(57)【要約】ペプチドまたはタンパク質のような薬物を充填した脂質ナノ粒子について記載する。これら脂質ナノ粒子を得る方法、及び医薬組成物を製造するためのその使用についても開示する。好ましい態様によれば、薬物はＬＨＲＨ類似体であり、より好ましくはＬＨＲＨアンタゴニストであり、脂質マトリックスは少なくとも７０％ｗ／ｗのモノグリセリドを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物、脂質マトリックス及び界面活性剤を含む脂質ナノ粒子であって、前記薬物がペプチドまたはタンパク質であり、前記脂質マトリックスが、脂質マトリックスの重量に対して少なくとも７０％ｗ／ｗのモノグリセリド含量を有することを特徴とする前記脂質ナノ粒子。
【請求項２】
前記モノグリセリド含量が、前記脂質マトリックスの重量に対して７５〜９９％ｗ／ｗであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項３】
前記脂質ナノ粒子が界面活性補助剤も含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項４】
前記薬物がタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項５】
前記薬物がペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項６】
前記薬物が、ＬＨＲＨ類似体からなる群より選択されるペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項７】
前記ペプチドがＬＨＲＨアンタゴニストとして作用するデカペプチドであることを特徴とする、請求項６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項８】
前記デカペプチドがアンタイド、Ｎ−Ａｃ−Ｄ−２−Ｎａｌ，Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ，Ｄ−３−Ｐａｌ，Ｓｅｒ，ＮｉｃＬｙｓ，Ｄ−ＮｉｃＬｙｓ，Ｌｅｕ，Ｉｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｄ−Ａｌａ，ＮＨ２であることを特徴とする、請求項６または７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９】
前記デカペプチドがセトロタイド、Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｎ５−（アミノカルボニル）−Ｄ−オルニチル−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｐｒｏであることを特徴とする、請求項６または７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１０】
前記界面活性剤が、合成リン脂質、それらの水素化誘導体及びそれらの混合物、スフィンゴ脂質及びグリコスフィンゴ脂質、飽和若しくは不飽和脂肪酸、脂肪アルコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、エトキシル化脂肪酸及びそれらのエステル若しくはエーテル、または上記のものの２種以上の組合せから選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１１】
前記界面活性剤がジミリストイルホスファチジルグリセロールであることを特徴とする、請求項１０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２】
前記界面活性補助剤が、ブタノール、酪酸、ヘキサン酸、コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウムまたはグリココール酸ナトリウムからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が他の医薬的に許容可能な賦形剤も含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４】
そのような賦形剤が、アクリルポリマー、中鎖脂肪酸及びポリエチレングリコールからなる群より選択される、生体接着性または吸収増強性をもつポリマーであることを特徴とする、請求項１３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が１ｎｍ〜３μｍの範囲であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１６】
医薬として使用するための請求項１〜１５のいずれかに記載する脂質ナノ粒子。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の脂質ナノ粒子と、それらの医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の脂質ナノ粒子の製造方法であって、
−制御加熱条件下で、前記薬物を脂質相に取り込み、前記界面活性剤と場合により界面活性補助剤を水相に溶解して水相に添加し、
−前記脂質相を前記水相と混合し、
−得られたプレエマルジョンに高圧均質化処理を適用し、次いで
−温度制御条件下で前記ナノ−エマルジョンを冷却する、
各工程を含むか、または各工程から成る、前記製造方法。
【請求項１９】
前記工程をｐＨ１〜９の間で実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
有機相と水相との前記混合工程を、３０℃〜９０℃の温度で実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記高圧均質化工程を、３０℃〜９０℃の温度で実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記高圧均質化工程を、５０バール〜２０００バールの圧力で実施することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法に従って得られる脂質ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ペプチド及び／またはタンパク質の取り込みを促進する、両親媒性成分に富む脂質から成る脂質ナノ粒子、それらを得る方法、並びにそれらの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
長年にわたって研究されてきた薬物送達システムとしては、マイクロ粒子；リポソーム水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョン及び合成ポリマーまたは天然高分子をベースとするナノ粒子が挙げられる。
【０００３】
薬物送達用のマトリックス材料として固体脂質を使用することは、経口薬物送達用の脂質ペレット（例えばムコソルバン（登録商標）遅延化カプセル）により周知である。噴霧凝固による脂質マイクロ粒子の製造については、１９８０年代始めにSpeiserにより記載され（Speiser et al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54）、その後、経口投与用の脂質ナノペレットについても記載されている（Speiser、欧州特許第０１６７８２５号、１９９０）。基本的に、使用できる脂質は、身体が十分に許容するものである（例えば、非経口栄養物用のエマルジョン中に配合される脂肪酸から構成されるグリセリド）。
【０００４】
Baghamによって１９６５年に「リポソーム」として再発見されたリン脂質小胞は、１９８６年に化粧品業界への道が開かれた（J. E. Diederichs et al., Pharm. Ind. 56 (1994) 267-275）。
【０００５】
ポリマーマイクロ粒子に関しては、市場におけるその数は少なく、マイクロ粒子状製品の数はほんの少ししか増加していない。ポリマーナノ粒子に関しては、３０年以上研究されていても状況はもっと悪く、この送達系は市場に実質的には存在していない。これに関しては極めて周知の理由があり、そのうち、ポリマーの細胞毒性と、好適な大規模スケールでの製造方法がないという２つの問題は、注目すべきものである。インプラントとして使用が認められたポリマーが必ずしもナノ粒子の形状でも許容度が高いとは限らない。ナノメートルサイズ範囲〜数ミクロンのサイズである場合、例えばポリエステルポリマーに関して報告されているように（Int. J. Pharm. 30 (1986) pp.215-220， A. Smith）、ポリマーは細胞（例えばマクロファージ）に内部移行し、細胞内で分解して、細胞毒性作用をもたらすことがある。
【０００６】
リポソーム、脂質エマルジョン、ナノ粒子及びマイクロスフィアなどの従来の薬物担体の限界を考慮すると、特に調製、安定性及び毒性に関する従来の系の欠点を回避するために、ペプチドまたはタンパク質などの生物活性物質を制御送達する担体系に対する需要があるのは一目瞭然である。
【０００７】
脂質ナノ粒子は、エマルジョン、リポソーム並びにポリマーマイクロ粒子及びナノ粒子などの従来のコロイド状担体に対し代替の担体系を提示し、且つ以下に示す特性：
・生分解性及び非毒性；
・水に難溶性の物質を取り込む能力；
・高い化学的及び物理的安定性；
・乾燥貯蔵製剤を調製する可能性；
・取り込んだ物質の制御放出性、
を有する。
【０００８】
脂質ナノ粒子は、例えば以下の：
・脂質マトリックスの固相状態によって薬物放出を長引かせることができる；
・脂質マトリックスの固相状態が取り込んだ成分を化学分解から保護する；
・この脂質は基本的に許容度が高い（細胞毒性及び全身毒性が低い）；
・エマルジョン及びリポソームと同様に、高圧均質化により大規模スケールでの製造が可能である、
などの他の薬物送達システムの好都合な点を組み合わせることによって、ナノメートルサイズ範囲で固体物質状態の脂質粒子として特徴付けられることも周知である。
【０００９】
多くの種類の薬物が脂質ナノ粒子に取り込まれ、薬物担体系の好適性を評価するためにその充填能力が検証されてきた。Westesenらは、ユビデカレノンで薬物の取り込みについて研究している（J. Control. Release 48 (1997) pp.223-236）。例えば、テトラカインまたはエトミデート（J. Microencapsulation, vol.16, No.２, (1999) pp.205-213）、ビタミンＥパルミテート（Proc. Int. Symp. Control. Release Bioact. Mater. 25 (1998) pp.433-434）、シクロスポリン（ＷＯ９９／５６７３３号（１９９９年））、チモロール（S. T. P. Pharma Sciences, ６ (1992) 514-518, Gasco et al.）、ドキソルビシン及びイダルビシン（Int. J. Pharm. 89 (1993), Gasco et al.）などの数種の薬物が、脂質ナノ粒子中に内臓させることができると記載されている。しかしながら、例えばMullerらのリゾチーム−充填脂質ナノ粒子（Int. J. Pharm. 149 (1997), pp.255-265）のように、ペプチドを脂質ナノ粒子に取り込ませることに関しては殆ど研究されてこなかった。
【００１０】
今日まで、多くの研究者が薬物の制御放出用のコロイド状担体として脂質ナノ粒子を調製してきた。Dombら（ＷＯ９１／０７１７１号）は、薬物や他の生物活性剤の担体としてリポスフィアを製造した。超音波処理を使用することにより、Speiserら（Ger. Offen. ＤＥ３４２１４６８号（１９８５年））は、主に脂肪酸と、そのグリセロールとのエステルとから構築した脂質ナノペレット（８０〜８００ｎｍ）を得た。Sjosrtom及びBergenstahlは、溶媒エマルジョン中に沈澱させることにより脂質ナノ粒子を得た（Int. J. Pharm. 88 (1993), pp.53-62）。Siekmann及びWestesen（Pharm. Pharmacol. Lett. １ (1992) pp.123-126）、Westesenら（Int. J. Pharm. 93 (1993) pp.189-199）並びにMullerら（J. Controlled Rel. 30 (1994) pp.83-96）は、界面活性剤水溶液中に分散させた融解脂質を高圧均質化することによって脂質ナノ粒子を製造した。
【００１１】
薬物送達系として脂質ナノ粒子を使用する際に、ペプチド及び／またはタンパク質を充填することに関しては、
−充填した薬物の溶解性が低い；
−充填した薬物の安定性が低い；
−薬物と脂質マトリックスの間の相互作用が少ない；
−酵素分解及び化学分解；
−胃腸管を経由する吸収が悪い、
という幾つかの問題が残っている。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、一度投与されたら制御放出を提供する、ペプチド及び／またはタンパク質を取り込むのに好適な両親媒性脂質を含む新規タイプの脂質ナノ粒子を提供する。
【００１３】
特に本発明の主目的は、薬物、脂質マトリックス及び界面活性剤を含む新規タイプの脂質ナノ粒子であって、前記薬物がペプチドまたはタンパク質であり、前記脂質マトリックスが、脂質マトリックスの重量に対して少なくとも７０％ｗ／ｗのモノグリセリド含量であることを特徴とする、前記脂質ナノ粒子を提供することである。
【００１４】
この脂質マトリックス中に前記ペプチド及び／またはタンパク質をより多く取り込ませるために、例えばトリ−、ジ−及びモノ−グリセリド、ＰＥＧ−またはＰＰＧ−グリセリド、糖−グリセリド、脂肪酸並びにそれらの混合物など、種々の親水性／疎水性特性及び化学組成をもった数種の脂質をスクリーニングした。
【００１５】
驚くべきことに、高モノグリセリド含量の脂質マトリックスを使用することによって、ペプチド及び／またはタンパク質の最大充填量が達成され、これによりその脂質ナノ粒子に両親媒性が付与されることが知見された。前記脂質マトリックス量のモノグリセリド含量は、少なくとも７０％ｗ／ｗであり、好ましくは７５〜９９％ｗ／ｗであるべきことが判明した。従って、本発明によれば、モノグリセリド含量の総量が上記の如く少なくとも７０％であれば、上記脂質のいずれでも、またはこれらの１種以上のいかなる混合物でも使用することができる。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、この脂質マトリックスは少なくとも６５℃の融解ピークをもち、少なくとも７０℃の融解ピークをもつのがより好ましい。脂質マトリックスの融解ピークは、当技術分野に公知の任意の方法により容易に測定することができる。これらの方法の一例としては、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）がある。
【００１７】
さらに本発明の他の好ましい態様によれば、この脂質マトリックスの結晶含有量は高い。この結晶含有量は、当技術分野に公知の任意の方法により測定することができる。例えば、ＤＳＣの実験によって、この脂質マトリックスが高結晶含有量であるか、多形であるか定性的に確定することができる。実際、多形脂質マトリックスのＤＳＣプロットは、複数の低温且つブロードな融解ピークを示すが、高結晶含有量の脂質マトリックスでは、ＤＳＣプロットは高温且つシャープなピークを示す。
【００１８】
本発明の薬物充填脂質ナノ粒子は、イオン性または非イオン性界面活性剤などの化合物によって安定化する。好適な界面活性剤としては以下の：合成リン脂質、それらの水素化誘導体及びそれらの混合物、スフィンゴ脂質及びグリコスフィンゴ脂質、飽和若しくは不飽和脂肪酸、脂肪アルコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、エトキシル化脂肪酸及びそれらのエステル若しくはエーテル、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロールまたはこれらの２種以上の組合せ、が挙げられるがこれらに限定されるものではない。本発明の好ましい界面活性剤は、ジミリストイルホスファチジルグリセロールである。
【００１９】
前記脂質ナノ粒子は、場合によりさらに、ブタノール、酪酸、ヘキサン酸、コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム及びグリココール酸ナトリウムを含むかまたはこれらから成る群より選択される少なくとも１種の界面活性補助剤、より好ましくはコール酸ナトリウムによって安定化する。
【００２０】
本発明の脂質ナノ粒子は、例えば生体接着性または吸収増強性をもつポリマーなどの他の賦形剤を含むこともでき、これらはアクリルポリマー（カルボポール（登録商標）、ポリカルボフィル、ノベオン（登録商標））、中鎖脂肪酸及びポリエチレングリコールを含むか、またはこれらから成る群より選択される。好ましい賦形剤は、上記のアクリルポリマーである。
【００２１】
脂質マトリックス、界面活性剤、界面活性補助剤及び他の賦形剤は全て医薬的に許容可能なものとする。
通常、本発明の脂質ナノ粒子には、任意の治療上有効なペプチドまたはタンパク質を取り込ませることができる。治療上有用なタンパク質の多くは、以下の３種類に分けることができる：
−ホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、それらのレセプターを含む調節因子、並びに酵素を含む細胞増殖及び代謝を調節する他の因子；
−血清由来血液因子及び酵素フィブリノーゲン活性化因子などの血液産物；
−モノクローナル抗体。
【００２２】
本発明の態様によれば、上記の如き好適なタンパク質またはペプチドとしては、以下の：ＡＡＴ、ＵＫ、ＰＵＫ、ストレプトキナーゼ、ｔＰＡ、ＳＯＤ、インスリン、ＧＨ、ＧＲＨ、ＡＮＦ、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ類似体、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３／多能ＣＳＦ、インターロイキン−４、インターロイキン−５（または好酸球−ＣＳＦ）、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、白血病阻害因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、幹細胞因子及びこれらのレセプター、が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、前記タンパク質またはペプチドは、インターロイキン−６、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ類似体、ＧＨ、ＧＲＦ、ゴナドトロピン（ＦＳＨ、ＬＨ及びｈＣＧのような）、及びＴＮＦレセプターまたはその可溶性フラグメントからなる群より選択される。
【００２４】
より好ましくは、ペプチドは、ＬＨＲＨ類似体からなる群より選択され、より好ましくはＬＨＲＨアンタゴニストとして作用するデカペプチドである。
本発明の特に好ましい態様では、前記ペプチドの非限定的なリストとして、以下の化合物が挙げられる。
【００２５】
−アバレリックス（Abarelix）（ＷＯ９６／４０７５７号に開示）はＬＨＲＨアンタゴニストとして作用し、以下の式により定義される：
Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｎ−メチル−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００２６】
−アンタレリックス（Antarelix）（ＷＯ９２／１９６５１号に開示）はＬＨＲＨアンタゴニストとして作用し、以下の式により定義される：
Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｎ６−（アミノカルボニル）−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００２７】
−アザリンＢ（Azaline B）（米国特許第５２９６４６８号に開示）はＧｎＲＨアンタゴニストとして作用し、以下の式により定義される：
Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−４−［（５−アミノ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）アミノ］−Ｌ−Ｐｈｅ−４−［（５−アミノ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）アミノ］−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００２８】
−ガニレリックス（Ganirelix）（欧州特許第２７７８２９号に開示）はＬＨＲＨアンタゴニストとして作用し、以下の式により定義される：
Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｎ６−［ビス（エチルアミノ）メチレン］−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｎ６−［ビス（エチルアミノ）メチレン］−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００２９】
本発明のより好ましい態様において、ＬＨＲＨアンタゴニストとして作用する前記ペプチドは、アンタイド（Antide）といわれる特定のデカペプチドである。このデカペプチド（Ｎ−Ａｃ−Ｄ−２−Ｎａｌ、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｄ−３−Ｐａｌ、ＮｉｃＬｙｓ、Ｄ−ＮｉｃＬｙｓ、Ｉｌｙｓ、Ｄ−Ａｌａ、ＮＨ２）は、優れた抗排卵活性及びＬＨＲＨアンタゴニスト特性をもち、女性のホルモン代謝に直接的に作用するものとして既に記載されている（欧州特許第３７７６６５号及び米国特許第５４７０９４７号）。
【００３０】
ＬＨＲＨアンタゴニストとして作用する他の特に好ましいペプチドは、セトロタイド（Cetrotide）といわれる他のデカペプチド（このＩＮＮは、欧州特許第２９９４０２号に開示されるセトロレリックス（Cetrorelix）である）であり、以下の式をもつ：Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｎ５−（アミノカルボニル）−Ｄ−オルニチル−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００３１】
以下に、ペプチド−またはタンパク質−充填脂質ナノ粒子は、医薬組成物を製造するための医薬として使用するのに実際に好適であることを報告する。ペプチドがＬＨＲＨアンタゴニストとして作用するデカペプチドである好ましい場合では、医薬組成物は、哺乳類におけるホルモン代謝の調節に、または女性のホルモン代謝の異常活性に関連する障害の治療若しくは予防に有用であろう。より具体的には、ＬＨＲＨ経路の異常活性に関連する障害の治療または予防に有用であろう。この特定の場合において、ペプチド−充填脂質ナノ粒子は、哺乳類での排卵を阻害したり、ホルモン依存性腫瘍の増殖または哺乳類でのテストステロン産生を阻害する避妊薬などの、ＬＨＲＨの拮抗が重要な役割を果たす、ホルモン疾患、病的状態の治療、または避妊活動に有用である。ペプチド−充填脂質ナノ粒子は、単独でまたは他の薬物と組み合わせて使用することができる。
【００３２】
医薬として使用する場合、本発明のペプチド−またはタンパク質−充填脂質ナノ粒子は、通常、医薬剤形の形状で投与される。従って、ペプチド−またはタンパク質−充填脂質ナノ粒子と、希釈剤、酸化防止剤、界面活性剤、界面活性補助剤、増粘剤、抗菌剤、凍結保護物質などの医薬賦形剤とを含む医薬組成物も、本発明の範囲内である。そのような組成物は、医薬分野において周知の方法で製造することができる。通常、本発明のペプチド−またはタンパク質−充填脂質ナノ粒子は、治療上有効量で投与される。実際に投与される量は、通常、処置すべき症状、選択した投与経路、それぞれの患者の年齢、体重及び応答、患者の症状の重篤度などを含む関連する状況を考慮して、医師により決定される。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、皮膚、舌下、直腸、口腔、膣内、鼻腔または肺などの種々の経路により投与することができる。経口投与経路が本発明の好ましい経路である。
【００３４】
意図する送達経路により、化合物を液体形にも固体形にも製剤することができる。経口投与用の組成物は、バルク液体溶液若しくは懸濁液、または混合散剤の形態をとることができる。
【００３５】
経口投与に好適な液体形としては、緩衝剤、懸濁化剤及び分散剤、着色剤、香料などと混合した好適な水性または非水性ビヒクルが挙げられる。
固体形としては、例えば、以下の成分または同様の性質の化合物：微結晶セルロース、トラガカントゴム若しくはゼラチンなどの結合剤；デンプン若しくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモジェル若しくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤（glidant）；ショ糖若しくはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジフレーバー剤などのフレーバー剤など、のいずれも含有できる。
【００３６】
注射可能な組成物は、通常、注射可能な滅菌塩水若しくはリン酸塩緩衝化塩水または、当技術分野に公知の他の注射可能な担体をベースとする。
本発明のさらなる目的は、上記の如きペプチドまたはタンパク質を充填した脂質ナノ粒子を製造する方法である。
【００３７】
好ましい製造方法によれば、本発明のペプチド−またはタンパク質−充填脂質ナノ粒子は、以下の工程を含む方法により製造することができる(図２を参照されたい)。
１．制御加熱条件下で、薬物を脂質相に取り込み、界面活性剤と、場合により界面活性補助剤を水相に溶解して水相に添加し；
２．この脂質相を前記水相と混合し；
３．得られたプレエマルジョンを高圧で均質化し；
４．正確に制御した温度条件下で前記ナノ−エマルジョンを冷却する；
５．場合により水を除去する。
【００３８】
上記工程をそれぞれ以下に詳述する。
第１工程
前記ペプチド及び／またはタンパク質は、周知の共融解技術によって脂質マトリックスに取り込まれる。特に、脂質を最初にサーモスタット付きの浴中で、使用する脂質に依存して適当な温度で融解させる。次いで前記ペプチド及び／またはタンパク質を、絶えず撹拌しながら、この融解した脂質に徐々に添加する。
【００３９】
「溶媒−ストリッピング」法を使用して、薬物を脂質マトリックスに取り込ませることもできる。最初に薬物と脂質を適当な溶媒中に好適な温度で同時に溶解し、次いで溶媒を適当な条件で（真空下、好適な温度で）除去する。
【００４０】
この第１工程において、マトリックスを、界面活性（tensioactive）特性と親水性を備えるリン脂質のような追加の賦形剤で変性し、薬物をマトリックスに取り込ませるのをさらに促進させることもできる。リン脂質は、非経口及び経腸エマルジョンを製造するため、並びに懸濁液、スプレー及びエアロゾルを安定化させるため、そしてリポソーム製造のために通常医薬業界において使用される。さらに、これらの賦形剤は、薬物の吸収においても有利な効果があるだろう。
【００４１】
第１工程では、界面活性剤と、場合により界面活性補助剤とを水相に溶解させる。界面活性剤は、脂質と水相との間の界面張力を低下させることによって、エマルジョン／懸濁液に安定化作用をもたらす。
【００４２】
界面活性補助剤は、２相間の界面にあると考えられるので、安定剤としても作用し、そのため、粒子表面に電荷を与えて、粒子が凝集しないようにする。
薬物を脂質マトリックスに取り込ませるために「溶媒−ストリッピング」法を使用する場合は、使用する溶媒は、水、エタノール、プロパノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、またはそれらの混合物からなる群より選択され、より好ましくはベンジルアルコールである。
【００４３】
第２工程
同一温度（３０℃〜９０℃、好ましくは５０℃〜８０℃、より好ましくは６５℃〜８５℃）に保持した水相と脂質相とを激しく混合して、プレエマルジョンを得る。
【００４４】
第３工程
高圧均質化は、３０℃〜９０℃の温度で、５０バール〜２０００バール、好ましくは５００バール〜１８００バール、より好ましくは１０００バール〜１５００バールの圧力で実施する。この工程の間に、空洞形成と機械的応力とにより粒子が破裂して、ナノエマルジョンができる。
【００４５】
第４工程
得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却する。固体脂質ナノ粒子は、脂質の結晶化後に現れる。
【００４６】
上記工程は、ｐＨ１〜９、好ましくは５〜７の範囲で実施する。
この工程では、本発明の脂質ナノ粒子は水性懸濁液中にあるが、固相中で得られる。
脂質ナノ粒子製剤中の脂質ナノ粒子のサイズ（平均径）は、数ｎｍ（１０ｎｍ）〜約１０μｍの範囲を網羅するベル型プロフィール（頻度対サイズのログプロット、図３を参照されたい）をもつ。従って、粒子群のサイズは、以下のような粒子群のサイズ分布を定義する、Ｄ（ｖ，０．１）、Ｄ（ｖ，０．５）及びＤ（ｖ，０．９）パラメーターのほうが表しやすい。
【００４７】
−  Ｄ（ｖ，０．１）＝粒子の１０％（体積）がこの値未満のサイズをもつ。
−  Ｄ（ｖ，０．５）＝粒子の５０％（体積）がこの値未満のサイズをもつ。
−  Ｄ（ｖ，０．９）＝粒子の９０％（体積）がこの値未満のサイズをもつ。
【００４８】
発明者らが選択した最も有望な脂質ナノ粒子製剤に関するサイズパラメーターは、６ヶ月までの種々の時間において分析した脂質ナノ粒子製剤の、重ね書きしたＬＤふるい下体積曲線（overlayed LD volume undersize curve）を示す図６及び表３に示されているデータから解るように、例えば、以下のようなものである。
【００４９】
−  Ｄ（ｖ，０．１）＝０．１５μｍ〜０．２０μｍの範囲内。
−  Ｄ（ｖ，０．５）＝０．３０μｍ〜０．６０μｍの範囲内。
−  Ｄ（ｖ，０．９）＝１μｍ〜１０μｍの範囲内。
【００５０】
本発明の好ましい態様に従って得られる脂質ナノ粒子水性製剤の組成を以下に記載する。
【００５１】
【表１】
2004519447.tif 000002
【００５２】
本発明の好ましい組成物によれば、ペプチドまたはタンパク質含量は、最終水性製剤の重量に対して０．１〜２０％ｗ／ｗであり、好ましくは０．１〜０．５％ｗ／ｗである。
本発明の好ましい態様では、脂質マトリックス含量は、最終水性製剤の重量に対して２〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは５〜４０％ｗ／ｗであり、より好ましくは８〜３０％ｗ／ｗである。
【００５３】
本発明の他の好ましい態様によれば、界面活性剤の含量は、最終水性製剤の重量に対して１〜５％ｗ／ｗ、好ましくは２〜４％ｗ／ｗである。
本発明の特に好ましい組成物によれば、界面活性補助剤含量は、最終水性製剤の重量に対して０〜１％ｗ／ｗ、好ましくは０．２〜０．８％ｗ／ｗである。
【００５４】
本発明の特に好ましい組成物によれば、吸収増強性添加剤の含量は、最終水性製剤の重量に対して０〜５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．２〜１％ｗ／ｗである。
本発明の特に好ましい組成物によれば、生体接着性添加剤含量は、最終水性製剤の重量に対して０〜０．０５％ｗ／ｗ、好ましくは０．００５〜０．０５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．００５〜０．０２％ｗ／ｗである。
【００５５】
非常に驚くべきことに、本発明のペプチド−／タンパク質−充填脂質ナノ粒子は、内蔵効率も変化せず、十分な安定性（６ヶ月以上）を示した（図６を参照されたい）。
シクロスポリンを充填した本発明のCompritol脂質ナノ粒子と、シクロスポリンを充填したImwitor 900脂質ナノ粒子（ＤＥ１９８１１９２７３号）との比較は、サイズに関して本組成物がより安定であることを示している（図４及び図５を参照されたい）。
【００５６】
第５工程（任意）
脂質ナノ粒子を固体剤形の医薬製剤に使用すると考えられる場合、水性懸濁液の水は除去しなければならない。水の除去は、例えば濾過若しくは限外濾過により、または凍結乾燥によるなど、当技術分野に公知の任意の方法により実施することができる。
【００５７】
この段落では、種々の生物学的用語及び分析用語の略語及び定義並びに本出願に使用する略語を提供し、他に記載しない限り、本明細書及び請求の範囲において一律に適用するものとする。
【００５８】
「両親媒性」なる用語は、２つの異なる環境に対する親和性をもつ化合物、例えば親水性（極性）領域と、親油性（非極性）領域とをもつ分子を指す。洗剤は、典型例である。
「ＡＡＴ」は、α−１−アンチトリプシンを指す。
【００５９】
「ＡＮＦ」は、心房性ナトリウム利尿因子を指す。
「アンタイド」は、Iturelixが提唱されたＩＮＮであるが、以下のデカペプチドを指す：Ｎ−Ａｃ−Ｄ−２−Ｎａｌ、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｄ−３−Ｐａｌ、Ｓｅｒ、ＮｉｃＬｙｓ、Ｄ−ＮｉｃＬｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｄ−Ａｌａ、ＮＨ２；但し、
「２−Ｎａｌ」は３−（２−ナフチル）アラニンを指し；
「Ｉｌｙｓ」は、Ｎ−イソプロピルリジンを指し；
「ＮｉｃＬｙｓ」は、Ｎ−ニコチノイルリジンを指し；
「３−Ｐａｌ」は３−（３−ピリジル）アラニンを指す。
【００６０】
「ＤＳＣ」は示差走査熱量分析を指す。
「△Ｈ」は、エンタルピー変化量を指す。
「ＤＭＰＣ」は、ジミリストイルホスファチジルコリンを指す。
【００６１】
「ＤＭＰＧ」は、ジミリストイルホスファチジルグリセロールを指す。
「第ＶＩＩＩ因子」は、２３３１アミノ酸を含む糖タンパク質を指す。
「ＦＳＨ」は、卵胞刺激ホルモンを指す。
【００６２】
「ＧＨ」は成長ホルモンを指す。
「グリセリド」は、Ｃ４〜Ｃ３０の飽和または不飽和の脂肪酸のグリセロールエステルを意味するものとする。
【００６３】
「ＧＲＦ」は、成長ホルモン放出因子を指す。
「ＧｎＲＨ」は、ゴナドトロピン放出ホルモンを指す。
「ＨＰＨ」は、高圧均質化を指す。
【００６４】
「ＬＤ」は、レーザー回折法を指す。
「ＬＨＲＨ」は、黄体形成ホルモン放出ホルモンを指す。
本発明による「脂質」なる用語は、水に難溶性であるが、有機溶媒には溶解性である物質を指す。本発明によれば、脂質には、脂肪酸、モノ−、ジ−及びトリグリセリド、リン脂質、ＰＥＧ−グリセリド、糖−グリセリドまたは蝋、並びにこれらの任意の混合物が含まれる。
【００６５】
「ＬＮ」は、脂質ナノ粒子を指す。
「ｍ．ｐ．」は融点を指す。
「モノグリセリド」は、以下に示すようなグリセロールアルコール官能基の１つを脂肪酸によりエステル化すること：
ＣＨ２ＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ    →    ＣＨ２ＯＣＯＲ１−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ
グリセロール モノグリセリド
（式中、Ｒ１は、Ｃ４〜Ｃ３０の飽和または不飽和の炭化水素鎖である）により、またはトリグリセリドの部分加水分解により得られる化合物を指す。
【００６６】
「ナノ粒子」は、その平均径が１ｎｍ〜３０００ｎｍの範囲で構成される粒子を指す。
「ＰＣＳ」は、光子相関分光法を指す。
「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールを指す。
【００６７】
「ペプチド」は、アミド基間に四面体炭素原子を含むポリアミド主鎖を意味する。ペプチド鎖は、アミノ酸の縮合により得られ：１個のアミノ基が次のカルボキシル基と結合すると、ペプチド結合が１個形成される。
【００６８】
「医薬的に許容可能な」とは、活性成分の生物活性の有効性を妨げず、且つ投与する宿主に対して無毒性である任意の物質を包含するものとする。
「多形体」とは、固体状態において幾つかの結晶形をとる可能性がある物質を指す。
【００６９】
「タンパク質」とは、ポリペプチドアミノ酸配列を含む分子を指す。ペプチドとタンパク質との大きな違いは、そのサイズである。本発明では、ペプチドは１００個以下のアミノ酸を含むが、タンパク質は１００個を超えるアミノ酸を含む。
【００７０】
「ＰＵＫ」とはプロウロキナーゼを指す。
「糖」とは、少なくとも２個のヒドロキシル基をもつアルデヒド基またはケトン基を指し、この糖は幾つかの形態：モノマー形（単糖）、二量体形（二糖）、三量体形（三糖）、オリゴマー（オリゴ糖）、及びポリマー（多糖）をとる。
【００７１】
「ＳＯＤ」はスーパーオキシドジスムターゼを指す。
「界面活性剤」は、水溶液中の非極性物質のエマルジョン及び懸濁液を安定化させ得る両親媒性化合物を指す。
【００７２】
「界面活性補助剤」は、界面活性剤の作用を最適化し且つ完全にすることができる両親媒性化合物を指す。
「治療上有効量」とは、上記の疾患の経過及び重篤度に影響を与えて、そのような病状を軽くしたり、寛解させるのに十分な量を指す。この有効量は、投与経路及び患者の症状に依存するであろう。
【００７３】
「ＴＮＦ」は、腫瘍壊死因子を指す。
「ｔＰＡ」は、組織プラスミノーゲン活性化因子を指す。
「ＵＫ」は、ウロキナーゼを指す。
【００７４】
「ｗ／ｗ」は、重量／重量を指す。
以下の図面を参照する実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【００７５】
実施例
以下、本明細書で報告される実施例で使用したペプチドはアンタイドである。このペプチドは、以下のデータにより示されるように両親媒性である。
【００７６】
表面張力分析：  表面張力γＬＶ、測定は、種々の薬物濃度、即ち０．０１、０．１、１．０、１０ｍＭのアンタイド水溶液で、Kruss張力計（液滴形状分析システム）を使用して実施した。結果を図１に示す。
【００７７】
分配係数：  有機相としてオクタノール、親水相として水を使用して測定した。２相を室温で２４時間、互いに飽和させた。次いでアンタイドを、飽和より十分低い濃度で水相に溶解させた。続いて、等量の有機相を水相に添加し、混合物を室温で２４時間、撹拌しながら保持した。２相中のアンタイド濃度をＲＰ−ＨＰＬＣで測定し、有機相と水相の薬物濃度比から、分配係数を得た。
【００７８】
得られたオクタノール／水の係数は、８．５６×１０−２であった。
幾つかの脂質中でのアンタイド半定量的溶解度評価の結果を、脂質モノグリセリド含量と共に表１に示す。
【００７９】
ペプチド−充填脂質ナノ粒子の製造と性質決定
本発明に関連する幾つかの実施例を、種々の組成を用いて以下に述べる。図２は、ＨＰＨ法による脂質ナノ粒子の製造を図式化したものである。
【００８０】
材料と装置
アンタイドバルク、Bachem。
Imwitor 900（グリセリルモノステアレート）、Condea Chemie−ＤＥ。
【００８１】
Compritol E ATO（グリセリルモノベヘネート）、Gattefosse−ＦＲ。
Compritol 888 ATO（グリセリルベヘネート）、Gattefosse−ＦＲ。
Imwitor 312（ラウリン酸のモノグリセリド）、Condea Chemi−ＤＥ。
【００８２】
Imwitor 928（グリセリル モノ−／ジ−ココエート）、Condea Chemie−ＤＥ。
Geleol（グリセリル モノ−パルミテート／ステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
Compritol HD 5 ATO（グリセリル／ポリエチレングリコール ベヘネート）、Gattefosse−ＦＲ。
【００８３】
Superpolystate（ポリエチレングリコールステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
Precirol ATO 5（グリセリル モノ−／ジ−／トリパルテート／ステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
【００８４】
Witepsol E 85（Ｃ１０〜Ｃ１８飽和脂肪酸のトリグリセリド）、Massa Witepsol。
Softisan 142（水素化ココ−グリセリド）、Condea Chemie−ＤＥ。
Gelot 64（グリセリル／ポリエチレングリコール パルミテート／ステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
【００８５】
Monosteol（プロピレングリコールのパルミテート／ステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
Gelucire 44/14（ラウリン酸とグリセロール及びポリエチレングリコールとのモノ−／ジ−／トリ−エステルの所定のブレンド）、Gattefosse−ＦＲ。
【００８６】
Gelucire 50/13（ステアリン酸とグリセロール及びポリエチレングリコールのモノ−／ジ−／トリ−エステルの所定のブレンド）、Gattefosse−ＦＲ。
セチルアルコール、Sigma。
【００８７】
Lutrol F68（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン ブロックコポリマー）、Basf−Ｄ。
Tagat S（ＰＥＧ３０−グリセリルステアレート）、Goldschmidt−Ｄ。
【００８８】
カプリン酸、Sigma。
コール酸ナトリウム塩、ICN Aurora Ohio−ＵＳＡ。
１，２−ジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）ナトリウム塩、Chemi−Ｉ。
【００８９】
１，２−ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、Chemi−Ｉ。
Noveon AA1（Goodrich）。
Pemulen TR-2 NF（Goodrich）。
【００９０】
Perkin Elmer Pyris１示差走査熱量計。ＤＳＣ分析は、以下の操作条件：範囲：８℃〜１００℃；スキャン速度：５℃／分；パン（孔あき）容積：５０μＬ；Ｎ２フラックス：２０μＬ／分で、加熱及び冷却モードの両方で実施した。ＤＳＣパラメーターは、主な熱転移の徴候を示している２回目の加熱測定で評価した。
【００９１】
Malvern Mastersizer Microplus MAF 5001レーザー回折計。
Malvern Zetasizer 3000HS（サイズ分析及びゼータ−ポテンシャル分析）。
高圧ホモジナイザーMICRON LAB 40（ＡＰＶ）、温度自動調節ジャケット付き。
【００９２】
液滴形状分析システムDSA 10-Kruss。
Waters ＨＰＬＣシステム：２６９０分離モジュール；ＲＰカラム、Jupiter ５μm Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）；２４８７  二重λ吸光度検出器。
【００９３】
実施例１：  Compritol E ATO、Tagat S及びコール酸ナトリウムを使用する脂質ナノ粒子の製造
８５℃で、融解脂質（Compritol E ATO、３．９２ｇ）にペプチド（アンタイド、０．０８ｇ）を分散させた後、界面活性剤（Tagat S、１．０ｇ）と界面活性補助剤（コール酸ナトリウム、０．２ｇ）とを含む温かい水相を添加した。通常の均質化ツールを使用して、得られた混合物を同じ温度で予備均質化し、プレエマルジョンを得た。このエマルジョンを８０℃〜９０℃で高圧均質化にかけた。このようにして得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却し、脂質を結晶化させた後、固体ナノ粒子が生じた。バッチサイズは４０ｇであった。
【００９４】
実施例２：  Compritol E ATO、DMPG、Tagat S及びコール酸ナトリウムを使用する脂質ナノ粒子（ＬＮ２７）の製造
８５℃で、ＤＭＰＧ（０．２ｇ）を含む融解脂質（Compritol E ATO、３．７２ｇ）にペプチド（アンタイド、０．０８ｇ）を分散させた後、界面活性剤（Tagat S、１．０ｇ）と界面活性補助剤（コール酸ナトリウム、０．２ｇ）とを含む温かい水相を添加した。通常の均質化ツールを使用して、得られた混合物を同じ温度で予備均質化し、プレエマルジョンを得た。このエマルジョンを８０℃〜９０℃で高圧均質化にかけた。このようにして得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却し、脂質を結晶化させた後、固体ナノ粒子が生じた。バッチサイズは４０ｇであった。
【００９５】
実施例２Ａ：  Imwitor 900、DMPG、Tagat S及びコール酸ナトリウムを使用する脂質ナノ粒子の製造
Compritol E ATOの代わりにImwitor 900を使用して、実施例２を繰り返した。粒子が凝集する傾向があったので、手順の最後にナノ粒子は生じなかった。これは、この２つの脂質間で、モノグリセリド含量、融解ピーク及び結晶含量が異なっていたためである。そのような違いは全て図７に報告されている。
【００９６】
実施例３：  Compritol E ATO、Imwitor 900、DMPG、Tagat S及びコール酸ナトリウムを使用する脂質ナノ粒子の製造
８５℃で、ＤＭＰＧ（０．２ｇ）を含む融解脂質ブレンド（Compritol E ATOとImwitor 900、９：１、３．７２ｇ）にペプチド（アンタイド、０．０８ｇ）を分散させた後、界面活性剤（Tagat S、１．０ｇ）と界面活性補助剤（コール酸ナトリウム、０．２ｇ）とを含む温かい水相を添加した。通常の均質化ツールを使用して、得られた混合物を同じ温度で予備均質化し、プレエマルジョンを得た。このエマルジョンを８０℃〜９０℃で高圧均質化にかけた。
【００９７】
このようにして得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却し、脂質を結晶化させた後、固体ナノ粒子が生じた。バッチサイズは４０ｇであった。
実施例４：  Compritol E ATO、DMPG及びLUTROL F68を使用する脂質ナノ粒子（ＬＮ２８）の製造
８５℃で、ＤＭＰＧ（０．２ｇ）を含む融解脂質（Compritol E ATO、３．７２ｇ）にペプチド（アンタイド、０．０８ｇ）を分散させた後、界面活性剤（Lutrol F68、２．０ｇ）を含む温かい水相を添加した。通常の均質化ツールを使用して、得られた混合物を同じ温度で予備均質化し、プレエマルジョンを得た。このエマルジョンを８０℃〜９０℃で高圧均質化にかけた。このようにして得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却し、脂質を結晶化させた後、固体ナノ粒子が生じた。バッチサイズは４０ｇであった。
【００９８】
実施例５：  Compritol E ATO及びLutrol F68を使用する脂質ナノ粒子（ＬＮ２９）の製造
８５℃で、融解脂質（Compritol E ATO、３．９２ｇ）にペプチド（アンタイド、０．０８ｇ）を分散させた後、界面活性剤（Lutrol F58、２．０ｇ）を含む温かい水相を添加した。通常の均質化ツールを使用して、得られた混合物を同じ温度で予備均質化し、プレエマルジョンを得た。このエマルジョンを８０℃〜９０℃で高圧均質化にかけた。このようにして得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却し、脂質を結晶化させた後、固体ナノ粒子が生じた。バッチサイズは４０ｇであった。
【００９９】
実施例６：  Compritol E ATO、カプリン酸、Tagat S及びコール酸ナトリウムを使用する脂質ナノ粒子の製造
８５℃で、融解脂質相（Compritol E ATO、３．６４ｇ及びカプリン酸０．０８ｇ）にペプチド（アンタイド、０．０８ｇ）を分散させた後、界面活性剤（Tagat S、１．０ｇ）と界面活性補助剤（コール酸ナトリウム、０．２ｇ）とを含む温かい水相を添加した。通常の均質化ツールを使用して、得られた混合物を同じ温度で予備均質化し、プレエマルジョンを得た。このエマルジョンを８０℃〜９０℃で高圧均質化にかけた。このようにして得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却し、脂質を結晶化させた後、固体ナノ粒子が生じた。バッチサイズは４０ｇであった。
【０１００】
実施例７：  Compritol E ATO、DMPG、Lutrol F68及びNoveon AA1を使用する脂質ナノ粒子の製造
８５℃で、ＤＭＰＧ（０．４ｇ）を含む融解脂質（Compritol E ATO、３．９２ｇ）にペプチド（アンタイド、０．０８ｇ）を分散させた。水相は以下のようにして調製した。界面活性剤（Lutrol F68、２．０ｇ）を半分の容量の水相（約１７ｍＬの水）に溶解し、同時にNoveon AA1（４ｍｇ）をもう半分の容量の水相（約１７ｍＬの水）に分散させた。最初に界面活性剤を含む温かい水相を融解脂質相に添加し、続いてNoveonを含む他方の水相をこの混合物に注ぎ、これを通常の均質化ツールを使用して、同じ温度で予備均質化し、プレエマルジョンを得た。このエマルジョンを８０℃〜９０℃で高圧均質化にかけた。このようにして得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却し、脂質を結晶化させた後、固体ナノ粒子が生じた。バッチサイズは４０ｇであった。
【０１０１】
実施例８：  Compritol E ATO、Lutrol F68及びPemulen TR-2 NFを使用する脂質ナノ粒子の製造
８５℃で、ＤＭＰＧ（０．４ｇ）を含む融解脂質（Compritol E ATO、３．９２ｇ）にペプチド（アンタイド、０．０８ｇ）を分散させた。水相は以下のようにして調製した。界面活性剤（Lutrol F68、２．０ｇ）を半分の容量の水相（約１７ｍＬの水）に溶解し、同時にPemulen（４ｍｇ）をもう半分の容量の水相（約１７ｍＬの水）に分散させた。最初に界面活性剤を含む温かい水相を融解脂質相に添加し、続いてPemulenを含む他方の水相をこの混合物に注ぎ、これを通常の均質化ツールを使用して、同じ温度で予備均質化し、プレエマルジョンを得た。このエマルジョンを８０℃〜９０℃で高圧均質化にかけた。このようにして得られたナノエマルジョンを温度制御条件下で冷却し、脂質を結晶化させた後、固体ナノ粒子が生じた。バッチサイズは４０ｇであった。
【０１０２】
実施例１〜５に記載の如く製造した脂質ナノ粒子の性質決定について以下に報告する。
実施例９：  脂質ナノ粒子のアンタイド被包効率の評価
脂質ナノ粒子のアンタイド被包効率を、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して測定した。最初に脂質ナノ粒子懸濁液をアセトンに完全溶解させた。次いで、有機相に水を添加してアンタイドを抽出した。２相の混合物を撹拌し、超音波処理し、遠心分離し、透明相を回収し、ＨＰＬＣカラムに注入した。この方法で決定した薬物含有量は、脂質ナノ粒子に取り込まれたアンタイドや連続する水相に溶解したアンタイドに全く関係なく、全薬物含有量とみなされなければならないことに注意すべきである。驚くべきことに、このアンタイドは８５〜９０％の効率で被包されていた。さらに、形成した脂質ナノ粒子は、４℃で製造後少なくとも６ヶ月にわたって物理的且つ化学的に安定であった。実際のところ、活性成分の分解は知見されず、脂質ナノ粒子の物理的特性は変化しなかった。粒子間での凝集も見られなかった。
【０１０３】
実施例１０：  in vitro アンタイド放出
アンタイド−脂質ナノ粒子を放出媒体（水）中でインキュベーションし、種々の時間でサンプルを取りだし、続いて０．２２μｍのAcrodiscフィルターでろ過した。透明溶液をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。２種類の製剤からのアンタイド放出の結果を図８に示す。
【０１０４】
実施例１１：  脂質ナノ粒子の物理化学的性質決定
アンタイド−充填脂質ナノ粒子製剤の粒度と粒度分布について、Malvernレーザー回折計とZetasizerを使用して、レーザー回折法（ＬＤ）と光子相関分光法（ＰＣＳ）によりそれぞれ評価した。Zetasizerを使用して、脂質ナノ粒子のZetaポテンシャルも測定した。結果を表３に報告する。ＬＤ分析に関しては、脂質ナノ粒子を数滴、１００ｍＬの脱イオン水に分散させて、５％〜３０％の混濁値を得た。サンプルは、ポンプ速度１５００ｒｐｍで分散ユニット内を循環させながら保持した。それぞれのサンプルについて少なくとも３回測定し、データはプレゼンテーション５ＮＦＤ（実部及び虚部として、それぞれ粒子ＲＩ＝［１．４５６，０．０１］、分散剤ＲＩ＝１．３３００）を使用して処理した。ＰＣＳ−サイズ分析は、ろ過した（０．２μｍ）Milli Q水を分散媒として使用して実施した。分析用に使用した脂質ナノ粒子製剤の濃度は約１μＬ／ｍＬであり、５００Ｋｃｐｓ未満の計数率を得た。脂質ナノ粒子のＺ−ポテンシャル分析用には、約５０μＳ（伝導度メータにより正確に測定）の伝導度をもつろ過した（０．２μｍ）ＮａＣｌ水溶液を分散剤として使用した。この分析用の脂質ナノ粒子製剤濃度は約０．３μＬ／ｍＬであり、約３０００〜３５００Ｋｃｐｓの計数率を得た。
【０１０５】
生物学的結果
実施例１２：  in vitroアッセイ
図９に示された結果により、脂質ナノ粒子の製造法が、薬物活性に大きな変性をもたらさなかったことが確認されている。このことは、以下に記載の如く実施したラット下垂体細胞アッセイにおいて示されている。
【０１０６】
ラット下垂体細胞の初代培養は、雌のラットから切除した下垂体を酵素消化することから始めて確立した。回収した細胞を２４穴プレートに２．５×１０５個／ウェルの濃度でまき、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間培養した。
【０１０７】
ウェルを３回洗浄し、次に０．７５、１．５、３、６及び１２ｎｇ／ｍｌの３種類の脂質ナノ粒子−アンタイド製剤（ＬＮ２７、ＬＮ２８及びＬＮ２９）で、または社内標準試料アンタイド中で２４時間三重試験法で処理した。基底レベル及び最大レベルの分泌ＬＨのウェルは培地単独とした。
【０１０８】
次いで、洗浄後、サンプルと標準アンタイド希釈液を新しくし、等量の培地の入った基底レベルウェル以外は、全てのウェルにＬＨＲＨ（１０−８Ｍ）を添加した。４時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後に、それぞれのウェルからの調製培地を回収し、ＬＨ含有量をアッセイするまで−２０℃で保存した。
【０１０９】
分泌ＬＨの評価に関しては、市販のＲＩＡ（Amersham Pharmacia Biotech）を使用した。アンタイドによるＬＨ分泌のパーセント阻害として、結果を表した。
実施例１３：  in vivoアッセイ
成体（６３〜７０日齢で約３００ｇ）Sprague Dawley雄ラットを本研究で使用した。全ての動物は、「自由に」食餌可能とした。飲料水も「自由に」摂取させた。
【０１１０】
アンタイドの脂質ナノ粒子を含む試験製剤は、アンタイド０．６ｍｇ（約２ｍｇ／ｋｇ）を１回分の皮下用量として、それぞれのラット群に皮下投与した。アンタイドの脂質ナノ粒子は、約５％グルコース水溶液で投与した。
【０１１１】
ビヒクル中のナノ粒子含有量は、約１２０ｍｇ／ｍｌであった。投与量はラット１匹当たり４００μｌであった。
以下の実験計画に従った。
【０１１２】
【表２】
2004519447.tif 000003
【０１１３】
投与前一晩断食させた動物に化合物を投与した。
第１〜４群の動物から、８時間までのそれぞれのサンプリング時間に、舌下または尾部静脈から約０．５〜１ｍｌの血液を採取した。２４時間（第１群に関しては７２時間）に、動物をエーテルで麻酔し、腹大動脈から放血させて殺した。
【０１１４】
第５〜８群の動物は、表示のサンプリング時間に腹大動脈から放血させることによりサンプルをとった。
ヘパリンチューブに血液を集め、４℃で遠心分離（２５００×ｇ）することにより血漿を分離した。殺した時点で得られた血漿を少なくとも１ｍｌの３つのアリコートに分けた。
【０１１５】
アンタイドの血漿濃度を、質量スペクトル検出を使用するＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で測定した。そのようなｐＫの結果を図１０に示す。
薬理マーカーであるテストステロンを、殺した時点で採取した全ての血漿サンプルで測定した。
【０１１６】
テストステロンレベルは、Diagnostic Product Corporation（ＤＰＣ）製ＲＩＡキットを使用して測定した。
得られた結果を表４に示すが、この結果は、テストステロン産生が投与後短時間で阻害されたことを示しており、アンタイドの徐放性を示している。さらに、投与後１日に得られたテストステロン血漿濃度０．０±０．０は、実際にテストステロンが完全に抑制されていることを示している。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
【表５】
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【０１２０】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、種々の薬物濃度におけるアンタイド水溶液の表面張力に関するものである。
【図２】図２のスキームは、本発明のペプチド−充填脂質ナノ粒子の製造方法を記載する。
【図３】図３は、以下の組成：０．２％アンタイド、９．８％ Compritol E ATO、５％ Lutrol F 68、水１００％まで、の脂質ナノ粒子製剤のＬＤ頻度曲線を示す。
【図４】図４は、シクロスポリンを充填したＬＮ製剤のＬＤ頻度曲線を示す。本発明の製剤は、０．２％シクロスポリン、９．３％ Compritol E ATO、０．５％ DMPG Na、２．５％ Tagat S及び０．５％コール酸Ｎａから構成される。測定は種々のｔ値で実施した。点線：ｔ＝０；細い棒線：ｔ＝２４時間；破線：ｔ＝１４日；太い棒線：ｔ＝１ヶ月。
【図５】図５は、シクロスポリンを充填したＬＮ製剤のＬＤ頻度曲線を示す。ＤＥ１９８１９２７３号に記載されているような製剤は、０．２％シクロスポリン、９．３％ Imwitor 900、２．５％ Tagat S及び０．５％コール酸Ｎａから構成される。測定は種々のｔ値で実施した。点線：ｔ＝０；細い棒線：ｔ＝２４時間；破線：ｔ＝１４日；太い棒線：ｔ＝１ヶ月。
【図６】図６は、６ヶ月以内の種々の時間でのＬＤ分析から得られた脂質ナノ粒子製剤（０．２％アンタイド、９．３％ Compritol E ATO、０．５％ DMPG、２．５％ Tagat S、０．５％コール酸ナトリウム、水１００％までの量で構成される）の、重ね書きしたＬＤふるい下体積曲線に関するものである。
【図７】図７は、純粋なCompritol E ATO（モノグリセリド含量：８０％）とImwitor 900（モノグリセリド含量：４０〜５０％）のＤＳＣ分析を示す。
【図８】図８は、アンタイド−充填ＬＮ２７及びＬＮ２８の水中におけるin vitro薬物放出プロフィールに関するものである。
【０１２２】
ＬＮ２７＝０．２％アンタイド、９．３％ Compritol E ATO、０．５％ DMPG、２．５％ Tagat S、０．５％コール酸ナトリウム。
ＬＮ２８＝０．２％アンタイド、９．３％ Compritol E ATO、０．５％ DMPG、５％ Lutrol F68。
【０１２３】
全製剤中の水の含有量＝１００％まで。
【図９】図９は、脂質系に取り込まれたアンタイドのin vitro生物活性の評価に関するものである。
【０１２４】
ＬＮ２７＝０．２％アンタイド、９．３％ Compritol E ATO、０．５％ DMPG、２．５％ Tagat S、０．５％コール酸ナトリウム。
ＬＮ２８＝０．２％アンタイド、９．３％ Compritol E ATO、０．５％ DMPG、５％ Lutrol F68。
【０１２５】
ＬＮ２９＝０．２％アンタイド、９．８％ Compritol E ATO、５％ Lutrol F68。
全製剤中の水の含有量＝１００％まで。
【図１０】図１０は、ラットに皮下注射したときの、３種類のアンタイド−充填脂質ナノ粒子製剤の放出動態を示す。曲線は、一定の時間内でのアンタイドの血漿濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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