(57)【要約】本発明は、免疫複合体の部位特異的ＰＥＧ化に向けられる。特に本発明は、エフェクター分子にターゲッティング分子を付着させるコネクター分子が１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール分子に接合される免疫複合体を提供する。本発明はさらに、免疫毒素の抗腫瘍活性を増大するための方法であって、部位特異的方法で、免疫毒素のターゲッティング部分に毒性部分を結合するリンカーに１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール分子を付着させることを包含する方法を提供する。
2004503512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コネクター分子を介してエフェクター分子に連結されたターゲッティング分子、ならびに前記コネクター分子に接合された１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む組成物。
【請求項２】
前記ターゲッティング分子がリガンド、抗体および抗体の断片から選択され、断片が抗原認識能力を保有する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体またはその断片がＴａｃを特異的に認識する請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記エフェクター分子が細胞毒素、標識、放射性核種、検出可能標識、薬剤、リポソーム、核酸、組換えウイルス、糖タンパク質、リガンドおよび抗体からなる群から選択される請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞毒素がシュードモナス外毒素（ＰＥ）、あるいは細胞毒素活性を保有するその断片または突然変異体、ジフテリア毒素、あるいは細胞毒素活性を保有するその断片または突然変異体、リシン、サポニン、ゲロニン、リボソーム不活性化タンパク質、アブリンおよびボツリヌスＡ〜Ｆからなる群から選択される請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＥがＰＥ３８である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記コネクター分子がペプチドである請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記コネクター分子がＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）、ＡＳＧＣＣＧＰＥ（配列番号３）、ＡＳＣＧＳＧＣＰＥ（配列番号４）、ＫＡＳＧＫＫＹＧＣＫＫＧＰＥ（配列番号５）、ＡＳＣＧＴＴＧＣＰＥ（配列番号８）およびＫＧＧＧＣＡＧＧＰＥ（配列番号６）からなる群から選択される請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記ＰＥＧ分子が前記コネクター分子のアミノ酸残基上の反応性基の代わりに置換される請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＰＥＧ分子が１〜１００ ｋＤの分子量を有する請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＰＥＧ分子が約３ ｋＤ〜約５０ ｋＤの分子量を有する請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＰＥＧ分子が約５ ｋＤ〜約２０ ｋＤの分子量を有する請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
前記ターゲッティング分子が抗Ｔａｃとして既知の抗ＩＬ−２受容体αサブユニット抗体であり、前記エフェクター分子がＰＥ３８であり、そして前記コネクター分子がＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）である請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
製薬上許容可能な担体中の請求項１記載の組成物を含む組成物。
【請求項１５】
製薬上許容可能な担体中の請求項１３記載の組成物を含む組成物。
【請求項１６】
コネクター分子に連結されたターゲッティング部分および毒素部分を有する免疫毒素の抗腫瘍活性の増大方法であって、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）分子を前記コネクター分子と共有的に結合させることを包含する方法。
【請求項１７】
前記コネクター分子の２つまたはそれ以上のアミノ酸残基がＰＥＧと接合される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ターゲッティング分子がリガンド、抗体および抗体の断片から選択され、断片が抗原認識能力を保有する請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がＴａｃを特異的に認識する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記エフェクター分子が細胞毒素、標識、放射性核種、検出可能標識、薬剤、リポソーム、核酸、組換えウイルス、糖タンパク質、リガンドおよび抗体からなる群から選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞毒素がシュードモナス外毒素（ＰＥ）、あるいは細胞毒素活性を保有するその断片または突然変異体、ジフテリア毒素、あるいは細胞毒素活性を保有するその断片または突然変異体、リシン、サポニン、ゲロニン、リボソーム不活性化タンパク質、アブリンおよびボツリヌスＡ〜Ｆからなる群から選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＥがＰＥ３８である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記コネクター分子がペプチドである請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記コネクター分子がＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）、ＡＳＧＣＣＧＰＥ（配列番号３）、ＡＳＣＧＳＧＣＰＥ（配列番号４）、ＫＡＳＧＫＫＹＧＣＫＫＧＰＥ（配列番号５）、ＡＳＣＧＴＴＧＣＰＥ（配列番号８）およびＫＧＧＧＣＡＧＧＰＥ（配列番号６）からなる群から選択される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＥＧ分子が前記コネクター分子のアミノ酸残基上の反応性基の代わりに置換される請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＥＧ分子が１〜１００ ｋＤの分子量を有する請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＥＧ分子が約３ ｋＤ〜約５０ ｋＤの分子量を有する請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＥＧ分子が約５ ｋＤ〜約２０ ｋＤの分子量を有する請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記ターゲッティング分子がＩＬ−２受容体αサブユニットを特異的に認識する抗体であり、前記エフェクター分子がＰＥ３８であり、そして前記コネクター分子がＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）である請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対する引用
本出願は、米国特許仮出願第６０／２１１，３３１号（２０００年６月９日提出）および第６０／２１３，８０４号（２０００年６月２２日提出）の利益を請求する。これら両出願の記載内容は、すべての目的に関して本明細書中に援用する。
連邦政府後援の研究および開発下でなされた発明に対する権利に関する宣言
該当せず
【０００２】
発明の背景
組換え免疫複合体は、「エフェクター分子」と呼ばれる意図された機能を有する分子が、典型的には特定の受容体またはターゲッティング分子により認識される抗原を発現する細胞に対して複合体を標的化するターゲッティング分子と結合される。免疫毒素は、通常は切頭化される毒素がエフェクター分子として役立ち、そして抗体のＦｖ部分にまたはターゲッティング部分として役立つリガンドに融合される免疫複合体の形態である。腫瘍関連抗原に対する抗体のＦｖ部分がその細胞結合ドメインの欠失を有する３８ｋＤａ突然変異体形態のシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）に融合される多数の異なる組換え免疫毒素が産生されている（Ｐａｓｔａｎ（１９９７） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ２４：１３３３； Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｌｏｏｄ ８３：４２６−４３４； Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８１：１４８−１５５； Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８６１６−８６２０； Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：２７１４−２７１８； Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１８３２７−１８３３１）。これらの組換え免疫毒素のうちの５つ（抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８、Ｂ３（Ｆｖ）−ＰＥ３８、ＲＦＢ４（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８およびｅ２３（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８）が、癌患者におけるＩ期試験で近年評価された（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｌｏｏｄ ９４：３３４０−３３４８； Ｐａｉ−Ｓｃｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５：２３１１−２３１５）。これらの免疫毒素はすべて、ヌードマウスにおけるヒト癌異種移植片の完全退行を生じ、マウスおよびサルにより相対的に良好に耐容される。
【０００３】
ＩＬ−２受容体αサブユニット（Ｔａｃ、ｐ５５またはＣＤ２５とも呼ばれる）に結合された抗ヒトＴａｃモノクローナル抗体のＦｖ断片を含む抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８（「ＬＭＢ−２」としても既知である）は、血液学的悪性疾患における主要臨床応答を生じた（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｌｏｏｄ ９４：３３４０−３３４８）。ＬＭＢ−２は、標準および救命療法に失敗したＣＤ２５プラス血液学的悪性疾患患者３５名に投与された。毛様細胞白血病（ＨＣＬ）患者１名は２０ヶ月目に存続中の完全退行を示し、そしていくつかの部分応答がＨＣＬ、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ホジキン病および成人Ｔ細胞白血病で観察された（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １８（８）：１６２２−３６参照）。
【０００４】
しかしながらＬＭＢ−２は、患者に投与され得る免疫毒素の量を制限する副作用を示した。これらの毒性副作用は、ある用量制限毒性がＩＬ−２重量％を発現しない肝細胞に対する損傷であったため、少なくとも一部は正常組織とのＬＭＢ−２の非特異的結合によるものである（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ （１９９５） Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ５：２９７−３０６）。ＣＤ２５プラス正常細胞の特異的ターゲッティングに起因する副作用も起こり得た。さらにヒト抗ＰＥ抗体および時としては抗マウスＦｖ抗体が、ＬＭＢ−２で処置された何名かの患者で生成された。組換え免疫毒素のこの免疫原性は、それらの治療的有用性を低減する。副作用および免疫原性が予防され得るならば、より多くの免疫毒素を投与して、ヒト悪性疾患における応答改善を得ることができるはずである。その等電点を下げるためにＦｖの枠組み構造領域中に突然変異が導入されるＬＭＢ−２の副作用を低減することを意図された新規の戦略が、近年記載された（Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：６０７２−６０７７）。これらの突然変異体免疫毒素はマウスに対して低毒性であり、より高容量を投与させて、抗腫瘍活性の実質的増大を生じる。しかしながら肝臓損傷が依然として用量制限毒性であり、このアプローチは免疫原性を低減するよう意図されない。
【０００５】
これらの組換え免疫毒素（分子量：６３，０００）は、慣用的抗体毒素複合体（分子量：〜１９０，０００）より低分子量を有する。低分子量分子は腫瘍（ならびに種々の正常組織、例えば腎臓および肝臓）中への分布を増大したが、しかしそれらは大型分子より早く循環から除去もされる。予備臨床試験は、組換え免疫毒素が循環中でより長く存続する場合、抗腫瘍活性が強化されることを示した（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：２８０８−２８１２）。したがって低分子量免疫毒素の血中滞留時間の増大は、抗腫瘍活性の増大をもたらすに違いない。正味の結果は、それらの治療能力の増加である。
【０００６】
タンパク質の血中滞留を増大するための一方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でそれらを修飾することである。ＰＥＧによるタンパク質の化学的修飾（ＰＥＧ化）は、それらの分子サイズおよび立体障害を増大し、その両方ともがタンパク質に結合されたＰＥＧによっている。これは、血漿半減期の改善およびタンパク質分解的安定性を生じ、免疫原性および肝臓取り込みを低減する（Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８９：１６４３−１６５１； Ｐｙａｔａｋ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． Ｃｈｅｍ． Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２９：１１３−１２７）。インターロイキン−２のＰＥＧ化は、ｉｎ ｖｉｖｏでその抗腫瘍能力を増大することが報告されており（Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８４：１４８７−１４９１）、モノクローナル抗体Ａ７に由来するＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化はその腫瘍局在化を改善した（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２８：１３８７−１３９４）。
【０００７】
トランスフォーミング増殖因子αおよびＰＥから成るＰＥＧ化キメラ毒素はその血中滞留時間の改善およびその免疫原性の低減を示して、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍能力の強化およびｉｎ ｖｉｖｏ毒性の低減を生じる、ということを以前われわれは報告した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：４５８８−４５９４）。しかしながら、ＰＥＧ化は、標的化細胞に対する細胞毒活性の望ましくない且つ有意の損失を伴う、ということもわれわれは見出した。小基質に作用する酵素のＰＥＧ化とは違って、組換え免疫毒素のＰＥＧ化は、これらの過程が結合ＰＥＧにより容易に立体的に障害される高分子相互作用に基づいているために、抗原結合の、サイトゾルへの転位の、またはＡＤＰ−リボシル化活性の損失によるそれらの活性の低減を引き起こし得る。ほとんどの場合、タンパク質のＰＥＧ化は非特異的であり、タンパク質中のすべてのリシン残基を標的化し、そのうちのいくつかは活性部位にまたはその近くに存在し得る。この欠点を克服するために、ＰＥの表面に１つまたはそれ以上のシステイン残基を含有するよう工学処理された突然変異体ＰＥ分子の部位特異的ＰＥＧ化が試みられた（Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１３３９８−１３３４０４； Ｋｕａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：７６１０−７６１６）。遊離チオール化学は、これらの残基へのＰＥＧの付着のために用いられた。このアプローチは首尾よくいかないことを立証し、ＰＥＧ化免疫毒素の低収率および活性の有意の低減を生じた。
【０００８】
したがって免疫毒素およびその他の免疫複合体のための技術において、抗腫瘍活性を保存しながら、毒性低減を示す必要性が存在する。
【０００９】
発明の要約
本発明は、免疫毒素を含めた免疫複合体の部位特異的ＰＥＧ化に向けられる。特に本発明は、免疫毒素のターゲッティング部分に毒素部分を付着させるコネクター分子をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾するための新規のアプローチを提供する。本発明のいくつかの局面において、当該免疫毒素の突然変異体が調製されるが、この場合、１つまたはそれ以上のシステインが毒素に抗体を結合するペプチドコネクター中に導入され、突然変異体は次にＰＥＧ−マレイミドで修飾される。ＰＥＧ化免疫毒素は、腫瘍細胞に対する匹敵するｉｎ ｖｉｔｒｏ特異的細胞毒性を有するが、しかしその他の特性、例えば安定性、血漿半減期、抗腫瘍活性、免疫原性および非特異的毒性は大いに改善される。
【００１０】
一局面では、本発明は、コネクター分子を介して毒素に連結される、抗体または抗原認識能力を保有するその断片を含む組成物に向けられるが、この場合、コネクター分子は１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール分子を含む。一実施態様では、コネクター分子はペプチドである。別の実施態様では、毒素はシュードモナス外毒素（ＰＥ）である。好ましい実施態様では、毒素は、ＡＤＰ−リボシル化活性を保有するシュードモナス外毒素の一部分、好ましくは３８ ｋＤａ断片（ＰＥ３８）である。さらに別の実施態様では、免疫毒素の抗体部分は、抗ヒトＴａｃモノクローナル抗体の一本鎖Ｆｖ断片である。好ましい実施態様では、免疫毒素は抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８（すなわちＬＭＢ−２）である。
【００１１】
本発明はさらに、コネクター分子に連結されたターゲッティング部分および毒素部分を有する免疫毒素の抗腫瘍活性の増大方法であって、ポリエチレングリコール分子を前記コネクター分子と共有的に結合させることを包含する方法を提供する。毒素部分は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、あるいは細胞毒素活性を保有するその断片または突然変異体、ジフテリア毒素、あるいは細胞毒素活性を保有するその断片または突然変異体、リシン、サポニン、ゲロニン、リボソーム不活性化タンパク質、アブリンおよびボツリヌスＡ〜Ｆからなる群から選択され得る。好ましい実施態様では、毒素はシュードモナス外毒素（ＰＥ）である。さらに好ましい実施態様では、毒素はシュードモナス外毒素からの３８ｋＤａ断片である。さらに別の実施態様では、免疫毒素の抗体部分は、抗ヒトＴａｃモノクローナル抗体の一本鎖Ｆｖ断片である。特に好ましい実施態様では、免疫毒素は抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８（すなわちＬＭＢ−２）である。
【００１２】
特に本発明は、コネクター分子を介してエフェクター分子に連結されたターゲッティング分子を含む組成物であって、コネクター分子が１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む組成物を提供する。ターゲッティング分子は、リガンド、抗体および抗体の断片から選択され得るし、断片は抗原認識能力を保有する。抗体または抗原認識能力を保有するその断片は、ＩＬ−２受容体αサブユニットを特異的に認識し得る。いくつかの実施態様では、エフェクター分子は毒素であり、そして好ましい実施態様では、ＡＤＰ−リボシル化活性を保有するシュードモナス外毒素またはその一部分（「ＰＥ」）である。特に好ましい実施態様では、ＰＥはＰＥ３８である。
【００１３】
好ましい実施態様では、コネクター分子はペプチドである。ペプチドは４〜１００アミノ酸であり得るし、好ましくは約５０アミノ酸より短いが、一方、好ましい実施態様では、コネクター分子は、ＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）およびＡＳＧＣＣＧＰＥ（配列番号３）の場合のようにシステインを含有するよう部位特異的突然変異誘発により突然変異化されたＡＳＧＧＰＥ（配列番号１）であり得るし、あるいは例えばＡＳＣＧＳＧＣＰＥ（配列番号４）、ＫＡＳＧＫＫＹＧＣＫＫＧＰＥ（配列番号５）、ＡＳＣＧＴＴＧＣＰＥ（配列番号８）またはＫＧＧＧＣＡＧＧＰＥ（配列番号６）であり得る。
【００１４】
ＰＥＧ分子は、コネクター分子のアミノ酸上の反応性基の代わりに置換される。ＰＥＧ分子は、１〜１００ ｋＤ、さらに好ましくは約３ ｋＤ〜５０ ｋＤ、さらに好ましくは約５ ｋＤ〜約２０ ｋＤの分子量を有し得る。特に好ましい実施態様では、ターゲッティング分子は抗Ｔａｃとして既知の抗ＩＬ−２受容体αサブユニット抗体であり、この場合、前記のエフェクター分子はＰＥ３８であり、そして前記のコネクター分子はＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）である。
【００１５】
実施態様の一群において、本発明は、製薬上許容可能な担体中の前記の組成物を含む組成物を提供する。
【００１６】
別の群の実施態様では、本発明は、コネクター分子に連結されたターゲッティング部分および毒素部分を有する免疫毒素の抗腫瘍活性の増大方法であって、ポリエチレングリコール分子を前記コネクター分子と共有的に結合することを包含する方法を提供する。前記のコネクター分子の２つまたはそれ以上の残基は、ＰＥＧ分子に接合され得る（すなわち、各残基は、他の残基が接合されるＰＥＧ分子から分離されるＰＥＧ分子に別々に接合される）。ターゲッティング分子は、リガンド、抗体およびその断片が抗原認識能力を保有する抗体の断片から選択される。いくつかの好ましい実施態様では、抗体またはその断片は、ＩＬ−２受容体αサブユニットを特異的に認識する。エフェクター分子は、毒素であり得る。特にエフェクターは、シュードモナス外毒素（ＰＥ）またはＡＤＰ−リボシル化活性を保有するその一部分であり得る。好ましい実施態様では、ＰＥはＰＥ３８である。
【００１７】
コネクター分子は、ペプチドであり得る。特にコネクター分子は以下のペプチドのいずれかであり得るが、しかしシステインの位置は、所望により変更され得る：ＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）、ＡＳＧＣＣＧＰＥ（配列番号３）、ＡＳＣＧＳＧＣＰＥ（配列番号４）、ＫＡＳＧＫＫＹＧＣＫＫＧＰＥ（配列番号５）、ＡＳＣＧＴＴＧＣＰＥ（配列番号８）およびＫＧＧＧＣＡＧＧＰＥ（配列番号６）。
【００１８】
本発明の免疫複合体は、コネクター分子の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の上の反応性基の代わりにＰＥＧ分子を置換することによりＰＥＧ化される。ＰＥＧ分子は、１〜１００ ｋＤの分子量（Ｍｗ）を有し、典型的には約３ ｋＤ〜５０ ｋＤ、好ましくは約５ ｋＤ〜約２０ ｋＤの分子量を有し得る。
【００１９】
エフェクター分子は、細胞毒素、標識、放射性核種、検出可能標識、薬剤、リポソーム、核酸、組換えウイルス、糖タンパク質、リガンドおよび抗体であり得る。細胞毒素は、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、あるいは細胞毒素活性を保有するその断片または突然変異体、ジフテリア毒素、あるいは細胞毒素活性を保有するその断片または突然変異体、リシン、サポニン、ゲロニン、リボソーム不活性化タンパク質、アブリンまたはボツリヌスＡ〜Ｆであり得る。
【００２０】
好ましい実施態様では、ターゲッティング部分は抗Ｔａｃとして既知の抗ＣＤ３５抗体であり、エフェクター分子はＰＥ３８であり、そしてコネクター分子はＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）である。
【００２１】
特定の実施態様の説明
Ｉ．序論
意外にも、その毒性および免疫原性を低減しながら、免疫毒素のリンカーまたはコネクター部分のＰＥＧ化は免疫毒素の抗腫瘍活性を増大する、ということが発見された。したがって本発明は、免疫毒素の療法的ウインドウを増大するための手段を提供することにより、当業界における有意の進歩を提供する。この結果は、リンカーのＰＥＧ化が免疫毒素のフォールディングまたは活性を、特にターゲッティング部分のまたは毒素部分の機能を妨げるか否かが未知であり得るため、予測され得なかった。
【００２２】
さらに意外にも、小および大の両分子量（Ｍｗ）ポリエチレングリコールが活性に悪影響を及ぼさずに免疫毒素のリンカー部分に接合され得る、ということが発見された。本発明までの当業界における教示は、ＰＥＧ化タンパク質の活性は、結合ＰＥＧによる立体障害がＰＥＧ鎖の漸増長に伴って増大するため、結合ＰＥＧの漸増分子量に伴って低減する、ということであった（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７４：１０９０−１０９５）。しかしながら、２０ｋＤ形態のＰＥＧでＰＥＧ化された免疫毒素が５ｋＤ形態でＰＥＧ化さえた同様の免疫毒素とほぼ同一の活性を有する、ということをわれわれは実証した。したがってリンカーのＰＥＧ化は、高分子量形態のＰＥＧと関連すると従来考えられた活性を損失することなく、特定の開業医により所望される安定性の程度および血清循環時間を構築物に提供するあらゆる分子量のＰＥＧで免疫毒素をＰＥＧ化させる。
【００２３】
この毒素を用いて得られた結果に基づいて、薬剤および金属キレート化剤のような毒素以外のエフェクター分子に連結されたターゲッティング分子が、同様に治療効果改良を示す、ということが予測される。
【００２４】
好ましい実施態様では、ＰＥＧが接合されるリンカーは、好ましくは約３〜５０アミノ酸長のペプチドであり、約６〜２０がさらに好ましい。多数のこのようなリンカーペプチドが当業界で既知であり、本発明に用いるのに適している。リンカーは、所望の位置でリンカーにシステインを組み入れ、ＰＥＧマレイミドのようなＰＥＧ誘導体がチオール化学により接合されるのを可能にすることによりＰＥＧに接合され得るのが便利である。しかしながら他のアミノ酸残基の反応性部位は、以下でさらに説明されるように、リンカーに適切なＰＥＧ誘導体を接合するために利用され得る。好ましい実施態様では、ＰＥＧはリンカー中の単一アミノ酸残基に結合される。しかしながらリンカーの２つまたはそれ以上の残基が、所望によりＰＥＧ化され得る。このような構築物は、このような多重ＰＥＧ化が免疫毒素の活性プロフィール（即ち、その血清循環時間、標的細胞と結合し、それを殺害する能力等）に悪影響を及ぼさないことを保障するために、例えば実施例に記述された検定により試験されるべきである。
【００２５】
したがって本発明は、免疫複合体のエフェクター分子およびターゲッティング部分を連結するリンカーがＰＥＧ化される組成物に向けられる。特に本発明は、免疫毒素を含む組成物であって、毒素にターゲッティング部分を連結するコネクターが部位特異的方法でＰＥＧ化される組成物を提供する。本発明はさらに、免疫毒素の抗腫瘍活性の増大方法であって、ターゲッティング部分に毒素を結合するコネクターに１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール分子を結合することを包含する方法に向けられる。
【００２６】
特に本発明は、当該毒素に抗体または抗体断片を結合するコネクター領域中に突然変異を導入するための、特にシステイン残基を導入するための方法を提供する。システイン残基またはその他の導入残基は次に、コネクター領域の部位特異的ＰＥＧ化のために用いられ得る。システイン残基の導入の場合、ＰＥＧ化は、チオール化学を用いて達成されるのが便利であり得る。ＰＥＧ化を達成するための化学は、本発明内でより詳細に考察される。
【００２７】
一組の実施態様において、本発明の免疫毒素中に用いられる毒素は、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）である。典型的には、このような免疫毒素中に用いられるＰＥ分子は、非特異的結合および毒性を低減または排除するために修飾されている。好ましい実施態様では、毒素は、ＰＥ３８として既知のシュードモナス外毒素の３８ｋＤａ細胞毒性切頭化断片である。別の組の実施態様では、免疫毒素の抗体部分は、ＩＬ−２受容体αサブユニット（Ｔａｃとしても既知である）に対する抗ヒトＴａｃモノクローナル抗体の一本鎖Ｆｖ断片である。特に好ましい実施態様では、免疫毒素は、ＬＭＢ−２としても既知の抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８である。
【００２８】
これらは特に好ましい実施態様であるが、しかし癌細胞上に発現される多数の抗原が、それらの癌抗原と特異的に結合する抗体と同様に、当業界で既知である。さらにこれらの抗体を用いる免疫複合体および免疫毒素も、当業界で既知である．本発明は特に、これらの免疫複合体および免疫毒素の安定性および血清循環時間がそれらのリンカー部分のＰＥＧ化により改善され得ることを意図する。
【００２９】
ＩＩ．定義
単位、記号および符号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）採用形態で表示される。数値範囲は、範囲を限定する数を含める。別記しない限り、核酸は、左から右に５’−３’配向で記述され、アミノ酸配列は左から右にアミノ−カルボキシ配向で記述される。本明細書中に提示される見出しは、本発明の種々の局面または実施態様を限定するものではなく、全体として本明細書に対する参照により示され得る。したがってすぐ後に限定される用語は、そっくりそのまま本明細書に対する参照によりさらに詳細に限定される。
【００３０】
本発明の情況においては、「抗体」または「抗体断片（単数または複数）」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、全免疫グロブリンあるいは標的抗原と結合し、そして以下でさらに限定される免疫グロブリン分子の抗体または任意の機能的断片を指す。このような機能的存在物の例としては、完全抗体、抗体断片、例えばＦｖ、一本鎖Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変部）、ＶＨ（重鎖可変部）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’およびそれらの任意の組合せまたは標的抗原と結合し得る免疫グロブリンペプチドの任意のその他の機能的部分が挙げられる（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， １９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）； Ｋｕｂｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）参照）。
【００３１】
特定の抗原と免疫学的に反応性である抗体は、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択のような組換え法により（例えばＨｕｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）； Ｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４−５４６ （１９８９）；およびＶａｕｇｈａｎ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４：３０９−３１４（１９９６）参照）、あるいは抗原でまたは抗原をコードするＤＮＡで動物を免疫感作することにより、生成され得る。
【００３２】
典型的には免疫グロブリンは、重および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常部および可変部（部は「ドメイン」としても既知である）を含有する。軽および重鎖可変部は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変部により遮断される「枠組み構造」領域を含有する。枠組み構造領域およびＣＤＲの程度は、限定されている（Ｋａｂａｔ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ， Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， （１９８７）参照）。異なる軽または重鎖の枠組み構造領域の配列は、種内に相対的に保存されている。構成的軽および重鎖の組合せ枠組み構造領域である抗体の枠組み構造領域は、三次元空間においてＣＤＲを配置し、整列するのに役立つ。
【００３３】
抗体は、例えば無傷免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により産生される多数の十分に特性化された断片として存在する。したがって例えばペプシンはヒンジ部におけるジスルフィド結合より下で抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に連結される軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、ヒンジ部中のジスルフィドを破壊する低刺激性条件下で還元され、それによりＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に転化する。Ｆａｂ’単量体は、本質的にはヒンジ部の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ， ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９９３）参照）。種々の抗体断片は無傷抗体の消化に関して定義されるが、しかし、このような断片は化学的にまたは組換えＤＮＡ法を用いてｄｅ ｎｏｖｏで合成され得る、と当業者は理解する。したがって抗体という用語は、本明細書中で用いる場合、全抗体の修飾により産生された抗体断片、または組換えＤＮＡ法を用いてｄｅ ｎｏｖｏで合成されるものも包含する。さらに本発明の情況では、「抗体」という用語は、遺伝子工学処理形態、例えばキメラ抗体（例えばヒト化ネズミ抗体）、ヘテロ接合体抗体（例えば二特異的抗体）および組換え一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖ断片（米国特許出願第０８／０７７，２５２号参照）またはｐＦｖ断片（米国特許出願第６０／０４２，３５０号および第６０／０４８，８４８号参照）も包含する。
【００３４】
「一本鎖抗体」という用語は、抗体の機能的断片をコードする遺伝子情報がＤＮＡの単一連続長中に置かれる抗体を指す。一本鎖抗体の綿密な説明に関しては、例えばＢｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９を参照されたい。
【００３５】
「Ｔａｃ」とは、ＩＬ−２受容体αサブユニットを指す。このサブユニットと特異的に結合する抗体は、「抗Ｔａｃ」抗体と呼ばれる。
本発明においては、「キメラタンパク質」とは、それらのネイティブ状態で別々に存在する２つまたはそれ以上の分子が一緒に連結されて、その構成分子のすべての所望の機能性を有する単一分子を生成するタンパク質を指す。
【００３６】
「免疫複合体」という用語は、直接的にあるいはコネクターまたはリンカー分子を介してのエフェクター分子へのターゲッティング分子の共有結合への言及を包含する。本発明の情況では、エフェクター分子およびターゲッティング分子は、リンカー分子を介して連結される。本発明の好ましい実施態様の多くにおいて、エフェクター分子は毒素であり、毒素分子を組入れる免疫複合体は、「免疫毒素」という用語によってより特定的に指示される。
【００３７】
「部分」という用語は分子の一部分を指すために用いられるが、その部分は、意図された機能性を有する。したがって免疫複合体中では、ターゲッティング部分はターゲッティング部分と呼ばれ、そして免疫毒素中では組入れられた毒素分子は「毒素部分」と呼ばれ得る。
「治療的部分」とは、治療剤として作用するよう意図された免疫複合体の一部分である。
【００３８】
「治療剤」という用語は、抗新生物剤、抗炎症剤、サイトカイン、抗感染剤、酵素活性剤または阻害剤、アロステリック改質剤、抗生物質または患者における所望の治療効果を誘導するために投与されるその他の作用物質として作用するよう後に開発された任意の数の化合物を包含する。治療剤は毒素でもあり得るが、この場合、意図される治療効果は、例えば癌細胞の殺害である。それはさらに、例えば放射性同位元素、しばしば金属キレート化剤でもあり、これは当業界における化学標準によりリンカーに接合される。
【００３９】
「検出可能マーカー」とは、免疫複合体に関して、その存在を検出可能にさせる特性を有する免疫複合体の一部分を意味する。例えば免疫複合体は、免疫複合体が存在する細胞を免疫組織化学検定において検出される得るようにする放射性同位元素で標識され得る。
「エフェクター部分」または「エフェクター分子」という用語は、ターゲッティング部分により標識される細胞に及ぼす作用を有するよう、または免疫複合体の存在を同定するよう意図された免疫複合体の部分を意味する。したがってエフェクター部分は、例えば治療的部分、毒素、放射性標識または蛍光標識であり得る。
【００４０】
「免疫毒素」とは、典型的には「毒素」が、直接またはリンカーを介して、「ターゲッティング部分」に結合されて有力な細胞型特異的殺害試薬を生成するキメラタンパク質である。本発明の情況では、「ターゲッティング部分」という用語は、通常はその対応する標的（例えば細胞表面の受容体）に対して特異的に結合することにより、当該細胞または組織に対して毒素または毒性部分を標的にし得る免疫毒素の一部分を指す。「ターゲッティング部分」の例としては、受容体結合リガンド、ならびに抗体または抗原認識能力を保有し得る抗体断片、例えばｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、例えばターゲッティング部分が抗体である場合、免疫毒素は、抗体が向けられるエピトープを保有する細胞と特異的に結合する。本明細書中で用いる場合、「ターゲッティング部分」および「ターゲッティング分子」という用語は、互換的に用いられる。
【００４１】
「毒素」とは典型的には、通常は植物および細菌からの細胞毒性酵素であり、その例としては、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、ならびに当該細胞に対して標的化された場合に細胞毒特性を保有するこれらの毒素の修飾化および突然変異化形態が挙げられる。例えばＰＥおよびＤＴは、典型的には肝臓毒性により死をもたらす高毒性化合物である。しかしながらＰＥおよびＤＴは、毒素のネイティブターゲッティング構成成分（例えばＰＥのドメインＩａまたはＤＴのＢ鎖）を除去し、それを異なるターゲッティング部分、例えば抗体と置き換えることにより免疫毒素中に用いるための形態に修飾され得る。「毒性部分」は、全体的分子の細胞毒性に関与する免疫毒素の部分である。
【００４２】
免疫毒素は、ターゲッティング部分により認識される特定の標的分子を保有する細胞に対して毒素を特異的に標的化することにより有力な細胞殺害剤として作用する。免疫毒素に関する広範な文献が存在し、その例としては、例えばＰａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１： ３３１−３５４； Ｙｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８０） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：５４８３； Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８０） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４５３９； Ｋｒｏｌｉｅｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８０） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：５４１９； Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） “Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ” ｐ４３３， Ｂｏｓｔｏｎ／Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ／Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ； Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８；およびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１：１４５５が挙げられる。
【００４３】
本発明の免疫毒素のターゲッティング部分および毒素部分は、「コネクター」または「リンカー」と呼ばれる分子により結合される。本明細書中で用いる場合、「コネクター」および「リンカー」という用語は、互換的である。典型的には、コネクターは、タンパク質を連結すること、あるいは何らかの最小距離またはそれらの間の他の空間的関係を保存すること以外の特異的生物学的活性を有さない。しかしながらコネクターの構成分アミノ酸は、分子の何らかの特性、例えばフォールディング、正味電荷または疎水性に影響を及ぼすよう選択され得る。リンカーは、抗体とのならびに毒素分子との両方の共有結合を形成し得る。
「組換えＤＮＡ」、「組換え核酸」または「組換え的産生ＤＮＡ」という用語は、そのネイティブまたは内因性供給源から単離され、そして天然フランキングまたは内部ヌクレオチドを付加し、欠失しまたは変更することにより、化学的または酵素的に修飾されたＤＮＡを指す。フランキングヌクレオチドは、記載配列から上流または下流にあるヌクレオチドあるいはヌクレオチドの亜配列であるが、一方、内部ヌクレオチドは、記載配列または亜配列内に生じるヌクレオチドである。
【００４４】
「組換え手段」という用語は、タンパク質が単離され、タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が同定され、そして発現ベクター中に挿入される技法を指す。次にベクターは細胞中に導入され、細胞はタンパク質を発現する。組換え手段は、異なる供給源からキメラタンパク質の発現、タンパク質の構成的発現またはタンパク質の誘導性発現のための一ベクター中へのコードまたはプロモーターＤＮＡの結繋も包含する。
【００４５】
「組換えタンパク質」、「組換え的産生タンパク質」または「組換え的産生免疫毒素」という用語は、タンパク質を発現し得るＤＮＡの内因性コピーを有さない非ネイティブ細胞を用いて産生されるペプチドまたはタンパク質を指す。細胞は、それらが適切な核酸配列の導入により遺伝子的に変更されたために、タンパク質を産生する。組換えタンパク質は、タンパク質およびタンパク質を産生する細胞と普通は関連するその他の亜細胞構成成分と関連して見出されない。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーについての言及を含む。当該用語は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに、ならびに天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。当該用語は、タンパク質が機能を保有するよう、保存的アミノ酸置換を含有するポリマーに当てはまる。
「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（集合的に「ペプチド」）中に組入れられるアミノ酸についての言及を含む。アミノ酸は天然アミノ酸であり、そして別記しない限り、天然アミノ酸と類似の方法で機能し得る天然アミノ酸の既知の類似体を包含し得る。
【００４７】
本明細書中で言及されるアミノ酸および類似体は、以下の表Ａのように簡略な名称で記載される。
【表１】
2004503512.tif 000003
【００４８】
「保存的置換」とは、タンパク質を説明する場合、タンパク質の活性を実質的に変更しないタンパク質のアミノ酸組成の変化を指す。したがって特定のアミノ酸配列の「保存的修飾化変異」とは、タンパク質活性に重要でないアミノ酸のアミノ酸置換、あるいは重要でないアミノ酸の置換が活性を実質的に変更しないよう、類似の特性（例えば酸性、塩基性、正または負荷電、極性または非極性等）を有する他のアミノ酸によるアミノ酸の置換を指す。機能的に類似のアミノ酸を提示する保存的置換表は、当業界で周知である。表Ｂ中の以下の６群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
【００４９】
表Ｂ
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ａ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）も参照されたい。
【００５０】
ペプチドの情況において「実質的に同様の」という用語は、ペプチドが、１０〜２０アミノ酸の比較ウインドウ全体の参照配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウ全体の２つの任意に整列された配列を比較することにより確定されるが、この場合、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適整列に関して参照配列（付加または欠失を含まない）と比較した場合に付加または欠失（即ちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、適正位置の数を得るために同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に生じる位置の数を確定し、比較のウインドウ中の位置の総数で適正位置の数を割り、そしてその結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより算定される。
【００５１】
「ジスルフィド結合」または「システイン−システインジスルフィド結合」という語句は、システインの硫黄原子が参加されてジスルフィド結合を形成する２つのシステイン間の共有的相互作用を指す。ジスルフィド結合の平均結合エネルギーは、水素結合に関する１〜２ ｋｃａｌ／ｍｏｌと比較して、約６０ ｋｃａｌ／ｍｏｌである。本発明の状況では、ジスルフィド結合を形成するシステインは、一本鎖抗体の枠組み構造領域内にあり、抗体の配座を安定化するのに役立つ。
「接合する」、「連接する」、「結合する」または「連結する」という用語は、２つのポリペプチドを１つの連続ポリペプチド分子に作製することを指す。本発明の情況では、本用語は、毒素分子に抗体部分を連結することへの言及を含む。連鎖は、化学的または組換え手段によるものであり得る。「化学的手段」とは、２つの分子間に形成される共有結合が存在して、１つの分子を生成するような、抗体部分と毒素部分との間の反応を指す。特に本発明の情況では、「化学的手段」とは、リンカー分子、通常は短いペプチドが、一端ではターゲッティング分子と、そして他端では毒素分子と共有結合される反応を指す。
【００５２】
ＩＩＩ．リンカー分子
本発明の免疫毒素は、リンカーにより連結されるターゲッティング部分および毒素部分を含む。種々のリンカーが当業界で既知であり、そして生理学的条件下では非反応性である、ならびにターゲッティングおよび毒素部分の活性を妨げない特性を共有する。抗体および毒素分子がポリペプチドである場合、リンカーはそれらの側鎖基を介して（例えばシステインとのジスルフィド結合により）構成分アミノ酸に連結され得る。しかしながら好ましい実施態様では、リンカーは、末端アミノ酸のα炭素アミノおよびカルボキシル基に連結される。
【００５３】
好ましい実施態様では、リンカーはペプチドであり、好ましくは１〜１５０残基長、さらに好ましくは３〜１００残基長、さらに好ましくは約３〜５０またはそれ未満の残基長である。さらに好ましい実施態様では、リンカーは約４〜約２０アミノ酸残基長であり、ある特に好ましい実施態様では、約６〜約１７残基長、そして他の実施態様では約６〜１０残基長である。大型分子量分子は腫瘍浸透低減を示す傾向があり、同一ターゲッティングおよび毒素部分を有するがしかし１０アミノ酸残基またはそれ未満のリンカーを有する免疫毒素と比較して、腫瘍を浸透する免疫毒素の能力を５０％より多く、またはさらに好ましくは２５％より多く低減する限り、リンカー部分は存在する必要がない。免疫毒素による腫瘍浸透を確定するための検定は当業界で周知であり、そして、例えば免疫毒素を放射能標識し、固形腫瘍を有する動物（例えばヒト固形腫瘍の細胞が導入されたヌードマウス）中に免疫毒素を導入し、次に切片にして、腫瘍をオートラジオグラフィー処理して、腫瘍中にどのくらい深く細胞毒素が浸透したかを確定することにより実施され得る。
【００５４】
特に好ましい実施態様では、リンカーは約４〜約２０アミノ酸残基長のペプチドである。概して、それが免疫毒素のターゲッティング部分または毒素部分の適正なフォールディングまたは活性を妨げない限り、この長さの任意のペプチドが用いられ得る。これらの部分の活性に及ぼすリンカーの作用は、その標的とのターゲッティング部分の結合を検定することにより、そしてターゲッティング部分により標的化された細胞上の毒性部分の細胞毒性を検定することにより、容易に確定され得る。２５％より多くのターゲッティング部分の結合親和性の低減または２５％より多い毒素部分の細胞毒性の低減、あるいはその両方は、試験された特定のリンカーペプチドが適切でないことを示す。多数の抗体およびリガンドの結合能力を確定するための検定が、当業界で既知である。例えば、免疫毒素のターゲッティング分子として用いられるリガンドの結合親和性は、その標的基質からネイティブリガンドを置換するターゲッティング分子の能力を測定することにより検定され得る。これは、ネイティブリガンドを標識し、次に一定量の標識化リガンドおよび種々の濃度のリガンド含有免疫毒素とともに、標的受容体を保有する細胞をインキュベートすることにより成し遂げられ得る。結合ネイティブリガンドの量は、標的細胞に結合された標識の量を検出することにより確定され得る。非標識化ネイティブリガンドは、対照として実行され得る。
【００５５】
標的細胞の選択は、特定リガンドにより確定される、と当業者は認識する。特定標識は、標識化ネイティブリガンドの結合を最小限妨げるよう選定される。適切な標識は当業者には周知であり、その例としては、放射性標識（例えば１２５Ｉ、３２Ｐ）、蛍光標識（例えばフルオレセインまたはローダミン）および酵素標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞毒性は、下記の実施例で教示されるような標準検定により確定され得る。ペプチドは、部位特異的突然変異誘発により突然変異化されて、ＰＥＧと反応するための適切な官能基を有する残基を所望の点でリンカー中に導入するか、あるいはこのような官能基を有する残基をリンカー中に予め存在するアミノ酸残基のいずれかの代わりに置き換え得る。ＰＥＧをアミノ酸残基と接合するための官能基の化学は周知であり、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９６）， ａｔ Ｃｈａｐｔｅｒ １５およびＺａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ，” ｉｎ Ｄｕｎｎ ａｎｄ Ｏｔｔｅｎｂｒｉｔｅ， ｅｄｓ．， Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９９１）のような参考文献中に教示されている。
【００５６】
システインは、実施例に記述されているようなチオール化学によりＰＥＧ誘導体の接合を準備させるため、リンカー中に導入されるかまたは置換されるために特に好ましい。所望により、２つまたはそれ以上のシステインがリンカーに付加され得る。チオール化学は周知であり、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（上記）およびＺａｌｉｐｓｋｙ（上記）のような参考文献中に教示されている。
【００５７】
システインを含有するよう突然変異化するための好ましいリンカー分子は、ＡＳＧＧＰＥ（配列番号１）である。好ましい実施態様では、リンカーペプチドは、標準一文字暗号で記述される以下のペプチドから選択される：ＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）、ＡＳＧＣＣＧＰＥ（配列番号３）、ＡＳＣＧＳＧＣＰＥ（配列番号４）、ＡＳＣＧＴＴＧＣＰＥ（配列番号８）、ＫＡＳＧＫＫＹＧＣＫＫＧＰＥ（配列番号５）およびＫＧＧＧＣＡＧＧＰＥ（配列番号６）。最初の３つが特に好ましい。システインはリンカー中の他の位置におかれ得る。例えば好ましいペプチドＡＳＧＧＰＥ（配列番号１）は、以下のように配置されたシステインを有し得る：ＣＡＳＧＧＰＥ（配列番号９）、ＡＣＳＧＧＰＥ（配列番号１０）、ＡＳＣＧＧＰＥ（配列番号１１）、ＡＳＧＧＣＰＥ（配列番号１２）、ＡＳＧＧＰＣＥ（配列番号１３）およびＡＳＧＧＰＥＣ（配列番号１４）。リンカーの１つより多い残基がＰＥＧ化されるよう、１つより多いシステインがリンカー中に導入され得る。これらのリンカーを用いる構築物は、実施例に記述されるような標準検定により活性に関して試験されて、ＰＥＧ化が免疫複合体の所望の活性を妨害しないことを確証し得る。
【００５８】
ＩＶ．リンカー分子のＰＥＧ化
本発明の免疫複合体においては、リンカー分子はＰＥＧ化される。概してリンカーの任意の残基がＰＥＧ化され得るが、しかし、リンカーの最初と最後の残基以外の残基（即ちターゲッティングおよびエフェクター部分に直接共有的に結合される残基）によるＰＥＧ化が、これらの残基のＰＥＧ化がターゲッティングまたはエフェクター部分のフォールディングまたは活性を妨害すると思われるので、一般的に好ましい。しかしながら所望により、これらの残基はＰＥＧ化され、そしてその結果生じる免疫複合体が、例えば実施例における免疫毒素の毒性の検定により、ターゲッティングおよびエフェクター活性に関して試験される。
【００５９】
分子をＰＥＧ化するための種々の手法が当業界で既知である。典型的には、このような手法は、所望の反応条件下でのタンパク質とのＰＥＧの結合を可能にする誘導かＰＥＧを用いる。多数のこのような誘導化ＰＥＧ、例えばＰＥＧカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、モノメトキシＰＥＧ２−ＮＨＳ、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシニミジルエステル（ＳＣＭ−ＰＥＧ）、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカルボネート誘導体、ＰＥＧのグリシジルエステル、ＰＥＧｐ−ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ−ＮＰＣ、例えばメトキシＰＥＧ−ＮＰＣ）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドおよびカルボニルジイミダゾール活性化ＰＥＧが既知である。生接合のためのもっとも便利なＰＥＧ誘導体のうちの１つは、ＰＥＧ−チオールである。ＰＥＧ−マレイミドは、本発明の免疫毒素中のペプチドリンカーとＰＥＧを接合するのに用いるために特に好ましい。列挙したＰＥＧ誘導体のすべてが、種々の分子量で市販されている。例えばＣａｔａｌｏｇ， Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， ２０００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を参照されたい。このカタログは、各誘導体の接合の化学の説明およびこのような接合のためのプロトコールに関する文献への言及も含有する。所望により、多数の前記の誘導体が一官能性モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）形態で利用可能である。本明細書中の免疫複合体のペプチドリンカーのような分子のＰＥＧ化は、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９６）， ａｔ Ｃｈａｐｔｅｒ １５およびＺａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ，” ｉｎ Ｄｕｎｎ ａｎｄ Ｏｔｔｅｎｂｒｉｔｅ， ｅｄｓ．， Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９９１）でさらに考察されている。
【００６０】
ＰＥＧは、部位特異的突然変異誘発によりリンカー中の選定位置に取付けられ得るのが便利である。例えばリンカーは、ＰＥＧの結合を促すよう所望された位置にシステイン残基を有するよう工学処理され得る。リンカー中に工学処理されるシステインに対するチオール化学によりリンカーにＰＥＧを結合するための例示的手法は、実施例に記述されている。しかしながらその他の接合化学も用いられ得る。例えばＰＥＧ−マレイミドが実施例で用いられており、ＰＥＧ−ビニルスルホンまたはＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィドは、まずチオエステル結合により、その後ジスルフィド結合によって、システイン残基に結合され得る活性化ＰＥＧである。
【００６１】
システイン残基との接合は、リンカーがＰＥＧ化され得る１つの便利な方法であるが、しかし他の残基も所望により用いられ得る。アミノ酸残基の側鎖の反応性は周知である（例えばＦｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，” ｉｎ Ｆｅｅｎｅｙ ａｎｄ Ｗｈｉｔａｋｅｒ， ｅｄｓ． Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９８２）， ａｔ Ｔａｂｌｅ １参照）。例えばＣＯＯＨ、Ｓ−Ｓまたは−ＳＣＨ基ではなく、ＮＨ２およびＳＨ基と反応するために無水酢酸が用いられ得るが、しかし過酸化水素は、ＮＨ２ではなく、−ＳＨおよび−ＳＣＨ基と反応するために用いられ得る。反応は、周知の確立された反応性を利用する化学を用いてリンカー中の所望の残基への接合に適した条件かで実行され得る。
【００６２】
組換え手段よりむしろ合成化学によりリンカーが作られる場合、付加的化学が活用され得る。例えば、通常のα−アミノ基よりむしろε−アミノ基を用いてペプチド結合を形成することにより、リシン残基がリンカーに付加され得る。このようなリシンの遊離α−アミノ基は、α−アミノ基により結合される免疫毒素中のリシンの遊離ε−アミノ基の場合より低いｐＨで脱プロトン化する。反応条件のｐＨを制御することにより、遊離α−アミノ基を有するリシンは、リンカー中の他のリシンをもＰＥＧ化することなくＰＥＧと反応され得るし、あるいはリンカーが免疫毒素中に組入れられた後にＰＥＧ化が実施される場合には、免疫毒素中の他のリシンと反応され得る。
【００６３】
概して、リンカーに付加されるＰＥＧは、数百ダルトン〜約１００ｋＤの分子量（Ｍｗ）の範囲である。より大きい分子量のＰＥＧが用いられ得るが、しかしＰＥＧ化タンパク質の収量の多少の損失を生じ得る。低Ｍｗに関して得られうるような高い純度の高ＭｗＰＥＧを得るのは難しいので、高ＭｗＰＥＧ分子の純度も観察される必要がある。少なくとも８５％の純度の、さらに好ましくは少なくとも９０％、９５％またはそれ以上の純度のＰＥＧを用いるのが好ましい。高ＭｗＰＥＧは、標的細胞結合、転位（エフェクター分子がインターナライズされる場合）に関して、そしてＰＥベースの免疫毒素の場合には毒素によるＡＤＰ−リボシル化に関して、異なる特徴も示し得る。これらの特徴は、異なる型の腫瘍に関して変わり得る（血液学的腫瘍対癌腫）。それらは、実施例に教示されているような標準検定により、容易に試験され得る。
【００６４】
好ましくはＰＥＧのＭｗは、約１ｋＤ〜約３０ｋＤ、さらに好ましくは約３ｋＤまたはそれ以上〜約３０ｋＤである。特に好ましい実施態様では、Ｍｗは約５ｋＤ〜２０ｋＤの範囲であるべきである。ＰＥＧの種々の誘導体が、これらの分子量で市販されている。例えばＰＥＧのモノメチルエーテルは、１ｋＤ、２ｋＤ、３ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、１２ｋＤおよび２０ｋＤのＭｗでＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．から入手可能であり、一方種々の形態のＰＥＧスクシニミジルプロピオネートは、２ｋＤ、３，４００ Ｄ、５ｋＤおよび２０ｋＤのＭｗで入手可能である。前記のように、より高ＭｗＰＥＧも用いられ得るが、しかし、単にそれらがより容易に商業的に入手可能であるために、３０ｋＤまでのＰＥＧが好ましい。前記のように、有意に高いＭｗのＰＥＧ、例えば１００ｋＤを超えるＭｗを有するＰＥＧは、腫瘍浸透または抗腫瘍活性のその他の局面、薬物動態、あるいは分子のその他の特性をある程度妨害するためにそのような大きさであり得る。しかしながらこれらの問題は、標的組織中のＰＥＧ化免疫複合体のより長い滞留時間により平衡され得る。任意の特定のＰＥＧは、実施例に記述された検定、ならびに当業界で既知のその他の検定により試験されて、そのＰＥＧを組入れる免疫複合体が低ＭｗＰＥＧに接合された同一免疫複合体の場合より低い望ましい活性プロフィールを有するか否かを確定し得る。
【００６５】
前記から明らかになるように、ＰＥＧは、リンカーのアミノ酸残基の反応性側鎖上の置換基としてリンカーに付加される。ＰＥＧは、リンカーポリマーの内部部分として組み入れられない。ＰＥＧ分子は、リンカーの、特に２０アミノ酸またはそれ以上のリンカー上の１つより多いアミノ酸残基に接合され得る。ＰＥＧが取付けられる残基間のリンカー分子の長さに沿って多少の距離を有するのが一般的に望ましい。５つの残基の空間的配置は、通常は許容可能である。単一リンカー上の４つより多い残基をＰＥＧ化するのは通常は望ましくない。
２つより多い残基と接合されたＰＥＧを有する免疫複合体は、それらが満足すべき活性を保有することを確証するために試験される（例えば下記の検定により）必要がある。概して免疫複合体が、ＰＥＧ分子に接合されたリンカー残基を１つだけ有する同様の免疫複合体と比較して、その活性の２５％より多くを損失する場合には、ＰＥＧに接合されたその免疫複合体の残基の数は低減されるべきである。
【００６６】
Ｖ．免疫複合体の産生
免疫複合体としては、治療剤と抗体との共有結合が存在する分子が挙げられるが、これらに限定されない。治療剤は、特定の標的分子にまたは標的分子を保有する細胞に対して向けられる特定の生物学的活性を有する作用物質である。治療剤としては、種々の薬剤、例えばビンブラスチン、ダウノマイシン等、細胞毒素、例えばネイティブまたは修飾化シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素、それ自体が薬理学的組成物を含有する封入剤（例えばリポソーム）、放射性作用物質、例えば１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓ、ならびにその他の標識、標的部分およびリガンドが挙げられ得る、と当業者は理解する。
【００６７】
特定の治療剤の選定は、特定の標的分子または細胞によっており、生物学的効果が惹起されるのが望ましい。したがって例えば治療剤は、特定の標的細胞の死をもたらすために用いられる細胞毒素であり得る。逆に、非致死的生物学的応答を引き起こしたいだけである場合には、治療剤は非致死性薬理学的作用物質または非致死性薬理学的作用物質を含有するリポソームと接合され得る。
本明細書中に提示された治療剤および抗体を用いて、機能的等価の核酸、例えば配列は異なるがしかし同一エフェクター分子（ＥＭ）または抗体配列をコードする核酸を含有する種々のクローンを、当業者は容易に構築し得る。したがって本発明は、抗体および接合体ならびにそれらの融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００６８】
Ａ．組換え方法
本発明の免疫複合体をコードする核酸配列は、任意の適切な方法、例えば適切な配列のクローニングにより、あるいはＮａｒａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０−９９（１９７９）のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８］：１０９−１５１（１９７９）のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９−１８６２（１９８１）のジエチルホスホルアミダイト法、例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されたような自動合成機を用いたＢｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔｓ． ２２（２０）：１８５９−１８６２（１９８１）により記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法、ならびに米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法のような方法による直接化学合成により、調製され得る。化学的合成は、一本鎖化オリゴヌクレオチドを生じる。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションにより、あるいは鋳型として一本鎖を用いるＤＮＡポリメラーゼを用いた重合により、二本鎖に転化され得る。ＤＮＡの化学的合成は約１００塩基の配列に限定されるが、しかしそれより長い配列は、短い配列の結繋により生成され得ると当業者は認識する。
【００６９】
好ましい実施態様では、免疫複合体をコードする核酸配列は、クローニング技法により調製される。適切なクローニングおよびシーケンシング技法の例、ならびに多数のクローニング実行により当業者を指導するのに十分な指導は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（２ｎｄＥＤ）， Ｖｏｌｓ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （ｅｄｓ．）， ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９８７）またはＡｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ（１９８７）に見出される。生物学的試薬および実験装置についてのメーカーからの製品情報も有用な情報を提供する。このようなメーカーとしては、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ， ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ （Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ， Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、ならびに当業者に既知の多数のその他の商業的供給元が挙げられる。
【００７０】
ネイティブタンパク質ＥＭ、リンカーペプチドまたは抗体をコードする核酸は、ＥＭ、リンカーペプチド、抗体、またはターゲッティング部分がリンカーによりＥＭに連結される免疫複合体を生成するよう修飾され得る。部位特異的突然変異誘発による修飾は、当業界で周知である。タンパク質ＥＭまたは抗体をコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法により増幅され得る。増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、自立配列複製系（３ＳＲ）が挙げられる。広範な種々のクローニング法、宿主細胞およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方は、当業者に周知である。
【００７１】
好ましい実施態様では、免疫複合体は、抗Ｔａｃ　ｓｃＦｖ抗体をコードするｃＤＮＡを、ＥＭをコードするｃＤＮＡおよびリンカーをコードするｃＤＮＡを含むベクター中に挿入することにより調製される。挿入は、ｓｃＦｖ、リンカーおよびＥＭが枠内で、即ち機能性Ｆｖ領域、リンカーおよび機能性ＥＭ領域を含有する一連族ポリペプチド中で読み取られるよう、成される。
【００７２】
本発明のＥＭ、抗体または免疫複合体をコードする核酸が単離され、クローン化されれば、組換え的工学処理細胞、例えば細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳類細胞中で所望のタンパク質を発現し得る。タンパク質の発現のために利用可能な多数の発現系、例えば大腸菌、その他の細菌宿主、酵母ならびに種々のより高等な真核生物細胞、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株に当業者は精通している、と予測される。要するに、本発明の単離タンパク質をコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、プロモーター（構成性または誘導性である）にＤＮＡまたはｃＤＮＡを操作可能的に連結し、その後、発現カセット中に組入れることにより達成される。カセットは、原核生物または真核生物における複製および組込みに適切であり得る。典型的発現カセットは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにタンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用なプロモーターを含有する。クローン化遺伝子の高レベル発現を得るためには、最低でも、転写を指図する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含有する発現カセットを構築するのが望ましい。大腸菌に関しては、これは、プロモーター、例えばＴ７、ｔｒｐ、ｌａｃまたはラムダプロモーター、リボソーム結合部位、ならびに好ましくは転写終止シグナルを包含する。真核生物細胞に関しては、制御配列は、プロモーター、ならびに好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス由来のエンハンサー、ならびにポリアデニール化配列を包含し、そしてスプライス供与体および受容体配列を含み得る。本発明のカセットは、周知の方法により、例えば大腸菌のための塩化カルシウム形質転換または電気穿孔、ならびに哺乳類細胞のための燐酸カルシウム処理、電気穿孔またはリポフェクションにより、選定宿主細胞中に移入され得る。カセットにより形質転換された細胞は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子のようなカセット中に含入される遺伝子により付与された抗生物質に対する耐性により選択され得る。
【００７３】
修飾は、その生物学的活性を減少させることなく、本発明のポリペプチドをコードする核酸に対してなされ得る（即ち抗−Ｔａｃ抗体、ＰＥまたはそれらの組合せから生成される免疫複合体）、と当業者は認識する。いくつかの修飾は、クローニング、発現または融合タンパク質中へのターゲッティング分子の組入れを促すためになされ得る。このような修飾は当業者には周知であり、その例としては、例えば終止コドン、開始部位を提供するために網の末端に付加されるメチオニン、便宜的に置かれる制限部位を作成するための末端に置かれる付加的アミノ酸または精製過程に役立つための付加的アミノ酸（例えばポリＨｉｓ）が挙げられる。
【００７４】
組換え方法のほかに、免疫複合体、ＥＭおよび抗体またはその他のリガンドは、標準ペプチド合成を用いて、全体的にまたは一部分構築され得る。約５０アミノ酸長未満の本発明のポリペプチドの固相合成は、不溶性支持体に配列のＣ末端アミノ酸を結合し、その後、配列中の残りのアミノ酸を逐次付加することにより成し遂げられ得る。固相合成の技法は、Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， ＴＨＥ ＰＥＰＴＩＤＥＳ： ＡＮＡＬＹＳＩＳ， ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ， ＢＩＯＬＯＧＹ． ＶＯＬ．２： ＳＰＥＣＩＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ， ＰＡＲＴ Ａ． ｐｐ．３−２８４；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５６（１９６３）およびＳｔｅｗａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ， ２ＮＤ ＥＤ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩＩ．（１９８４）に記載されている。より長いタンパク質は、短い断片のアミノおよびカルボキシル末端の縮合により合成され得る。カルボキシル末端の活性化（例えばカップリング試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）によるペプチド結合の形成方法は、当業者に既知である。
【００７５】
Ｂ．精製
一旦発現されれば、本発明の組換え免疫複合体、抗体、エフェクター分子およびリンカー分子は、当業界の標準手法、例えば硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー等により精製され得る（一般に、Ｒ． Ｓｃｏｐｅｓ， ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．（１９８２）参照）。少なくとも約９０〜９５％均質性を有する実質的に純粋な組成物が好ましく、そして９８〜９９％またはそれ以上の均質性は、製薬的使用のためにはもっとも好ましい。部分的にまたは所望どおりの均質性に精製されれば、治療的に用いられる場合、ポリペプチドは実質的に内毒素を含有すべきでない。
【００７６】
大腸菌のような細菌からの、一本鎖抗体の発現のためのおよび／または一本鎖抗体を含めた適切な活性形態への再フォールディングのための方法が記載されており、周知であり、そして本発明の抗体に適用可能である（Ｂｕｃｈｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０５：２６３−２７０（１９９２）； Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５ （１９９１）； Ｈｕｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）およびＷａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４（１９８９）参照）（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）。
【００７７】
しばしば、大腸菌またはその他の細菌からの機能性異種タンパク質は封入体から単離され、そして強変性剤を用いて可溶化し、その後再フォールディングする必要がある。可溶化過程中は、当業界で周知のように、ジスルフィド結合を分離するために還元剤が存在しなければならない。還元剤を有する例示的緩衝液は、０．１ Ｍトリス、ｐＨ８、６ Ｍグアニジン、２ ｍＭＥＤＴＡ、０．３ ＭＤＴＥ（ジチオエリトリトール）である。Ｓａｘｅｎａ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：５０１５−５０２１（１９７０）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているように、そして特にＢｕｃｈｎｅｒ等（上記）に記載されているように、ジスルフィド結合の再酸化は、還元および酸化形態での低分子量チオール試薬の存在下で起こり得る。
【００７８】
再生は、典型的には変性および還元タンパク質の再フォールディング緩衝液中での希釈（例えば１００倍）により成し遂げられる。例示的緩衝液は、０．１ Ｍトリス、ｐＨ８、０．５ ＭＬ−アルギニン、８ ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）および２ ｍＭＥＤＴＡである。
二鎖抗体精製プロトコールに対する修飾として、重鎖および軽鎖領域が別々に可溶化され、還元されて、次に再フォールディング溶液中で併合される。一方のタンパク質のモル数が他方の５倍を越えないようなモル比でこれら２つのタンパク質が混合される場合に、好ましい収率が得られる。レドックス−シャッフリングが完了後に、再フォールディング溶液に、余分量の酸化グルタチオンまたは他の酸化低分子量化合物を付加するのが望ましい。
【００７９】
ＶＩ．免疫毒素
本発明の一局面において、免疫複合体は免疫毒素である。例示的毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、サポニン、ゲロニンおよびリボソーム不活性化タンパク質、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが挙げられる。これらの毒素は、商業的供給元（例えばＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から容易に入手可能である。ジフテリア毒素は、コリネバクテリウム属のジフテリア菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅから単離される。リシンは、ヒマ属のトウゴマＲｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ｃａｓｔｏｒ ｂｅａｎトウゴマ）からのレクチンＲＣＡ６０である。本用語は、米国特許第５，０７９，１６３号および第４，６８９，４０１号に教示されたもののようなその毒性変異体にも言及する。トウゴマアグルチニン（ＲＣＡ）は、それぞれ約６５および１２０ ｋＤのそれらの分子量によりＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と呼ばれる２つの形態で生じる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＆ Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２６６：５４３（１９７２））。Ａ鎖はタンパク質合成不活性化および細胞殺害に関与する。Ｂ鎖は、リシンを細胞表面ガラクトース残基に結合し、サイトゾル中へのＡ鎖の輸送を促す（Ｏｌｓｎｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２４９：６２７−６３１（１９７４）および米国特許第３，０６０，１６５号）。
【００８０】
アブリンとしては、トウアズキ属のトウアズキＡｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓからの毒性レクチンが挙げられる。毒性成分アブリンａ、ｂ、ｃおよびｄは、約６３〜６７ｋＤの分子量を有し、２つのジスルフィド連結ポリペプチド鎖ＡおよびＢから成る。Ａ鎖はタンパク質合成を抑制する。Ｂ鎖（アブリン−ｂ）はＤ−ガラクトース残基と結合する（Ｆｕｎａｔｓｕ， ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ５２： １０９５ （１９８８）；およびＯｌｓｎｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ５０： ３３０−３３５ （１９７８）参照）。
【００８１】
本発明の好ましい実施態様では、毒素はシュードモナス外毒素（ＰＥ）である。「シュードモナス外毒素」という用語は、本明細書中で用いる場合、全長ネイティブ（天然）ＰＥを、あるいは修飾されたＰＥを指す。このような修飾としては、ドメインＩａの排除、ドメインＩｂ、ＩＩおよびＩＩＩ中の種々のアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換、ならびにＫＤＥＬおよびＲＥＤＬのようなカルボキシル末端での１つまたはそれ以上の配列の付加が挙げられるが、これらに限定されない（例えばＳｉｅｇａｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１４２５６−１４２６１（１９８９）参照）。好ましい実施態様では、ＰＥの細胞毒性断片は、ネイティブＰいいの細胞毒性の少なくとも５０％、好ましくは７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは９５％を保有する。特に好ましい実施態様では、細胞毒性断片は、ネイティブＰＥより高毒性である。
【００８２】
ネイティブシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）は、シュードモナス属の緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにより分泌される非常に活性な単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）であり、真核生物細胞中でのタンパク質合成を抑制する。ネイティブＰＥ配列は、共通譲渡米国特許第５，６０２，０９５号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に提示されている。作用の方法は、延長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化の不活性化である。外毒素は、協力して細胞毒性を生じるよう作用する３つの構造ドメインを含有する。ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）は、細胞結合を媒介する。ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６４）はサイトゾル中への転位に関与し、ドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は延長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介する。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能は依然として限定されていないが、しかしその大部分（アミノ酸３６５〜３８０）は、細胞毒性の損失を伴わずに欠失され得る（Ｓｉｅｇａｌｌ， ｅｔ ａｌ．， （１９８９）（上記）参照）。
【００８３】
本発明に用いられるＰＥとしては、ネイティブ配列、ネイティブ配列の細胞毒性断片、ならびにネイティブＰＥの保存的修飾化変異体およびその細胞毒性断片が挙げられる。ＰＥの細胞毒性断片は、標的細胞中でのその後のタンパク質分解的またはその他のプロセシングを伴いまたは伴わずに（例えばタンパク質または前タンパク質として）、細胞毒性であるものを包含する。ＰＥの細胞毒性断片としては、ＰＥ４０、ＰＥ３８およびＰＥ３５が挙げられる。
【００８４】
好ましい実施態様では、ＰＥは、米国特許第４，８９２，８２７号に教示されているように、しばしばドメインＩａを欠失することにより、非特異的細胞結合を低減しまたは排除するために修飾されたが、しかしこれは、例えばドメインＩａの一定の残基を突然変異化することによっても達成され得る。例えば米国特許第５，５１２，６５８号は、ドメインＩａが存在するが、しかし位置５７、２４６、２４７および２４９のドメインＩａの塩基性残基が酸性残基（グルタミン酸または「Ｅ」）で置換される突然変異化ＰＥが大いに低減された非特異的細胞毒性を示す、ということを開示する。この突然変異体形態のＰＥは、時としてはＰＥ４Ｅと呼ばれる。
【００８５】
ＰＥ４０は、当業界で従来記載されているように、ＰＥの切頭化誘導体である（Ｐａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：３３５８−６２（１９９１）；およびＫｏｎｄｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：９４７０−９４７５（１９８８）参照）。ＰＥ３５は、アミノ酸残基１〜２７９が欠失されたＰＥの３５ｋＤカルボキシル末端断片であり、その分子は位置２８０のメチオニンで開始し、ネイティブＰＥのアミノ酸２８１〜３６４および３８１〜６１３が後に続く。ＰＥ３５およびＰＥ４０は、例えば米国特許第５，６０２，０９５号および第４，８９２，８２７号に開示されている。
もっとも好ましい実施態様では、細胞毒性断片はＰＥ３８である。ＰＥ３８は、細胞内でのプロセシング時にその細胞毒性形態に活性化されるアミノ酸２５３〜３６４および３８１〜６１３から成る切頭化ＰＥプロタンパク質である（例えば米国特許第５，６０８，０３９号およびＰａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３３３：Ｃ１−Ｃ６（１９９７）参照）。
【００８６】
前記のように、いくつかのまたはすべてのドメイン１ｂは欠失され、そして残りの部分はリンカーにより、または直接ペプチド結合により連結される。ドメインＩＩのアミノ部分のいくつかは、欠失され得る。そしてＣ末端は残基６０９〜６１３のネイティブ配列（ＲＥＤＬＫ）（配列番号１５）を含有し得るし、あるいはサイトゾル中に転位する構築物の能力を保持するために見出される変異、例えばＲＥＤＬ（配列番号１６）またはＫＤＥＬ（配列番号１７）、並びにこれらの配列の反復を含有し得る（例えば米国特許第５，８５４，０４４号、第５，８２１，２３８号および第５，６０２，０９５号、ならびにＷＯ９９／５１６４３参照）。好ましい実施態様では、ＰＥはＰＥ４Ｅ、ＰＥ４０またはＰＥ３８であるが、一方、非標的化細胞に対する有意の毒性が生じないレベルに非特異的細胞毒性が排除または低減された任意の形態のＰＥは、それが標的化細胞中での転位およびＥＦ−２リボシル化を依然として可能にする限り、本発明の免疫毒素中に用いられ得る。
【００８７】
Ａ．ＰＥの保存的修飾化変異体
ＰＥの保存的修飾化変異体またはその細胞毒性断片は、当該ＰＥ、例えばＰＥ３８と、アミノ酸レベルで少なくとも８０％の配列類似性、好ましくは少なくとも８５％の類似性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列類似せい、もっとも好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有する。
【００８８】
「保存的修飾化変異体」という用語は、アミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関しては、保存的修飾化変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の核酸配列を指す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸は任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば暗号ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって暗号によりアラニンが特定されるすべての位置で、暗号は、コードポリペプチドを変更することなく、記載された対応する暗号のいずれかに変更され得る。このような核酸変異は、保存的修飾化変異の一種である「無症候性変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列は、核酸のすべての考えうる無症候性変異も記載する。核酸中の各暗号（普通はメチオニンに関する唯一の暗号であるＡＵＧを除く）は修飾されて機能的に同一の分子を生じ得る、と当業者は認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各無症候性変異は、各記載配列中に内在する。
【００８９】
アミノ酸配列に関しては、コード配列中の単一アミノ酸または小パーセンテージのアミノ酸を変更、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的修飾化変異体」であり、この場合変更はあるアミノ酸の、化学的に同様のアミノ酸による置換を生じる、と当業者は認識する。
【００９０】
Ｂ．ＰＥの細胞毒性に関する検定
本発明に用いられるシュードモナス外毒素は、当業者に周知の検定により、所望のレベルの細胞毒性に関して検定され得る。例示的毒性検定は、当業界で周知である。したがってＰＥの細胞毒性断片およびこのような断片の保存的修飾化変異体は、細胞毒性に関して容易に検定され得る。多数の候補ＰＥ分子が、当業界で周知の方法により細胞毒性に関して同時に検定され得る。例えば候補分子の亜群が、細胞毒性に関して検定され得る。候補分子の陽性反応亜群は、所望の細胞毒性断片（単数または複数）が同定されるまで、継続的に細分され、そして再検定され得る。このような方法は、ＰＥの多数の細胞毒性断片または保存的変異体の迅速スクリーニングを可能にする。
【００９１】
Ｃ．ターゲッティング部分および毒素の接合
毒性部分および抗体は、化学的手段により、または組換え的手段により接合され得る（Ｒｙｂａｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ １：１４１参照）。本発明の免疫毒素中では、ターゲッティングおよび毒素部分は、通常は短いペプチドであるリンカー分子を介して連結される。化学的修飾としては、例えばタンパク質化学の業界で周知の方法により、リンカーにその部分を連結する目的のための誘導化が挙げられる。毒性部分および認識部分をリンカーに連結する適切な手段は、最終的にその部分とリンカーとの間の分子内ジスルフィド結合の形成に寄与するヘテロ二機能性カップリング試薬を含む。本発明に関するこの能力に有用である他の種類のカップリング試薬は、例えば米国特許第４，５４５，９８５号に記載されている。あるいは分子内ジスルフィドは、天然に生じるか、または遺伝子工学処理により挿入される各部分中のシステイン間に形成されると便利である。部分の連結手段は、ヘテロ二機能性架橋試薬または特定の低ｐＨ切断可能架橋剤または特定のプロテアーゼ切断可能リンカー間のチオエーテル結合、あるいはその他の切断可能または非切断可能化学結合も用い得る。免疫毒素の部分を連結する手段は、標準ペプチド合成化学または組換え手段により別々に合成される部分間に形成されるペプチジル結合も含み得る。
【００９２】
異なるタンパク質または免疫毒素の一部分の考え得る遺伝子工学的修飾としては、組換えＤＮＡ技術により得られる単一遺伝子から発現される一本鎖多機能性生合成タンパク質への各々の関連機能的ドメインの組合せが挙げられる（例えばＰＣＴ公開出願ＷＯ／８８／０９３４４参照）。さらに組換えＤＮＡ技術は、組換え毒素および抗体をリンカーに連結するために用いられ得る。したがって免疫毒素は、毒素を伴う一端で開始し、他端で抗体で終止する融合タンパク質を含み得る。
組換え融合タンパク質の製造方法は、当業者には周知である。したがって、例えばＣｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４； Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５： １５１９８； Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８５４５；およびＣｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： １０６６は、種々の一本鎖抗体−毒素融合タンパク質を記載する。
【００９３】
概して、免疫毒素融合タンパク質の製造は、抗体、抗体断片（例えばＦｖ軽および重鎖）またはリガンドをコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、および用いられる毒素をコードするＤＮＡを別々に調製することを包含する。次に配列がプラスミドまたはその他のベクター中で併合されて、特定の所望のキメラタンパク質をコードする構築物を生成する。より簡単なアプローチは、特定の抗体断片（例えばＦｖ領域）またはリガンドをコードするＤＮＡを、すでに所望の毒素およびリンカーをコードする構築物中に挿入することを包含する。
【００９４】
したがって例えば抗Ｔａｃ抗体／毒素免疫毒素をコードするＤＮＡは、所望の毒素およびリンカーをコードするＤＮＡをすでに含有する構築物中に抗体ＶＨおよびＶＬ鎖（Ｆｖ領域）をコードするＤＮＡを挿入することにより、あるいはその逆により、最も容易に調製される。Ｆｖ領域をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の技法を用いて構築物中に挿入される。
哺乳類細胞は、ハイブリッド分子、例えば抗体−サイトカイン（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０９６： ３４５； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８： １０２７）および抗体−酵素（Ｃａｓａｄｅｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２０４７； Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｇｅｎｅ ４３：３１９）を発現し、分泌するために用いられてきた。一部は、外来タンパク質の免疫原性は、組換えタンパク質上に存在する不正確なグリコシル化パターンのためである。したがって真核生物細胞株は、発現化タンパク質がグリコシル化される場合、原核生物細胞よりも好ましい。ヒト由来細胞株は、これらの細胞が末端グリコシドとしてシアル酸を組入れる場合、特に好ましい。ハムスターＣＨＯおよびＢＨＫ、ならびにＨＥＫ−２９３ヒト繊維芽細胞株のような細胞株が、組換えヒトタンパク質を発現するために用いられてきた。
【００９５】
本発明の免疫毒素のタンパク質部分のその他の遺伝子工学処理的修飾としては、タンパク質のサイズを低減し、あるいは溶解性に影響を及ぼすための配列変化（例えばシステインからセリンに）またはグリコシル化部位のような産生または実用性を促すその他のパラメターを修飾するために機能的に不必要なドメインの欠失を包含する。タンパク質の多数の付加的な周知の化学的および遺伝子的修飾は有益には任意のタンパク質に適用され得る、と当業者は理解する。
【００９６】
本発明の好ましい免疫毒素は、非特異的細胞結合を低減または排除するよう修飾されたシュードモナス外毒素（ＰＥ）を毒性部分として含有するキメラタンパク質である。特に好ましい実施態様では、毒素部分は、ＩＬ−２受容体αサブユニットを結合する抗ヒトＴａｃモノクローナル抗体のＦｖ断片に短いペプチドを介して連結されたその細胞結合ドメインにおける欠失を有する切頭形態の３８ｋＤのＭｗを有するＰＥ（ＰＥ３８）である。毒素および抗体間の融合タンパク質のこの独特の結合の構築は、化学的連結抗体／毒素タンパク質接合体の不均質性を排除する。これは、免疫毒素の効力増大および免疫原性低減に寄与し得ると考えられる。特に好ましい実施態様では、抗Ｔａｃ抗体のＦｖ部分は、配列ＡＳＧＧＰＥを有するペプチドコネクターによりＰＥ３８に連結される。
本発明は、本明細書中に記載された新規のタンパク質をコードする核酸構築物を包含する。核酸構築物は、適切なベクター中に組入れられた場合、宿主中で複製し得るものである。構築物は、構築物の発現に影響を及ぼし得るその他の配列、例えばプロモーターおよびエンハンサーに連結され得る。
【００９７】
Ｄ．免疫毒素の使用
本発明の免疫毒素は、細胞を免疫毒素と接触することにより免疫毒素がターゲッティング部分によって標的化される細胞の選択的抑制または殺害のために利用され得る。この方法は、選択的に殺害されるべき種類の細胞上に特異的にまたは優先的に見出される細胞表面マーカーと結合する抗体またはリガンドの適切な選択に基づいている。例えば本発明の免疫毒素としては、ＩＬ−２受容体αサブユニット（ＣＤ２５）と結合する抗体を含むものが挙げられる。好ましい実施態様では、本発明の免疫毒素は、ＣＤ２５＋血液学的悪性疾患、例えば毛様細胞白血病（ＨＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ホジキン病および成人Ｔ細胞白血病の細胞を殺害するかまたは細胞の増殖を抑制するために用いられる。免疫毒素は、例えばＣＤ２５＋悪性疾患の細胞の培養を清浄にするために、または培養中のこのような細胞の増殖を抑制するために、細胞培養に付加され得る。免疫毒素はさらに、生物体中の悪性細胞の増殖を抑制するために、ｉｎ ｖｉｖｏで用いられ得る。
【００９８】
ＶＩＩ．免疫毒素以外の免疫複合体
免疫毒素のほかに、本発明は、従来利用可能なものより大きい安定性および低減された免疫原性を有するその他の免疫複合体を提供する。したがって抗体は、抗体により特異的に認識される抗原を保有する細胞に直接送達されるべき治療剤または標識にリンカーにより付着され得る。治療剤としては、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸または誘導体、糖タンパク質、放射性同位元素、脂質、炭水化物、または組換えウイルスのような化合物が挙げられる。核酸治療および診断部分としては、アンチセンス核酸、一重鎖または二重鎖ＤＮＡとの共有架橋のための誘導化オリゴヌクレオチド、ならびにおよび三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
あるいは、抗体またはその他のターゲッティング部分に連結される分子は、治療用組成物、例えば薬剤、核酸（例えばアンチセンス核酸）または好ましくは循環系への直接曝露を保護される別の治療用部分を含有する封入系、例えばリポソームまたはミセルであり得る。抗体に付着されるリポソームの調製手段は、当業者に周知である（例えば米国特許第４，９５７，７３５号；およびＣｏｎｎｏｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒ． ２８：３４１−３６５（１９８５）参照）。
【００９９】
Ａ．検出可能標識
抗体またはその他のリガンドは任意に、検出可能標識に共有的にまたは非共有的に連結され得る。このような使用に適した検出可能標識としては、分光分析的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）、蛍光染料（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質等）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびＥＬＩＳＡに一般的に用いられるその他のもの）、比色定量的標識、例えばコロイド金あるいは着色ガラスまたはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズが挙げられる。金属キレート化剤は、当業界で周知の方法により、抗体またはその他のターゲッティング部分に連結され得る（例えばＲｏｂｅｒｔ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６： ４７５８−４７６５ （１９９６）参照）。例えば、腫瘍とならびに金属キレート化剤と結合し得る二特異的抗体が開発された（Ｓｔｉｃｋｎｅｙ， Ｄ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１（２４）： ６６５０−５ （１９９１）； Ｒｏｕｖｉｅｒ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． ４７ （４−６）： １６３−１６７（１９９７））。これらのキレート化剤は、画像形成のためにまたは細胞殺害のために、放射性同位元素、例えば１１１インジウムを含有し得る。当業界で既知の技法は、例えばキレート化剤に対しておよび免疫複合体のターゲッティング部分に対して二特異的な抗体をリンカー分子として用いることにより、本発明に適用可能である。この場合、二特異的抗体は、例えば抗体の枠組み構造領域の表面に曝露されたシステインを工学処理することにより、ＰＥＧ化のために工学処理され得る。
【０１００】
このような標識の検出手段は、当業者には周知である。したがって例えば放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーション計数器を用いて検出され得るし、蛍光マーカーは、発光照度を検出するために光検出器を用いて検出され得る。酵素標識は、典型的には基質に酵素を提供し、基質に及ぼす酵素の作用により産生された反応産物を検出することにより検出され、そして比色定量的標識は、着色標識を単に可視化することにより検出される。
【０１０１】
Ｂ．抗体またはその他のターゲッティング分子との接合
本発明の非組換え実施態様では、エフェクター分子、例えば治療的、診断的または検出部分は、当業者に既知の任意数の手段を用いて、リンカー分子を介してターゲッティング分子に連結される。共有的および非共有的結合手段が用いられ得る。
エフェクター分子をリンカーに結合するための手法は、ＥＭの化学構造によって変わる。ポリペプチドは、典型的には、ペプチド上の適切な官能基との反応のために利用可能である種々の官能基、例えばカルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含有する。
あるいは抗体は、付加的反応性官能基を曝露または結合するために誘導される。誘導化は、このような接合を起こさせるための、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能なもののような多数の分子のいずれかの結合を包含し得る。
【０１０２】
いくつかの環境においては、免疫複合体がその標的部位に達した場合、ターゲッティング分子からエフェクター分子を遊離するのが望ましい。したがってこれらの環境では、免疫複合体は、標的部位の近くで切断可能である結合を含む。リンカー分子からエフェクター分子を放出するためのリンカーの切断は、酵素活性または免疫複合体が標的細胞の内側でまたは標的部位の近くで受ける条件により促進され得る。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在する条件下で（例えば腫瘍関連酵素または産生ｐＨに曝露される場合）切断可能であるリンカーが用いられ得る。
種々の放射性診断化合物、放射性治療化合物、薬剤、毒素およびその他の作用物質を抗体に結合するために報告されてきた多数の方法にかんがみて、所定の作用物質を抗体またはその他のポリペプチドに結合するための適切な方法を、当業者は決定し得る。
【０１０３】
ＶＩＩＩ．製剤組成物および投与
本発明は、製薬上許容可能な担体中に本発明の免疫複合体を含む組成物にも関する。治療的用途において、組成物は、疾患およびその合併症の進行を遅らせるのに、または疾患またはその合併症を部分的にまたは完全に停止するのに十分な量で、疾患に罹患している患者に投与される。１つまたはそれ以上のこれらの目標を達成するのに適した量は、治療的有効量として限定される。このような使用のために有効な量は、疾患の重症度および患者の健康の全身状態によっている。
【０１０４】
本発明の免疫複合体は、異なる目的に適した種々の手段により投与され得る。例えば本発明の免疫毒素は、他の免疫毒素に関して当業界で既知の方法にしたがって、身体の種々の部分における腫瘍に接触するために用いられ得る（例えばＲｙｂａｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｉｎ “Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，” Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓおよびそこに記載された参考文献参照）。免疫毒素は、注射により、もっとも好ましくは静脈内注射により全身的に投与されるが、しかし筋肉内、皮下、鞘ない、腹腔内投与により、血管間隙に、または関節に、例えば関節内注射によっても投与され得る。
【０１０５】
したがって本発明は、本発明の免疫複合体および製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物、特に前記の投与手段に適した組成物にも関する。用量は、用いられる免疫複合体の特性、例えばその活性および生物学的半減期、処方物中の免疫複合体の濃度、投与の部位および速度、関与する患者の臨床的耐容性等によっており、これらは十分に医師の手腕内である。
組成物の１回または多数回投与は、必要とされる、そして患者に耐容されるような投与量および頻度によって投与され得る。例えば免疫毒素の投与に関しては、組成物は、疾患またはその合併症の進行を遅らせるかまたは停止させるのに十分な量の本発明の免疫毒素を提供すべきである。
【０１０６】
投与のための組成物は、製薬上許容可能な担体、好ましくは水性担体中の免疫複合体、例えば免疫毒素の溶液を含み得る。種々の水性担体、例えば緩衝化食塩水等が用いられ得る。これらの溶液は滅菌性であり、一般的に望ましくない物質を含有しない。これらの組成物は、慣用的な周知の滅菌技法により滅菌され得る。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる場合、製薬上許容可能な補助物質、例えばｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有し得る。溶液のｐＨは、好ましくはｐＨ５〜９．５の範囲であり、好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。典型的には、免疫複合体またはその誘導体は、適切な製薬上許容可能な緩衝剤、例えばリン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌまたはクエン酸塩等を有する溶液中に存在する。緩衝剤濃度は、１〜１００ ｍＭの範囲であるべきである。免疫複合体の溶液は、塩、例えば塩化ナトリウムまたは塩化カリウムも５０〜１５０ ｍＭの濃度で含有し得る。有効量の安定剤、例えばアルブミン、グロブリン、洗剤、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミンの塩も含まれ得るし、免疫複合体を含有する溶液に、または溶液が調製される組成物に付加され得る。免疫複合体の全身投与は、典型的には２〜３日毎に、または週に１回なされる。あるいは毎日投与が有用である。通常は、投与は筋肉内注射または血管内注入による。
【０１０７】
静脈内投与のためには、典型的製剤組成物は、約０．０１〜１００ ｍｇ／患者／日である。特に薬剤が奥まった部位に投与され、血流中には投与されない場合、例えば腫瘍またはその中に腫瘍が存在する器官に投与される場合は、０．１〜約１０００ ｍｇまで／患者／日の投与量が用いられ得る。非経口的投与組成物の実際的製造方法は、当業者には既知であるかまたは明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ，（１９８０）のような出版物に詳細に記載されている。
【０１０８】
投与は、鼻腔内または他の非腸管外経路によりものでもあり得る。免疫複合体は、血液を含めたある種の組織中に置かれた微小球、リポソームまたはその他の微小粒子送達系を介しても投与され得る。
免疫複合体は、肺への局在化送達を達成するためにエーロゾルによっても投与され得る。これは、免疫複合体またはその誘導体を含有する水性エーロゾル、リポソーム調製物または固体粒子を調製することにより成し遂げられる。非水性（例えばフルオロカーボン噴射剤）懸濁液が用いられ得る。ソニックネビュライザーは、好ましくはエーロゾルの調製に用いられる。ソニックネビュライザーは、抗体またはその誘導体を、免疫複合体の分解を生じ得る剪断に露呈するのを最小限にする。
【０１０９】
普通は水性エーロゾルは、慣用的な製薬上許容可能な担体および安定剤と一緒に免疫複合体の水性溶液または懸濁液を処方することにより製造される。担体および安定剤は特定の免疫複合体に関する要件によって変わるが、しかし典型的には非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０ＯＲ−８０（商標）、プルロニック−Ｆ１２８ＯＲ−６７（商標）またはポリエチレングリコール）、無毒タンパク質例えば血清アルブミン、あるいはソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、アミノ酸例えばグリシン、緩衝剤、塩、糖または糖アルコールを包含する。処方物は滅菌性である。エーロゾルは一般に、等張性溶液から調製される。
【０１１０】
さらに本発明は、リガンドまたは抗体の結合を可能にする条件下で殺害されるべき細胞の表面の標的に特異的なリガンドまたは抗体を有する本発明の選択的免疫毒素を用いて細胞を選択的に殺害する方法に関する。細胞上の表面マーカーとのリガンドまたは抗体の結合は、毒素（例えばＰＥまたはＰＥ３８）に細胞を選択的に殺害させる。本発明のこの方法は、例えば放射線による骨髄焼灼を受けている患者への移植前に、骨髄中の望ましくない種類の細胞を選択的に殺害することによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞分離のために用いられ得る。
【０１１１】
ＩＸ．実施例
Ａ．材料および方法
１．試薬
メトキシ−ポリエチレングリコール−マレイミド（ＰＥＧ−マレイミド、Ｍｗ：５，０００または２０，０００）は、ＦｌｕｋａまたはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒから入手した。その他の試薬および溶媒は、標準供給元から入手した。
【０１１２】
２．細菌株およびプラスミド
プラスミドの増殖のために、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）からの大腸菌ＤＨ５α（最大効率）を用いた。オリゴデオキシヌクレオチド特異的突然変異誘発のための鋳型として用いられる一本鎖ウラシル含有ファジミドＤＮＡの調製のためには、大腸菌ＣＪ２３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。λプロファージ上の誘導性プロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）は、組換え免疫毒素の発現のための宿主として用いた。プラスミドｐＲＫ７９は、抗−Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８（ＬＭＢ−２）をコードする（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）、上記）。
【０１１３】
３．ＬＭＢ−２の突然変異誘発
以前に記載された（Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、上記）ようないくつかの修飾を有するＫｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０４：１２５−１３９）により、ＬＭＢ−２の突然変異誘発を実行した。プラスミドにおける突然変異は、ＤＮＡシーケンシングにより確証した。
【０１１４】
４．組換え免疫毒素の発現および精製
以前に記載された（Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、上記）ような対応する発現プラスミド（ｐＲＫ７９または突然変異体ｐＲＫ７９）を含有する大腸菌ＢＬ２１中で、ＬＭＢ−２（ネイティブＬＭＢ−２）およびｃｙｓ１−ＬＭＢ−２の構成成分を生成した。
【０１１５】
５．１個のシステインによるｃｙｓ１−ＬＭＢ−２のＰＥＧ化
ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の調製のための典型的手法を以下に示す。リン酸塩緩衝化生理食塩水中の遊離チオール基を有するＬＭＢ−２を、２５℃で１２時間、３０倍モル余分量の５−ｋＤａまたは２０−ｋＤａＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧ５ＫまたはＰＥＧ２０Ｋ）と反応させた。反応混合物を２０容積の緩衝液Ａ（２０ ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で希釈し、次に緩衝液Ａで予め平衡されたＱ−セファロースカラム上に直接載せた。非結合ＰＥＧ５ＫおよびＰＥＧ２０Ｋを除去するために、カラムを５０容積の緩衝液Ａで洗浄し、次に緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中の１ ＭＮａＣｌ）で溶離した。ＰＥＧ化ＬＭＢ−２を含有する適切なＱ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）分画を収集し、５容積の緩衝液Ａで希釈し、次に緩衝液Ａで予め平衡させておいたモノ−Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）カラム上に載せて、非修飾化ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２からＰＥＧ化ＬＭＢ−２を大まかに分離した。カラムを１０容積の緩衝液Ａで洗浄し、次に緩衝液Ａ中のＮａＣｌ勾配（０〜１ Ｍ）で溶離した。ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ−１０（ＡＭＩＣＯＮ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）により適切なモノ−Ｑ分画を濃縮後、粗製ＰＥＧ化ＬＭＢ−２を、リン酸塩緩衝化生理食塩水で平衡され、溶離されるＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷ上で分離した。生成したＰＥＧ化ＬＭＢ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると非常に純粋であった。
ＤＴＮＢ法（Ｒｉｄｄｌｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９４：７５−８１）により、遊離スルフヒドリル基含量を確定した。
Ｃｈｉｌｄｓの方法（Ｃｈｉｌｄｓ （１９７５） Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２０：１９０−１９２）の修飾により、ＰＥＧ含量を検定した。ＰＥＧ５ＫまたはＰＥＧ２０Ｋを標準として用いた。
【０１１６】
６．細胞毒性検定
ＡＴａｃ−４細胞でのタンパク質合成抑制検定（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）、上記）により、ネイティブ、ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２およびＰＥＧ化ＬＭＢ−２の特異的細胞毒性を査定した。
【０１１７】
７．安定性検定
ＬＭＢ−２、ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２およびＰＥＧ化ＬＭＢ−２の安定性を、マウス血清中で３７℃で１０ μｇ／ｍｌの最終濃度でそれらをインキュベートすることにより確定した。異なる時間のインキュベーション後に残存する活性免疫毒素の量を、ＡＴａｃ４細胞毒性検定により確定した。
【０１１８】
８．非特異的毒性検定
４、５または７匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜７週齢；約２０ ｇ）の群に、２００μｌの漸増用量のＬＭＢ−２、ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２およびＰＥＧ化ＬＭＢ−２を静脈内注射した。０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを希釈剤として用いた。ＬＤ５０は、５０％の動物を殺害する組換え免疫毒素の算定用量である。
【０１１９】
９．抗腫瘍試験
ＡＴａｃ−４腫瘍を保有するマウスにおいて、免疫毒素の抗腫瘍活性を確定した。ＡＴａｃ−４細胞（２ ｘ １０６）を０日目にヌードマウス（Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｃｒ ｎｕ／ｎｕ；７週齢；約２０ ｇ）に皮下接種した。４日目に開始して、マウスを免疫毒素の静脈内注射で処置した。０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを希釈剤として用い、１０ μｇ／マウスのＰＥＧ５ＫまたはＰＥＧ２０Ｋを対照として用いた。４、６、８日目に治療を施した。各処置群は、５匹のマウスで構成された。２日毎にキャリパーで腫瘍を測定し、式：腫瘍容積（ｍｍ３）＝長さｘ（幅）２ｘ０．４を用いて腫瘍の容積を算定した。
【０１２０】
１０．薬物動態検定
正常雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜７週齢；約２０ ｇ）に、種々の免疫毒素２μｇを静脈内注射した。異なる時間に血液試料を採取した。希釈血清試料をＡＴａｃ−４細胞とともにインキュベートするバイオアッセイにおいて組換え免疫毒素のレベルを測定し、タンパク質合成を抑制する血清試料の能力を測定した。プログラムＲＳＴＲＩＰ（バージョン５、ＭｉｃｒｏＭａｔｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を適合させる指数曲線により、データを分析した。
【０１２１】
１１．免疫原性検定
５匹の群の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜７週齢；約２０ ｇ）に、０．２％マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を含有するＰＢＳ中の４μｇ／マウスまたは４０μｇ／マウスの用量でのＬＭＢ−２、ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２およびＰＥＧ化ＬＭＢ−２を腹腔内免疫感作した。一次免疫感作の１週間後に、適切な抗原を用いてマウスを再び免疫感作した。一次免疫感作後７日毎に血液試料を採集した。アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）に接合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体および基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）により、血清中の特異的ＩｇＧレベルを確定した。プレートをＬＭＢ−２で被覆した。
【０１２２】
Ｂ．結果
１．ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の調製および特性化
ＬＭＢ−２において、抗−Ｔａｃ抗体のＦｖ部分をペプチドコネクター（ＡＳＧＧＰＥ（配列番号１））によりＰＥ３８に連結する。ＣＤ２５＋腫瘍細胞に対するその特異的細胞毒性活性に必要なＬＭＢ−２の抗原結合、転位およびＡＤＰ−リボシル化機能の損失を防止するために、ＦｖをＰＥ３８に連結するペプチド中に１個のシステインを有するＬＭＢ−２の突然変異形態（ＡＳＧＣＧＰＥ）を調製した（図１Ａ）。システインは、遊離チオール化学を用いる部位特異的ＰＥＧ化のために用いた。図２に示したように、ＰＥＧ化ＬＭＢ−２分子は、単一ピークとしてＴＳＫサイズ排除カラムから溶離される場合、ＳＤＳ　ＰＡＧＥ上の単一帯域として走行した。図２および表１は、ＡＴａｃ−４細胞（ＣＤ２５＋細胞株）に対するｃｙｓ１−ＬＭＢ−２の特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性がネイティブＬＭＢ−２と類似したことを示す。予測どおり各ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２分子は１個の遊離チオール基を含有したが、一方、ネイティブＬＭＢ−２は含有しなかった。封入体から調製された高精製ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２の収率は〜７．０％であったが、これはネイティブＬＭＢ−２（７．３％）と同様であった。
【０１２３】
ＰＥＧ５Ｋ−またはＰＥＧ２０Ｋ−マレイミドを用いて、チオエーテル結合の形成により、コネクター中に遊離チオール基を有する精製ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２を部位特異的に修飾した（図１Ｂ）。精製後、両型のＰＥＧ化ＬＭＢ−２は類似の細胞毒活性を有し、これらは非修飾化ネイティブおよび突然変異体ＬＭＢ−２と同一であった（図２および表１）。ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２の部位特異的ＰＥＧ化後、ＰＥＧ化ＬＭＢ−２は遊離チオール基を有さず、代わりに約１モルのＰＥＧ／タンパク質１モルを含有した。
【０１２４】
２．マウス血清中のＰＥＧ化ＬＭＢ−２の安定性
種々のＬＭＢ−２分子の安定性を、３７℃で種々の時間、マウス血清中でそれらをインキュベートすることにより査定した（図３）。ネイティブおよび突然変異体の両ＬＭＢ−２は１時間かなり安定していたが、その後それらの細胞毒活性は時間依存様式で減少した。これに対比して、両ＰＥＧ化ＬＭＢ−２は安定であった。２４時間後、ＰＥＧ５Ｋ−およびＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２はそれらの初期活性の約４０％および５０％を保持した。
【０１２５】
３．ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の毒性
毒性試験のために、いくつかの異なる用量の各種類の免疫毒素をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射した。ほとんどすべての死亡は、処置後４日以内に起きた。表２は、死亡マウス数および注射マウス総数を処置後１４日目に記録した。ネイティブおよび突然変異体ＬＭＢ−２のＬＤ５０は、表１に示したように約０．５ ｍｇ／ｋｇであることが判明した。対照してみると、ＰＥＧ化ＬＭＢ−２は十分に耐容された；ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２およびＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２のＬＤ５０は、約３．０ ｍｇ／ｋｇであった。
【０１２６】
４．ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の抗腫瘍活性
抗腫瘍活性を査定するために、０日目にヌードマウスにＡＴａｃ−４細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ ｍ３と測定された４日目に処置を開始した。４、６および８日目に投与される３つの用量を用いて、動物を静脈内処置した。対照群にはビヒクル（０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）または１０μｇのＰＥＧ５ＫまたはＰＥＧ２０Ｋを投与した。ネイティブおよび突然変異体ＬＭＢ−２は、用量依存様式で腫瘍増殖を抑制した（図４）。両非ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の抗腫瘍活性は同様であった。１回目注射のレベルで６日間、平均腫瘍容積を維持するのに必要な容量は、ＬＭＢ−２およびｃｙｓ１−ＬＭＢ−２に関しては０．０５ ｍｇ／ｋｇｘ３、ＰＥＧ５ＫＬＭＢ−２およびＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２に関しては０．００６ ｍｇ／ｋｇｘ３であった。５０日後より後まで再増殖を伴わない腫瘍の消失と定義される完全退行は、それぞれ０．１ ｍｇ／ｋｇｘ３のネイティブまたは突然変異体ＬＭＢ−２の用量での５匹のうちの２匹または５匹のうちの１匹で観察された。０．２ ｍｇ／ｋｇｘ３用量レベルでは、ネイティブまたは突然変異体ＬＭＢ−２を投与された５匹のうち１匹が治療期間中に毒性により死亡したが、残りの４匹すべてにおいて完全退行が観察された。両種類のＰＥＧ化ＬＭＢ−２の抗腫瘍活性は、顕著に改善された。完全退行は、それぞれＰＥＧ５Ｋ−またはＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２の０．０２５ ｍｇ／ｋｇｘ３の用量で５匹のうちの１匹または５匹のうちの２匹において観察された。０．０５ ｍｇ／ｋｇｘ３の用量では、ＰＥＧ化ＬＭＢ−２は、５０日間に亘って存続する完全退行を生じた。それ自体を投与した場合、ＰＥＧ５ＫおよびＰＥＧ２０Ｋ（１０μｇ／マウス）は、抗腫瘍活性を示さなかった。全体的に、ＰＥＧ化ＬＭＢ−２のいずれかを用いる場合、腫瘍容積の匹敵する変化を生じるためには、約４倍の用量が必要であった。
【０１２７】
５．ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の薬物動態
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２μｇの各形態のＬＭＢ−２の単一用量を静脈内注射した。注射後の異なる時点で血液を採取し、Ａｔａｃ−４細胞での免疫毒素レベルに関して検定した。図５に示したように、ネイティブおよび突然変異体ＬＭＢ−２の血清濃度プロフィールは、二指数排除曲線を示した。非修飾化ＬＭＢ−２の血漿半減期は、約１３分であった（表３）。これに対比して、両ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の血清濃度プロフィールは、一指数排除曲線を示した。ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２の血漿半減期は約５倍増大され、ＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２は約８倍増大された。両ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の曲線下面積および平均滞留時間も実質的に増大された。
【０１２８】
６．ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の免疫原性
免疫原性を査定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに各形態のＬＭＢ−２を４μｇ／マウスまたは４０μｇ／マウスの用量で０および１４日目に、腹腔内免疫感作した。
一次免疫感作後２１日目に血清試料を採集し、血清中のマウス抗ＬＭＢ−２ＩｇＧ抗体レベルを、コーティング抗原としてネイティブＬＭＢ−２を用いてＥＬＩＳＡにより確定した。図６に示したように、４μｇ／マウスｘ２の用量でのネイティブＬＭＢ−２および突然変異体ＬＭＢ−２は、マウスにおいて抗ＬＭＢ−２ＩｇＧ抗体を顕著に誘導した。より高容量のネイティブＬＭＢ−２および突然変異体ＬＭＢ−２は、マウスに対する毒性のために投与されなかった。これに対比して、両ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の免疫原性は、非常に低いことが判明した。ネイティブＬＭＢ−２をこの試験における抗体応答を検出するために用いたが、しかし突然変異体ＬＭＢ−２またはＰＥＧ化ＬＭＢ−２を用いてプレートを被覆した場合に、非常によく似た結果を得た。
【０１２９】
Ｃ．考察
組換え免疫毒素ＬＭＢ−２の部位特異的ＰＥＧ化は、その安定性、血液滞留時間および抗腫瘍活性を増大するが、一方、その非特異的毒性および免疫原性を低減する。全体的には、治療ウインドウは、２０倍以上増大される。これらの結果は、患者における免疫毒素の使用に関して、重大な臨床的合併症を有する。
【０１３０】
近年完了した臨床試験では、ＬＭＢ−２は、患者３５名に投与され、種々の悪性疾患において抗腫瘍活性を示した。１例の完全応答が毛様細胞白血病において観察され、これは２２ヶ月以上存続した。数例の異なる毒性が、この試験において観察された。これらは、肝臓損傷、重量増、低血圧および発熱のためのトランスアミナーゼ増大を包含した。組換え免疫毒素の毒性副作用は、２つの型を有する。１つの型は、腫瘍細胞と同一抗原を発現する正常細胞の特異的ターゲッティングに起因する。この毒性を克服するためには、正常細胞では発現されない標的抗原を発見する必要がある。新規の腫瘍関連抗原の同定は、発現配列タグデータベース分析の分析により進行中である（Ｖａｓｍａｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ６：３００−３０４）。毒性の他方の型は、ＣＤ２５陰性正常細胞による非限定性非特異的吸着および取込みから生じる。ＬＭＢ−２を用いたＩ期試験において、ならびにそのＣＤ２５がＬＭＢ−２と反応しないマウスまたはそのＣＤ２５が反応するサルを用いた、ＬＭＢ−２の毒性試験において、血中のトランスアミナーゼ増大により立証されるような肝臓損傷にしばしば遭遇した（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９）、上記；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ （１９９５）、上記）。この型の毒性が低減され得た場合、患者を処置するために用いられる免疫毒素の用量を増大し、より高頻度且つ実質的臨床応答を得る事ができるに違いない。非特異的毒性を低減する一アプローチは、その血中滞留時間を増大することにより、血液から正常組織への免疫毒素の分布を制限することである。さらに血漿半減期の延長は、抗腫瘍効力の強化をもたらし得る（Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９９）、上記）。ＰＥＧ化は、ＬＭＢ−２の血中滞留を増強するための、そしてその治療的効力を強化するための一手段である。
【０１３１】
タンパク質のＰＥＧ化は、タンパク質分解を低減し、そして組織分布、例えば腎臓による糸球体濾過および肝臓取込みを制限することによりそれらの血漿半減期を増大する（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：２８０８−２８１２； Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８９：１６４３−１６５１； Ｙａｂｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８９：１１７６−１１８４； Ｐｙａｔａｋ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． Ｃｈｅｍ． Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２９：１１３−１２７； Ｋａｔｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８４：１４８７−１４９１； Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２８：１３８７−１３９４； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：４５８８−４５９４； Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１３３９８−１３３４０４； Ｋｕａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：７６１０−７６１６）。この作用は、タンパク質へのＰＥＧ付着に起因する分子サイズおよび立体障害の増大に関与する。ほとんどの場合、高分子相互作用に基づいているリガンド−受容体および抗原−抗体結合を付着したＰＥＧ鎖が立体的に阻害し得るため、ＰＥＧ化の適用は、その基質が極小分子である酵素、例えばアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）およびスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）に限定されてきた（Ｂｅｎｈａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４）、上記；Ｋｕａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）、上記）。さらにＰＥＧ化は通常はリシン残基で起こり、そのいくつかはタンパク質の活性部位またはその近くに存在し得る。そしてＰＥＧによるこのリシン修飾は無作為であり、制御するのが難しい（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ７１：９６３−９６８）。組換え免疫毒素は、３つの重要な機能を有する（Ｐａｓｔａｎ（１９９７）、上記；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）、上記；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９）、上記；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、上記；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４）、上記；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４）、上記）。これらは、ＥＦ２の抗原結合、転位およびＡＤＰ−リボシル化である。３つはすべて、高分子相互作用を包含する。抗原−結合ドメインおよびＡＤＰ−リボシル化ドメインはともに、リシン残基を含有する。高分子相互作用による妨害を回避するために、ＬＭＢ−２のＦｖおよびＰＥモチーフ間の非機能性コネクター中に１個のシステイン残基を有する突然変異体ＬＭＢ−２を作製し、部位特異的ＰＥＧ化のためにシステインのチオールを用いた（図１）。
【０１３２】
ＣＤ２５＋腫瘍細胞（ＡＴａｃ−４）に対する余分のシステイン残基を含有するｃｙｓ１−ＬＭＢ−２の特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性は、親ＬＭＢ−２の場合とほぼ同一である（図２および表１）。コネクター領域中の遊離チオール基とＰＥＧの末端マレイミド基との間のチオエーテル結合の形成により、ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２を特異的にＰＥＧ化した。生成されたＰＥＧ５Ｋ−およびＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２は、非修飾化ネイティブおよび突然変異体ＬＭＢ−２と比較した場合、十分な細胞毒活性を保持した（図２および表１）。アミノ酸２７９および２８０ＰＥ間のタンパク質分解性切断によりＬＭＢ−２が細胞内で２つの断片にプロセシングされるため、これは一部である。ＰＥＧはＦｖとともに残存するが、一方、ほとんどの毒素（ａａ２８０〜６１３）は、小胞体に輸送されて、そこでそれはサイトゾルに転位し、細胞を殺害する。通常は、付着ＰＥＧによる立体障害がＰＥＧ鎖長の増大に伴って増大するために、ＰＥＧ化タンパク質の活性は付着ＰＥＧの分子量増大に伴って低減する（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ７４：１０９０−１０９５）。しかしながらこの場合、ＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２は、ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２とほとんど同一の活性を有した。これは、コネクター中のＰＥＧ付着部位とＬＭＢ−２の活性部位との間の相対的に長い距離によるものであり得る。プロテアーゼおよびその他の不活性化活性を含有するマウス血清中での３７℃でのＰＥＧ化ＬＭＢ−２の安定性は、非修飾化ネイティブおよび突然変異体ＬＭＢ−２と比較して、強化された（図３）。ＰＥＧは、凝集を生じ、そしてＰＥＧ２０ＫがＰＥＧ５Ｋより有効であるタンパク質分解性襲撃またはＶＨおよびＶＬ鎖の解離からＬＭＢ−２を立体的に妨げ得る。
【０１３３】
両型のＰＥＧ化ＬＭＢ−２は、非修飾化ネイティブおよび突然変異体ＬＭＢ−２より３〜４倍高い抗腫瘍活性を示した。さらに、マウスに対するそれらの毒性は、約６分の１に低減された（図４、表１および２）。その結果として、ＰＥＧ化は治療効力の２０倍の増大をもたらした。ＬＭＢ−２のＰＥＧ化は、その血中滞留およびＡＵＣを有効に増大したが、これは分子サイズの増大および安定性強化によるものである（図５）。血漿半減期は、非修飾化ＬＭＢ−２よりも、ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２に関しては５倍、ＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２に関しては８倍長くなった。抗腫瘍活性の増大は、おそらくは、腫瘍中にしばしば見出される漏出性毛管を通って長時間、より多くの免疫毒素が腫瘍に進入するのを可能にする血漿半減期の増大によるものである。血液から正常組織へのＰＥＧ化タンパク質の輸送が限定され、そしてＰＥＧ化分子の非特異的細胞吸収および取込みが低減される、ということは周知である（Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８９：１６４３−１６５１； Ｉｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ８：１１３−１１７； Ｗｏｏｄｌｅ ａｎｄ Ｌａｓｉｃ （１９９２） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １４：１７１−１９９）。したがってＬＭＢ−２の毒性の低減は、少なくとも一部は、その分子サイズ増大のための、血液から正常組織、例えば肝臓へのその分布の低減によるものであると思われる（Ｃｈａｆｆｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２）、上記）。さらに、正常細胞によるＬＭＢ−２の非特異的結合および取込みは、イオン相互作用を遮蔽するＰＥＧ化により抑制され得る。ＰＥＧ化ＬＭＢ−２は免疫原性低減も示すことが判明したが、これはマクロファージのような抗原提示細胞による分解低減、分解後のペプチドのいくつかのエピトープの遮蔽（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：４５８８−４５９４）またはＢ細胞上の受容体との結合の防止のためであると思われる。さらに、前記のように、血液から免疫組織、例えば脾臓、骨髄およびリンパ組織へのＰＥＧ化ＬＭＢ−２の輸送は限定され、そして抗原提示細胞によるＰＥＧ化タンパク質の非特異的結合および取込みが低減され得る。組織分布および細胞結合に関する詳細な研究は、これらの問題を明らかにするのに役立つ。
【０１３４】
要するに、ＬＭＢ−２の部位特異的ＰＥＧ化は、その血漿半減期の増大およびその非特異的毒性の低減により、マウスにおける抗腫瘍剤としてのその治療効力を大いに改善する。ＬＭＢ−２とともに用いられるアプローチは、他の組換え免疫毒素およびその他の免疫複合体に適用可能であり、そして患者におけるそれらの活性を増大するはずである。
【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
【表４】
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【０１３８】
本明細書中に引用された出版物および特許出願はすべて、個々の出版物または特許出願が特定的におよび個別的に本明細書中に援用されると示されたように、それらの記載内容は、本明細書中に援用する。
前記の発明は明快な理解のために図面および実施例により多少詳細に説明してきたが、添付の特許請求の精神および範囲を逸脱しない限り、それに対して一定の変更および修正がなされ得るということは、本発明の教示にかんがみて、当業者には容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
（Ａ）コネクター中に１つのシステインを有する突然変異体ＬＭＢ−２（抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８）の模式図。ＰＥ配列にまたがるアミノ酸の位置に番号を付す。突然変異体ＬＭＢ−２（ｃｙｓｌ−ＬＭＢ−２）のコネクター（Ｃ）のアミノ酸配列は、ＡＳＧＧＰＥ（配列番号１）からＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２）に変更される。ＶＨは、抗Ｔａｃ抗体の重鎖断片をさす；Ｌは、ペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号７）に該当する；ＶＬは、軽鎖断片を示す；Ｃはコネクターをあらわす；ＩＩはＰＥドメインＩＩである；ＩｂはＰＥドメインＩｂである；そしてＩＩＩはＰＥドメインＩＩＩである。
（Ｂ）ＬＭＢ−２突然変異体のコネクター中のシステイン残基に対する部位特異的ＰＥＧ化。ｃｙｓｌ−ＬＭＢ−２は、ＬＭＢ−２突然変異体のコネクター中の遊離チオール基とＰＥＧ鎖の一端のマレイミドとの間のチオエーテル結合の形成を介してＰＥＧと部位特異的に接合される。
【図２】
ＬＭＢ−２分子の特性。
（Ａ）ＰＥＧ化ＬＭＢ−２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。レーンＭは分子量標準を示し、上から下に、分子量１１１，０００、７３，０００、４７，５００、３３，９００、２８，８００および２０，５００である；レーン１、２、３および４は、それぞれＬＭＢ−２；ｃｙｓｌ−ＬＭＢ−２；ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２；およびＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２に対応する。
（Ｂ）ＡＴａｃ４細胞に及ぼす種々の形態のＬＭＢ−２のｉｎ ｖｉｔｒｏ特異的細胞毒性。種々のＬＭＢ−２をＤＰＢＳ中の０．２％ＢＳＡで希釈した。ＬＭＢ−２（○）、ｃｙｓｌ−ＬＭＢ−２（●）、ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２（□）およびＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２（黒四角）の付加、ならびに３７℃で２４時間のそれらのインキュベーションの２４時間前に、ＡＴａｃ−４細胞を９６ウエルプレート中に２．０ ｘ １０４細胞／ウエルで植えつけた。次に３Ｈ−ロイシンの取込みの抑制を測定することにより、細胞を検定した。
【図３】
マウス血清中のＰＥＧ化ＬＭＢ−２ｓの安定性。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスからのマウス血清中での３７℃で１０μｇ／ｍｌでのインキュベーション（４０μｇ／ｍｌ免疫毒素５０ μｌ＋マウス血清１５０μｌ）により、ＬＭＢ−２（○）、ｃｙｓｌ−ＬＭＢ−２（●）、ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２（□）、ＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２（黒四角）の安定性を確定した。異なるインキュベーション時間後に残存する活性免疫毒素の量を、細胞毒性検定により確定した。
【図４】
ＡＴａｃ−４固形腫瘍に及ぼすＰＥＧ化ＬＭＢ−２の抗腫瘍作用。ＡＴａｃ−４細胞（２ ｘ １０６）をヌードマウスに０日目に皮下接種した。４日目に開始して、マウスを４、６、８日目に免疫毒素の静脈内注射で処置した。５匹のマウスの群を各用量レベルで各用量ＱＯＤｘ３に関して処置した。（Ａ）ＬＭＢ−２、（Ｂ）ｃｙｓｌ−ＬＭＢ−２、（Ｃ）ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２、（Ｄ）ＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２。以下の記号を用いた：○、希釈物；□、０．１００ ｍｇ／ｋｇ；黒四角、０．０５０ ｍｇ／ｋｇ；△、０．０２５；黒三角、０．０１３ ｍｇ／ｋｇ；◆、０．００６ ｍｇ／ｋｇ；●、ＰＥＧ５Ｋ０．５ ｍｇ／ｋｇ；◇、ＰＥＧ２０Ｋ０．５ ｍｇ／ｋｇ。
【図５】
マウスにおけるＰＥＧ化の薬物動態。正常雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２μｇのＬＭＢ−２（○）、ｃｙｓｌ−ＬＭＢ−２（●）、ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２（□）、ＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２（黒四角）を静脈内注射した。血液試料を異なる時点で採取した。希釈血清試料をＡｔａｃ−４細胞とともにインキュベートし、タンパク質合成を抑制する血清試料の能力を測定するバイオマスにより、免疫毒素のレベルを測定した。各免疫毒素に関して、標準曲線を作成した。４匹のマウスの群を用いた。値は平均±ＳＤである。
【図６】
ＰＥＧ化ＬＭＢ−２に対するマウスにおけるＩｇＧ応答。５匹の群におけるマウスに、０．２％マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を含有するＰＢＳ中の４μｇ／マウスまたは４０μｇ／マウスの用量でＬＭＢ−２（○）、ｃｙｓｌ−ＬＭＢ−２（●）、ＰＥＧ５Ｋ−ＬＭＢ−２（□）およびＰＥＧ２０Ｋ−ＬＭＢ−２（黒四角）を腹腔内注射した。一次免疫感作後２週間目に、適切な抗原を用いてマウスをもう一度免疫感作した。２１日目に、ＥＬＩＳＡにより特異的ＩｇＧレベルを確定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503512.tif 000071
2004503512.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】平成13年12月28日(2001.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
本発明の好ましい実施態様では、毒素はシュードモナス外毒素（ＰＥ）である。「シュードモナス外毒素」という用語は、本明細書中で用いる場合、全長ネイティブ（天然）ＰＥを、あるいは修飾されたＰＥを指す。このような修飾としては、ドメインＩａの排除、ドメインＩｂ、ＩＩおよびＩＩＩ中の種々のアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換、ならびにＫＤＥＬ（配列番号１７）およびＲＥＤＬ（配列番号１６）のようなカルボキシル末端での１つまたはそれ以上の配列の付加が挙げられるが、これらに限定されない（例えばＳｉｅｇａｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１４２５６−１４２６１（１９８９）参照）。好ましい実施態様では、ＰＥの細胞毒性断片は、ネイティブＰいいの細胞毒性の少なくとも５０％、好ましくは７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは９５％を保有する。特に好ましい実施態様では、細胞毒性断片は、ネイティブＰＥより高毒性である。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
Ｂ．結果
１．ＰＥＧ化ＬＭＢ−２の調製および特性化
ＬＭＢ−２において、抗−Ｔａｃ抗体のＦｖ部分をペプチドコネクター（ＡＳＧＧＰＥ（配列番号１））によりＰＥ３８に連結する。ＣＤ２５＋腫瘍細胞に対するその特異的細胞毒性活性に必要なＬＭＢ−２の抗原結合、転位およびＡＤＰ−リボシル化機能の損失を防止するために、ＦｖをＰＥ３８に連結するペプチド中に１個のシステインを有するＬＭＢ−２の突然変異形態（ＡＳＧＣＧＰＥ（配列番号２））を調製した（図１Ａ）。システインは、遊離チオール化学を用いる部位特異的ＰＥＧ化のために用いた。図２に示したように、ＰＥＧ化ＬＭＢ−２分子は、単一ピークとしてＴＳＫサイズ排除カラムから溶離される場合、ＳＤＳ　ＰＡＧＥ上の単一帯域として走行した。図２および表１は、ＡＴａｃ−４細胞（ＣＤ２５＋細胞株）に対するｃｙｓ１−ＬＭＢ−２の特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性がネイティブＬＭＢ−２と類似したことを示す。予測どおり各ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２分子は１個の遊離チオール基を含有したが、一方、ネイティブＬＭＢ−２は含有しなかった。封入体から調製された高精製ｃｙｓ１−ＬＭＢ−２の収率は〜７．０％であったが、これはネイティブＬＭＢ−２（７．３％）と同様であった。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
【表２】
2004503512.tif 000073
【国際調査報告】
2004503512.tif 000074
2004503512.tif 000075
2004503512.tif 000076