(57)【要約】モノクローナル抗体５Ｄ１２のような、抗ＣＤ４０分子を、ケラチノサイトの免疫学的活性化を阻害するのに十分な量投与することを含む、乾癬又は炎症性皮膚状態の治療方法。抗ＣＤ４０分子は、抗体、ペプチド及び他の分子を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４０に結合するがＣＤ４０−発現ケラチノサイトを活性化しない分子を投与することを含む、ケラチノサイトの免疫学的活性化の阻害方法。
【請求項２】
前記分子は、Ｃ３、ファクターＢ、ＭＣＰ、ＤＡＦ又はＣＤ５９の発現を変化させない請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分子は、配列番号２で表されるエピトープを標的とし、これに結合し又はこれと相互作用する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記分子はＣＤ４０に結合するが、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との結合を妨害しない請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記分子は、モノクローナル抗体又はその断片である請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体は、キメラ、ヒト化、ヒト、Ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ（商標）又は単鎖抗体である請求項５記載の方法。
【請求項７】
抗ＣＤ４０抗体の内発的生産を誘起するペプチド、抗体若しくはその断片、又は抗ＣＤ４０抗体若しくはその断片をコードする遺伝子を投与することを含む、ケラチノサイトの免疫学的活性化の阻害方法。
【請求項８】
ＣＤ４０に結合し又はこれと相互作用する分子を、ケラチノサイトの免疫学的活性化を阻害するのに十分な量投与することを含む、乾癬又は炎症性皮膚状態の治療方法。
【請求項９】
前記分子は、配列番号２で表されるエピトープに結合し又はこれと相互作用する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記分子はＣＤ４０に結合するが、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との結合を妨害しない請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記分子は、モノクローナル抗体又はその断片である請求項８ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体は、キメラ、ヒト化、ヒト、Ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ（商標）又は単鎖抗体である請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年４月９日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第０６／１９８，１７４号に基づく優先権の利益を主張するものであり、該仮出願は、これをこの明細書に組み入れられたものとする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、乾癬及び他の炎症性皮膚状態の治療用ＣＤ４０アンタゴニストに関する。
【０００３】
発明の背景
真皮及び表皮における増大した免疫応答及び／又は異常な抗原提示により特徴付けられる多くの皮膚状態がある。このような炎症過程の進行の生理学的なメカニズムはよくわかっていない。しかしながら、皮膚細胞が、皮膚の炎症応答の発生にとって重要であることがわかった（（Ｋｕｐｐｅｒ， ”Ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ”， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ８６， ｐｐ． １７８３−８９ （１９９０））。
【０００４】
増殖性皮膚疾患は、世界中に蔓延しており、何百万人もの人及び彼らの家畜を苦しめている。ケラチノサイトの過増殖を伴う疾患の一例が乾癬である。これは遺伝的に決定された疾患であり、米国人口の約２％で発生している。乾癬の多くの病理学的特徴は、表皮ケラチノサイトの増殖及び成熟における変化に起因する。過度のスケーリング及び厚くなった表皮は、この病気の臨床的特徴である（Ｇ． Ｄ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｊ． Ｌ． ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ， Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ， ｐ． ３２７−３４２）。この臨床的発現は、表皮細胞の過増殖により引き起こされる。この過増殖はまた、乾癬患者の非乾癬皮膚においても見られる。このことは、乾癬患者の「正常な」皮膚細胞においてもまた遺伝的な欠陥が存在することを示している（同上）。
【０００５】
正常成人表皮集団は、１〜２％のランゲルハンス細胞と約９８％のケラチノサイトを含む。ケラチノサイト及び皮膚中に存在する他の非造血的に誘導された細胞は、免疫ホメオスタシスに寄与し、Ｔ細胞の移動及び接着分子の発現に影響する種々のサイトカインを生産することができる。
【０００６】
通常、免疫系は、例えば寄生的乾癬、ウイルスおよび細菌の感染等の外来性の抗原から生体を防御する。しかしながら、多くの疾患状態及び／又は不全は、免疫応答の異常な又は望ましくない活性化の結果であることがよく知られている。
【０００７】
免疫応答は、一連の複雑な細胞−細胞相互作用を介して調和された過程において、多くの免疫系エフェクター細胞、すなわち、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、好酸球及び好中球の補充と活性化を包含する。Ｂリンパ球（Ｂ細胞）は、抗原に対する生体内における免疫応答の間に重要な役割を果たす。外来タンパク質に対して免疫応答が開始される典型的なシナリオは次の通りである。抗原がＢ細胞の表面に結合し、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の増大された発現を包含する、一連の反応の引き金を引く。タンパク抗原は、内部に取り込まれ、細胞表面に提示されるこれらのクラスＩＩ分子に結合する。これは次にヘルパーＴ細胞抗原認識及び活性化を引き起こす。活性化されたＴ細胞は、細胞表面分子を発現し、それらのうちの１つがＣＤ４０リガンド（「ＣＤ４０Ｌ」）である。ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞の表面上に発現される５０ｋＤＡの１型膜糖タンパクであるＣＤ４０に結合し、Ｂ細胞を成熟させ、可溶性免疫グロブリンの分泌を開始させる。
【０００８】
最近、機能的なＣＤ４０が、マクロファージ、樹状細胞、胸腺上皮細胞、ランゲルハンス細胞及び内皮細胞を包含する、Ｂ細胞以外の種々の細胞型の上で発現されていることが発見された。これらの研究の故に、ＣＤ４０が、Ｔ細胞及びＢ細胞並びの他の細胞型の相互作用を媒介することにより、免疫調節において広範な役割を果たしているということが現在信じられるようになった。この見解を支持するものとして、マクロファージ及び樹状細胞におけるＣＤ４０の刺激が、抗原提示の最中のＴ細胞活性化に必要であることが示された（Ｇｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋ． Ｌｙｍｐｈｏｍａ， ２４， ３９３ （１９９７））。最近の証拠は、組織炎症におけるＣＤ４０の役割も示している。マクロファージによる炎症メディエーターＩＬ−１２及び一酸化窒素の生産が、ＣＤ４０依存性であることが示されている［Ｂｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｎｏｅｌｌｅ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６， ８３ （１９９６）］。内皮細胞において、ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の刺激が、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の表面発現を誘起し、炎症部位への白血球の接着を促進することが見出されている［Ｂｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｎｏｅｌｌｅ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６， ８３ （１９９６）； Ｇｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋ． Ｌｙｍｐｈｏｍａ， ２４， ３９３ （１９９７）］。
【０００９】
増殖、分化、アポトーシスからの救出及びアイソタイプスイッチングを包含するＢ細胞の機能は、ＣＤ４０がＣＤ４０Ｌに結合した時に誘起されることが示されている。ＣＤ４０分子を、この分野で知られている抗ＣＤ４０抗体で架橋することによりＢ細胞の活性化が引き起こされる。Ｊ． Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９） １４７：８は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、Ｂ細胞活性化におけるＴヘルパー細胞の効果を真似ることができ、Ｂ細胞の増殖を誘起したことを示した。しかしながら、これらの抗体は、Ｂ細胞を刺激するだけであり、その増殖及び分化を阻害するものではない。
【００１０】
最近、ＣＤ４０に結合し、Ｂ細胞の増殖及び分化を刺激しないが、その代わりＢ細胞応答を阻害する抗体が開発された。米国特許第５，６７７，１６５号及び５，８７４，０８２号を参照のこと。
【００１１】
生体内でのＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用の役割が、抗ＣＤ４０Ｌ処理、ＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌノックアウト動物又はＣＤ４０Ｌ発現についてのトランスジェニック動物を用いた動物モデルにおいて示された。予想通り、この相互作用を妨害することにより、コラーゲン関節炎、狼瘡、腎炎、移植片対宿主疾患、実験的アレルギー性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）及びアレルギー性接触皮膚炎の徴候が軽減され、また、移植片の生存率が増加した。
【００１２】
このように、ＣＤ４０活性を妨害することは、自己免疫、アレルギー性疾患及び、外来性血液産物による治療や遺伝子治療のような免疫原性タンパク質が治療に用いられる状態のような、抗体媒介疾患のために潜在的に利益がある。したがって、ＣＤ４０活性を妨害することは、乾癬及び他の皮膚の炎症状態を包含する、細胞媒介免疫疾患の治療に利益があり得る。
【００１３】
発明の概要
本発明は、ＣＤ４０上の特定のエピトープを標的にし、これに結合し又はこれと相互作用することにより、ケラチノサイトの増殖、活性化及び／又は分化を阻害することによって、乾癬又は他の炎症性皮膚状態の治療のためにケラチノサイトの活性化を阻害する剤及び方法に関する。該剤は、ＣＤ４０Ｌがこのようなエピトープに結合することを妨害しないという、さらなる性質を有していてもよい。
【００１４】
このようなエピトープの一例が、５Ｄ１２と呼ばれる抗体により結合されるＣＤ４０上のエピトープである。このエピトープは、ＣＤ４０抗原配列（配列番号１参照）のアミノ酸残基番号５２〜６３にある。ＣＤ４０抗原のモデルにより、このエピトープは、ＣＤ４０ＬがＣＤ４０に結合する側と反対側に結合することが示されている。ＣＤ４０Ｌの結合に関係するアミノ酸は、ＣＤ４０の７０〜１２０番目のアミノ酸残基の領域に位置する。図１参照。
【００１５】
本発明の分子は、モノクローナル抗体、その断片、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び他の化学物質を包含する。また、抗ＣＤ４０抗体の発現を誘起するペプチド及び遺伝子も包含される。これらの分子は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を中断するために有用であり、乾癬及び他の皮膚の炎症性状態の治療に有用である。
【００１６】
発明の詳細な説明
記載され、ケラチノサイトの活性化を阻害するために用いられる分子は、モノクローナル抗体、その断片、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び他の化学物質を包含する。モノクローナル抗体は、動物を免疫し、次いで目的のモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を単離し、次いでミエローマ細胞と融合させる、従来の方法により作製することができる。好ましいモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ（商標）抗体、単鎖抗体並びにＦａｂ， Ｆ（ａｂ’）２， Ｆｖ及び親抗体の抗原結合機能を維持する他の断片を包含する断片を包含する。単鎖抗体（「ＳｃＦｖ」）及びその構築方法は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００１７】
キメラ抗体はこの分野において周知の組換え法により生産され、動物の可変領域とヒトの定常領域を有する。ヒト化抗体は、キメラ抗体よりもさらにヒト抗体に近い配列を有する。ヒト化抗体では、抗原結合及び特異性を担う、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のみが非ヒトから誘導され、非ヒト抗体に対応するアミノ酸配列を有し、分子の実質的に他の全ての部分（ある場合には、可変領域内のフレームワーク領域内の小さな部分を除く）はヒトから誘導され、ヒト抗体に対応するアミノ酸配列を有する。Ｌ． Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ；３３２：３２３−３２７ １９８８；米国特許第５，２２５，５３９；米国特許第５，５８５，０８９； ５，６９３，７６１； ５，６９３，７６２参照。
【００１８】
ヒト化抗体は、数種類の異なる方法により作製することができる。このような方法は、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ．， カリフォルニア州ラ・ジョラ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．，英国、ロンドン）を用いてヒト抗体の断片（ＶＨ， ＶＬ， Ｆｖ， Ｆｄ， Ｆａｂ又は（Ｆａｂ’）２）を生産する方法、及びキメラ抗体を生産するのと同様な技術を用い、これらの断片の適当な部分を融合して全ヒト抗体を生産する方法を包含する。ヒト抗体もまた、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウス中で生産することができる。このようなマウスは、カリフォルニア州フレモントのＡｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．及びニュージャージー州アナンデールのＭｅｄａｒｅｘ， Ｉｎｃ．から入手できる。Ｈ鎖及びＬ鎖のＦｖ領域を結合することに加え、Ｆａｂは同様な方法により構築し発現することができる（Ｍ．Ｊ． Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， １８４： １２３−１３８ １９９５）。
【００１９】
Ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ（商標）抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０１４７３に記載されているように、潜在的なＴ細胞エピトープが除去されているものである。従って、これを生体に投与した場合に、ヒトにおける免疫原性が排除又は実質的に減少されている。
【００２０】
上記した全体的及び部分的ヒト化抗体並びにその断片及び単鎖抗体は、全体的にマウス又は非ヒト由来抗体よりも免疫原性が低い。従って、これらの分子（又はそれらの誘導体）の全ては、免疫応答又はアレルギー応答をより引き起こしにくい。従って、それらは全体的に非ヒト抗体よりもヒトの生体に対する投与に適している。とりわけ、乾癬や他の炎症性皮膚症状の治療にとって必要な、反復的又は長期に亘る投与が必要な場合には、特にそうである。
【００２１】
非抗体分子は、常法により化合物ライブラリーから単離又はスクリーニングすることができる。化合物ライブラリーを生成しスクリーニングするための自動化装置が米国特許第５，９０１，０６９号及び５，４６３，５６４号に記載されている。より焦点を合わせた方法として、結合部位の三次元的モデリング及び次いでこのモデルに適合する一群の分子を作製する方法が挙げられる。次に最適な結合特性を有する分子をこれらからスクリーニングする。
【００２２】
他の方法は、組換えペプチドライブラリーを生成し、次いで、目的のＣＤ４０のエピトープに結合するものをスクリーニングすることである。例えば、米国特許第５，７２３，３２２号を参照。このエピトープは、下記実施例に記載するモノクローナル抗体により結合されるものと同じである。分子は、実際、一旦エピトープが知られれば、この分野において周知の技術により比較的容易に生成又は単離することができる。
【００２３】
他の方法は、所望の抗−ＣＤ４０抗体の内発的な生産を誘起するペプチド若しくは抗体を投与することにより、又は適当な抗−ＣＤ４０分子又はその断片をコードする遺伝子を投与し、細胞内に取り込ませ、発現させる遺伝子治療により、所望の抗−ＣＤ４０抗体の内発的な生産を誘起することである。これらの分子のいずれの製造方法及び投与方法もこの分野において周知である。
【００２４】
分子は、乾癬若しくは他の炎症性皮膚状態の予防又は治療に有効な濃度で、多数の経路のいずれによっても投与することができる。この目的のために、抗体は、この分野において知られている、種々の許容される賦形剤を用いて製剤することができる。この投与を達成する方法は、当業者によって知られている。局所的又は経口的に投与することができる組成物や、粘膜を介して移動できる組成物を得ることもできる。
【００２５】
患者に投与する前に、製剤成分を抗体に加えることができる。液状製剤が好ましい。例えば、これらの製剤成分は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤及び増量剤を包含する。好ましい炭水化物は、モノ−、ジ−、及び多糖類のような糖及び糖アルコール、並びに水溶性グルカンを包含する。糖類又はグルカンは、フラクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、シュクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファ及びベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びカルボキシメチルセルロース並びにこれらの混合物を包含する。シュクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、−ＯＨ基を有する炭素数４〜８の炭化水素と定義され、ガラクチトール、イノシトール、マニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール及びアラビトールを包含する。マニトールが最も好ましい。上記したこれらの糖又は糖アルコールは、単独で又は組み合わせて用いることができる。アミノ酸は、カルニチン、アルギニン及びベタインの左旋型（Ｌ）を包含する。もっとも、他のアミノ酸を添加することもできる。ポリマーは、平均分子量２０００〜３０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及び平均分子量３０００〜５０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。溶液のｐＨの変化を最小化するために、凍結乾燥前又は再構成後に緩衝剤を用いることが好ましい。ほとんどの生理的緩衝液を用いることができるが、クエン酸、リン酸、コハク酸及びグルタミン酸緩衝剤並びにこれらの混合物が好ましい。最も好ましいものはクエン酸緩衝剤である。好ましくは、その濃度は０．０１〜０．３Ｍである。製剤に添加することができる界面活性剤は、欧州特許２７０，７９９及び２６８，１１０に記載されている。
【００２６】
さらに、抗体は、例えば、循環半減期を長くするために、共有結合によりポリマーに結合することにより化学的に修飾することもできる。好ましいポリマー及びそれらをペプチドに結合させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６， ４，１７９，３３７， ４，４９５，２８５及び４，６０９，５４６に記載されており、これらの全体は、この明細書に組み入れられたものとする。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水に可溶であり、好ましい分子量は１０００〜４００００、さらに好ましくは２０００〜２００００、最も好ましくは３０００〜１２０００である。
【００２７】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた有用であり得る。これらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）を包含する。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール主鎖は、例えば動物及びヒトにおけるモノ−、ジ−、トリクリセライドのような天然の主鎖と同じであるからである。したがって、この分岐は、生体内において、必ずしも異物とは見られないであろう。ＰＯＧの好ましい分子量は、ＰＥＧの場合と同様である。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１５０６４−１５０７０に記載されており、ＰＯＧ／ＩＬ−２結合体の議論は、米国特許第４，７６６，１０６に記載されており、これらは両者ともこの明細書に組み入れられたものとする。
【００２８】
本発明の分子の作用の期間を制御するために、さらなる薬剤的賦形剤を用いることができる。それらは、コロイダルドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェラー、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおける、コアセルベーション技術又は界面重合により調整されるマイクロカプセル中に捕捉することができる。リポソームデリバリーシステムの作製方法は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９８２） ４２：４７３４； Ｃａｆｉｓｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ （１９８１） ６４９：１２９； 及びＳｚｏｋａ， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｅｎｇ （１９８０） ９：４６７に論じられている。他のドラッグデリバリーシステムは、この分野において知られており、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ （Ｒ． Ｌ． Ｊｕｌｉａｎｏ， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎ．Ｙ． １９８０）， ｐｐ． ２５３−３１５； Ｍ． Ｌ． Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｖｓ （１９８４） ３６：２７７に記載されている。
【００２９】
液体医薬組成物を調製した後、分解を防止し、無菌状態を維持するために、組成物を凍結乾燥してもよい。液体組成物を凍結乾燥する方法は当業者に公知である。使用直前に、組成物を無菌の希釈液（例えば、リンゲル液、蒸留水、滅菌食塩水）で再構成することができる。再構成してから、組成物を投与することができる。
【００３０】
好ましい投与経路は非経口である。非経口投与において、本発明の組成物は、医薬として許容できる非経口賦形剤と共に、溶液、懸濁液又は乳濁液のような、注射可能な形態で、単位投与量に製剤されるであろう。このような賦形剤は、本来的に無毒で非治療的である。このような賦形剤の例として、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及びハンクス液を挙げることができる。固定油及びオレイン酸エチルのような非水生賦形剤もまた用いることができる。好ましい賦形剤は、食塩水中の５％デキストロースである。賦形剤は、緩衝剤及び殺菌剤を包含する、等張性及び化学的安定性を高める物質のような、少量の添加剤を含んでいてもよい。本発明の非ペプチド分子は、懸濁液及び錠剤等を包含する形態で、経口投与することができる。液状製剤は、凍結乾燥又はエアロゾル化したマイクロカプセルの吸入により投与することができる。座薬もまた用いることができる。
【００３１】
投与量及び投与の形態は、個々に応じて異なる。一般的に、組成物は、抗体の投与量が１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜７ ｍｇ／ｋｇとなる投与量で投与される。投与量は、臨床的なルーチンな実験により決定することができる。実験の出発点は、抗体が有効であった動物モデルからの外挿により最適投与量を決定することである。抗体を瞬時投与し、投与４〜６時間後に循環濃度が１０〜２０倍になるように投与することができる。瞬時投与後、継続的に輸液を行ってもよい。
【００３２】
このような投与量範囲試験は、Ｂリンパ球、単球若しくは樹状細胞の減少、又は遊離の免疫グロブリンの現象及び疾患徴候に対する効果を包含する、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路に関連する種々のインジケーターを監視することもできる。有害作用及び副作用もまた監視されるであろう。
【００３３】
本発明の分子の生体内での効果は、ケラチノサイトを包含する、ＣＤ４０担持細胞の増殖又は分化を引き起こさない、ある抗ＣＤ４０抗体の公知の効果から外挿することができる。５Ｄ１２と呼ばれる抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の、ケラチノサイト活性化に対する効果は、以下に記載する通り研究されている。
【００３４】
１．　５Ｄ１２結合エピトープ及びＣＤ４０Ｌ結合エピトープの位置
ＣＤ４０の細胞外ドメインのアミノ酸配列に対応する、重複する合成ペプチドのパネルと５Ｄ１２との反応性を試験した。モノクローナル抗体５Ｄ１２は、ウェスタンブロットで試験した場合にはＣＤ４０と弱くしか結合しないので、５Ｄ１２がＥＬＩＳＡにおいて変性ＣＤ４０にまだ結合するかどうかを見るために、いくつかの対照実験を行った。ＣＤ４０−Ｉｇを、３７℃一夜又はＰＢＳ中４℃一夜乾燥させることによりＥＬＩＳＡプレート上にコートした。それぞれの場合、ＣＤ４０−Ｉｇは、１０分間煮沸することにより及び／又は１ｍＭ　ＤＴＴで処理することにより前処理した。
【００３５】
これらのパイロット実験により、コーティングの前に該抗原を煮沸することによっては、モノクローナル抗体５Ｄ１２の結合は有意に減少しないことが示された。しかしながら、ＣＤ４０−Ｉｇ中の全てのジスルフィド結合を還元することにより、モノクローナル抗体５Ｄ１２の結合は大きく減少した。これらの条件下でも弱いシグナルが残っていたので、ペプスカン（Ｐｅｐｓｃａｎ）分析を行うことに決定した。これにより、モノクローナル抗体５Ｄ１２は、ＣＤ４０の細胞外部分の１つの特定の１２−ｍｅｒのペプチド（配列番号２参照）と強く反応することが示された。このペプチドは、成熟タンパク質のアミノ酸３２〜４３に対応する。ＣＤ４０配列のこの位置において、ＣＤ４０は、非ヒト霊長類種と高い（９０％）相同性を有する。対照的に、５Ｄ１２が結合しない、マウス及びウシＣＤ４０との相同性は、それぞれ僅か４２％及び５８％であった。興味深いことに、このペプチドは、ＣＤ４０上のＣＤ４０Ｌ結合部位から遠く離れている。ＣＤ４０Ｌとの結合に関与するＣＤ４０中のアミノ酸は、成熟タンパク質のアミノ酸７０〜１２０の領域内に位置する。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用は、ＣＤ４０上の残基の少なくとも２個の塊上に集中しているように思われ、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０接触は、２個のＣＤ４０Ｌモノマーと１個のＣＤ４０鎖の界面に沿って起きることが予言される（Ｂａｊｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：９８８４ （１９９５））。図１は、ＣＤ４０の細胞外ドメインのモデル上の推定５Ｄ１２結合エピトープの位置を示す（Ｂａｊｏｒａｔｈ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２７：５９ （（１９９７））。このモデルでは、アミノ酸３２〜４３を太くして目立たせ、ＣＤ４０Ｌとの結合に関与されると推定される多くの残基を点線で示す。このモデルは、推定ＣＤ４０結合エピトープが、ＣＤ４０分子の「外側」上に位置することを示している。ここで、「外側」は、３個のＣＤ４０モノマーが１個のＣＤ４０Ｌトリマーの周りに結合するという過程に基づいた場合の外側である。
【００３６】
２．　ＣＤ４０Ｌは、５Ｄ１２とは異なるＣＤ４０上の位置に結合する；５Ｄ１２はＣＤ４０Ｌシグナリングに影響するように思われる
予備的な２色ＦＡＣＳ分析により、５Ｄ１２及びＦＩＴＣ−標識可溶性ＣＤ４０Ｌトリマー（ＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣ）は、ＣＤ４０発現細胞に同時に結合できることが示された。５Ｄ１２が、ＣＤ４０Ｌとは異なるエピトープに結合するという仮説を試験するために更なる実験を行った。ＪＹ　Ｂ細胞を、ＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣと共に又はＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣなしで前インキュベートした場合、飽和量の５Ｄ１２で得られた染色強度に差はなかった。反対実験により、飽和量の５Ｄ１２は、その後のＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣの結合に影響しなかった（図２）。対照的に、ＪＹ　Ｂ細胞を、他の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（それらのうちの１つはＧ２８．５と呼ばれる）と共に前インキュベートした場合には、その後のＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣの結合が妨害された（図３）。
【００３７】
染色したＪＹ　Ｂ細胞からの５Ｄ１２及びＣＤ４０Ｌの消失を時間をかけて調べた。ＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣで標識したＪＹ　Ｂ細胞を洗浄し、次いで３７℃で培養すると、蛍光シグナルは時間と共に減少した。細胞表面からのＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣの放出速度は、５Ｄ１２の存在下でＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣ付加細胞を培養した場合の放出速度とほぼ同じであった。さらに、反対実験において、ＪＹ　Ｂ細胞上のＣＤ４０の濃度は、５Ｄ１２と共に培養した場合にも有意に影響されるようには見えなかったし、また、細胞にＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣを予め結合させても、５Ｄ１２を用いて検出したＣＤ４０の濃度に影響しなかった。
【００３８】
要するに、これらの実験は、生体外で、５Ｄ１２は、（ｉ）ＣＤ４０への結合についてＣＤ４０Ｌと競合しない、（ｉｉ）ＣＤ４０に結合したＣＤ４０Ｌの放出を引き起こさない、（ｉｉｉ）細胞表面からのＣＤ４０の修飾を引き起こさないことを明確に示している。以前の結果は、ＣＤ４０上の５Ｄ１２の阻害効果が、ＣＤ４０Ｌの刺激効果を上回ることを示している。５Ｄ１２は、ＣＤ４０Ｌが既にＣＤ４０に結合している場合に、ＣＤ４０を介するシグナリングが妨害されるというようにＣＤ４０を修飾しているのかもしれない。
【００３９】
３．　５Ｄ１２は、ＣＤ４０Ｌ媒介活性化を阻害する
ＴＨＰ−１アッセイにおいて、ＮＦ Ｂを介したシグナルにより多数の異なる刺激により誘起されるＩＬ−８の生産に対するマウス５Ｄ１２の効果を試験した。モノクローナル抗体５Ｄ１２がＣＤ４０Ｌ媒介ＩＬ−８生産を完全に阻害する濃度において、通常ＩＬ−８の生産を誘起する、ＬＰＳ， ＴＮＦ−アルファ、ＰＭＡ又はイオノマイシンで刺激されたＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−８の生産が影響を受けないことが見出された。
【００４０】
４．　抗ＣＤ４０は、ケラチノサイトの活性化を阻害する
ケラチノサイトは、ＣＤ４０発現免疫担当細胞である。いくつかの皮膚の炎症状態では、ケラチノサイトが発現するＣＤ４０の量が増大し、ＣＤ４０Ｌを発現する活性化されたＴ細胞を結合し得ると信じられる。この結合は、いくつかの炎症性メディエーターの放出を誘起し、したがって、いくつかの皮膚の炎症状態に関与し得る。ＩＦＮ−γで前処理した培養ヒトケラチノサイト（ＣＤ４０＋ケラチノサイト）を、ＣＤ４０Ｌトランスフェクト細胞又は可溶性ＣＤ４０ＬによりＣＤ４０活性化することで、ケモカインＩＬ−８， ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１並びに補体タンパク質Ｃ３及びファクターＢの生産が高められるか否かを試験するためにＥＬＩＳＡを用いた。ＣＤ４０＋ケラチノサイトのＣＤ４０活性化の、補体調節タンパク質、すなわち、膜コファクタータンパク（「ＭＣＰ」）、減衰加速因子（ｄｅｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（「ＤＡＦ」）及びＣＤ５９、の発現に対する影響もフローサイトメトリーにより試験した。
【００４１】
ＣＤ４０＋ケラチノサイトのＣＤ４０活性化により、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳの放出が大幅にアップレギュレートされ、ＭＣＰ−１の放出が中程度にアップレギュレートされた。Ｃ３及びファクターＢの生産並びにＭＣＰ， ＤＡＦ及びＣＤ５９の発現は変化しなかった。ＣＤ４０Ｌトランスフェクト細胞での結果の特異性は、非トランスフェクト細胞をコントロールとして用い、ＣＤ４０＋ケラチノサイトとトランスフェクト細胞とを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステム中で物理的に互いに接触させ又は接触させずに共培養し、ＣＤ４０活性化を、中和抗ＣＤ４０モノクローナル抗体で阻害して確認した。
【００４２】
これらの実験は、抗ＣＤ４０分子が、ケラチノサイトの活性化を阻害するのに効果的であることを示している。このような分子は、乾癬又は他の炎症性皮膚状態の治療に有効であろう。
【００４３】
ここで用いた用語及び表現は、例示的なもので限定的なものではなく、本発明の範囲は、以下の請求項によってのみ規定され、これらの請求項の主題の全ての均等物を包含することが理解されるべきである。
【００４４】
【配列表】
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【００４５】
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【００４６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＣＤ４０上の、モノクローナル抗体５Ｄ１２の推定結合部位及びＣＤ４０Ｌ結合部位を模式的に示す。
【図２】
飽和量の抗体５Ｄ１２が、ＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣの結合に影響しないことを示すＦＡＣＳグラフである。
【図３】
Ｂ細胞を５Ｄ１２以外の抗ＣＤ４０抗体と前インキュベートすることにより、ＣＤ４０Ｌ−ＦＩＴＣの結合が阻害され得ることを示すＦＡＣＳグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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