(57)【要約】本発明は、フィブリン、特にフィブリノーゲンと比べた場合のフィブリンの検出、単離または位置決定が有利である場合に、様々な用途を有するフィブリンに対する結合部分を提供する。特に開示するのは、フィブリンに結合可能で、血栓で見とめられる重合フィブリンの形態を認識可能な合成単離ポリペプチドである。さらに、このポリペプチドは、フィブリンよりも遅い解離速度を有し、これは、フィブリン血餅部位におけるコントラスト画像を形成する能力を改善する。そのため開示する結合部分を特に血栓の造影剤として有用である。
2004523514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ（配列番号２）を含み、ここで、
Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ４は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ６は、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり；
Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ８は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒである、
フィブリンに結合する能力を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｔｒｐ−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ（配列番号４２）を含み、ここで、
Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒ；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ４は、ＧｌｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ８は、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒである、
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下のアミノ酸位置が、以下：アミノ酸残基Ｘ２はＰｒｏ、アミノ酸残基Ｘ３はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔもしくはＴｒｐ、アミノ酸残基Ｘ４はＧｌｕ、アミノ酸残基Ｘ５はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏもしくはＳｅｒ、アミノ酸残基Ｘ６はＴｒｐ、アミノ酸残基Ｘ７はＬｅｕもしくはＴｈｒ、アミノ酸残基Ｘ８はＰｈｅ、のように独立的に選択されるか、またはこのような選択の組合せである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
以下のアミノ酸配列：
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ（配列番号２１）、
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（配列番号２２）、
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号２３）、
Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号２４）、
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号２５）、
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号４３）；
Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ（配列番号４４）；
Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（配列番号４５）；
Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号４６）；
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号４７）；
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（配列番号４８）；
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号４９）；
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５０）；
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（配列番号５１）；
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５２）；
Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（配列番号５３）；
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５４）；
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５５）；および
Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（配列番号５６）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１のポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（配列番号２６）を含む、フィブリン結合ポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５（配列番号１）を含み、ここで、
Ｘ１は、Ｃｙｓ、ＰｒｏまたはＴｒｐであり；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌであるか、またはＸ４およびＸ１２がＣｙｓでない場合には、Ｘ２はＣｙｓであり得る；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＰｒｏまたはＴｈｒであり；
Ｘ４は、Ｃｙｓ、またはＸ１２と共有結合により架橋を形成できる他のアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ７は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ８は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ９は、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり；
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１１は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１２は、Ｃｙｓ、またはＸ４と共有結合により架橋を形成できる別のアミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１４は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＨｉｓであり；
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＨｉｓである、
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｔｒｐ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５（配列番号４１）を含み、ここで、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌであるか、またはＸ４およびＸ１２がＣｙｓでない場合には、Ｘ２はＣｙｓであり得る；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、またはＰｒｏであり；
Ｘ４は、Ｃｙｓ、またはＸ１２と共有結合により架橋を形成できる他のアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｘ７は、ＧｌｕまたはＳｅｒであり；
Ｘ８は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり；
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり；
Ｘ１１は、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１２は、Ｃｙｓ、またはＸ４と共有結合により架橋を形成できる別のアミノ酸であり；
Ｘ１３は、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；
Ｘ１４は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓであり；
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓである、
請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
以下のアミノ酸位置が、以下：アミノ酸残基Ｘ２はＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＬｙｓもしくはＭｅｔ；アミノ酸残基Ｘ３はＡｌａ、Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＰｒｏ；アミノ酸残基Ｘ４はＣｙｓ；アミノ酸残基Ｘ５はＰｒｏ；アミノ酸残基Ｘ６はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔもしくはＴｒｐ；アミノ酸残基Ｘ７はＧｌｕ；アミノ酸残基Ｘ８はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏもしくはＳｅｒ；アミノ酸残基Ｘ１０はＬｅｕもしくはＴｈｒ；アミノ酸残基Ｘ１１はＰｈｅ；アミノ酸残基Ｘ１２はＣｙｓ；アミノ酸残基Ｘ１３はＴｒｐ；アミノ酸残基Ｘ１４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｈｅもしくはＳｅｒ；アミノ酸残基Ｘ１５はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｒｏもしくはＳｅｒ、のように独立的に選択されるか、またはこのような選択の組合せである、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
以下のアミノ酸位置が、以下：アミノ酸残基Ｘ５はＰｒｏ、アミノ酸残基Ｘ７はＧｌｕ、アミノ酸残基Ｘ１０はＬｅｕ、アミノ酸残基Ｘ１１はＰｈｅ、アミノ酸残基Ｘ１３はＴｒｐ、のように独立的に選択されるか、またはこのような選択の組合せである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
以下のアミノ酸配列：
Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（配列番号３）、
Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ（配列番号４）、
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号５）、
Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号６）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７）、
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（配列番号２７）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号２９）；
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３０）；
Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号３１）；
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号３２）；
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３３）；
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３４）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３５）；
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３６）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３７）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号３８）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号３９）；および
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４０）、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド
【請求項１１】
アミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（配列番号８）を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
哺乳動物被検体においてフィブリンを検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを検出可能に標識化するステップ、
（ｂ）被検体に該標識化ポリペプチドを投与するステップ、および、その後
（ｃ）該被検体中の該標識化ポリペプチドを検出するステップ、
を含む、上記方法
【請求項１３】
標識が、蛍光性、音響発生性、放射性、または常磁性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標識が、１１１Ｉｎまたは９９ｍＴｃである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
検出ステップが、深静脈血栓症、肺塞栓症、心臓性血栓症、アテローム硬化症、または発作を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
血栓形成が関与する疾患を治療する方法であって、そのような疾患の治療を必要とする哺乳動物被検体に、該血栓形成が関与する疾患を治療するのに有効な医薬とコンジュゲートされた請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、上記方法。
【請求項１７】
疾患が、深静脈血栓症、肺塞栓症、心臓性血栓症、アテローム硬化症、心筋梗塞、再灌流虚血、または発作である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
医薬が、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼから選択される血栓溶解剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の外因性フィブリン結合ポリペプチドを表面上で発現する組換え宿主細胞またはバクテリオファージ。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドに連結した少なくとも１つの常磁性金属原子を含む、磁気共鳴造影造影剤。
【請求項２１】
ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＥＤＴＡ、ＴＥＴＡ、ＥＨＰＧ、ＨＢＥＤ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＭＡ、ＴＥＴＭＡ、ＰＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＬＩＣＡＭおよびＭＥＣＡＭからなる群より選択される少なくとも１つのキレート化剤をさらに含む、請求項２０に記載の磁気共鳴造影造影剤。
【請求項２２】
キレート化剤が、ジエチレントリアミンもしくはテトラアザシクロドデカン、またはそれらのカルボキシメチル置換型誘導体を含む、請求項２１に記載の磁気共鳴造影造影剤。
【請求項２３】
常磁性金属元素が、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｇｄ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｐｒ３＋、Ｃｒ３＋、Ｃｏ３＋、Ｆｅ３＋、Ｔｉ３＋、Ｔｂ３＋、Ｎｄ３＋、Ｓｍ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｐａ４＋およびＥｕ２＋からなる群より選択される、請求項２１に記載の磁気共鳴造影造影剤。
【請求項２４】
常磁性金属元素が、Ｇｄ３＋である、請求項２３に記載の磁気共鳴造影造影剤。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフィブリン結合ポリペプチドを利用して、フィブリン標的と複合体を形成するステップ；該複合体を１つ以上の潜在的フィブリン結合化合物と接触させるステップ；および該１つ以上の潜在的フィブリン結合化合物が、該フィブリン標的と複合体を形成するのに、該フィブリン結合ポリペプチドと競合するか否かを決定するステップを含む、フィブリン結合化合物の同定方法。
【請求項２６】
潜在的フィブリン結合化合物を含有する溶液をフィブリン標的と接触させて該化合物と該フィブリン標的との複合体を形成するステップ；該複合体を請求項１〜１１のいずれか１項に記載のフィブリン結合ポリペプチドと接触させるステップ；および該フィブリン結合ポリペプチドが、該フィブリン標的と複合体を形成するのに、該潜在的フィブリン結合化合物と競合するか否かを決定するステップを含む、フィブリン結合化合物の同定方法。
【請求項２７】
検出可能な標識に連結されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、診断用造影剤。
【請求項２８】
ポリペプチドが放射性標識されている、請求項２７に記載の造影剤。
【請求項２９】
ポリペプチドが９９ｍＴｃで標識されている、請求項２７に記載の造影剤。
【請求項３０】
ポリペプチドがフルオレセイン標識されている、請求項２７に記載の造影剤。
【請求項３１】
ポリペプチドが、超音波画像法に適した音響発生標識に連結されている、請求項２７に記載の造影剤。
【請求項３２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む造影剤の医薬製剤を、哺乳動物被検体に投与するステップ、ならびに、磁気共鳴画像法、超音波画像法、光学画像法、音ルミネセンス画像法、光音響画像法および核画像法からなる群より選択するステップにより該造影剤を画像化するステップを含む、医療画像化方法。
【請求項３３】
投与ステップが、吸入、経皮吸収、筋内注射、皮下注射、静脈内注射、および動脈内注射からなる群より選択される、請求項３２に記載の医療画像化方法。
【請求項３４】
医薬製剤が、キット、シリンジ、バイアル、瓶、可塑性容器、パケットまたは吸入器からなる群より選択される容器にパッケージングされている、請求項３２に記載の医療画像化方法。
【請求項３５】
フィブリンまたはフィブリン様ポリペプチドを含有する溶液からフィブリンまたはフィブリン様ポリペプチドを精製する方法であって、該溶液を、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドと接触させ、次いで該ポリペプチドを該溶液から分離させることを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理的血管内血栓症の検出および治療のためのフィブリン結合ポリペプチドおよび組成物に関する。特に、本発明は、血栓を検出、画像化および位置決定するのに有用な物質および方法に関する。本発明は、フィブリンと循環フィブリノーゲンとを区別可能で、フィブリンからの比較的低い解離速度を示す結合部分を提供する。このような遅く解離する結合部分は、血栓部位における結合部分の滞在時間を長くし、循環から素早くクリアされる非結合部分と比べてシグナルが高く、従って、フィブリン血栓の検出画像の精度および鮮明度を改善する。このような結合部分は、磁気共鳴画像法、放射線画像法、および他の画像法による、フィブリン含有血餅の検出、画像化および位置決定のために有用であり、またフィブリンが役割を果たす冠状動脈症状の診断および治療においても有用である。
【背景技術】
【０００２】
血栓関連疾患は、血餅の存在により発達する血管症状である。このような疾患は、主要な死因であり、従って、血栓特異的診断、治療、および検出方法論、ならびに試薬を開発することは、臨床上大変重要である。肺塞栓症（ＰＥ）、深静脈血栓症、発作、およびアテローム硬化症は、血栓関連疾患の例である。
【０００３】
深静脈血栓症は、脚および鼡径部の深血管（deep blood vessel）において血餅が形成される症状である。これらの血餅は、脚から心臓へ戻る血液の流れをブロックし得る。時々、血餅の一部が脱離し、血流に乗り、心臓を通り血管まで運ばれて、血管組織への血液の流れをつかえさせたり、少なくしたり、またはブロックする。これを、塞栓症と呼ぶ。肺における血管中のこのような血餅のつかえは、肺塞栓症、すなわちＰＥである。ＰＥは、息切れ、胸痛、さらには死をもたらし得る。
【０００４】
米国だけでも、毎年推定６００，０００人の患者が肺塞栓症を患っている。これらの患者のうちの約３７８，０００人において、ＰＥが検出されず、これらの患者のうち約１１４，０００人がその後この疾患に関連した合併症により死亡する。この高い死亡率は、一部には、多くの場合に臨床的症状が無いこと、および現在利用可能な調査および検出方法に有意な限界があることが原因である。
【０００５】
従って、様々な発達段階の血栓塞栓症の存在を検出するための感度が高くかつ有効なアッセイ、初期および後期血栓の有無の診断手法、ならびに血栓に特異的に結合でき、かつ患者における初期および後期血栓の有無を検出するのに有用な非侵襲性の試薬、が必要とされている。
【０００６】
血栓形成
架橋フィブリンは、静脈および動脈の血餅または血栓の両方の基礎となる基幹を形成する（Harkerら, Am. J. Cardiology, 60:20B-28B(1987)）。血栓は、酵素トロンビンが活性化された場合に形成され、血漿フィブリノーゲンの切断によりフィブリノペプチドを放出し、フィブリン重合部位を曝す（Hermansら, Semin. Thromb. Hemost., 8:11-24 (1982)）。
【０００７】
フィブリンおよび血餅形成の生物学は、多くの研究者により近年研究されてきており、血餅形成に至る事象のカスケードが詳細に理解されてきた。凝固には２つの主要な活性化経路がある：すなわち、第ＸＩＩ、第ＩＸおよび第ＶＩＩＩ因子を必要とする内因性経路、および組織因子および第ＶＩ因子が関与する外因性経路である。両方の経路とも、第Ｘ因子（プロトロンビンをトロンビンに変換する原因となる酵素）を活性化する時点で収束する。
【０００８】
外因性経路は、第ＶＩＩ因子とカルシウム依存型複合体を形成する、遍在する細胞リポタンパク質である、組織因子により開始される。複合体形成の際に、第ＶＩＩ因子は第ＶＩＩａ因子に活性化され、これは、第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換する。第Ｘａ因子は、プロトロンビンを、第Ｖａ因子、カルシウムおよびリン脂質と共に、トロンビンに変換する。プロトロンビン変換はまた、内皮表面および活性化血小板でも生じ、第Ｘａ因子、第Ｖａ因子およびプロトロンビン間の複合体の会合を必要とする。この変換は、リン脂質およびカルシウムイオンの存在を必要とする。
【０００９】
内因性または接触凝固経路は血小板により開始される。このカスケードは、第ＸＩＩ因子、高分子量キニノーゲンおよびプレカリクレインの複合体形成から開始する。複合体形成の際に、第ＸＩＩ因子は第ＸＩＩａ因子に切断される。外因性経路におけるような、第ＸＩ、第ＩＸ、第ＶＩＩＩ、第Ｘおよび第Ｖ因子の段階的活性化の後、プロトロンビンがトロンビンに活性化される。トリプシン様セリンプロテアーゼであるトロンビンは、止血および血栓症の中心となる調節因子である。フィブリンはフィブリノーゲンから誘導され、フィブリンの重合は、トロンビンによるフィブリノーゲンの酵素的切断の後に生じる。フィブリノーゲン（３４０ｋＤ）は、３対の同一ペプチド（Ａα、Ｂβおよびγと呼ばれる）からなる。化学構造分析および電子顕微鏡検査により、このタンパク質は三結節（trinodular）構造を有することが実証された。２つのＡαＢβγサブユニットが、逆平行配向に方向付けられている。６本の鎖のアミノ末端部分が共に束にされて中央「Ｅ」ドメインを形成する。２つの二重コイル鎖はＥドメインの両側から外側に向かって２つの末端ノード（すなわち「Ｄ」ドメイン）に延びる。これらの二重コイル領域は１１０アミノ酸の長さで３本の鎖全てで構成されている。Ｄドメインは２つの高親和性Ｃａ２＋結合部位を含み、フィブリン重合においてＥドメインと関与する。広範囲なジスルフィド架橋は、共有結合により２つのサブユニットを架橋し、球状ドメインを安定化させる。Ａα鎖のＣ末端部分は、Ｄドメインを超えてフレキシブルな伸長部分を形成する。Ｄドメインは、第ＸＩＩＩａ因子架橋部位を含み、フィブリン溶解の間の血漿消化の主要部位である。
【００１０】
フィブリノーゲンからのフィブリン形成は、トロンビンによるフィブリノペプチドの除去により生じる、自発的な自己会合プロセスである。Ａα鎖中のＡｒｇ１６−Ａｒｇ１７結合およびＢβ鎖上のＡｒｇ１４−Ｇｌｙ１５結合におけるトロンビン切断は、フィブリノペプチドＡおよびＢを放出し、α鎖のＮ末端から主に構成されるＥドメインにおいて重合部位を曝す。配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌを有するこのＮ末端は、２本の隣接するフィブリノーゲン鎖上の相補的な重合部位に結合する。Ｄドメインに仲介されるこれらのフィブリノーゲン分子の端部間会合は、第３のフィブリノーゲン分子上に位置する、Ｅドメイン重合部位の結合部位を作る。このＤＤ（Ｅ）三次複合体は、形成されるフィブリンゲルを安定化させる核を形成する。出発重合生成物は線状の二本鎖プロトフィブリルである。これらのプロトフィブリルの横の結合により、太い繊維の枝分かれした三次元マトリックスが生じる。横の会合は複雑であるが、おそらくＢ重合部位（βのＮ末端）、およびＤドメイン相互作用を介して形成される三分子複合体が関与すると思われる。
【００１１】
フィブリル内の隣接するフィブリン単量体は、第ＸＩＩＩａ因子（トロンビンおよびフィブリンによりそれ自体が活性化される血漿トランスグルタミナーゼ）により共有結合で架橋される。これらの架橋により、フィブリンネットワークに機械的な安定性が加わり、血餅分解に対する耐性を増す。第ＸＩＩＩａ因子はまた、特化した（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）タンパク質（プラスミンインヒビターα２抗プラスミンおよび接着性タンパク質フィブロネクチンが挙げられる）をフィブリンに架橋させることにより、血餅安定性を増強する。
【００１２】
血栓画像化
血栓特異的造影剤についての調査は、放射性標識フィブリノーゲンが初めて評価された３０年前に始まった（Kakkarら, Lancet, 1:540-542(1970)）。それ以来、多数の血栓造影剤が説明されており、血栓を形成するのに採用される薬剤、および先に形成された血栓の成分に結合する薬剤が挙げられる（Knightら, Radiology, 156:509-514 (1985)；Alaviら, Radiology, 175:79-85 (1990)；Rosebroughら, J. Nuc. Med. 31:1048-1054 (1990)）。血栓を可視化または画像化するのに有用な物質の開発に採用されてきた最近の手法としては、形成する血栓に結合する放射性標識化血小板および抗血小板抗体、抗フィブリン抗体、抗活性化血小板抗体、ならびに活性化または不活化組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）がある（Thakurら, Throm. Res., 9:345-357 (1976)；Palabricaら, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:1036-1040 (1989)）。
【００１３】
血小板親和性ペプチドも、血餅を検出するために使用されてきた。この手法は、血小板に結合可能な小さい９９ｍＴｃ標識化ペプチドを利用する。標識化ペプチドが付着した血小板は、血栓に取り込まれ、血栓を検出可能にする（Bautovichら, J. Nucl. Med., 35:195-202(1994)；Mutoら, Radiology, 189 (suppl):303 (1993)）。
【００１４】
血栓中の血小板は、時間の経過と共に分解するため、血小板親和性ペプチド、抗血小板抗体、および血小板に結合するその他の薬剤または血小板の位置を検出する薬剤は、初期血餅（１２時間未満）の検出にしか有用ではなく、塞栓症、特に肺塞栓症の検出および画像化に使用できない。
【００１５】
フィブリンは、血栓中の主要なタンパク質成分であることから、被検体中の血餅の位置をマークし、大きさを測定することができる薬剤にとって望ましい標的である。しかし、フィブリン標的化は、フィブリンとその循環前駆体であるフィブリノーゲンとの構造が非常に近似しているために複雑である。成功した手法の１つでは、フィブリンに特異的なモノクローナル抗体を単離することを行っている。このようなクラスのモノクローナル抗体の１つは、フィブリン単量体のαおよびβ鎖の新しく曝露されたＮ末端を認識する。別のクラスのモノクローナル抗体は、重合（第ＸＩＩＩ因子、ＤＤ二量体ドメイン、または推定ｔＰＡ結合部位の共有結合架橋等）の結果として曝露されたエピトープを認識する。しかし、抗体を造影剤として使用することは、いくつかの短所を有する。すなわち、高分子量の抗体は、小さい分子に必要とされるよりも、大きな質量の薬剤を血餅に送達させる必要があり、これは、十分なシグナルコントラストを得るために高濃度の造影剤が必須であるために重大な限界となり得る。標識化抗体は、比較的長いｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期のために、クリアランスの問題を示すことが多く、血液と組織バックグラウンドとのコントラストを限定する。さらに、抗体は、調製および製剤化するのに費用がかかることが多く、またそれらを使用することで、望ましくない潜在的に致命的な免疫原応答が生じる得る。
【００１６】
肺塞栓症診断に使用する別の方法は、肺換気／血流スキャンである。肺換気／血流スキャンでは、患者はラジオグラフィーガスを吸引し、換気が可能な肺の領域の画像を記録する。その後、患者に放射性剤を注射し、肺動脈を通る薬剤の動きを追跡する。２つの画像を比較し、肺換気データと血流データとを比較することにより、あらゆる血栓症領域を検出する。米国では、毎年約９３０，０００の肺換気／血流スキャンが行われているが、約６０％が決定的ではない。
【００１７】
肺塞栓症診断の代替的な方法は、Ｘ線血管撮影法である。この方法は、Ｘ線不透明（Ｘ線不透過性）化合物を、患者の大腿静脈に導入した動脈カテーテルを介して、心臓または肺動脈近くに導入することにより行う。Ｘ線カメラにより肺動脈を通る化合物を追跡し、このような追跡により血栓症を検出する。この方法は、臨床家により「最も基準となる検査」であると考えられており、年間に約６０，０００の血管撮影法が行われているが、このテストは、侵襲性であり、費用がかかる。さらに、Ｘ線血管撮影法を受ける２００人の患者のうちの１人が、その過程自体の直接的な結果として死亡する。
【００１８】
最近、フィブリン血餅の位置決定および画像化用の造影剤として、（例えば、常磁性金属または放射性核種で）検出可能に標識化された場合に有用なフィブリン結合ポリペプチドが発見された。参照により本明細書に援用するＰＣＴ／ＵＳ００／２０６１２号を参照のこと。このようなフィブリン結合ポリペプチドは、当該分野において大いに必要とされる進歩であるが、フィブリン基質に対するポリペプチドのアビディティー等の特徴における改善の余地はある。
【００１９】
フィブリンに結合し、低い「オフ速度（off-rate）」を示す（すなわち、フィブリンについて既に特徴付けられた結合部分よりも低い解離速度を有する）ポリペプチドのグループを発見した。このような遅く解離するフィブリン結合ポリペプチドは、フィブリン血餅の部位に集中し、自由に循環している同様のポリペプチドと比べて長い間そこに留まる。つまり、患者に投与した後、フィブリンに結合しない循環ポリペプチドは循環から除去され、患者の器官系に残ったポリペプチドは、主にフィブリンに結合するポリペプチドである。従って、循環する標識化ポリペプチドに起因する妨害バックグラウンドシグナルは除去され、血餅部位における標識化ポリペプチドが残り、血餅の位置決定および画像化のためのより良好な検出可能なシグナルを作る。
【００２０】
新たに発見されたフィブリン結合ポリペプチドは、先に説明されたフィブリン結合部分とは異なるアミノ酸配列を有する。例えば、造影剤またはフィブリン誘導性（fibrin-homing）療法のための融合パートナーとしてのこのようなポリペプチドの調製および使用を、本明細書に詳細に記載する。
【発明の開示】
【００２１】
フィブリン血餅を検出、位置決定、測定および治療するための改善された物質および方法の要望に対する答えとして、驚くべきことに本発明者らは、フィブリンに特異的に結合する非天然型ポリペプチドのグループを発見した。このようなポリペプチドの適切な標識化は、高濃度で血餅に結合する検出可能な造影剤を提供し、優秀な血栓特異的造影剤を提供する。このようなポリペプチドと、血栓溶解剤等の有効な薬剤とのコンジュゲーションまたは融合を使用して、血栓症状を治療できる（例えば、コンジュゲートまたは融合体をフィブリン血餅部位に「誘導（ｈｏｍｅ）」させて、血栓関連疾患の有効な治療を提供する）。本発明のフィブリン結合ポリペプチドを提示する、組換えバクテリオファージもしくは酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または他の原核細胞もしくは真核細胞を提供するが、このようなファージおよび細胞産物は、血栓の有効な検出および診断用の貴重な試薬でもある。
【００２２】
（例えば、アテローム硬化斑上の）血栓塞栓症および血栓形成の検出に加えて、新たに発見されたフィブリン結合剤は、フィブリンが役割を果たす多数の他の病態生理学を検出するためにも有利に使用できる。これらの場合、フィブリン画像化は、診断的または治療的モニタリングの有用な直接または代理マーカーとなり得る。例えば、腹膜接着は、手術または炎症および新形成過程後に生じることが多く、フィブリンネットワーク、繊維芽細胞、マクロファージ、および新血管を含む。慢性関節リウマチ、狼瘡または敗血性関節炎を患う患者は、関節の滑液中に米粒体と呼ばれるフィブリン含有組織のフラグメントを有することが多い。血栓性血小板減少性紫斑病では、貧血の種類、小動脈におけるフィブリン沈積物（fibrin deposits）は、荒い血液の流れを生じ、赤血球のストレスおよび崩壊を生じる。本発明のフィブリン結合部分は、このようなフィブリン関連障害の検出および診断において使用できる。
【００２３】
フィブリン特異的薬剤はまた、他の症状（低酸素症、または心臓、腎臓、肝臓、肺、脳もしくは他の器官の虚血、ならびに腫瘍、糖尿病性網膜症、初期もしくは危険性の高いアテローム硬化症、他の自己免疫および炎症性障害の検出が挙げられるがこれらに限定されない）を検出するためにも使用できる。フィブリン特異的薬剤は、低酸素症および新脈管形成が役割を果たすと予想される疾患モデルの直接または代理マーカーの両方をも提供できる。低酸素状態では、フィブリン（フィブリノーゲン）は、低酸素誘導可能因子１（ＨＩＦ−１）の制御下で発現される。腫瘍成長および浸潤等の新脈管形成が役割を果たす疾患モデルでは、フィブリンは、新しい血管生成に必要な構造的網を提供する。
【００２４】
本発明は、フィブリン結合部分に関する。本発明による結合部分は、フィブリンまたはそのフラグメント（例えば、ＤＤおよびＤＤ（Ｅ））の結合、検出または単離が有利なあらゆる用途において有用である。本明細書に開示する結合部分の特に有利な使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏで血栓を画像化する方法にある。本方法は、本発明によるフィブリン特異的結合部分の使用を伴い、造影剤（磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）造影剤、Ｘ線画像化剤、放射性医薬画像化剤、超音波画像化剤、および光学画像化剤が挙げられる）として結合部分を検出可能に標識化して、血栓を検出する。
【００２５】
本発明による最も好ましいフィブリン結合部分は、フィブリンに対して高い親和性を有する単離された合成ポリペプチドである。本発明は、以下のアミノ酸配列を有し、フィブリンに結合する能力を有する、新しいクラスのフィブリン結合ポリペプチドを提供する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５（配列番号１）、
ここで、
Ｘ１は、Ｃｙｓ、ＰｒｏまたはＴｒｐであり、好ましくはＴｒｐである；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（すなわち、Ｃｙｓ以外の任意のアミノ酸）であるか、またはＸ４およびＸ１２がＣｙｓでない場合には、Ｘ２はＣｙｓであり得る；最も好ましくは、Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＭｅｔである；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＰｒｏまたはＴｈｒである；最も好ましくは、Ｘ３はＡｌａ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＰｒｏである；
Ｘ４は、Ｃｙｓ、またはＸ１２と共有結合により架橋を形成できる他のアミノ酸である；最も好ましくはＸ４およびＸ１２は両方ともＣｙｓである；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒである；Ｘ５は、Ｐｒｏであることが好ましい；
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌである；Ｘ６は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＴｒｐであることが好ましい；
Ｘ７は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｇｌｕであることが最も好ましい；
Ｘ８は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒである；Ｘ８は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであることが好ましい；Ｘ８は、Ｐｒｏであることが最も好ましい；
Ｘ９は、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、Ｔｒｐであることが好ましい；
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである；Ｘ１０は、ＬｅｕまたはＴｈｒであることが好ましい；
Ｘ１１は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒである；
Ｘ１２は、Ｃｙｓ、またはＸ４と共有結合により架橋を形成できる別のアミノ酸である；
Ｘ１３は、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、Ｔｒｐであることが最も好ましい；
Ｘ１４は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＨｉｓである；Ｘ１４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＳｅｒであることが好ましい；
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＨｉｓである；Ｘ１５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｒｏまたはＳｅｒであることが好ましい。
【００２６】
特に、以下の式を有し、フィブリンに対して高親和性を有する安定した結合ループを開示する：
Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ（配列番号２）、
ここで、
Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒである；Ｘ２は、Ｐｒｏであることが好ましい；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌである；Ｘ３は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＴｒｐであることが好ましい；
Ｘ４は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｇｌｕであることが最も好ましい；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒである；Ｘ８は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであることが好ましい；Ｘ５は、Ｐｒｏであることが最も好ましい；
Ｘ６は、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、Ｔｒｐであることが好ましい；
Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである；Ｘ７は、ＬｅｕまたはＴｈｒであることが好ましい；
Ｘ８は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒである。
【００２７】
本発明による特に好ましいフィブリン結合部分は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドである：
Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（配列番号３）、
Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ（配列番号４）、
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号５）、
Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号６）、
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７）、および
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（配列番号８）。
【００２８】
本発明によるさらに好ましいフィブリン結合部分は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドである：
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（配列番号２７）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号２９）；
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３０）；
Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号３１）；
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号３２）；
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３３）；
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３４）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３５）；
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３６）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３７）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号３８）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号３９）；および
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４０）。
【００２９】
本発明の別の態様は、放射性標識、酵素標識、またはＭＲ常磁性キレートもしくは微粒子での標識化；超音波気泡、微粒子、微小球、エマルジョンもしくはリポソームへの取り込み；または光学染料等の添加による上記ポリペプチドの改変により、フィブリン特異的造影剤を提供することに関する。
【００３０】
本発明の別の態様では、フィブリン結合部分の単離方法を提供する。このような方法は、血栓の検出、位置決定、定量および治療用の他の試薬を単離するために有用である。
【００３１】
本発明の別の態様では、フィブリン含有病態生理（血栓を含む）の検出方法を提供し、また血栓疾患の治療方法を提供する。
【００３２】
本発明の別の態様では、血栓溶解剤または他の治療薬と、本発明によるフィブリン結合部分との組合せ、コンジュゲーションまたは融合を含む治療薬を提供する。このような組成物は、血栓関連疾患および症状の治療に有用である。
【００３３】
本発明の別の態様では、フィブリン結合ポリペプチドを表面上に提示する、組換えバクテリオファージ、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または他の原核細胞もしくは真核細胞も提供する。このようなファージおよび宿主細胞は、スクリーニング試薬およびフィブリン検出用試薬として有用である。
【００３４】
本発明の上記および他の態様は、以下の詳細な説明を参照することにより、明らかになる。
【００３５】
定義
以下の節においては、「組換え」という用語は、非天然の改変または操作された核酸、外因性核酸によりトランスフェクトされた宿主細胞、または単離ＤＮＡの操作および宿主細胞の形質転換を介して非天然的に発現されたポリペプチドを表すために使用する。組換えは、遺伝子操作技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡ分子を特に網羅する用語であり、「組換え」という用語を形容詞として使用する場合には、特に天然型の分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを除く、分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを説明するためのものである。
【００３６】
本明細書で使用する「フィブリン誘導型ポリペプチド」という用語は、フィブリン、またはフィブリンと免疫学的に交差反応するフィブリンフラグメント（タンパク質の免疫学的反応性フラグメントを含む）の任意の部分成分を指す。
【００３７】
「バクテリオファージ」という用語は、ＤＮＡ核、および多数の異なるタンパク質分子の凝集により構成された保護殻を含む細菌ウイルスとして定義される。「バクテリオファージ」および「ファージ」という用語は、本明細書において、互換的に使用する。特に明記しない限り、「バクテリオファージ」および「ファージ」という用語は、当業者に周知の通り、「ファージミド」（すなわち、ヘルパーファージでの宿主の重感染によりパッケージングされ得るプラスミドをゲノムが含むバクテリオファージ）も包含する。本発明の好適な実施形態では、ファージはＭ１３ファージである。
【００３８】
「ポリペプチド」という用語は、（側鎖に対して）主鎖を介して、ペプチドアミド結合（−Ｃ（：Ｏ）ＮＨ−）により連結した２つ以上のアミノ酸の化合物を指す。「ペプチド」という用語は、本明細書において、「ポリペプチド」と互換的に使用するが、概して２５アミノ酸未満のポリペプチドを指すのに使用される。
【００３９】
本明細書で使用する「結合部分」という用語は、別の分子と結合複合体を形成可能な任意の分子を指す。「フィブリン結合部分」は、血餅、可溶性もしくは不溶性フィブリン、またはフィブリンにより示される構造または特徴は有するがフィブリノーゲンのフラグメントは持たない可溶性もしくは不溶性フィブリンフラグメントと複合体を形成する結合部分である。このような可溶性または不溶性フィブリンフラグメントとして挙げられるのは、「フィブリン誘導型」ポリペプチドと定義されるフラグメントである。本発明の目的であるフィブリン誘導型ポリペプチドは、本明細書に記載するＤＤ、ＤＤ二量体、およびＤＤ（Ｅ）ポリペプチドについての集合的な用語として使用される。このようなフィブリン誘導型ポリペプチドは、架橋フィブリンのタンパク質分解処置により典型的に生成されるが、フィブリン特有の構造的特徴を保持する。フィブリン結合部分の具体的な例としては、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、配列番号１〜８および２７〜４０を含む）、このようなポリペプチドを取り入れているハイブリッドおよびキメラポリペプチド、ならびに任意のこのようなポリペプチドを提示する組換え細胞またはバクテリオファージが挙げられる。同じくフィブリン結合部分の定義に含まれるものとしては、本明細書に開示されているように改変されたポリペプチドである。改変の具体的な例としては、例えば、結合部分を、検出可能な画像化標識または他の基質に連結する目的のために、ＣまたはＮ末端アミノ酸置換または伸長が挙げられる（例としては、例えば、精製を容易にするためのポリヒスチジン「テイル」の付加；酵素切断部位を取り除くための１個から数個のアミノ酸の置換；ポリグリシンまたはポリリシンセグメント等のＮ末端またはＣ末端の改変またはリンカーの使用；官能基（特に、ヒドラジド（−ＮＨ−ＮＨ２）官能基）を含むように改変して、本発明による結合ペプチドを固体支持体に固定化するのを容易にする；等）。本明細書にさらに記載する検出可能標識に加えて、フィブリン結合ポリペプチドのための他の適切な基質としては、血栓溶解剤もしくは酵素（例えば、ｔＰＡ、プラスミン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ヒルジン）、リポソーム（例えば、血栓溶解剤、適切な超音波ガスもしくは両方を充填されたもの）、または固体支持体、ウェル、プレート、ビーズ、チューブ、スライド、フィルターもしくは皿が挙げられる。このような改変フィブリン結合部分は全て、フィブリンまたはフィブリン誘導型ポリペプチドと結合する能力を保持する限り、フィブリン結合部分と考えられる。
【００４０】
「ＤＤ」、「ＤＤ二量体」および「ＤＤ（Ｅ）」という用語は、プラスミンまたはトリプシンでのフィブリンのタンパク質溶解分解により典型的に生成されるフィブリン部分成分を指す。「ＤＤ」および「ＤＤ二量体」という用語は、両方とも、約１８０ｋＤａの分子量の、隣接するフィブリン単量体のグルタミナーゼ架橋型Ｄドメインを指す。「ＤＤ二量体」という用語は、フィブリンのＣ末端部分を含み、ヒトフィブリノーゲン配列のα（１１１〜１９７）、β（１３４〜４６１）およびγ（８８〜４０６）を大まかに含む。「ＤＤ（Ｅ）」という用語は、フィブリンの中心Ｅドメインを有するＤＤの複合体を指し、約６０ｋＤａの分子量で、ヒトフィブリノーゲン配列中のα（１１１〜１９７）、β（１３４〜４６１）、γ（８８〜４０６）、α（１７〜７８）、β（１５〜１２２）およびγ（１〜６２）を大まかに含む。「ＤＤ」および「ＤＤ（Ｅ）」は、フィブリンのタンパク質分解産物であるため、プロテアーゼ消化およびその後の単離の手法に応じて、それらの組成にはわずかな不均一性があり得る。（Olexaら, Biochemistry, 20: 6139-6145(1981)；MoskowitzおよびBudzynski, Biochemistry, 33: 12937-12944(1994)；Spraggonら, Nature, 389: 455-462(1997）；および該文献中の参考文献を参照）。
【００４１】
「結合」という用語は、本明細書に記載するものを含む、結合部分は所与の標的を認識かつ可逆的に結合するという、標準的アッセイによる決定を指す。このような標準的アッセイとしては、平衡透析法、ゲル濾過法、および結合から生じる光学的変化のモニターが挙げられる。
【００４２】
「特異性」という用語は、一方に比べて他方の標的に対してより高い結合親和性を有する結合部分を指す。「フィブリン特異性」という用語は、フィブリノーゲンよりもフィブリンに対して高い親和性を有するフィブリン結合部分を指す。フィブリン特異性は、２つのテスト物質の解離平衡定数（ＫＤ）または会合平衡定数（Ｋａ）により特徴付けられ得る。本発明による結合ポリペプチドは、既に公知のフィブリン結合ポリペプチドよりも低い、フィブリンからの解離速度を有する。Ｋｏｆｆは、フィブリン／フィブリン結合部分複合体の解離についての一次速度定数である。Ｋｏｎは、フィブリン／フィブリン結合部分複合体の形成についての二次速度定数である。解離平衡定数は、ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎとして速度定数に関連し、従って、低いＫＤは、低いＫｏｆｆと相関するが、保証するものではない。本発明による結合部分は、既に単離された結合ポリペプチドよりも低い解離速度を有することが好ましい。
【００４３】
本明細書で使用する「患者」という用語は、任意の哺乳動物、特にヒトを指す。
【００４４】
「製薬上許容可能」キャリアまたは賦形剤という用語は、本発明の化合物と共に、患者に投与され得、その薬理学的活性を損なわない、非毒性キャリアまたは賦形剤を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は、フィブリンに対する新規結合部分を提供する。このような結合部分は、フィブリンまたはフィブリン誘導型ポリペプチドを含有する溶液中または系中のフィブリンまたはフィブリン誘導型ペプチドの効率的な検出、画像化および位置決定を可能にする。特に、本発明の結合部分は、適切に標識化された場合には、フィブリン含有血栓または他のフィブリン特異的病態生理を検出、画像化および位置決定するのに有用であり、従って、血栓疾患を診断および治療するための様々な診断薬および治療薬を作製するのに使用できる。本発明の好適な結合部分は、フィブリンおよび／またはフィブリン誘導型ポリペプチドと高い親和性で結合する（すなわち、公知の抗フィブリン抗体および他のフィブリン結合タンパク質と匹敵する、生理的に関連する低濃度にて作用する）。
【００４６】
本発明の特異的なフィブリン結合ポリペプチドは、ファージ提示ライブラリー（すなわち、表面上に外因性ペプチドループを発現するように形質転換された組換えバクテリオファージの集合）のスクリーニングにより最初に単離された。特定の標的（例えば、フィブリン）について新しいポリペプチド結合部分を単離するために、例えばファージ提示技術を用いた、大規模なペプチドライブラリーのスクリーニングが特に有利である。なぜなら、非常に多数（例えば、５×１０９）の可能性のある結合因子がテストでき、良好な結合因子を短時間で単離できるからである。
【００４７】
フィブリン結合ペプチド等の結合部分についてスクリーニングするための潜在的ポリペプチドのファージライブラリーを用意するために、ライブラリー中で提示されるペプチド用の構造鋳型としての役割を果たす候補結合ドメインを選択する。ファージライブラリーは、親（parental）ドメインまたは鋳型の多数の類似体からなる。結合ドメイン鋳型は、天然型もしくは合成型タンパク質、またはタンパク質の領域もしくはドメインであり得る。結合ドメイン鋳型は、結合ドメイン鋳型とフィブリンとの公知の相互作用の知識に基づき選択され得るが、これは決定的なものではない。事実、ライブラリーの鋳型として作用するように選択されるドメインは、標的に対して全く親和性を有する必要はなく、類似した構造のポリペプチド（類似体）が多数生成できる（ライブラリー）構造を提供することが目的である（ここで、多数の類似体は、所望の結合特性（およびスクリーニングする任意の他の特性）を示す１つ以上の類似体を含むことが望ましい）。
【００４８】
ライブラリーの多様なアミノ酸配列の基となる親結合ドメインまたは鋳型を選択するに当たって、最も重要な考慮は、多様なペプチドドメインがどのように標的に提示されるか（すなわち、どのコンホメーションで、ペプチド類似体が標的と接触するか）ということである。ファージ提示方法論では、例えば、類似体は、類似体をコードする合成ＤＮＡをファージに挿入し、ファージの表面上に類似体を提示させることにより生成される。幅広い種類の異なるポリペプチドを提示するこのようなファージ（Ｍ１３ファージ）のライブラリーは、例えば、Kayら, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual（Academic Press, Inc., San Diego 1996）および米国特許第５，２２３，４０９号（Ladnerら）（参照により本明細書に援用される）に記載される技術により用意できる。
【００４９】
ファージ提示ライブラリーの形成のために、非構造化線状ペプチドよりも、構造化ポリペプチドを、結合ドメイン鋳型として使用することが好ましい。タンパク質中の表面残基の突然変異は、通常、タンパク質の全体的な構造または全般的な特性（大きさ、安定性、および変性の温度等）にほとんど影響を与えないが、同時に、表面残基の突然変異は、タンパク質の結合特性に多いに影響する。ポリペプチドセグメントをきつく制約すればするほど、任意の特定の標的に結合する可能性が低くなるが、それでもポリペプチドが結合するのであれば、その結合はより高い親和性かつより大きい特異性を有する可能性がある。従って、ある程度の厳密性を有するフレームワーク内に制約された、親ドメイン、そして可能性のあるポリペプチド結合因子についての構造を選択することが好ましい。本発明の特定のポリペプチドを単離するのに当たって、ＴＮ７／ＩＶ、ＴＮ８／ＩＸおよびＴＮ９／ＩＶと称する３つのライブラリー（それぞれ、２×１０９を上回るアミノ酸配列多様性を有する）を使用した。各ライブラリーは、Ｍ１３ファージ上での多様化ポリペプチドの発現のために構築した。ＴＮ７／ＩＶライブラリーは、１３アミノ酸鋳型に含まれる単一のポリペプチド結合ループを提示するように構築した。ＴＮ７／ＩＶライブラリーは、鋳型配列Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号９）を利用した。ＴＮ８／ＩＸライブラリーは、１４アミノ酸鋳型に含まれる単一ポリペプチド結合ループを提示するように構築した。ＴＮ８／ＩＸライブラリーは、鋳型配列Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１０）を利用した。ＴＮ９／ＩＶライブラリーは、１５アミノ酸鋳型に含まれる単一ポリペプチド結合ループを提示するように構築した。ＴＮ９／ＩＶライブラリーは、鋳型配列Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１１）を利用した。
【００５０】
このような小さい結合ループペプチドは、大きいタンパク質に比べていくつかの利点を有する。第一に、結合部位当たりの質量が減る（例えば、このような高度に安定し、低い分子量のポリペプチドドメインは、抗体（１５０ｋＤａ）または一本鎖抗体（３０ｋＤａ）よりも、グラム当たりの結合がはるかに高い）。第二に、利用可能な表面が少ないために非特異的結合の可能性が低いことである。第三に、小さいタンパク質またはポリペプチドは、大きいタンパク質または抗体では実行不可能な手法により、末端ポリリシンセグメント等の特有の固定部位（tethering site）を有するように操作できる。第四に、制約されたポリペプチド構造は、構造ドメインが無傷のまま一方のフレームワークから他方のフレームワークに移された場合に（つまり、結合ドメイン構造が、ライブラリーでの提示（例えば、ファージ上での提示）に使用されるフレームワークから、提示フレームワークから外れたまたはクロマトグラフィー基板に固定化された単離タンパク質に移る可能性が高い）、機能性を保持する可能性がより高い。
【００５１】
ＴＮ７、ＴＮ８およびＴＮ９ライブラリーは、ポリペプチド鋳型のコード配列中に設計した一連の突然変異または多様化を作ることにより作製した（各変異型配列は、鋳型の配列において１つ以上のアミノ酸多様性を有すること以外は、全体的な構造が鋳型に対応する結合ループ類似体をコードする）。新規多様化（変異型）ＤＮＡは、配列多様性を提供し、各形質転換体ファージは、ＤＮＡにコードされた最初の鋳型アミノ酸配列の１つの変異体を提示し、異なるが構造的には関係する膨大な数のアミノ酸配列を提示するファージ集合（ライブラリー）をもたらす。アミノ酸多様性は、少なくともほとんどの置換について構造を有意に変化させることなく、結合ループまたはドメインの結合特性を変化させることが予想される。多様化のために選択されるアミノ酸位置（多様化アミノ酸位置）が、表面アミノ酸位置（すなわち、ドメインが最も安定したコンホメーションにある場合に、ドメインの外面（すなわち、溶液に曝される表面）に現れる、ドメインのアミノ酸配列中の位置）であることが好ましい。多様化させるアミノ酸位置は、隣接するかまたは近くにあり、置換の効果を最大化することが最も好ましい。
【００５２】
既に示したように、Kayら, Phage Display of Peptides and Proteins: A LaboratoryManual（Academic Press, Inc., San Diego 1996）および米国特許第５，２２３，４０９号で議論されている技術は、選択された親鋳型に対応する潜在的結合因子のライブラリーを作製するのに特に有用である。ＴＮ７、ＴＮ８およびＴＮ９ライブラリーは、このような技術に従い作製され、固定化フィブリン標的（例えば、ＤＤ（Ｅ）フィブリン）に対するフィブリン結合ポリペプチドについてスクリーニングした。
【００５３】
典型的なスクリーニングでは、ファージライブラリーを、標的（この場合、血餅において見とめられる重合形態のフィブリン固有の構造を表すフィブリンまたは特定の部分成分（ＤＤ（Ｅ）等））と接触させ、結合させる。結合因子および非結合因子を分離し易くするために、標的を固体支持体上に固定化すると都合がよい。フィブリンは既に不溶性であるため、ファージスクリーニングに適応し易い。一方で、ＤＤ（Ｅ）等の可溶性標的は、化学修飾により固定化しなければならない。標的結合部分を有するファージは、固体支持体上の標的と複合体を形成し、非結合ファージは溶液中に残り、過剰緩衝液と共に洗い流される。次いで、緩衝液を極端なｐＨ（ｐＨ２またはｐＨ１０）に変えること、緩衝液のイオン強度を変えること、変性剤を添加すること、または他の公知の手段により、結合したファージを標的から遊離させる。次いで、回収したファージを、細菌細胞の感染を介して増幅し、非結合因子を枯渇させて結合因子を富化させた新しいプールでスクリーニングプロセスを繰り返してもよい。より少数の結合ファージの回収でも、プロセスを完了させるのに十分である。数ラウンドの選択後、結合プール中の選択したファージクローンから誘導した結合部分をコードする遺伝子配列を、以下に記載の従来方法により決定し、ファージと標的との結合親和性を付与するペプチド配列を明らかにする。選択プロセスが成功する場合、所望の結合因子が残るまで、集合の配列多様性が各選択ラウンドごとに低下していく。配列は、少数の関連結合因子（典型的に、１０００万を上回るの元の候補のうち１０〜５０）に収束される。各選択ラウンドにおいて回収されるファージ数の増加、そして当然密接に関係する配列の回収は、スクリーニングにおいてライブラリーの収束が生じているという良い徴候である。
【００５４】
結合ポリペプチドのセットが同定された後、配列情報を使用して、別の所望の特性を有するメンバーについて偏った他の二次ファージライブラリーを設計してもよい。このような二次ライブラリーは、ＴＮ９／ＩＶライブラリーから単離したフィブリン結合ポリペプチドに基づいて設計した（以下の実施例６を参照）。
【００５５】
本明細書に記載するように行う解離速度の遅いフィブリン結合因子についてのスクリーニングでは、ＴＮ７／ＩＶおよびＴＮ９／ＩＶライブラリーのみが、比較的低いｋｏｆｆを有するフィブリン結合ポリペプチドを提供した。ＴＮ９／ＩＶライブラリーは、ゆっくりと解離するフィブリン結合因子を多数産出したため、配列を注意深く分析して、各アミノ酸位置において適したアミノ酸の範囲および種類を決定して、ＴＮ９／ＩＶライブラリーの鋳型に対応する以下のアミノ酸配列を含む、特定のフィブリン結合因子のファミリーを特定した：すなわち、
Ｔｒｐ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｔｒｐ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５（配列番号４１）
ここで、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（すなわち、Ｘ４とＸ１２とのジスルフィド形成を脱安定化させ得る、Ｃｙｓ以外の任意のアミノ酸）であり得る、またはＸ４およびＸ１２がＣｙｓでない場合には、Ｘ２はＣｙｓであり得る；最も好ましくは、Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＬｙｓもしくはＭｅｔである；
Ｘ３は、Ｃｙｓ以外の任意の非荷電アミノ酸であり、すなわち、Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、またはＰｒｏのグループから選択される；最も好ましくは、Ｘ３はＡｌａ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＰｒｏである；
Ｘ４は、Ｃｙｓ、もしくはＸ１２と共有結合により架橋を形成できる他のアミノ酸である；最も好ましくはＸ４およびＸ１２は両方ともＣｙｓである；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、または小さい非荷電極性アミノ酸（すなわち、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒもしくはＴｈｒである）；Ｘ５は、Ｐｒｏであることが好ましい；
Ｘ６は、Ｃｙｓ以外の任意の非塩基性アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌ）であり；Ｘ６は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＴｒｐであることが好ましい；
Ｘ７は、ＧｌｕまたはＳｅｒであり、Ｇｌｕであることが最も好ましい；
Ｘ８は、Ｐｒｏ、または酸性アミノ酸（すなわち、ＡｓｐもしくはＧｌｕ）、またはＣｙｓ以外の非荷電極性側鎖を有するアミノ酸である（すなわち、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）である；Ｘ８は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであることが好ましい；Ｘ８は、Ｐｒｏであることが最も好ましい；
Ｘ１０は、Ｃｙｓ以外で、脂肪族非荷電極性または脂肪族非極性（疎水性）側鎖を有するアミノ酸である（すなわち、Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである）；Ｘ１０は、ＬｅｕまたはＴｈｒであることが好ましい；
Ｘ１１は、芳香族疎水性アミノ酸である（すなわち、Ｘ１１は、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒである）；
Ｘ１２は、Ｃｙｓ、またはＸ４と共有結合により架橋を形成できる別のアミノ酸である；
Ｘ１３は、芳香族疎水性アミノ酸（すなわち、Ｘ１３は、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒ）であり、Ｔｒｐであることが最も好ましい；
Ｘ１４は、Ｐｒｏもしくは小さいアミノ酸（すなわち、ＡｌａもしくはＧｌｙ）、Ｃｙｓ以外の極性非荷電アミノ酸（すなわち、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒもしくはＴｙｒ）、酸性アミノ酸（すなわち、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕ）、または弱塩基性アミノ酸（すなわち、Ｈｉｓ）である；Ｘ１４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｈｅもしくはＳｅｒであることが好ましい；
Ｘ１５は、非極性アミノ酸（すなわち、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐもしくはＶａｌ）、Ｃｙｓ以外の非荷電極性アミノ酸（すなわち、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒもしくはＴｙｒ）、または弱塩基性アミノ酸（すなわち、Ｈｉｓ）である；Ｘ１５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｒｏもしくはＳｅｒであることが好ましい。
【００５６】
このようなポリペプチドの特に好ましい例としては、以下が挙げられる：
Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ（配列番号３）、
Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ（配列番号４）、
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号５）、
Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号６）、および
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７）。
【００５７】
配列Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（配列番号８）を有する単一のＴＮ７結合因子を単離した。
【００５８】
これらのポリペプチドのシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成すると考えられており、これは、非還元条件下で、ポリペプチドに安定したループまたは環状構造を形成させる。従って、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィブリン結合ループの発見に関する：
Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｔｒｐ−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ（配列番号４２）
ここで、
Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒ、好ましくはＰｒｏである；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり、好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＴｒｐである；
Ｘ４は、ＧｌｕまたはＳｅｒであり、好ましくはＧｌｕである；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒであり、好ましくはＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり、最も好ましくはＰｒｏである；
Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌであり、好ましくはＬｅｕまたはＴｈｒである；
Ｘ８は、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、好ましくはＰｈｅである。
【００５９】
ＴＮ７単離体のフィブリン結合ループは、Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（配列番号１２）である。
【００６０】
特定のフィブリン結合ポリペプチドに基づく二次ライブラリーの作製、および解離の遅い結合因子の選択により、以下の別のフィブリン結合ポリペプチドが単離された：
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（配列番号２７）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号２９）；
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３０）；
Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号３１）；
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号３２）；
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３３）；
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３４）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３５）；
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３６）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３７）；
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号３８）；
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号３９）；および
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号４０）。
【００６１】
これらの配列と、既に単離された配列との比較による検査により、以下の式のアミノ酸配列を含むフィブリン結合ポリペプチドの拡張されたクラスが提供される：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５（配列番号１）、
ここで、
Ｘ１は、Ｃｙｓ、ＰｒｏまたはＴｒｐであり、好ましくはＴｒｐである；
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＶａｌ（すなわち、Ｃｙｓ以外の任意のアミノ酸）であるか、またはＸ４およびＸ１２がＣｙｓでない場合には、Ｘ２はＣｙｓであり得る；最も好ましくは、Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＬｙｓもしくはＭｅｔである；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＰｒｏまたはＴｈｒである；最も好ましくは、Ｘ３はＡｌａ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＰｒｏである；
Ｘ４は、Ｃｙｓ、もしくはＸ１２と共有結合により架橋を形成できる他のアミノ酸である；最も好ましくはＸ４およびＸ１２は両方ともＣｙｓである；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒである；Ｘ５は、Ｐｒｏであることが好ましい；
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌである；Ｘ６は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＴｒｐであることが好ましい；
Ｘ７は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｇｌｕであることが最も好ましい；
Ｘ８は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒである；Ｘ８は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであることが好ましい；Ｘ８は、Ｐｒｏであることが最も好ましい；
Ｘ９は、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、Ｔｒｐであることが好ましい；
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである；Ｘ１０は、ＬｅｕまたはＴｈｒであることが好ましい；
Ｘ１１は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒである；
Ｘ１２は、Ｃｙｓ、またはＸ４と共有結合により架橋を形成できる別のアミノ酸である；
Ｘ１３は、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、Ｔｒｐであることが最も好ましい；
Ｘ１４は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＨｉｓである；Ｘ１４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｈｅまたはＳｅｒであることが好ましい；
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＨｉｓである；Ｘ１５は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＰｒｏまたはＳｅｒであることが好ましい。
【００６２】
さらに、以下の式を有し、フィブリンに対して高親和性を有する安定した結合ループを提供する：
Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ（配列番号２）、
ここで、
Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒである；Ｘ２は、Ｐｒｏであることが好ましい；
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌである；Ｘ３は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＴｒｐであることが好ましい；
Ｘ４は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＴｙｒであり、Ｇｌｕであることが最も好ましい；
Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒである；Ｘ５は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであることが好ましい；Ｘ５は、Ｐｒｏであることが最も好ましい；
Ｘ６は、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり、Ｔｒｐであることが好ましい；
Ｘ７は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌである；Ｘ７は、ＬｅｕまたはＴｈｒであることが好ましい；
Ｘ８は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒである。
【００６３】
ジスルフィド結合ループの形成は、このようなペプチドに対する親和性および特異性を高めるために有利である。しかし、血清において、ジスルフィド結合は、遊離システインまたは他のチオール含有分子により開かれ得る。従って、位置４および／または１２においてアミノ酸を改変して、別の反応の低い結合でジスルフィド架橋を置き換えることが有用であるかもしれない。上記１５量体ペプチドは、５つの共有結合を含む−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−架橋により連結されたアミノ酸４および１２のα炭素を有する。典型的なＣ−Ｃ単一結合は、約１．５Åの長さであり、Ｓ−Ｓ結合は約２．０Å、そしてＣ−Ｓ結合は約１．８Åである。−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−架橋は、硫黄間の二面結合が９０度に近い、好ましい幾何学を有するが、厳密な幾何学は、他の側基の状況および分子の結合状態により決定される。結合ループの閉じられた架橋の好ましい改変は、全体的な結合長さおよび角度を可能な限り保つ。このような適切な代替的な架橋としては、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−等のチオエーテル結合；−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−および−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−等のラクタム結合；−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−等のエーテル結合；−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝４、５または６）のアルキレン架橋；結合−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−、ならびに当該分野で公知の類似グループが挙げられる。
【００６４】
安定したジスルフィド連結結合ループを含むポリペプチドが最も好ましいが、（例えば、一方または両方のシステイン残基の置換により）上記配列から誘導される、ジスルフィドループを含む元のポリペプチドの少なくともいくらかのフィブリン結合活性を保持し得る、線状ポリペプチドが簡単に調製され得る。このようなＣｙｓ置換を作るために、アミノ酸Ｇｌｙ、ＳｅｒおよびＡｌａが好ましく、両方のＣｙｓ残基を置換して、ポリペプチドを二量化または溶液中の他の遊離チオール基と反応させうる単一のＣｙｓを残さないようにすることも好ましい。フィブリン結合特性を保持するこのような線状誘導体は全て、本発明の範囲内にある。
【００６５】
本発明のペプチドの直接合成は、固相ペプチド合成、溶液相合成等の従来技術を用いて達成され得る。固相合成が好ましい。Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis (1989), W.H.Freeman Co., San Francisco；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154(1963)；BondanszkyおよびBondanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, New York 1984)（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００６６】
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成を業務として提供する会社（例えば、BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA；Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkington, MA）により商業的に調製されてもよい。
【００６７】
Perkin-Elmer Applied Biosystemsが製造するような自動化ペプチド合成機械も利用可能である。
【００６８】
ポリペプチド化合物は、化学的または組換え技術のいずれかにより、単離または合成された後に精製されることが好ましい。精製目的のために、Ｃ４−、Ｃ８−またはＣ１８−シリカ等のアルキル化シリカカラムを用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む多くの標準的方法が採用され得る。精製を行うためには一般的に有機含量が増加する勾配移動相（例えば、通常少量のトリフルオロ酢酸を含む、水性緩衝液中のアセトニトリル等）が使用される。イオン交換クロマトグラフィーを使用して、電荷に基づいてペプチドを分けてもよい。ポリペプチドの精製の程度は、ＨＰＬＣ上の主要な大きいピークを同定すること等、様々な方法により決定され得る。ＨＰＬＣカラム上にインプットする物質の少なくとも９５％の単一のピークを生成するポリペプチドが好ましい。ＨＰＬＣカラム上にインプットする物質の少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはさらに９９．５％の単一ピークを生成するポリペプチドがさらにより好ましい。
【００６９】
上述した任意の技術を用いて得られたペプチドが、本発明の組成物において使用するのに望ましいペプチドであることを確認するために、ペプチド組成の分析を行ってもよい。このような組成分析は、高分解能質量分析法を使用して、ペプチドの分子量を測定して行い得る。あるいはまた、酸性水溶液中にペプチドを加水分解させ、ＨＰＬＣまたはアミノ酸分析器を用いて、混合物の組成を分解、同定および定量することで、ペプチドのアミノ酸内容を確認できる。ペプチドを逐次分解してアミノ酸を順番に同定するタンパク質シークエネーターを使用して、ペプチドの配列を確実に決定してもよい。
【００７０】
本発明のフィブリン結合ポリペプチドは、配列中の２つのシステイン残基間のジスルフィド連結によりコンホメーションが拘束（restrain）され得る。このコンホメーションの拘束により、ペプチドが、フィブリノーゲンよりもフィブリンに対するペプチドの親和性およびフィブリンに対する特異性に寄与する結合構造を有することが確実になる。同様のコンホメーションおよびフィブリン特異性をそのペプチドのために保持しうる他のペプチド拘束方法は、当該分野で記載されており、本明細書において使用することができる（ペプチド上の２つの位置間のより安定したまたはコンホメーションとして好ましい結合を形成する目的で、１つ以上のシステイン残基を非天然型アミノ酸またはペプチド模倣体と置換することが挙げられる）。このような改変型フィブリン結合部分も全て、フィブリンまたはフィブリン誘導型ポリペプチドに結合する能力を保持する限り、フィブリン結合部分と考えられる。非環状、すなわち線状形態のペプチドも、フィブリンに対する結合能力および特異性を保持し得、同様に本発明において使用され得る。
【００７１】
本明細書に記載するフィブリン結合ポリペプチドの相同体は、当該分野で公知の特定の目的のために、当該分野で周知の方法を採用して、１つ以上のアミノ酸を置換、付加または欠失することにより作製され得る。このような相同ポリペプチドは、アミノ酸の置換、付加または欠失によりそのフィブリン結合能力が失われない限り、本発明の範囲内にあると理解される。本明細書で使用する「相同」という用語は、２つの高分子（すなわち、ポリペプチド分子または核酸分子）間の配列類似性の程度を指す。比較する２つの高分子において、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基が配列位置を占める場合、それらの高分子はその位置において相同である。例えば、２本のポリペプチド配列中の１００のアミノ酸位置のうちの６０におけるアミノ酸残基が一致または相同である場合、２本の配列は６０％の相同性を有する。相同％の数字は、本明細書において、２つの高分子間の最大可能相同性（すなわち、２つの高分子が最大数の一致（相同）位置を有するようにアライメントされた場合の相同％）を反映する。本発明の範囲内で相同なポリペプチドは、本明細書に開示する少なくとも１つのフィブリン結合配列に少なくとも８０％、好ましくは９０％を上回る相同性を有する。
【００７２】
本発明によるフィブリン結合ポリペプチドは、本発明によるポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を利用し、それらを組換え手法により発現させる組換えＤＮＡ技術を用いて（すなわち、宿主細胞を、公知の手法により外因性核酸分子の導入により操作して、この宿主細胞に所望のフィブリン結合ポリペプチドを生成させることにより）産生され得る。このような手順は、当業者の能力内にある（Davisら, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)を参照）。本明細書に記載するような短いペプチドの組換え作製は、直接合成と比べて実用的ではないかもしれないが、本発明のフィブリン結合部分をハイブリッドポリペプチドまたは融合タンパク質に取り入れる場合には、組換え作製手段は非常に有用となり得る。
【００７３】
本発明の実施において、フィブリノーゲンと比べたフィブリンに対するフィブリン結合部分の親和性の測定は有用な指標（measure）であり、フィブリンに対する特異性と呼ばれる。結合の定量および親和性の測定のための標準的なアッセイとしては、平衡透析法、平衡結合法、ゲル濾過法または、結合部分とその標的との相互作用により生じ得る多数の分光学的変化（例えば、蛍光偏光の変化等）をモニターすることが挙げられる。これらの技術は、結合および遊離リガンドの濃度を、リガンド（またはタンパク質）濃度の関数として測定する。以下の等式に示すように、結合ポリペプチドの濃度（［結合］）は、遊離ポリペプチドの濃度（［遊離］）およびポリペプチド（すなわちフィブリン上）の結合部位の濃度（Ｎ）と関係する：
［結合］＝Ｎ×［遊離］／（（１／Ｋａ）＋［遊離］）
上記等式に対するデータの解は、会合定数Ｋａ（すなわち、結合親和性の定量的指標）を生じる。会合定数Ｋａは、解離定数ＫＤの逆数である。ＫＤの方が、親和性の測定において頻繁に報告される。フィブリンよりもフィブリノーゲンに対してＫＤが１．５倍高いペプチドは、特異性が低いフィブリン結合因子と考えられる。フィブリンよりもフィブリノーゲンに対してＫＤが１０倍高いペプチドは、特異性が低いフィブリン結合因子と考えられ、フィブリンよりもフィブリノーゲンに対してＫＤが１００倍以上高いペプチドは、フィブリンに対して高い特異性を有すると言う。本発明のペプチドおよび薬剤は、フィブリンよりもフィブリノーゲンに対してＫＤが、好ましくは少なくとも１．５倍高い、より好ましくは少なくとも１０倍高い、さらにより好ましくは少なくとも１００倍高い、そして最も好ましくは１０００倍高い。好ましいフィブリン結合ポリペプチドは、フィブリンに対するＫＤが、１ナノモル（ｎＭ）〜１００マイクロモル（μＭ）の範囲にあり、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、少なくとも６０ｎＭ、少なくとも８０ｎＭ、少なくとも１μｍ、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも６０μＭ、および少なくとも８０μＭのＫＤ値を含む。
【００７４】
フィブリン結合部分を造影剤として採用する場合、結合特異性の他の点がより重要となり得る：造影剤と標的（血餅）との結合は、画像化過程の間、安定した平衡状態にないという意味で、造影剤は動的な系で作用する。例えば、造影剤を最初に注射した時には、造影剤の濃度および薬剤−標的複合体の濃度は急速に高くなる。しかし、注射後間もなく、循環（遊離）造影剤が、腎臓または肝臓を介して除去され始め、造影剤の血漿濃度が降下し始める。この血漿中の遊離造影剤の濃度の降下は、結果的に薬剤−標的複合体を解離させる。造影剤の有用性は、薬剤のクリアランス速度と比較した薬剤−標的解離速度の差に依存する。解離速度は、クリアランス速度と比べて遅く、血漿中の薬剤−標的複合体の濃度が高くかつ遊離造影剤（バックグラウンドシグナル）の濃度が低い、長い画像化時間が得られることが理想的である。複合体の解離速度は、解離速度定数Ｋｏｆｆにより制御される。ｋｏｆｆの高い値は、速い解離速度に対応するため、造影剤として使用するには低いｋｏｆｆを有する結合ペプチドを得ることが好ましい。
【００７５】
低いｋｏｆｆを有するペプチドを得るために、標準的な溶出ステップを置き換えることにより、標準的な提示ライブラリースクリーニング手順を改変し得る。例えば、ライブラリースクリーニングの通常の過程では、ライブラリーと固定化標的とを、結合因子が標的と複合化するのに十分な期間の間インキュベートして、次に固定化複合体を数回洗浄して、弱いおよび非特異的結合因子を除去し、次に複合体周囲の溶液の条件を、それ以上結合を援助しない条件に変化させることにより溶出する。典型的に、ｐＨを急速に低下させる溶出条件（例えば、ｐＨ７．０で結合させた後にｐＨ２．０）により、多くの候補がさらなる特徴決定のために溶出される。解離の遅い（低いｋｏｆｆの）フィブリン結合因子を単離するために、溶液条件の変化を、動的溶出ステップと置き換えてもよい。この場合、固定化ファージ／標的複合体と高濃度の可溶性フィブリン標的を長時間インキュベートすることにより、結合因子提示ファージを固定化フィブリン標的から回収した。標的に最も長い時間付着できるファージは、最も低いＫｏｆｆを提示するペプチドである。過剰競合リガンド（すなわち、可溶性標的）の存在下では、数個のファージしか固定化標的に非常に長時間付着しないため、ＥＬＩＳＡにより解離の遅いファージを全て検査することも可能である。これにより、全過程を、収束（convergence）を観察するのに必要な典型的な３〜５ラウンドのスクリーニングではなく、１ラウンドのスクリーニングにより行うことができる。
【００７６】
本発明のフィブリン結合ポリペプチドは、以下に記載するように固定化フィブリン様ポリペプチド標的からの動的溶出により推定された場合に解離の遅い（すなわち解離定数の低い）フィブリン結合因子である。解離速度の定量測定は、ファイバ光学蛍光定量法（例えば、AndersonおよびMiller, Clin. Chem., 34(7):1417-21(1988)を参照）、表面プラスモン共鳴（Malmborgら, J. Immunol. Methods, 198(1):51-7(1996)、およびSchuck, Current Opinion in Biotechnology, 8:498-502 (1997)を参照）、共振ミラー、および格子結合平面導波路（grating coupled planar waveguiding）（例えば、Hutchinson, Molec. Biotechnology, 3:47-54 (1995)を参照）等、当該分野で公知のいくつかの方法を用いて簡単に行うことができる。結合動力学を測定するために自動化バイオセンサが市販されている（ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラスモン共鳴センサ（Biacore AB, Uppsala SE）、ＩＡｓｙｓ共振ミラーセンサ（Fisons Applied Sensor Technology, Cambridge GB）、ＢＩＯＳ−１格子結合平面導波路センサ（Artificial Sensor Instruments, Zurich CH）。
【００７７】
フィブリン結合ポリペプチドの用途
本発明のフィブリン結合部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのフィブリンの検出および／または画像化のために非常に有用であり、特にフィブリン血餅の検出および／または画像化のために有用である。任意の適切なフィブリンアッセイまたは画像化方法が採用され得る。
【００７８】
溶液中のフィブリンまたはフィブリン誘導型ポリペプチドの検出のために、本発明の結合部分を検出可能に標識化（例えば、蛍光標識、放射性標識または酵素標識）して、溶液と接触させ、その後結合部分とフィブリン標的との複合体の形成を検出できる。例として、フィブリンについてテストする溶液にペプチドを結合が生じる条件下で添加するｉｎ  ｖｉｔｒｏフィブリン検出アッセイのために、蛍光標識されたフィブリン結合ペプチドを使用してもよい。遊離ペプチドと比べたフィブリン結合ペプチドから生じる蛍光偏光の増加を測定することにより、蛍光標識フィブリン結合ペプチドとフィブリンとの複合体を検出および定量できる。
【００７９】
あるいはまた、フィブリン結合部分を、プラスチックチューブまたはウェル等の固体支持体に固定化し、フィブリンまたはフィブリン誘導型ポリペプチドを含むと思われる溶液を該固定化結合部分と接触させ、非結合物質を洗い流し、適切な検出試薬（フィブリンを認識するモノクローナル抗体等）を使用して複合化ポリペプチドを検出する、サンドウィッチ型ＥＬＩＳＡアッセイを使用してもよい。モノクローナル抗体は、当該分野で公知の従来手段により検出可能である（検出可能標識化、例えば、放射性標識化するか、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素とコンジュゲートするか、または蛍光標識する等が挙げられる）。
【００８０】
溶液中または溶液からの可溶性フィブリンまたはフィブリン誘導型ポリペプチドの検出または精製のために、本発明の結合部分を、クロマトグラフィー支持体または他の多孔性材料等の固体基板上に固定化し、結合部分／フィブリン複合体の形成に適した条件下で、固定化した結合因子に溶液を充填するか溶液と接触させる。溶液の非結合部分を除去し、複合体を検出する（例えば、抗フィブリンまたは抗結合部分抗体を使用するか、またはフィブリン標的を、適切な溶出条件下で結合部分から放出させてもよい）。
【００８１】
フィブリンおよび血餅形成の生物学は、多くの研究者により調査されてきており、調査および開発の活発な分野であり続けている。純粋なフィブリンは、治療上有用な凝固剤としての利用性も有する。このような調査および開発を促進するために、大量の純粋形態のフィブリンを精製する方法が望まれており、上述した一般的な精製方法論を使用して、本発明による結合部分はこの目的のために特に有用である。
【００８２】
血栓画像化
本発明のポリペプチドの特に好ましい用途は、可視的に読取り可能な血栓の画像を作成して、血栓関連障害の診断、モニターおよび治療を助けることである。本明細書に開示するフィブリン結合ポリペプチドは、ポリペプチドを、診断検出に適した標識とコンジュゲートすることにより、血栓を検出するための造影剤に変換できる。フィブリノーゲンよりもフィブリンに対してより高い特異性を示すペプチドを、採用する検出方法論に適した標識とコンジュゲートまたは連結させることが好ましい。例えば、フィブリン結合因子を、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に適した常磁性キレート、Ｘ線画像法に適した放射性標識、超音波検出に適した超音波微粒子もしくはリポソーム、または光学画像化染料とコンジュゲートし得る。
【００８３】
適切なリンカーは、置換または非置換アルキル鎖、アミノ酸鎖（例えば、ポリグリシン）、ポリエチレングリコール、ポリアミド、および当該分野で公知の他の単純な高分子リンカーであり得る。
【００８４】
一般的に、検出可能に標識されたフィブリン結合部分を使用する技術は、標識が、患者の身体の外側で検出可能なシグナルを生成するという前提に基づく。検出可能に標識されたフィブリン結合部分を、血栓を有すると疑われる患者に投与した場合、血栓中のフィブリンに対するフィブリン結合部分の高親和性が、フィブリン結合部分を血栓に結合させ、血栓の部位において標識を蓄積させる。標識化ペプチドが血栓部位に局在化するのに十分な時間が与えられる。標識化ペプチドにより生成されるシグナルは、使用する標識の種類に応じて変化する走査装置により検出され、次いでシグナルを血栓の画像に変換する。
【００８５】
Ａ．磁気共鳴画像化
本発明のフィブリン結合部分は、常磁性金属キレートとコンジュゲートして、ＭＲＩに使用される造影剤を形成することが有利でありうる。好ましい常磁性金属イオンは、原子番号２１〜２９、４２、４４または５７〜８３を有する。これは、１つ、より好ましくは５つ以上の不対電子を有し、少なくとも１．７ボーア磁子の磁気モーメントを有する、遷移金属またはランタニド系列のイオンを含む。好ましい常磁性金属は、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩおよびＩＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｔｂ（ＩＩＩ）、Ｈｏ（ＩＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩＩ）、ならびにＥｕ（ＩＩＩ）からなる群より選択される。Ｇｄ（ＩＩＩ）は、緩和性（relaxivity）が高く、毒性が低く、生物学的に利用されうる（accessible）酸化状態が１つしかないため、ＭＲＩに特に好ましい。Ｇｄ（ＩＩＩ）キレートは、１９８８年から臨床的および放射線ＭＲ用途のために使用されており、ＭＲ試験の約３０％が現在ガドリニウム利用型造影剤を採用している。
【００８６】
医者は、血栓の検出するのに必要な用量に応じて、および患者に対する金属の毒性等の他の要素を考慮して金属を選択するであろう。Tweedleら, Magnetic Resonance Imaging (第二版), vol.1, Parteinら編(W.B. Saunders Co. 1988), pp. 796-7を参照のこと。一般的に、個々の金属についての所望の用量は、その緩和性に比例し、金属の生物分布、薬物動態学および代謝により加減される。三価陽イオンＧｄ３＋は、緩和性の高さと毒性の低さ、さらに患者による所望でない金属の代謝を最小限にするたった１つの生物学的に利用され得る酸化状態で存在するという利点を有するために、ＭＲＩに特に好ましい。別の有用な金属は、比較的費用が安いＣｒ３＋である。
【００８７】
有機キレート化剤は、常磁性金属に対するリガンドとして作用し、常磁性金属と複合化する、１つ以上の極性基を有する分子である。適切なキレート化剤は、当該分野で公知であり、メチレンホスホン酸基、メチレンカルボヒドロキサミン酸基、カルボキシエチリデン基またはカルボキシメチレン基を有する酸が挙げられる。キレート化剤の例としては、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、および１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。他のキレート型リガンドは、エチレンビス−（２−ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）、およびそれらの誘導体（５−Ｃｌ−ＥＨＰＧ、５Ｂｒ−ＥＨＰＧ、５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ、５ｔ−ＢＵ−ＥＨＰＧ、および５ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧを含む）；ベンゾジエチレントリアミンペンタ酢酸（ベンゾ−ＤＴＰＡ）およびそれらの誘導体（ジベンゾ−ＤＴＰＡ、フェニル−ＤＴＰＡ、ジフェニル−ＤＴＰＡ、ベンジル−ＤＴＰＡ、およびジベンジルＤＴＰＡを含む）；ビス−２（ヒドロキシベンジル）−エチレン−ジアミンジ酢酸（ＨＢＥＤ）およびそれらの誘導体；少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも６つの炭素元素、および少なくとも２つのヘテロ原子（Ｏおよび／またはＮ）を含み、１つの環または２もしくは３つの環がヘテロ環元素において結合したものからなり得る、大環状化合物のクラス（例えば、ベンゾ−ＤＯＴＡ、ジベンゾ−ＤＯＴＡ、およびベンゾ−ＮＯＴＡ（ここでＮＯＴＡは、１，４，７−トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ''−トリ酢酸）、ベンゾ−ＴＥＴＡ、ベンゾ−ＤＯＴＭＡ（ここでＤＯＴＭＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチルテトラ酢酸））、およびベンゾＴＥＴＭＡ（ここでＴＥＴＭＡは、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−（メチルテトラ酢酸）；１，３−プロピレンジアミンテトラ酢酸（ＰＤＴＡ）およびトリエチレンテトラアミンヘキサ酢酸（ＴＴＨＡ）の誘導体；１，５，１０−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリケートコレート（tricatecholate）（ＬＩＣＡＭ）および１，３，５−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）の誘導体がある。本発明で使用するのに好ましいキレート化剤は、ＤＴＰＡである。本発明で意図する代表的なキレート化剤およびキレート型基の例は、ＷＯ９８／１８４９６号、ＷＯ８６／０６６０５号、ＷＯ９１／０３２００号、ＷＯ９５／２８１７９号、ＷＯ９６／２３５２６号、ＷＯ９７／３６６１９号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１４７３号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０１８２号、および米国特許第４，８９９，７５５号（全て、参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００８８】
本発明によれば、ＭＲＩ造影剤のキレート化剤は、フィブリン結合部分と結合する。キレートの位置付けは、フィブリン結合部分の結合親和異性または特異性と妨害しないように選択されるべきである。キレートは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに付属するべきであるが、キレートは、配列内のどこにでも付着し得る。好適な実施形態では、遊離中心（free central）カルボキシル酸基を有するキレート化剤（例えば、ＤＴＰＡ−Ａｓｐ（β−ＣＯＯＨ）−ＯｔＢｕ）は、アミド結合の形成によりペプチドのＮ末端に付着し易くする。キレートは、リンカーの助けを得てＣ末端に付着し得る。あるいはまた、イソチオシアネートコンジュゲーション化学物質を、ＤＴＰＡを担持する適切なイソチオシアノ基（isothocyanto group）を、ペプチド配列内の任意の場所にある遊離アミノ基に連結するための手段として採用してもよい。
【００８９】
一般的に、フィブリン結合部分は、金属キレート化剤（または他の検出可能標識）に直接または共有結合により結合できるか、またはリンカー（アミド、尿素、アセタール、ケタール、二重エステル（double ester）、カルボニル、カルバミン酸塩、チオ尿素、スルホン、チオエステル、エステル、エーテル、ジスルフィド、ラクトン、イミン、ホスホリル、またはホスホジエステル連結；置換または非置換の飽和または非飽和アルキル鎖；単一のアミノ酸または異なるアミノ酸の線状、分岐または環状アミノ酸鎖（例えば、フィブリン結合部分のＮまたはＣ末端の伸長部分（extensions））；誘導化または非誘導化ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンもしくはポリビニルピリジン鎖；置換または非置換ポリアミド鎖；誘導化または非誘導化ポリアミン、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリアクリレート、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロールもしくはオリゴ糖（例えば、デキストラン）鎖；交互ブロック重合体；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびピメリン酸；カプロン酸；単純ジアミンおよびジアルコール；ならびに当該分野で公知の他の単純な高分子リンカー（例えば、ＷＯ９８／１８４９７号、ＷＯ９８／１８４９６号を参照）が挙げられるがこれらに限定されない）を使用して金属キレート化剤に結合またはコンジュゲートされ得る。リンカーの分子量は、厳密に制御され得ることが好ましい。分子量の大きさは、１００未満から１０００を上回ってもよい。リンカーの分子量は１００未満であることが好ましい。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで生分解可能なリンカーを利用して、本発明の造影剤の効率的な排出経路を得ることが望ましいかもしれない。リンカー内での位置に応じて、このような生分解可能な官能基としては、エステル、二重エステル、アミド、ホスホエステル、エーテル、アセタールおよびケタール官能基が挙げられる。
【００９０】
一般的に、公知の方法を使用し、このようなリンカーを用いて、金属キレートとフィブリン結合部分とを連結できる。例えば、ＷＯ９５／２８９６７号、ＷＯ９８／１８４９６号、ＷＯ９８／１８４９７号、および該文献中の議論を参照のこと。フィブリン結合部分は、そのＮ−またはＣ−末端を介してアミド結合により、例えば、金属キレートの金属配位骨格窒素、または金属キレート自体のアセテートアームに連結され得る。本発明は、金属キレートが、金属に強固に結合する能力を保持して、毒性を最小限にするという前提のもと、あらゆる位置においてキレートを連結することを意図する。同様に、改変または伸長によりフィブリン結合能力が失われないという前提のもとで、フィブリン結合部分を改変または伸長して、金属キレートへの付着座（locus for attachment）を生成してもよい。
【００９１】
本明細書の開示に従って調製されたＭＲＩコントラスト試薬（画像化試薬）は、従来のＭＲＩコントラスト試薬と同じように使用され得る。血栓を画像化する場合、バックグラウンド血液および組織に対する血栓のコントラストを増強するために、特定のＭＲ技術およびパルスシーケンスが好ましいかもしれない。これらの技術としては、例えば、高速スピン（fast spin）エコーシーケンス（例えば、Alexanderら, Magnetic Resonance in Medicine, 40(2):298-310 (1998)を参照）、および非造影(flow-spoiled)勾配エコーシーケンス（例えば、Edelmanら, Radiology, 177(1):45-50 (1990)を参照）等の、血液を黒くするブラックブラッド（black blood）血管造影シーケンスが挙げられる（ただしこれらに限定されない）。これらの方法は、コントラスト増強血栓と血液および組織とのＴ１差により、コントラスト差を増強する流動独立（flow independent）技術も含む（血栓とバックグラウンド組織とのコントラストを増強する反転回復生成（inversion-recovery prepared）または飽和−回復生成（recovery prepared）シーケンス等）。さらに、本発明は、Ｔ２を有意に変化しないため、Ｔ２調製方法も有用であることが分かる（例えば、Gronasら, Journal of Magnetic Resonance Imaging, 7(4):637-643 (1997)を参照）。最後に、磁化移動前処理（magnetic transfer preparation）も、これらの薬剤とのコントラストを改善し得る（例えば、Goodrichら, Investigative Radiology, 31(6):323-32 (1996)を参照）。
【００９２】
標識化試薬は、注射可能な組成物の形態で患者に投与される。ＭＲＩ造影剤の投与方法は、腸管外、つまり静脈内、動脈内、髄腔内、組織内（intersitially）、または腔内投与であることが好ましい。画像化血栓のためには、静脈内または動脈内投与が好ましい。ＭＲＩのためには、被検体は、血栓部位にてＭＲシグナルを少なくとも１０％増強するのに十分な投薬量の造影剤を受けることが意図される。フィブリン結合部分含有ＭＲＩ試薬を注射した後、患者をＭＲＩ機において走査し、あらゆる血栓の位置を決定する。治療設定においては、血栓位置決定の際に、必要であれば血栓溶解剤を直ちに投与してもよく、その後患者を走査して、血栓分解について可視化してもよい。
【００９３】
Ｂ．超音波画像化
超音波が物質に伝達される場合、物質の音響特性は、伝達速度および物質の密度に依存する。音響特性の変化は、異なる物質（固体、液体、気体）の界面において最も顕著である。超音波造影剤は、液体（例えば、血液）と、溶解した気体を含有する微粒気泡、リポソームまたは微小球との音響の差により、強力な音波反射物質である。超音波微粒気泡、リポソーム、微粒子等は、それらの大きさのために、他の検出可能部分よりも、注射後に血流に長時間留まる。従って、標的化フィブリン特異的超音波剤は、血栓の優秀な画像化を実証し得る。
【００９４】
本発明の本態様では、フィブリン部分は、超音波画像化に有用な材料に連結され得る。検出可能な標識として機能する液体または気体（音響発生ガスまたは音響発生ガスを生成可能な物質）を含む小胞（例えば、リポソーム、微粒気泡、微小球またはエマルジョン）を形成するように材料を採用する。このような小胞の調製のための材料としては、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、糖質、および合成または天然型高分子材料が挙げられる。適切な材料および方法についてのさらなる説明については、ＷＯ９８／５３８５７号、ＷＯ９８／１８４９８号、ＷＯ９８／１８４９５号、ＷＯ０９／１８４９７号、ＷＯ９８／１８４９６号およびＷＯ９８／１８５０１号を参照のこと。
【００９５】
適切な気体としては、Ｃ１−６ペルフルオカーボン（perfluocarbon）ガス、ＳＦ６、低分子量Ｃ１−６フッ化もしくはハロゲン化アルケン、アルキンもしくはそれらの環状バージョン、またはＷＯ９７／２９７８３号、ＷＯ９８／５３８５７号、ＷＯ９８／１８４９８号、ＷＯ９８／１８４９５号、ＷＯ９８／１８４９６号、ＷＯ９８／１８４９７号、ＷＯ９８／１８５０１号、ＷＯ９８／０５３６４号、ＷＯ９８／１７３２４号に記載されているような他の適切な気体もしくはそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用する「気体（ガス；gas）」という用語は、正常のヒト体温である３７℃にて気体状態である物質を指す。超音波小胞は、そのまま単独で、または界面活性剤もしくは他の安定化物質（乳化剤および／もしくは粘性増強剤、抗凍結剤、凍結乾燥保護剤、または充填剤等）で安定化され得る。
【００９６】
超音波小胞は、本明細書に記載の他の検出可能標識よりも大きくあり得るため、複数のフィブリン結合部分と、それらの表面上で、結合またはコンジュゲートされて、薬剤の標的化効率を高めてもよい。付着は、フィブリン結合部分と、小胞を作るのに使用する材料との間の直接共有結合を介してもよいし、先に記載したようにリンカーを介してもよい。例えば、ペプチドと二官能性ＰＥＧリンカーとの付着、次いでそれとリポソーム組成物との反応の説明については全般的にＷＯ９８／５３８５７号を参照のこと。また、Lanzaら, Ultrasound in Med. and Bio., 23(6):863-870(1997)も参照のこと。標的化超音波小胞は、当該分野で公知の従来方法を用いて調製され得る。公知の方法としては、所望の音響発生ガスまたはガス混合物の存在下または不在下における、緩やかな振とう、ローターミキシング、音波処理、高圧均質化、高速攪拌、高剪断ミキシング、乳化、およびコロイドミル手順を用いて、小胞を生成することが挙げられる。あるいはまた、所望の音響発生ガスは、小胞に、該ガスの気圧または超過気圧をかけることにより、小胞に取り込まれ得る（米国特許第５，６７４，４６９号を参照）。
【００９７】
本発明により使用され得る超音波画像化技術としては、カラードップラー、パワードップラー、ドップラー増幅、誘導型音響画像化、および２次元または３次元画像化技術等の公知技術が挙げられる。画像化は、好ましい第２の調波と共に、調和（共振周波数）または基本モードで行われ得る。
【００９８】
Ｃ．光学画像化、音ルミネセンス、または光音響画像化
本発明によれば、多数の光学パラメータを採用して、光学標識化フィブリン結合部分を被検体に注射した後にｉｎ  ｖｉｖｏ光画像化により、フィブリンの位置を決定してもよい。画像作製（preparation）において検出される光学パラメータとしては、伝達される放射線、吸光度、蛍光または燐光発光、光反射、吸光度の大きさまたは最大値の変化、および弾性散乱放射能が挙げられる。例えば、生物学的組織は、６５０〜１０００ｎｍの近赤外線（ＮＩＲ）波長範囲にある光に対して比較的半透明である。ＮＩＲ放射は、数センチほど組織を通ることができ、本発明のフィブリン結合部分を、ｉｎ  ｖｉｖｏでのフィブリン光学画像化のために使用することを可能にする。
【００９９】
フィブリン結合部分は、広範囲の非局在化環構造を有し、４００〜１５００ｎｍの範囲に吸収または発光最大値を有する光学染料（有機発色団または蛍光団が挙げられる）等の光標識とコンジュゲートされ得る。あるいはまた、フィブリン結合部分は生物発光分子と誘導化され得る。光標識について好ましい吸光度最大値の範囲は、６００〜１０００ｎｍであり、ヘモグロビンからのシグナルによる妨害を最小限にする。光吸光度標識は、大きいモル吸光度率（例えば、＞１０５ｃｍ−１Ｍ−１）を有し、蛍光光学染料は高い量子収量を有することが好ましい。光学染料の例としては、ＷＯ９８／１８４９７号、ＷＯ９８／１８４９６号、ＷＯ９８／１８４９５号、ＷＯ９８／１８４９８号、ＷＯ９８／５３８５７号、ＷＯ９６／１７６２８号、ＷＯ９７／１８８４１号、ＷＯ９６／２３５２４号、ＷＯ９８／４７５３８号および該公報中で引用される参考文献に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されない。光標識は、フィブリン結合部分に直接共有的に連結されてもよいし、先に記載したようにリンカーを介してフィブリン結合部分に連結されてもよい。
【０１００】
光学標識化フィブリン結合部分の注射後、剤に採用する光標識に適した波長範囲にある１つ以上の光源（例えば、レーザ）で患者を走査する。使用する光は、単色光または多色光で、連続またはパルス状のものであり得る。１つ以上の波長にチューニングした光検出器を介して、透過光、散乱光または反射光を検出して、被検体中のフィブリンの位置を決定する。光学パラメータの変化を、時間経過と共にモニターして、血栓部位における光学標識化試薬の蓄積を検出し得る。標準的な画像処理および検出装置を、本発明の光学造影剤と使用してもよい。
【０１０１】
上述した光学造影剤は、光学標識化造影剤を用いて行われる音響光学または音ルミネセンス画像化にも使用され得る（米国特許第５，１７１，２９８号、ＷＯ９８／５７６６６号、および該公報中の参考文献を参照）。音響光学画像化において、超音波放射（radiation）を被検体にかけ、透過光、発光または反射光の光学パラメータに影響させる。音ルミネセンス画像化では、適用される超音波は実際に検出される光を生成する。このような技術を用いた適切な画像化法は、ＷＯ９８／５７６６６号に記載されている。
【０１０２】
Ｄ．核画像化（放射性核種画像化）
フィブリン結合部分を、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴ画像化に適した放射性核種リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とコンジュゲートしてもよい。ＰＥＴ剤としての使用のためには、ペプチドを、５１Ｍｎ、５２Ｆｅ、６０Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、９４ｍＴｃ、または１１０Ｉｎ等の様々な陽電子放射金属イオンの１つと複合化させる。好ましい金属放射性核種としては、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、４７Ｓｃ、６７Ｇａ、５１Ｃｒ、１７７ｍＳｎ、６７Ｃｕ、１６７Ｔｍ、９７Ｒｕ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、および１４１Ｃｅが挙げられる。９９ｍＴｃは、その費用の低さ、利用可能性、画像化特性、および高い比活性のために好ましい。Ｔｃ−９９ｍの核および放射能特性により、この同位体は理想的なシンチグラフィー造影剤とされる。この同位体は、１４０ＫｅＶの単一の光子エネルギー、約６時間の放射能半減期を有し、９９Ｍｏ−９９ｍＴｃ生成器（generator）から容易に得られる。放射性金属は、例えば、線状、大環状、テルピリジン、およびＮ３Ｓ、Ｎ２Ｓ２もしくはＮ４キレート（米国特許第５，３６７，０８０号、同第５，３６４，６１３号、同第５，０２１，５５６号、同第５，０７５，０９９号、同第５，８８６，１４２号も参照）、ならびに当該分野で公知の他のキレート化剤（ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、およびビスアミノビスチオール（ＢＡＴ）キレート化剤（米国特許第５，７２０，９３４号も参照）が挙げられるがこれらに限定されない）により、キレートを作られ得る。キレートは、フィブリン結合部分に直接共有連結されるか、または先に記載したようにリンカーを介してフィブリン結合部分に連結され、次いで、選択した放射性金属で直接標識される（ＷＯ９８／５２６１８号、米国特許第５，８７９，６５８号、および同第５，８４９，２６１号を参照）。
【０１０３】
放射性テクネチウムと本発明の試薬との複合体を形成する際、テクネチウム複合体、好ましくはＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩の塩を、還元剤の存在下で試薬と反応させる。好ましい還元剤は、亜ジチオン酸塩、第一スズおよび第一鉄イオンであり、最も好ましい還元剤は塩化第一スズである。このような複合体を調製する手段は、標識化される所定量の本発明の試薬、およびＴｃ−９９ｍｍで試薬を標識化するのに十分な量の還元剤を含む密封バイアルを含むキット形態で都合よく提供されている。あるいはまた、適切なキレート化剤とコンジュゲートした本発明のペプチドを、テクネチウムと伝達リガンドとして知られている他の化合物との予め形成された不安定複合体と反応させることにより、複合体を形成してもよい。このプロセスは、リガンド交換として知られており、当業者に周知である。不安定化合物は、例えば、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩またはマンニトール等の伝達リガンドを用いて形成され得る。Ｔｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩のうち、本発明に有用なものとしては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩等）、またはアンモニウム塩もしくは低アルキルアンモニウム塩が挙げられる。
【０１０４】
本発明が提供する放射性標識化シンチグラフィー造影剤は、適量の放射性を有するように提供される。Ｔｃ−９９ｍ放射性化合物を形成する際に、１ｍＬにつき約０．０１ミリキュリー（ｍＣｉ）〜１００ｍＣｉの濃度で放射能を含む溶液中で放射性複合体を形成することが一般的に好ましい。
【０１０５】
一般的に、投与する単位用量は、約０．０１ｍＣｉ〜約１００ｍＣｉ、好ましくは１ｍＣｉ〜２０ｍＣｉの放射能を有する。単位投薬量で注射される溶液は、約０．０１ｍＬ〜約１０ｍＬである。
【０１０６】
本発明の放射性核種標識化フィブリン結合造影剤の典型的な用量は、１０〜２０ｍＣｉである。フィブリン特異的放射性核種造影剤を患者に注射した後、造影剤に入った核種のγ線エネルギーについて目盛をつけたγカメラを使用して、薬剤の取込領域を画像化し、血餅に存在する放射能の量を定量する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの血栓の画像化は、数分足らずで行うことができる。しかし、所望であれば、放射性標識ペプチドを患者に注射してから数時間またはそれ以上経ってから、画像化を行うこともできる。ほとんどの場合、約０．１時間内に、十分量の投与用量が、画像化される領域に蓄積されて、シンチフォトが撮影できる。
【０１０７】
治療的用途
本発明のフィブリン結合ポリペプチドは、フィブリンに対する親和性およびフィブリン血餅における滞在時間をもたらすかまたは改善することにより、血餅に対する血栓溶解剤の活性を改善するために使用できる。本発明の本態様では、本発明のフィブリン結合ポリペプチドと血栓溶解剤とをコンジュゲートすることにより、ハイブリッド血栓溶解剤を提供する。コンジュゲートのフィブリン結合ポリペプチド部分は、血栓溶解剤をフィブリン血餅部位に「誘導（home）」させ、血餅に対するコンジュゲートの親和性を改善して、コンジュゲートの血栓溶解活性を血餅部位に、より局在化させ集中させる。このようなコンジュゲートは、哺乳動物（ヒトを含む）における、血栓関連疾患、特に急性心筋梗塞を治療するのに有用であり得る。本方法は、血栓溶解剤とコンジュゲートされた有効量の本発明のフィブリン結合部分を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む。本発明はまた、このようなコンジュゲートを、哺乳動物（ヒトを含む）における血栓関連疾患の治療のための医薬製造においてこのようなコンジュゲートを使用することも提供する。本発明の本態様において使用するのに適した血栓溶解剤としては、プラスミノーゲンアクチベーターを含むフィブリン溶解酵素が挙げられる。プラスミノーゲンアクチベーターという用語は、ストレプトキナーゼ、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、およびウロキナーゼ（一本鎖および二本鎖形態の両方）を含むが、これらに限定されない。このような酵素は、組換え生成により、天然由来源または組織から得られる。他の適切な血栓溶解剤としては、異なる二本鎖（２−ｃｈａｉｎ）プロテアーゼの鎖に連結した二本鎖プロテアーゼの１本の鎖を含み、ハイブリッドタンパク質中の少なくとも１本の鎖がフィブリン溶解活性プロテアーゼから誘導されている、フィブリン溶解活性ハイブリッドタンパク質（例えば、ＥＰ−Ａ−１５５  ３８７を参照）；可逆的にブロックされたプラスミンに連結したウロキナーゼ等の血栓溶解タンパク質コンジュゲート（例えば、ＥＰ−Ａ−１５２  ７３６を参照）；フィブリン溶解活性の要因となる酵素上の触媒部位が、可逆的連結基により結合されたヒトタンパク質によりブロックされているフィブリン溶解酵素の誘導体（例えば、ヒトプラスミンの活性中心に可逆的に連結したウロキナーゼ）；天然型プラスミノーゲンアクチベーターの突然変異タンパク質を含む遺伝子操作された誘導体；ハイブリッド分子（例えば、ＥＰ−Ａ−２９７  ８８２を参照）；可逆的にブロックされたｉｎ  ｖｉｖｏフィブリン溶解酵素（ストレプトキナーゼとプラスミノーゲンとの二元複合体、最も好ましくは内部結合切断のないｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン複合体（米国特許第４，８０８，４０５号に記載のアニストレプラーゼ）等）；等が挙げられる。
【０１０８】
血栓溶解剤およびフィブリン結合部分は、ＭＲＩ造影剤を構築することに関して上記議論したリンカーと同じ種類のものを使って、公知の手法により血尾久または融合できる。好ましいリンカーは、置換または非置換アルキル鎖、アミノ酸鎖、ポリエチレングリコール鎖、および当該分野で公知の他の単純な高分子リンカーである。より好ましいのは、血栓溶解剤自体のコードＤＮＡ配列が公知のタンパク質の場合、上述した組換えＤＮＡ技術を用いて作製された同じ合成遺伝子から血栓溶解タンパク質およびフィブリン結合ポリペプチドを同時発現させてもよい。フィブリン結合ポリペプチドのコード配列を、血栓溶解タンパク質のコード配列とフレームを合わせて融合させて、血栓溶解タンパク質のアミノまたはカルボキシ末端において、または末端間の位置（該位置において、血栓溶解タンパク質またはフィブリン結合ポリペプチドのいずれかの必要とされる生物学的機能を破壊しないということが判断された場合）においてペプチドが発現されるようにしてもよい。この一般的な手法の具体的な利点は、複数のタンデムに配置されたフィブリン結合ポリペプチドのコンカテマー化が可能で、各血栓溶解タンパク質と会合するフィブリン結合部位の数および濃度を増加できることである。このようにして、フィブリン結合アビディティーを高め、これは、組換え治療タンパク質の効力を改善すると期待される。
【０１０９】
血栓溶解剤に加えて、本発明によるフィブリン結合ペプチドを使用して、他の有効物質をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでフィブリン部位に送達することができる。例えば、小分子治療薬または他の治療剤を、１つ以上のフィブリン結合ペプチドと連結させ、コンジュゲートを被検体に投与、またはフィブリン含有溶液に導入すると、コンジュゲートのフィブリン結合特性が、フィブリン蓄積部位において小分子または治療薬を集中させる。特に好適な態様では、本発明のフィブリン結合ペプチドは、新脈管形成プロモーター（例えば、繊維芽細胞成長因子）等のフィブリンの存在下で活性な薬剤を送達するために使用され得る。フィブリン結合ペプチドは、フィブリン血餅において化合物または薬剤を蓄積させることにより（これは徐々に放出される）、化合物または薬剤の血液クリアランス半減期を高めるためにも使用され得る。
【０１１０】
上記治療法において、化合物は、血栓溶解剤のように任意の都合の良い経路（例えば、輸液またはボーラス注射）により投与され得る。好適な実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適応した医薬組成物として、常套手順により製剤化され得る。典型的に、静脈内投与の用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液に入った溶液である。必要であれば、組成物は、可溶化剤および局部麻酔（リグノカイン等）を含んで、注射部位における痛みを和らげてもよい。一般的に、成分は、別々にまたは単位投薬剤形として一緒に混合されて、例えば、有効物質の量を活性単位で示すアンプルまたはサシェットなどの密閉容器に入った乾燥凍結乾燥粉末または非水含有濃縮物として、供給される。輸液により組成物を投与する場合、滅菌医薬品グレードの「注射用水」または食塩水を含む輸液瓶で投薬され得る。組成物を注射により投与する場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを用意して、投与前に成分を混合してもよい。
【０１１１】
投与する物質の量は、血栓塞栓状態の重度、ならびに血餅の位置および大きさに依存する。採用する厳密な用量、および投与形態は、必然的に病態の性質を考慮して、状況に応じて、治療を監視している医師により決定されなければならない。一般的に、フィブリン結合因子／血栓溶解剤コンジュゲートの投薬量は、血栓溶解剤単独の場合の慣習的な投薬量に従うが、フィブリン結合因子成分により添加されるフィブリンに対する改善された親和性により、標準の血栓溶解剤投薬量を減らしてもよい。本療法において使用が意図される具体的な血栓溶解剤（用量および投与方法の例を含む）は以下の通りである：
2004523514.tif 000003
【０１１２】
好ましい特徴では、フィブリン結合部分は、酵素切断部位（例えば、第Ｘａ因子、トロンビンまたはプラスミン切断部位等、通常、凝固カスケード中の酵素により切断される酵素切断部位）を含むリンカーにより、血栓溶解剤に結合される。血栓溶解剤は、血餅部位においてフィブリン結合部分から切断されるまでは活性化されないことが好ましい。血栓溶解剤の切断は、血餅部位において生じるため、血餅から離れた部位における望ましくない出血事象の危険性は最小限にされる。
【０１１３】
あるいはまた、治療血栓溶解剤を、本発明のフィブリン結合部分により、その表面上で誘導化された超音波小胞に充填できる。小胞はまた、超音波能率ガス（efficient gas）（ペルフルオロプロパンまたはペルフルオロブタン等が挙げられるがこれらに限定されない）で充填され得る。超音波でモニターした際にフィブリン特異的小胞が血栓部位に誘導したら、かける超音波の頻度およびエネルギーを変えて、血栓部位から血栓溶解剤を制御的に放出させる（例えば、ＷＯ  ９３／２５２４１を参照）。
【０１１４】
医薬的用途
フィブリン結合部分を、検出および診断のために、または血栓の治療的分解を促すために患者に使用する場合でも、このような使用はフィブリン結合部分を医薬剤として処置する必要がある。本発明の医薬組成物は、本発明の任意の化合物、および製薬上許容可能なその塩を、任意の製薬上許容可能な成分、賦形剤、キャリア、アジュバントまたはビヒクルと共に含む。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、他の診断または治療剤と同様の手法により、ヒトを含む哺乳動物に投与され得る。投与される投薬量、および投与形態は、年齢、体重、性別、患者の状態、および遺伝的要因等の様々な要因に依存し、最終的には担当の医師または獣医により決定される。一般的に、診断的感度または治療的効力のために必要とされる投薬量は、約０．００１〜５０，０００μｇ／ｋｇ宿主体重、より通常には０．０１〜２５．０μｇ／ｋｇ宿主体重である。
【０１１６】
本発明の医薬組成物において使用され得る製薬上許容可能なキャリア、アジュバントおよびビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミン等）、緩衝物質（リン酸塩等）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩もしくは電解液（硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム等）、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、様々な経路または形態により投与され得る。これらとしては、経口、気管内、舌下、肺、局所、直腸、鼻腔、頬腔、膣、腸管外、または移植リザーバを介する投与が挙げられるがこれらに限定されない。移植リザーバは、機械的、浸透圧、または他の手段により機能し得る。腸管外という用語は、本明細書において、腹腔内、傍脊椎、関節周囲、骨膜、皮下、皮内、静脈内、動脈内、筋内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病変内および頭蓋内の注射または輸液技術を含む。
【０１１８】
このような組成物は、好ましくは腸管外投与のために、より好ましくは静脈内または動脈内投与のために製剤化される。一般的に、そして特に投与が静脈内または動脈内である場合、医薬組成物は、ボーラス、別々の時間に分けた２回以上の用量、または一定もしくは非直線的流体輸液として与えられ得る。
【０１１９】
投薬量、投薬剤形、投与形態、組成等に関する詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Alfonso R. Gennaro編（Mack Publishing Co., Easton, PA 1990）（参照により本明細書に援用する）等の標準的な製薬テキストにおいてさらに議論されている。
【０１２０】
分子ライブラリーをスクリーニングするためのフィブリン結合ポリペプチドの使用
フィブリンと本発明のフィブリン結合部分との間で形成される複合体は、小分子ライブラリーをスクリーニングするために使用して、フィブリンに特異的かつ高い親和性をもって結合可能な、非ペプチド、ペプチド模倣体、または他の分子もしくは化合物を見つけてもよい。フィブリンに可逆的または共有結合により結合し得るこのような新規フィブリン結合化合物は、本発明のフィブリン結合部分について現在想定されている使用に匹敵するか、または異なる使用を有し得る。
【０１２１】
スクリーニングは、ハイスループット形式で行うことが好ましい。ある形式のスクリーニングでは、本明細書に記載のフィブリン結合ポリペプチドを検出可能に標識し、溶液として、表面（プラスチックアッセイプレート（例えば、ポリスチレン９６ウェルプレート）のウェルが挙げられるがこれに限定されない）に付着させたフィブリンタンパク質に加え、非共有結合複合体を形成させる。フィブリン／結合ポリペプチド結合は、平衡状態に到達させてもさせなくてもよい。その後、単一濃度の非標識化テスト化合物を１つのウェルに加えるか、様々な濃度のテスト化合物を複数のウェルに加え、フィブリン、標識化ポリペプチドおよびテスト化合物間の部分的または完全な平衡状態まで時間を置く。テスト化合物がフィブリンと結合した場合、テスト化合物とフィブリンとの結合親和性に比例して、いくらかの標識化ペプチドが競合的に置き換えられる。ウェルを洗浄して、非フィブリン結合標識化ペプチドおよびテスト化合物を除去し、その後、ＥＬＩＳＡプレートリーダー等により、残った置き換えられなかった標識化ペプチドを検出する。適切な陽性および陰性対照との比較により閾値量の標識化ペプチドを置き換えることができたと判断されたテスト化合物は、推定フィブリン結合分子として同定され、さらにそれらの物理学的、化学的、生物学的そして薬理学的特性について調査される。
【０１２２】
ハイスループットアッセイの代替的な実施形態では、標識化ポリペプチドを、テスト化合物と混合し、それぞれ同時に、結合したフィブリンタンパク質を含むウェルに加える。さらに別の実施形態では、フィブリン結合ポリペプチドを固体表面に付着させ、フィブリンを検出可能に標識化する。
【０１２３】
ある濃度範囲のテスト化合物および公知の親和性を有する非標識形態のフィブリン結合ポリペプチドが、所与の濃度の同種の標識化ペプチドに置き換わる有効性の比較により、テスト化合物のフィブリン結合親和性の推定値が得られる。
【０１２４】
本発明によるフィブリン結合部分の単離を、以下の実施例においてさらに例示する。以下の実施例中に含まれる具体的なパラメーターは、本発明の実施を例示することを意図したもので、あらゆる意味で本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：ライブラリースクリーニング用のフィブリン標的の調製
ライブラリーをスクリーニングしてフィブリンに対する結合部分を単離するために、公表されている方法（MoskoitzおよびBudzynksi, Biochemistry, 33: 12937-12944 (1994)ならびに該文献中の参照文献）の変法に従って、可溶性フィブリン誘導型ポリペプチドＤＤ（Ｅ）を調製した。第ＸＩＩＩ因子微量不純物（trace impurity）を含むフィブリノーゲン（１ｇ、グレードＬ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから購入）を、ＴＢＳ緩衝液に溶解し、５ｍＭクエン酸塩を含むＴＢＳに対して一晩透析した。フィブリノーゲン濃度を、３．０ｍｇ／ｍｌに調節し、ＣａＣｌ２を１０ｍＭの濃度となるまで添加した。トロンビンを０．５Ｕ／ｍｌとなるよう添加してフィブリノーゲンを凝固させ始め、血餅を３時間３７℃にてインキュベートした。血餅を、スパチュラで切断して水を放出し、血餅を濃縮した。血餅切片を、ＴＢＳ−Ｃａ緩衝液（２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴＢＳ）で２回洗浄し、洗浄と洗浄の間に４，０００×ｇにて遠心分離にかけて血餅を凝縮させた。血餅物質を、２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍｇのフィブリンにつき２Ｋ．Ｉ．Ｕ．プラスミンを含む２５０ｍｌ  ＴＢＳに再懸濁させた。血餅を２０℃にて一晩消化させた。未消化血餅をピペットで取り出し、上清を１０ｍｌのリシンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に３０分間振とうし、濾過して樹脂を除去した。手法ニンを、濾液に、５００Ｕ／μＬの濃度となるよう添加した。硫酸アンモニウムを３０％飽和まで添加し、沈降したタンパク質を遠心分離により除去した。さらに硫酸アンモニウムを、５０％飽和の最終濃度まで上清に添加し、沈降したタンパク質を遠心分離分離により濃縮した。ＤＤ（Ｅ）を含むペレットを、少量の緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）（＜１０ｍｌ）に再懸濁させ、同じ緩衝液中、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ  Ｓ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイズ排除カラム（５×１００ｃｍ）上でクロマトグラフィーにかけた。カラムから溶出されたタンパク質の画分を、ＤＤ（Ｅ）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥでアッセイした。ＤＤ（Ｅ）は、５５ｋＤ（フラグメントＥ）および１９０ｋＤ（フラグメントＤＤ）のサブユニットを含む。
【０１２６】
ライブラリースクリーニングの標的としてＤＤ（Ｅ）を調製するために、まず複合体をビオチン化した。緩衝液を５０ｍＭリン酸ナトリウムに変え、１０当量のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、すなわちビオチン部分をアミン反応部位に付加するアミノ官能基化合物と反応させる。ビオチン結合タンパク質ストレプトアビジンで被膜された磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．）を、次いでビオチン化ＤＤ（Ｅ）で被膜した。１ミリグラムのビーズにつきおおよそ１００ｐｍｏｌのＤＤ（Ｅ）を固定化した。次いで、ビーズを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．１％ヒト血清アルブミンを含む１００μＬの緩衝液に懸濁して、非特異的結合に対する部位をブロックする。
【０１２７】
実施例２：ファージ提示ライブラリーのスクリーニング
構造Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号１３）（Ｍ１３ファージ上に提示された３．３×１０１２のペプチド多様性）を有するポリペプチド鋳型に基づいて、多様性外因性単一ループペプチドを提示するＴＮ６／ＶＩファージライブラリーを含むいくつかのファージ提示ライブラリーを、１００μＬの結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に希釈した。
【０１２８】
フィブリンまたはＤＤ（Ｅ）標的に結合したファージを選択する前に、各スクリーニングラウンドの始めに、ライブラリーからフィブリノーゲン結合因子を枯渇させた。ＤＤ（Ｅ）ビオチン化のために採用したのと同じ方法でフィブリノーゲンをビオチン化し、次いで、磁気ビーズ上に固定化した。ビーズを５つのチューブに等分した。ファージライブラリーを、最初のチューブに入ったビーズと共に１０分間インキュベートし、ビーズを磁石でペレット化し、少なくとも部分的にフィブリノーゲン結合ファージが枯渇した上清を第２のチューブに移す。このプロセスを５つのチューブにわたり繰り返し、最後の枯渇後、ライブラリーを、上記したように調製した固定化ＤＤ（Ｅ）標的を含むマイクロタイタープレートに導入した。ファージとＤＤ（Ｅ）とを結合させるための標的との２時間のインキュベーション後、プレートのウェルを十分に（１５回）洗浄し、非結合または弱い結合のファージを除去した。ｐＨ２．０のクエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で標的からファージを溶出することにより、結合ファージを回収した。回収したファージを、続く選択ラウンドでの使用のために、増殖および調製した。全体で、５ラウンドの枯渇および選択を行った。各ラウンド後、溶出したファージを数えて、回収したファージの量が（インプットの割合％として）増加したか否か（スクリーニングプロセスにより、小さい配列ファミリーに収束しているということを示す）を決定した。
【０１２９】
実施例３：Ｋｏｆｆ値が高い単離体の分析
５ラウンドの選択後、溶出したファージを増殖させ、一部をプレートにまいて、個々のクローンから生じるファージプラークを単離した。９０ものこのようなクローンをランダムに選択し、増殖させ、乾燥フィブリンプレートアッセイ中でフィブリンに対する結合について個々にテストした。乾燥フィブリンプレートを、ライブラリースクリーニングのために上述したように調製した。ファージサンプル（それぞれ約１０９ファージ）を、乾燥させたフィブリンプレートウェルで、０．１％  ＨＳＡを含む結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中でインキュベートした。１時間後、プレートを結合緩衝液で５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体を、結合緩衝液中１／５０００に希釈してウェルに添加し、フィブリンと共に１時間インキュベートした。ウェルを再度結合緩衝液で５回洗浄し、抗体／ファージ／フィブリン複合体の存在を、ＨＲＰ熱量試薬（３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびＨ２Ｏ２）で測定した。５９５ｎｍの（酸化ＴＭＢによる）高い吸光度は、強いファージ／フィブリン相互作用を示し、これらのウェルに対応するファージクローンはフィブリン結合部分を有すると同定された。
【０１３０】
これらのフィブリン結合陽性クローンを、いくつかの二次ＥＬＩＳＡアッセイに供した。これらのアッセイは、標的固定化の方法、ならびに結合および洗浄緩衝液からＨＳＡを省略したという変更以外は、乾燥フィブリンＥＬＩＳＡアッセイについて上記詳細に記載したものと同様のプロトコールに従った。ＤＤ（Ｅ）に対するスクリーニングは、フィブリン結合活性をさらに確認するための役割を果たした。（ＤＤ（Ｅ）について使用したビオチン／ストレプトアビジンプロトコールによりプレートに固定化された）フィブリノーゲンに対するＥＬＩＳＡスクリーニングは、フィブリノーゲン結合についてチェックするものであり、実施例２で詳細に記載した陰性選択手順が有効であることを確認した。最後に、（ポリスチレンプレートに受動的に結合した）固定化ＨＳＡおよび標的非含有マイクロタイタープレートに対する結合をアッセイするためのＥＬＩＳＡは、無差別または非特異的に結合したファージを無くすための対照とした。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡ陽性クローン（フィブリンに対して陽性であるが、フィブリノーゲン、ＨＳＡおよびポリスチレンプレートに対して陰性）から得たファージ提示ポリペプチドのアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列決定により推定した。このようにして単離した高親和性フィブリン結合ポリペプチドはＷＯ０１／０９１８８号（参照により本明細書に援用される）に記載されている。フィブリンについての解離定数を、以下の方法を用いて、上述したように単離した多くのフィブリン結合因子について決定した。
【０１３２】
フィブリノーゲン溶液を、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中１０ｍｇ／ｍｌにて（または所望のフィブリンの濃度の二倍で）調製した。フィブリノーゲン溶液は典型的に約１７ｍＭのクエン酸塩を含んだ。その後、２Ｕ／ｍｌトロンビン、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５ｍＭε−アミノカプロン酸がＴＢＳに入った溶液を調製した。フィブリノーゲン溶液およびトロンビン溶液を１：１で、９６ウェルプレートのウェル中で、各溶液を各ウェルに５０μＬづつ分注して混合した（合計容量＝１００μＬ）。プレートを一晩３７℃にて蒸発乾固させた。水に溶解させた被検ポリペプチドを、１〜２００μＭの範囲の濃度で各ウェルに添加した。典型的な結合アッセイは、２、４、６、８、１０、１２、１４、１７、２０、２３、２６、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、１００、１２５、１５０、１７５および２００μＭの濃度の２４ポイントを含んでいた。ペプチドおよび（再水和した）乾燥フィブリンを含むプレートをカバーし、振とうテーブル上で３７℃にて２時間インキュベートした。
【０１３３】
各ウェル中の上清をピペットで取り出し、質量分析法によりポリペプチドの濃度を測定した。サンプルを質量分析計に注入した後、ペプチドの質量において検出されたイオン電流をモニターした。ピーク下面積を測り、既知濃度の標準値と比較した。上清中のペプチドの濃度は、遊離ペプチドの濃度と等しい。結合ペプチドの濃度は、合計（出発）濃度から遊離ペプチドの濃度を引くことで測定した。［結合ペプチド］対［遊離ペプチド］のプロットを用いて、飽和にある結合ペプチドのＫｄおよび濃度を測定した。曲線は以下の式に当てはまった：
［結合］＝Ｎ×［遊離］／（Ｋｄ＋［遊離］）
ここで、［結合］は結合ポリペプチドの濃度、［遊離］は遊離ポリペプチドの濃度、Ｋｄは解離定数（Ｋａの逆数に等しい）、およびＮは結合部位の濃度である。フィブリン分子当たりの結合部位の数は、アッセイで使用したフィブリン（１５μＭ）の濃度で割った、［結合ポリペプチド］対［遊離ポリペプチド］プロットで測定された結合部位の濃度に等しかった。
【０１３４】
上述したように単離した合成フィブリン結合ポリペプチドについての解離定数は、約７００ｎＭ〜約１３μＭ以上にわたった。様々な実施形態で行った後、配列：Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号１４）を有する合成ペプチドＤＸ−１０１は、フィブリンに対して最も低いＫＤ（７００ｎＭ）を示した。
【０１３５】
さらに、蛍光偏光およびフルオレセイン標識形態のペプチドを用いて、ペプチドとＤＤ（Ｅ）との間の解離定数（ＫＤ）を測定した（Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy (1983), Plenum Press, New Yorkを参照）。このようにして得たＫＤ値は、上述したフィブリンについて見とめられたものと類似している。
さらにＫＤが低く、フィブリン標的からの解離の速度が低い高親和性フィブリン結合ポリペプチドを得るために、さらにスクリーニングを行った。
【０１３６】
実施例４：Ｋｏｆｆ値が低いフィブリン結合因子の動的溶出（kinetic elution）
Ｋｏｆｆ値が低いペプチドを得るために、実施例２に記載した手順における標準溶出ステップを置き換えることにより通常のスクリーニング手順を改変した。この場合、固定化ファージ／ＤＤ（Ｅ）標的複合体を、高濃度の可溶性ＤＤ（Ｅ）と共に、結合緩衝液中で長時間インキュベートすることにより、ファージを固定化ＤＤ（Ｅ）標的から溶出した。
【０１３７】
上記技術と同じ技術を用いてフィブリノーゲン結合因子を枯渇したファージライブラリーＴＮ７／ＩＶ、ＴＮ８／ＩＸおよびＴＮ９／ＩＶを、上述したように固定化ＤＤＥと共にインキュベートしてフィブリン結合因子を捕捉し、洗浄して非結合ファージを無くし、その後、連続的に３００μＬ容量の０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＤ（Ｅ）で溶出した。各容量の溶出液中のファージの数を、ファージ力価測定により分析した。待望通り、ファージが固定化標的から放出される速度は、溶出時間が長くなると共に低くなった（図１を参照）。
【０１３８】
個々のファージ単離体を、最も長い持続時間の溶出液から回収し、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングして、フィブリノーゲンと結合しないＤＤ（Ｅ）の特異的結合因子を検出した。ＥＬＩＳＡは、上述したように行った。所望の結合選択性を有する単離体を配列決定し、得られた配列を表１に示す。
【表１】
2004523514.tif 000004
【０１３９】
２つの遅く解離するフィブリン結合配列００２−３７−Ｃ１１および００２−３７−Ｄ０２を用いて、さらなる実験において検査する合成ペプチドを設計した。合成ペプチド構造を表２に示す。全てのペプチドはＮ末端においてアシル化（Ａｃ）され、Ｃ末端においてアミド化（−Ｃ：Ｏ−ＮＨ２）されて、固定化を促した。
【表２】
2004523514.tif 000005
【０１４０】
フルオレセイン標識ペプチド（ＤＸ−３０３およびＤＸ−３０４）を用いて、蛍光偏光を用いて、ＤＤ（Ｅ）に対するペプチドの平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。図２および３は、ＤＸ−３０３およびＤＸ−３０４にそれぞれ結合するＤＤ（Ｅ）の解離定数を測定するための異方性プロットを示す。ＤＸ−３０３は５００ｎＭのＫＤを有し、ＤＸ−３０４は４００ｎＭのＫＤを有する。従って、これらのペプチドは、先に単離されたあらゆるフィブリン結合ペプチド（例えば、ＤＸ−１０１、配列番号１４、前掲）よりも低い解離定数を示した。ＫＤは、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎとしてｋｏｆｆと関係する。ｋｏｎは、ペプチド間で変わり得るため、低いＫＤは、より低いｋｏｆｆと相関する（ただし、必ずしも比例的ではない）。
【０１４１】
実施例５：単離されたフィブリン結合因子から調製された造影剤のテスト
新しく発見されたペプチドの造影剤としての能力をテストするために、ＤＸ−３０３およびＤＸ−３０４合成ペプチドを、ヒドラジノニコチン酸（ＨＹＮＩＣ、Schwartzら, Bioconj. Chem., 2, 333 (1991)を参照）で標識して、ＤＸ−３２８（配列番号１６）およびＤＸ−３２９（配列番号１９）を生成した。ＨＹＮＩＣは、９９ｍＴｃの強力なキレート化剤である。ＨＹＮＩＣは、Ｔｃ上の配位部位の１つのみを占領するため、他の部位を占領するために追加のコリガンド（coligand）を必要とする。他のキレート化剤と比べたＨＹＮＩＣの利点は、放射性標識複合体が、他のキレート化剤のものと比べてより安定しているということ、そして、造影剤の生物分布（biodistribution）および血液クリアランス時間がコリガンドを変化させることにより改変できることである。
【０１４２】
トリシンをコリガンドとして用いて、９９ｍＴｃ標識化ＤＸ−３２８で予備画像化実験を行った。ヒトフィブリンゲルを、ウサギの大腿部動脈に配置された小さいワイヤーの周りに形成した。放射性標識化造影剤を、ウサギの耳静脈に注射し、γカメラを用いて画像を撮った。
【０１４３】
図４は、ＤＸ−３２８を投与されたテストウサギ、および市販の造影剤ＡＣＵＴＥＣＴ（Ｄｉａｔｉｄｅ）を投与された別のテストウサギのＸ線画像を示す。
【０１４４】
図４を参照すると、ＤＸ−３２８を投与されたウサギにおいて、血餅のない右腿と比べて、左腿の血餅（腹部画像中、ウサギの右側に見える）がはっきりと見える。血餅に結合しないＤＸ−３２８は、腎臓を介して身体から排出されるため、腎臓および膀胱は、予想通り高レベルの活性を有する。肺領域における放射性の強度は、まだクリアランスされていない循環している造影剤によるものである。注射と画像化との間の時間を長くすることで、非結合造影剤が腎臓を介してクリアランスされるので、肺領域およびその他の領域におけるバックグラウンドは低くなるであろう。あるいはまた、造影剤のクリアランス時間を減らすことで同じ効果が得られる。これは、トリシンの代わりにＥＤＤＡをコリガンドとして使用することにより達成できる。
【０１４５】
陽性対照として、ＡＣＵＴＥＣＴを用いて、血餅画像を、別のウサギにおいて得た。Ａｃｕｔｅｃｔは、フィブリンよりも、活性化血小板に結合する。従って、Ａｃｕｔｅｃｔ画像化実験のためには、フィブリンゲルの代わりに新しいヒト血液血餅を用いた。注射後９０分におけるＡｃｕｔｅｃｔ画像は、血餅のある左腿、対、血餅の無い右腿の区別ができたが、ＤＸ−３２８画像よりも違いがはっきりとしていない。
【０１４６】
実施例６：二次ライブラリーの作製およびスクリーニング
鋳型であるＴＮ−９／ＩＶライブラリーから単離したフィブリン結合ペプチドを用いて、二次ライブラリーを作製した。Fairbrotherら, Biochemistry, 37:17754-17764(1998)に記載されるソフトランダム化（soft randomization）によるペプチド最適化方法を用いて、アミノ酸配列ＷＱＰＣＰＷＥＳＷＴＦＣＷＤＰ（配列番号５）を有する合成ペプチドに基づきライブラリーを調製した。ライブラリーを作製するのに使用する鋳型ＤＮＡを合成する間、鋳型の各残基位置において、特定のコドン内の特定のヌクレオチドを置換した。従って、特定のコドンは、親コドンをコードしない他の３つのヌクレオチドを一定量付加することにより、進化させた。各コドンにおいて７０％の頻度で親ヌクレオチドを維持し、他のヌクレオチドは１０％の頻度で置換することで、サブライブラリーを作製した。親ヌクレオチドを大部分維持することで、全体的なコンセンサス配列を維持できた。しかし、個々の単離体の検査の際に、複数の突然変異が可能であり、これにより、親配列と比べて結合能力が改善したペプチドの選択が可能であった。
【０１４７】
フィブリンに特異的に結合するファージを選択する前に、ストレプトアビジン被膜ビーズを導入して、合計２×１０１１ｐｆｕのファージの二次ライブラリーから、ストレプトアビジンに対して親和性を有するファージを枯渇させた。枯渇させたファージライブラリーを、フィブリン標的（すなわち、実施例２と同様に調整したビオチン化し、ストレプトアビジンビーズに固定化させたヒトＤＤ（Ｅ））と混合した。２時間のインキュベーション、およびファージをＤＤ（Ｅ）に結合させるために標的を連続的に混合した後、ビーズを洗浄緩衝液（ＴＢＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）で複数回洗浄して、非結合ファージを除去した。
【０１４８】
結合したファージの回収は、二次ライブラリーを作製するのに使用する鋳型に対応する５０μＭの合成ペプチド（すなわち、ＤＸ−２８７（配列番号１５））をそれぞれ用いて３ステップで行った。第１のステップは、室温にて１時間の動的溶出であった。溶出したファージを回収し、細胞に感染させて増殖させるために使用した。第２のステップは、結合ファージを新しいペプチドと４℃にて一晩インキュベートおよび混合することにより行う動的溶出であった。溶出したファージを回収し、細胞に感染させて増幅させた。第３のステップでは、ファージを含むビーズを、宿主細胞に直接接触させ感染させることにより、（ＤＤ（Ｅ）ビーズ上に固定化されたままの）残ったファージを回収した。
【０１４９】
３ラウンドの選択を行った。第２および第３ラウンドのファージプラークを採取し、ＥＬＩＳＡおよび実施例３と同様の配列決定方法により分析して、ＤＤ（Ｅ）の特異的結合因子を検出し、高親和性フィブリン結合ペプチドの第２世代を同定した。二次ライブラリーから単離したフィブリン結合ペプチドの配列を以下の表３に示す。
【０１５０】
ＤＤ（Ｅ）陽性単離体を、５０μＭおよび５μＭの遊離ＤＸ−２８７ペプチドに対する競合についてアッセイした。親ペプチドと最小限の競合を示したペプチドは、より高い親和性結合因子であると見なされた。
【表３】
2004523514.tif 000006
【０１５１】
多数の実施形態および特徴を記載してきたが、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の開示または範囲の教示から逸脱することなく、記載してきた実施形態および特徴の改変および変更を行ってもよいことが当業者により理解されるであろう。
【０１５２】
本明細書において引用される文献は参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】動的溶出時間の関数として、回収したファージ単離体の数を示す(実施例４を参照)。
【図２】蛍光異方性による合成フィブリン結合ペプチドＤＸ−３０３の解離定数の測定を示す。
【図３】蛍光異方性による合成フィブリン結合ペプチドＤＸ−３０４の解離定数の測定を示す。
【図４】本発明の放射性標識化ペプチド（ＤＸ−３２８）、または市販のＸ線造影剤（Ａｃｕｔｅｃｔ）から調製した造影剤を用いて可視化した、人工フィブリン血餅を有するウサギのＸ線画像を隣り合わせて比較したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004523514.tif 000100
2004523514.tif 000101
【国際調査報告】
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