(57)【要約】本発明は、医薬品として受容し得る担体または希釈剤及び、（ｉ） 部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡ配列、及び（ｉｉ）組換え酵素の認識配列及び異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを含む細菌を含むワクチンに関するものである。この組換え酵素はプラスミドの遺伝を安定化し、それによって異種ポリペプチドを発現する能力が細菌から失われるのを防いでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として受容し得る担体または希釈剤及び下記を含む細菌：
（ｉ）部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡ配列；及び
（ｉｉ）組換え酵素の認識配列及び異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド、
からなるワクチン。
【請求項２】
異種ポリペプチドが病原体の抗原である請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
プラスミドが部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡ配列を含む請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
部位特異的組換え酵素が部位特異的組換え酵素の解離酵素ファミリーの一員である上記請求項のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
部位特異的組換え酵素がＲｓｄ解離酵素でありそして認識配列がｃｒｓ認識配列である請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
Ｒｓｄ解離酵素およびｃｒｓ認識配列がプラスミド上で０．５ｋｂ以下離れている請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
Ｒｓｄ解離酵素が
（ａ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置６８０から１４５９のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、
（ｂ）　（ａ）の相補体にハイブリッド形成するＤＮＡ分子、または
（ｃ）　（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ分子と同じアミノ酸配列をコードするが（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ分子の縮重型であるＤＮＡ分子、
によってコードされている請求項５または６に記載のワクチン。
【請求項８】
ｃｒｓ認識配列が
（ａ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド５４から５５６またはその相補体、または
（ｂ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド５３から５５６の配列を含むＤＮＡ分子とハイブリッド形成するＤＮＡ分子またはその相補体、
の配列を有する請求項５，６または７に記載のワクチン。
【請求項９】
認識配列と異種ポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターの間に転写終結配列が存在する上記請求項のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項１０】
ポリペプチドの発現がｎｉｒＢ， ｐａｇＣ， ｓｓａＨまたはｈｔｒＡプロモーターにより推進される上記請求項のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項１１】
細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ， Ｖｉｂｒｉｏ， Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ， Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ， ＬｉｓｔｅｒｉａまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属から選択されている上記請求項のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項１２】
細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ， Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ， Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ， Ｖｉｂｒｉｏ ＣｈｏｌｅｒａｅまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
細菌が病原性細菌の弱毒株である上記請求項のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項１４】
細菌がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉの弱毒株である請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
細菌がエンテロトキシン性Ｅ． ｃｏｌｉ （ＥＴＥＣ）、腸病原性Ｅ． ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸侵襲性Ｅ． ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）または腸管出血性Ｅ． ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）の弱毒株である請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１６】
細菌がＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉまたは Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉである請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１７】
細菌が以下の遺伝子：
ａｒｏ遺伝子、ｐｕｒ遺伝子、ｏｍｐＣ， ｏｍｐＦ， ｏｍｐＲ， ｈｔｒＡ， ｇａｌＥ， ｃｙａ， ｃｒｐおよびｐｈｏＰ、の少なくとも一つの遺伝子における非復帰突然変異により弱毒化している請求項１３から１６のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項１８】
細菌が１個、２個、３個または４個の異なる遺伝子における非復帰突然変異により弱毒化している請求項１３から１７のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項１９】
細菌が（ｉ）ｈｔｒＡ遺伝子または少なくとも一つのｏｍｐ遺伝子における非復帰突然変異及び（ｉｉ）少なくとも一つのａｒｏ遺伝子における非復帰突然変異により弱毒化している請求項１３から１８のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項２０】
細菌がａｒｏＣ遺伝子、ｏｍｐＦ遺伝子及びｏｍｐＣ遺伝子のそれぞれにおける非復帰突然変異により弱毒化している請求項１３から１８のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項２１】
細菌が２個の異なるａｒｏ遺伝子のそれぞれにおける非復帰突然変異により弱毒化している請求項１３から１９のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項２２】
ａｒｏ遺伝子がａｒｏＡ及びａｒｏＣ， ａｒｏＡ及びａｒｏＤまたはａｒｏＣ及びａｒｏＤである請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
異種ポリペプチドの発現が真核発現カセットにより行われる請求項１から９及び１１から２２のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項２４】
細菌が侵襲的細菌である請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
異種抗原がＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原である請求項２から２４のいずれか一つに記載のワクチン。
【請求項２６】
上記請求項のいずれか一つに規定されている細菌。
【請求項２７】
請求項１から１０、２３及び２５のいずれか一つに規定されているプラスミド。
【請求項２８】
ヒトまたは動物に予防接種する方法に使用する請求項１から２５のいずれか一つに記載のワクチンまたは請求項２６に記載の細菌。
【請求項２９】
ヒトまたは動物に予防接種するための医薬品を製造するために請求項２６に記載された細菌の使用。
【請求項３０】
請求項１から２５のいずれかに記載のワクチンまたは請求項２６に記載の細菌を宿主に投与することを含むヒトまたは動物に免疫応答を引き起こす方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はワクチンに使用するための細菌におけるプラスミド遺伝の安定化に関するものである。
【０００２】
（発明の背景）
予防接種の原理は宿主に免疫応答を誘導し、その後の病原体の攻撃に対する防御をすることである。これは病原体の生弱毒株、すなわち、強毒病原体によって引き起こされる病気を生じないような弱い毒性の株の接種により行なうことができる。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術の出現はワクチンの開発を非常に加速した。特に、この技術は病原体の異種抗原をコードする発現ベクターで形質転換された細菌を使用するワクチン開発の道を開いた。このことは、性質がよく分かっている細菌株を広範囲の種々の抗原を発現させるために使用することができ、免疫系に抗原を提示する担体として働かせることができることを意味している。
【０００４】
理想的には、ワクチンに使用する細菌は遺伝的に規定されており、弱毒であり、使用される動物及びヒトにおける耐容性があり、免疫原性を保持している。最近の遺伝子技術を使用して、今では安定した弱毒化欠失を創り出す遺伝的に確立した弱毒細菌株を構築することが可能になった。多数のサルモネラの位置指定突然変異がこの技術を使用して創り出された。非常に多数の遺伝子における突然変異は弱毒であったと報告されており、これにはａｒｏ遺伝子（例えば、ａｒｏＡ， ａｒｏＣ， ａｒｏＤ及びａｒｏＥ）， ｐｕｒ， ｈｔｒＡ， ｏｍｐＲ， ｏｍｐＦ， ｏｍｐＣ， ｇａｌＥ， ｃｙａ， ｃｒｐ及びｐｈｏＰが含まれる。
【０００５】
異種抗原の発現を指令するための組換えプラスミドをワクチンに使用する際の大きな問題はその不安定性である。ほとんどの組換えプラスミドは実験室に適合させたＥ．ｃｏｌｉまたはその他の細菌の株において比較的安定して遺伝するが、活発に増殖する細菌種、例えばチフス菌からは急速に消失することがしばしばある。
【０００６】
宿主に投与した生菌ワクチンから発現プラスミドが消失することは発現した免疫応答に対して悪影響を及ぼす。したがってその発現プラスミドの安定性の改善は生ワクチン開発に成功するための重要な要件である。生ワクチン中のプラスミドの維持を達成するために多数の系が示されている：
【０００７】
１．プラスミド維持はインビトロにおいて抗生物質耐性のようなプラスミドがコードするマーカーを指標として継続的に選別することにより行われることがある。しかし、これは、抗生物質の濃度を維持できないインビボにおいてプラスミド安定性を維持するには有効な方法ではない。
【０００８】
２．必要とする異種抗原をコードする遺伝物質をプラスミドベクターを全く必要とせずに細菌染色体中に組込むことができる。しかし、単一染色体コピーからの抗原発現のレベルでは一般的に機能的な免疫応答を発生させるには充分でない。
【０００９】
３．必須遺伝子を欠失した細菌株は細菌染色体から失われた必須遺伝子を有するプラスミドと合わせて使用される。プラスミドを失った細菌細胞はすべて死滅する。この最もよい例はａｓｄ「平衡致死」系（Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １９８９， １８（１−４）： ５８３−５９６）である。ａｓｄ平衡致死系において、ジアミノピメリン酸の非存在下に増殖すると染色体のａｓｄ突然変異は細胞を分解し易くする。ａｓｄ遺伝子はプラスミドが担っているので、プラスミドが失われると細胞の分解を生じる。この系ではプラスミド遺伝を改善しない；単にプラスミドを失った細胞を集団から除去するのみである。したがって、もしもプラスミドが遺伝の低下を示すと、細菌は増殖の低下を示し、これによりチフス菌の弱毒化を著しく促進し、ワクチンとしての作用を減じてしまう。プラスミドが比較的安定して遺伝するネズミチフス菌においてはこの系を使用する異種抗原の導入には成功したが、プラスミド遺伝の効率が余りよくないチフス菌ではよい成績は得られなかった（Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， １９９７． ６５（８）： ３３８１−３３８５）。このように平衡致死系はインビトロでは充分にプラスミドを維持したが、インビボでは有効ではなかった。
【００１０】
４．Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ （Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， １９９９， ６７（１２）： ６４２４−６４３３）はプラスミド維持を増強するために、安定化遺伝子座（プラスミドＰＳＣ１０１のｐａｒ）、分配系（プラスミドＲ１のｐａｒＡ）及びプラスミドＲ１のｈｏｋ−ｓｏｋ自殺系を組合わせて使用した。Ｇａｌｅｎらが使用した系のいずれも部位特異的組換え系を含んでいない。
【００１１】
組換えプラスミドに（１），（３）または（４）の系を取り入れたとしても、不安定な遺伝はチフス菌のような細菌において長期複製（１培養継代以上）では問題が継続する。（１）から（４）の系の中では系（４）のみが、そして特に（４）に使用されたｐａｒ及びｐａｒＡが、プラスミド遺伝の増強に役立っている；系（１）から（３）においては細菌集団からのプラスミドの消失は続くが、死滅機構によるプラスミドを失った細胞の除去によってプラスミドが維持されることはない。不安定プラスミドによるそのような死滅機構を使用することにより、既に弱毒化しているワクチン株はさらに弱毒化を生じ、有効性を低下させてしまう。
【００１２】
組換えプラスミドの不安定遺伝の原因は多分いくつかあるだろう。Ｓｕｍｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ （Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９３． ８（６）： １０３１−８）は、プラスミド不安定性の可能な要因として相同組換えの結果として細菌細胞に生じるプラスミド多量体の形成にあることを示唆している。
【００１３】
プラスミドは天然にはほとんどの細菌中に存在する。これらの大部分はコピー数が少ないが、選別をしなくともその遺伝は非常に安定している。天然に存在する系の安定性に寄与するいくつかの遺伝システムが記述されている。それらは：
−　分裂する細胞がそれぞれプラスミドの少なくとも１コピーを受け取る確率を増加させる分配機構；
−　コンジュゲーションによりプラスミドのない宿主にプラスミドを拡散することを可能にする移転機能（Ｅａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｏｌ．， １９９７． ７９（２０）： ６４７２−６４７９）；
−　細胞からのプラスミドの消失に基づいて活性化される自殺機構 （Ｐｅｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．， １９９７． ６３（５）： １９１７−１９２４）；及び
−　部位特異的組換えを必要とする多量体分解システム。
【００１４】
多量体分解システムはプラスミド多量体を単一プラスミドコピーに分解することにより安定性をもたらし、そしてそれ故に細胞分裂の無作為分離の間に生じるプラスミドの無い娘細胞の確率を減少させる。プラスミド多量体を単量体に分解するように作用する多数の部位特異的組換え系が同定されている。
【００１５】
（発明の要約）
ワクチンに使用する弱毒生菌の新規な株を開発する計画の一部として、我々は異種ポリペプチド、典型的に病原菌の異種抗原をこれらの細菌中で発現させるための発現プラスミドを開発した。このプラスミドは抗生物質選別を適用した場合に弱毒生菌中で安定して遺伝し、抗生物質選別を行なわない場合には同一菌株から消失することを発見した。我々はその安定性を増加させることを意図してプラスミドを修飾した。
【００１６】
我々は部位特異的組換え酵素および組換え酵素の認識配列をコードするＤＮＡフラグメントを含むカセットをプラスミド中に導入した。この修飾プラスミドは抗生物質選別をせずに増殖した弱毒生菌中に発現した場合にそれが由来した親のプラスミドよりも著しく安定していることが判明した。カセットを含むプラスミドは弱毒細菌中で抗生物質選別を適用して発現した場合にも親プラスミドよりも安定であることが判明した。
【００１７】
抗生物質選別を行なわずに４０から４５代培養した後にカセットを含むプラスミドは１００％の細菌細胞中に存在したが、一方カセットを含まない親プラスミドは同代数の培養後に１０％以下の細胞に存在した。抗生物質選別を適用した同様の実験では、修飾プラスミドはやはり親プラスミドより安定であった；典型的に、カセットを含むプラスミドは１００％の細胞が含んでいたのに対し、カセットを含まない親プラスミドはわずか８０％の細胞が含んでいた。
【００１８】
したがって、本発明は医薬として受容し得る担体または希釈剤及び細菌を含むワクチンを提供し、その細菌は以下を含有している：
（ｉ）部位特異的組換え酵素をコードしているＤＮＡ配列；及び
（ｉｉ）組換え酵素の認識配列を含むプラスミド及び異種ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列。
【００１９】
さらに、部位特異的組換え酵素をコードする配列と認識配列の間に介在する配列をカセットから除去して、この二つの機能的遺伝子座が互いに約１．５ｋｂフラグメント上に隣接するような改良がカセットに施されている。カセットから不必要な配列を除去することによりカセットが小さくなり、それを含むプラスミドをより小さくし、それにより操作がし易くなる。このカセットの縮小版もプラスミド遺伝を安定化するという点では元の大きな配列と同様に機能する。
【００２０】
またカセットを含むプラスミドは認識配列と異種ポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターの間に転写終結配列を導入する修飾も行なわれた。安定化カセット中の活性プロモーターによると推定される、カセットを含むプラスミドからの異種ポリペプチドの高レベルな構成的発現が観察されたので、これを行なった。この転写終結配列は、異種ポリペプチドの発現がそのためのプロモーターのみによって調節されることを確実にする。また安定化作用を維持しつつプロモーター作用に対応するカセットの領域を除去することも可能である。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明において有用なプラスミド
本発明に使用するプラスミドは部位特異的組換え酵素の認識配列及び異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでいる。望ましくはプラスミドは部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡ配列も含んでいる。そうでなければ、組換え酵素をコードするＤＮＡ配列は別のプラスミドに存在することもできるし、あるいは細菌染色体に組込むこともできる。本発明に使用することができる組換え酵素及び認識配列の性質について以下に詳細に検討する。
【００２２】
プラスミドが認識配列及び組換え酵素をコードするＤＮＡ配列を含む場合には、この二つの間に介在する配列の長さは少ない方が望ましい。介在配列の大きさを減ずる、または除去することによりカセットの大きさを減ずることは、それを含むカセット及びプラスミドが小さくなり、したがって組換えＤＮＡ技術を使用する操作が容易になる。典型的に、認識配列と組換え酵素をコードする配列の間隔は１．５ｋｂ以下、望ましくは０．５ｋｂ以下そしてさらに望ましいのは０．２ｋｂ以下である。
【００２３】
本発明の一態様において、認識配列及び異種ポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーターの間に転写終結配列が存在する。転写終結配列は、異種ポリペプチドの発現がそのためのプロモーターのみによることを確実にする。適当な転写終結配列はどれでも使用することができ、最小限の転写を生じるかあるいは全く生じない強力な転写終結配列が望ましい。本発明の望ましい態様において、５Ｓ ｒｒｎＢ転写ターミネーター類、ｒｒｎＢ Ｔ１及びｒｒｎＢ Ｔ２が使用される。これらのターミネーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されている。
【００２４】
望ましくは、異種ポリペプチド及び／または組換え酵素用の発現カセットは、プロモーター、転写開始部位、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、異種ポリペプチドまたは組換え酵素のコード配列、翻訳停止コドン及び転写ターミネーターから構成されている。
【００２５】
異種ポリペプチドの発現は種々のプロモーターにより行なうことができる。望ましくは原核プロモーター、及び特に選択した細菌株に適したプロモーターが使用されるであろう。特に、発現はｎｉｒＢプロモーターまたはｈｔｒＡプロモーター（それぞれＵＳＰ ５，６８３，７００及び ＷＯ ９５／２０６６５を参照）によって行なうことができる。ｐａｇＣまたはｓｓａＨプロモーターも使用することができる。典型的に組換え酵素の発現はそれ自身の内在性プロモーターによって行われるであろう。
【００２６】
プラスミドはまた抗生物質耐性のような選別マーカーを含むことができる。典型的にアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性遺伝子が使用される。本発明の望ましい態様において、カナマイシン耐性マーカーが使用される。本発明に使用したプラスミドは認識配列及び任意に組換え酵素をコードする配列も含むように修飾した当業者既知のプラスミドである。
【００２７】
本発明のプラスミドはプラスミド安定性またはプラスミド維持を増加させるための他のシステムを１以上含むこともできる。適当なシステムとしては自殺システム、平衡致死システム、パーティションシステム及びプラスミドｐＳＣ１０１のｐａｒ遺伝子座（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ，上記）がある。
【００２８】
平衡致死システムの場合には、細菌の生存に必須な遺伝子は細菌の染色体から除去される。染色体から除去された遺伝子はプラスミド上に存在する；したがってプラスミドの消失は細菌が生存できないことを意味する。本発明の一態様において使用された平衡致死システムは上記（３）に記述されたａｓｄシステムである。
【００２９】
自殺システムの場合には、プラスミドまたは細菌染色体はプラスミドをバラバラに分解する強力な細胞死滅剤をコードしているが、一方でこのプラスミドを持つ細菌は細胞死滅剤の解毒剤をコードするプラスミドにより保護されている。典型的に、細胞死滅剤及び／またはそれをコードするＲＮＡは解毒剤または解毒剤をコードするＲＮＡより安定である。このことは、プラスミドが消失した後に細胞死滅剤は細胞中に解毒剤よりも長くあるいは高濃度に存在するであろうから、プラスミドの消失は細菌の死を生じるであろう、と言うことを意味する。一般的に、細胞死滅剤はトキシンでありそして細胞膜孔または溶原物質であろう。解毒剤は細胞死滅剤をコードする遺伝子の発現を阻止することができるアンチセンスＲＮＡ、その物質を分解することができる酵素またはその物質に結合してそれを不活化するタンパクであろう。本発明の一態様において、自殺システムはｈｏｋ−ｓｏｋシステムである（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ上記）。
【００３０】
パーティションシステムの場合には、プラスミドの中に細胞分裂の際にプラスミドのコピーを各娘細胞が受け取る確率を増加させるような遺伝配列が含まれている。そのようなシステムは典型的にプラスミド分子を積極的に娘細胞中に物理的に分離するように作用する。本発明に使用するために適したパーティションシステムとしてはプラスミドｐＲ１（Ｇａｌｅｎ ｅｔ ａｌ上記）のｐａｒＡ動原体様積極パーティションシステムがある。
【００３１】
組換え酵素及び認識配列
認識配列を含むプラスミドの遺伝を安定化する部位特異的組換え酵素はいずれも本発明に使用することができる。組換え酵素は一般的に解離酵素である。解離酵素はプラスミド多量体を解離することができる。部位特異的組換え酵素はインテグラーゼまたはインベルターゼでもあり得るし、その一部は解離酵素活性を有している。
【００３２】
本発明に使用し得る解離酵素の例としてはプラスミドＰ１のＣｒｅ組換え酵素、Ｅ． ｃｏｌｉ ＸｅｒＣ （ＡｒｇＲ）タンパク、プラスミドＦのＤタンパク組換え酵素、プラスミドＲＰ４及びＲＰ２のＲａｒＡ組換え酵素、プラスミドＲ１の部位特異的組換え酵素、Ｔｎ３様転位性遺伝因子によりコードされる解離酵素及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ毒性プラスミドのＲｓｄ解離酵素がある。ここで言及しなかったが同様の作用を有するその他の解離酵素も本発明に使用することができる。本発明の特に望ましい態様において、組換え酵素はＲｓｄ解離酵素である。Ｒｓｄ解離酵素は
（ａ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置６８０から１４５９までのヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、
（ｂ）　（ａ）の相補体にハイブリッド形成するＤＮＡ分子または
（ｃ）　（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ分子と同じアミノ酸配列をコードしているが（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ分子と縮重しているＤＮＡ分子によってコードすることができる。
【００３３】
解離酵素をコードする配列に加えて、細菌は本発明に使用される部位特異的組換え酵素による多量体解離に必要な、または促進する、ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含むことができる。
【００３４】
本発明に使用できる認識配列は上記組換え酵素のためのものである。使用した部位特異的組換え酵素によって認識される認識配列であればいずれも使用することができる。適当な認識配列としてはＸｅｒＣ部位特異的組換え酵素によって認識される部位、例えばプラスミドＣｏｌＥ１のｃｅｒ部位及び類似するＣｏｌＫのｃｋｒ部位（Ｓｕｍｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｅｓ．， ２０１（２）： ３３４−３３８）、プラスミドｐＳＣ１０１のｐｓｉ部位及びＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉのプラスミドｐＨＳ−２のｃｅｒ様部位がある。その他の使用できる認識配列としてはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ毒性プラスミドのｃｒｓ部位、プラスミドＰ１のｌｏｘＰ部位、Ｆプラスミドのｒｆｓ部位及びＴｎ３様転位性遺伝因子のｒｅｓ部位がある。特にここで言及しなかったが同じ作用を有する配列も使用することができる。本発明の望ましい態様において、ｃｒｓ認識配列が認識配列として使用されている。ｃｒｓ認識配列は
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の５４から５５６のヌクレオチドまたはその相補体、または
（ｂ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の５３から５５６のヌクレオチドを含むＤＮＡ分子またはその相補体とハイブリッド形成するＤＮＡ分子、の配列を持つことができる。
【００３５】
採用した個別の組換え酵素を採用した細菌株に使用するために順応させることができる。例えば、選択した細菌株において特に良好に作用する既知組換え酵素の変異体を単離するために上述の検定と組合わせて突然変異選別を使用することができる。
【００３６】
同一細菌細胞中で二つ以上のプラスミドを安定化するために二つ以上の異なる部位特異的組換え酵素を同時に使用することができる。そのような態様において、安定化されるそれぞれのタイプのプラスミドは典型的に使用した組換え酵素の一つに特異的な異なる認識配列を含んでいる。その他には、各プラスミドがその組換え酵素の認識配列を含んでいる、同一細胞中の二つ以上の異なるプラスミドを安定化するために単一の部位特異的組換え酵素を使用することができる。
【００３７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の６８０から１４５９位置のＲｓｄ解離酵素をコードするポリヌクレオチド配列の同族体及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の５４から５５６位置のｃｒｓ認識配列のヌクレオチド配列の同族体を本発明に使用することができる。典型的に、同族体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の対応する配列と少なくとも７０％の配列相同性を有し、望ましくは少なくとも８０または９０％そしてより望ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％の配列相同性を有している。その配列相同性は少なくとも１５、望ましくは少なくとも３０、例えば４０，６０または１００またはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域に亘って存在している。
【００３８】
ポリヌクレオチド相同性の測定方法は当業者には良く知られている。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供するＵＷＧＣＧパッケージを相同性を計算するために、例えば、デフォルトセッティングで使用することができる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムも相同性を計算するためにまたは配列を整列するために（典型的にデフォルトセッティングで）使用することができる、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６： ２９０−３００またはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３−１０に記述されている。
【００３９】
同族体は典型的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中の対応する配列とバックグランド以上の有意レベルでハイブリッド形成する。同族体とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列の間の相互作用によって発生するシグナルのレベルは典型的にバックグランドハイブリッド形成の強さの少なくとも１０倍、望ましくは少なくとも１００倍である。相互作用の強さは、例えば、プローブの、例えば、３２Ｐによる放射標識により測定することができる。選択的ハイブリッド形成は典型的に中間から高度ストリンジェンシー、例えば０．０３Ｍ塩化ナトリウム及び０．００３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃から約６０℃という条件を使用して行なう。
【００４０】
同族体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中の対応する配列とは同族体の少なくとも３０、例えば少なくとも４０，６０または１００の連続ヌクレオチドの領域に亘って少なくとも１，２，５，１０あるいはそれ以上の置換、欠失または挿入によって異なっているであろう。この様に同族体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中の対応する配列とは少なくとも１，２，５，１０，３０あるいはそれ以上の置換、欠失または挿入によって異なっているであろう。
【００４１】
Ｒｓｄ解離酵素またはｃｒｓ認識配列の同族体について被検プラスミドを安定化する能力を試験することができる。可能性がある認識配列を試験する場合には、候補配列を試験プラスミド中に挿入しそして１以上の細菌株において組換え酵素の存在下または非存在下にそして／または配列を欠失したプラスミドと比較してプラスミドの安定性を評価することができる。組換え酵素同族体をコードする配列について組換え酵素の存在下と非存在下においてプラスミド安定性を比較することにより認識配列を含むプラスミドを安定化する能力を評価することができる。
【００４２】
プラスミド安定性は下記例に記述するプラスミド遺伝検定を使用して評価することができる。一般的に、この検定はプラスミドを含む細菌のコロニーまたは培養を準備することが必要である。細菌を培地に接種する。培養は一定時間増殖し、そして継代することができる。培養の終了時にまたは培養の間の時系列において、例えばプラスミド上に存在する選別マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含む細菌の比率を測定することにより、プラスミドを含んでいる細菌の比率を測定する。
【００４３】
プラスミド安定性はまたプラスミドを含むネズミチフス菌のような細菌でマウスに予防接種してインビボにおいて評価することもできる。脾臓中のそのプラスミドを含む細菌の比率を測定することができる。
【００４４】
さらに、プラスミド安定性はプラスミドで形質転換した細菌からプラスミドを単離し、単量体及び多量体のプラスミドの比率を測定することにより評価することができる；プラスミドの多量体型の存在は、プラスミドが単量体に解離されておらず、プラスミドが不安定であることを示している。典型的に、プラスミドＤＮＡは予め定めた時間、細菌の分裂回数または継代数、の後に単離され、そして単離は望ましくは経時的なプラスミド安定性を評価するために時系列に沿って行われる。
【００４５】
プラスミドＤＮＡの単量体及び多量体型の比率は、プラスミドＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動を行いそしてプラスミドの単量体及び多量体型の相違を、典型的に臭化エチジューム染色及びＵ．Ｖ．照射を使用して可視化することにより測定することができる。プラスミドの多量体型は単量体型よりもゲル中を遅く移動するのでこの二つを区別することができる。典型的にプラスミドＤＮＡは切れ目がないので超コイル構造をとっており、プラスミドの種々の型の解離は容易であろう。ある場合には種々のサイズの多量体がゲル上に段になって認められることがあり、それぞれの型の相対的比率を評価できる。代表的なゲルを図９に示したが、その中のレーン２は本発明のプラスミドを含みそしてレーン１は小さい対照プラスミドを含んでいる。
【００４６】
本発明に使用するための認識配列及び／または組換え酵素はこれらの検定において被検プラスミドを安定化し、または安定性を増加させることが望ましい。典型的にそれらはこれらの検定において被検プラスミドの多量体型を減少させまたは除去するであろう。
【００４７】
ＤＮＡワクチン
本発明の一態様において、ワクチンはＤＮＡワクチンである。望ましくは、その態様においてワクチンの担体細菌は侵襲的細菌でありそして異種抗原の発現は真核プロモーターによって行われる。本発明のそのような態様において、異種抗原の発現は典型的に予防接種された固体の細胞中において生じるであろう。
【００４８】
侵襲的細菌（宿主細胞に入り込むことができる細菌）はＤＮＡワクチンを搬送するために使用できることが示されている。米国特許番号５，８７７，１５９にはＤＮＡワクチンの原理及びそのようなワクチンがどのように作られるかが記述されている。米国特許５，８７７，１５９に使用されている方法及びワクチンは本発明と組合わせて適用することができる。
【００４９】
侵襲的細菌としては動物細胞の細胞質または核に自然に入り込むことができる細菌、並びに動物細胞の細胞質または核に自然に入り込むことはできないが遺伝子操作により入り込めるようにした細胞が含まれる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株はＤＮＡワクチンを搬送するために使用できることが示されている（Ｄａｒｊｉ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｃｅｌｌ， ９１， ７６５−７７５； Ｐａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， １９９８， ９２（９） ３１７２−３１７６）。
【００５０】
この態様において異種抗原を発現するために使用されるプロモーターは真核細胞中で機能する。プロモーターはＳＶ４０，ＣＭＶまたはＲＳＶプロモーターのようなウイルスプロモーターまたはβ−カゼイン、ウテログロビン、β−アクチンまたはチロシナーゼプロモーターのような真核細胞プロモーターであろう。望ましくは異種抗原を発現させるために使用されるプロモーターは抗原提示細胞（ＡＰＣ）において発現することができるものであろう。
【００５１】
本発明に有用な細菌
本発明のワクチンを作製するために使用される細菌は一般的に経口的に感染するものである。その細菌は真核細胞に侵入しそして増殖しそして／または粘膜表面にコロニーを作るものであろう。細菌は一般的にグラム陰性であるが鼻腔内予防接種を含む一部の態様においてはグラム陽性細菌を使用することができる。細菌は一般的に弱毒である。
【００５２】
使用する細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ， Ｖｉｂｒｉｏ， Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ， Ｙｅｒｓｉｎｉａ， Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ， Ｂｒｕｃｅｌｌａ， Ｌｉｓｔｅｒｉａ， Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ， Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ， Ａｅｒｏｍｏｎａｓ， Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ， Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ， Ｃｈｌａｍｙｄｉａ， Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ， Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ， Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ， ＬｅｉｓｈｍａｎｉａまたはＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ属から選択することができる。
【００５３】
本発明に使用するために特に望ましい細菌の例はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ‐これはヒトに下痢を生じさせることができる；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ‐いくつかの動物種においてサルモネラ病の原因；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ‐ヒトチフスの病因；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ‐ヒトにおける食中毒の原因の一つ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ‐ブタにおけるサルモネラ病の一因；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ‐ウシ、特に新生子ウシにおける全身性及び下痢性疾患の一因；Ｈａｅｍｏｐｈｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ‐髄膜炎の一因；Ｎｅｉｓｓｅｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ‐淋疾の一因；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ‐胃腸炎から致死性敗血症まで広い範囲のヒト病気の原因；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ‐百日咳の原因；及びＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ‐ウシの流産及び不妊及びヒトの波状熱として知られる病気の一因、である。
【００５４】
本発明においてＥ． ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株は特に有用である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは強力な免疫原であり、全身的及び局所的に細胞及び抗体の応答を刺激することができる。特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉの弱毒株は本発明において使用することが望ましい。本発明において使用することが望ましいＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉの株としてはＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ（ΔａｒｏＣΔａｒｏＤΔｈｔｒＡ）及びＣＶＤ９０８（ΔａｒｏＣΔａｒｏＤ）である（Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ６５（２）， ４５２−４５６）。エンテロトキシン性Ｅ． ｃｏｌｉ（「ＥＴＥＣ」）の弱毒株も使用することができる。ＥＴＥＣは下痢を生じるＥ． ｃｏｌｉに属している。ＥＴＥＣは小腸起始部にコロニーを作る。標準的なＥＴＥＣ株はＡＴＣＣ Ｈ１０４０７である。腸病原性Ｅ． ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸侵襲性Ｅ． ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）または腸出血性Ｅ． ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）の弱毒株も使用することができる。
【００５５】
侵襲的細菌は、予防接種した個体の細胞中に異種抗原を発現させるために真核発現カセットが使用される本発明の態様においては特に有用である。使用することができる天然の侵襲的細菌の例としてはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ， Ｌｉｓｔｅｒｉａ及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、並びにＥＴＥＣである。
【００５６】
本発明に使用するために望ましいＳｈｉｇｅｌｌａ株は米国特許５，８７７，１５９に記述されているものである。それらはＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ， （ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９９０３）， Ｓｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．２９９３０）， 及びＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅ （ＡＴＣＣ Ｎｏ．１３３１３）である。弱毒Ｓｈｉｇｅｌｌａ株はＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ２４５７ＴΔａｒｏＡ．ΔｖｉｒＧ （Ｎｏｒｉｅｇａ ｅｔ ａｌ， 上記）， Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｍ９０ＴΔｉｃｓＡ （Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６２：５６６４−５６６８ （１９９４））， Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｙ ＳＦＬ１１４ ａｒｏＤ突然変異体（Ｋａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｖａｃｃ．， １０： １６７−１７４ （１９９２））， 及びＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ΔａｒｏＡΔａｒｏＤ （Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ， Ｖａｃｃ．， ９： ６−９ （１９９１）である。
【００５７】
侵襲性になるように操作された非天然侵襲性細菌の例としてはＹｅｒｓｉｎｉａ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，Ａｅｒｏｍｏｎａｓ，Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ，Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂｒｕｃｅｌｌａ， Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，Ｖｉｂｒｉｏ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ及びＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ属から由来したものがある。これらの細菌は一般的にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｈｉｇｅｌｌａ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ，または腸侵襲性Ｅ．ｃｏｌｉの侵襲的性質を模倣して操作することができる。
【００５８】
典型的に、細菌は動物細胞の細胞質に入り込むことを可能にする遺伝子を挿入することにより遺伝子操作される。そのような遺伝子の例としては、Ｓｈｉｇｅｌｌａの侵襲タンパク、溶血素をコードするもの、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａの侵襲プラスミド上にあるもの、及びＬｉｓｔｅｒｉａのリステリオリシンＯがある（Ｆｏｒｍａｌ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ４６： ４６５（１９８４）； Ｂｉｅｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ３４５： １７５−１７６ （１９９０）； Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｉｎ： Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８６， １２１−１２４， Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． （１９８６）； ａｎｄ Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃ． Ｍｉｃｒｏ．， １１： ６１９−６２７ （１９９４））。インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ−２のようなウイルス遺伝子も使用することができる（Ｐｌａｎｋ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６９：１２９１８−１２９２４（１９９４））。
【００５９】
ここに言及した抗原はいずれも本発明のＤＮＡワクチンを使用して発現することができる。特に、ウイルスまたは真核抗原は真核細胞中で発現するように既に典型的に最適化されているので、それらは発現するであろう。例えば特別なコドンを使用しているために、真核細胞中では発現し難い細菌または非真核抗原の場合には、真核細胞中における発現を改善するためにこれらのポリペプチドをコードする遺伝子を修飾することができる。
【００６０】
弱毒化突然変異
望ましくは、本発明に使用する細菌は病原性を弱められている。使用される弱毒化突然変異は一般的に遺伝子の機能を完全に破壊している。これは遺伝子からのポリペプチド合成を完全に壊してしまうかまたは機能しないポリペプチドを合成するような突然変異を起こさせることにより達成される。いずれのポリペプチド合成も行なわせないために、遺伝子全体またはその５’−末端を除去することができる。遺伝子のコード配列ないの欠失または挿入を行なうことにより機能しないポリペプチド（例えば、野生型タンパクのＮ−末端のみを含むポリペプチド）のみを合成する遺伝子を創り出すことができる。
【００６１】
望ましくは突然変異は非復帰突然変異である。これは細菌がワクチンとして使用された時に本質的に野生型に復帰しないことを示す突然変異である。そのような突然変異には挿入及び欠失がある。挿入及び欠失は大きいことが望ましく、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０から６００ヌクレオチドである。
【００６２】
ワクチンに使用される細菌は規定された突然変異、つまり解析された突然変異、のみを含むことが望ましい。良く解析されていない突然変異は好ましくない副作用の原因となる性質を細菌に付与するリスクがあるので、そのゲノムの中に良く解析されていない突然変異を持つ細菌をワクチンとして使用することは好ましくない。
【００６３】
弱毒化突然変異は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような試薬を使用して化学的に、またはＴｎ１０突然変異誘発、Ｐ２２−介在形質導入、ラムダファージ介在乗換え、及び接合型転位のような組換えＤＮＡ技術を使用する非特異的突然変異を使用して細菌に導入することができる。しかし、組換えＤＮＡ技術を使用する部位指定突然変異誘発が望ましい、何故ならこの様にして構築された株は非常に良く規定されているからである。特に相同組換えを含む技術による遺伝子の欠失または突然変異が望ましい。
【００６４】
弱毒化突然変異の例としては、これに限定しないが：
（ｉ）独立栄養突然変異、例えばａｒｏ （Ｈｏｉｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９１：２３８−２３９ （１９８１））， ｇｕａ （ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｐａｔｈ．， ３： １２９−１４１ （１９８７））， ｎａｄ （Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂａｃｔ．， １７０： ３７２５−３７３０ （１９８８）， ｔｈｙ （Ｎｎａｌｕｅ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５５： ９５５−９６２ （１９８７）），及び ａｓｄ （Ｃｕｒｔｉｓｓ，上記 ）突然変異；
（ｉｉ）全体的調節機能を不活化する突然変異、例えばｃｙａ （Ｃｕｒｔｉｓｓ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５５： ３０３５−３０４３ （１９８７））， ｃｒｐ （Ｃｕｒｔｉｓｓ ｅｔ ａｌ （１９８７）， 上記）， ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ （Ｇｒｏｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８６： ７０７７−７０８１ （１９８９）； 及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８６： ５０５４−５０５８ （１９８９））， ｐｈｏＰ．ｓｕｐ．ｃ （Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂａｃｔ， １７２： ２４８５−２４９０（１９９０）） またはｏｍｐＲ （Ｄｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５７： ２１３６−２１４０ （１９８９））突然変異；
（ｉｉｉ）ストレス応答を修飾する突然変異、例えばｒｅｃＡ （Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏ．， ７： ９３３−９３６ （１９９３））， ｈｔｒＡ （Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏ．， ５： ４０１−４０７ （１９９１））， ｈｔｐＲ （Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍ．， １００： ８９４−９００ （１９８１））， ｈｓｐ （Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， １８： ２９５−３２９ （１９８４）） 及びｇｒｏＥＬ （Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉ．， ２４８： ７３０−７３２ （１９９０））突然変異；
（ｉｖ）特異的毒性因子における突然変異、例えばｌｓｙＡ （Ｌｉｂｂｙ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９１： ４８９−４９３ （１９９４））， ｐａｇまたは ｐｒｇ （Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９０）， ｓｕｐｒａ； ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ （１９８９）， 上記）， ｉｓｃＡまたは ｖｉｒＧ （ｄ’Ｈａｕｔｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏ．， ６： ８３３−８４１ （１９９２））， ｐｌｃＡ （Ｍｅｎｇａｕｄ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５： ３６７−７２ （１９９１）； Ｃａｍｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ， １７３： ７５１−７５４ （１９９１）），及び ａｃｔ （Ｂｒｕｎｄａｇｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９０： １１８９０−１１８９４ （１９９３））突然変異；
（ｖ）ＤＮＡトポロジーに影響する突然変異、例えばｔｏｐＡ （Ｇａｌａｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５８： １８７９−１８８５ （１９９０））突然変異；
（ｖｉ）表面ポリサッカライドの生合成を阻害する突然変異、例えばｒｆｂ， ｇａｌＥ （Ｈｏｎｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， １５６： １６４−１６７ （１９８７））またはｖｉａ （Ｐｏｐｏｆｆ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３８： ２９７−３０４ （１９９２））突然変異；
（ｖｉｉ）自殺システムを修飾する突然変異、例えばｓａｃＢ （Ｒｅｃｏｒｂｅｔ ｅｔ ａｌ， Ａｐｐ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ．， ５９： １３６１−１３６６ （１９９３）； Ｑｕａｎｄｔ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ， １２７： １５−２１ （１９９３））， ｎｕｃ （Ａｈｒｅｎｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ， Ａｐｐ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ．， ６０： ３７４６−３７５１ （１９９４））， ｈｏｋ， ｇｅｆ， ｋｉｌ， または ｐｈｌＡ （Ｍｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４７： １３９−１６６ （１９９３））突然変異；
（ｖｉｉｉ）自殺システムを誘導する突然変異、例えばＰ２２ （Ｒｅｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｖｉｒｏｌ．， １４３： ２８０−２８９ （１９８５））によりコードされる溶原、ラムダムレイングリコシル転位酵素（Ｂｉｅｎｋｏｗｓｋａ−Ｓｚｅｗｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １８４： １１１−１１４ （１９８１））またはＳ−遺伝子（Ｒｅａｄｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｖｉｒｏｌ．， ４３： ６２３−６２８ （１９７１）； 及び
（ｉｘ）正しい細胞周期を混乱させるかまたは修飾する突然変異、例えばｍｉｎＢ（ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ， ５６： ６４１−６４９ （１９８９））突然変異。
【００６５】
望ましくは、本発明に使用される細菌は１個、２個、３個または４個の別々の遺伝子における非復帰突然変異により弱毒化される。典型的に突然変異は少なくとも次の遺伝子の一つにあるであろう：ａｒｏ遺伝子、ｐｕｒ遺伝子、ｏｍｐＣ， ｏｍｐＦ， ｏｍｐＲ， ｈｔｒＡ， ｇａｌＥ， ｃｙａ， ｃｒｐ， 及びｐｈｏＰ。
【００６６】
本発明の望ましい態様において、細菌は下記における非復帰突然変異により弱毒化される：
−　ｈｔｒＡ遺伝子及び少なくとも１個のａｒｏ遺伝子；
−　少なくとも１個のａｒｏ遺伝子及び少なくとも１個のｏｍｐ遺伝子；
−　ａｒｏＣ遺伝子、ｏｍｐＦ遺伝子、及びｏｍｐＣ遺伝子のそれぞれ；または
−　２個の別々のａｒｏ遺伝子のそれぞれ、特にａｒｏＡ及びａｒｏＣ、ａｒｏＡ及びａｒｏＤまたはａｒｏＣ及びａｒｏＤ。
【００６７】
異種ポリペプチド
幅広い種類の異種ポリペプチドを本発明のワクチンに使用される細菌によって発現することができる。細菌によって自然には発現されないという意味においてそのポリペプチドは細菌にとっで「異種」である。そのペプチドは典型的に宿主細菌にとっては異なる種のものであるが、同じ種の異なる株のものであり得る。細菌を操作して１以上の異種ポリペプチドを発現することができるが、その場合にポリペプチドは同じ生物のものでも異なる生物のものでも良い。
【００６８】
本発明の望ましい態様において、異種ポリペプチドは病原体の異種抗原である。異なる病原体の２以上の異種抗原を発現することができ、１つのワクチンにより複数の病原体それぞれに対して予防接種することができる。
【００６９】
異種ポリペプチドは抗原決定基を含む完全なタンパクまたはタンパクの一部であり得る。本発明の一態様において、異種ポリペプチドは融合タンパクである。融合は２以上の異なる抗原または抗原と異種ポリペプチドの免疫原性を高めるように設計された領域を含むことができる。破傷風毒素の無毒性フラグメントＣ（ＴｅｔＣ）との融合を使用することができる。
【００７０】
抗原は細菌、ウイルス、イースト、カビまたは寄生虫のものであり得る。
【００７１】
異種ポリペプチドを誘導することができるウイルスの例としては：呼吸器シンシチアウイスル；オルソミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルス；レトロウイルス、例えばＲＳＶ，ＨＩＶ及びＳＩＶ；ヘルペスウイルス、例えばＥＢＶ，ＣＭＶまたは単純疱疹ウイルス；レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス；ラブドウイルス、例えば狂犬病ウイルス；ピコルナウイルス、例えばポリオウイルス；ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス；ロタウイルス；及びパルボウイルスがある。
【００７２】
異種ポリペプチドとして発現される望ましいウイルス抗原の例としては、ヒト免疫不全ウイルス抗原Ｎｅｆ，ｐ２４，ｇｐ１２０，ｇｐ４１，Ｔａｔ，Ｒｅｖ，及びＰｏｌ（Ｎａｔｕｒｅ， ３１３： ２７７−２８０ （１９８５））及びｇｐ１２０のＴ細胞及びＢ細胞の抗原決定基（Ｐａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４２： ３６１２−３６１９ （１９８９））；Ｂ型肝炎表面抗原（Ｗｕ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８６： ４７２６−４７３０ （１９８９））；ロタウイルス抗原、例えばＶＰ４（Ｍａｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８７： ５１８−５２２ （１９９０））及びＶＰ７（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６２： １８１９−１８２３ （１９８８））、ヘマグルチニンまたは核タンパクのようなインフルエンザウイルス抗原（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， 上記；Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，上記）及び単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｈｉｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ， Ｉｎ： Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ８２５−８５４ページ）がある。
【００７３】
異種抗原を誘導することができる病原性細菌の例としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ， Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｓｈｉｇｅｌｌａ， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ， Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ， Ｌｉｓｔｅｒｉａ， Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ， Ｙｅｒｓｉｎｉａ， Ｖｉｂｒｉｏ， Ｂｏｒｅｌｌｉａ， Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ， Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｂｒｕｃｅｌｌａ， Ａｅｒｏｍｏｎａｓ， Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ， Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ， Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ， Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ， Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ及びＣｈｌａｍｙｄｉａ属がある。
【００７４】
異種抗原として発現される望ましい細菌抗原の例としては、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ １型抗原（Ｆｏｒｍａｌ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ３４： ７４６−７５０ （１９８１））；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓのＦ１抗原（Ｔｉｔｂａｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， １９９７， ６５（５）， １９２６−１９３０）； Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｔｉｄｉｓの抗原及び特にＧＮＡ３３，ＧＮＡ２００１，ＧＮＡ１２２０及びＧＮＡ１９４６遺伝子によってコードされる抗原（Ｐｉｚｚａ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０００， ２８７， １８１６−１８２０ （２０００））；Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｉｎａｂａ ５６９Ｂ株Ｏ−抗原（Ｆｏｒｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．， １５９： １４５−１４６ （１９８９）；毒素原性大腸菌の防御抗原、例えばコロニー形成因子抗原を含む線毛抗原、特にＣＦＡ／Ｉ，ＣＦＡ／ＩＩ，及びＣＦＡ／ＩＶ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５０： ９２５−９２８ （１９８５））及び熱不安定トキシンの非毒性Ｂ−ユニット（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ， ４６： ５６４−５６９ （１９８４））；百日咳菌のペルタクチン（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｖａｃｃ．， １０： ４３−４８ （１９９２））、百日咳菌のアデニルシクラーゼ−溶血素（Ｇｕｉｓｏ ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏ． Ｐａｔｈ．， １１： ４２３−４３１ （１９９１））；破傷風菌の破傷風毒素のフラグメントＣ（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５８： １３２３−１３２６ （１９９０））及びＬＴ（熱不安定腸毒素）及びＳＴ（熱安定毒素）抗原がある。
【００７５】
それから異種抗原を誘導することができる寄生虫抗原の例としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ， Ｃｈｔａｍｙｄｉａ， Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ， Ｇｉａｒｄｉａ， Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ， Ｂａｂｅｓｉａ， Ｅｎｔａｍｏｅｂａ， Ｅｉｍｅｒｉａ， Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ， Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ， Ｂｒｕｇｉａ， Ｆａｓｃｉｄａ， Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ， Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ， 及びＯｎｃｈｏｃｅｒｅａ属がある。
【００７６】
異種抗原として発現する寄生虫病原体の望ましい抗原の例としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のマラリア原虫抗原（Ｓａｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０： ３３６−３３７ （１９８８））、例えばＰ． ｂｅｒｇｅｒｉｉのマラリア原虫抗原またはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのマラリア原虫抗原；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のメロゾイト表面抗原（Ｓｐｅｔｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．， ４３： ３５１−３５８ （１９９４））；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａのガラクトース特異的レクチン（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８８： ３２４８−３２５２ （１９９１））；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種のｇｐ６３（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４０： １２７４−１２７８ （１９８８））；Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉのパラミオシン（Ｌｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．， ４９： ３１５−３２３ （１９９１））；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉのトリオースリン酸イソメラーゼ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８９： １８４２−１８４６ （１９９２））；Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓの分泌グロビン様タンパク（Ｆｒｅｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．， ５０： ２７−３６ （１９９２））；Ｆｒａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ（Ｈｉｌｌｙｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｘｐ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．， ７５： １７６−１８６ （１９９２））、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｂｏｖｉｓ及びＳ． ｊａｐｏｉｃｕｍ （Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ， Ｔｒｏｐ． Ｇｅｏｇ． Ｍｅｄ．， ４６： ２５５−２５８ （１９９４）） のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｂｏｖｉｓ及びＳ． ｊａｐｏｎｉｃｕｍのＫＬＨ（Ｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ， 上記）がある。
【００７７】
異種抗原は腫瘍特異的抗原でもあり得る。望ましい腫瘍特異的抗原としては、前立腺特異的抗原（Ｇａｔｔｕｓｏ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ．， ２６： １２３−１２６ （１９９５））、ＴＡＧ−７２及びＣＥＡ（Ｇｕａｄａｇｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｒｋｅｒｓ， ９： ５３−６０ （１９９４）），ＭＡＧＥ−１及びチロシナーゼ（Ｃｏｕｌｉｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａ．， １４： １０４−１０９ （１９９３））がある。
【００７８】
異種抗原は移植抗原でもあり得る。望ましい移植抗原の例としては、Ｔ細胞上のＣＤ３受容体がある。（Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ， Ｄｉｇｅｓｔ． Ｄｉｓ． Ｓｃｉ．， ４０：５８−６４ （１９９５））
【００７９】
異種抗原は修飾されていても良いしあるいは免疫される種に本来備わっている抗原であっても良い。異種抗原は自己免疫抗原でもあり得る。自己免疫抗原の例はＩＡＳβ鎖である（Ｔｏｐｈａｍ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９１： ８００５−８００９ （１９９４））。
【００８０】
本発明の特に望ましい態様において、異種抗原はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属の細菌、特にＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉから誘導される。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原はウレアーゼ、カタラーゼ、ＡｌｐＡまたはこれらのいずれかのフラグメントであり得る。本発明の望ましい態様において、２以上のＨ． ｐｙｌｏｒｉ抗原がワクチンによって提供される。
【００８１】
本発明の一部の態様において、安定化するためにプラスミドによってコードされている異種ポリペプチドは異種抗原をコードする配列と別に、またはそれに加えて存在することができる。例えば、ポリペプチドは細菌染色体または第二プラスミド上の配列によりコードされている異種抗原の発現を調節または変化させることができる。その他に、または加えて、プラスミドによりコードされている異種ポリペプチドは選別マーカーまたはプラスミドを有している細菌の最適な増殖に必要なポリペプチドであろう。
【００８２】
異種ポリペプチドが調節的な役割を演じている場合には、異種抗原をコードする配列の発現を活性化するまたは増加することに関係しているであろう。調節は適当な時に、例えば増殖の適当な段階または予防接種のために宿主に投与された時、にのみ抗原の発現が活性化されるように誘導することができる。このことは発現が誘導されるまでプラスミドを有する細菌に対する早期の選別圧力を除くかまたは減少させるのに役立つ。
【００８３】
ワクチンの作製
ワクチンは弱毒細菌ワクチンを作製する既知技術を使用して製剤化することができる。ワクチンは典型的に経口投与のために、例えば投与の前に緩衝液に入れて調製するための乾燥した安定な粉末として提供される。調製は細菌の生存を保証する適当なｐＨの緩衝液で簡単に行われる。弱毒細菌及びワクチンを胃酸から保護するために、重炭酸ナトリウム製剤をワクチンの投与毎に一緒に投与するのが便利である。その他には、ワクチンは腸溶カプセルの形態で提供される。
【００８４】
ワクチンは望ましくは哺乳動物の、特にヒト宿主のみならず動物宿主の予防接種に使用することができる。このように微生物、特に病原体による感染を本発明によって調製したワクチンの有効量を投与することにより防ぐことができる。本発明の一態様において、ワクチンは病原性微生物の心配を減少させるであろうし、また感染を防ぐ事ができなくても感染により生じる病気を防ぐか好転させるであろう。使用する用量は最終的には医師の判断によるが、宿主の大きさ及び体重及び製剤化したワクチンのタイプなどを含む種々の因子によるであろう。しかし、７０ｋｇ成人宿主に対する用量は１０７から１０１１細菌、望ましくは１０８から１０９及びより望ましくは５ｘ１０８細菌が適当であろう。
【００８５】
本発明の一部の態様では、ワクチンは１以上の細菌株または種を含んでおり、それぞれの細菌は異なる抗原または抗原のセットを発現する。
【００８６】
例
配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はｒｓｄ及びｃｒｓ配列（天然に存在する介在配列を除去した）及びｒｒｎＢ転写終結配列を含む本発明に使用し得るカセットのヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列にコードされているＲｓｄ組換え酵素のアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はＰＣＲプライマー５９５９のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はＰＣＲプライマー５９６０のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５はＰＣＲプライマー５９６１のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はＰＣＲプライマー５９６２のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７はＰＣＲプライマー５９７４のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８はＰＣＲプライマー５９８９のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９はＰＣＲプライマー５９９０のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はＰＣＲプライマー５９９１のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１はＰＣＲプライマー５９９２のヌクレオチド配列を示す。
【００８７】
材料及び方法
細菌株及びプラスミド。使用した細菌株及びプラスミドは表１に示した。
【００８８】
組換えＤＮＡ技術。標準的な方法を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）。プラスミド精製はＱＩＡＧＥＮＴＭのキットを使用して行なった。クローニングのためのＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅は高度信頼性Ｐｆｕ ＴｕｒｂｏＴＭポリメラーゼ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）を使用して行なった。他のＰＣＲ増幅はＴａｑポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＴＭ）を使用して行なった。ＤＮＡフラグメントはアガロースゲルからＱＩＡＧＥＮＴＭのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して単離した。
【００８９】
プラスミド遺伝検定。アンピシリン２００ ｍｇ／ｍｌ、カルベニシリン３００ ｍｇ／ｍｌ、またはカナマイシン２０ ｍｇ／ｍｌを添加したチフス菌株のＬ−ブロス培養をコロニーから接種し、３７℃で終夜増殖した。この培養を抗生物質選別なしで１：１０，０００希釈して新鮮Ｌ−ブロスに接種するために使用し、新規な培養を３７℃で終夜増殖した。この株を数回この様にして継代し、そして各培養毎に細菌の全数及びアンピシリン耐性菌数を測定するため希釈液を３重複してＬ−寒天及びアンピシリン２００ ｍｇ／ｍｌまたはカナマイシン２０ ｍｇ／ｍｌを添加したＬ−寒天上に展開した。抗生物質耐性を維持しているコロニーの比率を測定して各プラスミドの安定性を少なくとも３回の独立した実験において測定した。図５−８のデータは各時点における３回の測定の平均値としてプロットしてある。
【００９０】
ウレアーゼ発現のウエスタンブロット分析。これはＮｏｖｅｘＴＭの装置及び試薬を使用して行なった。細菌細胞を３７℃で終夜培養したＬ−ブロス培養の１ｍｌから採取した。細胞を１ｍｌ ＰＢＳで洗い、１００ｍｌ ＰＢＳに再懸濁した。２％β−メルカプトエタノールを添加した同容量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検体平衡液を加え、沸騰水浴中５分間インキュベートした。３から６ｍｌ容量を１２％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、タンパクをニトロセルロース膜に電気転移した。以降の処理は室温において行なった。膜をＰＢＳ中５％脱脂乳、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ（ＰＢＳＴ）で１時間固定し、ついで１％脱脂乳ＰＢＳＴ中１：２，０００に希釈した抗−ウレアーゼポリクロナールウサギ血清に移した。次いで膜を１％脱脂乳ＰＢＳＴ中１０分間４回洗い、次いで１％脱脂乳ＰＢＳＴ中１：２，０００に希釈したヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートと１時間インキュベートした。膜を上記のように４回洗い、次いでＥＣＬフィルムに照射する前に増強化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）検出試薬（ＡｍｅｒｓｈａｍＴＭ）を加えた。
【００９１】
結果
例１：
Ｓ． ｔｙｐｈｉにおけるプラスミド消失。プラスミドｐＨＵＲ３（図１）及びｐＮＵＲ３はそれぞれネズミチフス菌ｈｔｒＡまたはｎｉｒＢプロモーターにより発現するＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉから由来した複製起点及びｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性決定基及びｕｒｅＡＢ遺伝子を使用している。我々は、ブロス培養における対数増殖期の間に両プラスミドはチフス菌ワクチン株ＣＶＤ９０８及びＢＲＤ９４８から消失することを観察した。この不安定性は、３０継代後に一般的に組換えプラスミドを含有し続けている細菌細胞は２０％以下であるような程度である。さらに、アンピシリンによる選別の存在下においても、静止期培養中の細菌のかなりの部分はプラスミドを持っていない（図５）。これは多分多数の細菌が培養中にβ−ラクタマーゼを発現するためにアンピシリンが急速に不活化されるからである。
【００９２】
Ｓ． ｄｕｂｌｉｎ毒性プラスミドのｒｓｄ−ｃｒｓ遺伝子座を取込むプラスミド誘導体の構築。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ毒性プラスミドのトランス作用解離酵素遺伝子（ｒｓｄ）及びシス作用多量体解離部位（ｃｒｓ）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ及びＳｍａＩにより作製した３ｋｂフラグメントの中にマップし、そしてそのヌクレオチド配列を確認した（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １９９１． １７３（１８）： ５７５４−５７６２）。ｒｓｄ−ｃｒｓ遺伝子座を取込んだＤＮＡフラグメントはプライマーとしてオリゴヌクレオチド５９６０及び５９６１を使用してＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎから調製したプラスミドＤＮＡから増幅した。このフラグメントはＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＨＵＲ３のＥｃｏＲＩ部位にクローン化してプラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄ（図２）を得た。このプラスミドはチフス菌株ＢＲＤ９４８及びＢＲＤ１１１６を電気穿孔により形質転換するために使用した。生成した株のいずれもプラスミドｐＨＵＲ３を含有する株に比較して遺伝安定性が有意に増加することを示した（図６）。
【００９３】
例２：
プラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ毒性プラスミドのｒｓｄ組換え酵素およびｃｒｓ組換え部位を天然の構造で、機能不明のオープンリーディングフレームを含む約１．５ｋｂの介在配列と共に、組込んでいる。我々は組換え発現ベクターのサイズを小さくするために介在配列を除去したｐＨＵＲ３ｒｓｄの変異体を作製した。鋳型としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎから調製したプラスミドＤＮＡ及びプライマーとしてｃｒｓに対してオリゴヌクレオチド５９６０及び５９６２、及びｒｓｄに対して５９６１及び５９７４（表２）を使用して、ｒｓｄ及びｃｒｓ遺伝子座をＰＣＲ増幅した。次いで２個のフラグメントに重複延長ＰＣＲによるスプライシングを行ない、そして生成したｒｓｄ−ｃｒｓカセットをベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ （ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）中にクローン化した。ここからｐＨＵＲ３のＥｃｏＲＩ部位中にこのカセットを再クローンしてプラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４（図３）を得た。
【００９４】
ｒｓｄ−ｃｒｓカセットは弱毒チフス菌株におけるｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４の遺伝を安定化する。プラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４を弱毒チフス菌株ＢＲＤ９４８中に遺伝子導入し、継代数に対するプラスミド含有細胞比率を数回の実験により測定した。ｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４誘導体は殆どの実験において元のプラスミドｐＨＵＲ３よりも有意に安定であった（図７）。しかし、ｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４の消失率は実験間で若干の変動があった。さらに、一度ｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４の消失が始まると、その消失はｐＨＵＲ３よりも早かった。
【００９５】
ＵｒｅＡＢはｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４から過剰発現する。プラスミドｐＨＵＲ３はその中のウレアーゼ、ｕｒｅＡＢ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉのオペロンはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｈｔｒＡプロモーターから発現する発現ベクターである。これは、異種抗原に対する免疫応答を増強することが認められているチフス菌の宿主細胞への侵襲が生じた時にｕｒｅＡＢの発現が誘導されるのを確実にする。さらに、異種抗原の発現はそれがコードされているプラスミドの遺伝に対して不安定化する影響を及ぼすことができる。したがって、それをコードしているプラスミドを維持するためにインビトロ増殖の間は異種抗原の発現を抑制することが望ましい。したがって、我々はｐＨＵＲ３中へのｒｓｄ−ｃｒｓカセットの導入がｕｒｅＡＢの発現に影響しないことを確認することにした。チフス菌株のウエスタンブロット分析は、ｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４からのＵｒｅＡＢの発現はｐＨＵＲ３からよりは有意に高いことを示した。これもまたｒｓｄ−ｃｒｓカセットの方向が逆転しているケースであった。このことはｒｓｄ−ｃｒｓカセット内に始まる強いそして異なるプロモーター作用があり、ｕｒｅＡＢオペロンの制御できない転写を生じたことを示している。
【００９６】
高レベルのウレアーゼ発現のために安定化カセットに調節できないプロモーターを加えてしまったのでそれを含むチフス菌細胞にプラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４が著しい負荷を与えていると我々は結論する。プラスミドを失った細胞が稀に生じた時には、この追加的負荷のために速い速度でウレアーゼを発現し続ける細胞がより早く増殖する。このように、一度開始したプラスミド消失の速度はｐＨＵＲ３におけるよりもｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４における方が速い。
【００９７】
例３：
Ｅ． ｃｏｌｉのｒｒｎＢ ５Ｓ ＲＮＡ遺伝子の３’−領域は強力な転写ターミネーターを組込んでいる（Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ， １９８４． ２７（２）： １６１−１７２）。ウレアーゼ発現に対するｒｓｄ−ｃｒｓカセットの作用に対抗するために、ｈｔｒＡプロモーターのすぐ上流にこの転写ターミネーターを使用してｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４誘導体を構築した。さらに、β−ラクタム抗生物質は治療に使用されることが多いので、ワクチン株の成分としてβ−ラクタマーゼ抵抗性決定基を持たない方が望ましい。したがって我々は、このｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４誘導体のｂｌａ遺伝子をプラスミドｐＨ３ＲＣ３に付与したカナマイシン抵抗性決定基と置換した（図５）。
【００９８】
プラスミドｐＨ３ＲＣ３は以下のようにして構築した。最初に、ｃｒｓに近接するＥｃｏＲＩ部位を除去した。ＥｃｏＲＩで部分消化した後アガロースゲルから線状プラスミドを単離してこれを行なった。付着末端を付けそしてＤＮＡを結合してＥ． ｃｏｌｉ株ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）に遺伝子導入した。関連ＥｃｏＲＩ部位を欠失した組換えプラスミドを選別し、ｐＨ３ＲＣ１と命名した。ｒｒｎＢ ５Ｓ転写ターミネーター領域をプライマーとしてオリゴヌクレオチド５９９１及び５９９２（表２）を使用してＥ． ｃｏｌｉ　ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。オリゴヌクレオチドの効果により、生成したフラグメントは一端にＥｃｏＲＩ領域を、他端にＥｃｏＲＩに適合する付着末端を作るＡｐｏＩ部位を含んでいる。ＰＣＲ増幅により得られたフラグメントはｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）にクローン化し、そしてこれからＡｐｏＩを使用して切り出し、そしてｐＨ３ＲＣ１のＥｃｏＲＩ部位に再クローンした。クローン化フラグメントを適切な方向に有する組換えプラスミドはプライマーとしてオリゴヌクレオチド５９９２及び５９５９を使用するＰＣＲにより同定し、ｐＨ３ＲＣ２と命名した。カナマイシン耐性決定基をカナマイシンＧｅｎＢｌｏｃｋ（ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭ）からプライマーとしてオリゴヌクレオチド５９８９及び５９９０（表２）を使用してＰＣＲ増幅した。生成したフラグメントをＢｓｐＨＩで消化し、そしてアンピシリン耐性決定基を除去するために同じ制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＨ３ＲＣ２の中へ直接クローン化した。カナマイシン耐性誘導体を選別し、そしてカナマイシン抵抗決定基の方向を、正しい構造に期待されるサイズ（約１．２ｋｂ）のＤＮＡフラグメントを発生するオリゴヌクレオチド５９６２及び５９９０を使用するＰＣＲにより確認した。これらの誘導体の一つをｐＨ３ＲＣ３（図４）と命名した。
【００９９】
チフス菌におけるプラスミドｐＨ３ＲＣ３のインビトロ安定性。プラスミドｐＨ３ＲＣ３をＢＲＤ９４８に導入し、そして大きな継代数における遺伝を検定した。独立に行なった３実験において８０世代の間消失せずに維持された（図８）。
【０１００】
例４：
本発明はＤＮＡワクチンの安定化にも使用することができ、そしてこの例はどのようにしてＤＮＡワクチンを作ることができるかを説明するための紙上例である。
【０１０１】
ｃｒｓ−ｒｓｄカセットは制限フラグメント上のｐＨ３ＲＣ３から作ることができ、そして標準的なクローニング方法によりＤＮＡワクチンベクター中に挿入する。例えば、ｐＶＡＸ−Ｆは、ＥｃｏＲＩフラグメント上の呼吸器シンシチアウイルスのＦ抗原をコードする遺伝子をＣＭＶ−βプロモーターの多重クローニング部位下流にクローニングすることにより市販ベクターｐＶＡＸ−１（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）から作製することができる。
【０１０２】
本発明のＤＮＡワクチンの安定性は、原核発現プラスミドについて記述したのと同様のインビトロシステムを使用してチフス菌及びネズミチフス菌において評価することができる。さらに、このプラスミドを含有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株はＪ７７４及びＵ９３７のような細胞系にマクロファージを感染させそして株の経時的なプラスミド維持能力を測定することもできるであろう。
【０１０３】
ＤＮＡワクチンを含むネズミチフス菌株でマウスを経口的に予防接種することができる。株の維持、及びその中のプラスミドの安定性は予防接種後の種々の時点においてマウス脾臓において測定することが可能である。
【０１０４】
例５：
ｃｒｓ−ｒｓｄカセットのｃｒｓ領域は両方向に強いプロモーター作用を持っている。このことはｐＨＵＲ３に比較してプラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４によりウレアーゼ発現のレベルが増加することにより示されている。この性質は、例えばｈｔｒＡまたはｎｉｒＢプロモーターによるインビボ調節発現をするように設計した発現ベクターには望ましくない。ｃｒｓ領域のプロモーター作用はＲｓｄ結合及び安定遺伝の性質を生じる組換えに必要な部位とは異なるであろう。プロモーター部位を決定するｃｒｓ領域及び組換えに必要な領域のマッピングは組換え作用を持つがプロモーター作用は持たない誘導体を構築することを可能にするであろう。これはこのことをどのようにして行なうかを示す紙上実験である。
【０１０５】
ｃｒｓ領域の削除誘導体を前記重複延長ＰＣＲの修正方法を使用して作製することができる（図１０及びＴａｏ， Ｂ．Ｙ． ａｎｄ Ｋ．Ｃ．Ｐ． Ｌｅｅ， Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ＰＣＲ， Ｉｎ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ， Ｈ．Ｇ． Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ａ．Ｍ． Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｅｄｉｔｏｒｓ． １９９４， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．： Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ． Ｐ．６９−８３を参照）。これを行なうために、削除する領域に隣接するＤＮＡフラグメントを４個のオリゴヌクレオチド（図１０のオリゴ１＆２及びオリゴ３＆４）を使用して二つの別個のＰＣＲ反応により作製する。削除する領域に直ちに隣接する２個のオリゴヌクレオチド（図１０のオリゴ２及びオリゴ３）は互いに相補的である約２０ｂｐの５’−ヌクレオチド配列を有している。このようにして作製された２個のフラグメントを混合し、プライマーとして外側のオリゴヌクレオチド（図１０のオリゴ１及びオリゴ４）を取込む第３のＰＣＲ反応における鋳型として使用するならば、単一のｃｒｓ欠失フラグメントが作製される。
【０１０６】
組換え作用の安定化は以下のようにして測定することができる。プラスミドｐＨ３ＲＣ３の誘導体はその中の複製起点に近いＢｓｓＳＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を削除して作製することができる。これはプラスミドｐＨ３ＲＣ３をＢｓｓＳＩで部分消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで付着末端に結合し、Ｅ． ｃｏｌｉの実験室株に遺伝子導入することにより行われる。次いで求めるプラスミドはＢｓｓＳＩで消化したプラスミド標本中に見出すことができる。求めるプラスミドは約６ｋｂ及び０．６ｋｂのＢｓｓＳＩフラグメントである。欠失フラグメントはＰＣＲ反応の最初のペアにおいてｐＨ３ＲＣ３を使用する延長ＰＣＲによっても作製することができる。このようにｃｒｓを含むプラスミドｐＨ３ＲＣ３のＢｓｓＳＩフラグメントの外側とハイブリッドするようにオリゴヌクレオチドを作製することができる。組込まれたＢｓｓＳＩ部位はプラスミドｐＨ３ＲＣ３の野生型ｃｒｓフラグメントの代わりに欠失フラグメントのクローン化に使用することができ、そしてこれらのプラスミド誘導体の遺伝性は材料と方法に記述したプラスミド遺伝検定を使用して試験することができる。著しい消失を示すプラスミド誘導体は組換えを安定化するのに必要な配列を欠失したと見なすことができる。
【０１０７】
プロモーター作用は、Ｖａｌｄｉｖｉａ及びＦａｌｋｏｗ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９６． ２２（２）： ｐ． ３６７−７８）によって記述されているｐＦＰＶ２５のようなプラスミド発現ベクターによって運ばれ、緑色蛍光タンパクをコードする遺伝子、ｇｆｐの前に欠失フラグメントを組込むことにより測定することができる。この目的のために、ｃｒｓの外側とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドがｇｆｐ遺伝子の発現を推進するために必要な位置であるｐＦＰＶ２５のＢａｍＨＩ部位への取り込みを促進するためのＢａｍＨＩまたはＢｇ１ＩＩ制限酵素部位を包含するために必要である。
【０１０８】
一度組換え作用及びプロモーター作用を安定化する位置がほぼ決定すれば、組換え作用を失わずにプロモーター作用を削除することは可能である。
【０１０９】
もしも組換えとプロモーターの作用が同じ領域内に位置する、またはかなり重複している、ことが判明したなら、組換え作用に影響しない点突然変異の導入によってはプロモーター作用を不活化することは不可能であろう。これは既に引用した論文にＴａｏ ａｎｄ Ｌｅｅ （１９９４）によって記述されているのと同じ方法で重複延長ＰＣＲを使用して行なわれる。次いで突然変異フラグメントは組換え作用をプラスミド安定性検定を使用して、プロモーター作用を上述のｇｆｐ発現ベクター検定において検定することができる。
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【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉから由来したプラスミドｐＢＲ３２２及びＵｒｅＡＢ遺伝子の複製及びアンピシリン決定基を使用し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｈｔｒＡプロモーターによって発現するプラスミドｐＨＵＲ３の遺伝地図。
【図２】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎの毒性プラスミドのトランス作用解離酵素遺伝子（ｒｓｄ）及びシス作用多量体解離部位（ｃｒｓ）を有する３ ｋｂフラグメントを挿入することによりｐＨＵＲ３から作製したプラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄの遺伝地図。
【図３】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎの毒性プラスミドに存在するｒｓｄ遺伝子及びｃｒｓ部位を含んでいるが介在配列のない１．５ｋｂカセットを挿入することによりｐＨＵＲ３から作製したプラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４の遺伝地図。
【図４】
ｈｔｒＡプロモーターのすぐ上流で転写終結をするＥ． ｃｏｌｉのｒｒｎＢ ５Ｓ ＲＮＡ遺伝子の３’領域を挿入することによりｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４から作製したプラスミドｐＨ３ＲＣ３の遺伝地図。
【図５】
継代数に対するプラスミドを維持している細菌の比率として示した、チフス菌ＣＶＤ９０８及びＣＶＤ９４８株におけるプラスミドｐＨＵＲ３及びｐＮＵＲ３の遺伝。（Ａ）継代数に対するプラスミドを維持している細菌のパーセントを示す。（Ｂ）継代数（線型スケール）に対するプラスミドを維持している細菌のパーセント（対数スケール）を示す。
【図６】
チフス菌ＢＲＤ９４８及びＢＲＤ１１１６株におけるプラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄの経時的遺伝。（Ａ）継代数に対するプラスミドを維持している細菌のパーセントを示す。（Ｂ）継代数（線型スケール）に対するプラスミドを維持している細菌のパーセント（対数スケール）を示す。
【図７】
チフス菌ＢＲＤ９４８株におけるプラスミドｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４の遺伝。（Ａ）継代数に対するプラスミドを維持している細菌のパーセントを示す。（Ｂ）継代数（線型スケール）に対するプラスミドを維持している細菌のパーセント（対数スケール）を示す。
【図８】
チフス菌ＢＲＤ９４８株におけるプラスミドｐＨ３ＲＣ３の遺伝。（Ａ）継代数に対するプラスミドを維持している細菌のパーセントを示す。（Ｂ）継代数（線型スケール）に対するプラスミドを維持している細菌のパーセント（対数スケール）を示す。
【図９】
Ｒｓｄ／ｃｒｓシステムのｐＨ３ＲＣ３多量体解離に及ぼす影響。ｐＨＵＲ３（対照プラスミド）及びｐＨ３ＲＣ３（本発明によるプラスミド）を含んでいるＢＲＤ９４８のプラスミドＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動にかけた。ｐＨ３ＲＣ３の方が大きなプラスミドであるにもかかわらず、プラスミドｐＨＵＲ３の方が移動は少なかった。このことはネズミチフス菌ＢＲＤ９４８株のｐＨＲＣ３に比較してｐＨＵＲ３は多量化していることを示しており、ｐＨＵＲ３について認められた遺伝の不安定はプラスミド多量体の形成によるという考えを補強している。
【図１０】
修飾重複延長ＰＣＲの説明。修飾重複延長ＰＣＲはＤＮＡにおける規定の欠失突然変異を作製するために使用する。欠失に隣接する２個のＤＮＡフラグメントを増幅するために４個のオリゴヌクレオチドが設計される。最も遠いオリゴヌクレオチド（オリゴ１及びオリゴ４）は最終産物をクローニングできるようにその５’−末端（“Ｒ”及び“Ｓ”）に制限エンドヌクレアーゼ部位を正常に含んでいる。内側のオリゴヌクレオチド（オリゴ２及びオリゴ３）の５’−末端の約２０塩基は生成したＤＮＡフラグメントの末端の基礎的ペアリングを可能にするために互いに相補的（太線で示す）である。第一段階において、欠失させる領域に隣接した２個のＤＮＡフラグメントを別々のＰＣＲ反応に於いてオリゴ１とオリゴ２、及びオリゴ３とオリゴ４を使用して増幅する。第二段階においてこのようにして生成したＤＮＡフラグメントをオリゴ１とオリゴ４を使用する別のＰＣＲ反応に鋳型として使用する。
【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年10月8日(2002.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
プラスミド遺伝検定。アンピシリン２００ ｍｇ／ｍｌ、カルベニシリン３００ ｍｇ／ｍｌ、またはカナマイシン２０ ｍｇ／ｍｌを添加したチフス菌株のＬ−ブロス培養をコロニーから接種し、３７℃で終夜増殖した。この培養を抗生物質選別なしで１：１０，０００希釈して新鮮Ｌ−ブロスに接種するために使用し、新規な培養を３７℃で終夜増殖した。この株を数回この様にして継代し、そして各培養毎に細菌の全数及び抗生物質耐性菌数を測定するため希釈液を３重複してＬ−寒天及びアンピシリン２００ ｍｇ／ｍｌまたはカナマイシン２０ ｍｇ／ｍｌを添加したＬ−寒天上に展開した。抗生物質耐性を維持しているコロニーの比率を測定して各プラスミドの安定性を少なくとも３回の独立した実験において測定した。図５−８のデータは各時点における３回の測定の平均値としてプロットしてある。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
Ｅ． ｃｏｌｉのｒｒｎＢ ５Ｓ ＲＮＡ遺伝子の３’−領域は強力な転写ターミネーターを組込んでいる（Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ， １９８４． ２７（２）： １６１−１７２）。ウレアーゼ発現に対するｒｓｄ−ｃｒｓカセットの作用に対抗するために、ｈｔｒＡプロモーターのすぐ上流にこの転写ターミネーターを使用してｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４誘導体を構築した。さらに、
β例３：
−ラクタム抗生物質は治療に使用されることが多いので、ワクチン株の成分としてβ−ラクタマーゼ抵抗性決定基を持たない方が望ましい。したがって我々は、このｐＨＵＲ３ｒｓｄΔ５９７４誘導体のｂｌａ遺伝子をプラスミドｐＨ３ＲＣ３に付与したカナマイシン抵抗性決定基と置換した（図４）。


【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
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【国際調査報告】
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