(57)【要約】拡張コバルト複合体をコントラスト増強剤として利用して磁気共鳴画像法を実施することにより、個体の組織をｉｎ　ｖｉｖｏにおいて画像化するための方法。前記拡張コバルト複合体は、コバルト原子、カルボン酸リガンド、アミンリガンド、および多座配位性チオール含有有機リガンドから成り、前記コバルト原子がチオール基および対イオンに結ばれている。また、拡張コバルト複合体にカップリングされた抗体を用いて、サンプル中における抗原の存在を視覚的に検出するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）　コバルト原子、カルボン酸リガンド、アミンリガンド、および多座配位性チオール含有有機リガンドを含む拡張コバルト複合体を提供し、前記コバルト原子がチオール基および対イオンに結合されており、前記拡張複合体が、
ｉ）　安定であり；
ｉｉ）　水溶性であり；
ｉｉｉ）　非凝集性であり；
ｉｖ）　磁性であり；かつ
ｖ）　０．５から１０ｎｍまでの大きさである；ということを特徴とし、
ｂ）　組織を拡張コバルト複合体に触れさせるために、段階ａ）の拡張コバルト複合体を個体に投与し、そして、
ｃ）　組織を画像化するために個体に対して磁気共鳴画像法を実施すること、より成る個体の組織をｉｎ　ｖｉｖｏで画像化するための方法。
【請求項２】
前記組織が腫瘍である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組織が創傷から再生している請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記組織が骨、筋肉、軟骨、肝臓、膵臓、腎臓、静脈、動脈、肺、心臓、脳、胸部、結腸、リンパ節、消化管、および前立腺である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記個体がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記個体が動物である請求項１記載の方法。
【請求項７】
ａ）　コバルト原子、カルボン酸リガンド、アミンリガンド、および多座配位性チオール含有有機リガンドを含む拡張コバルト複合体を提供し、前記コバルト原子がチオール基および対イオンに結合されており、前記拡張複合体が、
ｉ）　安定であり；
ｉｉ）　水溶性であり；
ｉｉｉ）　非凝集性であり；
ｉｖ）　磁性であり；かつ
ｖ）　０．５から１０ｎｍまでの大きさである；ということを特徴とし、
ｂ）　腫瘍を拡張コバルト複合体に触れさせるために、段階ａ）の拡張コバルト複合体を個体内に投与し、そして、
ｃ）　腫瘍を同定するために個体に対して磁気共鳴画像法を実施すること、より成る個体中の腫瘍を同定するための方法。
【請求項８】
前記個体がヒトである請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記個体が動物である請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記拡張コバルト複合体がターゲティング分子に連結されている請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲティング分子が、抗体フラグメント、抗体、ポリペチド、核酸、炭水化物、脂質、合成分子から成るグループより選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
投与段階ｂ）が、腹膜内投与、静脈内投与、筋肉内投与、および経口投与から成るグループより選択される投与形態による、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
ａ）　コバルト原子、カルボン酸リガンド、アミンリガンド、および多座配位性チオール含有有機リガンドを含む拡張コバルト複合体を提供し、前記コバルト原子がチオール基および対イオンに結合されており、前記拡張複合体が、
ｉ）　安定であり；
ｉｉ）　水溶性であり；
ｉｉｉ）　非凝集性であり；
ｉｖ）　磁性であり；かつ
ｖ）　０．５から１０ｎｍまでの大きさである；ということを特徴とし、
ｂ）　組織を拡張コバルト複合体に触れさせるために、前記拡張コバルト複合体を個体に投与し、そして、
ｃ）　傷ついた組織を画像化するために個体に対して磁気共鳴画像法を実施すること、より成る創傷から再生している個体の組織をｉｎ　ｖｉｖｏで画像化するための方法。
【請求項１４】
前記組織が骨格組織、分泌組織、消化組織、筋組織、生殖組織、循環組織、および、免疫組織、神経組織から成るグループより選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記組織が肝臓、膵臓、腎臓、静脈、動脈、肺、心臓、脳、胸部、結腸、リンパ節、消化管、および前立腺から成るグループより選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ａ）　分子マーカーに特異的な結合部分に機能的に連結されている拡張コバルト複合体を提供し、前記拡張コバルト複合体がコバルト原子、カルボン酸リガンド、アミンリガンド、および多座配位性チオール含有有機リガンドを含み、前記コバルト原子がチオール基および対イオンに結合されており、前記拡張複合体が、
ｉ）　安定であり；
ｉｉ）　水溶性であり；
ｉｉｉ）　非凝集性であり；
ｉｖ）　磁性であり；かつ
ｖ）　０．５から１０ｎｍまでの大きさである；ということを特徴とし、
ｂ）　組織の分子マーカーを拡張コバルト複合体に触れさせるために、段階ａ）の拡張コバルト複合体を個体に投与し、そして、
ｃ）　分子マーカーを発現する組織を画像化するために、個体に対して磁気共鳴画像法を実施すること、より成る特異的な分子マーカーを発現している個体の組織をｉｎ　ｖｉｖｏで画像化するための方法。
【請求項１７】
ａ）　抗原に特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体が特徴的な色を持つ拡張コバルト複合体にカップリングされており、
ｂ）　段階ａ）の抗体を、抗体−抗原結合に適切な条件の下で、サンプルに触れさせ、そして、
ｃ）　拡張コバルト複合体の存在が抗体の存在の指標となり、そして従ってサンプル中の抗原の存在の指標となることにより、拡張コバルト複合体の特徴的な色の検出を通して、サンプル中の拡張コバルト複合体の存在を視覚的に検出すること、より成るサンプル中の抗原の存在を視覚的に検出するための方法。
【請求項１８】
ａ）　抗原に特異的に結合する抗体を提供し、前記抗体が特徴的な色を持つ拡張コバルト複合体にカップリングされており、
ｂ）　段階ａ）の抗体を、抗体−抗原結合に適切な条件の下で、サンプルに触れさせ、そして、
ｃ）　拡張コバルト複合体の存在が、抗体の存在の指標となり、そして従ってサンプル中の抗原の存在の指標となることにより、拡張コバルト複合体の磁気的性質の検出を通して、サンプル中の拡張コバルト複合体の存在を検出すること、より成るサンプル中の抗原の存在を検出するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の背景〕
磁性材料は、コンピューターディスク記憶装置、オーディオおよびビデオ用の記録テープ、センサー、コーティング、光磁気デバイスにおける使用、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）コントラスト増強剤として、そして、分子もしくは細胞のタギングもしくは分離のためのバイオラベルにおける使用を初めとする多くの実用性を持っている。磁気テープでは一般に、酸化鉄、赤鉄鉱、Ｆｅ２Ｏ３、磁赤鉄鉱、γ−Ｆｅ２Ｏ３、および磁鉄鉱、Ｆｅ３Ｏ４が使用され、または、アルニコ磁石（アルミニウム、ニッケル、コバルト）におけるようなさまざまな合金鋼、もしくはスピネルＢａＦｅ１２Ｏ１９およびＢａ２Ｍｎ２Ｆｅ１２Ｏ２２などの八面体Ｆｅ３＋イオンとの混合酸化物材料が使用される。ＭＲＩ増強のためには、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）と複合体化したガドリニウム、Ｇｄ−ＤＴＰＡが一般に用いられる。
【０００２】
残念なことに、現在利用できる磁性材料は、それらが用いられる用途の潜在能力を制限する多くの欠点を持つ。たとえば、磁気記録メディアは、記憶ビット（ｓｔｏｒａｇｅ　ｂｉｔ）を調製し、磁気的に分離し、規則的なより小さい要素をアレイ状にまとめ上げる際における正確な制御の欠如のために、その潜在的な密度のはるかに下にある。これは主として、記録メディアが不規則な領域を形成する大量のコーティングをアニーリングすることによって生成されるためである。十分な情報の分離を提供するためには、望ましいものより大きな面積が各情報ビットに割り当てられなければならない。磁気記録メディアが、その代わりに、至適な大きさにされた磁性ナノ粒子から構成されたなら、全体的な品質を減じることなく、より高い記録密度が利用されうるであろう。医療分野においては、造影剤として使われる酸化鉄ナノ粒子は大きさが不規則で、関連した毒性を有し、また、ｉｎ　ｖｉｖｏで投与されると不規則な生体分布を示す。受け入れられているＭＲＩコントラスト増強剤であるＧｄ−ＤＴＰＡは、血流中で短い半減期を持ち、これは、より長い可視化期間を必要とする使用を不可能としている。また、Ｇｄ−ＤＴＰＡが抗体などのターゲティング部分に連結されると、標的で生成される画像化シグナルはあまりに弱く、たとえば、腫瘍、凝血塊もしくはアテローム斑のターゲティングされた画像化には一般に役立たない。体内の一つの部位に分配された鉄などの磁性粒子への振動磁場の治療的応用が、腫瘍を加熱してそれらを破壊することにおける使用について提案された。しかし、特定の腫瘍による不十分な粒子の取り込み、十分な粒子蓄積の欠如、および相応な粒子の毒性によって、成功は限定された。
【０００３】
磁性ナノ粒子の合成は一般に、巨視的な磁石の粉砕、超音波処理、ミセルの形成、ｐＨ調整、もしくは調節された酸化を含む。残念なことに、現在使われているこれらの方法は、多くの用途において最適以下であったり、それらの使用を妨げてしまう不均一な大きさの粒子を生成する。一様で小さな磁性材料、特に１０ｎｍ未満のものに対しては、関連する技術分野においてニーズがある。
【０００４】
当該技術分野において現在利用できる磁性ナノ粒子は通常、材料の電子顕微鏡写真から立証されるように、形成および使用の間に凝集する。凝集は望ましくない性質である。さらなる望ましくない性質は、磁性材料の安定度の欠如である。当該技術分野における磁性粒子は、短期間の貯蔵後に変質し、劣化した磁気的性質を示す。多くの鉄粒子は、さびつきに普通なように、酸化し続ける。
【０００５】
しばしば、使用前にさらに磁気粒子を修飾することが必要である。たとえば、多くの磁性材料はコーティングされなければならない。コーテングは糖、ポリマーおよび、さまざまな他の物質を粒子と混ぜ合わせることによる。これらのコーテングは吸着の不安定性をこうむる。もう一つの修飾は、粒子への分子の共有結合的な付着である。一つの例は、酸化鉄粒子の酸素原子への分子の付着である。この産物（ｐｒｏｄｕｃｅ）は多くの用途に有用な共有結合を有しているものの、使用を制限する不安定性、乏しいサイズ分布、毒性および凝集といった、鉄粒子を磁性材料として利用することに関連する多くの他の不利益がある。
【０００６】
〔発明の概要〕
本発明の一つの態様は、拡張コバルト複合体（ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｃｏｂａｌｔ　ｃｏｍｐｌｅｘ）をコントラスト増強剤として利用して、個体の内部成分（たとえば組織）をｉｎ　ｖｉｖｏで画像化するための方法である。拡張コバルト複合体は、コバルト原子、カルボン酸リガンド、アミンリガンド、および多座配位性チオール含有有機リガンドを含んで成り、このコバルト原子はチオール基および対イオンに結合している。この拡張コバルト複合体は、安定で、水溶性で、非凝集性で、磁性であり、０．５〜１０ｎｍの大きさであることを特徴とする。本方法は、拡張コバルト複合体を個体に投与して組織を拡張コバルト複合体に触れさせ、そして、個体に磁気共鳴画像法を実施して組織を画像化することを含む。一つの実施態様では、画像化される組織は腫瘍である。この方法は腫瘍の臨床診断に非常に有用である。もう一つの実施態様では、組織が創傷から再生している。拡張コバルト複合体は、場合によって、生体分子、好ましくは、画像化される組織上で選択的に発現される標的分子へと拡張コバルト複合体を特異的に誘導する結合部分に連結される。
【０００７】
本発明のもう一つの態様は、抗原に特異的に結合する抗体であって、特徴的な色を持つ拡張コバルト複合体にカップリングされている抗体を用いて、サンプル中の抗原の存在を視覚的に検出するための方法に関する。この方法では、抗体は抗体−抗原結合に適切な条件の下でサンプルに接触され、サンプルは未結合の抗体を取り除くために洗浄され、残っている拡張コバルト複合体の存在が、その特徴的な色により視覚的に検出される。
【０００８】
〔発明の詳細な記述〕
本発明の態様は、ニッケルおよび／もしくはコバルトを含むナノ粒子の形態の新しいクラスの有機磁性材料の開発に関する。先行技術の磁性ナノ粒子は、コバルトもしくは酸化鉄などの磁性材料の固形粒子である。そのような粒子はそのままで使用されるか、もしくは、たとえば、デキストランでコーティングされる。大きさの範囲の他端には、ガドリニウム−ＤＴＰＡのような、さまざまな有機分子と複合体化した単一の磁性イオンがある。本発明では、磁性ナノ粒子組成物は、チオール基を含む小さいペプチド（本明細書中ではチオール含有ペプチドもしくはチオールペプチドという）および、さまざまな対イオン（リガンドともいう）から合成されて、（溶出剤として水を用いたゲル濾過カラム上での排除によって測定されるところでは）見かけの分子量が約３，０００ダルトンよりも大きくなるような、複数のコバルトもしくはニッケル原子が複数のペプチドに結合されている拡張複合体を形成する。この拡張複合体は、分子量３，０００（名目上）のフィルター（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３）を通り抜けないが、分子量１０，０００のフィルター（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０）を大部分通り抜ける。形成される複合体は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（分子量５４８）などの低分子量複合体よりも、はるかに大きなサイズであることから、「拡張（ｅｔｘｅｎｄｅｄ）」もしくは「大きな（ｌａｒｇｅ）」と呼ばれる。
【０００９】
本発明の別の態様は、拡張複合体の合成方法に関する。超音波処理、ミセル、強い還元剤、粉砕、酸化、もしくは単純なコンプレキシオン（ｃｏｍｐｌｅｘｉｏｎ）を使用する既存の磁性材料の合成方法とは異なり、本拡張複合体を形成するためには、コバルトもしくはニッケル金属塩が、塩基性の溶液中でチオールペプチド（グルタチオン）、クエン酸、アンモニア、および塩化物と複合体化される。この方法は、新たな形態の磁性ナノ粒子を捜している間に偶然に発見された。本明細書に記述されている方法は、もとの手順を洗練したものである。拡張コバルト複合体を合成する際、合成中に薄赤色もしくは桃色から濃い、ほぼ不透明な茶色への瞬間的な溶液の色の変化が、沈殿なしに生じる。拡張ニッケル複合体を合成する際には、緑色から濃い、ほぼ不透明な茶色への変色が、沈殿なしに起こる。観察される変色は、初め予期せぬものであった。その結果生じる材料の色と光学密度の変化は、近接して間隔をあけられた金属原子のプラズモン相互作用、もしくは複合体化しているリガンドの変更を示す。また、合成反応から作り出された拡張複合体が、出発反応物のどれよりも著しく大きいという発見および、それが本明細書に記述される磁気的性質を有するという発見も予期せぬものであった。
【００１０】
拡張有機コバルトおよび／もしくはニッケル磁性複合体は、チオール含有多座配位性架橋リガンド（「多座配位性チオール含有有機リガンド」）ならびにカルボン酸およびアミンリガンドと複合体を形成した金属イオンＣｏ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）から構成され、個々の出発成分よりも著しく大きな産物を形成する。他のリガンドもまた、豊富な多リガンド性の拡張複合体に取り込まれうる（たとえば、塩化物もしくは水酸化物イオン）。水力学的測定は、以下の実施例のセクションに詳しく述べられている方法によって生成される茶色の複合体が３，０００〜２０，０００の範囲にあるように見える分子量を持つことを示す。
【００１１】
多座配位性架橋リガンドが、拡張複合体の形成に用いられる。好ましい実施態様では、チオールペプチドのグルタチオンが使用されている。さらに、アミンおよびカルボン酸リガンド、好ましくは塩基性溶液中のアンモニウムイオンからのアンモニア、およびクエン酸三ナトリウムからのクエン酸もまた使用される。
【００１２】
グルタチオンは、ガンマ・グルタミン酸−システイン−グリシンから成るトリペプチドである。これは一般に６個の配位部位を持つ金属に配位する、アミン、カルボキシルおよびチオールリガンドを提供する。これは、架橋配位複合体が形成されて、本発明の「拡張」つまり多量体性の複合体が生成されうることを意味する。グルタチオンは、他の分子への架橋に有用であり、よって、コンジュゲートの形成を可能とする、いくつかの反応性の基（アミン、カルボキシルおよびチオール）を含む。
【００１３】
拡張複合体は、したがって、金属原子に配位した複数の種を含む。複合体の合成中もしくは合成後に、さらなる分子がにこれらのリガンドのうちの一つと置換され、置換分子の拡張複合体への直接的な取り込み、もしくは結合を生じることができる。たとえば、Ｆａｂ’抗体フラグメントは、複合体の形成中にそれらが存在すると、複合体内に安定に取り込まれうることが見出された。本発明のこの態様は、以下にさらに詳細に記述される。
【００１４】
本発明の拡張複合体はまた、上に同定された成分に類似の物質を使っても合成されうる。たとえば、金属イオンを架橋することによって拡張複合体を形成することができる多座配位性リガンド（たとえば、ペプチドもしくはポリマー）が、グルタチオンの代わりに使用されうる。アンモニアおよびクエン酸などの配位性リガンドもまた、金属に同様に配位する他の物質と交換されうる。アンモニアおよびクエン酸の代わりに用いられうる、コバルトおよびニッケルについて一般に既知のいくつかのリガンドには、Ｉ−、Ｂｒ−、Ｃｌ−、ＳＣＮ−、Ｆ−、尿素、ＯＨ−、酢酸、シュウ酸、水、ＮＣＳ−、グリシン、ピリジン、アンモニア、エチレンジアミン、ＳＯ３２−、ジピリジン、ｏ−フェナントロリン、ＮＯ２−およびＣＮ−がある。
【００１５】
以下の段階が、コバルト有機複合体、ニッケル有機複合体、もしくはコバルトおよびニッケル有機複合体の組み合わせを調製するために使用されうる：
１．　適切な金属の塩が水の中に溶解される；好ましいコバルト塩は塩化コバルトであり、好ましいニッケル塩は硫酸ニッケルである。混合金属複合物を生成するためには、コバルトおよびニッケルの両方を含む溶液が使用される。
【００１６】
２．　塩基が調製される；好ましい塩基は、水酸化アンモニウムおよび水酸化ナトリウムである。
【００１７】
３．　多座配位性チオール含有有機リガンドの水溶液が調製される；好ましい材料は、ペプチド・グルタチオンである。
【００１８】
４．　アミンリガンドが調製される；好ましい供給源は、塩化アンモニウムの水溶液である（水酸化アンモニウムが塩基に用いられる場合は、これは省略されることができる）。
【００１９】
５．　カルボン酸リガンドが調製される；好ましい供給源は、クエン酸三ナトリウムの水溶液である。
【００２０】
６．　上記の溶液が、拡張有機コバルトおよび／もしくはニッケル複合体を生成するために組み合わされる；好ましい添加の順番は、以下の通りである：クエン酸溶液がコバルトおよび／もしくはニッケル溶液に加えられ、その後、水酸化アンモニウム、それから、チオールペプチドを添加。この順番は沈殿物を生じることなく、すべてを可溶な形で維持する。添加の順番は、本質的に同様な産物を生じるために変更されうるが、これは中間体の沈殿物を生じることもある。
【００２１】
複合体形成のための最終的な調製物の好ましいｐＨは９〜１０である。ある一定の範囲外では拡張複合体が形成しないか、もしくはその代わりに大量の凝集が生じることから、さまざまな成分の量および濃度は重要である。好ましい量は、０．４ｍｌのＨ２Ｏ中の（重量で）２０％のＣｏＣｌ２・６Ｈ２ＯもしくはＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍｌのＨ２Ｏ中の２０％　Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７・２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｌの２Ｍ　ＮＨ４ＯＨ、および０．１５ｍｌの８％グルタチオンである。使用される成分の好ましい最終濃度は、以下の通りである：１２０ｍＭのコバルトもしくはニッケルイオン、１００ｍＭのクエン酸イオン、２０ｍＭのグルタチオン、および０．３Ｍの水酸化アンモニウム。あるいは、０．３Ｍの水酸化アンモニウムは、０．５Ｍの塩化アンモニウムおよび０．３Ｍの水酸化ナトリウムと交換されてもよい。体積はもちろん、より多く、もしくはより少ない産物を生成するためにスケーリングされうる。これらの値の付近での、ある程度の異なる成分の変更は、なお同一もしくは同様な産物をもたらすであろう。複合体に取り込まれない過剰成分は、ゲル濾過、クロマトグラフィー、もしくは当該技術分野において知られている他の技法によって分離されうる。好結果の調製物は、これらの濃度値を適度にスケーリングし、相対値を同一に保つことによって、作製されうる。好ましい成分のモル比は、以下の通りである：１モルのグルタチオン：６モルのコバルトもしくはニッケル：５モルのクエン酸塩：１５モルの水酸化アンモニウム。拡張複合体の形成に有用な、これらの成分の範囲は、以下を含む：４〜８モルのコバルトおよび／もしくはニッケルの塩、０．６〜１．５モルの多座配位性チオール含有有機リガンド、８〜３０モルのアミンリガンド、および３〜７モルのカルボン酸リガンド（ただし、他の組合わせも可能である）。
【００２２】
驚くべきことに、形成される複合体は、出発成分のどれよりもはるかに大きな、３，０００〜２０，０００ダルトンの間の見かけの水力学的分子量を持つ。好ましい出発成分の分子量は、以下の通りである：ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：２３８；　Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７・２Ｈ２Ｏ：２９４；　ＮＨ４ＯＨ：３５；　グルタチオン：　３０９。
【００２３】
上述の手順は０．５〜１０ｎｍ、典型的には０．５〜５ｎｍの範囲の大きさを持つ拡張複合体を生成する。５〜２０ｎｍの複合体は、調製物中のチオール複合体化剤の量を減少させることによって取得されうる。これは茶色ではなく、オレンジ色もしくは赤色の粒子をもたらす。
【００２４】
コバルトおよびニッケルは、混合された組成の磁性原子との複合体を生成するために、合成中に比例した量のコバルトおよびニッケルの塩を混合することによって、調製物中で組み合されうる。生成されるそのようなハイブリッド粒子は、ユニークな磁気的性質を有するであろう。さらに、他の金属もまた、取り入れられることができる。コバルト、ニッケル、もしくはコバルトおよびニッケルの組み合わせを含む上述の拡張複合体は、本明細書に記述される方法における使用に適している。特に明記しない限り、用語「拡張複合体」は、拡張コバルト複合体、ニッケルの拡張複合体、ならびにコバルトおよびニッケルの合金拡張複合体を包含する。
【００２５】
この拡張複合体は、それが示すいくつかの性質によって特徴づけられる。それは非常に水溶性であり、乾燥されることができ、そのあと明白な変質なく、水に容易に再懸濁されることができる。合成反応で形成された複合体の電子顕微鏡法による検査は、それらが密集した固形の核として金属を持つのではなく、金属が各複合体上にかなり均一に分布されており、その範囲にわたって比較的一様な密度を与える、約０．５〜５ｎｍの大きさの構造物であることを示す。複合体の凝集は検出されない。
【００２６】
コバルト複合体の水溶液から得られる磁気計測は、磁場（Ｍ）対磁界強度（Ｈ）が、最高１３，０００ガウスまでの浅い勾配を持つ直線であり、強磁性もしくは超常磁性の徴候は与えないことを示す。材料のモル磁化率は低く、約０．０２（ｃｇｓ単位系）未満であり、溶液中のコバルトイオンの範囲内である。これらのデータのすべては、金属が中央の核に高度に濃縮されてない有機金属複合体に一致している。この複合体は濃い茶色をしており、紫外−可視分光法は、約３８０および４５０ｎｍにピークもしくは肩を持ち、２４０ｎｍ（測定された最も短い波長）の高い吸収から６００ｎｍの低い吸収まで減少するスペクトルを明らかにする；一つの形態は約３６４ｎｍに肩を示す。より大きなコバルトおよびニッケルの複合体もまた、合成されることができる。これらは、より長い波長（およそ５２０〜５４０ｎｍ）にピークもしくは肩を持ち、オレンジ色もしくは赤色をしている。乾燥もしくは、溶液への塩基の添加によって沈殿された場合、その結果生じる微粒子は、不均質な磁場中で運動を示す。室温で水中に保管すると、コバルト複合体は数ヶ月の期間にわたって性質に明白な変化を示さない。この材料は非常に水溶性であるだけでなく、それは「粘着性」でもなく、ガラス表面もしくはアルブミンのようなタンパク質に粘着しない。拡張複合体は、ゲル濾過カラム上では水性バッファー中で単一のピークとして移動し、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）プレート上では５０：５０のメタノール：水の中で単一のスポットとして移動する。イオン交換クロマトグラフィーは、関連するいくつかの荷電した種を分離することができ、拡張複合体産物が完全に均一な混合液ではないことを示す。これらの珍しい特性は、この新たな磁性材料と以前に記述された他のものとを区別する。
【００２７】
ニッケルの拡張複合体は、拡張コバルト複合体よりも安定性が低い。それは時間が経つとその性質に変化を示し、一般に数時間後に部分的な形成の逆転を示す。しかし、ニッケル複合体は複合体の有機部分を架橋することによって安定化されうる。
【００２８】
そのユニークな性質のため、本拡張複合体はさまざまな用途（その大半は水溶液を利用する）に有用である。その安定性は、ほぼすべての使用にとって価値のある強みとなる。複合体粒子の非凝集性は、それらの使用にとって特に重要である。凝集した材料は、変化した性質を示し、大きさの制御は困難であり、精製は妨げられ、拡張複合体を分子的に操作する際、制御は一般に失われる。この複合体の極めて小さなサイズ（０．５〜１０ｎｍ）は、それをｉｎ　ｖｉｖｏでの使用のため、超薄の層もしくはコーテングを形成するため、および材料への迅速な拡散のために理想的とする。複合体はアルブミンおよび多くの他のタンパク質に粘着しないため、バックグラウンドもしくは変化した生体分布へと導く望ましくない非特異的接着を生じることなく、ｉｎ　ｖｉｖｏもしくはｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用されることができる。拡張複合体粒子の大いに着色された性質は、それらを放射性タグもしくは他の二次的増強手順の非存在下における、直接的な可視化および染色に理想的にする。拡張複合体は、酸化鉄およびガドリニウムのような一般に使われる他の、より磁性の高い材料の代わりに、コバルトもしくはニッケルからできている。比べると、コバルトの毒性はとても低く、より大量の複合体が投与されうるｉｎ　ｖｉｖｏでの応用において、かなり有利に使用されることができる。
【００２９】
拡張複合体中における金属原子の散布的な配置は、この材料を、いくつかの用途における使用に理想的とする。コバルトおよびニッケル原子が一般に、中央の密集した核にあるのではなく、複合体上に分散されているため、それらはさまざまな理由から、当該技術分野において一般に使われる他の磁性材料よりも優れている。たとえば、ＭＲＩの手順において、画像化の部位にあるコントラスト増強剤は、隣接する水のプロトンの緩和時間を変化させる。最大の効果は、磁性原子が水分子と緊密な接触にあるときに得られる。拡張複合体は、より多くの金属原子への水のアクセスを許容するため、それは内部原子が水分子から遮蔽される固形領域を含む材料よりも、はるかに効果的な増強剤として働く。この点について、本発明の拡張複合体は、同数の磁性原子を持つ固形粒子に比べ、向上されたＭＲＩ増強を提供する。
【００３０】
拡張複合体の有機ペプチド成分は、結合部分（たとえば、抗体および受容体）のような他の分子への共有結合による連結を容易にする。別の分子への拡張複合体の連結は、つながれた産物に磁気的性質を授ける。抗体、ペプチド、核酸、炭水化物、もしくはタンパク質といった別の分子につながれた拡張複合体は、たとえば、拡張複合体を特定の分子へとターゲティングする際（たとえば、腫瘍、アテローム斑、凝血塊、もしくは特定の細胞外マトリックス成分、組織もしくは細胞の同定において）に有用である。結合をつくる方法は以下で議論される。
【００３１】
拡張複合体は複数のコバルトおよび／もしくはニッケル原子を含むため、１もしくは数個の磁性原子のみにつながれた抗体（たとえば、ガドリニウムにつながれた抗体）から成る類似した薬剤に比べ、より多くのこれらの磁気的に活性な原子が、単一の連結された抗体によって標的に送達されることができる。抗原を磁性材料で標識（本明細書ではターゲティングともいう）する際、標的に届けられる磁性材料の量は、得られることのできるシグナル、もしくは生成されることのできる治療効果に正比例する。よって、画像化もしくは治療のためのターゲティングされた送達における感度と効力は、磁性複合体の使用によって強化される。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ標識は同様に、単一の磁性原子による標識の使用を上まわって改善される。センサーもしくはコーティングにおけるような材料的な用途には、磁性原子の密度もまた、産物の品質に相関する。
【００３２】
拡張複合体の一つのそのような使用は、マトリクス内の特定部位で熱を発生させることにおいてなされる。これは、拡張複合体を標的部位に送達し、それから、遠隔的に磁性粒子を熱するために振動磁場を適用することによって引き起こされる。これは、磁性粒子を含む領域のマトリクスのみにおける選択的な加熱を生じる。材料的な用途については、本発明の拡張複合体の使用は、ナノファブリケーション（ｎａｎｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）、選択的な重合、および局所的な加熱が要求される他の使用において、助けとなりうる。Ｉｎ　ｖｉｖｏにおける治療の場合、好ましくは、除去もしくは改変を必要とする腫瘍もしくは他の組織、アテローム斑、もしくは細胞外マトリックス成分に対する結合部分によってターゲティングされた拡張複合体の送達と、その後の磁場の適用によるこれら特定領域における温度の上昇は、その場所における細胞死もしくは他の熱関連応答を引き起こすであろう。この治療様式は、現在利用できる磁性材料が持つ問題（送達、毒性、副作用、および不十分な反応の生成など）のために、現在では臨床的に利用可能でない。しかし、拡張複合体の使用、特にターゲティングされた拡張複合体の使用は、大量の非毒性磁性材料が目的部位へと特異的に誘導されることを可能とすることによって、これらの困難の多くを克服する。
【００３３】
本発明の別の態様は、拡張複合体に他の分子をカップリングさせるための方法に関する。拡張複合体に他の分子を連結するために、いくつかの方法が開発され、よって、さまざまな物質の結合のための柔軟なプロトコールが提供された。好ましい方法は、一つもしくはそれより多いフリーな蝶番チオール（ｈｉｎｇｅ　ｔｈｉｏｌ）を有するＦａｂ’抗体フラグメントに拡張複合体をつなげることである。この方法では、Ｆａｂ’抗体フラグメントはチオールペプチドの添加に先立ち、拡張複合体合成反応に加えられる。それから、金属がチオールと複合体化され、拡張複合体の形成中にＦａｂ’を取り込む。これは、これらの粒子の合成に特異的なユニークな方法であり、他で記述されたことはない。本方法は、それが長々しい段階もしくは精製を要求しないという点で迅速である。安定なコンジュゲートが数秒のみで形成する。同様に、チオール基を含む他の分子もまた、合成反応におけるそのような取り込みよって、拡張複合体にカップリングされることができる。
【００３４】
拡張複合体を他の分子につなげるための代わりの方法は、前もって形成された拡張複合体上に存在する他の官能基（たとえば、アミノ基、カルボキシル基、もしくはチオール基）に、望まれる分子を共有結合的にカップリングさせることである。たとえば、チオールペプチドのαアミノ基は、ヒドロキシスクシニミドエステルの使用といった、標準的な架橋試薬によって連結されうる。チオール基へのカップリングはマレイミドの使用によることができ、カルボキシル基はカルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）など）もしくは他のそのような反応によって連結されうる。当該技術分野において知られている他の反応基および連結剤もまた利用されうる。
【００３５】
したがって、複合体がつくられる前もしくは後に、さらなる分子のカップリングが行われることができる。これらの方法によって、実質的に他のあらゆる分子もしくは表面が、複合体に共有結合で結び付けられうる。付着させるのに有用な分子には、Ｆａｂ’、ＩｇＧ、ペプチド、ホルモン、色素、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、核酸、ポリマー、およびガラスがある。
【００３６】
本発明の別の態様は、拡張複合体（コバルトおよび／もしくはニッケル、または他の合金）をコントラスト増強剤として用いた磁気共鳴画像法による、個体の組織のｉｎ　ｖｉｖｏにおける画像化に関する。個体の組織を画像化するため、画像化される個体の組織への薬剤の接触を促進する方法によって、拡張複合体分子が個体に投与される。投与に続き、当該技術分野における通常の方法によって、磁気共鳴画像法が個体に対して実施される。
【００３７】
個体の組織の画像化は本明細書中で記述される。しかし、本明細書に記述されている同一の方法によって、組織、器官、細胞、血液、細胞外基質成分、アミロイド斑およびアテローム斑などの沈着物、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）、および体の他の内部構造を限定することなく含む、さまざまな個体の内部成分を画像化するために、本発明が使用されうるということは当業者によって認識されるであろう。
【００３８】
拡張複合体分子の投与方法は、画像化される組織の位置に依存し、熟練した実務家によって容易に決定される。投与は、たとえば、腹膜内注射、静脈内注射、筋肉内注射、および経口投与を通してなされうる。投与される拡張複合体の量は、磁気共鳴画像法に使用される機械の感度、および他の変数に依存し、各特定の応用に対して熟練した実務家によって決定されるであろう。一般的な経験則としては、個体の体重１キログラムあたり０．１〜１０ｍｇの量のコントラスト増強剤が好ましい。しかし、これらの量は本発明にとって限定的であるとみなされるべきではない。
【００３９】
Ｉｎ　ｖｉｖｏにおける画像化のための本方法は、磁気共鳴画像法が通常実施される、あらゆる動物に適している。好ましい実施態様では、個体はヒトである。この方法による画像化に適した組織は、骨格組織、分泌組織、消化組織、筋組織、生殖組織、循環組織、免疫組織、神経組織、および腫瘍組織を限定することなく含む。画像化のための組織の特定のいくつかの例は、肝臓、膵臓、腎臓、静脈、動脈、肺、心臓、脳、胸部、結腸、リンパ節、消化管、および前立腺である。
【００４０】
上述の方法による組織のｉｎ　ｖｉｖｏ画像化は、個体中の腫瘍を同定する際に特に有用であり、ルーチン的な診断スクリーニングに使用されることができる。一つの実施例において、腫瘍は脳腫瘍である。下記の実施例セクションにおいて詳述されるように、拡張コバルト複合体のコントラスト増強剤としての使用は、さもなければ、当該技術分野において使用される標準的なコントラスト増強剤であるガドジアミドを用いては検出されない、ラット中の脳腫瘍の検出を可能とした。
【００４１】
コントラスト増強剤による組織もしくは他の内部成分の特異的なターゲティングを容易にするために、拡張複合体は、画像化される組織もしくは成分に独特な成分に対して親和性を持つ部分、またはそうでなければ、個体のバイオプロセスによって画像化される組織の領域に局在化もしくは運ばれる部分に、操作可能に連結されうる。そのような部分は、有用な生体分子（たとえば、抗原に結合する抗体フラグメント、抗体、ポリペチド、核酸、炭水化物、もしくは脂質）、薬剤、または組織のターゲティングのために特別に改変もしくは設計された合成分子でありうる。一つの実施態様では、この部分は分子マーカーに特異的に結合する、もしくは結合される結合部分である。非常に有用な結合部分は、特異的な結合ペアのメンバー（たとえば、抗体−抗原、受容体−リガンド、ハイブリダイズする核酸）である。生理的条件下で十分な親和性を持つそのような結合が、画像化中に、結びつけられているコバルト複合体を分子マーカーに固定するために必要である。本明細書中で使用される「操作可能に連結」という用語は、その結合中の成分（コントラスト増強剤および結合部分）の基本機能が保存されることを示すために使用される。したがって、拡張複合体は造影剤としての機能を保持し、結合部分は分子マーカーに対するその親和性を保持する。拡張複合体の結合部分への連結は、生理的条件下で結合部分を拡張複合体へと安定して物理的に結合させるあらゆる方法による。好ましくは、この結合は共有結合である。そのような結合をつくるための方法は、上述されている。
【００４２】
拡張複合体がターゲティングされうる分子マーカーは、好ましくは、標的を構成する細胞上で、体内の他の場所よりも有意に高いレベルで発現される。たとえば、前立腺に特異的な抗原は、前立腺組織の画像化に有用である。いくつかの有用な分子マーカーは、受容体、腫瘍性タンパク質、表面抗原、脂質、炭水化物、および腫瘍抗原を限定することなく含む。拡張複合体のターゲティングは、たとえば、診断を助けるために、外来の細胞もしくは細胞の副産物（たとえば、真菌細胞）が選択的にターゲティングされうるという点で、個体の内在性の細胞に限定されない。
【００４３】
画像化のために好ましい投与後の時間は、未結合の薬剤が明らかに取り除かれた時間の後である（これが最適な信号雑音比を生成するからである）。この時間はルーチン実験を通して決定され、平均的な当業者の能力の範囲内である。
【００４４】
本発明の別の態様は、特定の分子マーカーを発現している腫瘍組織を選択的に画像化することによって、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける腫瘍の進行もしくは機能性を診断するための方法に関する。分子マーカーを発現している腫瘍の画像化は、特異的な結合部分への連結を通して分子マーカーへと特異的にターゲティングされた拡張複合体を用いて実施される。このようにして、磁気共鳴画像法により、腫瘍上における腫瘍進行のマーカー（たとえば、癌遺伝子）の有無が決定される。同様に、ターゲティングされた拡張複合体は、表面抗原の差異的な発現をもたらす他の疾患（たとえば、ウイルス感染）のマーカーの存在を決定するために用いられることができる。拡張複合体に連結された結合部分もしくは他のターゲティング作用剤は、コントラスト増強剤を分子マーカーの位置に誘導する。拡張複合体を利用して、診断目的のためにコントラスト増強剤をターゲティングすることは、感度が標的上に存在する抗原の量によって制限されるガドリニウムを用いた同じアプローチよりも優れている。拡張複合体は、より強力であるため、この手順はより感度が高い。
【００４５】
本発明の拡張複合体はまた、創傷から再生している組織を画像化するためにも、磁気共鳴画像法においてコントラスト増強剤として用いられうる。この方法は基本的に、個体における組織のｉｎ　ｖｉｖｏ画像化について上に示されたようにして、拡張複合体造影剤により授けられる増加したコントラストによって容易にされた再生中の創傷の特異的同定によって実施される。本明細書中で述べるところでは、創傷は組織に損害を与えて、裂傷、切傷、もしくは擦過傷を生じた力もしくは病態の結果である。画像化される創傷の部分は、組織の再生およびリモデリングを受けている領域である。あらゆる損害を受けた組織が、このようにして画像化されうる。たとえば、傷つけられ、再生している骨格組織（硬骨、軟骨）、分泌組織、消化組織、筋組織、生殖組織、血管組織、循環組織、脳組織、胸部組織、前立腺組織、動脈組織、および心臓組織は、本方法によって画像化されることができる。傷ついた組織を画像化することは、診断目的および治癒過程のモニタリングのために有用である。これは、臨床視診によって容易に観察できない内部の損傷もしくは病変に特に有用である。
【００４６】
本発明の別の態様は、蓄積された拡張複合体の視覚的もしくは、その代わりに磁気的な検出による、サンプル中の標的分子（たとえば、抗原）の存在の検出における、上述の拡張複合体の使用に関する。以下の実施例セクションに詳述される実験（例５および６）は、上で述べたように、特異的な結合部分（たとえば、抗体）に機能的に連結された拡張複合体の分子が、標的分子への暴露に伴い、標的分子の特定の位置に集中することを示している。この濃縮は拡張複合体の特徴的な色のために、目に見えて検出できる。
【００４７】
サンプル中における標的分子（たとえば、抗原）の存在を検出するために、標的分子に特異的にターゲティングされた拡張複合体が、結合部分による標的の結合に適切な条件の下で、サンプルに接触させられる。場合により、サンプルはそれから、未結合の拡張複合体を取り除くために洗浄され、よって、信号雑音比が改善される。標的に結合したまま残っている拡張複合体の存在はそれから、その特徴的な性質（色もしくは磁気的性質）によって同定される。拡張複合体の存在は結合部分の存在の指標であり、それゆえ、標的分子の存在の指標である。好ましくは、結合部分は抗体であり、標的分子は抗体が結合する抗原である。
【００４８】
標的分子は、検出過程を通して（たとえば、洗浄および、使用されるあらゆる検出の過程）結合が持続する十分な親和性をもって、必ず特異的な結合部分によって結合され、もしくは代わりに、必ず特異的な結合部分に結合する。検出されることのできる標的の最小量は、色もしくは磁気的な検出の感度によって制限される。マイクログラム量の標的分子で、裸眼に見えるだけの十分な量の蓄積が可能である。検出感度は、拡張複合体の特異的色吸収波長（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｏｌｏｒ　ａｂｓｏｒｂｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）を検出するための光学的検出装置を用いて、もしくは磁気検出装置を用いて高められうる。
【００４９】
サンプルは水溶液であっても、もしくは非水溶液サンプル（たとえば、組織）であってもよい。検出は、サンプルの分画（たとえば、大きさにより）および／もしくは固形支持体上へのサンプルの固定化（たとえば、免疫ブロットもしくはＥＬＩＳＡ）によって、大いに容易にされる。そのような応用は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｓｉｔｕの分析に非常に適している。
【００５０】
標的分子の定量的検出が、ターゲティングされた拡張複合体を用いて可能である。定量的検出のためには、標準化された量の標的分子が、ターゲティングされた拡張複合体によって生成される検出シグナルを較正するために用いられる。サンプル中の標的分子の量はそれから、サンプルから生成された検出シグナルと、標準で得られた較正されたシグナルとの比較によって決定される。そのような較正は、当該技術分野において日常的に実施されており、熟練した実務家には公知である。本発明のこの態様は、家庭用妊娠検査として現在市販されているキットの類のような、現在コロイド状の金および着色ラテックス粒子／ビーズを利用しているワンステップ検出キットにおいて極めて有用である。
【００５１】
【実施例】
以下の例は、当業者にとって変更、拡張および応用が明らかであることから、本明細書で特定される可能性の見本としてのみ提供され、限定的となることは意図されていない。
例１：　有機コバルト複合体の製造。
【００５２】
０．４ｍｌの水に溶かした（重量で）２０％の塩化コバルト（ＩＩ）六水化物溶液が、０．４ｍｌのＨ２Ｏに溶かした２０％のクエン酸（三）ナトリウム溶液と混合された。次に、０．４ｍｌの２Ｍ水酸化アンモニウムが加えられ、赤い溶液が、より桃／紫色に変化した。次に、０．１ｍｌの８％還元グルタチオン水溶液が加えられ、溶液はそれから濃い茶色に変化した。５分後、さらなる一定量、すなわち０．０５ｍｌの８％グルタチオン水溶液が加えられ、溶液はより濃い色になった。
【００５３】
この産物はＡｍｉｃｏｎ　ＧＨ２５を充填したゲル濾過サイズ分画カラム上で精製され、溶出剤としての水と共に流された。複合体は空隙容量中に現れ、見かけの分子量が約３，０００未満のあらゆる種、すなわち、あらゆる遊離のコバルトイオンもしくはグルタチオンを取り除くために、この段階が使用された。
【００５４】
複合体を含む画分は、真空回転蒸発によって乾燥され、それから、少量の水の中に再懸濁された。これは産物の容易な濃縮を可能とした。電子顕微鏡は０．５〜１０ｎｍの複合体が形成されたことを確認した。
例２：　有機ニッケル複合体の製造。
【００５５】
０．２ｍｌの１０％クエン酸ナトリウム水溶液が、０．２ｍｌの１０％硫酸ニッケル水溶液に加えられた。次に、０．２ｍｌの１Ｍ水酸化アンモニウム溶液が加えられた。それから、０．０５ｍｌの４％グルタチオン水溶液が加えられ、混合液は濃い茶色に変化した。５分後に、０．０５ｍｌの４％グルタチオン水溶液がさらに加えられた。
例３：　１０〜２０ｎｍの有機コバルト複合体の製造。
【００５６】
０．２ｍｌの１０％クエン酸ナトリウム水溶液が、０．２ｍｌの１０％塩化コバルト水溶液に加えられた。次に、０．２ｍｌの１０％塩化アンモニウム溶液が加えられ、それに続き、０．２ｍｌの０．１％次亜リン酸ナトリウム水溶液が加えられた。次に、０．３ｍｌの１Ｍ水酸化アンモニウム溶液が加えられた。それから、０．０２ｍｌの４％グルタチオン水溶液が加えられ、混合液はオレンジ色に変わり、その後、数時間をかけてオレンジ−赤色に、それから赤色の溶液へと熟した。別の製法では、０．２ｍｌの１０％クエン酸ナトリウム水溶液と０．２ｍｌの１０％塩化コバルト水溶液を混合し、その後、０．４ｍｌの１Ｍ水酸化アンモニウム溶液を加え、それから、０．０５ｍｌの４％グルタチオン水溶液を加えることにより、同様な大きさのコバルト複合体が形成された。
例４：　コバルトおよびニッケルの混合複合体の製造。
【００５７】
０．１ｍｌの１０％塩化コバルト水溶液が、０．１ｍｌの１０％硫酸ニッケル水溶液と混合された。それから、０．２ｍｌの１０％クエン酸ナトリウム水溶液が加えられた。次に、０．２ｍｌの１Ｍ水酸化アンモニウム溶液が加えられた。それから、０．０５ｍｌの４％グルタチオン水溶液が加えられ、混合液は茶色に変化した。５分後に、０．０５ｍｌの４％グルタチオン水溶液がもう一度加えられた。
例５：　有機コバルトもしくはニッケル拡張複合体の調製中における、抗体の共有結合による複合体への連結、および複合体の抗原へのターゲティング。
【００５８】
Ｆａｂ’抗体フラグメントは、マウスＩｇＧに特異的に結合するウサギ抗マウス抗体０．２ｍｇを５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ　６）中、３０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で１時間、還元することによって調製された。Ｆａｂ’抗体フラグメントはそれから、ゲル排除カラム（Ａｍｉｃｏｎ　ＧＨ２５）に溶出剤としての水と共に流して、ＤＴＴおよび他の低分子量成分から精製された。タンパク質ピークは２ｍｌ体積中にプールされた。
【００５９】
コバルトもしくはニッケルの複合体は、０．４ｍｌの水に溶かした（重量で）２０％の塩化コバルトもしくは硫酸ニッケルの溶液を、０．４ｍｌの水に溶かした２０％のクエン酸（三）ナトリウム溶液と混合することによって調製された。次に、０．４ｍｌの２Ｍ水酸化アンモニウムが加えられた。この点まで、いくつかの同一な調製物が作製された。いくつかには約０．０８ｍｇの抗体を含む１ｍｌの精製Ｆａｂ’抗体溶液が加えられ、他のいくつかには０．３ｍｌのＦａｂ’が加えられ、その他のいくつかには０．０３ｍｌが加えられ、その他のいくつかには抗体は加えられなかった。０．１ｍｌの８％グルタチオン水溶液が各反応に加えられ、それから、溶液は濃い茶色に変わった。５分後、さらなる一定量、すなわち０．０５ｍｌの８％グルタチオン水溶液が加えられ、溶液はより濃い色になった。
【００６０】
さらなる精製もしくは、反応量および時間の最適化がなされえたが、サンプルは直ちに使用された。それらはすべて２ｍｌに希釈され、各１ｍｌが５マイクログラムのマウスＩｇＧ（標的抗原）の結合した個々のニトロセルロース膜に適用された。ニトロセルロース膜はあらかじめ乾燥され、４％血清アルブミンでブロッキングされていた。５分後、最大量のウサギ抗マウスＦａｂ’で生成されたサンプルは、抗原の位置に茶色の呈色を生じた。これは抗体の連結された複合体の抗原へのターゲティングを表わした。より少ない量のＦａｂ’で生成されたサンプルもまた、抗原の位置に茶色の呈色を生じたが、この呈色は同時に、より弱く、現像により長い時間を要した（１０分後に明白となった）。Ｆａｂ’を使用せずに生成したサンプルは抗原の呈色を生じず、これは抗体を持たない複合体が抗原に対して非特異的な結合を有意に示さなかったことを示している。アルブミンで覆った膜上の抗原を含まない領域では、有意な茶色の呈色が検出されなかったという事実は、抗体の有無にかかわらず、複合体がアルブミンに対して有意な親和性を持たなかったことを示す。
例６：　調製後における、抗体の共有結合による有機コバルトもしくはニッケル拡張複合体への連結、および複合体の抗原へのターゲティング。
【００６１】
コバルトもしくはニッケル有機複合体は、上記の例１〜３に記述されているようにして調製および精製された。粒子中の有機ペプチドのフリーなアミノ基は、過剰モル量（ｍｏｌａｒ　ｅｘｃｅｓｓ）のビス（スルホスクシニミジル）（ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ））基質を混合することによって、連結された。３０分後、粒子はゲル排除クロマトグラフィーによって過剰な試薬から精製された。ウサギ抗マウスＩｇＧが加えられ、４℃で一晩インキューベートされた。粒子はそれから、例５のブロット法を用いて、それらの適切な抗原への免疫ターゲティングを実証した。これは、粒子が有機部分のアミノ基を使って共有結合的にカップリングされることができ、フリーなアミノ基を含む分子に連結されうることを示した。
例７：　拡張コバルト複合体の磁気的性質の実証。
【００６２】
拡張コバルト複合体は、例１に記述されているようにして調製された。この複合体は、さらなる量のグルタチオンを追加することにより、もしくは水酸化ナトリウムの添加によって沈殿された。水溶液の底の茶色の沈殿物はそれから、マグネトロン磁石の極の端（ｐｏｌｅ　ｅｄｇｅ）近くに置かれ、粒子はこの不均質な場の中で磁石極（ｍａｇｎｅｔ　ｐｏｌｅ）の方へ引き寄せられた。
結論
上述の実験は、ユニークな性質を持つ新しいクラスの拡張有機コバルトおよびニッケル磁性複合体の生産、およびそれらを合成するための過程を詳述している。コバルトおよびニッケルの混合された拡張複合体もまた含まれている。有機部分は従来的な架橋技法による抗体、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、または他の有機もしくは無機分子への便利な共有結合的連結を可能とする。複合体の合成中におけるＦａｂ’抗体フラグメントもしくは他のチオール化合物の新たな取り込みもまた、記述されている。これらはｉｎ　ｖｉｖｏもしくはｉｎ　ｖｉｔｒｏで磁性複合体を目的の部位へとターゲティングする方法、または表面をコーティングするための方法、またはポリマーもしくは他の材料への包含のための方法を提供する。粒子の大きさを制御する方法もまた発見された。
【００６３】
磁性材料はセンサー、コンピューター記憶装置、光磁気装置、医療用の画像化および治療を含む多くの分野において有用であることが見出されていることから、この新しいクラスの磁性材料の効果（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）は遠くまで及ぶ。
例８：　コバルト複合体を用いた脳腫瘍のＭＲＩ。
【００６４】
ラットは、腫瘍細胞の定位的注入によって、脳内に腫瘍が移植された。１４日後、脳走査磁気共鳴画像が、標準的なガドリニウム造影剤であるガドジアミド（Ｏｍｎｉｓｃａｎ，　Ｎｙｃｏｍｅｄ）および、本発明のコバルト複合体の両方を使って撮影された。それぞれ同じ腫瘍（Ｎ３２もしくはＦ９８のいずれか）を移植された２匹のラットが、造影剤としてガドジアミドもしくはコバルト複合体のいずれかを用いて、並行して画像化された。ガドジアミドでは、どちらの脳腫瘍（Ｎ３２およびＦ９８）の増強も見られなかった。この薬剤を用いては、ＭＲＩによって腫瘍は位置付けられなかった。しかし、造影剤としてコバルト複合体を用いると、腫瘍は明瞭に画像化された。これらの画像は優れたコントラストを有していた。１８日目に、ラットは解剖され、すべての動物に当量の腫瘍が存在したことが実証された。よって、差異的な腫瘍の発達が、ガドジアミドとコバルト複合体の差異的な腫瘍の検出における要因ではなかった。ガドリニウムを使用して得られた結果は、ヒトにおける腫瘍可視化のためのその使用を反映しており、それによってガドリニウム剤はいくつかの腫瘍の画像化を容易にするが、他の多くの場合には不十分である。
【００６５】
さまざまなＭＲＩ画像化モードが、分析において使用された：Ｔ１強調、Ｔ２強調、およびＴ２＊強調。すべての場合において、コバルト複合体を用いると腫瘍は明瞭に可視であったが、ガドジアミンを用いては、どの腫瘍の痕跡も明白でなかった。重要なことに、良い画像コントラストが、画像化が終了する時間であるコバルト複合体の注射後３０分まで保持された。撮像期間中におけるこの画像コントラストの最小の変化は、有用な画像化がこの時点を十分に超えて達成されうることを示す。これは、ガドリニウム剤が系を迅速に一掃するという事実のために、一般にはるかにより一過性であるガドリニウム画像とは対照的である。この長寿性は、コバルト複合体が、ガドリニウム剤では現在可能でない、長期間にわたる画像化（たとえば、外科手術中）のために使用されうることを示す。
例８　方法
腫瘍の移植。　２つの細胞株が腫瘍を接種するために使用された：Ｆ９８およびＮ３２（Ｂａｒｔｈ，　Ｒ．Ｆ．，　Ｊ．　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　３６：　９１　（１９９８）；　Ｓｉｅｓｊｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．　３７：　６７　（１９９３））。Ｆ９８もしくはＮ３２細胞のいずれかを接種された約３５０ｇの体重のラットが、腫瘍の画像化のために使用された。麻酔下のラットの頭蓋骨を通して、０．５ｍｍ未満の穿頭孔が接種の個所にあけられた。腫瘍は１０，０００個の培養細胞を含む１マイクロリットルの培養培地を、左線条体（ｌｅｆｔ　ｓｔｒｉａｔｕｍ）中の深さ４〜５ｍｍ、（鋸歯状の）冠状縫合（ｃｏｒｏｎａｌ　ｓｕｔｕｒｅ）の正中線の左４ｍｍの個所に、接種することによって惹起された。頭蓋骨の下４〜５ｍｍの細胞注入を確実にするために深さを制限するプラスチック襟を装備された２７ゲージ針が、柔軟な管を介してハミルトン微量注射器に接続された。３０秒間の細胞の注入後、針を取り除く前に、もう３０秒間が細胞を安定させるためにとられた。Ｆ９８腫瘍動物の場合、接種後２４＋日に死亡が生じた。
コバルト複合体：　コバルト複合体は例１のようにして調製された。
ＭＲＩ。　ＭＲＩは腫瘍細胞の移植後、１６日目に実施された。動物は麻酔され、２００マイクロリットルのガドジアミド（１ｍｌあたり２８７ｍｇのガドジアミド）（Ｏｍｎｉｓｃａｎ，　Ｎｙｃｏｍｅｄ，　Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，　ＮＪ）もしくは２００マイクロリットルの拡張コバルト複合体（１ｍｌあたり１０ｍｇ±３０％のＣｏを含む）のいずれかが腹膜内に注入された。ラットは直ちに支持体上に配置され、ＭＲＩが１．５テスラ全身臨床スキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ　Ｖｉｓｉｏｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）上でヒト四肢（膝）用コイルを用いて実施された。高分解能ターボスピンエコー矢状画像化（Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｔｕｒｂｏ　ｓｐｉｎ−ｅｃｈｏ　ｓａｇｉｔｔａｌ　ｉｍａｇｉｎｇ）が、以下の画像化パラメーターと共にスライス位置を選ぶために使用された。Ｔ２強調画像について：繰り返し時間（ＴＲ）＝３０００ｍｓｅｃ；エコー時間（ＴＥ）＝２５ｍｓｅｃ；視野（ＦＯＶ）＝１００×１００ｍｍ；マトリクスサイズ＝２５６×２５６；画像スライス厚（ＴＨ）＝２ｍｍ。腫瘍画像は１回の腹膜内注入の後、さまざまな時間に収集された。撮像時間は１スキャンあたり３分であり、分解能は０．３１２５ｎｍであった。画像化は注入後３０分の期間にわたった。
【００６６】
１匹はガドジアミド、もう１匹はコバルト試薬を用いた２匹のラットが同時に画像化された。Ｔ２強調画像化が、わずかにより良いように見えた。Ｔ１強調およびＴ２＊強調画像は同等の結果を与えた。腫瘍のコントラストは、注入後３０分でもまだ明白であった。
例９：　コバルト複合体を用いたＭＲＩによる創傷治癒の描写
例８において腫瘍を移植されたラットの造影剤としてコバルト複合体を用いたＭＲＩは、腫瘍細胞を注入する２週間前に切開された部位における画像のコントラストを明らかにした。この部位は画像中で白く見え、非常にコントラストが良かった。ガドジアミド造影剤を用いて生成された画像では、対応する部位におけるこのようなコントラストは明白でなかった。これは、創傷治癒の領域（たとえば、血管再生、凝固、リモデリング、血塊溶解、および組織再生）が、コバルト複合体によって明瞭に画像化されうることを示す。創傷領域の脈管構造および成分は正常組織とは微妙にのみ異なり、これらの差異はガドジアミド試薬によっては強調されないことから、これは驚くべきことである。この種の画像化は、内部損傷、内出血、もしくは他の形の病変を、コバルト複合体を造影剤として用いたＭＲＩで検出するために使用されうる。
例９　方法
方法は例８のようにして実施された。
例１０：　コバルト複合体の毒性測定。
【００６７】
２つの造影剤の毒性を研究するため、コバルト複合体もしくはガドジアミドを受けたラットに対して、血液分析が実施された。分析は、１）対照のラット、２）ガドジアミドの注入後のラット、および３）コバルト複合体の注入後のラット、に対して実施された。毒性を示すために一般に用いられている標準的な血液学的および血液化学的指標が、標準的な方法によって測定された。これらの指標は、グルコース（ＧＬＵＣｍ）、血中尿素窒素（ＢＵＮｍ）、クレアチン（ＣＲＥｍ）、ナトリウム（ＮＡ）、カリウム（Ｋ）、塩化物（ＣＬ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニン・トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）およびアルブミン（ＡＬＢｍ）の濃度であった。結果は、以下の表１に示されている。対照と比較して、肝酵素活性におけるわずかな増加が、コバルト複合体もしくはガドジアミドを注入したラットについて観察された。観察された上昇は、コバルト複合体を注入したラットよりも、ガドジアミドを注入したラットの方が大きかった。全体として、非毒性として受け入れられているガドジアミドと比較して、コバルト複合体の認識可能な毒性はなかった。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
例１０　方法
ラットは例８に記述されているようにして腫瘍を接種された。標準のラットはＮ３２腫瘍を接種され、ガドジアミドもしくはコバルト複合体のいずれかを受けたラットはＦ９８腫瘍を接種された。ガドジアミドおよびコバルト複合体は、ＩＰ注入によって送達された。血液が薬剤注入の１日後に採取され、室温に２０〜３０分間静置して凝固させられ、それから３５００ｒｐｍで遠心分離された。透明な血清は−２０℃で凍結された。血清はそれから、標準的な方法によってＧＬＵＣｍ、ＢＵＮｍ、ＣＲＥｍ　ＮＡ、ＫＣｌ、ＣＯ２、ＣＫ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、およびＡＬＢｍについて分析された。データは各試験ラットの一つから導き出されている。これらの結果は、さらなる被検ラットにおいて確かめられた。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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