(57)【要約】ｈＭｅｔＡＰ２の阻害剤を同定する方法および、特定の構造的、物理的および空間的特徴を有する阻害剤を用いてｈＭｅｔＡＰ２を阻害する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＭｅｔＡＰ２を阻害する方法であって、ｈＭｅｔＡＰ２の阻害を必要とする哺乳類に、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位に空間的に適合する１つまたは２つのヘテロ原子を含む化合物を投与することを含み、該化合物が以下のいずれかを含む方法：
ｉ）ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位の金属の一方または両方に対する、単独で、または対として共同しての相互作用であって、該金属が、コバルト、亜鉛、マンガン、鉄およびニッケルからなる群から選択され、該ヘテロ原子が最も近位の金属から１．５−３．５Åである相互作用；
ｉｉ）ヒスチジン２３１との水素結合相互作用；
ｉｉｉ）チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、グリシン２２２、およびイソロイシン３３８からなる群から選択される２以上のアミノ酸残基の原子との疎水性相互作用；
ｉｖ）ヒスチジン３３９、イソロイシン３３８およびチロシン４４４からなる群から選択される１以上の残基との疎水性相互作用；
ｖ）アスパラギン３１５との水素結合相互作用；または、
ｖｉ）ロイシン３２８、ロイシン４４７、ヒスチジン２３１、およびアラニン２３０からなる群から選択される１以上の残基との疎水性相互作用。
【請求項２】
ｈＭｅｔＡＰ２の阻害方法であって、ｈＭｅｔＡＰ２の阻害を必要とする哺乳類に、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位に空間的に適合する１つまたは２つのヘテロ原子を含む化合物を投与することを含み、該化合物が以下のいずれかを含む方法：
ｉ）ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位における金属の一方または両方に対する、単独で、または対として共同しての相互作用であって、該ヘテロ原子が最も近位の金属から１．７−２．４Åである相互作用；
ｉｉ）ヒスチジン２３１と相互作用する、酸素、窒素または硫黄などの水素結合を形成することのできる原子であって、該相互作用により該原子とヒスチジン２３１との距離が２．２−４．５Åとなる原子；
ｉｉｉ）チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、イソロイシン３３８、およびグリシン２２２からなる群から選択される残基と相互作用する疎水性基であって、該相互作用により該疎水性基原子と該残基との間の距離が２．２−４．５Åとなる疎水性基；
ｉｖ）イソロイシン３３８、チロシン４４４またはヒスチジン３３９と相互作用する疎水性基であって、ヒスチジン３３９が、以下の対の回転異性体角度ｃｈｉ−１およびｃｈｉ−２：（−１６４，１７７）、（−１５０，−１３３）、および（−７０，−１４９）からなる群から選択される少なくとも３種類のコンホメーションのうちのいずれかにて存在する疎水性基；
ｖ）カルボニル酸素またはエーテル酸素などの水素結合をすることができる基であって、該水素結合によりアスパラギン３１５と相互作用する基；
ｖｉ）ロイシン３２８、ロイシン４４７、ヒスチジン２３１、またはアラニン２３０と接触するメチル基などの疎水性基であって、該接触により該疎水性基と該残基の間の距離が３．４−５．０Åとなる疎水性基。
【請求項３】
化合物が以下の相互作用の１以上を含む、請求項１に記載の方法：．
ｉ）ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位における金属の一方または両方に対する、単独で、または対として共同しての相互作用であって、該金属がコバルト、亜鉛、マンガン、鉄およびニッケルからなる群から選択され、該ヘテロ原子が最も近位の金属から１．５−３．５Åである相互作用；
ｉｉ）ヒスチジン２３１との水素結合相互作用；
ｉｉｉ）チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、グリシン２２２、およびイソロイシン３３８からなる群から選択される２以上のアミノ酸残基の原子との疎水性相互作用；
ｉｖ）ヒスチジン３３９、イソロイシン３３８およびチロシン４４４からなる群から選択される１以上の残基との疎水性相互作用；
ｖ）アスパラギン３１５との水素結合相互作用；または、
ｖｉ）ロイシン３２８、ロイシン４４７、ヒスチジン２３１、およびアラニン２３０からなる群から選択される１以上の残基との疎水性相互作用。
【請求項４】
化合物が以下の化合物あるいはその医薬上活性な塩または溶媒和化合物である請求項１記載の方法：
４−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；
３−アニリノ−５−［２−（フェニル）エチル］−１，２，４−トリアゾール；
３−メチルアセテート−３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；
３−（２−イソプロピル−アニリノ）−５−（チオフェン−２−イルチオ）−１，２，４−トリアゾール；
４−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；
４−（２−クロロフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；
３−ベンジル−５−（ベンジルチオ）−１，２，４−トリアゾール；
３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；または、
１Ｈ−ナフト［１，２−ｄ］−１，２，３−トリアゾール。
【請求項５】
ｈＭｅｔＡＰ２に結合する能力を有し、そのタンパク分解活性を阻害する能力のある阻害剤化合物を同定する方法であって、以下の工程を含む方法：
触媒活性部位を含む、ｈＭｅｔＡＰ２分子の活性部位コンホメーションを規定する情報を、好適なコンピュータプログラムに入力する工程であって、該活性部位が表１に示されるタンパク質座標によって規定され、該プログラムがその３次元構造を表示する工程；
該コンピュータプログラムにおいて、活性部位溝の３次元表示を作成する工程；
被験化合物のモデルを表示し、それを該活性部位のモデルに重ね合わせる工程；
該被験化合物モデルが空間的に活性部位に適合するか否かを評価する工程；
活性部位に空間的に適合する該被験化合物を調製する工程；
該被験化合物を用いて該活性部位によって特徴付けられるプロテアーゼについての生物学的アッセイを行う工程；そして、
該被験化合物が該アッセイにおいてｈＭｅｔＡＰ２活性を阻害するか否かを判定する工程。
【請求項６】
請求項５記載の方法によって同定された、ペプチド、ペプチド擬似体または合成分子。
【請求項７】
ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位に結合する化学的存在をコンピュータにより評価するために、ｈＭｅｔＡＰ２結晶の構造座標を用いることを含む薬物設計方法。
【請求項８】
該化学的存在がｈＭｅｔＡＰ２の競合的または非競合的阻害剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
触媒的活性部位によって特徴付けられるｈＭｅｔＡＰ２分子の活性部位またはその断片に競合的に結合する阻害剤を同定する方法であって、該活性部位が表Ｉのタンパク質座標によって規定され、以下の工程を含む方法：
コンピュータ化されたモデリングシステムにプロテアーゼの活性部位の座標を入力する工程；
該構造に結合するであろう化合物を同定する工程；そして、
同定された化合物をプロテアーゼ阻害生物活性についてスクリーニングする工程。
【請求項１０】
以下の工程を含むｈＭｅｔＡＰ２酵素の阻害剤候補を同定する方法：
表Ｉのタンパク質座標によって規定される該酵素の３次元構造を用いる工程；
該３次元構造を用いて該阻害剤候補を設計または選抜する工程；
該阻害剤候補を合成する工程；および、
基質の存在下で該阻害剤候補を該酵素に接触させて、該阻害剤候補が該酵素を阻害する能力を測定する工程。
【請求項１１】
該阻害剤候補が新規に設計されたものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該阻害剤候補が既知の阻害剤から設計されたものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該３次元構造を用いて該化合物を設計または選抜する工程が、以下の工程を含む請求項１０に記載の方法：
該酵素に結合する能力のある化学的存在または断片を同定する工程；および、
同定された化学的存在または断片を編集して単一の分子とし、その阻害剤候補の構造を提供する工程。
【請求項１４】
該阻害剤候補が新規に設計されたものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該阻害剤候補が既知の阻害剤から設計されたものである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の構造的、物理的および空間的特徴を有し、酵素の活性部位の特定の残基と相互作用できる化合物を投与することによる、ｈＭｅｔＡＰ２の阻害方法に関する。本発明の化合物と活性部位の間のこの相互作用により、ｈＭｅｔＡＰ２の活性が阻害され、該化合物は血管新生により媒介される症状、例えば、癌、血管腫、増殖性網膜症、関節リウマチ、アテローム硬化型新血管新生、乾癬、眼新血管新生および肥満などの治療に有用である。本発明はまた、この酵素のメタロプロテアーゼ触媒活性部位の同定、および該活性部位の阻害剤の設計および選抜を可能にする方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７４年に、Folkmanは腫瘍が臨界サイズを超えて成長して広がって転移を形成するためには、血管新生と称される過程において、周囲の間質から内皮細胞を集め独自の内因性微小循環を形成しなけばならないことを提案した (Folkman J. (1974) Adv Cancer Res. 19; 331)。酸素および栄養素の生命線として腫瘍細胞によって誘発された新規な血管はまた、癌細胞が体の他の部分に広がるための出口を提供する。この過程の阻害により固形腫瘍の増殖および転移を効果的に停止できることが示された。この過程を特異的に阻害する薬剤は血管新生阻害剤として知られている。
【０００３】
癌の治療のための有望な新戦略として登場した抗血管新生療法（「間接的攻撃」）は、「直接的攻撃」戦略よりいくつかの有利な点を有する。すべての「直接的攻撃」アプローチ、例えば、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗剤の使用、ＲＡＳ経路の攻撃、ｐ５３の修復、細胞死プログラムの活性化、攻撃性Ｔ細胞の使用、モノクローナル抗体の注入、テロメラーゼの阻害などでは、結果として耐性腫瘍細胞の選抜が起こることが避けられない。しかし、「間接的攻撃」におけるように腫瘍の内皮部分を標的とすることにより耐性の問題は避けられる。なぜなら内皮細胞は腫瘍細胞ほどにはゲノムが不安定ではないからである。さらに、正常は内皮細胞は体内で比較的静止状態にあり、非常に長いターンオーバーを示すことから、抗血管新生療法は概して毒性が低い。また、「間接的攻撃」と「直接的攻撃」とでは異なる型の細胞を標的にするため、より効率的な併用療法の可能性がある。
【０００４】
３００を超える血管新生阻害剤が発見されており、そのなかで約３１の薬剤が現在癌の治療における人体実験において試験されている (Thompson, et al., (1999) J Pathol 187, 503)。アスペルギラス・フイガツス（Aspergillus fuigatus）のフマギリン(fumagillin)の半合成誘導体であるＴＮＰ−４７０はなかでももっとも強力な血管新生阻害剤である。それはインビボおよびインビトロで直接内皮細胞成長および遊走を阻害することにより作用する(Ingber et al. (1990) Nature 348, 555)。フマギリンとＴＮＰ−４７０は２型メチオニンアミノペプチダーゼ（以後、ＭｅｔＡＰ２と称する）を、その活性部位を不可逆的に修飾することによって阻害することが示された。フマギリンアナログの生化学的活性は、そのヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対する阻害効果と相関することが示された。フマギリンおよび関連化合物のＭｅｔＡＰ２−媒介内皮細胞分裂停止効果に対する選択的作用のメカニズムは確立されていないが、細胞増殖におけるＭｅｔＡＰ２の役割の可能性が示唆された。
【０００５】
まず、ｈＭｅｔＡＰ−２に触媒される、タンパク質の開始メチオニンの切断は、ミリストイル化の後、細胞増殖に関与する重要なシグナル伝達細胞因子として機能する多くのタンパク質の放出に必須である可能性がある。ミリストイル化されることが知られているタンパク質には、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、小さいＧＴＰａｓｅＡＲＦ、ＨＩＶタンパク質ｎｅｆおよびヘテロダイマーＧタンパク質のαサブユニットが含まれる。細胞のアポトーシスに関与する膜タンパク質である、一酸化窒素合成酵素のミリストイル化がフマギリンによって阻害されることが最近公表された研究によって示された(Yoshida, et al. (1998) Cancer Res. 58(16), 3751)。これは、グリシン−末端ミリストイル化基質のＭｅｔＡＰ２に触媒される放出の阻害の間接的結果であると提案されている。ＭｅｔＡＰ酵素は「Ｎ−末端則」によるタンパク質のインビボでの安定化のために重要であることが知られている。「Ｎ−末端則」はメチオニンが切断されたタンパク質のほうがそのＮ−末端メチオニン前駆体に比べて安定性が高いことを示唆するものである (Varshavsky, A (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93, 12142)。ｈＭｅｔＡＰ２の阻害は、細胞周期に必須のいくつかの細胞タンパク質の異常な存否に帰結する。
【０００６】
メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ）はすべての生物に普遍的に存在している。これは新たに翻訳されたポリペプチドからの開始メチオニンの除去を、補因子として二価金属イオンを用いて触媒する。２つの類縁性の低いＭｅｔＡＰ酵素の１型および２型が真核生物においてみられるが、少なくとも酵母においてはこれらは両者とも正常の成長に必要である。真正細菌においては１つのＭｅｔＡＰ（１型）のみがみられ、古細菌においてはＭｅｔＡＰ（２型）のみがみられる。Ｎ−末端延長領域により真核生物のメチオニンアミノペプチダーゼは原核生物のものから区別される。触媒Ｃ−末端ドメインにおける６４アミノ酸配列挿入（ｈＭｅｔＡＰ２における残基３８１〜４４４）により、ＭｅｔＡＰ−２ファミリーがＭｅｔＡＰ−１ファミリーから区別される。遺伝子構造の相違にかかわらず、すべてのＭｅｔＡＰ酵素が、「ピタ−ブレッド」骨格と称される高度に保存された触媒骨格を共有するようであり (Bazan, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 2473)、これは金属補因子の配位に関与する６つの厳密に保存された残基を含む。
【０００７】
哺乳類２型メチオニンアミノペプチダーゼは二機能性タンパク質として同定されており、一方では新生ポリペプチドからのＮ−末端メチオニンの切断を触媒することができ (Bradshaw, et al (1998) Trends Biochem. Sci. 23, 263)、一方では真核生物開始因子２α（ｅＩＦ−２α）と結合してそのリン酸化を妨げることができる (Ray, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 539)。ヒトおよびラットのＭｅｔＡＰ２遺伝子の両方がクローニングされ、９２％の配列同一性を示した (Wu,. et al. (1993) J Biol. Chem. 268, 10796; Li, X. & Chang, Y.-H. (1996) Biochem. & Biophys. Res. Comm. 227, 152)。これら酵素のＮ−末端延長部は高度に荷電しており、２つの塩基性ポリリジンブロックと１つのアスパラギン酸ブロックとからなり、これはｅＩＦ−２αへの結合に関与していると考えられている (Gupta, et al. (1993) in Translational Regulation of Gene Expression 2 (Ilan, J., Ed.), pp405-431, Plenum Press, New York)。
【０００８】
抗血管新生化合物であるフマギリンとそのアナログは、ｈＭｅｔＡＰ２とｅＩＦ２αとの複合体形成を阻害することなく、ｈＭｅｔＡＰ２のエキソ−アミノペプチダーゼ活性を特異的に阻害することが示された (Griffith, et al., (1997) Chem. Biol. 4, 461; Sin, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6099)。フマギリンおよびそのアナログはｈＭｅｔＡＰ２の酵素活性を高い特異性で不活性化し、このことはこれら化合物が密接に関連した１型メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ１）に対して酵母においてインビボおよびインビトロの両方で効果を有さないことによって強調される(Griffith, et al., (1997) Chem. Biol. 4, 461; Sin, et al. (1997) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 94, 6099)。これら阻害剤の非常に高い能力（ＩＣ５０＜１ｎＭ）は、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位残基であるＨｉｓ２３１の不可逆的修飾によるようである (Liu, et al. (1998) Science 282, 1324)。インビボでのＭｅｔＡＰ２活性の妨害は酵母(Griffith, et al., (1997) Chem. Biol. 4, 461; Sin, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6099; In-house data)およびショウジョウバエ (Cutforth & Gaul (1999) Mech. Dev. 82, 23) の正常な成長を損なう。もっとも重要なことには、フマギリン関連化合物のインビトロでのｈＭｅｔＡＰ２の酵素活性に対する阻害効果と、これらの化合物のインビボでの腫瘍誘発性血管新生に対する抑制効果の間に明らかな相関関係があるようである (Griffith, et al., (1997) Chem. Biol. 4, 461)。
【０００９】
癌は米国において心臓疾患に次ぐ第二の死因である。最近、ある種の腫瘍性疾患に対する療法が成功しているにもかかわらず、別の種の腫瘍性疾患はいまだに治療に対して不応性である。したがって癌はいまだに米国内外において主な死因であり罹患率が高い (Bailar and Gornik (1997) N Engl J Med 336, 1569)。ＭｅｔＡＰ２の阻害は癌の治療における新規な抗血管新生薬の開発に有望なメカニズムを提供する。
【００１０】
驚くべきことに、広範であって構造的に異なる化合物の一群が、該化合物とＭｅｔＡＰ２の活性部位の特定の残基との間の相互作用を可能にする構造的、物理的および空間的特徴を有しており、血管新生によって媒介される疾患、例えば、癌、血管腫、増殖性網膜症、関節リウマチ、アテローム硬化型新血管新生、乾癬、眼新血管新生および肥満などの治療に有用なことが見出された。したがって、本発明は以下に規定する特性を有する化合物を用いたｈＭｅｔＡＰ２の阻害方法に関する。
【発明の概要】
【００１１】
一つの態様において、本発明は、化合物と酵素の活性部位の特定の残基との間の相互作用を可能とするような特定の構造的、物理的および空間的特徴を有する化合物を投与することにより、ｈＭｅｔＡＰ２を阻害する方法を提供する。この相互作用はｈＭｅｔＡＰ２の活性を阻害し、したがって血管新生が因子である疾患、例えば、癌、血管腫、増殖性網膜症、関節リウマチ、アテローム硬化型新血管新生、乾癬、眼新血管新生および肥満などの治療が可能となる。
【００１２】
別の態様において、本発明は上記成分の阻害剤の同定方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
ｈＭｅｔＡＰ２のメタロプロテアーゼ構造の配位をコンピュータ化したモデリングシステムに提供する工程；
該構造に結合する化合物を同定する工程；そして、
ｈＭｅｔＡＰ２阻害生物活性について同定された化合物またはそれに由来するアナログをスクリーニングする工程。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明はｈＭｅｔＡＰ２の１または複数の活性部位結合ポケットまたは該結合ポケットに類似した構造的ホモログを含む、結晶化した分子および分子複合体を提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明はこれらの結晶化した分子または分子複合体の対応する構造配位をコード化したデータ記憶媒体を提供する。そのようなデータ記憶材料はコンピュータスクリーン上でグラフィカルな３次元表示としてそのような分子および分子複合体をディスプレーすることができる。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、ｈＭｅｔＡＰ２の構造配位（座標）および原子の詳細を用いて、ｈＭｅｔＡＰ２の望ましくない物理的および医学的特性を回避しつつ、ｈＭｅｔＡＰ２に結合する阻害剤、その変異体またはホモログをスクリーニングし、コンピュータによって評価し、そして設計および合成する方法を提供する。
【００１６】
本発明のその他の態様および利点を以下の好適な態様の詳細な記載においてさらに説明する。
（図面の簡単な説明）
【００１７】
図１は、ｈＭｅｔＡＰ２のリボンダイアグラムである。アミノ末端およびカルボキシル末端は、ＮおよびＣと示す。図はプログラムMOLSCRIPT [Kraulis, P., J. Appl. Crystallogr., 24, 946-950 (1991)]を用いて作成した。
【００１８】
図２は、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【００１９】
図３は、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位の立体図である。明確化のために水素原子または水分子は示していない。
【００２０】
図４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０はｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。（図４：阻害剤＝４−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；図６：阻害剤＝３−アニリノ−５−［２−（フェニル）エチル］−１，２，４−トリアゾール；図８：阻害剤＝３−メチルアセテート−３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；図１０：阻害剤＝３−（２−イソプロピル−アニリノ）−５−（チオフェン−２−イルチオ）−１，２，４−トリアゾール；図１２：阻害剤＝４−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；図１４：阻害剤＝４−（２−クロロフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；図１６：阻害剤＝３−ベンジル−５−（ベンジルチオ）−１，２，４−トリアゾール；図１８：阻害剤＝３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；図２０：阻害剤＝１Ｈ−ナフト［１，２−ｄ］−１，２，３−トリアゾール。これらの図はそれぞれの阻害剤と、阻害剤の５Å以内にあるヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の残基のすべての原子との相互作用を示す。明確化のため、水素原子および水分子は示していない。２つの活性部位の金属原子は球として示す。
【００２１】
図５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。（図５：阻害剤＝４−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；図７：阻害剤＝３−アニリノ−５−［２−（フェニル）エチル］−１，２，４−トリアゾール；図９：阻害剤＝３−メチルアセテート−３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；図１１：阻害剤＝３−（２−イソプロピル−アニリノ）−５−（チオフェン−２−イルチオ）−１，２，４−トリアゾール；図１３：阻害剤＝４−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；図１５：阻害剤＝４−（２−クロロフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；図１７：阻害剤＝３−ベンジル−５−（ベンジルチオ）−１，２，４−トリアゾール；図１９：阻害剤＝３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；図２１：阻害剤＝１Ｈ−ナフト［１，２−ｄ］−１，２，３−トリアゾール。これらの図はそれぞれの阻害剤と、阻害剤の５Å以内にあるヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の残基のすべての原子との相互作用を示す立体図である。水分子および２つの活性部位の金属原子は図において十字印として示す。
【００２２】
表Iは、本発明のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の結晶構造の３次元タンパク質座標を提供する。
【００２３】
表ＩＩ−Ｘは、本発明の特定の阻害剤とヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２との複合体の３次元座標を提供する；表ＩＩ：４−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；表ＩＩＩ：阻害剤＝３−アニリノ−５−［２−（フェニル）エチル］−１，２，４−トリアゾール；表ＩＶ：阻害剤＝３−メチルアセテート−３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；表Ｖ：阻害剤＝３−（２−イソプロピル−アニリノ）−５−（チオフェン−２−イルチオ）−１，２，４−トリアゾール；表ＶＩ：阻害剤＝４−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；表ＶＩＩ：阻害剤＝４−（２−クロロフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；表ＶＩＩＩ：阻害剤＝３−ベンジル−５−（ベンジルチオ）−１，２，４−トリアゾール；表ＩＸ：阻害剤＝３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；表Ｘ：阻害剤＝１Ｈ−ナフト［１，２−ｄ］−１，２，３−トリアゾール。
【発明の詳細な記載】
【００２４】
本発明は、ｈＭｅｔＡｐ２タンパク質の結晶形態を用いてタンパク質活性部位とタンパク質阻害剤との阻害剤複合体を形成させる方法を提供し、ここで該方法は、結晶形態と活性部位を用いてタンパク質阻害剤化合物を同定する。
【００２５】
本出願において用いる「結合ポケット」の語は、その形状の結果として、他の化学的存在または化合物と好適に結合する分子または分子複合体の領域を意味する。
【００２６】
本出願において用いる「活性部位結合ポケット」または「ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位」の語は独立に、ペプチド基質からＮ−末端メチオニン切断が起こる部位を指す。ｈＭｅｔＡＰ２の結晶構造を解像したところ、本出願人らはｈＭｅｔＡＰ２のアミノ酸は活性部位に存在するペプチド分子とそれが相互作用するのに十分に近く（５Å以内）に存在することを見出した。当業者にとっては、ｈＭｅｔＡＰ２の他のアイソフォームにおけるアミノ酸の番号は、ヒト内皮細胞から単離されたものと異なることが明らかであろう。
【００２７】
本出願において用いる「と結合する」または「の間の結合」の語は独立に、化学的存在または化合物あるいはその部分と、ｈＭｅｔＡＰ２分子またはその部分との間が近接している状態を指す。結合は非共有結合であってよく（ここで近位は水素結合、ファンデルワールスまたは静電相互作用によるものがエネルギー的に好ましい）共有結合であってもよい。
【００２８】
本出願において用いられる「求電子性原子」の語は電子欠損の原子を指す。この語は酸素、窒素または硫黄原子を含む。
【００２９】
本出願において用いられる「水素結合」の語は一方の分子の水素原子と他方の分子の２つの非共有電子対の間の結合を意味し、ここで原子間距離は３．０−６．０オングストローム（以後「Å」と称する）である。
【００３０】
本出願において用いられる「疎水性相互作用」の語は、疎水性基または原子、例えば非極性または分極性原子、具体的にはＣ、Ｎ、ＯまたはＳなどの芳香族環原子、Ｃ、ＨまたはＳなどの脂肪族非極性原子と残基との間の接触を指し、ここで接触とは原子間距離が３．３−５．５Åであることをいう。
【００３１】
アミノ酸略記：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン          Ｔ＝Ｔｈ＝トレオニン
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン            Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン          Ｙ＝Ｔｈｒ＝チロシン
Ｉ＝Ｉｌｃ＝イソロイシン      Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン          Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン  Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン    Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン        Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン          Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン
【００３２】
本発明によるｈＭｅｔＡＰ２に結合するまたはそれを阻害する化合物の設計は概して２つの因子を考慮して行う。第一に化合物はｈＭｅｔＡＰ２と物理的および構造的に結合できなければならない。ｈＭｅｔＡＰ２とその基質との結合において重要な非共有結合分子相互作用には、水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水性相互作用が含まれる。
【００３３】
第二に、化合物はｈＭｅｔＡＰ２と結合することが可能なコンホメーションを想定できなければならない。化合物の特定の部分がｈＭｅｔＡＰ２との結合に直接参加しないとしても、それらの部分は分子の全体のコンホメーションに影響を与える余地がある。これは作用強度に重大な影響を与え得る。そのような配置的要求には、全体の３次元構造、結合部位の全体または一部、例えばｈＭｅｔＡＰ２活性部位またはアクセサリ結合部位に対する化学的存在または化合物の配向、あるいはｈＭｅｔＡＰ２と直接相互作用するいくつかの化学的存在を含む化合物の官能基の間の空間などが含まれる。
【００３４】
特に、本発明において用いられるｈＭｅｔＡＰ２の阻害剤は１または２のヘテロ原子を含み、ここで阻害剤は以下の１または複数と相互作用する：
１．ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位の一方または両方の金属に対する単独で、または対として共同しての相互作用（ここで金属はコバルト、亜鉛、マンガン、鉄およびニッケルから選択され、ヘテロ原子は最も近位の金属から１．５−３．５Åである）；
２．ヒスチジン２３１との水素結合相互作用；
３．以下から選択される２以上のアミノ酸残基の原子との疎水性相互作用：チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、グリシン２２２、およびイソロイシン３３８；
４．以下から選択される１以上の残基との疎水性相互作用：ヒスチジン３３９、イソロイシン３３８またはチロシン４４４；
５．アスパラギン３１５との水素結合相互作用；そして、
６．以下から選択される１以上の残基との疎水性相互作用：ロイシン３２８、ロイシン４４７、ヒスチジン２３１、またはアラニン２３０。
【００３５】
好ましくは、本発明で用いられるｈＭｅｔＡＰ２の阻害剤は、活性部位の上記の領域の２以上と相互作用する。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法で用いられる化合物は５員環または６員環の芳香族複素環構造を含み、ここで環において少なくとも１つのヘテロ原子が存在する。
【００３７】
Ｈｉｓ３３９との疎水性相互作用に関して、ｈＭｅｔＡＰ２のＨｉｓ３３９は複数のコンホメーションで存在し得ることを理解されたい。それゆえＨｉｓ３３９残基での相互作用は、Ｈｉｓ３３９の様々な回転異性体角度(rotomeric angle) コンホメーションの側鎖のいずれかとのものである。
【００３８】
本発明の阻害剤の重要な構造特性は、複素環基、好ましくは１，２，３−トリアゾールまたは１，２，４−トリアゾール環系、および疎水性基を含むことである。これらの特性はｈＭｅｔＡＰ２活性部位と適切な相互作用を形成することができなければならない。
【００３９】
好ましくは本発明のｈＭｅｔＡＰ２の阻害方法は、ｈＭｅｔＡＰ２の阻害を必要とする哺乳類、好ましくはヒトにｈＭｅｔＡＰ２の活性部位に空間的に適合する化合物を投与することを含み、該化合物は１または２のヘテロ原子を含み、ここで該化合物は以下の相互作用の１または複数を有する。
ｉ）単独で、あるいは対として共同しての、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位における一方または両方の金属との相互作用（ここで該ヘテロ原子は最も近位の金属から１．５−３．５Åであり、好ましくはヘテロ原子は最も近位の金属から１．７−２．４Åである）。
ｉｉ）酸素、窒素または硫黄などの水素結合が可能な原子であってヒスチジン２３１と相互作用し、これにより該原子とヒスチジン２３１との距離が２．２−４．５Å、好ましくは２．４−３．２Åである原子。
ｉｉｉ）以下から選択される残基と相互作用する疎水性基：チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、イソロイシン３３８、およびグリシン２２２、（相互作用の結果、疎水性基原子と該残基との距離が２．２−４．５Å、好ましくは２．４−３．２Åとなる）。
ｉｖ）以下から選択される残基と相互作用する疎水性基：イソロイシン３３８、チロシン４４４またはヒスチジン３３９、（ここでヒスチジン３３９は以下の対の側鎖回転異性体角度ｃｈｉ−１およびｃｈｉ−２：（−１６４，１７７）、（−１５０，−１３３）、または（−７０，−１４９）から選択される少なくとも３種類のコンホメーションのいずれかにおいて存在し得る）。
ｖ）アスパラギン３１５と相互作用する水素結合が可能な基、（例えば、カルボニル酸素またはエーテル酸素）。
ｖｉ）以下の残基と接触するメチル基などの疎水性基：ロイシン３２８、ロイシン４４７、ヒスチジン２３１、またはアラニン２３０、（ここで接触により疎水性基と該残基の間の距離は３．４−５．０Åとなる）。
【００４０】
好ましくは本発明のｈＭｅｔＡＰ２の阻害方法は、ｈＭｅｔＡＰ２の阻害を必要とする哺乳類、好ましくはヒトにｈＭｅｔＡＰ２の活性部位に空間的に適合する化合物を投与することを含み、該化合物は１または２のヘテロ原子を含み以下の相互作用を有する：
（ｉ）単独で、または対として共同してのｈＭｅｔＡＰ２の活性部位の一方または両方の金属との相互作用（ここで金属は、コバルト、亜鉛、マンガン、鉄およびニッケルから選択され、ヘテロ原子は最も近位の金属から１．５−３．５Åである）。または、
（ｉｉ）以下から選択される残基との疎水性相互作用：チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、イソロイシン３３８、およびグリシン２２２、（相互作用の結果、疎水性基原子と該残基との間の距離は２．２−４．５Å、好ましくは２．４−３．２Åとなる。好ましくは、活性部位における金属はコバルトまたは亜鉛である）。
【００４１】
あるいは、本発明のｈＭｅｔＡＰ２の阻害方法は、ｈＭｅｔＡＰ２の阻害を必要とする哺乳類、好ましくはヒトに、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位に空間的に適合する化合物を投与することを含み、該化合物は１または２のヘテロ原子を含み、そして以下の相互作用を有する：
（１）（ｉ）単独で、または対として共同してのｈＭｅｔＡＰ２の活性部位における金属の一方または両方に対する相互作用（ここで金属はコバルト、亜鉛、マンガン、鉄およびニッケルから選択され、ヘテロ原子は最も近位の金属から１．５−３．５Åである）、または、
（ｉｉ）以下から選択される残基との疎水性相互作用：チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、イソロイシン３３８、およびグリシン２２２、（相互作用の結果、疎水性基原子と該残基との間の距離は２．２−４．５Å、好ましくは２．４−３．２Åとなる）；そして、
（２）以下から選択されるさらなる相互作用：
（ｉ）ヒスチジン２３１との水素結合相互作用；
（ｉｉ）イソロイシン３３８、チロシン４４４またはヒスチジン３３９との疎水性相互作用（ここで、ヒスチジン３３９は以下の対の側鎖回転異性体角度ｃｈｉ−１およびｃｈｉ−２：（−１６４，１７７）、（−１５０，−１３３）、または（−７０，−１４９）から選択される少なくとも３種類のコンホメーションのいずれかで存在し得る）；
（ｉｉｉ）水素結合相互作用（ここでカルボニル酸素またはエーテル酸素などの基がアスパラギン３１５と相互作用する）；そして、
（ｖｉ）メチル基などの基と、接触するロイシン３２８、ロイシン４４７、ヒスチジン２３１、またはアラニン２３０の間の疎水性相互作用（相互作用により、疎水性基と該残基との間の距離は３．４−５．０Åとなる）。
【００４２】
あるいは、本発明のｈＭｅｔＡＰ２の阻害方法は、ｈＭｅｔＡＰ２の阻害を必要とする哺乳類、好ましくはヒトにｈＭｅｔＡＰ２の活性部位に空間的に適合する化合物を投与することを含み、該化合物は１または２のヘテロ原子を含み、以下の相互作用を有する：
（１）（ｉ）単独で、または対として共同しての、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位の金属の一方または両方に対する相互作用（ここで、金属はコバルト、亜鉛、マンガン、鉄およびニッケルから選択され、ヘテロ原子は最も近位の金属から１．５−３．５Åである）；または、
（ｉｉ）以下から選択される残基との疎水性相互作用：チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、イソロイシン３３８、およびグリシン２２２、（相互作用により、疎水性基原子と該残基との間の距離は２．２−４．５Å、好ましくは２．４−３．２Åとなる）；そして、
（２）以下から選択される少なくとも２つのさらなる相互作用：
（ｉ）ヒスチジン２３１との水素結合相互作用；
（ｉｉ）イソロイシン３３８、チロシン４４４またはヒスチジン３３９との疎水性相互作用（ここで、ヒスチジン３３９は以下の対の側鎖回転異性体角度ｃｈｉ−１およびｃｈｉ−２：（−１６４，１７７）、（−１５０，−１３３）、または（−７０，−１４９）から選択される少なくとも３種類のコンホメーションのいずれか１つにて存在し得る）；
（ｉｉｉ）カルボニル酸素またはエーテル酸素などの基がアスパラギン３１５と相互作用する水素結合相互作用；そして、
（ｖｉ）メチル基などの基と、接触するロイシン３２８、ロイシン４４７、ヒスチジン２３１、またはアラニン２３０の間の疎水性相互作用（相互作用により疎水性基と該残基との間の距離は３．４−５．０Åとなる）。
【００４３】
あるいは、本発明のｈＭｅｔＡＰ２の阻害方法は、ｈＭｅｔＡＰ２の阻害を必要とする哺乳類、好ましくはヒトに、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位と空間的に適合する化合物を投与することを含み、該化合物は１または２のヘテロ原子を含み、以下の相互作用を有する：
（１）（ｉ）単独で、または対として共同してのｈＭｅｔＡＰ２の活性部位の金属の一方または両方に対する相互作用（ここで、金属はコバルト、亜鉛、マンガン、鉄およびニッケルから選択され、ヘテロ原子は最も近位の金属から、１．５−３．５Åである）または、
（ｉｉ）以下から選択される残基との疎水性相互作用：チロシン４４４、ヒスチジン２３１、ヒスチジン３８２、アラニン４１４、チロシン３８３、フェニルアラニン２１９、プロリン２２０、メチオニン３８４、イソロイシン３３８、およびグリシン２２２、（相互作用により、疎水性基原子と該残基との間の距離は２．２−４．５Å、好ましくは２．４−３．２Åとなる）；そして、
（２）以下から選択される少なくとの１つのさらなる相互作用：
（ｉ）ヒスチジン２３１との水素結合相互作用；
（ｉｉ）イソロイシン３３８、チロシン４４４またはヒスチジン３３９との疎水性相互作用（ここで、ヒスチジン３３９は、以下の対の側鎖回転異性体角度ｃｈｉ−１およびｃｈｉ−２：（−１６４，１７７）、（−１５０，−１３３）、または（−７０，−１４９）から選択される少なくとも３種類のコンホメーションのいずれか１つで存在し得る）；
（ｉｉｉ）カルボニル酸素またはエーテル酸素などの基がアスパラギン３１５と相互作用する水素結合相互作用；そして、
（ｖｉ）メチル基などの基と、接触するロイシン３２８、ロイシン４４７、ヒスチジン２３１、またはアラニン２３０の間の疎水性相互作用（相互作用により、疎水性基と該残基との間の距離は３．４−５．０Åとなる）。
【００４４】
本発明の方法に用いられる化合物は以下のものを含むがそれらに限定されない：
４−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；
３−アニリノ−５−［２−（フェニル）エチル］−１，２，４−トリアゾール；
３−メチルアセテート−３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；
３−（２−イソプロピル−アニリノ）−５−（チオフェン−２−イルチオ）−１，２，４−トリアゾール；
４−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；
４−（２−クロロフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール；
３−ベンジル−５−（ベンジルチオ）−１，２，４−トリアゾール；
３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール；および、
１Ｈ−ナフト［１，２−ｄ］−１，２，３−トリアゾール、
またはこれらの医薬上活性な塩または溶媒和化合物。
【００４５】
本発明の方法に用いられる化合物は、これに限定されるものではないが、式（I)の化合物またはその医薬上活性な塩または溶媒和化合物を含む：
【化１】
2004535377.tif 000002
［式中：ｎは１または２；
Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは独立にＣ、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される；
Ｒは５つまでであり独立に−Ｈ、−ＯＨ、Ａｒ−Ｃ０−６アルキル−、Ｈｅｔ’−Ｃ０−６アルキル−、任意に置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、任意に置換されていてもよいＨｅｔ−Ｃ０−６アルキル−、Ｃ３−７シクロアルキル−Ｃ０−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ、−Ｓ−Ｃ１−６アルキル、任意に置換されていてもよいＡｒ−Ｃ０−６アルコキシ−、Ｈｅｔ’−Ｃ０−６アルコキシ−、−ＮＲ４Ｒ５、Ｈｅｔ’−Ｓ−Ｃ０−６アルキル−、−（ＣＨ２）１−６ＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＨ２）０−６ＣＯ２Ｒ６、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＣＯ２Ｒ６、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ２Ｒ６、−ＳＲ７、−ＯＲ７、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、またはハロゲンから選択され、そしてＰｈまたはＨｅｔ’は１または複数のＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、−（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ６、ＣＦ３またはハロゲンによって置換されている；
あるいはＲは−Ｃ０−６アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｘ’ＡＢ、−Ｃ０−６アルキル−Ｓ（Ｏ）２Ｘ’ＡＢ、−Ｃ０−６アルキル−Ｘ’ＡＢ（ここでＸ’はＯ、Ｓ、ＣまたはＮであり、ＡおよびＢは独立にＨ、任意に置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、任意に置換されていてもよいＡｒ−Ｃ０−６アルキル−、任意に置換されていてもよいＨｅｔ−Ｃ０−６アルキル−、またはＣ３−７シクロアルキル−Ｃ０−６アルキル−から選択される）；
あるいは２つのＲ基が結合して５員環から７員環の飽和または不飽和の、炭素環または複素環を形成してもよい；
あるいはＲは式（ＩＩ）の部分である、
【化２】
2004535377.tif 000003
（式中、Ｑは任意にＮ、Ｏ、またはＳから選択される２つまでのヘテロ原子を含んでいてもよい５員環または６員環の単環式環であるか、または、任意にＮ、Ｏ、またはＳから選択される４つまでのヘテロ原子を含んでいてもよい８員環から１１員環の縮合二環式環；
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ−、Ｐｈ−Ｃ０−６アルキル−、Ｈｅｔ−Ｃ０−６アルキル−、Ｃ１−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−、−Ｓ−Ｃ１−６アルキル−、Ｐｈ−Ｃ０−６アルコキシ−、Ｈｅｔ−Ｃ０−６アルコキシ−、ＨＯ−、Ｒ４Ｒ５Ｎ−、Ｈｅｔ−Ｓ−Ｃ０−６アルキル−、Ｐｈ−Ｓ−Ｃ０−６アルキル−、ＨＯ（ＣＨ２）１−６−、Ｒ４Ｒ５Ｎ（ＣＨ２）２−６−、Ｒ４Ｒ５Ｎ（ＣＨ２）２−６Ｏ−、Ｒ６ＣＯ２（ＣＨ２）０−６−、Ｒ６ＣＯ２（ＣＨ２）１−６Ｏ−、Ｒ６ＳＯ２（ＣＨ２）１−６−、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、またはハロゲンから選択され、そして、ＰｈまたはＨｅｔは５つまでのＣ２−６アルキル−、Ｃ１−６アルコキシ−、Ｒ４Ｒ５Ｎ（ＣＨ２）１−６−、Ｒ４Ｒ５Ｎ（ＣＨ２）２−６Ｏ−、−ＣＯ２Ｒ６、−ＣＦ３または、ハロゲンによって置換されている）；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立にＨ−、任意に置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、任意に置換されていてもよいＡｒ−Ｃ０−６アルキル−、任意に置換されていてもよいＨｅｔ−Ｃ０−６アルキル−、またはＣ３−７シクロアルキル−Ｃ０−６アルキル−、−Ｃ０−６アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｘ’ＡＢ、−Ｃ０−６アルキル−Ｓ（Ｏ）２Ｘ’ＡＢ、−Ｃ０−６アルキル−Ｘ’ＡＢから選択される（ここで、Ｘ’はＯ、Ｓ、ＣまたはＮ；ＡおよびＢは独立にＨ、任意に置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、任意に置換されていてもよいＡｒ−Ｃ０−６アルキル−、任意に置換されていてもよいＨｅｔ−Ｃ０−６アルキル−、またはＣ３−７シクロアルキル−Ｃ０−６アルキル−である）；そして、
Ｒ７は任意に置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、任意に置換されていてもよいＡｒ−Ｃ０−６アルキル−、任意に置換されていてもよいＨｅｔ−Ｃ０−６アルキル−、Ｃ３−７シクロアルキル−Ｃ０−６アルキル−である］。
【００４６】
本出願において用いる「Ｃ１−６アルキル」の語は、鎖長が限定されない場合、置換および非置換の直鎖または分枝鎖の炭素数１から６のラジカルであり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびｔ−ブチル、ペンチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルおよびヘキシル、そして単純なこれらの脂肪族異性体が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃ１−６アルキル基は１または複数の−ＯＲ４、−Ｒ４、−ＮＲ４Ｒ５によって独立に任意に置換されていてもよい。Ｃ０アルキルは当該部分にアルキル基が存在しないことを意味する。したがって、Ａｒ−Ｃ０アルキル−はＡｒに等しい。
【００４７】
本出願において用いる「Ｃ３−７シクロアルキル」の語は、置換または非置換の炭素数３から７の環状ラジカルを意味し、例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルラジカルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
本出願において用いる「Ｃ２−６アルケニル」の語は、炭素数２から６のアルキル基において炭素−炭素単結合が炭素−炭素二重結合によって置換されているものを意味する。
Ｃ２−６アルケニルとしては例えば、エチレン、１−プロペン、２−プロペン、１−ブテン、２−ブテン、イソブテンおよびいくつかの異性体のペンテンおよびヘキセンが挙げられる。シスおよびトランス異性体の両方が本発明の範囲に含まれる。Ｃ２−６アルケニル基は１または複数のＰｈ−Ｃ０−６アルキル−、Ｈｅｔ’−Ｃ０−６アルキル−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−、−Ｓ−Ｃ１−６アルキル、Ｐｈ−Ｃ０−６アルコキシ−、Ｈｅｔ’−Ｃ０−６アルコキシ−、−ＯＨ、−ＮＲ４Ｒ５、Ｈｅｔ’−Ｓ−Ｃ０−６アルキル−、−（ＣＨ２）１−６ＯＨ、（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＨ２）０−６ＣＯ２Ｒ６、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＣＯ２Ｒ６、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ２Ｒ７、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３またはハロゲンによって独立に任意に置換されていてもよい。
【００４９】
本出願において用いる「Ｃ２−６アルキニル」の語は炭素数２から６のアルキル基において１つの炭素−炭素単結合が炭素−炭素三重結合によって置換されているものを意味する。Ｃ２−６アルキニルとしては例えば、アセチレン、１−プロピン、２−プロピン、１−ブチン、２−ブチン、３−ブチンおよび単純な異性体のペンチンおよびヘキシンが挙げられる。
【００５０】
本出願において用いる「Ａｒ」または「アリール」の語は、同じ意味で用いられ、１または複数のＰｈ−Ｃ０−６アルキル、Ｈｅｔ’−Ｃ０−６アルキル−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−、−Ｓ−Ｃ１−６アルキル、Ｐｈ−Ｃ０−６アルコキシ−、Ｈｅｔ’−Ｃ０−６アルコキシ−、−ＯＨ、−ＮＲ４Ｒ５、Ｈｅｔ’−Ｓ−Ｃ０−６アルキル−、−（ＣＨ２）１−６ＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−（ＣＨ２）０−６ＣＯ２Ｒ６、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＣＯ２Ｒ６、−（ＣＨ２）１−６ＳＯ２、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３またはハロゲンによって任意に置換されていてもよいフェニルおよびナフチルを意味する；ＰｈおよびＨｅｔは1または複数のＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−、−ＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ６、−ＣＦ３、またはハロゲンによって任意に置換されていてもよい；２つのＣ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシ基は結合して、Ａｒ環に対して縮合した飽和または不飽和の５員環から７員環を形成してもよい（例えば、Ａｒ環の隣接する位置に結合した二価のアルキレンまたはアルキレンジオキシ部分を形成してもよい）。
【００５１】
本出願において用いる「Ｈｅｔ」または「複素環」の語は同じ意味で用いられ、安定な５員環から７員環の単環式、安定な７員環から１０員環の二環式、または安定な１１員環から１８員環の三環式複素環を意味し、これらは飽和または不飽和であり、炭素原子とＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される１から３のヘテロ原子とから構成され、ここで窒素および硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に四級化されていてもよく、そして上記の複素環がベンゼン環に縮合した二環式基を含む。複素環はいずれのヘテロ原子または炭素原子に結合してもよく、その結果安定な構造が形成され、そして１または複数のＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ６、−ＣＦ３、またはハロゲンによって任意に置換されていてもよい。
【００５２】
そのような複素環としては例えば、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロロジニル、２−オキソアゼピニル、アゼピニル、ピロリル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、ピリジニル、ピラジニル、オキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル、チアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリル、キヌクリジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、ベンズオキサゾリル、フリル、ピラニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、チエニル、ベンズオキサゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアモルホリニルスルホン、およびオキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピリダジニル、ピリミジニルおよびトリアジニルが挙げられるがこれらに限定されず、これらは常套の化学合成によって入手でき安定である。
【００５３】
Ｈｅｔ’はＨｅｔについては定義されており、１または複数のＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ−、−ＯＨ、−（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−Ｏ（ＣＨ２）１−６ＮＲ４Ｒ５、−ＣＯ２Ｒ６、−ＣＦ３、またはハロゲンによって任意に置換されていてもよい。
【００５４】
本出願において用いる「ヘテロ」または「ヘテロ原子」の語は同じ意味に用いられ、酸素、窒素および硫黄を意味する。
【００５５】
本出願において用いる「ハロ」または「ハロゲン」の語は同じ意味に用いられ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩを意味する。
【００５６】
ここで、および本出願全体において、Ｃ０の語は、直後に置換基がないことを意味する；例えば、部分ＡｒＣ０−６アルキル−において、Ｃが０の場合、該置換基はＡｒ、例えば、フェニルである。逆に部分ＡｒＣ０−６アルキル−が特定の芳香族基、例えば、フェニルとして決定される場合、Ｃは０であると理解される。
【００５７】
さらに、部分が「任意に置換されていてもよい」場合、該部分は１または複数の任意の置換基を含んでいてもよく、それぞれの任意の置換基は独立に選択されることを理解されたい。
【００５８】
式（Ｉ）の化合物は置換された複素環部分を含み、例えば、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、イソキサゾール、イソチアゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、ピリジン、ジアジン、ピリミジン、ピラジン、１，２，３−トリアジン、１，２，４−トリアジン、１，３，５−トリアジンが含まれるがこれらに限定されない。本発明の部分を形成する複素環の炭素原子に上記のＲ基が結合していてもよいことが理解される。
【００５９】
調製方法
式（Ｉ）の化合物であって、Ａ、ＤおよびＥがそれぞれ窒素、Ｂが炭素、Ｒが独立に−ＮＲ４Ｒ５および−ＳＲ７であり、ｎが１である化合物をスキーム１に記載の方法と同様の方法によって調製した。
【化３】
2004535377.tif 000004
【００６０】
ａ）チオウレア、ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ；ｂ）ＥｔＩ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＦ；ｃ）Ｈ２ＮＮＨ２、ＥｔＯＨ；ｄ）Ｒ７Ｘ（Ｘ＝ハロゲン）、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ；ｅ）ＣｌＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、ＮａＨ、ＴＨＦ；ｆ）Ｒ５ＣＨ２Ｂｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ；ｇ）ＴＦＡ
【００６１】
イソチオシアナート（例えばフェニルイソチオシアナート）（１−スキーム１）を、アセトニトリル／水中でチオウレアと水酸化ナトリウムで処理し、２−スキーム１を得、これをＤＭＦ中でヨードエタンおよびトリエチルアミンで処理して３−スキーム１を得た。３−スキーム１のエタノール中のヒドラジンでの処理により４−スキーム１を得、これをＤＭＦ中のアルキルハライド（例えばベンジルブロミドまたは４−クロロベンジルクロリド）および炭酸カリウムで処理して５−スキーム１を得た。トリアゾール５−スキーム１をメトキシメチルエチルエーテルとして保護して６−スキーム１を得る。６−スキーム１のアルキルハライド（例えば、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化ｉ−イソブチル、ヨウ化ｎ−プロピル、ヨウ化ブチル、アリルブロミド、ベンジルブロミド、およびメチルブロモアセテートなど）によるアルキル化により、所望の三級アミン７−スキーム１を得た。ＭＯＭ−エーテル７−スキーム１のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での脱保護により所望の生成物８−スキーム１を得た。
【００６２】
式（Ｉ）の化合物であって、Ａ、ＤおよびＥがそれぞれ窒素であり、Ｂが炭素、Ｒが独立に−ＮＲ４Ｒ５および−ＯＲ７、そしてｎが１である化合物は、スキーム２に記載の方法と同様の方法によって調製できる。
【化４】
2004535377.tif 000005
【００６３】
ａ）チオウレア、ＥｔＩ、ＥｔＯＨ；ｂ）ＮＨ２ＮＨ２、ＥｔＯＨｃ）１，１’’−カルボニルジイミダゾール、ＥｔＯＨ；ｄ）Ｒ７Ｘ（Ｘ＝ハロゲン）、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ；ｅ）ＣｌＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、ＮａＨ、ＴＨＦ；ｆ）Ｒ５ＣＨ２Ｂｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ；ｇ）ＴＦＡ
【００６４】
チオウレア（例えばフェニルチオウレア）（８−スキーム２）をヨウ化エチルで処理し、ＥｔＯＨ中で還流し、その結果得られるＳ−エチルチオウレアを次にヒドラジンの存在下で加熱し、９−スキーム２を得る。ヒドラジン９−スキーム２をカルボニルジイミダゾールで処理し、加熱して１０−スキーム２を得る。１０−スキーム２のＤＭＦ中でのアルキルハライド（例えばベンジルブロミドまたは４−クロロベンジルクロリド）および炭酸カリウムでの処理により１１−スキーム２を得る。トリアゾール１１−スキーム２をメトキシメチルエチルエーテルとして保護し１２−スキーム２を得る。１２−スキーム２のアルキルハライド（例えばヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化ｉ−イソブチル、ヨウ化ｎ−プロピル、ヨウ化ブチル、アリルブロミド、ベンジルブロミド、およびメチルブロモアセテート）でのアルキル化により所望の三級アミン１３−スキーム２を得る。ＭＯＭ−エーテル１３−スキーム２のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での脱保護により所望の生成物１４−スキーム２を得る。
【００６５】
式（Ｉ）の化合物であって、Ｂ、ＤおよびＥがそれぞれ窒素、Ａが炭素、Ｒが式（ＩＩ）の部分、そしてｎが１である化合物を、スキーム３に記載の方法と同様の方法によって調製した。
【化５】
2004535377.tif 000006
【００６６】
ａ）Ｐ（Ｏ）（ＯＭｅ）２Ｃ（Ｎ２）Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ、ｂ）１．Ｍｅ３ＳｉＮ３、ＰｈＣＨ３、１１０℃；２．Ｈ２Ｏ
【００６７】
アルデヒド（例えば２−チオフェンカルボキシアルデヒド）（１−スキーム３）を乾燥メタノール中で１−ジアゾ−２−オキソプロピルホスホナートおよび炭酸カリウムで処理して２−スキーム３を得た。還流中のトルエン中でのアセチレン（例えば２−エチニルチオフェン）（２−スキーム３）のアジドトリメチルシランでの処理、次いで水の添加により３−スキーム３を得た。
【００６８】
式（Ｉ）の化合物であって、Ｂ、ＤおよびＥがそれぞれ窒素、Ａが炭素、Ｒが式（ＩＩ）の部分、ｎが１、そしてＲ２がＮＨＲ４である化合物をスキーム４に記載の方法と同様の方法によって調製した。
【化６】
2004535377.tif 000007
【００６９】
ａ）Ｒ４−Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｎａ（ＯＡｃ）３ＢＨ、ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、ＡｃＯＨ、ｂ）１．Ｍｅ３ＳｉＮ３、ＰｈＣＨ３、１１０℃；２．Ｈ２Ｏ
【００７０】
アルキニルアニリン（例えば３−エチニルフェニルアミン）をアルデヒドによる還元的アミノ化反応により置換して５−スキーム４を得た。アセチレン（５−スキーム４）の還流中のトルエン中でのアジドトリメチルシランでの処理、次いで水の添加により６−スキーム４を得た。
【００７１】
式（Ｉ）の化合物であって、Ａ、ＤおよびＥがそれぞれ窒素、Ｂが炭素、Ｒが独立に−ＮＲ４Ｒ５および任意に置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、任意に置換されていてもよいＡｒ−Ｃ１−６アルキル、任意に置換されていてもよいＨｅｔ−Ｃ１−６アルキル、または任意に置換されていてもよいＣ３−７シクロアルキル−Ｃ１−６アルキル、そしてｎが１である化合物を、スキーム５記載の方法と同様の方法によって調製した。
【化７】
2004535377.tif 000008
【００７２】
ａ）ＥｔＩ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＦ；ｂ）Ｒ３ＣＯＮＨＮＨ２、ピリジン、８５℃；ｃ）Ｒ３ＣＯ２Ｈ、ＨＯＢＴ、ＤＣＣ、ＣＨ２Ｃｌ２；ｄ）  ＮＨ２ＮＨ２、アセトニトリル、８５℃
【００７３】
チオウレア（例えば１−（２−メチルフェニル）チオウレア、１−（４−メチルフェニル）−チオウレア、１−（４−フルオロフェニル）チオウレア、１−（４−メトキシフェニル）チオウレア、１−（２−ピリジル）チオウレア、１−（２−イソプロピルフェニル）−チオウレア、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−カルボチオ酸アミド）（１−スキーム５）をＤＭＦ中でヨードエタンとトリエチルアミンで処理して２−スキーム５を得た。２−スキーム５のピリジン中でのアシル−ヒドラジド（例えば３−フェニル−プロピオニックヒドラジドおよびチオフェン−２−イルスルファニル−酢酸ヒドラジド）での処理によりトリアゾールＩ−スキーム５を得た。あるいは、Ｓ−エチルイソチオウレア２−スキーム５を標準的カップリング条件下でカルボン酸（例えば２−メチル−３−フェニル−プロパン酸、３−シクロヘキシルプロピオン酸、３−（２−チエニル）プロパン酸、フェニルスルファニル−酢酸）によりアセチル化してアミド３−スキーム５を得ることができる。エタノール中でのアミド３−スキーム５のヒドラジンでの処理により、トリアゾールＩ−スキーム５を得た。
【００７４】
式Ｉの化合物であって、Ａ、ＤおよびＥがそれぞれ窒素、Ｂが炭素、Ｒが独立に−ＳＲ７、−ＯＲ７または任意に置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、任意に置換されていてもよいＡｒ−Ｃ０−６アルキル、任意に置換されていてもよいＨｅｔ−Ｃ０−６アルキル、あるいは任意に置換されていてもよいＣ３−７シクロアルキル−Ｃ０−６アルキル、そしてｎが１である化合物を、スキーム６に記載の方法と同様の方法によって調製する。
【００７５】
【化８】
2004535377.tif 000009
【００７６】
ａ）ＨＣｌ、ＭｅＯＨ；ｂ）ＮＨ２ＮＨ２、ＭｅＯＨ；ｃ）Ｎ−ベンゾイルイソチオシアナートまたはＮ−ベンゾイルイソシアナート、ＥｔＯＨ、８５℃；ｄ）４Ｎ  ＮａＯＨ、ＥｔＯＨ、８５℃；ｅ）ＮａＨ、Ｒ−ＣＨ２−ＳＲ７またはＲ−ＣＨ２−ＯＲ７、ＤＭＦ
【００７７】
カルボン酸（例えば２−メチル−フェニル酢酸、３−メチル−フェニル酢酸、２−メトキシ−フェニル酢酸、４−メトキシ−フェニル酢酸、４−クロロ−フェニル酢酸、２−ピリジル酢酸、４−ジメチルアミノ−フェニル酢酸、１−インダンカルボン酸、および２−チオフェン酢酸）（１−スキーム６）を濃ＨＣｌおよびＭｅＯＨ中で加熱して対応するメチルエステルを得た。このエステルを次いでＭｅＯＨ中の無水ヒドラジンで処理してヒドラジド２−スキーム６を得た。このヒドラジド２−スキーム６を次いでＮ−ベンゾイルイソチオシアナートまたはＮ−ベンゾイルイソシアナートで処理してカルバジド３−スキーム６を得た。エタノール中でのカルバジド３−スキーム６の４ＮａＯＨでの処理によりメルカプト−トリアゾール４−スキーム６を得た。このトリアゾール４−スキーム６のＤＭＦ中でのＮａＨおよびアルキルハライド（例えばベンジルブロミド、４−フルオロ−ベンジルブロミド、２−クロロメチル−フラン、３−クロロメチル−フラン、２−クロロメチル−３−メチル−チオフェン、２−クロロメチル−５−メチル−チオフェン、２−クロロメチルチオフェン、３−クロロメチル−チオフェン、ただし２−クロロメチル−５−クロロ−チオフェン、ブロモメチルシクロヘキサン、および１−ブロモヘキサンは除く）での処理によりアルキル化トリアゾールＩ−スキーム６を得た。
【００７８】
本発明によると、ヒトＭｅｔＡＰ２の結晶構造が９種類の阻害剤との複合体において解像度３．０−２．２Åにて決定された。該構造は分子置換法を用いて決定し、Ｒｃ値を０．１９０−０．２６７の範囲にしぼった。
【００７９】
さらに原子座標を修正することにより表Ｉの値に変化が生じる。結晶構造の別の結晶形態からの修正により、新しいセットの座標が得られ、別のメタロプロテアーゼの結晶構造の決定の結果、表Iにおいて異なるセットの値の座標が得られる。これはおよそ０．４Åの実験誤差を有する。また例えば、メタロプロテアーゼのアミノ酸配列は、突然変異誘導体化により、または異なる起源のタンパク質の使用により変動しうる。
【００８０】
表Ｉは、ｈＭｅｔＡＰ２のタンパク質座標を開示する。これらのデータは本出願において記載された結晶構造について報告する。該データはオングストロームにて、標準的フォーマットの直交座標系を参照して原子、即ち、窒素、酸素、炭素、硫黄（アミノ酸残基のα、β、γ、δ、またはε位置のもの）；原子がアミノ酸番号内に位置するアミノ酸残基、結晶構造からのオングストローム（Å）にてのＸ、ＹおよびＺの座標を示す。活性部位および全体構造における各原子は結晶中にて唯一の位置を有することに注意されたい。データはまたＢ即ち温度因子値も報告し、これは２乗平均平方根置換測定（Å２）における原子の熱運動の程度を示す。
【００８１】
ｈＭｅｔＡＰ２の３次元構造は明らかに構造に基く酵素阻害剤の設計に有用であり、該阻害剤は血管新生の阻害が望まれる疾患に対する治療薬として有用であろう。触媒部位における阻害剤−酵素複合体の発見により、強力な高度に選択的なプロテアーゼ阻害剤の設計が可能となる。
【００８２】
本発明の別の態様は、本明細書において記載した結晶構造および活性部位によって特徴付けられるｈＭｅｔＡＰ２の阻害剤の同定方法および該阻害剤自体に関する。本発明の新規なプロテアーゼ結晶構造により、プロテアーゼ活性の阻害剤の同定が可能となる。そのような阻害剤はｈＭｅｔＡＰ２の活性部位の全体または一部に結合する；それらは競合的または非競合的阻害剤である。一旦同定され、生物活性についてスクリーニングされると、これら阻害剤はプロテアーゼ活性を阻害するために治療的または予防的に用いることができる。
【００８３】
１つの設計アプローチは本発明のｈＭｅｔＡＰ２を、様々な種類の化学的存在から構成される分子でプローブして、ｈＭｅｔＡＰ２阻害剤候補と酵素の間の相互作用の最適部位を決定することである。例えば、溶媒で飽和した結晶から回収した高分解能Ｘ−線回折データにより、それぞれのタイプの溶媒分子が付く部位の決定が可能となる。こういった部位にぴったりと結合する小分子を設計、合成してそのｈＭｅｔＡＰ２阻害剤活性について調べることができる。
【００８４】
本発明によってまた、基質またはｈＭｅｔＡＰ２に結合するその他の化合物の化学反応において短寿命の反応中間体に異性化しうる化合物の開発が可能となる。したがって、他の分子との相互作用中のｈＭｅｔＡＰ２の構造変化の時間依存的分析が可能となる。ｈＭｅｔＡＰ２の反応中間体も、ｈＭｅｔＡＰ２との共複合体における反応生成物から推定できる。そのような情報は、既知のメタロプロテアーゼ阻害剤を改良したアナログの設計、または、ｈＭｅｔＡＰ２酵素の反応中間体とｈＭｅｔＡＰ２阻害剤共複合体に基く新規なクラスの阻害剤の設計に有用である。これによって高い特異性および安定性をもって、ｈＭｅｔＡＰ２阻害剤の設計の新規な経路が提供される。
【００８５】
本発明により可能となる別のアプローチは、コンピュータによって、ｈＭｅｔＡＰ２酵素に全体で、あるいは部分において結合し得る化学的存在または化合物について小分子データベースをスクリーニングすることである。このスクリーニングにおいて、結合部位に対するそのような化学的存在または化合物の適合の質は、形状相補性（shape complementarity） [R. L. DesJarlais et al.、J. Med. Chem. 31:722-729 (1988)]あるいは推定相互作用エネルギー [E. C. Meng et al、J. Comp. Chem.、13:505-524 (1992)]によって判断できる。
【００８６】
ｈＭｅｔＡＰ２は複数の結晶形態で結晶化し得るため、本発明によって提供される、ｈＭｅｔＡＰ２またはその部分の構造座標は、特に別の結晶形態のｈＭｅｔＡＰ２の構造を解明するために有用である。これらはまたｈＭｅｔＡＰ２突然変異体、ｈＭｅｔＡＰ２共複合体、またはｈＭｅｔＡＰ２のいずれかの機能的ドメインと有意なアミノ酸配列相同性を有する別のタンパク質の結晶形態の構造を解明するのにも有用である。
【００８７】
この目的のために用いられる１つの方法は分子置換である。この方法では、未知の結晶構造（ｈＭｅｔＡＰ２の別の結晶形態、ｈＭｅｔＡＰ２突然変異体、またはｈＭｅｔＡＰ２共複合体、あるいはｈＭｅｔＡＰ２のいずれかの機能的ドメインと有意なアミノ酸配列相同性を有する別のタンパク質の結晶のいずれでもよい）を、表Ｉに提供する本発明の、ｈＭｅｔＡＰ２構造座標を用いて決定できる。この方法は、未知の結晶について正確な構造形態を、そういった情報を最初から決定しようと試みるよりも、迅速かつ効率的に提供する。
【００８８】
したがって、本発明で提供するｈＭｅｔＡＰ２の構造により、コンピュータ化された評価システムを用いて、既知の分子のスクリーニングおよび／またはプロテアーゼ構造、特に活性部位に結合する新規な分子の設計が可能となる。例えば、プロテアーゼの配列および表Ｉによって提供されるプロテアーゼ構造（即ち、ｈＭｅｔＡＰ２の原子座標および／または活性部位溝の原子座標、結合角、ねじれ角、活性部位領域における原子間距離など）を入力することができるコンピュータモデリングシステムが入手可能である。したがって、この工程では機械読み取り可能な媒体に、表Ｉの座標を表すデータをコード化する。次いでコンピュータは被験化合物が結合する部位の詳細な構造を作成し、それによって該被験化合物の相補的構造の詳細の決定が可能となる。
【００８９】
より具体的には、本発明によるｈＭｅｔＡＰ２に結合するかまたはそれを阻害する化合物の設計は、一般に２つの因子の考慮を要する。第一に、化合物は物理的かつ構造的にｈＭｅｔＡＰ２に結合できなければならない。ｈＭｅｔＡＰ２とその基質の結合に重要な非共有分子相互作用には、水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水性相互作用が含まれる。
【００９０】
第二に、化合物はそれがｈＭｅｔＡＰ２と結合できるようなコンホメーションを取ることができなければならない。化合物の特定の部分はｈＭｅｔＡＰ２との結合に直接は参加しないこともあるが、こういった部分であっても分子の全体のコンホメーションに影響を及ぼす可能性がある。そのためこれは作用強度に重要な影響を与え得る。そのような配置的要求には、全体の３構造次元構造および結合部位、例えばｈＭｅｔＡＰ２の活性部位またはアクセサリ結合部位の全体または一部に対する化学的存在または化合物の配向、あるいはｈＭｅｔＡＰ２と直接相互作用する複数の化学的存在を含む化合物の官能基の間の空間が含まれる。
【００９１】
化合物のｈＭｅｔＡＰ２に対する阻害または結合効果の可能性は、その実際の合成および試験に先立って、コンピュータモデリング技術を用いることによって評価することができる。所与の化合物の理論構造が、その化合物とｈＭｅｔＡＰ２との不充分な相互作用および結合を示唆する場合は、その化合物の合成および試験は不必要である。しかし、コンピュータモデリングにより強力な相互作用が示された場合は、分子を合成してそのｈＭｅｔＡＰ２への結合能力について好適なアッセイにおいて試験すればよい。このようにして効力のない化合物の合成を避けることができる。
【００９２】
ｈＭｅｔＡＰ２の阻害化合物またはその他の結合化合物は、一連の工程からなる手段によってコンピュータにより評価および設計することができる。該工程において、化学的存在または断片を、そのｈＭｅｔＡＰ２の個々の結合ポケットまたはその他の領域と結合する能力についてスクリーニングおよび選抜する。
【００９３】
当業者であればｈＭｅｔＡＰ２、より具体的にはｈＭｅｔＡＰ２活性部位の個々の結合ポケットまたはアクセサリ結合部位と結合する能力について化学的存在または断片をスクリーニングするいくつかの方法のいずれかを用いることができるであろう。この方法は、例えば表ＩのｈＭｅｔＡＰ２の座標に基くコンピュータスクリーン上で活性部位を目視によって調べることにより始めることができる。選抜した断片または化学的存在を次いでｈＭｅｔＡＰ２に位置付ければよい。ドッキングはＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌといったソフトウェアを用いて達成できる。次いで、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲといった、標準的分子構造力場（molecular mechanics forcefield)によるエネルギー最小化および分子動力学を行えばよい。
【００９４】
断片または化学的存在を選抜する工程には、特殊化したコンピュータプログラムも利用できる。これらには以下のものが含まれる：
* GRID [P. J. Goodford、"A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules"、J. Med. Chem.、28:849-857 (1985)].  GRID はOxford University、Oxford、UKから入手できる。
* MCSS [A. Miranker and M. Karplus、"Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method"、Proteins: Structure、Function and Genetics、11:29-34 (1991)].  MCSS は Molecular Simulations、Burlington、MAから入手できる。
* AUTODOCK [D. S. Goodsell and A. J. Olsen、"Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing"、Proteins: Structure、Function、and Genetics、8:195-202 (1990)].  AUTODOCK は Scripps Research Institute、La Jolla、CAから入手できる。
* DOCK [I. D. Kuntz et al、"A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions"、J. Mol. Biol.、161:269-288 (1982)].  DOCK は University of California、San Francisco、CAから入手できる。
【００９５】
、
小分子化合物についてのさらなる市販のコンピュータデータベースには、Cambridge Structural Database および Fine Chemical Databaseが含まれ、概説としてはRusinko、A.、Chem. Des. Auto. News 8、44-47 (1993)を参照されたい。
【００９６】
一旦好適な化学的存在または断片を選抜したら、それらを編集して単一の化合物または阻害剤とすればよい。編集は、ｈＭｅｔＡＰ２の構造座標に関してコンピュータスクリーン上に表示した３次元画像に対して断片相互の関係を目視観察することによって行うことができる。この後、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌといったソフトウェアを用いて手動でモデル構築を行うとよい。
【００９７】
個々の化学的存在または断片の結合のために当業者に利用できる有用なプログラムには以下のものが含まれる：
* CAVEAT [P. A. Bartlett et al、"CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules"、in Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems"、Special Pub.、Royal Chem. Soc. 78、pp. 182-196 (1989)].  CAVEAT はthe University of California、Berkeley、CAから入手できる。
* MACCS-3D (MDL Information Systems、San Leandro、CA)などの３次元データベースシステム。この分野はY. C. Martin、"3D Database Searching in Drug Design"、J. Med. Chem.、35:2145-2154 (1992)において概説されている。
* HOOK (Molecular Simulations、Burlington、MAから入手可能)。
【００９８】
ｈＭｅｔＡＰ２阻害剤の構築を上記のように一度に１つの断片または化学的存在を組み立てる段階的方法を進めるかわりに、阻害化合物または別のタイプの結合化合物を、空の活性部位または既知の１または複数の阻害剤の１または複数の部分を任意に含んだ活性部位を用いて、全体として即ち新規に設計することができる。この方法には以下のものが含まれる:
* LUDI [H.-J. Bohm、"The Computer Program LUDI:A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors"、J. Comp. Aid. Molec. Design、6:61-78 (1992)].  LUDI は Biosym Technologies、San Diego、CAから入手できる。
* LEGEND [Y. Nishibata and A. Itai、Tetrahedron、47:8985 (1991)].  LEGEND は Molecular Simulations、Burlington、MAから入手できる。
* LeapFrog (Tripos Associates、St. Louis、MOから入手可能)。
【００９９】
本発明においてその他の分子モデリング技術も用いることができる。例えば、N. C. Cohen et al、"Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry"、J. Med. Chem.、33:883-894 (1990)を参照されたい。また、M. A. Navia and M. A. Murcko、"The Use of Structural Information in Drug Design"、Current Opinions in Structural Biology、2:202-210 (1992)も参照されたい。例えば被験化合物の構造が既知の場合、被験化合物のモデルは、本発明の構造のモデルに重ね合わせればよい。この工程を行うための多数の方法および技術が知られておりそのいずれを使用してもよい。例えば、P.S. Farmer、Drug Design、Ariens、E.J.、ed.、Vol. 10、pp 119-143 (Academic Press、New York、1980); 米国特許第 ５３３１５７３号；米国特許第５５００８０７号; C. Verlinde、Structure、2:577-587 (1994); および I. D. Kuntz、Science、257:1078-1082 (1992)を参照されたい。本出願において記載したモデル構築技術およびコンピュータ評価システムは本発明を限定するものではない。
【０１００】
したがって、これらのコンピュータ評価システムを用いて多数の化合物を迅速かつ簡便に調べることができ、高価で時間のかかる生化学的試験を避けることができる。さらに、多くの化合物の実際の合成の必要が効率的に除外できる。
【０１０１】
モデリング技術によっていったん同定されたら、プロテアーゼ阻害剤は標準的技術を用いてその生物活性について試験できる。例えば、本発明の構造は、阻害剤をスクリーニングするための常套の形式を用いた結合アッセイにおいて用いることができる。本発明において用いられる好適なアッセイには、以下に規定するｈＭｅｔＡＰ２活性アッセイが含まれるがこれに限定されるものではない。その他のアッセイ形式を利用することができ、これらのアッセイ形式は本発明を限定するものではない。
【０１０２】
以下の実施例は本発明の様々な態様を例示する。これらの実施例は添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０３】
Ａ．阻害剤の検出方法
３次元原子構造を阻害剤の候補を選抜するためのテンプレートとして簡単に利用できる。様々なコンピュータプログラムおよびデータベースがこの目的のために利用できる。良好な阻害剤は、結合に際するエントロピー減少を最小にするために少なくとも標的に対して非常に良好な立体的および静電的相補性、かなりの量の疎水性表面埋もれ（surface buried）および十分な立体配置強剛性を有するべきである。このアプローチは通常いくつかの工程を含む：
１）標的の領域の規定。ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位溝を選択することができるが、プロテアーゼ活性に必須であるいずれの部位も標的の候補とできる。結晶構造が決定されているため、標的領域の空間的および化学的性質は既知である。
２）小分子の標的へのドッキング。これを達成するために多くの方法が利用可能である。無数の小分子化合物をスクリーニングするための三次元構造のデータベースを利用することができる。これらの化合物のネガティブイメージを計算することができ、標的溝の形状に適合させるために用いることができる。水素結合供与−受容プロフィールおよびこれら化合物の親油性部位を、標的のものへの相補のために用いることができる。当業者であればヒットするような多くの小分子または断片を同定することができよう。
３）認識断片の結合および延長。上記手順によって同定されたヒット部分を用いて、単一のより大きな分子となるように様々な官能基または小分子を組み合わせることができる。その結果得られた分子はより強力でありより高い特異性を有するであろう。「シード」阻害剤を改良する試みとして、標的タンパク質と相互作用するさらなる原子または断片を加えることができる。最初に規定された標的領域を拡張してさらに必要な延長を容易に行うことができる。
【０１０４】
限定数の有望な化合物をこの工程において選抜することができる。これらを合成して阻害特性についてアッセイすることができる。成功率は２０％もの高さになることもあり得、コンピュータ方法の迅速な発展により成功率はより高くなり得る。
【０１０５】
Ｂ．阻害剤の調製
【実施例１】
【０１０６】
４−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾールの調製
不活性雰囲気下での８ｍｌトルエン中の４−エチニルトルエン（０．９２ｇ、７．８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、トリメチルシリルアジド（２ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）を添加した。その結果得られた溶液を還流しながら２日間加熱した。この混合物に水（２ｍｌ）を添加し、蒸発させた後、その結果得られた残渣を分取ＨＰＬＣによって精製し、表題の化合物を白色固体として調製した（１４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．９６（ｓ、１Ｈ）、７．７３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．２８−７．３０（ｍ、２Ｈ）、１．５７（ｓ、３Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）１６０．２（Ｍ＋Ｈ）＋．（この手順はTanaka、Y.; Velen、S. R.; Miller、S. I. Tetrahedron、1973、29、3271から適用した)。
【実施例２】
【０１０７】
３−アニリノ−５−［２−（フェニル）エチル］−１，２，４−トリアゾールの調製
８ｍｌピリジン中の３−フェニル−プロピオニックヒドラジド（０．２０ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）(Verma、R.; Ghosh、S. K. J. Chem. Soc.  Perkin Trans. I、1998、15、2377)の攪拌溶液に、ヨウソ酸Ｓ−エチル−１−フェニルイソチオウレア（０．３３ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）(Shearer、B. G.; Lee、S.; Oplinger、J. A.; Frick、L. W.; Garvey、E. P.; Furfine、E. S. J. Med. Chem. 1997、40、1901)を添加した。反応混合物を１１５℃で１５時間加熱し、濃縮して乾燥させ、分取ＨＰＬＣで精製して表題の化合物を白色固体として得た（４７ｍｇ、１５％）。ＭＳ（ＥＳＩ）２６５．２（Ｍ＋Ｈ）＋。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ４−ＭｅＯＨ）：・・・１．０８（２Ｈ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、３．０２（２Ｈ、ｍ）、６．８８（１Ｈ、ｍ）、７．１７−７．２８（６Ｈ、ｍ）、７．３７（ｍ、２Ｈ）。
【実施例３】
【０１０８】
３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾールの調製
ａ）１−フェニル−２，４−ジチオビウレット
６０ｍＬの１０％Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ中のＮａＯＨ（０．５２ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、チオウレア（１．０ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）を添加した。その結果得られた懸濁液を４０℃で２０分間加熱し、次いで室温まで冷却した。この混合物にフェニルイソチオシアナート（１．５ｍｌ、１３．１ｍｍｏｌ）を添加し、明黄色溶液を一晩攪拌した。１２時間の攪拌後、白色沈殿が形成されるまで１Ｎ  ＨＣｌを添加した。沈殿をろ過し、Ｈ２Ｏで洗浄し、減圧下で乾燥させて表題の化合物を明黄色粉末として得た（０．７８ｇ、３０％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ・７．２５（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．４０（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、７．５６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、９．１３−９．２９（ブロード一重線、１Ｈ）、および１０．２６−１０．７９（ブロード一重線、２Ｈ）。
【０１０９】
ｂ）  ２−エチル−１−フェニル−２−イソジチオビウレット
４ｍＬのＤＭＦ中の実施例１（ａ）の化合物（１５０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にトリエチルアミン（５７μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を添加した。その結果得られた黄色／緑色溶液を室温で１０分間攪拌した。この溶液にヨウ化エチル（１００μＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２時間攪拌した。黄色溶液を２０ｍＬのＨ２Ｏに注ぎ、ＥｔＯＡｃで４回抽出した。有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過および濃縮し、粗残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；酢酸エチル／ヘキサン）にかけて、表題の化合物を白色結晶固体として得た（１０８ｍｇ、６４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．２２（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．９６（四重線、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、６．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．１６（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．２９−７．４１（ｍ、３Ｈ）、８．２７（ブロード一重線、１Ｈ）、９．８９（ブロード一重線、１Ｈ）、および１０．９９（ブロード一重線、１Ｈ）。
【０１１０】
ｃ）３−アニリノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾール
２ｍＬのＥｔＯＨ中の実施例１（ｂ）の化合物の攪拌溶液に、５０μＬの無水ヒドラジンを添加した。反応混合物を８０℃で１時間加熱し、濃縮して乾燥させ、分取ＨＰＬＣで精製して表題の化合物を白色固体として得た（３０ｍｇ、３７％）。ＭＳ（ＥＳＩ）１９０．９０（Ｍ−Ｈ）＋。
【０１１１】
ｄ）３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール
１．２ｍＬのＤＭＦ中の実施例１（ｃ）の化合物（２３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、次いでベンジルブロミド（２０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を一晩撹拌し、ろ過し、そして分取ＨＰＬＣで精製して表題の化合物を白色固体（３０ｍｇ、７０％）として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ９．３０（ブロード一重線、１Ｈ）、７．４７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．３９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．３１（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．２３（四重線、３Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．８２（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、および４．３（ｓ、２Ｈ）。
【実施例４】
【０１１２】
３−メチルアセテート−３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾールの調製
ａ）３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１または／２−メチルエチルエーテル−１，２，４−トリアゾール
８ｍＬＤＭＦ中の３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１，２，４−トリアゾール（０．６８ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＮａＨ（０．１２５ｇ、３．１３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物にクロロメチルエチルエーテル（０．２５１ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を一晩攪拌した。反応混合物を５０ｍｌのＨ２Ｏに注ぎ、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。粗混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）にかけて表題の化合物を明黄色油の位置異性体混合物として得た（０．５８ｇ、７１％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）化合物１：δ９．３３（ブロード一重線、１Ｈ）、７．５１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．４２−７．２２（ｍ、８Ｈ）、５．２３（ｓ、２Ｈ）、４．４７（ｓ、２Ｈ）、３．４３（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．０４（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）。化合物２：δ９．２０（ブロード一重線、１Ｈ）、７．６３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．４２−６．９３（ｍ、８Ｈ）、５．４４（ｓ、２Ｈ）、４．３０（ｓ、２Ｈ）、３．５１（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．１Ｈｚ）、１．０７（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．０）。ＭＳ（ＥＳＩ）３４１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１３】
ｂ）メチル［（５−ベンジルスルファニル−１，２，４−トリアゾリル−３−イル）フェニルアミノ］アセテート
１ｍｌのＴＨＦ中の３−アニリノ−５−ベンジルチオ−１または／２−メチルエチルエーテル−１，２，４−トリアゾール（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＮａＨ（１１．８ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液にメチルブロモアセテート（０．０５４ｍｌ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩攪拌した。ＴＨＦを除去し、０．５ｍｌのＴＦＡを残渣に添加し、一晩攪拌した。ＴＦＡを減圧下で除去し、混合物を分取ＨＰＬＣで精製して表題の化合物を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ）δ７．３７−７．２２（ｍ、１０Ｈ）、４．５９（ｓ、２Ｈ）、４．２６（ｓ、２Ｈ）、３．７４（ｓ、３Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）３５５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【実施例５】
【０１１４】
３−（２−イソプロピル−アニリノ）−５−（チオフェン−２−イルチオ）−１，２，４−トリアゾールの調製
工程（ａ）におけるフェニルイソチオシアナートの代わりに２−イソプロピルフェニルイソチオシアナートを、工程（ｄ）におけるベンジルブロミドの代わりに２−クロロメチルチオフェンを用いる以外は実施例３（ａ）−３（ｄ）の手順にしたがって、表題の化合物を白色固体として調製した。ＭＳ（ＥＳＩ）３３１．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【実施例６】
【０１１５】
４−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾールの調製
不活性雰囲気下での４ｍｌのトルエン中の３−エチニルトルエン（０．４６ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、トリメチルシリルアジド（１ｍｌ、８ｍｍｏｌ）を添加した。その結果得られた溶液を還流しながら３日間加熱した。この混合物に水（１ｍｌ）を添加し、蒸発させた後、その結果得られた残渣を分取ＨＰＬＣで精製して表題の化合物を白色固体として得た（２３％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ８．１４（ｓ、１Ｈ）、７．６７（ｓ、１Ｈ）、７．６２（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．３４（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．２０（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．４１（ｓ、３Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）１６０．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【実施例７】
【０１１６】
４−（２−クロロフェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾールの調製
不活性雰囲気下での４ｍｌのトルエン中の１−クロロ−２−エチニルベンゼン（０．５５ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、トリメチルシリルアジド（１ｍｌ、８ｍｍｏｌ）を添加した。その結果得られた溶液を還流しながら３日間加熱した。この混合物に水（１ｍｌ）を添加し、蒸発させ、その結果得られた残渣を分取ＨＰＬＣで精製して表題の化合物を白色固体（３５％）として調製した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ８．２９（ｓ、１Ｈ）、７．９０（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．５３−７．５６（ｍ、１Ｈ）、７３７−７．４４（ｍ、２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）１８０．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【実施例８】
【０１１７】
３−ベンジル−５−（ベンジルチオ）−１，２，４−トリアゾールの調製
ａ）フェニル酢酸メチルエステル
ＭｅＯＨ（２５０ｍｌ）中のフェニル酢酸（４．７９ｇ、３５．１６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に濃ＨＣｌ（２．５ｍｌ）を添加した。混合物を還流しながら２４時間加熱し、室温まで冷却し、次いで濃縮した。粗エステルをＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、次いで１０％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。ＣＨ２Ｃｌ２層を捨て、炭酸水素ナトリウム層を濃ＨＣｌでｐＨ＜２まで酸性にした。酸性水層をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で３回抽出し、ＥｔＯＡｃ抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過および濃縮してエステルを透明油として得た（４．１４ｇ、７９％）。
【０１１８】
ｂ）フェニル酢酸ヒドラジド
ＭｅＯＨ（２５０ｍｌ）中のフェニル酢酸メチルエステル（４．１４ｇ、２７．５６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に無水ヒドラジン（４．３３ｍｌ、１３７．８２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２４時間攪拌し、濃縮してヒドラジドを白色固体として得た（４．１４ｇ、１００％）。
【０１１９】
ｃ）１−Ｎ−フェニルアセチル−４−Ｎ−ベンゾイル−チオセミカルバジド
ＥｔＯＨ（３５ｍｌ）中のフェニル酢酸ヒドラジド（３．８６ｇ、２５．７３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にＮ−ベンゾイルイソチオシアナート（３．４６ｍｌ、２５．７３ｍｍｏｌ）を添加した（Amir、M.; Shahani、S. Indian J. Heterocyclic Chem. 1998、8、707-710.）。混合物を８５℃で２時間加熱し、濃縮してスラリーとした。固体をろ過し、冷却ＥｔＯＨで洗浄し、回収して表題の化合物を白色固体として得た（６．８１ｇ、８４％）。
【０１２０】
ｄ）３−ベンジル−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾール
ＥｔＯＨ（４０ｍｌ）中の１−Ｎ−フェニルアセチル）−４−Ｎ−ベンゾイル−チオセミカルバジド（６．８１ｇ、２１．７２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（１７ｍｌ）を添加した。混合物を還流しながら１時間加熱し、そして室温まで冷却した。混合物を最初の容積の半分になるまで濃縮し、ＡｃＯＨでｐＨ４まで酸性にした。沈殿をろ過し、冷却ＥｔＯＨおよび水で洗浄し、減圧下で乾燥させて表題の化合物を白色固体として得た（２．７８ｇ、６７％）。
【０１２１】
ｅ）３−ベンジル−５−（ベンジルチオ）−１，２，４−トリアゾール
ＤＭＦ（１ｍｌ）中の３−ベンジル−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾール（４８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＮａＨ（１０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を５分間撹拌し、ベンジルブロミド（Berry、J. M.; Watson、C. Y.; Whish、W. J. D.; Threadgill、M. D. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1997、8、1147) をシリンジで添加した（４４．５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）。混合物を室温で１５時間撹拌し、ろ過し、粗トリアゾールを分取ＨＰＬＣで精製して表題の化合物を白色固体として得た（２５％）。ＭＳ（ＥＳＩ）２８２．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【実施例９】
【０１２２】
１Ｈ−ナフト［１，２−ｄ］−１，２，３−トリアゾールの調製
Morgan、G.; J. Chem. Soc. 1910、97、1719、の手順にしたがって表題の化合物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）１７０．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２３】
Ｃ．結晶データ
タンパク質−阻害剤複合体の結晶化および構造解明
２つのタンパク質試料を用いて阻害剤複合体の研究用の結晶を調製した。［S.Liu、J.Widom、C.W.Kemp、C.M.Crews、J.Clardy、Structure Of Human Methionine Aminopeptidase-2 Complexed With Fumagillin Science 282 ,1324 (1998)］に記載のように精製したタンパク質の全体の未処理の配列および同様に精製した大腸菌で発現させた残基１１０−４７４からなるヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２のクローンであった。結晶形成後、固体阻害剤を結晶母液に導入することによって複合体を調製し、４℃で２４−４８時間インキュベートした。
【０１２４】
阻害剤と複合体形成したヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の結晶は４℃で約６日間以内でおよそ０．１−０．２ｍｍ３の大きさに成長した。結晶化において用いた、阻害されたヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の濃度はおよそ１０−１５ｍｇ／ｍｌであった。滴の固定において（in sitting drops)蒸気拡散法を用いてヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の溶液から結晶を成長させた。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー中の１０％グリセロール溶液中のタンパク質を含有する滴から４℃で結晶を成長させた。この溶液を等容量の０．４−０．１Ｍのクエン酸ナトリウムを含有するｔｅｒｔ−ブチルアルコールの１５−２０％（ｐＨ５．５）の蓄積溶液と混合した。複合体の結晶は斜方晶であり、空間群はＣ２２２１であり、セル定数はａ＝８９．７、ｂ＝９９．７、およびｃ＝１００．６オングストロームであった。結晶は非対称単位において１分子含んでおり、溶媒はおよそ５４％であり、Ｖｍ値は２．７５Ａ３／ダルトンであった。Ｘ−線回折データは各阻害剤複合体について１つの結晶から、the Advance Photon Source、Argonne National Laboratoryのビームライン17-IDから提供されるシンクロトロン放射を用いて測定した。すべての複合体のタンパク質構造は、ＣＮＸ（ Molecular Simulations Inc）を用いた分子置換によって決定した。開始モデルは、Liuら [S.Liu、J.Widom、C.W.Kemp、C.M.Crews、J.Clardy 、Structure Of Human Methionine Amino peptidase-2 Complexed With Fumagillin Science 282 ,1324 (1998)]によって発表されたヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の公表された構造のすべてのタンパク質原子からなるものとした。このモデルを剛体修正によって修正し(refined)、その結果得られた相を用いて係数｜Ｆｏ−Ｆｃ｜および｜２Ｆｏ−Ｆｃ｜のフーリエマップを計算し、そこにヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の原子モデルを分子画像システムXtalView (Molecular Simulations Inc)を用いて構築した。常套の位置修正をＣＮＸを用いてタンパク質モデル構築の際におこなった。阻害剤に対応する密度をXtalViewを用いてディフェレンスフーリエ電子密度マップに適合させ、その結果得られた阻害剤複合体構造をＣＮＸを用いて修正し、種々の阻害剤複合体について最終Ｒｃ値を０．２２から０．３２とした。種々の阻害剤複合体構造の解像範囲は１．８から２．５オングストローム分解の範囲であった。
【０１２５】
略語
ｍＭ、ミリモル
Ｒｃ＝Σ│（Ｆｏ−Ｆｃ）｜／Ｆｏ
Ｆｏ＝観察構造振幅
Ｆｃ＝計算構造振幅
【０１２６】
Ｄ．生物学的データ
ｈＭｅｔＡＰ２の直接分光測定アッセイ
ｈＭｅｔＡＰ２活性は、別の基質、Ｌ−メチオニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｍｅｔ−ｐＮＡ）およびＬ−メチオニン−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｍｅｔ−ＡＭＣ）を用いた直接分光測定アッセイ法によって測定できる。ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）または７−アミド−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の形成を、それぞれ４０５ｎｍおよび４６０ｎｍの吸収または蛍光の増大によって、対応するプレートリーダー上で連続的にモニターした。すべてのアッセイは３０℃で行った。蛍光または分光測定プレートリーダーは、それぞれSigmaから入手した標準ｐＮＡおよびＡＭＣを用いて較正した。典型的な９６ウェルプレートアッセイにおいて、各ウェルの５０μＬアッセイ溶液の吸光度（ｐＮＡについては４０５ｎｍ）または蛍光発光（ＡＭＣについてはλｅｘ＝３６０ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ）の増大を用いてｈＭｅｔＡＰ２の初速度を計算した。それぞれの５０μＬのアッセイ溶液は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ．Ｎａ＋（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０−１００ｎＭ精製ｈＭｅｔＡＰ２酵素、および様々な量のＭｅｔ−ＡＭＣ（３％  ＤＭＳＯ水溶液中）またはＭｅｔ−ｐＮＡを含んでいた。アッセイは基質の添加により開始し、初速度は、ｈＭｅｔＡＰ２の不在下で測定したバックグラウンド速度について修正した。
【０１２７】
ｈＭｅｔＡＰ２の結合分光測定アッセイ
ｈＭｅｔＡＰ２のメチオニンアミノペプチダーゼ活性は遊離Ｌ−アミノ酸形成をモニタリングすることによっても分光光度的に測定できる。トリペプチド（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、Sigma）またはテトラペプチド（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ、Sigma）基質からのＮ−末端メチオニンの放出は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＡＡＯ）／セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体(eq. 1-3a,b)を用いてアッセイした。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の形成を４５０ｎｍ（酸化によるｏ−ジアニシジン(Sigma)の吸収増大、Δε＝１５，３００Ｍ−１ｃｍ−１）２にて３０℃で９６−または３８４−ウェルプレートリーダーによって、Tsunasawa、S. et al.(1997) (eq. 3a)から適応させた方法により、連続的にモニターした。あるいは、Ｈ２Ｏ２の形成を、５８７ｎｍでの蛍光発光増大（Δε＝５４，０００Ｍ−１ｃｍ−１、λｅｘ＝５６３ｎｍ、励起と発光のスリット幅は１．２  ｍｍ）を３０℃で Amplex Red (Molecular Probes、Inc) (Zhou、M. et al. (1997) Anal. Biochem. 253、162) (eq. 3b)を用いてモニターすることで追跡した。総容量５０μＬにおいて、典型的なアッセイでは、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ．Ｎａ＋、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μＭ  ＣｏＣｌ２、１ｍＭ  ｏ−ジアニシジンまたは５０μＭ アンプレックスレッド（Amplex Red）、０．５ユニットのＨＲＰ(Sigma)、０．０３５ユニットのＡＡＯ (Sigma）、１ｎＭのｈＭｅｔＡＰ２、および様々な量のペプチド基質を含んでいた。アッセイはｈＭｅｔＡＰ２酵素の添加によって開始し、速度はｈＭｅｔＡＰ２酵素の不在下で測定したバックグラウンド速度について修正した。
【０１２８】
【化９】
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【０１２９】
動力学データ分析
データはGrafitコンピュータソフトウェアを用いた適当な速度式に当てはめた。ミカエリス−メントン動力学に従う初速度データを等式４に当てはめた。見かけの競合的および非競合的阻害に従う阻害パターンを等式５および等式６にそれぞれ当てはめた。
ｖ＝ＶＡ／（Ｋａ＋Ａ）                                  （４）
ｖ＝ＶＡ／［Ｋａ（１＋Ｉ／Ｋｉｓ）＋Ａ］                  （５）
ｖ＝ＶＡ／［Ｋａ（１＋Ｉ／Ｋｉｓ）＋Ａ（１＋Ｉ／Ｋｉｉ）］  （６）
【０１３０】
等式４−６において、ｖは初速度、Ｖは最大速度、Ｋａはみかけのミカエリス定数、Ｉは阻害剤濃度、そしてＡは様々な基質の濃度である。阻害定数に関する速度式において用いた命名は、Cleland (1963)のものであり、ここでＫｉｓおよびＫｉｉはそれぞれみかけの勾配および切片(intercept)阻害定数である。
【０１３１】
細胞成長阻害アッセイ
ｈＭｅｔＡＰ２阻害剤が細胞成長を阻害する能力を標準的ＸＴＴマイクロタイターアッセイによってアッセイした。真核細胞のミトコンドリアのｐＨ変化に感受性の色素であるＸＴＴを用いて化合物の存在下での細胞の生存度を定量する。所与の数を播種された細胞は、７２時間のインキュベーション中に平均しておよそ２回の分裂を経る。化合物の不在下ではこの細胞集団はインキュベーション期間の最後には対数増殖期にある。これらの細胞のミトコンドリア活性は分光測定の読み（Ａ４５０）によって反映される。所与の濃度の化合物の存在下での類似の細胞集団の生存度を、対照ウェルと被験ウェルのＡ４５０の読みの比較によってアッセイする。トリプシン処理した対数増殖期の培養物から適当な数の細胞（２００μＬ容量中４−６ｘ１０３細胞／ウェル）を平底９６ウェルプレートに播種する。ＨＵＶＥＣの場合は、ウェルを培養物の樹立に先立ってマトリゲルでコーティングする。「ブランク」のウェルには培地のみを添加する。細胞を一晩インキュベートして付着させる。翌日、細胞を含有するウェルからの培地を１８０μＬの新鮮な培地で交換する。被験化合物を適当に希釈したものをウェルに添加し、すべてのウェルの最終ＤＭＳＯ濃度を０．２％にする。細胞と化合物をさらに３７℃で７２時間、該細胞系に用いられる通常の培養条件でインキュベートする。細胞を次に標準ＸＴＴ／ＰＭＳ（使用直前に調製：プレート当たり８ｍｇのＸＴＴ(Sigma X-4251)を１００μｌのＤＭＳＯに溶解する。３．９ｍｌのＨ２Ｏを添加してＸＴＴを溶解し、２０μｌのＰＭＳストック溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）を、冷凍したストック溶液（３．３ｍｌＰＢＳ中のカチオンを含まない１０ｍｇのＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート、Sigma P-9625）のアリコットから添加する。これらのストックは使用するまで−２０℃で冷凍する）。５０μｌのＸＴＴ／ＰＭＳ溶液を各ウェルに添加し、プレートを９０分間（時間は細胞系などによって変動しうる）３７℃でＡ４５０が１．０を超えるまでインキュベートする。４５０ｎＭでの吸収を９６ウェルＵＶプレートリーダーを用いて測定する。各ウェルにおける細胞の生存度のパーセンテージをこれらのデータから計算する（バックグラウンド吸収については予め修正しておく）。ＩＣ５０は対照（未処理）の細胞生存度を５０％に減少させる化合物の濃度である。
【０１３２】
本発明の化合物は０．００００１から１００μＭの範囲のＩＣ５０値を有するｈＭｅｔＡＰ２阻害剤活性を示す。構造／活性の関連性は本発明の化合物について完全には解明されていない。しかし、本出願の開示により、当業者であればここに記載のアッセイを用いて本発明の化合物のいずれがｈＭｅｔＡＰ２阻害剤であって０．０００１から１００μＭの範囲のＩＣ５０値でそれに結合するかを決定することができる。
【０１３３】
本明細書において引用した、特許および特許出願を含むがそれらに限定されないすべての刊行物が、あたかも個々の刊行物の内容が本明細書において完全に開示されているかのように、引用により本明細書に含まれる。
【０１３４】
上記の開示は好適な態様を含む本発明を完全に開示するものである。本願明細書において具体的に開示された態様の改変および改良は添付の特許請求の範囲の記載の範囲内にある。さらなる過度の実験をせずに当業者であれば、この開示を読むことにより本発明を完全に利用することができる。それゆえ実施例は単に本発明を例示するものであり、その範囲を限定するものではない。その排他的権利または特権が特許請求の範囲に規定されている本発明の態様は添付の特許請求の範囲の通りである。
【０１３５】
表 I
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【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、ｈＭｅｔＡＰ２のリボンダイアグラムである。
【図２】図２は、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図３】図３は、ｈＭｅｔＡＰ２の活性部位の立体図である。
【図４】図４は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図５】図５はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【図６】図６は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図７】図７はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【図８】図８は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図９】図９はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【図１０】図１０は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図１１】図１１はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【図１２】図１２は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図１３】図１３はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【図１４】図１４は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図１５】図１５はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【図１６】図１６は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図１７】図１７はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【図１８】図１８は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図１９】図１９はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【図２０】図２０は、ｈＭｅｔＡＰ２の新規な阻害剤との複合体におけるｈＭｅｔＡＰ２の活性部位を示す図である。
【図２１】図２１はヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の新規な阻害剤との複合体中のヒトメチオニンアミノペプチダーゼ−２の活性部位の立体図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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