(57)【要約】本発明は、正常細胞および悪性腫瘍の細胞における遺伝子発現に関し、特に癌に関連する新規マーカーＴｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ 、ならびにＴｒｐ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ をコードする遺伝子に関する。ベクター、宿主細胞、抗体、およびこれらのヒトタンパク質を産生するための組換え方法も提供される。本発明はさらに、腫瘍を診断および治療するのに有用な診断方法および治療方法に関する。
2004505617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト前立腺癌に関連するタンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａもしくはＴｒｐ１０ｂまたはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａもしくはＴｒｐ１０ｂの生物学的特性を示すタンパク質をコードし、かつ
（ａ） 図７ 、８Ａ、９ 、１０または１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子、
（ｂ） 図７ 、８Ａ、９ 、１０または１１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｃ） ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭ １３５７９ 、ＤＳＭ １３５８０ 、ＤＳＭ １３５８４ 、ＤＳＭ １３５８１ またはＤＳＭ．．．． に含まれる核酸分子、
（ｄ） （ａ） 〜（ｃ） に規定された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、
（ｅ） （ａ） 〜（ｄ） に規定された核酸配列から遺伝子コードの縮重により変化した核酸配列の核酸分子、ならびに
（ｆ） （ａ） 〜（ｅ） に規定された核酸配列の断片、誘導体または対立遺伝子バリエーションを示す核酸分子、
からなる群より選ばれるものである、単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含んでなる組換えベクター。
【請求項３】
核酸分子が調節エレメントに操作可能に連結され、原核生物宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において翻訳可能なＲＮＡ の翻訳および合成が可能である請求項２記載の組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項５】
哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞または酵母細胞である、請求項４記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分子によりコードされるヒト前立腺癌に関連するタンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂの生物学的特性を示す単離されたタンパク質。
【請求項７】
請求項６記載の単離されたタンパク質を発現する組換え宿主細胞。
【請求項８】
ヒト前立腺癌に関連するタンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂの生物学的特性を示す単離されたタンパク質を作製する方法であって、
（ａ） 該タンパク質が発現される条件下で請求項６記載の組換え宿主細胞を培養すること、ならびに
（ｂ） 該タンパク質を回収すること
を含む、方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法により作製されたタンパク質。
【請求項１０】
請求項１記載の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、該ｍＲＮＡまたはその一部に選択的に結合しうることを特徴とし、該核酸分子によりコードされるタンパク質の合成を阻害しうるアンチセンスＲＮＡ 配列。
【請求項１１】
請求項１記載の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、該ｍＲＮＡまたはその一部に選択的に結合し、かつ切断しうることを特徴とし、したがって該核酸分子によりコードされるタンパク質の合成を阻害するリボザイム。
【請求項１２】
請求項６記載のタンパク質の活性を抑制しうることを特徴とするインヒビター。
【請求項１３】
タンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、あるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡを含むことが推測される標的試料と、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、あるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡと反応する試薬とを接触させること、ならびにＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、あるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡを検出することを含む、前立腺癌の診断方法。
【請求項１４】
試薬が核酸である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
試薬が抗体である請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
試薬が検出可能に標識されている請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
標識が、放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、または酵素からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質Ｔｒｐ８ａ および／またはＴｒｐ８ｂ 、あるいはＴｒｐ８ａ および／またはＴｒｐ８ｂ をコードするｍＲＮＡを含むことが推測される標的試料と、Ｔｒｐ８ａ および／またはＴｒｐ８ｂ 、あるいはＴｒｐ８ａ および／またはＴｒｐ８ａ および／またはＴｒｐ８ｂ をコードするｍＲＮＡと反応する試薬とを接触させること、ならびにＴｒｐ８ａ および／またはＴｒｐ８ｂ 、あるいはＴｒｐ８ａ および／またはＴｒｐ８ｂ をコードするｍＲＮＡを検出することを含む、子宮内膜癌（子宮癌）の診断方法。
【請求項１９】
試薬が核酸である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
試薬が抗体である請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
試薬が検出可能に標識されている請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
標識が、放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、または酵素からなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
試料と、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂアンチセンスＲＮＡ 、あるいはＴｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂに関連するアンチセンスＲＮＡ を検出する試薬とを接触させることを含む、被験体の組織における黒色腫、絨毛膜癌、肺癌および前立腺癌の診断方法。
【請求項２４】
Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂの発現、および／またはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂの活性を減少または阻害する試薬の治療有効量を哺乳動物被験体に投与することを含む、前立腺腫瘍、子宮内膜癌（子宮癌）腫瘍、絨毛膜癌、肺癌または黒色腫の予防、治療、または改善方法。
【請求項２５】
試薬が、アンチセンスＲＮＡ を含むヌクレオチド配列である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
試薬が、リボザイムを含むヌクレオチド配列である、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
試薬が、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂのインヒビターである、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
試薬が、抗Ｔｒｐ８ａ 抗体、抗Ｔｒｐ８ｂ 抗体、抗Ｔｒｐ１０ａ抗体および／または抗Ｔｒｐ１０ｂ抗体、またはそれらの断片である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
試料中のＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、あるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡまたはＴｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂアンチセンス転写物の検出に有用であり、ここで、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、あるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡまたはＴｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂアンチセンス転写物の増大した濃度の存在が、前立腺腫瘍、子宮内膜癌（子宮癌）腫瘍、絨毛膜癌、肺癌または黒色腫を示すものであり、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂ、あるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡまたはＴｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂアンチセンス転写物の検出のためのプローブを含むキット。
【請求項３０】
検出される標的成分がＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂであり、プローブが抗体である、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
試験化合物とイオンチャンネルＴｒｐ８、Ｔｒｐ９および／またはＴｒｐ１０ｂとを接触させること、ならびに該試験化合物がカルシウム取り込みに影響を与えるかどうかを決定することを含む、イオンチャンネルＴｒｐ８、Ｔｒｐ９および／またはＴｒｐ１０ｂのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、正常細胞および悪性腫瘍細胞における遺伝子発現に関し、特に癌に関連する新規マーカー（Ｔｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ ）ならびにＴｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ をコードする遺伝子に関する。
【０００２】
発明の背景
前立腺癌は、世界中の高齢男性の最も一般的な疾患の１つである。前立腺癌の診断およびモニタリングは、疾患の不均質性に起因して、困難である。診断について、悪性疾患の種々の格付けは、Ｇｌｅａｓｏｎ−Ｓｃｏｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ によって区別され得る。この診断のために、前立腺組織サンプルが、患者から生検によって採取され、組織の形態が調査される。しかし、このアプローチは、病理学者の経験に依存する主観的な結果を得るのみである。これらの結果の確認のため、かつ早期診断を得るため、さらなる診断方法が適用され得る。この診断方法は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ ）の検出に基づく。ＰＳＡ は、血清サンプル、血液サンプルなどにおいて、抗ＰＳＡ 抗体を使用してアッセイされる。しかし、原則としてＰＳＡ はまた、正常な前立腺組織においても発現されるので、正常前立腺組織と悪性前立腺組織との間の区別を可能にするため、閾値の規定（例えば、約４ｎｇ／ｍｌ ＰＳＡ）を必要とする。あいにく、この診断方法は、全く感度が低く、しばしば偽陽性結果を得る。さらに、この診断方法を使用することによっては、悪性疾患の格付け、腫瘍の進行およびその転移の可能性に関する判定が全く得られ得ない。従って、分子マーカーの使用は、特に非常に悪い予後を有し、前立腺癌が転移している患者に対する、良性組織と悪性組織の区別ならびに前立腺癌の格付けおよび病気分類に有用である。
【０００３】
前立腺腫瘍、特に転移腫瘍、の存在に相互に関係ある有意義な特異的マーカーを提供するための先行技術の上で考察した限定および欠点が、この疾患の進行に沿って診断的に、予後的にかつ治療的に使用され得るマーカーの必要性を引き起こしている。本発明は、Ｔｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ ならびにＴｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ をコードする遺伝子の供給によってこのような必要性を満たす：Ｔｒｐ８およびＴｒｐ１０ をコードする遺伝子は、前立腺癌および前立腺転移において発現されるが、正常な前立腺、良性肥厚（ＢＨＰ ）および前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ ）には発現されない。さらに、Ｔｒｐ１０ 転写物の発現は、癌において検出可能であるが、肺、前立腺、胎盤の健常な組織および黒色腫においては検出不可能である。
【０００４】
発明の要旨
本発明は、癌に関連する新規マーカー（Ｔｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ ）をコードする遺伝子の単離に基づく。新規カルシウムチャンネルタンパク質Ｔｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ は、ｔｒｐ （過渡レセプターポテンシャル（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ））ファミリーのメンバーであり、ヒト胎盤（Ｔｒｐ８ａ およびＴｒｐ８ｂ ）ならびにヒト前立腺（Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよびＴｒｐ１０ｂ）から単離される。Ｔｒｐ タンパク質は、Ｃａ２＋選択イオンチャンネルおよび非選択イオンチャンネルの着実成長（ｓｔｅａｄｉｌｙ ｇｒｏｗｉｎｇ）ファミリーに属する。近年、７つのＴｒｐ タンパク質（ｔｒｐ１〜ｔｒｐ７）が、同定されており、陽イオンエントリー、レセプター作動カルシウムエントリーおよびフェロモン感覚シグナル伝達に関連することが示唆されている。構造的に関連するｔｒｐ タンパク質は、心臓によって引き起こされる侵害（ｎｏｃｉｏｃｅｐｔｉｏｎ）に共に関連するバニロイド（ｖａｎｉｌｌｏｉｄ ）レセプター（ＶＲ１ ）およびバニロイド用レセプター（ＶＲＬ−１ ）である。さらに、２つのカルシウム透過性チャンネルが、ラット小腸（ＣａＴ１）およびウサギ腎臓（ＥＣａＣ）において同定された。これらの遠縁に関連するチャンネルは、小腸（ＣａＴ１）の管腔からのカルシウムイオンの取り込みまたは腎臓（ＥＣａＣ）の遠位細管におけるカルシウムイオンの再取り込みに関連すると示唆される。一般的特性またはＴｒｐ および関連チャンネルは、いくつかの保存アミノ酸モチーフを含む６つの膜貫通ドメインを構成すると提案された構造である。本発明において、ヒト胎盤由来のＣａＴ１様カルシウムチャンネル（Ｔｒｐ８）ならびにＴｒｐ９およびＴｒｐ１０ （２つのバリアント、Ｔｒｐ１０ａおよびＴｒｐ１０ｂ）のクローニングおよび発現が記載される。Ｔｒｐ８ ｃＤＮＡ の２つの多型改変体は、胎盤から単離された（Ｔｒｐ８ａ およびＴｒｐ８ｂ ）。ＨＥＫ （ヒト胎児腎臓）細胞におけるＴｒｐ８ｂ ｃＤＮＡの一過的発現は、Ｔｒｐ８チャンネルが発現系において構造的開放であることを意味する細胞質ゾルのカルシウム過負荷を生じる。Ｔｒｐ８は、ＨＥＫ 細胞において高度なカルシウム選択的内部流動を誘導する。Ｔｒｐ８タンパク質のＣ 末端は、カルシウム依存様式でカルモジュリンを結合する。Ｔｒｐ９チャンネルは、胎盤の栄養芽細胞および合胞体栄養細胞層においてならびに膵臓腺房細胞において発現される。さらに、Ｔｒｐ８チャンネルは、前立腺癌および前立腺転移において発現されるが、前立腺の正常組織においては発現されない。Ｔｒｐ８転写物の発現は、良性前立腺肥厚（ＢＰＨ ）または前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ ）においては検出不可能である。従って、Ｔｒｐ８チャンネルは、もっぱら悪性前立腺組織において発現され、前立腺癌に対する分子マーカーとして利用される。実験結果から、Ｔｒｐ８および／またはＴｒｐ１０ のモジュレーション（例えば、発現または活性の阻害）が治療目的（例えば、腫瘍進行の予防に対する）であることもまた明らかである。
【０００５】
従って、本発明は、Ｔｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ タンパク質をそれぞれ、ならびにこのタンパク質をコードする核酸分子、そしてさらにＴｒｐ８、Ｔｒｐ９および／またはＴｒｐ１０ の発現あるいは活性を阻害し得るアンチセンスＲＮＡ 、リボザイムならびにインヒビターを提供する。
【０００６】
１つの実施形態において、本発明は、被験体の組織中のＴｒｐ８またはＴｒｐ１０ に関連する前立腺癌または子宮内膜癌（子宮の癌）を検出するための診断方法を提供し、この方法は、Ｔｒｐ８および／またはＴｒｐ１０ をコードするｍＲＮＡを含むサンプルをＴｒｐ８および／またはＴｒｐ１０ あるいは対応するｍＲＮＡを検出する試薬と接触させることを含む。
【０００７】
さらなる実施形態において、本発明は、被験体の組織において黒色腫、絨毛膜癌、肺の癌および前立腺の癌を検出するための診断方法を提供し、この方法は、サンプルをＴｒｐ１０ａアンチセンス転写物および／またはＴｒｐ１０ｂアンチセンス転写物あるいはＴｒｐ１０ａ関連アンチセンス転写物および／またはＴｒｐ１０ｂ関連アンチセンス転写物を検出する試薬と接触させることを含む。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、Ｔｒｐ８および／またはＴｒｐ１０ に関連する前立腺腫瘍、肺の癌、胎盤の癌（絨毛膜癌）または黒色腫の処置の方法を提供し、この方法は、このような障害に罹患している被験体に治療的有効量の試薬（Ｔｒｐ８および／またはＴｒｐ１０ の発現あるいはこのタンパク質の活性を調節（例えば、阻害）する）（例えば、上記化合物）を投与することを含む。
【０００９】
最後に、本発明は、遺伝子治療の方法を提供し、この方法は、被験体の細胞へ上記のアンチセンスＲＮＡ またはリボザイムをコードするヌクレオチド配列（プロモーターに作動可能に連結している）を含む発現ベクターを導入することを含む。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト前立腺癌関連タンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂあるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂの生物学的特性を示すタンパク質をコードし、そして以下からなる群より選択される単離された核酸分子に関する：
（ａ） 図７ 、８Ａ、９ 、１０、または１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
（ｂ） 図７ 、８Ａ、９ 、１０、または１１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）ＤＳＭＺ 受託番号ＤＳＭ１３５７９（寄託日：２０００年６ 月２８日）、ＤＳＭ１３５８０（寄託日：２０００年６ 月２８日）、ＤＳＭ１３５８４（寄託日：２０００年７ 月５ 日）、ＤＳＭ１３５８１（寄託日：２０００年６ 月２８日）またはＤＳＭ．．．． （寄託日：．．．．）に含まれる核酸分子；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ） に規定された核酸分子にハイブリダイズする核酸分子；
（ｅ） （ａ） 〜（ｄ） に規定された核酸配列から遺伝子コードの縮重により変化した核酸配列の核酸分子；および
（ｆ） （ａ） 〜（ｅ） に規定された核酸配列のフラグメント、誘導体または対立遺伝子バリエーションを示す核酸分子。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂの生物学的特性を示すタンパク質は、以下の実施例に例示するような少なくとも１つの活性を有するタンパク質であることが理解される。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された核酸分子」としては、天然に付随する他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に有さない核酸分子が挙げられる。
【００１３】
第１の実施形態において、本発明は、図７ 、８Ａ、９ 、１０、または１１に示されるアミノ酸配列を含むヒト前立腺癌関連タンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、図７ 、８Ａ、９ 、１０、または１１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００１４】
本発明は、図７ 、８Ａ、９ 、１０、または１１においてそれぞれ同定された生成ヌクレオチド配列だけではなく、それぞれの予測翻訳アミノ酸配列、ならびにＤＳＭＺにＤＳＭ１３５７９で寄託されたＴｒｐ８ａ ｃＤＮＡ、ＤＳＭＺにＤＳＭ１３５８０で寄託されたＴｒｐ８ｂ ｃＤＮＡ、ＤＳＭＺにＤＳＭ１３５８４で寄託されたＴｒｐ９ ｃＤＮＡ 、ＤＳＭＺにＤＳＭ１３５８１で寄託されたＴｒｐ１０ａ ｃＤＮＡ 、およびＤＳＭＺにＤＳＭ．．．． で寄託されたＴｒｐ１０ｂ ｃＤＮＡ をそれぞれ含むプラスミドＤＮＡ を提供する。各寄託Ｔｒｐ クローンのヌクレオチド配列は、公知の方法に従って寄託クローンを配列決定することによってたやすく決定され得る。次いで、予測アミノ酸配列が、このような寄託物から実証され得る。さらに、各寄託クローンによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチド配列決定によってか、または寄託Ｔｒｐ コードＤＮＡ を含む適切な宿主細胞においてタンパク質を発現し、このタンパク質を回収し、そしてその配列を決定することによって直接決定され得る。
【００１５】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ 分子およびＲＮＡ 分子の両方であり得る。例えば、適切なＤＮＡ 分子は、ゲノム分子またはｃＤＮＡ分子である。Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂの全てあるいは一部をコードする全ての核酸分子がまた、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする限り、含まれることが理解される。本発明の核酸分子は、天然供給源から単離され得るか、または公知の方法に従って合成され得る。
【００１６】
本発明はまた、上記核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイズする」とは、従来のハイブリダーゼーション条件下、好ましくは例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ に記載されるようなストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの意味を有する。意図されるものはまた、より低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件でＴｒｐ 核酸分子にハイブリダイズする核酸分子である。ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーにおける変化は、ホルムアミド濃度（より低いパーセンテージのホルムアミドはより低いストリンジェンシーを生じる）、塩条件または温度の操作を介して主に達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件としては、６ ×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ ；９．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ７．４ ）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ ホルムアミド、ＤＮＡ をブロックする１００ μｇ／ｍｌのサケ精子を含有する溶液中での３７℃一晩インキュベーション、次いで５０℃での１ ×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた洗浄が挙げられる。加えて、さらにより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントハイブリダーゼーション後に実施する洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５ ×ＳＳＣ ）でなされ得る。上記条件における変動は、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグランドを抑制するために使用される代替のブロック試薬の含有および／または置換を介して達成され得る。特異的なブロック試薬の含有は、互換性の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１７】
本発明の分子にハイブリダイズする核酸分子は、例えば、ヒト細胞株または組織から生成されるゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから単離され得る。このような核酸分子を同定して単離するために、本発明の分子またはこれらの分子の一部またはこれらの分子の逆（ｒｅｖｅｒｓｅ ）相補体が、例えば、従来の方法に従うハイブリダイゼーション（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）によって使用され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、例えば、図７ 、８Ａ、９ 、１０、または１１にそれぞれ示されるヌクレオチド配列あるいはこれらの配列の一部を正確にまたは基本的に有する核酸分子が、使用され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして使用されるフラグメントは、従来の合成方法によって生成された合成フラグメントであり得、その配列は本発明の核酸分子の配列に基本的に対応する。
【００１８】
本発明の核酸分子としてはまた、遺伝子コードの結果として縮重した配列を有する分子が挙げられる。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質をコードする上記の核酸分子のフラグメント、誘導体および対立遺伝子バリアントを含む核酸分子を提供する。「フラグメント」は、記載のタンパク質の１つをコードするのに十分な長さである核酸分子の一部であることが理解される。これらのフラグメントは、本発明の核酸分子の転写物に特異的にハイブリダイズする核酸分子を含む。これらの核酸分子は、例えば、プローブまたはプライマーとして、下記の診断アッセイおよび／またはキットにおいて使用され得、好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、特に少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、特に好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドである。本発明の核酸分子およびオリゴヌクレオチドはまた、例えば、ＰＣＲ 反応のためのプライマーとして使用され得る。特に有用なプローブ（プライマー）の例は、表１および２に示される。
【００２０】
【表１】
2004505617.tif 000003
【００２１】
【表２】
2004505617.tif 000004
【００２２】
本文脈における用語「誘導体」とは、これらの分子の配列が１つの位置または数個の位置で上記の核酸分子の配列と異なっているが、これらの配列と高いレベルの相同性を有していることを意味する。この結果、相同性とは、少なくとも４０％ の配列同一性、特に少なくとも６０％ の同一性、好ましくは８０％ より高い同一性、特に好ましくは９０％ より高い同一性を意味する。核酸分子によってコードされるこれらのタンパク質は、図７ 、８Ａ、９ 、１０、または１１にそれぞれ示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％ 、好ましくは８５％ 、そして特に好ましくは９０％ より高い（９７％ および９９％ ）配列同一性を有する。上記核酸分子に対するずれは、欠失、置換、挿入または組換えによって生成され得る。誘導体の定義としてはまた、スプライスバリアント（例えば、図８Ｂ〜８Ｅおよび９Ｂに示されるスプライスバリアント）が挙げられる。
【００２３】
上記分子に相同であり、かつこれらの分子の誘導体になる核酸分子は、通常、同じ生物学的機能を有する改変を表すこれらの分子のバリエーションである。これらは、天然に存在するバリエーション（例えば、他の生物由来の配列）または天然に存在し得るか、もしくは特定の変異誘発によって誘導され得るかのいずれかの変異体である。さらに、バリエーションは、合成的に生成された配列であり得る。この対立遺伝子バリアントは、天然に存在するバリアント、または合成的に生成されたバリアントまたは組換えＤＮＡ プロセスによって生成されたバリアントのいずれかであり得る。
【００２４】
一般的に、従来の分子生物学的プロセスによって、異なる変異を本発明の核酸分子へ導入することは可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、参照のこと）。結果として、おそらく変更された生物学的特性を有するＴｒｐ タンパク質またはＴｒｐ 関連タンパク質が合成される。１つの可能性は、核酸分子がコードＤＮＡ 配列の５’末端または３’末端から連続的な欠失によって生成され、それに応じて短縮されたタンパク質の合成を導く欠失変異体の生成である。別の可能性は、アミノ酸配列の修飾が例えば、イオンチャンネル特性またはｔｒｐ イオンチャンネルの調節に影響を及ぼす位置での単一の点変異の導入である。この方法により、例えば、改変されたイオン伝導孔、改変されたＫ ｍ 値を有するか、または通常細胞内に存在する調節機構（例えば、アロステリック調節もしくは共有結合修飾に関して）をもはや受けないムテインが生成され得る。このようなムテインはまた、それぞれ、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂの治療的に有用なアンタゴニストとして貴重であり得る。
【００２５】
遺伝子工学による原核生物細胞における操作のため、本発明の核酸分子またはこれらの分子の一部が、プラスミドへ導入され得、ＤＮＡ 配列の組換えによる配列の変異誘発または改変を可能にする。従来の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、参照）によって、塩基が交換され得、天然または合成配列が付加され得る。ＤＮＡ フラグメントを互いに連結するため、アダプターまたはリンカーがフラグメントに付加され得る。さらに、適切な切断部位を提供するか、または余分なＤＮＡ もしくは切断部位を除去する操作が、実施され得る。挿入、欠失または置換が可能な場合、インビトロ変異誘発、プライマー修復、拘束またはライゲーションが実施され得る。解析方法として、通常、配列解析、拘束解析および他の生化学的または分子生物学的方法が使用される。
【００２６】
本発明の核酸分子の種々のバリアントによってコードされるタンパク質は、特定の一般的な特徴（例えば、イオンチャンネル活性、分子量、免疫学的反応性または立体配座または物理的特性（例えば、電気泳動移動度、クロマトグラフィー性質（ｂｅｈａｖｉｏｒ）、沈降係数、可溶性、スペクトル特性、安定性、ｐＨ最適条件、温度最適条件など））を示す。
【００２７】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。好ましくは、それらは、遺伝子工学の分野で通常使用されるプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび他のベクターである。本発明の使用に適切なベクターとしては、哺乳動物細胞における発現用のＴ７ベース発現ベクターおよび昆虫細胞における発現用のバキュロウイルス由来ベクターが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、本発明の核酸分子は、翻訳され得る原核生物細胞および／または真核生物細胞におけるＲＮＡ の転写および合成を請け負う本発明の組換えベクター中の調節エレメントに作動可能に連結される。転写されるべきヌクレオチド配列は、Ｔ７、メタロチオネシンＩ またはポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結され得る。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明は、一過的にまたは安定に本発明の核酸分子またはベクターを含む組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、インビトロで組換えＤＮＡ を組み込み、場合により本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質を合成し得る生物と理解される。好ましくは、これらの細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞または酵母細胞）である。本発明の宿主細胞は、好ましくは、本発明の導入核酸分子が、形質転換細胞に関して異種（すなわちこれらの細胞中に天然には存在しない）であるか、または対応する天然に存在する配列のゲノム中の場所とは異なる場所に局在化することにより特徴付けられる。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、ヒト前立腺癌関連タンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂの生物学的特性を示し、かつ本発明の核酸分子によってコードされる単離されたタンパク質、ならびにそれらの産生方法に関する。それにより、例えば、本発明の宿主細胞は、タンパク質の合成を可能にする条件下で培養され、そしてこのタンパク質が続いて培養細胞および／または培養培地から単離される。組換え的に産生されたタンパク質の単離および精製は、従来の手段（予備クロマトグラフィーならびに抗Ｔｒｐ８ａ 抗体、抗Ｔｒｐ８ｂ 抗体、抗Ｔｒｐ９抗体、抗Ｔｒｐ１０ａ抗体または抗Ｔｒｐ１０ｂ抗体それぞれとの親和性に関連する親和性分離および免疫学的分離が挙げられる）によって実施され得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「単離されたタンパク質」としては、天然に付随する他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に有さないタンパク質が挙げられる。しかし、このようなタンパク質は、組換え的に産生されたタンパク質を含むだけではなく、単離された天然に存在するタンパク質、合成的に生成されたタンパク質、またはこれらの方法の組み合わせによって生成されたタンパク質も含む。このようなタンパク質を調製するための手段は、当該分野で十分に理解される。Ｔｒｐ タンパク質は、好ましくは実質的に精製された形態である。ヒト前立腺癌関連タンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂタンパク質（分泌タンパク質を含む）の組換え的に生成されたバージョンは、Ｓｍｉｔｈ およびＪｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７；３１−４０（１９８８）に記載される１工程方法によって実質的に精製され得る。
【００３１】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、アンチセンスＲＮＡ 配列およびリボザイムに関する。このアンチセンスＲＮＡ 配列は、本発明の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、かつこのｍＲＮＡに選択的に結合し得ることに特徴を有し、この配列は、この核酸分子によってコードされるタンパク質の合成を阻害し得る。このリボザイムは、本発明の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、かつこのｍＲＮＡに選択的に結合そして切断し得ることに特徴を有し、従って、この核酸分子によってコードされるタンパク質の合成を阻害する。単一のＲＮＡ 鎖から構成されるリボザイムは、標的ＲＮＡ （例えば、Ｔｒｐ 遺伝子のうちの１つから転写されたｍＲＮＡ）を分子間切断し得るＲＮＡ 酵素、すなわち、触媒ＲＮＡ である。現在、論文（例えば、Ｔａｎｎｅｒら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９３），４１５−４２６ を参照のこと）に記載されるストラテジーに従って標的ＲＮＡ を特異的部位で切断し得るリボザイムを構築することは可能である。このようなリボザイムに対する２つの主な必要条件は、切断のために必須の、標的ＲＮＡ に相補的であり、かつその基質に結合可能な触媒ドメインおよび領域である。この相補的配列、すなわちアンチセンスＲＮＡ またはリボザイムは、Ｔｒｐ８ａ 発現、Ｔｒｐ８ｂ 発現、Ｔｒｐ９発現、Ｔｒｐ１０ａ発現およびＴｒｐ１０ｂ発現のそれぞれの抑制、すなわち、前立腺癌または子宮内膜癌（子宮の癌）の処置の場合に有用である。好ましくは、本発明のアンチセンスＲＮＡ およびリボザイムは、コード領域に相補的である。本発明の核酸分子の配列を提供された当業者は、上記アンチセンスＲＮＡ またはリボザイムを産生および利用する立場にいる。本発明の核酸分子から転写されたｍＲＮＡに相補性を示すアンチセンスＲＮＡ およびリボザイムのそれぞれの領域は、好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド長、特に少なくとも１５ヌクレオチド長および特に好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長を有する。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、上記のアンチセンスＲＮＡ またはリボザイムと類似の目的（すなわち、生物学的に活性なＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂ分子の減少または除去）を満たすＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよびＴｒｐ１０ｂのそれぞれのインヒビターに関する。このようなインヒビターは、例えば、アンタゴニストとして作用する対応するタンパク質の構造アナログであり得る。さらに、このようなインヒビターは、組換え的に生成されたタンパク質の使用によって（例えば、適切な条件下でタンパク質に結合する強力なインヒビターの能力を利用することによって）同定された（例えば、この組換え的に生成されたタンパク質を使用して、インヒビターをスクリーニングかつ同定し得る）分子を含む。このインヒビターは、例えば、試験混合物を調製することによって同定され得、ここで、このインヒビター候補は、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂがネイティブ構造であり得る適切な条件下でＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂそれぞれと共にインキュベートされる。このようなインビトロ試験系は、当該分野で周知の方法に従って確立され得る。インヒビターは、例えば、組換え的に生成されたＴｒｐ タンパク質に結合する合成または天然に存在する分子のいずれかに対する第一スクリーニング、次いで第二工程において、以下の実施例に記載されるような生物学的活性のうち少なくとも１つの阻害によって影響を及ぼされるようなＴｒｐ タンパク質の阻害に対する細胞アッセイにおいてこれらの選択された分子を試験することによって同定され得る。Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂを結合する分子のこのようなスクリーニングは、ラージスケールで、例えば、合成および／または天然分子のライブラリーから候補分子をスクリーニングすることによって容易に実施し得た。このようなインヒビターは、例えば、合成有機化学物質、天然発酵産物、微生物、植物もしくは動物から抽出された基質、またはペプチドである。インヒビターのさらなる例は、特異的抗原、好ましくはモノクローナル抗体である。さらに、本発明のヌクレオチド配列およびコードされるタンパク質を使用して、腫瘍発達および進行に関するさらなる因子を同定し得る。本文脈においては、ｔｒｐ ファミリーのメンバーのカルシウムチャンネルの改変はＴ リンパ球の増殖を導くＴ リンパ球の免疫応答の刺激を生じ得ることが強調されるべきである。本発明のタンパク質は、例えば、タンパク質／タンパク質相互作用に基づくスクリーニング方法（例えば、ツーハイブリッドシステム　Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．およびＳｏｎｇ， Ｏ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ （３４０）：２４５−２４６）を使用して腫瘍に関連するさらなる（非関連）タンパク質を同定するために使用され得る。
【００３３】
本発明はまた、タンパク質Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂあるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂコードｍＲＮＡを含むと考えられる標的サンプルを、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂあるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂコードｍＲＮＡと反応する試薬と接触させて、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂあるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂコードｍＲＮＡを検出することを含む前立腺癌の診断方法を提供する。
【００３４】
胎盤の癌細胞（絨毛膜癌）、肺の癌細胞および前立腺の癌細胞はＴｒｐ１０ 転写物ならびにＴｒｐ１０ アンチセンス転写物およびＴｒｐ１０ アンチセンス転写物に部分的に相補的な転写物を発現することがわかっている。従って、本発明はまた、被験体の組織中の黒色腫、絨毛膜癌、肺の癌および前立腺の癌を診断する方法を提供する。この方法は、サンプルをＴｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂアンチセンスＲＮＡ を検出する試薬と接触させることを含む。
【００３５】
標的がｍＲＮＡ（またはアンチセンスＲＮＡ ）である場合、試薬は、典型的に核酸プローブまたはＰＣＲ に対するプライマーである。当業者は、図７ 、８ａ、１０および１１にそれぞれに、または上記の表１および２に示されるようなＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂのヌクレオチド配列に関する情報に基づいて、適切な核酸プローブを設計する立場にある。標的がタンパク質である場合、試薬は、典型的に、抗体プローブである。用語「抗体」とは、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有するプールモノクローナル抗体から本質的になる抗体および独特なモノクローナル抗体調製物をいう。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって本発明のタンパク質のフラグメントを含む抗原から作製される（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ ）は、タンパク質に特異的に結合し得るインタクトな分子および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ およびＦ（ａｂ’）２ フラグメントなど）を含むことが意味される。Ｆａｂ およびＦ（ａｂ’）２ フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより速やかになくなり、そしてインタクトな抗体よりも低い非特異的組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３） ）。従って、これらのフラグメントおよびＦＡＢ または他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の抗体としては、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。例えば、生物学的流体または組織における標的細胞成分、すなわち、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、あるいはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂコードｍＲＮＡあるいはＴｒｐ１０ａ／ｂアンチセンス転写物は、例えば、インサイチュハイブリダーゼーション（例えば、以下の実施例に従って）によって直接インサイチュで検出され得るか、またはプローブと接触させる前に当業者に公知の一般的方法によって他の細胞成分から単離され得る。検出方法としては、ノザンブロット分析、ＲＮａｓｅ 保護、インサイチュ方法（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション）、インビトロ増幅方法（ＰＣＲ 、ＬＣＲ 、ＱＲＮＡレプリカーゼまたはＲＮＡ 転写／増幅（ＴＡＳ 、３ＳＲ ）、逆ドットブロット（ＥＰ−Ｂ１ Ｏ ２３７ ３６２ に開示される））、免疫アッセイ、ウエスタンブロットおよび当業者に公知の他の検出アッセイが挙げられる。
【００３６】
インビトロ増幅によって得られた産物は、確立された方法に従って（例えば、産物をアガロースゲル上で分離し、続いてエチジウムブロマイドで染色することによって）検出され得る。あるいは、増幅産物は、増幅または標識ｄＮＴＰに対する標識プライマーを使用することによって検出され得る。
【００３７】
このプローブは、例えば、放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート剤または酵素を用いて検出可能に標識され得る。
【００３８】
組織におけるＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよびＴｒｐ１０ｂそれぞれの発現は、古典的免疫組織学方法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１ （１９８５）， ９７６−９８５； Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５ （１９８７）， ３０８７−３０９６； Ｓｏｂｏｌ ら、Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｐａｔｈｏｌ． ２４ （１９８２）， １３９−１４４； Ｓｏｂｏｌら、Ｃａｎｃｅｒ ６５ （１９８５）， ２００５−２０１０ ）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ ）などの免疫アッセイが挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識、および放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ ）、硫黄（３５Ｓ ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ ）およびテクネチウムローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。生物学的サンプルにおけるＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａまたはＴｒｐ１０ｂレベルをアッセイすることに加えて、タンパク質はまた、画像化によってインビボで検出され得る。タンパク質のインビボ画像化のための抗体標識またはマーカーとしては、Ｘ−線撮影法、ＮＭＲ またはＥＳＲ によって検出可能なものが挙げられる。Ｘ−線撮影法について、適切な標識としては、検出可能な放射線を放射するが被験体に対して明白に有害ではないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位体が挙げられる。ＮＭＲ およびＥＳＲ に対する適切なマーカーとしては、直接的なハイブリドーマに対する栄養素を標識することによって抗体に組み込まれ得る重水素などの検出可能な特徴的なスピンを有するものが挙げられる。適切な検出可能な画像化部分（例えば、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ 、９９ｍＴｃ ）、放射性不透明（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）基質、または核磁気共鳴で検出可能な物質）で標識されているタンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動物へ導入される（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）。被験体のサイズおよび使用される画像化システムが診断画像を生成するのに必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体に対して、注入される放射性同位体の量は、通常約５ 〜２０ミリキュールの９９ｍＴｃ の範囲である。標識された抗体または抗体フラグメントは、次いで、特異的タンパク質を含む細胞の位置で好ましくは蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ． Ｂｕｒｃｈｉｅｌ ら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ 第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓ．Ｗ． ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ． Ｒｈｏｄｅｓ 編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【００３９】
マーカーＴｒｐ８ａ およびＴｒｐ８ｂ はまた、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションを使用することによって腫瘍の進行および前立腺腫瘍の悪性の程度の診断評価（格付けおよび病気分類）をモニターするため、予後に有用である。原発性癌においては、Ｔｒｐ８は約２ 〜１０％ の癌細胞中において発現され、レジディブ（ｒｅｚｉｄｉｖｅ）癌においては約１０〜６０％ の細胞において発現され、および転移においては約６０〜９０％ の細胞において発現される。
【００４０】
本発明はまた、タンパク質Ｔｒｐ８ａ および／もしくはＴｒｐ８ｂ 、またはＴｒｐ８ａ および／もしくはＴｒｐ８ｂ コードｍＲＮＡを含むと考えられる標的サンプルを、Ｔｒｐ８ａ および／もしくはＴｒｐ８ｂ またはそのコードｍＲＮＡと反応する試薬と接触させて、Ｔｒｐ８ａ および／またはＴｒｐ８ｂ コードｍＲＮＡを検出することを含む子宮内膜癌（子宮の癌）の診断方法に関する。本方法の特定の実施形態に関して、参考は、上記の前立腺癌の診断方法の特定の実施形態に対してなされる。
【００４１】
Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａもしくはＴｒｐ１０ｂの濃度またはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａもしくはＴｒｐ１０ｂコードｍＲＮＡの濃度が正常であるか、あるいは増加しているか、従って、悪性腫瘍の存在についての指標を評価するため、測定濃度は、好ましくは数量化のためにＴｒｐ８ａ ：Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ８ｂ ：Ｔｒｐ９またはＴｒｐ１０ （ａ もしくはｂ ）／Ｔｒｐ９ の比を使用することによって正常組織における濃度と比較される。
【００４２】
前立腺癌は侵襲的に増加している場合、それ自身の基底膜を形成するので、Ｔｒｐ８およびＴｒｐ１０ を発現する細胞のみが、この現象に関連すると結論付けられ得る。従って、これらのタンパク質の発現および／または活性を阻害することによって、ＰＣＡ のような癌の有効治療が提供されると結論付けられ得る。
【００４３】
従って、本発明はまた、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／もしくはＴｒｐ１０ｂ発現またはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／もしくはＴｒｐ１０ｂの活性を減少あるいは阻害する試薬を含む医薬組成物、ならびに哺乳動物被験体に治療的に有効な量の試薬（Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／もしくはＴｒｐ１０ｂ発現またはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／もしくはＴｒｐ１０ｂの活性を減少あるいは阻害する）を投与することを含む前立腺腫瘍、子宮内膜癌（子宮癌）腫瘍、絨毛膜癌、肺の癌または黒色腫を予防、処置、または改善する方法に関する。このような試薬の例は、上記のアンチセンスＲＮＡ 、リボザイムまたはインヒビター（例えば、特異的抗体）である。さらに、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂの生物学的機能を阻害あるいは調節するペプチドは、治療試薬として有用であり得る。例えば、これらのペプチドは、Ｒｏｔｔｇｅｎ， Ｐ． およびＣｏｌｌｉｎｓ， Ｊ．（Ｇｅｎｅ （１９９５）１６４（２）：２４３−２５０）に記載されるように、組み合わせファージディスプレイライブラリー（Ｃｏｓｍｉｘ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ ）のスクリーニングによって得られ得る。さらに、Ｔｒｐ８およびＴｒｐ１０ タンパク質の抗原性エピトープは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＴｒｐ８およびＴｒｐ１０ エピトープライブラリーの発現（Ｍａｒｑｕａｒｔ， Ａ ＆ Ｆｌｏｃｋｅｒｚｉ， Ｖ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４０７（１９９７），１３７−１４０； Ｔｒｏｓｔ， Ｃ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５１（１９９９），２５７−２６３）および前立腺の癌または子宮内膜の癌に罹患する患者の血清を用いたこれらのライブラリーの連続スクリーニングによって同定され得る。次いで、免疫原性であり、かつ患者の血清中の抗体の形成を導くこれらのＴｒｐ８およびＴｒｐ１０ エピトープは、Ｔｒｐ８またはＴｒｐ１０ を発現する癌細胞に対する免疫発見のためのＴｒｐ８またはＴｒｐ１０ 誘導ペプチドワクチンとして使用され得る。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系に対して、Ｔｒｐ８もしくはＴｒｐ１０ またはＴｒｐ８およびＴｒｐ１０ のエピトープは、ヒト胎児腎臓（Ｈｅｋ２９３）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３ ）などの哺乳動物細胞株において発現され得る。
【００４４】
最後に、上記疾患の治療に有用な化合物は、イオンチャンネルＴｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ 上でアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する化合物を含む。Ｔｒｐ８は、一価イオン（すなわちナトリウム）および二価イオン（すなわちカルシウム）の存在下でカルシウムイオンに対してのみ透過性である高いカルシウム選択的イオンチャンネルであることが示され得た（以下の実施例４ 、および図３Ａ、Ｃ 、Ｅ を参照のこと）。生理学的条件下で、Ｔｒｐ８は、大きな内部電流を示すカルシウム選択チャンネルである。Ｔｒｐ８チャンネル（ならびにＴｒｐ９およびＴｒｐ１０ａ／ｂチャンネル）のこの非常に大きな伝導性は、Ｔｒｐ チャンネルと相互作用する薬理学化合物をスクリーニングするための系（ハイスループットスクリーニング系を含む）を確立するのに有用である。有用なハイスループットスクリーニング系は、当業者に周知であり、例えば、生物学的系におけるカルシウムシグナル伝達を検出するためのアッセイにおいてＴｒｐ８、Ｔｒｐ９およびＴｒｐ１０ チャンネルをコードするＤＮＡ 配列で安定にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞株を使用することが挙げられる。このような系としては、Ｃａ感受性色素（例えば、エクオリン、アポエクオリン、Ｆｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３およびＩｎｄｏ−１など）に基づくアッセイが挙げられる。
【００４５】
したがって、本発明はまた、イオンチャンネルＴｒｐ８、Ｔｒｐ９および／またはＴｒｐ１０ におけるアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を同定する方法に関し、該方法は、好ましくは、Ｔｒｐ８、Ｔｒｐ９および／またはＴｒｐ１０ をコードするＤＮＡ 配列と安定にまたは一過的にトランスフェクトした細胞に基づくシステムを用いることにより、試験化合物とイオンチャンネルＴｒｐ８、Ｔｒｐ９および／またはＴｒｐ１０ とを接触させ、該試験化合物がカルシウム取り込みに影響を与えるかどうかを決定することを含む。
【００４６】
投与のために、上記試薬は好ましくは適切な医薬キャリアと組み合わされる。適切な医薬キャリアの例は、当該分野において周知であり、リン酸緩衝化生理食塩水、水、オイル／水エマルジョンなどのエマルジョン、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。かかるキャリアは、通常法により配合され得、適切な用量で被験体に投与されうる。適切な組成物の投与は、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所または皮内投与などの異なる経路によりもたらされうる。投与経路は、もちろん腫瘍の性質および医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。用量養生法は、担当医師および他の臨床因子により決定されうる。医学分野で周知のように、任意の一患者の用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間および投与経路、腫瘍の種類および段階、全身の健康および同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。
【００４７】
本発明のアンチセンスＲＮＡ またはリボザイムの送達は、直接適用により、または好ましくは、これらの化合物を含むキメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いることにより、達成されうる。所望の標的にこれらの核酸を送達することにより、例えば、ＰＣＡ の転移形成に関して、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂの細胞内発現、およびしたがって、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂのレベルが減少されえ、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂの陰性効果の阻害を生じうる。
【００４８】
例えば、コロイド分散系として衝撃送達により、または動脈における部位へカテーテルにより、標的部位への直接適用を行ないうる。上記核酸の送達に使用しうるコロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび水中油エマルジョンを含む液体基準系（混合）、ミセル、リポソームおよびリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）が挙げられる。好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームの組成は、通常リン脂質およびステロイド、特にコレステロールの組み合わせである。当業者は、所望の核酸分子の送達に適切なかかるリポソームを選択する位置にある。組織特異的または細胞特異的リポソームを、所望の腫瘍へのみの送達を達成するために使用しうる。リポソームの標的化は、一般に公知の方法を適用することにより、当業者により行われうる。この標的化は、受動的標的化（洞様毛細血管を含む器官においてＲＥＳ の細胞に分配するリポソームの自然の傾向を利用する）および能動的標的化（例えば、既知の方法により、例えば、抗体、レセプター、糖、糖脂質、タンパク質などの特異的リガンドにリポソームを結合させることにより）を含む。本発明では、特異的細胞表面リガンドを介して特異的腫瘍へのリポソームを標的化させるために、好ましくはモノクローナル抗体が使用される。
【００４９】
遺伝子治療に有用な好ましい組換えベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはより好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡ ウイルスである。よりいっそう好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。本発明で使用されうるかかるレトロウイルスベクターの例は、Ｍｏｌｏｎｅｙ マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ） およびＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ） である。最も好ましくは、マウスベクターと比較して、より広い宿主範囲を提供するテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）などの非ヒト霊長類レトロウイルスベクターが使用される。組換えレトロウイルスは不安定であるので、伝染性粒子を作製するために援助が必要である。かかる援助は、例えば、ＬＴＲ 内での調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を用いることにより、提供されうる。適切なヘルパー細胞株が、当業者に周知である。かかるベクターは、選択可能なマーカーをコードする遺伝子をさらに含みうるので、形質導入細胞が同定されうる。さらに、レトロウイルスベクターは、標的特異的になるように改変されうる。これは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、達成されうる。当業者は、標的特異的ベクターのさらなる作製方法を知っている。インビトロ遺伝子療法またはインビボ遺伝子療法に関するさらに適切なベクターおよび方法が、文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、ＷＯ９４／２９４６９またはＷＯ９７／００９５７参照。
【００５０】
標的器官、すなわち処置対象の腫瘍においてのみ発現を達成するために、例えば、アンチセンスＲＮＡ またはリボザイムをコードする核酸がまた、作動可能に組織特異的プロモーターに連結され、遺伝子療法に使用されうる。かかるプロモーターは、当業者に周知である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ら、（１９９４） Ｎｅｕｒｏｎ １２、１１−２４； Ｖｉｄａｌら； （１９９０） ＥＭＢＯ Ｊ． ９、８３３−８４０； Ｍａｙｆｏｒｄら、（１９９５）、Ｃｅｌｌ ８１ 、８９１−９０４； Ｐｉｎｋｅｒｔら、（１９８７） Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １ 、２６８−７６参照） 。
【００５１】
前記で論じた診断的研究における使用に対して、キットがまた本発明により提供される。かかるキットは、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、または代替的にはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡまたはＴｒｐ１０ａ／ｂアンチセンス転写物である標的細胞成分の検出に有用であり、ここで、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、または代替的にはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡまたはＴｒｐ１０ａ／ｂアンチセンス転写物の存在または増大した濃度は、前立腺腫瘍、子宮内膜癌、黒色腫、絨毛膜癌または肺癌を示し、該キットは、Ｔｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂ、または代替的にはＴｒｐ８ａ 、Ｔｒｐ８ｂ 、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ１０ａおよび／またはＴｒｐ１０ｂをコードするｍＲＮＡまたはＴｒｐ１０ａ／ｂアンチセンス転写物の検出のためのプローブを含む。プローブは、検出可能に標識されうる。かかるプローブは、特異的抗体または特異的オリゴヌクレオチドでありうる。好ましい態様において、前記キットは、抗Ｔｒｐ８ａ 抗体、抗Ｔｒｐ８ｂ 抗体、抗Ｔｒｐ９抗体、抗Ｔｒｐ１０ａ抗体および／または抗Ｔｒｐ１０ｂ抗体を含み、例えばＥＬＩＳＡ により前記診断を可能にし、当該分野で公知の技術を用いて、固体支持体、例えば、ポリスチレンマイクロタイター皿またはニトロセルロース紙に結合した抗体を含む。代替的には、前記キットは、ＲＩＡ に基づき、放射性同位体で標識された前記抗体を含む。本発明のキットの好ましい態様において、抗体は、酵素、蛍光化合物、発光化合物、強磁性プローブまたは放射性化合物で標識される。本発明のキットは、例えば、本発明の１つ以上のプローブが充填された１つ以上の容器を含みうる。医薬品または生物学的産物の製造、使用または販売を調整する政府機関により規定された形態における通知がキットの容器に付随し、通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売による機関による承認を反映する。
【００５２】
実施例
以下の実施例は、説明を意図し、本発明を限定しない。かかる実施例は、使用されうる代表的なものである一方、当業者に公知の他の方法が代替的に利用されうる。
【００５３】
実施例１：材料および方法
（Ａ）ｃＤＮＡクローンの単離およびノーザンブロット解析
全ＲＮＡ を標準技術を用いてヒト胎盤および前立腺から単離した。製造業者の説明書にしたがって、ポリ（Ａ） ＋ ＲＮＡ−スピンカラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＵＳＡ） を用いてｍＲＮＡの単離を行なった。ｃＤＮＡ選択システム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＵＳＡ） を用いてポリ（ａ） ＋ ＲＮＡ を逆転写し、λ−Ｚａｐファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＵＳＡ） にサブクローン化した。ヒト発現配列タグ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号１４０４０４２）を用いて、オリゴｄ（Ｔ）プライム化（ｐｒｉｍｅｄ）ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。いくつかのｃＤＮＡクローンを同定し、単離した。プライマー５’−ｇｃａ ｔａｇ ｇａａ ｇｇｇ ａｃａ ｇｇｔ ｇｇ−３’および５’−ｇａｇ ａｇｔ ｃｇａ ｇｇｔ ｃａｇ ｔｇｇ ｔｃｃ−３’ を用いて、さらなるｃＤＮＡクローンを２つの特異的なプライム化ｃＤＮＡライブラリーから単離した。
【００５４】
ｃＤＮＡクローンをサーモサイクラー（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ）およびＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて配列決定した。ＤＮＡ 配列を、自動シークエンサー（Ｌｉｃｏｒ， Ｌｉｎｃｃｏｌｎ， ＵＳＡ）を用いて解析した。
【００５５】
ノーザンブロット解析のために、０．８ ％アガロースゲル上の電気泳動により、ヒト胎盤または前立腺由来の５ μｇ のヒトポリ（Ａ） ＋ ＲＮＡ を分離した。ポリ（Ａ） ＋ ＲＮＡ をＨｙｂｏｎｄ Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。膜を４２℃で一晩５０％ホルムアミドの存在下でハイブリダイズした。［α３２Ｐ ］ｄＣＴＰおよび「ｒｅａｄｙ ｐｒｉｍｅ 」標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＤＮＡ プローブを標識した。市販のノーザンブロットを配給業者の説明書にしたがってハイブリダイズさせた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｏｌｏ Ａｌｔｏ， ＵＳＡ） 。
【００５６】
（Ｂ）発現プラスミドの構築およびＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
Ｔｒｐ８ｂ のｃＤＮＡを含む組換えジシストロン（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ）真核生物発現プラスミドｐｄｉＴＲＰ８ を用いて、トリβアクチンプロモーター、次いで内部リボソームエントリーサイド（ＩＲＥＳ）およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ） のｃＤＮＡの制御下で、リポフェクションを行なった。ＴＲＰ８ｂ およびＧＦＰ の全タンパク質コード領域を保有するｐｄｉＴＲＰ８ を得るために（Ｐｒａｓｈｅｒ， Ｄ．Ｃ．ら（１９９２）、Ｇｅｎｅ １１１、２２９−２３３）、ＴＲＰ８ｂ ｃＤＮＡの５’および３’− 非翻訳配列を除去し、脊椎動物における翻訳の開始に対するコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ， Ｍ．（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５ 、８１２５−８１４８）を翻訳開始コドンのすぐ５’に導入し、得られたｃＤＮＡを、トリβアクチンプロモーターの下流のｐＣＡＧＧＳベクター（Ｎｉｗａ，Ｈ．、Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ． およびＭｉｙａｚａｋｉ，Ｊ． （１９９１）、Ｇｅｎｅ ８、１９３−１９９）にサブクローン化した。脳心筋炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｇ． 、Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｍ． 、Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｋ． およびＳｈｉｎ Ｈ．Ｓ．（１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２， ３６３６−３６４３） 、それに続いてＳｅｒ６５Ｔｈｒ変異を含むＧＦＰ ｃＤＮＡ（Ｈｅｉｍ， Ｒ、Ｃｕｂｉｔｔ， Ａ．Ｂ．、Ｔｓｉｅｎ， Ｒ．Ｙ．（１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７３、６６３−６６４）を、ＴＲＰ８ｂ ｃＤＮＡに３’をクローン化した。ＩＲＥＳ配列は１つの転写物からＴＲＰ８ｂ およびＧＦＰ の同時翻訳を可能にする。したがって、グリーン蛍光の発現により、トランスフェクト細胞を明白に検出しうる。
【００５７】
細胞内Ｃａ２＋濃度のモニタリングのために、リポフェクタミン（Ｑｕｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｒｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ） の存在下に４：１ のモル比でｐｃＤＮＡ３−ＴＲＰ８ｂベクターおよびｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰベクターを用いて、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ ２９３） 細胞を同時トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３−ＴＲＰ８ｂを得るために、脊椎動物における翻訳の開始に対するコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ， Ｍ．（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５， ８１２５−８１４８） を含むＴＲＰ８ｂ の全タンパク質コード領域をｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にサブクローン化した。カルシウムモニタリングおよびパッチクランプ試験を、それぞれ２日およびトランスフェクション後１日行なった。
【００５８】
（Ｃ）Ｔｒｐ８遺伝子の染色体局在化
ＮＩＧＭＳ 体ハイブリッドマッピングパネルＮｏ．２（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃａｍｄｅｎ， ＮＪ， ＵＳＡ）を用いて、以前記載されたようにヒトＴＲＰ８遺伝子の染色体局在化を行なった（Ｄｒｗｉｎｇａ，Ｈ．Ｌ． 、Ｔｏｊｉ，Ｌ．Ｈ． 、Ｋｉｍ， Ｃ．Ｈ． 、Ｇｒｅｅｎｅ，Ａ．Ｅ． 、Ｍｕｌｉｖｏｒ，Ｒ．Ａ．（１９９３） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６、３１１−３１４； Ｄｕｂｏｉｓ，Ｂ．Ｌ．およびＮａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９３） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６ 、３１５−３１９）。
【００５９】
（Ｄ）インビトロ翻訳、グルタチオン−セファロースおよびカルモジュリンアガロース結合アッセイ
Ｎ−およびＣ−末端Ｔｒｐ８− フラグメントをｐＧＥＸ−４Ｔ２ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）にサブクローン化し、グルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｔｒｐ８融合構築物を生じた（図４）。大腸菌ＢＬ ２１ 細胞においてＧＳＴ−ＴＲＰ８− 融合タンパク質を発現させ、グルタチオン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。
【００６０】
ＴＮＴ 結合転写／翻訳キット（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ） を用いて、３５Ｓ−メチオニンの存在下で、ヒトＴｒｐ８ ｃＤＮＡ およびアフリカツメガエルカルモジュリン（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ｃＤＮＡ（Ｄａｖｉｓ， Ｔ．Ｎ．およびＴｈｏｒｎｅｒ， Ｊ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， ７９０９−７９１３） のインビトロ翻訳を行なった。翻訳産物をゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ 、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ） により精製し、１ｍＭ Ｃａ２＋または２ｍＭ ＥＧＴＡの存在下で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、ｐＨ７．４ 、０．１ ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中にて、ＧＳＴ−Ｔｒｐ８またはカルモジュリン−アガロースに結合したグルタチオンビーズ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共に等量の３５Ｓ 標識プローブを２時間インキュベートした。３回洗浄した後、結合タンパク質をＳＤＳ サンプルバッファーを用いて溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、３５Ｓ 標識タンパク質をＰｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ） を用いて検出した。
【００６１】
（Ｅ）カルシウム測定
細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ ）をデジタル画像化システム（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ． Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ， Ｐｌａｎｅｇｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて二重波長ｆｕｒａ−２蛍光比測定（Ｔｓｉｅｎ， Ｒ．Ｙ．（１９８８） Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １１、４１９−４２４）により決定した。ＨＥＫ 細胞を１０％ウシ胎仔血清の存在下で最少必須培地において増殖させ、前記（Ｂ）に記載のようにｐｃＤＮＡ３−ＴＲＰ８ｂベクターおよびｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰベクターを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクト細胞をグリーン蛍光の発現により検出した。４ μＭ ｆｕｒａ−２／ＡＭ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ， Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ）を細胞に１時間負荷した。負荷後、細胞をバッファーＢ１（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ 、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、５ｍＭ ＫＣｌ 、ｐＨ７．４）で３回リンスし、（Ｇａｒｃｉａ， Ｄ．Ｅ． 、Ｃａｖａｌｉｅ， Ａ． およびＬｕｘ， Ｈ．Ｄ．（１９９４） Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４ 、５４５−５５３）に記載のように３４０ｎｍ および３８０ｎｍ の励起波長で得られる蛍光比から［Ｃａ２＋］ｉ を計算した。
【００６２】
（Ｆ）電気生理学的記録
ＨＥＫ 細胞を（Ｂ）に記載の真核生物発現プラスミドｐｄｉＴＲＰ８ を用いてトランスフェクトし、トランスフェクション後１日電気力学的記録を行なった。（Ｈａｍｉｌｌ， Ｏ．Ｐ． 、Ｍａｒｔｙ， Ａ． 、Ｎｅｈｅｒ， Ｅ． 、Ｓａｋｍａｎｎ， Ｂ． およびＳｉｇｗｏｒｔｈ， Ｆ．Ｊ．（１９８１） Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． ３９１、８５−１００；Ｐｈｉｌｉｐｐ， Ｓ．、Ｃａｖａｌｉｅ， Ａ． 、Ｆｒｅｉｃｈｅｌ， Ｍ．、Ｗｉｓｓｅｎｂａｃｈ， Ｕ．、Ｚｉｍｍｅｒ， Ｓ．、Ｔｒｏｓｔ， Ｃ． 、Ｍａｒｑｕａｒｔ， Ａ．、Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｍ．およびＦｌｏｃｋｅｒｚｉ， Ｖ．（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ． ６１６６−６１７１） に記載のように、パッチクランプ技術のホールセルモードで、単細胞を電圧固定した。ピペット溶液は、（ｍＭ）で含まれる：１４０　アスパラギン酸、１０ ＥＧＴＡ 、１０ ＮａＣｌ 、１ ＭｇＣｌ２ 、１０ Ｈｅｐｅｓ（ＣｓＯＨ を有してｐＨ７．２）または１２５ ＣｓＣｌ、１０ ＥＧＴＡ 、４ＣａＣｌ２、１０ Ｈｅｐｅｓ（ＣｓＯＨ を有してｐＨ７．２）を含んだ。容器の溶液は、（ｍＭ）で含まれる：１００ＮａＣｌ、１０ＣｓＣｌ、２ＭｇＣｌ２、５０マンニトール、１０グルコース、２０Ｈｅｐｅｓ（ＣｓＯＨを有してｐＨ７．４）および２ＣａＣｌ２を含むか、またはＣａＣｌ２ を添加しなかった（−Ｃａ２＋溶液） 。二価を含まない容器の溶液は、（ｍＭ）：１１０Ｎ−メチル−Ｄ− グルカミン（ＮＭＧＤ）を含んだ。変化する保持電位（ｈｏｌｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ）で−１００〜＋１００ｍＶの１００ｍｓｅｃ 電圧ランプの間ホールセル電流を記録した。
【００６３】
（Ｇ）インサイチュハイブリダイゼーション
６ 〜８ μＭ の厚さのホルマリン固定組織スライスを用いて、インサイチュハイブリダイゼーションを行なった。スライスを水和し、１０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ） を含むＰＢＳ バッファーの存在下で０．５ 時間インキュベートした。ビオチン標識デオキシ−オリゴヌクレオチド（０．５ｐｍｏｌ／ μｌ ） を用いて３３％ホルムアミドの存在下にスライスを３７℃で１２時間ハイブリダイズさせた。さらに、スライスを２ ×ＳＳＣ で数回リンスし、アビジン／ビオチン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ， ＤＡＫＯ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＵＳＡ）を用いて２５℃で０．５ 時間インキュベートした。ＰＢＳ バッファーを用いて数回洗浄した後、スライスをビオチン標識チラミド （ｔｙｒａｍｉｄ）および過酸化物（０．１５ ％ ｗ／ｖ） の存在下で１０分間インキュベートし、ＰＢＳ バッファーでリンスし、さらにＡＢＣ 複合体と共に０．５ 時間インキュベートした。スライスをＰＢＳ バッファーを用いて洗浄し、ＤＡＢ 溶液（Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド中にジアミノベンジジン（５０ μｇ／ｍｌ） 、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファーｐＨ８．４ 、０．１５％ Ｈ２Ｏ２ ； Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下でインキュベートした。４分後、水中でスライドをインキュベートすることにより検出を停止した。ＮＨＳ−ＬＣビオチン（スルホスクシニミジル−６−（ビオチニミド）−ヘキサノエート） 、２．５ｍｇ／ｍｌ； Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ） およびチラミン−ＨＣｌ（０．７５ｍｇ／ｍｌ， Ｓｉｇｍａ）を２５ｍＭホウ酸バッファー、ｐＨ８．５ 中で１２時間インキュベートすることにより、チラミドをビオチン標識した。チラミド溶液をＰＢＳ バッファー中で１ 〜５：１０００に希釈した。
【００６４】
（Ｈ）ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号：ＴＲＰ８ａ、Ａｊ２４３５００；ＴＲＰ８ｂ Ａｊ２４３５０１
【００６５】
実施例２：ＴＲＰ８転写物の発現
イオンチャンネルのＴＲＰ ファミリーに遠く関連するタンパク質の検索において、ヒト発現配列タグ（ＥＳＴ， ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号１４０４０４２）をＶＲ１ 遺伝子に少し相同であるＢＬＡＳＴ プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）にて；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ． 、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ． 、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｊ．（１９９０） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５、４０３−４１０）を用いてＧｅｎＢａｎｋ データベースにおいて同定した。数個のヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを構築し、プローブとしてこのＥＳＴ ＤＮＡ を用いてスクリーニングした。数個の全長ｃＤＮＡクローンを同定し、単離した。全長ｃＤＮＡクローンは、３個のアミノ酸において異なる２つの推定上のタンパク質をコードし、Ｔｒｐ８ａ およびＴｒｐ８ｂ と呼んだ（図１ｃ、２ａ、７ および８Ａ）。２個体の胎盤から構築された２つのｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離することにより、この知見を再現した。誘導されたタンパク質配列は、６個の膜貫通ドメイン、ｔｒｐ チャンネルに特有の全般的な特徴および関連するタンパク質を含む（図１ｂ）。配列は、一方で公開された、ラット腸から単離されたカルシウム取り込み輸送タンパク質１（ＣａＴ１）（Ｐｅｎｇ， Ｊ．Ｂ． 、Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｚ． 、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．Ｖ． 、Ｖａｓｓｉｌｅｖ， Ｐ．Ｍ．、Ｔｓｕｋａｇｕｃｈｉ，Ｈ． 、Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｍ．およびＨｅｄｉｇｅｒ Ｍ．Ａ．（１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．６；２７４ 、２２７３９−２２７４６）およびウサギ腎臓から単離された上皮カルシウム取り込みチャンネル（ＥＣａＣ）（Ｈｏｅｎｄｅｒｏｐ，Ｊ．Ｇ． 、ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｅｍｐ，Ａ．Ｗ． 、Ｈａｒｔｏｇ，Ａ． 、ｖａｎ ｄｅ Ｇｒａａｆ，Ｓ．Ｆ． 、ｖａｎ Ｏｓ， Ｃ．Ｈ．、Ｗｉｌｌｅｍｓ， Ｐ．Ｈ． およびＢｉｎｄｅｌｓ， Ｒ．Ｊ．（１９９９） Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２６；２７４ 、８３７５−８３７８）に密接に関連した。Ｔｒｐ８ａ／ｂ 転写物の発現は、ヒト胎盤、膵臓および前立腺において検出可能であり（図５）、ノーザンシグナルのサイズ（３．０ｋｂ） は、単離された全長ｃＤＮＡのサイズに対応する。さらに、１．８ｋｂ のより短い転写物、おそらくスプライスバリアントは、ヒト精巣において検出可能である。Ｔｒｐ８ ｍＲＮＡ は小腸または結腸では発現されないこと（図５）は、Ｔｒｐ８がラットＣａＴ１またはウサギＥＣａＣタンパク質のヒトオルソログではないことを意味する。他の関連配列があるかどうかを調査するために、Ｔｒｐ８ａ／ｂ 由来プライマー（ＵＷ２４１、５’−ＴＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＧＣ−３’ およびＵＷ２４２ 、５’−ＣＡＡ ＡＧＴ ＡＧＡ ＴＧＡ ＧＧＴ ＴＧＣ−３’）を使用して、Ｔｒｐ８配列にヌクレオチドレベルで９５％同一である１０５ｂｐ フラグメントをヒトゲノムＤＮＡ から増幅した（データは示さず）。これは、ヒトにおける少なくともゲノムレベルでの数個の類似配列の存在を示す。
【００６６】
実施例３：Ｔｒｐ８タンパク質の２つのバリアント（Ｔｒｐ８ａおよびＴｒｐ８ｂ）は多型を生じる
Ｔｒｐ８ ｃＤＮＡ の２つのバリアントをヒト胎盤から単離し（図２Ａ、７ および８Ａ）、それは３つのアミノ酸において異なる２つのタンパク質をコードし、Ｔｒｐ８ａ およびＴｒｐ８ｂ と呼んだ。Ｔｒｐ８ａ／ｂ 特異的プライマーを設計し、ヒトＴ−リンパ球から単離したゲノムＤＮＡ 由来のＴｒｐ８遺伝子の４５８ｂｐ のＤＮＡ フラグメントを増幅した（プライマー対：ＵＷ２４３、５’−ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＡＴ ＣＴＡ ＣＣ−３’およびＵＷ２４４ 、５’−ＣＡＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＣ−３’） 。増幅産物は、Ｔｒｐ８ａ の由来するタンパク質の配列がアミノ酸のバリンを含み、Ｔｒｐ８ｂ 配列がメチオニンを含む１部の配列ならびにサイレント塩基対置換（ｇ対ａ）および３０３ｂｐ のイントロンを含む（図２Ａ、Ｂ ）。Ｔｒｐ８遺伝子の両方のバリアント（ａ、ｂ）が等量でゲノムＤＮＡ から増幅された。このことは、ヒトゲノムにおける両方のバリアントの存在を示し、それゆえにＲＮＡ 編集の結果でない（図２Ｂ）。Ｔｒｐ８ａ 遺伝子は、制限酵素Ｂｓｐ１２８６Ｉを用いる４５８ｂｐ のゲノムフラグメントを切り出すことにより、Ｔｒｐ８ｂ 遺伝子と区別されうる（図２Ｂ） 。鋳型として１２人のヒト被験体の血液から単離したヒトゲノムＤＮＡ を用いて、４５８ｂｐ フラグメントを増幅し、ＢＳＰ１２８６Ｉを用いて拘束した。試験した被験体１１人において、Ｔｒｐ８ｂ 遺伝子のみが検出可能であり、一方１人の被験体（７） がＴｒｐ８ａ およびＴｒｐ８ｂ 遺伝子を含む（図２Ｄ） 。これらは、２ つのＴｒｐ８バリアントが多型により生じ、個体の遺伝子を表さないことを示す。Ｔｒｐ８特異的プライマーおよび染色体ＤＮＡ を鋳型として用いると、Ｔｒｐ８遺伝子座は第７ 染色体で検出可能である（図２Ｃ） 。
【００６７】
実施例４：Ｔｒｐ８ｂ はカルシウム透過チャンネルである
Ｔｒｐ８ｂ ｃＤＮＡのタンパク質コード配列を、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ） の制御下でｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にサブクローン化した。Ｔｒｐ８ｂ ｐｃＤＮＡ３構築物（ｐｃＤＮＡ３−Ｔｒｐ８ｂ ベクター） およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ） をコードするｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰベクターを４：１ の比で用いてヒト胎児腎臓（ＨＥＫ ２９３） 細胞を同時トランスフェクトした。Ｔｒｐ８ｂ ｃＤＮＡおよびレポーターのｃＤＮＡ、ＧＦＰ をヒト胎児腎臓（ＨＥＫ ２９３） 細胞において、一過性に発現させた。レポーター遺伝子ＧＦＰ のグリーン蛍光により同定した同時トランスフェクト細胞において、二重波長ｆｕｒａ−２蛍光比測定により、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ ）および［Ｃａ２＋］ｉ の変化を決定した（図３Ｆ） 。
【００６８】
二重波長ｆｕｒａ−２蛍光比測定は、蛍光Ｃａ２＋感受性染料であり、ＥＧＴＡの構造に基づいてＲ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ により設計された（例えば、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １１ 、４１９−４２４（１９８８））ｆｕｒａ−２を用いる標準手順である（例えば、Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （Ｈａｌｌ， Ｚ．Ｗ． 編） Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＵＳＡ（１９９２） ）。その蛍光放出スペクトルは、生理学的濃度範囲におけるＣａ２＋への結合により変化する。Ｃａ２＋の不在下で、ｆｕｒａ−２は、３８５ｎｍ の励起波長で最も強く蛍光を発し、ｆｕｒａ−２がＣａ２＋に結合する場合、最も有効な励起波長は、３４５ｎｍ にシフトする。この特性を使用して細胞内の局部的なＣａ２＋濃度を測定する。細胞膜を横切って拡散し、サイトゾルエステラーゼにより活性化ｆｕｒａ−２に加水分解されるｆｕｒａ−２エステル（例えば、ｆｕｒａ−２ＡＭ） と共に細胞に負荷をかけうる。
【００６９】
１ｍＭ Ｃａ２＋の存在下で、Ｔｒｐ８発現細胞は３００ｎＭ より多くのサイトゾルＣａ２＋を典型的に含み、一方非トランスフェクト対照は１００ｎＭ 未満のＣａ２＋イオンを含んだ（図３Ｆ） 。細胞外Ｃａ２＋なしでＴｒｐ８ｂ トランスフェクト細胞をインキュベートしたとき、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ ）は、非トランスフェクト細胞に匹敵するレベルに減少した。容器への１ｍＭ Ｃａ２＋の再添加は、Ｔｒｐ８ｂ トランスフェクト細胞においてサイトゾル［Ｃａ２＋］の有意な増加を生じたが、対照では生じなかった（図３Ｆ） 。Ｃａ２＋イオンの容器溶液への再添加の後、サイトゾルＣａ２＋濃度は、Ｔｒｐ８ｂ トランスフェクト細胞において高い定常状態レベルのままである。
【００７０】
実施例５：Ｔｒｐ８発現細胞はカルシウム選択内部電流を示す
ＴＲＰ８の電気生理学的特性を詳細に特徴付けるために、ジシストロン発現ベクターｐｄｉＴＲＰ８ を用いて、ＨＥＫ ２９３ 細胞においてＴＲＰ８およびＧＦＰ を同時発現させ、パッチクランプ技術を用いてホールセルモードで電流を測定した（Ｈａｍｉｌｌ，Ｏ．Ｐ． 、Ｍａｒｔｙ，Ａ．、Ｎｅｈｅｒ，Ｅ．、Ｓａｋｍａｎｎ，Ｂ．およびＳｉｇｗｏｒｔｈ，Ｆ．Ｊ．（１９８１） Ｐｆｌｕｇｅｒｓ　Ａｒｃｈ． 、３９１ 、８５−１００）。
【００７１】
真核生物発現プラスミドｐｄｉＴＲＰ８ は、トリβアクチンプロモーター、次に内部リボソームエントリーサイド（ＩＲＥＳ）およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ ）のｃＤＮＡの制御下でＴｒｐ８ｂ のｃＤＮＡを含む。ＴＲＰ８ｂ およびＧＦＰ の全タンパク質コード領域を保有するｐｄｉＴＲＰ８ を得るために（Ｐｒａｓｈｅｒ， Ｄ．Ｃ．ら（１９９２）、Ｇｅｎｅ １１１、２２９−２３３）、ＴＲＰ８ｂ ｃＤＮＡの５’および３’− 非翻訳配列を除去し、脊椎動物における翻訳の開始に対するコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ， Ｍ．（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５， ８１２５−８１４８） を翻訳開始コドンの５’直前に導入し、得られたｃＤＮＡを、トリβアクチンプロモーターの下流のｐＣＡＧＧＳベクター（Ｎｉｗａ，Ｈ．、Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ． およびＭｉｙａｚａｋｉ，Ｊ． （１９９１）、Ｇｅｎｅ ８、１９３−１９９）にサブクローン化した。次いで、脳心筋炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｇ． 、Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｍ． 、Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｋ． およびＳｈｉｎ Ｈ．Ｓ．（１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２ 、３６３６−３６４３）、それに続いてＳｅｒ６５Ｔｈｒ変異を含むＧＦＰ ｃＤＮＡ（Ｈｅｉｍ， Ｒ， Ｃｕｂｉｔｔ， Ａ．Ｂ．、Ｔｓｉｅｎ， Ｒ．Ｙ．（１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７３、６６３−６６４）を、ＴＲＰ８ｂ ｃＤＮＡに３’をクローン化した。ＩＲＥＳ配列は１つの転写物からＴＲＰ８ｂ およびＧＦＰ の同時翻訳を可能にする。したがって、グリーン蛍光の顕色により、トランスフェクト細胞を明白に検出しうる。
【００７２】
２ｍＭ の外部カルシウムの存在下で、Ｔｒｐ８ｂ トランスフェクトＨＥＫ 細胞は内部整流電流を示し、その大きさは細胞内カルシウムのレベルおよび電気化学的推進力に依存する。静止膜電位を、−４０ｍＶ で保持するか、またはパルス間でカルシウムの流入に対する推進力を下げるために＋７０ｍＶ のいずれかで保持した。電流の跡を−１００から＋１００ｍＶまで電圧スロープに応答して記録し、毎秒ごとに適用した。内部および外部電流を経時的にモニターするために、本発明者らはスロープの−８０ｍＶ および＋８０ｍＶ で電流の大きさを解析した。図３Ａは、経時的な−８０ｍＶ での電流の代表的な跡を示す。−４０ｍＶ または＋７０ｍＶ の両方の保持電位で、電流は、ＧＦＰ 含有ベクターのみを有するトランスフェクトされた細胞においてよりも有意に大きい（図３Ｅ）。驚くべきことに、正の保持電位への変更後、Ｔｒｐ８トランスフェクト細胞における電流の大きさはゆっくり増加し、約７０秒後に定常状態に届く（図３Ａ）。誘導電流の選択性を決定するために、次に、本発明者らは、ナトリウムを含まずＣａ２＋を添加しない溶液（図３Ａ、Ｃ ）、またはナトリウムを含むが二価のイオンを含まない容器溶液のいずれかを用いて細胞を灌流した。溶液変化のみの効果についての対照のために、本発明者らはまた、標準容器を用いて灌流した（図３Ａのパフを参照）。外部Ｃａ２＋の除去は、ｔｒｐ８誘導電流を完全に廃止する−残りの電流は大きさおよび形において対照と同一である一方（図３Ａ、Ｃ 、Ｅ ）、外部ナトリウムの除去は効果がない（図３Ｅ）。カルシウム選択チャンネル（例えば、Ｖｅｎｎｅｋｅｎｓ， Ｒ． 、Ｈｏｅｎｄｅｒｏｐ， Ｇ．Ｊ． 、Ｐｒｅｎｅｎ，Ｊ． 、Ｓｔｕｉｏｖｅｒ，Ｍ． 、Ｗｉｌｌｅｍｓ 、ＰＨＧＭ、Ｄｒｏｏｇｍａｎｓ， Ｇ． 、Ｎｉｌｉｕｓ， Ｂ．およびＢｉｎｄｅｌｓ，Ｒ．Ｊ．Ｍ （１９９９） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５ 、３９６３−３９６９ ）の重要な性質は、全ての外部二価イオン、すなわちＣａ２＋およびマグネシウムを除去した場合にのみナトリウムを処理するための能力である。ｔｒｐ８チャンネルがこの現象と一致するかどうかを調べるために、標準の容器溶液をナトリウムと１ｍＭ のＥＧＴＡのみを含む溶液に切り替えた。図３ＢおよびＤ に見られうるように、Ｔｒｐ８トランスフェクト細胞は、このとき非常に大きいナトリウム電流を伝導しうる。驚くべきことに、溶液変更直後、電流は迅速に増加する前にまずより小さくなり、孔は最初はまだカルシウムにより遮断されたまま（変則モル画分挙動と通常呼ばれる現象（Ｗａｒｎａｔ，Ｊ， 、Ｐｈｉｌｉｐｐ，Ｓ．、Ｚｉｍｍｅｒ，Ｓ． 、Ｆｌｏｃｋｅｒｚｉ，Ｖ．、およびＣａｖａｌｉｅ Ａ．（１９９９）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ） ５１８、６３１−６３８ ））であり得ることを示す。標準の容器溶液におけるＴｒｐ８トランスフェクト細胞の測定外部電流は、非トランスフェクト対照細胞またはレポーター遺伝子ＧＦＰ を発現するのみである細胞と有意に異ならない。外部Ｃａ２＋の除去がＴｒｐ８特異的電流を廃止する場合、残りの電流を溶液変化の前の電流から引き算し、非混入Ｔｒｐ８コンダクタンスを得た（図３Ｃにおける挿入図を参照）。所定��イオン条件（内部の高いＥＧＴＡ、外部の２ｍＭ Ｃａ２＋）から予期されるように、電流−電圧の関係は、ここで外部電流がほとんどないか全くない顕著な内部整流を示す。
【００７３】
Ｔｒｐ８電流の発生の時間経過と電流の大きさの両方が、刺激の頻度（データ示さず）、内部Ｃａ２＋濃度および外部Ｃａ２＋濃度ならびに静止膜電位に依存し、このことは、Ｔｒｐ８カルシウムコンダクタンスがＣａ２＋媒介フィードバック機構により複雑に（ｉｎｔｒｉｃａｌｌｙ）調節されることを示唆する。
【００７４】
実施例６：Ｃａ２＋／カルモジュリンはＴｒｐ８タンパク質のＣ 末端に結合する
カルシウム調節フィードバックの主な媒介物質であるカルモジュリンが関与するかどうかを試験するために、まずＴｒｐ８タンパク質がカルモジュリンに結合しるうるかどうかを生化学的に調査した。インビトロで３５Ｓ−メチオニンの存在下にてＴｒｐ８ ｃＤＮＡ を翻訳し、産物をカルモジュリンアガロースビーズと共にインキュベートした。Ｃａ２＋の存在下または不在下のいずれかで数回洗浄した後、ビーズをＬａｅｍｍｌｉ バッファー中でインキュベートし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。Ｃａ２＋の不在下ではなく、Ｃａ２＋（１ｍＭ ）の存在下で、Ｔｒｐ８タンパク質はカルモジュリンに結合する（図４Ｂ）。
【００７５】
結合部位を厳密にするために、２つのアプローチを行った。第１に、Ｔｒｐ８の様々な細胞内ドメインのＧＳＴ−ＴＲＰ８融合タンパク質を構築し、大腸菌において発現させ、グルタチオンセファロースビーズに結合させた。次にこれらのビーズをインビトロで翻訳された３５Ｓ−標識カルモジュリンとインキュベートし、洗浄し、ゲル電気泳動に供した。第２に、インビトロで翻訳されたＴｒｐ８タンパク質の切断型を、上記カルモジュリン−アガロースへの結合に使用した。図４ＡおよびＣ で示されるように、Ｔｒｐ８のＮ 末端領域（Ｎ１、Ｎ２）の融合タンパク質はカルモジュリンに結合しなかった一方、Ｃ 末端フラグメント（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４）は、カルシウムの存在下でカルモジュリン結合を示した（全体のＴｒｐ８タンパク質内のフラグメントの局在下について、図４Ｃ参照）。したがって、インビトロで翻訳されたＴｒｐ８の切断型は、Ｃ 末端の３２個のアミノ酸残基を欠如し、カルモジュリン−アガロースに結合しなかった（４Ｂ）。本発明者らは、カルモジュリン結合部位をＴｒｐ８タンパク質のアミノ酸残基６９１ 〜７１１ に制限している。このカルモジュリン結合部位は、典型的に保存されたＩＱ（通常のミオシンのモチーフ）に類似しないが、数個の荷電アミノ酸残基が保存されたショウジョウバエメラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ） の一過性レセプター電位様（ｔｒｐｌ ）タンパク質（ＷａｒｒおよびＫｅｌｌｙ 、１９９６）のカルシウム依存性カルモジュリン結合部位１に対する制限された配列相同性を有する。Ｔｒｐ８タンパク質のカルモジュリン結合部位の配列は、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ−ＶｉｔａｎｅｎおよびＤｅ Ｇｒａｄｏにより提案されたモデル（１９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３９、４５５−４７８ ）による、帯電し、かつ疎水的部位を有する推定の両親媒性のαヘリックスホイール構造に似ている。
【００７６】
実施例７：ヒト胎盤および膵臓におけるＴｒｐ８転写物の発現
インサイチュでのハイブリダイゼーション実験のために、１０週齢の発育不全のヒト胎盤由来の数個のスライドを使用した。インサイチュでのハイブリダイゼーション実験は、ヒト胎盤でのＴｒｐ８転写物の発現を示した（図５Ｂ）。発現は、胎盤の栄養膜および合胞体層で検出可能であったが、ランゲルハンス細胞では検出不可能であった。
【００７７】
Ｔｒｐ８転写物は、ヒト膵臓において検出可能である（図５Ａ）。したがって、Ｔｒｐ８プローブを、ヒト膵臓の組織切片にハイブリダイズさせた。膵臓癌を罹患する患者から膵臓組織を取り出した。Ｔｒｐ８発現は、膵臓腺房細胞において検出可能であるが、ランゲルハンス島においては検出不可能である（図５Ｃ）。膵臓癌の領域には、Ｔｒｐ８発現を見出さなかった（データ示さず）。
【００７８】
さらに、インサイチュでのハイブリダイゼーションならびにノーザン解析により、ヒト結腸においてもヒト腎臓においてもＴｒｐ８ ｃＤＮＡ は、検出不可能である（図５Ａ、Ｄ ）。インサイチュ発現データとあわせたノーザン結果は、Ｔｒｐ８タンパク質が、ラット腸から（Ｐｅｎｇ，Ｊ．Ｂ． 、Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｚ． 、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．Ｖ． 、Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｐ．Ｍ． 、Ｔｓｕｋａｇｕｃｈｉ， Ｈ．、Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｍ．およびＨｅｄｉｇｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６；２７４，２２７３９−２２７４６ ）ならびにウサギ腎臓から（Ｈｏｅｎｄｅｒｏｐ，Ｊ．Ｇ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｅｍｐ，Ａ．Ｗ． 、Ｈａｒｔｏｇ，Ａ． 、ｖａｎ ｄｅ Ｇｒａａｆ， Ｓ．Ｆ．、ｖａｎ Ｏｓ，Ｃ．Ｈ． 、Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｐ．Ｈ．およびＢｉｎｄｅｌｓ，Ｒ．Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７４、８３７５−８３７８ ）それぞれクローン化されたＣａＴ１およびＥＣａＣチャンネルのヒトオルソログではないことを示している。Ｔｒｐ８は、その発現がＣａＴ１が豊富に発現される小腸および結腸組織において検出不可能であるので、ＣａＴ１のヒト型を表さないようである。しかしながら、Ｔｒｐ８がラットＣａＴ１のヒト型である場合、第２の遺伝子産物は、ラット小腸および結腸におけるＣａＴ１に帰するヒト小腸および結腸におけるＣａ２＋取り込みに必要とされるようである。
【００７９】
実施例８：前立腺の良性組織および悪性組織におけるＴｒｐ８転写物の異なる発現
市販のノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）に対するＴｒｐ８プローブのハイブリダイゼーションにより示されるように、Ｔｒｐ８転写物をヒト前立腺において発現させる（図５Ａ）。Ｔｒｐ８転写物は、良性前立腺過形成（ＢＰＨ ）を罹患する患者のプールされたｍＲＮＡを用いるノーザンブロット解析により、検出不可能であった（図５Ａ、前立腺＊ ）。細胞レベルでのＴｒｐ８発現を試験するために、Ｔｒｐ８特異的ｃＤＮＡプローブを用いて前立腺組織の切片をハイブリダイズさせた（表３）。Ｔｒｐ８転写物の発現は、正常前立腺（ｎ＝３）、良性過形成（ＢＰＨ 、ｎ＝１５） または前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ 、ｎ＝９）において検出不可能である（図６Ａ、Ｃ 、Ｅ ）。Ｔｒｐ８転写物は、発現レベルは異なるが、前立腺癌（ＰＣＡ ）においてのみ検出可能であった。低い発現レベルが、原発性癌において見出された（癌細胞の２ 〜１０％、ｎ＝８ ）（図７Ｂ）。非常に強い発現がレジディブ（ｒｅｚｉｄｉｖｅ）癌（１０〜６０％）（図７Ｄ、ｎ＝６ ）および前立腺の転移（６０〜９０％、ｎ＝４ ）（図７Ｆ）において検出可能であった。したがって、図５Ａで使用された市販のノーザンブロットは、配給業者により示されるような正常前立腺ｍＲＮＡを含むのみではないことが結論づけられるべきである。配給業者の説明書により、このノーザンブロットに使用した前立腺ｍＲＮＡは１４〜６０歳の範囲の１５人のヒト被験体から回収した。この前立腺組織を病理学的手段により実験しなかった。Ｔｒｐ８発現は、正常または良性前立腺において検出不可能であるので、この知見は、このノーザンブロットに使用したｍＲＮＡが、前立腺癌組織からいくぶん抽出されたことを示す。要約すると、Ｔｒｐ８発現は、悪性前立腺においてのみ検出可能であり、したがって、Ｔｒｐ８ ｃＤＮＡ は、前立腺癌に対するマーカーである。結果を表４にまとめる。
【００８０】
【表３】
2004505617.tif 000005
【００８１】
【表４】
2004505617.tif 000006
【００８２】
（Ｂ）子宮の良性組織および悪性組織におけるＴｒｐ８転写物の特異的発現
さらに、Ｔｒｐ８が、子宮内膜癌（子宮癌とも呼ばれ、子宮肉腫または子宮頸の癌とは区別される）において発現される一方、正常な子宮組織では発現が観察されなかったことが示されうる。したがって、Ｔｒｐ８もまた、前記癌の診断に対する特異的なマーカーである（図１２）。
【００８３】
実施例９：Ｔｒｐ９の特徴付け
Ｔｒｐ９の完全なタンパク質コード配列を決定した（図９ ）。Ｔｒｐ９転写物は、ヒト前立腺およびヒト結腸において優勢に発現する。ノーザンブロット解析により示されうるように、良性前立腺過形成（ＢＰＨ 、図１３、上のパネル左） または前立腺癌（図１３、上のパネル右） においてＴＲＰ９の発現の差異はない。しかしながら、Ｔｒｐ９は、前立腺癌に対する参照マーカーとして有用である、すなわち、Ｔｒｐ８の発現レベルの定量に使用されうる。患者および健常個体におけるＴｒｐ８：Ｔｒｐ９の発現の比は、定量アッセイの開発に有用である。
【００８４】
実施例１０：Ｔｒｐ１０ の特徴付け
ＴＲＰ１０ （ａ およびｂ ）の完全なタンパク質コード配列をバイオコンピューティングにより決定した（図１０および１１）。ノーザンブロット解析におけるプローブとしてＴｒｐ１０ ｃＤＮＡの２３５ｂｐ フラグメントを用いると、ＴＲＰ１０ 転写物は、前立腺癌を罹患する個体から単離されたｍＲＮＡにおいてのみ検出されうるが（図１３、下のパネル） 、前立腺の良性組織（前立腺ＢＰＨ ）から単離されたｍＲＮＡにおいても、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓から単離されたｍＲＮＡにおいても検出され得ない。Ｔｒｐ１０ ｃＤＮＡの２３５ｂｐ ｃＤＮＡフラグメントを、プライマー対ＵＷ２４８ 、５’−ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＴＡ ＴＴＣ Ｃ−３’ およびＵＷ２４９ ５’−ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＴＴＴ ＧＴＡ ＣＣ −３’ および前立腺ｃＤＮＡを鋳型として用いて増幅した。要約すると、ＴＲＰ８に類似するＴｒｐ１０ａおよびＴｒｐ１０ｂはまた、悪性前立腺組織において発現される。ここまでは、その発現は、試験した他のいずれの組織においても観察され得なかった（上記参照のこと）。したがって、Ｔｒｐ１０ａおよびＴｒｐ１０ｂはまた、悪性前立腺組織に特異的である有用なマーカーである。
【００８５】
さらに、生物学的情報のための国立センター（ＮＣＢＩ）の公開データベースにおけるデータベース検索は、Ｔｒｐ１０ 配列と部分的に同一である数個の発現配列タグ（ＥＳＴ クローン）の存在を明らかにした。これらのＥＳＴ クローンを肺、胎盤、前立腺の癌組織から、および黒色腫から最初から単離した。これらのクローンは、次のアクセッション番号：ＢＥ２７４４４８、ＢＥ４０８８８０、ＢＥ２０７０８３、ＢＥ７９１１７３、ＡＩ６７１８５３、ＢＥ３９０６２７を有するクローンを含む。結果は、これらの組織の癌細胞がＴｒｐ１０ 関連転写物を発現する一方、対応する健常組織におけるＴｒｐ１０ 転写物の発現が検出不可能であることを示す（図１３）。さらに、黒色腫および前立腺癌の癌細胞において、Ｔｒｐ１０ 転写物は、４個のアンチセンスプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションにより示されるように発現されることが示され得た（図１４Ａ−Ｅ および１３Ｋ−Ｏ および表２、前記）。さらに、Ｔｒｐ１０ 転写物を発現するこれらの組織の癌細胞はまた、４個のセンスプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションにより、図１４Ｆ−Ｊ 、図１４Ｐ−Ｒ および図１４Ｔ に示されるようにＴｒｐ１０−アンチセンス転写物を発現することが明らかに示され得た（表２、前記）。インサイチュハイブリダイゼーション実験は、肺、胎盤、前立腺の癌および黒色腫に由来する癌細胞のサブセットの検出が、それぞれＴｒｐ１０ 転写物に相補的であるかまたはＴｒｐ１０−アンチセンス転写物に相補的であるアンチセンスならびにセンスプローブを用いて可能であることを証明する。
【００８６】
前記は説明を意図し、本発明の範囲の限定ではない。前記教示に基づいて、過度の実験なしに、当業者は、さらなる態様を容易に構想し、製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、ｔｒｐ および関連タンパク質の系統発生的関係である。図１Ｂは、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ に従うＴｒｐ８タンパク質配列のヒドロパシープロットである。図１Ｃは、上皮カルシウムチャンネルＥＣａＣ（ウサギ由来）およびＶｒ１ （ラット由来）に対するＴｒｐ８ａ／ｂ のアラインメントである。推定膜貫通ドメインに下線を施している。
【図２】
図２Ａは、Ｔｒｐ８遺伝子の多型である。多型改変体Ｔｒｐ８ａ およびＴｒｐ８ｂ は、５つの塩基対で異なり、誘導タンパク質配列において３つのアミノ酸変換を生じる。特異的プライマーは、矢印で示されるようにＴｒｐ８遺伝子由来であった。図２Ｂは、Ｔｒｐ８ａ およびＴｒｐ８ｂ 遺伝子が単一の制限部位で区別できることを示す。Ｔｒｐ８遺伝子のゲノムフラグメントは、特異的プライマーを使用して増幅され得る（図２Ａに示される）。Ｔｒｐ８ｂ 遺伝子のゲノムフラグメントは、制限酵素ＢＳＰ１２８６Ｉのさらなる部位を含む（ 図２Ｂ） 。図２Ｃは、Ｔｒｐ８遺伝子が第７ 染色体上に位置されることを示す。図２Ｄは、７人のヒト被験体の遺伝子型である。Ｔｒｐ８遺伝子の４５８ｂｐ のゲノムフラグメントは、特異的プライマーを用いて増幅され（図２Ａに示される）、ＢＳＰ１２８６Ｉで拘束された。生じたフラグメントは、ＰＡＧＥ電気泳動によって分析された。
【図３】
図３は、Ｔｒｐ８ｂ タンパク質がカルシウム選択イオンチャンネルであることを示す。Ａは、ｐｄｉＴｒｐ８ｂトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の代表的なトレースである。Ｔｒｐ８ｂ 媒介電流は、−４０ｍＶ または＋７０ｍＶ での保持電位で１００ｍｓｅｃ の電圧スロープ（−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶ）によって活性化され；１、Ｔｒｐ８電流は、２ｍｍ［Ｃａ２＋］０で存在し；２、溶液スイッチの効果は３のみ、名目上０ カルシウム溶液へスイッチする。Ｂは、０ 個の二価陽イオンの存在下でのＴｒｐ８電流である。Ｃは、Ａに示される電流の電流電圧関係（流入、電流を減ずるリーク）である。Ｄは、Ｂに示される電流の電流電圧関係である。Ｅは、代表的な実験の統計である。黒：Ｔｒｐ８トランフェクト細胞、灰色：対照細胞。左から右への列：−４０ｍＶ でのＴｒｐ８電流（ｎ＝８ ）および＋７０ｍＶ の保持電位でのＴｒｐ８電流（ｎ＝１２）。標準的な電解槽溶液（ナトリウムを含まない１２０ｍＭ ＮＭＤＧ（ｎ＝７ ）および名目上０ のカルシウムイオンを含む１２０ｍＭ ＮＭＤＧ（ｎ＝８ ）を含む、または０ 個の二価陽イオンを含む１ｍＭ ＥＧＴＡの存在する（ｎ＝６ ））におけるＴｒｐ８電流。Ｆは、１ｍＭ［Ｃａ２＋］０の存在または非存在下でのＴｒｐ８ｂ トランスフェクトＨＥＫ 細胞（灰色）および対照（黒）中の［Ｃａ２＋ ］ ｉ における代表的な変化である。対照細胞と比較した、１ｍＭ［Ｃａ２＋］０の再添加前および後のＴｒｐ８ｂ トランスフェクトＨＥＫ 細胞の細胞質ゾルカルシウム濃度の流入、相対的増加。
【図４】
図４は、Ｔｒｐ８タンパク質のＣ 末端領域がカルモジュリンと結合することを示す。Ａは、カルモジュリン結合研究に使用されるＴｒｐ８タンパク質のＮ 末端フラグメントおよびＣ 末端フラグメントである。Ｂは、Ｔｒｐ８タンパク質およびｃＤＮＡのＭｕｎＩ切断後にインビトロで翻訳された切断Ｔｒｐ８タンパク質である。このタンパク質は、Ｃ 末端の３２個のアミノ酸残基が欠失する。これらのタンパク質は、３５Ｓ メチオニンの存在下でインビトロで翻訳され、１ｍＭ のＣａ２＋または２ｍＭ のＥＧＴＡの存在下でカルモジュリン結合アガロースビーズと共にインキュベートされた。Ｃは、Ｃａ２＋（１ｍＭ ）またはＥＧＴＡ（２ｍＭ ）の存在下でのＴｒｐ８タンパク質のＮ 末端フラグメントおよびＣ 末端フラグメントへのカルモジュリン結合である。
【図５】
図５は、Ｔｒｐ８ ｃＤＮＡ の発現パターンである。Ａは、ノザンブロット（左パネル、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｐｏｌｏ Ａｌｔｏ）がＴｒｐ９ ｃＤＮＡ の３４８ｂｐ のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＴフラグメントを用いてハイブリダイズされたことを示す。このプローブは、市販用のブロットから単離されたｍＲＮＡ種へハイブリダイズするが、良性前立腺肥厚から単離されたｍＲＮＡ種（右パネル、良性前立腺肥厚に罹患している２０人のヒト被験体から単離したｍＲＮＡ）へはハイブリダイズしない。Ｂ、Ｃは、ヒト組織のスライド上のビオチニル化Ｔｒｐ８特異的オリゴヌクレオチドを用いたインサイチュハイブリダイゼーションである。左列はアンチセンスプローブ、右列はセンスプローブ、Ｄはアンチセンスプローブである。
【図６】
図６は、ヒト前立腺におけるＴｒｐ８ ｃＤＮＡ の特異的発現である。Ａ〜Ｆは、前立線組織を用いたインサイチュハイブリダイゼーションである。Ａは、正常前立腺。Ｂは、原発性癌、Ｃは、良性肥厚、Ｄは、レジディブ癌、Ｅは、前立腺上皮内新形成、Ｆは、前立腺のリンパ節転移である。
【図７】
図７は、Ｔｒｐ８ａ ｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列である。
【図８】
図８Ａは、Ｔｒｐ８ｂ ｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列である。図８Ｂは、スプライスバリアント１のｃＤＮＡ配列である（１２Ｂ１）。図８Ｃは、スプライスバリアント２のｃＤＮＡ配列である（１７−３）。図８Ｄは、スプライスバリアント３のｃＤＮＡ配列である（２３Ａ３）。図８Ｅは、スプライスバリアント４のｃＤＮＡ配列である（２３Ｃ３）。
【図９】
図９Ａは、Ｔｒｐ９ ｃＤＮＡ 配列および誘導アミノ酸配列である。図９Ｂは、スプライスバリアント１５のｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列である。
【図１０】
図１０Ａは、Ｔｒｐ１０ａのｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列である。図１０Ｂは、Ｔｒｐ１０ａのｃＤＮＡフラグメントおよび誘導アミノ酸配列である。
【図１１】
図１１は、Ｔｒｐ１０ｂのｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列である。
【図１２】
図１２は、ヒト子宮内膜癌または子宮の癌におけるＴｒｐ８ ｍＲＮＡ の発現である。Ａ〜Ｄは、Ｔｒｐ８アンチセンスとハイブリダイズされた子宮内膜癌のスライドを用いたインサイチュハイブリダイゼーション（左列）または対照としてのセンスプローブ（右列）である。Ｅ〜Ｆは、正常な子宮内膜のスライドにハイブリダイズされたＴｒｐ８アンチセンスプローブである。正常な子宮内膜組織ではハイブリダイゼーションは起こらないことが明らかに見え得る。
【図１３】
図１３は、ヒトＴｒｐ９およびＴｒｐ１０ 遺伝子の発現である。ノザンブロットは、Ｔｒｐ９（上パネル）またはＴｒｐ１０ （下パネル）特異的プローブを使用してハイブリダイズされた。Ｔｒｐ９ ｃＤＮＡ の発現は、ヒト前立腺および結腸を含む多くの組織ならびに良性前立腺肥厚において検出可能である。Ｔｒｐ１０ ｃＤＮＡの発現は、市販のノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、右側）のヒト前立腺において検出可能である。このノザンブロットは、１４〜６０歳の範囲の１５人のヒト被験体から収集した前立腺組織を含む。Ｔｒｐ１０ ｃＤＮＡの発現は、良性前立腺肥厚においては検出不可能であった（左側）。
【図１４】
図１４は、ヒト前立腺癌および黒色腫の転移におけるＴｒｐ１０ 転写物およびＴｒｐ１０ アンチセンス転写物の発現である。Ｔｒｐ１０ アンチセンス（Ａ〜Ｅ、Ｋ〜Ｎ）およびＴｒｐ１０ 関連センスプローブ（Ｆ〜Ｊ、Ｐ〜Ｒ）でハイブリダイズされたスライドのインサイチュハイブリダーゼーション。両プローブは、これらの癌細胞がＴｒｐ１０ 転写物およびＴｒｐ１０ アンチセンス転写物を発現することを示す同じ癌細胞を検出することが明らかにわかり得る。Ｓは、Ｔｒｐ１０ 発現が前立腺の良性肥厚（ＢＰＨ ）において検出不可能であることを示す。ＯおよびＴは、ヒト肺における黒色腫の転移におけるＴｒｐ１０ 転写物（Ｏ）およびＴｒｐ１０ アンチセンス転写物（Ｔ）の発現を示す。黒色腫癌細胞は、Ｔｒｐ１０ 転写物およびＴｒｐ１０ アンチセンス転写物の両方を発現する。
【図１】
2004505617.tif 000007
【図２】
2004505617.tif 000008
【図３】
2004505617.tif 000009
【図４】
2004505617.tif 000010
【図５】
2004505617.tif 000011
【図６】
2004505617.tif 000012
【図７】
2004505617.tif 000013
2004505617.tif 000014
2004505617.tif 000015
【図８】
2004505617.tif 000016
2004505617.tif 000017
2004505617.tif 000018
2004505617.tif 000019
2004505617.tif 000020
2004505617.tif 000021
【図９】
2004505617.tif 000022
2004505617.tif 000023
2004505617.tif 000024
2004505617.tif 000025
2004505617.tif 000026
2004505617.tif 000027
【図１０】
2004505617.tif 000028
2004505617.tif 000029
2004505617.tif 000030
2004505617.tif 000031
【図１１】
2004505617.tif 000032
2004505617.tif 000033
【図１２】
2004505617.tif 000034
【図１３】
2004505617.tif 000035
【図１４】
2004505617.tif 000036
2004505617.tif 000037
【国際公開パンフレット】
2004505617.tif 000038
2004505617.tif 000039
2004505617.tif 000040
2004505617.tif 000041
2004505617.tif 000042
2004505617.tif 000043
2004505617.tif 000044
2004505617.tif 000045
2004505617.tif 000046
2004505617.tif 000047
2004505617.tif 000048
2004505617.tif 000049
2004505617.tif 000050
2004505617.tif 000051
2004505617.tif 000052
2004505617.tif 000053
2004505617.tif 000054
2004505617.tif 000055
2004505617.tif 000056
2004505617.tif 000057
2004505617.tif 000058
2004505617.tif 000059
2004505617.tif 000060
2004505617.tif 000061
2004505617.tif 000062
2004505617.tif 000063
2004505617.tif 000064
2004505617.tif 000065
2004505617.tif 000066
2004505617.tif 000067
2004505617.tif 000068
2004505617.tif 000069
2004505617.tif 000070
2004505617.tif 000071
2004505617.tif 000072
2004505617.tif 000073
2004505617.tif 000074
2004505617.tif 000075
2004505617.tif 000076
2004505617.tif 000077
2004505617.tif 000078
2004505617.tif 000079
2004505617.tif 000080
2004505617.tif 000081
2004505617.tif 000082
2004505617.tif 000083
2004505617.tif 000084
2004505617.tif 000085
2004505617.tif 000086
2004505617.tif 000087
2004505617.tif 000088
2004505617.tif 000089
2004505617.tif 000090
2004505617.tif 000091
2004505617.tif 000092
2004505617.tif 000093
2004505617.tif 000094
2004505617.tif 000095
2004505617.tif 000096
2004505617.tif 000097
2004505617.tif 000098
2004505617.tif 000099
2004505617.tif 000100
2004505617.tif 000101
2004505617.tif 000102
2004505617.tif 000103
2004505617.tif 000104
2004505617.tif 000105
2004505617.tif 000106
2004505617.tif 000107
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505617.tif 000108
2004505617.tif 000109
2004505617.tif 000110
2004505617.tif 000111
2004505617.tif 000112
2004505617.tif 000113
2004505617.tif 000114
2004505617.tif 000115
2004505617.tif 000116
2004505617.tif 000117
2004505617.tif 000118
2004505617.tif 000119
2004505617.tif 000120
2004505617.tif 000121
2004505617.tif 000122
2004505617.tif 000123
2004505617.tif 000124
2004505617.tif 000125
2004505617.tif 000126
2004505617.tif 000127
2004505617.tif 000128
2004505617.tif 000129
2004505617.tif 000130
2004505617.tif 000131
2004505617.tif 000132
2004505617.tif 000133
2004505617.tif 000134
2004505617.tif 000135
2004505617.tif 000136
2004505617.tif 000137
2004505617.tif 000138
2004505617.tif 000139
2004505617.tif 000140
2004505617.tif 000141
2004505617.tif 000142
2004505617.tif 000143
2004505617.tif 000144
2004505617.tif 000145
2004505617.tif 000146
2004505617.tif 000147
2004505617.tif 000148
2004505617.tif 000149
2004505617.tif 000150
2004505617.tif 000151
2004505617.tif 000152
2004505617.tif 000153
2004505617.tif 000154
2004505617.tif 000155
2004505617.tif 000156
2004505617.tif 000157
2004505617.tif 000158
2004505617.tif 000159
2004505617.tif 000160
2004505617.tif 000161
2004505617.tif 000162
2004505617.tif 000163
2004505617.tif 000164
2004505617.tif 000165
2004505617.tif 000166
2004505617.tif 000167
2004505617.tif 000168
2004505617.tif 000169
2004505617.tif 000170
2004505617.tif 000171
2004505617.tif 000172
2004505617.tif 000173
2004505617.tif 000174
2004505617.tif 000175
2004505617.tif 000176
2004505617.tif 000177
2004505617.tif 000178
2004505617.tif 000179
2004505617.tif 000180
2004505617.tif 000181
2004505617.tif 000182
2004505617.tif 000183
2004505617.tif 000184
2004505617.tif 000185
2004505617.tif 000186
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505617.tif 000187
2004505617.tif 000188
【国際調査報告】
2004505617.tif 000189
2004505617.tif 000190
2004505617.tif 000191
2004505617.tif 000192
2004505617.tif 000193
2004505617.tif 000194
2004505617.tif 000195
2004505617.tif 000196
2004505617.tif 000197