(57)【要約】本発明は、哺乳類または鳥類の細胞におけるｃ−ｊｕｎ活性化を阻害する薬物の製造のために、ヤヌス　ファミリー　キナーゼ３（ＪＡＫ−３）の活性を阻害する化合物または薬学的に容認できるその塩の使用方法を提供する。【選択図】図１
2004504259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤヌス　ファミリー　キナーゼ３（ＪＡＫ−３）の活性を阻害する物質に哺乳類または鳥類の細胞を接触させることにより、それらの細胞中でのｃ−ｊｕｎ活性化を阻害することを含む方法。
【請求項２】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞のａｒａ−Ｃ、トポイソメラーゼＩＩインヒビター、紫外線放射、アルキル化剤またはイオン化放射線への被爆に起因する請求項１の方法。
【請求項３】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞の紫外線放射またはイオン化放射線への被爆に起因する請求項１の方法。
【請求項４】
前記接触がインビトロで行われる請求項１の方法。
【請求項５】
前記接触がインビトロで行われる請求項１の方法。
【請求項６】
前記接触が前記被爆に先立って起こる請求項２の方法。
【請求項７】
前記接触が前記被爆の後で起こる請求項２の方法。
【請求項８】
前記物質がタンパク質である請求項１の方法。
【請求項９】
前記物質が式Ｉの化合物または薬学的に容認できるその塩である請求項１の方法。
【化１】
2004504259.tif 000008
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、
Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項１０】
前記物質が４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンもしくは４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンまたは薬学的に容認できるそれらの塩である請求項１の方法。
【請求項１１】
前記細胞が哺乳類のものである請求項１の方法。
【請求項１２】
前記細胞がヒトのものである請求項１の方法。
【請求項１３】
前記細胞が鳥類のものである請求項１の方法。
【請求項１４】
ｃ−ｊｕｎ活性化が含まれており、その活性化の阻害は、望ましくは、治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、ＪＡＫ−３の活性を阻害する物質を投与する、哺乳動物の病的な状態を予防するかまたは処置する治療の方法。
【請求項１５】
式Ｉの化合物または薬学的に許容できるその塩の、ヤヌス  ファミリー  キナーゼ３（ＪＡＫ−３）の活性を阻害する薬剤の製造のための使用方法。
【化２】
2004504259.tif 000009
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、
Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項１６】
式Ｉの化合物または薬学的に許容できるその塩の、哺乳類または鳥類の細胞内でのｃ−ｊｕｎ活性化を阻害する薬剤の製造のための使用方法。
【化３】
2004504259.tif 000010
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、
Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項１７】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞の、放射線またはＤＮＡ損傷を引き起こす化学薬品への被爆に起因する請求項１６の使用方法。
【請求項１８】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞の、ａｒａ−Ｃ、トポイソメラーゼＩＩインヒビター、紫外線放射、アルキル化剤またはイオン化放射線への被爆に起因する請求項１６の使用方法。
【請求項１９】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞の紫外線放射またはイオン化放射線への被爆に起因する請求項１６の使用方法。
【請求項２０】
式Ｉの化合物または薬学的に容認できるその塩の、医学的治療のための使用方法。
【化４】
2004504259.tif 000011
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、
Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項２１】
前記治療は、哺乳動物の病的な状態を予防するかまたは処置することである請求項２０の化合物。
【請求項２２】
前記病的な状態は、組織の損傷、器官の損傷、炎症、脱毛症、または、化学療法の間に酸素フリーラジカルにより引き起こされる負の効果である請求項２１の化合物。
【請求項２３】
前記器官は心臓、肝臓または腎臓である請求項２２の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
前癌遺伝子ｃ−ｊｕｎは、鳥類肉腫ウィルス１７のｖ−ｊｕｎ癌遺伝子の細胞性対照物（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）である。ｃ−ｊｕｎ発現は、ＤＮＡに損傷を与える薬品（ａｒａ−Ｃを含む）、紫外線放射、トポイソメラーゼＩＩインヒビター、アルキル化剤およびイオン化放射線の種々の組み合わせに反応して活性化される。多面発現性シグナルによって誘発される即時早期反応遺伝子のように、ｃ−ｊｕｎは、細胞周期の進行、増殖および生存のために重要な調節機能を持っていると思われる。以下を参照。Ｒｙｄｅｒ， Ｋ．， Ｌａｕ， Ｌ． Ｆ．， ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ， Ｄ． ”Ａ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｖ−ｊｕｎ，”  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８５： １４８７−１４９１， １９８８； Ｓｃｈｕｔｔｅ， Ｊ．， Ｖｉａｌｌｅｔ， Ｊ．， Ｎａｕ， Ｍ．， Ｓｅｇａｌ， Ｓ．， Ｆｅｄｏｒｋｏ，  Ｊ．， ａｎｄ Ｍｉｎｎａ， Ｊ． ”ｊｕｎ−Ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｎｄ ｃ−ｆｏｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃ−ｊｕｎ， Ｃｅｌｌ． ５９： ９８７−９９７， １９８９； Ｎｅｕｂｅｒｇ， Ｍ．， Ａｄａｍｋｉｅｗｉｃｚ， Ｊ．， Ｈｕｎｔｅｒ， Ｊ． Ｂ．， ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｒ． ”Ａ ｆｏｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｊｕｎ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｆｏｒｍｓ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｗｈｉｃｈ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ＡＰ−１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ，”  Ｎａｔｕｒｅ． ３４１： ５８９−５９０， １９８９； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｐ． Ｊ． ａｎｄ Ｔｊｉａｎ， Ｒ． ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４５： ３７１−３７８， １９８９； Ｂｏｈｍａｎｎ， Ｄ．， Ｂｏｓ， Ｔ． Ｊ．， Ａｄｍｏｎ， Ｔ．， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｒ．， Ｖｏｇｔ， Ｐ． Ｋ．， ａｎｄ Ｔｉｊｉａｎ， Ｒ． ”Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ ｃ−ｊｕｎ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＡＰ−１，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２３８： １３８６−１３９２， １９８８； Ｋｈａｒｂａｎｄａ． Ｓ． Ｍ．， Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｍ． Ｌ．， ａｎｄ Ｋｕｆｅ， Ｄ． Ｗ． ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ−ｊｕｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ，”  Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ８６： １５１７−１５２３， １９９０； Ｒｏｓｅｔｔｅ， Ｃ． ａｎｄ Ｋａｒｉｎ， Ｍ． ”Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ： ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＪＮＫ ｃａｓｃａｄｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４： １１９４−７， １９９６； Ｒｕｂｉｎ， Ｅ．， Ｋｈａｒｂａｎｄａ， Ｓ．， Ｇｕｎｊｉ， Ｈ．， ａｎｄ Ｋｕｆｅ， Ｄ． ”Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃ−ｊｕｎ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｙｌｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ３９： ６９７−７０１， １９９１； Ｄｏｓｃｈ， Ｊ． ａｎｄ Ｋａｉｎａ， Ｂ． ”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃ−ｆｏｓ， ｃ−ｊｕｎ， ＪｕｎＢ ａｎｄ ｊｕｎＤ ｍＲＮＡ ａｎｄ ＡＰ−１ ｂｙ ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ０６−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＭＧＭＴ） ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ， ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，”  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． １３： １９２７−３５， １９９６； Ｃｈａｅ， Ｈ． Ｐ．， Ｊａｒｖｉｓ， Ｌ． Ｊ．， ａｎｄ Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ． ”Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ−ｊｕｎ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ，”  Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ４４７−５１， １９９３； ａｎｄ Ｋａｒｉｎ， Ｍ．， Ｌｉｕ， Ｚ．−Ｇ．， ａｎｄ Ｚａｎｄｉ， Ｅ． ”ＡＰ−１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ９： ２４０−２４６， １９９７．
【０００２】
ｃ−ｊｕｎは、ホモおよびヘテロ二量化に関連するロイシンジッパー領域を含む核ＤＮＡ結合タンパク質ＪＵＮをエンコードする。ＪＵＮタンパク質は、他のＪＵＮタンパク質またはｃ−ｆｏｓ遺伝子の生産物と共に二量化し、活性化タンパク質１（ＡＰ−１）転写要素を形成する。ＪＵＮ−ＪＵＮホモダイマーおよびＪＵＮ−ＦＯＳヘテロダイマーは、倍数増殖調節遺伝子の制御領域に見出された、特定の、七量性の共通塩基配列と優先的に結合する。ｃ−ｊｕｎ前癌遺伝子発現の変質は、それゆえに、細胞増殖および分化に影響するいくつかの成長調節因子の転写を調節することができる。以下を参照。Ｒｙｄｅｒ， Ｋ．， Ｌａｕ， Ｌ． Ｆ．， ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ， Ｄ． ”Ａ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｖ−ｊｕｎ，”  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８５： １４８７−１４９１， １９８８； Ｎｅｕｂｅｒｇ． Ｍ．， Ａｄａｍｋｉｅｗｉｃｚ， Ｊ．， Ｈｕｎｔｅｒ， Ｊ． Ｂ．， ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｒ． ”Ａ ｆｏｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｊｕｎ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｆｏｒｍｓ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｗｈｉｃｈ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ＡＰ−１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ，”  Ｎａｔｕｒｅ． ３４１： ５８９−５９０， １９８９； Ｋａｒｉｎ， Ｍ．， Ｌｉｕ， Ｚ．−Ｇ．， ａｎｄ Ｚａｎｄｉ， Ｅ． ”ＡＰ−１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ９： ２４０−２４６， １９９７； Ａｎｇｅｌ， Ｐ．， Ａｌｌｅｇｒｅｔｔｏ， Ｅ． Ａ．， Ｏｋｉｎｏ， Ｓ． Ｔ．， Ｈａｔｔｏｒｉ， Ｋ．， Ｂｏｙｌｅ， Ｗ． Ｊ．， Ｈｕｎｔｅｒ， Ｔ．， ａｎｄ Ｋａｒｉｎ， Ｍ． ”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｊｕｎ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ＡＰ−１”  Ｎａｔｕｒｅ． ３３２： １６６−１７０， １９８８； ａｎｄ Ｍｕｓｔｉ， Ａ． Ｍ．， Ｔｒｅｉｅｒ， Ｍ．， ａｎｄ Ｂｏｈｍａｍ， Ｄ． ”Ｒｅｄｕｃｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ−Ｊｕｎ ａｆｔｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７５： ４００−４０２， １９９７．
【０００３】
ｃ−ｊｕｎは、Ｒａｓにより引き起こされる変異において重要な役割を演じ、また、デ・ノボタンパク質合成が必要とされる場合に、アポプトーシスの調節因子に含まれてきている。ｃ−ｊｕｎ誘発は、紫外線への被爆またはＤＮＡ損傷の他の形態の後にセラミドにより引き起こされるアポプトーシスおよびストレスにより引き起こされるアポプトーシスのために必要とされる。この誘発は、ＪＵＮ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＵＮｓ）（これもまたストレスにより活性化されるタンパク質キナーゼとして知られている）の活性化により引き起こされると考えられている。それは、ＪＵＮの、その転写活性化能力を増加させる部位におけるリン酸化により、増大したｃ−ｊｕｎ転写につながる。優勢ネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）の、Ｎ末端を欠くｃ−ｊｕｎ変異体および優勢ネガティブのＪＮＫキナーゼの異所性の発現は、ストレスにより引き起こされるアポプトーシスを廃止する。以下を参照。Ｋａｒｉｎ， Ｍ．， Ｌｉｕ， Ｚ．−Ｇ．， ａｎｄ Ｚａｎｄｉ， Ｅ． ”ＡＰ−ｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ９： ２４０−２４６， １９９７； Ｃｏｌｌｏｔｔａ， Ｆ．， Ｐｏｌｅｎｔａｒｕｔｔｉ， Ｎ．， ａｎｄ Ｍａｎｔｏｖａｎｉ， Ａ． ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃ−ｆｏｓ ａｎｄ ｃ−ｊｕｎ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，”  Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １８２７８−１８２８３， １９９２； Ｈａｍ， Ｊ．， Ｂａｂｉｊ， Ｃ．， Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ， Ｊ．， Ｐｆａｒｒ， Ｃ． Ｍ．， Ｌａｌｌｅｍａｎｄ， Ｄ．， Ｙａｎｉｖ， Ｍ．， ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ， Ｌ． Ｌ． ”Ａ ｃ−Ｊｕｎ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ，”  Ｎｅｕｒｏｎ． １４： ９２７−９３９， １９９５； Ｖｅｒｈｅｉｊ， Ｍ．， Ｂｏｓｅ， Ｒ．， Ｌｉｎ， Ｘ． Ｈ．， Ｙａｏ， Ｂ．， Ｊａｒｖｉｓ， Ｗ． Ｄ．， Ｇｒａｎｔ， Ｓ．， Ｂｉｒｒｅｒ， ＫＭ． Ｊ．， Ｓｚａｂｏ， Ｅ．， Ｚｏｎ， Ｌ． Ｉ．， Ｋｙｒｉａｋｉｓ， Ｊ． Ｍ．， Ｈａｉｍｏｖｉｔｚ ＦＡ．， Ｆｕｋｓ， Ｚ．， ａｎｄ Ｋｏｌｅｓｎｉｃｋ， Ｒ． Ｎ． ”Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｅｒａｍｉｄｅ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ＳＡＰＫ／ＪＮＫ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ． ３８０： ７５−９， １９９６； Ｈｉｂｉ， Ｍ．， Ｌｉｎ， Ａ．， Ｓｍｅａｌ， Ｔ．， Ｍｉｎｄｅｎ， Ａ．， ａｎｄ Ｋａｒｉｎ， Ｍ． ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ− ａｎｄ ＵＶ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｃ−Ｊｕｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，”  Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７： ２１３５−４８， １��９３； Ｄｅｒｉｊａｒｄ， Ｂ．， Ｈｉｂｉ， Ｍ．， Ｗｕ， Ｉ． Ｈ．， Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｔ．， Ｓｕ， Ｂ．， Ｄｅｎｇ， Ｔ．， Ｋａｒｉｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｒ． Ｊ． ”ＪＮＫ１： ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＵＶ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａ−Ｒａｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｃ−Ｊｕｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，”  Ｃｅｌｌ． ７６： ｌ０２５−３７， １９９４； ａｎｄ Ｃｈｅｎ， Ｙ． Ｒ．， Ｗａｎｇ， Ｘ．， Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ， Ｄ．， Ｄａｖｉｓ， Ｒ． Ｊ．， ａｎｄ Ｔａｎ， Ｔ． Ｈ． ”Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ （ＪＮＫ） ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｃ ａｎｄ ｇａｍｍａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ． Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＮＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍａｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，”  Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７１： ３１９２９−３６， １９９６．
【０００４】
タンパク質チロシンキナーゼは、Ｂ系統関係のリンパ腫細胞における増殖および生存に影響を与える生化学的な生体情報伝達カスケードのイニシエーションおよび維持において重要な役割を演じる。酸化的ストレスは、ＢＴＫ、ＳＹＫおよびＳｒｃファミリーＰＴＫを活性化することが示されてきた。ＰＴＫ活性化は、ヒトＢ系統関係リンパ腫細胞の、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ前癌遺伝子発現の活性化に先立って起こり、それを統治することが知られている（Ｃｈａｅ， Ｈ． Ｐ．， Ｊａｒｖｉｓ， Ｌ． Ｊ．， ａｎｄ Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．  Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ４４７−５１， １９９３）。しかしながら、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化に応答するＰＴＫの本質はいまだに知られていない。以下を参照。Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ． Ｇ．， Ｍａｈａｊａｎ， Ｓ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｔａｋａｔａ， Ｍ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ． ”ＢＴＫ ａｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＤＴ−４０ ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｂ ｃｅｌｌｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７３： １０９６−１００， １９９６； Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”  Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９： ３０９−１８， １９９７； Ｕｃｋｕｎ Ｆ． Ｍ， Ｅｖａｎｓ Ｗ． Ｅ， Ｆｏｒｓｙｔｈ Ｃ． Ｊ， Ｗａｄｄｉｃｋ Ｋ． Ｇ， Ｔ−Ａｈｌｇｒｅｎ Ｌ．， Ｃｈｅｌｓｔｒｏｍ Ｌ． Ｍ， Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ Ａ．， Ｂｏｌｅｎ Ｊ．， Ｍｙｅｒｓ Ｄ． Ｅ． ”Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｂ−ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ｔｏ ＣＤ １９−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７： ８８６−８９１， １９９５； Ｍｙｅｒｓ Ｄ． Ｅ．， Ｊｕｎ Ｘ．， Ｗａｄｄｉｃｋ Ｋ．Ｇ．， Ｆｏｒｓｙｔｈ Ｃ．， Ｃｈｅｌｓｔｒｏｍ Ｌ．Ｍ．， Ｇｕｎｔｈｅｒ Ｒ． Ｌ．， Ｔｕｍｅｒ Ｎ． Ｅ， Ｂｏｌｅｎ Ｊ．， Ｕｃｋｕｎ Ｆ． Ｍ． ”Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＣＤ １９−ＬＹＮ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｓ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐ５３−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｂｃｌ−２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ．”  Ｐｒｏｃ Ｎａｔ ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２： ９５７５−９５７９， １９９５； Ｔｕｅｌ Ａｈｌｇｒｅｎ， Ｌ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ． Ｇ．， Ｊｉｎ， Ｊ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ． ”Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ−ａｒｒｅｓｔ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｂ−ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ａｔ ｔｈｅ Ｇ２−Ｍ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ，”  Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． ２０： ４１７−２６， １９９６； Ｑｉｎ， Ｓ．， Ｍｉｎａｍｉ， Ｙ．， Ｈｉｂｉ， ��．， Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ．， ａｎｄ Ｙａｍａｍｕｒａ， Ｈ． ”Ｓｙｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅｓ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｏｓｍｏｔｉｃ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ，”  Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７２： ２０９８−１０３， １９９７； Ｓａｏｕａｆ， Ｓ． Ｊ．， Ｍａｈａｊａｎ， Ｓ．， Ｒｏｗｌｅｙ， Ｒ． Ｂ．， Ｋｕｔ， Ｓ．， Ｆａｒｇｎｏｌｉ， Ｊ．， Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ， Ａ． Ｌ．， Ｔｓｕｋａｄａ， Ｓ．， Ｗｉｔｔｅ， Ｏ． Ｎ．， ａｎｄ Ｂｏｌｅｎ， Ｊ． Ｂ． ”Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ，”  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９１： ９５２４−２８， １９９４； Ｌａｗ， Ｄ． Ａ．， Ｃｈａｎ， Ｖ． Ｆ． Ｗ．， Ｄａｔｔａ， Ｓ． Ｋ．， ａｎｄ ＤｅＦｒａｎｃｏ， Ａ． Ｌ． ”Ｂ−ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｔｉｆｓ ｈａｖｅ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｎｄ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ＰＴＫ７２， Ｌｙｎ ａｎｄ Ｆｙｎ，”  Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． ３： ６４５−５７， １９９３； Ｈｉｂｂｓ， Ｍ． Ｌ．， Ｔａｒｌｉｎｔｏｎ， Ｄ． Ｍ．， Ａｒｍｅｓ， Ｊ．， Ｇｒａｉｌ， Ｄ．， Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｇ．， Ｍａｇｌｉｔｔｏ， Ｒ．， Ｓｔａｃｋｅｒ， Ｓ． Ａ．， ａｎｄ Ｄｕｎｎ， Ａ． Ｒ． ”Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｌｙｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ， ｃｕｌｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ，”  Ｃｅｌｌ． ８３： ３０１−３１１， １９９５； Ａｏｋｉ， Ｙ．， Ｉｓｓｅｌｂａｃｋｅｒ， Ｋ． Ｊ．， ａｎｄ Ｐｉｌａｉ， Ｓ． ”Ｂｒｕｔｏｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｐｒｅ−Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ，”  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９１： １０６０６−ｌ０６０９， １９９４； Ｊｕｇｌｏｆｆ， Ｌ． Ｓ． ａｎｄ Ｊｏｎｇｓｔｒａ Ｂｉｌｅｎ， Ｊ． ”Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＩｇＭ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒａｐｉｄ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＭ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｉｇ ａｌｐｈａ， Ｌｙｎ， ａｎｄ Ｓｙｋ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｋｅｌｅｔｏｎ，  Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： １０９６−１０６， １９９７； Ｔｈｏｍｉｓ， Ｄ． Ｓ．， Ｇｕｒｎｉａｋ， Ｃ． Ｂ．， Ｔｉｖｏｌ， Ｅ．， Ｓｈａｒｐｅ， Ａ． Ｈ．， ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｌ． Ｊ． ”Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋ���ｎｇ Ｊａｋ ３，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７０： ７９４−７９７， １９９５； Ｎｏｓａｋａ， Ｔ．， Ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ， Ｊ． Ｍ．， Ｔｒｉｐｐ， Ｒ．Ａ．， Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ， Ｗ． Ｅ．， Ｗｉｔｔｈｕｈｎ， Ｂ． Ａ．， ＭｃＭｉｃｋｌｅ， Ａ． Ｐ．， Ｄｏｈｅｒｔｙ Ｐ． ｃ．， Ｇｒｏｓｖｅｌｄ， Ｇ． Ｃ．， ａｎｄ Ｉｈｌｅ， Ｊ． Ｎ． ”Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ Ｊａｋ ３，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７０： ８００−８０２， １９９５
【０００５】
米国特許出願シリアルナンバー０９／０８７，４７９（Ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒと題され、１９９８年５月２８日に出願されている）は、ヒト神経膠芽細胞腫細胞（すなわち、脳腫瘍細胞）に対し強力な細胞毒性を示すヒドロキナゾリン誘導体を開示する。なぜならば、ＪＡＫ−３は、それら神経膠芽細胞腫細胞の中に存在することが知られておらず、前記ヒドロキナゾリン誘導体の細胞毒性活性はＪＡＫ−３活性の阻害に起因するとは信じられていないからである。さらに、前記ヒドロキナゾリン誘導体の細胞毒性活性は、ｃ−ｊｕｎ活性化の阻害に起因するとは知られていない。
【０００６】
最近、放射線への被爆およびＤＮＡの損傷を引き起こす化学薬品に起因する細胞のダメージを予防するかまたは減少するのに有用な治療上の薬品および方法が必要とされている。また、放射線または化学薬品への被爆に起因するＤＮＡ損傷と結びついた生物学的経路をさらに研究するために使用することのできる化学薬品ならびにインビトロおよびインビボの方法も必要とされている。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、ヤヌス  ファミリー  キナーゼ３（ＪＡＫ−３）の活性を阻害する物質に細胞（例えば、哺乳類または鳥類の）を接触させる（インビトロまたはインビボで）ことにより、それらの細胞中でのｃ−ｊｕｎ発現を阻害することを含む方法を提供する。
本発明は、また、ｃ−ｊｕｎ活性化が含まれており、その活性化の阻害は、望ましくは、治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、ＪＡＫ−３の活性を阻害する物質を投与する、哺乳動物（例えば、ヒト）の病的な状態を予防するかまたは処置する治療の方法をも提供する。
本発明は、また、式Ｉで表される新規な化合物ならびにそれらの調製に有用なプロセスおよび中間体をも提供する。
本発明は、また、医学的療法に使用するための（好ましくは、放射線またはＤＮＡ損傷を引き起こす化学薬品への被爆に起因する状態の処置に使用するための）ＪＡＫ−３の阻害に効果的な物質ならびに放射線またはＤＮＡ損傷を引き起こす化学薬品への被爆と結びついた状態の処置用薬剤の製造のためのＪＡＫ−３を阻害する物質の使用方法をも提供する。
【０００８】
（図面の簡単な説明）
図１．野生型ＤＴ−４０リンパ腫Ｂ細胞の、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化。
［Ａ］．ｃ−ｊｕｎ  ｍＲＮＡの誘発における用量応答。
ＤＴ−４０ニワトリ細胞を、示された容量（０、１０、１５、２０Ｇｙ）で放射した。全ＲＮＡは、２時間または４時間の放射後時間において抽出した。ＲＮＡ（２０ｍｇ）は、ノーザンゲル上にロードし、キャピラリーによるブロッティングでナイロン膜に転移させた。そのノーザンブロットは、３２Ｐラベルされたニワトリｃ−ｊｕｎプローブ（図の上部）またはニワトリＧＡＰＤＨプローブ（図の下部）とハイブリダイゼーションした。挿入画は、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｉｍａｇｅｒおよび対応するＳＩ値から決定されたｃ−ｊｕｎ／ＧＡＰＤＨ転写発現割合の数値を示す。
［Ｂ］．ＰＴＫインヒビターゲニステインの、ｃ−ｊｕｎ  ｍＲＮＡ誘発における効果。
細胞は、２０Ｇｙのイオン化放射線に被爆する前に、３０ｍｇ／ｍｌのゲニステインにより、３７℃で２４時間処理した。ｃ−ｊｕｎ発現レベルは、［Ａ］におけると同様に決定した。
【０００９】
図２．ＢＴＫ−ＤＴ−４０細胞における、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化。
二つの代表的な実験（［Ａ］および［Ｂ］として示す）は、野生型（ＷＴ）およびＢＴＫ−ＤＴ−４０細胞における、イオン化放射線によるｃ−ｊｕｎ  ｍＲＮＡ発現の誘発を示す。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、非放射の細胞および放射された細胞（２０Ｇｙ、放射後２時間の回復期間）から単離した。２ｍｇのポリ（Ａ）＋のノーザンブロットは、ｃ−ｊｕｎプローブ（図の上部）、（−アクチンプローブ（図の中部、［Ａ］のみ）、およびＧＡＰＤＨプローブ（図の下部）とハイブリダイゼーションした。それぞれの図の下方における挿入画は、ＲＮＡロードのために標準化されたｃ−ｊｕｎの相対発現（ｃ−ｊｕｎ／ＧＡＰＤＨ比）およびＳＩ（非照射の対照を超える誘発を含む）を示す。
【００１０】
図３．野生型および変異のＤＴ−４０細胞ラインにおける、イオン化放射線により引き起こされるｃ−ｊｕｎ  ｍＲＮＡ発現の誘発。
ＤＴ−４０、ＢＴＫ−ＤＴ−４０、ＳＹＫ−ＤＴ−４０（［Ａ］に示す）ならびにＬＹＮ−ＤＴ−４０およびＬＹＮ−ＳＹＫ−ＤＴ−４０細胞（［Ｂ］に示す）は、２０Ｇｙで照射し、そして、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（［Ａ］に含まれる）または全ＲＮＡ（［Ｂ］に含まれる）は、２時間の回復期間後、収集した。非放射の細胞からのＲＮＡは、対照として用いた。各々の細胞ラインからの２ｍｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（［Ａ］に含まれる）または２０ｍｇの全ＲＮＡ（［Ｂ］に含まれる）を含むノーザンブロットは、３２Ｐラベルしたｃ−ｊｕｎプローブ（図の上部）およびＧＡＰＤＨプローブ（図の下部）の両方とハイブリダイゼーションした。図の下方の挿入画は、ＲＮＡロードのために標準化されたｃ−ｊｕｎの相対発現（ｃ−ｊｕｎ／ＧＡＰＤＨ比）およびＳＩ（非照射の対照を超える誘発を含む）を示す。
【００１１】
図４．ＪＡＫ−３インヒビター。
［Ａ］．ＪＡＫ−３インヒビターの構造。
［Ｂ］．ＪＡＫ−３インヒビターの特性。ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２またはＪＡＫ−３のバキュロウィルス発現ベクターに感染したＳｆ２１細胞は、抗ＪＡＫ抗体と共に免疫沈澱させた。ＪＡＫ−１（Ｂ．１に示す）、ＪＡＫ−２（Ｂ．２に示す）およびＪＡＫ−３（Ｂ．３およびＢ．４に示す。これらの図は２回の独立な実験による。）免疫複合体は、記述したように（２０、２２）、ホットキナーゼアッセイに先立ち、１％ＤＭＳＯ（ベヒクルコントロール＝ＣＯＮ）、化合物１または化合物２で１時間処理した。双方の化合物とも、１０μｇ／ｍｌで用いたときＪＡＫ−３を阻害したが、ＪＡＫ−１またはＪＡＫ−２は、７５μｇ／ｍｌでさえも阻害しなかった。
［Ｃ］．３２Ｄｃ２２−ＩＬ−２Ｒβ細胞のＥＭＳＡｓ。化合物１（１００（ｇ／ｍｌ）および化合物２（１００（ｇ／ｍｌ）は、３２Ｄｃ２２−ＩＬ−２Ｒβ細胞において、ＩＬ−２が引き金となるＪＡＫ−３依存性ＳＴＡＴ活性を阻害したが、ＩＬ−３が引き金となるＪＡＫ−１／ＪＡＫ−２依存性ＳＴＡＴ活性は阻害しなかった。
【００１２】
図５．非放射のＤＴ−４０細胞のｃ−ｊｕｎ誘発におけるＪＡＫ−３インヒビターの効果。
細胞は、２０Ｇｙのイオン化放射に先立ち、キナゾリン誘導体４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（１００ｍｇ／ｍｌ）で、３７℃において２４時間処理した。ｃ−ｊｕｎ発現レベルは、図１〜３で概述したように決定した。
【００１３】
（詳細な説明）
ここで使用される「阻害」という用語は、測定可能な量で減少させること、または完全に予防することを意味する。また、「ｃ−ｊｕｎ活性化を阻害する」という句は、ＲＮＡ生産の阻害およびＲＮＡによりエンコードされるタンパク質の生産の阻害を含む。
【００１４】
出願人らは、ＢＴＫ、ＳＹＫおよびＬＹＮの、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化における潜在的な関連性について、選択的な遺伝子破壊により前記特定のＰＴＫの欠乏を引き起こされたＤＴ−４０ニワトリリンパ腫Ｂ細胞クローンを用いて試験した。ＢＴＫは、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化において何の役割も演じないことがわかった。同様に、ＬＹＮおよびＳＹＫのどちらも、放射線への被爆後のｃ−ｊｕｎ活性化には必要とされない。しかしながら、それらの参加は、ｃ−ｊｕｎ応答の強度に影響すると思われる。ところが、ヤヌス  ファミリー  キナーゼ３（ＪＡＫ−３）のインヒビターが放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化を廃棄したことが、予期せずして発見された。
【００１５】
ｃ−ｊｕｎ発現は、ａｒａ−Ｃ、トポイソメラーゼＩＩインヒビターまたはアルキル化剤のような、ＤＮＡに損傷を与える化学薬品への被爆により活性化されることが可能である。ｃ−ｊｕｎ発現は、また、紫外線放射またはイオン化放射線への被爆にも起因して起こることが可能である。本発明によれば、ＪＡＫ−３のインヒビターは、放射線への被爆または化学薬品への被爆に起因するｃ−ｊｕｎ発現の阻害に使用することができる。
【００１６】
本発明の方法は、インビトロで実行することが可能である。そのようなインビトロの方法は、また、ＤＮＡに損傷を与える薬品への細胞の応答と結びついた生物学的プロセスを研究するのに有用である。本発明の方法は、また、インビボでも実行することが可能である。そのような方法は、また、ＤＮＡに損傷を与える薬品への細胞の応答と結びついた生物学的プロセスを研究するために、ならびに、哺乳類（例えば、ヒト）の、ＤＮＡに損傷を与える薬品への被爆に起因する病的な状態を処置するために使用することが可能である。
【００１７】
ＤＮＡに損傷を与える薬品への被爆に起因する病的な状態は、組織または器官（例えば、心臓、肝臓または腎臓）の損傷、炎症および脱毛症のような、酸化的ストレスに起因する状態、ならびに化学療法の間に酸素フリーラジカルにより引き起こされる負の効果を含む。酸化的ストレスは、外部薬品への被爆に起因しても良いし、または内部プロセスに起因しても良い。そのように、ＪＡＫ−３インヒビターは、また、老化および脊髄萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）のような、内部発生した酸素フリーラジカルの活動に起因する状態の処置のために有用である。
【 ００１８】
本発明によれば、ＪＡＫ−３インヒビターは、予防的、すなわち、ＤＮＡに損傷を与える薬品への被爆の前に投与して良い。または、ＪＡＫ−３インヒビターは、ＤＮＡに損傷を与える薬品への被爆の後に投与しても良い。
【００１９】
本発明の方法において有用なＪＡＫ−３インヒビターは、ＪＡＫ−３活性を阻害する能力のあるすべての化合物を含む。化合物がＪＡＫ−３を阻害する能力をいかにして測定するかは、例えば、以下の実施例２における「ＪＡＫ−３インヒビターの、放射により引き起こされるＤＴ−４０細胞中のｃ−ｊｕｎ活性化における効果」という題目の下に記述した試験と同様の標準試験を使用することは、技術的に周知である。
【００２０】
本発明の方法において有用なＪＡＫ−３インヒビターは、式Ｉの化合物または薬学的に容認できるその塩を含む。
【化５】
2004504259.tif 000003
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、  Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【００２１】
別に記述しない限り、以下の定義を使用する。ハロとは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードである。アルキル、アルカノイル等は、直線状および枝分かれした基の両方を示す。しかし、個々のラジカルに関しては、「プロピル」などは直鎖状ラジカルのみを含み、枝分かれした鎖の異性体には「イソプロピル」などが特別に当てはめられる。Ｃ１からＣ４のアルキルとは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびｓｅｃ−ブチル基を含む。Ｃ１からＣ４のアルコキシとは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシおよびｓｅｃ−ブトキシを含む。また、Ｃ１からＣ４のアルカノイルとは、アセチル、プロパノイルおよびブタノイルを含む。
【００２２】
化合物の、ある特定のグループは、Ｒ１からＲ５は、それぞれ独立に、水素、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロゲンである式Ｉの化合物である。
【００２３】
化合物の、別の特定のグループは、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、ハロもしくはＣ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである式Ｉの化合物またはその塩である。
【００２４】
本発明の方法において有用なＪＡＫ−３インヒビターもまた、米国特許出願シリアルナンバー０９／０８７，４７９（Ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒと題され、１９９８年５月２８日に出願されている）に記述される通り、式Ｉの化合物を含む。
【００２５】
好ましいＪＡＫ−３インヒビターは、４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンおよび４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシルフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンまたは薬学的に容認できるそれらの塩を含む。
【００２６】
ＪＡＫ−３を阻害する化合物（「前記化合物（たち）」）は、薬学的合成により組織立て、また、人間の患者のような哺乳類である宿主に、選択された投与の経路に採用される多様な形態、すなわち、経口的にまたは非経口的に、経静脈、筋肉内、局所または皮下の経路により投与することが可能である。
【００２７】
そのように、前記物質は、全身に投与して良い。例えば、経口的に、不活性な希釈剤または消化できる可食性の担体のような薬学的に容認できるベヒクルと共にである。それらは、硬いまたは柔らかい殻状のゼラチンカプセルに封入して良く、錠剤に圧縮しても良く、または、患者の食事における食物に直接に組み入れても良い。治療上の経口投与のために、前記物質は、一またはそれ以上の添加剤と結合させて、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ、カプセル、エリキシール、縣濁液、シロップ、ウェファースその他の形態で用いても良い。そのような調合物および調製物は、前記物質を少なくとも０．１％含むべきである。前記調合物および調製物のパーセンテージは、もちろん変えて良いし、便利には、与えられた投薬剤のユニットにおける重量の約２から６０％の間が良い。治療上有用な調合物における物質の量がそのようであると、効果的な用量レベルが得られるであろう。
【００２８】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルその他は、また、以下の物を含んでいても良い。すなわち、トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのような結合剤、リン酸ジカルシウムのような添加剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等のような崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、ステアリン酸マグネシウムのような滑剤、およびスクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームのような甘味剤またはペパーミント、ウィンターグリーンの油もしくはチェリーフレーバーのような着香剤を添加して良い。前記投薬剤のユニットがカプセルである場合は、それは、上記タイプの材料に加えて、ベジタブルオイルまたはポリエチレングリコールのような液体の担体を含んでいても良い。多様なその他の材料が、コーティングとして、また、他に、前記固形の投薬剤のユニットの物理的形態を修正するために存在して良い。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖等でコートして良い。シロップまたはエリクシールは、甘味剤としてのスクロースまたはフルクトース、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジフレーバーのような色素および香料といった活性化合物を含んでいて良い。もちろん、どの投薬剤のユニットを調製するのに使用するどの材料も、薬学的に容認することができ、費やされる用量で本質的に無毒であるべきである。さらに、前記物質は、持効性薬剤および手段（ｄｅｖｉｃｅｓ）に組み入れて良い。
【００２９】
前記物質は、また、静脈内にまたは腹腔内に、点滴（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）または注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により投与しても良い。前記物質の溶液は、水から、任意に無毒の界面活性剤と混合して調製することが可能である。分散液は、また、グリセロール、液体のポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物ならびにオイルから調製することが可能である。通常の保存および使用の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存料を含む。
【００３０】
注射または点滴に適した薬学的な剤形は、前記物質を含む無菌の水溶液または分散液または無菌の粉末を含むことが可能である。それは、無菌の、注射可能な（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）もしくは点滴可能な（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ）溶液または分散液の即席の調製に適合しており、任意にリポソーム中に封入されている。すべてのケースにおいて、最適の剤形は、無菌で、流動性で、および製造と保存の条件下で安定でなければならない。前記液体の担体またはベヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体のポリエチレングリコール、その他）、ベジタブルオイル、無毒のグリセロールエステル、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液体の分散媒であることが可能である。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散液のケースでは必要とされる粒子サイズを保持することにより、または界面活性剤の使用により保つことが可能である。微生物の活動の防止は、多様な抗バクテリアのおよび抗菌の薬品、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビンさん、チメロサール等によって引き起こすことが可能である。多くのケースでは、例えば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウムといった等張の薬品を含むことが好ましい。注射可能な化合物の延長された吸収は、吸収を遅らせる薬品の調合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって引き起こすことが可能である。
【００３１】
無菌の注射可能な溶液は、前記物質を、必要とされる量、上に列挙した多様な他の処方成分を含む適切な溶媒に組み入れることによって調製される。必要に応じ、続いてろ過による滅菌が行われる。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末のケースでは、好ましい調製の方法は、減圧乾燥および凍結乾燥の技法である。それは、無菌ろ過する前の溶液中に存在する、活性な処方成分に加えて任意の他の望ましい処方成分の粉末を産出する。
【００３２】
局所的な投与のために、前記物質は、前記物質は純粋な形態で適用しても良い。すなわち、それが液体のときである。しかしながら、一般的には、それを皮膚に、調合物または製剤として、皮膚科学的に容認可能な担体と共に投与することが望ましい。それは固体であってもまたは液体であっても良い。
【００３３】
有用な固体の担体は、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等のような細かく分割された固体を含む。有用な液体の担体は、水、アルコールまたはグリコールまたは水−アルコール／グリコール混合物を含み、その中で、前記物質は、任意に無毒の界面活性剤の助けを借りて、効果的なレベルで溶解するかまたは分散することが可能である。フレグランスおよび追加の抗菌性薬品のような補助剤は、特性を、与えられた使用方法のために最適化する目的で、加えることが可能である。結果として生じる液体の調合物は、含浸包帯および他の包帯剤に吸収性のパッドを用いてそこから、または冒された領域にポンプ型もしくはエアロゾルスプレーを用いて噴霧して適用することが可能である。
【００３４】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸の塩およびエステル、脂肪族アルコール、修飾されたセルロースまたは修飾された無機材料のような増粘剤も、また、使用者の皮膚に直接適用するために、塗布可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸剤等を形成する目的で、液体の担体と共に用いることが可能である。
【００３５】
前記物質を皮膚に届けるために使用可能な有用な皮膚科学的調合物の例は、技術的に公知である。例えば、Ｊａｑｃｕｅｔら（米国特許４，６０８，３９２号公報）、Ｇｅｒｉａら（米国特許４，９９２，４７８号公報）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許４，５５９，１５７号公報）、Ｗｏｒｔｚｍａｎ（米国特許４，８２０，５０８号公報）。
【００３６】
前記式Ｉの化合物の有用な用量は、そのインビトロ活性と、動物モデルにおけるインビボ活性を比較することにより決定することが可能である。マウスおよび他の動物における効果的用量のヒトへの外挿法のための方法は、技術的に公知である。例えば、米国特許４，９３８，９４９号公報参照。
【００３７】
一般的には、前記物質の、ローションのような液体の調合物中における濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％である。ゲルまたは粉末のような半固体または固体の調合物中における濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％である。
【００３８】
治療薬における使用のために必要とされる前記物質の量は、選択された特定の塩によってのみでなく、投与の経路、処置されるべき状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によって変化し、また、究極的には、付き添いの医師または臨床家の自由裁量による。
【００３９】
一般的には、しかしながら、好適な用量は、約０．５から約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、一日当たり約１０から約７５ｍｇ／ｋｇ体重であり、一日当たり受容者の体重１ｋｇについて３から約５０ｍｇのようにであり、好ましくは６から９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、最適には１５から６０ｍｇ／ｋｇ ／日の範囲である。
【００４０】
前記物質は、投薬剤ユニットとして便利に投与され、例えば、５から１０００ｍｇ、便利には１０から７５０ｍｇ、最も便利には５０から５００ｍｇの活性処方成分を１の投薬剤ユニット当たり含む。
【００４１】
理想的には、前記物質は、約０．５から約７５μＭ、好ましくは約１から５０μＭ、最適には約２から約３０μＭの最高血漿中濃度を達成するように投与されるべきである。これは、例えば、前記物質の０．０５から５％溶液を、任意に食塩水によって静脈内注射することにより、または、前記物質を約１〜１００ｍｇ含むボラスとして経口投与することによって達成されるであろう。望ましい血中濃度は、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時を提供する継続的な点滴によって、または前記物質を約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇ含む間欠的な点滴によって維持されるであろう。
【００４２】
前記物質は、便利には、一回量で、または適切な間隔で、例えば一日当たり２回、３回、４回またはより多くの副用量で投与される分割量で提示することができる。前記副用量それ自体は、さらに分割しても良い。例えば、注入器からの複数回の吸入または眼内への複数滴の適用のような、多数の、分離した、緩く間隔の開いた投与として。
【００４３】
ここで、本発明を、以下の限定しない実施例により明らかにする。
【実施例】
【００４４】
実施例１．ＪＡＫ−３インヒビターの化学合成およびキャラクタリゼーション
融点は未補正値である。１ＨＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００スペクトロメータを用いて、ＤＭＳＯ−ｄ６またはＣＤＣｌ３で記録した。化学シフトは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準０ｐｐｍとして、百万分率（ｐｐｍ）で報告した。結合定数（Ｊ）は、ヘルツで与えられており、また、略号ｓ、ｄ、ｔ、ｑおよびｍは、それぞれ、シングレット、ダブレット、トリプレット、カルテットおよびマルチプレットをさす。赤外スペクトルは、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＰＲＯＴＥＧＥ  ４６０−ＩＲスペクトロメータにより記録された。マススペクトルは、ＨＰ５９７３質量選択検出器を有するＦＩＮＮＮＩＧＡＮＮ  ＭＡＴ  ９５、ＶＧ  ７０７０Ｅ−ＨＦ  Ｇ．Ｃ．システムにより記録された。ＵＶスペクトルは、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＤＵ  ７４００により、メタノールを溶媒として用いて記録された。ＴＬＣは、プレコートされたシリカゲルプレート（Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ＫＧＦ；Ｗｈｉｔｍａｎ  Ｉｎｃ）により行われた。すべてのカラムクロマトグラフィー分離には、シリカゲル（２００〜４００メッシュ、Ｗｈｉｔｍａｎ  Ｉｎｃ．）を用いた。すべての化学薬品は、試薬等級であり、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００４５】
化合物（１）および（２）を調製するのに使用された、共通の合成前駆体４−クロロ−６，７−ジメトキシキナゾリン（７）は、スキーム１に図示した、文献記載の方法によって調製した。
【００４６】
【化６】
2004504259.tif 000004
Ｆ． Ｎｏｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．  Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．  １９９０， ３８， １５９１−１５９５に従い、４，５−ジメトキシ−２−ニトロ安息香酸（３）を塩化チオニルで処理し、続いてアンモニアと反応させて、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンズアミド（４）を得た。化合物（４）のニトロ基を、硫酸銅の存在下、水素化ホウ素ナトリウムにより還元して（Ｃ．Ｌ． Ｔｈｏｍａｓ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｖｅｎ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７０）を参照）、４，５−ジメトキシ−２−アミノベンズアミド（５）を得て、それを、ギ酸と共に還流して環化させ、６，７−ジメトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（６）を得た。化合物（６）を、オキシ三塩化リンと共に還流して、共通の合成前駆体（７）を与えた。
【００４７】
化合物１および２（図４）は、共通の合成前駆体（７）および必要なアニリンから、以下により調製した。
【００４８】
４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（１）。
４４８ｍｇ（２ｍｍｏｌ）の４−クロロ−６，７−ジメトキシキナゾリン（７）と２．５ｍｍｏｌの４−ヒドロキシアニリンのアルコール（エタノールまたはメタノール）中における混合物を、８時間還流した。冷却した後、前記溶液にトリエチルアミンを加えて塩基性にし、そして、溶媒は材料を得るまで濃縮し、その材料をＤＭＦから再結晶して化合物（１）を８４．２９％の収率で得た。
融点  ２４５．０−２４８．０  ℃；１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  １１．２１（ｓ，  １Ｈ，  −ＮＨ），  ９．７０（ｓ，  １Ｈ，  −ＯＨ），  ８．７４（ｓ，  １Ｈ，  ２−Ｈ），  ８．２２（ｓ，  １Ｈ，  ５−Ｈ），  ７．４０（ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝８．９  Ｈｚ，  ２’，６’  −Ｈ），
７．２９（ｓ，  １Ｈ，  ８−Ｈ），  ６．８５（ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝８．９  Ｈｚ，  ３’，５’−Ｈ），  ３．９８（ｓ，  ３Ｈ，  −ＯＣＨ３），  ３．９７（ｓ，  ３Ｈ，  −ＯＣＨ３）．  ＵＶ（ＭｅＯＨ）  λｍａｘ（ｅ）：  ２０３．０，  ２２２．０，  ２５１．０，  ３２０．０  ｎｍ．  ＩＲ（ＫＢｒ）ｕｍａｘ：  ３４２８，  ２８３６，  １６３５，  １５１６，  １４４３，  １２３４  ｃｍ−１．  ＧＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２９８（Ｍ＋＋１，  １００．００），  ２９７（Ｍ＋，  ２６．５６），  ２９６（Ｍ＋−１，  １２．４６）．
【００４９】
４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（２）。
４４８ｍｇ（２ｍｍｏｌ）の４−クロロ−６，７−ジメトキシキナゾリン（７）と２．５ｍｍｏｌの３−ブロモ−４−ヒドロキシアニリンのアルコール（エタノールまたはメタノール）中における混合物を、８時間還流した。冷却した後、前記溶液にトリエチルアミンを加えて塩基性にし、そして、溶媒は材料を得るまで濃縮し、その材料をＤＭＦから再結晶して化合物（１）を８４．２９％の収率で得た。
融点  ２３３．０−２３３．５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  １０．０８（ｓ，  １Ｈ，  −ＮＨ），  ９．３８（ｓ，  １Ｈ，  −ＯＨ），  ８．４０（ｓ，  １Ｈ，  ２−Ｈ  ），  ７．８９（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ２’，５’＝　２．７　Ｈｚ，　２’−Ｈ），　７．７５（ｓ，　１Ｈ，　５−Ｈ），　７．５５（ｄｄ，　１Ｈ，　Ｊ５’，６’＝　９．０　Ｈｚ，　Ｊ２’，６’＝　２．７　Ｈｚ，　，　６’−Ｈ），　７．１４（ｓ，　１Ｈ，　８−Ｈ），　６．９７（ｄ，　１Ｈ，　Ｊ５’，６’＝　９．０　Ｈｚ，　５’−Ｈ），　３．９２（ｓ，　３Ｈ，　−ＯＣＨＥＲ），  ３．９０（ｓ，  ３Ｈ，  −ＯＣＨ３）．  ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ｅ）：  ２０３．０，  ２２２．０，  ２５０．０，  ３３５．０  ｎｍ．  ＩＲ（ＫＢｒ）ｕｍａｘ：  ３４３１（ｂｒ），  ２８４１，  １６２４，  １４９８，  １４２３，  １２４４  ｃｍ−１．  ＧＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７８（Ｍ＋＋２，  ９０．６８），  ３７７（Ｍ＋ ＋１　，３７．４９），　３７６（Ｍ＋，１００．００），  ３６０（Ｍ＋３．６３），  ２９８（１８．８６），  ２８２  （６．６５）．
【００５０】
実施例２、生物学的スクリーニング
材料および方法
（細胞ライン）
ＤＴ−４０ニワトリリンパ腫細胞の、ＢＴＫ欠乏、ＳＹＫ欠乏およびＬＹＮ欠乏クローンならびに再構成ＳＹＫ−欠乏細胞ラインの立証およびキャラクタリゼーションは、以前に報告されていた。培地は、１％ニワトリ血清（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州セントルイス）、５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補足されたＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ；メリーランド州ギャザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））であった。以下を参照。Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ． Ｇ．， Ｍａｈａｊａｎ， Ｓ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｔａｋａｔａ， Ｍ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７３： １０９６−１００， １９９６； Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９： ３０９−１８， １９９７； Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓ． Ａ．， Ｐａｏ， Ｌ．， Ｓａｄａ， Ｋ．， Ｙａｍａｍｕｒａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｃａｍｂｉｅｒ， Ｊ． Ｃ．  Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２： １８１５−１８２３， １９９５； ａｎｄ Ｄｉｂｉｒｄｉｋ Ｉ．， Ｋｒｉｓｔｕｐａｉｔｉｓ Ｄ．， Ｋｕｒｏｓａｋｉ Ｔ．， Ｔｕｅｌ−Ａｈｌｇｒｅｎ Ｌ．， Ｃｈｕ Ａ．， Ｐｏｎｄ Ｄ．， Ｔｕｏｎｇ Ｄ．， Ｌｕｂｅｎ Ｒ．， Ｕｃｋｕｎ Ｆ．Ｍ．  Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（７）， ｐｐ：４０３５−４０３９． １９９８．
【００５１】
（ＰＴＫインヒビターの使用）
細胞（２×１０６／ｍｌ）は、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化に対するこれらの薬品の効果を推し量る目的で、放射前に、（１）または（２）により、３７℃で２４時間処理された。
（１）ＰＴＫインヒビター  イソフラボン  ゲニステイン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラ  ジョーラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ））１１１ｍＭ（３０ｍｇ／ｍｌ）濃度
（２）ヤヌス  ファミリー  キナーゼ、３（ＪＡＫ−３）特異性ＰＴＫインヒビター４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、Ｃ１６Ｈ１４Ｂｒ（Ｎ３Ｏ３）（ミネソタ州ロッシュビル、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．のＸｉｎｇ−Ｐｉｎｇ−Ｌｉｕ博士よりご提供いただいた）、２７０ｍＭ（１００ｍｇ／ｍｌ）
【００５２】
（細胞への放射）
プラスチック製組織培養フラスコ中の細胞（２×１０６個／ｍｌ）は、対数増殖期の間中、好気性条件で、１３７Ｃｓ放射機器（Ｊ． Ｌ． Ｓｈｅｐｈａｒｄ， カリフォルニア州グレンデール（Ｇｌｅｎｄａｌｅ））を用いて、以下の文献に述べられているように、４Ｇｙ／ｍｉｎ用量の割合で、１０〜２０Ｇｙ放射した。Ｔｕｅｌ Ａｈｌｇｒｅｎ， Ｌ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ． Ｇ．， Ｊｉｎ， Ｊ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ． ”Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ−ａｒｒｅｓｔ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｂ−ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ａｔ ｔｈｅ Ｇ２−Ｍ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ，”  Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． ２０： ４１７−２６， １９９６； ａｎｄ Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．， Ｊａｓｚｃｚ． Ｗ．， Ｃｈａｎｄａｎ Ｌａｎｇｌｉｅ， Ｍ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ． Ｇ．， Ｇａｊｌ Ｐｅｃｚａｌｓｋａ， Ｋ． ａｎｄ Ｓｏｎｇ， Ｃ． Ｗ． ”Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｂ−ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｎｋｅｍｉａ，”  Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓ． ９１：１０４４−１０５１， １９９３．いくつかの実験では、細胞は、放射前に、ＰＴＫインヒビターで２４時間プレインキュベートした。
【００５３】
（ｃ−ｊｕｎプローブ）
Ａ５０６塩基対（ｂｐ）ｃ−ｊｕｎプローブは、ニワトリゲノムＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得た。プライマー配列は、ニワトリｃ−ｊｕｎの配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセスコード  ＣＨＫＪＵＮ）に基づき決定した。増幅には、５’−ＡＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および５’−ＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＣＡＧＣＴＴＴＡＣＧＣＧ−３’ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の２つのプライマーを用いた。増幅は、Ｔａｑポリメラーゼおよびプルーフリーディングポリメラーゼ（ｅＬＯＮＧａｓｅ：Ｔａｑポリメラーゼに加えＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種のＧＢ−Ｄポリメラーゼ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）の混合物により、Ｅｒｉｃｏｍｐ  Ｄｅｌｔａ  ＩＩ  サイクラーというサーモサイクラーで、ホットスタートを用いて行われた。ＰＣＲ生成物は、続いてクローニングベクターＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）にクローニングした。適切なサイズ（５０６塩基対）の挿入は、ＰＲＩＳＭ染色ターミネーターサイクル配列（登録商標ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ）を用いた配列解析により、ニワトリｃ−ｊｕｎと同定し、そして、ＡＬＦエクスプレスシーケンサーという自動シーケンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ニュージャージー州ピスケータウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））で解析した。５３８塩基対のニワトリグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プローブは、５’−ＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）および５’−ＧＴＧＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のプライマーを持つニワトリＲＮＡからの逆転写および続いてのＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）により生成させた。４１３塩基対のニワトリＢ−アクチンプローブは、５’−ＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）および５’−ＴＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＴＴＡＴＧＧＧＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のプライマーを持つニワトリＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ増幅により生成させた。前記増幅させたｃＤＮＡは、ＰＣＲ２．１にクローニングした。
【００５４】
（ＲＮＡ単離およびノーザンブロットハイブリダイゼーション解析）
全ＲＮＡは、ほぼ２．５×１０７個の細胞から、トリアゾール試薬で抽出した。トリアゾール試薬は、フェノールおよびグアニジンイソチオシアン酸塩の一相性溶液であり、Ｃｈｏｍｃｚｎｓｋｉ，Ｐ． ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ． ”Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，” Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５６−１５９， １９８７により述べられている。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、１〜３×１０８個の細胞から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆａｓｔ  Ｔｒａｋ  ２．０  ｍＲＮＡ単離キットを用いて、直接単離した。簡単に言うと、細胞を、専売のプロテアーゼ混合物を含むドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶解緩衝液で溶解させた。その溶解物は、吸収および続いてのポリ（Ａ）＋ＲＮＡの溶出のため、オリゴｄＴで直接インキュベートした。
２マイクログラムのポリ（Ａ）＋または２０マイクログラムの全ＲＮＡは、１％アガロース−ホルムアミド変性ゲル上にローディングする前に、ホルムアルデヒド／ホルムアミドローディング色素により、６５度で変性させた。転写サイズは、０．５〜９ｋｂのＲＮＡマーカーと比較して決定した。前記ゲルは、ローディングおよびＲＮＡの完全性をチェックするために、転移に先立ち、Ｈ２Ｏ中ラジアント赤（Ｒａｄｉａｎｔ  Ｒｅｄ）で染色した。前記ＲＮＡは、続いて、２０Ｘ標準クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）転移緩衝液（１ＸＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムに等しい）で、下方毛管転移により、正に帯電したナイロン膜に転移させた。前記ｃ−ｊｕｎ断片は、［（−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍＭ）［Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）］（４０）で、ランダムプリンティングにより同位体ラベルした。ノーザンブロットは、プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミドと、専売のブロッキングおよびバックグラウンド減少試薬、Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）により、４２℃で１６〜２４時間、終夜ハイブリダイゼーションした。そして、非結合プローブは、念の為に、０．１％ＳＤＳ、０．１ＸＳＳＣ（６５℃）で洗浄して除去した。前記ブロットは、オートラジオグラフィにより、およびＢｉｏＲａｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いての双方で、定量的追跡のために解析した。前記ブロットは、続いて、熱した０．１％ＳＤＳ中で切断し、そしてつぎに、ニワトリＧＡＰＤＨおよび／またはニワトリ（β−アクチンプローブで、ローディングの相違点を標準化するために再ハイブリダイゼーションした。
【００５５】
結果および論議
（ＤＴ−４０ニワトリリンパ腫Ｂ細胞の、ｃ−ｊｕｎ前癌遺伝子を活性化するイオン化放射線への被爆）
ヒトリンパ腫Ｂ細胞の、１０〜２０Ｇｙ線への被爆は、１〜２時間で、増大されたｃ−ｊｕｎ発現を最大応答で引き起こした（Ｃｈａｅ， Ｈ． Ｐ．， Ｊａｒｖｉｓ， Ｌ． Ｊ．， ａｎ ｄ Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．  Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．  ５３： ４４７−５１， １９９３）。イオン化放射線が、ＤＴ０−４０ニワトリリンパ腫Ｂ細胞についても、ヒトリンパ腫Ｂ細胞と同様に生化学的および生物学的シグナルの引き金となることも、またすでに報告されている（Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ．Ｇ．， Ｍａｈａｊａｎ， Ｓ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｔａｋａｔａ， ａｍ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７３： １０９６−１００， １９９６）。ＤＴ−４０ニワトリリンパ腫Ｂ細胞が、イオン化放射線に対すると同様のｃ−ｊｕｎ応答を示すかどうか確認するために、ＤＴ−４０細胞を、５、１０、１５または２０Ｇｙで放射し、そして、１．８ｋｂニワトリｃ−ｊｕｎ転写の発現レベルの放射線被爆を定量的ノーザンブロット解析により行ってから２〜４時間後に、細胞から収穫された全ＲＮＡを試験した。図１Ａに示す通り、放射線被爆は、２０Ｇｙ後４時間で、ｃ−ｊｕｎ転写のレベルを用量および時間依存の程度で増大させ、ＧＡＰＤＨ転写レベルは最大刺激指数（ＳＩ）［非放射対放射細胞のｃ−ｊｕｎ／ＧＡＰＤＨ比の比較により決定した］３．１で顕著な影響を与えることはなかった。追加した７回の独立の実験では、２０Ｇｙのイオン化放射線において放射線被爆後２時間での刺激指数は、２．４から３．８の範囲であった（平均（標準偏差＝２．９±０．４）。
【００５６】
ＰＴＫインヒビターは、ヒトリンパ腫Ｂ細胞の、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化を予防することを示したので、ニワトリリンパ腫Ｂ細胞の、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ発現の活性化におけるＰＴＫの役割を、つぎに試験した。図１Ｂに示す通り、イオン化放射線は、ＰＴＫ阻害性イソフラボン、ゲニステイン（刺激指数＝１．１）で処理されたＤＴ−４０細胞のｃ−ｊｕｎ発現レベルを顕著に増大させることはなかった。これは、ＰＴＫの活性化は、ニワトリリンパ腫Ｂ細胞における、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ発現においても同様に必要とされることを示している。これらの発見は、ＤＴ−４０ニワトリリンパ腫Ｂ細胞を、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化の分子メカニズムをさらに明らかにするための好適なモデルとして確立した。
【００５７】
（細胞質のタンパク質チロシンキナーゼＢＴＫ、ＬＹＮ、およびＳＹＫは、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化において必要とされない）
ＢＴＫは、リンパ腫Ｂ細胞において豊富に発現し、また、その活性は、放射により引き起こされるＤＴ−４０細胞のアポプトーシスにおいて必要であることが示されている（Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ． Ｇ．， Ｍａｈａｊａｎ， Ｓ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｔａｋａｔａ， Ｍ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７３：１０９６−１００， １９９６）。ＤＴ−４０細胞は、ＢＴＫを目標とした遺伝子破壊が放射線への被爆後のアポプトーシスを受けないことにより、ＢＴＫ欠乏を引き起こされた。したがって、我々は、ＢＴＫ欠乏（ＢＴＫ−）と野生型のＤＴ−４０細胞のｃ−ｊｕｎ誘発のレベルを比較することにより、ＢＴＫが、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化においてもまた、その原因のＰＴＫであり得るのかどうかを決定することに着手した。我々の予想とは反対に、三回独立に行われたどの実験においても、２０Ｇｙのイオン化放射線は、ＢＴＫ欠乏ＤＴ−４０細胞においてｃ−ｊｕｎ発現を誘発するのに失敗しなかった。その刺激指数は、１．６から３．９の範囲であった（平均±標準偏差＝２．４±０．５）（図２）。そのように、イオン化放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ転写レベルの増加は、ＢＴＫの存在に依存しない。  ＳＹＫもまたＤＴ−４０細胞内で顕著に発現し、イオン化放射後に急速に活性化された。我々は、つぎに、ＳＹＫが、放射線によって引き起こされるｃ−ｊｕｎ転写レベルの増加において、その原因のＰＴＫであり得るのかどうかについて実験した。図３Ａに示す通り、２０Ｇｙのイオン化放射線は、選択的な遺伝子破壊によりＳＹＫ欠乏を引き起こされたＳＹＫ−ＤＴ−４０細胞中のｃ−ｊｕｎ発現を増大させた。５回の独立な実験により観測されたその刺激指数が、野生型細胞のそれよりも低かった（１．９±０．２、対２．９±０．４、ｐ＜０．０１）にもかかわらず、である。そのように、ＳＹＫは、ＤＴ−４０細胞中の、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化には必要とされないが、しかし、最適なシグナルの生成には参加すると思われる。
【００５８】
ＤＴ−４０細胞は、高いレベルのＬＹＮを発現するが、ＢＬＫ、ＨＣＫ、ＳＲＣ、ＦＹＮまたはＹＥＳを含むＳｒｃ  ＰＴＫ  ファミリーの他のメンバーは、探知できるレベルでは発現しない。以下を参照。Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ． Ｇ．， Ｍａｈａｊａｎ， Ｓ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｔａｋａｔａ， Ｍ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７３： １０９６−１００， １９９６； Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓ． Ａ．， Ｐａｏ， Ｌ．， Ｓａｄａ， Ｋ．， Ｙａｍａｍｕｒａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｃａｍｂｉｅｒ， Ｊ． Ｃ． ”Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｙｋ ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ａｎｄ ＳＨ２ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”  Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２： １８１５−１８２３， １９９５； ａｎｄ Ｔａｋａｔａ， Ｍ．， Ｈｏｍｍａ， Ｙ．， ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ． ”Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ−γ２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｆａｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．，”  Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８２： ９０７−９１４， １９９５．ＳＲＣファミリーＰＴＫは、紫外線刺激によるｃ−ｊｕｎ発現の増加に必須であることがすでに以前から示されているが、我々は、有力なＳＲＣファミリーメンバーＬＹＮが放射により引き起こされるＤＴ−４０細胞中のｃ−ｊｕｎ発現を媒介するであろうと仮定した。この仮説を検証するために、我々は、イオン化放射線が、選択的な遺伝子破壊によりＬＹＮ欠乏を引き起こされたＤＴ−４０細胞中のｃ−ｊｕｎ発現を活性化する能力を試験した。ＬＹＮ欠乏（ＬＹＮ−）細胞は、その刺激指数が野生型ＤＴ−４０細胞のそれよりも低かった（図３Ｂ）にも関わらず、放射の後、増大したｃ−ｊｕｎ発現を示した。ＬＹＮおよびＳＹＫは、Ｂ細胞の他のシグナルの生成に協力することがすでに示されているが（Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”  Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９： ３０９−１８， １９９７を参照）、イオン化放射線が、ＬＹＮ−欠乏ＤＴ−４０細胞におけるｓｙｋ遺伝子を目標とした破壊により生成したＬＹＮ−ＳＹＫ−ＤＴ−４０細胞中でｃ−ｊｕｎ発現を引き起こす能力について試験した。図３Ｂに示す通り、ＬＹＮ−ＳＹＫ−ＤＴ−４０細胞は、放射後に高いｃ−ｊｕｎ転写レベルを示した。これは、ｃ−ｊｕｎ応答が、それらＰＴＫのどちらにも、それらが単独または協力しているかのどちらであっても、依存しないことを示している。ＳＹＫと同様に、ＬＹＮは、放射により引き起こされるＤＴ−４０細胞中のｃ−ｊｕｎ活性化には必要とされないが、最適な応答の生成には参加すると思われる。
【００５９】
面白いことに、４回の独立な実験において、我々は、ＳＹＫ−ＤＴ−４０細胞において、野生型ＤＴ−４０細胞よりもさらに高いｃ−ｊｕｎのベースライン発現レベルを観測した（範囲：１．４〜２．３倍、平均±標準偏差＝１．６±０．２倍）。このことは、Ｓｙｋがｃ−ｊｕｎのベースラインレベルの調節に関係しているであろう事を示している。この可能性をさらに拡大するために、我々は、ＳＹＫ−細胞中のｃ−ｊｕｎレベルを、野生型またはキナーゼドメイン変異（Ｋ−）ｓｙｋ遺伝子から再構成したＳＹＫ−細胞のそれと比較した。我々は、野生型ｓｙｋからの再構成は、ＳＹＫ−細胞中のより高いｃ−ｊｕｎのベースライン発現レベルを低下させた事を観測した。ところが、Ｋ−ｓｙｋからの再構成は、ｃ−ｊｕｎレベルを低下させる事に失敗した（データ示さず）。これらの結果は、ＳＹＫをｃ−ｊｕｎ発現の負のレギュレータとして関係させる。この、ＳＹＫの新規な機能は、そのキナーゼドメインに依存しているように見える。
【００６０】
（ＪＡＫ−３インヒビターの、放射により引き起こされるＤＴ−４０細胞中のｃ−ｊｕｎ活性化における効果）
Ｂ細胞形質導入イベントは、酸化的ストレスの間中、細胞の生存に関係する基本決定を支配する。Ｂ細胞シグナリング経路間の力学的相互作用のより良い解釈は、細胞内酸化変化の間中、いかにして生体の決定が書き取られるのかを決定するために必要である。ＳＴＡＴタンパク質（シグナルトランスデューサーかつ転写の活性剤である）は、インターフェロン（ＩＦＮ）ａまたはｇ刺激遺伝子転写標的の検索の間に確認されたＤＮＡ結合タンパク質のファミリーである。現在、７のＳＴＡＴファミリーメンバーがある。細胞質のタンパク質キナーゼにおけるＪＡＫファミリーは、当初は、ＩＦＮシグナリングにおいても機能すると説明され、そして、現在は、レセプターにより活性化されたシグナルカスケードの幅広い範囲に参加する事が知られている。種々のリガンドおよび細胞活性化剤は、特定のＪＡＫおよびＳＴＡＴファミリーメンバーを用いる。ＳＴＡＴ活性化の基本的なモデルは、刺激されていない細胞では、ＳＴＡＴの潜在性形態は、主として細胞質内に局在化している事を提示する。リガンドへの結合は、ＳＴＡＴタンパク質が細胞内の膜間レセプターにおけるホスホチロシン残基と結合する事を引き起こす。ＳＴＡＴがひとたびレセプターに結合すると、レセプターに結合したＪＡＫキナーゼが、前記ＳＴＡＴタンパク質をリン酸化する。ＳＴＡＴタンパク質は、つぎに、特定の相互交換のＳＨ２ホスホチロシン相互作用を通じて二量化し、そして、他のＤＮＡ結合タンパク質と複合体を形成することができる。ＳＴＡＴ複合体は、核に移動し、ＤＮＡ応答要素と相互作用し、標的遺伝子の転写を増大させる。アポプトーシス的応答を調節するシグナリングイベントは、ＳＴＡＴタンパク質を利用することが示された。特に、最近の研究は、順にＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−３およびＳＴＡＴ−６のチロシンリン酸化および活性化へと続く、活性酸素中間体に被爆した細胞内のチロシンリン酸化によるＪＡＫ活性化を示した。
ＬＹＮ、ＢＴＫおよびＳＹＫキナーゼが放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化に必要でないことを証明した後、我々は、ｃ−ｊｕｎ活性化がＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路と機能的に結合しているかどうかを決定することに着手した。その結果、我々は、放射されたＤＴ−４０細胞のｃ−ｊｕｎ発現レベルにおける、ＪＡＫ−３阻害性の新規なキナゾリン誘導体の効果を検証した。強力なＪＡＫ−３特異性インヒビターを確立するために、２種類の新規なキナゾリン誘導体の、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２およびＪＡＫ−３の酵素活性に対する効果を、これらのキナーゼのバキュロウィルス発現ベクターに感染したＳｆ２１細胞を用いて、標準的方法を用いて試験した（図４）。感染した細胞は収穫し、ＪＡＫは適切な抗体（抗ＪＡＫ−１：（ＨＲ−７８５）、ｃａｔ＃ｓｃ−２７７、ウサギポリクローナルＩｇＧアフィニティー精製、０．１ｍｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；抗ＪＡＫ−２：（Ｃ−２０）−Ｇ、ｃａｔ＃ｓｃ−２９４−Ｇ、ヤギポリクローナルＩｇＧアフィニティー精製、０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；抗ＪＡＫ−３：（Ｃ−２１）、ｃａｔ＃ｓｃ−５１３、ウサギポリクローナルＩｇＧアフィニティー精製、０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に免疫沈澱させ、キナーゼアッセイは、以下の文献に述べられているように、免疫沈澱したＪａｋを、前記キナゾリン化合物に１時間被爆した後で行われた。Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．， Ｗａｄｄｉｃｋ； Ｋ． Ｇ．， Ｍａｈａｊａｎ． Ｓ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｔａｋａｔａ， Ｍ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｋｕｒｏｓａｋｉ， Ｔ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７３： １０９６−１００， １９９６； Ｕｃｋｕｎ Ｆ．Ｍ， Ｅｖａｎｓ Ｗ． Ｅ， Ｆｏｒｓｙｔｈ Ｃ． Ｊ， Ｗａｄｄｉｃｋ Ｋ． Ｇ， Ｔ−Ａｈｌｇｒｅｎ Ｌ．， Ｃｈｅｌｓｔｒｏｍ Ｌ．Ｍ， Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ Ａ．， Ｂｏｌｅｎ Ｊ．， Ｍｙｅｒｓ Ｄ． Ｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：８８６−８９１， １９９５； ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ Ｄ． Ｅ．， Ｊｕｎ Ｘ．， Ｗａｄｄｉｃｋ Ｋ． Ｇ．， Ｆｏｒｓｙｔｂ Ｃ．， Ｃｈｅｌｓｔｒｏｍ Ｌ．Ｍ．， Ｇｕｎｔｈｅｒ Ｒ． Ｌ．， Ｔｕｍｅｒ Ｎ． Ｅ， Ｂｏｌｅｎ Ｊ．， Ｕｃｋｕｎ Ｆ． Ｍ．  Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２： ９５７５−９５７９， １９９５； ａｎｄ Ｔｕｅｌ Ａｈｌｇｒｅｎ． Ｌ．， Ｊｕｎ， Ｘ．， Ｗａｄｄｉｃｋ， Ｋ． Ｇ．， Ｊｉｎ． Ｊ．， Ｂｏｌｅｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｕｃｋｕｎ， Ｆ． Ｍ．  Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． ２０： ４１７−２６， １９９６
【００６１】
図４Ｂに示す通り、双方の化合物ともＪＡＫ−３を阻害したが（図Ｂ．３およびＢ．４）、ＪＡＫ−１（図Ｂ．１）またはＪＡＫ−２（図Ｂ．２）は阻害しなかった（図４Ｄ）。双方の化合物の、サイトカインにより引き起こされるＳＴＡＴ活性化に対する効果を試験するために、電気泳動速度シフトアッセイ（ＥＭＳＡｓ）が行われた。特に、３２Ｄｃ１ｌ／ＩＬ２Ｒβ細胞（Ｊａｍｅｓ  Ｉｈｌｅ、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌよりの寄贈）は、ＦＢＳから補給されたＲＰＭＩ中８×１０６個／ｍｌで、ＪＡＫ−３インヒビターに最終濃度１％ＤＭＳＯ中１０μｇ／ｍｌで）１時間被爆し、続いて、示したように、ＩＬ２またはＩＬ３で刺激した。細胞は１５分後に収集し、溶解緩衝液（１００ｍＭのトリス塩酸塩  ｐＨ８．０、０．５％のＮＰ−４０、１０％のグリセロール、１００ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＮａＶＯ３、５０ｍＭのＮａＦ、１５０ｍＭのＮａｃｌ、１ｍＭのＤＴＴ、３（ｇ／ｍｌのアプロチニン、２ｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１（ｇ／ｍｌのロイペプチンおよび０．２ｍＭのＰＭＳＦ）に再縣濁させた。溶解物は、３０分間の遠心分離によりプレクリアーした。細胞抽出物（およそ１０ｇ）は、２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）に３０分間浸漬し、続いて、ＩＲＦ−１  ＳＴＡＴ  ＤＮＡ結合配列を示す１ｎｇのポリヌクレオチドキナーゼ３２ＰラベルダブルスタンダードＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））に３０分間浸漬した。サンプルは、非変性ＰＡＧＥで解析され、オートラジオグラフィーで視覚化された。図４Ｃに示す通り、双方の化合物は、ＩＬ−２刺激後のＪＡＫ−３依存性ＳＴＡＴ活性化を阻害したが、ＩＬ−３刺激後のＪＡＫ−１／ＪＡＫ−２依存ＳＴＡＴ活性化には影響しなかった。放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化に対するＪＡＫ−３阻害の効果を試験するようデザインされたさらなる実験のために、化合物２が選択された。
【００６２】
図５に示す通り、イオン化放射は、ＪＡＫ−３インヒビターで処理されたＤＴ−４０細胞におけるｃ−ｊｕｎ発現を引き起こすことに失敗した。このことは、ＪＡＫ−３インヒビターは、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ発現を阻害する能力があることを示している。
【００６３】
未処理の細胞では、ｃ−ｊｕｎ発現はＤＮＡに損傷を与える化学薬品への被爆および放射線への被爆によって引き起こされる。そのように、ｃ−ｊｕｎ発現は、そのようなＤＮＡに損傷を与える薬品に対する細胞の応答の早期マーカーである。ＪＡＫ−３を阻害する化合物は、ｃ−ｊｕｎ発現を阻害する能力があることはすでに示した。したがって、ＪＡＫ−３インヒビターは、病気またはＤＮＡに損傷を与える薬品への被爆から生じる状態を予防することまたは処置することに有用であると思われる。
【００６４】
ＪＡＫ−３は、ヒト染色体の１９ｐ１２−１２．１．にマップされる。前癌遺伝子をエンコードした遺伝子のクラスターおよび転写要素もまた、この領域の近くに位置する。成熟したＢ細胞においても、Ｂ細胞前駆体と同様にＪＡＫ−３発現が示された。ＪＡＫ−３は、また、白血病Ｂ細胞前駆体およびリンパ腫Ｂ細胞前駆体においても検出された。ＪＡＫ−３の生理学的な役割は、マウスでの選択的な遺伝子破壊の研究、重症複合型免疫不全の患者の遺伝子解析、および細胞ラインにおけるＪＡＫ−３の生化学的研究を通じてすでに確証された。Ｂ細胞においてＪＡＫ−３活性化を引き起こす広い範囲の刺激物には、インターロイキン７およびインターロイキン４が含まれている。Ｂ細胞マーカーＣＤ４０は、ＪＡＫ−３と構造的に結合し、ＣＤ４０の連結反応は、ＣＤ４０媒介の遺伝子発現に必須であることがすでに示されているＪＡＫ−３活性化につながる。ＪＡＫ−３の構造的活性は、ｖ−ａｂｌ形質転換したプレＢ細胞において観測され、そして、副免疫沈澱物は、物理的にＪＡＫ−３と結合したｖ−ａｂｌすなわちＪＡＫ−３をその中に含むｖ−ａｂｌは、細胞形質転換を引き起こしたことを示している。以下を参照。Ｉｈｌｅ， Ｊ． Ｎ． ”Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，”  Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ３５１： １５９−６６， １９９６； Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｗ． Ｊ． ”ＳＴＡＴｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”  Ｎａｔ Ｍｅｄ ２：９６８−９， １９９６； Ｌｅｖｙ， Ｄ． Ｅ． ”Ｔｈｅ ｈｏｕｓｅ ｔｈａｔ Ｊａｋ／Ｓｔａｔ ｂｕｉｌｔ，”  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ８：８１−９０， １９９７； Ｒｉｅｄｙ， Ｍ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． ”Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＪＡＫ−３，”  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７， ５７−６１， １９９６； Ｓａｆｆｏｒｄ， Ｍ．Ｇ．， Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ， Ｍ．， Ｔｓｉｆｒｉｎａ， Ｅ．， Ａｍｉｎ， Ｓ．， Ｈａｗｋｉｎｓ， Ａ． Ｌ．， Ｇｒｉｆｆｉｎ． Ｃ． Ａ．， Ｃｉｖｉｎ， Ｃ． Ｉ． ａｎｄ Ｓｍａｌｌ， Ｄ． ”ＪＡＫ−３： ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９ｐ１２−１３．１” ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｅｒｒａｔｕｍ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９７ Ｊｕｌ；２５（７）：６５０］． Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２５， ３７４−８６， １９９７； Ｋｕｍａｒ， Ａ．， Ｔｏｓｃａｎｉ， Ａ．， Ｒａｎｅ， Ｓ． ａｎｄ Ｒｅｄｄｙ， Ｅ． Ｐ． ”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＪＡＫ−３ ｌｏｃｕｓ，”  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３， ２００９−１４， １９９６； Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｓ． Ｍ．， Ｌａｉ， Ｋ． Ｓ．， Ｔｏｍｆｏｈｒｄｅ， Ｊ．， Ｂｏｗｃｏｃｋ， Ａ．， Ｇｏｒｄｏｎ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｍｏｈｒｅｎｗｅｉｓｅｒ， Ｈ． Ｗ． ”ＪＡＫ−３ ｍａｐｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １９ｐ１２ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，”  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４３， １０９−１１１， １９９７； Ｔｏｒｔｏｌａｎｉ， Ｐ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＡＫ−３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，”  Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５， ５２２０−６， １９９５； Ｓｈａｒｆｅ， Ｎ．， Ｄａｄｉ， Ｈ． Ｋ．， ＪＪ， Ｏ． Ｓ． ａｎｄ Ｒｏｉｆｍａｎ， Ｃ． Ｍ． ”ＪＡＫ−３ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ，”  Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０８， ５５２−６， １９９７； Ｇｕｒｎｉａｋ， Ｃ． Ｂ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｌ． Ｊ． ”Ｍｕｒｉｎｅ ＪＡＫ−３ ｉｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ，”  Ｂｌｏｏｄ ８７， ３１５１−６０， １９９６； Ｒｏｌｌｉｎｇ， Ｃ．， Ｔｒｅｔｏｎ， Ｄ．， Ｂｅｃｋｍａｎｎ， Ｐ．， Ｇａｌａｎａｕｄ， Ｐ． ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄ， Ｙ． ”ＪＡＫ−３ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ，”  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０， １７５７−６１， １９９５； Ｒｏｌｌｉｎｇ， Ｃ．， Ｔｒｅｔｏｎ， Ｄ．， Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ， Ｓ．， Ｇａｌａｎａｕｄ， Ｐ． ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄ， Ｙ． ”ＩＬ４ ａｎｄ ＩＬ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｓｈａｒｅ ｔｈｅ ｇａｍｍａ ｃ ｃｈａｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅ ＳＴＡＴ６， ＳＴＡＴ３ ａｎｄ ＳＴＡＴ５ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ，”  ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３９３， ５３−６， １９９６； Ｈａｎｉｓｓｉａｎ， Ｓ． Ｈ． ａｎｄ Ｇｅｈａ， Ｒ． Ｓ． ”ＪＡＫ−３ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＤ４０ ａｎｄ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ＣＤ４０ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ，”  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６， ３７９−８７， １９９７； Ｄａｎｉａｌ， Ｎ． Ｎ．， Ｐｅｒｎｉｓ， Ａ． ａｎｄ Ｒｏｔｈｍａｎ， Ｐ． Ｂ． ”Ｊａｋ−ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｖ−ａｂｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９， １８７５−７， １９９５．
【００６５】
（要約）
Ｂ系統関係のリンパ球系細胞のイオン化放射線への被爆は、ｃ−ｊｕｎ前癌遺伝子ｍＲＮＡレベルでの上昇を引き起こす。このシグナルは、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）インヒビターにより廃棄される。このことは、いまだ構造決定されていないＰＴＫの活性化が、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ発現には必須であることを示している。実験的証拠は、細胞質のチロシンキナーゼＢＴＫ、ＳＹＫおよびＬＹＫはこのシグナルに必要でないことを示す。選択的な遺伝子破壊によりＬＹＮ、ＳＹＫまたはその両方の欠乏を引き起こされたリンパ腫Ｂ細胞は、放射後において増加したｃ−ｊｕｎ発現レベルを示したが、刺激の大きさは、野生型細胞よりも小さかった。特に、ヤヌス  ファミリー  キナーゼ３（ＪＡＫ−３）のインヒビターは、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化を廃棄した。このことは、ＪＡＫは放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化の重要なレギュレーターであり、また、ＪＡＫ−３インヒビターは、病気または化学的に引き起こされるもしくは放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化の結果として生じる状態を、予防することまたは治療することに有用であることを提示する。
【００６６】
すべての出版物、特許および特許資料は、参照することによりあたかも個々に組み込まれたように、参照することによりこの中に組み込まれる。本発明は、様々な特別のおよび好ましい実施形態および技法に関して記述されてきた。しかし、本発明の本質および適用領域の範囲内にとどまる限り、多くの変化および変更がされて良いものと理解すべきである。
【００６７】
【配列表】
2004504259.tif 000005
2004504259.tif 000006
2004504259.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】
野生型ＤＴ−４０リンパ腫Ｂ細胞の、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化を示す図である。
【図２】
ＢＴＫ−ＤＴ−４０細胞における、放射により引き起こされるｃ−ｊｕｎ活性化を示す図である。
【図３】
野生型および変異のＤＴ−４０細胞ラインにおける、イオン化放射線により引き起こされるｃ−ｊｕｎ  ｍＲＮＡ発現の誘発を示す図である。
【図４Ａ】
ＪＡＫ−３インヒビターの構造を示す図である。
【図４Ｂ】
ＪＡＫ−３インヒビターの特性を示す図である。
【図４Ｃ】
３２Ｄｃ２２−ＩＬ−２Ｒβ細胞のＥＭＳＡｓを示す図である。
【図５】
非放射のＤＴ−４０細胞のｃ−ｊｕｎ誘発におけるＪＡＫ−３インヒビターの効果を示す図である。
【図１】
2004504259.tif 000012
【図２】
2004504259.tif 000013
【図３】
2004504259.tif 000014
【図４Ａ】
2004504259.tif 000015
【図４Ｂ】
2004504259.tif 000016
【図４Ｃ】
2004504259.tif 000017
【図５】
2004504259.tif 000018
【国際公開パンフレット】
2004504259.tif 000019
2004504259.tif 000020
2004504259.tif 000021
2004504259.tif 000022
2004504259.tif 000023
2004504259.tif 000024
2004504259.tif 000025
2004504259.tif 000026
2004504259.tif 000027
2004504259.tif 000028
2004504259.tif 000029
2004504259.tif 000030
2004504259.tif 000031
2004504259.tif 000032
2004504259.tif 000033
2004504259.tif 000034
2004504259.tif 000035
2004504259.tif 000036
2004504259.tif 000037
2004504259.tif 000038
2004504259.tif 000039
2004504259.tif 000040
2004504259.tif 000041
2004504259.tif 000042
2004504259.tif 000043
2004504259.tif 000044
2004504259.tif 000045
2004504259.tif 000046
2004504259.tif 000047
2004504259.tif 000048
2004504259.tif 000049
2004504259.tif 000050
2004504259.tif 000051
2004504259.tif 000052
2004504259.tif 000053
2004504259.tif 000054
2004504259.tif 000055
2004504259.tif 000056
2004504259.tif 000057
2004504259.tif 000058
2004504259.tif 000059
2004504259.tif 000060
2004504259.tif 000061
2004504259.tif 000062
2004504259.tif 000063
2004504259.tif 000064
【手続補正書】
【提出日】平成12年1月31日(2000.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤヌス　ファミリー　キナーゼ３（ＪＡＫ−３）の活性を阻害する物質に哺乳類又は鳥類の細胞を接触させることにより、それらの細胞中でのｃ−ｊｕｎ活性化を阻害することを含む方法。
【請求項２】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞のａｒａ−Ｃ、トポイソメラーゼＩＩインヒビター、紫外線放射、アルキル化剤またはイオン化放射線への被爆に起因する請求項１の方法。
【請求項３】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞の紫外線放射またはイオン化放射線への被爆に起因する請求項１の方法。
【請求項４】
前記接触がインビトロで行われる請求項１の方法。
【請求項５】
前記接触がインビトロで行われる請求項１の方法。
【請求項６】
前記接触が前記被爆に先立って起こる請求項２の方法。
【請求項７】
前記接触が前記被爆の後で起こる請求項２の方法。
【請求項８】
前記物質がタンパク質である請求項１の方法。
【請求項９】
前記物質が式Ｉの化合物または薬学的に容認できるその塩である請求項１の方法。
【化１】
2004504259.tif 000065
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、  Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項１０】
前記物質が４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンもしくは４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンまたは薬学的に容認できるそれらの塩である請求項１の方法。
【請求項１１】
前記細胞が哺乳類のものである請求項１の方法。
【請求項１２】
前記細胞がヒトのものである請求項１の方法。
【請求項１３】
前記細胞が鳥類のものである請求項１の方法。
【請求項１４】
ｃ−ｊｕｎ活性化が含まれており、その活性化の阻害は、望ましくは、治療を必要とする哺乳動物に、効果的な量の、ＪＡＫ−３の活性を阻害する物質を投与する、哺乳動物の病的な状態を予防するかまたは処置する治療の方法。
【請求項１５】
式Ｉの化合物または薬学的に許容できるその塩の、ヤヌス  ファミリー  キナーゼ３（ＪＡＫ−３）の活性を阻害する薬剤の製造のための使用方法。
【化２】
2004504259.tif 000066
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、
Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項１６】
式Ｉの化合物または薬学的に許容できるその塩の、哺乳類または鳥類の細胞内でのｃ−ｊｕｎ活性化を阻害する薬剤の製造のための使用方法。
【化３】
2004504259.tif 000067
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、
Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項１７】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞の、放射線またはＤＮＡ損傷を引き起こす化学薬品への被爆に起因する請求項１６の使用方法。
【請求項１８】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞の、ａｒａ−Ｃ、トポイソメラーゼＩＩインヒビター、紫外線放射、アルキル化剤またはイオン化放射線への被爆に起因する請求項１６の使用方法。
【請求項１９】
前記ｃ−ｊｕｎ活性化が、前記細胞の紫外線放射またはイオン化放射線への被爆に起因する請求項１６の使用方法。
【請求項２０】
式Ｉの化合物または薬学的に容認できるその塩の、組織の損傷、器官の損傷、炎症、脱毛症、または、化学療法の間に酸素フリーラジカルにより引き起こされる負の効果を予防するかまたは処置する薬剤の製造のための使用方法。
【化４】
2004504259.tif 000068
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、
Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項２１】
前記器官は心臓、肝臓または腎臓である請求項２０の使用方法。
【請求項２２】
式Ｉの化合物または薬学的に容認できるその塩の、脊髄萎縮性側索硬化症を予防するかまたは処置する薬剤の製造のための使用方法。
【化５】
2004504259.tif 000069
ここで、
ＸはＨＮ、Ｒ１１Ｎ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ２、またはＲ１１ＣＨであり、
Ｒ１１は水素、Ｃ１からＣ４のアルキルまたはＣ１からＣ４のアルカノイルであり、
Ｒ１からＲ８は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロである。ここで、Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基は、合わせてそれらの結合しているフェニル環と共に任意に縮合環を形成してもよく、例えばナフチルまたはテトラヒドロナフチル環を形成し、さらにここで、前記Ｒ１からＲ５のうちの２つの隣接した基により形成された環は、任意に１個、２個、３個または４個のヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロで置換されていても良い。また、
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである。
【請求項２３】
Ｒ１からＲ５は、それぞれ独立に、水素、メルカプト、アミノ、ニトロ、Ｃ１からＣ４のアルキル、Ｃ１からＣ４のアルコキシ、Ｃ１からＣ４のアルキルチオ、またはハロゲンである請求項１５、１６、２０、２１または２２の使用方法。
【請求項２４】
Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、Ｃ１からＣ４のアルキル、ハロもしくはＣ１からＣ４のアルカノイルであるか、または、Ｒ９およびＲ１０は、合わせてメチレンジオキシである請求項１５、１６、２０、２１または２２の使用方法。
【請求項２５】
式Ｉの化合物が、４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンもしくは４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリンまたは薬学的に容認できるそれらの塩である請求項１５、１６、２０、２１または２２の使用方法。
【手続補正書】
【提出日】平成12年8月15日(2000.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記接触がインビボで行われる請求項１の方法。
【国際調査報告】
2004504259.tif 000070
2004504259.tif 000071
2004504259.tif 000072