(57)【要約】合成赤血球産生刺激タンパク質が提供される。このタンパク質の合成方法も提供される。本発明はさらに、定義されたやり方でポリマー修飾されるそのような合成赤血球産生刺激タンパク質の誘導体に関する。そのようなタンパク質および誘導タンパク質の利用方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の水溶性ポリマーが付着している合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２】
赤血球産生を増加するインビボ生物活性を有する、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、リボソーム特定（ｒｉｂｏｓｏｍａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）エリスロポエチンのアミノ酸配列および１つ以上の化学的ライゲーション部位により共有結合された１つ以上の非重複ペプチドセグメントを有するポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項４】
１つ以上の前記水溶性ポリマーが、前記リボソーム特定エリスロポエチンのグリコシル化部位に対応する部位において前記ポリペプチド鎖に付着している、請求項３に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項５】
前記リボソーム特定エリスロポエチンが、ヒト型である、請求項３に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項６】
前記リボソーム特定エリスロポエチン糖タンパク質が、非天然である、請求項３に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項７】
非天然の、前記リボソーム特定エリスロポエチンが、１つ以上の非天然グリコシル化部位を有する、請求項６に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項８】
前記水溶性ポリマーが、前記リボソーム特定エリスロポエチンのグリコシル化部位に対応する１つ以上の部位において、前記ポリペプチド鎖に排他的に付着している、請求項２に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項９】
１つ以上の前記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドまたはそれらの誘導体を含む反復単位を含む、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１０】
前記ポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドが、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシド反復単位を含む、請求項９に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１１】
１つ以上の前記水溶性ポリマーが、分岐状である、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１２】
１つ以上の前記水溶性ポリマーが、生理学的条件下で負の実効電荷を有する、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１３】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、３〜７に等電点を有する、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１４】
前記水溶性ポリマーが、単分散である、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１５】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、単分散である、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１６】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、２５ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１７】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、４０ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１８】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、５０ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項１９】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、６０ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２０】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、７０ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２１】
前記ポリペプチド鎖が、１つ以上の不規則アミノ酸を含む、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２２】
前記不規則アミノ酸、は非天然側鎖を含む、請求項２１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２３】
前記不規則アミノ酸が、擬似アミノ酸を含む、請求項２１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２４】
前記擬似アミノ酸が、擬似グルタミン酸塩である、請求項２３に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２５】
前記非天然側鎖が、水溶性ポリマーに共有結合している、請求項２２に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質・
【請求項２６】
前記水溶性ポリマーが、化学的ライゲーションにより形成される結合を介して前記側鎖に共有結合している、請求項２５に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２７】
化学的ライゲーションにより形成される前記結合が、アミド、オキシム、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンおよびチオエステルからなる群から選ばれる、請求項２６に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２８】
１つ以上の前記化学的ライゲーション部位が、アミド結合を含む、請求項３に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項２９】
前記水溶性ポリマーが、前記ポリペプチド鎖の化学的ライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖を介して前記ポリペプチド鎖に付着している、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項３０】
ＳＥＰ−１およびＳＥＰ−３からなる群から選ばれる合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項３１】
ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１およびＳＥＰ−３、ならびにそれらの類似体からなる群から選ばれる合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項３２】
前記類似体が、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０、ＳＥＰ−１−Ｂ５１、およびＳＥＰ−１−Ｂ５２からなる群から選ばれる、請求項３１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質。
【請求項３３】
請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質または薬学的に許容できるその塩を含む薬剤組成物。
【請求項３４】
バッファー、キャリアタンパク質、アミノ酸、界面活性剤、脂質、水溶性ポリマーおよび保存剤からなる群から選ばれる１つ以上の賦形剤を含む、請求項３３に記載の薬剤組成物。
【請求項３５】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質以外の１つ以上の別の生物活性薬剤を含む、請求項３３に記載の薬剤組成物。
【請求項３６】
哺乳動物のヘマトクリットを増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質を投与し、それにより前記哺乳動物におけるヘマトクリットを増加させる方法。
【請求項３７】
哺乳動物における赤血球産生を増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項１に記載のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を投与し、それにより前記哺乳動物における赤血球産生を増加させる方法。
【請求項３８】
哺乳動物におけるヘモグロビン産生を増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項１に記載のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を投与し、それにより前記哺乳動物におけるヘモグロビン産生を増加させる方法。
【請求項３９】
哺乳動物における網状赤血球数を増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項１に記載の合成赤血球産生刺激タンパク質を投与し、それにより前記哺乳動物における網状赤血球数を増加させる、方法。
【請求項４０】
合成赤血球産生刺激タンパク質を含むポリペプチド鎖を産生する方法であって、前記合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合し、それにより前記合成赤血球産生刺激タンパク質を含むポリペプチド鎖を産生する方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチド鎖を折りたたみ、それにより生物活性のある合成赤血球産生刺激タンパク質を産生する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
１つ以上の前記ペプチドセグメントが、部分的に保護されている、前記請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
１つ以上の前記ペプチドセグメントが、未保護である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
１つ以上の前記ペプチドセグメントが、それに付着している水溶性ポリマーを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記化学的ライゲーションが、天然型化学的ライゲーション、拡張天然型化学的ライゲーション、擬似天然型化学的ライゲーション、オキシム形成化学的ライゲーション、ヒドラゾン形成化学的ライゲーション、オキサゾリジン形成化学的ライゲーション、チアゾリジン形成化学的ライゲーションおよびチオエステル形成化学的ライゲーションから選ばれる化学選択的ライゲーション化学を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチド鎖が、それに付着している１つ以上の水溶性ポリマーを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチド鎖が、リボソーム特定エリスロポエチンのアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
１つ以上の前記水溶性ポリマーが、前記リボソーム特定エリスロポエチンのグリコシル化部位に対応する部位において前記ポリペプチド鎖に付着している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記リボソーム特定エリスロポエチン糖タンパク質が、組換えにより産生される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記リボソーム特定エリスロポエチン糖タンパク質が、非天然である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記非天然のリボソーム特定エリスロポエチン糖タンパク質が、１つ以上の非天然グリコシル化部位を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記リボソーム特定エリスロポエチンが、ヒト型である、前記請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記水溶性ポリマーが、前記リボソーム特定エリスロポエチンのグリコシル化部位に対応する部位において前記ポリペプチド鎖に排他的に付着している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
１つ以上の前記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシドまたはそれらの誘導体を含む反復単位を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドが、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシド反復単位を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
１つ以上の前記水溶性ポリマーが、分岐状である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
１つ以上の前記水溶性ポリマーが、生理学的条件下で負の実効電荷を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、３〜７に等電点を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５９】
前記水溶性ポリマーが、単分散（ｍｏｎｏ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、単分散である、前記請求項４０に記載の方法。
【請求項６１】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、２５ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、４０ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、５０ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、前記請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、６０ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６５】
前記合成赤血球産生刺激タンパク質が、７０ｋＤａ以上のモノマー分子量を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリペプチド鎖が、１つ以上の不規則（ｉｒｒｅｇｕｌａｒ）アミノ酸を含む、前記請求項４０に記載の方法。
【請求項６７】
前記不規則アミノ酸が、非天然側鎖を含む、前記請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記不規則アミノ酸が、擬似アミノ酸を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリペプチド鎖が、アミド、オキシム、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンおよびチオエステルからなる群から選ばれる結合を有する化学的ライゲーション部位を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項７０】
前記水溶性ポリマーが、非天然側鎖を有する前記ポリペプチド鎖のアミノ酸に付着している、請求項４６に記載の方法。
【請求項７１】
前記水溶性ポリマーが、化学的ライゲーショにより形成される結合を介して前記側鎖に共有結合している、請求項４６の方法。
【請求項７２】
化学的ライゲーションにより形成される前記結合が、アミド、オキシム、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンおよびチオエステルからなる群から選ばれる、前記請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記水溶性ポリマーが、前記ポリペプチド鎖の化学的ライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖を介して前記ポリペプチド鎖に付着している、請求項４６に記載の方法。
【請求項７４】
前記生物活性合成赤血球産生刺激タンパク質が、赤血球産生を増加するインビボ生物活性を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリペプチド鎖が、ＳＥＰ−１およびＳＥＰ−３からなる群から選ばれる合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項に記載４０の方法。
【請求項７６】
合成赤血球産生刺激タンパク質が、ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１およびＳＥＰ−３ならびにそれらの類似体からなる群から選ばれる、請求項４０に記載の方法。
【請求項７７】
前記類似体が、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０、ＳＥＰ−１−Ｂ５１、およびＳＥＰ−１−Ｂ５２からなる群から選ばれる、前記請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、定義された方法でポリマー修飾される合成赤血球産生刺激タンパク質、ならびに製造方法および使用方法に関する。
【０００２】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許出願第６０／２３１，３３０号（２０００年９月８日出願）および同第６０／２３６，３７７号（２０００年９月２９日出願）の一部継続出願であり、そのどちらも参照により本明細書に全体が組み入れられる。
【０００３】
（背景技術）
赤血球産生は、赤血球の代謝回転および損失を調節するために生じる赤血球産生のためのプロセスである。エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球産生を刺激するタンパク質ホルモンである。自然発生ヒトＥＰＯは、主として腎臓中で作られて血流中へ分泌される１６５個のアミノ酸を含む糖タンパク質であり、骨髄中の前駆細胞からの赤血球産生を刺激する。ヒトＥＰＯをコード化している遺伝子は、１６６個のアミノ酸残基を有する分子を予測するけれども、カルボキシ末端アルギニンは、その成熟形における翻訳後修飾において除去される。
【０００４】
グリコシル化ヒトＥＰＯは、位置２４、３８、および８３に付着した（ａｔｔａｃｈｅｄ）３つのＮ結合糖鎖を有している。これは、位置１２６に存在するＯ結合糖部分も有している。グリコシル化の影響は複雑である。非グリコシル化ＥＰＯは、インビトロで活性がある。しかしながら、インビボでの完全活性についてはグリコシル化が必要であることが研究により明らかになっている。可変グリコシル化パターンが可変的効果を示すことも研究により明らかになっている。例えば、脱シアル酸化ＥＰＯは、インビトロ活性の増加とインビボ活性減少の両方を示し、これは肝細胞によって、認識、結合および除去されるガラクトース残基の露出に帰される効果である。完全シアル酸化されたＥＰＯの分岐パターンも、生物活性に違いを作り出すことが明らかにされている。主に四本触覚型の分岐ＥＰＯは、「標準」ＥＰＯと同等の活性示し、それに対して主に二本触覚型の分岐ＥＰＯはインビトロでは３倍の活性を示すが、インビボでは正常活性の１５％を示すにすぎない。さらに、ＥＰＯ機能においては、Ｏ結合型ではなくＮ結合型糖類が重要であることが様々な研究により示されている。
【０００５】
組換えにより作られたグリコシル化ＥＰＯを含有するいくつかの薬剤が利用可能である。しかしながら、現在利用可能なＥＰＯ製剤は、それらの血漿半減期が短いことおよびプロテアーゼ分解に対する感受性により制限される。それらは、各Ｎ結合グリコシル化部位および部位間で生じる分岐およびシアル酸含有量における高度の不均一性に起因する種々のグリコフォームの複雑な混合物も含んでいる。これらの欠点により、これらの製剤が最大の臨床効力を達成することが妨げられてきた。
【０００６】
そのようなＥＰＯタンパク質の循環半減期およびその他の特性を改善するため、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような水溶性ポリマーが付着されてきたが、制御されたやり方でかつユーザー定義された精密さでポリマーを付着させることが困難であることを考えると、結果はまちまちであった。例えば、ＰＥＧのようなポリマー部分および関連ポリマーを、タンパク質上に見出される反応基へ付着させるために各種の方法が用いられてきた（米国特許第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．）、および米国特許第４，００２，５３１号（Ｒｏｙｅｒ）参照）。概説については、「薬としての酵素」（Ｊ． Ｓ． Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， ｅｄｓ． ｐｐ． ３６７−３８３（１９８１））のＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．およびＺａｌｉｐｓｋｙ， Ｓ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）６：１５０−１６５）を参照されたい。タンパク質を修飾するためにＰＥＧおよびその他のポリマーを使用することも、Ｃｈｅｎｇ， Ｔ．−Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９９）１０： ５２０−５２８； Ｂｅｌｃｈｅｖａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９９）１０： ９３２−９３７； Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９８）９：８４２−８４６； Ｈｕａｎｇ， Ｓ．−Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９８）９：６１２−６１７； Ｘｕ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９７）１３：２４４７−２４５６； Ｓｃｈｗａｒｚ， Ｊ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（１９９９）１２１：２６６２−２６７３； Ｒｅｕｔｅｒ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９９）１０：２７１−２７８； Ｃｈａｎ， Ｔ．−Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．（１９９７）６２：３５００−３５０４により論じられている。タンパク質中の典型的な付着部位として、リジン残基上またはＮ末端におけるような第一アミノ基、システイン側鎖上におけるようなチオール基、およびグルタミン酸またはアスパラギン酸残基上またはＣ末端におけるようなカルボキシル基が含まれる。最も一般的な付着部位のいくつかは、糖タンパク質の糖残基、システインまたは標的タンパク質のＮ末端およびリジンである。
【０００７】
ＥＰＯへのポリマーのコンジュゲーション（接合）について多くの様々な方法が記載されてきたが、コンジュゲーションプロセスには、厄介な問題が無いわけではない。コンジュゲーション反応により引き起こされる生物活性損失を制限するように注意しなければならない。例えば、付着部位数を最小限にするため、折りたたみまたは再生されたタンパク質が一般的に用いられる。しかしながら、活性化されたポリマーのあまりに多くが標的タンパク質またはポリペプチドに付着すると、生物活性はひどく減少したり失われたりすることがある。同様に、ポリマーをタンパク質に結合する不適切なリンカーが用いられるか、または不十分な量のポリマーが標的に付着されると、結果として生じるコンジュゲートの治療効果が限定されることがあり、さらにその生物活性における損失を補うのに十分な循環寿命の増加を示さないことがある。修飾ポリマーによりタンパク質の活性部位が遮断される結果としても問題が生じ得る。ポリマーとタンパク質は、一般に溶液ベースの反応で結合されるので、この問題は回避困難なことがある。ピリドキサールリン酸のような物質で活性部位をプレブロックすることが提案されてきたが、結果は矛盾したものであった（米国特許第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓｅｔ ａｌ．）参照）。これらの問題は、より低分子量のタンパク質およびペプチドの場合に特に深刻であり、これらは生物活性と関連しない付着部位をしばしばほとんど持たない。
【０００８】
例えば、一般的な技法は、水溶性ポリマーを標的タンパク質中の第１アミンに付着させるというものであった（例えば、リジンのＮ末端アミノ基およびε−アミノ基）。チオール反応性ポリマーコンジュゲートも、ポリマーをシステインのチオール側鎖に付着させるために用いられてきた。ほとんどのタンパク質が、タンパク質の活性、折りたたみ、再生および安定性を定義する場合に重要な役割を果たすポリペプチド主鎖の様々な領域上に展開されたそのような反応性基の多数のコピーを含んでいるので、両方の方法とも重大な問題がある。従って、広範に用いられてはいるが、そのような方法には、タンパク質の生物活性における多少とも不完全または望ましくない減少があること、ならびに分離および特徴付けが困難な通常は複雑な混合物である、という問題がある（Ｄｅｌｇａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９７）３：５９−６６）。
【０００９】
ランダムな付着を減らす試みにおいて、ポリマー付着の所望部位にリジンを付加すると共に天然リジンを除去したタンパク質が作られた（米国特許第４，９０４，５８４号）。例えば、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−２がこの方法で修飾された。ランダムな付着を回避する他の試みは、ポリマー付着の所望部位に天然システインを付加すると共にシステインを除去するか、あるいはもし存在したとても天然システインを除去せずにシステインを付加したタンパク質を作ることであった（ＥＰ０６６８３５３号）。例えば、ＥＰＯはこの方法で作られた。そのようなシステインまたはリジン変異体により部位特定的ポリマー付着が理論上可能になるのに対し、すべての選ばれた部位が制御されたやり方で修飾できるという保証は依然として皆無である。
【００１０】
多数のアミノ酸を含むタンパク質を、同じまたは類似した反応性官能基を持つ側鎖で部位特異的に修飾することができないので、最近の試みはタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端の修飾に向けられてきた。アミノまたはカルボキシ末端の修飾は、これらの部位を一意的に修飾するいくつかの化学的コンジュゲーション手法の能力に依存してきた（ＷＯ９０／０２１３６号およびＷＯ９０／０２１３５号）。例えば、この手法は、Ｇ−ＣＳＦおよびケモカインＩＬ−８のＮ末端残基へのＰＥＧ鎖の付着に利用された（Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．（１９９６）７（１）：３８−４４、およびＷＯ９６／４１８１３号）。しかしながら、ＮまたはＣ末端の修飾により、タンパク質の活性は一般的に減少する（例えば、Ｇ−ＣＳＦのＮ末端およびリジン側鎖へのＰＥＧの付着を論じている米国特許第５，９８５，２６５号参照）。水溶性ポリマーによるタンパク質修飾に伴う欠点にもかかわらず、ＰＥＧ化および他の水溶性ポリマーのタンパク質への付着が追求され続けている。例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の糖鎖およびリジンのような内部アミノ酸（ＥＰ０６０５９６３号およびＷＯ００／３２７７２号）、ならびにＮ末端（米国特許第６，０７７，９３９号およびＷＯ００／３２７７２号）へのＰＥＧの付着も記載されている。あいにく、そのようなＰＥＧ化ＥＰＯは、分離および特徴付けが困難な複雑な混合物という結果になる。
【００１１】
別の問題は、上記のポリマーが高度に非均質であり、これによりポリマー修飾タンパク質混合物の分析的キャラクタリゼーションおよび精製が困難になることである（Ｄｅｌｇａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９７）３：５９−６６）。例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧベースの鎖を調製するために用いられる手法は、それが３４００程度のかなり低い相対分子量のものであっても、制御が不十分な重合段階を伴い、これにより調製品は平均値の回りに広がる鎖長を有することになる。すなわち、それらの手法は、ｎが離散的な値ではなく、むしろ平均値付近の範囲にある値を有する（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのポリマー調製品を伴う。結果として得られる誘導タンパク質の異質性は、しばしば、同定ましてや分離が容易にできない特性の範囲を伴う。
【００１２】
しかしながら、あいにくなことに、適切なポリマーを同定し使用することの問題は、治療的用途に現在用いられるすべてのＥＰＯタンパク質が組換えＤＮＡ技術から誘導されるという事実によって悪化する。組換えＤＮＡ技術の使用により、性能強化部分と組換えにより産生されたＥＰＯタンパク質との間に形成され得る結合のタイプおよび特異性に厳しい制限が課される。これは、第一に、結合に適した官能基の数がごく限られているからであり、第二に、修飾されているタンパク質中に一般に反応性官能基のコピーがいくつかあり、従って、修飾のどのような特異性も不可能にるからである。例えば、超酸化ジスムターゼとＰＥＧとの非選択的コンジュゲーションの場合には、修飾された酵素のいくつかのフラクションが完全に不活性であった（Ｐ． ＭｃＧｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：３０７９−３０９１）。また、もし異なる数のそのような部分がランダムに付着されれば、治療的タンパク質の薬物動態学は正確に予測できず、投薬は大きい問題になるであろう。付着を制御できないことにより、さらに、（ａ）効力の減少、（ｂ）誘導体の膨大な混合物を分離するための手の込んだ精製の必要および（ｃ）修飾部分のことによると不安定な付着という結果につながる。また、トレシルクロイドベース結合のような、技術的に既知のいくつかの結合が免疫原性であることも知られている。
【００１３】
従って、循環半減期を改善し、タンパク質分解および免疫原性を減少させ、さらに生物学的に産生されたタンパク質の他の特性を改善するため、ＰＥＧのような水溶性ポリマーを付着させ得るが、それらを制御された方法でかつユーザー定義された精度で付着させることが困難であることを考えれば、結果はまちまちである。また、正確なユーザー定義された部位でのポリマー付着は成果が限られているので、タンパク質に一般に適用可能である好適な付着部位についてはほとんど知られていない。さらに、付着の確率性、およびそのような目的のために現在使用されているＰＥＧおよび他の水溶性ポリマーのヘテロ分散的性質により、ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートの精製および分析的特徴付けは困難であった。従って、再現可能な付着制御が不十分ということとポリマーの不均一性とが組み合された問題により、治療法としてのポリマー修飾タンパク質のルーチン的な承認は厳しく妨げられてきた（１９７０年代初期に導入されたにもかかわらず、治療的使用について承認されたものは現在までのところごくわずかである）。
【００１４】
従って、組換えＤＮＡ技術ならびに天然および組換えにより産生されたＥＰＯを修飾するために用いられるポリマー技術とは異なる生物活性赤血球産生刺激タンパク質を製造する方法に対するニーズが存在する。臨床特性を改善した赤血球産生刺激タンパク質も必要とされる。本発明はこれらおよびその他のニーズを満たすものである。
【００１５】
（発明の開示）
本発明は、合成赤血球産生刺激タンパク質、それらの製造方法および使用方法に関する。特に、本発明は、１つ以上の水溶性ポリマーが付着させられた合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を含む製剤組成物も提供される。
【００１６】
本発明はさらに、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質で哺乳動物を治療する方法にも向けられる。１つの実施態様においては、哺乳動物のヘマトクリット値を増加させるための方法が提供される。別の実施態様においては、哺乳動物における赤血球産生を増加させるための方法が提供される。別の実施態様は、哺乳動物のヘモグロビンを増加させる方法に向けられる。さらなる実施態様は、哺乳動物における網状赤血球数を増加させるための方法に向けられる。これらの方法は、所望の効果を達成するために本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を哺乳動物に有効量投与することを含む。
【００１７】
好ましいポリマー修飾形態および中間体を含む、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質の製造方法も提供される。この方法は、合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合することを含み、それにより合成赤血球産生刺激タンパク質を含むポリペプチド鎖が産生される。
【００１８】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、合成赤血球産生刺激タンパク質、生産方法および使用方法に関する。
【００１９】
Ｉ．本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質
好ましい実施形態において、本発明は、１つ以上の水溶性ポリマーを付着して有する合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。「赤血球産生刺激タンパク質」は、エリスロポエチン依存性細胞株の成長を促進するインビトロ生物活性を有するタンパク質を意味する。好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、赤血球産生を促進するインビボ生物学活性を有する。タンパク質の赤血球産生刺激活性は、インビボ投与後に赤血球産生を追う、ＥＰＯ依存性細胞株の増殖を仲介するタンパク質の能力をアッセイする等、の各種の手段のいずれかにより決定できる。
【００２０】
「水溶性ポリマー」は、水に可溶性の実質的に非抗原性ポリマーを意味している。
【００２１】
本明細書中で用いられているように、タンパク質は、そのアミノ酸残基のいくつか、最も好ましくはそのすべてを重合させるために非組換え技術が使用されていれば「合成」であると言われる。用語「非組換え技術」は、有機化学および他の合成重合方法を伴う技術を、インビボあるいはインビトロにおいてタンパク質中へのＲＮＡの翻訳を伴う技術から区別することを意図している。合成タンパク質は、完全合成および半合成タンパク質を含んでいる。完全合成タンパク質は、すべてのライゲーション成分が、化学合成すなわちリボソーム不使用（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ−ｆｒｅｅ）合成による人工的なものである場合に生産される。半合成タンパク質は、ライゲーション成分の少なくとも一部が、生物学的合成、すなわち細胞翻訳系または細胞不使用（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）翻訳系中でリボソームによって作られ、別の部分は化学合成により作られて生産される。
【００２２】
好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、リボソーム特定（ｒｉｂｏｓｏｍａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）エリスロポエチンのアミノ酸配列、および１つ以上の化学的ライゲーション部位により共有結合的に結合された１つ以上の非重複ペプチドセグメントを有するポリペプチド鎖を含む。最も好ましくは、エリスロポエチンは哺乳動物のものであり、より好ましくはヒトのものまたはそれらの誘導体である。例えば、多くのエリスロポエチンのアミノ酸配列が知られており、ヒトエリスロポエチンについては、その多くの活性変異体が作られており（例えば、米国特許第５，８５６，２９８号、第５，９５５，４２２号、第８，８８８，７７２号、第５，８５８，３４７号、第５，６１４，１８４号、第５，４５７，０８９号、第６，０７７，９３９号、およびＷＯ００／３２７７２号参照）、従って、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、そのようなアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含み得る。
【００２３】
好ましい実施形態においては、リボソーム特定エリスロポエチン（ｒｉｂｏｓｏｍａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）は、１つ以上のグリコシル化部位を含み、水溶性ポリマーは、リボソーム特定エリスロポエチンの１つ以上のグリコシル化部位に対応する１つ以上の部位において合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖に付着させられる。より好ましい実施形態においては、水溶性ポリマーは、１つ以上のそのようなグリコシル化部位に対応する１つ以上の部位でポリペプチド鎖に排他的に付着させられる。本発明のこの観点は、リボソーム特定エリスロポエチンが組換えにより作られる合成赤血球産生刺激タンパク質を含んでいる。従って、リボソーム特定エリスロポエチンは、天然エリスロポエチンまたは非天然エリスロポエチンとすることができ、後者は１つ以上の非天然グリコシル化部位をさらに含み得る。
【００２４】
「グリコシル化部位」は、タンパク質の一つのアミノ酸配列を意味し、この配列は、そのタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基の側鎖へのオリゴ糖（炭水化物）鎖の酵素的付着をコード化するものであり、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化部位がよい例である。ポリマー修飾のための残基部位が位置的に同じなので、１つ以上のそのようなグリコシル化部位を除去するために変異されたエリスロポエチンが「グリコシル化部位」の定義に含まれることが理解されるであろう。「自然発生グリコシル化部位」は、自然状態で見い出されるエリスロポエチン糖タンパク質のグリコシル化部位を意味する。「非自然発生グリコシル化部位」は、エリスロポエチン中に設計されたグリコシル化部位を意味する。例えば、組換えヒトＥＰＯがこの方法で設計されている（例えば、米国特許第５，８５６，２９８号参照）。
【００２５】
本発明のこの実施形態は、ヒトエリスロポエチンのポリペプチド鎖を有する合成赤血球産生刺激タンパク質がその１つ以上のグリコシル化部位において本明細書中に記載されるような水溶性ポリマーで修飾される場合に、その水溶性ポリマーは、相当する自然発生エリスロポエチン糖タンパク質中の当該位置に通常見出される糖鎖に帰される生物学的効果の１つ以上を活用するために利用できるという知見に部分的に基づいている。そのような生物学的効果には、プロテアーゼ耐性、免疫原性、レセプター特異性、比活性、効力および薬物動態学の調節が含まれる。しかしながら、糖鎖の存在を排除し、これを本発明の好ましい水溶性ポリマーと置き換えることにより、糖鎖のペンダントシアル酸残基が除去された場合のような酵素分解およびクリアランス、不安定性、限定された循環半減期、分布、低いハンドリング特性等の回避が含まれる大きな利益がもたらされる。重要なことには、本発明のそのようなポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、未修飾の対応する合成タンパク質と比較した場合に、生物活性の損失が実質的にないのでそのような有利な生物学的特性を保持し、合成タンパク質のモノマー分子量が２５ｋＤａ以上である場合でさえも生物活性が増加することも見出されている。
【００２６】
従って、別の好ましい実施形態においては、本発明は、リボソーム特定エリスロポエチンのアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられ、そこでは、ポリペプチド鎖は、それに付着させられた１つ以上の水溶性ポリマーを有しかつモノマー分子量が２５ｋＤａ以上であり、さらに合成赤血球産生刺激タンパク質は、前記水溶性ポリマーを欠いたポリペプチド鎖を有する対応する合成タンパク質と同等か上回る生物活性を備える。生物活性は、インビトロ、インビボまたはその両方であり得る。好ましい実施形態においては、生物活性はインビボである。別の好ましい実施形態においては、本発明は、リボソーム特定エリスロポエチンのアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられ、そこでは、ポリペプチド鎖は、そ１つ以上の水溶性ポリマーを付着して有しかつモノマー分子量が２５ｋＤａ以上であり、さらに合成赤血球産生刺激タンパク質は、リボソーム特定エリスロポエチンと同等か上回る生物活性を備える。ここでも、生物活性は、インビトロ、インビボまたはその両方であり得る。好ましい実施形態においては、生物活性はインビボである。最も好ましくは、そのようなポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、それに付着させられた不連続な数の水溶性ポリマーを有するであろう。
【００２７】
「化学的ライゲーション部位」は、第１のペプチドまたはポリペプチドのＮ末端アミノ酸および第２のペプチドまたはポリペプチドのＣ末端アミノ酸を意味し、これらは、化学的ライゲーションにより、その間で非可逆的共有結合を形成するか形成する能力がある。本明細書中で用いられているように、「化学的ライゲーション」は、２つの化学的部分の共有結合を伴う化学選択的反応を言い、それぞれの部分は、他方と非可逆的共有結合を一意的に形成する相互に反応性の官能基を有する。化学的ライゲーションは、（１）一意的な反応性Ｃ末端基を有する第１のペプチドまたはポリペプチドと、（２）一意的な反応性Ｎ末端基を有する第２のペプチドまたはポリペプチドとの共有結合的ライゲーションを含み、そこでは、Ｃ末端およびＮ末端反応基がその間で非可逆的共有結合を形成する。特に、化学的ライゲーションには、未保護ペプチドセグメントのライゲーションに適用し得る任意の化学選択的反応化学が含まれる。
【００２８】
水溶性ポリマーについては、好ましい水溶性ポリマーは、以下の式により表すことができる。
Ｕｎ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−ポリマー−ｓ３−Ｊ＊
【００２９】
Ｕは、合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖に共有結合された唯一の官能基の残基である。特に、Ｕ基は、合成赤血球産生刺激タンパク質の１つ以上の非重複ペプチドセグメントの１つ以上のアミノ酸の側鎖ｎの相互に反応性の唯一の官能基と結合されており、そこではｎは１〜６の整数である。より好ましくは、側鎖ｎは１〜４の整数であり、最も好ましくは１〜２である。本明細書中で使われているように、用語「アミノ酸」は、遺学伝的にコード化された２０個のアミノ酸、天然に見出される稀なまたは異常なアミノ酸、および時々、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関連する場合にアミノ酸残基と呼ばれることもある不規則アミノ酸のような任意の非天然的に生じるアミノ酸を意味する。Ｕおよび側鎖ｎの好ましい実施形態は、一意的な相互に反応性の基から形成された共有結合であり、そこではそのような結合は、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、チアゾリジン、チオエーテル、エーテル、およびエステルから選ばれる。最も好ましいＵおよびｎ結合は、Ｕが、アミド、オキシム、チオエステル、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンからなる群から選ばれる化学的ライゲーションにより形成された結合を介して側鎖ｎと共有結合しているものである。
【００３０】
Ｂは、同じまたは異なる３つ以上のアームを有する分岐核であり、存在していても存在していなくてもよい。最も好ましくは、Ｂは存在しかつ３つ以上のアーム、さらに好ましくは４つ以上のアームを有する。特に、Ｂの１つのアームがＵに（任意にスペーサーまたはリンカーｓ１を介して）結合されており、Ｂの第２のアームがポリマーに（任意にスペーサーまたはリンカーｓ２を介して）結合される。好ましいポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、Ｂの分岐アームの少なくとも１つが、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、およびチアゾリジンからなる群から選ばれる結合の残基を含むものである。本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の好ましい分岐核Ｂは、アミノ、カルボキシレートおよび混合アミノ−カルボキシレートからなる群から選ばれた分岐核を含む。好ましいアミノ分岐核はリジンを含み、好ましいカルボキシレート分岐核はグルタミン酸またはアスパラギン酸を含み、さらに混合アミノ−カルボキシレート分岐核はγ−グルタミン酸またはその誘導体を含む。
【００３１】
「ポリマー」成分は、実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Ｂが存在する場合にはＢと同じか異なることができる。「水溶性ポリマー」は、水に可溶性で、原子分子量が約１０００ダルトン以上の実質的に非抗原性のポリマーを意味する。「ポリマー」は、好ましくは、有効流体力学的分子量が１０，０００Ｄａ以上であり、より好ましくは約２０，０００〜５００，０００Ｄａ、および最も好ましくは約４０，０００〜３００，０００Ｄａである。「有効流体力学的分子量」は、水ベースのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定されるようなポリマー鎖の有効水−溶媒和サイズを意味する。水溶性ポリマーが、エチレンオキサイド反復単位のようなポリアルキレンオキシド反復単位を有するポリマー鎖を含んでいる場合、各鎖の原子分子量が、約２００〜約８０，０００Ｄａ、好ましくは約１，５００〜約４２，０００Ｄａ、最も好ましくは２，０００〜約２０，０００Ｄａであることが好適である。具体的に言及されているのでなければ、分子量は、原子分子量を指すことを意図している。
【００３２】
「ポリマー」成分は、広範囲の分子量およびポリマーサブユニットを持つことができる。これらのサブユニットは、生物学的ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組み合わせを含み得る。そのような水溶性ポリマーの例としては、デキストランならびに硫酸デキストラン、Ｐ−アミノ架橋デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンを含むデキストラン誘導体、セルロースならびにメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むセルロース誘導体、デンプンおよびデキストリン類、ならびにデンプンの誘導体および加水分解物、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーを含むポリアルキレングリコールならびにそれらの誘導体が含まれ、そこでは、前記ホモポリマーおよびコポリマーは、未置換または一端がアルキル基、ヘパリンおよびヘパリンのフラグメント、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルトアミド、およびポリオキシエチエレン化ポリオール、デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体で置換されている。具体的に列挙した水溶性ポリマーの様々な誘導体も考えられることが理解されるであろう。
【００３３】
上記で説明した水溶性ポリマー、とりわけポリエチレングリコール「ＰＥＧ」のようなポリアルキレンオキシドベースのポリマーは周知である（例えば、”Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｎｓ”， Ｊ． Ｍ． Ｈａｒｒｉｓ， Ｅｄ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （１９９２）； ”Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ｊ． Ｍ． Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ． Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｅｄｓ．， ＡＣＳ （１９９７）； 国際特許出願ＷＯ９０／１３５４０号、ＷＯ９２／００７４８号、ＷＯ９２／１６５５５号、ＷＯ９４／０４１９３号、ＷＯ９４／１４７５８号、ＷＯ９４／１７０３９号、ＷＯ９４／１８２４７号、ＷＯ９４／２８９３７号、ＷＯ９５／１１９２４号、ＷＯ９６／０００８０号、ＷＯ９６／２３７９４号、ＷＯ９８／０７７１３号、ＷＯ９８／４１５６２号、ＷＯ９８／４８８３７号、ＷＯ９９／３０７２７号、ＷＯ９９／３２１３４号、ＷＯ９９／３３４８３号、ＷＯ９９／５３９５１号、ＷＯ０１／２６６９２号、ＷＯ９５／１３３１２号、ＷＯ９６／２１４６９号、ＷＯ９７／０３１０６号、ＷＯ９９／４５９６４号、および米国特許第４，１７９，３３７号；第５，０７５，０４６号；第５，０８９，２６１号；第５，１００，９９２号；第５，１３４，１９２号；第５，１６６，３０９号；第５，１７１，２６４号；第５，２１３，８９１号；第５，２１９，５６４号；第５，２７５，８３８号；第５，２８１，６９８号；第５，２９８，６４３号；第５，３１２，８０８号；第５，３２１，０９５号；第５，３２４，８４４号；第５，３４９，００１号；第５，３５２，７５６号；第５，４０５，８７７号；第５，４５５，０２７号；第５，４４６，０９０号；第５，４７０，８２９号；第５，４７８，８０５号；第５，５６７，４２２号；第５，６０５，９７６号；第５，６１２，４６０号；第５，６１４，５４９号；第５，６１８，５２８号；第５，６７２，６６２号；第５，６３７，７４９号；第５，６４３，５７５号；第５，６５０，３８８号；第５，６８１，５６７号；第５，６８６，１１０号；第５，７３０，９９０号；第５，７３９，２０８号；第５，７５６，５９３号；第５，８０８，０９６号；第５，８２４，７７８号；第５，８２４，７８４号；第５，８４０，９００号；第５，８７４，５００号；第５，８８０，１３１号；第５，９００，４６１号；第５，９０２，５８８号；第５，９１９，４４２号；第５，９１９，４５５号；第５，９３２，４６２号；第５，９６５，１１９号；第５，９６５，５６６号；第５，９８５，２６３号；第５，９９０，２３７号；第６，０１１，０４２号；第６，０１３，２８３号；第６，０７７，９３９号；第６，１１３，９０６号；第６，１２７，３５５号；第６，１７７，０８７号；第６，１８０，０９５号；第６，１９４，５８０号；第６，２１４，９６６号参照）。
【００３４】
より好ましい「ポリマー」成分は、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。より好ましいポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドは、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシド反復単位を含む。よりいっそう好ましい「ポリマー」成分は、式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−の分子量約１０００ダルトン以上のポリアミドであり、そこでは、ＸおよびＹは、同じかまたは異なり、分岐状または直鎖状である二価のラジカルであり、ｎは、２〜１００、より好ましくは２〜５０の整数であり、ＸおよびＹのいずれかまたは両方は、直鎖状または分岐状の生体適合性で実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含む。その最も好ましい水溶性反復単位は、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシドを含む。そのような水溶性反復単位の数は大きく変わり得るが、そのような反復単位のより好ましい数は、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、最も好ましくは、２〜５０である。より好ましい実施形態の例は、ＸおよびＹの一方または両方が、−（（ＣＨ２）ｎ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）−または−（（ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）から選ばれるものであり、ここでｎ１は、１〜６、１〜５、１〜４、最も好ましくは１〜３であり、ｎ２は、２〜５０、２〜２５、２〜１５、２〜１０、２〜８、最も好ましくは２〜５である。非常に好ましい実施形態の例は、Ｘが−（ＣＨ２−ＣＨ２）−であり、Ｙが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）−である。
【００３５】
「ポリマー」成分あるいは１つ以上のスペーサーまたはリンカーは、存在する場合には、生物安定性または生物分解性であるポリマー鎖または単位を含み得る。例えば、反復結合を有するポリマーは、結合不安定性に応じて生理学的条件下での安定性の程度が変わる。そのような結合を有するポリマーは、低分子量の類似体の既知の加水分解速度に基づいて、生理学的条件下でのそれらの相対的な加水分解速度により分類され、例えば、より不安定なものからより安定なものについて、ポリカーボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリオルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞ポリアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）である。同様に、水溶性ポリマーを標的分子に付着させる結合システムは、生体安定性または生体分解性とすることができ、例えば、より安定なものからより不安定なものついて、カーボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞オルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞アミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）である。これらの結合は例として示されるものであり、本発明の水溶性ポリマーのポリマー鎖または結合システムにおいて用い得る結合のタイプを限定することを意図するものではない。
【００３６】
成分Ｊ＊は、負、正および中性からなる群から選ばれ、生理学的条件下で実効電荷を有するペンダント基の残基である。これは、置換または未置換のアルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、アシル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、アミド、アミノ基，カルボニル基等、ならびにそれらの塩を含む。好ましくは、中性基はアルキル基またはアルコキシ基であり、１〜１８個の炭素を含有する部分を含み得るが、それに限定されず、さらに直鎖状または分岐状とすることができる。帯電した基として提供される場合には、Ｊ＊はイオン性官能基を含む。官能基の例としては、カルボン酸、エステル、アミド、ニトリル、チオール、およびヒドロキシル基が含まれるが、これらに限定されない。そのようなＪ＊基は、アミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物、およびそれらの誘導体、ならびにキチン、キトサン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、デルマタンおよび硫酸デルマタン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸、リン脂質、シアル酸等のような成分とすることができる。Ｊ＊は、好ましくは、カルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ホスホリル、グアニジウム、イミダゾールおよびそれらの塩から選ばれたイオン性部分を含む。最も好ましいのは、Ｊ＊がイオン性カルボキシレート部分を含み、生理学的条件下で負の実効電荷を有する場合である。例えば、本発明の好ましいポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、３〜７の等電点を有し、従って、負の電荷を持つＪ＊基により、ｐｌの微調整に利用できる。
【００３７】
成分ｓ１、ｓ２およびｓ３は、同じまたは異なってもよいスペーサーまたはリンカー部分であり、個々に存在しても存在しなくてもよい。好ましいスペーサーまたはリンカーとしては、水溶性ポリマー中に用いられる１つ以上の反復単位、ジアミノおよびまたは二酸単位、天然または非天然アミノ酸もしくはそれらの塩、ならびに好ましくは１８個までの炭素原子または付加的なポリマー鎖さえも含むアルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、ヘテロアリール基、アルコキシ基等を含む脂肪族部分を含む直鎖または分岐状部分を含む。最も好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、ポリマー鎖を含む。
【００３８】
代わりに、上記の式Ｕｎ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−ポリマー−ｓ３−Ｊ＊は、「Ｕｎ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊」としてあらわすことができ、ここではｓ１、ｓ２およびｓ３基は存在しても存在しなくてもよい。
【００３９】
より好ましい「ポリマー」成分は、水溶性ポリマーＵ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−ポリマー−ｓ３−Ｊ＊が全体として段階的合成により製造されるものである。これにより、正確な分子量および定義された構造を有するポリマーの構成が可能になる。対照的に、標準的ポリマー合成は重合プロセスであって、鎖長が異なる混合物が得られ、従って、分子量およびサイズが分布し、この分離は不可能ではないとしても困難である。分子の純度を制御する能力は、水溶性ポリマーが付着されかつ単分散である合成タンパク質を構成できるという点で、有利である。このことは、異質な化合物の結果として得られる特性が変化するということを回避し、かつ最も好ましい特性を持つ化合物だけを比較的容易に調製および単離できるという点で、大いに有利である。
【００４０】
別の好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、１つ以上の不規則アミノ酸を含む。ここで使われているように、「不規則アミノ酸」は、非遺学伝的にコード化された側鎖、非遺学伝的にコード化されたバックボーン、非遺学伝的にコード化された置換されたＮαまたはαＣ（Ｏ）部分、あるいはそれらの組み合わせを有するアミノ酸、すなわちリボソームによって組み込まれた２０個の遺学伝的にコード化されたアミノ酸以外のものを指す。好ましい不規則アミノ酸の例としては、遺学伝的にコード化された官能基以外の一意的な官能基を持つ側鎖を有するアミノ酸、ならびに擬アミノ酸および様々なアミノ酸誘導体が含まれる。この点について、本発明により、合成赤血球産生刺激タンパク質の設計および／または構造における幅広い選択性および柔軟性が可能になる。発明品により用い得る非リボソーム的に組み込まれたアミノ酸の例として以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。すなわち、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、擬似グルタミン酸塩、γ−アミノブチレート、オルニチン、ホモシステイン、Ｎ置換アミノ酸（Ｒ． Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｔ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：９３６７−７１、ＷＯ９１／１９７３５号（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｔ．）、米国特許第５，６４６，２８５号（Ｂａｉｎｄｕｒ））、α−アミノメチレンオキシ酢酸（アミノ酸−Ｇｌｙジペプチド等配体）、α−アミノオキシ酸ならびに非遺学伝的に非コード化された側鎖官能基を有する他のアミノ酸および誘導体等である。チオアミド、ビニル型アミド、ヒドラジノ、メチレンオキシ、チオメチレン、ホスホンアミド、オキシアミド、ヒドロキシエチレン、還元アミドおよび置換還元アミド等配体ならびにβ−スルホンアミドが使用できる。「擬似アミノ酸」は、遺学伝的にコード化されたアミノ酸として同一のバックボーン構造および側鎖基を持つが、側鎖原子の原子組成が異なるアミノ酸を意味する。
【００４１】
好ましい実施形態においては、そのポリペプチド鎖の不規則アミノ酸に水溶性ポリマーが付着させられた合成赤血球産生刺激タンパク質が提供される。水溶性ポリマー付着のためにより好ましい不規則アミノ酸は、遺学伝的にコード化された官能基の存在下でこれと反応することなく用い得る化学選択的ライゲーション化学を使用する。
【００４２】
上記で言及したように、全体が段階的集合により作られる水溶性ポリマーは、単分散（ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）、例えば本発明の好ましいポリアミドエチレンオキシドとして作り得る。従って、別の好ましい実施形態は、水溶性ポリマーが単分散であるものである（すなわち、単一かつ構造的に定義された意図する分子種を含む分子的に均質な組成物）。また、合成赤血球産生刺激タンパク質は全体を化学合成により作り得るので、これらは単分散とすることもできる。そのような化合物には非常に純粋であるという利点があり、ヘテロ分散ポリマーを使用する場合のような精製および分析的特徴付けの問題が回避される。そのような化合物は、再現性のある投薬等の点に関しても有利である（例えば、糖タンパク質とＰＥＧ化組換え生産タンパク質との典型的な混合物とは対照的な単一分子種）。
【００４３】
上記で言及したように、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、２５ｋＤａ以上のモノマー分子量を持つことができる。本発明の目的のため、そのような分子量決定は、変性ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりなされるべきである。用語「モノマー分子量」は、タンパク質またはポリペプチドの複数のコピーを持つことがある合成タンパク質とは区別されるモノマー合成タンパク質の分子量を指すことを意図している。用語「モノマーポリペプチド分子量」は、そこに付着させられたポリマーおよび／またはタンパク質またはポリペプチドの複数のコピーを持つことがある合成タンパク質とは区別されるモノマーポリペプチドの分子量を指すことを意図している。より好ましくは、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のモノマー分子量は、４０ｋＤａ以上、より好ましくは５０ｋＤａ以上であり、最も好ましくは６０以上〜７０ｋＤａである。例えば、ＳＥＰ−１−Ｂ５１と呼ばれる本発明の好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質のモノマー分子量は、約７３ｋＤａである。しかしながら、さらに大きい構成物は本発明の範囲内に十分あるものと見なされる。
【００４４】
別の実施形態においては、本発明は、タンパク質のライゲーション部位に擬似アミノ酸を含み、任意にタンパク質に付着させた水溶性ポリマーを含む合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。これらの化合物は、システインのような化学選択的反応性官能基を含むＮ末端アミノ酸を有する第１のペプチドまたはポリペプチドを、α−カルボキシチオエステルのような化学的ライゲーション適合性Ｃ末端官能基を有する第２のペプチドまたはポリペプチドに結合し、さらに擬似グルタメートアミノ酸を形成するシステインチオール側鎖のカルボキシメチル化のようなライゲーション部位の未保護側鎖官能基を擬似アミノ酸に化学的に変換することにより、ライゲーション部位における未保護側鎖官能基を有するライゲーション産物を形成することにより製造される。天然型化学的ライゲーション部位のシステインの変換により形成された擬似アミノ酸は、本明細書中では「擬似天然型化学的ライゲーション」と呼ばれ、以下で詳細に説明される。
【００４５】
タンパク質のライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖に付着させられた水溶性ポリマーを含む合成赤血球産生刺激タンパク質も提供される。これらの化合物は、システインのような化学選択的反応性官能基を含むＮ末端アミノ酸を有する第１のペプチドまたはポリペプチドを、α−カルボキシチオエステルのようなライゲーション適合性Ｃ末端官能基を有する第２のペプチドまたはポリペプチドに結合し、ライゲーション部位における未保護側鎖官能基に水溶性ポリマーを付着させることにより、ライゲーション部位において未保護側鎖官能基を有するライゲーション産物を形成することにより合成される。
【００４６】
擬似アミノ酸化学的ライゲーションの利用および本発明の化学的ライゲーション部位ポリマー修飾方法により、従来技術に対する利点が提供され、その利点としては、別の方法では適切なライゲーション部位を欠く多様な範囲の赤血球産生刺激タンパク質の活発な合成、日常的な費用効率の高い方法で部位特定的ポリマー修飾が活用できる部位の拡張（および付着化学）、ならびにとりわけかなり大きい分子量の合成赤血球産生刺激タンパク質の合成が含まれる。それらは、水溶性ポリマー付着のための個々または複数の部位のスキャニングを含む、所望の生物学的特性を微調整するための高処理能力のアナログ化に特に適している。
【００４７】
上記で言及したように、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の生物学的特性は、ポリマー付着の部位と結合化学を正確に調整すると共に水溶性ポリマーの分子量、ポリマー組成、構造（例えば、直鎖状か分岐状かあるいはその混合）、およびペンダント基（例えば、帯電か未帯電かあるいはその混合）を正確に調整することによって修正できる。特に、半減期、および分岐等を改善するためにタンパク質の分子量を増加させることに加えて、タンパク質に付着させられた水溶性ポリマーは、合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列が基づく対応する生物学的に生産されたタンパク質の荷電にほぼ等しい等電点により測定されるような正確な電荷を合成赤血球産生刺激タンパク質が持つようにできる。これには、対応するリボソーム特定タンパク質の自然状態の荷電を模倣できるという利点がある。従って、本発明の好ましい実施形態は、上記の特徴ならびにそのために利用される水溶性ポリマー、特に事前に選択された位置に付着させ得る構造的に定義されたポリマー付加物を組み合わせる合成赤血球産生刺激タンパク質に向けられる。
【００４８】
特に、本発明の好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質（「ＳＥＰ」）は、好ましくはヒト尿ＥＰＯのポリマー修飾合成類似体である。好ましい実施形態においては、これらは、チオエーテル、オキシム、アミドまたはその他の結合を介して１つ以上のペプチド残基に付着させられた１つ以上の水溶性ポリマーを含んでいる。非常に好ましい実施形態においては、そのような結合は、ヒト尿ＥＰＯにおいて天然にグリコシル化された１つ以上の位置（すなわち、位置２４、３８、８３および１２６）にあるであろう。最も好ましくは、ＳＥＰ分子は、２つ以上のそのような位置にポリマー部分を有するであろう。他の実施形態においては、他のタンパク質残基はポリマー部分によって修飾できる。本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のための修飾位置は、タンパク質の無秩序なループ、領域またはドメイン、あるいは潜在的なプロテアーゼ切断部位またはその近くに位置する残基を含む。例えば、ポリマー修飾は、ＥＰＯの９、６９および／または１２５の１つ以上の位置に導入し得る。さらに、もし１つ以上の天然グリコシル化部位がポリマーで修飾されずに残った場合には、それらの領域中の１つ以上のアミノ酸を希望により他の残基に変換することができる、例えば、もし正の電荷が必要であれば、リジンに変換でき、負の電荷が必要な場合であれば、アスパラギン酸もしくグルタミン酸、あるいはアラニン等に変換し得る。本発明のＳＥＰ分子の総分子量は、約２５〜約１５０ｋＤａ、より好ましくは、約３０〜約８０ｋＤａである。分子量は、任意の類似体の修飾に利用される水溶性ポリマーの数および構造を増大または減少させることによって制御できる。
【００４９】
例えば、オキシム結合ポリマーＳＥＰ類似体は、好ましくは、アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能化した水溶性ポリマーをＳＥＰタンパク質に、側鎖アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能性を持つ非天然的にコード化されたアミノ酸において付着させることにより構成される。例えば、ＳＥＰ−０およびＳＥＰ−１の位置８９および１１７は、擬似グルタメート（式−ＣＨα−ＣＨ２−Ｓ−ＣＯＯＨの側鎖を有する非天然的にコード化されたアミノ酸（グルタメート側鎖−ＣＨα−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨと比較して））を含む。チオエーテル結合を利用しているＳＥＰ類似体は、好ましくは、システインまたはチオールを有する非天然アミノ酸により提供されるチオール官能性を含むように構成される。図１０は、好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質の１つのタイプの基本構造を示す。
【００５０】
他の実施形態においては、本発明のＳＥＰ分子は、ＥＰＯの天然のアミノおよびカルボキシ末端が再配置されている「円形に並べ替えられた」ＥＰＯ類似体を含み得る。最も好ましくは、そのような再配置により、アミノおよびカルボキシ末端が、無秩序ループ等のような、構造的拘束が小さい位置へ移動される。位置１２５および１２６周囲の無秩序ループ（天然のＥＰＯ残基ナンバリングシステムに関して）は、そのような再配置部位の例である。最も好ましくは、そのようなＳＥＰは、ジスルフィドフリーであり、事前選択された残基においてポリマー部分に含むように化学的に修飾される。
【００５１】
あるいは、ＳＥＰ分子は、自然発生グリコシル化部位、または位置１２６および１２５のようなグリコシル化を受けやすい他の部位へ再配置されたアミノおよびカルボキシ末端を持つことができる。ＳＥＰ分子は、電荷を除去または修正するためにアミノおよびカルボキシ末端の（カルボキシアミド化等によるような）修飾も含み得る。そのような円形に並べ替えられた分子の好ましい例において、新規なＮおよびＣ末端が位置１２６および１２５によりそれぞれ提供される。位置７、２９、３３および１６１の天然のジスルフィド形成システインは、好ましくは、ジスルフィドブリッジを形成できない非天然的にコード化されたアミノ酸、Ｌ−α−Ｎ−酪酸（Ａｂａ）、で置換される。残基Ｒ１６６、Ｅ３７およびＶ８２は、好ましくは、生産を改善するため、アラニンで置換される。また、付加的システインは、好ましくは、以下で「０」として番号付けられる天然ＥＰＯ番号方式に関して位置１と１６６との間に挿入される。結果として得られる分子は、４つのシステインを位置１２６、０、３８および８３に（Ｎ末端からＣ末端への方向に読んで）含み、これらは、（１）ライゲーション部位および（２）チオエーテル形成ｐＰＥＧ付着部位として利用される。任意に、付加的なｐＰＥＧ付着部位を提供するために、システインはＡ１２５に取って代わることができる。
【００５２】
本発明のそのようなＳＥＰ分子の総分子量は、約２５〜約１５０ｋＤａ、より好ましくは約３０〜約８０ｋＤａである。この分子量は、任意の類似体の修飾に利用される（ｐＰＥＧのような）ポリマーの数および構造を増減することによって制御できる。より大きい構成物についてのｐＰＥＧ仲介流体力学的ＭＷは、１００ｋＤａ以上である。任意のｐＰＥＧ付着部位は、位置１２５、９、および２４（Ｎ末端からＣ末端への方向に読んで）に位置する。付加的ＳＥＰ類似体設計は、上記の無秩序ループ領域の代替的ＮおよびＣ末端を有し、および／または新しいＮおよび／またはＣ末端から残基を切り取る。好ましい円形に並べ替えられた分子の基本構造を図１１に示す。図１２には、好ましい水溶性ポリマーの構造、ならびに種々の直鎖状および分岐状構成物を示す。
【００５３】
例えば、本明細書中の実施例に記載される特定のＳＥＰ構成物に加え、ヒトＥＰＯの天然配列を円形に並べ替えることによって配列を以下のやり方で設計した。すなわち、天然Ｎ末端Ａｌａ１およびＣ末端Ａｒｇ１６６は、別のＣｙｓ残基により結合され、従って、１６７アミノ酸のポリペプチドが得られ、新しいＮおよびＣ末端が、天然配列の残基１２５−１２６において鎖を分離させることによって作り出され、すべての天然Ｃｙｓ残基は、Ｌ−α−アミノ−ｎ−酪酸残基で置換され、さらに、以下の置換を行った。すなわち、Ｇｌｕ３７Ａｌａ、Ａｓｎ３８Ｃｙｓ、Ｖａｌ８２Ａｌａ、Ａｓｎ８３Ｃｙｓ、Ｓｅｒ１２６Ｃｙｓ、Ａｒｇ１６６Ａｌａ（すべての残基番号は、ヒトＥＰＯの天然配列に基づく）である。同時に、これらの設計要素の結果、示されるようなＳＥＰ−５のアミノ酸配列が得られる。ＳＥＰ−５−Ｌ２８タンパク質は、Ｃｙｓ残基１２６、０、２４、３８、および８３（ヒトＥＰＯ配列に基づく番号付け）において、マイケル付加反応によって、マレイミド修飾直鎖（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）６カルボキシレートポリマー構成物によってポリマー修飾された。これらの変更は、ＳＥＰ−５−Ｌ２８タンパク質の合成および取り扱いを改善するために設計された。設計された配列は、それぞれがＮ末端Ｃｙｓ残基を持つ４つのペプチドセグメントから作られた。化学的ライゲーション部位は、Ｃｙｓ０、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ８３であった。Ｃ末端ペプチドがα−カルボキシレートであるペプチドが合成され、他の３つのペプチドはα−チオエステルであり、このようにして、Ｎ末端Ｃｙｓ残基は、側鎖Ａｃｍ保護された。Ｃｙｓ２４は側鎖未保護であった。セグメントは、Ｃ末端の２つのセグメントで始め、天然型化学的ライゲーションにより逐次結合された。ライゲーション後、ライゲーション部位のフリーなＣｙｓ側鎖は、マイケル付加反応により、マレイミド修飾直鎖状（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）６カルボキシレートポリマー構成物と反応し、次にＣｙｓ側鎖Ａｃｍ保護基が除去され、次のセグメントのライゲーションとポリマー修飾が同様に実行された。Ａｃｍ基の除去後、次の（第４の）セグメントのライゲーションが実行され、最後のＡｃｍ基が除去されポリマー修飾が同様に実行されて、上記で説明し図３０に示した、円形に並べ替えられたポリマー修飾ＳＥＰ構成物が得られた。
【００５４】
ＩＩ．本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質の生産
ポリマー修飾赤血球産生刺激タンパク質は以前から記載されているが、本発明はそのような従来の試みとは顕著に異なる。例えば、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、全体的または部分的に化学合成される。さらに、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、１つ以上の特定のユーザー選択およびユーザー定義された部位で水溶性ポリマーにより修飾されている。
【００５５】
さらに、本発明における赤血球産生刺激タンパク質の合成的生産により、調製品中の全分子のユーザー選択およびユーザー定義された部位のそれぞれにそのような修飾が確実に存在するようにできる。合成のそのような均一性および制御により、本発明は先行技術の方法の使用に許されたランダム修飾から顕著に区別される。重要なことに、本発明により、どのような重要でない残基もポリマー付加物を含むように誘導体化し得る合成赤血球産生刺激タンパク質を設計できるようになる。さらに、そのようなユーザー選択およびユーザー定義された部位の各々について、ユーザーは、それを介してそのような付加物がポリペプチドまたはタンパク質バックボーンに結合される正確な結合（アミド、チオエステル、チオエーテル、オキシム等）を定義できる。加えて、特定部位に存在してほしい特定のポリマー付加物は変更および制御することができ、その結果、存在するすべてのタンパク質またはポリペプチドが正確に同じ誘導体化部位に正確に同じ誘導体化付加物を含む最終調製品が得られる。従って、本発明により、ポリマー修飾赤血球産生刺激ポリペプチドおよびタンパク質の均質調製品の形成が可能になる。
【００５６】
水溶性ポリマーを結合し得る付着部位の位置および数を変えるための手段の提供に加え、本発明により、結合ポリマーの性質を変えることが可能になる。どのような特定のユーザー選択およびユーザー定義された部位にも組み込み得るポリマー付加物は、任意の定義された長さとし得る。同様に、本発明の方法に従って、種々の部位において種々の長さのポリマーを使用することが可能である。従って、１つの実施形態において、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、水溶性ポリマー付加物でモノ修飾またはポリ修飾し得る。１つ以上のポリマー付加物が特定のポリペプチドまたはタンパク質中に導入される場合、使用されるポリマーは、「単種分化」、「多種分化」、「均一種分化」、または「多様に種分化」されたものとし得る。本明細書中で用いられているように、用語「単種分化された」は、単一種のポリマーにより修飾されたタンパク質またはポリペプチドを意味する。対照的に、用語「多種分化された」は、２つ以上のポリマー種により修飾されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。そのような多種分化されたポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾された各部位において、同じ単一のポリマー種が存在すれば「均一種分化された」と呼ばれる。対照的に、多種分化されたポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾された部位が異なるポリマー種で修飾されていれば、「多様に種分された」と呼ばれる。
【００５７】
さらに、ユーザー選択およびユーザー定義された各部位におけるポリマー付加物の直鎖性または分岐性の程度を変えることが可能である。従って、ポリマー付加物は、直鎖状、分岐状、または均一分岐状とし得る。用語「均一分岐状」は、特定部位におけるポリマーのすべての分岐が同じ構造および長さを有することを意味する。理解されるように、本発明により、任意の個々の分岐の長さならびにそのような分岐点に存在するポリマー構造の両方を独立して変えることが可能になる。
【００５８】
要約すると、本発明により、ポリペプチドまたはタンパク質バックボーン中のポリマー修飾され、ユーザー選択およびユーザー定義された部位の（１）位置および（２）頻度を定義すること、ならびにそのような部位の各々に存在する分岐の（３）長さ、（４）種、および（５）程度を制御することが可能になる。加えて、複数のポリマー修飾を有するポリペプチドおよびタンパク質に関して、上記で確認した５つの変数の各々を各部位について独立して定義することが本発明により可能になる。さらに、分岐ポリマー修飾を有する合成赤血球産生刺激ポリペプチドおよびタンパク質に関して、上記で確認した５つの変数の各々を各分岐点について独立して定義することが本発明により可能になる。これは、存在しかつ不要なポリマー付着により妨害されずにいる２０個の遺学伝的にコード化されたアミノ酸側鎖のいずれかまたはすべての多重コピーを有する正確にポリマー修飾された合成赤血球産生刺激タンパク質の均質組成物の合成を考慮している。
【００５９】
従って、本発明により、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の設計、合成および使用における大きな柔軟性がもたらされる。例えば、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質のアミノ酸配列は、それが基づく遺学伝的にコード化されたタンパク質のアミノ酸配列に関する１つ以上の欠失、挿入または置換を含み得る。アミノ酸配列は、擬似アミノ酸または不自然な側鎖等を持つ他のアミノ酸、例えば水溶性ポリマーをそれに付着させるための一意的な化学選択的官能基を持つように修飾されたもの、などの１つ以上の不規則なアミノ酸で置換できる。従って、水溶性ポリマーは、不規則アミノ酸、または遺学伝的にコード化されたアミノ酸を介して付着させ得る。水溶性ポリマーは直鎖状または分岐状とすることができ、カルボン酸、脂肪族、アミドまたはアミンのような化学的部分を含む末端基を有し得る。さらに、水溶性ポリマーは単分散とすることができ、すなわち、正確に定義された構造および組成の単一分子種を含むように作り得る。従って、水溶性ポリマーは、それで修飾された標的タンパク質の半減期、免疫原性、効力、貯蔵安定性、投与量、デリバー可能性等を正確に調整する特徴を含むように設計できる。
【００６０】
特に、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質の生産は、以下の段階を有するものとして想定できる。すなわち、設計、ペプチド合成、ペプチドライゲーション、タンパク質生成のための完全長ライゲーション産物の折りたたみ、およびタンパク質の生物活性評価である。ポリマー修飾は、ペプチド合成、ライゲーションまたは折りたたまれた産物の段階の１つ以上で実行できることを本発明者らは見出した。しかしながら、ポリマーを、ペプチドまたは折りたたみ前のライゲーション産物に付着させることが好ましい。このようにして生産された所望の生物活性を示すタンパク質は、選択されて、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質となる。
【００６１】
好ましい方法においては、合成赤血球産生刺激タンパク質を構成するポリペプチド鎖は、合成赤血球産生刺激タンパク質の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合して作られる。特に、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質分子は、当該合成赤血球産生刺激タンパク質分子のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合して作られ、そこではライゲーションに用いられる１つ以上のペプチドセグメントは、ユーザー定義および事前選択された部位において水溶性ポリマーが付着されている。次に、ポリマー修飾ポリペプチド鎖は折りたたまれて、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を生産することができる。
【００６２】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を生産する別の好ましい方法は、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合する段階と、その１つ以上の化学的ライゲーション部位におけるアミノ酸の側鎖に１つ以上の水溶性ポリマーを付着させる段階とを含む。次に、ポリマー修飾ポリペプチド鎖は折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を生産する。
【００６３】
それほど好ましくはないが、合成赤血球産生刺激タンパク質は、（１）合成赤血球産生刺激タンパク質のポリペプチド鎖の非重複アミノ酸配列を含むペプチドセグメントと化学的に結合して、合成赤血球産生刺激タンパク質に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、少なくとも１つのペプチドセグメントが、第１の化学選択性官能基を有する不規則アミノ酸を含み、（２）ポリペプチド鎖を折りたたみ、（３）第１の化学選択性基と一意的かつ相互に反応する第２の化学選択性基を含む水溶性ポリマーをそれに付着させることにより作ることができる。
【００６４】
特に、本発明において具体化され、かつ実施例において例証されるこれらの多様なプロセスは、図面において合成赤血球産生刺激タンパク質について一般に示されるように例示され得る。例えば、図１Ａ〜図１Ｅには、ライゲーションの前もしくは後またはそれらの組み合わせにおける、部分的または完全に未保護のペプチドセグメント
【化１】
2004515471.tif 000002
への水溶性ポリマー（本明細書中で定義されるＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊）の付着を伴うライゲーションの図式が示してある。図１Ａ〜図１Ｄにおいては、Ｙａａは、一意的な化学選択性部分（例えば、α−カルボキシルチオエステルを持つアミノ酸）を持つ第１のペプチドセグメント上のＣ末端アミノ酸で、前記部分は、Ｙａａとの化学選択的化学的ライゲーションが可能な一意的かつ相互に反応性のＮ末端アミノ酸Ｘａａ（例えば、アミノ末端システイン）部分を持つ第２のペプチドセグメントへの化学的ライゲーションのための部分である。ＹａａとＸａａとの間の化学選択的反応により、それらの間に共有結合的結合が生成する（例えば、アミド結合）。従って、ＹａａおよびＸａａは、化学選択的ライゲーション対を形成する。Ｕｎ−は、図に示されるように、アミノ酸の側鎖上の正確なユーザー定義部位に組み込まれ、さらに水溶性ポリマーＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊の基Ｕ−に対し化学選択的かつ相互に反応性の第２の一意的な化学選択的部分を表す。例えば、Ｕｎがケトン基を持つように修飾された側鎖である場合、水溶性ポリマーＵ−ポリマー−Ｊ＊は、ケトンと反応する化学選択的な基、例えば、その間にオキシム結合を作り出すアミノオキシ基である。Ｕｎ−の添字「ｎ」はアミノ酸の数を表し、それらの側鎖は、化学選択的基Ｕを持つように設計されており、例えば、２つの特定的かつユーザー定義部位がポリマー修飾される場合にはｎ＝２であり、これはＵ２またはＵｎ＝２と表すこともできる。すべての場合において、ｎは設計により正確に制御される正の整数である。従って、ＵｎおよびＵは、ＸａａおよびＹａａの化学選択的基と両立できかつこれと非反応性の第２の化学選択的ライゲーション対を表す。図１Ａおよび図１Ｂは、２つの異なる可能な反応を例示するものである。図示された第１の反応において、Ｕｎ官能性を持つポリペプチド鎖は第２のポリペプチドに結合され、次に、ポリマー修飾ポリペプチドを得るために、Ｕ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊部分と反応させられる。描かれた第２の反応において、ポリマー修飾ポリペプチドを得るために、Ｕｎ官能性を持つポリペプチド鎖はＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊部分と反応させられ、次に、より大きいポリマー修飾ポリペプチドを得るために、第２のポリペプチドに結合される。これらの図は、図１Ａにおいては、Ｘａａ残基を持つポリペプチドがポリマー修飾を受け、それに対して、図１Ｂにおいては、Ｙａａ残基を持つポリペプチドがポリマー修飾を受けるという点で異なる。図１Ｃは、より大きいポリペプチドを形成するため、複数のポリペプチド鎖をそのライゲーションの前もしくは後に修飾する本発明の能力を例示するものである。図１Ｄにおいては、ＰＧおよびＰＧ’は保護基を表しており、そこでは、ＰＧ’は直交保護基を示し、すなわち、ＰＧおよびＰＧ’は異なる条件下で除去可能であり、かつ異なる水溶性ポリマーが同じ化学を介してＵｎ基に付着させられている場合、あるいはＵｎ基が、ポリマー修飾したくない側鎖官能基である場合（例えば、水溶性ポリマーのＵ基が第１アミノまたは側鎖チオールともっぱら反応するように設計されている場合の反応性の−ＮＨ２または−ＳＨを持つ側鎖）に有用である。図１Ｄは、本発明���方法に従って結合されているポリペプチドの所望の側鎖を保護するために保護基が使用できることを示している。
【００６５】
図１Ｅは、図１Ａ〜図１Ｄによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を例示するものである。
【００６６】
図２Ａ〜図２Ｃは、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの付加的な概略図を示す。特に、図２Ａ〜図２Ｂは、ライゲーション部位（例えば、システインの側鎖チオール）におけるアミノ末端基Ｘａａの側鎖への水溶性ポリマーＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊の付着を伴うライゲーションの図式を示す。図２Ｃは、図２Ａ〜図２Ｂによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を例示するものである。
【００６７】
図３Ａ〜図３Ｂは、３つ以上の非重複ペプチドセグメントの化学的ライゲーションを伴うマルチセグメントライゲーションを達成するためのプロセスの付加的な図式を示す。すなわち、少なくとも一つのセグメントは、最終的な完全長ライゲーション産物に対応する中央セグメントである。このようにして調製されたペプチドは、例えば図１Ａ〜図１Ｅ、図２Ａ〜図２Ｃ、および図４Ａ〜図４Ｃに示されるような別のライゲーション反応に関与するペプチドセグメントを調製するために用い得る。一般に、マルチセグメントライゲーションについては、中央セグメントは、使用されるライゲーション化学に応じて、そのペプチドの環化または鎖状体形成を回避するために、保護されたＸａａ基または保護されたＹａａ基を有している。逐次または連続ライゲーションについては、中央セグメントのＸａａ基が保護されている（例えば、Ｃｙｓ（Ａｃｍ））のに対して、Ｙａａ基は未保護である（例えば、Ｙａａ−ＣＯＳＲ。ここでＣＯＳＲは、α−カルボキシルチオエステルである）。ここでは、Ｙａａ基は、未保護Ｘａａ基を持つ第２のペプチドと自由に反応し、そこでは第２のペプチドはフリーなＹａａ基を欠いている。ライゲーションに続き、次のライゲーション反応用にＸａａ基を再生するために保護基が除去される。このプロセスは必要なだけ続けることができ、それにより、伸長されたポリペプチド鎖が生成される。Ｙａａ基の保護は、４つ以上のセグメントで構成される最終的なライゲーション産物の生産を伴う収束的化学的ライゲーションの場合に特に有用である。例えば、４セグメントライゲーションから生成されたタンパク質標的（すなわち、３つのライゲーション反応）の場合、タンパク質の一端に対応する２つのセグメントと、タンパク質の他端に対応する２つのセグメントは、逐次的とは対照的に並行して結合でき、２つの端部は最終的ライゲーション反応において接合される。そのような収束的化学的ライゲーション方式も、直交ライゲーション化学を用いることができる。ここで再び、そのようなペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性を図１Ｅ、図２Ｃおよび図４Ｃに例示する。
【００６８】
図４Ａ〜図４Ｃは、本発明の原理に従って、結果として得られる側鎖チオールの天然型化学的ライゲーションおよび化学修飾がどのように達成し得るかを例示するものである。特に、図４Ａ〜図４Ｂは、チオアルキル化およびチオエーテル結合を含む化学的に修飾された側鎖（Ψで表される）を介しての「擬似アミノ酸」（ΨＸａａで表される）を形成するために、ライゲーション部位における結果として得られるシステイン側鎖チオールの天然型化学的ライゲーションおよび化学修飾を示している。図示してない別の実施形態においては、側鎖チオールは脱硫反応においてアラニンに変換できる（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （２００１） １２３（４）：５２６−５３３）。両方の反応にとって重要な観点は、変換または修飾したくない他のどのような側鎖チオールも、適切な保護基（ＰＧ）により保護され、あるいはマルチセグメントライゲーションの場合には直交保護基（ＰＧ’）で保護され、そこではカルボキシ末端Ｙａａ基を持つセグメントは保護されたアミノ末端Ｘａａ基、すなわちＰＧ−Ｘａａ−ペプチドを含み、これは一例として図４Ｂに示してある。図４Ｃには、図１Ａ〜図１Ｅ、図２Ａ〜図２Ｃ、および図３Ａ〜図３Ｂだけでなく、図４Ａ〜図４Ｂによるライゲーションおよびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメント中に存在するかまたは存在しない基の多様性が示してある。
【００６９】
設計と併せて、ポリペプチドバックボーンの合成に利用されるペプチドまたはポリペプチドセグメントが構成される。これは、様々なポリペプチドバックボーンセグメントを集合させるために選択されたライゲーション化学、所与の標的タンパク質のために選択されたポリマー付着化学、および特定のポリマー付着部位に基づいて選ばれる適切なライゲーション部位の選択を伴う。天然型化学的ライゲーションが使用される場合、システインライゲーション部位は、適切な自然発生システイン残基について標的ポリペプチドバックボーンのアミノ酸配列をスキャニングすることにより決定される。本明細書中に記載されるように、拡張天然型化学的ライゲーションが使用される場合、スキャニングライゲーション部位は、Ｘａａ−Ｇｌｙ部位のような強いライゲーションを可能にする適切な自然発生ライゲーション部位接合部について標的ポリペプチドバックボーンアミノ酸配列をスキャニングすることにより選択し得る。拡張天然型化学的ライゲーションは、システイン残基におけるライゲーションに限定されないので、任意の数の残基がライゲーション部位接合部となり得る。いくつかの例では、天然型および拡張天然型化学的ライゲーションの組み合わせを設計の一部とし得る。
【００７０】
好ましい実施形態において、天然型化学的ライゲーションは、完全長ポリペプチド鎖の一部または全部の生成に用いられる。合成赤血球産生刺激タンパク質の基になる自然発生タンパク質中に存在するシステインは、化学的ライゲーション部位として用い得る。しかしながら、好ましいライゲーション接合部が適切なシステインを欠いている場合には、その位置の非システインアミノ酸は、その部位での天然型化学的ライゲーションを可能にするため、システインと置き換えることができる。もし必要であれば、新規に導入されたシステインは、本明細書中に記載されるように、その位置でオリジナルのアミノ酸に対応する擬似アミノ酸残基に変換できる。あるいは、ポリマー修飾のためにシステインがある部位に導入される場合、標的ポリペプチド中の修飾したくない他のすべてのシステインが保護されていれば、側鎖チオールは、チオール反応性水溶性ポリマー構成物の付着に利用できる。
【００７１】
別の好ましい実施形態においては、拡張天然型化学的ライゲーションは、ここに記載されるように、完全長ポリペプチドの一部またはすべてを生成するために利用できる。この方法のため、Ｎ末端のＮα置換された２ないし３つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸が用い得る。そのような残基（ライゲーションに用いられるペプチドまたはポリペプチドセグメントのＮ末端に存在する場合）は、本明細書中に記載の拡張天然型化学的ライゲーションの方法に従って、Ｃ末端α−カルボキシチオエステル部分を有するポリペプチドへ当該ポリペプチドを結合するのに有利に使用できる。
【００７２】
一般的には、ペプチド合成には、標準的な自動ペプチド合成器を用いる段階的標準Ｂｏｃおよび／またはＦｍｏｃ固相ペプチド合成が用いられ、または標準プロトコルに従って手作業で行うか、あるいは商業ベンダーから注文および購入される。（”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，”Ｇ． Ａ． Ｇｒａｎｔ， Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９２ ； ”Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９３； ”Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９４； ａｎｄ ”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，” Ｐ． Ｊ． Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ， Ｅｄ．， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ， １９９４ ； ”Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅｄｓ． Ｗ． Ｃ． Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐ． Ｄ． Ｗｈｉｔｅ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０００）。天然型化学的ライゲーションのためのようなチオエステル仲介ライゲーションに利用されるペプチドについては、標準的プロトコルに従って同様に作ることができる。（例えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９４） ２６６： ７７６−７７９； Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９９５） ３６： １２１７−１２２０； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９６／３４８７８号； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２８４３４号； Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＣＳ （１９９９） １２１ （４９）： １１３６９−１１３７４； およびＨａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． （１９９９） ９６： １００６８−１００７３）； 上記のＡｍｉａｔｏ ｅｔ ａｌ．参照）。
【００７３】
水溶性ポリマーのライゲーションおよび部位特定的付着については、不要な付着を作り出す副反応を回避するため、化学的直交戦略がペプチド合成（例えば、図１〜図４および実施例を参照）に用いられる。例えば、ライゲーション設計およびポリマー付着方法に応じて、種々の直交合成戦略が利用できる。特に、付着させるべき水溶性ポリマーの性質、および特にこれをポリペプチドに結合するための官能基が、例えば本発明の好ましいグリコ模倣（ｇｌｙｃｏ−ｍｉｍｅｔｉｃ）ポリマーについて下記で論じるように、考慮される。
【００７４】
特に、水溶性ポリマーは、ライゲーションに用いられる標的ペプチド、完全長物質または折りたたまれたポリペプチド上の一意的官能基と選択的に反応性の一意的官能基Ｕを含むようにされる。化学合成が用いられる時、ペプチドは、相互に反応性の化学選択的基を、正確なユーザー定義部位に含むようにされる。本発明のこの観点は、ペプチド合成（保護基戦略）および化学的ライゲーション（部分的または無保護基戦略）の原理を具体化する。保護基戦略については、水溶性ポリマー上の所望の官能基を除くすべての潜在的な反応性官能基および標的分子上に存在するその相互に反応性の官能基が、適切な保護基によりブロックされる。多くの保護基が周知であり、この目的に適している（例えば、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９９； ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ ２０００； ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，” Ｇ． Ａ． Ｇｒａｎｔ， Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９２； ”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｗ． Ｄ．． Ｂｅｎｎｅｔ， Ｊ． Ｗ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｌ． Ｋ． Ｈａｍａｋｅｒ， Ｍ． Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｍ． Ｒ． Ｒｈｏｄｅｓ， ａｎｄ Ｈ． Ｈ． Ｓａｎｅｉｉ， Ｅｄｓ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ， １９９８ ； ”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９３； ”Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９４；および”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，” Ｐ． Ｊ． Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ， Ｅｄ．， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ， １９９４参照）。
【００７５】
従って、水溶性ポリマーは、上記に記載されるような広範囲の官能基を有するように作り得る。部分的保護基戦略または無保護基戦略については、ポリマー上の官能基および標的ペプチドまたはポリペプチド上に存在するその相互に反応性の官能基は、他の官能基が反応系中に存在し得るが非反応性である化学選択的反応対を用いる。これには、アミン捕獲戦略（例えば、ヘミアミナール形成、イミン形成、およびマイケル付加によるライゲーション）、チオール捕獲戦略（例えば、メルカプチド形成、ジスルフィド交換によるライゲーション）、天然型化学的ライゲーション戦略（例えば、システインまたは側鎖アミノ酸誘導体含有チオールのチオエステル交換によるライゲーション）、および直交ライゲーションカップリング戦略（例えば、チアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド形成、およびアミド形成によるライゲーション）ができる基が含まれる（例えば、Ｃｏｌｔａｒｔ， ＤＭ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ （２０００） ５６：３４４９−３４９１参照）。
【００７６】
この実施形態に好ましい化学選択的Ｕ基は、天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９４） ２６６：７６６−７７９； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９６／３４８７８６６号）、拡張一般化学的ライゲーション（Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２８４３４号）、オキシム形成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９４） １１６：３０−３３）、チオエステル形成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９２） ２５６：２２１−２２５）、チオエーテル形成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． （１９９５） ３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン形成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． （１９９４） ５（４）：３３３−３３８）、チアゾリジン形成ライゲーションおよびオキサゾリジン形成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９８） ９５（１６）：９１８４−９１８９； Ｔａｍ， ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／００８４６号）または他の方法（Ｙａｎ， Ｌ． Ｚ． ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ， Ｐ． Ｅ．， ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ，” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００１， １２３， ５２６−５３３， 参照により本明細書に組み込まれる； Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ２００１ ３ （９）： １３３１−１３３４； Ｓａｘｏｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．，”Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ” Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ． Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ２０００， ２， ２１４１−２１４３）のような水性両立ライゲーション化学で用いられる一意的官能基の残基を含む。
【００７７】
上記で記載される種々の付着化学を考えると、水溶性ポリマーと標的ペプチドまたはポリペプチドとの間で形成された結合は、カーボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等から選ばれた結合の残基を含み得る。最も好ましい結合は、オキシムおよびアミド結合である。
【００７８】
例えば図１〜図４に示されるようなペプチドライゲーション段階は、固相または液相ライゲーション戦略を用い得る。図８は、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のライゲーションおよび生産に使用できるペプチドセグメントへの水溶性ポリマーの精密な付着のための別の経路を示すものである。第１ステップは固相ペプチド合成（「ＳＰＰＳ」）（例えば、ＦｍｏｃまたはＢｏｃＳＰＰＳ）が用いられ、そこではポリマー付着の標的とされたアミノ酸側鎖は、直交保護基で保護される（例えば、ＦｍｏｃＳＰＰＳを用いるのであれば、ポリマー付着部位を保護するのにＢｏｃ基を用いることができ、ＢｏｃＳＰＰＳを用いるのであれば、直交保護基としてＦｍｏｃ基を用いることができる）。ペプチド合成に続いて、直交保護基が選択的に除去されるのに対して、ペプチドの残りは保護されたままである。これにより、次のステップである固相ポリマー合成のための単一付着部位がもたらされる。ひとたび直交保護基が除去されると、ポリマー鎖は前駆体として付着させられる。より好ましくは、ポリマー鎖は、図６Ａ〜図６Ｄに示されるプロセスを用いたポリマー合成の連続的ラウンドで作られる。単一ポリマー付着部位が示してあるが、２つ以上が提供できる。図９は概括的な反応方式を示すものである。
【００７９】
上記で述べたように、化学的ライゲーションは、第１の化学成分と第２の化学成分との間の選択的な共有結合的結合の形成を伴う。第１および第２の成分上に存在する一意的で相互に反応性の官能基は、ライゲーション反応を化学選択的にするために使用できる。例えば、ペプチドおよびポリペプチドの化学的ライゲーションは、適合できる一意的で相互に反応性のＣ末端およびＮ末端アミノ酸残基を持つペプチドまたはポリペプチドの化学選択的反応を伴う。この目的のためにいくつかの異なる化学反応が用いられており、その例としては、天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９４） ２６６：７７６−７７９； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９６／３４８７８号； Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２８４３４号）、オキシム形成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９４） １１６：３０−３４）、チオエステル形成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９２） ２５６：２２１−２２５）、チオエーテル形成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． （１９９５） ３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン形成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． （１９９４） ５（４）：３３３−３３８）、チアゾリジン形成ライゲーションおよびオキサゾリジン形成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９８） ９５（１６）：９１８４−９１８９； Ｔａｍ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９５／００８４６号； 米国特許第５，５８９，３５６号）； Ｇｉｅｓｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ （Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ． （２００１） ３（９）：１３３１−１３３４； ａｎｄ Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ａｍｋｄｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ （Ｓａｘｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． （２０００） ２：２１４１−２１４３）が含まれる。従って、理解されるように、そのような目的に適したどのような化学選択的反応化学も未保護ペプチドのライゲーションに適用可能である。
【００８０】
任意のライゲーション化学のための反応条件は、ライゲーションに使用されるペプチドまたはポリペプチドセグメントの所望の相互作用を維持するように選択される。例えば、ｐＨおよび温度、ライゲーションラベルの水溶性、第１のセグメントと第２のセグメントとの比、反応混合物の含水率および組成を改変してライゲーションを最適化できる。所望のライゲーション反応の特異性および速度を制御するため、すなわちペプチドまたはポリペプチドセグメントの可溶性を操作することによって反応性基の暴露および表出を制御するため、ライゲーションセグメントを種々の程度に可溶化する試薬の付加または除外をさらに用い得る。反応条件は、１つ以上の内部および／または外部対照と比較した所望の化学選択的反応生成物についてアッセイすることにより容易に決定される。
【００８１】
Ｎ末端システイン残基を有するポリペプチドとの接合をライゲーションが伴う場合、好ましくは天然型化学的ライゲーションの手順が使用される（Ｄａｗｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９４） ２６６：７７６−７７９； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９６／３４８７８号； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２８４３４号））。この方法論は、ライゲーション部位で天然アミド結合を生成するための確固たる方法論であることが判明した。天然型化学的ライゲーションは、Ｃ末端α−カルボキシチオエステル部分を有する第１のペプチドまたはポリペプチドセグメントと、Ｎ末端システイン残基を有する第２のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択的反応を伴う。チオール交換反応は、最初のチオエステル結合された中間体を作り出し、これは自然に再配列して、ライゲーション部位で天然アミド結合を与え、そして一方でシステイン側鎖チオールを再生する。多くの例において、天然タンパク質の配列は、天然型化学的ライゲーション反応において、Ｎ末端システイン残基を有するポリペプチドフラグメントが合成および使われるように、適切に配置されたシステイン残基を含む。他の例においては、ペプチド合成は、システイン残基をこの目的のためのポリペプチドに導入するために実施できる。従って、その標準的形態において、天然型化学的ライゲーションは、標的ポリペプチド配列中のシステイン残基におけるチオエステル仲介された化学選択的反応を伴い、ペプチド結合がライゲーション部位で形成され、Ｃｙｓの側鎖は天然形状に再生される。
【００８２】
あるいは、本発明のタンパク質は、「擬似天然型化学的ライゲーション」または「拡張天然型化学的ライゲーション」を使用して合成し得る。擬似天然型化学的ライゲーションは、タンパク質合成に使用されるペプチド中の事前選択された位置における非天然的に生じる擬似アミノ酸残基の使用を伴う（例えば、図４参照）。そのような擬似アミノ酸の構造は、システインの構造および合成されているタンパク質中のそのような事前選択された位置に天然に見出されるアミノ酸の構造の両方を模倣する。従って、擬似天然型化学的ライゲーションは、ライゲーション部位において天然型化学的ライゲーションから生成されたシステイン側鎖のチオアルキル化に向けられる。好ましい態様は、システインライゲーション部位におけるチオアルキル化であり、そこでは少なくとも１つのペプチドは、チオール側鎖が適切な保護基で保護された天然システインを含んでいる。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態においては、システイン基のチオール部分は所望の側鎖、例えばリボソーム特定アミノ酸の側鎖、そのようなアミノ酸の類似体、または非リボソーム特定（ｎｏｎ−ｒｉｂｏｓｏｍａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）アミノ酸へ修飾される。本明細書中で用いられるように、リボソーム特定アミノ酸は、タンパク質翻訳のプロセスにおいてリボソームにより認識され、リボソームによって作り出されたタンパク質中に組み入れられ得るアミノ酸である。システイン側鎖チオール部分の化学的修飾を記載した刊行物がかなり存在する（例えば、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，” Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ： Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａ／．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ （２０００））。Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．は、自然発生アミノ酸側鎖の化学特性を模倣するために、システイン残基側鎖の変換を記載している（例えば、Ｋａｉｓｅｒ， Ｅ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８４ Ｎｏｖ ２； ２２６ （４６７４）： ５０５−１１）。加えて、ラベルをペプチドまたはタンパク質中に導入するためのシステイン側鎖の使用が記載されている。システイン側鎖修飾は、「タンパク質結合および架橋の化学」（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）， Ｓ． Ｓ． Ｗｏｎｇ， （１９９１， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、「タンパク質の化学的修飾」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）， Ｇａｒｙ Ｅ． Ｍｅａｎｓ ｅｔ ａ／．， （１９７１， Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ）、「タンパク質の化学的修飾：選択された方法および分析手順」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）， Ｇｌａｚｅｒ， Ａ． Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９７５， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、「タンパク質修飾のための化学試薬」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）， ＲＬ Ｌｕｎｄｂｌａｄ （１９９１， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）で概説されている。Ｔａｍら（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ （１９９８）４６：３１９−３２７）は、非Ｃｙｓ天然型化学的ライゲーションのためのホモシステイン（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ）の使用に続き、ホモシステイン側鎖を天然メチオニン側鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３）に変換するためにメチルｐ−ニトロベンゼンスルホネート（メチル化試薬）を使用するチオアルキル化を開示している。本発明は、ホモシステインを擬似アミノ酸、すなわちメチオニン以外のアミノ酸に変換するためにも用い得る。しかしながら、本明細書中に記載されるシステインの変換と同様に、本発明に従って、変換したくない少なくとも１つの天然システインを含むペプチドのためのジスルフィドペアリングに関与する天然システインの破壊を避けるために保護基を用いる必要である。適切な保護基は以下に記載する。
【００８４】
擬似天然型化学的ライゲーションの方法は、所定のリボソーム特定アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、およびプロリン）（ただし、アラニンの側鎖は、脱硫反応により形成し得る）（Ｌｉａｎｇ， Ｚ．Ｙ． ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ， Ｐ．Ｅ．， ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ，” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００１， １２３， ５２６−５３３、参照により本明細書に組み込まれる）の側鎖の模倣を容易にはしないのであるが、多くのリボソーム特定または非コード化アミノ酸を模倣する側鎖を形成するために用いることができる。本発明の擬似天然型化学的ライゲーション方法に従って産生されたアミノ酸はチオエーテル結合を含み、β分岐を全く持たない（それらすべてがβ位置にメチル基を含んでいる、すなわちａａ−ＣＨ２−Ｓ−、という点で）。従って、β分岐アミノ酸、イソロイシンおよびトレオニンの擬似アミノ酸バージョンは、β幾何学およびそれに付随する制約を有することなく、ペンダント側鎖構造を持たせ得る。
【００８５】
重要なことに、本発明の方法は、リボソーム特定アミノ酸の長さと同じ長さ、あるいはそのような長さよりも長いまたは短いアミノ酸側鎖の形成に用い得る。側鎖長さのそのような改変は、三次元コンホメーションを安定化（または不安定化）してタンパク質安定性を増大させる（またはタンパク質のコンホメーションを改変し、それによって自然発生タンパク質により受け入れられたそれらと関連する広範囲の基質、インヒビター、受容体、リガンド等を受け入れるタンパク質の能力を強化する）ために用い得る。例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＯＯＨにより、Ｃｙｓ−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（そのような「擬似グルタミン酸」は１つの付加的側鎖原子、すなわち−Ｓ−基を有する。代わりに、アスパラギン酸の代わりに用いられれば、２つの付加的側鎖原子、すなわち−ＣＨ２−Ｓ−基を有する）が生じる。他の側鎖は、側鎖中に同数の原子を有しているが、チオエーテル結合（−Ｓ−）を含む点が異なる。例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＰＧに続いて、ＰＧを除去することにより、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２が生じる。結果として得られる構造は、側鎖中に付加的な原子を全く持っていないが、１つの−ＣＨ２−基が−Ｓ−で置き換えられる。メチオニンはここでは別の例であり、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ＋Ｉ−ＣＨ２−ＣＨ３によりＣｙｓ−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３（Ｍｅｔ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３の天然のｍｅｔ構造に対して）が生じ、従って、チオエーテルが再配置される。アルギニンも同様である。すなわち、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｂｒ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（（−ＮＨ２）（＝ＮＨ２＋））により、Ｃｙｓ−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（（−ＮＨ２）（＝ＮＨ２＋））が生じる。好ましくは、反応性アミノ基の保護は、とりわけ構成擬似リジンについて、不要な副反応を回避するために用い得る。ひとたびチオアルキル化反応が実行されれば、保護基は除去し得る。
【００８６】
一般に、自然発生タンパク質をできる限り綿密に模倣することが要望される場合、タンパク質のそのような位置に普通存在するリボソーム特定アミノ酸の長さと同じ長さである側鎖長さを有する擬似アミノ酸分子を使用することが最も好まれ、リボソーム特定アミノ酸の長さより１原子分長い側鎖長を有する擬似アミノ酸分子を用いることはあまり好まれず、さらに、リボソーム特定アミノ酸の長さより２原子分長い側鎖長を有する擬似アミノ酸分子を用いることはさらに好まれない。さらに、遺学伝的変化が機能を混乱させないと思われる、または関連したタンパク質中のその部位のアミノ酸が保存されているシステインライゲーション部位を選択することが好まれる。そのような部位は、アラニンスキャニング、相同性モデリングおよびその他の方法によって同定できる。
【００８７】
擬似天然型化学的ライゲーションにおいて、アミノ末端システイン残基を含んでいるペプチドは、天然型化学的ライゲーションにおけるように、カルボキシ末端チオエステルを有するペプチドに結合される。次に、システインのチオール側鎖が、式Ｒａａ−Ｘ（Ｘは良好な離脱基であり、Ｒａａはその構造がリボソーム特定または合成アミノ酸の側鎖の末端部分を模倣する基である）の化合物と反応させられる。
【００８８】
重要なことには、擬似天然型化学的ライゲーションの反応は、システイン側鎖の天然のＬ−立体配置、またはＤ−立体配置で働く。Ｄ−立体配置の使用により、そのライゲーション部位におけるプロテアーゼ耐性を付与でき、従って、タンパク質分解に対する安定性を増大させることが求められる場合に使用できる。しかしながら、Ｄ−システインを使う場合には、その部位におけるバックボーン構造は改変されるであろう。そのような改変は、プロテアーゼ耐性に加え、生物活性を改変することが求められ得る。しかしながら、生物活性へのインパクトを最小限にするため、Ｄ−システインを、無秩序領域、結果として得られる折りたたまれた分子の表面に配置される無秩序ループあるいは分子の無秩序末端におけるような、高い可撓性の部位に配置するのが好ましい。望ましくは、擬似天然型化学的ライゲーションの反応は、合成された分子の表面に大きい帯電側鎖（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＧｌｕの側鎖）を配置するために用い得る。
【００８９】
適切で良好な脱離基Ｘの例としては、ハロゲン、特にヨウ素および臭素が含まれる。Ｒａａ基の例としては、ＰＯ４基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯ基、ＣＯＮＨ２基、グアニジウム基、アミン基、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、イミダゾール基、アルキル化イミダゾール基、インドール基、またはアルキル化インドール基が含まれる。
【００９０】
用いるＲａａの選択は、特定位置に存在することが望まれるアミノ酸側鎖に依存するであろう。従って、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質が以下のアミノ酸配列を有している：
ａａＮＨ２−Ｑ−ａａｘ−ａａｙ−Ｗ−ａａＣＯＯＨ
式中、ＱおよびＷはそれぞれ、付加的なアミノ酸残基の任意の存在または不在を示し、ａａｘおよびａａｙは内部隣接残基を示し（それぞれ、側鎖ｘおよびｙを有する）、ａａＮＨ２およびａａＣＯＯＨはそれぞれ、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ（Ｎ−）末端残基およびカルボキシ（Ｃ−）末端残基を示し、以下の２つのペプチドを調製することにより合成される：
ａａＮＨ２−Ｑ−ａａｘ−ＣＯＳＲおよびＣｙｓ−Ｗ−ａａＣＯＯＨ
式中、Ｃｙｓはシステインによるａａｙの置換を示し、Ｒはチオエステル基と適合する任意の基であり、アリール、ベンジル、およびアルキル基を含むがこれらに限定されない。Ｒの例としては、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、ベンジルエステル、およびメルカプトプロピオン酸ロイシンエステルが含まれる（例えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａ／．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９４） ２６６： ７７６−７７９； Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９９５） ３６：１２１７−１２２０； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．， ＷＯ／９６／３４８７８号； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４号； Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＣＳ （１９９９） １２１ （４９）：１１３６９−１１３７４；およびＨａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９９９） ９６：１００６８−１００７３参照）。他の例としては、ジチオスレイトール、あるいはアルキルまたはアリールチオエステルが含まれ、これらは周知のインテイン仲介生物学的手法により生産できる（例えば、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （１９９７） １９２： ２７７−２８１； Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９８） ２６：５１０９−５１１５； Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａ／．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９８） ７：２２５６−２２６４；およびＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） ６ （９）： ２４７−２５６参照）；次いで、両フラグメントを結合し、ａａＮＨ２−Ｑ−ａａｘ−Ｃｙｓ−Ｗ−ａａＣＯＯＨ
を形成する。
【００９１】
次に、結合されたフラグメントはＲｙ−Ｘと反応させられ、ここでＲｙはｙ側鎖の構造を模倣する側鎖である。この反応は、システインのチオール基を「擬似ｙ」側鎖に変換するのに十分な条件下で実施される。例えば、もしＲａａがＣＨ２−ＣＯＯＨまたは（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨとなるように選択されれば、反応は、アスパラギン酸（「擬似−Ａｓｐ」）またはグルタミン酸（「擬似−Ｇｌｕ」）の構造と機能を模倣するアミノ酸残基の形成に至るであろう。理解されるように、上記の記載に鑑みて、より複雑な合成が、３つ以上のペプチドフラグメントを用いて実施できる。
【００９２】
この方法の重要な特徴は、反応しているセグメント中で修飾したくないシステイン残基が、ライゲーション部位におけるもの以外のＣｙｓ残基の化学的修飾を防ぐため、例えばＣｙｓ（Ａｃｍ）のように側鎖保護されること、あるいは反応しているセグメント中の他のどのＣｙｓ残基も、ライゲーション後に化学的修飾反応による同一の「擬似アミノ酸」の同時形成を意図されるということである。
【００９３】
本明細書中で使われているように、記号φはベンジル基を示し、ＩＭはイミダゾール基を示し、ＩＮはインドール基を示し、ＰＧは保護基を示す。以下は、本発明に従って擬似アミノ酸残基を含むペプチドを合成するために用い得るＲａａ側鎖の概要であり、式中Ｘはハロゲン（Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ）であり、たいていの場合はＢｒおよびＣｌが好ましく、Ｆはφ付着について好ましい。
塩基性アミノ酸：
Ｌｙｓ（余分な原子無し）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＰＧ、続いて脱保護することにより、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２が得られる。
Ａｒｇ（余分な原子無し）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（（ＮＨ２）（＝ＮＨ２＋））により
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（（ＮＨ２）（＝ＮＨ２＋））が得られる。
Ｈｉｓ（余分な原子２個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−ＩＭにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＩＭが得られる。
酸性アミノ酸：
Ａｓｐ（余分な原子２個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−ＣＯＯＨにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨが得られる。
Ｇｌｕ（余分な原子１個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−ＣＯＯＨにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨが得られる。
非荷電極性アミノ酸：
Ｔｙｒ（余分な原子無しまたは１個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｆ−φ−ｐＯＨにより−ＣＨ２−Ｓ−φ−ｐＯＨが得られる（余分な原子無し、同じ幾何配置）。
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｂｒ／Ｉ−ＣＨ２−φ−ｐＯＨにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−φ−ｐＯＨが得られる（余分な原子１個）。
Ｇｌｎ（余分な原子１個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ２）により−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ２）が得られる。
Ａｓｎ（余分な原子２個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ２）により−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ２）が得られる。
Ｓｅｒ（余分な原子２ないし３個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２ＯＨにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＯＨが得られる（余分な原子２個）
−ＣＨ２−ＳＨ＋Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨが得られる（余分な原子３個）。
Ｔｈｒ（余分な原子２ないし３個、β分岐が無い）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ（（ＣＨ３）（Ｏ−ＰＧ））に続いてＰＧを除去することにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＯＨ））が得られる（余分な原子２個）。
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ３）（Ｏ−ＰＧ））に続いてＰＧを除去することにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＯＨ））が得られる（余分な原子３個）。
非極性アミノ酸：
Ｌｅｕ（余分な原子１ないし２個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＣＨ３））により−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＣＨ３））が得られる（余分な原子１個）。
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−（（ＣＨ３）（ＣＨ３））により−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＣＨ３））が得られる（余分な原子２個）。
Ｉｌｅ（余分な原子２ないし３個、β分岐無し）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３により−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３が得られる（余分な原子２個）。
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３により−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３が得られる（余分な原子３個）。
Ｐｈｅ（余分な原子１ないし２個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｆ−φにより−ＣＨ２−Ｓ−φが得られる（余分な原子１個）。
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｂｒ／Ｉ−ＣＨ２−φにより−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−φが得られる（余分な原子２個）。
Ｍｅｔ（余分な原子無し）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｉ−ＣＨ２−ＣＨ３により−ＣＨ２−ＳＨ−ＣＨ２−ＣＨ３が得られる。
Ｔｒｐ（余分な原子１個）
−ＣＨ２−ＳＨ  ＋  Ｆ−ＩＮにより−ＣＨ２−Ｓ−ＩＮが得られる。
【００９４】
しかしながら、ライゲーションに用いられるポリペプチドの所与のＮ末端にシステインまたはホモシステイン残基を導入するために、あるいはライゲーション部位において擬似アミノ酸を利用するために、タンパク質配列を修飾することが不便または望ましくない場合には、天然型化学的ライゲーションの方法は、Ｎ末端がＮ置換、好ましくはＮα置換された２つないし３つの炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含むように修飾され、その結果天然型化学的ライゲーションの原理をシステイン残基を欠くポリペプチドと共に用いることを可能にするように拡張できる（米国特許出願番号第６０／２３１，３３９号参照。参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９５】
「拡張天然型化学的ライゲーション」の方法は、カルボキシルチオエステル、より好ましくはα−カルボキシルチオエステルを含む第１の成分を、酸安定Ｎ置換、好ましくはＮα置換された２つないし３つの炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含む第２の成分と結合させることを伴う。第１の成分のカルボキシチオエステルと、第２の成分のＮ置換された２つないし３つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオールのチオールと間の化学選択的反応は、チオエステル結合された中間体を介して進み、初期のライゲーション産物に分解する。より具体的には、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で生じるチオール交換により、チオエステル結合中間体ライゲーション産物が生成し、これは自発的再配列後に、アミノアルキルチオール成分が以下の式ＩまたはＩＩを有しているかによって、それぞれ５員環または６員環の中間体を介してアミド結合された第１のライゲーション産物を生成する。
2004515471.tif 000003
式中、Ｊ１は、１つ以上の任意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化された表面、リンカーないし検出可能マーカー、または化学的ペプチド合成ないし拡張天然型化学的ライゲーションと両立できる任意の他の化学的部分であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立的に、Ｃ１に結合されたＨまたは電子供与基であり、ただし、Ｒ１、ＲおよびＲ３の少なくとも１つが、Ｃ１に結合された電子供与基を含み、さらに、Ｊ２は、１つ以上の任意に保護されたアミノ酸側鎖を有するペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化された表面、リンカーないし検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成ないし拡張天然型化学的ライゲーションと両立できる任意の他の化学的部分である。
【００９６】
ライゲーション部位における、Ｎ置換された２つないし３つの炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］もしくは［ＨＳ−（Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチド適合条件下で、生成物への損傷なく、除去することができ、その結果、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する、式ＩＩＩの最終的なライゲーション産物を生成できる。
2004515471.tif 000004
式中、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義された通りである。
【００９７】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３基は、ペプチド適合切断条件下でＮ−Ｃ１結合の切断を容易にするように選択される。例えば、電子供与基は、特にＣ１にコンジュゲートされると、切断を容易にするＣ１における共鳴安定化カチオンを形成するために用い得る。化学的ライゲーション反応は、好ましくは、賦形剤としてチオール触媒を含み、水性または混合有機−水性条件で中性ｐＨ近傍の条件で実行される。第１および第２の成分の化学的ライゲーションは、自発的再配列が生じる５〜６員環を経て進み、Ｎ置換アミド結合ライゲーション産物を作り出す。第１および第２の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、Ｎ置換アミド結合ライゲーション産物は式ＩＶまたはＶを有する：
2004515471.tif 000005
式中、Ｊ１、Ｊ２およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＺ２は、上記で定義された通りである。
【００９８】
Ｎ置換アミド結合ライゲーション産物のコンジュゲートされた電子供与基Ｒ１、Ｒ２またはＲ３は、Ｎ−Ｃ１結合の切断およびＮ置換アミド結合ライゲーション産物からの２ないし３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を容易にする。ペプチド適合性切断条件下でのＮのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去は、ライゲーション部位での天然アミド結合を有するライゲーション産物を生成する。第１および第２の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション産物は以下の式を有する：
2004515471.tif 000006
式Ｉについての代表的なＲ１置換基を表Ｉに示す。
表Ｉ
【表１】
2004515471.tif 000007
式ＩＩについての代表的なＲ１、Ｒ２およにＲ３置換基を表ＩＩに示す。
表ＩＩ
【表２】
2004515471.tif 000008
【００９９】
Ｎ置換された２炭素鎖化合物の場合と同様、ライゲーションの後のＮα−Ｃ１結合の強い切断に対応してＣ１炭素への電子コンジュゲーションを維持するためには、オルトまたはパラ位置におけるベンジルおよびピコリル電子供与置換基Ｒ１’、Ｒ３’およびＲ５’のポジショニングが必要である。しかしながら、Ｒ２およびＲ３がＣ２およびＣ３と共にベンジル基を形成する場合、Ｒ１’およびＲ３’の少なくとも１つは、強力な電子供与基を含み、そこではＲ１’またはＲ３’は、メトキシ基（−ＯＣＨ３）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、およびチオメチル基（−ＳＣＨ３）から選択される。Ｒ２およびＲ３が水素であるＮ置換された３炭素鎖チオールについては、Ｒ１はベンジルまたはピコリル基を含み、そこではＲ１’、Ｒ３’およびＲ５’は強いまたは中程度の電子供与基、あるいはそれらの組み合わせを含む。Ｎ置換された２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールと同様、強い電子供与基は、ライゲーションに続く切断に対する３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの感受性を高める。従って、特定の電子供与基またはそれらの組み合わせがそれに応じて選ばれ得る。
【０１００】
Ｎ置換された２炭素鎖化合物の場合と同様、本発明のＮ置換された３炭素鎖化合物は、対象となる構成物における置換に利用可能な場合にＲ１’およびＲ５’位置におけるＲ１の置換基としてのチオールを含み得る。ここで再び、電子供与チオール基はＣ１にコンジュゲートされ、これらの位置で導入されることにより、これらの化合物が６員環形成ライゲーションの際の２つの経路を持つことが可能になる。それは、α−カルボキシチオエステルと反応するための利用可能なチオールの局所濃度も増大させ、ライゲーションを改善できる構造的制約という意味で更なるコンホメーションを提供する。
【０１０１】
本発明のＮ末端Ｎ置換の２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、本明細書中で、例えば、スキームＩおよびスキームＩＩにおいて説明されたように、技術的に周知の標準的有機化学手法に従って実行し得る。例えば、”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，” ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊ． Ｍａｒｃｈ （Ｅｄ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９２； ”Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，” Ｒ． Ｌａｒｏｃｋ （Ｅｄ．）， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８９を参照のこと。それらは、溶液中で、ポリマー坦持合成、またはその組み合わせにより合成できる。好ましい方法では、Ｎα保護Ｎアルキル化Ｓ保護アミノアルキル−またはアリール−チオールアミノ酸前駆体が用いられる。合成に利用される試薬は、どのような数の商業的ソースからでも入手できる。また、個々のアミノ酸誘導体のような、出発成分および種々の中間体が、キット等で供給されており、後に使用するために保存できることが理解されるであろう。
【０１０２】
本発明のＮ末端Ｎα置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の調製においては、保護基戦略が用いられる。種々の合成戦略において一般に利用される好ましい保護基（ＰＧ）は、固相ペプチド合成（「ＳＰＰＳ」）と両立できる。いくつかの例では、種々の条件下で除去可能な直交保護基を利用することも必要である。多くのそのような保護基は周知であり、この目的に適している（例えば、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９９； ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ ２０００； ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，” Ｇ． Ａ． Ｇｒａｎｔ， Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９２； ”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｗ． Ｄ．． Ｂｅｎｎｅｔ， Ｊ． Ｗ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｌ． Ｋ． Ｈａｍａｋｅｒ， Ｍ． Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｍ． Ｒ． Ｒｈｏｄｅｓ， ａｎｄ Ｈ． Ｈ． Ｓａｎｅｉｉ， Ｅｄｓ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ， １９９８； ”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９３； ”Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９４；および”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，” Ｐ． Ｊ． Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ， Ｅｄ．， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ， １９９４参照）。例としては、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｔｒｔ、Ｎｐｓ、ＦｍｏｃＣｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ；ＮＳＣ；ＭＳＣ、Ｄｄｅ等が含まれる。硫黄部分については、適切な保護基の例としては、ベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、トリチル、ＡＣＭ、ＴＡＣＡＭ、キサンチル、ジスルフィド誘導体、ピコリル、およびフェナシルが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０３】
より具体的には、Ｎα置換された２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、スキームＩ（Ｎα置換された前駆体の固相調製）、スキームＩＩ（Ｎα置換された前駆体の液相調製）により調製される。スキームＩにおいて、Ｎα置換された２または３炭素鎖アルキル基またはアリールチオールは、ポリマー坦持有機合成の標準的方法を使って固相上で直接的に組み立てられ、それに対してスキームＩＩのＮα保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体は、標準的なカップリングプロトコルを使って樹脂にカップリングされる。ラセミまたはジアステレオマー生成物が生産される場合、拡張天然型化学的ライゲーションにおける使用前にこれらを標準的な方法で分離することが必要なことがある。
スキームＩ
【化２】
2004515471.tif 000009
スキームＩＩ
【化３】
2004515471.tif 000010
【０１０４】
α−カルボキシチオエステルは、実施例を含み本明細書中に記載されているような、技術的に周知の標準的な化学的または生物学的方法に従って生成できる。化学合成については、α−カルボキシチオエステルペプチドは、溶液中またはチオエステル生成樹脂から合成でき、これらの手法は周知である（例えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９４） ２６６：７７６−７７９； Ｃａｎｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９９５） ３６：１２１７−１２２０； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９６／３４８７８号； Ｋｅｎｔ， ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／２８４３４号； Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＣＳ （１９９９） １２１（４９）：１１３６９−１１３７４；およびＨａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９９９） ９６：１００６８−１００７３）； 上記Ａｍｉａｔｏ ｅｔ ａｌ．参照）。例えば、化学的に合成されたチオエステルペプチドは、対応するペプチドα−チオ酸から作ることができ、これが今度は、樹脂法が好まれるけれども、チオエステル−樹脂上または溶液中で合成できる。ペプチド−α−チオ酸は、対応する３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、対応するベンジルエステル、あるいは各種のアルキルチオエステルのいずれかに変換できる。これらのチオエステルはすべて、ライゲーション反応用に満足すべき残留基を提供し、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルは、対応するベンジルチオエステルよりも若干速い反応速度を示し、これが今度はアルキルチオエステルよりもより反応性になり得る。別の例としては、トリチル関連メルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステル生成樹脂を、Ｃ末端チオエステルの構成に利用できる（上記Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．）。Ｃ末端チオエステル合成も、３−カルボキシプロパンスルホンアミド安全キャッチリンカーを用い、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルで活性化し続いて適切なチオールで置換することにより達成できる（上記Ｉｎｇｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．； Ｂｅｒｔｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．）。
【０１０５】
Ｃ末端α−カルボキシチオエステルペプチドも、インテイン仲介生物学的手法のような生物学的プロセスを用いて作ることができる（例えば、Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （１９９７） １９２：２７７−２８１； Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９８） ２６：５１０９−５１１５； Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９８） ７：２２５６−２２６４；およびＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） ６ （９）：２４７−２５６参照）。例えば、インテイン発現系は、アフィニティタグのようなラベルのあるまたはなしに、「インテイン」タンパク質スプライシング要素の誘導可能性自己切断活性を利用してＣ末端ジチオスレイトール（ＤＴＴ）エステルのペプチドまたはポリペプチドセグメントを生成するために利用できる。特に、インテインは、ＤＴＴ、ｂ−メルカプトエタノールまたはシステインのようなチオールの存在下で特定の自己切断を受け、これにより、Ｃ末端チオエステルを持つペプチドセグメントが生成される。例えば、上記のＣｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、上記のＣｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９８）、上記のＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．、および上記のＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．参照。しかしながら、組換えにより生産されたセグメントを用いる場合、最終構成物の化学的に合成された部分は、含まれる場合には、一般にポリマー修飾を含む。
【０１０６】
本発明のＮ置換された２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分と第１のカルボキシチオエステル成分とのライゲーションにより、ライゲーション部位にＮ置換アミド結合を有するライゲーション産物が生成する。反応のライゲーション条件は、Ｎ置換された２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール部分でチオエステルの選択的反応性を維持するように選ばれる。好ましい実施形態において、ライゲーション反応は、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲を有するバッファー中で実行される。バッファー溶液は、水性、有機、またはそれらの混合物とすることができる。ライゲーション反応は、１つ以上の触媒および／または１つ以上の還元剤、脂質、界面活性剤、その他の変性剤または可溶化試薬等も含み得る。好ましい触媒の例は、チオフェノール、ベンジルメルカプタン、ＴＣＥＰおよびアルキルホスフィンのようなチオールおよびホスフィン含有部分である。変性および／または可溶化剤の例としては、グアニジウム、尿素の水またはＴＦＥ、ＨＦＩＰ、ＤＭＦ、ＮＭＰのような有機溶媒溶液、水とアセトニトリルの混合物、および尿素の水溶液が含まれる。ライゲーション反応の速度を調節するために温度も用いることができ、温度は通常５℃〜５５℃であり、好ましい温度は１５℃〜４０℃である。一例として、ライゲーション反応は、ｐＨ６．８〜７．８で６Ｍグアニジウム中の２％チオフェノールを有する反応系中で良好に進行する。
【０１０７】
Ｎ置換された２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合は、ライゲーションイベントは、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で生じるチオール交換に起因する。この交換により、チオエステル連結中間ライゲーション産物が生成され、これは５員環中間体を経て自発的再配列の後に、除去可能なＮ置換された２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］をライゲーション部位に有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２のライゲーション産物が生成され、そこでは置換基は上記で定義された通りである。ライゲーション部位におけるＮ置換された２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチド適合条件下で除去されて、ライゲーション部位で天然アミド結合を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２の最終ライゲーション産物を生成できる。
【０１０８】
Ｎ置換された３炭素鎖アリールまたはアルキルチオールの場合は、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間のチオール交換により、チオエステル連結中間ライゲーション産物が生成され、これは６員環中間体を介しての自発的再配列の後に、除去可能なＮ置換された３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］をライゲーション部位に有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２の第一のライゲーション産物が生成される。ライゲーション部位におけるＮ置換された３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチド適合条件下で除去されて、ライゲーション部位で天然アミド結合を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２の最終のライゲーション産物を生成できる。
【０１０９】
Ｎ置換されたアルキルまたはアリールチオール基の除去は、Ｎ−Ｃ１結合の切断を容易にするため、好ましくは酸性条件で実行され、安定化された未置換のアミド結合がライゲーション部位で作り出される。「ペプチド適合切断条件」は、ペプチドと両立できかつライゲーション産物からのアルキルまたはアリールチオール部分の切断に適した物理化学的条件を意味する。一般にペプチド適合切断条件は、用いられるα−置換化合物に応じて選択され、これは日常的かつ周知の方法により用意に推論できる（例えば、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９９； ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ ２０００； ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，” Ｇ． Ａ． Ｇｒａｎｔ， Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９２； ”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｗ． Ｄ．． Ｂｅｎｎｅｔ， Ｊ． Ｗ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｌ． Ｋ． Ｈａｍａｋｅｒ， Ｍ． Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｍ． Ｒ． Ｒｈｏｄｅｓ， ａｎｄ Ｈ． Ｈ． Ｓａｎｅｉｉ， Ｅｄｓ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ， １９９８ ；”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，”Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９３； ”Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９４；および”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，” Ｐ． Ｊ． Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ， Ｅｄ．， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ， １９９４参照）。
【０１１０】
例えば、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３置換基がメトキシ、ヒドロキシル、チオールまたはチオメチル、メチル等を含む場合、より一般的な除去方法は、ペプチド合成化学に典型的な酸性の切断条件を伴う。これには、強い酸性条件下または水−酸性条件下で、還元剤および／またはスカベンジャー系（例えば、無水フッ化水素（ＨＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはトリメチルスルホニルフルオロ酢酸（ＴＭＳＦＡ）等の酸）が有りまたは無しでのＮ−Ｃ１結合の切断が含まれる。より具体的な酸性切断系は、所定の構成物についてアリールまたはアルキルチオール部分を除去するためにＮα−Ｃ１結合の切断を最適化するように選ばれ得る。そのような条件は周知であり、ペプチドの完全性の維持と両立できる。特に、ペプチドまたはポリペプチド配列中にトリプトファンが存在する場合、トリプトファン側鎖と遊離アリールまたはアルキルチオール部分との反応を回避するため、チオールスカベンジャーを含ませ得る。チオールスカベンジャーの例として、エタンジオール、システイン、β−メルカプトエタノールおよびチオクレゾールが含まれる。
【０１１１】
他の特殊化された切断条件としては、ピコリル基が置換基である場合の光または還元的切断条件が含まれる。一例として、Ｒ１、またはＲ２およびＲ３置換基がピコリル部分を含む場合、光分解（例えば、紫外光）、亜鉛／酢酸または電解還元を、標準プロトコルに従って切断用に用い得る。Ｎ置換された２炭素鎖チオールのＲ１がＲ１にチオメタンを含む場合、水銀またはＨＦ切断が用い得る。この切断システムは、第１または第２のライゲーション成分が他の保護基を含む場合に、固体支持体から同時切断用におよび／または脱保護試薬としても用い得る。
【０１１２】
本発明の１つの実施形態において、Ｎα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、合成赤血球産生刺激タンパク質を産生するために拡張化学的ライゲーション用の基質として用い得る適切にＮ末端誘導体化されたポリペプチドを産生するために、ペプチド合成ステップ（特に、自動化ペプチド合成、ならびに直交および収束的ライゲーション戦略）中で用いられる。そのような化合物は、完全に保護された、部分的に保護されたまたは完全に未保護の酸安定性Ｎα−置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含み、これらは式が（ＰＧ１）Ｓ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ２）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２または（ＰＧ１）Ｓ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ２）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２であり、以下で表ＩＩＩおよび表ＩＶに図示してある。特に、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の内の２つ以上は、Ｃ１にコンジュゲートされた電子供与基を含み、これは、Ｎα−置換アミノアルキルまたはアリールチオールのＮα−置換アミドアルキルまたはアリールチオールへの変換に続いて、ペプチド適合性切断条件下でＮα−Ｃ１結合の切断を容易にするＣ１における共鳴安定化カチオンを形成できるものである。ＰＧ１およびＰＧ２は、個別にまたは組み合わせて存在しまたは存在せず、または同じまたは異なる保護基であり、そこではＺ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合性がある任意の化学的部分であり、Ｊ２は、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合性がある任意の化学的部分である。ＰＧ１（またはＸ１）は、アミンを保護するための基である。ＰＧ２（またはＸ２）は、チオールを保護するための基である。多くのそのような保護基は周知であり、この目的に適している（例えば、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９９； ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ ２０００； ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，” Ｇ．Ａ． Ｇｒａｎｔ， Ｅｄ．， Ｗ．Ｈ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９２； ”Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｗ．Ｄ．． Ｂｅｎｎｅｔ， Ｊ．Ｗ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｌ．Ｋ． Ｈａｍａｋｅｒ， Ｍ．Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｍ．Ｒ． Ｒｈｏｄｅｓ， ａｎｄ Ｈ．Ｈ． Ｓａｎｅｉｉ， Ｅｄｓ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ， １９９８； ”Ｐｒｉｃｉｐｉｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９３； ”Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．，” Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９４； ａｎｄ ”Ｐｒｏｔｅｃ���ｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，” Ｐ．Ｊ． Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ， Ｅｄ．， Ｇｅｏｒｇ ＴｈｉｅｍｅＶｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ， １９９４）。
表ＩＩＩ
【表３】
2004515471.tif 000011
【０１１３】
ＰＧ１およびＸ１として好ましい保護基の例としては、［Ｂｏｃ（ｔ−ブチルカルバメート）、Ｔｒｏｃ（２，２，２，−トリクロロエチルカルバメート）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルカルバメート）、Ｂｒ−ＺまたはＣｌ−Ｚ（Ｂｒ−またはＣｌ−ベンジルカルバメート）、Ｄｄｅ（４，４，−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシル−イリデン）、ＭｓＺ（４−メチルスルフィニルベンジル−カルバメート）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホエチルカルバメート）、Ｎｓｃ（４−ニトロフェニルエチルスルホニル−エチルオキシカルボニル）が含まれるがこれらに限定されない。好ましいＰＧ１およびＸ１保護基は、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， （１９９９）から選ばれ、最も好ましいものはＦｍｏｃおよびＮｓｃである。ＰＧ２として好ましい保護基の例としては、［Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ＭｅｏＢｚｌまたはＭｏｂ（ｐ−メトキシベンジル）、Ｍｅｂ（ｐ−メチルベンジル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｘａｎ（キサンテニル）、ｔＢｕｔｈｉｏ（ｓ−ｔ−ブチル）、Ｍｍｔ（ｐ−メトキシトリチル）、２または４ピコリル（２または４ピリヂル））、Ｆｍ（９−フルオレニルメチル）、ｔｂｕｔ（ｔ−ブチル）、Ｔａｃａｍ（トリメチルアセトアミドメチル）］が含まれるが、これらに限定されない。好ましい保護基ＰＧ２およびＸ２は、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， （１９９９）から選ばれ、最も好ましいものはＡｃｍ、Ｍｏｂ、ＭｅＢ、ピコリルである。表ＩＶ
【表４】
2004515471.tif 000012
【０１１４】
本発明のＮα−置換された２または３鎖アルキルまたはアリールチオールは、上記のスキームＩおよ１１におけるように調製し得る。
【０１１５】
本発明の化合物は、ハロゲン仲介アミノアルキル化、還元的アミノ化を含む各種の手段のいずれによっても、および固相アミノ酸合成方法と適合するＮα−保護された、Ｎ−アルキル化された、Ｓ−保護された、アミノアルキル−およびアリール−チオールアミノ酸前駆体の調製により生産できる。必要な場合には、許容できるキラル純度の化合物を得るために産生されたラセミ化合物またはジアステレオマーの分割を標準的方法により実行できる。
【０１１６】
ＩＩＩ．本発明の好ましい水溶性ポリマーの合成および製造
本明細書中で使われているように、「分子不均一性」は、タンパク質製剤の個々のタンパク質に付着させられたポリマー分子の数における変動を意味することを意図している。用語「分子多様性」は、（ａ）ポリマーにより修飾されるタンパク質の部位における変動、（ｂ）同じタンパク質の異なる部位の、またはタンパク質製剤の異なるタンパク質の同じ部位のポリマー付加物の長さの変動、または（ｃ）同じタンパク質の異なる部位の、またはタンパク質製剤の異なるタンパク質の同じ部位のポリマー付加物の任意の分岐の程度および／または性質の変動を意味することを意図している。本明細書中で使われているように、「分子的に均質」は、すべてのタンパク質分子がアミノ酸配列および同じ位置に同じポリマー修飾を含んでいるタンパク質製剤を意味することを意図している。２つ以上の「分子的に均質」なタンパク質製剤混合物は、本明細書中では、「分子的に定義された」製剤と呼ばれる。
【０１１７】
本発明のこの観点に従って、上記で特定したポリマー不均一性、多様性、および不適性の問題に対する解決策は、ポリペプチドの利点（正確な長さ、便利な合成）と「ｐＰＥＧ」（「精密ＰＥＧ」の利点（可撓性両親媒性、非免疫原性で、プロテアーゼの影響を受けないポリマー））Ｒｏｓｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．（米国特許出願番号第０９／３７９，２９７号、参照により本明細書に組み込まれる）の両方を組み合わせる新規な種類の生体適合性ポリマーの製造を伴う。この新規な種類の生体適合性ポリマーは、以下の式を有する：
−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−
ｎは整数であり、好ましくは１〜１００、より好ましくは２〜１００であり、ＸおよびＹは、アミド結合により連結された正確な構造の生体適合性の反復要素である。ＸおよびＹは、好ましくは、反応官能基を欠いているか存在しない２価の有機ラジカルであり、さらに同じまたは異なっており、各反復単位（ｎ）と共に独立して変わり得る。好ましくは、ｎ＝２の場合には、ＸまたはＹの少なくとも一方は、置換、未置換、分岐および直鎖状脂肪族ならびに芳香族基からなる群から選ばれる。より好ましくは、ＸまたはＹの一方は、フェニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有Ｃ１−Ｃ１０アルキレン部分、ヘテロ原子含有Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、それらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０１１８】
特に、好ましいｐＰＥＧ部分は以下の式を有する：
−｛ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ｝ｎ−
（式中、ｎは、好ましくは１〜１００、より好ましくは２〜１００）、または
−｛ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ｝ｎ−
（式中、ｎは、好ましくは１〜５０、より好ましくは２〜５０で変化する。）
【０１１９】
そのようなｐＰＥＧ部分は、各種の方法のいずれによっても合成できる。しかしながら、そのような部分は好ましくは、重合プロセスというよりむしろ単位の固相段階的の組上げを用いて生成される。そのような組上げプロセスを用いることにより、製剤の部分が、それらの長さ、それらのＸおよびＹ置換基の性質、（もしあれば）分岐点の位置、ならびに任意の分岐の長さ、Ｘおよび置換基、および位置に関して定義された均質な構造を有することが可能になる。
【０１２０】
好ましくは、そのような部分は以下のようなステップによって合成される：
（ａ）式Ｚ−Ｑ−支持体の化合物のアミノまたはヒドロキシル基を、式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨを有するモル過剰の二酸誘導体でアシル化するステップ（式中、ＺはＨ２Ｎ−またはＨＯ−、Ｑはリンカーまたは標的分子、支持体は固相のマトリクスまたは表面）、
（ｂ）ステップ（ａ）の産物の遊離カルボキシル基を活性化するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の産物を、式ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２を有するモル過剰のジアミンでアミノ分解するステップ、さらに
（ｄ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨおよびＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２を用いてステップ（ａ）〜（ｃ）を任意に反復するステップで、前記ＸおよびＹは、２価の有機ラジカルであるか存在せず、さらに同じかまたは異なっており、前記任意に反復される単位と共に独立して変わることができ、前記のアシル化およびアミノ分解ステップのいずれかで用いられるＸおよびＹ置換基と同じまたは異なる。
【０１２１】
好ましい実施形態において、上記反復単位の６−マー、１２−マー、１８−マーおよび３２マーが用いられる。必要な場合には、反復単位は、例えば、リジンのアミノ基と共に用いて分岐ｐＰＥＧ構造を形成できる。ｐＰＥＧは、チオエーテル、オキシムおよびアミド結合形成を含む各種の化学によって、本発明の合成タンパク質に付着させ得る。
【０１２２】
１つの実施形態においては、単位の固相段階的鎖集合は以下のステップを含む：
ステップ１：保護または未保護二酸を樹脂上のアミノにカップリングして結合部位にアミド結合を生成する（ＰＧは、用いる二酸に応じて存在するかまたは存在しない保護基）：
ＰＧ−ＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨ  ＋  ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ−樹脂
【０１２３】
ステップ２：もし存在するのであれば、樹脂上の保護基（ＰＧ）を除去する
ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
【０１２４】
ステップ３：保護または未保護のジアミノを樹脂上のカルボキシにカップリングして結合部位にアミド結合を生成する（ＰＧは、用いるジアミノに応じて存在するかまたは存在しない）
ＰＧ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ  ＋  ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
【０１２５】
ステップ４：もし存在するのであれば、樹脂上の保護基（ＰＧ）を除去する
−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
【０１２６】
ステップ５：ステップ１〜４を「ｎ」回反復して「ｎ」個の単位を付加し、次いで樹脂から切断する
−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］
−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］
−
【０１２７】
論じたように、直鎖状および分岐状ｐＰＥＧ構成物は、本発明の合成赤血球産生刺激分子への付着について好ましい水溶性ポリマーである。用いられるｐＰＥＧは、生理学的条件下での中性または帯電したペンダント基を持ち、さらに用いるｐＰＥＧに応じて付着化学、長さ、分岐および溶解性を変えることができる。上で言及したように、本発明の好ましいｐＰＥＧは、反復単位−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−を有する水溶性ポリアミドを含み、ＸおよびＹの一方または両方は、水溶性反復単位、最も好ましくは「ＰＥＧ」ベースの反復単位を含む。オリゴ尿素は原則として、アミノ樹脂ＮＨ２−樹脂、および対称的ジアミンＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２のケースについて以下に示すような単純な２段階の固相手順を用いて入手できる。
【０１２８】
カルボニルジイミダゾールによる活性化→ｉｍ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
ジアミンＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２によるアミノ分解→ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
これら２つのステップを多数回繰り返して、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−反復単位を有するオリゴ尿素を得ることができるが、この方法はあまり好まれない。これは、上記のステップの収率が、非常に大過剰の試薬と長い反応時間であってさえも、室温で非定量的なことがあるからである。従って、ポリアミドを形成するために、アミノ樹脂ＮＨ２−樹脂のケースについて下記に示される３ステップ固相手順を用いることがより好ましい。異性体産物を回避するため、試薬ＨＯ２Ｃ−Ｘ−ＣＯ２ＨおよびＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２は対称的とすべきである。
【０１２９】
二酸ＨＯ２Ｃ−Ｘ−ＣＯ２Ｈを用いたアシル化→ＨＯ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
カルボニルジイミダゾールを用いた活性化→ｉｍ−ＣＯ−ＯＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
ジアミンＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２を用いたアミノ分解→ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
これらの３つのステップは、反復単位−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−を有するポリイミドを得るため、順次多数回繰り返すことができる。ポリマーは正確な数のモノマー単位を含み、ＸおよびＹは各ステップにおいて独立的に変えることができ、末端基は自由に選ばれ得る。例えば、アシル化ステップに無水コハク酸（「Ｓｕｃｃ」）を用い、アミノ分解ステップに４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（「ＥＤＡ」または「ＴＴＤ」とも呼ばれる）を用いることにより、「ＰＥＧ」ベースのポリアミドが形成され、そこではＸは−ＣＨ２ＣＨ２−、Ｙは−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−であり、反復単位は−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−である。この手順が保護基の無い２価の試薬を伴うという事実にかかわらず、標準的な市販のペプチド合成樹脂を用いる場合には、分岐構成物を作るために分岐Ｌｙｓ核のケースについて以下で言及されることを除き、架橋は問題ではない（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，（米国特許出願番号第０９／３７９，２９７号）およびＲｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９９）１２１：７０３４）。
【０１３０】
例えば、分岐ｐＰＥＧ構成物は、Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，（米国特許出願番号第０９／３７９，２９７号）、Ｒｏｓｅ， Ｋ．およびＶｉｚｚａｖｏｎａ， Ｊ． （Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９９） １２１：７０３４）に記載される「ケモボディー」構成物についてと同様にして作り得る。分岐ｐＰＥＧ構成物は、リジン分岐核のような分岐核を持つようにすることができ、これはオキシムリンカーを介して、−（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−のような好ましい水溶性ポリアミドにカップリングされる。例えば、オキシム結合は、ポリアミドの他端におけるＬｙｓ側鎖上のアミノオキシアセチル基と、リジン核、例えば四量体核（Ｏ＝ＣＨＣＯ）４Ｌｙｓ２Ｌｙｓ−上のグリオキシリル基との間で容易に形成され得る。従って、各リジン分岐点から切り離されたオキシムリンカーを、−Ｌｙｓ（ＣＯＣＨ２ＯＮ＝ＣＨＣＯ−）アミド−の構造として作ることができる。別の構成では、好ましくはポリアミドのカップリング後に単保護されたジアミンと脱保護を用いて下記の４価の分岐構成物を生成して、ポリアミドとポリアミドの遊離ペンダント基との間にオキシム結合を配置することができる：
［Ｏ＝ＣＨＣＯ−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−［ＯＣＨ２ＣＨ２］３−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）ｎ］４Ｌｙｓ２Ｌｙｓ−
【０１３１】
オキシム化学は、二量体および四量体の分岐構成物を作る際に用い得るだけでなく、八量体分岐構成物の集合にも適している（Ｒｏｓｅ， Ｋ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９４） １１６： ３０； Ｒｏｓｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． （１９９６） ７： ５５２）。当然、そのようなｐＰＥＧポリアミドを用いる場合にそのような目的のために他の化学を使うことが可能である（例えば、図１３参照）。さらに、ポリアミド形成は、ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学を伴うペプチド合成の合成スキームに組み入れ得るが、そのようなスキームを作り上げる際に、アミノ分解ステップによりＦｍｏｃ基が除去され、もしＢｏｃ化学が使われることになるのであればインドールのホルミル保護が除去されることに留意しなければならない。
【０１３２】
従って、そのようなｐＰＥＧは、好ましい結合（例えば、アミド、チオエーテル、オキシム等）を介して直鎖状水溶性ポリマー（例えば、−（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）ｎ−等）に連結された種々の分岐核（例えば、リジン分岐核等）を持つようにすることができ、そこでは、各直鎖状水溶性ポリマーの自由端は各々所望のペンダント基（例えば、カルボキシレート、アミノ、アミド等）でキャッピングして所望の電荷をもたらすことができる。さらに、本発明の直鎖状および分岐状ｐＰＥＧは、１つ以上の一意的で相互に反応性の官能基を持つ合成タンパク質への付着に対し一意的な官能基を含むようにすることができ、ｐＰＥＧのペンダント基は、好ましくは非抗原性である（例えば、図１３参照）。
【０１３３】
特に好ましい実施形態においては、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質は、以下の式の分子的に均質なグリコ模倣水溶性ポリマーで修飾される：
Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−ポリマー−ｓ３−Ｊ＊
式中、Ｕは一意的な官能基の残基、Ｂは、同じでも異なってもよくさらに存在しても存在しなくてもよい３つ以上のアームを有する分岐核、「ポリマー」は、式が−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−で、分子量が約５，０００Ｄａ以上のポリアミドであり、ここでＸおよびＹは、同じでも異なってもよく、さらに分岐状でも直鎖状でもよい２価ラジカルであり、ｎは２〜５０の整数であり、さらにＸおよびＹの一方または両方は、直鎖状でも分岐状でもよい実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含み、Ｊ＊は、負、正、および中性からなる群から選ばれ、生理学的条件下で実効電荷を有する実質的に非抗原性ペンダント基であり、ｓ１、ｓ２およびｓ３は、同じでも異なってもよくさらに個別に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である。そのようなポリマーとしては、米国特許出願番号第６０／２３６，３７７号に記載されるものが含まれ、本明細書にその全体が組み入れられる。式Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−ポリマー−ｓ３−Ｊ＊は、式Ｕ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊で表すこともでき、ここではスペーサーまたはリンカー基ｓ１、ｓ２、ｓ３は存在していても、していなくてもよい。
【０１３４】
本発明の好ましいグリコ模倣ポリマーの好ましい形成プロセスは、図５〜図７に示してある。図５Ａ〜図５Ｂは、分岐核（Ｂ）および本発明の水溶性ポリマーＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊の一意的な化学選択性官能基（Ｕ）を生成するための固相プロセスを示す。示されるような固相法が好ましいが、このプロセスは溶液中で実行できる。特に、図５Ａには、直交的に保護された反応性基
【化４】
2004515471.tif 000013
を有するＵ−Ｂ前駆体部分が示してあり、そのような構成物の基本的幾何学構造は、結合により連結された点
【化５】
2004515471.tif 000014
により表され、この基本的幾何学構造は、用いられる化学的結合または基のタイプを限定することを意図するのものでなく、本発明のＵ−Ｂ部分の生成に適した構造および化学的加工ポイントを作るための幾何学の相対的ポイントを単に例示するものである。直交的に保護されたＵ−Ｂ前駆体は、Ｕ−Ｂ前駆体への共有結合が可能な活性化に続いて、適切な切断可能リンカーおよび共反応性基
【化６】
2004515471.tif 000015
を含むポリマー支持体／樹脂にカップリングされる：
【化７】
2004515471.tif 000016
【０１３５】
この系は、ポリマー支持体された有機化学の原理を使用する。カップリングに続き、分岐核は、例示されるように加工され（第１の分岐点のみが示してあり、付加的な分岐点は存在しても存在しなくていもよい）実質的に非抗原性の水溶性直鎖状ポリマーのような所望のポリマー成分の引き続いての付着に適切な分岐核を生成する。Ｕ基も示してあり、これは、合成の最初に、直交的に保護されたＵ−Ｂ前駆体の一部として提供、または分岐核Ｂの加工の間または後に加工し得る。ポリマー成分の付着がオンレジンで、すなわち切断より前に達成できるのに対して、好ましい経路は、ポリマー成分の引き続いての付着のために精製し得るＵ−Ｂ核を生成するため、ポリマー支持体／樹脂からのＵ−Ｂ部分の切断である。
【０１３６】
例示されるように、核基Ｂのペンダント分岐点は官能基（Ｆｕｎｃ）を含むように作られ、これは同じまたは異なるものとすることができ、可逆的に保護（ＰＧ、ＰＧ’、またはＰＧ’’）または未保護にできる。個々のケースにおいて、ポリマー成分の付着のための最終ステップは、ペンダント分岐点における官能基（Ｆｕｎｃ）の生成、および基Ｕの生成を伴う（図７参照）。図５Ｂは代替的プロセスを示し、そこでは保護されたＵ−Ｂ前駆体が、リンカーを持つポリマー支持体と共に用いられ、これは切断と同時に、所望の保護されたまたは未保護のＵ基を生成する。図５Ｂには、ポリマー支持体への事前集合された分岐核Ｂの付着、およびポリマー成分の引き続いての付着のためのＵ−Ｂ部分を作るためにＵ基生成樹脂の使用も示してある。
【０１３７】
図６Ａ〜図６Ｄには、引き続いてのＵ−Ｂ核への付着のための本発明の好ましい実質的に非抗原性の水溶性ポリアミドポリマー−Ｊ＊成分を生成するための固相プロセスが示してある。固相プロセスが例示されているが、これは好ましいプロセスであって、溶液相プロセスを適合させて同じ最終結果を達成するようにできる。図６Ａおよび図６Ｂにおいては、二酸およびジアミノ単位が、固相有機化学の原理を使ってカップリングされる。任意に、保護されたアミノ−Ｘ’−酸および／またはアミノ−Ｙ’−酸単位は、式−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｘ−ＣＯ］−のポリアミド構造を有する最終切断産物中の基ＸおよびＹの付加的多様性のために組み入れ得る。図６ＡはＮからＣ末端方向への合成を示すのに対して、図６ＢはＣからＮ末端方向への合成を示す。図６Ｃおよび図６Ｄにおいては、保護されたアミノ−Ｘ’−酸および／またはアミノ−Ｙ’−酸単位が、固相有機化学の原理を使ってカップリングされる。図６ＣはＮからＣ末端方向への合成を示すのに対して、図６ＤはＣからＮ末端方向への合成を示す。図６Ａ〜図６Ｄから明白なように、最終的ポリアミド産物の性質は正確に制御され、これは合成のために実施される多数のサイクルに依存する。さらに、ペンダント基Ｊ＊は、事実上どのようなユーザー定義仕様にでも作ることができる。単分散反復単位Ｘ、Ｙ、Ｘ’およびＹ’が用いられる場合、最終的ポリアミド産物の正確な分子構造が正確に制御できる。
【０１３８】
式Ｕ−Ｂポリマー−Ｊ＊の本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成するためにＵ−Ｂ成分をポリマー−Ｊ＊成分にカップリングするための好ましいプロセスが図７に示してある。例示されているように、種々の保護基を提供でき、それらは、所定の構成物の意図される最終用途に応じて任意である。所望のＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊構成物を産生するための種々の経路も例示されており、固相方法および溶液相方法が含まれる。
【０１３９】
上記で言及されたように、好ましい水溶性反復単位は、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。最も好ましい水溶性反復単位は、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）―または―（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシドを含み得る。そのような水溶性反復単位の数は大きく変わり得るが、そのような単位のより好ましい数は、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２〜５０であり、より好ましくは２〜３２であり、３〜８が最も好ましい。より好ましい実施形態の例は、ＸおよびＹの一方または両方が、−（（ＣＨ２）ｎ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）−または−（（ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）から選ばれ、ここでｎ１は、１〜６、１〜５、１〜４であり、最も好ましくは１〜３であり、ｎ２は、２〜５０、２〜２５、２〜１５、２〜１０、２〜６であり、最も好ましくは２〜５である。非常に好ましい実施形態の例は、Ｘが−（ＣＨ２−ＣＨ２）−で、Ｙが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）−である場合である。いっそう好ましくは、個々のｎが整数である単分散混合物である。非常に好ましい実施形態においては、Ｘは−（ＣＨ２−ＣＨ２）−であり、Ｙは−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは１２〜３６である。
【０１４０】
特に、「ポリマー」は好ましくは、エチレンオキシド反復単位のようなポリアルキレンオキシドを有するポリマー鎖を有する水溶性ポリマーを含み、各鎖の分子量は、約１５００〜約４２，０００Ｄａであり、約２，０００〜約２０，０００Ｄａが最も好ましい。
【０１４１】
好ましいＵ基は、化学的ライゲーション可能な部分を含む。好ましいポリマーは、基Ｂが３本以上のアームを含む場合に分岐する。好ましい成分Ｊ＊は、生理学的条件下でイオン化可能性な基を、そして最も好ましくは負に帯電する基を含む。ＵおよびＪのいずれかまたは両方は、構成物の完全性を損うことなく除去可能な保護基を含み得る。
【０１４２】
好ましいスペーサーまたはリンカーは、水溶性ポリマー中に用いられる１つ以上の反復単位、ジアミノおよびまたは二酸単位、天然または非天然アミノ酸もしくはそれらの誘導体を含む直鎖状または分岐状部分、ならびに好ましくは最大で１８個の炭素原子さらには付加的ポリマー鎖までも含むアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシ等を含む直鎖状または分岐部分を含む。
【０１４３】
上記で言及したように、成分Ｕは、ペプチド、ポリペプチド、または関心のある他の表面のような標的分子に付着できる可能性があるか、または付着されている官能基の残基である。Ｕが標的分子へのコンジュゲーションのための官能基の残基である場合、Ｕは求核基または求電子基を含み、標的分子は、相互に反応性の求電子基または求核基をそれぞれ含む。
【０１４４】
そのような相互に反応性の多くの官能基は周知であり、ペプチドおよびポリペプチドに共通の側鎖官能基への付着が可能である（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９５） ６：１５０−１６５； ”Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｃ．Ｆ． Ｍｅａｒｅｓ， Ｅｄ．， ＡＣＳ， １９９３； ”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ”， Ｓ．Ｓ． Ｗｏｎｇ， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９３））。官能基の例としては、（ａ）ｐ−ニトロフェニル、またはスクシンイミジルのようなカーボネート、（ｂ）カルボニルイミダゾール、（ｃ）アズラクトン、（ｄ）環状イミドチオン、さらに（ｅ）イソシアネートまたはイソチオシアネートのようなアミノ基と反応可能な基が含まれる。カルボン酸基および反応性カルボニル基と反応可能な官能基の例としては、（ａ）第１アミン、または（ｂ）ヒドラジンおよびアシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼート、アミノオキシ等のヒドラジドが含まれる。メルカプトまたはスルフヒドリル基と反応可能な官能基としては、フェニルグリオキサール、マレイミド、およびハロゲンが含まれる。（カルボキシル）酸のようなヒドロキシル基と反応可能な官能基、または求電子中心と反応可能な他の求核試薬の例としては、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール基、活性メチレン等が含まれる。
【０１４５】
例えば、上記のポリマーは、標的分子へ付着するための官能基として成分Ｕを持つように調製することができ、そこでは官能基は、アクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニルカーボネート、オルトピリジルジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン、スクシンイミジルグルタレート、スクシミジルスクシネート、コハク酸、トレシレート等である。Ｕは、活性化可能な形態、例えば、アミンのような求核試薬と反応可能な活性エステルに変換できるカルボキシル酸でも提供できる。
【０１４６】
好ましい実施形態においては、Ｕは、標的分子上の一意的官能基と選択的反応性である一意的官能基の残基である。本発明のこの観点は、セクションＩＩにおいて上で論じたようなペプチド合成の原理（保護基戦略）および化学的ライゲーション（部分的または無保護基戦略）の原理を具体化するものである。従って、Ｕは、上で記載したような広範囲の官能基の残基を表し得る。好ましいＵ基は、アミンキャプチャ戦略（例えば、ヘミアミナール形成、イミン形成、およびマイケル付加によるライゲーション）、チオールキャプチャ戦略（例えば、メルカプチド形成、ジスルフィド交換によるライゲーション）、天然型化学的ライゲーション戦略（例えば、システインまたはチオール含有側鎖アミノ酸誘導体を伴うチオエステル交換によるライゲーション）、および直交ライゲーションカップリング戦略（例えば、チアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド交換、およびアミド形成によるライゲーション）（例えば、Ｃｏｌｔａｒｔ， ＤＭ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ （２０００） ５６：３４４９−３４９１参照）。特に好ましいＵは、セクションＩＩにおいて上記で記載されたような水性適合化学的ライゲーション化学中で用いられる一意的官能基の残基を含む。従って、Ｕは、カーボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等からなる群から選ばれる結合を形成可能な官能基とし得る。好ましい結合は、オキシムおよびアミド結合である。
【０１４７】
上記で言及したように、Ｂは、３本以上のアームを有する分岐核部分であり、存在してもしなくてもよい。Ｂが存在する場合、１本のアームが、ＵあるいはＵに付着させられたスペーサーまたはリンカーに結合され、他の各々のアームは、ポリマーあるいはポリマーに付着させられたスペーサーまたはリンカーと結合される。分岐核Ｂの例としては、アミノ、アミド、カルボキシル、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。これらは、リジン等のオリゴアミド、あるいはアルカンジアミンとアクリル酸とから調製されたオリゴマー（「ポリアミドアミン」）を含み、後者は分岐核中に実効正電荷をもたらす。（例えば、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ． （１９９６） ２：６６−７２； Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， （１９９６） ７（５）：５５２−５５６； ＮｏｖｏＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ， ２００１； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ （１９９８） ４７：３８１−３９６ ； Ｍａｈａｊａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） ４０：４９０９−４９−１２； Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ３９：１２９９−１３０２； Ｓｗａｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） ６２：４９０２−４９０３、米国特許第５，９３２，４６２号、第５，９１９，４５５号、第５，６４３，５７５号、第５，６８１，５６７号参照）。他の多種多様な分岐核は用いることができ、かつこの目的に適しており、置換ジアミン、置換二酸、グリセロールのようなアルキル酸、および３つ以上の感応基または活性化可能基を有する他の部分、多価アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、およびアルコキシ部分等、ならびにオリゴ糖が含まれる（例えば、Ｎｉｅｒｅｎｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９９９） ４０：５６８１−５６８４； Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． （１９９８） １−５６； Ｓｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （２０００） ３３：２５３； Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． （１９９９） ３８：８８４； Ｓｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ． （２０００） １２：２３５； Ｍｕｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９９７） ３８：６３１−６３４； Ｍｕｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９９７） ３８：３０−３０８８；およびＴｕｒｎｂｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｂｉｏｃｅｈｍ （２０００） １ （１）：７０−７４）。ポリマー成分に結合された最も好ましい分岐核は、アミド結合により結合される。
【０１４８】
好ましい分岐核は、アミノ、カルボキシルまたは混合されたアミノおよびカルボキシル官能性から出る。好ましい分岐核の例としては、それぞれリジンアミノ核、アスパラギン酸またはグルタミン酸分岐核、およびγ−グルタミン酸分岐核である。さらに、好ましい分岐ポリマー構成物は、分岐がオリゴアミドまたはポリアミドアミン核のような単独の分岐核から出ているものである。しかしながら、ポリマーバックボーンに沿って分配された多数の分岐核の連続から分岐が出ているウォーム状構造のような他の部類の分岐構成物を用いることができる（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． （２０００） ３９： ８６４）。化学組成および／またはポリマーバックボーンおよび反復単位のかさ高性に応じて、結果として得られるウォーム状構造は、水溶性となるようにまたは液晶組織を生じさせ易くなるように設計でき（Ｏｕａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （２０００） ３３：６１８５）、これは送達用途、安定性、および作用持続期間にとり有利になり得る。本発明の他の分岐ポリマー構成物と同様、ウォーム状構成物は、Ｕを含むペンダント官能基を含むように作られる。
【０１４９】
ポリマー成分、あるいは１つ以上のスペーサーまたはリンカーは、例えば上記のセクションＩで論じたように、生体安定性または生体分解性のポリマー鎖あるいは空間を置いたリンカーまたは結合を含み得る。上記のセクションＩで同様に言及されたように、成分Ｊ＊は、負、正および中性からなる群から選ばれる生理学的条件下での実効電荷を有するペンダント基の残基である。最も好ましいのは、Ｊ＊がイオン化可能カルボキシレート部分を含み、生理学的条件下で負の実効電荷を有する場合である。成分ｓ１、ｓ２、およびｓ３は、同じでも異なってもよいスペーサーまたはリンカー部分であり、セクションＩにおいて論じたもののように、個々に存在しても存在しなくてもよい。最も好ましくは、スペーサーまたはリンカーはポリマー鎖を含み、その場合、スペーサーまたはリンカーは式−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−の１つ以上の反復単位を含む。
【０１５０】
ＩＶ．製剤：
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、疾病および症状の処置を行うために、薬剤として用いることができる。従って、別の実施形態においては、本発明は、本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質または薬学的に許容できるその塩を含む製薬組成物に向けられる。そのような製薬組成物は１つ以上の賦形剤を含み得る。好ましい賦形剤は、バッファー、キャリアタンパク質、アミノ酸、界面活性剤、脂質、水溶性ポリマー、および保存剤からなる群から選ばれる。医薬製剤は、合成赤血球産生刺激タンパク質以外の、１つ以上の付加的な生物活性薬剤（例えば、小形有機分子、他のタンパク質治療剤等）のような１つ以上の付加的な活性医薬成分を組み合わせることもできる。そのような製薬組成物は、本発明の好ましい方法おいて使用できる。これらには、哺乳動物における赤血球産生、ヘマトクリット、ヘモグロビン、および網状赤血球数を増加させる方法が含まれる。これらの方法は、所望の効果を得るために本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を有効量哺乳動物に投与することが含まれる。
【０１５１】
最も好ましくは、治療を必要としている患者または個人に投与される場合、そのような合成赤血球産生刺激タンパク質および／またはポリペプチドは、ドラッグデリバリーシステムを用いて投与される。そのようなシステムを使うことにより、患者が薬物を使用できかつ所望の生物活性の有効性を高めるように薬物を患者に提示することが可能になる。本発明の目的である好ましいドラッグデリバリーシステムは、ポリペプチドまたはタンパク質を、経口的、経鼻的、または吸引的経路で、あるいは筋肉内、皮下、経皮、静脈内、耳内または眼内への投与が可能なシステムを含む、
【０１５２】
そのようなドラッグデリバリーシステムは、部位特定的放出をもたらしたり、腸粘膜の保護を強化したりする処方を含み得る。適切な処方としては、ドライパウダー処方、ウイルス粒子カプセル封入によるデリバリー、リポソームカプセル封入、経皮パッチ、電気的支援移送（エレクトロポレーション療法）およびポリマー／ｎｉａｚｏｎｅコンジュゲーションが含まれる。
【０１５３】
好ましい実施形態において、そのようなドラッグデリバリー装置は生物学的環境にける変化に応答して、この変化に基づいて薬物を送達、または送達を停止する。薬物および他の活性薬剤の放出を制御するために広範囲の物質が用いられてきた。すなわち、ポリ（ウレタン）、ポリ（シロキサン）、ポリ（メチルメタクリレート）、親水性および強度のためのポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）等である。さらに好ましい実施形態においては、生分解性ポリマーが、ドラッグデリバリーを容易にするため使用される。そのようなポリマーとしては、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコーリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ酸水化合物、およびポリオルソエステルが含まれる。ドラッグデリバリー機器およびそれらの使用方法は、以下の米国特許に記載されている。米国特許第６，０７２，０４１号；第６，０４１，２５３号；第６，０１８，６７８号；第６，０１７，３１８号；第６，００２，９６１号；第５，８７９，７１２号；第５，８４９，３３１号；第５，７９２，４５１号；第５，７８３，２１２号；第５，７６６，６３３号；第５，７５９，５６６号；第５，６９０，９５４号；第５，６８１，８１１号；第５，６５４，０００号；第５，６４１，５１１号；第５，４３８，０４０号；第４，８１０，４９９号；および第４，６５９，５５８号。
【０１５４】
従って、本発明の別の観点は、製薬組成物および、それを必要としている哺乳動物を、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質または薬学的に許容できるその塩を含む化合物を治療的に有効な量投与して治療する方法に関する。「薬学的に許容できる塩」は、本発明のポリペプチドの生物学的有効性および特性を保持し、かつ生物学的にまたは他の点で好ましくないものではない塩を意味するものである。塩は、酸または塩基から誘導し得る。酸性付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸（硫酸塩および重硫酸塩を与える）、硝酸、燐酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サルチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸から導かれる。塩基性付加塩は無機塩基から導かれ、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩等を含み得る。有機塩基から導かれる塩としては、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール， トロメタミン， リジン， アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン等を含む、第１、第２および第３アミン、自然生成置換アミンを含む置換アミンおよび環状アミンから導かれる塩が含まれる。好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミン、およびコリンである。
【０１５５】
本明細書中で用いられる用語「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾病および状況（例えば、貧血）の任意の処置をカバーし、（ｉ）疾病に罹患しやすくなっている可能性があるが、その疾病を有しているとまだ診断されていない被検者において、疾病または状況の発生を防止すること、（ｉｉ）疾病または状況を抑制、すなわち、その進行を停止すること、または（ｉｉｉ）疾病または状況を軽減、すなわち、その症状の後退または改善を引き起こすことを含む。
【０１５６】
本明細書中で用いられる用語「赤血球産生刺激タンパク質を用いた処置により防止または軽減される哺乳動物における疾病状態」は、一般に赤血球産生刺激タンパク質で有効に処置されると一般に認識されているすべての疾病状態をカバーすることを意図するものであり、それらの疾病状態は、本発明の特定の化合物により有効に防止または軽減されることが見出されている。これらの疾病状態には、貧血、β地中海貧血、悪性貧血、鎌状赤血球症、慢性細菌性心内膜炎、骨髄炎、若年性間接リウマチ、リウマチ熱、クローン病、潰瘍性大腸炎等が例として含まれるがこれらに限定されない。
【０１５７】
本明細書中で用いられる用語「治療上有効な量」は、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を、それを必要とする哺乳動物に、例えば赤血球産生誘発剤、抗貧血薬等として投与した場合に、（上記で定義されたような）処置を行うのに十分な量を指す。「治療上有効な量」となる量は、タンパク質誘導体、状態または疾病およびその重篤度、ならびに処置される哺乳動物、その体重、年齢等に応じて変わるであろうが、現代の知識および本開示に関して通常の機能を有する者により日常的に決定し得る。本明細書中で用いられるるように、用語「ｑ．ｓ．」は、定められた機能を達成するのに十分な量を付加、例えば、溶液を所望の容積（例えば、１００ｍＬ）にすることを意味する。
【０１５８】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質およびそれらの薬学的に許容できる塩、すなわち活性成分は、治療上有効な投薬量、すなわち上記に記載されるように、それを必要としている哺乳動物に投与した場合に、有効な処置を行うのに十分な量、で投与される。本明細書中に記載される合成赤血球産生刺激タンパク質の投与は、同様の用途に使われる薬剤の一般に認められた投与法のいずれかによることができる。本明細書中で使われるように、用語「本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質」、「本発明のポリペプチドの［薬学的に許容できる塩］」および「活性成分」は互換的に使われる。
【０１５９】
処方中のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質のレベルは、当業者により用いられる全範囲内で変わり得る。例えば、全体処方に基づいて約０．０１重量パーセント（％ｗ）〜約９９．９９％ｗのタンパク質アンタゴニストまたはアゴニストおよび約０．０１％ｗ〜約９９．９９％ｗの賦形剤である。より一般的には、ポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、約０．５％ｗ〜約８０％ｗのレベルで存在する。
【０１６０】
ヒト投薬レベルを本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質について最適化する必要がまだある一方で、一般的に、投与される化合物の量は当然、予防または軽減を標的とする被検者および疾病状態、苦痛の性質および重篤度、投与方法およびスケジュールならびに処方医師の判断に依存するであろう。そのような使用最適化は、技術的に通常のスキルを有する当業者の範囲内に十分ある。
【０１６１】
投与は、任意の許容された全身または局所経路とすることができ、例えば、非経口、経口（特に乳幼児用処方）、静脈内、経鼻、気管支吸入（すなわち、エアゾール処方）、経皮的または局所経路を介して、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、液体、溶液、エマルション、注射剤、懸濁液、座剤、エアゾール等の、固体、半固体もしくは液体またはエアゾールの投薬形態とすることができる。本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、所定レートでのポリペプチドの、好ましくは正確な用量の単一投与に適した単位服用形態での長期間投与の場合には、蓄積注射、浸透圧ポンプ、丸剤、経皮（電気輸送を含む）パッチ等を含む徐放性または制御放出投薬形態で投与することができる。これらの組成物は、従来の製薬担体または賦形剤および本発明のタンパク質アンタゴニストまたはアゴニストを含み、加えて、他の薬剤、製薬薬剤、担体、アジュバント等を含み得る。担体は種々の油剤から選択され、これには石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等である。水、食塩水、水性デキストロース、およびグリコール類は、特に注射可能溶液の場合に、特に好ましい液体担体である。適切な製薬担体としては、デンプン、セルロース、タルク、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、テアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。他の適切な製薬担体およびそれらの処方は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。
【０１６２】
必要であれば、投与される製薬組成物は、湿潤または乳化剤、例えば酢酸ナトリウム塩のようなｐＨ緩衝剤、ソルビタンモノステアレート、オレイン酸トリエタノールアミン等のような少量の非毒性補助物質も含み得る。
【０１６３】
活性成分がより多く必要とされることがあるが、便利な１日用量計画を用いて本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を送達するために、経口投与を用いることができ、用量計画は、所望の予防の程度に従って、または苦痛の緩和において調節できる。そのような経口投与のために、薬剤学的に許容可能で、非毒性組成物が、例えば調剤グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、クロスカーメロースナトリウム、ブドウ糖、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウム等のような、通常用いられる賦形剤のいずれかを混合することにより形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、分散性錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性処方等の形態を取る。経口処方は、胃腸疾患の治療に特に適している。一般的な全身的目的のための経口バイオアベイラビリティは、アセチル化アミノ酸を含む処方のような全身的循環への取込みを改善する賦形剤を利用することによって調節できる。例えば、米国特許第ＵＳ５，９３５，６０１号および米国特許第ＵＳ５，６２９，０２０号を参照。
【０１６４】
これらの組成物は、カプセル、丸剤または錠剤の形態を取ることができ、従って、組成物は、活性成分に加えて、乳糖、ショ糖、リン酸二カルシウム等のような希釈剤、クロスカーメロールナトリウム、デンプンまたはその誘導体のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体等のバインダーを含む。
【０１６５】
液状の薬剤学的に投与可能な組成物は、例えば、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質（約０．５％〜約２０％）および調剤補助薬を、例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセリン、グリコール類、エタノール、保存料等のような担体中に溶解、分散等することにより調製でき、それにより溶液または懸濁液を形成することができる。必要であれば、投与される製薬組成物は、湿潤剤、懸濁剤、乳化剤、または可溶化剤、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムといったｐＨ緩衝剤等、シクロデキストリン誘導体、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートまたはステアレート等の少量の非毒性補助薬剤を含むこともできる。そのような投薬形態を調製する実際の方法は公知、または当業者にとり明白であろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉを参照。投与される組成物すなわち処方は、いずれにせよ、処置されている被検者の症状を予防または軽減するのに有効な量の活性成分を含む。乳幼児への経口投与の場合は、（シロップまたは懸濁液のような）液状処方が好まれる。
【０１６６】
液体を含む固形剤形の場合は、例えばプロピレンカーボネート、植物油トリグリセリド中の溶液または懸濁液は、好ましくはゼラチンカプセル中に被抱される。液状の剤形の場合は、例えばポリエチレングリコール中の溶液は、投与用に容易に計量されるように、十分な量の薬学的に許容できる液状の担体、例えば水で希釈できる。
【０１６７】
代わりに、液状または半固形の経口処方は、活性成分を、植物油、グリコール類、トリグリセリド類、プロピレングリコールエステル類（例えば、プロピレンカーボネート）等の中に溶解し、これらの溶液または懸濁液を硬質または軟質ゼラチンカプセルシェル内に被抱することによって調製できる。
【０１６８】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を上記条件の処置に適用する際には、本明細書中に記載される活性成分の投与は、好ましくは非経口的に投与される。非経口投与は一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射を特徴とし、皮内または腹腔内注射、ならびに胸骨内注射または注入を含み得る。注射剤は、液状の溶液または懸濁液、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態として、エマルションまたは生体適合性ポリマーベースの微小球として従来の形態で調製できる（例えば、リポソーム、ポリエチレングリコール誘導体、ポリ（Ｄ，Ｃ）ラクチド等）。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等である。加えて、必要であれば、投与される調剤組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、ポリエキシエチレン、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、シクロデキストリン、血清アルブミン等のような、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、溶解性促進剤、タンパク質担体等の少量の非毒性補助物質も含み得る。
【０１６９】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質は、例えば、ケモカイン受容体モジュレーターを（水または食塩水のような）適切な溶媒中に溶解またはリポソーム処方中に組み込み、続いて許容できる注入流体中へ分散することによって、非経口的に投与できる。本発明のポリペプチドの典型的な１日用量は、１回の注入で、または周期的な間隔を置いての一連の注入により投与できる。非経口投与については、水溶性形態、例えば水溶性塩の形態、または増粘物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストラン、そして必要であれば安定剤、を含む水性注射懸濁液という形態の活性成分の特に適切な水溶液がある。活性成分は、任意に賦形剤と共に、凍結乾燥物の形態とすることもでき、さらに非経口投与の前に適切な溶媒を加えることにより溶液にすることができる。
【０１７０】
非経口投与用により最近考案されたアプローチでは、一定の投薬レベルが維持されるように、遅延放出または徐放出システムの埋め込みが用いられる。例えば、参照により組み込まれる米国特許第３，７１０，７９５号、米国特許第５，７１４，１６６号および米国特許第５，０４１，２９２号を参照。
【０１７１】
そのような親組成物中に含まれている活性成分の百分率は、ポリペプチドの活性および被検者のニーズだけでなく、組成物の特定の性質にも大いに依存する。しかしながら、溶液中で０．０１％〜１０％の活性成分の百分率を用いることができ、もし組成物がその後上記の百分率にまで希釈される固体であれば、より高くなる。好ましくは、組成物は、溶液中に活性成分を０．０２〜８％含む。
【０１７２】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を投与する別の方法では、静脈内ボーラス注射および連続注入が用いられる。
【０１７３】
エアゾール投与は、本発明のタンパク質を気道へ直接送達するための効果的な手段である。この方法の利点のいくつかは下記の通りである。すなわち、１）酵素的分解、胃腸管からの低い吸収、または肝臓の初回通過効果による薬剤損失の影響を回避し、２）分子サイズ、電荷または肺外部位への親和性のために、他の方法では気道中の標的部位に到着できないであろう活性成分を投与する、３）肺胞を介した体内への速やかに吸収できるようにする、４）他の器官系が活性成分に曝されないようにし、これは暴露により望ましくない副作用が引き起こされることがある場合には重要である。これらの理由により、エアゾール投与は、喘息、肺局部感染、ならびに肺および気道の他の疾患および疾患状態の処置にとり特に有利である。
【０１７４】
３タイプの医薬用吸入装置、すなわちネブライザ吸入器、定量吸入器およびドライパウダー吸入器がある。ネブライザ吸入器は、高速の空気流を作り出し、これにより（液状形態に処方された）タンパク質誘導体が患者の気道内に運ばれるミストとして噴霧される。定量吸入器は一般に、圧縮ガスと共に包装された処方を有しており、作動と同時に、圧縮ガスにより定量のポリペプチドを放出し、このようにして所定量薬剤の信頼できる投与方法を提供する。ドライパウダー吸入器は、自由流動粉体の形でポリペプチドを投与し、この粉体は、この装置による呼吸中に患者の気流中に分散できる。自由流動流粉体を得るため、ケモカイン誘導体は、乳糖のような賦形剤と共に処方される。定量のタンパク質誘導体は、カプセル形態で貯蔵され、作動ごとに患者に分配される。上記の方法のすべては、本発明の投与に用い得る。
【０１７５】
リポソームに基づく製剤処方も、本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質と共に使用するのに適している。例えば、米国特許第５，６３１，０１８号、同第５，７２３，１４７号、および同第５，７６６，６２７号を参照。リポソームの利点は、薬のリポソーム取込みに起因するインビボ分布および薬物動態学的パラメーターにおける有利な変化に関係していると信じられており、当業者により本発明のポリペプチドに適用し得る。注射または経口投与のための制御された放出リポソーム液体調剤処方も用い得る。
【０１７６】
座剤による全身投与については、伝統的なバインダーおよび担体として、例えば、ポリエチレングリコール類またはトリグリセリド類、例えばＰＥＧ１０００（９６％）およびＰＥＧ４０００（４％）が含まれる。そのような座剤は、活性成分を約０．５ｗ／ｗ％〜約１０ｗ／ｗ％、好ましくは約１ｗ／ｗ％〜約２ｗ／ｗ％の範囲で含む混合物から形成できる。
【０１７７】
本明細書中で言及したすべての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。今や本発明の概要を説明したのであるから、例示のために提供されかつ特に明記してあるものを除き本発明を限定することを意図しない以下の以下の実施例を参照して、本発明はより容易に理解されるであろう。
【０１７８】
（実施例）
略語
Ａｃｍ＝アセトアミドメチルチオール保護基［すなわち、−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ３］
ＡｏＡ＝アミノオキシアセチル
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）＝Ｌ−アルギニン（側鎖ＮＧトルエンスルホニル−保護）
ＡＲＴ＝絶対網状赤血球数
Ａｓｐ（ｃＨｅｘ）＝Ｌ−アスパラギン酸（側鎖シクロヘキシルエステル保護）
ＡＵＣ＝曲線下面積
Ｂｏｃ＝ｔｅｒ−ブトキシカルボニル
ＣＤ＝円偏光二色性
ＣＤＩ＝カルボニルジイミダゾール
ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣
ＣＬ＝クリアランス（ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ）
Ｃｍａｘ＝最大濃度
Ｃｙｓ（４ＭｅＢｚｌｌ）＝Ｌ−システイン（側鎖（４−メチル）ベンジル−保護）
Ｃｙｓ（Ａｃｍ）＝Ｌ−システイン（側鎖アセトアミドメチル［すなわち、−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ３］−保護）
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＩＣ＝ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルジメチルスルホキシド
ＤＰＣ＝ドデシルホスホコリン
Ｄｐｒ＝Ｌ−１，２ジアミノプロピオン酸
ＥＤ５０＝５０％最大効果に達するために必要な有効量
ＥＤＡ＝（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３ジアミン
ＥＬＩＳＡ＝酵素結合イムノアッセイ
ＥＰＯ＝エリスロポエチン
ＥＳ−ＭＳ＝エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＢＳ＝ウシ胎仔血清
Ｇｌｕ（ｃＨｅｘ）＝Ｌ−グルタミン酸（側鎖シクロヘキシルエステル保護）
ＧＭ−ＣＳＦ＝顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＨＡＴＵ（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアンモニウムヘキサフルオロフォスフェート
ＨＣＴ＝ヘマトクリット
ＨＧＢ＝ヘモグロビン
Ｈｉｓ（Ｄｎｐ）＝Ｌ−ヒスチジン（側鎖ＮＩｍジニトロフェニル保護）
ＨＯＢＴ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー
ＩＭＤＭ＝イスコフ改変ダルベッコ培地
ＩＰＡ＝イソプロパノール
Ｌｅｖ＝レブリン酸
Ｌｙｓ（ＣＩＺ）＝Ｌ−リジン（側鎖２−クロロベンジルオキシカルボニル）−保護
ＭＢＨＡ＝４−メチルベンズヒドリルアミン
ＭＲＴ＝平均滞留時間
ＭＴＴ＝４−メチルトリチル
ＭＴＴ＝チアゾリルブルー
ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂＝−Ｏ−ＣＨ２−Ｂｚ−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２（コポリスチレンジビニルベンゼン）−樹脂
Ｐｂｏ＝４−（ＣＨ３Ｓ（Ｏ）−）ベンジル
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＶ＝赤血球沈層容積
ＲＢＣ＝赤血球
ＲＥＴ＝網状赤血球
ｒｈＥＰＯ＝組換えヒトＥＰＯ
ＲＳＡ＝ラット血清アルブミン
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＰ＝合成赤血球産生タンパク質
Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）＝Ｌ−セリン（側鎖ベンジル−保護）
【０１７９】
実施例１
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−０の合成
合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ）を合成した。完全長合成タンパク質（「ＳＥＰ−０（１−１６６）」と表される）の配列は以下の通りである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ
ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ
ＬＶＫＳＳＱＰＷΨＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：１）
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を示す。ＳＥＰ−０タンパク質を、以下の４つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した：
セグメントＳＥＰ−０：１（ＧＲＦＮ１７１１；配列番号：１の残基１−３２により構成）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル
セグメントＳＥＰ−０：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：１の残基３３−８８により構成）
ＣＳＬＮＥＫＩＴＶＰ ＤＴＫＶＮＦＹＡＷＫ ＲＭＥＶＧＱＱＡＶＥ ＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥ
ＡＶＬＲＧＱＡＬＬＶ ＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ３３はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−０：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：１の残基８９−１１６により構成）
ＣＰＬＱＬＨＶＤＫＡ ＶＳＧＬＲＳＬＴＴＬ ＬＲＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ８９はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−０：４（ＧＲＦＮ１７１４、配列番号：１の残基１１７−１６６により構成）
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＳ ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ
ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｃ末端システイン（Ｃｙｓ１６１）はピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を持っている）
【０１８０】
ペプチドＳＥＰ−０：１およびＳＥＰ−０：２およびＳＥＰ−０：３を、チオエステル生成樹脂上で、Ｂｏｃ（ｔｅｒ−ブトキシカルボニル）化学用ｉｎ ｓｉｔｕ中和プロトコルおよび段階的固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、確立されているＳＰＰＳ、側鎖保護およびチオエステル樹脂戦略（Ｈａｃｋｅｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （１９９９） ９６： １００６８−１００７３； ａｎｄ Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．， （１９９２） ４０： １８０−１９３））を用いてＡＢ１４３３Ａ自動ペプチド合成装置でまたは手作業での鎖集合により合成し、あるいは商業ベンダーへ注文して入手した。例えば、ＢｏｃＳＰＰＳ保護基の標準キットを用いた。すなわち、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）；Ａｓｐ（ｃＨｅｘ）；Ｃｙｓ（４ＭｅＢｚｌ）＆Ｃｙｓ（Ａｃｍ）；Ｇｌｕ（ｃＨｅｘ）；Ｈｉｓ（ＤＮＰ）；Ｌｙｓ（ＣＩＺ）；Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）；Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）；Ｔｒｐ（ｆｏｒｍｙｌ）；Ｔｙｒ（ＢｒＺ）；Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｕは、側鎖未保護であった。セグメントＳＥＰ−０：４を、−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で相似的に合成した。ペプチドを脱保護し、同時に、標準的Ｂｏｃ化学手順に従って、樹脂支持体からＨＦ／ｐ−クレゾールを用いて切断した。しかしながら、ＨＦ／ｐ−クレゾール中で除去されない保護基を含むペプチドについては、保護基は保持された。ペプチドは、調製用Ｃ４逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。純粋なペプチドを含んでいるフラクションは、ＥＳ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化質量分析）を使って同定し、その後のライゲーション用にプールし凍結乾燥した。
【０１８１】
ステップ１：ライゲーション＃１  セグメントＳＥＰ−０：４およびセグメントＳＥＰ−０：３を、１５ｍＭの濃度でＴＦＥに溶解した。６Ｍ塩化グアニジウムおよび１％チオフェノールを含む飽和リン酸塩バッファー（ｐＨ７．９）を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。ライゲーション後、ライゲーションミックスを、ＴＦＥ（トリフルオロエタノール）２ｍｌ、６Ｍ塩化グアニジウム６ｍｌ、２５％β−メルカプトエタノール含有１００ｍＭリン酸塩の溶液に加え、２０分間インキュベートした。この溶液を、１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン．ＨＣｌ）氷酢酸溶液で酸性化し、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム（直径１インチ）にロードした。次に、ペプチドを、調製用グラジエント逆相ＨＰＬＣで精製した。所望のライゲーション産物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、プールした。
【０１８２】
ステップ２：Ａｃｍ−除去＃１  Ａｃｍ除去のため、プールしておいたＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、ＨＰＬＣグレード水で１×希釈し、固体尿素を最終的に２モル濃度となるように加えた。３％酢酸水溶液中の３０ｍｇ／ｍｌ  Ｈｇ（酢酸塩）２溶液を（予期される総システイン濃度に関して）３倍モル過剰加え、溶液を１時間攪拌する。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、半調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０１８３】
ステップ３：ライゲーション＃２  等量のＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４およびＳＥＰ−０：２を共に、純ＴＦＥ中に１５ｍＭの濃度で溶解した。６Ｍ塩化グアニジウムおよび１％チオフェノールを含むリン酸塩バッファー（ｐＨ７．５）２５０ｍＭを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。１日ライゲーションした後、ライゲーションミックスを、ＴＦＥ１０ｍｌ、β−メルカプトエタノール１０ｍｌ、ピペリジン１０ｍ、および６Ｍ塩化グアニジウム２０ｍｌのｐＨ４の溶液に加え、どのような残留保護基も除去されるように２０分間インキュベートした。この溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＣＥＰで酸性化し、調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０１８４】
ステップ４：カルボキシメチル化  ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を、ＴＦＥ中に１５ｍＭの濃度で溶解した。６Ｍ塩化グアニジウムを含む２倍過剰（ｖ／ｖ）の２００ｍＭリン酸塩バッファー（ｐＨ７．９）を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。最小量のメタノール中に溶解した２５倍過剰のブロモ酢酸を加え、溶液を２時間反応させた。この溶液は、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＣＥＰで酸性化し、調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のカルボキシメチル化産物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔを含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、プールした。
【０１８５】
ステップ５：ピコリル除去  亜鉛末を２Ｍ  ＨＣｌ中で３０分間活性化した。ペプチドＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔを、生のＴＦＥ中に約１０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解した。この溶液を、（新たに添加された）３５ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−メチオニンおよび３５ｍｇ／ｍｌドデシルサルコシン（すなわち、ナトリウムＮ−ドデカノイルサルコシン）を含む４ｘ（ｖ／ｖＴＦＥに関して）６Ｍ塩化グアニジウム、１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４、で希釈した。この反応は、〜１時間間隔でモニターし、５時間で完了した。完了後、上澄みを除去し、残留Ｚｎ末を、６Ｍ塩化グアニジウム、ｐＨ４、３５ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−メチオニン含有１００ｍＭ酢酸塩および２０％ＴＦＥ含有３５ｍｇ／ｍｌドデシルサルコシンで５分間２回洗い、２０％β−メルカプトエタノールを含む同じ溶液でさらに１回洗う。結合産物を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＣＥＰの溶液で酸性化し、調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の修飾産物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−Ｐｉｃｏを含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、プールした。
【０１８６】
ステップ６：Ａｃｍ除去＃２  プールしておいたＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−Ｐｉｃｏの溶液を、ＨＰＬＣグレード水で３×希釈し、固体尿素を最終的に２モル濃度となるように加えた。３％酢酸水溶液中の３０ｍｇ／ｍｌ  Ｈｇ（酢酸塩）２溶液を（予期される全システイン濃度に対して）３倍モル過剰加え、溶液を１時間攪拌する。次に、溶液をβ−メルカプトエタノール中に２０％とし、半調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、ステップグラジエントで精製した。所望の産物ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−Ｐｉｃｏを含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、２×（ｗ／ｗペプチド質量に関して）ＤＰＣ（ドデシルホスホコリン）を含む水で２×（ｖ／ｖ）希釈し、一晩凍結乾燥した。
【０１８７】
ステップ７：ライゲーション＃３  等量のＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−ＰｉｃｏおよびＳＥＰ−０：１を共に、純ＴＦＥ中に１５ｍＭの濃度で溶解し、６Ｍ塩化グアニジウム含むリン酸塩バッファー（ｐＨ７．５）２５０のｍＭを加える。この溶液に１％チオフェノールを加えた。１日ライゲーションした後、ライゲーションミックスをＴＦＥ１０ｍｌ、β−メルカプトエタノール１０ｍｌ、ピペリジン１０ｍ、および６Ｍ塩化グアニジウム２０ｍｌのｐＨ４の溶液に加え、どのような残留保護基も除去されるように２０分間インキュベートした。この溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＣＥＰで酸性化し、調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物ＳＥＰ−０（１−１６６）：（配列番号：１）を含むフラクションをエレクトロスプレーイオン化質量分析で同定し、により、２×（ｗ／ｗペプチド質量に関して）ドデシルサルコシンを含む水で２×（ｖ／ｖ）希釈し、凍結乾燥した。
【０１８８】
ステップ８：折りたたみ  完全長結合されたペプチドＳＥＰ−０（１−１６６）を、６Ｍ塩化グアニジウム、２０％ＴＦＥおよび１０倍モル過剰（タンパク質のＣｙｓ残基に関して）のシステインを含む２００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．７）中に溶解した。この溶液を、３Ｍ塩化グアニジウムを含む２００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．７）溶液に対して、室温で一晩透析した。次に、この溶液を、１Ｍ塩化グアニジウムを含む２００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．７）の溶液に対して室温で４時間４℃で、そして最終的に１０ｍＭリン酸塩バッファー（ｐＨ７．０）に対して４時間４℃で透析して最終的な折りたたまれた産物を得た。折りたたみは、エレクトロスプレーＥＳ−ＭＳおよびＣＤ（円偏光二色性）分光分析により検証した。
【０１８９】
ステップ９：精製  折りたたまれたポリペプチドを、セントリコン・コンセントレーター・バイアル中で５×濃縮し、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０で平衡化したリソースＳ陽イオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、１０分間リニア塩グラジエントで５００ｍＭ  ＮａＣｌ中に溶離した。所望の折りたたまれた産物ＳＥＰ−０（１−１６６）を含むフラクションを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で同定し、凍結し、−８０℃で保存した。ＣＤスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析逆相ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＥＳ−ＭＳスペクトルによっても、折りたたまれたタンパク質の存在が証明された。
【０１９０】
実施例２
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ３０の合成
オキシム形成基をＳＥＰ−０の位置２４および１２６に含むように、第２の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｌ３０と呼ぶ）を合成した。次に、これらの基を用いてＳＥＰ−１−Ｌ３０を形成し、そこでは直鎖状の（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ−）１８カルボキシレート（ＥＤＡ＝（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３ジアミン（ＴＴＤとも呼ばれる）；Ｓｕｃｃ＝−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）ポリマーがタンパク質バックボーンに結合されている。完全長ＳＥＰ−１（１−１６６）の配列は下記の通りである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫｏｘＩＴＴＧＣＡ ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ
ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ
ＬＶＫＳＳＱＰΨＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫｏｘＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Ｋｏｘは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。ＳＥＰ−１−Ｌ３０の構造も図１５に示してある。
【０１９１】
以下で説明されるＳＥＰ−１−Ｌ３０の化学合成を例示する概略図を図１４に示す。簡潔に言えば、図１４Ａおよび図１４Ｂにおいて、水溶性ポリマーＧＲＦＮ３２（ＧＰ３２）は、オキシム結合形成化学的ライゲーション反応を介してペプチドＳＥＰ−１：１およびＳＥＰ−１：４に付着させられる。示されるように、ペプチドＳＥＰ−１：１は、その後の天然型化学的ライゲーションのためのヒスチジンα−カルボキシルチオエステルを含むＣ末端Ｙａａ基を位置３２に、および位置２４（天然ヒトＥＰＯのグリコシル化部位）に非天然リジン残基を持ち、後者の側鎖は、アミノオキシアシル部分を含むＵｎ＝１基を持つように化学的に修飾されている。最終的な完全長産物の位置１に対応するＮ末端アラニンを参照用に示してある。ペプチドＳＥＰ−１：４は、位置１１７にシステインを含む未保護Ｎ末端Ｘａａ基を、位置１２６（天然ヒトＥＰＯのグリコシル化部位）にアミノオキシアシル修飾リジンを含むＵｎ＝１基を、そして位置１６１（ジスルフィド形成システイン）に側鎖チオールがピコリル基で保護されたシステインを有する。Ｃｙｓ１６１は、天然型化学的ライゲーション部位のために導入されたシステインのその後の変換におけるそのチオアルキル化を防止するために保護されており（図１４Ｄ参照）、また、ピコリル保護基が使われており、これはその除去が、最初の天然型化学的ライゲーション反応（図１４Ｃ参照）においてＡｃｍ（アセトアミドメチル）保護システインを除去するために必要な条件に直交するからである。位置２４および１２６におけるＧＰ３２ポリマー構成物の部位特定かつ排他的付着は、精密ポリマー修飾ペプチドＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２およびＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２を作り出すオキシム形成化学的ライゲーションにより達成される。図１４Ｃは、ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の中間ペプチドＳＥＰ−１：３への天然型化学的ライゲーションおよびＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の生成を示すもので、後者のライゲーション部位は、Ｌｙｓ１１６およびＣｙｓ１１７である。示されるように、ペプチドＳＥＰ−１：３は、位置８９にＡｃｍ保護システインを含むＮ末端Ｘａａ基を、位置１１６にリジンα−カルボキシルチオエステルを含むＣ末端Ｙａａ基を含む。天然型化学的ライゲーションに続いて、Ａｃｍ保護基は、次のライゲーション反応のためのこのライゲーション産物を調製するために除去される。図１４Ｄは、ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の中間ペプチドＳＥＰ−１：２への天然型化学的ライゲーションおよびＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の生成を示すもので、後者のライゲーション部位は、Ｔｒｐ８８およびＣｙｓ８９である。示されるように、ペプチドＳＥＰ−１：２は、位置３３にＡｃｍシステインを含むＮ末端Ｘａａ基を、位置８９にトリプトファンα−カルボキシルチオエステルを含むＣ末端Ｙａａ基を含む。天然型化学的ライゲーションに続いて、ライゲーション産物は、ライゲーション部位システイン８９および１１７の側鎖チオールのカルボキシメチル化のためにブロモ酢酸にさらされ、このようにして擬似グルタミン酸へ変換される。カルボキシメチル化に続いて、Ａｃｍおよびピコリル保護基は、次のライゲーション反応のために、この未保護のポリマー修飾ライゲーション産物を調製するために除去される。図１４ＥはＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２のペプチドセグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２（完全長産物のＮ末端セグメントに対応）への天然型化学的ライゲーションおよび完全長ＳＥＰ−１−Ｌ３０産物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２＋ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の生成を示すもので、その最終的なライゲーション部位はＨｉｓ３２およびＣｙｓ３３である。示されるように、完全長ＳＥＰ−１−Ｌ３０産物は、ユーザー定義された部位、すなわち天然ヒトＥＰＯの位置２４および位置１２６に対応するグリコシル化部位、において排他的に付着させられた２つの水溶性ポリマー（Ｇ３２）を含む。合成の詳細を以下に説明する。
【０１９２】
Ａ．ＦＮＰ３２によるＧＲＦＮ１７７６およびＧＲＦＮ１７１１ＧＲのオキシム化
オキシム形成は、アミノオキシアセチル基を持つ水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を持つペプチドに付着させるために実行した。これを達成するため、以下のペプチドセグメントを合成した：
セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６；配列番号：２の残基１１７−１６６により構成）
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＫ ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ
ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ１２６は、ε−アミノ基においてレブリン酸残基で修飾されており、Ｃｙｓ１１７は、Ａｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号：２の残基１−３２により構成）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ２４は、レブリン酸残基で修飾されている）
【０１９３】
実施例１と同様に、セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１）をチオエステル生成樹脂上で、セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６）を−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で合成した。これら２つのペプチドセグメントのリジン２４および１２６は、当初ε−アミノ基においてＦｍｏｃ基で保護した。鎖集合の完了後、Ｆｍｏｃ保有アミノ基を、標準的Ｆｍｏｃ脱保護手順に従って脱保護し、各ペプチド樹脂へレブリン酸を付着することによりそれぞれ修飾した。次に、これらのペプチドを脱保護し、実施例１に記載されるように、樹脂支持体から同時に切断した。ペプチドは、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣにより精製した。純粋なペプチドを含んでいるフラクションを、ＥＳ−ＭＳを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。ＧＲＦＮＰ３２［−（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８カルボキシレート］を、標準的プロトコルに従ってＳａｓｒｉｎカルボキシル生成樹脂上で集合させた（Ｒｏｓｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， 米国特許出願番号第０９／３７９，２９７号；Ｒｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． （１９９９） １２１：７０３４）。アミノオキシアセチル（ＡｏＡ）部分を、５倍過剰の活性化Ｂｏｃアミノオキシ酢酸をカップリングすることによってポリマーのＮ末端アミノ基に付着させた。ポリマー鎖は、古典的なＦｍｏｃ化学手順を用いて樹脂支持体から切断した。ポリマー鎖は、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣにより精製した。純粋なポリマーを含んでいるフラクションを、ＥＳ−ＭＳを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【０１９４】
セグメントＳＥＰ−１：４およびＧＲＦＮＰ３２を共に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントＣ４逆相ＨＰＬＣで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０１９５】
セグメントＳＥＰ−１：１およびＧＲＦＮＰ３２を共に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントＣ４逆相ＨＰＬＣで未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０１９６】
Ｂ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ３０の合成
ＳＥＰ−１−Ｌ３０を、溶液中で以下の４つのポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１−３２に対応）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫｏｘＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ２４は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル）（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合（Ｋｏｘと表される）を介してＧＲＦＮＰ３２にカップリングされている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３−８８に対応）
ＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ
ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ３３は、Ａｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に対応）
ＣＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ８９は、Ａｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ：１：４＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１１７−１６６に対応）
ＣＡＩＳ ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ１２６は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル）（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合（Ｋｏｘと表される）を介してＧＲＦＮＰ３２にカップリングされており、Ｃ末端システインは、ピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有する）
【０１９７】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、実施例１に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｌ３０を得た。ＣＤスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析用逆相ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＥＳ−ＭＳスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【０１９８】
実施例３
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ２６の合成
オキシム形成基をＳＥＰ−０の位置２４および１２６に含むように、第３の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｌ２６と表される）を合成した。次に、これらの基を用いてＳＥＰ−１−Ｌ２６を形成し、そこでは位置２４および１２６でそれにおいて直鎖状ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８カルボキシレートおよび（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）６−アミドが、オキシム結合を介してタンパク質バックボーンにそれぞれ結合されている。完全長ＳＥＰ−１（１−１６６）の配列は下記の通りである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ
ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ
ＬＶＫＳＳＱＰＷΨＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Ｋｏｘは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【０１９９】
ＳＥＰ−１−Ｌ３０とは対照的に、ＳＥＰ−１−Ｌ２６構成物は、位置１２６において付着させられたより小さく未帯電の水溶性ポリマーを持つように設計した。位置２４において付着させられたポリマーは、ＳＥＰ−１−Ｌ３０におけるものと同じであった。完全長産物の集合は、実施例２に記載した通りであった。ＳＥＰ−１−Ｌ２６の構造を図１６に示す。
【０２００】
Ａ．ＧＲＦＮＰ６によるＧＲＦＮ１７７６のオキシム化およびＧＲＦＮＰ３２によるＧＲＦＮ１７１１のオキシム化
オキシム形成は、アミノオキシアセチル基を持つ水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を持つペプチドに付着させるために実行した。これを達成するため、以下のペプチドセグメントを合成した：
セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６；配列番号：２の残基１１７−１６６により構成）
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＫ ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ
ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ１２６は、ε−アミノ基においてレブリン酸残基で修飾されており、Ｃｙｓ１１７は、Ａｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号：２の残基１−３２により構成）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ２４は、レブリン酸残基で修飾されている）
【０２０１】
実施例１と同様に、セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１）をチオエステル生成樹脂上で、セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６）を−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で合成した。これら２つのペプチドセグメントのリジン２４および１２６は、当初ε−アミノ基においてＦｍｏｃ基で保護した。鎖集合の完了後、Ｆｍｏｃ保有アミノ基を、標準的Ｆｍｏｃ脱保護手順に従って脱保護し、各ペプチド樹脂へレブリン酸を付着することによりそれぞれ標準的カップリング手順に従って修飾した。次に、これらのペプチドを脱保護し、実施例１に記載されるように、標準的Ｂｏｃ−化学手順に従って、樹脂支持体から同時に切断した。ペプチドは、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣにより別個に精製した。各ペプチドについて、純粋なペプチドを含んでいるフラクションを、ＥＳ−ＭＳを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【０２０２】
水溶性ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８カルボキシレート（ＧＲＦＮＰ３２）を、標準的プロトコルに従ってＳａｓｒｉｎカルボキシル生成樹脂上で集合させた（Ｒｏｓｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， 米国特許出願番号第０９／３７９，２９７号；Ｒｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． （１９９９） １２１：７０３４）。水溶性ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）６−アミド（ＧＲＦＮＰ３２）を、標準的プロトコルに従ってＳｉｅｂｅｒアミド生成樹脂上で集合させた（Ｒｏｓｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， 米国特許出願番号第０９／３７９，２９７号；Ｒｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． （１９９９） １２１：７０３４）。アミノオキシアセチル（ＡｏＡ）部分を、５倍過剰の活性化Ｂｏｃアミノオキシ酢酸をカップリングすることによって各樹脂結合ポリマーのＮ末端アミノ基に付着させた。２つのポリマー鎖は、古典的なＦｍｏｃ化学手順を用いてそれぞれの樹脂支持体から別個に切断した。各ポリマー鎖は、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣにより精製した。各ポリマーについて、純粋なポリマーを含んでいるフラクションを、ＥＳ−ＭＳを使って同定し、プールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【０２０３】
セグメントＳＥＰ−１：４およびＧＲＦＮＰ６を共に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントＣ４逆相ＨＰＬＣで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ６を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２０４】
セグメントＳＥＰ−１：１およびＧＲＦＮＰ３２を共に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。次に、この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントＣ４逆相ＨＰＬＣで未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２０５】
Ｂ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ２６の合成
ＳＥＰ−１−Ｌ２６は、溶液中で以下の４つのポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ：１：１＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１−３２に対応）
セグメントＳＥＰ：１１＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ３２配列番号の残基１−３２に対応：２）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫｏｘＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ２４は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル）（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合（Ｋｏｘと表される）を介してＧＲＦＮＰ３２にカップリングされている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３−８８に対応）
ＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ
ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ３３は、Ａｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に対応）
ＣＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ８９は、Ａｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ：１：４＋ＧＰ６（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ６、配列番号：２の残基１１７−１６６に対応）
ＣＡＩＳ ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ１２６は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル）（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合（Ｋｏｘと表される）を介してＧＲＦＮＰ３２にカップリングされており、Ｃ末端システイン［すなわち、Ｃｙｓ１６１］は、ピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有する）
【０２０６】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、実施例１および２に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｌ２６を得た。ＣＤスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物の分析用逆相ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＥＳ−ＭＳスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【０２０７】
実施例４
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５０の合成
第４の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｂ５０と表される）を合成した。完全長ＳＥＰ−１−Ｂ５０のアミノ酸配列は、ＳＥＰ−１−Ｌ３０の配列と同じである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫｏｘＩＴＴＧＣＡ ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ
ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ
ＬＶＫＳＳＱＰΨＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫｏｘＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Ｋｏｘは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【０２０８】
しかしながら、このタンパク質は、ＳＥＰ−１−Ｌ３０の直鎖状（Ｓｕｃｃ−ＥＤＡ）１８ポリマーではなく、４つの直鎖状（Ｓｕｃｃ−ＥＤＡ）１２部分を有する分岐ポリマー構成物で誘導体化した。誘導体化はオキシム結合を介して達成した。
【０２０９】
図１７は、以下で詳細に説明されるようにオキシム形成ライゲーションを介してＳＥＰ−１−Ｂ５０に結合された分岐水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ２９（ＧＰ２９）の化学合成を例示する概略図である。図１７に示されるように、Ｕ基としてアミノオキシアシルを持ち、さらにＧＰ２９と呼ばれコハク酸残基により提供されたペンダントカルボキシレートを持つ直鎖状水溶性ポリアミドエチレンオキシド構成物へのチオエーテル結合を介したその後のカップリングのための４つのペンダントチオール基を持つ３×リジン分岐核Ｂを有するＵ−Ｂ成分ＧＲＦＮ１７（ＧＰ１７）を生成するために、直交的に保護されたリジンＵ−Ｂ前駆体を使用した。完全長産物の集合は、実施例２で記載される通りであった。ＳＥＰ−１−Ｂ５０の構造を図１８に示す。
【０２１０】
Ａ．複数のチオール基を持つ鋳型ＧＲＦＮＰ１７の合成
鋳型ＧＲＦＮＰ１７を、アミド生成（４−メチル）ベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）−樹脂上で０．４ｍｍｏｌスケールで手動で合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを、標準的カップリングプロトコルを用いてカップリングした（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， Ｍ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．（１９９２）４０：１８０−９３）。２．１ｍｍｏｌアミノ酸、３．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＨＢＴＵ中の１０％ＤＩＥＡ、すなわち、アミノ酸の５倍過剰を用いた。Ｆｍｏｃ保護基の除去後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを、標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした（２．１ｍｍｏｌアミノ酸、３．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＨＢＴＵ中の１０％ＤＩＥＡ、すなわち、アミノ酸の５倍過剰を用いた）。第２のＦｍｏｃ除去ステップ後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを、標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした（４．２ｍｍｏｌアミノ酸、７．６ｍｌ  ０．５Ｍ  ＨＢＴＵ中の１０％ＤＩＥＡ、すなわち、遊離アミンに対して５倍過剰のアミノ酸）。最終的Ｆｍｏｃ脱保護ステップ後、ＤＭＦ中のＳ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル（ＳＡＭＡ−ｏＰｆｐ）の５倍過剰（遊離アミンに対して）を３０分間カップリングした。Ｃ末端リジル残基の側鎖のＢｏｃ保護基を、純ＴＦＡによる１分間の洗浄２回し、続いてＤＭＦ中の１０％ＤＩＥＡで洗って樹脂を中和して除去した。２ｍｍｏｌ  Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸および２ｍｍｏｌ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を３ｍｌ  ＤＭＦ中に溶解した。２ｍｍｏｌ  ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）の添加後、酸を３０〜６０分間活性化した。この溶液を、中和された樹脂に加え、１時間カップリングさせ。最終的に、Ｓ−結合アセチル基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで３０分間かけて除去した。鋳型を脱保護し、同時に遊離アルデヒドのスカベンジャーとしてのシステインの存在で標準的Ｂｏｃ−化学手順に従ってＨＦ／ｐ−クレゾールを用いて樹脂支持体から切断した（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， Ｍ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ． （１９９２） ４０：１８０−９３）。５０％Ｂ［すなわち、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液］（アルデヒドフリー）中の再生ポリアミドを凍結し、凍結乾燥した。精製のため、鋳型粗製産物を、２ｍｌ  ５０％Ｂ中に溶解し、１００ｍｌ  １００％Ａ［すなわち、水中の０．１％ＴＦＡ］を加えて試料を希釈した（アルデヒドの付加が保証されているので、塩化または酢酸グアニジウムの添加を回避する）。鋳型を、Ｔ＝４０℃および３％Ｂで平衡化したＣ４調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。塩をイソクラティック溶離し、所望の鋳型、ＧＲＦＮＰ１７をリニアグラジエントで精製した。所望の産物を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２１１】
Ｂ．分岐水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ２９の合成
分子量１５ｋＤａの分岐（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１２ポリマーであるＧＲＦＮＰ２９を、精製チオール含有鋳型ＧＲＦＮＰ１７および直鎖状ポリマーＧＲＦＮＰ３１、Ｂｒ−アセチル−１２（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）カルボキシレートのチオエーテル生成ライゲーションにより合成し、ここでＧＲＦＮＰ３１は標準的プロトコルに従ってＳａｓｒｉｎカルボキシ−生成樹脂上で合成した（Ｒｏｓｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， 米国特許出願番号第０９／３７９，２９７号； Ｒｏｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． （１９９９） １２１： ７０３４）。
【０２１２】
１．３倍モル過剰（全チオールに対して）の精製ＧＲＦＮＰ３１、Ｂｒ−アセチル化（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１２、および精製チオール含有鋳型ＧＲＦＮＰ１７を共に、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／６Ｍ塩化グアニジウム、ｐＨ８．７に、〜１０ｍＭ濃度で溶解した。溶解後、溶液を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．７バッファーで３倍（ｖ／ｖ）希釈した。ライゲーションミックスを室温で攪拌し、反応を逆相ＨＰＬＣおよびＥＳ−ＭＳにより監視した。付加的なＧＲＦＮＰ３１反応物を、所望の反応産物が主産物になるまで必要なだけ付加した。ワークアップのため、３×（ｖ／ｖライゲーションミックスに対して）０．１Ｍ酢酸塩／６Ｍ塩化グアニジウム、ｐＨ４を添加し、溶液を調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、リニアグラジエントにより精製した。純粋なＧＲＦＮＰ２９構成物を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳを用いて同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２１３】
Ｃ．ＧＲＦＮＰ２９によるＧＲＦＮ１７７６およびＧＲＦＮ１７１１のオキシム化
セグメントＳＥＰ−１：４およびセグメントＳＥＰ−１：１を実施例２に記載されるように合成した。セグメントＳＥＰ−１：４およびＧＲＦＮＰ２９を共に、０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。この溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を、調製用逆相ＨＰＬＣカラム（１インチ直径）にロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントＣ４逆相ＨＰＬＣで未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物ＳＥＰ：１：４＋ＧＰ２９を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールした。
【０２１４】
セグメントＳＥＰ−１：１およびＧＲＦＮＰ２９を共に、０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。この溶液を凍結し、凍結乾燥した。乾燥粉末を、０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液中に溶解し、調製用ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）カラム（１インチ直径）ロードした。ポリマー修飾ペプチドを、イソクラティック溶離により未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化産物ＳＥＰ−１を含むフラクション：１＋ＧＰ２９を、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールした。
【０２１５】
Ｄ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５０の合成
ＳＥＰ−１−Ｂ５０（配列番号：２）は、溶液中で以下の４つのポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ２９（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ２９、配列番号２の残基１−３２に対応）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫｏｘＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ２４は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル）（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合（Ｋｏｘと表される）を介してＧＲＦＮＰ２９にカップリングされている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３−８８に対応）
ＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ
ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ３３は、Ａｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に対応）
ＣＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ８９は、Ａｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ：１：４＋ＧＰ２９（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ２９、配列番号：２の残基１１７−１６６に対応）
ＣＡＩＳ ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ１２６は、ε−アミノ基においてレブリンオキシムリンカー基で修飾され、この基は、レブリン−アミノオキシアセチル）（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合（Ｋｏｘと表される）を介してＧＲＦＮＰ２９にカップリングされており、Ｃ末端システインは、ピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有する）
【０２１６】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、基除去反応、折りたたみおよび精製は、精製がリソースＱカラム上であったこと以外は、実施例１および２に記載されるように実行し、完全長の折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｂ５０（配列番号：２）を得た。ＣＤスペクトルだけでなく折りたたまれたタンパク質産物ＳＥＰ−１−Ｂ５０の分析用Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＥＳ−ＭＳスペクトルにより、折りたたまれたタンパク質産物の存在が証明された。
【０２１７】
実施例５
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−３−Ｌ４２の合成
第５の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−３−Ｌ４２と呼ぶ）を合成した。完全長ＳＥＰ−３タンパク質のアミノ酸配列は下記の通りである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＣＩＴＴＧＣＡ ＥＨＣＳＬＮＥＣＩＴ
ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ
ＬＡＣＳＳＱＰＷＥＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＣＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：３）
【０２１８】
位置２４、３８、８３、および１２６のシステイン残基を、マレイミド官能化した（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８（ＧＲＦＮＰ３２）ポリマー単位（マイケル付加反応を介して）で修飾してＳＥＰ−３−Ｌ４２を形成した。ＳＥＰ−３−Ｌ４２の構造を図２０に示す。
【０２１９】
以下で説明されるＳＥＰ−３−Ｌ４２の化学合成を例示する概略図を図１９に示す。簡潔に言えば、図１９Ａおよび図１９Ｂは、４つのＳＥＰ−３−Ｌ４２ペプチドセグメント、ＳＥＰ−３：１〜ＳＥＰ−３：４の天然型化学的ライゲーションを示し、これによりヒトＥＰＯにおける４つ全ての天然グリコシル化部位に対応するライゲーション部位でシステインが生成する。特に、図１９Ｂは、すべてのジスルフィド形成システインが保護された完全長ポリペプチドを示し、これによりシステインライゲーション部位において４つの帯電直鎖状水溶性ポリマー（ＧＲＦＮ３２−マレイミド（ＧＰ３２マレイミド）と呼ぶ）のマイケル付加反応を介した部位特定的付着が可能になる。図１９Ｂも、ジスルフィド形成システインの最終的脱保護ステップ、および完全長のポリマー修飾産物の生成を示す。
【０２２０】
詳細には、ＳＥＰ−３は溶液中で以下の４つのポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−３：１（ＧＲＦＮ１７４７、配列番号：３の残基１−３７に対応）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＣＩＴＴＧＣＡ ＥＨＣＳＬＮＥ−チオエステル（Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ２９、およびＣｙｓ３３はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−３：２（ＧＲＦＮ１７７４、配列番号：３の残基３８−８２に対応）
ＣＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ
ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＡ−チオエステル（Ｃｙｓ３８は、Ａｃｍ基により保護された側鎖）
セグメントＳＥＰ−３：３（ＧＲＦＮ１７４９、配列番号：３の残基８３−１２５に対応）
ＣＳＳＱＰＷＥＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳ
ＰＰＤＡＡ−チオエステル（Ｃｙｓ８３は、Ａｃｍ基により保護された側鎖）
セグメントＳＥＰ−３：４（ＧＲＦＮ１７５０、配列番号：３の残基１２６−１６６に対応）
ＣＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｃｙｓ１６１は、Ｐｂｏ［すなわち、４−（ＣＨ３Ｓ（Ｏ）−）ベンジル−］保護されている）
【０２２１】
ペプチド合成。ペプチドＳＥＰ−３：１、ＳＥＰ−３：２、およびＳＥＰ−３：３を、実施例１に記載されるような確立された側鎖保護戦略を用い、上記の特定のペプチドにおいて言及したような保護基戦略を変えて、Ｂｏｃ化学ＳＰＰＳのためのｉｎ ｓｉｔｕ中和プロトコルにより、チオエステル生成樹脂上で合成した。セグメントＳＥＰ−３：４を、−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で相似的に合成した。ペプチドを脱保護し、実施例１に記載されるように、樹脂支持体から同時に切断した。結果として得られた上記のペプチドを、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。純粋なペプチドを含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳを用いて同定し、ブールし、その後のライゲーション用に凍結乾燥した。
【０２２２】
ステップ１：ライゲーション＃１  セグメントＳＥＰ−３：４およびセグメントＳＥＰ−３：３を、１５ｍＭの濃度でＴＦＥに溶解した。６Ｍ塩化グアニジウムおよび１％チオフェノールを含む飽和リン酸塩バッファー（ｐＨ７．５）を加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。ライゲーション後、ライゲーションミックス（１容積と定義する）を、｛ＴＦＥ２ｍｌ、６Ｍ塩化グアニジウム６ｍｌ、２５％β−メルカプトエタノール含有１００ｍＭリン酸塩の溶液｝２容積に加え、２０分間インキュベートした。この溶液を、１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＣＥＰの氷酢酸溶液で酸性化し、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、プールした。
【０２２３】
ステップ２：Ａｃｍ除去＃１  Ａｃｍ除去のため、プールしておいたＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、ＨＰＬＣグレード水で１×希釈し、固体尿素を最終的に２モル濃度となるように加えた。３％酢酸水溶液中の３０ｍｇ／ｍｌ  Ｈｇ（酢酸塩）２溶液を３倍モル過剰加え、溶液を１時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、半調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２２４】
ステップ３：ライゲーション＃２  等量のＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４およびＳＥＰ−３．２を共に、純ＴＦＥ中に１５ｍＭの濃度で溶解した。６Ｍ塩化グアニジウムおよび１％チオフェノールを含むリン酸塩バッファー（ｐＨ７．５）２５０ｍＭを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。１日ライゲーションした後、ライゲーションミックス（１容積と定義する）を、ＴＦＥ１０ｍｌ、β−メルカプトエタノール１０ｍｌ、ピペリジン１０ｍ、および６Ｍ塩化グアニジウム２０ｍｌのｐＨ４の溶液２容積に加え、どのような残留保護基も除去されるように２０分間インキュベートした。この溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＣＥＰで酸性化し、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２２５】
ステップ４：Ａｃｍ除去  Ａｃｍ除去のため、プールしておいたＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、ＨＰＬＣグレード水で１×希釈し、固体尿素を最終的に２モル濃度となるように加えた。３％酢酸水溶液中の３０ｍｇ／ｍｌ  Ｈｇ（酢酸塩）２溶液を３倍モル過剰（予想される総システイン濃度に対して）加え、溶液を１時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、Ｃ４半調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の産物ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２２６】
ステップ５：ライゲーション＃３  等量のＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４およびＳＥＰ−：３：１を共に、純ＴＦＥ中に１５ｍＭの濃度で溶解した。６Ｍ塩化グアニジウムおよび１％チオフェノールを含むリン酸塩バッファー（ｐＨ７．５）２５０ｍＭを加え、ペプチドセグメントの清澄な溶液を得た。１日ライゲーションした後、ライゲーションミックス（１容積と定義する）を、ＴＦＥ１０ｍｌ、β−メルカプトエタノール１０ｍｌ、ピペリジン１０ｍおよび６Ｍ塩化グアニジウム２０ｍｌのｐＨ４の溶液２容積に加え、どのような残留保護基も除去されるように２０分間インキュベートした。この溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌ  ＴＣＥＰで酸性化し、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、リニアグラジエントで精製した。所望のライゲーション産物ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２２７】
ステップ６：ポリマーＧＲＦＮＰ３２の付着  ＧＲＦＮＰ３２−マレイミドと呼ばれるマレイミド官能化直鎖状（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８ポリマーを、マレイミド官能化（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８ポリマー［すなわち、マレイミド−（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８］を形成するためのメーカーのプロトコルに従い、ＧＲＦＮＰ３２をＢＭＰＳ（３−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル、Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）で官能化することにより調製した。ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を、必要最小量のＴＦＥ中に溶解した。３倍過剰のＧＲＦＮＰ３２−マレイミドを、６Ｍ塩化グアニジウム、１００ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．５、中に溶解し、ＴＦＥ溶液に加えた。マイケル付加反応の進行は、分析用逆相ＨＰＬＣで追った。反応完了後、この溶液を、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、リニアグラジエントにより精製した。所望のポリマー修飾産物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ｐＰＥＧ［すなわち、Ｃｙｓ２４、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ８３およびＣｙｓ１２６の側鎖チオールに付着させられたＧＲＦＮＰ３２の４つのコピーを持つ結合された完全長１６６残基ポリペプチド鎖、従ってＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２とも呼ばれる］を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２２８】
ステップ７：Ｐｂｏ除去  Ｐｂｏ還元のため、ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２の凍結乾燥粉末を、５％エタンジチオールを含む純ＴＦＡ中に溶解した。次に、Ｐｂｏ基を、３０分間かけて１０％チオアニソールおよび１５％ブロモトリメチルシランを加えることにより切断した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥し、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル水溶液に取り込んだ。結果として得られた溶液を、半調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望のＣｙｓ１６１−脱保護産物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２−Ｐｂｏを含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２２９】
ステップ８：Ａｃｍ除去  Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ２９、およびＣｙｓ３３の側鎖から最終的にＡｃｍを除去するため、ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２−Ｐｂｏのプールしておいたフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、ＨＰＬＣグレード水で１ｘ希釈し、固体尿素を最終的に２モル濃度となるように加えた。３％酢酸水溶液中の３０ｍｇ／ｍｌ  Ｈｇ（酢酸塩）２溶液を（予期される全システイン濃度に関して）３倍モル過剰加え、溶液を１時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、半調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、ステップグラジエントにより精製した。所望の結合されたポリマー修飾産物ＳＥＰ−３（１−１６６）を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳで同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２３０】
ステップ９：折りたたみ  完全長結合されたポリマー修飾ペプチドＳＥＰ−３（１−１６６）を、６Ｍ塩化グアニジウム、２０％ＴＦＥおよび１０倍モル過剰（ＳＥＰ−３中のＣｙｓ残基に関して）のシステインを含む２００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．７）中に溶解した。この溶液を、３Ｍ塩化グアニジウムを含む２００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．７）溶液に対して、室温で一晩透析した。次に、この溶液を、１Ｍ塩化グアニジウムを含む２００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．７）の溶液に対して室温で４時間４℃で、そして最終的に１０ｍＭリン酸塩バッファー（ｐＨ７．０）に対して４時間４℃で透析して最終的な折りたたまれた産物を得た。折りたたみは、エレクトロスプレーＥＳ−ＭＳおよびＣＤ分光分析により検証した。
【０２３１】
ステップ１０：精製  折りたたまれたポリペプチドを、セントリコン・コンセントレーター・バイアル中で５×濃縮し、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０で平衡化したリソースＳ陽イオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、１０分間リニア塩グラジエントで５００ｍＭ  ＮａＣｌ中に溶離した。所望の折りたたまれた産物ＳＥＰ−３−Ｌ４２を含むフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定し、凍結し、−８０℃で保存した。
【０２３２】
実施例６
合成赤血球産生刺激タンパク質の生物活性アッセイ
折りたたまれた合成赤血球産生刺激タンパク質、ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０、およびＳＥＰ−３−Ｌ４２の生物活性を、ＵＴ／７および３２Ｄ１０３１９７細胞系を用い、対照標準として市販の組換えエリスロポエチンを用いた因子依存性細胞系増殖アッセイにおいて決定した。ＵＴ−７は、成長および生存についてインターロイキン−３、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）の１つに絶対的に依存するヒト巨核芽球白血病細胞系である（Ｍｉｕｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ （１９９８） ９９：１８０−１８４） ； Ｋｏｍａｔｓｕ Ｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９９１） ５１：３４１−８）。３２Ｄ１０３１９７は、マウス造血細胞系である（Ｍｅｔｃａｌｆ， Ｄ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９９２） １０：１１６−２５）。
【０２３３】
ＳＥＰ構成物の原液を、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、グルタミンおよびＰｅｎｓｔｒｅｐ中で作り、これらの現役の連続した２×希釈をマルチウェルプレートに加え、これにヒトＵＴ／７ＥＰＯ細胞を５０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌの濃度で加えた。プレートは、３７℃で５％Ｏ２存在下でインキュベートし、成長を毎日モニターした。４日後、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）中の２．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ（メチルチアゾールテトラゾリウム）２０μｌを加え、プレートを４時間インキュベートした。ＩＰＡ１５０μｌを加え、各ウェルの吸光度を５６２ｎｍで読んだ。ＳＥＰ化合物についてＥＤ５０（最大効果の５０％に達するための有効用量）値を決定しＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞産生ｒｈＥＰＯ（組換えヒトエリスロポエチン）の値と比較した。これらの実験の結果により、合成赤血球産生刺激タンパク質のすべてが生物活性を示すことが実証された。ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、およびＳＥＰ−１−Ｂ５０についてのＥＤ５０結果を表ＶＩに示す。
表ＶＩ
【表５】
2004515471.tif 000017
【０２３４】
ポリマー修飾ＳＥＰ−１−Ｌ３０の場合の吸光度によりタンパク質濃度を計算するために吸光係数を用いるだけでペプチド含有量について基準化した場合のこれらの実験からの付加的結果は、ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０およびＳＥＰ−３−Ｌ４２について表ＶＩＩおよび図２６に示してある（ＳＥＰ−１−Ｂ５１化合物の合成は以下の実施例７に記載）。一括して、これらのインビトロアッセイは、インビトロ生物活性に対するポリマー構造および付着部位を変えることの差動効果を実証するものであり、そこでは、これらの化合物の相対的な効力の序列は、（１）ヒトＥＰＯ受容体活性について試験した場合には、（最も強力なのものから最も弱いものへ）ＳＥＰ−１−Ｌ２６（ＳＥＰ−１−Ｌ３０＞ＳＥＰ−１−Ｂ５０（ＳＥＰ−１−Ｂ５１＞ＳＥＰ−３−Ｌ４２＞ＳＥＰ−０であり、（２）マウスＥＰＯ受容体活性について試験した場合には、（最も強力なのものから最も弱いものへ）ＳＥＰ−１−Ｌ−２６＞ＳＥＰ−１−Ｌ３０＞ＳＥＰ−０＞ＳＥＰ−３−Ｌ４２＞ＳＥＰ−１−Ｂ５０（ＳＥＰ−１−Ｂ５１である。
表ＶＩＩ
【表６】
2004515471.tif 000018
【０２３５】
表ＶＩＩおよび図２６の結果は、非ポリマー修飾構成物ＳＥＰ−０と比較したポリマー修飾ＳＥＰ構成物についての受容体優先性において有意な差も示している。特に、ＳＥＰ−１−Ｌ２６は、対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位位置２４（この部位に付着させられたペンダント負電荷を持つ５．５ｋＤａ直鎖状ポリマー）および位置１２６（この部位に付着させられたペンダント中性電荷を持つ１．８ｋＤａ直鎖状ポリマー）に付着させられた異なる直鎖状ポリマーで修飾されており、この構成物はヒト受容体およびマウス受容体両方に対して同様な活性を有していた。ＳＥＰ−１−Ｌ３０は、対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位位置２４および１２６にペンダント負電荷を有する５．５ｋＤａ直鎖状ポリマーで修飾されており、この構成物はマウス受容体と比較してヒト受容体に対して約５倍活性であった。ＳＥＰ−３−Ｌ４２は、対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位位置２４、３８、８３および１２６にペンダント負電荷を有する５．５ｋＤａ直鎖状ポリマーで修飾されており、マウス受容体と比較してヒト受容体に対して約１０倍活性であった。最大の差は、ＳＥＰ−１−Ｂ５０およびＳＥＰ−１−Ｂ５１について観察され、これらは、対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位位置２４および１２６に付着させられた分岐状の負帯電の１５ｋＤａポリマーで修飾されており、ｐｌが約５（ヒトＥＰＯと同様）であり、マウス受容体と比較してこれらの２つの構成物はヒト受容体に対して〜６０倍活性であった。
【０２３６】
マウスＥＰＯは、ヒトＥＰＯ位置１２６に対応する位置にグリコシル化部位を欠いているので（マウスＥＰＯは、ヒトＥＰＯに見られるＯ−グリコシル化セリンの代わりに非グリコシル化プロリンを有している）、改変された受容体活性は、ある程度この違い、従って対応する位置１２６にＯ−結合グリコシル化を欠いているＥＰＯについてのマウス受容体の優先性に起因し得る。これは、ＳＥＰ−１−Ｌ２６およびＳＥＰ−１−Ｌ３０とＳＥＰ−１−Ｂ５０およびＳＥＰ−１−Ｂ５２との比較に一致している。例えば、ＳＥＰ−１−Ｌ２６は、１．８ｋＤａ未帯電ポリマーを位置１２６に有するのに対して、ＳＥＰ−１−Ｌ３０は、５．５ｋＤａ負帯電ポリマーを位置１２６に有している。ヒトＥＰＯ受容体に対して同等な活性が観察されたけれども、マウスＥＰＯ受容体に対しては４倍の違いが見られた。最大の差は、対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位位置１２６に負帯電１５ｋＤａポリマーが付着させられたＳＥＰ−１−Ｂ５０およびＳＥＰ−１−Ｂ５１構成物の場合に観察された。ヒトＥＰＯにおける４つの天然グリコシル化位置すべて、すなわち２４、３８、８３および１２６、に対応する部位における５．５ｋＤａ負帯電ポリマーの付加は、ＳＥＰ−３−Ｌ４２構成物と同様に、マウスについての優先性をなおいっそう減少させたが、ＳＥＰ−１−Ｂ５０およびＳＥＰ−１−Ｂ５１構成物よりは少なかった。これらの結果は、生物学的に産生され、グリコシル化されたタンパク質におけるグリコシル化部位に対応する部位の精密修飾によって、およびポリマーのサイズ、分岐の性質および電荷を調節することによって受容体特異性を調整できることを立証している。
【０２３７】
実施例７
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５１の合成
Ａ．ＳＥＰ−１−Ｂ５１の組成
第６の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｂ５１と呼ぶ）を合成した。完全長ＳＥＰ−１−Ｂ５１のアミノ酸配列は、ＳＥＰ−１−Ｂ５０の配列と同じである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫｏｘＩＴＴＧＣＡ ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ
ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ
ＬＶＫＳＳＱＰＷΨＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫｏｘＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Ｋｏｘは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【０２３８】
しかしながら、ＳＥＰ−１−Ｂ５０とは対照的に、タンパク質は、アミド結合を介してリジン分岐核に結合された４つの直鎖状（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−アラニン−ＯＨ［すなわち、（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−Ａｌａ−ＯＨ、あるいは（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２Ｓｕｃｃ−Ａｌａ］ポリマーを有する分岐状ポリマー構成物で誘導体化されている。アミド結合を介した分岐核への直鎖状ポリマーのカップリングは、安定性を向上するように設計された。４つの直鎖状ポリマーも、アラニン部分およびペンダント負電荷を持つように設計され、負電荷がシアル酸を模倣し、アラニンが糖鎖のペンダント糖部分に類似の疎水性を模倣する。分岐ポリマーも、分岐核鋳型の合成および取り扱い特性を改善するために、さらにタンパク質バックボーンへの糖付着部位と糖質の第１の分岐点との間の天然糖質鎖に見られるスページングを模倣するために、分岐核とタンパク質バックボーン付着部位との間に水溶性スペーサーを持つように設計された。
【０２３９】
図２１は、以下で説明されるようにオキシム形成ライゲーションを介してＳＥＰ−１−Ｂ５１に結合された分岐水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ４１（ＧＰ４１）の化学合成を例示する概略図である。完全長産物の集合は、実施例２に記載の通りであった。ＳＥＰ−１−Ｂ５１の構造は図２２に示してある。
【０２４０】
Ｂ．分岐鋳型（ＧＲＦＮＰ４０）にカップリングするための（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）の合成
直鎖状ポリマー（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）を、０．５ｍｍｏｌスケールで、Ｓａｓｒｉｎ酸不安定な、カルボン酸生成樹脂上で合成した。０．５ｍｍｏｌ（〜０．５グラム）Ｓａｓｒｉｎ酸不安定な、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂（ヒドロキシル置換１．０２ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＭＦ中で１５分間膨潤させ、次いで排液した。このヒドロキシル−官能化された樹脂に、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）５００マイクロリットル（３．９ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ８ｍｌ中に溶解した無水コハク酸４５０ｍｇ（４．５ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン４８８ｍｇ（４ｍｍｏｌ）を加え、渦撹拌により３０分間反応させ、排液した。カップリングを反復し、過剰反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌ）を、新たに用意したＤＭＦ中の１．０Ｍ（８ｍｍｏｌ）ＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）溶液８ｍｌを加えて活性化し、４０分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。ＤＭＦ中の０．５Ｍ（２ｍｍｏｌ）ＨＯＴＢ溶液４ｍｌ中に溶解した（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３ジアミン（ＴＴＤ）４ｍｌ（４グラム、１８．２ｍｍｏｌ）を加え、渦流攪拌により３０分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。ＤＩＥＡを５００マイクロリットル（３．９ｍｍｏｌ）含む０．５Ｍ（４ｍｍｏｌ）ＨＯＢＴ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液８ｍｌ中に溶解した無水コハク酸（４５０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）を樹脂に加え、１５分間渦流攪拌して反応させ、次いで排液した。３つのステップ（ＣＤＩ活性化、ＴＴＤカップリング、無水コハク酸反応）を１１回［すなわち、合計１２回］反復した。過剰反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌ）を、新たに用意したＤＭＦ中の１．０Ｍ（８ｍｍｏｌ）ＣＤＩ溶液８ｍｌで活性化し、４０分間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。Ｈ−ＡｌａＯｔＢｕ・ＨＣＬ２．５ｍｍｏｌを、ＤＩＥＡ１５０マイクロリットル（１１１ｍｇ、０．８２５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ中の０．５Ｍ（２．３７５ｍｍｏｌ）ＨＯＢＴ溶液４．７５ｍｌ中に溶解し、さらにＣＤＩ−活性化ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌ）と渦撹拌により１時間反応させ、次いで排液した。過剰反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、次いで排液した。生成物ｔｅｒｔＢｕＯＯＣ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂を、ＤＣＭ（ジクロルメタン）で徹底的に洗浄し、排液し、次いで、樹脂を真空下で一定重量になるまで乾燥した。生成物−樹脂の典型的な重量は約２グラムであった。
【０２４１】
直鎖状（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕポリマーを、ＤＣＭ中の４％ＴＦＡを用いる標準的Ｆｍｏｃ−化学手順に従って樹脂支持体から切断した。沈降した粗生成物を、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥ポリマーを、０．１％ＴＦＡを含む少量の５０％アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度を１％未満まで減少させるために希釈した。粗生成物を、Ｔ＝４０℃において３％Ｂで平衡化したＣ４調製用逆相カラムにロードした。塩類をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、２０−３５％バッファーＢ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液の６０分間にわたるリニアグラジエントにより精製した。所望の（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ物質（ＧＲＦＮＰ３９）を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳで同定し、凍らせ、凍結乾燥した。
【０２４２】
Ｃ．分岐のための複数のアミン基およびタンパク質（ＧＲＦＮＰ４０）への（後の）付着のための保護されたアミノオキシ基を持つ鋳型の合成
鋳型ＧＲＦＮＰ４０を、Ｓｉｅｂｅｒアミド生成樹脂上で０．４ｍｍｏｌスケールで手作業で合成した。すべてのカップリング、脱保護および活性化ステップの間にＤＭＦによる１分間のフロー洗浄ステップがあった。Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎβ−（Ｂｏｃ−アミノオキシアセチル）−Ｌ−ジアミノプロピオン酸２ｍｍｏｌを、１時間、ＤＣＭ／ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中のＤＩＣ  ２ｍｍｏｌおよびＮＨＳ  ２ｍｍｏｌを用いた３０分間のＮＨＳ−エステル事前活性化を用いて樹脂に結合させた。Ｆｍｏｃ保護基の除去（ＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖピペリジン２×３分間）および洗浄後、ＤＩＥＡ  ２．２ｍｍｏｌを含む０．５Ｍ  ＨＯＢＴ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液８ｍｌ中に無水コハク酸４ｍｍｏｌを溶解し、１０分間樹脂にカップリングさせた。このステップの後、カルボキシル基を、新たに調製したＤＭＦ中の０．５Ｍ（４ｍｍｏｌ）ＣＤＩ溶液８ｍｌで活性化した。ＴＴＤ  ４ｍｌ（１８．２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中の０．５ｍＨＯＢＴ溶液４ｍｌに加え、３０分間カップリングさせた。
【０２４３】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（２ｍｍｏｌ）を、結果として得られるアミノ−ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ−Ｄｐｒ（ＢｏｃＡｏＡ）−樹脂（Ｄｐｒ＝ジアミノプロピオン酸）に、ＤＭＦ中のＤＩＣ  ２ｍｍｏｌおよびをＮＨＳ  ２ｍｍｏｌによる３０分間の事前活性化を用いて１時間カップリングさせた。このカップリングを１度繰り返した。Ｆｍｏｃ除去ステップ（ＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖピペリジンで２×３分間）後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ  ４ｍｍｏｌを上述の通りに再カップリングを含むカップリングをさせた。最終的なＦｍｏｃ保護ステップ（ＤＭＦ中の２０％ｖ／ｖピペリジンで２×３分間）後、鋳型を、ＤＣＭ中の４％ＴＦＡを用いる標準的Ｆｍｏｃ−化学手順に従って樹脂支持体から切断した。沈降した生成物を、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥した粗生成物を、０．１％ＴＦＡを含む少量の５０アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度が１％未満となるように希釈した。鋳型を、Ｔ＝４０℃で３％バッファーＢ（アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）で平衡化したＣ４調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。塩類および他の非アミド物質をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、５−１２％バッファーＢ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液の６０分間にわたるリニアグラジエントにより精製した。所望のＬｙｓ−Ｌｙｓ（Ｌｙｓ）−ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ−Ｄｐｒ（ＢｏｃＡｏＡ）アミド物質（ＧＲＦＮＰ４０）を含むフラクションをＥＳ−ＭＳでついて同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【０２４４】
Ｄ．アミドカップリングされた分岐ポリマー（ＧＲＦＮＰ４１）の集合および脱保護
分子量１６ｋＤａの分岐（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）４９−ポリマーであるＧＲＦＮＰ４１を、ＧＲＦＮＰ３９［（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ］を精製鋳型ＧＲＦＮＰ４０にカップリングすることにより合成した。６０℃でＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した精製（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）（１．０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ中で濃度１０ｍｇ／ｍｌのＨＡＴＵ｛Ｏ−（７−アザベンドトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート｝０．９５モルで、２０倍（モル）過剰ＤＩＥＡ存在下で活性化した。ＤＭＳＯ中に濃度３．９ｍｇ／ｍｌで溶解した精製鋳型ＧＲＦＮＰ４０（０．２４モル）を直ちに加えた。反応の進行は、Ｃ４分析用逆相ＨＰＬＣおよびＥＳ−ＭＳにより監視した。典型的には、カップリングは数分以内で完了した。ワークアップのため、４容積（ライゲーションミックスに対して）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム／６Ｍ塩化グアニジウム、ｐＨ４を加え、溶液を調製用（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。塩類および他の非アミド含有物質をイソクラティック溶離し、所望の分岐ポリマー産物を、２０−３５％バッファーＢ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液のリニアグラジエントにより８０分間にわたり精製した。所望の物質を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳで同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【０２４５】
結果として得られる精製ポリマーを、純ＴＦＡ中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で１時間かけて溶解し、Ｂｏｃ基をアミノオキシアセチル部分から除去し、ｔｅｒｔ−ブチルエステル基を−Ａｌａ−ＯｔＢｕ部分から除去した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥するまで回転させ、乾燥ポリマーを、５０％バッファーＢ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）中に溶解させた。付加物形成不純物を捕捉するため、アミノオキシ酢酸（ａ．ｋ．ａ「カルボキシメトキシルアミン」）を最終濃度０．５Ｍまで加えた。２０分後、溶液を３．３容積バッファーＡ（０．１％ＴＦＡ水溶液）で希釈し、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、すべてのアミノオキシ酢酸が除去されるまで１０％バッファーＢでポンプ送液し、次いでポリマーを、１５％から４５％のバッファーＢ対０．１％ＴＦＡ水溶液のステップグラジエントで８０分間にわたり精製した。所望の分岐ポリマー物質（ＧＲＦＮＰ４１）を含むプールされたフラクションを凍らせ、凍結乾燥した。
【０２４６】
Ｅ．分岐ポリマーＧＲＦＮＰ４１によるペプチドセグメントＧＲＦＮ１７７６およびＧＲＦＮ１７１１のオキシム形成ライゲーション（オキシム化）
セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６、配列番号：２の残基１１７−１６６で構成される）およびセグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号：２の残基１−３２で構成される）を、実施例１に記載されるように、標準的ｉｎ ｓｉｔｕ中和Ｂｏｃ化学ＳＰＰＳを用いて合成した。ペプチドＧＲＦＮ１７７６を、同様に上記で記載されるように、標準的プロトコルに従って−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で合成した。ペプチドＧＲＦＮ１７１１を、上記で記載されるように、標準的プロトコルに従ってチオエステル−生成樹脂上で合成した。Ｌｙｓ１２６にレブリンアシル部分を含むセグメントＧＲＦＮ１７７６およびＡｏＡ含有ＧＲＦＮＰ４１を共に、０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末粗製産物を、０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液中に再溶解し、調製用逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエント逆相ＨＰＬＣによって未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム結合（オキシム化）産物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１を含むフラクションをＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２４７】
Ｌｙｓ２４にレブリンアシル部分を含むセグメントＧＲＦＮ１７１１およびＡｏＡ含有ＧＲＦＮＰ４１を共に、０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解した。溶液を凍らせ、凍結乾燥した。乾燥粉末を、０．１％ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水溶液中に再溶解し、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、調製用グラジエントＣ４逆相ＨＰＬＣによって未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム結合（オキシム化）産物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１を含むフラクションをＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２４８】
Ｆ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１Ｂ５１の合成
（配列番号：２）を有するＳＥＰ−１−Ｂ５１を、溶液中で以下の４つのポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ４１（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ４１、配列番号：２の残基１−３２に対応）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫｏｘＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ２４は、Ｋｏｘにより示されるように、分岐ポリマーＧＲＦＮＰ４１にオキシム結合されたレブリンアシルペンダント部分を有し、Ｈｉｓ３２はＤｎｐ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３−８８に対応）
ＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬ
ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ３３はＡｃｍ保護されており、３つのＴｒｐ残基はホルミル保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に対応）
ＣＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ８９はＡｃｍ保護されており、Ｈｉｓ９４はＤｎｐ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ４１、配列番号：２の残基１１７−１６６に対応）
ＣＡＩＳ ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｃ末端システイン（すなわち、Ｃｙｓ１６１）はピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有し、Ｌｙｓ１２６はＫｏｘにより示されるように、分岐ポリマーＧＲＦＮＰ４１にオキシム結合されたレブリンアシルペンダント部分を有する）
【０２４９】
完全長の折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｂ５１（配列番号：２）を産するため、付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみおよび精製を、以下の変更を伴って、実施例１−４に記載されるように実行した：
【０２５０】
ステップ１：ライゲーション＃１  セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１を、３ｍＭの濃度でＴＦＥ（１容積）に溶解した。セグメントＳＥＰ−１：３を、６Ｍ塩化グアニジウムを含む２容積の３００ｍＭ  Ｎａリン酸塩バッファー（ｐＨ７．９）中に２．２５ｍＭの濃度まで溶解した。２つの溶液を混合して、最終的なセグメント濃度を１ｍＭ  ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１および１．５ｍＭ  ＳＥＰ−１：３とし、１％チオフェノールを加え、ｐＨ６．８〜７．２でペプチドセグメント溶液（「３容積」）を得た。反応を室温で一晩進行させた。ライゲーション後、β−メルカプトエタノール（３容積）をライゲーションミックスに加え、続いて３容積の６Ｍ塩化グアニジウム３００ｍＭ  Ｎａリン酸塩ｐＨ７．９バッファー、そしてＴＣＥＰを加え（ペプチドセグメントの全重量の０．２５重量比）、溶液を２０分間攪拌した。この溶液を、０．６容積の氷酢酸でｐＨ４．０＋／−０．１に酸性化して清澄な溶液とし、これに６Ｍ塩化グアニジウムを含むｐＨ４．０、１００ｍＭ  Ｎａ酢酸塩希釈バッファーを３０容積加えた。結果として得られる溶液を、調製用逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣカラムに送液した。すべての非ペプチド物質がカラムから溶離されるまで、バッファーを５％Ｂ［従って、残りは９５％バッファーＡ（０．１％ＴＦＡ水溶液）］で送液し、次いでライゲーション産物を２５−４５％バッファーＢのグラジエントにより８０分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物（Ｃｙｓ８９（Ａｃｍ））｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールした。
【０２５１】
ステップ２：Ａｃｍ−除去＃１  Ａｃｍ除去のため、（Ｃｙｓ８９（Ａｃｍ））｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝のプールされたフラクションを含むアセトニトリル水溶液を、ＨＰＬＣグレード水で１×希釈し、固体尿素を最終的に２モル濃度となるように加えた。３％酢酸水溶液中の３０ｍｇ／ｍｌ  Ｈｇ（酢酸塩）２溶液を（総システイン濃度に関して）３倍モル過剰加え、溶液を１時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、半調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、すべての非ペプチド物質が溶離されるまで２５％バッファーＢで送液し、次いで産物を、５０％バッファーＢへのステップグラジエントにより精製した。所望のライゲーション産物｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を含むフラクションをはエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２５２】
ステップ３：ライゲーション＃２  ステップ２からの｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝産物、［すなわち、１７１３−１７７６−ＧＰ４１］を、ＴＦＥ（１容積）中に濃度３ｍＭで溶解した。セグメントＳＥＰ−１：２（セグメントＧＲＦＮ１７１２）を、６Ｍ塩化グアニジウム含有３００ｍＭ  Ｎａリン酸塩バッファー（ｐＨ７．９）２容積中に２．２５ｍＭの濃度まで溶解した。２つの溶液を混合して、最終的なセグメント濃度を１ｍＭ  ｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４−ＧＰ４１｝および１．５ｍＭ  ＳＥＰ−１：２とし、１％チオフェノールを加え、ｐＨ６．８〜７．２でペプチドセグメント溶液（「３容積」）を得た。反応を室温で一晩進行させた。次いで、ライゲーションミックスを、３容積（すなわち、上記で用いたＴＦＥの容積に対して）の希釈バッファー、すなわち６Ｍ塩化グアニジウム含有１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０で希釈し、次に、ＴＦＥ３容積、β−メルカプトエタノール３容積、ピペリジン３容積および６Ｍ塩化グアニジウム６容積、１００ｍＭ  Ｎａ酢酸塩ｐＨ４．０から成り４℃に冷却した溶液に加え、どのような残留保護基も除去するために、室温で２０分間攪拌した。この溶液を１．８容積の凍結氷酢酸で酸性化して清澄な溶液とし、これにＴＣＥＰ（ペプチドセグメントの総重量に対して０．２５の比率）を加え、溶液を２０分間インキュベートした。次に、６Ｍ塩化グアニジウムを含むｐＨ４．０、１００ｍＭ  Ｎａ酢酸塩希釈バッファーを３０容積加え、溶液を混合した。結果として得られる溶液を、調製用逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣカラムに送液した。すべての非ペプチド物質がカラムから溶離されるまで、バッファーを３０％Ｃ［バッファーＣ：イソプロパノール６０％／アセトニトリル３０％／水１０％中の０．１％ＴＦＡ］で送液し、次いでライゲーション産物を３７−５７％バッファーＣのグラジエントにより８０分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ））｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を含むフラクションをＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２５３】
ステップ４：残基Ｃｙｓ８９およびＣｙｓ１１７のカルボキシメチル化  （Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ））｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝［すなわち、（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ））−１７１２−１７１３−１７７６−ＧＰ４１］を、ＴＦＥ中に１ｍＭの濃度で溶解した。６Ｍ塩化グアニジウムを含む３００ｍＭ  Ｎａリン酸塩バッファー（ｐＨ７．９）１０容積を加えた。メタノール中に７５ｍｇ／ｍｌで溶解した２５倍過剰（スルフヒドリル基について）のブロモ酢酸を加え、溶液を室温で２時間攪拌しつつ反応させた。次に、この反応混合物を１００ｍＭ  Ｎａ酢酸塩、ｐＨ４．０、６Ｍ塩化グアニジウム溶液１１容積で希釈し、調製用逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣ カラムにロードし、すべての非ペプチド成分が溶離されるまで２０％バッファーＣで送液し、次いでライゲーション産物を、５５％バッファーＣへのステップグラジエントで精製した。所望の修飾産物（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；Ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０２５４】
ステップ５：ピコリル除去  亜鉛末（ペプチド１ミリグラムあたり７１ミリグラム）を２Ｍ  ＨＣｌ中で５分間活性化させ、この活性化をもう１度繰り返し、次いで、過剰な酸を除去するため、（新たに加えた）Ｌ−メチオニン３５ｍｇおよび３５ｍｇ／ｍｌ  Ｎａドデカノイルサルコシンならびに１０％ｖ／ｖＴＦＥを含む６Ｍ塩化グアニジウム、５０ｍＭグリシンｐＨ２．２で１０分間洗った。洗浄をもう１度繰り返した。Ｃｙｓ１６１（Ｐｉｃｏ）含有ペプチド（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；Ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を、純ＴＦＥ中に約３０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。この溶液を、（新たに加えた）Ｌ−メチオニン３５ｍｇおよび３５ｍｇ／ｍｌ  Ｎａドデカノイルサルコシンならびに１０％ｖ／ｖＴＦＥを含む６Ｍ塩化グアニジウム、５０ｍＭグリシンｐＨ２．２、４容積（ＴＦＥに対して）で希釈した。この溶液を活性化亜鉛末に加え、室温で５０分間攪拌した。反応は、アリコット（等量のβ−メルカプトエタノールおよび数粒のＴＣＥＰで処理し、次いで分析用に２容積の６Ｍ塩化グアニジウム、１００ｍＭ  Ｎａ酢酸塩ｐＨ４．０で希釈）の分析用Ｃ４逆相ＨＰＬＣで、〜１時間間隔で監視し、２〜５時間後に完了した。分析用ＨＰＬＣピーク（すなわち、９２Ｄａ質量の損失）のＥＳ−ＭＳ分析により示されるようなピコリル基除去の完了後、上澄みをろ過により除去し、残ったＺｎ末を、Ｌ−メチオニン３５ｍｇおよび３５ｍｇ／ｍｌドデシルサルコシンならびに２０％ｖ／ｖＴＦＥを含む６Ｍ塩化グアニジウム、ｐＨ４、１００ｍＭ酢酸塩で３度洗った。ＢｉｏＲａｄＳＭ−２ビーズ（溶液容積の約３分の１）を、上澄みと洗液とを合わせたものに加え、室温で３０分間攪拌し、次いでろ過した。β−メルカプトエタノールを１０％ｖ／ｖになるまで加え、次に、０．２５×（ペプチドの総合重量）のＴＣＥＰを加え、溶液を室温で５分間攪拌した。この溶液を、等量の１００ｍＭ  Ｎａ酢酸塩ｐＨ４．０、６Ｍ塩化グアニジウムで１：１希釈し、調製用（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラムにロードし、すべての非ペプチド物質が溶離されるまで、３５％バッファーＣを送液し、所望の産物を５５％バッファーＣへのステップグラジエントにより精製した。所望のＣｙｓ１６１脱保護産物（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；Ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１−Ｐｉｃｏ｝をエレクトロスプレー質量分析で同定し、プールした。
【０２５５】
ステップ６：Ａｃｍ除去＃２  プールしておいた（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；Ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１−Ｐｉｃｏ｝［すなわち、（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；Ψ８９，１１７−１７１２−１７１３−１７７６−ＧＰ４１］の溶液を、ＨＰＬＣグレード水で３×希釈し、固体尿素を最終的に２モル濃度となるように加えた。３％酢酸水溶液中の３０ｍｇ／ｍｌ  Ｈｇ（酢酸塩）２溶液を（全システイン濃度に対して）３倍モル比率で加え、溶液を室温で１時間攪拌した。次に、この溶液をβ−メルカプトエタノール中に２０％とし、半調製用（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。すべての非ペプチド物質が溶離されるまで、バッファーＣ（２０％）を送液し、次に、所望の産物を、５５％バッファーＣへのステップグラジエントにより精製した。所望の産物（Ｃｙｓ３３；Ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１−Ｐｉｃｏ｝を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、２×（ｗ／ｗ、ペプチド質量に対して）ＤＰＣ（ドデシルホスホコリン）を含む水で２×（ｖ／ｖ）希釈し、一晩凍結乾燥した。
【０２５６】
ステップ７：ライゲーション＃３  （Ｃｙｓ３３；Ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１−Ｐｉｃｏ｝［すなわち、（Ｃｙｓ３３；Ψ８９，１１７）−１７１２−１７１３−１７７６−ＧＰ４１］を、純ＴＦＥ（１容積）中に３ｍＭ濃度で溶解した。ＳＥＰ−１：１［すなわち、１７１１−ＧＰ４１］を、６Ｍ塩化グアニジウムを含む３００ｍＭ  Ｎａリン酸塩バッファー（ｐＨ７．９）２容積中に溶解した。これらの溶液を合わせ、１％ｖ／ｖチオフェノールを加えた。ライゲーションミックスを室温で一晩攪拌した。この溶液に、β−メルカプトエタノール（上記のＴＦＥ容積に対して）３容積、およびライゲーションバッファー（６Ｍ塩化グアニジウムを含む３００ｍＭ  Ｎａリン酸塩バッファー。ｐＨ７．９）９容積を加えた。この溶液に、０．２５×（ペプチドの総合重量）ＴＣＥＰを加え、溶液をは２０分間室温で攪拌した。氷酢酸（０．６容積）を加えて溶液をｐＨ４．０に酸性化し、次にこの溶液を、３０容積の６Ｍ塩化グアニジウム含有１００ｍＭ  Ｎａ酢酸塩ｐＨ４．０で希釈し、調製用（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。すべての非ペプチド物質が溶離されるまでバッファーＣ（２５％）を送液し、次にライゲーション産物を、３５−５５％のバッファーＣのリニアグラジエントによって８０分間にわたって精製した。所望のライゲーション産物ＳＥＰ−１（１−１６６）（Ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：１（＋ＧＰ４１）＋ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝（配列番号：２）を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析により同定し、プールした。
【０２５７】
ステップ８：折り返し  完全長の結合されたペプチドＳＥＰ−１（１−１６６）（Ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：１（＋ＧＰ４１）＋ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝［すなわち、１７１１（ＧＰ４１）−１７１２−１７１３−１７７６−ＧＰ４１］を含む組み合わせたフラクションに、固体塩化グアニジウム、１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．７）および蒸留水を加え、最終的な溶液を、結合されたペプチドＳＥＰ−１（１−１６６）０．１ミリグラム／ｍｌ、６Ｍ塩化グアニジウム、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓあたり０．１ミリグラムとした。この結合されたペプチド（「タンパク質」）溶液を、１５ｍｌ透析カセット中にロードし、３Ｍ塩化グアニジウム、５マイクロモルのシステインおよび２マイクロモルのシスチンを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５）溶液に対して４℃で一晩透析した。次に、このタンパク質溶液を、１Ｍ塩化グアニジウムを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５）溶液に対して４℃で８時間透析し、最終的に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）に対して４℃で１４時間透析して折りたたまれた産物を産生した。透析カセットからの折りたたまれたタンパク質を含む溶液を合わせた。折りたたみは、ＥＳ−ＭＳ、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＣＤ分光測定法により立証された。
【０２５８】
ステップ９：精製  折りたたまれたタンパク質を含む溶液を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒａｏｓｅイオン交換カラムにロードした。折りたたまれたタンパク質を、１２５ｍＭ  ＮａＣｌへのリニア塩グラジエントを用いて溶離した。所望の折りたたまれた産物ＳＥＰ−１−Ｂ５１を含むフラクションを、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定し、プールした。合わせたフラクションを限外ろ過により濃縮し、約２ミリグラム／１ミリリットルの濃度にし、次に、このタンパク質溶液を２．６×１００ｃｍＳ−３００ゲルろ過カラムにロードした。精製されたＳＥＰ−１−Ｂ５１を、１０ｍＭ  ＴｒｉｓｐＨ７．０、１３７ｍＭ塩化ナトリウムにより溶離した。高純度ＳＥＰ−１−Ｂ５１を含むフラクションを、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールし、凍結し、−８０℃で保存した。最終的な精製された折りたたまれたタンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５１を、分析用（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣ、ＥＳ−ＭＳ、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＣＤ分光測定によりキャラクタリゼーションした。図２５には、折りたたまれた精製ＳＥＰ−１−Ｂ５１の相対分子量を示す代表的な等電電気泳動ゲル（ＩＥＦ）および非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示してある。同じゲル上で走らせた分子量標準を、比較用に示してある。示されるように、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されたＳＥＰ−１−Ｂ５１の相対分子量は７３ｋＤａである。相対ｐｌは約５．０である。折りたたまれた精製されたＳＥＰ−１−Ｂ５１産物、代表的なＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムも示してある。これは、本発明の精密ポリマー修飾タンパク質の純度および増大した相対分子量を例示している。
【０２５９】
実施例８
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５２の合成
Ａ．ＳＥＰ−１−Ｂ５２の組成
第７の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｂ５２と呼ばれる）を合成した。完全長ＳＥＰ−１−Ｂ５２のアミノ酸配列は、ＳＥＰ−１−Ｂ５１の配列と同じである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ
ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ
ＬＶＫＳＳＱＰＷΨＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ
ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を表し、Ｋｏｘは、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介してカップリングされたオキシムリンカー基によってε−アミノ基において化学的に修飾された非天然リジンを表す。
【０２６０】
ＳＥＰ−１−Ｂ５２タンパク質は、残基２４および１２６において、ＳＥＰ−１−Ｂ５１と同様な分岐（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−Ａｌａポリマー構成物で誘導体化したが、この類似体については、ポリマーはピルビン酸とアミノオキシ酢酸との間のオキシム結合を介して付着させた。さらに、リジン残基２４および１２６のε−アミノ基は、レブリンアシル部分の代わりにアミノオキシアセチル官能基を持つように修飾し、分岐（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−Ａｌａポリマー構成物は、ペンダントピルビンアシル部分を持つようにした。これらの変化は、合成および取り扱いを改善し、オキシム結合の安定性をさらに増大させるために設計した。
【０２６１】
図２３は、以下で記載されるようなオキシム形成ライゲーションによってＳＥＰ−１−Ｂ５２に結合される分岐水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ４３（ＧＰ４３）の化学合成を例示する概略図である。完全長産物の集合は、実施例２において説明した。ＳＥＰ−１−Ｂ５２の構造は図２４に示してある。
【０２６２】
Ｂ．分岐鋳型（ＧＲＦＮＰ４２）へのカップリングのための（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）の合成
（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）を、０．５ｍｍｏｌスケールで合成した。０．５ｍｍｏｌ（−０．５グラム）Ｓａｓｒｉｎ酸不安定性、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂（ヒドロキシル置換１．０２ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＭＦ中で１５分間膨潤させ、次に排液した。このヒドロキシル官能化樹脂に、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）を５００マイクロリットル（３．９ｍｍｏｌ）含むＤＭＦ８ｍｌ中に溶解させた無水コハク酸４５０ｍｇ（４．５ｍｍｏｌ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン４８８ｍｇ（４ｍｍｏｌ）を加え、３０分間渦撹拌により反応させ、次いで排液した。このカップリングを繰り返し、過剰な反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）による１分間の渦洗浄で除去し、排液した。ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中の新規な１．０Ｍ（８ｍｍｏｌ）ＣＤＩ溶液８ｍｌを加えて活性化し、４０分間反応させ、次いで排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄によって除去し、排液した。は、ＤＭＦ中の０．５ｍ（２ｍｍｏｌ）ＨＯＢＴ溶液４ｍｌ中に溶解させたＴＴＤ４ｍｌ（４グラム、１８．２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間渦攪拌によって反応させ、排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄によって除去し、排液した。ＤＩＥＡ５００マイクロリットル（３．９ｍｍｏｌ）を含む８ｍｌの０．５Ｍ（４ｍｍｏｌ）ＨＯＢＴ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液中に溶解させた無水コハク酸（４５０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）を樹脂に加え、渦攪拌によって１５分間反応させ、次に排液した。これらの３ステップ（ＣＤＩ活性化、ＴＴＤカップリング、無水コハク酸反応）を１１回［すなわち、合計１２回］繰り返した。過剰な反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、排液した。ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中の新規な１．０Ｍ（８ｍｍｏｌ）ＣＤＩ溶液８ｍｌで活性化し、４０分間反応させ、排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、排液した。Ｈ−ＡｌａＯｔＢｕ・ＨＣｌ  ２．５ｍｍｏｌを、ＤＩＥＡ  １５０マイクロリットル（１１１ｍｇ、０．８２５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ中の０．５Ｍ（２．３７５ｍｍｏｌ）ＨＯＢＴ４．７５ｍｌ中に溶解させ、ＣＤＩ−活性化されたＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌ）と渦撹拌して１時間反応させ、次に排液した。過剰な反応物および可溶性副産物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）を用いた１分間の渦流洗浄により除去し、次に排液した。産物ｔｅｒｔＢｕＯＯＣ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ−ＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂をＤＣＭで徹底的に洗い、排液し、次に樹脂を真空下で一定重量になるまで乾燥した。産物樹脂の典型的な重量は約２グラムであった。
【０２６３】
直鎖状ＧＲＦＮＰ３９を、標準的Ｆｍｏｃ−化学手順に従って、ＤＣＭ中の４％ＴＦＡを用いて樹脂支持体から切断した。沈降した粗製産物を、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥されたポリマーを、０．１％ＴＦＡを含む少量の５０％アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度を１％未満になるまで希釈した。粗製産物を、Ｔ＝４０℃において３％Ｂで平衡化したＣ４調製用逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。塩類をイソクラティック溶離し、所望の鋳型を、２０−３５％バッファーＢ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液のリニアグラジエントにより６０分以上かけて精製した。所望の（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ物質（ＧＲＦＮＰ３９）を含むフラクションをＥＳ−ＭＳで同定し、凍らせて、凍結乾燥した。
【０２６４】
Ｃ．分岐のための複数のアミン基およびタンパク質（ＧＲＦＮＰ４２）への（後の）付着のためのペンダントピルビナシル部分を持つ鋳型の合成
鋳型を、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で０．４ｍｍｏｌスケールで手作業により合成した。ＤＭＦによる１分間のフロー洗浄ステップを、すべてのカップリング、脱保護および活性化ステップの間で用いた。Ｂｏｃ基を、純（すなわち、１００％）ＴＦＡで処理して除去した。ＤＭＦ洗浄後、Ｆｍｏｃ−（Ｒｉｎｋ−リンカー）−ＯＨ  ２ｍｍｏｌを、ＤＩＥＡ  １ｍｌを含むＤＭＦ  ３．８ｍｌ中のＨＢＴＵ  １．８ｍｍｏｌによる活性化後、樹脂にカップリングさせた。Ｆｍｏｃ保護基除去（２×３分間ＤＭＦ中の２０％ピペリジン）後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＴＴ）−ＯＨ［ＭＴＴ＝４−メチルトリチル］２ｍｍｏｌを、ＤＭＦ中のＤＩＣ  ２ｍｍｏｌおよびＮＨＳ  ２ｍｍｏｌによるＮＨＳ−エステル活性化を用いて樹脂にカップリングした。Ｆｍｏｃ基除去（２×１分間ＤＭＦ中の０．５％ＤＢＵ）後に、８ｍｌのＤＩＥＡ  ２．２ｍｍｏｌを含む０．５Ｍ  ＨＯＢＴ溶液中に溶解させた無水コハク酸４ｍｍｏｌを、１０分間樹脂にカップリングした。このステップの後、樹脂結合カルボキシル基を、ＤＭＦ中の新たな０．５Ｍ  ＣＤＩ溶液８ｍｌで活性化した。ＴＴＤ  ４ｍｌを、０．５Ｍ  ＨＯＢＴ溶液４ｍｌに加え、３０分間カップリングした。
【０２６５】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ  ２ｍｍｏｌを、ＤＭＦ中のＤＩＣ  ２ｍｍｏｌおよびＮＨＳ  ２ｍｍｏｌによるＮＨＳ−エステル活性化を用いて樹脂にカップリングした。Ｆｍｏｃ除去ステップ（２×１分間ＤＭＦ中の０．５％ＤＢＵ）後、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨＳ  ４ｍｍｏｌをＤＭＦ  ３ｍｌ中でカップリングした。
【０２６６】
ＭＴＴ保護基はＤＣＭ中の２％ＴＦＡによる複数回の洗浄により除去した。上澄みがその黄色を失うと脱保護は完了する。樹脂を、ＤＭＦ中の１０％ＤＩＥＡにより１分間中和した。ＤＭＦ中のＤＩＣ  ２ｍｍｏｌおよびＮＨＳ  ２ｍｍｏｌによるＮＨＳ−エステル活性化を用いて、ピルビン酸２ｍｍｏｌを４５分間かけて樹脂にカップリングした。鋳型を脱保護し、水５％を含む純ＴＦＡを用いて樹脂支持体から切断した。切断溶液を、ロータリーエバポレーター中で乾燥するまで蒸発させた。残基を、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥した鋳型を、０．１％ＴＦＡを含む少量の５０％アセトニトリル水溶液中に溶解し、有機物濃度が１％未満になるまで希釈した。ピルビン酸塩含有鋳型を、Ｔ＝４０℃において０％バッファーＢ［すなわち、１００％バッファーＡ＝０．１％ＴＦＡ水溶液］で平衡化したＣ４調製用カラムにロードした。塩類を、イソクラティック溶離し、所望の鋳型を、５−１２％バッファーＢ対０．１％ＴＦＡ水溶液のリニアグラジエントにより６０分間で精製した。所望の物質（ＧＲＦＮＰ４２）を含むフラクションを、ＥＳＩ−ＭＳにより同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【０２６７】
Ｄ．アミドカップリングされた分岐ポリマー（ＧＲＦＮＰ４３）の集合および脱保護
分子量１６ｋＤａの分岐（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）４９−ポリマーであるＧＲＦＮＰ４３を、ＧＲＦＮＰ３９を精製鋳型ＧＲＦＮＰ４２にカップリングすることにより合成した。ＤＭＳＯ中に６０℃で１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた精製（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）（１．０ｍｍｏｌ）を、２０倍（モル）過剰のＤＩＥＡ存在下において、ＤＭＳＯ中の濃度２０ｍｇ／ｍｌのＨＡＴＵ  ０．９５ｍｏｌにより活性化した。ＤＭＳＯ中に３．９ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた精製鋳型（０．２４ｍｏｌ）ＧＲＦＮＰ４２を直ちに加えた。反応の進行を、分析用Ｃ４逆相ＨＰＬＣおよびＥＳ−ＭＳにより監視した。典型的には、カップリングは数分以内で完了した。ワークアップのため、４容積（ライゲーションミックスに対して）の０．１Ｍ酢酸塩／６Ｍ塩化グアニジウム、ｐＨ４を加え、溶液を調製用（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。塩類および他の非アミド含有物質をイソクラティック溶離し、所望の分岐ポリマー産物を、２０−３５％バッファーＢ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液のリニアグラジエントにより８０分間にわたり精製した。所望の物質を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳで同定し、凍らせて凍結乾燥した。
【０２６８】
結果として得られる精製分岐ポリマー構成物ＧＲＦＮＰ４３を、純ＴＦＡ中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で１時間かけて溶解し、Ａｌａ−ＯｔＢｉｔｅｒｔブチルエステル保護を除去した。溶液をロータリーエバポレーター中で乾燥するまで蒸発させ、乾燥ポリマーを、５０％バッファーＢ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）中に溶解させた。ポリマーを、調製用逆相ＨＰＬＣ上で１５％から４５％バッファーＢ対０．１％ＴＦＡ水溶液のステップグラジエントを用いて８０分間で脱塩した。所望の物質（ＧＲＦＮＰ４３）を含むプールしたフラクションを凍らせて凍結乾燥し、乾燥粉体をオキシム化形成ライゲーションステップに用いた。
【０２６９】
Ｅ．分岐ポリマーＧＲＦＮＰ４３によるＧＲＦＮ１７７６およびＧＲＦＮ１７１１のオキシム形成ライゲーション（オキシム化）
セグメントＳＥＰ−１：４およびセグメントＳＥＰ−１：１を、実施例２、３、４、および７において上記に記載されるように合成し、ただしレブリン酸の代わりにアミノオキシアセチル（ＡｏＡ）部分をそれぞれのペプチドセグメント中のＬｙｓ２４およびＬｙｓ１２６に、標準的カップリングプロトコルに従って付加した。従って、ペプチド−樹脂の集合後、側鎖Ｆｍｏｃ基が個々のペプチド樹脂から除去され、Ｂｏｃアミノオキシ酢酸２ｍｍｏｌを、ＤＭＦ中のＤＩＣ  ２ｍｍｏｌおよびＮＨＳ  ２ｍｍｏｌによるＮＨＳエステル活性化を用いて樹脂に付加した。２つのペプチドを、ＨＦを用いて脱保護および樹脂から切断し、Ｃ４逆相ＨＰＬＣにより精製した。カルボニル化合物への暴露を回避するため、適切な予防策を取った。セグメントＳＥＰ−１：４およびＧＲＦＮＰ４３を共に等モル比率で、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む５０％アセトニトリル水溶液中に溶解させた。溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に再溶解させ、調製用Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから、調製用グラジエント逆相ＨＰＬＣにより分離した。所望のオキシム化産物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４３を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳで同定し、プールした。
【０２７０】
ＳＥＰ−１：１およびＧＲＦＮＰ４３を共に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に等モル比率で溶解させた。溶液を凍らせて凍結乾燥した。乾燥粉末を、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液中に溶解させ、調製用グラジエントＣ４逆相ＨＰＬＣカラムにロードした。ポリマー修飾ペプチドを、未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから、調製用逆相グラジエント溶離により分離した。所望のオキシム化産物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ４３を含むフラクションを、ＥＳ−ＭＳにより同定し、プールした。
【０２７１】
Ｆ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５２の合成
ＳＥＰ−１−Ｂ５２（配列番号：２）を、以下の４つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した：
セグメントＳＥＰ：１：１＋ＧＰ４３（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ４３、配列番号：２の残基１−３２に対応）
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＩＬＥＡＫ ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ２４は、（ＫＯＸにより示されるような）分岐ポリマーＧＲＦＮＰ４３にオキシム結合されたＡｏＡペンダント部分を有し、Ｈｉｓ３２はＤｎｐ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３−８８に対応）
ＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ
ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ３３はＡｃｍ保護されており、３つのＴｒｐ残基はホルミル保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に対応）
ＣＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ８９はＡｃｍ保護されており、Ｈｉｓ９４はＤｎｐ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４３（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ４３、配列番号：２の残基１１７−１６６に対応）
ＣＡＩＳ ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｃ末端システイン（すなわち、Ｃｙｓ１６１）は、ピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有し、Ｌｙｓｑ１２６は、（ＫＯＸにより示されるような）分岐ポリマーＧＲＦＮＰ４３にオキシム結合されたＡｏＡペンダント部分を有している）
【０２７２】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみおよび精製を、実施例１、２、３、４、および７において上記で記載されるように実施して完全長の折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｂ５２（配列番号：２）を作り、これを分析用（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣ、ＥＳ−ＭＳ、および非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりキャラクタリゼーションした。バイオアッセイを、他のＳＥＰ構成物について記載されるように実行した。
【０２７３】
実施例９
ＳＥＰ−３−Ｌ４２の効力研究
シトレート・バッファー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）プラス０．２５％ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）中でＳＥＰ−３−Ｌ４２を再処方化し、正常な雄ラット（１群あたりラット５匹）に対し、０、１、５、または１０μｇ／ｋｇの用量で、週３回（ｔｉｗ）１、３、および６日目に静脈内投与した。最後の注入の４日後（９日目）に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。これらの用量でのＳＥＰ−３−Ｌ４２の最後の注入の４日後における赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、および網状赤血球数（ＲＥＴ）の値には、対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差は全くなかった。
【０２７４】
実施例１０
ＳＥＰ−３−Ｌ４２の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）プラス０．２５％ＲＳＡ、ｐＨ６．９、においてＳＥＰ−３−Ｌ４２を再処方化し、正常な雄ラットに対し、５μｇ／ｋｇの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から０、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間後に血液試料を採取した。血漿中ＳＥＰ−３−Ｌ４２濃度を、メーカーの指示に従い、抗ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｉｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＃ＤＥＰ００）により決定した。結果を図２７に示する。
【０２７５】
図２７に例示されるように、ＳＥＰ−３−Ｌ４２と比較して、ＳＥＰ−１−Ｂ５０は若干遅いクリアランスを示す。その循環半減期にもかかわらず、ＳＥＰ−３−Ｌ４２は、試験した用量での赤血球産生促進における統計的に有意な差を示さなかった。対照的に、ＳＥＰ−１−Ｂ５０は、同じ用量で赤血球産生を刺激した。このことは、薬物動態学的挙動および効力を含むインビボ生物学特性の微調整に、ポリマー構造を利用できることを例示している。
【０２７６】
実施例１１
ＳＥＰ−１−Ｌ３０の効力研究
シトレート・バッファー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）プラス０．２５％ＲＳＡ中でＳＥＰ−１−Ｌ３０を再処方化し、正常な雄ラット（１群あたりラット５匹）に対し、０、１、５、２５、または５０μｇ／ｋｇの用量で、週３回（ｔｉｗ）１、３、および５日目に静脈内投与した。最後の注入の４および８日後（９および１３日目）に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。対照群の値と比較した場合に、ＳＥＰ−１−Ｌ３０による処置後のどのような間隔においても、ＲＢＣ、ＨＧＢ、およびＨＣＴの値に、統計的に有意な差は全くなかった。網状赤血球数は、２５および５０μｓｇ／ｋｇで処置したラットの場合に最後の注入から４日後（９日目）には、より高かった（対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差）。ＳＥＰ−１−Ｌ３０で処理したどの動物についても、血液学的パラメーターの他の差は、９日目または１３日目には全く観察されなかった。［データは示してない］
【０２７７】
実施例１２
ＳＥＰ−１−Ｌ３０の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）プラス０．２５％ＲＳＡ、ｐＨ６．９、においてＳＥＰ−１−Ｌ３０を再処方化し、正常な雄ラットに対し、５または２５μｇ／ｋｇの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から０、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、および１６８時間後に血液試料を採取した。ＳＥＰ−３−Ｌ４２の血漿中濃度を、メーカーの指示に従い、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｉｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＃ＤＥＰ００）により決定した。所定用量におけるどの時点においてもＳＥＰ−１−Ｌ３０は全く検出できなかった。
【０２７８】
実施例１３
ＳＥＰ−１−Ｂ５０の効力研究
無菌ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）プラス０．２５％ＲＳＡ中でＳＥＰ−１−Ｂ−５０を再処方化し、正常な雄ラット（１群あたりラット５匹）に対し、０、１、５、２５、または１２５μｇ／ｋｇの用量で、週３回（ｔｉｗ）１、３、および６日目に静脈内投与した。最後の注入の４、９および１４日後（１０、１５および２０日目）に血液試料を採取し、血液学的パラメーターについて分析した。データを表ＶＩＩＩに示す。５、２５および１２５μｇ／ｋｇのＳＥＰ−１−Ｂ５０を投与した動物については、最後の注入から４日後（１０日目）に、増加したＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ、およびＲＥＴに用量関連応答が観察された（対照群の値と比較した場合に、統計的に有意な差）。これらの動物のＲＢＣ、ＨＧＢ、およびＨＣＴは、１５日目の対照値よりも高いままであり、１２５μｇ／ｋｇで処置した動物の場合に２０日目（最後の注入から１４日後）まで対照群の値と比較した場合に若干高く継続した。ＲＥＴ産生は、１０日後には減少し、２５および１２５μｇ／ｋｇ動物の場合に１５および２０日目は有意に低い値を示す。表ＶＩＩＩ
ＳＥＰ−１−Ｂ５０の多重用量後の血液学所見
【表７】
2004515471.tif 000019
【０２７９】
実施例１４
ＳＥＰ−１−Ｂ５０の薬物動態学的研究
シトレート・バッファー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）プラス０．２５％ＲＳＡ、ｐＨ６．９、においてＳＥＰ−１−Ｂ５０を再処方化し、正常な雄ラットに対し、５または２５μｇ／ｋｇの用量レベルで単一用量として静脈内投与した。投薬から０、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間後に血液試料を採取した。ＳＥＰ−１−Ｂ５０の血漿中濃度を、メーカーの指示に従い、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｉｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＃ＤＥＰ００）により決定した。排出半減期は、５および２５μｇ／ｋｇ用量について、それぞれ９．７および９．９時間であると決定された。観察されたＭＲＴ（平均滞留時間）は、５および２５μｇ／ｋｇ用量について、それぞれ１３．９および１４．４時間であった。ＳＥＰ−１−Ｂ５０の代表的な薬物動態学的側面を図２７に示す。
【０２８０】
実施例１５
ＳＥＰ−１−Ｂ５１の効力研究
ＳＥＰ−１−Ｂ５１を、２つの実験において正常な雄ラットに静脈内投与した。
【０２８１】
実験１：シトレート・バッファー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）プラス０．２５％ＲＳＡ中でＳＥＰ−１−Ｂ５１を再処方化し、正常な雄ラット（１群あたりラット５匹）に対し、０、１、５、または２５μｇ／ｋｇの用量で、週３回（ｔｉｗ）１、３、および６日目に静脈内投与し、最後の注入の４、９および１４日後（１０、１５および２０日目）に血液学的パラメーター分析用に血液試料を採取した。データを下記の表ＩＸに示す。ＳＥＰ−１−Ｂ５１の３回目にして最後の静脈内注入の４日後（１０日目）、対照群の値と比較して、ＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ、および絶対網状赤血球数（ＡＲＴ）における統計的に有意な増加が、２５μｇ／ｋｇ  ＳＥＰ−１−Ｂ５１を投与した動物について観察された。これらの動物についてのＲＢＣ値は、１５日目には対照値より高いままであり、２０日目には対照値と同程度であった。網状赤血球産生は、１０日後に減少し、１５日目には５および２５μｇ／ｋｇ動物について有意により低い値が観察された。
表ＩＸ
ＳＥＰ−１−Ｂ５１の多重用量後の血液学所見
【表８】
2004515471.tif 000020
【０２８２】
実験２：シトレート・バッファー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）プラス０．２５％ヒト血清アルブミン中でＳＥＰ−１−Ｂ５１を再処方化し、雄ラット（１群あたりラット５匹）に対し、０、１、５、または２５μｇ／ｋｇの用量で、週３回（ｔｉｗ）１、３、および５日目に静脈内投与し、最後の注入の２、４および６日後（７、９および１１日目）に血液学的パラメーター分析用に血液試料を採取した。さらに、ヘマトクリットのみの測定用［充填赤血球量（ＰＣＶ）として］の血液試料を残りの研究日（２、３、４、５、６、８、１０、１２、および１３日目）に毎日採取した。データを表Ｘに示す。ＨＣＴ（ＰＣＶまたは計算された）値は、５および２５μｇ／ｋｇを投与した動物の場合に、最初の注入から２日後（３日目）から有意に増加し、３回目にして最後の注入の６日後（１１日目）まで継続した。ＲＢＣおよびＨＧＢも、５および２５μｇ／ｋｇを投与した動物の場合に、測定した日（最初の投与の２、４、および６日後、７、９、および１１日目）に有意に増加した。ＡＲＴは、２５μｇ／ｋｇの群の場合にのみ、最後の投与の２日および４日後（７および９日目）に有意に増加した。
表Ｘ
ＳＥＰ−１−Ｂ５１の多重用量後の血液学所見
【表９】
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【０２８３】
追加のラット群を、ＳＥＰ−１−Ｂ５１の２５μｇ／ｋｇでの単一静脈内用量で処置し、血液学的パラメーターの分析のために、注入の４８時間後に血液試料を採取した。ヘマトクリットのみの測定用（充填赤血球量として）の血液試料を、注射後、８、２４、および７２時間後、ならびに７日後（１、２、４、および８日目）に採取した。ＳＥＰ−１−Ｂ５１で静脈内的に処置したラットの場合のＨＣＴ、ＨＧＢ、およびＡＲＴの値は、３日目（注入の２日後）に対照動物の値よりも高く（統計的に有意）、ＨＣＴも、これらの動物において４日目に有意に増加した。
【０２８４】
実施例１６
ＳＥＰ−１−Ｂ５１についての赤血球増加および低酸素モデルにおける効力研究  それぞれ１０匹の正常なマウスの群（媒介物対照、４つの用量レベルでＣＨＯ−細胞（「ｒｈＥＰＯ」）中で産生した組換えグリコシル化ヒトエリスロポエチン、および４つの用量レベル、すなわち１００ｍＵ／ｎｇを想定した０．３２、１、５、２５μｇ／ｋｇ／用量、ＳＥＰ−１−Ｂ５１）を、模擬高高度室内で２０日間、５０６．５ｍｂに保った大気空気に１日あたり１８時間曝した。シトレート・バッファープラス０．２５％ヒト血清アルブミン中で処方化したｒｈＥＰＯまたはＳＥＰ−１−Ｂ５１を２００μＬ−容積、低酸素後４日目に静脈注射（ＩＶ）した。２日後、各マウスに０．２μＣｉの５９Ｆｅを腹腔内注射（ｉ．ｐ．．）した。ＲＢＣ−放射性鉄取込みは、３日後、心臓穿刺により採取した血液５００μＬ中に存在する放射能量を測定することによって評価した。
【０２８５】
ＳＥＰ−１−Ｂ５１およびｒｈＥＰＯの場合の７２時間ＲＢＣ−５９Ｆｅ取込み（用量の％）により、５μｇ／ｋｇまでの用量の増加に伴って増加した５９Ｆｅ取込みにおける明確な用量関連応答が示され、前記用量以上で応答は頭打ちになる（２５μｇ／ｋｇ）。従って、３つの最低用量レベルを、線形回帰を計算するために用いた。ＳＥＰ−１−Ｂ５１およびｒｈＥＰＯの線形回帰分析を図２８に示す。ＳＥＰ−１−Ｂ５１およびｒｈＥＰＯの応答は本質的に同じであった。ＳＥＰ−１−Ｂ５１のｒｈＥＰＯに対する「効力比」は、１．００３５（０．６９４７〜１．４４９８の９５％信頼区間）であり、このアッセイにおいて決定されたＳＥＰ−１−Ｂ５１の効力は、１００ｍＵ／ｎｇであった（６９〜１４５の９５％信頼区間）。
【０２８６】
ＳＥＰ−１−Ｂ５１は、ｒｈＥＰＯのインビボ活性と同様の活性を示し、用量依存的に作用し、このモデルにおけるｒｈＥＰＯの場合に典型的なネガティブフィードバック機構の誘発に起因するより高用量におけるプラトー応答が含まれる。このことは、ＳＥＰ−１−Ｂ５１分子の精密なユーザー定義グリコシル化部位に付着させられたポリマー構造が、ｒｈＥＰＯの糖鎖により付与されるインビボ活性を模倣することを例示している。
【０２８７】
実施例１７
ＳＥＰ−１−Ｂ５１の薬物動態学的研究
シトレート・バッファープラス０．２５％ヒト血清アルブミン、あるいはｒｈＥＰＯ（５００Ｕ／ｋｇに等価）中で処方化したＳＥＰ−１−Ｂ５１を５μｇ／ｋｇの単一用量で正常な雄ラット群に静脈内投薬し、この群を、投薬から５、３０、６０分、２、４、８、および２４時間、さらに２、３、４、５、６、および７日後に採血した。血漿試料中のＳＥＰ−１−Ｂ５１またはｒｈＥＰＯの濃度を、メーカーの指示に従って、Ｒ＆Ｄシステム部抗ＥＰＯＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＃ＤＥＰ００）を用いたアッセイにより決定した。
【０２８８】
濃度の対数の最小二乗法分析を実行し、以下の表ＸＩに記載の薬物動態学的パラメーターを得た。５μｇ／ｋｇの単一静脈内投薬を受けた雄ラットにおけるＳＥＰ−１−Ｂ５１の血漿中濃度における経時的変化は、半減期が１０．５±０．５時間の単一指数薬物動態学的性質関数により説明できた。ＳＥＰ−１−Ｂ５１についての中央区画の分布容積（Ｖｃ）は、３２．５±２．０ｍＬ／ｋｇであった。クリアランス（ＣＬ）は２．１５ｍＬ／時／ｋｇで、平均滞留時間（ＭＲＴ）１５．１±０．７時間であった。比較すると、５μｇ／ｋｇの静脈内投薬を受けた雄ラットにおけるｒｈＥＰＯの血漿中濃度における変化は、α半減期が１．２４±０．２２時間でβ半減期が５．５１±０．４０時間の両側指数薬物動態学的性質関数を使って最もうまく説明された。ｒｈＥＰＯについてのＶｃは５７．０±３．２ｍＬ／ｋｇであった。ＣＬは、１６．０±０．５ｍＬ／時／ｋｇで、ＳＥＰ−１−Ｂ５１の値より約８倍大きい。ｒｈＥＰＯの平均滞留時間（ＭＲＴ）は、５．７３±０．１７時間で、ＳＥＰ−１−Ｂ５１の値より約３倍短い。
表ＸＩ
ｒｈＥＰＯと比較したＳＥＰ−１−Ｂ５１の薬物動態学的パラメーター
【表１０】
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【０２８９】
ＳＥＰ−１−Ｂ５１およびｒｈＥＰＯの血漿クリアランスは図２９に示してある。これらのデ−タにより、グリコシル化組換えヒトＥＰＯと比較してＳＥＰ−１−Ｂ５１の循環半減期が有意に増加すること、さらに、この増加は、分子中の精密なユーザー定義部位に付着させられたポリマー構造に起因していることが示される。
【０２９０】
本発明は、その特定の実施形態に関して説明を行ってきたが、本発明はさらなる変形が可能であること、および本願は、本発明のどのような変更例、利用または改変をも対象として含み、さらに本発明が関連する技術内において公知の、または通例の実施方法の範囲に入るような、また上述の本質的特徴に適応し得るような本開示からの逸脱を含むことが理解されるであろう。
【０２９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
本発明のポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの概要を示す。
【図１Ｂ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｃ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｄ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｅ】
図１Ａと同様な図である。
【図２Ａ】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質を調製するためのプロセスの概要を示す。
【図２Ｂ】
図２Ａと同様な図である。
【図２Ｃ】
図２Ａと同様な図である。
【図３Ａ】
３つ以上の非重複ペプチドセグメント、すなわち少なくとも１つのセグメントが最終的な完全長化学的ライゲーション産物に対応する中間セグメントである、化学的ライゲーションを伴うマルチセグメントライゲーションのためのプロセスの概要を示す。
【図３Ｂ】
図３Ａと同様な図である。
【図４Ａ】
天然型化学的ライゲーションおよび結果として得られる側鎖チオールの化学修飾を例示する。
【図４Ｂ】
図４Ａと同様な図である。
【図４Ｃ】
図４Ａと同様な図である。
【図５Ａ】
本発明の水溶性ポリマーＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊の分岐核（Ｂ）および一意的化学選択的官能基（Ｕ）を生成させるための固相プロセスを示す。
【図５Ｂ】
図５Ａと同様な図である。
【図６Ａ】
Ｕ−Ｂ核へのその後の付着のための本発明の好ましい実質的に非抗原性水溶性ポリアミドポリマー−Ｊ＊成分を生成するための固相プロセスを示す。
【図６Ｂ】
図６Ａと同様な図である。
【図６Ｃ】
図６Ａと同様な図である。
【図６Ｄ】
図６Ａと同様な図である。
【図７】
Ｕ−Ｂ成分をポリマー−Ｊ＊成分にカップリングして式Ｕ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊の本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成するためのプロセスを示す。
【図８】
本発明の赤血球産生刺激合成タンパク質のライゲーションおよび産生に使用可能なペプチドセグメントへの水溶性ポリマーの精密付着のための代替経路を示す。
【図９】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質調製の全体的プロセスを例示する。
【図１０】
好ましいタイプの合成赤血球産生刺激タンパク質の基本構造を示す。ｐＰＥＧ＝「精密ＰＥＧ」
【図１１】
再配置されたアミノおよびカルボキシ末端を有する円形に並べ替えられたＳＥＰ類似体の一般構造を示す。
【図１２Ａ】
好ましい水溶性ポリマー、およびその種々の直鎖および分岐構成物の構造を示す。
【図１２Ｂ】
図１２Ａと同様な図である。
【図１２Ｃ】
図１２Ａと同様な図である。
【図１２Ｄ】
図１２Ａと同様な図である。
【図１３】
分岐鎖ｐＰＥＧポリマーの形成を概略的に示す。
【図１４Ａ】
ＳＥＰ−１−Ｌ３０と呼ばれる合成サイトカインの合成を示し、これは実施例２において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図１４Ｂ】
図１４Ａと同様な図である。
【図１４Ｃ】
図１４Ａと同様な図である。
【図１４Ｄ】
図１４Ａと同様な図である。
【図１４Ｅ】
図１４Ａと同様な図である。
【図１５】
ＳＥＰ−１−Ｌ３０と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例２において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図１６】
ＳＥＰ−１−Ｌ２６と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例３において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図１７Ａ】
ＳＥＰ−１−Ｂ５０と呼ばれる合成サイトカインに付着させられる好ましい分岐鎖水溶性ポリマーの形成を概略的に示し、これは実施例４において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図１７Ｂ】
図１７Ａと同様な図である。
【図１８】
ＳＥＰ−１−Ｂ５０と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例４において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図１９Ａ】
ＳＥＰ−３−Ｌ４２と呼ばれる合成サイトカインの合成を示し、これは実施例５において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図１９Ｂ】
図１９Ａと同様な図である。
【図２０】
ＳＥＰ−３−Ｌ４２と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例５において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図２１Ａ】
実施例７において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体であるＳＥＰ−１−Ｂ５１と呼ばれる合成サイトカインに付着させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す。
【図２１Ｂ】
図２１Ａと同様な図である。
【図２２】
ＳＥＰ−１−Ｂ５１と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例７において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図２３Ａ】
実施例８において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体であるＳＥＰ−１−Ｂ５２と呼ばれる合成サイトカインに付着させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す。
【図２３Ｂ】
図２３Ａと同様な図である。
【図２４】
ＳＥＰ−１−Ｂ５２と呼ばれる合成サイトカインを示し、これは実施例８において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体である。
【図２５】
実施例２〜５および７〜８において説明されるように調製されたヒトＥＰＯの精密ポリマー修飾合成類似体についての代表的分析データを示す。示されるように、代表的な等電点ゲル（ＩＥＦ）および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、折りたたまれ精製されたＳＥＰ−１−Ｂ５１の相対的なモノマー分子量を明示する。
【図２６】
ＳＥＰ化合物ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０、ＳＥＰ−１−Ｂ５１およびＳＥＰ−３−Ｌ４２の因子依存性細胞系のインビトロ活性を示す。
【図２７】
ＳＥＰ−３−Ｌ４２およびＳＥＰ−１−Ｂ５０のナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）で表した血漿中濃度を時間（ｈｏｕｒｓ）で表した期間と比較したときの代表的な薬物動態学的側面を示す。
【図２８】
ＳＥＰ−１−Ｂ５１および低酸素ラットモデルにおけるＣＨＯ−細胞（「ｒｈＥＰＯ」）中で作られた組換えグリコシル化ヒトエリスロポエチンについて、７２時間赤血球（ＲＢＣ）−５９Ｆｅ取込み（投与量の％としての）により測定したインビボ活性の線形回帰分析を示す。
【図２９】
各化合物について５μｇ／ｋｇの単一ＩＶ投与量に続いて、ＳＥＰ−１−Ｂ５１およびｒｈＥＰＯのｎｇ／ｍｌで表した血漿中濃度を時間（ｈｏｕｒｓ）で表した期間と比較したときのラットにおけるクリアランスについての代表的な薬物動態学的側面を示す。
【図３０】
円形に並べ替えられたポリマー修飾ＳＥＰ構成物を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
2004515471.tif 000033
【図２Ｂ】
2004515471.tif 000034
【図２Ｃ】
2004515471.tif 000035
【図３Ａ】
2004515471.tif 000036
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
2004515471.tif 000057
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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