(57)【要約】本発明は細胞ＤＮＡサンプルあるいはパラフィン固定組織片あるいは凍結組織片内の低豊富ＨＩＶ核酸配列を検出することによって潜伏ＨＩＶ感染を判定するための方法を提供する。この技術はヒト・クロモソームＤＮＡ内のＡｌｕ配列に対する１つのプライマーと、ウイルスＬＴＲ末端近くのもうひとつのプライマーを必要とする。そして、ＰＣＲ増幅ＤＮＡを増幅ＬＴＲ配列だけを識別するプローブとハイブリダイズさせる。このプローブはいろいろな方法でラベルすることができ、潜伏ＨＩＶあるいはその他のレトロウイルス感染の定量的アッセイを開発することが可能であろう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの組織サンプル内の組込みレトロウイルスを検出する方法において、
上記サンプル内のＤＮＡをＡｌｕ配列に対する１つのプライマーとレトロウイルス配列に対する別のプライマーを用いるＰＣＲで増幅するステップと、
上記ＰＣＲ増幅ＤＮＡを上記増幅レトロウイルス配列を特異的に識別するプローブとハイブリダイズさせるステップと、そして
上記プローブのハイブリダイゼーションを検出するステップとで構成され、上記ハイブリダイゼーションがそのサンプル内での組込みレトロウイルスの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記組織サンプルがパラフィンに埋め込まれた組織片と凍結組織片によって構成される群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記組織サンプルがリンパ球、血液、及びリンパ節によって構成される群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
レトロウイルス配列に対する上記プライマーがＨＩＶのＬＴＲ配列を識別することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記プライマーが配列識別番号２の配列を有していることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記プライマーが配列識別番号３の配列を有していることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
Ａｌｕ配列に対する上記プライマーが配列識別番号１の配列を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記方法がヒト組織サンプル内の組込みＨＩＶを有する細胞の数を判定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
組込みレトロウイルスを検出し、及び／又はヒト組織サンプル内の組込みレトロウイルスを有する細胞の数を判定するためのキットにおいて、
Ａｌｕ配列に対するプライマーと、
レトロウイルス配列に対するプライマーと、
増幅されたレトロウイルス配列を特異的に識別するプローブと、そして
上記増幅されたレトロウイルス配列に対する上記プローブのハイブリダイゼーションを検出する検出剤
によって構成されることを特徴とするキット。
【請求項１０】
上記Ａｌｕ配列に対するプライマーが配列識別番号４の配列を有していることを特徴とする請求項９記載のキット。
【請求項１１】
上記レトロウイルス配列に対する上記プライマーがＨＩＶのＬＴＲ配列を識別することを特徴とする請求項９記載のキット。
【請求項１２】
上記プライマーが配列識別番号２の配列を有していることを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
上記ヒト組織サンプルがパラフィン埋め込み組織断片と凍結組織片によって構成される群から選択されることを特徴とする請求項９記載のキット。
【請求項１４】
上記ヒト組織サンプルがリンパ球、血液、及びリンパ節によって構成されることを特徴とする請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的にはウイルス学及び診断学の分野に関するものである。より具体的には、本発明は組込みレトロウイルスに特異性を示すＰＣＲハイブリダイゼーション・アッセイの開発と、患者における潜伏感染の判定におけるその利用に関するものである。
【０００２】
（関連技術の説明）
ｉｎ ｖｉｔｒｏで感染細胞株において潜伏ＨＩＶ感染が起き得ることは長年にわたって知られており、ＨＩＶ潜伏感染の根底にある分子メカニズムに関する初期の研究のほとんどすべては、潜伏感染期のクローン技術で誘導されたＴ−細胞株（２−４、１０、１３、１５）において何が起きているかを調べるものであった。ＨＩＶ患者においては、ＨＩＶ ＤＮＡを含んでいるリンパ球の方が、細胞増殖を通じて感染される（つまり、ＨＩＶ ＤＮＡを保有したり、ＨＩＶ ＲＮＡ、ウイルス性蛋白質、そして後代ビリオンをつくりだす）細胞と比較してかなり高い出現頻度（約１００倍以上）を有していることが何年も前に実証されている（６，７）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで休止状態の、あるいは活性化されたＣＤ４リンパ球のＨＩＶ感染を調べる研究は、活性化された細胞だけが主にウイルス複製を許容し、後代ウイルス生産を可能とし、そして、休止細胞の感染は通常不稔性感染をもたらして、ウイルスが結合したり、進入して、全体的あるいは部分的にプロウイルスＤＮＡを逆転転写することを明らかに示した。しかしながらこのウイルス性ＤＮＡはその細胞が数日間以内に活性化されて分裂状態に入るまで融合しない（９， １７）。ＨＩＶ患者でのＤＮＡ＋／ＲＮＡ−リンパ球の比較的高い出現（約０．８％）（５）のほとんどは、従って、最近感染された（不稔的に）休止状態にあるリンパ球である可能性が非常に高い。すべてのリンパ球のうち９９％は休止状態にあるので、このことは当然予想されることである（１６）。しかしながら、感染された個体において見出されるこれらのＨＩＶ ＤＮＡ＋／ＲＮＡ−細胞の一部は潜伏感染期にある細胞である可能性もあり、これらの細胞は融合されたプロウイルスＤＮＡを持っているであろうが、後代ウイルスはつくりださない。ＨＩＶ＋個体における潜伏感染期の細胞の出現頻度は明らかではない。
【０００３】
ヒトＴ細胞株及びＰＨＡ刺激ＣＤ４ ＰＢＬの両方の急性及び慢性感染を調べるｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ウイルスの潜伏状態への徐々に進行する活動停止は急性的に感染された細胞の大部分にとって日常的に起きることであり、潜伏状態への活動停止はウイルスのライフ・サイクルにおいて通常に起きることであるとみなされるべきである（１１）。従って、ＨＩＶ患者においては、免疫系、あるいは細胞病理性ＨＩＶの増殖によって消滅されない増殖によって感染される細胞のすべては潜伏感染細胞になるのである。従って、患者における潜伏感染細胞の出現頻度に関する信頼できる定量データはそうした細胞が大量に存在していることを明らかにするであろう。
【０００４】
１つの研究はＰＣＲ増幅ＨＩＶ細胞性ＤＮＡの非効率な再ライゲーション技術を用いてＨＩＶ患者の潜伏感染細胞の出現頻度を直接定量しようとしたものであり、その出現頻度は低く、増殖的に感染される細胞とほぼ同じ頻度（１０６個あたり約７個程度）であることを見出した（５）。より最近の研究は、患者から得られたリンパ球の限定希釈培養を用いており、これらは潜伏ウイルスを再活性化するためにＰＨＡによって活性化される。これらの細胞の出現頻度はずっと高い（８）。残念なことに、この手順は最近不稔的に感染された休止細胞のすべてがウイルス増幅複製サイクルを完全に行ってＨＩＶ生産細胞に転化することを可能にしてしまい、従って、これらの研究は不稔的に感染された細胞と潜伏感染細胞との間の違いを完全には示さない。
【０００５】
ＨＡＡＲＴ療法は血漿ウイルス負荷を長期間にわたって低下させることができるが、その薬品が除かれると、通常はウイルスが戻ってしまうので、潜伏感染の程度を理解することは非常な重要性を帯びてきている。このウイルスの戻りのかなりの部分が潜伏感染細胞からのＨＩＶの再活性化によるものであると推測するのは合理的であるように思われる。
【０００６】
先行技術は患者における潜伏ＨＩＶ感染を検出するための有効な手段がない点で欠陥がある。本発明はこの技術分野における長年にわたるニーズと願望を満たすものである。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は融合されたレトロウイルスだけを検出するｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲアッセイについて開示するものであり、これは患者における増殖性感染細胞と潜伏感染細胞の出現頻度を正確に評価することを可能にする筈である。任意の時点での患者における増殖性感染細胞の頻度は非常に低いことが分かっており、高めの頻度は潜伏感染の測定結果を示している筈である。ＰＣＲの利用とハイブリダイゼーションを通じて、細胞クロモソーム性ＤＮＡ内の融合レトロウイルスを検出するための新しい方法を確立することは可能である。この方法は抗レトロウイルス薬治療を受けている感染個体内の潜伏ＨＩＶ感染の定量的アッセイの多くの形態で採用することが可能であり、医師達が潜伏感染期の細胞を検出して、治療を中断すべきかどうかを判断することをできるようにしてくれる。
【０００８】
本発明はＰＣＲを利用し、ヒト・クロモソームＤＮＡ内のＡｌｕ配列に対する１つのプライマーとそのウイルスのＬＴＲの末端近くの他のプライマーを用いる。そしてＰＣＲ増幅ＤＮＡを増幅されたＬＴＲ配列だけを識別するプローブとハイブリダイズさせる。このプローブはいろいろの方法でラベルすることが可能であり、このテストを多くの形態で実施することが可能であろうが、その多くは定量的なものであろう。
【０００９】
本発明の１つの形態で、ＨＩＶ潜伏感染を測定するための定量的ＰＣＲアッセイが提供される。
【００１０】
本発明の別の形態で、ヒトのサンプルにおける融合レトロウイルスを検出するためのキットが提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の形態で、本発明は他のレトロウイルスによる潜伏感染をモニターするために用いることができる。
【００１２】
本発明のその他の、そしてさらなる形態、特徴、及び利点は開示のために示される本発明の現段階における好ましい実施の形態についての以下の説明から明らかになるであろう。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
細胞がそのクロモソームＤＮＡに組込みレトロウイルスを有しているかどうかのアセスメントは調べられる細胞のすべてが少なくとも１つのウイルス・コピーを有している場合は比較的簡単である。これは未切断あるいは制限酵素消化クロモソームＤＮＡのいずれかの通常のサザン・ブロット・ハイブリダイゼーション技術によって行うことができる。しかしながら、ＨＩＶ感染の場合は、１％よりずっと低い割合の細胞が組込みレトロウイルスを含んでいるだけであり、ＰＣＲ技術を用いる必要がある。
【００１４】
現在、臨床医達は定量的ＰＴ−ＰＲＴアッセイによって新たにつくられたウイルスをモニターするか、あるいはＰＣＲによってＨＩＶ ＤＮＡの存在をモニターすることができるだけである（その９９％はウイルスをつくりだす細胞ではなく、新たに感染された細胞の不稔性感染を示している）。潜伏感染の程度を示す簡単な方法はない。本発明は細胞クロモソームＤＮＡ内の組込みレトロウイルスを定量的に検出する新しい方法であり、抗レトロウイルス薬剤治療を受けている患者での増殖的＋潜伏性ＨＩＶ感染の定量的アッセイに適用できる可能性がある。この技術は細胞性ＤＮＡ内での低豊富ＨＩＶ核酸配列を検出するためにＰＣＲを用いており、パラフィン固定組織断片あるいは凍結断片上でのｉｎ ｓｉｔｕアッセイについて述べてあるが、他の多数のフォーマットでも使用することは可能であろう。本発明はヒト・クロモソームＤＮＡ内のＡｌｕ配列に対する１つのプライマーとウイルスＬＴＲの末端近くのもうひとつのプライマーについての特徴を明らかにする（図１参照）。ＰＣＲ増幅ＤＮＡは次に増幅ＬＴＲ配列だけを識別するプローブとハイブリダイズされる。このテストの多数の形式を開発することが可能であろうが、その多くは定量的なものとなろう。
【００１５】
ＤＮＡハイブリダイゼーション・プローブは当業者に周知のいずれの方法を用いてでもラベルすることができる。こうした研究に用いられる最も一般的なラベルは放射性元素、酵素、紫外線に照射されると蛍光を発する化学物質などである。多数の蛍光物質が知られており、ラベルとして用いることができる。これらには、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサス・レッド、ＡＭＣＡブルー、そしてルシフェール・イェロウなどがある。放射性ラベルは現在用いられている計数手順のいずれでも検出することが可能である。好ましい同位元素は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、及び１８６Ｒｅから選択される。
【００１６】
酵素ラベルも同様に有益であり、現在用いられている比色分析、分光光度分析、蛍光分光光度分析、電流測定、あるいはガス定量手法のいずれを用いてでも検出することができる。酵素はカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋性分子との反応によって指定された粒子に接合される。こうした手順で用いることができる多数の酵素が知られており、用いることができる。当業者であれば本発明に従って用いることができる適切なラベルはすぐ分かるであろう。
【００１７】
本発明の１つの実施の形態で、まず最初にサンプル内のＤＮＡをＡｌｕ配列に対する１つのプライマーとレトロウイルス配列に対する別のプライマーを用いるＰＣＲで増幅させてヒトのサンプル内の組込みレトロウイルスを検出する定量的方法が提供される。好ましくは、Ａｌｕ配列に対するプライマーは５’−ＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧ−３’（配列識別番号１）の配列を有しており、ＨＩＶの５’ＬＴＲ配列を識別するレトロウイルス配列に対するプライマーは５’−ＡＡＧＣＴＣＧＡＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴ−３’（配列識別番号２）を有している。あるいは、（５’−ＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴＧ−３’などの、配列識別番号３）３’ＬＴＲに対するプライマーを用いることも可能であろう。次にＰＣＲ増幅ＤＮＡを増幅されたレトロウイルス配列を特異的に識別するプローブにハイブリダイズさせる。好ましくは、サンプルは血液、リンパ節、あるいはリンパ球のパラフィンに埋め込んだ断片あるいは凍結断片である。本発明の別の実施の形態では、その他のレトロウイルスのＬＴＲ配列を特異的に識別するプライマーの使用を通じて、他のレトロウイルスによる潜伏感染をモニターするためにこの手法を用いることができる。
【００１８】
本発明の別の実施の形態においては、組込みレトロウイルスを検出したり、及び／又はヒト・サンプル内での組込みレトロウイルスを有する細胞の数を判定するためのキットが提供される。このキットはＡｌｕ配列に対するプライマー、レトロウイルス配列に対するプライマー、増幅レトロウイルス配列を特異的に識別するプローブ、そして上記プローブの増幅レトロウイルス配列に対するハイブリダイゼーションを検出する検出剤を含んでいる。好ましくは、Ａｌｕ配列に対するプライマーは５’−ＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧ−３’（配列識別番号４）を有しており、ＨＩＶの５’−ＬＴＲ配列を識別するレトロウイルス配列に対するプライマーは５’−ＡＡＧＣＴＣＧＡＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴ−３’（配列識別番号２）の配列を有している。このキットは血液、リンパ節、あるいはリンパ球のパラフィンに埋め込んだ断片あるいは凍結断片のサンプル上で用いることができる。本発明の別の実施の形態で、このキットはその他の組込みレトロウイルスを検出したり、及び／又は他のレトロウイルスのＬＴＲ配列を特異的に識別するプライマーを用いて他の組込みレトロウイルスを有する細胞の数を判定するために用いることができる。
【００１９】
以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を説明する目的で開示されるものであって、いかなる意味でも本発明の範囲の限定は意図していない。
【００２０】
【実施例】
実施例１
細胞培養
ＬＳＭを通じて遠心分離によってヒトの血液から単離された抹消血液リンパ球をＰＨＡ刺激して、１５％ＦＢＳと４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で補強されたＲＰＭＩ−１６４０培地内で成長させた。未感染細胞はネガティブ・コントロールトとして使われ、実験室で単離したＨＩＶ（ＡＣ１及びＲ２８）で感染された培養物はポジティブ・コントロール・サンプルとして用いられた。また、ＣＥＭ細胞はネガティブ・コントロールとして用いられ、組込みＨＩＶプロウイルスの１つ又は２つのコピーを含んでいるＨＩＶ（３５．８細胞）をつくりだすクローン性ＣＥＭ株はポジティブ・コントロールとして用いられた。
【００２１】
実施例２
Ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション
５０μｌのＰＢＳ内に３ ｘ １０５個の細胞をガラス・スライド上に１０００ ｒｐｍで２分間細胞遠心分離した。次にそれらのスライドを室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）内に浸した。そして、それらを３Ｘ ＰＢＳに室温で２分間入れ（反応停止）、さらに、１Ｘ ＰＢＳに２分間、そして新鮮な１Ｘ ＰＢＳに２分間移した。次にこれらのスライドを５０％、７０％、１００％エタノール内にそれぞれ４分間入れて脱水処理し、空気乾燥させた。これらのスライドを加熱ブロックで９０秒間１００℃に加熱して、その後、０．３％Ｈ２Ｏ２を用いて室温で一昼夜処理した。翌日、これらのスライドを洗浄して、希釈プロテアーゼＫをＰＢＳに溶かしたもの（６μｇ／ｍｌ）内に室温で５分間浸した。これらのスライドを９５℃で２分間加熱して反応を停止させ、ＰＢＳ内で１０分間すすぎ、そしてさらにＨ２Ｏ内で１０分間すすいだ。そしてそれらを空気乾燥させた。５０μｌの増幅カクテル（３０．５μｌ　ｄＨ２Ｏ、５．０μｌ １０Ｘ ＰＣＲ緩衝液、４．０μｌ ｄＮＴＰ、１．０μｌプライマー１、１．０μｌプライマー２、８．０μｌ　ＭｇＣｌ２、０．５μｌ　Ｔａｑ）を各ウェルに加え、ウェル周辺をカバースリップで丁寧にシールした。これらのスライドを加熱ブロック上で９２ ℃で９０秒間加熱した。ＰＣＲを９５℃で４０秒間、５５℃で９０秒間、そして７２℃で９０秒間の割合で３０サイクル実施した。これらのスライドを１００％エタノールに浸し、９２℃で１分間加熱した。これらのスライドを２Ｘ ＳＳＣに室温で５分間浸し、４ ℃の温度下で一昼夜放置した。１００μｌのハイブリダイゼーション・ミックス（５０μｌの脱イオン化ホルムアミド、１０μｌの２０Ｘ ＳＳＣ、１０μｌの１００Ｘ デンハート・ゾル、１０μｌのｓｓＤＮＡ （１０ｍｇ／ｍｌ）、１０μｌの１０％ ＳＤＳ、４μｌのｄＨ２Ｏ、及び６μｌのプローブ（２５−５０ｍｇ／ｍｌ））をスライド上の各ウェルに加えて、９５℃の温度で５分間加熱した。そしてスライドを氷上に１分間置いて、加湿チェンバー内でカバースリップと共に４２℃の温度下で２−４時間培養した。スライドを２Ｘ ＳＳＣ内で室温で５分間づつ２度洗浄してから、０．１Ｘ ＳＳＣ内で４２℃の温度下で１０分間洗浄した。これらの組織片を緩衝液１（０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）に浸して、２０−４０μｌの緩衝液２（緩衝液１に０．５％ブロッキング剤）で覆った。カバースリップを加えて、それらのスライドを室温下に１５分間放置した。カバースリップを取り出して、スライドを緩衝液１に浸した。１：５００で抗ジゴキシゲニンＡｂを緩衝液２に希釈した２０μｌを各スライドに加え、カバースリップし、加湿チェンバー内で室温下で１時間培養した。カバースリップを取り出して、スライドを緩衝液１で１０分間づつ２度洗浄して、緩衝液３内で５分間均衡させた（色検出Ｂ）。各組織片に２０μｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えて、カバースリップを置き換えた。これらのスライドを光がない状態で一昼夜培養して、翌日顕微鏡で観察した。
【００２２】
実施例３
クローンされた、あるいは通常のＴ細胞における潜伏感染
未感染、潜伏感染、及び増殖的に感染されたＣＥＭ Ｔ細胞をガラス・スライド上に細胞遠心分離し、パラホルムアルデヒド内に固定し、そして上に述べたのと同様にｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲアッセイを行った。図２は未感染の細胞（ＣＥＭ）では何の反応も起こらず、慢性的及び増殖的に感染した細胞（３５．８）と潜伏感染期の細胞の両方では強い青色反応が起きたことを示している。図２ＢはＨＩＶ ｐ２４に対するｉｎ ｓｉｔｕ蛍光免疫染色で上のどの細胞がＨＩＶをつくりだしているかを示している。ＡｌｕプライマーあるいはＬＴＲプライマーだけでＰＣＲを行った場合は何の反応も示されなかった（図２Ｃ）ので、従って、このＰＣＲアッセイはＨＩＶ ＤＮＡの存在に対して特異性を示すようである。潜伏感染細胞の大部分はｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色ではＨＩＶ Ｐ２４をつくりださなかった（図２Ｂ）。
【００２３】
未感染及び急性感染の精製ＣＤ４ ＰＨＡ−ブラストでｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲハイブリダイゼーション反応も行った。これらの細胞を固定し、パラフィンに埋め込んで、切断した。感染したリンパ球では強い青色反応が起きたが、未感染細胞では起きなかった（図３）。この場合も、潜伏感染ＰＢＬｓはポジティブであったが、Ｐ２４はネガティブであった（図３Ｂ）。従って、この手法はパラフィンに埋め込んだ通常にリンパ球に対してはうまく行く。
【００２４】
この手順が組込みＨＩＶ ＤＮＡだけを検出することを明確に示すために、休止ＣＤ４リンパ球を急性感染させて、１８時間後にガラス・スライド上に細胞遠心分離させ、ｉｎ−ｓｉｔｕ ＰＣＲハイブリダイゼーションも行った（図４）。不稔的に感染させた休止細胞はネガティブであったが、これらの細胞から抽出されたＤＮＡは通常のＰＣＲでＨＩＶ−ＤＮＡポジティブであった（図５）。従って、このｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ−ハイブリダイゼーション手法は組込まれたＨＩＶ ＤＮＡは検出するが、組込まれていないＨＩＶ ＤＮＡは検出しない。
【００２５】
本明細書では以下の資料を引用した。
2004504013.tif 000002
【００２６】
本明細書で取り上げられているすべての特許あるいは刊行物は本発明が関係する分野の当業者のレベルに対応するものである。これらの特許及び刊行物はそれらを参照することで、各個別資料が参照による個々に具体的に組み込まれるのと同じ程度に全体として本明細書に組み込まれるものとする。
【００２７】
当業者であれば、本発明は上に述べられた、及びそれらに本質的に付随した目的を実行し、課題をアッセイするのによく適合していることは容易に理解できるであろう。上に述べた実施例は、本明細書に述べられている方法、手順、措置、分子、及び具体的な化合物と共に例示的なものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。請求項の範囲に限定される本発明の精神の範囲に含まれるその変更やその他の利用法は当業者には容易に想起されるであろう。
【図面の簡単な説明】
本発明の上に述べたような特徴、利点、及び目的と、以下に明らかになるようなその他の特徴、利点及び目的を達成し、より詳細に理解することができるように、上に要約的に示した本発明のより具体的な説明を添付図面に示すそのいくつかの実施の形態を参照して以下に行う。これらの図面は本明細書の一部を形成するものである。なお、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであって、その範囲の限定を意図したものはない。
【図１】プライマー設計とプローブ・ハイブリダイゼーションを示す図。１つのプライマーがヒトのクロモソームＤＮＡ内のａｌｕ配列に存在しており、他方のプライマーはウイルスＴＲＬの末端近くにある。そしてＰＣＲ増幅ＤＮＡを増幅されたＬＴＲ配列だけを識別するプローブとハイブリダイズさせる。
【図２Ａ】未感染ＣＥＭ細胞、増殖的に感染された３５．８細胞、それら両者の５０％づつの混合物、そしてＨＩＶ潜伏感染ＣＥＭ細胞上でのｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲハイブリダイゼーションの結果を示す図。未感染細胞では反応は起きなかったが、増殖的に感染した細胞及び潜伏感染細胞の両方で強い反応が起きた。
【図２Ｂ】ｉｎ ｓｉｔｕ　ＰＣＲハイブリダイゼーション・アッセイで用いられるＣＥＭ細胞群のＨＩＶ ｐ２４免疫染色を示す図。未感染ＣＥＭ細胞（ネガティブ・コントロール）、増殖的に感染された３５．８細胞（ポジティブ・コントロール）、潜伏感染ＣＥＭ細胞は、これらの細胞のうちでＨＩＶをつくりだすのは５％以下であることを示す。
【図２Ｃ】単一プライマーだけを用いてＣＥＭ細胞及び潜伏感染ＣＥＭ上でのｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲハイブリダイゼーションを示している。ａｌｕプライマーあるいはＬＴＲプライマーだけでアッセイを行った場合はいずれの反応も起きなかった。
【図３Ａ】未感染細胞、急性感染、及び潜伏感染精製ＣＤ４ ＰＨＡブラスト上でのｉｎ ｓｉｔｕ　ＰＣＲハイブリダイゼーション反応の結果を示す図。細胞を固定し、パラフィンに埋め込み、そして切断部分を作成した。
【図３Ｂ】未感染、急性感染、及び潜伏感染精製ＣＤ４ ＰＨＡブラストのＨＩＶ ｐ２４免疫染色を示す図。潜伏感染ＰＢＬｓはネガティブであった。
【図４】このアッセイで急性不稔性感染がネガティブであることを示す図。休止状態にあるＣＤ４リンパ球を急激に感染させて、１８時間後にガラス・スライド上に細胞遠心分離し、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲハイブリダイゼーションを行った。
【図５】ＨＩＶ ｇａｇプライマーを用いて図４の不稔的に感染された休止細胞から抽出されたＤＮＡでの標準ＤＮＡ ＰＣＲを示す図。この図はＨＩＶ ＤＮＡがこれらの細胞に存在しているが、それは非組込み形態であることを示している。未感染細胞から抽出されたＤＮＡは比較対象として用いられた。
配列表
2004504013.tif 000003
2004504013.tif 000004
2004504013.tif 000005
【図１】
2004504013.tif 000006
【図２Ａ】
2004504013.tif 000007
【図２Ｂ】
2004504013.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2004504013.tif 000010
【図３Ｂ】
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【図４】
2004504013.tif 000012
【図５】
2004504013.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004504013.tif 000014
2004504013.tif 000015
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