(57)【要約】本発明は、ａ）３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列と第一の５’確定増幅可能配列を含む第一プライマーを標的ＲＮＡにハイブリダイズさせ；ｂ）該第一プライマーを逆転写酵素で伸長させて第一ｃＤＮＡ鎖を形成し；ｃ）３’ランダムｃＤＮＡハイブリダイズ配列と第二の５’確定増幅可能配列を含む第二プライマーを第一ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ；ｄ）該第二プライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて第二ｃＤＮＡ鎖を形成し；ｅ）第一の５’確定増幅可能配列を含む第三プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることによって、ＲＮＡ配列を増幅させるための方法と構成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ配列を増幅させる方法において、
（ａ）３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列と第一の５’確定増幅可能配列を含む第一プライマーを標的ＲＮＡにハイブリダイズさせ；
（ｂ）該第一プライマーを逆転写酵素で伸長させて第一ｃＤＮＡ鎖を形成し；
（ｃ）３’ランダムｃＤＮＡハイブリダイズ配列と第二の５’確定増幅可能配列を含む第二プライマーを第一ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ；
（ｄ）該第二プライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて第二ｃＤＮＡ鎖を形成し；
（ｅ）第一の５’確定増幅可能配列を含む第三プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させる；
工程を含み、
工程（ｂ）は、標的ＲＮＡと第一ｃＤＮＡのヘテロ二重鎖を生じ、第一ｃＤＮＡ鎖を溶融工程なしに第二プライマーとハイブリダイズさせるのに十分なＲＮＡｓｅでヘテロ二重鎖の標的ＲＮＡを分解する工程を更に含んでなる方法。
【請求項２】
３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムではない請求項１に記載の方法。
【請求項４】
３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムではなく、コード領域、ポリＡジャンクション、又はポリＡテイルから選択される予め決められた配列と相補的である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第一及び第二の５’確定増幅可能配列が同一である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第一及び第二の５’確定増幅可能配列が異なっており、
工程（ｂ）と（ｃ）の間で第一プライマーを機能的に欠失させる工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第一及び第二の５’確定増幅可能配列が異なっており、
工程（ｂ）と（ｃ）の間で第一プライマーを機能的に欠失させる工程を更に含み、
工程（ｅ）が、第二の５’確定増幅可能配列を含む第四プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第一及び第二の５’確定増幅可能配列が異なっており、
工程（ｂ）と（ｃ）の間で第一プライマーを機能的に欠失させる工程を更に含み、
工程（ｅ）が、第二の５’確定増幅可能配列を含む第四プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることを更に含み、
（ｆ）増幅されたｃＤＮＡを、過剰な第三又は第四プライマーの何れかで増幅させて、予め決まった向きの主に一本鎖の増幅プローブを形成する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
単一チューブ（均質）内で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
単一チューブ内で実施され、工程（ｅ）の第三プライマーが第一プライマーより機能的に多く加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｄ）と（ｅ）の間に残っている第一及び第二プライマーを機能的に欠失させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第一及び第二の５’確定増幅可能配列が同一であり、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第一及び第二の５’確定増幅可能配列が同一であり、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムでない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第一及び第二の５’確定増幅可能配列が同一であり、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムでなく、単一のチューブ内で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムでなく、第一及び第二の５’確定増幅可能配列が異なっており、工程（ｂ）と（ｃ）の間で第一プライマーを機能的に欠失させる工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムでなく、第一及び第二の５’確定増幅可能配列が異なっており、工程（ｂ）と（ｃ）の間で第一プライマーを機能的に欠失させる工程を更に含み、単一のチューブ内で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ配列を増幅させる方法において、
（ａ）３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列と第一の５’確定増幅可能配列を含む第一プライマーを標的ＲＮＡにハイブリダイズさせ；
（ｂ）該第一プライマーを逆転写酵素で伸長させて第一ｃＤＮＡ鎖を形成し；
（ｃ）３’ランダムｃＤＮＡハイブリダイズ配列と第二の５’確定増幅可能配列を含む第二プライマーを第一ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ；
（ｄ）該第二プライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて第二ｃＤＮＡ鎖を形成し；
（ｅ）第一の５’確定増幅可能配列を含む第三プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させる、
工程を含んでなり；
３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムであり；第一及び第二の５’確定増幅可能配列が異なっており；工程（ｂ）が次の工程において第一ｃＤＮＡ鎖とハイブリダイズすることを防止するために第一プライマーを機能的に欠失させる工程を含む、方法。
【請求項１８】
工程（ｅ）が、第二の５’確定増幅可能配列を含む第四プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｅ）が、第二の５’確定増幅可能配列を含む第四プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることを更に含み、
（ｆ）増幅されたｃＤＮＡを、過剰な第三又は第四プライマーで増幅させて、予め定まった向きの主に一本鎖の増幅プローブを形成する工程を更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｅ）が、第二の５’確定増幅可能配列を含む第四プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることを更に含み、
（ｆ）増幅されたｃＤＮＡを、過剰な第三又は第四プライマーで増幅させて、予め定まった向きの主に一本鎖の増幅プローブを形成する工程を更に含み、
単一のチューブ内で実施される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（序）
（発明の分野）
本発明の分野はＲＮＡの増幅である。
【０００２】
（背景）
ＲＮＡは、マイクロアレイに基づく診断法及びシークエンシングのような、遺伝子分析のための常用される出発材料であり、一般には先ずＲＮＡをｃＤＮＡに複製し、ついでＰＣＲ及び／又は繰り返しの転写を用いて増幅産物を得ることにより、ＲＮＡを増幅するために様々な方法が案出されている。例えば、Ｓｉｌｖｅｒ等（１９９２）の米国特許第５１０４７９２号；Ｌｉａｎｇ等（１９９７）の米国特許第５５９９６７２号；及びＳｈｕｂｅｒ（１９９９）の米国特許第５８８２８５６号はＲＮＡを増幅する方法を記述している。本発明は、全ＲＮＡインプット、低品質インプット（１００ｐｇ以下のｍＲＮＡ）及び線形又は定量的ＰＣＲ増幅に適合化可能な改良されたＲＮＡ増幅法を提供する。
【０００３】
（発明の概要）
本発明はＲＮＡ配列を増幅するための方法及び構成物を提供する。一側面では、本発明は、
ａ）３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列と第一の５’確定増幅可能配列を含む第一プライマーを標的ＲＮＡにハイブリダイズさせ；
ｂ）該第一プライマーを逆転写酵素で伸長させて第一ｃＤＮＡ鎖を形成し；
ｃ）３’ランダムｃＤＮＡハイブリダイズ配列と第二の５’確定増幅可能配列を含む第二プライマーを第一ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ；
ｄ）該第二プライマーをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて第二ｃＤＮＡ鎖を形成し；
ｅ）第一の５’確定増幅可能配列を含む第三プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させる、
工程を含む。
主要な一実施態様では、工程（ｂ）は標的ＲＮＡと第一ｃＤＮＡのヘテロ二重鎖を生じ、第一ｃＤＮＡ鎖を溶融工程なしに第二プライマーとハイブリダイズさせるのに十分なＲＮａｓｅでヘテロ二重鎖の標的ＲＮＡを分解する工程を更に含む。様々な応用例では、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列はランダムでもランダムでなくてもよく、例えば予め決められた配列（例えばコード領域、ポリＡジャンクション、又はポリＡテイル）に相補的であり、第一及び第二の５’確定増幅可能配列は同じでも異なっていてもよい。第一及び第二の５’確定増幅可能配列が異なっている特定の実施態様では、該方法は工程（ｂ）及び（ｃ）の間で第一プライマーを機能的に欠失させる工程を更に含み；工程（ｅ）は第二の５’確定増幅可能配列を含む第四プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることを更に含み；及び／又は該方法は増幅されたｃＤＮＡを過剰の第三又は第四プライマーの何れかで増幅させて、予め定まった向きの主に一本鎖の増幅プローブを形成する工程（ｆ）を更に含む。特定の応用例では、該方法は単一のチューブ（均一なアッセイ）で実施されうる。
【０００４】
他の主要な実施態様では、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列はランダムである；第一及び第二の５’確定増幅可能配列は異なっている；そして工程（ｂ）は次の工程において第一ｃＤＮＡ鎖とハイブリダイズすることを防止するために第一プライマーを機能的に欠失させる工程を含む。
双方の主要実施態様では、増幅工程（ｅ）での第一及び／又は第二プライマーの干渉は、第一及び／又は第二プライマーより機能的に多く工程（ｅ）の第三及び／又は第四プライマーを加え；及び／又は工程（ｄ）及び（ｅ）の間で残りの第一及び第二プライマーを機能的に欠失させることによって低減されうる。
【０００５】
（発明の特定の実施態様の記載）
特定の実施態様と実施例の次の記載は例示のために提供されるもので限定のためではない。特に矛盾せず又はそれ以外の定義が示されない限り、これらの記載及び本明細書全体を通じて、「ａ」及び「ａｎ」という用語は一又は複数を意味し、「又は」という用語は及び／又はを意味する。
【０００６】
開示された方法の第一工程は、（ａ）３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列と第一の５’確定増幅可能配列を含む第一プライマーを標的ＲＮＡにハイブリダイズさせることを含む。全細胞ＲＮＡ、増幅ＲＮＡ、精製ＲＮＡ種、例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又は好ましくはｍＲＮＡ等々を含む、様々な標的ＲＮＡ種を使用することができる。第一プライマーは標的ＲＮＡとハイブリダイズするのに十分な配列と長さの３’配列を含む。応用例に応じて、この３’ハイブリダイズ配列はランダム、特異的又はランダム及び特異的配列の組み合わせでありうる。例えば、ランダムな３’ハイブリダイズ配列を含むプライマー集団は任意のＲＮＡ種を標的とすることが可能な「普遍的な」プライマー集団を提供する。他の実施態様では、ポリＴ３’ハイブリダイズ配列を含むプライマーを用いてｍＲＮＡのポリＡテイルを標的としてもよい；予め定まった特異的配列を含むプライマーを用いて相補的配列を含む特定の予め定まったＲＮＡ種を標的としてもよい；またポリＴ領域に結合したウォッブルヌクレオチド（Ａ、Ｃ又はＧ）に結合したランダム領域を含むプライマーを用いてｍＲＮＡポリＡジャンクションを標的とすることができる。第一プライマーはまた第一の５’確定増幅可能配列を含み、これは、次の特異的増幅工程において使用され得る任意の配列であってよく、好ましくはＰＣＲ可能なタグを含む。標的ＲＮＡと第一プライマーとの間のハイブリダイゼーションを実施するための好適な反応条件は従来から知られており、実験的に直ぐに確認され、及び／又は記載され、及び／又はここに実証されている。
【０００７】
本方法の第二の工程は、第一プライマーを逆転写酵素で伸長させて第一ｃＤＮＡ鎖を形成することを含む。応用例に応じて、ＲＮＡｓｅ活性がこの工程中に存在し得、逆転写に続いて又は同時に元のＲＮＡ鋳型の分解を生じ得、例えば同じプライマーでの新しいｃＤＮＡ鎖のプライミングを可能にする。好適な実施態様では、ＲＮＡｓｅ活性は逆転写酵素、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（双方ともＰｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩから入手可能）、ラウス随伴ウイルス２（ＲＡＶ２）及びヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）逆転写酵素（双方ともアマシャムファルマシアから入手可能）等々によってもたらされる。３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列がランダムで第一及び第二５’確定増幅可能配列が異なっている応用例では、ＲＮＡｓｅ活性は好ましくは第二鎖ｃＤＮＡの合成が同じ反応混合物中では起こらないように排除される。ＲＮａｓｅ活性のない好適な逆転写酵素の例には、ＭＭＬＶ−ＲＴ ＲＮａｓｅＨマイナス（例えばプロメガのカタログ番号Ｍ５３０１及び番号Ｍ３６８２）、ディスプレイＴＨＥＲＭＯ−ＲＴ（Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｖｉｓｔａ ＣＡ）、Ｓｔｒａｔ−ＳｃｒｉｐｔＲＴ（ストラタジーン， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）等々が含まれる。
【０００８】
該方法の第三工程は、（ｃ）３’ランダムｃＤＮＡハイブリダイズ配列と第二５’確定増幅可能配列を含む第二プライマーを第一ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせることを含む。応用例に応じて、第二プライマーは第一プライマーと同じ３’ハイブリダイズ配列及び／又は同じ５’確定増幅可能配列を有していてもよく、又は一方又は双方の配列は異なっていてもよい；以下の実施例を参照のこと。例えば、第一及び第二５’確定増幅可能配列が異なっている場合、該方法はまた工程（ｂ）及び（ｃ）の間に第一プライマーを機能的に欠失させる工程を含んでもよい。機能的欠失は第二プライマー伸長反応との第一プライマーの干渉を低減するもので、任意の常套的な手段、例えば除去（例えばサイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィー）、不活性化（例えば加水分解、コンジュゲーション等々）によって行わしめることができる。
【０００９】
該方法の第四工程は（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼで第二プライマーを伸長させて第二ｃＤＮＡ鎖を形成することを含む。好適なＤＮＡポリメラーゼと反応条件は従来から知られており、経験的に直ぐに確認され、及び／又は記載され、及び／又はここに実証されている。
【００１０】
該方法の第五工程は（ｅ）第一の５’確定増幅可能配列を含む第三プライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることを含む。第一プライマーからの干渉を低減するために、工程（ｅ）の第三プライマーは、第一プライマーより機能的に多く加えるか、及び／又は残っている第一（及び／又は、もし存在し第一プライマーと区別される場合は第二プライマー）を工程（ｄ）と（ｅ）の間で機能的に欠失させることができる。特定の応用例に応じて、増幅工程（ｃ）は更なるプライマー及び反応を用いてもよい。例えば、第一及び第二５’確定増幅可能配列が異なっている場合は、工程（ｅ）は第二の５’確定増幅可能配列を含む第四のプライマーで第二ｃＤＮＡ鎖を増幅させることを更に含みうる。この応用例のより特定的な実施態様では、該方法は過剰の第三又は第四プライマーで増幅ｃＤＮＡを増幅させて予め定まった向きの主に一本鎖の増幅プローブを形成する工程（ｆ）を更に含む。
【００１１】
該方法の好適な応用例は、例えば洗浄工程のような、従来の方法に固有の取り扱い工程を低減し、好ましくは一つの洗浄工程にするか、より好ましくは洗浄工程をなくし、該方法が連続的に、好適には均質に、単一のチューブ（すなわち容器又は反応器）内で実施される。
第三及び第四プライマーは第一及び第二プライマーの確定配列部分のものに同一の配列を含み、その３’末端以外の位置に任意的な検出可能標識を含みうる。標識は、蛍光又は放射性標識のように直接的に検出可能でも、ビオチン、ニトロフェノールのように間接的に検出可能でも；又は直接的に検出可能な標識を含み間接的な方式の存在を測定する第二の結合反応に使用される高親和性の特異的結合試薬がある関連した標識でもよい。
【００１２】
好適な形態では、第一プライマーと第二プライマーの配列特異的部分の配列は同一である。この形態では、標識されていてもよい第三及び第四プライマーはまた同一であり、二つのプライマーだけが全増幅及び標識工程に対して必要になる。更に好適な形態では、ｍＲＮＡにハイブリダイズする第一プライマー部分とｃＤＮＡにハイブリダイズする第二プライマー部分のハイブリダイゼーション温度は２０℃から４５℃の間であり、第一及び第二プライマーの配列特異的部分のハイブリダイゼーション温度は５０℃から８０℃の間である。
【００１３】
この発明の更に他の形態では、標識は増幅過程には生じないが増幅後になされる。この形態では、増幅産物は、末端ヒドロキシル基、ＤＮＡ塩基の環外アミン、及び橋かけヌクレオチド間ホスフェート基を含むＤＮＡ鎖の部位と共に反応性標識試薬をインキュベーションすることを含む様々な方法によって標識することができる。あるいは、標識は適切に標識されたヌクレオチドトリホスフェート及び適切なＤＮＡポリメラーゼ、例えばクレノウ断片を用いるニックトランスレーション法によって導入することができる。
【００１４】
ガラス、シリコン、プラスチック、ナイロン膜等々のような基体の離散したエレメントにポリヌクレオチドを配列させるために様々な材料と方法が従来から知られており、接触付着法、例えば米国特許第５８０７５２２号；第５７７０１５１号等々；フォトリソグラフィー法、例えば米国特許第５８６１２４２号；第５８５８６５９号；第５８５６１７４号；第５８５６１０１号；第５８３７８３２号等々；流路（ｆｌｏｗ ｐａｔｈ−ｂａｓｅｄ）法、例えば米国特許第５３８４２６１号；浸けペン（ｄｉｐ−ｐｅｎ）ナノリソグラフィー法、例えばＰｉｎｅｒ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊａｎ ２９ １９９９： ６６１−６６３等々などを含む。好適な実施態様では、捕獲ポリヌクレオチドが高密度、一般には平方センチ当たり少なくとも１００、好ましくは少なくとも１０００、より好ましくは少なくとも１００００、最も好ましくは少なくとも１０００００の離散エレメントで対応する離散エレメントに配列される。
【００１５】
本方法の主要な一応用例では、工程（ｂ）は標的ＲＮＡと第一ｃＤＮＡのヘテロ二重鎖を生じ、第一ｃＤＮＡ鎖を溶融工程なしに第二プライマーとハイブリダイズさせるのに十分なＲＮａｓｅでヘテロ二重鎖の標的ＲＮＡを分解する工程を更に含む。この応用例の特定の実施態様では、第一及び第二の５’確定増幅可能配列は同じであり、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列はランダムである；第一及び第二の５’確定増幅可能配列は同じであり、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列はランダムではない；第一及び第二の５’確定増幅可能配列は同じであり、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列はランダムではなく、本方法は単一のチューブ内で実施される；３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列はランダムではなく、第一及び第二の５’確定増幅可能配列は異なっており、本方法は工程（ｂ）と（ｃ）の間に第一プライマーを機能的に欠失させる工程を更に含む；３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列はランダムではなく、第一及び第二の５’確定増幅可能配列は異なっており、本方法は工程（ｂ）と（ｃ）の間に第一プライマーを機能的に欠失させる工程を更に含み、本方法は単一のチューブ内で実施される。
【００１６】
本方法の第二の主要な応用例では、３’標的ＲＮＡハイブリダイズ配列はランダムであり；第一及び第二の５’確定増幅可能配列は異なっており；工程（ｂ）は次の工程で第一のｃＤＮＡ鎖とハイブリダイズすることを防止するために第一プライマーを機能的に欠失させる工程を含む。これらの主要な応用例の代表的な実施例のための例示的プロトコルを以下に提供する。
【００１７】
（実験プロトコルの例）
実施例１　ポリＡからのランダムプライム
インサイト・ゲノミックス社の米国特許第５８０７５２２号に従ってｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。オペロンテクノロジーによってオリゴヌクレオチドを合成精製し、更に精製することなく使用した。
次のオリゴヌクレオチド配列を実施例の実施に使用した：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＣ （配列番号：１）
ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＣ　（配列番号：２）
【００１８】
配列番号：１のオリゴヌクレオチドを、鋳型として複合ポリＡ精製ヒトｍＲＮＡを使用する標準的な第一鎖ｃＤＮＡ逆転写反応をランダムにプライミングするために用いた。Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ＋）逆転写酵素を反応の酵素として使用した。逆転写反応の間、第一ｃＤＮＡ鎖と相補的な第二ｃＤＮＡ鎖を合成した。この第二ｃＤＮＡ鎖は一端には配列番号：２を、他端にはその逆の相補鎖を持っており、中間にはｍＲＮＡ配列があった。
第二鎖ｃＤＮＡ産物をついでＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そこでは、５’Ｃｙ３又は５’Ｃｙ５の配列番号：２を指数的増幅のための普遍的なプライマーとして使用した。
このＣｙ３又はＣｙ５標識された二本鎖ＰＣＲ産物をついで精製し、２５ｕＬまで濃縮し、ｃＤＮＡマイクロアレイの表面に塗布した。それを５ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの溶液中で５０℃にて６から１２時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたマイクロアレイをついで１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳの溶液中で４５℃にて１０分間洗浄した。一回目の洗浄後直ぐに、マイクロアレイを０．１ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの第二洗浄液中で３分間３５℃にて洗浄した。ついでマイクロアレイをＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ａマイクロアレイスキャナーを使用してスキャンし、ハイブリダイゼーションパターンを検出した。
【００１９】
実施例２　ニックトランスレーションを用いたポリＡからのランダムプライム
インサイト・ゲノミックス社の米国特許第５８０７５２２号に従ってｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。オペロンテクノロジーによってオリゴヌクレオチドを合成精製し、更に精製することなく使用した。
次のオリゴヌクレオチド配列を実施例の実施に使用した：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＣ （配列番号：１）
ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＣ　（配列番号：２）
【００２０】
配列番号：１のオリゴヌクレオチドを、鋳型として複合ポリＡ精製ヒトｍＲＮＡを使用する標準的な第一鎖ｃＤＮＡ逆転写反応をランダムにプライミングするために用いた。Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ＋）逆転写酵素を反応の酵素として使用した。逆転写反応の間、第一ｃＤＮＡ鎖と相補的な第二ｃＤＮＡ鎖を合成した。この第二ｃＤＮＡ鎖は一端には配列番号：２を、他端にはその逆の相補鎖を持っており、中間にはｍＲＮＡ配列があった。
第二鎖ｃＤＮＡ産物をついでＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そこでは、５’Ｃｙ３又は５’Ｃｙ５の配列番号：２を指数的増幅のための普遍的なプライマーとして使用した。
このＣｙ３又はＣｙ５標識された二本鎖ＰＣＲ産物をついで精製し、ＥｔＯＨ沈殿させた。ついで、このプローブサンプルをニックトランスレーションの鋳型として使用した。プロメガキット：ニックトランスレーションシステム番号Ｕ１００１を使用し、４：１のコールドからホットな比でＣｙ３又はＣｙ５標識ｄＣＴＰを導入した。
ついでニックトランスレーション産物を２５ｕＬまで濃縮し、ｃＤＮＡマイクロアレイの表面に塗布した。それを５ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの溶液中で６０℃にて６から１２時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたマイクロアレイをついで１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳの溶液中で４５℃にて１０分間洗浄した。一回目の洗浄後直ぐに、マイクロアレイを０．１ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの第二洗浄液中で３分間２５℃にて洗浄した。ついでマイクロアレイをＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ａマイクロアレイスキャナーを使用してスキャンし、ハイブリダイゼーションパターンを検出した。
【００２１】
実施例３　ウォッブルなしの全体からの増幅
インサイト・ゲノミックス社の米国特許第５８０７５２２号に従ってｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。オペロンテクノロジーによってオリゴヌクレオチドを合成精製し、更に精製することなく使用した。
次のオリゴヌクレオチド配列を実施例の実施に使用した：
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　（配列番号：３）
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡ　（配列番号：４）
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　（配列番号：５）
【００２２】
配列番号：３のオリゴヌクレオチドを、鋳型として複合全ＲＮＡを使用する標準的な第一鎖ｃＤＮＡ逆転写反応をプライミングするために用いた。Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ＋）逆転写酵素を反応の酵素として使用した。逆転写反応の後、過剰な試薬を精製して除去し、第二の逆転写反応を実施した。配列番号：５を使用して、第二の逆転写反応は第一ｃＤＮＡ鎖と相補的なｃＤＮＡ鎖を生じた。この第二ｃＤＮＡ鎖は一端には配列番号：４を、他端にはその逆の相補鎖を持っており、中間にはｍＲＮＡ配列があった。
第二鎖ｃＤＮＡ産物をついでＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そこでは、５’Ｃｙ３又は５’Ｃｙ５の配列番号：４を指数的増幅のための普遍的なプライマーとして使用した。このＣｙ３又はＣｙ５標識された二本鎖ＰＣＲ産物をついで精製し、２５ｕＬまで濃縮し、ｃＤＮＡマイクロアレイの表面に塗布した。それを５ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの溶液中で５０℃にて６から１２時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたマイクロアレイをついで１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳの溶液中で４５℃にて１０分間洗浄した。一回目の洗浄後直ぐに、マイクロアレイを０．１ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの第二洗浄液中で３分間３５℃にて洗浄した。ついでマイクロアレイをＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ａマイクロアレイスキャナーを使用してスキャンし、ハイブリダイゼーションパターンを検出した。
【００２３】
実施例４　ウォッブルを伴っての全ＲＮＡからの増幅
インサイト・ゲノミックス社の米国特許第５８０７５２２号に従ってｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。オペロンテクノロジーによってオリゴヌクレオチドを合成精製し、更に精製することなく使用した。
次のオリゴヌクレオチド配列を実施例の実施に使用した：
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ （配列番号：６）
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡ　（配列番号：４）
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　（配列番号：５）
【００２４】
配列番号：３のオリゴヌクレオチドを、鋳型として複合全ＲＮＡを使用する標準的な第一鎖ｃＤＮＡ逆転写反応をプライミングするために用いた。Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ＋）逆転写酵素を反応の酵素として使用した。逆転写反応の後、過剰な試薬を精製して除去し、第二の逆転写反応を実施した。配列番号：５を使用して、第二の逆転写反応は第一ｃＤＮＡ鎖と相補的なｃＤＮＡ鎖を生じた。この第二ｃＤＮＡ鎖は一端には配列番号：４を、他端にはその逆の相補鎖を持っており、中間にはｍＲＮＡ配列があった。
第二鎖ｃＤＮＡ産物をついでＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そこでは、５’Ｃｙ３又は５’Ｃｙ５の配列番号：４を指数的増幅のための普遍的なプライマーとして使用した。このＣｙ３又はＣｙ５標識された二本鎖ＰＣＲ産物をついで精製し、２５ｕＬまで濃縮し、ｃＤＮＡマイクロアレイの表面に塗布した。それを５ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの溶液中で５０℃にて６から１２時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたマイクロアレイをついで１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳの溶液中で４５℃にて１０分間洗浄した。一回目の洗浄後直ぐに、マイクロアレイを０．１ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの第二洗浄液中で３分間３５℃にて洗浄した。ついでマイクロアレイをＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ａマイクロアレイスキャナーを使用してスキャンし、ハイブリダイゼーションパターンを検出した。
【００２５】
実施例５　ウォッブルなしのポリＡ精製物からの増幅
インサイト・ゲノミックス社の米国特許第５８０７５２２号に従ってｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。オペロンテクノロジーによってオリゴヌクレオチドを合成精製し、更に精製することなく使用した。
次のオリゴヌクレオチド配列を実施例の実施に使用した：
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　（配列番号：３）
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡ　（配列番号：４）
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　（配列番号：５）
【００２６】
配列番号：３のオリゴヌクレオチドを、鋳型としてポリＡ精製ヒトｍＲＮＡを使用する標準的な第一鎖ｃＤＮＡ逆転写反応をプライミングするために用いた。Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ＋）逆転写酵素を反応の酵素として使用した。逆転写反応の後、過剰な試薬を精製して除去し、第二の逆転写反応を実施した。配列番号：５を使用して、第二の逆転写反応は第一ｃＤＮＡ鎖と相補的なｃＤＮＡ鎖を生じた。この第二ｃＤＮＡ鎖は一端には配列番号：４を、他端にはその逆の相補鎖を持っており、中間にはｍＲＮＡ配列があった。
第二鎖ｃＤＮＡ産物をついでＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そこでは、５’Ｃｙ３又は５’Ｃｙ５の配列番号：４を指数的増幅のための普遍的なプライマーとして使用した。このＣｙ３又はＣｙ５標識された二本鎖ＰＣＲ産物をついで精製し、２５ｕＬまで濃縮し、ｃＤＮＡマイクロアレイの表面に塗布した。それを５ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの溶液中で５０℃にて６から１２時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたマイクロアレイをついで１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳの溶液中で４５℃にて１０分間洗浄した。一回目の洗浄後直ぐに、マイクロアレイを０．１ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの第二洗浄液中で３分間３５℃にて洗浄した。ついでマイクロアレイをＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ａマイクロアレイスキャナーを使用してスキャンし、ハイブリダイゼーションパターンを検出した。
【００２７】
実施例６　ウォッブルを伴ってのポリＡ精製物からの増幅
インサイト・ゲノミックス社の米国特許第５８０７５２２号に従ってｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。オペロンテクノロジーによってオリゴヌクレオチドを合成精製し、更に精製することなく使用した。
次のオリゴヌクレオチド配列を実施例の実施に使用した：
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ （配列番号：６）
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡ　（配列番号：４）
ＡＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　（配列番号：５）
【００２８】
配列番号：３のオリゴヌクレオチドを、鋳型として複合ポリＡ精製ヒトｍＲＮＡを使用する標準的な第一鎖ｃＤＮＡ逆転写反応をプライミングするために用いた。Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ＋）逆転写酵素を反応の酵素として使用した。逆転写反応の後、過剰な試薬を精製して除去し、第二の逆転写反応を実施した。配列番号：５を使用して、第二の逆転写反応は第一ｃＤＮＡ鎖と相補的なｃＤＮＡ鎖を生じた。この第二ｃＤＮＡ鎖は一端には配列番号：４を、他端にはその逆の相補鎖を持っており、中間にはｍＲＮＡ配列があった。
第二鎖ｃＤＮＡ産物をついでＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そこでは、５’Ｃｙ３又は５’Ｃｙ５の配列番号：４を指数的増幅のための普遍的なプライマーとして使用した。このＣｙ３又はＣｙ５標識された二本鎖ＰＣＲ産物をついで精製し、２５ｕＬまで濃縮し、ｃＤＮＡマイクロアレイの表面に塗布した。それを５ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの溶液中で５０℃にて６から１２時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたマイクロアレイをついで１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳの溶液中で４５℃にて１０分間洗浄した。一回目の洗浄後直ぐに、マイクロアレイを０．１ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの第二洗浄液中で３分間３５℃にて洗浄した。ついでマイクロアレイをＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ａマイクロアレイスキャナーを使用してスキャンし、ハイブリダイゼーションパターンを検出した。
【００２９】
実施例７　ビーズ上のランダムなポリＡ精製物の増幅
インサイト・ゲノミックス社の米国特許第５８０７５２２号に従ってｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。オペロンテクノロジーによってオリゴヌクレオチドを合成精製し、更に精製することなく使用した。
次のオリゴヌクレオチド配列を実施例の実施に使用した：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＣ （配列番号：１）
ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＣ　（配列番号：２）
【００３０】
配列番号：１のオリゴヌクレオチドを、ＱｉａｇｅｎのｍＲＮＡミニキットによって提供されたオリゴｄＴ／ラテックスビーズ上に捕捉された複合ポリＡｍＲＮＡを使用する標準的な第一鎖ｃＤＮＡ逆転写反応をランダムにプライミングするために用いた。ラテックスビーズの除かれたｍＲＮＡ溶出はなされなかった。Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ＋）逆転写酵素を反応の酵素として使用した。逆転写反応の間、第一ｃＤＮＡ鎖と相補的な第二ｃＤＮＡ鎖を合成した。この第二ｃＤＮＡ鎖は一端には配列番号：２を、他端にはその逆の相補鎖を持っており、中間にはｍＲＮＡ配列があった。
第二鎖ｃＤＮＡ産物をついでＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そこでは、５’Ｃｙ３又は５’Ｃｙ５の配列番号：２を指数的増幅のための普遍的なプライマーとして使用した。このＣｙ３又はＣｙ５標識された二本鎖ＰＣＲ産物をついで精製し、２５ｕＬまで濃縮し、ｃＤＮＡマイクロアレイの表面に塗布した。それを５ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの溶液中で５０℃にて６から１２時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしたマイクロアレイをついで１ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳの溶液中で４５℃にて１０分間洗浄した。一回目の洗浄後直ぐに、マイクロアレイを０．１ＸＳＳＣと０．２％ＳＤＳの第二洗浄液中で３分間３５℃にて洗浄した。ついでマイクロアレイをＡｘｏｎ Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ａマイクロアレイスキャナーを使用してスキャンし、ハイブリダイゼーションパターンを検出した。
【００３１】
この明細書において引用した全ての刊行物と特許出願とそこに引用されている全ての文献は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願又は文献が特定されて個々に出典明示により取り込まれている如く、出典明示によってここに取り込まれる。前記の発明は理解の明瞭化の目的のための実施例と説明によってある程度詳しく説明されているが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなくある種の変化又は変更をそれに施すことができることは本発明の教唆に照らして当業者には直ぐに理解できるであろう。
【国際公開パンフレット】
2004504039.tif 000002
2004504039.tif 000003
2004504039.tif 000004
2004504039.tif 000005
2004504039.tif 000006
2004504039.tif 000007
2004504039.tif 000008
2004504039.tif 000009
2004504039.tif 000010
2004504039.tif 000011
2004504039.tif 000012
2004504039.tif 000013
2004504039.tif 000014
2004504039.tif 000015
2004504039.tif 000016
2004504039.tif 000017
2004504039.tif 000018
2004504039.tif 000019
2004504039.tif 000020
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504039.tif 000021
【国際調査報告】
2004504039.tif 000022
2004504039.tif 000023
2004504039.tif 000024