(57)【要約】この発明は、軟骨欠損の治療薬剤と方法に関する。また、この発明は、軟骨欠損の治療用インプラントに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された表層軟骨始原細胞群。
【請求項２】
細胞が哺乳動物である請求項１に記載の単離された表層軟骨始原細胞群。
【請求項３】
細胞がヒトである請求項１に記載の単離された表層軟骨始原細胞群。
【請求項４】
単離された表層軟骨始原細胞群からなる組成物。
【請求項５】
哺乳動物の軟骨の表層由来の増強された群を得ることからなる、表層軟骨始原細胞群の単離方法。
【請求項６】
哺乳動物がヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
表層軟骨始原細胞群を投与することからなる、患者の治療方法。
【請求項８】
表層軟骨始原生細胞を投与することからなる、軟骨欠損によって特徴付けられる疾患又は臨床上の症状の治療方法。
【請求項９】
軟骨欠損を特徴とするか、又はそれによって特徴づけられる、疾患又は臨床上の症状の治療で用いるための表層軟骨始原細胞。
【請求項１０】
軟骨欠損を特徴とするか、又はそれによって特徴づけられる、疾患又は臨床上の症状の治療で用いるための表層軟骨始原生細胞を含む薬剤の製造方法。
【請求項１１】
表層軟骨始原細胞の投与からなる、軟骨の成長方法。
【請求項１２】
方法がインビトロである請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
軟骨欠損を再植するよう増殖し、これが分化して成熟軟骨形成細胞を形成する表層軟骨始原細胞を供することによる、軟骨欠損の再修復方法。
【請求項１４】
成熟軟骨形成細胞が関節軟骨を形成する請求項１３に記載の軟骨欠損の修復方法。
【請求項１５】
骨−軟骨の界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と暴露された関節表面に接触して、又はその近くに位置するのに適した第二表面とからなり、さらに表層軟骨始原細胞からなる軟骨欠損修復に適したインプラント。
【請求項１６】
生体適合性スカホールドからなる請求項１５に記載のインプラント。
【請求項１７】
第一表面と第二表面との距離がｄ１であり、第二表面からｄ２の深部までに、インプラントの残りの深部よりも高い濃度の表層軟骨始原細胞を含み、ｄ２／ｄ１＜１である請求項１５に記載のインプラント。
【請求項１８】
ｄ２／ｄ１＜０・５である請求項１７に記載のインプラント。
【請求項１９】
ｄ２／ｄ１＜０・３である請求項１７に記載のインプラント。
【請求項２０】
ｄ２／ｄ１＜０・２である請求項１７に記載のインプラント。
【請求項２１】
生体適合性スカホールドが、軟骨始原細胞結合材を含む請求項１６に記載のインプラント。
【請求項２２】
軟骨始原細胞結合材が、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、抗−ノッチ抗体、抗インテグリンβ１抗体からなる群から選択される請求項１７に記載のインプラント。
【請求項２３】
軟骨始原細胞結合材がフィブロネクチンであり、フィブロネクチンが細胞性フィブロネクチン、血漿フィブロネクチン、細胞性フィブロネクチン、フィブロネクチンエキストラドメインＡ（ＥＤＡ）からなる群から選択される請求項２２に記載のインプラント。
【請求項２４】
表層軟骨始原細胞が、ｄ２の深部に表層軟骨始原細胞が高濃度となるように濃縮される請求項１７に記載のインプラント。
【請求項２５】
表層軟骨始原細胞の濃縮が、
（ｉ）　細胞の浮遊密度又は沈降速度（フィコール勾配又は向流懸濁分離法）；
（ｉｉ）　特定の細胞表面エピトープへの抗体結合（蛍光細胞分類、磁気ビーズへの結合又は補足的な媒介細胞溶解を介する）、
（ｉｉｉ）　特定の基質への識別接着；
（ｉｖ）　それぞれの細胞型の成長に好ましい選択的な培養培地もしくは培養条件、又は
（ｖ）　細胞の他の物理特性、例えば大きさ、粒状度又は電気キャパシタンス
に基づく技術範囲を用いて行われる請求項２５に記載のインプラント。
【請求項２６】
ポリ−アニオン性の特定のゲルからなる請求項１５又は１７に記載のインプラント。
【請求項２７】
ポリ−アニオン性の特定のゲルが、スルフェートイントラサイトＴＭである請求項２６に記載のインプラント。
【請求項２８】
複数の層からなる請求項１５に記載のインプラント。
【請求項２９】
マイクロ担体ビーズ又はビーズからなる請求項１５に記載のインプラント。
【請求項３０】
生体再吸収材からなる請求項１５〜２８のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項３１】
非再吸収材からなる請求項１５〜２８のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項３２】
補強成分からなる請求項１５〜３０のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項３３】
軟骨始原細胞結合材が、インプラントの第二表面又はその近くにある請求項２１又は２２に記載のインプラント。
【請求項３４】
第一表面が骨−軟骨界面又はその近くにあり、第二表面が暴露された関節表面又はその近くにあるのに適したインプラントの第一表面よりもインプラントの第二表面付近で、濃度の高い表層軟骨始原細胞を配置する工程からなる、インプラントの製造方法。
【請求項３５】
第一表面と第二表面との距離がｄ１であり、第二表面からｄ２の深部まで軟骨始原細胞結合材からなり、ｄ２／ｄ１＜１である請求項３３に記載のインプラント。
【請求項３６】
骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と暴露された関節表面に接触するか、又はその近くに位置するのに適した第二表面とからなり、骨−軟骨界面よりも関節表面又はその近くに未成熟な軟骨始原細胞をより高濃度で含む、軟骨欠損修復に適したインプラント。
【請求項３７】
第一表面と第二表面との距離がｄ１であり、第二表面からｄ２の深部まで高濃度の未成熟軟骨始原細胞を含み、ｄ２／ｄ１＜１である請求項３６に記載のインプラント。
【請求項３８】
ｄ２／ｄ１＜０・５である請求項３６に記載のインプラント。
【請求項３９】
ｄ２／ｄ１＜０・３である請求項３６に記載のインプラント。
【請求項４０】
ｄ２／ｄ１＜０・２である請求項３６に記載のインプラント。
【請求項４１】
生体適合性スカホールドからなる請求項３６〜４０のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項４２】
未成熟軟骨始原細胞が、骨髄間質細胞からなる請求項３６〜４０のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項４３】
未成熟軟骨始原細胞が、表層軟骨始原細胞からなる請求項３６〜４０のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項４４】
軟骨始原細胞結合材からなる請求項３６〜４０のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項４５】
軟骨始原細胞結合材が、フィブロネクチン、抗−ノッチ抗体、抗インテグリンβ１抗体からなる群から選択される請求項４４に記載のインプラント。
【請求項４６】
軟骨始原細胞結合材がフィブロネクチンであり、フィブロネクチンが、血漿フィブロネクチン、細胞性フィブロネクチン、フィブロネクチン−ＥＤＡからなる群から選択される請求項４５に記載のインプラント。
【請求項４７】
複数の層である請求項３６に記載のインプラント。
【請求項４８】
生体再吸収材からなる請求項３６に記載のインプラント。
【請求項４９】
非再吸収材からなる請求項３６に記載のインプラント。
【請求項５０】
補強成分からなる請求項３６に記載のインプラント。
【請求項５１】
スカホールドからなる請求項３６に記載のインプラント。
【請求項５２】
スカホールドが、ポリ−アニオン性微粒子である請求項５１に記載のインプラント。
【請求項５３】
ポリ−アニオン微粒子が、スルフェートイントラサイトＴＭである請求項５２に記載のインプラント。
【請求項５４】
装置の近く、又はこれと接触させて、あるいはこれに関連させて軟骨始原細胞を配置することによる軟骨欠損の修復方法であって、装置が互いに対向する第一表面と第二表面とからなり、第二表面又はその近くに未成熟軟骨始原細胞を高濃度に含み、その軟骨始原細胞が欠損を再植するよう増殖し、次いで分化して成熟軟骨形成細胞を形成する、軟骨欠損の修復方法。
【請求項５５】
成熟軟骨形成細胞が、関節軟骨を形成する請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
互いに対向する第一表面と第二表面とからなり、第二表面又はその近くに未成熟軟骨始原細胞を高濃度に含む装置の近く、又はこれと接触させて、あるいはこれに関連させて軟骨始原細胞を配置することによる、軟骨始原細胞の分化促進方法。
【請求項５７】
互いに対向する第一表面と第二表面とからなり、第二表面又はその近くに未成熟軟骨始原細胞を高濃度に含む装置の近く、又はこれと接触させて、あるいはこれに関連させて軟骨始原細胞を配置することによる、軟骨形成の促進方法。
【請求項５８】
未成熟軟骨始原細胞が、表層軟骨始原細胞からなる請求項５４〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５９】
未成熟軟骨始原細胞が、骨髄間質細胞からなる請求項５４、５５、５６又は５７に記載の方法。
【請求項６０】
インビトロである請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項６１】
骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と、暴露された関節表面に接触させて、又はこれの近くに位置するのに適した第二表面を有し、第一表面と第二表面との距離がｄ１であり、インプラントの第二表面からｄ２の深部まで生体適合性スカホールドと軟骨始原細胞結合材を含み、ｄ２／ｄ１＜１である、軟骨欠損修復用インプラント。
【請求項６２】
インプラントの第二表面からｄ２の深部まで生体適合性スカホールドと軟骨始原細胞結合材吸収性物質を含み、ｄ２／ｄ１＜１である請求項６１に記載の軟骨欠損修復用インプラント。
【請求項６３】
軟骨始原細胞結合材が、フィブロネクチン、抗−ノッチ抗体又は抗インテグリンβ１抗体からなる群から選択される材を含む請求項６１又は６２に記載のインプラント。
【請求項６４】
軟骨始原細胞結合材がフィブロネクチンであり、フィブロネクチンが、血漿フィブロネクチン、細胞性フィブロネクチン、フィブロネクチン−ＥＤＡからなる群から選択される請求項６３に記載のインプラント。
【請求項６５】
軟骨始原細胞結合材が間葉前駆体細胞を結合する、請求項６１〜６３のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項６６】
軟骨始原細胞結合材が表層軟骨始原細胞を結合する、請求項６１〜６５のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項６７】
単層からなる請求項６１〜６６のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項６８】
複数の層からなる請求項６１〜６７のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項６９】
マイクロ担体ビーズ又はビーズの形態である請求項６１〜６４のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項７０】
生体再吸収材からなる請求項６１〜６９のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項７１】
非再吸収材からなる請求項６１〜６６のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項７２】
補強成分からなる請求項６１〜７１のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項７３】
軟骨始原細胞結合材が、スカホールド表面で被覆された層に含まれるか、又はスカホールド自体又はその双方の内部に含まれる請求項６１〜７１のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項７４】
ｄ２／ｄ１＜０・５である請求項６１に記載のインプラント。
【請求項７５】
ｄ２／ｄ１＜０・３である請求項６１に記載のインプラント。
【請求項７６】
ｄ２／ｄ１＜０・２である請求項６１に記載のインプラント。
【請求項７７】
軟骨始原細胞結合材からなる軟骨欠損修復用インプラント。
【請求項７８】
軟骨始原細胞結合材が、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、抗−ノッチ抗体又は抗−インテグリンβ１抗体からなる群から選択される材を含む請求項７７に記載のインプラント。
【請求項７９】
軟骨始原細胞結合材がフィブロネクチンからなり、フィブロネクチンが、血漿フィブロネクチン、細胞性フィブロネクチン、フィブロネクチン−ＥＤＡからなる群から選択される、請求項７７に記載のインプラント。
【請求項８０】
軟骨始原細胞が間葉前駆体細胞である、請求項７７又は７８に記載のインプラント。
【請求項８１】
軟骨始原細胞が表層軟骨始原細胞である、請求項７７、７８又は７９に記載のインプラント。
【請求項８２】
生体再吸収材からなる請求項７７〜８１のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項８３】
非−生体再吸収材からなる請求項７７〜８１のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項８４】
さらに、補強化合物からなる請求項７７〜８２のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項８５】
軟骨始原細胞結合材が、スカホールドの被覆層内に含まれるか、又はスカホールド自体又はその双方の内部に含まれる請求項７７〜８４のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項８６】
骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と暴露された関節表面に接触して、又はその近くに位置するのに適した第二表面を有し、
ａ．　生体適合性スカホールド、及び
ｂ．　 それに結合して、又はその中に含まれる、第一表面から第二表面に伸びる適合性領域
からなる、軟骨欠損修復用合成インプラント。
【請求項８７】
移植片に接触して配置することを意図した組織よりも低い圧縮率を有する、請求項８６に記載の合成インプラント。
【請求項８８】
合成インプラントの圧縮率が、第一表面から第二表面に移動する方向で増加する、請求項８６に記載の合成インプラント。
【請求項８９】
適合性領域の圧縮率が１．０ＭＰａ未満である、請求項８６、８７又は８８のいずれか１つに記載の合成インプラント。
【請求項９０】
第二表面から第一表面に伸びる関節領域からなる、請求項８６、８７、８８又は８９のいずれか１つに記載の合成インプラント。
【請求項９１】
関節領域が１．０ＭＰａより大きい弾性率を有する、請求項９０に記載の合成インプラント。
【請求項９２】
三次元の織物、三次元のニット材、フリース、スポンジ、発泡体又は微粒子からなる群から選択される材を含む請求項８６〜９０のいずれか１つに記載の合成インプラント。
【請求項９３】
生体再吸収材からなる請求項８６〜９２のいずれか１つに記載の合成インプラント。
【請求項９４】
ポリ（乳酸）からなる請求項８６に記載の合成インプラント。
【請求項９５】
適合性領域と関節領域が異なる材からなる、請求項９０に記載の合成インプラント。
【請求項９６】
骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と、暴露された関節表面に接触して又はその近くに位置するのに適した第二表面を有し、適合性領域と関節領域からなるスカホールドを含み、関節領域が第二表面から第一表面に向かって伸び、第一表面から第二表面に向かって伸びる適合性領域に合う、軟骨欠損修復用合成インプラント。
【請求項９７】
さらに生物活性物を含む、請求項８６〜９５に記載の合成インプラント。
【請求項９８】
細胞を接種した、請求項８６〜９５に記載の合成インプラント。
【請求項９９】
スカホールドを含む請求項８６に記載の合成インプラント。
【請求項１００】
スカホールドが、ポリアニオン性微粒子ゲルである請求項９９に記載の合成インプラント。
【請求項１０１】
ポリアニオン性微粒子ゲルが、スルフェートイントラサイトＴＭである請求項１００に記載の合成インプラント。
【請求項１０２】
骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と、暴露された関節表面に接触して、又はその近くに位置するのに適した第二表面とを有し、生体適合性スカホールドと、それに結合するか、又はその中に含まれる、第一表面から第二表面に向かって伸びる適合性領域からなる細胞接種合成インプラントの製造法であって、
ａ．　細胞が微粒子表面に接着するよう、細胞を微粒子と接触させ、
ｂ．　次いで、スカホールド内に細胞被覆微粒子を導入する
工程からなる方法。
【請求項１０３】
骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と、暴露された関節表面に接触して、又はその近くに位置するのに適した第二表面とを有し、適合性領域と関節領域からなるスカホールドを含み、関節領域が第二表面から第一表面に向かって伸びて、第一表面から第二表面に向かって伸びる適合性領域に合う、細胞−接種合成インプラントの製造法であって、
ａ．　細胞が微粒子表面に接着するよう、細胞を微粒子と接触させ、
ｂ．　次いで、スカホールド内に細胞被覆微粒子を導入する
工程からなる方法。
【請求項１０４】
細胞接種微粒子のインキュベートに適したインキュベーションチャンバーとスカホールド手段の支持に適した直径ｄ１のスカホールド支持チャンバーからなり、
ａ．　ｄ２＝ｄ１の時点でスカホールド支持チャンバーに合うよう、インキュベーションチャンバーの直径ｄ２がスカホールド支持チャンバーに接近するにつれて減じるか、又は
ｂ．　インキュベーションチャンバーとスカホールド支持チャンバーが、インキュベーションチャンバーと接触する端部で直径ｄ２を有し、スカホールド支持チャンバーと接触する端部における直径ｄ１に細くなる、ろうと手段で接続される、
バイオリアクター。
【請求項１０５】
インキュベーションチャンバーが管形状である請求項１０４に記載のバイオリアクター。
【請求項１０６】
ろうと手段とスカホールド支持チャンバーが、バイオリアクターへの挿入に適した担体内に必須として含まれる請求項１０４及び１０５に記載のバイオリアクター。
【請求項１０７】
ａ．　バイオリアクターのスカホールド支持チャンバー内にスカホールドを配置し、
ｂ．　バイオリアクターのインキュベーションチャンバーに細胞接種微粒子を導入し、
ｃ．　十分なインキュベーション作用を行うのに適当な期間のあいだ、温度、湿度、ｐＨ及び栄養素などの適当な条件下でバイオリアクターを攪拌し、
ｄ．　バイオリアクターを遠心分離して、スカホールドを有する細胞接種微粒子を集め、かつ
ｅ．　バイオリアクターのスカホールド支持チャンバーから細胞接種微粒子からなるスカホールドを除くこと
からなる、細胞接種微粒子を有するスカホールドを有するバイオリアクターの製造方法。
【請求項１０８】
成熟軟骨始原細胞結合材からなる軟骨欠損修復用インプラント。
【請求項１０９】
成熟軟骨始原細胞結合材が、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ビトロネクチンからなる群から選択される材を含む請求項１０８に記載のインプラント。
【請求項１１０】
生体再吸収材からなる請求項１０８又は１０９に記載のインプラント。
【請求項１１１】
非生体再吸収材からなる請求項１０８又は１０９に記載のインプラント。
【請求項１１２】
補強化合物からなる請求項１０８又は１１１のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項１１３】
スカホールドからなる請求項１０８又は１１１のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項１１４】
スカホールドが、ポリ−アニオン性微粒子ゲルからなる請求項１１３に記載のインプラント。
【請求項１１５】
ポリ−アニオン性微粒子ゲルが、スルフェートイントラサイトゲルである請求項１１４に記載のインプラント。
【請求項１１６】
スカホールドからなる請求項７７〜８２のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項１１７】
スカホールドが、ポリ−アニオン性微粒子ゲルからなる請求項１１６に記載のインプラント。
【請求項１１８】
ポリ−アニオン性微粒子ゲルが、スルフェートイントラサイトＴＭである請求項１１７に記載のインプラント。
【請求項１１９】
スカホールドが、軟骨始原細胞結合材からなる請求項１１６〜１１８のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項１２０】
機械的に強力なスカホールド内に収容される請求項１５〜３３及び３５〜５３のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項１２１】
機械的に強力なスカホールドが、１．０ＭＰａより高い圧縮率を有する請求項１２０に記載のインプラント。
【請求項１２２】
スカホールドが、中に含まれているか、中にあるか、又はその近くにある周囲組織より脆弱な材である請求項１２０又は１２１に記載のインプラント。
【請求項１２３】
適合性領域を有する請求項１５〜３５、３６〜５３又は１２０〜１２２のいずれか１つに記載のインプラント。
【請求項１２４】
第三及び第四表面間の距離がｄ３である第三表面と第四表面からなり、第三表面の少なくとも部分的な長さについて第三表面からｄ４の深部まで高濃度の未成熟軟骨始原細胞を有し、ｄ４／ｄ３＜１である請求項３７に記載のインプラント。
【請求項１２５】
第三及び第四表面間の距離がｄ３である第三表面と第四表面からなり、第四表面の少なくとも部分的な長さについて第四表面からｄ５の深部まで高濃度の未成熟軟骨始原細胞を有し、ｄ５／ｄ３＜１である請求項３７に記載のインプラント。
【請求項１２６】
未成熟軟骨始原細胞が、表層軟骨始原細胞又は骨髄間質細胞又はその双方からなる請求項１２４又は１２５に記載のインプラント。
【請求項１２７】
ｄ４／ｄ３＜０．３である請求項１２４に記載のインプラント。
【請求項１２８】
ｄ５／ｄ３＜０．３である請求項１２４に記載のインプラント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、損傷を受けた軟骨の置換、より詳しくは、負荷のかかった軟骨組織、例えば関節間軟骨及び関節軟骨の置換用インプラントに関する。また、この発明は、本発明によるインプラントを外科的に移植する工程からなる治療方法及びスカホールドの選択領域で低割合の細胞混合物として存在する軟骨始原細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を選択的に濃縮する方法に関する。
【０００２】
関節軟骨欠損の治療に一般的な現在の手法には、（主として欧州で行われる）高度な脛骨切骨及び関節の生体力学と負荷を変える筋肉弛緩；胃洗浄及び骨増殖体や軟骨の原繊維からなる領域を除く創面切除ならびに出血や血塊の形成を誘発する肋軟骨下骨の穿孔と透過が含まれる。しかし、これらの技術は、いずれも関節軟骨の構造、組成、機械的特性又は耐久性を二倍にする組織の再生には至っていない。
最も一般的な技術は、フィブリン血塊及び繊維組織を形成する肋軟骨下ドリル（ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ ｄｒｉｌｌｉｎｇ）の技術である。約７５％の患者では結果は十分なものであるが、手術から２年後には、依然として無症状の患者はわずか１２％である。この手法の限界は、臨床結果の質と持続を予測し難く、長期的にみて、この手法がしばしば患者を悪化状態にすることである。他方、肋軟骨下ドリルと創面切除は、症状の緩和と１〜３年ごとの膝関節全体を置換する必要性を延期する点で一般的に成功している。
【０００３】
この技術に対する代替的な同種異型組織−工学的解決策は、外科的手法を１回のみ伴うが、長期にわたる複雑な製造過程を介した移植可能な組織工学的移植片の生産を要し、実際的かつ規則的な困難性を伴う。
予測どおりに痛みを和らげ、機能を回復し、良好な固定を達することができ、少なくとも１０〜１５年以上持続可能な耐久性を有する軟骨修復製品は、多くの外科医によって重要な目標とみなされている。
【０００４】
上記の目的に合致するよう試みられている現在利用可能な製品は、炭素繊維のロッドからなる：軟骨損傷は清浄にされて、肋軟骨下骨に摘出され、そこにつくられた穴に炭素繊維ロッドが挿入される。修復は、ロッドの上部周囲でのコラーゲンの沈着で開始する。これらの島細胞群の成長はすぐに大きくなって完全に欠損を充たし、ロッドが欠損での修復組織用の固定源となる。この製品に伴う顕著な問題は、滑液腔でみられる炭素繊維磨耗残がいの生成であり、これは剥離の問題を生ずる可能性がある。
【０００５】
検討されている別の手法は、ニット織物からなる、ある面積のインプラントの使用である。これは、構造上の安定性を生じ、中に接種された細胞を含み、支持する膨張性ハイドロゲルを生じる。このインプラントは軟骨の損傷に配置され、ハイドロゲルの膨張から生じる圧力の増加によって軟骨の成長を促進することを目的とする。
上記の進歩にもかかわらず、十分な厚みがある関節軟骨の病巣の障害に十分な治療は、現在のところない：利用可能な方法は、作用が不十分であるか、かなり高価であるか、又はそれらに付随する他の問題があるものと一般的にはみなされている。
【０００６】
本発明者らの手法もまた、軟骨、特に関節軟骨の構造を詳細に検討した。関節軟骨は、関節表面で層を形成している。この組織は、当初は構造及び組成において均一であると思われるが、実際には、幾つかの層からなっている。組織について表面、中央（又は中間）及び深部の層があるので、３層が同定されている。表層は、軟骨表面と平行した方向の平坦な細胞からなる。比較すると、中間層と深層の細胞は、球形で、ランダムに、又は関節表面に垂直な方向の列で配置される傾向にある。これらの特徴的な層特異的な細胞と構造の特性は、現在の技術を用いて生産される修復組織、組織工学的構築物及び製品にはない。
【０００７】
いずれの理論にも拘束されず、表層の細胞で軟骨−形成性軟骨始原細胞が多いことが初めて今回考慮されている。これは、（ｉ） この層の細胞が、深層の細胞より代謝上かつ合成上活性であり； （ｉｉ）それらがインビトロでコロニーを形成し（高度に増殖性の前駆体細胞について広く認識される特徴）； （ｉｉｉ） 前駆体細胞に特徴的なシグナル系を有し、かつ（ｉｖ） 代謝ラベルの取り込みの動力学が初期の軟骨始原細胞のプールの存在と一致しているためである。表層は、組織の深部領域にはない幾つかの細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分を含む。これらの成分の幾つかは組織内で純粋な構造上又は機械的な役割を有している可能性があるが、他の表層のＥＣＭ成分は、軟骨始原細胞に適切な生化学的環境（いわゆる「幹細胞ニッチ」）を生ずるのにさらに役立っている可能性がある。さらに、中間層と深層で見られるあるＥＣＭ成分は、それらの層の構造及び組成の形成と維持に寄与している可能性のあることが考慮される。いずれの理論にも拘束されず、表層の細胞は軟骨の形成と修復に重要な役割を果たしていることが、初めて考えられている。
【０００８】
軟骨の修復に対する改良法は、層状化された組織構造と同定された組成を少なくとも幾つか回復することを目的としている。特に、軟骨修復の改良法は、健康な関節軟骨の表層に存在するものに似た軟骨始原細胞の層を回復することがここで同定された。
さらに、病巣の関節軟骨欠損の修復に対する現在の組織工学的手法は、機械的弾性及び側方結合の矛盾する要求に合致できない。細胞接種されたインプラントが機械的負荷に耐えるように十分に強固な細胞外マトリクスを有する場合、その細胞はマトリクス内に捕捉されて、周囲の組織に移動できず、その結果、側方結合に寄与できない。逆に、組織工学的な関節軟骨移植片の細胞外マトリクスが十分に透過性で細胞の移動と側方結合を許容できれば、あまりにも弱くて、機械的負荷に耐えることができない。
【０００９】
堅い基質上で平坦な細胞の単層として成長すると、軟骨細胞は増殖するが脱分化する一方、丸い形態を採用できる条件（例えばアルギナートゲル内）、特に高細胞密度の条件で維持されれば、機能上の表現型を維持するが、分裂しないことが文献で認識されている。既存のスカホールドは、限られた数の初期の細胞から多数の機能的な軟骨細胞を生ずるための環境刺激について必要な組み合わせを提供しない。
本発明の第一の目的は、軟骨欠損によって特徴づけられる疾患又は症状の治療用薬剤を提供することである。
本発明の第二の目的は、軟骨欠損、特に関節軟骨の欠損に流し込む（ｆｌｕｓｈ−ｆｉｔ）ことができ、迅速な治癒及び組織再生を促進する組織インプラントを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、軟骨、特に関節軟骨の表層の細胞及び構造の特性を回復できる組織インプラントを提供することである。
本発明のさらなる目的は、表層下に位置する軟骨、特に関節軟骨の細胞及び構造の特性を回復できる組織インプラントを提供することである。
本発明のさらなる目的は、機械的負荷に耐えることができるが、十分に透過性で、細胞の移動と側方結合を可能にする組織インプラントを提供することである。
また、本発明の目的は、軟骨始原細胞結合材を提供することである。
さらに、この発明の別の目的は、細胞、例えば軟骨始原細胞を保持するのに適した代替的なスカホールドを提供することである。
【００１１】
細　胞
この発明の第一の観点によれば、単離された表層軟骨始原細胞群が提供される。
用語「表層軟骨始原細胞」は、健康な関節軟骨の表層内にみられる軟骨始原細胞を意味する。これらの軟骨始原細胞は、特異的な組織配置を有し（つまり、表層内）、隣接する軟骨細胞に異なるコントロール系を有し（例えばシグナルレセプターノッチ（ノッチ）が存在する）、かつフィブロネクチンのスプライス−変異体Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡを含む特徴的な細胞外マトリクスを有する。
好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞、適切にはヒトである。
【００１２】
表層軟骨始原細胞群の単離は、哺乳動物、例えばヒトの関節の軟骨の表層由来の表層軟骨始原細胞が多いいずれかの群を得ることによる単離であってもよい。　これらの細胞は、患者への投与前にインビトロで成長させることができる。生細胞の投与は、適当な担体、例えばインプラント上のスカホールドを用いても、又は用いなくともよい。
意外なことに、表層軟骨始原細胞は、身体に単に投与することによって身体の軟骨欠損を修正することができる。
【００１３】
これらの表層軟骨始原細胞は軟骨の修復で役割を果たしていないというのが、技術分野での以前の見解であった。
外観が平坦な表層軟骨始原細胞は、マトリクス機能に関わる機械的機能のみを有すると以前は考えられていた。
一般に、関節軟骨組織は、関節軟骨損傷の治癒の細胞源に寄与しないと認められている（Ｍａｎｋｉｎ ＨＪ　Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｏ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｐａｒｔ Ｉ Ｎ Ｅｎｇｌ． Ｊ Ｍｅｄ． １９７４； ２９１： １２８６， Ｍａｎｋｉｎ ＨＪ Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｏ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｐａｒｔ ＩＩ Ｎ Ｅｎｇｌ． Ｊ Ｍｅｄ． １９７４； ２４１： １３３５， Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ Ｊｏｈｎ Ｂ ＭｃＧｉｎｔｙ）。
【００１４】
通常の環境下、成熟関節軟骨の軟骨細胞は、あったとしても分裂することがほとんどなく、軟骨、特に表層の細胞数密度は加齢に伴って低下すると当該分野では一般的に考えられている（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ Ｒ Ａ： Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｏｓｔａｌ ｃａｒｔｉｌａｇｅ． Ｊ Ａｎａｔ １９６７； １０１： ７５３−７６３， Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ Ｒ Ａ， Ｍｅａｃｈｉｏｎ Ｇ： Ｔｈｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ， ｉｎ Ｆｒｅｅｍａｎ ＭＡＲ （編集）： Ａｄｕｌｔ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ， ｅｄ ２， Ｔｕｎｂｒｉｄｇｅ Ｗｅｌｌｓ， Ｐｉｔｍａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ， １９７９， ｐｐ６９−１４４参照）。
これらの年齢に関連する細胞密度と細胞の合成機能の低下は、損傷を受けたマトリクスを回復する細胞の能力を制限する可能性がある（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ− Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅｓ； 第９章、段落Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ； ｐｐ ４１４〜４１６）。
【００１５】
実際、当該分野では、軟骨の修復手法は、肋軟骨下骨に多数の小さなドリル穴をつくる技術によるものであると考えられていた。修復組織は、ドリル穴から成長し、暴露された骨中に広がる（Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｎｄ Ｋｎｅｅ Ｊｏｉｎｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ， Ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ ｏｒ Ａｂｒａｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ Ｂｏｎｅ ｐａｒａｇｒａｐｈ； ｐｐ４４， Ａ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ａｎｄ ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ ｂｙ Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ／Ｚｉｍｍｅｒ， Ｊ Ｗｈｉｔ Ｅｗｉｎｇ編集）。
意外なことに、軟骨始原細胞、特に表層軟骨始原細胞は、他の軟骨始原細胞の分化を促進し、また軟骨形成を促進することができる。
意外なことに、軟骨始原細胞、特に表層軟骨始原細胞は、軟骨の修復を促進し、特に関節軟骨の修復を促進することができる。
【００１６】
したがって、表層軟骨始原生細胞は、軟骨の欠損によって特徴づけられる疾患又は症状を治療する薬剤又は組成物又はインプラントで用いることができる。
この発明のひとつの観点によれば、表層軟骨始原生細胞を投与することからなる、軟骨欠損によって特徴付けられる疾患又は臨床上の症状の治療方法が提供される。
この発明の別の観点によれば、骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と、暴露された関節表面と接触するか、又はその近くに位置するのに適した第二表面からなり、さらに表層軟骨始原細胞を含む、軟骨欠損修復に適したインプラントが提供される。
【００１７】
層状化構造物
この発明の別の観点によれば、骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と、暴露された関節表面に接触して、又はその近くに位置するのに適した第二表面とからなり、骨−軟骨界面よりも関節表面又はその近くに高濃度の未成熟軟骨始原細胞を含む、軟骨欠損修復に適したインプラントが提供される。　骨−軟骨の界面近くか、あるいはそこでの軟骨始原細胞は、軟骨の関節表面近く又はそこでの細胞よりも成熟した軟骨始原細胞である傾向にある。この発明は、ある具体例において、この取り合わせを反映している。
【００１８】
適切には、未成熟細胞は、表層軟骨始原細胞である。
未成熟な軟骨始原細胞、例えば表層軟骨始原細胞と成熟な軟骨始原細胞を軟骨でみられるのと同一又は類似の構造で配置すると、軟骨の成長及び修復に有用である。未成熟な軟骨細胞、例えば表層軟骨始原細胞と、成熟な軟骨始原細胞を軟骨で見られるのと同一又は類似の構造で配置することの重要性は、これまでに知られていなかった。
【００１９】
前記のとおり、これらの細胞は分化せず（又は分化能力が限られ）、軟骨の成長又は修復と関係しないということが、広く考えられていた。これは、細胞の平坦な外観と軟骨−骨の界面からのその距離に起因する事実であると考えられた。
適切には、第一及び第二表面間の距離がｄ１であるこの発明のインプラントは、第二表面からｄ２の深部までに、インプラントの残りの深部よりも高濃度の未成熟な軟骨始原細胞、例えば表層軟骨始原細胞を含む。ここで、ｄ２／ｄ１＜１であるが、ｄ２／ｄ１＜０・５、＜０・３又は＜０・２でもある。
【００２０】
適切な生体適合性スカホールドは、軟骨始原細胞、例えば表層軟骨始原細胞を保持するようインプラント内で用いてもよい。スカホールド又は担体として作用するいずれかの適当な物質、例えばスルフェートイントラサイト（Ｉｎｔｒａｓｉｔｅ）ゲルを用いてもよい。
インプラントは、単層、複層、マイクロビーズの形態又は本発明を実施し得る何れかの他の適当な形状であってもよい。
インプラントは、インプラントの強度を補助する補強成分を有していてもよい。好ましくは、インプラントは生体再吸収材からなる。
【００２１】
また、この発明によれば、第一表面が骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適しており、第二表面が暴露された関節表面に接触して、又はその近くに位置するのに適した、インプラントの第一表面よりもインプラントの第二表面付近で、濃度の高い未成熟軟骨始原細胞、例えば表層軟骨始原細胞を局在又は配置する工程からなる、インプラントの製造方法が提供される。
また、この発明によれば、この発明のインプラントの近く、又はこれと接触させて、又はこれと関連させて細胞を配置することによる、軟骨形成の促進方法が提供される。適切には、軟骨形成が促進される細胞は、軟骨始原細胞又は軟骨細胞であろう。
【００２２】
同様に、この発明によれば、この発明のインプラント近く、又はこれと接触させて、あるいはこれと関連させて軟骨始原細胞を配置することによる、軟骨始原細胞の分化の促進方法が提供される。
関連手段は、表層軟骨始原細胞が分化又は軟骨形成を生じることのできるいずれの手段であってもよい。
【００２３】
結合材
この発明の別の観点によれば、骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と、暴露された関節表面に接触させて、又はこれの近くに位置するのに適した第二表面を有し、第一表面と第二表面との距離がｄ１であり、インプラントの第二表面からｄ２の深部まで生体適合性スカホールドと軟骨始原細胞結合材を含み、ｄ２／ｄ１＜１である、軟骨欠損修復用インプラントが示される。
【００２４】
この発明の別の観点によれば、骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と、暴露された関節表面に接触させて、又はこれの近くに位置するのに適した第二表面を有し、第一表面と第二表面との距離がｄ１であり、インプラントの第二表面からｄ２の深部まで生体適合性スカホールドと軟骨始原細胞結合材吸収性物質を含み、ｄ２／ｄ１＜１である、軟骨欠損修復用インプラントが示される。
【００２５】
序文に述べたように、この発明の目的は、ひとつの具体例において、天然の軟骨、特に関節軟骨で同定される層状化組織構造及び組成を少なくとも幾つか回復することである。重要なことに、この発明の幾つかの具体例では、表層の構造と組成を回復することが望ましい。軟骨始原細胞結合材又は軟骨始原細胞結合材吸収性物質を第二表面（暴露面に接触するか、又はその近くに位置するのに適当な表面、つまり表層が従属している表面）からの従属領域に導入することによって、軟骨始原細胞は、インプラントのこの領域に引き寄せられて結合し、その結果、前述の目的に達するのに役立ち得る。
【００２６】
ここで、物質が「生体適合性」であるというとき、それは、物質が哺乳動物の生体に外科的に導入される際、擬似外科手術のみの結果として生じることに加えて、臨床上著しい急性又は慢性的な副作用反応が本質的にないことを意味する。
「スカホールド」というとき、それは、三次元の少なくとも部分的に多孔性の構造物であり、その孔度は細胞が浸透できる程度で、スカホールドの暴露部分（内外双方）は、細胞の増殖と細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の生成が生じ、組織がつくられるように、細胞を接着させ、成長させることができる。
「軟骨始原細胞」というとき、それは、間葉幹細胞のような、軟骨細胞系の最初又はその付近にあり、一般に増殖能が高い細胞を意味する。
【００２７】
「軟骨細胞系」というとき、それは、間葉幹細胞が、分化した有糸分裂後の軟骨細胞を最終的に生じるように成熟する経路を意味する。
「軟骨始原細胞結合材」というとき、それは、軟骨細胞系の最後にある細胞よりも、間葉幹細胞のような系の最初又はその付近の細胞に選択的に結合する物質である。
「軟骨始原細胞結合材吸収性物質」というとき、それは、上記のように軟骨始原細胞結合材を物理的に吸収する（つまり、非共有結合できる）か、又は化学的（つまり、共有架橋の作用を介して）に結合でき、それにより、軟骨始原細胞への結合親和性を増した複合体を形成できる物質を意味する。
【００２８】
本発明によるスカホールドは、１つの層からなってもよく、又は複数の層からなってもよい。層又は各層は、上記のとおり三次元の少なくとも部分的に多孔性の構造からなる。層又は各層は、例えば三次元の織物又はニット織物（つまり、スペーサー織物）、フリース（つまり不織）材、スポンジ、発泡体、マイクロ担体ビーズ又はこれらの材の組み合わせからなってもよい。スカホールドが複数の層からなる場合、これらの層は全て同一の材からなってもよい。あるいは、各層は、幾つかの又は全ての他の層とは異なる材からなってもよい。
【００２９】
この発明によるスカホールドが少なくとも１層の三次元の織物又はニット織物からなる場合には、層を熱硬化（ｈｅａｔ ｓｅｔ）することが好ましい。この工程は、織物に賦課した方向に再配置するよう分子を織物に生じ、織物をやや縮める。いずれの作用によっても、織物をより安定にすることができる。熱硬化は、この分野の当業者に公知であり、当該物質に依存した温度及び時間で行われる。
好ましい形態では、この発明によるスカホールドは２層からなる。有利には、１層は三次元のニット構造からなり、他方の層はそれに貼り合わされる不織（フェルト）材からなる。これらの２層は、ステッチ、縫製、（ニット層とフェルト層の１方又は双方に熱硬化繊維を導入することによる）熱結合などの種々の方法により、又は接着剤もしくはポリマー溶液によって互いに固定させてもよい。
【００３０】
ここで用いられるように、用語「マイクロ担体ビーズ」は、細胞の接着を支持するか、又は細胞結合表層を有することのできる何らかの微粒子材を意味する。そのような微粒子は、２５〜２０００μｍの大きさであってもよく、好ましくは１００〜２５０μｍの範囲である。そのようなビーズが構築される材の例は、架橋性タンパク質、多糖類、誘導性多糖類及び合成生体適合性ポリマー、例えばスカホールドの製造について後述されるポリマーである。市場で入手可能なマイクロ担体ビーズは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ とＳｉｇｍａによって提供されている。
スカホールドの層又は層類は、生体再吸収材又は非生体再吸収材からなってもよい。
【００３１】
材が生体再吸収性であるというとき、それは、材が化学／生物学的作用によって時間をかけて崩壊することを意味し、用語「再吸収」ならびに「再吸収する」は、それに応じて解釈される。好ましくは、完全な再吸収は約５年以内に、より好ましくは約３年以内に生じる。生体再吸収材を用いる利点は、後に材を除く外科手術が不要であるように、それらが崩壊して、完全に組織を修復し、欠損部位を充填できることである。
【００３２】
ある生体再吸収材を用いる場合、好ましい選択基準は、組織が材の内部でつくられるあいだは、材が有意に再吸収しないという条件である。この条件を満たすことにより、その形状と機械的完全性をも本質的に保持する、生細胞からなるインプラントが確実に生成される。数字の観点では、生体再吸収材を１２週間インビボで移植する際、重量損失が５％未満であることが好ましい。より好ましくは、同一時間中、重量損失は２％未満である。他方、生体再吸収材が２以上あれば、インプラントを構造上完全にするため、生体再吸収材の少なくとも１つがこの基準を満たすことが好ましい。
【００３３】
インビボでの再吸収時間が異なる、広範囲な生体再吸収材が知られている。材によって再吸収時間が変化するのみならず、１つの材自体の再吸収時間は分子量及び構造の配置で著しく変化することができる。最後に、異なる生体再吸収材をブレンド及び／又は共重合して、及び／又は成分の分子量もしくは結晶度を変えることによって、要求に対する生体再吸収材の再吸収時間を、近い将来、正確に調整できるものと思われる。
上記の点に留意すれば、本発明による生体再吸収材は、以下のモノマー又はポリマー混合物及び／又はそれによって形成されるコポリマーからなる生体再吸収ポリマー又はコポリマーからなってもよい：ヒドロキシ酸、特に乳酸、グリコール酸；カプロラクトン；ヒドロキシブチレート；ジオキサノン；オルトエステル；オルトカーボネート；アミノカーボネート。
【００３４】
この発明による生体再吸収材は、コラーゲン、セルロース、フィブリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、キトサン又はこれらの２以上の材の混合物のような天然の材からなってもよい。生体再吸収材は、誘導化された異種移植片及び／又は誘導化された同種移植片からなってもよい。
生体再吸収性セラミックが、スカホールド内に含まれてもよい。この発明により使用されうる生体再吸収性セラミックは、モノ−、ジ−、オクタ−、α−トリ−、β−トリ−及びテトラ−カルシウムリン酸、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム又はこれらの２以上の材の混合物である。
【００３５】
この発明による好ましい生体再吸収材は、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート及びポリ（トリメチレンカーボネート）又はその混合物からなる。
特に、ポリ（乳酸）を用いることが好ましい。この材は、良好な機械的強度を有し、あまり迅速に再吸収せず、その結果、修復された組織が荷重のかかった機能を引き継ぐ時点で組織修復に十分な時間のあいだ、その機械的特性を保持できる利点を有する： Ａ．Ｇ．Ａ． Ｃｏｏｍｂｅｓ 及びＭ．Ｃ． Ｍｅｉｋｌｅ， ’Ｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ’， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １７， （１９９４）， ｐｐ ３５−６７ を参照すると、ポリ（乳酸）の試料は、１２週間の試験に対しわずか１〜２％の重量を損失しているにすぎないことが示されている。
【００３６】
この発明による適当な非−生体再吸収材には、ポリエステル、特に芳香族ポリエステル、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ） 及びポリブチレンテレフタレートのようなポリアルキレンテレフタレート；ポリアミド；ポリエチレン及びポリプロピレンのようなポリアルケン；ポリ（フッ化ビニル）ポリテトラフルオロエチレン炭素繊維、シルク（天然又は合成）、炭素繊維、ガラス及びこれらの材の混合物が含まれる。さらに、非再吸収セラミックを用いてもよい。そのような材の例は、純粋なヒドロキシアパタイト、ジルコニア及びアルミナである。非生体再吸収材の利点は、それらが本質的にその当初の機械特性−つまり、強度が時間中に低減しないような特性を保持していることである。したがって、それらは、長期にわたって修復組織に機械的な支持を提供し得る。
【００３７】
この発明によるスカホールドが２層−上記のようなフェルト層に貼り付けたニット層からなる有利な場合には、ポリ（乳酸）又はＰＥＴからなるようにニット層を製造し、かつポリ（グリコール酸）からなるようにフェルト層を製造することが特に好ましい。
この発明の第一の観点の好ましい形態によれば、スカホールドは、抵抗性の機械的な荷重を補助するための構造内に補強成分を含むことにより補強されてもよい。スカホールドが複数の層からなる場合、ひとつの層から全ての層が補強されてもよい。補強成分は、スカホールドの製造について上記した生体再吸収性又は非生体再吸収性のポリマー型からなってもよい。好ましくは、補強成分は、スカホールド内の隣接する鎖に連結し、それによりその圧縮率を改善するようにスカホールドに添加される熱硬化溶融ポリマー又は熱硬化ポリマー溶液からなる。より好ましくは、補強成分はポリカプロラクトンからなる。
【００３８】
上記補強材を提供するひとつの方法は、２つの「ニップ」ローラー間で織物を圧縮し、その上に溶融又は溶解した補強ポリマーのプールを供給することである。ローラー間で織物が圧縮され、引き出されるにつれて、少量の補強ポリマーがそれとともに運ばれ、これが、片側のローラーで織物が再度拡張した際に織物に取り込まれ、それにより織物をコーティングする。
本発明によるインプラントは、１ ＭＰａ以上の圧縮率を有する少なくとも１つの層からなることが有利である。好ましくは、層又は層類の圧縮率は１〜３ＭＰａの範囲であり、より好ましくは、１〜２ ＭＰａの範囲である。層又は層類の圧縮率は、固有の特性であるか、あるいは上記のような補強工程から生じてもよい。
【００３９】
本発明により用いられ得る軟骨始原細胞結合材には、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、抗−ノッチ抗体、抗−インテグリンβ１抗体及びこれらの材の組み合わせが含まれる。
フィブロネクチンは、ひとつの遺伝子によってエンコードされる細胞外−マトリクス糖タンパク質で、代替的なＲＮＡスプライシング及び翻訳後修飾によって導入されるタンパク質不均一性が著しい。「フィブロネクチン」というときには、フィブロネクチン；フィブロネクチンの結合スプライス変異体、例えばＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡ、又はフィブロネクチンエキストラ−ドメインＡ（ＥＩＩＩＡ 又は ＥＤＩとも称される）、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＢ （ＥＤＩＩＩＢ 又はＥＤＩＩとも称される）及び Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＩＩＩＣＳ （Ｖ等とも称される）； ドメイン自体、例えばＥＤＡ、ＥＤＢ；フィブロネクチンの同族体又はその成分ドメイン（配列等価性７５％以上）又はフィブロネクチンの修飾変異体又はそのドメイン、例えばリンカー配列及び／又はポリＨＩＳのような生体適合物質結合配列に結合したＥＤＡ配列が含まれる。
【００４０】
この発明の第一の観点の好ましい形態では、軟骨始原細胞結合材は、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡ（ＥＤＡドメイン自体及び／又はリンカーに結合したＥＤＡドメインは生体適合物質表面に結合できる）からなる。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ −ＥＤＡのようなフィブロネクチンのスプライス変異体は、天然の関節軟骨の表層に濃縮していることが知られている。インプラントの表層に上記の材が結合することにより、機器表面への軟骨始原細胞の付着の選択性が増し得る。
この発明による軟骨始原細胞結合材吸収性物質は、ヘパリン、スルフェートイントラサイトＴＭ及びテトラヒドロフルフリルを含むポリアニオンである。これらの材はこの発明によるインプラント内に含まれると、移植後に周囲の組織から天然に存在する上記のような軟骨始原細胞結合材を吸収することができる。あるいは、軟骨始原細胞結合材は、移植の前後にインプラントに添加されてもよい。
【００４１】
上記のように、この発明によるインプラントは、軟骨始原細胞結合材又は軟骨始原細胞結合材吸収性物質からなる。これらの物質はスカホールドの第二表面に被覆された層内に含まれてもよく、又はスカホールド自体又はその双方の内部に含まれてもよい。
また、上記のように、インプラントの第一表面と第二表面との距離がｄ１であれば、インプラントは、ｄ２／ｄ１＜１であるように、インプラントの第二表面から深部ｄ２まで軟骨始原細胞結合材又は軟骨始原細胞結合材吸収性物質を含む。好ましくは、ｄ２／ｄ１＜０．５、より好ましくはｄ２／ｄ１＜０．３、もっとも好ましくはｄ２／ｄ１＜０．２である。
【００４２】
インプラント内に配置される軟骨始原細胞結合材又は軟骨始原細胞結合材吸収性物質は、連続的な濃度勾配又は一連の不連続段階からなる濃度勾配として一定濃度で存在してもよい。いずれかのタイプの濃度勾配として存在する場合には、濃度は、第一表面から第二表面への直接移動又は第二表面から第一表面への移動で増加する可能性があるが、濃度は、第一表面から第二表面への直接移動で増加することが好ましい。というのは、最高濃度、つまり最大の結合度は、スカホールドの第二表面に向かって有利に生じるからである。
一般的に、軟骨始原細胞結合材又は軟骨始原細胞結合材吸収性物質からなる領域の厚み、つまり第二表面からの深部ｄ２は、０．０５ｍｍ〜８ｍｍ、より好ましくは０．２ｍｍ〜８ｍｍである。
【００４３】
序文に述べたように、表層以外の層にみられるあるＥＣＭ成分は、構造の形成と維持ならびにそれらの層の組成に寄与しているものと考えられる。この発明の第一の観点の好ましい形態では、インプラントは、軟骨、特に関節軟骨、例えばＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン又はビトロネクチンの表層以外の層に見られる細胞を結合し得る別の細胞結合材をさらに含む。これらの材は、ｄ３／ｄ１＜０．８であるようにインプラントの第一表面から深部ｄ３までインプラント内に含まれる。好ましくは、ｄ３／ｄ１＜０．７、より好ましくはｄ３／ｄ１＜０．５である。
【００４４】
前記の記載から明らかなように、この発明によるインプラントは細胞を有することを意図する。これは、滅菌インプラントが周囲の宿主組織からインプラントに移動する細胞を有することによって達成され得る。このような移動過程は、例えばマトリクス分解酵素又は走化性因子をインプラント内とその周囲に導入して補助され得る。
あるいは、自己又は同種異系の軟骨始原細胞を、インプラントに添加してもよい。適当な軟骨始原細胞源には、未分化間葉細胞の何らかの源（例えば骨髄、精製されるか、又は増加した骨髄間質細胞群、血管周囲細胞、骨膜、軟骨膜、脂肪又は骨膜もしくは軟骨膜のカンブリア層由来細胞）が含まれる。これらの細胞は、移植前後に加えてもよい。
【００４５】
この発明の別の観点によれば、上記のインプラントを外科的に移植する工程からなる、哺乳動物生体の軟骨欠損の治療方法が提示される。
この発明の別の観点によれば、方法は、支持体マトリクスに軟骨始原細胞結合材を結合させ、それを介して又はその間、細胞混合物をとおすか、又はそれによって静置させ、その結果、軟骨始原細胞を軟骨始原細胞結合材に接着させ、洗浄し、汚染細胞を除く工程からなる、少量の細胞混合物として存在する軟骨始原細胞を選択的に濃縮することを提示している。
【００４６】
この発明の特別な観点による方法では、軟骨始原細胞からなる細胞混合物は、例えばワルトンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎｓ ｊｅｌｌｙ）、骨髄、関節軟骨の表層、骨膜又は軟骨膜のような初期間葉組織前駆細胞の軟骨源及び非軟骨源に由来してもよい。
この発明のひとつの具体例による支持体マトリクスは、ペトリ皿又はアフィニティカラムであってもよく、結合は物理的又は化学的であってもよい。最後の工程は、例えば培養培地での穏やかな洗浄からなってもよい。
【００４７】
出願している図を参照する。
図１．１は、Ｎ１ （ノッチ−１）の免疫学的局在性を示す。Ｎ１を発現しない新生ウシ関節軟骨細胞の表層の上部の２〜３細胞層にほぼ完全に制限されていることが分かっているＮ１発現（緑、１．１１）は、ヨウ化プロピジウムによって対比染色される（赤、１．１０）。矢印１．１３は、関節表面を示す。
図１．２は、図１．１の拡大図である。
図１．３は、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの免疫学的局在性を示す。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡ 発現は細胞結合性で、関節軟骨の外表面にほぼ完全に制限されている（緑、１．３１）。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡを発現しない細胞は、ヨウ化プロピジウムによって対比染色される（赤、１．３２）。矢印（１．３３）は、関節表面を示す。
【００４８】
図１．４は、中央層でのＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡについて最小限の免疫学的局在性を示す。
図１．５は、図１．４のコントロールを示す；コントロール区分、緑染色がないことに注意。
図１．６は、Ｎ１免疫学的局在性を示す。
図１．７は、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの免疫学的局在性の図である。
図１．８は、未成熟なウシ軟骨におけるＮ１とＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの同時局在を示す。Ｎ１免疫局在（緑、１．８１）、フィブロネクチン−ＥＤＡ免疫局在（赤、１．８２）の重層。矢印は、関節表面を示す。これは、Ｎ１発現細胞もフィブロネクチン−ＥＤＡを発現することを示している。
【００４９】
図１．９は、「早期−フィブロネクチン結合（’ｆａｓｔ−ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）」表層のコロニー形成効率が、他の軟骨細胞群に見られるよりも著しく高かったグラフを示している（ｐ＜０・０１）。
図１．１０は、「早期−フィブロネクチン結合」表層細胞によって形成されるコロニーの顕微鏡写真である。
図１．１１は、軟骨細胞単離直後のノッチ標識を示す。ＦＡＣＳ分析を用いる軟骨細胞による特異なＮ１発現の分析。約７５％の表層、１０％の中央層及び２５％の深層の細胞が、組織からの単離直後のＮ１に陽性であった。
【００５０】
図１．１２は、ノッチ陽性細胞の磁気ビーズ分離を用いて６日目のコロニー形成効率についてのＮ１陽性選択の作用を示す。Ｎ１陽性の中央層及び深層の細胞のものより、Ｎ１陽性表層細胞由来のコロニーが著しく多かった（ｐ＜０・００１）。
図１．１３は、ＦＡＣＳを用いる表層軟骨細胞による特異なインテグリン発現の分析である。
図１．１４は、表層、中央層及び深層の軟骨細胞の平均細胞径のグラフである （平均±ＳＥＭ）。表層、中央層及び深層の軟骨細胞の平均細胞サイズの測定。ＳＺＣ （表層軟骨細胞）とＭＺＣ （中央層軟骨細胞）（ｐ ＜０・０５） ならびにＳＺＣとＤＺＣ （深層軟骨細胞） （ｐ＜０・００５）との直径には有意差がある。
【００５１】
図１．１５ ａ、ｂ、ｃは、相対比光学（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｏｐｔｉｃｓ）を用いてそれぞれ視覚化されたＳＺＣ、ＭＺＣ及びＤＺＣの代表写真である（倍率 ｘ２００）。
図１．１６は、ペレット培養の組織学的研究を示す。「早期−結合」表層軟骨細胞ペレットのＨ＋Ｅ 染色は、試料図１．１６ａ （７ 日； ＳＺＣ； Ｈ＋Ｅ； ｘ５ｏｂｊ） 及び図１．１６ｂ （７日；　ＳＺＣ エッジ； Ｈ＋Ｅ； ｘ２０ｏｂｊ）全体に形態学的に正常で生存力ある細胞の存在を示した。
図１．１７は、ペレット培養の組織学的研究を示す。ピクロシリウスレッド（Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）は、特に細胞を取巻く領域のマトリクスでコラーゲンの沈着を示した（２１日； ｘ２０ｏｂｊ）。
【００５２】
図１．１８は、ペレット培養の組織学的研究を示す。グリコサミノグリカンのサフラニンＯ染色は、細胞によって産生される細胞外マトリクスの濃い暗橙色染色を呈し、細胞がプロテオグリカン−リッチなマトリクスを分泌することを示した（２１ 日； ＳＺＣ； ｘ５ｏｂｊ）。
図１．１９は、ペレット培養の免疫細胞化学研究を示す。免疫化学は、細胞がペレット培養で軟骨特異的なマトリクス成分を合成していたことを示した。ペレット中の細胞外マトリクスは、ＩＩ型コラーゲンを含んだ（１４日； ＳＺＣ； ｘ２０ｏｂｊ）。
【００５３】
図１．２０は、ペレット培養の免疫細胞化学研究を示す。Ｉ型コラーゲンの不在は、細胞が分化して軟骨細胞を形成し、脱分化が生じていないことを示す（１４日； ＳＺＣ； ｘ２０ｏｂｊ）。
図１．２１は、ペレット培養のマトリクスにおけるコンドロイチン４スルフェートの存在を示す。
図１．２２ は、ペレット培養のマトリクスにおけるコンドロイチン６スルフェートの存在を示す。
図１．２３は、ペレット培養中の関連結合タンパク質の分布を示す蛍光画像である（１０日； ｘ１２６ｏｂｊ）。
図１．２４は、部分的に厚みのある軟骨欠損に移植された表層、中央層及び深層の軟骨細胞のペレット培養を示す。
【００５４】
図１．２５は、発達中の軟骨、例えば耳の盃状窩（ｏｔｉｃ ｃｕｐ）を含む胚のＣＦＤＡ ＳＥ標識細胞域を用いるインオボ（ｉｎ ｏｖｏ）の軟骨始原細胞追跡を示す。
図１．２６は、Ｈ＆Ｈ 段階３０−３２のニワトリ胚の軟結合組織におけるＣｙ３−接合第二抗体で局在化されるウシＭＨＣ１陽性細胞を示す（倍率 ｘ １２６）。
図１．２７は、Ｈ＆Ｈ 段階３０−３２のトルイジンブルー染色したニワトリ胚を示す。ひよこの翼のウシ異所性軟骨は、注入された表層軟骨細胞から生じた。
Ａ．　崩壊した異所性軟骨のメタ染色性顆粒染色。
Ｂ．　周囲の繊維組織。
【００５５】
図２．１ と２．２は、培養物の「層状化」領域の潜在的な形態とプロフィルを示す。
図２．３は、細胞接合因子被覆スルフェートに結合した骨髄間質細胞を示す。１６時間以内のイントラサイトと増殖。
図２．４は、４日後の材表面上の接着細胞群を示すカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭ染色を示す。
図２．５は、ピクロシリウスレッドで示される培養物中の７日後のコラーゲンマトリクスの沈着を示す。
図２．６は、１０日後のフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトで培養される骨髄間質細胞の試料におけるＩ型コラーゲンの産生を示す免疫化学を示す。
図 ２．７は、コラーゲンＩＩの産生の証拠が認められないことを示している。
【００５６】
図２．８は、材粒子表面上とそれらの間の空間の双方における、凝集物全体にわたる生存力ある細胞を示すＭＴＴ染色を示す。
図２．９ａは、細胞が、ピクロシリウスレッドで染色された凝集物内に膠原マトリクスを沈積していることを示し、また軟骨細胞が特異的な軟骨形態のコラーゲン、ＩＩ型コラーゲンを発現したことを免疫細胞化学的に示している（図２．９ｂ）。
図２．１０は、細胞表面マトリクスへ軟骨細胞がコラーゲンＶＩを分泌していることを免疫細胞化学により示している。
図２．１１は、培養中２７日後ですら、軟骨細胞がコラーゲンＩを産生していないことを免疫細胞化学により示している。
【００５７】
図２．１２は、ウシの軟骨細胞が、最初の１０日間に生じるかなり迅速な発生を伴って培養期間中１４．４倍に増すことを示すグラフである。
図２．１３は、二層の繊維補強細胞／生態適合性構築物を形成するためのスカホールドに（Ｉ）骨髄間質細胞を接種したフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト及び（ＩＩ）軟骨細胞−接種被覆スルフェートイントラサイトを連続的に遠心分離することによる、二層構築物の形成に用いられる使用装置及び方法の概要を示す。
図２．１４は、遠心分離回転の回転方向に対する「非対称カラー」の好ましい方向とローターの根軸を示す。
図２．１５は、着色したスルフェートイントラサイトの二分子層の沈着を示す。
【００５８】
図２．１６は、（Ｉ）ピコグリーン（ｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎ）染色した骨髄間質細胞を接種した、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトの層及び（ＩＩ） ＥｔＢｒＨＤ染色した軟骨細胞を接種した、被覆スルフェートイントラサイトの層からなる二分子層構築物を示す。
図２．１７は、コントロールに比較した、２つのフェルトにおける緑蛍光の定量を示す。直接的な外観では、下部のフェルトを同一細胞群で接種する前の３０分間、フィブロネクチンで被覆され、軟骨細胞混合群で接種された上部のフェルトに多量のＮ１＋ 蛍光がある。
図２．１８は、種々の層における緑蛍光の定量を示す。直接的な外観では、フィブロネクチンで被覆した上部表面を有するフェルトの上部表面に多量のノッチ１＋ 蛍光がある。
【００５９】
図３．１ａ 〜３．１ｄは、この発明によるインプラントを示す。
図３．２ａ 〜３．２ｃは、多層インプラントを製造するための、細胞結合特性及び浮遊密度／沈降速度が異なる被覆マイクロビーズの使用を例示している。沈降速度の異なる２種のマイクロビーズ（微粒子体）を軟骨細胞懸濁液に混合し（図３．２ａ）、凝集させる（図３．２ｂ）。マイクロビーズ型の１つは、軟骨始原細胞を選択的に結合する材で被覆されるが、他方のマイクロビーズ型は、別の細胞種（例えば下方の軟骨細胞系に見られる多くの成熟軟骨細胞）に選択的に結合する。細胞の接着後、細胞被覆マイクロビーズが沈降されて、多層沈着物を形成する（図３．２ｃ）。次いで、沈着物が一緒になって、元の場所で硬化する結合材（例えばアルギネートゲル）を用いてインプラントを形成する。
【００６０】
図３．３ａ〜３．３ｃは、沈降速度の異なる２種以上のマイクロビーズと組み合わさった、３Ｄ−ニットであり得るスカホールド材を用いる多層インプラントの製造を例示する。図３．２にあるように、あるマイクロビーズ型を軟骨始原芽細胞結合材で被覆し；別の型を別の細胞種（例えば下方の軟骨細胞系に見られる多くの成熟軟骨細胞系）を選択的に結合する材で被覆する。図３．２にあるように、マイクロビーズを軟骨細胞の懸濁液と混合し（図３．３ａ）、懸濁液中の細胞と相互作用させ（図３．３ｂ）、生体適合性スカホールドの空のスペースに沈降させて多層インプラントを形成する（図３．３ｃ）。
【００６１】
図３．４ａ〜３．４ｃは、均質なろ紙（ｇｒａｄｅｄ ｆｉｌｔｅｒ）として役立つことを目的とした、３Ｄ−ニットであり得る、大きさ、細胞結合親和性及び生体スカホールド材の異なる２種以上のマイクロビーズとの組み合わせを用いる多層インプラントの製造を例示する。前記の図にあるように、あるマイクロビーズ型は軟骨始原細胞結合材で被覆され；他方は、下方の軟骨細胞系に見られる別の細胞種に選択的に結合する材で被覆される。細胞結合粒子と軟骨細胞（示さず）を混合し（図３．４ａ）、細胞をある又は別の群のビーズに選択的に結合させた（図３．４ｂ）。細胞被覆マイクロビーズを均質なろ紙に出す。別の型のマイクロビーズよりもさらに小さいマイクロビーズ（ある細胞型で被覆）をさらにろ紙に出し、（細胞型が異なるので）、それにより層状化装置を生ずる。
【００６２】
図３．５は、本発明によるインプラントの概略図である。
図 ３．６は、種々のリガンドへの最初の結合から４日後の表面とＤＺＣのコロニー形成効率を示す（ＦＮ、フィブロネクチン； Ｃ１、コラーゲンＩ； ＣＩＩ、コラーゲンＩＩ； ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン； ＣＩＶ、コラーゲンＩＶ； ＬＭ、ラミニン； ＴＮ、テンサシン（ｔｅｎｓａｃｉｎ））。合計した３実験の平均（±ｓｅｍ）、ｎ＝４ ディッシュ／リガンド／実験。
図３．７は、ＰＢＳ被覆スルフェートイントラサイトに比較される、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトへの表層細胞結合を形成する多くのコロニーを示すコロニー涸渇アッセイの使用を示す。結果は、４個の複製マルチウェルプレートの１２ウェルそれぞれで形成されるコロニー数である。
【００６３】
図３．８は、ＰＢＳ、血漿フィブロネクチン、細胞性フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、ラミニン又はポリリジンで被覆したスルフェートイントラサイトへのコロニー形成骨髄間質細胞結合を比較するコロニー涸渇アッセイの使用を示す。血漿フィブロネクチン−被覆スルフェートイントラサイトは、コロニー形成細胞に最も高い親和性を有するが、コラーゲンＩＶ被覆イントラサイトは、コロニー形成細胞結合について高いレベルを示す。
【００６４】
この発明の好ましい具体例を、これらの図を引用して詳細に説明する：
図３．１は、この種の装置の４つの可能性ある具体例を示す：
図３．１ａは、不織ポリマーフェルトからなる単層スカホールドからなるインプラントを示す。その上部（関節）表面（３．２）から拡張しているスカホールドの一部は、軟骨始原細胞結合材（例えばフィブロネクチン）からなる。下方の（骨−接触）表面（３．１）は、軟骨始原細胞結合材を含まない。
図 ３．１ｂは、三次元のニット織物からなる、単層のスカホールドからなるインプラントを示す。インプラントは、軟骨始原細胞結合材（例えばフィブロネクチン）からなる被覆材で被覆される上部（関節）表面（３．２）を有する。また、下方（骨接触）表面（３．１）は、軟骨始原細胞結合材を含まない。
【００６５】
図３．１ｃは、中に軟骨始原細胞結合材（例えばフィブロネクチン）を配置した三次元ニット織物からなる単層スカホールドからなるインプラントを示す。上部（関節）表面（３．４）がインプラントの深部領域、特に下方の表面（３．３）より軟骨始原細胞に高い親和性を有するように、該表面からの距離に伴って濃度を減じる軟骨始原細胞結合材の濃度勾配がある。
図３．１ｄは、三次元のニット織物の上部（関節）層と高度に適合性の不織材の下方（骨接触）層を導入する、二層スカホールドからなるインプラントを示す。軟骨始原細胞結合材（例えばフィブロネクチン）は、装置の上部（関節）表面（３．６）が深部の骨界面層（３．５）より軟骨始原細胞に高い親和性を有するように、装置内に含まれる。軟骨始原細胞結合材は、下方層に拡張してもよく、あるいは、層の厚みに応じて上部の層に制限されてもよい。
【００６６】
軟骨始原細胞結合材で被覆されたマイクロビーズからなるスカホールドからなるインプラント
この発明によるインプラントは、軟骨始原細胞結合材で被覆されたマイクロビーズからなってもよい。そのような場合、スカホールドは非被覆−ビーズからなってもよく、被覆されたビーズは、スカホールドの第二表面から下方、深部ｄ２に位置するように配置される。このような配置は、例えば大きさ又は密度が他の型と異なるビーズ型を生じることによるなどの幾つかの方法によって成すことができる。
さらにこの概念を工程に考慮すれば、軟骨始原細胞結合材で幾つかのビーズを被覆し、軟骨の中央層び深層、特に関節軟骨に一般に見られる他の細胞、例えば多くの成熟軟骨細胞（下方の軟骨細胞系）を結合する材で他のビーズを被覆することができる。図３．２ａ〜３．２ｃ、３．３ａ〜３．３ｃ 及び３．４ａ〜３．４ｃでは、２つの異なる細胞種を以下の記号によって示している：
【００６７】
【化１】
2004504835.tif 000002
【００６８】
軟骨始原細胞結合材の例は、この場合フィブロネクチン−ＥＤＡであり、深層の結合材の例はコラーゲンＶＩである。フィブロネクチン−ＥＤＡとコラーゲンＶＩは、マイクロ担体ビーズのような、大きさ、密度及び／又は沈降速度の異なる２つの異なるタイプの微粒子生体物質で被覆される。図３．２ａ〜３．２ｃ、３．３ａ〜３．３ｃ 及び３．４ａ〜３．４ｃでは、２つの異なるビーズ型を以下の記号で示している：
【００６９】
【化２】
2004504835.tif 000003
【００７０】
マイクロ担体ビーズは沈降されて多層沈積物を形成する。これは、アルギネート又はプルロニックゲルのような結合剤で凝集され、２つの結合剤それぞれがその適当な層に本質的に制限されるインプラントを生ずる（図３．２ａ〜３．２ｃ参照）。あるいは、被覆されたビーズは、スカホールド材上に沈降し、次いで結合剤をその後適用するか、適用せずに使用することができる（図３．３ａ〜３．３ｃ参照）。また、あるいは２種のビーズの大きさが異なっていれば、均質なろ紙として役立つスカホールドにそれらを封入して分離し（図３．４ａ〜３．４ｃ参照−細胞示さず）、それにより、大きな粒子よりも小さい粒子が（細胞型の異なる）ろ紙内にさらに出され、この結果、多層装置が生ずる。
【００７１】
図３．５に関して、本発明によるインプラント（３．７）の概略図を示す。このインプラントは、骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一下方表面（３．８）及び暴露された関節表面に接触して、又はその近くに位置するのに適した第二の上部表面（３．９）を有する。第一表面と第二表面との距離は、ｄ１である。第二表面からｄ２の深部まで、インプラントは軟骨始原細胞結合材を含む。第一表面（３．８）からｄ３の深部まで、インプラントは、軟骨の表層以外の層に見られる細胞を結合し得る、コラーゲンＶＩのような別の細胞結合材を含む。
【００７２】
さらに本発明の別の観点によれば、成熟軟骨細胞結合材からなる軟骨欠損の修復用インプラントが提供される。適切には、成熟軟骨細胞結合材は、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン又はビトロネクチンである。
【００７３】
実施例１：表層軟骨始原細胞の特性
要約
この実施例は、健康な関節軟骨の表層内に軟骨始原細胞の層が存在することを実証する：
１．　　無傷の軟骨の免疫細胞化学分析は、軟骨始原細胞が、特有の組織位置（すなわち表層内）、隣接する軟骨細胞と異なるコントロール系（例えば、シグナルレセプターＮ）、及び特有の細胞外マトリクス質（フィブロネクチンスプライス変異Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡを含む）を有することを示す。
２．　　インビトロ分析は、細胞がフィブロネクチンを迅速に結合し、高いコロニー形成効率（始原細胞用「ゴールドスタンダード」試験）、インテグリン発現の特異なパターン、及び平均より小さい細胞サイズを有することを示す。インビトロ分析は、抗ノッチ抗体被覆磁気ビーズを用いて細胞を増強できること、及びノッチ陽性細胞がコロニー形成活性を強化することも示している。
【００７４】
３．　　細胞のペレット培養物は表層始原細胞が軟骨を形成できることを示し、それらが軟骨産生細胞系の一部であることを立証している。
４．　　損傷した軟骨に接触させて始原細胞をインキュベートしたところ、損傷した軟骨における細胞死及びマトリクス崩壊が減少し、始原細胞が軟骨損傷の修復を促進し得ることを示している。
５．　　細胞は、インオボで血管内注入されれば、発達中の軟骨組織に集中し、それらが未分化な間葉前駆体というよりむしろ軟骨始原細胞であることを示唆している。
【００７５】
上記性質が組み合わさった細胞は、中間層や深層の軟骨では見られない。表層軟骨始原細胞も、骨髄間質から得た早期の間葉細胞とは異なる。なぜなら、間質細胞コロニーは線維芽細胞性であり、４日以内に形成されるのに対して、表層軟骨細胞はより長期間で（通常６日間）球状の細胞コロニーを形成するからである。　これらの結果をまとめると、表層細胞が間葉細胞系ファミリーの軟骨細胞分枝内で特異な前駆体細胞期を構成していることが分かる。マーカー発現の詳細なパターンは、種によって加齢及び疾患又は損傷修復期間中で異なる一方、この始原細胞層の存在は、おをらく関節軟骨の発達、維持及び修復の継続的な特徴であろう。
【００７６】
実施例１．１：ウシの新生関節軟骨表層内の軟骨始原細胞の免疫細胞化学的証拠
方法
凍結軟骨切片の準備。　２〜３週齢のウシの中足指節関節から、全層関節軟骨の細片（約３０ｍｍ×３ｍｍ）を取り出し、ＯＣＴ（Ｇｕｒｒ）に包理し、液体窒素で冷却されたイソペンタンスラッシュを用いて凍結した。切片（７μｍ）を、Ｌｅｉｃａ Ｊｕｎｇ ＣＭ３０００クリオスタットを用いて試料から切り取り、ポリリジン被覆スライドガラス（Ｓｉｇｍａ）の上に置いた。切片を、室温で１０分間アセトンに浸漬して固定し、空気乾燥させた。スライドは使用するまで−２０℃で保管した。
【００７７】
Ｎ１の免疫局在決定。　切片をＰＢＳ中で洗浄し（２×１０分；Ｏｘｏｉｄ）、ＰＢＳ中の正常な２．５％ウサギ血清（Ｄａｋｏ）で２０分間室温でブロックした。ペーパーティッシュを用いてブロッキング溶液を吸い取り、ポリクローナルヤギ抗ヒトＮ１（Ｃ末端）抗体（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又は同濃度の非免疫ヤギＩｇＧ（Ｄａｋｏ）で切片を１時間室温でインキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄し（３×１０分）、ウサギ抗ヤギＦＩＴＣ結合体のＰＢＳ中１：１００希釈液と室温で４５分間インキュベートし、続いてＰＢＳ中で３×１０分間洗浄した。ヨウ化プロピジウムを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）に切片をのせ、カバーガラスで覆って、４８８ｎｍ及び５６８ｎｍで励起するＡｒＫｒレーザーを用いたＬｅｉｃａ ＤＭ−ＲＥ共焦点顕微鏡を使用して観察した。
【００７８】
Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの免疫局在決定。　ウシの新生関節軟骨の凍結切片をヒアルロニダーゼで消化し（５μｇ／ｍｌ、３７℃、１時間；Ｓｉｇｍａ）、細胞周囲のマトリクスを露出させ、ＰＢＳで洗浄し（２×１０分）、ＰＢＳ中の正常な２．５％ウサギ血清（ＤＡＫＯ）で２０分間ブロックした。ペーパーティッシュを用いてブロッキング溶液を吸い取り、切片を、マウスモノクローナル抗フィブロネクチン−ＥＤＡ抗体（ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は同濃度の非免疫マウスＩｇＧ １（Ｄａｋｏ）と４℃で一晩インキュベートした。試料をＰＢＳで３回洗浄し、ビオチニル化ウサギ抗マウス二次抗体（ＰＢＳ中１：１００希釈；Ｄａｋｏ）とインキュベートし、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ結合体で処理した（ＰＢＳ中１：１００希釈；６０分；Ａｍｅｒｓｈａｍ）。切片をＰＢＳ中で３回洗浄し、共焦点顕微鏡検査で観察した。
【００７９】
未成熟なウシの軟骨におけるＮ１及びＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの共局在。　切片をブロックし、２つの一次抗体培養物を結合させた（上記に記載）。Ｎ１にはウサギ抗ヤギ−ＦＩＴＣ結合二次抗体（Ｄａｋｏ）を、フィブロネクチン−ＥＤＡにはビオチニル化ウサギ抗マウス二次抗体、続いてストレプトアビジン−テキサスレッド（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して検出を行った。
【００８０】
結果
Ｎ１の免疫局在決定。　Ｎ１発現（緑）は、ウシの新生関節軟骨の表層の上部２〜３細胞層にほぼ限定されているのが示された（図１．１及び１．２）。Ｎ１を発現しない細胞は、ヨウ化プロピジウムにより赤に対比染色される。矢印は関節表面を示す。
フィブロネクチン−ＥＤＡの免疫局在決定。　フィブロネクチン−ＥＤＡ発現が細胞に関連しており、関節軟骨の表層にほぼ限定されていることを結果は示した（図１．３）。少量の蛍光が中間層に見られるが（図１．４）、これはコントロールの切片にも見られたので（図１．５）、非特異的な染色である可能性がある。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ −ＥＤＡを発現しない細胞は、ヨウ化プロピジウムにより赤に対比染色される。矢印は関節表面を示す。
【００８１】
未成熟なウシの軟骨におけるＮ１及びＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの共局在。　図１．６、１．７及び１．８は、それぞれＮ１免疫局在決定、フィブロネクチン−ＥＤＡ免疫局在決定及び２つの画像を重ね合わせたものを示す。矢印は関節表面を示す。重ねた画像は、Ｎ１発現細胞がフィブロネクチン−ＥＤＡも発現することを示す。コントロールの画像は蛍光を示さなかった（画像示さず）。
【００８２】
考察
これらの結果は、ノッチ陽性及びフィブロネクチン−ＥＤＡ陽性軟骨始原細胞の群が健康な関節軟骨の表層内に存在するという仮説と一致する。ノッチ及びフィブロネクチン−ＥＤＡは、非軟骨組織の始原細胞のマーカーとしてこれまで認識されてきた。ノッチレセプターは、細胞内の転写因子発現を変えるシグナル系の一部であり、細胞が分化するのを防ぐ。フィブロネクチン−ＥＤＡは、始原細胞又は未分化細胞がたくさんある状況（例えば、胚発生、損傷修復及び腫瘍形成）で産生されるため、フィブロネクチンの「腫瘍−胎児（ｏｎｃｏ−ｆｏｅｔａｌ）」形態として記述されてきた。フィブロネクチン−ＥＤＡは、初期始原細胞を支持する特殊な細胞外マトリクスの一領域である「幹細胞−ニッチ」の構成部分であるかもしれない。共局在実験は、表層内の細胞により２つのマーカーが同時に発現され、個々の標識細胞に識別可能なパターンが無かったことを示した。これは、ノッチ及びフィブロネクチン−ＥＤＡが、軟骨細胞分化の２つの別個の、又は重なる段階を標識するという仮説と一致せず、表層軟骨始原細胞が表層内に存在する十分に均質な細胞の集団であることを示す。
【００８３】
実施例１．２：表層軟骨細胞のインビトロ特性決定
方法
ウシの関節軟骨からの表層、中間層及び深層細胞の分離。　ウシの新生中足指節関節から表層、中間層及び深層の軟骨を切除し、プロナーゼ（ＤＭＥＭ／５％ ＦＣＳ中０．１％；３時間；Ｍｅｒｃｋ　４×１０６単位／ｇ）及びコラゲナーゼ（ＤＭＥＭ／５％　ＦＣＳ中０．０４％；１６時間静かに振盪；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　２３７Ｕ／ｍｇ）中で連続的に消化することにより軟骨細胞を放出させた。組織消化物を、濾過し（７０μｍ細胞ストレーナー；Ｆａｌｃｏｎ）、遠心分離し（１０００ｒｐｍ；５分）、無血清ＤＭＥＭ（１０ｍｌ）で洗浄し、再び遠心分離して、無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁させた。
フィブロネクチン被覆培養プラスチックの製造。　２４ウェル培養プレート及び３５ｍｍ ペトリ皿を、ウシの血漿フィブロネクチン（１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＣａＣｌ２を加えたダルベッコのＰＢＳ中に１０μｇｍｌ−１；１６時間；４℃）又は賦形剤で被覆し、１％ ＢＳＡでブロックした。
【００８４】
フィブロネクチン及びＰＢＳ被覆皿への細胞接着。　表層、中間層及び深層の関節軟骨細胞（４０００細胞／ペトリ皿）を、フィブロネクチン（ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ、１０μｇｍｌ−１）又はＰＢＳ被覆の３５ｍｍの皿に２０分間植えつけた。未接着細胞を取り除き、新しいＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ又はＰＢＳ被覆皿にさらに４０分間置いてから、もう一度未接着細胞を取り除いた。
２０分及び４０分間フィブロネクチンに識別接着された表層、中間層及び深層の軟骨細胞のコロニー形成効率。　表層、中間層及び深層の関節軟骨細胞（４０００細胞／ペトリ皿）を、フィブロネクチン（ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ　１０μｇｍｌ−１）又はＰＢＳ被覆皿に２０分間植えつけ、未接着細胞を取り除き、それを同様に処理した皿に４０分間植えつけてから未接着細胞を取り除いた。形成されたコロニー数（＞４細胞）を６日及び１０日間培養後評価し、「コロニー形成効率」（すなわち、コロニー数／最初の接着細胞）として表した。
【００８５】
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を用いた、表層軟骨細胞による特異なインテグリン及びＮ１発現の分析。　１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＣａＣｌ２（ＰＢＳ＋）を含むＰＢＳ中の１０μｇ ｍｌ−１のウシのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）で、ペトリ皿（３５ｍｍ）を一晩４℃で被覆した。軟骨細胞を添加する前に、ＰＢＳ＋中の１％ＢＳＡで皿をブロックした。コントロールの皿をＰＢＳ＋で一晩４℃で処理した。７日齢の子ウシの表層、中間層及び深層の関節軟骨から軟骨細胞を前述のとおり単離した。単離後、０．１％ゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ中で軟骨細胞（４，０００ｍｌ−１）を３５ｍｍプラスチック皿に３７℃で２０分間植えつけた。２０分後、培地（及び未接着細胞）を取り除き、第二皿に３７℃で４０分間置いてから、この培地（及び未接着細胞）を取り除き、第三皿に置いた。２０分及び４０分後に培地を取り除いた後、ゲンタマイシン及び１％ＦＣＳを含む新鮮なＤＭＥＭを残っている接着細胞に添加し、１０日間まで培養を維持した。
【００８６】
プロナーゼ／コラゲナーゼ連続単離直後、及び識別接着後の異なる時点において軟骨細胞を非酵素的に皿から除き、ＰＢＳ中の１×１０６細胞ｍｌ−１で再懸濁した。２×１０５細胞を、室温で３時間α５及びβ１インテグリンのサブユニットならびにＮ１に対する抗体とインキュベートした。細胞を２，５００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを除去し、各洗浄の間に遠心分離を行いながら細胞をＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、細胞を１時間室温で適切なＦＩＴＣ結合二次抗体とインキュベートし、上記のとおりＰＢＳ中で３回洗浄した。最後に、標識細胞を２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、シングルチャンネルＦＡＣＳ分析にかけた。
【００８７】
表層、中間層及び深層の軟骨細胞の平均細胞サイズの測定。　精密切開及びプロナーゼ／コラゲナーゼ連続消化作用を用いて、１〜３週齢のウシの中足指節関節の関節軟骨から表層（ＳＺＣ）、中間層（ＭＺＣ）及び深層（ＤＺＣ）の軟骨細胞を単離した。単離細胞懸濁液のアリコートを血球計数器に分注し、カバーガラスで覆った。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＫ４０倒立顕微鏡を用いて細胞を観察し、画像内に細胞が十分存在するか（ｎ＞１２０）を確認しながら倍率×１００で撮影した。グラティキュールで目盛を定めたソフトウェア付きＩｍａｇｅ−Ｐｒｏを用いて画像分析を行い、画像内に存在する細胞の平均直径を測定した。
【００８８】
結果
「早期−フィブロネクチン結合」表層軟骨細胞によるコロニー形成。　添加された細胞のうち３〜４時間後に結合したものの％として表した、フィブロネクチン被覆組織培養プラスチックへの最初の細胞接着を表１に示す：
【００８９】
【表１】
2004504835.tif 000004
【００９０】
表１．１．　フィブロネクチン及びＰＢＳ被覆組織培養プラスチックへの表層、中間層及び深層の軟骨細胞接着。＊、４０分と比較したｐ＜０．００１、＊＊、４０分と比較したｐ＜０．０１、＊＊＊、ＰＢＳコントロールと比較したｐ＜０．００１、＾、表層ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ２０と比較したｐ＜０．０１、＾＾、深層ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ２０と比較したｐ＜０．００１。
【００９１】
接着細胞により形成されたコロニー数（＞４細胞）を６日及び１０日間培養後評価し、「コロニー形成効率」（すなわち、コロニー数／最初の接着細胞数）として表した。「早期−フィブロネクチン結合」表層細胞のコロニー形成効率は、他の軟骨細胞の群で観察されたものよりも極めて高かった（図１．９参照。＊＝ｐ＜０．０１）。図１．１０は、「早期−フィブロネクチン結合」表層細胞により形成されたコロニーの顕微鏡写真を示す。
ＦＡＣＳ分析を用いた軟骨細胞による特異なノッチ−１発現の分析。　７日齢の子ウシの表層、中間層及び深層の間接軟骨から軟骨細胞を、プロナーゼ／コラゲナーゼ連続消化作用を３７℃で一晩用いて単離し、ＰＢＳ中で洗浄して、抗Ｎ１ポリクローナル抗体を用いてＦＡＣＳ分析にかけた。組織からの単離直後、表層細胞の約７５％、中間層細胞の約１０％及び深層細胞の約２５％がＮ１に陽性であった（図１．１１）。
【００９２】
ノッチ陽性細胞の磁気ビーズ分離。　抗Ｎ１抗体被覆磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いて、Ｎ１免疫陽性ＳＺＣ、ＭＺＣ及びＤＺＣを単離し、６日間培養してコロニー形成効率を評価した。Ｎ１陽性の中間層及び深層の細胞由来よりもＮ１陽性表層細胞由来のコロニーが有意に（ｐ＜０．００１）多かった（図１．１２）。
【００９３】
ＦＡＣＳを用いたＳＺＣによる特異なインテグリン発現の分析。　識別接着後、ＳＺＣ、ＭＺＣ及びＤＺＣは、標識強度及び標識細胞数における差が顕著ではあったが、分析された全ての時点において基質に関係なくα５及びβ１サブユニットを発現した。単離直後及び識別接着から４時間後にフローサイトメトリーを用い、ＭＺＣ（５％）及びＤＺＣ（２．５％）と比較して、ＳＺＣ（７９％＋ｖｅ）がβ１サブユニットを優先的に発現することが分かった。α５サブユニット発現の差は軟骨細胞では検出されず、発現レベルは表層から深層まで、８８〜６７％の範囲に及んだ。フィブロネクチンへの識別接着に続いて７２時間培養した後、軟骨細胞α５及びβ１サブユニット発現の差は、組織の深さに関係なく検出されなかった。しかしながら、識別接着から４時間後の発現に比べて、α５及びβ１サブユニットの発現全体は、あらゆる組織深さの軟骨細胞において減少した（図１．１３）。
【００９４】
【表２】
2004504835.tif 000005
【００９５】
表２
ＳＺＣ、ＭＺＣ及びＤＺＣの平均細胞サイズの測定。図１．１４は、表層（ｎ＝１２４）、中間層（ｎ＝２７５）及び深層（ｎ＝１８２）の軟骨細胞の平均細胞直径を図示する。ＳＺＣとＭＺＣ（ｐ＞０．０５）及びＳＺＣとＤＺＣ（ｐ＞０．００５）の直径には双方とも有意差があった。このデータは、未成熟なウシ軟骨の表層由来細胞が中間層及び深層の細胞より小さい直径を平均的に有することを証明する。図１．１５ａ、１．１５ｂ及び１．１５ｃは、それぞれ位相差顕微鏡レンズ（倍率×２００）を用いて観察した、表層細胞、中間層細胞及び深層細胞の代表的な写真である。
【００９６】
考察
これらの結果は、コロニー形成軟骨細胞の群が関節軟骨の表層内に存在することを示す。インビトロのコロニー形成は、始原細胞について最も信頼できる試験である。なぜなら、高い反復細胞分裂の能力を細胞が有する（すなわち、細胞が自己再生する）ことが証明されるからである。したがって、これらの結果は、始原細胞が表層内に存在することを示す。コロニー形成表層細胞はフィブロネクチンに高い親和性を有することが示された。これは、表層内でのα５β１インテグリンの高いレベルの発現に関係があると推測される観察である。表層と中間層／深層とのβ１インテグリン発現の差は、特に顕著であった。ノッチ発現が表層細胞に集中していることをＦＡＣＳ分析が立証したのに対して、形態学的分析は、表層細胞が他の軟骨細胞より小さいことを示した。これらの結果をまとめると、表層細胞は他の軟骨細胞とは異なる特性を持つ別個の細胞群であることがわかった。
【００９７】
結果が、抗ノッチ抗体がノッチ陽性細胞を生体適合物質の表面に選択的に結合させるのに使用でき、それによってコロニー形成始原細胞を粒状材料の表面に濃縮させることを示したのは重要である。同様に、抗インテグリンβ１抗体は軟骨始原細胞を生体適合物質の表面に選択的に結合させるのに使用できる。コロニー形成細胞のフィブロネクチンに対する高い親和性は、コロニー形成軟骨始原細胞を生体適合物質の表面に結合させるのにフィブロネクチンも使用できるであろうことを示唆する。細胞と生体適合物質間のこのような選択的親和性は、正常な軟骨内で発生するのと同じ解剖学的位置に軟骨始原細胞が集中される、軟骨インプラントの形成に適用できるであろう。
【００９８】
実施例１．３：フィブロネクチンに高い親和性を持つＳＺＣのペレット培養物によるインビトロ軟骨形成
方法
「早期−フィブロネクチン結合」ＳＺＣのペレット培養。　ペレット培養は、軟骨始原細胞がインビトロで軟骨を形成するのを可能にする、確立された方法である（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９９９）。
精密切開により、１〜３週齢のウシの中足指節関節から、表層及び中間層の関節軟骨を得た。軟骨の削りくずをプロナーゼで消化し（ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ中０．１％；３７℃で３時間；Ｍｅｒｃｋ、４×１０単位／ｇ）、ＰＢＳ中で洗浄し、コラゲナーゼを用いて表層及び中間層の細胞懸濁液を単離した（ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ中０．０４％；静かに振盪して３７℃で１６時間；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ＩＩ型；２３７Ｕ／ｍｇ）。放出された細胞を７０μｍ細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）で濾過し、遠心分離し（１０００ｒｐｍ；５分）、無血清ＤＭＥＭ中で洗浄し、血球計測器を用いて計数し、１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。
【００９９】
６ウェルプレートのウェルをウシの血漿フィブロネクチンで被覆した（１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＣａＣｌ２を加えたダルベッコのＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ；４℃で１６時間；Ｓｉｇｍａ）。フィブロネクチン溶液を吸引し、プレートをＢＳＡでブロックした（１％ ｗ／ｖ；１時間）。
ＳＺＣ又はＭＺＣ（無血清ＤＭＥＭ中２×１０６細胞；２ｍｌ）をフィブロネクチン被覆ウェルに植え付け、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、培地を静かにかき混ぜ、破棄し、接着した「早期−結合」細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で、５％加湿ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で９６時間インキュベートした。「早期−結合」表層及び中間層の細胞をトリプシン処理し、ピルビン酸塩（Ｓｉｇｍａ）、ＩＴＳ（１％；Ｓｉｇｍａ）、アスコルビン酸−２−リン酸塩（１００μｍ；Ｓｉｇｍａ）、デキサメタゾン（１０−７Ｍ；Ｓｉｇｍａ）、ＨＥＰＥＳ（２０μｌ／ｍｌ；１Ｍ；Ｓｉｇｍａ）及び形質転換成長因子β１（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＋Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足した０．５ｍｌ ＤＭＥＭ中、２ｍｌ無菌丸底遠心管（Ｅｐｉｎｄｏｒｆ）にアリコートした（５００ｋ細胞）。管を遠心分離し（２５００ｒｐｍ；１０分）、２日ごとに培地を変えながら、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で７、１４及び２１日間インキュベートした。
【０１００】
組織学的分析。　インキュベート期間の終わりに、培地を取り除き、試料を１０％ホルマール緩衝食塩水に固定し（０．５ｍｌ；２４時間）、ＶＩＰプロセッサで加工し、ろう包埋し、Ｌｅｉｃａミクロトームで切断した（５μｍ）。組織学的分析のため、標本を脱ろうし、再水和して、サフラニンＯ（０．１％、６分）、ピクロシリウスレッド（Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）（飽和アルコールピクリン酸中０．１％、９０分）、トルイジンブルー（０．５％；１５秒）又はヘマトキシリン及びエオシン（Ｇｉｌｌｓ ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ、６分及びアルコールエオシン、４分）のいずれかで染色した。Ｈｉｓｔｏｍｏｕｎｔを用いて標本をのせ、Ｌｅｉｃａ顕微鏡、ＳＰＯＴカメラ及び関連ソフトウェアを用いて撮像した。
【０１０１】
免疫細胞化学分析。　スライドを脱ろうし、再水和してＤａｋｏ ＨＭＡＲ〔熱媒介抗原回復システム；Ｄａｋｏ〕にかけた。Ｉ型コラーゲン検出のため、スライドをブタの血清中でブロックし（２．５％、室温で２０分；Ｄａｋｏ）、ＰＢＳ中で完全に洗浄して、ウサギポリクローナル抗Ｉコラーゲン抗体（１０μｍｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は同等濃度の非免疫ウサギＩｇＧ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）のいずれかに４℃で一晩浸漬した。スライドを次いでＰＢＳ中で洗浄し、ブタ抗ウサギビオチニル化二次抗体に浸漬し（１：１００；室温で３０分；Ｄａｋｏ）、ＰＢＳ中で洗浄し、ストレプトアビジンテキサスレッドに浸漬し（１：１００、室温で３０分；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＰＢＳ中で洗浄して、蛍光のためＶｅｃｔｏｒｍｏｕｎｔを用いて載せて、カバーガラスで覆った。
【０１０２】
ＩＩ型コラーゲン検出のため、スライドをウサギ血清中でブロックし（２．５％、室温で２０分；Ｄａｋｏ）、ＰＢＳ中で完全に洗浄して、マウスモノクローナルＩＩコラーゲン一次抗体（１μｇ／ｍｌ；Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）又は同等濃度の非免疫マウスＩｇＧ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）のいずれかに４℃で一晩浸漬した。スライドを次いでＰＢＳ中で洗浄し、ウサギ抗マウスビオチニル化二次抗体（１：１００；室温で３０分間；Ｄａｋｏ）に浸漬して、ＰＢＳ中で完全に洗浄し、ストレプトアビジン ＦＩＴＣ（１：１００；室温で３０分；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に浸漬させ、ＰＢＳ中で完全に洗浄し、蛍光のためＶｅｃｔｏｒｍｏｕｎｔを用いて載せて、カバーガラスで覆った。
【０１０３】
グリコサミノグリカンエピトープコンドロイチン４スルフェート、コンドロイチン６スルフェート及びデルマタンスルフェートの検出のため、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで切片を湿らせ、（ｉ）コンドロイチナーゼＡＣ（０．２５ｕ／ｍｌ）、（ｉｉ）コンドロイチナーゼＡＢＣ（０．２５ｕ／ｍｌ）又は（ｉｉｉ）コンドロイチナーゼＡＢＣ（０．２５ｕ／ｍｌ）のいずれかで１時間３７℃で消化し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄して、適切なブロッキング血清で３０分間室温でインキュベートした。ブロッキング血清を次いで吸い取り、切片を、（ｉ）抗体２Ｂ６（５００中１；コンドロイチナーゼＡＣ処理後、コンドロイチン４スルフェートＧＡＧの残骸（ｓｔｕｂ）を認識；Ｃａｔｅｒｓｏｎら、１９８５）、（ｉｉ）抗体２Ｂ６（５００中１；コンドロイチナーゼＡＢＣ処理後、デルマタンスルフェートＧＡＧの残骸を認識；Ｃａｔｅｒｓｏｎら、１９８５）、又は（ｉｉｉ）抗体３Ｂ３＋（５００中１；コンドロイチナーゼＡＢＣ処理後、コンドロイチン６スルフェートの残骸を認識；Ｃｏｕｃｈｍａｎら、１９８４）のいずれかの中でインキュベートした。スライドを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０中で洗浄し、２０％ＦＣＳを含むＰＢＳで希釈された適切な蛍光複合抗体を用いて室温で１時間抗体結合を検出し、次いでＰＢＳで洗浄した。
【０１０４】
Ｌｉｎｋ蛋白質の検出のため、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で切片を湿らせ、コンドロイチナーゼＡＢＣ（０．２５ｕ／ｍｌ）を加えたコンドロイチナーゼＡＣ（０．２５ｕ／ｍｌ）で１時間３７℃で消化し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、ブロッキング血清中で３０分間室温でインキュベートした。ブロッキング血清を吸い取り、ポリクローナル抗リンク蛋白質抗体（３０中１）又は同等濃度の非免疫血清のいずれかの中で切片をインキュベートした。スライドをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０中で洗浄し、２０％ＦＣＳを含むＰＢＳで希釈された関連蛍光複合抗体を用いて室温で１時間抗体結合を検出し、次いでＰＢＳで洗浄した。
スライドを観察し、Ｓｐｏｔカメラ付きＬｅｉｃａ顕微鏡及び関連ソフトウェアを用いて撮像した。
【０１０５】
結果及び考察
組織学的研究。　「早期−結合」表層軟骨細胞ペレットのＨ＋Ｅ染色は、形態学的に正常で生存可能な細胞の存在を標本全体にわたって示した（図１．１６）。ピクロシリウスレッドは、特に細胞を囲むマトリクス領域でコラーゲン沈着を示した（図１．１７）。グリコサミノグリカンのサフラニンＯ染色は、細胞により生じた、細胞外マトリクスに非常に濃いオレンジ色の染色を呈し、細胞がプロテオグリカン−リッチなマトリクスを分泌したことを示している（図１．１８）。この結果は、マトリクスが紫／青に染色されたトルイジンブルー染色標本により確認されたが、これもグリコサミノグリカン生成のしるしである。これらの結果をまとめると、「早期−結合」表層細胞のペレット培養物が、正常な軟骨の組織学的特徴を持つマトリクスを分泌することが分かる。
【０１０６】
免疫細胞化学的研究。　免疫細胞化学は、細胞がペレット培養物内で軟骨特異的なマトリクス成分を合成していたことを示した。ペレット内の細胞外マトリクスはＩＩ型コラーゲンを含んでいたが（図１．１９）、Ｉ型コラーゲンを含んでおらず（図１．２０）、細胞が分化して軟骨細胞を形成したこと、及び脱分化が起こらなかったことを示している。
免疫染色は、ペレット培養物のマトリクスにおいて、コンドロイチン４スルフェート及びコンドロイチン６スルフェートが存在することを示した（図１．２１及び１．２２）。サフラニンＯ及びトルイジンブルーの組織化学染色の結果とまとめると、これらのデータは、細胞がかなりの量の軟骨マトリクス様プロテオグリカンを分泌していることを示す。これは、主要な軟骨構造成分アグレカンの成分であるリンクタンパク質の存在により確認された（図１．２３）。
これら結果は全体として、ペレット培養物内で成長した早期−フィブロネクチン結合表層細胞が、関節軟骨の２つの主要な構造成分であるコラーゲンＩＩ及びアグレカンを生成することを示す。これは、早期−フィブロネクチン結合表層細胞が軟骨産生性であることを示す。
【０１０７】
実施例１．１及び１．２の結果をまとめると、これらの結果は、軟骨産生コロニー形成軟骨始原細胞の群が関節軟骨の表層内に存在すること、及びこれらの細胞が、（ｉ）フィブロネクチン及び／又は（ｉｉ）抗Ｎ１抗体及び／又は（ｉｉｉ）抗インテグリンβ１抗体のいずれかで被覆された生体適合物質に急速に／選択的に結合することを示す。このような選択的細胞結合は、前駆細胞及び成熟軟骨細胞が正しい解剖学的位置にある層状インプラントを生成するのに使用できるであろう。
これらの結果を概括してみると、軟骨始原細胞もしくは他の軟骨産生間葉前駆細胞のいずれかを選択的に結合する細胞外マトリクス成分又は抗体はいずれも、生体適合性インプラント材料の表面に付着させ、（ｉ）軟骨始原細胞を結合し、（ｉｉ）それらを軟骨修復用に設計されたインプラントの選択領域に局在化させるのに使用できるものと予測される。
【０１０８】
実施例１．４：損傷した関節軟骨への軟骨細胞ペレット移植の効果
方法
フィブロネクチンに親和性が高い表層軟骨細胞のペレットならびに中間層及び深層の軟骨細胞ペレットを７日間培養し、局部的に深い傷を含むウシの軟骨外植片に埋め込んだ。さらに７日後、外植片をエチジウムホモダイマーとインキュベートし（９０分）、（ｉ）１０％ＮＢＦＳで固定し、ろう包埋し、切断してサフラニンＯで染色するか、又は（ｉｉ）脱ろうし、蛍光光学のもとに検査して細胞死を評価した。
【０１０９】
結果及び考察
コントロール外植片（ペレットを与えない）ならびに中間層及び深層の軟骨由来のペレットを与えた外植片は、創縁及び関節表面の両方から明確なマトリクスの損失を示した。コントロール試料ならびに中間層及び深層ペレットを与えた試料の創縁及び関節表面に沿って、細胞死もまた明らかであった。対照的に、表層関節軟骨由来のペッレトを与えた外植片は、創縁からのマトリクス損失の減少及び細胞死の減少を示した。Ｎ１陽性コロニー形成表層細胞が、軟骨細胞形成及び修復で重要な役割を果たす可能性が結論付けられた。
【０１１０】
実施例１．５：ニワトリ胚に注入された軟骨始原細胞：ＣＦＤＡ ＳＥを用いたインオボ軟骨始原細胞追跡
材料及び方法
プロナーゼ／コラゲナーゼ連続消化作用を用いて、７日齢のウシの関節軟骨からＳＺＣ及びＤＺＣを単離し、６０ ｍｍの皿で２０分間５×１０６個の細胞をＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮに識別接着させた。次いで、５％ＣＯ２中３７℃で３０分間、２０μＭ ＣＦＤＡ−ＳＥ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ；ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）を用いて細胞をＰＢＳ中で標識した。無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で細胞を３０分間洗浄し、次いで１０％ＦＣＳ ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で４８時間インキュベートした。標識細胞をトリプシン処理し、プールし、計数し、いかなる添加物も含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中に、第一実験 １×１０５細胞１００μｌ−１、そして第二実験 ２．５×１０５細胞１００μｌ−１で再懸濁した。窓を開けた（ｗｉｎｄｏｗｅｄ）４日齢のニワトリ胚の胚体外管に、１００μｌ細胞懸濁液を注入した。セロテープ（登録商標）でウィンドーを封止した後、６日まで胚をインキュベートした。注入から３日及び６日後、頚管転位により胚を殺し、１０％ＮＢＦＳ中に固定し、ろう包埋するか、又は−７０℃のｎ−ヘキサン中に沈漬して冷却した。
蛍光顕微鏡を用いて、標識細胞の存在について切片を検査した。
【０１１１】
結果
発達中軟骨、例えば盃状窩を含む胚の領域内で、標識細胞が観察された（図１．２５）。低レベルの染色細胞が発達中の腱で観察された。これらの結果は、表層細胞が発達中の軟骨に結合することを示唆している。注入細胞を高感度に検出することにより、細胞のクラスター及び異所性軟骨組織の形成が発達中の胚内で示された。これらの結果は、表層細胞がインビボで軟骨組織を形成できることを示唆している（図１．２６及び１．２７）。
【０１１２】
実施例２：層状培養物の生成
実施例は、未成熟なウシの関節軟骨表層内に軟骨始原細胞群があることを示している。これらの細胞は、フィブロネクチンに対する高い親和性及びコロニー形成効率に基づいて同定された。細胞は、Ｎ１及びＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡを発現することも示された。
現在の組織工学的手法は、天然の関節軟骨の層状構造の再生を全く試みていない。これらの実施例は、層状構造の異なる組織工学的な軟骨構築物をいかにして生成するかについて、いくつかの方法を示している。実施例は、特定の領域に軟骨始原細胞が局在化した生体適合物質を生成するため、特異的な結合材料（例えばフィブロネクチン）を用いた例を示している。
本発明の実施例はさらに、本発明の層状構造が、コントロールよりも軟骨修復／成長を改善することを示す。
【０１１３】
実施例２．１：層状構造−選択肢の範囲
培養物の「層状」領域は、多くの潜在的な形状及びプロフィールを呈することができる。
成熟した被験者の軟骨と比べると、治癒の潜在能力が高いことが知られているので、軟骨が胎児段階又は新生段階にある構造を再生するというのが１つの考えである。境界層の軟骨始原細胞の濃度変化は、１段変化又は曲線的変化のどちらであってもよい、すなわち、表層は軟骨始原細胞で満たされ、残りの部分は混合成熟軟骨細胞で充填される。図２．１。
しかし、軟骨始原細胞は、移植組織を天然の軟骨と統合し、創縁周辺の細胞死を減少させるのに、より効果的であるものと予測される。統合が無いことが移植失敗の主な要因である。このため、外面だけでなく側面周辺にも軟骨始原細胞が豊富な層を持つインプラントを設計した。図２．２。
【０１１４】
【表３】
2004504835.tif 000006
【０１１５】
実施例２．２
序文
この実施態様は、線維性スカホールド、２種類の被覆粒状生体適合物質及び自己骨軟骨栓から得た細胞を組み合わせて、（ｉ）軟骨始原細胞層が装置の関節表面付近（すなわち表層内）に凝縮され、（ｉｉ）成熟した軟骨細胞層が肋軟骨下骨近く（すなわち中間層及び深層；図２．１６参照）に凝縮される層状線維強化軟骨インプラント（直径〜１．５ｃｍ及び厚さ４ ｍｍ）を形成する。 この方法は、最初に得た組織の体積より１８．４倍大きい構造物を生成する。
【０１１６】
骨髄間質細胞分離
方法
ウシの新生中足指節関節を無菌的に切開し、Ａｃｕｆｅｘ円筒形のみを用いて、直径３．５ ｍｍ×深さ５ ｍｍの骨軟骨栓を関節表面から手動で抽出した。骨軟骨栓の骨部から骨髄間質細胞を得た。メスで軟骨から骨を切り離し、ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ（３ｍｌ）中で０．０８％コラゲナーゼにフラグメント化し（ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎタイプＩＩ）、激しく撹拌して３７℃で９０分間インキュベートし、骨髄細胞懸濁液を放出した。次いで、骨片を再撹拌し、上澄みを回収して、骨片の３つのＰＢＳ洗浄液と合わせた。プールされ、回収された骨髄細胞を遠心分離し（１０００ｒｐｍ；５分間）、ＰＢＳ中で洗浄し、再遠心分離して（１０００ｒｐｍ；５分間）、細胞ペレットをＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（５ｍｌ）中に再懸濁させた。５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、６ウェルプレートのウェル内で、放出された細胞を、接着細胞が融合性になるまで（通常６日間）３７℃でインキュベートした。接着線維芽細胞をＰＢＳで洗浄して、非接着造血細胞を取り除き、トリプシンを用いて残屑及び線維芽細胞を回収した。
単一の骨軟骨栓から得た回収済（「第１継代」）骨髄間質細胞を使用して、二層構造物の１層を生成するのに十分な、４．１２５ ｍｇの細胞接着因子被覆スルフェートイントラサイトを植えつけた。
【０１１７】
結果
新たに培養された骨髄細胞分離物は、多くの赤血球、非接着造血細胞、残屑ならびに不定期接着線維芽及びマクロファージ様細胞で構成された。組織培養プラスチック上で培養すると、接着線維芽細胞は急速に増殖し、それによって、利用可能な軟骨始原細胞数が増した。３．５ ｍｍ骨軟骨栓由来の典型的な培養物は、〜６日目後、骨髄間質細胞の１０ ｃｍ２融合単層を生成した（一般的に５００，０００〜７５０，０００回収済細胞）。
【０１１８】
ウシの新生軟骨細胞の分離
方法
ウシの新生中足指節関節を無菌的に切開し、Ａｃｕｆｅｘ円筒形のみを用いて、直径３．５ ｍｍ×深さ５ ｍｍの骨軟骨栓を関節表面から手動で抽出した。栓の上軟骨部から軟骨細胞を得た。軟骨を骨から切断し、スライスして、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、上記のとおり）及び５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ； ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ）を補足したＤＭＥＭ中で、コラゲナーゼ（０．１％；３ ｍｌ；ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎタイプＩＩ）を含む玉（ｂｉｊｏｕ）に移した。５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、静かに混合しながら、組織を３７℃で１６時間消化し、軟骨細胞の懸濁液を放出した。放出された細胞を、７０μｍナイロンメッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで１０ｍｌに希釈し、遠心分離して（１０００ｒｐｍ；５分間）、上澄みを廃棄し、洗浄工程を繰り返した。
【０１１９】
単一の骨軟骨栓の軟骨から得た軟骨細胞を使用して、二層構造物の一層を生成するのに十分な、４．１２５ ｍｇの細胞接着因子被覆スルフェートイントラサイトを植えつけた。
結果
直径３．５ ｍｍの軟骨栓は６６８±８５×１０３個の軟骨細胞を放出した（通常、１外植片当たり５００〜９００×１０３細胞）
【０１２０】
血漿フィブロネクチン又はＦＣＳから吸着された細胞付着分子の混合物を用いたスルフェートイントラサイトの生成及び被覆
スルフェートイントラサイトゲル（構造物の一層当たり４．１２５ ｍｇ；ＰＢＳ中６．５ ｍｇ／ｍｌ）を調製し、実施例４に記載するように滅菌した。ＤＭＥＭ（５００ ｍｌ）、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；５ ｍｌ）、非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ；５ ｍｌ）ならびにＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ；５ ｍｌ）を混合して無血清ＤＭＥＭを生成した。
オートクレーブしたスルフェートイントラサイトをＰＢＳで４０ ｍｌに希釈し、遠心分離し（２５００ｒｐｍ；５分）、上澄み３０ ｍｌを除去して、３０ ｍｌの無血清ＤＭＥＭを添加した。管を遠心分離し（２５００ｒｐｍ；５分）、上澄みを除去して、２．５ ｍｌの液体中に生体適合物質を残した。細胞付着因子（例えば、血漿フィブロネクチン；６０μｇ／ｍｌ）、ＰＢＳ賦形剤又はウシ胎児血清（１０％）を添加し、管を４℃で２時間激しく混合した。
【０１２１】
血漿フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト上での骨髄間質細胞の付着及び成長
方法
アスコルビン酸２リン酸（最終２５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）をＤＭＥＭ中に溶解し（Ｓｉｇｍａ）、濾過滅菌し（０．２μｍ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン及び１０％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＡＳＣＰ）に添加した。
直径３．５ ｍｍの骨軟骨栓から得たトリプシン処理済骨髄間質細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＡＳＣＰ（２０ｍｌ）中で、血漿フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトゲル（４．１２５ｍｇ）に添加した。最初の２時間、培養物を時々混合して、植え付けをより均一にし、次いで、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で１０日間インキュベートした。
【０１２２】
培養培地にＭＴＴ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を２．５時間添加し、試料をＰＢＳ中で洗浄し、位相差顕微鏡で細胞を観察して、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト上に成長する骨髄間質細胞の生存度を評価した。さらに、カルセインＡＭを添加し（０．６μｌ／ｍｌ；１ ｍｇ ｍｌ；９０分；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡を用いて標本を観察して、細胞生存度を測定した。
組織染料ピクロシリウスレッドを用いて、コラーゲンマトリクスの沈着を評価した。細胞を植え付けた生体適合物質の試料（２００μｌ）をリン酸緩衝ホルマリンで固定し、ＰＢＳで洗浄して（２×３ ｍｌ）、ピクロシリウスレッド（１ｍｌ、３０分；１００ｍｌ飽和水性ピクリン酸中０．１ｇシリウスレッド；Ｓｉｇｍａ）で染色した。ＰＢＳ中で試料を１６時間繰り返し洗浄し、特異的に結合していない染料を除去し、顕微鏡検査で観察した。
【０１２３】
Ｉ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンの生成を免疫細胞学により測定した。骨髄間質細胞を植え付けた、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトを、２０ｍｌ ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＡＳＣＰ中で１０日間インキュベートし、ＰＢＳ中で３回洗浄して（１０ｍｌ；２５００ｒｐｍで遠心分離；５分）、メタノール中で固定した（−２０℃；１０分）。試料をＰＢＳで２回洗浄し（１０ｍｌ；２５００ｒｐｍで遠心分離；５分）、ＢＳＡでブロックして（ＰＢＳ中３％ｗ／ｖ；５ｍｌ；３７℃で１時間）、ＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、抗コラーゲン抗体又は同濃度及び同体積の非免疫性イムノグロブリンと標本を３７℃で１時間インキュベートした〔すなわち、ウサギ抗Ｉ型コラーゲン抗体（ＰＢＳで２０μｌ を１０中１希釈；２００μｌ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、非免疫ウサギ血清コントロール（ＰＢＳで２０００中１希釈；２００μｌ；Ｄａｋｏ）、マウス抗ＩＩ型コラーゲン抗体（２００中１希釈；５００μｌ；Ｎｅｗ Ｍｒｋｅｒｓ）又は非免疫マウス血清（１００中１希釈；５００μｌ；Ｄａｋｏ）のいずれか〕。次いで、標本をＰＢＳ中で３回洗浄した。標本及びそのコントロールを、「Ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ」（２μｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えたブタ抗ウサギイムノグロブリンＦＩＴＣと３７℃で１時間インキュベートして、抗Ｉ型コラーゲン抗体を視覚化した。
【０１２４】
標本又はそのコントロールを、ビオチニル化ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ＰＢＳ中１００中１；Ｄａｋｏ）と３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で３回洗浄し、３７℃で３０分間「Ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ」（２μｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えたストレプトアビジンＦＩＴＣ（ＰＢＳ中、１００中１希釈；Ａｍｅｒｓｈａｍ）中でインキュベートして、抗ＩＩ型コラーゲン抗体を視覚化した。
試料をＰＢＳ中で３回洗浄し、Ｌｅｉｃａ顕微鏡及びスポットカメラを用いて観察した。
【０１２５】
結果
骨髄間質細胞を、細胞接着因子被覆スルフェートイントラサイトに１６時間以内で接着させ（図２．３）、増殖させて、最初に粒状生体適合物質の表面を覆い、次いで細胞、生体適合物質及び細胞外マトリクス成分の巨視的クラスターに凝集させた。カルセイン ＡＭ染色は、４日後の物質表面に接着細胞群を示したのに対して（図２．４）、ピクロシリウスレッドは、培養７日後にコラーゲンマトリクスの沈着を示した（図２．５）。
免疫細胞化学では、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト上に培養された骨髄間質細胞の標本内でのＩ型コラーゲンの生成が１０日後に示された（図２．６）。コラーゲンＩＩの生成の形跡は観察されなかった（図２．７）。
【０１２６】
ウシ胎児血清から吸着された細胞接着因子で被覆されたスルフェートイントラサイト上でのウシの新生軟骨細胞の付着及び成長
方法
アスコルビン酸２リン酸（最終２５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）をＤＭＥＭ中に溶解し（Ｓｉｇｍａ）、濾過滅菌し（０．２μｍ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン及び１０％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＡＳＣＰ）に添加した。
スルフェートイントラサイトゲル（４．１２５ｍｇ）を、ウシ胎児血清から吸着された細胞付着因子で被覆した。直径３．５ｍｍの骨軟骨栓の骨部からウシの新生軟骨細胞を得た。細胞及び被覆ゲルをＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＡＳＣＰ（２０ｍｌ）中で合わせ、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で２７日間までインキュベートした。培養物を、最初の２時間時々混合して植え付けをより均一にした。
【０１２７】
細胞を植え付けた材料をＭＴＴ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）と２時間インキュベートし、リン酸緩衝ホルマリンで試料を固定して（２ｍｌ；１５分）、細胞生存度を確認した。管をＰＢＳで洗浄し（２×５分；１０ｍｌ；２５００ｒｐｍで遠心分離；５分）、サフラニン Ｏ（０．１％水性１ｍｌ）を２．５時間添加した。ＰＢＳで試料を３回洗浄し、ＰＢＳ中に４℃で１６時間保管して、非特異的に結合した染料を溶離させた。試料をＰＢＳ中で２回洗浄し、顕微鏡スライドに移し、Ｌｅｉｃａ顕微鏡を用いて観察した。スポットカメラを用いて撮像した。　組織染料ピクロシリウスレッドを用いてコラーゲンマトリクスの沈着を評価した。細胞を植え付けた生体適合物質の試料（２００μｌ）をリン酸緩衝ホルマリンで固定し、ＰＢＳで洗浄し（２×３ｍｌ）、ピクロシリウスレッドで染色した（１ｍｌ、３０分；１００ｍｌ飽和水性ピクリン酸中０．１ｇシリウスレッド；Ｓｉｇｍａ）。試料をＰＢＳ中で１６時間繰り返し洗浄し、非特異的に結合している染料を除去し、顕微鏡法により観察した。
【０１２８】
Ｉ型、ＩＩ型及びＶＩ型コラーゲンの生成を免疫細胞化学により評価した。
軟骨細胞を植え付けた、被覆スルフェートイントラサイトをＰＢＳ中で３回洗浄し、試料をメタノール中で固定し（−２０℃；１０分）、標本をＰＢＳ中で３回洗浄して、ＩＩ型コラーゲンの生成を評価した。次いで、ＢＳＡ（ＰＢＳ中３％ ｗ／ｖ；１０ｍｌ）を管に３７℃で１時間添加した。ゲルをＰＢＳ中で３回洗浄し、３７℃で１時間、マウス抗ウシＩＩ型コラーゲン抗体（ＰＢＳ中、２００中１希釈；５００μｌ；Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）又は同濃度の非免疫マウスイムノグロブリン（１００中１希釈；５００μｌ；Ｄａｋｏ）のいずれかで処理した。管をＰＢＳ中で３回洗浄し、ビオチニル化ウサギ抗マウスイムノグロブリンを添加した（ＰＢＳ中、１００中１希釈；５００μｌ；Ｄａｋｏ）。管をＰＢＳ中で３回洗浄し、「Ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ」（２μｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えたストレプトアビジンＦＩＴＣ（ＰＢＳ中、１００中１；５００μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を３０分間添加した。試料をＰＢＳで３回洗浄し、Ｌｅｉｃａ顕微鏡及びスポットカメラを用いて観察した。
【０１２９】
軟骨細胞を植え付けた被覆スルフェートイントラサイトをＰＢＳで３回洗浄し、材をＢＳＡに分散させて（ＰＢＳ中３％ ｗ／ｖ；１０ｍｌ；１時間；Ｓｉｇｍａ）ブロッキングすることにより、ＶＩ型コラーゲンの生成を実証した。材をＰＢＳ中で３回洗浄し、上澄みを除去して、ウサギ抗ヒトコラーゲンＶＩ（ＰＢＳ中、５０中１希釈；Ａｂｃａｍ）又は同濃度の非免疫ウサギＩｇＧ（ＰＢＳ中、１０００中１；Ｄａｋｏ）のいずれかで試料を３７℃で１時間インキュベートした。試料をＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ標識ブタ抗ウサギイムノグロブリン（１００中１希釈；１時間；３７℃；Ｄａｋｏ）中でインキュベートした。試料をＰＢＳ中で３回洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。
【０１３０】
軟骨細胞を植え付けた被覆スルフェートイントラサイトをＰＢＳ中で３回洗浄し、試料をメタノール中で固定して（−２０℃；１０分）、標本をＰＢＳ中で３回洗浄して、Ｉ型コラーゲンの生成を評価した。次いで、ＢＳＡ（ＰＢＳ中３％ ｗ／ｖ；１０ｍｌ）を管に３７℃で１時間添加した。ゲルをＰＢＳ中で３回洗浄し、３７℃で１時間、ウサギ抗ウシＩ型コラーゲン抗体（ＰＢＳで１０中１希釈；２００μｌ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は同濃度の非免疫ウサギイムノグロブリン（ＰＢＳで２０００中１希釈；２００μｌ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）のいずれかで処理した。管をＰＢＳ中で３回洗浄し、３７℃で１時間、ＥｔＢｒＨＤ（２μｌ；Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を加えたＦＩＴＣ標識ブタ抗ウサギイムノグロブリン（ＰＢＳ中に１００中１希釈；Ｄａｋｏ）中でインキュベートした。試料をＰＢＳ中で３回洗浄し、Ｌｅｉｃａ顕微鏡及びスポットカメラを用いて観察した。
【０１３１】
結果
軟骨始原細胞は、被覆スルフェートイントラサイト粒子に接着し、粒子上で増殖して、細胞、生体適合物質及び細胞外マトリクス成分の凝集体を形成した。軟骨細胞により形成された凝集体は、肉眼で見ると間質細胞により形成されたものよりも大きく、それらが多くのマトリクスを合成していたことを示している。ＭＴＴ染色は、材粒子の表面上及びそれらの間の空間の両方で、凝集体全体にわたる生存細胞を示した（図２．８）。ピクロシリウスレッドは、細胞が凝集体内にコラーゲンマトリクスを沈殿させたことを示した（図２．９ａ）。凝集体内の細胞は、軟骨細胞表現型の保持率と一致する完全な形態学を持っていた。
【０１３２】
免疫細胞学化学は、軟骨特定形のコラーゲンであるＩＩ型コラーゲンを軟骨細胞が発現したことを示した（図２．９ｂ）。この知見は、被覆生体適合物質上で成長する細胞が軟骨細胞表現型を培養物内で保持していることを立証した。免疫細胞化学は、軟骨細胞が、その細胞周囲マトリクスにＶＩコラーゲンを分泌していたことをさらに示した（図２．１０）。この分子は、成熟軟骨細胞を直接囲む周囲の重要成分であり、細胞をマトリクスに結びつけると考えられる。
重要なことであるが、免疫細胞化学は、軟骨細胞が培養２７日後もコラーゲンＩを生成していなかったことを示した（図２．１１）。この知見は、培養の初期段階（細胞が急速に増殖していた時）又は後の時点のいずれかの間、軟骨細胞が脱分化していなかったことを示した。
【０１３３】
ＦＣＳ前処理済スルフェートイントラサイト及びＦＣＳ前処理済ＤｘＳ上でのヒツジ軟骨細胞の増殖速度の定量
スルフェートイントラサイトゲル（１００ｍｇ）又はデキストランスルフェートビーズ（１００ｍｇ；ＤｘＳ；Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳ（１５．３８ｍｌ）で再水和し、オートクレーブで滅菌した（１２１℃；１５分）。コラゲナーゼを用いて、新鮮な軟骨からヒツジの関節軟骨を単離した（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中０．２％ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎタイプＩＩ）。
無菌ゲル／ビーズ懸濁液に渦を作り、Ｆａｌｃｏｎ ５０ｍｌ遠心管にアリコートし（１０ｍｌ）、ＰＢＳで４０ｍｌに希釈した。管を遠心分離し（２５００ｒｐｍ、５分）、上澄み３０ｍｌを破棄した。ＰＢＳ洗浄工程を繰り返し、ウシ胎児血清１５ｍｌ（多価アニオン結合細胞付着糖タンパク質の源、例えばフィブロネクチン及びビトロネクチン）をゲル／ビーズに添加して、管を２時間インキュベートした。次いで、血清前処理済懸濁液をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで４０ｍｌに希釈し、遠心分離し（２５００ｒｐｍ、５分）、更なるアリコートのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（３０ｍｌ）で洗浄し、再遠心分離して、上澄み３０ｍｌを除去した。
【０１３４】
血清前処理済スルフェートイントラサイトゲル、血清前処理済ＤｘＳビーズ又はＤＭＥＭ／ＦＣＳ（１０ｍｌ）のみを含むＦａｌｃｏｎ管に、新たに単離したヒツジの軟骨細胞（１０ｍｌＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中２．５×１０６細胞）を添加し、培養物を時々混合しながら３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞を植え付けた粒子を１０個のＦａｌｃｏｎ管の群にアリコートし（２ｍｌ）、アスコルビン酸２リン酸（２５μｇ／ｍｌ）を含む２３ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを各管に添加した。培養物にフィルタ蓋をかぶせ、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で３日、１０日及び１６日間改質Ｓｐｉｒａｒａｃｋ上でインキュベートした。
【０１３５】
インキュベート期間の終わりに、ＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ； ４００μｌ）を管に添加し、ヒツジの軟骨細胞の標準曲線に、培養物を９０分間インキュベートした。培養物を次いで遠心分離し（３０００ ｒｐｍ； ５ ｍｉｎ）、ＰＢＳで３回洗浄し、上澄みを除去して、最終量を４００μｌとした。酸イソプロパノール（４％ １Ｍ ＨＣｌ含有イソプロパノール；１．６ｍｌ）を各管に添加し、培養物を２時間混合した。次いで、３つの２００μｌアリコートを各管から回収し、９６ウェルプレートのウェルに移し、６５５ｎｍの基準に対する５７０ｎｍの吸収度を読み取った。
結果
データは、ヒツジの軟骨細胞が、最初の１０日間に最も急速に増殖して、インキュベート期間の間に１４・４倍に増殖したことを示した（図２．１２参照）。血清前処理済ＤＸＳビーズ上に成長する培養物又は懸濁液培養物中に成長する軟骨細胞では、低い成長率が観察された。
【０１３６】
二層構造のための培養装置及び概略方法
二層構造は、（ｉ）骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト、及び（ｉｉ）軟骨細胞を植え付けた被覆スルフェートイントラサイトをスカホールドに順次的に遠心分離して、二層線維強化細胞／生体適合物質構造を形成することにより形成される。用いた装置及び方法の概要を図２．１３に示す。
【０１３７】
図２．１３のパネル（１）に示す管は、遠心分離中にスカホールドを支える空隙充填寒天栓（２．１）；層状構造物を形成するために細胞を植え付けた粒子を遠心分離する機械的に頑強なスカホールド（２．２）；菅内の正確な位置にスカホールドを維持する「不均整環」（２．３）；ならびに多量の培養培地（２．４）及びガスを交換させる０〜２μｍフィルターを備えた蓋（２．５）を含む。パネル２は、骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト（２．６）の培地への導入を示す。管の遠心分離は、骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトを、構造物の関節表面付近の圧縮層に沈降させる（パネル３、（２．７））。軟骨細胞を植え付けたＦＣＳ被覆スルフェートイントラサイトの次の添加（２．８）をパネル（３）に示す。管を再遠心分離して、軟骨細胞を植え付けたＦＣＳ被覆スルフェートイントラサイト（２．９）を、骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトの層（２．７）の上に沈降させ、スカホールド内に細胞材料の二重層を形成する（パネル４（２．９））。得られた構造物を環と一緒に管から除き、環から外し、逆さにして軟骨欠損部位に埋め込む。構造物の重要な特徴、すなわち、スカホールド／構造物の関節表面５（２．１０）；軟骨始原細胞の豊富な表層５（２．１１）；成熟軟骨細胞で占められた中間層及び深層５（２．１２）及び装置の骨対向面５（２．１３）をパネル５の拡大図に示す。
【０１３８】
パネル６は、鋭く切除した局所関節軟骨欠損への装置の埋め込みを示す（６（２．１４））。パネル６（２．５）は、関節の関節表面；６（２．７）関節軟骨；６（２．１６）肋軟骨下骨板の上面を示す。
実験目的のため、スカホールドを、７０μｍナイロンメッシュに接着したプラスッチク環からなる「かご（ｂａｓｋｅｔ）」と取り替えてもよい。これは沈殿した細胞／材のペレットを回収し、コントロールとして使用可能である。
「不均整環」は、管内の正しい位置にスカホールドを維持し、細胞を植え付けた材を遠心分離中にスカホールドに注ぎ込むよう設計されている。細胞を植え付けた生体適合物質の多くは、遠心分離中（すなわち回転子が加速している間）、急速に沈殿することに留意されたい。結果として、細胞／材ペレットは、管の中線から離れて蓄積される。遠心分離機回転子の回転方向及び回転子の放射軸に関連する「不均環」の正しい方向づけを図２．１４に示す。
【０１３９】
染色スルフェートイントラサイトゲルの２つの試料を用いた二層形成の実証
方法
アガロース（ＰＢＳ中４％ ｗ／ｖ； Ｓｉｇｍａ）をマイクロ波で溶融し、Ｆａｌｃｏｎ管の底にアリコートして（５ｍｌ）、４℃で凝固させた。「かご」を「不均整環」にはめ込み、寒天栓の上に置き、図２．１６に示すように方向づけし、装置を６０℃の水浴中に入れた。スルフェートイントラサイト（３．８ｍｌ ＰＢＳ中２４．７５ｍｇ）をサフラニン Ｏ（０．１％水性； １ｍｌ）又はトルイジンブルー（ＰＢＳ中０．０１％）のどちらかで３０分間４℃で染色した。染色されたゲルを、次いでＰＢＳ（２５ｍｌ）で希釈し、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、上澄みを除去し、染色された材料をＰＢＳで６ｍｌに希釈し、６０℃の水浴中に入れた。アガロース（ＰＢＳ中１．５％）をマイクロ波で溶融し、水浴中で６０℃に上げた。溶融されたアガロース（２２．５ｍｌ； １．５％； ６０℃）を不均整環を含む管に添加し、１ｍｌのサフラニンＯ染色スルフェートイントラサイトゲルを慎重に溶融寒天にピペットで移した。次いで管を封し、遠心分離機回転子内で方向づけ、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離してサフラニンＯ染色材料を沈殿させた。次いで管を水浴中に戻し、１ｍｌのトルイジンブルー染色スルフェートイントラサイトを慎重に溶融寒天にピペットで移した。管を次いで回転子内で再び方向づけ、再遠心分離して（２５００ｒｐｍ；５分）青色染色ゲルをオレンジ染色ゲル上に沈殿させた。管の内容物を次に４℃で１６時間凝固させた。アガロース及び沈殿された染色スルフェートイントラサイトの栓をかごから切除し、解剖顕微鏡を用いて観察した。
【０１４０】
結果
図２．１５は、この装置及び方法を用いた、染色スルフェートイントラサイトの二層の沈着を示す。サフラニンＯで染色されたオレンジの材は図の上層を形成するのに対して、トルイジンブルー染色スルフェートイントラサイトは下層を形成する。（この実験で粒子を一緒に結合する）アガロース栓は、顕微鏡写真の下層で認識できる。
【０１４１】
細胞を植え付けたスルフェートイントラサイトゲルの２つの試料を用いた、二層形成の実証
方法
細胞を植え付けた２つの生体適合物質の試料（すなわち、（ｉ） 骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト及び（ｉｉ）軟骨細胞を植え付けたＦＣＳ被覆スルフェートイントラサイト）を遠心分離し（２５００ｒｐｍ； ５分）、試料をＰＢＳで洗浄した（１０ｍｌ； ２５００ｒｐｍ； ５分）。標本をメタノール中に固定し（−２０℃； １０ｍｌ； １０分； Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰＢＳ中で３回洗浄し（１０ｍｌ； ２５００ｒｐｍ； ５分）、上澄み９ｍｌを管から除去した。骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトをグリーンの核染色ピコグリーンで染色した（１０μｌ； ３０分； ４℃；暗い； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。軟骨細胞を植え付けたＦＣＳ被覆スルフェートイントラサイトをレッド核染色、ＥｔＢｒＨＤで染色した（５μｌ； ３０分； ４℃； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。試料をＰＢＳで３回洗浄し（２５００ｒｐｍ；５分）、上澄みを除去して試料を６０℃の水浴中に入れた。
【０１４２】
アガロース（ＰＢＳ中４％ ｗ／ｖ； Ｓｉｇｍａ）をマイクロ波で溶融し、Ｆａｌｃｏｎ管の底にアリコートして（５ｍｌ）、４℃で凝固させた。「かご」を「不均整環」にはめ込み、寒天栓の上に置いて、図２．１４に示すように方向づけし、装置を６０℃の水浴に入れた。溶融アガロース（２０ｍｌ； １．５％； ６０℃）を、不均整環を含む管に添加し、ピコグリーン染色骨髄間質細胞／生体適合物質凝集物をゲルの上にピペットで移した。次いで管を封し、遠心分離機回転子内で方向づけ、遠心分離して（２５００ｒｐｍ；５分）間質細胞を植え付けた材を「かご」に沈殿させた。ＥｔＢｒＨｄ染色軟骨細胞／生体適合性物質を次いでアガロースの上にピペットで移し、管を再遠心分離した（２５００ｒｐｍ；５分）。次いで管の内容物を１６時間４℃で凝固させた。アガロースの栓及び沈殿し、染色された、細胞を植え付けたスルフェートイントラサイトをかごから切除し、二等分してＬｅｉｃａ顕微鏡を用いて観察した。スポットカメラを用いて撮像した。
【０１４３】
結果
図２．１６は （ｉ）ピコグリーンで染色された、骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトの層及び（ｉｉ）ＥｔＢｒＨＤで染色された、軟骨細胞を植え付けた被覆スルフェートイントラサイトの層からなる、輪郭がはっきりし、よく凝固された二層構造物を、本方法及び装置が生成したことを示す。
【０１４４】
生存可能な二層構造の生成
細胞を植え付けた２つの生体適合性物質の試料（すなわち、（ｉ）骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト及び（ｉｉ）軟骨細胞を植え付けたＦＣＳ被覆スルフェートイントラサイト）を遠心分離し（２５００ｒｐｍ；５分）、上澄みを除去して約１ｍｌの培地に植種生体適合物質を残した。
【０１４５】
アガロース（ＤＭＥＭ中４％ ｗ／ｖ； Ｓｉｇｍａ）をマイクロ波で溶融し、Ｆａｌｃｏｎ管の底にアリコートして（５ｍｌ）、４℃で凝固させた。「かご」を「不均整環」にはめ込み、ＰＢＳ中の６０％アセトンに浸漬して滅菌し、寒天栓の上において、図２．１４に示すように方向づけた。ＤＭＥＭ１０％ ＦＣＳ（２０ｍｌ）を管に添加し、骨髄間質細胞を植え付けた、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトを慎重に管にピペットで移した。次いで、遠心分離機回転子内で装置を方向づけ、遠心分離して（２５００ｒｐｍ；５分）、材の第一層を沈殿させた。次いで、軟骨細胞を植え付けた、ＦＣＳ被覆スルフェートイントラサイトを、既存の層を妨害することなく慎重にピペットで管に移し、管を再遠心分離した（２５００ｒｐｍ；５分）。「環及びかご」を次いでＦａｌｃｏｎ管から抜き取り、沈殿した細胞を含む「かご」を「環」から取り外し、５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを含む６ウェルプレートのウェルに細胞／材の凝集物を慎重に移して、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、培養物を３７℃でインキュベートした。
【０１４６】
実施例２．２のエックスビボ評価
方法
全層関節軟骨の一組のストリップ（５ｍｍ×〜４０ｍｍ）をウシの新生蹄の中手指節関節から切除し、メスで横切して、３外植片（それぞれ５ｍｍ×１０ｍｍ）の群を２つ作った。バイオプシーパンチ（直系３．５ｍｍ；Ｓｔｉｅｆｅｌ）を用いて、各群の２つの軟骨外植片において円柱状の全層欠損を切り取り、負傷したトロイドの外植片及び負傷していない外植片を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（８ｍｌ）を含む６ウェルプレートのウェルに移した。　（ｉ）骨髄間質細胞を植え付けた、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト及び（ｉｉ） 軟骨細胞を植え付けた、ＦＣＳ被覆スルフェートイントラサイトの試料を遠心分離し（２５００ｒｐｍ；５分）、上澄みを除去して、約１ｍｌの培地に植種生体適合物質を残した。
【０１４７】
アガロース（ＤＭＥＭ中４％ ｗ／ｖ； Ｓｉｇｍａ）をマイクロ波で溶融し、Ｆａｌｃｏｎ管の底にアリコートし（５ｍｌ）、４℃で凝固させた。直径３ｍｍのポリカプロラクトン再強化３Ｄニットのスカホールド（Ｃｕｌｚｅａｎ）を「不均整環」にはめ込み、ＰＢＳ中の６０％アセトンに浸漬して滅菌し、寒天栓の上に置いて、図２．１４に示すように方向づけた。ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（２０ｍｌ）を管に添加し、骨髄間質細胞を植え付けたフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトを慎重にピペットで管に移した。次いで、遠心分離機回転子内で装置を方向づけ、遠心分離して（２５００ｒｐｍ；５分）、材の第一層をスカホールドの表層に沈殿させた。次いで、軟骨細胞を植え付けたＦＣＳ被覆スルフェートイントラサイトを、間質細胞層を邪魔することなくピペットで慎重に管に移し、管を再遠心分離した（２５００ｒｐｍ；５分）。「環及びスカホールド」を次いでＦａｌｃｏｎ管から取り出し、細胞を植え付けたスカホールドを「環」から取り外して逆さにし、軟骨外植片の直径３ｍｍの欠損に挿入した。
【０１４８】
アスコルビン酸２リン酸（２５μｇ／ｍｌ）を補足した８ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを含む６ウェルプレートの３つのウェルに、単一の軟骨ストリップの３つの外植片群（すなわち、傷ついていないもの１つ、空の欠損を持つもの１つ、及び細胞を植え付けた二層構造を含む欠損を持つもの１つ）を移し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、培養物を３７℃で０〜１４日間インキュベートした。
インキュベート期間の終わりに、（ｉ）標本内の生存可能及び生存不能細胞の分布を測定するための生／死染色法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、（ｉｉ）試料の一般的な形態、細胞充実性及びマトリクス成分を視覚化するための組織学ならびに（ｉｉｉ）どの細胞がＩＩ型コラーゲン（すなわち、正常な表現型の軟骨細胞）又はＩ型コラーゲン（線維芽細胞、始原細胞及び脱分化軟骨細胞）を発現しているか決定するための免疫細胞化学を用いて、試料を分析した。
【０１４９】
生存度測定のため、試料を二等分し、カルセインＡＭ（０．６μｌ／ｍｌ；９０分；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とＥｔＢｒＨＤ（１０μｌ；９０分）を組み合わて染色し、試料をＰＢＳ中で洗浄し（３×１５分）、切断面の上に置いて、標本の１００μｍの光学断面を共焦点顕微鏡で観察した。
組織学については、培地を取り除き、１０％ホルマール緩衝食塩水中で試料を固定し（０．５ｍｌ； ２４時間）、ＶＩＰプロセッサ上で加工し、ろう包埋し、Ｌｅｉｃａミクロトームで切断した（５μｍ）。組織学的分析のため、標本を脱ろうし、再水和してサフラニンＯ（０．１％、６分）、ピクロシリウスレッド（飽和アルコール性ピクリン酸中０．１％、９０分）、トルイジンブルー（０．５％；１５秒）、又はヘマトキシリン及びエオシン（Ｇｉｌｌｓ ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ、６分及びアルコール性エオシン、４分）のいずれかで染色した。Ｈｉｓｔｏｍｏｕｎｔを用いて標本を載せ、Ｌｅｉｃａ顕微鏡ならびにスポットカメラ及び関連ソフトウエアを用いて撮像した。
【０１５０】
免疫細胞化学分析のため、スライドを脱ろうし、再水和してＤａｋｏ ＨＭＡＲ（熱媒介抗原回復システム；Ｄａｋｏ）にかけた。Ｉ型コラーゲン検出のため、ブタの血清中でスライドをブロックし（２．５％、室温で２０分；Ｄａｋｏ）、ＰＢＳ中で完全に洗浄し、ウサギポリクローナル抗Ｉコラーゲン抗体（１０μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は同濃度の非免疫ウサギＩｇＧイムノグロブリン（Ｄａｋｏ）のどちらかに４℃で一晩浸漬した。スライドを次いでＰＢＳ中で洗浄し、ブタの抗ウサギビオチニル化二次抗体に浸漬し（１：１００；室温で３０分；Ｄａｋｏ）、ＰＢＳ中で洗浄し、ストレプトアビジンテキサスレッドに浸漬し（１：１００、室温で３０分；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＰＢＳ中で洗浄して蛍光用にＶｅｃｔｏｒｍｏｕｎｔを用いて載せ、カバーガラスで覆った。
【０１５１】
ＩＩ型コラーゲン検出のため、ウサギ血清中でスライドをブロックし（２．５％、室温で２０分；Ｄａｋｏ）、ＰＢＳ中で完全に洗浄し、マウスモノクローナルＩＩコラーゲン一次抗体（１μｇ／ｍｌ；Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）又は同濃度の非免疫マウスＩｇＧ免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）のどちらかに４℃で一晩浸漬した。スライドを次いでＰＢＳ中で洗浄し、ウサギ抗マウスビオチニル化二次抗体に浸漬し（１：１００；室温で３０分；Ｄａｋｏ）、ＰＢＳ中で完全に洗浄し、ストレプトアビジン ＦＩＴＣに浸漬し（１：１００；室温で３０分；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＰＢＳ中で完全に洗浄して、蛍光用にＶｅｃｔｏｒｍｏｕｎｔを用いて載せ、カバーガラスで覆った。
【０１５２】
結果及び考察
欠損のない外植片は、分散している死細胞を外植片の鉱化底部で、そして限られた数の死細胞を表層面に沿って示したことを除いては、生存細胞を組織全体にわたって示した。マトリクスは、サフラニン Ｏ及びトルイジンブルーで強度のメタクロマチック染色（グリコサミノグリカンリッチなマトリクスの存在を示す）、ピクロシリウスレッドで赤染色（コラーゲンの存在を示す）及びＨ＋Ｅで形態学的に正常な軟骨的様相を示した。
空の欠損を持つ試料は、輪郭のはっきりした、広帯域の細胞死を創縁に沿って示した。Ｈ＋Ｅ染色は、この層で核が縮んだ形態学的壊死細胞を示したのに対して、サフラニン Ｏ及びピクロシリウスレッドは、傷の端部付近のマトリクス染色の損失を示した。少数の標本において、約６日間培養後、欠損の底部の鉱化組織から軟骨の切断表面にわたって細胞が移動するのが観察された。これらの移動細胞は、剥離関節形成術、外科的微小骨折又は肋軟骨下骨板の穿孔の後に、軟骨欠損を埋める細胞と同類である可能性がある。
【０１５３】
インプラントを含む試料は、インプラント及び周辺軟骨の中間／深層内の軟骨細胞によるコラーゲンＩＩの産生に加えて、装置の表層内での限られた量のコラーゲンＩ染色を示した。周辺軟骨組織よりはかなり低レベルではあったが、組織学的染料でコラーゲンとグリコサミノグリカンの双方を染色されたインプラント中のマトリクスは、周辺軟骨組織で確認された。形態学的データは、生存細胞が創縁上に成長していたことを示したが、これらの細胞が外植片の底部から発生したのか又はこれら実験のインプラントから発生したのかを断定的に述べることはできなかった。さらに、細胞死の層が減少し、マトリクス損失の程度が低下したように思われた。全般的に言えば、結果は、これらの方法を用いて生成された層状スカホールド強化インプラントが局所全層軟骨損傷に移植され、軟骨修復を促進するのに使用できるという仮説と一致する。
【０１５４】
実施例２．３
序文
この実施例の目的は、層状インプラントを生成するのに、選択された材への表層軟骨始原細胞の早期の結合速度がどのように使用されるかを示すことである。インプラントの層の１つは軟骨始原細胞が豊富であるのに対して、残りの層は涸渇している。この実施例では、高い割合の早期結合表層軟骨始原細胞が付着するが、成熟軟骨細胞の大半は許容時間中に付着できないような限られた時間のあいだ、フィブロネクチンで被覆された線維スカホールドに細胞の混合群（すなわち表層、中間層及び深層）を植えつける。その時間内に付着しない細胞（すなわち、成熟細胞）は別のフェルトに植えつけ、接着させる。次いで２つのスカホールドをまとめて、２層培養物を形成する。最初のフェルトは、表層軟骨始原細胞が豊富である。表層軟骨始原細胞は、Ｎ１の免疫染色により同定される。
【０１５５】
実験
針フェルト（ｎｅｅｄｌｅ−ｆｅｌｔ）の被覆
１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＣａＣｌ２を有するダルベッコのＰＢＳ中の血漿フィブロネクチン１０μｇ／ｍｌで、密度６２ｍｇ／ｃｃの、厚さ０．５ｍｍ直径１０ｍｍのＰＥＴ針フェルト（バッチ番号ＥＴ２１６／２００／４／１）を４℃で一晩被覆した。さらに、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭで、密度が４５ｍｇ／ｃｃの直径１０ｍｍ、厚さ２ｍｍのＰＥＴ針フェルト（バッチ番号ＰＳ０３２４／０４）を４℃で一晩被覆した。細胞植え付けの前に、０．５ｍｍの針フェルトを１％ＢＳＡで１時間、３７℃でブロックした。
【０１５６】
細胞単離
２〜３週齢のウシの中足指節関節の関節軟骨から、表層、中間層及び深層の軟骨細胞の混合群を単離した。次いで、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び０．１％プロナーゼ（Ｍｅｒｃｋ、４×１０６ユニット／ｇ）を含むダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）に軟骨の部分を直接入れ、３７℃で３時間インキュベートした。次いで軟骨をＰＢＳで１回洗浄し、５％ＦＣＳ及び０．０４％コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、２３７Ｕ／ｍｇ）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートして、静かに振りながら３７℃で一晩インキュベートした。
次いで、７０μｍ細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）で組織消化物を濾過し、残屑を除去した。得られた濾液を次いで１０００ｒｐｍで５分間ペッレット細胞に遠心分離した。次いで、細胞ペレットを無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁させた。次に細胞数を計数し、細胞を所望の濃度に再懸濁させた。
【０１５７】
細胞植え付け
０．５ｍｍ及び２ｍｍの針フェルトを、それぞれ血漿フィブロネクチン及びＦＣＳで被覆し、上記の通りにブロックした。軟骨細胞の混合群を単離し、４×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた。軌道シェーカーを３７℃で一定に撹拌しながら、０．５ｍｍフェルトにこの懸濁液１ｍｌを３０分間付けた。この後、フェルトを取り除き、無血清培地で３回洗浄して、未接着細胞を取り除き、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに５時間移した。洗浄液をプールし、最初の植え付け細胞懸濁液に添加して、遠心分離によりペレット化し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に再懸濁させて、上記のように３７℃で一晩２ｍｍ厚のフェルトに付けた。植え付け過程の後、両方のフェルトをＰＢＳで２回洗浄し、−２０℃のメタノールに１０分間固定し、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに移した。免疫染色用に使用するまで、この溶液中にフェルトを４℃で保管した。
実施例２．３のコントロールとして、上記０．５ｍｍのフェルト無しで、ＦＣＳで一晩４℃で被覆した２ｍｍのフェルトに、軟骨細胞の混合群を植え付けた。
【０１５８】
ノッチ１免疫染色
免疫染色のため、フェルトをＰＢＳで３×５分洗浄し、室温で１時間、２．５％正常ウサギ血清でブロックした。次いでフェルトをＰＢＳで３×５分洗浄し、１０μｇ／ｍｌヤギ抗ノッチ１抗体と一晩４℃でインキュベートした。フェルトを次にＰＢＳで３×５分洗浄し、ビオチニル化ウサギ抗ヤギ二次抗体の１：１００ＰＢＳ希釈液と１時間室温でインキュベートした。フェルトを再びＰＢＳで３×５分洗浄し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣの１：１００ＰＢＳ希釈液と室温で１時間インキュベートした。次いで、フェルトをＰＢＳで３×５分洗浄し、次に４８８ｎｍで励起するＡｒＫｒレーザーを使用したＬｅｉｃａ ＣＭ−ＩＲＢＥ倒立共焦点顕微鏡を用いて観察した。フェルトの表面から４００μｍの深さまで１０μｍ間隔で光学切片を撮影した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＮＴソフトウェアＭａｘｉｍｕｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ機能を用いて画像を積み重ねると、ｚ−軸に沿って最大グレースケール値が示された。画像上の緑蛍光（Ｎ１染色）の面積を算出したＩｍａｇｅ Ｐｒｏ−ｐｌｕｓを用いて画像を定量化した。ｘ−及びｙ−軸の画像のサイズに加えて、光学切片の深さ（ｚ−軸；４００μｍ）がわかっているので、ｍｍ３当たりの緑蛍光の量を算出できる。
【０１５９】
結果
図２．１７は、コントロールと比較した、２つのフェルトにおける緑蛍光の定量を示す。フィブロネクチンで被覆され、下のフェルトに軟骨細胞の混合群を植え付ける前に同じ細胞を３０分間植え付けた上のフェルトでＮ１＋蛍光の量が多いことがすぐにわかる。
【０１６０】
【表４】
2004504835.tif 000007
【０１６１】
結論
この研究は、成熟軟骨細胞を含む別のフェルトに層状化される軟骨始原細胞結合材としてのフィブロネクチン被覆フェルトの使用を実証した。層状に植えつけられたインプラントはこのように生成される。
【０１６２】
実施例２．４
序文
この実施例の目的は、層状インプラントを生成するのに、表層軟骨始原細胞の選択された材への早期結合速度がどのように使用され得るかを実証することである。インプラントの層の１つは軟骨始原細胞が豊富であるが、残りは涸渇している。この実施例では、層は単一のスカホールド内で生成される。繊維スカホールドの選択層をフィブロネクチンで被覆し、次いで、細胞の混合群（すなわち、表層、中間層、及び深層）を限られた時間植え付ける。この時間は、早期結合表層軟骨始原細胞が高い割合でフィブロネクチン被覆層に付着する一方で、成熟軟骨細胞の大半は付着できないような時間である。この時間内に付着しない細胞（すなわち、成熟細胞）を回収し、結合材と一緒にスカホールドに再導入して、スカホールド全体に接着させる。表層軟骨始原細胞は、ノッチ１の免疫染色により同定される。
【０１６３】
実験
針フェルトの被覆
密度が４５ｍｇ／ｃｃの、厚さ２ｍｍ、直径１０ｍｍのＰＥＴ針フェルトの上面を、１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＣａＣｌ２ （Ｓｉｇｍａ）を有するダルベッコのＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ濃度の血漿フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）で被覆した。フェルトを４℃で一晩被覆した。１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＣａＣｌ２のみを有するダルベッコのＰＢＳ中で、コントロールを一晩被覆した。細胞植え付けの前に、３７℃で１時間、フェルトを１％ＢＳＡでブロックした。
【０１６４】
細胞単離
２〜３週齢のウシの中足指節関節の関節軟骨から、表層、中間層及び深層軟骨細胞の混合群を単離した。次いで、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び０．１％プロナーゼ（Ｍｅｒｃｋ、４×１０６ユニット／ｇ）を含むダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）に軟骨の部分を直接入れて、３７℃で３時間インキュベートした。軟骨を次いでＰＢＳで１回洗浄し、５％ＦＣＳ及び０．０４％コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、２３７Ｕ／ｍｇ）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートし、静かに振りながら３７℃で一晩インキュベートした。
次いで、組織消化物を７０μｍ細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）で濾過し、残屑を除去した。得られた濾液を次いで１０００ｒｐｍで５分間ペレット細胞に遠心分離した。細胞ペレットを次いで無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁させた。次に細胞数を計数し、所望の濃度に細胞を再懸濁した。
【０１６５】
針フェルトを１０μｇ／ｍｌの血漿フィブロネクチンで被覆し、３７℃で１時間１％ＢＳＡでブロックした。軟骨細胞の混合群を単離し、４×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。軌道シェーカーを３７℃で一定に撹拌しながら、この懸濁液１ｍｌをフェルトに３０分間付けた。細胞を植え付けたフェルトを次いで無血清培地で２×１０分洗浄し、非接着細胞を取り除いて、洗浄液をプールし、遠心分離によりペレット化し、１０％ＦＣＳを含む１ｍｌＤＭＥＭ中に再懸濁した。次いで、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに植え付けフェルトを移した。プールされた非接着細胞及び植え付けフェルトを３７℃で一晩インキュベートした。
プールされた細胞を次いで対応するフェルトに植え戻した。次いで、軌道シェーカーを３７℃で一定に撹拌しながら細胞懸濁液中で約７時間フェルトをインキュベートした。この後、フェルトをＰＢＳで２回洗浄し、−２０℃のメタノールで１０分間固定し、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに移した。免疫染色に使用するまで、この溶液中にフェルトを４℃で保管した。
【０１６６】
Ｎ１免疫染色
免疫染色のため、フェルトをＰＢＳで３×５分洗浄し、室温で１時間、２．５％正常ウサギ血清でブロックした。次いでフェルトをＰＢＳで３×５分洗浄し、１０μｇ／ｍｌヤギ抗ノッチ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と一晩４℃でインキュベートした。フェルトを次いでＰＢＳで３×５分洗浄し、室温で１時間ビオチニル化ウサギ抗ヤギ二次抗体の１：１００ＰＢＳ希釈液とインキュベートした。フェルトをＰＢＳで３×５分再洗浄し、室温で１時間ストレプトアビジン−ＦＩＴＣの１：１００ＰＢＳ希釈液とインキュベートした。次いで、フェルトをＰＢＳで３×５分洗浄し、４８８ｎｍで励起するＡｒＫｒレーザーを使用したＬｅｉｃａ ＤＭ−ＩＲＢＥ倒立共焦点顕微鏡を用いて観察した。フェルトの表面から４００μｍの深さまで、１０μｍ間隔で光学切片を撮影した。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＮＴソフトウェアＭａｘｉｍｕｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ機能を用いて画像を積み重ねると、ｚ−軸に沿って最大グレースケール値が示された。被覆フェルトの表面、被覆フェルトの下側（すなわち、非被覆領域）ならびに非被覆フェルトの上面及び下面の画像を撮影した。
【０１６７】
画像上の緑蛍光（Ｎ１染色）の面積を算出したＩｍａｇｅ Ｐｒｏ−ｐｌｕｓを用いて画像を定量化した。ｘ−及びｙ−軸の画像のサイズに加えて（１０００μｍ×１０００μｍ）、光学切片の深さ（ｚ−軸；４００μｍ）がわかっているので、ｍｍ３当たりの緑蛍光の量を算出できる。結果
【０１６８】
【表５】
2004504835.tif 000008
【０１６９】
図２．１８は、様々な層における緑蛍光の定量を示す。上面をフィブロネクチンで被覆されたフェルトの上面にＮ１＋蛍光量が多いことがすぐにわかる。
結論
この研究は、層状に植え付けられた生体適合性物質、すなわち、上面に軟骨始原細胞及び下方領域に成熟細胞を有する生体適合性物質を産生するための、軟骨始原細胞結合材としてのフィブロネクチンの使用を実証した。
【０１７０】
実施例２．４のエックスビボ評価
序文
実施例２．４は、表層軟骨始原細胞の早期結合速度を選択された材に用いて、層状インプラントを生成する。インプラントの層の１つは軟骨始原細胞が豊富であるのに対して、残りは涸渇している。線維スカホールドの選択層をフィブロネクチンで被覆し、次いで細胞の混合群（すなわち、表層、中間層、及び深層）を限られた時間植え付ける。この時間は、早期結合表層軟骨始原細胞が高い割合でフィブロネクチン被覆層に付着する一方で、成熟軟骨細胞の大半は付着できないような時間である。この時間内に付着しない細胞（すなわち、成熟細胞）を回収し、結合材と一緒にスカホールドに再導入して、スカホールド全体に接着させる。
【０１７１】
方法
ＰＥＴ針フェルト（直径３．５ｍｍ×厚さ３ｍｍ；４５ｍｇ／ｃｃ）の上面を、４℃で１６時間、血漿フィブロネクチン（ダルベッコのＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）又はＰＢＳのいずれかで被覆し、３７℃で１時間、フェルトを１％ＢＳＡでブロックした。
２〜３週齢のウシの中足指節関節の全層関節軟骨の外植片を、５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び０．１％プロナーゼ（Ｍｅｒｃｋ、４×１０６ユニット／ｇ）を含むダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に直接入れ、３７℃で３時間インキュベートした。軟骨を次いでＰＢＳで１回洗浄し、５％ＦＣＳ及び０．０４％コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、２３７Ｕ／ｍｇ）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートし、静かに振りながら３７℃で一晩インキュベートした。組織消化物を７０μｍ細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）で濾過して、組織残屑を除去し、得られた濾液を遠心分離し（１０００ｒｐｍ；５分）、細胞をペレット化した。細胞ペレットを無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁し、遠心分離して（１０００ｒｐｍ；５分）、無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁した。
【０１７２】
混合軟骨細胞懸濁液（７５０，０００細胞／ｍｌ； １ｍｌ）を、軌道シェーカを３７℃で一定に撹拌しながらフェルトに３０分間付けた。細胞を植え付けたフェルトを次いで無血清培地で洗浄して（２×１０分）、非接着細胞を取り除き、洗浄液をプールし、遠心分離（１０００ｒｐｍ；５分）によりペレット化して、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（１ｍｌ）中に再懸濁した。次いで、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で植え付けフェルトを３７℃で１６時間インキュベートした。プールされた非接着細胞を次いでフェルトに植え戻し、軌道シェーカを３７℃で一定に撹拌しながら培養物を１６時間インキュベートした。次いで、１０％ＦＣＳを含む新鮮なＤＭＥＭに植え付けフェルトを移し、７日間培養した。
【０１７３】
２〜３週齢のウシの中足指節関節から軟骨のストリップ（約３０ｍｍ×５ｍｍ）を得て、片に切断し（〜５ｍｍ×５ｍｍ四方）、直径３．５ｍｍのＡｃｕｆｅｘ円筒形のみを用いて、軟骨外植片の中心から直径３．５ｍｍの穴を全層にわたって切除して欠損を作った。欠損を：
［１］　細胞を植え付けた層状構造物
［２］　細胞を植え付けたコントロール構造物（すなわち、フィブロネクチン非被覆）
［３］　細胞を植え付けていない構造物
［４］　最初に切り出された円盤状切片の代替物
［５］　欠損を空のままにしておく
で充填して、５つの実験群を作成した。
次いで実験群を７日間培養し、その後、エチジウムホモダイマーとインキュベートし（９０分）、（ｉ）１０％ＮＢＦＳで固定し、ろう包理し、切除して、従来の組織学的染料、例えばＨ＆Ｅ及びサフラニン Ｏで染色するか、又は（ｉｉ）脱ろうし、蛍光光学のもとに検査して、細胞死を評価した。
【０１７４】
結果
未充填欠損は、創縁で死細胞の一団及びマトリクスの質の低下を示した。細胞死の量は、軟骨の栓が欠損部位に戻された試料、特に２つの切除軟骨表面間の近接領域で減少した。細胞を植え付けていない構築物は、軟骨外植片の基部から発生する可能性のある少量の遊走細胞を除いては、７日間のインキュベート期間空のままであった。遊走細胞の多くは切除軟骨表面に付着したままであった。コントロール及び層状植え付け構築物は、生存細胞をインプラント全体に示し、軟骨の創縁上の細胞数を上昇させた。これらの結果は、層状植え付け構築物が、軟骨修復を促進するためのインプラントとして使用できることを示唆している。
【０１７５】
実施例３．１：発明の第一及び第二観点の実施例
インプラントの製造
本発明のインプラントは、以下の方法に従って作製されたスカホールドからなる：三次元のＰＥＴニット織物（厚さ２ｍｍ、十字形スペーサー布構造及び直径１〜２ｍｍの孔を含むマクロ孔質骨対向面を有する、Ｃｕｌｚｅａｎ Ｆａｂｒｉｃｓ社製）を、１２１℃で１５分間熱硬化し、一対の電動「ニップローラ」を用いて溶融ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）のプールに布地を引き出すことによりＰＣＬで補強する。三次元のニット織物内の一組の隣り合うスペーサー布線維を交差させ、ＰＣＬですぐに橋かけされる底広の「Ｘ」を形成し、それによって、補強された布の強度を最大化する。同様に、３Ｄ編み物の上面及び下面の密集した線維をＰＣＬで頻繁に橋かけして、縫合を維持するのに十分頑強な、強くて熱硬化可能な表面を形成する。
【０１７６】
材を再膨張させ、冷却して、１．８ＭＰａの圧縮率及び７５％以上の空隙率を持つスカホールド層を生成した。
圧縮率が極めて低く（〜０．０２ＭＰａ）、空隙率が９０％以上で厚さ１ｍｍの適合性不織ＰＧＡ針フェルトを、三次元補強３Ｄのニット織物の片面に接合させた。熱及びポリマー溶液を用いて接合を行った。三次元ニット織物の厚さ２０％の深さ（複合インプラントの厚さの１３．３％）まで、補強されたニット織物の第二（上部、関節）表面を軟骨始原細胞結合材、この場合フィブロネクチンで被覆する。ニット織物の下方領域及び不織ＰＧＡフェルトは、軟骨始原細胞結合材で被覆しない。
【０１７７】
インプラント生成／細胞の植え付け
スカホールドを徐々に加熱してポリカプロラクトンを軟化し（４０〜６０℃）、移植部位の輪郭に成型した。得られたスカホールドは、機能的付加に耐えるように十分に頑強であると同時に、欠損部位内の細胞移動を可能にするのに十分に多孔質な構造を保持している。
患者のバイオプシー／モザイク形成外植片から抽出された自己細胞からなる関節軟骨細胞及び軟骨始原細胞の源（骨髄間質線維芽細胞）を直径５０〜２５０μｍのマイクロ担体ビーズに植え付け、インビトロで増殖させた。欠損部位への埋め込みの前に、ニット織物の空所に沈降させて、得られた細胞被覆生体適合性材料粒子を導入する（≧１×１０６細胞／ｃｍ２移植面積とする）。粒状担体材料によって軟骨細胞を培養物内で増殖させ、トリプシン処理及び再付着工程の必要なしに装置の本体に導入する。
【０１７８】
埋め込み
肋軟骨下骨を露出し、削るために、埋め込み部位の基部を機械的に創傷清拭して、さらに、鋭利器具を用いて欠損の辺縁を健康な軟骨まで切除した。次いで、欠損部位に装置を圧入し、縫合糸及び／又は生体再吸収性釘で正しい位置に固定した。擦過肋軟骨下骨由来間葉細胞は不織フェルトに移動し、埋め込みから数週間後のインプラントの固定に寄与する。
【０１７９】
実施例３．２：軟骨始原細胞を精製するための軟骨始原細胞結合材の使用
フィブロネクチンを３５ｍｍペトリ皿に被覆した（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）。プロナーゼ及びコラゲナーゼ中で表層軟骨を消化し、放出された細胞を無血清培地ＤＭＥＭ中に懸濁させて軟骨細胞を生成した（４０００表層細胞／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）。単離細胞をフィブロネクチン被覆皿に４０分間添加した。次いで、被覆ペトリ皿を無血清培地ＤＭＥＭで洗浄し、非接着細胞を取り除いて、新鮮な培養皿に移した。コロニー形成効率（１０日間のインキュベート期間、分裂して、コロニーを形成できる細胞の％）は、非接着細胞よりもフィブロネクチン接着細胞の方がはるかに高いことがわかった（ｐ＝＜０．００１）。フローサイトメトリーは、接着細胞が、フィブロネクチンへの細胞結合に関係するの知られている細胞表面マーカーである、インテグリンβ１を高いレベルで発現することを示した。
【０１８０】
実施例３：軟骨始原細胞に選択的に結合するか、又は成熟軟骨細胞に結合する材料の同定
軟骨始原細胞又は成熟軟骨細胞いずれかを優先的に結合する材は、（ｉ） ＳＺＣ、ＭＺＣ及びＤＺＣの、組織培養プラスチックを被覆する細胞結合材候補物への接着率を比較し、（ｉｉ）被覆培養プラスチック上で成長する表層細胞間のコロニー形成効率の差を測定し、（ｉｉｉ）「結合材」−被覆粒状生体材料（例えば、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト）の、コロニー形成ＳＺＣ及びコロニー形成骨髄間質細胞を結合する能力を実証することにより同定された。
【０１８１】
方法
細胞単離
慎重な切除に続いてプロナーゼ／コラゲナーゼ連続消化（３．１７ＩＵ ｍｌ−１プロナーゼ３７℃で３時間； ５％ ＦＣＳ、５０μｇ ｍｌ−１ゲンタマイシン、１００μｇ ｍｌ−１アスコルビン酸を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中３７℃で１６時間０．１２ＩＵ ｍｌ−１Ｉ型コラゲナーゼ）を行うことにより、ウシの新生関節軟骨の表層、中間層及び深層由来軟骨細胞を中足指節関節から単離した。細胞を遠心分離し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に再懸濁し、血球計測器を用いて計数し、無血清培地中に再懸濁させた。
無血清ＭＧ−６３調整培地（４０ｍｌ；８０％融合細胞から４８時間にわたって回収）を、１０ｍｌｈ−１の流速で抗ＦＮ−ＥＤＡ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体被覆免疫アフィニティカラムの中で１６時間４℃で循環させた。溶離液を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ２分光光度計を用いて、吸光度Ａ２８０ｎｍ で吸光度がゼロになるまで１０分ごとに測定した。次いで、溶離緩衝剤（２０ｍＭ ＣＡＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ１１）を用いてＦＮ−ＥＤＡをカラムから溶離し、吸光度がゼロに戻るまでフラクションを１０分ごとに回収した。
【０１８２】
フラクションを含むＦＮ−ＥＤＡをプールし、１０，０００ ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、４Ｌの透析緩衝剤（１０ｍＭ ＣＡＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ１１）に対して４℃で一晩透析した。ＦＮ−ＥＤＡを透析膜から除き、Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡアッセイによりタンパク質濃度を測定した。溶離ＦＮ−ＥＤＡ、非結合ＦＮ−ＥＤＡ及び非分画ＭＧ−６３培地のプールされたフラクションをＥＬＩＳＡにより試験した。４〜１２％のビス−アクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ）上に、１μｇの精製ＦＮ−ＥＤＡを１μｇの血漿及び細胞フィブロネクチンと一緒に流すことによりＳＤＳ−ＰＡＧＥも行った。両方の試験で高純度のＦＮ−ＥＤＡが確認された。
【０１８３】
組織培養プラスチックを被覆した細胞結合材候補への表層、中間層及び深層軟骨細胞の接着力の評価
マルチウェルプレートを、一晩４℃で、候補材（１０μｇ／ｍｌ）又はコントロール物質（１０％ ＦＣＳ、陽性コントロール；１０％ ＢＳＡ陰性コントロール）で被覆した。プレートをＢＳＡでブロックし（１％；３７℃で１時間）、表層、中間層又は深層のウシの新生軟骨細胞の懸濁液を添加した（０．５ｍｌ；１ｍｌにつき１０００細胞）。
５％ ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で２０分間、１５０分間、１日間又は４日間培養物をインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で１．５時間インキュベートして、細胞接着を安定させた。次いで、プレートをＰＢＳ中で洗浄し、メタノールで固定し（−２０℃；３０分）、蒸留水でゆすいで、空気乾燥させた（固定されたプレートは、試験前に１ヶ月間４℃で保管してもよい）。
分析のため、細胞をＰＢＳで洗浄し、エチジウムホモダイマーで染色し（１０００中１希釈；３７℃；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、蛍光顕微鏡を用いて計数した。結果を結合細胞の％として表し、分類して、特定の細胞群を優先的に結合する材を同定した。
【０１８４】
軟骨始原細胞接着アッセイ：識別接着及びコロニー形成効率
２４ウェルプレートのウェルを、４℃で１６時間、細胞外マトリクス成分（フィブロネクチン、酸可溶性Ｉ型コラーゲン、酸可溶性ＩＩ型コラーゲン、酸可溶性ＩＶ型コラーゲン、ラミニン又はテンサシン；１ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ中２７ｎＭ；「ＰＢＳ＋」）で被覆した。プレートをＰＢＳ＋中で洗浄し、ＳＺＣ又はＤＺＣを植え付け（７００細胞ｍｌ−１；ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１ｍｌ）、５％ ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で２０分間インキュベートした。
４時間後、位相差顕微鏡を用いて接着細胞／ウェルの総数を数えた。４日後、位相差顕微鏡を用いて１皿当たりのコロニー数（４以上の軟骨細胞のクラスターとして定義される）を計数し、コロニー形成効率（ＣＦＥ）を以下のとおり算出した：
【０１８５】
【数１】
2004504835.tif 000009
【０１８６】
実験を繰り返して血漿フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）と細胞フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）又はアフィニティ精製フィブロネクチン−ＥＤＡの活性を比較した。
【０１８７】
コロニー形成ＳＺＣ及びコロニー形成骨髄間質細胞の接着因子被覆スルフェートイントラサイトへの接着：「コロニー欠乏アッセイ」
少数のＢＭＳＣ及びＳＺＣは、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中の組織培養プラスチックにそれぞれ４及び６日間培養されると、１６細胞より多いコロニーを形成する。これらのコロニー形成細胞を前駆細胞とみなす。スルフェートイントラサイトを、４℃で２時間、血漿フィブロネクチン、細胞フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、ポリリジン、ラミニン（全て６０μｇ／ｍｌ）又は２．５ｍｌ ＤＭＥＭ中のＰＢＳで被覆した。被覆生体適合性材を、骨髄間質細胞又はＳＺＣ懸濁液（無血清培地中に１２５ｋ細胞／ｍｌ）と３７℃で３時間インキュベートし、懸濁液を１０００倍に希釈して、１２ウェルプレートのウェルにアリコートした（４ｍｌ）。次いで、ウシの胎児血清（０．４ｍｌ）を各ウェルに添加し、培養物をさらに１６〜２４時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（２ｍｌ）中で培養物をさらに４〜６日間インキュベートした。コロニー（細胞が１６より多い個々のクラスター）を位相差顕微鏡で視覚化し、ブラインドを数えた。結果を、接着因子前処理済スルフェートイントラサイトに暴露された細胞懸濁液により形成されたコロニーの数／ＰＢＳ前処理済スルフェートイントラサイトに暴露された細胞により形成されたウェル当たりのコロニーの数として定義される「コロニー欠乏スコア」として表した。＜＝０．５のコロニー欠乏スコアは、コロニー形成細胞結合の優先値として定義されたのに対して、＜＝０．８の値は、許容できるコロニー形成細胞結合の閾値として定義された。
【０１８８】
結果
組織培養プラスチックを被覆する細胞結合材候補に対する表層、中間層及び深層軟骨細胞の接着評価
データは、インキュベート期間の最初の２０分間、表層細胞が、中間又は深層細胞より多くフィブロネクチン被覆培養プラスチックに結合したことを示した（表３．１）。ＶＩコラーゲン及びピーナッツアグルチニンも、この初期時点で表層細胞を優先的に結合したが、細胞接着の大きさは最小であった（表３．１）。
対照的に、１５０分間のインキュベート後、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン及びビトロネクチンは、表層細胞よりも、中間層及び深層細胞をより多く結合した（表３．２）。
【０１８９】
軟骨始原細胞接着アッセイ：識別接着及びコロニー形成効率
２０分以内にフィブロネクチンに接着したＳＺＣのコロニー形成効率は、他のどの処置群で観察されたものよりも著しく高かった（ｐ＜０．０５）（図３．６）。統計的に有意差は他になかった（全てにおいてｐ＞０．０５）。
血漿フィブロネクチン、細胞フィブロネクチン及びフィブロネクチン−ＥＤＡの有効度の有意差は、（ｉ）ＳＺＣ又はＭＺＣの初期接着（ｉｉ）細胞のコロニー形成効率又は（ｉｉｉ）形成されたコロニーの大きさのいずれについても観察されなかった。
【０１９０】
コロニー形成表層細胞及びコロニー形成骨髄間質細胞の、接着因子被覆スルフェートイントラサイトへの接着：「コロニー欠乏アッセイ」
これらの実験において、被覆スルフェートイントラサイト粒子に付着しない細胞は、培養プラスチックに付着し、その後コロニーを形成できる。スルフェートイントラサイト粒子に結合する細胞を、洗浄工程中に取り除いた。したがって、被覆スルフェートイントラサイトへのコロニー形成細胞の接着は、培養プラスチック上に形成されたコロニー数の減少により示された。最初の３時間のインキュベート後の細胞及び粒子の希釈懸濁液の顕微鏡検査は、未付着細胞と共に、（いくつかは接着細胞を持つ）粒子のまばらな分布を示した。ウシの胎児血清の、これらの培養物への１６〜２４時間の添加は、生体材料粒子に付着しなかった細胞を、組織培養プラスチックに接着させた。次の洗浄工程で、培養プラスチックに接着した細胞だけを残して、粒子及び粒子に接着した細胞を除去した。結果は、表層細胞が血漿フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトにさらされた時、１ウェル当たり２１．０±１．３９コロニーが存在したのに比べて、表層軟骨細胞がＰＢＳ前処理済スルフェートイントラサイトとインキュベートされた時、１ウェル当たり４６．８±３．７６のコロニーが存在したことを示した（すなわち、０．４５のコロニー欠乏指数；ｐ＜０．００１；図３．７参照）。同様に、接着因子被覆スルフェートイントラサイトとインキュベートされた骨髄間質細胞は、血漿フィブロネクチン０．４９、ＩＶコラーゲン０．６７、細胞フィブロネクチン０．８、ポリリシン０．８８、及びラミニン１．２６のコロニー欠乏指数を示した（図３．８参照）。
【０１９１】
考察
ここまでの結果は、Ｎ１陽性フィブロネクチン−ＥＤＡ分泌、強インテグリンβ１陽性、コロニー形成軟骨始原細胞の群が、新生関節軟骨の表層内に存在することを示した。（ｉ）これら始原細胞の特定の特徴を用いて、軟骨始原細胞又は成熟軟骨細胞のいずれかを選択的に結合する生体材料を開発でき、かつ（ｉｉ） 軟骨始原細胞が関節表面付近に層を形成する一方、成熟軟骨細胞がインプラントの深層で結合される層状インプラントを形成するように、そのような生体材料に細胞を植え付け、凝集させることができるという仮説が立てられた。
【０１９２】
これらの結果は、（ｉ）ＳＺＣがフィブロネクチン被覆表面に迅速に結合し、（ｉｉ）「迅速なフィブロネクチン−結合」ＳＺＣが、フィブロネクチン被覆表面上で成長した時、高いコロニー形成効率を有し、かつ（ｉｉｉ）微粒子生体材料「フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト」が、表層軟骨及び骨髄間質両方の双方からコロニー形成細胞を結合することを示す。これは、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトが、提案された層状組織工学軟骨インプラントの表層内で使用するのに適した材料であることを示唆している。異なる形態のフィブロネクチン（たとえば、血漿フィブロネクチン、細胞フィブロネクチン及びフィブロネクチン−ＥＤＡ）は、これらのアッセイシステムにおいてほぼ類似した結果を示し、全てこの目的のために使用できることを示唆している。
【０１９３】
結果は、コラーゲンＩＶが、ＳＺＣを選択的に結合することも、コロニー形成表層細胞の接着及び増殖を支持することもないことを示す。しかし、コラーゲンＩＶは、粒状ポリアニオン生体材料に吸着されて、骨髄間質からコロニー形成細胞を結合する表面を有する材料を生じる。骨髄間質中のコロニー形成細胞は、骨、軟骨、脂肪及び線維組織を形成できる初期間葉細胞であるので、コラーゲンＩＶは、新生関節軟骨の表層でよく発生するコロニー形成細胞よりも、より原始的な間葉前駆体群を結合することができる。
対照的に、１５０分間のインキュベート後、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン及びビトロネクチンは全て、表層細胞よりも中間層及び深層細胞を多く結合した。したがって、これらの細胞外マトリクス成分を利用して、成熟軟骨細胞を粒状生体材料に結合させてもよい。このような細胞を植え付けた材料は、層状組織工学軟骨インプラントの中間層及び／又は深層を形成するのに使用できるであろう。
【０１９４】
【表６】
2004504835.tif 000010
【０１９５】
【表７】
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【０１９６】
細胞分離方法
細胞の均質な群、例を挙げると、例えば表層軟骨始原細胞のような軟骨始原細胞を、他の方法によって分離してもよい。細胞の均質な群を、（ｉ）細胞の浮遊密度又は沈降速度（フィコール勾配又は向流懸濁分離法）、（ｉｉ） （蛍光細胞分類、磁気ビーズへの結合又は補足的な媒介細胞溶解を介する）特定の細胞表面エピトープへの抗体結合、（ｉｉｉ）特定基質への識別接着、（ｉｖ）別のものではなく１つの細胞型の成長を支持する選択的な培養培地又は培養条件、（ｖ）細胞の他の物理特性、例えば、大きさ、粒状度又は電気キャパシタンスなどに基づく技術範囲を用いて強化したり、又は異種細胞混合物から分離してもよい。
これらの技法は、本発明のインプラントを生成するのに使用してもよい。
【０１９７】
スルフェートイントラサイト
本発明の異なる観点において、本発明は、損傷した軟骨の代わり、より詳しくは、半月及び関節軟骨のような荷重軟骨組織の代わりとなる合成インプラントに関する。本発明はさらに、スカホールド手段に細胞を植え付ける方法；その方法で使用するのに適したバイオリアクター；バイオリアクターを特に用いてスカホールド手段に植え付けする方法ならびにスカホールド手段及びその内部で分散される細胞被覆微粒子からなるハイブリッドインプラントに関する。最後に、本発明は、本発明の合成インプラント又はハイブリッドインプラントを外科的に埋め込む工程からなる治療方法にも関する。
【０１９８】
関節軟骨欠損の治療に一般的な現在の手法には、（主として欧州で行われる）高度な脛骨切骨及び関節の生体力学と負荷を変える筋肉弛緩；胃洗浄及び骨増殖体や軟骨の原繊維からなる領域を除く創面切除ならびに出血や血塊の形成を誘発する肋軟骨下骨の穿孔と透過が含まれる。しかし、これらの技術は、いずれも関節軟骨の構造、組成、機械的特性又は耐久性を二倍にする組織の再生には至っていない。
最も一般的な技術は、フィブリン血塊及び繊維組織を形成する肋軟骨下ドリルの技術である。約７５％の患者では初期の結果は十分なものであるが、手術から２年後には、依然として無症状の患者はわずか１２％である。この手法の限界は、臨床結果の質と持続を予測し難く、長期的にみて、この手法がしばしば患者を悪化状態にすることである。他方、肋軟骨下ドリルと創面切除は、症状の緩和と１〜３年ごとの膝関節全体を置換する必要性を延期する点で一般的に成功している。
【０１９９】
多くの外科医は、痛みを予測どおりに緩和し、機能を回復させ、優れた固定を実現することができ、長期間、例えば少なくとも１０〜１５年以上持続可能な耐久性を有する合成軟骨修復生成物を重要な目的とみなしている。
上記の目的に合致するよう試みられている現在利用可能な製品は、炭素繊維のロッドからなる：軟骨損傷又は他の欠損は清浄にされて、肋軟骨下骨に摘出され、そこにつくられた穴に炭素繊維ロッドが挿入される。修復は、ロッドの上部周囲でのコラーゲンの島細胞の沈着で開始する。これらの島細胞群の成長はすぐに大きくなって完全に欠損を充たし、ロッドが欠損での修復組織用の固定源となる。この製品に伴う顕著な問題は、滑液腔でみられる炭素繊維磨耗残がいであり、これは剥離の問題を生ずる可能性がある。
【０２００】
検討されている別の手法は、ニット織物からなるインプラントの使用である。これは、構造上の安定性を生じ、中に接種された細胞を支持するための膨張性ハイドロゲルを含む。このインプラントは軟骨の損傷に配置され、ハイドロゲルの膨張から生じる圧力の増加によって軟骨の成長を促進することを目的とする。この種のインプラントの使用に伴う問題は、インプラントとその真下の組織、特に肋軟骨下骨との統合が弱いことである。
【０２０１】
軟骨修復用装置を製造するための組織工学的手法は、細胞及び生体材料の組み合わせを用いるが、生体材料は、上記の通り合成修復生成物の形態であってもよい。製造された装置は、（患者自身の細胞に由来する）自己細胞又は組織もしくは（提供された組織に由来する細胞を用いる）同種異系の細胞又は組織を含んでもよい。自己由来の手法は、提供された組織の使用に伴う疾患伝染の危険性を最小限にするが、装置に使用される組織を回収する操作と、装置を製造したらすぐに外科的に導入する操作の２つの操作が必要になる欠点がある。同種異系細胞を用いた組織工学的手法は、自己細胞の使用に伴う問題を回避し、１回の操作手順で軟骨欠損の修復に使用できる規格品の軟骨インプラントを製造することを目的としている。この手法にも問題が無いわけではない。当面の問題には、ドナー組織調達に伴う法的及び倫理的問題、ならびに病原菌、ウイルス又はプリオンの伝染を防ぐためのドナー材料のスクリーニングが含まれている。
【０２０２】
同種異系細胞又は自己細胞の使用に特有の問題に加えて、機械的に適当なマトリクス設計するために細胞を培養する工程は、構造物の中心に栄養を拡散する問題をもたらす。最初、細胞複製は、構造物全体に均一に細胞数を増す。細胞数が増え、細胞外マトリクスの沈着が始まるにつれて、構造物周辺の細胞が、装置内に拡散している栄養素をより高い割合で消費し、それによって構造物の中心の細胞を飢えさせて、その成長を妨げる。最終的に、構造物の中心の細胞は死に、薄く、生存可能な表面を持つが、壊死性液化コアを有する構造物が生ずる。この作用を回避する軟骨修復用装置の製造法は、現存の技術に勝る有意な改良となるであろう。
【０２０３】
軟骨修復に用いられる現在の合成軟骨修復生成物及び組織工学装置もまた、機械的弾性エネルギーと側方統合の対立する要件に合致できない。細胞を植え付けたインプラント又は細胞が移動した合成インプラントが、機械的負荷に耐えられるほど十分に頑強な構造を有する場合は、伝統的に、細胞はマトリクス内に閉じ込められ、周辺組織に移動することができなくなるため、側方統合に寄与できない。反対に、インプラントが細胞移動及び側方統合に十分透過性であれば、一般的には弱すぎて機械的負荷に耐えることができない。したがって、機械的に頑強であるものの、インプラント内での細胞の移動も可能にするインプラントの提供が望まれている。
【０２０４】
本発明の目的は、この種の従来技術製品に伴う問題を回避する合成軟骨修復製品を提供することである。とりわけ、特に肋軟骨下骨に接した組織との統合を改善する合成軟骨修復生成物を提供することが目的である。
本発明のもう１つの目的は、機械的に頑強であるが、インプラント内での細胞の移動を可能にする合成軟骨修復製品を提供することである。
さらに本発明の別の観点は、インプラント内部の細胞への不十分な栄養素の拡散の問題を回避する組織工学軟骨インプラントの培養法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、以下の記載を読むことで明らかになるであろう。
【０２０５】
１つの観点では、本発明は、骨−軟骨界面又はその近くに位置するのに適した第一表面と暴露された関節表面に接触して、又はその近くに位置するのに適した第二表面を有し、
ａ．　生体適合性スカホールド、及び
ｂ．　それに結合して、又はその中に含まれる、第一表面から第二表面に伸びる適合性領域
からなる、軟骨欠損修復用合成インプラントからなる。
ここで、物質が「生体適合性」であるというとき、それは、物質が哺乳動物の生体に外科的に導入される際、擬似外科手術のみの結果として生じることに加えて、臨床上著しい急性又は慢性的な副作用反応が本質的にないことを意味する。
【０２０６】
用語「スカホールド」は、三次元の少なくとも部分的に多孔性の構造物を吹くと解釈すべきであり、その孔度は細胞が浸透でき、インプラントの暴露部分（内外双方）は、細胞の増殖と細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の生成が生じ、組織がつくられるように、細胞を接着させ、成長させることができることを目的とする。
ここで、用語「適合性領域」という記載は、層とその層が接触する全ての材（肋軟骨下骨又は軟骨のような組織）との間隙を埋めるため、埋め込み時に変形する層を意味し、圧縮率が１．０ＭＰａ未満の層を含むと解釈されるべきである。
【０２０７】
適合性領域の利点は、埋め込み時に接触して配置される組織よりもはるかに低い圧縮率を有し、それにより、埋め込み部位周囲組織の摩滅の問題を回避し得ることである。適合性領域は、埋め込み時に変形して、合成インプラントの第一表面と、それが接触する組織（一般に、肋軟骨下骨又は軟骨）との間隙を埋める。これにより、骨形成細胞が合成インプラントの下側に移動し、新しい骨を蓄積し、その結果、合成インプラントを欠損部位に結合させることができる。
本発明の一つの観点の好ましい形態において、合成インプラントの圧縮率は第一表面から第二表面に移動する方向で増加する。この発明による増加は、連続的であってもよく、又は１回以上の不連続な増加であってもよく、前者の場合、増加の勾配は一定か、もしくはそれ自体が増加又は減少してもよい。
【０２０８】
上記の理由により、適合性領域の圧縮率は１．０ＭＰａ未満であってもよい。好ましくは、適合性領域は０．５ＭＰａ以下の圧縮率を有する。より好ましくは、適合性領域の圧縮率は０．１ＭＰａ以下である。最も好ましくは、適合性領域の圧縮率は０．０５ＭＰａ以下である。領域内の圧縮率が一定でなくとも、全領域の圧縮率はそれぞれの基準を満たさなければならない。
【０２０９】
本発明の一つの観点の別の好ましい形態において、合成インプラントは、１．０ＭＰａ以上の圧縮率を持ち、第二表面から第一表面に伸びる関節領域を含む。この剛性関節領域は、内部の細胞を、関節などの埋め込み部位に存在し得る厳しい機械的条件から保護し、更に、関節領域への細胞移動及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の沈着を可能にする。他方、関節層は通常、一般に圧縮率が５ＭＰａより高い軟骨や骨のような周辺組織よりも低い圧縮率を有するであろう。この結果、外科医がインプラントを誤って埋め込み、その場で正しい位置に操作する必要があっても、この操作のあいだに変形するのはインプラントであって、周辺組織ではなく、組織変形及び摩滅により生じる問題が最小限とされる。
【０２１０】
好ましくは、関節領域は１．８ＭＰａ以上の圧縮率を有する。より好ましくは、関節領域は３．０ＭＰａ以上の圧縮率を有する。層内の圧縮率が一定でなくとも、領域全体の圧縮率はそれぞれの基準を満たさなければならない。
既述のとおり、合成インプラントは上記に定義するスカホールドを含む。本発明のスカホールドは、適合性領域及び／又は関節領域とは異なる別個のものであってもよい。あるいは、適合性領域及び関節領域の１つ又は両方が、用語「スカホールド」に関して上記したように三次元の少なくとも部分的に多孔性の構造を含む際には、スカホールド自体が適合性領域及び／又は関節領域を導入しても良い。
本発明のスカホールドは、例えば三次元の織物又はニット織物（すなわち、スペーサー織物）、フリース（すなわち不織）材、スポンジ、発泡体、微粒子又はこれら材料のいかなる組み合わせを含んでもよい。
【０２１１】
「微粒子」という用語は、細胞接着を支持可能な１０〜２０００μｍ、好ましくは、１００〜６００μｍの大きさの材料を含むと解釈すべきである。本発明による微粒子は、架橋タンパク質、多糖類、変性（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）多糖類及びスカホールドの製造について後述されるような合成生体適合性ポリマーを含んでもよい。市販の微粒子は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ＣＹＴＯＰＲＥＴＭ及びＣＹＴＯＤＥＸＴＭ）ならびにＳｉｇｍａ（再びＣＹＴＯＤＥＸＴＭ）から得られるであろう。
スカホールドは１以上の層を含むことができる。スカホールドが複数の層を含む際には、これらの層はすべて同一の材からなってもよい。あるいは、各層は、他のいくつかの層又は他の全ての層と異なる材料からなってもよい。
【０２１２】
本発明のスカホールドが、三次元の織物又はニット織物の少なくとも１層を含む場合には、層を熱硬化するのが好ましい。この工程は、線維中の分子を線維上に設置した方向に再配置し、織物を幾分収縮させる。いずれの作用も、織物をより安定にするのに役立つ。熱硬化は、当業者にとって公知の温度及び時間で行われ、当該材料に左右される。
スカホールドの単層又は複層は、生体再吸収性又は非生体再吸収性材料からなってもよい。
材が生体再吸収性であるというとき、それは、材が化学／生物学的作用によって時間をかけて崩壊することを意味し、用語「再吸収」ならびに「再吸収する」は、それに応じて解釈される。好ましくは、完全な再吸収は約５年以内に、より好ましくは約３年以内に生じる。生体再吸収材を用いる利点は、後に材を除く外科手術が不要であるように、それらが崩壊して、完全に組織を修復し、欠損部位を充填できることである。
【０２１３】
ある生体再吸収材を用いる場合、好ましい選択基準は、組織が移植後に材の内部でつくられるあいだは、材が有意に再吸収しないという条件である。この条件を満たすことにより、内生生物組織がその形及び機械的完全性を引き継げるようになるまで、インプラントがこれらの機能を本質的に保持することが確実になる。数字の観点では、生体再吸収材を１２週間インビボで移植する際、重量損失が５％未満であることが好ましい。より好ましくは、同一時間中、重量損失は２％未満である。他方、スカホールドが２以上の生体再吸収材からなる際には、インプラントを構造上完全にするため、生体再吸収材の少なくとも１つがこの基準を満たすことが好ましい。
【０２１４】
インビボでの再吸収時間が異なる、広範囲な生体再吸収材が知られている。材によって再吸収時間が変化するのみならず、１つの材自体の再吸収時間は分子量及び構造の配置で著しく変化することができる。最後に、異なる生体再吸収材をブレンド及び／又は共重合して、及び／又は成分の分子量もしくは結晶度を変えることによって、要求に対する生体再吸収材の再吸収時間を、近い将来、正確に調整できるものと思われる。
上記の点に留意すれば、本発明による生体再吸収材は、以下のモノマー又はポリマー混合物及び／又はそれによって形成されるコポリマーからなる生体再吸収ポリマー又はコポリマーからなってもよい：ヒドロキシ酸、特に乳酸、グリコール酸；カプロラクトン；ヒドロキシブチレート；ジオキサノン；オルトエステル；オルトカーボネート；アミノカーボネート。
【０２１５】
この発明による生体再吸収材は、コラーゲン、セルロース、フィブリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、キトサン又はこれらの２以上の材の混合物のような天然の材からなってもよい。生体再吸収材は、誘導化された異種移植片及び／又は誘導化された同種移植片からなってもよい。
生体再吸収性セラミックが、スカホールド内に含まれてもよい。この発明により使用されうる生体再吸収性セラミックは、モノ−、ジ−、オクタ−、α−トリ−、β−トリ−及びテトラ−カルシウムリン酸、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム又はこれらの２以上の材の混合物である。
【０２１６】
この発明による好ましい生体再吸収材は、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート及びポリ（トリメチレンカーボネート）又はその混合物からなる。
特に、ポリ（乳酸）を用いることが好ましい。この材は、良好な機械的強度を有し、あまり迅速に再吸収せず、その結果、修復された組織が荷重のかかった機能を引き継ぐ時点で組織修復に十分な時間のあいだ、その機械的特性を保持できる利点を有する： Ａ．Ｇ．Ａ． Ｃｏｏｍｂｅｓ 及びＭ．Ｃ． Ｍｅｉｋｌｅ， ’Ｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ’， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １７， （１９９４）， ｐｐ ３５−６７ を参照すると、ポリ（乳酸）の試料は、１２週間の試験に対しわずか１〜２％の重量を損失しているにすぎないことが示されている。
【０２１７】
この発明による適当な非−生体再吸収材には、ポリエステル、特に芳香族ポリエステル、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ） 及びポリブチレンテレフタレートのようなポリアルキレンテレフタレート；ポリアミド；ポリエチレン及びポリプロピレンのようなポリアルケン；ポリ（フッ化ビニル）ポリテトラフルオロエチレン炭素繊維、シルク（天然又は合成）、炭素繊維、ガラス及びこれらの材の混合物が含まれる。さらに、非再吸収セラミックを用いてもよい。そのような材の例は、純粋なヒドロキシアパタイト、ジルコニア及びアルミナである。非生体再吸収材の利点は、それらが本質的にその当初の機械特性−つまり、強度が時間中に低減しないような特性を保持していることである。したがって、それらは、長期にわたって修復組織に機械的な支持を提供し得る。
【０２１８】
適合性領域は、フリース（すなわち、不織）材料、スポンジ、発泡体、微粒子、ゲル又はこれら材料の組み合わせを含んでもよく、生体再吸収材又は非生体再吸収材を含んでもよい。スカホールドに関して挙げた生体再吸収材又は非生体再吸収材は、圧縮率条件が満たされる限り、いずれも使用できる。適合層がゲルを含む際には、組織を内生させるように機能することを条件として、それはプラスに荷電したゲル、マイナスに荷電したゲル又は中性ゲルであってよい。適合性領域は少なくとも１つの薄層を含み、複数の薄層を含んでもよい。適合性領域が複数の薄層を含む際には、これらは全て、同一の材からなってもよい。あるいは、各薄層は他のいくつかの薄層又は全ての薄層と異なる材料からなってもよい。
【０２１９】
関節領域は、三次元の織物又はニット織物（すなわちスペーサー織物）、フリース（すなわち、不織）材料、スポンジ、発泡体、微粒子又はこれら材の組み合わせを含んでもよく、生体再吸収材もしくは非生体再吸収材を含んでもよい。スカホールドに関して挙げた生体再吸収材又は非生体再吸収材はいずれも使用できるが、圧縮率条件が満たされていることを条件とする。関節領域は、少なくとも１つの薄層を含み、複数の薄層を含んでもよい。関節領域が複数の薄層を含めば、これらは全て同一の材料を含んでもよい。あるいは、各薄層は他のいくつかの薄層又は全ての薄層と異なる材料を含んでもよい。
関節領域の圧縮率は、内部に含まれる材料の種類及び構造の固有の性質であってもよい。あるいは、関節領域は補強されてもよい。補強は、機械的負荷に耐えるのを補助するように、補強成分を構造内に包含することにより達成され得る。
【０２２０】
存在する際には、補強成分は、スカホールドの製造について上記した種類の生体再吸収性ポリマー又は非生体再吸収性ポリマーを含んでもよい。補強成分は、関節領域内に強化ブリッジを形成するために添加される、溶融熱硬化ポリマー又は熱硬化性リマー液を含むことが好ましい。さらに、ポリマーは、体温のすぐ上、すなわち６０℃未満で熱硬化するものがより好ましい。関節領域が線維材料（織物、不織物又はニットなど）を含む際には、溶融補強材は、その中に隣接するストランドを結合し、それによってその圧縮率を増加させる。最も好ましくは、補強成分はポリカプロラクトンを含む。なぜなら、この材料は、体温より少し高い融解温度を持ち、生体適合性かつ生体再吸収性で、インプラントを成型可能にするからである。
【０２２１】
上記補強材を提供するひとつの方法は、２つの「ニップ」ローラー間で織物を圧縮し、その上に溶融又は溶解した補強ポリマーのプールを供給することである。ローラー間で織物が圧縮され、引き出されるにつれて、少量の補強ポリマーがそれとともに運ばれ、これが、片側のローラーで織物が再度拡張した際に織物に取り込まれ、それにより織物をコーティングする。
本発明の一つの観点の特に好ましい形態において、合成インプラントは、それ自体が適合性領域と関節領域からなるスカホールドからなる。有利には、関節領域は、第二表面から第一表面に向かって伸びて、第一表面から第二表面に向かって伸びる適合性領域に合う。好ましくは、関節領域は、ポリ（乳酸）〔生体再吸収性〕及び／又はＰＥＴ〔非生体再吸収性〕線維からなる三次元のニット織物からなり、それは、溶融ポリカプロラクトン補強成分の添加により補強される。適合性領域は、有利には、ポリ（グリコール酸）及び／又はＰＥＴ線維からなるフェルト（不織）からなる。
【０２２２】
本発明の一つの観点の好ましい形態によると、合成インプラントは、埋め込まれる組織の受容力、及びその組織への統合を改善するために、ある付加成分を含んでもよい。
インプラントに有利に添加できる付加成分の１群は、生物活性材料である。本発明によるインプラントのあらゆる部分にも導入可能な生物活性材料は、成長因子、例えば、ＴＧＦβを含むトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリー、骨形態発生タンパク質 ＢＭＰ （例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４）、軟骨由来形態発生タンパク質ＣＤＭＰ （例えば、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２）及び成長分化因子（例えば、ＧＤＦ５）；血小板由来細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；表皮成長因子ファミリー、例えばＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子αＴＧＦα；血小板由来成長因子、例えばＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＢＢ；繊維芽細胞成長因子、例えばＢＦＧＦ；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；インシュリン−様成長因子、例えばＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ；成長ホルモン（ＧＨ）； インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１１）；連結組織成長因子（ＣＴＧＦ）；甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒｐ）及びこれら材の少なくとも２つの混合物などを含む。
【０２２３】
上記のほかに、脈管形成因子（アンギオゲニン）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）をインプラントの適合性領域に有利に添加することができる。
本発明の合成インプラントは、埋め込み前に細胞を植え付けてもよい。あるいは、それらを細胞なしに埋め込んだり、細胞を埋め込み後のあらゆる時点で注入してもよいし、あるいは細胞群及び細胞付着が細胞内植だけによって生じるよう、全く細胞なしに埋め込んでもよい。
本発明のインプラントに植え付けてもよい細胞は、軟骨細胞、軟骨始原細胞及び間葉幹細胞などの軟骨細胞に分化できる細胞ならびに、他の細胞を軟骨細胞に分化させる細胞である。始原間葉前駆細胞の適当な源には、軟骨膜、骨膜、骨髄及びワルトンゼリーが含まれる。
【０２２４】
本発明のインプラントに細胞が植え付けられれば、インプラントの第一表面から適合層を介してインプラントの第二表面の方へ伸びる（しかし、届かない）穿孔をインプラントに提供するのが好ましい。穿孔は直径２．５ｍｍまであってもよく、好ましくは直径０．６〜２．５ｍｍ、より好ましくは直径１．６〜２．２ｍｍである。穿孔は、インプラントの第一表面の面積の５〜３５％、好ましくはその表面の１６〜３０％に及ぶのが有利である。定義された範囲内のパラメータを持つこのような穿孔の存在は、効率的な細胞植え付けを容易にする。
本発明の別の観点によると、細胞が微粒子の表面に接着するように細胞を微粒子に接触させ、次いで、細胞被覆微粒子をスカホールド手段に導入する工程からなる、細胞をスカホールド手段に植え付ける方法が示される。
【０２２５】
「スカホールド手段」というここでの記載は、上記に定義されるようにスカホールドを含むあらゆる装置を意味する。本発明の一観点による合成インプラントは、特に「スカホールド手段」という用語の範囲内に含まれる。
微粒子は、細胞を本質的に結合できるもの、又は細胞を結合できる材料で被覆されてもよいもの、もしくはその両方であってもよい。微粒子を被覆し得る適当な細胞結合材料には、コラーゲンＩ、ＩＩ及びＩＶ、フィブロネクチン及びフィブロネクチンスプライス変異体、ゼラチン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリカチオンポリマーならびにポリアニオンポリマーを含む。
好ましくは、細胞は、スカホールド手段に導入される前に栄養溶液中で微粒子上でインキュベートされて、細胞を成長させ、細胞外マトリクスを発生させる。より好ましくは、インキュベートは６週間の期間まで行われる。最も好ましくは、インキュベートは１〜３週間の間の期間である。
【０２２６】
細胞被覆微粒子は、沈降によりスカホールド手段に導入されてもよいが、一般に、重力だけよりも強い力が必要とされる。細胞被覆微粒子は、ポンプ圧の利用又は遠心分離によりスカホールド手段に押し入れられるのが有利である。好ましくは、細胞被覆微粒子は、遠心分離によりスカホールド手段に導入される。
この植え付け方法の利点は、従来技術の方法に伴う問題、すなわちインビトロ細胞成長段階中の構造物の中心へ拡散される栄養が不十分であるという問題を回避することである−序文参照。これは、本方法による細胞成長が、スカホールド手段に導入される前に、一定量の培地中に分散される微粒子上で起こってもよいからである。インビボにすれば、インプラントは、栄養素を出し入れする組織に対する周期性圧縮応力に助けられて、肋軟骨下骨内の血管により栄養素を提供される。
【０２２７】
本発明の別の観点によると、本発明の前述の実施態様の方法での使用に適したバイオリアクターが提供される。本発明の一実施態様のバイオリアクターは、細胞接種微粒子のインキュベートに適したインキュベーションチャンバーとスカホールド手段の支持に適した直径ｄ１のスカホールド支持チャンバーからなり、ａ）　ｄ２＝ｄ１の時点でスカホールド支持チャンバーに合うよう、インキュベーションチャンバーの直径ｄ２がスカホールド支持チャンバーに接近するにつれて減じるか、又はｂ） インキュベーションチャンバーとスカホールド支持チャンバーが、インキュベーションチャンバーと接触する端部で直径ｄ２を有し、スカホールド支持チャンバーと接触する端部における直径ｄ１に細くなる、ろうと手段で接続される。
【０２２８】
本発明の一実施態様のインキュベートチェンバーは、例えば、球形、円錐形又は管状であってもよい。それは、管状であるのが有利である。
インキュベートチェンバーは、スカホールド支持チェンバーより大きいか、それと同じサイズ又はそれより小さくてもよいが、スカホールド支持チェンバーより小さいのが好ましい。
本発明の有利な代替例において、ろうと手段及びスカホールド支持チェンバーは、バイオリアクターへの挿入に適した挿入手段内に一体的に含めてもよい。あるいは、バイオリアクターは管を含むのが有利である。
【０２２９】
本発明の更に別の観点によると、本発明の一実施態様によるバイオリアクターを用いて細胞−接種微粒子をスカホールド手段に植え付ける方法が提供される。本発明の一実施態様の方法は、以下の工程：
・　バイオリアクターのスカホールド支持チャンバー内にスカホールド手段を配置し、
・　バイオリアクターのインキュベーションチャンバーに細胞接種微粒子を導入し、
・　十分なインキュベーション作用を行うのに適当な期間のあいだ、温度、湿度、ｐＨ及び栄養素などの適当な条件下でバイオリアクターを攪拌し、
・　バイオリアクターを遠心分離して、スカホールドを有する細胞接種微粒子を集め、
・　バイオリアクターのスカホールド支持チャンバーから細胞接種微粒子からなるスカホールド手段を除くこと
からなる。
【０２３０】
上記のとおり、「十分なインキュベーション作用を行うのに適当な期間のあいだ」という表現は、細胞を成長させ、細胞外マトリクスを生じさせるため、細胞が栄養溶液中でインキュベートされることを意味する。好ましくは、このインキュベートは、６週間まで行われる。より好ましくは、インキュベートは、１〜３週間の間の期間である。
本発明の別の実施態様によると、スカホールド手段及び細胞被覆微粒子からなるハイブリッドインプラントが示される。
さらに本発明によると、合成インプラント又はハイブリッドインプラントを欠損に外科的に埋め込むことからなる、哺乳動物の軟骨欠損の治療方法が示される。
【０２３１】
応用例の図が参照として示されるが、これらは制限的ではない。
図４．１は、本発明の実施態様の合成インプラントを示す。
図４．２は、本発明のバイオリアクターに挿入するための挿入手段を示す。
図４．３は、細胞接種及び微粒子のインキュベート段階中の本発明の実施態様のバイオリアクターを示す。
図４．４は、細胞−接種微粒子を図３の合成インプラントに遠心分離した直後の、本発明の実施態様のバイオリアクター内に設置したハイブリッドインプラントを示す。
図４．５は、顕微鏡でのサルフェート材の外観を示す。
【０２３２】
図４．６は、改質及び非改質材の代表的なスペクトルを示す。
図４．７は、スルフェートイントラサイトＴＭに結合する血漿フィブロネクチン、細胞フィブロネクチン及びフィブロネクチン−ＥＤＡを示す。
図４．８は、スルフェートイントラサイトＴＭに結合するコラーゲンＶＩを示す。
図４．９は、ＦＣＳからの吸収後に、スルフェートイントラサイトＴＭに結合するフィブロネクチン及びビロトネクチンを示す。
図４．１０は、サルフェート及び非スルフェートイントラサイトＴＭへの細胞の植え付けを示す。
【０２３３】
実施例４．１
合成インプラントの製造
関節層を形成するために、三次元でニットのＰＥＴ織物を、表４．１に示すパターンに従って、ダブルベッドラッセルたて編み織機上で製造した：
【０２３４】
【表８】
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【０２３５】
布は、十字形スペーサー線維構造を有する厚さ３ｍｍのものであった。布を６０℃の精製水で洗浄し、高純度のプロパン−２−オール中で更に洗浄し、次いで乾燥させ、１２１℃で１５分間オートクレーブ内で熱硬化した。次いで、内部加熱された１組のニップローラを用い、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、Ｓｏｌｖａｙ製ＣＡＰＡ ６８６と溶融含浸させてそれを補強した。ニップの間隙及び圧力を調節して、被覆物の均一性及び重量を調整した。布１グラム当たり０．８０グラムＰＣＬの被覆物の重量を得た。三次元のニットのモノフィラメントスペーサー線維は互いに交差して、重なった「Ｘ」を形成する。それらが互いに交差する所をＰＣＬで接着し、それによって含浸布の完全性及び圧縮率を高める。同様に、３Ｄニットの上面及び下面のマルチフィラメント線維を、ＰＣＬによりすぐに含浸させ、縫合糸を保持するのに十分頑強な、強い、熱硬化可能な表面を形成した。この被覆重量で、モノフィラメントスペーサー線維をしっかりと接着したが、布のニット表面にいくらかの孔が残った。
【０２３６】
被覆ニップを残すと同時に、０．０２ＭＰａの圧縮率及び７５％より大きい空隙率を持つ厚さ０．７５ｍｍの不織針フェルトを、３Ｄニットの編物片面上の溶融ＣＡＰＡにより接着し、適合性領域を形成した。
材を再膨張させ、冷却させて、１．８ＭＰａの圧縮率及び７５％より大きい空隙率を持つ関節層（３Ｄ−ニット）をつくった。次いで、組成物を冷却させ、固めた。
液圧プレス内で打抜機を用いて、強化布を８ｍｍ円盤型合成インプラントに切断した。先端が鋭い加熱プローブを用いて、これらインプラントの第一表面を穿孔し、そこを通して、３Ｄニットの織物に永久開口部（７×直径１．８ｍｍ）を形成し、布の中心へのアクセス経路を生じた。開口部は、インプラントの第二表面までは及ばなかった。
図４．１は、第一表面（４．１）、第二表面（４．２）、不織フェルトからなる適合性領域（４．３）、３Ｄニットからなる関節層（４．４）、及びインプラントの内部へのアクセス経路を提供する適合性領域への開口部（４．５）からなる本発明の合成インプラントを示す。
【０２３７】
微粒子の合成
部分的な架橋サルフェートカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）微粒子を以下のとおりに製造した。すべてのガラス製品、金属製品及び部分的な架橋ＣＭＣ粉末（Ａｋｚｏ Ｘ１８１ＴＭ）を、オーブン内で乾燥させた（１１０℃、一晩）。Ａｋｚｏ Ｘ１８１ＴＭ粉末（４ｇ）及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０ｍｌ）をフラスコ内に置き、不活性雰囲気下、三酸化硫黄−ＤＭＦ複合体（１８．４ｇ）を添加した。乾燥した不活性雰囲気下、混合物を５０℃で約４時間機械的に撹拌した。冷却後、重炭酸ナトリウムを十分に添加して、反応を止め、余分な三酸化硫黄−ＤＭＦ複合体（最小限の水中に約２０ｇ）を中和した。反応混合物を透析管に移し、蒸留水に対して約４８時間透析した。次いで、管の固体内容物を、ブッフナー器具で濾過して回収し、水で洗浄した。生成物を乾燥させ（４５℃の減圧下）、中央の長さが１５０μｍ（最短長さ２５μｍ、最長長さ５００μｍ）の楕円形微粒子を得た。
【０２３８】
培養装置
管Ａ：０．４５μｍのフィルターカートリッジ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ００３００９９１７６ＴＭ）及び０．２μｍフィルタ（Ｆｉｓｈｅｒ ＦＤＰ ９５４ ０５０ＸＴＭ）を支えるねじぶたを有する５０ｍｌ円錐底遠心分離管。凍結乾燥したコラゲナーゼ（２４ｍｇ；２７６Ｕ／ｍｌ）を、４．５ｍｍフィルタの上の管内に粉末状で供給した。
管Ｂ：標準５０ｍｌ円錐底遠心分離管（例えば、Ｆａｌｃｏｎ ３５２０７４ＴＭ）
バイオリアクター：０．２μｍフィルタを支えるねじぶた（Ｆａｌｃｏｎ ３１０７ＴＭ）を有する１５ｍｌ Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ円錐底遠心分離管（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ ０５−５３９−５ＴＭ）、又はあるいは５０ｍｌ円錐底遠心分離管（Ｆａｌｃｏｎ ３５２０７４ＴＭ）と０．２μｍフィルタを支えるねじぶた（Ｆｉｓｈｅｒ ＦＤＰ ９５４ ０５０ＸＴＭ）のどちらかの管を使用した。
【０２３９】
バイオリアクターの基部を、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２９ＴＭ）中の溶融４％アガロース溶液（Ｓｉｇｍａ Ａ−９０４５ＴＭ）で充填した。２ｍｌアガロース溶液を１５ｍｌ管と使用し、５ｍｌ溶液を５０ｍｌ管と使用した。寒天を冷却させ、固定して、垂直に保持された管で栓を形成した。この栓は、栄養素及び老廃物質を交換するための材料を提供する利点を持つ任意の特徴−扁平容器の底がなすことのできない機能である。
高密度ポリエチレンを転化した、ろうと手段及びスカホールド支持チェンバー両方からなる挿入手段は、バイオリアクターに挿入される。図４．２は、例えば：ａ ＝ １３．５ｍｍ； ｂ ＝ ７．５ｍｍ； ｃ ＝ ４ｍｍ；ｄ ＝ ３ｍｍ（より大きい管に使用される挿入手段の寸法もそれに従って拡大してよい）の１５ｍｌ管状バイオリアクターと使用される挿入手段をを図示する。
上記のように製造される合成インプラントを、挿入手段のスカホールド支持チェンバーに挿入し（一番上に適合性不織層）、スカホールド／挿入手段集合体を、アガロース層の上に載るようにバイオリアクターに滑り込ませた。粒状充填材料（部分的な架橋サルフェートＣＭＣ；スカホールド内容量１ｍｌ当たり３５０ｍｇ；より小さい管と使用される直径８ｍｍのスカホールドには７０ｍｇ）を、インキュベートチェンバー（挿入手段の上）に添加し、バイオリアクターに蓋をした。
【０２４０】
細胞分離
ＤＭＥＭ（１２ｍｌ）を管Ａに添加して、コラゲナーゼを再組成した。ヒト自己血清（４．８ｍｌ）及びＤＭＥＭ（２．２ｍｌ）を、バイオリアクターに添加して、微粒子を再水和し、血清から細胞付着因子を吸収させた。
４ｍｍ軟骨バイオプシーを、関節の無負荷部分から得て、メスで薄く切って管Ａに添加した。次いで、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、管を、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした（ふた内の０．２μｍフィルタはガス交換を可能にすると同時に、無菌性を確保する）。細胞を備える４．５μｍフィルタカートリッジ及びコラゲナーゼの一部を次いで管Ｂに移し、遠心分離して（１０００ｒｐｍ；５分）、分離細胞をコラゲナーゼ溶液から分離した。
分離細胞をＤＭＥＭ（１ｍｌ）中で再懸濁し、バイオリアクターに移した。
【０２４１】
バイオリアクターを、ゆっくりと回転するミキサー上に置いて、５％ＣＯ２加湿雰囲気下、３７℃で７〜１０日間インキュベートした。図４．３は、本方法のこの段階を図示する：バイオリアクター（４．６）は、スカホールド支持チェンバー内に保持されたスカホールド（４．８）がそこに位置する挿入手段（４．７）を含む。挿入手段の上は、ＤＭＥＭ中に懸濁した細胞（図示せず）及び細胞が接着する微粒子（４．９）を含むインキュベートチェンバーである。注：寒天栓（４．１０）は合成インプラントの下に示す。　培養期間の終わりに、バイオリアクターを遠心分離し（５００ｒｐｍ；５分）、細胞被覆粒状材料を合成インプラントの空隙に凝集させて、図４．４に示すハイブリッドインプラント（４．１１）を生成した。
【０２４２】
埋め込み
埋め込み部位の基部を機械的に創傷清拭して、肋軟骨下骨を露出させて削り、凹部を作って、更に、欠損の軟骨周辺を、鋭利器具を用いて健康な軟骨まで切除した。次いで、培地をバイオリアクターから吸引し、挿入手段及びハイブリッドインプラントを取り出し、ハイブリッドインプラントを挿入手段からはずして、逆さにした。骨膜弁を脛骨から回収し、関節層（３Ｄ強化ニット）の頑強な上面の上に縫合して、軟骨始原細胞及びより滑らかな関節表面の源を提供した。ハイブリッドインプラントを、次いで欠損部位に圧入し、周辺軟骨と面一にした。ハイブリッド軟骨を、縫合糸及び生体再吸収性釘で正しい位置に固定した。
【０２４３】
実施例４．２：スルフェートイントラサイト
スルフェートイントラサイトゲル（ＳＸ−ＣＭＣゲル）の合成及び滅菌
方法
イントラサイト粉末（２ｇ；１１０℃でオーブン乾燥；１６時間；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｎｅｐｈｅｗ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１０ｍｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ）及び三酸化硫黄−ピリジン複合体（９．２ｇ；Ａｌｄｒｉｃｈ）を、５０℃で４時間機械的に撹拌した。反応混合物を冷却し、重炭酸ナトリウム（最小限の水中に約１０ｇ）を添加して、余分な三酸化硫黄−ピリジン複合体を中和した。生成物を、蒸留水に対して透析し（２〜７日間）、凍結乾燥させて、４℃で保管した。材料をＰＢＳ（１００ｍｇ；６．５ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁し、１２１℃で１５分間、オートクレーブで処理して滅菌した。
【０２４４】
結果
反応は、一般に１ｇのサルフェート物質をもたらした。顕微鏡で見ると、凍結乾燥スルフェートイントラサイトは、綿状で、やや線維質の白い材料であった。凍結乾燥スルフェートイントラサイトは、ＰＢＳ中ですぐに再水和し、半透明の懸濁液を形成した。重力下、粒子を沈殿させて、ゲル及び透明な上澄みの層を生成した。顕微鏡で見た材料の外観を図４．５に示す。
【０２４５】
スルフェートイントラサイトの分析
方法
改質ポリマーの化学的性質を、Ｒａｍａｎ分光学（Ｒｅｎｉｓｈａｗ Ｒａｍａｎ顕微鏡）又は赤外分光学（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １７５０又はＭａｔｔｓｏｎ Ｇａｌａｘｙ ＦＴＩＲｓ）により調査し、得られたスペクトルを、公開された基準のスペクトルに対して比較した。硫黄含量を、公認の実験室（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ）で、元素分析により測定した。粒子サイズの分布をＣｏｕｌｔｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅサイズアナライザーを用いて測定した。
アルシアンブルー〔Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ〕（臨界電解質濃度染料）を、変性（ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅｄ）ポリマーを視覚化するのに使用した。アルシアンブルー（０．２Ｍアセテート緩衝剤ｐＨ ５．８中０．０５ｇに加えて０．０６Ｍ， ０．３Ｍ， ０．５Ｍ， ０．７Ｍ又は０．９Ｍの ＭｇＣｌ２）を、ポリマーと室温で１６時間インキュベートし、サンプルをＰＢＳ中で洗浄して、肉眼と位相差顕微鏡の両方で観察した。
【０２４６】
結果
図４．６は、改質及び非改質材料の代表的なスペクトルを示す。１２８０μｍで、はっきりとしたピークが出現したこと及び非改質材料の＜０．３Ｍと比較して、アルシアンブルーが０．９Ｍ ＭｇＣｌ２の存在下で改質物質へ結合したことより、硫酸化が確認された。粒子サイズ分析は、材料の８０％が直径１６２〜９２３μｍの粒子からなることを示唆するが、この数字は、粒子のクランピングにより不自然に増加した可能性がある。アルシアンブルーＣＥＣは、非改質イントラサイトが、０．３Ｍ未満のＭｇＣｌ２濃度（弱アニオン物質と一致する）でアルシアンブルーを結合するのに対して、スルフェートイントラサイトは、０．９Ｍを含む、使用された全てのＭｇＣｌ２濃度でアルシアンブルーを結合したことを示した。この知見は、改質材料が、成功した硫酸化と矛盾しない、非常に強いアニオン性であることを示す。
【０２４７】
スルフェートイントラサイトの常套分析
方法
オートクレーブ処理したスルフェートイントラサイトのポリアニオン性質を、１００μｌ材料をＰＢＳ（９００μｌ）と希釈し、組織学的染料サフラニンＯを添加して（０．１％； ２０μｌ； ３０分）、通常どおり確認した。混合物をＰＢＳで２０ｍｌに希釈して、遠心分離し（２５００ｒｐｍ；５分）、上澄みを破棄して、染色材料を２０ｍｌＰＢＳ中に再懸濁した。
結果
ポリアニオンスルフェートイントラサイトは、濃いオレンジ色に染色した。非改質又は手順を終了した（ｅｘｐｉｒｅｄ）材料は、薄いピンクに染色した。
【０２４８】
細胞付着蛋白質の、スルフェートイントラサイトへの吸着
方法
細胞付着蛋白質の、スルフェートイントラサイト粒子への吸着を、免疫細胞化学により確認した。スルフェートイントラサイト（１ｍｌ；ＰＢＳ中６．５ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ中で３回洗浄し（１０ｍｌ；２５００ｒｐｍ遠心分離；５分）、（ｉ）精製／組み換え細胞接着因子の６０μｇ／ｍｌ溶液〔血漿フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、細胞フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、フィブロネクチン−ＥＤＡ（アフィニティ精製）、コラーゲンＶＩ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（すべてＰＢＳ中２ｍｌ）〕又は（ｉｉ）ＰＢＳ中６０％ウシ胎児血清（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかの中でインキュベートした（１６時間；４℃；一定に撹拌）。ＢＳＡ（２ｍｌ ＰＢＳ中６０μｇ／ｍｌ）を対照として使用した。
血清中のフィブロネクチンの濃度は、約１００μｇ／ｍｌである。結果として、６０％希釈液は、約６０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンを生じる。
【０２４９】
被覆材料をＰＢＳで３回洗浄し、ＢＳＡ（ＰＢＳ中３％ｗ／ｖ；１時間；室温Ｓｉｇｍａ）中でインキュベートして、ブロックした。次いで、ゲルを３回洗浄し、３７℃で１時間、関連する結合材料に対して生じた一次抗体と１ｍｌＰＢＳ中でインキュベートした。使用した抗体は、マウス抗フィブロネクチン−ＥＤＡ抗体（５０μｇ／ｍｌ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウサギ抗フィブロネクチン抗体（５０μｇ／ｍｌ；Ｄａｋｏ）、ウサギ抗ビトロネクチン抗体（５０μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及びウサギ抗コラーゲンＶＩ抗体（２０μｇ／ｍｌ；Ａｂｃａｍ）であった。非免疫ウサギＩｇＧフラクション（５０μｇ／ｍｌ；Ｄａｋｏ）を対照として使用した。
【０２５０】
次いで、試料をＰＢＳ中で３回洗浄した。ウサギ抗体標識試料を視覚化するために、標本を、ＦＩＴＣ複合ブタ抗ウサギ二次抗体（ＰＢＳ中１：１００希釈；３７℃で１時間；Ｄａｋｏ）とインキュベートした。マウス抗フィブロネクチン−ＥＤＡ抗体の検出のため、ビオチニル化ウサギ抗マウス二次抗体（Ｄａｋｏ）を使用し、続いて洗浄し（ＰＢＳ中で３回）、３７℃で１時間、ＰＢＳ中の１：１００希釈液で、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて検出した。次いで、ゲルをＰＢＳで３回洗浄した。少量のアリコートを、次いでガラススライドに移し、カバーガラスで覆って、４８８ｎｍで励起するＡｒＫｒレーザを用いたＬｅｉｃａ ＤＭ−ＲＥ共焦点顕微鏡を使用して観察した。
【０２５１】
結果
試験されたすべての細胞接着因子は、スルフェートイントラサイトゲルに結合するのが立証できた。図４．７は、スルフェートイントラサイトに結合する血漿フィブロネクチン、細胞フィブロネクチン及びフィブロネクチン−ＥＤＡを図示する。図４．８は、コラーゲンＶＩ結合を図示する。図４．９は、ＦＣＳからの吸収に後の、フィブロネクチン及びビトロネクチン結合を図示する。染色は、ＢＳＡで被覆された対照ゲル及び非免疫ウサギＩｇＧとインキュベートされたゲルでは起こらなかった。
【０２５２】
スルフェートイントラサイト及び非改質イントラサイトへの細胞付着
方法
ＤＭＥＭ（５００ｍｌ）、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ；５ｍｌ）、非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ ５ｍｌ）ならびにＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ；５ｍｌ）を混合して、無血清ＤＭＥＭを調製した。
サルフェート及び非改質イントラサイトを、ＰＢＳ中に再懸濁し（６．５ｍｌ／ｍｌ）、１２１℃で１５分間、オートクレーブで処理して、滅菌した。オートクレーブで処理された材料を、ＰＢＳで３回洗浄し（２５００ｒｐｍ遠心分離；５分）、ＰＢＳ又は６０％ウシ胎児血清（ＰＢＳ中；Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかの中に４℃で２時間再懸濁させた。
次いで、試料をＰＢＳ中で２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ中に再懸濁させた。
【０２５３】
骨髄間質細胞の融合Ｔ１７５フラスコをＰＢＳ中ですすぎ、トリプシン処理した（Ｓｉｇｍａ）。懸濁した骨髄間質細胞（７５０ｋ細胞）、ＰＢＳ又はＦＣＳ前処理済スルフェートイントラサイトもしくは未処理イントラサイトを、２０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中で混合し、培養物を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で１時間〜１４日間インキュベートした。あらゆる生存接着細胞を視覚化するために、培養物をカルセインＡＭで処理し（０．６μｌ；１ｍｇ／ｍｌ；９０分；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０２５４】
結果
ＰＢＳ又はウシ胎児血清（６０％）で前処理されたかどうかにかかわらず、ごくわずかな細胞しか、非改質イントラサイトゲルに接着しなかった。同様に、ＰＢＳだけで前処理したスルフェートイントラサイトに接着する細胞はほとんどなかった。対照的に、細胞は、６０％ＦＣＳ前処理済スルフェートイントラサイトにすぐに接着し、その表面上で拡散した。図４．１０は、ＦＣＳ前処理済非改質イントラサイトへの細胞付着を、ＦＣＳ前処理済スルフェートイントラサイトへの細胞付着と比較したものである。
結論
血清からスルフェートイントラサイトの表面上に吸収された細胞接着因子は、この生体材料への細胞付着を支持できるであろうという結論が下された。
【０２５５】
（以前は「ｐ−トシルクロライド」として知られていた）ｐ−トルエンスルホニルクロライドを用いた、スルフェートイントラサイトへの抗体の付着
異なる細胞タイプは、特定の組の細胞表面分子（例えば、シグナルレセプター、酵素、構造成分又は表層結合シグナル分子）により特性付けされる。これらの表面マーカーに対して生成された特異的抗体を、１つの細胞タイプを選択的に結合させ、それを混合群から分離するのに使用してもよい。以下の方法は、軟骨始原細胞結合材料を生成するために、抗ノッチ−１抗体又は抗インテグリンβ１（表層軟骨始原細胞により発現されたエピトープを認識する抗体）が、いかにしてスルフェートイントラサイトに結合され得るかを記載する。この方法は、これら抗体に特異的ではなく、異なる抗体を粒状生体材料に付着させるのに使用できるであろう。
【０２５６】
スルフェートイントラサイトＴＭを乾燥ピリピリジン（３５％ ｗ／ｗ）中に懸濁し、わずかにモルが余分なトシルクロライド（１０％ｗ／ｗ）と混合し、不活性雰囲気下、８℃で１６時間撹拌した。活性ゲルを濾過により回収し、完全に洗浄して、１〜２時間材料をボルテックスし、均質な懸濁液を調製した。抗ノッチ−１抗体（５μｇ； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又は抗β１インテグリンを添加して、１〜２分、懸濁液をボルテックスした。ＢＳＡ（０．５％ ｗ／ｖ最終濃度）を添加して、反応を終わらせる前に、懸濁液を、傾むけてゆっくりと回転させながら３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、反応混合物を回転子に戻し、３７℃で更に１６〜２４時間インキュベートした。
抗体変性サルフェートイントラサイトＴＭを、アセテート緩衝剤中で２回洗浄し（０．１Ｍ；ｐＨ ４．０；４℃で５分）、３７℃で４時間、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１回洗浄した。材料をアセテート緩衝剤中で洗浄し（５分；４℃）、４℃で保管した。
【０２５７】
細胞付着因子を結合し、細胞接着を支持するための代替ポリアニオン、ポリサッカリド材の使用
（細胞又はタンパク質を結合しない）架橋ポリサッカリド材「セファロース」からなるヘパリンセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、生分解性ポリアニオン材のヘパリンに共有結合させた。このようなビーズは、生物学的分子の混合物からタンパク質を精製するために生化学で広く使用される。これらは一般的に、細胞培養には使用されない。ヘパリンセファロースビーズは、細胞を直接結合しないが、細胞接着因子を結合し、細胞接着因子で被覆されると、細胞付着を支持するであろうと仮定された。
【０２５８】
方法
ヘパリンセファロースビーズ（２００ｍｇ； Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、ＰＢＳで再水和し（４０ｍｌ；３７℃で１５分）、ＰＢＳで２回洗浄し、１１０℃で３０分間、オートクレーブで処理して滅菌した。ヘパリンセファロースビーズ（１０ｍｇ）を、２０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、８０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０％ ＦＣＳ、４０％ ＦＣＳ又はＰＢＳのみ（２０ｍｌ総量）のいずれかで前処理した。ビーズを１５分間沈殿させ、上澄み１５ｍｌを除去して、無血清ＤＭＥＭ（１５ｍｌ）中の４００×１０３個の骨髄間質細胞で取り替えた。培養物を混合し、３７℃で３０分〜３時間インキュベートした。非組織培養処理９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルに試料（１００μｌ）を移し、倒立位相差顕微鏡で観察した。
【０２５９】
コラーゲンＩＶ（２．５及び１０μｇ／ｍｌ）及びウシ胎児血清（４０％）を用いて実験を繰り返し、ヘパリンセファロースビーズ（２５ｍｇ）を被覆した。５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で６時間インキュベートした後、細胞を植え付けた被覆ビーズの４つの試料を位相差顕微鏡で観察し、１ビーズ当たりの接着細胞数を計数した。
さらに、骨髄間質細胞を植え付けたＦＣＳ前処理済ヘパリンセファロースビーズの試料を上記のとおりに予備調製し、ＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中で１〜２２日間培養して、位相差顕微鏡で観察した。
【０２６０】
結果及び考察
３０分後、細胞接着は、すべてのＢＳＡ又はヘパリンセファロースビーズのＦＣＳ前処理済試料でほとんどもしくは全く観察されなかった。しかし、３時間後、細胞接着及び細胞拡散が、４０％ＦＣＳ処理ヘパリンセファロースビーズ上で起こったが、ＢＳＡ処理試料、１０％ＦＣＳ前処理試料又はＰＢＳのみで前処理した試料では、どれにも起こらなかった。いくつかの細胞クランピングが、非付着細胞の中で観察され、非付着細胞が、ＢＳＡ被覆ビーズ、１０％ＦＣＳ被覆ビーズ又はＰＢＳのみにさらされたビーズに接着しなかったが、互いに接着可能であったことが示された。
【０２６１】
ＰＢＳ、コラーゲンＩＶ及びＦＣＳ前処理済ヘパリンセファロースビーズに付着した細胞の計数は、１ビーズ当たりの結合細胞の数が（平均±ＳＥＭ）：１ビーズ当たりＰＢＳ前処理済０．５１±０．０９細胞；１ビーズ当たりコラーゲンＩＶ（２．５μｇ／ｍｌ）前処理済３．４５±０．１９細胞（ｐ＜０．００１）；１ビーズ当たりコラーゲンＩＶ（１０μｇ／ｍｌ）前処理済３．２３±０．２２細胞（ｐ＜０．００１）；及び１ビーズ当たり４０％ＦＣＳ前処理済３．１７±０．４２細胞（ｐ＜０．００１）であることを示した。ヘパリンセファロースビーズは、ＦＣＳ中に存在するコラーゲンＩＶ又は細胞接着分子を吸収し、その後、細胞接着を支持できるであろうという結論が下された。これはタンパク質に特異的な性質である。なぜなら、ＢＳＡはビーズを被覆できないし、細胞接着も支持できないからである。
【０２６２】
細胞の試料及びＦＣＳ前処理済ヘパリンセファロースビーズを６〜１０日間培養すると、それらは、細胞、ビーズ及び細胞外マトリクス成分の肉眼的凝集体を形成した。細胞−接種凝集体を長期間（すなわち１４〜２２日間）培養すると、細胞／材料凝集体は収縮し、ビーズを放出して、小さな細胞クラスターを残すことが観察された。サフラニン Ｏでの組織学的染色は、この染色が、ヘパリン被覆が劣化した時に起こったことを示した。これは、推測するに、この染色が非細胞接着セファロースを露出させ、細胞付着因子を放出し、それによってビーズへの細胞付着を終わらせるからである。この観察は、「切り替え可能」細胞結合材料への経路を示唆したが、軟骨インプラントの理想的な性質ではないと判断された。共有連鎖アニオン官能基を持つ、ゆっくりと劣化するポリサッカリド材料又は非生分解性のポリサッカリド材料は、ヘパリンセファロースに好ましいであろうという結論が下された。
【０２６３】
デキストランビーズを着けた（ｄｅｘｔｒａｎ ｂｅａｄｅｄ）サルフェートビーズ（Ｓｉｇｍａ）は、共有結合アニオン基を持つ、球形の架橋ポリサッカリド粒状材料である。材料を細胞接着因子で被覆し、細胞付着及び成長を支持する能力を評価した。
デキストランサルフェートビーズ（６６７ｍｇ；Ｓｉｇｍａ）を、２６．７ｍｌのＰＢＳ中で３０分間再水和し、オートクレーブで処理して（１２１℃；１５分）、冷却させた。無菌材料をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ｄｅｎｌｅｙミキサー上で、３７℃で２時間、６０％ ＦＣＳ（総量６６．７ｍｌ中）又はＰＢＳ（６６．７ｍｌ）のいずれか中でインキュベートした。ビーズを沈降させ、無血清ＤＭＥＭ中で３回洗浄して、〜１７ｍｌの４０ｍｇ／ｍｌ ６０％ＦＣＳ前処理済デキストランサルフェートビーズを生成した。
【０２６４】
６０％ＦＣＳ前処理済デキストランサルフェートビーズ（３０ｍｇ）又はＰＢＳ前処理済デキストランサルフェートビーズ（３０ｍｇ）を、Ｈａｍｓ Ｆ−１２（１０％）、ＦＣＳ（１０％）及びアスコルビン酸二リン酸（５０μｇ／ｍｌ；５ｍｌ）を補足したＤＭＥＭ中で、骨髄間質細胞（２００ｋ細胞）と混合した。培養物を３７℃で０〜２２日間インキュベートした。
結果
骨髄間質細胞は、６０％ＦＣＳ前処理済デキストランサルフェートビーズの表面にすぐに接着したが、ＰＢＳ前処理済デキストランサルフェートビーズの表面には付着しなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１．１】Ｎ１ （ノッチ−１）の免疫学的局在性を示す。Ｎ１を発現しない新生ウシ関節軟骨細胞の表層の上部の２〜３細胞層にほぼ完全に制限されていることが分かっているＮ１発現（緑、１．１１）は、ヨウ化プロピジウムによって対比染色される（赤、１．１０）。矢印１．１３は、関節表面を示す。
【図１．２】図１．１の拡大図である。
【図１．３】Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの免疫学的局在性を示す。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡ 発現は細胞結合性で、関節軟骨の外表面にほぼ完全に制限されている（緑、１．３１）。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡを発現しない細胞は、ヨウ化プロピジウムによって対比染色される（赤、１．３２）。矢印（１．３３）は、関節表面を示す。
【図１．４】中央層でのＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡについて最小限の免疫学的局在性を示す。
【図１．５】図１．４のコントロールを示す；コントロール区分、緑染色がないことに注意。
【図１．６】Ｎ１免疫学的局在性を示す。
【図１．７】Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの免疫学的局在性の図である。
【図１．８】未成熟なウシ軟骨におけるＮ１とＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ＥＤＡの同時局在を示す。Ｎ１免疫局在（緑、１．８１）、フィブロネクチン−ＥＤＡ免疫局在（赤、１．８２）の重層。矢印は、関節表面を示す。これは、Ｎ１発現細胞もフィブロネクチン−ＥＤＡを発現することを示している。
【図１．９】「早期−フィブロネクチン結合」表層のコロニー形成効率が、他の軟骨細胞群に見られるよりも著しく高かったグラフを示している（ｐ＜０・０１）。
【図１．１０】「早期−フィブロネクチン結合」表層細胞によって形成されるコロニーの顕微鏡写真である。
【図１．１１】軟骨細胞単離直後のノッチ標識を示す。ＦＡＣＳ分析を用いる軟骨細胞による特異なＮ１発現の分析。約７５％の表層、１０％の中央層及び２５％の深層の細胞が、組織からの単離直後のＮ１に陽性であった。
【図１．１２】ノッチ陽性細胞の磁気ビーズ分離を用いて６日目のコロニー形成効率についてのＮ１陽性選択の作用を示す。Ｎ１陽性の中央層及び深層の細胞のものより、Ｎ１陽性表層細胞由来のコロニーが著しく多かった（ｐ＜０・００１）。
【図１．１３】ＦＡＣＳを用いる表層軟骨細胞による特異なインテグリン発現の分析である。
【図１．１４】表層、中央層及び深層の軟骨細胞の平均細胞径のグラフである （平均±ＳＥＭ）。表層、中央層及び深層の軟骨細胞の平均細胞サイズの測定。ＳＺＣ （表層軟骨細胞）とＭＺＣ （中央層軟骨細胞）（ｐ ＜０・０５） ならびにＳＺＣとＤＺＣ （深層軟骨細胞） （ｐ＜０・００５）との直径には有意差がある。
【図１．１５】図１．１５ ａ、ｂ、ｃは、相対比光学を用いてそれぞれ視覚化されたＳＺＣ、ＭＺＣ及びＤＺＣの代表写真である（倍率 ｘ２００）。
【図１．１６】ペレット培養の組織学的研究を示す。「早期−結合」表層軟骨細胞ペレットのＨ＋Ｅ 染色は、試料図１．１６ａ （７ 日； ＳＺＣ； Ｈ＋Ｅ； ｘ５ｏｂｊ） 及び図１．１６ｂ （７日；　ＳＺＣ エッジ； Ｈ＋Ｅ； ｘ２０ｏｂｊ）全体に形態学的に正常で生存力ある細胞の存在を示した。
【図１．１７】ペレット培養の組織学的研究を示す。ピクロシリウスレッドは、特に細胞を取巻く領域のマトリクスでコラーゲンの沈着を示した（２１日； ｘ２０ｏｂｊ）。
【図１．１８】ペレット培養の組織学的研究を示す。グリコサミノグリカンのサフラニンＯ染色は、細胞によって産生される細胞外マトリクスの濃い暗橙色染色を呈し、細胞がプロテオグリカン−リッチなマトリクスを分泌することを示した（２１ 日； ＳＺＣ； ｘ５ｏｂｊ）。
【図１．１９】ペレット培養の免疫細胞化学研究を示す。免疫化学は、細胞がペレット培養で軟骨特異的なマトリクス成分を合成していたことを示した。ペレット中の細胞外マトリクスは、ＩＩ型コラーゲンを含んだ（１４日； ＳＺＣ； ｘ２０ｏｂｊ）。
【図１．２０】ペレット培養の免疫細胞化学研究を示す。Ｉ型コラーゲンの不在は、細胞が分化して軟骨細胞を形成し、脱分化が生じていないことを示す（１４日； ＳＺＣ； ｘ２０ｏｂｊ）。
【図１．２１】ペレット培養のマトリクスにおけるコンドロイチン４スルフェートの存在を示す。
【図１．２２】ペレット培養のマトリクスにおけるコンドロイチン６スルフェートの存在を示す。
【図１．２３】ペレット培養中の関連結合タンパク質の分布を示す蛍光画像である（１０日； ｘ１２６ｏｂｊ）。
【図１．２４】部分的に厚みのある軟骨欠損に移植された表層、中央層及び深層の軟骨細胞のペレット培養を示す。
【図１．２５】発達中の軟骨、例えば耳の盃状窩を含む胚のＣＦＤＡ ＳＥ標識細胞域を用いるインオボの軟骨始原細胞追跡を示す。
【図１．２６】Ｈ＆Ｈ 段階３０−３２のニワトリ胚の軟結合組織におけるＣｙ３−接合第二抗体で局在化されるウシＭＨＣ１陽性細胞を示す（倍率 ｘ １２６）。
【図１．２７】Ｈ＆Ｈ 段階３０−３２のトルイジンブルー染色したニワトリ胚を示す。ひよこの翼のウシ異所性軟骨は、注入された表層軟骨細胞から生じた。
Ａ．　崩壊した異所性軟骨のメタ染色性顆粒染色。
Ｂ．　周囲の繊維組織。
【図２．１および２．２】培養物の「層状化」領域の潜在的な形態とプロフィルを示す。
【図２．３】細胞接合因子被覆スルフェートに結合した骨髄間質細胞を示す。１６時間以内のイントラサイトと増殖。
【図２．４】４日後の材表面上の接着細胞群を示すカルセインＡＭ染色を示す。
【図２．５】ピクロシリウスレッドで示される培養物中の７日後のコラーゲンマトリクスの沈着を示す。
【図２．６】１０日後のフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトで培養される骨髄間質細胞の試料におけるＩ型コラーゲンの産生を示す免疫化学を示す。
【図２．７】コラーゲンＩＩの産生の証拠が認められないことを示している。
【図２．８】材粒子表面上とそれらの間の空間の双方における、凝集物全体にわたる生存力ある細胞を示すＭＴＴ染色を示す。
【図２．９】図２．９ａは、細胞が、ピクロシリウスレッドで染色された凝集物内に膠原マトリクスを沈積していることを示し、また軟骨細胞が特異的な軟骨形態のコラーゲン、ＩＩ型コラーゲンを発現したことを免疫細胞化学的に示している（図２．９ｂ）。
【図２．１０】細胞表面マトリクスへ軟骨細胞がコラーゲンＶＩを分泌していることを免疫細胞化学により示している。
【図２．１１】培養中２７日後ですら、軟骨細胞がコラーゲンＩを産生していないことを免疫細胞化学により示している。
【図２．１２】ウシの軟骨細胞が、最初の１０日間に生じるかなり迅速な発生を伴って培養期間中１４．４倍に増すことを示すグラフである。
【図２．１３】二層の繊維補強細胞／生態適合性構築物を形成するためのスカホールドに（Ｉ）骨髄間質細胞を接種したフィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイト及び（ＩＩ）軟骨細胞−接種被覆スルフェートイントラサイトを連続的に遠心分離することによる、二層構築物の形成に用いられる使用装置及び方法の概要を示す。
【図２．１４】遠心分離回転の回転方向に対する「非対称カラー」の好ましい方向とローターの根軸を示す。
【図２．１５】着色したスルフェートイントラサイトの二分子層の沈着を示す。
【図２．１６】（Ｉ）ピコグリーン染色した骨髄間質細胞を接種した、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトの層及び（ＩＩ） ＥｔＢｒＨＤ染色した軟骨細胞を接種した、被覆スルフェートイントラサイトの層からなる二分子層構築物を示す。
【図２．１７】コントロールに比較した、２つのフェルトにおける緑蛍光の定量を示す。直接的な外観では、下部のフェルトを同一細胞群で接種する前の３０分間、フィブロネクチンで被覆され、軟骨細胞混合群で接種された上部のフェルトに多量のＮ１＋ 蛍光がある。
【図２．１８】種々の層における緑蛍光の定量を示す。直接的な外観では、フィブロネクチンで被覆した上部表面を有するフェルトの上部表面に多量のノッチ１＋ 蛍光がある。
【図３．１】図３．１ａ 〜３．１ｄは、この発明によるインプラントを示す。
【図３．２】図３．２ａ 〜３．２ｃは、多層インプラントを製造するための、細胞結合特性及び浮遊密度／沈降速度が異なる被覆マイクロビーズの使用を例示している。沈降速度の異なる２種のマイクロビーズ（微粒子体）を軟骨細胞懸濁液に混合し（図３．２ａ）、凝集させる（図３．２ｂ）。マイクロビーズ型の１つは、軟骨始原細胞を選択的に結合する材で被覆されるが、他方のマイクロビーズ型は、別の細胞種（例えば下方の軟骨細胞系に見られる多くの成熟軟骨細胞）に選択的に結合する。細胞の接着後、細胞被覆マイクロビーズが沈降されて、多層沈着物を形成する（図３．２ｃ）。次いで、沈着物が一緒になって、元の場所で硬化する結合材（例えばアルギネートゲル）を用いてインプラントを形成する。
【図３．３】図３．３ａ〜３．３ｃは、沈降速度の異なる２種以上のマイクロビーズと組み合わさった、３Ｄ−ニットであり得るスカホールド材を用いる多層インプラントの製造を例示する。図３．２にあるように、あるマイクロビーズ型を軟骨始原芽細胞結合材で被覆し；別の型を別の細胞種（例えば下方の軟骨細胞系に見られる多くの成熟軟骨細胞系）を選択的に結合する材で被覆する。図３．２にあるように、マイクロビーズを軟骨細胞の懸濁液と混合し（図３．３ａ）、懸濁液中の細胞と相互作用させ（図３．３ｂ）、生体適合性スカホールドの空のスペースに沈降させて多層インプラントを形成する（図３．３ｃ）。
【図３．４】図３．４ａ〜３．４ｃは、均質なろ紙として役立つことを目的とした、３Ｄ−ニットであり得る、大きさ、細胞結合親和性及び生体スカホールド材の異なる２種以上のマイクロビーズとの組み合わせを用いる多層インプラントの製造を例示する。前記の図にあるように、あるマイクロビーズ型は軟骨始原細胞結合材で被覆され；他方は、下方の軟骨細胞系に見られる別の細胞種に選択的に結合する材で被覆される。細胞結合粒子と軟骨細胞（示さず）を混合し（図３．４ａ）、細胞をある又は別の群のビーズに選択的に結合させた（図３．４ｂ）。細胞被覆マイクロビーズを均質なろ紙に出す。別の型のマイクロビーズよりもさらに小さいマイクロビーズ（ある細胞型で被覆）をさらにろ紙に出し、（細胞型が異なるので）、それにより層状化装置を生ずる。
【図３．５】本発明によるインプラントの概略図である。
【図３．６】種々のリガンドへの最初の結合から４日後の表面とＤＺＣのコロニー形成効率を示す（ＦＮ、フィブロネクチン； Ｃ１、コラーゲンＩ； ＣＩＩ、コラーゲンＩＩ； ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン； ＣＩＶ、コラーゲンＩＶ； ＬＭ、ラミニン； ＴＮ、テンサシン（ｔｅｎｓａｃｉｎ））。合計した３実験の平均（±ｓｅｍ）、ｎ＝４ ディッシュ／リガンド／実験。
【図３．７】ＰＢＳ被覆スルフェートイントラサイトに比較される、フィブロネクチン被覆スルフェートイントラサイトへの表層細胞結合を形成する多くのコロニーを示すコロニー涸渇アッセイの使用を示す。結果は、４個の複製マルチウェルプレートの１２ウェルそれぞれで形成されるコロニー数である。
【図３．８】ＰＢＳ、血漿フィブロネクチン、細胞性フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ、ラミニン又はポリリジンで被覆したスルフェートイントラサイトへのコロニー形成骨髄間質細胞結合を比較するコロニー涸渇アッセイの使用を示す。血漿フィブロネクチン−被覆スルフェートイントラサイトは、コロニー形成細胞に最も高い親和性を有するが、コラーゲンＩＶ被覆イントラサイトは、コロニー形成細胞結合について高いレベルを示す。
【図４．１】本発明の実施態様の合成インプラントを示す。
【図４．２】本発明のバイオリアクターに挿入するための挿入手段を示す。
【図４．３】細胞接種及び微粒子のインキュベート段階中の本発明の実施態様のバイオリアクターを示す。
【図４．４】細胞−接種微粒子を図３の合成インプラントに遠心分離した直後の、本発明の実施態様のバイオリアクター内に設置したハイブリッドインプラントを示す。
【図４．５】顕微鏡でのサルフェート材の外観を示す。
【図４．６】改質及び非改質材の代表的なスペクトルを示す。
【図４．７】スルフェートイントラサイトＴＭに結合する血漿フィブロネクチン、細胞フィブロネクチン及びフィブロネクチン−ＥＤＡを示す。
【図４．８】スルフェートイントラサイトＴＭに結合するコラーゲンＶＩを示す。
【図４．９】ＦＣＳからの吸収後に、スルフェートイントラサイトＴＭに結合するフィブロネクチン及びビロトネクチンを示す。
【図４．１０】サルフェート及び非スルフェートイントラサイトＴＭへの細胞の植え付けを示す。
【図１．９】
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【図１．１１】
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【図１．１２】
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【図１．１３】
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【図１．１４】
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【図１．２４】
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【図２．１２】
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【図２．１４】
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【図２．１７】
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【図２．１８】
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【図３．６】
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【図３．７】
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【図３．８】
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【図４．６】
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【図４．７】
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【図４．８】
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【図４．９】
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【図４．１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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