(57)【要約】キメラタンパク質は、ある供給源由来の酸化還元触媒領域及びこれと異なる供給源由来の電子伝達領域を含む。上記タンパク質は、上記酸化還元触媒領域のための基質が作用し、電子を上記酸化還元触媒領域と上記電子伝達領域との間で、及び、上記電子伝達領域と電極との間で移動させる方法において用いられる。上記電極における電流又は電圧を、分析対照物である基質の存在又は量を決定するために監視することができる。また、電流は、上記電極を通って、上記基質の反応を引き起こすために、例えば試料を解毒するために放出されてよい。上記酸化還元触媒領域はチトクロムＰ４５０由来のものが好ましく、上記電子伝達領域はフラボドキシンであってよい。
2004538465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の供給源由来の酸化還元触媒領域、及び、前記第一の供給源とは異なる第二の供給源由来の電子伝達領域を含むキメラタンパク質を、前記触媒領域に対する基質及び電極と接触させることにより、前記基質を前記触媒領域付近で作用させて生成物を形成させ、前記電極と前記電子伝達領域との間で、及び、直接的に前記電子伝達領域と前記触媒領域との間で電子を移動させる方法。
【請求項２】
前記酸化還元触媒領域はヘム含有領域である
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヘム含有領域はモノオキシゲナーゼ領域である
ことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記電子伝達領域はヘムレダクターゼ領域であり、かつ、前記電極は陰極である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記電子伝達領域はフラボタンパク質である
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
前記フラボタンパク質はＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来フラボドキシン、又は、その活性電子伝達変異体である
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
電子は前記電極から前記電子伝達領域へ直接移動させる
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８】
前記キメラタンパク質は、前記電子伝達領域のための結合部位を有する結合配列を更に含んでいる
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記結合配列は前記酸化還元触媒領域と同じ供給源由来である
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化還元触媒領域の供給源はチトクロムＰ４５０である
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化還元触媒領域は細菌性チトクロムＰ４５０酵素由来である
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素は巨大菌のＢＭ３である
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電極への又は前記電極からの電子の流れは、検流器又は電圧検知機を用いて測定する
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質が分析対象物であり、流動電子を測定して基質の存在又は量を検出している
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
電子が前記電極から放出され、前記基質が消費され、前記生成物が前記キメラタンパク質から分離されて回収される
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記キメラタンパク質が前記電極に固定され、前記基質が固定化された酵素と接触した状態で溶液中に最初から存在し、かつ、前記生成物が溶液中から回収されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ａ）第一の供給源に由来する酸化還元触媒領域、及び、前記第一の供給源と異なる第二の供給源に由来する電子伝達領域を含むキメラタンパク質、及び、
ｂ）電極
を有する
ことを特徴とするキット。
【請求項１８】
前記酸化還元触媒領域に対する基質を含む
ことを特徴とする請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
前記電子伝達領域及び前記電極が、電子が前記電極から前記電子伝達領域へ直接移動可能となるように選択される
ことを特徴とする請求項１７又は１８記載のキット。
【請求項２０】
前記電子伝達領域が前記陰極上に固定されている
ことを特徴とする請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
前記固定は、前記電子伝達領域のアミノ酸残基の側鎖と前記電極表面との共有結合によるものである
ことを特徴とする請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
前記酸化還元触媒領域はヘム含有領域である
ことを特徴とする請求項１７〜２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】
前記ヘム含有領域はモノオキシゲナーゼ領域である
ことを特徴とする請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
前記電子伝達領域はヘムレダクターゼ領域であり、かつ、前記電極は陰極である
ことを特徴とする請求項１７〜２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
前記電子伝達領域はフラボタンパク質である
ことを特徴とする請求項１７〜２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
前記フラビン結合タンパク質はＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来フラボドキシン、又は、その活性電子伝達変異体である
ことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
電子は前記陰極から前記電子伝達領域へ直接移動させる
ことを特徴とする請求項１７〜２６のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
前記キメラタンパク質は、前記電子伝達領域のための結合部位を有する結合領域を更に含んでいる
ことを特徴とする請求項１７〜２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
前記結合領域は前記酸化還元触媒領域と同じ供給源由来である
ことを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記酸化還元触媒領域の供給源はチトクロムＰ４５０である
ことを特徴とする請求項１７〜２９のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
前記酸化還元触媒領域は細菌性チトクロムＰ４５０酵素由来である
ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記酵素は巨大菌のＢＭ３である
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３３】
前記電極、溶液中に前記酸化還元触媒領域に対する基質を含む液体、及び、前記酸化還元触媒領域が前記基質と接触している状態で、かつ、電子が前記陰極から前記電子伝達領域へ移動されていてもよい状態の前記キメラタンパク質を含む反応容器を有するキットであって、前記キットは前記電極に電気的に接続されたカレント・コレクタ（ａ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）を更に有する、
ことを特徴とする請求項１７記載のキット。
【請求項３４】
前記カレント・コレクタ及び前記電極を流れる電流、並びに／又は、前記電極の電位を検出するための、電流及び／又は電圧監視手段を更に有する
ことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラタンパク質を用いて電気化学的処理を行う方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）は生物分析分野と深い関連がある（非特許文献１）。Ｐ４５０は、今日使用されている薬剤のほとんどの代謝に重要な組織の全てに存在する酵素で、一大ファミリーを形成しており、薬剤の開発と発見の過程で重要な役割を果たしている（非特許文献２、３）。Ｐ４５０は、酸素分子の原子２つのうち１つが様々な基質（Ｒ）の広範囲の場所に挿入されるのを触媒し、同時にもう１つの酸素原子を下記の反応に従って水に還元する反応を引き起こす。
ＲＨ＋Ｏ２＋２ｅ−＋２Ｈ＋→ＲＯＨ＋Ｈ２Ｏ
【０００３】
Ｐ４５０はこのように重要であるにも関わらず、電極表面との相互作用が小さいことや、哺乳類のＰ４５０が生体膜と結合することに関わる問題があるため、Ｐ４５０を生物分析分野に応用するのは困難である。それでもやはり、新規の潜在的な薬剤の代謝的変換又は毒性の傾向を高速で大量にスクリーニングするための電極を作成できれば、この酵素を素晴らしく応用できる可能性がある。
【０００４】
チトクロムＰ４５０ＢＭ３は、触媒として自給自足できる可溶性の脂肪酸モノオキシゲナーゼであり、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から単離された（非特許文献４、５）。この酵素が多領域構造を有していること、すなわち１０４８個の残基からなる１１９ｋＤａのポリペチド鎖１つに融合している３つの領域、ＦＡＤ１つ、ＦＭＮ１つ及びヘム領域１つからなっている点が特に興味深い。更に、Ｐ４５０ＢＭ３は、細菌由来であるにも関わらず、ミクロソームに存在する真核生物のＰ４５０に代表される、クラスＩＩのＰ４５０酵素に分類される（非特許文献６）。Ｐ４５０ＢＭ３は、その配列の３０％がミクロソームの脂肪酸ｗ−ヒドロキシラーゼと同一で、３５％がミクロソームのＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼと同一であり、他の細菌性Ｐ４５０とは２０％の相同性を有するのみである（非特許文献６）。上記の特徴は、Ｐ４５０ＢＭ３を哺乳類のＰ４５０の代替として使用できる可能性を示唆しており、このことは最近、ウサギＰ４５０２Ｃ５の構造が解明された際に実証された（非特許文献７）。
【０００５】
非特許文献８は、巨大菌のＢＭ３由来の酸化還元触媒領域、及び、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ）由来のフラボドキシンからなり、ｐＴ７発現系において発現しているキメラタンパク質を開示している。ＢＭ３の酸化還元触媒領域に結合しているアラキドン酸（基質）の存在下でＦＬＤ（フラボドキシン）をそのセミキノン体に光還元し、この現象を一酸化炭素雰囲気下において４５０ｎｍで監視することによって、ＢＭ３由来の酸化還元触媒領域とＦＬＤの電子伝達領域との間の電子伝達が観察された。
【非特許文献１】
Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｔｓｏｔｓｏｕ，Ｇ．Ｅ．，Ｆａｉｒｈｅａｄ，Ｍ．，Ｍｅｈａｒｅｎｎａ，Ｙ．Ｔ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（２００１）“Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐ４５０  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”Ｉｎ：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｄｅ  Ｃｕｙｐｅｒ，Ｍ．，Ｂｕｌｔｅ，Ｊ．（Ｅｄｓ），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２】
Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｌ．（１９９５）“Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５，７６７−７７４
【非特許文献３】
Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，Ｆ．Ｐ．（１９９９）“Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９，１−１７
【非特許文献４】
Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．，Ｆｕｌｃｏ，Ａ．Ｊ．（１９８６）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａ１１ｙ  ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  １１９，０００−Ｄａｌｔｏｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１（１６），７１６０−７１６９
【非特許文献５】
Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．，Ｆｕｌｃｏ，Ａ．Ｊ．（１９８７）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０ＢＭ３，  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｎｏｏｘｉｇｅｎａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２（１４），６６８３−６６９０
【非特許文献６】
Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｂｏｄｄｕｐａｌｌｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｈａｓｅｍａｎｎ，Ｃ．Ａ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９３）“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｐ４５０ＢＭ−３，  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｐ４５０ｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，７３１−７３６
【非特許文献７】
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ａ．，Ｃｏｓｍｅ，Ｊ．，Ｓｒｉｄｈａｒ，Ｖ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｆ．，ＭｃＲｅｅ，Ｄ．Ｅ．（２０００）“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，５，１２１−１３１
【非特許文献８】
Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｍｅｈａｒｅｎｎａ，Ｙ．Ｔ．，Ｆａｎｔｕｚｚｉ，Ａ．，Ｖａｌｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（２０００ａ）“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｒｅｄｏｘ  ｃｈａｉｎｓ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｅｇｏ”Ｆａｒａｄａｙ  Ｄｉｓｃｕｓｓ．，１１６，１３５−１５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、第一の供給源由来の酸化還元触媒領域、及び、上記第一の供給源とは異なる第二の供給源由来の電子伝達領域を含むキメラタンパク質を、触媒領域に対する基質及び電極と接触させることにより、上記基質を上記触媒領域付近で作用させて生成物を形成させ、上記電極と上記電子伝達領域との間で、及び、上記電子伝達領域と上記触媒領域との間で電子を直接移動させる新規の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記方法では、第一の供給源と第二の供給源とは由来源の属や種が異なるが、異なる細胞小器官又は区画に由来するものであれば互いに同じ種に由来していてもよい。しかしながら、異なる種に由来する方が好ましい。
【０００８】
上記酸化還元触媒領域は、ヘム含有領域であることが好ましく、Ｐ４５０酵素由来であることが好ましい。また、上記ヘム含有領域はモノオキシゲナーゼ領域であることが好ましい。
【０００９】
上記電子伝達領域はヘムレダクターゼ領域であることが好ましく、かつ、上記電極は陰極であることが好ましい。また、上記電子伝達領域は、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来フラボドキシン等のフラボタンパク質、又は、その活性電子伝達変異体であることが好ましい。
【００１０】
いくつかの実施形態においてはユビキノンやチトクロム等の他の電子伝達モジュールによって電子を移動させることも可能であるが、電子は上記電極から上記電子伝達領域へ直接移動させることが好ましい。
【００１１】
上記キメラタンパク質は、上記電子伝達領域のための結合部位を有する結合配列を更に含んでいることが好ましい。上記結合配列は、上記酸化還元触媒領域と同じ供給源由来であってもよいが、巨大菌タンパク質ＢＭ３由来の結合部位であることが好ましい。
【００１２】
上記酸化還元触媒領域の供給源は、概してモノオキシゲナーゼ酵素であるチトクロムＰ４５０等のオキシゲナーゼ酵素であることが好ましい。ある実施形態において、上記酸化還元触媒領域は細菌性チトクロムＰ４５０酵素由来であり、最も好ましくは巨大菌のＢＭ３等の自給自足性酵素由来である。上記酸化還元触媒領域は、それ自身に複数の供給源由来の成分を含んでいてよい。このように、上記領域は、ある供給源由来の電子伝達領域のための結合部位、及び、異なる種、更には異なる属に由来する等、別の供給源に由来する基質結合部位を含んでいてよい。ある供給源は、哺乳類Ｐ４５０酵素等の哺乳類由来のものであってよい。
【００１３】
上記方法では、上記電極からの電子の流れは、例えば検流器又は電圧検知機を用いて測定することができる。通常、電流を測定することが望ましい。
【００１４】
上記方法は、分析対象物の存在、濃度又は異化作用を判定するために用いることができる。このような実施形態においては上記基質が分析対象物であり、上記方法では流動電子を測定して基質の存在又は量を検出している。
【００１５】
上記方法を電子が上記電極から上記電子伝達領域へ流れる場合の方法に用いることも可能であるが、電子が上記電極から放出され、かつ、上記基質が消費されることが好ましい。好ましい実施形態においては、上記生成物を上記キメラタンパク質から分離して、通常は回収する。上記方法が基質を解毒するのに有用であって、上記生成物を回収せずに単に処分する場合もある。本発明は、ヒトやそれ以外の動物に対して投与される、又は、これらに経口摂取される薬剤やそれ以外の化合物等の基質と上記酸化還元領域との反応を判定するのに有用であってよい。
【００１６】
別の方法においては、この工程を市販の製品として使用される製品の生産に用いることができる。このような方法においては、例えば上記電極に上記タンパク質を固定して上記生成物を溶液中から回収することにより、繰り返し反応を行う際に上記キメラタンパク質を用いることができる。例えば本発明は、電極に電流を流し、出発原料（基質）を消費し、所望の生成物を合成して溶液中から回収するといった電気化学合成に用いることもできる。
【００１７】
本発明にはまた、上記キメラタンパク質及び電極を含むキットも含まれる。上記電極は一般に、上記タンパク質を含有する水性反応媒体、及び、通常は上記基質を入れるための容器中に供給される。上記キットは上述の方法における好ましい特徴を有するべきである。
【００１８】
上記タンパク質の上記電極への固定は、例えばイオン結合を含む吸着によって、必要であれば対イオン的にタンパク質と上記電極の表面との両方に結合できる可溶性の荷電物質を用いて行ってよい。上記電子伝達領域のアミノ酸残基の側鎖から上記電極表面への共有結合による固定が好ましい。電極の形成に有用な方法等、タンパク質を表面、特に導電面に結合させるための従来公知の方法を用いてよい。例えば、システイン残基のチオール基を、金の表面に共有結合させるために用いてよい（Ｂａｇｂｙら（１９９１））。
【００１９】
いくつかの実施形態においては、上記キットは、固定化された状態の上記キメラタンパク質を備えて提供されてよい。別の実施形態においては、上記キメラタンパク質は上記キット中で水溶性の状態である。上記タンパク質が水溶性の状態で供給されるキットにおいては、上記タンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕで固定するための固定化手段を含んでいてもよく、その手段としては例えば多価荷電化合物、特にネオマイシンが挙げられる。
【００２０】
また、本発明は、
ｉ）ａ）電極、
ｂ）溶液中に上記酸化還元酵素の基質を含む液体、及び
ｃ）上記キメラタンパク質
を含む反応容器、及び、
ｉｉ）上記電極に電気的に接続されたカレント・コレクタ（ａ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）
を有する器具を提供する。
【００２１】
この器具は、上記カレント・コレクタ及び上記電極を流れる電流、並びに／又は、上記電極の電位を検出するための、公知の電流及び／又は電圧監視手段に接続していてよい。
【００２２】
本発明を関連する図によって説明する。
【００２３】
図１は、本発明をＰ４５０ＢＭ３に適用して、（Ａ）融合を通じて電子伝達タンパク質フラボドキシンと電気化学的に接近できるＰ４５０触媒領域を形成すること、及び、（Ｂ）薬理学的及びバイオセンシング的に応用する目的で、異なる触媒領域を有するＰ４５０ＢＭ３酵素ライブラリーを作成すること、を示す。
【００２４】
図２は、（Ａ）アラキドン酸結合ＢＭＰ（ＢＭＰ−Ｓ）のフラボドキシンセミキノン体（ＦＬＤｓｑ）による、４５０ｎｍにおいてストップフロー分光測定法により測定した、一酸化炭素存在下での還元、及び、（Ｂ）ＦＬＤｓｑとＢＭＰ−Ｓとの間のイオン強度（Ｉ）の平方根に対する限定擬一次速度定数（ｋｌｉｍ）の値、を示す。
【００２５】
図３は、ガラス質炭素電極における、ネオマイシンの不在下（１、細線）及び存在下（２、太線）での、ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質のサイクリックボルタモグラムを示す。一酸化炭素を添加した場合に、ピークが高電位に偏移している（３、点線）。電位は飽和カロメル電極に対して記載している。
【００２６】
図４は、ＢＭＰの遺伝子とＦＬＤの遺伝子を融合してＢＭＰ−ＦＬＤキメラを作成するための分子生物学的アプローチを示す。ＮＩａＩＩＩ制限部位は、オリゴヌクレオチド指定突然変異（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって導入した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下の実施例により、本発明を更に詳しく記載する。上記細菌性チトクロムＰ４５０ＢＭ３を用いて上述の３つの課題に対応するために用いた方法を図１に示す。
【００２８】
チトクロムＰ４５０ＢＭ３は触媒として自給自足できる可溶性の脂肪酸モノオキシゲナーゼであり、巨大菌から単離された（Ｎａｒｈｉ、Ｆｕｌｃｏ、（１９８６、１９８７））。
【００２９】
この酵素が多領域構造を有していること、すなわち１０４８個の残基からなる１１９ｋＤａのポリペチド鎖１つに融合している３つの領域、ＦＡＤ１つ、ＦＭＮ１つ及びヘム領域１つからなっている点が特に興味深い。更に、Ｐ４５０ＢＭ３は、細菌由来であるにも関わらず、ミクロソームに存在する真核生物のＰ４５０に代表される、クラスＩＩのＰ４５０酵素に分類される（Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎら（１９９３））。Ｐ４５０ＢＭ３は、その配列の３０％がミクロソームの脂肪酸ｗ−ヒドロキシラーゼと同一で、３５％がミクロソームのＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼと同一であり、他の細菌性Ｐ４５０とは２０％の相同性を有するのみである（Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎら（１９９３））。
【００３０】
上記の特徴は、Ｐ４５０ＢＭ３を哺乳類のＰ４５０の代替として使用できる可能性を示唆しており、このことは最近、ウサギＰ４５０２Ｃ５の構造が解明された際に実証された（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０００））。
【００３１】
上記の理由から、本実験の分子Ｌｅｇｏアプローチに用いる理想的候補としてこの酵素のヘム領域を選択し、所望の電気化学的特性を持つＰ４５０を生産する。特に、Ｐ４５０の電極表面への電子伝達を効率よくするために、Ｐ４５０ＢＭ３（ＢＭＰ）のヘム領域（１〜４７０残基）を触媒モジュールとして選択し、合理的な設計により、電子伝達モジュールとして用いるための、電子化学的特性の十分分かったＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のフラボドキシンと融合した（図１Ａ）。上記設計においては、上記電子伝達モジュール（フラボドキシン）が、結果的に得られるＰ４５０多領域構造と上記電極表面との接触を容易にし、埋め込まれているＰ４５０ヘムとの電気化学的接触を可能にするであろう。
【００３２】
Ｐ４５０酵素と未改質電極を電気化学的に直接作用させることは、ヘム補因子が深く埋め込まれていること、及び、生物マトリックスが上記電極表面との相互作用において不安定であることから、一般的に大変難しいことが分かっている。これらの問題に対する解決法の１つとしては、電極表面の改質がある。これまでなされてきた試みはほとんど、Ｐ４５０ｃａｍを電気化学的に特徴付けることを焦点としていた。この酵素が脂質又は多価電解質のフィルムに組み入れられ、そのヘム鉄（ＩＩ／ＩＩＩ）由来の酸化還元作用が明確にされた（Ｚｈａｎｇら（１９９７））。
【００３３】
最近、この酵素が、モンモリロナイトナトリウムにより改質されたガラス質炭素電極に対して、高速の不均一酸化還元反応を示すことが分かった（Ｌｅｉら（２０００））。更に、Ｈｉｌｌとその同僚ら（Ｋａｚｌａｕｓｋａｉｔｅら（１９９６））が、先端の平らなグラファイト電極を用いることによって、溶液中におけるＰ４５０ｃａｍの直接的な電気化学的特性について報告した。同じグループ（Ｌｏら（１９９９））が、先端の平らなグラファイト電極の、種々のＰ４５０ｃａｍの変異体に対するサイクリックボルタモグラムを明らかにした。しかし、これまでのところ、チトクロムＰ４５０ＢＭ３の電気化学的特性は、その溶解性、及び、膜結合型の哺乳類の酵素との密接な関係にも関わらず、文献において報告されていない。
【００３４】
＜方法＞
（Ｐ４５０ＢＭ３ヘム領域（ＢＭＰ）とフラボドキシン（ＦＬＤ）との間の電子伝達測定）
吸光度の測定は全て、ヒューレット・パッカード社製８４５２ダイオード・アレイ・スペクトロフォトメーターを用いて行った。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来の野生型フラボドキシン（ＦＬＤ、４．９μＭ）を５ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．３）に溶解したものを、２．５μＭのデアザリボフラビン（ｄｅａｚａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）（ｄＲｆ）及び０．８５ｍＭのＥＤＴＡ（犠牲電子供与体）の存在下で、そのセミキノン体に光還元した（ＦＬＤｓｑ、結果を記載している部分における反応式［１］及び［２］）。アラキドン酸結合ＢＭＰの還元を行った後、一酸化炭素雰囲気下で、４５０ｎｍでの吸光度を長さ１ｃｍのセルを備えたＨｉ−Ｔｅｃｈ社ＳＦ−６１ストップフロー装置を用いて２３℃において監視し、速度を測定した。アラキドン酸結合ＢＭＰの典型的な濃度は１μＭであり、ＦＬＤの典型的な濃度は２〜２０μＭに変化した（結果を記載している部分における反応式［３］）。全ての溶液について、アルゴンを気泡注入する特別の処置を行うことにより、嫌気状態にした。
【００３５】
（ＢＭＰ−ＦＬＤキメラの構築と発現）
ＢＭＰ−ＦＬＤ融合複合体を、ＮｌａＩＩＩ部位を、ｐＴ７ＢＭ３ＺにおけるＰ４５０ＢＭ３レダクターゼ遺伝子のループの３’末端（Ｌｉら（１９９１））、及び、ｐＴ７ＦＬＤ遺伝子の５’末端（Ｋｒｅｙら（１９８８）、Ｖａｌｅｔｔｉら（１９９８））に導入することによって構築した。この構築は、配列番号１（ＢＭ３に対して）及び配列番号２（フラボドキシンに対して）の変異原性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法によって行った。上記２つの遺伝子は、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼで消化した後、結合段階に供した。野生型（ｗｔ）Ｐ４５０ＢＭ３及びＢＭＰ−ＦＬＤキメラの発現及び精製を公知の手順によって行った（各々、Ｌｉら（１９９１）及びＳａｄｅｇｈｉら（２０００ａ））。
ＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＧＴＴＴＴＣ  配列番号１
ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＣＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣ  配列番号２
【００３６】
（ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質における電子伝達の測定）
４μＭのＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質を、５μＭのデアザリボフラビン及び５μＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、完全嫌気状態において、定常状態で光還元した。光照射は１００Ｗのランプを用いて行った。レーザー閃光光分解を以前に記載されている通りに行った（Ｈａｚｚａｒｄら（１９９７））。上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質（５μＭ）を、１００μＭのデアザリボフラビン及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む、一酸化炭素で飽和させた１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、完全嫌気状態において保持した。
【００３７】
（ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質における電気化学実験）
電気化学実験は全て、ＧＰＥＳソフトウェアで制御したＡｕｔｏｌａｂ  ＰＳＴＡＴ１０（Ｅｃｏ  Ｃｈｅｍｉｅ社、ユトレヒト、オランダ）を用いて行った。階段状サイクリックボルタンメトリーを、カウンターとして白金線を備えたガラス質炭素ディスクを動作電極として用いたハーゲンセル（Ｈａｇａｎ  ｃｅｌｌ）中で行った（Ｈｅｅｒｉｎｇ、Ｈａｇｅｎ（１９９６））。この動作電極を、以前に記載されている通りに活性化して研磨した（Ｈｅｅｒｉｎｇ、Ｈａｇｅｎ（１９９６））。参照電極には、＋２４６ｍＶ  ｖｓ．  ＮＨＥ（標準水素電極）の電位を有する飽和カロメルを用いた。測定は全て、完全嫌気状態において、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）中におけるタンパク質の濃度を３０μＭとして、７℃において行った。
【００３８】
（分子模型）
模型の実験と計算は全て、Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳｌ社製ソフトウェアをＳＧＩ社製ｉｎｄｉｇｏ２ワークステーションＩＲＩＸ６．２にインストールしたものを用いて行った。表面静電電位は、ＤｅｌＰｈｉ２．０モジュールを用いてＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ環境において計算した。ＤｅｌＰｈｉの計算は、誘電定数を溶質について２．０、溶媒について８０とし、１００ｍＭのイオン強度で行った。溶媒半径は１．４Å、イオン半径は２．０Åに設定した。ポアゾン−ボルツマンの演算法を、非線形の状態において、反復の限界を２０００及び収束を０．００００１で、タンパク質を中心とする分解能１．０Å以下の格子（ｇｒｉｄ）に適用した。分子表面と格子境界との間の距離の最小値は１５．０Åであった。形式電荷のみを考慮に入れた。Ｃ末端及びＮ末端、及び、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＬｙｓ側鎖は完全にイオン化されているものとし、ＦＭＮリン酸塩及びヘム鉄（ＦｅＩＩ）ついても計算に含んだ。溶媒暴露（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）は、Ｃｏｎｎｏｌｌｙの演算法（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３））により、半径１．４Åのプローブを用いて計算した。
【００３９】
タンパク質データバンク（ｐｄｂ）ファイルとしては、酸化型ＦＬＤ（Ｗａｔｔら（１９９１））、Ｐ４５０ｔｅｒｐ（Ｈａｓｅｍａｎｎら（１９９４））、Ｐ４５０ｃａｍ（Ｐｏｕｌｏｓら（１９８６））、Ｐ４５０ｅｒｙＦ（Ｃｕｐｐｖｉｃｋｅｒｙ、Ｐｏｕｌｏｓ（１９９５））、及び、Ｐ４５０ＢＭ３のヘム領域（Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎら（１９９３）、Ｌｉ、Ｐｏｕｌｏｓ（１９９７）、Ｓｅｖｒｉｏｕｋｏｖａら（１９９９））を用いた。
【実施例１】
【００４０】
Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のフラボドキシン（ＦＬＤ）、及び、巨大菌由来のチトクロムＰ４５０ＢＭ３（ＢＭＰ）のヘム領域が、共有結合による多領域構造構築に用いる電子伝達モジュール及び触媒モジュールとしての適しているかどうかを試験した。個々のタンパク質間における電子伝達（ＥＴ）をストップフロー分光光度法によって調べた。フラボドキシン（ＦＬＤｑ）を、嫌気的に、定常状態においてセミキノン体（ＦＬＤｓｑ）に還元した。この還元は、ストップフロー装置の１つのシリンジ中で、ＥＤＴＡ存在下での光照射により生成したデアザリボフラビン（ｄＲｆＨ）のセミキノンラジカルを用いて行った。行った反応のスキームを以下の反応式に要約する（Ｓａｄｅｇｈｉら（１９９９））。
【００４１】
【化１】
2004538465.tif 000003
【００４２】
擬一次飽和条件下では、ＦＬＤｓｑ／（ＢＭＰ−Ｓ）ｏｘ酸化還元対のＥＴの経過は、４５０ｎｍにおける吸光度の増加を示した（図２Ａ）。このことは、４５０ｎｍにおける吸光度を左右する一酸化炭素付加体を迅速に形成する（ＢＭＰ−Ｓ）ｏｘの還元と一致する。擬一次速度定数（ｋｏｂｓ）を、データ値を単純指数の成分に合わせることによって計算した。ＦＬＤｓｑの濃度が２〜２０μＭで変化する場合、ｋｏｂｓは、２つのタンパク質間での複合体の形成と一致して飽和することが分かった。ＦＬＤｓｑの濃度に対するｋｏｂｓのデータ値を双曲関数に合わせることにより、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．３）中においてイオン強度２５０ｍＭで、限定速度定数ｋｌｉｍ４３．７７±２．１８ｓ−１、及び、見かけの解離定数Ｋａｐｐ１．２３±０．３２μＭを得た。
【００４３】
効率のよいＥＴを得るための重要な要因は、酸化還元対間におけるＥＴコンピテント複合体の形成である。ＢＭＰとＦＬＤとの間の複合体の形成における静電気力の効果を、タンパク質溶液のイオン強度を変化させることによって調べた。得られたＫｌｉｍ値をイオン強度Ｉの平方根に対して示したが、これは図２Ｂに示すように円錐形となる傾向を示した。これは通常、複合体の形成に関わる疎水的及び静電的相互作用によるものである（Ｓａｄｅｇｈｉら（２０００ｂ））。このことは、図３に示すように２つのタンパク質の表面電位を計算することによって確認された。
【００４４】
選択したタンパク質モジュールの３Ｄ構造が有用であるため、可能性のある複合体の３Ｄモデルの構築に用いる計算方法が使用できる。このようなモデルの構造は、本研究において、ここに記載する共有結合による集合体を合理的に設計するために重要である。
【００４５】
上記ＦＬＤ／ＢＭＰ複合体のモデルを、ＦＬＤの３Ｄ構造を短小化Ｐ４５０ＢＭ３の３Ｄ構造に重ね合わせることによって作成した（Ｓｅｖｒｉｏｕｋｏｖａら（１９９９））。この複合体の酸化還元中心間の距離は１８Åであり、上記短小化Ｐ４５０ＢＭ３の構造におけるものと同程度であった（Ｓｅｖｒｉｏｕｋｏｖａら（１９９９））。
【００４６】
しかしながら、ＦＬＤのＦＭＮ領域が、近接したＢＭＰ表面の、ヘムの配位子であるシステイン４００周辺の正に荷電しているくぼみに結合している場合は、代替モデルを用いることも可能である。このモデルは、１２Å未満という近い距離に２つの補因子を有している。上記の可能性のある２つのモデルは、天然Ｐ４５０−レダクターゼ複合体についても仮定されている、上記ＥＴコンピテント複合体の形成及び再編成を伴う動的現象の存在を示しているのかもしれない（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０００））。
【００４７】
上記ＥＴコンピテント複合体のモデルを用いて、ＢＭＰ−ＦＬＤの共有結合による複合体を形成した。この形成は、図４Ｂに示す遺伝子融合で導入した順応性のある接続ループを結合させることによって行った。この方法は、２つの酸化還元領域を動的形態に保つという利点がある。ＢＭＰ−ＦＬＤシステムの融合は、ＤＮＡレベルで、ＢＭＰ遺伝子（１〜４７０残基）とＦＬＤ遺伝子（１〜１４８残基）とをＰ４５０ＢＭ３（４７１〜４７９残基）のレダクターゼ領域の天然ループを通して結合させることによって行った。遺伝子融合は、関連するＤＮＡ配列を合成ＮｌａＩＩＩ制限部位と連結させることによって行った。
【００４８】
融合遺伝子は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣＩのポリペプチド１本鎖において非相同的に発現した。精製したキメラタンパク質の吸収スペクトルは、ヘムとＦＭＮが１：１の割合で組み込まれていることを示唆した。また、還元されたタンパク質は、４５０ｎｍにおける吸光度が特徴的な一酸化炭素付加体を形成できただけでなく、４１９ｎｍから３９７ｎｍという低スピンから高スピンへの予想された偏移を示す基質（アラキドン酸）へ結合できたが、このことはこの共有結合による複合体が確かに機能的Ｐ４５０であることを示している。
【００４９】
上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質の完全な二次構造をＣＤ光度法によって確認したが（データは図示せず）、おそらく人工ループを添加したために、α−ヘリックス含量がＢＭＰと比較して２％までの範囲で増加していた。光度法によるデータは、上記融合タンパク質が確かに、可溶性で折りたたみ構造を持った機能的タンパク質として発現していることを示す（Ｓａｄｅｇｈｉら（２０００ａ））。
【００５０】
上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質において、ＦＭＮ含有領域からヘム含有領域への分子内部でのＥＴが基質存在下で起こるかどうかを、定常状態の条件下で調べた。フラビン領域を、デアザリボフラビンによって、ＥＤＴＡの存在下、嫌気状態において光還元した。続いて起こるフラビン領域からヘム領域へのＥＴを、ヘムの吸光度を３９７ｎｍから４５０ｎｍに移動させて、一酸化炭素飽和雰囲気下で追跡した。上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質における分子内部でのＥＴの速度を、トランジェント吸光光度法によって調べた。実験設備において、ＦＭＮからヘムへのＥＴが、ＦＬＤｓｑの５８０ｎｍにおける吸光度が減少したことによって分かった。ＥＴの速度を測定したところ、３７０ｓ−１であった。この値は、ＦＡＤ領域を除去した上記短小化Ｐ４５０ＢＭ３の、タンパク質内部でのＦＭＮ領域からヘム領域へのＥＴを測定した値（２５０ｓ−１）と同程度である（Ｈａｚｚａｒｄら（１９９７））。これらの結果は、上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質の機能が生理的タンパク質の機能と同等であることを示すもので、極めて心強いものである。
【００５１】
上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質についての予備的な電気化学的実験を、ガラス質炭素電極を用いて行った。上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質とＢＭＰとのサイクリックボルタモグラム（ｃｖ）を図３に示す。むき出しのガラス質炭素電極上のＰ４５０ＢＭ３酵素には電流は観察されなかったが、上記ＢＭＰ−ＦＬＤは測定可能な規模の酸化還元活性を示している（図３、細線）。特に、上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質と電極との間に、ネオマイシンの存在下でより多い電流が測定されたことから（図３、太線）、この間の相互作用が向上している。ネオマイシンは、負に荷電したＦＬＤと負に荷電した電極表面との間の静電的反発を克服すると考えられている、正に荷電したアミノグリコシドである（Ｈｅｅｒｉｎｇ、Ｈａｇｅｎ（１９９６））。
【００５２】
ネオマイシンの存在下でＢＭＰ−ＦＬＤについて観察された電流の増加は、ＦＬＤが電極とＢＭＰとの間の電気化学的な接触を補助しているという仮説を裏付けるものである。現在、酸化試験で確認される電流の低下と電気化学的セル内で漏出した酸素量とが一致するというように、電気化学的に完全に可逆とするための試みがなされている。この結果はＰ４５０ヘムの電気化学的応答と一致しているということが、一酸化炭素を添加した後にｃｖにおいて高い電位で偏移することによって裏付けられる（図３、点線）。
【００５３】
上記データは、ＢＭＰ触媒モジュールとＦＬＤ電子伝達領域との間、及び、ＦＬＤと電極との間における非生理的な電子伝達が実際に可能であること、及び、共有結合している多領域構造ＢＭＰ−ＦＬＤが野生型ＢＭＰに比べてよりよい電気化学的特性を示すことを証明している。
【００５４】
＜参照文献＞
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本発明をＰ４５０ＢＭ３に適用して、（Ａ）融合を通じて電子伝達タンパク質フラボドキシンと電気化学的に接近できるＰ４５０触媒領域を形成すること、及び、（Ｂ）薬理学的及びバイオセンシング的に応用する目的で、異なる触媒領域を有するＰ４５０ＢＭ３酵素ライブラリーを作成すること、を示す。
【図２】図２は、（Ａ）アラキドン酸結合ＢＭＰ（ＢＭＰ−Ｓ）のフラボドキシンセミキノン体（ＦＬＤｓｑ）による、４５０ｎｍにおいてストップフロー分光測定法により測定した、一酸化炭素存在下での還元、及び、（Ｂ）ＦＬＤｓｑとＢＭＰ−Ｓとの間のイオン強度（Ｉ）の平方根に対する限定擬一次速度定数（ｋｌｉｍ）の値、を示す。
【図３】図３は、ガラス質炭素電極における、ネオマイシンの不在下（１、細線）及び存在下（２、太線）での、ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質のサイクリックボルタモグラムを示す。一酸化炭素を添加した場合に、ピークが高電位に偏移している（３、点線）。電位は飽和カロメル電極に対して記載している。
【図４】図４は、ＢＭＰの遺伝子とＦＬＤの遺伝子を融合してＢＭＰ−ＦＬＤキメラを作成するための分子生物学的アプローチを示す。ＮＩａＩＩＩ制限部位は、オリゴヌクレオチド指定突然変異（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって導入した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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