(57)【要約】本発明は、新規組み換え遺伝子発現ベクターをベースとする、新規組み換え遺伝子発現法を記載し、前記ベクターは、以下の順で、プロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナルおよび前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を有する。
2004538002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の順にプロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナルおよび前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を含む組み換え遺伝子発現ベクターであって、組み換え遺伝子発現ベクターには、以下の順にプロモーター配列、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、ＴＧＡ停止コドン、および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子と翻訳可能に結合しているルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む組み換え遺伝子発現ベクターが含まれないことを特徴とする、組み換え遺伝子発現ベクター。
【請求項２】
少なくとも２種類の目的遺伝子を有することを特徴とする、請求項１に記載の組み換え遺伝子発現ベクター。
【請求項３】
前記選択マーカー遺伝子が、前記組み換え遺伝子発現ベクターを含み、前記選択マーカー遺伝子を発現する宿主細胞とを選択するための融合たんぱく質をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の組み換え遺伝子発現ベクター。
【請求項４】
前記翻訳停止シグナルが、ＴＡＡ、ＴＧＡおよびＴＡＧの群から選択される少なくとも１種の停止コドンであることを特徴とする、請求項１に記載の組み換え遺伝子発現ベクター。
【請求項５】
前記選択マーカー遺伝子の下流に、相当のｍＲＮＡから前記選択マーカー遺伝子が発現されるのを調節するＳＥＣＩＳエレメントを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組み換え遺伝子発現ベクター。
【請求項６】
以下の順に、プロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナルおよび前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を含む組み換え遺伝子発現ベクターであって、分泌物たんぱく質をコードする目的遺伝子と選択マーカー遺伝子とは、翻訳停止シグナルとフレーム内膜透過停止配列で分断されていることを特徴とする、組み換え遺伝子発現ベクター。
【請求項７】
宿主細胞が、前記目的遺伝子および前記目的遺伝子と前記選択マーカー遺伝子との融合たんぱく質の両方を発現できることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の組み換え遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞株であり、培養中に前記目的遺伝子の発現が安定に維持されることを特徴とする、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の組み換え遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞クローンを製造する方法であって、前記方法が、請求項１から６までのいずれか１項に記載の前記組み換え遺伝子発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記選択マーカー遺伝子の発現時に前記組み換え遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞クローンを選択することを含むことを特徴とする、宿主細胞クローンの製法。
【請求項１０】
目的遺伝子でコードされるたんぱく質の製法であって、前記製法が、組み換え遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞株の製造、前記宿主細胞株の培養、前記目的遺伝子の発現の安定維持、および前記目的遺伝子産物の回収工程を含み、前記組み換え遺伝子発現ベクターが、以下の順に、プロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナルおよび前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を含み、前記宿主細胞株の製造が、前記組み換え遺伝子発現ベクターによる形質転換と前記選択マーカー遺伝子発現時の前記組み換え遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞の選択とを含むことを特徴とする、目的遺伝子でコードされるたんぱく質の製法。
【請求項１１】
目的遺伝子がコードする分泌物たんぱく質を製造する方法であって、前記製法が、組み換え遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞株の製造、前記宿主細胞株の培養、前記目的遺伝子の発現の安定維持、および前記分泌物たんぱく質の細胞周囲に存在する培地からの回収工程を含み、前記組み換え遺伝子発現ベクターが、以下の順に、プロモーター配列、分泌物たんぱく質をコードする目的遺伝子、翻訳停止シグナルおよび前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を含み、前記宿主細胞株の製造が、前記組み換え遺伝子発現ベクターによる形質転換と前記選択マーカー遺伝子発現時の前記組み換え遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞の選択とを含むことを特徴とする、目的遺伝子がコードする分泌物たんぱく質の製法。
【請求項１２】
目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞を効率的に選択するための方法における、請求項１から６までのいずれか１項に記載の組み換え遺伝子発現ベクターの使用。
【請求項１３】
目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞株の製法であって、この方法が、請求項９に記載の宿主細胞クローンの製法と前記目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞クローンの効率的な選択とを含むことを特徴とする、目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞株の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、宿主細胞での組み換えたんぱく質発現の分野に関し、目的遺伝子を限界レベルを超えて発現し且つ培養中に発現レベルを安定に維持または増加させる細胞クローンを獲得および同定する方法、ならびに組み換えたんぱく質の製法に関する。
【０００２】
従来技術
様々な遺伝子導入法により培養細胞または動物全体を遺伝子的に修飾する一般的な原理は公知であり、基礎研究およびバイオテクノロジー両分野の主要な方策である。大規模生産や種々の小規模用途において、組み換え産物を効率的かつ安定に発現させることは、絶対に必要な条件である。しかし、組み換えたんぱく質を十分なレベルで産生する宿主細胞を同定すること、および長期の培養期間に亘って発現レベルを維持する宿主細胞クローンを同定することは、困難である。
【０００３】
組み換え遺伝子発現に焦点を当てた多くの方法では、修飾宿主細胞中で異なる遺伝子産物を同時に発現する必要がある。特定のたんぱく質を産生する修飾宿主細胞を構築するために頻繁に利用される方法では、外来核酸、例えば発現ベクターを宿主細胞に導入し、選択マーカー遺伝子と目的遺伝子とを同時に発現させる必要がある。このことは、多くの場合、別個のＤＮＡ構築物上に存在する両遺伝子を同時に移入するかまたは、２つの異種転写制御エレメントを有する単一ベクターに両遺伝子の発現カセットを配置することにより実現される（例えばｐＣＤＮＡ３  Huang, C. F. et al.（2001）、Disrupting the transforming activity of shrimp ras (Q(61)K) by deleting the CAAX box at the C-terminus. J. Exp. Zool. 289: 441〜448）。選択過程を生き残るクローンの大部分はたいてい、目的のたんぱく質を、限界値を超えて発現することはない。通常、選択されたクローンの１％以下が高レベルのプロデューサーである（Fussenegger, M. et al.,（1999）Genetic optimization of recombinant glycoprotein production by mammalian cells. Trends in Biotechnology 17: 35〜42）。いずれの方法でも、所望の遺伝子産物を長期に亘って発現する細胞株が生成されることはほとんどない。選択圧下に産物を中程度のレベルで発現する細胞クローンは実験目的で使用されることが多いが、これらの細胞クローンは工業的条件には合致しない。安定した細胞クローンを獲得するには、時間のかかる面倒なスクリーニングが必要である。前記の遺伝子発現法を用いると発現の安定性が欠如するのは、選択マーカー遺伝子と目的遺伝子が個々に独立した発現レベルを示す結果であり、すなわち、前記細胞クローンで選択マーカー遺伝子が高レベルで発現しても、前記目的遺伝子が同時に高レベルで発現されるわけではない。このような状態は、両遺伝子が同じプロモーターから転写される構築体、すなわち多シストロン性発現構築体または二方向性プロモーターを使用することにより、改善される。
【０００４】
ＥＰ−Ａ−０１１７０５８には、脊柱動物の宿主細胞中で所望のたんぱく質を発現させることのできる発現ベクターが記載され、このベクターは、所望のたんぱく質をコードする第１ＤＮＡ配列とスクリーニングマーカーたんぱく質をコードする第２ＤＮＡ配列とを含み、前記したＤＮＡ配列は両方とも同じプロモーター配列へ操作可能に連結しており、翻訳停止コドンと開始コドンとで分断されている；前記した両遺伝子は翻訳可能に結合されているのではない。従って、両たんぱく質は別々に完全形で産生される。
【０００５】
ＷＯ８８０５４６６には、目的遺伝子と選択マーカー遺伝子とを含む組み換え二シストロン性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、目的遺伝子産物を真核細胞中で発現させるための組成物および方法が記載され、この際、配列は相互に自然な結合をしており、１つの共通プロモーターに依存している。従って、このようなベクターでトランスフェクトされた細胞は、両方の遺伝子から遺伝子産物を発現することができる。
【０００６】
ＷＯ９７０８３３０は、新規発現系、特に目的遺伝子が至的レベルで発現される発現系に関する。この発明は、目的遺伝子と選択マーカー遺伝子とを含む組み換え発現ベクターを提供し、ここで、選択マーカー遺伝子は目的遺伝子の下流に位置しており、目的遺伝子のための停止コドンと前記選択マーカー遺伝子のための開始コドンとは、相当のｍＲＮＡから前記選択マーカーたんぱく質が相当の発現する前に翻訳を再開させるのに十分な距離に間隔を空けて存在する。両遺伝子は翻訳可能に結合しているのではない。
【０００７】
重要であるのは、前記の例が、選択マーカーの翻訳開始コドンを目的遺伝子の読み取り枠の外側に有すると記載している点である。目的遺伝子を停止させるフレーム内停止コドンが増加しても、選択マーカーの読み取り枠の翻訳が常に低下するわけではない。目的遺伝子と選択マーカー遺伝子の読み取り枠は重複しておらず、定義付け得る関係を有さない。
【０００８】
ＷＯ０１４４５１６には、細胞内での早期翻訳停止（premature translation termimation）やナンセンス仲介減衰（nonsense mediated RNA decay、ＮＭＤ、ナンセンス変異を介したｍＲＮＡの分解）が起こるのを阻止する化合物をアッセイする高処理方法が記載される。記載の方法は、ポリペプチドをコードする核酸を用いることを基礎とし、ポリペプチドをコードする配列は異常な停止コドン（premature stop codon、早期停止コドン）を含む。
【０００９】
Ｚｉｎｏｎｉ等（Zinoni F et al. (1990) PNAS87: 4660）は、内部ｆｄｈＦ−ｍＲＮＡ  ＵＧＡコドンの識別を分析するためのｆｄｈＦ−ｌａｃＺ融合構築体を記載している。表２によれば、ｆｄｈＦ−ｌａｃＺ構築体は以下のカセットを含む：ｌａｃＺの５’−部−ｆｄｈＦ＋内部ＵＧＡ−ｌａｃＺの３’−部−停止コドン。
【００１０】
Ｓｏｇａａｒｄ等（Sogaard TMM et al.(1999) Biochemistry 64: 1668）は、翻訳停止活性を監視するためのｉｎ  ｖｉｖｏ系を記載している。この系は、熱安定性の分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を基礎とし、停止コドンによる抑制は、Ｓ−ペプチドを有する前記たんぱく質を識別可能にする。Ｓ−ペプチドを含む融合たんぱく質は、マイクロタイタープレート上にコートされたＳ−たんぱく質と特異的に結合する。マイクロタイタープレート上にコードされたＳＥＡＰ−活性を有する上清のＳＥＡＰ活性を比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳停止を監視する。
【００１１】
Ｇｏｌｄｍａｎ等（Goldman E et al. (2000) FASEB 14: 603）は、一般的なヌクレオチド配列Ｈ１０のレポーター系へのクローニング（β−ガラクトシダーゼを使用する）とＥ．ｃｏｌｉ中での発現試験について記載している。図１で実験計画を開示している。ＤＮＡ構築体は以下の順に、転写開始、ＦＬＡＧ、内部停止コドンを含むＨ１０配列、Ｅ−ｔａｇおよびβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含有する。Ｇｌｏｄｍａｎ等は、ここに記載するような組み換え遺伝子発現ベクターを開示しておらず、安定した発現を示すバクテリア細胞クローンおよび哺乳動物細胞クローンの単離法についても記載していない。
【００１２】
Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ等（Danielson S et al. (2001) Gene 272: 267）は、野生株リポラーゼ遺伝子のファージミドベクター（phagemid vector）への挿入について記載している。得られる構築体は、５ｋＤａの血清アルブミン結合ドメインへの融合物として、抑制可能なＴＡＧ停止コドンとＭ１３ファージコートたんぱく質３のトランケート形（truncated version）が続く、リパーゼの分泌発現をコードしている。リパーゼ−ＡＢＤ融合たんぱく質としてのリパーゼの発現についても記載している。Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ等はここに示されるようなＤＮＡ構築体を記載しておらず、安定な発現を示すバクテリア細胞クローンおよび哺乳動物細胞クローンの単離法を開示していない。
【００１３】
Ｋｏｌｌｍｕｓ等（Kollmus H. et al., (1996) Analysis of eukaryotic mRNA structures directing cotranslational incorporation of selenocysteine. Nucleic Acid Research 24: 1195〜1201）は、哺乳動物細胞での停止コドン抑制に影響を及ぼすＤＮＡエレメントの分析が容易になるように設計されたアッセイ系を記載している。この系は、ＴＧＡ停止コドンによりフレーム内に融合されているβガラクトシダーゼとルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を基礎とする。ＤＮＡはＳＶ４０プロモーターの制御下で転写され、翻訳によりβ−ガラクトシダーゼを産生する前記レポーター酵素またはＴＧＡコドンの抑制時であれば、β−ガラクトシダーゼとルシフェラーゼの融合たんぱく質の合成を導く。Ｋｏｌｌｍｕｓ等は、本発明のような、選択マーカー遺伝子を含む組み換え遺伝子発現ベクターについて記載していない。さらに、Ｋｏｌｌｍｕｓ等は、安定な発現を示すバクテリア細胞クローンおよび哺乳動物細胞クローンの単離法も開示していない。
【００１４】
これまでに引用した特許または文献のいずれにも、目的遺伝子を効率的に発現する宿主細胞株の製法は記載されていない。
【００１５】
すなわち、多シストロン性構築体であっても、選択圧が強かったり細胞培養を長期に亘って実施すると、選択マーカー遺伝子を効率的に発現できても目的遺伝子を効率的に発現することができない細胞クローンしか単離されないのである。従って、目的遺伝子を高レベルで発現する安定な発現用バクテリア細胞クローンおよび哺乳動物細胞クローンを単離するための、正確で（一般的実験室研究にとって）金銭的に手頃な方法の不在が大きな問題である。
【００１６】
本発明の詳細な説明
本発明は、翻訳停止シグナルによって上流に位置する目的遺伝子と分断されている選択マーカーたんぱく質をコードする遺伝子を含む新規組み換え遺伝子発現ベクターを基礎とする新規組み換え遺伝子発現法について記載するものであり、この際、両遺伝子は翻訳可能に結合されている。従って、前期選択マーカー遺伝子の発現は、目的遺伝子の発現率よりも低いと考えられる。
【００１７】
意外にも、本発明の新規組み換え遺伝子発現ベクターを使用することにより、選択圧下に、単一発現細胞クローンが高率で得られることが見出された。前記した単一発現細胞クローンでは、マーカー遺伝子発現と目的遺伝子発現の、停止コドン−依存性の翻訳が組み合わされることにより、２種類の組み換え遺伝子産物、すなわち目的遺伝子でコードされるたんぱく質と、目的遺伝子と選択マーカー遺伝子とが組み合わされた融合タンパク質とが得られる。
【００１８】
さらに意外には、新規組み換え遺伝子発現ベクターを使用して、選択条件に対する抵抗性と目的の組み換え遺伝子の発現とを区別する細胞メカニズムの影響を回避することにより、選択条件下で安定な遺伝子発現を実現できる。従って、目的遺伝子の発現は、コードされた選択マーカーたんぱく質の活性を調節することにより、強化または安定化される。
【００１９】
特に意外には、形質移入細胞の選択手段に対する抵抗性を得るのに十分な選択マーカー遺伝子発現レベルおよび選択マーカー活性を実現するために、停止コドン抑制を利用できることが見出された。さらに特に意外には、前記した新規組み換え遺伝子発現ベクターを含み且つ選択条件下で細胞が生存するために必要な抵抗性を獲得するのに十分なレベルで前記選択マーカーが発現できる前記細胞クローンが、前記目的遺伝子を限界レベルを超えて発現し、そのレベルは、一般的な組み換え遺伝子発現ベクターを含み且つ標準的な技術で目的遺伝子を発現する細胞クローンによって得られる値と少なくとも同程度であるかまたはそれを上回る。
【００２０】
翻訳停止シグナルと分泌物たんぱく質をコードする目的遺伝子の両方を含む本発明の組み換え遺伝子を含有する宿主細胞は、前記目的遺伝子の均質な産物を製造でき、産生される均質な遺伝子産物の量は、分泌物たんぱく質をコードする遺伝子を含む一般的な組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞で得られる量と同程度かまたはそれを上回る。
【００２１】
この系の利点は、選択マーカー遺伝子発現と目的遺伝子発現のきわめて強固な組み合わせである。この特性により、以下の幾つかの有利な特徴がもたらされる：
−選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択した後の、前記目的遺伝子を発現する形質転換／形質移入宿主細胞の割合が増加すること。
−翻訳段階で選択マーカーの発現を制限することにより、組み換え遺伝子の転写活性が増加した形質転換／形質移入宿主細胞が選択されること。従って、目的遺伝子の組み換えたんぱく質発現の平均値も、選択遺伝子発現を制限していない発現ベクターと比べて増加している。
−別の選択メカニズム有する慣用の発現ベクター、例えば多シストロン性ベクター（Mueller, P. P et al. (1999) Recimbinant glycoprotein product quality in proliferation controlled BHK-21 cells. Biotech. and Bioeng. 65: 529〜536）または二方向性プロモーターを有するベクター（Baron, U. et al. (1995) Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Research 23: 3605〜3606）と比べて、選択条件下での目的遺伝子の発現の安定性が向上すること。
【００２２】
本発明の最初の形態では、以下の順に、プロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナルおよび前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を有する組み換え遺伝子発現ベクターを提供し、この際、この組み換え遺伝子発現ベクターには、以下の順に、プロモーター配列、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、ＴＧＡ停止コドン、および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子と翻訳可能に結合しているルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む組み換え遺伝子発現ベクターが含まれない。
【００２３】
本発明の第２の形態では、目的遺伝子を１種類以上含有する、前記の組み換え遺伝子発現ベクターを提供する。
【００２４】
有利には、本発明は、前記の順序で前記のエレメントを含有する組み換え遺伝子発現ベクターを提供し、目的遺伝子と選択マーカー遺伝子とは翻訳可能に結合している。本発明において、翻訳可能な結合は読み取り枠融合を意味し、リボソームは目的遺伝子と同じ翻訳開始部位から選択マーカーを翻訳する。特に有利に、翻訳可能な結合とは、目的遺伝子と選択マーカー遺伝子とが完全にまたは部分的に同じ読み取り枠内に存在する構築体を意味する。目的遺伝子と選択マーカー遺伝子とは、翻訳停止シグナルおよび／または翻訳フレームシフトシグナルで分断されていてよい。
【００２５】
本発明は、（１）前記目的遺伝子と前記選択マーカー遺伝子の読み取り枠内配置および（２）前期目的遺伝子と前記選択マーカー遺伝子の両方を含むｍＲＮＡ産物の獲得を実現するデオキシリボヌクレオチドの任意の配列に言及するものである。従って、目的遺伝子は融合した読み取り枠の５’−末端に位置し、下流に位置する選択マーカー遺伝子とは独立して翻訳され得る。さらにこの配置により、前記選択マーカー遺伝子の読み取り枠は前記目的遺伝子の下流に位置することとなり、選択マーカー遺伝子産物が融合たんぱく質として発現され得るように、選択マーカー遺伝子読み取り枠の翻訳は、先の目的遺伝子の翻訳に依存する。特に、本発明は、選択マーカー遺伝子読み取り枠のための別個の翻訳開始コドンが省略された前記組み換え遺伝子発現ベクターに言及するものである。
【００２６】
本発明において、遺伝子は、一次ＲＮＡ転写物またはたんぱく質の合成に関する情報をコードするデオキシリボヌクレオチドの任意配列に関する。目的遺伝子とは、その発現に関心が持たれているたんぱく質またはそのたんぱく質のフラグメントをコードし、前記組み換え遺伝子ベクター中でクローニングするために使用される、任意の核酸配列を意味する。本発明では、目的遺伝子は野生株遺伝子かまたは修飾遺伝子であり、野生株遺伝子とは、それが（生存および再生能力の点で）最適であるために個体群で優勢となっている任意の遺伝子を意味し、修飾遺伝子とは、単一または複数のヌクレオチド配列の突然変異、欠失、挿入、あるいは遺伝子配列の少なくとも一方の末端への付加的な配列融合により、野生株遺伝子と異なる配列を有する任意の遺伝子を意味する。本発明の好ましい形態において、目的遺伝子は薬理学的に興味深いたんぱく質をコードする遺伝子を意味し、例えば（１）サイトカイン（インシュリン、ＥＰＯ（エリスロポイエチン）、ＴＰＯ（ティシュープラスミノーゲンアクチベーター）、ＧＣＳＦ（顆粒球コロニー形成刺激因子）、ＧＭＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー形成刺激因子）、血液凝固因子ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩ、（２）その他の薬理学的に活性な産物、例えばＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−ＣまたはＳＰ−Ｄの群から選択されるサーファクタントたんぱく質（ＳＰ）、（３）薬剤標的を特定するために使用される遺伝子産物、（４）任意のＥＳＴ（Expressed Sequence Tag、発現配列タグ）読み取り枠、および（５）任意のレポーター遺伝子、特にＳＥＡＰ（分泌アルカリホスファターゼ）、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ホタルまたはウミシイタケのルシフェラーゼ）、ＧＦＰ（緑色蛍光たんぱく質）およびそれらの誘導体および類似した機能を有するたんぱく質、例えば赤色蛍光たんぱく質（ＲＦＰ）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、細胞表面に発現しているたんぱく質およびレポーターたんぱく質、例えばｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、またはｆｌａｇ抗原（flag antigen）である。本発明の特に好ましい形態において、本発明の前記目的遺伝子は、有利に、薬理学的に活性なたんぱく質をコードする。薬理学的に活性なたんぱく質とは、人や動物の身体の生理学的機能の診断、予防、治療または改善に使用できる任意のたんぱく質と理解される。
【００２７】
本発明では、１つのプロモーターが少なくとも１種の目的遺伝子と１種の選択マーカー遺伝子との発現を制御している。プロモーターとは、核酸配列の転写促進に関与する任意のＤＮＡ配列を意味する。特に、プロモーターとは、ＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス）、ＲＳＶ（ニワトリ肉腫ウイルス）、ＭＳＰＶ（脊髄増殖性肉腫ウイルス）等のレトロウイルスのＬＴＲ（末端反復配列）プロモーターエレメントを意味する。特に、プロモーターは、他のウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０（シミアンウイルス）の初期または後期プロモーター、またはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターを意味する。また、ＥＦ（延長因子）プロモーターまたは人工プロモーター、例えばテトラサイクリン制御プロモーター（Gossen, M. and Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters. PNAS 89: 5547〜5551）または別の公知のプロモーター、例えば真核性、原核性またはウイルス性プロモーターを意味する。
【００２８】
本発明の方法で使用されるベクターは、細胞内、特にバクテリア細胞内で自律複製できる任意のＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む公知の種類のものであってよく、例えば発現プラスミドまたはベクターである。本発明の別の形態において、ベクターとは、細胞内で自律複製できない任意のＤＮＡ断片で、そのＤＮＡ断片が前記細胞の染色体中に組み込まれているものを意味する。
【００２９】
本発明の第３の形態では、以下の順に、プロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナルおよび前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子（機能性たんぱく質をコードしている）を含む組み換え遺伝子発現ベクターを提供し、この際、この組み換え遺伝子発現ベクターには、以下の順に、プロモーター配列、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、ＴＧＡ停止コドン、および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子と翻訳可能に結合しているルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む組み換え遺伝子発現ベクターが含まれない。
【００３０】
一般的に、プラスミドベクターで形質転換されたバクテリア細胞は、前記プラスミドの有する優性抗生物質耐性マーカーにより正の選択を受け、プラスミド−含有細胞の数は効果的に維持される。形質移入真核性系では、同一または異なるマーカー、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼを使用する。バックグラウンドレベルを超えるマーカー活性を実現できるほどの高い融合遺伝子活性が得られるのであれば、別の選択またはスクリーニングマーカーを使用してもよい。
【００３１】
本発明はまた、組み換え遺伝子発現ベクターに関し、この際、形質移入細胞を選択するために使用される前期選択マーカー遺伝子は、選択条件への抵抗性を付与するたんぱく質をコードする薬剤耐性遺伝子、例えばｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｈｙｇ（ヒグロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｔｋ（単純ヘルペスチミジンキナーゼ）、ＰＡＣ（ピロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｚｅｏ（ゼオジン耐性遺伝子）、ＤＨＦＲ（ジヒドロフォレートレダクターゼ）である。
【００３２】
本発明の変法において、前記選択マーカー遺伝子は、レポーター遺伝子、特にＧＦＰ（緑色蛍光たんぱく質）を意味し、その発現は、前記選択マーカー遺伝子を産生する宿主細胞と前記遺伝子を発現しない宿主細胞とを区別するために利用できる。
【００３３】
特に本発明は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする選択マーカー遺伝子を有する組み換え遺伝子発現ベクターに関する。このベクターを有する形質移入宿主細胞株は、Ｇ４１８を使用することにより、前記ベクターの欠如した多くの細胞から確実に選択される（正の選択）。Ｇ４１８は、原核性のリボゾームと真核性のリボゾームとを識別する。Ｇ４１８は、リボゾームに結合して翻訳の正確性を低下させるアミノグリコシド系抗生物質である。Ｇ４１８は、バクテリアのｎｅｏ遺伝子でコードされるネオマイシンホスホトランスフェラーゼの基質であり、リン酸化を受けてＧ４１８は不活化する（Beck, E. et al. (1982) Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene 19: 327〜336; Colbere-Garapin, F. et al. (1981) A new dominant hybrid selective marker for higher eukaryotic cells J. Mol. Biol. 150: 1〜13）。
【００３４】
本発明の第４の形態では、前記の組み換え遺伝子発現ベクターを提供し、この場合、前記翻訳停止シグナルは、ＴＡＡ、ＴＧＡおよびＴＡＧの群から選択される少なくとも１種の停止コドンである。
【００３５】
本発明では、前記選択マーカー遺伝子は、前記目的遺伝子の下流に位置しており、両遺伝子は翻訳停止シグナルで分断されている。翻訳停止シグナルとは、読み取り枠の翻訳を停止させるのに適した任意の遺伝エレメントであり、これにより、ｍＲＮＡ中で前記翻訳停止シグナルの下流にコードされている任意の読み取り枠の翻訳率が低下する。特に、翻訳停止シグナルとは、相当のＤＮＡ構築体上でＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧでコードされている、ＵＧＡ、ＵＡＡおよびＵＡＧの群から選択されるｍＲＮＡ上の少なくとも１種の停止コドンを意味する。本発明の別の形態において、１種以上の停止コドン、好ましくは２種または３種の同種または異種停止コドンが前記群から選択される。従って、上流遺伝子の停止コドンが除かれている慣用の翻訳融合の場合と比べ、選択マーカー遺伝子の発現が低下する。付加的な遺伝子エレメントが存在しないのであれば、選択マーカー遺伝子発現の減少は、停止コドンの読み飛ばしが自然の割合で生じているからであると考えられる。哺乳動物細胞の場合、自然発生的な停止コドンの読み飛ばし率は、約０.１％である（Kollmus. H. et al. (1996) Analysis of eukaryotic mRNA structures directing cotranslational incorporation of selenocysteine. Nucleic Acids Research 24: 1195〜1201）。複数の停止コドンをフレーム内に使用することにより、自然発生的な停止コドンの読み飛ばし率は、場合により、さらに低下するかまたは強化される。
【００３６】
読み飛ばし率は、停止コドン抑制のメカニズムを組み込むことにより変化させることができる。これは、ＵＧＡ抑制のためのＳＥＣＩＳエレメント、サプレッサーｔＲＮＡ、野生株ｔＲＮＡの異所発現、別の停止コドンＵＡＧまたはＵＡＡの使用、停止コドンの含量の変化、フレームシフトの導入、別の転写停止シグナルの付加により実施できる。別の転写停止シグナルは、自然な切断、目的遺伝子の停止コドンの好ましくは下流、または選択マーカー遺伝子の５’−領域に挿入されたポリ（Ａ）付加部またはポリ（Ａ）コンセンサス配列であってよい（Minvielle-Sebastia. L., Keller, W. (1999) mRNA polyadenylation and its coupling to other RNAprocessing reactions and to transcription. Curr. Opin. Cell. Biol. 11: 352〜357; Wahle, E., Ruegsegger, U. (1999) 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS Microbiol Rev 23: 277〜295; Edwalds-Gilbert, G., Veraldi, K. L., Milcarek, C. (1997) Alternative poly (A) site selection in complex transcription units: means to an end? Nucleic Acids Research 25: 2547〜2561）。
【００３７】
本発明の第５の形態では、プロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナル、選択マーカー遺伝子（フレーム内に位置）およびＳＥＣＩＳエレメントを含む組み換え遺伝子発現ベクターを提供する。ＳＥＣＩＳエレメント（セレノシステイン挿入配列）は、２１番目のアミノ酸であるセレノシステインを停止コドンＵＧＡ部に挿入できる真核性ｍＲＮＡ中の構造エレメント（ヘアピン構造）であり（Kollmus H et al. (1996) Analysis of eukaryotic mRNA structures directing cotranslational incorporation of selenocysteine. Nucleic Acids Research 24: 1195〜1201; Fagegaltier, D. et al. (2000) Structural analysis of new local features in SECIS RNA hairpins. Nucleic Acids Research 28: 2679〜2689）、これにより停止コドンの読み飛ばしが増加し、下流に位置する任意の遺伝子の発現が増大する。
【００３８】
Ｋｏｌｌｍｕｓ等は、豚の心臓のホスホリピドヒドロペルオキシダーゼグルタチオンペルオキシダーゼ（ＰＨＧＰｘ）遺伝子を使用して、ＢＨＫ−２１細胞中での停止コドン抑制率の低下を測定した。ＳＥＣＩＳエレメントは、２.８％の停止コドン抑制活性を支持した。最小のＳＥＣＩＳエレメントでは、１０倍に低下した、０.３％の停止コドン読み飛ばし活性を示した（Kollmus, H. et al. (1996) Analysis of eukaryotic mRNA structures directing cotranslational incorporation of selenocysteine. Nucleic Acids Research 24: 1195〜1201）。ラットの５’−デイオジナーゼをコードする遺伝子のＳＥＣＩＳエレメントは、１.１％の相対的なコドン抑制効果を示した（Kollmus H et al. (1996) Analysis of eukaryotic mRNA structures directing cotranslational incorporation of selenocysteine. Nucleic Acids Research 24:1195〜1201）。このエレメントの突然変異は効果を０.１６％に減少させる。
【００３９】
Ｋｏｌｌｍｕｓ等によれば（Kollmus. H.et  al. (1996) Analysis of eukaryotic mRNA structures directing cotranslational incorporation of selenocysteine. Nucleic Acids Research 24: 1195〜1201）、停止コドン抑制率は、特定のバクテリアプラスミドを有する細胞のルシフェラーゼ発現活性（ルシフェラーゼの酵素活性を測定することにより決定する）とコントロールプラスミドで得られる値との関連付けにより、算出することができる。停止コドン抑制率を決定するためのこの酵素法によれば、本発明において、停止コドン抑制率は、０.０１〜１０％であることが好ましい。特に、本発明の停止コドン抑制率は０.１〜５％である。
【００４０】
前記組み換え発現ベクターでは、前記目的遺伝子と前記選択マーカー遺伝子とが翻訳可能に結合されている。従って、読み飛ばしにより、前記目的遺伝子と前記選択マーカー遺伝子の両産物を含む融合たんぱく質が産生される。前記選択マーカー遺伝子でコードされているたんぱく質の融合は融合たんぱく質内に保存され、本明細書中で実証されるように、これらの構築体でトランスフェクトされた細胞に抗生物質耐性がもたらされる（図３参照）。このようにして、前記組み換え発現ベクターを有する宿主細胞は、前記融合たんぱく質の発現により正の選択を受けて選ぶことができる。
【００４１】
本発明の別の形態では、宿主細胞が前記目的遺伝子と、前記目的遺伝子および前記選択マーカー遺伝子の融合たんぱく質との両方を発現することを特徴とする、前期組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞を提供する。
【００４２】
本発明では、ここに開示した組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞は、前記組み換え遺伝子発現ベクターで形質移入／形質転換された真核性または原核性の細胞株を含む。
【００４３】
本発明において、形質転換と形質移入（トランスフェクション）とは同義である。
【００４４】
本発明において、前記組み換え遺伝子発現ベクターを有する真核性の宿主細胞株は、培養細胞を含む任意の種類の細胞を意味し、例えばＢＨＫ−２１、ＣＨＯ（種々のチャイニーズハムスターの卵巣細胞株）、２９３（人の腎癌腫細胞株）、ＮＩＨ３Ｔ３（ネズミ細胞株）、ＳＰ２／０（ハイブリドーマ）、他の薬理学的または実験室的研究対象である真核細胞株、一次細胞、例えばＥＳ細胞（胚幹細胞）、哺乳動物の他の幹細胞または始源細胞、例えば骨髄始源細胞であり、全生物において、前記組み換え遺伝子発現ベクターは、トランスフェクションにより前記宿主細胞株へ移入されている。本発明において、トランスフェクションとは、（１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の記載する技術（Sambrook et al (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition）、例えばリン酸カルシウム−トランスフェクション、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−デキストランを用いたトランスフェクション、リポフェクション、（２）エレクトロポレーション、（３）インフェクション、例えばウイルス性ベクター系を介したインフェクションを意味する。本発明の変法では、前記の宿主細胞株の形質移入法が、特殊技術を含む。特に、特殊技術とは、以下の文献に記載される技術を意味する：Wigler, M. et al. (1977) Tranfer of purified herpes virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells. Cell 11: 223〜232; Chesnoy S and Huang L (2000) Structure and function of lipid-DNA complexes for gene delivery. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29: 27〜47; De Smedt SC, Demeester, J., Hennink, W. E. (2000) Cationic polymer based gene delivery systems. Pharm. Research 17: 113〜26; Mahato, R. I. (1999) Non-viral peptide-based approaches to gene delivery. J. Drug Target 7: 249〜268; Stone, D. et al. (2000) Viral vectors for gene delivery and fene therapy within the endocrine system. J. Endocrinol 164: 103〜118; Zhao. X., (2000) Gene transfer and drug delivery by electronic pulse delivery. A nonviral delivery approach. Methods Mol. Biol. 133: 37〜43。また、当業者に公知の別の方法を利用してもよい。形質移入細胞を選択するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の記載する方法（Sambrook et al (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition）または真核細胞のトランスフェクションに関する前記文献に記載される方法および当業者に公知の別の選択方法を利用することもできる。
【００４５】
バクテリア宿主細胞の場合、形質転換とポジティブクローンの選択とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の技術（Sambrook et al (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition）またはエレクトロポレーション、バクテリオファージインフェクションまたは当業者に公知の別の方法で実施される。
【００４６】
前記の形質転換法は、前記発現ベクターを使用し、前記選択マーカー遺伝子産物の発現時に形質転換／形質移入宿主細胞を選択することにより、利用される。この方法は、真核細胞および原核細胞の両方で実施される。この方法は、組み換えたんぱく質の発現レベルが不安定であるかまたは予測不能である細胞で実施されるのが好ましい。
【００４７】
本発明の別の形態では、前記組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞クローンを製造する方法を提供し、この方法は、宿主細胞を前記組み換え遺伝子発現ベクターで形質転換し、前記選択マーカー遺伝子の発現時に、前記組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞クローンを選択することから成る。
【００４８】
本発明において宿主細胞クローンとは、宿主細胞群を意味し、その全ては、無性生殖により１つの細胞に由来している。突然変異による変化は除き、全ての宿主細胞クローンは遺伝子的に同一である。実験室培養で宿主細胞クローンを継続的に増殖させると、宿主細胞株が得られる。
【００４９】
本発明によれば、特に前記選択マーカー遺伝子によりコードされたたんぱく質を十分な量で発現する前記組み換え遺伝子発現ベクターを有する形質転換／形質移入宿主細胞は、前記組み換え遺伝子発現ベクターを有さない類似細胞の細胞死を誘導する条件下に前記組み換え発現ベクターを有する宿主細胞を形質転換した後に、選択条件を生き残る細胞クローンを得るための、適量の前記選択マーカー遺伝子産物である。特に、前記選択マーカー遺伝子でコードされた十分量のたんぱく質とは、前記組み換え発現ベクターのＤＮＡまたはＲＮＡを宿主細胞へ導入した後に、多くの細胞から少なくとも１種の形質転換宿主細胞を選択するための、適量の前記選択マーカー遺伝子産物を意味する。
【００５０】
本発明の別の形態では、前記目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞クローンを効率的に選択する方法における、前期組み換え遺伝子発現ベクターの使用を提供する。
【００５１】
本発明における効率的な選択とは、宿主細胞を形質転換し、前記選択マーカー遺伝子の発現時に前記形質転換宿主細胞を選択し−この際、宿主細胞は、前記組み換え発現ベクターを有し、前期組み換え発現ベクターを有さない類似細胞の細胞死を誘導する条件下に選択マーカー遺伝子を発現し、選択条件を生き残る−選択条件を生き残る宿主細胞クローンの全数に対して少なくとも５％を占める、目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞クローンを同定する方法を意味する。特に、効率的な選択とは、前記の選択方法であって、前記目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞クローンの少なくとも１０％が選択条件下に生存する。効率的な選択とは、前記の選択方法であって、前記目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞クローンの少なくとも１４％が選択条件下に生存する選択法を意味するのが特に好ましい。
【００５２】
本発明によれば、前記目的遺伝子の高率発現とは、前記目的遺伝子でコードされるタンパク質が限界レベルを超えて発現されることを意味する。本発明の意味において、限界レベルとは、全細胞たんぱく質の少なくとも０.５％である。特に、限界レベルは、全細胞たんぱく質の少なくとも５％を意味する。好ましくは、限界レベルとは全細胞たんぱく質の少なくとも２５％を意味する。限界レベルが、全細胞たんぱく質の少なくとも５０％を意味することが特に好ましい。限界レベルが全細胞たんぱく質の少なくとも７５％を意味することが特に非常に好ましい。特に、哺乳動物細胞中で産生される前記組み換え発現たんぱく質の限界レベルとは、培養上清１ｍｌあたり少なくとも１μｇのたんぱく質最終濃度を意味する。哺乳動物細胞では少なくとも１０μｇ／ｍｌの限界レベルであることが好ましい。特に有利には、前記限界レベルとは、少なくとも２５μｇ／ｍｌを意味する。さらに非常に有利に、前記限界レベルとは、少なくとも５０μｇ／ｍｌを意味する。特に、前記限界レベルが少なくとも１００μｇ／ｍｌであるのが大変有利である。
【００５３】
本発明において、たんぱく質濃度は、Ｓｍａｂｒｏｏｋ等の方法により測定される（Sambrook et al (1989): Melecular Cloning: A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition）。
【００５４】
本発明の別の形態では、目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞株を製造する方法を提供し、この方法は、宿主細胞を前記組み換え遺伝子発現ベクターで形質転換し、前記選択マーカー遺伝子の発現時に、前記発現ベクターを有する宿主細胞クローンを選択し、前期目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞クローンを同定する過程を含む、開示の宿主細胞の製法である。
【００５５】
前記組み換え発現ベクターを有する形質転換／形質移入宿主細胞は、前記選択マーカー遺伝子でコードされたたんぱく質を十分な量で発現でき、前記組み換え遺伝子発現ベクターを有さない類似細胞の細胞死を誘導する条件下での前記組み換え発現ベクターを有する宿主細胞の形質転換後に、選択条件を生き残る細胞クローンを得るための、適量の前記選択マーカー遺伝子産物である。特に、前記選択マーカー遺伝子でコードされた十分量のたんぱく質とは、前記組み換え発現ベクターのＤＮＡまたはＲＮＡを宿主細胞へ導入した後の多くの細胞から少なくとも１種の形質転換宿主細胞を選択するための、適量の前記選択マーカー遺伝子産物を意味する。
【００５６】
本発明の別の形態では、目的遺伝子をコードするたんぱく質を製造する方法を提供し、この方法は、組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞株の製造、前記宿主細胞株の培養、前記目的遺伝子発現の安定な維持、および前記目的遺伝子産物の回収工程を含み、前記組み換え遺伝子発現ベクターは、以下の順で、プロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナル、および前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を有し、前記宿主細胞株の製造には、前記組み換え遺伝子発現ベクターによる形質転換と選択マーカー遺伝子発現時の前記組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞の選択とが含まれる。
【００５７】
本発明において、培養時の前記目的遺伝子の安定な発現の維持とは、細胞株の１０回の継代に亘って、前記目的遺伝子と前記選択マーカー遺伝子とがコードするタンパク質が、ほぼ一定に製造されることを意味する。特に、２５回の細胞継代が好ましい。特に有利には、前記宿主細胞株は、５０回の細胞周期にわたって、ほぼ一定のレベルで前記たんぱく質を製造する。特に有利に、前記宿主細胞株は、１００回の細胞周期に亘って、ほぼ一定のレベルで前記たんぱく質を製造する。また、形質転換バクテリア細胞を培養する際の前記目的遺伝子の安定な発現の維持とは、バクテリア中での組み換えたんぱく質の生産能力が、ここに記載する遺伝子融合技術を用いない関連ＤＮＡ構築体で得られる生産能力の安定性を上回ることを意味する。
【００５８】
本発明の別の形態では、宿主細胞株が、培養時に、前記目的遺伝子の発現を安定に維持する、前記組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞株を提供する。
【００５９】
多くの真核性たんぱく質は細胞質中で合成される。従ってたんぱく質は、自身を適当な細胞コンパートメントへ輸送できる、認識可能な配列または構築体を有していなければならない。プレたんぱく質は、保存アミノ酸残基を含み、特に細胞輸送の情報を有するプレたんぱく質の末端（シグナルペプチド）に見出される。真核生物では、分泌目的のたんぱく質、例えば分泌物たんぱく質は、最初に小胞体（ＥＲ）を標的とする。この際、Ｎ−末端疎水性配列シグナルペプチドが必要となる。シグナル配列は、ポリペプチドがＥＲの内腔へ同時翻訳的に入り込んだときに切断される。膜貫通たんぱく質、例えば胎盤アルカリホスファターゼおよび多くの細胞表面レセプターサブユニット、例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプターは、内部疎水性膜透過停止配列を有し、しばしば正に帯電した残基が隣接している（Dalbey, R. E. (1990) Positively charged residues are important determinants of membrane protein topology. Trends Biochem. Sci. 15: 253〜257）。分泌たんぱく質中の膜スパンドメインの存在は、ＥＲ膜、ゴルジ体または細胞膜等の細胞膜中にたんぱく質を保持する。そのようなタンパク質で膜スパンドメインが除去されると、分泌が起き、ＳＥＡＰの場合には、アルカリホスファターゼが分泌形となる。バクテリア細胞の膜たんぱく質も疎水性膜透過停止配列を有し、バクテリア細胞膜中に組み込まれている。
【００６０】
本発明の別の形態では、以下の順に、プロモーター配列、目的遺伝子、翻訳停止シグナル、膜透過停止配列および目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を有する組み換え遺伝子発現ベクターを提供する。前記発現系は、分泌物たんぱく質に利用できる。
【００６１】
前記組み換え遺伝子発現ベクターを有する真核性宿主細胞は、前記融合たんぱく質の発現時に正の選択を受け、前記選択マーカー遺伝子を有している。融合たんぱく質はＥＲ内腔に保持され、これにより耐性が媒介され、その際、前記目的遺伝子産物は細胞周囲の培地中に分泌される。この系により、分泌物たんぱく質の単純かつ選択的な組み換え製造が可能となる。
【００６２】
本発明の別の形態では、目的遺伝子でコードされる分泌物たんぱく質を製造するための方法を提供し、この方法は、組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞株の製造、前期宿主細胞株の培養、前記目的遺伝子の安定な発現の維持、細胞周囲培地からの前記分泌物たんぱく質の回収工程を含み、前記組み換え遺伝子発現ベクターは、以下の順に、プロモーター配列、分泌物たんぱく質をコードする遺伝子、翻訳停止シグナル、フレーム内膜透過停止配列および前記目的遺伝子と翻訳可能に結合している選択マーカー遺伝子を有し、前記宿主細胞株の製造は、前記組み換え遺伝子発現ベクターを用いた形質転換と前記選択マーカー遺伝子発現時の前記組み換え遺伝子発現ベクターを有する宿主細胞の選択とを含む。本発明の変法において、前記した遺伝子エレメントを有する前記組み換え遺伝子発現ベクターもまた、バクテリア細胞中での分泌物たんぱく質の発現に利用できる。
【００６３】
図を参照しながら例示により本発明を詳細に記載する。以下の実施例により本発明の範囲が制限されることはない。
【００６４】
図面の詳細な説明
図１．停止コドン抑制依存性の発現に使用される発現構築体
プラスミドは、薬剤耐性遺伝子であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）またはＧＦＰ−ｎｅｏ融合たんぱく質（ＧＦＰｎｅｏ）をコードする転写単位を有するＤＮＡフラグメントから構築された。プラスミドは、フレーム内停止コドンで分断されたＧＦＰ−ｎｅｏ融合たんぱく質で構築されているか（ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ）、フレーム内停止コドンで分断され且つ停止コドンの位置でのアミノ酸セレノシステインの挿入を促進するエレメント（ＳＥＣＩＳ）を有するＦＧＰ−ｎｅｏ融合たんぱく質で構築されているか（ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ−ＳＥＩＣＳ）、停止コドンで読み取り枠が終了している分泌アルカリホスファターゼで構築されている（ＳＥＡＰ）。下流配列は、エラーの生じた時やリボゾームが停止コドンで翻訳を終了しなかったときにのみ翻訳され得る。ＳＥＡＰの次にｎｅｏ読み取り枠に融合した膜スパンドメイン（Ｍ）が続く（ＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏ）；膜スパンドメインは、プラスミドｐＤＩＳＰＬＡＹ（Invitrogen）から単離された血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）であり、分泌たんぱく質を原形質膜へ固定するために働く。従って、分泌物ＳＥＡＰは細胞外に露出しているが、ｎｅｏたんぱく質は膜の細胞内表面上に存在する。細胞内への局在は、抗生物質耐性を得るための必要条件であると考えられる。
【００６５】
図２．ＧＦＰｎｅｏおよびＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ読み取り枠によりコードされる翻訳産物
ＧＦＰｎｅｏ読み取り枠（Ａ、四角の囲み）は、単一のＧＦＰｎｅｏ融合たんぱく質（Ａ、上に記載される矢印）をコードする。ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ構築体は、ＧＦＰ読み取り枠（これはフレーム内停止コドンで停止されている）とｎｅｏ読み取り枠とを有する。ＧＦＰ読み取り枠は、ＧＦＰたんぱく質（Ｂ、上に記載される矢印）をコードし、停止コドン抑制が自然の割合で起きて、ＧＦＰ−ｎｅｏ融合たんぱく質を少量製造する（Ｂ、下に記載される矢印）。
【００６６】
図３．停止コドン抑制依存性の発現構築体によって得られる耐性細胞クローンの割合
同量の、薬剤耐性遺伝子ｎｅｏをコードするプラスミドＤＮＡ（ｎｅｏ；ＧＦＰ−ｎｅｏ融合体（ＧＦＰｎｅｏ））；フレーム内停止コドンで分断されたＧＦＰ−ｎｅｏ融合体（ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ）；フレーム内停止コドンで分断され、停止コドン抑制エレメントが続く、ＧＦＰ−ｎｅｏ融合体（ＧＦＰ−ｓｔｏｐｎｅｏ−ＳＥＩＣＳ）を使用して、燐酸カルシウム同時沈殿法により、ＢＨＫ−２１細胞（ｎｅｏ）を安定にトランスフェクトした（Pellicer, A. et al. (1978) The transfer and stable integration of the HSV thymidine kinase gene into mouse cells. Cell 14: 133〜141）。牛胎児血清アルブミン（ＦＣＳ）１０％を含む標準的なＤＭＥＭ（Gibco）中に薬剤Ｇ４１８が１０００μｇ／ｍｌ存在している状態で生存するＧ４１８耐性細胞を５％ＣＯ2のインキュベーター内で３７℃の培養温度で選択した後、それぞれの構築体に関してクローン数を測定し、別のｎｅｏ構築体から得られるクローン数と比較した（耐性細胞クローンの割合）。棒グラフの上部の線は、標準偏差を表す。
【００６７】
図４．停止コドン抑制依存性の翻訳で細胞クローン中に起こる遺伝子発現
ＢＨＫ−２１細胞を前記プラスミドＤＮＡ（図１参照）で安定にトランスフェクトした。Ｇ４１８を含む細胞培養培地中でｎｅｏ発現クローンを選択した後、単一の懸濁細胞のＧＦＰ蛍光強度を蛍光励起細胞分離捕集装置（ＦＡＣＳ）分析により測定した。
【００６８】
図５．停止コドン抑制依存性の選択条件下での培養中の発現の安定性
フレーム内停止コドンで分断されたＧＦＰ−ｎｅｏ読み取り枠融合構築体（ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ）からのＧＦＰ発現の安定性を、各細胞の蛍光をＦＡＣＳ分析することにより、非−蛍光参照細胞を基準に、３種の異なる単一細胞クローンで長期培養時に試験した。非−ＧＦＰ含有細胞の蛍光強度を上回るＧＦＰ蛍光細胞の割合を示す。
【００６９】
図６．選択を行わない一過性トランスフェクションアッセイにおける、停止コドン抑制依存性の翻訳構築体からの分泌たんぱく質の発現
ＢＨＫ−２１細胞に対して、ＩｇＧ発現構築体（Geserick C et al. (2000) Enhanced productivity during controlled proliferation of BHK-21 cells in continuously perfused bioreactors. Biotech and Bioeng 69: 266〜274）および前記ＳＥＡＰ発現構築体を用いて、カルシウム同時沈殿法により、一過性トランスフェクションを行った。細胞培養上清からのＩｇＧ  ＥＬＩＳＡおよびＳＥＡＰ活性をトランスフェクション２日後に測定した。ＳＥＡＰ活性は、最初のＳＥＡＰ構築体およびＩｇＧ標準の発現レベルに対して決定された（Geserick C et al. (2000). Enhanced productivity during controlled proliferation of BHK-21 cells in continuously perfused bioreactors. Biotech. And Bioeng. 69, 266〜274）。
【００７０】
図７．選択後の停止コドン抑制依存性の翻訳構築体からのＳＥＡＰ発現クローン分画
ＢＨＫ−２１細胞を、停止コドン抑制依存性ｎｅｏ読み取り枠翻訳構築体（ＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏ）でトランスフェクトするかまたは、別個にＳＥＡＰとｎｅｏとで同時にトランスフェクトした（それぞれ、プラスミドＤＮＡの割合は、１：１０（ＳＥＡＰ＋１／１０ｅｎｏ）および１：１（ＳＥＡＰ＋ｎｅｏ）である）。薬剤耐性ＢＨＫ−２１細胞単一クローンからのＳＥＡＰ活性を、アガロースオーバーレイ技術により測定した（Kirchhoff, S. et al. (1995) Identification of mammalian cell clones exhibiting highly regulated expression from inducible promoters. Trends Genet. 11: 219〜220; McCracken, A. A. et al. (1984) Studies on the secretion of serum proteins from rat hepatoma cells. Hepatology. 4: 715〜721; Walls, J. D., Grinnell, B. W. (1990) A rapid and versatile method for the detection and isolation of mammalian cell lines secreting recombinant proteins. Biotechniques 8: 138〜142）。ＳＥＡＰ陽性の染色細胞の数は、得られたＧ４１８耐性クローンの総数に対するものである。
【００７１】
図８．ｐＳＥＡＰｓｔｏｐｎｅｏのプラスミドマップ
プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）の最小プロモーター配列を有し、エンハンサーエレメントは脊髄増殖性肉腫ウイルスプロモーターに由来するものであり、ｓｄ−ｓａは、ＳＶ４０の後期スプライス部位（late splice site）に由来するスプライス−ドナーおよびスプライス−アクセプターであり、ＳＥＡＰ（５４５〜２０６２）は胎盤アルカリホスファターゼの分泌形であり、ｄｎｅｏ（２２７１〜３１２８）は、Ｎ末端でトランケートされたｎｅｏフラグメントをコードする配列を意味する。これらのエレメントの位置を図中に括弧で示す。
【００７２】
図９．ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏのプラスミドマップ
ＭＳＤ（２０４８〜２２６３）は、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）に由来する膜スパンドメインをコードし、突然変異は、もとのＰＤＧＦＲ膜スパンドメインに存在した非−開始ＡＵＧコドンが消失したものである。残るエレメントは図８の説明に記載される。
【００７３】
図１０．ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏのプラスミドマップ
ＧＦＰは、クラゲ（Aequorea victoria）の緑色蛍光たんぱく質をコードする（Tsien, R. Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67: 509〜544）。残りのエレメントは図８の説明に記載される。
【００７４】
図１１．ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏＳＥＣＩＳのプラスミドマップ
ＳＥＣＩＳは、ＵＧＡコドンの翻訳を促進するセレノシステイン挿入エレメントを意味する（Walczak, R. et al. (1997) Solution structure of SECIS, the mRNA element required for eukaryotic selenocysteine insertion−interaction studies with the SECIS-biding protein SBP. Biomed. Environ. Sci. 10: 177〜181; Hubert, N. et al. (1996) RNAs mediating cotranslational insertion of selenocysteine in eukarotic selenoproteins. Biochimie 78: 590〜569）。残りのエレメントは先の図の説明中に記載される。
【００７５】
図１２．ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏのＤＮＡ配列
全てのエレメントは図１０の説明に記載される。
【００７６】
図１３．ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏＳＥＣＩＳのＤＮＡ配列
全てのエレメントは図１１の説明に記載される。
【００７７】
図１４．ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏのＤＮＡ配列
全てのエレメントは図９の説明に記載される。
【００７８】
図１５．ｐＳＥＡＰｓｔｏｐｎｅｏのＤＮＡ配列
全てのエレメントは図８の説明に記載される。
【００７９】
図１６．プロデューサー細胞の発現レベルに対する選択圧の影響
弱い選択圧（Ｌ）で生存するプロデューサー細胞の統計的に予測される数は、曲線下面積として図解される。高い発現率を示す細胞分画は強い選択圧（Ｈ）でも生存できる。強い選択圧であれば、非効率なプロデューサー細胞（左）の増殖を妨げることにより、小数の至的プロデューサー細胞（右）を同定するためのスクリーニングに掛かる手間を軽減できる。
【００８０】
図１７．生存クローン数の減少
ＢＨＫ−２１細胞を、組み換えプラスミドＤＮＡを用いて、燐酸カルシウム同時沈殿によりトランスフェクトした（Wigler M, Silverstein S, Lee LS, Pellicer A, Cheng Y, Axel R. Transfer of purified herpes virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells. Cell. 1977, 11: 223〜32）。トランスフェクションの２日後に、培養培地１ｍｌあたり１ｍｇのＧ４１８を添加し、コントロール実験で生存細胞が検出できなくなるまで細胞をさらにインキュベートした。棒グラフは、選択下に生存している単一細胞プロデューサークローンの分画を示す。数は、２つの独立した実験の平均として計算された（ＳＥＡＰ−Ｓｔｏｐ−Ｍ−ｎｅｏ，プラスミドｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏのＤＮＡでトランスフェクトする；ＳＥＡＰ＋ｎｅｏ，ＳＥＡＰをコードするプラスミドＤＮＡとｎｅｏをコードするプラスミドＤＮＡとで一般的な同時トランスフェクトを行う）。
【００８１】
図１８．プロデューサークローンの割合の増加
グラフは、ＳＥＡＰフィルターオーバーレイアッセイで陽性であった単一細胞コロニーの分画を示す（Kirchhoff S, Koster M, Wieth M, Schaper F, Gossen M, Bujard H, Hauser H. Identification of mammalian cell clones exhibiting highly regulated expression from inducible promoters. Trends Genet. 1995; 11: 219〜20）。この試験で陽性であった細胞クローンの最低発現レベルは０.０１ｐｇ／細胞であった。実験の詳細は図１７に記載される。
【００８２】
実施例：
以下の実施例により本発明を詳細に説明する、すなわち停止コドン抑制依存性の融合たんぱく質の翻訳が、目的産物と選択マーカー遺伝子の発現の組み合わせを改善できるかどうかの実行可能性を説明する。
【００８３】
図１に示されるように、選択マーカー遺伝子は目的産物遺伝子の翻訳に厳密に依存して発現し、この際、選択マーカー遺伝子であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）の開始コドンは、ＰＣＲ−による突然変異誘発で除かれており、これによりフレーム内で融合したトランケートｎｅｏ読み取り枠が生じ、停止コドンを含む目的産物遺伝子−読み取り枠が完成する。目的産物遺伝子の例として、生物発光クラゲ（Aequorea victoria）に由来する細胞内緑色蛍光たんぱく質ＧＦＰ（Naylor LH. (1999) Reporter gene technology: the future looks bright. Biochem. Pharmacol. 58: 749〜757; Keith, J. , Frank, H., Martine, K. (1999) Lowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine Trends in Biotechnology 12: 477〜481; Ellenberg, L., Lippincott-Schwartz, J., Presley, J. F. (1999) Dual-color imaging with GFP variants. Trends Cell. Biol. 9. 52〜56）またはヒトアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の分泌形（Berger, J. et al. (1998) The secreted alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66: 1〜10）を、様々に配置して使用した（図１）。ＤＮＡ操作をＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等に従って実施した（Maniatis, T., Fretsch, E. F., Sambrook, J., (1982): Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）。ＢＨＫ−２１宿主細胞の操作はＭｕｅｌｌｌｅｒ  ＰＰ等またはＧｅｓｅｒｉｃｋ  Ｃ等に従って実施した（Mueller PP et al. (1999) Recombinant glycoprotein product quality in proliferation controlled BHK-21 cells. Biotech. And Bioeng. 65: 529〜536およびGeserick, C et al (2000) Enhanced productivity during controlled proliferation of BHK-21 cells in continuously perfused bioreactors. Biotech and Bioeng 69: 266〜274）。
【００８４】
例１：停止コドン抑制−依存性の融合たんぱく質翻訳による遺伝子発現の組み合わせの改善
ＧＦＰｎｅｏ構築体は、Ｎ−末端ＧＦＰドメインとＣ−末端ｎｅｏドメインを有する融合たんぱく質をコードしている（図２Ａ）。ＧＦＰ読み取り枠が停止コドンで停止される場合（ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ）、コードされたＧＦＰたんぱく質がこの構築体から発現された。リボゾームは少しのエラー率を示し、Ｃ−末端に伸長されたたんぱく質を生じた（図２Ｂ）。このような自然発生的な翻訳エラーを、少量のＧＦＰｎｅｏ融合たんぱく質の発現に利用した（図２Ｂ）。
【００８５】
自然発生的な割合の翻訳ミスでも、形質移入ＢＨＫ−２１  ２１細胞へＧ４１８耐性を付与するのに十分なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性が認められた（図３参照；ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ）。期待のＧＦＰ−ｎｅｏ融合たんぱく質は、形質移入細胞へｎｅｏ活性とＧ４１８耐性とを付与した。ＧＦＰ読み取り枠の末端にフレーム内停止コドンを有さない構築体（ＧＦＰｎｅｏ）を、ＧＦＰ−ｎｅｏ融合たんぱく質がＧ４１８耐性を付与できるかどうか試験するための平行実験に使用した（Geserick, C. et al. (2000) Enhanced productivity during controlled proliferation of BHK-21 cells in continuously perfused bioreactors. Biotech and Bioeng. 69: 266〜274）（図３参照）。
【００８６】
さらに、ＳＥＣＩＳ配列を停止コドン抑制−依存性の構築体へ加えた（ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ  ＳＥＣＩＳ）。記載される全ての構築体は、Ｇ４１８耐性コロニーを形成し、この際、偽形質移入細胞、すなわち方法過程からＤＮＡを除く以外は同様に操作された細胞は、Ｇ４１８に対する感受性を保持した。これにより全ての構築体が、形質移入細胞へＧ４１８耐性を付与するのに十分なｎｅｏ活性を有する十分な遺伝子産物の合成を誘導することが実証され、最も有利なのはＧＦＰ−ｎｅｏ融合たんぱく質であった。
【００８７】
ｎｅｏ読み取り枠の翻訳を制限することにより、Ｇ４１８の存在下で、高い発現レベルを示す形質移入細胞クローンのみが生存した。耐性細胞クローン中での目的産物の形成レベルは、ＧＦＰ蛍光強度を測定することにより決定された。この目的のために、５％のＦＣＳを含むＰＢＳ中の細胞懸濁液をヨウ化プロピジウム０.５μｇ／ｍｌで染色し、ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎで分析した（図４参照）。ＧＦＰ停止コドンを有する構築体（図４参照；ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ）でトランスフェクトした細胞中の蛍光レベルは、コントロールの構築体（ＧＦＰｎｅｏまたはＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏＳＥＣＩＳ）よりも高かった。このことから、ｎｅｏ遺伝子産物の活性の制限を、高率のプロデューサー細胞クローンを単離するために有利に使用できることが実証された。
【００８８】
停止コドン依存性の翻訳融合は、目的遺伝子発現時に、選択マーカー遺伝子の影響を強く受ける。目的産物の形成は、培養培地中にＧ４１８が１ｍｇ／ｍｌ存在した状態で長期に増殖されても維持された（図５参照）。これに対して、同一細胞での慣用の同時トランスフェクト構築体の発現は時間の経過と共に減少した（Geserick, C. et al. (2000) Enhanced productivity during controlled proliferation of BHK-21 cells in continuously perfused bioreactors. Biotech and Bioeng. 69: 266〜274）。
【００８９】
例２：分泌物たんぱく質−停止コドン抑制−依存性融合たんぱく質の翻訳
選択系は、分泌物たんぱく質、例えば分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）にも利用できた。停止コドン依存性翻訳構築体（ＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏ、ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏ用、図８参照）のＳＥＡＰ活性を、一過性トランスフェクションアッセイのコントロール（ＳＥＡＰ）と比較した。ＳＥＡＰ活性をＢｅｒｇｅｒ，Ｊ等に従って測定した（Berger, J. et al. (1988) The secreted alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66: 1〜10）（図６参照）。データーから、ｎｅｏをコードする配列を有するｍＲＮＡ産物の伸長は、選択圧がないと、ＳＥＡＰ発現率を妨害することはなかった。全ての構築体は同様のＳＥＡＰ発現を誘導し、このことは、加えたｎｅｏ配列が発現レベルに対して決定的な効果を持たないことを意味している。
【００９０】
Ｇ４１８の存在下に選択を生き残るクローン中のＧＨＫ−２１プロデューサー細胞分画（Geserick, C. et al. (2000) Enhanced productivity during controlled proliferation of MHK-21 cells in continuously perfused bioreactors. Biotech and Bioeng 69: 266〜274）は、目的産物遺伝子の発現と選択マーカー遺伝子の発現との組み合わせの厳重性の指標であった。プロデューサークローン分画を、生存選択とＧ４１８の存在下での増殖後に測定した（図７および表１参照）。プロデューサー細胞クローンの数（図７および表１、ＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏ）はコントロールのトランスフェクション体と比べて著しく多く（図７および表１、ＳＥＡＰ＋ｎｅｏ参照）、このことは、停止コドン依存性の翻訳選択が、より好ましい組み合わせ率を示すことを示唆している。
【００９１】
表１．停止コドン抑制依存性の翻訳構築体の、選択後の、クローン形成率
ＢＨＫ−２１細胞を、停止コドン抑制依存性ｎｅｏ読み取り枠翻訳構築体を用いて燐酸カルシウム同時沈殿することにより、または別個のＳＥＡＰとｎｅｏ構築体を用いて（それぞれ、プラスミドＤＮＡの割合は、１：１０（ＳＥＡＰ＋１／１０ｎｅｏ）および１：１（ＳＥＡＰ＋ｎｅｏ）である）、同時トランスフェクトすることにより、形質移入した。培地１ｍｌあたり１０００μｇを添加し、非−トランスフェクトコントロール培養で全細胞が死滅するまでインキュベートを継続した。プロデューサークローンは、アルカリホスファターゼ活性を調べるためのアガロースオーバーレイ拡散フィルター結合アッセイにより測定された。
【００９２】
【表１】
2004538002.tif 000003
例３：ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ構築体
プラスミドｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏを、既存のプラスミドＰＭＣ２ＬＵＺＩから（Mielke, C., Tummler, M., Bode, J. A., simple assay for puromycin N-acetyltransferase: selectable marker and reporter. Trends Genet. (1995) 11: 258〜259）、一般的な組み換えＤＮＡ技術（Sambrook et al. (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition）により構築した。
【００９３】
ｎｅｏ遺伝子は、バクテリアのトランスポゾンＴｎ５に由来した。ｎｅｏ融合たんぱく質を製造するために、ＡＵＧ開始コドンを、ＰＣＲ−仲介突然変異誘発により、プライマーＰＭＵ２１２：
【００９４】
【数１】
2004538002.tif 000004
およびＰＭＵ２１３：
【００９５】
【数２】
2004538002.tif 000005
を用いてｎｅｏ読み取り枠から消失させ、ｅＧＦＰ（CLontech Laboratories, Inc., PaloAlto, CA）を用いて融合ＰＣＲ（フュージョンＰＣＲ）を行い、ＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ読み取り枠融合体を形成した。得られたＰＣＲフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩおよびＳｍａＩを用いて切断し、同一の酵素で切断した後に、ＩＲＥＳエレメント（Internal Ribosome Entry Site）の下流にあるＰＡＣ遺伝子の位置で、ベクターのバックボーンへ連結した。エレクトロポレーションにより、ライゲーションミクスチュアをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞へ形質移入した。形質転換体を、アンピシリン含有固形培地上で選択した。ＤＮＡを各コロニーから単離し、予測される制限フラグメントの存在を試験した。停止コドンの周囲の重要な配列を、酵素シークエンスにより確認した（Sanger. F., Coulson, A. R. (1975) A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol. 94: 441〜448）。
【００９６】
例４：ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏＳＥＣＩＳ構築体
ＳＥＣＩＳの共通エレメントを以下の配列を有する２種類の相補的オリゴヌクレオチドとして合成した（５’から３’方向）：
【００９７】
【数３】
2004538002.tif 000006
【００９８】
これを、Ｔ４ＤＮＡライゲースを用いて、ｎｅｏ読み取り枠の下流のプラスミドｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏの特異的ＳａｃＩＩ制限部位へ挿入した。
【００９９】
例５：ｐＳＥＡＰｓｔｏｐｎｅｏ構築体
ｐＳＥＡＰｓｔｏｐｎｅｏは、分泌アルカリホスファターゼ−読み取り枠に続いてｎｅｏ読み取り枠を有するプラスミドベクターである。構築体は、ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏに由来し、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等に従って、ＢｓｔＢＩで切断および連結されている（Maniatis, T., Fritsch. E. F., Sambrook, J., (1982) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）。
例６：ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏ構築体
ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏは、分泌アルカリホスファターゼ読み取り枠に続いて停止コドンおよび膜スパンドメイン、ならびにｎｅｏ読み取り枠を有するプラスミドベクターである。この構築体は、ｐＭＰＳＶＨＥ（Artelt, P. et al. (1988) Vectors for efficient expression in mammalian fibroblastoid, myeloid and lymphoid cells via transfection or infection. Gene 68: 213〜219）と胎盤アルカリホスファターゼの分泌形をコードする遺伝子（Berger, J. et al (1988) The secreted alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66: 1〜10）に由来した。膜スパンドメインは、２種類のプライマーＰＭＵ２０２およびＰＭＵ２０３を用いてｐＨｏｏｋ−１（ＴＭ）ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）からＰＣＲ増幅させたものであり、Ｍｆｅｌ制限フラグメントとしてＢＭＳ２の特異的ＲｃｏＲＩ部位へ挿入され、両部位とも破壊されている。開始コドンの有さないｎｅｏ読み取り枠を、ＳａｌＩおよびＳｐｅＩによるｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ−ＳＥＣＩＳ  ＤＮＡの酵素切断後に単離されるＤＮＡフラグメントとして挿入し、ｐＳＥＡＰｓｔｏｐ（ｐＡ）Ｍｎｅｏを得た。プラスミドＤＮＡを次にＢｓｐＥＩで切断し、ｐ（Ａ）配列を除去した。残るプラスミドＤＮＡを再度連結し、ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏを得た。
【０１００】
【数４】
2004538002.tif 000007
例７：目的遺伝子を高率で発現する細胞クローンの効率的な選択
哺乳動物細胞のゲノムへ組み換え遺伝子を組み込んだ後の組み換え遺伝子の発現率は、変動エレメントの数に依存する。組み換え細胞が選択条件を生き残れるように選択マーカーが発現していたとしても、選択マーカー遺伝子の発現は目的遺伝子の発現レベルに直接相関するわけではない。既存の技術で知られる選択法は、一日あたり１０００００００細胞に対して組み換えたんぱく質１μｇを下回る発現を示す低率プロデューサー細胞クローン分画を多くもたらし、目的細胞を高率で発現する細胞クローン（すなわち一日あたり１０００００００細胞に対して１μｇを上回る発現を示す細胞）の分画は少ない。目的遺伝子を高率で発現する細胞クローンは、かなりのスクリーニング労力を費やしてしか同定できない。スクリーニングの労力は以下のようにして軽減できる：（１）低プロデューサー細胞を除くために選択圧を強化し、スクリーニングされるべき細胞クローンの数を減少させる、（２）選択マーカー遺伝子の発現と目的遺伝子の発現との関りを強化して、選択マーカー遺伝子のみを効率的に発現するが目的遺伝子を発現しないクローンの単離を回避する。この結果、選択条件を生き残る細胞クローンの平均発現レベルは上昇すると考えられる（図１６）。
【０１０１】
記載の組み換え遺伝子発現ベクターが、目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞クローンを効率的に選択する方法に使用できることを立証するために、リン酸カルシウム同時沈殿により、ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏプラスミドＤＮＡをＢＨＫ−２１細胞へ形質移入した（Wigler M, Silverstein S, Lee LS, Pellicer A, Cheng Y, Axel R. Transfer of purified herpes virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells. Cell. 1977, 11: 223〜32）。トランスフェクションの２日後に、細胞培養培地へＧ４１８を１ｍｇ／ｍｌ加えて、選択条件を適用した。コントロール実験（選択マーカー遺伝子を含まない細胞もＧ４１８を１ｍｇ／ｍｌ含有する細胞培養培地中でインキュベートした）で生存細胞が検出できなくなるまで、細胞を前記選択条件下にインキュベートした。平行実験として、細胞を（１）ＳＥＡＰをコードするプラスミドＤＮＡ構築体および（２）ｎｅｏプラスミドＤＮＡ構築体で、慣用の同時形質移入法により、同時にトランスフェクトした。結果、ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏプラスミドＤＮＡで得られる生存細胞クローンの数は、少なくとも５０％まで減少し、これは、ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏがスクリーニングの労力を低下させるのに使用可能なことを意味している（図１７）。
【０１０２】
目的遺伝子の平均発現率がｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏを有する細胞クローン中で高いことを立証するために、前記実験で得られた約１００個の細胞クローンをＳＥＡＰフィルターオーバーレイアッセイで評価した（Kirchhoff S, Koster M, Wirth M, Schaper F, Gossen M, Bujard H, Hause H. Identification of mammalian cell clones exhibiting highly regulated expression from inducible promoters. Trends Genet. 1995; 11: 219〜20）。結果として、ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏでトランスフェクトされた細胞クローンの１４％が目的遺伝子を高率で発現し、この値は、ＳＥＡＰをコードするプラスミドＤＮＡ構築体とｎｅｏプラスミドＤＮＡ構築体とで同時にトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞から得られる高率発現細胞クローン数の３倍を超えていた（図１８）。この結果から、ここに記載する組み換え遺伝子発現ベクターを、目的遺伝子を高率で発現する宿主細胞クローンを効率的に選択する方法に使用できることが明確に立証された。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】停止コドン抑制依存性の発現に使用される発現構築体を示す図である。
【図２】ＧＦＰｎｅｏおよびＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏ読み取り枠によりコードされる翻訳産物を示す図である。
【図３】停止コドン抑制依存性の発現構築体によって得られる耐性細胞クローンの割合を示す図である。
【図４】停止コドン抑制依存性の翻訳で細胞クローン中に起こる遺伝子発現を示す図である。
【図５】停止コドン抑制依存性の選択条件下での培養中の発現の安定性を示す図である。
【図６】選択を行わない一過性トランスフェクションアッセイにおける、停止コドン抑制依存性の翻訳構築体からの分泌たんぱく質の発現を示す図である。
【図７】選択後の停止コドン抑制依存性の翻訳構築体からのＳＥＡＰ発現クローン分画を示す図である。
【図８】ｐＳＥＡＰｓｔｏｐｎｅｏのプラスミドマップを示す図である。
【図９】ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏのプラスミドマップを示す図である。
【図１０】ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏのプラスミドマップを示す図である。
【図１１】ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏＳＥＣＩＳのプラスミドマップを示す図である。
【図１２】ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏのＤＮＡ配列を示す図である。
【図１３】ｐＧＦＰｓｔｏｐｎｅｏＳＥＣＩＳのＤＮＡ配列を示す図である。
【図１４】ｐＳＥＡＰｓｔｏｐＭｎｅｏのＤＮＡ配列を示す図である。
【図１５】ｐＳＥＡＰｓｔｏｐｎｅｏのＤＮＡ配列を示す図である。
【図１６】プロデューサー細胞の発現レベルに対する選択圧の影響を示す図である。
【図１７】生存クローン数の減少を示す図である。
【図１８】プロデューサークローンの割合の増加を示す図である。
【図５】
2004538002.tif 000008
【図１６】
2004538002.tif 000009
【図３】
2004538002.tif 000010
【図４】
2004538002.tif 000011
【図６】
2004538002.tif 000012
【図７】
2004538002.tif 000013
【図８】
2004538002.tif 000014
【図９】
2004538002.tif 000015
【図１０】
2004538002.tif 000016
【図１１】
2004538002.tif 000017
【図１７】
2004538002.tif 000018
【図１８】
2004538002.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2004538002.tif 000020
2004538002.tif 000021
2004538002.tif 000022
2004538002.tif 000023
2004538002.tif 000024
2004538002.tif 000025
2004538002.tif 000026
2004538002.tif 000027
2004538002.tif 000028
2004538002.tif 000029
2004538002.tif 000030
2004538002.tif 000031
2004538002.tif 000032
2004538002.tif 000033
2004538002.tif 000034
2004538002.tif 000035
2004538002.tif 000036
2004538002.tif 000037
2004538002.tif 000038
2004538002.tif 000039
2004538002.tif 000040
2004538002.tif 000041
2004538002.tif 000042
2004538002.tif 000043
2004538002.tif 000044
2004538002.tif 000045
2004538002.tif 000046
2004538002.tif 000047
2004538002.tif 000048
2004538002.tif 000049
2004538002.tif 000050
2004538002.tif 000051
2004538002.tif 000052
2004538002.tif 000053
2004538002.tif 000054
2004538002.tif 000055
2004538002.tif 000056
2004538002.tif 000057
2004538002.tif 000058
2004538002.tif 000059
2004538002.tif 000060
2004538002.tif 000061
2004538002.tif 000062
2004538002.tif 000063
2004538002.tif 000064
2004538002.tif 000065
2004538002.tif 000066
2004538002.tif 000067
【国際調査報告】
2004538002.tif 000068
2004538002.tif 000069
2004538002.tif 000070
2004538002.tif 000071