(57)【要約】本発明はＧＳ１−２ 遺伝子に関する転写調節領域を供する。ＧＳ１−２ 転写調節領域は効果的に、作用可能式に結合した遺伝子の茎に特異的な発現を駆る。従って、開示した転写調節領域は、種子の同化及び生長を作用する為並びに真菌及び疾患耐性を増加する為の掛けがえのない道具を供する。種子の生長及び疾患耐性に影響を与える為の組換えＤＮＡ構築体及び方法が供される。
2004504814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る、単離したＤＮＡ分子。
【請求項２】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る、単離したＤＮＡ分子。
【請求項３】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る、単離したＤＮＡ分子。
【請求項４】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る、単離したＤＮＡ分子。
【請求項５】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列のポリヌクレオチドの機能的な変異体。
【請求項６】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る単離したＤＮＡ分子を含んで成る、組換えＤＮＡ構築体。
【請求項７】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列のポリヌクレオチドの機能的な変異体を含んで成る、組換えＤＮＡ構築体。
【請求項８】
前記構築体が更に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３を含んで成る、請求項６記載の組換えＤＮＡ構築体。
【請求項９】
前記構築体が更に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３を含んで成る、請求項７記載の組換えＤＮＡ構築体。
【請求項１０】
注目のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに転写及び翻訳終結調節領域を更に含んで成り、ここにおいて注目のタンパク質をコードする当該ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチド、及び前記調節領域に作用可能式に結合している、請求項６記載の組換えＤＮＡ構築体。
【請求項１１】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る単離したＤＮＡ分子を含んで成る組換えＤＮＡ構築体を含んで成る、宿主細胞。
【請求項１２】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチドの機能的な変異体を含んで成る組換えＤＮＡ構築体を含んで成る、宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞がトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞である、請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞がトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞である、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１５】
疾患耐性を増加した植物を生産する方法であって、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体により植物細胞を形質転換することを含んで成る方法。
【請求項１６】
前記組換えＤＮＡ構築体が更に、抗真菌タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んで成る、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
マイコトキシンレベルを減らした植物を生産する方法であって、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体により植物細胞を形質転換することを含んで成る、方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ構築体が更に、β−グルカナーゼ、キチナーゼ、デフェンシン、リボソーム不活性化タンパク質及びチオニンからなる群から選択されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んで成る、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
注目の植物において種子の収量及び品質を高める方法であって、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体により植物細胞を形質転換することを含んで成る、方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ構築体が更に、グルタミン合成酵素、グルタミン合成酵素のイソ酵素、アミノ酸トランスアミナーゼ、リンゴ酸酵素及びインベルターゼからなる群から選択された代謝酵素をコードするポリヌクレオチドを含んで成る、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質を生産する方法であって、
（Ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体を宿主細胞中に導入し；
（Ｂ）細胞を増殖させ、そして当該タンパク質を単離する
ことを含んで成る、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
高等植物において、母性組織（ｍａｔｅｒｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ）は生長途中の造胞体をとり囲み、種の成長において重要且つ動的な役割を果たす。Ｔｈｏｒｎｅ， Ｊ．Ｈ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３６ ： ３１７−３４３ （１９８５） を参照のこと。トウモロコシの穀粒が生長する間、茎、基底母性組織（ｂａｓａｌ ｍａｔｅｒｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ）は、種子を成長させる為に、植物の生長機能に関する部分より窒素と炭素の化合物を運搬する為の管路として働き、そして種子に結合した組織を同化流が通過する時、その内容を改変する。Ａｒｒｕｄａら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １８ ： ４０９−４１０ （１９７９） ； Ｌｙｚｎｉｋら、Ｍａｙｄｉｃａ， ２７ ： １９１−１９８ （１９８２） を参照のこと。同化物は師部から外れ、そして茎の組織の細胞を、共原形質体経路を介して横切る。Ｆｅｌｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ６５ ： ８６４−８７０ （１９８０） を参照のこと。管組織から生長途中の造胞体の内乳への移送の間、スクロースが、細胞壁に結合したインベルターゼ活性の作用によりヘキソースに加水分解され（Ｓｈａｎｎｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ４９ ： ２０３−２０６ （１９７２））そして、主要なアミノ酸たるグルタミンが生成基底内乳転移細胞によって取り込まれるようにするような方法において、移送アミノ酸が代謝及び再合成される。
【０００２】
グルタミンは茎から放出される主なアミノ酸である（Ｐｏｒｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ８５ ： ５５８−５６５ （１９８５））。放射性同位元素標識研究及び他の補強証拠は、茎がトウモロコシの穀粒におけるグルタミン合成の主要な部位であることを示唆する。Ｌｙｚｎｉｋら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２４ ： ４２５−４３０ （１９８５） ； Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｍ．Ｊ．， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３２ ： １１２５−１１３０ （１９９３） ； Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｍ．Ｊ．， Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １４３ ： ３７２−３７８ （１９９４） ； Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｍ．Ｊ．， Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓ． Ｄｅｖｅｌ．， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．， ３ ： ６３−８２ （１９９９） を参照のこと。これらの研究と合致して、茎は比較的高レベルのグルタミン合成酵素活性（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ６．３．１．２）を持っている。Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｍ．Ｊ．， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ， ７４ ： １７６−１８０ （１９９８） 。
【０００３】
グルタミン合成酵素（ＧＳ）はアンモニアのグルタミンへの同化を触媒し、そして植物の窒素代謝における鍵となる酵素である。トウモロコシの穀粒茎内で、グルタミン合成酵素は２つのイソ酵素からなり（Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｍ．Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ９１ ： ８６８−８７５ （１９８９））、その１つは母性結合種子組織（ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）に特有のようだ（Ｍｕｈｉｔｃｈら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １０７ ： ７５７−７６３ （１９９５））。高等植物において、ＧＳは様々な器官及び組織で特異的に発現するイソ酵素のファミリーとして生ずる。ＭｃＧｒａｔｈら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １ ： ２７５−２８０ （１９９１） ； Ｌａｗら、Ｐａｎｔ Ｃｅｌｌ， ７ ： ８８７−８９８ （１９９５） を参照のこと。多くの植物において、色素体ＧＳをコードする単一遺伝子がある一方で、サイトゾルの対応物が小遺伝子ファミリーによりコードされるようだ。Ｃｕｌｌｉｍｏｒｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２ ： ５８９−５９９ （１９８４） ； Ｔｉｎｇｅｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ６ ： １−９ （１９８７） ； Ｓａｋａｂａｒｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３３ ： ４９−５８ （１９９２） ； Ｌｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３ ： ４０１−４０７ （１９９３） を参照のこと。細胞質トウモロコシＧＳ遺伝子の１つ、即ちＧＳ１−２ は最近、茎に特異的なトウモロコシＧＳタンパク質をコードするとして同定されている。Ｒａｓｔｏｇｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ３９ ： ４４３−４４６ （１９９８） を参照のこと。
【０００４】
基底穀粒組織内で生じる代謝作用は、種子の同化及び生長において調節的な意味を持ちうる。例えば、グルタミンレベルは全窒素の存在量の指標として働くこと（Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓ． Ｄｅｕｅｌ． Ｐｈｙｔｏ Ｃｈｅｍ， ３ ： ６３−８２ （１９９９））及びグルコースレベルは種子内で細胞の分化を調節することを示唆する、間接的な証拠がある。Ｂｏｒｉｓｊｕｋら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １５ ： ５８３−５９１ （１９９８） を参照のこと。茎内の高い移送アミノ酸の代謝回転に一貫して、高いＧＳ活性がこの領域において観察される。Ｌｙｚｎｉｋら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２４ ： ４２５−４３０ （１９８５） ； Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ ７４ ： １７６−１８０ （１９９８） を参照のこと。茎内の優占ＧＳ形態は、固有の、ＧＳの組織特異的なイソ酵素である。Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ９１ ： ８６８−８７５ （１９８９） を参照のこと。茎に特異的なＧＳイソ酵素に対して生じたモノクローナル抗体を用いる免疫細胞化学的研究は、このイソ酵素が茎の組織のみならず、より低い周辺果皮（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｐｅｒｉｃａｒｐ）内でも発見されたことを示した。Ｍｕｈｉｔｃｈｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０７ ： ７５７−７６３ （１９９５） 。
【０００５】
茎の代謝において、推定上のＧＳ１−２ の調節の役割により、ＧＳ１−２ の転写調節領域の同定は、種子の同化及び生長に影響を与える為の掛けがえない道具を供給しただろう。例えば、基底穀粒組織内の細胞壁インベルターゼは、トウモロコシの穀粒の生長における不可欠な役割を果たすことが示されている。Ｃｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８ ： ９７１−９８３ （１９９６） を参照のこと。又、Ｂｏｒｉｓｊｕｋらは、グルコースレベル（インベルターゼの産物）とヴィシア・ファーバ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）の生長中の子葉における細胞の分裂指数、分化及び貯蔵産物の蓄積との間の強い相関を証明した。Ｂｏｒｉｓｊｕｋら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １５ ： ５８３−５９１ （１９９８） を参照のこと。更に放射性アミノ酸を用いるパルス標識追跡調査（Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３２ ： １１２５−１１３０， （１９９３） ； Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １４３ ： ３７２−３７８ （１９９４） 、及び糖と窒素のレベルは貯蔵タンパク質遺伝子の発現に直接作用する証拠（Ｇｒｉｅｒｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ５ ： ８１５−８２６ （１９９４） ； Ｇｉｒｏｕｘら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １０６ ： ７１３−７２２ （１９９４））は、生長中の造胞体に届く同化流の組成における改変が種子の収量及び品質を変える為に用いられて良いことを示唆する。そのような改変は、炭素及び／又は窒素代謝に関する代謝酵素（例えば、インベルターゼ又はアミノ酸トランスアミナーゼ）の茎での発現に関連する。それは生長中の穀粒に至る途中で茎の細胞を通過する時、同化プールを改変するであろう。
【０００６】
更に、ＧＳ１−２ の転写調節領域の同定は、抗真菌タンパク質及び他の疾患耐性遺伝子の組織に特異的な発現を可能にするであろう。例えば、フザリウム・モルチリホルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｒｔｉｌｉｆｏｒｍｅ）のような、内性植物（ｅｎｄｐｈｙｔｉｃ）病原性菌は、生長機能に関する組織及びトウモロコシの穂軸を介して増殖し、そして無症候性の穀粒の茎において発見される。これらの茎は、環境条件が真菌の胚及び内乳への侵入並びにフモニシン・マイコトキシン（ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ）の生産を可能とした時、真菌の為の生存構造及び侵入口として働くようだ（Ｂａｃｏｎら、１９９２）。種子外部の病原性真菌の侵入は、茎の包葉の接着点において自然に生じる小さな破裂により観察されている（Ｓｍａｒｔら、１９９０）。更に、より上にある果皮及び内皮の機械的又は昆虫による損傷で真菌に感染した生長途中の穀粒は、感染した穀粒の茎を通り、穂軸に入り、そして茎を介して隣接する穀粒へと出ていく真菌の増殖で周囲の穀粒へと疾患を広げるようだ（Ｓｍａｒｔら、１９９０）。茎の柔組織に内在する包葉、及び果皮において強い発現を有する、ＧＳ１−２ 遺伝子の発現のパターンは、抗真菌タンパク質及び他の疾患耐性遺伝子の組織に特異的な発現により、穂軸を蝕む真菌に対して、トウモロコシの穀粒の耐性を高めることを試みるに特にふさわしい魅力的なビヒクルを提案する。病原性の菌による収量の損失を防ぐことに加えて、この戦略は種子のマイコトキシンのレベルを下げなければならず、何故なら、これら有害な物質が生産される前に真菌が周囲の母性組織より胚乳及び胚に侵入しなくてはならないからである（Ｂａｃｏｎら、１９９２）。
【０００７】
従って、ＧＳ１−２ 遺伝子に関する転写調節領域の解明についての要請がある。
【０００８】
発明の概要
故に、本発明の目的は、トウモロコシＧＳ１−２ 遺伝子に関する転写調節領域を供することである。
【０００９】
本発明のこの及び他の目的を達成することにおいて、本発明のある側面に従って、ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域を示すＤＮＡ配列が与えられている。ＧＳ１−２ 転写調節領域を含むＤＮＡ構築体が又供されている。更に、細胞がｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏであり、それらが又、本発明により熟考されているような構築体を含んで成る宿主細胞を含んで成る。
【００１０】
他の実施態様において、タンパク質を生産する方法が供されている。ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体により植物細胞を形質転換することを含んで成り、マイコトキシンレベルが下った植物を生産する方法が又供されている。更に尚、他の実施態様において、ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体により植物細胞を形質転換することを含んで成り、注目の植物において種子の収量及び品質を高める方法が又供されている。
【００１１】
本実施態様の詳細な説明
本発明はトウモロコシのＧＳ１−２ 遺伝子に関する転写調節領域を供する。図２中のＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を参照のこと。ＧＳ１−２ 転写開始部位の上流に位置した、新規６４４ｂｐの配列は従来同定されたＧＳプロモーターと殆んど相同性を有さない。例えば、開示した調節領域は、ピスム・サチブム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（ｐｅａ）のＧＳ３Ａ調節領域と３７％、ピスム・サチブム（ｐｅａ）のＧＳ２調節領域と３９％、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（大豆）のＧＳ１５調節領域と３９％、ファセオルス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（豆）のＧＳ−ｇｌｎ−α調節領域と３８％及びファセオルス・ブルガリス（豆）のＧＳ−ｇｌｎ−β調節領域と３６％のみ相同性を有する。更に、開示したＧＳ１−２ 転写調節領域は、茎並びにトウモロコシの穀粒の他の母性組織において、強力なタンパク質の発現を指示することが知られている最初の調節領域である。
【００１２】
作用可能式に結合した遺伝子の母性種子に関連した、組織に特異的な発現、（遺伝子）を駆るＧＳ１−２ 転写調節領域の独特の力は、種子の同化及び生長を促進するのに使用できうる。同様に、本発明の調節領域は、抗真菌タンパク質及び他の疾患耐性遺伝子の茎に特異的な発現を指示することにより、植物における疾患の耐性を高めるのに使用できうる。従って、本発明は組換えＤＮＡ構築体並びに植物における種子の生長及び疾患の耐性に影響を与える為の方法を供する。タンパク質を生産する方法並びに形質転換した宿主細胞及び植物も、又供されている。
【００１３】
本発明のある実施態様において、ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域は転写開始部位より上流の６６４ｂｐのヌクレオチド配列において発見されている（図２を参照のこと）。本発明の様々な実施態様において、ＧＳ１−２ プロモーター組換え構築体より得られた更なるヌクレオチド配列を含むことが所望されうる。そのような更なる配列は、ｍＲＮＡ種の非翻訳リーダーをコードする配列、例えば限定することなくＧＳ１−２ の５′非翻訳リーダー、イントロン、例えば限定することなく天然のＧＳ１−２ 遺伝子のイントロンが注目の遺伝子を適当な細胞下区画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に対してターゲッティングさせるターゲッティング配列、及びポリアデニル化シグナルのような３′非翻訳配列等であって良い。本発明のそのようなある実施態様において、ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域は、転写開始部位の上流にあるヌクレオチド配列、天然の５′ＵＴＲ及びＧＳ１−２ 遺伝子に結合した１以上のイントロンが含まれて成る（図１を参照のこと）。発現がＧＳ１−２ 調節領域の制御下にあるだろう、下流に結合した異種配列は、ＡＴＧ開始部位、リボソーム結合部位等のような更なる転写制御成分を要求しうる。これらは、転写融合において注目の遺伝子の結合により補充されて良く、又は、代わりの方法として、異種配列は、組換え融合タンパク質を生産する転写の融合において、インフレームで連結されて良い。
【００１４】
他の実施態様において、ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域のトランケーション型が供されている。例えば、転写開始部位より上流の７２ｂｐを含んで成るＤＮＡ配列（図１を参照のこと）は、有効に高レベルの転写を指示しているようだ。ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域のトランケーション型を含んで成る組換えＤＮＡ構築体が供されている。
【００１５】
定義
定義は本明細書中で本発明の理解を助ける為に供されている。
【００１６】
用語「転写調節領域」及び「調節領域」は、遺伝子の転写を調節するＤＮＡの部分をいう。調節領域は、限定することなく、様々なｃｉｓ−作用成分例えばプロモーター、エンハンサー及びホルモン応答成分等を含んで良い。又、イントロン及び５′ＵＴＲは転写に影響することが知られているので、転写調節領域はそのような配列を含むことができる。
【００１７】
用語「遺伝子」及び「構造遺伝子」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ配列をいい、次いでｍＲＮＡは特異的なポリペプチド（タンパク質）に特有のアミノ酸の配列に翻訳される。
【００１８】
用語「プロモーター」は、一般的に、ＲＮＡを生産する構造遺伝子の転写を指示するＤＮＡ配列をいう。一般的に、プロモーターは遺伝子の５′領域にあり、転写開始部位に近接する。もしプロモーターが誘導プロモーターであるならば、その時は、誘導試薬に応答して転写の速度が増減する。対して、もしプロモーターが構成性プロモーターであるならば、転写の速度は誘導試薬により調節されない。
【００１９】
用語「エンハンサー」は、転写に関連した遺伝的成分をいう。エンハンサーは、転写の開始部位に対して、エンハンサーの距離又は方向とは無関係に、特定の遺伝子がｍＲＮＡへと転写される効率を高めることができる。エンハンサーの効果は、配列に特異的なＤＮＡ結合タンパク質により仲介される。エンハンサーは度々「応答エレメント」として言及されている。
【００２０】
用語「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、逆転写酵素によりｍＲＮＡの鋳型から形成できうる単鎖のＤＮＡ分子をいう。一般的に、ｍＲＮＡの部分に相補的なプライマーは、逆転写の開始に使われる。当業者は又、単鎖ｍＲＮＡ分子由来の二重鎖ＤＮＡ分子を言及するのに用語「ｃＤＮＡ」を用いる。
【００２１】
用語、「ゲノムＤＮＡ」は、染色体ＤＮＡをいい、そしてイントロンを含みうる。イントロンは介在配列である。（介在配列は）遺伝子内のＤＮＡの非コーディング配列であり、ｈｎＲＮＡへと転写されるが、次いで核におけるＲＮＡのスプライシングにより除去され、その後細胞質にて翻訳される成熟ｍＲＮＡを残す。イントロンの末端の領域は、自己相補的であり、ｈｎＲＮＡにおいて天然に形成されるヘアピン構造を可能にする。
【００２２】
用語「発現」は、ポリペプチドが構造遺伝子より生産される過程をいう。当該過程は、遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を包含する。
【００２３】
用語「クローニングベクター」は、ＤＮＡ分子、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミドもしくはバクテリオファージもしくは他のウィルスに由来するものをいい、一般的に、宿主細胞中で複製する力を有し、そして遺伝子操作の目的で細胞を形質転換するのに用いられる。一般的にクローニングベクターは、外来のＤＮＡ配列が、ベクターの必須の機能を失わせることなく決定可能な状況で外来のＤＮＡ配列において挿入されて良い、１又は複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、並びにクローニングベクターにより形質転換された細胞の同定及び選択において用いるのに適切であるマーカー遺伝子を含む。一般的に、適切なマーカー遺伝子は、様々な抗生物質又は除草剤耐性を担う遺伝子等である。様々なマーカーが当業者により入手可能である。
【００２４】
用語「発現ベクター」は、組換え宿主中で外来タンパク質の発現を供する外来タンパク質をコードするクローン化した構造遺伝子を含んで成るＤＮＡ分子をいう。一般的に、クローン化した遺伝子の発現は、（即ち作用可能式に結合した）プロモーター及びエンハンサー配列のような所定の調節配列の制御の下で行われている。プロモーター配列は、構成又は誘導性であって良い。
【００２５】
用語「組換え宿主」は、原核生物の細胞又は植物細胞のような真核生物の細胞をいい、クローニングベクター又は発現ベクターを含んでいる。この用語は又、宿主細胞の染色体又はゲノム中にクローン化した遺伝子を含むのに遺伝子操作されている細胞等を意図する。
【００２６】
ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域の獲得
γＥＭＢＬ−３トウモロコシゲノムライブラリーは、標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて、ＧＳ１−２ 遺伝子に特異的なプローブによりスクリーニングされた。１８個の推定ポジティブクローンが単離された。詳細な制限地図作成及びＤＮＡ解析は、５つのクローンが５′上流プロモーター領域を含んだことを示した。それぞれ５′及び３′末端に特異的なプローブにハイブリダイズする２つのＨｉｎｄＩＩＩ 断片、３及び４．５ｋｂは２つのゲノムクローンからサブクローニングされた。部分的なシーケンシングで、これら２つの断片は共同でＧＳ１−２ 遺伝子の全体を含み、そして３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ 断片は、転写開始部位の５′側に２ｋｂ超の配列を含んだことを明らかになった。
【００２７】
本発明の単離したポリヌクレオチドは本明細書中で、当業界で周知である（ａ）合成の技術、（ｂ）標準的な組換え方法、もしくは（ｃ）精製技術、又はこれらの組合わせを用いることによる教示に従い獲得できうる。例えば、本発明の単離したポリヌクレオチドは、固相ホスホラミダイトトリエステル（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｃｌｉｔｅ）法（Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔｓ． ２２ （２０） ： １８５９−１８６２ （１９８１） ； 自動化合成機器（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １２ ： ６１５９−６１６８ （１９８４） ； 又は米国特許第４，４５８，０６６号固相支持（Ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）法を用いる直接化学合成により調製できうる。一般的に化学合成は単鎖オリゴヌクレオチドを産み出す。これは、相補的な配列とのハイブリダイゼーション、又は単鎖を鋳型として用いるＤＮＡポリメラーゼによる重合により二重鎖ＤＮＡへと転換できうる。当業者は、ＤＮＡの化学合成は長さにおいて制限される一方、より長い配列は、より短い配列のライゲーションにより獲得できうることに気付くであろう。
【００２８】
もう一つの方法として、本発明のポリヌクレオチドは、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチド（ｍｕｔｕａｌｌｙ ｐｒｉｍｉｎｇ ｌｏｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を用いる組換え法により獲得できうる。Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓら、Ｉｎｃ． １９９０） を参照のこと。又、Ｗｏｓｎｉｃｋら、Ｇｅｎｅ ６０ ： １１５ （１９８７） ； 及びＡｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）， ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５） を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技術は、長さにおいて２ｋｂ以上のポリヌクレオチドを合成する力を供する。Ａｄａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１ ： １１３１ （１９９３） ； Ｂａｍｂｏｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２ ： ２６６ （１９９３） ； Ｄｉｌｌｏｎら、“Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ，”ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． １５ ： ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ： ＣＵＲＲＥＮＴ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ， Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）、ページ２６３−２６８， （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９３） ； Ｈｏｌｏｗａｃｈｕｋら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． ４ ： ２９９ （１９９５） 。
【００２９】
機能的な変異体
当業者は、ＧＳ１−２ 調節領域の組成に対する所定の変化は、その調節機能を中断しないであろうことに気付くであろう。転写調節は、僅かに制限されるので、調節領域内の離散配列、重要ではない配列における塩基の変化は遺伝子発現における最小限の変化を生み出すであろう。機能的な変異体はハイブリダイゼーションアッセイを使って同定できうる。機能的な変異体、例えば断片、アナログ又は誘導体は、ストリンジェント条件下で、開示した調節領域の相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするそれらの力により同定できうる。適切なハイブリダイゼーションの条件は以下に論ざれている。
【００３０】
「ハイブリダイゼーション」は本明細書で、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生む相補的な核酸配列の対合を示すのに用いられている。相補的なＤＮＡ配列は、塩基対合の法則により関連している配列である。ＤＮＡにおいて、ＡはＴと対になり、そしてＣはＧと対になる。ＲＮＡにおいて、ＵはＡと対になりそしてＣはＧと対になる。一般的に、ハイブリダイゼーションの方法により比較されるヌクレオチド配列は、ドットブロッティング、スロットブロッティング、ノーザン又はサザンブロッティングにより解析されている。サザンブロッティングはＤＮＡ配列の相補性を決めるのに用いられている。ノーザンブロッティングはＤＮＡ及びＲＮＡ配列の相補性を決める。ドット及びスロットブロッティングはＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡの相補性を解析するのに用いることができうる。これらの技術は当業者により周知である。典型的な方法はＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．） （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５） に記載されている。
【００３１】
プローブは、同定の場合に備えて、生物学的に放射性同位元素により標識され又は他の方法により標識されている。プローブは遺伝子、遺伝子産物又はタンパク質を同定するのに用いられる。従って、ポリヌクレオチドプローブは相補的なヌクレオチド配列を同定するのに使用できうる。ｍＲＮＡプローブはその対応するＤＮＡとハイブリダイズするだろう。
【００３２】
一般的に、以下の一般的な手順は、ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションを特定するのに用いられる。試料のポリヌクレオチドは膜上に固定化され、そして開示した調節領域に相補的なＤＮＡ配列が「プローブ」として用いられる。当業者に周知の手順を用いて、試料のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするプローブの力を解析できうる。反対に、開示した調節領域に対し相補的なＤＮＡ配列は固定化されて良く、そして試料のポリヌクレオチドはプローブとして使用できうる。
【００３３】
当業者は、様々な因子が固定化されたＤＮＡに対して結合するプローブの量及び検出能に影響しうることに気付くだろう。プローブの比活性は検出を可能にするのに十分高くなければならない。一般的に、放射性ハイブリダイゼーションプローブを用いる時、弱い又は検出不可のハイブリダイゼーションシグナルを避けるのには、１０８ｄｍｐ／μｇ以上の比活性が必要である。１０８ 〜１０９ｄｐｍ／μｇの比活性を有するプローブは約０．５ｐｇのＤＮＡを検出できる。検出を可能にする為には、十分なＤＮＡが膜上に固定化されなければならないことは当業界において周知である。ＤＮＡが過剰に固定化されていることが望ましく、そして、一般的に１０μｇのＤＮＡのスポッティングは、多くの状況において至適な検出を可能にする許容量である。１０％（ｗ／ｖ）のデキストラン・サルフェート（分子量５００，０００）又はＰＥＧ６０００のような不活性ポリマーをハイブリダイゼーション溶液に加えることで、又ハイブリダイゼーションの感度を高めることができる。これらのポリマーを添加することは、ハイブリダイゼーションシグナルを増加するのに公知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５） を参照のこと。
【００３４】
膜上に固定化された一次ヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションプローブとして用いられる二次ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションよりもたらされる有意な結果に達する為に、（１）検出可能なシグナルを生むのに、十分なプローブが固定化ＤＮＡに対し結合しなければならず（感度）、そして（２）洗いの手順に続いて、当該プローブは、プローブの配列に対して所望された程度の相補性を有する固定化された配列にのみ結合されてなければならない（特異性）。本明細書中で用いた「ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、及び所定の有機化合物の存在に関する条件である。用いたストリンジェンシーがより高くなるにつれ、プローブと固定化ＤＮＡとの相補性の程度は高くなった。
【００３５】
「ストリンジェント条件」は、高頻度の相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドのみが互いにハイブリダイズする条件をいう。例えば、ストリンジェント条件は、（１）０．７５Ｍ第二リン酸ナトリウム／０．５Ｍ第一リン酸ナトリウム／１ｍＭジナトリウムＥＤＴＡ／１％サルコジルで約４２℃で約３０分間以上、（２）６．０Ｍ尿素／０．４％ナトリウムローレル硫酸塩／０．１％ＳＳＣで約４２℃で約３０分間以上、（３）０．１Ｘ　ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで約６８℃で約２０分間以上、（４）１Ｘ　ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで約５５℃で約１時間、（５）１Ｘ　ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで約６２℃で約１時間、（６）１Ｘ　ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで約６８℃で約１時間、（７）０．２Ｘ　ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで約５５℃で約１時間、（８）０．２Ｘ　ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで約６２℃約１時間、そして（９）０．２Ｘ　ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで約６８℃で約１時間である。Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５） ； Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ． Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９） を参照のこと。
【００３６】
ストリンジェント洗浄は、約４２℃〜約６８℃の温度で行われる一方、他の温度がストリンジェント条件に適していると認める当業者もいる。最大のハイブリダイゼーションは、一般的に、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイズに適した、Ｔｍ より下の約２０〜約２５℃で起こる。Ｔｍ は融解温度、又は２つのヌクレオチド配列が解離する温度であることは当業界において周知である。Ｔｍ を見積る為の方法は、当業界において周知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＡＬＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５）を参照のこと。最大のハイブリダイゼーションは、一般的にＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイズに適したＴｍ より下の約１０〜約１５℃で生じる。
【００３７】
機能的な変異体も又、それらの構造的な類似性、又は相同性を、開示した調節領域と比較することにより同定できうる。開示された調節領域に対して７５％以上、特に８５〜９５％、の配列の相同性を有するＤＮＡ断片は、機能的な変異体であると考えられ、そして本発明により包含されている。数学的アルゴリズム、例えばＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが又配列の相同性を決定するのに用いられて良い。Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １４７ ： １９５−１９７ （１９８１） ； Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １１ ： ６３５−６５０ （１９９１） を参照のこと。任意の配列のアルゴリズムが機能的な変異体を同定するのに用いることができうるが、本発明はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに関連して機能的な変異体を定義できる。ここで、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１は、長さに関するポリヌクレオチドの相同物の相同性の百分率を決定する為に、参照配列として用いられている。更に生物学的に現実味のある結果を他よりも生むのに発見されているパラメーター値もあるが、マッチ、ミスマッチ及び挿入又は欠失に関するパラメーターの値の選択は任意である。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに適するある好適な一組のパラメーター値はマッチした残基に対して１の値を用い、そしてαはミスマッチ残基に対して用いられる（残基は単一のヌクレオチド又は単一アミノ酸である）「最大類似セグメント」アプローチで記載されている（Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４６ ： ４７３−５００ （１９８４））。挿入及び欠失のｘは、ｘＫ ＝１＋ｋ／３（ｋは所定の挿入又は欠失における残基の数（Ｉｄ））として重みづけされている。
【００３８】
好適な変異体ポリヌクレオチドは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、ＧＳ１−２ 転写調節領域に対して約７５％の配列の相同性を有するものである。特に好適な変体ポリヌクレオチドは約９０％以上の配列の相同性を持つ。更に、好ましい変体ポリヌクレオチドは約９５％以上の配列の相同性を有し、そして更に好まれた変体ポリヌクレオチドは９８％以上の配列の相同性を有する。
【００３９】
組換えＤＮＡ構築体
本発明のある実施態様において、本発明の転写調節領域を含んで成る組換えＤＮＡ構築体が供されている。注目のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに転写及び翻訳終結調節領域を含んで成る組換えＤＮＡ構築体が本発明により供されておりここで注目のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の転写調節領域に作用可能式に結合している。構築体は選択マーカー、検出マーカー及び複製開始点を含んで成って良い。他の実施態様において、本発明の転写調節領域を含んで成る発現カセットが供されている。本発明の構築体は、対象とする宿主において、ポリヌクレオチドの、茎に特異的な転写を指示するのに有用である。
【００４０】
本発明の他の実施態様において、ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域を含んで成る組換えＤＮＡ構築体は、転写開始部位の上流の６６４ｂｐのヌクレオチド配列を含んでいる（図２を参照のこと）。他の実施態様において、ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域を含んで成る組換えＤＮＡ構築体であって、ここにおいて当該転写調節領域が転写開始部位の上流のヌクレオチド配列、ＧＳ１−２ ５′ＵＴＲ及びＧＳ１−２ 遺伝子に結合した１つ以上のイントロンを含んで成る組換えＤＮＡ構築体、が供されている。５′ＵＴＲ及びＧＳ１−２ 遺伝子に結合したイントロンに関するヌクレオチド配列は以下に供されている。
【化１】
2004504814.tif 000003
【００４１】
調節開始部位の上流のヌクレオチド配列、５′非翻訳領域（ＵＴＲ）及びイントロンを含んで成る様々な組換えＤＮＡ構築体は、本明細書中に含まれた教示を参照にしながら当業界で周知の方法により調製できうる。ある例において、常駐のＡＴＧ転写開始部位等の天然のＧＳ１−２ エキソン及び一方又は双方のイントロンは、図１に与えられたヌクレオチド配列から取り除かれ、そして注目の融合遺伝子の転写開始部位で転写が始まる。他の例において、注目の遺伝子は、第一、第二又は第三ＧＳ１−２ エキソンにインフレームで融合できうる。
【００４２】
本発明の他の実施態様において、ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域のトランケーション型を含んで成る組換えＤＮＡ構築体が供される。例えば、転写開始部位の上流の近傍約７２個のヌクレオチドを含んで成るＤＮＡ配列（図１を参照のこと）は、全穀粒組織並びに葉及び根において高レベルの転写を効果的に指示するようである。従って、注目の遺伝子に作用可能式に結合したこのＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ構築体は、多量な所望のタンパク質を合成する為に有用である。この７２ｂｐの断片のＤＮＡ配列は以下に供されている。
【化２】
2004504814.tif 000004
【００４３】
同種又は異種タンパク質を発現する目的の組換えＤＮＡ構築体の合成は、通常当業者に周知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５）を参照のこと。本発明で用いる為の適切な様々な発現ベクターも又当業界で周知である。特に、好ましいのは、植物細胞においてタンパク質の発現を指示する発現ベクターである。例えば、カリフラワーウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（Ｂｅｎｆｅｙら、ＥＭＢＯ Ｊ， ８ ： ２１９５−２２０２ ； Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ６ ： ３９０１−３９０７ （１９８７））、イネアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２ ： １６３−１７１ （１９９０））、トウモロコシユビキチン−Ｉプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＱｕａｉｌ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５ ： ２１３−２１８ （１９９６））及びノパリン合成酵素プロモーター（Ｋｏｒｏｎｏｗｉｃｓら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ４ ： １７−２７ （１９９２））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４４】
本発明の構築体は、様々な方法を用いて宿主細胞中で形質転換できうる。例は、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６ ： ５５９−５６３ （１９８８））、エレクトロポレーション（Ｄｈｕｌｌｕｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ４ ： １４９５−１５０５ （１９９２））、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介形質転換（Ｉｓｈｉｄａら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４ ： ７４５−７５０ （１９９６））及びポリエチレングリコール処理（Ｇｏｌｖｋｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ， ９０ ： ４１−５２ （１９９３））が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４５】
形質転換は、サザンハイブリダイゼーション等により確かめることができうる。注目のタンパク質の特異的な発現は、例えば、ノーザンブロット解析、ｍＲＮＡのｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、組織化学的方法（Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ．， １０４ ： ４２３−４３０ （１９９８））、タンパク質の免疫局在化及び発現しているタンパク質の活性の特性決定等様々な方法学を用いて確めることができうる。
【００４６】
本発明の構築体は、注目のほぼ全ての任意のタンパク質を発現するのに用いることができる。好適な実施態様において、本発明の組換えＤＮＡ構築体は、種子の生長及び代謝に関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んで成る。例としては、窒素代謝の酵素、例えば、グルタミン合成酵素及びそれらのイソ酵素、アミノ酸トランスアミナーゼ等、炭素の代謝に関連する酵素、例えばインベルターゼ、及び炭素／窒素相互作用に関連する酵素、例えば、リンゴ酸酵素、が挙げられるが、それらに限定されない。他の好適な実施態様において、本発明の組換えＤＮＡ構築体は、抗真菌タンパク質又は他の疾患耐性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る。例えば、β−グルカナーゼ、キチナーゼ、デフェンシン、リボソーム不活性化タンパク質又はチオミンをコードする遺伝子は、本発明の構築体を用いて茎の内で発現できうる。他の例において、本発明の構築体はマイコトキシン輸送タンパク質、マイコトキシン修飾タンパク質又はマイコトキシン−耐性宿主標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んで成る。
【００４７】
他の実施態様において、本発明の構築体は、標的組織においてアンチセンス転写産物を生産するのに用いることができうる。そのような構築体は、注目の遺伝子のセンス鎖のポリヌクレオチド配列を含んで成る。従って、組換えＤＮＡ構築体の異種遺伝子が転写される時、アンチセンス転写産物が生産される。次いで合成された転写産物は、内因性の遺伝子、即ちセンス鎖の転写産物にハイブリダイズし、そして内因性の転写産物の翻訳を阻害する。この方法において、本発明の構築体は注目の遺伝子の発現を効率的に阻害する。
【００４８】
他の実施態様において、本発明は植物においてタンパク質を生産する方法を供する。従って、（Ａ）宿主細胞中へと、本発明の転写調節領域の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体を導入し；（Ｂ）細胞を増殖させそしてタンパク質を単離すること；を含んで成るタンパク質を生産する方法が供されている。組換えＤＮＡ構築体は当業界で周知の標準方法に従い形質転換している。形質転換はサザン解析により確めることができうる。トランスジェニック植物は、発現したタンパク質の存在に対して、当業界で周知の標準的な免疫学的な方法を用いて解析できうる。タンパク質は、当業界で周知の標準的な方法を用いて、植物の組織より精製されうる。
【００４９】
他の実施態様において、本発明の転写調節領域の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体により植物細胞を形質転換することを含んで成る、疾患耐性を増やした植物を生産する方法が供される。ある実施例において、更に組換えＤＮＡ構築体は抗真菌タンパク質を含んで成る。組換えＤＮＡ構築体は、当業界で周知の標準的な方法に従って形質転換されている。形質転換は、サザン解析により確認できうる。トランスジェニック植物は、発現した注目のタンパク質の存在について、当業界で周知の標準的な方法を用いることで解析できうる。
【００５０】
更に他の実施態様において、本発明は、本発明の転写調節領域の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体により植物細胞を形質転換することを含んで成る、マイコトキシンレベルを下げた植物を生産する方法を供する。そのような組換えＤＮＡ構築体は更に、例えば、マイコトキシン輸送タンパク質、マイコトキシン修飾タンパク質又はマイコトキシン耐性宿主標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んで成って良い。これら異種遺伝子の発現は、宿主の標的部位を変化させること、毒を修飾すること又は植物細胞の外へ送出することにより、マイコトキシンを減らす。
【００５１】
尚他の実施態様において、本発明は、本発明の転写調節領域の配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換えＤＮＡ構築体により植物細胞を形質転換することを含んで成る、注目の植物において種の収量及び品質を高める方法を供する。
【００５２】
従って、一般的に記載された、本発明は、実例により供され、本発明の限定を意図していない、以下の実施例を参照にすることにより更に容易に理解されるであろう。
【００５３】
実施例
１．３′遺伝子に特異的なプローブの作製
ＧＳ１−２ 遺伝子に特異的なプローブを、以下のプライマーを用いてＧＳ１−２ ３′ＵＴＲのＰＣＲ増幅により作製した。
【化３】
2004504814.tif 000005
【化４】
2004504814.tif 000006
【００５４】
ＰＣＲ増幅を各５０ｐｍｏｌの各センス及びアンチセンスプライマー及び２０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰを含む１００μｌの反応溶液中で、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｃｒｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ２４００ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）を用いて行った。反応条件は、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間プライマーのアニーリング及び７２℃で１分間合成を全３０サイクル渡り行った。プローブをゲル抽出しそしてＦｅｉｎｂｅｒｇ及びＵｏｇｅｌｓｔｅｉｎの方法論を用いて３２Ｐによりランダム−プライム化標識した。Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ａｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ， １３２ ： ６−１３ （１９８３） を参照のこと。
【００５５】
２．ゲノムクローンの単離
トウモロコシゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａ）より３００，０００超の組換えプラークを、上記のランダム−プライム化標識した、ＧＳ１−２ 遺伝子に特異的なプローブを用いてスクリーニングした。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， （２ＮＤ ＥＤ） （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９） を参照のこと。フィルターを２度０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０°でオートラジオグラフィー前に洗浄した。ポジティブプラークを採取しそして精製し、そしてＤＮＡをγＤＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて抽出した。１８個の推定上のポジティブクローンが単離された。詳細な制限地図作成及びＤＮＡの解析で５つのクローンが５′上流プロモーター領域を含んだことが明らかになった。５′及び３′末端に特異的なプローブにハイブリダイズする、３及び４．５ｋｂの、２つのＨｉｎｄＩＩＩ 断片をそれぞれ、２つのゲノムクローン由来のｐＢｌｕｅ　ｓｃｒｉｐｔ中でサブクローン化した。ゲノム挿入体をＴａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネーターサイクルシークエンスキット（Ｐ．Ｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いてシーケンシングした。シーケンス解析をＤＮＡＭＡＮ（Ｌｙｎｎｏｎ ＢｉｏＳｏｆｔ， Ｖａｕｄｒｅｕｉｌ， Ｃａｎａｄａ）を用いて行った。部分的なシーケンシングで、これら２つの断片が共同でＧＳ１−２ 遺伝子全体を含んだこと及び３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ 断片は、転写開始部位の５′側に２ｋｂ超の配列を含んだことが明らかになった。約１ｋｂの上流プロモーター領域をシーケンシングした。プロモーター配列をＢｌａｓｔ　ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＢＩ）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋにおいて従来公表された配列と比較した。
【００５６】
ＧＳ１−２ 遺伝子の転写調節領域を図１に与えている。ＧＳ１−２ 遺伝子の推定上の転写開始部位（＋１、図１を参照のこと）、ＡＴＧより１０３ｂｐ上流のＧ残基を、ｃＤＮＡの配列と比較することにより推定した。５′領域の配列解析で−４０〜−４５のＴＡＴＡボックス様配列及び−１６６〜−１６３の有力なＣＡＡＴボックス成分を同定した。コーディング領域の部分的な配列の解析で、ＧＳ１−２ 遺伝子は、１３個のエキソン及び１２個のイントロンを含み、その５′末端よりに、推定上の転写開始部位より６６４ｂｐだけ上流で、ＣＤＣ２遺伝子の３′末端が隣接し、逆向きの方向にあるＰＧＭ２遺伝子がその３′末端に隣接したことが示される（図３を参照のこと）。
【００５７】
３．プロモーター／レポーター遺伝子カセットの構築
推定上の転写開始部位の上流６６４ｂｐの位置からエキソンＩＩＩ の中程にあるＨｉｎｄＩＩＩ 制限部位迄広がる１５０５ｂｐのＧＳ１−２ ゲノムクローンの断片をＧＵＳレポーター遺伝子にインフレームで融合させｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）由来の３′ＮＯＳターミネーターと結合した。生じた異種遺伝子を、ＳａｌＩからＥｃｏＲＩ方向においてＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ部位でｐＵＣ１９ポリリンカー中でサブクローニングした。生じたプラスミド（ｐＧＳ１３５）を図９中に概略で示している。
【００５８】
ルシフェラーゼレポーターを有するＧＳ１−２ プロモーター欠損系を創る為に、プロモーター断片を、５′ＵＴＲ及びエキソンＩＩＩ の中程におけるＨｉｎｄＩＩＩ 制限部位に至る部分と共に、３．０ｋｂのＧＳ１−２ ゲノムクローンＨｉｎｄＩＩＩ 制限断片のＰＣＲ増幅により得た。生じた欠損系を、ｐＢＩ２２１に由来する、ＮＯＳターミネーターを含むｐＧＥＭ−ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）由来のＬｕｃとインフレームで融合した。一連のイントロン、エキソン、を有さないＧＳ１−２ プロモーター断片を得る為にＨｉｎｄＩＩＩ 部位からＡＴＧの丁度上流のＧＳ領域を除く場合を除いては、トウモロコシＡＤＨ１イントロンを含むＧＳプロモーター構築体を同じ方法で作製した。回収したＧＳ断片を、ｐＲＬＰ７３（Ｄｒ． Ｒｏｂｅｒｔ Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｕｎｉｍｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｉｎａ ａｔ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）由来のＡＤＨＩ／ＬＵＣ／ＮＯＳのＰＣＲ増幅により生じたｐＵＣ１８−塩基ＡＤＨＩ／ＬＵＣ／ＮＯＳベクターにつないだ。
【００５９】
最小プロモーター／ＬＣＵリポーターを過渡的なアッセイ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｓｓａｙ）における基底発現を確立するのに用いた。ｐＢＩ２２１骨格由来の３５Ｓ　ＣａＭＶ最小プロモーター（−７２）を上記ＡＤＨ／ＬＵＣ／ＮＯＳベクターに融合することにより作製した。
【００６０】
ｐＡＨＣ２５（Ｄｒ． Ｐｅｔｅｒ Ｑｕａｉｌ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｒｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ， ＣＡ）由来のＵｂｉ−１トウモロコシプロモーター、及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＮＯＳターミネーターからなるプラスミドを過渡的なアッセイにおいて、形質転換効率を測定する内部コントロールとして用いた。
【００６１】
４．過渡的な発現の解析
穀粒を、１０％の漂白剤、０．１％のＴｗｅｅｎ　２０で１０分間、しかる後に、無菌蒸留水により３回洗浄し滅菌した。胚を摘出し、そしてＭＳ培地プレート上のフィルターに置いた（胚２０個以内／プレート）。従来の記載（Ｍｕｈｉｔｃｈ及びＳｈａｔｔｅｒｓ， １９９８）のようにボンバードメントを即座に行った。２０μｇのキメラＧＳプロモーターホタルルシフェラーゼ及び０．２μｇのレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼレポーター（形質転換効率を決定するのに用いた）をマイクロプロジェクタイル上に沈降させた。ボンバードメント後、胚を同じ培地上で２８℃で３６〜４８時間に渡り解析の前インキュベートした。組織の抽出物を受身溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｕｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中で発芽中の胚を粉砕することにより調製した。ルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙｍａｎａｌに従い評価した。
【００６２】
過渡的な遺伝子発現の予備的な実験を、１．９ｋｂのＧＳ１−２ プロモーター／ＧＵＳ構築体の、ＧＳ１−２ が駆る茎に特異的な遺伝子発現を示さないが、胚におけるレポーター活性は示す縦方向に切った穀粒の半分に対する粒子のボンバードメントにより行った。結果的に、胚の過渡的な遺伝子発現を、最初ＧＳ１−２ プロモーターの特性決定するのに用いた。２つのＧＳ１−２ プロモーター欠損のセットを作製した：１）最初の２つのＧＳ１−２ イントロンを含んでいる転写ＬＵＣ融合系、及び２）トウモロコシＡｄｈ１イントロンを含んでいる転写ＬＵＣ融合系（図４ａ〜４ｇを参照のこと）。傾向はＧＳ１−２ プロモーター欠損系と同様ではあるが、ＬＵＣ活性は、常により高く且つＡｄｈ１イントロン−含有欠損構築体を用いることで一層再現可能であるのでそのデータのみ表わされている。結果（図５）は、−７２〜−３４のセグメントが取り除かれ、急に遺伝子発現が衰える迄、５′末端が取り除かれているので、ＧＳ１−２ プロモーター活性が変わらないことを示す。分散の解析（ＡＮＯＶＡ）は、−３５構築体のみは、他と有意に異なっていた（Ｐ≦０．００２、ｎ＝４）ことを明らかにした。更なる研究において、ｐＧＳ１５３と命名したベクターであり、転写調節領域の約７２ヌクレオチドを含むベクターは、トウモロコシ植物中で安定して形質転換された時ＧＵＳ融合タンパク質の強靭な遍在的常時発現を達成した。図１１ａ及び図１１ｃはｐＧＳ１５３により形質転換された植物由来の穀粒を示す一方、図１１ｂ及び１１ｄはコントロールの、非形質転換穀粒を示す。全穀粒をＧＵＳ組織化学的反応培地中で１６時間に渡りインキュベートした。図１０にはｐＧＳ１５３に関するベクター地図を供している。
【００６３】
Ｇｕｓｔｉｎ及びＢｕｒｋｅのリンカー走査方法論（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４ ： ２２−２３ （１９９３））をプロモーターを更に特性決定するのに用いた。−７２〜−３４領域のリンカー走査で、推定のＴＡＴＡボックス（転写開始部位の−３５〜４０上流）領域の解裂は、プロモーター活性の劇的な減少をもたらすことが示された（図６）。図６において、示した比活性は４つの独立事象の平均であり、そして記号「※」は、分散の解析（Ｐ≦０．０４）により決定した時の変異体３９〜３７又は３６〜３４と残りの変異体間のみの統計的な差を示す。過渡的な発現系において、穀粒における茎に特異的な発現を示すことが出来なかったことは意外な事実ではない。それは過渡的な遺伝子発現系において、組織に特異的なプロモーターが組織特異性を欠くことは異常なことではないからである。Ｒｕｓｅｌｌ及びＦｒｏｍｍ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ， ６ ： １５７−１６８ （１９９７） を参照のこと。
【００６４】
５．ＧＳ１−２ プロモーターを用いるトランスジェニックトウモロコシにおけるＧＵＳの組織に特異的な遺伝子発現
組織に特異的な遺伝子発現を指示する、本発明の転写調節領域の容量を評価するのに、Ｋｌｅｉｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６ ： ５５９−５６３ （１９９８））らの方法論を用いて、トウモロコシＨｉＩＩ胚又は胚由来のカルスをｐＧＳ１３５ベクター（図９を参照のこと）で形質転換した。この方法論を用いて、胚をｐＧＳ１３５、及びビアロホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）に対しての耐性を供す第二ベクター（Ｐｅｔｅｒ Ｈ． Ｑｕａｉｌにより提された）によりボンバーディングすることにより安定なトウモロコシの形質転換体を調製した。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＱｕａｉｌ， Ｔｒａｎｓ． Ｒｅｓ．， ５ ： ２１３−２１８ （１９９６） を参照のこと。トウモロコシの安定な形質転換を、Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ， Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕａｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｔ Ａｕｒｅｓで行った。トウモロコシの組織におけるＧＵＳの組織解剖学的検出を従来記載された（Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐａｎｔ．， １０４ ： ４２３−４３０ （１９９８））のように行った。ビアロホス−耐性−カリ（Ｂｉｏｌｏｐｈｏｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃａｌｌｉ）をＰＣＲ解析及び組織解剖学的ＧＵＳ活性測定によりスクリーニングした。ＰＣＲ解析は以下のプライマーを使用する当業界において周知の標準的な方法を用いて行った。
【化５】
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【００６５】
１８個のクローン由来の植物を首尾良く再生した。これらについて、５つの植物が正常に生長し、そして生存に適した種を生産した。しかし、再生した植物クローンの１つだけが若い（受粉後２３日）及び老いた（受粉後５０日）両方の穀粒においてＧＵＳ活性を示した。結果を図７及び８に示している。図７ａは、非形質転換コントロール（左）及びトランスジェニッククローン（右）に関する１６時間（一晩）後のトウモロコシの穀粒の組織学的ＧＵＳ染色を示す。図７ｂは、穀粒の更なるインキュベーションの１６時間後の染色を示す。図７ｃはインキュベーションの４時間後のコントロール（左）及びトランスジェニック（右）穀粒の組織化学的染色を示す。図７ｄは、１６時間に渡りＧＵＳ組織化学的反応混合物においてインキュベートしたトランスジェニック穀粒の果皮の染色を示す。図７ｅは、７ｄのように１６時間に渡りインキュベートしたコントロールの穀粒の果皮の染色を示す。図８ａは、ＧＵＳ組織化学的反応混合物中で１６時間に渡りインキュベートした、トランスジェニック穀粒の茎及び包葉のクローズアップ図を供す。図８ｂは、ＧＵＳ組織化学的反応混合物中で４時間に渡りインキュベートしたトランスジェニック穀粒の茎及び包葉のクローズアップ図である。図８ｃは、ＧＵＳ組織化学的反応混合物中で１６時間に渡りインキュベートし、次いでエタノールでクロロフィルを除いたトランスジェニックトウモロコシ由来の葉の部分を示す。図８ｄは、ＧＵＳ組織化学的反応混合物で１６時間に渡りインキュベートした同じトウモロコシのクローン由来の根の部分を示す。
【００６６】
ＧＵＳ組織化学的反応混合物中で一晩インキュベートした、トランスジェニック穀粒の半分及び切片は、母性穀粒組織、例えば、果皮、茎及び結合して内在する包葉において、強い組織特異的染色を示した（図７ａ〜ｄ）。特に顕著なのは、基底内乳移行細胞（ｂａｓａｌ ｅｎｄｏｐｅｒｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｌｌ）に内在する茎の柔組織領域におけるＧＵＳ染色であった。この結果は、穀粒をより短い時間に渡りインキュベートした時一層明らかであった（図７ｃ，８ｂ）。果皮は全体が染色された；しかし穀粒のより低い部分、茎により近い部分でより強く染色されていた（図７ｄ）。
【００６７】
母性種子組織とは対照的に、内乳又は胚（図７−ｃ）、葉（図８ｃ）又は根（図８ｄ）において染色は検出されなかった。初期のｍＲＮＡ解析（Ｒａｓｔｏｇｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３９ ： ４４３−４４６ （１９９８））並びに免疫学的及び酵素活性研究（Ｍｕｈｉｔｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ９１ ： ８６８−８７５ （１９８９） ； Ｍｕｈｉｔｃｈら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０７ ： ３７２−３７８ （１９９５））と一致して、ＧＳ１−２ 転写調節領域は、内乳もしくは胚又は生長機能に関する葉もしくは根の組織において、遺伝子発現を指示しなかった。この結果は又、この特殊なＧＳ形態は、種子の生長に関連する窒素同化においてとても特異的な機能を有することを示唆する。内乳に内在する茎の柔組織内での非常に強い遺伝子発現は、特に、内乳及び胚が生長する途中で、大半の窒素同化物が通過する注目のこの領域に関して予測可能である。
【００６８】
上記の文章は本発明の所定の側面を論じている一方、本発明の範囲及び精神から出発せずとも本明細書中の教示の視点において、当業者は改良版を作成可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
トウモロコシＧＳ１−２ 転写調節領域、５′非翻訳領域、エキソン１、２及び３（太字で下線を引いた）及び対応のイントロン領域のオリゴヌクレオチド配列を供している。−６６４に至る迄の５′欠損開始部位を矢印で示しており、転写開始部位（＋１）に関連して番号をつけている。推定上の転写因子結合部位は下線を引き名前をつけられている。
【図２】
トウモロコシＧＳ１−２ 転写調節領域の６６４ｂｐのヌクレオチド配列を供す。推定上の転写因子結合部位は下線を引き名前をつけている。
【図３】
ＧＳ１−２ 遺伝子のゲノム組織及びそのフランキング配列を示す。エキソンをベタの四角で示しており、そして転写開始部位を＋１として示している。ＧＳ１−２ 及びそのフランキング遺伝子（ＣＤＣ２及びＰＧＭ２）の方向及び転写の終末を矢印により示している。
【図４】
一連のＧＳ１−２ プロモーター／レポーター遺伝子構造の概略図である。
【図５】
一連の欠損ＧＳ１−２ プロモーター−レポーター遺伝子構造の過渡的な発現により正常化したルシフェラーゼ活性を示す。
【図６】
転写開始部位に関連して、−７２〜−３４のＧＳ１−２ 領域のリンカースキャニングを示す。
【図７】
ｐＧＳ１３５により安定に形質転換された植物体由来のトウモロコシの穀粒及び形質転換をしていないコントロールの植物体によるトウモロコシの穀粒の組織化学的なＧＵＳ染色を示す。
【図８】
ｐＧＳ１３５により安定に形質転換した植物由来のトウモロコシの穀粒、葉及び根の組織化学的なＧＵＳ染色を示す。
【図９】
ｐＧＳ１３５のベクター地図を与える。
【図１０】
ｐＧＳ１５３のベクター地図を与える。
【図１１】
トランケーション型ＧＳ１−２ ／ＧＵＳ構築体（ｐＧＳ１５３）により形質転換されたトウモロコシの穀粒、及びコントロールの、形質転換されていないトウモロコシ植物由来の穀粒の組織化学的なＧＵＳ染色を示す。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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