(57)【要約】ブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）とブタにおける先天性振せん（震顫）との関連性の同定に関し、関連する診断および治療組成物および方法に関する。より詳細には、特定の先天性振せん関連ＰＣＶ核酸およびポリペプチドに関する。特に、ブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）から単離された核酸であって、配列番号１から配列番号７からなる群から選択された配列と同一の配列を有する核酸を提供する。
2004503234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）から単離された核酸であって、配列番号１から配列番号７からなる群から選択された配列と同一の配列を有する核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された核酸を含む核酸。
【請求項３】
ブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）から単離された核酸であって、配列番号１から配列番号７の任意の配列の任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列からなる群から選択された配列を有する、シルコウイルス・ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項４】
配列番号１から配列番号７の任意の配列のＯＲＦ１からＯＲＦ１１の配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
発現調節配列と機能的に結合された請求項３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
【請求項７】
請求項５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
ＰＣＶタンパク質を産生する方法であって、シルコウイルスタンパク質をコードする核酸の発現をもたらす条件下で、請求項７に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項９】
ＰＣＶタンパク質が、配列番号１から配列番号７の任意の配列によって付加された配列の、任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）から単離されたポリペプチドであって、配列番号１から配列番号７の任意の配列の任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列からなる群から選択された配列を有するポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離されたポリペプチドおよびアジュバントを含むワクチン。
【請求項１２】
単離されたブタ・シルコウイルス株であって、配列番号１から配列番号６の配列からなる群から選択された配列を含むゲノムを有する単離された株。
【請求項１３】
弱毒化、不活化、または死滅化された請求項１２に記載のブタ・シルコウイルス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のブタ・シルコウイルスおよびアジュバントを含むワクチン。
【請求項１５】
ブタにおいて先天性振せんの病因を診断する方法であって、そのブタが、ブタ・シルコウイルス株１型または２型に感染しているかどうかを判別することを含む方法。
【請求項１６】
ブタ・シルコウイルスが、配列番号１から配列番号６の配列からなる群から選択された配列を含むゲノムを有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ブタにおいて先天性振せんの病因を診断する方法であって、そのブタが、配列番号１から配列番号６の配列からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス株に感染しているかどうかを判別することを含む方法。
【請求項１８】
感染の判別が、ブタから得た生物試料中のＰＣＶ核酸の存在を検出することによって行われる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１から配列番号６の２０個の連続塩基に見出される配列、またはその相補配列を有する少なくとも約２０塩基のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
感染の判別が、ブタから得た生物試料中のＰＣＶポリペプチドの存在を検出することによって行われる請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号１から配列番号６の任意の配列の任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列からなる群から選択された配列を有するポリペプチドを特異的に結合する抗体の結合を検出することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
感染の判別が、ブタから得た生物試料中のＰＣＶポリペプチドに対する抗体の存在を検出することによって行われる請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項２４】
ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、１型または２型ＰＣＶ株の免疫原性ポリペプチド、およびアジュバントを含む免疫防御量のワクチンを投与することを含む方法。
【請求項２５】
ＰＣＶポリペプチドが、配列番号１から配列番号６の任意の配列の任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、配列番号１から配列番号６の任意の配列の任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する免疫原性ポリペプチド、およびアジュバントを含む免疫防御量のワクチンを投与することを含む方法。
【請求項２７】
ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、１型または２型ＰＣＶ株の免疫原性ポリペプチドをコードする免疫防御量のＰＣＶ核酸を、薬学的に許容される担体と共に投与することを含む方法。
【請求項２８】
ＰＣＶポリペプチドが、配列番号１から配列番号６の任意の配列の任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、配列番号１から配列番号６の任意の配列の任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する免疫原性ポリペプチドをコードする免疫防御量のＰＣＶ核酸を、薬学的に許容される担体と共に投与することを含む方法。
【請求項３０】
ブタまたはその子孫において先天性振せんを予防または治療する方法であって、そのような治療を必要とするブタに、免疫防御量の請求項２３に記載の抗体を投与することを含む方法。
【請求項３１】
ブタ・シルコウイルス株を培養する方法であって、配列番号１から配列番号６からなる群から選択された配列を含む核酸を、配列番号１から配列番号６からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス粒子の産生をもたらす条件下で、適切な宿主細胞に導入することを含む方法。
【請求項３２】
宿主細胞がＰＫ−１５細胞である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
核酸がクローン化された２本鎖ＤＮＡの形態で導入される請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて２０００年６月１５日に出願された米国特許仮出願第６０／２１１７１０の優先権を主張するものであり、その出願の全体を参照により本明細書の一部とする。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、ブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）とブタにおける先天性振せん（震顫）との関連性の同定に関し、関連する診断および治療組成物および方法に関する。本発明は、より詳細には、特定の先天性振せん関連ＰＣＶ核酸およびポリペプチドに関する。
【０００３】
ブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）は、当初は、ブタ腎臓細胞系、ＰＫ−１５の非細胞変性性混入物として発見された（Ｔｉｓｃｈｅｒ等、Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｅ ２２６：１５３−１６７、１９７４）。このウイルスは、１９８２年に特性決定され（Ｔｉｓｃｈｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ、２９５：６４−６６、１９８２）、ニワトリ貧血ウイルス（Ｙｕａｓａ等、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２３：３６６、１９７９）、オウム嘴羽毛病ウイルス（ＰａｓｓおよびＰｅｒｒｙ、Ａｕｓｔｒｉａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、６１：６９−７４、１９８４）、およびハト・シルコウイルス（Ｗｏｏｄｓ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ：５：６０９−６１２、１９８３）と共にシルコウイルス科に分類された。シルコウイルスのゲノムは、環状１本鎖アンビセンスＤＮＡゲノムの単一コピーからなる（Ｌｕｋｅｒｔ等、Ｓｉｘｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ、１６６−１６８、１９９５）。このゲノムの大きさは、１．７から２．３ｋｂの間で多様である。シルコウイルスは、非エンベロープ型であり、正２０面体対称を有する。ＰＫ−１５細胞由来のＰＣＶは、初め病原性ではないと考えられていた。その完全ゲノムが配列決定され（Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２２１−２２７、１９９７）、電子顕微鏡検査法によって特性決定された（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３６：３６８−３７８、１９９９）。ＰＫ−１５−ＰＣＶは自然発生疾患と関連づけて考えられたことはなく、ブタの実験接種は臨床的疾患を生じなかった（Ｔｉｓｃｈｅｒ等、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９１：２７１−２７６、１９８６、Ａｌｌａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １２１：１−１１、１９９５）。
【０００４】
ＰＫ−１５−ＰＣＶ、ニワトリおよびオウム動物シルコウイルス、植物ジェミニウイルスおよびナノウイルス（以前には植物シルコウイルスとして知られていた）の系統発生分析は、ＰＫ−１５−ＰＣＶをオウム嘴羽毛病ウイルスにもっとも近いと分類し、ＰＫ−１５−ＰＣＶとオウム・シルコウイルスは共に、２種の植物ウイルス群と特徴を共有しており、それらの中間であった（Ｎｉａｇｒｏ等、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４３：１７２３−１７４４、１９９８）。さらなる分析は、ＰＫ−１５−ＰＣＶおよび／またはオウム・シルコウイルスの前身は、脊椎動物宿主に感染して、脊椎動物感染ＲＮＡウイルス、おそらくはカリチウイルスと組み換えられた植物ナノウイルスに源を発することを示唆した（ＧｉｂｂｓおよびＷｅｉｌｌｅｒ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、９６：８０２２−８０２７、１９９９）。
【０００５】
ＰＣＶによる感染は、離乳後多臓器性発育不全症候群（ＰＭＷＳ）と関連づけられており、この症候群は離乳後のブタにおける進行性体重減少、呼吸困難、頻呼吸、および黄疸によって臨床的に特徴づけられる（Ｄａｆｔ等、Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉａｎｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｒｏｃｋ、ＡＲ、ＵＳＡ、３２頁、１９９６、Ｃｌａｒｋ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ２８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓ、Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ、Ｑｕｅｂｅｃ、４９９−５０１頁、１９９７、Ｋｉｕｐｅｌ等、Ｉｎｄｉａｎａ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５：３０３−３０７、１９９８、Ｅｌｌｉｓ等、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ３９：４４−５１、１９９８、ＡｌｌａｎおよびＥｌｌｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｎｉａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ １２：３−１４、２０００）。いくつかのＰＭＷＳ関連ＰＣＶの完全ゲノム配列は入手可能である（Ｈａｍｅｌ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５２６２−５２６７、１９９８、Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：２１７１−２１７９、１９９８、Ｍｏｒｏｚｏｖ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：２５３５−２５４１、１９９８、Ｍａｎｋｅｒｔｓ等、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６６６５−７７、２０００、ＷＯ９９／１８２１４、ＷＯ９９／４５９５６、米国特許第６２１７８８３号）。ＰＭＷＳ−ＰＣＶの単離株は、抗原的および遺伝子的にＰＫ−１５−ＰＣＶと異なる（Ａｌｌａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｎｉａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ １０：３−１０、１９９８、Ｈａｍｅｌ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５２６２−５２６７、１９９８）。したがって、ＰＣＶ１と呼ばれる元のＰＫ−１５細胞培養単離株と対照的に、これらのＰＭＷＳ−関連ＰＣＶはＰＣＶ２と呼ばれた（Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：２１７１−２１７９、１９９８）。
【０００６】
ブタにおける先天性振せん（ＣＴ）は、ミエリン欠損と関連づけられており、遺伝的異常（Ｈａｒｄｉｎｇ等、Ｖｅｔ Ｒｅｃ ９２：５２７−５２９、１９７３、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ等、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ２６：４８１−４８５、１９７６）、胎内トリクロルフォン毒性（Ｋｎｏｘ等、Ｎｏｒｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｅｒｍｅｄ ３０：５３８−５４５、１９７８）、および古典的ブタコレラ・ウイルスの胎内感染（Ｈａｒｄｉｎｇ等、Ｖｅｔ Ｒｅｃ ７９：３８８−３９０、１９６６）、またはアウエスキー・ウイルス（Ｍａｒｅ等、Ｊ Ａｍ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ １６４：３０９−３１０、１９７４）が原因である可能性がある。北米でもっとも一般的なＣＴの形態は伝染性であり、Ａ２型と分類されている（Ｄｏｎｅ等、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ａｎｎｕａｌ １６：９８−１０２、１９７６）。ＣＴＡ２型の疫学はこれまで検討されてきた（Ｂｏｌｉｎ等、Ｌｅｍａｎ ＡＤ、Ｓｔｒａｗ ＢＥ、Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ ＷＬ、Ｄ’Ａｌｌａｉｒｅ Ｓ、Ｔａｙｌｏｒ ＤＪ編、第７版、２４７−２４９頁、１９９２）。疾患はすべての品種で起こり、季節性ではなく、初産雌ブタの同腹子でより一般的であり、しばしば外部からの補充繁殖家畜の導入に伴う（Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ等、Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ １９：３７７−３８２、１９５８）。冒された同腹子内の有病率は０−１００％まで多様である。発生は一般に１−８週間続くが、疾患が風土性であることはまれである。罹患ブタは、異なる重篤度で骨格筋の間代性収縮を示し、これは一般に４週齢までに減少、消散するが、屠殺齢まで持続する可能性もある。ブタが安静にしているとき、ミオクロヌスは弱まり、外部刺激によって増悪する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等、Ｎｏｒｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｅｒｍｅｄ ８：９２１−９４３、１９５６、Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ等、Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ２０：３１９−３２３頁および６２７−６３３頁、１９５９）。罹患ブタの死亡率は５０％という高い率となる可能性があり、これは哺乳ができないことによる。
【０００７】
ウイルスとＣＴＡ２型との関連性は長い間知られてきたが、これまでのところそのウイルス株は同定されていない。最初の研究は、ＣＴＡ２型を有する新生ブタ由来の１次腎細胞培養物から得た濾液中の約２０ｎｍの立方体様未同定ウイルスを記載している（Ｋａｎｉｔｚ ＣＬ、１９７２、Ｍｙｏｃｌｏｎｉａ ｃｏｎｇｅｎｉｔａ：Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍｙｃｌｏｎｉｃ ｐｉｇｓ、博士論文、Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮ）。これらの研究には、腎細胞培養物上澄みの濾液として調製された立方体様ウイルスによる妊娠雌ブタの筋肉内接種も含まれており、これによって先天性振せんを有する同腹子が分娩された。他の研究者等は、ＣＴＡ２型を有するブタから得た１次腎細胞培養物から塩化セシウム勾配でウイルスを精製し、そのウイルスを形態学および間接免疫法に基づいてＰＣＶと同定した（Ｈｉｎｅｓ ＲＫ、１９９４、Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｃａｕｓｅｓ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｔｒｅｍｏｒｓ ｔｙｐｅ Ａ−１１ ｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｆｕｌｆｉｌｌｉｎｇ Ｋｏｃｈ’ｓ ｐｏｓｔｕｌａｔｅｓ、博士論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）。続いて妊娠第３三半期の妊娠ブタに精製ウイルスを皮下、経鼻、および経口接種することによって、先天性振せんを有するブタが分娩された。ＰＣＶは、ＣＴを有するブタの腸管組織から再単離されたが、神経組織からは再単離されず、擬接種雌親由来の正常な対照ブタの組織からは再単離されなかった。ＰＭＷＳＰＣＶ単離株を増幅するために設計されたＰＣＲプライマー・セットを用いて、ＣＴを有するブタ群の試料からＰＣＶＤＮＡも見出された（Ｇ．Ｗ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等、ＩＸ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ、１９９９年６月）。
【０００８】
しかしながら、ＣＴに関連するＰＣＶ単離株の遺伝子分析は、まだ報告されていない。したがって、ＰＣＶと先天性振せんとの関連性を確認すること、この疾患に関わるＰＣＶの型を正確に同定することが求められている。現在は先天性振せんに対する有効な診断試験もワクチンも入手不可能であり、実際のところ、そのような分析によってのみ、ブタの先天性振せんに対する診断用および治療用ツールの製造が可能となるかもしれない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明は、先天性振せんを有するブタのブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）株のクローニングに基づく。
【００１０】
これらの結果は、診断および治療応用例の発展の第一段階を提供する。
【００１１】
したがって本発明は、ブタの先天性振せんの病理原因を診断する方法を提供し、その方法は、そのブタがブタ・シルコウイルス株の１型または２型に感染しているかどうかを判別することを含む。
【００１２】
本発明はさらに、ブタの先天性振せんを予防または治療する方法を提供し、その方法は、有効量の免疫原性ＰＣＶ１またはＰＣＶ２ポリペプチド、あるいはこのポリペプチドをエンコードする核酸をそのブタに投与することを含む。
【００１３】
本発明の他の主題は、本発明者等によって同定された新規なＰＣＶ核酸配列、その配列によってエンコードされたポリペプチド、ならびに新規なＰＣＶ単離株およびその免疫原性製剤である。
【００１４】
したがって、本発明は単離されたブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）に関し、その核酸は、配列番号１から配列番号７からなる群から選択された配列と同一である配列を有する。
【００１５】
本発明はさらに、ブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）から単離された核酸に関し、その核酸は、任意の配列番号１から配列番号７の配列の、任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされた配列かならなる群から選択された配列を有するシルコウイルス・ポリペプチドをコードする配列を含む。
【００１６】
本発明の他の主題は、発現制御配列と有効に結合しているこの核酸を含む発現ベクターである。
【００１７】
この発現ベクターは、薬学的に許容される賦形剤と結合してワクチンを形成することができ、これも本発明の一部である。
【００１８】
本発明はさらに、この発現ベクターを含む宿主細胞を対象とする。
【００１９】
本発明はさらに、ＰＣＶタンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、シルコウイルスをコードする核酸の発現をもたらす条件下で、この宿主細胞を培養することを含む。
【００２０】
任意の配列番号１から配列番号７のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってエンコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにそれらのポリペプチドに対する抗体も本明細書に記載される。
【００２１】
本発明のさらなる主題は、ブタ・シルコウイルス株を培養する方法であり、その方法は、配列番号１から配列番号６からなる群から選択された配列を含む核酸を、配列番号１から配列番号６からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス粒子の産生をもたらす条件下で、適切な宿主細胞に導入することを含む。
【００２２】
本発明はさらに、配列番号１から配列番号６から選択された配列を含むゲノムを有する単離ＰＣＶ株を包含する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明は、先天性振せんに関する病原体の株を確実に同定するという問題を解決する。先天性振せんを有するブタのブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）株をクローニングおよび配列決定し、それらをＰＭＷＳに関連するＰＣＶ株と比較することによって、プライマー、プローブ、またはウイルス株などの多くの有用な材料の発展に至った。本発明は、知られているＣＴ病原性の株のクローニング、ウイルスの培養を可能にする。
【００２４】
本発明は、ブタのニューロンに存在する、ならびにより少ない程度で脳のグリア細胞および脊髄に存在するＰＣＶゲノムＤＮＡが、離乳後多臓器性発育不全症候群（ＰＭＷＳ）に関連する株のゲノムＤＮＡと、約９５％を超える非常に近い配列類似性を共有するという発見に部分的に基づいている。先天性振せん（ＣＴ）またはＰＭＷＳを有するブタから得た７種のＰＣＶ単離株の全ゲノムを、クローン化し、配列決定した。単離株の１種は、１９６０年代終わりに単離されたＣＴＡ２型を有する新生ブタから得たものであった。２種の新しいＰＣＶ単離株は、無関係に発生したＣＴＡ２型を有する異なる農場の２頭の感染新生ブタから得た。４種の単離株は、ＰＭＷＳを有するブタの、４つの異なる農場を起源とするものであった。この４種のＰＭＷＳ−ＰＣＶの比較分析は、それらが互いに９９％の配列同一性を共有し、以前に配列決定されたＰＭＷＳ−ＰＣＶと９６％を超える配列同一性を共有することを実証した。しかしながら２種の新しいＣＴ−ＰＣＶは、互いに、さらに興味深いことに新しいＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株とも９９％の同一性を共有した。ＰＭＷＳと新しいＣＴ単離株との間に、一貫したゲノムの相違はなかった。古いＣＴ−ＰＣＶは、ＰＫ−Ｉ５由来ＰＣＶ株と９８％の同一性を示し、新しいＣＴ−ＰＣＶとはわずか７２％の同一性を示した。系統発生分析は、ＰＣＶ単離株が２つのグループに分類できることを確認した。ＰＣＶＩ型は、ＰＫ−１５−ＰＣＶ、および本発明の古いＣＴ−ＰＣＶ単離株からなり、ＰＣＶ２型は、ＰＭＷＳ、および本発明の新しいＣＴ単離株を含む。
【００２５】
さらなる研究によって、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および凍結組織切片の間接蛍光抗体試験を用いて、天然ＣＴＡ２型を有する１−２日齢ブタにおけるＰＣＶの組織分布、および遺伝子型を確立した。ＣＴＡ２型が発生した米国中西部の４つの農場を起源とする、ＣＴ罹患ブタ、および臨床的に正常なブタを選択した。ＣＴブタのすべて、および正常ブタのほとんどが、ＰＣＶに感染していた。ＰＣＶは感染ブタの組織に広範に分布しており、中枢神経組織、および肝臓にもっとも一般的に分布していた。すべての感染ブタにおいて、非神経組織に比べて、脳および脊髄により多くのＰＣＶ感染細胞が存在した。ＣＴブタは、分布が広汎で、感染細胞の割合が高いために、臨床的に正常なブタに比べて、脳および脊髄により多くのＰＣＶ感染細胞を有した。脳および脊髄において、もっとも一般的にＰＣＶが感染した細胞は、大ニューロンであった。非神経組織では、マクロファージがもっとも高頻度に感染した細胞型であった。ＰＣＲ試験は、４つのすべての農場のすべてのＰＣＶ感染ブタにおいて、ＰＣＶ２型のみを実証し、ＰＣＶ１型は実証されなかった。
【００２６】
本発明はさらに、ＰＣＶ２が感染雌ブタから胎内の同腹子に伝播され得るという証拠に基づいている。したがってＰＣＶ２は、単独で、あるいは補因子との組合せによって、先天的に伝播可能である。
【００２７】
上述のとおり、これらの発見は、ＰＣＶのＣＴとの病因論的関係、ならびにＰＭＷＳに関連するＰＣＶウイルス間の関係のあいまいさを解明する（従来の研究は、たとえば、実際にＰＣＶがＣＴの病原体であった場合にも、別のＰＣＶウイルス株がＣＴに関連する可能性を残していた）。したがって、本明細書に記載した新規なＰＣＶ株（たとえば、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ２、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ３、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ４、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ６、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７）に加えて、本発明は、これらの試薬をベースとする診断および治療方法および材料を提供し、診断上の評価、および治療的、特に免疫学的介入の標的としてＰＣＶ、特にＰＣＶ２型を同定する。
【００２８】
本明細書では、「ＰＣＶ」という用語は、たとえばブタおよびウシ・シルコウイルス単離株の全ゲノムの距離マトリクス分析（図３）に示したように、特にブタ・シルコウイルスを指す。特に、ＰＣＶという用語は、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１（配列番号１）、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ２（配列番号２）、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ３（配列番号３）、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ４（配列番号４）、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５（配列番号５）、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ６（配列番号６）を意味する。さらに、ＰＣＶには、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７（配列番号７）、ＰＫ−１５ＰＣＶ（Ｍｅｅｈａｎ等、１９９７）、およびＰＭＷＳ−ＰＣＶ（Ｈａｍｅｌ等、１９９８）が含まれる。
【００２９】
「ＰＣＶポリペプチド」（または「ＰＣＶタンパク質」）は、ＰＣＶオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）によってエンコードされたポリペプチド遺伝子産物を指す。各ＰＣＶは１１のＯＲＦを有し、したがって上記のとおり、各株に対してＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０、およびＯＲＦ１１が存在する。ＯＲＦおよびそれらがエンコードするポリペプチドの特徴は、以下の実施例１の表、および図４−１４に示す。
【００３０】
「ワクチン」という用語は、レシピエント（受容者）において防御免疫性を誘導するために用いることのできる組成物（タンパク質またはベクター。後者は、厳密でなく「ＤＮＡワクチン」と呼ぶこともできるが、ＲＮＡベクターも使用可能である）を指す。本発明のワクチンは母集団の一部において免疫性を誘導することができ、いくらかの個体では、強固な免疫応答、または防御的な免疫応答を開始できず、あるいは場合によってはいかなる免疫応答も開始できない可能性があることに留意されたい。この無効性は、個々の遺伝的背景に由来するか、あるいは免疫欠損状態（後天性または先天性）、または免疫抑制（たとえば、器官拒絶を防ぐため、または自己免疫状態を抑制するための免疫抑制剤による治療）によるものである。
【００３１】
「免疫療法」という用語は、病原体特異免疫応答の活性化に基づく治療計画を指す。ワクチンは、免疫療法の一形態であり得る。ｅｘ ｖｉｖｏ（その後、対象に移植）、またはｉｎ ｖｉｖｏで、樹状細胞に、ＰＣＶポリペプチド、場合によっては刺激サイトカイン、たとえばＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌｔ３リガンドを負荷することも免疫療法の一形態である。
【００３２】
本明細書では、「防御する」という用語は、対象におけるＰＣＶ感染の予防または治療、あるいは適宜その両方を意味する。したがって、ワクチンの予防的投与は、レシピエント対象をＰＣＶ感染から防御することができ、たとえば感染性単核球症、またはリンパ増殖性疾患を予防することができる。ワクチンの治療的投与または免疫療法は、レシピエントをＰＣＶ感染媒介性病因から防御することができ、たとえばＰＭＷＳまたはＣＴなどの疾患または障害を治療することができる。
【００３３】
本明細書では、「対象」という用語は、ＰＣＶを支持（維持）する動物を指す。特に、この用語はブタを指す。
【００３４】
本明細書では、「ブタにおける発現のためのベクター」、または「ブタ発現ベクター」という用語は、ブタ細胞において有効なプロモータを少なくとも含むベクターを意味し、好ましくはブタにおいて安全で有効なベクターを意味する。そのようなベクターは、たとえば、免疫性の発展に関与しない外来遺伝子を除外する。ベクターがウイルス・ベクターである場合、強固な感染の複製および展開を可能にする部位を除外し、ｉｎ ｖｉｖｏでの複製能力の発達を回避するために操作される。そのようなベクターは、好ましくは、農場のブタに用いるのに安全であり、より好ましい実施形態において、ベクターは、ブタにおける臨床試験または使用に関して、政府規制機関（たとえば、米国農務省など）によって承認されている。特定のベクターは以下に詳しく記載する。
【００３５】
本明細書では、「免疫原性ポリペプチド」という用語は、そのポリペプチドが、体液性または細胞性、好ましくは両方の免疫応答を誘導できることを意味する。免疫原性ポリペプチドは抗原性でもある。ある分子は、免疫系の抗原認識分子、たとえば免疫グロブリン（抗体）、またはＴ細胞抗原受容体などと特異的に相互作用することができるとき、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸のエピトープを含有する。本明細書ではエピトープとも呼ばれるポリペプチドの抗原性部分は、抗体またはＴ細胞受容体認識に関して免疫優性な部分であることが可能であり、あるいはその抗原性部分を免疫化のための担体ポリペプチドと複合して、その分子に対する抗体を産生するために用いられる部分であることができる。抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である、すなわち担体なしに免疫応答を誘導できる必要はない。
【００３６】
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。アジュバントは、ゆっくりと抗原を放出する組織貯蔵所として機能することができ、さらに非特異的に免疫応答を増強するリンパ系活性化剤として機能することも可能である（Ｈｏｏｄ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、１９８４、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、３８４頁）。多くの場合、アジュバントが存在しないとき、抗原単独による１次投与は、体液性または細胞性免疫応答を誘導できないであろう。アジュバントには、これに限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント、サポニン、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウムなど、界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油、または炭化水素エマルジョンなど、および潜在的に有用なヒト・アジュバント、たとえばＢＣＧ（カルメット・ゲラン杆菌）および挫瘡プロピオンバクテリウムなどが含まれる。別法として、またはこれに加えて、以下に記載する免疫刺激タンパク質をアジュバントとして、またはワクチンに対する免疫応答を高めるために用いることができる。好ましくは、このアジュバントは薬学的に許容される。
【００３７】
「薬学的に許容される」、または「獣医学的に許容される」という語句は、動物に投与されたとき、生理的に耐性であり、典型的にアレルギー反応、または類似の不都合な反応、たとえば胃の不調、めまい感などを生じない分子実体、および組成物を指す。本明細書では、好ましくは、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されている、あるいは米国薬局方、または動物に用いるための一般に認められている他の薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」という用語は、それと共に化合物を投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。滅菌水または水溶液、食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は、特に注射可能溶液用に担体として好ましく用いられる。適切な薬剤担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎの「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００３８】
本明細書では、「単離」という用語は、言及された材料が、その天然の環境、たとえば細胞から取り出されることを意味する。したがって、単離された生物材料は、いくつかの、またはすべての細胞成分、すなわちその天然材料が天然に発生する細胞の成分（たとえば、細胞質成分または細胞膜成分）を含まないことが可能である。ある材料が細胞抽出物中に存在する場合、または異種細胞または細胞抽出物中に存在する場合、単離されたものとみなされる。核酸分子の場合、単離核酸には、ＰＣＲ産物、単離ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または制限フラグメントが含まれる。単離核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列が含まれ、すなわちそれがキメラ組換え核酸構成体の一部を形成する。したがって、特定の実施形態において、組換え核酸は単離核酸である。単離タンパク質は、それが細胞内で結合する他のタンパク質、または核酸、あるいはその両方と結合していてもよく、あるいは膜結合タンパク質である場合、細胞膜と結合していてもよい。単離小器官、細胞、または組織は、生体においてそれが見出される解剖学的部位から取り出される。単離材料は、必要ではないが、精製することができる。
【００３９】
本明細書では、「精製」という用語は、その材料が得られた天然材料を含む関連のない材料、すなわち不純物の存在を低減または排除する条件下で単離された材料を指す。たとえば、精製タンパク質は、好ましくは、細胞内でそれが結合している他のタンパク質、または核酸を実質的に含まず、精製核酸分子は、好ましくは、細胞内でそれとともに見出される可能性のある、タンパク質、または他の関連のない核酸分子を実質的に含まない。本明細書では、「実質的に含まない」という用語は、材料の分析試験のコンテクストにおいて適切に用いられる。好ましくは、実質的に不純物を含まない精製材料は、少なくとも５０％の純度である。純度は、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的検定、および当分野で知られる他の方法によって評価することができる。
【００４０】
本発明に従って、当分野の技術の範囲内である通常の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技法を用いることができる。そのような技法は文献において充分に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書において「Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９」とする）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻および第２巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）］、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００４１】
「オープン・リーディング・フレーム」、「コード配列」、または発現産物、たとえばＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素などを「エンコードする」配列は、発現したときに、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列であり、すなわちそのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質、または酵素のアミノ酸配列をエンコードする。タンパク質のコード配列には、開始コドン（一般にＡＴＧ）、および終止コドンを含むことができる。
【００４２】
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡ、特にｍＲＮＡに転写し、次いでそれがトランスＲＮＡスプライシングされ（イントロンを含有する場合）、そのコード配列によってエンコードされたタンパク質に翻訳されるとき、コード配列は、細胞内で転写および翻訳制御配列の「制御下にある」か、あるいは「機能的に結合している」。
【００４３】
「発現調節配列」は、エンハンサ、レプレッサ、またはプロモータ配列を含む、転写または翻訳調節配列である。
【００４４】
「プロモータ」または「プロモータ配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することのできるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモータ配列は、転写開始部位によってその３’末端に結合され、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むために上流（５’方向）に延長する。プロモータ配列内で、転写開始部位（たとえば、ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピングによって都合よく定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を起こすタンパク質結合領域（コンセンサス配列）が見出される。
【００４５】
「ベクター」、「クローニング・ベクター」、および「発現ベクター」という用語は、それによってＤＮＡまたはＲＮＡ配列（たとえば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、それによって宿主を形質転換し、導入された配列の発現（たとえば、転写および翻訳）を促進することのできるビヒクルを意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれ、それらについては以下に詳しく論じる。
【００４６】
ベクターは典型的に、伝達性因子のＤＮＡを含有し、その中に外来ＤＮＡが挿入される。ＤＮＡの１つの断片をＤＮＡの別の断片に挿入する一般的な方法には、制限部位と呼ばれる特定の部位（特定のヌクレオチド群）でＤＮＡを開裂する制限酵素と呼ばれる酵素を使用することが含まれる。
【００４７】
「カセット」は、定義された制限部位でベクターに挿入されることのできる発現産物をコードするＤＮＡコード配列、またはＤＮＡの断片を指す。カセット制限部位は、適切なリーディング・フレーム内に確実にカセットを挿入するように設計されている。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位に挿入され、次いで、ベクターによって伝達性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞に運ばれる。発現ベクターなどの挿入または付加ＤＮＡを有するＤＮＡの断片または配列は、「ＤＮＡ構成体」と呼ぶこともできる。ベクターの一般的な型は「プラスミド」であり、これは一般的に、通例は細菌起源の２本鎖ＤＮＡの自己完結型分子であり、容易に追加の（外来）ＤＮＡを受容することができ、容易に適切な宿主細胞に導入される。プラスミド・ベクターは多くの場合、コーディングＤＮＡおよびプロモータＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡの挿入に適した１つまたは複数の制限部位を有する。コーディングＤＮＡは、特定のタンパク質または酵素に関する特定のアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ配列である。プロモータＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始、調節、あるいは仲介、または制御するＤＮＡ配列である。プロモータＤＮＡ、およびコーディングＤＮＡは、同一の遺伝子由来であることができ、あるいは異なる遺伝子由来であることができ、さらに同一の生体由来、または異なる生体由来であることができる。プラスミドおよび菌類ベクターを含む多数のベクターが、多様な真核生物および原核生物宿主における複製および／または発現に関して記載されてきた。非限定的な例には、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＲＳＥＴまたはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、および本明細書に記載または引用した方法、あるいは関連分野の技術者に知られている方法を用いる多くの適切な宿主細胞が含まれる。組換えクローニング・ベクターは多くの場合、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製系、宿主における選択のための１つまたは複数のマーカ、たとえば抗生物質抵抗性など、および１つまたは複数の発現カセットを含む。
【００４８】
「発現する」および「発現」という用語は、遺伝子またはＤＮＡ配列の情報が顕性となるのを可能にすること、あるいはそれをもたらすことを意味し、たとえば対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関わる細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生する。ＤＮＡ配列は、細胞において、または細胞によって発現し、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、たとえば生じたタンパク質も、その細胞によって「発現した」と言うことができる。発現産物は、細胞内、細胞外、または分泌型として特徴づけることができる。「細胞内」という用語は、細胞の内部にあるものを意味する。「細胞外」という用語は、細胞の外部にあるものを意味する。ある物質が細胞上または内部のどこからか、著しい程度で細胞外部に現れる場合、その物質は細胞によって「分泌」されている。
【００４９】
「トランスフェクション」という用語は、細胞への外来核酸の導入を意味する。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外在または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味し、それによって宿主細胞は導入遺伝子または配列を発現し、所望の物質、典型的には導入遺伝子または配列によってコードされたタンパク質または酵素を産生することになる。導入遺伝子または配列は、「クローン」または「外来」遺伝子または配列と呼ぶこともでき、調節または制御配列、たとえば開始、終止、プロモータ、シグナル、分泌、または細胞の遺伝子機構によって用いられる他の配列などを含むことができる。この遺伝子または配列は、非機能性配列、または未知の機能を有する配列を含むことができる。導入ＤＮＡおよびＲＮＡを受容し、発現する宿主細胞は、「形質転換」されており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であることができ、宿主細胞と同一の属または種の細胞、あるいは異なる属または種の細胞を含む。
【００５０】
「宿主細胞」という用語は、たとえば遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、タンパク質、または酵素の細胞による発現など、細胞による物質の産生のために、選択、修飾、形質転換、増殖、あるいは任意の方法で用いられるか、操作される任意の生体の任意の細胞を意味する。適切な宿主細胞には、１次マクロファージ、特にブタ・マクロファージ、またはそのマクロファージ細胞系、ブタ腎細胞、あるいはＰＣＶがウイルスを産生できる、またはそれがウイルス感染を支持できる、またはその両方であるような他の哺乳動物細胞が含まれる。
【００５１】
「発現系」という用語は、たとえばベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のためなどの、適切な条件下にある宿主細胞、および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系には、大腸菌宿主細胞およびプラスミド・ベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルス・ベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが含まれる。特定の実施形態において、当該タンパク質は、ＣＯＳ−１、またはＣ２Ｃ１２細胞に発現する。他の適切な細胞には、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３Ｔ（ヒト腎細胞）、マウス１次筋芽細胞、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が含まれる。
【００５２】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体」とは、所与のコドン位置における１つまたは複数のヌクレオチドの変化が、その位置でエンコードされたアミノ酸に変更を生じない変異体である。
【００５３】
「機能保存的変異体」とは、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変更することなく、変化している変異体であって、これに限定されるものではないが、類似の特性（たとえば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など）を有するものによるアミノ酸の置換が含まれる。類似の特性を有するアミノ酸は、当技術分野においてよく知られている。たとえば、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンは、親水性−塩基性アミノ酸であり、互換性である可能性がある。同様に、疎水性アミノ酸のイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、またはバリンと置換することができる。そのような変化は、見かけの分子量、あるいはタンパク質またはポリペプチドの等電点にほとんど、またはまったく影響を及ぼさないことが予期される。保存として指示された以外のアミノ酸はタンパク質または酵素中で異なっている可能性があり、そのため類似の機能を有する任意の２つのタンパク質の、タンパク質またはアミノ酸配列の類似性パーセントは多様であり、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄなどによるアライメント・スキームによって求めた類似性は、たとえば７０％から９９％であることができる。「機能保存的変異体」はさらに、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって求めたアミノ酸同一性が、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、もっとも好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％であって、比較される天然または親タンパク質または酵素と同一の、または実質的に類似の特性または機能を有するポリペプチドまたは酵素を含む。
【００５４】
本明細書では、すべての文法形態および綴りの変形形態の「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、スーパーファミリー由来のタンパク質（たとえば、免疫グロブリン・スーパーファミリー）、および異なる種由来の相同性タンパク質（たとえば、ミオシン軽鎖など）を含む、「共通の進化学的起源」を有するタンパク質間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋ等、Ｃｅｌｌ ５０：６６７、１９８７）。そのようなタンパク質（およびそれらのエンコード遺伝子）は、類似性パーセントまたは保存位置における特定の残基またはモチーフの存在という点において、それらの配列類似性によって表される配列相同性を有する。
【００５５】
したがって、すべての文法形態の「配列類似性」という用語は、共通の進化学的起源を共有していても、共有していなくてもよいタンパク質の核酸またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度を指す（上述のＲｅｅｃｋ等を参照のこと）。しかしながら、慣例的な使用、および本出願において、「高度に」などの副詞によって修飾されているとき、「相同性」という用語は、配列類似性を指すことができ、共通の進化学的起源に関連しても、関連していなくてもよい。
【００５６】
特定の実施形態において、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳｔｒｉｄｅｒなどの配列比較アルゴリズムによって求められたＤＮＡ配列の定義された長さに渡るヌクレオチドの一致が、少なくとも約８０％、もっとも好ましくは少なくとも約９０または９５％であるとき、２つのＤＮＡ配列は、「実質的に相同性」、または「実質的に類似性」である。そのような配列の例は、本発明の特定の遺伝子の対立遺伝子、または種変異体である。実質的に相同性である配列は、たとえば特定のシステムに関して定義された厳格な条件下で、配列データバンクで入手可能な標準的なソフトウェアを用いて、またはサザン・ハイブリダイゼーション実験において、配列を比較することによって同定できる。
【００５７】
同様に、特定の実施形態において、８０％を超えるアミノ酸が同一であるとき、または約９０％を超えるアミノ酸が類似している（機能的に同一である）とき、２つのアミノ酸配列は、「実質的に相同性」、または「実質的に類似性」である。好ましくは、類似性または相同性配列は、たとえばＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアップ・プログラム、または上記の任意のプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を用いるアライメントによって同定される。
【００５８】
核酸分子の１本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、他の核酸分子とアニール可能なとき、その核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイゼーション可能」である（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）。温度およびイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同性核酸の予備スクリーニングの場合、Ｔｍ（融解温度）５５℃に対応するストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件を用いることができ、たとえば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％乳、ホルムアミド非含有、または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳである。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応し、たとえば、４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣである。ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件は、最高温度のＴｍに対応し、たとえば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣである。ＳＣＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有していることを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間の誤対合も可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、および相補性の程度に応じて決まり、変数は当分野においてよく知られている。２つのヌクレオチド配列の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴｍ値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で減少する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。ヌクレオチドが１００を超える長さのハイブリッドの場合、Ｔｍを算出するための等式がすでに得られている（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等、９．５０〜９．５１を参照のこと）。短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、誤対合の位置はより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等、１１．７〜１１．８を参照のこと）。ハイブリダイゼーション可能な核酸の最短の長さは、少なくとも約１０のヌクレオチド、好ましくは約１５のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０のヌクレオチドの長さである。
【００５９】
特定の実施形態において、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、Ｔｍ５５℃を指し、上述の条件を用いる。好ましい実施形態において、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい実施形態において、Ｔｍは６５℃である。特定の実施形態において、「高いストリンジェンシー」は、０．２×ＳＳＣ中６８℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中４２℃のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件、またはこれら２つのいずれかの条件下で認められるものと同等のハイブリダイゼーションレベルが得られる条件下を指す。
【００６０】
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般にヌクレオチドが少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０で、好ましくはヌクレオチドが１００以下の核酸を指し、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または他の対象となる核酸をエンコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子とハイブリダイゼーション可能である。オリゴヌクレオチドは、たとえば３２Ｐ−ヌクレオチド、またはビオチンなどの標識が共有的にコンジュゲートしているヌクレオチドで標識することができる。一実施形態において、標識ヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド（１つまたは両方が標識されていてよい）は、遺伝子の全長またはフラグメントをクローニングするため、またはそのタンパク質をエンコードする核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして用いることができる。さらなる実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子と共に３重らせんを形成することができる。一般にオリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸合成装置で調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、非天然ホスホエステルアナログボンド、たとえばチオエステルボンドなどを用いて調製することができる。
【００６１】
ＰＣＶのクローニングおよび発現
本発明は、７種のブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）株のクローン化、および配列決定に成功した。１９６０年代終わりに単離され（本明細書ではＣＴ−ＰＣＶ７と称する）、２型の先天性振せん（ＣＴ）を有する新生ブタを起源とする１種のウイルス株、ＣＴを示すブタから得た２種の新しいＰＣＶ単離株（本明細書ではＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ６と称する）、および離乳後多臓器性発育不全症候群（ＰＭＷＳ）の徴候を示すブタから得た４種のＰＣＶ株（本明細書ではＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ２、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ３、およびＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ４と称する）である。
【００６２】
ＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株は、互いに約９９％のヌクレオチド配列同一性を生じることが見出された。さらに、１９９０年代終わりの新しいＣＴ−ＰＣＶ単離株、および１９６０年代終わりの古いＣＴ−ＰＣＶ単離株はＣＴ Ａ２型を有する新生ブタを起源としたが、それらはわずか７２％のヌクレオチド配列同一性を共有した。２種の新しいＣＴ−ＰＣＶのゲノムは、２型のＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株と高い配列相同性を共有する。他方、ＣＴ−ＰＣＶ−７株は、１型のＰＫ−１５−ＰＣＶ変株に非常に近いことが見出された。
【００６３】
したがって本発明の主題は、ＰＣＶから単離された核酸であって、その核酸は、配列番号１から配列番号７からなる群から選択された配列を含む。
【００６４】
本発明の他の主題は、ＰＣＶから単離された核酸であって、配列番号１から配列番号７からなる群から選択された配列と同一の配列を有する。
【００６５】
本発明の核酸配列は、生物試料中のＰＣＶ核酸の存在を検出するためのプローブまたはプライマーを設計するのに有用である可能性がある。そのようなプローブまたはプライマーは、より詳細にはオリゴヌクレオチドの形態であることができ、ストリンジェンシーの高い条件下でＰＣＶ核酸配列に特異的にハイブリダイズする。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも約２０の塩基を含み、配列番号１から配列番号７の２０個の連続塩基に見出される配列、またはそれらの相補鎖を有する。
【００６６】
１１種のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）配列が決定され、それを実施例の表２および４に示す。対応するポリペプチド配列も、図４から１４に示す。
【００６７】
したがって、本発明はさらに、その核酸が任意の配列番号１から配列番号７の配列の、任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１によってコードされたアミノ酸配列からなる群から選択された配列を有するシルコウイルス・ポリペプチドをコードする配列を含む、ＰＣＶ由来の核酸を提供する。より詳細には、本発明の核酸は、任意の配列番号１から配列番号７の配列の、任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１から選択された配列を含む。これらの中で、ＯＲＦ１、２、３、または４が特に興味深い。
【００６８】
本発明は、保存的配列、すなわち記載された配列、またはその配列によってエンコードされたポリペプチドの機能性または株特異性を変化しない配列を包含する。これらの配列はまた、「機能保存的変異体」とも呼ばれる。「配列保存的変異体」と呼ばれる、コードの縮重によって異なる配列も包含される。
【００６９】
本発明はさらに、ストリンジェンシーの高い条件下で上記の配列とハイブリダイズすることができ、かつ／または本発明の株と非常に高い相同性を有するという点において同等の配列を包含する。
【００７０】
任意のこれらの核酸配列を含むクローニング・ベクターも、本発明の一部である。そのようなベクターの調製は、当分野の技術者によく知られており、上述の定義に記載されている。
【００７１】
これらの核酸配列およびそのフラグメントは、適切な発現ベクターの助力によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの発現に有利に用いることができる。
【００７２】
これらのベクターは、より詳細には、発現制御配列と有効に結合した、任意の配列番号１から配列番号７の配列の任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１からなる群から選択された配列を含む。
【００７３】
本発明のベクターは、宿主細胞をトランスフェクトするために用いることができ、これも本発明の一部である。ベクターは当分野で知られている方法、たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション（リソーム融合）、遺伝子銃、またはＤＮＡベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入される（たとえばＷｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７、１９９２、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４、１９８８、Ｈａｒｔｍｕｔ等、カナダ特許出願第２０１２３１１号、１９９０年３月１５日出願を参照されたい）。
【００７４】
本発明はさらに、ＰＣＶタンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、シルコウイルス・タンパク質をコードする核酸の発現を生じる条件下で、上に定義したように発現ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞を培養することを含む。大腸菌、またはバキュロウイルスは、この目的のために用いることのできる発現系である（米国特許第４７４５０５１号）。コード配列は、バキュロウイルスゲノム（たとえば、ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ ＡｃＮＰＶ）に組み込むことができ、次いで後者を昆虫細胞、たとえばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９（寄託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）上で増殖できる。
【００７５】
より一般的には、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでのＰＣＶポリペプチドまたはタンパク質の発現を対象とする。これらの様々な目的に関して、当分野の技術者は、以下に記載する任意の適切な発現系を選択することができる。
【００７６】
発現系
多様な宿主／発現ベクターの組合せ（すなわち、発現系）を、本発明のポリペプチドの発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、たとえば、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなることができる。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体、および既知の細菌プラスミド、たとえば大腸菌プラスミドｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ等、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０、１９８８）、ｐＭＢ９およびその誘導体、プラスミド、たとえばＲＰ４など；グラム陽性ベクター、たとえばＳｔｒｅｐ．ｇａｒｄｏｎｉｉなど；ファージＤＮＡ、たとえばファージ１の多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３、および糸状１本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、たとえば２μプラスミドまたはその誘導体など；真核細胞に有用なベクター、たとえば昆虫または哺乳動物細胞に有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクター、たとえばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドなどが含まれる。
【００７７】
タンパク質またはポリペプチドの発現は、当分野で知られる任意のプロモータ／エンハンサ因子によって制御することができるが、これらの調節因子は、発現のために選択された宿主において機能性でなければならない。遺伝子発現を制御するために用いることのできるプロモータには、これに制限されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ、およびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’側長末端反復に含有されたプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７、１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼ・プロモータ（Ｗａｇｎｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５、１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２、１９８２）；原核生物発現ベクター、たとえばｂ−ラクタマーゼ・プロモータ（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１、１９７８）、またはｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５、１９８３）；さらに「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、２４２：７４−９４、１９８０を参照のこと；酵母または他の真菌のプロモータ因子、たとえばＧａｌ４プロモータ、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモータ、アルカリホスファターゼプロモータなど；造血組織特異性を示す制御部位、特に骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御部位（Ｍｏｇｒａｍ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０、１９８５、Ｋｏｌｌｉａｓ等、Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４、１９８６）、造血幹細胞分化因子プロモータ、エリトロポイエチン受容体プロモータ（Ｍａｏｕｃｈｅ等、Ｂｌｏｏｄ、１５：２５５７、１９９１）など、および粘膜上皮細胞特異性を示す制御部位が含まれる。
【００７８】
特にｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ、およびｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏワクチン接種に好ましいベクターは、ウイルス・ベクター、たとえばレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および望ましい細胞親和性を備えた他の組換えウイルスなどである。したがって、免疫原性ポリペプチドをエンコードするベクターは、ウイルス・ベクターを用いて、またはＤＮＡの直接導入によって、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで導入することができる。標的組織における発現は、ウイルス・ベクターまたは受容体リガンドなどを用いてトランスジェニック・ベクターを特定の細胞に向けることによって、または組織特異性プロモータを用いて、あるいはその両方によって実施することができる。標的遺伝子送達は、１９９５年１０月公開の国際特許公開ＷＯ９５／２８４９４に記載されている。
【００７９】
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの標的化およびワクチン接種手順に一般に用いられるウイルス・ベクターは、ＤＮＡをベースとするベクター、およびレトロウイルス・ベクターである。ウイルス・ベクターを構成する方法、および用いる方法は、当分野で知られている（Ｍｉｌｌｅｒ、およびＲｏｓｍａｎ、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７：９８０−９９０、１９９２を参照のこと）。好ましくは、ウイルス・ベクターは複製欠損であり、すなわち標的細胞において自律的に複製することができない。好ましくは、この複製欠損ウイルスは最小ウイルスであり、すなわちウイルス粒子を産生するためにゲノムを包膜するのに必要なゲノムの配列のみを保持している。
【００８０】
ＤＮＡウイルス・ベクターには、弱毒または欠損ＤＮＡウイルスが含まれ、たとえば、これに限定されるものではないが、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルスなどである。特定のベクターの例には、これに限定されるものではないが、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ等、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０、１９９１、国際特許公開ＷＯ９４／２１８０７、１９９４年９月２９日公開、国際特許公開ＷＯ９２／０５２６３、１９９４年４月２日公開）、弱毒アデノウイルス・ベクター、たとえばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ等によって記載されているベクターなど（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０、１９９２、さらにＬａ Ｓａｌｌｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０、１９９３を参照のこと）、および欠損アデノ関連性ウイルス・ベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１、１９８７、Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８、１９８９、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６、１９８８）が含まれる。
【００８１】
多数の会社が商業的にウイルス・ベクターを製造しており、これに限定されるものではないが、Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルス・ベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルス、およびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ、ＰＡ、アデノウイルス、およびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルス・ベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、アデノウイル・スベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルス・ベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルス・ベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ、英国、レンチウイルス・ベクター）、およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、フランス、アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルス・ベクター）が含まれる。
【００８２】
アデノウイルス・ベクター。アデノウイルスは、本発明の核酸を多様な細胞型に有効に送達するために修飾することのできる真核生物ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスの様々な血清型が存在する。これらの血清型において、本発明の範囲内で、２型または５型ヒト・アデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）、あるいは動物起源のアデノウイルス（ＷＯ９４／２６９１４参照）を用いることが好ましい。本発明の範囲内で用いることのできるそのような動物起源アデノウイルスには、イヌ、ウシ、マウス（例Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、鳥類、およびサル（例ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが含まれる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌ・アデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルスである（たとえば、Ｍａｎｈａｔｔａｎ、またはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣＶＲ−８００））。種々の複製欠損アデノウイルス、および最小アデノウイルス・ベクターが記載されている（ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８）。本発明による複製欠損組換えアデノウイルスは、当分野の技術者に知られている任意の技法で調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ等、Ｇｅｎｅ １０１：１９５、１９９１、ＥＰ１８５５７３、Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７、１９８４、Ｇｒａｈａｍ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９、１９７７）。組換えアデノウイルスは、標準的な分子生物学技法を用いて回収、および精製され、それらは当分野の技術者によく知られている。
【００８３】
アデノ関連性ウイルス。アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）は、安定な部位特異的な方式で、それらが感染する細胞のゲノムに組み込まれることのできる比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。アデノ関連性ウイルスは、細胞増殖、形態、または分化への影響を誘発することなく広範囲の細胞に感染することができ、ヒトの病理には関係していないと考えられる。ＡＡＶゲノムはクローン化され、配列決定され、特性付けされている。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を伝達するためにＡＡＶから誘導されたベクターを用いることが記載されている（ＷＯ９１／１８０８８、ＷＯ９３／０９２３９、ＵＳ４７９７３６８、ＵＳ５１３９９４１、ＥＰ４８８５２８を参照のこと）。本発明による複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）領域に脇を固められた対象となる核酸配列を含有するプラスミド、およびＡＡＶ包膜遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を有するプラスミドを、ヒト・ヘルパー・ウイルス（たとえば、アデノウイルス）に感染している細胞系に共トランスフェクションすることによって調製できる。その後、産生されたＡＡＶ組換え型を標準的な技法によって精製する。
【００８４】
レトロウイルス・ベクター。他の実施形態において、たとえば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、米国特許第５３９９３４６号、Ｍａｎｎ等、Ｃｅｌｌ ３３：１５３、１９８３、Ｔｅｍｉｎ他、米国特許第４６５０７６４号、Ｔｅｍｉｎ他、米国特許第４９８０２８９号、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０、１９８８、Ｔｅｍｉｎ他、米国特許第５１２４２６３号、ＥＰ４５３２４２、ＥＰ１７８２２０、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ等、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ他による１９９５年３月１６日公開の国際特許公開ＷＯ９５／０７３５８、およびＫｕｏ等、Ｂｌｏｏｄ ８２：８４５、１９９３に記載されているように、遺伝子をレトロウイルス・ベクターに導入することができる。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルスである。レトロウイルス・ゲノムは、２つのＬＴＲ、包膜配列、３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルス・ベクターにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は一般に、全体的または部分的に除去され、対象となる異種核酸配列と置き換えられる。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス、たとえばＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（マウスモロニー白血病ウイルス）、ＭＳＶ（マウスモロニー肉腫ウイルス）、ＨａＳＶ（ハーベイ肉腫ウイルス）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、およびフレンドウイルスなどから構成することができる。適切なパッケージング細胞系統は従来技術に記載されており、特に細胞系ＰＡ３１７（ＵＳ４８６１７１９）、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系（ＷＯ９０／０２８０６）、およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系（ＷＯ８９／０７１５０）である。さらに、組換えレトロウイルス・ベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＰ内の修飾、ならびにｇａｇ遺伝子の一部を含むことのできる延長包膜配列を含有することができる（Ｂｅｎｄｅｒ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１６３９、１９８７）。組換えレトロウイルス・ベクターは、当分野の技術者に知られている標準的な技法によって精製される。
【００８５】
レトロウイルス・ベクターはまた、ＤＮＡウイルスによって導入されることができ、それにより１サイクルのレトロウイルス複製が可能となり、トランスフェクション効率が増幅される（ＷＯ９５／２２６１７、ＷＯ９５／２６４１１、ＷＯ９６／３９０３６、ＷＯ９７／１９１８２を参照のこと）。
【００８６】
レンチウイルス・ベクター。他の実施形態において、脳、網膜、筋肉、肝臓、および血液を含むいくつかの組織型で、導入遺伝子を直接送達し、持続発現させるための因子としてレンチウイルス・ベクターを用いることができる。このベクターは、それらの組織において分裂および非分裂細胞を有効に形質導入し、対象となる遺伝子の長期発現を維持することができる。概説として、Ｎａｌｄｉｎｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９：４５７−６３、１９９８、さらにＺｕｆｆｅｒｅｙ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：９８７３−８０、１９９８を参照されたい。レンチウイルス・パッケージング細胞系は入手可能であり、当分野で一般に知られている。これらは、遺伝子治療のための高力価レンチウイルス・ベクターの産生を促進する。例としては、テトラサイクリン誘導ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ・レンチウイルス・パッケージング細胞系であり、これは少なくとも３から４日間、１０６ＩＵ／ｍｌを超える力価でウイルス粒子を産生することができる（Ｋａｆｒｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：５７６−５８４、１９９９）。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで非分裂細胞を有効に形質導入するための必要に応じて、誘導細胞系によって産生されたベクターを濃縮することができる。
【００８７】
非ウイルス・ベクター。他の実施形態において、ベクターは、ｎａｋｅｄ ＤＮＡとしてリポフェクションによって、または他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）を用いてｉｎ ｖｉｖｏで導入することができる。マーカをエンコードする遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのリポソームを調製するために、合成カチオン脂質を用いることができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７、１９８７、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８、１９８９、Ｍａｃｋｅｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１、１９８８参照、Ｕｌｍｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８、１９９３）。核酸を伝達するのに有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３、およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国特許第５４５９１２７号に記載されている。脂質は、標的化のために他の分子と化学的に結合することができる（上記のＭａｃｋｅｙ等を参照のこと）。標的化ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、たとえば抗体、または非ペプチド分子などは、化学的にリポソームと結合することができる。
【００８８】
他の分子も、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用であり、たとえばカチオンオリゴペプチド（たとえば、国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質から誘導されたペプチド（たとえば、国際特許公開ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオンポリマー（たとえば、国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）などである。
【００８９】
さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでｎａｋｅｄ ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子治療に用いるｎａｋｅｄ ＤＮＡベクターは、当分野で知られている方法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用（弾道トランスフェクション）、またはＤＮＡベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入することができる（たとえばＷｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７、１９９２、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４、１９８８、Ｈａｒｔｍｕｔ等、カナダ特許出願第２０１２３１１号、１９９０年３月１５日出願、Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０、１９９１を参照されたい）。受容体媒介ＤＮＡ送達法も用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４、１９９２、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２、１９８７）。米国特許第５５８０８５９号および第５５８９４６６号は、トランスフェクション促進剤を含まない外因性ＤＮＡ配列の哺乳動物における送達を開示している。最近、比較的低電圧で効率の高い、電気伝達と呼ばれるｉｎ ｖｉｖｏのＤＮＡ伝達技法が記載された（Ｍｉｒ等、Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３２１：８９３、１９９８、ＷＯ９９／０１１５７、ＷＯ９９／０１１５８、ＷＯ９９／０１１７５）。
【００９０】
ＰＣＶポリペプチドの精製
そのようにして産生されたポリペプチドは回収し、好ましくは精製することができる。精製方法は当分野でよく知られている。精製方法には、これに限定されるものではないが、分取ディスク・ゲル電気泳動および等電点電気泳動；アフィニティ、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過またはサイズ排除、イオン交換、および分配クロマトグラフィ；沈降および塩析クロマトグラフィ；抽出、および向流分配が含まれる。目的によっては、タンパク質が精製を促進する追加の配列標識を含有するような組換え系でポリペプチドを生成することが好ましく、これに限定されるものではないが、たとえばポリヒスチジン配列、またはＦＬＡＧおよびＧＳＴなどの抗体と特異的に結合する配列などである。次いでこのポリペプチドを、適切な固相マトリクスのクロマトグラフィによって、宿主細胞の粗溶解産物から精製することができる。別法として、タンパク質に対して、またはそれから誘導されたペプチドに対して産生された抗体を、精製試薬として用いることができる。
【００９１】
抗ＰＣＶ抗体
そのような抗体には、これに限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリが含まれる。
【００９２】
ＰＣＶポリペプチド、あるいはその誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体を産生するために、当分野で知られる様々な手順を用いることができる。抗体の産生のために、抗原性ポリペプチドを注入することによって種々の動物を免疫化することができ、これに限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。好ましくは、免疫化動物は、抗体に対するアレルギー反応を回避するために、受動免疫法においてその抗体を受容する動物と同一の種である。
【００９３】
ＰＣＶポリペプチドに対するモノクローナル抗体を調製するために、培養において連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いることができる。これらの技法には、これに限定されるものではないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に開発されたハイブリドーマ技法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５）、ならびにトリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２、１９８３、Ｃｏｔｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−２０３０、１９８３）、およびヒト・モノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７−９６頁、１９８５）が含まれる。本発明のさらなる実施形態では、モノクローナル抗体は、無菌動物において産生することができる（国際特許公開ＷＯ８９／１２６９０、１９８９年１２月２８日公開）。
【００９４】
本発明によれば、単鎖抗体を産生するために記載された技法（Ｈｕｓｔｏｎの米国特許第５４７６７８６号および第５１３２４０５号、米国特許第４９４６７７８号）を、ＰＣＶポリペプチド特異単鎖抗体を産生するために適合させることができる。さらに、これらの遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏでの発現のために送達することができる。本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリを構成するために記載された技法（Ｈｕｓｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１、１９８９）を用い、ＰＣＶポリペプチド、あるいはその誘導体または類似体に対する所望の特異性を備えたモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能にする。
【００９５】
抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、知られている技法によって産生することができる。たとえば、そのようなフラグメントには、これに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生することのできるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって産生することのできるＦａｂ’フラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって産生できるＦａｂフラグメントが含まれる。
【００９６】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野で知られている技法によって達成することができ、たとえばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ（たとえば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（たとえば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどである。一実施形態において、抗体結合は、１次抗体における標識を検出することにより検出することができる。他の実施形態において１次抗体は２次抗体または試薬の１次抗体との結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、２次抗体は標識される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当分野で知られており、それらは本発明の範囲内である。
【００９７】
ＰＣＶのｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養
本発明はさらに、ブタ・シルコウイルス株を培養する方法に関し、その方法は、配列番号１から配列番号６からなる群から選択された配列を含む核酸を、配列番号１から配列番号６からなる群から選択された配列を含むゲノムを有するブタ・シルコウイルス粒子の産生をもたらす条件下で、適切な宿主細胞に導入することを含む。
【００９８】
任意の型の非感染細胞、好ましくはブタ細胞（たとえば、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、またはＴａｙａｓｓｕ ｔａｊａｃｕ由来の細胞）、より好ましくは神経誘導ブタ細胞（たとえば、グリア細胞）、ブタ腎細胞（たとえば、ＰＫ−１５細胞）、またはブタ・マクロファージ細胞は、本発明のＰＣＶ核酸（たとえば、１本鎖、好ましくは２本鎖ゲノムＤＮＡ、あるいはＰＣＶゲノムＤＮＡを含む１つまたは複数のプラスミド）を細胞に導入することによって感染させることができる。宿主細胞系の感染またはトランスフェクションは、当分野で一般に知られている技法であり、当分野の技術を有する任意の実施者によって行うことができる。たとえば、実施例１は、ＰＣＶＤＮＡを用いてＰＫ−１５細胞をトランスフェクトする手順を含む（クローン化ＰＣＶＤＮＡのトランスフェクションおよびＰＣＶの検出を参照されたい）。
【００９９】
感染後、感染細胞系の１つまたは複数のクローンを選択し、増殖させることができる。選択されたクローンの細胞を貯蔵（たとえば、凍結）し、マスター細胞バンクとして用いることができ、そこから試料を取り、複数の使用細胞系を産生するために用いることができる。ワクチンの生成のために用いられ、かつウイルスタンパク質源として用いられるウイルス粒子は、この使用細胞系から得ることができる。詳細には、使用細胞系は、凍結マスター細胞系の試料を融解し、培養においてその細胞を増殖することによって産生することができ、その増殖細胞培養の細胞を使用細胞系として用いる。たとえば、マスター細胞系を融解し、多量の細胞を産生するために、Ｎｕｎｃ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）で増殖することができる。
【０１００】
ウイルス粒子は、当分野の技術者に一般に知られている方法によって、使用細胞系から得ることができる。たとえば、使用細胞系の培養上澄み中のウイルス粒子を採取し、濾過し、精製して（たとえば、勾配遠心分離によって）、ワクチン生成に用いることができる。
【０１０１】
先天性振せんの診断
ブタ・シルコウイルスと先天性振せん（ＣＴ）とが関連するという証拠によって、本発明者等は、ブタまたはその子孫における先天性振せん（ＣＴ）の病因を診断する方法を提供することができ、その方法は、そのブタがブタ・シルコウイルスに感染しているかどうかを判別することを含む。
【０１０２】
本明細書では、「診断」という用語は、進行の任意の病期にある疾患の同定を指し、さらに胎児または新生子ブタがその疾患を発現する素因、または雌ブタが胎児にその疾患を伝染する素因を判別することを含む。
【０１０３】
本発明の診断方法は、１型または２型の任意のＰＣＶ株を検出することを含むことができる。２種の型間のＰＣＶ株の再分配を図３に示す。１型のＰＣＶ株には、より詳細には、ＰＫ−１５ＰＣＶ、または配列番号７の核酸配列を含むいわゆる「ＣＴ−ＰＣＶ−７」株が含まれる。２型のＰＣＶ株には、より詳細には、配列番号１から配列番号６の任意の核酸配列を含む株が含まれる。ＰＭＷＳに関連するＰＣＶ株（ＰＭＷＳ−ＰＣＶ）も、この標的ＰＣＶ株に含まれる。
【０１０４】
本発明の診断方法は、たとえば国際出願ＷＯ９９／１８２１４に概説されているとおり、当分野の技術者によく知られている標準的な技法で実施することができる。
【０１０５】
第１の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のＰＣＶ核酸の存在を検出することを包含できる。
【０１０６】
第２の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のＰＣＶポリペプチドの存在を検出することを包含できる。
【０１０７】
第３の実施形態において、感染の判別は、試験ブタの生物試料中のＰＣＶポリペプチドに対する抗体の存在を検出することによって行うことができる。
【０１０８】
生物試料は任意の種類であることができ、流体試料（血液、血漿、血清、脳脊髄液など）、あるいは器官または組織試料（神経節、肝臓など）を含む。より詳細には死後診断のために、中枢神経系から得た細胞または細胞抽出物を用いることができる。
【０１０９】
しかしながら、好ましい試験試料および方法は、農場において獣医師または動物飼育者によって容易に実施できるものである。したがって、ウエスタンブロット、免疫蛍光検査法、ＥＬＩＳＡ、または免疫クロマトグラフィは、これらの応用例に非常によく適合する。
【０１１０】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、本発明のポリペプチド、またはそのエピトープ・フラグメントを、選択された表面上、たとえばポリスチレンのマイクロタイタ・プレートのウェルなどタンパク質を結合することのできる表面上に固定する。不完全に吸着されたポリペプチドを洗浄によって除去した後、試験試料に対して抗原性が中性であることが知られているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液などの非特異タンパク質を、選択された表面に結合することができる。これによって固定化表面の非特異吸着部位が遮断され、したがって抗血清の表面への非特異結合によって起こるバックグラウンドが低減される。次いで固定化表面を、免疫複合体（抗原／抗体）が形成されるようなやり方で、試験される臨床材料または生物材料などの試料と接触させる。これには、試料を、ＢＳＡ溶液、ウシ・ガンマグロブリン（ＢＧＧ）、および／またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの希釈剤で希釈することを含むことができる。その後、２から４時間、約２５℃から３７℃程度の温度で、試料をインキュベートする。インキュベーションに続いて、試料に接触した表面を洗浄して、非免疫複合体化材料を除去する。洗浄手順には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、またはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することを含むことができる。試験試料と結合ポリペプチドとの間の特異的免疫複合体の形成、その後の洗浄に続いて、第１の抗体に対して特異性を有する第２の抗体にその免疫複合体を供することによって、免疫複合体形成の発生を判別し、さらにはその量まで求めることができる。検出手段を提供するために、第２の抗体は、たとえば適切な色素形成基質と共にインキュベートすることによって発色を生じる酵素活性など、関連した活性を有することができる。次いで、たとえば可視スペクトル分光計を用いて発色の程度を測定することによって、定量化を行うことができる。
【０１１１】
免疫クロマトグラフィ技法に関して、当分野の技術者は、Ｆ．Ｚｕｒｋ等のＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３１／７、１１４１−１１５０（１９８５）、ならびに特許および特許出願ＷＯ８８／０８５３４、ＷＯ９１／１２５２８、ＥＰ２９１１７６、ＥＰ２９９４２８、ＥＰ２９１１９４、ＥＰ２８４２３２、ＵＳ５１２０６４３、ＵＳ５０３０５５８、ＵＳ５２６６４９７、ＵＳ４７４０４６８、ＵＳ５２６６４９７、ＵＳ４８５５２４０、ＵＳ５４５１５０４、ＵＳ５１４１８５０、ＵＳ５２３２８３５、ＵＳ５２３８６５２に詳細な情報を見出すことができる。
【０１１２】
別法には、生物試料中のＰＣＶ核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチドなどの核酸配列を用いることが含まれる。
【０１１３】
この目的のために、当分野の技術者は、溶液ハイブリダイゼーションにおいて、および固相法を用いる実施形態において、ハイブリダイゼーション・プローブを用いることができる。固相法を含む実施形態において、選択されたマトリクスまたは表面に試料を吸着させるか、あるいは付着させる。次いで、固定１本鎖核酸を、選択されたプローブと共に特異ハイブリダイゼーションに供する。
【０１１４】
他の実施形態において、当分野の技術者は、生物試料に潜在的に存在する標的ＰＣＶ核酸を特異的に増幅するために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの増幅技法において、オリゴヌクレオチド・プライマーを用いることができる。そのようなプライマーの例を、実施例１の表１に示す。
【０１１５】
先天性振せんの予防および治療
本発明は、先天性振せんを予防または治療するための、ワクチン接種、または受動免疫化を企図する。本発明の抗原性または免疫原性組成物は、ブタ・シルコウイルスによる感染からブタまたはその子孫を防御するために、広く適用可能である。本明細書では、「防御する」という用語は、ＰＣＶ感染および先天性振せんの治療または予防を意味する。したがって、この種の感染に対して感受性である任意の動物にワクチン接種することができる。ブタは任意の年齢で治療することができ、新生子ブタを含む。雌ブタの治療は、胎児を防御するために特に有用である。
【０１１６】
本発明は、より詳細には、シルコウイルス抗原、獣医学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤、さらに通例は獣医学的に許容されるアジュバントを含む抗原性または免疫原性組成物に関する。
【０１１７】
免疫原性組成物は、免疫応答を誘導し、その必要はないが防御的であり得る。ワクチン組成物は、防御反応を誘導する。したがって、「免疫原性組成物」という用語は、ワクチン組成物を含む（前者は防御的組成物であり得る）。
【０１１８】
本発明の主題はさらに、先天性振せんに対する免疫化またはワクチン接種の方法であって、ブタ・シルコウイルスに対する免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む。この免疫化またはワクチン接種の方法は、特に以下に定義されるワクチンを用いる。
【０１１９】
したがって本発明の主題は、先天性振せん（ＣＴ）に対する抗原性製剤であり、少なくとも１種のブタ・シルコウイルス（ＰＣＶ）抗原を含む。この抗原は、弱毒化生全ＰＣＶ、不活性化全ＰＣＶ、サブユニット抗原、組換え生ベクター、またはＤＮＡベクターからなることができる。
【０１２０】
全ＰＣＶワクチン
本発明の主題は、単離ブタ・シルコウイルス株であり、配列番号１から配列番号７の任意の配列の、任意のＯＲＦ１からＯＲＦ１１からなる群から選択された核酸配列を含むゲノムを有する。これらの配列を承知する当分野の技術者は、ビリオンの精製製剤を得ることができる。
【０１２１】
これらのウイルスは、先天性振せんに対してブタにワクチン接種するための抗原性組成物に用いることができる。この目的のために、以下に記載するとおり、当分野の技術者によく知られている標準的な技法によって、ウイルス粒子を弱毒化、不活性化、または不活化することができる。
【０１２２】
シルコウイルス抗原性製剤を生成するために、細胞、特に細胞系、たとえばＰＫ／１５細胞における継代後、シルコウイルスを得ることができる。場合によって標準的な技法で精製した、培養上澄みまたは抽出物を抗原性製剤として用いることができる。
【０１２３】
弱毒化抗原性製剤、および弱毒化免疫原性組成物またはワクチンというコンテクストにおいて、弱毒化は、慣例的な方法によって行うことができ、たとえば細胞での継代、好ましくはブタ細胞での継代、ＰＫ／１５など、特に細胞系での継代による（たとえば継代５０から１５０、特に１００程度）。これらの免疫原性組成物およびワクチンは一般に、獣医学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤、場合によってはさらに獣医学的に許容されるアジュバント、ならびに場合によっては凍結乾燥安定剤を含む。
【０１２４】
これらの抗原性製剤、免疫原性組成物、およびワクチンは、好ましくは、ＴＣＩＤ５０ １０３から１０７の対象弱毒化ウイルスを含むことになる。
【０１２５】
それらは、不活性化全抗原をベースとする抗原性製剤、免疫原性組成物およびワクチンであることができる。不活性化免疫原性組成物およびワクチンはさらに、獣医学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤、場合によってはさらに獣医学的に許容されるアジュバントを含む。
【０１２６】
本発明によるシルコウイルスは、存在する可能性のある分画と共に、当分野の技術者に知られている技法によって不活性化される。不活性化は、好ましくは、化学的経路によって、たとえばホルムアルデヒド（ホルマリン）、パラホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、またはエチレンイミン、あるいはその誘導体などの化学薬剤に抗原を暴露することによって行われる。本発明において不活性化の好ましい方法は、化学薬剤、特にエチレンイミン、またはβ−プロピオラクトンへの暴露であろう。
【０１２７】
抗原性製剤、免疫原性組成物、およびワクチンは、好ましくは、ＴＣＩＤ５０が１０５から１０８の当該不活性化全ウイルスを含むことになる。
【０１２８】
好ましくは、本発明による弱毒化または不活性化抗原性製剤、ならびに弱毒化または不活性化免疫原性組成物およびワクチンにはアジュバントが補足され、有利には、当分野の技術者によく知られる技法に従って、エマルジョン、たとえば油中水型、または水中油型の形態で提供される。有効成分に慣例的なアジュバント化合物を組み込むことで、アジュバントの特性を得ることも可能である。
【０１２９】
用いることのできるアジュバントのなかで、例として挙げることができるのは、水酸化アルミニウム、サポニン（たとえば、ＱｕｉｌｌａｊａサポニンまたはＱｕｉｌＡ、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆ．Ｐｏｗｅｌ、Ｍａｒｋ Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｌｏｎｄｏｎ、２１０頁を参照のこと）、Ａｖｒｉｄｉｎｅ．ＲＴＭ．（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ １４８頁）、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ １５７頁）、ポリホスファゼン（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ ２０４頁）、あるいは鉱油をベースとする水中油型エマルジョン、スクアレン（たとえば、ＳＰＴエマルジョン、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ １４７頁）、スクアレン（たとえば、ＭＦ５９、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ １８３頁）、または代謝可能な油をベースとする油中水型エマルジョン（好ましくはＷＯ９４／２００７１による）、ならびに米国特許第５４２２１０９号に記載のエマルジョンである。アジュバントの組合せ、たとえばエマルジョンと組み合わせたＡｖｒｉｄｉｎｅ．ＲＴＭ．またはＤＤＡを選択することも可能である。
【０１３０】
凍結乾燥安定剤として、例として挙げることができるのは、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９、５０９、９５０）、炭水化物、たとえばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、またはグルコースなど、タンパク質、たとえばアルブミン、またはカゼインなど、これらの化合物の誘導体、または緩衝剤、たとえばアルカリ金属リン酸塩などである。
【０１３１】
サブユニットおよびベクター・ワクチン
本明細書では、「サブユニット抗原」という用語は、抗原性ＰＣＶポリペプチド、またはその抗原性フラグメントを指す。「サブユニットまたはポリペプチド・ワクチン」という用語は、免疫原性ポリペプチド、および通例はアジュバントを含むワクチンを指す。
【０１３２】
「ベクター・ワクチン」は、「組換え生ベクター」、または「ＤＮＡベクター」を含む。
【０１３３】
本明細書では、「組換え生ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏワクチン接種のための抗原性または免疫原性ポリペプチドを発現するために用いられるベクターを指す。好ましいベクターは、ＤＮＡをベースとするベクター、およびレトロウイルス・ベクターなどのウイルス・ベクターである。適切な生ベクターとして、好ましく用いることができるのは、当分野の技術者によく知られている技法に従って、好ましくはブタにおいて増殖することができ、ブタに対して非病原性の（天然に非病原性であるか、あるいはそのようにされた）生ウイルスである。特に用いることができるのは、パルボウイルス（ＵＳ６２１７８８３）、ブタ・ヘルペスウイルス、たとえばアウエスキー病ウイルスなど、ブタ・アデノウイルス、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、トリ・ポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ブタ痘ウイルスである。ＤＮＡベクターも、ベクターとして用いることができる（ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９３／１９８１３、ＷＯ９４／２１７９７、ＷＯ９５／２０６６０）。一般に、ベクターはｉｎ ｖｉｖｏで投与されるが、適切な抗原呈示細胞、たとえば樹状細胞などのｅｘ ｖｉｖｏ形質導入、その形質導入細胞のｉｎ ｖｉｖｏ投与も企図される。
【０１３４】
他の実施形態において、ベクターは、ｎａｋｅｄ ＤＮＡとして、または他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）と共にリポフェクションによってｉｎ ｖｉｖｏで導入されることのできるＤＮＡ分子の形態であることができる。この実施形態は、本明細書において「ＤＮＡベクター」技術と呼ばれる。ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのためのリポソームを調製するために、合成カチオン脂質を用いることができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７、１９８７、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８、１９８９、Ｍａｃｋｅｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１、１９８８参照、Ｕｌｍｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８、１９９３）。核酸の伝達に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３、およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国特許第５４５９１２７号に記載されている。脂質は、標的化のために他の分子と化学的に結合することができる（上記のＭａｃｋｅｙ等を参照のこと）。標的ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、たとえば抗体、または非ペプチド分子などは、化学的にリポソームと結合することができる。他の分子も、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用であり、たとえばカチオンオリゴペプチド（たとえば、国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質から誘導されたペプチド（たとえば、国際特許公開ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオンポリマー（たとえば、国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）などである。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでｎａｋｅｄ ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子治療に用いるｎａｋｅｄ ＤＮＡベクターは、当分野で知られている方法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用（弾道トランスフェクション）、またはＤＮＡベクター・トランスポータの使用によって所望の宿主細胞に導入することができる（たとえばＷｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７、１９９２、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４、１９８８、Ｈａｒｔｍｕｔ等、カナダ特許出願第２０１２３１１号、１９９０年３月１５日出願、Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０、１９９１を参照されたい）。受容体媒介ＤＮＡ送達法も用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４、１９９２、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２、１９８７）。米国特許第５５８０８５９号および第５５８９４６６号は、トランスフェクション促進剤を含まない外因性ＤＮＡ配列の哺乳動物における送達を開示している。最近、比較的低電圧で効率の高い、電気伝達と呼ばれるｉｎ ｖｉｖｏのＤＮＡ伝達技法が記載された（Ｍｉｒ等、Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３２１：８９１、１９９８、ＷＯ９９／０１１５７、ＷＯ９９／０１１５８、ＷＯ９９／０１１７５）。
【０１３５】
ワクチン接種方法
先天性振せんに対して対象にワクチン接種するために、種々の方法を用いることができる。ポリペプチド・ワクチン製剤は、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、真皮下（ｓ．ｄ．）、真皮内（ｉ．ｄ．）によって、または抗原呈示細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ投与、それに続く細胞の対象への投与によって送達することができる。
【０１３６】
同様に、たとえば遺伝子銃または直接注入などによる、ｎａｋｅｄ ＤＮＡおよびＲＮＡ送達など、上に記載した任意の遺伝子送達方法を、対象にベクター・ワクチンを投与するために用いることができる。
【０１３７】
ワクチン接種の有効性は、免疫刺激分子、たとえば免疫刺激または免疫増強活性サイトカイン、リンホカイン、またはケモカインを、そのワクチン、特にベクター・ワクチンと併用投与することによって増強することができる。たとえば、サイトカインまたはサイトカイン遺伝子、たとえばインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、マクロファージ炎症因子など、ならびにいくつかの主要共刺激分子またはその遺伝子（たとえば、Ｂ７．１、Ｂ７．２）を用いることができる。
【０１３８】
粘膜ワクチン接種。感染は多くの場合粘膜を経て起こるので、粘膜ワクチン方法は多くの病原性細菌に関して特に有効である。したがって、ポリペプチド、およびＤＮＡワクチンの両方に関して粘膜ワクチン接種方法が企図される。粘膜はワクチンの局所送達によって標的とされることができる一方、種々の方法が免疫原性タンパク質を粘膜に送達するために用いられてきた（これらの方法には、たとえばベクター標的タンパク質として特定の粘膜標的タンパク質を用いることによって、または粘膜標的タンパク質との混合剤でワクチン・ベクターを送達することによってＤＮＡワクチンを送達することも含む）。
【０１３９】
たとえば特定の実施形態において、免疫原性ポリペプチドまたはベクター・ワクチンを、コレラ毒素Ｂ、またはコレラ毒素Ａ／Ｂキメラなどのコレラ毒素との混合剤で、あるいはコレラ毒素との複合体またはキメラｆｕｓｔｉｏｎタンパク質として、投与することができる（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ等、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：４３２２−３２、１９９５、ＪｏｂｌｉｎｇおよびＨｏｌｍｅｓ、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６０：４９１５−２４、１９９２）。コレラ毒素Ｂサブユニットの使用に基づく粘膜ワクチンは、これまでに記載されている（ＬｅｂｅｎｓおよびＨｏｌｍｇｒｅｎ、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ８２：２１５−２７、１９９４）。他の実施形態において、易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）との混合剤を、粘膜ワクチン接種のために調製することができる。
【０１４０】
他の粘膜免疫化方法には、免疫原をマイクロカプセルに被包すること（米国特許第５０７５１０９号、第５８２０８８３号、および第５８５３７６３号）、および免疫増強活性膜様担体を用いること（ＷＯ９８／０５５８）が含まれる。経口投与された免疫原の免疫原性は、赤血球（ｒｂｃ）、またはｒｂｃゴーストを用いることによって（米国特許第５６４３５７７号）、またはブルータング抗原を用いることによって（米国特許第５６９０９３８号）増強することができる。標的化免疫原の全身投与も、粘膜免疫化をもたらすことができる（米国特許第５５１８７２５号を参照）。
【０１４１】
粘膜組織での発現のために遺伝子を送達するために、キメラ・ライノウイルス（米国特許第５７１４３７４号）、アデノウイルスの使用、または核酸の特異標的化（ＷＯ９７／０５２６７）など、種々の方法を用いることができる。
【０１４２】
受動免疫化
上に記載した能動免疫化ワクチン接種方法に加えて、本発明はさらに、好ましくはＰＣＶ抗原に対して産生されたＰＣＶ抗原反応性抗体による受動免疫化を企図する。受動免疫化は、宿主の免疫機構が応答できる以前の初期感染または確立感染に対して特に有効である。
【０１４３】
受動免疫化に用いる抗体源の１つは、感染宿主と同一種の罹患動物の回復期血清から得られる。したがって、たとえば、好ましくはＰＣＶポリペプチドに対する親和精製によってブタ血清から抗体を単離し、新しく感染したブタを受動的に免疫化するために用いることができる。
【０１４４】
別法として、抗体を免疫原性ポリペプチドに対して産生することができ、すなわちワクチン方法を、受動免疫化の抗体を産生するためにも用いることができる。
【０１４５】
本発明の抗ＰＣＶ抗体は、交叉反応性であることができ、たとえば種々のＰＣＶ株を認識することができる。ポリクローナル抗体は、交叉反応性である可能性が高い。
【０１４６】
先天性振せんに対する防御免疫のイムノアッセイ
他の実施形態において、本発明の免疫原性ポリペプチドは、ブタの先天性振せんに対する防御抗体を検出するためのイムノアッセイに用いることができる。本発明の発見に基づいて、高力価のＰＣＶ抗原との（特異的な）抗体反応性は、その個体がＰＣＶによる感染から、したがって先天性振せんから防御されている可能性を示す。ＰＣＶ抗原との低い、または検出されない抗体反応性は、その個体が感染から防御されていない可能性を示す。
【０１４７】
本発明のイムノアッセイは、たとえば回復期血清など、ＰＣＶ感染に暴露された対象において抗体レベルを検出するために用いることができる。このイムノアッセイはさらに、未知の状態の対象において抗体を検出するために用いることもできる。そのような対象の高レベルの抗体力価は、ＰＣＶへの事前暴露、および防御免疫性の可能性を示す。最後に、このイムノアッセイは、本発明のワクチンの有効性を評価するために用いることができる。
【０１４８】
上述の任意のイムノアッセイ方式を、本発明のイムノアッセイに用いることができる。好ましくは、ＰＣＶポリペプチドを固相に吸着させ、血清（好ましくは段階希釈中）を固相に接触させ、たとえば血清中の抗体に特異的な標識抗体を用いて抗体結合を検出するＥＬＩＳＡアッセイを用いる。別法として、血清試料中の抗ＰＣＶ抗体が、たとえば上述のとおり調製されたＰＣＶポリペプチドに特異的な標識抗体に対して固相ポリペプチドへの結合を競合する、競合ＥＬＩＳＡ方式を用いることができる。さらなる別法においては、ポリペプチドを標識し、そのポリペプチドに特異的な抗体を、固相支持体に吸着させる。生物試料（たとえば、血清）中に抗体が存在すると、ポリペプチドに対する競合が生じ、標識の吸着抗体への結合を妨げることになる。さらに、以下に記載する都合のよいクロマトグラフィ・イムノアッセイ方式を用いることができる。
【０１４９】
ここに記載したイムノアッセイは、血清における抗ＰＣＶ抗体の存在を試験することに関しているが、抗体を提供する任意の生物試料を試験することができ、これらに限定することなく、血液、血清、血漿、組織試料、リンパ、粘膜分泌物、痰、滑液、および他の炎症性流体などが含まれる。
【０１５０】
キット
イムノアッセイを実施するための構成要素は、都合よくキット形態で提供することができる。もっとも基本的な実施形態において、本発明のキットは、ＰＣＶポリペプチド、および試験される対象の抗体に特異的な標識抗体などの抗体検出剤を提供する。それぞれの量を予め測定して、規定数のアッセイを提供することができる。
【０１５１】
さらなる実施形態において、このキットは、プレートなどの、好ましくはプラスチック、またはタンパク質の非特異結合を回避するように処理された材料のアッセイ容器を含む。本明細書では、容器という用語はもっとも広範な意味を有し、すなわち材料または試薬を保持するための任意の入れ物である。この容器は、ガラス、プラスチック、セラミック、金属などから製造することができる。
【０１５２】
さらなる実施形態において、このキットは、ＰＣＶポリペプチド、またはＰＣＶポリペプチドに特異的な抗体いずれか１種の試薬が不可逆的に結合した、免疫クロマトグラフィ膜または支持体を含む。免疫クロマトグラフィ・アッセイに関して当分野で知られている多くの方法および装置を、本発明において用いることができる。上述のとおり、免疫クロマトグラフィ・アッセイは、実験室の機器が利用できない野外条件下で特に有用である。そのようなアッセイの例は、米国特許第５２４８６１９号、第５４５１５０４号、第５５００３７５号、第５６２４８０９号、および第５６５８８０１号に記載されている。
【０１５３】
本発明のキットは、好ましくは、包装、および、たとえば包装上の、または包装に挿入された使用説明書を含む。
【０１５４】
複合法
複合免疫化またはワクチン接種プログラムに関して、ブタ・シルコウイルスに対する免疫化またはワクチン接種を、他のブタ病原体、特にＰＭＷＳ症候群に関連する病原体に対する免疫化またはワクチン接種と組み合わせることも可能である。したがって、本発明による免疫原性組成物またはワクチンは、パルボウイルス（ＵＳ６２１７８８３）から、ＰＲＲＳ（ブタ繁殖呼吸障害症候群）、および／またはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、および／または大腸菌、および／または萎縮性鼻炎、および／または仮性狂犬病（アウエスキー病）ウイルス、および／またはブタ・インフルエンザ、および／またはアクチノバチルス胸膜肺炎、および／またはブタ・コレラ、およびそれらの組合せから選択された別のブタ病原体に対応する別の価を含むことができる。好ましくは、本発明による免疫化またはワクチン接種プログラム、およびワクチンは、シルコウイルスに対する免疫化またはワクチン接種と、ＰＲＲＳ（ＷＯ９３／０７８９８、ＷＯ９４／１８３１１、ＦＲ−Ａ−２７０９９６６、Ｃ．Ｃｈａｒｒｅｙｒｅ等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １５．ｓｕｐ．ｔｈ．ＩＰＶＳ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ、７月５−９、１９９８、１３９頁）、および／またはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＰ−Ａ−５９７８５２、ＥＰ−Ａ−５５０４７７、ＥＰ−Ａ５７１６４８、Ｏ．Ｍａｒｔｉｎｏｎ等、１５７、２８４、２８５頁、およびＧ．Ｒｅｙｎａｕｄ等、１５０頁、すべてＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １５．ｓｕｐ．ｔｈ．ＩＰＶＳ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ）、および／またはブタ・インフルエンザと組み合わせられる。したがって、本明細書に記載のとおり、ブタ・シルコウイルスに対する免疫原性組成物またはワクチンと組み合わせるために、任意の適切な形態の免疫原性組成物またはワクチン、特に任意の市販のワクチンを用いることが可能である。
【０１５５】
したがって、本発明の主題はさらに、多価免疫原性組成物およびワクチン、多ワクチンキット、およびそのような複合免疫化またはワクチン接種プログラムの使用を可能にする複合免疫化またはワクチン接種方法である。
【０１５６】
本発明は以下の実施例を参照することによってよりよく理解されるであろうが、実施例は例示のために示されるものであって、本発明を限定するものではない。
【０１５７】
【実施例】
実施例Ｉ：ブタの先天性振せんに関連するブタ・シルコウイルスの配列分析
方法
ＰＣＶ感染組織試料および細胞系：ＰＣＶに感染したブタを、米国インディアナ州の農場から得た。ブタは最初に、ＰＭＷＳまたはＣＴいずれかの徴候によって、続いて組織切片の顕微鏡検査によって識別した。組織中のＰＣＶの存在は、さらにＰＣＶ特異オリゴヌクレオチド・プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＶに対する抗血清を用いる間接蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）、およびＰＣＶに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって確認した。ＰＭＷＳの徴候を示すブタから採取した４種のＰＣＶ単離株は、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ２、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ３、およびＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ４と命名した。ＣＴの徴候を示すブタから採取した２種のＰＣＶ単離株は、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ６と命名した。
【０１５８】
歴史上重要なＰＣＶ単離株を単離するために、ＰＣＶ混入細胞系（ＰＣＮＳ）を、ＣＴの徴候を示すブタの脳から誘導した。妊娠した雌ブタに、ＣＴブタ腎細胞から得た細胞培養上澄みを実験的に接種した（ＧｕｓｔａｆｓｏｎおよびＫａｎｉｔｚ、１９７４）。ＰＣＮＳ細胞を、１０％ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅＩＩＩ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．）を含有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．］中で増殖した。細胞を採取し、ＰＣＶ特異オリゴヌクレオチド・プローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、電子顕微鏡検査（ＥＭ）、およびＰＣＶ特異プライマーを用いるＰＣＲによって、ＰＣＶに関して試験した。このＰＣＶ単離株は、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７と命名した。
【０１５９】
ＤＮＡ単離およびＰＣＲ：細胞が培地で浮動を開始したときに、ＥＭＥＭで増殖させたＰＣＮＳ細胞を採取した。細胞ペレットを、ＳＤＳプロナーゼ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５％のＳＤＳ中プロナーゼ５００μｇ／ｍｌ）で溶解し、一晩３７℃でインキュベートした。全細胞ＤＮＡを、フェノールの抽出、続いてエタノールの沈殿によって単離した。
【０１６０】
ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ６のリンパ節、ならびにＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５の肝臓を、ティシュマイザ（ｔｉｓｓｕｍｉｚｅｒ）を用い、続いて音波破砕機を用いる音波破砕によってＥＭＥＭ中で均質化した。組織ホモジネートを、等量のＳＤＳ−プロナーゼ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＥＤＴＡ、および１％のＳＤＳ中プロナーゼ１ｍｇ／ｍｌ）と共に、一晩３７℃でインキュベートした。フェノール抽出、およびエタノール沈殿によって、全細胞ＤＮＡを得た。全ＰＣＶゲノムを増幅するための２対のプライマーと共にＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ）を用いるＰＣＲに、このＤＮＡをテンプレートとして用いた。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５、およびＰ６に対して、ＰＣＶ２−１およびＰＣＶ２−２と、ＰＣＶ２−３およびＰＣＶ２−４のプライマー・セットを用いた（表１）。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ４に対しては、ＰＣＶ２−１およびＰＣＶ２−２と、ＰＣＶ４−１およびＰＣＶ４−２のプライマー・セットを用いた（表１）。ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７に対しては、ＰＣＶ１−３およびＰＣＶ１−４と、ＰＣＶ７−１およびＰＣＶ７−２のプライマー・セットを用いた（表１）。ＰＣＲ産物を、１％アガロース・ゲルで分析し、ＵＶトランスイルミネータで視覚化した。
【表１】
2004503234.tif 000003
【０１６１】
ＰＣＲ産物のクローニング：ＰＣＲ産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ）を用いる平滑末端ライゲーションによって、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローン化した。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、および−Ｐ３の全ゲノムを構成するために、ＰＣＶ２−１および２プライマーで増幅したｎｔ１０７６−６７９のＰＣＲ産物、ＰＣＶ２−３および４プライマーで増幅したｎｔ７−１６５７のＰＣＲ産物を含有するｐＵＣ１８を、ＳｔｕＩおよびＫｐｎＩを用いて消化した。ＰＣＶ２−１および２で増幅したＰＣＲ産物を含有するｐＵＣ１８の４ｋｂのＳｔｕＩ−ＫｐｎＩフラグメントを用いて、ＰＣＶ２−３および４で増幅したＰＣＲ産物を含有するｐＵＣ１８の１．３ｋｂのＳｔｕＩ−ＫｐｎＩフラグメントを挿入し、ヌクレオチド１０７６−１７６８、および１−１６５７のＰＣＶゲノムを含有するｐＵＣ１８を生じた。結果として生じたＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、または−Ｐ３いずれかのゲノムを含有するプラスミドを、それぞれ、ｐＰＣＶ−Ｐ１、ｐＰＣＶ−Ｐ２、およびｐＰＣＶ−Ｐ３と命名した。これらのプラスミドをＳａｃＩＩ１３５で消化して、完全ＰＣＶゲノムの線形化形態を産生した。同様に、他のＰＣＶ株から得たＰＣＲ産物も、平滑末端ライゲーションによって、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位でクローン化した。プラスミドＤＮＡを、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配中、等密度遠心分離によって精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）。
【０１６２】
クローンＰＣＶＤＮＡのトランスフェクションおよびＰＣＶの検出：ＰＣＶＤＮＡ（ＰＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、および−Ｐ３）の全ゲノムを含有するプラスミドをＳａｃＩＩで消化して、２つのフラグメント、全ＰＣＶゲノムＤＮＡ、ｐＵＣ１８とＰＣＶＤＮＡの一部、を生じた。６ウェル・プレート中のＰＣＶを含まないＰＫ−１５細胞の半融合単一層を、リポフェクチン媒介トランスフェクション・プロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、１μｇのライゲートしたＰＣＶゲノムでトランスフェクトした。細胞を３回継代した。３回目の継代後、細胞を採取し、サイトスピンし、アセトンで固定した。ウサギで作製したＰＭＷＳ−ＰＣＶに対するポリクローナル抗体を（ＭｏｒｏｚｏｖおよびＰａｕｌ、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ａｍｅｓ、Ｉｏｗａ）、ＩＦＡに用いた。ＥＭのために、細胞ペレットに水を加え、細胞内容物を５分間１００００ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを集め、４０分間２００００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、３％リンタングステン酸、および１％ウシ血清アルブミンを含有する水に再懸濁した。試料を、炭素被覆グリッド上で霧状にし、Ｐｈｉｌｉｐｓ２０１電子顕微鏡で検査した。
【０１６３】
ＤＮＡ配列決定および配列分析：ＰＣＶＤＮＡを含有するプラスミドを、ユニバーサル・プライマーおよびリバース・プライマーを用いて配列決定した。その後、ＤＮＡの両株を、応用Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３Ａ自動配列装置を用いて、プライマー・ウォーキングによって配列決定した。７種のＰＣＶ単離株（ＰＭＷ−ＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、−Ｐ３、−Ｐ４、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５、−Ｐ６、および−Ｐ７）の全ゲノムを、ＧＣＧ配列分析ソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｐａｃｋａｇｅ）を用いて分析した。
【０１６４】
系統発生の算出：ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムによって、配列アライメントを得た。系統発生の算出を、ＰＨＹＬＩＰプログラム・パッケージ、バージョン３．５７２ｃによって行った（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ ５：１６４−１６６、１９８９）。最大節約分析のために、ＰｒｏｔｐａｒｓまたはＤＮＡｐａｒｓプログラムを用いた。距離分析のために、Ｐｒｏｔｄｉｓｔ（ＤａｙｈｏｆｆＰＡＭ００１マトリクス）またはＤＮＡｄｉｓｔ（Ｋｉｍｕｒａ２パラメータ）、続いてＦｉｔｃｈ（全体的な再配列を伴う）を適用した。ブートストラップ分析の間、上記の算出をＳｅｑｂｏｏｔ（１００データ・セット）によって進め、続いてＣｏｎｓｅｎｓｕｓプログラムによって、コンセンサス系統樹を得た。最後に、Ｔｒｅｅ Ｖｉｅｗプログラムによって結果を視覚化した（Ｐａｇｅ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １２：３５７−３５８、１９９６）。応用した方法のより詳細な説明は他に発表されている（ＨａｒｒａｃｈおよびＢｅｎｋｏ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２１：３０９−３３９、１９９８）。
【０１６５】
結果
ＰＣＶを含まないＰＫ−１５細胞のＰＣＶＤＮＡによるトランスフェクション。最初に、ＰＭＷＳに関連する３種のＰＣＶ単離株（ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、および−Ｐ３）の全ゲノムを、２組のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産生フラグメントを用いて、ＰＣＶゲノムを含有するプラスミド（ｐＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、および−Ｐ３）を構成した。これらのプラスミドをＳａｃＩＩで消化して、完全ＰＣＶゲノムの線状形態を得た。クローンＰＣＶゲノムが感染しているかどうかを試験するために、ＳａｃＩＩ消化再ライゲート、または非ライゲートｐＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、および−Ｐ３を用いて、ＰＣＶを含まないＰＫ−１５細胞をトランスフェクトした。３回の継代後に細胞を採取し、ＩＦＡによってＰＣＶ抗原の存在を分析した。ＩＦＡによって、ＳａｃＩＩ消化再ライゲートＰＣＶＤＮＡでトランスフェクトしたいくつかの細胞はＰＣＶ抗原に対して陽性であり、それに対して、ＳａｃＩＩ消化非ライゲートＰＣＶＤＮＡでトランスフェクトした細胞はＰＣＶ抗原に対して陰性であった。ＰＣＶＤＮＡによるトランスフェクションがＰＣＶビリオンの産生をもたらすのかどうかをさらに確認するために、ＰＣＶＤＮＡでトランスフェクトしたＰＫ−１５細胞をＥＭによって分析した。直径約１７ｎｍの小さい球状ウイルスが認められた。ＰＣＶＤＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＰＣＶ抗原の検出、およびウイルス粒子の観察は、クローン全長環状ＰＣＶＤＮＡが、ウイルスの複製、およびウイルス粒子の産生をもたらすことを示した。ＰＣＲによって増幅されたこの全長ＰＣＶゲノムは感染性であったので、本発明者等はＰＣＲ技法を用いて、他のＰＣＶ野外株のゲノムを増幅した。
【０１６６】
ＰＭＷＳ−ＰＣＶと、旧および新ＣＴ−ＰＣＶ単離株の配列比較。本発明者等は、ＰＭＷＳに関連する４種のＰＣＶ単離株（ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、−Ｐ３、および−Ｐ４）、１９９０年代終わりのＣＴに関連する２種のＰＣＶ単離株（ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５、および−Ｐ６）、および１９６０年代終わりのＣＴに関連する１種のＰＣＶ単離株（ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７）の全ゲノムを配列決定した。これらの単離の配列を、以前に記載されたＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株（Ｈａｍｅｌ等、１９９８）、およびＰＫ−１５−ＰＣＶ単離株（Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２２１−２２７、１９９７）の配列と比較した。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、−Ｐ２、および−Ｐ４のゲノムは１７６８ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり、それに対してＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ３は、８２０と８２５ｎｔとの間で６ｎｔが欠失しているため、他のＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株よりも６ヌクレオチド短かった（図１）。本発明のすべてのＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株は、互いに全体で９９％のｎｔ配列同一性を有した。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１の各ＯＲＦの配向、および相対的長さを示す（図２Ａ）。ＰＭＷＳ−ＰＣＶのゲノムにおける各ＯＲＦのコーディング鎖、アミノ酸数、および位置を表に示す（表２）。
【表２】
2004503234.tif 000004
【０１６７】
ＯＲＦ１のアミノ酸配列は、これらのすべてのＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株の間で高度に相同性であった（アミノ酸レベルで約９９％の相同性）。これらのＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株のいくつかのＯＲＦにおいて認められたアミノ酸残基の変化を表に示す（表３）。ＯＲＦ２は、ＯＲＦ１と比較してＰＭＷＳ−ＰＣＶの間でアミノ酸変化が多かったが、それでも約９７％の相同性を有した。オープン・リーディング・フレーム３、４、７、および８は、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株の間で同一であり、他のＯＲＦでは少数のみが変化していた（表３）。
【表３】
2004503234.tif 000005
【０１６８】
ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ４のＯＲＦ、およびＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ３のＯＲＦ１０は、本発明の他のＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株の対応するＯＲＦと比べて、それぞれアミノ酸５４個、および２６個長かった。
【０１６９】
１９９０年代終わりに単離された２種の新しいＣＴ−ＰＣＶ単離株（ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５、および−Ｐ６）は、１７６８ｎｔの長さであった（図２）。これらのＣＴ−ＰＣＶは、約９９％のｎｔ配列同一性を有した。興味深いことに、新しいＣＴ−ＰＣＶ単離株はさらに、新しいＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株と、約９９％のｎｔ配列同一性を示した。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１とＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５のゲノムは同一であった。ＰＭＷＳ−ＰＣＶおよび新しいＣＴ−ＰＣＶのゲノムは共に１１の潜在ＯＲＦをエンコードする。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１のＯＲＦと比較した新しいＣＴ−ＰＣＶの種々のＯＲＦにおけるアミノ酸変化を表に示す（表３）。
【０１７０】
古いＣＴ−ＰＣＶ（ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７）のゲノムは、１７５９ヌクレオチドの長さであった（図１）。ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７のゲノムも、１１の潜在ＯＲＦをエンコードした。各ＯＲＦの配向、相対的長さを図２Ｂに示す。
【０１７１】
ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７の各ＯＲＦのアミノ酸数、および位置を示す（表４）。
【表４】
2004503234.tif 000006
【０１７２】
ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７のゲノムは、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ、および両方の新しいＣＴ−ＰＣＶとわずか約７２％のｎｔ配列同一性を有したが、驚くことにＰＫ−１５−ＰＣＶと約９８％のｎｔ配列同一性を共有した。ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７のすべてのＯＲＦのアミノ酸配列も、ＰＫ−１５−ＰＣＶのＯＲＦと高度に相同性であった。ＰＫ−１５−ＰＣＶのＯＲＦと比較したＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７の種々のＯＲＦにおけるアミノ酸変化を表に示す（表３）。
【０１７３】
Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７８：２２１−２２７、１９９７は、ＰＫ−１５−ＰＣＶのステム・ループ構造の先端にノナヌクレオチド配列の存在を認めており、これは植物のナノウイルスおよびジェミニウイルスで述べられたものと類似していた。本発明のすべてのＰＣＶ単離株は、ステム・ループ構造およびノナヌクレオチド（Ａ／ＴＡＧＴＡＴＴＡＣ）を保存しており、これはローリング・サークル型ＤＮＡ複製の起点を表す（Ｍａｎｋｅｒｔｓ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：２５６２−２５６６、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：３８１−３８４、１９９８）。以前にＨａｍｅｌ等（１９９８）によって報告されている潜在的なグリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｔ、またはＮ−Ｘ−Ｓ、Ｘは任意のアミノ酸）は、６位でアミノ酸残基「Ｎ」が「Ｄ」と置き換わっているＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７のＯＲＦ６を除いて、本発明のすべてのＰＣＶ単離株で保存された。
【０１７４】
系統発生分析：複製関連タンパク質（ＯＲＦ１／レプリカーゼ／ｒｅｐ／ｃｏａｔ／Ｐ３５．８タンパク質）、およびタンパク質Ｐ２７．９（ＯＲＦ２）などの個々のタンパク質の推定アミノ酸配列、または完全ゲノムのヌクレオチド配列を系統発生分析に用いたとき、距離マトリクスおよび最節約分析は共に、かなり類似したトポロジーを有する２つの別個の集団を生じた。株間の相違は適度なものであり、距離マトリクス分析がより一貫性のあるデータを与えると考えられたので（ＨａｒｒａｃｈおよびＢｅｎｋｏ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２１：３０９−３３９、１９９８）、本発明者等は研究結果を完全ゲノムの距離マトリクス分析によって示すことを選択した（図３）。
【０１７５】
種々のブタおよびウシ・シルコウイルスゲノムに関する距離マトリクス分析のもっとも明白な結果は、単離株の２集団への明確な単離であった（図３）。検査したゲノムの数は（７つの新しい配列を含む）２９であり、単離株の起源は地理的に遠い地域に及んだが、中間の遺伝子型は見つからなかった。
【０１７６】
小さいほうの集団（１型）は、ＰＫ−１５細胞系の異なる系統由来の単離株、および異なる病理学的実体（ＰＭＷＳおよびＣＴ）から単離された２種のシルコウイルス株（ＰＭＷＳアクセッション番号ＡＦ０１２１０７、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７）を含有した。他方のかなり大きい集団（２型）は、ＰＭＷＳを有するブタ由来の２１種、２種の新しいＣＴ単離株（ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５および−６）、およびウシ単離株（ＡＦ１０９３９７）を含む残りの２４種の単離株を含有した。この系統樹に基づいて考えると、シルコウイルス株の遺伝的関係は、その病原性能と直接関連していないように思われる。
【０１７７】
考察
本研究の目的は、ＣＴに関連するＰＣＶの遺伝的変異性を求めることであった。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株は、互いに約９９％のｎｔ配列同一性を有し、さらに英国、カナダ、フランス、および米国で単離されたＰＭＷＳ−関連ＰＣＶと９６％のｎｔ同一性を有し（Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：２１７１−２１７９、１９９８、Ｍｏｒｏｚｏｖ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：２５３５−２５４１、１９９８、Ｈａｍｅｌ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５２６２−５２６７、１９９８、Ｍａｎｋｅｒｔｚ等、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６６６５−７７、２０００）、種々のＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株はその起源の場所にかかわらず相同性が高いことを示している。
【０１７８】
１９９０年代終わりの新しいＣＴ−ＰＣＶ単離株、および１９６０年代終わりの古いＣＴ−ＰＣＶ単離株は、ＣＴＡ２型を有する新生ブタを起源としたが、それらはわずか７２％のｎｔ配列同一性を共有した。２種の新しいＣＴ−ＰＣＶのゲノムは、ＰＭＷＳＰＣＶの新しい単離株とかなり類似しており、それに対して古いＣＴ−ＰＣＶ単離株は、ＰＫ−１５−ＰＣＶ変株に非常に近かった。広範な系統発生算出に基づいて、異なるＰＣＶ単離株を、２つのグループに分けることができる。ＰＫ−１５−ＰＣＶ変株、本発明の古いＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７、および単一の特性決定されていないＰＭＷＳ単離株（ＡＦ０１２１０７）は、ＰＣＶ１型（ＰＣＶ１）を構成し、残りの２０種の新しいＰＭＷＳ−ＰＣＶ、および２種の新しいＣＴ−ＰＣＶ野外単離株（ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５および−Ｐ６）は、ＰＣＶ２型（ＰＣＶ２）を構成する。ＰＫ−１５−ＰＣＶおよび４種のＰＭＷＳ関連ＰＣＶ単離株の配列分析に基づいて、ＰＫ−１５−ＰＣＶをＰＣＶ１、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ単離株をＰＣＶ２と分類する予備案が提示された（Ｍｅｅｈａｎ等、１９９８）。
【０１７９】
ＰＫ−１５−ＰＣＶ（ＰＣＶ１単離株）は、離乳ブタの接種実験において臨床的に非病原性であったが（Ｔｉｓｃｈｅｒ等、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９１：２７１−２７６、１９８６、Ａｌｌａｎ等、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４４：４９−６４、１９９５）、それに対してＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７単離株（同じくＰＣＶ１）は１９６０年代終わりにＣＴを有する新生ブタから得られたものであり、妊娠７０日で妊娠雌ブタに接種したとき、子孫に先天性振せんを引き起こすようである（Ｋａｎｉｔｚ、博士論文、Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９７２）。ＰＫ−１５−ＰＣＶもＣＴの原因となり得るのか、あるいはＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７が離乳ブタにおいて病原性であるのかどうかは明らかでない。年齢、感染経路、および／またはいくつかの他の要因が、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２の病原性および臨床的発現を決定する可能性がある。新しいＣＴ−ＰＣＶおよびＰＭＷＳ−ＰＣＶ株の間に約９９％のｎｔ配列同一性が存在することは、最近のＰＭＷＳおよびＣＴの発生がＰＣＶの同一の型（すなわち、ＰＣＶ２）に関連していることを示唆している。ＰＭＷＳを有するブタの報告された年齢は６−１２週であるのに対して（Ｅｌｌｉｓ等、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ３９：４４−５１、１９９８、Ｋｉｕｐｅｌ等、Ｉｎｄｉａｎａ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５：３０３−３０７、１９９８、Ｒｏｓｅｌｌ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １２０：５９−７８、１９９９）、ＣＴは新生ブタの疾患である（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ、印刷中）。ＰＣＶによって起こる症候群の型の決定には、年齢が重要な役割を果たしているようである。最近、自然発生のＣＴを有する新生ブタの脳および脊髄の多数のニューロンにおいて、ＰＣＶ２ＤＮＡの存在が実証された。胎児の発育中、神経細胞分裂が排他的に起こる。ＰＣＶはその複製に細胞分裂を必要とするので、胎児発育中が、ＰＣＶにとって神経組織内で複製し、ＣＴの徴候に至ることのできる唯一の期間である可能性がある（Ｔｉｓｃｈｅｒ等、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９６：３９−５７、１９８７）。ＰＣＶ２を無菌ブタに接種したとき、接種後３５日までに病変が発現するが、ＰＭＷＳの典型的な臨床疾患ではない。しかしながら、ＰＣＶ２をブタ・パルボウイルスまたはブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスと共に接種したとき、ＰＣＶの複製は増強され、ＰＭＷＳが再現される（Ａｌｌａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １２１：１−１１、１９９９）。他のウイルスは、ＰＣＶ標的細胞の分裂を直接または間接的に引き起こすことによって、ＰＣＶ複製を強化する可能性がある。
【０１８０】
ＰＣＶ１は、最初に１９６０年代および７０年代に同定され（Ｔｉｓｃｈｅｒ等、Ｚｅｎｔｒａｂｌａｔｔ ｆｕｒ Ｂａｋｔｅｒｉｏｌｏｇｉｅ， Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｕｎｄｅ， Ｉｎｆｅｋｔｉｏｎｓｋｒａｎｋｈｅｉｔｅｎ， ｕｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ−Ｅｒｓｔｅ Ａｂｔｅｉｌｕｎｇ Ｏｒｉｇｉｎａｌｅ−ＲｅｉｈｅＡ：Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｅ ２２６：１５３−１６７、１９７４、Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２２１−２２７、１９９７、本研究）、それに対してＰＣＶ２は、１９９０年代終わりに同定された（Ｈａｍｅｌ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５２６２−５２６７、１９９８、Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：２１７１−２１７９、１９９８、Ｍａｎｋｅｒｔｚ等、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６６６５−７７、２０００）。配列分析に基づいて、ＰＣＶ２はＰＣＶ１に由来する可能性があると考えられる。しかしながら、２種の型の間に大きな系統発生距離があること、および中間体が完全に欠けていると思われることは、２種の型の間の直接的な最近の関係に矛盾する。これらの発見は、蔓延したＰＣＶ感染（たとえば、ワクチン媒介疾患）の起源としてのＰＫ−１５細胞系の役割を支持しない。２型ＰＣＶの集団には、単一のウシ起源シルコウイルス単離株が含まれる。シルコウイルス感染がどのようにウシに広がったのかはわかっていない。この単一ウシ単離株とＰＣＶ２との間の高い類似性に基づいて考えると、この２種の異なるＰＣＶ系統が、アデノウイルスの場合に見られるように（ＲｕｓｓｅｌｌおよびＢｅｎｋｏ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４−２１頁、１９９９）、ブタおよびウシ宿主において以前に、同時に進化したという魅力的な推測は否定される。しかしながら、そのようなＰＣＶ１およびＰＣＶ２株の進化は、２種以上のまだ同定されていない宿主種で発生した可能性はある。
【０１８１】
実施例ＩＩ：自然発生先天性振せんを有するブタにおけるブタ・シルコウイルスの組織分布および遺伝子タイピング
材料および方法
研究計画：２日齢未満のブタを、ＣＴＡ２型と一致する疾患が発生した米国中西部の４つの農場から選択した。各農場から、ＣＴを有するブタ２−４頭（ｎ＝１３）、および臨床的に正常なブタ１−２頭（ｎ＝６）を、Ｐｕｒｄｕｅ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮに移送し、ペントバルビタールで安楽死させた。死体解剖検査を行い、試験のために組織を採取した。大脳、小脳、脳橋、脊髄分節Ｃ１、Ｃ４、Ｃ７、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ９、Ｔ１２、Ｌ２、Ｌ５、およびＳ２、肺、肝臓、腎臓、脾臓、扁桃、腸間膜および鼡径リンパ節の試料を、試験のために、中性緩衝ホルマリン中に採取するか、または−２０℃で凍結した。
【０１８２】
組織病理学およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：慣例的な方法によって、組織を室温で２４時間固定し、次いでパラフィンに包埋し、薄片にして、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。すべての組織を、顕微鏡的病変に関して評価した。前に記載したとおり、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２の両方でハイブリダイズすることが知られているＰＣＶオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った（Ｋｉｕｐｅｌ等、Ｅｕｒ Ｊ Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ．、１９９９、Ｒｏｓｓｅｌｌ等、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４−２１頁、１９９９）。ＰＣＶ特異オリゴヌクレオチドをジゴキシゲニンで３’末端標識した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）。脱パラフィン化し、０．２５％のペプシンを用いて１０５℃で８分間、続いて３７℃で１０分間タンパク質酵素消化を行い、オートメーション・バッファで洗浄、１００％のホルムアミドを用いて１０５℃で５分間プレハイブリダイゼーションした後、市販のワークステーション（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いて、プローブ濃度５μｌ／ｍｌで、１０５℃で５分間、および３７℃で６０分間、ハイブリダイゼーションを行った。食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液で高ストリンジェンシーの洗浄を行い、プローブと標的の結合を確実にした。アルカリホスファターゼとコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体からなる検出系（希釈１：５００）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を３７℃で４５分間適用し、基質「ＮＢＴ／Ｘ−Ｐｈｏｓ」（ニトロブルー・テトラゾリウム５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を適用した。連続切片上で、４５分、９０分、および１８０分間、不溶性青色ホルマザンに色素還元した。対照は、ＰＣＶ１感染ＰＫ−１５細胞（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３６：３６８−３７８、１９９９）、ＰＣＶ２−感染ブタ（Ｋｉｕｐｅｌ等、Ｉｎｄｉａｎａ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５：３０３−３０７、１９９８）およびＰＣＶを持たないノイバイオート・ブタの脳、脊髄、およびリンパ組織のドット・ブロット・スライドを含んだ。スライドを、プローブを用いずにハイブリダイゼーション溶液でインキュベートし、陰性試薬対照として用いた。
【０１８３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験：ＰＣＶの遺伝子型を１型または２型として求めるために、すべてのブタから得た小脳および肝臓試料のＰＣＲ試験を行った。対照は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験と同じものを用いた。組織を、ティシュマイザーを用い、等量のＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で均質化した。標準的なプロトコルを用いて、全細胞ＤＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）。ＰＣＶ（Ｍｅｅｈａｎ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２２１−２２７、１９９７）、またはＰＣＶ２（Ｈａｍｅｌ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５２６２−５２６７、１９９８）に対して特異性となるようにプライマー・セットを設計し、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いてＰＣＲによってＰＣＶ配列を増幅するためにそれを用いた。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ試料を、電気泳動によって１％アガロース・ゲル上で分析し、予期されるサイズの帯を、ＵＶトランスイルミネーターで視覚化した。ＰＣＲ成果物の特異性は、配列分析によって確認した。
【０１８４】
凍結切片間接免疫蛍光抗体試験：前にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってＰＣＶに関して陽性を試験した肝臓および小脳の試料を、各群１頭のブタから選択した。ＰＣＶ特異抗原の存在を確認するために、間接蛍光抗体試験を行った。凍結組織切片を調製し、間接蛍光抗体試験は、１：５００希釈のウサギで作製した精製ＰＣＶ２に対して作られた市販のポリクローナル抗体（ＭｏｒｏｚｏｖおよびＰａｕｌ、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）、および１：２５０希釈のフルオレセイン・コンジュゲート・マウス抗ウサギＩｇＧを用いて、慣例的な方法で行った。
【０１８５】
他の因子の試験：仮性狂犬病ウイルス（ＮＹＳＬ、ＡＭＥＳ、ＩＡ）、ブタ・インフルエンザウイルス（ＮＹＳＬ、ＡＭＥＳ、ＩＡ）、ブタ・ロタウイルス（ＮＹＳＬ、ＡＭＥＳ、ＩＡ）、ブタ血球凝集性脳炎ウイルス（ＮＹＳＬ、ＡＭＥＳ、ＩＡ）、ブタ・パルボウイルス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｅｖｉｅｒｖｉｌｌｅ、ＴＮ）、および伝染性胃腸炎ウイルス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｅｖｉｅｒｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を含む、他のブタ・ウイルス因子に関して、間接免疫蛍光を用いる慣例試験を、Ｐｕｒｄｕｅ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ ＩＮで市販の診断用試薬を用いて行った。血清、脾臓、および肺の試料を、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスに関して、ブタ１次肺胞マクロファージ細胞培養物中、ウイルス単離によって試験した。脳、脾臓、および扁桃の試料を、仮性狂犬病ウイルスに関して、直接蛍光抗体試験およびブタ鼻甲介細胞中ウイルス単離によって試験した。脳、脾臓、および扁桃の試料を、細胞変性ウイルスに関して、ブタ鼻甲介およびブタ精巣細胞中で試験した。
【０１８６】
結果
ＣＴが発生した４つの農場はすべて、外部の供給源から更新用の種蓄を購入していた。種蓄の供給源は各農場で異なっており、いずれの農場も共通の遺伝を共有していなかった。ブタが屠殺齢まで維持された３つの農場では、最近のＰＭＷＳ歴はなかった。試験に用いるために選択されたＣＴを有するブタはすべて、生後４８時間以下で、中程度から重篤な振せんを伴い、ブタが自発的運動を試みたときにもっとも重篤であった。ブタが安静なときは、振せんが部分的に弱まった。年齢を対応させた臨床的に正常な対照ブタとして選択されたブタはすべて、ＣＴブタのいないリフター（ｌｉｆｔｅｒ）を起源とした。試験に選択されたブタはすべて敏捷で、活発であり、他の点では臨床的に正常であった。
【０１８７】
いずれのＣＴブタまたは正常ブタにおいても、肉眼的病変、または顕微鏡的病変はなかった。ＰＲＲＳウイルス、仮性狂犬病ウイルス、および他の細胞変性ウイルスに関するすべての試験は陰性であった。ＰＣＶは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、およびＩＦＡ試験によって、ＣＴブタ１３頭中１３頭、臨床的正常ブタ６頭中５頭の組織で実証された。ＣＴブタおよび臨床的正常ブタの両方で、もっとも一般的にＰＣＶに感染していた組織は、中枢神経組織および肝臓であった。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＰＣＶ陽性ブタにおいて、ＣＴブタの１２／１３および臨床的正常ブタの５／６の中枢神経組織、ＣＴブタの１１／１３および臨床的正常ブタの２／６の肝臓、ならびにより低い割合でＣＴブタおよび臨床的正常ブタ５／６のすべての他の組織で、ＰＣＶを実証した。形態学的にマクロファージの典型である分散細胞の少数が、肝臓および他の非神経組織において陽性であった。ＰＣＶ核酸は、陽性のマクロファージの細胞質のほとんど、陽性マクロファージの少数の核にのみ存在した。ＣＴブタおよび臨床的正常ブタの両方の中枢神経組織に、他の組織より多くのＰＣＶ陽性細胞が存在した。脳および脊髄の陽性細胞は、主として大ニューロンであり、陽性小ニューロンはそれよりも少なく、陽性稀突起神経膠細胞は希少であった。大脳および骨髄の核において大ニューロンが陽性であり、小脳のプルキンエ細胞が陽性であり、脊髄灰白質の大ニューロン、特に下位運動ニューロンが陽性であった。マクロファージと同様に、陽性ニューロンは一般に、細胞質にのみＰＣＶ核酸を有し、核には希少であった。
【０１８８】
中枢神経系のＰＣＶ感染細胞は、臨床的に正常なブタよりもＣＴブタにおいて、数が多く、より広範に分布していた（表５）。一般に、ＣＴブタは、脳および脊髄に広範に分布した多数の陽性大ニューロンを有した。臨床的に正常なブタは、脳および脊髄に多焦点に分布した、より少数のＰＣＶ陽性大ニューロンを有した。
【表５】
2004503234.tif 000007
【０１８９】
各群１頭のブタから得た小脳および肝臓の凍結切片の間接蛍光抗体試験によって、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験の結果が確認された。ＰＣＶ特異抗原は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのＰＣＶ特異核酸とほぼ同じ数および細胞型で、同じ細胞位置において実証された。すべてのブタから得た小脳および肝臓のＰＣＲ試験は、４つすべての農場のすべての陽性ブタにおいて、ＰＣＶ２特異配列の増幅を実証したが、ＰＣＶ１特異配列は実証されなかった。
【０１９０】
考察
ＣＴＡ２型の発生中に、臨床的に正常なブタ、およびＣＴブタの両方が、１−２日齢でＰＣＶ２に感染していた。両方とも、先天的にウイルスに感染していたと思われる。ＰＣＶ２は、すべての感染ブタで広範囲に分布しており、もっとも一般的には中枢神経組織に存在していた。
【０１９１】
しかしながら、臨床的に正常なブタと比較したとき、分布がより広範で、感染細胞の割合が高いために、ＣＴブタの脳および脊髄により多くのＰＣＶ感染細胞が存在した。もっとも一般的な感染細胞は、脳および脊髄の大ニューロン、ならびに非神経組織のマクロファージであった。稀突起神経膠細胞はほとんど感染していなかった。
【０１９２】
ＣＴブタが脳および脊髄において先天的にミエリンを欠損していることは、以前の研究で実証されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｎｏｒｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｅｒｍｅｄ ８：９２１−９４３、１９５６）。他の研究は、年齢および遺伝的に対応する正常な対照ブタと比較して、ＣＴブタが不相応に低いセレブロシド、および高いコレステロールからなる異常に未熟なミエリンを有することを実証した（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ２６：４８１−４８５、１９７６）。稀突起神経膠細胞がＣＮＳにおいてＰＣＶに感染する主要な細胞であって、それがミエリン合成の減少および異常の原因であろうというのが、本研究以前の仮説であった。脳および脊髄において多数のＰＣＶ感染ニューロンが見つかったことは驚くべきことであり、さらにこのことがミエリン欠損は別にして、あるいはミエリン欠損に加えて、ＣＴの重要な原因である可能性がある。以前の研究は、ＣＴブタにおけるミエリン欠損の程度は変化し、振せんの重篤度とは密接に関連していないことを実証した（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、Ｊ．Ａｍ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ ２９（１２）：２２５５−２２６２、１９６８）。この発見は、ミエリン異常は、単独ではＣＴの原因となり得ないことを示唆している。一研究において、ＣＴおよび対照ブタの神経系で、大脳除去、片側迷路摘出、腰仙根の片側神経根切断、および胸髄離断を含む外科的切除が行われ、手術後神経学的検査によって振せんの原因が脊髄レベルに位置することが確認された。他の研究によって、ＣＴブタにおける脊髄反射は、単シナプス過剰興奮性であることが判明した（Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ２０：３１９−３２３、１９５９）。脊髄の運動ニューロンのＰＣＶ感染が機能に直接影響を及ぼし、運動ニューロンをより興奮性にし、それによって脊髄反射弓に影響を与えている可能性がある。
【０１９３】
ＰＣＶ２感染稀突起神経膠細胞が少数であることは、ＰＣＶ２感染稀突起神経膠細胞の機能障害をＣＴＡ２型におけるミエリン欠損の原因とする仮説を支持しない。しかしながら、本発明者等はこれらのブタにおいてミエリン欠損を確認しておらず、そのため存在しなかったことも考えられる。さらに、これらのブタにおいて、以前にＰＣＶ誘発の稀突起神経膠細胞の喪失および除去があった可能性も排除できない。ＰＭＷＳを有するブタにおけるＰＣＶ２感染に伴う肉芽腫性炎症性反応は、これらのＣＴブタのいずれのＰＣＶ２感染組織においても認められなかった。炎症が見られない理由は明らかではないが、胎内でのＰＣＶ感染は免疫耐性を誘導する可能性がある。
【０１９４】
実施例ＩＩＩ：ＰＣＶ２の先天性伝播
方法
ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）にセロネガティブである、健康状態の高い民間のブタ農場から入手した８頭の多経産妊娠雌ブタを、帝王切開／初乳非投与（ＣＤ／ＣＤ）ブタを産生するために用いた。すべての雌ブタを、妊娠後９０日より前にＰｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの隔離室に移し、妊娠第９４日に、４頭の雌ブタに、組織培養適合ＰＣＶ２（ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ４）１．０ｍｌ（１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を筋肉内および鼻腔内接種した。妊娠第１１４日に、４頭のＰＣＶ接種雌ブタ、および４頭の非ＰＣＶ接種雌ブタに帝王切開手術を行い、続いて安楽死をさせて、先天的にＰＣＶ２にされた暴露ＣＤ／ＣＤブタ（Ｃ＋ブタ）、および先天的にＰＣＶ２を伴わないＣＤ／ＣＤブタ（Ｃ−ブタ）を産生した。雌ブタの死体解剖検査を行い、種々のブタ・ウイルスに関して試験をするために、血清、脳、脊髄、肝臓、肺、脾臓、気管気管支リンパ節、および鼡径リンパ節の試料を採取した。各同腹子から３頭のブタを生後３日に安楽死させた。残りの新生ブタは、ＰＭＷＳの病変を産生するための実験に用いた。安楽死させたブタ、および帝王切開後の最初の２週間の間に死亡したブタの完全な死体解剖検査を行った。各ブタから脳、脊髄、肝臓、肺、腎臓、脾臓、扁桃、骨髄、胸腺、気管気管支リンパ節、および鼡径リンパ節の試料を採取し、−２０℃で保存するか、あるいは中性緩衝ホルマリンに保存（血清および血液以外）した。組織病理学、およびＰＣＶｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをすべての組織で行い、顕微鏡的病変、およびＰＣＶ分布を評価した。選択したプール試料でＰＣＶ２ＰＣＲを行った。
【０１９５】
結果
帝王切開後、最初の２週の間に、４頭のＣ＋雌ブタ由来の１５頭が死亡し、さらに３頭を安楽死させた。最初の３日間で死亡した４頭のブタ、さらに死産であった１頭の子ブタは、ドーム形状の頭を有し、小さく、虚弱で、環境に順応することが困難であった。１１頭のＣ＋ブタはすべて活力に欠け、数頭は細菌性敗血症によって死亡した。全体として、Ｃ−ブタに比べて、Ｃ＋ブタは活力に欠け、生後２週間まで生育することができなかった。研究の最初の３週間の間に死体解剖を行った１９頭のＣ＋ブタにおいて、ＰＭＷＳに特徴的な肉眼的病変は同定されなかった。
【０１９６】
顕微鏡的には、最初の３週で死亡した８頭のＣ＋ブタは、重篤な間質性肺炎を有し、細菌性敗血症を示した。これらのブタにおいて他の顕微鏡的病変は見られなかった。３週齢の間に死亡した５頭のＣ＋ブタから得たリンパ節の切片、１頭のブタの肝臓の切片、２頭の肺の切片、および１頭のブタの心臓の切片は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってＰＣＶ２が疑われた。個々のブタから得た脾臓、扁桃、気管支、および腸間膜リンパ節を含むリンパ組織のプールは、１９頭のＣ＋ブタの７頭で、ＰＣＶによってＰＣＶ２に陽性であった。すべてのＣ＋ブタの肺、脾臓、および気管支リンパ節の試料は、および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ブタ・インフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタ・パルボウイルス（ＰＰＶ）、または伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に関して、ウイルス単離およびＦＡ試験によって陰性であった。３週齢の間に出血した３頭のＣ＋ブタの利用可能な血液試料は、ＰＣＶ２、およびＰＰＶに対して血清学的に陰性であった。このＰＣＶ２接種材料は、ＰＰＶが混入していることがわかった。
【０１９７】
考察
これらの結果は、ＰＣＶ２が、感染した雌ブタからその同腹子に伝播され得ることを示唆した。ＰＣＶ２単独で、または補助因子との組合せで、先天的に伝播することが可能であった。
【０１９８】
実施例ＩＶ：ウサギにおけるＰＣＶ特異抗体の作製
ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１ ＯＲＦ１（３１４Ｒ）、ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１ ＯＲＦ２カルボキシ領域（１２９Ｒ）、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ６ ＯＲＦ３（１０４Ｒ）、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ６ ＯＲＦ４（５９Ｒ）、ＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７ ＯＲＦ２（カルボキシ部）を代表するオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を、適切なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、ヒスチジンカセットに融合した異種挿入物の発現を駆動する細菌発現および精製ベクターｐＥＴ３０ａに挿入した。細菌におけるＰＣＶタンパク質の発現は非常に効率がよく、これらのＯＲＦが機能タンパク質をコードする可能性を有することを示唆した。融合タンパク質としてＰＣＶ特異タンパク質をＮｉ＋＋アフィニティ・クロマトグラフィによって精製した。これらの精製タンパク質を、ウサギを免疫化して抗体を作製するために用いた。
【０１９９】
実施例Ｖ：ＰＣＶ２抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡの発展
本発明者等は、細菌性発現ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１ ＯＲＦ２カルボキシ部精製タンパク質を用いてプレートを被覆することによって、ＰＣＶ２に対する抗体を検出するためにブタ血清をスクリーニングするＥＬＩＳＡアッセイをより詳細に発展させた。
【０２００】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。さらに上記の説明および添付の図面から、本明細書に記載したものに加えて本発明の様々な変更が当分野の技術者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の請求の範囲に含まれるものとする。
【０２０１】
さらに、すべての値が近似値であり、説明のために提供されたものであることが理解される。
【０２０２】
本明細書において引用したすべての特許、特許出願、刊行物、および他の資料は、その全体を参照により本明細書の一部とする。
【０２０３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７のヌクレオチド配列の比較を示す図である。
−は同一のヌクレオチドを表す。
・は欠失ヌクレオチドを表す。
ＰＭＷＳ−ＰＣＶ、およびＰＫ−１５−ＰＣＶのヌクレオチド配列は、それぞれＨａｍｅｌ等、１９９８、およびＭｅｅｈａｎ等、１９９７から採用した。
【図２】
ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１（図２Ａ）、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７（図２Ｂ）の１１種のＯＲＦの概略図である。ＰＭＷＳ−ＰＣＶ−Ｐ１、およびＣＴ−ＰＣＶ−Ｐ７のゲノムの大きさは、それぞれヌクレオチド１７６８、および１７５９である。矢印の方向は、各ＯＲＦの配向を表す。
【図３】
ブタおよびウシ・シルコウイルス単離株の全ゲノムの距離マトリクス分析を示す図である。枝の長さは、単離株の系統発生距離に比例する。線は２つの配列間の１０％の差異を表す。無根系統樹、１型株（ＣＴ−Ｐ７、ＰＭＷＳ−ＡＦ０１２１０７、およびＰＫ−１５細胞系由来株）はアウトグループとして用いた。ブートストラップ値（１００データセット）を示す（全長アラインメントによって得られた系統樹トポロジーが確認されなかったＰＣＶ２−Ｂの場合を除く）。ウイルス株は、原因疾患（既知の場合）、および株名（得られる場合。得られない場合は、アクセッション番号、または提示された制限酵素フラグメンテーションの型）によって表す。株（本発明のもの以外）、およびそのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は以下のとおりである。ＰＫ−１５細胞系由来株：ＰＫ−ＩＳＡ（Ｕ４９１８６）、ＰＫ−１５Ｂ（Ｙ０９９２１）、ＰＫ−１５Ｃ（ＡＦ０７１８７９）、ＰＭＷＳ株：ＰＭＷＳ−ＡＦ０１２１０７、Ｐ／４８１２１（Ｉｍｐ．１０１１ ４８１２１、ＡＦ０５５３９３）、Ｐ／ＩＳＵ−３１（ＡＪ２２３１８５）、Ｐ／４８２８５（Ｉｍｐ．１０１１ ４８２８５、ＡＦ０５５３９４）、Ｐ／ＡＦ０２７２１７、Ｐ／ＩＳＵＶＤＬ（ＩＳＵＶＤＬ９８−１５２３７、ＡＦ１４７７５１）、（Ｉｍｐ．９９９（ＡＦ０５５３９１）、Ｐ／Ｉｍｐ．１０１０（Ｉｍｐ．１０１０−Ｓｔｏｏｎ、ＡＦ０５５３９２）、疾患の記載のない株：Ｔａｉｎａｎ（ＡＦ１６６５２８）、ＭＬＴＷ９８（ＡＦ１５４６７９）、Ｂ９（ＡＦ０８６８３４）、９７４１（ＡＦ０８６８３５）、４１２４５０（ＡＦ０８５６９５）、Ｍ２２６（ＡＦ０８６８３６）、制限酵素フラグメンテーション・パターンの型名を有する株：ＰＣＶ２−Ｂ（ＡＦ１１２８６２）、ＰＣＶ２−Ｃ（ＡＦ１０９３９８）、ＰＣＶ２−Ｄ（ＡＦ１１７７５３）、ＰＣＶ２−Ｅ（ＡＦ１０９３９９）、ウシ・シルコウイルス：Ｂｏｖｉｎｅ ＣＶ（ＡＦ１０９３９７）。
【図４】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム１（ＯＲＦ１）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図５】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム２（ＯＲＦ２）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図６】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム３（ＯＲＦ３）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図７】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム４（ＯＲＦ４）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図８】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム５（ＯＲＦ５）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図９】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム６（ＯＲＦ６）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図１０】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム７（ＯＲＦ７）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図１１】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム８（ＯＲＦ８）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図１２】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム９（ＯＲＦ９）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図１３】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム１０（ＯＲＦ１０）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【図１４】
本発明のＰＭＷＳ−およびＣＴ−ＰＣＶ単離株のオープン・リーディング・フレーム１１（ＯＲＦ１１）をＰＷＭＳ−ＰＣＶおよびＰＫ−１５−ＰＣＶの公開配列と比較したタンパク質相同性を示す図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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