(57)【要約】グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)が融合のパートナーである融合タンパク質は、タンパク質の相互作用に基づくスクリーニング手順又は他の多検体試験手順において固定化された結合メンバーとして用いられる。かかる手順において、特定のタンパク質は、候補タンパク質の群から、そのタンパク質の、標的タンパク質の対する結合親和性に基づいて、そしてGST及びグルタチオンで覆われた粒子上でGSTがグルタチオンに対して結合することによって固定化されている融合タンパク質のGST部分との融合パートナーである候補タンパク質又は標的タンパク質のどちらかに対する結合親和性に基づいて選択される。粒子それら自身は、フローサイトメトリーにより粒子が識別されることを可能にする異なる値の差別化パラメーターによって分類できる。そしてこの手順は、個々の候補タンパク質と粒子の個々種類との相関関係を取る方法によって行われる。候補タンパク質と標的タンパク質との間で結合相互作用が起こった場合、粒子上で起こっている相互作用はフローサイトメトリーにより迅速に識別されて結合を示した候補タンパク質との相関関係が取られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の候補タンパク質の中から、選定の結合メンバーと親和性型の結合をするものを選択する為の方法であって、前記方法は:
(a)  それぞれが、グルタチオンS−トランスフェラーゼと融合した前記候補タンパク質の１つを含んで成る融合タンパク質を形成し;
(b)  前記融合タンパク質を、グルタチオンで覆われた複数の粒子に対して、前記グルタチオンS−トランスフェラーゼと前記グルタチオンとの親和性によって固定化し、ここで前記粒子は、選定の差別化パラメーター(differentiation parameter)の値によって異なる集団に分類でき、従って、各々の集団はそれに結合した異なる融合タンパク質を有し;
(c)  前記複数の粒子を単一の混合物に組み合わせ、そして前記混合物と前記選定の結合メンバーとをインキュベートし;そして
(d)  前記選定の結合メンバーが結合した粒子を検出し、そしてこのようにして検出された前記粒子の差別化パラメーターの値と、それに結合した融合タンパク質との相関関係を取り、前記選定の結合メンバーに対して親和性型の結合により結合した候補タンパク質を同定する;
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記融合タンパク質が組換えDNAによって形成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階(c)が、前記粒子を、前記タンパク質を含む液状媒体中で懸濁させることを含んで成り、そして段階(d)が前記粒子を前記混合物から回収し、そして前記回収された粒子と前記結合メンバーに対する標識された抗体とをインキュベートすることを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階(c)が、前記粒子を、前記タンパク質を含む液状媒体中で懸濁させることを含んで成り、そして段階(d)が前記粒子を前記混合物から回収し、そして前記回収された粒子を前記結合メンバーに対するビオチン化抗体とインキュベートし、そして、前記粒子と蛍光標識されたアビジンとを接触させることによって結合したビオチン化抗体を担持する粒子を検出することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記グルタチオンで覆われた粒子が、グルタチオンのスルフヒドリル基に対して共有結合している、アクセス可能なリジン残基を含有するタンパク質で最初に覆われた粒子を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アクセス可能なリジン残基を含むタンパク質がヘモグロビンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記差別化パラメーターは、粒子サイズ、蛍光減衰時間、光散乱の程度、蛍光の強度、吸光度、及び前方散乱光(foward light scatter)、側方散乱光(lateral light scatter)の組み合わせ、及び様々な波長の組み合わせおいての蛍光強度の組み合わせからなる群から選択される構成員である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記差別化パラメーターは、蛍光減衰時間、蛍光の強度、吸光度、及び前方散乱光、側方散乱光の組み合わせ、及び様々な波長の組み合わせにおいての蛍光強度の組み合わせからなる群から選択される構成員である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数の候補タンパク質の中から、選定の結合メンバーと親和性型の結合をするものを選択する為の方法であって、前記方法は:
(a)  グルタチオンS−トランスフェラーゼと融合した前記選定の結合メンバーを含んで成る第1融合タンパク質を形成し;
(b)  それぞれが、エピトープ標識と融合した前記候補タンパク質の１つを含んで成る複数の第2融合タンパク質を形成し;
(c)  前記第1融合タンパク質を、グルタチオンで覆われた複数の粒子に対して、前記第１融合タンパク質のグルタチオンS−トランスフェラーゼと前記グルタチオンとの親和性結合によって固定化し、ここで前記粒子は選定の差別化パラメーターの値によって異なる集団に分類でき;
(d)  粒子の各集団を個別に前記第2融合タンパク質の1つと、異なる候補タンパク質が粒子の各集団とインキュベートされるようにインキュベートし;そして
(e)  前記粒子の集団の全てと前記エピトープ標識に対して選択的に結合する標識された結合メンバーとのインキュベートをし、そして前記標識された結合メンバーが結合した粒子を検出し、そしてこのようにして検出された前記粒子の差別化パラメーター値と、それに結合した第2融合タンパク質との相関関係を取り、前記選定の結合メンバーに対して親和性型の結合により結合した候補タンパク質を同定する;
ことを含んで成る方法。
【請求項１０】
複数の候補タンパク質の中から、選定の結合メンバーと親和性型の結合をするものを選択する為の方法であって、前記方法は:
(a)  グルタチオンS−トランスフェラーゼと融合した前記選定の結合メンバーを含んで成る融合タンパク質を形成し;
(b)  それぞれの前記候補タンパク質と蛍光標識とを接合し、複数の蛍光接合体を形成し;
(c)  前記融合タンパク質を、グルタチオンで覆われた複数の粒子に対して、前記融合タンパク質のグルタチオンS−トランスフェラーゼと前記グルタチオンとの親和性結合によって固定化し、ここで前記粒子は選定の差別化パラメーターの値によって異なる集団に分類でき;
(d)  粒子の各集団を個別に前記蛍光接合体の1つと、異なる候補タンパク質の蛍光接合体が粒子の各集団とインキュベートされるようにインキュベートし;そして
(e)  前記蛍光標識が結合した粒子を検出し、そしてこのようにして検出された前記粒子の差別化パラメーター値と、それに結合した蛍光接合体との相関関係を取り、前記選定の結合メンバーに対して親和性型の結合により結合した候補タンパク質を同定する;
ことを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、タンパク質間相互作用を評価するスクリーニングアッセイの分野に属し、そして標的タンパク質に対する親和性について候補タンパク質を選別するスクリーニングアッセイの分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
２．従来技術の説明
多くの臨床試験及び研究調査には、特定のタンパク質に対して結合特異性を示すものを発見する為のタンパク質又はペプチドをスクリーニングする為、2つの相互作用するタンパク質の結合親和性を測定する為、及びタンパク質と第2のタンパク質の相互作用を担うタンパク質の部位又はアミノ酸を同定する目的の為の、タンパク質間相互作用の調査が伴なう。タンパク質の機能に関連する情報は、そのタンパク質が公知の機能を持つ他のタンパク質と相互作用するかどうか又は公知の機能を持つ他のタンパク質とどのようにして相互作用するかを測定するによって得られうる。この種類の情報は、薬剤のデザイン及びスクリーニングにおいても有用あり、そして一般に疾患の診断及び治療の為の方法の開発においても有用である。
【０００３】
本発明に更に関連するものは、グルタチオンとグルタチオンS−トランスフェラーゼの公知の特異的結合相互作用である。グルタチオン(γ−グルタミルシステニルグリシン)は高等動物の細胞中、約5mMの濃度で発見されるトリアミノ酸ペプチドである。グルタチオンの独特の特性は、その、グルタミル残基のαカルボキシル基ではなくγ−カルボキシル基での結合にある。グルタチオンS−トランスフェラーゼ(「GST」)はグルタチオンに対する親和性が高い26kDaのタンパク質である。この親和性は、タンパク質の精製において活用されてきた。それは、最初にGSTが融合パートナーとして含まれている組換えタンパク質を形成し、そしてグルタチオンが固定化されたカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって組換えタンパク質を精製することによる。GST含有組換えタンパク質も、GSTに融合しているタンパク質に対する抗体を検出する為の手段として用いられてきた。この方法は、Murray, A.Mら「Production of glutathione−coated microtitre plate for capturing recombinant glutathione S−transferase fusion protein as antigens in immunoassays」J.Immunol.Meth.218（1998）:pp.133〜139などに記載されている。
【０００４】
本発明に更に関連する可能性が有るものは、微粒子に対して結合する粒子及び物質の検出及び分析をする為のフローサイトメトリーの使用に関連する技術の記載である。フローサイトメトリーは、Coulter Electronics inc.によって抗原及び抗体を検出する為の使用が開示されており(1980年、2月13日に刊行された英国特許第1,561,042号)；そしてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)の産物を定量する為の使用がVlieger,A.M.ら  Analytical Biochemistry 205：pp.1〜7に開示されている。フローサイトメトリーにおける磁性粒子の使用は、1999年5月27日に刊行された、出願人はBio−Rad Laboratories Inc.,の国際特許出願刊行物第WO99／26067号、「Multiplex Flow Immunoassays With Magnetic Particles as Solid Phase」に開示されており、上に列挙した全ての参考文献は本明細書中に組み込まれている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
グルタチオンGST結合は、多重形態にある固体粒子の差別化可能集団（differentiable group）を用いるタンパク質間相互作用の研究における固定化結合（immobilizing linkage）として有効に働くということがこの度発見された。従って本発明は、他のタンパク質のような標的結合メンバーに対する選定のタンパク質の結合親和性に基づいて、特定のタンパク質が候補タンパク質の群から選択される異なるスクリーニング方法又は選別方法に属し、この選別は、フローサイトメトリーによって又は粒子を差別化する他の方法によって行われる。
【０００６】
本発明のある観点において、１つの候補タンパク質をGSTとの融合のパートナーとしてそれぞれが含む融合タンパク質が形成される。融合タンパク質は、一度形成されると、フローサイトメトリーによって互いに差別化されうる、異なる集団又は種類のグルタチオンで覆われた粒子上で固定化される。各集団は異なる融合タンパク質を有し、それ故に異なる候補タンパク質を有し、従って、個々の候補タンパク質は個別に差別化可能な粒子種類に結合している。次いで、全ての粒子は、所望の候補タンパク質が選択的に結合するだろう結合メンバーとインキュベートされ、そして結合メンバーが結合した粒子が検出される。検出された粒子種類とその粒子の種類に結合した融合タンパク質中に含まれている候補タンパク質との相関関係を取ることによって、当業者は、標的物質に対する特異的結合性を示す候補タンパク質を同定することができる。各種類の粒子に対して結合する標的物質の割合の違いを検出することによって、異なる候補タンパク質間での結合親和性(即ち、異なる結合強度)を比較するのに同様の又は類似の方法を用いることもできうる。
【０００７】
他の観点において、融合タンパク質は、GSTと標的結合メンバーとを組み合わせることによって形成される。次いで、更なる融合タンパク質が形成され、それぞれ1つには1候補タンパク質＋1エピトープ標識が含まれる。次いで、GST含有融合タンパク質は、フローサイトメトリーによって互いを差別化できうる異なる集団又は種類の、グルタチオンで覆われた粒子上に固定化され、その後、各種類は、候補タンパク質−エピトープ融合タンパク質の1つとインキュベートされる。次いで、各粒子クラスは、別個の候補タンパク質−エピトープ融合タンパク質、故に別個の候補タンパク質とインキュベートされ、そして標的結合メンバーに対して選択的に結合する候補タンパク質とインキュベートされた粒子のみがその後(異なる親和性結合及び共有結合を介して)エピトープを有するだろう。次いで、これらの粒子上に存在するエピトープ標識は、粒子をエピトープ標識に対する標識された抗体とインキュベートすることによって測定され、そして上記のようにして相関関係を取ること及び同定が行われて良い。
【０００８】
第3の観点において、候補タンパク質は、蛍光標識など直接検出可能標識に対して接合され、そして接合体は、候補タンパク質−エピトープ融合タンパク質の代わりに用いられる。
【０００９】
本発明の中心的な考え方の更なる観点、実施態様、実施、及び用途は、以下の記述から明らかになるだろう。
【００１０】
発明の詳細な説明及び実施態様
用語「融合タンパク質」とは、任意の方法でもしくは任意の種類の結合、共有結合、静電気的結合、疎水性相互作用、親和性型結合、によって結合した2つのタンパク質もしくはペプチドの組み合わせを示す為に、又は別の方法の、パートナー間での結合を維持し、本発明において行われる手順の段階中に結合が解裂するのを防ぎ、そしてタンパク質の結合特性を実質的に変化させない方法よって結合した2つのタンパク質もしくはペプチドの組み合わせを示す為に本明細書中で用いられている。本発明の目的の為の好適な種類の融合タンパク質とは、2種以上の遺伝子がコードする配列が同じ読み枠にあるように、即ち、遺伝子装置（genetic apparatus）が遺伝子融合を単一遺伝子として読むように結合されている2つ以上の異なる遺伝子の部分を含む組換え遺伝子から作製されたポリペプチドである。この種類の融合タンパク質はハイブリッドタンパク質又はキメラタンパク質としても公知である。
【００１１】
用語「接合」とは、タンパク質に関連して、任意の結合の種類、共有結合、静電気的結合、疎水性相互作用、親和性型結合によって結合したタンパク質と他の物質、例えば標識、結合メンバー、もしくはエピトープ標識どの組み合わせを示す為に、又は別の方法の、パートナー間での結合を維持し、本発明の実施において行われる手順の段階中に結合が解裂するのを防ぎ、そしてタンパク質の結合特性を実質的に変化させない方法よって結合したタンパク質と他の物質の組み合わせを示す為に本明細書中で用いられている。
【００１２】
用語「候補タンパク質」とは、結合特異性、結合親和性又はその両方の観点から、他のポリペプチドと比較される任意の長さもしくは大きさのポリペプチドを示す為に本明細書中で用いられている。
【００１３】
本発明で用いられる為のグルタチオンで覆われた粒子は、当業界で公知の方法によって調製されている。適切な方法とは、GSTに対するグルタチオンの結合親和性が損なわれないような方法において、グルタチオンが粒子表層に対して結合しているものである。かかる結合は、例えば、グルタチオンの中心スルフヒドリル基によって達成されて良い。これらのスルフヒドリル基は、粒子表層に対して予め適用されているタンパク質コーティング上のリジン残基に共有結合できうる。従って、グルタチオンで覆われた粒子を形成する好適な手段とは、GSTに対する非特異的親和性のレベルが非常に低く（又はゼロ）且つ結合の為にアクセス可能性であり続けるリジン残基を有するタンパク質で粒子を最初に覆い、次いでヘテロ2官能性架橋剤によりグルタチオン分子のスルフファチジル基を前記リジン残基に対して結合させる手段である。GSTに対する非特異的結合親和性が低く、そしてアクセス可能なリジン残基を有するタンパク質の例はヘモグロビンである。リジン残基とスルヒドリル基を結合させる為の適切なヘテロ2官能性架橋剤の例は、スルホスクシニミジル４−（p−マレイミドフェニル）ブチラートである。リジン含有タンパク質及びヘテロ2官能性架橋剤の他の例は、当業者によって明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ヘモグロビンとスルホスクシニミジル４−（p−マレイミドフェニル）ブチラートを用いることでのコーティング手順とは、粒子を例えば、0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6中のウシヘモグロビン2％（重量で）の溶液と数時間に渡りインキュベートし、当該粒子を洗浄し、次いで前記粒子を室温で１時間に渡り、PBS中でスルホスクシニミジル４−（p−マレイミドフェニル）ブチラート（0.1〜1.0mM）の溶液でインキュベートすることからなって良い。その後、粒子はPBSで洗浄され、還元グルタチオン溶液（10〜50mM）共に、脱気した10mMのリン酸酸トリウム、0.15Mの塩化ナトリウム、1mMのエチレンジアミンテトラ酢酸中、pH6.7で数時間に渡り室温でインキュベートされ、しかる後に洗浄される。
【００１５】
融合タンパク質を調製する為の組換え方法は当業者に周知であり、そしてかかる公知の手順は本発明の実施において用いられて良い。前記手順は、例えば、GSTと融合するタンパク質をコードする領域及びGSTをコードする領域の構築体を形成して当該構築体をGST融合タンパク質発現ベクター（例えば、Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey,USAから入手できるpGEX−5x−1）のフレームの中に挿入し、その後、タンパク質を大腸菌（E.Coli）中で発現させることからなって良い。その後タンパク質（候補タンパク質又は標的タンパク質）の発現は、抗GST抗体によるウェスタンブロッティングによって検出できうる。
【００１６】
融合タンパク質のGST部分を粒子上のグルタチオンコーティングに対して結合させる為及び候補タンパク質を標的結合メンバーに対して結合させる為のインキュベーションは、免疫学及びタンパク質結合研究者によく知られている日常的な手段によって行われて良い。液相からの固層の分離及び洗浄段階も常用且つ日常的な方法に従って行われる。
【００１７】
候補タンパク質−標的タンパク質結合の検出は、親和性型の結合又はタンパク質検出が一般に行われるイムノアッセイ及び他の手順において有効であることが知られている任意の様々な標識を用いることによって達成されて良い。例えば、GST融合タンパク質がGSTと候補タンパク質の融合体である場合、前記標識は標的タンパク質に対する抗体に接合されて良い。この場合の標識は、例えば、蛍光標識、化学発光標識、又は自動化された装置によって検出可能及び測定可能であるシグナルを放射する任意の他の標識であって良い。もう1つの方法としては、ビオチン化抗体が用いられて良く、そして検出は、粒子と発蛍光団標識したアビジンとをインキュベートすることによって達成されて良い。このような用途の為に特に好都合な発蛍光団は、フィコエリトリンである。更なる代わりの方法としては、候補タンパク質又は標的タンパク質が、発蛍光団又は化学発光標識などの検出可能標識に接合されていて良い。従って、GST融合タンパク質が、GSTと候補タンパク質の融合体である場合、発蛍光団又は化学発光標識が接合されている標的タンパク質が用いられ、そして標識は直接検出されて良く、又はGST融合タンパク質が、GSTと標的タンパク質の融合体である場合、個々の候補タンパク質には、発蛍光団又は化学発光標識が接合されていて良い。
【００１８】
本発明の実施において用いられた粒子は、微視サイズであるのが好ましく、それ故に、微粒子といわれて良い。この微粒子は一般に、イムノアッセイにおいてこの粒子が有効に機能することを可能にする所定の特性を持つポリマー性材料から形成される。かかる特性１つには、候補タンパク質及び標的タンパク質及び粒子をグルタチオンで覆う為に用いられる試薬以外のアッセイ試薬に対しては前記ポリマー性材料が不活性であるということが挙げられる。他の特性とは、前記粒子が固体状であり、そして反応媒体及び手順の中で用いられた任意の他の溶媒又は担体中で不溶性であり、そして前記粒子がその表層に対してグルタチオンを結合させることができるが、これは上記の、ヘモグロビンのような仲介タンパク質コーティングを用いることによって達成されるという特性である。蛍光が検出の手段として用いられるであろう場合、前記ポリマー性の材料は、最小量の自己蛍光を示すものであるのが好ましい。適切なポリマー性材料の例は、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、酸化ポリアルキレン、ポリアミド、ポリウレタン、多糖類、セルロース、及びポリイソプレンである。粒子に対して構造の健全性及び厳密性を与える為に、多くのポリマーにおいて架橋を行うことは有用である。
【００１９】
フローサイトメトリーと組み合わせた蛍光による検出が行われる実施態様において、強い自己蛍光を放つ粒子の使用を避ける為の注意が払われるべきである。その理由は、この自己蛍光がスクリーニング検出に干渉を及ぼすだろうからだ。自己蛍光が弱い粒子は、標準の乳化重合技術によって異なる開始モノマーから作製されて良い。空隙率が高く且つ表面積が広い粒子（即ち「マクロポーラス」粒子）、並びにジビニルベンゼンモノマーの％が高い粒子は避けられるべきである。何故なら、それらは強い自己蛍光を発する傾向があるからだ。しかしながら一般に、本発明で用いる為に適切な粒子の大きさは様々であって良く、そして大きさは本発明において重要ではない。多くの場合、粒子範囲が直径で約0.3μm〜約100μm、好ましくは約0.5μm〜約40μmにある粒子集団で最良の結果が得られるだろう。
【００２０】
手順の段階において、粒子が液状反応媒体から分離される場合、かかる分離を達成する1つの手段は、磁気反応性物質（magnetically responsive materials）で作製された又は磁気反応性物質を含む粒子を用いることである。本発明の実施において用いることができうる磁気反応性物質としては、常磁性体、強磁性体、フェリ磁性体、及びメタ磁性体が挙げられる。常磁性体が好的である。例は、鉄、ニッケル、及びコバルト、並びに金属酸化物、例えばFe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3及びCoMnPである。磁気反応性物質により粒子全体が構築されて良いが、粒子の成分は1つのみあり、残りは、磁気反応性物質が添加されているポリマー性材料であるのが好ましい。
【００２１】
磁気反応性物質を含む粒子が用いられる場合、粒子中でのかかる物質の量は重要ではなくそして広い範囲に渡り変わって良い。しかし、量は粒子の密度に影響を及すが、量と粒子サイズは、懸濁状態にある粒子の維持しやすさに影響を及ぼす。懸濁を保つことは、液相と固相が最大限に接触するのを促し、そしてフローサイトメトリーを円滑にする働きがある。蛍光が検出の役割を果たす手順において、粒子中に過剰量である磁気反応性物質も当該手順を妨げるのに十分高レベルの自己蛍光を生産するだろう。従って、磁気反応性物質の濃度は、当該物質から発せられる全ての自己蛍光の量を最小限にとどめる少ない量であることが好ましい。これらを考慮することにより、本発明に従う粒子中での磁気反応性物質は、粒子全体で約1重量％〜75重量％の範囲にあるのが好ましい。一層好適な重量％の範囲は、約2％〜約50％であり、そして尚好ましい重量％の範囲は、約3％〜約25％であり、そして更に好ましい重量％の範囲は、約5％〜約15％である。磁気反応性物質は、ポリマー表層に対するコーティングとして適用される、もしくは表層に対する2つ以上のコーティングの１つとして適用される、又はポリマーマトリックス中で当該物質を固定化する他の任意の方法において組み込みもしくは添加されて、ポリマー全体に分散されて良い。
【００２２】
本発明に従う粒子を用いることでの多重化は、粒子を2つ以上の集団に分けることによって達成され、各集団は他の集団から「差別化パラメーター(differentiation parameter)」（この用語は、本明細書中では、ある集団のアッセイ結果と他の集団のアッセイ結果との独立の検出を可能にする、識別可能な特性を意味する為に用いられている）によって差別化されることができる。粒子の様々な集団を識別に用いることができうる差別化パラメーターの１つの例は、粒子サイズである。この例において、集団は、サイズの非重複サブレンジ（subrange）よって規定さている。粒子は、2つ以上のかかるサブレンジに分類され、そして多くの場合、このサブレンジの数は2〜100であって良く、１のアッセイでは各々は選択的に活性（active）であり、そして同時に実行又は検出が行われる他のアッセイに関しては作用しない（inactive）。
【００２３】
サイズサブレンジの幅及び隣接するサブレンジの平均直径の間隔は、フローサイトメトリーによるサブレンジの差別化をはかれるように選択され、そしてそれはそれはフローサイトメトリーを使用する当業者及び装置において明らかであろう。本明細書中で、用語「平均直径」とは、数平均直径をいう。多くの場合、好適なサブレンジ範囲は、平均直径のCV±5％以下であり、ここで、CVとは変動係数であり、そして（粒子直径の標準偏差／平均粒子直径）×100％として定義されている。異なるサブレンジにおいて平均直径同士の最小間隔は、粒子サイズ分布、異なる融合タンパク質を付着させる目的の為のサイズによる粒子分類のしやすさ、フローサイトメトリー装置の種類と感度によって変える事ができる。多くの場合、異なるサブレンジの平均直径がサブレンジの1つの平均直径の約6％以上、好ましくは約8％以上、そして最も好ましくは10％以上に離れて広がっている時に最適な結果が達成されるだろう。他の好適なサブレンジ幅の関係とは、各サブレンジ内の粒子直径の標準偏差が、隣接サブレンジの平均直径の分離の1／3未満である。
【００２４】
粒子の様々な集団を識別をするのに用いることができうる差別化パラメーターの他の例は、蛍光である。異なる蛍光放出スペクトルを有し且つこれを基に識別可能である様々な蛍光物質を粒子中に組み込むことで差別化が達成される。
【００２５】
実際に、蛍光は、集団を互いに識別する手段及び粒子に対して行われるアッセイの為の検出手段の両方として用いることができうる。異なる放射スペクトルを有する複数の蛍光物質を使用することにより、集団を互いに識別する手段が供され、そして集団分類とアッセイ検出との識別をする手段として用いられる。蛍光物質の組み合わせの例であって、その物質の1つは集団を識別する手段として用いることができ、そしてもう一方の物質はアッセイ検出の為に用いることができうる蛍光物質の組み合わせの例は、フルオレセインとフィコエリトリンの組み合わせである。異なる粒子集団が異なる濃度のフルオレセインで染められ、そして標識された結合タンパク質は、それに標識として連結したフィコエリトリンを有する。
【００２６】
粒子の様々な集団を識別をするのに用いることができうる差別化パラメーターの更なる他の例には、光散乱、光放射、又は光散乱と光放射の組み合わせが挙げられる。側方散乱光（side angle light scatter）は、粒子サイズ、粒状性、吸光度及び表面粗度により変わる一方で、前方散乱光（forward angle light scatter）は主にサイズ及び屈折率により影響を受ける。従って、任意のこれらの性質を変化させることにより、様々な集団を識別する手段として働かせることができる。光放射は、微粒子中に蛍光物質を組み込むこと及び様々な蛍光強度を有するもしくは様々な波長の蛍光を放射する蛍光物質を用いることによって、又は組み込まれる蛍光物質の量を変化させることによって、変えることができうる。様々な波長の複数の蛍光放射物を用いることによって、波長の違いを用いて粒子集団を互いに識別でき、そしてアッセイ中に結合反応が生じていることを示す標識を、粒子集団を同定する標識から識別することもできる。
【００２７】
好適な実施態様では、粒子には2つ以上の発蛍光団又は蛍光色素がその内に組み込まれて良く、従って、アレー中の各粒子はそれに関連する3つ以上の識別可能なパラメーター、即ち、2つの異なる波長の蛍光放射と一緒に、側方散乱光を有して良い。例えば、前記粒子はCy5のような赤い蛍光色素をCy5.5のようなオレンジの蛍光色素と一緒に含むように作製されて良い。システムを更に拡張するのに更なる蛍光色素が用いられて良い。従って、各粒子は様々な波長の複数の蛍光色素を含むことができる。
【００２８】
粒子の様々な集団を識別するのに用いることができうる差別化パラメーターの更なる他の例は、吸光度である。光が粒子に対して適用される場合に、粒子による光の吸収は、多くの場合、横方向（側方）に散乱した光の強さによって示されるが、前方に散乱した光の強度は、比較的影響を受けない。従って、粒子に結合した様々な着色色素における吸光度の差異は、横方向に散乱した光の強度の違いを観察することによって決定される。
【００２９】
上記の例が示すように、多くの異なるパラメーター又は特性は、ある集団の粒子を他の集団のものから識別する為の差別化パラメーターとして用いることができうる。差別化パラメーターは、粒子サイズ、粒子組成、光散乱に影響を与える粒子の物理的特性、粒子に対して様々な放射スペクトル及び／もしくは散乱特性を与える励起可能な蛍光色素もしくは着色色素、又は異なる濃度の1もしくは複数の蛍光色素から生じる。識別可能な粒子パラメーターが蛍光色素又は蛍光着色剤である場合、それで粒子の表層を覆うこと、それを粒子中に埋め込むこと、又は粒子材料の分子に結合させることができうる。従って、蛍光粒子は、ポリマー性材料と蛍光色素とを組み合わせること、又は粒子に色素を刷り込むことによって作製されて良い。色素が予め組み込まれておりその結果本発明中で用いる為に適切な粒子は、Spheiotech, Inc (Libertyvill, Illinois, USA) 及びMolecelar Probes, Inc. (Eugene, Oregon, USA) などの供給者から商業的に入手可能である。
【００３０】
フローサイトメトリーの使用伴う本発明の実施態様について、フローサイトメトリーの方法及び装置は当業界で公知である。フローサイトメトリーの装置及び方法の説明の例は以下の刊行物に記載されている。McHugh,「Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes」Methods in Cell Biology 42, Part B (Academic Press, 1994) ; McHughら、「Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytometry Instrumentation」Clinical Flow Cytometry, Bauer, K.D.,ら、eds. (Baltimore, Maryland, USA : Williams and Williams, 1993), pp. 535〜544 ; Lindmoら、「Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity」J. Immunol. Meth. 126 : pp. 183〜189 (1990) ; McHug,「Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays」Immunochemica 5 : p. 116 (1991) ; Horanら、「Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis : Rheumatoid Factor Specificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry」Immunoassays in the Clinical Laboratory, pp. 185〜189 (Liss 1979) ; Wilsonら、「A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry」J. Immunol. Meth. 107 : pp. 225〜230 (1988) ; Fulwylerら、「Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes」Meth. Cell Biol. 33 : pp. 613〜629 (1990) ; Coulter Electronics Inc、英国特許第1,561,042号（1980年2月13日に刊行された) ; 及び Steinkampら、Review of Scientific Instruments 44 (9) : pp. 1301〜1310 (1973)。これらの参考文献中で開示された内容は本明細書中に参照として組み込まれている。
【００３１】
図には、本発明に従う選り抜きの手順の為の結合の順番が非常に簡単に例示されている。フローサイトメトリーによって識別可能である個々の集団に分けられる多量の微小ビーズ（小さな円の形態の単一ビーズによって図中に示されている）は全て、グルタチオン（三角形で示されている）で覆われており、次いでそのことによりGST融合タンパク質（三日月で示されている）に対して結合可能になる。本発明のある実施態様では、各融合タンパク質とは、GSTと候補タンパク質の1つ（「タンパク質A」として示される）との融合であり、そして、個々の候補タンパク質は粒子の個々の集団と結合する。従って、単一の三日月型記号のみが図中に示されているが、これは互いに「タンパク質A」成分が異なる複数の融合タンパク質を表す。次いで、標的タンパク質（単一のタンパク質でありそして用語「タンパク質B」が記されているより大きな円形で表す）の溶液が、全集団の粒子（分離されている状態である必要はないが溶液中で単一の懸濁を形成できる）とインキュベートされ、そして標的タンパク質は、当該標的タンパク質に対する結合親和性を有する候補タンパク質を伴う融合タンパク質に対して結合するだろう。次いで、標的タンパク質（「タンパク質B」）に対して特異的結合親和性を有する標識された抗体（だ円形の標識を伴う横向きのY字の記号で示された）が前記粒子とインキュベートされ、そして当該標的タンパク質に対して結合する。その後、前記粒子は液相から分離され、そして候補タンパク質成分が標的タンパク質に対して結合する融合タンパク質の付着していたものがそれらに対して接着する標識を有する。次いで、これらの標識された粒子は、フローサイトメトリーによって検出され、そして検出された粒子集団はその集団に対する候補タンパク質（「タンパク質A」）との相関関係を取られ、そうすることによって標的タンパク質（「タンパク質B」）に対して結合する特定の候補タンパク質が同定される。
【００３２】
もう１つの方法の例示としては、標的タンパク質が「タンパク質B」ではなく、「タンパク質A」であり、グルタチオン−GST相互作用により粒子に対して結合する融合タンパク質（三日月型）は、全ての粒子に対して結合する共通の融合タンパク質（共通の標的タンパク質成分を伴う）である。「タンパク質B」は候補タンパク質（多数をまとめて単一の記号で示されている）を示し、そして粒子の個々の集団は、各候補タンパク質が粒子の単一の集団と結びつくように、様々な候補タンパク質とのインキュベートをする間分けられている。候補タンパク質が全て直接標識されて良いこと及びこの粒子に対して結合するようになるもののみが、検出される標識を有するだろうこと以外は、残りの手順は、先の段落で記載されたのと同じである。同じ種類の相関関係を用いることで、標的タンパク質（GST融合タンパク質の一部である）に対して結合する特定の候補的分子が同定される。
【００３３】
前述の説明は主に例示の目的で示されている。示された材料と手順の更なる変更及び代案は上記本発明の範囲内であることは当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図は本発明によるスクリーニング手順の概略図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月20日(2002.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月2日(2003.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の候補タンパク質の中から、選定の結合メンバーと親和性型の結合をするものを選択する為の方法であって、前記方法は:
(a)  それぞれが、グルタチオンS−トランスフェラーゼと融合した前記候補タンパク質の１つを含んで成る融合タンパク質を形成し;
(b)  前記融合タンパク質を、グルタチオンで覆われた複数の粒子に対して、前記グルタチオンS−トランスフェラーゼと前記グルタチオンとの親和性によって固定化し、ここで前記粒子は、選定の差別化パラメーター(differentiation parameter)の値によって異なる集団に分類でき、従って、各々の集団はそれに結合した異なる融合タンパク質を有し;
(c)  前記複数の粒子を単一の混合物に組み合わせ、そして前記混合物と前記選定の結合メンバーとをインキュベートし;そして
(d)  前記選定の結合メンバーが結合した粒子を検出し、そしてこのようにして検出された前記粒子の差別化パラメーターの値と、それに結合した融合タンパク質との相関関係を取り、前記選定の結合メンバーに対して親和性型の結合により結合した候補タンパク質を同定する;
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記融合タンパク質が組換えDNAによって形成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階(c)が、前記粒子を、前記タンパク質を含む液状媒体中で懸濁させることを含んで成り、そして段階(d)が前記粒子を前記混合物から回収し、そして前記回収された粒子と前記結合メンバーに対する標識された抗体とをインキュベートすることを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階(c)が、前記粒子を、前記タンパク質を含む液状媒体中で懸濁させることを含んで成り、そして段階(d)が前記粒子を前記混合物から回収し、そして前記回収された粒子を前記結合メンバーに対するビオチン化抗体とインキュベートし、そして、前記粒子と蛍光標識されたアビジンとを接触させることによって結合したビオチン化抗体を担持する粒子を検出することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記グルタチオンで覆われた粒子が、グルタチオンのスルフヒドリル基に対して共有結合している、アクセス可能なリジン残基を含有するタンパク質で最初に覆われた粒子を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アクセス可能なリジン残基を含むタンパク質がヘモグロビンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記差別化パラメーターは、粒子サイズ、蛍光減衰時間、光散乱の程度、蛍光の強度、吸光度、光散乱及び蛍光強度の組み合わせ、並びに様々な波長の組み合わせにおいての蛍光強度の組み合わせからなる群から選択される構成員である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記差別化パラメーターは、蛍光減衰時間、蛍光の強度、吸光度、光散乱及び蛍光強度の組み合わせ、並びに様々な波長の組み合わせにおいての蛍光強度の組み合わせからなる群から選択される構成員である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数の候補タンパク質の中から、選定の結合メンバーと親和性型の結合をするものを選択する為の方法であって、前記方法は:
(a)  グルタチオンS−トランスフェラーゼと融合した前記選定の結合メンバーを含んで成る第1融合タンパク質を形成し;
(b)  それぞれが、エピトープ標識と融合した前記候補タンパク質の１つを含んで成る複数の第2融合タンパク質を形成し;
(c)  前記第1融合タンパク質を、グルタチオンで覆われた複数の粒子に対して、前記第１融合タンパク質のグルタチオンS−トランスフェラーゼと前記グルタチオンとの親和性結合によって固定化し、ここで前記粒子は選定の差別化パラメーターの値によって異なる集団に分類でき;
(d)  粒子の各集団を個別に前記第2融合タンパク質の1つと、異なる候補タンパク質が粒子の各集団とインキュベートされるようにインキュベートし;そして
(e)  前記粒子の集団の全てと前記エピトープ標識に対して選択的に結合する標識された結合メンバーとのインキュベートをし、そして前記標識された結合メンバーが結合した粒子を検出し、そしてこのようにして検出された前記粒子の差別化パラメーター値と、それに結合した第2融合タンパク質との相関関係を取り、前記選定の結合メンバーに対して親和性型の結合により結合した候補タンパク質を同定する;
ことを含んで成る方法。
【請求項１０】
複数の候補タンパク質の中から、選定の結合メンバーと親和性型の結合をするものを選択する為の方法であって、前記方法は:
(a)  グルタチオンS−トランスフェラーゼと融合した前記選定の結合メンバーを含んで成る融合タンパク質を形成し;
(b)  それぞれの前記候補タンパク質と蛍光標識とを接合し、複数の蛍光接合体を形成し;
(c)  前記融合タンパク質を、グルタチオンで覆われた複数の粒子に対して、前記融合タンパク質のグルタチオンS−トランスフェラーゼと前記グルタチオンとの親和性結合によって固定化し、ここで前記粒子は選定の差別化パラメーターの値によって異なる集団に分類でき;
(d)  粒子の各集団を個別に前記蛍光接合体の1つと異なる候補タンパク質の蛍光接合体が粒子の各集団とインキュベートされるようにインキュベートし;そして
(e)  前記蛍光標識が結合した粒子を検出し、そしてこのようにして検出された前記粒子の差別化パラメーター値と、それに結合した蛍光接合体との相関関係を取り、前記選定の結合メンバーに対して親和性型の結合により結合した候補タンパク質を同定する;
ことを含んで成る方法。
【国際調査報告】
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