(57)【要約】明細書に記載したのは、結腸直腸癌の診断および予後診断のために使用可能な方法である。さらに、結腸直腸癌を調節可能にする候補となる対生物作用剤をスクリーニングするのに使用可能な方法が記載されている。加えて、結腸直腸癌および他の癌における治療上の介入のための方法および分子標的（遺伝子およびその生成物）が記載されている。
2004510951.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤候補をスクリーニングする方法において、
ａ）　ＣＺＡ８，ＢＣＸ２，ＣＢＣ２，ＣＢＣ１，ＣＢＣ３，ＣＪＡ８，ＣＪＡ９，ＣＧＡ７，ＢＣＮ５，ＣＱＡ１，ＢＣＮ７およびＣＱＡ２またはこれらのフラグメントから成るグループから選択されたタンパク質をコードする発現プロフィール遺伝子を発現させる細胞を提供し、
ｂ）　前記細胞に薬剤候補を添加し、さらに、
ｃ）　前記発現プロフィール遺伝子の発現に基づき、前記薬剤候補の効果を検出する
ことを特徴とする、薬剤候補をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記検出が前記薬剤候補が存在しないときの発現レベルを前記薬剤候補が存在するときの発現レベルと比べることを含んで成り、ここで前記薬剤候補の濃度はそれが存在するときは変えてよく、前記比較は薬剤候補の添加または除去のあとで行ってよい、請求項１記載の方法。
【請求項３】
薬剤候補の導入の結果、前記プロフィール遺伝子の発現が減じる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
結腸直腸癌調節タンパク質（ＣＣＭＰ）に結合可能な対生物作用剤のためのスクリーニング法において、前記ＣＣＭＰがＣＪＡ８またはそのフラグメントであり、前記方法が、前記ＣＣＭＰと候補の対生物作用剤とを組み合わせ、前記ＣＣＭＰに対する前記候補剤の結合を検出することを含むことを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項５】
結腸直腸癌調節タンパク質（ＣＣＭＰ）の活性を調節することができる対生物作用剤のためのスクリーニング法において、前記ＣＣＭＰがＣＪＡ８またはそのフラグメントであり、前記方法が、前記ＣＣＭＰと候補の対生物作用剤とを組み合わせ、前記ＣＣＭＰの対生物作用における前記候補剤の効果を検出することを含むことを特徴とする、スクリーニング方法。
【請求項６】
候補の結腸直腸癌薬剤の効果を評価する方法において、
ａ）　前記薬剤を患者に投与し、
ｂ）　前記患者から細胞サンプルを除去し、
ｃ）　前記細胞の発現プロフィールを検出する
ことを特徴とする、候補の結腸直腸癌薬剤の効果を評価する方法。
【請求項７】
さらに、前記発現プロフィールを、健康な個体の発現プロフィールと比べる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＣＪＡ８１をコードする核酸セグメントまたはそのフラグメントを含んでなり、１０００個未満の核酸プローブを含んで成ることを特徴とする生物チップ。
【請求項９】
結腸直腸癌を診断する方法において：
ａ）第１の個体の第１の組織タイプで、ＣＪＡ８をコードする遺伝子をまたはそのフラグメントの発現を検出し、
ｂ）前記遺伝子の前記発現を、前記第１の個体または影響を受けていない第２の個体由来の正常な第２の組織タイプから得られた遺伝子の発現と比較し、
前記発現における差異が、第１の個体が結腸直腸癌を有していることを示す
ことを特徴とする、結腸直腸癌を診断する方法。
【請求項１０】
ＣＪＡ８またはそのフラグメントに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１１】
ＣＡＡ９またはそのフラグメントに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１２】
前記フラグメントがＣＡＡ９ｐ１、ＣＡＡ９ｐ２、ＣＡＡ９ｐ３、ＣＡＡ９ｐ４、ＣＡＡ９ｐ４ＭＡＰＳ、ＣＡＡ９ｐ５、ＣＡＡ９ｐ５ＭＡＰＳのグループから選択されている、請求項１１記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１０記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が抗体フラグメントである、請求項１０記載の抗体。
【請求項１６】
結腸直腸癌調節タンパク質（ＣＣＭＰ）またはそのフラグメントと、前記ＣＣＭＰまたはそのフラグメントに結合する抗体との結合を干渉することができる対生物作用剤のためのスクリーニング法において、
ａ）　ＣＣＭＰまたはそのフラグメントと、候補の対生物作用剤と、前記ＣＣＭＭＰまたはそのフラグメントに結合する抗体とを組み合わせ、
ｂ）　前記ＣＣＭＰまたはそのフラグメントと前記抗体との結合を検出する
ことを特徴とする、スクリーニング法。
【請求項１７】
結腸直腸癌を阻害する方法において、該方法が、ＣＡＪ８またはそのフラグメントに対する抗体を含んで成る組成物を細胞に投与することを含んで成ることを特徴とする、結腸直腸癌を阻害する方法。
【請求項１８】
前記細胞が個体の細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記個体が癌を有している、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が抗体フラグメントである、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
細胞内の結腸直腸癌を阻害する方法において、該方法が、ＣＪＡ８に対するアンチセンス分子を含んで成る組成物を細胞に投与することを含んで成ることを特徴とする、細胞内の結腸直腸癌を阻害する方法。
【請求項２３】
ＣＡＡ９ｐ１、ＣＡＡ９ｐ２、ＣＡＡ９ｐ３、ＣＡＡ９ｐ４、ＣＡＡ９ｐ４ＭＡＰＳ、ＣＡＡ９ｐ５またはＣＡＡ９ｐ５ＭＡＰＳから本質的に成ることを特徴とする、ペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のペプチドを含んで成ることを特徴とする、組成物。
【請求項２５】
個体内で免疫反応を誘導させる方法において、該方法が、ＣＪＡ８またはそのフラグメントを含んで成る組成物を前記個体に投与することを含んで成ることを特徴とする、個体内で免疫反応を誘導させる方法。
【請求項２６】
個体内で免疫反応を顕在化させる方法において、該方法が、ＣＪＡ８をコードする配列またはそのフラグメントを含んで成る核酸を含んで成る組成物を、前記個体に投与することを含んで成ることを特徴とする、個体内で免疫反応を誘導させる方法。
【請求項２７】
個体内で免疫反応を誘導させることができる組成物において、該組成物がＣＪＡ８またはそのフラグメントと、医薬的に許容されるキャリヤとを有していることを特徴とする、個体内で免疫反応を誘導させることができる組成物。
【請求項２８】
個体内で免疫反応を誘導させることができる組成物において、該組成物が、ＣＪＡ８をコードする配列またはそのフラグメントを含んで成る核酸を含んで成る組成物と、医薬的に許容されるキャリヤとを含んで成ることを特徴とする、個体内で免疫反応を誘導させることができる組成物。
【請求項２９】
結腸直腸癌に対して個体を治療するための方法において、前記個体にＣＪＡ８の阻害剤を投与することを含んで成ることを特徴とする、結腸直腸癌に対して個体を治療するための方法。
【請求項３０】
前記阻害剤が抗体である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
結腸直腸癌を有する個体の予後の状態を判断するための方法において、サンプル中のＣＪＡ８のレベルを検出することを含んでなり、高レベルのＣＪＡ８が劣悪な予後を示すことを特徴とする、結腸直腸癌を有する個体の予後の状態を判断するための方法。
【請求項３２】
ＣＪＡ８またはそのフラグメントの効果を中和する方法において、前記タンパク質にとって特異的な薬剤を、中和に十分な量で前記タンパク質に接触させることを含んで成ることを特徴とする、ＣＪＡ８またはそのフラグメントの効果を中和する方法。
【請求項３３】
治療用成分を結腸直腸癌組織に局在させる方法において、前記治療用成分に接合させたＣＪＡ８またはそのフラグメントに対する抗体の作用下に、前記組織を置くことから成ることを特徴とする、方法。
【請求項３４】
前記治療用成分が細胞障害剤である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記治療用成分が放射性同位元素である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
結腸直腸癌を治療するための方法において、治療用成分に接合させたＣＪＡ８またはそのフラグメントに対する抗体を、結腸直腸癌を有する個体に投与することを含んで成ることを特徴とする、結腸直腸癌を治療するための方法。
【請求項３７】
前記治療用成分が細胞障害剤である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記治療用成分が放射性同位元素である、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、直腸結腸癌に関与する発現プロフィールおよび核酸の同定ならびに直腸結腸癌の診断および予後におけるこのような発現プロフィールおよび核酸の使用に関する。本発明は、さらに、直腸結腸癌を調整する候補因子および／または標的の同定法および使用法に関する。
【０００２】
（発明の背景）直緒結腸癌は西洋人に多い癌である。これは、正常な結腸上皮の侵襲性癌への病理学的変換の結果として発症する。２つのクラスの遺伝子（腫瘍抑制遺伝子およびプロトオンコジーン）の変異を含む直緒結腸癌に関連している多数の最近特徴づけられた遺伝子の変化が存在し、最近の研究により、ＤＮＡ修復遺伝子の変異もまた腫瘍形成に関連し得ることが示唆されている。例えば、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子（腫瘍抑制遺伝子）の両対立遺伝子の変異の不活化は、直腸結腸癌の最も早い事象の１つであるようであり、開始事象でもあり得る。直腸結腸癌に関連する他の遺伝子には、ＭＣＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＤＣＣ（直腸結腸癌欠失）遺伝子、および他の染色体１８ｐ遺伝子、およびＴＧＦ−βシグナル伝達経路遺伝子が含まれる。総説として、「直腸結腸癌の分子生物学」、２３８〜２９９、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｃａｎｃｅｒ、Ｓｅｐ／Ｏｃｔ、１９９７を参照のこと。
【０００３】
直腸結腸癌の画像診断は、問題が多く、かつ制限される。さらに、腫瘍細胞の局所リンパ節への散在（転位）は、重要な予後因子である。５年生存率は、リンパ節転移していない患者の８０％からリンパ節転移している患者では４５〜５０％に低下する。以前は直腸結腸癌の大部分に存在するが正常な組織には存在しないとされていたが、最近の報告で癌胎児性抗原のｍＲＮＡの存在に基づく逆転写ＰＣＲ法を用いてリンパ節から微小転移を検出することができることが示された。Ｌｉｅｆｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ．ｏｆ　Ｍｅｄ、３３９（４）、２２３、１９９８。
【０００４】
したがって、直腸結腸癌の診断および予後に使用することができる方法が望ましいであろう。したがって、本発明では直腸結腸癌の診断および予後に使用することができる方法を提供する。さらに、直腸結腸癌を調節することができる候補生物活性剤のスクリーニングに使用することができる方法を提供する。さらに、本発明では、直腸結腸癌および他の癌における治療介入用の分子標的を提供する。
【０００５】
発明の要旨
本発明は、直腸結腸癌を調節する組成物のスクリーニング法を提供する。本発明はまた、細胞、好ましくは直腸結腸癌細胞の増殖阻害法を提供する。癌治療法および組成物もまた提供する。
【０００６】
１つの態様では、薬物候補のスクリーニング法は、発現プロフィール遺伝子またはそのフラグメントを発現する細胞を得る工程を包含する。発現プロフィール遺伝子の好ましい実施態様は、他の細胞と比較して癌細胞、好ましくは直腸結腸癌細胞において区別をつけて発現される遺伝子である。本明細書中の方法で使用される発現プロフィール遺伝子の好ましい実施態様には、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９）からなる群が含まれるが、これらに限定されない。この群のたんぱく質フラグメントもまた好ましい。本発明で使用される分子は列挙した分子の任意の形状または任意のサブセット由来であり得ることが理解される。したがって、例えば、上記の任意の１つまたは複数の遺伝子を本明細書中の方法で使用することができる。別の実施態様では、核酸は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。本方法は、さらに、細胞に薬物候補を添加する工程と、発現プロフィール遺伝子の発現に対する薬物候補の効果を同定する工程とを包含する。
【０００７】
１つの実施態様では、薬物候補のスクリーニング法には、薬物候補の非存在下での発現レベルと薬物候補の存在下での発現レベルとを比較する工程を包含し、存在する場合、前記薬物候補濃度は変化してもよく、前記薬物候補の添加または除去後に比較を行うことができる。好ましい実施態様では、細胞は少なくとも２つの発現プロフィール遺伝子を発現する。プロフィール遺伝子は、増加または減少を示し得る。
【０００８】
本発明はまた、直腸結腸癌調節タンパク質（ＣＣＭＰ）に結合することができる生物活性剤のスクリーニング法、ＣＣＭＰと候補生物活性剤とを組み合わせる工程と、ＣＣＰへの候補因子の結合を同定する工程とを提供する。好ましくは、ＣＣＭＰは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９からなる群から選択されるタンパク質またはそのフラグメントである。別の実施態様では、タンパク質は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される核酸によってコードされる。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。
【０００９】
本発明は、さらに、ＣＣＭＰの活性を調節することができる生物活性剤のスクリーニング法を提供する。１つの実施態様では、本方法は、ＣＣＭＰと候補生物活性剤とを組み合わせる工程と、ＣＣＭＰの活性に対する候補因子の効果を同定する工程とを包含する。好ましくは、ＣＣＭＰは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９からなる群から選択されるタンパク質またはそのフラグメントである。別の実施態様では、タンパク質は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される核酸によってコードされる。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。
【００１０】
ＣＣＭＰを発現するか過剰発現するトランスジェニック動物または例えば、遺伝子ノックアウトの結果としてＣＣＭＰを欠く動物に薬物を投与する工程を包含する、候補直腸結腸癌薬の効果の評価法も提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、患者に薬物を投与する工程と、前記患者由来の細胞サンプルを取り出す工程とを包含する、候補直腸結腸癌薬の効果の評価法を提供する。次いで、細胞の発現プロフィールを同定する。本方法は、さらに、前記発現プロフィールと健常個体の発現プロフィールとを比較する工程を包含する。
【００１２】
さらに、本発明は、好ましくは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌タンパク質をコードする核酸セグメントを含み、１０００個未満の核酸プローブを含むバイオチップを提供する。好ましくは、少なくとも２つの核酸セグメントを含む。別の実施態様では、核酸は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。
【００１３】
さらに、直腸結腸癌に関連する障害の診断法を提供する。本方法は、好ましくは、第１の個体の第１の組織型におけるＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌タンパク質をコードする核酸の発現を同定する工程と、第１の個体または第２の罹患していない個体由来の第２の正常な組織型由来の遺伝子発現の分布と比較する工程とを包含する。別の実施態様では、タンパク質は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される核酸によってコードされる。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。発現の相違により、第１の個体が直腸結腸癌に関連する障害を有することが示される。
【００１４】
別の態様では、本発明は、好ましくは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。別の実施態様では、タンパク質は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される核酸によってコードされる。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。好ましい実施態様では、ＣＡＡ９のフラグメントは、ＣＡＡ９ｐ１、ＣＡＡ９ｐ２、ＣＡＡ９ｐ３、ＣＡＡ９ｐ４、ＣＡＡ９ｐ４ＭＡＰＳ、ＣＡＡ９ｐ５、およびＣＡＡ９ｐ５ＭＡＰＳから選択される。乳癌の他の好ましいフラグメントを図に示す。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。抗体は、本明細書中に詳述の単鎖抗体などの抗体のフラグメントであるか別の分子と結合することができる。１つの実施態様では、抗体はヒト化抗体である。
【００１５】
１つの実施態様では、直腸結腸癌タンパク質（ＣＣＭＰ）またはそのフラグメントを干渉することができる生物活性剤および前記ＣＣＭＰまたはそのフラグメントに結合する抗体のスクリーニング法を提供する。好ましい実施態様では、本方法は、ＣＣＭＰまたはそのフラグメントと、候補生物活性剤と、ＣＣＭＰまたはそのフラグメントに結合する抗体とを組みあせる工程を包含する。本方法は、さらに、前記ＣＣＭＰまたはそのフラグメントと前記抗体との結合を同定する工程を包含する。結合の変化が存在する点で、薬剤は干渉剤として同定される。前記干渉剤はアゴニストまたはアンタゴニストである。好ましくは、前記薬剤と同様に前記抗体は直腸結腸癌を阻害する。
【００１６】
さらなる態様では、直腸結腸癌の阻害法を提供する。１つの実施態様では、本方法は、好ましくは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌調節タンパク質に対する抗体を含む組成物を細胞に投与する工程を包含する。別の実施態様では、タンパク質は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される核酸によってコードされる。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。本方法を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ、好ましくは個体へのｉｎ　ｖｉｖｏで行うことができる。好ましい実施態様では、直腸結腸癌の阻害法は癌を罹患した個体に提供される。本明細書中に記載のように、直腸結腸癌阻害法を、アンチセンス分子、好ましくは小分子を含む直腸結腸癌活性のインヒビターの投与によって行うことができる。
【００１７】
本発明はまた、個体の免疫応答の誘導法を提供する。１つの実施態様では、本明細書中で提供する方法は、好ましくは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌調節タンパク質を含む組成物を個体に投与する工程を包含する。別の実施態様では、タンパク質は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される核酸によってコードされる。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。別の態様では、前記組成物は、好ましくは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌調節タンパク質をコードする配列を含む核酸を含む。別の実施態様では、核酸は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。
【００１８】
本発明は、さらに、個体の免疫応答を誘導することができる組成物を提供する。１つの実施態様では、本明細書中で提供する組成物は、好ましくは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌調節タンパク質および薬理学的に許容されるキャリアを含む。別の実施態様では、タンパク質は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される核酸によってコードされる。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。別の実施態様では、前記組成物は、好ましくは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌調節タンパク質をコードする配列を含む核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含む。別の実施態様では、核酸は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。
【００１９】
前記タンパク質に特異的な薬剤と中和十分量のタンパク質とを接触させる工程を包含する、好ましくは、ＣＺＡ８、ＢＣＸ２、ＣＢＣ２、ＣＢＣ１、ＣＢＣ３、ＣＪＡ８、ＣＪＡ９、ＣＧＡ７、ＢＣＮ５、ＣＱＡ１、ＢＣＮ７、ＣＱＡ２、ＣＧＡ８、ＣＡＡ７、およびＣＡＡ９またはそのフラグメントからなる群から選択される直腸結腸癌調節タンパク質の効果の中和法を提供する。別の実施態様では、タンパク質は、図１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４から選択される核酸によってコードされる。好ましい核酸は、図１２、より好ましくは図１３、最も好ましくは図１４の核酸である。
【００２０】
本発明の別の態様では、直腸結腸癌個体の治療法を提供する。１つの実施態様では、本方法は、前記個体にＣＪＡ８のインヒビターを投与する工程を包含する。別の実施態様では、本方法は、直腸結腸癌患者に治療部分と結合させたＣＪＡ８に対する抗体を投与する工程を包含する。このような治療部分は、細胞障害剤または放射性同位体であり得る。
【００２１】
本発明はまた、サンプル中のＣＪＡ８を同定する工程を包含し、高レベルのＣＪＡ８では予後が不十分であることを示す、直腸結腸癌個体の予後の同定法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、新規の配列を提供する。本発明の以下の記載により、本発明の他の態様が当業者に自明となる。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、直腸結腸癌（ＣＲＣ）の新規の診断および予後評価法ならびにＣＲＣを調節する組成物のスクリーニング法を提供する。１つの実施態様では、発現プロフィールを得るために診断または予後情報が望まれる、異なる患者サンプルにおける遺伝子の発現レベルを同定する。特定のサンプルの発現プロフィールは、本質的にサンプルの状態の「フィンガープリント」である一方で、２つの状態は、類似して発現する任意の特定の遺伝子を有し得るので、多数の遺伝子の評価による細胞の状態によって固有の遺伝子発現プロフィールが同時に得られる。すなわち、正常な組織を、ＣＲＣ組織と区別することができ、ＣＲＣ内で、異なる予後状態（例えば、長期の見込みが良好または不十分）を同定することができる。既知の異なる状態の結腸組織の発現プロフィールの比較により、これらの各状態における遺伝子の重要な情報（遺伝子のアップおよびダウンレギュレーションを含む）が得られる。ＣＲＣと正常な結腸組織との間で区別して発現する配列の同定ならびに異なる予後結果が得られる識別発現によって多数の方法での情報の使用が可能である。例えば、特定の治療計画の評価を評価することができる。化学療法剤は特定の患者において長期予後を改善するように作用する。同時に、患者のサンプルと既知の発現プロフィールとの比較によって診断を行うか確認することができる。さらに、これらの遺伝子発現プロフィール（または各遺伝子）により、特定の発現プロフィールを模倣または変更を目的とする薬物候補のスクリーニングが可能である。例えば、ＣＲＣ発現プロフィールを抑制するか不十分な予後プロフィールをより良好な予後プロフィールに変換する薬物についてスクリーニングすることができる。重要なＣＲＣ遺伝子セットを含むバイオチップを作製し、その後これらのスクリーニングに使用することによってこれを行うことができる。タンパク質を基本としてこれらの方法を行うこともできる。すなわち、ＣＲＣタンパク質のタンパク質発現レベルを、診断および予後目的についてまたは候補薬剤をスクリーニングするために評価することができる。さらに、遺伝子治療を目的としてＣＲＣ核酸配列を投与する（治療薬としてのアンチセンス核酸またはＣＲＣタンパク質（抗体およびその他の調節）の投与）ことができる。
【００２４】
したがって、本発明は、直腸結腸癌（ＣＲＣ）で区別して発現する核酸およびタンパク質配列（本明細書中で「ＣＲＣ配列」という）を提供する。以下に概説するように、ＣＲＣ配列には、ＣＲＣにおいてアップ・レギュレーションされるもの（すなわち、高レベルで発現される）およびＣＲＣにおいてダウン・レギュレーションされるもの（すなわち、低レベルで発現される）が含まれる。好ましい実施態様では、ＣＲＣ配列はヒト由来である。しかし、当該分野で自明であるように、動物疾患モデルおよび薬物評価において他の生物由来のＣＲＣ配列が有用である。したがって、脊椎動物（哺乳動物、げっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを含む））から他のＣＲＣ配列が得られる。以下に概説の技術を用いて、他の生物由来のＣＲＣ配列を得ることができる。
【００２５】
ＣＲＣ配列には、核酸およびアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施態様では、ＣＲＣ配列は組換え核酸である。本明細書中で使用される、用語「組換え核酸」は、一般に、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼによる核酸の操作によってｉｎ　ｖｉｔｒｏで独創的に形成された、通常天然には見出されない形態の核酸を意味する。したがって、線状の単離核酸または通常は連結されていないＤＮＡ分子のライゲーションによってｉｎ　ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは共に、本発明の目的のための組換えであると考えられる。一旦組換え核酸が作製されて宿主細胞または生物に再移入されると非組換え的に（すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ操作よりもむしろｉｎ　ｖｉｖｏ細胞機構を用いて）複製されることが理解される。しかし、このような一旦組換えにより産生された核酸は、その後非組換的に複製されるにもかかわらず、本発明の目的のための組換えと考える。
【００２６】
同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術（すなわち、上記のように組換え核酸の発現によって）を用いて作製されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも１つまたは複数の特徴によって天然に存在するタンパク質と区別される。例えば、タンパク質を、通常その野生型宿主に結合しているいくつかまたは全てのタンパク質および化合物から単離するか精製して、実質的に純粋にすることができる。例えば、単離タンパク質は、所与のサンプル中の通常その天然の状態で結合している少なくともいくつかの物質を、全タンパク質の好ましくは少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％含まない。実質的に純粋なタンパク質は、全タンパク質の少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約８０重量％、好ましくは少なくとも約９０重量％を占める。この定義は、異なる生物または宿主細胞中のある生物からのＣＲＣタンパク質の産生を含む。あるいは、タンパク質濃度レベルが増加するように誘導プロモーターまたは高発現プロモーターの使用によって、通常認められるよりも有意に高濃度でタンパク質を作製することができる。あるいは、タンパク質は、下記のようにエピトープタグの付加またはアミノ酸の置換、挿入、および欠失のように通常天然では認められない形態であり得る。
【００２７】
好ましい実施態様では、ＣＲＣ配列は核酸である。当業者に自明であり、かつ以下に詳述するように、ＣＲＣ配列は、種々の適用（天然に存在する核酸を検出する診断適用ならびにスクリーニング適用（例えば、ＣＲＣ配列に対する核酸配列を含むバイオチップを作製することができる）を含む）で有用である。広義では、本明細書中で使用される、「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または文法上の等価物は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般に、リン酸ジエステル結合を含むが、いくつかの場合、以下に概説のように、代替バックボーン（例えば、ホスホラミデート（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ｅｔ　ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９（１０）、１９２５、１９９３およびその参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３５、３８００、１９７０；Ｓｐｒｉｎｚｌ　ｅｔ　ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８１、５７９、１９７７；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１４、３４８７、１９８６；Ｓａｗａｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８０５、１９８４；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１０、４４７０、１９８８；およびＰａｕｗｅｌｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｈｅｍｉｃａ　Ｓｃｒｉｐｔｅ、２６、１４１、９、１９８６）、ホスホロチオエート（Ｍａｇ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１９、１４３７、１９９１および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１、２３２１、１９８９）、ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，［オリゴヌクレオチドおよびアナログ：実用的アプローチ］、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、およびペプチド核酸バックボーンおよび結合（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４、１８９５、１９９２；Ｍｅｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３１、１００８、１９９２；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ、３６５、５６６、１９９３；Ｃａｒｉｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８０、２０７、１９９６を参照のこと）（これらの全てが参考として援用される）を含む）を有し得る核酸アナログを含む。他のアナログ核酸には、陽性バックボーン（Ｄｅｎｐｃｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、６０９７、１９９５；非イオン性バックボーン（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，８３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号、Ｋｌｅｄｒｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｌｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ、３０、４２３、１９９１、Ｌｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１０、４４７０、１９８８、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　＆　Ｎｕｃｒｅｏｔｉｄｅ、１３、１５９７、１９９４、第２章および第３章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、「アンチセンス研究における炭水化物修飾」、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｌ　ａｎｄ　Ｐ．Ｄａｎ　Ｃｏｏｋ編、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、４、３９５、１９９４、Ｊｅｆｆｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＮＭＲ、３４、１７、１９９４、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．、３７、７４３、１９９５）；および非リボースバックボーン（を含む米国特許第５，２３５，０３３号、同第５，０３４，５０６号、および第６章および第７章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、「アンチセンス研究における炭水化物修飾」、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｌ　ａｎｄ　Ｐ．Ｄａｎ　Ｃｏｏｋ編））を有するものが含まれる。１つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた核酸の定義の１つに含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．、１９９５、１６９〜１７６を参照のこと）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ、Ｃ　＆　Ｅ　Ｎｅｗｓ、Ｊｕｎｅ　２，１９９７、３５に記載されている。これらの引例は全て、特に参考として援用される。これらのリボース−リン酸バックボーンの修飾を、種々の理由（例えば、生理学的環境におけるこの分子の安定性および半減期の増加またはバイオチップにおけるプローブとして）で行うことができる。
【００２８】
当業者に認識されるように、これら全ての核酸アナログを本発明で使用することができる。さらに、天然に存在する核酸とアナログとの混合物を作製することができる。あるいは、異なる核酸アナログの混合物および天然に存在する核酸とアナログとの混合物を作製することができる。
【００２９】
ペプチド核酸アナログを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）が特に好ましい。天然に存在する核酸の高度に荷電したホスホジエステルバックボーンと対照的に、これらのバックボーンは中性条件下で実質的に非イオン性である。この結果は２つの利点を有する。第１に、ＰＮＡバックボーンは、改良されたハイブリッド形成速度を示す。ＰＮＡは、ミスマッチ塩基対と完全に適合した塩基対とを区別するための融解温度（Ｔｍ）がさらに変更されている。ＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的には、内部ミスマッチについて２〜４℃低い。非イオン性ＰＮＡバックボーンでは約７〜９℃低い。同様に、非イオン性であるために、これらのバックボーンに結合した塩基のハイブリッド形成は、塩濃度に比較的非感受性である。さらに、ＰＮＡは細胞酵素によって変性されないので、より安定であり得る。
【００３０】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖または記載のように二本鎖または一本鎖配列の一部を含んでもよい。当業者が認識するように、一本鎖の欠失（「ワトソン」）はまた、他の鎖の配列（「クリック」）と定義する。したがって、本明細書中に記載の配列はまた、配列の相補物を含む。核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせおよび任意の塩基の組み合わせ（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ハイポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む）を含む場合、核酸はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得る。本明細書中で使用されるように、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログ、ならびに修飾ヌクレオシド（アミノ修飾ヌクレオシドなど）を含む。さらに、「ヌクレオシド」は、天然に存在しないアナログ構造を含む。したがって、例えばペプチド核酸の各単位（それぞれ塩基を含む）は、本明細書中ではヌクレオチドという。
【００３１】
ＣＲＣ配列を、最初に、本明細書中で概説のＣＲＣ配列に対する実質的な核酸および／またはアミノ酸配列相同性によって同定することができる。このような相同性は、全核酸またはアミノ酸配列に基づき、一般に、以下の概説のように相同性プログラムまたはハイブリッド形成条件を使用して同定する。
【００３２】
本発明のＣＲＣ配列を、以下のように同定することができる。正常および腫瘍組織のサンプルを、核酸プローブを含むバイオチップに適用する。適用可能な場合、ｍＲＮＡ調製分野で公知のように、サンプルを最初に顕微解剖する。適切なバイオチップは、市販されている（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。本明細書中に記載のように遺伝子発現プロフィールを作製し、データを分析する。
【００３３】
好ましい実施態様では、正常と疾患状態との間で発現が変化する遺伝子を、他の正常な組織（肺、心臓、脳、肝臓、腎臓、筋肉、前立腺、小腸、大腸、脾臓、骨、および胎盤が含まれるが、これらに限定されない）で発現した遺伝子と比較する。好ましい実施態様では、他の組織において任意の有意な量で発現されたＣＲＣスクリーニング中に同定された遺伝子を、プロフィールから除去するが、いくつかの実施態様ではその必要はない。すなわち、薬物スクリーニングの場合、可能な副作用を最小にするために標的は疾患特異性であることが好ましい。
【００３４】
好ましい実施態様では、ＣＲＣ配列は、ＣＲＣにおいてアップ・レギュレーションされる配列である。すなわち、この遺伝子の発現は、正常な結腸組織と比較して直腸結腸癌で高い。本明細書中で使用される、「アップ・レギュレーション」は、少なくとも約２倍の変化、好ましくは少なくとも約３倍の変化を意味するが、少なくとも約５倍またはそれ以上が好ましい。本明細書中の全てのアクセッション番号はＧｅｎＢａｎｋ配列データベースのものであり、アクセッション番号の配列は特に参考として援用される。ＧｅｎＢａｎｋは当該分野で公知であり、例えば、Ｂｅｎｓｏｎ，ＤＡ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、２６、１〜７、１９９８およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照のこと。さらに、これらの遺伝子は、心臓、脳、肺、肝臓、乳房、腎臓、前立腺、小腸、および脾臓で少量発現するか全く発現されないことが見出された。
【００３５】
好ましい実施態様では、ＣＲＣ配列は、ＣＲＣにおいてダウン・レギュレーションされる配列である。すなわち、この遺伝子の発現は、正常な結腸組織と比較して直腸結腸癌で低い。本明細書中で使用される、「アップ・レギュレーション」は、少なくとも約２倍の変化、好ましくは少なくとも約３倍の変化を意味するが、少なくとも約５倍またはそれ以上が好ましい。
【００３６】
本発明のＣＲＣタンパク質を、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質として分類することができる。好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質は細胞内タンパク質である。細胞内タンパク質を、細胞質および／または核中に見出すことができる。細胞内タンパク質は、細胞機能および複製（例えば、シグナル伝達経路を含む）に関連し、このタンパク質の異常発現により細胞の工程が無秩序になるか制御されなくなる。例えば、多数の細胞内タンパク質は、プロテインキナーゼ活性、プロテインホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、ポリメラーゼ活性などの酵素活性を有する。細胞内タンパク質はまた、タンパク質複合体の組織化または種々の細胞下局在化へのタンパク質の標的化に関与し、オルガネラ構造の完全性の維持に関連するドッキングタンパク質として作用する。
【００３７】
特徴づけた細胞内タンパク質の認識されつつある概念は、定義された機能が帰する１つまたは複数のモチーフタンパク質の存在である。タンパク質の酵素ドメイン中に認められる高度に保存された配列に加えて、タンパク質−タンパク質相互作用に関連するタンパク質中に高度に保存された配列が同定された。例えば、Ｓｒｃ−ホモロジー２（ＳＨ２）ドメインは、配列依存性様式でチロシン−リン酸化標的を結合させる。ＳＨ２ドメインと異なるＰＴＢドメインもまた、チロシン−リン酸化標的を結合させる。ＳＨ３ドメインは、プロリンが豊富なドメインに結合する。さらに、例としてＰＨドメイン、テトラトリコペプチド反復、およびＷＤドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用の媒介を示した。これらのうちのいくつかはまた、リン脂質または他の第２のメッセンジャーへの結合に関連し得る。当業者に認識されるように、これらのモチーフは一次配列を基本として同定することができる。したがって、タンパク質配列の分析により、タンパク質が会合することができる分子の酵素としての潜在性を洞察することができる。
【００３８】
好ましい実施態様では、ＣＲＣ配列は膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質は、細胞のリン脂質二重層をわたる分子である。これは、細胞内ドメイン、細胞がドメイン、またはその両方を含み得る。このようなタンパク質の細胞内ドメインは、細胞内たんぱく質とすでに説明されているドメインを含む多数の機能を有し得る。例えば、細胞内ドメインは酵素活性を有し、そして／またはさらなるタンパク質の結合部位として作用することができる。頻繁に、膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは両方の役割を果たす。例えば、一定のレセプターチロシンキナーゼは、タンパク質キナーゼ活性およびＳＨ２ドメインの両方を有する。さらに、レセプター分子自体におけるチロシンの自己リン酸化により、さらなるＳＧ２ドメイン含有タンパク質の結合部位が作製される。
【００３９】
膜貫通タンパク質は、１つから多数の膜貫通ドメインを含み得る。例えば、レセプターチロシンキナーゼ、一定のサイトカインレセプター、レセプターグアニルイルシクラーゼ、およびレセプターセリン／トレオニンプロテインキナーゼは、１つの膜貫通ドメインを含む。しかし、チャネルおよびアデニルイルシクラーゼを含む種々の他のタンパク質は、多数の膜貫通ドメインを含む。７つの膜横断領域を含むので、多くの重要な細胞表面レセプターが「７膜貫通ドメイン」タンパク質として分類されている。重要な膜貫通タンパク質レセプターには、以下が含まれるが、これらに限定されない：インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター、ヒト成長ホルモンレセプター、グルコース輸送体、トランスフェリンレセプター、上皮成長因子レセプター、低密度リポタンパク質レセプター、上皮成長因子レセプター、レプチンレセプター、インターロイキンレセプター（例えば、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−２レセプター）など。
【００４０】
膜貫通ドメインの特徴には、その後に荷電アミノ酸となり得る約２０個の連続的疎水性アミノ酸が含まれる。したがって、特定のタンパク質のアミノ酸分析の際、タンパク質内の膜貫通ドメインの局在化および数を予想することができる。
【００４１】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは多様であるが、種々の細胞外ドメインの間での保存モチーフの反復が認められている。保存構造および／または機能は、異なる細胞外モチーフに帰する。例えば、サイトカインレセプターは、システインのクラスターおよびＷＳＸＷＳ（Ｗ＝トリプトファン、Ｓ＝セリン、Ｘ＝任意のアミノ酸）モチーフとして特徴づけられている。免疫グロブリン様ドメインは高度に保存されている。ムチン様ドメインは、細胞接着に関連し、ロイシン豊富な反復はタンパク質−タンパク質相互作用に関与し得る。
【００４２】
多数の細胞外ドメイが他の分子への結合に関与する。１つの態様では、細胞外ドメインはレセプターである。レセプタードメインに結合する因子には、ペプチド、タンパク質、またはアデノシンなどの小分子などであり得る循環リガンドが含まれる。例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ、およびＰＤＧＦなどの成長因子は、種々の細胞応答を誘導する同族レセプターに結合する循環成長因子である。他の因子には、サイトカイン、分裂促進因子、神経栄養因子などが含まれる。細胞外ドメインはまた、細胞会合分子に結合する。これに関して、細胞外ドメインは、細胞−細胞相互作用を媒介する。細胞会合リガンドを、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞に繋ぐことができるか、それ自体が膜貫通タンパク質であり得る。細胞外ドメインはまた、細胞外基質に会合し、細胞構造の維持に寄与する。
【００４３】
膜貫通であるＣＲＣタンパク質は、本明細書中に記載の免疫治療薬の良好な標的であるので、本発明に特に好ましい。さらに、以下に概説するように、膜貫通タンパク質はまた、画像診断に有用であり得る。
【００４４】
膜貫通タンパク質を、例えば組換え法による膜貫通配列の除去によって可溶化させることができることが当業者に認識される。さらに、可溶化させた膜貫通タンパク質を、適切なシグナル配列の付加による組換え法によって分泌させることができる。
【００４５】
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質は分泌タンパク質であり、その分泌を構成的にするか調節することができる。これらのタンパク質は、分泌経路に分子を標的化するシグナルペプチドまたはシグナル配列を有する。分泌タンパク質は、その循環する性質によって多数の生理学的事象に関与し、これはシグナルを種々の他の細胞型に伝達するように作用する。分泌タンパク質は、自己分泌様式（因子を分泌する細胞に対して作用する）、傍分泌様式（因子を分泌する細胞に近い細胞に対して作用する）、または内分泌様式（離れた細胞に対して作用する）で機能することができる。したがって、分泌分子は、多数の生理学的態様の調節または変更に使用される。分泌タンパク質であるＣＲＣタンパク質は、診断マーカー（例えば、血液試験）の良好な標的として作用するので、本発明で特に好ましい。
【００４６】
ＣＲＣ配列は、本明細書中で概説したＴＣＲＣ配列に相同な実質的な核酸および／またはアミノ酸配列によって最初に同定された。このような相同性は全核酸またはアミノ酸配列に基づき、一般に、以下に概説のように相同性プログラムまたはハイブリッド形成条件を用いて同定される。
【００４７】
本明細書中で使用されるように、図のアミノ酸配列による核酸配列に対する核酸配列の全相同性が約７５％を超えるか、より好ましくは約８０％を超えるか、さらにより好ましくは約８５％を超えるか、最も好ましくは９０％を超える場合、核酸は、「ＣＲＣ核酸」である。いくつかの実施態様では、相同性は、約９３％〜９５％または９８％ほどである。この文脈での相同性は、配列類似性または配列同一性を意味するが、同一性が好ましい。相同性に好ましい比較は、配列決定エラーを含む配列と正確な配列との比較である。この相同性を当該分野で公知の標準的な技術（局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ　＆　Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２、４８２、１９８１）、相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　＆　Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８、４４３、１９７０）、類似性検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、８５、２４４４、１９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、５７５、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、ベストフィット配列プログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１２、３８７〜３９５、１９８４（デフォルト設定を使用するか検査によることが好ましい）が含まれるが、これらに限定されない）を用いて同定する。
【００４８】
好ましい実施態様では、配列同一性または類似性の同定に使用する配列は、図面に記載の配列、好ましくは図１２に記載の配列、より好ましくは図１３Ａおよび図１３Ｂに記載の配列、さらにより好ましくは図１４〜２０、図２２〜２５、図２７〜２９、図３１〜３３、図３５〜３７、および図３９〜４８に記載の配列またはそのフラグメントから選択される。１つの実施態様では、本明細書中で使用される配列は、図に記載の配列である。別の実施態様では、配列は、図に記載の配列の天然に存在する対立遺伝子変異体である。別の実施態様では、配列は、本明細書中にさらに記載された配列変異型である。
【００４９】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進歩した対形成アラインメントを使用して関連配列の群由来の多数の配列アラインメントを作製する。これはまた、アラインメント作製に使用されたクラスター形成関係を示す系統樹をプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ　＆　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、３５、３５１〜３６０、１９８７（この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ　＆　Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１〜１５３、１９８９に記載の方法に類似する）の改良アラインメント法の簡略形を使用する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトギャップウェイト３．００、デフォルトギャップレングスウェイト０．１０、および末端ギャップの負荷を含む。
【００５０】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３〜４１０、１９９０およびＫｅｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、９０、５８７３〜５７８７、１９９３に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６、４６０〜４８０、１９９６、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＣＲＣＥ．ｈｔｍｌから得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータ（そのほとんどがデフォルト値の設定である）を使用する。調節可能なパラメータを、以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、文字列閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ　ＳおよびＨＳＰ　Ｓ２パラメータは変数であり、目的の配列を検索する特定の配列の組成と特定のデータベースの組成との比較に依存してプログラム自体によって確立されるが、この値は、感度が増加するように調整される。アミノ酸配列同一％を、適合した同一の残基数を整列領域中の「より長い」配列の残基数で割ることによって同定する。「より長い」配列は、整列配列中で最も現実的な残基を有する配列である（アラインメントスコアを最大にするためのＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２で導入されたギャップは無視する）。
【００５１】
したがって、「核酸配列同一パーセント（％）」は、図の配列のヌクレオチド残基と同一な候補配列中のヌクレオチド残基の％として定義する。好ましい方法は、オーバーラップスパンおよびオーバーラップフラクションのデフォルトパラメータをそれぞれ１および０．１２５に設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
【００５２】
アラインメントには、整列させる配列中へのギャップの導入を含み得る。さらに、図のヌクレオシドよりも多いか少ないヌクレオシドを含む配列について、相同性％を、全ヌクレオシド数に対する相同ヌクレオシド数に基づいて同定することが理解される。したがって、例えば、配列相同性は本明細書中で同定された配列の相同性よりも低く、以下に考察のように、より短い配列中のヌクレオシド数を使用して同定する。
【００５３】
１つの実施態様では、核酸相同性を、ハイブリッド形成研究によって同定する。したがって、例えば、高ストリンジェンシー下で図で同定したペプチドまたはその相補物をコードする核酸配列とハイブリッド形成する核酸を、ＣＲＣ配列と考える。高ストリンジェンシー条件は当該分野で公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９およびＳｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．編（その両方が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が異なれば条件も異なる。特に高温でより長い配列がハイブリッド形成される。核酸のハイブリッド形成についてのさらなるガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｂｅｓ、「ハイブリッド形成の原理および核酸アッセイのストラテジーの総説」、１９９３に見出される。一般に、ストリンジェント条件として、定義したイオン強度ｐＨでの特異的配列について熱融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低い温度を選択する。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡してハイブリッド形成する温度（定義したイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度）である。ストリンジェントな条件は、塩濃度は約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．００１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３であり、温度は短いプローブ（例えば、１０〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０個を超えるヌクレオチド）では少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することができる。
【００５４】
別の実施態様では、あまりストリンジェントではないハイブリッド形成条件（例えば、当該分野で公知の中程度または低いストリンジェンシー条件（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｎｄ　Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、およびＴｉｊｓｓｅｎ、前出を参照のこと）を使用した）を使用する。
【００５５】
さらに、本発明のＣＲＣ核酸配列は、より大きな遺伝子のフラグメント（すなわち、核酸セグメント）である。この文脈では　「遺伝子」には、コード領域ならびにコード領域および非コード領域の混合物が含まれる。したがって、当業者に認識されるように、本発明で得た配列当該分野で周知のより長い配列または全長配列のクローニング法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．およびＡｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．、前出（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）を使用してＣＲＣ遺伝子のさらなる配列を得ることができる。
【００５６】
一旦ＣＲＣ核酸が同定されると、必要ならばこれをクローン化することができ、その成分を組換えて全ＣＲＣ核酸を形成する。一旦天然の供給源から単離されると（例えば、プラスミドまたは他のベクターに含まれるか直鎖核酸セグメントとしてそれから切り出された）、組換えＣＲＣ核酸を他のＣＲＣ核酸（例えばさらなるコード領域）を同定および単離するためのプローブとしてさらに使用することができる。これを、「前駆体」核酸として使用して、修飾または変異体ＣＲＣ核酸およびタンパク質を作製することもできる。
【００５７】
本発明のＣＲＣ核酸はいくつかの方法で使用される。第１の実施態様では、ＣＲＣ核酸に対する核酸プローブを作製して、以下に概説のようにスクリーニング法および診断法、または投与（例えば遺伝子治療および・またはアンチセンスの適用）に使用する。あるいは、ＣＲＣタンパク質のコード配列を含むＣＲＣ核酸を、ＣＲＣタンパク質発現またはスクリーニングもしくは患者への投与用の発現ベクターに適用することができる。
【００５８】
好ましい実施態様では、ＣＲＣ核酸に対する核酸プローブ（図で概説したペプチドをコードする核酸配列および／またはその相補物）を作製する。バイオチップに結合させた核酸プローブを、標的配列と本発明のプローブとがハイブリッド形成するように、ＣＲＣ核酸（すなわち、例えばサンドイッチアッセイ用の標的配列（サンプルの標的配列または他のプローブ配列））に実質的に相補的であるように設計する。以下に概説するように、この相補性は完全である必要はない。標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリッド形成を干渉するいくつのかの塩基対ミスマッチが存在しても良い。しかし、変異数が多すぎて最も低いハイブリッド形成条件下でさえもハイブリッド形成することができない場合、配列は、相補性標的配列ではない。したがって、本明細書中の「実質的に相補性」は、プローブが正常な反応条件、特に高ストリンジェンシー条件でハイブリッド形成するのに十分に標的配列に相補的であることを意味する。
【００５９】
核酸プローブは、一般に一本鎖であるが、特に一本鎖および特に二本鎖であり得る。プローブの鎖の数は、標的配列の構造、組成物、および特性によって予想する。一般に、核酸プローブは、約８〜約１００塩基長の範囲であるが、約１０〜約８０塩基長が好ましく、約３０〜約５０塩基長が特に好ましい。すなわち、一般に、全遺伝子を使用しない。いくつかの実施態様では、数百塩基までのさらにより長い核酸を使用することができる。
【００６０】
好ましい実施態様では、配列あたり１個のプローブを使用するが、標的と重複するプローブまたは異なる切片のプローブを使用する。すなわち、２個、３個、４個、またはそれ以上（３個が好ましい）のプローブを使用して、特定の標的の重複を構築する。プローブを重複させるか（すなわち、いくつかの共通配列を有する）分離させることができる。
【００６１】
当業者に認識されるように、核酸を、広範な種々の方法によって固体支持体に結合または固定することができる。本明細書中の「固定された」およびその文法的等価物は、以下に概説のように、核酸プローブと固体支持体との間の会合または結合が結合、洗浄、分析、除去条件下で、十分に安定であることを意味する。結合は、共有結合または非共有結合であり得る。本明細書中の「非共有結合」およびその文法的等価物は、１つまたは複数の静電気的、親水性、および疎水性相互作用を意味する。非共有結合は、分子（ストレプトアビジンなど）の支持体への共有結合およびビオチン化プローブのストレプトアビジンへの非共有結合が含まれる。本明細書中の「共有結合」およびその文法的等価物は、２つの部分（固体支持体およびプローブ）が少なくとも１つの結合（σ結合、π結合、および配位結合を含む）で結合していることを意味する。共有結合を、プローブと固体支持体との間に直接形成させるか、架橋剤または固体支持体またはプローブまたは両分子上の特異的反応基の封入によって形成させることができる。固定化はまた、共有および非共有相互作用の組み合わせを含み得る。
【００６２】
一般に、当業者に認識されるように、プローブは広範な種々の方法でバイオチップに結合させる。本明細書中に記載のように、最初に核酸を合成し、その後バイオチップに結合させるかバイオチップ上で直接合成することができる。
【００６３】
バイオチップは、適切な固体支持体を含む。本明細書中の「基体」もしくは「固体支持体」または他の文法的等価物は、核酸プローブの結合または会合に適切な不連続なそれぞれの部位を含むように修飾するか、少なくとも１つの検出法が可能なように修飾することができる任意の物質を意味する。当業者に認識されるように、非常に多数の基体が可能であり、以下が含まれるが、これらに限定されない：ガラスおよび修飾または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンＪなどを含む）、ポリサッカリド、ナイロンまたはニトロセルロール、樹脂、シリカまたシリカベースの物質（シリコンおよび修飾シリコンを含む）、カーボン、金属、無機ガラス、プラスチックなど。一般に、基体は光学的に検出することができるが、検出可能なほど蛍光を発しない。好ましい基体は、「再利用可能低蛍光プラスチック製バイオチップ」というタイトルの同時係属出願（１９９９年３月１５日に提出された米国特許出願番号０９／２７０，２１４）（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００６４】
一般に、基体は平面であるが、当業者に認識されるように、他の基体の構成も同様に使用することができる。例えば、流入サンプル分析用にサンプル体積を最小にするために、プローブをチューブ内表面に置くことができる。同様に、基体は可動性（特定のプラスチック製の独立気泡フォームを含む可動性フォームなど）であり得る。
【００６５】
好ましい実施態様では、バイオチップおよびプローブの表面を、その後のこれらの結合のために化学官能基で誘導体化することができる。したがって、例えば、バイオチップを、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、およびチオール基が含まれるが、これらに限定されない化学基（アミノ基が特に好ましい）で誘導体化する。これらの官能基を使用して、プローブをプローブ上の官能基を用いて結合させることができる。例えば、アミノ基を含む核酸を、当該分野で公知のリンカー（例えば、ホモまたはヘテロ二官能価リンカーが周知である（１９９４年のＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙカタログのクロスリンカーに関する技術の部、１５５〜２００（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））を使用してアミノ基を含む表面に結合させることができる。さらに、いくつかの場合、アルキル基など（置換アルキル基およびヘテロアルキル基を含む）のさらなるリンカーを使用することができる。
【００６６】
この実施態様では、当該分野で公知のようにオリゴヌクレオチドを合成し、その後固体支持体表面に結合させる。当業者に認識されるように、５’または３’末端のいずれかを固体支持体に結合させるか、内部ヌクレオシドを介して結合させることができる。
【００６７】
さらなる実施態様では、固体支持体への固定は、非常に強力であるが、非共有性である。例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドを作製し、これはストレプトアビジンで共有結合によって被覆した表面に結合するので、その結果結合させることができる。
【００６８】
あるいは、当該分野で公知のようにオリゴヌクレオチドを表面上で合成することができる。例えば、光重合化合物および技術を使用した光活性化技術を使用する。好ましい実施態様では、当該分野で周知の写真平板術（ＷＯ　９５／２５１１６、ＷＯ　９５／３５０５、米国特許第５，７００，６３７号および同第５，４４５，９３４号（そのすべてが参考として援用される本明細書中の引例）に記載の技術など（これらの結合形態の方法はＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ　ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ技術を基本としている））を使用して核酸をｉｎ　ｓｉｔｕで合成することができる。
【００６９】
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質をコードするＣＲＣ核酸を使用して、ＣＲＣタンパク質を発現するための種々の発現ベクターを作製し、以下に記載のように、その後これをスクリーニングアッセイに使用することができる。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれたベクターのいずれかであり得る。一般に、これらの発現ベクターには、ＣＲＣタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された転写および翻訳調節核酸が含まれる。用語「調節配列」は、特定の宿主生物中の作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物で安定な調節配列には、例えば、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列およびリボゾーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００７０】
別の核酸配列と機能的関連がある場合、核酸は「作動可能に連結されている」。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチド分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合はポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響を与える場合はコード配列に作動可能に連結され、リボゾーム結合部位が翻訳を容易にするために置かれる場合はコード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は近接し且つ読み取り相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接していなくてよい。都合の良い制限部位でのライゲーションによって結合する。このような部位が存在しない場合、従来の方法にしたがって合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。転写および翻訳調節核酸は、一般に、ＣＲＣタンパク質の発現に使用される宿主に適切である（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来の転写および翻訳調節核酸配列を使用して、ＢａｃｉｌｌｕｓにおいてＣＲＣタンパク質を発現させる）。種々の宿主用の多数の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列の型は当該分野で公知である。
【００７１】
一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、調節配列には、プロモーターならびに翻訳開始および終止配列が含まれる。
【００７２】
プロモーター配列は、構成プロモーターまたは誘導プロモーターをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。１つを超えるプロモーターエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターもまた当該分野で公知であり、本発明で有用である。
【００７３】
さらに、発現ベクターはさらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは２つの複製系を有し得るので、２つの生物（例えば、発現については哺乳動物または昆虫ならびにクローニングおよび複製については原核宿主）で維持することが可能である。さらに、発現ベクターの組み込み用に、発現ベクターは宿主細胞ゲノムに対して相同な少なくとも１つの配列、好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みベクターを、ベクターへの封入に適切な相同配列の選択によって宿主細胞中の特的遺伝子座に指向させることができる。組み込みベクター用の構築物は、当該分野で周知である。
【００７４】
さらに、好ましい実施態様では、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当該分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変化する。
【００７５】
本発明のＣＲＣタンパク質を、ＣＲＣタンパク質発現を誘導するか引き起こす適切な条件下でＣＲＣタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞の培養によって産生させる。ＣＲＣタンパク質発現に適切な条件は、選択される発現ベクターおよび宿主細胞によって変化するが、これは日常的な実験によって当業者に容易に確認される。例えば、発現ベクター中の構成プロモーターには宿主細胞の成長および増殖の最適化が必要であり、誘導プロモーターの使用には誘導用の適切な成長条件が必要である。さらに、いくつかの実施態様では、回収のタイミングは重要である。例えば、昆虫細胞発現に使用するバキュロウイルス系は溶菌ウイルスであるので、産物において回収時間の選択が重要であり得る。
【００７６】
適切な宿主細胞には、酵母、古細菌、真菌、昆虫、および動物細胞（哺乳動物細胞）が含まれる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２８細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ１細胞株（マクロファージ細胞株）ならびにヒト細胞および細胞株が特に目的とされる。
【００７７】
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質を哺乳動物細胞で発現させる。哺乳動物発現系はまた当該分野で公知であり、レトロウイルス系が含まれる。好ましい発現ベクター系は、一般にＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８（その両方が本明細書中で参考として援用される）に記載のレトロウイルス系である。哺乳動物プロモーターとして特に使用されるものは、ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、宿主範囲が広いので、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス哺乳動物腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びＣＭＶプロモーターが含まれる。典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’に存在する（したがって、プロモーターエレメントと共存し、コード配列に隣接する）調節領域である。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０由来のものが含まれる。
【００７８】
哺乳動物宿主ならびに他の宿主への外因性核酸の移入法は当該分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変化する。この技術には、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、およびＤＮＡの核への直接的マイクロインジェクションが含まれる。
【００７９】
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質を、細菌系で発現させる。細菌発現系は当該分野で周知である。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた使用することができ、これは当該分野で公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である。例えば、ｔａｃプロモーターはｔｒｐとｌａｃプロモーター配列とのハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターには、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する天然に存在する非細菌起源のプロモーターが含まれる。機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボゾーム結合部位が望ましい。発現ベクターには、細菌中でＣＲＣタンパク質を分泌させるシグナルペプチド配列もまた含まれる。タンパク質は、成長培地（グラム陽性細菌）または細胞の内膜と外膜との間に存在する細胞膜周辺腔（グラム陰性細菌）中に分泌される。細菌発現ベクターには、形質転換された細菌株を選択する選択マーカー遺伝子もまた含み得る。適切な選択遺伝子には、細菌に薬物耐性（アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、およびテトラサイクリンなど）を付与する遺伝子が含まれる。選択マーカーは、生合成遺伝子（ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路中の遺伝子など）もまた含まれる。これらの成分を、発現ベクターへと組み立てる。細菌の発現ベクターは当該分野で周知であり、これには、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓなどのベクターが含まれる。細菌発現ベクターを、当該分野で周知の技術（塩化カルシウム処理、エレクトロポレーションなど）を使用して細菌宿主細胞に形質転換する。
【００８０】
１つの実施態様では、ＣＲＣタンパク質を昆虫細胞中に産生させる。昆虫細胞での形質転換用の発現ベクター（特に、バキュロウイルスベースの発現ベクター）は当該分野で周知である。
【００８１】
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質を酵母細胞中に産生させる。酵母発現系は当該分野で周知であり、これには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、ならびにＹａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの発現ベクターが含まれる。
【００８２】
ＣＲＣタンパク質を、当該分野で周知の技術を用いて融合タンパク質として作製することもできる。したがって、例えば、所望のエピトープが小さい場合、モノクローナル抗体作製用にＣＲＣタンパク質をキャリアタンパク質に融合して免疫原を形成させることができる。あるいは、発現の増加または他の理由のために、ＣＲＣタンパク質を融合タンパク質として作製することもできる。例えば、ＣＲＣタンパク質はＣＲＣペプチドであり、発現させるためにこのペプチドをコードする核酸を他の核酸に連結することができる。
【００８３】
１つの実施態様では、本発明のＣＲＣ核酸、タンパク質、および抗体を標識する。本明細書中の「標識」は、化合物がこの化合物の検出を可能にするために結合させた少なくとも１つのエレメント、同位体、または化合物を有することを意味する。一般に、標識は以下の３つのクラスに分類される：ａ）放射性同位体または安定同位体であり得る同位体標識、ｂ）抗体または抗原であり得る免疫標識、およびｃ）有色または蛍光色素。標識を、任意の位置でＣＲＣ核酸、タンパク質、および抗体に組み込む。例えば、標識は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じることができるはずである。検出可能部分は、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなど）、蛍光または化学発光化合物（フルオレセインイソチアネート、ローダミン、またはルシフェリンなど）、または酵素（アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼなど）であり得る。標識への抗体結合分野で公知の任意の方法を使用することができ、これには、Ｈｕｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１４４、９４５、１９６２；Ｄａｖｉｄ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３、１０１４、１９７４；Ｐａｉｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０、２１９、１９８１；およびＮｙｇｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、３０、４０７、１９８２に記載の方法が含まれる。
【００８４】
したがって、本発明はまた、ＣＲＣタンパク質を提供する。本発明のＣＲＣタンパク質を、いくつかの方法で同定することができる。この意味での「タンパク質」には、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドが含まれる。当業者に認識されるように、本発明の核酸配列を使用してタンパク質配列を作製することができる。これを行う種々の方法（全遺伝子のクローニングならびにそのフレームおよびアミノ酸配列の評価またはフレームを得るため相同性検索用の既知の配列との比較を含む）が存在し、想定したＣＲＣタンパク質は使用したデータベース中のいくつかのタンパク質と相同性を示す。一般に、核酸配列の相同性について３つ全てのフレームを検索するプログラムに入力する。これを、以下のＮＣＢＩ改良ＢＬＡＳＴパラメータにしたがった好ましい実施態様で行う。プログラムはｂｌａｓｔｘおよびｂｌａｓｔｎである。データーベースはｎｒである。入力データは「ＦＡＳＴＡ形式配列」に従う。生物リストは「なし」である。「期待数」は１０である。フィルターはデフォルトである。「順位」は５００であり、「アラインメント」は５００であり、「アラインメントビュー」はペアである。「検索遺伝子コード」はスタンダード（１）である。行列はＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップ存在数は１１であり残基あたりのギャップ数は１であり、λ比は８５デフォルトである。これにより、推定タンパク質配列が得られる。
【００８５】
本明細書中で同定した天然に存在するアミノ酸変異体もまたＣＲＣタンパク質の１つの実施態様に含まれる。好ましくは、変異体は、野生型配列と好ましくは約７５％を超える相同性、より好ましくは約８５％を超える相同性、最も好ましくは９０％を超える相同性を示す。いくつかの実施態様では、相同性は、約８３％〜９５％または９８％ほどである。核酸についてのこの文脈における相補性とは、類似性または同一性を意味するが、同一性が好ましい。この相同性を、核酸相同性について上記概説のように当該分野で公知の標準的な技術を用いて同定する。
【００８６】
本発明のＣＲＣタンパク質は、野生型アミノ酸配列よりも短くても長くても良い。したがって、好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質の定義の範囲内に本明細書中の野生型配列の一部またはフラグメントが含まれる。さらに、上記概説のように、本発明のＣＲＣ核酸を使用して、さらなるコード領域を得て、当該分野で公知の技術を用いてタンパク質配列を得ることができる。
【００８７】
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質は、野生型配列と比較して誘導体または変異体ＣＲＣタンパク質である。すなわち、以下により完全に概説するように、誘導体ＣＲＣタンパク質は少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含むが、アミノ酸置換が特に好ましい。アミノ酸の置換、挿入または欠失は、ＣＲＣペプチド内の任意の残基で起こり得る。
【００８８】
アミノ酸配列の変異体もまた、本発明のＣＲＣタンパク質の実施態様に含まれる。これらの変異体は、３つのクラス（置換、挿入、または欠失変異体）の１つまたは複数に分類される。これらの変異体を、通常は、変異体をコードするＤＮＡを産生させるためのカセットもしくはＰＣＲ変異誘発または当該分野で周知の他の技術を用いてＣＲＣタンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発および上記概説の組換え細胞培養におけるＤＮＡの発現によって調製する。しかし、１００〜１５０までの残基を有する変異体ＣＲＣタンパク質フラグメントを、確立された技術を使用してｉｎ　ｖｉｔｒｏで調製することができる。アミノ酸配列変異体を、変異の性質（ＣＲＣタンパク質アミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子または種間変異とは異なった性質）の予備的同定によって特徴づける。変異体は、典型的に、天然に存在するアナログと同一の定性的生物活性を示すにもかかわらず、以下により完全に概説するように、改変された特徴を有する変異体を選択することができる。
【００８９】
アミノ酸配列変異体の移入部位または領域を予め同定するが、変異自体は予め同定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を最適化するために、標的コドンまたは領域で無作為変異誘発を行し、発現したＣＲＣ変異体を所望の活性の適切な組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有する予め同定したＤＮＡ部位に置換変異を行う技術は周知である（例えば、Ｍ１３変異およびＰＣＲ変異誘発）。ＣＲＣタンパク質活性アッセイを使用して変異のスクリーニングを行う。
【００９０】
アミノ酸置換は、典型的には１残基である。挿入は、通常約１〜２０アミノ酸オーダーであるが、非常に大きな挿入も許容される。欠失は約１〜約２０残基の範囲であるが、いくつかの場合欠失はより大きくても良い。
【００９１】
置換、欠失、挿入、またはその任意の組み合わせを用いて、最終的な誘導体を得ることができる。一般に、分子の変化を最小にするようにいくつかのアミノ酸についてこれらの変化を行う。しかし、一定の環境下でさらに大きな変化も許容される。ＣＲＣタンパク質の特徴の小さな変化が望ましい場合、一般に以下のチャートにしたがって置換を行う。
元の残基　　　　　　　　　　チャート１（置換の例）
Ａｌａ　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ
Ａｒｇ　　　　　　　　　　　Ｌｙｓ
Ａｓｎ　　　　　　　　　　　Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ａｓｐ　　　　　　　　　　　Ｇｌｕ
Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ
Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　Ａｓｎ
Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　Ａｓｐ
Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ
Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　Ａｓｎ、Ｇｌｎ
Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　Ｉｌｅ、Ｖａｌ
Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ
Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　Ｔｈｒ
Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ
Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　Ｔｙｒ
Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　Ｔｒｐ、Ｐｈｅ
Ｖａｌ　　　　　　　　　　　Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
【００９２】
チャート１よりも保存性が低い置換の選択によって、機能または免疫学的同一性を実質的に変化させる。例えば、変異領域のポリペプチドバックボーン構造（例えば、αヘリックスまたはβシート構造）、標的部位での分子の電荷または疎水性、または側鎖のかさに有意に影響を与える置換を行うことができる。一般にポリペプチドの性質に最も大きな変化をもたらすと予想される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルたはトレオニル）を疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）に置換する、（ｂ）システインまたはプロリンを任意の他の残基に置換する、（ｃ）正電荷の側鎖（リジル、アルギニル、またはヒスチジル）を負電荷の残基（グルタミるルまたはアスパラチル）に置換する、（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）を側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）に置換するような置換である。
【００９３】
典型的には、変異体は、天然に存在するアナログと同一の定性的生物活性を示し、かつ同一の免疫応答を誘導するにもかかわらず、また、必要なＣＲＣタンパク質の特徴を修飾するように変異体を選択する。あるいは、ＣＲＣタンパク質の生物活性を変化させるように変異体を設計することができる。例えば、グリコシル化部位を変化させるか除去することができる。
【００９４】
ＣＲＣポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内である。共有結合修飾の１つの型には、ＣＲＣポリペプチドのアミノ酸残基のＣＲＣポリペプチドの選択した側鎖またはＮもしくはＣ末端と反応することができる有機誘導体化剤との反応が含まれる。二官能価剤での誘導体化は、例えば、以下により完全に記載される抗ＣＲＣ抗体の精製またはスクリーニング法で使用するための水溶性支持基質または表面へのＣＲＣの架橋に有用である。一般的に使用される架橋剤には、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、）、ホモ二官能価イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロパネートなどのシスクシンイミジルエステルを含む）、二官能価マレイミド（ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなど）、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの薬剤が含まれる。
【００９５】
他の修飾には、グルタミルおよびアスパルチル残基に対応するグルタミニルおよびアルパラギニル残基の脱アミド、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、トレオニル、またはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、タンパク質：構造および分子の特性、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
＆　Ｃｏ．、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９〜８６、１９８３）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【００９６】
本発明の範囲内に含まれるＣＲＣの別の型の共有結合修飾は、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンの変化を含む。「天然のグリコシル化パターンの変化」は、天然の配列ＣＲＣポリペプチドに見出される１つまたは複数の炭水化物の欠失および／または天然の配列ＣＲＣポリペプチドに存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位の添加を意味する本明細書中の目的を意図する。
【００９７】
ＣＲＣポリペプチドへのグリコシル化部位の添加を、そのアミノ酸配列の変化によって行うことができる。例えば、天然の配列ＣＲＣポリペプチドへの１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加または置換（Ｏ結合グリコシル化部位について）によって変化させることができる。任意選択的に、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが作製されるように予め選択した塩基でのＣＲＣポリペプチドをコードするＤＮＡの変異によるＤＮＡレベルでの変化によってＣＲＣアミノ酸配列を変化させることができる。
【００９８】
ＣＲＣポリペプチド上の炭水化物部分の数の別の増加手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的または酵素的カップリングである。このような方法は、当該分野で（１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ　８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ　ａｎｄ　Ｗｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ　Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０５、１９８１）説明されている。
【００９９】
ＣＲＣポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去を、グリコシル化の標的として作用するアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によって化学的または酵素的に行うことができる。化学的脱グリコシル技術は当該分野で公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９、５２、１９８７およびＥｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ．、かｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８、１３１、１９８１に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素切断を、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８、３５０、１９８７に記載の種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。
【０１００】
ＣＲＣの共有結合修飾の別の型には、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９５，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号に記載の様式における、種々の非タンパク質ポリマーの１つ（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）へのＣＲＣポリペプチドの結合が含まれる。
【０１０１】
本発明のＣＲＣポリペプチドを種々の方法で修飾して、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合させたＣＲＣポリペプチドを含む化学的分子を形成させることもできる。１つの実施態様では、これらの化学的分子には、ＣＲＣポリペプチドと抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープが得られるタグポリペプチドとの融合が含まれ得る。エピトープタグは、一般に、ＣＲＣポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に存在する。このようなＣＲＣポリペプチドのエピトープタグ化形態の存在を、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの使用により、エピトープタグに結合する抗タグ抗体または別の型の親和性基質を用いた親和性生成によりＣＲＣポリペプチドを容易に精製することができる。別の実施態様では、化学分子には、ＣＲＣポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合を含み得る。化学分子の２価の形態について、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。
【０１０２】
種々のタグポリペプチドおよびそのそれぞれの抗体は、当該分野で周知である。例として、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ　ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８、２１５９〜２１６５、１９８８）；ｃ−ｍｙｃタグならびにその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、５、３６１０〜３６１６、１９８５）；単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（５）、５４７〜５５３、１９９０）が含まれる。他のタグポリペプチドには、フラッグペプチド（Ｈｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、１２０４〜１２１０、１９８８）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５、１９２〜１９４、１９９２）；タブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６、１５１６３〜１５１６６、１９９１）；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙａｒｍｕｔｈ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、５７、６３９３〜６３９７、１９９０）が含まれる。
【０１０３】
以下に概説のように、クローン化および発現されるＣＲＣファミリーの他のＣＲＣタンパク質および他の生物由来のＣＲＣタンパク質もまた、１つの実施態様でのＣＲＣタンパク質の定義に含まれる。したがって、プローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を使用して、ヒトまたは他の生物由来の他の関連するＣＲＣタンパク質を見出すことができる。当業者に認識されるように、特に有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列には、ＣＲＣ核酸配列の固有の領域が含まれる。当該分野で公知のように、好ましいＰＣＲプライマーは、約１５〜約３５ヌクレオチド長であるが、約２０〜約３０ヌクレオチド長が好ましく、必要に応じてイノシンを含むことができる。ＰＣＲ反応条件は、当該分野で周知である。
【０１０４】
さらに、本明細書中に概説のように、例えばさらなる配列の誘導、エピトープまたは精製タグの付加、他の融合配列の付加によって図に記載のものより長いＣＲＣタンパク質を作製することができる。
【０１０５】
ＣＲＣ核酸によってコードされるＣＲＣタンパク質を同定することもできる。したがって、本明細書中に概説のように、ＣＲＣタンパク質は、配列表の配列またはその相補物とハイブリッド形成する核酸によってコードされる。
【０１０６】
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質を使用して例えば免疫療法用の抗体を作製する場合、ＣＲＣタンパク質は、全長タンパク質と少なくとも１つのエピトープまたは決定基を共有すべきである。本明細書中の「エピトープ」または「決定基」は、ＭＨＣに関して抗体またはＴ細胞を作製および／または結合するタンパク質の一部を意味する。したがって、ほとんどの例では、より小さなＣＲＣタンパク質に対して作製した抗体は、全長タンパク質に結合することができる。好ましい実施態様では、エピトープは固有である。すなわち、固有のエピトープに対して作製された抗体は、交叉反応をほとんど示さないか全く示さない。好ましい実施態様では、エピトープは、ＣＡＡ２ｐ１、ＣＡＡ２ｐ２である。別の好ましい実施態様では、エピトープは、ＣＡＡ９ｐ１、ＣＡＡ９ｐ２、ＣＡＡ９ｐ３、ＣＡＡＱ９ｐ４、ＣＡＡ９ｐ４ＭＡＰＳ、ＣＡＡ８９ｐ５、およびＣＡＡ９ｐ５ＭＡＰＳから選択される。
【０１０７】
１つの実施態様では、用語「抗体」には、全抗体または組換えＤＮＡ技術を用いてｄｅ　ｎｏｖｏで合成された抗体の修飾によって作製される当該分野で公知の抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖抗体（例えばＦｖ）、キメラ抗体などを含む）が含まれる。
【０１０８】
ポリクローナル抗体の調製法は、当業者に周知である。ポリクローナル抗体を、例えば、１つまたは複数の免疫剤および所望ならばアジュバントの注射によって哺乳動物中で誘導させることができる。典型的には、免疫剤および／またはアジュバントを、複数回の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物中に注射する。免疫剤には、ＣＡＡ２もしくはそのフラグメントまたはその融合タンパク質を含み得る。これは、免疫化された哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質への免疫剤の結合に有用であり得る。このような免疫原性タンパク質には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ダイズトリプシンインヒビターが含まれるが、これらに限定されない。使用することができるアジュバントの例には、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ合成トレハロースジコリノミコレート）が含まれる。免疫化プロトコールを、過度の実験を行うことなく当業者によって選択することができる。
【０１０９】
あるいは、抗体はモノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５、１９７５に記載の方法など）を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、典型的には、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を、免疫剤と特異的に結合する抗体を作製するか作製することができるリンパ球を誘導するための免疫剤で免疫化する。あるいは、リンパ球を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫化することができる。免疫剤には、典型的には、ＣＡＡ２ポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはその融合タンパク質が含まれる。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を使用し、非ヒト哺乳動物機嫌が望ましい場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用する。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用してリンパ球を免疫化細胞株と融合してハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体：原理および実施、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６、５９〜１０３）。通常、免疫化細胞株は哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ、およびヒト起源の形質転換哺乳動物細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞を使用する。ハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない免疫化細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の基質を含む適切な培養培地中で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を阻害するヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。
【０１１０】
１つの実施態様では、抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、モノクローナル抗体であり、少なくとも２つの異なる抗原に結合特異性を有するヒトまたはヒト化抗体であることが好ましい。この場合、結合特異性の１つはＣＲＣタンパク質またはそのフラグメントについてであり、他方は他の任意の抗原（好ましくは細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニット（腫瘍特異性であることが好ましい）についてである。
【０１１１】
好ましい実施態様では、以下に記載のように、ＣＲＣの抗体は、ＣＲＣの生物学的機能を誘導するか消失させることができる。すなわち、ＣＲＣ（またはＣＲＣを含む細胞）への抗ＣＲＣ抗体（ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナル）の付加により、ＣＲＣ活性が減少させるか消失させることができる。一般に、少なくとも２５％の活性の減少が好ましいが、少なくとも約５０％の減少がとく好ましく、約９５％〜１００％の減少が特に好ましい。
【０１１２】
好ましい実施態様では、ＣＲＣプローブに対する抗体は、ヒト化抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合配列など）である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域由来の残基が所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（マウス、ラット、またはウサギ）のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）に置換されたヒト免疫グロブリンが含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基に置換されている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも輸送されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも認められない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、且つ全てまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。任意選択的に、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５、１９８６；Ｒｌｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２３２、３２３〜３２９、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２、５９３〜５９６、１９９２）。
【０１１３】
非ヒト抗体のヒト化法は当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来のアミノ酸が移入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば輸送残基といわれ、典型的には、輸送可変ドメインを受け継いでいる。本質的には、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列とヒト抗体の対応配列との置換による、Ｗｉｎｔｅｒ　ａｎｄ　ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒの方法（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２７、１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３８、１９８８）にしたがってヒト化を行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、インタクトな可変ドメインよりも実質的に少なく非ヒト類由来の対応配列で置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。特に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能ないくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似部位由来の残基と置換されているヒト抗体である。
【０１１４】
また、ヒト抗体を、当該分野で公知の種々の技術（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ　ａｎｄ　Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７、３８１、１９９１；Ｍａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１、１９９１を含む）を使用して産生することができる。Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．およびＢｏｅｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．、「モノクローナル抗体および癌治療」、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７、１９８５およびＢｏｅｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）、８６〜９５、１９９１）。同様に、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているトランスジェニック動物（例えば、マウス）へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の移入によってヒト抗体を作製することができる。攻撃の際にヒト抗体産生を観察すると、遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む全てにおいて、ヒトでみとめられるものと密接に類似している。このアプローチは、例えば、以下に記載されている：米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６３５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、および以下の科学刊行物Ｍａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３、１９９２；Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、８５６〜８５９、１９９４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、８１２〜１３、１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８４５〜５１、１９９６；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、８２６、１９９６；Ｌｏｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｏｌ．、１３、６５〜９３、１９９５。
【０１１５】
免疫治療は、ＣＲＣタンパク質に対して誘導する抗体でのＣＲＣの治療を意味する。本明細書中で使用される、免疫治療は受動的であるか能動的であっても良い。本明細書中で定義される、受動的免疫治療はレシピエント（患者）への抗体の受動的導入である。能動的免疫化は、レシピエント（患者）における抗体および／またはＴ細胞応答の誘導である。免疫応答の誘導は、抗体が誘導される抗原を有するレシピエントの獲得の結果である。当業者に認識されるように、レシピエントで誘導されることが望ましい抗体に対するポリペプチドの注射、または抗原発現条件下でのレシピエントと抗原を発現することができる核酸との接触によって抗原を得ることができる。
【０１１６】
好ましい実施態様では、上記のように、抗体が誘導されるＣＲＣタンパク質は分泌タンパク質である。理論に拘束されないが、治療に使用した抗体が結合して、分泌タンパク質のそのレセプターへの結合を防止することにより、分泌ＣＲＣタンパク質が不活化される。
【０１１７】
別の好ましい実施態様では、抗体が誘導されるＣＲＣタンパク質は膜貫通タンパク質である。理論に拘束されないが、治療に使用された抗体はＣＲＣタンパク質の細胞外ドメインに結合して、他のタンパク質（循環リガンドまたは細胞会合分子など）への結合を防止する。抗体は、膜貫通ＣＲＣタンパク質をダウン・レギュレーションすることができる。当業者に認識されるように、抗体は、ＣＲＣタンパク質の細胞外ドメインに結合するタンパク質の競合性、非競合性、または不競合性インヒビターであり得る。抗体はまた、ＣＲＣタンパク質のアンタゴニストである。さらに、抗体は、膜貫通ＣＲＣタンパク質の結合を防止する。１つの態様では、抗体がＣＲＣタンパク質への他の分子の結合を防止する場合、抗体は細胞成長を防止する。抗体はまた、細胞障害剤（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−ｂ、ＩＬ−１、ＩＮＦ−ｇ、およびＩＬ−２が含まれるが、これらに限定されない）または化学療法剤（５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキセートなどを含む）に対して細胞を感作する。いくつかの例では、膜貫通タンパク質と複合体化して細胞障害性を媒介する場合、抗体は血清捕体を活性化するサブタイプに属する。したがって、膜貫通ＣＲＣタンパク質に対して指向する患者の抗体への投与によってＣＲＣを治療する。
【０１１８】
別の好ましい実施態様では、抗体を治療部分と結合させる。１つの態様では、治療部分は、ＣＲＣタンパク質活性を調節する小分子である。別の態様では、治療部分は、ＣＲＣタンパク質と会合しているか密接に近接している分子の活性を調整する。治療部分は、ＣＲＣに関連するプロテアーゼまたはプロテインキナーゼ活性などの酵素活性を阻害することができる。
【０１１９】
好ましい実施態様では、治療成分はまた、細胞障害剤であり得る。この方法では、細胞障害剤の腫瘍組織または腫瘍細胞への標的化によって罹患細胞数が減少するので、ＣＲＣに関連する症状を軽減させる。細胞障害剤は多種多様であり、細胞傷害薬または毒素もしくはこのような毒素の活性なフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。適切な毒素およびその対応するフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、菌体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが含まれる。また細胞障害剤には、ＣＲＣタンパク質に対して誘導される抗体への放射性同位体の結合または抗体に共有結合されたキレート剤への放射性同位体の結合によって作製された放射化学物質が含まれる。膜貫通ＣＲＣタンパク質への治療部分の標的化により、ＣＲＣ罹患領域中の治療部分の局所濃度の増加に作用するだけでなく、治療部分に関連し得る副作用の軽減にも作用する。
【０１２０】
別の好ましい実施態様では、抗体を誘導させるＣＲＣタンパク質は細胞内タンパク質である。この場合、抗体を、細胞中への侵入を容易にするタンパク質に結合させることができる。この場合、抗体は、エンドサイトーシスによって細胞内に侵入する。別の実施態様では、抗体をコードする核酸を、固体または細胞に投与する。さらに、ＣＲＣタンパク質を細胞内（すなわち、核）に標的化することができるという点で、ＣＲＣタンパク質に対する抗体は局在化を標的化するシグナル（すなわち、核局在化シグナル）を含む。
【０１２１】
本発明のＣＲＣ抗体は、ＣＲＣタンパク質に特異的に結合する。本明細書中の「特異的に結合する」は、抗体はタンパク質に少なくとも１０−４〜１０−６Ｍ−１の範囲の結合速度でタンパク質に結合ことを意味し、１０−７〜１０−８Ｍ−ｌの範囲が好ましい。
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質を、発現後に精製または分離する。ＣＲＣタンパク質は、サンプル中に他のいかなる成分が存在するかに応じて、当業者に公知の種々の方法で分離または精製すればよい。標準的な精製方法としては、イオン交換、疎水性、アフィニティーおよび逆相ＨＰＬＣ、クロマトグラフィー、およびクロマトフオーカシング等のような分子、免疫およびクロマトグラフィー技術が挙げられる。例えば、標準的な抗ＣＲＣ抗体カラムを使用してＣＲＣタンパク質を精製することができる。限外ろ過およびダイアフィルトレーション技術を、タンパク質濃縮と併用する方法も有用である。適当な精製技術の概要については、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９８２）を参照されたい。
必要に応じて発現させ、精製したＣＲＣタンパク質および核酸は多様な用途に利用することができる。
一方、遺伝子の発現レベルは、ＣＲＣ表現型におけるそれぞれ異なる細胞状態について測定する：即ち、正常な結腸組織とＣＲＣ組織における遺伝子の発現レベルを（場合によっては、後述するように、予後に関連するＣＲＣの深刻度も）評価することによって、発現プロフィールを解明する。特定の細胞状態または発生段階の発現プロフィールは、本質的には状態を特定する“フィンガープリント”であり；２つの状態に、特定の遺伝子が共通して発現する場合もあり得るが、多数の遺伝子を同時評価することによって細胞状態に特有の遺伝子発現プロフィールを得ることができる。状態の異なる細胞の発言プロフィールを比較することによって、それぞれの状態においてどの遺伝子が重要であるかという情報（遺伝子のアップまたはダウン・レギュレーションをも含めて）が得られる。ついで、特定の患者から得られた組織が正常またはＣＲＣ組織の遺伝子発現プロフィールを有するかどうかの診断を試みるか、または確認することができる。
ここに使用する語“示差発現”または文法的等価物は、細胞内および細胞間における、遺伝子の時間的および細胞別発現パターンに現れる質的量的差を意味する。従って、例えば、正常な組織とＣＲＣ組織とで発現に差異のある遺伝子は、活性、不活性を含めて、その発生に質的な差が現れる。即ち、特定の状態において、遺伝子は他の状態に対してＯＮまたはＯＦＦの状態となる。当業者には明らかなように、２つ以上の状態をなんらかの方法で比較することは可能である。このように質的にレギュレートされた遺伝子は、状態または細胞タイプの範囲内で、標準的な技術で検出できても、状態、細胞タイプの双方の範囲では検出できない出現パターンを示す。測定は定量的でもあり、発現が増減いずれであるかが測定される；即ち、遺伝子の発現がアップ・レギュレーションされて転写量の増大となるか、またはダウン・レギュレーションされて転写量の減少となるか、である。発現程度の差は後述するような標準的検出技術、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）発現アレイのほか、参考のため、本願明細書中に引用するＬｏｃｋｈａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０（１９９６）を利用して定量するのに十分であればよい。その他の技術としては、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護なども含まれる。既に概要を上述したように、発現の変化（即ち、アップ・レギュレーションまたはダウン・レギュレーション）は好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、さらにより好ましくは少なくとも約１５０％、あるいは少なくとも約２００％、特に好ましくは３００〜少なくとも１０００％である。
当業者には明らかなように、これは遺伝子転写またはタンパク質レベルを評価することによって、行うことができる。即ち、遺伝子発現量を、遺伝子転写のＤＮＡまたはＲＮＡ当量に対して核酸プローブを使用してモニターすることができ、遺伝子発現レベルまたは最終遺伝子生成物自体（タンパク質）を、例えば、ＣＲＣタンパク質に対する抗体および標準的免疫検定（ＥＬＩＳＡｓなど）またはその他の、例えば、質量分析検定、２Ｄゲル電気泳動検定等によってモニターすることができる。従って、ＣＲＣ遺伝子に対応するタンパク質、即ち、ＣＲＣ表現型に重要であることが判明しているＣＲＣ遺伝子を、ＣＲＣ診断テストにおいて評価することができる。
好ましい実施態様では、遺伝子発現をモニターするとともに、同時に、遺伝子数、即ち、発現プロフィールをモニターする。ただし、多重的にタンパク質発現モニターを行うこともできる。同様に、これらの検定を別々に実施することもできる。
この実施態様では、特定細胞におけるＣＲＣ配列の検出および定量に関連して概説するように、バイオチップにＣＲＣ核酸プローブを付着させる。この検定は下記の例の中で更に説明する。
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質をコードする核酸を検出する。ＣＲＣタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを検出することは可能であるが、ＣＲＣタンパク質をコードするｍＲＮＡを検出する方法が特に興味深い。サンプル中のｍＲＮＡの存在は、ＣＲＣ遺伝子が転写されてｍＲＮＡを形成したことを示唆し、タンパク質の発現を示唆する。ｍＲＮＡを検出するためのプローブはｍＲＮＡと相補性であり、ｍＲＮＡと塩基対を形成するなら、いかなるヌクレオチド／デオキシヌクレオチドであってもよく、例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを使用することができる。プローブは本明細書で規定する検出可能な標識をも含まねばならない。１つの方法では、検査すべき核酸をナイロン膜のような固形支持体に固定し、プローブとサンプルとのハイブリッドを形成した後に、ｍＲＮＡを検出する。非特異結合プローブを除去するための洗浄後、標識を検出する。他の方法では、ｍＲＮＡの検出をｉｎ　ｓｉｔｕで行う。この方法では、透過性にした細胞または組織を、プローブがターゲットｍＲＮＡとハイブリッド形成できる充分な時間にわたって、検出可能に標識付けした核酸プローブと接触させる。非特異結合プローブを除去するための洗浄後、標識を検出する。例えば、ＣＲＣタンパク質をコードするｍＲＮＡと相補性であるジゴキシゲニンで標識付けされたリボプローブ（ＲＮＡプローブ）を、ジゴキシゲニンを抗ジゴキシゲニン２次抗体と結合させることによって検出し、ニトロ・ブルー・テトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル・ホスフェートで現像する。
好ましい実施態様では、３種類のタンパク質のいずれか（分泌、貫膜または細胞内タンパク質）を診断検定に使用する。ＣＲＣタンパク質、抗体、核酸、変性タンパク質、およびＣＲＣ配列を含む細胞を、診断検定に使用する。この診断検定は個々の遺伝子または対応のポリペプチドのレベルに基づいて行うことができる。好ましい実施態様では、発現プロフィールを、好ましくは高処理量スクリーニング技術と併用することによって、発現プロフィール遺伝子および／または対応のポリペプチドのモニターを可能にする。
上記の通り、細胞内、膜貫通または分泌タンパク質などのＣＲＣタンパク質はＣＲＣのマーカとして利用される。推定されるＣＲＣ組織または患者からこれらのタンパク質を検出することによって、ＣＲＣを検出または診断することができる。ＣＲＣの検出には公知の種々の方法が採用されている。１つの実施態様では、抗体を利用してＣＲＣタンパク質を検出する。好ましい方法としては、ゲルに対する電気泳動によって、サンプルまたは患者からタンパク質を分離する（典型例としては、タンパク質ゲルを変性させ、還元するが、等電点電気泳動ゲル等のような他のタイプのゲルでもよい）。タンパク質を分離した後、ＣＲＣタンパク質に対する抗体でイムノブロットすることによってＣＲＣタンパク質を検出する。イムノブロットの方法は当業者に公知である。
他の好ましい方法では、ｉｎ　ｓｉｔｕ　画像診断に、ＣＲＣタンパク質に対する抗体を使用する。非特異抗体結合を除去するための洗浄後、抗体の存在を検出する。１つの実施態様では、検出可能な標識を含む２次抗体とともに保温することによって、抗体を検出する。別の方法では、ＣＲＣタンパク質に対する１次抗体が検出可能な標識を含む。他の方法では、ＣＲＣ１次抗体が明確な、かつ検出可能な標識を含む。この方法は複数のＣＲＣタンパク質を同時スクリーニングするのに特に有用である。当業者には明らかなように、他の多くの組織学的画像診断技術も本発明に使用できる。
好ましい実施態様では、種々の波長の放出を検出および弁別できる蛍光光度計で標識を検出する。また、この方法では、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を使用することができる。
他の好ましい実施態様では、血液サンプルから得られるＣＲＣの診断に抗体を使用する。既に述べたように、ある種のＣＲＣタンパク質は分泌／循環分子である。従って、血液サンプルは分泌ＣＲＣタンパク質の存在を検出するためにプローブ又は検査すべきサンプルとして有用である。ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（ウェスターン・ブロッテリング）、免疫沈降、ＢＩＡＣＯＲＥ技術等、当業者にとって公知の上記免疫検定技術のいずれかによってＣＲＣを検出するのに抗体を利用することができる。
好ましい実施態様では、標識付けされたＣＲＣ核酸プローブと組織アレイとをｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成させる。例えば、ＣＲＣ組織および／または正常組織を含む組織サンプル・アレイを作成する。この場合、公知のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成を行えばよい。
なお、個体と標準とのフィンガープリント比較により、当業者は診断および予後判定を行うことができる。さらにまた、診断結果を示唆する遺伝子は、予後を示唆する遺伝子とは異なる。
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質、抗体、核酸、変性タンパク質、およびＣＲＣ配列を含有する細胞を予後検定に使用する。長期予後に関しては、ＣＲＣ深刻度と相関関係にある遺伝子プロフィールを作成すればよい。この場合も、タンパク質またはゲル・レベルで作成できるが、遺伝子を利用することが好ましい。上述したように、ＣＲＣプローブをバイオチップに付着させて、組織または患者におけるＣＲＣ配列を検出および定量する。検定は診断と同様の手順で行われる。
好ましい実施態様では、上記３種類のタンパク質を使用して、薬剤スクリーニング検定を行う。ＣＲＣタンパク質、抗体、核酸、変性タンパク質、およびＣＲＣ配列を含有する細胞を使用して薬剤スクリーニング検定を行うか、または“遺伝子配列プロフィール”またはポリペプチドの発現プロフィールに対する候補薬剤の効果を評価する。好ましい実施態様では、発現プロフィールを、高処理量スクリーニング技術と併用することにより、候補薬剤による処理後の発現プロフィール遺伝子のモニターを可能にする。Ｚｌｏｋｓｔｎｉｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９，８４−８（１９９８），Ｈｅｉｄ，１９９６＃６９を参照。
好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質、抗体、核酸、変性タンパク質、および未変性または変性ＣＲＣタンパク質を、スクリーニング検定に使用する。即ち、本発明は、ＣＲＣ表現型を調節する組成物をスクリーニングする新規の方法を提供する。このスクリーニングは個々の遺伝子レベルで行うことができるが、“遺伝子発現プロフィール”に対する候補薬剤の効果を評価することによっても行うことができる。好ましい実施態様では、発現プロフィールを、好ましくは高処理量スクリーニング技術と併用することによって、候補薬剤による処理後の発現プロフィール遺伝子をモニターすることができる。上記Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ参照。
特異な発現態様を有する遺伝子を特定した時点で、種々の検定を行えばよい。好ましい実施態様では、個々の遺伝子またはタンパク質レベルで検定を行うことができる。即ち、特定の遺伝子がＣＲＣ中でアップ・レギュレートされているのを識別したら、この遺伝子の応答を調節するため；好ましくは遺伝子をダウン・レギュレートするため、ただし、場合によっては、遺伝子をアップ・レギュレートする生物に作用する候補薬剤をスクリーニングすればよい。このように、“調節”は遺伝子のアップ・レギュレーションとダウン・レギュレーションの双方を含む。好ましい調節量は、正常な組織と腫瘍組織とで異なる遺伝子発現の変化に応じて異なり、少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは１００〜３００％、場合によっては３００〜１０００％以上である。従って、もし遺伝子が腫瘍において、正常な組織と比較して４倍の増加を示すなら、約４倍の減少が望ましく；腫瘍において、正常な組織と比較して１０倍の減少を示すなら、候補薬剤に対して発現が１０倍増加することが望ましい。
当業者には明らかなように、この検定は遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。即ち、核酸プローブおよび遺伝子発現レベルの定量によって遺伝子発現量をモニターするか、または、例えば、ＣＲＣタンパク質に対する抗体および標準的な免疫検定を利用することによって、遺伝子生成物そのものをモニターすることができる。
好ましい実施態様では、遺伝子発現をモニターすると同時に、遺伝子数、即ち、遺伝子プロフィールをモニターする。ただし、多重タンパク質発現をモニターすることもできる。
この実施態様では、ＣＲＣ核酸プローブをバイオチップに付着させて、特定細胞におけるＣＲＣ配列の検出および定量を行う。この検定については、さらに後述する。
一般に、好ましい実施態様では、分析に先立ち、生物に作用する候補薬剤を細胞に添加する。また、結腸直腸癌を調節し、ＣＲＣタンパク質を調節し、ＣＲＣタンパク質と結合し、またはＣＲＣタンパク質と抗体の結合に干渉する、生物に作用する候補薬剤を同定するためのスクリーニングを提供する。
本明細書中に使用する語“生物に作用する候補薬剤”または“生物に作用する候補薬剤”または文法的等価物は、直接的または間接的にＣＲＣ表現型、または核酸配列とタンパク質配列の双方を含めたＣＲＣ配列の発現を変化させることができる生物に作用する薬剤として試験される分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド等を意味する。好ましい実施態様では、この生物に作用する薬剤が、発現プロフィール、発現プロフィール核酸またはタンパク質を調節する。特に好ましい実施態様では、候補薬剤がＣＲＣ表現型を、例えば、正常な結腸組織フィンガープリントにまで抑制する。同様に、候補薬剤は深刻なＣＲＣ表現型を抑制することが好ましい。一般に、複数の検定混合物に種々の濃度の薬剤を添加して、濃度に応じて異なる応答を得る。典型例として、これらの濃度の１つが負の対照として採用される。即ち、ゼロ濃度または検出レベル以下の濃度である。
一方、候補薬剤はＣＲＣタンパク質の作用を中和する。“中和する”とは、細胞に殆ど作用しないように、タンパク質の活性を抑制するか、または逆作用させることを意味する。
候補薬剤は広範囲の化学物質にわたるが、典型的には、有機分子、好ましくは分子量が１００超、約２，５００ダルトン未満の小有機化合物である。好ましい小分子は、分子量が２０００未満、または１５００未満、または１０００未満、さらに好ましくは５００Ｄ未満のものである。候補薬剤はタンパク質との構造的相互作用，特に水素結合に必要な作用基を含み、典型的には、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み、好ましくはこれら作用基の少なくとも２個を含む。多くの場合、候補薬剤は上記作用基の１つまたは２つ以上で置換された、環状炭素または複素環構造および／または芳香族または多芳香族構造を含む。候補薬剤としては、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造的類似物またはこれらの組み合わせ等のような生体分子をも挙げることができる。特に好ましいのはペプチドである。
候補薬剤は一連の合成または天然化合物を含む広範な供給源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含む広範な有機化合物および生体分子をランダムおよび非ランダム合成には多様な手段を利用できる。あるいは、細菌、真菌、動植物エキスの形態を取る一連の天然化合物を利用または容易に製造できる。さらにまた、天然または合成生成物および化合物を、公知の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に変性させることができる。公知の薬剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化、等のようなランダムまたは非ランダム化学変性処理することができるによって、構造的類似物を製造することができる。
好ましい実施態様では、生物に作用する候補薬剤はタンパク質である。ここにいう“タンパク質”とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチド等のような少なくとも２個の共有結合アミノ酸を意味する。タンパク質は天然に産出するアミノ酸・ペプチド結合物でも、合成ペプチド状構造でもよい。ここにいう“アミノ酸”たは“ペプチド残基”は、天然、合成双方のアミノ酸を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的にかなったアミノ酸であると考えられる。“アミノ酸”はまた、プロリンやヒドロキシプロリンのようなイミノ酸をも含む。側鎖は（Ｒ）配置でも（Ｓ）配置でもよい。好ましい実施態様では、アミノ酸は（Ｓ）または（Ｌ）配置である。非天然側鎖を使用するなら、例えば、生体内分解を防止または抑制するため、非アミノ酸置換基を使用してもよい。
好ましい実施態様では、生物に作用する候補薬剤が天然タンパク質またはそのフラグメントである。従って、例えば、タンパク質を含有する細胞エキス、またはたんぱく性細胞エキスのランダムまたは非ランダム消化物を使用することができる。従って、本発明の方法におけるスクリーニングには、原核タンパク質および真核タンパク質のライブラリーを形成すればよい。この実施態様において特に好ましいのは細菌、真菌、ウィルス、および哺乳類タンパク質のライブラリーであり、哺乳類タンパク質が好ましく、特にヒトタンパク質が好ましい。
好ましい実施態様では、約５〜約３０個、好ましくは約５〜約２０個、より好ましくは約７〜約１５個のアミノ酸のペプチドを候補薬剤として使用する。ペプチドとしては、上記天然タンパク質の消化物、ランダム・ペプチド、または“バイアスされた”ランダム・ペプチドを使用できる。ここにいう“ランダム化”または文法的等価物とは、それぞれの核酸およびペプチドが本質的にランダム・ヌクレオチドおよびアミノ酸からそれぞれ成ることを意味する。これらのランダム・ペプチド（または下記核酸）は化学的に合成されるのが普通であるから、任意の位置に任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を組み込むことができる。合成方法は、配列の全長にわたって可能な組み合わせのすべてまたは大部分の形成を可能にして、一連のランダム化された、たんぱく性の候補薬剤を形成できるように、ランダム化タンパク質または核酸を発生させるように構成することができる。
１つの実施態様では、ライブラリーを完全にランダム化し、いかなる位置にも配列の優先または定常条件を設けない。好ましい実施態様では、ライブラリーをバイアスする。即ち、配列内の幾つかの位置を定常のままとするか、または限られた数の可能性から選択する。例えば、好ましい実施態様では、所与の種類、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的にバイアスされた（大小）残基等の範囲内で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基をランダム化することによって、核酸結合ドメインを形成し、架橋にはシステインを、ＳＨ−３ドメインにはプロリンを形成し、ホスホリル化部位にはセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジン、さらには、プリンなどを形成する。
好ましい実施態様では、生物に作用する候補薬剤として、上記核酸を使用する。
タンパク質および核酸に関連して上述したように、生物に作用する候補薬剤として、天然核酸、ランダム核酸、または“バイアスされた”ランダム核酸を使用する。例えば、原核または真核ゲノムをタンパク質として使用することができる。
好ましい実施態様では、生物に作用する候補薬剤として有機化学成分を使用するが、その種類は文献に照らしても広い範囲にわたる。
候補薬剤を添加し、必要な時間にわたって細胞を保温した後、分析すべきターゲット配列を含むサンプルをバイオチップに加える。必要なら、公知の技術を利用してターゲット配列を作成する。例えば、当業者には明らかなように、公知の溶菌バッファ、エレクトロポレーション等を利用してサンプルを処理することにより、細胞を溶菌し、必要に応じてＰＣＲのような精製および／増幅を行う。例えば、ヌクレオシドに共有付着させた標識とともにｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を行う。一般に、核酸を、ビオチン−ＦＩＴＣまたはＰＥ、またはｃｙ３またはｃｙ５で標識付けする。
好ましい実施態様では、ターゲット配列を、例えば、蛍光性、化学発光性、化学的、または放射性シグナルで標識付けすることによって、プローブとのターゲット配列の特異結合を検出する手段とする。標識として、検出可能な生成物を生成する適当な物質を付着させるなら、アルカリ性ホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素を使用することもできる。あるいは、酵素と結合するが酵素によって触媒作用を受けたり、変質させられたりすることがない酵素阻害剤のような標識付けされた化合物または小分子を使用することも可能である。ビオチンの例として、ストレプトアビジンを上記のように標識付けすることにより、結合ターゲット配列に関する検出可能なシグナルを得る。公知のように、分析に先立ち、非結合標識付けストレプトアビジンを除去する。
当業者には明らかなように、これらの検定は直接的なハイブリッド形成検定でもよいし、参考のため、その内容を本明細書中に引用する米国特許第５，６８１，７０２号、５，５９７，９０９号、５，５４５、７３０号、５，５９４，１１７号、５，５９１，５８４号、５，５７１，６７０号、５，５８０，７３１号、５，５７１，６７０号、５，５９１，５８４号、５，６２４，８０２号、５，６３５，３５２号、５，５９４，１１８号、５，３５９，１００号、５．１２４，２４６号および５，６８１，６９７号に記載されているような、複数プローブの使用を含む“サンドウィッチ検定”でもよい。この実施態様では、上述のようにターゲット核酸を作成し、次いで、ハイブリッド形成複合体の形成を可能にする条件下で、複数の核酸プローブを含むバイオチップに添加する。
本発明では、多様なハイブリッド形成条件を採用できる。例えば、高、中程度および低ストリンジェンシー条件を採用できる。検定は、ターゲットの存在においてのみ標識プローブ・ハイブリッド形成複合体の形成を可能にするストリンジェンシー条件下で行うのが普通である。ストリンジェンシーは熱力学変数であるステップ・パラメータを変化させることによって制御することができる。ステップ・パラメータとしては、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶剤濃度等が挙げられる。
これらのパラメータは米国特許第５，６８１，６９７号に記載されているような非特異結合の制御にも利用できる。非特異結合を少なくするため、幾つかのステップを比較的高いストリンジェンシー条件下で行うことが望ましい。
以上に述べた反応は、当業者には公知の種々の方法で行うことができる。反応成分は同時に、または任意の順序で添加すればよく、好ましい実施態様を後述する。また、反応には他の種々の試薬を使用できる。例えば、塩、バッフア，中性タンパク質、例えば、アルブミン、デタージェント等、最適ハイブリッド形成、検出、および／または非特異またはバックグランド相互作用の軽減を容易にするのに利用できる試薬も使用できる。検定の効率を向上する試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤なども、サンプル調製方法およびターゲット純度に応じて使用することができる。
検定が終了したら、データを分析して発現レベル、段階ごとの、個々の遺伝子の発現レベル変化を測定し、遺伝子発現プロフィールを形成する。
ＣＲＣ表現型を調節する薬剤または生物に作用する薬剤を同定するため、スクリーニングを行う。スクリーニングには幾つかの種類がある。特定の発現プロフィールを誘発または抑制できる候補薬剤をスクリーニングするには、関連の表現型を発生させることが好ましい。即ち、正常な結腸組織の発現プロフィールと同様のＣＲＣの発現プロフィールをシュミレートできる候補薬剤がＣＲＣ表現型を抑制すると期待される。従って、この実施態様では、発現プロフィールをシュミレートするか、または１つのプロフィールを他のプロフィールに変えるのが目的である。
好ましい実施態様においては、診断および予後診断に適用するものとして、示差発現遺伝子をいずれか１つの状態において重要であると識別した場合、遺伝子の発現を個々に変えるためにスクリーニングを行うことができる。すなわち、単一の遺伝子の発現レギュレーションを調節するためのスクリーニングを行うことができる。すなわち、発現プロフィールの全てまたは一部を模倣しようとするのではなく、個々の遺伝子のレギュレーションのためのスクリーニングを行うことができる。こうして、例えばその存在の有無が２つの状態間で唯一のものである標的遺伝子の場合、スクリーニングは標的遺伝子発現の調節のために行われる。
好ましい実施態様においては、示差発現させられた遺伝子の発現生成物の生物学的な機能を変えるために、スクリーニングが行われる。また、特定の状態において、遺伝子の重要性を識別した場合、遺伝子生成物の生物学的活性を結合しかつ／または調節する薬剤のためのスクリーニングを行うことができる。これについては下でさらに詳しく略説する。
従って、遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルでＣＲＣ表現型を調節する候補剤のスクリーニングを行うことができる。
加えて、候補剤に反応して誘発された新規の遺伝子のためにもスクリーニングを行うことができる。ＣＲＣ発現パターンを抑圧して正常な発現パターンにし、または、単一のＣＲＣ遺伝子発現プロフィールを調節して正常な組織からの遺伝子の発現を模倣する能力に基づいて候補剤を識別したあと、上述のようなスクリーニングを実施して、薬剤に反応して特異的に調節された遺伝子を識別することができる。正常な組織と薬剤によって処理されたＣＲＣ組織との間の発現プロフィールを比較することにより、正常な組織またはＣＲＣ組織において発現させられない遺伝子が明らかになる。薬剤に対して特異的なこれらの配列は、ＣＲＣ遺伝子またはタンパク質に対する、明細書中に記載した方法のいずれかによって識別し、使用することができる。特にこれらの配列および配列がコードするタンパク質は、薬剤によって処理された細胞のマーキングまたは識別に使用される。加えて、薬剤によって誘発されたタンパク質に対して抗体を拮抗させることができ、処置されたＣＲＣ組織サンプルを新しい療法の目標とするために、これらの抗体を使用することができる。
こうして１実施態様においては、候補剤がＣＲＣ細胞集団に投与される。この細胞集団は、連携するＣＲＣ発現プロフィールを有している。明細書中の「投与」または「接触」は、薬剤が取り込み・細胞内作用によってであれ、細胞表面における作用であれ、細胞に作用することを可能にするように、候補剤が細胞に添加されることを意味する。いくつかの実施態様においては、タンパク質候補剤をコードする核酸がウィルス構造、例えばレトロウィルス構造にさせられてよく、ペプチド剤の発現が達成されるように、細胞に添加されてよい。（ＰＣＴ　ＵＳ９７／０１０１９参照、参考のために本明細書中に引用する。）
候補剤が細胞に投与されると、所望の場合には細胞は洗浄されてよく、所定の時間好ましくは生理学的な条件下で保温することが許される。次いで細胞を取り入れることができ、本明細書中に略説したように、新しい遺伝子発現プロフィールが生成される。
こうして例えば、ＣＲＣ表現型を減小させ抑圧する薬剤のために、ＣＲＣ組織がスクリーニングされてよい。発現プロフィールの少なくとも１つの遺伝子における変化は、薬剤がＣＲＣ活性に作用していることを示す。ＣＲＣ表現型に対するこのようなサインの意味を明確にすることによって、表現型を変える新しい薬剤のためのスクリーニングが可能になる。このようなアプローチによって、薬剤の標的は知られる必要がなく、最初の発現スクリーニングプラットフォームにおいて表示される必要もなく、しかも、標的タンパク質のための転写レベルを変える必要もない。
上に略説したように、好ましい実施態様においては、個々の遺伝子および遺伝子生成物（タンパク質）上でスクリーニングが行われてよい。すなわち、特定の示差出現遺伝子を特定の状態において重要だと識別すると、遺伝子の発現調節または遺伝子生成物自体の調節のスクリーニングを行うことができる。示差出現遺伝子の遺伝子生成物をここでは「ＣＲＣタンパク質」または「ＣＣＭＰ」と呼ぶことがある。好ましい実施態様においては、ＣＣＭＰは図１７〜図２０，２４，２５，２９，３３，３６に示したように、さらに詳しく述べるならば、図２９または図３６に示し、あるいは図２７，３６および３９〜４８の配列によってコードされた配列を有するタンパク質である。ＣＣＭＰはフラグメントであってよく、または、図示のフラグメントとは異なり、全長のタンパク質であってもよい。好ましくはＣＣＭＰはほぼ１４〜２４個のアミノ酸長のフラグメントである。さらに好ましくは、フラグメントは溶解性フラグメントである。
好ましい実施態様においては、フラグメントはＣＡＡ９から形成されている。好ましくはフラグメントは非膜貫通領域を有している。好ましい実施態様ではＣＡＡ９フラグメントは溶解性を助成するためにＮ末端システインを有している。好ましくは、フラグメントはＣＡＡ９ｐ１，Ｃａａ９ｐ２，ＣＡＡ９ｐ３，ＣＡＡ９ｐ４，ＣＡＡ９ｐ４ＭＡＰＳ，ＣＡＡ９ｐ５およびＣＡＡ９ｐ５ＭＡＰＳから選択される。
好ましい実施態様においては、フラグメントはチャージされてＣＡＡ２のｃ末端から形成される。１実施態様においてはフラグメントのｃ末端は遊離酸として保たれ、ｎ末端は遊離アミンであって、カップリング、つまりシステインとのカップリングを助成する。別の実施態様においては、フラグメントは内部ペプチドとオーバラップする、ＣＡＡ２の親水性の筋状部分である。好ましい実施態様においては、末端はブロックされる。好ましくはＣＡＡ２のフラグメントはＣＡＡ２ｐ１またはＣＡＡ２ｐ２から選択される。別の好ましい実施態様においては、フラグメントはＮ末端から形成された新規のフラグメントである。１実施態様においては、フラグメントは、Ｎ末端の外側の配列を排除する。別の実施態様においては、フラグメントはＮ末端の少なくとも一部を含む。「Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ」は上述の「Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ」と交互に使用される。
１実施態様においては、ＣＲＣタンパク質はここで述べたように、免疫原性剤に複合されている。１実施態様においてはＣＲＣタンパク質はＢＳＡに接合されている。
従って好ましい実施態様においては、特定の遺伝子発現調節のためのスクリーニングを行うことができる。これは上に略述したように行われるが、しかし一般的には唯１つのまたは数個の遺伝子の発現が評価される。
好ましい実施態様においては、スクリーニングは、示差発現タンパク質に結合できる候補剤を先ず見出すようにデザインされている。こうしてこれらの薬剤は、示差発現活性を変化させる、候補薬の能力を評価する分析に使用することができる。従って当業者にとっては明らかなように、実施することができる多くの種々異なる分析、例えば結合分析および活性分析がある。
好ましい実施態様においては、結合分析が行われる。一般には精製または分離された遺伝子生成物が使用される。すなわち、１つまたは複数の示差発現核酸の遺伝子生成物が作成される。一般にはこのことは当業者に良く知られているような形式で行われる。例えば、抗体がタンパク質遺伝子生成物に対して生成され、存在するタンパク質量を測定するために標準的な免疫分析が行われる。これとは異なり、ＣＲＣタンパク質を有する細胞が分析に使用されてもよい。
従って、好ましい実施態様においては、本発明による方法は、ＣＲＣタンパク質と候補の対生物作用剤とを組み合わせ、ＣＲＣタンパク質に対する候補剤を結合を検出することから成る。たとえばヒトの疾患の動物モデルの発展のために、他の哺乳類のタンパク質が使用されてもよいが、好ましい実施態様では、ヒトＣＲＣタンパク質が利用される。略説したように、いくつかの実施態様においては変異型ＣＲＣまたは誘導ＣＲＣタンパク質が使用されてよい。
一般的には、本発明の方法の好ましい実施態様においては、ＣＲＣタンパク質または候補剤は不溶性の支持体に拡散不能に結合される。この支持体は、分離されたサンプルを受容する領域（例えばマイクロタイタープレート、アレイなど）を有している。不溶性の支持体は、前記組成物を結合できるようないかなる組成からなっていてもよく、可溶性材料からたやすく分離され、さらにスクリーニング法全体との適合性を有している。このような支持体の表面は個体または多孔性であってよく、あらゆる便利な形状を有していてよい。適切な不溶性支持体の例には、マイクロタイタープレート、アレイ、メンブランおよびビーズが含まれる。これらは典型的にはガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロン、テフロン（商標）等から成っている。マイクロタイタープレートおよびアレイが特に便利である。なぜならば、少量の反応物およびサンプルを使用して、多数の分析を同時に行うことができるからである。組成物の特定の結合形式は、反応物および本発明の方法全体との適合性があり、組成物の活性を維持し、拡散不能である限り、さほど重要ではない。結合の好ましい方法には、抗体（タンパタ質が支持体に結合されたとき、リガンド結合部位や活性配列を立体的には妨害しない）の使用、「粘着性」またはイオン支持体への直接的な結合、化学的な架橋、表面におけるタンパク質または薬剤の合成が含まれる。タンパク質または薬剤の結合に続いて、結合されていない過剰材料が洗浄により除去される。次いで、サンプル受容領域が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の非毒性のプロテインまたは他の用量とともに保温されることによってブロックされてよい。
好ましい実施態様において、ＣＲＣタンパク質は支持体に結合されており、候補の対生物作用剤が分析に加えられる。これとは異なる実施態様においては、候補剤が支持体に結合され、ＣＲＣタンパク質が加えられる。新規の結合剤には、特定の抗体、化学的ライブラリーのスクリーニングで識別される非自然結合剤、ペプチド類似体等が含まれる。特に有利なのはヒト細胞に対する毒性の低い薬剤のためのスクリーニング分析である。このような目的には広い範囲にわたる種々の分析を用いることができ、これらの分析には、インヴィトロで標識付けされたタンパク質−タンパク質の結合分析、電気泳動移動度分析、タンパク質結合のための免疫分析、機能分析（りん酸化分析等）等が含まれる。ＣＲＣタンパク質に対する候補の対生物作用剤の結合は種々の方法で検出されてよい。好ましい実施態様においては、候補の対生物作用剤は標識付けされ、結合が直接的に判断される。このことは、個体支持体にＣＲＣタンパク質の全てまたは一部を付与し、標識付けされた候補剤（例えば蛍光標識）を添加し、過剰の反応物を洗い落とし、標識が個体支持体上に存在するかどうかを判断することによって行われる。当業者にはよく知られているように、種々のブロック・洗浄ステップが利用されてよい。
ここで云う「標識付けされた」とは、化合物が直接的または間接的に、検出可能なシグナル、例えば放射性同位元素、蛍光剤、酵素、抗体、磁気粒子のような粒子、化学発光物質、または特定の結合分子などを提供するラベルで標識付けされることを意味する。特定の結合分子には、ビオチンおよびストレプトアビジンから成る対、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンから成る対、等が含まれる。特定の結合メンバーに対しては、上に略説したように、公知の手順に従って、通常の場合相補メンバーが検出を可能にする分子で標識付けされることになる。標識は直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる。
いくつかの実施態様では成分のうちの１つだけが標識付けされる。例えばタンパク質（またはタンパク質候補剤）が１２５Ｉを使用して、または発蛍光団で、チロシン位置で標識づけされてよい。これとは異なる態様として、２つ以上の成分が、例えばタンパク質に対して１２５Ｉを使用し、候補剤に対して発蛍光団を使用して、異なる標識で標識付けされてよい。
好ましい実施態様においては、候補の対生物作用剤の結合は、競合結合分析を使用して検出される。この実施態様では競合剤は標的分子（すなわちＣＲＣ）に結合するために周知の結合用量、例えば抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンド等である。一定の環境下では、対生物作用剤を置換する結合用量との、対生物作用剤と結合用量との間のような競合的結合があってよい。
１実施態様においては、候補の対生物作用剤が標識付けされる。候補の対生物作用剤または競合剤、またはその両方が先ずタンパク質に、結合（もし存在するなら）を可能にするのに十分な時間だけ添加される。最適な活性を容易にする温度、典型的には４〜４０℃で保温が行われてよい。保温期間が静的な活性のために選択されるが、しかし、高速スクリーニングを容易にするために保温時間が最適化されてもよい。典型的には０．１〜１時間で十分である。一般的には過剰の反応物が除去され、洗い流される。次いで第２の成分が添加され、これに続いて標識付けされた成分の有無が結合を示す。
好ましい実施態様においては、競合剤が先ず添加され、これに続いて候補の対生物作用剤が添加される。競合剤の置換は、候補の対生物作用剤がＣＲＣタンパク質に結合しており、したがってＣＲＣタンパク質の活性に結合してこれを潜在的に調節することができる。この実施態様においては、どちらの成分にも標識付けすることができる。こうして例えば、競合剤が標識付けされた場合には、洗浄溶液中の標識の存在が薬剤による置換を示す。これとは別に、候補の対生物作用剤が標識付けされた場合には、支持体上の標識の存在が置換を示す。
別の実施態様では、候補の対生物作用剤が添加されて保温、洗浄され、これに続いて競合剤が添加される。競合剤による結合がないことは、対生物作用剤が比較的高い親和力を持ってＣＲＣタンパク質に結合されていることを示すことができる。こうして候補の対生物作用剤が標識付けされている場合には、支持体上の標識の存在は、競合剤結合がないことと相俟って、候補剤がＣＲＣタンパク質に結合可能であることを示す。
好ましい実施態様においては、これらの方法はＣＲＣタンパク質の活性を調節できる対生物作用剤を識別するための、差のあるスクリーニングを含んでいる。このような実施態様では、これらの方法は第１のサンプルにおいて、ＣＲＣタンパク質と競合剤とを組み合わせる。第２のサンプルは候補の対生物作用剤とＣＲＣタンパク質と競合剤とを有している。両サンプルに対して、競合剤の結合が検出されるか、または、２つのサンプル間の結合における差が、ＣＲＣタンパク質に結合できてその活性を潜在的に調節することのできる薬剤の存在を示す。すなわち、第２のサンプルにおいて競合剤の結合が第１のサンプルとは異なる場合、薬剤はＣＲＣタンパク質に結合することができる。
これとは別に、好ましい実施態様は差のあるスクリーニングを利用して、自然ＣＲＣタンパク質には結合するがしかし調節されたＣＲＣタンパク質には結合しない薬剤候補を識別する。ＣＲＣタンパク質の構造はモデリングされて、その部位と相互作用する薬剤を合成するために、薬剤示性デザインに使用されてよい。ＣＲＣ対生物活性に影響を与える薬剤候補はまた、タンパク質の活性を向上させるかまたは低減する能力のために、ドラッグをスクリーニングすることにより識別される。
ポジティブなコントロールとネガティブなコントロールとが分析に用いられる。好ましくは全てのサンプルコントロールテストが少なくとも３回ずつ行われて、統計的に重要な結果が獲得される。すべてのサンプルがタンパク質に薬剤を結合するのに十分な時間だけ保温される。保温に続いて、全てのサンプルが、非特異的に結合された物質がないように洗浄され、結合物の量が、主として標識付けされた薬剤によって検出される。たとえば、放射線標識が採用されたところでは、サンプルはシンチレーションカウンタでカウントされて、結合化合物量を検出する。
種々の他の反応物がスクリーニング分析に含まれていてよい。これらの分析には、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にしかつ／または非特異的な相互作用またはバックグラウンド相互作用を減じるのに使用できる塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗剤等が含まれる。またこの他、分析の効率を向上させる反応物、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等も使用されてよい。成分の混合物は必須の結合を可能にするように添加されてよい。
ＣＲＣタンパク質の活性を調節する薬剤のためのスクリーニングが行われてもよい。好ましい実施態様では、ＣＲＣタンパク質の活性を調節することができる対生物作用剤のためのスクリーニング法は、上述のように、ＣＲＣタンパク質サンプルに候補の対生物作用剤を添加するステップと、ＣＲＣタンパク質の生物学的活性における変化を検出するステップとを含む。「ＣＲＣの活性を調節する」ことには、活性の増大、活性の減小、または存在する活性のタイプまたは種類の変化が含まれる。従って、この実施態様においては、候補剤がＣＲＣタンパク質に結合しなければ（これは不要かもしれないにもかかわらず）ならず、しかも、明細書中に規定したように、生物学的または生化学的な活性を変えなければならない。これらの方法には、概ね上で略説したようなインヴィトロ・スクリーニング法と、ＣＲＣタンパク質の存在、分布、活性または量における変化のための細胞のインヴィヴォ・スクリーニングとが含まれる。
従ってこの実施態様において、本発明の方法には、ＣＲＣサンプルと候補の対生物作用剤とを組み合わせ、ＣＲＣ活性における効果を評価することが含まれている。明細書中の「ＣＲＣ活性」または文法的等価物は、好ましくは結腸組織における細胞分裂、細胞増殖、腫瘍増殖、細胞の形質転換を含む（しかしこれに限定されるものではない）ＣＲＣの生物学的活性を意味する。１実施態様においてはＣＲＣ活性には、ＣＺＡ８，ＢＣＸ２，ＣＢＣ２，ＣＢＣ１，ＣＢＣ３，ＣＪＡ９，ＢＣＮ５，ＣＱＡ１，ＢＣＮ７，ＣＱＡ２，ＣＪＡ８，ＣＡＡ２，ＣＡＡ９，ＣＧＡ７および／またはＣＧＡ８が含まれ、好ましくは図１４にリストしたＣＲＣタンパク質の１つである。ＣＲＣ活性の阻害剤が任意の１又は複数のＣＲＣ活性の阻害剤である。
好ましい実施態様においては、ＣＲＣタンパク質の活性が増大させられ、別の好ましい実施態様においては、ＣＲＣタンパク質の活性が減小させられる。アンタゴニストである対生物作用剤はいくつかの実施態様において好適であり、アゴニストである対生物作用剤は他の実施態様において好適である。
好ましい実施態様においては、本発明は、ＣＲＣタンパク質の活性を調節できる対生物作用剤のためのスクリーニング法を提供する。これらの方法には、上で規定したような候補となる対生物作用剤を、ＣＲＣタンパク質を有する細胞に添加することが含まれる。異なる細胞タイプにはほとんどあらゆる細胞が含まれる。細胞はＣＲＣタンパク質をコードする組換え核酸を含む。好ましい実施態様においては、候補剤が複数の細胞上でテストされる。
一方、分析は生理的なシグナル、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子群、活動電位、化学療法薬を含む薬品、放射線、発癌性物質、または他の細胞（すなわち細胞間接触）の有無、または、これらのシグナルの影響を前後に受けたかどうかにおいて評価される。別の例においては、細胞サイクルプロセスの異なる段において検出が行われる。
こうして、対生物作用剤が識別される。薬理作用を有する化合物は、ＣＲＣタンパク質の活性で向上させるか、または、干渉することができる。１実施態様においては、ここに使用したような結腸直腸癌タンパク質活性には、次のもののうちの少なくとも１つが含まれる：結腸直腸癌活性、ＣＪＡ８との結合、ＤＪＡ８の活性化またはＣＪＡ８によるＣＪＡ８の基体の活性化。１実施態様においては、結腸直腸癌活性は直腸組織の無秩序な増殖、直腸内の癌の成長として規定される。一方、ここに規定されたような結腸直腸癌活性は直腸癌組織内のＣＪＡ８のアップ・レギュレーションにおけるＣＪＡ８の活性に関連する。
別の実施態様においては、結腸直腸癌タンパク質活性には、次のもののうちの少なくとも１つが含まれる：結腸直腸癌活性、ＣＡＡ２，ＣＡＡ９，ＣＧＡ７およびＣＧＡ８のうちの１つとの結合、ＣＡＡ２，ＣＡＡ９，ＣＧＡ７およびＣＧＡ８のうちの１つの活性化、または、それぞれＣＡＡ２，ＣＡＡ９，ＣＧＡ７またはＣＧＡ８によるＣＡＡ２，ＣＡＡ９，ＣＧＡ７またはＣＧＡ８の基体の活性化。１つの好ましい実施態様においては、ＣＡＡ２はそのＮ末端部を有している。一方、ここに規定したような結腸直腸癌活性は、直腸癌組織内のそれぞれＣＡＡ２，ＣＡＡ９，ＣＧＡ７および／またはＣＧＡ８のアップ・レギュレーションにおけるＣＡＡ２，ＣＡＡ９，ＣＧＡ７および／またはＣＧＡ８の活性に関連する。
１実施態様において、結腸癌細胞分裂の阻害法が提供される。この方法には、結腸直腸癌阻害剤の投与が含まれる。
別の実施態様では癌の成長を阻害する方法が提供される。この方法には、結腸直腸癌阻害剤の投与が含まれる。
さらに別の実施態様においては、癌を有する細胞または個体の治療法が提供される。この方法には、結腸直腸癌阻害剤の投与が含まれる。
１実施態様においては、結腸直腸癌阻害剤は、上で述べたような抗体である。別の実施態様においては、結腸直腸癌阻害剤はアンチセンス分子である。ここに使用されたようなアンチセンス分子は、結腸直腸癌分子のための標的ｍＲＮＡ（センス）配列またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を有するアンチセンスまたはセンス・オリゴヌクレオチドを含んでいる。好ましいアンチセンス分子はＣＺＡ８，ＢＣＸ２，ＣＢＣ２，ＣＢＣ１，ＣＢＣ３，ＣＪＡ８，ＣＪＡ９，ＢＣＮ５，ＣＱＡ１，ＢＣＮ７，ＣＱＡ２，ＣＡＡ２，ＣＡＡ９，ＣＧＡ７またはＣＧＡ８、さらに好ましくは図１４で参照されるＣＲＣ配列またはそのリガンドまたは活性化因子に対して作用するものである。最も好ましいアンチセンス分子はＣＪＡ８またはそのリガンドまたは活性化因子に対して作用するものである。本発明によれば、アンチセンスまたはセンス・ヌクレオチドは概ね少なくとも約１４個のヌクレオチド、好ましくは１４〜３０個のヌクレオチドを有している。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスまたはセンス・ヌクレオチドを誘導する能力は、例えばステインおよびコーエン（Ｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ）の「Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８」およびヴァン・デア・クロル（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ）等の「Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８，１９８８」に記載されている。
アンチセンス分子は、国際公開第９１／０４７５３号パンフレットに記載されたように、リガンド結合分子との複合物を形成することにより、標的ヌクレオチド配列を含む細胞内に導入されてよい。適切なリガンド結合分子には、細胞表面受容体、成長因子群、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、リガンド結合分子の複合は、リガンド結合分子の、その対応する分子または受容体を結合する能力をほとんど干渉せず、また、センスまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドの入口をブロックしたりまたは複合されたものが細胞内へ入るのを阻むこともない。これとは異なる実施態様では、センスまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、国際公開第９１／０４７５３号パンフレットに記載されたように、オリゴヌクレオチド脂質錯体を形成することにより、標的核酸配列を含むセル内に導入されてよい。アンチセンス分子またはノックアウトモデルおよびノックインモデルは、治療法に加えて、上述のようなスクリーニング分析において使用されてもよいことは明らかである。
先に述べたように、所望の薬理学的な活性を有する化合物が、生理学的に許容可能なキャリヤにおいてホストに投与されてよい。薬剤は種々の形式で、経口的または非経口的に、例えば皮下、腹膜、脈管等から投与されてよい。導入形式に応じて、化合物は種々に処方されてよい。治療上の作用を有する、処方された化合物の濃度は、約０．１〜１００重量％で変ってよい。薬剤は単独で投与されてもよいし、または他の治療、すなわち放射線と組み合わせて投与されてもよい。
薬剤化合物は種々の形、例えば顆粒剤、錠剤、丸剤、座剤、懸濁剤、軟膏、ローション剤等の形で調製することができる。経口的および局所的な使用に適した、製薬上の等級の有機的または無機的なキャリヤおよび／または希釈剤を、治療に効果のある化合物を含む組成を作るのに使用することができる。当業者に良く知られた希釈剤には、水性媒体、植物性および動物性のオイルおよび脂肪が含まれる。安定剤、湿潤・乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なｐＨ値を確保するためのバッファ、および皮膚浸透性向上剤を助剤として使用することができる。
理論に縛られることなく、種々のＣＲＣ配列がＣＲＣにおいて重要であることは明らかである。従って、突然変異または変異ＣＲＣ遺伝子に基づく障害を検出することができる。１つの実施態様においては、本発明の、変異ＣＲＣ遺伝子を含む細胞を識別するための方法が、細胞内に少なくとも１つの内因性のＣＲＣ遺伝子配列の全てまたは一部を検出することから成っている。当業者には明らかなように、このことは、あらゆる数のシーケンス技術を使用して行われてよい。好ましい実施態様では、本発明による、個体のＣＲＣ遺伝子タイプを識別する方法は、個体の少なくとも１つのＣＲＣ遺伝子配列の全てまたは一部を検出することから成っている。このことは一般的には、個体の少なくとも１つの組織内で行われ、多数の組織または同一組織の異なるサンプルの評価を含む。この方法は、配列ＣＲＣ遺伝子の配列を周知のＣＲＣ遺伝子、すなわち野生型遺伝子と比較することを含む。
この場合、ＣＲＣ遺伝子の全てまたは一部の配列を、差異が存在するかどうかを検出するために、周知のＣＲＣ遺伝子の配列と比較することができる。このことは、周知のあらゆる数の相同プログラム、例えばベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）等を使用して行うことができる。好ましい実施態様においては、明細書中に略説したように、患者のＣＲＣ遺伝子と周知のＣＲＣ遺伝子との間の配列の差異の存在が、疾患状態または疾患状態の傾向を示す。
好ましい実施態様においては、ＣＲＣ遺伝子はゲノムにおけるＣＲＣ遺伝子のコピーの数を検出するためのプローブとして使用される。
別の好ましい実施態様においては、ＣＲＣ遺伝子はＣＲＣ遺伝子の染色体の局在性を検出するためのプローブとして使用される。染色体の局在性のような情報は、特に転座のような染色体の異常性等がＣＲＣ遺伝子座において識別されたときに、診断または予後診断を行うのに用いられる。
こうして１実施態様において、細胞内または生体内のＣＲＣを調節する方法が提供される。１実施態様においては、本発明による方法は、内因性ＣＲＣタンパク質の生物学的な活性を減じるかまたは排除する抗ＣＲＣ抗体を細胞に投与することから成っている。これとは別に、本発明による方法は、ＣＲＣタンパク質をコードする組換え核酸を細胞または生体に投与することから成っている。当業者には明らかなように、このことはいかなる数の方法で達成されてもよい。好ましい実施態様においては、例えばＣＲＣ配列がＣＲＣ内でダウン・レギュレートされている場合、ＣＲＣ遺伝子の活性は、例えば周知の遺伝子治療技術を用いて細胞内のＣＲＣ量を増大させること、例えば内因性ＣＲＣを過剰発現させるかまたはＣＲＣ配列をコードする遺伝子を投与することによって増大させられる。好ましい実施態様において、遺伝子治療技術は、例えばその全体を参考のために参照したＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８に記載されているように、増強された相同組換え（ＥＨＲ）を用いて、内因性遺伝子を組み込むことを含んでいる。これとは別に、ＣＲＣ配列がＣＲＣにおいてアップ・レギュレートされている場合には、内因性ＣＲＣ遺伝子の活性は、例えばＣＲＣアンチセンス核酸を投与することによって減小させられる。
１実施態様において、本発明のＣＲＣタンパク質は、ＣＲＣタンパク質に対する多クローン性抗体または単クローン性抗体を生成するのに用いられてよい。これらの抗体は本明細書中に記載したように有益である。同様に、ＣＲＣタンパク質は標準的な技術を用いて、アフィニティ・クロマトグラフィー・カラムにカップリングすることもできる。この場合、これらのカラムはＣＲＣ抗体を精製するのに使用されてよい。好ましい実施態様においては、抗体はＣＲＣタンパク質に固有のエピトープに対して生成される。すなわち、これらの抗体は他のタンパク質に対しては交互反応性をほとんどまたはまったく示さない。これらの抗体は多くの用途に用いられる。例えば、ＣＲＣ抗体は標準的なアフィニティ・クロマトグラフィー・カラムにカップリングされ、ＣＲＣタンパク質を精製するのに使用されてよい。これらの抗体は上に略説したように、ポリペプチドをブロックするものとして使用されてもよい。それというのはこれらの抗体は特異的にＣＲＣタンパク質に結合することになるからである。
１実施態様において、ＣＲＣまたはその調節の治療上効果的な用量が患者に投与される。「治療上効果的な用量」とは、投与されることにより効果を生み出す用量を意味する。正確な用量は治療目的に関連し、周知の技術を用いて当業者によって突き止めることができる。当業者には良く知られているように、ＣＲＣ分解、全身的な供給に対する局部的な供給、および新しいタンパク質分解酵素の比率の調節、ならびに、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬剤相互作用、および病状の重さに合わせた調節が必要となり、これらの調節の度合いは当業者の日常の実験により突き止めることができる。
本発明の目的となる「患者」には、人間および他の動物双方、特に哺乳類、および生物が含まれる。従って、本発明の方法は人間の治療および獣医学的な治療双方に適用可能である。好ましい実施態様においては、患者は哺乳類であり、最も好ましい実施態様では、患者は人間である。
本発明のＣＲＣタンパク質および調節の投与は上述のように種々の方法で行うことができる。このことには、口腔、皮下、静脈、鼻腔、経皮、筋肉、肺内、膣、直腸または眼内への投与が含まれるが、これらに制限されるものではない。いくつかの例においては、例えば負傷および炎症の治療時には、ＣＲＣタンパク質および調節は水剤またはスプレーとして直接塗布されてよい。
本発明の製薬上の組成は、患者への投与に適した形のＣＲＣタンパク質からなっている。好ましい実施態様において、製薬上の組成は、製薬上許容できる塩として存在しているような水溶性の形である。この塩は、酸および塩基を添加した塩を含むことを意味している。「製薬上許容できる酸添加塩」とは、遊離塩の生物学的な効力を維持し、生物学的または他の点で望ましくないことがない塩のことを云う。この塩は、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、燐酸等のような無機酸と、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、琥珀酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等のような有機酸と一緒に形成されている。「製薬上許容できる塩基添加塩」は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム等の塩のような無機塩から誘導された塩を含む。特に好ましくは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩である。製薬上許容できる有機非毒性塩基から誘導された塩には、第１、第２および第３アミン、自然発生した置換アミン、環状アミン、塩基イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミンの塩が含まれる。
製薬上の組成には、次のもののうちの１つまたは２つ以上が含まれていてもよい：キャリヤタンパク質、例えば血清アルブミン；バッファ；賦形剤、例えば微晶質セルロース、ラクトース、コーンおよび他のでんぷん類；結合剤；甘味料および他の調味料；着色剤；およびポリエチレングリコール。添加剤は当業者に良く知られており、種々の処方で使用される。
好ましい実施態様においては、ＣＲＣタンパク質および調節は治療剤として投与され、上に略説したように処方することができる。同様にＣＲＣ遺伝子（全長配列、部分配列の両方、またはＣＲＣコーディング領域の調節配列を含む）も当業者に良く知られているように遺伝子治療の用途で投与することができる。これらのＣＲＣ遺伝子は、当業者にとっては明らかなように、遺伝子治療としての（すなわちゲノム内に組み入れるための）、またはアンチセンスしアンチセンス用途を含むことができる。
好ましい実施態様においては、ＣＲＣ遺伝子はＤＮＡワクチンとして、単独の遺伝子またはＣＲＣ遺伝子の組み合わせで投与される。ネイクドＤＮＡワクチンは当業者に知られている。ブラウアー（Ｂｒｏｗｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６；１３０４−１３０５（１９９８）参照。
１実施態様においては、本発明のＣＲＣ遺伝子はＤＮＡワクチンとして使用される。ＤＮＡワクチンとして遺伝子を使用する方法は、当業者に良く知られており、発現のためプロモーターのコントロール下で、ＣＲＣ患者体内にＣＲＣ遺伝子またはＣＲＣ遺伝子の一部を配置することを含む。ＤＮＡワクチンのために使用されるＣＲＣ遺伝子は全長ＣＲＣタンパク質をコードすることができるが、より好ましくは、ＣＲＣタンパク質から誘導されたペプチドを含むＣＲＣタンパク質部分をコードする。好ましい実施態様においては、患者は、ＣＲＣ遺伝子から誘導された複数のヌクレオチド配列を有するＤＮＡワクチンで免疫にさせられる。同様に、複数のＣＲＣ遺伝子またはここに規定したようなＣＲＣ遺伝子部分で患者を免疫にすることが可能である。理論に縛られることなしに、ＤＮＡワクチンによってコードされたポリペプチドの発現、細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞およびＣＲＣタンパク質を発現させる細胞を認識し破壊または排除する抗体が誘導される。
好ましい実施態様において、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンで補助分子をコードする遺伝子を含んでいる。このような補助分子は、ＤＮＡワクチンによってコードされたＣＲＣポリペプチドに反応する免疫原を増大させるサイトカインを有している。付加的または上記のものとは別の佐剤は、当業者には良く知られており、本発明において使用される。
別の好ましい実施態様においてはＣＲＣ遺伝子はＣＲＣの動物モデルの生成に使用される。当業者には明らかなように、識別されたＣＲＣ遺伝子がＣＲＣ組織内で抑制されるかまたは弱化させられると、遺伝子治療技術においては、ＣＲＣ遺伝子に向けられたアンチセンスＲＮＡがやはり遺伝子の発現を弱化させるかまたは抑制する。このようなものとして生成された動物は、対生物作用剤候補をスクリーニングするのに使用するＣＲＣの動物モデルとして役立つ。同様に、遺伝子ノックアウト技術が、例えば適当な遺伝子を標的とするベクターによる相同的組換えの結果、ＣＲＣタンパク質をなくする。所望の場合には、ＣＲＣタンパク質の、組織にとって特異的な発現またはノックアウトが必要なことがある。
また、ＣＲＣ内でＣＲＣタンパク質が過剰発現させられることも可能である。このようなものとして、形質転換動物を、ＣＲＣタンパク質を過剰発現させるように生成することができる。所望の発現レベルに応じて種々の強さを有するプロモータを、形質転換遺伝子を発現させるために採用することができる。また、組み込まれた形質転換遺伝子のコピーの数を検出し、これを形質転換遺伝子の発現レベルの検出のために比較することができる。このような方法により生成された動物は、ＣＲＣの動物モデルとして使用され、ＣＲＣを治療するための対生物作用分子のためのスクリーニングに付加的に役立つ。
明細書中に記載した例は本発明の範囲を限定するものではなく、例示の目的で提供したにしぎない。本明細書に引用した全ての参考文献および一連の受け入れ番号を参考のために全体的に引用する。
例
例１
組織調製、チップの標識付けおよびフィンガープリント法
ＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して組織から総ＲＮＡを純化する
組織重量を算出する。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ３１００ホモジェナイザを使用して、組織５０ｍｇ当たり１ｍｌのＴＲＩｚｏｌで組織サンプルを均質化する。使用されるジェネレータ／プローブは組織サイズに依存する。均質化しようとする組織量に対してジェネレータがあまりにも大きいと、サンプルのロスが生じ、ＲＮＡ収率が低下する。０．６ｇよりも重い組織に対しては、２０ｍｍのジェネレータを使用する。作業容積が２ｍｌよりも大きい場合には、１５ｍｌポリプロピレン管（Ｆａｌｃｏｎ２０５９）内で組織を均質化する。１０ｍｌ以下で管を充填する。
均質化
ジェネレータは使用前に、石鹸質のＨ２０に通し、完全にすすぐことによって、最後の使用後に清浄化されなければならない。滅菌のためにＥｔＯＨを通す。準備ができるまで組織を冷凍しておく。冷凍された組織に直接的にＴＲＩｚｏｌを添加し、次いで均質化する。
均質化に続いて、ソーバル・スーパースピード（Ｓｏｒｖａｌｌ　ｓｕｐｅｒｓｐｅｅｄ）において１５分間７５００　ｘ　ｇで、またはエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機において１０分間１２，０００　ｘ　ｇで、４℃で遠心分離することにより、ホモジネートから不溶性物質を取り除く。清浄化されたホモジネートを新しい管に移す。今やサンプルを−６０℃〜−７０℃で冷凍して（そして少なくとも一ヶ月保存して）よく、または、精製を続けてもよい。
相分離
均質化されたサンプルを５分間、室温で保温する。
最初の均質化に使用されたＴＲＩｚｏｌ１ｍｌ当たり０．２ｍｌのクロロホルムを加える。
管をしっかりキャップし、１５秒間手によって強く振る（ボルテックスにかけてはならない）。
サンプルを室温で２〜３分間保温する。サンプルをソーバル・スーパースピードで３０分間、６５００ｒｍｐで４℃において遠心分離する。（１０分間１２，０００　ｘ　ｇまで回転させてもよいが、遠心機内の管が破損するリスクがある。）
ＲＮＡの沈殿
水性相を新鮮な管に移す。ＤＮＡまたはタンパク質の隔離が望まれる場合には、有機相を取っておく。最初の均質化に使用されたＴＲＩｚｏｌ１ｍｌあたり０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを加える。管をしっかりキャップし、逆さにして混合する。サンプルを室温で１０分間保温する。サンプルをソーバル・スーパースピードで２０分間、６５００ｒｐｍで４℃において遠心分離する。
ＲＮＡの洗浄
上澄を流し落とす。ペレットを低温７５％エタノールで洗浄する。最初の均一化に使用されたＴＲＩｚｏｌ１ｍｌ当たり１ｍｌの７５％エタノールを使用する。管をしっかりキャップし、数回逆さにしてペレットをばらす。（ボルテックスにかけてはならない）。４℃で５分間、８０００ｒｐｍ（７５００　ｘ　ｇ）未満で遠心分離する。ペレットを注意深くエッペンドルフ管に移す（ペレットを管から新しい管内にすべり落とし、必要な場合には、ペレットの導入を助けるためにピペットの先端を用いる）。取り扱う容積に応じて、ＲＮＡを沈殿させようとする管のサイズを決定することができる。出願人が大型の１５ｍｌの管にＲＮＡを残そうとしたときには、場合によっては小型の管に移さなければならないほど、乾燥するのに時間がかかった（つまり乾かなかった）。フード内でペレットを乾燥させる。適切な容積のＤＥＰＣ　Ｈ２Ｏ中でＲＮＡを再懸濁させる。吸収度を読む。
総ＲＮＡからポリＡ＋ｍＲＮＡを精製するか、または、ＱｌａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットで総ＲＮＡを浄化する
総ＲＮＡからポリＡ＋ｍＲＮＡを精製する。オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）懸濁液を３７℃に加熱し、ＲＮＡに添加する直前に混合する。溶離バッファを７０°Ｃで保温する。バッファ内に沈殿物がある場合には、２　ｘ　結合バッファを６５℃に加熱する。オリゴテックス・ハンドブックの第１６頁の表２に従って、ＤＥＰＣ処理された水、２　ｘ　結合バッファおよびオリゴテックスを総ＲＮＡに添加する。３分間、６５℃で保温する。１０分間、室温で保温する。
１４，０００〜１８，０００ｇで２分間、遠心分離する。遠心分離機が「ソフト設定」を有する場合には、この設定を用いる。オリゴテックス・ペレットを妨害せずに上澄を取り除く。オリゴテックスのロスを減じるために、少量の溶液が後に残されてよい。ポリＡ＋ｍＲＮＡの満足できる結合および溶離が生じたことを確認するまで、上澄を取っておく。
洗浄バッファＯＷ２中で静かに再懸濁する。スピンカラムを全速（可能であればソフト設定で）、１分間遠心分離する。
スピンカラムを新しい管に移し、洗浄バッファＯＷ２中で静かに再懸濁し、ここに説明するように遠心分離する。
スピンカラムを新しい管に移し、予加熱された（７０℃）２０〜１００ｕｌの溶離バッファで溶離する。ピペットを上下させることによりオリゴテックス樹脂を静かに再懸濁する。上述のように遠心分離する。新鮮な溶離バッファで溶離を繰り返すか、または溶離容積を小さく保つために最初の溶離液を使用する。
希釈された溶離バッファをブランクとして使用して、吸収率を読む。
ｃＤＮＡ合成物を用いた処置の前に、ｍＲＮＡを沈殿させなければならない。
残されたいくらかの成分またはオリゴテックス精製処置から溶離バッファ中にあるいくらかの成分はｍＲＮＡの下流側での酵素反応を阻害する。
エタノール沈殿
０．４容積の７．５Ｍ　ＮＨ４ＯＡｃ＋２．５容積の低温１００％エタノールを添加する。−２０℃で１時間から一晩沈殿させる。１４，０００〜１６，０００　ｘ　ｇで３０分間、４℃で遠心分離する。０．５ｍｌの８０％エタノール（−２０℃）でペレットを洗浄し、１４，０００〜１６，０００　ｘ　ｇで５分間、室温で遠心分離する。８０％エタノール洗浄を繰り返す。フード内でペレットからエタノールを最後まで乾燥させる（高速真空を用いてはならない）。ＤＥＰＣＨ２Ｏ中で１ｕｇ／ｕｌ濃度でペレットを懸濁する。
ＱｌａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを使用して総ＲＮＡを浄化する
ＲＮｅａｓｙコラムに１００ｕｇ以下を添加する。ＲＮアーゼの含有されていない水で、サンプルを１００ｕｌの容積に調節する。３５０ｕｌのバッファを、次いで２５０ｕｌのエタノール（１００％）をサンプルに添加する。ピペットにより混合し（ボルテックスにかけてはならない）、次いでサンプルをＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに付与する。１５秒間１０，０００ｒｐｍよりも高速で遠心分離する。収率を考えるならば、流過物をカラムに再付加して再び遠心分離する。カラムを新しい２ｍｌ捕集管に移す。５００ｕｌのバッファＲＰＥを添加し、１５秒間１０，０００ｒｐｍよりも高速で遠心分離する。流過物を廃棄する。５００ｕｌのバッファＲＰＥを添加し、１５秒間１０，０００ｒｐｍよりも高速で遠心分離する。流過物を廃棄し、最大速度で２分間遠心分離してカラムメンブランを乾燥させる。カラムを新しい１．５ｍｌ捕集管に移し、３０〜５０ｕｌの、ＲＮアーゼの含有されない水を直接的にカラムメンブランに付与する。１分間１０，０００ｒｐｍよりも高速で遠心分離する。溶離を繰り返す。吸収率を読む。必要な場合、アンモニウムアセテートと２．５Ｘ容積の１００％エタノールとを有するエタノール沈殿が得られる。
ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）の「ｃＤＮＡ合成物のためのスーパースクリプト選択システム」（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｃｈｏｉｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を使用してｃＤＮＡを作成する
第１ストランドｃＤＮＡ合成
５ｕｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを出発物質として使用する。総ＲＮＡに対しては、２ｕｌのスーパースクリプトＲＴを使用する。ポリＡ＋ｍＲＮＡに対しては、１ｕｌのスーパースクリプトＲＴを使用する。第１ストランド合成混合物の最終的な容積は２０ｕｌである。ＲＮＡは容量が１０ｕｌよりも大きくてはならない。ＲＮＡを１ｕｌの１００ｐｍｏｌ　Ｔ７−Ｔ２４　オリゴと共に１０分間、７０℃で保温する。氷上で、７ｕｌの４ｕｌの５ｘ第１ストランドバッファ、２ｕｌの０．１Ｍ　ＤＴＴおよび１ｕｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物を添加する。３７℃で２分間保温し、スーパースクリプトＲＴを添加し、３７℃で１時間保温する。
第２ストランド合成
第１ストランド反応物を氷上に置く。
添加：９１ｕｌのＤＥＰＣ　Ｈ２０
３０ｕｌの５Ｘ　第２ストランドバッファ
３ｕｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物
１ｕｌの１０Ｕ／ｕｌ　大腸菌ＤＮＡリガーゼ
４ｕｌの１０Ｕ／ｕｌ　大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
１ｕｌの２Ｕ／ｕｌ　ＲＮアーゼ　Ｈ
３つ以上のサンプルがある場合には、上述のものを混合物にする。混合して２時間１６℃で保温する。２ｕｌのＴ４　ＤＮＡ　ポリメラーゼを添加する。１５分間１６℃で保温する。１０ｕｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡを添加する。
ｃＤＮＡを浄化する
フェーズ−ロック・ゲル管（Ｐｈａｓｅ−Ｌｏｃｋ　ｇｅｌ　ｔｕｂｅｓ）フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を精製する：すなわち、最大速度で３０秒間、ＰＬＧ管を遠心分離する。ｃＤＮＡ混合物をＰＬＧ管に移す。同一容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、強く振る（ボルテックスにかけてはならない）。５分間最大速度で遠心分離する。上面水溶性容積を新しい管に移す。エタノール沈殿物：７．５Ｘ　５Ｍ　ＮＨ４Ｏａｃおよび２．５Ｘ容積の１００％エタノールを添加する。すぐに室温で２０分、最大速度で遠心分離する。上澄を取り除き、次いで低温８０％エタノールでペレットを洗浄する。可能な限り多くのエタノール洗浄液を取り除き、ついでペレットを空気乾燥させる。ペレットを３ｕｌのＲｎアーゼの含有されていない水中で再懸濁させる。
インヴィトロ転写およびビオチンでの標識付け
１．５ｕｌのｃＤＮＡを薄壁のＰＣＲ管内にピペットで入れる。
ＮＴＰ標識付け混合物を作る
室温で組み合わせる：
2004510951.tif 000003
反応全体の最終的な容積は２０ｕｌである。ＰＣＲ機内で６時間、３７℃で保温する。
ＩＶＴ製品のＲＮｅａｓｙカラムのための先の指示に従うか、または、ＱｌａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ報告書ハンドブックを参照する。
ｃＲＮＡはほとんどエタノール沈殿が必要となる。フラグメント化ステップと適合性のある容積中で再懸濁させる。
フラグメント化
１５ｕｇの標識付けされたＲＮＡが通常の場合フラグメント化される。フラグメント化反応容積を最小化しようとするには、１０ｕｌ容積が望ましいが、しかし２０ｕｌでもよい。２０ｕｌよりも大きくしてはならない。それというのは、フラグメント化バッファ中のマグネシウムがハイブリッド形成バッファにおける沈殿に貢献するからである。１ｘフラグメント化バッファ中で３５分間、９４℃で保温することによりＲＮＡをフラグメント化する。
５ｘフラグメント化バッファ
２００ｍＭ　トリス・アセテート、ｐＨ８．１
５００ｍＭ　ＫＯＡｃ
１５０ｍＭ　ＭｇＯＡｃ
標識付けされたＲＮＡ転写はフラグメント化の前後で分析することができる。サンプルは１５分間６５℃に加熱し、１％アガロース／ＴＢＥゲルで電気泳動させて転写サイズをほぼ認識することができる。
ハイブリッド形成
１００ｕｌ（１０ｕｇのｃＲＮＡ）のハイブリッド形成混合物がチップ上に置かれる。（５チップセットセットのような）複合的なハイブリッド形成が行われる場合には、３００ｕｌ以上の初期ハイブリッド形成混合物が作られることが望ましい。
ハイブリッド形成混合物：
フラグメントによって標識付けされたＲＮＡ（５０ｎｇ／ｕｌ最終濃度）
５０ｐＭ　９４８−ｂコントロールオリゴ
１．５ｐＭ　ＢｉｏＢ
５ｐＭ　ＢｉｏＣ
２５ｐＭ　ＢｉｏＤ
１００ｐＭ　ＣＲＥ
０．１ｍｇ／ｍｌ　ニシン精子ＤＮＡ
０．５ｍｇ／ｍｌ　アセチル化されたＢＳＡ
３００ｕｌになるように１ｘＭＥＳ　ハイブリッド形成バッファと混合する
ここに使用した指示マニュアルを本明細書中にマニュアル全体にわたって引用する。
ここで使用される標識付けプロトコル
ハイブリッド形成反応：
（ＲＮｅａｓｙカラムによって精製された）非ビオチン化ＩＶＴで開始する
（組織からＩＶＴへのステップに関しては例１を見よ）
2004510951.tif 000004
−　１０分間７０℃で保温し、氷上に置く。
逆転写：
2004510951.tif 000005
−　ハイブリッド形成反応物に添加する。
−　３０分間４２℃で保温する。
−　１μｌのＳＳＩＩを添加し、さらに１時間放置する。
氷上に置く。
−　５０Ｘ　ｄＮＴＰ混合物（２５ｍＭの低温のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、１０ｍＭのｄＴＴＰ：それぞれ２５μｌの１００ｍＭ　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；１０μｌの１００ｍＭ　ｄＴＴＰを１５μｌのＨ２Ｏに添加する。ｄＮＴＰはファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能である。
ＲＮＡ分解：
2004510951.tif 000006
５００μｌのＴＥ／サンプルが７０００ｇで１０分間回転する。精製のために流過物を取っておく。
Ｑｌａｇｅｎ精製：
−　ｕ−ｃｏｎによって回収された物質を５００μｌのバッファＰＢ中で懸濁する。
−　標準的なＱｌａｇｅｎプロトコルに進む。
ＤＮＡｓｅダイジェスト：
−　１／１００ｄｉｌの１／１００ｄｉｌ　ＤＮＡｓｅ／３０μｌ　Ｒｘを１μｌ添加し、３７℃で１５分間保温する。
−　酵素を変性させるために、５分間９５℃にする。
サンプル調製：
−　添加：
2004510951.tif 000007
−　高速真空で乾燥させる。
−　１５μｌのＨ２Ｏ中で再懸濁する。
−　０．３８μｌの１０％ＳＤＳを添加する。
−　９５℃で２分間加熱する。
−　ゆっくりと室温で２０分間冷却する。
スライドに載置し、一晩６４℃でハイブリッド形成する。
ハイブリッド形成後の洗浄：
３ＸＳＳＣ／０．０３％　ＳＤＳ：
２分間。２５０ｍｌｓ　Ｈ２Ｏ中
３７．５ｍｌｓ　２０ＸＳＳＣ＋０．７５ｍｌｓ　１０％ＳＤＳ
１ＸＳＳＣ：
５分間。２５０ｍｌｓ　Ｈ２Ｏ中
１２．５ｍｌｓ　２０ＸＳＳＣ
０．２ＸＳＳＣ：
５分間。２５０ｍｌｓ　Ｈ２Ｏ中
２．５ｍｌｓ　２０ＸＳＳＣ
スライドを遠心分離機で１分間、１０００ＲＰＭで乾燥させる。
適切なＰＭＴおよびチャネルでスキャンする。
その結果が図１〜図１１に示されている。遺伝子のリストは疾患の様々な段階の結腸・直腸腫瘍に由来する。腫瘍内で（全体にわたって）アップ・レギュレートされる遺伝子は、ボディマップ内に制限された量で発現させられるか、または全く発現させられないことも判っている。結腸・直腸研究プロジェクトのためのボディマップは１０の組織、すなわち、心臓、脳、肺、肝臓、乳房、腎臓、前立腺、小腸、脾臓および結腸から成る。正常な結腸に対する、腫瘍におけるダウン・レギュレートされた遺伝子は、ボディマップにおける発現のために選択されないか、または発現させられなかった。図示のようにいくつかの受け入れ番号は発現配列タグ（ＥＳＴ）を含んでいる。従って、本発明の１実施態様においては、発現プロフィール内の遺伝子（発現プロフィール遺伝子とも呼ばれる）はＥＳＴを含み、必ずしも全長ではない。図１は５１個のアップ・レギュレートされた遺伝子を示し、図２は１９４個のアップ・レギュレートされた遺伝子を示し、図３は１１４４個のアップ・レギュレートされた遺伝子を示し、図４は１８１５個のアップ・レギュレートされた遺伝子を示す。図１および図５に示した遺伝子が特に好ましい。図５は５４個のダウン・レギュレートされた遺伝子を示し，図６は５５８個のダウン・レギュレートされた遺伝子を示し、図７は１９２３個のダウン・レギュレートされた遺伝子を示し、図８，９，１０および１１は、正常の直腸組織と比較した、腫瘍組織内でアップ・レギュレートされた遺伝子に受け入れ番号を、発現配列タグを含めて提供する。
例２
ここでは発現研究が行われた。
図２１に示したように、ＣＡＡ２が直腸癌組織内でアップ・レギュレートされている。ＣＡＡ２は染色体１５、細胞帯（ｃｙｔｏｂａｎｄ）１５ｑ１５−２２、インタバルＤ１５Ｓ１４６−Ｄ１５Ｓ１１７に見出される。図１８および図１９に示された好ましいフラグメントは１ｍｇ／１ｍｌ　Ｈ２０の溶解度を有している。
図２６に示したように、ＣＡＡ９は直腸癌組織内でアップ・レギュレートされている。ＣＡＡ９は染色体５、細胞帯５ｑ２３．３、インタバルＤ５Ｓ４７１−Ｄ５Ｓ３９３に見出される。
図３０Ａおよび３０Ｂに示したように、ＣＧＡ７は直腸癌組織内でアップ・レギュレートされている。ＯＧＡ７は染色体２内に見出される。
図３４に示したように、ＯＧＡ８は直腸癌組織内でアップ・レギュレートされている。
図３７に示したように、ＣＪＡ８は直腸癌組織内でアップ・レギュレートされている。ＣＪＡ８は染色体１１内に見出される。
図３８に示したように、ＢＣＮ７は直腸癌組織内でアップ・レギュレートされている。ＢＣＮ７は染色体５、細胞帯５ｑ２２、インタバルＤ５Ｓ４７１−Ｄ５Ｓ３９３に見出される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号（アクセッション番号が備えられている場合、本明細書中および本出願の全体で参考として援用される）を示す図である。
【図２】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。
【図３】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。
【図４】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。
【図５】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でダウン・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。
【図６】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でダウン・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。
【図７】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でダウン・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。
【図８】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。配列中の読み取り枠は、シグナル配列（ＳＳ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）などを有すると特徴づけられた。
【図９】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。配列中の読み取り枠は、シグナル配列（ＳＳ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）などを有すると特徴づけられた。
【図１０】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。配列中の読み取り枠は、シグナル配列（ＳＳ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）などを有すると特徴づけられた。
【図１１】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。配列中の読み取り枠は、シグナル配列（ＳＳ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）などを有すると特徴づけられた。
【図１２】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、発現配列タグを含む遺伝子のアクセッション番号を示す図である。配列中の読み取り枠は、シグナル配列（ＳＳ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）などを有すると特徴づけられた。
【図１３】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、遺伝子またはコードタンパク質の説明を含む遺伝子またはそのフラグメントのアクセッション番号を示す図である。
【図１４】
正常な結腸組織と比較して腫瘍細胞でアップ・レギュレーションされた、コードする遺伝子に関連する核酸配列のアクセッション番号を含む、タンパク質のリストを示す図である。
【図１５】
本発明で提供される直腸結腸タンパク質（ＣＡＡ２）をコードする配列を含む核酸の実施態様を示す図である。開始コドンおよび終止コドンを斜線で示す。２つのクロスマーク内の配列は、本発明でていきょうしたＣＡＡ２の好ましい新規のフラグメント（本明細書中では「ＣＡＡ２　５’末端」という）を示す。ＣＡＡ２の好ましい実施態様には、少なくともＣＡＡ２　５’の一部が含まれる。太字およびおよび「ＧＧＣ」で始まり「ＡＡＡ」で終わる右下のバーで示した配列は、アクセッション番号ＡＡ５０５１３３に見出すことができる。
【図１６】
開始コドンおよび終止コドンを斜線で示した、ＣＡＡ２をコードする核酸の実施態様を示す図である。
【図１７】
ＣＡＡ２のアミノ酸配列の実施態様を示す図である。好ましいフラグメントには、Ｎ末端中の少なくとも約１０アミノ酸が含まれる。本明細書中で定義されたＮ末端には、最初のアミノ酸からこれらの上部に点でマークした３つのアミノ酸のうちの任意のおよそ１つまでが含まれる。別の実施態様では、ＣＡＡ２のＮ末端を、ＣＡＡ２　５’末端によってコードされるアミノ酸配列と定義する。
【図１８】ＣＡＡ２ｐ１（本明細書中に記載の好ましいＣＡＡ２フラグメント）のアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】
ＣＡＡ２ｐ２（本明細書中に記載の好ましいＣＡＡ２フラグメント）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】
ヒトおよび本明細書中に記載のマウスＣＡＡ２ポリペプチドのアラインメントを示す図である。マウスポリペプチドは、以下のアクセッション番号のいずれかの配列の内の少なくともいくつかを含む：ＡＡ３８６８３７；ＡＩ５０８７７３；ＡＡ５０５２９３；およびＡＡ６３６５４６。
【図２１】
直腸結腸癌組織（黒塗りのバー）および多数の正常な組織型（白抜きのバー）の種々のサンプル中のＣＡＡ２の相対発現量を示す図である。
【図２２】
直腸結腸癌核酸ＣＡＡ９　ｍＲＮＡの実施態様を示す図である。開始コドンおよび終止コドンを下線で示す。
【図２３】
開始コドンおよび終止コドンを下線で示した、ＣＡＡ９遺伝子の読み取り枠を示す図である。
【図２４】
推定膜貫通配列を下線で示した、直腸結腸癌タンパク質ＣＡＡ９のアミノ酸配列の実施態様を示す図である。１つの実施態様では、ＣＡＡ９またはＣＡＡ９のフラグメントは可溶性であるので、膜貫通ドメインを欠失、不活化させ、そして／またはペプチドを短縮（再ライゲーションを行うか行わない）して、可溶性ＣＡＡ９を形成する。
【図２５】
直腸結腸癌タンパク質（直腸結腸癌調節タンパク質ともいう）の実施態様を示す図である。特に、図２５は、ＣＡＡ９ｐ１、ＣＡＡ９ｐ２、ＣＡＡ９ｐ３、ＣＡＡ９ｐ４、ＣＡＡ９ｐ４ＭＡＰＳ、ＣＡＡ９ｐ５、およびＣＡＡ９ｐ５ＭＡＰＳならびにそれぞれの溶解物を示す。
【図２６】
結腸癌組織（黒塗りのバー）および正常な組織（白抜きのバー）のいくつかの異なるサンプル中のＣＡＡ９の相対発現量を示す図である。
【図２７】
ＣＧＡ７をコードする遺伝子の核酸配列を示す図である。開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を、斜線のボックスで示す。太字は、アクセッション番号ＡＡ３３１３９３の配列である。下線は、ｅｓｔ配列の編集およびアラインメント由来のコンセンサス配列である。
【図２８Ａおよび図２８Ｂ】
図１のコンセンサス配列を作成するために編集した種々のｅｓｔ（アクセッション番号による）のそれぞれアラインメントのまとめおよび説明を示す図である。
【図２９】
ＣＧＡ７のアミノ酸配列を示す図である。
【図３０Ａおよび図３０Ｂ】
正常な組織および結腸癌組織におけるＣＧＡ７の相対発現を示す図である。
【図３１】
ＣＧＡ８をコードするｍＲＮＡの核酸配列を示す図である。開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を、斜線のボックスで示す。太字は、アクセッション番号ＡＡ２７８６５０３の配列である。下線は、ｅｓｔ配列の編集およびアラインメント由来のコンセンサス配列である。
【図３２Ａおよび図３２Ｂ】
図１のコンセンサス配列を作成するために編集した種々のｅｓｔ（アクセッション番号による）のそれぞれアラインメントのまとめおよび説明を示す図である。
【図３３】
ＣＧＡ８のアミノ酸配列を示す図である。
【図３４】
乳癌組織、結腸癌組織、正常な組織、および胎児組織におけるＣＧＡ８の相対発現を示す図である。
【図３５】
ＣＪＡ８をコードするｍＲＮＡの配列を示す図である。（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を、斜線のボックスで示す。
【図３６】
ＣＪＡ８のアミノ酸配列を示す図である。推定膜貫通領域を、斜線で示す。このヒトタンパク質のマウスホモログは、アクセッション番号ＡＡＦ２１３０８．１で見出される。
【図３７】
結腸組織（黒塗りのバー）および正常な組織（白塗りのバー）のいくつかの異なるサンプル中のＣＪＡ８の相対発現量を示す図である。
【図３８】
プローブとしてアクセッション番号Ｎ２２１０７の配列を使用して同定した、結腸組織（黒塗りのバー）および正常な組織（白塗りのバー）のいくつかの異なるサンプル中のＢＣＮ７の相対発現量を示す図である。
【図３９】
本明細書中に記載の直腸結腸癌タンパク質ＢＣＮ７をコードする配列を含む核酸の実施態様を示す図である。
【図４０】
ＣＺＡ８をコードするｍＲＮＡの配列を示す図である。（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を下線で示す。
【図４１】
ＢＣＸ２をコードするｍＲＮＡの配列を示す図である。（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を下線で示す。
【図４２】
ＣＢＣ２をコードするｍＲＮＡの配列を示す図である。（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を下線で示す。
【図４３】
ＣＢＣ１をコードするｍＲＮＡの配列を示す図である。（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を下線で示す。
【図４４】
ＣＢＣ３をコードするｍＲＮＡの配列を示す図である。（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を下線で示す。
【図４５】
ＢＣＮ５をコードするｍＲＮＡの配列を示す図である。（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）を下線で示す。
【図４６】
本明細書中に記載の直腸結腸癌タンパク質ＣＪＡ９をコードする配列を含む核酸の実施態様を示す図である。
【図４７】
本明細書中に記載の直腸結腸癌タンパク質ＣＱＡ１をコードする配列を含む核酸の実施態様を示す図である。
【図４８】
本明細書中に記載の直腸結腸癌タンパク質ＣＱＡ２をコードする配列を含む核酸の実施態様を示す図である。
【国際公開パンフレット】
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2004510951.tif 000009
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【国際調査報告】
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