(57)【要約】本発明は細胞および組織培養装置に関し、この装置は、少なくとも一つの培養ウエル（18-I）、夫々が少なくとも一つの可撓性ポーチ（6，7；27，29）を収容し、その一方が少なくとも培養液を受け取ることができる第一（2）および第二（25）のリザーバ、ウエルを介して一方のリザーバから他方のリザーバへと培養液を循環させるためにウエルおよびポーチに結合されたリンク手段、第一（2）および第二（25）のリザーバのポーチに対して、それぞれ制御モジュール（50）によって決定され且つウエルにおける培養液循環を制御するように設計された第一および／または第二の外部圧力シーケンスを加えるための加圧手段、ウエル内部に第一の選択された温度を維持し、且つウエルに供給するために第一および第二のリザーバから流出する培養液を第二の選択された温度に設定するように設計された制御モジュールによってモニターされる温度制御手段（49，51-58）を具備する。【選択図】図１
2004524046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞および組織を培養するための装置であって：該装置は、
培養すべき細胞または組織を収容するのに適した少なくとも一つの培養ウエル（18-i）と；
夫々が少なくとも一つの可撓性バッグ（6，7；27，29）であって、その少なくとも一つは培養液を収容するのに適しているものを収容する、第一および第二のリザーバ（2，25）と；
前記ウエルおよび前記バッグに結合して、前記培養液を一方のリザーバからウエルを介して他方のリザーバに流すことを可能にするリンク手段（20，21）と；
前記第一および第二のリザーバ（2，25）に対して、前記ウエルを通して前記培養液を流すために、それぞれ少なくとも一つの制御モジュール（50）によって定義される第一および／または第二のシーケンスの外部圧力を加えるように配置された加圧手段とを具備し、
前記ウエル（18-i）の内部に第一の選択された温度または第一の選択された温度サイクルを維持し、および／またはウエルに供給するために前記第一および第二のリザーバから流出する培養液を第二の選択された温度にするように、前記制御モジュールによって制御された温度調節手段（35，47，49，51-58）を含むことを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、前記温度調節手段は、前記ウエル（18-i）を定義する壁に組込まれ、且つ熱搬送流体がその中を循環するように構成された第一の部分（47）を含む、流体回路を具備することを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項２に記載の装置であって、前記流体回路の第一の部分は、前記ウエル（18-1）の壁に組込まれた熱搬送流体のための循環チャンネル（47）の中に開口した、第一の接続手段（46）を含むことを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の装置であって、前記温度調節手段は、夫々第一および第二のリザーバ（2，25）を定義する壁（15）に組込まれた第二および第三の部分（35）を含み、且つ熱搬送流体がその中を通って循環することを可能にするように構成された、流体回路を具備することを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項４に記載の装置であって、前記第一および第二のリザーバの夫々は、内側シェル（16）および該内側シェルを収容する外側シェル（17）を一緒に組立て、その中で熱搬送流体が循環できるシェル間スペース（35）を定義することによって作製されることを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項４または５と組合された請求項２または３に従う装置であって、前記流体回路の第二の部分（35）は、前記第一の部分（47）に熱搬送流体を供給するように構成され、前記流体回路（35）の第三の部分は、前記第一の部分（47）を循環した熱搬送流体を回収数量に構成されることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項３、５および６の組合せに従う装置であって、前記流体回路の第二および第三の部分（35）は、シェル間スペース（35）の中に開口した第二および第三の接続手段（43，45）を含み、また第一の副部分が前記第一の接続手段に接続され、第二の副部分が熱搬送流体を供給および回収するための前記流体回路の第四の部分に接続されるのに適することを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項２〜７の何れか１項に記載の装置であって、前記流体回路は、前記熱搬送流体の画分を含む主コンテナ（49）に結合されたポンプと、前記第一、第二および第三の部分（47，43および45）に供給される前に前記熱搬送流体を制御された方法で加熱するための電気ヒータ手段（51）とを含むことを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の装置であって、前記温度調節手段は、前記ウエルの制御された加熱の少なくとも幾らかを提供するための、第一および第二の電気ヒータ素子を具備することを特徴とする装置。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の装置であって、前記温度調節手段は、前記第一および第二のリザーバの制御された加熱の少なくとも一部を提供するための第二の電気ヒータ素子を含むことを特徴とする装置。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の装置であって、前記電気ヒータ素子は、リザーバおよび／またはウエルを定義する壁に固定されたヒータ抵抗を具備することを特徴とする装置。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の装置であって、前記第一および第二のリザーバ（2，25）は、狭い中間部分（5，23）を介して相互連結された頂部（3，26）および底部（4，28）を備え、前記第一および第二のリザーバの各頂部および底部は夫々のバッグを収容しており、前記頂部および底部の可撓性バッグ（6，27；7，29）は前記中間部分（5，23）を介して相互に連通し、また前記リンク手段（20，21）は前記底部バッグ（6，29）と連通しており、前記第一および第二のリザーバ（2，25）の頂部および底部（3，26；4，28）は、それぞれが漏出のない入口（38．40）を更に含んでいることと、並びに前記加圧手段は、高圧の加圧流体を、前記加圧回路（64）の第一の部分を介して、制御モジュール（50）により制御された頂部および底部の弁（78，81，84，87；79，80，85，86）に接続された前記加圧回路（77，82，83，89）の第二の部分へと供給するのに適し、且つ前記第一および第二のリザーバの頂部および底部（3，26；4，28）の夫々に、前記漏出のない入口（38，40）を介して高圧、低圧または中程度の圧力の加圧流体を供給するのに適した、流体ポンプ（60）を具備することを特徴とする装置。
【請求項１３】
請求項８〜１２に記載の組合せに従う装置であって、前記加圧回路（64，65）の第一の部分は、前記加圧回路（77，82，83，89）へ加熱された加圧流体を供給するように、前記主コンテナ（49）に含まれる熱搬送流体中に浸漬された副部分（73）を含むことを特徴とする装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の装置であって、前記加圧手段は、前記熱搬送流体に接触して前記主コンテナ（49）内に配置された補助コンテナ（74）を含み、該コンテナは加湿流体を含み、且つ前記加圧回路の第一の部分の副部分（74）によって加圧流体を供給されて、前記加圧回路（65）の第二の部分に供給される該加圧流体が選択された湿度を呈するようになっていることを特徴とする装置。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか１項に記載の装置であって、直列に配置され且つ前記リンク手段（21）を介して相互に連通している少なくとも二つのウエル（18-i）を含み、該ウエルの一方（18-1）は前記第一のリザーバ（2）に接続され、他方のウエル（18-3）は前記第二のリザーバ（25）に接続されていることを特徴とする装置。
【請求項１６】
請求項１５に記載の装置であって、前記二つのウエルの間に直列に配置され、且つ前記リンク手段（23）を介してこれらウエルの夫々に連通している第三のウエル（18-2）を含むことを特徴とする装置。
【請求項１７】
請求項１〜１６の何れか１項に記載の装置であって、前記制御モジュール（50）は、前記圧力シーケンス並びに前記第一および第二の選択された温度、または前記第一および第二の選択された温度サイクルを保存するのに適した、書換え可能なタイプのメモリー（98）を含むことを特徴とする装置。
【請求項１８】
請求項１〜１７の何れか１項に記載の装置であって、前記制御モジュール（50）は、前記各リザーバおよび前記チャンバの入口区画を、それらが共通の熱搬送回路によって供給されるときに、それらの温度を夫々独立に制御するように配置されることを特徴とする装置。
【請求項１９】
請求項１〜１８の何れか１項に記載の装置であって、少なくとも一つの栄養素コンテナ（14）、およびサーモスタット回路に接続されたガスまたは液体供給装置（32）を含むことと、前記制御モジュール（50）は、前記栄養素コンテナ（14）および／または前記ガス供給装置（32）の夫々の内容物を、選択された温度に維持するように配置されていることとを特徴とする装置。
【請求項２０】
請求項１〜１９の何れか１項に記載の装置であって、夫々のリザーバ部分は、前記チャンバの両側に配置されるリザーバ部分が異なる温度で配置されて、前記ウエル内に温度サイクルまたは温度プロファイルを形成し得るように、加熱流体回路に接続されることを特徴とする装置。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか１項に記載の装置であって，前記温度調節手段は，前記チャンバおよび／またはウエルの内部に温度ショックを付与するように配置されることを特徴とする装置。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れか１項に記載の装置であって、前記温度調節手段は、ウエル内の温度を表す測定値を前記制御モジュールに適用するのに適した、少なくとも一つの温度センサを含むことを特徴とする装置。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れか１項に記載の装置であって、少なくとも前記ウエルを外部から隔離するためのカバーを含むことを特徴とする装置。
【請求項２４】
請求項２３に記載の装置であって、前記カバーは、前記ウエルおよび前記リザーバの療法を外部から隔離するためのものであることを特徴とする装置。
【請求項２５】
細胞および組織を培養するための設備であって、請求項１〜２４の何れか１項に記載の少なくとも二つの装置（1-i）を、該装置を一緒に制御するための主制御ユニット（50）と共に具備することを特徴とする設備。
【請求項２６】
請求項２５に記載の設備であって、各装置の前記ウエルおよび／またはリザーバに並列に供給する主流体回路を含むことを特徴とする設備。
【請求項２７】
請求項２５に記載の設備であって、前記主制御ユニット（50）により制御され、且つ各装置のウエル内部に、選択された同じ第一の温度または選択された同じ第一の温度サイクルを維持するように、および／または各装置の前記第一および第二のリザーバの少なくとも一方から流出して前記ウエルに供給される前記培養液を、選択された同じ第二の温度または選択された同じ第二の温度サイクルに服せしめるために配置された、中央温度調節手段を含むことを特徴とする設備。
【請求項２８】
請求項２７に記載の設備であって、前記主制御ユニットは前記各装置の温度制御手段を制御して、それらが相互に独立に、前記装置のウエル内に選択された第一の温度または第一の選択された温度サイクルを維持するようにし、および／またはそれらが相互に独立に作用して、前記ウエルに供給されるために前記装置の第一および第二のリザーバの少なくとも一方から流出する培養液を、第二の選択された温度または第二の選択された温度サイクルに服させることを特徴とする設備。
【請求項２９】
請求項２５〜２８の何れか１項に記載の設備であって，各装置の少なくとも前記ウエルを外部から隔離するための主カバーを含むことを特徴とする設備。
【請求項３０】
請求項２９に記載の設備であって、前記主カバーは、各装置の前記ウエルおよび前記リザーバを同時に外部から隔離するように働くことを特徴とする設備。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、移動する培養液または栄養培地を用いて、細胞および組織をダイナミックに培養する分野に関する。
【０００２】
より正確に言えば、本発明は、ｉ）培養される細胞または組織を収容するためのチャンバを限定する一以上の培養ウエルと；ｉｉ）夫々が少なくとも一つの可撓性バッグを収容して、且つそのうちの少なくとも一つが培養液を収容するのに適した第一および第二のリザーバと；ｉｉｉ）培養液が一つのリザーバから前記ウエルを介して他のリザーバへと流れることを可能にするために、前記ウエルおよび前記バッグに結合されたリンク手段と；ｉｖ）前記第一および第二のリザーバのバッグが、それぞれ一以上の制御モジュールによって決定される第一および／または第二のシーケンスの外部圧力を受けることを可能にし、且つ前記ウエル内での培養液の流れを支配するように働く加圧手段と；を具備した細胞および組織を培養するための装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
フランス特許出願00/00548号に記載された種類の装置は、培養の全期間を通して、適切な流れ条件が維持されることを可能にする。しかし、培養が温度制御下にあることを必要とするとき、このタイプの装置は適切なインキュベータの内部に配置される必要があり、それによって取替えに伴う生物学的リスク、コスト、取扱いおよびサイズが増大し、またインキュベーションが起きている間に、顕微鏡を使用して培養がどのように進行しているかを観察することが不可能になる。加えて、この移動は温度変化を導き、これが有害な生物学的結果を生じることがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上記で特定した欠点の全部または幾つかについての独創的解決を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的のために、本発明は、導入部で説明した種類の装置であって、制御モジュールの制御下にある温度調節手段が設けられ、前記ウエル内に第一の選択された温度または第一の選択された温度サイクルを維持するように、および／または前記ウエルに供給するために前記第一および第二のリザーバの少なくとも一方を出て行く培養液に、第二の選択された温度または第二の選択された温度サイクルを適用するように働く装置を提供する。
【０００６】
こうして、当該装置内の温度調節は、専らウエルレベルにおいて、または専らウエルに供給される培養液のレベルの何れかにおいて行うことができ、或いは、実際には培養液とセルとの間の交換を行うときの温度分布を最小化するように、ウエルレベルおよび培養液のレベルの両方において同時に行うことができる。
【０００７】
前記第一および第二の温度（または第一および第二の温度サイクル）は、培養の種類の関数として選択される。従って、培養に必要とされるならば、それらは実質的に同一であることができ、または異なることもできる。第二の温度（または第二のサイクル）もまた、必要であれば、一つのリザーバと他のリザーバとで変化させることができる。また、培養が進行する間に温度（またはサイクル）を変化させることも可能である。これを行うために、例えば制御モジュールにより付与される外部圧力シーケンスを決定するプログラムの中に含めることによって、温度を変化させるためのパラメータをプログラムしてもよい。このようなプログラミングは、入力インターフェースを使用して行ってもよく、或いは、予め定義されたプログラムを、前記制御モジュールに結合（または集積）された当該装置のメモリーの中に移動させ、次いで該プログラムの一つを選択することによって直接に行ってもよい（該メモリーは任意に、上記インターフェースを介して書き換え可能であってもよい）。
【０００８】
本発明の装置の第一の実施例において、前記温度調節手段は加熱流体回路を含み、該回路はウエル（多分チャンバの周縁に形成された流れチャンネルの形態、またはウエルの壁に形成され且つ第一の連結手段に結合された液体流れを可能にするための空間）を形成する壁に組込まれた少なくとも第一の部分、または前記第一および第二のリザーバを形成する壁の中にそれぞれ組込まれ且つ熱を運ぶ液体が流れることを可能にするように配置された第二および第三の部分（これらは、一緒に組立てられたときに前記第一および第二のリザーバを形成する内側シェルと外側シェルの間に形成された空間であってもよい）を具備し、或いは前記第一、第二および第三の部分の組合せを具備する。この組合せの場合、好ましくは、第二の部分は第一の部分に熱搬送流体（液体またはガス）を供給するように配置されるのに対して、第三の部分は、第一の部分を流れた熱搬送流体を選択するように配置される。従って、熱搬送流体を供給および回収するために、特に有利には、前記流体回路の第二および第三の部分が第二および第三の接続手段を含み、これら接続手段はシェル間の空隙の中に開いており、且つそれぞれが第一の接続手段および前記流体回路の（主要な）第四の部分に接続されるのに適している。
【０００９】
この第一の実施例において、加熱流体回路は、好ましくは、前記熱搬送流体（液体またはガス）の画分を含んだ主コンテナに接続されたポンプ、並びに前記第一、第二および第三の部分に供給される前の前記熱搬送流体を、制御された方法で加熱するための電気ヒータ手段（例えばヒータ抵抗）を含んでいる。
【００１０】
本発明の装置の第二の実施例において、前記温度調節手段は、前記ウエルの制御された加熱の少なくとも一部を与えるための第一の電気ヒータ素子（例えば、前記ウエルの壁に対して配置されまたは該壁の中に隔離されたヒータ抵抗の形態）、または前記第一および第二のリザーバの制御された加熱の少なくとも一部を提供するための第二の電気ヒータ素子（例えば、前記リザーバの壁に対して配置されまたは該壁の中に隔離されたヒータ抵抗によって構成される）、または前記第一および第二の電気ヒータ素子の組合せを具備している。
【００１１】
当然ながら、温度調節手段が流体回路（第一の実施例のような）および電気ヒータ素子（第二の実施例のような）の両方を具備した、本発明の装置の第三の実施例を想定することも可能である。
【００１２】
本発明の装置は、追加の特徴、特に下記の特徴を別々にまたは組合せて含んでいてもよい：
・前記第一および第二のリザーバの夫々は、狭い中間部分により接続された頂部または底部と、複数の底部バッグを連通させるリンク手段とを具備してもよく、前記頂部および低部は更に漏出しない入口を含んでいる。同時に、加圧手段は、前記漏出のない入口を介して各頂部リザーバ部分および底部リザーバ部分に高圧もしくは低圧、または実際には中間圧で加圧流体を供給するために、制御モジュールによって制御される頂部および底部の圧力調節弁に接続された前記加圧回路の（主要な）第一の部分および第二の部分を介して、高圧で加圧流体を供給するための流体ポンプを含んでいてもよい。このような環境下では、前記加圧回路の第一の部分が、前記熱搬送流体（液体またはガス）の中に浸漬された副部分を含んでいるのが特に有利であり、これは前記加圧回路の第二の部分に加熱された加圧流体を供給するように、前記主コンテナの中に収容される。これは、前記培養液に対する温度の外乱を最小化することを可能にする。更に、前記加圧回路の第二の部分に対して選択された湿度の加圧流体を供給するように、前記熱搬送流体に接触して前記主コンテナの外側に収容され、且つ前記加圧回路の第一の部分の副部分によって加圧下の流体を供給される、加湿流体を収容する補助コンテナ（ウオーターバス(bain-marie)）を提供することも可能である。これは、前記可撓性バッグが半透過性であるときに特に重要である。
【００１３】
・少なくとも二つ、好ましくは三つまたは四つのウエルを直列に配置し、リンク手段を介して相互に連通させ、第一のウエルは第一のリザーバに接続する一方、該第一のウエルの反対側のウエルは第二のリザーバに接続してもよい。
【００１４】
・前記温度調節手段は、ウエル内部またはその直近の温度を表す測定値を前記制御モジュールに与えるために、少なくとも一つの温度センサを含んでもよい。
【００１５】
・ウエルを外部から隔離し、また可能であれば前記リザーバ、および実際には全体の装置を隔離するために、カバーを設けてもよい。
【００１６】
本発明はまた、細胞および組織を培養するための設備であって、並列に配置された少なくとも二つの上記タイプの装置を具備し、それらの制御ユニットの全てを制御するか、またはそれ自身がそれらの機能を行う一つの制御ユニットを共有する設備を提供する。
【００１７】
この設備は、各装置のウエルおよび／またはリザーバに並列に供給するための主流体回路を含んでいてもよい。この場合、主制御ユニットによって制御される中央温度調節手段であって、選択された共通の第一の温度または選択された共通の第一の温度サイクルを各装置のウエル内に維持し、および／または各装置の第一および第二のリザーバの少なくとも一方から流出する培養液を、選択された共通の第二の温度または選択された共通の第二の温度サイクルでそのウエルに供給するように働く、中央温度調節手段を設けるのが特に有利である。
【００１８】
一つの変形例において、前記主制御ユニットは、各装置の温度調節手段を制御して、それらが相互に独立に、対応する装置のウエル内において第一の選択された温度または第一の選択された温度サイクルを維持し、および／または前記対応する第一および第二のリザーバの少なくとも一方を出る培養液が、相互に独立に、第二の選択された温度または第二の選択された温度サイクルでそのウエルに供給されるようになっている。
【００１９】
当該設備はまた、各装置のウエルを同時に外部から隔離し、可能であれば関連のリザーバまたは完全な装置と共に隔離する主カバーを含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面を精査することにより明らかになるであろう。
【００２１】
添付の図面は、その性質において本質的に定義的である。従って、それらは本発明を説明するために寄与できるだけでなく、適切な場合にはそれを限定するために寄与することができる。
【００２２】
先ず、非限定的な実施例における細胞および組織培養装置を説明するために、図１〜図４を参照する。
【００２３】
図１に示された装置1は、先ず、中間部分5を介して底部4に結合された頂部3を有する第一のリザーバ2を具備している。このリザーバ2は、該リザーバに一定の容積を与える剛性の壁15によって形成されており、これについては以下で更に述べる。
【００２４】
図示の例において、リザーバの頂部3は、可撓性の頂部バッグ6を収容している。同様に、底部4は可撓性の底部バッグ7を収容しており、該バッグは、中間部5に収容されたダクト8を介して頂部バッグ6に結合され、第一のリザーバ2の頂部および底部3および4が相互に隔離されるようにその中に近接して収容されている。
【００２５】
頂部バッグ6は、第一のリザーバ2の頂部パーティションの一つに形成された頂部開口部10と漏出のない仕方で協働できるように適合された、入口／出口9を有している。従って、頂部バッグ6は、それ自身が培養液またはガス供給モジュールに結合された頂部アクセス制御手段11に接続されてもよく、または図示のように、好ましくは加圧された栄養素（または培養流体）コンテナ14に接続されてもよい。コンパクト化の理由で、栄養素コンテナ14はリザーバ2の頂部下に配置されるが、それは他の場所に配置されてもよいであろう。
【００２６】
同様に、図１に示すように、底部バッグ7は、第一のリザーバ2の底部4の壁または他の場所に形成された、漏出のない開口部と協働するように適合された入口／出口12を有しており、この場合、リザーバ2の底部4の外側に収容されたアクセス制御手段13と協働するようになっている。
【００２７】
底部バッグ7は、非常な高圧を受けたときに完全に平たくなるのを防止するように、二つの実質的に剛性の部材を備えていてもよい。何故なら、それは培養液の良好な流れを妨げるからである。また、好ましくは、中間部分5において、第一のリザーバ2は、手動でまたは自動的に、液体またはガスをダクト8の中に注入し、またはその内部から抜取ることを可能にする追加の開口部を有している。該開口部には、好ましくは、注入または抜取りのための装置が針を装着したシリンジであるときに特に適した隔壁が装着される。また、リザーバの底部および頂部の夫々に隔壁を与えるのも好ましい。
【００２８】
また、好ましくは、頂部および底部のバッグ6および7は多孔質の材料、少なくとも外側から内側に向って多孔質の材料でできている。それらは、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（PDSM）、実際にはポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、または実際にはジメチルおよびメチルビニルシロキサンポリマー製であってよい。これは、可撓性バッグ内にある培養流体と、第一のリザーバ2の頂部および底部3，4の内側にトラップされたガスとの間でのガス交換を可能にする。これらのバッグは、特にリザーバの内部に含まれる流体（一般には以下でより詳細に述べる加圧ガス）との交換に関して異なる機能を与えるように、異なる材料でできている。加えて、一つのリザーバ内のバッグは、異なる形状および容積を与える。
【００２９】
図１に示した例において、底部バッグ7は、アクセス制御手段13および該リザーバの壁に形成された底部開口部を介して、培養ウエル18-1〜18-3と連通している。
【００３０】
アクセス制御手段13は、好ましくは「ピンチ」型である。それらは中空末端を有しており、その中にはリンク手段20の一端が挿入され、該リンク手段はその反対端において、第一のウエル18-1の培養チャンバ19-1の中への開口を有するダクト（または管）の形態で作製されている。この第一の培養チャンバ19-1は、同様にダクト（または管）の形態で実施されたもう一つのリンク手段21を介して、第二のウエル18-2に収容された第二の培養チャンバ19-2と連通している。同様に、第二の培養チャンバ19-2は、ダクト（または管）の形態で作製されたもう一つのリンク手段21を介して、第三のウエル18-3に収容された第三の培養チャンバと連通している。最後に、この例においては、最後のリンク手段20が、第三の培養チャンバ19-3と以下で述べる第二のリザーバ25との間の連通を提供する。
【００３１】
第二のリザーバ25は、好ましくは、図１〜図４を参照して上記で述べた第一のリザーバ2と実質的に同一である。従って、この例では、該リザーバ25は、その中に収容された頂部可撓性バッグ27を有する頂部26と、その中に収容された底部可撓性バッグ29を有する底部28と、頂部バッグ27を底部バッグ29に結合する中間ダクト24を収容するための狭い中間部分23とを具備している。このダクト24は、頂部26が底部28から気密に隔離されるように、同様に中間部分23の中に厳密に収容される。
【００３２】
頂部バッグ27は、アクセス制御手段31に連結された適切な入口／出口30を有しており、該アクセス制御手段31は、アクセス制御手段11と同様に、ガスもしくは液体供給装置32または抽出器に接続することができる。同様に、底部バッグ29は入口／出口33を有しており、図示の例において、これは第二のリザーバ25における底部28の外側に配置されたアクセス制御手段34に接続されている。
【００３３】
第二のリザーバ25はまた、好ましくは、その頂部、中間部および底部26，23および28に開口部を含んでおり、手動でまたは自動的に、液体またはガスがポケットもしくは中間ダクト24の中に注入されまたは抜取られることを可能にしている。これらの開口部は、好ましくは夫々の隔壁に設けられている。
【００３４】
この例において、アクセス制御手段34は同様に、好ましくは「ピンチ」型であり、この目的のためにリンクダクト20の末端に結合される中空末端を有している。
【００３５】
従って、第一のリザーバ2の頂部バッグ6と第二のリザーバ25の頂部バッグ27との間に、培養チャンバ19-i（この例ではi＝1〜3）およびリンク部材20，21を介して回路が形成される。
【００３６】
培養増殖を熱的に制御することを可能にするために、当該装置は、培養ウエルの内部の温度を調節し、またはウエルに供給される培養液の温度を調節するために、または、実際に好ましくは、ウエル内および培養液の両方の温度を調節するために、図１〜図４に示すような温度調節手段を有している。
【００３７】
これらの図に示した実施例では、培養液の温度は、二つのリザーバ2および25において、熱搬送流体（液体またはガス）を、それらの剛性壁15の内側で循環させることによって調節される。より正確には、リザーバ2および25の頂部および底部を定義する壁15は、その中に組込まれた流体循環スペース35を有しており、これは加熱目的の流体回路の一部を形成している。図２〜図４に示すように、この循環スペース35は、内側シェル16と、該内側シェル16を収容する外側シェル14とを一緒に組立てることによって形成するのが有利である。
【００３８】
内側シェル16は、好ましくは、各リザーバ2および25の頂部、中間部および底部の内側部分を形成する二つのシェル半型16aおよび16bを一緒に組立てることによって構成される。
【００３９】
外側シェル17は同様に、好ましくは、内側シェル16の外表面に形成された第二の保持手段37（この場合はスタッド）と協働する第一の保持部材36（この場合にはオリフィス）を持った、二つのシェル半型17aおよび17bを一緒に組立てることによって構成される。その頂部において、それはまた、第一のコネクタ43（加熱流体回路の「外部」主要部分への接続に適している）に嵌め込まれた入口42を有しており、その底部には、端部壁18-1および18-3に適合された第三または第四のコネクタ46への接続に適した第二のコネクタ45を備えた出口44を有している。その結果として、熱搬送流体は、リザーバ2および25の壁15の内部で循環して、バッグ内で循環する培養液のための効果的な温度調節を与えることができる。
【００４０】
ウエル内の温度調節を与えるために、加熱流体回路のもう一つの部分を形成するチャンネル47が与えられている。ウエル18が厚い固体ブロック48の中に作られるとき、チャンネル47は好ましくは、該ウエルを定義するゾーンの周縁に、好ましくはその下にも、前記ブロック48の中に中空を作製することによって形成される。一変形例においては、前記ウエルおよびリザーバが支持体プレート上に据付けられるとき、該支持体プレートは、熱搬送流体の一部をウエル18の下に循環させるためのチャンネル47を含んでいてもよい。これらのチャンネル47は、第一のリザーバ2の第二のコネクタ45への接続のための第三のコネクタ46の一方の側に、また第二のリザーバ25の第一のコネクタ43への接続のための第四のコネクタの反対側に接続される。
【００４１】
熱搬送流体は、加熱流体回路の主要部分内を循環して、第一のコネクタ43を介して第一のリザーバ2のウエル15に到達し、シェル間スペース35の中を循環し、次いで第二のコネクタ45に到達する。次いで、それは第三のコネクタ46を介してウエル18のチャンネル47の中に流入し、第四のコネクタ46に到達する。その後、それはその第二のコネクタ45を介して第二のリザーバ25のウエル中に流入し、シェル間スペースの中を循環し、次いでその第一のコネクタ43に到達して、そこから加熱流体回路の主要部分へと帰還する。
【００４２】
熱搬送流体が循環するのを可能にするために、流体回路の主要部分は、第一に熱搬送流体のフラクションを含有する主コンテナ49を含んでおり、また電気ヒータ手段51、例えば調節可能なヒータ抵抗、ダクト53を介して第二のリザーバの第一のコネクタ43に接続された入口52と、もう一つのダクト55を介して第一のリザーバ2の第一のコネクタ43に供給するポンプ（図示せず）に接続された出口54を含んでいる。このもう一つのダクト55は、調節の目的で、好ましくは二つの並列に接続されたソレノイド弁（または空気弁）56および57、並びに圧力センサ58（または圧力コンタクト）を備えている。主コンテナ49内の熱搬送流体の温度は、第一のリザーバ内に収容された底部バッグ7の出口12における培養液が、培養目的に適する温度であるように選択される。
【００４３】
当然ながら、ウエル内部の温度は、必要に応じて、第一のリザーバを出て行く培養液の温度とは異なってもよく、または実質的に同一であってもよい。
【００４４】
一つの変形例において、リザーバ2および25、並びにウエル18は同じ熱搬送流体を平衡して供給されてもよく、または二つもしくは三つの独立した加熱流体回路から来る熱搬送流体を供給されてもよい。また、リザーバの各部分のための加熱流体回路を提供することも可能である．これは、温度プロファイルまたは温度サイクルを形成するように、培養チャンバの両側に異なる温度で配置された、培養媒質を含有するリザーバを提供することを可能にする。
【００４５】
供給源（または栄養素コンテナ）14および／またはガスもしくは液体供給装置（または廃液容器）32も、それらの内容物を選択された温度（これは任意に異なっていてもよい）に維持するように、それら自身のサーモスタット回路を有していてもよい。このサーモスタット的に制御される温度は、加熱または冷却を含んでいてもよい。一般には、培地が安定であることを保証するために、それらを約3℃〜約12℃の範囲の温度に維持するのが好ましい。
【００４６】
完全に異なるもう一つの変形例において、温度調節手段は、ヒータ抵抗または制御された温度プロファイル（CTP）素子のような電気ヒータ手段を含んでいる。このような手段は、リザーバおよび／またはウエルを定義している壁または該壁の中の選択された位置に配置すればよい。
【００４７】
また、ヒータ抵抗および加熱流体回路を組合わせることを想定することも可能である。
【００４８】
更に、ウエルおよび／またはリザーバ内の温度制御を改善するために、選択された位置に一以上の温度センサを設けて、制御ユニットへの温度測定を与えてもよい。
【００４９】
頂部バッグ6および27、並びに底部バッグ7および29の内部容積を制御するために、本発明の装置は、図１を参照して以下に述べる加圧手段を含んでいる。
【００５０】
図示の実施態様においては、二つのリザーバ2および25に共通の加圧手段が使用されており、これら手段は殆どの温度制御手段と共に、外部ユニット105（例えば、図１に破線で表されるユニット）の中に収容される。しかし、一つの変形例において、各リザーバは、夫々のユニット位置、例えばリザーバの頂部下に収容されたそれ自身の加圧手段を有していてもよい。
【００５１】
当該加圧手段は、周囲の空気61を供給されて、好ましくは圧力センサ（または圧力コンタクト）63に結合された加圧供給源62に供給する圧力ブースター（またはポンプ）60を有する、高圧加圧回路59を具備している。容器62は、圧力調節器65を備えた主ダクト64に供給し、次いで第一の流速調節器66および粒子フィルタ67（例えば0.01ミクロンの格子を有する）に供給する。当該装置が複数の異なる加圧流体（例えば空気および二酸化炭素）と共に使用されるときは、補助流体69（例えば二酸化炭素）を供給される補助ダクト68が設けられ、該補助ダクトは第二の圧力調節器70およびこれに続く第二の流速調節器71を有し、第一の圧力調節器65とフィルタ67の間で主ダクト64に供給する。このような環境下においては、フィルタ67と補助ダクト68が接続される点との間に、第三の流速調節器72を設けるのが有利である。
【００５２】
主ダクト64は、圧縮流体を、二つのリザーバ2および25の間に供給し、また培養液コンテナ14に供給するように働く。加圧流体がリザーバ2および25の頂部および底部を貫通することによって生じる温度の乱れを最小化するために、加圧流体は、主コンテナ49の中に位置する熱搬送流体によって加熱される。これを行うために、主ダクト64の一部は、好ましくはコイルまたは熱交換を促進する何れかの形態で主コンテナ49に収容される。
【００５３】
加えて、加圧流体がリザーバ2および25の中に貫通する前にその湿度を制御できるように、好ましくは、補助コンテナ74が主コンテナ49の中に設けられ、且つ加湿液体で部分的に満たされ、熱搬送流体の中に浸漬される主ダクト部分73は、前記補助コンテナの中に開いている。
【００５４】
補助コンテナ74の中に開いている主ダクト65の一部75は、好ましくは温度計／湿度計76を介して、第一に、並列に接続された四つの弁78，79，80および81を備えた第一のポート77に高圧（例えば約45ミリバール(mbar)）で供給し、第二に、培養液コンテナ14の中に開いた第二のポート82に高圧（例えば約45 mbar）で供給し、第三に、並列に接続された四つの弁84，85，86および87が、好ましくはこれら弁の上流に配置された第四の流速調節器88と共に備えられた第三のポート83に低圧（例えば約10 mbar）で供給し、第四に、好ましくは第五の流速調節器90と、それに続くソレノイド弁91（または空気弁）および加圧供給源92を備えた第四のポート89に中程度の圧力（例えば約30 mbar）で供給し、この加圧供給源92は前記四つの弁78，79，80および81（好ましくはソレノイド弁または空気弁）に供給する。
【００５５】
一つの変形例においては、同じリザーバの頂部および底部内に収容されたバッグの容積を支配するために、異なる加圧流体回路を設けてもよい。これによって、これらバッグが異なる機能を行うように、例えば比較試験を実行するために、同じリザーバ内に異なる加圧流体を使用することが可能になる。
【００５６】
種々のソレノイド弁（または空気弁）78〜81および84〜87は、好ましくは全てが三方弁（二つの入口および一つの出口）であり、ソレノイド弁（または空気弁）78〜81はソレノイド弁（または空気弁）84〜87の入口に夫々供給し、これらの出口はそれぞれ、漏出のない入口38，40に装着されたコネクタ39，41に接続されたコネクタ93から96を介して作用して、第一のリザーバ2の頂部および底部3，4、並びに第二のリザーバ25の頂部および底部26，28の内側に供給し、その中に含まれる可撓性バッグの容積を決定する。
【００５７】
また、これらのソレノイド弁（または空気弁）は、上記で述べたように好ましくは「ピンチ」型の、例えば特許出願FR 00/00548に記載された、ウエル18および可撓性バッグのアクセス制御手段の状態を決定するためにも使用できる。しかし、これは単に可能な一例に過ぎず、スイッチまたは弁を使用することもできるであろう。
【００５８】
全てのソレノイド弁および加圧流体ポンプは、電子制御ユニット50によって制御され、この目的のために、該ユニットには、好ましくはプロセスコンピュータによって遠隔制御できるように、リンクインターフェース97（例えばRS232型）に接続された、カードに搭載されたマイクロプロセッサ（またはマイクロコントローラ）が設けられる。
【００５９】
プログラムされると、マイクロコントローラ50は、必要に従って、リザーバ2および25の頂部および底部3，4において、バッグに対して加圧流体により高圧および／または低圧のシーケンスを加えるように、ソレノイド弁（または空気弁）を制御する。当然ながら、マイクロコントローラ50は、複数の培養プログラムを含むメモリー98、好ましくは書き換え可能なメモリーを含んでいてもよく、各培養プログラムは、種々の可撓性バッグの夫々の容積、並びにウエルおよび／または熱搬送流体の調節された温度を決定するために、第一および第二の圧力シーケンスを決定する。
【００６０】
上記で述べたように、一つの加圧回路を支配するマイクロコントローラを使用する代りに、例えばこれらリザーバの頂部下に設置された少なくとも部分的に独立の二つの加圧回路を支配する、同じマイクロコントローラを使用することが可能である。もう一つの変形例においては、二つの独立した加圧回路を支配するために、予め同期されている二つの独立したマイクロコントローラを使用することが可能である。
【００６１】
当該装置は、好ましくは、一つまたは複数のウエルを外部媒質から隔離し、また可能であればリザーバを外部媒質から隔離するためのカバーを含んでいる。これは、種々の隔膜を通して生じる交換を回避するだけでなく、温度の乱れを制限するように働く。これはまた、ウエルの回りに「機械的」な保護バリアを確立するように働く。また、このカバーは全体の装置をカバーすることができ、それによって、前記装置自身が層流フード下に配置されないときに特に有用な、生物学的バリアを定義する囲いを形成する。このカバーの形状および材料は、ウエル内に含まれる細胞および組織が、それらを培養している際に、顕微鏡下でまたは他の適切な光学手段を用いて観察できるように選択することができる。この目的のために、該カバーは、好ましくは破損せず且つウエルの上が透明な材料で作製される。
【００６２】
また、制御ユニットの制御下にあるソレノイド弁（または空気弁）99〜102を備えた大気圧への接続のための出口を、リザーバ2，25の頂部および底部に設けてもよい。加えて、図２〜４に示したように、頂部可撓性バッグ6，27の入口9，30は、好ましくは、内側シェル半型16a，16bの剛性壁によって定義された剛性ダクト103の中に配置されており、また操作中にリザーバ2および25の可撓性バッグの中に形成され得る空気の何らかの微小泡を抜くように、排出手段（図示せず）を備えた夫々の頂部キャビティー104が設けられている。
【００６３】
本発明の装置は、恐らくは単回使用のみの消耗部材（リザーバおよび／またはウエル）に結合された制御ユニットを不備するものと看做すことができる。これは、単に外部コントロール、夫々が加圧および温度調節回路に接続される第一および第二の接続手段93〜96，106を備えた加圧および温度調節ユニット105を提供し、第二には、夫々がリザーバの一部内の頂部および底部、並びにシェル間スエース35に接続された第三および第四の接続手段39，41および43を備えた各装置の二つのリザーバ2および25を提供し、次いで第一の接続手段93〜96を第三の接続手段39，41に接続し、また第二の接続手段106を第四の接続手段43に接続することによって達成することができる。
【００６４】
新たな培養を開始するためには、使用された消耗品(リザーバおよび／またはウエル）を取外し、これらを新たな消耗品に取替えて外部制御ユニットに接続する。
【００６５】
図５および図６に概略的に示すように、複数の装置１を並列に配置して、高スループット（同一培養物）または高度の分化（異なる培養物）のための、細胞および組織を培養する設備を構成するようにすることが可能である。この例にでは、当該設備は四つの並列な装置1-1〜1-4を有しており、各装置1-i（この場合、i=1〜4）は直列に接続された三つの培養ウエル18-j（この場合、j=1〜3）を有している。夫々の熱搬送流体回路スペースを備えたリザーバは、例えば内側シェル半型16b上のスタッド37を、外側シェル半型17a，17bに形成された適切な孔108を通して取付けることにより相互に接続される（図６参照）。
【００６６】
これらの装置は、相互に完全に独立であることができる。このような環境において、それらは、相互に独立である加圧および温度調節回路を制御する共通の制御ユニット、または夫々が一つの加圧回路および一つの温度調節回路を制御する独立した制御ユニットを有していてもよい。このような環境において、温度および／または加圧流体の調節は、各装置毎に異なることができる。しかし、それらのウエルの幾つかは連通している可能性があるので、このような装置は相互に依存する可能性がある。
【００６７】
また、共通の（または主要な）制御ユニットによって制御される共通の加圧回路および共通の温度調節回路を共有することにより、装置が相互に独立したウエルを有する設備を想定することも可能である。このような環境において、前記加圧手段および前記温度調節手段の主要部分、並びに前記主制御ユニットは、外部ユニット105（図１に破線で表されるもの）の中に収容される。その結果、当該装置が多分一回のみの使用のための「消耗品」型のモジュール部品を構成するような設備を構成することが可能である。これは、単に、第一の接続手段93〜96，106を、それぞれ加圧回路および温度調節回路に接続した外部の制御、加圧および温度調節ユニット105を提供し、第二に、第三および第四の接続手段39，41および43を、それぞれリザーバ内部の頂部および底部ならびにシェル間スペース35に接続した各装置の二つのリザーバ2および25を提供し、次いで前記第一の接続手段93〜96を前記第三の接続手段39，41に接続し、また前記第二の接続手段106を前記第四の接続手段43に接続することによって達成することができる。
【００６８】
新たな培養を進めるためには、使用された消耗品（容器および／またはウエル）を除去し、そのウエルに任意に細胞が接種されている新たな消耗品で置き換える。
【００６９】
このような設備において、並列に接続される装置の数は、必要に応じて変化させることができる。
【００７０】
本発明の設備においては、本発明の装置におけるように、培養ウエル18-jは、図５に示すように支持プレート107上で一連に接続され、或いは、それらは厚い固体ブロック48を中空にすることによって直接形成されてもよい（図１に示す通り）。
【００７１】
第一の例（図５）において、支持体プレート107は、ウエル18i-j（この場合はi=1〜4、j=1〜3）の夫々、および熱搬送流体の画分をこれらウエルの周囲に近接させて循環させるためのチャンネル47を収容するための、ハウジングを有することができる。また、該支持体プレート107は、加圧流体の画分を循環させるためのチャンネルまたはダクトを有していてもよい。この第二の実施形態において、当該装置の培養ウエルは独立した複数の固体ブロック、または一つのブロックの中に作製することができる。本発明の装置に使用するのに適したウエルの実施形態に関する詳細は、特許出願書類FR 00/00548の中に与えられている。
【００７２】
装置1を説明するときに上記で述べたように、ウエルを外部から隔離し、可能であれば当該設備の各装置における二つのリザーバ、または実際には装置の全部を隔離するように、主カバーを提供するのが有利である。これは、各装置について夫々カバーを使用することで回避することが可能である。
【００７３】
本発明の装置および設備を実施する例（即ち、該リザーバのバッグの容積を決定するための第一および第二の一連の圧力）が、特許出願文書FR 00/00548に見られる。ここでは、単に、当該設備および装置が、以下で述べる種々のモードでの動作に適していることを想起されたい。
【００７４】
「層流」モードは、二つのリザーバの頂部バッグと底部バッグとの間の高さの差を確立するように、培養液を二つのリザーバの一方の頂部バッグの中に上昇させ、次いで培養液を重力下で中部リザーバから底部リザーバへと流し、また他のリザーバの頂部バッグへと培養液を上昇させる際に存在する。次いで、二つのリザーバ間でウエルを介して完全な１サイクル（報復）を実行するために、この同じ動作が逆方向（「復路方向」）に繰り返される。サイクルの数は、ウエル18内で実行される培養の種類の関数である。層流モードにおける報復サイクルの四工程は、図７において一緒に分類される。連続するサイクルの数は、実行される培養の種類の関数として選択される。
【００７５】
「乱流」モードは、第一および第二のリザーバ2および25の底部バッグ7および29に対して、連続的に高圧を加える際に存在する。即ち、第一および第二のリザーバの頂部バッグの第一および第二のシーケンスは、四つの低圧周期の連続によって構成される。このモードは、図８の「往復」サイクルの形態で一緒に分類される二つの工程だけを有している。連続サイクルの数は、実行される培養の種類の関数として選択される。このモードは第一の変形例（図９）において実施されてもよく、ここでは二つの底部バッグ7および29には高圧が連続的に維持されず、頂部バッグ6および27に対しては高圧が連続的に維持される。これは、頂部バッグ6および27内の高圧のため前記液体が最早上昇できないとしても、培養液が二つの底部バッグ7および29の間で迅速に流されることを可能にする。第二の変形例（図示せず）において、第一のリザーバの各バッグに加えられる第一のシーケンスは、交互に低圧の第二周期を伴う高圧の第一周期からなっており、第二のリザーバの各バッグに加えられる第二のシーケンスは、交互に高圧の第二周期を伴う低圧の第一周期からなっている。
【００７６】
上記の二つの動作モード、即ち、層流モードおよび乱流モード、並びに変形モードは、単に、想定し得る多数の例の中の少数の例に過ぎない。従って、乱流動作サイクルを層流動作サイクルに組合わせることが可能である。
【００７７】
本発明は、特に下記に列記するような、非常に多くの種類の細胞および組織に適用される：
・腸の細胞：腸407、Caco-2、Colo 205、T84、SW 1116、WiDr、HT 29、HT 115、HT 55；
・内皮細胞：人大動脈平滑筋細胞（HAOSMC）；
・上皮細胞：人新生児上皮ケラチン細胞（NHEK-Neopooled）、ウマ真皮；
・癌細胞：HeLa、CHO-K1；
・腸型繊維芽細胞：CCD-18Co；
・MRC-5、3T3、Wi-38型の繊維芽細胞；
・ミエローマ：SP20-Ag14、P3X63 Ag8 653、MPC11；
・ハイブリドーマ；
・昆虫細胞：SF9。
【００７８】
このリストは如何なる意味でも網羅的ではなく、単に例を与えるものに過ぎない。
【００７９】
本発明は、単なる例として上記で述べた、当該装置および設備を動作するモードに制限されるものではなく、逆に、当業者が特許請求の範囲の領域内で想起するであろう全ての変形例をカバーするものである。
【００８０】
従って、上記においては、熱搬送流体が温度を上昇するものク敵で循環される温度調節回路が説明された。しかし、一定の媒質、例えば保存物を冷凍するために、循環する熱搬送流体が熱を除去するように作用する補助温度調節回路を使用してもよい。当然ながら、このような環境において、本発明の装置は制御モジュールの制御下で冷却媒体に適合される必要がある。
【００８１】
更に、上記の説明では、ウエルが第一の選択された温度に置かれ、および／または流体が一以上の第二の選択された温度におかれる。しかし、これらウエルを、第一の温度サイクルまたはプロファイル下に置き、および／または流体を第二の温度サイクルまたはプロファイル下に置くことを想定することも可能である。
【００８２】
加えて、特に共通の熱搬送回路によって供給されるときには、各リザーバおよびチャンバの入口区画を、夫々の温度を独立に制御するように調節することも可能である。
【００８３】
最後に、温度調節手段は、チャンバおよび／またはウエルに熱ショックを与えるように配置してもよい。これは、細胞膜の状態を修飾する必要があるときに特に有利である。熱ショックは、流体の流速および／またはチャンバの内部圧力を制御することによって達成される圧力変化と組合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、複数のチャンバを有する本発明の培養装置の、断片的な概略断面図である。
【図２Ａ】図２Ａは、一緒に組立てる前の、図１のリザーバの二つの内側シェル半型の斜視図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、一緒に組立てた後の、図１のリザーバの二つの内側シェル半型の斜視図である。
【図３】図３は、リザーバの二つの外側シェル判型と共に組み立てる前の、図２の二つの内側シェル半型の斜視図である。
【図４Ａ】図４Ａは、内側シェル半型が対応する外側シェル半型の内側に配置される仕方を示す、組立ての前の斜視図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、内側シェル半型が対応する外側シェル半型の内側に配置される仕方を示す、組立ての後の斜視図である。
【図５】図５は、並列に配置された四つの培養装置によって構成された培養設備の概略斜視図である。
【図６】図６は、図５に示したタイプの設備のための、四つの二重シェル型リザーバのアセンブリーを示す斜視図である。
【図７】図７は、層流モードの培養液についての、一連の連続的な８段階の往復工程を示す図である。
【図８】図８は、乱流モードの培養液についての、一連の連続的な４段階の往復工程を示す図である。
【図９】図９は、図８に示した乱流モードの一変形例を示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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