(57)【要約】塩化メチレンを含む一酸化炭素生成性化合物を使用して、血管の疾患を治療し、炎症性の及び免疫的過程を調節するための方法及び組成物が提供される。対象の化合物は血管平滑筋細胞の増殖を阻害し、酸化的ストレス及び傷害に対して脈管構造を保護し、多様な免疫系の細胞の活性を調節し、前炎症性のサイトカインの産生を阻害し、抗炎症性のサイトカインの産生を促進することができることによって、有毒な増殖性の又は炎症性の応答に関連する状態の治療に有効である。移植器官の生存の延長及び受容者における慢性の拒絶反応の阻害のための方法もまた、提供される。
2004526739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における血管の、炎症性の、及び免疫の障害の治療のための医薬組成物であって、前記哺乳動物中のカルボキシヘモグロビンレベルを増加させることのできる一酸化炭素生成性化合物を含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記一酸化炭素生成性化合物が塩化メチレンを含む、請求項1に記載の上記医薬組成物。
【請求項３】
哺乳動物中のカルボキシヘモグロビンレベルを増加させるための医薬組成物であって、薬剤として許容可能なビヒクル中に塩化メチレンを含む、前記組成物。
【請求項４】
哺乳動物中のカルボキシヘモグロビンレベルを増加させるための方法であって、血中カルボキシヘモグロビンレベルを約1及び10％の間まで増加させるのに十分な量の一酸化炭素生成性化合物を前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
前記一酸化炭素生成性化合物が塩化メチレンを含む、請求項4に記載の上記方法。
【請求項６】
前記塩化メチレンが経口投与される、請求項5に記載の上記方法。
【請求項７】
受容者において移植器官の生存を延長するための方法であって、以下の：
前記受容者への治療的な量の一酸化炭素生成性化合物の投与であって、それにより前記移植器官の生存時間が延長される、
を含む、前記方法。
【請求項８】
炎症性のサイトカインタンパクを産生することのできる細胞による、当該炎症性のサイトカインタンパクの産生を阻害するための方法であって、以下の：
前記細胞を治療的な量の一酸化炭素生成性化合物と組み合わせ；
ここで、前記細胞による前記炎症性のサイトカインの産生が阻害される、
を含む、前記方法。
【請求項９】
哺乳動物において、炎症性の応答を阻害するための方法であって、以下の：
前記哺乳動物を治療的な量の一酸化炭素生成性化合物に接触させ；
ここで、前記炎症性の応答が阻害される、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記炎症性の応答が敗血性ショック、関節リューマチ、クローン病、大腸炎又は虚血／再灌流傷害と関連する、請求項9に記載の上記方法。
【請求項１１】
血管平滑筋細胞の増殖を阻害するための方法であって、以下の：
前記哺乳動物を治療的な量の一酸化炭素生成性化合物と接触させ；
ここで、前記VSMCの増殖が阻害される、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
血管傷害後の新内膜の形成を阻害するための方法であって、以下の：
前記哺乳動物を治療的な量の一酸化炭素生成性化合物と接触させ；
ここで、前記新内膜の形成が阻害される、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記一酸化炭素生成性化合物が塩化メチレンである、請求項7−12のいずれか1項に記載の上記方法。
【請求項１４】
前記治療的な量が約1−100mg/kgの範囲内にある、請求項13に記載の上記方法。
【請求項１５】
前記治療的な量が、前記哺乳動物の上記血中カルボキシヘモグロビンレベルを約1及び10％の間まで増加させるのに十分である、請求項13に記載の上記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本出願は、2001年3月30日に出願された、米国仮出願第60/280,526号に基づく優先権の利益を請求する。
【０００２】
背景技術
免疫システムは、腫瘍症のような有害な異常に対して体を監視すると同時に、広く多様な病原体に対して哺乳動物宿主を保護する細胞及び組成物の非常に複雑な組み合わせである。免疫システムの1の支流は、（ａ）骨髄由来Bリンパ球、胸腺由来Tリンパ球及びナチュラルキラー（NK）細胞のようなリンパ球、（ｂ）単球及びマクロファージの両方を含む単核貪食細胞、の両方を含む、免疫システムの機能を実行する細胞を含む。リンパ球が主として特異的な免疫応答と関連する一方、単核貪食細胞は、それらの特異的に抗原決定基を認識し、識別する能力によって、貪食作用を通した外来の微生物の一般的な除去、並びに微生物自体により直接的に、又は抗原刺激されたTリンパ球への応答のいずれかにより誘導されたサイトカインの産生及び分泌に最もしばしば関係する。リンパ球及び単核貪食細胞の機能は高度に相互連絡し、適切な免疫システム機能に必須である。
【０００３】
多様なインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、ケモカイン、造血成長因子、及び遊走阻害因子のようなサイトカインは、広く多様な免疫システムの異なる細胞タイプによって産生される多様なタンパク群である。最も重要なことは、サイトカインは多様な刺激に応答して多様なリンパ球及び単核貪食細胞により産生され及び／又はこれらにより応答される。ほとんどの部分で、サイトカインは自然の及び特異的な免疫のエフェクター相中で産生され、免疫及び炎症性の応答の両方を仲介し、制御する。他のポリペプチドホルモン同様、サイトカインは標的細胞表面の特異的受容体に結合することによってその作用を開始し、その活性化はしばしば炎症性の応答という結果となる。
【０００４】
免疫応答及びサイトカインにより誘導される炎症性の応答の活性化が宿主の健康及び免疫システムの適切な機能発揮に非常に重要である一方、そのような活性化が望ましくない多くの状況がある。1の特別な領域では、敗血症ショック、関節リューマチ、クローン病、大腸炎などのような疾患と関連した炎症性の応答のように、サイトカインにより仲介される炎症性の応答が宿主の健康に有害に影響するように機能する。他の出来事においては、インシュリン依存性の真性糖尿病（IDDM）のような自己免疫疾患において起こるように、CTLｓの一部に欠陥があり、それらがMHC及び関連するペプチドの両方が内因性である細胞を攻撃する。更なる出来事は移植と関連しており、そこにおいては提供者と受容者間のMHC抗原が一致することは稀である。
【０００５】
CTLsの活性化が望ましくない状況では、免疫抑制が一般的なアプローチとなった。しかしながら、シクロスポリンA、FK506などの免疫抑制剤は多くの望ましくない副作用を有する。さらに、炎症性の応答をコントロールし、阻害するために多様なアプローチが採用されたが、これらのアプローチの多くも1以上の望ましくない副作用を有する。したがって、外来性の感染に対する防御のための免疫システムの実質的な比率を宿主に残すように、免疫システムに対する普遍的な免疫抑制効果及び副作用がより少ない一方、リンパ球細胞、特にCTLsの活性化を阻害するために作用することのできる新しい作用物質の同定は実質的な関心事である。また、有害な炎症性の反応をコントロール又は阻害するために機能する新しい作用物質の同定も実質的な関心事である。
【０００６】
ヘムオキシゲナーゼ（HO)は、ヘムのビリルビンへの酸化的変換の最初のステップである、ヘムのビリバルディン、一酸化炭素（CO)及び遊離の鉄への変換を触媒する律速酵素である。HO−2は、HO−1が酸化的な傷害に対する防御を提供する誘導可能なアイソフォームである一方、生理的条件下で存在する構成的なアイソフォームである。最近、虚血及び免疫原性の効果を含む、酸化的なストレス及び侵襲に対する細胞の応答におけるHO−1の役割が大きな関心事である。HO−1の発現のアップレギュレーション又は誘導が、同種異形間移植片の生存延長及び移植片対宿主疾患の軽減を含む多様で強力な潜在的抗炎症性の及び免疫抑制効果を生じさせることがわかった。
【０００７】
より最近には、Otterbein et al.,Nature America6(4): 422-28(2000)が、COがHO−1とともに見られる抗炎症性効果の多く、又はすべてを仲介することができることを示唆した。彼らのデータは、COが前炎症性サイトカインであるTNF−α、IL−1β及びMIP−1βの発現を選択的に阻害することができ、そして抗炎症性サイトカインIL−10の産生を増加させることができることを示す。これらの研究者からのその後のデータは移植片の拒絶反応の予防におけるHO−1の保護効果がCOの生成を通じて仲介されることができることを示唆する。したがって、薬剤が単独で、又は他の薬剤と結びついて作用することができ、炎症性の疾患の異なる症状を治療し、慢性的な拒絶反応を含む移植の結果を改善するためのCOに基づいたアプローチの開発が実質的な関心事である。
【０００８】
ヘムオキシゲナーゼ経路はまた、適切な組織の酸素化及び灌流を保証するために血管緊張を制御し、保持することに決定的な役割を果たす。血管の細胞は酸化的ストレスの環境に、内因性の抗酸化的保護メカニズムを誘導することにより、応答する。生理的条件下における主要な細胞内調節物質は、内皮由来の酸化窒素（NO)であり、これはグアニレートシクラーゼの活性化によるその血管平滑筋細胞（VSMC)中のサイクリックグアノシン3',5'−モノホスフェート（ｃGMP)の制御を通じて正常の血管緊張を保持する。低酸素又はアテローム発生のようにNO産生が損なわれた状況では、ヘムオキシゲナーゼの誘導は抗酸化物ビリルビン及び血管拡張剤COの生成を通じた抗酸化的防御の重要な2次ラインを提供することができる。
【０００９】
最近の報告は、そのような状況においてVSMC由来のCOが遺伝子発現及び血管内皮及び平滑筋細胞中のcGMPレベルの調節物質をつとめることができることを示唆した。Morita et al.,J. Clin. Investigation96:2676-2682(1995); Siow et al.,Cardiovascular Res.41:385-394(1999)。特別には、COがcGMPメカニズムを介したVSMCの拡張剤であることが判明し、内皮細胞中のエンドセリン−1（ET−1）及び血小板由来の成長因子-B遺伝子の発現を抑制し、そして平滑筋細胞の増殖を阻害することが示された。COはまた、その細胞サイクル進行の制御に含まれる転写因子であるE2F−1遺伝子の発現の抑制を通じて、VSMC増殖に対する内皮細胞非依存性の効果を有する。Morita et al.,J. Biol. Chem.272(52):32804-9(1997)。
【００１０】
したがって、ヘムオキシゲナーゼ経路によって生成した内因性のCOはまた、アテローム性動脈硬化、内膜肥厚及び肺性高血圧を含む多くの心臓血管疾患の病原中の主要事象である過剰のVSMC増殖の予防にも効果がある。VSMCの増殖及び蓄積はまた、バルーン傷害により引き起こされた裸出のような動脈の傷害によって誘発された新内皮の発生に関係する。Togane et al.,Am J. Physiol. Heart Circ. Physiol.278:H623-H632(2000)。バルーン傷害はET−1を含むいくつかの血管作用性因子の産生を誘導し、そしてVSMC層を血流中の赤血球細胞に直接露出させ、それは血管壁のずり応力及び酸化還元状態を変化させることができる。COは新内膜形成を阻害し、したがって動脈の傷害にも決定的な防御機能を果たす。
【００１１】
しかしながら、不幸なことに現在、細胞のカルボキシヘモグロビンレベルを増加させるための実際的かつ予測可能な治療様式がない。外因性のCOの冗長な吸入と結びついた毒性によって、炎症性の、免疫の及び血管の疾患の予防的及び治療的処置に必要とされる、カルボキシヘモグロビンレベルを全身的及び局所的に調節するための他の様式を発見することが緊急に必要である。これらの様式は他の薬剤と結びついた使用が可能であり、ここで有害な副作用を減少させるように、顕著な副作用を有する他の薬剤のより低いレベルが有効に使用されることができる。アテローム性動脈硬化のリスクを軽減し、バルーン血管形成のような動脈壁に傷害をもたらす外科的手順と結びついた合併症を最小化するための新しいアプローチの開発に対する実質的な関心もある。本発明はこれらの関心事すべてに取り組み、解決する。
【００１２】
関連する文献の簡単な説明
ヘムオキシゲナーゼは、総説Abraham et al.,Int. J. Biochem.20(6):543-558(1988)によって、並びにRaju and Maines,Biochimica et Biophysica Acta1217:273-280(1994); Neil et al.,J. of Ocular Pharmacology and Therapeutics11(3):455-468(1995); Haga et al.,同書1316:29-34(1996); Willis et al.,Nature Medicine2(1):87-90(1996); 及びAgarwal et al.,Transplantation61(1):93-98(1996)によって証明された数多くの研究の対象である。
【００１３】
ヘムオキシゲナーゼ活性の調節は、Woo et al.,Transplantation69(4):623(2000); DeBruyne et al.,Transplantation69(1):120(2000); Amersi et al.,J. Clin. Invest.104(11):1631-39(1999); Cuturi et al.,Mol. Med.5(12):820(1999); Brouard et al.,Transplantation67(12):1614-31(1999); Hancock et al.,Nature Med.4(12):1392-96(1998); Squiers et al.,Transplantation66:1558-65(1998); Woo et al.,Transplant. Immunol.6(2):84-94(1998);及びIyer et al.,J. Biol. Chem.273(5):2692-97におけると同様にその開示が本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第5,756,492号及び同第6,060,467号並びにPCT出願公開第WO00/36113号中に記載されている。
【００１４】
より最近には、Otterbeinらにより、一酸化炭素が分裂促進因子によって活性化されたプロテインキナーゼ経路を含む抗炎症性効果を有することが示唆された;Nature America6(4):422-428(2000);Satoらが外因性のCOが移植片の拒絶反応の予防においてヘムオキシゲナーゼに取って代わることができることを示唆した一方;J. Immunol.166:4185-94(2001);BrouardらはCOが内皮細胞のアポトーシスを抑制することを示した。J. Exp. Med.192(7):1015-25(2001)。
【００１５】
血管の疾患におけるヘムオキシゲナーゼの誘導に関して、上記Siow et al. はアテローム発生におけるヘムオキシゲナーゼ、CO及びビリルビンの役割について総説している。上記Togane らは動脈の傷害によって誘発された新内膜の発生における内因性のCOの防御的役割を報告し、一方、Duckers らはHO−1の抗増殖的効果は血管が傷害された条件下で低酸素でなくても、防御的であり得ることを示唆する。Nature Med.7:693-698(2001)。
【発明の開示】
【００１６】
発明の要約
本発明は、in vivoにおいて一酸化炭素に代謝されることのできる一酸化炭素生成性化合物を使用する血管の、炎症性の、及び免疫疾患の治療のための方法および組成物を提供する。好ましい実施態様において一酸化炭素生成性化合物は塩化メチレン（CH2CL2）であり、それはin vivoでCO 及びCO2に代謝される。
【００１７】
１の実施態様において、本発明は哺乳動物における血管の、炎症性の及び免疫の障害の治療のための医薬組成物であって、前記哺乳動物においてカルボキシヘモグロビンレベルを増加させることのできる一酸化炭素生成性化合物を含む、前記医薬組成物を提供する。好ましい実施態様において、上記一酸化炭素生成性化合物は塩化メチレンを含む。特別に好ましい実施態様においては、上記発明は薬剤として許容可能なビヒクル中の塩化メチレンを含む、哺乳動物においてカルボキシへモグロビンレベルを増加させるための医薬組成物を提供する。さらに、前記哺乳動物に約１及び10％、より好ましくは約2及び9％、最も好ましくは約3及び8％、一般的には約3及び10％の間のレベルまで血中カルボキシヘモグロビンレベルを増加させるのに十分な量の塩化メチレンのような一酸化炭素生成性化合物を投与することを含む、哺乳動物においてカルボキシヘモグロビンレベルを増加させるための方法も提供される。
【００１８】
さらなる実施態様においては、本発明は体全体の炎症性の及び免疫のプロセスを調節するための方法及び組成物を提供する。対象の化合物は多様な免疫システムの細胞の活性を調節し、前炎症性サイトカインの産生を阻害し、抗炎症性サイトカインを産生することのできる細胞によるそのようなサイトカインの産生を促進し、それによって有害な炎症性の応答と結びついた状態の治療に有効であることができる。
【００１９】
受容者中で移植された器官の生存を延長するための方法もまた提供され、それらの方法は前記受容者に、移植器官に対する免疫応答を調節するために機能する一酸化炭素生成性化合物を投与することを含み、それによって受容者における器官移植の生存期間が延長される。本発明の一酸化炭素生成性化合物は、抗炎症性の及び前炎症性のサイトカインの産生を調節することを通じてリンパ球の活性化及び炎症性プロセスを実質的に阻害するのに十分な量を、移植される器官に対してex vivoで、非経口的な全身的又は局所的投与を含むいずれかの便利な手段によってin vivoで、投与されることができる。
【００２０】
脈管構造において、対象の化合物はVSMCの増殖の阻害並びに酸化的ストレス、及び低酸素に対する防御によって血管緊張を制御することができ、これらは血管緊張、内皮の透過性及び血液凝固機能に深い影響を有する。対象の一酸化炭素生成性化合物は、酸化的ストレスへの応答としてのHO−1誘導に関連した血管増殖性の疾患及び他の障害の治療に使用されるであろう。
【００２１】
１の実施態様において、バルーン血管形成術のような動脈の傷害が必要又はそれを含む手法を行っている患者に対して、新内膜発生に対する防御のために機能する一酸化炭素生成性化合物を投与することを含む、新内膜形成を阻害し侵襲性の血管手法の結果を改善するための方法が提供される。他の実施態様においては、対象の一酸化炭素生成性化合物は、脈管構造中の特異的な酸化的事象に応答して、又は例えばアテローム発生に含まれると考えられる高レベルの低密度リポプロテイン（LDL）などのリスクの高い患者において予防的にアテローム発生を防止するために採用される。本発明の一酸化炭素生成性化合物の投与は、VSMC増殖を実質的に阻害し、酸化的ストレスへの血管の応答を調節するのに十分な量の、非経口的な全身的又は局所的投与を含むいずれの便利な手段によってもよい。
【００２２】
さらなる実施態様は本明細書を読んだ上で明らかになるであろう。
【００２３】
特異的な実施態様の説明
本明細書において方法及び組成物は、in vivo及びin vitroで一酸化炭素生成性化合物を使用することを通じて血管の、炎症性の及び免疫疾患を治療するために提供される。本明細書中で示されるとおり、対象の化合物は、in vitro及び in vivoの両方において、HO−１の細胞保護的活性を仲介することができる。したがって、対象の化合物は、HO−１のアップレギュレーションに伴って見られる抗炎症性の、及び他の保護的効果を擬態することが望まれる状況において使用されることができる。
【００２４】
好ましい実施態様において、対象の発明の一酸化炭素生成性化合物は、血管緊張の制御、VSMC増殖の阻害及び酸化的ストレスに対する保護のために使用され、それによってアテローム発生、再狭窄、心臓の圧力又は容量過剰負荷、高血圧、くも膜下出血、新内膜の形成及び成長、血管狭窄、肺水腫、並びに静脈循環内の血栓形成などのような多様な障害を治療するために有用である。
【００２５】
１の実施態様において、バルーン血管形成術のような動脈の傷害を含む手法を行っている患者に、新内膜の発生に対する保護に機能する一酸化炭素生成性化合物を投与することを含む、新内皮の形成を阻害し及び侵襲性の血管手法の結果を改善するための方法が提供される。他の実施態様においては、対象の一酸化炭素生成性化合物は特異的な酸化的事象に応答して、又は例えばアテローム発生に含まれると考えられる高レベルの低密度リポプロテイン（LDL）を有するような高リスクの患者において予防的にアテローム発生を防ぐために採用される。
【００２６】
他の好ましい実施態様は、in vitro及び in vivoにおいて炎症性の及び免疫過程を調節するための方法及び化合物を提供する。対象の発明の一酸化炭素生成性化合物は炎症性サイトカインの産生の阻害及びTNFα、インターフェロン‐γのようなインターフェロン、IL‐1、IL‐4、IL‐5、IL‐6、IL‐8、IL‐10、IL‐12、IL‐13、IL‐16、のようなインターロイキン、MIP1α、ケモカイン、造血性成長因子などのような抗炎症性サイトカインの産生の促進に使用され、それによって、関節リューマチ、敗血性ショック、クローン病、大腸炎、多発性硬化症、肉芽性炎、肝炎、アレルギー性反応、自己免疫疾患、虚血／再灌流傷害などのような多様な障害と結びついた炎症性の応答の阻害、並びにin vitro及び in vivoの両方においてIDDMを発生するリスクの高い患者においてIDDMの発症を遅らせることに有用である。特別に好ましい実施態様において、問題の化合物は関節リューマチの治療、器官移植（例えば、腎臓、肝臓、心臓など）の結果の改善、及び虚血／再灌流傷害の予防に使用される。
【００２７】
上記の一酸化炭素生成性化合物は、in vitro及び in vivoの両方で、それらが導入された宿主又はサンプルのそれぞれにおいて炎症及び／又は免疫応答を調節するように機能するであろう。調節は一般的には、前炎症性サイトカインの発現の阻害、及び／又は抗炎症性サイトカインの産生の増加が典型的である。そのようなサイトカインの発現レベルを決定するための信頼性のある高感度アッセイは周知であり、BioSource International, Inc. in Camarillo, Californiaのような供給源から商業的に入手可能である。
【００２８】
“一酸化炭素生成性化合物”によって、一酸化炭素又は他の生物適合性の分解産物に代謝的に変換され得る化合物が意味される。好ましい実施態様において、一酸化炭素生成性化合物は塩化メチレン（MC)であり、これはシトクロームP-450酸化システムを介して排他的にCOとCO2に代謝される。Gargas et al.,Toxicol. Appl. Pharmacol.87:211-23(1986); Andersen et al.,Toxicol. Appl. Pharmacol.87:185-205(1987)。対象の化合物、例えば塩化メチレン、の代謝により生成された一酸化炭素は、in vivoで患者のカルボキシヘモグロビン（COHb）レベルを治療的範囲まで増加させるように、ヘモグロビンに結合する。好ましくは、一酸化炭素生成性化合物は患者の全身的な（すなわち血液）COHbレベルを約1-10％、より好ましくは2-9％、最も好ましくは3-8％、通常は3-10％まで増加させるのに十分な量で投与される。得られたCOHbレベルのモニタリングは、各組織又は器官におけるモニタリング同様、全身的なモニタリングのために、当業者に知られた入手可能な高感度アッセイを使用することによって容易に達成されることができる。例えば、Wong et al.,Trans Am. Clin. Climatol. Assoc.111(1):61-75(2000)を参照のこと。
【００２９】
対象の一酸化炭素生成性化合物は投与の性質及び目的、治療される特定の炎症性の疾患、特別な生成性化合物、投与回数、封入体又は他の薬物の使用などによって多様な方法で製剤されることができ、それは当業者によって経験的に決定されることができる。製剤は一般的には生理学的に許容可能な形態であり、水、脱イオン水、リン酸緩衝液、水性エタノール、グルコース、プロピレングリコール、植物油、オリーブオイルなどのような多様な担体又は溶剤を含むことができる。いくつかの場合には、対象の一酸化炭素生成性化合物は、除放性の剤型に製剤されることができ、対象の化合物は、広く多様な担体中に封入されることができ、カプセル又はプロドラッグとして投与されることができる。製剤はまた、細菌性の作用物質、安定化剤、緩衝液などを含むこともできる。
【００３０】
対象の一酸化炭素生成性化合物はまた、他の抗炎症性化合物（例えば、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤（NSAIDS）、Remicade（登録商標）のようなモノクローナル抗体、サイトカインアンタゴニスト又はEnbrel（登録商標）（TNFインヒビター）のような阻害剤など）或いは免疫抑制薬剤（例えば、シクロスポリン、Prograf（登録商標）(FK−506)、マイコフェノレート、Simulect（登録商標）、Zenapax（登録商標）のようなモノクローナル抗体、又はThymoglobulin（登録商標）Lymphoglobuline（登録商標）などのような他のバイオテクノロジー製品）とともに付加的治療において使用されることができ、より低い量の薬剤が使用されることができ、指標として一般的には少なくとも25％の量、より普通には少なくとも40％以上の量の、治療的用量からの減少が採用される。対象の化合物はまた、本明細書において検討される特異的な適応症の治療に採用されることのできる他の作用物質(例えば、抗生物質、抗代謝又は他の細胞毒性物質、ヒト白血球抗原、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、脂肪変換作用物質、ACE阻害剤又は他の血管拡張剤、サルファサラジン（sulfasalazine）及び関連化合物など)と有利に併用されることもできる。
【００３１】
対象の生成性化合物はin vivo、ex vivo又はin vitroのいずれかによって投与されることができ、非経口で又は経口で服用され、一般的には血管内に、経皮的に、静脈内に、又は筋肉内に投与されることができる。in vivoのデリバリーはまた、カテーテルを経由した直接的な注入或いは有害な増殖性の、炎症性の、又は免疫応答に含まれるか、冒された脈管、器官、又は組織内への他の灌流方法による注入を含むが、これらに限定されない。対象の化合物は、例えば移植された器官又は炎症を起こした組織に近い位置で血管内に投与されることができ、又は全身的に投与されることができる。当業者は、デリバリーの各様式の利点及び不利な点を理解するであろうし、また、過度の実験をすることなく、満足のいくデリバリー手段及びデリバリー養生法を決定することができるだろう。
【００３２】
投与量は、そのすべてが当業者によって経験的に決定されることのできる、何が投与されるか、予防又は治療のような投与の目的、宿主の状態、投与様式、投与回数、及び投与間隔などに依存して可変であるだろう。これらの因子を適用することによって、用量は一般的には約5〜500mg/kgの範囲内となるであろう。非経口的に投与された場合、1日あたりの問題の一酸化炭素生成性化合物の総量は一般的には、約1〜500mg/kgの範囲内、より普通には約1〜100mg/kgの範囲内、最も好ましくは1〜10mg/kgの範囲内となるであろう。
【００３３】
用量は単回のボーラスであることができ、または期間の間中、宿主中に所望の一酸化炭素レベルを供給するために分割され、部分で投与されることができ、そして対象の化合物の代謝的変換速度に基づいて調節されるであろう。例えば、塩化メチレンでは、上記化合物の約50〜80％のみが一酸化炭素に変換される。したがって、10〜500mg/kgの塩化メチレンの投与は、典型的にはin vivoで約3〜165mg/kgのCOを得る。そのような化合物の薬物動態及び代謝に関する情報は本分野において知られており、当業者が適切な投与量を経験的に決定するのに入手可能である。例えば、Angelo et al.,J. Pharmacokinetics and Biopharmaceutics12(4):413-435(1984)を参照のこと。
【００３４】
塩化メチレンは、本明細書中で特別に好ましい実施態様であり、直線に近い用量−反応関係を有し、したがって所望の治療的範囲内のCOHbレベルを保持するようにCOHbの形成の程度をコントロールすることを当業者に提供する。したがって、その用量−反応関係の予測可能性が、重大なCO毒性、例えばカルボキシヘモグロビン血症と結びついた毒性を回避する一方、COHbの治療的レベルの維持を可能とすることにおいて、MCは他の治療様式に対してかなりの有利性を提供する。ヒトにおいて、MCは好ましくは経口的に約1〜100mg/kg、より好ましくは約1〜80mg/kgの間、最も好ましくは約1〜60mg/kgの間、一般的には約1〜30mg/kgの間の量で投与されるであろう。
【００３５】
上で示したとおり、本明細書中の一酸化炭素生成性化合物はまた、それら自身によって、又は他の免疫抑制剤ととともに、免疫システムの細胞の活性化を阻害すること、特別には移植片の寿命を延長することに利用される。したがって、他の実施態様においては、本発明は哺乳動物宿主中の移植片の受容を延長するための方法を提供し、移植の前に、付随して、後に又はこれと併用して一酸化炭素生成性化合物を投与することを採用する。投与のための特別な養生法が採用され、ここで、単回のボーラス又は複数の用量が受容者及び／又は提供者に、受容者への器官の移植の前に、付随して、又は後に投与されることができる。特別なプロトコールは、器官の性質、提供者、受容者、又は器官のいずれが治療されるのか、採用される特別な一酸化炭素生成性化合物、および他の免疫抑制剤の使用に依存するであろう。
【００３６】
投与は、移植の前14日以内、好ましくは約3日以内、望ましくは移植の前日を含み、最も好ましくは移植と同日及び／又は翌日に始まることができる。投与は連続した日において、又は非連続の日において一般的にはいずれの間隙も10日未満であることができる。好ましい実施態様において、移植に付随する投与又は同日の投与が採用され、そして特別に好ましい実施態様においては、投与は移植と同日又は前日に開始し、移植片が安定化するまで、一般的には12ヶ月を超えないように、より普通には4〜12週間を超えないように続けられることができる。しかしながら、移植後、対象の化合物は上記器官又は細胞に対する受容者の応答に依存して、必要に応じて投与されることができる。いくつかの状況では、対象の化合物は移植片が宿主中に存在する限り、慢性的に投与されることができる。一酸化炭素生成性化合物はまた、普通には器官の除去の3日以内、より普通には器官の除去の前日以前に、望ましくは器官の除去の約12時間以内に、提供者に投与されることができる。
【００３７】
対象の一酸化炭素生成性化合物は広く多様な宿主、特別には霊長類、より特別にはヒト、又は家畜などに使用されることができる。問題の一酸化炭素生成性化合物は腎臓、心臓、肝臓、脾臓、骨髄、膵臓、肺、ランゲルハンス島などのような広く多様な器官の移植とともに使用されることができる。
【００３８】
一般的には、移植片の寿命は、対象の一酸化炭素生成性化合物の非存在下で通常予想されるものから少なくとも3日間、より普通には少なくとも5日間延長されるだろう。これは、同種異形間移植を待って異種間移植片が使用された領域において免疫抑制剤の量の低下又は免疫抑制剤を一緒に使用することの回避に備えるために有用であることができる。対象の化合物は異種間と同様、同種異形間移植に使用されることができる。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は、例示のためのものであり、限定的なものではない。
【００４０】
実施例1
外因性のCO投与
ガス状のCOの免疫系への効果を調べるために、C57/BL6マウス（B6, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）を最初に密閉チャンバー中で、空気中の500ppmCO（Praxair, Danbury, CT）に、リポポリサッカライド（LPS)（0.3mg/kg, i.v., Sigma, St Louis, MO）の注入の前に1時間、露出した。注入後、それらをCOチャンバー中でさらに1時間露出した。血液サンプルをLPS注入の1時間後に（大動脈を通じて）採取し、全血中のCOHbレベルを全血AVOXimeter4000（A-VOX Systems, San Antonio, TX）によって測定した。血清サンプルを分離し、分析まで−80℃で保存した。血清TNF−αをサンドイッチELISA（Biosource，Camarillo，CA）によって測定した。
【００４１】
本実験の結果を図1A〜1Cに示す。0.3mg/kgのLPS単独で処理したマウスは高いレベルのTNF−αを産生した（5090.7±1595pg/ml）。500ppmのガス状COに露出されたマウスは血清TNF-αレベルの有意な低下（ｐ＜0.05）を示した（3,347±1393pg/ml）（図1A)。処理されたマウス中のCOHbレベルもまた測定した。期待されるとおり、ガス状のCOに露出されたマウスは空気に露出されたマウス（3.65±.43％）に比較して有意に高いCOHbパーセンテージを有した（23.83±2.48％、ｐ＜0.01）(図1B）。付随的に、ガス状のCOに露出されたマウスのCOHbレベルの増加はO2Hbレベルの減少と関連していた(図1C、それぞれCO処理されたマウス中で79.18±1.569％及び未処理マウス中で97.53±1.67％）。
【００４２】
実施例2
一酸化炭素生成性化合物としての塩化メチレン
CO生成剤の治療的可能性を明らかにするために、塩化メチレン（MC, Sigma, St. Louis MO）をリード化合物として選択した。異なる濃度のMCをオリーブオイルを溶媒として用いて調製した。LPS投与の1時間前に、マウスを経口による5mg/kg、50mg/kg、及び500mg/kgのMCで処理した。図2に示すように、5mg/kgのMCで処理したマウスからのTNF−αレベル（3720±1666pg/ml）がLPS処理したコントロール（5090.7±1595pg/ml）に比較してわずか又は有意でない相違（p=0.06）しかなかった一方、50mg/kg及び500mg/kgのMCで処理したマウスは、有意なTNF−αの減少を有した（それぞれ、3124.2±1147 pg/ml、ｐ＜0.05及び2339±770 pg/ml、ｐ＜0.05）。用量依存的なTNF-αの減少は用量依存的なCOHbの変化と関連していた。MC5mg/kgで処理したマウスはMC処理をしないマウス（3.1±0.6%）に比較して顕著なCOHbレベルの違いが無かった(4.22±1.2%）（図3）。しかしながら、50mg/kgのMC及び500mg/kgのMCで処理したマウスは未処理マウスに比較してCOHbレベルの有意な増加を有した（5.48±0.7%COHb、ｐ＜0.05及び13.92±0.7％COHｂ、ｐ＜0.05）。
【００４３】
ガス状のCOで処理されたマウスが阻害的用量のMCで処理されたマウスよりも高いレベルのCOHbを有したことは、注目すべきである。これは吸入されたCOの大部分が標的組織へ向かうよりも肺のヘモグロビンによって捕捉され、したがって、より高いCOHbレベルに導いたことによるであろう。反対に、GI路を通じて吸収される、経口的に投与されたMCは、肝臓で代謝される。したがって、放出されたCOのほとんどはCOHbに結合しているよりは肝臓中に集中して位置する。したがってデータは、CO生成性化合物は無秩序な免疫応答を阻害するために潜在的な治療的COを炎症性領域にデリバリーするための選択手段であることができることを示している。CO生成性化合物は、同種異形間移植の拒絶反応及び自己免疫疾患をコントロールする免疫抑制候補薬物群であることができる。
【００４４】
実施例３
虚血／再灌流傷害に対するCOにより仲介される保護
虚血／再灌流(I/R)傷害は、正所性肝臓移植における摘出による傷害の抗原非依存性の成分であり、相変わらずこの方法を制限する主要なものの１である。Farmer et al.,Transplatation Reviews14(2):106-116(2000)。肝臓の損傷の程度は、肝臓酵素の上昇とともにある可逆性の変化から細胞死及び究極の肝不全に帰する重大な傷害にわたるI/Rによる。先の研究は、HO−１のアップレギュレーションが肝臓及び心臓の細胞を虚血及び再灌流傷害により引き起こされた酸化的ストレスから保護し得ることを示した。Kato et al.,Am. J. Transplant.1:121-28(2001); Katori et al.,Transplantation(印刷中)。HO−１が仲介するI/R傷害に対する保護のメカニズムをよりよく理解するために、この研究はHO副産物であるCOの、ex vivoの単離ラット肝臓灌流モデルにおける低温I/R傷害に対する効果をテストするために設計された。
【００４５】
材料及び方法
動物：300−350ｇの間の体重の雄性Sprague Dawley (SD)ラット（Harlan Splague Dawley, Indianapolis, IN)を使用した。動物に標準的なげっ歯類の餌及び水並びにリビタム（libitum）を与え、American Association of Laboratory Animal Careにより承認されたガイドラインに従って世話をした。
【００４６】
単離肝臓の灌流装置：単離された肝臓の灌流装置が上記のAmersi et al.,及び Maulik et al.,Circulation94:398-406(1996)に記載されたとおりに使用された。すなわち、4のドナー動物から各実験のために得た同系のラット血液はクレブス・リンガー炭酸塩緩衝液（mM: NaCl 118, KH2POF 1, MgSO40.9, CaCl22.5、デキストロース 11.1及びNaHCO225）で15％のヘマトクリットまで希釈し、7.4のｐHで保存した。灌流液を、門脈の血流を測定するフローメーター（Cole Palmer Instruments, Chicago, IL）に接続したシラスティックチューブ製の酸素負荷装置を介して、灌流液を37℃に温める加温された貯蔵器からポンプで押し出した。門脈の圧力は、門脈カニューレ中のTフィッティングに連結した圧力モノメーターを通して一定に保持した。下大静脈中の拍出カニューレから拍出貯蔵器へ排出した。実験の間、pH、温度及び酸素負荷を一定に保持した。
【００４７】
ex vivoの低温虚血モデル：SDラットにイソフルラン麻酔と全身的なヘパリン処置を行った。肝臓の肉を取り去った後、門脈、下大静脈、及び総胆管にカニューレを挿入し、肝臓に10ｍLのUniversity of Wisconsin(UW)溶液を流した。肝臓はその後UW溶液中、4℃で24時間貯蔵され、続いて離れた肝臓灌流装置上でex-vivoで1−2時間、再灌流した。門脈の血流、血圧、胆汁産生を30分毎に記録した。血液サンプルを30分間隔で採取し、血清グルタミックオキサロアセティックトランスアミナーゼ（sGOT）レベルをANTECH Diagnostics(Irvine, CA)からの自動分析器を使用して測定した。実験の最後に、ｍRNA抽出／ウエスタンブロット分析のために肝臓の一部を瞬間冷凍し、残ったサンプルをH&E染色のためにホルマリン中に固定した。
【００４８】
肝臓のI/R傷害におけるCO−HO−1経路の役割を5の主要処置群（ｎ=4.8ラット/群）において研究した。1群においては、I/R傷害の程度をCO（1,000,000あたり300[ppm]；0.03％平衡空気）対  空気単独（21％O2）で飽和した血液でex vivoで灌流した肝臓について比較した。NOがHO−1の発現を促進する（上記のBrouard et al.,）ことから、我々はその後2群の肝臓中の上記2のガス状分子間の関連を研究し、それらを誘導可能なNO阻害剤である25mM NG−ニトロ−L−アルギニンメチル塩酸エステル(L−NAME；Sigma Chemicals, St. Louis, MI)を追加したCOで灌流した。COの生物学的機能がcGMPの生成と関連するので、3群においてcGMPアナログである10mM 6―アニリノ―5,8−キナリネドン（LY―83583；Calbiochem, San Diego, CA）を加えたCOで肝臓を灌流することによってグアニルシクラーゼを阻害することを試みた。外因性のCOが、I/R傷害の予防においてHO−1にとって替わることができるかを分析するために、4群のラットを肝臓の獲得の24時間前にHO―1阻害剤であるZnPP（1.5mg/kg/腹腔内；Porphyrin Products, Logan UT）で処理し、続いてex vivo においてCOで灌流した。COがp38MAPKシグナル伝達経路の活性化に依存する抗アポトーシス効果を表すことが示された。上記のBrouard et al。したがって、5群のラットはp38MAPK阻害剤であるSB203580、ピリジニルイミダゾール（25mg/kg経口；Sigma)で採集の60分前に前処理した。さらに、COによる再灌流に先立って、SB203580（20μM)を灌流液に添加した。
【００４９】
組織学：肝臓標本を10％緩衝ホルマリン溶液中に固定し、パラフィン中に包埋した。4μmで切片を作成し、H&Eで染色した。I/R傷害の組織学的重症度をInternational Banff Criteria(Int'l Banff Schema Conference Worksheet, The Third Int'l Banff Conference on Allograft Pathology, June 21-25(1995))を用いて等級付けした。これらの基準を用いて、小葉の錯綜配列及びバルーンによる変化を1−4に等級付けし、変化なしには1のスコアそして重症の錯綜配列又はバルーンによる変化には4のスコアを与えた。
【００５０】
ミエロペルオキシダーゼ（MPO)アッセイ：MPOは好中球の天然の成分であり、好中球の浸潤のマーカーとして使用される。凍結組織サンプルを解凍し、pHを5に調整した氷冷の0.5％ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（Sigma）及び50mMリン酸カリウム緩衝溶液（Sigma)に懸濁した。サンプルを30秒間ホモジナイズし、15分間、4℃で15,000rpmで遠心分離した。その後、0.1mlの上清を過酸化水素―酢酸ナトリウム及びテトラメチルベンジジン（Sigma)の溶液中に混合した。460nmの吸収の変化をBeckman DU 分光光度計（Beckman Institute, Fullerton, CA）で測定した。1分あたり、25℃で、組織1グラムあたり1μモルの過酸化物を分解する酵素の量を1ユニットのMPO活性と定義した。
【００５１】
ウエスタンブロット：タンパクを肝臓サンプルからPBSTDS緩衝液（50mM Tris, 150mM NaCl, 0.1%SDS, 1%ナトリウムデオキシコレート及び1%triton X-100,pH7.2 ）で抽出した。SDS負荷緩衝液（50mM Tris, pH7.6, 10%グリセロール, 1% SDS）中のタンパク(30μg/サンプル)は12%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜（Bio−Rad, Hercules, CA）に移す。等量のタンパク負荷を実証するために、ゲルをクマシーブルーで染色した。膜をPBS中3％ドライミルク及び0.1％Tween20（USB, Cleveland, OH）でブロックし、ウサギ抗ラットHO−1抗体又はiNOSポリクローナルAbs（SangStat, Fremont, CA)とともにインキュベートした。相対的なタンパク量をデンシトメーター（Kodak Digital Science 1D Analysis Software, Rochester, NY）を使用して測定した。
【００５２】
HO−1酵素活性：肝臓を氷上、0.5％Triton X-100及びプロテアーゼ阻害剤を含むTris-HCl溶解緩衝液(pH7.4）中でホモジナイズした。ホモジネート（100μl）を0.8mMNADPH、0.8mMグルコース-6-ホスフェート、1.0ユニットのG-60Pデヒドロゲナーゼ、1mM MgCl2及び10mlの精製ラット肝臓ビリバルディンレダクターゼと4℃で混合した。反応はヘミン（最終濃度0.25mM）の添加によって開始した。反応混合物を暗所、37℃で15分間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に不溶性物質を遠心分離によって除去し、上清をビリバルディン濃度について分析した。A460-530における吸光係数40ｍM-1cm-1を形成されたビリバルディン量の計算のために使用した。コントロールは、NADPH生成系非存在下の自然のサンプル及び移植片ホモジネート非存在下の反応混合物のすべての成分を含むものであった。ビリバルディンレダクターゼをBrowne and Ultrich,Mol. Pharmacol.32:497-504(1987)に記載されたとおりにラット肝臓から精製した。
【００５３】
HO−1タンパク発現のためのELISA：肝臓を氷上、0.5％TritonX-100及びプロテアーゼ阻害剤を含むTris-HCl溶解緩衝液(pH7.4）中でホモジナイズした。平底の96穴マイクロタイタープレート(Nunc）をPBS中7μg/mlの抗HO―1mAb（OSA-111, Stressgen, Canada）で18時間、室温でコートした。結合しないAbを洗浄し(洗浄緩衝液：50mM リン酸緩衝液、pH7.5中0.05％Tween 20）、残りの結合部位を5％BSA/PBS溶液とともにインキュベート（1時間）することにより、ブロックした。組換えHO−1（SPP−730）及び組織ホモジネートをアッセイ希釈液（0.5％BSA/0.05%Tween20/PBS）で希釈し、抗HO―1mAbでコートしたウエル中で1時間室温でインキュベートした。その後、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、ウサギ抗HO―1ポリクローナル抗体（SPA-895, Stressgen,; アッセイ希釈液で1：1000に希釈）とともに30分間、室温でインキュベートした。結合したウサギIgGをロバ抗ウサギ（gG-HRP接合体、711-035-152、Jackson Research Laboratories;アッセイ希釈液で1：8000に希釈）で検出した。結合しない2次Abを洗浄によって除去し、結合したHRPを基質緩衝液（0.1％H2O20.1Mクエン酸、0.2MNa2PO4、pH5.0）中1mg/mlのOPDを使用して検出した。呈色反応をで1M HClで停止し、490nmにおける光学濃度を測定した。
【００５４】
統計学：統計分析のために、群間の比較を分散の反復測定分析（ANOVA)を使用して行った。差異が確立された場合、我々は0.05未満のｐ値が統計的に有意と見なされる、統計的有意性の判定のためのTukey−Fisher最小有意性（Least Significance）（LSD)基準を使用した。値は平均±SEMとして表した。
【００５５】
結果
再灌流がその後に続く、低温虚血のex-vivoラット肝臓モデルにおけるCOの効果：HO―1によるI/R傷害の回復がHO-1-COの下流情報伝達経路によって仲介される場合、門脈抵抗、胆汁産生及びsGOTレベルをCO（300ppm平衡空気）を補充した血液対空気のみ（21％O2）を補充した血液による2時間の灌流がそれに続く、24時間の低温保存を行ったラット肝臓中で測定した。
【００５６】
門脈抵抗（圧力／流量）は類洞のうっ血及び肝細胞の傷害に影響される。灌流液へのCOの添加は2時間の再灌流期間を通して、コントロールに比較して有意に（ｐ＜0.001）門脈抵抗（mmH2O/分/ml)を低下させた（図4）。さらに図5に示すように、CO処理された肝臓は空気のみに露出した血液で灌流した肝臓と比較して有意に（ｐ＜0.005）多量の胆汁を産生した（ml/g組織重量）。
【００５７】
次に、我々はsGOT放出により測定されたようにCOを伴う灌流が肝細胞傷害を回復させたのかについて判定した。COで灌流された肝臓は、空気のみで灌流されたコントロール肝臓と比較した場合、有意に低いsGOTレベル（IU/L）を示した（ｐ＜0.0001）（それぞれ、1時間：79±14対362±51；2時間：163±27対497±31；データは示さない）。
【００５８】
I/R傷害の組織学的特徴の重症度に対するCOの効果をBanffの判断基準によって評価した。空気を補充した血液で灌流したコントロール肝臓は類洞及び中心静脈のうっ血と関連する広範な小葉中心の風船様拡大と壊死を再灌流の1時間（スコア＝3.6±0.25）及び2時間（スコア＝4.0±0.0）において示した。顕著に対照的に、付属的なCOとともに1時間灌流した肝臓は中心静脈及び類洞のうっ血を伴わない肝臓構造全体の保存を示し、小葉中心の風船様拡大または壊死が無かった（スコア＝1.2±0.31）。2時間COで灌流された肝臓はところどころに小葉中心の風船様拡大と最小の壊死とともに軽い血管のうっ血及び小葉の血色の悪さを示した(スコア＝2.0±0.12）。
【００５９】
I/R傷害に対するCOにより仲介される細胞保護的効果のメカニズムを研究するために、MPOアッセイが2時間の灌流の結果としての肝臓組織中の好中球活性を決定するのに採用された。図6に示すとおり、COとともに灌流した肝臓（1.3±0.2；ｐ＜0.04）に比較して、コントロール肝臓は有意なMPO活性の増加（4.0U/mg）を示した。
【００６０】
COの保護効果は、一連のCOHb測定値（図7）に相関する。1時間COに露出された血中のCOHb濃度、3.64±0.32％は、2時間のCOを伴う再灌流後に6.79±1.47％に増加した。この値は空気のみで1時間（0.27±0.19％COHb；ｐ＜0.01）又は2時間（1.59±0.13％COHb；ｐ＜0.002）灌流した肝臓に比較して有意に高かった。
【００６１】
外因性のCOの肝臓のI/R傷害に対する効果はNO非依存性の経路を通る：COは直接的にNOシンターゼ酵素のヘム部分に結合すること、及びNO産生を調節することが示された。Dulkanchainun et al.,Ann. Surg.227:832-840(1998)。したがって、我々はCOとともに観察される肝臓のI/R傷害の回復がNOを介するものか否かを研究した。再灌流の開始において、iNOSの選択的阻害剤であるL-NAME25mMをCOを含む灌流液に添加した。CO存在下でL-NAMEで処理された肝臓は、COのみに露出された肝臓の2時間の灌流後に見られた効果（それぞれ、図8及び9）に類似して、門脈抵抗（mmH2O/分/ml）の減少及び胆汁産生（ml/g組織重量）の増加を示した。さらには、sGOT放出（IU/L）もまた、COのみで処理された群（163±27）と同様に減少した（191±16）。
【００６２】
外因性のCOの肝臓I/R傷害に対する効果はcGMP非依存性の経路を通る：COがその保護効果を現す、可能性のあるメカニズムをさらに研究するために、我々は内皮依存性の血管拡張に寄与することが知られている、cGMPの阻害の効果を調べた。Suematsu et al.,J. Cli
n. Invest.96:2431-37(1994)。ヌクレオチドの作用を妨害するcGMPアナログであるLY-83583を、COを含む灌流液に、再灌流時に添加した。2時間の再灌流後、LY-83583の付随的な使用後のcGMPの阻害は、COのみで灌流した肝臓に比較して肝臓機能に対する有意な効果を有さなかった。LY-83583とともに灌流した群において門脈の血液抵抗がわずかに増加したにもかかわらず（図8；図示しない）、胆汁の産生（図9）はsGOTレベル（186±21IU/L）と同様に両群において匹敵するものであった。
【００６３】
肝臓のI/R傷害の予防において外因性のCOは内因性のHO-1にとって替わり得る：内因性のHO-1活性の低下がI/R傷害に対する外因性のCOによる保護能力に影響するか否かを研究するために既知のHO-1阻害剤、ZnPP（1.5mg/kg/i.p.）を採取の24時間前に投与した。その後、上記のとおり、肝臓を4℃で24時間保持し、ex vivo で2時間灌流した。有意に、ZnPPで前処理した肝臓は、COのみとともに灌流した群中の肝臓と同様の機能的特徴、すなわち、減少した門脈抵抗（図8）、増加した胆汁産生（図9）、及びsGOTレベルによって測定されるように（202±11IU/L）改善した肝細胞機能、を示した。実際、これらの細胞保護効果は、ZnPP処理群（0.95±0.06）中の、COのみ（2.25±0.18；ｐ＜0.01）又は空気のみ（1.37±0.11；ｐ＜0.02）とともに灌流した群に比較して低下したHO-1酵素活性（nmolのビリバルディン/mg/タンパク/分；n＝3-4/群）と相関していた（データは示さない）。同様に、ELISAで補助された肝臓サンプル中のHO-1タンパク発現の検出（ngHO-1/mgライセート；ｎ＝3-4/群）は、HO-1産生量が、ＣＯのみ(7.51±2.13；ｐ＜0.01)又は空気のみ（1.28±1.46；ｐ＜0.01）とともに灌流した群に比較してZnPP前処理群において顕著に減少したことを明らかにした（データは示さない）。
【００６４】
HO-1及びiNOSの発現：ウエスタンブロット分析は、肝臓のI/R傷害に対するCOに仲介された細胞保護効果がHO-1発現のアップレギュレーションと相関することを示した。HO-1タンパクは、コントロール群（空気のみ）及びZnPP（データは示さない）で処理した群とを比較した場合、CO、CO＋L-NAME及びCO＋LY-83583とともに灌流した２時間後に３倍に増加した。ウエスタンブロットを使用したiNOS発現の分析はCO、CO＋L-NAME、CO＋LY83583及びCO＋ZnPPで処理した群では検出可能なバンドが無いという結果となり；しかし、空気のみを伴う再灌流の２時間後のコントロール肝臓中で低密度のバンドが検出された。
【００６５】
COがp38MAPKの活性化を通じて肝臓のI/R傷害を予防する：COがp38MAPK形質導入経路の活性化を介して内皮細胞のアポトーシスを予防することが他で示された（上記Brouard et al.,）ように、我々はこのメカニズムが我々のモデルにおいて役割を果たすかを研究した。ピリミジルイミダゾール阻害剤、SB203580で処理した肝臓はCO存在下で、COのみを伴う２時間の再灌流後の肝臓と比較して、有意な門脈抵抗の増加（ｐ＜0.025）及び有意に少ない胆汁を産生した（ｐ＜0.01）（それぞれ図８及び図９）。さらに、CO単独処理群（163±27IU/L；ｐ＜0.05）に比較した場合、sGOT放出が増加した（352±21IU/L）。このデータはCOを介したI/R傷害に対する保護効果がp38MAPK情報伝達経路の活性化を通じたものであるという主張を支持するものである。
【００６６】
組織学：I/Rに誘導された肝細胞傷害をまた、２時間の灌流時間の結果においてBanff’s Criteriaを使用して等級付けした。CO+L-NAMEで処理した肝臓は中心静脈又は類洞のうっ血を伴わずに肝臓構造が保存されること、及び最小の小葉中心の風船様拡大が壊死を伴わないこと（スコア＝1.5±0.25）を明らかにした。cGMPアナログとCOで前処理した肝臓は中心静脈又は類洞のうっ血を伴わない肝臓構造の保存及び小葉中心の風船様拡大／壊死の無いこと（スコア＝1.25±0.25）を明らかにした。ZnPPで前処理し、COとともに灌流した肝臓は、最小の小葉中心の風船様拡大、うっ血及び壊死を示した（スコア＝1.5±0.0）。最後に、CO＋SB2035890で処理した肝臓は類洞及び中心静脈のうっ血を伴う中程度の風船様拡大変化を示した（スコア＝3.25±0.25）。
【００６７】
上記データが示すように、24時間の低温保存後、ex vivoでCOで２時間灌流したラット肝臓はコントロール肝臓と比較して、門脈抵抗及び胆汁産生が有意に増加した。これは肝機能の改善（sGOTレベル）、減少した好中球の浸潤、及び肝細胞傷害の組織学的特徴（Banffのスコア）の低下と相関していた。COを介する細胞保護効果は酸化窒素又はcGMP非依存性であったが、p38マイトジェンにより活性化されたプロテインキナーゼ（MAPK）依存性であった。さらには、COは、肝臓のI/R傷害の予防においてp38MAPKの活性化を介して内因性のHO-１に取って代わることができた。したがって、COの投与は肝臓のI/R傷害の予防及び移植受容者のための肝臓提供者プールの拡大において潜在的な治療的適用を有する。
【００６８】
実施例４
塩化メチレンの投与はアポトーシスを予防し、肝臓同種異形間移植片の生存を延長する
アポトーシス又はプログラムされた細胞死は免疫システムの恒常性に対して決定的なものであり、細胞毒性を有するTリンパ球（CTLs）による急性の同種異形間移植片の拒絶反応の破壊相において中心的な役割を果たす。CTLsは、標的細胞を溶解するためのCD95/FASシステムを含む多様なメカニズムを利用することができる。Ju et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:4185-89(1994)。この研究はCD95/FASを介するアポトーシスを予防し、同種異形間のOLT生存を延長することにおけるHO-１の下流のメディエーターとしてのCOの効果を調べたものである。
【００６９】
材料及び方法
Fasリガンド（Ad-CD95）、ヘムオキシゲナーゼ1（Ad-HO-1）及びβ-ガラクトシダーゼ受容体遺伝子（Ad-β-gal）をコードする組換えアデノウイルス（Ad）の作製：Shibahara et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA93:10393-98 (1985)に記載されるとおり、Ad-HO-1を作製した。すなわち、Xho1-HindIII部位に隣接した1.0k bpのラットHO-1cDNAをpAC-CMVpLpAプラスミド中にクローン化した。得られたpAC-HO-1プラスミドをpJM17プラスミドとともに911細胞中へ同時形質移入した。相同組換えは、複製不全のAd-HO-1に帰した。組換えAd-HO-1クローンはサザンブロットによってスクリーニングした。Ad-CD95及びE. コリ（E. coli）βガラクトシダーゼ遺伝子を含むAd(Ad-β-gal)はKe et al.,Transplantation69:1690-94 (2000)に記載された。組換えAdsの単離、増殖、力価測定は、通常の方法によって行った。Graham et al.,Virology52:456-67 (1973)を参照のこと。
【００７０】
細胞株：すべての細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD)より得た。Hela細胞は、Dulbecco’s minimum essential medium(DMEM; GIBCO, Grand Island, NY)+10%ウシ胎児血清（FBS）中で、及びYAC-1細胞は、RPMI 1640(GIBCO)+10%FBS培地中で維持した。
【００７１】
in vitro の細胞毒性アッセイ：Hela細胞及びYAC-1細胞を1×105細胞/ウエルで100μlのDMEM+10%FBS中で一夜培養した。３回洗浄した後、Ad-CD95（感染多重度[MOI]=5,10,及び20において）及びAd-HO-1又はAd-β-gal（MOIが10で）を添加し、100μlの血清を含まないDMEM中で１時間インキュベートした。培地をその後除去し、100μlの2%FBSを含むDMEMに変え、36-48時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を3回洗浄した後、10μlのMTT（5mg/ml、Sigma Chemical, St. Louis, MO）を各ウエルに添加し、4時間インキュベートした。培地除去後、100μlの0.01%HClを含むイソプロピルアルコールを添加した。酵素結合免疫測定法の読み取り機を550のODで使用した。細胞毒性のパーセントを以下の：1-OD実験値/ODコントロール×100％で計算した。
【００７２】
in vitro アポトーシスアッセイ：1×105細胞/ウエルで96ウエル中に培養したHela 及びYAC-1細胞を100μlのDMEM+10%FBS中で一夜培養した。３回洗浄後、Ad-CD95（5、10、及び20のMOIで）及びAd-HO-1又はAd-β-gal（10のMOIで）を添加し、100μlの血清を含まないDMEM中で１時間インキュベートした。培地をその後除去し、100μlの2%FBSを含むDMEMに変えて36-48時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をPBS/1%BSAで3回洗浄後、100μl/ウエルの新鮮な4%パラホルムアルデヒド溶液を細胞に添加し、1時間インキュベートした。その後、100μl/ウエルの透過化溶液（0.1%クエン酸ナトリウム中0.1%Triton X-100）を2分間氷上で添加した。PBSで2回洗浄後、細胞に50μl/ウエルのTUNEL（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを介するdUTPのニック-エンド標識、以下を参照のこと）反応混合物（Roche Molecular Biochemicals, Germany）を添加し、加湿した大気中、暗所、37℃で1時間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄後、蛍光顕微鏡法で分析した。200倍の倍率の顕微鏡視野あたりのアポトーシス細胞の数を平均することによって結果を準定量的に等級付けした。サンプルあたり少なくとも6の視野を評価した。各実験群を3連で行った。すべてのデータを平均±標準偏差で表した。
【００７３】
OLTモデルにおけるAd-HO-1の形質導入：10-16週令の雄性Dark-Agouti（DA;RT13）及びLewis（LEW;RT1’）ラットをHarlan Sprague Dawley, Inc.(San Diego, CA)より購入し、UCLA Chancellor’s  Animal Research Committee(CARC)により承認された条件下で飼育した。すべての動物はウイルスのない施設中のマイクロアイソレーターケージ中に入れ、実験用飼料を随意に与えた。正所性の肝臓移植を前述のとおりにDA提供者及びLEWラット受容者の間で実施した。上記のAmersi et al.; Kato et al.,Am. J. Transplant1:121-28 (2001)。肝臓移植片中へのex vivo の遺伝子の移入を、5×1010pfu（プラーク形成単位）のAd-HO-1を含む2mlの低温の乳酸加リンガー液で門脈を灌流することを介する低温保存中に実施する。コントロール移植片を5×1010pfu（プラーク形成単位）のAd-β-galで灌流した。動物を生存について追跡調査した。受容者の別々の群を移植の3、7、及び10日後に犠牲にし、組織学的評価のためにOLTsを採集し、一方、血液サンプルをsGOTレベルの測定のために採集した。
【００７４】
OLTモデルにおける塩化メチレン処理：COがこのシステムにおいて機能的な下流HO-1メディエーターとなるか否かを調べるために、塩化メチレンを一酸化炭素生成剤として使用した。上記のとおり、MCの代謝はCO2及びCOの排他的な産生に帰することが知られている。上記のGargas et al.。DAの肝臓を移植されたLEWラットに移植の2時間前に塩化メチレン(500mg/kg)を与え、続いて移植後2週間与えた（500mg/kg/日）。実験動物の血液中のCoHbレベルを第0、5、及び10日に測定した。動物の生存をスクリーニングし、OLTsを組織学的に分析した。
【００７５】
組織学：移植後の第3、7、及び10日に肝臓同種異形間移植片を採集した。組織を小片にスライスし、10%中性緩衝ホルマリン中に保存し、5μmの切片に切断し、標準的な方法でヘマトキシリン及びエオシン（H&E）染色した。
【００７６】
in vivoのアポトーシス検出：商業的なin situの組織化学的アッセイ（Klenow-FragEL, Oncogene Research Products, Cambridge, MA）をホルマリン固定されパラフィン包埋された組織片中のアポトーシスのDNA断片形成特性を検出するために実施した。この方法において、Klenowはアポトーシスのシグナルに応答して生じたDNAフラグメントの露出した末端に結合し、ビオチン標識された及び非標識のデオキシヌクレオチドの鋳型依存性の付加を触媒する。ビオチン化されたヌクレオチドはストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）接合体を用いて検出する。ジアミノベンジジンは標識サンプルと反応して不溶性の着色された基質をDNA切断部位において生成する。メチルグリーンによる対比染色は形態学的評価及び正常及びアポトーシス性の細胞の特徴づけの助けとなる。200倍の倍率の顕微鏡視野あたりのアポトーシス性の細胞数を平均することによって結果を準定量的に等級付けした。組織サンプルあたり６の視野を評価した。すべてのデータを平均±標準偏差で表した。
【００７７】
結果
Ad-HO-1遺伝子の移入はCD95/Fasを介するアポトーシスをin vitroで予防する：Adに基づくin vitroにおけるHO-1の過剰発現の効果を分析するために細胞毒性アッセイ及びTUNEL染色を使用した。図10に示すように、Fasに関連するYAC-1標的細胞に対するCD-95を介した細胞毒性が、Ad-CD-95＋Ad-β-galコントロールと比較して、Ad-CD95+Ad-HO-1で形質移入された群において、一貫して減少した。実際に、5、10、及び20のMOIで、コントロールにおける39%、49%、及び76.5%の細胞死率は、Ad-CD95+Ad-HO-1形質移入群における4.5%、7%、及び14％の細胞死と比較して有意に高かった（ｐ＜0.001）。細胞毒性アッセイの結果と一致して、Ad-CD95+Ad-β-gal群（211.5±76）におけるTUNEL+アポトーシス性のYAC-1細胞の数は、Ad-CD95+Ad-HO-1群（36.5±14）に比較して有意に（ｐ＜0.001）増加した（データは示さない）。
【００７８】
Ad-HO-1遺伝子の移入が同種異形間のOLT生存を延長し、急性の拒絶反応の組織学的兆候を回復させ、そして肝機能を改善する：未処理のLEWラットはDAの肝臓の正所性移植後10日間以内に死亡した（以下の表1を参照のこと）。Ad-β-galによるDAの肝臓の形質移入は移植後の動物の生存に影響しなかった（平均生存時間[MST]±SD＝9.5±0.5日；n=6）。しかしながら、Ad-HO-1で形質移入したOLTsの生存は32±42日より長くまで有意に増加し、12の肝臓のうち2は120日を超えて持ちこたえた（表1）。Ad-β-galによる形質移入後のX-gal陽性染色は移植後第3、7、及び10日においてそれぞれ約90%、80%及び70%（平均、2-3動物/群）であった。Ad-β-galコントロール群におけるOLTsは壊死、出血及び移植後第10日まで生存可能な肝実質が25％未満であることを伴い、重症の急性拒絶反応の進行性の兆候を示した。対照的に、Ad-HO-1群中の対応するOLTサンプルは、高密度の炎症性の浸潤を伴う弱い〜中程度の拒絶反応を示したが、90%を超える実質が保存された。そして我々はOLT機能の機能的測定としてsGOTレベルを分析した。移植後第10日において、sGOTレベル（IU/L）は、Ad-β-Galコントロール（1208±611；ｐ＜0.05）に比較してAD-HO-1遺伝子移入群において減少した（412±105）。
【００７９】
Ad-HO-1遺伝子の移入がアポトーシスを予防し、同種異形間OLTs中の抗ーアポトーシス性分子の発現をアップレギュレートする：第10日までに、Ad-β-gal群中の肝臓同種異形間移植片は高密度の核の辺縁趨向（TUNEL+細胞/視野で64±25）を伴う肝細胞のアポトーシスを示した。対照的にAD-HO-1遺伝子移入を行った同種異形間OLTsにおけるアポトーシス細胞数はバックグラウンドレベル内に留まった（TUNEL+細胞/視野で0.8±0.7；ｐ＜0.05）。
【００８０】
内因性のCOのアップレギュレーションが同種異形間OLTの生存を延長する：COが拒絶反応カスケードの重要な下流HO-1メディエーターであるか否か調べるために、OLT同種異形間移植の受容者を塩化メチレンで処理した（500mg/kg/日×14日）。この養生法は良好な耐容性を示し、副作用が見られなかった。CoHb血液レベルは実験開始時（第0日）の1.3±0.1％から5.8±0.2％、及び6.8±0.5％へ、第+5日及び+10日においてそれぞれ増加した（平均±標準偏差；n=2-3測定/群）。すべての未処理LEWラットは同種異形間のDAの肝臓移植後10日以内に死亡した（以下の表1）。対照的に、移植後に塩化メチレンを与えた後、OLT生存は有意に増加し（MST±SD=＞47±46日）、7のうち2のラットは120日を超えて生存した。第10日までに、未処理の受容者中のOLTsは高密度の炎症性浸潤、壊死性の内皮炎を示す門脈／中心静脈及び10％未満の生存可能な肝臓実質を伴う重症の急性拒絶反応を示した。対照的に、塩化メチレン処理した宿主から採集されたOLTsは弱い〜中程度の拒絶を示唆する、弱い〜中程度の炎症性の浸潤及び中心静脈の内皮炎を示し、80％を超える実質が良好に保存された。塩化メチレンに基づくin vivo のCOデリバリーは同種異形間OLTsにおけるアポトーシスを、移植後第10日で未処理コントロール中のTUNEL＋細胞の61±25から塩化メチレン処理したラット中のTUNEL＋細胞の4.5±2.3まで有意に減少させた（ｐ＜0.0025）。
【００８１】
【表１】
2004526739.tif 000003
【００８２】
上記データが示唆するとおり、Ad-HO-1遺伝子治療を介したin vivoのHO-1発現が同種異形間OLT後の動物の生存を顕著に延長し、急性の拒絶反応の組織学的重症度を減少させ、及び肝細胞の構造を保存し、そしてまた、sGOTレベルによって測定されたOLT機能を改善した一方、Ad-HO-1遺伝子治療はin vitro におけるCD95/Fasを介するアポトーシスを予防した。相対的に、OLT受容者への他の免疫抑制を伴わない日毎の塩化メチレン単独の供給は、約10日の急性のOLT拒絶反応を画一的に予防し、約50%のラット受容者が3週間を超えて生存し、顕著に動物の生存を延長した。塩化メチレンの投与に続くCoHbレベルの上昇（未処理ラットにおける約1.3%から10日間の処理後の約6.8%まで）は一貫して得られ、上記養生法は、良好な耐容性を有した。さらに、HO-1−CO下流の情報伝達経路における抗-アポトーシス性の効果が同種異形間移植の拒絶反応カスケードの抑制に重要であるという指摘と一致して、塩化メチレン投与は、移植片部位におけるTUNEL+細胞の頻度を減少させた。
【００８３】
したがって、塩化メチレンに関する上記の研究は、肝臓の同種異形間移植受容者におけるAd-HO-1を介する抗-炎症性効果が少なくとも部分的にはCOの生成に依存することを示す。上記のデータはCOが単独で十分にHO-1を介する細胞保護に取って代わりうるという他者(上記のBrouard et al. (2000);上記のSato et al.及び,Fujita et al.,Nat. Med.7:598-604(2001）)に一致する。細胞のアポトーシスを抑制するその可能性に加えて、COはまた、フィブリン溶解性の軸椎を減少させ（Fujita et al.）、血小板凝集を阻害し（Brune and Ulrich,Mol. Pharmacol.32:497-504(1987)）及び／又は血管拡張を促進すること（Motterlini et al., Cir. Res. 83:568-77 (1998)）によって移植片の拒絶を回復し得る。
【００８４】
実施例5
塩化メチレン投与は慢性的拒絶反応を阻害する
慢性の拒絶反応は同種異形間移植片の動脈硬化、内膜の肥厚による広汎な進行性の移植片血管の狭小化、に特徴を有する。Libby and Roper,Immunity14:387-97 (2001)。I/R傷害及び内皮細胞により発現される不適合性のMHC抗原に対する免疫応答は両方とも上記疾患の開始原因であると見られている。内膜及び外膜の白血球の浸潤と同様に、内皮細胞の破壊及び／又は活性化は、VSMCsのそれらの中膜内の正常な位置から中膜の内皮下層スペースへの異常な増殖及び遊走、並びに異常な血管狭窄に導く。同上。急性の拒絶反応とは異なり、ここ10年間では慢性の拒絶反応の速度を低下させることにおいては進歩がわずかであり、新しい治療ストラテジーの緊急の必要性がある。
【００８５】
HO-1は、異種間の（上記のSoares et al. 及び Sato et al.）及び同種異形間の（上記のWoo et al. 及び Hancock et al.）移植片の拒絶反応同様に、虚血／再灌流傷害（上記Amersi et al.）、アテローム性動脈硬化（Ishikawa et al.,Cir. Res.88:506-604(2001)）、動脈の傷害に続く新内膜の形成（Togane et al.,Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol.278:623-32 (2000)）のような慢性の拒絶反応に関連する病理学的状態における炎症を抑制することが示され、それはHO-1が上記疾患の免疫的及び非免疫的成分に作用することによって慢性の拒絶反応から保護することができることを示唆する。より最近には、COが単球マクロファージに関連した前炎症性の表現型を抑制すること（上記のOtterbein et al.）、多様な細胞タイプをアポトーシスを行うことから保護すること（Petrache et al.,Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol.Physiol.278:L312-319(2000); 上記のBrouard et al.）、異種間移植片の拒絶反応を抑制すること（上記のSato et al.）及び線溶を減少させること（上記のFujita et al.）が明らかとなった。本実施例は一酸化炭素生成性化合物、塩化メチレンを使用して、慢性の大動脈同種異系間移植片の拒絶反応（上記のLibby,）のよく特徴付けされ、広く使用されたモデルにおけるCOデリバリーの効果を実証する。
【００８６】
材料及び方法
動物及び大動脈移植：移植は、250gの近交系雄性Lewis 1週令ラット（LEW.1W,ハプロタイプRT1u）を提供者として、及びLEW.1Aラット（ハプロタイプRT1a）を受容者として使用して実施した（CERJ, Le Genest St. Isle, France）。これらの動物はMHC領域全体について完全に不適合である。動物の方法は動物実験のためのヨーロッパのガイドラインに従った。下行胸部大動脈を採取し、生理食塩水で灌流し、腎動脈の下で及び動脈分岐の上で受容者の腹部大動脈と吻合した。吻合は、終末−側方様式で実施し、受容者の腹部大動脈を2移植片吻合の間で結紮した。移植された大動脈は移植の30日後に採取した。１の大動脈部分を10%ホルムアルデヒドで形態測定的評価のために固定し、他の部分をOCT化合物（Tissue Tek, Miles Laboratories, Elkhart, IN）中に包埋し、そして免疫組織学的分析のために液体窒素中で凍結した。
【００８７】
MC（Sigma, St. Louis, MO）をオリーブオイルで希釈し、500mg/kgの日毎の体制で（0〜30日）経口投与した。この用量はシトクロームP-450酸化的システムを飽和させ、静脈又は動脈の血液中で10%COHbという最大COHb値を得た。上記のGargas et al. 及び Andersen et al.; Wirkner et al.,Toxicol. App. Pharmacol.143:83-88(1997)。先に出版されたデータは、経口的に投与された500mg/kgのMCが急速に吸収され、血中平均濃度60-70mg/kgに達し、約3時間の半減期で代謝され、半減期約2時間のHbCOを約10%生成したことを実証した。同上。先に出版されたデータはまた、4週間の500mg/kgのMC投与がラットに主要な体重、生化学的又は組織学的変化を誘導しなかったことを示した。Kirschman,Fd. Chem. Toxic.24:943-49(1986); Dhillon and Von Burg,Toxicology Update1:329-35(1995)。MCはより高い及び／又はより長い露出によって、肝臓及び中枢神経系の毒性を示すことができる。同上。COHbレベルはVOXimeter センサー（A-VOX Systems, San Antonio, TX）を使用してヘパリン化静脈血中で評価し、総ヘモグロビンのパーセンテージとして表した。重炭酸塩、可溶性CO2、総CO2、及びpHを標準的な臨床生化学の技術（Laboratory of Biochemistry, University Hospital of Nantes）を使用して測定した。
【００８８】
組換えアデノウイルス及び大動脈中への遺伝子移入：HO-1（AdHO-1）をコードするアデノウイルスを293の細胞中でpAdEasy及びpAdTrack-CMVシステム（He et al.,Proc, Natl' Acad. Sci.95:2509-14(1998)）を使用して構築した。AdHO-1はヒトCMVプロモーター及びその3’末端でFlag配列に融合したヒトHO-1ｃDNAプロモーターを有する発現カセットを含む。非コーディングアデノウイルスベクターAdd1324が先に記載され、David et al.,Hum. Gene Ther9:1755-68(1998)、そしてその中で記載されるように組換えアデノウイルスを精製した。組換えアデノウイルスについてReplicaiton Center Assay (RCA)を使用して力価測定した。本来はアデノウイルスに関連したベクターの力価測定のために記載されたプロトコール（Salvetti et al.,Hum. Gene Ther.9:6950706(1998)）を感染性のアデノウイルス粒子（IP)の定量を可能とするために改変した。すなわち、293の細胞を8×104細胞／ウエルで48穴プレートに播種した。翌日、それらを連続的に希釈したベクターに感染させた。細胞を36時間後にトリプシン処理し、Zetaprobe メンブレン（Biorad）を通して濾過した。フィルターをその後0.5M NaOH, 0.5M NaCl中に5分浸漬し、1M Tris-HCl pH7.0, 2X SSC中で中和し、最後に上記DNA結合性タンパク遺伝子にハイブリダイズする蛍光標識された核酸プローブとともにインキュベートした。感染性のアデノウイルス粒子の定量は、感染した293の細胞上のスポット（個々のウイルス複製事実に対応する）の数を数えることによって決定した。重要なことは、RCA収率力価による定量が感染単位（抗−DBP抗体を用いた蛍光抗体法によって決定された）と等しいということである。提供者の大動脈を採集し、組換えアデノウイルス（1％FCSを補充したDMEMの200μl中1010IP）を管腔中へ注入し、両端を結紮した。大動脈をその後45分間37℃5％CO2でインキュベートし、DMEMを流して取り込まれないアデノウイルスを除去し、受容者に移植した。
【００８９】
組織学及び外形測定分析：ホルムアルデヒド固定の後、大動脈セグメントをパラフィン中に包埋し、5μmの切片をヘマトキシリンーエオシンーサフロン（HES)で染色した。カラーカメラを使用して顕微鏡画像を収集した。画像分析処理をScion Image software(National Institutes of Health)を使用してブラインドで実施した。各切片において、管腔内の領域の内部及び外部の弾性ラミナを手動で区切り、測定した。内膜の厚さを以下の式：内膜／（内膜+中膜）×100によって計算し、内膜肥厚のパーセントとして表した。
【００９０】
内皮細胞(ECs）中の遺伝子移入及びウエスタンブロット分析：初代ラット大動脈ECsを10%FCSを補充したDMEM中でAdd1324又はAdHO-1（細胞あたり50IP）とともにインキュベートし（37℃、90分）、洗浄し、10％FCSを補充した培地中で30時間培養した。細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、10ｍM Tris pH7.4中に1％SDS、240μg/mlAEBSF（Sigma）及び0.71TIU/mlアプロチニン（Sigma）を含む緩衝液中で溶解した。20μgのタンパクを煮沸し、10%SDS-ポリアクリルアミドゲルに負荷し、続いて電気泳動、及びニトロセルロース膜上にブロッティングした。膜をその後0.1% Tween20及び5%無脂肪のドライミルクを含むPBSでブロックし（一夜、4℃）、ヒト及びラット由来のHO-1の両方と反応するウサギ抗ーHO-1抗体（Stressgen, Victoria, BC, Canada）、マウスMab抗-Flag抗体（クローンM2)（Sigma, St. Louis, MO）又はマウスMab抗-β-チューブリン抗体（Carbiochem, San Diego, CA）とともにインキュベートした（2時間、室温）。その後それらを洗浄し、HRP-標識した抗-ウサギ又は抗-マウスIgG抗体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）とともにインキュベートし、そして増強したケミルミネッセンス（Amersham, Arlington Heights, IL）でX線フィルムを用いて検出した。
【００９１】
免疫組織学的分析：先に詳細に記載されたとおり、クリオスタット切片について免疫組織学を実施した。Guillot et al.,J. Immunol.164:5258-68 (2000)。白血球の浸潤についての免疫組織学的分析を移植の30日後に以下のマウスMab：2の抗-白血球CD45Mabs抗体（OX1及びOX30）の混合物、抗-単球／マクロファージCD68抗体（ED1)、抗-αβTCR抗体（R7.3）、抗-CD4抗体（W3/25)、抗-CD8α鎖抗体（OX8)、抗-単形性クラスIIMHC抗原抗体（OX6)、抗-CD25抗体（OX39)（すべてECACC, Wiltshire, UKより得た）、抗-CD54抗体（ICAM-1)（Seikagaku America Inc., Rockville, MA）、抗-CD86抗体（B7.2）（Pharmingen, Franklin Lakes, NJ）及び関連のないマウスMab抗体（3G8、抗-ヒトCD16）を使用して実施した。VSMCsをマウス抗-αヒト平滑筋アクチンMab抗体（Sigma, St. Louis, MO）を使用して検出した。そしてスライドをビオチンと接合した抗-マウスイムノグロブリン抗体（Vector Laboratories, Burlingame, CA）とともにインキュベートし、続いてHRPと接合したストレプトアビジン（Vector Laboratories）及びVIP基質とともにインキュベートした。IFNγの発現をハムスターMab(Genzyme, Cambridge, MA)を使用して検出した。IP10ケモカインをヤギ抗-IP10抗体（Santa Cruz, Santa Cruz, CA）を使用して検出した。iNOS（Transduction Laboratories, Lexington, KY）、HO-1（Stressgen）及びTGFβ1（Promega, Madison, WI）を検出するためにウサギ抗体を使用した。ビオチンと接合した抗-ハムスター、抗-ヤギ、及び抗-ウサギ抗体はJackson Immunoresearchより得た。これらの抗体の結合はHRPと接合したストレプトアビジン及びVIP基質とともにインキュベーションすることによって検出した。組織セクションをヘマトキシリン及びリチウムカーボネートで対比染色した。
【００９２】
Add1324又はAdHO-1で形質導入した大動脈のクリオスタットセクション（20μm）について、まさに記載のとおりに移植の前にアデノウイルスを介する遺伝子移入後のHO-1の発現を確認し、アデノウイルスを介する遺伝子移入後に、内皮を休止及び活動状態に保つことを可能とする先に記載した技術に従って、10%FCSを含むDMEM中で2日間培養した。Merrick et al.,Transplantation62(8):1085-1089(1996); Merrick et al.,Transplant. Immunol.5:3-9(1997)。大動脈クリオスタットセクション（20μm）を2%パラホルムアルデヒドで固定し(20分、室温）、0.1%トライトンで透過化し、200μlのビオチンと接合した抗-Flag又はウサギ抗-HO-1抗体（BSA1%、ラット血清1%及びtritonX100を含むPBS中で希釈した10μg/ml）とともにインキュベートした（18時間、4℃）。これらの抗体の結合を上記のとおりに検出した。すべての免疫組織学の実験は、ネガティブコントロールとして3G8と関連のないMab又は炎症のメディエーターの検出に使用される種からのコントロール血清を含んだ。
【００９３】
アロ抗体の検出：提供者のLEW.1Wの脾細胞をELW.1A受容者からの熱不活化した血清であって連続的にPBSで希釈したものとともにインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、同時にFITCと結合したロバ抗-ラットIgG抗体（Jackson Laboratories）及びビオチン標識した抗-B細胞Mab（クローンOX33,ECACC）とともにインキュベートした。洗浄後、細胞をフィコエリトリンと結合したストレプトアビジンとともにインキュベートした。アロ抗体の血清レベルを細胞蛍光測定法（FACScalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA）により決定し、血清の各希釈度における平均チャンネル蛍光（MCF)として報告した。ある耐性モデル中に（Cuturi et al.,Eur. J. Immunol.24:1627-31 (1994)）先に記載されたとおり、抗-提供者MHCクラスIIアロ抗体の優越性はアロ抗体のOX33陽性細胞（B細胞）のみへの結合によって検出した。抗-MHCクラスIアロ抗体の存在はOX33陰性（T細胞）及び陽性細胞の標識化に帰する。OX33陰性細胞へのアロ抗体結合のMCFは、抗-MHCIアロ抗体のレベルを示唆した。
【００９４】
統計学：統計的有意性（ｐ＜0.05）はANOVAを用いて評価した。
【００９５】
結果
アデノウイルスを介する遺伝子移入後のHO-1発現及びMC投与後のCO放出：AdHO-1による感染後のHO-1の発現をインキュベートしたラットECs及び大動脈において確認した。抗-HO-1抗体及び抗-Flag抗体でのウエスタンブロットによって検出されたようにAd-HO-1で形質導入したECsは強いHO-1の発現を示したにもかかわらず、未処理のラットECs及びAdd1324で形質導入した細胞は内因性のHO-1発現の低いレベルを示した。Flagペプチドの存在によって、AdHO-1の形質移入に続いて発現されたHO-1は内因性のHO-1よりも高い分子量を有する（33対32kDa）。抗-Flag抗体は、コントロール細胞における非特異的な交差反応にもかかわらず、AdHO-1で形質導入されたECのみにおいて予想分子量のバンドを示した。HO-1の酵素活性（ビリルビンの生成）は、Add1324で形質導入された細胞に比較して、AdHO-1で形質導入された細胞において増強された。
【００９６】
HO-1の発現はAdHO-1で形質導入された大動脈中で抗-HO-1及び抗-Flag抗体を使用して免疫組織学によって確認した。コントロールアデノウイルス処理組織及び抗-Flag抗体中では、HO-1-Flag分子の発現は無かった。先に記載した技術（上記のMerrick et al.）を使用してすべての大動脈断片についての免疫組織学により、内皮によるHO-1発現もまたAdHO-1で形質導入された大動脈中で検出されたが、Add1324-HO-1で形質導入された大動脈中では検出されなかった。HO-1発現は第10日まで移植大動脈中で検出され、第15日には検出されなかった。これらの結果はAdHO-1によって運ばれたHO-1がECs及び大動脈中への遺伝子移入に続いて発現されたことを示唆する。
【００９７】
経口的に投与されたMCの代謝に続くCOの産生を多様な時点においてCOHb血中レベルの分析によって確認した(図11）。MCの投与に続いて、COHbレベル（総Hbの平均±平均値の標準誤差、n=4）は10時間以内に0.8±0.3から10.6±1に上昇し、MC投与の24時間後以内に正常レベルまで低下した。投与前の値に比較して、MCを受容し（500mg/kg、n=5）、4、8、10、12、16、20、24時間において分析された動物は血中重炭酸塩、可溶性CO2、総CO2及びpH値が変化しなかった（データは示さない）。したがって、MCから生成したCO2は有効に炭酸塩システムによって緩衝化され、そして生理的修飾をされずに呼吸によって除かれた。先に出版されたデータ（上記のKirschman and Dhillon et al.）に一致して、MC-処理したマウスは正常の行動、食物消費を示し、特別な全体の剖検の変化を示さなかった。これらの結果は、MC投与の効果がCO2でなく、COデリバリーの結果であることを示す。
【００９８】
遺伝子移入後のHO-1の発現及びCOデリバリーが内膜肥厚を減少させる：内膜の肥厚は慢性的に拒絶された未処理大動脈の及びコントロール-アデノウイルス処理した大動脈において、類似の大きさ及び状況であった（平均±平均の標準誤差；それぞれ、21.2±5.6%、n=4及び21.1±1.2%、n=5）（図12）。異種間移植片中の内膜肥厚（4.8±0.7%、n=4）及び非移植大動脈中の内膜肥厚は類似していた（データは示さない）。内膜肥厚の有意な減少という結果となったAdHO-1を使用した遺伝子移入はまた、MC処理した受容者においても観察された（8.3±4.5%、n=5）。
【００９９】
HES染色した未処理及びコントロール-アデノウイルス処理した大動脈の顕微鏡検査は内膜肥厚が細胞の浸潤及び細胞外マトリックスの沈着の結果であることを明らかにした。慢性的に拒絶された大動脈の中膜は、外膜がその内膜中の細胞外マトリックスの沈着によってひどく浸潤された一方、細胞密度の減少を示した。AdHO-1処理した大動脈の外膜は、MC処理した大動脈からの外膜が中程度の減少を示したにもかかわらず、浸潤細胞の明らかな減少を示した。
【０１００】
これらの結果は、HO-1の遺伝子移入又はHO-1によるヘム分解の1の産物であるCOの投与が慢性的な拒絶による損傷の進展を減少させることを示唆する。
【０１０１】
HO-1の遺伝子移入及びCOデリバリーが内膜の細胞の浸潤を減少させる：異種間移植片の免疫組織学的分析は、内膜又は外膜の白血球浸潤のないことを明らかにした。VSMCsはVSMCs密度の減少を伴わずに中膜に限定されていた（表2）。非コーディングアデノウイルスで処理した同種異形間移植片中では、多数の浸潤性の白血球を内膜及び外膜中に観察した（表2）。浸潤性のCD45+白血球の大部分は、CD68+マクロファージであり、より少ない程度でTリンパ球であった（表2）。T細胞集団はCD8+細胞よりもより多くのCD4+細胞を含んでいた（表2）。VSMCsが均一に中膜内に分布していた異種間の大動脈とは反対に、非コーディングアデノウイルス処理した同種異形間の大動脈は内膜中のVSMCs及び中膜中の数の減少を示した（表2）。
【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
上の表に示されるように、AdHO-1で処理した大動脈は、コントロールのアデノウイルス処理した大動脈に比較して内膜及び外膜中で総CD45+白血球、マクロファージ、T及びCD4+細胞による浸潤の顕著な現象を示した。AdHO-1処理した大動脈は内膜中のVSMCsの減少を示したが、中膜のいくつかの区域はVSMCs密度の減少を示した。
【０１０４】
AdHO-1で形質導入された大動脈において観察された効果に類似して、MC処理を通じたCOのデリバリーが総白血球、マクロファージ、T,及びCD+4細胞による内膜の浸潤を減少させた。しかしながら、この効果はAdHO-1処理した大動脈においてはより少なく表されたように見えた。加えて、CO処理は外膜の白血球浸潤に影響しなかった（表2）。一方、VSMCsに対するCOの効果はAdHO-1で処理した大動脈よりも多く表された。なぜなら、MC処理した受容者からの大動脈中のVSMC分布は、異種間移植された大動脈中のVSMC分布と同一で：VSMCsは内膜中に検出されず、中膜は正常のVSMC密度を示したからである（表2）。
【０１０５】
HO-1の遺伝子移入及びCOデリバリーが活性化マーカー及びサイトカインの発現を減少させる：異種間の大動脈は、内皮上でICAM-1の弱い標識化、B7.2及びMHCクラスII抗原の非標識化、及び中膜及び外膜中のIP10、TGFβ1及びiNOSの低度から中度の標識化を示した（表3）。コントロールのアデノウイルス処理した同種異形間の大動脈では、内膜及び外膜中の多数の細胞がICAM-1、B7.2、及びMHCクラスII抗原の強い発現を示した(表3）。以下の表3に表されるように、IP10、TGFβ1及びiNOSの発現もまた、コントロールのアデノウイルス処理した大動脈の内膜及び外膜中、加えて中膜中で増加した。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
AdHO-1処理した大動脈はICAM−1、B7.2、MHCクラスII抗原を発現する細胞の数を減少させた。コントロールのアデノウイルス処理した大動脈に比較してIP10、TGFβ1、及びiNOSはより弱い強度で発現された（表3）。MC投与を通じたCO処理はICAM-1、B7.2、及びMHCクラスII分子の発現を中程度に減少させた（表3）。TGFβ1及びiNOS発現が中膜又は外膜中で減少せず内膜中で減少したにもかかわらず、IP10発現は中膜及び外膜中で減少したが、内膜中では減少しなかった（表3）。IL-2受容体（CD25)及びIFNγは同種異形間移植片の稀なそして分散した細胞中に検出され、実験群間での差異がなく、異種間移植片中では検出されなかった（データは示さない）。
【０１０８】
結論として、白血球及び炎症性のメディエーターの分析は、CO処理した大動脈がこれらの炎症性のマーカーの内膜中での減少をより少なく表し、外膜中では減少しなかったにもかかわらず、AdHO-1処理した大動脈が内膜及び外膜の炎症の低下を示したことを表す。対照的に、内膜中のVSMCsの減少及び中膜中の増加に対する効果は、CO処理した大動脈中の方がAd-HO処理した大動脈中よりもより多く表された。
【０１０９】
Ad-HO-1の効果は、鉄の除去と同様にAd-HO-1で形質導入されたEC中のビリバルディン及びビリルビンの産生、したがって、EC活性化の阻害、そしてしたがって白血球の接着及び組織の浸潤によって説明されることができる。同時に、Ad-HO-1で形質導入されたECから拡散するCOは近接するEC及びマクロファージに対して作用するだけでなく、VSMCsにも作用し、それらのアポトーシス、増殖、及び活性化を阻害する。Ad-HO-1により仲介されるHO-1の一過性の発現は、移植後の第15日に検出不能であり、これは早期の白血球浸潤相へのより有効な効果、及び後のVSMC増殖に対するより少なく表される効果を説明することができる。対照的に、塩化メチレン治療は実験の間中、継続的に施され、白血球浸潤よりもVSMC増殖をより効果的に阻害した。加えて、COデリバリーはまた、Ad-HO-1遺伝子移入に比較して動脈壁中のCOをより高いレベルで産生することもできる。
【０１１０】
AdHO-1で処理された移植片及びCOデリバリー後の移植片を有する受容者におけるアロ抗体の分析：アロ抗体は2次的リンパ系器官で産生され、CD4依存性のアロ反応性を反映する。アロ抗体はすべてではないが、一定のモデルにおける慢性の拒絶反応の発生に結び付けられてきた（上記のLibby and Pober）。抗-提供者MHCクラスIIアロ抗体の優勢は先に長期の同種異形間移植片の生存と関連して記載された（Cuturi et al.,Eur. J. Immunol.24:1627-31 (1994)）。Ad-HO-1処理された大動脈又はMCの受容者はコントロールのアデノウイルス処理した大動脈の受容者と同じに、提供者のT及びBの両細胞に結合するアロ抗体のプロフィールを示し、抗-MHCクラスIIアロ抗体が優先的に産生されないことを示唆した（データは示さない）。抗-MHCクラスIアロ抗体のレベルはコントロール又はAdHO-1処理した大動脈を移植された受容者、或いはMC投与後にCOに露出されたそれらの者の間で統計学的な差異を示さなかった（図13）。
【０１１１】
アロ抗体レベルがAd-HO-1処理した大動脈又はCO処理した大動脈の受容者において減少しなかったことはいずれのアロ抗体も慢性的な拒絶反応のこのモデルにおいて重要な役割を果たさないこと又はHO-1及びCOがアロ抗体の下流の効果を阻害しうることを示す。これらの結果は、白血球による浸潤及び前炎症性のメディエーターの産生とともにHO-1遺伝子の移入又はCO治療が、主にエフェクターメカニズムに対する局所的な免疫抑制効果を通じて作用することを示唆する。
【０１１２】
上記のデータにより実証されるように、コントロールの非コード性アデノウイルス処理した大動脈に比較して、大動脈の内皮中へのアデノウイルスを介するHO-1遺伝子の移入及びCOデリバリーの両者は、内膜肥厚を顕著に減少させる。Ad-HO-1で形質導入された、又はCO処理された大動脈は、接着分子、同時刺激分子及びサイトカインの発現の減少と同様に、マクロファージ、T細胞及びCD4+細胞数の減少を示し、遺伝子移入はCO処理よりもより多く表された効果を示した。反対に、COは内膜中のVSMC蓄積を阻害し、Ad-HO-1処理よりもより効果的に血管中膜を保存した。Ad-HO-1で得られたと同様に、塩化メチレンを使用するCO治療が、慢性の拒絶反応の阻害を示すという所見に基づいて、上記の結果は、COがHO-1発現の増加に関連した保護効果を仲介し得ることを示唆する。
【０１１３】
実施例6
ラットコラーゲン-関節炎モデルにおける塩化メチレンの治療的効果
コラーゲンにより誘導された関節炎（CIA)は関節リューマチのT細胞依存性動物モデルである。Trentham et al.J. Exp. Med.146:857-68(1977); Brahn et al.,Arthritis and Rheumatism37(6):839-45(1994)。フロイントの不完全アジュバント中のタイプIIコラーゲンで免疫化した2週間以内に、感受性のあるラットはパンヌス形成及び骨／軟骨の侵食という組織学的変化を伴う多発性関節炎を発症する。加えて、関節リューマチと同様に、CIAにおいてもタイプIIコラーゲンに対する体液性の及び細胞性の応答が起こる。結論として、CIAは、炎症性滑膜炎の病因を解明するための、及び潜在的に新しい治療的処置のためのin vivoのシステムとして働く、有用なそして容認された関節リューマチの動物モデルである。
【０１１４】
この疾患モデルにおける一酸化炭素生成性化合物としての塩化メチレンの治療的潜在能力を評価するために、0.1M酢酸に溶解し、フロイントの不完全アジュバントに懸濁した0.5mgの天然ニワトリタイプIIコラーゲンを、120及び150gの間の体重の雌性Lewisラットに皮内注射した。疾患の発症時に（約10日）、動物を3の群に分けた。1の群を日毎にビヒクルで、第2及び第3の群を100mg/kg/日及び500mg/kg/日の塩化メチレン(P.O.)で処理した。疾患の重症度を膨潤及び関節周囲の紅斑の標準化されたレベルに基づく定量法を用いて日毎に評価した。動物を第28日に犠牲にした。図14に図解するように、試験終了時にビヒクル処理された動物中の関節炎スコアは6.8±0.7（平均±標準誤差）、100mg/kg/日で処理された動物で3.8±1.0、そして500mg/kg/日で処理された動物で2.75であった。コントロール動物に比較して、これらの差異は統計学的に有意であった（ｐ＜0.02）。
【０１１５】
X線による骨の侵食のブラインド分析は、塩化メチレン治療の治療的効果を確認した。ビヒクル処理した動物からの肋骨のX線スコアは、4.8±0.7であった。100mg/kg/日での塩化メチレン治療は2.7±0.8のスコア、500mg/kg/日での治療は1.8±0.7のスコアに帰した。この相違は統計学的に有意であった（ｐ＜0.05）。
【０１１６】
実施例7
アテローム形成性アポE-/-マウスにおける頚動脈ワイアー傷害後の新内膜の成長に対する塩化メチレン治療の効果
内皮の損傷に応答した中膜のVSMCsの遊走及び増殖の結果としての新内膜中のVSMCsの蓄積はアテローム性動脈硬化の開始に含まれる主要な事象であると考えられた。先に、ヘムオキシゲナーゼを通じて生成された一酸化炭素がマイトゲンによって誘導された血管平滑筋細胞の増殖を阻害することが示された（上記のTogane et al., Duckers et al.,Nat. Med.7(6):693-98(2001)）。
【０１１７】
塩化メチレンの代謝的分解を通じて生成されるCOの効果を、アテローム形成性マウス頚動脈内膜剥離モデルにおいて研究する。雌性C57BL/6アポE（-/-）マウス（10-12週令、n=12/群）に傷害前1週間及び傷害後の4週間、Westernダイエットを与える。第0日にマウスにケタミン（80mg/kg)及びキシラジン(5mg/kg)を腹腔内注射し、麻酔する。左頚動脈を単離し、2の結紮糸(6-Oシルク）を外部頚動脈の周囲に配置し、また、結紮糸を総頚動脈及び内部頚動脈の周囲にも配置する。遠位の外部頚動脈の結紮糸を結んだ後、頚動脈をVannasシザーで結紮の近位で切開する。湾曲したフレキシブルワイアー（直径0.35mm/0.014インチ）を外部頚動脈内に導入し、総頚動脈壁に沿って回しながら3回通過させる。ワイアーを除去した上で、近位で頚動脈の結紮糸を結び、皮膚を6-Oシルクで再び向かい合わせにする。
【０１１８】
塩化メチレン（25、100、400mg/kg/日）を第-1日に始めて第28日まで腹腔内に又は経口的に投与する。コントロール群をビヒクルで処理する。第28日に動物を犠牲にし、切開した後、左右の総頚動脈、外部及び内部頚動脈を結紮する。胸骨切除後、総頚動脈を大動脈弓まで、解剖する。A-27ゲージニードルを左心室に配置し、リン酸緩衝化パラホルムアルデヒド（100mM、4%重量/容積、pH7.3）による灌流を100mmHgで左心室のカニューレを通じて実施する。続いて、総頚動脈、内部及び外部頚動脈を横切開し、除去する。切片をエタノール及びキシレン中で脱水し、パラフィン中に包埋する。組織セクションを染色し、VSMC増殖を顕微鏡で組織形態計測により、評価する。400、100、及び25mg/kg/日の塩化メチレン治療は新内膜形成をそれぞれ90%、75%、及び30%阻害する。
【０１１９】
本明細書中に示されたすべての出版物及び特許出願は、各出版物又は特許出願が特別に及び個別に参考文献として援用されることを意図されたかのように、本明細書中に参考文献として援用されている。
【０１２０】
本発明はここに完全に記載され、添付された請求項の精神の範囲から離れることなく、当業者によって多くの変更及び改変がそこへなされ得ることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図1A、1B及び1Cは、500ppmのガス状COを伴い、又は伴わずにLPSで処理したマウスにおける血清TNF-α、カルボキシヘモグロビン及びO2Hbレベルのグラフである。
【図２】図2は、LPSにより誘導されたTNF-α産生に対する塩化メチレン投与の効果のグラフである。
【図３】図3は、血中カルボキシヘモグロビンレベルに対する塩化メチレン投与の効果のグラフである。
【図４】図4は、再灌流がそれに続く低温虚血のex vivoラット肝臓モデル中の門脈抵抗に対する外因性のCOの効果のグラフである。
【図５】図5は、再灌流がそれに続く低温虚血のex vivoラット肝臓モデル中の胆汁産生に対する外因性のCOの効果を示すグラフである。
【図６】図6は、再灌流がそれに続く低温虚血のex vivoラット肝臓モデル中の、ミエロペルオキシダーゼアッセイによって測定される好中球活性に対する外因性のCOの効果を示すグラフである。
【図７】図7は、再灌流がそれに続く低温虚血のex vivoラット肝臓モデル中のCOHｂレベルに対する外因性のCOの効果を示すグラフである。
【図８】図8は、L-NAME（誘導可能なNO阻害剤）若しくはLY-83583（ｃGMPアナログ）の添加又はHO-1阻害剤であるZnPPによる前処理の存在下及び非存在下における、再灌流がそれに続く低温虚血のex vivoラット肝臓モデル中の胆汁産生に対する外因性のCOの効果を示すグラフである。
【図９】図9は、p38MAPK阻害剤であるSB203580の添加の存在又は非存在下における、再灌流がそれに続く低温虚血のex vivoラット肝臓モデル中の胆汁産生に対する外因性のCOの効果を示すグラフである。
【図１０】図10は、Ad-CD95+Ad-HO-1（塗りつぶしたバー）及びAD-CD95+AD-β-gal（空白のバー）で形質移入したYac-1及びHela細胞に露出後のFas-担持YAC-1標的細胞に対するin vitroの細胞毒性を示すグラフである。
【図１１】図11は、ラット大動脈モデル中の経口塩化メチレン投与後の全身的なカルボキシヘモグロビン（COHb）レベルについての薬物動態試験を示すグラフである。
【図１２】図12は、コントロール（Addl324）、Ad-HO-1又は塩化メチレンで処理した場合の、移植後第30日おける異種間及び同種異形間移植片中の内膜肥厚のコンピューターを使用した形態計測を示すチャートである。
【図１３】図13は、Ad-HO-1又はCOで処理した大動脈同種異形間移植片の受容者中のアロ抗体レベルを図解するグラフである。
【図１４】図14は、ラットコラーゲン-関節炎モデルにおけるコントロール及びMC処理したラット中の関節炎スコアを示すチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004526739.tif 000079
2004526739.tif 000080
【国際調査報告】
2004526739.tif 000081
2004526739.tif 000082