(57)【要約】高分子量クロレラ多糖および多糖複合体を含有したクロレラ抽出物は、免疫調節、特に免疫刺激活性を示す。その多糖および多糖複合体は、グルコースと、ガラクトース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースのいずれかの組合せ、並びにＮ‐アセチルグルコサミンおよびＮ‐アセチルガラクトサミンを含有している。未会合核酸、リボ核酸およびタンパク質を除去するために、抽出物はプロナーゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびプロテアーゼで処理してもよい。抽出物は特定のグリコシド結合の開裂を行うための処理もうけてよく、その結合はアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼまたはノイラミニダーゼによる開裂に対するそれらの感受性により規定される。クロレラ抽出物は、脾臓細胞の増殖と、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＮＦ‐γおよびＴＮＦ‐αのようなサイトカインの産生を増加させるために、哺乳類へ投与してもよい。それらは予防接種法への補助剤として用いてもよい。
2004505925.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子量クロレラ多糖および多糖複合体を含んでなる抽出物であって、
高分子量多糖および多糖複合体が約１×１０５Ｄａ〜約１×１０７Ｄａであり、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも２２％（ｗ／ｗ）を構成している、上記抽出物。
【請求項２】
高分子量クロレラ多糖および多糖複合体からなる抽出物であって、
高分子量多糖および多糖複合体が約１×１０５Ｄａ〜約１×１０７Ｄａである抽出物。
【請求項３】
高分子量多糖および多糖複合体が約５×１０５Ｄａ〜約５×１０６Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項４】
高分子量多糖および多糖複合体が約１×１０５Ｄａ〜約３×１０５Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項５】
高分子量多糖および多糖複合体が約３×１０５Ｄａ〜約５×１０５Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項６】
高分子量多糖および多糖複合体が約５×１０５Ｄａ〜約６×１０５Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項７】
高分子量多糖および多糖複合体が約６×１０５Ｄａ〜約７×１０５Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項８】
高分子量多糖および多糖複合体が約７×１０５Ｄａ〜約８×１０５Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項９】
高分子量多糖および多糖複合体が約８×１０５Ｄａ〜約９×１０５Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１０】
高分子量多糖および多糖複合体が約９×１０５Ｄａ〜約１×１０６Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１１】
高分子量多糖および多糖複合体が約１×１０６Ｄａ〜約２×１０６Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１２】
高分子量多糖および多糖複合体が約２×１０６Ｄａ〜約３×１０６Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１３】
高分子量多糖および多糖複合体が約３×１０６Ｄａ〜約４×１０６Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１４】
高分子量多糖および多糖複合体が約４×１０６Ｄａ〜約５×１０６Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１５】
高分子量多糖および多糖複合体が約５×１０６Ｄａ〜約７×１０６Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１６】
高分子量多糖および多糖複合体が約７×１０６Ｄａ〜約９×１０６Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１７】
高分子量多糖および多糖複合体が約９×１０６Ｄａ〜約１×１０７Ｄａである、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項１８】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも２３％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項１９】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも２４％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２０】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも２６％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２１】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも２８％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２２】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも３０％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２３】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも３５％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２４】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも４０％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２５】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも４５％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２６】
高分子量多糖および多糖複合体が、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも５０％（ｗ／ｗ）を構成している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２７】
高分子量多糖および多糖複合体が、グルコースと、少くとも、ガラクトース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースからなる群より選択される単糖とを含有している、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２８】
高分子量多糖および多糖複合体がリボースを実質的に含んでいない、請求項２７に記載の抽出物。
【請求項２９】
核酸およびリボ核酸を実質的に含んでいない、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３０】
高分子量多糖および多糖複合体がＮ‐アセチルグルコサミンおよびＮ‐アセチルガラクトサミンも含有している、請求項２７に記載の抽出物。
【請求項３１】
未会合タンパク質を実質的に含んでいない、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３２】
未会合ＤＮＡの消化を行うために十分な条件および時間での処理に際して、免疫調節活性を留めている、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３３】
未会合ＲＮＡの消化を行うために十分な条件および時間での処理に際して、免疫調節活性を留めている、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３４】
未会合タンパク質の消化を行うために十分な条件および時間での処理に際して、免疫調節活性を留めている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３５】
アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼおよびノイラミニダーゼからなる群より選択される少くとも１種のグリコシダーゼでのグリコシド結合の開裂を行うために十分な条件および時間での処理に際して、免疫調節活性を留めている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３６】
（ｉ）３つ以上のα‐１，４‐結合Ｄ‐グルコース単位；
（ｉｉ）α‐１，４‐結合グルコシド；
（ｉｉｉ）α‐１，４‐結合ガラクトシド；または
（ｉｖ）α‐１，４‐結合Ｄ‐グルコース
の開裂を行うために十分な条件および時間での処理に際して、免疫調節活性を留めている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３７】
処理がプロナーゼによる消化である、請求項３１または３２に記載の抽出物。
【請求項３８】
処理がＤＮアーゼまたはプロナーゼによる消化である、請求項３２に記載の抽出物。
【請求項３９】
処理がＲＮアーゼによる消化である、請求項３３に記載の抽出物。
【請求項４０】
高分子量クロレラ多糖および多糖複合体がＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａに由来する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項４１】
製薬上許容される希釈物またはキャリアと一緒に、請求項１〜４０のいずれか一項に記載された抽出物を含んでなる、医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載された抽出物と、炭水化物、脂肪および窒素源からなる群より選択される少くとも１種のエネルギー源とを含んでなる、栄養組成物。
【請求項４３】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載された抽出物と、ビタミンＥ、ビタミンＣおよび葉酸からなる群より選択される慣用的補助剤とを含んでなる、栄養補助物。
【請求項４４】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載された抽出物と、魚油、ｓｐｉｒｕｌｉｎａおよびｅｃｈｉｎａｃｅａからなる群より選択されるニュートラシューティカルとを含んでなる、栄養補助物。
【請求項４５】
免疫調節物として使用向けの指示書と一緒に、請求項１〜４０のいずれか一項に記載された抽出物を活性成分として含有している、商業パッケージ。
【請求項４６】
免疫調節活性を有するクロレラ抽出物を得るための方法であって、
（ａ）クロレラの水性抽出物をサイズ分別し、および
（ｂ）約１×１０５Ｄａ〜約１×１０７Ｄａの高分子量多糖および多糖複合体を含んでなるフラクションを選択する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項４７】
選択されたフラクションをプールおよび濃縮するステップを更に含んでいる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
サイズ分別ステップがクロマトグラフィーまたは限外濾過を含んでなる、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４６〜４８のいずれか一項に記載された方法から得られた抽出物。
【請求項５０】
哺乳類の免疫応答を調節するための方法であって、
請求項１〜４０および４９のいずれか一項に記載された抽出物の有効量を哺乳類へ投与することからなる上記方法。
【請求項５１】
調節が脾臓細胞の増殖増加を含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
調節がサイトカインの産生増加を含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
サイトカインが、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＮＦ‐γおよびＴＮＦ‐αからなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ワクチンに対する免疫応答を哺乳類で補うための方法であって、
予防接種される哺乳類へ請求項１〜４０および４９のいずれか一項に記載された抽出物の有効量を投与することからなる上記方法。
【請求項５５】
ワクチンがインフルエンザワクチンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
哺乳類で細菌感染を予防または治療するための方法であって、
請求項１〜４０および４９のいずれか一項に記載された抽出物の有効量を哺乳類へ投与することからなる上記方法。
【請求項５７】
哺乳類で真菌感染を予防または治療するための方法であって、
請求項１〜４０および４９のいずれか一項に記載された抽出物の有効量を哺乳類へ投与することからなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、免疫調節物向けのクロレラ抽出物に関する。
【０００２】
【発明の背景】
クロレラは、日光からエネルギーを得る超栄養素と称されている単細胞緑藻類である。この食用微小藻類で判明した有益な特性には、創傷治癒、解毒、便秘の軽減および成長促進がある。いくつかの研究でも、クロレラがインビトロおよびインビボの双方で免疫系に有益な効果を有することを示した。
【０００３】
クロレラは淡水および海洋水の双方で生じる。クロレラ属の種類は、生理学的および生化学的性質で著しい多様性を示す（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｅ．”Ｐｈｙｃｏｔａｌｋ”１９８９，１：１４１−１５３，Ｖ．Ｒａｓｔｏｇｉ Ｐｕｂｌ．，Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）。クロレラは小さなセルロースおよび他の不消化性細胞壁物質を産生し、そのため可能な新食物源、特に原材料として詳しく研究された（Ｌｅｅ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．”Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ”２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，ｐａｇｅ ２８１，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【０００４】
クロレラは、あらゆる公知植物の中で最高のクロロフィル分を有している。それはビタミン、ミネラル、食物繊維、核酸、アミノ酸、酵素なども含有している。それは９％以上の脂肪を含有している（そのうち、多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は約８２％である）。ビタミン分は、プロビタミンＡ、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、ナイアシン、Ｂ１２、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＫ、パントテン酸、葉酸、コリン、リポ酸、イノシトール、ＰＡＢＡなどからなる。存在するミネラルの中で、最も重要なものはＰ、Ｋ、Ｍｇ、Ｓ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｍｎ、Ｃｕ、ＺｎおよびＣｏである。クロレラ細胞の主成分は、約６０％のタンパク質（すべての基本アミノ酸から構成されている）および２０％の炭水化物である。
【０００５】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａの水性抽出物は、その栄養分と他の健康効果のために用いられてきた。改善された免疫系の機能および有害毒素の解毒を含めた多くの健康効果について、研究は報告している。それは、より消化性にする新規な技術プロセスが開発された１９７７年にＵＳＡで健康食品として売り出され、日本では数年間にわたり最大の売上高を上げた健康補助食品であった。Ｔａｉｗａｎ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ社は世界最大のクロレラ供給業者であり、アジア、ヨーロッパおよび北アメリカへと世界中へ製品を次のブランド名で販売している：Ａｌｇａｅ、Ｂｉｏ−ＲＥＵ−ＲＥＬＬＡ、Ｇｒｅｅｎ Ｇｅｍ、Ｇｒｅｅｎ Ｂｏｏｓｔ、Ｇｒｅｅｎ Ｎａｔｕｒｅ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｏｗｅｒ、Ｊｏｙａｕ ＶｅｒｔおよびＮａｔｕｒａｌ Ｂｏｏｓｔ
【０００６】
いくつかの研究が、抗腫瘍活性とＬｉｓｔｅｒｉａおよびＥ．ｃｏｌｉに対する活性とを有するＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ抽出物について発表した（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．，１９９０，１２（２）：２７７−２９１；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９８，４５（６）：３１３−３２０；Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９０，１２（８）：８８３−８９１）。これらの活性は、腫瘍または病原体に対する直接毒性というよりも、むしろ免疫媒介性であるらしい。
【０００７】
Ｓｗｉｓｓ ＨｅｒｂａｌおよびＮａｔｕｒｅ’ｓ Ｗａｙの製品を含めて、いくつかのクロレラ抽出物が市販されている。Ｓｗｉｓｓ Ｈｅｒｂａｌ製品は、タンパク質６１％、炭水化物２１．１％、脂肪１１．０％、クロロフィル２．８６６％、ＲＮＡ２．９４％およびＤＮＡ０．２８％を含有した純粋クロレラ破壊細胞として同定される。
【０００８】
本分野に関連した他の文献として、以下がある：
日本特許出願公開昭５８‐１５９２０は、免疫賦活および抗腫瘍活性を有する淡水クロレラからの多糖類を開示している。
【０００９】
Ｎｅｖｅｕ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，１９７８，３４（１２）：１６４４−１６４５は、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａが免疫応答調節物であることを開示している。
【００１０】
Ｖｅｒｍｅｉｌ ａｎｄ Ｍｏｒｉｎ ＣＲ Ｓｅａｎｃｅｓ Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｆｉｌ．，１９７６，１７０（３）：６４６−６４９は、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａが、おそらくその細胞壁の性質により、肉腫移植からマウスを防御することを開示している。
【００１１】
Ｍｉｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，２４（２−３）：１３５−１４６は、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ細胞または抽出物が抗腫瘍応答の宿主免疫増強を媒介することを開示している。
【００１２】
Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９８２，３０（９）：１０４１−１０４６およびＫｏｍｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９８６，３４：３０２−３０７は、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａからの酸性多糖Ｃｈｌｏｎ Ａが免疫増強および抗腫瘍効果を有することを開示している。Ｃｈｌｏｎ Ａは、ラムノース、アラビノース、グルコース、ガラクトースおよびグルクロン酸を含有している。
【００１３】
Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｂａｒｂｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９７２，２６４：１１７−１２８は、主にラムノースと、アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノースおよびグルクロン酸を含有した、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａからの８８ｋＤａ酸性多糖について開示している。
【００１４】
ＵＳ特許４，５３３，５４８は、主にラムノースと、アラビノース、ガラクトース、グルコースおよびグルクロン酸を含有した、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａからの酸性多糖ＣＨ‐１について開示している。その多糖はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５によるゲル濾過で得られた。
【００１５】
ＵＳ特許４，８３１，０２０は、免疫刺激および抗腫瘍活性を有した、海洋クロレラのＣ．ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａからの多糖抽出物について開示している。この特許は、海洋クロレラ種からの多糖が淡水クロレラ種のものよりも免疫を活性化する上で効果的である、と述べている。その多糖抽出物はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０によるゲル濾過で得られた。
【００１６】
ＵＳ特許４，７８６，４９６は、免疫賦活活性を有する海洋クロレラの脂質および糖脂質フラクションについて開示している。
【００１７】
Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒｅｔｉｃ．Ｓｏｃ．，１９７３，１４：１９２−２０８は、クロレラからの１２５０〜１４００Ｄａ細網内皮系（ＲＥＳ）‐活性グリカンについて開示している。
【００１８】
ＵＳ特許３，４６２，４１２は、クロレラからＲＥＳ刺激抽出物を調製するための方法について開示している。
【００１９】
日本特許出願公告０６２４８００３は、抗新生物活性を有した、主にガラクトースを含有する多糖類からなる、１５〜２５ｋＤａのクロレラ抽出物について開示している。
【００２０】
Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｕｌｌ．Ｆａｃ．Ａｇｒ．Ｓｈｉｚｕｏｋａ Ｕｎｉｖ．（静岡大学農学部研究報告），１９８０，３０：５１−５９は、双方とも見かけ上低分子量の、クロレラからの天然グリカン類の２つのフラクションについて開示している。
【００２１】
Ｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｐｒｏｃ．Ｇｉｆｕ Ｐｈａｒｍ．Ｕｎｉｖ．（岐阜薬科大学），１９９０，３９：４４−４８は、ＲＥＳ刺激活性を有する、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａからの２種の多糖、ＣＰ‐ＩおよびＣＰ‐ＩＩについて開示している。ＣＰ‐Ｉはグルコース、フコース、ラムノース、ガラクトースおよびマンノースからなる；ＣＰ‐ＩＩはグルコース、ガラクトース、ラムノースおよびマンノースからなる。
【００２２】
Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９８２，２９（３−４）：２４１−２５２は、クロレラを含めた５藻類種の多糖、エタノール沈澱フラクションが主にグルコース、マンノース、リボース／キシロース、ラムノースおよびフコースを含有していることを開示している。
【００２３】
【発明の要旨】
本発明に従い調製されたクロレラ抽出物は、薬理および臨床試験で免疫刺激活性を示す。一面において、本発明により提供される抽出物は、従来に調製および使用された抽出物よりも高い免疫刺激活性を有している。
【００２４】
一面において、本発明は高分子量クロレラ多糖および多糖複合体を含んでなる調製物を提供する。その高分子量多糖および多糖複合体は約１×１０５Ｄａ〜約１×１０７Ｄａであり、抽出物の全クロレラ由来分のうち少くとも２２％（ｗ／ｗ）を占めている。好ましい態様において、その抽出物はＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａに由来する。
【００２５】
その高分子量多糖および多糖複合体は、選択された範囲、例えば約１×１０５Ｄａ〜約３×１０５Ｄａ、約３×１０５Ｄａ〜約５×１０５Ｄａ、約５×１０５Ｄａ〜約６×１０５Ｄａ、約６×１０５Ｄａ〜約７×１０５Ｄａ、約７×１０５Ｄａ〜約８×１０５Ｄａ、約８×１０５Ｄａ〜約９×１０５Ｄａ、約９×１０５Ｄａ〜約１×１０６Ｄａ、約１×１０６Ｄａ〜約２×１０６Ｄａ、約２×１０６Ｄａ〜約３×１０６Ｄａ、約３×１０６Ｄａ〜約４×１０６Ｄａ、約４×１０６Ｄａ〜約５×１０６Ｄａ、約５×１０６Ｄａ〜約７×１０６Ｄａ、約７×１０６Ｄａ〜約９×１０６Ｄａおよび約９×１０６Ｄａ〜約１×１０７Ｄａのものでありうる。
【００２６】
抽出物は、抽出物の全クロレラ由来分のフラクションとして、様々な異なる割合で多糖および多糖複合体を含有してよい。その割合は、少くとも２４％（ｗ／ｗ）、少くとも２６％（ｗ／ｗ）、少くとも２８％（ｗ／ｗ）、少くとも３０％（ｗ／ｗ）、少くとも３５％（ｗ／ｗ）、少くとも４０％（ｗ／ｗ）、少くとも４５％（ｗ／ｗ）、少くとも５０％（ｗ／ｗ）または少くとも６０％（ｗ／ｗ）でありうる。
【００２７】
もう１つの面において、高分子量多糖および多糖複合体は、グルコースと、ガラクトース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースのいずれかの組合せとを含有している。
【００２８】
もう１つの面において、高分子量多糖および多糖複合体はリボース、核酸、リボ核酸および未会合タンパク質を実質的に含まない。高分子量多糖および多糖複合体は、Ｎ‐アセチルグルコサミンおよびＮ‐アセチルガラクトサミンも含有してよい。
【００２９】
もう１つの面において、本発明の抽出物は、未会合ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を除去するための処理に際して、免疫調節活性を留めている。このような処理には、プロナーゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびプロテアーゼによる消化がある。
【００３０】
もう１つの面において、本発明の抽出物は、特定のグリコシド結合の開裂を行うための処理に際して、免疫調節活性を留めており、その結合はアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼまたはノイラミニダーゼによる開裂に対するそれらの感受性で規定される。このような感受性結合は、典型的には：
（ｉ）３つ以上のα‐１，４‐結合Ｄ‐グルコース単位；
（ｉｉ）α‐１，４‐結合グルコシド；
（ｉｉｉ）α‐１，４‐結合ガラクトシド；または
（ｉｖ）α‐１，４‐結合Ｄ‐グルコースである。
【００３１】
本発明は、炭水化物、脂肪または窒素である少くとも１種のエネルギー源と一緒に、高分子量クロレラ抽出物を含有した、栄養組成物も提供する。
本発明の抽出物は、ビタミンＥ、ビタミンＣおよび葉酸のような慣用的補助剤との組合せまたは混合物として用いてもよい。その抽出物は、魚油、ｓｐｉｒｕｌｉｎａおよびｅｃｈｉｎａｃｅａのような他のニュートラシューティカル（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）、特に免疫刺激活性を有するニュートラシューティカルと一緒に用いてもよい。
【００３２】
本発明は、免疫調節活性を有したクロレラ調製物を得るための方法も提供する。その方法は：
（ａ）クロレラの水性抽出物をサイズ分別し、および
（ｂ）約１×１０５Ｄａ〜約１×１０７Ｄａの高分子量多糖および多糖複合体を含んでなるフラクションを選択する、
ステップを含んでなる。
【００３３】
クロレラ抽出物を得るための方法には、選択されたフラクションをプールおよび濃縮するステップを更に含んでもよい。サイズ分別はクロマトグラフィー、限外濾過または超遠心により行える。
【００３４】
本発明は、有効量の高分子量クロレラ抽出物を哺乳類へ投与することによる、ヒトを含めた哺乳類の免疫応答を調節するための方法も提供する。このような調節は、脾臓細胞の増殖増加と、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＮＦ‐γおよびＴＮＦ‐αのようなサイトカインの産生増加があり、細菌または真菌感染を治療または予防する上で有利に用いられる。
【００３５】
その抽出物は、免疫応答を更に刺激するために予防接種法への補助剤として、更に投与してもよい。インフルエンザワクチンもその抽出物と有利に併用しうる。抽出物は、ワクチンへのアジュバント、特に経口ワクチンアジュバントとして存在してもよい。
【００３６】
【発明の具体的な説明】
本発明は、ヒトを含めた哺乳類の免疫防御メカニズムを高めるための方法に関する。免疫防御は、分子量１×１０５Ｄａ〜１×１０７Ｄａのクロレラ由来抽出物の形で、クロレラ由来免疫調節物の投与により高められる。
【００３７】
Ａ．クロレラ
本発明で用いられるクロレラ属の種類には次のものがある：特にｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ、ｍａｒｉｎａ、ｓａｌｉｎａ、ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、ｖｕｌｇａｒｉｓ、ａｎｉｔｒａｔａ、ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、ｒｅｇｕｌａｒｉｓ（Ｗｏｒｌｄ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ａｌｇａｅ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ ５８−７４，Ｍｉｙａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ），１９８９，Ｊａｐａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ参照；その内容は参考のためここに組み込まれる）。
【００３８】
例えば光照射（例えば、紫外線、Ｘ線）、化学変異誘発物質または部位特異的変異誘発で人工的にまたは自然に発生したクロレラの変異株も、本発明の範囲内に属する。一態様において、Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａおよびその変異株が好ましい。別な態様では、Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａおよびその変異株が好ましい。クロレラの培養は、適切な培地および培養条件を用いて、当業界で公知の方法により行われる（例えば、Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｂａｒｂｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９７２，２６４：１１７−１２８参照）。多糖産生は生理および代謝操作により影響をうけることがある。増殖培地の組成は増殖速度に影響を与えて、細胞壁厚に変化をもたらす。増殖に関与する遺伝子はアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされうる。真核藻類を形質転換させるために用いられる方法については、例えばＵＳ特許６，０２７，９００参照；藻類変異株を選択するための方法については、例えばＵＳ特許５，８７１，９５２参照。こうして、様々な条件下での選択により、クロレラからのバイオポリマー免疫調節物の変異株を作製してよい。
【００３９】
Ｂ．クロレラ抽出物およびそれらの調製
（ａ）粗製抽出物の調製：
クロレラの粗製水性抽出物は、培養細胞または噴霧乾燥細胞の熱水抽出（ＵＳ４，８３１，０２０およびＵＳ５，７８０，０９６）および溶媒抽出法（Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｂａｒｂｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９７２，２６４：１１７−１２８；ＵＳ３，４６２，４１２）を含めた、当業界で公知の方法により調製される。粗製抽出物はＴａｉｗａｎ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ社（ｗｗｗ．ｔａｉｗａｎｃｈｌｏｒｅｌｌａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ−３．ｈｔｍ）から得られる。
【００４０】
一態様において、粗製抽出物は平均水分０．３％の噴霧乾燥クロレラ細胞から調製される（５ｍｍの真空度で１６時間にわたり噴霧乾燥物質を乾燥した後で、水分が調べられた）。粗製抽出物は、穏やかに攪拌しながら、水性媒体、好ましくは、水または、酢酸、アスコルビン酸、安息香酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、プロピオン酸、ソルビン酸、コハク酸などのような有機酸、好ましくは安息香酸の弱溶液で細胞を処理することにより調製される。抽出プロセスは０〜１００℃、好ましくは５０〜９０℃にわたる様々な温度で行える。クロマトグラフィープロファイルと関連した収率および免疫活性によると、８０℃で１時間がこのステップを効率的に行う上で適切な時間および温度の組合せであることを示している。
【００４１】
残留細胞および細胞残渣が１５０〜１０，０００ｇ、好ましくは４０００〜１０，０００ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）で遠心により分離された。このステップを終了させるために必要な時間は遠心力と関連している；１０，０００ｇのときは２０分間で十分である。次いで上澄が精密濾過された。一方、濾過も全細胞および残渣を除去するために用いてよく、その場合には粗目から始まり、中度を経て、精密濾過で終わる、一連のフィルターの使用が必要である。クロスフロー濾過または振動膜テクノロジーが汚れを減らす上で勧められる。濾過は、抽出に要する温度および時間の影響を特にうけやすい。したがって、遠心が好ましい手段である。
【００４２】
遠心または濾過後に、上澄（または濾液）は乾燥形でＩＢＰ‐１産物を得るために乾燥させてもよい。乾燥は凍結乾燥、冷気流により、または好ましくは噴霧乾燥により行われた。一方、抽出物の容量を最初に（１０〜５０％、好ましくは２０％まで）減少させてから、活性物質を適切な沈澱剤、好ましくはエタノールまたは硫酸アンモニウムで溶液から沈澱させてもよい。
【００４３】
ＩＢＰ‐１が塩および低分子質量産物から遊離された。様々な水性媒体（例えば、希アルコール、様々な緩衝液、希酢酸など）が用いうるが、水が透析向けに十分な媒体であるとわかった。このステップは抽出物質の質量を約５０％まで減少させ、その特異的免疫活性（脾臓細胞の刺激に及ぼす効果により判断、下記参照）を約２５％増加させた。透析は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ６または相当物のようなゲル濾過媒体で脱塩することにより代用しうる。同様に、相当分子量カットオフの相当限外濾過膜も用いうる。脱塩ステップ後に、物質（ＩＢＰ‐２）もＩＢＰ‐１について記載された方法を用いて乾燥させてよい。
【００４４】
（ｂ）抽出物のサイズ分別：
クロレラ抽出物のサイズ分別は、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降分析、例えば勾配遠心、および限外濾過を含めた、当業界でいずれか公知の方法により行える。
【００４５】
ＩＢＰ‐１またはＩＢＰ‐２は、１００〜１０，０００ｋＤａにわたる対象の免疫調節フラクションの平均分子質量を有した、多糖および多糖複合体の混合物である。多糖複合体とは、有意の免疫活性をそれ自体では有しない非多糖バイオポリマーと非共有結合した多糖である。非多糖バイオポリマーには、抽出物の累積分子量に関与するが、有意の免疫活性を有しないＤＮＡおよびタンパク質がある。
【００４６】
様々な態様において、高分子量多糖および多糖複合体は、約１×１０５Ｄａ〜約１×１０５Ｄａ、約３×１０５Ｄａ〜約５×１０５Ｄａ、約５×１０５Ｄａ〜約６×１０５Ｄａ、約６×１０５Ｄａ〜約７×１０５Ｄａ、約７×１０５Ｄａ〜約８×１０５Ｄａ、約８×１０５Ｄａ〜約９×１０５Ｄａ、約９×１０５Ｄａ〜約１×１０６Ｄａ、約１×１０６Ｄａ〜約２×１０６Ｄａ、約２×１０６Ｄａ〜約３×１０６Ｄａ、約３×１０６Ｄａ〜約４×１０６Ｄａ、約４×１０６Ｄａ〜約５×１０６Ｄａ、約５×１０６Ｄａ〜約７×１０６Ｄａ、約７×１０６Ｄａ〜約９×１０６Ｄａおよび約９×１０６Ｄａ〜約１×１０７Ｄａである。
【００４７】
上記のフラクションを得るためのサイズ分別は、分子ふるいの原理に基づいている。典型的には、サイズ排除クロマトグラフィー技術および限外濾過法が用いられる。サイズ排除クロマトグラフィーの基本原理は当業者に周知であり、”Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｉｇｈｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｒａｈｈｍｓ Ｉ Ｌｕｎｄ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ”で説明されている。特定範囲を分別するために適したカラム、例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ １００ ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ２００ ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ３００ ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ４００ ＨＲおよびＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ５００ ＨＲまたはそれらの相当物が、上記フラクションを分離する上で、容易に選択および有効に使用しうる。同様の方式で、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ媒体またはそれらの相当物、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、４Ｂ、２Ｂも用いうる。
【００４８】
多糖またはタンパク質との多糖複合体の精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどを含めた他のクロマトグラフィー技術と組み合わせて行える。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたＩＢＰ‐２（ＩＢＰ‐２をＭＷＣＯ＞１ＭＤａの限外濾過膜へ通過させた後の貯留物）クロマトグラフィーの例は、図１６および１７で示されている。図は、ＩＢＰ‐２が限外濾過膜を通過した後におけるタンパク質分の有意な減少を証明している。
【００４９】
サンプルの限外濾過は、適切な分子質量カットオフの分子膜を用いて行える。分別を行うために用いられる具体的な膜および操作は、
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｋｕ．ｆｉ／ｌａｉｔｏｋｓｅｔ／ａｎａｔ／ＰＧ／ｃ−ｍｅｔｈｏｄ．ｈｔｍ．
で略記されているように、当業者に広く利用されている。
【００５０】
一態様において、これらの物質を特徴化および定量するために用いられる方法は、組合せサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）／マルチアングルレーザー光散乱（ＭＡＬＳ）／屈折率検出（ＲＩ）に基づいている。そのハイブリッド技術（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ／ＲＩ）では、Ｔｏｓｏｈａａｓ ＧＭＰＷＸＬ ＳＥＣカラムを用いた無勾配ＨＰＬＣ実験が分子サイズに従い混合物を分離するために用いられる。オンラインＭＡＬＳが溶出バイオポリマーの平均分子量分布を決定し、こうして分析に具体性をもたらしている。ＲＩ検出は、定量のため、並びに、ＭＡＬＳデータを処理する上で必要な溶出プロファイルをもたらすための双方に用いられる。
【００５１】
典型的な抽出物に関して得られるＳＥＣクロマトグラムの例は、図１で示されている。上のトレースはＲＩ検出器を用いて記録されたクロマトグラムであり、下のトレースは検出器の１つ（９０度）におけるＭＡＬＳ応答である。ＭＡＬＳピークは、上のトレースからみられるように、全抽出物のうち小さな割合に事実上相当する高分子質量成分で最大である。そのため、分子量範囲は数ＫＤａ〜約１０ＫＤａにわたるが、全抽出物の重量平均分子量（ＭＷ）は約９０ｋＤａとわかる。これはＩＢＰ‐１の累積分子量プロファイルから最もはっきりとわかる（図２）。
【００５２】
ＩＢＰ‐１またはＩＢＰ‐２は、適切なクロマトグラフィーまたは限外濾過技術を用いて更に分別しうる。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ １０００ ＳＦのような広分別範囲のサイズ排除クロマトグラフィーマトリックスが抽出物を２つのピークへ分離した：第一は空隙容量直後に溶出した；その平均分子質量はＭＡＬＳで測定すると平均１０００ＫＤａである；第二のピークは第一のピーク直後に溶出した。第一のピークを表わす混合フラクションは脱塩され、ＩＢＰ‐１の場合と同様に乾燥されて、ＩＢＰ‐３を生じた。この物質は第二のピーク（ＩＢＰ‐４）と比較してその免疫活性が優れていた。水性媒体、好ましくは０．１５Ｍ ＮａＣｌがこのクロマトグラフィー操作で用いられた。ＩＢＰ‐１はＩＢＰ‐２より高い免疫活性を示したが、その差異は有意でなかった。分子質量が約５００ＫＤａへ達したときに、（質量に応じて徐々に増加する）免疫刺激活性への寄与が横ばいになりはじめる。
【００５３】
ＩＢＰ‐４は、適切なクロマトグラフィーまたは限外濾過技術を用いて更に分別しうる。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）およびＳＥＣの双方が、ＩＢＰ‐４の更なる分離に有用であるとわかった。適切な分別範囲のＳＥＣマトリックス、例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ３００が用いうる。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ３００ ＨＲはＩＢＰ‐１またはＩＢＰ‐２を２つのピークに分離した（図４）。第一のピークはカラムの空隙容量のまさに最後のフラクションで溶出しはじめた。溶出バイオポリマーの大部分は、１００〜５００ＫＤａ範囲の分子質量を示した。第一のピークを表わす混合フラクションは脱塩され、ＩＢＰ‐１の場合と同様に乾燥されて、ＩＢＰ‐５を生じた。この物質は、第一のピークがベースラインへ達した直後に溶出した第二のピーク（ＩＢＰ‐６）と比較して、その免疫活性が優れていた（図５）。ＩＢＰ‐５は典型的には両ピークの混合質量の３０％のみに相当した。水性媒体、好ましくは直線ＮａＣｌ勾配のｐＨ４．５緩衝液、０．１Ｍ酢酸が、このクロマトグラフィー操作で用いられた。ＩＢＰ‐５とＩＢＰ‐６との免疫活性に関する差異は、ＩＢＰ‐３とＩＢＰ‐４との場合よりも高かった；典型的には、増殖脾臓細胞中への３Ｈ‐取込みレベルにより測定したところ、ＣＰＭＩＢＰ‐３対ＣＰＭＩＢＰ‐４の比率は５：２であった。そのプロセスは約５００ＫＤａの分子質量カットオフを有する限外濾過膜の使用により、ある程度まで簡素化しうる。例えば、Ｏｍｅｇａ ＺＭ ５００膜がうまく用いうる。
【００５４】
ＩＢＰ‐６は、適切なクロマトグラフィーまたは限外濾過技術を用いて、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ １００、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ７５もしくは類似媒体または相当限外濾過膜のようなクロマトグラフィーマトリックスを用いて更に分別しうる。しかしながら、ＩＢＰ‐６に存する特異的免疫活性はＩＢＰ‐３およびＩＢＰ‐５の場合より有意に弱く、そのため主要な対象ではなかった。しかしながら、低免疫活性を有する大部分の低分子量物質（ＩＢＰ‐８）をＩＢＰ‐２から除去するために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ １００が効率的に用いうる（図６）。典型的には、ＣＰＭＩＢＰ‐７対ＣＰＭＩＢＰ‐８の比率は１０：１であった（ＩＢＰ‐７は高分子質量および免疫活性フラクションである）。この精製ステップはＹＭ‐１００限外濾過膜でも同様にうまく行える。
【００５５】
クロレラの粗製抽出物は、約６１％のタンパク質および２１％の炭水化物を含有している。本発明によるクロレラのプロセッシングは高割合の多糖および多糖複合体をもたらし、即ち、本発明の抽出物は、クロレラ由来の全物質に対して、破壊細胞からの粗製抽出物と比べ高割合の多糖および多糖複合体を有している。クロレラに無関係の物質もクロレラ抽出物へ加えてよく、このような抽出物も本発明の範囲内に属するものと理解されている。
【００５６】
本発明の抽出物中における多糖および多糖複合体の割合は、抽出物の全クロレラ由来分として少くとも２３％（ｗ／ｗ）である。様々な態様において、その割合は少くとも２４％（ｗ／ｗ）、少くとも２６％（ｗ／ｗ）、少くとも２８％（ｗ／ｗ）、少くとも３０％（ｗ／ｗ）、少くとも３５％（ｗ／ｗ）、少くとも４０％（ｗ／ｗ）、少くとも４５％（ｗ／ｗ）、少くとも５０％（ｗ／ｗ）または少くとも６０％（ｗ／ｗ）である。
【００５７】
高分子量多糖および多糖複合体は、非多糖成分の除去により、上記の様々な割合へ更に精製および単離してよい。このような非多糖成分には、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび未会合タンパク質がある（未会合タンパク質とは、多糖複合体で多糖と会合していないタンパク質として、本出願の目的から定義される）。
【００５８】
１つの除去方法は、下記例（例７）で記載されているように、非多糖成分を開裂するために消化酵素、次いで開裂産物を除去するためにサイズ分別を用いることである。消化酵素には、当業界で周知であり、様々なテキストで記載されているような、プロナーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼおよびプロテアーゼがあり、その一例はＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋである。未会合タンパク質の消化に有用なプロテアーゼには、エンド‐およびエキソペプチダーゼ、プロナーゼ、セリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシンおよびズブチリシン、チオールプロテアーゼ、例えばパパイン、およびカルシウム要求プロテアーゼ、例えばサーモリシンがある。
【００５９】
一方、非多糖成分は、アフィニティークロマトグラフィー、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ結合マトリックスの使用により除去してもよい（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。もう１つのオプションは、レクチンのような多糖結合マトリックスの使用により混入成分を除いて、多糖および多糖複合体を精製することである。別な態様では、本発明の抽出物は：
（ｉ）３つ以上のα‐１，４‐結合Ｄ‐グルコース単位；
（ｉｉ）α‐１，４‐結合グルコシド；
（ｉｉｉ）α‐１，４‐結合ガラクトシド；または
（ｉｖ）α‐１，４‐結合Ｄ‐グルコース
の開裂を行うために十分な条件および時間で、グリコシド酵素により処理してもよい。
このようなグリコシド結合の開裂に有用なグリコシド酵素の例には、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼおよびノイラミニダーゼがある。
【００６０】
Ｃ．抽出物の特徴化
本発明のクロレラ抽出物の炭水化物組成、ＤＮＡ分およびアミノ酸組成は、当業界で公知のいずれか適切な方法により調べられる。
【００６１】
本発明の抽出物の免疫活性は、グリコシド結合でつながれた単糖からなる高分子として定義される、高分子量クロレラ多糖に伴う。その多糖は遊離多糖または複合多糖（即ち、有意の免疫活性をそれ自体では有しない非多糖バイオポリマーと非共有結合した多糖）の形で抽出物中に存在する。一態様において、その抽出物のタンパク質分は約２０〜５０％、好ましくは２０〜３０％である。この割合のタンパク質のうち、約４０〜６０％が多糖と会合している。
【００６２】
非多糖バイオポリマーには、抽出物の累積分子量に関与するが、有意の免疫活性を有しない、ＤＮＡ、タンパク質、および可能であればＲＮＡがある。未会合ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質、即ち多糖と複合化していないものは、抽出物の免疫活性に有意には寄与していない。本出願の目的にとり、未会合ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質とは、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）とセリンおよびチオール類の共通のプロテアーゼによる開裂をうけやすいＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質として、機能面から定義される。本発明の抽出物は、このように、未会合ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質を本質的に含まないもの、または実質的に含まないものでもよい。“本質的に含まない”とは、５％未満の未会合ＤＮＡまたはＲＮＡ、および１５％未満の未会合タンパク質を意味する。“実質的に含まない”とは、２％未満の未会合ＤＮＡまたはＲＮＡ、および１０％未満の未会合タンパク質を意味する。
【００６３】
複合体の非多糖バイオポリマーは、免疫調節物として多糖を有効に機能させる、ある立体または極性要件を満たすことから、非多糖バイオポリマー自体は免疫活性を欠いても、それらと多糖との会合は多糖の免疫活性に寄与しうると理解されている。
【００６４】
本発明の抽出物は、免疫活性の有意な損失なしに、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼおよびノイラミニダーゼで消化しうる。そのため、免疫活性は、実質量で３つ以上のα‐１，４‐結合Ｄ‐グルコース単位；α‐１，４‐結合グルコシド；α‐１，４‐結合ガラクトシド；またはα‐１，４‐結合Ｄ‐グルコースを含有していない多糖またはそれらの複合体にも、見かけ上存する。しかしながら、上記のグリコシド結合が酵素消化をうけにくいならば、免疫調節性多糖はこのような結合を含んでもよいと理解されている。
【００６５】
Ｄ．抽出物の使用
生物応答改変物（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）とは、様々な治療効果をもたらす免疫系の刺激により、宿主の生物応答を変えるものとして定義されている。この種類に属する物質のカテゴリーの１つが免疫調節物である。ここで用いられている“免疫調節物”という用語は、免疫応答を調節しうるものに関する。本発明の関係において、このような調節は宿主の免疫防御メカニズムの増強である。
【００６６】
クロレラ抽出物は、主にＢ細胞およびマクロファージ刺激物であると思われている。Ｂ細胞免疫調節物の１効果は、それらが抗原に対する抗体応答に障害のあるヒトで免疫機能を刺激しうることである。しかも、Ｂ細胞刺激物は、新たに感染したとき、抗体免疫応答の迅速性を増す。クロレラ抽出物は、予防健康処置向けに安全、有効でコスト効率の良い代替物を提供する。
【００６７】
インビトロ研究では、クロレラ抽出物がＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞の増殖と、ＩＬ‐６およびＮＯ２のマクロファージ産生を刺激することを証明した。クロレラ抽出物はインビボでも試験したところ、真菌Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのみならず、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる感染も有意に減らすことがわかった（例８〜１３参照）。
【００６８】
３回にわたる一連の毒性試験がクロレラ抽出物で行われた。クロレラ抽出物投与の無効は、ラットで２８日間にわたる経口毒性研究から明らかであった。ラットの急性経口毒性で、１回経口投与後における製品の最大非致死または最少致死用量を調べてみると、粗製クロレラ抽出物の最少致死用量が２０００ｍｇ／ｋｇ体重を超えることが研究からわかった。細菌変異アッセイでは、クロレラ抽出物が試験条件下でいかなる変異誘発活性も示さないことを示した。
【００６９】
最近終了したランダム二重盲検プラセボコントロール研究では、クロレラ抽出物が、プラセボ対照と比較して、インフルエンザワクチンを接種された健康な成人で有意な免疫刺激効果を示すことがわかった（例１４参照）。
ヒト血液細胞のインビトロ実験では、マウスモデルでみられる場合と類似したインターロイキン産生の刺激を示す。
【００７０】
本発明のクロレラ抽出物は、免疫応答増強または調節が望まれるいかなる症状または病状でも使用に適している。一態様において、クロレラ抽出物は、特に経口投与で、様々な形態の粘膜ワクチン製剤にアジュバントとして、有効量で用いられる。
【００７１】
アジュバントは抗原を局所的に閉じ込めることで急速な分散からそれを防護したり、またはそれらは、宿主を刺激して、免疫系のマクロファージおよび他成分にとり化学走性の因子を分泌させる物質を含有していることがある。粘膜投与向けに知られたアジュバントには、細菌毒素、例えばコレラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよびｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ＰＴ）がある。高分子量の食用品で、それ自体が免疫刺激物であるクロレラ抽出物は、経口ワクチンでアジュバントとして使用向けの候補である。
【００７２】
免疫調節物の“有効量”という用語は、宿主防御メカニズムを高めるために十分な免疫調節物の量に関する。この量は投与様式に応じてある程度変わるが、同様の一般的範囲内にある。２種以上の免疫調節物（例えば、ｅｃｈｉｎａｃｅａと組み合わせたクロレラ抽出物）が用いられるならば、各々がこれらの量で存在しても、または総量がこの範囲内でもよい。必要とされる正確な有効量は、種類、被治者の年齢および一般的状態、治療される症状の重篤度、投与様式などに応じて、被治者毎に変わる。そのため、正確な有効量を特定することは不可能である。しかしながら、適切な有効量は、日常的実験または免疫調節物関連の従来知識のみを用いて、当業者により決めてもよい。
【００７３】
ここで用いられている“治療”という用語は、哺乳類、特にヒトのあらゆる治療を含んでおり、
（ｉ）病気になりやすいが、まだそれを有するとは診断されていない被治者で生じないよう、病気を防止すること；
（ｉｉ）病気を抑制する、即ちその進行を抑えること；または
（ｉｉｉ）病気を軽減する、即ち病気を退行させること
を含む。
【００７４】
Ｅ．抽出物の形態
本発明のクロレラ抽出物を含有した栄養および医薬組成物は、経腸投与、例えば経口投与またはチューブ供給に適したいずれかの形態で処方および投与されうる。処方物は水性液の形態で好都合に投与される。したがって、経腸適用に向いた処方物は好ましくは水性形態、粉末または顆粒形態、例えば錠剤形態をとる。粉末または顆粒は、便宜上、使用前に水へ加えてもよい。液体形態のとき、組成物は典型的には０．１〜５０重量％、好ましくは１〜１０重量％の固形分を有する。ドリンクとして、組成物はいずれか公知の手法により、例えばクロレラ抽出物を炭水化物、脂肪および窒素源のようなエネルギー源と混ぜることにより得られる。
【００７５】
栄養組成物は完全処方食の形態（液体または粉末形態）でよく、そのため唯一の栄養源として用いられるとき、本質的にすべての１日カロリー、窒素、脂肪酸、ビタミン、ミネラルおよび微量元素要求量が満たされる。しかしながら、本発明の栄養組成物は、好ましくは補助食としての使用が意図されている。
【００７６】
本発明の医薬組成物は１回用で処方してもよく、そのときそれらはクロレラ抽出物および製薬上許容されるキャリアを含んでいる。このような医薬組成物は、経口、経鼻または経直腸投与のような経腸投与に適している。適切な組成物は液体形態でもまたは固体形態でもよい。液体組成物の用量は、典型的には０．１〜５０重量％、好ましくは１〜１０重量％のクロレラ抽出物である。固体組成物の用量は、典型的には０．２〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇのクロレラ抽出物である。組成物は錠剤、硬および軟カプセル、および薬包の形態でもよい。
【００７７】
適切なキャリアは当業界で公知である。それらには、フィラー、例えば糖またはセルロース、結合剤、例えばデンプン、および必要であれば崩壊剤がある。
【００７８】
下記例は説明のために示され、限定のためではない。
例１：ＩＢＰ‐１の調製
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａの乾燥粉末２０ｇを蒸留水１００ｍｌと混ぜ、穏やかに攪拌しながら８０℃で１時間加熱した。その物質を１０，０００ｇで２０分間遠心し、残留ペレットを２回洗浄した。次いで合わせた上澄を精密濾過し、噴霧乾燥した。平均収率は１０．５％であった。単純な洗浄の代わりに、８０℃で１時間にわたるペレットの抽出を数回、好ましくは２回繰り返してもよい。
一方、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて、合わせた上澄を原容量の１／５まで蒸発させ、次いでエタノール（８０％最終エタノール分）で沈澱させた。混合物を４℃で１８時間保ち、次いで沈殿物を濾去し、無水エタノールで洗浄し、真空乾燥した。
【００７９】
例２：ＩＢＰ‐２の調製
上記のように調製された抽出物質を４℃で水に対する徹底透析により脱塩し、次いで噴霧乾燥した。平均収率は約７．５％であった。
【００８０】
例３：ＩＢＰ‐２のクロマトグラフィーおよびＩＢＰ‐３の調製
ＩＢＰ‐２　２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、０．４５μｍフィルターで前濾過し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ １０００ ＨＲカラム（１．０×５０ｃｍ）へ適用し、０．１５Ｍ ＮａＣｌで溶離させた。溶離フラクションとフェノール／硫酸試薬との相互作用後に、クロマトグラフィーを２８０ｎｍおよび４９０ｎｍでモニターした。混合物は２つのピークに分離した。主要な免疫活性は高分子質量ピーク（ＩＢＰ‐３）にあった。しかしながら、低分子質量ピーク（ＩＢＰ‐４）も相当部分の免疫活性を含んでいた。クロマトグラムは図３で示されている。
【００８１】
例４：ＩＢＰ‐２のクロマトグラフィーおよびＩＢＰ‐５の調製
ＩＢＰ‐２　２００ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解し、０．４５μｍフィルターで前濾過し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ３００ ＨＲカラム（２．５×９０ｃｍ）へ適用し、ｐＨ４．５で直線ＮａＣｌ勾配の０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶離させた。溶離フラクションとフェノール／硫酸試薬との相互作用後に、クロマトグラフィーを２８０ｎｍおよび４９０ｎｍでモニターした。混合物は２つのピークに分離した。主要な免疫活性は高分子質量ピーク（ＩＢＰ‐５）にあった。低分子質量ピーク（ＩＢＰ‐６）は２つの融合ピークからなっていた（見かけのピークショルダー、そのフラクションはＩＢＰ‐６ｓとして試験された；図５）。ＳＥＣプロファイルは図４で示されている。
【００８２】
例５：ＩＢＰ‐２のクロマトグラフィーおよびＩＢＰ‐７の調製
ＩＢＰ‐２　２００ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解し、０．４５μｍフィルターで前濾過し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ １００カラム（２．５×９０ｃｍ）へ適用し、ｐＨ４．５で直線ＮａＣｌ勾配の０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶離させた。溶離フラクションとフェノール／硫酸試薬との相互作用後に、クロマトグラフィーを２８０ｎｍおよび４９０ｎｍでモニターした。混合物は２つのピークに分離した。主要な免疫活性は高分子質量ピーク（ＩＢＰ‐７）にあった。低分子質量ピーク（ＩＢＰ‐８）はかなり少ない活性を留めていた。ＩＢＰ‐９はＩＢＰ‐８に続くフラクションを表わす（図６）。
【００８３】
例６：組成分析
透析または限外濾過は、少ない部分の免疫活性のみが低分子質量（１００ＫＤａ以下）化合物と関連していることを証明した。活性物質は熱的に安定であり、エタノールまたは硫酸アンモニウムで溶液から沈澱させうる。抽出物の熱安定性は噴霧乾燥に適している；実際に、免疫調節活性は噴霧乾燥プロセス後に残留していた。フラクションの典型的タンパク質分は約３０％である。ＤＮＡ分は０〜２０％であり、１００ＫＤａより大きな分子質量は０〜２％である。
【００８４】
（ａ）プレイナークロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフ（ＧＣ）による炭水化物組成：
一態様において、凍結乾燥抽出物（または更に精製されたフラクション）を水（１ｍｇ／ｍｌ、４００μＬ）に溶解し、密封４ｍｌスクリューキャップバイアル中で、１００℃で一夜攪拌しながら１Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１ｍｌ）で加水分解した。次いでメタノールを用いてサンプルを何回も蒸発乾固させた。１Ｍ ＮＨ４ＯＨ（０．６ｍｌ）中０．５Ｍ ＮａＢＨ４を用いて、乾燥された加水分解産物を室温で一夜攪拌しながら還元した。次いで水素化ホウ素を酸性メタノール（メタノール中２０％酢酸、１ｍｌ）で分解させ、混合物を蒸発乾固させた。
【００８５】
無水酢酸３ｍｌをサンプルに加えた；混合物を水浴中で８０℃に２時間加熱して、アセチルアルジトールを生成させ、次いで蒸発乾固させた。
アセチルアルジトールサンプルを、その反応混合物を酢酸エチルと水に分配することにより抽出した；有機相をガスクロマトグラフィー／マススペクトロスコピー（ＧＣ‐ＭＳ）分析に直接用いた。
【００８６】
すべての標準およびサンプル抽出物を酢酸エチルに溶解し、約１００μＬに濃縮した。サンプルを１０：１スプリットでＴｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ Ｔｒａｃｅ ２０００ ガスクロマトグラフのスプリットモードを用いて注入し、ＳＧＥ ＢＰＸ７０キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍフィルム厚）でクロマトグラフィーに付した。ヘリウムキャリアガスを１．０ｍｌ／ｍｉｎの一定流速で用いた。
【００８７】
ガスクロマトグラフオーブンを１９０℃の初期温度（１分間保持）、次いで２６０℃（２６０℃で１０分間保持）まで３℃／ｍｉｎランプでプログラムした。キャピラリーカラムを２６０℃のトランスファーライン温度でマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ　ＧＣＱ イオントラップ）へ直接接続した。このオーブンプログラムを用いたとき、対象の全化合物が２０分間以内で溶出することがわかった。
【００８８】
マススペクトロメーターイオン源を１５０℃で維持した。電子衝撃モード（７０ｅＶ）およびアンモニア試薬ガスによる化学イオン化（ＣＩ）モードの双方を用いて、スペクトルをｍ／ｚ５０〜５００で記録した。
【００８９】
個別糖の純粋標準を誘導することにより、および／または酢酸アルジトール（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．）の市販混合物をクロマトグラフィーに付すことにより、単糖の保持時間を確認した。サンプル抽出物中に存在する糖をこれらの標準に対する保持時間および質量スペクトルの比較により同定した。免疫調節活性を有するすべてのサンプルが、グルコース、ガラクトース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースを含有している。１×１０６Ｄａ以上の分子量の抽出物はリボースを実質的に含まない。
【００９０】
（ｂ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いた単糖組成分析：
多糖主鎖から酸性、中性または塩基性単糖を放出させるための標準加水分解プロトコールを用いた。遊離単糖を最初に蛍光標識試薬２‐アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）で標識し、次いで形成されたシッフ塩基を水素化シアノホウ素ナトリウムで還元した。次いで混合物のポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用マニュアルに従い勾配ゲルでランした。ＩＢＰ‐２から産生された加水分解産物は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、マンノースおよびアラビノースを含有していた。実質量のリボースもみられた。しかしながら、１００℃で５時間にわたるＩＢＰ‐５およびＩＢＰ‐７の２Ｍ ＴＦＡ処理により産生された加水分解産物は、グルコースおよびガラクトースと、ラムノース、マンノースおよびアラビノースのみを明らかに含有していた。リボースはこれらの加水分解産物でみられなかった。これは、低分子質量のＲＮＡフラグメントがＩＢＰ‐２に存在しているという我々の以前の発見と一致した。しかしながら、それらの小さなサイズのせいで、それらはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ １００またはＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ３００クロマトグラフィーから各々得られたＩＢＰ‐５およびＩＢＰ‐７の高分子質量ピークに存在しなかった。Ｎ‐アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とマンノースとの間に位置するもう１つのバンドをＰＡＧＥで検出したが、これはいかなる一般的単糖にも該当しなかった。シアル酸放出に用いられた条件下（０．１ＴＦＡ、８０℃、１時間）で行われた加水分解により得られた反応混合物は、シアル酸の場合と一致するＲｆの生成物、およびＧａｌＮＡｃに相当する場合よりも有意に遅い保持時間の別な主要バンドを生じた。１００℃で３時間の４Ｍ ＨＣｌ加水分解（アミノ糖放出の条件）は、ＧａｌＮＡｃおよびＮ‐アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に相当するバンドをＰＡＧＥで生じた。しかしながら、他のバンドの強度から判断すると、それらはＩＢＰ‐５またはＩＢＰ‐７の微々たる成分であった。
【００９１】
（ｃ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いた単糖組成分析：
従ったプロトコールはＳａｔｏらのものであった（Ｓａｔｏ Ｋ．，Ｏｋｕｂｏ Ａ．，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｔ．，（１９９７） Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（キャピラリー電気泳動による２‐アミノ安息香酸で誘導された単糖の決定）．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５１：１１９−１２１）。ＩＢＰ‐２またはそのフラクションを最初に１００℃で１８時間かけて０．１Ｍ ＴＦＡ（１ｍｇ／ｍｌ）で加水分解し、水性酸を減圧下で除去し、残留ＴＦＡを乾燥するまでメタノールでの連続蒸発により除去した。
【００９２】
粗製抽出物ＩＢＰ‐２は主にグルコースおよびガラクトースを含有している；グルコースが抽出物中で最も多い単糖である。ラムノース、マンノースおよびアラビノースも存在するが、かなり少ない量である（図１４）。１ＭＤａ ＭＷＣＯ膜を用いて抽出物を限外濾過に付したとき（図１５）、グルコースとガラクトースとの比率が変化し、リボースピークが消失して、ＲＮＡおよびそのフラグメントの除去を示した（ＰＡＧＥデータと一致）。
【００９３】
（ｄ）アミノ酸組成：
抽出物中に含有された遊離アミノ酸を次のように調べた：サンプルを１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で蒸留脱イオン水に溶解した。各サンプル２５μＬ（２５０μｇ）に、Ｂｅｃｋｍａｎサンプル緩衝液（Ｎａ‐Ｓ）７５μＬを加えた。サンプルを１６，０００ｇで遠心して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ ６３００アミノ酸アナライザーで分析前に粒状物質を除去した。遠心で溶液を清澄化し、ペレットを保持した；上澄を遊離アミノ酸について分析した。
【００９４】
全加水分解産物のアミノ酸組成を調べるために、各サンプルの一部（２５０μｇ）を内部標準ノルロイシンおよび６Ｎ ＨＣｌ １ｍｌと一緒に清潔なガラス試験管へ入れた。管を真空下で密封し、ペプチドおよびポリペプチドを１０５℃で２０時間加水分解した。管を開き、サンプルを室温でＳａｖａｎｔ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃで乾燥させた。残留物をＮａ‐Ｓ緩衝液に再溶解し、遊離アミノ酸の決定に関して前記のように取扱った。
【００９５】
（ｅ）ＤＮＡ分：
クロレラ抽出物を蒸留水（５００μＬ）に溶解した。等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）溶液を加える。混合物を激しく振盪し、次いで１３，０００ｒｐｍで５分間遠心する。上の水層をピペットで取出し、更に有機混合物５００μＬで再抽出する。タンパク質層（水層と有機層との可視界面）が無視しうるまで、水層を再抽出する。最終タンパク質抽出後に、水層を新しい管へ移し、それにグリコーゲン（１０μＬ）、３Ｍ酢酸ナトリウム（５０μＬ）および冷エタノール（１ｍｌ）を加えた。混合液を振盪し、−８０℃フリーザーに１時間入れた。次いでそれを１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄を注ぎ出した。ペレットをスピード真空で乾燥させ、水に再溶解させた。その吸光度を水ブランクに対して２６０ｎｍで測定した。タンパク質も２６０ｎｍで吸光するため、２８０ｎｍのタンパク質吸光度もＤＮＡサンプルにおけるタンパク質分の尺度として読取った。
【００９６】
例７：抽出物の酵素消化
酵素分解を、クロレラ抽出物から様々な高分子種を選択的に除去するための技術として用いた。ＩＢＰ‐２またはそのフラクション（ＩＢＰ‐２およびそのフラクションの双方をこの例ではＯＮＣ‐１０７と称している）を別々の実験でプロナーゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼおよびノイラミニダーゼで処理した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびアガロース電気泳動と薄層クロマトグラフィーを用いて、酵素反応をモニターした（下記セクション（ａ）〜（ｇ）参照）。最終反応混合物を透析、凍結乾燥し、マウス脾臓細胞へのチミジン取込みにより未分化脾臓細胞を刺激しうる能力に関して試験した（例９および１１）。結果は次のように要約される：
【００９７】
・選択酵素での処理後に、統計学的有意性内で未分化脾臓細胞を刺激しうる能力に関して、効果なし
・ＩＢＰ‐２に大きな分子質量ＲＮＡの存在なし。これは他の発見（上記）、特にリボースが高分子質量種（ＩＢＰ‐５、ＩＢＰ‐７）およびＭＷＣＯ＞１ＭＤａで限外濾過されたフラクションでみられなかったことと一致する。これは明らかに、ＲＮＡが免疫刺激活性の主要源でないことを証明している。
・極めて少量のＤＮＡがみられたが、これは炭化ケイ素カラムを用いたＤＮ　Ａの単離から得られる我々のデータと一致する（約２％含有率、５００ｂｐ）（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ Ｙ （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ．カナダ公開出願２，２７０，１０６参照）。
【００９８】
酵素が確実に活性であるように、すべての酵素消化を陽性コントロールと並行して行った。実験では明らかに、未会合の酵素接近可能なタンパク質および核酸が活性源であるとは思えないことを示している。免疫活性源は（有意の効果をそれ自体では有さずに、間接的役割、例えば安定性をもたらすことがある、もう１つのバイオポリマーとおそらく複合化されている）多糖である。多糖の免疫活性は、３つ以上のα‐１，４‐結合Ｄ‐グルコース単位、α‐１，４‐結合グルコシドおよびガラクトシド、またはα‐１，４‐結合Ｄ‐グルコースの領域において、このような結合が酵素開裂をうけやすいとしても、その開裂により影響されない。
【００９９】
（ａ）プロテアーゼ処理
プロテアーゼ（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）をトリス緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．４）中のＯＮＣ‐１０７（２０ｍｇ／ｍｌ）へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。インキュベートを８０℃で１時間にわたる酵素の熱不活化、次いで１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心により停止させた。一部を０、５、１０、１５、３０および６０分の間隔で溶液から取出し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動（１２％ゲル、全タンパク質染色）による分析の準備をした。プロテアーゼの至適濃度をＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）に関する類似の電気泳動時間経過により求めた。最終切断混合物をアガロース電気泳動により分析した（臭化エチジウムで１％染色）。
【０１００】
（ｂ）ＤＮアーゼ処理
ＤＮアーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中のＯＮＣ‐１０７（２０ｍｇ／ｍｌ）へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。インキュベートを８０℃で１時間にわたる酵素の熱不活化、次いで１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心により停止させた。最終消化混合物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動（１２％ゲル、全タンパク質染色）により分析して、タンパク質分解について調べた。アガロース電気泳動（臭化エチジウムで１％染色）を用いて、核酸分解を確認した。
【０１０１】
（ｃ）ＲＮアーゼ処理
ＲＮアーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＯＮＣ‐１０７（２０ｍｇ／ｍｌ）へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。インキュベートを８０℃で１時間にわたる酵素の熱不活化、次いで１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心により停止させた。最終消化混合物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動（１２％ゲル、全タンパク質染色）により分析して、タンパク質分解について調べた。アガロース電気泳動（臭化エチジウムで１％染色）を用いて、核酸分解を確認した。
【０１０２】
（ｄ）アミラーゼ処理
アミラーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．４）中のＯＮＣ‐１０７（２０ｍｇ／ｍｌ）へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。インキュベートを８０℃で１時間にわたる酵素の熱不活化、次いで１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心により停止させた。最終消化混合物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動（１２％ゲル、全タンパク質染色）により分析して、タンパク質分解について調べた。アガロース電気泳動（臭化エチジウムで１％染色）を用いて、核酸分解を確認した。
【０１０３】
一方、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で次のように酵素の活性を確認した。アミラーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をデンプン（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。ＴＬＣによりｋｅｉｓｇｅｌシリカプレートを用いてイソプロパノール：酢酸エチル：水（７：１：２）で溶離することにより、溶液を分析した。硫酸／エタノール溶液を用いて水平位置で１０分間の乾燥後に、プレートを展開した。グルコース（１ｍｇ／ｍｌ）を未処理デンプンのコントロールとして用いた。アミラーゼによるデンプンの処理で、グルコースの遊離を生じた。
【０１０４】
（ｅ）アミログルコシダーゼ
アミログルコシダーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ４．４）中のＯＮＣ‐１０７（２０ｍｇ／ｍｌ）へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。インキュベートを８０℃で１時間にわたる酵素の熱不活化、次いで１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心により停止させた。ＴＬＣで次のように酵素の活性を確認した。アミログルコシダーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をデンプン（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。ＴＬＣによりｋｅｉｓｇｅｌシリカプレートを用いてイソプロパノール：酢酸エチル：水（７：１：２）で溶離することにより、溶液を分析した。水平位置で１０分間の乾燥後に硫酸／エタノール溶液を用いて、プレートを展開した。グルコース（１ｍｇ／ｍｌ）を未処理デンプンのコントロールとして用いた。アミログルコシダーゼによるデンプンの処理で、グルコースの遊離を生じた。
【０１０５】
（ｆ）セルラーゼ
セルラーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．４）中のＯＮＣ‐１０７（２０ｍｇ／ｍｌ）へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。インキュベートを８０℃で１時間にわたる酵素の熱不活化、次いで１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心により停止させた。ＴＬＣで次のように酵素の活性を確認した。セルラーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をセルロース（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。ＴＬＣによりｋｅｉｓｇｅｌシリカプレートを用いてイソプロパノール：酢酸エチル：水（７：１：２）で溶離することにより、溶液を分析した。硫酸／エタノール溶液を用いて、水平位置で１０分間の乾燥後に、プレートを展開した。グルコース（１ｍｇ／ｍｌ）を未処理セルロースのコントロールとして用いた。セルラーゼによるセルロースの処理で、グルコースの遊離を生じた。
【０１０６】
（ｇ）ノイラミニダーゼ
ノイラミニダーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．０）中のＯＮＣ‐１０７（２０ｍｇ／ｍｌ）へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。インキュベートを８０℃で１時間にわたる酵素の熱不活化、次いで１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心により停止させた。ＴＬＣで次のように酵素の活性を確認した。ノイラミニダーゼ（１００μｇ／ｍｌ）をＮ‐アセチルノイラミドース（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液へ加え、３６℃で１時間インキュベートした。ＴＬＣによりｋｅｉｓｇｅｌシリカプレートを用いてイソプロパノール：酢酸エチル：水（７：１：２）で溶離することにより、溶液を分析した。硫酸／エタノール溶液を用いて、水平位置で１０分間の乾燥後に、プレートを展開した。
【０１０７】
例８：脾臓細胞増殖の刺激
新鮮な脾臓細胞（脾臓細胞一次培養物）を９６ウェル平底組織培養プレート中１００μＬ容量でｃＲＰＭＩ培地へ３×１０５細胞／ウェルで入れた。細胞培地１００μＬ中の試験サンプルを三重ウェルへ加えて、最終総容量を各ウェルで２００μＬにした。プレートを無菌蓋で覆い、ＣＯ２インキュベーター中５％ＣＯ２下３７℃および１００％湿度で４８時間インキュベートした。次いで細胞を３Ｈ‐チミジン（１０μＬ ｃＲＰＭＩ中１μＣｉ／ウェル）でパルス標識し、１８時間インキュベートした。細胞をフィルターストリップ装備の自動細胞収集器で収集した。フィルターストリップを３７℃で３時間乾燥させた。液体シンチレーションカウンターでシンチレーション媒体に浸漬されたフィルターストリップをカウントすることにより、細胞により取り込まれた放射能を調べた。その実験の例は図７で示されている。出願人の抽出物と市販サンプル２種との比較が図１３で示されている。
【０１０８】
例９：脾臓細胞からのＢ細胞およびＴ細胞の単離と、その細胞の刺激
マウス脾臓細胞を所定の方法で単離し、３７℃で２時間にわたり組織培養フラスコへ入れ、マクロファージを静置してフラスコへ付着させた。次いで（懸濁して、付着していない）リンパ球を除去し、５０ｍｌ遠心管へ入れ、回転させ、少量の冷ＰＢＳ‐ＥＤＴＡ‐ＢＳＡ緩衝液（ｐＨ７．４；１〜３ｍｌ）へ再懸濁し、氷上に置いた。細胞をカウントし、再遠心した。次いで、それらを１５ｍｌ遠心管中のＰＢＳ‐ＥＤＴＡ‐ＢＳＡ緩衝液０．３ｍｌ中へ１×１０８で再懸濁した。
【０１０９】
Ｂ細胞のネガティブ単離：抗Ｔｈｙ‐１．２抗体でコートされたＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズ１００μＬを再懸濁細胞へ加え、混合物を２０分間インキュベートした。ＰＢＳ‐ＥＤＴＡ‐ＢＳＡ（５ｍｌ）を加え、懸濁液をｍｉｄｉＭＡＣＳ磁石付きｍｉｄｉＭＡＣＳカラム中へピペットで取出した。そのカラムは、流速を制限するために、流出口に２５ゲージ針を有していた。抗Ｔｈｙ‐１．２抗体被覆磁気ビーズへ結合しているＴ細胞は、カラムに付着した。Ｂ細胞は通過したため、集めた。磁石から離すことなく、カラムを緩衝液５ｍｌですすいで、いかなる残留Ｂ細胞も除去した。Ｂ細胞を集め、回転させ、ｃＲＰＭＩ １ｍｌに再懸濁し、カウントした。次いでそれらを５×１０６細胞／ｍｌ ｃＲＰＭＩに再懸濁し、刺激アッセイのため１００μＬ／ウェルで入れた。
【０１１０】
Ｔ細胞のネガティブ単離：Ｂ細胞の単離の場合と同様の操作に従ったが、但しインキュベートに用いられる磁気ビーズを、抗Ｔｈｙ‐１．２の代わりに、抗Ｂ２２０抗体で被覆した。
精製ＴおよびＢ細胞群を例８で記載されたように試験した。結果は図８で示されている。
【０１１１】
例１０：マウス腹腔内マクロファージの亜硝酸アッセイ
マウスを頚部脱臼により安楽死させ、あおむけに手足を広げて置いた。それらの腹部を７０％アルコールで殺菌し、腹腔壁を無傷で露出させる中線切開を慎重に行った。１０ｍｌシリンジを用いて、冷ｃＲＰＭＩ‐１６４０をマウス腹膜腔中へ注入した。針を挿入したまま、マウスを左右に優しく揺り動かした。腹腔内マクロファージを含有したｃＲＰＭＩ‐１６４０を腹膜腔から針でゆっくり抜き取った。マウス１匹当たり約８ｍｌの液体を回収した。腹腔液をプールし、氷上の５０ｍｌ遠心管へ入れた。細胞を回転沈降させ、洗浄し、ｃＲＰＭＩ‐１６４０ １ｍｌに再懸濁した。カウント後、それらを１〜２×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、９６ウェル組織培養プレートへ１００μＬ容量で１×１０５細胞／ウェルで入れた。試験サンプルをＩＦＮ‐μと一緒におよびそれなしでｃＲＰＭＩ（１００μＬ）へ加えた。陽性コントロールは細胞＋ＩＦＮ‐μおよびＬＰＳ＋ＩＦＮ‐μであった。細胞をＣＯ２インキュベーター中５％ＣＯ２下で４８時間インキュベートした。
【０１１２】
培養液５０μＬを集めて、９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートのウェルへ移した。ｃＲＰＭＩ中ＮａＮＯ２の２倍連続希釈（１２５μＭから１μＭ最終濃度まで）を行い、各Ｇｒｅｉｓｓ試薬溶液およびＮａＮＯ２希釈液５０μＬを一連のウェルへ加えて、標準曲線を作成した。５５０ｎｍの吸光度を測定し、ＮａＮＯ２濃度に対する吸光度値をプロットした。標準曲線を用いて、腹腔内マクロファージサンプルにより産生されたＮＯ２−の量を調べた。その実験の例は図９で示されている。
【０１１３】
例１１：マウス脾臓細胞によるサイトカイン産生の刺激に関するサンドイッチＥＬＩＳＡによる測定
サイトカイン産生をマウス脾臓細胞、単離マウスＴおよびＢリンパ球、およびマウスマクロファージで測定した。試験サンプルをマイクロタイター組織培養プレート中の細胞へいくつかの濃度で加えた。２４〜４８時間のインキュベート後に、対象のサイトカインに応じて、上澄培養液をＥＬＩＳＡ用に取り出した。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡプレートをｐＨ９．６炭酸緩衝液中４℃で一夜のインキュベートにより抗サイトカインモノクローナル抗体で被覆した。次いでプレートをトリス緩衝液（ＴＢＳ）で洗浄し、室温で２時間かけてＴＢＳ（２００μＬ／ウェル）中ＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌで後被覆し、ＴＢＡ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。サンプルおよび標準（後者は２倍希釈で１ｎｇ／ｍｌから１５ｐｇ／ｍｌへ希釈した）をＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌ含有ＴＢＡ／Ｔｗｅｅｎ（１００μＬ／ウェル）で希釈し、プレートへ加え、４℃で一夜インキュベートし、次いでＴＢＡ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。
【０１１５】
ＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌ含有ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１００μＬ／ウェル）中の適切なビオチニル化抗サイトカインｍＡｂ（０．５μｇ／ｍｌ）を加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＴＢＡ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌ含有ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１００μＬ／ウェル）中のエキストラビジン‐ペルオキシダーゼを加え、室温で３０分間インキュベートした。次いでプレートを洗浄した。ＴＭＢ基質溶液１００μＬ／ウェルを加え、１０〜３０分間後に、発色に応じて、反応を１Ｍ Ｈ３ＰＯ４ １００μＬ／ウェルで停止させた。プレートを４５０ｎｍで読んだ。ＩＬ‐６産生の刺激の例は図１０で示されている。
【０１１６】
例１２：感染マウスでＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの増殖におよぼすＩＢＰ‐２の効果
２用量のＩＢＰ‐２（０．１ｍｇまたは４ｍｇ）またはただの水（ネガティブコントロール）を４週間にわたり胃内チューブでＢａｌｂ／ｃマウスへ週３回投与した。次いでマウスを５０００生育Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ生物の静脈注射により感染させた。Ｌｉｓｔｅｒｉａ注射から３日後、マウスを殺した。それらの脾臓の細胞懸濁物を作製し、培養皿で培養して、脾臓中の細菌数を調べた。給水動物はそれらの脾臓で９２，２０２（±２３，０００）細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）を有していた（括弧内の数値は標準偏差を表わす）。０．１ｍｇ／回のＩＢＰ‐２を投与した動物は４３，３１０（±７０２１）ＣＦＵを有し、４ｍｇ／回のＩＢＰ‐２を投与した動物は５３１７（±４９２）ＣＦＵのみを有していた（ｐ＜０．０５）（図１１）。
【０１１７】
例１３：感染マウスでＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖におよぼすＩＢＰ‐２の効果
ＩＢＰ‐２（４ｍｇ）、粗製藻類（４ｍｇまたは２０ｍｇ）またはただの水を２週間にわたり胃内チューブでＢａｌｂ／ｃマウスへ週３回投与した。次いでマウスを５００，０００生育Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ生物の静脈注射により感染させた。注射から１２日後にマウスを殺すまで、給餌を続けた。腎臓を摘出し、細胞懸濁物を作製し、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天で培養して、一夜で増殖したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓコロニーの数を調べた。次の結果を得た：給水マウス５９４（±５５６）コロニー（平均±標準偏差）；ＩＢＰ‐２（４ｍｇ）投与マウス４２（±７５）（給水マウスと比較してｐ＜０．０５）；藻類（４ｍｇ）投与マウス３３５（±６６３）；藻類（２０ｍｇ）投与マウス７９（±７０）（統計学的に、給水群と比較したこの群のｐ値は＞０．０５であったが、それは有意性ありと非常に近かった）。結果は図１２で示されている。
【０１１８】
例１４：第２相臨床試験研究
この研究は、５０歳以上の健康な成人で栄養補助物としてクロレラ抽出物の免疫刺激効力を評価するために立案した。３週間にわたり１日１回の補助食として与えたときに、ＩＢＰ‐１に相当するクロレラ抽出物の安全性および許容性を証明する初回人体（ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｍａｎ）研究を行った。この第２相研究のこの目的は、安全性および許容性評価の向上を介してクロレラ抽出物のヒト実体験を増やすこと、およびヒトで免疫刺激栄養補助食としてクロレラ抽出物の能力を探ることであった。
【０１１９】
ＩＢＰ‐１に相当するクロレラ抽出物の２００ｍｇカプセル（この研究の目的からＯＮＣ‐１０７と称している）、ＯＮＣ‐１０７の４００ｍｇカプセルまたはプラセボカプセル（ＯＮＣ‐１０７を含有しない）を５０歳以上の成人が摂取するようにランダムに割り当てられる研究を、ランダムプラセボコントロール臨床試験として立案した。試験が進行中のとき、試験者、看護士および他の研究者および参加者は、彼らがどのグループに割り当てられたか知らなかった。安全性および副作用は、いかなる有害作用も参加者へ慎重に記録させて、これらを研究者へ報告することにより調べた。調べられる具体的な有害作用としては、発熱、腹痛、悪心、嘔吐、下痢、疲労、食欲不振、頭痛、体の痛み、関節痛および発疹があった。安全性も、研究カプセルの開始前および研究カプセルの終了時に、一連の血液試験により調べた。これらの試験には、肝機能（ＡＳＴ、ＡＬＴ）、血液プロファイル（全血カウント）および免疫機能（ＡＮＡ、抗ＤＮＡ、リウマチ因子、Ｃｏｏｍｂｓ、Ｃ３、Ｃ４、定量ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の試験があった。投薬は２８日間行った；２１日後に参加者を市販の不活化スプリットビリオンインフルエンザワクチンで免疫した。免疫感作前、その７および２１日後に、３種のインフルエンザウイルス株に対する抗体を測定することにより、免疫感作に対する抗体応答を評価した。研究の開始時および免疫感作から１週間後に、インフルエンザ皮膚試験に対する応答を評価することにより、細胞媒介免疫を調べた。
【０１２０】
合計１２４例の被験者を研究に参加させ、研究投薬を行った；参加者７人が研究から退いた。１人の参加者のみが有害作用（悪心および腹痛）のせいで退いた。３治療群は、研究の開始時に、年齢、性別、基準病歴および身体検査で類似していた。大部分の参加者は女性であった（各群の７３．２〜８０．５％）。参加者の遵守性は優れていた。インフルエンザワクチンに対する抗体応答は、ＯＮＣ‐１０７治療参加者で全体的に有意に高くはなかったが、５５歳以下の参加者では、一部の抗体測定で有意に高い応答があった（その他のトレンドは一致）。いずれの研究参加者にも重篤な有害作用はなかった。有害作用は研究中にほとんどの参加者で時々報告されたが、ほとんどにおいて、これらの作用はプラセボ受容者と比較してＯＮＣ‐１０７受容者で少なく報告された（疲労は２００ｍｇ ＯＮＣ‐１０７受容者でより多く、腹痛は５５歳を超えるプラセボ受容者でより多く報告された）。治療前および後、またはＯＮＣ‐１０７とプラセボとの受容者間で、実験測定に有意差はなかった。
【０１２１】
健康な成人で２８日間にわたる２００ｍｇおよび４００ｍｇの用量で栄養補助食ＯＮＣ‐１０７のこの第２相研究の結果が、以下で略記されている。それらは、年齢の影響にもかかわらず、この産物が経口投与に十分耐えられて安全であり、相当な免疫刺激効果を有することを示している。
【０１２２】
５０歳以上の健康な成人でインフルエンザワクチンに対する抗体応答により免疫刺激効果を測定したが、これらの応答は研究群で若い方のコホート（５０〜５５歳）に一般的に限定された。このサブグループにおける抗体応答の増加は一部の比較に関して統計学的に有意であったが、そのトレンドは行われたすべての血清学的比較で明らかであった。インフルエンザワクチンに対する応答性減少のせいで、ＯＮＣ‐１０７の効果が高齢の被験者の方で最も良く観察されるという予備研究仮説は、データで支持されなかった；逆に、ＯＮＣ‐１０７の効果を証明したのは、若い方のより応答しやすい被験者であった。
【０１２３】
若年齢被験者は、ＯＮＣ‐１０７の免疫刺激効果を示しやすかった（特に４００ｍｇ用量）。高齢群で効果の欠如を生じうる理由は、高齢群の方が高い免疫前抗体力価を有して、抗原的に類似したインフルエンザウイルスＡ株（Ｂ株ではない）へ事前にかなりの程度で暴露されていたのであろう、ということであった。
【０１２４】
１．インフルエンザワクチンのＡ／Ｃａｌｅｄｏｎｉａ株の場合、若年齢（≦５５歳）群は７日目（７日目は有意でない）および２１日目（ｐ＝０．０５）の双方でプラセボよりも高い平均抗体力価を両用量で有していた：プラセボ＝４３．２；２００ｍｇ＝８４．３；４００ｍｇ＝８４．４。
【０１２５】
２．インフルエンザワクチンのＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ株の場合、４００ｍｇ群はプラセボ（１４．４、ｐ＝０．０３）よりも高い力価（３０．１）を７日目に有していたが、これは２１日目に有意でなかった。２００ｍｇ用量は７日目（１５．９）または２１日目（２５．３）にプラセボほど有意には大きくなかった。
【０１２６】
３．インフルエンザワクチンのＡ／Ｐａｎａｍａ株の場合、４００ｍｇ用量に有利な類似のトレンドがあったが、それは有意ではなかった。７日目に、４００ｍｇ群はプラセボ（３９．９）と比較して６４．５の力価を有していたが、これは有意ではなかった。２００ｍｇ群は２６．６の力価を有している。２１日目には、プラセボよりも４００ｍｇに有利なトレンドもあった；一方、２００ｍｇはプラセボ（５７．４）より優れてはいなかった．
【０１２７】
同様のトレンドが、２および４倍抗体応答を有する被験者の割合に関して観察された。
＜５５歳群でＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉの場合、プラセボの５％のみが７日目に２倍抗体応答を有していた。これは４００ｍｇ群（４１．２％、ｐ＝０．０１）および２００ｍｇ群（６．３％、ｐ＝０．０４）と対照的である。
２１日目には応答増加に関して非有意なトレンド、および免疫後７日目に４０ＲＤ（逆希釈）の血清防御レベルに達した＜５５歳群の割合に関して非有意なトレンドもあった。
【０１２８】
請求項で規定された本発明の範囲から逸脱することなく、上記発明の具体的態様に多くの修正、変更および改変が加えうる。
【図面の簡単な説明】
本発明は、その様々な態様において、添付された図面を参照しながら記載されている。
【図１】
免疫ブースター調製物ＩＢＰ‐１またはＩＢＰ‐２の組合せサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）／屈折率検出（ＲＩ）／マルチアングルレーザー光散乱（ＭＡＬＳ）クロマトグラム。上のトレースはＲＩクロマトグラムである；下のトレースはＭＡＬＳ応答である；
【図２】
ＩＢＰ‐１の累積分子量プロファイル；
【図３】
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ １０００ ＳＦを用いたＩＢＰ‐２のＳＥＣクロマトグラム；
【図４】
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ３００ ＨＲを用いたＩＢＰ‐２（またはＩＢＰ‐１）のＳＥＣクロマトグラム；
【図５】
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ３００ ＨＲにより分離された様々なクロレラ抽出物フラクションによる脾臓細胞増殖の刺激；ＩＢＰ‐６ｓはＩＢＰ‐６のピークショルダーフラクションである；‘細胞’および‘細胞＋ＤＭＳＯ’は陰性コントロールである；ＬＰＳは陽性コントロールとして用いられたリポ多糖である；
【図６】
ＩＢＰ‐２のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００クロマトグラフィーにより分離された様々なクロレラ抽出物フラクションによる脾臓細胞増殖の刺激；‘細胞’は陰性コントロールである；ＬＰＳは陽性コントロールである；
【図７】
脾臓細胞増殖‐ＩＢＰ‐２の滴定曲線；‘細胞’は陰性コントロールである；ＬＰＳは陽性コントロールである；
【図８】
ＩＢＰ‐２ ２５μｇ／ｍｌの存在下で単離ＢまたはＴ細胞による３Ｈ‐取込み量を測定する増殖アッセイ；
【図９】
様々な濃度のＩＢＰ‐２の存在下で培養されたＢＡＬＢ／ｃ炎症腹腔マクロファージによる酸化窒素産生；‘ＩＦＮ＋ＬＰＳ’は陽性コントロールである；
【図１０】
様々な濃度のＩＢＰ‐２の存在下でＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞によるＩＬ‐６産生；‘ＣｏｎＡ’はコンカナバリンＡである；‘細胞＋ＣｏｎＡ’および‘細胞＋ＬＰＳ’は陽性コントロールサンプルであり、コンカナバリンＡは１０μｇ／ｍｌである；ＬＰＳは２０μｇ／ｍｌである；
【図１１】
マウスでのＬｉｓｔｅｒｉａ単球遺伝子増殖に関する、ｅｃｈｉｎａｃｅａ（Ｅｃｈｉｎ．）４ｍｇと比較したＩＢＰ‐２の効果；
【図１２】
マウスでのＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ増殖に関する、粗製藻類およびｅｃｈｉｎａｃｅａと比較したＩＢＰ‐２の効果；
【図１３】
ＩＢＰ‐２またはＳｗｉｓｓ ＨｅｒｂａｌおよびＮａｔｕｒｅ’ｓ Ｗａｙ市販のクロレラ抽出物の存在下で培養された、３Ｈ‐取込みにより測定されたマウス脾臓細胞増殖；
【図１４】
透析された粗製抽出物ＩＢＰ‐２のキャピラリー電気泳動クロマトグラム；単糖類は各ピークへ次のように該当する：９．０５位のリボース；１０．４７位のラムノース；１０．６８位のマンノース；１１．１４位のガラクトース；および１１．６５位のグルコース；
【図１５】
ＩＢＰ‐２を１ＭＤａ ＭＷＣＯ限外濾過膜へ通過させた後における貯留部分のキャピラリー電気泳動クロマトグラム；単糖類は各ピークへ次のように該当する：７．３０位のＮ‐アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）；７．４３位のＮ‐アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；１０．５２位のアラビノース；１０．９０位のラムノース；１１．１１位のマンノース；（１１．０１位のピークはバブルであることに留意せよ；マンノースピークはこのピークのすぐ右である）；１１．６２位のガラクトース；および１２．１３位のグルコース；
【図１６】
ＩＢＰ‐２のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；サンプルをＰｈａｒｍａｃｉａ １．０×３０ｃｍカラムへ適用し、ピペラジン／ＨＣｌ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．８）緩衝液により５ｍｌ／ｍｉｎの速度で溶出させた。ＮａＣｌ勾配を用いた：２０倍カラム容量で０〜２０％、次の２倍カラム容量で２０〜１００％；
【図１７】
ＩＢＰ‐２をＭＷＣＯ １ＭＤａ限外濾過膜へ通過させた後における貯留部分のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；サンプルをＰｈａｒｍａｃｉａ １．０×３０ｃｍカラムへ適用し、ピペラジン／ＨＣｌ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．８）緩衝液により５ｍｌ／ｍｉｎの速度で溶出させた。ＮａＣｌ勾配を用いた：２０倍カラム容量で０〜２０％、次の２倍カラム容量で２０〜１００％。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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2004505925.tif 000081
2004505925.tif 000082
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505925.tif 000083
【国際調査報告】
2004505925.tif 000084
2004505925.tif 000085
2004505925.tif 000086
2004505925.tif 000087