(57)【要約】腫瘍組織および一連の正常組織に発現する転写産物の公的データベースのスクリーニング、または、癌および精巣組織（他の正常組織ではない）に発現する遺伝子のスクリーニングにより癌・精巣（ＣＴ）抗原が同定された。本発明は、癌を患う患者において発現されるＣＴ抗原である核酸およびコードされたポリペプチドを含む。本発明は、とりわけ、単離された核酸分子、それらの分子を含有する発現ベクター、およびそれらの分子でトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本発明は、単離されたタンパク質およびペプチド、それらのタンパク質およびペプチドに対する抗体、ならびにタンパク質およびペプチドを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球も提供する。機能的断片および変異体を含めた上記のものの断片も提供される。上記の分子を含有するキットも付加的に提供される。本発明により提供される分子は、１つまたは２つ以上のＣＴ抗原の発現により特徴づけられる症状の診断、モニタリング、研究または処置に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の診断方法であって、
対象から単離された、精巣によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物、ＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片或いはその発現産物または断片と結合する抗体と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、および
前記剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定し、対象における癌を診断すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
剤が、
（ａ）配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその断片、
（ｂ）配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の発現産物に結合する抗体、
（ｃ）ＨＬＡ分子および配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の発現産物の断片の複合体と結合する剤、および
（ｄ）前記発現産物または断片に結合する抗体に結合するポリペプチド、
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌が複数のヒトＣＴ抗原前駆体の発現により特徴づけられ、ここで、剤が、その各々が異なるヒトＣＴ抗原前駆体に特異的である複数の剤であり、そして前記複数の剤は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０種のこのような剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌の診断方法であって、
対象から単離された、精巣、脳によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物、ＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片または該発現産物または断片に結合する抗体と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号３２で示されるヌクレオチド配列を含み、および、
前記剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、
を含む、前記方法。
【請求項５】
癌の診断方法であって、
対象から単離された、精巣、卵巣、子宮頸部、肺によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物、ＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片または該発現産物または断片に結合する抗体と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号３４で示されるヌクレオチド配列を含み、および、
前記剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、
を含む、前記方法。
【請求項６】
癌の診断方法であって、
対象から単離された、精巣、卵巣、肺、乳房、前立腺、大腸によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物、ＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片または該発現産物または断片に結合する抗体と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号３６で示されるヌクレオチド配列を含み、および、
前記剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
癌の診断方法であって、
対象から単離された、精巣、胎盤、肺、乳房、前立腺によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物、ＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片または該発現産物または断片に結合する抗体と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号３８で示されるヌクレオチド配列を含み、および、
前記剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
癌の診断方法であって、
対象から単離された、精巣、卵巣、胎盤、肺、前立腺、子宮頸部によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物、ＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片または該発現産物または断片に結合する抗体と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号４０で示されるヌクレオチド配列を含み、および、
前記剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、
を含む、前記方法。
【請求項９】
癌の診断方法であって、
対象から単離された、精巣、卵巣、前立腺によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物、ＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片または該発現産物または断片に結合する抗体と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号５１で示されるヌクレオチド配列を含み、および、
前記剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の異常なレベルの発現により特徴づけられる癌の退行、進行または発症の決定方法であって、
癌を有するかまたは有することが疑われる対象から、異なる時期に得た精巣によるものではない複数個の試料を、
（ｉ）タンパク質、
（ｉｉ）タンパク質由来のペプチド、
（ｉｉｉ）タンパク質またはペプチドを選択的に結合する抗体、
（ｉｖ）タンパク質由来のペプチドおよびＭＨＣ分子の複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞、および
（ｖ）配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、
からなる群から選択されるパラメータに関して、モニタリングすること、および前記複数個の試料によるパラメータを比較することによって、癌の退行、進行または発症を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
試料が、体液、身体滲出液、細胞または組織である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
モニタリングの工程が、試料を、
（ａ）（ｉ）のタンパク質または（ｉｉ）のペプチドを選択的に結合する抗体またはその断片、
（ｂ）（ｉｉｉ）の抗体と結合するタンパク質またはペプチド、
（ｃ）（ｉｖ）のペプチドおよびＭＨＣ分子の複合体を提示する細胞、および（ｄ）（ｖ）の核酸分子またはその相補体にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸プローブまたはプライマー、
からなる群から選択される検出可能な剤と接触させること、
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗体、タンパク質、ペプチド、細胞または核酸プローブまたはプライマーが放射性標識または酵素で標識された、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が複数のタンパク質であり、パラメータが複数のパラメータであり、該複数のパラメータの各々が複数のタンパク質の異なる１つに特異的であり、そのうちの少なくとも１つが配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるＣＴ抗原タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト対象のための医薬製剤であって、
対象に投与された場合、ＨＬＡ分子およびヒトＣＴ抗原ペプチドの複合体の存在を選択的に豊富化する剤、および
薬学的に許容し得る担体、
を含み、
ここで、ヒトＣＴ抗原ペプチドは、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるヒトＣＴ抗原の断片である、
前記医薬製剤。
【請求項１６】
剤が、その各々がＨＬＡ分子および異なるヒトＣＴ抗原ペプチドの複合体を対象中で選択的に豊富化する複数の剤を含み、
ここで、ヒトＣＴ抗原の少なくとも１つは、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる、
請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
剤が、
（１）ヒトＣＴ抗原ペプチドを含む単離ポリペプチド、
（２）単離ポリペプチドを発現するためのプロモーターに作動可能に連結された単離された核酸、
（３）単離ポリペプチドを発現する宿主細胞、および
（４）ポリペプチドとＨＬＡ分子との単離複合体、
からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
アジュバントをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項１９】
剤が、ヒトＣＴ抗原ペプチドを含む単離ポリペプチドを発現する細胞であり、ここで、該細胞は、非増殖性である、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
剤が、ヒトＣＴ抗原ペプチドを含む単離ポリペプチドを発現する細胞であり、ここで、該細胞は、該ポリペプチドに結合するＨＬＡ分子を発現する、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
細胞が、組み換え的にポリペプチドおよびＨＬＡ分子の一方または両方を発現する、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
細胞が、非増殖性である、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５および３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに選択的に結合する、単離された剤を含む、組成物。
【請求項２４】
剤が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項２３に記載の物質の組成物。
【請求項２５】
抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項２３または２４に記載の剤および治療剤または診断剤の結合体を含む物質の組成物。
【請求項２７】
結合体が、剤および毒素である治療剤または診断剤の結合体である、請求項２６に記載の物質の組成物。
【請求項２８】
配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、および
薬学的に許容し得る担体、
を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
単離された核酸分子が、２つの異なるポリペプチドをコードする少なくとも２つの単離された核酸分子を含み、各ポリペプチドが異なるヒトＣＴ抗原を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
単離された核酸分子と作動可能に連結されたプロモーターを有する発現ベクターをさらに含む、請求項２８または２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
単離された核酸分子を組換え的に発現する宿主細胞をさらに含む、請求項２８または２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む単離ポリペプチド、および
薬学的に許容し得る担体
を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
単離ポリペプチドが、少なくとも２つの異なるポリペプチドを含み、各ポリペプチドは異なるヒトＣＴ抗原を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
アジュバントをさらに含む、請求項３２または３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
タンパク質マイクロアレイであって、
配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド、または
該ポリペプチドの抗原断片、
を含む、前記マイクロアレイ。
【請求項３６】
少なくとも１つのポリペプチドが、配列番号１９、２１、２３、４７、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のマイクロアレイ。
【請求項３７】
タンパク質マイクロアレイであって、
配列番号２４、２６、２８および３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド、または
該ポリペプチドの抗原断片、
を含む、前記マイクロアレイ。
【請求項３８】
少なくとも１つのポリペプチドが、配列番号２５、２７、２９および３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載のマイクロアレイ。
【請求項３９】
タンパク質マイクロアレイであって、
配列番号３２、３４、３６、３８、４０および５１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド、または
該ポリペプチドの抗原断片、
を含む、前記マイクロアレイ。
【請求項４０】
少なくとも１つのポリペプチドが、配列番号３３、３５、３７、３９、４１および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のマイクロアレイ。
【請求項４１】
タンパク質マイクロアレイであって、
配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドまたはそのポリペプチドの抗原断片に特異的に結合する、複数の抗体またはその抗原結合断片、
を含む、前記マイクロアレイ。
【請求項４２】
ポリペプチドが、配列番号１９、２１、２３、４７、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載のマイクロアレイ。
【請求項４３】
タンパク質マイクロアレイであって、
配列番号２４、２６、２８および３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドまたはそのポリペプチドの抗原断片に特異的に結合する、複数の抗体またはその抗原結合断片、
を含む、前記マイクロアレイ。
【請求項４４】
ポリペプチドが、配列番号２５、２７、２９および３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載のマイクロアレイ。
【請求項４５】
タンパク質マイクロアレイであって、
配列番号３２、３４、３６、３８、４０および５１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドまたはそのポリペプチドの抗原断片に特異的に結合する、複数の抗体またはその抗原結合断片、
を含む、前記マイクロアレイ。
【請求項４６】
ポリペプチドが、配列番号３３、３５、３７、３９、４１および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のマイクロアレイ。
【請求項４７】
核酸マイクロアレイであって、
配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、または
生物学的試料において、その相補体に選択的にハイブリダイズする少なくとも２０ヌクレオチドのその断片、
を含む、前記核酸マイクロアレイ。
【請求項４８】
核酸マイクロアレイであって、少なくとも１つの核酸分子が、
配列番号２４、２６、２８および３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または
生物学的試料において、その相補体に選択的にハイブリダイズする少なくとも２０ヌクレオチドのその断片、
を含む、前記核酸マイクロアレイ。
【請求項４９】
核酸マイクロアレイであって、少なくとも１つの核酸分子が、
配列番号２４、２６、２８および３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または
生物学的試料において、その相補体に選択的にハイブリダイズする少なくとも２０ヌクレオチドのその断片、
を含む、前記核酸マイクロアレイ。
【請求項５０】
ＨＬＡ分子またはヒト抗体に結合するヒトＣＴ抗原の単離断片であって、前記ヒトＣＴ抗原またはその一部が、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる、前記断片。
【請求項５１】
断片が、ＨＬＡ分子との複合体の一部である、請求項５０に記載の断片。
【請求項５２】
断片が、８〜１２アミノ酸長である、請求項５０に記載の断片。
【請求項５３】
１つまたは２つ以上のヒトＣＴ抗原の発現の存在を検出するためのキットであって、各々の単離された核酸分子が、
（ａ）配列番号１８、２０、２２、４６または４８のいずれかのヌクレオチド配列の１２〜３２ヌクレオチドコンティグセグメント、および
（ｂ）（ａ）の相補体からなる群から選択される核酸分子、
から本質的になる、２または３対以上の単離された核酸を含み、
ここで、前記コンティグセグメントは非重複性であり、各対の核酸分子は、ヒトＣＴ抗原に特異的である、前記キット。
【請求項５４】
単離された核酸分子の対が、構築され、配置されて、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択される単離された核酸分子の少なくとも１つの断片を選択的に増幅する、請求項５に記載のキット。
【請求項５５】
ヒトＣＴ抗原の発現により特徴づけられる癌を有する対象の処置方法であって、
疾患を改善するのに効果的な量の、ＨＬＡ分子およびヒトＣＴ抗原の複合体の存在を対象中で選択的に豊富化する剤を対象に投与することを含み、
ここで、前記ヒトＣＴ抗原ペプチドは、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるヒトＣＴ抗原の断片である、前記方法。
【請求項５６】
癌が、複数のヒトＣＴ抗原の発現により特徴づけられ、ここで、剤が、その各々がＨＬＡ分子および異なるヒトＣＴ抗原ペプチドの複合体の存在を対象中で選択的に豊富化する複数の剤であり、および前記ヒトＣＴ抗原の少なくとも１つが、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
剤が、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる単離ポリペプチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
対象の細胞のヒトＣＴ抗原の発現により特徴づけられる癌を有する対象の処置方法であって、
（ｉ）対象から免疫反応性細胞含有試料を取り出すこと、
（ｉｉ）ヒトＣＴ抗原の断片であるヒトＣＴ抗原に対する細胞溶解性Ｔ細胞の産生に好都合な条件下で、宿主細胞に前記免疫反応性細胞含有試料を接触させること、
（ｉｉｉ）ヒトＣＴ抗原を発現する細胞を溶解するのに有効な量で、対象に細胞溶解性Ｔ細胞を導入すること、を含み、
ここで、宿主細胞は、プロモーターと作動可能に連結された単離された核酸分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、および前記単離された核酸分子は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、
前記方法。
【請求項５９】
宿主細胞が、ヒトＣＴ抗原ペプチドと結合するＨＬＡ分子を組換え的に発現する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
宿主細胞が、ヒトＣＴ抗原と結合するＨＬＡ分子を内生的に発現する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
対象の細胞中のヒトＣＴ抗原の発現により特徴づけられる癌を有する対象の処置方法であって、
（ｉ）癌細胞により発現される核酸分子またはその断片を同定することであって、ここで、核酸分子は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）（ａ）同定された核酸分子、（ｂ）ヒトＣＴ抗原をコードするセグメントを含有する、同定された核酸の断片、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の縮重からなる群から選択される核酸で宿主細胞をトランスフェクトすること、
（ｉｉｉ）トランスフェクトした前記宿主細胞を培養して、トランスフェクトした核酸分子を発現させること、および
（ｉｖ）前記状態に関連する対象の細胞に対する免疫応答を増大するのに有効な量の前記宿主細胞またはその抽出物を対象に導入すること、
を含む、前記方法。
【請求項６２】
核酸分子の発現産物の一部分を提示するＭＨＣ分子を同定することをさらに含み、ここで、宿主細胞は、同定されたものと同一のＭＨＣ分子を発現し、および宿主細胞は、核酸分子の発現産物のＭＨＣ結合部分を提示する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
免疫応答が、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
応答が、核酸分子の発現産物の一部を提示する宿主細胞またはヒトＣＴ抗原を発現する対象の細胞に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞の生成を含むＴ細胞応答である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
核酸分子が、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
宿主細胞を処理してそれらを非増殖性にすることをさらに含む、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６７】
精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を処置、または診断もしくはモニタリングするための方法であって、
タンパク質またはそれに由来するペプチドと特異的に結合する抗体であって、治療的または診断的に有用な剤に結合される前記抗体を、前記状態を治療、診断またはモニタリングするのに有効な量で対象に投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項６８】
抗体が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
モノクローナル抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を処置するための方法であって、
対象における前記状態を防止し、その発症を遅延し、または抑制するのに有効な量で、１つまたは２つ以上の前記医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７１】
精巣ではない組織内で異常量の前記タンパク質を対象が発現することを最初に同定することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を処置するための方法であって、
（ｉ）異常量のタンパク質を発現する細胞を対象から同定すること、
（ｉｉ）前記細胞の試料を単離すること、
（ｉｉｉ）前記細胞を培養すること、および
（ｉｖ）前記、細胞に対する免疫応答を惹起するのに有効な量で対象に前記細胞を導入すること、
を含む、前記方法。
【請求項７３】
対象にそれらを導入する前に、細胞を非増殖性にすることをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる病理学的細胞症状の処置方法であって、
それを必要とする対象に、前記タンパク質の発現または活性を抑制する有効量の剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７５】
剤が、選択的にタンパク質に結合する阻害抗体または抗体断片であって、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
剤が、タンパク質をコードする核酸分子と選択的に結合するアンチセンス核酸分子である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
配列番号１９、２１、２３、４７、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸を含む複数のタンパク質に対する免疫応答を刺激するのに有用な物質の組成物であって、タンパク質の断片である複数のペプチドを含み、ここで、該ペプチドは、精巣によるものではない細胞の表面に提示される１つまたは２つ以上のＭＨＣ分子と結合する、前記組成物。
【請求項７８】
複数のペプチドの少なくとも一部分がＭＨＣ分子と結合し、それに対する細胞溶解性応答を引き出す、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
少なくとも１つのタンパク質が、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８０】
アジュバントをさらに含む、請求項７７に記載の物質の組成物。
【請求項８１】
アジュバントが、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキンおよび免疫増強性オリゴヌクレオチドである、請求項８０に記載の物質の組成物。
【請求項８２】
単離された抗体であって
（ｉ）配列番号１９、２１、２３、４７、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質の断片であるペプチド、および
（ｉｉ）前記ペプチドと結合して複合体を形成するＭＨＣ分子、
の複合体と選択的に結合し、
（ｉ）または（ｉｉ）単独とは結合しない、前記抗体。
【請求項８３】
抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはそれらの抗原結合断片である、請求項８２に記載の抗体。
【請求項８４】
精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択ヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を、処置、診断またはモニタリングするための方法であって、
前記状態を処置、診断またはモニタリングするのに効果的な量で、請求項８２に記載の治療的または診断的に有用な剤と結合する抗体を、対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項８５】
精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択ヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を、処置、診断またはモニタリングするための方法であって、
前記状態を処置、診断またはモニタリングするのに効果的な量で、請求項８３に記載の治療的または診断的に有用な剤と結合する抗体を、対象に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ§１１９（ｅ）の下で、２００１年３月３０日付の米国仮出願番号60/280,718、２００１年４月２０日付の米国仮出願番号60/285,154および２００１年１０月５日付の米国仮出願番号60/327,432による優先権を主張する、現在係属中の２００２年１月２２日付の出願番号10/054,683の一部継続出願である。
【０００２】
技術分野
本発明は、種々の癌に発現する新規な癌・精巣抗原（cancer/testis antibody）である核酸およびコードされたポリペプチドに関する。本発明はまた、該核酸またはポリペプチドに結合する試薬にも関する。核酸分子、かかる分子によりコードされるポリペプチド、そこから得られるペプチド並びに関連抗体および細胞溶解性Ｔリンパ球は、とりわけ、診断および治療状況において有用である。
【０００３】
背景技術
腫瘍免疫学の研究が、癌関連および非癌関連分野において、非常に重要なの多くの発見をもたらしたことは、ある程度認識されている事実である。例えば、腫瘍抗原の調査により、ＣＤ８ Ｔ細胞抗原（１）および分化抗原（２）（および細胞表面抗原を類別するＣＤシステム）並びにｐ５３（３）を発見することとなった。ウイルス性白血病誘発に対する抵抗性の免疫原性分析は、ＭＨＣと疾患感受性との最初の掛け橋となり(４)、癌への非特異的な免疫に基づく関心により、ＴＮＦを発見した（５）。
【０００４】
有望な腫瘍免疫学の他の分野としては、癌・精巣（ＣＴ）抗原に関するカテゴリーであり、これは、自己由来のヒトメラノーマ細胞のＣＤ８ Ｔ細胞認識に対する標的として最初に認識された（６、７）。これら抗原の分子的な定義は、従来の努力が成就することにより、自己由来の腫瘍細胞（自己由来の形別）への体液性（８）および細胞性（９）免疫反応の明白な分析におけるシステムおよび方法を確立し、そして、自己由来の形別のこのアプローチはまた、体液性免疫反応を誘発する腫瘍抗原の分子構造を決定するためのＳＥＲＥＸ（ｃＤＮＡ発現ライブラリーの血清分析）を開発した（１０）。
【０００５】
癌の診断および治療における既知のＣＴ抗原の有用性は認められているが、様々な種類およびソースの腫瘍におけるこれら抗原の発現は、一般的なものではない。したがって、癌の診断および治療をターゲットとしたさらなるＣＴ抗原を同定し、診断的および治療的な用途において有用な医薬の開発が希求されている。
【０００６】
発明の要約
配列データベースのバイオインフォマティクス分析を適用して、癌・精巣抗原のプロファイルにフィットする発現特性を有する配列を同定した。いくつかの新規な癌・精巣抗原および癌関連抗原を同定した。本発明は、とりわけ、単離された核酸分子、それらの分子を含有する発現ベクターおよびそれらの分子によってトランスフェクトされる宿主細胞を提供する。本発明はまた、単離されたタンパク質およびペプチド、それらのタンパク質およびペプチドに対する抗体ならびにタンパク質およびペプチドを認識するＣＴＬも提供する。上記のもの断片および変異体も提供する。付加的に上記の分子を含有するキットも提供する。上記のものは、１つまたは２つ以上の癌・精巣および／または癌関連抗原の発現により特徴づけられる状態の診断、モニタリング、研究または処置に用いることできる。
【０００７】
本発明の前、過去２０年で同定されたのは少数の癌関連遺伝子に過ぎない。本発明は、数個の遺伝子の意外な発見を含み、そのうちのいくつかは従来既知であり、いくつかは従来未知であって、これらは癌を有する個体中で発現される。これらの個体はすべて、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質（またはそれらの断片）に対する血清抗体を有する。したがって、異常発現遺伝子は、宿主の免疫系により認識され、したがって診断、モニタリングおよび治療のための基礎を形成し得る。
【０００８】
本発明は、単一物質、複数の異なる物質、そして物質の大型パネルおよび組合せの使用さえも含む。例えば単一遺伝子、遺伝子によりコードされる単一タンパク質、その単一機能的断片、それに対する単一抗体等は、本発明の方法および製品に用いることできる。同様に、これらの物質の対、群、そしてパネルでさえ、ならびに任意にその他の癌関連抗原遺伝子および／または遺伝子産物は、診断、モニタリングおよび治療のために用いることできる。対、群またはパネルは、２、３、４、５またはそれ以上の遺伝子、遺伝子産物、その断片またはこのような物質を認識する剤を含み得る。複数のこのような物質は、このような遺伝子を異常に発現する細胞をモニタリングし、類型分類し、特徴づけ、そして診断するのに有用なだけでなく、複数のこのような物質は治療的にも用いることできる。このような遺伝子を発現しているかまたは発現するであろう癌細胞の予防、発症の遅延、改善等のための複数のこのような物質の使用の一例は、予防的または短期的である。遺伝子、遺伝子産物、ならびに遺伝子および遺伝子産物を認識する物質の任意のおよびすべての組合せが試験され、本発明による使用に関して同定することができる。このような組合せをすべて列挙するのはあまりに冗長過ぎる。当業者は、特に本明細書中に含入された教示に鑑みて、組合せがどの情況に最も適しているかを容易に決定し得る。
【０００９】
以下の考察から明らかになるように、本発明は、治療的、診断的、モニタリングおよび研究目的のためを含めて、in vivoおよびin vitro用途を有する。本発明の一態様は、例えばこのような遺伝子産物の発現を定量することによる本発明にしたがって同定される多数の遺伝子を発現する細胞をフィンガープリントする能力である。このようなフィンガープリントは、例えば癌の段階、癌の種類の特性を、または癌に及ぼす治療の動物モデルにおける影響の特性さえ示す。このような細胞が本発明により同定された遺伝子を異常に発現するか否かを決定するために、細胞はさらにスクリーニングすることができる。
【００１０】
本発明は、一態様において、核酸分子によりコードされる癌関連抗原前駆体の発現により特徴づけられる障害の診断方法である。本方法は、対象から単離された生物学的試料を、核酸分子、その発現産物またはＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片と特異的に結合する剤に接触させる工程であって、ここで、核酸分子は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、および、剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定し、対象の癌を診断すること、を含む。
【００１１】
ある態様においては、（ａ）配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその断片、（ｂ）配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の発現産物に結合する抗体、（ｃ）ＨＬＡ分子および配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の発現産物の断片の複合体と結合する剤、および（ｄ）発現産物または断片に結合する抗体に結合するポリペプチド、
からなる群から選択される。
【００１２】
他の態様においては、癌は複数のヒトＣＴ抗原前駆体の発現により特徴づけられ、ここで、剤が、その各々が異なるヒトＣＴ抗原前駆体に特異的である複数の剤であり、そして前記複数の剤が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０のこのような剤である癌は複数のヒトＣＴ抗原前駆体の発現により特徴づけることができる。
【００１３】
本発明の別の側面では、癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から単離された精巣、脳によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物またはＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号３２で示されるヌクレオチド配列を含み、および、剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、を含む。
【００１４】
本発明のさらなる側面では、他の癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から単離された精巣、卵巣、子宮頸部、肺によるではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物またはＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号３４で示されるヌクレオチド配列を含み、および、剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、を含む。
【００１５】
本発明はまた、他の癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から単離された精巣、卵巣、肺、乳房、前立腺、大腸によるではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物またはＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号３６で示されるヌクレオチド配列を含み、および、剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、を含む。
【００１６】
本発明の別の側面では、他の癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から単離された精巣、胎盤、肺、乳房、前立腺によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物またはＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号３８で示されるヌクレオチド配列を含み、および、剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、を含む。
【００１７】
本発明のさらなる別の側面では、他の癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から単離された精巣、卵巣、胎盤、肺、前立腺によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物またはＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号４０で示されるヌクレオチド配列を含み、および、剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、を含む。
【００１８】
本発明のまた別の側面では、他の癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から単離された精巣、卵巣、前立腺によるものではない生物学的試料を、核酸分子、その発現産物またはＨＬＡ分子と複合されたその発現産物の断片と特異的に結合する剤とを接触させること、ここで、核酸分子は、配列番号５１で示されるヌクレオチド配列を含み、および、剤と核酸分子または発現産物との間の相互作用を決定して、対象の癌を診断すること、を含む。
【００１９】
本発明の他の側面においては、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の異常レベルの発現により特徴づけられる癌の退行、進行または発症の決定方法を提供する。該方法は、癌を有するかまたは有することが疑われる対象から、異なる時期において得られる精巣によるものではない複数個の試料を、（ｉ）タンパク質、（ｉｉ）タンパク質由来のペプチド、（ｉｉｉ）タンパク質またはペプチドを選択的に結合する抗体、（ｉｖ）タンパク質由来のペプチドおよびＭＨＣ分子の複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞、および（ｖ）配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、からなる群から選択されるパラメータに関して、モニタリングする方法を含む。該方法はまた、複数個の試料によるパラメータを比較することによって、癌の退行、進行または発症を決定することを含む。
【００２０】
いくつかの態様においては、試料が、体液、身体滲出液、細胞または組織である。他の態様においては、モニタリングの工程は、試料を、（ａ）（ｉ）のタンパク質または（ｉｉ）のペプチドを選択的に結合する抗体、（ｂ）（ｉｉｉ）の抗体と結合するタンパク質またはペプチド、（ｃ）（ｉｖ）のペプチドおよびＭＨＣ分子の複合体を提示する細胞、および（ｄ）（ｖ）の核酸分子またはその相補体にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸プローブまたはプライマー、からなる群から選択される検出可能な剤と接触させることを含む。好ましくは、抗体、タンパク質、ペプチドまたは細胞が放射性標識または酵素で標識される。さらなる態様においては、タンパク質が複数のタンパク質であり、パラメータが複数のパラメータであり、複数のパラメータの各々が複数のタンパク質の異なる１つに特異的であり、そのうちの少なくとも１つが配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるＣＴ抗原タンパク質である。
【００２１】
本発明のさらに別の側面では、ヒト対象のための医薬製剤を提供する。該医薬製剤は、対象に投与された場合、ＨＬＡ分子およびヒトＣＴ抗原ペプチドの複合体の存在を選択的に豊富化する剤、および薬学的に許容し得る担体を含む。ヒトＣＴ抗原ペプチドは、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるヒトＣＴ抗原の断片である。
【００２２】
いくつかの態様において、前記医薬製剤は、その各々がＨＬＡ分子および異なるヒトＣＴ抗原ペプチドの複合体を対象中で選択的に豊富化する複数の剤を含み、ここで、ヒトＣＴ抗原の少なくとも１つは、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる。
【００２３】
前記医薬製剤の他の態様においては、剤が、（１）ヒトＣＴ抗原ペプチドを含む単離ポリペプチド、（２）単離ポリペプチドを発現するためのプロモーターに作動可能に連結された単離された核酸、（３）単離ポリペプチドを発現する宿主細胞、および（４）ポリペプチドとＨＬＡ分子の単離複合体、からなる群から選択される。
【００２４】
さらなる他の態様において、剤が、ヒトＣＴ抗原ペプチドを含む単離ポリペプチドを発現する細胞であるか、または、ヒトＣＴ抗原ペプチドを含む単離ポリペプチドおよびポリペプチドに結合するＨＬＡ分子を発現する細胞である。ある態様においては、該細胞は、組み換え的に（recombinantly）ポリペプチドおよび／またはＨＬＡ分子を発現する。好ましくは、前記細胞は非増殖性である。
前記医薬製剤はまた、好ましくは、アジュバントを含む。
【００２５】
本発明の別の側面では、組成物を提供する。該組成物は、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５および３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに選択的に結合する単離された剤を含む。好ましくは、剤は、抗体またはその抗原結合断片である。さらに好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である、キメラ抗体またはヒト化抗体である。また、前記剤および治療または診断剤の１つまたは２つ以上の結合体を含む物質の組成物を提供する。好ましくは、治療剤または診断剤は毒素である、
【００２６】
本発明の別の側面では、医薬組成物を提供する。該組成物は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子および薬学的に許容し得る担体を含む。いくつかの態様において、単離された核酸分子は、２つの異なるポリペプチドをコードする少なくとも２つの単離された核酸分子を含み、各ポリペプチドが異なるヒトＣＴ抗原を含む。他の態様において、前記医薬製剤はまた、単離された核酸分子と作動可能に連結されたプロモーターを有する発現ベクターをさらに含む。また、他の態様においては、前記医薬製剤はまた、単離された核酸分子を組換え的に発現する宿主細胞をさらに含む。
【００２７】
本発明のさらなる側面においては、さらなる医薬組成物を提供する。該組成物は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む単離ポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む。ある態様においては、単離された核酸分子は、２つの異なるポリペプチドを含む単離された核酸分子を含み、各ポリペプチドは異なるヒトＣＴ抗原を含む。また、他の態様においては、前記医薬組成物はまたアジュバントを含む。
【００２８】
さらに、本発明の別の側面では、タンパク質マイクロアレイを提供する。タンパク質マイクロアレイは、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド、または少なくとも１つのポリペプチドの抗原断片を含む。好ましい態様においては、少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号１９、２１、２３、４７、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
また、本発明の別の側面では、タンパク質マイクロアレイを提供する。タンパク質マイクロアレイは、配列番号２４、２６、２８および３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド、または少なくとも１つのポリペプチドの抗原断片を含む。好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号２５、２７、２９および３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明の別の側面では、さらなるタンパク質マイクロアレイを提供する。該マイクロアレイは、配列番号３２、３４、３６、３８、４０および５１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド、または少なくとも１つのポリペプチドの抗原断片を含む。好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号３３、３５、３７、３９、４１および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明の別の側面においては、（ｉ）配列番号１８、２０、２２、４６および４８、（ｉｉ）２４、２６、２８および３０または（ｉｉｉ）３２、３４、３６、３８、４０および５１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、複数の抗体またはその抗原結合断片、或いは前記ポリペプチドの抗原断片を含む、マイクロアレイを提供する。好ましくは、該ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１９、２１、２３、４７、４９（ｉｉ）配列番号２５、２７、２９および３１または（ｉｉｉ）配列番号３３、３５、３７、３９、４１および５２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
【００３２】
さらに、本発明の別の側面では、（ｉ）配列番号１８、２０、２２、４６および４８、（ｉｉ）２４、２６、２８および３０または（ｉｉｉ）３２、３４、３６、３８、４０および５１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子、または生物学的試料において、その相補体に選択的にハイブリダイズする少なくとも２０ヌクレオチドのその断片を含む、核酸マイクロアレイを提供する。
【００３３】
また、本発明の他の側面では、ＨＬＡ分子またはヒト抗体に結合する単離ヒトＣＴ抗原またはその一部を提供する。前記ヒトＣＴ抗原は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる。いくつかの態様において、断片はＨＬＡとの複合体の一部である。好ましくは、断片は、８〜１２アミノ酸長である。
【００３４】
本発明のさらに別の側面では、１つまたは２つ以上のヒトＣＴ抗原の発現の存在を検出するためのキットを提供する。該キットは、各々の単離された核酸分子が、（ａ）配列番号１８、２０、２２、４６または４８のいずれかのヌクレオチド配列の１２〜３２ヌクレオチドコンティグセグメント（contig segment）および（ｂ）（ａ）の相補体からなる群から選択される核酸分子から本質的になる、２または３対以上の単離された核酸を含み、ここで、コンティグセグメントが非重複性であり、各対の核酸分子は、ヒトＣＴ抗原に特異的である。ある態様において、単離された核酸分子の対が構築され、配置されて、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択される単離された核酸分子の少なくとも断片を選択的に増幅する。
【００３５】
また、本発明のさらなる側面では、ヒトＣＴ抗原の発現により特徴づけられる癌を有する対象の処置方法を提供する。該方法は、疾患を改善するのに効果的な量の、ＨＬＡ分子およびヒトＣＴ抗原の複合体の存在を対象中で選択的に豊富化する剤を対象に投与することを含む。ヒトＣＴ抗原ペプチドは、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるヒトＣＴ抗原の断片である。ある態様において、癌は、複数のヒトＣＴ抗原の発現により特徴づけられ、剤が、その各々がＨＬＡ分子および異なるヒトＣＴ抗原の複合体の存在を対象中で選択的に豊富化する複数の剤であり、ヒトＣＴ抗原の少なくとも１つが、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる。他の態様において、剤は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる単離ポリペプチドである。
【００３６】
さらに、本発明の別の側面では、対象の細胞のヒトＣＴ抗原の発現により特徴づけられる癌を有する対象の処置方法を提供する。該方法は、（ｉ）対象から免疫反応性細胞含有試料を取り出すこと、（ｉｉ）ヒトＣＴ抗原の断片であるヒトＣＴ抗原に対する細胞溶解性Ｔ細胞の産生に好都合な条件下で宿主細胞に免疫反応性細胞含有試料を接触させること、（ｉｉｉ）ヒトＣＴ抗原を発現する細胞を溶解するのに有効な量で対象に細胞溶解性Ｔ細胞を導入すること、を含む。これらの方法においては、宿主細胞がプロモーターと作動可能に連結された単離された核酸分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、単離された核酸分子は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。前記方法の他の態様においては、宿主細胞が、ヒトＣＴ抗原と結合するＨＬＡ分子を内生的に発現する。
【００３７】
さらに、本発明の別の側面においては、対象の細胞中のヒトＣＴ抗原の発現により特徴づけられる癌を有する対象の処置方法を提供する。（ｉ）癌細胞により発現される核酸分子を同定することであって、ここで、核酸分子は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、（ｉｉ）（ａ）同定された核酸分子、（ｂ）ヒトＣＴ抗原をコードするセグメントを含有する同定された核酸の断片、（ｃ）（ａ）または（ｂ）の縮重からなる群から選択される核酸で宿主細胞をトランスフェクトすること、（ｉｉｉ）トランスフェクトした宿主細胞を培養して、トランスフェクトした核酸分子を発現させること、および（ｉｖ）該状態に関連する対象の細胞に対する免疫応答を増大するのに有効な量の宿主細胞またはその抽出物を対象に導入すること、を含む。
【００３８】
ある態様において、前記方法は、核酸分子の発現産物の一部分を提示するＭＨＣ分子を同定することを含み、ここで、宿主細胞は、同定されたものと同一のＭＨＣ分子を発現し、および宿主細胞は、核酸分子の発現産物のＭＨＣ結合部分を提示する。他の態様において、免疫応答は、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答を含む。好ましくは、応答は、核酸分子の発現産物の一部を提示する宿主細胞またはヒトＣＴ抗原を発現する対象の細胞に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞の生成を含むＴ細胞応答である、
【００３９】
いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択される。さらに、他の態様においては、該方法はまた、宿主細胞を処理してそれらを非増殖性にさせることを含む。
【００４０】
また、本発明の別の側面においては、精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を処置し、または診断し、またはモニタリングするための方法を提供する。該方法は、タンパク質またはそれに由来するペプチドと特異的に結合する抗体であって、治療的または診断的に有用な剤に結合される抗体を、該状態を治療、診断またはモニタリングするのに有効な量で対象に投与すること、を含む。
【００４１】
いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。好ましくは、モノクローナル抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【００４２】
本発明の別の側面においては、精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を処置するための方法を提供する。該方法は、対象における状態を防止し、その発症を遅延し、または抑制するのに有効な量で、１つまたは２つ以上の前記医薬組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、該方法はまた、精巣でない組織内で異常量のタンパク質を対象が発現することを最初に同定することを含む。
【００４３】
本発明の別の側面では、精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を処置するための方法を提供する。該方法は、（ｉ）異常量のタンパク質を発現する細胞を対象から同定すること、（ｉｉ）前記細胞の試料を単離すること、（ｉｉｉ）前記細胞を培養すること、および（ｉｖ）前記細胞に対する免疫応答を惹起するのに有効な量で対象に前記細胞を導入すること、を含む。ある態様において、該方法はまた、対象にそれらを導入する前に前記細胞を非増殖性にすることを含む。
【００４４】
本発明の別の側面では、精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる病理学的細胞症状の治療方法を提供する。該方法は、それを必要とする対象に、タンパク質の発現または活性を抑制する有効量の剤を投与することを含む。いくつかの態様において、剤は、タンパク質と選択的に結合する抑制抗体であり、ここで、抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。他の態様においては、タンパク質をコードする核酸分子と選択的に結合するアンチセンス核酸分子である。
【００４５】
また、本発明のさらなる側面では、配列番号１９、２１、２３、４７、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸を含む複数のタンパク質に対する免疫応答を刺激するのに有用な物質の組成物を提供する。該組成物は、タンパク質の断片である複数のペプチドを含み、ここで、該ペプチドは、精巣によるものではない細胞の表面に提示される１つまたは２つ以上のＭＨＣ分子と結合する。該組成物のある態様においては、複数のペプチドの少なくとも一部分がＭＨＣ分子と結合し、それに対する細胞溶解性応答を引き出す。他の態様においては、タンパク質は、配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択ヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。好ましくは、該組成物は、アジュバントをさらに含む。好ましいアジュバントは、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキンおよび免疫増強性オリゴヌクレオチド  である。
【００４６】
本発明の別の側面では、（ｉ）配列番号１９、２１、２３、４７、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質の断片であるペプチド、および（ｉｉ）ペプチドと結合して複合体を形成するＭＨＣ分子の複合体と選択的に結合する単離された抗体を提供し、ここで（ｉ）または（ｉｉ）単独とは結合しない。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはそれらの抗原結合断片である。
【００４７】
本発明のさらなる側面では、精巣以外の細胞または組織中の配列番号１８、２０、２２、４６および４８からなる群から選択ヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるタンパク質の発現により特徴づけられる癌を有する対象を、処置、診断またはモニタリングするための方法を提供する。該方法は、該状態を処置、診断またはモニタリングするのに効果的な量で、前記抗体を、対象に投与することを含む。好ましくは、抗体は、１つまたは２つ以上の治療的または診断的に有用な剤と結合する。
【００４８】
本発明はまた、医薬の調製における遺伝子、遺伝子産物、それらの断片、それらと結合する剤等の使用も含む。好ましくは、医薬は、癌の処置に関するものである。
【００４９】
これらおよびその他の側面は、以下の発明の詳細な説明に沿って、さらに詳しく記載される。
【００５０】
発明の詳細な説明
Ｔ細胞のエピトープクローニングおよびＳＥＲＥＸ分析の結果、癌・精巣（CT）抗原の成長数が決定した。表１およびその中の引用文献を参照されたい。推定の癌・精巣抗原をコードする同定された１４の遺伝子または遺伝子ファミリーが存在する。
【００５１】
【表１】
2004532629.tif 000002
【００５２】
これら遺伝子分析を通して、以下の特性を有する産物をコードすることが明らかになる。
ｉ）正常組織のｍＲＮＡ発現は、精巣、胎児性の卵巣および胎盤に限定され、成熟した卵巣においては、ほとんどまたは全く検出されない。
ｉｉ）種々の源の癌におけるｍＲＮＡ発現は、一般的であり、複数の異なる癌種、例えば、メラノーマ、膀胱癌、肉腫の３０〜４０％が、１つまたは２つ以上のＣＴ抗原を発現する。
ｉｉｉ）Ｘ染色体は、ＣＴ抗原の大部分をコードするが、最近定義されたＣＴコード遺伝子の大部分は、非Ｘ染色体座を有する。
ｉｖ）正常な成熟した卵巣においては、ＣＴ抗原の発現は、本質的に、未熟な生殖細胞、例えば、精原細胞（３１）に制限される。しかしながら、最近定義されたＣＴ抗原、ＯＹ−ＴＥＳ−１は、明らかに精子の成熟の後期段階に含まれる（下記を参照）。胎児性の卵巣においては、未熟な生殖細胞（卵原細胞／一次卵母細胞）は、ＣＴ抗原を発現するが、増殖していない原始卵胞の卵母細胞は発現しない（３２）。胎児性の胎盤おいては、細胞栄養芽層および合胞体層は共にＣＴ抗原を発現するが、満期（term）の胎盤においては、ＣＴ抗原発現は、ほとんどまたは全く見られない（３３）。
【００５３】
ｖ）ＣＴ抗原発現の高可変パターンは、一般的に同質的な発現パターンを有する他の腫瘍に対する唯一の単一陽性細胞陽性または陽性細胞の小さなクラスターを示す腫瘍とは異なる癌において確認された（３１、３４）。
ｖｉ）調整遺伝子発現におけるいくつかの役割は明らかになっているが、多くのＣＴ抗原の機能は知られていない。しかしながら、２つのＣＴ抗原は、配偶子の発達−ＳＣＰ−１（シナプトネマ構造タンパク質）において役割を有し、減数分裂における染色体還元に関与し（３５）、ＯＹ−ＴＥＳ−１は、精子頭部（sperm head）のアクロソームのアクロシンのパッケージングに関与すると考えられるプロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２前駆体である（３６）。
ｖｉｉ）ＣＴ発現は、腫瘍発達および悪性の可能性が高い腫瘍と相関することの証拠となる。例えば、高頻度のＭＡＧＥｍＲＮＡ発現は、転移性と 原発性メラノーマ（３７）および侵略性と表在性膀胱癌（３８）および膀胱癌のＮＹ−ＥＳＯ−１発現は、核異型度と相関する（３９）。
ｖｉｉ）異なるＣＴ抗原の固有の免疫原性の多数の変化は、抗原陽性腫瘍を有する患者の特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞そして抗体応答により示される。今日まで、ＮＹ−ＥＳＯ−１は、任意のＣＴ抗原の最も強い自発的な免疫原性を有し、例えば、進行したＮＹ−ＥＳＯ−１＋腫瘍を有する患者の５０％までは、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する体液性および細胞性免疫を発達させる（４０、４１）。
【００５４】
これらの特性は、診断剤および治療剤における使用に癌・精巣抗原が望ましいことを示す。これらの特性はまた、さらなる癌・精巣抗原の同定の基礎を提供する。
【００５５】
他に、公的なデータベースにおいて、バイオインフォマティクス技術の使用により、癌関連配列の同定がなされた（例えば、データベースマイニングおよび蛍光−ＰＣＲ発現による迅速スクリーニング：Loging et al., Genome Res 10 (9): 1393-402,2000）が、これら技術は、好ましい癌・精巣抗原をプロファイルする核酸配列の同定を中心とするものではなかった。特に、本発明は、一層厳格な基準により癌・精巣配列の同定を含む。癌・精巣抗原配列のためのデータベース分析基準は、配列が、少なくとも２つの異なる組織による癌に発現されることを必要とし、そして好ましくは、少なくとも３つの異なる組織による癌に発現される。さらに、該配列は、好ましくは、精巣、胎盤および卵巣（好ましくは、胎児の卵巣のみ）からなる群から選択される１つまたは２つ以上の組織に制限される正常組織発現を有する。
【００５６】
上記の概要および以下の説明において、配列のリストが提供される。リストは、各々の単一配列を別々に、２つまたはそれ以上の配列が同一遺伝子の一部を形成する場合にはそれらを一緒に、各々及びすべての組合せが別々にかつ特定的に列挙されるかのように、リスト上の総数を含めてその数までの異なる遺伝子に関連がある２つまたはそれ以上の配列の任意の組合せを含むよう意図される。同様に、断片サイズを記述する場合、各々及びすべての断片長が特定的に列挙されるかのように意図される配列（それが断片であるよう１ヌクレオチドまたはアミノ酸より小さい）の言及した最小断片から全長までを一範囲が含むよう意図される。したがって、断片が長さ１０〜１５であり得る場合、それは長さ１０、１１、１２、１３、１４または１５を意味するよう明瞭に意図される。
【００５７】
要約および特許請求の範囲は、抗原前駆体および抗原を記述する。概要および特許請求の範囲で用いる場合、前駆体は、単離ＤＮＡのコード領域によりコードされる実質的に全長のタンパク質であり、抗原は、ＭＨＣ、好ましくはＨＬＡと複合体をなし、その複合体の一部として免疫応答に関与するペプチドである。このような抗原は、典型的には９アミノ酸長であるが、これはわずかに変わり得る。
【００５８】
本明細書中で用いる場合、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類である。全実施態様において、現在同定された癌関連抗原と同一の実質的なヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を有するヒト癌抗原およびヒト対象が好ましい。
【００５９】
一側面において、本発明は、癌および正常細胞に独占的に発現された転写産物に対するデータベースマイニング（例えば、ユニジーン）によりヒトＣＴ遺伝子産物の同定を含む。続く、候補転写産物のｍＲＮＡ発現分析により高く制限されたｍＲＮＡ発現パターンを有するいくつかの遺伝子産物を同定し、これらのいくつかはＣＴ抗原として分類された。本明細書に記載の方法により同定されたＣＴ抗原遺伝子を表す配列は、添付の配列表に示される。本発明の他の側面は、癌を有する対象の自己由来の抗血清を用いるヒトＣＴ抗原の同定を含む。癌患者の免疫システムにより認識されるＣＴ抗原をコードする配列の性質は、当然ながら、予期することはできない。
【００６０】
したがって、本発明の一側面においては、ＣＴ抗原ポリペプチド、それらポリペプチドをコードする遺伝子、機能的な修飾および前記の変異体、前記の有用な断片並びにそれらに関する診断剤および治療剤を含む。
【００６１】
本発明のＣＴ抗原核酸のホモログおよびアレレは、実施例で用いられる技術を含む慣用的な方法により同定することができる。したがって、本発明の一側面は、それらＣＴ抗原前駆体をコードする核酸配列である。
【００６２】
「ストリンジェントな条件」という用語は、本明細書中で用いる場合、当分野において精通されているパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションパラメータは、このような方法を編集する参考文献、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出され得る。特に、ストリンジェントな条件は、本明細書中で用いる場合、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中での６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム／０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり、ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転移された膜を、例えば２ｘＳＳＣ中で室温で洗浄し、次に０．１〜０．５ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳ中で６８℃までの温度で洗浄する。
【００６３】
使用できる、同程度のストリンジェンシーを生じるその他の条件、試薬などが存在する。当業者はこのような条件に精通しており、したがって、それらはここでは示されない。しかしながら、当業者は、本発明の癌関連抗原核酸の相同体および対立遺伝子の明白な同定を可能にするような方法で（例えば、より低いストリンジェントな条件を用いて）条件を操作し得る、と理解されるであろう。当業者は、このような分子の発現のための細胞およびライブラリーをスクリーニングし、次にルーチンに単離した後、関連する核酸分子を単離し、そしてシークエンシングするための方法にも精通している。
【００６４】
概して、相同体および対立遺伝子は、典型的にはそれぞれ、癌関連抗原核酸およびポリペプチドの配列と少なくとも７５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有し、いくつかの場合には、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有し、そしてさらに他の場合には、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有するであろう。相同性は、インターネット（ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/）を介して得られるＮＣＢＩ（Bethesda, Maryland）により開発された種々の公的に利用可能なソフトウェアツールを用いて算定され得る。ツールの例としては、デフォルト設定を用いて、http://www.ncbi.nlm.nih.govにて利用可能なＢＬＡＳＴシステムが挙げられる。Pairwise and ClustalWアラインメント（BLOSUM30マトリックス設定）ならびにKyte-Doolittle水治療法分析は、Mac Vector配列分析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を用いて得られる。前記の核酸のワトソン−クリック相補体も本発明に包含される。
【００６５】
癌関連抗原遺伝子に関するスクリーニングにおいて、サザンブロットは、放射性プローブとともに前記の条件を用いて実施され得る。ＤＮＡが最終的に転移された膜を洗浄後、その膜は、放射性シグナルを検出するためにＸ線フィルムに接触するように置かれる。癌関連抗原核酸の発現に関するスクリーニングにおいて、前記の条件を用いるノーザンブロットハイブリダイゼーションは、癌患者から、または癌関連抗原遺伝子の発現により特徴づけられる症状を有する疑いのある対象から採取された試料に対して実施され得る。示された配列とハイブリダイズするプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応のような増幅プロトコルも、癌関連抗原遺伝子またはその発現の検出のために用いられ得る。
【００６６】
本発明は、ネイティブ物質中に存在するものに対する代替的コドンを含む縮重核酸も含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによりコードされる。６つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的に関して等価である。したがって、延長癌関連抗原ポリペプチドにin vitroまたはin vivoでセリン残基を組み入れるようセリンコードヌクレオチドトリプレットのいずれかを、タンパク質合成装置を指図するために用いることができる、ということは当業者には明らかである。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＴ（トレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンコドン）；ならびにＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）が挙げられるが、これらに限定されない。その他のアミノ酸残基は、多重ヌクレオチド配列により同様にコードされる。したがって、本発明は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列中の生物学的単離された核酸とは異なる縮重核酸を含む。
【００６７】
本発明は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む修飾核酸分子も提供する。好ましい実施態様では、これらの修飾核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドは、非修飾核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能、例えば抗原性、酵素活性、受容体結合、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子によるペプチドの結合による複合体の形成等を保持する。ある種の実施態様では、修飾核酸分子は、修飾ポリペプチド、好ましくは本明細書中に別記されているような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。修飾核酸分子は、非修飾核酸分子と構造的に関連があり、好ましい実施態様では、修飾および非修飾核酸分子が当業者に既知のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするよう、非修飾核酸分子と十分に構造的に関連がある。
【００６８】
例えば、単一のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする修飾核酸分子を調製することができる。これらの核酸分子は各々、本明細書中に記載するような遺伝暗号の縮重に対応するヌクレオチド変化と相容れない１、２または３つのヌクレオチド置換を有し得る。同様に、２つのアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする修飾核酸分子を調製することができるが、これらは例えば２〜６のヌクレオチド変化を有する。例えばアミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６等をコードするコドンのヌクレオチドの置換を含めたこれらと同様の多数の修飾核酸分子が当業者により容易に想像される。上記の例では、２つのアミノ酸の各組合せは、修飾核酸分子組に、ならびにアミノ酸置換をコードするすべてのヌクレオチド置換に含まれる。当業者に容易に想像されるように、さらなる置換（即ち、３またはそれ以上）、付加または欠失（例えば、停止コドンまたはスプライス部位（単数または複数）の導入による）を有するポリペプチドをコードする付加的核酸分子も調製することができるし、本発明に包含される。上記の核酸またはポリペプチドはいずれも、本明細書中に開示される核酸および／またはポリペプチドに対する構造的関連または活性の保持に関して、ルーチン実験により試験することができる。
【００６９】
本発明は、ＣＴ抗原核酸配列またはその相補体の単離断片、好ましくは非反復断片も提供する。非反復断片は、大型核酸に関する「特徴」である断片である。それは、例えば、上記のＣＴ抗原核酸外のヒトゲノム（およびヒト対立遺伝子）内の分子中にその正確な配列が見出されないことを保証するのに十分な長さである。当業者は、断片がヒトゲノム内で非反復(unique)であるか否かを決定するためにルーチン手法を適用することができ、例えば、ヒトゲノムの他の配列から対象の配列断片を選択的に区別するための、公的に利用することができる配列比較ソフトウェアを用いることができるが、in vitroにおける確認ハイブリダイゼーションおよびシークエンシング分析も実施できる。
【００７０】
断片、好ましくは非反復断片は、このような核酸を同定するために、サザンおよびノーザンブロット検定におけるプローブとして用いることができ、あるいはＰＣＲを用いる検定のような増幅検定に用いることができる。当業者には既知のように、大型プローブ、例えば２００、２５０、３００またはそれ以上のヌクレオチドが、ある種の用途、例えばサザンおよびノーザンブロットには好ましいが、一方、小型断片は、ＰＣＲのような用途のために好ましい。断片は、抗体を生成するか、またはポリペプチド断片の結合を決定するために、あるいはイムノ検定構成成分を生成するために融合タンパク質を産生するためにも用いることができる。同様に、断片は、例えば抗体の調製に、およびイムノ検定に有用なＣＴ抗原ポリペプチドの非融合断片を産生するために用いることができる。断片はさらに、特に以下でより詳細に記載されるような治療目的のために、ＣＴ抗原核酸およびポリペプチドの発現を抑制するためのアンチセンス分子として用いることできる。
【００７１】
上記のように、本開示は、第１ヌクレオチドから開始して、第２ヌクレオチドと、最後の８ヌクレオチドまでの短さで、各配列に関して第８、９、１０から最後のヌクレオチドまで、あらゆる場所で終わる、各配列の各々のおよびすべての断片を含むよう意図する。好ましい断片は増幅プライマーとして有用なもの、例えば、塩基長が、典型的には１２〜３２ヌクレオチド間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２）のものである。
【００７２】
当業者は、典型的に必要なすべてである既知のデータベース上の配列に対する断片のヒトゲノム中の他の配列から、当該配列を選択的に区別する非反復断片の能力に典型的に基づいて、かかる配列を選択する方法によく精通しているが、in vitro確認ハイブリダイゼーションおよびシークエンシング分析を実施しても良い。
【００７３】
特に好ましい核酸分子としては、「ポリトープ」として既知の一連のエピトープをコードする核酸が挙げられる。エピトープは、天然フランキング配列を用いて、または用いずに、シークエンシャルまたはオーバーラップ方式で整列することができる（例えば、Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15:1280-1284, 1997を参照）し、所望により、非関連リンカー配列により分離することができる。ポリトープは、免疫応答の発生のための免疫系により認識される個々のエピトープを生成するようプロセッシングされる。
【００７４】
したがって、例えば本明細書中に開示された核酸の１つによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド由来のペプチドであって、ＭＨＣ分子により提示され、ＣＴＬまたはＴヘルパーリンパ球により認識されるペプチドは、１つまたはそれ以上のその他のＣＴ抗原からのペプチドと併合されて（例えば、ハイブリッド核酸またはポリペプチドの調製により）、「ポリトープ」を形成し得る。２つまたは３つ以上のペプチド（またはペプチドをコードする核酸）は、本明細書中に記載されたものから選択され得るか、あるいはそれらは、従来から知られているＣＴ抗原の１つまたは２つ以上のペプチドを含み得る。免疫応答を誘導または強化するために投与することができる癌関連ペプチド抗原の例は、腫瘍関連遺伝子およびコードされたタンパク質、例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−１、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ｂ４、チロシナーゼ、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、メラン−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５、ＮＹ  ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７から得られる（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９６／１０５７７号を参照）。その他の例は、当業者に既知であり、本明細書に開示されたような同様の方式で本発明に用いることできる。ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの他の例は、当業者に既知であるであろう。
【００７５】
例えば、以下の文献を参照することができる：
【表２】
2004532629.tif 000003
【００７６】
当業者は、１つまたは２つ以上のＣＴ抗原ペプチドおよび１つまたは２つ以上の上記の癌関連ペプチドを含むポリペプチド、あるいはこのようなポリペプチドをコードする核酸を、分子生物学の標準手法にしたがって、調製することができる。
【００７７】
したがって、ポリトープは、種々の配列で（例えば連鎖状、オーバーラッピング）ともに接合することができる２つまたはそれ以上の潜在性免疫原性または免疫応答刺激性ペプチドの群である。ポリトープ（またはポリトープをコードする核酸）は、免疫応答を刺激し、強化し、および／または惹起する場合のポリトープの有効性を試験するために、標準免疫処置プロトコルで、例えば動物に投与することができる。
【００７８】
ペプチドは、直接的に、またはフランキング配列の使用を介して、ともに接合されポリトープを形成することができる。ワクチンとしてのポリトープの使用は当分野で周知である（例えば、Thomson et al., Proc. Acad. Natl. Acad. Sci. USA 92（13）:5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15（12）:1280-1284, 1997; Thomson et al., J. Immunol. 157（2）:822-826, 1996; Tam et al., J. Exp. Med. 171（1）:299-306, 1990を参照）。例えば、Tamは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ結合エピトープの両方からなるポリトープがマウスモデルにおいて抗体および防御免疫を首尾よく生成することを示した。Tamは、エピトープの「列」を含むポリトープがプロセッシングされて、ＭＨＣ分子により提示されＣＴＬにより認識される個々のエピトープを産生することも実証した。したがって、種々の数および組合せのエピトープを含有するポリトープが調製され、ＣＴＬによる認識に関して、および免疫応答を増大する効力に関して試験することができる。
【００７９】
腫瘍は一組の腫瘍抗原を発現し、そのうちのある種のサブセットのみが任意の所与の患者の腫瘍で発現され得ることが知られている。特定の患者に発現される腫瘍拒絶抗原のサブセットを示すエピトープの異なる組合せに対応するポリトープを調製することができる。ポリトープは、腫瘍型により発現されることが知られているより広範囲の腫瘍拒絶抗原を反映するよう調製することができる。ポリトープは、ポリペプチド構造物として、または当分野で既知の核酸送達系の使用を介して、かかる処置を必要とする患者に導入することができる（例えば、Allsopp et al., Eur. J. Immunol. 26（8）:1951-1959, 1996を参照）。アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｔｙ−ウイルス様粒子、アデノ関連ウイルス、プラスミド、細菌等を、このような送達に用いることができる。ポリトープ送達系の効力を決定するために、マウスモデルにおいて該送達系を試験し得る。この系は、ヒト臨床試験においても試験することができる。
【００８０】
ＨＬＡクラスＩ分子がＣＴ抗原から得られる腫瘍拒絶抗原を提示する場合、発現ベクターは、これらの核酸およびポリペプチドに由来する任意の特定の腫瘍拒絶抗原を提示するＭＨＣ分子をコードする核酸配列も含み得る。あるいは、このようなＭＨＣ分子をコードする核酸分子は、別個の発現ベクター内に含入することができる。ベクターが両コード配列を含有する状況では、単一ベクターは、いずれか一方を正常に発現しない細胞をトランスフェクトするために用いることできる。ＣＴ抗原前駆体、およびそれを提示するＭＨＣ分子をコードする配列が別個の発現ベクターに含有される場合、発現ベクターは共トランスフェクトされ得る。ＣＴ抗原前駆体コード配列は、例えば宿主細胞がすでに前駆体分子由来のＣＴ抗原を提示するＭＨＣ分子を発現している場合には、単独で用いることできる。当然ながら、用いることできる特定の宿主細胞に関して制限はない。２つのコード配列を含有するベクターは所望により任意の抗原提示細胞に用いることできるので、ＣＴ抗原前駆体に関する遺伝子は、ＣＴ抗原を提示するＭＨＣ分子を発現しない宿主細胞で用いることできる。さらに、無細胞転写系を、細胞の代わりに用いることできる。
【００８１】
上述したように、本発明はＣＴ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子と選択的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、ＣＴ抗原の発現を減少させる。これは、ＣＴ抗原の発現の減少が望ましい実質的にあらゆる医療状態において、例えば癌治療において望ましい。これはまた、１つまたはそれ以上のＣＴ抗原の発現の減少の効果をin vitroまたはin vivoにて試験するのに有用である。
【００８２】
本明細書中で用いる場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語は、生理学的条件下で、特定の遺伝子を包含するＤＮＡと、またはその遺伝子のｍＲＮＡ転写体とハイブリダイズして、それによりその遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を抑制するオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチドまたは修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを表現する。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写体とのハイブリダイゼーション時に標的遺伝子の転写または翻訳を妨げるよう設計される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的とのその相補性の程度は、標的の配列、ならびにその配列を包含する特定の塩基を含めて、選択される特異的な標的に依存すると当業者は認識するであろう。生理学的条件下で標的と選択的に結合するよう、即ち、生理学的条件下で標的細胞中の他のいかなる配列とよりも実質的に多く、標的配列とハイブリダイズするように、アンチセンスオリゴヌクレオチドが構築され、配列されるのが好ましい。ＣＴ抗原をコードする核酸の配列を基礎にして、あるいは対立遺伝子または相同性ゲノムおよび／またはｃＤＮＡ配列を基礎にして、当業者は、本発明にしたがって用いるための任意の多数の適切なアンチセンス分子を容易に選定し、合成し得る。
【００８３】
抑制に対して十分に選択的で、かつ効力があるようにするために、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的と相補的である少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも１５の連続した塩基を包含すべきであるが、場合によっては、７塩基長という短い修飾オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドとして首尾よく用いられている（Wagner et al., Nature Biotechnol. 14:840-844, 1996）。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補的配列を包含する。
【００８４】
遺伝子またはｍＲＮＡ転写体の任意の領域に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドを選択してもよいが、好ましい実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮ−末端または５’上流部位、例えば翻訳開始、転写開始またはプロモーター部位に対応する。さらに、３’−非翻訳領域を標的化してもよい。ｍＲＮＡスプライシング部位に対する標的化も当分野で用いられてきたが、代替的ｍＲＮＡスプライシングが起こる場合には、あまり好ましくないこともある。さらに、アンチセンスは、好ましくは、ｍＲＮＡ二次構造が予期されず（例えば、Sainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14（5）:439-457, 1994を参照）、かつタンパク質が結合することが予期されない部位に対して標的化される。好適なアンチセンス分子は、ＣＴ抗原核酸に対応するオーバーラップオリゴヌクレオチドが合成され、発現を阻害する能力を試験し、センス転写産物の劣化の引き起こす「ジーンウォーク（gene walk）実験により同定することができる。最後に、列挙した配列はｃＤＮＡ配列であるが、当業者は、ＣＴ抗原のｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡを容易に得る場合がある。したがって、本発明は、ＣＴ抗原をコードする核酸に対応するゲノムＤＮＡと相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供する。同様に、対立遺伝子ｃＤＮＡ、相同性ｃＤＮＡ（例えば、ヒト）およびゲノムＤＮＡに対するアンチセンスは、過度の実験を伴わずに与えられる。
【００８５】
一組の実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「天然」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの任意の組合せで構成することができる。即ち、天然系における場合と同様に、ホスホジエステルヌクレオシド間結合により、あるネイティブヌクレオチドの５’末端および別のネイティブヌクレオチドの３’末端は共有結合することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、手動で実行することができる、当分野で認識された方法により、または自動合成機により調製することができる。該オリゴヌクレオチドはまた、ベクターにより組換え的に生産することができる。
【００８６】
しかしながら、好ましい実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「修飾」オリゴヌクレオチドも含み得る。即ち、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがそれらの標的とハイブリダイズしないようにするが、それらの安定性または標的化を強化する、あるいはそうでなければそれらの治療的有効性を強化する多数の方法で修飾することができる。
【００８７】
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で用いられる場合、（１）そのヌクレオチドのうちの少なくとも２つが合成ヌクレオシド間結合（即ち、あるヌクレオチドの５’末端および別のヌクレオチドの３’末端間のホスホジエステル結合以外の結合）により共有結合され、および／または（２）核酸と正常に連合されない化学基がオリゴヌクレオチドと共有結合されたオリゴヌクレオチドを記述する。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【００８８】
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、共有的修飾塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドも含む。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、３’位置のヒドロキシル基以外の、および５’位置のホスフェート基以外の低分子量有機基と共有結合される主鎖糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。したがって、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、修飾オリゴヌクレオチドは、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含み得る。例えば、Ｃ−５プロピン修飾塩基などの類似塩基もまた包含される（Nature Biotechnol. 14:840-844, 1996）。したがって本発明は、ＣＴ抗原ポリペプチドをコードする核酸と、相補的であり、かつ生理学的条件下で、それらとハイブリダイズすることができる修飾アンチセンス分子を、薬学的に許容し得る担体とともに含有する医薬製剤を意図する。
【００８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の一部として投与することができる。かかる医薬組成物は、当業者に公知の標準的な生理学的および／または薬学的に許容し得る担体と組み合わせたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。該組成物は、滅菌され、患者への投与において適切な重量または容量単位の治療的に有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有すべきである。「薬学的に許容し得る」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。「生理学的に許容し得る」という用語は、例えば、細胞、細胞培養、組織、生物体などの生物学的な系に適合する非毒性物質を意味する。該担体の特性は、投与経路に依存するであろう。生理学的および薬学的に許容し得る担体は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、防腐剤、可溶化剤およびさらに以下で記載される当業者に十分に既知の他の材料を含む。
【００９０】
本明細書中で用いる場合、「ベクター」とは、異なる遺伝子環境間の輸送のための、または宿主細胞中での発現のための制限および連結により所望の配列を挿入することができる多数の核酸のいずれかであり得る。ベクターは、典型的にはＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、プラスミド、ファージミドおよびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞中で自律的に複製可能であるか、またはゲノム中に組み込まれ得るものであって、かつ新規の組換えベクターが宿主細胞中で複製するその能力を保持するようにベクターが決定可能な様式で切断され、そしてこれに所望のＤＮＡ配列を連結することができる１つまたは２つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によりさらに特徴づけられるものである。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数を増大する場合は多数回起こるし、あるいは宿主が有糸分裂により繁殖する前には宿主当たり１回だけ起こり得る。ファージの場合は、複製は、溶菌期中は能動的に起こり、溶原期中は受動的に起こり得る。発現ベクターは、調節配列に作動可能に連結され、そしてＲＮＡ転写体として発現することができるように、所望のＤＮＡ配列を制限および連結により挿入することができるものである。ベクターは、細胞がベクターで形質転換またはトランスフェクトされていたかあるいはされていなかったかを同定する際に用いるのに適した１つまたはそれ以上のマーカー配列をさらに含有し得る。マーカーとしては、例えば、抗生物質またはその他の化合物に対する耐性または感受性を増大または低減するタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当分野で既知の標準検定により検出可能である酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）をコードする遺伝子、ならびに形質転換したまたはトランスフェクトした細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に視覚的に作用する遺伝子（例えば、グリーン蛍光タンパク質）が挙げられる。好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されているＤＮＡセグメント中に存在する構造遺伝子産物の自律的複製および発現が可能なベクターである。
【００９１】
本明細書中で用いる場合、コード配列および調節配列は、調節配列の影響または制御下にコード配列の発現または転写を置くような方法でそれらが共有結合される場合、「作動可能に（operably）」連結されると言われている。コード配列が機能性タンパク質に翻訳されるのが望ましい場合、５’調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写を生じ、二つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入を生じない、（２）コード配列の転写を指図するプロモーター領域の能力を妨げない、または（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写体の能力を妨げないならば、二つのＤＮＡ配列は作動可能に連結されると言われている。したがって、結果的に生じる転写体が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳することができるようにプロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写を実行可能であった場合には、プロモーター領域はコード配列と作動可能に連結されるであろう。
【００９２】
遺伝子発現に必要とされる調節配列の的確な性質は種または細胞型間で変わり得るが、概して、必要な場合には、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写化および５’非翻訳化配列を含むであろう。特に、このような５’非転写調節配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。調節配列は、望ましい場合には、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含み得る。本発明のベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列を任意に含み得る。適切なベクターの選定および設計は、当業者の能力および自由裁量の範囲内である。
【００９３】
発現のための必要な要素をすべて含有する発現ベクターは市販されており、当業者に既知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照）。細胞は、癌関連抗原ポリペプチドあるいはその断片または変異体をコードする異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞への導入により遺伝子工学処理される。その異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、宿主細胞中での異種ＤＮＡの発現を可能にするために転写性素子の操作可能制御下に置かれる。
【００９４】
哺乳類細胞中でのｍＲＮＡ発現のための好ましい系は、Ｇ４１８耐性を付与する遺伝子（安定トランスフェクトした細胞系の選択を促す）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列のような選択可能マーカーを含有するｐｃＤＮＡ３．１およびｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad, CAから入手可能）のような系である。さらに、霊長類またはイヌ細胞系中での発現に適しているのは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含有し、多重コピー染色体外要素としてのプラスミドの保持を促すｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）である。別の発現ベクターは、in vitroでの転写を効率的に刺激するポリペプチド延長因子１αのプロモーターを含有するｐＥＦ  ＢＯＳプラスミドである。本プラスミドは、Mishizuma and Nagata（Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990）により記載されており、トランスフェクション実験におけるその使用は、例えばDemoulin（Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716, 1996）により開示されている。さらに別の好ましい発現ベクターは、Stratford-Perricaudetにより記載されたアデノウイルスであり、これはＥ１およびＥ３タンパク質を欠いている（J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992）。抗原の発現のためのAdeno.Ｐ１Ａ組換え体としてのアデノウイルスの使用は、Ｐ１Ａに対する免疫処置のためのマウスにおける皮内注射において、Warnier等により開示されている（Int. J Cancer, 67:303-310, 1996）。
【００９５】
本発明は、当業者が所望の単数または複数の発現ベクターを調製するのを可能にするいわゆる発現キットも含む。かかる発現キットは、少なくとも別々の部分のベクターおよび１つまたは２つ以上の上述のＣＴ抗原核酸分子を含む。その他の構成成分は、必要とされる上述の核酸分子が含まれる限り、所望により添加することができる。本発明は、ＣＴ抗原核酸とハイブリダイズする少なくとも一対の増幅プライマーを含めた癌関連抗原核酸の増幅のためのキットも含む。プライマーは、好ましくは１２〜３２のヌクレオチド長であり、「プライマー二量体」の形成を防止するために非重複性である。ＣＴ抗原核酸の増幅を可能にする配列で、プライマーの１つは、ＣＴ抗原核酸の一方の鎖とハイブリダイズし、第二プライマーはＣＴ抗原核酸の相補的鎖とハイブリダイズする。適切なプライマー対の選択は、当分野の標準である。例えば、選択は、このような目的のために設計されたコンピュータープログラムの助けを借りて、任意にその後、増幅特異性および効率に関してプライマーを検査することによりなすことができる。
【００９６】
本発明は、細胞および動物におけるＣＴ抗原遺伝子「ノックアウト」および「ノックイン」の構築およびトランスジェニックも可能にして、癌および癌に対する免疫系応答のある種の態様を試験するための物質を提供する。
【００９７】
本発明は、上記のＣＴ抗原核酸によりコードされる単離ポリペプチド（全タンパク質および部分タンパク質を含む）も提供する。かかるポリペプチドは、例えば単独で、または抗体を生成するための融合タンパク質として、イムノ検定または診断検定の構成成分として、あるいは治療薬として有用である。ＣＴ抗原ポリペプチドは、組織または細胞ホモジネートを含めた生物学的試料から単離されて、発現系に適した発現ベクターを構築し、発現系に発現ベクターを導入し、かつ組換え的発現タンパク質を単離することにより、種々の原核生物および真核生物発現系中で組換え的に発現することができる。タンパク質断片および抗原性ペプチド（免疫認識のために細胞の表面のＭＨＣ分子により提示されるような）を含めた短いポリペプチドも、ペプチド合成の十分に確立された方法を用いて化学的に合成することができる。
【００９８】
ＣＴ抗原ポリペプチドの非反復断片は、概して、核酸と関連して上記のような非反復断片の特徴および特性を有する。当業者に認識されるように、非反復断片のサイズは、断片が保存タンパク質ドメインの一部を構成するか否かといったような剤に依存している。したがって、ＣＴ抗原のいくつかの領域は、より長いセグメントが非反復であるよう求めるが、その他は、典型的には５〜１２アミノ酸（例えば、全長までの各整数を含めた５、６、７、８、９、１０、１１または１２アミノ酸、または全長までのそれぞれの整数値を含むより長いアミノ酸）の短いセグメントのみを要する。
【００９９】
ＣＴ抗原ポリペプチドの断片は、好ましくはポリペプチドの機能的容量を保持する断片である。ポリペプチドの断片において、保持することができる機能的容量は、抗体との相互作用、他のポリペプチドまたはその断片との相互作用、核酸またはタンパク質の選択的結合、および酵素活性を含む。重要な一活性は、ポリペプチドを同定するための徴候として作用する能力である。別のものは、ＭＬＡと複合体をなし、ヒトにおいて免疫応答を惹起する能力である。当業者は、典型的には、非ファミリー構成要素から当該配列を選択的に区別する非反復断片の能力に基づいて、非反復アミノ酸配列を選択するための方法に精通している。典型的に、断片の配列と既知のデータベース上の配列との比較が、必要なすべてである。
【０１００】
本発明は、上記のＣＴ抗原ポリペプチドの変異体を含む。本明細書中で用いる場合、癌関連抗原ポリペプチドの「変異体」とは、ＣＴ抗原ポリペプチドの一次のアミノ酸配列に対する１つまたはそれ以上の修飾を含有するポリペプチドである。ＣＴ抗原変異体を作り出す修飾は、ＣＴ抗原ポリペプチドに対してなされて、１）ＣＴ抗原ポリペプチドの活性を低減または排除し、２）ＣＴ抗原ポリペプチドの特性、例えば発現系におけるタンパク質安定性またはタンパク質−タンパク質結合の安定性を強化し、３）ＣＴ抗原ポリペプチドに対する新規の活性または特性、例えば抗原性エピトープの付加または検出可能部分の付加を提供し、あるいは４）ＭＨＣ分子との等価のまたはより良好な結合を提供する。ＣＴ抗原ポリペプチドに対する修飾は、典型的にはＣＴ抗原ポリペプチドをコードする核酸に対してなされ、欠失、点突然変異、切頭化、アミノ酸置換およびアミノ酸または非アミノ酸部分の付加を含み得る。あるいは、修飾は、例えば切断、リンカー分子の付加、ビオチンのような検出可能部分の付加、脂肪酸の付加等により、ポリペプチドに対して直接なすことができる。修飾は、ＣＴ抗原アミノ酸配列の全部または一部を含む融合タンパク質も含む。当業者は、タンパク質配列における変化のタンパク質配座に及ぼす作用の予測方法に精通しており、したがって、既知の方法により変異体ＣＴ抗原ポリペプチドを「設計」し得る。このような方法の一例は、Dahiyat and MayoによりScience 278: 82-87, 1997に記載されており、それによりタンパク質は新規に設計することができる。本方法は、既知のタンパク質に適用されて、ポリペプチド配列の一部分のみを変更し得る。DahiyatとMayoの計算方法を適用することにより、ＣＴ抗原ポリペプチドの特定の変異体が提唱され、その変異体が所望の配座を保持するか否かを決定するために試験することができる。
【０１０１】
概して、変異体は、その所望の生理学的活性に関連しないポリペプチドの特徴を変更するために特異的に修飾されるＣＴ抗原ポリペプチドを含む。例えば、システイン残基は、置換または欠失されて、望ましくないジスルフィド結合を防止し得る。同様に、ある種のアミノ酸は、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質分解を排除することによりＣＴ抗原ポリペプチドの発現を強化するよう変更することができる（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系中の二塩基性アミノ酸残基）。
【０１０２】
ＣＴ抗原ポリペプチドをコードする核酸の突然変異は、好ましくはコード配列のアミノ酸リーディングフレームを保存し、好ましくは、ハイブリダイズして変異体ポリペプチドの発現に有害であり得るヘアピンまたはループのような二次構造を形成すると思われる核酸中の領域を作製しない。
【０１０３】
突然変異は、アミノ酸置換を選択することにより、またはポリペプチドをコードする核酸中の選定部位のランダム突然変異誘発によりなすることができる。次に変異体ポリペプチドが発現され、１つまたはそれ以上の活性に関して試験されて、どの突然変異が所望の特性を有する変異体ポリペプチドを提供するか否かを決定する。ポリペプチドのアミノ酸配列についてサイレントであるが、特定の宿主中での翻訳のための好ましいコドンを提供するさらに別の突然変異が、変異体に対して（または非変異体ＣＴ抗原ポリペプチドに対して）なすることができる。例えば大腸菌中での核酸の翻訳のための好ましいコドンは、当業者には周知である。ＣＴ抗原遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して、さらに他の突然変異がなされて、ポリペプチドの発現を強化し得る。ＣＴ抗原ポリペプチドの変異体の活性は、細菌または哺乳類発現ベクター中に変異体ＣＴ抗原ポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、変異体ＣＴ抗原ポリペプチドを発現させ、そして本明細書中に開示した上記のようなＣＴ抗原ポリペプチドの機能的能力に関して試験することにより、試験することができる。例えば、変異体ＣＴ抗原ポリペプチドは、実施例に開示されているような自系および同種異系血清との反応に関して試験することができる。その他の変異体ポリペプチドの調製は、当業者には理解されるように、その他の活性の試験に好都合であり得る。
【０１０４】
当業者は、ＣＴ抗原ポリペプチドで保存的アミノ酸置換がなされて、上記のポリペプチドの機能的均等な変異体、即ち、ＣＴ抗原ポリペプチドの機能的能力を保持する変異体を提供し得るということも認識するであろう。本明細書中で用いる場合、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的電荷またはサイズ特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。変異体は、当業者に既知のポリペプチド配列を変更するための方法をまとめた参考文献中に、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出されるような方法により調製することができる。ＣＴ抗原ポリペプチドの機能的均等な変異体の例としては、本明細書中に開示したタンパク質のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換が挙げられる。アミノ酸の保存的置換としては、以下の群内のアミノ酸間でなされる置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【０１０５】
例えば、癌関連抗原ポリペプチド由来のペプチドがＭＨＣ分子により提示され、ＣＴＬにより認識されることを決定する際に（以下の例において記載されるように）、ペプチドのアミノ酸配列に対して、特にＭＨＣ分子との直接接点ではないと考えられる残基での、保存的アミノ酸置換をなし得る。当業者は、マーキングした変異体のペプチドのこれら残基を知っており、そして、選択的に他のアミノ酸残基を置換するであろう。また、特定のアンカー残基のコンセンサスアミノ酸の他のメンバーを用いることもできる。例えば、ＨＬＡ−Ｂ３５に対するコンセンサスアンカー残基は、２位置のＰおよび９位置のＹ、Ｆ、Ｍ、ＬまたはＩである。したがって、ペプチドの９位置のチロシン（Ｙ）の場合は、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）を置換し、該ペプチドのアンカー残基の位置のコンセンサスアミノ酸を維持することができる。
【０１０６】
概して、変種ポリペプチドを調製する場合は、全アミノ酸よりも少ない範囲で変えることが好ましい。特に、アミノ酸残基が機能を与えることが知られている場合は、例えば、置換されないまたは代替的に保存的アミノ酸置換により置換される場合である。変異体ペプチドを調製する場合、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８などのペプチド長よりも１つ短い範囲で変える。一般に、最も少ない置換が好ましい。したがって、変種体ポリペプチドの１つの作製方法としては、特定の単一アミノ酸以外のすべてのアミノ酸を置換し、次いで、該変種体の活性を調査し、そして、最善の活性を有する１つまたは２つ以上のポリペプチドによってそのプロセスを繰り返すことである。
【０１０７】
別の例としては、例えば、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体の同定方法は、StromingerとWucherpfennigの公開済ＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３１８２）に提供されている。１つまたは２つ以上のアミノ酸置換を保有するペプチドも、例えばD’AmaroとDrijfhout（D’Amaro et al., Human Immunol. 43: 13-18, 1995; Drijfhout et al., Human Immunol. 43: 1-12, 1995）により記載されたコンピュータプログラムを用いた合成の前に、既知のＨＬＡ／ＭＨＣモチーフとの一致に関して試験することができる。次に置換ペプチドは、ＭＨＣ分子との結合、ならびにＭＨＣに結合された場合には抗体またはＣＴＬによる認識に関して試験することができる。これらの変異体は、改良された安定性に関して試験され、とりわけワクチン組成物中で有用である。
【０１０８】
ＣＴ抗原ポリペプチドの機能的均等な変異体を産生するためのＣＴ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列中の保存的アミノ酸置換は、典型的には、ＣＴ抗原ポリペプチドをコードする核酸の変更によりなされる。このような置換は、当業者に既知の種々の方法によりなすることができる。例えば、アミノ酸置換は、Kunkel（Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82:  488-492, 1985）の方法によるＰＣＲ特異的突然変異、部位特異的突然変異誘発により、あるいはＣＴ抗原ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成によりなすることができる。アミノ酸置換が、自系または同種異系血清あるいは細胞溶解性Ｔリンパ球により認識される抗原性エピトープのようなＣＴ抗原ポリペプチドの小非反復断片に対してなされる場合、置換は、ペプチドを直接合成することによりなすることができる。ＣＴ抗原ポリペプチドの機能的等価断片の活性は、細菌または哺乳類発現ベクターに改変されたＣＴ抗原ポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、改変されたＣＴ抗原ポリペプチドを発現させ、そして本明細書中に開示したようなＣＴ抗原ポリペプチドの機能的能力に関して試験することにより、試験することができる。化学的に合成されたペプチドは、機能に関して、例えば関連抗原を認識する抗血清との結合に関して直接試験することができる。
【０１０９】
本発明は、ある実施態様では、癌関連抗原ポリペプチド由来の「優性ネガティブ」ポリペプチドも提供する。優性ネガティブポリペプチドは、細胞機構との相互作用により、細胞機構とのその相互作用からの活性タンパク質を置き換え、あるいは活性タンパク質と競合し、それにより活性タンパク質の作用を低減するタンパク質の不活性変異体である。例えば、リガンドを結合するが、リガンドの結合に応答してシグナルを伝達しない優性ネガティブ受容体は、リガンドの発現の生物学的作用を低減し得る。同様に、標的タンパク質と正常に相互作用するが、標的タンパク質をリン酸化しない優性ネガティブ触媒的不活性キナーゼは、細胞シグナルに応答して標的タンパク質のリン酸化を低減し得る。同様に、遺伝子の制御領域におけるプロモーター部位と結合するが、遺伝子転写を増大しない優性ネガティブ転写因子は、転写の増大を伴わずにプロモーター結合部位を占めることにより、正常転写因子の作用を低減し得る。
【０１１０】
細胞中の優性ネガティブポリペプチドの発現の最終結果は、活性タンパク質の機能の低減である。当業者は、タンパク質の優性ネガティブ変異体に関する潜在性を査定することができ、標準的な突然変異誘発技法を用いて１つまたはそれ以上の優性ネガティブ変異体ポリペプチドを作製する。例えば、ＣＴ抗原、特に既知の活性を有する既知のタンパク質と同様であるものについて本明細書中に含入された教示を前提として、当業者は、部位特異的突然変異誘発、走査突然変異誘発、部分遺伝子欠失または切頭化等によりＣＴ抗原の配列を修飾できる（例えば、米国特許第5,580,723号およびSambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989参照）。次に当業者は、選定された活性の縮小および／またはこのような活性の保持に関して突然変異ポリペプチドの集団を試験し得る。タンパク質の優性ネガティブ変異体を作製し、試験するためのその他の同様の方法は、当業者には明らかであろう。
【０１１１】
本発明は、本明細書中に記載されているように多数の用途を有し、そのいくつかは本明細書中の他の箇所に記載されている。第一に、本発明は、ＣＴ抗原タンパク質分子の単離を可能にする。当業者に周知の種々の方法は、単離されたＣＴ抗原分子を得るために利用することができる。ポリペプチドは、クロマトグラフィー的手段または免疫学的認識によりポリペプチドを天然に産生する細胞から精製することができる。あるいは、発現ベクターが細胞中に導入されて、ポリペプチドの産生を生じ得る。別の方法では、ｍＲＮＡ転写体が微量注射され、または他の方法が細胞中に導入されて、コードされたポリペプチドの産生を生じ得る。無細胞抽出物、例えば網状赤血球溶解物系におけるｍＲＮＡの翻訳も、ポリペプチドを産生するために用いることできる。当業者は、ＣＴ抗原ポリペプチドを単離するための既知の方法にも容易に従い得る。これらには、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明はまた、本明細書に記載のとおりのＣＴ抗原に結合するタンパク質を単離することを可能にし、これは、抗体およびＣＴ抗原の結合パートナーを含む。さらなる用途を以下でさらに記載する。
【０１１３】
ＣＴ抗原遺伝子の単離および同定は、癌関連抗原の発現により特徴づけられる障害を当業者が診断することも可能にする。これらの方法は、１つまたは２つ以上のＣＴ抗原核酸および／またはコードされたＣＴ抗原ポリペプチドおよび／またはそれらに由来するペプチドの発現を決定することを含む。前者の場合には、かかる決定は、ポリメラーゼ連鎖反応を含めた任意の標準核酸決定検定、あるいは標識化ハイブリダイゼーションプローブを用いた検定により実行することができる。後者の場合には、かかる決定は、例えば、ＣＴ抗原に対するＥＬＩＳＡ、組織試料の免疫組織化学を含むイムノアッセイそして、ポリペプチドの認識に関して患者抗血清をスクリーニングすることにより実行することができる。
【０１１４】
本発明はまた、対象の癌の発症、進行または退行を、例えば、連続的な時間で、対象から細胞または組織試料を得ること、そして、かかる試料に関して本発明の癌関連ポリペプチドの存在および／または発現レベルを試験することによって、モニタリングするための方法も含む。対象が癌を有する疑いがあるかまたは有しないと考えられるかを判断でき、そして、試料は、対象による次の細胞または組織試料のベースラインとして機能する。
【０１１５】
状態の発症は、対象の生理学的変化または状態に関連する特徴が開始することである。かかる変化は、生理学的症候によって証拠づけられるか、または臨床的に無症候であってもよい。例えば、その時に臨床的な症状が明らかでなくても、癌の発症が、対象の癌に関連する生理学的特徴が見られる期間があってもよい。状態の進行は、発症に続く、該状態の生理学的特徴の発達であり、臨床的な症候の増加が、見られても、見られなくてもよい。また、状態の退行は、該状態の生理学的特徴の減衰であり、恐らく、症候の平行的な（parallel）減衰を有し、そして、該状態の処置または自然的な回復によりもたらされてもよい。
【０１１６】
対象から得られる細胞または組織試料の癌関連核酸またはポリペプチドの存在は、対象の癌に対するマーカーとなる、その核酸またはポリペプチドの上記ベースラインレベルで決定される。例えば、癌のマーカーは、癌関連ポリペプチドの結合に特異的であり得る。癌の状態の徴候は、前もって決定されたかかるマーカーがない対象の試料において、かかるマーカーの出現によって示され得る。例えば、対象による第一の試料に癌のマーカーが存在しない場合、対象による第二の試料または後続の試料における癌マーカーの存在の確認は、対象の癌の徴候の示唆となる。
【０１１７】
癌状態の進行または退行は、それぞれ、長期に渡る対象の試料中のマーカーの増大または減少により示される。例えば、対象による第一の試料において癌のマーカーが存在し、そして、対象による第二の試料または後続の試料において追加的なマーカーまたは当初以上のマーカーの存在が確認された場合、それは、癌の進行を示す。癌の退行は、対象による試料においてマーカーが発見されない、または対象による第二の試料または後続の試料において、その量が少なくなったことが確認されることによって示される。
【０１１８】
癌状態の進行および退行はまた、対象の決定された癌関連ポリペプチドの発言の特性に基づいて示される。例えば、癌の特定のステージ（例えば、初期ステージの癌関連ポリペプチド、中期ステージの癌関連ポリペプチドおよび後期ステージの癌関連ポリペプチド）においては、いくつかの癌関連ポリペプチドは、異常的に発現されてもよい。別の例としては、限定ではないが、癌関連ポリペプチドは、差別的に転移巣（metastase）に対する原発腫瘍において、発現されてもよく、従って、疾患のステージおよび／または診断レベルを、対象試料の選択された癌関連ポリペプチドの同定に基づいて確定することができる。
【０１１９】
単一組織種の異なる種類の癌は、異なる癌関連ポリペプチドおよびそのコード核酸分子または異なる空間的なまたは一時的なパターンを有してもよい。かかる変化により、癌特異性を診断し、そして、患者の特定状態に対する後続の処置を調整することができる。発現のこれらの差異は、医師による癌関連ポリペプチドおよび本発明のコード核酸分子の差別的な発現またはそれに対する免疫応答（例えば、血清抗体）に基づく癌の診断を可能にし、そして、差別的な発現に基づいて、特定の処置の選択および投与させることができる。
【０１２０】
癌関連核酸およびポリペプチドの単離および同定はまた、癌関連ポリペプチドの発現に特徴づけられる、好ましくは、癌関連ポリペプチドに対する免疫応答によって特徴づけられる障害を、当業者が診断することも可能にする。本明細書で示されるように、癌を有する対象の癌関連ポリペプチドの発現により、対象の癌関連ポリペプチドへの免疫応答の測定が可能となる。この免疫応答の評価は、１つまたは２つ以上の本発明の癌関連ポリペプチドを発現する対象の癌の診断に有用である。
【０１２１】
癌関連ポリペプチド免疫応答に関連する本発明の方法は、１つまたは２つ以上癌関連ポリペプチドに対する免疫応答（抗体または細胞性）の決定を含む。免疫応答は、当業者に公知の種々の免疫学的検定法の手順で調査することができる。例えば、抗原性癌関連ポリペプチドは、イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、試料、例えば、患者から取り出した血液試料による捕捉抗体を標的とすることができる。したがって、本発明は、１つまたは２つ以上の本明細書に記載される癌関連ポリペプチドへの免疫応答の存在を決定することによって対象の癌を診断またはモニタリングするいくつかの側面に関与する。好ましい態様において、この決定は、対象から得られる体液、例えば、血液、リンパ節液を調査することによって実施し、１つまたは２つ以上の癌関連ポリペプチドに対する抗体存在または癌関連ポリペプチドをコードする核酸分子、或いは本明細書に記載されるような、癌関連ポリペプチドの１つに対する抗体の存在を決定することができる。
【０１２２】
長期間に渡る連続的な決定による本明細書に記載の１つまたは２つ以上の癌関連ポリペプチドに対する免疫応答の測定は、処置の経過から得られる癌の徴候、進行または退行のモニタリングに有用である。例えば、血液またはリンパ節液などの試料を対象から得て、本発明の癌関連ポリペプチドに接触させることができ、そして、試料中の剤（例えば、抗体）と癌関連ポリペプチドとを結合させ、癌関連ポリペプチドへの免疫応答の示唆となる。二回目、後続の時間、別の試料を、対象から得ることができ、同様に試験する。第一および第二試験（および／または後続の試験）の結果、癌の徴候、退行または進行の測定として比較することができ、または、試料を採取の間に癌の処置がなされない場合には、処置の効果を、２つの試験の結果を比較することによって評価することができる。
【０１２３】
対象の癌のステージは、本発明の癌関連ポリペプチドへの患者の免疫応答の変化に基づいて決定することができる。該ポリペプチドへの免疫応答の変動性は、対象の癌の示唆に用いることができる。例えば、いくつかの癌関連ポリペプチドは、他の癌関連ポリペプチドにより誘発されるものよりも、異なるステージの癌において免疫応答を誘発することができる。本明細書に記載の癌特異性診断もまた、異なる癌関連ポリペプチドへの免疫応答の変化に基づくことができる。
【０１２４】
本発明は、癌関連ポリペプチドおよび／または癌関連ポリペプチドに特異的に結合する抗体を調査するためのキットを含む。キットの例としては、癌関連ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み得る。抗体またはその抗原結合断片は、癌を有する、癌を有する疑いがあるまたは癌がないと思われる患者の組織または細胞試料に適用することができ、次いで、その試料を処理し、抗体およびポリペプチドまたは試料の他の成分の間に特異的な結合が存在するか否かを評価することができる。
【０１２５】
かかるキットの別の例としては、基板、例えば、ディップスティックに結合する上記ポリペプチドを含み、これは、対象の血液または体液試料に浸漬することによって得られる。次いで、基板の表面を、当業者に十分に公知の手順によって処理し、対象の試料中のポリペプチドと剤（例えば抗体）との間に特異的な結合が存在するか否かを評価する。例えば、手順は、限定ではないが、二次抗体との接触または特異的な結合の存在を示す他の方法を含む。
【０１２６】
さらに、抗体またはその抗原結合断片は、癌を有する疑いがある、癌を有すると診断された、または癌がないと考えられる対象による体液試料、例えば、血液またはリンパ節液に適用することができる。当業者に理解されるであろうが、かかる結合試験はまた、試料または抗体および／または癌関連ポリペプチドによって接触された対象を用いて、例えば、９６ウェルプレート中で、または対象表面に直接適用することができる。
【０１２７】
本発明のキットの別の例としては、１つまたは２つ以上の本発明の癌関連核酸分子の発現レベルを決定するのに必要な部品を提供するキットである。かかる部品は、１つまたは２つ以上の癌関連核酸分子の増幅および／またはＰＣＲ増幅のための他の化学物質の増幅に有用である。
【０１２８】
本発明のキットの別の例としては、本発明の１つまたは２つ以上の癌関連核酸分子の発現レベルを、ハイブリダイゼーションの方法を用いて決定するのに必要な部品を提供するキットである。
【０１２９】
前記キットは、診断用キットの種々の部品の使用法する説明書または他の印刷資料を含む。
【０１３０】
本発明は、さらに、核酸或いはポリペプチドをコードする核酸またはＣＴ抗原を有するタンパク質マイクロアレイを含む。本発明の他の態様においては、タンパク質マイクロアレイ技術の標準的な技法は、ＣＴ抗原の発現を評価すること、および／またはそのようなタンパク質およびペプチドを結合する生物学的構成成分を同定することに活用される。生物学的試料の構成成分は、抗体、リンパ球（特にＴリンパ球）などを含む。タンパク質マイクロアレイ技術、これはタンパク質チップ技術および固相タンパク質アレイ技術を含む他の名前でも知られているが、これは当業者によく知られており、次に限定されるものではないが、固定基材上に同定したペプチドまたはタンパク質のアレイを得ること、該ペプチドと標的分子または生物学的構成成分を結合すること、およびそのような結合を評価することに基づく。例えば、G. MacBeath and S. L. Schreiber, "Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination," Science 289(5485):1760-1763, 2000を参照。核酸アレイ、特にＣＴ抗原に結合するアレイはまた、診断用途、例えばＣＴ抗原発現によって特徴付けられる状態を有する対象の同定に用いることができる。
【０１３１】
マイクロアレイの基材は、限定されないが、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、アルミナおよびニッケル酸化物などの金属酸化物、種々のクレイ、ニトロセルロースまたはナイロンを含む。マイクロアレイの基材は、基材上のプローブ（ペプチドまたは核酸）の合成を増強するように化合物でコートされる。基板上のカップリング剤または基は、基材への第一のヌクレオチドまたはアミノ酸の共有的に結合されるために用いることができる。多種もカップリング剤または基は、当業者に既知である。したがって、ペプチドまたは核酸プローブは、所定のグリッドの基材上で直接的に合成することができる。これらの態様において、合成されたプローブは、基材にプローブを接触プリント法またはインクジェットもしくはピエゾ電気分配などの非接触法で適用するためにコンピュータで制御されたロボットを利用し、正確に、予め決定された量とグリッドパターンで基材へ適用される。プローブは、基材と共有的に結合され得る。
【０１３２】
標的は、天然または合成であってよい。組織は、対象から得ることができ、または培養によって（例えば、癌細胞系から）増殖させ得る。
【０１３３】
いくつかの態様において、１または２以上の対照ペプチドまたはタンパク質が基材へ付着する。好ましくは、対照ペプチドまたはタンパク質分子により、ペプチドまたはタンパク質の質および結合特性、試薬の質および効果、結合成功率および分析の閾値および成功率などの因子の決定が可能になる。
【０１３４】
他の態様において、１または２以上の対照ペプチドまたは核酸分子が基材へ付着する。好ましくは、対照核酸分子により、ペプチドまたは核酸の質および結合特性、試薬の質および効果、結合成功率および分析の閾値および成功率などの因子の決定が可能になる。
【０１３５】
核酸マイクロアレイ技術は、核酸マイクロアレイ技術、これはＤＮＡチップ技術、遺伝子チップ技術、そして固相核酸アレイ技術を含む他の名前でも知られているが、これは当業者によく知られており、次に限定されるものではないが、固定基材上に同定した核酸プローブのアレイを得ること、レポーター分子（例えば、フルオレセイン、Cye3-dUTPまたはCye5-dUTPなどの、放射能性、化学蛍光性または蛍光性のタグ）で標的分子を標識すること、標的核酸とプローブとをハイブリダイズすること、および標的−プローブハイブリダイゼーションを評価することに基づく。標的配列に完全に合致する核酸配列を備えたプローブは、一般的に、あまり完全に合致しないプローブよりも強いレポーター分子シグナルの検出をもたらす。核酸マイクロアレイ技術に活用される多くの成分および技法は、"The Chipping Forecast", Nature Genetics, Vol. 21, 1999年1月に示されており、ここにその完全な内容を参照によって組み込む。
【０１３６】
本発明により、マイクロアレイの基材は、限定されないが、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、アルミナおよびニッケル酸化物などの金属酸化物、種々のクレイ、ニトロセルロースまたはナイロンを含む。すべての実施態様において、ガラス基材が好ましい。本発明により、プローブは、限定されないが、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む核酸の群から選択され、天然であっても合成であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、20〜25-merのオリゴヌクレオチドであり、ＤＮＡ／ｃＤＮＡプローブは、他の長さも用い得るが、好ましくは500〜5000塩基長である。好適なプローブの長さは、以下の技術的に知られた方法により当業者によって決定されてもよい。一態様において、好ましい核酸プローブは、本明細書で述べるＣＴ抗原核酸分子の２つまたは３つ以上のセットである。プローブは、ゲル濾過または沈降などの当業者に知られた標準的な方法を用いて混入物を除去するために精製してもよい。
【０１３７】
一態様において、マイクロアレイの基材は、基材上でプローブの合成を高めるための化合物で被覆されていてもよい。このような化合物には、限定されないが、オリゴエチレングリコールを含む。他の実施態様において、基材上に剤または基を結合することは、基材へ第一のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを共有的に結合することに用いることができる。これらの剤または基は、例えば、アミノ、ヒドロキシ、ブロモおよびカルボキシル基を含んでもよい。これらの反応基は、好ましくは、アルキレンまたはフェニレンの２価のラジカルなどのヒドロカルビル基を介して基材に付着し、一価の位置が鎖状結合（chain bonding）により占められ、残りが官能基に付着する。これらヒドロカルビル基は、約１０までの炭素原子を含んでもよく、好ましくは、約６までの炭素原子を含んでもよい。アルキレンラジカルは、常に主鎖に２〜４炭素原子を含むことが好ましい。該方法およびそのさらなる詳細は、例えば、全体が参照文献により組み込まれる米国特許第4,458,066号に開示されている。
【０１３８】
一態様において、プローブは、光誘導（light-directed）化学合成、光化学脱保護、またはヌクレオチド前駆体を基材へ運搬と、それに続くプローブ産生などの方法を用いて、所定のグリッドパターンで基材上に直接合成する。
【０１３９】
他の実施態様において、基材はプローブの基材への結合を高めるために化合物で被覆してもよい。このような化合物は、限定されないが、ポリリシン、アミノシラン、アミノ反応性シラン（Chipping Forecast, 1999）またはクロムを含む。この実施態様において、予め合成されたプローブは、基材にプローブを接触プリント法またはインクジェットもしくはピエゾ電気分配などの非接触法で適用するためにコンピュータで制御されたロボットを利用し、正確に、予め決定された量とグリッドパターンで基材へ適用される。プローブは、限定されないが、ＵＶ-照射を含む方法で、基材と共有的に結合され得る。他の実施態様において、プローブは熱で基材と結合される。
【０１４０】
標的は、限定されないが、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む核酸であり、天然または合成によるものであってよい。すべての態様において、ヒト組織からの核酸標的分子が好ましい。該組織は、対象から得ることができ、または培養によって（例えば、癌細胞系から）増殖させ得る。
【０１４１】
本発明の態様においては、対照核酸分子が基材へ付着する。好ましくは、対照核酸分子により、核酸の質および結合特性、試薬の質および効果、結合成功率および分析の閾値および成功率などの因子の決定が可能になる。対照核酸は、限定されないが、ハウスキーピング遺伝子などの遺伝子またはその断片の発現産物を含む。
【０１４２】
いくつかの態様においては、１つまたは２つ以上の対照ペプチドまたは核酸分子が基材へ付着する。好ましくは、対照ポリペプチドまたは核酸分子により、ポリペプチドまたは核酸の質および結合特性、試薬の質および効果、結合成功率および分析の閾値および成功率などの因子の決定が可能になる。
【０１４３】
ＣＴ抗原ポリペプチドの発現もまた、タンパク質測定法によって決定できる。タンパク質の特異的および定量的な測定の好ましい方法は、限定ではなく、例えば、表面増強レーザ脱着／イオン化（ＳＥＬＤＩ：例えば、Ciphergen Proteinchip System, Ciphergen Biosystems, Fremont CA）などの質量分析に基づく方法、非質量分析に基づく方法および、例えば、二次元ゲル電気泳動などの免疫組織化学に基づく方法を含む。
【０１４４】
ＳＥＬＤＩ方法論は、当業者に知られた方法であるが、微量の癌組織を蒸発し、個々のタンパク質の「フィンガープリント」をつくり、これにより、１つの試料の多くのタンパク質の存在量の同時の測定を可能にするように用いられる。好ましくは、ＳＥＬＤＩに基づく分析は、腫瘍を同定および／または分類することに活用してもよい。このような分析は、限定されないが、好ましくは以下の例を含む。核酸マイクロアレイで分析された核酸にコードされる遺伝子産物は、ＳＥＬＤＩタンパク質ディスクに対する特異的な（抗体関連の）キャプチャー（例えば、選択的ＳＥＬＤＩ）によって、選択的に測定され得る。タンパク質スクリーニング（例えば、２−Ｄゲル）によって発見された遺伝子産物は、本明細書中に記載のＣＴ抗原の中から対象のこれら特定マーカーを視覚化するのに最適化された「全タンパク質ＳＥＬＤＩ」により解明され得る。
【０１４５】
腫瘍は、多様なＣＴ抗原の測定に基づいて分類することができる。ＣＴ抗原発現に基づく分類は、疾患をステージングし、疾患の進行または退行をモニタリングし、そして、癌患者のための処置計画を選択することに用いることができる。
【０１４６】
本発明は、ＣＴ抗原ポリペプチドと結合するポリペプチドのような剤も含む。かかる結合剤は、例えばＣＴ抗原ポリペプチドおよびＣＴ抗原ポリペプチドとそれらの結合相手との複合体の存在または非存在を検出するためのスクリーニング検定に、ならびに単離されたＣＴ抗原ポリペプチドおよびＣＴ抗原ポリペプチドとそれらの結合相手との複合体のための精製プロトコルに用いることできる。かかる剤は、例えばこのようなポリペプチドとの結合により、ＣＴ抗原ポリペプチドのネイティブ活性を抑制するためにも用いることできる。
【０１４７】
したがって、本発明は、例えばＣＴ抗原ポリペプチドと選択的に結合する能力を有する抗体または抗体の断片であり得るペプチド結合剤を含む。抗体は、慣用的方法により調製されるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。
【０１４８】
有意には、当分野で周知のように、抗体分子の小部分のみ、即ちパラトープが、抗体のそのエピトープとの結合に関与する（概して、Clark, W.R.（1986）The Experimental Foundations of Modem Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, 1.（1991）Essential Immunology 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford参照）。例えばｐＦｃ’およびＦｃ領域は相補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されていた、またはｐＦｃ’領域を伴わずに産生されていた、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれる抗体は、無傷抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されていた、またはＦｃ領域を伴わずに産生されていた、Ｆａｂ断片と呼ばれる抗体は、無傷抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。さらに続けると、Ｆａｂ断片は、共有結合された抗体軽鎖、およびＦｄと示される抗体重鎖の一部分からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要決定因子であり（単一Ｆｄ断片は、抗体特異性の変化を伴わずに１０までの異なる軽鎖と会合することができる）、Ｆｄ断片は単離した状態でエピトープ結合能力を保持する。
【０１４９】
当分野で周知であるように、抗体の抗原結合部分内には、相補性決定領域が（ＣＤＲ）が存在し、これが抗原のエピトープ、およびパラトープの三次構造を保持する枠組み構造領域（ＦＲ）と直接相互作用する（概して、Clark, 1986; Roitt, 1991参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片および軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）により別々に分けられる４つの枠組み構造領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、より詳細には重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性に大いに寄与する。
【０１５０】
哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域は、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種異系抗体または異種抗体の同様領域と置換することができる、ということは、当分野で目下十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合されて機能性抗体を産生する「ヒト化」抗体の開発および使用において最も明白に示される（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第５，８５９，２０５号参照）。
【０１５１】
十分なモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分に対してトランスジェニックなマウスに免疫を与えることによって調整できる。例えば、米国特許第５,５４５,８０６号、第６,１５０,５８４号および本明細書に記載の文献を参照されたい。これらのマウス（例えば、XenoMouse (Abgenix)、HuMAbマウス(Medrarex/GenPharm)）の免疫化に続き、モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術によって調製できる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有し、したがって、ヒトに投与した場合には、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を引き起さないであろう。
【０１５２】
したがって、当業者には明らかなように、本発明は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同性ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同性ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同性ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦａｂ断片抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同性ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦｄ断片抗体も提供する。本発明は、いわゆる一本鎖抗体も含む。
【０１５３】
したがって、本発明は、ＣＴ抗原ポリペプチド、ならびにＣＴ抗原ポリペプチドとそれらの結合相手との複合体と特異的に結合する多数のサイズおよび種類のポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、抗体技術以外の供給源からも得られる。例えば、かかるポリペプチド結合剤は、溶液中で、固定化態様でまたはファージディスプレイライブラリーとして容易に調製することができる縮重ペプチドライブラリーにより提供することができる。１つまたは２つ以上のアミノ酸を含有するペプチドの組合せライブラリーも合成することができる。ペプトイドおよび非ペプチド合成部分のライブラリーをさらに合成することができる。
【０１５４】
ファージディスプレイは、本発明により有用な結合ペプチドを同定するのに特に有効であり得る。要するに、慣用的手法を用いて、４〜約８０個のアミノ酸残基の挿入物を表示するファージライブラリー（例えば、ｍ１３、ｆｄまたはλファージを用いる）を調製する。挿入物は、例えば完全縮重またはバイアス化アレイを表し得る。次に、ＣＴ抗原ポリペプチドと結合するファージ保有挿入物を選択し得る。この過程は、ＣＴ抗原ポリペプチドと結合するファージの、数サイクルの再選択により反復することができる。反復回数は、ファージ保有特定配列の豊富化をもたらす。ＤＮＡ配列分析を実行して、発現されたポリペプチドの配列を同定し得る。ＣＴ抗原ポリペプチドと結合する配列の最小線状部分を決定することができる。最小線状部分の一部または全部を含有する挿入物＋それらの上流または下流の１つまたはそれ以上の付加的縮重残基を含有するバイアス化ライブラリーを用いて、当該手法を反復し得る。癌関連抗原ポリペプチドと結合するポリペプチドを同定するために、酵母２ハイブリッドスクリーニング法も用いることできる。したがって、本発明のＣＴ抗原ポリペプチドまたはそれらの断片を用いて、ファージディスプレイライブラリーを含めたペプチドライブラリーをスクリーニングして、本発明のＣＴ抗原ポリペプチドのペプチド結合相手を同定し、選定し得る。かかる分子は、上記のように、スクリーニング検定に、精製プロトコルに、癌関連抗原の機能の直接的妨害に、ならびに当業者には明らかであろうその他の目的に用いることができる。
【０１５５】
本明細書中に記載されているように、上記の抗体およびその他の結合分子は、例えばタンパク質を発現する組織を同定し、またはタンパク質を精製するために用いることできる。抗体はさらに標準カップリング手法により、癌関連抗原を発現する細胞および組織の画像化のための特異的診断用標識剤と、あるいは治療的に有用な剤と結合することができる。診断剤としては、硫酸バリウム、ヨーセタム酸、ヨーパン酸、イポデートカルシウム、ジアトリゾアートナトリウム、ジアトリゾアートメグルミン、メトリザマイド、チロパノエートナトリウムおよび放射線診断剤、例えば陽電子放出体、例えばフッ素−１８および炭素−１１、γ放出体、例えばヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１、ならびに核磁気共鳴のための核種、例えばフッ素およびガドリニウムが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で有用なその他の診断剤は、当業者には明らかであろう。
【０１５６】
本明細書中で用いる場合、「治療的に有用な剤」は、望ましくは、本明細書中に開示された癌抗原のうちの１つを発現する細胞を選択的に標的とする任意の治療用分子を含み、それらの例としては、抗腫瘍剤、放射性ヨウ素化化合物、毒素、その他の細胞増殖抑制剤または細胞溶解剤等が挙げられる。抗腫瘍性治療薬は周知であり、その例としては以下のものが挙げられる：アミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビジン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトタン、プロカルバジン  ＨＣｌ、チオグアニン、硫酸ビンブラスチンおよび硫酸ビンクリスチン。さらに別の抗腫瘍剤としては、Antineoplastic Agents（Paul Calabresi and Bruce A. Chabner）の52章およびその序文、Goodman and Gilmanの“The Pharmacological Basis of Therapeutics,” Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc. （Health Professions Division）の1202〜1263頁に開示されているものが挙げられる。毒素は例えばアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質のようなタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン(gelonin)、アブリン、ジフテリア体外毒素、またはシュードモナス体外毒素であり得る。毒素部分は、コバルト６０のような高エネルギー放出放射性核種でもあり得る。
【０１５７】
いくつかの態様において、本発明により調整される抗体は、本明細書に記載されるＭＨＣ分子とＣＴ抗原の複合体に特異的である。
【０１５８】
「障害」という用語が本明細書中で用いられる場合、それは、癌関連抗原が発現される任意の病理学的症状を指す。このような障害の一例が癌であり、制限されないが、胆道癌、膀胱癌、乳癌、膠芽腫と髄芽腫を含む脳癌、子宮頸癌、絨毛膜癌腫、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭および首部の癌、白血病および骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳに関連する白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫を含む血液の新生物(neoplasms)、ボーエン病とパジェット病を含む上皮内の新生物、肝臓癌、小さな細胞肺癌および小さくない細胞肺癌を含む肺癌、ホジキン病を含むリンパ腫およびリンパ球性リンパ腫、神経芽細胞腫、扁平上皮細胞癌を含む口腔癌、上皮細胞、ストロマ細胞、生殖細胞および間充織の細胞から生じるものを含む卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、骨液肉腫および骨肉腫を含む肉腫、メラノーマ、Kaposi肉腫、塩基性細胞（basocelluer）癌、扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌、精上皮腫のような胚腫瘍、非精上皮腫(奇形種、絨毛膜癌腫)、ストロマの腫瘍および生殖細胞腫瘍を含む精巣癌、アデノカルチノーマ（adenocarcinoma）および髄様癌を含む甲状腺癌、腺癌およびWilms腫瘍を含む移行（transitional）の癌および腎臓癌を含む。
【０１５９】
本明細書中に記載した種々の方法に用いるための組織および／または細胞の試料は、パンチ生検および細胞掻き取りを含めた組織生検、ならびに吸引またはその他の方法による血液またはその他の体液の収集のような標準的方法により採取することができる。
【０１６０】
本発明のある態様では、免疫反応性細胞試料が対象から取り出される。「免疫反応性細胞」とは、適切な刺激時に、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞または細胞溶解性Ｔ細胞）中で成熟し得る細胞を意味する。したがって、免疫反応性細胞としては、ＣＤ３４＋造血性幹細胞、未熟Ｔ細胞および未熟Ｂ細胞が挙げられる。ＣＴ抗原を認識する細胞溶解性Ｔ細胞を産生するのが望ましい場合、免疫反応性細胞は、細胞溶解性Ｔ細胞の産生、分化および／または選択に好都合な条件下でＣＴ抗原を発現する細胞と接触させられる。抗原への曝露時のＴ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、免疫系のクローン選択と同様である。
【０１６１】
本開示に基づいたいくつかの治療的アプローチは、対象の免疫系による応答が前提であって、１つまたは２つ以上のＣＴ抗原を提示する癌細胞のような抗原提示細胞の溶解をもたらす。かかるアプローチの１つは、問題の表現型の異常細胞を有する対象へのＣＴ抗原／ＭＨＣ複合体に特異的な自系ＣＴＬの投与である。in vitroでのこのようなＣＴＬを開発することは、当業者の能力の範囲内である。Ｔ細胞分化のための方法の一例は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５６０７号に示されている。一般に血液細胞のような対象から採取される細胞の試料は、複合体を提示する細胞であって、ＣＴＬが増殖するのを惹起することが可能な細胞と接触させられる。標的細胞は、ＣＯＳ細胞のようなトランスフェクト体であり得る。これらのトランスフェクト体はそれらの表面に所望の複合体を提示し、当該ＣＴＬと組合されると、その増殖を刺激する。ＣＯＳ細胞は、他の適切な宿主細胞と同様に、広範に利用可能である。ＣＴＬクローンの特異的産生は、当分野で周知である。クローン拡張性自系ＣＴＬは次に対象に投与される。
【０１６２】
抗原特異的ＣＴＬクローンを選択するための別の方法が近年記載されており（Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol. 8:413-416, 1998）、この場合、特異的ＣＴＬクローンを検出するために、ＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド複合体の蛍光原性四量体が用いられる。要するに、β２−ミクログロブリン、およびクラスＩ分子を結合するペプチド抗原の存在下で、可溶性ＭＨＣクラスＩ分子がin vitroで折り畳まれる。精製後、ＭＨＣ／ペプチド複合体が精製され、ビオチンで標識される。ビオチニル化ペプチド−ＭＨＣ複合体を標識化アビジン（例えば、フィコエリトリン）と４：１のモル比で混合することにより四量体を形成する。四量体は次に、末梢血またはリンパ節のようなＣＴＬの供給源と接触させられる。四量体は、ペプチド抗原／ＭＨＣクラスＩ複合体を認識するＣＴＬを結合する。四量体により結合された細胞は、蛍光活性化細胞分類により分類されて、反応性ＣＴＬを単離し得る。次いで、単離されたＣＴＬは、本明細書中に記載するような使用のためにin vitroで拡張することができる。
【０１６３】
養子移入（Greenberg, J. Immunol. 136（5）:1917, 1986; Riddel et al., Science 257:238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21:1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59:603-614, 1989）と呼ばれる治療方法論を詳述するために、所望の複合体を提示する細胞（例えば樹状細胞）はＣＴＬと組合されて、それに特異的なＣＴＬの増殖をもたらす。増殖したＣＴＬは次に、特定の複合体を提示するある種の異常細胞により特徴づけられる細胞異常を有する対象に投与される。次いで、ＣＴＬは、異常細胞を溶解し、それにより所望の治療目的を達成する。
【０１６４】
上記の治療は、対象の異常細胞の少なくともいくつかが関連ＨＬＡ／ＣＴ抗原複合体を提示することを想定する。これは、特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定するための方法、ならびに関連する配列、この場合は癌関連抗原配列のＤＮＡを発現する細胞の同定方法に当分野が精通しているので、非常に容易に決定することができる。いったん関連複合体を提示する細胞が上記のスクリーニング方法論により同定されれば、細胞は患者からの試料と組合せることができるが、この場合、試料はＣＴＬを含有する。複合体提示細胞が、混合されたＣＴＬ試料により溶解される場合には、ＣＴ抗原が提示されていること、および対象がここで述べる治療的アプローチのための適切な候補者であることが想定することができる。
【０１６５】
養子移入は、本発明により利用可能な治療の唯一の態様であるというわけではない。ＣＴＬは、多数のアプローチを用いて、in vivoでも惹起することができる。一アプローチは、複合体を発現する非増殖性細胞の使用である。本アプローチに用いられる細胞は、複合体を正常に発現する細胞、例えば照射腫瘍細胞、あるいは複合体の提示に必要な遺伝子の一方または両方でトランスフェクトされた細胞（即ち、抗原性ペプチドおよび提示ＭＨＣ分子）であり得る。Chen等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110-114, 1991）はこのアプローチを例証して、治療レジメンにおけるＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクトした細胞の使用を示している。種々の細胞型を用いることできる。同様に、当該遺伝子の一方または両方を保有するベクターを用いることできる。ウイルスまたは細菌ベクターが特に好ましい。例えば、ＣＴ抗原ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸は、ある種の組織または細胞型における癌関連抗原ポリペプチドまたはペプチドの発現を導くプロモーターおよびエンハンサー配列と作動可能に連結することができる。核酸は、発現ベクター中に組み入れられ得る。発現ベクターは、本明細書中の他の箇所に記載されているように、ＣＴ抗原をコードする核酸のような外因性核酸の挿入を可能にするよう構築されまたは修飾されたウイルスゲノム、プラスミド、または非修飾細胞外染色体核酸であり得る。ＣＴ抗原をコードする核酸は、レトロウイルスゲノム中にも挿入されることが可能であり、それにより標的組織または細胞型のゲノムへの核酸の組込みを促し得る。これらの系では、当該遺伝子は、微生物、例えばワクシニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス、ならびに事実上、宿主細胞を「感染」させる物質により保有される。結果として生じる細胞は、当該複合体を提示し、自系ＣＴＬにより認識され、その後、細胞が増殖する。
【０１６６】
同様の作用は、ＣＴ抗原またはその刺激断片をアジュバントと組合せてin vivoでの抗原提示細胞中への組み入れを促すことにより達成することができる。癌関連抗原ポリペプチドは、ＭＨＣ分子のペプチド相手を産生するようプロセッシングされるが、一方、ＣＴ抗原ペプチドはさらなるプロセッシングを必要とせずに提示することができる。一般に、対象は、有効量のＣＴ抗原の皮内注射を受けることができる。当分野での免疫処置プロトコル標準にしたがって、初期用量と、その後の追加免疫用量を投与することができる。
【０１６７】
本発明は、対象を「免疫処置する」ための、または「ワクチン」としての、本明細書中に開示された種々の物質の使用を含む。本明細書中で用いる場合、「免疫処置」または「予防接種」とは、抗原に対する免疫応答を増大または活性化することを意味する。それは症状の排除または根絶を必要とせず、むしろ抗原に対する免疫応答の臨床的に好都合な強化を意図する。一般的に許容される動物モデルは、ＣＴ抗原核酸を用いた癌に対する免疫処置の試験のために用いることができる。例えばヒト癌細胞は、マウスに導入されて、腫瘍を作り出し、１つまたは２つ以上のＣＴ抗原核酸を本発明書中に記載された方法により送達することができる。癌細胞に及ぼす作用（例えば腫瘍サイズの低減）は、癌関連抗原核酸免疫処置の有効性の測定値として査定することができる。当然ながら、免疫処置のためのより慣用的な方法を用いた上記の動物モデルの試験には、免疫応答を高めるための、１つまたは２つ以上のＣＴ抗原ポリペプチドまたはそれらに由来するペプチドの、任意に１つまたはそれ以上のアジュバントおよび／またはサイトカインと組合せた投与が挙げられる。ワクチン組成物の処方ならびに用量、投与経路および投与計画（例えば、初回および１回またはそれ以上の追加免疫投与）の選択を含めた免疫処置のための方法は、当分野で周知である。試験はヒトでも実施することができるが、この場合、終点は抗原を保有する細胞に対する増大レベルの循環ＣＴＬの存在に関して試験すること、抗原に対する循環抗体のレベルに関して試験すること、抗原を発現する細胞の存在に関して試験すること等である。
【０１６８】
免疫処置組成物の一部として、１つまたは２つ以上のＣＴ抗原またはその刺激断片が、１つまたは２つ以上のアジュバントとともに投与されて、免疫応答を誘導するか、または免疫応答を高める。アジュバントは、抗原に組み入れられるかまたは抗原とともに投与される物質であり、これが免疫応答を増強する。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を高め得る。多数の種類のアジュバントが、当分野で周知である。アジュバントの特定の例としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ、SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖の精製および酸加水分解後に得られる同属体；サポニン、例えばＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995を参照）；ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。好ましくは、ペプチドは、ＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せと混合して投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲でワクチン処方物中に存在する。その他のアジュバントが当分野で既知であり、本発明に用いることできる（例えば、Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, 2nd Ed., 1986を参照）。ペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの製造方法は、予防接種の当業者には周知である。
【０１６９】
対象の免疫応答を刺激するその他の剤も、対象に投与することができる。例えばその他のサイトカインも、それらのリンパ球調節特性の結果として、予防接種プロトコルに有用である。このような目的のために有用な多数のその他のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されている（例えば、Science 268:1432-1434, 1995を参照）インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８が挙げられる。したがって、サイトカインは抗原およびアジュバントと一緒に投与されて、抗原に対する免疫応答を増大し得る。
【０１７０】
予防接種プロトコルに用いることできる多数の免疫応答助長化合物が存在する。これらは、タンパク質または核酸態様で提供される共刺激分子を含む。このような共刺激分子としては、樹状細胞（ＤＣ）で発現される分子であって、Ｔ細胞で発現されるＣＤ２８分子と相互作用するＢ７−１およびＢ７−２（それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６）分子が挙げられる。この相互作用は、抗原／ＭＨＣ／ＴＣＲ刺激（シグナル１）Ｔ細胞に共刺激（シグナル２）を提供して、Ｔ細胞増殖およびエフェクター機能を増大する。Ｂ７はＴ細胞でＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）とも相互作用し、ＣＴＬＡ４およびＢ７リガンドを含む試験は、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用が抗腫瘍免疫性およびＣＴＬ増殖を強化し得るということを示す（Zheng P., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95（11）:6284-6289（1998））。
【０１７１】
Ｂ７は、典型的には腫瘍細胞で発現されないため、それらはＴ細胞に関する効率的抗原提示細胞（ＡＰＣ）ではない。Ｂ７発現の誘発は、ＣＴＬ増殖およびエフェクター機能を、より効率的に腫瘍細胞が刺激するのを可能にする。Ｂ７／ＩＬ−６／ＩＬ−１２共刺激の組合せは、Ｔ細胞母集団中にＩＦＮ−γおよびＴｈ１サイトカインプロフィールを誘導して、Ｔ細胞活性のさらなる強化をもたらすことが示されている（Gajewski et al., J. Immunol, 154:5637-5648（1995））。Ｂ７による腫瘍細胞トランスフェクションは、Wang等（J. Immunol., 19:1-8（1986））による養子移入免疫治療に関するin vitroでのＣＴＬ拡張に関連して考察されている。Ｂ７分子のためのその他の送達メカニズムは、核酸（裸ＤＮＡ）免疫処置（Kim J., et al. Nat Biotechnol., 15:7:641-646（1997））および組換えウイルス、例えばアデノおよびポックス（Wendtner et al., Gene Ther., 4:7:726-735（1997））を含む。これらの系は、他の選定分子、例えば特に、本明細書中で考察される抗原または抗原の断片（単数または複数）（ポリトープを含む）またはサイトカインとのＢ７の同時発現のための発現カセットの構築および使用をすべて施し易い。これらの送達系は、in vitroでの適切な分子の導入のために、ならびにin vivoでの予防接種の場合のために用いることができる。Ｔ細胞をin vitroおよびin vivoで直接刺激するための抗ＣＤ２８抗体の使用も考慮することができる。同様に、外来抗原に対するＴ細胞応答を誘導する誘導可能共刺激分子ＩＣＯＳは、例えば抗ＩＣＯＳ抗体の使用により調整することができる（Hutloff et al., Nature 397: 263-266, 1999）。
【０１７２】
リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）はＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞で発現され、Ｔ細胞で発現されるＣＤ２と相互作用する。この相互作用は、Ｔ細胞ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を誘導し、したがってＢ７／ＣＤ２８共刺激相互作用を補足し得るが、置換しない（Parra et al., J. Immunol., 158: 637-642（1997）, Fenton et al., J. Immunother., 21: 2: 95-108（1998））。
【０１７３】
リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）は白血球で発現され、ＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞で発現されるＩＣＡＭ−１と相互作用する。この相互作用は、Ｔ細胞ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を誘導し、したがってＢ７／ＣＤ２８共刺激相互作用を補足し得るが、置換しない（Fenton et al., J. Immunother., 21: 2: 95-108（1998））。したがってＬＦＡ−１は、上記でＢ７に関して考察した種々の方法における予防接種プロトコルにおいて提供することができる共刺激分子のさらなる一例である。
【０１７４】
完全ＣＴＬ活性化およびエフェクター機能は、Ｔｈ細胞ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド）分子およびＤＣにより発現されるＣＤ４０分子間の相互作用によるＴｈ細胞ヘルプを要する（Ridge et al., Nature, 393: 474（1998）、Bennett et al., Nature, 393: 478（1998）、Schoenberger et al., Nature, 393: 480（1998））。この共刺激シグナルのこのメカニズムは、ＤＣ（ＡＰＣ）によるＢ７および関連ＩＬ−６／ＩＬ−１２産生の上向き調節を含むと思われる。したがってＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、シグナル１（抗原／ＭＨＣ−ＴＣＲ）およびシグナル２（Ｂ７−ＣＤ２８）の相互作用を補足する。
【０１７５】
ＤＣ細胞を直接刺激するための抗ＣＤ４０抗体の使用は、常態では炎症状況の外面で遭遇するかまたは非専門的ＡＰＣ（腫瘍細胞）により提示される腫瘍抗原に対する応答を増強すると予測される。これらの状況では、ＴｈヘルプおよびＢ７同時刺激シグナルは、提供されない。このメカニズムは、抗原を間欠的に投与したＤＣベースの療法状況で、またはＴｈエピトープが既知のＴＲＡ前駆体内に限定されなかった状況で用いられ得る。
【０１７６】
ＣＴ抗原ポリペプチドまたはその断片は、それらのネイティブ結合相手を単離するためにも用いることできる。このような結合相手の単離は、周知の方法により実施することができる。例えば単離されたＣＴ抗原ポリペプチドは、支持体（例えば、クロマトグラフィー媒質、例えばポリスチレンビーズまたはフィルター）に結合され、次に結合相手を含有する疑いのある溶液を支持体に適用することができる。ＣＴ抗原ポリペプチドと相互作用し得る結合相手が溶液中に存在する場合には、それは支持体結合ＣＴ抗原ポリペプチドと結合する。次に結合相手を単離することができる。
【０１７７】
本発明は、発現ベクター中のＣＴ抗原ｃＤＮＡ配列の使用、ならびに宿主細胞および細胞株（これらが原核生物（例えば、大腸菌）または真核生物（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現系および昆虫細胞中の組換えバキュウロウイルス発現）である場合）をトランスフェクトすることを包含するということも認識されるであろう。特に有用なのは、哺乳類細胞、例えばヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類等である。それらは、広範な種々の組織型であり得るし、一次細胞および細胞株を含み得る。特定の例としては、樹状細胞、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚幹細胞が挙げられる。発現ベクターは、関連配列、即ち上記の核酸がプロモーターと作動可能に結合されることを必要とする。
【０１７８】
本発明は、予防接種のための核酸、ポリペプチドまたはペプチドの送達も意図する。ポリペプチドおよびペプチドの送達は、当分野で周知の標準予防接種プロトコルにしたがって成し遂げられ得る。別の実施態様では、核酸の送達は、ex vivo方法により、即ち対象から細胞を取り出し、細胞を遺伝子工学処理して、ＣＴ抗原を含有させ、そして工学処理細胞を対象に再導入することにより成し遂げられる。かかる手法の一例は、米国特許第５，３９９，３４６号に、そしてこの特許の包袋履歴に提出される参照書類に略記されている（これらはすべて、公的利用可能文書である）。概して、それは対象の細胞（単数または複数）中への遺伝子の機能的コピーのin vitroでの導入、および遺伝子工学処理細胞（単数または複数）を対象に戻すことを包含する。遺伝子の機能的コピーは、遺伝子工学処理細胞（単数または複数）中の遺伝子の発現を可能にする調節要素の操作可能な制御下にある。多数のトランスフェクションおよび形質導入技法ならびに適切な発現ベクターは、当業者には周知であり、そのいくつかは、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／００６５４に記載されている。ウイルスおよび標的リポソームのようなベクターを用いたin vivo核酸送達も、本発明により意図される。
【０１７９】
好ましい態様では、ＣＴ抗原をコードする核酸を送達するためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびＴｙウイルス様粒子からなる群から選択される。外因性核酸を送達するために用いられてきたウイルスおよびウイルス様粒子の例としては、複製欠陥アデノウイルス（例えば、Xiang et al., Virology 219: 220-227, 1996; Eloit et al., J. Virol. 7: 5375-5381, 1997; Chengalvala et al., Vaccine 15: 335-339, 1997）、修飾レトロウイルス（Townsend et al., J. Virol. 71: 3365-3374, 1997）、非複製レトロウイルス（Irwin et al., J. Virol. 68: 5036-5044, 1994）、複製欠陥セムリキ森林熱ウイルス（Zhao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3009-3013, 1995）、カナリア痘ウイルスおよび高弱毒化ワクシニアウイルス誘導体（Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11349-11353, 1996）、非複製ワクシニアウイルス（Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11341-11348, 1996）、複製ワクシニアウイルス（Moss, Dev. Biol. Stand. 82:55-63, 1994）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（Davis et al., J. Virol. 70: 3781-3787, 1996）、シンドビスウイルス（Pugachev et al., Virology 212: 587-594, 1995）およびＴｙウイルス様粒子（Allsopp et al., Eur. J. Immunol 26: 1951-1959, 1996）が挙げられる。好ましい態様では、ウイルスベクターはアデノウイルスである。
【０１８０】
ある用途のための別の好ましいウイルスは、アデノ関連ウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ関連ウイルスは、広範囲の細胞型および細胞種を感染させ得るし、複製欠損性になるよう工学処理することができる。それはさらに、熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を含めた多様な系統の細胞における高形質導入頻度、ならびに重複感染抑制の欠如といった利点を有するため多数組みの形質導入を可能にする。アデノ関連ウイルスは、部位特異的様式でヒト細胞ＤＮＡ中に組み込まれ、それにより挿入性突然変異誘発の可能性および挿入遺伝子発現の変動性を最小限にし得る。さらに、野生型アデノ関連ウイルス感染は、選定圧の非存在下で１００より多い継代の間組織培養で継がれるが、これは、アデノ関連ウイルスゲノム組込みが相対的に安定した事象であることを意味する。アデノ関連ウイルスは、染色体外様式でも機能し得る。
【０１８１】
概して、その他の好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が当該遺伝子に置き換えられた非細胞障害性真核生物ウイルスを基礎にしている。非細胞障害性ウイルスとしては、その生活環が、ＤＮＡへのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写とその後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス組込みを含むレトロウイルスが挙げられる。アデノウイルスおよびレトロウイルスは、ヒト遺伝子治療試験に関して承認されている。概して、レトロウイルスは、複製欠損性である（即ち、所望のタンパク質の合成を指示し得るが、感染性粒子を製造できない）。このような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoでの遺伝子の高効率性形質導入のための一般的実用性を有する。複製欠損性レトロウイルスを産生するための標準プロトコル（プラスミドへの外因性遺伝物質の組み入れの過程、プラスミドによるパッケージング細胞系のトランスフェクションの過程、パッケージング細胞系による組換えレトロウイルスの産生の過程、組織培地からのウイルス粒子の収集の過程、ならびにウイルス粒子による標的細胞の感染の過程を含む）は、Kriegler, M., “Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual,” W.H. Freeman Co., New York（1990）およびMurry, E.J. Ed.”Methods in Molecular Biology,” vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey（1991）に提示されている。
【０１８２】
好ましくは、上記の核酸送達ベクターは、（１）哺乳類細胞中へ転写され、翻訳されることができる、そして宿主中での免疫応答を誘導し得る外因性遺伝物質を含有し、ならびに（２）標的細胞、例えば哺乳類細胞の表面の受容体と選択的に結合し、それにより標的細胞への進入を獲得する配位子を表面に含有する。
【０１８３】
核酸が宿主中にin vitroで導入されるかまたはin vivoで導入されるかによって、細胞中に本発明の核酸を導入するための種々の技法を用いることができる。かかる技法としては、核酸−ＣａＰＯ４沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥに関連した核酸のトランスフェクション、当該核酸を含めた上記のウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介性トランスフェクション等が挙げられる。ある種の用途のためには、特定の細胞に対して核酸を標的化するのが好ましい。このような場合、細胞中に本発明の核酸を送達するために用いられるビヒクル（例えば、レトロウイルスまたはその他のウイルス；リポソーム）は、それに結合されたターゲッティング分子を有し得る。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体のような分子、または標的細胞上の受容体に対するリガンドは、核酸送達ビヒクルに結合されるか、またはその中に組み入れられ得る。好ましい抗体としては、癌関連抗原を、単独でまたはＭＨＣ分子との複合体として、選択的に結合する抗体が挙げられる。特に好ましいのは、モノクローナル抗体である。本発明の核酸を送達するためにリポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連した表面膜タンパク質と結合するタンパク質は、ターゲッティングのためにおよび／または取込みを促すために、リポソーム処方物中に組み入れられ得る。かかるタンパク質としては、特定の細胞型に向性であるキャプシドタンパク質またはその断片、周期中にインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を強化するタンパク質等が挙げられる。当業者に既知であるように、高分子送達系も、細胞中に核酸を送達するために首尾よく用いられている。このような系は、核酸の経口送達さえ可能にする。
【０１８４】
投与される場合、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容し得る調製物中で投与され得る。このような調製物は、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、補助免疫強化剤、例えばアジュバントおよびサイトカイン、ならびに任意にその他の治療剤をルーチンに含有し得る。
【０１８５】
本発明の治療薬は、注射を含めた任意の慣用的経路により、または長時間に亘る漸進的注入により投与することができる。投与は、例えば経口的、静脈内、腹腔内、筋内、腔内、皮下または経皮的であり得る。抗体が治療的に用いられる場合、好ましい投与経路は、肺エーロゾルによる。抗体を含有するエーロゾル送達系を調製するための技法は、当業者には周知である。一般に、このような系は、抗体の生物学的特性、例えばパラトープ結合能力を有意に損傷しない構成成分を利用すべきである（例えば、Sciarra and Cutie, “Aerosols,” in Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp 1694-1712参照、この記載内容は参照により本明細書中に援用される）。当業者は、過度の実験に頼ることなく、抗体エーロゾルを生成するための種々のパラメータおよび条件を容易に決定し得る。本発明のアンチセンス調製物を用いる場合には、緩徐静脈内投与が好ましい。
【０１８６】
本発明の組成物は、有効量で投与される。「有効量」とは、単独でまたはさらなる用量とともに、所望の応答を生じる、例えば癌関連抗原に対する免疫応答を増大する癌関連抗原組成物の量である。１つまたはそれ以上の癌関連抗原の発現により特徴づけられる特定の疾患または症状、例えば癌を治療する場合には、望ましい応答は、疾患の進行の抑制である。これは、疾患の進行を一時的に遅くすることのみを包含し得るが、さらに好ましくは、永続的に疾患の進行を停止させることを含む。これは、ルーチン法により監視することができるし、あるいは本明細書中で考察される本発明の診断方法により監視することができる。疾患または症状の治療に対する望ましい応答は、疾患または症状の発症を遅らせることでもあり、あるいは発症を防止することでさえある。
【０１８７】
かかる量は、当然ながら、治療中の特定の症状、症状の重篤度、年齢、体調、サイズおよび体重を含めた個々の患者パラメータ、治療の継続期間、併用治療の性質（もしあれば）、特定の投与経路、ならびに健康従事者の知識および専門的技術の範囲内の同様の剤によっている。これらの剤は、当業者には周知であって、ルーチンに過ぎない実験を用いて扱われ得る。個々の構成成分またはその組合せの最大用量が用いられるのが、即ち健全な医学的判断による最大安全用量が用いられるのが一般に好ましい。しかしながら、患者は、医学的理由、心理学的理由、または事実上あらゆるその他の理由のために低用量または耐容可能用量を主張し得るということが当業者には理解されよう。
【０１８８】
上記の方法に用いられる医薬組成物は、好ましくは滅菌性であり、患者への投与に適した重量または容量の単位での所望の応答を得るための有効量の癌関連抗原または癌関連抗原をコードする核酸を含有する。応答は、例えば遺伝子発現のような下流作用を測定することによって、または腫瘍の後退または疾患症状の低減といった癌関連抗原組成物の生理学的作用を測定することによって、レポーター系を介して癌関連抗原組成物の投与後の免疫応答を決定することにより測定することができる。その他の検定は当業者に既知であり、応答のレベルを測定するために用いることできる。
【０１８９】
対象に投与される癌関連抗原組成物（例えば、ポリペプチド、ペプチド、抗体、細胞または核酸）の用量は、異なるパラメータにしたがって、特に用いられる投与方式および対象の状態にしたがって選定することができる。その他の剤としては、所望の治療期間が挙げられる。対象における応答が適用された初期用量で不十分である場合には、患者の耐容性が許す程度まで、より高用量（または異なるより局在化された送達経路による有効高用量）を用いることができる。
【０１９０】
概して、免疫応答を引き出すかまたは増大するための治療に関しては、癌関連抗原の用量が処方され、当分野の任意の標準手法により、１ｎｇ〜１ｍｇの、好ましくは１０ｎｇ〜１００μｇの用量で投与される。癌関連抗原またはその変異体をコードする核酸が用いられる場合、標準手法にしたがって１ｎｇ〜０．１ｍｇの用量が一般に処方され、投与されるであろう。癌関連抗原組成物の投与のためのその他のプロトコルは当業者には既知であり、その場合、投与量、注射計画、注射部位、投与方式（例えば、腫瘍内）等は、上記とは変わる。例えば試験目的または獣医学的治療目的のためのヒト以外の哺乳類への癌関連抗原組成物の投与は、上記と実質的に同一条件下で実行される。
【０１９１】
ＣＴ抗原ペプチドが予防接種用に用いられる場合、抗原に対する免疫応答が増大されるように、癌関連抗原およびアジュバントを効率的に送達する投与方式が用いられ得る。アジュバント中の癌関連抗原ペプチドの投与のためには、好ましい方法としては、皮内、静脈内、筋肉内および皮下投与が挙げられる。これらは好ましい実施態様であるが、しかし本発明は、本明細書中に開示された特定の投与方式に限定されない。当分野の標準的参考文献（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990）は、免疫原をアジュバントとともに、または非アジュバント担体中で送達するための投与方式および処方物を提供する。
【０１９２】
投与される場合、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容し得る量で、ならびに薬学的に許容し得る組成物で適用される。「薬学的に許容し得る」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。このような調製物は、塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体および任意にその他の治療薬をルーチン的に含有し得る。薬剤中に用いられる場合、塩は製薬上許容可能であるべきであるが、非製薬上許容可能塩は、その薬学的に許容し得る塩を調製するために便利に用いることできるし、本発明の範囲から除外されない。このような薬理学的および薬学的に許容し得る塩としては、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、薬学的に許容し得る塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として、例えばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製することができる。
【０１９３】
癌関連抗原組成物は、所望により薬学的に許容し得る担体と組合せられ得る。本明細書中で用いられる「薬学的に許容し得る担体」という用語は、ヒトへの投与に適した１つまたはそれ以上の相溶性固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。「担体」という用語は、活性成分がそれと組合されて適用を促進する天然または合成の、有機または無機成分を意味する。医薬組成物の構成成分は、所望の製薬効力を実質的に減損する相互作用が存在しないような方式で、本発明の分子と、そして互いに混合することができる。
【０１９４】
医薬組成物は、適切な緩衝剤、例えば塩の酢酸、塩のクエン酸、塩のホウ酸および塩のリン酸を含有し得る。
医薬組成物は、任意に、適切な防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールも含有し得る。
医薬組成物は、単位投与態様で提示されるのが便利であり得るし、製薬分野で周知の方法のいずれかにより調製することができる。すべての方法が、１つまたはそれ以上の補助成分を構成する担体と活性剤を会合させる過程を含む。概して、組成物は、均一にかつ密接に活性化合物を液体担体、微粉固体担体または両方と会合させることにより、そして次に、必要な場合には、生成物を造形することにより調製される。
【０１９５】
経口投与に適した組成物は、各々が予定量の活性化合物を含有する、カプセル、錠剤、ロゼンジのような離散単位として提示することができる。その他の組成物としては、水性液体または非水性液体中の懸濁液、例えばシロップ、エリキシルまたはエマルションが挙げられる。
【０１９６】
非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張である、ＣＴ抗原ポリペプチドまたは核酸の滅菌水性または非水性調製物を含むのが便利である。この調製物は、適切な分散剤または湿潤剤および沈澱防止剤を用いて既知の方法により処方することができる。滅菌注射可能調製物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能溶液または懸濁液でもあり得る。用いることのできる許容し得るビヒクルおよび溶媒に、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として用いられるのが便利である。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含めた任意の無刺激固定油が用いることできる。さらに、脂肪酸、例えばオレイン酸は、注射可能薬物の調製物中に用いることできる。経口、皮下、静脈内、筋内投与等に適した担体処方物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに見出すことができる。
【０１９７】
核酸に関して本明細書中で用いる場合、「単離された」という用語は、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりin vitroで増幅されるか、（ｉｉ）クローニングにより組換え的に生産されるか、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル分離により精製されるか、または（ｉｖ）例えば化学合成により合成されることを意味する。単離された核酸は、当分野で周知の組換えＤＮＡ技術により容易に操作可能であるものである。したがって、５’および３’制限部位が既知であるか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクター中に含入されたヌクレオチド配列は、単離されたとみなされるが、その天然宿主中にそのネイティブ状態で存在する核酸配列はそうではない。単離された核酸は実質的に精製することができるが、そうである必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内で単離される核酸は、それが存在する細胞中の物質を極小パーセンテージのみ含み得るという点で純粋ではない。しかしながらこのような核酸は、当業者に既知の標準技法によりそれが容易に操作されるため、その用語が本明細書中で用いられるように、単離される。単離された核酸とは、本明細書中で用いる場合、天然染色体ではない。
【０１９８】
ポリペプチドに関して本明細書中で用いる場合、「単離された」とは、そのネイティブ環境から分離され、その同定または使用を可能にするのに十分な量で存在することを意味する。単離されたとは、タンパク質またはポリペプチドを指す場合、例えば、（ｉ）発現クローニングにより選択的に産生されるか、あるいは（ｉｉ）例えばクロマトグラフィーまたは電気泳動により精製されることを意味する。単離されたタンパク質またはポリペプチドは実質的に純粋であってもよいが、そうである必要はない。「実質的に純粋」という用語は、タンパク質またはポリペプチドが、それらが天然にまたはin vivo系で、それらの意図された使用のために実際的および適切な程度に見出されることができるその他の物質を本質的に含有しないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当分野で周知の技法により産生することができる。単離されたタンパク質は薬学的に許容し得る担体とともに医薬製剤中に混合することができるため、タンパク質は小重量％の調製物のみを構成し得る。タンパク質は、それが生きている系に関連し得る物質から分離されたという点で、それでもなお単離される、即ち、他のタンパク質から単離される。
【０１９９】
例
例１：ＣＴ抗原の特定
ＣＴ抗原の癌ワクチンの開発のターゲットとしての可能性について、多大なる関心が払われ、そして、変異抗原およびウィルスコード抗原以外のものとして、ＣＴ抗原は、明らかに、今日までに見出されたもののうち最も特異的な腫瘍抗原として位置づけられている。しかし、ＣＴ抗原は、癌およびその病気におけるその進行を考えるための新たな道を与える。
【０２００】
この考え方の出発点は、以下の事実、すなわちＣＴ抗原の発現は、初期生殖細胞の成長過程および癌に限られるということである。生殖細胞によって配偶子（卵母細胞および精母細胞）および栄養膜細胞が生じ、これらは絨毛膜および胎盤の形成に関与する。初期生殖細胞は、卵黄嚢壁に生じ、卵形成の間に将来的に性腺部位となる場所に移行する。卵形成において、そのプロセスは出生前に始まり、卵原細胞は一次卵母細胞に分化する。一次卵母細胞は、胎児の発育の間に最大数に達するが、これは減数分裂の初期段階において捕獲され、排卵および精子形成において初めて減数分裂を再開し、完了する。対照的に、精子形成は成熟期に始まり、連続的な有糸分裂のプロセスであり、精母細胞のプールおよび減数分裂を保ち、成熟精子群を生じせしめる。プロアクロソーム結合タンパク質前駆体であるＳＣＰ−１およびＯＹ−ＴＥＳ−１のように、ＣＴ抗原が配偶子形成において重要なのは明らかであり、そして他のＣＴ抗原であって配偶子に発現が限定されているものおよび栄養膜細胞も、配偶子細胞の初期成長において重要な役割を果たしていると考えられる。
【０２０１】
癌におけるＣＴ発現の異常を説明し得る可能性の一つは、ある種の癌に関連する全体的なデメチル化に関連する（４２）。ＭＡＧＥ遺伝子のプロモーター領域は転写活性化因子との結合部位を有しており、かかる結合部位は正常体細胞においてはメチル化されるが、ＭＡＧＥ発現癌細胞および精巣においてはデメチル化される。したがって、癌関連デメチル化によってＣＴ(ＭＡＧＥ)発現を説明できる可能性があるが、頻繁に観察される、多くの腫瘍における異なるＣＴ抗原の非調和的な発現パターン（セット）を、それによって完全に説明することはできない。また、ある種の腫瘍における極めて異質なＣＴ発現（３４、４３）も、全体的なデメチル化プロセスによって完全に説明することはできない。
【０２０２】
癌におけるＣＴ発現の再活性化の他のメカニズムは、ＣＴ遺伝子の調節領域における変異に関連する。今日までにＣＴ遺伝子における変異は見出されていないが、より伸長されたシークエンシング、とくにプロモーター領域におけるシークエシングがなされて初めてその可能性が排除される。しかし、ＣＴ遺伝子の変異は、癌におけるＣＴ発現の誘導の通常のメカニズムであるとは考えにくい。
【０２０３】
ＣＴ抗原の発生を説明し得る他の可能性は、癌における配偶子形成プログラムの誘導または活性化である。この考え方によれば、癌に見出される異なるＣＴセットが対応するＣＴ抗原セットであって、配偶子形成または栄養膜細胞の異なるステージにおいて通常発現されるものを複製することになる。配偶子形成プログラムを誘導する解発事象は、生殖細胞の発達における、未だ特定されていないマスタースイッチにおける変異である可能性があり、または癌遺伝子、抑制遺伝子、または癌における他の遺伝子における閾値以上および／または変異による、このマスタースイッチ活性化であり得る。単一のＣＴ遺伝子の活性化が、配偶子形成プログラム他の遺伝子の活性化のスイッチである可能性もある。この考えを支持する証拠は滑膜肉腫の研究に見出され、それによれば第１８染色体のＳＹＴ遺伝子およびＸ染色体上のＳＳＸ−１またはＳＳＸ−２遺伝子に関連する転座事象が関連性を有しないＣＴ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥの発現に関与している（４４、４５）。この理論構築を延長し、それをＣＴ抗原の発生におけるデメチル化の役割に関連づけると、癌（原因とは無関係に）におけるデメチル化の状態によって配偶子形成プログラムを誘導し、サイレントなＣＴ遺伝子の活性化につながる。一方、デメチル化は配偶子形成プログラムの生得的な部分であり、それは配偶子形成プログラムおよび癌におけるＣＴ遺伝子がスイッチングされた結果であって、原因ではないとすることも可能である。
【０２０４】
癌におけるＣＴ抗原再活性化発現メカニズムに関する疑問点に加えて、他に重要な問題は、癌におけるこれらの遺伝子が、その悪性挙動に関与しているか否かである。配偶子、栄養膜細胞および癌が、これらの細胞に限定される抗原の一群を共通に有しているという発見は、他の共通する特性を見出すためのより広範な研究の動機付けとなっている。
【０２０５】
栄養膜細胞と癌との間に生物学的特性上の類似点があることによって、スコットランドの発生学者であるJohn Beardは、前世紀の末期に癌の栄養膜細胞理論（trophoblastic theory of cancer）（４６、４７）を提唱するに至った。彼の理論によれば、癌は、性腺に移動する途中にあるかまたは性腺に捕獲された配偶子細胞から生じる。発癌性の刺激により、前記細胞は悪性の栄養膜細胞への転換を受ける。これらの悪性栄養膜細胞は、器官の種類に依存して常駐細胞の型（resident cell types）を取るが、結果的に生じる癌は、細胞の由来である場所や態様上の差異の程度とは無関係に、栄養膜細胞由来のものである。Beardによれば、癌の侵襲的特性、破壊的特性、そして転位性特性は、栄養膜細胞が通常示す機能、例えば血管の侵襲、子宮壁への成長、および子宮を越えた拡散、に帰着される。現代の考え方からは、Beardの癌は捕獲された配偶子細胞に由来するという着想は、血清学的マーカーおよび分子マーカーであって、正常分化およびそれらの保存の異なる経路を癌において区別するものに関して増大する我々の情報とは相容れないものである。栄養膜細胞と癌とが共通の特性を有しているというBeardの理論は、常駐癌における配偶子形成プログラムの誘導によって、異常型配偶子細胞から生じるとするより明快に説明される。しかし、最終的な結果は、同様であるといえる。すなわち、配偶子形成および栄養膜細胞の発達を受ける細胞の選択された特性によって、体細胞は変質を受ける。
【０２０６】
ＣＴ抗原に加えて、配偶子細胞および癌には他にも共通する特性が認められている。例えば、ＳＣＰ−１は減数分裂プログラムにおける重要な因子であるが、これは非配偶子細胞癌に発現される。体細胞における減数分裂の誘導は、正常であれ異常であれ、染色体の混乱状態（chromosomal anarchy）につながり、これは成長した癌の第一の特徴である。したがって、減数分裂に特有に関連し、癌において発現される他のタンパク質もＣＴ抗原の候補として認識される。
【０２０７】
ＯＹ−ＴＥＳ−１は、プロアクロシン結合タンパク質前駆体であり、精子形成につながる特有のプログラムに関与するものであるが、ＣＴ抗原として認識されている。したがって、他の成熟精子に特有な、癌における遺伝子産物もＣＴ抗原の候補として認識される。
【０２０８】
さらに、栄養膜細胞によるＣＴ抗原の発現によって、旧来の問題が新たに脚光を浴びた。研究が進んだ、ヒト癌における、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）および他の栄養膜細胞ホルモン（trophoblastic hormones）の散発的産生である（例えば４８、４９、５０）。癌によるＨＣＧの産生は、一般に癌遺伝子における遺伝の不安定さを示唆する他の根拠であるとみなされていて、かかる不安定さとは、発癌期および腫瘍進行期においてサイレント遺伝子をランダムかつ悪性に活性化する結果をもたらすことである。しかし、それを癌における配偶子／栄養膜細胞プログラムの誘導の結果であり、ＣＴ抗原の半調整的発現にもつながるものであるとみなすことも可能である。このプログラムの活性化は、癌に生殖細胞、配偶子細胞、および栄養膜細胞の他の特性を付与することになるが、これらを正確に関連づけることはさらに困難である。しかし、不死、侵襲性、接着の欠如、移行挙動、血管の誘導、デメチル化およびＭＨＣの下方調節は、癌と生殖細胞／配偶子細胞／栄養膜細胞分化経路を経る細胞とが共通して有している特性である。癌の転移性も、生殖細胞の移動性と対応するものである可能性があり、通常の栄養膜細胞が、他の器官、例えば肺に、通常の妊娠期に移行するが、ある時期に退縮する性質に対応するものである可能性がある。
【０２０９】
癌における、配偶子形成特性の発現につながるプログラムの変換に関する考え方を追求するにあたり、「癌における配偶子形成プログラム」（"Gametogenic Program Induction in Cancer"（ＧＰＩＣ））と題された仮説が提唱され、それによれば生殖細胞の発達に関与している少なくとも４つの異なる経路の区別がなされる可能性がある：Ａ）生殖細胞から生殖細胞へ、Ｂ）生殖細胞から卵原細胞へ、そして卵細胞へ、Ｃ）生殖細胞から精原細胞へ、そして精子へ、およびＤ）生殖細胞から栄養膜細胞へ。減数分裂プログラムは、BおよびCに共通するが、ＯＹ−ＴＥＳ−１のようなタンパク質はＣに限定され、そしてＨＣＧはＤに特有のものであると考えられる。これらの経路および究極的には各経路のステージを区別する理由は、ＣＴ抗原の種々のパターンまたはセットが異なる癌においてみられ、このことは生殖細胞プログラム、例えば経路およびステージであってこれらの癌において誘導されるもの、を反映するものであるかもしれないからである。
【０２１０】
この背景および枠組みによって配偶子形成と癌の発達との関係について考察するにあたり、数多くの取る得るアプローチの方法があり、さらなるＣＴ抗原を特定することができる。
【０２１１】
１．新たなＣＴ抗原の探索が数種の方法を用いて達成され、これはＳＥＲＥＸ（例えば参考文献１０を参照）、とくに精巣からのライブラリー、正常もしくは異常な栄養膜細胞からのライブラリー、または腫瘍もしくは腫瘍セルライン（デメチル化試薬存在下または非存在下にて成長しているもの）であって各種ＣＴ抗原を発現するものからのライブラリーによって、および発現差解析法（representational difference analysis）を拡張的に用いて達成される。バイオインフォマティクスおよびチップテクノロジーを用いれば、データバンクから転写物であって癌／配偶子／栄養膜細胞を示すものを探り出すことができる。
【０２１２】
２．既知のＣＴ抗原の、正常配偶子形成および栄養膜細胞の発達における発現パターンを決定し、マーカーであって異なる経路およびステージであって正常配偶子形成プログラムにおけるものを区別するものを特定する。この情報によって、ＣＴ抗原発現の複雑なパターンの解析が得られ、ＣＴ表現型に基づく癌を分類する新たな方法が得られる。
【０２１３】
３．個々のＣＴ抗原であって異なる型の腫瘍におけるものの発現頻度が、今日までに知られているＣＴ抗原について特定されている。本明細書に記載されている方法によって特定されたＣＴ抗原の発現頻度を解析することに加えて、さらなる情報として個々の腫瘍の複合されたＣＴ発現型、およびこれらの複合されたＣＴ発現型パターンが、由来の異なる腫瘍においてみられる頻度が集められる。治療上のデータ、遺伝子型データ、表現型データおよびＣＴ抗原発現データを個々の腫瘍について集めたデータベースが確立されているため、個々の腫瘍の特性を比較し、前記データとの相関を調査する目的に用いることができる。この情報によって、ＣＴ発現と腫瘍の他の生物学的特性、例えば成長速度、局所的かまたは浸潤性か、一次か転移性か、同一の患者における異なる転移腫瘍であるかなど、との相関を調べることができる。
【０２１４】
４．癌のライフヒストリーのどのステージにおいてＣＴ（配偶子形成）の特性が誘導されるかを決定するには、マウスモデル系、ヒト細胞を用いたインビトロ系、または自然発生によるヒトの腫瘍であって、腫瘍の進行における漸進的段階を示すものを用いることが可能である。上記において議論したように、ＣＴ発現はより大きい悪性の発症である。
【０２１５】
５．ＣＴ抗原の発現が、多くのヒトの癌において不均一であることを理解する必要がある。これは、ＣＴ＋およびＣＴ−細胞におけるｍＲＮＡ／タンパク質レベルの定性的差異を反映するものであるかもしれないし、またはＣＴｍＲＮＡ／タンパク質発現に関するＣＴ＋およびＣＴ−細胞間の定性的差異があるかもしれない。レーザー分解顕微鏡（Laser dissection microscopy）は、この問題を解決する一つの方法かもしれないし、ＣＴ発現が不均一な腫瘍からの腫瘍細胞のクローニングは、不均一な発現を理解するための別法である。確立されたヒト癌セルラインは、ＣＴ抗原発現を、対応する腫瘍の型、とくにＣＴ発現頻度が低い腫瘍、のＣＴタイピングから予想されるより、より高いＣＴ頻度を示すとされる印象が増大している。このことはインビトロ培養の二次的な結果かもしれないし、またはＣＴ＋細胞（それらは腫瘍の一部を占める群にすぎないが）は、インビトロにおいて増殖する際の成長する上での優位性を有し、おそらくインビボにおいてもそうであるかもしれない。
【０２１６】
６．ＣＴ抗原は配偶子形成プログラムおよび癌との間の密接な結びつきを供するものであるが、配偶子の発達における他の差別化特性を癌が発現するか、そしてＣＴ抗原発現との相関を有するかが決定されている。過去３０年間の、ある種のヒト癌によるＨＣＧ産生に関する多くの報告によって、この問題を解明し、ＨＣＧの産生がＣＴ抗原発現、とくにＣＴ抗原発現の独自のパターン、例えば栄養膜細胞プログラムを反映するようなパターン、と相関を有するかを問うための、特定の出発点が供される。
【０２１７】
７．遺伝子改変およびノックアウトアプローチであって、マウスＣＴ対応部分（counterpart）を用いるもの、およびトランスフェクション解析であってＣＴコード遺伝子であって正常および悪性ヒト細胞を用いるアプローチを実施することによって、配偶子形成および栄養膜細胞の成長におけるＣＴ抗原の役割および癌における機能的重要性が特定される。
【０２１８】
例２：ＣＴ遺伝子産物の特定
新たなＣＴ抗原遺伝子産物を特定するために、ＥＳＴおよびジェンバンクデータベースの両方の編集物であるユニジーンデータベース（Unigene database）を探索し、癌を有する精巣および正常精巣に特有に発現される転写産物を求めた。これに続く、候補転写産物のＲＴ−ＰＣＲ解析によって、数種の遺伝子産物を特定したが、これらは高度に限定されたｍＲＮＡ発現パターンを有し、新たに特定された３種のＣＴ遺伝子を含んでいた。
【０２１９】
方法と材料
癌・精巣関連油にユニジーンクラスターのバイオインフォマティックスによるな特定
癌ゲノム解析プロジェクト(http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler)のｃＤＮＡＸプロファイラツールを用いてユニジーンデータベースを以下のようにして探索した。まず、発現シークエンスタグ（ＥＳＴ）２つのプールを構築した。プールＡは６個の正常精巣ｃＤＮＡライブラリーに由来するＥＳＴからなり、そしてプールＢは１８８個の腫瘍由来ｃＤＮＡライブラリー（全ての組織学的な型）に由来するＥＳＴからなるものであった。Ｘプロファイラ検索エンジンを、プールＡおよびプールＢの両方からのＥＳＴを含むそれらのユニジーンクラスターを特定するように方向付けし、そして他の全ての正常組織ｃＤＮＡライブラリーからのＥＳＴを含むユニジーンクラスターを除いた。得られたユニジーンクラスターの組織発現パターンの解析も、インシリコの遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）によって、ＳＡＧＥ：各ユニジーンクラスターエントリーに関連する、遺伝子をタグにマッピングするためのツール、を用いて行った。既知の遺伝子産物に対するそれらの関係を、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースのＢＬＡＳＴサーチ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)または推定されるタンパク質への翻訳のモチーフ解析(http://motif.genome.ad.jp)によって決定した。さらに、全ての認識されたユニジーンクラスターからの代表的なＥＳＴのＢＬＡＳＴサーチを実施し、それはヒトゲノム配列データベースに対してであり、ゲノムマッピング情報を得て、そしてイントロン／エクソンの境界をＰＣＲプライマーデザインを用いて決定した。
【０２２０】
逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）解析
２０個の異なる正常ヒト組織からの総ＲＮＡをClontech Laboratories Incorporated (Palo Alto, Calif.) およびAmbion Incorporated(Austin, Tex.)から購入した。腫瘍組織は外科手術由来の標本であり、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Weill Medical College of Cornell UniversityおよびKrankenhaus Nordwest(Frankfurt, Germany)から得た。腫瘍組織からの総ＲＮＡはグアニジニウムチオシアネート法によって調製した。
【０２２１】
ＲＴ−ＰＣＲ反応においてテンプレートとして用いるｃＤＮＡの調製は、Superscript first strand synthesis kit (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.)を用いて行った。ｃＤＮＡの合成は、５μｇの総ＲＮＡを、４０μｌ１Ｘ逆転写酵素バッファであってランダムヘキサマー１００ｎｇ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、５．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＤＴＴ、８０Ｕのリボヌクレアーゼ阻害剤および１００ＵのスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素を含むものの中で、４２℃にて５０分間インキュベートすることによって行った。ゲノムＤＮＡの増幅程度を評価するためのコントロールテンプレートの調製は、逆転写酵素を欠如した複製サンプルとして行った。
【０２２２】
オリゴヌクレオチドプライマーであって選択されたユニジーンクラスターに存在するものと相同のものを商業的に（Invitrogen Life Technologies）合成した。
【０２２３】
【化１】
2004532629.tif 000004
【０２２４】
ＲＴ−ＰＣＲは以下のように行った。２５μｌのＰＣＲ反応混合物であって、２μｌのｃＤＮＡ（または２．０μｌのゲノムＤＮＡ増幅コントロール）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５μＭの遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマー、および２．５Ｕの白金ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen Life Technologies）からなるものを９４℃に２時間加熱し、その後３４回のサーマルサイクルに付し、それは９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間であり、そして最終サイクルを９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で５分間とした。サーマルサイクリングはABI 7700 Sequence Detectorを用いて行った。得られたＰＣＲ産物の解析を、２％アガロース／Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡゲルにおいて行い、特定結果をＤＮＡをシークエンシングすることによって確認した。
【０２２５】
リアルタイム定量的逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ
総ＲＮＡサンプルであって８個の異なる正常成人組織から得たものおよび８個の腫瘍標本から得たものを調製し、上記のように逆転写させてｃＤＮＡを得た。遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲプライマーを設計したが、これにはPrimer Express software (PE Biosystems, Foster City Calif.) を用い、商業的に（PE Biosystems）行った。関連するｔａｑｍａｎプライマーの組およびプローブのＤＮＡ配列は以下の通りである。
【０２２６】
【化２】
2004532629.tif 000005
【０２２７】
マルチプレックスＰＣＲ反応物の調製は、２．０μｌのｃＤＮＡ（または２．０μｌのゲノムＤＮＡ増幅コントロール）を、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスであって、２００ｎＭのＦａｍ（6-carboxy-fluorescein）を遺伝子特異的なＴａｑＭａｎプローブによってラベルしたもの、３００〜９００ｎＭの遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマー（予め決定した至適濃度）、Ｖｉｃラベルしたヒトベータグルクロニダーゼ、またはホスホグリセロキナーゼ内部コントロールプローブ／プライマー混合物（特許にかかる色素、PE Biosystems）を加えたものに希釈したものを用いて行った。６個の２５μｌＰＣＲ反応物を、各ｃＤＮＡサンプル（各内部コントロールに３個）に調製した。ＰＣＲサイクルは４０サイクルであって、９５℃（１５秒間）の変性および６０℃（６０秒間）のアニーリング／伸長によって構成した。サーマルサイクリングおよび蛍光モニターは、ＡＢＩ  ７７００シークエンスアナライザ（PE Biosystems）を用いて行った。一定の閾値以上のＰＣＲ産物が初めて検出されるインターバルをサイクル閾値（Ｃｔ）と称し、これを各サンプルにつき決定し、そして３反復サンプルの平均を記録した。遺伝子特異的転写産物のコピー数をＲＮＡ出発物質１μｇあたりとして求めたが、これはＣｔ値の標準曲線との比較によって行った。前記Ｃｔ値の標準曲線は既知濃度の、相同遺伝子産物をコードするｃＤＮＡから決定した。総ＲＮＡサンプル中に存在するｍＲＮＡの量を標準化するために、内部コントロールから得たＣｔ値を遺伝子特異的Ｃｔ値から減じた（ΔＣｔ＝ＣｔＦＡＭ−ＣｔＶＩＣ）。３反復のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、２組の３つのΔＣｔ値が各ＲＮＡサンプルに与えられ（内部コントロール１個につき１組）、そして６個のΔＣｔの平均値を計算した。遺伝子特異的ｍＲＮＡ濃度のうち、正常組織由来または腫瘍組織由来のものを正常精巣に対して計算したが、これは標準化したＣｔを同様に扱い（ΔΔＣｔ＝正常組織または腫瘍組織のΔＣｔ−正常精巣のΔＣｔ、そして相対濃度（相対濃度＝２−ΔΔＣｔ）を求めることによって行った。標準化した総ＲＮＡ１μｇあたりの転写産物のコピー数の計算は各ｃＤＮＡサンプルの平均相対濃度に精巣組織におけるコピー数を乗じることによって行い、精巣組織におけるコピー数は標準曲線から求めた（コピー数＝２−ΔΔＣｔ×精巣組織におけるコピー数）。
【０２２８】
結果
バイオインフォマティクス解析
１３２５個の異なるユニジーンクラスターであって、ＣＴ抗原に類似したインシリコ発現プロファイルを有するものが特定され、これはユニジーンデータベースを発現シークエンスタグ（ＥＳＴ）であって、腫瘍組織および正常精巣のｃＤＮＡライブラリーに限定的に由来するものを含む遺伝子クラスターを探索することによって行われた。これらの癌・精巣関連ユニジーンクラスターは、６１個の既知の遺伝子および１２６４個の非特徴的（uncharacterized）遺伝子を示していた。表２に示すように、ユニジーンクラスターを２つのカテゴリーに分類した。グループＩは８５９個の異なる遺伝子クラスターからなり、精巣および腫瘍ｃＤＮＡライブラリーに限定的に由来するものを含むものであり、これを癌・精巣（ＣＴ）関連ユニジーンクラスターと称した。グループＩＩは４００個の異なる遺伝子クラスターからなり、精巣および生殖細胞腫瘍（他の型の癌は含まない）ｃＤＮＡライブラリーに限定的に由来するものを含むものであり、これを精巣関連ユニジーンクラスターと称した。他の６６個の遺伝子クラスターはさらに追求しなかったが、その理由はそれら個々のユニジーンデータベースエントリーが本研究の最中に改変されたか、または既知の遺伝子産物に関する文献報告によって、それらが精巣以外の他の正常組織においても発現することが示唆されていたからである。ユニジーンデータベースに従って、本研究においては特異的遺伝子クラスターをHomo sapiens．数字による記載（例：Ｈｓ．１２３４５６）によって指定した。
【０２２９】
【表３】
2004532629.tif 000006
【０２３０】
グループＩおよびグループＩＩユニジーンクラスターのｍＲＮＡの発現パターンのさらなる解析を、インシリコ遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）によって行った。表２に示すように、グループＩおよびグループＩＩユニジーンクラスターのサブグループとしてＡ、ＢおよびＣに再分割したが、これは相同のＳＡＧＥタグの存在および組織分布に基づいて行った。サブグループＩＡおよびＩＩＡは、ＳＡＧＥタグとして腫瘍および／またはセルライン由来のＳＡＧＥライブラリーにのみ存するものを有している。サブグループＩＢおよびＩＩＢは、信頼できるＳＡＧＥタグを有していない。サブグループＩＣおよびＩＩＣは、ＳＡＧＥタグとして、正常組織ＳＡＧＥライブラリーに存するものを有している。４個の既知の癌・精巣抗原が１３２５ユニジーンクラスターに特定され、これはＣＴ１１ｐ／Ｈｓ．２９３２６６（グループＩＡ）、ＧＡＧＥ  ４／Ｈｓ．１８３１９９（グループＩＢ）、ＭＡＧＥＢ１／Ｈｓ．７３０２１（グループＩＣ）、およびＳＡＧＥ／Ｈｓ．１９５２９２（グループＩＩＡ）を含むものであった。
【０２３１】
組織限定的ｍＲＮＡ転写物のＲＴ−ＰＣＲによる特定
１３２５個の本研究において特定されたユニジーンクラスターのうち、７３個のｍＲＮＡ発現パターンの解析をＲＴ−ＰＣＲによって、２０個の正常組織由来のＲＮＡサンプルパネルを用いて行った。数種の基準を用いて、これらの癌・精巣関連ユニジーンクラスターであってＲＴ−ＰＣＲ用のものを選択した。既知のＣＴ抗原はＸ染色体にマップされているため、全ての癌・精巣関連ユニジーンクラスターマッピングをＸ染色体に対して試験を行った（総計１９個）。また、メラノーマおよび肉腫は数多くのＣＴ抗原を発現するため、１０個の癌・精巣関連ユニジーンクラスターであって、メラノーマおよび肉腫ライブラリー由来のＥＳＴを有するものについても試験を行った。癌・精巣関連ユニジーンクラスターのうち、機能上の重要性を癌に関連して有するもの（例えば転写因子、接着分子）についても試験を行った（総計２１個）。残りの２３個の解析したユニジーンクラスターはランダムに選択した。癌・精巣関連ユニジーンクラスター下位群に関連して、５９個のＣＴ関連ユニジーンクラスター（３８個がグループＩＡから、９個がグループＩＢから、１２個がグループＩＣから）および１４個の精巣関連ユニジーンクラスター（６個がグループＩＩＡ、７個がグループＩＩＢから、１個がグループＩＩＣから）の解析をＲＴ−ＰＣＲによって行った。
【０２３２】
図１に示すように、７３個の癌・精巣関連ユニジーンクラスターであってＲＴ−ＰＣＲ解析に付したもののうち、１０個が異なる発現を行っていると考えられ、特定された転写物の数が正常組織に比して限定的であり、すなわちｍＲＮＡの発現が正常組織に対して７／２０しか検出されなかった。これらを表３に示す。
【０２３３】
【表４】
2004532629.tif 000007
【０２３４】
他の６３個の遺伝子産物のｍＲＮＡ発現パターンは、正常組織に偏在するか（４３個のユニジーンクラスター）、もしくは不明瞭なＲＴ−ＰＣＲの結果であって、イントロを有しないＤＮＡからの増幅（８個のユニジーンクラスター）、非特異的増幅（４個のユニジーンクラスター）からのものを生ぜしめたか、または増幅されなかった（８個のユニジーンクラスター）。  特定された１０個の異なる発現転写産物のうち、７個は精巣にのみ発現され（他の正常組織においては０／１９）、そして３個の他の遺伝子産物は、限定された数の正常組織であって、精巣および卵巣以外のものにおいて検出された（図１Ａ）。７個の精巣に限定的に生じた転写産物のうち、２個は既知のタンパク質、すなわちユビキリン３（Ｕｂｑｌｎ  ３、Ｈｓ．１８９１８４、グループＩＩＡ）ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ２またはフェルチリンβ（ＡＤＡＭ２、Ｈｓ．１７７９５９、グループＩＣ）をコードし、５個は非特徴的な遺伝子産物であるＨｓ．１２１５５４（グループＩＡ）、Ｈｓ．１７８０６２（グループＩＡ）、Ｈｓ．２４５４３１（グループＩＢ）、Ｈｓ．９７６４３（グループＩＣ）およびＨｓ．１９５９３２（グループＩＩＡ）をコードしていた。ＳＡＧＥタグであって、既知の正常大腸組織における遺伝子産物であるＡＤＡＭ２／Ｈｓ．１７７９５９（グループＩＣ）に対応するものについては、本出願人らのＲＴ−ＰＣＲ発現データからはＡＤＡＭ２／Ｈｓ．１７７９５９の正常大腸組織における発現は確認されない（図１Ａ）。７個の精巣限定的な転写産物以外に、３個の他のユニジーンクラスターが、限定された数の正常組織において発現されていた。制御因子Ｘ４をコードする転写産物（ＲＦＸ４、Ｈｓ．１８３００９、グループ  ＩＡ）は精巣および脳においてのみ検出された（他の正常組織においては０／１８）。２個の非特徴的転写産物であるＨｓ．１２８８３６（グループＩＣ）およびＨｓ．２９３３１７（ＩＩＡ）は、精巣、卵巣、子宮頸管および肺（他の正常組織においては０／１６）  精巣、前立腺、卵巣、肺、乳房および大腸（他の正常組織においては０／１４）においてそれぞれ発現されていた。
【０２３５】
癌におけるＣＴ関連ユニジーンクラスター
７個の精巣限定的転写物は、全てＣＴ遺伝子産物であると考えられたが、それは同一配列が腫瘍由来ＥＳＴライブラリー（グループＩユニジーンクラスター）またはＳＡＧＥライブラリー（グループＩＩＡユニジーンクラスター）に存在していることに基づく。このことをインシリコ発現プロファイルによって確かめるために、本研究において特定された組織限定的転写物をＲＴ−ＰＣＲにより解析を、その際種々の悪性組織由来のＲＮＡサンプルを用いて行った。図１Ｂに示すように、７個の精巣限定的転写物のうちの３個、すなわちＡＤＡＭ２／Ｈｓ．１７７９５９、Ｈｓ．２４５４３１、およびＨｓ．１７８０６２も腫瘍組織にも発現され、新たなＣＴ遺伝子として特定された。これらのＣＴ遺伝子は、１個の既知の遺伝子産物を表し、２個の非特徴的転写産物を表す。既知のタンパク質であるＡＤＡＭ２／Ｈｓ．１７７９５９を、限定的に精巣および１６例中２例においては腎臓癌においても発現されていた（表３および４）。
【０２３６】
【表５】
2004532629.tif 000008
【０２３７】
ＣＴ抗原に関して提唱された命名（２１）に従って、ＡＤＡＭ２はＣＴ位置指定（designation）をＣＴ１５とした。ＡＤＡＭ２／ＣＴ１５は、メタロプロテイナーゼ様の、ディスインテグリン様の、システインリッチなドメインファミリーの精子表面タンパク質であって、卵／精子相互作用に関与している（５１）。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＣＴ１５／Ｈｓ．１７７９５９について配列番号１８および１９に記載している。
【０２３８】
本研究において特定された他のＣＴ遺伝子産物は、ＣＴ１６と位置指定され、これは非特徴的転写産物であり、Ｈｓ．２４５４３１ユニジーンクラスターによって表される。ＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１は４／１８のメラノーマ、７／１８の肺癌、１／１８の乳癌、１／９の大腸癌および７／１６の腎臓癌において発現されていた（表３および４）その発現は、数種の腫瘍細胞セルラインにおいても見出され、それはＳＫ−ＬＵ−１７肺癌、ＳＷ１０４５肉腫、および４／８のメラノーマセルライン（ＳＫ−ＭＥＬ−１９、−１０９、−３７、および−１０）を含むが、正常メラニン細胞にはみられなかった。ＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１のｃＤＮＡ配列は７６３個のヌクレオチド（ジェンバンクＡｃｃ＃  ＢＣ００９２３０）からなり、完全なオープンリーディングフレームを有し、それは１１０個のアミノ酸からなる仮想全長タンパク質をコードしている。予測されているＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１アミノ酸配列は、３０％〜４０％の相同性をＣＴ抗原ファミリーであるＧＡＧＥ−Ａに対して有し（１５）、そして４０％〜５０％の相同性をＧＡＧＥ−Ｂ／ＰＡＧＥ−１に対して有している（５２）。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Ｈｓ．２４５４３１についてはそれぞれ配列番号２０および２１として示してある。
【０２３９】
第３の新たに特定されたＣＴ遺伝子産物は、ＣＴ１７と位置指定し、Ｈｓ．１７８０６２ユニジーンクラスターを表し、１／１８の乳癌および４／１６の腎臓癌において発現されていた（表３および４）。ＣＴ１７／Ｈｓ．１７８０６２のｃＤＮＡ配列は８７７個のヌクレオチドからなり（配列番号２２；ジェンバンクアクセス＃  ＡＡ４７００３５）、２０２個のアミノ酸からなる、タンパク質の一部をコードし（配列番号２３）それは３０％の相同性をホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼＡ１に対して有している（５３）。
【０２４０】
他の４個の精巣限定的遺伝子産物であるＴＳＰＮＹ／Ｈｓ．９７６４３  １０（配列番号２４および２５）、ＴＴＹ１２／Ｈｓ．１９５９３２（配列番号  ２６および２７）、Ｕｂｑｌｎ  ３／Ｈｓ．１８９１８４（配列番号２８および２９）およびＨｓ．１２１５５４（配列番号３０および３１）（表２）、は、腫瘍組織においては検出されなかった。
【０２４１】
３個の遺伝子産物であって、本研究において限定された数の正常組織において特定されたものは、腫瘍細胞においても発現されていた（表５）。
【０２４２】
【表６】
2004532629.tif 000009
【０２４３】
既知の遺伝子である制御因子Ｘ４（ＲＦＸ４、Ｈｓ．１８３００９）は、精巣および脳にのみ限定的に発現され、１／９の大腸癌、および４／８メラノーマセルライン（ＳＫ−ＭＥＬ−１９、−３７、−１０、および−３０）においても発現されていたが、正常なメラニン細胞には発現されなかった（表３および５）。ＲＦＸ４／Ｈｓ．１８３００９（配列番号３２および３３）は、ユニジーンデータベースにおいて、乳癌における転位産物として示され、該産物は偏在して発現される第６染色体上のエストロゲン受容体１遺伝子、および新規なＲＦＸ様遺伝子（ＲＦＸ−４）第１２染色体（５４）を含んでいた。
【０２４４】
第二の異なる発現を示す転写産物は、Ｈｓ．１２８８３６ユニジーンクラスターによって示され、正常な精巣、卵巣、子宮頸管および肺に発現され、７／１８の肺癌、２／４の卵巣癌、２／１８の乳癌、１／９の大腸癌および２／１６の腎臓癌においても発現していた（表３および５）。Ｈｓ．１２８８３６のｃＤＮＡｓ配列は５５８個のヌクレオチドからなり（配列番号３４）、１６４個のアミノ酸からなる、仮想タンパク質の部分をコードし（配列番号３５）、特徴的なタンパク質または既知のタンパク質モチーフとの相同性を示さなかった。
【０２４５】
第二の異なる発現を示す転写産物は、Ｈｓ．２９３３１７ユニジーンクラスターによって示され、正常な精巣、卵巣、肺、乳房、前立腺および大腸に発現され、９／１８のメラノーマ、１４／１８の肺癌、６／１８の乳癌、１／９の大腸癌２／４の卵巣癌、および３／９の大腸癌においても発現していた（表３および５）。転写産物は２つの腫瘍セルラインであるＳＷ１０４５  肉腫およびＳＫ−ＬＵ−１７肺癌においても検出されたが、８個のメラノーマセルラインには発現されず、正常なメラニン細胞には発現された。Ｈｓ．２９３３１７は新規なｃＤＮＡ配列であり、５４９個のヌクレオチド（ジェンバンク＃  ＡＷ００２９１５）であり、完全なオープンリーディングフレームを有し、それは１１０個のアミノ酸からなる仮想全長タンパク質をコードし、該タンパク質は新たに特定されたＣＴ遺伝子である、上記ＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１に対して８９％の相同性を有していた。ＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１との相同性を基に、Ｈｓ．２９３３１７はＣＴ１６．２と位置指定された。ユニジーンクラスターＨｓ．２９３３１７によって特定されたコンティグの遺伝子配列は、配列番号３６として示した。前記コンティグの翻訳ポリペプチドは、配列番号３７として示した。
【０２４６】
癌・精巣遺伝子発現の定量的解析
ｍＲＮＡ発現プロファイルを、ＣＴ１５、ＣＴ１６およびＣＴ１７についてさらに調査を行うために、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、種々の組織および腫瘍標本由来のＲＮＡパネルを用いて行った。比較のために、プロトタイプのＣＴ抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１（１８）およびＭＡＧＥ−３（５５）についても同様な方法で解析を行った。ＣＴ遺伝子発現の標準レベルを正常組織および癌について、精巣における発現レベルと対比して表６に示した。
【０２４７】
【表７】
2004532629.tif 000010
【０２４８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、全体として、ＣＴ遺伝子産物について、正常な非配偶子形成組織において発現は全くないか、または正常な精巣に比して極めて低いレベル（３％以下）であることが明らかになった。正常組織については、ＣＴ１５の発現は、精巣における検出の１％のレベルで膵臓において検出された。ＣＴ１６のｍＲＮＡの発現は、正常組織においては転写産物は腎臓および肝臓にのみ検出され、検出レベルはそれぞれ精巣の０．１％および０．４％であった。ＣＴ１７およびＭＡＧＥ−３のｍＲＮＡの発現は、精巣に限定されていた。ＮＹ−ＥＳＯ−１の場合については、正常な脳、大腸および肺における発現レベルは、それぞれ精巣における検出レベルの３％、２％および３％であった。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、卵巣においても精巣における検出レベルの５２％検出された。ＣＴ転写産物の総ＲＮＡμｇあたりのコピー数についても、これらの相対的発現レベル（表６）およびコピー数が既知である相同ｃＤＮＡの標準曲線との比較に基づいて計算した。精巣におけるＣＴ遺伝子の発現レベルの変動幅は大きく、ＣＴ１５が最大のコピー数を有し（４４５，０００コピー／μｇＲＮＡ）、ＣＴ１６（１４９，０００コピー／μｇＲＮＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１  （３１，３００コピー／μｇＲＮＡ）、ＣＴ１７（１６，１００コピー／μｇＲＮＡ）およびＭＡＧＥ−３（１５，０６０コピー／μｇＲＮＡ）がこれに次いだ。
【０２４９】
腫瘍組織におけるＣＴ遺伝子についても、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。腎臓癌標本であるＲＣＣ１、ＲＣＣ５およびＲＣＣ６において、ＣＴ１５の発現レベルは、それぞれ精巣における検出レベルの２％、０．０７％および０．８％であった（表６）。ＲＣＣ１およびＲＣＣ６腫瘍は、いずれもＣＴ１５の発現は、通常のＲＴ−ＰＣＲにより陽性であったが、ＲＣＣ５は陰性であった（図１Ｂ）。表６に示すように、ＣＴ１６の発現レベルは２つのメラノーマサンプルにおいて、それぞれ３．１倍および６４培のレベルであった。乳癌標本においては、ＣＴ１６発現レベルは、精巣における検出レベルの３．２培であった。これら２つのメラノーマサンプルおよび乳癌サンプルは、ＣＴ１６発現に関し、通常のＲＴ−ＰＣＲにより陽性であった（図１Ｂ）。乳癌標本（ＨＢＲ２９７）および腎臓癌標本（ＲＣＣ５）において、ＣＴ１７の発現レベルは、精巣における検出レベルのそれぞれ２．８９および０．１９であり（表６）、これは通常のＲＴ−ＰＣＲの結果と一致した。ＮＹ−ＥＳＯ−１発現の、２つの肺癌標本におけるレベルは、精巣における検出レベルのそれぞれ１４％および１９％であった（表６）。腎臓癌標本において、ＮＹ−ＥＳＯ−１の発現レベルは精巣における検出レベルの６％であった。最後に、ＭＡＧＥ−３の発現レベルは、２つのメラノーマ標本および肺癌標本において、精巣における検出レベルのそれぞれ８％、１１％および３０％であった。
【０２５０】
考察
発現シークエンスタグ（ＥＳＴ）はヒトトランスクリプトームの宝庫であり、豊富な核酸配列情報およびｍＲＮＡ発現データを有している。ＥＳＴデータベース配列が拡張されたものがユニジーンであり、それは公のドメイン配列プロジェクトから得られた情報を蓄積したものであり、該プロジェクトはＥＳＴ、ジェンバンク、オレステス（ＯＲＥＳＴＥＳ）およびヒトゲノムプロジェクトを包含し、この情報を数多くの関連するデータベースとリンクさせており、それは例えば科学文献、ヒトゲノム、プロテオーム、単一ヌクレオチド多型、および遺伝子変異である。癌ゲノム解析プロジェクトと関連して、ユニジーンデータベースによって、ＥＳＴデータ、遺伝子発現プロファイル、およびデジタル解析のためのツールが提供され、それはインシリコの遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現プロファイリング、およびディファレンシャルディスプレイを包含している。ＣＴ抗原の免疫療法上の重要性に鑑み、すなわち、ＣＴ抗原は抗原特異的癌ワクチンの有望な標的分子であるため、本研究がユニジーンデータベースから探索した遺伝子クラスターは、ＥＳＴのうち限定的に癌および精巣ｃＤＮＡライブラリー由来のものを含むものとした。
【０２５１】
今日のバイオインフォマティック解析によって、約１３００個の異なる癌・精巣関連ユニジーンクラスターが特定されている。予備的な証拠であって、ユニジーンクラスターを探索するために用いたアプローチのサポートは、４個の存在していた既知のＣＴ、すなわちＣＴ１１ｐ、ＧＡＧＥ  ４、ＭＡＧＥＢ１、およびＳＡＧＥであり、これらは前記１３００個の癌・精巣関連ユニジーンクラスターであって、本研究において特定されたものに含まれていた。逆に、このバイオインフォマティック解析によって、９個の他の以前に特定されていたＣＴ遺伝子ファミリーであって文献に記載されていたメンバーは特定されなかった。この理由は、データベースサーチツール（Ｘプロファイラ）を本研究において用いたが、これはｃＤＮＡライブラリーのグループを３個以上は相互に参照しないからである。本研究において特定されなかったＣＴ抗原に対応するものは、ＥＳＴのうち二要素相互参照プール（正常精巣と癌）からはずれるｃＤＮＡライブラリーに由来するものを含むものである。例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２／ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０、およびＣＴ−７ユニジーンクラスターは、ＥＳＴのうち胎盤由来のものを含み、ＢＡＧＥ、ＳＣＰ−１およびＣＴ−１０ユニジーンクラスターはＥＳＴセルライン由来のものを含み、ＢＲＤＴ／ＣＴ９ユニジーンクラスターは、ＥＳＴのうちサブトラクション精巣ライブラリー由来のものを含み、またｓｐ３２／ＯＹ−ＴＥＳ−１ユニジーンクラスターが含むｂＥＳＴは、正常腎臓および胎児の心臓由来のものを含んでいる。また、ＣＴＡＧＥ−１ユニジーンクラスターは正常精巣のＥＳＴのみを含み、腫瘍精巣由来ＥＳＴを含まない。
【０２５２】
ｍＲＮＡ発現パターンを７３個のこれらの精巣／癌関連ユニジーンクラスターについて、ＲＴ−ＰＣＲによって、種々の正常組織および悪性組織由来のＲＮＡサンプルのパネルを用いて調査を行った。前記７３個の遺伝子産物のうち、ＣＴ１５／Ｈｓ．１７７９５９、ＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１、およびＣＴ１７／Ｈｓ．１７８０６２は、通常のＲＴ−ＰＣＲによって精巣および悪性組織に限定的に発現され、そのためＣＴ抗原類似の発現プロファイルを有していることが示された。他の類似点も、新たに特定されたＣＴ遺伝子および既知のＣＴ抗原の間に存在する。特定されたＣＴ遺伝子のうちの２個、すなわちＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１およびＣＴ１７／Ｈｓ．１７８０６２が示すユニジーンクラスターは、精巣由来ｃＤＮＡライブラリーＥＳＴに加えて、それぞれメラニン細胞および肉腫ｃＤＮＡライブラリー由来のものを含む。この２個の腫瘍タイプは、既知のＣＴ抗原の大きな割合の部分を発現することが知られている（５６）。また、ＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１はＸ染色体にマップされ、そのゲノム上の位置は、１４個の既知のＣＴ抗原マップの第８である。さらに、ｍＲＮＡの発現頻度は、新たに特定されたＣＴ遺伝子のうち癌に存するものにおいては、以前に特定されたＣＴ抗原の発現頻度と一致していた（与えられた腫瘍タイプのうち２０％〜４０％、引用文献２１）。すなわち、大腸癌および腎臓癌におけるＣＴ１６発現は、それぞれ１１％〜４４％であり、そして乳癌および腎臓癌におけるＣＴ１７発現は、それぞれ５％〜２５％であった。逆に、限定的と思われるＣＴ１５／ＡＤＡＭ２の発現は正常精巣および腎臓癌において特有のものである。しかし、本研究において調査を行ったサンプルサイズは比較的小さいものであったため、はるかに広範なｍＲＮＡ発現によって、癌におけるそれらの発現頻度に関するより確定的な結論が与えられよう。
【０２５３】
プロアクロシン結合タンパク質であるＯＹ−ＴＥＳ−１（３０）およびシナプトネマ構造タンパク質−１（２０）を除き、ＣＴ抗原の生物学的機能は知られていない。本研究においては、特定されたＣＴ遺伝子産物のうち２個は、既知の機能または既知の機能モチーフを有するタンパク質をコードしている。ＡＤＡＭ２／ＣＴ１５／Ｈｓ．１７７９５９は、メタロプロテイナーゼ様の、ディスインテグリン様の、システインリッチなドメインファミリーの細胞表面プロテアーゼ／接着分子の領域ファミリーのメンバーであって、卵／精子膜相互作用に関与していると考えられている（５１）。ＡＤＡＭ２／ＣＴ１５は機能的メタロプロテイナーゼ領域を欠くがディスインテグリンは含んでおり、該領域はインテグリンα６β１または他の類似分子に結合する可能性がある（５７。）もう一つのＣＴ遺伝子産物であるＣＴ１７／Ｈｓ．１７８０６２はホスホリパーゼとの類似性を有していて、それは受精における精子の先体エクソサイトーシスを担っている（５８）。
【０２５４】
他のＣＴ遺伝子であるＣＴ１６／Ｈｓ．２４５４３１およびその類縁遺伝子であるＣＴ１６．２／Ｈｓ．２９３３１７は、３０〜５０％の類似性をＧＡＧＥタンパク質に対して有している（１５、５２）。ＧＡＧＥ  Ａファミリー間の類似性（９０％以上のアミノ酸配列（identity））ならびにＧＡＧＥ−ＡおよびＧＡＧＥ−Ｂファミリーの類似性（４０〜５０％のアミノ酸配列）を基に結論されるのは、Ｈｓ．２４５４３１／ＣＴ１６が新たなＧＡＧＥ遺伝子ファミリーを表し、それは暫定的にＣＴ  １６ファミリーと称され、それは組織限定的遺伝子産物であるＣＴ１６．２／Ｈｓ．２９３３１７も含んでいるということである。ＧＡＧＥタンパク質の生物学的機能は知られていないし、ＧＡＧＥタンパク質に対する免疫反応についても報告は僅かである。ＧＡＧＥ−Ａ１およびＣＴ１６を除いて、大部分のＧＡＧＥ遺伝子は、ＣＴ１６．２も含め、正常な成人組織の狭い範囲のみに発現される（５９）。個々のＧＡＧＥ遺伝子ファミリー間の類似性をがあることから、ＧＡＧＥタンパク質に対する免疫反応の欠如が示しているのは、高度に類似していて、かつより普遍的に発現されるＧＡＧＥ遺伝子に対する耐性を反映するものである可能性があると考えられる。
【０２５５】
ＣＴ遺伝子に加えて、本研究において特定されたのは３個の組織限定的遺伝子産物、ＲＦＸ４／Ｈｓ．１８３００９、Ｈｓ．１２８８３６およびＨｓ．２９３３１７であり、これらは癌においても発現されている。ＲＦＸ４が発現されるのは正常な精巣および脳においてのみであり、さらに１／９の大腸癌および４／８メラニンセルラインにおいてである。したがって、ＲＦＸ４は、癌・精巣／脳抗原（ＣＴＢ抗原）と称せられるタンパク質の仮想的メンバーであると考えられる。他にＣＴＢ抗原に含まれるのは、ＣＤＲ（６０）、Ｍａ１（６１）、およびＭａ２（６２）であり、これらはPosnerおよび共同研究者らによって特定されたものであるが、腫瘍随伴症候群に罹患している患者における自己抗体によって認識される標的分子として特定された。ＲＦＸ４が属するのはＤＮＡタンパク質ファミリーであり、それはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写産物を制御する（６３）。ＲＦＸタンパク質をコードしている遺伝子であるＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰにおける欠陥によって不全リンパ球症候群が発生し、これは重篤な劣性の免疫不全病である（６４に総説）。ＭＨＣ遺伝子の下方調節が精巣、脳および癌において行われていることから、これらの組織におけるＲＦＸ遺伝子の発現は重要であるかもしれない。２つの非特徴的転写物であるＨｓ．１２８８３６およびＨｓ．２９３３１７のｍＲＮＡ発現プロファイルも、限定された数の正常な組織および癌に限られている。機能的領域を欠いているため、これらの遺伝子産物の生物学的重要性は決定されていない。
【０２５６】
３個のＣＴ遺伝子および３個の組織限定的転写産物に加えて、さらに４個の遺伝子産物であって精巣限定的発現プロファイルを有するものが特定され、これらはＨｓ．１２１５５４、Ｈｓ．９７６４３、Ｈｓ．１９５９３２、およびＨｓ．１８９１８４である。ユニジーンクラスタであってこれらの４個の精巣限定的遺伝子産物に対応するものも、ＥＳＴおよび／またはＳＡＧＥタグとして腫瘍由来のものを含んでいる。
【０２５７】
これらの遺伝子産の解析を継続してＲＮＡの拡大したパネルであって、より広範な種類の悪性組織由来のものを拡大したものを用いることによって、それらを腫瘍組織において検出できるかもしれないし、それに続いてＣＴ遺伝子の分類につながるかもしれない。残りの１２００個の癌・精巣関連ユニジーンクラスターであって、ＲＴ−ＰＣＲによって解析を行っていないものについてのさらなる研究の焦点は、それらの遺伝子産物であって、インシリコ発現プロファイルとしてＣＴ関連のものと対応するもの（グループＩ）ユニジーンクラスターおよび精巣関連ユニジーンクラスターでＳＡＧＥタグを有し、腫瘍細胞由来のもの（グループＩＩＡ）である。Logingおよび共同研究者らが記載した方法であって、迅速な発現スクリーニングをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって行うものは、これらの研究に先んじるものであるといえる（６５）。
【０２５８】
個々のＣＴ遺伝子産物を癌の遺伝子ワクチンの標的分子として用いることは不適切であると思われるが、その理由はそれらの発現頻度が癌患者の群においては比較的低く、腫瘍内自体における不均一な発現および与えられた組織において抗原のロスがあるからである。代替物として開発されるべきものは、多価癌ワクチンであり、数多くの異なるＣＴ遺伝子によってコードされたエピトープを含むものである。そのような多価ワクチンによって、効果的にワクチン治療を受け得る癌患者の数が増大し、そして障害のうち、腫瘍の不均一性および免疫回避に関連するもののいくつかが克服されるかもしれない。この目的を達成するために、本研究においてはＣＴ１５、ＣＴ１６およびＣＴ１７をタンパク質のレパートリーであって、多価ＣＴ癌ワクチンに用い得るものを加えた。さらに、ＡＤＡＭ２／ＣＴ１５は、２つの免疫療法上の価値を有する標的分子と考えられるが、その理由は、それが細胞表面局在性を有するため、モノクローナル抗体に基づく免疫療法の標的分子にもなり得るからである。結論は、ユニジーンデータベースには、潤沢な情報が含まれており、それを利用することによって、新たな癌関連遺伝子として療法上重要なものが発見される可能性があるということである。
【０２５９】
例３：さらなるＣＴ抗原産物および関連遺伝子の特定
ユニジーンデータベースについて、上記のように特定されたＥＳＴのＣＴ抗原であるＣＴ１６との類似性を有するものをサーチすることによって、２つのユニジーンクラスター、すなわちＨｓ．４３８７９およびＨｓ．１６３２３を見出した。これらのクラスターの位置指定は、それぞれ（下記理由により）ＣＴ１９．２（核酸：配列番号：３８、ポリペプチド配列番号：３９）およびＣＴ１９．３（核酸：配列番号：４０、ポリペプチド配列番号：４１）とした。特異的なプライマーをこの配列に対して用いて（ＣＴ１９．２プライマー：配列番号：４２および４３、ＣＴ１９．３プライマー：核酸：４４および４５）、ＲＴ−ＰＣＲを用いることによって、Ｈｓ．４３８７９／ＣＴ１９．２およびＨｓ．１６３２３／ＣＴ１９．３の発現は、いずれも限られた数の正常組織ならびに癌および精巣において発現されたことが決定された。
【０２６０】
他のファミリーメンバーの存否を確認するために、ヒトゲノムデータベースをサーチして相同遺伝子の探索を、Ｈｓ．４３８７９／ＣＴ１９．２ユニジーンクラスター内の配列を用いて行った。このサーチによって、仮説的な転写物がＸ染色体に見出された（位置はｒｅｆ｜ＮＴ＿０２５２９７．５｜ＨｓＸ＿２５４５３ホモ・サピエンスＸ染色体作動性ドラフト配列断片のｂｐ１７９６８２〜１８２９１８５内）。この配列は、位置指定をＣＴ１９．１とし（核酸：配列番号：４６、ポリペプチド配列番号：４７）９０％および８４％の相同性をＨｓ．４３８７９／ＣＴ１９．２およびＨｓ．１６３２３／ＣＴ１９．３それぞれに対して有し、同一のイントロン／エクソン構造をＨｓ．４３８７９／ＣＴ１９．２およびＨｓ．１６３２３／ＣＴ１９．３に対して有している。
【０２６１】
プライマーのデザインは、ＣＴ１９．１の最も固有な領域（most unique region）に基づいて行った。ＣＴ１９．１プライマー（下記参照、配列番号：５８および５９）は、Ｈｓ．４３８７９／ＣＴ１９．２またはＨｓ．１６３２３／ＣＴ１９．３配列を増幅しない。ＣＴ１９．１転写産物は、胎児の脳、精巣および種々の腫瘍に検出され（そのため、その位置指定は、ＣＴ抗原であるＣＴ１９．１とした。下記参照）いくつかの例においては、２つのバンドがＲＴ−ＰＣＲによって検出され、その低分子量バンドは一貫して検出されたが、高分子領域のバンドは散見されたのみであった。いずれのバンドについても配列決定を行い、低分子量バンド（配列番号：４６）のみが予見されたタンパク質産物（配列番号：４７）であって、Ｈｓ．４３８７９／ＣＴ１９．２およびＨｓ．１６３２３／ＣＴ１９．３類似のものを与えた一方、高分子量バンドは切断部を有する翻訳タンパク質であった（配列の他の部分に停止コドンを有する）したがって、低分子量バンドはＣＴ１９．１の配列になる。
【０２６２】
発現解析
ＣＴ１９．１、ＣＴ１９．２およびＣＴ１９．３のｍＲＮＡ発現プロファイルの決定を、正常組織および悪性組織において、遺伝子特異的プライマーであって下記の３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ（例２に記載）によって特定されたものを用いて行った。結果を下記表７に示す。
【０２６３】
【化３】
2004532629.tif 000011
【０２６４】
【化４】
2004532629.tif 000012
【０２６５】
【化５】
2004532629.tif 000013
【０２６６】
【表８】
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【０２６７】
タンパク質の位置合わせ
ＣＴ１９．２のＧＡＧＥ−Ａ１のタンパク質配列配列（配列番号：５７）との位置合わせにつき下記に示す。縦線によって、両配列におけるアミノ酸の一致を表す。
【０２６８】
【化６】
2004532629.tif 000015
【０２６９】
ＣＴ１９．１、ＣＴ１９．２およびＣＴ１９．３のタンパク質配列の位置合わせにつき下記に示す。
【化７】
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【０２７０】
下線を付したアミノ酸は、配列中において他の２つの位置合わせを行ったＣＴ１９配列における同一位置のアミノ酸との相違を示す。ダッシュは、他の配列からの欠如（gap）を示す。配列の位置合わせの結果、８１％の相同性がＣＴ１９．１およびＣＴ１９．２ポリペプチド間において見出され、６９％の相同性がＣＴ１９．１およびＣＴ１９．３ポリペプチド間において見出され、そして７３％の相同性がＣＴ１９．２およびＣＴ１９．３ポリペプチド間において見出された。
【０２７１】
例４：絨毛癌／腫瘍（ＣｈＴ）遺伝子産物の特定
ユニジーンデータベースを探索し、ＥＳＴのうち、絨毛癌および癌からのＥＳＴライブラリーＣＴ抗原において限定的に見出されるものを、上記例２に記載したＣＴ抗原探索のように行った。
簡潔にいうと、２つのプールとして発現シークエンスタグ（ＥＳＴｓ）を構築した。
プールＡは、３つの絨毛癌ｃＤＮＡライブラリーからのＥＳＴからなり、そしてＰｏｏｌＢは３，２８９個の（多くの組織学的タイプの）腫瘍由来ｃＤＮＡライブラリーからのＥＳＴの全てからなる。ＣＧＡＰのＸプロファイラツールをユニジーンデータベースのサーチに用いて、ユニジーンクラスターのうちプールＡおよびプールＢからのＥＳＴを含むものを対象とし、そして正常組織ｃＤＮＡライブラリーからのものは除外した。
【０２７２】
このサーチによって、４９個の絨毛癌／腫瘍（ＣｈＴ）関連ユニジーンクラスターが見出され、それらは４個の既知の遺伝子産物（そのうち３個はＣＴ抗原：ＬＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１２）を含み、および４５個は新規であった。４９個のＣｈＴ関連ユニジーンクラスターのうち、３１個はイントロを含まない配列（単一エクソン、疑似遺伝子、遺伝的夾雑物）であり、調査は行わなかった。残りの１８個のＣｈＴ関連ユニジーンクラスターは、明確なイントロン／エクソン境界を有し、そして（既知のＣＴ抗原配列を除いた後の）１５個の解析をＲＴ−ＰＣＲによって、正常および悪性組織のパネルについて行った。２つのＣｈＴ遺伝子産物、Ｈｓ．３１３５０７／ＣＴ２０（配列番号：４８）およびＨｓ．１９７６６４（配列番号：５１）のｍＲＮＡ発現プロファイルは興味深いものであり、それについては下記の通りである。さらに、Ｈｓ．３１３５０７／ＣＴ２０ユニジーンクラスターは２つのタイプの転写産物、精巣ｃＤＮＡ配列であって、ＦＬＪ３２９０９と称せられるものおよび１１個の腫瘍由来ＥＳＴを有しており、ＦＬＪ３２９０９のｂｐ７７０〜９６１は腫瘍由来ＥＳＴには欠けていた。これらの異なる転写産物、すなわち仮想スプライシング変種は、２つの異なるタンパク質産物をコードしている：イソフォームＡ（配列番号：４９）はＥＳＴ転写産物の産物であり、イソフォームＢ（配列番号：５０）、精巣転写産物の産物である。．Ｈｓ．１９７６６４がコードしているのは単一のタンパク質産物（配列番号：５２）であり、それは３０％の相同性をＮＹ−ＣＯ−４１／メチルＣｐＧ結合タンパク質２に対して有する。
【０２７３】
発現解析
上記のような３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲを、下記プライマーを用いて行った。結果を表８に示す。
【０２７４】
【化８】
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【０２７５】
【化９】
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【０２７６】
【表９】
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【０２７７】
例５：ＣＴ抗原の相同性の確認
上記において特定された配列の長さを伸長することは可能であるが、前提としてさらなる配列領域であって、それによって遺伝子データベースにおいて関連する配列をサーチできるものの存在が前提となる。上記配列の伸長は、標準的な方法（例えばＰＣＲ）を用いて行われ、現在既知の領域を越えてＤＮＡ配列を伸長するものであり、とくに不完全なタンパク質をコードしていると思われる配列に対して行われる。ＰＣＲベース増幅法においては５’ＲＡＣＥが行われ、それによって既知の部分的なｃＤＮＡｓの未特定の（missing）５’末端の単離が可能になる。さらに、３’ＲＡＣＥを用いて、ｃＤＮＡの未特定３’末端の伸長が行える。これらの追加される末端領域の配列決定には、マッチングおよび相同性のためにデータベースをスクリーンする情報が用いられる。
【０２７８】
既知の配列を伸長するためのもう一つの方法は、従来からのライブラリースクリーニング手法によるものであり、それによってライブラリーからより長い配列の単離を行うことができる。伸長された配列が特定されると、それを用いて遺伝子データベースのサーチを行い、配列マッチおよび続く発現パターンの調査を行うことができる。スクリーニング手法において用いるライブラリーは一般的なライブラリーであるか、またはより組織特異的もしくは発生段階特異的なライブラリーである。
【０２７９】
例６：組み換えＣＴ抗原の調製
ＣＴ抗原（例えばＣＴ１５、ＣＴ１６、ＣＴ１９．１、およびＣＴ２０）を、ｈｉｓタグタンパク質としてＥ．ｃｏｌｉに発現させたが、ヒスチジンタグ含有ベクターｐＱＥ３０（Qiagen, Valencia, Calif.）を用いて、引用文献４０に記載のように行った。組み換えタンパク質合成の誘導およびそれに続くＮｉ＋２カラムによる精製は、Chen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:1004-1008, 1994の記載に従って行った。
【０２８０】
他の方法においては、ＣＴ抗原をコードするクローンをバキュロウィルス発現ベクターにサブクローンし、そして該組み換え発現ベクターを適切な昆虫細胞に導入する。バキュロウィルス／昆虫クローニング系が好ましいのは、翻訳後の改変が昆虫細胞において行われるからである。もう一つの好ましい真核細胞系は、InvitrogenによるDrosophila発現系である。クローンのうち組み換えタンパク質を大量に発現するものを選択し、組み換えタンパク質の産生に用いる。他の系として、酵母発現系および哺乳類細胞培養系も用いることができる。
【０２８１】
例７：ＣＴ抗原に対するＣＴ抗体の調製
上記例６のように調製した組み換えＣＴ抗原を用いて、ポリクローナル抗血清およびおよびモノクローナル抗体を標準法に従って調製した。そのように調製した前記抗血清および抗体の試験を、ＣＴ抗原認識の確度について、抗血清／抗体を用いて、細胞抽出物のうち特定のＣＴ抗原を発現することが知られている患者のもののアッセイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ）によって行った。これらの抗体は実験目的（例えばＣＴ抗原の局在化、免疫沈降、ウェスタンブロットなど）に用いることが可能であり、また診断目的（例えば、組織バイオプシー抽出物の試験、ＣＴ抗原の存在確認試験）にも用いることができる。
前記抗体の有用性は、正確かつ簡便な癌組織サンプルのタイピングを、ＣＴ抗原の発現について行えることにある。
【０２８２】
例８：同一の起源および異なる起源を有する癌におけるＣＴ抗原の発現
１種または２種以上のＣＴ抗原の発現の試験を広範な範囲の腫瘍に関して行い、存在する場合には、他の如何なる悪性を診断可能であるか、および／または本明細書に記載の方法によって処置される他の悪性を決定した。腫瘍セルラインおよび腫瘍サンプルの試験をＣＴ抗原の発現に関して、好ましくはＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲにより、上記手法に従って行った。ノーザンブロットも用い、ＣＴ抗原の発現の試験も行った。抗体ベースアッセイ、すなわちＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを用いてタンパク質発現を決定することも可能である。（他種の癌および同一タイプの他の癌患者における）ＣＴ抗原の発現を試験するための好ましい方法は、遺伝子多型血清タイピングであり、これには改変ＳＥＲＥＸプロトコールを用いる。
【０２８３】
前記の全てのにおいて用いられた抽出物は、患者の腫瘍からのものであり、該患者はＣＴ抗原の最初の単離のために血清を提供し、該抽出物をポジティブコントロールとして用いる。細胞のうち組み換え発現ベクターであって、上記例に記載したものをポジティブコントロールとして用いることも可能である。
上記実験によって得られた結果によって提供されるのは、複数種の癌関連核酸および／またはポリペプチドであり、これらは診断方法（例えば癌の存在の決定、治療を受けている患者の予後診断など）および治療方法（ワクチン組成物など）に用い得るものである。
【０２８４】
例９：ＣＴ抗原に対してポジティブな患者のＨＬＡタイピング
どのＨＬＡ分子が本発明によって得られたＣＴ抗原由来ポリペプチドを与えるかを決定するために、患者のＣＴ抗原を発現する細胞のＨＬＡのタイピングを行った。末梢血リンパ球を患者から採取し、ＨＬＡのタイピングをクラスＩまたはクラスＩＩについて行い、さらにクラスＩまたはクラスＩＩの特定のサブタイプに関しても行った。腫瘍バイオプシーサンプルもタイピングに用いることもできる。ＨＬＡのタイピングの実施は、免疫療法の分野における標準的な方法であれば、如何なるものによっても可能であり、例えば特異的なモノクローナル抗体、または遺伝子座特異的ＰＣＲ（例えばWO97/31126に記載）である。
【０２８５】
例１０：ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子によって提示されるＣＴ抗原ペプチドの特徴付け
抗原のうち抗体反応を対象において惹起するものは、細胞媒介性免疫反応を惹起する可能性もある。細胞によって、タンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子における提示のためのペプチドにプロセスされ、免疫探査を細胞表面において行う。特定のＭＨＣ／ＨＬＡ分子によって提示されたペプチドは、一般的にはモチーフに一致する。これらのモチーフはいくつかの場合に知られていて、ＣＴ抗原のスクリーニングに用いることによって潜在的なクラスＩおよび／またはクラスＩＩペプチドの提示のためのＣＴ抗原を与える。クラスＩおよびクラスＩＩモチーフに関するサマリーが刊行されている（例えば、Rammensee et al., Immunogenetics 41:178-228、1995）。上記のような実験の結果に基づいて、ＨＬＡタイプのうち個別のＣＴ抗原を提示するものが知られている。これらのＨＬＡ分子が提示するペプチドのモチーフが、好ましくサーチされる。
【０２８６】
クラスＩおよびクラスＩＩモチーフのサーチを、コンピューターアルゴリズムを用いて行うこともできる。例えば、潜在的なＣＴＬエピトープを既知のクラスＩモチーフを基に予知するためのコンピュータープログラムについての記載がある（例えば、Parker et al, J. Immunol. 152:163, 1994; D'Amaro et al., Human Immunol. 43:13-18, 1995; Drijfhout et al., Human Immunol. 43:1-12, 1995を参照）。潜在的なＴ細胞エピトープを既知のクラスＩＩモチーフを基に予知するためのコンピュータープログラムについての記載もある（例えば、Sturniolo et al., Nat Biotechnol 17(6):555-61, 1999を参照）。ＨＬＡへの結合の予知については便利な方法があり、それはNIH全世界ウェブサイトにおいて、インターネットによって利用可能なアルゴリズムであり、ＵＲＬはhttp://bimas.dcrt.nih.govである。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩのウェブサイトも参照されたい。これはＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのインターネットデータベースである（アクセスはhttp://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/またはhttp://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm）。ＨＬＡクラスＩＩペプチドを決定するための方法およびその置換体（substitutions）を作製するための方法を知ることも可能である（例えばStrominger and Wucherpfennig(PCT/US96/03182)）。
【０２８７】
例１１：抗原をコードしているポリペプチドに関連する癌の部分の特定
上記のように特定され単離されたＣＴ抗原が、細胞溶解性Ｔリンパ球反応を惹起し得るか否かを決定するためには、以下の方法を実施する。ＣＴＬクローンの産生を、患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）の刺激によって行う。該刺激は自己の正常細胞であって、ＣＴ抗原ポリペプチドをコードしているクローンの１種によってトランスフェクトするか、または合成ペプチドとして仮想タンパク質に一致し、適切な（上記のような）ＨＬＡクラスＩ分子に対するコンセンサスにマッチするものを担持せしめた、照射したＰＢＬによってトランスフェクトしたものによって行い、これによって抗原性ペプチドをＣＴ抗原クローンに局在化する（例えば、Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3511-3515, 1984; van der Bruggen et al., Eur. J. Immunol. 24:3038-3043, 1994を参照）。これらのＣＴＬクローンはＣＯＳ細胞のうち、ＣＴ抗原クローンおよび自己ＨＬＡ遺伝子座によってトランスフェクトしたものに対して特異的にスクリーンされるが、これについてはBrichard et al.の報告がある（Eur. J Immunol. 26:224-230, 1996）。ＣＴ抗原のＣＴＬに対する認識の決定は、細胞溶解性リンパ球からのＴＮＦの放出の測定または５１Ｃｒ放出アッセイ（Herin et al., Int. J. cancer 39:390-396, 1987）によって行う。ＣＴＬ  クローンが特異的にＣＯＳ細胞を認識した場合、ＣＴ抗原クローンを該ＣＯＳ細胞においてトランスフェクトし、そのより短い断片に対する試験を行い、ペプチドをコードしている遺伝子の領域を特定する。前記ＣＴ抗原クローンの断片の調製は、エクソヌクレアーゼＩＩＩによる消化または他の標準的な分子生物学的方法によって行う。合成ペプチドを調製することによって、抗原の正確な配列を確認する。
【０２８８】
場合によっては、ＣＴ抗原ｃＤＮＡのより短い断片をＰＣＲによって調製する。より短い断片を用いて、ＴＮＦの放出または５１Ｃｒの放出が上記のように行われる。
合成ペプチドであって、ＴＮＦの放出を惹起するＣＴ抗原クローンの断片のうち、最も短い断片部に一致するものを調製する。段階的により短いペプチドを合成し、所定のＨＬＡ分子に対して至適なＣＴ抗原による腫瘍拒絶抗原ペプチドを決定する。
同様な方法を実施することによって、ＣＴ抗原が、１種または２種以上のＨＬＡクラスＩＩペプチドであって、Ｔ細胞によって認識されたものを含むか否かを決定する。ＣＴ抗原ポリペプチドであって、ＨＬＡクラスＩＩモチーフに対するものは、上記のようにサーチすることができる。クラスＩポリペプチドとは対照的に、クラスＩＩペプチドの提示は限られた数のタイプの細胞によって行われる。したがって、これらの実験に好ましく用いられるのは、樹状細胞またはＨＬＡクラスＩＩ分子を発現するＢ細胞クローンである。
【０２８９】
【表１０】
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【０２９０】
【表１１】
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【０２９１】
【表１２】
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【０２９２】
【表１３】
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【０２９３】
【表１４】
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【０２９４】
【表１５】
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【０２９５】
【表１６】
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【０２９６】
【表１７】
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【０２９７】
【表１８】
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【０２９８】
等価なもの
当業者は、ルーチンを超えない実験を用いて、本明細書中に記載された本発明の特定の態様に対する多くの等価なものを、認識するかまたは確認することができる。このような等価なものは、特許請求の範囲により包含されるべきであることを意図する。
本明細書中に開示されたすべての参考文献は、その全体を参照により本明細書中に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０２９９】
【図１】図１は、正常な成熟した組織および癌における癌・精巣関連ユニジーンクラスターのＲＴ−ＰＣＲ発現のデジタル画像である。図１Ａは、ＰＣＲ３５サイクル後の正常な成熟した組織におけるｍＲＮＡ転写産物の発現を示す図である。１レーン：脳、２レーン：腎臓、３レーン：肝臓、４レーン：膵臓、５レーン：胎盤、６レーン：精巣、７レーン：小腸、８レーン：心臓、９レーン：前立腺、１０レーン：副腎、１１レーン：脾臓、１２レーン：大腸、１３レーン：胃、１４レーン：肺、１５レーン：膀胱、１６レーン：卵巣、１７レーン：乳房、１８レーン：子宮、１９レーン：骨格筋。転写産物の大部分は、Hs.183009、Hs.293317、Hs.128836およびHs.130926を除いて精巣に特異的なものである。Hs. 130926の発現は、種々の組織試料のｃＤＮＡテンプレートインテグリティの陽性コントロールとして用いることができる。図１Ｂは、腎臓癌（ＲＣＣ１、ＲＣＣ６、ＲＣＣ５）のＣＴ１５／Hs.177959 ｍＲＮＡ発現、メラノーマ（Ｍｅｌ−１およびＭｅｌ−１１）および乳癌のＣＴ１６／Hs.245431ｍＲＮＡ発現および乳癌（ＢＲ−２９７）、腎臓癌（ＲＣＣ５）およびメラノーマ（Ｍｅｌ−１）のＣＴ１７／Hs.178062 ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004532629.tif 000227
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