(57)【要約】本特許文書において開示される発明は、膜貫通受容体、さらに詳しくはヒトＧタンパク質共役受容体、および活性を示すヒトＧＰＣＲの変異（非内因性）型に関する。本発明は、膜貫通受容体、ある実施形態ではＧタンパク質共役受容体そして、いくつかの好ましい実施形態では受容体の構成的活性を構築または増強するように修飾された内因性ＧＰＣＲに関する。いくつかの実施形態では、構成的活性化ＧＰＣＲは、治療薬として適用可能性のある受容体アゴニストまたは逆アゴニストとして候補化合物を直接同定するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項２】
請求項１に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項３】
ベクターと配列番号１のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項４】
請求項３に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項６】
請求項５に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項７】
ベクターと配列番号３のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項９】
配列番号６のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項１０】
請求項９に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項１１】
ベクターと配列番号５のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項１３】
配列番号８のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項１５】
ベクターと配列番号７のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項１７】
配列番号１０のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項１９】
ベクターと配列番号９のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項２１】
配列番号１２のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項２２】
請求項２１に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項２３】
ベクターと配列番号１１のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号１４のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項２６】
請求項２５に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項２７】
ベクターと配列番号１３のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項２９】
配列番号１６のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項３０】
請求項２９に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項３１】
ベクターと配列番号１５のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項３３】
配列番号１８のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体。
【請求項３４】
請求項３３に記載のＧタンパク質共役受容体の非内因性・構成的活性化型。
【請求項３５】
ベクターと配列番号１７のｃＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項３６】
請求項３５に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９８年１０月１３日に出願された米国特許出願番号０９／１７０,４９６の一部継続出願であり、それに対応するＰＣＴ出願番号がＰＣＴ／ＵＳ９９／２３９３８であり、２０００年４月２０日にＷＯ ００／２２１２９ として公開された。本出願はまた、１９９７年４月１４日に出願された米国特許出願番号０８／８３９,４４９（放棄）の一部継続出願である、１９９８年４月１４日に出願された米国特許出願番号 ０９／０６０,１８８の一部継続出願である。前述のそれぞれについての優先権の利益は本願に請求されており、そして前述のそれぞれについての開示が、本願にその全文を参考文献として引用されている。本出願はまた、本願にその全文が参考文献として引用されている、２００１年２月２６日に出願された、米国仮出願番号６０／２７１,９１３の利益も請求する。本文書は、以下の出願に関連する。２０００年１２月１日に出願された米国仮出願番号６０／２５０,８８１、２０００年１１月２７日に出願された米国仮出願番号６０／２５３,４２８、２０００年１１月３日に出願された米国仮出願番号６０／２４５,８５３、２０００年９月２０日に出願された米国仮出願番号６０／２３４,０４５、２０００年４月２８日に出願された米国仮出願番号６０／２００,５６８、２０００年４月１９日に出願された米国仮出願番号６０／１９８,５１８、２０００年３月１４日に出願された米国仮出願番号６０／１８９,３５３、１９９９年１１月１７日に出願された米国仮出願番号６０／１６６,０８４、ならびに１９９８年１０月３０日に出願された米国仮出願６０／１０６,４５１、これらのそれぞれの開示は全文を参考文献として引用している。
（発明の分野）
本発明は、膜貫通受容体、ある実施形態ではＧタンパク質共役受容体そして、いくつかの好ましい実施形態では受容体の構成的活性を構築または増強するように修飾された内因性ＧＰＣＲに関する。いくつかの実施形態では、構成的活性化ＧＰＣＲは、治療薬として適用可能性のある受容体アゴニストまたは逆アゴニストとして候補化合物を直接同定するために使用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトにはかなりの数の受容体クラスが存在するが、圧倒的に最も豊富で治療に関連するものはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）クラスによって代表される。ヒトゲノムには３０，０００〜４０，０００個の遺伝子が存在すると推定され、そのうちの約２％がＧＰＣＲをコードすると推定される。内因性リガンドが同定されているＧＰＣＲを含む受容体は、「既知」受容体と呼ばれ、内因性リガンドが同定されていない受容体は「オーファン」受容体と呼ばれる。
【０００３】
ＧＰＣＲは医薬製品開発の重要な分野を代表しており、１００個の既知ＧＰＣＲの約２０個から、全ての処方薬の約６０％が開発されている。例えば、１９９９年には、ブランドネーム処方薬のトップ１００のうち、以下の薬剤がＧＰＣＲと相互作用する（治療される疾患および／または障害はカッコ内に表示する）。
【０００４】
クラリチン（登録商標）（アレルギー）
プロザック（登録商標）（鬱病）
バソテック（登録商標）（高血圧症）
パクシル（登録商標）（鬱病）
ゾロフト（登録商標）（鬱病）
ジブレキサ（登録商標）（精神病）
コザール（登録商標）（高血圧症）
イミトリックス（登録商標）（偏頭痛）
ザンタック（登録商標）（胃逆流症）
プロプルシド（登録商標）（胃逆流症）
リスパダール（登録商標）（精神分裂病）
セレベント（登録商標）（喘息）
ペプシド（登録商標）（胃逆流症）
ガスター（登録商標）（潰瘍）
アトロベント（登録商標）（気管支痙攣）
エフェクソール（登録商標）（鬱病）
デパコート（登録商標）（テンカン）
カルデュラ（登録商標）（前立腺肥大症）
アレグラ（登録商標）（アレルギー）
リュープロン（登録商標）（前立腺ガン）
ゾラデックス（登録商標）（前立腺ガン）
ディプリバン（登録商標）（麻酔）
ブスパール（登録商標）（不安）
ベントリン（登録商標）（気管支痙攣）
ハイトリン（登録商標）（高血圧症）
ウエルブトリン（登録商標）（鬱病）
ジルテック（登録商標）（鼻炎）
プラビックス（登録商標）（ＭＩ／卒中）
トプロール−ＸＬ（登録商標）（高血圧症）
テノルミン（登録商標）（アンギナ）
キサラタン（登録商標）（緑内障）
シングレア（登録商標）（喘息）
ディオバン（登録商標）（高血圧症）
ハルナール（登録商標）（前立腺肥大症）
（Ｍｅｄ  Ａｄニュース  １９９９データ）。
【０００５】
ＧＰＣＲは、７つのアルファヘリックスを形成する２２〜２４個の疎水性アミノ酸からなる７つの配列を有し、そのそれぞれが膜をスパンする（各スパンは、即ち、膜貫通―１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）などのように番号で識別される）共通の構造モチーフを共有する。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外側、あるいは「細胞外」側において、膜貫通−２と膜貫通−３、膜貫通−４と膜貫通−５、ならびに膜貫通−６と膜貫通−７の間でアミノ酸鎖によって結合される（これらは、「細胞外」領域１、２、および３（それぞれＥＣ−１、ＥＣー２、およびＥＣ−３）と呼ばれる）。膜貫通ヘリックスはまた、細胞膜の内側、あるいは「細胞内」側において、膜貫通−１と膜貫通−２、膜貫通−３と膜貫通−４、ならびに膜貫通−５と膜貫通−６の間でアミノ酸鎖によって結合される（これらは、「細胞内」領域１、２、および３（それぞれＩＣ−１、ＩＣー２、およびＩＣ−３）と呼ばれる）。受容体の「カルボキシ」（“Ｃ”）末端は細胞内側の細胞内空間に位置し、そして受容体の「アミノ」（“Ｎ”） 末端は細胞外側の細胞外空間に位置する。
【０００６】
一般的に、内因性リガンドが受容体と結合すると（受容体の「活性化」としばしば呼ばれる）、細胞内領域のコンフォーメーションに変化が生じ、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」間の共役が起こる。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に関して「乱交雑性」であることが報告されており、即ち、ＧＰＣＲは一つ以上のＧタンパク質と相互作用できる。Ｋｅｎａｋｉｎ, Ｔ．, ４３Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１０９５ （１９８８）を参照。その他のＧタンパク質が存在するが、現在同定されているＧタンパク質は、Ｇq、Ｇs、Ｇi、Ｇz、およびＧｏである。Ｇタンパク質と共役したリガンド活性化ＧＰＣＲは、シグナリングカスケードプロセス（「シグナル伝達」と呼ぶ）を開始する。正常条件では、シグナル伝達は、究極的には細胞活性化または細胞抑制を生起する。理論に束縛されることは意図しないが、受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられる。
【０００７】
生理学的条件下では、ＧＰＣＲは、「不活性」状態と「活性」状態の２つの異なるコンフォーメーションの平衡状態で細胞膜内に存在する。不活性状態にある受容体は、細胞内シグナル伝達経路に結合して生物学的応答を誘導するシグナル伝達を開始することができない。受容体のコンフォーメーションが活性状態に変化すると、（Ｇタンパク質を介して）伝達経路に結合して、生物学的応答を生じることが可能になる。
【０００８】
受容体は、リガンドまたは薬剤のような化合物によって活性状態に安定化され得る。受容体のアミノ酸配列の修飾を含むがそれのみに限定はされない、最近の発見は、受容体を促進ならびに安定化して活性状態のコンフォーメーションにするリガンドまたは薬剤以外の手段を提供する。これらの手段は、受容体に結合するリガンドの効果をシミュレートすることによって、受容体を効果的に安定化して活性状態にする。そのようなリガンドと無関係な手段による安定化は、「構成的受容体活性化」と呼ばれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
ヒトＧＰＣＲの内因性および非内因性型とその用途を本願に開示する。
【００１０】
本発明のある実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、配列番号６３のアミノ酸によってコードされるそれと同一物の非内因性・構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１１】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号６２のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明のある実施形態は、配列番号４のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、配列番号６５のアミノ酸によってコードされるそれと同一物の非内因性・構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号６４のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明のある実施形態は、配列番号６のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、それと同一物の非内因性・構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１５】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号５のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１６】
本発明のある実施形態は、配列番号８のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、および配列番号７３のアミノ酸によってコードされるそれと同一物の非内因性・構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１７】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、および配列番号７２のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１８】
本発明のある実施形態は、配列番号１０のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、配列番号７５および配列番号７７のアミノ酸によってコードされるそれと同一物の非内因性・構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００１９】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号７４および配列番号７６のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２０】
本発明のある実施形態は、配列番号１２のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、配列番号７９および配列番号８１のアミノ酸によってコードされるそれと同一物の非内因性・構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２１】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号７８および配列番号８０のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２２】
本発明のある実施形態は、配列番号１４のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、配列番号８３のアミノ酸によってコードされるそれと同一物の構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２３】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号８２のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２４】
本発明のある実施形態は、配列番号１６のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、配列番号８５のアミノ酸によってコードされるそれと同一物の構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２５】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号８４のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２６】
本発明のある実施形態は、配列番号１８のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、配列番号８７のアミノ酸によってコードされるそれと同一物の構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２７】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号８６のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２８】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号８４のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００２９】
本発明のある実施形態は、配列番号９８のアミノ酸配列によってコードされるＧタンパク質共役受容体、それと同一物の非内因性・構成的活性化型、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００３０】
本発明のある実施形態は、ベクターと配列番号９７のｃＤＮＡを含むプラスミド、ならびにそれと同一物を含む宿主細胞に関する。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
受容体についての科学的文献は、受容体に種々な影響を及ぼすリガンドに関連するいくつもの用語を採用している。明確性と統一性を図るために、本特許文書を通じて以下の定義を使用する。これらの定義がこれら用語のその他の定義と相反しない限り、以下の定義を使用する。
【００３２】
アゴニストとは、受容体に結合すると、細胞内応答を活性化するか、あるいはＧＴＰの膜結合を増強する物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。ある実施形態では、アゴニストは、受容体に結合すると細胞内応答を活性化すること、あるいはＧＴＰの膜結合を増強することが過去に知られていない物質である。
【００３３】
本願明細書で使用するアミノ酸略記を表１に詳述する。
【００３４】
【表１】
2004526441.tif 000002
アンタゴニストとは、アゴニストと同一部位で受容体と競合的に結合するが、活性型受容体によって開始される細胞内応答を活性化せず、その結果アゴニストによる細胞内応答を抑制することができる物質（例えば、リガンド、候補化合物）である。アンタゴニストは、アゴニストが存在しないと細胞内応答の基底（正常）値を漸減しない。ある実施形態では、アンタゴニストは、受容体に結合すると細胞内応答を活性化すること、あるいはＧＴＰの膜結合を増強することが過去に知られていない物質である。
【００３５】
候補化合物とは、スクリーニング法の対象となる分子である（例であって限定ではないが、化合物）。好ましくは、「候補化合物」という表現は、間接同定法によって過去に決定された（「間接同定化合物」）、受容体に対する逆アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストから成る群から選択される化合物であることが公知な化合物を含まず、さらに好ましくは、少なくとも一つの哺乳類において治療有効性があることが過去に決定されていることが間接的に同定された化合物を含まず、そして最も好ましくは、ヒトにおいて治療用途を有することが過去に決定されていることが間接的に同定された化合物を含まない。
【００３６】
組成物とは、少なくとも一つの成分を含む物質を意味し、「医薬品組成物」は組成物の一例である。
【００３７】
化合物有効性とは、受容体結合親和性に対して、受容体の機能性、即ちシグナル伝達経路を活性化／抑制する能力、を抑制または促進する化合物の能力の計量を意味する。化合物有効性を検出する典型的手段は、本特許文書の実施例セクションに開示されている。
【００３８】
コドンとは、一般的にリン酸基と結合するヌクレオシド（アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ））を含み、さらに翻訳されるとアミノ酸をコードする、３つのヌクレオチド（またはヌクレオチド等価物）の一つのまとまりを意味する。
【００３９】
構成的活性化受容体とは、構成的な受容体活性化を受けた受容体を意味する。構成的活性化受容体は、内因性または非内因性であり得る。
【００４０】
構成的受容体活性化とは、受容体をそのリガンドまたはその化学的等価物と結合すること以外の手段によって、受容体を活性状態に安定化することを意味する。
【００４１】
接触または接触するとは、少なくとも二つの部分を、インビトロ系またはインビボ系において、一緒にすることを意味する。
【００４２】
「候補化合物」という表現との関連における直接同定する、または直接同定されたとは、候補化合物を、構成的活性化受容体に対して、好ましくは構成的活性化オーファン受容体に対して、そして最も好ましくは構成的活性化Ｇタンパク質共役細胞表面オーファン受容体に対してスクリーニングすること、ならびにそのような化合物の化合物有効性を評価することを意味する。この表現は、どんな場合でも、「間接同定する」または「間接同定された」という表現に包含されたり、包含すると解釈または理解されてはならない。
【００４３】
内因性とは、哺乳類が天然に産生する物質を意味する。例であって限定ではないが、用語「受容体」に関連する内因性とは、哺乳類（例であって限定ではないが、ヒト）またはウイルスによって天然に産生されるものを意味する。対照的に、このような観点における非内因性という用語は、哺乳類（例であって限定ではないが、ヒト）またはウイルスによって天然に産生されないものを意味する。例であって限定ではないが、内因性型では構成的活性ではないが、操作されると構成的活性となる受容体が、本願では「非内因性・構成的活性化受容体」として最も好ましく参照される。どちらの用語も「インビボ」および「インビトロ」系を説明するために用いることができる。例であって限定ではないが、スクリーニング法において、内因性または非内因性受容体は、インビトロスクリーニング系に関連し得る。限定されることはないがさらなる例として、哺乳類のゲノムが、非内因性・構成的活性化受容体を含むように操作された場合、インビボ系の手段による候補化合物のスクリーニングが実行可能である。
【００４４】
Ｇタンパク質共役受容体融合タンパク質およびＧＰＣＲ融合タンパク質とは、本願に開示する本発明の観点からは、それぞれ、内因性・構成的活性化ＧＰＣＲ、あるいは少なくとも一つのＧタンパク質、最も好ましくは、そのようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（これはＧＴＰに結合するサブユニットである）に融合され、このＧタンパク質が好ましくは内因性オーファンＧＰＣＲと天然で共役するＧタンパク質と同タイプである、非内因性・構成的活性化ＧＰＣＲを含む非内因性タンパク質をそれぞれ意味する。例であって限定ではないが、内因状態において、Ｇタンパク質「Ｇsα」がＧＰＣＲと共役する主Ｇタンパク質である場合は、特定のＧＰＣＲに基づくＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｇsαに融合したＧＰＣＲを含む非内因性タンパク質であり、ある場合は、以下に記述するように、非優勢のＧタンパク質がＧＰＣＲに融合することがある。Ｇタンパク質は、構成的活性ＧＰＣＲのＣ末端に直接融合でき、またはこの２つの間にスペーサーが存在してもよい。
【００４５】
宿主細胞とは、その中にプラスミドおよび／またはベクターを組み込むことができる細胞を意味する。原核宿主細胞においては、宿主細胞が複製するとプラスミドは典型的には自律分子として複製される（一般的には、プラスミドはその後は真核宿主細胞中に導入するために単離される）。真核宿主細胞においては、プラスミドは、宿主細胞の細胞ＤＮＡ中に組み込まれ、したがって真核宿主細胞が複製するとプラスミドが複製する。ある実施形態では、宿主細胞は真核性であり、より好ましくは哺乳類、そして最も好ましくは２９３、２９３Ｔ、およびＣＯＳ-７細胞から成る群から選択される。
【００４６】
間接同定するまたは間接同定されたとは、内因性受容体に特異的な内因性リガンドの同定に関する創薬方法、リガンド−受容体相互作用を干渉および／または競合する候補化合物を決定するための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、ならびに活性化受容体と関連する少なくとも一つのセカンドメッセンジャー経路への影響についてその化合物の有効性を評価するための従来の方法を意味する。
【００４７】
用語「応答」との関連における、抑制するまたは抑制とは、化合物が存在しない場合に対して、化合物が存在すると応答が減少あるいは防止されることを意味する。
【００４８】
逆アゴニストとは、内因性型受容体または構成的活性化型受容体のいずれかに結合して、活性型受容体によって引き起こされる正常な細胞内応答をアゴニストが存在しない場合に観察される活性の正常基準レベル以下に抑制するか、あるいは膜に対するＧＴＰ結合を減少する物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。好ましくは、細胞内応答の正常値は、逆アゴニストが存在すると、逆アゴニストが存在しない場合の応答の正常値と比較して、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、ならびに最も好ましくは少なくとも９９％抑制される。
【００４９】
既知受容体とは、その受容体に特異的な内因性リガンドが既に同定されている内因性受容体を意味する。
【００５０】
リガンドとは、天然の受容体に特異的な分子を意味する。
【００５１】
内因性受容体の核酸および／またはアミノ酸配列に関連する、変異体または変異とは、内因性で構成的に活性化しない受容体の変異型が、その受容体の構成的活性化を示すような、そのような内因性配列に対する特異的変化（複数でもよい）を意味する。特定配列に対する等価物の観点からいえば、（ａ）ヒト受容体の後続変異型の構成的活性化の度合いが、その受容体の最初の変異が示す活性化の度合いと実質的に同じであり、さらに（ｂ）受容体の後続変異型と受容体の最初の変異の間の配列相同率（アミノ酸および／または核酸）が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、そして最も好ましくは少なくとも９９％である場合、ヒト受容体の後続変異型は、ヒト受容体の最初の変異と等価であると見なされる。ある実施形態では、構成的活性化を達成するために、本願において開示されているいくつかの好ましいカセットが、内因性型および非内因性型のＧＰＣＲ間における単一のアミノ酸および／またはコドン変化を含むという事実のために、配列相同率は少なくとも９８％であることが好ましい。
【００５２】
非オーファン受容体とは、受容体に結合すると細胞内シグナル伝達経路を活性化するような、既に同定されているリガンドに特異的な内因性の天然分子を意味する。
【００５３】
オーファン受容体とは、その受容体に特異的なリガンドが同定されていないか、あるいは未知である内因性受容体を意味する。
【００５４】
医薬品組成物とは、少なくとも一つの活性成分を含み、それによってその組成物が哺乳類（例であって、限定はしないが、ヒト）において特定の有効な成果について調査対象となる組成物を意味する。当業者は、活性成分が当業者のニーズに基づいて望ましい有効な結果を有するか否かを決定するために適切な方法を理解かつ評価しよう。
【００５５】
プラスミドとは、ベクターとｃＤＮＡを合わせたものを意味する。一般的には、プラスミドは、タンパク質としてのｃＤＮＡの複製および／または発現目的で宿主細胞中に導入される。
【００５６】
セカンドメッセンジャーとは、受容体活性化の結果として生じる細胞内応答を意味する。セカンドメッセンジャーは、例えば、イノシトール三リン酸（ＩＰ3）、ジアシクログリセロール（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、ならびにサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を含み得る。セカンドメッセンジャー応答を測定して、受容体活性化を判定することができる。さらに、セコンドメッセンジャー応答は、例えば、逆アゴニスト、アゴニスト、およびアンタゴニストを含む候補化合物を直接同定するために測定され得る。
【００５７】
信号雑音比（ＳＮ比）とは、活性化、増幅、または刺激に対する応答として発生されるシグナルであり、そのシグナルがバックグラウンド雑音以上であるか、または非活性化、非増幅、または非刺激に対する応答の基底レベル以上であることを意味する。
【００５８】
スペーサーとは、遺伝子、例えば目的のＧＰＣＲ、の最後のコドンまたは最後のアミノ酸の後に位置するが、目的のＧタンパク質の開始コドンまたは開始領域の前に位置し、目的のＧタンパク質の開始領域と翻訳領域内にある、翻訳されたアミノ酸数を意味する。翻訳アミノ酸数は、当業者のニーズに応じて調整することができ、一般的には約１個のアミノ酸、好ましくは２個のアミノ酸、さらに好ましくは４個のアミノ酸、さらに好ましくは５個のアミノ酸、それよりもさらに好ましくは６個のアミノ酸、それよりもさらに好ましくは７個のアミノ酸、それよりもさらに好ましくは８個のアミノ酸、それよりもさらに好ましくは９個のアミノ酸、それよりもさらに好ましくは１０個のアミノ酸、それよりもさらに好ましくは１１個のアミノ酸、そしてさらに好ましくは１２個のアミノ酸から成る。
【００５９】
用語「応答」との関連における、促進するまたは促進とは、化合物が存在しない場合に対して、化合物が存在すると応答が増加されることを意味する。
【００６０】
実質的とは、コントロール結果の４０％以内、好ましくは３５％以内、さらに好ましくは３０％以内、さらに好ましくは２５％以内、さらに好ましくは２０％以内、さらに好ましくは１５％以内、さらに好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内、さらに好ましくは２％以内、そして最も好ましくはコントロール結果の１％以内である結果を意味する。例えば、受容体の機能性の観点からいえば、本願で教示された方法または当業者に公知の同様な方法を用いて測定された伝達シグナルが、コントロールシグナルによって産生されたシグナルの４０％以内であるならば、テスト受容体がコントロール受容体と実質的に同様な結果を呈示し得る。
【００６１】
ｃＤＮＡに関するベクターとは、少なくとも一つのｃＤＮＡを組み込むことならびに宿主細胞内への組み込みが可能な環状ＤＮＡを意味する。
【００６２】
以下のセクションの順序は、効率的な提示を考慮して記述されており、開示またはこれに続く請求に対する限定を意図すると解釈されるべきではない。
Ａ．イントロダクション
受容体についての従来の研究は、典型的には、発見がアンタゴニストと受容体を影響し得るその他の分子の検索に進展できる前に、内因性リガンドをまず同定しなければならないという（先験に基づく）演繹的な仮定から発した。アンタゴニストがまず既知であるような場合でさえ、検索は内因性リガンドの探索へと直ちに拡大された。この思考様式は、構成的活性化受容体の発見後でさえも受容体研究に長く存続している。これまでに認識されていなかったことは、活性状態にある受容体が、受容体のアゴニストと逆アゴニスト発見に最も有用であるということである。活性過剰な受容体または活性が不十分な受容体に起因する疾患では、治療薬に望まれるものは、それぞれ受容体の活性状態を減少させたり、受容体の活性を増強するために作用する化合物であり、必ずしも内因性リガンドに対するアンタゴニストである薬剤ではない。これは、活性状態にある受容体の活性度を減少または増強する化合物は、内因性リガンドと同一部位に結合する必要がないからである。したがって、本発明の方法に教示されるように、治療化合物についてのいずれの検索もリガンドと無関係な活性状態に対して化合物をスクリーニングすることによって開始されるべきである。
Ｂ．ヒトＧＰＣＲの同定
ヒトゲノムプロジェクトの努力は、ヒトゲノム内に位置する核酸配列に関する過大な情報の同定を誘導し、この努力によって遺伝的配列情報が、いずれかの特定のゲノム配列がヒトタンパク質を翻訳する翻訳領域を含むか否かについて理解または認識することなく利用可能になった。ヒトゲノム内にある核酸配列を同定するためのいくつかの方法は、当業者の認識範囲である。
【００６３】
受容体ホモロジーは、ヒト身体内における受容体の役割の評価を得る観点から有用である。本特許文書では、これらの受容体を変異して、これらの受容体の非内因性・構成的活性化型を確立するための技法が考察される。
【００６４】
本願に開示される技法はまた、当業者には明らかであるように、当該分野に公知のその他のヒトＧＰＣＲに応用可能である。
Ｃ．受容体スクリーニング
本願に開示される非内因性・構成的活性化型ＧＰＣＲに対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内因性リガンドを使用する必要なく、細胞表面受容体に作用する候補化合物を直接同定することを可能にする。常套的、さらにしばしば市販の技法を用いることによって、本願に開示された内因性型のヒトＧＰＣＲが発現および／または過剰発現されている領域を身体内で決定することができる。特定組織における受容体の発現場所によって、科学者は受容体の生理学的、機能的役割を指定することができる。また、これらの技法を用いて、受容体の発現および／または過剰発現に関連する関連疾患／障害状態を明らかにすることが可能であり、そのような取り組み方が本特許文書に開示されている。さらに、疾患臓器における受容体の発現は、受容体の臨床的関連性の度合いの決定を補助し得る。
【００６５】
本願に開示されるＧＰＣＲの構成的活性化は、ＧＰＣＲのＴＭ６内に位置すると考えられているプロリン残基からの距離に基づき、このアルゴリズム法は、本願に一覧しているその他の特許文書と共に本願にその全文を参考文献として引用している、同時係属中で一般的にＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３９３８と指定され、２０００年４月２０日にＷＯ ００／２２１２９ として公開された特許文書中に開示されている。このアルゴリズム法は、従来の配列「アライメント」に基づくというよりはむしろ、前述のＴＭ６プロリン残基からの特定距離（または、勿論、そのようなプロリン残基の内因性・構成的置換）に根拠を置く。１６アミノ酸残基に位置するアミノ酸の残基を、この残基（おそらく、受容体のＩＣ３領域に位置する）から、最も好ましくは、リジン残基に変異することによって、受容体の構成的活性化が達成され得る。その他のアミノ酸残基は、この目的を達成するために本位置での変異に有用であり得る。
Ｄ．疾患／障害の同定および／または選択
以下にさらに詳説するように、非内因性・構成的活性化ＧＰＣＲに対する逆アゴニストとアゴニストは、本発明の方法論によって同定され得る。そのような逆アゴニストとアゴニストは、この受容体に関連する疾患を治療するための創薬プログラムにおけるリード化合物として理想的な候補である。ＧＰＣＲに対する逆アゴニストを直接同定する能力に拠って、医薬品組成物の開発が可能となり、ＧＰＣＲ関連疾患と障害の検索が適切になる。特定組織における受容体の発現場所によって、科学者は受容体の生理学的な機能を指定することができる。例えば、ＧＰＣＲの存在について疾患および正常組織サンプルをスキャンすることは、今では、学術的な作業、あるいは特定のＧＰＣＲに対する内因性リガンドを同定する方法に従って追求され得るものの域を超えて身近なものとなっている。健常ならびに疾患組織の広範囲にわたり組織スキャンを行うことができる。そのような組織スキャンは、特定の受容体を疾患および／または障害と関連させる可能性のある第一ステップを提供する。さらに、疾患臓器における受容体の発現は、受容体の臨床的関連性の度合いを決定する補助となり得る。本明細書の校閲によって、当業者は、いったん受容体が一定の組織または領域に限局化されると、ＧＰＣＲの機能を推論する能力が得られる。
【００６６】
ＧＰＣＲのＤＮＡ配列は、プローブ／プライマーを作成するために使用できる。ある好ましい実施形態では、ＤＮＡ配列は、（ａ）組織ｍＲＮＡに対するドット−ブロット分析、および／または（ｂ）組織サンプル中の受容体発現のＲＴ−ＰＣＲ同定、用のプローブの作成に使用される。組織ソース、または疾患組織中に受容体が存在すること、あるいは正常組織と比較して疾患組織中で受容体が高濃度で存在することを使用して、場所を機能と関連させて、受容体の生理学的役割／機能を指定して、限定はされないが、その機能／役割と関連する疾患を含む、治療方法を作出することができる。受容体はまた、この技法によって臓器の領域に限局化され得る。受容体が局在する特定組織の既知または想定される役割／機能に基づき、受容体の推定上の生理学的機能を引き出すことができる。限定ではない例として、視床領域に局在／発現されるタンパク質は、感覚運動プロセシングと覚醒に関連する（Ｇｏｏｄｍａｎ と Ｇｉｌｍａｎ,Ｔｈｅ ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（治療薬の薬理学的基礎）, 第９版,  ページ４６５ （１９９６）を参照）。海馬またはシュワン細胞で発現されるタンパク質は、学習および記憶、ならびに末梢神経の髄鞘形成にそれぞれ関連する（Ｋａｎｄｅｌ, Ｅ． ら,Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ ＮｅｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒ（神経科学と行動の本態）、それぞれ、ページ６５７, ６８０ と ２８, （１９９５））。ある実施形態では、プローブおよび／またはプライマーは、限定はされないが、下記の実施例６で同定される疾患と障害を含む、疾患および／または障害を検出および／または診断するために使用され得る。そのようなプライマーおよび／またはプローブの生成方法は、プライマーおよび／プローブを使用して疾患および／または障害を検出するための方法と並んで当業者には公知である。
Ｅ．候補化合物のスクリーニング
１．一般的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ法
Ｇタンパク質受容体が構成的活性になると、Ｇタンパク質（例えば、Ｇq, Ｇs, Ｇi, Ｇz, Ｇo）と結合して、Ｇタンパク質に対するＧＴＰの結合を促進する。Ｇタンパク質は次にＧＴＰ加水分解酵素として作用して、ＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、それによって正常条件下では、受容体が脱活性化状態になる。しかし、構成的活性化受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換し続ける。ＧＴＰの加水分解抵抗性類似体である[35Ｓ]ＧＴＰγＳを使って、構成的活性化受容体を発現する膜への結合の増強をモニタすることができる。[35Ｓ]ＧＴＰγＳを使用して、リガンドが存在する場合と存在しない場合における膜へのＧタンパク質の共役をモニタできることが報告されている。当該分野で公知かつ利用可能なその他の例の中でも、このモニタリングの例は、Ｔｒａｙｎｏｒ とＮａｈｏｒｓｋｉ によって１９９５年に報告された。この系は受容体の細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質に係わりなく全てのＧタンパク質共役受容体に一般的に適用可能であるために、このアッセイ系は典型的には候補化合物の最初のスクリーニングに使用される。
【００６７】
２．  特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ法
「一般的」Ｇタンパク質共役受容体アッセイ（即ち、アゴニストまたは逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を用いていったん候補化合物が同定されると、受容体部位で化合物が相互作用することを確認するための更なるスクリーニングが注目される。例えば、「一般的」アッセイによって同定された化合物は、受容体に結合するのではなく、その代わり単に細胞内ドメインからＧタンパク質を脱共役させるのみであり得る。
【００６８】
ａ．Ｇs、Ｇz、およびＧi
Ｇsは酵素アデニリルシクラーゼを促進する。Ｇi（およびＧzとＧo）は、他方、アデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼは、ＡＴＰからｃＡＭＰへの変換を触媒し、したがって、Ｇsタンパク質を共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、細胞のｃＡＭＰレベルの増加に関連する。他方、Ｇi（またはＧz、Ｇo）タンパク質と共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、細胞のｃＡＭＰレベルの低下に関連する。一般的には、Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（ニューロンから脳）（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ,Ｊ．Ｇ．ら編集、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ（シナプス伝達の間接的メカニズム）」,Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ, Ｉｎｃ． （１９９２）を参照。したがって、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、受容体に対する逆アゴニスト（即ち、そのような化合物はｃＡＭＰレベルを低下させる）であるかどうかを決定するために利用できる。ｃＡＭＰ測定について当該分野で公知の種々の方法が利用でき、最も好ましい方法は、ＥＬＩＳＡフォーマットにおける抗−ｃＡＭＰ抗体の使用に依拠する。利用できるアッセイの他のタイプは、全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子上にあるプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を動因する。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進し、次に特異的部位でプロモーターに結合し（ｃＡＭＰ応答エレメント）、そして遺伝子の発現を動因する。レポーター遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に複数のｃＡＭＰ応答エレメントを含むプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。したがって、受容体に結合した構成的活性化Ｇsは、ｃＡＭＰの蓄積を生起し、これは次に遺伝子を活性化して、レポータータンパク質の発現を誘導する。β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質は、次に標準生化学的アッセイ法を用いて検出することができる（Ｃｈｅｎら  １９９５）。
【００６９】
ｂ．ＧoとＧq
ＧqとＧoは、酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、その結果としてリン脂質ＰＩＰ2を加水分解して、２つの細胞内メッセンジャー、ジアシクログリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール１，４，５−三リン酸塩（ＩＰ3）を遊離する。ＩＰ3の蓄積の増加は、Ｇq−およびＧo−関連受容体の活性化に関連する。一般的には、Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（ニューロンから脳）（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ,Ｊ．Ｇ．   ら編集、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ（シナプス伝達の間接的メカニズム）」,第８章,  Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ, Ｉｎｃ． （１９９２）を参照。ＩＰ3蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、ＧqまたはＧo関連受容体に対する逆アゴニスト（即ち、そのような化合物はＩＰ3レベルを低下させる）であるかどうかを決定するために利用できる。Ｇq関連受容体はまた、Ｇq依存性ホスホリパーゼＣがＡＰ１エレメントを含む遺伝子の活性化を起因する、ＡＰ１レポーターアッセイを用いて検査することができ、したがって活性化Ｇq関連受容体は、そのような遺伝子発現増加を示し、それによってその逆アゴニストがそのような発現を減少すること、またアゴニストがそのような発現を増加することを示す。そのような検出用の市販アッセイが入手可能である。
【００７０】
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
逆アゴニスト、アゴニストの直接同定のための候補化合物のスクリーニングに、内因性・構成的活性化ＧＰＣＲまたは非内因性・構成的活性化ＧＰＣＲを使用する場合、必然として、受容体はそれに結合する内因性リガンドが存在しない場合でさえ活性であるという興味深いスクリーニングの困難性が生じる。したがって、例えば、候補化合物が存在する場合の非内因性受容体とその化合物が存在しない場合の非内因性受容体を識別するためには、かかる識別の目的がそのような化合物が逆アゴニストまたはアゴニストであるか、またはそのような受容体を影響しないかどうかを理解することなので、かかる識別を増強できる方法を利用することが好ましい。好ましい方法は、ＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【００７１】
一般的に、前述のアッセイ法（並びにその他の方法）を用いて非内因性ＧＰＣＲが構成的に活性化されていることがいったん判明すると、内因性ＧＰＣＲと共役する主Ｇタンパク質を決定することが可能である。Ｇタンパク質がＧＰＣＲと共役すると、評価可能なシグナル伝達経路を生じる。ある実施形態では、哺乳類発現系を用いてスクリーニングを行うことが好ましく、そのような系は内因性Ｇタンパク質を有することが予測される。したがって、定義上、そのような系では非内因性・構成的活性化ＧＰＣＲは持続的にシグナル伝達を行うであろう。ある実施形態では、例えば、受容体に対する逆アゴニストが存在する場合にこのシグナルが増強されることが好ましく、特にスクリーニングの観点からいえば、受容体が逆アゴニストと接触すると、より容易に受容体の識別が可能となることが好ましい。
【００７２】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｇタンパク質と非内因性ＧＰＣＲとの共役効力を増強することが意図されている。ＧＰＣＲ融合タンパク質は、内因性・構成的活性ＧＰＣＲまたは非内因性・構成的活性化ＧＰＣＲのいずれかのスクリーニングに向いており、それはそのような方法がそのようなスクリーニング法において使用されるシグナルを増加するためである。これは、有意な「信号雑音比」を促進するために重要であり、そのような有意な信号雑音比は本願に開示するような候補化合物のスクリーニングに好ましい。
【００７３】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現に有用な構築物の作成は当業者の認識範囲である。市販の発現ベクターおよびシステムは、研究者の特定のニーズに適合できる種々の方法を提供する。そのようなＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の作成における重要な判定基準は、限定はされないが、内因性ＧＰＣＲ配列とＧタンパク質配列がどちらも翻訳領域内（インフレーム）にあり（好ましくは、内因性ＧＰＣＲ配列がＧタンパク質配列の上流にあり）、さらにＧＰＣＲの「停止」コドンが欠失されているか、あるいはＧＰＣＲの発現に際して、Ｇタンパク質もまた発現できるように置換されていることを含む。その他の実施形態は、内因性ＧＰＣＲ配列とＧタンパク質配列が翻訳領域内にないか、および／または「停止」コドンが欠失または置換されていないような構築物を含む。ＧＰＣＲは直接Ｇタンパク質に結合されるか、あるいはこの二つの間にスペーサー残基が存在し得る（好ましくは、約１２個以下、この数値は当業者には容易に把握され得る）。便宜上、スペーサーを使用することが好ましい。非内因性ＧＰＣＲに共役するＧタンパク質は、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物を作出する前に同定されていることが好ましい。同定されているＧタンパク質はほんの僅かであるため、その中に内因性ＧＰＣＲ配列の挿入するために利用可能なＧタンパク質の配列を含む構築物（即ち、ユニバーサルＧタンパク質構築物（実施例を参照））であることが好ましく、これによって、別々の配列を有する種々の別個の内因性ＧＰＣＲの大規模なスクリーニングがさらに効率的になる。
【００７４】
前述のように、Ｇi、Ｇz、およびＧoに共役する構成的活性化ＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの形成を抑制して、これらのタイプのＧＰＣＲに基づくアッセイの作出を困難とすることが予測される（即ち、活性化されるとｃＡＭＰシグナルが減少して、例えば（このシグナルをさらに減少させるであろう）逆アゴニストの直接同定が困難となる。本願に開示するように、発明者らは、これらのタイプの受容体では、ＧＰＣＲ内因性Ｇタンパク質に基づかないＧＰＣＲ融合タンパク質を作出して、有効なシクラーゼアッセイを確立することが可能であることを確信した。  したがって、例えば、内因性Ｇi共役受容体をＧsタンパク質と融合することができ、そのような融合構築物は、発現に際して、内因性ＧＰＣＲが、例えば、「天然」Ｇiタンパク質というよりはむしろＧsと共役することを「動因」または「強制」して、それによってシクラーゼアッセイが確立され得る。したがって、Ｇi、Ｇz、およびＧo共役受容体について、ある実施形態では、ＧＰＣＲ融合タンパク質が使用されて、アッセイがアデニリルシクラーゼ活性の検出に基づくならば、融合構築物はＧs（または酵素アデニリルシクラーゼの形成を促進する等価Ｇタンパク質）によって構築されることが好ましい。
【００７５】
【表２】
2004526441.tif 000003
Ｇs、Ｇi、Ｇz、またはＧoと融合したＧqタンパク質を利用するＧタンパク質融合構築物は同様に有効である。ある実施形態では、Ｇタンパク質α−サブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６個のアミノ酸が欠失され、さらにＧαｑのＣ末端にある最後の５個のアミノ酸が目的のＧタンパク質のＧαの対応するアミノ酸で置換されている、Ｇqタンパク質によって達成され得る。例えば、融合構築物は、Ｇiタンパク質と融合したＧq（６個アミノ酸欠失）を有することが可能で、その結果「Ｇq／Ｇi融合構築物」が生じる。この融合構築物は、内因性Ｇi共役受容体をその非内因性Ｇタンパク質であるＧqと共役させ、したがってセカンドメッセンジャー、例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロール、がｃＡＭＰ産生の代わりに測定され得る。
【００７６】
４．ターゲットＧi共役ＧＰＣＲとシグナルエンハンサーＧs共役ＧＰＣＲの同時トランスフェクション（ｃＡＭＰベースアッセイ）
Ｇi共役受容体はアデニリルシクラーゼを阻害することが知られており、したがって、ｃＡＭＰ産生レベルを減少するために、ｃＡＭＰレベルの評価を困難にし得る。活性化時に主としてＧiを共役する受容体の構成的活性化の指標として、ｃＡＭＰ産生の減少を測定する有効な技法は、シグナルエンハンサー、例えば、活性化時に主としてＧsを共役する非内因性・構成的活性化受容体（例えば、以下に開示されるＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ）をＧＰＣＲと結合したＧiと共に同時トランスフェクトすることによって達成され得る。明らかであるように、Ｇs共役受容体の構成的活性化はｃＡＭＰの産生の増加に基づいて判定できる。Ｇi共役受容体の構成的活性化はｃＡＭＰ産生の減少を誘導する。したがって、この同時トランスフェクション法は、これらの「逆の」影響を好都合にも利用することを意図している。例えば、非内因性・構成的活性化Ｇs共役受容体（「シグナルエンハンサー」）と内因性Ｇi共役受容体（「ターゲット受容体」）の同時トランスフェクションは、ベースラインｃＡＭＰシグナルを生じる（即ち、Ｇi共役受容体はｃＡＭＰレベルを減少するが、この「減少」は、シグナルエンハンサーと共役した、構成的活性化Ｇsによって確立されたｃＡＭＰレベルの大幅な増加を基準にしている）。シグナルエンハンサーをターゲット受容体の構成的活性化型と同時トランスフェクトすることによって、Ｇiターゲットの機能的活性の増加（即ち、ｃＡＭＰを減少する）のために、ｃＡＭＰは（ベースラインに対して）さらに減少することが予測される。
【００７７】
ｃＡＭＰベースアッセイを用いる候補化合物のスクリーニングは、次に内因性受容体／Ｇタンパク質融合の用途に関する２つの「変化」によって達成することができる。その第一はＧi共役ターゲット受容体に関しては、即ち、Ｇi共役ターゲット受容体の逆アゴニストがｃＡＭＰの測定シグナルを増加し、Ｇi共役ターゲット受容体のアゴニストはこのシグナルの減少を起因するという「対向」効果を生じることであり、第二は、明らかであるように、この方法を用いて直接同定された候補化合物はこれらがシグナル増強受容体をターゲットしないことを確実にするために個別に評価されるべきことである（これは同時トランスフェクト受容体に対するスクリーニングの前または後に行うことができる）。
Ｆ．医薬品化学
しかし必ずではないが、一般的に、候補化合物の直接同定は、コンビナトリアル化学技法を介して生成された化合物と組み合わせて行われ、それによって何千もの化合物がそのような分析のためランダムに調製される。一般的に、そのようなスクリーニングの結果は、特有のコア構造を有する化合物であり、その後、これらの化合物は、さらにその医薬品特性を増強するために、好ましいコア構造（複数でもよい）周辺にさらなる化学的修飾を受け得る。そのような技法は、当業者には公知であるため、本特許文書において詳細に説明はしない。
Ｇ．医薬品組成物
さらなる開発のために選択された候補化合物は、当業者に公知の技法を用いて医薬品組成物に製剤化され得る。適切な薬剤認容性キャリアは当業者には入手可能であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ レミントン著、薬理科学）」、第１６版、Ｍａｃｋ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ,  １９８０  （Ｏｓｏｌら編集）を参照。
Ｈ．その他の用途
本願に開示の非内因性型ＧＰＣＲの好ましい用途は、候補化合物を逆アゴニストまたはアゴニスト（好ましくは医薬品製剤としての用途）として直接同定することであるが、これらの型のＧＰＣＲのその他の用途も存在する。例えば、ＧＰＣＲを組み込むインビトロおよびインビボ系は、これらの受容体がヒトの正常ならびに疾患状態において果たす役割をさらに解明かつ理解するため、ならびにシグナリングカスケードの理解に応用できるように、構成的活性化の役割を理解するために利用され得る。ある実施形態では、内因性受容体が「オーファン受容体」であること、即ち、その受容体の内因性リガンドが同定されていないこと、が好ましい。ある実施形態では、したがって、修飾された、非内因性ＧＰＣＲは、内因性リガンドが同定されない前に、ヒト身体における内因性受容体の役割を理解するために使用できる。そのような受容体はまた、既知の受容体およびそれらがシグナル伝達をする経路をさらに解明するために使用できる。開示された受容体のその他の用途は、なかんずく、本特許文書を校閲することによって当業者には明らかとなろう。
【実施例】
【００７８】
以下の例は、本発明の解明を目的として提示するもので、限定を意図するものではない。特定の核酸およびアミノ酸配列が本願に開示されるが、当業者はこれらの配列に僅かな変更を加えて、さらに以下の報告と同一または実質的に同様な結果を達成し得る能力を有する。一つの配列から別の配列への配列カセット（例えば、ラット受容体からヒト受容体、あるいはヒト受容体Ａからヒト受容体Ｂ）の適用または理解に対する従来の取り組み方は、一般的には、共通領域を決定するために配列を整列する配列アライメント法に基く。本願に開示する変異による取り組み方はこの方法には依拠せず、その代わりアルゴリズム法とヒトＧＰＣＲのＴＭ６領域内に位置するプロリン残基からの位置的距離に基づく。いったんこの取り組み方を理解すると、当業者は、それに僅かな変更を加えて本願の開示と実質的に同一な結果（即ち、構成的活性化）を作出する能力を得る。そのような変更された方法は、本開示の認識範囲であると見なされる。
［実施例１］
内因性ヒトＧＰＣＲ
以下のｃＤＮＡ受容体は、本セクションの技法を用いてクローン化された。以下参照。表Ｂは、本特許出願を通じて開示された受容体、翻訳領域、内因性ＧＰＣＲの核酸およびアミノ酸配列を一覧する（表３）。
【００７９】
【表３】
2004526441.tif 000004
２． 全長クローニングプロトコル
ａ．ＦＰＲＬ−２（配列番号１と２）
ＦＰＲＬ−２は、１９９２年にクローン化かつ配列決定された。Ｂａｏ, Ｌ． ら, １３（２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４３７-４０ （１９９２）。ＦＰＲＬ−２は染色体１９に位置し、Ｎ−ホルミルペプチド受容体Ｌｉｋｅ−１（ＦＰＲＬ−１）と類似の配列を有し、そのどちらもＮ−ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）と有意な類似性があることが報告されている。ＦＰＲに対する内因性リガンドはホルミルペプチドであるが、ＦＰＲの２つの相同体、ＦＰＲＬ−１とＦＰＲＬ−２、は同一リガンドに結合しないが、走化性受容体であるらしい。１３（２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４３７-４０ （１９９２）。走化性受容体は、炎症に関与することが報告されている。ＦＰＲＬ−２は、３５３個のアミノ酸から成るタンパク質をコードする１０６２ｂｐの翻訳領域を有するＧＰＣＲである。
【００８０】
ゲノムｃＤＮＡを鋳型として、ならびにｒＴｔｈポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（パーキンエルマー社）に製造元から提供されたバッファー系、０．２５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各４つのヌクレオチドを加えてＰＣＲを実施した。サイクル条件は、９４℃（１分）、６４℃（１分２０秒）、および７２℃（２分）のサイクルを３０回を繰り返した。５’ＰＣＲは、ＥｃｏＩ部位を以下の配列、
５'-ＡＡＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣ-３' （配列番号１９）
と共に含み、ならびに３’プライマーはＡｐａＩ部位を以下の配列、
５'-ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＣＴＣＡＣＡＴＴＧＣＴＴＧＴＡ -３' （配列番号２０）
と共に含んだ。
【００８１】
ＰＣＲフラグメントにＥｃｏＲＩとＡｐａＩを加えて消化して、ＣＭＶ発現ベクターのＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ部位中にクローン化した。ヒトＦＰＲＬ−２の核酸（配列番号１）とアミノ酸（配列番号２）配列は、その後配列決定ならびに検証された。
【００８２】
ｂ．ＳＴＬＲ３３（配列番号３と４）
ゲノムｃＤＮＡを鋳型として、ならびにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に製造元から提供されたバッファー系、０．２５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各４つのヌクレオチドを加えてＰＣＲを実施した。サイクル条件は、９４℃（１分）、６２℃（１分２０秒）、および７２℃（２分）のサイクルを３０回繰り返した。５’ＰＣＲは、ＥｃｏＲＩ部位を以下の配列、
５'-ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡ-３'（配列番号２１）
と共に含み、ならびに３’プライマーはＢａｍＨＩ部位を以下の配列、
５'-ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴ -３' （配列番号２２）
と共に含んだ。
【００８３】
ＰＣＲフラグメントにＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを加えて消化して、ＣＭＶ発現ベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位中にクローン化した。ヒトＳＴＲＬ３３ の核酸（配列番号３）とアミノ酸（配列番号４）配列は、その後配列決定ならびに検証された。
【００８４】
ｃ．ＣＰＲ４５（配列番号５と６）
ゲノムｃＤＮＡを鋳型として、ならびにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に製造元から提供されたバッファー系、０．２５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各４つのヌクレオチドを加えてＰＣＲを実施した。サイクル条件は、９６℃（２分）、９６℃（３０秒）、５５℃（２０秒）、７２℃（１分２０秒）、そして７２℃（５分）であり、サイクル２〜４は３５回繰り返した。５’ＰＣＲは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を以下の配列、
５'-ＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＴＣＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧ-３'（配列番号２３）
と共に含み、ならびに３’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を以下の配列、
５'-ＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＧＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＡ -３' （配列番号２４）
と共に含んだ。
【００８５】
ＰＣＲフラグメントはＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩを加えて消化して、ＣＭＶ発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した。ヒトＧＰＲ４５の核酸（配列番号５）とアミノ酸（配列番号６）配列は、その後配列決定かつ検証された。
【００８６】
ｃＤＮＡは次にＶ５−Ｈｉｓベクター中に再サブクローニングすることによってｐｆｕＰＣＲを用いてＶ５でタグされた。使用された以下の２つのプライマーは以下の配列、
５'-ＧＧＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＣＣＣＴＴ-３' （配列番号２５）および
５'-ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＡＣＴＧＧＴＴＦＴＣＡＴＴＧＣＡ-３' （配列番号２６）
を有した。
【００８７】
サイクル条件は、９４℃（１分）、６０℃（２分）、および７２℃（２分）のサイクルを３０回繰り返した。
【００８８】
ｄ．ｍＧＬＵＲ７（配列番号７と８）
グルタミン酸は、哺乳類の脳において大量に見いだされる興奮性神経伝達物質である。
【００８９】
Ｄｉｎｇｌｅｄｉｎｅ, Ｒ．ら, １３０（４Ｓ Ｓｕｐｐｌ）Ｊ Ｎｕｔｒ． １０３９５ （２０００）を参照。グルタミン酸受容体には、イオンチャネル型（リガンドゲート型イオンチャネル）と代謝調節型（ＧＰＣＲ）の２つのクラスがある。代謝調節型グルタミン酸受容体は、ＧＰＣＲの異種起源ファミリーであり、いくつかのセカンドメッセンジャー経路に結合して、ニューロン興奮性とシナプス伝達を制御する。（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ, Ｔ． ら, ５７（１）Ｂｒａｉｎ ＲｅｓＭｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ１３２ （１９９８）を参照）。代謝調節型グルタミン酸受容体タイプ７（ｍＧＬＵＲ７）は、脳において発現され、海馬、大脳皮質、および小脳において発現の度合いが最も高いことが報告されている。Ｍａｋｏｆｆ, Ａ．ら, ４０（１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ＭｏｌＢｒａｉｎ Ｒｅｓ１６５ （１９９６）参照。受容体が局在する脳の領域に基づいて、その受容体の推定上の機能的役割を推論することができる。例えば、特定の理論に束縛されることは意図しないが、ｍＧｌｕＲ７は、鬱病、不安症、肥満、アルツハイマー病、疼痛、および卒中に役割を果たしていると考えられる。
【００９０】
ｍＧｌｕＲ７ ｃＤＮＡは、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｈｏｆｆｍａｎ, Ｐｈ．Ｄ．の好意によって提供された。 ｍＧｌｕＲ７に使用されたベクターは、ｐＲｃＣＭＶであった（ｍＧｌｕＲ７のコード領域はｐＣＭＶベクターのＥｃｏＲＩ-ＣｌａＩ 部位にサブクローンされた）。ｍＧｌｕＲ７の核酸については配列番号７そして推論上のアミノ酸配列については配列番号８を参照。
【００９１】
ｅ．ＧＰＲ３７（配列番号９と１０）
本発明はまたヒトＧＰＲ３７に関する。ＧＰＲ３７は１９９７年にクローン化および配列決定された。Ｍａｒａｚｚｉｔｉ, Ｄ．ら, ４５ （１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６８-７７ （１９９７）。ＧＰＲ３７は６１３個のアミノ酸から成るタンパク質をコードする１８３９ｂｐの翻訳領域（オープンリーディングフレーム）を有するＧＰＣＲである。ＧＰＲ３７は、エンドセリンタイプＢ様受容体とホモロジーがあり、ヒト脳組織、特に脳梁、髄質、被殻、および尾状核で発現される。
【００９２】
ゲノムｃＤＮＡを鋳型として、ならびにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に製造元から提供されたバッファー系、０．２５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各４つのヌクレオチドを加えてＰＣＲを実施した。サイクル条件は、９４℃（１分）、６２℃（１分）、および７２℃（２分）のサイクルを３０回繰り返した。５’ＰＣＲは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を以下の配列、
５'-ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＣＧＡＧＣＣ-３'（配列番号２７）
と共に含み、ならびに３’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を以下の配列、
５'-ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＣＧＡＣＡＧＡＡＧＣ-３' （配列番号２８）
と共に含んだ。
【００９３】
この１．９ｋｂのＰＣＲフラグメントにＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩを加えて消化して、ＣＭＶｐ発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した。ヒトＧＰＲ３７の核酸（配列番号９）とアミノ酸（配列番号１０）配列は、その後配列決定かつ検証された。
【００９４】
ｆ．ＨＦ１９４８（配列番号１１と１２）
ＨＦ１９４８ ｃＤＮＡは、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｈｏｆｆｍａｎ, Ｐｈ．Ｄ．の好意によって提供された。 ＨＦ１９４８に使用されたベクターはｐＲｃＣＭＶであった（ＨＦ１９４８のコード領域はｐＣＭＶベクターのＨｉｎｄＩＩＩ-ＢａｍＨＩ 部位にサブクローンされた）。ＨＦ１９４８の核酸については配列番号１１そして推論上のアミノ酸配列については配列番号１２を参照。
【００９５】
ｇ．ＧＰＲ６６（配列番号１３と１４）
ヒトＧＰＲ６６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号、ＡＦ０４４６００およびＡＦ０４４６０１）のｃＤＮＡは、以下のようにしてｐＣＭＶ発現ベクター中に生成ならびにクローン化された。ＰＣＲはゲノムＤＮＡを鋳型に、そして第一ラウンドではＴａｑＰｌｕｓポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ストラタジーン社））、第二ラウンドＰＣＲではｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元から提供されたバッファー系、０．２５μＭの各プライマー、ならびに各４つのヌクレオチドを０．２ｍＭ（Ｔａｑプラスプレシジョン（ＴａｑＰｌｕｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ））または０．５ｍＭ（ｐｆｕ）と共に使用してＰＣＲを実施した。ｐｆｕを使用する場合は、１０％ＤＭＳＯをバッファー中に含んだ。サイクル条件は９４℃（１分）、６５℃（１分）を３０回繰り返し、そして（ａ）第一ラウンドＰＣＲでは７２℃（１分）および（ｂ）第二ラウンドＰＣＲでは７２℃（２分）であった。コード領域にイントロンがあるために、２セットのプライマーが重複５’および３’フラグメントを生成するので別々に使用された。５’フラグメントＰＣＲプライマーは、５'-ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＣＴ-３'（外部センス）（配列番号２９）および５'-ＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＧＧＣ-３ '（内部アンチセンス）（配列番号３０）であった。３’フラグメントＰＣＲプライマーは、５'-ＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＴ-３'（内部センス）（配列番号３１）および、５'-ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＧＣＣＴ-３'（ＥｃｏＲＩ部位を伴う外部アンチセンス（（配列番号３２）であった。
【００９６】
５’および３’フラグメントは、第一ラウンドＰＣＲを鋳型として、キナーゼ処理した外部センスプライマーと外部アンチセンスプライマーを用いて結合して、第二ラウンドＰＣＲを行った。この１．２ｋｂのＰＣＲフラグメントにＥｃｏＲＩを加えて消化して、ｐＣＭＶ発現ベクターの平滑末端型ＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した。ヒトＧＰＲ６６の核酸（配列番号１３）とアミノ酸（配列番号１４）配列は、その後配列決定かつ検証された。
【００９７】
ｈ．ＧＰＲ３５（配列番号１５と１６）
ＧＰＲ３５は、３０９個のアミノ酸配列であり、その内因性リガンドは未知である（Ｏ'Ｄｏｗｄ Ｂ．ら, ４７（２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３１０ （１９９８））。ＧＰＲ３５はＥ２Ｆとして知られる特定の転写因子と相互作用することが判明しており、その相互作用はＤＮＡ複製の開始、そして最終的には細胞増殖に必須である。細胞内では、Ｅ２Ｆは網膜芽細胞腫（“Ｒｂ”）として知られる腫瘍抑制遺伝子と共役する。この転写因子構築物がリン酸化すると、Ｅ２Ｆは、Ｒｂ遺伝子から遊離されて、次に細胞の核に入る。核の内部では、Ｅ２Ｆは、ＤＮＡポリメラーゼのような遺伝子と結合して、ＤＮＡ複製を開始し、その結果細胞の増殖を起こす。
【００９８】
ゲノムｃＤＮＡを鋳型として、ならびにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に製造元から提供されたバッファー系、０．２５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各４つのヌクレオチドを加えてＰＣＲを実施した。サイクル条件は、９４℃（１分）、６２℃（１分）、および７２℃（１分２０秒）のサイクルを３０回繰り返した。５’ＰＣＲプライマーは以下の配列、
５'-ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧ-３' （配列番号３３）
を加えてキナーゼ処理し、ならびに３’プライマーはＢａｍＨＩ部位を以下の配列、
５'-ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣ -３' （配列番号３４）
と共に含んだ。
【００９９】
この１ｋｂのＰＣＲフラグメントにＢａｍＨＩを加えて消化して、ＣＭＶｐ発現ベクターのＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩ 部位中にクローン化した。配列決定された全ての６個のクローンは、ＡｒｇからＳｅｒへのアミノ酸２９４の変化を伴う潜在的な多形性を含む。ヒトＧＰＲ３５の核酸（配列番号１５）とアミノ酸（配列番号１６）配列は、その後配列決定かつ検証された。
【０１００】
ｉ．ＥＴＢＲ −ＬＰ２ （配列番号１７と１８）
ＥＴＢＲ-ＬＰ２ は１９９８年にクローン化かつ配列決定された。Ｖａｌｄｅｎａｉｒｅ ０．ら, ４２４（３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９３ （１９９８）。推論上の核酸およびアミノ酸配列についてはＶａｌｄｅｎａｉｒｅの図１を参照。ＥＴＢＲ-ＬＰ２ は６１３個のアミノ酸から成るタンパク質をコードする１８３９ｂｐの翻訳領域を有する。ＥＴＢＲ-ＬＰ２は、エンドセリンタイプＢ受容体（ＥＴＢＲ-ＬＰ）とホモロジーがあることが報告されている。さらに、ＥＴＢＲ-ＬＰ２ は、ヒトＧＰＲ３７と約４７％のアミノ酸配列ホモロジーを有することが明らかにされている。ＥＴＢＲ-ＬＰ２は、ヒト中枢神経系（例えば、大脳皮質、内包線維、およびバーグマングリア（４２４ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ   １９６））で発現されることが報告されている。
【０１０１】
脳ｃＤＮＡを鋳型として、ならびにｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に製造元から提供されたバッファー系、０．２５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各４つのヌクレオチドを加えてＰＣＲを実施した。サイクル条件は、９４℃（１分）、６５℃（１分）、および７２℃（１．５分）のサイクルを３０回繰り返した。５’ＰＣＲは、ＥｃｏＩ部位を以下の配列、
５'-ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＧＧ -３'（配列番号３５）
と共に含み、３’ プライマーはＢａｍＨＩ部位を以下の配列、
５'-ＣＣＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧ -３' （配列番号３６）
と共に含んだ。
【０１０２】
結果生じるこの１．５ｋｂのＰＣＲフラグメントにＥｃｏＲＩ とＢａｍＨＩを加えて消化して、ｐＣＭＶ発現ベクターのＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩ 部位中にクローン化した。ヒトＥＴＢＲ-ＬＰ２ の核酸（配列番号１７）とアミノ酸（配列番号１８）配列は、その後配列決定かつ検証された。
【０１０３】
ｊ．ＧＰＲ２６（配列番号９７と９８）
４００ｂｐの３’ＰＣＲフラグメントであるＥＳＴクローンＨＩＢＢ０５５がヒトゲノムラムダダッシュＩＩライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ特別注文）をスクリーンするために使用される。スクリーニング条件は以下のようであった。フィルターはホルムアルデヒドベースのハイブリダイゼーション溶液中５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。洗浄条件は、２×  ＳＳＣ／１％ＳＤＳ、６５℃で２回、そして２×  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃で２回を各洗浄について２０分行った。フィルターをフィルム上に置いて−８０℃で一晩暴露させて、翌日現像した。陽性プラークは、同一条件で一次プラグから二回目のファージスクリーニングによってさらに特徴づけされた。
【０１０４】
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリＵｎｉ-ＺＡＰ ＸＲ ベクター（カタログ番号９３７２２７、 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、次にゲノムライブラリスクリーニングからの新しい配列から生成された２５０ｂｐのプローブを使ってプローブした。この２５０ｂｐプローブは、ＴａｑｐｌｕｓプレシジョンＰＣＲシステムに製造元から提供されたバッファー系を加えて生成された。サイクリングパラメータは以下のようであった。９５℃（４５秒）、５５℃（４０秒）、７２℃（１分）を３０回繰り返して、７２℃（１０分）の最終伸長を行った。以下のプライマー、５'-ＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＴＧＧＣ-３' （配列番号９９）および５'-ＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＴＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＡ-３'（配列番号１００）を使用した。
【０１０５】
ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを、同じ２５０ｂｐ  ＰＣＲフラグメントを用いて、ハイブリダイゼーション温度が４２℃である以外はゲノムライブラリーと同一条件下でプローブした。陽性の一次プラグは、ハイブリダイゼーション温度を５５℃として同一条件下で２回目のスクリーニングによってさらに特徴づけされた。陽性プラークは、サンガー法を用いる配列によって分析が行われ、開始コドンが陽性クローンの一つから得られた。
【０１０６】
ヒトＧＰＲ２６全長クローンは次に、以下のパラメータ、９５℃（４５秒）、６２℃（１分）、および７２℃（１．２分）を４０回繰り返して、７２℃（１０分）で最終伸長して、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 #６００２５０）を用いて生成された。鋳型としてはヒト胎仔脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（クローンテク社）、# ７４０２-１）が使用され、以下のプライマー、５'-ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＴＣＧＴＧＧＧＡＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＣ-３' （配列番号１０１）および５'-ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴ-３'（配列番号１０２）を使用した。
【０１０７】
生成されたフラグメントは、５’ＥｃｏＲＩリンカーと３’Ｘｈｏ１リンカーを有した。ＰＣＲ産物は所定のリンカー酵素で消化されて、ラピッドリゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ（ロッシュ社）、#１６３５ ３７９）を用いて、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（+） （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン社）、#Ｖ７９０-２０）のＥｃｏＲ１／Ｘｈｏ１部位中にサブクローンされた。ヒトＧＰＲ２６の核酸（配列番号９７）とアミノ酸（配列番号９８）配列は、その後配列決定かつ検証された。
［実施例２］  非内因性・構成的活性化ＧＰＣＲの調製
当業者は核酸配列の突然変異の技法を選択する能力を有している。上記に開示されたいくつかのヒトＧＰＣＲの非内因性型を作出するために使用される方法を以下に示す。以下に開示する変異は、（ＴＭ６／ＩＣ３インターフェース付近の、ＧＰＣＲのＴＭ６領域に位置する）保存プロリン（またはその内因性・保存置換）残基由来の（ＧＣＰＲのＩＣ３領域に位置する）１６番目のアミノ酸が、好ましくは、アラニン、ヒスチミン（ｈｉｓｔｉｍｉｎｅ）、アルギニン、またはリジンアミノ酸残基、最も好ましくは、リジンアミノ酸残基に変異されることによる、アルゴリズム法に基づく。
【０１０８】
１．部位特異的変異誘発
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製は、なかでも、トランスフォーマー部位特異的（商標）変異誘発キット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ（ＴＭ）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造元の指示に従って、あるいはクイックチェンジ（商標）部位特異的（商標）変異誘発キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（ＴＭ）Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ（ＴＭ）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、製造元の指示に従う）を用いてヒトＧＰＣＲで達成された。以下のＧＰＣＲは、所定の配列プライマー（表４）を用いて、上記の方法に従って変異された。  便宜上、ヒトＧＰＣＲに組み込まれたコドンの変異もまた、標準型で表記する（表４）。
【０１０９】
【表４】
2004526441.tif 000005
１． 非内因性ヒトＧＰＣＲ作成の代替方法
非内因性・構成的活性化ヒトＧＰＲ３５受容体の調製は、Ａ２１６Ｋ変異を作出することによって達成された。変異誘発は、トランスフォーマー部位特異的（商標）変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造元の指示に従って用いて実施した。（核酸配列については配列番号８４、アミノ酸配列については配列番号８５を参照）。以下の配列、
５'- ＧＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧ -３' （配列番号６０）および
５'- ＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴ -３' （配列番号６１）
をそれぞれ有する２つの変異誘発プライマー、リジン変異誘発オリゴヌクレオチドと選択マーカーオリゴヌクレオチド、が使用された。
【０１１０】
第一回目のＰＣＲでは、配列番号３３と配列番号６１を使って７００ｂｐの５’フラグメントが生成され、配列番号３４と配列番号６０を使って３５０ｂｐの３’フラグメントが生成された。内因性ＧＰＲ３５ｃＤＮＡを鋳型として、ならびにｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、１０％  ＤＭＳＯを補充した製造元から提供されたバッファー系、０．２５μＭの各プライマー、０．５ｍＭの各４つのヌクレオチドを加えてＰＣＲを実施した。サイクル条件は、９４℃（３０秒）、６５℃（１分）、および７２℃（２分２０秒）のサイクルを２５回繰り返した。第一回目のＰＣＲからの５’および３’ＰＣＲフラグメントを次に共鋳型として使用して、アニーリング温度を５５℃に、また伸長時間が２分である以外は前述のように、オリゴ１と２をプライマーに、そしてｐｆｕポリメラーゼを用いて第二回目のＰＣＲを行った。その結果生じるＰＣＲフラグメントを次に消化して、内因性ｃＤＮＡについて説明したようにｐＣＭＶ中にサブクローンした。
【０１１１】
非内因性ヒトＧＰＣＲを次に配列決定して、これに由来し、検証された核酸とアミノ酸配列を、以下の表５に要約するように、本特許文書に随伴する「配列一覧」付録に一覧する。
【０１１２】
【表５】
2004526441.tif 000006
［実施例３］  受容体の発現
タンパク質発現用として当業者は種々の細胞を利用可能であるが、哺乳類細胞を使用することが好ましい。この第一の理由は、実用性、即ち、ＧＰＣＲ発現のために、例えば、酵母細胞の使用は可能であるが、プロトコル中に、哺乳類系に進化してきた受容体共役、遺伝的メカニズム、および分泌経路を含まない可能性のある（事実、酵母の場合は、含まない）非哺乳類細胞を導入し、したがって、非哺乳類細胞において得られた結果は、使用可能ではあるが、哺乳類細胞を用いて得られた結果ほど好ましくはない。哺乳類細胞では、ＣＯＳ-７、２９３、および２９３Ｔ細胞が特に好ましいが、使用される特定の哺乳類細胞は、当業者の特定のニーズに応じて決定され得る。
【０１１３】
ａ．２９３細胞の一過性トランスフェクション
１日目には、１０ ｃｍのディッシュに６ｘ１０6個の２９３細胞を接種した。２日目に、２本の試験管を用意した（各試験管の大きさはプレートに依拠する）。試験管Ａは、４μｇ  ＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター、受容体ｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクター等）を０．５ｍｌ  無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（ギブコ  ＢＲＬ社））に混合することによって調製した。試験管Ｂは、２４μｌ  リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を０．５ｍｌ  無血清ＤＭＥＭに混合することによって調製した。試験管ＡとＢは（数回）反転することによって混合して、続いて室温で３０〜４５分インキュベートした。混合物は、「トランスフェクションミックス」と呼ばれる。平板培養された２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄してから、５ｍｌの無血清ＤＭＥＭを追加した。１ｍｌのトランスフェクションミックスを細胞に添加してから、３７℃／５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。トランスフェクションミックスを吸引除去してから、ＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清を１０ｍｌ添加した。細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートした。４８時間のインキュベートした後、細胞を収集して分析に使用した。
【０１１４】
ｂ．安定２９３細胞株
約１２ｘ１０6個の２９３細胞を１５ｃｍ細胞培養プレートに接種して、１０％ウシ胎仔血清と１％ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸、および抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地で生育させる。２９３細胞接種２４時間後（約８０％コンフルーエント）、１２μｇ  ＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトする。１２μｇ  ＤＮＡを、６０μｌ  リポフェクタミンと２ｍｌ  ＤＭＥ高グルコース無血清培地と混合する。プレートから培地を吸引除去して、無血清培地で細胞を一度洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクタミン、および培地混合物を、１０ｍｌの無血清培地と共にプレートに添加する。３７℃で４〜５時間インキュベート後、培地を吸引除去して、血清培地を２５ｍｌ添加する。トランスフェクションの２４時間後、再び培地を吸引除去して、新鮮な血清培地を添加する。トランスフェクションの４８時間後、培地を吸引除去して、ゲネチシン（Ｇ４１８薬剤）を含む血清培地を、最終濃度が５００μｇ／ｍｌになるように添加する。トランスフェクト細胞は次に、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を含む陽性トランスフェクト細胞についての選択を受ける。培地は、選択が行われる４〜５日ごとに取り替える。選択中、細胞は安定なプールを作出するために生育されるか、あるいは安定コロニー選択のためにスプリットされる。
【０１１５】
ｃ．ＲＧＴ細胞（ｍＧｌｕＲ７に使用）
ＲＧＴ細胞は、グルタミン酸−アスパラギン酸輸送体が安定的にトランスフェクトされているアデノウイルス形質転換シリアンハムスター細胞株（ＡＶ１２-６６４）に由来した。
【０１１６】
１日目には、１０ ｃｍディッシュに５ｘ１０6個のＲＧＴ細胞を接種した。２日目に、９１μｌの無血清培地を試験管に添加した後で、９μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。同一混合物に３ｕｇのＤＮＡを加えた（０．５μｇ／μｌ）。この混合物を穏やかに混合して、室温で１５分インキュベートし、次にこの混合物をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに生育する細胞中に一滴ずつ加えて、３７℃／５％Ｃ2条件下で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後に、細胞を収集して分析に使用した。
［実施例４］  非内因性ＧＰＣＲの構成的活性判定用アッセイ
非内因性ヒトＧＰＣＲの構成的活性を評価するために種々の方法が利用できる。以下は例示であり、当業者は、そのニーズのために優先的に利益のあるこれらの技法を決定する能力を有している。
【０１１７】
１．膜結合アッセイ、[35Ｓ]ＧＴＰγＳ アッセイ
リガンド結合あるいは構成的活性化の結果として、Ｇタンパク質共役受容体が活性状態にあると、受容体はＧタンパク質に共役して、ＧＤＰの遊離とそれに引き続くＧＴＰのＧタンパク質への結合を促進する。Ｇタンパク質−受容体複合体のアルファサブユニットは、ＧＴＰ加水分解酵素として作用して、緩徐にＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、その時点で受容体は通常は脱活性化される。構成的活性化型受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換し続ける。非加水分解型ＧＴＰ類似体である[35Ｓ]ＧＴＰγＳを利用して、構成的活性化受容体を発現している膜に対する[35Ｓ]ＧＴＰγＳの結合の増強を実証することができる。構成的活性化を測定するために[35Ｓ]ＧＴＰγＳ 結合を使用する利点は、限定はされないが、（ａ）一般的に全てのＧタンパク質共役受容体に適応可能である、（ｂ）膜表面近位にあるために、細胞内カスケードを影響する分子を捕獲する可能性が少ない、ことである。
【０１１８】
このアッセイは、関連受容体を発現している膜に対する[35Ｓ]ＧＴＰγＳ の結合を促進するＧタンパク質共役受容体の能力を利用する。このアッセイは、したがって、構成的活性化Ｇタンパク質共役受容体に対する候補化合物をスクリーンするための直接同定法に使用できる。このアッセイは一般的であり、全てのＧタンパク質共役受容体についての創薬に実用性を有する。
【０１１９】
[35Ｓ]ＧＴＰγＳ アッセイは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１〜２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2（この量は結果を最適化するために調節可能であるが、２０ｍＭであることが好ましい）、ｐＨ７．４、約０．３〜１．２ｎＭ  [35Ｓ]ＧＴＰγＳ （この量は結果を最適化するために調節可能であるが、１．２であることが好ましい）を含む結合バッファー、ならびに１２．５〜７５μｇ  膜タンパク質（例えば、Ｇs融合タンパク質を発現する２９３細胞、この量は最適化のために調節可能である）および１０μＭ  ＧＤＰ（この量は最適化のために調節可能である）中でインキュベートされる。麦芽凝集素ビーズ（２５μｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ（アマーシャム社））を次に加えて、混合物を室温でさらに３０分インキュベートする。この試験管を次に、室温、１５００×ｇで５分遠心分離してからシンチレーションカウンターでカウントする。
【０１２０】
２．細胞ベースｃＡＭＰ検出アッセイ
細胞ベースアッセイのためにデザインされたＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（フラッシュプレート）（商標）アデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ（ニューイングランドニュークレア社）、カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、粗原形質膜と使用するために修正され得る。このＦｌａｓｈ Ｐｌａｔｅウェルは、シンチラントコーティングを含み、またさらにｃＡＭＰを認識する特異的抗体を含むことができる。このウェルで生成されたｃＡＭＰは、放射性ｃＡＭＰトレーサーのｃＡＭＰ抗体に対する結合の直接競合によって定量することができる。以下は、受容体を発現する全細胞におけるｃＡＭＰレベルの変化測定のための簡単なプロトコルの役目を果たす。
【０１２１】
トランスフェクト細胞は、一過性トランスフェクションの約２４時間後に収集された。培地は注意深く吸引して廃棄された。１０ｍｌのＰＢＳをゆっくりと各ディッシュの細胞に加えてから注意深く吸引した。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離バッファーと３ｍｌのＰＢＳを各プレートに添加した。細胞をプレートからピペットで取り出して、細胞懸濁液を５０ｍｌの円錐状遠心管中に回収した。細胞を室温、１,１００ｒｐｍで５分遠心分離した。細胞ペレットを適量（約３ｍｌ／プレート）のＰＢＳ中に注意深く再懸濁した。細胞を次に血球計数器を用いてカウントし、追加ＰＢＳを加えて適切な数の細胞にした（最終容量が約５０μｌ／ウェル）。
【０１２２】
標準ｃＡＭＰと検出バッファー（１１ｍｌの検出バッファーについて１μＣｉのトレーサー[125ＩｃＡＭＰ（５０μｌ）] を含む）を調製して、製造元の指示に従って維持した。アッセイ用バッファーは、スクリーニング用に新しく調製し、５０μｌの促進バッファー、３μｌの試験化合物（最終アッセイ濃度  １２μＭ）および５０μｌの細胞を含み、アッセイ用バッファーは使用するまで氷上に保存した。アッセイは適切なウェルに５０μｌの標準ｃＡＭＰを添加することによって開始され、次にウェルＨ-１１とＨ-１２に５０μｌのＰＢＳＡを添加した。５０μｌの促進バッファーを全てのウェルに加えた。ＤＭＳＯ（または選択された候補化合物）を、３μｌの化合物溶液をディスペンスすることが可能なピンツールを用いて適切なウェルに、最終アッセイ濃度が１２μＭ  試験化合物と１００μｌ  総アッセイ容量となるように加えた。細胞を次にウェルに加えて、室温で６０分インキュベートした。１００μｌのトレーサーｃＡＭＰを含む検出ミックスを次ぎにウェルに加えた。プレートをさらに２時間インキュベートしてから、Ｗａｌｌａｃマイクロベータ（商標）シンチレーションカウンターでカウントした。ｃＡＭＰ／ウェル値を次に、各アッセイプレート内に含まれている標準ｃＡＭＰ曲線から外挿した。
【０１２３】
３．Ｇi共役ＦＰＲＬ−２とＧs／Ｇi融合タンパク質構築物の同時トランスフェクション
ＦＰＲＬ−２およびＧs／Ｇi融合タンパク質構築物を含むトランスフェクションミックス（実施例３Ａより）を吸引除去後、１０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清を加えた。細胞を次に３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートした。４８時間のインキュベーション後に、細胞を収集して分析に使用した。細胞ベースｃＡＭＰ検出アッセイを次に上記実施例４（２）のプロトコルに従って実施した。
【０１２４】
内因性ＦＰＲＬ−２は、その活性状態では優先的にＧiタンパク質と共役すると考えられるため、ｃＡＭＰ産生の減少は、開示された非内因性型ＦＰＲＬ−２が構成的に活性であることを表す。したがって、ｃＡＭＰシグナルを増加することによってＦＰＲＬ−２受容体を影響する候補化合物は逆アゴニストであり、ＦＰＲＬ−２アゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少する。図１を参照。
【０１２５】
図１は、Ｇs／Ｇiと比較すると、ＦＰＲＬ−２の活性が約４倍増加することを明らかにする。ＦＰＲＬ−２の内因性型をその非内因性型と比較すると、非内因性ＦＰＲＬ−２（“ＦＰＲＬ-２（Ｌ２４０Ｋ）”）は、コントロールである、Ｇs／Ｇiと比較すると受容体活性が約３倍増加することが明らかである。したがって、このデータはＦＰＲＬ−２の内因性および非内因性型のどちらも構成的に活性であることを示唆する。
【０１２６】
図９を参照する。図９では、非内因性ＧＰＲ３７（Ｌ３５２Ｒ） は、ＧＰＲ３７（“ＧＰＲ３７ ｗｔ”）の内因性型と比較すると、約３５４％のｃＡＭＰ増加を生じ、ＧＰＲ３７（Ｃ５４３Ｙ）は、ＧＰＲ３７ｗｔと比較すると約１８９％のｃＡＭＰ増加を生じた。このデータは、ＧＰＲ３７の非内因性Ｌ３５２ＲとＣ５４３Ｙ型のどちらも構成的に活性化されていることを示唆する。
【０１２７】
４．Ｇi共役型ターゲットＧＰＣＲ用の細胞ベースｃＡＭＰ
ＴＳＨＲは、活性化されるとｃＡＭＰの蓄積を起因するＧs共役型ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３の変異（即ち、アラニン残基のイソロイシン残基への変更）によって構成的活性化される。Ｇi共役受容体はアデニリルシクラーゼを阻害することが予測され、したがって、ｃＡＭＰ産生レベルを減少するために、ｃＡＭＰレベルの評価を困難とし得る。Ｇi共役受容体の構成的活性化の兆候としてｃＡＭＰ産生の減少を測定するための効果的な技法は、最も好ましくは、非内因性・構成的活性化ＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ）（あるいは、内因性・構成的活性化Ｇs共役受容体）を「シグナルエンハンサー」として、Ｇi結合型ターゲットＧＰＣＲと共に同時トランスフェクトして、ｃＡＭＰのベースラインレベルを確立することによって達成され得る。非内因性型Ｇi共役受容体を作出すると、この非内因性型ターゲットＧＰＣＲを次にシグナルエンハンサーと同時トランスフェクトして、この物質をスクリーンに用いることができる。この方法を使って、ｃＡＭＰアッセイが使用される際に効果的にシグナルを生成することができる。この方法は、Ｇi共役受容体に対する候補化合物の直接同定に使用することが好ましい。Ｇi共役型ＧＰＣＲについては、この方法を用いる際は、ターゲットＧＰＣＲの逆アゴニストはｃＡＭＰを増加させ、アゴニストはｃＡＭＰを減少することを特記する。
【０１２８】
細胞は、上記の実施例３Ａに従ってトランスフェクトされた。次にトランスフェクトされた細胞は、一過性トランスフェクションの約２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を収集される。細胞ベースｃＡＭＰ検出アッセイを次に上記実施例４（２）のプロトコルに従って実施した。
【０１２９】
好ましくは、前述のように、小分子候補化合物が、例えば、ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）ではなくてＧi共役型ターゲット受容体をターゲットすることを確実にするために、直接同定された候補化合物はターゲット受容体が存在しない状態でシグナルエンハンサーについてスクリーンすることが好ましい。
【０１３０】
図３を参照する。図３は、２９３細胞における、内因性ＧＰＲ４５（“ＧＰＲ４５ ｗｔ”）対コントロール（“ＣＭＶ”）の比較分析である。内因性ターゲット受容体ＧＰＲ４５は、シグナルエンハンサー、ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）、と共に同時トランスフェクトされた。ＴＳＨ受容体の内因性リガンドであるＴＳＨが存在しないと、ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）と内因性ＧＰＲ４５の同時トランスフェクションは、コントロール（ＣＭＶ）と比較すると、ｃＡＭＰの産生を約９６％減少することを明示する。ＴＳＨが存在すると、内因性ＧＰＲ４５（“ＧＰＲ４５ ｗｔ”）は、コントロール（“ＣＭＶ”）と比較すると、ｃＡＭＰの産生を約７３％減少することを明示する。このデータは、ＧＰＲ４５が内因性・構成的活性であり、Ｇiタンパク質を共役することを示す。
【０１３１】
図４と表Ｅを参照する。表Ｅは図４の要約であり、２９３細胞内における、内因性ｍＧｌｕＲ７（“ｍＧｌｕＲ７ ｗｔ”）とｍＧｌｕＲ７の非内因性型のいくつか（“Ｗ５９０Ｓ”、“Ｒ６５９Ｈ”、“Ｔ７７１Ｃ”および“１７９０Ｋ”） ならびにコントロール（“ｐＣＭＶ”）の比較分析である。表Ｅは、内因性リガンド（即ち、ＴＳＨ）が存在しない場合のシグナルエンハンサー受容体（即ち、ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ））とターゲット受容体（ｍＧｌｕＲ７）を含むベクターによるｃＡＭＰ産生、ＴＳＨが存在する場合のシグナルエンハンサーとターゲット受容体の同時トランスフェクションによるｃＡＭＰ産生、ＴＳＨが存在する場合に、ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）で同時トランスフェクトされたｍＧｌｕＲ７の内因性型と非内因性型の間のｃＡＭＰ産生のパーセント（％）減少を要約する。このデータは、ｍＧｌｕＲ７（“Ｗ５９０Ｓ”、“Ｒ６５９Ｈ”、“Ｔ７７１Ｃ” および “１７９０Ｋ”）の非内因性型が、内因性ｍＧｌｕＲ７と比較すると、ｃＡＭＰ産生を減少すること、したがって、前述の方法によって構成的に活性化されておることを実証する。
【０１３２】
【表６】
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ＲＧＴ細胞中でトランスフェクトされたｍＧｌｕＲ７型は前述のデータを支持する。図５を参照する。図５において、ｍＧｌｕＲ７受容体の内因性型と比較すると、Ｗ５９０Ｓは、ｃＡＭＰの産生を約５２％減少し、Ｒ６５９Ｈは、約４３％の減少、Ｔ７７１Ｃは、約５％の減少、ならびにＩ７９０Ｋは約２８％減少することが明示された。
【０１３３】
ｍＧｌｕＲ７は活性状態では優先的にＧiを共役するために、ｃＡＭＰ産生の減少は、ここに開示されたｍＧｌｕＲ７の非内因性型は構成的活性であることを意味する。したがって、ｃＡＭＰシグナルを増加することによってｍＧ１ｕＲ７受容体を影響する候補化合物は逆アゴニストであり、そしてｍＧ１ｕＲ７アゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少する。図５と６で得られたデータに基づき、２９３およびＲＧＴ両細胞におけるｃＡＭＰアッセイを用いるＴＳＨＲ構成的活性化同時トランスフェクション法で使用される際には、“Ｗ５９０Ｓ”、“Ｒ６５９Ｈ”、“Ｔ７７１ Ｃ”、および“Ｉ７９０Ｋ”は、ｍＧｌｕＲ７の好ましい非内因性型であり、“Ｗ５９０Ｓ”が最も好ましい。
【０１３４】
図１２を参照する。図１２において、ＨＦ１９４８（“Ｉ２８１Ｆ” と“Ｅ１３５Ｎ”）の非内因性型は、ＨＦ１９４８（“ｗｔ”）の内因性型と比較すると、それぞれ約１８％および約３９％のｃＡＭＰ産生の減少を示す。このデータは、ＨＦ１９４８の非内因性Ｉ２８１ＦおよびＥ１３５Ｎ型のどちらも構成的活性化されていることを示唆する。ｃＡＭＰのこの減少は、これらの型がＧi共役型であることをさらに示唆する。Ｇi共役型である他に、図１１は、ＨＦ１９４８の非内因性Ｉ２８１Ｆ型はまたＧqＧタンパク質を共役し得ることを示唆する。（以下の実施例４（５）（ｆ）を参照）。
【０１３５】
図１６を参照する。図１６は、（ＴＳＨが存在する場合に）ＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ （“ＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ”）と非内因性、構成的活性化ＥＴＢＲ-ＬＰ２ （“Ｎ３５８Ｋ”）で同時トランスフェクトされた細胞のｃＡＭＰ産生 （６５．９６ ピコモルｃＡＭＰ／ウェル） を、ＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ と内因性 ＥＴＢＲ-ＬＰ２ （“ＷＴ”） で同時トランスフェクトされた細胞のｃＡＭＰ産生（１０２．５９ ピコモルｃＡＭＰ／ウェル）と比較すると、約３６％のｃＡＭＰ産生の減少があることを明示する。ｐＣＭＶと共に同時トランスフェクトされたＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ （２９０．７５ピコモル ｃＡＭＰ／ウェル）に対して、ＥＴＢＲ-ＬＰ２（“Ｎ３５８Ｋ”） と共にトランスフェクトされたＴＳＨＲ-Ａ６２３ＩとＥＴＢＲ-ＬＰ２（“ＷＴ”）と共に同時トランスフェクトされたＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉをそれぞれ比較すると、ｃＡＭＰの産生が約７７％と約６５％減少することが示された。好ましくは、この方法は、アゴニストがシグナルを減少するのに反して、シグナルを増加する逆アゴニストをスクリーンするために使用される。小分子がＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ 構築物ではなくＥＴＢＲ-ＬＰ２に結合することを確認するためには、この小分子をＥＴＢＲ-ＬＰ２が存在しない状態でこの構築物に対してスクリーンすることが好ましい。
【０１３６】
５．受容体ベースアッセイ
ａ．ＣＲＥ−Ｌｕｃ受容体アッセイ（Ｇs関連受容体）
２９３および２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート上で、ウェル当たり２ ｘ １０4の細胞密度となるように接種して、翌日製造元の指示に従ってリポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。ＤＮＡ／脂質混合物を各６ウェルトランスフェクションが以下になるように調製した。２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを含む１００μｌのＤＭＥＭを２μｌの脂質を含む１００μｌのＤＭＥＭと穏やかに混合する（この２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、２００ｎｇの８ｘＣＲＥ-Ｌｕｃ レポータープラスミド、内因性または非内因性受容体を含む５０ｎｇのｐＣＭＶまたはｐＣＭＶのみ、ならびに１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３のＧＰＲＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。８ＸＣＲＥ-Ｌｕｃレポータープラスミドは以下のように調製する。ｐβｇａｌ-ベーシック ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内のＢｇ１Ｖ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、ラットソマトスタチンプロモーター（--７１／+５１）をクローン化することによってベクターＳＲＩＦ-β-ｇａｌを得た。ｃＡＭＰ応答エレメントの８コピーが、アデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８由来のＰＣＲから得られ（７Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１８８３ （７ ヒト遺伝子療法  １８８３ （１９９６）を参照） 、ＳＲＩＦ  β−ｇａｌベクターのＫｐｎ-Ｂｇ１Ｖ 部位にクローン化され、その結果として８ｘＣＲＥ−β-ｇａｌレポーターベクターが生成された。８ｘＣＲＥ-Ｌｕｃレポータープラスミドは、 ８ｘＣＲＥ-β-ｇａｌレポーターベクターのベータガラクトシダーゼ遺伝子を、ｐＧＬ３-ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ社））から得たルシフェラーゼ遺伝子と、ＨｉｎｄＩＩＩ-ＢａｍＨＩ 部位で置換することによって生成された。３０分、室温でインキュベート後、ＤＮＡ／脂質混合物を４００μｌのＤＭＥＭで希釈して、希釈混合物  １００μｌを各ウェルに加えた。細胞培養インキュベーター内で４時間インキュベートした後、１０％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ  １００μｌを各ウェルに加えた。翌日、トランスフェクトされた細胞は１０％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ  ２００μｌ／ウェルで交換された。８時間後、ＰＥＢＳで一回洗浄後、ウェルはウェルあたり１００μｌのフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに交換した。ルシフェラーゼ活性は、ＬｕｃＬｉｔｅ（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を製造元の指示に従って用いて、翌日測定し、１４５０マイクロベータ（商標）シンチレーションとルミネッセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ））で読み取った。
【０１３７】
図２を参照する。図２は、ＳＴＲＬ３３受容体１２．５ｎｇでコントロール（ＣＭＶ）と比較すると、ＳＴＲＬ３３の活性が約５０％減少することを明示する。ＳＴＲＬ３３の内因性型をその非内因性型と比較すると、非内因性ＳＴＲＬ３３（“ＳＴＲＬ３３（Ｌ２３０Ｋ）”）は、１２．５ｎｇのタンパク質で比較する場合は受容体活性の約３０％の低下、そして２５ｎｇのタンパク質では約４０％の活性低下を示す。このデータは、ＳＴＲＬ３３受容体の非内因性型は構成的活性であり、Ｇタンパク質であるＧiと共役し得ることを示唆する。
【０１３８】
ｂ．ＡＰ１受容体アッセイ（Ｇq関連受容体）
Ｇq促進の検出方法は、そのプロモーターにＡＰ１エレメントを含む遺伝子の活性化を起因するＧq依存性ホスホリパーゼＣの既知特性に基づく。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＡＰ-１シス−レポーティングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ＃ ２１９０７３）は、リン酸カルシウム沈降物の成分が４１０ｎｇ  ｐＡＰ１-Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ-受容体発現プラスミド、および２０ｎｇ  ＣＭＶ-ＳＥＡＰである以外は、ＣＲＥＢレポーターアッセイを基準にして上記に説明したプロトコルに従って使用された。
【０１３９】
図１７を参照する。図１７は、内因性ＥＴＢＲ-ＬＰ２（８６２相対光単位）と比べて、ヒトＥＴＢＲ-ＬＰ２（“Ｎ３５８Ｋ”）の非内因性・構成的活性型（２２０３相対光単位）は６１．１％の活性増加を示す。このデータは、ＥＴＢＲ-ＬＰ２ 受容体の非内因性型は構成的活性であり、Ｇタンパク質であるＧiと共役し得ることを示唆する。
【０１４０】
ｃ．ＳＲＦ−Ｌｕｃ受容体アッセイ（Ｇq関連受容体）
Ｇq促進を検出する一つの方法は、そのプロモーターに血清応答因子を含む遺伝子の活性化を起因するＧq依存性ホスホリパーゼＣの既知特性に基づく。Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ（商標）ＳＲＦ-Ｌｕｃレポーティングシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使って、例えばＣＯＳ７細胞におけるＧq共役活性をアッセイすることができる。細胞を、本システムのプラスミド成分と内因性または非内因性ＧＰＣＲをコードする指定の発現プラスミドで、哺乳類トランスフェクション（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 カタログ＃２００２８５）を製造元の指示に従って用いてトランスフェクトした。簡単に言えば、４１０ｎｇのＳＲＦ-Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ受容体発現プラスミド、および２０ｎｇのＣＭＶ-ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド、アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効率の変動を制御するために、トランスフェクトされた細胞の培地中で測定される）を、製造元の指示に従って、リン酸カルシウム沈降物中で混合する。この沈降物の半分は、９６ウェルプレート中の３つのウェルに均等に分配され、無血清培地中の細胞の上で２４時間保持される。最後の５時間は、指示に従って、細胞に１μＭ  アンジオテンシンを加えてインキュベートする。細胞を次に溶解して、Ｌｕｃｌｉｔｅ（商標）キット（Ｐａｃｋａｒｄ、カタログ＃６０１６９１１）および“Ｔｒｉｌｕｘ １４５０ マイクロベータ”液体シンチレーションならびにルミネッセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を製造元の指示に従って用いて、ルシフェラーゼ活性をアッセイする。データはグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）（商標）２．０ａ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．（グラスパッドソフトウェア社））を用いて分析することができる。
【０１４１】
ｄ．ＳＲＥレポーターアッセイ
ＳＲＥ-Ｌｕｃレポーター（マーキュリー・ルシフェラーゼシステム３の構成成分、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  カタログ番号Ｋ２０５３-１）を２９３細胞で使用した。細胞を、本システムのプラスミド成分および内因性または非内因性受容体をコードする指定の発現プラスミドで、リポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ＃１８３２４０１２）を製造元の指示に従って用いてトランスフェクトした。簡単に言えば、４２０ｎｇのＳＲＦ-Ｌｕｃ、５０ｎｇのＣＭＶ（ＧＰＲ３７受容体を含む）、および３０ｎｇのＣＭＶ-ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド、アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効率の変動を制御するために、トランスフェクトされた細胞の培地中で測定される）を、製造元の指示に従って、陽イオン性脂質−ＤＮＡ沈降物中で混合する。最終容量は、オプチメム（Ｏｐｔｉｍｅｍ）（Ｖｅｎｄｏｒ（ベンダー社））で２５μｌにした。これは「鋳型ミックス」として言及される。鋳型ミックスは、ポリスチレン試験管中でリポフェクタミンと混合して、３０分インキュベートした。インキュベーション中、細胞を１００μｌのオプチメムで洗浄した。インキュベーション後、２００μｌのオプチメムを加えて混合して、４０μｌ〜５０μｌ／ウェルにした。細胞を一晩混合放置した。翌朝培地を新鮮培地に交換して、各ウェル当たり１３０μｌのフェノールレッドを含まない、１％ＦＢＮＳ補充ＤＭＥＭにした。細胞を次に、Ｌｕｃｌｉｔｅ（商標）キット（Ｐａｃｋａｒｄ、カタログ＃６０１６９１１）および“Ｔｒｉｌｕｘ１４５０マイクロベータ”液体シンチレーションならびにルミネッセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を製造元の指示に従って用いて、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。データはグラフパッドプリズム（商標）２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて分析した。
【０１４２】
図７を参照する。図７では、ＧＰＲ３７（“Ｃ５４３Ｙ”）の非内因性型を内因性型（“ｗｔ”）と比較すると、Ｃ５４３Ｙ変異は、野生（ｗｔ）型よりも約３１．６％のｃＡＭＰの産生増加をし、非内因性型である“Ｌ３５２Ｒ”は、野生（ｗｔ）型よりも約１７８％のｃＡＭＰの産生増加を示す。 このデータは、ＧＰＲ３７の非内因性型である、Ｃ５４３ＹとＬ３５２Ｒのどちらも構成的活性化されていることを示唆する。
【０１４３】
ｅ．Ｅ２Ｆ-Ｌｕｃレポーターアッセイ
ｐＥ２Ｆ-Ｌｕｃ レポーター（マーキュリールシフェラーゼシステム３の構成成分、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  カタログ＃Ｋ２０５３-１）を２９３細胞で使用した。細胞を、本システムのプラスミド成分および内因性または非内因性受容体をコードする指定の発現プラスミドで、リポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ＃１８３２４０１２）を製造元の指示に従って用いてトランスフェクトした。簡単に言えば、４００ｎｇのｐＥ２Ｆ-Ｌｕｃ、８０ｎｇのＣＭＶ（ＧＰＲ３５受容体を含む）、および２０ｎｇのＣＭＶ-ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド、アルカリホスファターゼ活性は、サンプル間のトランスフェクション効率の変動を制御するために、トランスフェクトされた細胞の培地中で測定される）を、製造元の指示に従って、陽イオン性脂質−ＤＮＡ沈降物中で混合した。この沈降物の半分は、９６ウェルプレート中の３つのウェルに均等に分配して、細胞上で一晩保持して、翌日新鮮培地と交換した。トランスフェクション開始４８時間後、細胞を処理して、Ｌｕｃｌｉｔｅ（商標）キット（Ｐａｃｋａｒｄ、カタログ＃６０１６９１１）および“Ｔｒｉｌｕｘ １４５０ マイクロベータ”液体シンチレーションならびにルミネッセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を製造元の指示に従って用いて、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。データはグラフパッドプリズム（商標）２．０ａ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）（商標）を用いて分析した。
【０１４４】
図１４を参照する。図１４は、内因性ＧＰＲ３５（２４．９７相対光単位）と比べて、ヒトＧＰＲ３５（Ａ２１６Ｋ）の非内因性・構成的活性化型（６０７．１３相対光単位）は活性を約１００％増加することを示す。このデータは、ＧＰＲ３５（Ａ２１６Ｋ）が転写因子Ｅ２Ｆと相互作用して、ルシフェラーゼタンパク質の発現を誘導することを示唆する。Ｅ２Ｆとのそのような相互作用は、ＧＰＲ３５が結腸直腸ガン細胞において発現されることの実証と合わせて、さらにＧＰＲ３５がガン細胞増殖に役割を果たし得ることを示唆する。したがって、これらのデータに基づいて、ＧＰＲ３５受容体を影響する好ましい候補化合物は逆アゴニストである。このデータは、ＧＰＲ３５の逆アゴニストはガン性状態、特に結腸直腸ガンの治療に有用であることを示唆する。
【０１４５】
ｆ．細胞内ＩＰ3蓄積アッセイ（Ｇq関連受容体）
１日目は、受容体（内因性および／または非内因性）を含む細胞を２４ウェルプレート
上に、通常１ｘ１０5細胞／ウェル（この数値は最適化され得るが）となるように接種する。２日目には、細胞は、まず０．２５ｕｇ  ＤＮＡを含む５０μｌの無血清ＤＭＥＭ／ウェルを２μｌ  リポフェクタミンを含む５０μｌの無血清ＤＭＥＭ／ウェルと混合することによってトランスフェクトされた。この溶液を穏やかに混合して、室温で１５〜３０分インキュベートした。細胞を次に０．５ｍｌのＰＢＳと４００μｌの無血清培地で洗浄してから、トランスフェクション培地と混合して、細胞に加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ2で３〜４時間インキュベートしてから、トランスフェクション培地を除去して、１ｍｌ／ウェルの普通成長培地で置換した。３日目には、細胞を3Ｈ−ミオイノシトールで標識する。簡単に言えば、培地を除去してから細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。次に、各ウェルに０．５ｍｌのイノシトールを含まない無血清培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）と０．２５μＣｉの3Ｈ-ミオイノシトールを加えて、細胞を３７℃／５％ＣＯ2で１６〜１８時間一晩インキュベートした。４日目には、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、イノシトールを含まない無血清培地、１０μＭ  パージリン、１０ｍＭ  塩化リチウムを含む０．４５ｍｌのアッセイ培地あるいは０．４ｍｌのアッセイ培地を加えた。細胞を次に３７℃で３０分インキュベートした。細胞を次に０．５ｍｌＰＢＳで洗浄して、２００μｌの新鮮／氷冷停止溶液（１Ｍ  ＫＯＨ、１８ｍＭ  硼酸ナトリウム、  ３．８ｍＭ  ＥＤＴＡ）を各ウェルに加えた。この溶液を氷の上に５〜１０分（あるいは細胞が溶解するまで）保持して、次に２００μＬの新鮮／氷冷中和溶液（７．５％  ＨＣＬ）で中和した。この溶解産物を次に１．５ｍｌ  エッペンドルフ試験管内に移して、試験管あたり１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）を加えた。溶液を１５秒渦を巻くように振とうしてから、上相をＢｉｏｒａｄＡＧ１-Ｘ８（商標）陰イオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）にかけた。まず、樹脂を１：１．２５重量／容積の水で洗浄して、０．９ｍｌの上相をカラムに充填した。カラムを次に１０ｍｌの５ｍＭミオイノシトールと１０ｍｌの５ｍＭ硼酸ナトリウム／６０ｍＭギ酸ナトリウムで洗浄した。イノシトールトリスリン酸塩を２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを有するシンチレーションカクテル１０ｍｌを含むシンチレーションバイアル中に溶出した。カラムを１０ｍｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムで洗浄することにより再生して、ｄｄＨ2Ｏで二度濯いでから、４℃で水中保存した。
【０１４６】
図６を参照する。図６では、２９３細胞は、６つのアミノ酸欠失を含むＧｑタンパク質、“Ｇq（ｄｅｌ）”、Ｇiタンパク質と融合したＧqタンパク質、“Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇi”、Ｇq（ｄｅｌ）を加えた非内因性ｍＧｌｕＲ７であるＴ７７１、“Ｔ７７１ Ｃ+Ｇq（ｄｅｌ）”、ならびに“Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇi”を加えたＴ７７１Ｃ、“Ｔ７７１ Ｃ+Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇi”でトランスフェクトされた。グルタミン酸の存在する場合としない場合についてイノシトール三リン酸を測定した。ｍＧｌｕＲ７の非内因性型とＧq（ｄｅｌ）／Ｇi の同時トランスフェクションは、グルタミン酸が存在する場合において、Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇiと比較すると、約１８５０倍増加し、グルタミン酸が存在する場合Ｔ７７１Ｃ+Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇiと比較して約８６０倍増加を示した。これらのデータは、Ｇi共役型受容体であるｍＧｌｕＲ７がＧqタンパク質によって活性化され得ることを実証する。したがって、Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇi融合構築物は、ＧＰＣＲと同時トランスフェクトして、候補化合物をスクリーンするツールとして使用し得る。
【０１４７】
図１１を参照する。図１１では、ＨＦ１９４８の非内因性型（“Ｉ２８１Ｆ”）を内因性型（“ｗｔ”）と比較すると、Ｉ２８１Ｆ変異は、ｗｔ型よりもＩＰ3蓄積を約３６１％増加することを示す。このデータは、ＨＦ１９４８の非内因性Ｉ２８１Ｆ型が構成的活性化型ならびにＧq共役型であることを示唆する。
［実施例５］  融合タンパク質の調製
ａ．ＧＰＣＲ：Ｇs融合構築物
構成的活性化ＧＰＣＲ-Ｇタンパク質融合構築物のデザインは、以下のように達成され得る。ラットＧタンパク質Ｇsα（長型、Ｉｔｏｈ, Ｈら８３ＰＮＡＳ３７７６（１９８６））の５’および３’両末端を、その上にＨｉｎｄＩＩＩ（５'-ＡＡＧＣＴＴ-３'）配列を含むように操作する。正しい配列（隣接ＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む）の確認後、そのベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてサブクローニングすることによって全配列をｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号 Ｖ７９５-２０）中にシャトルする。ｐｃＤＮＡ３．１（−）中にサブクローニング後、Ｇsα配列の正しい方向性が決定される。ＨｉｎｄＩＩＩ配列にラットＧsα遺伝子を含む修飾ｐｃＤＮＡ３．１（−）を次に検証してから、このベクターをその後「ユニバーサル」Ｇsαタンパク質ベクターとして利用することができる。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に種々の既知制限部位を含み、したがって、Ｇsタンパク質の上流に内因性・構成的活性ＧＰＣＲのコード配列を挿入する能力を好都合にも提供する。これと同様な方法を使って、その他の「ユニバーサル」Ｇタンパク質ベクターを作出することができ、勿論、当業者に公知であるその他の市販または特許化されたベクターを使用することもできる。ある実施形態では、重要な判定基準は、ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質の配列の上流ならびに翻訳領域内にあることである。
【０１４８】
Ｇタンパク質とＧＰＣＲの間の制限部位にオプションとしてスペーサーがあってもよい。センスならびにアンチセンスプライマーはＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶの制限部位をそれぞれ含み、したがって（制限部位に起因する）スペーサーがＧタンパク質とＧＰＣＲの間に存在する。
【０１４９】
次に上記に開示されたＧsαユニバーサルベクター内で融合のためのそれぞれの受容体配列を確保するためにＰＣＲが使用され、それぞれについて以下のプロトコルが使用される。１００ｎｇ  ＧＰＣＲ用のｃＤＮＡを、２μｌの各プライマー（センスとアンチセンス）、３μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌ  の１０ＸＴａｑＰｌｕｓ（商標）プレシジョンポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ   #６００２１１）、ならびに８０μｌの水を含む別々の試験管に加える。ＧＰＣＲ用の反応温度およびサイクル時間は、９４℃（１分）、９４℃（３０秒）、６２℃（２０秒）、７２℃（１分４０秒）そして７２℃（５分）であって、ステップ２〜４を３５回繰り返した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルを通過させてから精製する。精製産物にＸｂａｌＩとＥｃｏＲＶを加えて消化して、所望のインサートを精製して、それぞれの制限部位でＧsユニバーサルベクター中に結合する。形質転換後に陽性クローンを単離して、制限酵素消化によって判定し、以下に記述するプロトコルに従って、２９３細胞を用いる発現が達成される。ＧＰＣＲ−Ｇs融合タンパク質の各陽性クローンは、その正確さを検証するために配列決定されよう。
【０１５０】
ｂ．Ｇq（６アミノ酸欠失）／Ｇi融合構築物
Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇi融合構築物のデザインは以下のように達成された。ＴＬＥＳＩＭ（配列番号８８）を有するＧαｑサブユニットのＮ末端６アミノ酸（アミノ酸２〜７）が欠失され、また配列ＥＹＮＬＶ（配列番号８９）を有するＣ末端５アミノ酸がＤＣＧＬＦ（配列番号９０）を有するＧαｉタンパク質の対応するアミノ酸で置換された。この融合構築物は、以下のプライマー、５’-ｇａｔｃＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧ-３’（配列番号９１）および ５’-ｇａｔｃＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ-３’（配列番号９２）、 ならびに赤血球凝集素タグを有するマウスＧαｑ野生型を含むプラスミド６３３１３を鋳型として用いるＰＣＲによって得られた。小文字のヌクレオチドはスペーサーとして含まれる。
【０１５１】
ＴａｇＰｌｕｓ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が以下のサイクル、９５℃（２分）、９５℃（２０秒）、５６℃（２０秒）、７２℃（２分）、そして７２℃（７分）、で増幅に使用され、ステップ２〜４は３５回繰り返した。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ-ＴＯＰＯ ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化され、ＡＢＩ ビッグダイターミネーター キット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐ．Ｅ．バイオシステムズ社））を用いて配列決定を行う。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローン由来のインサートは、２ステップクローニング法によって発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（+） のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ 部位にシャトルされる。
【０１５２】
ｃ．Ｇs／Ｇi融合タンパク質構築物
Ｇs／Ｇi融合構築物のデザインは以下のように達成された。配列５’-ＱＹＥＬＬ-３’ （配列番号９３） を有するＧαｓサブユニットのＣ末端５アミノ酸が欠失され、配列５’-ＤＣＧＬＦ-３’（配列番号９４）を有するＧαｉタンパク質の対応するアミノ酸で置換された。このタンパク質融合構築物は、５’および３’オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって得られた。
【０１５３】
ＴａｇＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が以下のサイクル、９８℃（２分）、９８℃（３０秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（２分）、そして７２℃（５分）で増幅に使用され、ステップ２〜４は２５回繰り返された。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ-ＴＯＰＯ ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化され、ＡＢＩ ビッグダイターミネーター キット（Ｐ．Ｅ． Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定が行われた。タンパク質融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローン由来のインサートは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（+） の制限部位中にシャトルされた。Ｇs／Ｇiタンパク質融合構築物の核酸配列を次に決定した。核酸配列については配列番号９５、そしてアミノ酸配列については配列番号９６を参照。
［実施例６］  シュワン細胞の調製
２Ｌの新生ラット仔（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）（出生時、出生後２日目、３日目）を氷の上に置いて安楽死させた。仔を取り出して、断頭して血液をドレインした。新生仔を解剖台に腹下位置に置いて、７０％エタノールでリンスして滅菌した。メスを使用して、大腿領域の皮膚を坐骨神経が露出するまで（あるいは脊髄から膝に伸びる細く白色の「ヒモ」が見えるまで）除去した。神経をＤＭＥＭ培地に入れて、次に吸引してから、ＤＭＥＭ培地で容量を２．４ｍｌにして、解離させるために３００ｕＬの１０Ｘコラゲナーゼ（０．３％  Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｃ-９８９１）と３００ｕＬの１０Ｘトリプシン（０．２５％、ＧＩＢＣＯ  カタログ＃２５０９５-０１９）を加えた。神経を次に３７℃で１５分インキュベートして、１,０００ｒｐｍで５分遠心分離してから、培地を除去した（二回反復）。１ｍＬのＤＭＥＭ-ＨＥＰＥと１ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを加えてから、５０ｍＬの円錐管に移した。試験管の内容物を次のゲージ針（ＶＷＲ）、１８Ｇで１回、２１Ｇで２回、そして２３Ｇで２回、剪断した。内容物をファルコン細胞ストレーナに入れて、超低速（約１２００ｒｐｍ）で遠心した。ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを加えて全量を１０ｍＬにして、ポリーＬ―リジン処理１０ｃｍプレート（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｐ-１２７４）上に接種した。プレートを次に７％ＣＯ2、３７℃の加湿インキュベーター内で一晩インキュベートした。新鮮培地を１００Ｘ  ＡＲＡ  Ｃ（１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｃ-１７６８）と共に加えて、さらに４８時間培養した。細胞を次にＰＢＳで（３回）洗浄して、ＡＲＡ  Ｃを除去してから、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、色々な濃度のフォルスコリン１００％エタノール溶液（２ｕＭ、５ｕＭ、１０ｕＭ、２０ｕＭ、および５０ｕＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ＃３４４２７０）、８０ｕｇの下垂体抽出物含有ＰＢＳ溶液（Ｓｉｇｍａ、#Ｐ-１１６７）および０．１％  ＢＳＡを加え、次に細胞を７％ＣＯ2、３７℃加湿器中で３０時間成長させた。細胞を回収してからＲＮＡを単離して分析した。
【０１５４】
抗体選択は以下のように達成された。ポリ−Ｌ−リジン処理プレートをまず１Ｘ  ＰＢＳで洗浄（３回）し、１ｍＬの０．５％  トリプシンＥＤＴＡを加えて約１分トリプシン処理してから、９ｍＬのＤＭＥＭ-ＨＥＰＥＳバッファーおよび１０％  ＦＢＳで中和した。細胞を１２００ｒｐｍで５分遠心分離し、トリプシンを洗出するために３ｍＬのＤＭＥＭ-ＨＥＰＥＳ中に再懸濁して、さらに１２００ｒｐｍで５分遠心した。細胞を次に６００ｕＬのＤＭＥＭ-ＨＥＰＥＳに再懸濁して、単一細胞を得るために遠心後いくらかの培地を残した。Ｔｈｙ１．１抗体（単クローン性抗体、Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｐ-１２７４）を１：１０００希釈で加えた。
【０１５５】
細胞を次に、２分ごとに試験管を僅かに撹拌しながら、３７℃で２０分インキュベートした。２０ｕＬのモルモット補体（ＧＩＢＣＯ、カタログ＃１９１９５-０１５）を使用前に解凍してから、抗体を加えた細胞の最終容量が１ｍＬになるように補体を加えた。細胞を３７℃の水浴中で２０〜３０分インキュベートして、１０ｍＬのＤＭＥＭ-ＨＥＰＥＳを加えてから１２００ｒｐｍで３分遠心沈降した。細胞を５ｍＬのＤＥＭＥ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁して、下垂体抽出物とフォルスコリンを含むポリ−Ｌ―リジン処理プレートに加えた。細胞は２４〜４８時間後に回収されるまで放置され、免疫選択法を二度反復した。
［実施例７］  ラット圧挫坐骨神経の調製
麻酔（イソフロレン）された成体（１０〜１３週齢）Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラットの坐骨神経を坐骨切痕で露出させた。神経圧挫は、坐骨神経を坐骨切痕できつく押しつけて、鉗子で２回、各１０秒、平坦にすることによって作出された。この技法は、軸索の変性を起こすが軸索の再生は可能である。神経損傷後様々な時間に、動物をＣＯ2吸入によって安楽死させ、遠位神経断端を除去して、最も近位部２〜３ｍｍを切り落とした。圧挫神経については、全遠位神経を収集した。神経は液体窒素中で直ちに冷凍して、-８０℃で保存した。損傷を受けていない坐骨神経を、Ｐ０（圧挫後）〜Ｐ１３までの異なる年齢の動物から得た。
［実施例８］  開示のヒトＧＰＣＲの組織分布
１．ＲＴ-ＰＣＲ
ＲＴ-ＰＣＲは、いくつかの新ヒトＧＰＣＲの発現を確認し、そしてその組織分布を決定するために適用され得る。使用されるオリゴヌクレオチドはＧＰＣＲ特異型であり、複数のヒト組織ｃＤＮＡパネル（ＭＴＣ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が使用される。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）は、製造元の指示に従って、４０ｕｌ反応での増幅に使用される。２０μｌの反応を１．５％アガロースゲルに負荷して、ＲＴ-ＰＣＲ産物を分析する。
【０１５６】
２．ドットブロット
市販のヒト組織ドットブロットフォーマットを用いて、内因性ＧＰＣＲは、そのような受容体が局在する領域決定用のプローブに使用された。実施例１のＰＣＲフラグメントをプローブに使用して、このフラグメントとＰｒｉｍｅ-Ｉｔ ＩＩ（商標）ランダムプライマー標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 #３００３８５）を製造元の指示に従って用いて放射線標識プローブを生成した。ヒトＲＮＡマスターブロット（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、 #７７７０-１）をＧＰＣＲ放射性標識プローブとハイブリダイズさせ、ストリンジェント条件下で、製造元の指示に従って洗浄した。ブロットは、-８０℃で一晩Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ オートラジオグラフィに暴露した。以下の表７は、発現が観察される受容体と組織を一覧する。受容体に関連する代表的疾患／障害は、以下実施例６に考察する。
【０１５７】
【表７】
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３．ノーザンブロット
ａ．ＧＰＲ３７
実施例６からのＲＮＡは、ＲＮＡｚｏｌ Ｂ試薬（ＴｅｌＴｅｓｔ Ｉｎｃ．（テルテスト社）、カタログ＃ＣＳ-１０４）を製造元の指示に従って用いて収集した。 １％アガロース／ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動後、１０Ｘ  ＳＳＣを用いる毛細管作用によって、ＲＮＡをナイロン膜（Ｓａｃｈｌｅｉｃｈｅｒ   Ｓｃｈｕｌｌ）に移動した。ＧＰＲ３７の３’末端に正確に対応するＤＮＡフラグメントとハイプライム標識キット（Ｒｏｃｈｅ   Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ロッシュモレキュラーバイオケミカル社））を製造元の指示に従って用いて、32Ｐ標識ＧＰＲ３７  ＤＮＡプローブを合成した。ハイブリダイゼーションは、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを補充したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、 カタログ＃８０１５-２）を用いて以下のように実施した。単離されたＲＮＡサンプルを含む膜にＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を加えて、６５℃でまず一晩インキュベートした。32Ｐ標識ＧＰＲ３７  ＤＮＡプローブを、約２分煮沸して変性し、５分氷上に置いた後、膜を浸しているＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中に移した。６５℃で一晩インキュベートした後、膜をハイブリダイゼーション溶液から取り出して、６５℃で２Ｘ  ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で各１５分ずつ４回洗浄し、その後で５５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で各１５分ずつ２回洗浄した。ゆるやかに振ってブロットから過剰水分を除去した後、ブロットをプラスチックラップで包み、―８０℃で一晩フィルムに暴露した。
【０１５８】
図９を参照する。図９は、ＧＰＲ３７がシュワン細胞で発現され、したがって、髄鞘形成が２０ｕＭフォルスコリンで維持され得ることを示す。
【０１５９】
図１０は、ＧＰＲ３７が、特に神経を圧挫７日後のラット圧挫坐骨神経でアップレギュレートされることを示す。そのようなデータは、ＧＰＲ３７がシュワン細胞における髄鞘形成のプロセスを促進することによって神経の再生に役割を果たし得るという図９に示すデータと一貫する。
【０１６０】
ＧＰＲ３７は、ヒト中枢神経系、特に脳組織で発現される。ＧＰＲ３７がシュワン細胞で発現することがさらに明らかにされている。軸索（または神経）が損傷されると、シュワン細胞は、軸索周りにミエリン鞘を形成して、ミエリン鞘の形状の「絶縁体」を供給することによって神経を再生するために作用する。髄鞘形成として知られるこのプロセスは、活動電位がより速い速度で進行し、それによって代謝エネルギーを節約するために重要である。シュワン細胞とその前駆体は、末梢神経を構成するその他の細胞の生存と分化の影響に重要な役割を果たす。さらに、ＧＰＲ３７は、ラット圧挫坐骨神経で発現されることが明らかにされている。そのようなデータは、ＧＰＲ３７が神経細胞の再生に役割を果たし得ることを示す。受容体が局在する特定の組織の既知の機能に基づき、受容体の推定上の機能的役割を引き出すことができる。したがって、髄鞘形成過剰（例えば、腫瘍発生）ではＧＰＲ３７に対する逆アゴニストが好ましく、髄鞘形成不全起こる場合（例えば、糖尿病のような変性疾患）ではアゴニストが好ましい。
【０１６１】
ｂ．ＧＰＲ６６
いくつかの膵臓細胞株（例えば、ＨＩＴ、ＡＲＩＰ、Ｔｕ６、ＲＩＮαＴＣ、ＳＴＣ、ＮＩＴおよび ＥｃＲ-ＣＨＯ、これらのいずれも市販されており入手可能）由来の全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ＃１５５９６-０１８）を製造元の指示に従って使用して単離した。１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動後、標準プロトコルを用いて、ＲＮＡをナイロン膜に移動した。全コード配列に正確に対応するＤＮＡフラグメントとＰｒｉｍｅ Ｉｔ ＩＩ ランダムプライマーラベリングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ＃３００３８５）を製造元の指示に従って使用して、32Ｐ標識ＧＰＲ６６プローブを合成した。ハイブリダイゼーションは、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを補充したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、 カタログ＃８０１５-２）を用いて以下のように実施した。単離されたＲＮＡサンプルを含む膜にまずＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を加えて、６５℃で１時間インキュベートした。32Ｐ標識ＧＰＲ６６  ＤＮＡプローブを、約２分煮沸して変性し、５分氷上に置いた後、膜を浸しているＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中に移した。６５℃で一晩インキュベートした後、膜をハイブリダイゼーションから取り出して、６５℃で２Ｘ  ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で各１５分ずつ４回洗浄し、その後で５５℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で各１５分ずつ２回洗浄した。ゆるやかに振ってブロットから過剰水分を除去した後、ブロットをプラスチックラップで包み、―８０℃で一晩フィルムに暴露した。
【０１６２】
図１３を参照する。膵臓におけるＧＰＲ６６の発現を実証する、ドットブロットデータと合わせたＲＮＡブロットの結果（図１３）は、全ての膵島細胞株および膵管細胞株であるＡＲＩＰ細胞において豊富に発現されていることを示唆する。いずれの理論にも束縛される意図はないが、膵臓細胞株におけるＧＰＲ６６の発現は、ＧＰＲが膵島新生に役割を果たし得ることを示唆する。
【０１６３】
ｃ．ＧＰＲ３５
いくつかのガン細胞株（例えば、ＲＩＮ-ＳＡＨ、 ＨＥＰ-Ｇ２、 Ａ５４９、ＨＥＬＡ、ＭＯＬＴ-４、 ＨＬ-６０ およびＳＷ４８０細胞、これらのいずれも市販されており入手可能）由来の全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ＃１５５９６-０１８）を製造元の指示に従って使用して単離した。１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動後、標準プロトコルを用いて、ＲＮＡをナイロン膜に移動した。全コード配列に正確に対応するＤＮＡフラグメントとＰｒｉｍｅ Ｉｔ ＩＩ ランダムプライマーラベリングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ＃３００３８５）を製造元の指示に従って使用して、32Ｐ標識ＧＰＲ３５プローブを合成した。ハイブリダイゼーションは、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを補充したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、 カタログ＃８０１５-２）を用いて以下のように実施した。単離されたＲＮＡサンプルを含む膜にまずＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を加えて、６５℃で１時間インキュベートした。32Ｐ標識ＧＰＲ３５  ＤＮＡプローブを、約２分煮沸して変性し、５分氷上に置いた後、膜を浸しているＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中に移した。６５℃で一晩インキュベートした後、膜をハイブリダイゼーションから取り出して、６５℃で２Ｘ  ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で各１５分ずつ４回洗浄し、その後で５５℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で各１５分ずつ２回洗浄した。ゆるやかに振ってブロットから過剰水分を除去した後、ブロットをプラスチックラップで包み、−８０℃で一晩フィルムに暴露した。
【０１６４】
図１５を参照する。ＲＮＡブロット（図１５を参照）の結果は、ＧＰＲ３５が結腸直腸ガン細胞株ＳＷ４８０において豊富に発現されていることを示す。そのようなデータは、ＧＰＲ３５が、結腸直腸の発ガン現象に役割を果たし得ることを示唆する。以下に論述する方法による、候補化合物の同定は、逆アゴニストであることが最も好ましい。ＧＰＲ３５の逆アゴニストは、ガン性細胞の細胞増殖を阻害するためにＤＮＡ複製を減少させることを意図する。ＧＰＲ３５は、大腸および小腸で発現される。ＧＰＲ３５が結腸直腸ガン細胞株（例えば、ＨＥＬＡ、ＭＯＬＴ-４、およびＳＷ４８０）で明らかに発現されている多数のガン細胞株が調査されている。そのようなデータは、ＧＰＲ３５が、結腸直腸の発ガン現象に役割を果たし得ることを示唆する。結腸直腸ガンは、結腸または直腸のいずれかから生じる悪性である。大腸ガンは、男性および女性に発見されるガンのうち二番目によく見られる形態である。
【０１６５】
ｄ．ＥＴＢＲ-ＬＰ２
実施例６からのＲＮＡをＲＮＡｚｏｌ Ｂ試薬（ＴｅｌＴｅｓｔＩｎｃ．、カタログ＃ＣＳ-１０４）を製造元の指示に従って使用して収集した。 １％アガロース／ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動後、１０Ｘ  ＳＳＣを用いる毛細管作用によって、ＲＮＡをナイロン膜（Ｓａｃｈｌｅｉｃｈｅｒ Ｓｃｈｕｌｌ）に移動した。ＥＴＢＲ-ＬＰ２ の３’末端に正確に対応するＤＮＡフラグメントとハイプライム標識キット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を製造元の指示に従って使用して、32Ｐ標識ＥＴＢＲ-ＬＰ２   ＤＮＡプローブを合成した。ハイブリダイゼーションは、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを補充したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、 カタログ番号８０１５-２）を用いて以下のように実施した。単離されたＲＮＡサンプルを含む膜にＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を加えて、６５℃で一晩インキュベートした。32Ｐ標識ＥＴＢＲ-ＬＰ２ ＤＮＡプローブを、約２分煮沸して変性し、５分氷上に置いた後、膜を浸しているＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中に移した。６５℃で一晩インキュベートした後、膜をハイブリダイゼーション溶液から取り出して、６５℃で２Ｘ  ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で各１５分ずつ４回洗浄し、その後で５５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で各１５分ずつ２回洗浄した。ゆるやかに振ってブロットから過剰水分を除去した後、ブロットをプラスチックラップで包み、−８０℃で一晩フィルムに暴露した。
【０１６６】
図１８を参照する。図１８は、ＥＴＢＲ-ＬＰ２ がシュワン細胞で発現され、したがって、髄鞘形成が２０ｕＭフォルスコリンで維持され得ることを示す。
【０１６７】
図１９は、ＥＴＢＲ-ＬＰ２ が、特に神経を圧挫７日後のラット圧挫坐骨神経でアップレギュレートされることを示す。そのようなデータは、ＥＴＢＲ-ＬＰ２ がシュワン細胞における髄鞘形成のプロセスを促進することによって神経の再生に役割を果たし得るという図１８に示すデータと一貫している。
【０１６８】
これらのデータに基づいて、ＥＴＢＲ-ＬＰ２ はシュワン細胞で発現されている。軸索（または神経）が損傷されると、シュワン細胞は、軸索周りにミエリン鞘を形成して、ミエリン鞘の形状の「絶縁体」を供給することによって神経を再生するために作用する。髄鞘形成として知られるこのプロセスは、活動電位がより速い速度で進行し、それによって代謝エネルギーを節約するために重要である。シュワン細胞とその前駆体は、末梢神経を構成するその他の細胞の生存と分化の影響に重要な役割を果たす。さらに、ＥＴＢＲ-ＬＰ２ は、ラット圧挫坐骨神経で発現されることが明らかにされている。そのようなデータは、ＥＴＢＲ-ＬＰ２ が神経細胞の再生に役割を果たし得ることを示す。受容体が局在する特定の組織の既知の機能に基づき、受容体の推定上の機能的役割を引き出すことができる。したがって、髄鞘形成過剰（例えば、腫瘍発生）ではＥＴＢＲ-ＬＰ２ に対する逆アゴニストが好ましく、髄鞘形成不全が起こる場合（例えば、糖尿病のような変性疾患）はアゴニストが好ましい。
【０１６９】
これらの組織または領域に局在する受容体に関連する疾患および障害は、限定はされないが、心臓障害および心臓病（例えば、血栓症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、心筋症）、腎臓障害／腎臓病（例えば、腎不全、腎尿細管アシドーシス、腎性糖尿、腎性尿崩症、シスチン尿症、多発性嚢胞腎）、好酸球増加症、白血球増加症、白血球減少症、卵巣ガン、性機能障害、多嚢胞性卵巣症候群、膵炎および膵臓ガン、過敏性腸症候群、結腸ガン、クローン病、潰瘍性大腸炎、憩室炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、肺炎、肺性高血圧、結核および肺ガン、パーキンソン病、運動障害および運動失調症、学習および記憶障害、摂食障害（例えば、拒食症、過食症など）、肥満症、ガン、胸腺腫、重症筋無力症、循環障害、前立腺ガン、前立腺炎、腎臓病／障害（例えば、腎不全、腎尿細管アシドーシス、腎性糖尿、腎性尿崩症、シスチン尿症、多発性嚢胞腎）、感覚運動プロセシングおよび覚醒障害、強迫性障害、精巣ガン、持続勃起症、前立腺炎、ヘルニア、内分泌障害、性機能障害、アレルギー、鬱病、精神病、偏頭痛、胸焼け、精神分裂病、潰瘍、気管支痙攣、テンカン、前立腺肥大、不安症、鼻炎、アンギナおよび緑内障を含む。したがって、本発明の方法は、またこれらならびにその他の疾患および障害の診断および／または治療に有用であり得る。
［実施例７］  プロトコル：逆アゴニストとアゴニストの直接同定
Ａ．[35Ｓ]ＧＴＰγＳ アッセイ
内因性・構成的活性ＧＰＣＲは、例えば、逆アゴニストのような候補化合物の直接同定に使用されてきたが、完全には理解されていない理由のために、アッセイ内のばらつきが悪化することがある。ある実施形態では、上記に開示されるＧＰＣＲ融合タンパク質はまた、非内因性・構成的活性化ＧＰＣＲと共に利用される。そのようなタンパク質が使用されると、アッセイ内のばらつきは有意に安定化され、そのため有効な信号雑音比が得られる。これは、候補化合物の同定をさらに強固なものとする有利な結果を有する。したがって、ある実施形態では、直接同定には、ＧＰＣＲ融合タンパク質が使用されることが好ましく、これが使用される際は、以下のアッセイプロトコルが使用される。
【０１７０】
１．膜の調製
目的の構成的活性オーファンＧＰＣＲ融合タンパク質を含み、逆アゴニストまたはアゴニストとしての候補化合物の直接同定に使用される膜は、以下のようにして調製されることが好ましい。
【０１７１】
ａ．材料
「膜剥離バッファー」は、２０ｍＭ   ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ   ＥＤＴＡを含み, ｐＨ ７．４であり、 「膜洗浄バッファー」は、２０ ｍＭ   ＨＥＰＥＳおよび０．１ ｍＭ   ＥＤＴＡを含み、ｐＨ ７．４であり、「結合バッファー」は、２０ｍＭ   ＨＥＰＥＳ、１００ ｍＭ  ＮａＣｌおよび １０ ｍＭ   ＭｇＣ１2を含み、 ｐＨ ７．４である。
【０１７２】
ｂ．手順
全ての材料はこの手順を通じて氷上で保つ。まず、コンフルエント単層細胞から培地を吸引除去し、次に１０ｍｌの冷ＰＢＳでリンスをしてから、吸引除去を行う。その後、５ｍｌの膜剥離バッファーを剥離細胞に加えた後で、細胞抽出物を５０ｍｌの遠心管中に移す（４℃、２０,０００ｒｐｍで１７分遠心分離する）。その後、上清を吸引除去して、そのペレットを３０ｍｌの膜洗浄バッファー中に再懸濁してから、４℃、２０,０００ｒｐｍで１７分遠心分離する。上清を次に吸引除去して、ペレットを結合バッファーに再懸濁する。再懸濁されたペレットを次にブリンクマン・ポリトロン（商標）ホモジナイザーを用いてホモジナイズする（懸濁液中の物質がバーストするまで、１５〜２０秒）。これを本願では「膜タンパク質」と呼ぶ。
【０１７３】
２．ブラッドフォードタンパク質アッセイ
均質化後、膜のタンパク質濃度を、例えば、ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて決定する（タンパク質は、約１．５ｍｇ／ｍｌに希釈して、分割量にして、後の使用のために冷凍（-８０℃）し得る、冷凍する場合は、使用プロトコルは以下の如くである。アッセイを行う日に、冷凍膜タンパク質を室温で解凍し、渦を巻くように動かしてから、ポリトロンで約１２ｘ１,０００ｒｐｍで約５〜１０分ホモジナイズする。複数を調製する場合、次の調製物をホモジナイズする前にホモジナイザーを十分に洗浄することを特記する。
【０１７４】
ａ．材料
結合バッファー（上記に説明）、ブラッドフォード色素試薬、ブラッドフォード標準タンパク質を、製造元の指示に従って使用する（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号５００−-０００６）。
【０１７５】
ｂ．手順
一つは膜を含み、他方はコントロール「空」である二本の試験管を用意する。各試験管は８００μｌの結合バッファーを含む。その後、１０μｌのブラッドフォード標準タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）を各試験管に加え、１０μｌの膜タンパク質を１本の試験管（「空」ではない）に加える。その後、２００μｌのブラッドフォード色素試薬を各試験管に加えてから渦を巻くように動かす。５分後、試験管を再び渦を巻くように動かしてから、その中の物質をキュベットに移動する。キュベットを次に、ＣＥＣＩＬ  ３０４１分光光度計を用いて、波長５９５で読み取る。
【０１７６】
３．直接同定アッセイ
ａ．材料
ＧＤＰバッファーは、３７．５ｍｌの結合バッファーと２ｍｇのＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ-７１２７）から構成され、０．２μＭのＧＤＰを得るために結合バッファーで一連の希釈を行う（各ウェル中のＧＤＰの最終濃度は、０．１μＭ  ＧＤＰ）。候補化合物を含む各ウェルは、１００μｌのＧＤＰバッファー（最終濃度  ０．１μＭ）、５０μｌの膜タンパク質結合バッファー溶液、および５０μｌの５０μｌ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ  （０．６ｎＭ）結合バッファー溶液（１０ｍｌの結合バッファー当たり２．５μｌの[35Ｓ]ＧＴＰγＳ ）から成る最終容量２００μｌを含む。
【０１７７】
ｂ．手順
候補化合物は、９６ウェルフォーマット（これらは-８０℃で冷凍し得る）を用いてスクリーンすることが好ましい。膜タンパク質（または、コントロールとしてＧＰＣＲ融合タンパク質を含まない発現ベクターを有する膜、）を懸濁液となるまで手短にホモジナイズする。例えば、前述のブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて、タンパク質濃度を決定する。膜タンパク質（およびコントロール）を次に結合バッファーで０．２５ｍｇ／ｍｌまで希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、１００μｌのＧＤＰバッファーを、Ｗａｌｌａｃ  シンチストリップ（商標）（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに加える。５μｌのピンツールを使って５μｌの候補化合物をそのようなウェル中に移す（即ち、全アッセイ量２００μｌのうちの５μｌが、候補化合物の最終スクリーニング濃度が１０μＭになるように、１：４０の比である）。さらに、汚染を避けるため、各移動ステップ後、ピンツールを水（１Ｘ）、エタノール（１Ｘ）および水（２Ｘ）を含む３つのレザバー中で濯ぎ、濯ぎの後は毎回、過剰な液体をツールから振り落として、ツールを紙およびキムワイプで乾燥させる。その後、５０μｌの膜タンパク質を各ウェルに加え（膜を含むがＧＰＣＲ融合タンパク質を含まないコントロールウェルをまた使用した）、室温で５〜１０分プレインキュベートする。その後、５０μｌの[35Ｓ]ＧＴＰγＳ （０．６ ｎＭ） 結合バッファー溶液を各ウェルに加え、室温、シェーカー上で６０分インキュベートする（この実施例では、プレートをフォイルで被った）。２２℃で１５分、４０００ＲＰＭでプレートを遠心することによってアッセイを停止する。プレートを次に８チャネルマニフォールドで吸引してからプレートカバーでシールする。プレートは次に、“Ｔｒｏｔ  ＃３７”設定を用いて（製造元の指示に従って）、Ｗａｌｌａｃ１４５０で読み取る。
Ｂ．サイクリックＡＭＰアッセイ
候補化合物を直接同定するためのもう一つのアッセイ法は、シクラーゼベースアッセイを用いて達成される。直接同定の他に、このアッセイ法は、前述するように [35Ｓ]ＧＴＰγＳ 法から得られる結果の確認をするための独立した方法としても使用され得る。
【０１７８】
修正Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ（商標）アデニリルシクラーゼキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、候補化合物をＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストとして直接同定するために、以下のプロトコルに従って使用することが好ましい。
【０１７９】
トランスフェクト細胞をトランスフェクトの約３日後に収集する。膜は、懸濁細胞を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含むバッファー中でホモジナイズすることによって調製される。均質化は、ブリンクマン・ポリトロン（商標）を約１０秒用いて、氷上で実施される。結果生じるホモジネートを４℃、４９,０００  Ｘ  ｇで１５分遠心分離する。生じたペレットを次に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４と０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むバッファーに再懸濁して、１０秒ホモジナイズした後、４℃、４９,０００  Ｘ  ｇで１５分遠心分離する。結果生じるペレットを使用するまで−８０℃で保存する。直接同定スクリーニングを行う日に、膜ペレットを室温でゆっくりと解凍して、最終タンパク質濃度が０．６０ｍｇ／ｍｌ になるように、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、 ｐＨ ７．４と１０ｍＭ ＭｇＣ１2を含むバッファーに再懸濁する（再懸濁された膜は使用するまで氷上に置く）。
【０１８０】
ｃＡＭＰスタンダードと検出バッファー（１１ｍｌの検出バッファーについて２μＣｉのトレーサー[125ＩｃＡＭＰ（１２５μｌ） を含む]を調製して、製造元の指示に従って維持した。アッセイ用バッファーは、スクリーニング用に新しく調製し、２０ｍＭ   ＨＥＰＥＳ、 ｐＨ ７．４、１０ｍＭ   ＭｇＣ１2, ２０ｍＭ   クレアチンリン酸（Ｓｉｇｍａ）、 ０．１ ユニット／ｍｌ クレアチンホスホキナーゼ （Ｓｉｇｍａ）、５０ｇＭ ＧＴＰ （Ｓｉｇｍａ）、および０．２ ｍＭ ＡＴＰ （Ｓｉｇｍａ）を含む。アッセイ用バッファーは使用するまでは氷上で保存する。
【０１８１】
前述のように同定された候補化合物（冷凍されている場合は、室温で解凍）を、好ましくは９６ウェルプレートウェル（３ｇｌ／ウェル、 １２μＭ 最終アッセイ濃度）に、４０μｌの膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）と５０μｌのアッセイ用バッファーと共に加える。この混合物を、ゆるやかな振とうを加えながら、室温で３０分インキュベートする。
【０１８２】
インキュベーション後、１００μｌの検出バッファーを各ウェルに加えて、２〜２４時間インキュベートする。"Ｐｒｏｔ． #３１" を（製造元の指示に従って）使用して、Ｗａｌｌａｃ マイクロベータ（商標）プレートリーダーでカウントする。
Ｃ．メラニン保有細胞スクリーニングアッセイ
ＧＰＣＲの候補アゴニストまたは逆アゴニストを同定するための方法は、特定の刺激に応答して色素を分散または凝集することおよびＧＰＣＲをコードする外来性クローンを発現できる色素細胞株のテスト細胞を導入することによって実施され得る。例えば、光のようなスティミュラントは、色素素質の初期状態を設定し、ＧＰＣＲの活性化が色素の分散を誘導するならば、色素はテスト細胞内で凝集する。しかし、色素素質の初期状態を設定するためにスティミュラントで細胞を刺激して、ＧＰＣＲの活性化が色素の凝集を誘導するならば、色素は分散する。テスト細胞は次に化合物と接触され、細胞内の色素素質が初期状態から変化したかどうかが決定される。候補化合物のＧＰＣＲへの共役に起因する色素細胞の分散は、ペトリ皿上では暗く見え、色素細胞の凝集は明るく見える。
材料と方法については、米国特許番号５,４６２,８５６ と米国特許番号６,０５１,３８６の公開に従い、それぞれの全文が参考文献として引用されている。
【０１８３】
種々の発現ベクターが、内因性および非内因性ヒトＧＰＣＲのための用途目的で、当業者に入手可能であるが、ある実施形態では、使用されるベクターはｐＣＭＶであることが好ましい。このベクターは、特許手続きを目標として微生物の国際寄託制度についてのブダペスト条約の規定により、１９８８年１０月１３日にアメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ）（１０８０１ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．, Ｍａｎａｓｓａｓ, ＶＡ ２０１１０-２２０９ ＵＳＡ）に寄託された。このＤＮＡはＡＴＣＣで試験されて、生存可能であることが決定された。ＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに以下の寄託番号：ＡＴＣＣ#２０３３５１を指定した。
【０１８４】
本特許文書を通じて引用されている、同時係属中および関連特許出願を含む、参考文献は、特記されない限りは、本願に参考文献として全面的に引用されている。
【０１８５】
当業者の認識範囲である開示発明の修正または拡張は、上記開示および以下の請求内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】図１は、内因性・構成的活性ＦＰＲＬ-２（“ＦＰＲＬ-２ ｗｔ”）、Ｇs／Ｇi融合タンパク質構築物に融合されたＦＰＲＬ-２ （“ＦＰＲＬ-２ （Ｌ２４０Ｋ）”）の非内因性・構成的活性化型、およびコントロール（“Ｇs／Ｇi”）の構成的シグナリングについての比較結果を示す、セカンドメッセンジャー細胞ベースサイクリックＡＭＰアッセイの結果のグラフ描写である。
【図２】図２は、内因性ＳＴＲＬ３３と非内因性・構成的活性化ＳＴＲＬ３３（“ＳＴＲＬ３３（Ｌ２３０Ｋ）”）を、２９３細胞において、８ＸＣＲＥ-Ｌｕｃレポーターアッセイを用いてコントロール（“ＣＭＶ”）と比較する場合の比較分析結果をグラフ表示する。
【図３】図３は、非内因性ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）（“シグナルエンハンサー”）と内因性ターゲット受容体−この場合はＧＰＲ４５（“ＧＰＲ４５ ｗｔ”）−の同時トランスフェクション対コントロール（“ＣＭＶ”）を、２９３細胞において細胞ベースのアデニリルシクラーゼアッセイを用いて比較分析した結果をグラフ表示する。このアッセイは、ＴＳＨＲの内因性リガンドである、ＴＳＨの添加を含む。
【図４】図４は、非内因性ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）（“シグナルエンハンサー”）と内因性ターゲット受容体−この場合は、ｍＧｌｕＲ７（“ｍＧ１ｕＲ７ｗｔ”）−の同時トランスフェクション対非内因性ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）と同時トランスフェクトされた、このターゲット受容体ｍＧｌｕＲ７の非内因性・構成的活性化型（“Ｗ５９０Ｓ”、 “Ｒ６５９Ｈ”、“Ｔ７７１Ｃ”および“Ｉ７９０Ｋ”）を、２９３細胞において細胞ベースのアデニリルシクラーゼアッセイを用いて比較分析した結果をグラフ表示する。このアッセイは、ＴＳＨＲの内因性リガンドである、ＴＳＨの添加を含む。
【図５】図５は、非内因性ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）（“シグナルエンハンサー”）と内因性ターゲット受容体−この場合は、ｍＧ１ｕＲ７ （“ｍＧｌｕＲ７ ｗｔ”）−の同時トランスフェクション対非内因性ＴＳＨＲ（Ａ６２３Ｉ）と同時トランスフェクトされたこのターゲット受容体ｍＧｌｕＲ７の非内因性・構成的活性化型（“Ｗ５９０Ｓ”、 “Ｒ６５９Ｈ”、“Ｔ７７１Ｃ”および“Ｉ７９０Ｋ”）を、ＲＧＴ細胞において細胞ベースのアデニリルシクラーゼアッセイを用いて比較分析した結果をグラフ表示する。このアッセイは、ＴＳＨＲの内因性リガンドである、ＴＳＨの添加を含む。
【図６】図６は、グルタミン酸が存在する場合と存在しない場合に、Ｇqタンパク質の非内因性型である、“Ｇq（ｄｅｌ）”と“Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇi” と同時トランスフェクトされた非内因性ｍＧｌｕＲ７である“Ｔ７７１Ｃ”のセカンドメッセンジャーＩＰ３産生を“Ｇq（ｄｅｌ）”と“Ｇq（ｄｅｌ）／Ｇi”に比較する例を示す。
【図７】図７は、内因性・非構成的活性ＧＰＲ３７（“ｗｔ”）とＧＰＲ３７の非内因性・構成的活性化型（“Ｃ５４３Ｙ”と “Ｌ３５２Ｒ”）の、ＳＲＥレポーターアッセイにおける比較分析であり、ここでコントロールは発現ベクター（“ＣＭＶ"）である。
【図８】図８は、Ｇs／Ｇi融合構築物と内因性ターゲット受容体−この場合はＧＰＲ３７（“ＧＰＲ３７ ｗｔ”）−の同時トランスフェクション対Ｇs／Ｇi融合構築物と同時トランスフェクトされたこのターゲット受容体ＧＰＲ３７の非内因性・構成的活性化型（“Ｃ５４３Ｙ”と “Ｌ３５２Ｒ”）の、全細胞セカンドメッセンジャーｃＡＭＰアッセイを用いる比較分析である。
【図９】図９は、フォルスコリン処理ラットシュワン細胞で発現されたＧＰＲ３７のノーザン分析の写像である。細胞分化は２０ｕＭ  フォルスコリンで維持された。
【図１０】図１０は、ラット圧挫坐骨神経で発現されたＧＰＲ３７のノーザン分析の写像である。ＧＰＲ３７は、圧挫後７日目に高度にアップレギュレートされた。
【図１１】図１１は、ＩＰ3アッセイにおける、内因性・非構成的活性ＨＦ１９４８（“ｗｔ”） とＨＦ１９４８の非内因性・構成的活性化型（“Ｉ２８１Ｆ”） の比較分析であり、ここでコントロールは発現ベクター（“ｐＣＭＶ”）である。
【図１２】図１２は、非内因性ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ（“シグナルエンハンサー”）と内因性ターゲット受容体−この場合は、ＨＦ１９４８（“ＨＦ１９４８ｗｔ”）−の同時トランスフェクション対非内因性ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉと同時トランスフェクトされたこのターゲット受容体ＨＦ１９４８の非内因性・構成的活性化型（“Ｉ２８１Ｆ”と “Ｅ１３５Ｎ”） を、全細胞アデニリルシクラーゼアッセイを用いて比較分析した結果をグラフ表示する。このアッセイは、ＴＳＨＲの内因性リガンドである、ＴＳＨの添加を含む。
【図１３】図１３は、複数の膵臓細胞株を用いる、ＧＰＲ６６のノーザンブロットの結果の写真の複写である。
【図１４】図１４は、内因性ＧＰＲ３５と非内因性・構成的活性化型ＧＰＲ３５（“ＧＰＲ３５（Ａ２１６Ｋ）”）を、２９３Ａ細胞において、Ｅ２Ｆ−Ｌｕｃレポーターアッセイを用いて比較分析した結果をグラフ表示する。
【図１５】図１５は、複数の組織（ヒト）ｃＤＮＡを用いる、ＧＰＲ３５のノーザンブロットの結果の写真の複写である。
【図１６】図１６は、非内因性ＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ （“ＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ”） （ＴＳＨが存在する場合としない場合）と内因性ＥＴＢＲ-ＬＰ２ （“ＷＴ”）の同時トランスフェクション対変異型ＴＳＨＲ-Ａ６２３Ｉ （ＴＳＨが存在する場合としない場合）と同時トランスフェクトされた非内因性・構成的活性化ＥＴＢＲ-ＬＰ２ （“Ｎ３５８Ｋ”）を、アデニリルシクラーゼアッセイを用いて比較分析した結果をグラフ表示する。
【図１７】図１７は、内因性ＥＴＢＲ-ＬＰ２ （“ＷＴ”） と非内因性・構成的活性化ＥＴＢＲ-ＬＰ２ （“Ｎ３５８Ｋ”）を、ＡＰ１レポーターアッセイ系を用いて、比較分析した結果をグラフ表示する。
【図１８】図１８は、フォルスコリン処理ラットシュワン細胞で発現されたＥＴＢＲ-ＬＰ２ のノーザン分析の写像である。細胞分化は２０ｕＭ  フォルスコリンで維持された。
【図１９】図１９は、ラット圧挫坐骨神経で発現されたＥＴＢＲ-ＬＰ２ のノーザン分析の写像である。ＧＰＲ３７は、圧挫後７日目に高度にアップレギュレートされた。
【図２０Ａ】図２０Ａと２０Ｂは、ヒトＥＴＢＲ ＬＰ２ （“ｈＥＴＢＲＬＰ２ｐ”） の推定アミノ酸配列とヒトＧＰＲ３７ （“ｈＧＰＲ３７ｐ”）の報告されたアミノ酸配列のアライメント報告を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ａと２０Ｂは、ヒトＥＴＢＲ ＬＰ２ （“ｈＥＴＢＲＬＰ２ｐ”） の推定アミノ酸配列とヒトＧＰＲ３７ （“ｈＧＰＲ３７ｐ”）の報告されたアミノ酸配列のアライメント報告を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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