(57)【要約】高分子、典型的には、タンパク質のアレイ（一次アレイ）（１００）を、例えば、二次元電気泳動によって作成し、続いて、エレクトロブロッティングなどによって支持膜（１０２）に転写する。一次アレイの画像を捕捉し（２０２）、一次アレイのさまざまな高分子スポットの座標を求める（４０２）。この方法の次の工程は、ピコリットル（ｐｌ）分注装置（７０２）を用いて、一次アレイの１つ以上のスポットすなわち座標上に１種類以上の試薬又は化学物質の二次（すなわちマイクロ）アレイをプリンティングすることである。高分子がタンパク質である場合、試薬は、トリプシンやGluCなどの酵素であってもよい。２種類の酵素を使用して同じスポット上の異なる座標に付着させることにより、タンパク質を別々のアミノ酸部位で切断し、そのスポットをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で解析した際のタンパク質内のペプチドの対象範囲を広げ、ペプチドの照合を向上させる。
2004532400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子混合物を解析する方法であって、
支持体上に、高分子を複数のスポットに分離した高分子アレイを作成する工程と、
上記アレイの１つ以上の高分子スポットに１種類以上の試薬からなる二次アレイをプリンティングする工程とを備えた方法。
【請求項２】
上記スポットに、少なくとも２種類の試薬がプリンティングされる請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記サンプルは、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質、核酸分子、糖タンパクを含む複合生体分子、及びそれらの混合物からなる群から選択された生体分子である請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記アレイは、クロマトグラフィーによって作成される請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記クロマトグラフィーは、電気泳動である請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記電気泳動は、ポリアクリルアミドゲル内で実行される請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動は、一次元目を等電点電気泳動によって、二次元目を天然ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動又はＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって二次元で実行される請求項６記載の方法。
【請求項８】
上記ゲル内に作成されたアレイは、上記二次アレイをプリンティングする前に、支持膜に転写される請求項７記載の方法。
【請求項９】
上記支持膜は、二フッ化ポリビニリデン、ニトロセルロース、ナイロン、テフロン、ザイテックス、ポリプロピレン、ポリ四フッ化エチレン、及び１つ以上の官能基を有するそれらの誘導体からなっている請求項８記載の方法。
【請求項１０】
検出手段を使用して、上記高分子スポットと該スポットに付与された試薬との間に相互作用が発生したか否かを検出する請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
上記高分子は、タンパク質である請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
上記試薬は、LysC、GluC、トリプシン、AspN、ArgC、ペプシン及びキモトリプシンからなる群から選択された酵素である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記試薬は、トリプシンとGluCである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で解析用のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析窒素レーザビームを用いて、膜上の原位置のマクロアレイの１スポットの範囲内で１つの特定の酵素反応を有する分析物を脱着させる工程をさらに備えている請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
上記高分子アレイは抗原又は抗体からなり、上記試薬はヒト又は動物由来のサンプルからなる請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
上記サンプルは、ヒトのサンプルであり、血漿、血清又は組織のサンプルである請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子、特にタンパク質のサンプルの解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
「プロテインチップ」の開発に関して、近年の文献に多数の記述が存在する。概して、これらは（通称マイクロアレイと呼ばれる）タンパク質アレイである。目下の展望は、数千個のタンパク質を同時に計測したり、タンパク質−タンパク質間相互作用、タンパク質−小分子間相互作用及び酵素基質反応を計測することが可能になるプロテインマイクロチップに向けられている。
【０００３】
プロテインチップを開発する現在の手法の多くは、通常、界面化学を利用して基板にタンパク質を固定化させるタンパク質固定化に依拠している。チップ用の基板はシリコンウェハであってもよいが、アルミニウムウェハやガラスなどの他の材料も、基板として使用されたり、使用が提案されている。基板を作成した後、抗体などのタンパク質捕捉物質をチップに張り付ける必要がある。カリフォルニアの一会社であるザイオミックス社（Zyomyx Inc.）によって提案された手法では、基板を薄い有機膜でコーティングし、その表面有機層に張り付けタグを設け、抗体断片やペプチドなどのタンパク質捕捉物質をタグの自由端に結合させる。
【０００４】
目下の方策は、抗体、場合によっては、親和性捕捉によって個々に精製された後に固定化される既知の発現タンパク質など、チップ表面上に積層化されているものについて知ることである。
【０００５】
抗体を積層化する他の方法も提案されている。しかしながら、抗体又は他のタンパク質捕捉物質を積層化する作業は、単純明快とはいかない。また、タンパク質がＤＮＡよりもはるかにロバスト性に欠け、脆弱で、粗雑に扱うと変性するという点で、問題も生じている。さらに、タンパク質は、基板の物理的化学的特性に対して非常に敏感である。
【０００６】
既存の「プロテインチップ」については、大きな欠点が存在する。第１に、タンパク質をアレイの所定位置でチップに結合させる必要がある。上述したように、これは、通常、単クローン抗体群など、製造に時間と費用がかかるアレイ型抗体群か、あるいは、アレイ型抗原群を使用することによって実現される。しかしながら、結合抗原の特異性、特に結合抗体の特異性は高くない。
【０００７】
第２の問題は、１つの抗体を使用しても、タンパク質が複数のイソフォームを有するという問題に対処できないことである。イソフォームが生物学的活性状態になるとは限らないこともあり得る。生物学的に活性なイソフォームが不活性のイソフォームに圧倒される可能性もある。
【０００８】
１つのサンプル内にリッチなタンパク質が存在する場合には、アレイへの非特異的な結合によって高いバックグラウンド「ノイズ」を発生させるという大きな問題がある。
【０００９】
組換え抗原を使用するという解決策では、組換えタンパク質と真正タンパク質との翻訳後修飾がほぼ確実に異なることになるので、真正な修飾が作成されない。したがって、プロテインチップ上での相互作用が、真正タンパク質と、例えば、別のタンパク質との間で発生するような「真の」相互作用であると確信することは到底不可能である。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、上述した従来技術の問題に対処し、それを解決するものである。
【００１１】
第１の広い態様では、本発明は、高分子アレイを作成し、続いて支持体に上記高分子アレイを転写する工程を有している。この工程では、一次すなわちマクロアレイが作成される。この方法の大きな利点は、従来技術の「プロテインチップ」では必要な固定化処理のための化学反応を用いることなく、真正の高分子を配置固定化できることである。
【００１２】
本発明の方法の次の工程では、一般には画像捕捉によって座標を決定することにより、捕捉された一次アレイの各座標上に試薬の二次（すなわちマイクロ）アレイを「プリンティング」する。この機能を実行するのに使用可能な装置は、「分子の解析（Analysis of Molecules）」という名称のオーストラリア特許第７２２５７８号に記載されており、この特許には、平坦な支持体上のスポットアレイの画像を捕捉し、その画像を利用してプリントヘッドを特定のスポットまで移動させ、そのスポットに試薬を付与する装置が記載されている。
【００１３】
発現高分子には、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質、核酸分子、糖タンパクを含む複合生体分子、及びそれらの混合物からなる群から選択された生体分子が含まれる。
【００１４】
生体分子は、クロマトグラフィーによって分離され、サンプルのアレイを形成することが好ましい。クロマトグラフィーは、電気泳動であることが好ましく、ポリアクリルアミドゲル内で実行される電気泳動であることがさらに好ましい。
【００１５】
上記電気泳動は、等電点電気泳動、天然ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動など、１次元で実行することができる。あるいは、上記ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動は、１次元目を等電点電気泳動によって、２次元目を天然ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動又はＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって２次元で実行される。
【００１６】
変性タンパク質ではなく、天然タンパク質のより真正なアレイを作成できるので、できる限り非変性用電気泳動分離法を利用することが好ましい。
【００１７】
上記支持体は、二フッ化ポリビニリデン、ニトロセルロース、ナイロン、テフロン、ザイテックス、ポリプロピレン、ポリ四フッ化エチレン、及び１つ以上の官能基を有するそれらの誘導体からなる膜であってもよい。
【００１８】
画像解析により、マクロアレイの各分子の個々のスポット間分解能を求めることができるだけでなく、マイクロアレイに実際にプリンティング可能な最大限のスポット数を求めることができる。
【００１９】
特異的又は非特異的な相互作用を同定する方法は、公開の方法に従う。
【００２０】
しかしながら、非特異的相互作用が外側コロナまで洗い流される一方で、特異的相互作用は付着された座標上に集中したまま残るというこのプリンティング処理特有の特徴を利用することができる。したがって、特異的相互作用が存在するか否かは、コロナの有無によって明らかになる。
【００２１】
タンパク質の検出は、マーカーなどによる標識の直付け又は蛍光標識された二次抗体などのサンドイッチ技術の利用によって支援することができる。
【００２２】
本方法の次の工程は、検出手段を使用して、タンパク質スポットとケミカルプリンタによって付与された試薬との間に相互作用が発生したか否かを検出することである。検出は、ＣＣＤなどの広域捕捉レンズ、カメラ、走査又はレーザ走査、顕微鏡などの適切な手段によって実行してもよい。
【００２３】
別の実施形態では、検出手段を、マイクロアレイの各座標まで直接移動させてもよい。
【００２４】
本発明の方法は、アフィニティタグを含んだ発現タンパク質をバッチモードで精製するために使用可能であると考えられる。例えば、特異的であるが異なるHisタグタンパク質を発現する例えば３８４個のクローンからなるバッチを、ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティクロマトグラフィー）カラムで精製してもよい。その後、カラム（すなわち、全３８４個のクローン）からの溶出物を、二次元電気泳動を用いてアレイ化し、基板に転写して予め指定されていないアレイを作成してもよい。これは、予め指定されたアレイを維持して位置情報を保持することに依拠する従来技術の既存の教示とは正反対である。この例の長所は、発現タンパク質をアレイ化することにより、予測された産物と比較した発現物（例えば、観測されたMr及びpIと比較した予測されたMr及びpI）の品質制御手段が実現されることである。
【００２５】
従来技術に対する本発明の主要な長所は、既存のプロテインチップが必要とする表面固定化化学反応を必要とすることなく、真正タンパク質のアレイを作成することである。
【００２６】
一特徴によれば、一次アレイの画像に含まれる情報を用いて、一次アレイ上にプリンティングされるマイクロアレイの型を決定することができる。例えば、解析対象の特定のスポットのサイズを利用して、そのスポット上に分注される試薬のパターンと間隔を決定することができる。例えば、直径２００ミクロンのスポット上には、２０ミクロンの液滴の試薬８ｘ８アレイを試薬スポット間の間隔を２５ミクロンにしてプリンティングできる一方、それより大きな例えば４００ミクロンのスポットの場合は、試薬のスポット同士は５０ミクロンの間隔があけられる。
【００２７】
分注装置に十分な精度があるので、一次アレイの個々の位置に非常に高密度のアレイをプリンティングすることが可能であり、精密な光ファイバを用いれば、微小な相互作用も同定可能である。
【００２８】
特に好ましい特徴では、マクロアレイの特定のタンパク質スポット上に、マイクロアレイとして多数のタンパク質分解酵素をプリンティングすれば有利である。例えば、直径５００ミクロンのタンパク質スポット上には、複数のエンドプロテイナーゼ酵素（トリプシン、エンドプロテイナーゼLysC、エンドプロテイナーゼGluC及びエンドプロテイナーゼAsp-N、好ましい酵素はトリプシンとGluC）からなるマイクロアレイを、２００ミクロンサイズのスポットで（中心間で）２００ミクロンの間隔を置いてプリンティングされる。そのスポットサイズと間隔は、平均ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析窒素レーザビーム（１００ミクロン）をマクロアレイの１スポットの範囲内で１つの特定の酵素反応を有する分析物のみを脱着させるように位置付けるだけの充分に小さいものである。この特徴の利点は、プロテイナーゼのマイクロアレイにより、マクロアレイのタンパク質スポットのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析時に検出されるペプチドの対象範囲が拡大することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の具体的な実施の形態を、図面に基づいて例示として説明する。
【００３０】
本発明では、タンパク質の混合物が分画されてリッチなタンパク質が除去され、狭い範囲のｐＨ勾配を利用してイソフォームが分解される（一次元電気泳動）。分画処理は、その内容全てが本明細書に参照の形で盛り込まれている国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ００／０１３９１に記載されているような多室電解槽を用いて行われてもよい。一次元電気泳動の代わりに二次元電気泳動などを利用して、リッチなタンパク質を除去した後のサンプルを図１に示すアレイ（１０）に析出してもよく、その後、アレイは、エレクトロブロッティングを用いてニトロセルロース膜などの膜上に転写される。ここで、タンパク質アレイは固定化され、「チップ」の形で取り扱われる準備が整う。なお、アレイは予め指定されているものではなく、アレイが作成された時点でどのタンパク質がアレイ上のどの位置に存在するかを知っている必要はない。
【００３１】
図１は、環に囲まれたタンパク質スポット１２を示す。この方法の次の工程は、タンパク質スポット上に試薬のアレイをプリンティングすることである。これは、図４及び図５に基づいて以下に説明するオーストラリア特許７２２５７８号に記載のケミカルプリンタを用いることによって実現される。
【００３２】
図４は、プリンタ装置の機能の概略説明図である。この装置は、アレイ１００と、画像収集装置２００と、画像解析装置３００と、コンピュータ４００と、ｘｙｚ調整プラットフォーム５００と、複数の薬剤分注制御部６００と、複数の分注ヘッド及び液だめ７００と、解析制御部８００と、解析装置９００と、データ解析ステーション９１０を備えている。
【００３３】
アレイ１００は、ｘｙｚ調整テーブル又はアーム５００の上又は下に配置され、画像２００が収集されて、ディジタル画像の形でコンピュータ４００に転送される。この画像は、画像解析装置３００によって解読され、アレイの各成分の座標が、真のｘ軸、ｙ軸、ｚ軸を反映する値に変換される。あるいは、解読することなく、コンピュータ４００内に記憶された画像が使用され、アレイ１００内の特定の成分の座標を用いて、分注ヘッド（噴射装置）７００を搬送するｘｙｚ調整テーブル又はアーム５００を移動させる。分注ヘッド７００は、コンピュータ４００に制御される薬剤分注制御部６００に制御され、アレイ１００の選択されたサンプル上に試薬を分注する。処理が完了すると、アレイ１００内の処理された成分の座標を用いて、解析装置９００を搬送するｘｙｚ調整テーブル又はアーム５００を移動させる。解析装置９００は、解析制御部８００に制御され、作業者がコンピュータ４００を介して選択したときに、選択された処理後のサンプル１００を解析する。解析によるデータは、その後、データ解析・管理装置９１０によって照合され、画像解析装置３００からの解読されたアレイ内の各サンプルの座標と関連付けされる。
【００３４】
図５に、コンピュータの制御下にある、ｘｙｚ調整プラットフォーム、薬剤分注制御部、分注ヘッド及び液だめ、並びに解析装置を示す。アレイ１０２は、プラットフォーム５０２上に固定されている。アレイ１０２の画像は、ディジタルカメラ２０２によって収集される。アレイ１０２は、カメラのフラッシュ又は外部のタングステンランプ２０６によって光が照射される。画像は、カメラ２０２からコンピュータ４０２に転送される。この画像は、処理され、「スポット上クリック」ソフトウェアに入力される。この処理により、画像の画素座標がロボットの座標に変換される。その後、「スポット上クリック」ソフトウェアを用いて、分注装置７０２を、ｘｙ方向可動バー５０４を介してアレイ内の選択されたサンプルまで移動させる。分注装置７０２のｚ方向の移動は、分注装置支持部５０６を介する。分注装置７０２に直接接続（６０４）された薬剤分注制御部６０２をコンピュータ制御（４０２）することによって、試薬だめ５０８から試薬が分注される。
【００３５】
図２は、分注装置７０２を、タンパク質スポット１２上方に移動してタンパク質スポット１２上に試薬のスポットを付着させるプリンタヘッド１４の形で示す。このプリンタは、圧電プリンティングを利用して、スポットに接触することなく微量（ピコリットルのオーダー）の液体をスポット上面に放出する。
【００３６】
プリントヘッド１４は、オーストラリア特許７２２５７８号に記載された上述の技術を利用してアレイ内の特定のスポットのｘｙ座標を提供する、先に生成されたアレイの画像を利用してスポットに向けられる。
【００３７】
図３は、タンパク質スポット１２上に付着された４ｘ４試薬アレイの画像を示す。
【００３８】
このように、従来技術と大きく異なり、本発明のプロテインチップによれば、真正のタンパク質アレイが提供されるとともに、イソフォームの問題を解決することができ、リッチなタンパク質を除去する技術が実現される。考えられる具体的な技術は、患者に抗体を作らせて、患者の血清をタンパク質アレイ上にプリンティングすることである。
【００３９】
本発明の潜在的な用途には、新しい抗原に対する抗体スクリーニングの用途、ペプチド−タンパク質間相互作用及びタンパク質−タンパク質間の相互作用を計測する用途がある。
【実施例１】
【００４０】
本実施例の目的は、精製された結核菌（ＴＢ）抗原をニトロセルロースのマトリックス上で用いてＴＢに対する患者の免疫反応性を決定する手法として、ＴＢに対して血清陰性又は血清陽性なヒト血清を微量分注する化学的プリンティング技術を開発することであった。適切な抗原を用いて複数の条件や疾病に対する患者の免疫反応性を決定するためにこの手法を利用できることは、明らかである。
【００４１】
（材料及び方法１．１）
一方はＴＢに対して血清陰性で他方は血清陽性な２人の患者からヒト血清を単離し、それをｐＨ７．４の燐酸緩衝生理食塩水＋０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム＋０．１％（ｖ／ｖ）Tween-20（燐酸緩衝生理食塩水−洗浄緩衝液（ＰＢＳ−ＷＢ））を用いて１０倍に希釈した後、０．２２μｍのシリンジフィルタ（オーストラリア国ノースライドのミリポア（Millipore）社製）でろ過した。ｐＨ７．４のＰＢＳに３８ｋＤａ精製ＴＢ抗原を３７０μｇ／ｍｌで溶解した液４μｌをニトロセルロース膜（カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラッド（Bio-Rad）社製）に加えた後、乾燥させた。その後、０．５％（ｗ／ｖ）カゼイン（オーストラリア国キャッスルヒルのシグマ（Sigma）社製）のＰＢＳ−ＷＢ溶液を使用して、ニトロセルロース上の非特異的結合部位を１５分間ブロッキングした。その後、５５μｍのオリフィスを有するAB-55微量噴射装置（テキサス州プレーノーのマイクロファブ・テクノロジーズ（MicroFab Technologies）社製）#B0-13-12を周波数２４０Ｈｚで使用して、各血清サンプルの、スポットあたり１００滴の４ｘ４アレイを個々のＴＢ抗原スポットに微量噴射した。ニトロセルロースの下にＰＢＳ−ＷＢで飽和させたろ紙を敷くことによって、血清注入の間ニトロセルロースを湿潤状態に保った。血清噴射の１０秒後、トランスファーピペットを用いて、ニトロセルロースをＰＢＳ−ＷＢ数滴ですすいだ。引き続いて、二トロセルロースを、フルオレッセインイソチオシアネート（カリフォルニア州サンフランシスコのザイメッド（Zymed）社製）に共役結合された抗ヒト免疫グロブリンＧを０．５％（ｗ／ｖ）カゼインのｐＨ７．４ＰＢＳ−ＷＢ溶液に１００倍の希釈率で希釈させたもので１時間温置した後、ＰＢＳ−ＷＢで洗浄した。標識された抗原を、バイオラッド（Bio-Rad）社（カリフォルニア州ハーキュリーズ）のFluorSTM マルチイメージャー（Multi-Imager）を用いて検出した。
【００４２】
（材料及び方法１．２）
図６（ａ）及び図６（ｂ）に示す装置を用いてニトロセルロースの下に吸収性組織を敷くこと以外は、上記の方法を繰り返した。吸収性薄紙は、ＴＢ抗原を含んだニトロセルロース膜の下に挿し込まれた。その後、この材料全体を、噴射対象領域を円形オリフィス１８から露呈させた状態で図６（ａ）乃至図６（ｃ）に示す装置の内部に閉じ込めるようにして圧締した。薄紙の下敷きにより、噴射溶液又は付与される少量の緩衝液や試薬を、瞬間的かつ特異な反応を許容する薄紙にニトロセルロースを通して確実に直ちに引き込むことができた。この手法により、免疫グロブリンの非特異的染色、ひいては非特異的反応の両方を防止し、ニトロセルロースの表面を横切って特定の抗体が注入されるのを防止することができた（下記参照）。方法１と異なり、この装置は、噴射中にニトロセルロース膜を乾燥状態に保った。その後、この膜をトランスファーピペットを用いて１滴のＰＢＳ−ＷＢで処理した後、上述したように、抗原上に血清を噴射させた。
【００４３】
図７（ａ）及び図７（ｂ）は、３８ｋＤａＴＢ抗原上にＴＢ陰性又はＴＢ陽性ヒト血清を微量噴射する効果を示す。ＴＢに対して血清陰性（−）又は血清陽性（＋）のヒト血清の４ｘ４アレイ２０を、３８ｋＤａＴＢ抗原１．４８μｇの４μｌスポットを含んだニトロセルロース上に噴射させた。このニトロセルロース膜の下に、ＰＢＳ−ＷＢで湿潤させたろ紙（Ａ）又は密着状に挿し込んだ吸収性薄紙（Ｂ）を敷いた。フルオレッセインイソチオシアネート標識つき二次抗体を用いて、標識された抗原を検出した後、バイオラッド（Bio-Rad）社のFluorSTM マルチイメージャー（Multi-Imager）で解析した。図７（ｂ）に符号２０で示す薄紙パッキン及び乾燥膜により、抗原検出の感度と分解能が向上したことは明らかである。
【実施例２】
【００４４】
精製された結核菌（ＴＢ）抗原に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、その後にダイレクトブルー染色を用いる場合と用いない場合とでニトロセルロースへの電気的転写を行うことによってＴＢに対する患者の免疫反応性を決定する手法として、ＴＢに対して血清陰性又は血清陽性なヒト血清を微量分注する化学的プリンティング技術の開発。
【００４５】
（材料及び方法２）
３８ｋＤａＴＢ抗原１４．８μｇを、等倍のＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元サンプル緩衝液を用いて２００μｌまで希釈させた。その後、サンプルを、４乃至１２％（ｗ／ｖ）トリス−ビスポリアクリルアミド勾配ゲル（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Invitrogen）社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１レーンあたり抗原１．４８μｇ）により解析した後、ニトロセルロースに電気的に転写させた。ブロットの２つのレーンをダイレクトブルー染色によって可視化する一方（図８）、他の２つのレーンは染色しなかった。両方のブロットともに、室温で乾燥させ、続いて０．５％（ｗ／ｖ）カゼインのＰＢＳ−ＷＢ溶液で１５分間ブロッキングした。その後、両方のブロットをＰＢＳ−ＷＢですすぎ、乾燥させた。その後、ブロットを図１に記載の吸着装置内に取り付けた後、血清陰性又は血清陽性のＴＢ血清を、上述したように、１ｘ５アレイの形でダイレクトブルー染色ブロットと非染色ブロットを交互に配した３８ｋＤａバンド上に噴射させた。約１０秒後に、トランスファーピペットを用いて両ブロットをＰＢＳ−ＷＢ２滴で洗浄した。その後、０．５％（ｗ／ｖ）カゼインのＰＢＳ−ＷＢ溶液で１０倍に希釈されたフルオレッセインイソチオシアネート標識つき二次抗体５μｌをブロットに付与し、その１０秒後に、トランスファーピペットを用いてＰＢＳ−ＷＢ２滴を加えた。標識された抗原をバイオラッド（Bio-Rad）社（カリフォルニア州ハーキュリーズ）のFluorSTM マルチイメージャー（Multi-Imager）で解析した。
【００４６】
図８は、ダイレクトブルー染色法を用いて、又は、用いないで、３８ｋＤａ変性ＴＢ抗原＋又は−上にＴＢ陰性又はＴＢ陽性ヒト血清を微量噴射する効果を示す。（Ａ）１レーンあたり１．４８μｇの３８ｋＤａＴＢ抗原を、４乃至１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、タンパク質をニトロセルロース上に電気的に転写させた。その後、レーンのうちの２つをダイレクトブルーで染色した。（Ｂ）０．５％（ｗ／ｖ）カゼインのＰＢＳ−ＷＢ溶液でブロッキングした後、ＴＢに対して血清陰性（レーン１及び３）又は血清陽性（レーン２及び４）のヒト血清１ｘ５アレイを、３８ｋＤａＴＢ抗原バンドに対して（上述したように）噴射させた。そのニトロセルロース膜の下に、図６（ａ）乃至図６（ｃ）に示す装置を用いた噴射の間、密着状に挿し込んだ吸収性乾燥薄紙を敷いた。血清を噴射する前に、レーン３及び４のみをダイレクトブルーで染色した（Ａ）。フルオレッセインイソチオシアネート標識つき二次抗体を用いて、標識された抗原を検出した後、バイオラッド（Bio-Rad）社のFluorSTM マルチイメージャー（Multi-Imager）で解析した。
【００４７】
ニトロセルロース膜上に固定化された所定の抗原に対してケミカルプリンタを用いてナノリットル量のヒト血清を注入する現在の手法は、非常に功を奏し、（１分以内で）ＴＢ免疫反応性免疫グロブリンＧを極めて高速に検出する手段を実現することが分かった。バックグラウンドも非特異的結合も観察されなかった。初期の研究では、噴射後の湿潤したニトロセルロース膜表面を横切って血清抗体が分散することにより、抗体アレイの分解能が低下することが分かった。乾燥したニトロセルロース膜の下に吸収性薄紙を敷くことによって、この問題がほぼ克服され、高特異性で分解能に優れた抗体アレイが実現される。
【実施例３】
【００４８】
この実施例は、タンパク質断片を質量分析装置でマトリックス支援レーザ脱着イオン化法（ＭＡＬＤＩ）により解析する前に、アレイ上のタンパク質に酵素を付与することに関する。周知のように、様々な酵素が、タンパク質を様々なアミノ酸部位で切断する。IysC, AspN, ArgCなどの一部の酵素は、単一の特異なアミノ酸部位でのみ切断を行う。このことは、非常に情報量の多いスペクトルを発生させないようにする数個の大きな断片を生成するので、ＭＡＬＤＩ解析にとって問題である。ペプシンやキモトリプシンなどの他の酵素は、多数のアミノ酸部位でタンパク質を切断する。ＭＡＬＤＩ解析の前にこれらの酵素を使用することは、スペクトル中に微小なピークを多数発生させ、解読も非常に困難にする過剰な小断片が発生するという理由によっても問題がある。トリプシンとGluCは、２つのアミノ酸部位で切断を行い、解析にとって適したスペクトルを発生させる傾向があるので、ＭＡＬＤＩ解析に最適の酵素である。
【００４９】
そうではあっても、これらの酵素は特異なアミノ酸部位でのみ切断を行うので、酵素を１種類だけ使用することは、タンパク質に関して限られた量の情報又は限られた対象範囲しか発生させない。しかしながら、本発明の方法を用いてアレイのタンパク質スポット上に２種類の酵素を噴射することにより、タンパク質の対象範囲が増加することになる。以下の実験は、本発明の方法を用いて２個のヒトプロアポリポタンパク質（human proapolipoprotein）上にトリプシンとGluCの両方を噴射して、トリプシンとGluCの両方を用いることによってトリプシン単独又はGluC単独の場合と比べて切断（ペプチドの照合）が向上することを説明している。
【００５０】
本実施例の目的は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ダイレクトブルー染色を用いたポリビニルジフルオリド膜へのエレクトロブロッティングを行った精製タンパク質に対して多数のエンドプロテアーゼを微量分注することによって、タンパク質同定を向上させる化学的プリンティング技術を開発することである。
【００５１】
（材料及び方法）
サンプルは、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及び５ｍＭトリスに全血漿を溶解させた液３６μｌであった。サンプルをＸトリブチルホスフィンで還元し、ｚヨードアセトアミドでアルカリ化した。このサンプルを超音波処理した後、遠心分離して上澄みを集めた。その内容全体が本明細書に参照の形で盛り込まれている、ハーバート、ビー．（Herbert, B）及びリゲッティ、ピー．ジー．（Righetti, P. G.）「プロテオーム解析の転機：等電膜を用いた多室電解槽によるサンプル前分取（A turning point in proteome analysis: sample prefractionation via multicompartment electrolyzers with isoelectric membranes）」エレクトロフォレシス（Electrophoresis）２１、３６３９〜３６４８（２０００）に記載された方法を用いて、多室電解槽（ＭＣＥ）を使用して前分取を実行した。
【００５２】
乾燥した１１ｃｍの５−６ＩＰＧストリップを、タンパク質サンプル２００μｌで６時間再水和させた。再水和ストリップを最大１００００Ｖで１２０ｋＶｈｒの間等電点電気泳動させた。電気泳動させたＩＰＧストリップを、６Ｍ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する平衡化緩衝液中で２０分間平衡化させた。
【００５３】
平衡化したＩＰＧストリップを６乃至１５％ゲルチップの添加用ウェルに挿入した。ゲルあたり５０ｍＡで１．５時間電気泳動を行った。タンパク質を、４００ｍＡで１時間２０分間イモビロンPSQ ＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロッティングさせた。タンパク質をダイレクトブルー７１で染色した。
【００５４】
その後、３Ｍ社の両面導電性テープを用いて、膜ブロットをAxima-CRF ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ターゲット板に貼り付けた（図９参照）。特定のタンパク質スポットを、各タンパク質スポットの１ｍｍ離れた２箇所に直径３００μｍの液滴５０滴で分注される、１％ポリビニルピロリドンの５０％メタノール溶液５ηｌでブロッキングした。過剰なポリビニルピロリドンをミリＱ水ですすいだ。２００μｇ／ｍｌGluCエンドプロテアーゼ５０ηｌをタンパク質上の一方のポリビニルピロリドンスポット上に噴射し、２００μｇ／ｍｌトリプシン未知量を同じタンパク質の残る一方のポリビニルピロリドンスポット上に噴射した。その後、水分を極力少なくした密閉状のランチボックス内に膜板を置いて加湿環境を作り、３７℃で３時間温置させた。タンパク質消化の後、２０％イソプロパノール、２０％２−ブタノール、３０％メタノール及び０．５％蟻酸に１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−ヒドロキシ桂皮酸を溶解した液１００ηｌを、消化タンパク質スポット上に噴射した（図１０）。消化物を、Axima-CRF ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置を用いて解析した。
【００５５】
多数のエンドプロテアーゼを微量分注することによってタンパク質同定のアミノ酸対象範囲を拡大させるこの手順は、GluC及びトリプシンがそれぞれ個別に達成可能なペプチド照合範囲が４０％と４６．０９％であるのに比べて、総計で６６．６７％のペプチド照合範囲をもたらすことによって、功を奏することが分かった。
【００５６】
使用されるマトリックス溶液は、２０％２−ブタノール、２０％イソプロパノール、３０％メタノール、３０％水及び０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）からなる。このマトリックス溶液は、長期間にわたって安定した液滴を分注するのに適した粘性を有するという利点がある。
【００５７】
上記具体的な実施形態に示す発明に対して、大略的に説明した本発明の意図と範囲から逸脱することなく多数の変形及び／又は変更を行い得ることは、当業者であれば理解できるであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示とみなされるべきであり、限定的に解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、二次元電気泳動によって分離され、固体支持膜上に転写されたタンパク質アレイを示す。
【図２】図２は、図１に示すアレイで同定されたタンパク質スポットの上面に小スポットからなるマイクロアレイ群を付着させるために使用されるケミカルプリンタを示す。
【図３】図３は、図１に示すスポット上に付着されたマイクロアレイを示す接写図である。
【図４】図４は、成分アレイ又はサンプルアレイの少なくとも１つの成分又はサンプルの位置の画像を収集又は記録し、記録された画像を利用して少なくとも１つの成分又はサンプルをその場で操作可能にすることによって成分アレイ又はサンプルアレイの情報を求める過程を示す概略図である。
【図５】図５は、成分アレイ又はサンプルアレイの少なくとも１つの成分又はサンプルを画像化し、操作し、解析する機器の概略図である。
【図６】図６（ａ）乃至図６（ｃ）は、ニトロセルロース（ＮＣ）膜を圧締する装置を示す。
【図７】図７（ａ）及び図７（ｂ）は、３８ｋＤａＴＢ抗原に対してＴＢ陰性又はＴＢ陽性ヒト血清を微量噴射する効果を示す。
【図８】図８は、ダイレクトブルー染色法を用いた場合と用いない場合の、３８ｋＤａ変性ＴＢ抗原に対してＴＢ陰性又はＴＢ陽性ヒト血清を微量噴射する効果を示す。
【図９】図９は、Axima ＭＡＬＤＩターゲット板に両面テープで貼着された膜ブロットB745を示す。
【図１０】図１０は、上面にマトリックスを付着させた、トリプシン又はGluCエンドプロテアーゼで消化されたタンパク質の接写図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年10月16日(2002.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上で一次スポットアレイ状の複数の高分子に対して複数の解析を同時に行う方法であって、
１種類以上の試薬を含んだ複数の組成物を、その各組成物が、上記高分子の一次アレイの各スポットの範囲内に収まるより小型の二次スポットアレイにおいて、該より小型の二次スポットアレイの各スポットを形成するよう付与することと、
上記一次アレイの高分子と上記二次アレイの形で付与された組成物内の上記試薬との間で相互作用が発生したか否かを検出することを備えた方法。
【請求項２】
上記一次アレイは、予め指定されたものではない請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記一次アレイは、表面固定化化学反応を用いることなく平坦な支持体上に作成される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上記一次アレイは、クロマトグラフィーによって作成される請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記クロマトグラフィーは、電気泳動である請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動である請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記クロマトグラフィーは二次元で実行され、一次元目は等電点電気泳動を使用し、二次元目は非変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動又はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を使用する請求項４乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
上記一次アレイは、クロマトグラフィーで作成された後に、膜に転写される請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
上記膜は、二フッ化ポリビニリデン、ニトロセルロース、ナイロン、テフロン（登録商標）、ザイテックス（登録商標）、ポリプロピレン、ポリ四フッ化エチレン、又はこれらのいずれかの誘導体である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
上記高分子は、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質、核酸分子、糖タンパク又はこれらのいずれかの混合物である請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
上記高分子は、タンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
上記高分子は、ヒト又は動物由来のタンパク質である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記高分子は、抗体である請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
上記高分子は、バクテリア由来の抗原である請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
上記試薬は、タンパク質である請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
上記タンパク質は、ヒト又は動物に由来する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記試薬は、抗体である請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
上記試薬は、酵素である請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１９】
上記酵素は、Lys-C、Glu-C、トリプシン、Asp-N、Arg-C、ペプシン及びキモトリプシンからなる群から選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
上記酵素は、トリプシンとGlu-Cである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
上記検出する工程（ｂ）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて行われる請求項１記載の方法。
【請求項２２】
複数の高分子に対して複数の解析を同時に行う方法であって、
支持体上に、スポットの形で高分子の一次アレイを作成することと、
１種類以上の試薬を含んだ複数の組成物を、その各組成物が、上記高分子の一次アレイの各スポットの範囲内に収まる二次スポットアレイにおいて、該二次スポットアレイの各スポットを形成するよう付与することと、
上記一次アレイの高分子と上記二次アレイの形で付与された組成物内の上記試薬との間で相互作用が発生したか否かを検出することを備えた方法。
【請求項２３】
上記高分子の一次アレイは、電気泳動によって作成される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
上記高分子は、タンパク質である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
複数の高分子に対して複数の解析を同時に行う方法であって、
高分子の一次アレイを作成することと、
上記高分子のアレイを支持体上に転写することと、
１種類以上の試薬を含んだ複数の組成物を、その各組成物が、上記高分子の一次アレイの各スポット範囲内に収まるより小型の二次スポットアレイにおいて、該より小型の二次スポットアレイの各スポットを形成するよう付与することと、
上記一次アレイの高分子と上記二次アレイの形で付与された組成物内の上記試薬との間で相互作用が発生したか否かを検出することを備えた方法。
【国際調査報告】
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