(57)【要約】本発明は、ＣＳＧポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特にこのポリヌクレオチドを発現することによる、上記ポリペチドの製造方法、ならびに上記ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。本発明はさらに、研究、診断および臨床技術に一部関連する用途のための、かかるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストを用いるための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＳＧであって、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオ
チド、またはそれらの変異体、
（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドにより発現されるタンパク質またはそれらの変異体、あるいは
（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のアンチセンス配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチド、
を含む、前記ＣＳＧ。
【請求項２】
患者における大腸癌の存在を診断する方法であって、
（ａ）患者における細胞、組織または体液における請求項１に記載のＣＳＧレベルを測定すること、および
（ｂ）正常ヒト対照由来の細胞、組織または体液におけるＣＳＧレベルと、測定されたＣＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者における測定ＣＳＧレベルの変化は、大腸癌の存在に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項３】
患者における大腸癌の転移を診断する方法であって、
（ａ）転移したことがわかっていない大腸癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）該患者由来の細胞、組織または体液の試料中の、請求項１に記載のＣＳＧレベルを測定すること、および
（ｃ）正常ヒト対照の細胞、組織または体液におけるＣＳＧレベルと、測定ＣＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者における測定ＣＳＧレベルの増加は、転移した癌に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項４】
大腸癌を有する患者における大腸癌をステージングする方法であって、
（ａ）大腸癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）患者由来の細胞、組織または体液の試料中の請求項１に記載のＣＳＧレベルを測定すること、および
（ｃ）正常ヒト対照の細胞、組織または体液におけるＣＳＧレベルと、測定ＣＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者における測定ＣＳＧレベルの増加は、進行している癌に関連し、測定ＣＳＧレベルの減少は、消退または寛解している癌に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項５】
転移の発生に関して、患者における大腸癌をモニタリングする方法であって、
（ａ）転移したことがわかっていない大腸癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）患者由来の細胞、組織または体液の試料中の請求項１に記載のＣＳＧレベルを定期的に測定すること、および
（ｃ）正常ヒト対照の細胞、組織または体液におけるＣＳＧレベルと、定期的に測定したＣＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者において定期的に測定したＣＳＧレベルのいずれか１つの増加が、転移した癌に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項６】
患者における大腸癌のステージの変化をモニタリングする方法であって、
（ａ）大腸癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）患者由来の細胞、組織または体液における請求項１に記載のＣＳＧレベルを定期的に測定すること、および
（ｃ）正常ヒト対照の細胞、組織または体液におけるＣＳＧレベルと、定期的に測定したＣＳＧレベルとを比較すること、ここで、正常ヒト対照に対する患者において定期的に測定したＣＳＧレベルのいずれか１つの増加は、ステージが進行している癌に関連し、減少が、ステージが後退しているかまたは寛解している癌に関連する、
を含む、前記方法。
【請求項７】
大腸癌のイメージングおよび処置における使用のための潜在的治療薬を発見する方法であって、化合物を、請求項１に記載のＣＳＧに結合する能力、または該化合物の非存在下におけるＣＳＧに対しその発現を減少させる能力に関してスクリーニングすることを含み、ここで、ＣＳＧに結合する化合物の能力またはＣＳＧの発現を減少させる能力は、該化合物が大腸癌のイメージングおよび処置において有用であることを示す、前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＣＳＧによりコードされるポリペプチドを特異的に結合する抗体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体を患者に投与することを含む、患者における大腸癌のイメージングの方法。
【請求項１０】
抗体が、常磁性イオンまたは放射性同位体で標識されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＣＳＧの発現または活性を下方調節する化合物を患者に投与することを含む、患者における大腸癌の処置の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のＣＳＧを発現する標的細胞に対する免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答が標的細胞に対して惹起されるように、免疫原性刺激量のＣＳＧポリペプチドをヒト患者に送達することを含む、前記方法。
【請求項１３】
ＣＳＧポリペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドによりコードされている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のＣＳＧを含む大腸癌処置用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、部分として、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体ならびに誘導体、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにそれらの変異体および誘導体を作製する方法、該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに癌、特に大腸癌の検出、診断、モニタリング、ステージング、予後判定、イメージングおよび処置のための、該ポリヌクレオチド、ポリペプチド、変異体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。特に、これらおよびその他の観点において、本発明は、以後大腸特異遺伝子または「ＣＳＧ」と称する大腸特異ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【０００２】
発明の背景
大腸の癌は、腸管に限局していれば、高度に処置可能で、多くの場合治癒する疾患である。それは、米国において最も頻繁に診断される悪性腫瘍の１つであるとともに、２番目に多い癌死の原因である。初期治療は手術であり、それにより約５０％の患者が治癒する。しかしながら、術後の再発が大きな問題であり、多くの場合それが最終的な死因となる。
大腸癌の予後判定は、腸管壁を介した腫瘍の侵入度合およびリンパ節転移（ｎｏｄａｌ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）の有無に明白に関係している。これら２つの特徴は、この疾患のために開発された全てのステージングシステムの基礎を形成している。処置の決定は、通常、ステージングのための旧デューク（ｏｌｄｅｒ Ｄｕｋｅ’ｓ）分類または改変Ａｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ（ＭＡＣ）分類を参照してなされる。
【０００３】
腸管閉塞および腸管穿孔が、大腸癌患者における不良な予後の指標である。処置前の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）の上昇した血清レベルもまた、予後に関してネガティブな意味を有する。
上診時における７０歳を超える年齢は、標準的な治療にとって禁忌ではない。許容し得る罹患率および死亡率、ならびに長期の生存が、この患者集団で達成されている。
【０００４】
本疾患が高頻度であり（年間約１６０，０００件の新たな結腸および直腸癌の症例）、ハイリスク集団が分かっており、一次病変の増殖が緩徐であること証明されており、早期の病変での生存が良好であり、そしてスクリーニング検査が比較的容易で正確なため、大腸癌のスクリーニングは、５０歳以上の全ての成人、特に結腸直腸癌の一等親血縁者の日常的なケアの一部となるべきである。
【０００５】
大腸癌の検出、診断、モニタリング、ステージング、および予後判定に用いられる手順は、患者の予後にとって決定的に重要である。例えば、早期大腸癌と診断された患者は、一般的に、遠隔転移性大腸癌と診断された患者の５年生存率と比較して、ずっと高い５年生存率を有する。大腸癌を早期に検出するための、より感受性が高く特異的な新たな診断方法が明らかに必要である。
【０００６】
初期治療後およびアジュバント療法中に、大腸癌患者を綿密にモニタリングして、治療に対する応答を測定し、持続性もしくは再発性の転移の疾患を検出する。大腸癌、その再発および進行を検出する際に、より感受性が高く特異的な大腸癌マーカーが明らかに必要である。
【０００７】
大腸癌を管理する際の別の重要なステップは、患者の疾患のステージを決定することである。ステージの決定は、潜在的な予後判定価値を有し、最適治療を設計するための基準を提供する。一般に、大腸癌の病理学的ステージングは、より正確な予後判定を与えるため、臨床的ステージングよりも好ましい。しかしながら、臨床的ステージングは、病理学的評価用組織を得るための侵襲的方法によらないので、少なくとも病理学的ステージングと同程度に正確である場合には好ましいであろう。大腸癌のステージングは、異なる浸潤のステージを識別することができる、細胞、組織または体液における新規マーカーを検出することにより改良されるであろう。
【０００８】
したがって、かかる癌が転移しているか否かを決定するための、より高感度で正確な、ヒトにおける大腸癌をステージングする方法、および転移の発生に関して、ヒトにおける転移していない大腸癌の進行をモニタリングする方法が強く求められている。
【０００９】
本発明では、本明細書中でＣＳＧと呼ばれる大腸特異遺伝子による大腸癌の検出、診断、モニタリング、ステージング、予後判定、イメージングおよび処置の方法が提供される。本発明に関しては、ＣＳＧはとりわけ配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子により発現される未変性（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質を表す。本明細書中では、「ＣＳＧ」はまた、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２に比べヌクレオチド配列中に変化を含むが、依然として同一タンパク質をコードするポリヌクレオチドをも意味する。
【００１０】
あるいは、本明細書中で用いられるＣＳＧが意味するものは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子にコードされる未変性ｍＲＮＡ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のレベル、または配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のアンチセンス配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドのレベルを意味する。
【００１１】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明より当業者に明らかになるだろう。しかしながら、以下の説明および具体的な例は、発明の好ましい態様を示すものではあるが、例示のみを目的として描写されたものであることが理解されるべきである。以下の記述を読むことにより、そして本開示のその他の部分を読むことにより、開示の発明の精神および範囲内での各種変更および改良は当業者に容易に明らかになるだろう。
【００１２】
発明の概要
これらの目的、およびその他の目的に対し、本発明の目的は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチド、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドにより発現されるタンパク質、あるいはそのタンパク質を発現するそれらの変異体、またはストリンジェントな条件下にて配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のアンチセンス配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、を含むＣＳＧを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルの変化を、正常ヒト対照の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧのレベルと比較して分析することにより、大腸癌の存在を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＣＳＧレベルの変化が大腸癌に関連する方法を提供することである。
【００１４】
さらに、転移した大腸癌を有することが疑われるヒト患者を同定し、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＣＳＧについて分析し、かかる細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルを正常ヒト対照の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較することにより、転移をしたことがわかっていない大腸癌を有する患者における転移性大腸癌を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＣＳＧレベルの増加が、転移をした大腸癌に関連する方法が提供される。
【００１５】
発明はさらに、大腸癌を有するヒト患者を同定し、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料を分析し、かかる細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較することにより、かかる癌を有するヒトにおいて大腸癌をステージングする方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＣＳＧレベルの増加が、消退または寛解している癌に関連する方法を提供する。
【００１６】
さらに、転移の発生について、大腸癌を有するヒトにおいて大腸癌をモニタリングする方法が提供される。この方法は、転移したことがわかっていないかかる癌を有する患者を同定することと、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＣＳＧについて定期的に分析することと、かかる細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較することとを含み、ここで、正常ヒト対照に対する患者におけるＣＳＧレベルの増加が、転移した癌に関連している。
【００１７】
さらに、大腸癌を有するヒトにおけるＣＳＧレベルを観察することにより、大腸癌を有するヒトの大腸癌のステージの変化をモニタリングする方法が提供される。この方法は、かかる癌を有するヒト患者を同定することと、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＣＳＧについて定期的に分析することと、かかる細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較することとを含み、ここで、正常ヒト対照に対する患者におけるＣＳＧレベルの増加が、進行している癌に関連し、ＣＳＧレベルの減少が、消退または寛解している癌に関連する。
【００１８】
さらに、大腸癌のイメージングおよび処置に使用するための、ＣＳＧを標的とする新たな治療薬を設計する方法を提供する。例えば、一態様では、ＣＳＧを標的とする抗体、またはかかる抗体の断片のような治療薬を用い、疾患もしくは症状を検出または診断することを目的とし、患者におけるＣＳＧの局在を処置、検出またはイメージングすることができる。この態様では、正常組織に比して検出される標識抗体量の増加が腫瘍転移または成長の指標となるであろう。かかる抗体は、ポリクローナル、モノクローナルまたはオムニクローナルであることができ、あるいは分子生物学的技術により調製できる。
【００１９】
本発明にて、および本明細書全体にわたって用いられる場合、「抗体」という用語はまた、ＳＥＬＥＸと呼ばれ、当業者に既知であるｉｎ ｖｉｔｒｏ進化プロトコルに由来するものなどのアプタマーおよび一本鎖オリゴヌクレオチドを含むとされる。抗体は放射性同位体および常磁性金属を含むが、これらに限定されない各種の検出可能でかつ治療的な標識で標識することができる。ＣＳＧの濃度および／または活性を下げる小分子および抗体などの治療薬もまたＣＳＧの過剰発現を特徴とする疾患の処置に使用できる。かかる薬剤は本明細書中の教示に従い容易に同定できる。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らかになるだろう。しかしながら、以下の説明および具体的な例は、発明の好ましい態様を示しているが、例示のみを目的としていると理解されるべきである。以下の説明を読み、および本開示のその他部分を読むことから、開示の発明の精神および範囲内の各種変更および改良は当業者に容易に明らかになるだろう。
【００２１】
用語集
以下の例示の説明は本明細書中、特に例中に頻繁に使用されるある種の用語の理解を助けるために提供される。説明は、便宜的に提供されるものであり、発明を限定するものではない。
【００２２】
単離されたとは、その自然状態から「人工的」に変更されること、すなわち自然界で生じる場合、それはその本来の環境から変更されたか、または取り出されたか、あるいはその両方を意味する。
その用語が本明細書中で使用されるように、例えば、生きている動物に、その自然な状態で自然に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その自然状態の共存物質から分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものである。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離されたという用語は、それが天然に存在する染色体および細胞から分離されていることを意味する。
【００２３】
単離の一部として、または単離に続いて、かかるポリヌクレオチドを、例えば、突然変異誘発、融合タンパク質を形成させること、および宿主内での増殖または発現のために、ＤＮＡなどの他のポリヌクレオチドに結合させることができる。単離ポリヌクレオチドは、単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合させて、培養液または生体全体において、宿主細胞に導入することができる。培養液または生体全体において、宿主細胞へ導入する場合、その用語が本明細書中で用いられるように、かかるＤＮＡは、自然の形態または環境にないことから、依然単離されている。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、培地配合物、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、例えば細胞への導入用の溶液、化学または酵素反応のための組成物もしくは溶液などの組成物中に現れてもよいが、それらは、自然に存在する組成物ではなく、そこで、それらは、本明細書中で用いられるような用語の意味において、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのままである。
【００２４】
オリゴヌクレオチドは、比較的短いポリヌクレオチドを指す。多くの場合、この用語は一本鎖デオキシリボヌクレオチドを指すが、とりわけ、同様に一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡも指すことができる。
一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成装置にて行なわれるものなどの化学的方法により合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ媒介技術にて、ならびに細胞および生体でのＤＮＡ発現による、各種のその他の方法により作製することができる。
【００２５】
まず化学的に合成したＤＮＡは、典型的には、５’リン酸塩なしで得られる。かかるオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子形成に典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用する連結反応によるホスホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドの連結が望ましい場合には、キナーゼおよびＡＴＰを使用するものなどの標準的技術によりリン酸塩を付加することができる。
【００２６】
化学的に合成したオリゴヌクレオチドの３’末端は、遊離の水酸基を一般的に有しており、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼの存在下にて、容易に別のオリゴヌクレオチドなどの別のポリヌクレオチドの５’リン酸塩とホスホジエステル結合を形成するだろう。周知のとおり、この反応は、望ましい場合、連結前に他のポリヌクレオチドの５’リン酸塩を除去することで選択的に阻止することができる。
【００２７】
ポリヌクレオチドは一般に、任意のポリリボヌクレオチドあるいはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、ならびに修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡを包含する。したがって、例えば、本明細書中で用いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、あるいはより一般的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を表す。
【００２８】
さらに、本明細書中で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域を指す。かかる領域内の鎖は同一分子または異なる分子由来であってもよい。この領域には、１または２以上の分子全てを含んでもよいが、より一般的にはいくつかの分子の領域のみが含まれる。三重らせん領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドという用語にはまた、１または２以上の修飾塩基を含有する上記のようなＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。すなわち、安定性またはその他の理由から修飾された主鎖を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中でその用語が意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの稀な塩基あるいはトリチル化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも、２例のみ挙げたが、本明細書中でその用語が使用されているポリヌクレオチドである。
【００３０】
当業者に既知の有益な用途を提供する様々な修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされることが理解されるだろう。本明細書中で使用されるポリヌクレオチドという用語には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびにとりわけ単純および複雑な細胞を含む、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態が包含される。
【００３１】
ポリペプチドは、本明細書中で使用される場合、以下に記載の全てのポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの基本構造は既知であり、当該分野の多くの教本およびその他の刊行物に記載されている。この情況では、本明細書中ではその用語は、ペプチド結合により直鎖状に相互に結合された２または３以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指すのに用いられる。本明細書中で用いる場合、その用語は一般には例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖型、および当該分野において一般にタンパク質と呼ばれる、多くの型がある長鎖型の両方を指す。
【００３２】
ポリペプチドが２０種類の天然アミノ酸と一般に呼ばれる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことが多々あること、および末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸が既定のポリペプチドにおいて、プロセシングやその他の翻訳後修飾のような自然のプロセスにより、または当該技術分野で既知の化学的修飾技術によって修飾されてもよいことが理解されるだろう。ポリペプチド中に自然に生ずる一般的修飾でさえ、あまりに多すぎて、本明細書中にその全体を列挙することはできないが、それらは基礎的テキスト、および詳細なモノグラフ、ならびに多くの研究文献に十分に記載されており、それらは当業者にとって既知である。
【００３３】
本発明のポリペプチド中に存在する既知の修飾は、代表的な少数のもの挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋形成、システイン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化を含む。
【００３４】
かかる修飾は当業者に既知であり、科学文献に詳細記載されている。グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化を含むがこれらに限定されない幾つかの特に一般的な修飾は、最も基本的なテキスト、例えばＰＲＯＴＥＩＮＳ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）に記載されている。
【００３５】
例えばＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）の中の、Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， ｐｇｓ， １−１２、Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６−６４６ （１９９０）、およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａａｃｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２ （１９９２）などの、多くの詳しいレビューが本件に利用できる。
【００３６】
本発明のポリペプチドは必ずしも全体が線状ではないということは理解されるであろう。むしろ、ポリペプチドはユビキチン化の結果により分枝されていてもよく、そして、それらは、一般に自然のプロセッシング現象を含む翻訳後の現象、および自然には起こらない人工的な操作によりもたらされる現象の結果として、分枝を伴った、または伴わない、環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳的自然プロセスにより、ならびに完全な合成的方法によっても合成され得る。
【００３７】
修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド中のいかなる場所でも起こり得る。実際に、共有結合的修飾によるポリペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるいは両方の遮蔽は天然および合成ポリペプチドにおいて一般的であり、かかる修飾は、本発明のポリペプチド中にも同様に存在し得る。例えば、タンパク質分解プロセシング前に大腸菌で作られたポリペプチドのアミノ末端残基は、大部分が不変的にＮ−ホルミルメチオニンであろう。
【００３８】
ポリペプチド中に見られる修飾は、多くの場合それが作製される条件を反映するであろう。例えば、宿主内でクローンニングした遺伝子を発現することにより作製されたポリペプチドでは、大部分の修飾の性質および程度が宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されるであろう。例えば、周知のように、グリコシル化は大腸菌などの細菌性宿主ではたいてい起こらない。
【００３９】
したがって、グリコシル化が望まれる場合には、ポリペプチドはグリコシル化用宿主、一般には真核生物細胞で発現させるべきである。しばしば昆虫細胞は、哺乳動物細胞と同一の翻訳後グリコシル化を行う。したがって、とりわけ自然なパターンのグリコシル化を有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために、昆虫細胞発現系が開発されている。他の修飾にも同様の考察が適用される。
【００４０】
同タイプの修飾が、所定のポリペプチド中の複数の部位にて同一程度または様々な程度で存在し得ることが理解されるだろう。また所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含んでもよい。
一般に、本明細書中で使用される場合には、ポリペプチドという用語は、かかる全ての修飾、特に宿主細胞中にてポリヌクレオチドを発現させることにより合成されたポリペプチド中に存在する修飾を包含する。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、それぞれ参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。
【００４２】
変異体ポリヌクレオチドに関して、一般にその差は、参照ヌクレオチドと変異体ヌクレオチドの配列が全体としては極めて類似しており、多くの領域で同一であるように制限される。したがって、変異体のヌクレオチド配列の変化はサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）であり得る。すなわち、それらはポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変化させないだろう。変化がこの型のサイレントな変化に限定される場合、変異体は参照と同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするだろう。あるいは、変異体のヌクレオチド配列中の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変してもよい。かかるヌクレオチドの変化は、参照配列によりコードされるポリペプチド中にアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断を生じ得る。
【００４３】
変異体ポリペプチドに関して、一般にその差は、参照体と変異体の配列が全体としては極めて類似しており、多くの領域で同一であるように制限される。例えば、変異体ポリペプチドと参照ポリペプチドは、１または２以上の、置換、付加、欠失、融合および切断によりアミノ酸配列が異なってもよく、それらは、いかなる組み合わせで存在してもよい。
【００４４】
本明細書中で用いる受容体分子は、本発明のＣＳＧＳポリペプチドと特異的に結合または相互作用する分子を指し、好ましい古典的な受容体だけでなく、発明のポリペプチドと特異的に結合または相互作用するその他分子も包含する（それらはまたそれぞれ「結合分子」および「相互作用分子」、ならびに「ＣＳＧ結合または相互作用分子」とも呼ばれる）。
【００４５】
本発明のポリペプチドと、受容体分子または結合分子または相互作用分子を含むかかる分子との結合は、本発明のポリペプチドに限定され得る（それは非常に高度に好ましい）か、または本発明のポリペプチドに高度に特異的であり得る（それは高度に好ましい）か、または本発明のポリペプチドを含むタンパク質のグループに高度に特異的であり得る（それは好ましい）か、あるいはその内の少なくとも１つが本発明のポリペプチドを含むタンパク質の複数のグループに特異的であり得る。
【００４６】
受容体はまた、本発明のポリペプチドに結合する、抗体および抗体由来試薬のように、非天然でもあってもよい。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ以下に詳述するように、本明細書中でＣＳＧと称する、新規大腸特異ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。
【００４８】
ポリヌクレオチド
本発明の一側面によれば、ＣＳＧポリペプチドをコードする単離ＣＳＧポリヌクレオチドが提供される。
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２に記載のポリヌクレオチド配列などの本明細書中に提供された情報を用いて、ＣＳＧをコードする本発明のポリヌクレオチドは、出発原料としてヒト腫瘍細胞由来のｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡのクローニング法などの標準的クローニングおよびスクリーニング手法を用いて得てもよい。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態、あるいは、例えば、クローニングにより得た、もしくは化学合成技術により、またはその組み合わせにより生産されたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖であるか、またはそれはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖でもよい。
【００５０】
ポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドのコード配列と同一であってもよい。またそれは、遺伝コードの冗長性（縮重）の結果として、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２によりコードされるのと同じポリペプチドをコードする、異なる配列を持つポリヌクレオチドであってもよい。
【００５１】
これらのポリペプチドをコードする、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２などの本発明のポリヌクレオチドは、それ自身成熟ポリペプチド用コード配列を含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、成熟ポリペプチド用コード配列およびプレタンパク質、またはプロタンパク質またはプレプロタンパク質配列などの、リーダー配列あるいは分泌配列をコードする配列などのさらなるコード配列含んでもよい。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、成熟ポリペプチドをコードする配列を、上記のさらなるコード配列を伴って、または伴わずに、追加の、非コード配列と一緒に含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドに組込んでもよい追加の非コード配列の例は、例えば、転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含むｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性の役割を果たす転写された非翻訳配列などのイントロン、ならびに非コード５’および３’配列、ならびに追加の機能を提供するようなアミノ酸をコードする、追加のコード配列を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
したがって、例えば、ポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドなどの、マーカー配列と融合してもよい。発明のこの側面のある好ましい実施例では、マーカー配列はとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）に提供されているタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８６： ８２１−８２４（１９８９））に記載されるように、例えばヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。ＨＡタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープである（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３７： ７６７ （１９８４））。
【００５４】
上記によれば、本明細書中で使用される「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、本発明のポリペプチドをコードする配列、特に配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語は、ポリペプチドをコードする単一連続領域または不連続領域（例えばイントロンにより中断された）を、さらにコードおよび／または非コード配列を含有してもよいさらなる領域とともに含むポリヌクレオチドを包含する。
【００５５】
本発明は、さらにＣＳＧポリペプチドの断片、類縁体および誘導体をコードする、本明細書中で上述したポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、天然の対立遺伝子変異体のような天然型変異体であってもよく、またはそれは天然に生ずることが知られていない変異体でもよい。かかる非天然型のポリヌクレオチド変異体は、ポリヌクレオチド、細胞または生体に適用されるものを含む突然変異誘発技術により作製され得る。
【００５６】
この観点の変異体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加により上記ポリヌクレオチドとは異なる変異体である。置換、欠失または付加は、１または２以上のヌクレオチドを包含する。変異体はコードまたは非コード領域、あるいはその両方が変更され得る。コード域内の変更は、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を生じてもよい。
【００５７】
この観点における本発明の特に好適な態様としては、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２を含むＣＳＧポリヌクレオチドによってコードされたのと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらの変異体、類縁体、誘導体および断片、ならびに変異体、類縁体および誘導体の断片がある。さらにこの観点で特に好適なものは、ポリペプチドの変異体、類縁体、誘導体および断片、ならびに該断片の変異体、類縁体および誘導体をコードするＣＳＧポリヌクレオチドであって、その中で幾つか、少数の、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１個または０個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されたものである。
【００５８】
これらの中で特に好ましいものは、ＣＳＧの特性および活性を変化させない、サイレントな置換、付加および欠失である。またこの点で特に好ましいものは、保存的な置換である。最も高度に好ましいのは、置換のない、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２によってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５９】
本発明のさらに好ましい態様は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一であるＣＳＧポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドである。より好ましいのは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一である領域を含むＣＳＧポリヌクレオチドである。
【００６０】
この点に関して、それ（ｔｈｅ ｓａｍｅ）と少なくとも９０％同一であるＣＳＧポリヌクレオチドが特に好ましく、これらの特に好ましいＣＳＧポリヌクレオチドの中でも、少なくとも９５％であるものが特に好ましい。さらに、少なくとも９５％であるものの中でも、少なくとも９７％であるものが非常に好ましく、これらの中でも、少なくとも９８％および９９％であるものが特に非常に好ましく、少なくとも９９％であるものが最も好ましい。
【００６１】
さらに、この点に関して特に好適な態様は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドによってコードされた成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００６２】
本発明はさらに、上記ＣＳＧ配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この観点では、本発明は特に、ストリンジェントな条件下にて本明細書中で上述したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いる場合、 「ストリンジェントな条件」という用語は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。
【００６３】
発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中でさらに記載するように、例えば本明細書記載の本発明のポリヌクレオチドは、ＣＳＧをコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、および、これらＣＳＧと高い配列類似性を有する他遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用ハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。かかるプローブは一般に、少なくとも１５塩基を含むだろう。好ましくは、かかるプローブは、少なくとも３０塩基を含み、少なくとも５０塩基を含んでもよい。
【００６４】
例えば、本発明のＣＳＧのコード領域は、既知のＤＮＡ配列から合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることにより単離してもよい。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、どのライブラリーの成員にプローブがハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするのに用いられる。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、特にポリヌクレオチドアッセイに関して、本明細書中にさら記載するように、ヒトの疾患に対する治療薬や診断薬発見のための研究用試薬および材料として用いられ得る。
【００６６】
ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質およびさらなるアミノまたはカルボキシル末端アミノ酸、あるいは成熟ポリペプチド内部のアミノ酸であるポリペプチド（例えば成熟形態が、１つよりも多いポリペプチド鎖を有する場合）をコードしてもよい。かかる配列は特に、前駆体からのタンパク質の成熟形態へのプロセシングの役割を果たしてもよく、タンパク質輸送を促進してもよく、タンパク質の半減期を延長または短縮してもよく、あるいはアッセイまたは生産に関するタンパク質の操作を容易にしてもよい。一般にｉｎ ｓｉｔｕでの場合に、さらなるアミノ酸は、細胞酵素により成熟タンパク質から加工される。
【００６７】
１または２以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を持つ前駆体タンパク質は、ポリペプチドの不活性体であり得る。プロ配列が取り除かれると、かかる不活性前駆体は一般に活性化される。活性化の前にプロ配列の幾らかまたは全てが取り除かれてもよい。一般に、かかる前駆体は、プロタンパク質と呼ばれる。
【００６８】
まとめると、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質にリーダー配列を加えたもの（プレタンパク質と称してもよい）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１または２以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはプロタンパク質の前駆体であり、ポリペプチドの活性かつ成熟体を生ずるプロセシング工程中に一般には取り除かれる、１または２以上のプロ配列を有するプレプロタンパク質をコードし得る。
【００６９】
ポリペプチド
本発明はさらに、ＣＳＧポリペプチド、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、これらポリペプチドの断片、類縁体および誘導体にも関する。本発明のポリペプチドを参照する場合、「断片」、「誘導体」および「類縁体」という用語は、かかるポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。したがって、類縁体は、プロタンパク質部分の切断により活性化され、活性成熟ポリペプチドを産生することができるプロタンパク質を含む。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってもよい。ある好ましい態様では、それは組換えポリペプチドである。
【００７１】
本発明のポリペプチドの断片、誘導体、または類縁体は、（ｉ）１または２以上のアミノ酸残基が保存的あるいは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換され、かかる置換アミノ酸残基は遺伝的コードによりコードされるものであってもよく、またはそうでなくてもよいもの、（ｉｉ）１または２以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合しているもの、または（ｉｖ）成熟ポリペプチドに、リーダーまたは分泌配列あるいは成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質の精製に利用される配列などのさらなるアミノ酸が融合されているものであってもよい。かかる断片、誘導体および類縁体は、本明細書中の教示により、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００７２】
好ましい変異体としては、保存的アミノ酸置換によって参照体から変化したものである。かかる置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性を持つ別のアミノ酸により置換するものである。典型的に保存的置換とし捉えられるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間でのあるものから別のものへの置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間の置換である。
【００７３】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離形態で提供され、好ましくは均一になるまで精製される。
【００７４】
本発明のポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（特に、成熟ポリペプチド）ならびに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと少なくとも７５％の類似性（好ましくは少なくとも７５％の同一性）、より好ましくは少なくとも９０％の類似性（好ましくは少なくとも９０％の同一性）、さらに好ましくは少なくとも９５％の類似性（好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを包含する。また一般に少なくとも３０個のアミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分が包含される。
【００７５】
当該技術分野にて既知のとおり、２つのポリペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列を比較し、一方のポリペプチド配列のその保存的アミノ酸置換と第２のポリペプチドの置換とを比較することで決定される。
本発明のポリペプチドの断片または部分は、ペプチド合成により対応する完全長ポリペプチドを産生するために用いてもよい。したがって、断片は完全長ポリペプチド産生のための中間体として使用してもよい。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分は、本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成するに使用してもよい。
【００７６】
断片
また本発明のこの側面の好ましい別態様としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの断片含むポリペプチドがある。この観点では、断片は上記ＣＳＧポリペプチド、およびそれらの変異体または誘導体のアミノ酸配列と部分的には完全に同一であるが、全てが同一ではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００７７】
かかる断片は、「遊離体（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であってもよく、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部でもなく、融合されていなくてもよく、またそれらが大型ポリペプチドの中に含まれてもよく、それらは、その大型ポリペプチドの一部または領域を形成する。大型ポリペプチド内に含まれる場合には、本明細書中に記載の断片は最も好ましくは単一の連続領域を形成する。しかしながら、複数の断片が単一の大型ポリペプチド内に含まれてもよい。
【００７８】
例えば、ある好ましい態様は、宿主内での発現用に設計された前駆体ポリペプチド内に含まれ、ＣＳＧ断片のアミノ末端に融合された異種のプレおよびプロポリペプチド領域、および該断片のカルボキシル末端に融合されたさらなる領域を有する本発明のＣＳＧポリペプチドの断片に関する。したがって、本明細書中に意図する意味の一側面における断片は、ＣＳＧポリペプチドに由来する融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の１または２以上の部分に関する。
【００７９】
本発明のポリペプチド断片の代表例として、約１５〜約１３９個のアミノ酸を有する上記断片が挙げられ得る。この情況においては、「約」とは、特に引用される範囲、および一方の極値または両極値においていくつか、数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸だけ広い、または狭い範囲を含む。この観点において非常に好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が５アミノ酸程度増減する範囲である。特に非常に好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が３アミノ酸程度増減する範囲である。特に好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が１アミノ酸増減する範囲、または、付加または欠失のない引用範囲である。この観点においてすべてのうち最も非常に好ましいのは、約１５〜約４５アミノ酸からなる断片である。
【００８０】
本発明の特に好ましい断片としては、ＣＳＧポリペプチドの切断突然変異体がある。切断突然変異体としては、アミノ末端を含む連続残基（すなわち連続領域、部分、または一部）またはカルボキシル末端を含む連続残基の欠失、あるいは二重切断突然変異体の場合には、一方がアミノ末端を含み、もう一方がカルボキシル末端を含む２つの連続残基の欠失を除く、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＳＧポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは誘導体が挙げられる。本明細書記載のサイズ範囲を有する断片もまた、切断断片の好ましい態様であり、一般には断片の中で特に好ましい。
【００８１】
また本発明のこの側面において好ましいのは、本発明のＣＳＧポリペプチドの構造的または機能的特質を特徴とする断片である。この観点における本発明の好ましい態様としては、本発明のＣＳＧポリペプチドのアルファへリックスおよびアルファへリックス形成領域（「アルファ領域」）、ベータシートおよびベータシート形成領域（「ベータ領域」）、回転（ｔｕｒｎ）および回転形成（ｔｕｒｎ−ｆｏｒｍｉｎｇ）領域（「回転領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性指数（ｈｉｇｈ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）領域を含む断片が挙げられる。
【００８２】
上記のタイプの領域は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列の分析によって定法により同定される。好ましい領域は、ガルニエ−ロブソン（Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ）アルファ領域、ベータ領域、回転領域およびコイル領域、チョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）アルファ領域、ベータ領域および回転領域、カイト−ドリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）親水性領域および疎水性領域、アイゼンベルク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）アルファおよびベータ両親媒性領域、カルプルス−シュルツ（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ）フレキシブル領域、エミニ（Ｅｍｉｎｉ）表面形成領域およびジャムセン−ウォルフ（Ｊａｍｓｅｎ−Ｗｏｌｆ）高抗原性指数領域を含む。
【００８３】
この観点において非常に好ましい断片としては、上記特徴の幾つかのような複数の構造的特徴を組み合わせるＣＳＧの領域を含む断片である。この点に関し、ＣＳＧポリペプチドの選択された残基により規定される領域は、その全てが回転領域、親水性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性指数領域に高度に特徴的なアミノ酸構成により特徴付けられており、特に非常に好ましい領域である。
【００８４】
かかる領域は、大型ポリペプチド内に含まれてもよく、または上記のような本発明の好ましい断片そのものでもよい。この項で用いられる「約」という用語は、断片に関して一般的に記載した上記の意味を有することが理解されるであろう。
【００８５】
さらに好ましい領域は、ＣＳＧポリペプチドの活性を媒介する領域である。この観点における最も非常に好ましいものは、同様の活性または改良された活性を有するか、あるいは望ましくない活性が低減された断片を含む、ＣＳＧポリペプチドの化学的、生物学的、またはその他の活性を有する断片である。この観点において非常に好ましいのは、関連ポリペプチドの活性領域と配列または位置について、あるいは配列および位置の両方について相同的であり、大腸特異結合タンパク質を含む断片である。これら観点において特に好ましい断片としては、上記の切断突然変異体である。
【００８６】
本発明はまた、上記断片をコードするポリヌクレオチド、断片をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、特にストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするもの、および、該断片をコードするポリヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌクレオチドに関することが理解されるであろう。これらの観点において、好ましいポリヌクレオチドは上記の好ましい断片に対応するものである。
【００８７】
融合タンパク質
本発明の１つの態様において、本発明のＣＳＧポリペプチドは、好ましくは他のタンパク質に融合される。これらの融合タンパク質は様々な用途に用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドをＨｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメインおよびマルトース結合タンパク質に融合すると精製が容易になる（ＥＰ Ａ ３９４，８２７、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． ，Ｎａｔｕｒｅ ３３１： ８４−８６ （１９８８）も参照）。同様にＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３およびアルブミンへの融合は、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長する。
【００８８】
本発明のポリペプチドに融合された核局在シグナルは、特定の細胞内局在性についてタンパク質を標的にすることができ、一方共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは融合タンパク質の活性を増加または低下させることができる。融合タンパク質はまた１つより多い機能を持つキメラ分子を作り出すこともできる。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質に比べ、融合タンパク質の溶解度および／または安定性を高めることができる。これら上記の全てのタイプの融合タンパク質は、よく知られた手順にしたがって作製することができる。
【００８９】
例えば、ＣＳＧポリペプチドを、以下の手順を介してＩｇＧ分子に融合することができる。簡単に述べると、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分を、配列の５’および３’末端に及ぶプライマーを用い、ＰＣＲ増幅する。これらプライマーはまた、発現ベクター、好ましくは哺乳動物発現ベクターへのクローニングを容易にするために好都合な制限酵素部位を有する。
【００９０】
例えば、ｐＣ４（アクセッション番号２０９６４６）を用いる場合、ヒトＦｃ部分はＢａｍＨＩクローニング部位に連結できる。この手順では、３’ＢａｍＨＩ部位は破壊されなければならない。次に、ヒトＦｃ部分を含むベクターはＢａｍＨＩにより再度制限処理され、これによりベクターは直線化され、本発明のＣＳＧポリヌクレオチドがこのＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドは終止コドンなしにクローニングされることが好ましい。さもなければ融合タンパク質は産生されない。
【００９１】
天然に存在するシグナル配列を用いて分泌タンパク質を産生する場合には、ｐＣ４は第２シグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在するシグナル配列を使用しない場合には、ベクターは異種シグナル配列を含むように改変することができる（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１参照）。
【００９２】
診断アッセイ
本発明はまた、ヒト患者のＣＳＧレベルと、正常ヒト対照でのＣＳＧのレベルとを比較することにより、癌を検出、診断、モニタリング、ステージング、および予後判定する定量的および定性的両方の診断アッセイならびに方法に関する。本発明に関して、ＣＳＧレベルが意味するものは、とりわけ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子により発現される未変性タンパク質である。
【００９３】
本明細書中で「ＣＳＧ」とはまた、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２と比較した場合にヌクレオチド配列に変化を含むが、依然として同一のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。検出される未変性タンパク質は、完全体、分解産物、分子複合体または化学的修飾体であってもよい。
【００９４】
あるいは、本明細書中で用いられる場合、ＣＳＧが意味するものは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチド配列によりコードされる未変性ｍＲＮＡ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のレベル、またはストリンジェントな条件下にて配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のアンチセンス配列にハイブリダイズが可能なポリヌクレオチドのレベルである。
【００９５】
かかるレベルは、好ましくは、正常および異常レベルの決定を含む、細胞、組織および／または体液の少なくとも１つについて測定される。したがって、例えば正常対照体液、細胞、または組織試料に比較したＣＳＧタンパク質の過剰発現を診断するための本発明による診断アッセイは、大腸癌の存在の診断に使用され得る。
【００９６】
本発明のすべての方法は、ＣＳＧと同様に、任意に他の癌マーカーのレベルを決定することを含んでもよい。ＣＳＧの以外の本発明に有用な他の癌マーカーは、試験される癌に依存しており、当業者に既知である。
【００９７】
本発明は、好ましくは同種類の正常ヒト対照由来の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較した、細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルの変化を分析することにより、大腸癌の存在を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＣＳＧレベルの増加が、大腸癌の存在に関連する方法を提供する。
【００９８】
本発明を限定するものではないが、典型的に、定量的診断アッセイにおいて、試験される患者が癌を有することを示す陽性の結果は、ＣＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、正常ヒト対照の好ましくは同一細胞、組織または体液中により、少なくとも２倍高く、最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。
【００９９】
本発明はまた、転移の発生に関して、いまだ転移していない大腸癌を有する患者において、転移性大腸癌を診断する方法も提供する。本発明の方法では、転移した大腸癌を持つと疑われる（しかしそれまでに転移したことはわかっていない）ヒト癌患者が同定される。このことは当業者に既知の各種手段により達成される。
【０１００】
本発明では、細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルの存在を決定することは、特に転移をしていない大腸癌と転移をしている大腸癌とを区別するのに有用である。従来技術は、転移をしている大腸癌と転移をしていない大腸癌とを区別することが難しく、適切な処置の選択はかかる知識に依存することが多い。
【０１０１】
本発明では、かかる細胞、組織または体液にて測定される癌マーカーレベルはＣＳＧであり、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較される。すなわち、観察される癌マーカーがまさに血清中のＣＳＧである場合、このレベルは好ましくは、正常ヒト対照の血清中のＣＳＧレベルと比較される。正常ヒト対照に対する患者におけるＣＳＧの増加は、転移を有する大腸癌に関連する。
【０１０２】
本発明を限定するものではないが、典型的に、定量的診断アッセイにおいて試験またはモニターされる患者における癌が転移していることを示す陽性結果は、ＣＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、正常患者の好ましくは同一細胞、組織または体液中よりも、少なくとも２倍高く、最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。
【０１０３】
本明細書中で用いる正常ヒト対照は、癌を有しないヒト患者および／または患者由来の非癌性試料を含み、転移を診断またはモニタリングする方法では、正常ヒト対照はまた、好ましくは、信頼性の高い方法により転移していない大腸癌を有することが決定されているヒト患者由来の試料を含んでもよい。
【０１０４】
ステージング
本発明はまた、ヒト患者における大腸癌をステージングする方法も提供する。この方法は、かかる癌を持つヒト患者を同定すること、およびかかるヒト患者由来の細胞、組織または体液をＣＳＧについて分析することを含む。次に、患者において決定されたＣＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較し、ここで、正常ヒト対照に対するヒト患者のＣＳＧレベルの増加が進行している癌に関連し、ＣＳＧレベルの低下（それでも真の正常レベルよりは高い）が、消退または寛解している癌に関連する。
【０１０５】
モニタリング
さらにかかる癌を持つヒト患者において、転移の発生に関して大腸癌をモニタリングする方法を提供する。この方法は、転移がしていることがわかっていないかかる癌を持つヒト患者を同定すること、かかる患者由来の細胞、組織または体液を定期的にＣＳＧレベルについて分析すること、およびヒト患者において決定されたＣＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較することを含み、ここで正常ヒト対照に対するヒト患者のＣＳＧレベルの増加が、転移している癌に関連する。この方法では、正常ヒト対照試料にはまた、以前の患者試料も含まれ得る。
【０１０６】
さらに本発明により提供されるのは、大腸癌のステージの変化を、かかる癌を有するヒト患者においてモニタリングする方法である。該方法は、かかる癌を有するヒト患者を同定すること、かかるヒト患者由来の細胞、組織または体液をＣＳＧについて定期的に分析すること、およびヒト患者において決定されたＣＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＣＳＧレベルと比較することを含み、ここで正常ヒト対照に対するヒト患者におけるＣＳＧレベルの増加が、ステージが進行している癌に関連し、ＣＳＧレベルの減少が、ステージが後退しているかまたは寛解している癌に関連する。この方法において、正常ヒト対照試料には、以前の患者試料も含まれる得る。
【０１０７】
転移の発生に関しての患者のモニタリングは定期的であり、好ましくは４半期ごとに実施される。しかしながら、これは、癌、特定患者および癌のステージに依存して、より高頻度で、またはより低頻度で実施されてもよい。
【０１０８】
予後判定試験および臨床試験モニタリング
本明細書中に記載の方法はさらに、ＣＳＧレベル増加に関連した疾患または障害を発症する対象、またはその危険性を有する対象を同定するための予後判定アッセイとしても利用できる。本発明は、試験試料をヒト患者より得て、ＣＳＧを検出する方法を提供する。正常ヒト対照に比べ高レベルのＣＳＧの存在は、癌、特に大腸癌を発症する危険性があるヒト患者のための診断である。
【０１０９】
本発明のＣＳＧの発現または活性を低下させる治療薬の有効性は、臨床試験中における、または、ヒト細胞におけるものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイにおける、ヒト患者のＣＳＧの発現レベルを分析することによりモニタリングすることもできる。このようにして、遺伝子発現パターンは、ヒト患者、場合によっては細胞の、試験される薬剤に対する生理学的応答を示すマーカーとして利用できる。
【０１１０】
遺伝子病変および突然変異の検出
本発明の方法はまた、ＣＳＧにおける遺伝子病変、または突然変異の検出にも使用することができ、これにより遺伝子病変を持つヒトが大腸癌に対する危険性を有するか、または大腸癌を有するかどうかを決定することができる。遺伝子病変は例えば、本発明のＣＳＧからの１または２以上のヌクレオチドの欠失および／または付加および／または置換の存在、ＣＳＧの染色体再配列、ＣＳＧの異常修飾（例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターン）、ＣＳＧのｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、ＣＳＧの対立遺伝子の欠損、および／またはＣＳＧタンパク質の不適切な翻訳後修飾の存在を確認することにより検出することができる。本発明のＣＳＧにおけるかかる病変を検出する方法は、当業者に既知である。
【０１１１】
例えば、１つの態様においては、本発明のＣＳＧポリヌクレオチドに対応する遺伝子の変化は、所定の表現型（疾患など）を示す全集団または個々の患者からのＲＮＡの単離によって決定される。次に、当該技術分野にて既知のプロトコルを用いて、これらのＲＮＡ試料からｃＤＮＡが生成される。これらの技法を詳述した多くの実験室マニュアルの代表例である、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照。
【０１１２】
次に、ｃＤＮＡを、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２において所定の領域を取り囲むプライマーを用いるＰＣＲ用の鋳型として使用する。ＰＣＲ条件は、典型的には、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： ７０６ （１９９１）に記載される緩衝溶液を用いて、９５℃での３０秒間、５２〜５８℃での６０〜１２０秒、および７０℃での６０〜１２０秒の３５サイクルから構成される。ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端にて標識したプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を配列決定する。
【０１１３】
選択エキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定され、ゲノムＰＣＲ産物を分析して、結果を確認する。次に、突然変異が疑われるＰＣＲ産物をクローニングして、配列決定して、直接シークエンスの結果を確認する。Ｈｏｌｔｏｎ Ｔ． Ａ． ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ， Ｍ． Ｗ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９： １１５６ （１９９１）に記載されるように、ＰＣＲ産物をＴ尾状（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ベクターにクローニングし、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて配列決定する。病気に冒されていない個体に存在しない突然変異により、病気に冒された個体を同定する。
【０１１４】
ゲノム再配列もまた、ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化を決定する方法として観察できる。この方法では、ゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸塩（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）でニックトランスレーションし、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５： ７３−９９ （１９９１）に記載されるように、ＦＩＳＨを実施する。標識プローブを用いたハイブリダイゼーションは、対応するゲノム座への特異的ハイブリダイゼーションのための、大過剰のヒトＤＮＡを用いて行われる。
【０１１５】
４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールおよびヨウ化プロピジウムで染色体を対比染色し、ＣおよびＲバンドの組合せを生じさせる。正確なマッピングのための整列画像（ａｌｉｇｎｅｄ ｉｍａｇｅ）は、冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ）および可変励起波長フィルターを併合したトリプルバンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， ＶＴ）を用いて得られる（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｃｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ．， ８： ７５ （１９９１））。
【０１１６】
画像収集、分析および染色体分画長測定は、ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃａｌプログラムシステム（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）を用いて行なう。プローブによりハイブリダイズされるゲノム領域の染色体変化は、挿入、欠失および転座として同定される。これらの変化は、関連疾患用診断マーカーとして用いられる。
【０１１７】
アッセイ技術
患者由来の試料における、本発明のＣＳＧなどの遺伝子の発現レベル（タンパク質レベルを含む）を決定するのに使用可能なアッセイ技術は、当業者に既知である。かかるアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよびプロテオミクスアプローチ、二次元ゲル電気泳動法（２Ｄ電気泳動）およびマススペクトロメトリーまたはタンパク質相互作用プロファイリングのような非ゲルベースのアプローチが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、ＥＬＩＳＡは生物学的液体中の遺伝子の発現タンパク質の診断に好まれることが多い。
【０１１８】
ＥＬＩＳＡアッセイはまず、販売元から容易に入手できない場合には、ＣＳＧに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらにＣＳＧに特異的に結合するレポーター抗体が一般には調製される。レポーター抗体は、検出可能な試薬、例えば放射性、蛍光または酵素試薬、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素あるいはアルカリホスファターゼに結合される。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡを行なうには、ＣＳＧに特異的な抗体を、抗体を結合する固体支持体、例えばポリスチレンディッシュ上でインキュベートする。次に、ディッシュの上のフリーなタンパク質結合部位をウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質とインキュベートすることにより覆う。次に、分析する試料をこのディッシュにてインキュベートし、その間にＣＳＧはポリスチレンディッシュに結合した特異抗体に結合する。未結合試料は緩衝液により洗い流される。ＣＳＧに対し特異的であり、かつ西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能試薬に結合しているレポーター抗体をディッシュに載せ、その結果レポーター抗体はＣＳＧに結合している任意のモノクローナル抗体に結合する。
【０１２０】
次に、未結合のレポーター抗体を洗い流す。次に、比色基質を含むペルオキシダーゼ活性用試薬をディッシュに添加する。ＣＳＧ抗体に結合した固定化ペルオキシダーゼが着色反応産物を生ずる。所定時間中に発色した色の量は、試料中に存在するＣＳＧタンパク質の量に比例する。定量的な結果は典型的に、標準曲線を参照することで得られる。
【０１２１】
競合アッセイもまた使用されるが、この場合ＣＳＧに特異的な抗体は、固体支持体に結合され、標識ＣＳＧおよび宿主由来の試料を固体支持体の上を通過させる。固体支持体に結合した検出される標識量を試料中のＣＳＧ量に相関させることができる。
【０１２２】
また、本発明のＣＳＧの核酸配列の全て、または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、核酸法を、大腸癌に関するマーカーとしてのＣＳＧのｍＲＮＡの検出に使用することもできる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその他の核酸法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）は、各種悪性腫瘍の診断およびモニタリングのための悪性細胞の検出に使用できる。
【０１２３】
例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、数千の他のｍＲＮＡ種の複雑な混合物中において特異的なｍＲＮＡ集団の存在を検出するのに使用可能な強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲでは、ｍＲＮＡ種はまず、酵素、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、次にｃＤＮＡは標準的ＰＣＲ反応で増幅される。したがって、ＲＴ−ＰＣＲは増幅により、単一のｍＲＮＡ種の存在を示すことができる。したがって、ｍＲＮＡがそれを産生する細胞に非常に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、特定のタイプの細胞の存在を同定することができる。
【０１２４】
固体支持体上に配列された（すなわちグリッディング）クローンまたまオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、その遺伝子の発現の検出、およびその発現レベルの定量の両方に使用できる。このアプローチでは、ＣＳＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、基板上に固定される。この基板はガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含むが、これらに限定されない任意の適切なタイプであり得る。ＣＳＧ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部がこの基板に結合され、次にＲＮＡまたはＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーであり得る、当該組織から単離された分析体とインキュベートされる。
【０１２５】
基板に結合したＤＮＡと分析体との間のハイブリダイゼーションは、分析体の放射性標識または蛍光標識、またはハイブリッドを検出するために設計した二次分子を含むが、これらに限定されない複数の手段により検出および定量することができる。遺伝子発現レベルの定量は、分析体からのシグナル強度を既知の標準物質から決定されたシグナル強度と比較することで行うことができる。標準物質は標的遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得ることができ、その収量を定量し、次にその物質を使って標準曲線を作成する。
【０１２６】
プロテオミクスアプローチのうち、２Ｄ電気泳動法が当業者に既知の技術である。血清などの試料からの個別のタンパク質の単離は、通常ポリアクリルアミドゲル上において、タンパク質を異なる特性により順次分離することで達成される。まずタンパク質は、電流を用い大きさにより分離される。電流は全てのタンパク質に均一に作用し、その結果小型のタンパク質ほど大型のタンパク質に比べゲル上を遠くへ移動する。
【０１２７】
第二の次元は、第一の次元に対し垂直方向に電流を作用させ、タンパク質の大きさに基づいてではなく、各タンパク質の持つ特異的電荷により分離する。異なる配列を持つ２つのタンパク質は、大きさと電荷の両方に基づいて同一であることはないので、２Ｄ分離の結果は、各タンパク質が特有のスポットを占有する方形のゲルである。このスポットの化学的または抗体プローブによる分析、あるいは続くタンパク質のマイクロシークエンシングにより、試料中の所定のタンパク質の相対量を明らかにすること、および該タンパク質を同定することができる。
【０１２８】
上記試験は、患者より得たホモジネートまたは可溶化組織などの、各種細胞、体液および／または組織抽出物由来の試料について行うことができる。組織抽出物は、組織生検および剖検材料から常法により得られる。本発明に有用な体液には、血液、尿、唾液またはそれらの任意の他の体分泌物または派生物が含まれる。血液とは、全血、血漿、血清または血液の任意の派生物を含むことを意味している。
【０１２９】
ＣＳＧのｉｎ ｖｉｔｒｏターゲティング／大腸癌治療
このＣＳＧの同定はまた、癌、特に大腸癌のイメージングおよび処置のための新規治療物質の合理的設計において有用である。例えば、一側面では、ＣＳＧに特異的に結合する抗体を産生し、大腸癌を患うことが疑われる患者にｉｎ ｖｉｖｏで使用することができる。ＣＳＧを特異的に結合する抗体は、診断および／または治療目的で大腸癌が疑われる患者に注射することができる。したがって、本発明の別の側面は、ヒト患者に対し有効量の抗体を投与することにより、かかる治療を必要としている患者の大腸癌の発症を防止し、治療するための方法に関する。
【０１３０】
「有効量」とは、腫瘍上に発現した標的抗原に結合し、外科的除去のための腫瘍の退縮または腫瘍の消失をもたらすのに必要な抗体量または濃度を意味する。過剰発現されたＣＳＧへの抗体の結合は、かかるＣＳＧを発現する癌細胞に死をもたらすと考えられる。ｉｎ ｖｉｖｏ診断および処置のための抗体の調製および使用は、当該技術分野で既知である。例えば、インジウム−１１１で標識された抗体−キレーターは、癌胎児抗原発現腫瘍のラジオイムノシンチグラフィイメージングでの使用について記載されている（Ｓｕｍｅｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １９９０ １７：２４７−２５４）。
【０１３１】
特に、これらの抗体−キレーターは、再発性結腸直腸癌が疑われる患者における腫瘍検出に使用されている（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃ． １９９１ ９：６３１−６４０）。磁気共鳴イメージングにおける使用のための、標識として常磁性イオンを有する抗体も記載されている（Ｌａｕｆｆｅｒ， Ｒ． Ｂ． Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９１ ２２： ３３９−３４２）。ＣＳＧに対する抗体は、同様に使用することができる。ＣＳＧを特異的に結合する標識抗体は、患者の疾患状態の診断またはステージングを目的として、大腸癌が疑われる患者に注射することができる。
【０１３２】
使用される標識は、使用するイメージング様式に応じ選択されるであろう。例えば、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１３１などの放射性標識体が平面スキャンまたは単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）に使用できる。フッ素−１９などの陽電子放射標識は、陽電子放射断層撮影法に使用できる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に使用できる。正常組織のイメージングと比べた標識の存在から、癌の播種を決定することができる。器官または組織内の標識量からはまた、その器官または組織中の癌の有無を決定できる。
【０１３３】
ｉｎ ｖｉｖｏの方法で使用可能な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびオムニクローナル抗体、ならびに分子生物学的技術により調製される抗体が含まれる。抗体断片およびアプタマー、ならびにＳＥＬＥＸと呼ばれる、当業者に既知のインビトロ進化プロトコルより得た一本鎖オリゴヌクレオチドも利用できる。
【０１３４】
スクリーニングアッセイ
本発明はまた、ＣＳＧタンパク質に結合するか、またはＣＳＧタンパク質の発現あるいは活性に対する調節効果を持つモジュレータを同定するための方法を提供する。ＣＳＧタンパク質の発現または活性を低下させるモジュレータは、大腸癌の処置に有用であると考えられる。かかるスクリーニングアッセイは、当業者に既知であり、細胞ベースアッセイおよび無細胞アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
コンピュータイメージングによりＣＳＧの領域に特異的に結合することが推測される小分子もまた、大腸癌のイメージングおよび処置での使用のために、設計、合成、および試験することができる。さらに、分子ライブラリーを、本発明で同定されたＣＳＧに対する分子の結合能力について評価することにより、潜在的な抗癌剤をスクリーニングすることができる。ライブラリーにてＣＳＧに結合できるものとして同定された分子は、大腸癌の処置における使用を目的としたさらなる評価のための重要な候補体である。好ましい態様では、これら分子は、細胞中のＣＳＧ発現および／または活性を下方調節するだろう。
【０１３６】
養子免疫治療およびワクチン
癌の養子免疫治療は、細胞が、定着した腫瘍の消退を直接または間接的に媒介することを目的として、抗腫瘍応答性を持つ免疫細胞を、担腫瘍宿主に投与する治療的アプローチである。リンパ球、特にＴリンパ球の輸血は、この治療分類に入るものであり、国立癌研究所（ＮＣＩ）の研究者等は、末梢血リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、皮下リンパ節の生検材料由来のＴ細胞培養物の自己輸血を複数のヒト癌患者の処置に使用している（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ．， 米国特許第４，６９０，９１４号、１９８７年９月１日発行； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９８８、Ｎ． Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３１９： １６７６−１６８０）。
【０１３７】
本発明は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）の非共役複合体ありまたはなしで、抗原性ＣＳＧ分子に対し感作されたマクロファージを用いた、原発性および転移性大腸癌の防止および／または処置のための養子免疫治療の組成物および方法に関する。ＣＳＧの抗原性または免疫原性は、ＣＳＧタンパク質またはその断片の抗体を産生する能力、またはナイーブなエフェクター細胞を教育する能力（エフェクター細胞は、次に抗原（またはエピトープ）発現標的細胞を溶解する）から容易に確認できる。
【０１３８】
癌細胞は、定義によれば、異常であり、正常組織には存在しないので、免疫系により外来物質として認識されるべきタンパク質を含む。しかしながら、免疫系はしばしばこの異常に気づかず腫瘍の攻撃をしないようである。癌細胞により産生される外来性ＣＳＧは、それらの存在を示すのに使用できる。ＣＳＧは腫瘍抗原と呼ばれる短い断片に分解され、細胞表面に提示される。
【０１３９】
これらの腫瘍抗原はクラスＩおよびクラスＩＩの２つの型が存在するＭＨＣと呼ばれる分子により、細胞表面に保持または提示される。ＭＨＣクラスＩ分子と会合する腫瘍抗原は、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるが、一方抗原−ＭＨＣクラスＩＩ複合体はヘルパー細胞と呼ばれる第２のＴ細胞サブセットにより認識される。これらの細胞はサイトカインを分泌し、これが腫瘍の増殖を遅らせるか、または停止させ、別の型の白血球、Ｂ細胞が腫瘍細胞に対する抗体を作るのを助ける。
【０１４０】
養子免疫治療では、Ｔ細胞またはその他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、腫瘍特異的ＣＳＧ抗原を用いて、体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で刺激される。次に、刺激された細胞は、患者に再注入され、そこでそれらは癌細胞を攻撃する。研究から、細胞障害性およびヘルパーＴ細胞の両方を使用すると、いずれか一方のサブセットのみを使用した場合に比べはるかに効果的であることが示されている。さらに、ＣＳＧ抗原は、米国特許第５，９８５，２７０号に記載されているように、熱ショックタンパク質と複合体を形成し、ＡＰＣを刺激し得る。
【０１４１】
ＡＰＣは、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない当該技術分野で既知の抗原提示細胞から選択でき、好ましくはマクロファージである。細胞がその個体に対して自己のものである好ましい使用では、養子移植のための免疫細胞のドナー選択の問題を回避するために、リンパ球、マクロファージ、またはその他のＡＰＣ等の自己の免疫細胞が用いられる。自己の免疫細胞の使用により回避できる他の問題は、処置が効を奏さない場合は致死的となる移植片対宿主病である。
【０１４２】
遺伝子治療を用いた養子免疫治療では、ＣＳＧのＤＮＡを従来の遺伝子治療と同様にしてエフェクター細胞内に導入することができる。これによりエフェクター細胞が抗原性タンパク質を産生するように操作されると、腫瘍細胞に対するこれら細胞の細胞障害性が高められ、結果として養子免疫治療が改善される。
【０１４３】
本発明のＣＳＧ抗原はまた、大腸癌ワクチン構成成分としても有用である。ワクチンは、免疫刺激量のＣＳＧ抗原を含む。免疫刺激量とは、大腸癌の改善または処置を目的としてレシピエント内に所望の免疫応答を惹起することができる抗原量を表す。有効量は、当業者に既知の標準的方法により経験的に決定され得る。
【０１４４】
ＣＳＧ抗原は、所望の型の免疫応答、例えば抗体および／または細胞媒介性の応答を誘発するために設計された多くのワクチン配合物のいずれか一つとして提供され得る。かかる配合物は、当該技術分野で既知であり、例えば米国特許第５，５８５，１０３号に記載されている配合物を含むが、これに限定されるものではない。免疫応答を刺激するのに使用される本発明のワクチン配合物はまた、薬学的に許容され得るアジュバントも含むことができる。
【０１４５】
ベクター、宿主細胞、発現
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。
【０１４６】
宿主細胞は、ＣＳＧポリヌクレオチドを組み込み、本発明のＣＳＧポリペプチドを発現するように遺伝的に操作することができる。例えば、ＣＳＧポリヌクレオチドは、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）および形質転換の周知技術を用いて、宿主細胞内に導入され得る。ＣＳＧポリヌクレオチドは、単独または他のポリヌクレオチドとともに導入されてもよい。かかる他のポリヌクレオチドは、単独で導入されてもよく、共導入されてもよく、または本発明のＣＳＧポリヌクレオチドと結合して導入されてもよい。
【０１４７】
例えば、本発明のＣＳＧポリヌクレオチドは、例えば哺乳動物細胞における、コトランスフェクションおよび選択に関する標準的技術を用いて、選択可能マーカーをコードする他の分離したポリヌクレオチドとともに、宿主細胞内にトランスフェクトされてもよい。この場合、ポリヌクレオチドは一般に、宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれるであろう。
【０１４８】
あるいは、ＣＳＧポリヌクレオチドは、宿主内での増殖用の選択可能マーカーを含むベクターに結合されてもよい。ベクター構築物は、上記技術により宿主細胞内に導入されてもよい。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物中に、または荷電脂質との複合体中に、ＤＮＡとして導入される。エレクトロポレーションもまた宿主内へのＣＳＧポリヌクレオチド導入に利用され得る。
【０１４９】
ベクターがウイルスの場合には、それはｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングされてもよく、またはパッケージング細胞内に導入され、パッケージングされたウイルスが細胞内に形質導入されてもよい。当業者により日常的に行なわれている、よく知られた広範な技術が、本発明のこの側面にしたがってＣＳＧポリヌクレオチドを作製し、およびＣＳＧポリヌクレオチドを細胞内に導入するのに好適である。かかる技術は、本明細書中に既述したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．などの参考文献に十分に概説されている。
【０１５０】
本発明で用いてもよいベクターは、例えばプラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡあるいはＤＮＡウイルスベクターを含む。かかるベクターは、細胞内へのＤＮＡおよびＲＮＡ導入に関する既知の技術により、細胞内にポリヌクレオチドとして、好ましくはＤＮＡとして導入され得る。ベクターは、ファージおよびウイルスベクターの場合、好ましくは、感染および形質導入に関する既知の技術によりパッケージされたウイルス、またはキャプシド形成されたウイルスとして細胞内に導入され得る。ウイルスベクターは、複製性または複製欠損性であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は一般に、補完宿主細胞（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）内でのみ生ずる。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現のための好ましいベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主細胞での発現に効果的なシス作用性の制御領域を含むベクターを包含するが、これに限定されない。適切なトランス作用性因子は、宿主により供給されるか、補完ベクター（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）により供給されるか、または宿主導入時にベクター自体により供給される。
【０１５２】
この観点でのある好ましい態様において、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘発性発現またはある型の細胞でのみの発現、もしくは誘発性および細胞特異的発現の両方であり得る。誘発性ベクターのうち特に好ましいのは、温度および栄養添加物といった操作が容易である環境因子により発現が誘発できるベクターである。原核生物および真核生物宿主での使用のための構成的および誘発的発現ベクターを含めた本発明のこの態様に適切な各種ベクターが既知であり、当業者により常法として使用されている。
【０１５３】
操作された宿主細胞は、通常の栄養培地中で培養でき、培地はとりわけプロモーターを活性化すること、形質転換体を選択すること、または遺伝子を増幅することに関して適切なように改良してもよい。発現のために選択された宿主細胞に従来使用されている温度、ｐＨ等の培養条件は、一般的に本発明のＣＳＧポリペプチドの発現に適切であろう。
【０１５４】
本発明のＣＳＧポリペプチドの発現には非常に多様な発現ベクターが使用可能である。かかるベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクターを含む。ベクターは、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、ならびに、それらの組合せ、例えば、コスミドおよびファージミドなどの、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝的要素に由来するものなどに由来してもよい。これらは全て本発明のこの側面による発現に使用され得る。一般に、宿主内でポリペプチドを発現させるためのポリヌクレオチドの維持、増殖、または発現に適切な任意のベクターをこの観点での発現に使用してもよい。
【０１５５】
適切なＤＮＡ配列は、各種既知の、かつ日常的な技術のいずれかによりベクター内に挿入され得る。一般に発現のためのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベクターを１または２以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを使い制限断片を一つに結合させることで、発現ベクターに結合される。この目的に使用できる制限および結合の手法は当業者にとって既知かつ常法である。この観点に適切な手法、および別の方法を用い発現ベクターを構築する手法は、当業者にとって既知かつ常法であり、本明細書の他所に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に詳細記載されている。
【０１５６】
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、例えばｍＲＮＡ転写に対するプロモーターを含む適切な発現制御配列に作動可能に連結されている。代表的なプロモーターは、よく知られた少数のプロモーターを挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターを含む。本発明のこの側面での使用に適切である多くの記載外のプロモーターが既知であり、本発明での議論および実施例に例示される様式によって当業者により容易に使用され得ることが理解されるだろう。
【０１５７】
一般に発現構築体物は転写の開始および終止に関する部位、および転写領域内には翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写体のコード部分は、開始部位に翻訳を開始するＡＵＧを、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドンを含む。
さらに、構築物は、発現を制御しかつ発現をもたらす制御領域を含んでもよい。一般には、多くの一般的に実施されている手法によれば、かかる領域は、とりわけリプレッサー結合部位やエンハンサーのように、転写を制御することで作動するであろう。
【０１５８】
増殖および発現用のベクターは、一般には選択マーカーを含むだろう。かかるマーカーはまた増幅にも適切であり、あるいはベクターはこの目的のためのさらなるマーカーを含んでもよい。この観点では、好ましくは発現ベクターは１または２以上の選択マーカー遺伝子を含み、形質転換した宿主細胞の選択に関する表現型の特徴を提供する。好ましいマーカーは、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸還元酵素あるいはネオマイシン耐性を、大腸菌やその他の細菌の培養についてテトラサイクリンあるいはアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【０１５９】
本明細書の他所に記載のような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター、およびその他の適切な制御配列を含むベクターは、その中での所望ポリペプチドの発現に適切である各種既知の技術を用い、適切な宿主内に導入され得る。
【０１６０】
適切な宿主の代表例は、大腸菌、放線菌およびネズミチフス菌細胞などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、ショウジョウバエのＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）のｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボーズ黒色腫細胞などの動物細胞、ならびに植物細胞を含む。非常に多様な発現構築物のための宿主がよく知られており、当業者は本開示により、本発明のこの側面に従って、ＣＳＧポリペプチドの発現に適した宿主を容易に選択することができるだろう。
【０１６１】
より具体的には本発明はまた、発現構築物などの、１または２以上の上記配列を含む組換え構築物も包含する。構築物には、本発明のかかるＣＳＧ配列が挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターが含まれる。配列は前向き、または逆向きに挿入され得る。この観点におけるある好ましい態様では、構築物は、例えばプロモーターなどの、配列に作動可能に連結された制御配列をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明での使用に適切なベクターが多く市販されている。
【０１６２】
以下に、市販のベクターを例示する。細菌での使用にとりわけ好ましいベクターは、Ｑｉａｇｅｎより入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＢＳベクター、ファージスクリプト（Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５である。とりわけ好ましい真核細胞ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ、およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐＳＫＶ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。
【０１６３】
これらベクターは、本発明のこの側面での使用に関し、当業者が利用可能な多くの市販されている既知のベクターから例示することのみを目的とし掲載されている。本開示を読むことにより、宿主内での、本発明のＣＳＧポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖および／または発現に適切な任意のその他のプラスミドまたはベクターが、本発明のこの側面に使用できることが当業者に理解されるであろう。
【０１６４】
プロモーター領域は、候補プロモーター断片、すなわちプロモーターを含み得る断片を導入するための、１または２以上の部位の下流の、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ｃａｔ」）転写単位などの、プロモーター領域を欠くレポーター転写単位を含むベクターを用いて、所望遺伝子より選択することができる。
【０１６５】
周知のように、ｃａｔ遺伝子の上流にある制限部位にて、プロモーターを含む断片をベクターに導入すると、標準的なＣＡＴアッセイにより検出することができるＣＡＴ活性が発生する。この目的に適切なベクターは既知であり、容易に入手できる。かかる２種類のベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。すなわち、本発明のＣＳＧポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターには、既知、かつ容易に入手可能なプロモーターだけでなく、レポーター遺伝子を使用した上記技術により容易に得ることができるプロモーターも含まれる。
【０１６６】
とりわけ知られている、本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な細菌プロモーターは、大腸菌ｌａｃｉとｌａｃＺおよびプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーター、およびｔｒｐプロモーターである。本観点に適切な、とりわけ知られている真核生物プロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のものなどの、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターである。
【０１６７】
宿主細胞での発現に適切であるベクターおよびプロモーターを選択することは既知の手法であり、発現ベクターの構築、宿主内へのベクターの導入および宿主での発現に必要な技術は、当該技術分野で日常の技術である。
本発明はまた、上記構築物を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は哺乳動物細胞などの高等真核生物細胞、または酵母細胞などの下等真核生物細胞である。あるいは、宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞である。
【０１６８】
宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法により行うことができる。かかる方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， （１９８６）などの多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
宿主細胞内の構築物は従来の様式で用いられ、組換え配列にコードされる遺伝子産物を産生できる。あるいは、本発明のＣＳＧポリペプチドは従来のペプチド合成装置により合成的に作製することができる。
【０１６９】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下において、哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現させることができる。無細胞翻訳系は、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを利用することで、かかるタンパク質の産生に利用することができる。原核生物および真核生物宿主とともに使用することに適したクローニングおよび発現ベクターは、本明細書の他所で引用されたＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記載されている。
【０１７０】
一般に、組換え発現ベクターは複製起点、下流の構造配列の転写を指示するための高発現遺伝子由来プロモーター、およびベクター暴露後にベクター含有細胞を単離できるようにする選択マーカーを含むだろう。特に適切なプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（「ＰＧＫ」）などの糖分解酵素、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、および熱ショックタンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。選択マーカーは、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔｒｐｌ遺伝子を含む。
【０１７１】
高等真核生物による本発明のＣＳＧポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することで高められる。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性要素であり、通常約１０〜３００塩基対（ｂｐ）であり、所定の宿主細胞タイプにおいてプロモーターの転写活性を高める。エンハンサーの例は、ｂｐ１００〜２７０にある複製起点の後方に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【０１７２】
本発明のＣＳＧポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的技術を用いることで、発現のためのプロモーターと作動可能に連結されるようにベクター内に挿入される。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結合部位に対し適切に５’側に位置するように配置される。
【０１７３】
リボソーム結合部位は発現されるべきポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’側になる。一般に、通常ＡＵＧである１つの開始コドンから開始し、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧの間に位置するような他のオープンリーディングフレームは存在しない。また一般に、ポリペプチドの末端には翻訳停止コドンがあり、さらに転写領域の３’末端に適切に配置されたポリアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在するだろう。
【０１７４】
小胞体内腔内、細胞周辺腔、または細胞外環境に翻訳タンパク質を分泌するために、発現ポリペプチド中に適切な分泌シグナルを組み込んでもよい。シグナルはポリペプチドに対し同種でも、あるいは異種シグナルでもよい。
【０１７５】
ポリペプチドは融合タンパク質などの修飾形態として発現されてもよく、分泌シグナルだけでなくさらなる異種機能領域を含んでもよい。すなわち、例えば宿主細胞内、精製中、あるいはその後の取り扱いや保存中における安定性および持久性を改善するために、さらなるアミノ酸領域、特には荷電アミノ酸をポリペプチドのＮ末端に付加してもよい。
【０１７６】
精製を容易にするためにポリペプチドに領域を付加してもよい。かかる領域は、ポリペプチドの最終調製前に取り除かれるだろう。分泌または排出を起こさせるために、あるいは安定性を向上させ、とりわけ精製を容易にするために、ポリペプチドにペプチド部分を加えることは、当該分野において一般的であり、日常的な技術である。
【０１７７】
本発明によるＣＳＧポリヌクレオチドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適切な原核動物宿主は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）やネズミサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の様々な種はこの観点における適切な宿主である。さらに、当業者に既知のその他の多くの宿主も、この観点において使用できるだろう。
【０１７８】
代表的であるが、非限定的な例としては、細菌での応用に有用な発現ベクターは、選択マーカーおよび既知のクローニングベクターであるｐＢＲ３２２の遺伝要素を含む市販プラスミド由来の細菌性の複製起点を含むことができる。かかる市販ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．， ＵＳＡ）を含む。
【０１７９】
これらのｐＢＲ３２２「主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」部分は適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と合わせられる。適切な宿主株を形質転換し、宿主株を選択したプロモーターが誘発可能な適切な細胞密度まで増殖させた後に、適切な手段でそれを誘発し（例えば温度変化、または化学的誘発物質への暴露）、細胞はさらなる期間培養される。
【０１８０】
次に、細胞は一般には、遠心分離により集められ、物理的または化学的手段により破壊され、そして得られた粗製抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来の方法により破壊することができ、かかる方法は当業者に既知である。
【０１８１】
同様に、発現には様々な哺乳動物細胞培養系が使用できる。典型的な哺乳動物発現系は、Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２３： １７５ （１９８１）に記載されている、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系である。適合するベクターを発現させることができるその他の哺乳動物細胞系は、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨＫ細胞系を含む。
【０１８２】
哺乳動物発現ベクターは複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、さらに発現に必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および５’フランキング非転写配列を含むだろう。この観点におけるある好ましい態様では、ＳＶ４０スプライス部位に由来するＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位がこれらのタイプの必須非転写遺伝要素として利用される。
【０１８３】
ＣＳＧポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、既知の方法により組換え細胞培養物より回収および精製され得る。最も好ましくは、精製には高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が用いられる。単離または精製中にポリペプチドが変性させられた場合には、活性立体構造を再生するためにタンパク質のリフォールディングに関する既知の技術が利用され得る。
【０１８４】
本発明のＣＳＧポリペプチドは、天然精製産物、化学合成産物、および例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物を含む原核生物または真核生物宿主から組換え技術により生産された産物を含む。組換え体の産生手法に用いた宿主に応じて、本発明のＣＳＧポリペプチドはグリコシル化されてもよく、あるいはグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のＣＳＧポリペプチドはさらに幾つかの例では宿主媒介性プロセスの結果としての初期修飾メチオニン残基を含んでもよい。
【０１８５】
ＣＳＧポリヌクレオチドおよびポリペプチドは本発明によれば、各種用途、特にＣＳＧの化学的および生物学的な特性を利用する用途に使用され得る。さらなる用途は、細胞、組織および生物体の障害の診断および処置に関する。本発明のこれらの側面は、以下の議論によってさらに説明される。
【０１８６】
ポリヌクレオチドアッセイ
上記においていくらか詳細に述べたとおり、本発明はまた、例えば診断薬としての相補的ポリヌクレオチドを検出することを目的としたＣＳＧポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関連したＣＳＧの突然変異体の検出は、ＣＳＧの過少発現、過剰発現または発現の変化の結果生ずる疾患または疾患に対する感受性、例えば遺伝性大腸癌に対する感受性の診断を追加または決定することができる診断ツールを提供するだろう。
【０１８７】
ヒトＣＳＧ遺伝子に突然変異を有する個体は、各種技術によりＤＮＡレベルで検出されるだろう。診断用の核酸は、患者細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得られる。ゲノムＤＮＡは検出に直接用いてもよく、または分析前にＰＣＲを使い酵素的に増幅してもよい（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ、３２４： １６３−１６６（１９８６））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に使用される。
【０１８８】
例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のＣＳＧポリヌクレオチドに相補的なＰＣＲプライマーは、ＣＳＧ発現および突然変異の同定および分析に使用できる。例えば欠失および挿入は、正常遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズ変化により検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを放射線標識したＣＳＧ　ＲＮＡに、または代替的に、放射線標識したＣＳＧアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることで同定できる。完全一致配列は、ＲＮａｓｅＡ消化または融解温度の差により、不一致二本鎖と識別することができる。
【０１８９】
参照遺伝子と突然変異を有する遺伝子との配列の差はまた、直接ＤＮＡ配列分析からも示される。さらにクローンニングしたＤＮＡ断片をプローブとして使用して、特定のＤＮＡ断片を検出してもよい。かかる方法の感度は、ＰＣＲまたはその他の増幅法を適切に利用することで大きく高めることができる。例えば、配列分析用プライマーは、変法ＰＣＲにより作成された二本鎖ＰＣＲ産物または一本鎖鋳型分子とともに用いられる。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いた従来の方法、または蛍光タグを用いた自動配列決定方法によって実施される。
【０１９０】
ＤＮＡ配列の差に基づく遺伝子検査は、変性剤が存在する、または存在しないゲル中でのＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することで達成され得る。小配列の欠失および挿入は、高解像度ゲル電気泳動法により視覚化することができる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別されるが、その場合、異なるＤＮＡ断片の移動度はそれらの特異的融解温度または部分融解温度に従ってゲル中の異なる点で遅くなる（例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １２４２ （１９８５）参照）。
【０１９１】
特異的位置における配列の変化はまた、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護または化学的切断法（例えばＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８５： ４３９７−４４０１ （１９８５））などのヌクレアーゼ保護アッセイによっても明らかとなり得る。
したがって、特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接ＤＮＡ配列分析または制限酵素の使用（例えば制限酵素長多型（「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングといった方法により達成できる。従来型のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列分析法に加えて、突然変異は、ｉｎ ｓｉｔｕ分析によっても検出できる。
【０１９２】
染色体アッセイ
本発明のＣＳＧ配列はさらに、染色体同定にも有用である。染色体上の特定部位を同定することが求められており、実際の配列データに基づいた（反復多型）少数の染色体マーキング試薬が、現在染色体位置をマーキングするために利用できる。本発明の各ＣＳＧ配列は、個々のヒト染色体上の特定位置に特異的に標的化され、それとハイブリダイズすることができる。したがって、ＣＳＧは、配列を疾患関連遺伝子と相関させる上での重要な第１段階である、ＤＮＡの染色体へのマッピングに用いることができる。
【０１９３】
この観点に関するある好ましい態様では、本明細書中に開示されたｃＤＮＡは本発明のＣＳＧのゲノムＤＮＡをクローニングするのに用いられる。これは、各種既知の技術と、一般に市販されているライブラリーを用いて達成できる。このゲノムＤＮＡは、その目的のための既知の技術を使用したｉｎ ｓｉｔｕ染色体マッピングに用いられる。
【０１９４】
幾つかの例では、配列は、ＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）をｃＤＮＡから調製することで、染色体にマッピングできる。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分析を使用することで、ゲノムＤＮＡ中の１つより多いエクソンに及ばないプライマーが迅速に選択されて、すなわち増幅工程を複雑にする。次にこれらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに用いられる。プライマーに対応したヒト遺伝子を含むハイブリッドだけが増幅断片を生ずる。
【０１９５】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定ＤＮＡを特定の染色体に割りふる迅速な手法である。同一オリゴヌクレオチドプライマーとともに本発明を使用すれば、特定の染色体またはより大型ゲノムクローンのプールに由来する断片のパネルを使用し、同様にサブローカリゼーションを行うことができる。その染色体へのマッピングに同様に使用できるその他のマッピング戦略は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、標識フロー選別染色体によるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのハイブリダイゼーションによる前選別を含む。
【０１９６】
展開した中期染色体へのｃＤＮＡクローンの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は５０または６０ｂｐといった短いｃＤＮＡで用いることができる。この技術は、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ： Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＡＳＩＣ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８））によって記載されている。
【０１９７】
いったん配列を染色体位置に正確にマッピングできれば、染色体における配列の物理的位置と遺伝地図データとを関連付けることができる。かかるデータは、例えばジョンホプキンス（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ）大学、ウエルチ（Ｗｅｌｃｈ）医学図書館よりオンラインで入手可能なＶ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ， ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ ＩＮ ＭＡＮに見いだされる。次に、連鎖分析（物理的に近接する遺伝子の随伴遺伝）により、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関連性が同定される。
【０１９８】
次に、病気に罹った個体と罹っていない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の差を決定する必要がある。もし変異が病気にかかった個体の一部または全部に観察されるが、いずれの正常個体にも観察されない場合、その変異はおそらく病気の原因物質である可能性がある。
【０１９９】
現時点の物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の解像度では、疾患関連染色体領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０ないし５００の潜在的原因遺伝子のうちの１個であろう。（これは１メガ塩基マッピングの解像度、および２０ｋｂ当たり１つの遺伝子と仮定）。
【０２００】
ポリペプチドアッセイ
上記でいくらか詳細に記載したとおり、本発明はまた、正常および異常レベルの決定を含む、細胞および組織、および例えば血液や尿などの生物学的液体中のＣＳＧポリペプチドのレベルを検出する定量および診断アッセイなどの診断アッセイに関する。したがって、例えば正常組織試料と比較したＣＳＧポリペプチドの過剰発現または過少発現を検出する本発明による診断アッセイは、例えば新生物の存在の検出に用いられる。
【０２０１】
宿主由来試料中の、本発明のＣＳＧポリペプチドなどのタンパク質のレベルの決定に使用できるアッセイ技術は、当業者に既知である。かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。とりわけＥＬＩＳＡが好ましい場合が多い。
【０２０２】
例えば、抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、試料中、好ましくは生物試料中のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウェルを、最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで、特異抗体により被覆する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり、本明細書記載の方法により産生される。ウェルへのポリペプチドの非特異的結合が低減するように、ウェルをブロッキングする。次に、被覆したウェルを、ＣＳＧポリペプチドを含有する試料とともに、室温にて２時間より長い時間インキュベートする。
【０２０３】
好ましくは、試料の連続希釈物を用いて、結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で３回洗浄して、未結合のポリペプチドを除去する。次に、２５〜４００ｎｇの濃度の特異抗体−アルカリホスファターゼ複合体５０μｌを添加して、室温にて２時間インキュベートする。再びプレートを脱イオン水または蒸留水で３回洗浄し、未結合の複合体を除去する。
【０２０４】
次に、各ウェルに、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＮＰＰ）基質溶液（７５μｌ）を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートする。マイクロタイタープレートリーダーにより、反応を測定する。対照試料の連続希釈物を用いて、標準曲線を作成し、Ｘ軸上にポリペプチド濃度を（対数目盛）、Ｙ軸上に蛍光または吸光度（均等目盛）をプロットする。標準曲線を用いて、試料中のＣＳＧポリペプチド濃度を内挿する。
【０２０５】
抗体
上記でいくらか詳細に記載したとおり、ＣＳＧポリペプチド、それらの断片またはその他の誘導体、もしくはその類縁体、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生ずるための免疫原として使用できる。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまたキメラ、単鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂ断片、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物も含む。かかる抗体および断片の産生のための、当該技術分野で既知の様々な手法が使用できる。
【０２０６】
抗体産生のための多様な方法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２に記載されている。
例えば、本発明のＣＳＧポリペプチドを発現する細胞を動物に投与して、ポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘発することができる。好ましい方法では、分泌タンパク質調製物を調製し、それを天然の夾雑物を実質的に含まないように精製する。
【０２０７】
次に、より高い特異的活性を有するポリクローナル抗血清を産生するために、この調製物を動物に導入する。得られた抗体は、ポリペプチド自体と結合するだろう。このようにすれば、ＣＳＧポリペプチドの断片のみをコードする配列でも、これを用いて全未変性ポリペプチドに結合する抗体を生成することができる。次にかかる抗体を用いてそのＣＳＧポリペプチドを発現している組織から、ＣＳＧポリペプチドを単離できる。
【０２０８】
あるいは、モノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の製造技術の例は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７ （１９７５））、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２（１９８３））および（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ ． ｐｇ．７７−９６ （１９８５））を含むが、これらに限定されない。ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術は、ヒトモノクローナル抗体の製造に有用である。
【０２０９】
ハイブリドーマ技術は、Ｋｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ５１１ （１９７６））、Ｋｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ２９２ （１９７６））およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ． Ｙ．， ｐｐ． ５６３−６８１ （１９８１））にも記載されている。一般に、かかる手法は、ＣＳＧポリペプチド、またはより好ましくは分泌ＣＳＧペプチド発現細胞で、動物（好ましくは、マウス）を免疫することを包含する。
【０２１０】
かかる細胞は、任意の適切な組織培養培地にて培養されてもよいが、１０％のウシ胎児血清（約５６℃にて不活性化）添加、ならびに非必須アミノ酸約１０ｇ／ｌ、ペニシリン約１，０００Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン約１００μｇ／ｍｌ添加、アール変法イーグル培地にて細胞を培養することが好ましい。かかるマウスの脾細胞を摘出し、適切な骨髄腫細胞系と融合させる。
【０２１１】
本発明によれば、いかなる適切な骨髄腫細胞系を用いてもよいが、ＡＴＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞系（ｐａｒｅｎｔ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）（ＳＰ２０）を用いることが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地にて選択的に保持され、続いてＷａｎｄｓ ｅｔ ａｌ． （Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０： ２２５−２３２ （１９８１））に記載されたように、限界希釈によりクローニングされる。次に、かかる選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、ポリペプチドを結合することが可能な抗体を分泌するクローンを同定する。
【０２１２】
あるいは、ポリペプチドに結合することが可能なさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を用いた二段階手法にて産生することができる。かかる方法は、抗体自身が抗原であるという事実を利用するものであり、したがって、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、タンパク質特異抗体を用いて、動物、好ましくはマウスを免疫する。
【０２１３】
次に、かかる動物の脾細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を生産し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、タンパク質特異抗体に結合する能力が、ポリペプチドにより阻止され得る抗体を産生するクローンを同定する。かかる抗体は、タンパク質特異抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、それを用いて、動物を免疫し、さらなるタンパク質特異抗体の形成を誘発することができる。
【０２１４】
単鎖抗体の生成に関し記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体の生成に適用することができる。さらにトランスジェニックマウス、ならびに他の非ヒトトランスジェニック動物もまた、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体の発現に使用され得る。
【０２１５】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他の断片を、本明細書に開示する方法に従って用いてもよいことが理解されるであろう。かかる断片は、典型的に、（Ｆａｂ断片を産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するための）ペプシンなどの酵素を用いて、タンパク質分解性切断により産生される。あるいは、分泌タンパク質結合断片は、組換えＤＮＡ技術の適用により、または合成化学により産生され得る。
【０２１６】
ヒトにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用に関して、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。かかる抗体は、上述のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝構築物を用いて産生することができる。キメラ抗体を産生する方法は、当該技術分野で既知である（レビューとして、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： １２０２ （１９８５）、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４： ２１４ （１９８６）、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８１６，５６７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ １７１４９６、Ｍｏｒｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ １７３４９４、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８６０１５３３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８７０２６７１、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６４３ （１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８ （１９８５）を参照）。
【０２１７】
上記抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによる単離および／または精製のために、固体支持体に抗体を結合させることで、本発明のＣＳＧポリペプチドを発現しているクローンを単離または同定すること、またはＣＳＧポリペプチドを精製することに使用され得る。上記でさらに詳細に述べられているとおり、ＣＳＧに特異的な抗体はまた、癌に苦しむ患者において、腫瘍、特に大腸の癌のイメージングに用いてもよい。かかる抗体はまた、ＣＳＧを発現する標的腫瘍に対し治療的に用いてもよい。
【０２１８】
ＣＳＧ結合分子およびアッセイ
本発明はまた、受容体分子などのＣＳＧを結合する分子の同定に関する方法も提供する。受容体タンパク質などの、ＣＳＧを結合するタンパク質をコードする遺伝子は、当業者に既知の様々な方法によって同定できる。例は、リガンドパニング法（Ｌｉｇａｎｄ ｐａｎｎｉｎｇ）およびＦＡＣＳソーティングを含むが、これらに限定されない。かかる方法は、例えばＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： Ｃｈａｐｔｅｒ ５（１９９１）などの多くの研究用マニュアルに記載されている。
【０２１９】
発現クローニングは、この目的にも用いることができる。そのためには、本発明のＣＳＧに反応する細胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製する。このＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、このライブラリーをプールに分ける。次に、このプールを本発明のＣＳＧに反応しない細胞に個別にトランスフェクトする。次に、トランスフェクトした細胞を標識ＣＳＧに暴露する。ＣＳＧポリペプチドは、放射性ヨウ素化法、または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位を含めること（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）などの標準的方法を含むが、これらに限定されない多様な既知の技術により標識できる。
【０２２０】
暴露後、細胞は固定され、標識ＣＳＧの結合が決定される。これら手法はガラススライド上で好都合に実行される。標識ＣＳＧを含むプールが、ＣＳＧ結合細胞が産生したｃＤＮＡを含むとして同定される。次に、これらの陽性体からサブプールが調製され、上記と同様に宿主細胞内にトランスフェクトされ、スクリーニングされる。サブプールプロセスとスクリーニングプロセスを繰り返すことで、受容体分子などの結合分子候補をコードする１または２以上の単一クローンを単離することができる。
【０２２１】
あるいは標識リガンドは、受容体分子などの、それを結合する分子を発現する細胞から調製された、膜あるいは膜抽出物などの細胞抽出物にフォトアフィニティー結合することができる。架橋した物質はポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分析され、Ｘ線フィルムに感光させられる。リガンド−受容体を含む標識複合体は切り出され、ペプチド断片に分解され、タンパク質マイクロシーケンシングにかけることができる。マイクロシーケンシングより得たアミノ酸配列を使用することで、候補受容体分子をコードする遺伝子を同定するためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのユニークまたは縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。
【０２２２】
本発明のポリペプチドはまた、受容体分子などのＣＳＧ結合分子の、細胞内または無細胞調製物中でのＣＳＧ結合能の評価に使用できる。
【０２２３】
アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子
本発明はまた、細胞においてＣＳＧの作用を高める、または阻止するような化合物をスクリーニングする方法も提供する。本明細書中で用いられる「化合物」は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体、ならびに細胞におけるＣＳＧの作用を高めるまたはアゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）または阻止するまたは拮抗する潜在力を有する、任意の他の候補分子を包含するとされる。
【０２２４】
本明細書中で用いる場合、アゴニストは、ＣＳＧの天然の生物学的機能を増加させるか、またはＣＳＧに類似の様式で機能する化合物であり、一方アンタゴニストは、本明細書で用いる場合、かかる機能を低下させるまたは排除する化合物である。アゴニストおよび／またはアンタゴニストについてスクリーニングするための多様な既知の方法を、ＣＳＧアゴニストまたはアンタゴニストの同定に用いるために適合させることができる。
【０２２５】
例えば、膜などの細胞コンパートメント、または膜調製物などのそれらの調製物は、ＣＳＧにより調節されるシグナリングまたは制御経路の分子などの、ＣＳＧを結合する分子を発現する細胞から調製され得る。この調製物は、ＣＳＧアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下にて、標識ＣＳＧとインキュベートされる。化合物の結合分子を結合する能力は、標識リガンドの減少した結合となって現れる。自由に結合する化合物、すなわちＣＳＧ結合分子の結合において、ＣＳＧの効果を誘発しない分子が最も良好なアンタゴニストであろう。
【０２２６】
十分に結合し、ＣＳＧと同一または密接に関係した効果を惹起する化合物はアゴニストである。潜在的アゴニストよびアンタゴニストのＣＳＧ類似の効果は、例えば候補分子を細胞または適切な細胞調製物と相互作用させた後に、第２メッセンジャー系の活性を決定すること、およびその効果をＣＳＧの効果、あるいはＣＳＧと同一の効果を惹起する分子の効果と比較することで測定され得る。この観点に関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系は、ＡＭＰグアニレートシクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解セカンドメッセンジャー系を含むが、これらに限定されない。
【０２２７】
ＣＳＧアンタゴニストに関するアッセイの別の例は、競合阻害アッセイに適切な条件の下にてＣＳＧならびに潜在的アンタゴニストを、膜結合ＣＳＧ受容体分子または組換えＣＳＧ受容体分子とを組み合わせる競合アッセイである。ＣＳＧは、受容体分子に結合したＣＳＧ分子の数を正確に決定し、潜在的アンタゴニストの有効性を評価できるように、例えば放射能で標識することができる。
【０２２８】
潜在的アンタゴニストは、本発明のＣＳＧポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または無力化する小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を含む。潜在的アンタゴニストはまた、小有機分子、ペプチド、ＣＳＧ誘発活性を誘発することなく、受容体分子などの結合分子上の同一部位に結合し、それによりＣＳＧを結合から排除することによりＣＳＧの作用を阻害する、密接に関連するタンパク質または抗体などのポリペプチドであってもよい。
【０２２９】
潜在的アンタゴニストは、ＣＳＧポリペプチドの結合部位に結合し、これを占有することで受容体分子などの細胞結合分子への結合を阻害し、その結果正常な生物学的活性が阻害される小分子を含む。小分子の例としては、小有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
その他の潜在的アンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを通じ、あるいは三重らせん形成を通じて遺伝子発現を制御するのに使用できる。アンチセンス技術は、例えばＯｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ５６： ５６０ （１９９１）； ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＳ ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ ＯＦ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ． （１９８８）の中で論じられている。
【０２３１】
三重らせん形成は、例えばＬｅｅｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６： ３０７３ （１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ４５６ （１９８８）、およびＤｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１： １３６０ （１９９１）の中で論じられている。該方法はポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば本発明の成熟型ＣＳＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用され得る。
【０２３２】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写物に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計されており、それによりＣＳＧポリペプチドの転写ならびに生成を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにてｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＣＳＧポリペプチドへの翻訳を阻止する。また上記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで発現され、ＣＳＧの産生を阻害するように細胞内に送達されることもできる。
【０２３３】
組成物
本発明はまた、ＣＳＧポリヌクレオチドまたはＣＳＧポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストを含む組成物に関する。
例えば、本発明のＣＳＧポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、細胞、組織または生体への使用のための非無菌的または無菌的な１または２以上のキャリア、例えば対象への投与に適切な薬学的キャリアと併用されてもよい。
【０２３４】
かかる組成物は、例えば媒体添加物または治療的な有効量の本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容し得るキャリアまたは賦形剤を含む。かかるキャリアは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。配合物は投与様式に適していなければならない。
【０２３５】
本発明の組成物は、個々の患者の臨床状態（特に、ポリペプチドまたは他の化合物単独での処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および開業医に既知の他の要素を考慮して、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）に沿った様式で、処方されて、投薬される。したがって、本明細書の目的に関する「有効量」は、かかる考慮により決定される。
【０２３６】
一般的な提案として、１回用量あたり非経口的に投与される分泌ポリペプチドの薬学的総有効量は、約１μｇ／ｋｇ（患者の体重）／日〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）／日の範囲であろうが、上述するように、これは治療上の判断に左右されるであろう。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、ヒトに関して最も好ましくは、ホルモンに関して約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２３７】
連続的に与えられる場合、ポリペプチドまたは他の化合物は、典型的に、１日あたり１〜４回の注射により、または連続皮下注入により（例えば、ミニポンプを用いて）、約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０ｍｇ／ｋｇ／時の用量速度にて投与される。点滴バッグ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｂａｇ）溶液もまた、用いてもよい。変化を観察するのに必要な処置の期間、および処置後に応答が生じる間隔は、所望の効果に依存して変わるようである。
【０２３８】
本発明の分泌タンパク質を含有する薬学的組成物は、経口的に、経直腸的に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、局所的に（パウダー、軟膏、ジェル、滴薬または経皮パッチによるものなど）、口腔に、または口腔もしくは鼻スプレーとして、投与される。「薬学的に許容し得るキャリア」は、無毒性の固形、半固形または液体賦形剤、希釈剤、カプセル用材料または任意のタイプの配合助剤を指す。本明細書で使用する「非経口」という用語は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内注射ならびに注入を含む投与様式を指す。
【０２３９】
ポリペプチドまたは他の化合物はまた、持続放出系により適切に投与される。持続放出性組成物の適切な例としては、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２： ５４７−５５６ （１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５： １６７−２７７ （１９８１）、およびＲ． Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２： ９８−１０５ （１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）が挙げられる。
【０２４０】
持続放出性組成物はまた、リポソームエントラップポリペプチドを包含する。ポリペプチドまたは他の化合物を含有するリポソームは、既知の方法により調製される（Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ３６８８−３６９２ （１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４０３０−４０３４ （１９８０）、ＥＰ ５２３２２、ＥＰ ３６６７６、ＥＰ ８８０４６、ＥＰ １４３９４９、ＥＰ １４２６４１、日本国特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号、ならびにＥＰ １０２３２４）。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、そこでの脂質含量は、約３０（ｍｏｌ％）コレステロールよりも高く、選択比率は、最適な治療に関して調節される。
【０２４１】
非経口投与に関して、一態様では、ポリペプチドまたは他の化合物は、一般的に所望の純度にて、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）で、薬学的に許容し得るキャリア、すなわち、使用する投与量および濃度にてレシピエントに無毒性であり、配合物の他の成分と併用可能（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であるもの）と混合することにより配合される。
例えば、配合物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドまたは他の化合物にとって有害であると知られている他の化合物を含まない。
【０２４２】
一般に、配合物は、液体キャリアまたは微細固体キャリア、あるいはその両方と、均一かつ緊密にポリペプチドまたは他の化合物を接触させることにより調製される。次に、必要な場合には、生成物を所望の配合物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口キャリア、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。かかるキャリア媒質の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびブドウ糖溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性媒質、ならびにリポソームもまた、本発明に有用である。
【０２４３】
キャリアは適切に、等張性および化学的安定性を高める物質などの、少量の添加剤を含有する。かかる物質は、用いる投与量および濃度にて、レシピエントに対して無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩などの緩衝液、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、および他の炭化水素、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの対イオン、および／またはポリソルベート、ポロクサマー、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０２４４】
ペプチドまたは他の化合物は、典型的に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨにて、かかるビヒクル中で配合される。先述の賦形剤、キャリアまたは安定剤のうちのあるものの使用は、結果としてポリペプチド塩または他の化合物の塩の形成を生じる結果となろうことは理解されるであろう。
【０２４５】
治療用投与のために使用されるべきポリペプチドはいずれも無菌であべきである。無菌状態は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロンの膜）を通した濾過により容易に達成される。治療用ポリペプチド組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により突き刺すことが可能なストッパーを有する点滴溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０２４６】
ポリペプチドは通常、単用量または複数用量容器（例えば、密封アンプルまたはバイアル）中に、水溶液として、または再構成用凍結乾燥配合物として、保管されるであろう。凍結乾燥配合物の例として、１０ｍｌバイアルを滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ポリペプチド水溶液５ｍｌで充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、注射用静菌水を用いて、凍結乾燥ポリペプチドを再構成することにより調製される。
【０２４７】
キット
本発明はさらに、本発明の上記組成物の１または２以上の成分が充填された１または２以上の容器を含む、薬学的パックおよびキットに関する。１または２以上のかかる容器には、医薬品または生物製品の製造、使用または販売を管轄する政府機関が定めた形式で書かれた、該機関による、ヒトへの投与に関する製品の製造、使用または販売の承認を示す通知を添付することができる。
【０２４８】
投与
本発明のＣＳＧポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはその他の化合物、好ましくはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、単独または治療化合物などのその他の化合物とともに使用してもよい。
薬学的組成物は、例えばとりわけ局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内または皮内経路による投与を含む効果的かつ便宜的な方法で投与され得る。
【０２４９】
薬学的組成物は一般に、特定の１または２以上の適応症の処置あるいは予防に有効な量で投与される。一般には、組成物は少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇの量で投与される。しかしながら、最適投与量は、適応症、その重症度、投与経路、合併症状等を考慮しながら、各処置の様式および適応症に関する標準的方法により決定されるだろう。
【０２５０】
個体においてＣＳＧポリペプチドの標準または正常発現レベルの減少により引き起こされる症状は、好ましくは分泌形態にある、本発明のＣＳＧポリペプチド、またはそのアゴニストを投与することにより処置できることが理解されるであろう。したがって、本発明はまた、ＣＳＧポリペプチドレベルの増加を必要とする個体を処置する方法であって、かかる個体においてＣＳＧポリペプチドの活性レベルを増加させるためのＣＳＧポリペプチドまたはそのアゴニストの量を含む薬学的組成物を、かかる個体に投与することを含む方法を提供する。例えば、減少したＣＳＧポリペプチドレベルを有する患者は、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇのＣＳＧポリペプチドまたはそのアゴニストを６日間連続で受けてもよい。好ましくは、ＣＳＧポリペプチドが投与される場合、それは好ましくは分泌形態においてである。
【０２５１】
本発明の組成物はまた、ＣＳＧポリペプチドの増大したレベルを処置するために投与することもできる。例えば、アンチセンス技術を、本発明のＣＳＧポリペプチドの産生を抑制するために用いることができる。この技術は、癌などの様々な病因に起因するポリペプチド、好ましくは分泌形態のもののレベルを減少させる方法の一例である。
【０２５２】
異常に増加したポリペプチドレベルを有すると診断された患者に、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ／日にて、２１日間、アンチセンスポリヌクレオチドを静脈内に投与することができる。この処置が十分に耐えられた場合、処置は７日の休止期間後に繰り返される。また、ＣＳＧポリペプチドのアンタゴニストを含む組成物を、患者におけるＣＳＧレベルを減少させるために投与することもできる。
【０２５３】
遺伝子治療
ＣＳＧポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストは、しばしば「遺伝子治療」と称される治療様式において、かかるポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで発現させることにより、本発明により使用されてもよい。
【０２５４】
したがって、例えば、患者由来の細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドにより操作されてもよく、次に操作された細胞を、ポリペプチドにより処置されるべき患者に提供することができる。例えば、細胞は本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ｅｘ ｖｉｖｏで操作することができる。かかる方法は、当該技術分野で既知であり、本発明でのそれらの使用は本発明中の教示より明らかになるだろう。
【０２５５】
同様に細胞は、当分野既知の方法によりｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチド発現のためｉｎ ｖｉｖｏで操作され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、上述したとおり、複製欠損レトロウイルスベクターでの発現のために操作され得る。
【０２５６】
次に、レトロウイルス発現構築物が単離され、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞内に、そのパッケージング細胞が次に所望遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するように導入され得る。これらの産生細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞を操作し、ｉｎ ｖｉｖｏにてポリペプチドを発現させることを目的として、患者に投与され得る。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよびその他の方法は、本発明の教示より当業者に明らかになるはずである。
【０２５７】
本明細書中で上述したレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどのレトロウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルスより得られる。
【０２５８】
かかるベクターは、ポリペプチドを発現させるための１または２以上のプロモーターを含むだろう。好適なプロモーターの選択は、本明細書の教示から当業者に明らかとなるだろう。しかしながら、使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７： ９８０−９９０ （１９８９）記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびベータアクチンプロモーターなどの真核生物細胞性プロモーターを含むが、これらに限定されない。使用され得るその他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０２５９】
用いられ得るさらなるプロモーターは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーターなどの誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、ヒトグロビンプロモーター、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、ベータアクチンプロモーター、およびヒト成長ホルモンプロモーターを含む。プロモーターは、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する未変性プロモーターでもよい。
【０２６０】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、好適なプロモーターの制御下に置かれ得る。
【０２６１】
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、プロデューサー細胞系を形成するパッケージング細胞系の誘導に使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＭｉｌｌｅｒ， Ａ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １： ５−１４ （１９９０）記載のＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６２】
ベクターは、当該技術分野に既知の任意の手段によりパッケージング細胞内に導入される。かかる手段としては、エレクトポレーション、リポソームの利用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム内にカプセル封入されるか、または脂質に結合された後に宿主に投与されてもよい。プロデューサー細胞系は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生するだろう。
【０２６３】
次に、かかるレトロウイルスベクター粒子を利用して、真核生物細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するだろう。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚性幹細胞、胚性腫瘍細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６４】
典型的な遺伝子治療の一方法は、ＣＳＧポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを発現することが可能な線維芽細胞を、患者に移植することを伴う。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により対象から得られる。得られた組織を組織培養培地に置き、小片に分離する。組織の小片を組織培養フラスコの湿った表面上へ載せ、各フラスコにおいて約１０片を載せる。フラスコを上下ひっくり返し、きつく閉めて、室温で一晩放置する。
【０２６５】
室温にて２４時間後、フラスコをひっくり返し、組織片をフラスコの底に固定させたままで、新鮮な培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン加）を添加する。次に、フラスコを３７℃にて約１週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を添加し、続いて数日毎に取り換える。さらに２週間の培養の後、線維芽細胞の単層が現れる。
【０２６６】
単層をトリプシン処理し、大きなフラスコへはがし取る。モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列に隣接したｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ， Ｐ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ， ７： ２１９−２５ （１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理する。アガロースゲル上で線状ベクターを分画し、ガラスビーズを用いて精製する。
【０２６７】
本発明のＣＳＧポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端配列に相当するＰＣＲプライマー用いて増幅することができる。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含有し、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線状主鎖ならびに増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、一緒に添加する。得られた混合物を、２つの断片の連結に適した条件下にて保持する。
【０２６８】
次に、連結混合物を用いて、バクテリアＨＢ　１０１を形質転換した後、ベクターが適切に挿入された所定の遺伝子を有することを確認する目的で、カナマイシンを含有する寒天上に蒔く。両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％の仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、コンフルエント密度に、組織培養で増殖させる。次に、遺伝子を含有するＭＳＶベクターを培地に添加し、パケージング細胞にベクターで形質導入する。
【０２６９】
すると、パッケージング細胞は、遺伝子を含有する感染ウイルス粒子を生産する（パッケージング細胞は、今度はプロデューサー細胞と称される）。形質導入したプロデューサー細胞に、新鮮な培地を添加し、続いて、コンフルエントなプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから、培地を採取する。ミリポアフィルターを通して感染ウイルス粒子を含有する使用済培地を濾過し、剥離したプロデューサー細胞を除去し、続いてこの培地を用いて、線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから、培地を除去し、プロデューサー細胞からの培地とすばやく入れ換える。この培地を除去し、新鮮な培地と入れ換える。
【０２７０】
ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞は感染し、選択は必要ない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。線維芽細胞がいったん効果的に感染したら、線維芽細胞を分析して、タンパク質が産生されるかどうかを決定する。次に、操作した線維芽細胞を、単独で、またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズ上にてコンフルエントまで増殖させた後に、宿主に移植する。
【０２７１】
あるいは、ＣＳＧに関連する障害、疾患および症状を処置するために、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療方法を用いることもできる。遺伝子治療方法は、ポリペプチドの発現を増加または減少させるための、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。
【０２７２】
例えば、本発明のＣＳＧポリヌクレオチドまたは、それに対するアゴニストもしくはアンタゴニストをコードする核酸配列は、プロモーターまたは標的組織によって、ポリペプチド発現に必要な任意の他の遺伝要素に作動可能に連結されてもよい。かかる遺伝子治療ならびに送達技術および方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ ９０／１１０９２、ＷＯ ９８／１１７７９、米国特許第５，６９３，６２２号、第５，７０５，１５１号、第５，５８０，８５９号、Ｔａｂａｔａ Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３５ （３）： ４７０−４７９、Ｃｈａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． ３５（６）： ５１７−５２２、Ｗｏｌｆｆ Ｊ． Ａ． （１９９７） Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ． Ｄｉｓｏｒｄ． ７ （５）： ３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３ （５）： ４０５−４１１， Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４ （１２）： ３２８１−３２９０（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０２７３】
ポリヌクレオチド構築物は、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間質腔への注射などの、動物細胞へ注入可能な物質を送達するいかなる方法により送達されてもよい。ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に許容し得る液体または水性キャリア中で送達することができる。
【０２７４】
「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡという用語は、細胞への侵入を補佐、促進または助長するよう作用する、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム配合物、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含むいかなる送達ビヒクルも含まない配列を指す。しかしながら、ポリヌクレオチドはまた、当業者に既知の方法により調製され得るリポソーム配合物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７２： １２６−１３９、およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ８５ （１）： １−７に教示されているもの）にて送達されてもよい。
【０２７５】
遺伝子治療方法にて使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれない構築物であり、またそれらは、複製が可能な配列を含有しないであろう。当業者に既知のいかなる強力なプロモーターも、ＤＮＡ発現を促進するために使用することができる。他の遺伝子治療技術と異なり、標的細胞へ裸の核酸配列を導入することの１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究により、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、最大６ヶ月の期間、所望のポリペプチドの産生を提供することができることがわかった。
【０２７６】
ポリヌクレオチド構築物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む、動物内組織の間質腔へ送達され得る。組織の間質腔は、細胞間液、器官組織の細網線維間のムコ多糖マトリックス、管または房の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、または筋細胞を覆う結合組織内もしくは骨小腔中にある同じマトリックスを含む。
【０２７７】
循環血漿およびリンパ管のリンパ液により占有される腔も同様である。筋組織の間質腔への送達が好ましい。ポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織への注射により利便性よく送達され得る。
【０２７８】
送達および発現は、未分化またはあまり完全には分化していない細胞、例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞などにて達成され得るが、それらは、好ましくは、分化した永続性の非分裂細胞に送達され、そこで発現される。ｉｎ ｖｉｖｏの筋細胞は特に、ポリヌクレオチドを取り込み、発現するそれらの能力に優れている。
【０２７９】
裸のポリヌクレオチド注射に関して、有効投与量のＤＮＡまたはＲＮＡは、約０．０５μｇ／体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／体重ｋｇの範囲であろう。好ましくは、投与量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであろう。当然のことながら、当業者が理解するように、この投与量は、注射の組織部位により変化するであろう。適切かつ有効な投与量の核酸配列は、当業者により容易に決定することができ、それは、処置する症状および投与経路に依存し得る。
【０２８０】
好ましい投与経路は、組織の間質腔への注射の非経口経路によるものである。しかしながら、特に肺もしくは気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送達用のエアロゾル配合物の吸入などの、他の非経口経路もまた使用してもよい。さらに、裸のポリヌクレオチド構築物は、血管形成中に、当該手順で使用されるカテーテルにより、動脈へ送達することができる。
【０２８１】
筋肉中に注射されたポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏでの用量反応効果は以下のように決定される。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生のための適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡは、環状または線状のいずれであってもよく、それは裸のＤＮＡとして用いられるか、あるいはリポソームと複合体を形成する。次に、マウスの四頭筋に、様々な量の鋳型ＤＮＡを注射する。
【０２８２】
５〜６週齢の雌および雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、２．５％アベルチン０．３ｍｌの腹腔内注射により麻酔する。腹側大腿上に１．５ｃｍの切開を施し、四頭筋を直接見えるようにする。筋肉の膝への遠位付着部位から約０．５ｃｍかつ約０．２ｃｍの深さで、１分にわたり、２７ゲージ針を通じて、１ｃｃの注射器内のキャリア０．１ｍｌ中の鋳型ＤＮＡを注射する。将来の位置確認のために注入部位上に縫合糸を設置し、皮膚をステンレス製クリップで閉じる。
【０２８３】
適切なインキュベーション時間後（例えば、７日）、四頭筋全体を切除することにより、筋肉摘出物を調製する。個々の四頭筋のすべての５番目の１５μｍ断面を、タンパク質発現のために組織化学的に染色する。タンパク質発現に関するタイムコースは、種々のマウス由来の四頭筋が異なる時間にて採取されることを除いて、同様の様式にて行われ得る。注射後の筋肉中のＤＮＡの永続性は、注射したマウスおよび対照マウスから全細胞ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後に、サザンブロット分析により確定されてもよい。
【０２８４】
マウスでの上記実験の結果を用いて、裸のＤＮＡを用いた、ヒトおよび他の動物における適切な投与量および他の治療パラメータを外挿することができる。
【０２８５】
非ヒトトランスジェニック動物
本発明のＣＳＧポリペプチドはまた、非ヒトトランスジェニック動物にて発現させることもでできる。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、小型ブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーが含まれるが、これらに限定されないあらゆる種の非ヒト動物を用いて、トランスジェニック動物を生み出してもよい。当該技術分野で既知の任意の技法を用いて、動物に導入遺伝子（すなわち、本発明のポリペプチド）を導入して、トランスジェニック動物の創始系統を生産してもよい。
【０２８６】
かかる技法としては、前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ）マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４０： ６９１−６９８ （１９９４）、Ｃａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １１：１２６３−１２７０ （１９９３）、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） ９： ８３０−８３４ （１９９１）； およびＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））、生殖系列（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８２： ６１４８−６１５２ （１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５６： ３１３−３２１ （１９８９））、細胞または胚へのエレクトロポレーション（Ｌｏ， １９８３， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３： １８０３−１８１４ （１９８３））、遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： １７４５ （１９９３）を参照）、胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞への幹細胞の移し戻し、および精子媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５７： ７１７−７２３ （１９８９））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８７】
かかる技法のレビューとして、Ｇｏｒｄｏｎ， ”Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ”， Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５： １７１−２２９ （１９８９）を参照されたい（それは、参照により全体が本明細書に援用される）。
当該技術分野において既知のいかなる技法、例えば、静止状態へ誘導された培養胚細胞、胎児細胞または成人細胞からの核の、脱核卵母細胞への核移入（Ｃａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ６４−６６ （１９６６）， Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８５： ８１０８１３ （１９９７））を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含有するトランスジェニッククローンを生産してもよい。
【０２８８】
本発明は、すべての動物細胞において導入遺伝子を持つトランスジェニック動物、ならびに、すべてではないが幾つかの細胞において導入遺伝子を持つ動物、すなわちモザイク動物またはキメラ動物を提供する。導入遺伝子は、単一導入遺伝子として、またはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム、もしくは頭−尾タンデム）のような多重コピーとして、組み込まれてもよい。導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．の教示（Ｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ６２３２−６２３６ （１９９２））に従って、特定の細胞タイプに選択的に導入されて、そこで活性化されてもよい。
【０２８９】
かかる細胞タイプ特異的な活性化に必要な調節遺伝子は、所定の特定細胞タイプに依存し、それは当業者には明らかであろう。ポリヌクレオチド導入遺伝子が内因性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが望ましい場合、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡潔に述べると、かかる技法を利用する場合、内因性遺伝子に相同的な幾つかのヌクレオチド配列を含有するベクターを、内因性遺伝子のヌクレオチド配列へ、染色体配列との相同組換えにより組み込み、その機能を崩壊させる目的で設計する。
【０２９０】
導入遺伝子はまた、特定の細胞タイプへ選択的に導入されてもよく、したがって、例えばＧｕ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５： １０３−１０６ （１９９４））の教示に従って、その細胞タイプのみで内因性遺伝子を不活性化させる。かかる細胞タイプに特異的な不活性化に必要な調節配列は、所定の特定細胞タイプに依存し、それは当業者には明らかであろう。
【０２９１】
トランスジェニック動物がいったん創出されれば、組換え遺伝子の発現は、標準的な技法を利用してアッセイされ得る。初期スクリーニングは、導入遺伝子の組み込みが起ったことを確認すべく動物組織を分析するために、サザンブロット分析またはＰＣＲ技法により達成され得る。
【０２９２】
トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得られた組織試料のノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）が含まれるが、これらに限定されない技法を用いて評価してもよい。トランスジェニック遺伝子発現組織の試料はまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて、免疫細胞化学的に、または免疫組織化学的に評価さてもよい。
【０２９３】
創始動物がいったん生産されれば、それらを、繁殖、同系交配、異系交配、または交雑させて、特定の動物コロニーを生産してもよい。かかる繁殖戦略の例としては、別個の系統を樹立するために、１つよりも多い組み込み部位を有する創始動物を異系交配すること、各導入遺伝子の付加的発現の効果が理由で、高いレベルで導入遺伝子を発現する複合遺伝子導入をもたらすために、別個の系統を同系交配させること、発現を増大させ、かつＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性をなくすために、所定の組み込み部位に関してホモ接合性の動物を生産するために、ヘテロ接合性のトランスジェニック動物を交雑させること、複合へテロ接合性またはホモ接合性系統を生産するために、別個のホモ接合性系統を交雑させること、および当該実験モデルに適切な明瞭なバックグラウンドに導入遺伝子を配置させるために繁殖させることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９４】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のＣＳＧポリペプチドの生物機能を説明し、ＣＳＧの異常発現に関連した症状および／または障害を研究し、かかるＣＳＧ関連症状および／または疾患を回復するのに効果的な化合物をスクリーニングするのに有用な動物モデル系を含むが、これに限定されない用途を有する。
【０２９５】
ノックアウト動物
内因性の遺伝子発現はまた、標的（ｔａｒｇｅｔｅｄ）相同組換えを用いて、遺伝子および／もしくはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することにより低減することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１７： ２３０−２３４ （１９８５）、Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ ５１： ５０３５１２ （１９８７）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５： ３１３−３２１ （１９８９）を参照。それらはそれぞれ、その全体が、参照により本明細書に援用される）。
【０２９６】
例えば、内因性ＣＳＧポリヌクレオチド配列（遺伝子のコード領域または調節領域）に相同的なＤＮＡに隣接した突然変異体である本発明の非機能性ＣＳＧポリヌクレオチド（または完全に非関連のＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いて、あるいは用いずに使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトすることができる。別の態様では、当該技術分野にて既知の技法を用いて、所定の遺伝子を含有するが、発現はしない細胞におけるノックアウトを生成する。
【０２９７】
標的相同組換えを介したＤＮＡ構築物の挿入は、結果として標的遺伝子の不活性化を招く。かかるアプローチは、研究および農業の分野に特に適しており、そこで胚性幹細胞の改変を用いて、不活性な標的遺伝子を有する動物の子孫を発生させることができる（例えば、上述のＴｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９を参照）。組換えＤＮＡ構築物が、当業者には明らかであろう適切なウイルスベクターを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏにて、必要とされる部位に直接的に投与されるか、または標的にされるという条件で、このアプローチはまた、ヒトにおける使用にルーチンで適合され得る。
【０２９８】
本発明のさらなる態様では、本発明のＣＳＧポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞、あるいは本発明のＣＳＧポリペプチドを発現しないように遺伝子操作された（例えば、ノックアウト）細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにて患者に投与する。かかる細胞は、患者、またはＭＨＣ適合ドナーから得てもよく、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞を含むことができるが、これらに限定されない。
【０２９９】
細胞は、組換えＤＮＡ技法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて遺伝子操作され、細胞に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するか、あるいは例えば形質導入（ウイルスベクター、好ましくは細胞ゲノムに導入遺伝子を組み込むベクターを用いて）またはプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソーム等の使用を含むが、これらに限定されないトランスフェクション手法により、本発明のポリペプチドに関するコード配列および／または内因性調節配列を崩壊させる。
【０３００】
本発明のＣＳＧポリペプチドのコード配列は、強力な構成もしくは誘導プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に置くことにより、本発明のＣＳＧポリペプチドの発現、好ましくは分泌を達成することができる。本発明のＣＳＧポリペプチドを発現、好ましくは分泌する操作細胞を全身的に、例えば、循環にて、または腹腔内にて患者に導入することができる。
【０３０１】
あるいは、細胞をマトリックス中に組み込み、体内へ移植することができ、例えば、遺伝子操作した線維芽細胞は、皮膚移植片の一部として移植することができ、または、遺伝子操作した内皮細胞は、リンパ管または血管移植片の一部として移植することができる（例えば、各々その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，３９９，３４９号、および米国特許第５，４６０，９５９号を参照）。
【０３０２】
投与されるべき細胞が非自系または非ＭＨＣ適合細胞である場合、それらは、導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を防ぐ既知の技法を用いて、投与され得る。例えば、細胞は、じかに接している細胞外環境との構成成分の交換が可能であるものの、導入細胞が宿主免疫系により認識されることが不可能なカプセル化形態で導入されてもよい。
【０３０３】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、本発明のＣＳＧポリペプチドの生物機能を説明し、異常なＣＳＧの発現に関連した症状および／または障害を研究し、かかるＣＳＧ関連症状および／または疾患を改善するのに効果的な化合物をスクリーニングするのに有用な動物モデル系を含むが、これらに限定されない用途を有する。
【０３０４】
例
本発明は以下の例によりさらに詳細に説明される。本例は具体的な態様を参照することで発明を例示するためにのみ提供される。これら例示は、本発明のある特定の側面を記述するものの、開示された発明の範囲を限定あるいは制限するものではない。
【０３０５】
全ての例は、特に詳細記載された場合を除き、当業者にとって既知、かつ日常的である標準的な技術を用いて実施された。以下の例の日常的な分子生物学的技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載されているとおりに実施された。
【０３０６】
ＣＳＧの同定
ＣＳＧ（大腸特異遺伝子）の同定は、本明細書中でＣＬＡＳＰと呼ぶデータマイニング、癌情報自動検索パッケージ（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅａｄｓ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｅａｒｃｈ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いた、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡから入手可能なデータベースであるＬＩＦＥＳＥＱ Ｇｏｌｄ中のデータの系統的分析により行なわれた。
【０３０７】
ＣＬＡＳＰは以下の工程を行なう。最初に、全ての他の器官に対する標的器官中の対応するＥＳＴの存在度レベルに基づき、高発現器官特異遺伝子が選択される。次に、それぞれの高発現器官特異遺伝子の発現レベルが、正常組織、腫瘍組織、および腫瘍または疾患に関連する組織ライブラリーにおいて分析される。候補は、ＥＳＴの構成要素の証明、ならびに、腫瘍組織または腫瘍ライブラリーにおける専らのまたはより頻繁な発現に基づいて選択される。
【０３０８】
こうして、ＣＬＡＳＰにより、高発現器官および癌特異遺伝子の同定が可能となる。次に、最終的な手動による詳細な評価を行ない、遺伝子選択の仕上げをする。
ＣＬＡＳＰ法を用いて、次のＩｎｃｙｔｅ配列が、ＣＳＧとして同定された。
【０３０９】
【表１】
2004510408.tif 000002
【０３１０】
遺伝子発現の相対的定量
蛍光性タックマン（Ｔａｑｍａｎ）プローブを用いたリアルタイム定量ＰＣＲは、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を利用する定量検出システムである。この方法は、５’をレポーター色素で、下流の３’をクエンチャー色素で標識した内部蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（タックマン）を用いる。ＰＣＲの間にＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性がレポーターを放出し、次にその蛍光がモデル７７００シークエンス検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）のレーザー検出器により検出することができる。
【０３１１】
内因性対照の増幅を使用し、反応に添加された試料ＲＮＡの量が標準化され、逆転写酵素（ＲＴ）の効率が正規化される。シクロフィリン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、または１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のいずれかがこの内部対照として用いられた。研究される全試料間の相対定量を計算するために、１つの試料についての標的ＲＮＡレベルを結果比較のための基礎（キャリブレーター）として用いた。「キャリブレーター」に対する定量化は、標準曲線法または比較法（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００シークエンス検出システム）を用いて得ることができる。
【０３１２】
標的遺伝子の組織分布およびレベルを、正常組織および癌組織の全ての試料について決定した。全ＲＮＡは、正常組織、癌組織、および癌とそれに対応する対応隣接組織から抽出した。続いて逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡを調製し、各標的遺伝子に特異的なプライマーとタックマンプローブとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。結果は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００シークエンス検出装置を用いて分析した。無名数は、キャリブレーター組織と比較した場合の特定組織中にある標的遺伝子の相対発現レベルである。
【０３１３】
以下のプライマーをリアルタイム定量ＰＣＲに用いた。
フォワードプライマー：
ＴＧＧＡＡＡＴＡＧＡＴＴＣＡＧＧＧＧＴＣＡＴ（配列番号２３）
リバースプライマー：
ＣＧＧＧＴＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号２４）
Ｑ−ＰＣＲプローブ：
ＴＧＴＣＴＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧ（配列番号２５）
【０３１４】
表１に記載の無名数は、２４の異なる正常組織における、遺伝子ＩＤ２０３２７９（本明細書中では、Ｃｌｎ１２９または配列番号５とも呼ばれる）の相対発現レベルである。値は全て、正常肝臓（キャリブレーター）と比較された。これらＲＮＡ試料は、異なる個体由来の特定組織の試料をプールすることにより得られた市販のプールである。
【０３１５】
【表２】
2004510408.tif 000003
【０３１６】
表１中の発現の相対レベルは、Ｃｌｎ１２９ｍＲＮＡの発現が、正常直腸のプール中で高レベルに（２３）、そして、腎臓でより低レベルに（３．７）検出されたことを示している。これに対し、Ｃｌｎ１２９は、分析した他の２２の正常組織プールにおいて、極めて低レベルで発現されていた。さらに、直腸での発現レベルは、腎臓での発現に比べ６倍高い。これらの結果は、Ｃｌｎ１２９ｍＲＮＡの発現が、直腸組織に高度に特異的であることを証明する。
【０３１７】
表１の無名数は、異なる個体由来の特定組織試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料より得たＲＮＡに由来する無名数とは比較できない。
表２に記載の無名数は、２１対の対応試料のＣｌｎ１２９の発現の相対レベルである。全ての値が正常肝臓（キャリブレーター）と比較されている。対応ペアは、特定組織に関する癌試料に由来するｍＲＮＡ、および同一個体由来の同一組織に関する正常隣接試料に由来するｍＲＮＡにより形成される。
【０３１８】
【表３】
2004510408.tif 000004
【０３１９】
１１の異なる組織を代表する表２中の４２の試料のうち、有意な発現は、大腸、腎臓および小腸組織でのみ見られた。これらの結果は、表１に示した正常試料により得られた組織特異性の結果を確認するものである。表１および表２は、合わせて合計２４のヒト組織種中の６６の試料を表している。大腸および直腸とは異なる２２の組織種を代表する合計４２の試料のうち、１つの小腸試料、１つの肺試料、１つの肝臓試料、および１つの腎臓試料のみが、Ｃｌｎ１２９の発現を示した。
【０３２０】
同一の個体からの大腸癌試料と正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルの比較が表２に示されている。Ｃｌｎ１２９は、１１の癌試料のうち８において（７３％）（大腸１、２、４、５、７、８、９、１０）正常隣接組織に比べ、より高レベルで発現していた。
総じて、高レベルの組織特異性に加え、試験した大腸癌対応試料の７３％におけるｍＲＮＡの上方調節は、Ｃｌｎ１２９が大腸癌の診断マーカーであることを示している。
【０３２１】
本発明は、上述の説明および例に特に記載したものと違うように実施されてもよいことは明らかであろう。上記の教示に鑑みて、本発明の数多くの変更およびバリエーションが可能であり、したがってそれらは、併記の特許請求の範囲内である。
発明の背景、詳細な説明および例において引用した各文献（特許、特許出願、論文、要約、実験室マニュアル、書籍、または他の開示を含む）の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書とともに提出する配列表のハードコピーおよび相当するコンピュータ読取り可能形態の両方が、全体として参照により本明細書中に援用される。
【国際公開パンフレット】
2004510408.tif 000005
2004510408.tif 000006
2004510408.tif 000007
2004510408.tif 000008
2004510408.tif 000009
2004510408.tif 000010
2004510408.tif 000011
2004510408.tif 000012
2004510408.tif 000013
2004510408.tif 000014
2004510408.tif 000015
2004510408.tif 000016
2004510408.tif 000017
2004510408.tif 000018
2004510408.tif 000019
2004510408.tif 000020
2004510408.tif 000021
2004510408.tif 000022
2004510408.tif 000023
2004510408.tif 000024
2004510408.tif 000025
2004510408.tif 000026
2004510408.tif 000027
2004510408.tif 000028
2004510408.tif 000029
2004510408.tif 000030
2004510408.tif 000031
2004510408.tif 000032
2004510408.tif 000033
2004510408.tif 000034
2004510408.tif 000035
2004510408.tif 000036
2004510408.tif 000037
2004510408.tif 000038
2004510408.tif 000039
2004510408.tif 000040
2004510408.tif 000041
2004510408.tif 000042
2004510408.tif 000043
2004510408.tif 000044
2004510408.tif 000045
2004510408.tif 000046
2004510408.tif 000047
2004510408.tif 000048
2004510408.tif 000049
2004510408.tif 000050
2004510408.tif 000051
2004510408.tif 000052
2004510408.tif 000053
2004510408.tif 000054
2004510408.tif 000055
2004510408.tif 000056
2004510408.tif 000057
2004510408.tif 000058
2004510408.tif 000059
2004510408.tif 000060
2004510408.tif 000061
2004510408.tif 000062
2004510408.tif 000063
2004510408.tif 000064
2004510408.tif 000065
2004510408.tif 000066
2004510408.tif 000067
2004510408.tif 000068
2004510408.tif 000069
2004510408.tif 000070
2004510408.tif 000071
2004510408.tif 000072
2004510408.tif 000073
2004510408.tif 000074
2004510408.tif 000075
2004510408.tif 000076
2004510408.tif 000077
2004510408.tif 000078
2004510408.tif 000079
2004510408.tif 000080
2004510408.tif 000081
2004510408.tif 000082
2004510408.tif 000083
2004510408.tif 000084
2004510408.tif 000085
2004510408.tif 000086
2004510408.tif 000087
2004510408.tif 000088
2004510408.tif 000089
2004510408.tif 000090
2004510408.tif 000091
2004510408.tif 000092
2004510408.tif 000093
2004510408.tif 000094
2004510408.tif 000095
2004510408.tif 000096
2004510408.tif 000097
2004510408.tif 000098
2004510408.tif 000099
2004510408.tif 000100
2004510408.tif 000101
2004510408.tif 000102
2004510408.tif 000103
2004510408.tif 000104
2004510408.tif 000105
2004510408.tif 000106
2004510408.tif 000107
2004510408.tif 000108
2004510408.tif 000109
2004510408.tif 000110
2004510408.tif 000111
2004510408.tif 000112
2004510408.tif 000113
2004510408.tif 000114
2004510408.tif 000115
2004510408.tif 000116
2004510408.tif 000117
2004510408.tif 000118
2004510408.tif 000119
2004510408.tif 000120
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510408.tif 000121
【国際調査報告】
2004510408.tif 000122
2004510408.tif 000123
2004510408.tif 000124
2004510408.tif 000125
2004510408.tif 000126
2004510408.tif 000127
2004510408.tif 000128
2004510408.tif 000129
2004510408.tif 000130