(57)【要約】本発明は、2つの異なる抗体及び所望によるリガンドが、抗体により認識されるリセプター、ポンプ、及び／又はタンパク質に結合され、そしてその抗体結合における変化が、測定される時に、細胞表面リセプター、ポンプ、又はタンパク質の存在及び／又はコンホメーションの変化を検出することに関する。その方法は、前記天然の細胞が、薬剤又は試験されるよう組み合わされた薬剤によりin vitroにおいて結合され、そしてその試料が、上記方法にて試験される、多剤耐性の場合の有効で、細胞増殖抑制薬剤の組み合わせを決定するため使用することができる。前記一致する方法が、周知の調節因子又は試験される調節因子の存在にて行われ、そして得られた活性値が比較される。さらに本発明の目的は、リセプター、ポンプ,及びタンパク質の存在、及びコンホメーションの変化を検出するため、多剤耐性の場合効力のある薬剤の組み合わせを決定するため、及び／又は)リセプター、ポンプ又はタンパク質を検出できる1次抗体、所望による他のリガンド、及び,結合を検出するための系を提供する前記系を含む調節因子の効力を検出するための診断キットである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つの異なる抗体、及び所望によるリガンドを、上記抗体により認識されるリセプター、ポンプ、及び／又はタンパク質に結合し、その結合の変化を測定することを含む細胞表面リセプター、ポンプ、又はタンパク質の存在、及び／又はそのコンホメーションの検出方法。
【請求項２】
前記抗体が、モノクロナール、又はポリクロナール抗体、又はその断片である請求項1記載の方法。
【請求項３】
モノクロナール抗体が、用いられる請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記抗体の１つが、UIC2及び／又はその断片である請求項1より3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、P-糖タンパク質である請求項1より4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、CD4細胞表面タンパク質である請求項1より4のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、基質、又は元に戻す化学合成剤及び/又は調整剤である請求項1より6のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
前記基質が、シクロスポリンA,PSC833,ビンブラスチン、又はバリノマイシンである請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記基質が、バラパミル、Tween 80、ニフェジピン、プロゲステロン、アクチオマイシンD、プラゾシン又はグラミシジンである請求項7記載の方法。
【請求項１０】
前記2次抗体が、MM12.10,NC57,MM8.15又はMRK16である請求項4記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンドが、抗CD4抗体、HIVウイルスのいずれかの成分、又はアウリントリカルボン酸である請求項6記載の方法。
【請求項１２】
前記HIVウイルス成分は、天然に発生する形状又は,人工的に作成されたgp1 20のタンパク質の形状である請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記天然の細胞が、薬剤又は試験されるよう組み合わされた薬剤によりin vitroにおいて組み合わされ、そして前記試料が、請求項1記載による方法にて試験される、多剤耐性に有効性があり、細胞増殖抑制薬剤の組み合わせを決定するための方法。
【請求項１４】
請求項1による方法が、シクロスポリンA調整剤により行われる請求項13記載の方法。
【請求項１５】
請求項1による方法が、周知の調節因子存在又は試験されるべき調節因子、及び得られた活性値が比較される多剤耐性調整剤の有効性を検出するための方法。
【請求項１６】
上記シクロスポリンA,PSC833,ビンブラスチン、又はバリノマイシンがコントロール試験に使用される請求項15記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも1種の抗体が、標識化される請求項1-16のいずれか1項記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1種の抗体が、蛍光染料により標識化される請求項17記載の方法。
【請求項１９】
両方の抗体が標識化される請求項17又は18記載の方法。
【請求項２０】
2つの抗体が、2つの異なる蛍光染料で標識化される請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記決定が、蛍光の決定に適した、フロー・サイトメトリー又は他の方法により行われる請求項17-20のいずれか1項記載による方法。
【請求項２２】
蛍光マイクロタイター法が用いられる請求項21記載の方法。
【請求項２３】
抗体により標識化された細胞が、標識化と結合の測定との間に固定された請求項1-21のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
細胞が抗体により結合する前に固定される請求項1-21のいずれか1項記載の方法。
【請求項２５】
リセプター、ポンプ,及びタンパク質の存在、及びコンホメーションの変化を検出するため、多剤耐性の場合効力のある薬剤の組み合わせを決定するため、及び／又は(a)リセプター、ポンプ又はタンパク質を検出できる1次抗体、(b) リセプター、ポンプ又はタンパク質を検出できる2次抗体、(c)所望による他のリガンド、(d)及び,結合を検出するための系を提供する前記系を含む調整剤の効力を検出するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、P-糖タンパク質及び他の細胞表面リセプター、ポンプ、及びタンパク質のコンホメーションの変化を、定性及びコンホメーションによる定量的検出のための抗体競合試験(ACT)、及びその使用に関する。より詳細に本発明の目的は、むしろ抗体競合試験「ACT」であり、それは、リセプターがタンパク質、多剤耐性としてしばしば関与するP-糖タンパク質(Pgp)を結合し、又はリガンドがHIVの感染に関与されるCD4リセプターと結合した後のコンホメーションの変化を検出するために使用できる。
【０００２】
本発明によれば、2つの異なる色の染料により適切に蛍光的に標識化された、2つの抗体の結合物質又は他の特異的タンパク質結合物質の比を測定し、そしてこの比の変化から他のリガンドの影響により、タンパク質のコンホメーションの変化が決定される。2つの染料で異なって標識化された2つの抗体を、同一又は重複して、あるいはアロスレカリー(allosterically)に結合されたエピトープに特異的にすることができる。本発明は、こうした例を言及し、ここで、2つの抗体の結合物質(標識化リガンド)が、ある種のリガンドの結合により形成される、リセプター、ポンプ、タンパク質のコンホメーション効果で、同程度又は同方向に変化することがない。一方この比の変化は、任意の抗体それ自体における単一結合の変化よりもコンホメーションの変化をより正確に反映し、他方2つの抗体を同時に結合する相対度が、コンホメーションに強く依存する可能性がある。
【０００３】
本発明の基本例の必須内容を、概略的に以下の図に示す：
【０００４】
【化１】
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【０００５】
第3のリガンド(「C」)の存在下、細胞表面リセプター(ここでは：ポンプ)に結合する2つの抗体(「A」及び「B」)が、変更された比率にて結合する。十字のサインは抗原を意味し、卵型のサインは細胞の意味である。
【０００６】
同じリセプターに結合する2つの抗体又はリガンドは、これらの適用される濃度又は親和性(Kassoc)に比例して所定タンパク質に結合する。タンパク質のコンホメーションが変化すれば、後者のパラメータの変化が可能である。抗体又はリガンドに対し翻訳できるKassocのこうした変化が、一般的に少なく、その検出には信頼性がなく、そして感受性が十分でない。2つの抗体又はリガンドは、同一又は重複して、あるいはアロステリカルに結合されたリセプター又はエピトープに結合すると、一方の結合が増大するに伴い、もう一方が減少する可能性がある。こうした例において、2つの物質の結合体を同時に測定することにより、コンホメーション変化を極めて正確に、そして極めて高い鋭敏な検出能力を得ることができる。
【背景技術】
【０００７】
腫瘍は、化学療法に対してしばしば抵抗し、こうした方法において化学療法剤の細胞内の濃度が、毒性レベル以下になる。多剤耐性(MDR)症状にしばしば関与するABC(ATP結合領域(ATP Binding Cassette))輸送体としてのP-糖タンパク質(Pgp)が、細胞から細胞増殖抑制因子の広範囲のスペクトルを取り除き、化学治療による療法を乗り越え(defeating)る可能性がある［(Gottesman MM.Pastan I:Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter,Annu.Rev.Biochem.62,385-427(1993)］。多くの両親媒性親脂質物質を輸送でき、そして相互に構造的に多くは類似しないというPgpの特定の性質、及びこれらのサイズが、広範囲に変化する[Gottesman MM.Pastan I:Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter,Annu.Rev.Biochem.62,385-427(1993)); Gottesman MM.Hrycyna,C.A.,Schoenlein,P.V.,Germann,U.A.and Pastan,I.:Genetic analysis of the multidrug transporter,Annu.Rev.Genet.29,607-649(1995);Seelig,A:A general pattern for substrate recongnition by P-glycoprotein,European Journal of Biochemistry 251,252-2619(1998)]を参照。
【０００８】
ヒトの悪性腫瘍の約半分においてPgpが、それ自体臨床的に関連する薬剤耐性を生ずる可能性のあるレベルで発現される、［Gottesman MM.Pastan I:Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter,Annu.Rev.Biochem.62,385-427(1993)］; Gottesman MM.Hrycyna,C.A.,Schoenlein,P.V.,Germann,U.A.and Pastan,I.:Genetic analysis of the multidrug transporter,Annu.Rev.Genet.29,607-649(1995);Nooter K.Sonneveld P.:Clinical Relevance of P-glycoprotein expression in haematological malignances,Leukemia Res.,18,233-243(1994);Bosch,I.and Crop,J.:P-glycoprotein multidrug resistance and cancer,Biochimica et Biophysica Acta 1288,37-54(1996);Sonneveld,P:Prognostic significance and reversal of MDR in multiple myeloma,pp.463-471,IN:Multidrug resistance in cancer cells.Molecular,biochemical,physiological and biological aspects,Ed.:Gupta S.and Tsuruo T.,John Wiley and Sons(1996);Aran,JM.,Pastan,I.and Gottesman,MM.:Therapeutic strategies involving the multidrug resistance phenotype:The MDRI gene as target,chemoprotectant and selectable marker in gene therapy,Adv.Pharmacology 46,1-42(1999);Doige C.A.and Ames,G.F.:APT-depeddent transport systems in bacteria and humans:relevance to cystic fibrosis and multidrug resistance,Ann.Rev.Microbiol.47,291-319(1993)]を参照。
【０００９】
腫瘍細胞中にPgpが存在し、腫瘍の進行中に選択的な利点を提供することは、一般的に受け入れられる理論である[Gottesman MM.Hrycyna,C.A.,Schoenlein,P.V.,Germann,U.A.and Pastan,I.:Genetic analysis of the multidrug transporter,Annu.Rev.Genet.29,607-649(1995);Seelig,A:A general pattern for substrate recongnition by P-glycoprotein,European Journal of Biochemistry 251,252-2619(1998);Bosch,I.and Crop,J.:P-glycoprotein multidrug resistance and cancer,Biochimica et Biophysica Acta 1288,37-54(1996);Sonneveld,P:Prognostic significance and reversal of MDR in multiple myeloma,pp.463-471,IN:Multidrug resistance in cancer cells.Molecular,biochemical,physiological and biological aspects,Ed.:Gupta S.and Tsuruo T.,John Wiley and Sons(1996);Aran,JM.,Pastan,I.and Gottesman,MM.:Therapeutic strategies involving the multidrug resistance phenotype:The MDRI gene as target,chemoprotectant and selectable marker in gene therapy,Adv.Pharmacology 46,1-42(1999)]を参照。
【００１０】
これと関連してその細胞表面の発現における定量的な特徴は、多くの腫瘍の臨床的症状に予後の有意性を有し、そして化学療養の選択性を指向することができる。これらの実際の観点に対してさえも、Pgp発現、又は臨床状況との関連性の程度の変動性を背景にしたその理由を知ることが重要となろう[Nooter K.Sonneveld P.:Clinical Relevance of P-glycoprotein expression in haematological malignances,Leukemia Res.,18,233-243(1994);Bosch,I.and Crop,J.:P-glycoprotein multidrug resistance and cancer,Biochimica et Biophysica Acta 1288,37-54(1996)]を参照。これらのうちのエラー源[Sonneveld,P:Prognostic significance and reversal of MDR in multiple myeloma,pp.463-471,IN:Multidrug resistance in cancer cells.Molecular,biochemical,physiological and biological aspects,Ed.:Gupta S.and Tsuruo T.,John Wiley and Sons(1996)を参照]、Pgp発現度と臨床的関係を結びつけた不確定性(Pgpの発現レベルが臨床的多剤耐性となるか、低レベル耐性かは、Pgpに依存していない可能性のあることが、正確に解っていない)、及び他の耐性機構の追加的、又は別の役割[Koshiyama,M.,Yoshida,M.,Fujii,H.,Nanno,H.,Hayashi,M.and Tauchi,K.:Expression of multidrug resistance-associated protein in endometrial carcinomas:correlation with clinicopathology and prognosis.Ann.Diagn.Pathol.2:81-87.(1999);Osmak,M.:Multifactorial molecular mechaniams are involved in resistance of preirradiated human cervix carcinoma cells to cis-dichlorodiammineplatinum(II) and vincristin.Neoplasma 40:97-101(1993);Michieli,M.,Damiani,D.,Ermacora,A.,Masolini,P.,Raspadori,D.,Visani,G.,Scheper,R.J.and Baccarani,;M.P-glycoprotein,lung resistance-related protein and multidrug resistance associated protein in de novo acute non-lymphocytic leukaemias:biological and clinical implication.Br.J.Haematol.104:328-335(1999)を参照]が主に言及されている。
【００１１】
本発明は、最初の2因子に直接に関する。
【００１２】
調整剤又は復帰剤と称する多くの物質[(たとえばCa-チャンネルブロッカー(ベラパミル(verapamil))カルモジュリン阻害因子、ステロイド；最も有効なPgp阻害因子は、臨床試験下シクロスポリン(A)、SDZ PSC833(シクロスポリンD誘導体)]及びSDZ-466ペプチド誘導体[Friche,E.and Beck,W.T.:Molecular pharmacology of reversal of multidrug resistance and its clinical implication.362-374. IN:Multidrug resistance in cancer cells.Molecular,biochemical,physiological and biological aspects,Ed.:Gupta S.and Tsuruo T.,John Wiley and Sons(1996)、Cornwell,M.M.,Pastan,L and Gottesman,M.M.:Certain calcium channel blockers bind specifically to multidrug-resistant human KB carcinoma membrane vesicles and inhibit drug binding to P-glycoprotein.Journal of Biological Chemistry 262 2166-2170(1987);Yusa,K.Naito,M.and Tsuruo,T.:Transport of P-glycoprotein-modifying agents by P-glycoprotein.pp.331-344.IN:Multidrug resistance in cancer cells.Molecular,biochemical,physiological and biological aspects,Ed.:Gupta S.and Tsuruo T.,John Wiley and Sons(1996 12-14)参照]が、基質の輸送を阻害することができる。これらが、たとえば結合するための基質と競合し、Pgpと直接相互作用する最も可能性のある機構として、Pgp発現細胞中における細胞増殖抑制因子の細胞内の濃度を増大させることは、これら大部分の物質から実証された。
【００１３】
一般的に、さらにこれら調整剤自体も輸送された。しかし同時に異なる基質は、相互の輸送を阻害する必要がない。Pgp分子が、正常な組織においてたとえば、小腸、胆管、腎管、及び脳の毛細管の正常な組織にて発現され[Gottesman,M.M., Hrycyna,C.A.,Schoenlein,P.V.,Germann,U.A.and Pastan,I.:Genetic analysis of the multidrug transporter,Annu.Rev.Genet.29,607-649(1995)、Thiebaut,F.,Tsuruo,T.,Hamada,H.,Gottesman,M.M.,Pastan,I.,Willingham,M.C.:Immunohistochemical localization in normal tissues of different epitopes in the multidrug transport protein P170:evidence for localization in brain capillaries and cross-reactivity of one antibody with a muscle protein.J.Histochem.Cytochem.37:159-164(1989)]を参照、そして調整剤か腫瘍組織(しばしばPgp+)の他に用いられる時に、Pgp基質の濃度が、Pgpを発現する組織において生理的に変化する場合があるか、あるいはそれらの近辺に予期せぬ望ましくない副作用を引き起こす場合がある[Schinkel,A.H.Mayer,U.,Wagenaar,E.,Mol,A.M.,Deemter,L.,Smit,J.J.M.,Valk,M.A.,Voordouw,A.C.,Spits,H.,Tellingen,O.,Zjilmans,J.M.,Fibbe,W.E.and Borst,P.:Normal viability and aitered pharmacokinetics in mice lacking mdr1-type(drug-transporting)P-glycoproteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94 4028-4033(1997);Miller,T.P.,Grogan,T.M.,Dalton,W.S.,Spier,C.M.,Scheper,R.J.,Salmon,S.E.P-glicoprotein expression in malignant lymphoma and reversal of clinical drug resistance with chemotherapy plus high-dose verapamil.J.Clin.Oncol.9 17-24.(1991);Friche,E.and Beck,W.T.:Molecular implications.pp.362-374.In:Multidrug resistance in cancer cells.Molecular,biochemical,physiological and biological aspects E.d.Gupta S.and Tsuruo T.(1996);Pennock,G.D.,Dalton,W.S.,Roeske,W.R.Appleton,C.P.Mosley,K.,Plezia,P.,Miller,T.P.,Salmon,S.E.:Systemic toxic effects associated with High-dose verapamil infusion and chemotherapy administration.J.Natl.Cancer Inst.105-110(1991)]を参照。
【００１４】
有効で、そしてこれらの副作用に寛容な復帰剤(reverting agents)は、ガンの化学療法に対し顕著な好機を表している。
【００１５】
細胞から基質を結合するため又はそれを除去するための正確な機構がまだ解っていないが、詳細なデータが、単一細胞及び細胞培養物レベルで、多くの薬剤の輸送、及び調整分子機構及び動的特性と関連して利用することができる。しかし多くの疎水性化合物を受け入れる、詳細なこの分子の認識過程が、まだ解っていない。さらなる構造パラメーター(化合物において少なくとも1つの複素環、電子供与基の相対距離など)により補足したさらなる疎水性の精製基準(criterium)が、こうした関係の発見ににおいて結果がまだ得られておらず、基質の設計により生成する可能性さえある本質的な基質と酵素との関連性を示すことになるだろう。
【００１６】
同時に広範囲の基質スペクトルが、極めて特異的な特徴を有し、すなわち点変異体の影響である種のアミノ酸の交換が生じ、基質-特異的方法においてポンプ効力が実質的に修飾される。極めて頻繁に引用されるポンプ機構の理論によれば、基質として受け入れられる疎水性分子が、親脂質培地から輸送され、これらが細胞質ゾルに到達する前でさえ、膜から輸送される。この理論は、Sarkadiと共同研究者のカルセイン-AM(calcein-AM)の実験により、極めて直接的に支持され、その化合物が、さらにアセトオキシメチルエーテル(さらにその「AM age」において)として輸送され、そして細胞ゾルのエステラーゼ効果で分解すべき時間さえ有しない[Homolya,L.,Hollo,Zs.Germann,U.A.,Pastan,L,Gottesman,M.M.and Sarkadi,B.:Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.Journal of Biological Chemistry 268 21493-21496(1993);Hollo Zs.,Homolya,L.,Davis,C.W.and Sarkadi,B.:Calcein accumulation as a fluorimetric functional assay of the multidrug transporter.Biochimica et Biophysica Acta 1191 384-388 1994 20,21]を参照。他のABC輸送因子に関する詳細なX-線結晶データから外挿されると、オン・サイトからオフ・サイトに基質の転移を起こすATP結合部位の周辺のコンホメーション変化が、基質結合領域に拡張することになる。
【００１７】
さらにこれらの実験は、コンホメーション変化を言及し、ポンプの基質飽和ばかりか特定モノクロナールの異なる結合特性を検出する[Mechetner,E.B.Schott,B.,Morse,SB.,Stein,W.,Druley,t.,Davis,K.A.,Tsuruo,T.and Roninson,I.:P-glycoprotein function involves conformational transitions detectable by differential immunoreactivity.Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 94 12908-12913(1997);Jachez B.Cianfriglia M.Loor F.Modulation of human P-glycoprotein epitope expression by temperature and/or resistance modulating agents.Anti-Cancer Drugs 5 655-665(1994)]を参照。これらのコンホメーション感受性抗体の１つがUIC2抗体で、その基質依存性結合特性により反映されるコンホメーション事象が、本発明と密接に関連している(？)。UIC2抗体の結合は、たとえばベラパミル、ビンブラチン、又はシクロスポリンAなどの存在下2-4倍増大する[Jachez B.Cianfriglia M.Loor F.Modulation of human P-glycoprotein epitope expression by temperature and/or resistance modulating agents.Anti-Cancer Drugs 5 655-665(1994)]を参照。この現象は、これは、機能的Pgpの検出のため又は少量のPgp能力を改良するため使用されるよう発見が提示され、いわゆるUIC2シフトであり、たとえば米国特許番号第5,872,014に記載されている。
【００１８】
Pgpの検出のための適切な方法及び物質は、米国特許番号第5,994,088、5,972,598、5,830,697、5,786,344、5,773,280又5,434,075に記載されている。他の抗体の結合が、調整剤-基質の存在下変化しないか、又はほとんど変化しない[Mechetner,E.B.Schott,B.,Morse,SB.,Stein,W.,Druley,T.,Davis,K.A.,Tsuro,T.and Ronison,I.:P-plycoprotein function involves conformational transitions detectable by differential immunoreactivity.Proceeding of the National Academy of Sciences,USA 94 12908-12913(1997);Schinkel,A.H.Arceci,R.J.Smit,J.J.M,Wagenaar,E.,Baas,F.,Dolle,M.,Tsuruo,T.,Mechetner,E.,Roninson,LB.and Borst,P.:Binding Properties of monoclonal antibodies recognizing external eitopes of the human mdrl P-glycoprotein.Int.I.Cancer 55 478484(1993)]を参照。これらのコンホメーション感受性の抗体が、ポンプの有効な阻害剤としても使用することができる[Mechetner EB.Roninson IB.:Efficient inhibition of P-glycoprotein-mediated multidrub resistance with monoclonal antibody.Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 89 5824-5828(1992)]を参照。
【００１９】
細胞表面Pgp分子の部位にのみ結合し、たとえばMRK16抗体に常にアクセスできる他の結合部が、Pgp基質の存在下でUIC2のみ利用できるようになることは、UIC2(Pgp阻害剤)抗体の興味ある特徴である(一方抗体の結合定数も変化するが、結合部位の数の変化が主要な要因になると考えられる)。異なる抗体により認識されるエピトープから作成される地図(1部正確でない）によれば、上記エピトープは、12膜貫通ヘリックスに結合するループの細胞外のメンバーにより形成される。たとえばMRK16の抗体が、#1及び#2の細胞外ループにより形成される複合エピトープをおそらく認識する、[Mechetner EB.Roninson IB,:Efficient inhibition of P-glycoprotein-mediate multidrug resistance with monoclonal antibody.Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 89 5824-5828(1992);Georges,E.,Tsuruo,T.and Ling,V.:Topology of P-glycoprotein as determined by epitope mapping of MRK-16 monoclonal antibody.Journal of Biological Chemistry 268 1792 1798(1993)]を参照。UIC2の場合、抗体の結合におけるループ#1の関与することが実証された[Schinkel,A.H.Arceci,R.J.Smit,J.J.M,Wagenaar,E.,Baas,F.,Dolle,M.,Tsuruo,T.,Mechetner,E.,Roninson,LB.and Borst,P.:Binding Properties of monoclonal antibodies recognizing external epitopes of the human mdrl P-glycoprotein.Int.J.Cancer 55 478484(1993)]を参照。本発明の基本を形成する本実験データ(以下に記載)が、上記のUIC2-シフト現象と密接な関連性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、上記詳細な現象事象に関するもで、本明細書に概略を記載する。P-糖タンパク質の場合、調整剤を使用すると、2-4倍以上のUIC2抗体が、細胞表面のPgp-sに結合する(上記米国特許番号を参照)。UIC2シグナルのこうした増大が、他の抗体の結合に何十倍(60倍以上)かの変化を伴い、これら全ての変化を生ずるこれによるコンホメーション変化は、極めて高い感度にて検出できることが、ここに実証されている。それは、本発明が、それがUIC2抗体の結合の増大に基づく、いわゆるUIC2方法の有意的な改良を提供する理由である。幾つかの復帰剤(調整剤)が、UIC2-シフトを起こすが、前記変化に等しい変化を生じることがないから、本発明による方法の適用には、UIC2-シフト法の感受性化ばかりか、他の種の技術としてPgpコンホメーション(下記参照)の変化を検出するための逆法工程を用いた方法がある。
【００２１】
本発明は、驚くベき現象に基づき、すなわちUIC2抗体が、MM12.10抗体の結合にほんのわずかに影響を与える[Romagnoli G.Signoretti C.Castagna M.Cianfriglia M.:Epitope mapping of the monoclonal antibody MM 12.10 to external MDR 1 P-glycoprotein domain by synthetic peptid scanning and phage display technologies.Bil.Chem.380 553-559(1999)](すなわち、UIC2の結合後、MM12.10をさらに結合していた）、しかしPgpを発現する細胞株が、特定の調整剤/基質で処理されたなら、UIC2抗体による前インキュベーション後にMM12.10の結合が、大きく減少するか又は停止した。この現象は、選択された(KB-V1)とヒトmdr1のトランスフェクトされた(NIH3T3 MDR1)細胞株の両方にて十分に再製することができる(図1及び図2を参照)。逆順序にてインキュベーションする場合、MM12.10が、UIC2の結合(それを阻止する）にも効果を有するが、この効果は、調整剤依存方法(図5を参照)に広くは及んでいない。
【００２２】
全ての調整剤が同様の動きをするとは限らない(図1及び図2を参照)。一方シクロスポリンA及びビンブラスチンにより、上記現象となり、有効量においてベラパミル(ほぼ最大のPgp機能の抑制を生じる)だけが、こうした効果を生じない。さらに他の多くの復帰剤と基質も比較した。2つの極めて異なる型の調整/基質を区別することができ、その一方が、UIC2後のMM12.10の結合を防止するコンホメーション変化し、もう一方はコンホメーション変化しない。第一群：シクロスポリン A(CSA)、PSC833、ビンブラスチン及びバリノマイシンであり、第二群：ベラパミル、Tween 80、ニフェジピン、プロゲステロン、アクチノマイシンD、パラゾシン及びグラミシジンである。
【００２３】
蛍光共鳴エネルギーの変換、及び共焦点顕微鏡による測定が、2つの抗体を用いて行われ、つなわち競合のない場合における2つの異なる抗体が、同じPgp分子に結合しないことが、われわれの予備実験により実証された。われわれの上記データでは、2つの異なるPgpの集団が同じ細胞上で区別できることが明示されている。
【００２４】
ACT,UIC2-シフト及び染色蓄積試験結果の間における関係を、3つの方法を同時に行うことにより検討した(図3を参照)。Rcompetition,Ractivity,及びRshiftパラメータ、すなわち競合抗体のある場合とない場合に判定された平均蛍光強度の比が、相互に対しプロットされた。CAS誘発のRcompetitionは、1.5-2倍のRshift値に対し30-60倍である。Pgp機能の調整は、これらの実験においてほぼ同じであった。機能的な調整は、指示剤がダウノルビシン(DNR)でも、カルセインであってもUIC2-シフトにより常に伴なわれたいた。同時に機能的な調整は、ACTにおける大きなRcompetition値が常に得られるとは限らない。
【００２５】
ATPの枯渇が、周知のUIC2反応性の増大を起こしていることから[Mechetner EB.Roninson IB.:Efficient inhibition of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance with monoclonal antibody.Proceeding of the National Academy of Sciences,USA 89 5824-5828(1992)を参照]。ACTの結果に対するオリゴマイシン又はアジ化ナトリウム及び2-ジオキシ-D-グルコースの効果を調査した。図4に示すことができるように、ATPが枯渇すると又CSAに対すると同様ACTの大きなRcompetitionを与えている。
【００２６】
抗Pgp抗体と交互に生きているPgpポジティブの細胞と、順次抗Pgp抗体の可能な組み合わせ体を使用すると、調整剤(図5）のある場合と無い場合に二次的に付加される抗体の結合に有意的な差があることが、他の抗体の対にも観察することができる。たとえば、最初にUIC2の抗体を加え,二次的に加えられるMRK16を結合する(上記米国特許番号を参照)又はMM8.15[Cianfriglia M.Loor F.Modulation of human P-glycoprotein epitope expression by temperayure and/or resistance modulating agents.Anti-Cancer Drugs 5 655-665(1994) を参照]抗体の結合が、調整剤、基質が存在しない時、激的に影響されなかった(最大50%)。しかし存在すればUIC2が全体的に、上記4種の抗体のいずれかに結合することを阻害した。
【００２７】
本発明は詳細に記載され、添付図面を以下のように要約されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、P-糖タンパク質及びCD4を含む細胞表面リセプター、ポンプ、タンパク質のコンホメーション変化を検出するための抗体競合試験を記載する。本発明の方法によれば、2つの抗体及び／又はリガンドが、これらにより認識されるリセプター、ポンプ及び／又はタンパク質に結合され、そして結合の相違からリセプター、又はタンパク質のコンホメーションの状態、又はコンホメーション状態の変化が決定される。
【００２９】
本発明の好ましい例における、他のリセプター、抗原、ポンプが、細胞の表面、又は膜の調製に、あるいは単離されたタンパク質又は人工的に生成されたタンパク質にて、タンパク質コンホメーションの状態又は後者の変化を検出するため、又はリガンド、抗体、基質、調整剤にこれらを結合させるために用いられる。
【００３０】
本発明の好ましい例におけるP-糖タンパク質、又は膜調製物に多剤物の輸送に関連した他のポンプのため、又は単離されたタンパク質又は人工的に生成されたタンパク質を、タンパク質のコンホメーションの状態又は後者の変化を検出するため、又はリガンド、抗体、基質、調整剤にその結合を検出するために、使用される。
【００３１】
実際の手順における本発明は、リガントとP-タンパク質との結合による相互作用(すなわち基質、復帰、化学的感作性調整剤)の検出のため使用される。
【００３２】
本発明の方法は、上記使用のみならず新たな復帰剤(化学的に感作又は調整する)の開発及び／又は検出のため極めて正確で、そして追尾できる方法を提供する。細胞表面のP-糖タンパク質のポンプタンパク質の場合における復帰剤(化学的感作又は調整する)による耐性の調整能力を推定するには、極めて有益でそれは、基礎研究、診断、療法などのため、ヒト由来の細胞株や細胞が、共にしばしば多剤耐性を背景にしている。
【００３３】
本発明の方法は、しばしば多剤耐性を背景とする一般的にある種の細胞表面ポンプとして使用される。上記方法は、細胞表面P-糖タンパク質のポンプとして使用するには好適であり、そして本発明は、主にこれと関連付けて記載されている。しかしながら、添付された請求の範囲が、上記タンパク質の使用を限定することがないが、その他のいずれかの細胞表面ポンプ、及びリセプターに対するリガンド結合タンパク質として使用することができることは、当業者にとって明確であるにちがいない。
【００３４】
本発明の方法によれば、当業者が周知な任意の抗体又はリガンドを使用することができ、それが、細胞表面のリセプター,抗原、ポンプ、膜調製物、単離された又は人工タンパク質と反応する。抗体又はリガンドばかりでなく、化学的又は遺伝子操作方法によって調製されたれらの異なる領域をさらに使用することができる。
【００３５】
本発明の最も好ましい例の１つによれば、異なる蛍光染料により標識化された2つのモノクロナール又はポリクロナール抗体、又はリガンドが、これにより同時に又は順次認識されるPgpエピトープに結合され、そして2つのシグナル比、又はその比の変化から、抗体又はリガンドで認識されるリセプター又は抗原のコンホメーションの状態を決定するためには、これらの結合が、好ましくはフローサイトメロリーにより、又は蛍光の検出に適切な他の方法により測定される。
【００３６】
本発明の例では、タンパク質のコンホメーションの状態又は後者の変化を検出のため、又はこれは結合抗体のある種の間接的(ビオチン化、二次抗体の使用など)な蛍光シグナルに基づいてリガンド、抗体、基質、調整剤に対するタンパク質の結合を検出するために細胞表面上のリセプター、抗原、ポンプ、膜調製物、単離又は人工タンパク質が使用される。
【００３７】
本発明の別の好ましい例によれば、単離又は人工的なタンパク質を細胞表面上のリセプター、抗原、ポンプ又は膜調製物への結合を検出することは、直接蛍光標識をすることにより行われ、上記タンパク質を特に認識するリガンドの検出に行われる。
【００３８】
本発明の方法において、実際的にこうした薬剤が用いられ、そのうちのタンパク質に結合し、蛍光標識された2つのリガンド及び抗体が、結合部位に対し互いに競合し、又は結合部位に重なるように結合し、又は互いの結合をアロステリカリーに影響を与える。
【００３９】
本発明の方法の好ましい例によれば、コンホメーションの変化を検出するために用いられる、ただ1種だけの抗体又はリガンド(ligandum)を標識化し、その他のものを標識化せず、そして上記標識化剤と競合するか、又はそのアロステリカリーな結合に影響を与える。
【００４０】
本発明の方法の特に好ましい例によれば、2つの異なる蛍光染料により標識化された、抗体又はリガンドの混合物が、増殖細胞に与えられか又はマイクロタイター・プレート上に増殖又は保存された細胞に与えられ、そして異なる薬剤がウエルに付加され、2つの異なる抗体又はリガンドの結合比が、適切な手段により検出され、そして結合された蛍光分子の比に対する付加された薬剤の効果を調査又は測定する。
【００４１】
上記方法の例では、マイクロタイター・プレートにおいて増殖又は保存される任意のP-糖タンパク質を発現する細胞株又はexvivoにおける細胞調製物、異なる調整剤(復帰剤など）、又はおそらくこうした効果を有する物質、あるいはその異なる濃度の溶液が、そのウエルに付加され、そして2つの異なる(例えば緑及び赤く蛍光する)抗-Pgp抗体が測定されるか、又はこれらを、順次使用しそして(非結合抗体を洗浄し排出した後)、2つの蛍光シグナルが検出され、そしてこれらの比がウエルに対し決定され、そしてこのようにしてこの比に最も大きな影響を有する物質が選択される。
【００４２】
上記方法の別の例において、マイクロタイター・プレート上にて増殖又は保存された、CD4を発現する細胞又は細胞株、異なるCD4-結合リガンド(アウリントリカルボン酸誘導体、gp120の遺伝子操作された変異株など)、又はおそらくこの効果を有する物質又はその異なる濃度の溶液を、ウエルに付加し、そして2つの異なる(例えば緑及び赤く蛍光する) 抗-Pgp抗体混合物を、測定するか又はこれらを順次使用し,そして(細胞を洗浄し排出した後)、2つの蛍光シグナルを検出し、そしてこれらの比がウエルに対して決定され、このようにしてこの比に極めて大きな影響を有する物質が選択される。
【００４３】
本発明の方法における別の好ましい例は、CD4分子の場合の適用例である。
【００４４】
さらにCD4分子が、免疫学的な認識の役割を有するが、リンパ球(limfocites)でこの分子を発現させると、周知のCD4のエピトープにHIVを結合させることにより、HIVウイルス(AIDSを発症させる)が、CD4ポジティブ細胞に入ることができる。一方CD4はコンホメーション変化を受ける[Szabo,G.Jr.,P.S.,Weaver,J.L.,Kasari,M.,Aszalos,A.:Epitope mapping by photobleaching fiuorescence resonance system transfer measurements using a laser scanning microscope system.Biophys.J.,61,661-670(1992);Szabo,G.,jr.,Pine,P.S.,Weaver,J.L.,Rao,P.E.,Aszalos,A.:CD4 changes conformation upon ligandum binding.J.Immunol.,149,3596-3604(1992);Szabo,G.Jr.,Pine,P.S.Weaver,J.L.,Kasari,M.,Aszalos,A.:Cross-linking of CD4 in a TcR/CD3-juxtaposed inhibitory state:a pFRET study.Biophys.J.,68,1170-1176(1995);Yachou A and Sekaly RP.:Binding of soluble recombinant HN envelope glycoprotein,rgp 120,induces conformational changes in the cellular membrane-anchored CD4 molecule.Biochemical and Biophysical Reserch Communications 265:428-433(1999)]を参照。さらにコンホメーションのこの変化が、上記分子(図6)の他のエピトープに結合される2つの抗体における結合比の変化にも反映している。細胞表面における2つの抗体の結合を測定することにより、CD4コンホメーションの変化が検出され、そしてCD4に結合する特異的リガンド(ligandumu)を認識する。
【００４５】
したがって、本発明の方法により、新たな天然及び人工のリガンドを研究及びスクリーニングすることをが可能であるが、HIV治療の開発のためのCD4の結合に対しては知られていなかった。さらに上記方法は、CD4分子又はその断片を生きた又は死の細胞、あるいは単離又は人工的生成物により輸送され、そして異なるCD4結合において変異化されるか又は別の理由から変更化されるウイルスの発見及び/又は単離に関し、上記理論による基づく蛍光測定の可能性を提供する。
【００４６】
本発明の方法は、初期に開発された方法と有意に相違し、そしてそれが、より効果がある理由である。本発明の方法の例において、Pgpに対する、UIC2抗体 (CSA-処理細胞上第二工程において、FITC-標識抗体と)の競合では、フローサイトメトリーにより測定された蛍光強度の変化60倍に等しいことが明示された。これによるコンホメーションの変化における検出の感度が、UIC2シフトと比較して増大する。UIC2シフトと比較される別の相違は、ある種の復帰剤が効果(CSA、ビンブラスチン、バリノマイシン)であるが、別の復帰剤(ベラパミル、Tween80)が有効でないことが判ったという事実である。このように今までの未知の分類、復帰剤の類別化、異なる復帰剤の分離が可能となる。上記のことが、UIC2-シフト試験と抗体競合試験(「ACT」)との間の実質的相違を指している。
【００４７】
前者で調整剤を用いた場合一般的に2-4倍も多いUIC2抗体、細胞表面のPgp-sに結合することが、文献(上記米国特許番号を参照)から知られたUIC2-シフト試験と抗体競合試験(「ACT」)との比を特徴とする。図１及び図2のデータから示すことができるように、こうしたUIC2シグナルが増大すると、他の抗体(たとえばMM12.10)結合の何十倍もの(60倍に等しい)変化が伴い、そしてこれによるこれらのこと全てを生ずるコンホメーションの変化を、より有意な感受性にて検出することができる。これは我々のACT法が意味し、UIC2抗体の結合の増大に基づく、いわゆるUIC2のシフト法を有意的な発展を同時に意味する。幾つかの復帰剤がUIC2-シフトを起こすが、2つの抗体の結合比において前者(図3を参照)と同等の変化を起こさないことから、このACTを使用には、Pgpコンホメーションの変化を検出するためための手法として、UIC2シフト技術の感受性ばかりか、異なる技術がある。
【００４８】
R123の蓄積を測定するような染色蓄積試験[Lee,JS.,Paull,K.,Alvarez,M.:Rhodamine efflux patterns predict P-glycoprotein substrates in the National Cancer Institute Drug Screen.Mol.Pharmacol.46:627-638(1994)を参照]、又は最近のカルセイン-AM[Homolya,L.,Hollo,Zs.Germann,U.A.,Pastan,L,Gottesman,M.M.and Sarkadi,B.:Fluorescent cellukar indicators are extruded by the multidrug resistance protein.Journal of Biological Chemistry 268 21493-21496(1993);Hollo,Zs.Homolya,L.,Davis,C.W.and Sarkadi,B.:Calcein accumulation as afluorimetric functional assay of the multidrug transporter.Biochimica rt Biophysica Acta 1191 384-388 (1994 20,21);Homolya,L.Hollo,Zs.,Muller,M.,Mechetner,E.B.,Sarkadi,B.:A new method for a quantitave assessment of P-glycoprotein-related multidrug resistance in tumour cells.Br.J.Cancer 73 849-855(1996);Hollo Zs.,Homolya,L.,Hegedus,T.,Muller,M.,Szakacs,G.,Jakab,K.,Antal,F.,Sarkadi,B.:Parallel functional and immunological detection of human multidrug resistance proteins,P-glycoprotein and MRP1.Anticancer Res.18 2981]参照。
【００４９】
Pgp機能の測定に極めて有効な方法で、他のポンプの存在を診断として使用することができる。しかしこれらの有意的な欠点は、試料採取位置にて最適に生きている細胞しか使用できないことである。しかし同時に本発明の方法又は測定のできる最も大きな利点は、細胞を固定したいずれかの後、簡単でそしてある特定のいずれかの時間に絶対的な正確性で実施できることに基づいている。しかし上記方法は、細胞が抗体により標識化する前に固定されるという方法でさえ行うことができる。この場合に、UIC2抗体の結合は、細胞表面上のUIC2結合コンホメーションにおけるPgp分子を示し、一方他の抗体(たとえば、MM12.10)の結合は、これらPgp-sを指示し、それが、調整剤(化学感受性剤、基質)の存在下、UIC2だけにより標識化することができる。すなわちこの場合、調整剤で処理することなく試験が行われ、UIC2-シフトアッセイより有意的な情報を得ている[As to the effect of influencing the UIC2 binding of different fixation procedures,see:Katalin Goda,Henrietta Nagy,Laszlo Bene,Margit Balazs,Robert Arceci,Eugene Mechetner,Gabor Szago:Conformational heterogeneity of P-glycoprotein,Cancer Detection and Prevention,24(5)415(2000)]を参照。
【００５０】
本発明は、以下の試料により詳細に示す。しかし当業者に明確にしなければならないが、記載と異なる工程及び物質、および添付された請求に範囲がこの例に限定されないことが当業者に理解できよう。
【００５１】
物質及び方法
細胞株
KB-3-1(Pgp=)及びわずかに耐性のあるKB-8-5、及び強い耐性のKB-V(Pgp+)ヒト表皮ガン細胞株、NIH3T3 MDR1トランスフェクト細胞株がある。これらの細胞株は、Michael Gottesman博士の実験室(NIH,Bethesda)[たとえば、Stability and covalent modification of P-glycoprotein in multidrug resistant KB cell.Richert ND,Aldwin L,Nitecki D,Gottesman MM,Pastan I.:Biochemistry 27 20 7607-13(1988 okt.4);ATP-binding properties of P glycoprotein from multidrug-resistant KB cells.Cornwell MM,Tsuruo T,Gottesman MM,Pastan I.FASEB J.:51-4(1987 julius 1)を参照]からのものである。
【００５２】
これらは、Dulbecco's Minimal Essential Medium(10%の胎児牛血清、25μ/lのゲンタマイシン及び2mMのL-グルタミンの存在により)に5%のCO2にて37℃で、単層培養物として培養することができる。薬剤耐性細胞を、適切な薬剤の存在下(180nMのビンブラスチン(KB-V 1)、25nMのコルキシン(KB-8-5)、及び690nMのドキソルビシン(NIH3T3 MDR1))にて、連続的に培養することができる。実験の2-3日前にその細胞をトリプシン処理し、さらに使用するまで薬剤のない培地でインキュベートした。
【００５３】
薬剤
ベラパミル、ビンブラスチン、シクロスポリンA、アクチノマイシンD、プラゾシン、プロゲステロン、バリノマイシン、ニフェジピン、グラミシジンが、Sigma-Aldrich(Budapest)であり、Tween80がSERVA(Heidelberg,Germany)である。細胞を処理するために用いられる調整剤の濃度が、50μMのベラパミル、10μMのシクロスポリンA、70μMのビンブラスチン、0.002%のTween80、10μMのバリノマイシン、5μMのアクチノマイシンD、10μMのプラゾシン、10μMのプロゲステロン、50μMのニフェジピン、5μMのグラミシジンである。ATP枯渇剤の濃度は、5μMのオリゴマイシン及び5mMのアジ化ナトリウム(5mMの2-デオキシ-D-グルコース)である。細胞培養培地及び添加剤は、Sigmaである。6-(フルオレセイン  -5-カルボキシアミド)ヘキサン酸サクシンイミジルエステル(5-sFx)、及びフルオレセイン-5-イソチオシアネート(FITC)が、Molecular Probes(Eugene,OR)である。他の全ての化学薬品が分析等級(Sigma)である。本明細書に記載されるFITC結合の方法の説明は、文献にて見出すことができる[DePetris S.:Methods in Membrane Biology Vol.9.(Ed.Korn,E.D.)Plenum Press,New York,pp.1-201(1978);Spack,EG.Jr.Packard,B.Wier,ML.Edidin,M.:Hydrophobic adsorption chromatography to reduce nonspecific staining by rhodamine-labeled antibodies.Anal.Biochem.158 233-237(1986)]を参照。
【００５４】
ACT法の説明
細胞を通常のようにトリプシン化し、PBS(リン酸塩緩衝化生理食塩水、pH7.4)にて2回洗浄した。106細胞/1mlのPBS(プラス8mMのグルコース)を、異なる薬剤により20分間37℃にて前インキュベートし、調整剤及びその細胞を洗浄することなく一次(「A」）モノクロナール抗体を、その試料に加えた。さらに30分インキュベート(37℃で)後、又は5-sFX結合の二次(「B」）抗体を上記試料に加え(再度細胞を洗浄せず）、そして別に30分間37℃でインキュベートした。
【００５５】
UIC2-シフト試験の場合、細胞をUIC2抗体でインキュベートし、2回洗浄しそして氷上、ヤギ抗-マウスIgG2a FITC結合体(F/P=4,3,Sigma)にて、100μのPBSにて45分間インキュベートした。2回洗浄した試料を、500μのPBSにて再懸濁し、さらにフローサイトメトリーにて分析した。用いられた抗体の濃度は、8μg/mlのMRK16、MC57,MM8.15,MM12.10及び10μg/mlのUIC2である。ダウノッルビシン(DNR)及びカルセイン蓄積試験は,[Goda,K.et al.:Practical guide to physical analysis of cell surface receptors,Ed.:Krasznai,Z.and Matyus,L.,pp.110-125(1998);Homolya,L.,Hollo,Zs.,Germann,U.A.,Pastan,L.,Davis,C.W.and Sarkadi,B.:Calcein accumulation as a fluorimetric functional assay of the multidrug trasporter.Biochemica et Biophysica Acta 1191 384-388 199420,21]を参照。
【００５６】
細胞当りの平均蛍光強度を、Becton Dickinson FACScan(Mountain View,CA)にて決定した。死んだ細胞は、プロピジウム・イオデイト染色による分析物から除去した。蛍光シギナルを対数の尺度にてプロットし、2レベルの分析が、BDIS CELLQuest及びFloWin softwares(SoftFlow Ltd.,Pecs,Hungary)にて行われた。
【００５７】
抗体及び標識化
UIC2[Mechetner EB.Roninson IB.:Efficient inhibition of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance with monoclonal antibody.Proceeding of the National Academy of Sciences,USA 89 5824-5828(1992)]、MM12.10[Romagnoli G.Poloni F.Flego M.Moretti F.DiModugno F.Chersi A.Falasca G.Signoretti C.Castagna M.Cianfriglia M.:Epitope mapping of the monoclonal antibody MM12.10 to external MDR 1 P-glycoprotein domain by synthetic peptide scanning and phage display technologis.Biol.Chem. 38 553-559(1999)]、MMK16[Gottesman,M.M.,Hrycyna,C.A.,Schoenlein,P.V.,Germann,U.A.and Pastan,I.:Genetic analysis of the multidrug transporter,Annu.Rev.Genet.29,607-649(1995)を参照]抗体である。5-sFx[6-(フルオレセイン-5-カルボキシアミド)ヘキサン酸コハク酸サクシンイミド-エステル]、及びX-TRITC(ロダミン・レッドTM-Xコハク酸イミドエステル)標識化が標準方法により実施された。
【実施例１】
【００５８】
臨床的、主に血液増殖の病跡においては、本発明のACT法によるPgp発現の研究、又はヒト診断目的のため、多剤耐性細胞又は耐性であると疑われる細胞にて機能的Pgpの検出がある。後者に対する、生きた細胞のポンピング染色を測定する方法に対し、本方法の有意な利点は(カルセイン-AM又はR123アッセイなど)、固定後標識化された細胞を長期間保存可能で、輸送することができそしてその試料を、元の場所から非常に遠方の場所で分析できるか、又はこれは収集された試料でさえ可能である。本実験によれば、本ACT方法は、UIC2試験(下記UIC2、カルセイン、及びACT試験)より有意的に感受性がある。
【００５９】
腫瘍治療と関連して問題が、頻繁に発生し、細胞が多剤耐性であるかどうか答えることが難しく、そのことが処理方法の選択に影響を与える。薬剤耐性を決定するために、染色蓄積試験又は抗体結合試験を行うことができる。前者の欠点は、新鮮な試料のみ信頼できる結果を得ることができる。後者の欠点は、ポンプ他タンパク質が存在でしか検出することができない。多剤耐性を背景に極めて頻繁にある、PgpのUIC結合を比較することにより、CSA前後の機能的Pgp分子の検出が可能である。この有意的な感受性の変異体がACTである。
【００６０】
腫瘍細胞が由来する懸濁状の単一細胞、たとえば白血病の細胞を、PBS(リン酸塩緩衝化生理食塩水、pH7.4)で2回洗浄し、106細胞/1mlのPBS(+8mMのグルコース）の細胞濃度に設定し、そして10μMのCSAで10分間前処理した後に、その試料を２等分の滴量に分ける。したがってその第一の滴量(I)では、第1(「A」）モノクロナール抗体が10-100μg/ml濃度にして前インキュベートされる。抗体を第二の滴量(II)に加えられないが、そのかわりPBSが加えられる。30分、インキュベート(37℃)した後、FITC又は5-sFxに結合する第二(「B」)が、試料に1-100μg/mlの濃度にて(細胞を洗浄することなく）加えられ、そしてさらに30分間37℃でインキュベートする。PBSにて2回洗浄した試料を、1mlのPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析する。細胞当りの平均蛍光強度は、死亡細胞を除去した後プロピジウム-イオデイト(propidium-iodate)の染色により決定した。ACT値を、試料I及びIIの平均蛍光強度の比、すなわちACT=II/Iにて計算する。その方法は、固定細胞の場合と同じである。後者の場合に抗体による標識化の後に試料を、1%のホルムアルデヒド溶液にて(PBSにおいて調製)、4℃にて30分間固定し次にその細胞を、この同じホルムアルデヒド溶液にて4℃にて(少なくとも数週間)保存することができる。「A」抗体がUIC2で、「B」抗体が、MM1210又はMRK16で、これら3種の全てを飽和濃度にて使用した。
【００６１】
さらに前者の方法が、指定された細胞増殖抑制薬剤の組み合わせの効能を予測するために使用することができる。この場合に元の位置で予測できる(すなわち血液)薬剤濃度にて、滴量(アリコート)の天然の細胞を薬剤により(CSAの換わりに) インキュベートし、そしてACT試験が行われる(上記方法により試料をさらに分割)。この方法により調製された2つの試料における平均蛍光値の比による(蛍光値を引いた後)、ACT値すなわちACT=II/I、それがゼロに近い場合、薬剤又はPgpと組み合わせた薬剤の相互作用することを意味し、治療効能の無い可能性、又は所定試料又は患者よりその成分の幾つか多剤耐性調整特性に等しく、そして値が0.5(0.2-0.9)近辺、あるいは算定されたATCにて薬剤のない状態で測定されたこの値の同定では、Pgpと使用薬剤の相互作用のないことを意味し、計画された治療の強力な効能のあることを意味する。
【実施例２】
【００６２】
Pgpの調整中に生ずるコンホメーションの位相幾何学的関係の変化を検出するための迅速な定量アッセイである。この試験は、有意的に効果のある調整剤を調査し、検出するためにPgp及び異なる復帰剤、ならびに基質の相互作用する間に、生ずるコンホメーションの変化の検出及び調査が、適応できる新規な手段である。スクリーニング、復帰剤を試験するため又は前に周知な化合物にこの種の効能を決定するために使用することができる。本ACT法は、バラパミル効果でさえ検出できるUIC2シフト法に対し最も有効な復帰剤の検出のためにのみ使用することができる。これは、前の薬剤と戦略的に異なる復帰剤を選択的に試験しそして最も大きなコンホメーション変化となる最も有効な薬剤の選択的な試験を行うことができる。
【００６３】
NIH 3T3 MDRの培養物(又はヒトMDR1でトランスフェクトされた他の細胞株)が使用される[Homolya L.,Hollo Z.,Germann UA,Pastan I.,Gottesman MM.,Sarkadi B.:Fluorescent cellular indicator are extruded by the multidrug resistance protein.Journal of Biological Chemistry 268,29 21439-6(1993.okt.15)]を参照。これらの細胞を、一般的に単層培地にて、5%のCO2と共に37℃にて、Dulbecco's Minimal Essential Medium(10%の胎児牛血清、25μg/mlのゲンタマイシン及び2mMのL-グルタミンの存在下)において一般的に培養することができる。薬剤耐性細胞を、適切な薬剤の存在下連続的に培養でき(我々の場合、たとえば690nMのドキソルビシンの存在下、所定の細胞に最適である) することができる。実験の2-3日前その細胞をトリプシン化し、そして使用するまで薬剤の無い培地にてインキュベートした。その細胞を、異なる薬剤としての調整剤により37℃、20分間前インキュベートしたPBS(+8mMのグルコース)で2回洗浄する。細胞を洗浄することなく、第一の(「A」)モノクロナール抗体を、その試料に加えた。さらに30分間のインキュベーション(37℃で)後、FITC又は5-sFx結合の第二の(「B」)抗体をその試料に加え(再度細胞を洗浄することなく)、そして37℃にて30分間インキュベートした。2回洗浄したその試料を、通常のように、例えば500μlのPBSにおいて再懸濁し、そしてフローサイトメトリーにて分析した。適用される抗体濃度は、8μg/mlのMRK16、MC57,MM8.15,MM12.10及び10μg/mlのUIC2である。
【００６４】
特に第一(「A」)抗体の場合、飽和濃度にて前記抗体を使用することは、一般的に適切である。細胞当りの平均蛍光強度が明示された。死亡細胞を、プロピジウム・イオデイト染色により分析より排除する。さらに処理は、マイクロタイター・プレートにて行われ、洗浄-遠心工程が、いずれかの実験において解決されるか、又はさらにこれらの工程が自動化される。フローサイトメトリーの評価の換わりに、ウエル当りの蛍光強度を、3回のPBS洗浄し、そして最後の抗体をインキュベートした後,蛍光マイクロタイター・プレートで読み出すことができ、そしてこれらの値を使用して、ウエル当たりのACT値を計算することができる。
【実施例３】
【００６５】
いわゆるPgpそれぞれのコンホメーション形状の検証及び研究するための方法[for example:Mechetner,E.B.,Schott,B.,Morse,SB.,Stein,W.,Druley,T.,Davis,K.A.,Tsuruo,T.and Roninson,I.:P-glycoprotein function involves conformational transitions detectable by differential immunoreactivety.Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 94 12908-12913(1997)]を参照。
【００６６】
両方の抗体、すなわちUIC2及びMRK16を標識化する場合、一方を緑色(たとえばFITC)、もう一方を赤色(たとえばTRITC又はPE)に蛍光染色し、そして2つの異なる色の蛍光比を、フローサイトメトリー又は蛍光マイクロタイター・プレート読み取り装置(又は同じく顕微鏡に基づく装置)で測定し、さらにより微妙に変化する感度が増大する方法により、検出することができる(この場合、たとえばUIC2のサインが増大すると、MRK16サインが、調整剤の影響により減少する)。蛍光共鳴エネルギー転換の程度により、生きた細胞又は膜調製物のUIC2とMM12.10との間の強度の変化が20%より少なくなり、そしてせいぜいこのオーダの規模で変化が予測できることから、この効果の結果として、この要因は、「2色」塗布する本方法を複雑にしない。
【実施例４】
【００６７】
Pgp-特異的抗体(ACT KB-V1細胞上）(図1)の結合比に対する復帰剤の効果
細胞を調整剤(CSA又はバラパミル、b-d,f)で前処理するか、又は前処理することなく(コントロール、a,e)37℃で30分間インキュベートした。次にその細胞を第一の(「A」)抗体(UIC2,MM8.1又はMC57のある場合とない場合でインキュベートした)にて30分間処理し、そしてその細胞を、FITC-MM12.10の(「B」)抗体で標識化される。その曲線は、それぞれ代表的な測定からフローサイトメトリーの棒状グラフである。連続線は(「A」)のないコントロール、太線は、「A」= UIC2であり、点線は、「A」=MM8.15(a-d)又はMC57(e-f)である。「A」抗体の結合を、独立的な２つの実験において、間接的な免疫蛍光性により検証した。
【実施例５】
【００６８】
フローサイトメトリー実験のデータ(図２)
UIC2抗体は、NIH3T3 MDR1の細胞に復帰剤の存在下、FIITC-MM12.10の結合を抑止する。UIC2の前処理のある場合とない場合、平均FITC MM12,10の蛍光強度の比から、Rcompetition値(黒色カラム)を与える。細胞を、復帰剤により20分間前処理し、さらに20分間、UIC2抗体によりインキュベートし、最終的にFIITC-MM12.10抗体を使用した（さらに30分間インキュベートする）。インキュベート工程の間は細胞を洗浄しない。復帰剤の濃度が、バラパミル(50μM)、Tween 80(0.002%)、ビンブラスチン(70μM)、シクロスポリンA(10μM)、バリノマイシン(10μM)である。UIC2-シフトが、間接的な免疫蛍光により検出され、白色カラムは、復帰処理(Rshift)のある場合とない場合で、検出される平均蛍光強度の比を示している。挿入された図に、同じUIC2-シフトデータを、拡大スケールでプロットする。4-6の独立した測定の平均値(±SEM)が示される。
【実施例６】
【００６９】
同時ACT(図3)
(Rcpmpetition、UIC2/FITC-MM12.10抗体対)、UIC2シフト(Rshift)及びPgp(Ractivity)間の関係を試験する。各記号は、独立した実験データを表している。
【実施例７】
【００７０】
ATP枯渇剤効果による本発明のACT法を用いNIH3T3-MDR細胞を試験した。調査の結果を図4に示す。
【実施例８】
【００７１】
ACTテストをNIH3T3 MDR1細胞上、異なる抗体の組み合わせにより行われた。UIC2又はMM12.10(染色体と結合しない)の前処理の後、その細胞を、FITC又は5sFx結合MM12.10,UIC2,MRK16及びMM18.15抗体で標識化する。抗体を加える前に、その細胞を、CSAを有する場合(灰色カラム)と有しない場合(黒色カラム)にて前処理する。２つの独立実験の結果を、図5に示す。
【実施例９】
【００７２】
2つの抗体の結合比に対するCD4結合の効果を試験した。Gp120,gp120+抗-gp120,又はLeu3aによる前処理の後、CD4-ポジテブ・ヒト白血球の細胞表面リセプターを、OKT4E-FITC(黒色カラム)、及びOKT4-PE(灰色カラム)抗体により同時に標識化され、そして細胞当りの平均FITC(緑色)、およびPE(赤)の蛍光強度が、フローサイトメトリーにより決定される。２の独立した試験の結果が、図６で示される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、KB-V1細胞上のPgp-特異的抗体の結合比に対する復帰剤による処理効果を示している。
【図２】図２は、NIH3T3 MDR1細胞上、異なる復帰剤の存在下、FITC-MM12.10抗体の結合に対するUIC2抗体の抑制効果(フローサイトメトリー曲線)を示す。
【図３】図３は、ACT(Rcompetition,UIC2/FITC-MM12.10抗体部分に対する)、UIC2-shift(Rshift)、及びPgp機能(Ractivity)の間の相互的な関連性の調査を示す。各記号は、独立した実験データを示す。
【図４】図４は、NIH3T3-mdr細胞(ACT)のATP-枯渇剤の効果を示す。
【図５】図５は、異なる抗体の組み合わせの場合、NIH3T3細胞のACT調査の結果を示す。
【図６】図６は、2つの抗体の結合比に対するCD4-結合の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月30日(2003.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多剤耐性の場合に有効で、細胞増殖抑制薬剤の組み合わせを決定するための方法において、ここで天然の細胞を、試験されるよう薬剤又は薬剤を組み合わせてin vitro において結合し、その後前記抗体により認識されるリセプター、ポンプ及び／又はタンパク質に結合できる少なくとも２つの異なる抗体を付加し、そして抗体結合比の変化を決定する前記方法。
【請求項２】
前記方法が、シクロスポリンA調整剤により行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、モノクロナール、又はポリクロナール抗体、又はその断片である請求項1記載の方法。
【請求項４】
モノクロナール抗体が、用いられる請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、細胞表面タンパク質を認識する請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記細胞表面タンパク質が、P-糖タンパク質である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、CD4細胞表面タンパク質である請求項1から６のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
前記抗体の１つが、UIC2及び／又はその断片である請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、基質又は復帰化学合成及び／又は調整剤である請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記2次抗体は、MM12.10,MC57,MM8.15又はMRK16である請求項4記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、抗CD4抗体、HIVウイルスのいずれかの成分、又はアウリントリカルボン酸である請求項6記載の方法。
【請求項１２】
前記HIVウイルス成分が、天然に形成されるか又は, gp120の人工的に作成された形状のタンパク質である請求項11記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２つの異なる抗体、及び前記抗体により認識されるリセプター、ポンプ、及び／又はタンパク質に所望によりリガンドを結合する、多剤耐性調整剤の効能を検出するための方法において、前記方法が、周知の調整剤,又は試験される調整剤の存在下にて行われ、そしてその結果の活性値が比較される、前記検出するための方法。
【請求項１４】
シクロスポリンA,PSC833,ビンブラスチン、又はバリノマイシンが、コントロール試験に使用される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1つの抗体が標識化される請求項１から１５のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも1つの抗体が、蛍光染料により標識化される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
両方の抗体が、標識化される請求項１５又は１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記２つの抗体が、２種の蛍光染料により標識化される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記決定が、フローサイトメトリー又は蛍光の決定に適切な他のいずれかの方法により行われる請求項１５から１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光マイクロタイター・プレート法が用いられる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
抗体により標識化された細胞が、標識化と結合測定との間に固定された請求項１から１９のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
細胞が抗体により標識化する前に固定される請求項１から１９のいずれか1項記載の方法。
【国際調査報告】
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