(57)【要約】本発明は２−ピリジナミンを含んで成る神経保護性の製薬学的組成物を提供する。本発明はまた、虚血性の細胞死、とりわけ神経細胞死を予防するため、および外傷性事象による被験体中の神経細胞死の見込みを低下させるためのこれらの組成物の使用方法も提供する。最後に、本発明は、本製薬学的組成物を被験体に投与するための装置を提供する。
2004510707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬学的に許容できる担体、および式
【化１】
2004510707.tif 000028
を有する化合物、
もしくはその製薬学的に許容できる塩［式中
（ａ）Ｒ１はＨ、または５もしくは６のいずれかの環位置で結合されかつアルキル、アルケニル、アルキニル、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、ピリミジニル、置換ピリミジニル、ピリジニル、置換ピリジニル、フェニルアルケニル、置換フェニルアルケニル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニルおよび置換フェニルよりなる群から選択される置換基であり、
前記置換フェニルは式
【化２】
2004510707.tif 000029
を有し、
式中（ｉ）Ｒ６はＨ、ＯＨ、ハロゲン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ置換ジアルキルアミノ、低級アルキル、酸性低級アルキル、アルコキシ、ハロゲン置換低級アルコキシ、フェニルおよびモルホリニルよりなる群から選択され、また、（ｉｉ）Ｒ７は、同一もしくは異なってよくかつＨ、ハロゲン、アミノ、アルキル、低級アルキル、ハロゲン置換低級アルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、酸性低級アルコキシ、アルコキシ、ハロゲン置換低級アルコキシ、アルコキシおよびフェニルアルコキシよりなる群から選択される１と４個との間の置換基を表すが、但し、Ｒ６およびＲ７が縮合されて２−ナフチルもしくは１，３，ベンゾジオキソリルを形成してよく；
（ｂ）各Ｒ２は独立にＨもしくは低級アルキルであり；
（ｃ）各Ｒ３は独立にＨ、低級アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノおよび低級アルコキシよりなる群から選択され；
（ｄ）Ｒ４はＨ、アルコキシもしくはモルホリニルであるが、但し、Ｒ４はＲ３と縮合されて２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシニルもしくは９−アルキル　９Ｈカルバゾリルを形成してよく；ならびに
（ｅ）Ｒ５はＨもしくは低級アルキルである］
を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項２】
Ｒ１が５の環位置の置換フェニルでありかつ各Ｒ２がＨである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項３】
Ｒ４がモルホリニルである、請求項２記載の製薬学的組成物。
【請求項４】
各Ｒ３が低級アルコキシでありかつＲ４が低級アルコキシである、請求項２記載の製薬学的組成物。
【請求項５】
Ｒ１が６の環位置にありかつ各Ｒ２がＨである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項６】
各Ｒ３およびＲ４が低級アルコキシである、請求項５記載の製薬学的組成物。
【請求項７】
化合物が５−（３−エトキシフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項８】
化合物がＮ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−５−（２−ナフチル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項９】
化合物が５−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１０】
化合物が５−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１１】
化合物が５−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−Ｎ−［４−（ペンチルオキシ）フェニル］−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１２】
化合物が５−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−［４−（ペンチルオキシ）フェニル］−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１３】
化合物が５−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１４】
化合物が５−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−Ｎ−［４−（ペンチルオキシ）フェニル］−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１５】
化合物が４−［６−［［４−（ペンチルオキシ）フェニル］アミノ］−３−ピリジニル］−ベンゼンプロパン酸である、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１６】
化合物が５−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［４−（ペンチルオキシ）フェニル］−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１７】
化合物がＮ−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−［（Ｅ）−２−フェニルエテニル］−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１８】
化合物がＮ−［６−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−２−ピリジニル］−９−エチル−９Ｈ−カルバゾル−３−アミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項１９】
化合物が６−（３−エトキシフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２０】
化合物が６−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２１】
化合物が６−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２２】
化合物が６−フェニル−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２３】
化合物が６−（３，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２４】
化合物が６−（３，４−ジメチルフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２５】
化合物がＮ−（４，５−ジメトキシ−２−メチルフェニル）−６−（３，４−ジメチルフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２６】
化合物が６−（２−ナフチル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２７】
化合物が６−（２−フェノキシフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２８】
化合物が６−［（Ｅ）−２−フェニルエテニル］−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミンである、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項２９】
細胞集団中の１個の細胞を、予防に有効な量の請求項１記載の化合物と接触させることを含んで成る、細胞集団中の虚血死の低下方法。
【請求項３０】
細胞が、神経細胞、膠細胞、心細胞、リンパ球、マクロファージおよび繊維芽細胞よりなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
外傷性事象の前、間もしくはその後の適する時間の期間内に、予防に有効な量の請求項１記載の化合物と神経細胞を接触させることを含んで成る、外傷性事象に応答しての神経細胞死の低下方法。
【請求項３２】
接触がインビトロで実施される、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
接触がインビトロで実施される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
接触がエクスビボで実施される、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
接触がエクスビボで実施される、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
接触がインビボで実施される、請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
接触がインビボで実施される、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
外傷性事象の前、間もしくはその後の適する時間の期間内に、予防に有効な量の請求項１記載の製薬学的組成物を被験体に投与することを含んで成る、外傷性事象に応答しての神経細胞死の低下方法。
【請求項３９】
被験体がヒトである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
外傷性事象が、医学的障害、物理的外傷、化学的外傷および生物学的外傷よりなる群から選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
製薬学的組成物が外傷性事象の前に投与される、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
製薬学的組成物が外傷性事象の間に投与される、請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
製薬学的組成物が外傷性事象の後に投与される、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
容器およびその中の製薬学的組成物［ここで、該容器は予防的用量の製薬学的組成物を被験体に送達させるための装置を有する］を含んで成る、請求項１記載の製薬学的組成物を被験体に投与するための装置。
【請求項４５】
製薬学的組成物を送達させるための装置がシリンジである、請求項４４記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の交差引用）
本出願は、２０００年８月８日出願の米国仮出願第６０／２２３，７９５号明細書（これにより引用することにより組み込まれる）からの優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、神経保護性の２−ピリジナミン組成物、および虚血事象後の細胞死を予防するためのそれらの使用方法に関する。本組成物は神経細胞死およびその結果として生じる障害の予防において特別の重要性を有する。
【０００３】
（発明の背景）
グルタミン酸は哺乳動物の中枢神経系における主要な迅速興奮性神経伝達物質である。それは３分類のリガンド依存性イオンチャンネル、すなわちＡＭＰＡ、カイニン酸およびＮＭＤＡ受容体を開放することによりニューロンを脱分極する。シナプスのグルタミン酸濃度の一過性の増大が、通常の興奮性伝達の間に起こる。しかしながら、シナプスのグルタミン酸濃度の過剰の増大はニューロンに対し毒性であり、そして普遍的にグルタミン酸興奮毒性と称される神経細胞死の過程を誘発する（ＭｅｌｄｒｕｍとＧａｒｔｈｗａｉｔｅ　１９９０）。グルタミン酸興奮毒性は、虚血誘発性の脳損傷、癲癇および多様な慢性神経変性性疾患に寄与する（ＭｅｌｄｒｕｍとＧａｒｔｈｗａｉｔｅ　１９９０）。
【０００４】
３分類のグルタミン酸依存性チャンネルのうち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の特異的過剰活性化が、主として多様なニューロン型における興奮毒性のニューロン死の原因である（ＭｅｌｄｒｕｍとＧａｒｔｈｗａｉｔｅ　１９９０）。動物卒中モデルにおいて、虚血誘発性の脳損傷は、特異的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１での前処理により大きく緩和することができる（Ｐａｒｋら　１９８８）。多くの型のニューロンにおいて、グルタミン酸興奮毒性は、主として、カルシウムに対するＮＭＤＡ受容体の高浸透性によるカルシウムイオンの過剰の流入に由来すると考えられている（Ｓｃｈｎｅｇｇｅｎｂｕｒｇｅｒら　１９９３）。高細胞内カルシウム濃度は、一酸化窒素合成酵素、ホスホリパーゼ、プロテアーゼおよびキナーゼのようなカルシウムに調節される酵素の過剰活性化につながるかもしれない。さらに、高細胞内カルシウム濃度は興奮毒性を媒介する。
【０００５】
ＮＭＤＡ受容体によるグルタミン酸のシグナル伝達は、初代ニューロン培養物中の分裂促進剤に活性化されるタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化および活性化を誘導する（ＢａｄｉｎｇとＧｒｅｅｎｂｅｒｇ　１９９１；Ｘｉａら　１９９５）。虚血性脳傷害の動物モデルは、ＭＡＰＫファミリーのメンバーの増大された活性が神経損傷を媒介するかもしれないことを示唆している（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉら　１９９９；Ｙａｎｇら　１９９７）。Ｊｎｋ３（主として脳で発現される、ＭＡＰキナーゼのＪＮＫファミリーの１メンバー）の欠失は、インビボでのカイニン酸誘発性の興奮毒性から海馬ニューロンを保護するが、とは言えこの形態の毒性におけるＮＭＤＡ受容体の役割は明らかでない（Ｙａｎｇら　１９９８）。ＥＲＫ１／２の上流の活性化するキナーゼ、（ｐ４４／４２）ＭＡＰキナーゼの特異的阻害は、焦点性脳虚血による神経損傷に対して保護する（Ａｌｅｓｓａｎｄｉｒｉｎｉら　１９９９）。培養された初代海馬ニューロンにおいて、ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２　ＭＡＰＫ）のシグナル伝達経路の阻害は、広範なスペクトルのグルタミン酸受容体アンタゴニスト、キヌレン酸の除去により誘導されるニューロン死に対し保護する（Ｍｕｒｒａｙら　１９９８）。受容体に媒介されないグルタミン酸誘導性の酸化的毒性もまた、ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路の阻害により封鎖される（Ｓｔａｎｃｊｕら　２０００）。集合的に、これらの報告は、グルタミン酸誘導性の神経毒性におけるＥＲＫ１／２　ＭＡＰＫシグナル伝達のための重要な役割を明瞭に示す。しかしながら、ＥＲＫ１／２　ＭＡＰＫ経路が非常に決定的に関与している興奮毒性シグナル伝達カスケードを、どの分類のグルタミン酸受容体が引き起こす可能性があるかに関して、不明なままである。
【０００６】
文献からの強固な証拠は、ＭＥＫ（ＭＡＰキナーゼもしくはＥＲＫキナーゼ、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のトレオニン−チロシンキナーゼ活性化物質）の阻害がインビボでの有効な神経保護戦略であることを示唆している（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉら　１９９９；ＨｕとＷｉｅｌｏｃｈ　１９９４；Ｋｉｎｄｙ　１９９３）。これらの報告は、一過性脳虚血がげっ歯類の脳中でｐ４２　ＭＡＰキナーゼのリン酸化を誘導することを示している。ＭＥＫ１／２の選択的阻害剤ＰＤ０９８０５９は、リン酸化におけるこの誘導を封鎖することができ、また、神経損傷の程度を低下させることができる（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉら　１９９９）。初代ニューロン培養物の文献はまた、ＭＡＰキナーゼ経路がインビトロでの興奮毒性損傷に関連することも示唆している（ＢａｄｉｎｇとＧｒｅｅｎｂｅｒｇ　１９９１；Ｆｉｏｒｅら　１９９３；Ｋｕｒｉｎｏら　１９９５；Ｍｕｒｒａｙら　１９９８；Ｒｏｓｅｎら　１９９４；Ｘｉａら　１９９６）。これらの報告は、その多様なイオンチャンネル共役型および／もしくは代謝共役型受容体によるグルタミン酸シグナル伝達がｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼの活性化をもたらすことを示している。増大されたｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性化は前初期遺伝子転写を誘導し（Ｘｉａら　１９９６）、また、培養された海馬ニューロン中での発作活動誘発性の細胞死に関係している（Ｍｕｒｒａｙら　１９９８）。
【０００７】
ＮＭＤＡ受容体をｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性化に結びつけるシグナル伝達経路、もしくはｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼを遅延型神経毒性に結びつける下流の経路は十分に理解されていない。ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼの上流の活性化物質はＭＥＫ１およびＭＥＫ２である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら　１９９０；Ｃｒｅｗｓ，ＡｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉとＥｒｉｋｓｏｎ　１９９２；ＺｈｅｎｇとＧｕａｎ　１９９３）。ＭＥＫ１／２はＲａｆファミリーのキナーゼによりリン酸化され（Ｊａｉｓｗａｌら　１９９４；Ｍｏｏｄｉｅら　１９９３）、これはＲａｓファミリーの小型のＧＴＰ結合タンパク質により活性化される（Ｐａｐｉｎら　１９９５）。
【０００８】
ＮＭＤＡ受容体の活性化をＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ｐ４２／４４　ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードに共役させるかもしれない１個の候補の中間体分子は、カルシウム依存性チロシンキナーゼＰＹＫ２である（Ｌｅｖら　１９９５）。増大された細胞内カルシウム濃度はＰＹＫ２を活性化することができ、これは順にＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を活性化することができる。
【０００９】
ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達にイオンチャンネル活性化を結びつけるかもしれない第二の候補の中間体は、カルモジュリンキナーゼ（ＣａＭ−Ｋ）である。２つの型のＣａＭ−Ｋ、ＣａＭ−ＫＩＩおよびＣａＭ−ＫＩＶがニューロン中で高度に発現されている（ＳａｋａｇａｍｉとＫｏｎｄｏ　１９９３；Ｓｏｌａ，ＴｕｓｅｌｌとＳｅｒｒａｔｏｓａ　１９９９）。これらのタンパク質キナーゼはカルシウムおよびカルモジュリンの結合に際して活性化され、そしてそれらはｐ３８、ＪＮＫおよびｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性を調節することができる（Ｅｎｓｌｅｎら　１９９６）。
【００１０】
第三の候補の中間体分子は一酸化窒素（ＮＯ）であるかもしれない。皮質ニューロン中で、ＰＳＤ−９５によるＮＯ産生に共役するＮＭＤＡ受容体が、ＮＭＤＡ受容体誘導性の神経毒性に必要とされる（Ｓａｔｔｌｅｒら　１９９９）。増大されたＮＯ産生はｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性もまた増大させることができる（Ｌａｎｄｅｒら　１９９６）。
【００１１】
ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼの下流にある分子は、ＣＲＥＢ、Ｅｌｋ−１、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓのような転写因子を包含する（Ｖａｎｈｏｕｔｔｅら　１９９９）。ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ経路はまた、ニューロフィラメントしのような細胞骨格成分のリン酸化も誘導し（Ｌｉら　１９９９ａ）、シナプシンＩとアクチンの相互作用も調節し（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃら　１９９６）、ミエリン塩基性タンパク質もリン酸化し（Ａｈｎら　１９９１）そしてアミロイド前駆体タンパク質の分泌も調節する（Ｄｅｓｄｏｕｉｔｓ−Ｍａｇｎｅｎら　１９９８）。従って、ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性化の下流に、神経毒性の多数の潜在的調節物質が存在する。
【００１２】
グルタミン酸受容体刺激の下流で活性化されるシグナル伝達経路の詳細な理解は、低酸素／虚血誘発性の神経損傷を予防する有効的な手段を決定するために有用であるとみられる。この目的に向かって、これらの経路を研究するための多数の試みがなされている。Ｌｉｐｔｏｎ（米国特許第５，５０６，２３１号明細書）は、ＮＭＤＡ受容体に拮抗する化合物の投与によるヒト免疫不全ウイルスに感染した患者におけるＣＮＳニューロンに対する損傷の低下方法を記述する。この特許は、ＮＭＤＡ受容体の下流のシグナル伝達経路の成分を調節する化合物の投与による神経保護効果を示唆していない。Ｍａｉｅｓｅ（米国特許第５，５１９，０３５号明細書）は、一酸化窒素投与により誘発される脳虚血から神経保護性として、タンパク質キナーゼＣ阻害剤を記述する。海馬ニューロン培養物を利用するモデルが記述される。Ｍａｈａｎｔｈａｐｐａ（国際特許出願第９９／００１１７号明細書）は、神経保護剤としてのｐａｔｃｈｅｄ媒介性シグナルに対するヘッジホッグの影響を模倣するＨ８９を包含する化合物、とりわけタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害剤を記述する。Ｌｉｕ（ＷＯ　９９／５８９８２）は、神経細胞、とりわけＨＮ３３海馬神経細胞中でｃ−Ｊｕｎ　Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）もしくは混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）に拮抗する神経保護性化合物の同定方法を記述する。最後に、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉ（ＷＯ　９９／３４７９２）は、焦点性脳虚血が誘発され、そして神経保護効果をモニターするためにＭＥＫ１阻害剤が投与される、卒中のマウスモデルを記述する。
【００１３】
グルタミン酸受容体に媒介される興奮毒性について知られていることにもかかわらず、その作用機序およびそれが引き起こす神経細胞死を選択的に阻害することができる化合物について、多くが学ばなければならないままである。
【００１４】
（発明の要約）
本発明は、製薬学的に許容できる担体、および式
【００１５】
【化３】
2004510707.tif 000003
【００１６】
を有する化合物、
もしくはその製薬学的に許容できる塩［式中
（ａ）Ｒ１はＨ、または５もしくは６のいずれかの環位置で結合されかつアルキル、アルケニル、アルキニル、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、ピリミジニル、置換ピリミジニル、ピリジニル、置換ピリジニル、フェニルアルケニル、置換フェニルアルケニル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニルおよび置換フェニルよりなる群から選択される置換基であり、
前記置換フェニルは式
【００１７】
【化４】
2004510707.tif 000004
【００１８】
を有し、
式中（ｉ）Ｒ６はＨ、ＯＨ、ハロゲン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ置換ジアルキルアミノ、低級アルキル、酸性低級アルキル、アルコキシ、ハロゲン置換低級アルコキシ、フェニルおよびモルホリニルよりなる群から選択され、また、（ｉｉ）Ｒ７は、同一もしくは異なってよくかつＨ、ハロゲン、アミノ、アルキル、低級アルキル、ハロゲン置換低級アルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、酸性低級アルコキシ、アルコキシ、ハロゲン置換低級アルコキシ、アルコキシおよびフェニルアルコキシよりなる群から選択される１と４個との間の置換基を表すが、但し、Ｒ６およびＲ７が縮合されて２−ナフチルもしくは１，３，ベンゾジオキソリルを形成してよく；
（ｂ）各Ｒ２は独立にＨもしくは低級アルキルであり；
（ｃ）各Ｒ３は独立にＨ、低級アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノおよび低級アルコキシよりなる群から選択され；
（ｄ）Ｒ４はＨ、アルコキシもしくはモルホリニルであるが、但し、Ｒ４はＲ３と縮合されて２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシニルもしくは９−アルキル　９Ｈカルバゾリルを形成してよく；ならびに
（ｅ）Ｒ５はＨもしくは低級アルキルである］
を含んで成る製薬学的組成物を提供する。
【００１９】
本発明はまた、本製薬学的組成物中に含有される予防に有効な量の該化合物と細胞を接触させることを含んで成る、細胞集団中の虚血死の低下方法も提供する。
【００２０】
本発明はさらに、外傷性事象の前、間もしくはその後の適する時間の期間内に、本製薬学的組成物中に含有される予防に有効な量の該化合物と神経細胞を接触させることを含んで成る、外傷性事象に応答しての神経細胞死の低下方法を提供する。
【００２１】
本発明はなおさらに、外傷性事象の前、間もしくはその後の適する時間の期間内に、予防に有効な量の本製薬学的組成物を被験体に投与することを含んで成る、被験体における外傷性事象に応答しての神経細胞死の低下方法を提供する。
【００２２】
最後に、本発明は、容器およびその中の製薬学的組成物［ここで、該容器は予防的容量の製薬学的組成物を被験体に送達させるための装置を有する］を含んで成る、本製薬学的組成物を被験体に投与するための装置を提供する。
【００２３】
（詳細な記述）
本発明は、製薬学的に許容できる担体、および式
【００２４】
【化５】
2004510707.tif 000005
【００２５】
を有する化合物、
もしくはその製薬学的に許容できる塩［式中
（ａ）Ｒ１はＨ、または５もしくは６のいずれかの環位置で結合されかつアルキル、アルケニル、アルキニル、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、ピリミジニル、置換ピリミジニル、ピリジニル、置換ピリジニル、フェニルアルケニル、置換フェニルアルケニル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニルおよび置換フェニルよりなる群から選択される置換基であり、
前記置換フェニルは式
【００２６】
【化６】
2004510707.tif 000006
【００２７】
を有し、
式中（ｉ）Ｒ６はＨ、ＯＨ、ハロゲン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ置換ジアルキルアミノ、低級アルキル、酸性低級アルキル、アルコキシ、ハロゲン置換低級アルコキシ、フェニルおよびモルホリニルよりなる群から選択され、また、（ｉｉ）Ｒ７は、同一もしくは異なってよくかつＨ、ハロゲン、アミノ、アルキル、低級アルキル、ハロゲン置換低級アルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、酸性低級アルコキシ、アルコキシ、ハロゲン置換低級アルコキシ、アルコキシおよびフェニルアルコキシよりなる群から選択される１と４個との間の置換基を表すが、但し、Ｒ６およびＲ７が縮合されて２−ナフチルもしくは１，３，ベンゾジオキソリルを形成してよく；
（ｂ）各Ｒ２は独立にＨもしくは低級アルキルであり；
（ｃ）各Ｒ３は独立にＨ、低級アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノおよび低級アルコキシよりなる群から選択され；
（ｄ）Ｒ４はＨ、アルコキシもしくはモルホリニルであるが、但し、Ｒ４はＲ３と縮合されて２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシニルもしくは９−アルキル　９Ｈカルバゾリルを形成してよく；ならびに
（ｅ）Ｒ５はＨもしくは低級アルキルである］
を含んで成る製薬学的組成物を提供する。
【００２８】
本製薬学的組成物の一態様において、Ｒ１は５の環位置の置換フェニルでありかつ各Ｒ２はＨである。別の態様において、Ｒ４はモルホリニルである。さらなる一態様において、各Ｒ３は低級アルコキシでありかつＲ４は低級アルコキシである。なおさらなる一態様において、Ｒ１は６の環位置にあり、各Ｒ２はＨであり、そして好ましくは各Ｒ３およびＲ４は低級アルコキシである。
【００２９】
本製薬学的組成物の好ましい態様において、その中に含有される化合物は以下の群から選択され、その構造は実験の詳細に示される：
５−（３−エトキシフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−５−（２−ナフチル）−２−ピリジナミン；
５−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−ピリジナミン；
５−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−ピリジナミン；
５−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−Ｎ−［４−（ペンチルオキシ）フェニル］−２−ピリジナミン；
５−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−［４−（ペンチルオキシ）フェニル］−２−ピリジナミン；
５−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−（４−メトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
５−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−Ｎ−［４−（ペンチルオキシ）フェニル］−２−ピリジナミン；
４−［６−［［４−（ペンチルオキシ）フェニル］アミノ］−３−ピリジニル］−ベンゼンプロパン酸；
５−（２−メトキシフェニル）−Ｎ−［４−（ペンチルオキシ）フェニル］−２−ピリジナミン；
Ｎ−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−［（Ｅ）−２−フェニルエテニル］−２−ピリジナミン；
Ｎ−［６−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−２−ピリジニル］−９−エチル−９Ｈ−カルバゾル−３−アミン；
６−（３−エトキシフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
６−［３−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
６−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
６−フェニル−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
６−（３，４−ジメトキシフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
６−（３，４−ジメチルフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
Ｎ−（４，５−ジメトキシ−２−メチルフェニル）−６−（３，４−ジメチルフェニル）−２−ピリジナミン；
６−（２−ナフチル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；
６−（２−フェノキシフェニル）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン；および
６−［（Ｅ）−２−フェニルエテニル］−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−ピリジナミン。
【００３０】
別の方法で明記されない限り、本明細書で使用されるところの「アルキル」という用語は、単に炭素およびＨよりなる飽和の直鎖状、分枝状もしくは環状の置換基を指す。低級アルキルは１ないし４個の炭素原子を含有するアルキルを指す。「アルケニル」という用語は、最低１個の二重結合を含有する単に炭素およびＨよりなる不飽和の直鎖状、分枝状もしくは環状の置換基を指す。「アルキニル」という用語は、最低１個の三重結合を含有する単に炭素およびＨよりなる不飽和の直鎖状、分枝状もしくは環状の置換基を指す。
【００３１】
「アルコキシ」という用語はＯ−アルキルを指し、ここでアルキルは定義されるとおりである。「アルキルチオ」という用語はＳ−アルキルを指し、ここでアルキルは定義されるとおりである。酸性アルキルは末端のＣＯＯＨ基をもつ炭素鎖である。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「アルキルアミノ」という用語はアルキル置換されたアミン基を意味する。同様に、「ジアルキルアミノ」という用語は２個の独立に選択されるアルキル基で置換されたアミノ基を意味する。「ヒドロキシ置換ジアルキルアミノ」という用語は、アルキル基のいずれかもしくは双方が該アルキル基（１個もしくは複数）の炭素原子のいずれかで独立に、ヒドロキシ基で独立に置換されるジアルキルアミノ基を指す。
【００３３】
「ハロ」という用語はフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。「ｐｈ」もしくは「ＰＨ」という記号はフェニルを指す。
【００３４】
特定の基が「置換される」（例えばアリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールなど）場合、その基は、置換基の一覧から独立に選択される１個もしくはそれ以上の置換基、好ましくは１から５個までの置換基、より好ましくは１から３個までの置換基、最も好ましくは１から２個までの置換基を有してよい。
【００３５】
置換基に関して、「独立に」という用語は、１種以上のこうした置換基が可能である場合にこうした置換基が同一もしくは相互と異なってよいことを意味する。
【００３６】
本発明の目的上、ピリジン環系は以下の番号付けを有する。
【００３７】
【化７】
2004510707.tif 000007
【００３８】
本製薬学的組成物中に含有される化合物は、下の実験の詳細の節で例示される。これらの化合物は、化合物ライブラリーの一部としてバイオフォーカス　ＰＣＣ（ＢｉｏＦｏｃｕｓ　ＰＣＣ）（英国）から商業的に入手可能である。あるいは、下に例示される化合物は既知の方法を使用して製造することができる。
【００３９】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる塩」という句は、遊離塩基の所望の薬理学的活性を所有しかつ生物学的にもそれ以外でも望ましくなくない遊離塩基の塩を意味する。これらの塩は無機もしくは有機酸由来であってよい。無機酸の例は、塩酸、硝酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸である。有機酸の例は酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイヒ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メチルスルホン酸、サリチル酸などである。
【００４０】
本製薬学的組成物は、慣習的製薬学的技術に従って製造することができる。その中の製薬学的に許容できる担体は、限定されるものでないが静脈内、経口、鼻もしくは非経口を挙げることができる全身投与のような投与に望ましい製剤の形態に依存して広範な形態をとってよい。経口の投薬形態での組成物の製造においては、経口の液体製剤（例えば懸濁剤、エリキシル剤および溶液）の場合は水、グリコール、油、アルコール、着香料、保存剤、着色剤、シロップなどのような通常の製薬学的担体、または経口の固体製剤（例えば散剤、カプセル剤および錠剤）の場合にはデンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのような担体のいずれかを使用してよい。
【００４１】
それらの投与の容易さのために、錠剤およびカプセル剤が有利な経口の投薬単位形態を代表し、ここでは固体の製薬学的担体が使用される。所望の場合は、錠剤を標準的技術により糖コーティングもしくは腸溶コーティングしてよい。非経口製剤については、担体は通常滅菌水を含むことができるが、とは言え溶解性もしくは保存の目的上の他の成分もまた包含してよい。注入可能な懸濁剤もまた製造してよく、ここでは適切な液体の担体、懸濁化剤などを使用してよい。該化合物はエアゾルの形態で投与してもまたよい。
【００４２】
本発明はまた、本製薬学的組成物中に含有される予防に有効な量の化合物と細胞を接触させることを含んで成る、細胞が虚血死を受ける見込みの低下方法も提供する。
【００４３】
本明細書で使用されるところの、細胞を指す場合の「虚血死」という用語は、酸素の欠乏により引き起こされる死を意味する。虚血性細胞死は例えば低酸素状態から生じる可能性がある。細胞もしくは組織全体のインビボもしくはエクスビボの虚血は、とりわけ、血管の閉塞、破壊もしくは狭窄により引き起こされる血液供給の妨害による限局性貧血から生じる可能性がある。虚血死およびその形態学的特徴は当業者に公知かつ同定可能である。
【００４４】
本明細書で使用されるところの、本製薬学的組成物もしくはその中の化合物の「予防に有効な量」は、細胞の集団中の細胞死の発生率を低下させる量を意味する。本製薬学的組成物は一般に、投薬量単位（例えば錠剤、カプセル剤、散剤、注入剤、茶さじ一杯分など）あたりに約０．００１から約１００ｍｇ／ｋｇまでを含有することができる。一態様において、本製薬学的組成物は、投薬量単位あたり約０．０１から約５０ｍｇ／ｋｇまでの化合物、および好ましくは約０．０５から約２０ｍｇ／ｋｇまでを含有する。本製薬学的組成物の予防に有効な用量の決定方法は当該技術分野で既知である。例えばヒトに該製薬学的組成物を投与するための有効用量は、動物試験の結果から数学的に決定することができる。
【００４５】
本明細書で使用されるところの「細胞集団」は、培養容器中のようなインビトロの、あるいは体液の一部としてまたは無傷の組織もしくは器官としてのインビボの細胞を指す。細胞集団は均質（１種の細胞型から構成される）もしくは不均質（混合された細胞型集団を含んで成る）であることができる。好ましい細胞集団は、本発明の化合物の存在下で虚血死から保護されるとして同定された最低１種の細胞型を含んで成る不均質な細胞集団である。
【００４６】
本方法の一態様において、細胞集団を構成する細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、およびより好ましくはヒト細胞である。外傷性事象に応答して低下された虚血性傷害を立証する細胞集団を構成する細胞は、限定されるものでないが、神経細胞、膠細胞、心細胞、リンパ球、マクロファージおよび繊維芽細胞よりなる群から選択される最低１種の細胞を含んで成る細胞集団を挙げることができる。好ましい態様において、細胞は神経細胞である。
【００４７】
本発明はまた、外傷性事象の前、間もしくはその後の適する時間の期間内に、本製薬学的組成物中に含有される予防に有効な量の化合物と神経細胞を接触させることを含んで成る、外傷性事象に応答しての神経細胞死の低下方法も提供する。
【００４８】
双方のこれらの本方法はインビトロ、エクスビボもしくはインビボで実施することができる。本明細書で使用されるところの「インビトロで」ある作用物質と細胞を接触させることは、例として、単一細胞培養物、混合細胞培養物もしくは初代細胞組織培養物中にある細胞とこうした作用物質を接触させることを包含する。「エクスビボで」ある作用物質と細胞を接触させることは、例として、それからそれが発する被験体の身体の外側で維持される組織化された組織もしくは器官の一部である細胞とこうした作用物質を接触させることを包含する。「インビボで」ある作用物質と細胞を接触させることは、こうした作用物質を被験体内に存在する細胞と接触させることを意味する。
【００４９】
本発明はさらに、外傷性事象の前、間もしくはその後の適する時間の期間内に、予防に有効な量の本製薬学的組成物を被験体に投与することを含んで成る、被験体における外傷性事象に応答しての神経細胞死の低下方法を提供する。「被験体」という用語は、制限なしに、いかなる動物もしくは人工的に改変された動物も包含する。好ましい態様において、被験体はヒトである。
【００５０】
被験体への本製薬学的組成物の投与経路は、好ましくは、例えば静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）および経口投与を包含する全身である。一態様において、本組成物は神経系に直接投与される。この投与経路は、限定されるものでないが、脳内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、クモ膜下、槽内、脊髄内および／もしくは脊髄周囲の投与経路を挙げることができ、それらは頭蓋内および脊椎内の針、ならびにポンプ装置を伴うもしくは伴わないカテーテルを使用することができる。注入用量は、例えば、数分から数日までの範囲にわたる期間にわたって約１．０から１．０×１０４μｇ／ｋｇ／分の本化合物までの範囲にわたることができる。局所投与のためには、本化合物は例えば約０．１ないし約１０％の薬物対ビヒクルの濃度で製薬学的担体と混合することができる。
【００５１】
本方法において、神経細胞死を引き起こす外傷性事象は、例えば、医学的障害、物理的外傷、化学的外傷および生物学的外傷を包含する。
【００５２】
神経細胞死を引き起こす医学的障害の例は、周産期低酸素虚血傷害、心停止、卒中／虚血発作、低血糖誘発性ニューロパシー、心臓外科手術誘発性脳虚血、外傷後ストレス障害、ストレス誘発性記憶障害、慢性癲癇、多発性硬化症、パーキンソン病、糖尿病性末梢ニューロパシー、神経障害性疼痛、顔面麻痺、洞不全症候群、アルツハイマー病、ピック病、びまん性レヴィー小体病、クロイツフェルト−ヤーコブおよびタンパク質凝集の他の疾患、進行性核上性麻痺（スティール−リチャードソン症候群）、多系統変性（シャイ−ドレーガー症候群）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、変性性運動失調、皮質基底核変性、グアムのＡＬＳ−パーキンソン−痴呆複合症、亜急性硬化性汎脳炎、ハンチントン病、シヌクレイノパシー（多系統萎縮症を包含する）、原発性進行性失語症、線条体黒質変性、マチャド−ジョセフ病、脊髄小脳性運動失調タイプ３、オリーブ橋小脳変性、ジル・ド・ラ・ツレット病、球および偽球麻痺、脊髄性および脊髄延髄性筋萎縮症（ケネディ病）、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ−ホフマン病、クーゲルベルク−ヴェランデル病、テイ−サックス病、ザントホフ病、家族性痙性疾患、神経弛緩薬性悪性症候群、ヴォールファルト−クーゲルベルク−ヴェランデル病、痙性不全片麻痺、進行性多病巣性白質脳症、ＡＩＤＳ関連性痴呆、洞不全症候群、ヘルペス後ニューロパシー、ウイルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、プリオン病ならびに家族性自律神経障害（ライリー−デイ症候群）を包含する。
【００５３】
神経細胞死を引き起こす物理的外傷は、例えば局所性脳外傷、びまん性脳外傷、脊髄傷害、脳梗塞、塞栓性閉塞、血栓性閉塞、再灌流、頭蓋内出血、むち打ち、揺さぶられっ子症候群および放射線誘発性末梢神経損傷を包含する。
【００５４】
神経細胞死を引き起こす化学的外傷は、例えば、アルコール、化学療法剤、毒ガス、鉛、シアノアクリレート、ポリアクリルアミドおよび毒性吸入剤に対する曝露を包含する。最後に、神経細胞死を引き起こす生物学的外傷は、例えばＨＩＶ、ヘルペスウイルス、ならびに髄膜炎を引き起こす細菌およびウイルスへの曝露を包含する。
【００５５】
本方法の実施において、該製薬学的組成物は外傷性事象の前、間もしくは後に被験体に投与することができる。本明細書で使用されるところの「後」という用語は、外傷性事象とともに開始しかつ該外傷性事象由来の細胞死の可能性が減少するまで継続する時間中のいずれかの点を指す。
【００５６】
最後に、本発明は、容器およびその中の製薬学的組成物を含んで成る、本製薬学的組成物のいずれかを被験体に投与するための装置を提供し、ここで、該容器は予防的容量の製薬学的組成物を被験体に送達させるための装置を有する。好ましい態様において、該製薬学的組成物を送達させるための装置はシリンジである。理想的には、本装置は、本組成物を含有する、単回使用の予め１回分ずつに分けられた自動注入可能な装置である。こうした装置は、例えば救急自動車（ｍｏｂｉｌｅ　ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ　ｕｎｉｔ）中で、もしくは神経毒性事象の危険にさらされる人への投与のために有用であるとみられる。機械的な自動注入可能な装置は当該技術分野で公知であり、そして例えばエピペン［ＥｐｉＰｅｎ］（商標）装置（メリディアン　メディカル　テクノロジーズ　インク（Ｍｅｒｉｄｉａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．））により例示され、これはアナフィラキシーショックにさらされる個体のための、エピネフリンを含有する自動注入可能な装置である。
【００５７】
本発明は後に続く実験の詳細への参照によりより良好に理解されるであろうが、しかし、当業者は、これらは、その後に続く請求の範囲においてより完全に記述されるところの本発明の具体的説明のみであることを容易に認識するであろう。加えて、本出願を通じて多様な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、これにより、本発明が関する従来技術をより完全に記述するために本出願に引用することにより組み込まれる。
【００５８】
【表１】
2004510707.tif 000008
【００５９】
【表２】
2004510707.tif 000009
【００６０】
【表３】
2004510707.tif 000010
【００６１】
【表４】
2004510707.tif 000011
【００６２】
実施例２
分化したＰ１９細胞の特徴づけ
Ｐ１９細胞の分化
Ｐ１９細胞は高用量のレチノイン酸の存在下で有糸分裂後のニューロンに比較的迅速に分化するよう誘導することができる多能性胚的癌腫系統である（Ｊｏｎｅｓ−Ｖｅｌｌｅｎｅｕｖｅら　１９８２；Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅら　１９８３；ＭｃＢｕｒｎｅｙとＲｏｇｅｒｓ　１９８２）。それらは、それもまた奇形癌前駆細胞のレチノイン酸分化に由来するヒトＮＴ−２Ｎニューロンのマウスの同等物である。分化したＮＴ−２Ｎニューロン（２種の奇形癌由来神経系統のおそらくより良好に知られるもの）は広範な神経マーカーを発現し、そしてＮＭＤＡ受容体に媒介される低酸素誘発性の興奮毒性細胞死を受ける（ＰｌｅａｓｕｒｅとＬｅｅ　１９９３；Ｐｌｅａｓｕｒｅ，ＰａｇｅとＬｅｅ　１９９２；Ｒｏｏｔｗｅｌｔら　１９９８）。ＮＴ−２Ｎと同様に、分化したＰ１９ニューロンもまた広範な神経マーカーを発現し、アゴニストに対するＮＭＤＡ受容体に媒介される細胞内カルシウム応答を表し、そして興奮毒性を受ける（Ｃａｎｚｏｎｉｅｒｏら　１９９６；Ｇｒｏｂｉｎら　１９９９；Ｍｏｒｌｅｙら　１９９５；ＲａｙとＧｏｔｔｌｉｅｂ　１９９３；Ｔｕｒｅｔｓｋｙら　１９９３）。
【００６３】
Ｐ１９細胞をＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）から購入した。それらを、１０％ウシ胎児血清、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（０．１５％　ｗ／ｖ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（５０単位／ｍＬ）で補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ギブコ　ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））中、１５０ｃｍ２の組織培養フラスコで、５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で成長させた。
【００６４】
分化プロトコルの第１日に、コンフルエントのＰ１９細胞を成長培地中で５０〜７０％コンフルエンスに分割した。プロトコルの第２日に、１０μＭの全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））および１０μＭのＭＫ−８０１を成長培地に添加した。１０μＭのＭＫ−８０１は、ＮＭＤＡ受容体を発現することを開始するニューロンの分化における細胞死を予防するためにこの段階で包含した。第４日に、新鮮な成長培地を、新鮮なＡＴＲＡおよびＭＫ−８０１とともに細胞上に置いた。第５日に、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理的食塩水で４回洗浄すること、ならびに４ｍＬの非酵素的細胞解離溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加することにより、細胞を組織培養フラスコから分離した。
【００６５】
一度分離した細胞を４０ｍＬの分化培地中に入れた。分化培地は、１％　Ｎ−２補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ギブコ　ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））、０．１％微量元素Ｂ（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ））、１ｍＭ硫酸カドミウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、２ｍＭグルタミン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（０．１５％　ｗ／ｖ）および１％抗生物質／抗真菌剤（ギブコ　ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））で補充された神経細胞培養用基礎培地（ギブコ　ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））よりなった。未分化細胞の成長を予防するために、１０μＭのシトシン−Ｄ−アラビノフラノシドを分化培地に添加した。ＭＫ−８０１はこの時点以降存在しなかった。細胞を２０回摩砕し、その後９６穴プレートに１：４で分割したか、もしくは１００ｍｍ組織培養皿に１：３で分割した。再プレート培養４日後に、細胞は化合物添加に至適であり、そして２４時間後にアッセイした。
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキットを使用して、分化したＰ１９ニューロンもしくは未分化のＰ１９細胞の１００ｍｍ組織培養皿から単離した。マウスＮＭＤＡ受容体サブユニットのＲＴ−ＰＣＲ増幅を、未分化のＰ１９細胞、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）誘導後４日の細胞およびＡＴＲＡ誘導後９日の細胞から単離された２５０ｎｇの全ＲＮＡ鋳型から得た。１段階のＲＴ−ＰＣＲ反応を、製造元のプロトコルに従ってライトサイクラー［ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ］（商標）−ＲＮＡ増幅キット、ＳＹＢＲグリーンＩキット（ベーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を使用して生じさせた。実時間ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ライトサイクラー［ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ］（商標）機器および２５０ｎｇの鋳型ＲＮＡ（ベーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を使用して、ライトサイクラー［ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ］（商標）ガラスキャピラリー中で実施した。逆転写酵素反応は５５℃で１０分間実施した。ＰＣＲは３０周期の間実施した。すなわち、アニーリング温度は５０℃であり、伸長温度は７２℃であり、そして融解温度は８０℃であった。反応を、各プライマー組についてＨ２Ｏ陰性対照と比較した。５μＬの反応生成物を取り出し、そして１×ＴＢＥアガロースゲル上で泳動した。使用された多様なマウスＮＭＤＡ受容体サブユニットについてのプライマー組はζ１およびε１−４を包含する。
【００６６】
レチノイン酸処理後４日および９日からのＲＮＡサンプル、未分化のサンプルならびに対照サンプルを電気泳動により分離しかつζ１、ε１およびε２の内的プライマーでプロービングした。
【００６７】
全ＲＮＡサンプルからのＮＭＤＡ受容体サブユニットのＲＴ−ＰＣＲは、分化のレチノイン誘導がζ１、ε１およびε２ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現もまた誘導することを示した。データは３回の別個の実験を使用して要約した。
ウェスタンブロット
１００ｍｍ組織培養皿上でプレート培養された細胞から培地を吸引した。細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（１００ｍＭトリスＨＣＬ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１０％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）中に収穫した。各サンプルを２０秒間超音波処理し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）のサンプル緩衝液（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））を最終の１×濃度まで添加し、そしてサンプルを９５℃で１０分間インキュベートした。ＮＭＤＡ受容体の抗体（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）から得られた、ラットＮＲ１、ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂに対するポリクローナル抗体）でプロービングされるべきサンプルを、６％トリス−グリシンプレキャストゲル（ノヴェックス（ＮＯＶＥＸ））上で電気泳動した。ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ抗体（ニュー　イングランド　バイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））でプロービングされるべきサンプルは１２％トリス−グリシンプレキャストゲル（ノヴェックス（ＮＯＶＥＸ））上で電気泳動した。電気泳動は、ノヴェックス（ＮＯＶＥＸ）の装置中、２００ボルトで１．５時間実施した。タンパク質は、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）湿式転写装置を使用して、ポリフッ化ビニリデンメンブレン（ＰＶＤＦ、ノヴェックス（ＮＯＶＥＸ））に１００ボルトで１時間転写した。転写前に、ＰＶＤＦメンブレンを１００％メタノールに１分間浸し、その後転写緩衝液中に５分間浸積した。転写後、メンブレンを取り出し、そしてブロッキング緩衝液（リン酸緩衝生理的食塩水中５％乳、０．０５％トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）−２０）中、４℃で一夜ゆっくりと振とうした。その後、メンブレンをＰＢＳ−トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）で１回洗浄し、そして５％乳を含むＰＢＳ−トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）中１０００倍希釈の一次抗体を室温で１時間インキュベートした。メンブレンを室温で１５分間４回洗浄した。ワサビペルオキシダーゼに結合された二次抗体を、５％乳を含むＰＢＳ−トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）中室温で約４５分間インキュベートした。その後、メンブレンを室温で１５分間４回洗浄した。ＥＣＬプラス（ＥＣＬ　ｐｌｕｓ）（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用してブロットを発色させ、そしてフィルムに曝露した。
【００６８】
ウェスタンブロット分析は、レチノイン酸曝露の４日もしくは９日後に収穫されたＰ１９細胞ライセート中のＮＭＤＡ受容体サブユニットタンパク質について実施した。適切な大きさに従って分類されたバンド（ζ１＝約１２０ｋＤａ、ε１およびε２＝約１８０ｋＤａ）が、最終的に分化したＰ１９ニューロンライセートから検出可能であったが、しかし未分化の細胞のライセートから検出可能でなかった。データは類似の結果を伴う３回の別個の実験を代表した。
【００６９】
ウェスタンブロット分析は、最終的に分化した１９ニューロンが検出可能なレベルのζ１、ε１およびε２タンパク質を発現することを示した。ε３およびε４のｍＲＮＡもしくはタンパク質は、これらの細胞中でいずれの時点でも検出可能でなかった。
【００７０】
これらのデータは、Ｐ１９細胞のニューロンへのこうした分化方法が、ｍＲＮＡ、タパク質、ＭＫ−８０１に感受性、のアゴニストに誘導される細胞内カルシウム応答、およびＭＫ−８０１に感受性のグルタミン酸毒性、のレベルでのＮＭＯＡ受容体の機能的発現を成功裏にもたらすことを立証する。これらのデータは文献と非常に良好に一致する。しかしながら、興味深いことに、ζ１およびε２の発現に加え、ＮＭＤＡ受容体のε１サブユニットの確かな発現もまた達成され、この発現はＰ１９細胞の他の報告された分化方法（ＲａｙとＧｏｔｔｌｉｅｂ　１９９３）で未だ達成されていない。全３種のサブユニットの存在は、大脳皮質および海馬を包含する成体げっ歯類の前脳領域中で観察される発現パターンにより緊密に似ている（Ｉｓｈｉｉら　１９９３；Ｌａｕｒｉｅら　１９９５；Ｍｏｎｙｅｒら　１９９４；Ｍｏｎｙｅｒら　１９９２；Ｓｔａｎｄａｅｒｔら　１９９４）。
実施例３
分化したＰ１９の興奮毒性アッセイ
細胞に５μＭのＦｕｒａ−２−ＡＭ（モレキュラー　プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ））を３７℃で１時間負荷した。それらをハンクス液（ＨＢＳＳ、ギブコ　ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））で１回洗浄し、そしてＨＢＳＳ緩衝液中でアッセイした。細胞を、改変アトフルオル［ＡＴＴＯＦＬＵＯＲ］（商標）イメージャ（Ｉｍａｇｅｒ）（アト　インストゥルメンツ（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、メリーランド州ロックビルパイク）の試料台上に置いた。ｆｕｒａ−２の高速二重励起を、レシオアーク［ＲＡＴＩＯＡＲＣ］（商標）高速励起装置（アト　インストゥルメンツ（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を使用して実施した。水銀灯光を、３３４ｎｍもしくは３８０ｎｍの帯域通過フィルター（１０ｎｍ帯域幅）を通過させ、そしてその後２．５Ｈｚの速度で２０倍対物レンズ（ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）、プラン−アポクロマト（Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）、ＮＡ＝０．７５）を通過させた。発射光を４００ｎｍの二色性ミラーにより伝播し、そしてアトフルオル［ＡＴＴＯＦＬＵＯＲ］（商標）インテンシファイアＣＣＤカメラに収集した。比画像（ｒａｔｉｏ−ｉｍａｇｅ）を獲得し、そして３３４ｎｍおよび３８０ｎｍで励起された場合の画像の平均強度を、アトフルオル（ＡＴＴＯＦＬＵＯＲ）のＲＡＴＩＯＶＩＳＩＯＮ（商標）ソフトウェア（アト　インストゥルメンツ（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、メリーランド州ロックビル）を使用して分析した。
【００７１】
Ｆｕｒａ−２の３３０ｎｍ／３８０ｎｍの強度比の変化を、ＡＴＲＡ後９日のＰ１９ニューロンを１００μＭのＭＫ−８０１の存在もしくは非存在下に３ｍＭグルタミン酸、１ｍＭグリシンで処理した場合にプロットした。ＭＫ−８０１はアッセイの２４時間前に投与した。トレース（ｔｒａｃｅ）は各条件について３回の別個の実験からの平均±標準誤差である。最終的に分化したＰ１９ニューロンは、ｆｕｒａ−２画像形成を使用してＮＭＤＡ受容体アゴニストの添加に際しての細胞内カルシウム濃度の増大を検出することにより具体的に説明されるとおり、機能的ＮＭＤＡ受容体を形成するＮＭＤＡ受容体サブユニットを発現した（図１Ａ）。選択的ＮＭＤＡ受容体チャンネルブロッカーＫＭ−８０１はこの応答を有意に阻害した（図１Ａ）。加えて、Ｐ１９ニューロンはＮＭＤＡ受容体の特異的結合部位を発現した。［３Ｈ］−ＭＫ−８０１結合のＭＫ−８０１阻害をＰ１９膜でアッセイした。ＭＫ−８０１濃度は１０−ｘモル濃度として表す。データ点は８回の実験からの平均±標準誤差を表す。対照％＝（（ＣＰＭ−ＣＰＭｂｏｔｔｏｍ）／（ＣＰＭｔｏｐ−ＣＰＭｂｏｔｔｏｍ））×１００。（図１Ｂ）。ＭＫ−８０１阻害は濃度依存性であり、そして１００％阻害が達成された。
【００７２】
対照のＰ１９ニューロンの細胞体および突起は、生存細胞の細胞質色素カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ）で明るく染色する。ＡＴＲＡ誘導後９日のＰ１９ニューロンをＣＦＤＡで標識し、そしてその後アトフルオル　イメージャ（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ　Ｉｍａｇｅｒ）を使用して共焦点モードで画像形成した。対照細胞はビヒクルで２４時間処理し、グルタミン酸細胞は１ｍＭグリシンの存在下で３ｍＭグルタミン酸を２４時間受領し、そしてグルタミン酸＋Ｕ０１２６細胞は３ｍＭグルタミン酸および１ｍＭグリシンと同時に１０μＭのＵ０１２６を２４時間受領した。フルオレセインジアセテートで染色された、対照の生存する細胞、グルタミン酸処理された細胞、死細胞およびＵ０１２６で保護された細胞から、３回の別個の実験で画像を採取した。Ｐ１９ニューロン細胞体は、特徴的に、平坦な組織培養プラスチック上でプレート培養される場合に堅固な凝集物に一緒に凝集させた。広範囲にわたる突起の網状構造が神経細胞体の集団を結合した。毒性濃度のグルタミン酸およびグリシンで２４時間処理されたＰ１９ニューロンは、単離された細胞体中で染色する蛍光を表し、突起は検出不可能であり、そして甚だしい細胞破片が明らかであった。細胞死の相対レベルを、生存細胞蛍光色素アラマーブルーを使用してプレートリーダー上で迅速かつ定量的に測定した（図２Ｂ）。
【００７３】
アラマーブルー蛍光（細胞生存率の指標）を使用して、ＮＭＤＡ誘発性の細胞傷害性の傷害後の細胞生存率を測定した。３２個のウェルがビヒクル対照を受領し、３２個のウェルが３ｍＭグルタミン酸および１ｍＭグリシンを２４時間受領し、そして３２個のウェルが５μＭのＡ２３１８７を２４時間受領した、単一の９６穴プレートからの計数を図２Ａに示す。グルタミン酸およびＡ２３１８７の条件は、ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）ソフトウェアを使用して実施されたＴｕｋｅｙ　ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析を用いた一元ＡＮＯＶＡにより決定されるとおり、対照と有意に異なった。これらのデータは、細胞をグルタミン酸およびグリシンで処理した場合にアラマーブルー蛍光の典型的な６０％低下を示す。しかしながら、生蛍光計数は実験により変動するため、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは対照のパーセントとして表す。
【００７４】
変動しない１ｍＭのグリシン濃度の存在下でのグルタミン酸の毒性の用量応答を、分化したＰ１９ニューロンで測定した。データ点により生成される曲線は６個の別個の用量応答曲線の平均である。データ点は対照細胞のパーセント±標準誤差として表す。対照％＝（（［グルタミン酸］ｅｘｐ−［グルタミン酸］ｍａｘ）／（対照ｖｅｈｉｃｌｅ−［グルタミン酸］ｍａｘ））×１００。グルタミン酸の毒性のＥＣ５０は８．１μＭであることが計算された［９５％信頼区間の下限＝３．５μＭ；９５％信頼区間の上限＝１９μＭ］。これらのデータは、２４時間のグルタミン酸処理が変動しない用量のグリシンの存在下で用量依存性にＰ１９ニューロンを殺したことを立証する（図２Ａ、２Ｂ）。グリシン単独はＰ１９ニューロンの生存率に影響を及ぼさなかった。
【００７５】
ＮＭＤＡ受容体ブロッカーＭＫ−８０１はＰ１９ニューロンにおいてグルタミン酸の毒性に対し用量依存性に保護した（図２Ｄ）。３ｍＭグルタミン酸および１ｍＭグリシンに誘発されるＰ１９細胞死のＭＫ−８０１の用量依存性の阻害。神経保護％＝（（グルタミン酸ｍａｘの存在下での阻害−［グルタミン酸］ｍａｘ）／（対照ｖｅｈｉｃｌｅ−［グルタミン酸］ｍａｘ））×１００。データ点は３回の別個の実験の平均±標準誤差である。達成された最大のＭＫ−８０１の保護は対照レベルに近かった。
【００７６】
これらのデータは、Ｐ１９ニューロンにおけるグルタミン酸の毒性がＮＭＤＡ受容体の活性化を必要とすることを立証する。該毒性は特異的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＮＫ−８０１の存在下で完全に封鎖されるからである。しかしながら、該データは、ＡＭＰＡもしくはカイニン酸の受容体もまたグルタミン酸により活性化されそして興奮毒性に寄与しているかもしれないという可能性を排除しない。この可能性は、グルタミン酸アゴニストに対する細胞内カルシウム応答が複数の構成要素を必要とすることを報告する初代神経培養物からのデータと矛盾しないとみられる（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ，ＬａｍｂｅｒｔとＮｉｃｈｏｌｌｓ　１９９０）。こうした構成要素は、ＡＭＰＡ／カイニン酸受容体の活性化、膜の脱分極、電位依存性カルシウムチャンネルの活性化、ＮＭＤＡ受容体のマグネシウム封鎖の解除およびＮＭＤＡ受容体の活性化を包含する。しかしながら、こうした高レベルの複雑さを伴ってさえ、多くの初代神経モデルにおいて、グルタミン酸の興奮毒性はＮＭＤＡ受容体によりシグナル伝達し、また、Ｐ１９ニューロンモデル系について真実であるとおり、神経死をもたらすためのその活性化を必要とする（Ｔｙｍｉａｎｓｋｉら　１９９３）。
【００７７】
これらの細胞を使用して、ＮＭＤＡにより誘導される細胞傷害性に対する多様な既知のキナーゼ阻害剤（表Ｉの化合物番号（ＩＤ）の欄）の影響を測定した。最初に、Ｐ１９細胞を実施例２に記述されたとおり分化させた。その後、細胞を１ｍＭグリシンの存在下で３ｍＭのグルタミン酸に曝露した。
【００７８】
細胞生存率を決定した。興奮毒性を予防した化合物を、毒性の傷害を与えなかった分化したＰ１９細胞に比較した生存可能な細胞のパーセンテージを測定することにより決定した（表Ｉ）。
【００７９】
細胞生存率は２つの方法を使用して測定した。第一の方法は、生存細胞色素カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ）を使用する共焦点単一細胞蛍光画像形成に基づく方法であった。ＣＦＤＡは生存する細胞の細胞体および突起を標識する。従って、生存細胞は甚だしいＣＦＤＡ標識を表す一方、死細胞はずっとより少ないＣＦＤＡ染色を表す。改変アトフルオル　イメージャ（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ　Ｉｍａｇｅｒ）装置（アト　インストゥルメンツ（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、メリーランド州ロックビルパイク）を使用してＣＦＤＡ蛍光を測定した。細胞を培地中で１μＭのＣＦＤＡで１５分間標識し、その後アトフルオル（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ）顕微鏡の試料台上に置いた。１０ｍｍ帯域幅の４８８ｎｍ帯域通過フィルターを通過され、ＣＡＲＶ実時間共焦点回転ディスクモジュール（アト　インストゥルメンツ（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、メリーランド州ロックビル）を通過され、そしてその後４０倍油浸対物レンズ（ツァイス　フルアル（Ｚｅｉｓｓ　Ｆｌｕａｒ）、ＮＡ＝１．３）を通過された水銀灯光源からの光により、色素を励起した。発射光は４９５ｎｍの二色性ミラーを通して伝播し、アトフルオル（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ）インテンシファイアＣＣＤカメラに収集し、そしてアトフルオル（Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ）ＲａｔｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（アト　インストゥルメンツ（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、メリーランド州ロックビル）を使用して画像を可視化した。
【００８０】
細胞生存率の第二の測定方法はプレートリーダー法であった。黒色９６穴プレート（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）ビュープレート）中にプレート培養された細胞に５％アラマーブルー色素（バイオソース　インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を負荷する。アラマーブルーは、非蛍光のレサズリンを蛍光のレソルフィン（励起５３５ｎｍ、発光５８０ｎｍ）に転化するミトコンドリアの還元酵素を利用する色素である。基礎の蛍光の計数を、アラマーブルーの添加直後にワラック（Ｗａｌｌａｃ）プレートリーダーで室温で読取った。細胞生存率の蛍光の計数を、３７℃で１時間のインキュベーション後に同一の様式で採取した。蛍光は、背景の蛍光の差し引き後に対照の未処理の細胞のパーセントとして表した。生存／死細胞は光学顕微鏡を用いて視覚的に確認した。
【００８１】
下の表Ｉで使用されるところの化合物Ａは式
【００８２】
【化８】
2004510707.tif 000012
【００８３】
を有する化合物を意味する。
【００８４】
【表５】
2004510707.tif 000013
【００８５】
キナーゼ阻害の活性および効力は文献に由来した（Ｃｈｉｊｉｗａら　１９９０；Ｆａｖａｔａら　１９９８；Ｈｅｎｒｙら　１９９８；ＩｎｈｏｒｎとＭａｊｅｒｕｓ　１９８７；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら　１９８９；Ｌｅｅら　１９９４；Ｏｎｏｄａら　１９８９；Ｔｏｋｕｍｉｔｓｕら　１９９０）。神経保護についてのＩＣ５０は３個の別個の曲線の平均であり、９５％信頼区間（Ｃ．Ｉ．）の上限および下限を示す。曲線を当てはめ、そしてＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して信頼区間（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）を決定した。
実施例４
分化したＰ１９におけるＭＥＫ１／２阻害剤の評価アッセイ
Ｕ０１２６（ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ］メチレン］ブタンジニトリル）はＭＥＫ１／２に高度に選択的であることが報告されており（Ｆａｖａｔａら　１９９８）、その結果がここで確認された。Ｕ０１２６が阻害することが見出された唯一の他のキナーゼはＰＫＣ−γであるが、しかし、この酵素の阻害に関するＩＣ５０は、野性型ＭＥＫ１／２に対するその公表されたＩＣ５０より６０倍より大きかった（下の表ＩＩおよびＩＩＩ）。
【００８６】
キナーゼ活性をアッセイするために使用された一般的手順は以下のとおりであった。すなわち、キナーゼ反応混合物を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ＝８、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０μＭ　ＡＴＰ、０．２５〜１μＭビオチニル化ペプチド基質、ウェルあたり０．２〜０．８μキュリーの３３Ｐ−γ−ＡＴＰ［２０００〜３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ］中で調製した。アッセイ条件は各タンパク質キナーゼについてわずかに変動し、例えば、インスリン受容体キナーゼは活性に１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２を必要とし、また、カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼはカルモジュリンおよび１０ｍＭ　ＣａＣｌ２を必要とする。反応混合物を、ストレプトアビジン被覆されたフラッシュプレート（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ）のウェルに分注し、そして１００％ＤＭＳＯ中の１μｌの薬物ストックを１００μＬの反応容量に添加して反応中で１％ＤＭＳＯの最終濃度をもたらした。酵素を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ＝８．０、０．１％ＢＳＡで希釈しそして各ウェルに添加した。反応を化合物の存在下に３０℃で１時間インキュベートした。１時間後に反応混合物をプレートから吸引し、そして１００ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳでプレートを洗浄した。プレートをシンチレーション計数器で読取って、固定されたペプチド中に取り込まれた３３Ｐ−γ−ＡＴＰを測定した。試験化合物は、１オーダーの大きさの段階で１００μＭから１０ｐＭまでの範囲にわたる８濃度で二重でアッセイした。アッセイのための最大および最少のシグナルを各プレート上で決定した。ＩＣ５０は、試験化合物の対数濃度に対して阻害パーセントをグラフにすることにより、式［最大シグナル−背景／試験化合物のシグナル−背景×（１００）］＝阻害％に従って、アッセイにおける最大シグナルの阻害パーセントの用量応答曲線から計算した。アッセイされているキナーゼに適切な既知の阻害剤化合物もまた各プレート上に包含した。結果を図３に提供する。
キナーゼ酵素の定義および起源
ＶＥＧＦ−Ｒ（血管内皮細胞増殖因子受容体−２）は、Ｎ末端のポリヒスチジン標識、次いでラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼドメインのアミノ酸７８６−１３４３を含有する融合タンパク質である。ＣＤＫ１（サイクリン依存性キナーゼ１）はヒトＣＤＫ１触媒サブユニットおよびその正の調節サブユニットサイクリンＢの双方を発現する昆虫細胞から単離される。インスリン受容体キナーゼは、ヒトインスリン受容体のβ−サブユニットの細胞質ドメインの残基９４１−１３１３よりなる。タンパク質キナーゼＡはウシ心から精製されたｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡの触媒サブユニットである。ＰＫＣ（タンパク質キナーゼ−Ｃ）は昆虫細胞中で産生されたヒトタンパク質のγもしくはβアイソフォームである。カゼインキナーゼ１は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生されたラットＣＫ１のδアイソフォームのＣ末端部分のアミノ酸３１８での短縮である。カゼインキナーゼ２は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生されたヒトＣＫ２タンパク質のαおよびβサブユニットを包含する。カルモジュリンキナーゼ（カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ２）は昆虫細胞中で産生されたラットタンパク質のαサブユニットの短縮されたバージョンである。グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生されたウサギ酵素のβアイソフォームである。ＭＡＰキナーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生されかつ精製前にＭＥＫ１でのリン酸化により活性される、Ｎ末端にポリヒスチジン標識を含有するラットＥＲＫ−２アイソフォームである。ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）はヒトＡ４３１細胞膜から精製される。下の図は選択されたキナーゼおよびそれらの対照阻害剤を示す。
【００８７】
下の表ＩＩＩで使用されるところの化合物Ａ（Ｃｍｐｄ　Ａ）は式
【００８８】
【化９】
2004510707.tif 000014
【００８９】
を有する化合物を意味する。
【００９０】
【表６】
2004510707.tif 000015
【００９１】
【表７】
2004510707.tif 000016
【００９２】
キナーゼ阻害についてのＩＣ５０値は最低２個の別個の曲線の平均であり、そしてＧｒａｐｈＰａｄ曲線当てはめソフトウェアを使用して決定した。
【００９３】
Ｕ０１２６がＰ１９ニューロンにおいてＭＥＫ１／２酵素を阻害するかどうかを決定するために、ＭＥＫ１／２の基質ｐ４２　ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）のグルタミン酸誘発性のリン酸化を封鎖するその能力を試験した。リン酸化された形態のｐ４２／４４（ＥＲＫ１／２）に特異的な抗体での処理後９日のＡＴＲＡ　Ｐ１９ニューロンライセートを使用して、ウェスタンブロットを最初にプロービングし、そしてその後細片にし、そして全ｐ４２／４４（ＥＲＫ１／２）を認識した抗体で再プロービングした。該データは、Ｐ１９ニューロン中で毒性を誘導するのに使用したグルタミン酸およびグリシンの濃度が、これらの細胞中でのｐ４２　ＭＡＰＫのリン酸化の迅速な再現可能な増大もまた誘導したことを立証する。Ｕ０１２６の存在下でホスホ−ｐ４２　ＭＡＰＫが還元されたが、とは言え全ｐ４２　ＭＡＰＫの量の変化は明らかでなかった。別のウェスタンブロット実験において、ＡＴＲＡ　Ｐ１９ニューロンライセートを、リン酸化された形態のｐ４２／４４（ＥＲＫ１／２）に特異的な抗体での処理後９日にプロービングした。同一のブロットを細片にし、そして全ｐ４２／４４（ＥＲＫ１／２）を認識した抗体で再プロービングした。ｐ４２　ＭＡＰＫのリン酸化のグルタミン酸誘発性の上昇は持続性であった。それは対照に対し２４時間でなお明瞭に増大されていたからである。これらのブロットは類似の結果を伴う３回の別個の実験を代表する。Ｕ０１２６はこの時点でのリン酸化の増大されたレベルを同様に封鎖した。全ｐ４２　ＭＡＰＫの変化は明らかでなかった。
【００９４】
Ｕ０１２６がＮＭＤＡ受容体を直接封鎖しないことを確実にするために、グルタミン酸およびグリシンに対するＰ１９ニューロンの細胞内カルシウム応答を、１０μＭのＵ０１２６の存在下で試験した。ＡＴＲＡ後９日のＰ１９ニューロンのｆｕｒａ−２画像形成トレースを、１０μＭ　Ｕ０１２６の存在下に３ｍＭグルタミン酸、１ｍＭグリシンで２４時間処理した。Ｕ０１２６はグルタミン酸およびグリシンと同時に投与した。トレースは、各条件について４回の別個の実験からの平均±標準誤差である。
【００９５】
該データは、Ｕ０１２６がこの細胞内カルシウムの応答を封鎖しなかったことを立証した。（図４Ａ）。Ｕ０１２６がＰ１９ニューロン中での［３Ｈ］−ＭＫ−８０１結合を阻害しなかったこともまた立証された。Ｕ０１２６のいずれの濃度でも有意の阻害は観察されなかった。データ点は８回の実験からの平均±標準誤差を表す。対照のパーセントは図１Ｂに記述されるとおり定義する（図４Ｂ）。一緒にすれば、これらのデータはＵ０１２６がＮＭＤＡ受容体活性化の下流のシグナル伝達経路に作用することをさらに立証する。
ｐ４２／４４　ＭＡＰＫ阻害剤Ｕ０１２６は遅延型神経保護を表す
有効性の時間経過は、潜在的な神経保護治療薬にとって極めて適切なパラメータである。該治療薬は虚血事象後数時間ないし数日に投与されかつなお有効性を保持することを必要とするとみられるからである。次の組の実験は、ＭＥＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６が、グルタミン酸攻撃後多様な時点で添加される場合に神経保護効力を保持するかどうかを検査した。アッセイは本質的に、記述されたとおり実施したが、とは言えＵ０１２６の投与の時間を初期興奮毒性に関して遅延させた。該データは、Ｕ０１２６がグルタミン酸攻撃後６時間まで最大に神経保護的であったことを立証した（図５Ａ）。しかしながら、ｐ３８阻害剤はグルタミン酸攻撃後１５分と同じくらいすぐに効力を喪失した（図５Ｂ）。Ｕ０１２６はグルタミン酸攻撃の開始数時間後に添加される場合でさえ最大に神経保護的であった。これは、グルタミン酸が、グルタミン酸添加後２４時間でさえ検出可能なＰ１９ニューロン中でのｐ４２　ＭＡＰＫリン酸化の持続性の増大を媒介するためであるかもしれない。グルタミン酸攻撃数時間後の、上流の活性化する酵素ＭＥＫのＵ０１２６阻害は、ｐ４２　ＭＡＰＫのホスファターゼの脱リン酸化に好都合でありそして細胞死を予防するのに十分な時間内にｐ４２／４４　ＭＡＰＫシグナル伝達経路を再安定化するかもしれない。
【００９６】
従って、ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ経路の活性化が、分化したＰ１９ニューロン中でのグルタミン酸誘発性の毒性に必要である。グルタミン酸誘発性の細胞死は、２４時間以内に起こり、用量依存性であり、そしてＮＭＤＡ受容体に媒介される。グルタミン酸はｐ４２　ＭＡＰキナーゼのリン酸化を誘導し、これは、その上流のキナーゼＭＥＫの阻害剤Ｕ０１２６により封鎖される。Ｕ０１２６はまた、用量依存性の様式でグルタミン酸の毒性も封鎖する。それはグルタミン酸攻撃の開始の前もしくは数時間後に投与される場合でさえ有効である。
【００９７】
虚血事象後に添加される場合でさえ遅延型の神経保護を発揮することが可能である化合物は、とりわけ、潜在的な卒中治療薬の特性を要求される。多彩な機構をもつ多くの化合物が治療後の遅延型神経保護を表すことが報告されている。これらのなかにはグルタミン酸受容体アンタゴニスト（Ｌｉら　１９９９ｂ；Ｔａｋａｈａｓｈｉら　１９９８；Ｔｕｒｓｋｉら　１９９８）、抗酸化剤（Ｃａｌｌａｗａｙら　１９９９；Ｐａｚｏｓら　１９９９；Ｓａｋａｋｉｂａｒａら　２０００）、抗痙攣薬（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ｂｌｏｏｍら　１９９８；Ｗａｓｔｅｒｌａｉｎら　１９９６；Ｙａｎｇら　１９９８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｈｅｎｇら　１９９８）、キナーゼ阻害剤（Ｔａｔｌｉｓｕｍａｋら　１９９８）、およびマグネシウム（ＨｅａｔｈとＶｉｎｋ　１９９９）がある。しかしながら、これは、ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ経路の特異的阻害剤が遅延型神経保護を表しかつ効力の時間枠が毒性の攻撃の開始後に十分に伸長した、ＮＭＤＡ受容体に媒介される興奮毒性の細胞培養物モデルでの最初の立証である。
Ｕ０１２６の神経保護はグルタミン酸誘発性の毒性に対し選択的である
Ｕ０１２６が多様な非特異的な毒性の傷害に対して保護的であるかどうか、もしくはこの化合物の有効性がグルタミン酸誘発性の毒性に対し選択的であるかどうかを決定するために、その効果をＰ１９ニューロン死の多様な他の誘導物質に対して試験した。
【００９８】
図６Ａは、１０μＭのＵ０１２６の存在もしくは非存在下での多様な濃度のＡ２３１８７での２４時間のＰ１９ニューロンの処理を示す。その後、細胞をアラマーブルー蛍光についてアッセイした。データ点により生成される曲線は３個の別個の用量応答曲線の平均である。データ点は対照細胞のパーセント±標準誤差として表す。Ｕ０１２６の非存在下でのＡ２３１８７の毒性についてのＥＣ５０は５２０ｎＭ［３４０ｎＭ〜７８４ｎＭ］であると計算された。１０μＭのＵ０１２６の存在下でのＡ２３１８７の毒性についてのＥＣ５０は８３３ｎＭ［４４０ｎＭ〜１．６μＭ］であると計算された。
【００９９】
図６Ｂは、１μＭのスタウロスポリンに誘発されるＰ１９ニューロンの毒性が、添加後２４時間のアラマーブルー蛍光により測定されるとおり、１０μＭのＵ０１２６により保護されることができなかったことを示す。スタウロスポリンよりもむしろビヒクルを受領した細胞は、対照のレベルのアラマーブルー蛍光を表した。しかしながら、Ｕ０１２６の濃度は、スタウロスポリン処理された細胞において、蛍光を対照レベルに戻さなかった。
【０１００】
図６Ｃは、毒性のいずれかの誘導物質の非存在下でビヒクルもしくは１０μＭのＵ０１２６で処理されたＰ１９ニューロンでアッセイされたアラマーブルー蛍光を立証する。Ｕ０１２６単独はこれらの対照のレベルの蛍光に影響を及ぼさなかった。該データは、Ｕ０１２６がスタウロスポリンもしくはＡ２３１８７に誘発される死に対し保護的でなかったことを立証する（図６Ａ、６Ｂ）。加えて、Ｕ０２１６はＰ１９ニューロンの基礎生存率に影響を及ぼさなかった（図６Ｃ）。
実施例５
分化したＰ１９細胞を使用する薬物スクリーニングのアッセイ
商業的に入手可能な化学物質ライブラリー（バイオフォーカス　ＰＬＣ（ＢｉｏＦｏｃｕｓ　ＰＬＣ）、英国）を、本明細書に記述される方法を使用してスクリーニングした。化合物のストック濃度はＤＭＳＯ中約４００μＭであった。一次スクリーニングで使用された化合物の濃度は１μＭであった。陽性の化合物は７０％もしくはそれより大きい神経保護を立証したものとして割り当てた。用量応答試験は９６穴プレートで実施し、ここで縦列１はビヒクル対照であり、縦列２は３ｍＭグルタミン酸および１ｍＭグリシンを受領し、そして縦列３は３ｍＭグルタミン酸、１ｍＭグリシンおよび１０μＭのＵ０１２６を受領した。縦列４〜１１は以下の最終濃度（μＭ）、すなわち３、１．２、０．４８、０．１９２、０．０７７、０．０３１、０．０１２および０．００５の化合物を受領した。各横列は確認のため異なる化合物を含有した。横列Ｂ−Ｇのみが化合物を受領し、そして横列ＡおよびＨは未処理のままであった。データは神経保護％＝（（化合物−グルタミン酸の平均）／（Ｕ０１２６−グルタミン酸の平均）×１００）として表す。
【０１０１】
２つの種類の化合物、すなわち４−ピリミジナミン類および２−ピリジナミン類が、データがここで示すとおり、神経保護的特性を表すことが見出された。２−ピリジナミン類のみが本発明の主題であるが、とは言え４−ピリミジナミンについての制限されたデータを同様に提示する。本生物学的試験の結果を以下の表に要約する。「％Ｉｎｈ」は２４時間後に生存する対照細胞のパーセントを示し、かつ、１マイクロモル濃度でスクリーニングされた化合物の神経保護効果を表す。ＩＣ５０は容量応答実験からのデータに関する。＞１として列挙されるＩＣ５０値は試験された最高用量（３μＭ）内で最大が観察されないことを示すが、それでもなお生物学的活性を示す。ＮＤは用量応答実験で試験されていない化合物を指す。
【０１０２】
【表８】
2004510707.tif 000017
【０１０３】
【表９】
2004510707.tif 000018
【０１０４】
【表１０】
2004510707.tif 000019
【０１０５】
【表１１】
2004510707.tif 000020
【０１０６】
【表１２】
2004510707.tif 000021
【０１０７】
【表１３】
2004510707.tif 000022
【０１０８】
【表１４】
2004510707.tif 000023
【０１０９】
【表１５】
2004510707.tif 000024
【０１１０】
実施例６
２−ピリジナミンおよび４−ピリミジナミン誘導体はＰ１９ニューロン中でＭＥＫ活性を阻害しない。
【０１１１】
ここで試験された商業的に入手可能な２−ピリジナミンおよび４−ピリミジナミン化合物はＰ１９ニューロン中でＭＥＫ１／２キナーゼ活性を阻害しなかった。それらはこれらの細胞中でのグルタミン酸誘発性のｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼのリン酸化を阻害しなかったからである。しかしながら、Ｕ０１２６は期待されたとおりこの活性を阻害した（図８）。Ｐ１９ニューロン中でのＭＥＫ活性を３ｍＭグルタミン酸および１ｍＭグリシンの添加により誘導し、そしてＭＥＫの基質、ｐ４４／４２　ＭＡＰキナーゼのリン酸化についてアッセイすることにより測定した。細胞を、グルタミン酸／グリシンの存在もしくは非存在下で本明細書に記述される化合物もしくはＵ０１２６で処理し、そしてその後のウェスタンブロット分析のために処理の５分後に収穫した。該データは、Ｕ０１２６が期待されたとおりＭＥＫ基質のリン酸化を効果的に阻害したこと、しかし２−ピリジナミンおよび４−ピリミジナミン化合物はしなかったことを立証する。従って、２−ピリジナミンおよび４−ピリミジナミン類はＭＥＫ阻害剤でない。
【０１１２】
２−ピリジナミンおよび４−ピリミジナミン類は、興奮毒性の開始後最低２時間で最大に神経保護的であった。化合物はグルタミン酸／グリシン添加の１５分前もしくは２時間後のいずれかに１μＭの濃度で投与した。Ｕ０１２６は陽性対照として試験した。Ｕ０１２６と同様、２−ピリジナミンおよび４−ピリミジナミン化合物は、異なる標的で活性であるにもかかわらず、双方の時点で最大の神経保護的有効性を保持した。
実施例７
神経保護のインビボモデル：中大脳動脈閉塞プロトコル
自発性高血圧（ＳＨＲ）雄性ラット（およそ９０〜１００日齢（〜２５０〜３００ｇ））の重量を測定し、そしてその後ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）／キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）カクテル（１．２ｍｌ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）で麻酔し、次いで長時間作用型の抗生物質（例えばコムバイオティック（ｃｏｍｂｉｏｔｉｃ））を皮下投与する。麻酔のレベルを、角膜反射（眼への空気の一吹き）および尾もしくは足のつまみに応答しての脚の攣縮により評価する。ラットが麻酔されれば、それを小型の動物外科手術板上に置き、そして外科的処置の間拘束する。ラットの体温を直腸プローブでモニターし、そして恒常的加熱パッドを用いて３７℃に維持する。切開の領域の体毛を剃りそしてベタジンを綿棒で塗る。手術区域は無菌である。全部の手術器具は、オートクレーブおよび／もしくはガラスビーズ乾式器具滅菌器中で滅菌し、その後使用前に滅菌生理的食塩水もしくはアルコールですすぐ。
【０１１３】
（１）大腿動脈カテーテル。留置カテーテルを、定期的な血液サンプル採取および動脈血圧の測定のために大腿動脈中に置く。切開を大腿動脈の領域の上で行う。組織を鈍的剥離して動脈を単離する。動脈の遠位端を滅菌縫合糸で結紮し、また、カテーテルを正しい場所に固定するために、ゆるい結紮を近位端の周囲に置く。小さい切開をカテーテルの挿入のため動脈中に行う。ＰＥ５０チューブの先端を斜めにされた端を動脈中に５ｍｍ挿入し、そしてその後滅菌縫合糸により正しい場所に固定する。ＰＥチューブを、ヘパリン化生理的食塩水で満たされた１ｃｃシリンジに取付け、それを動脈開存を保つために最小限に使用する。動脈血は３回、すなわち虚血１０分前、虚血の開始２時間後および再灌流１５分後にサンプル採取する。全部の血液サンプルは１００〜３００μｌの容量で採取して、ｐＨ、ＰａＯ２、ＰａＣＯ２、ヘマトクリットおよび血糖を測定する。実験を通じて引き抜かれた血液の最大量は動物あたり１ｍｌを越えない。血液サンプル採取が起こっていない場合は、血圧変換器をカテーテルに取り付けて平均動脈圧を測定する。外科的処置の終了時に、カテーテルを除去し、動脈を縛って血行を止め、そして切開領域を縫合閉鎖する。
【０１１４】
（２）局所性脳虚血の縦列ＣＣＡ−ＭＣＡ閉塞モデル。雄性自発性高血圧ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（ＳＨＲ）を、Ｂｒｉｎｔら（Ｊ．Ｃｅｒｅｂ　Ｂｌｏｏｄ　Ｆｌｏｗ　Ｍｅｔａｂ　８：４７４−４８５、１９８８）により記述された技術の変法を使用して、総頸動脈（ＣＣＡ）および中大脳動脈（ＭＣＡ）双方の一側の閉塞により、可逆性の局所性脳虚血のため準備する。左ＣＣＡを頸部の腹側面の切開により単離する。同側のＭＣＡの単離のために、左眼の側方眼角と対応する外耳道との間に第二の切開を行って、下にある頭蓋を露出させる。ＭＣＡを、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）の手術用顕微鏡を用いた直接可視化下に、頬骨弓および鱗骨（ｓｑｕａｍｏｓａｌ　ｂｏｎｅ）の融合部に対し吻側に２〜３ｍｍにドリルで穴を開けられた５ｍｍのバーホールにより露出させる。硬膜を滅菌２６ｇ針で開放し、そして白金ワイヤ（直径０．１ｍｍ）を、ＭＣＡの下、下皮質静脈のすぐ上に挿入する。ＭＣＡを、Ａｒｏｎｏｗｓｋｉら（Ｓｔｒｏｋｅ、２５：２２３５−２２４０、１９９４）により記述されたとおり、白金ワイヤを横切る血管の挙上および圧迫により一時的に閉塞する。同時に、ＣＣＡを動脈瘤クリップで閉塞する。ＣＣＡおよびＭＣＡの閉塞の持続期間は２時間である。この期間の終了時に、ワイヤおよびクリップを慎重に除去して血管の再灌流を可能にし、そして切開領域を縫合閉鎖する。ラットは自身の本来のケージに戻す前に隔離ケージに入れて回復させる。ラットを外科手術後２〜４時間緊密にモニターして、麻酔および外科的処置からの順調な回復を確実にする。麻酔からの回復後、ラットは、実験の分析に必要とされるまで、ＬＡＭの指針に従った確立されたプロトコルに従って収容する。
【０１１５】
（３）試験化合物はいずれかの適する経路、すなわち静脈内、皮下もしくは腹腔内により投与する。用量および化合物投与の時間はインビトロアッセイの結果もしくは参考文献に基づく。
【０１１６】
（４）２つの転帰尺度、すなわち（ａ）モリス水迷路、自発運動活動、放射状迷路およびＣＮＳの一般的挙動プロフィルのようないくつかのＣＮＳの範例に基づく挙動的反応；ならびに（ｂ）大脳皮質梗塞の大きさの組織学的検査を使用して化合物の有効性を評価する。虚血２４時間後にラットを挙動的範例で試験し、そしてそれからその後、脳の組織学のため安楽死させる。ラットをペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の腹腔内注入で深く麻酔する。麻酔の深さを角膜反射の欠如および尾のつまみにより確認する。ラットを、およそ５０ｍｌのヘパリン化生理学的生理的食塩水での経心的（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ）灌流により安楽死させる。灌流後、脳を取り出し、ブロッキングしそして１ｍｍ厚板の薄片を作る。各厚板を細胞生存率色素ＴＴＣの溶液に１５分間入れる。染色された厚板を、ニコン（Ｎｉｋｏｎ）ＳＭＺ−Ｕ解剖顕微鏡で可視化し、そして冒された脳領域の画像分析を、ＩｍａｇｅＰｒｏ　２．１ソフトウェアを使用して定量化する。梗塞容量を反体側の大脳半球の％として表す。処理群全体で統計学的比較比較を行う（一元ＡＮＯＶＡ）。
実施例８
インビボ研究：脳虚血の一過性モデル
雄性ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（Ｉｆｆａ　Ｃｒｅｄｏ、フランス）（体重２５０〜３００ｇ）を、実験前最小で５日間、５０±１５％の湿度を伴う２１±２℃の室温で、１２時間−１２時間（午前７：００に点灯し午後７：００に消灯する）の明−暗周期下にケージあたり２匹収容する。この時間の間、ラットは商業的ラット飼料（トロウ　ニュートリション　フランス（Ｔｒｏｕｗ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ｆｒａｎｃｅ）、フランス・ヴィニー、参照８１１００２）および水道水への自由な到達手段を有する。
【０１１７】
動物を、誘導のため空気中５％ハロタン、その後外科手術の間１〜２％ハロタンで麻酔する。ラットの体温は加熱パッドで３７℃に維持する。頸部の中央に２ｃｍの切開を行い、そして、右総頸動脈（ＣＣＡ）、外頸動脈（ＥＣＡ）および内頸動脈（ＩＣＡ）を手術用顕微鏡下に露出させる。ＩＣＡは翼突口蓋動脈（ＰＡ）枝および頭蓋内ＩＣＡ枝を同定するためにさらに剥離する。ＣＣＡを結紮する。３−０絹縫合糸をＥＣＡの起点で結びかつ結紮する。カテーテル（内径＝０．５８ｍｍ）を、小穿刺を通してＣＣＡ中に導入し、そしてＩＣＡの頭蓋内枝に前進させる。４−０外科用ナイロン縫合糸をカテーテル中に導入する。およそ１９ｍｍの長さのナイロン縫合糸を、縫合糸がＭＣＡの起点を封鎖するまでＣＣＡからＩＣＡの管腔中に穏やかに前進させる。縫合糸を熱によりカテーテル中に封止し、縫合糸を引き抜いて再灌流を可能にすることができるように１ｃｍのカテーテルの突出を残す。皮膚クリップを使用して切開を閉鎖する。その後麻酔を終了し、そして動物は麻酔からの回復まで加熱灯下に置く。ラットは１０〜１５分後に覚醒する。虚血の２時間後に、先端がＩＣＡ管腔を離れるまでの縫合糸の引き抜きにより、再灌流を実施する。ビヒクルもしくは試験化合物を、虚血開始後１時間に腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与する。
【０１１８】
閉塞の開始２４時間後にラットを断頭により殺す。脳を即座に取り出し、イソペンタン中で凍結させそして−２０℃で保存する。その後脳をクライオカット（ｃｒｙｏｃｕｔ）中で２０μｍ厚の薄片に切断する。２０番目ごとの薄片を使用して梗塞領域を測定する。薄片をクレシルバイオレットで染色し、そして線条体および大脳皮質中の梗塞の領域を、薄片画像のデジタル化後に画像分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ、ＮＩＨ）を使用する面積測定法により決定する。結果は前頭部から後頭部の皮質までの皮質および線条体の容量（ｍｍ３）として表す。データは分散分析（一元ＡＮＯＶＡ）、次いでＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定により分析する。
【０１１９】
前述の明細は具体的説明の目的上適用された実施例を用いて本発明の原理を教示する一方、本発明の実務は、以下の請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内にあるところの通常の変形物、翻案および／もしくは改変の全部を包含することが理解されるであろう。
【０１２０】
【表１６】
2004510707.tif 000025
【０１２１】
【表１７】
2004510707.tif 000026
【０１２２】
【表１８】
2004510707.tif 000027
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
発明にかかる、ＮＭＤＡ受容体に媒介される機能的細胞内カルシウム応答。黒四角の記号は対照を表し、黒三角の記号は１００μＭのＭＫ−８０−１を表す；
【図１Ｂ】
発明にかかる、分化したＰ１９ニューロン中での［３Ｈ］−ＭＫ−８０１結合。
【図２Ａ】
発明にかかる、アラマーブルー蛍光測定を使用するＰ１９ニューロン生存率実験。
【図２Ｂ】
発明にかかる、アラマーブルーの示度を用いる死のグルタミン酸用量応答。データは対照の％として提示される。
【図２Ｃ】
発明にかかる、ＭＫ−８０１の用量依存性の封鎖。
【図３Ａ】
発明にかかる、化合物Ａ（ｐ３８阻害剤）の前処理の用量応答。
【図３Ｂ】
発明にかかる、Ｕ０１２６（ＭＥＫ１／２阻害剤）の前処理の用量応答。
【図４Ａ】
発明にかかる、Ｕ０１２６はグルタミン酸誘発性のカルシウム応答を封鎖しない。
【図４Ｂ】
発明にかかる、Ｕ０１２６はＰ１９ニューロン中での［３Ｈ］−ＭＫ−８０１結合を封鎖しない。
【図５Ａ】
発明にかかる、Ｕ０１２６処理後の有効性の時間経過。
【図５Ｂ】
発明にかかる、化合物Ａ処理後の有効性の時間経過。
【図６Ａ】
発明にかかる、Ｕ０１２６はスタウロスポリン誘発性の毒性を阻害しない。黒四角の記号は化合物なしを表し；黒三角の記号は１０μＭのＵ０１２６を表す。
【図６Ｂ】
発明にかかる、Ｕ０１２６はＡ２３１８７誘発性の毒性を封鎖しない。
【図６Ｃ】
発明にかかる、Ｕ０１２６は基礎のＰ１９ニューロンの生存率に影響を及ぼさない。
【図７】
発明にかかる、２−ピリジナミンおよび４−ピリミジナミン化合物（化合物番号により列挙される）は、処理後の遅延型神経保護を表す。グルタミン酸処理後２時間に達成される有効性は、Ｐ１９ニューロンがこれらの化合物で前処理される場合に達成されるものと同等である。この一時的特徴はＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６のものと合致する。白の点をつけられた棒は処理前のＮＰの％を表し；黒の棒は処理２時間後のＮＰの％を表す。
【図１】
2004510707.tif 000030
【図２−１】
2004510707.tif 000031
【図２−２】
2004510707.tif 000032
【図３】
2004510707.tif 000033
【図４】
2004510707.tif 000034
【図５】
2004510707.tif 000035
【図６−１】
2004510707.tif 000036
【図６−２】
2004510707.tif 000037
【図７】
2004510707.tif 000038
【国際公開パンフレット】
2004510707.tif 000039
2004510707.tif 000040
2004510707.tif 000041
2004510707.tif 000042
2004510707.tif 000043
2004510707.tif 000044
2004510707.tif 000045
2004510707.tif 000046
2004510707.tif 000047
2004510707.tif 000048
2004510707.tif 000049
2004510707.tif 000050
2004510707.tif 000051
2004510707.tif 000052
2004510707.tif 000053
2004510707.tif 000054
2004510707.tif 000055
2004510707.tif 000056
2004510707.tif 000057
2004510707.tif 000058
2004510707.tif 000059
2004510707.tif 000060
2004510707.tif 000061
2004510707.tif 000062
2004510707.tif 000063
2004510707.tif 000064
2004510707.tif 000065
2004510707.tif 000066
2004510707.tif 000067
2004510707.tif 000068
2004510707.tif 000069
2004510707.tif 000070
2004510707.tif 000071
2004510707.tif 000072
2004510707.tif 000073
2004510707.tif 000074
2004510707.tif 000075
2004510707.tif 000076
2004510707.tif 000077
2004510707.tif 000078
2004510707.tif 000079
2004510707.tif 000080
2004510707.tif 000081
2004510707.tif 000082
2004510707.tif 000083
2004510707.tif 000084
2004510707.tif 000085
2004510707.tif 000086
2004510707.tif 000087
2004510707.tif 000088
2004510707.tif 000089
2004510707.tif 000090
2004510707.tif 000091
2004510707.tif 000092
2004510707.tif 000093
2004510707.tif 000094
2004510707.tif 000095
2004510707.tif 000096
2004510707.tif 000097
2004510707.tif 000098
2004510707.tif 000099
2004510707.tif 000100
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510707.tif 000101
【国際調査報告】
2004510707.tif 000102
2004510707.tif 000103
2004510707.tif 000104
2004510707.tif 000105