(57)【要約】本発明は、治療用途に好適であり、非常に簡単な方法で合成可能である、高活性で特異性の高いウロキナーゼ阻害剤に関する。驚くべきことに、アミジノベンジルアミン誘導体、特に２つのアミノ酸が結合した４−アミジノベンジルアミンは、高活性で非常に選択的なｕＰＡ阻害剤の新しいグループであることが分かった。本発明のウロキナーゼ阻害剤は、医療用途、例えば、転移性進行などの場合の悪性腫瘍の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉのウロキナーゼ阻害剤：
【化１】
2004503526.tif 000003
式中、置換基Ｙは３位又は４位に存在し、アミジノ基
【化２】
2004503526.tif 000004
であり、式中のＲ５はＨ、ＯＨ若しくはカルボニル基−ＣＯ−Ｒ若しくはオキシカルボニル基−ＣＯＯ−Ｒであり、ここにおいてＲは１〜１６のＣ原子を有する分岐又は直鎖アルキル、置換若しくは非置換アリール基若しくはヘテロアリール基又は置換若しくは非置換アラルキル基若しくはヘテロアラルキル基となることができ、
ＸはＣＨ基又はＮであり、
Ｒ１はＨ、１〜８のＣ原子を有する分岐若しくは直鎖アルキル、又はｎ＝１〜５である（ＣＨ２）ｎ−ＯＨであり、
Ｒ２はＨ又は１〜８のＣ原子を有する分岐若しくは直鎖アルキルであり、
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（ｎ＝１〜５）、１〜８のＣ原子を有する分岐若しくは直鎖アルキル、又はプロドラッグ形態で存在する（ＣＨ２）ｎ−ＯＸ（ｎ ＝ １〜５、Ｘはアルキル基、アラルキル基、またはアラルキルカルボニル基、あるいは対応するオキシカルボニル基となることができる）であり、及び
Ｒ４はスルホニル基−ＳＯ２−Ｒ、カルボニル基−ＣＯ−Ｒ、オキシカルボニル基−ＣＯＯ−Ｒ若しくはＨであり、
ここにおいてＲは１〜１６のＣ原子を有する分岐又は直鎖アルキル、置換若しくは非置換アリール基若しくはヘテロアリール基、置換若しくは非置換アラルキル基若しくはヘテロアラルキル基、アダマンチル基又はカンファー基である。
【請求項２】
前記アミジノベンジルアミド（ａｍｉｄｉｎｏｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ）において、アミジノ基が４位にあり、さらにアミノ酸Ｇｌｙ及びＤ−Ｓｅｒと、Ｒ４として、アリルサルホニル基又はアラルキルスルホニル基が結合している、ことを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
腫瘍を制御するために経口的、皮下的、静脈注射的、又は経皮的に投与できる薬剤の調製のための、請求項１に記載の阻害剤の使用方法。
【請求項４】
前記阻害剤が、錠剤、糖衣錠剤、カプセル、ペレット、座薬、溶液又は硬膏剤などの形状の薬剤として使用される、ことを特徴とする請求項３に記載の使用方法。
【請求項５】
特に腫瘍における診断薬としての、請求項１に記載される、前記阻害剤の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は悪性腫瘍および転移の治療のための新規ウロキナーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
周囲組織への固形腫瘍の播種および転移は、腫瘍細胞の周囲での細胞外マトリックスの破壊および／または基底膜への浸潤が可能なために起こりうる。種々のマトリックスメタロプロテイナーゼおよびカテプシン以外では、特にプラスミノゲンアクチベータのウロキナーゼ（ｕＰＡ）がこの過程において最も重要である（Ｐ． Ｍｉｇｎａｔｔｉ ａｎｄ Ｄ．Ｂ． Ｒｉｆｋｉｎ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７３， １６１−１９５， １９９３年）。従って、ｕＰＡはプラスミノゲンを活性化させ、その結果得られるプラスミンは細胞外マトリックス成分（特にフィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、およびプロテオグリカン） を破壊することができ、さらにメタロプロテアーゼとプロウロキナーゼも活性化させてｕＰＡを得る（Ｕ． Ｒｅｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １３， ８９３−９０６， １９９８年）。プロウロキナーゼとｕＰＡはどちらも、細胞表面にある特殊な受容体であるｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）と結合する。これによってｕＰＡが活性化され、その結果プラスミノゲンが活性化され、これは腫瘍細胞周囲で増加および集中する。腫瘍増殖および腫瘍播種におけるこの細胞関連プラスミノゲンアクチベータ系の重要性は、細胞生物学的研究および動物モデルの両方で示されている。従って、天然の阻害剤ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２でｕＰＡの酵素活性を阻害することによって 腫瘍細胞の浸潤能力が低下する（Ｊ．−Ｆ． Ｃａｊｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ６９３９−６９４３， １９９０年； Ｍ． Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０， ４８７６−４６８４， １９９０年）。ニワトリ胚では、ヒトガン細胞により生じた肺転移形成は、ｕＰＡに対する抗体を加えることによってほぼ完全に阻害された（Ｌ． Ｏｓｓｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３５， ６１１−６１９， １９８３年）。
【０００３】
最近では、プラスミノゲンアクチベータ系に関与する因子（ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＰＡＩ−１、およびＰＡＩ−２）の固形悪性腫瘍を有する患者の予後に対する臨床的関連性が集中的に研究されている。特に、種々の腫瘍組織中のｕＰＡの含有率が予後因子となることが分かった。従って、腫瘍中のｕＰＡ濃度の高い患者はｕＰＡ濃度が低い患者よりも予後が劣る（Ｍ． Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ７８， ２８５−２９６， １９９７年； Ｒ．Ｗ． Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ５２， ９９−１１１， １９９８年）。腫瘍組織中のｕＰＡＲの濃度増加も予後不良と関連がある （Ｈ． Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４， ４６７１−４６７５， １９９４年； Ｃ． Ｄｕｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６１， ５９７−６００， １９９５年）。
【０００４】
ｕＰＡＲ含有率の予後値および腫瘍組織中のｕＰＡ含有率に関する発見から、合成ｕＰＡ阻害剤が腫瘍細胞の浸潤および播種を抑制可能であると考えることができる。しかしながら、これまで公知となっているｕＰＡ阻害剤の数は比較的少ない。その大部分は、種々のベンズアミジンおよびβ−ナフトアミジン誘導体と同様に特異性および効力がほんのわずかである（Ｊ． Ｓｔｕｚｅｂｅｃｈｅｒ ａｎｄ Ｆ． Ｍａｒｋｗａｒｄｔ， Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ３３， ５９９−６０２， １９７８年）。ＶａｓｓａｌｌｉおよびＢｅｌｉｎ （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１４， １８７−１９１， １９９７年）がｕＰＡ阻害剤であるとして記載しているアミロリドはｕＰＡの特異的な阻害剤であるが、その阻害作用は弱い（ｋｉ ＝ ７ μＭ）。
【０００５】
４−置換ベンゾチオフェン−２−カルボキサミジンは、活性がより高いｕＰＡ阻害剤であることが分かっている（化合物６２３の場合でＫｉ ＝ ０．１６ μＭ）。この種の阻害剤は、ｕＰＡＲと結合するｕＰＡを不活性化する（Ｍ．Ｊ． Ｔｏｗｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３， ２５５３−２５５９， １９９３年）。これらのベンゾチオフェン誘導体は非常に特異的であり、プラスミンおよび組織型プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）に対する阻害作用はわずかであるが、この種の化合物の合成は非常に複雑である。
【０００６】
４−アミノメチルフェニルグアニジン誘導体は同等の特異性を有するが、ｕＰＡに対する阻害作用（最も活性の高い化合物の場合でＫｉ ＝ ２．４ μＭ） は比較的低い（Ｓ． Ｓｐｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７， ５１１３−５１１８， ２０００年）。
これとは対照的に、Ｎα−トリイソプロピルフェニルスルホニル−３−アミジノフェニルアラニン誘導体はマイクロモル濃度のＫｉ値（最も活性の高い化合物の場合で０．４１ μＭ ）を達成するが、非常に非特異的なｕＰＡ阻害剤であり、トリプシン、トロンビン、およびプラスミンに対して同等またはより強い阻害作用を示す（Ｊ． Ｓｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｌｅｔｔｅｒｓ ９， ３１４７−３１５２， １９９９年）。ＷＯ ９９／０５０９６号は、非常に有用なｕＰＡ阻害剤である改良されたβ−ナフトアミジンを開示している。この特許はＩＣ５０値がナノモル濃度範囲であると報告しているが、選択性や生物活性に関するデータは提供していない。
これまで基質の配列から誘導される少数のペプチドのみがｕＰＡ阻害剤であるとして記載されている。ＫｅｔｔｎｅｒおよびＳｈａｗ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ８０， ８２６−８４２， １９８１年）は、クロロメチルケトン類はｕＰＡを不可逆的に阻害するがｉｎ−ｖｉｖｏ用途には適していないと記載している。
【０００７】
欧州特許第１８ ３２ ７１号は、ある程度ｕＰＡを阻害するリシン誘導体を開示しているが、これらは他の類似の酵素も阻害し、そのため非常に特異的、または制限された方法でのみ医療用途に使用することができる。ｕＰＡ阻害剤であり、天然の阻害剤から誘導されるとＷＯ ９５／１７８８５号で報告されている低分子量ポリペプチド（約５０個のアミノ酸）についても同じことが言える。このペプチドの性質、およびその分子の大きさのため、ｉｎ−ｖｉｖｏ用途は非常に制限される。
【０００８】
しかしながら、ＷＯ ００／０５２４５号は、Ｃ末端にアルギンを含有しＰ３にＤ−セリンを含有するペプチジルアルデヒドが効率的にｕＰＡ阻害するとごく最近報告している。しかし、このアルデヒドの機能は不安定であり選択性が低い。Ｓｅｒのヒドロキシルをアシル化すると、その腫瘍化合物ｉＢｕＯＣＯ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｈの皮下投与による相対的バイオアベイラビリティが８７％であることが分かった（Ｓ． Ｙ． Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １０， ９８３−９８７， ２０００年）。
さらに、ｕＰＡと関連する酵素であるトロンビンの阻害剤に関する研究でＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ型のトリペプチド誘導体を使用する場合、アグマチン、ｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキシルアミン、または４−アミジノベンジルアミンをＣ末端に導入すると、阻害作用とバイオアベイラビリティの両方に関して顕著な進展が見られた。ピコモル濃度のＫｉ値が得られ経口バイオアベイラビリティも向上した（Ｔ．Ｊ． Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４０， １５６５−１５６９および３６８７−３６９３， １９９７年）がｕＰＡ阻害剤は見つからなかった。例えば、４−アミジノベンジルアミド残基をＣ末端に有するメラガトランはトリプシン（Ｋｉ ＝ ２．０ ｎＭ）およびトロンビン（Ｋｉ ＝ ２．０ ｎＭ）を非常に非特異的に阻害するが、ｕＰＡの阻害ではＫｉ ＝ ６．３ μＭであり、３桁分弱い値である（Ｄ． Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．． Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ． Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ７， ６９−７９， １９９６年； ＷＯ ９４／２９３３６号）。
【０００９】
本発明の主要な目的は、高い活性および選択性でウロキナーゼを阻害し、できるだけ簡単な合成によって調製可能であり、治療用途にも好適である有効化合物を特定することである。
【００１０】
驚くべきことに、請求項１に記載の式Ｉによるアシル化アミジノベンジルアミン、特にＸ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３によって天然および／または非天然のアミノ酸が得られる４−アミジノベンジルアミン化合物はウロキナーゼを非常に効率的かつ選択的に阻害することが分かった。これに関連して、アミジノ基が４位にあり、ＧｌｙおよびＤ−Ｓｅｒがアミノ酸として結合し、この化合物がアリールスルホニル基またはアラルキルスルホニル基で構成されるＮ末端保護基Ｒ４を有する場合、アミジノベンジルアミンは特に活性のウロキナーゼ阻害剤となる。
【００１１】
エステル、特にオキシカルボン酸とのエステルは、経腸摂取中に加水分解されるプロドラッグとして使用することができる。驚くべきことに、本発明による化合物のこれらのオキシカルボニル誘導体の一部も非常に強力なウロキナーゼ阻害剤であることも分かった。
ウロキナーゼ以外では、グリシン誘導体による他の酵素の阻害は明らかに弱く、このことは本発明によるこれらのアミジノベンジルアミン誘導体は非常に高活性で選択性の高いｕＰＡ阻害剤の新規グループであることを意味する。対照的に、Ｒ１としてＨを全く有さない化合物（例えばアラニン誘導体）はウロキナーゼを選択的に阻害しないが、トリプシン、トロンビン、およびプラスミンの強力な阻害剤でもある。
通常、本発明の化合物は鉱酸の塩として存在し、好ましくは塩酸塩、または好適な有機酸の塩として存在する。
【００１２】
式Ｉの化合物は、以下のような公知の方法を使用した比較的簡単な方法で調製することができる。
出発化合物の４−シアノベンジルアミンはＧａｂｒｉｅｌ合成（Ｇ． Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｉ． Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ， Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ３２， ７６−７７，． １９７７年； Ｂ．Ｃ． Ｂｏｏｋｓｅｒ ａｎｄ Ｔ．Ｃ． Ｂｒｕｉｃｅ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３． ４２０８−４２１８， １９９１年）によって４−シアノベンジルブロミドから調製される。Ｂｏｃで保護されたアセチルオキサミジノベンジルアミン（ａｃｅｔｙｌｏｘａｍｉｄｉｎｏｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ）はこのようにして調製された４−シアノベンジルアミンから得られる。他のアミノ酸と保護基Ｒ４のカップリングは、標準的カップリング方法によって行われ、Ｎ末端保護基としてＢｏｃが使用される。第二のアミノ酸もＮ−アリールスルホニルまたはＮ−アラルキルスルホニルで保護されたアミノ酸として直接カップリングさせることができる。ペプチド類縁物質は、アセチルオキサミジノベンジルアミンから出発して順次合成される。対応するエステルを合成する場合は、対象化合物を対応する酸塩化物と反応させる。生成物の大部分はよく結晶化するため、容易に精製可能である。最終段階において、阻害剤は分取用逆相ＨＰＬＣによって精製される。
【００１３】
本発明を、２つの実施例を使用して以下により詳細に説明する。
実施例１
ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ＨＣｌの合成１．１　Ｂｏｃ−４−シアノベンジルアミド
２０ ｇ（０．１５１ ｍｏｌ）の４−シアノベンジルアミンを３００ ｍｌの水、１５０ ｍｌのジオキサンと１５０ ｍｌの１ Ｎ ＮａＯＨに溶解した。氷冷下で３７．５ ｍｌのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートを滴下し、混合物を０℃で１時間かく拌し室温でさらに２４時間かく拌した。ジオキサンを真空除去し水性残渣を酢酸エチルで３回抽出した。一緒にまとめた抽出液を５％ＫＨＳＯ４溶液で３回洗浄した後に飽和ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し真空濃縮した（白色結晶）。ＨＰＬＣ：アセトニトリル／水、４４．１％アセトニトリルにて溶出；収率：３０．４８ ｇ（０．１３１ ｍｏｌ）、８７％。
【００１４】
１．２　Ｂｏｃ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミド
Ｊｕｄｋｉｎｓらの方法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ． ２６， ４３５１−４３６７， １９９６）に従って、３０．４８ ｇ（０．１３１ ｍｏｌ）のＢｏｃ−４−シアノベンジルアミドを、１３．６５ ｇ（０．１９７ ｍｏｌ）のヒドロキシルアミン ｘ ＨＣｌと３４ ｍｌ（０．１９７ ｍｏｌ）のＤＩＥＡとともに、３００ ｍｌの無水エタノールに溶解した。その溶液を２時間還流した後室温で一晩かく拌した。続いてバッチを真空濃縮し、残渣を約２００ ｍｌの酢酸に溶解し、その溶液を１８．６７ ｍｌ（０．１９７ ｍｏｌ）の無水酢酸で処理した。１時間後、それを再濃縮し、酢酸エチルに溶解し０℃にて５％ＫＨＳＯ４溶液及び飽和ＮａＣｌ溶液で各３回洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し真空濃縮した後、白色粉末が沈殿した。ＨＰＬＣ：アセトニトリル／水、３２．０％アセトニトリルにて溶出；収率：３１．３ ｇ（０．１０２ ｍｏｌ）、７８％。
【００１５】
１．３　４−アセチルオキサミジノベンジルアミン ｘ ＨＣｌ
５ ｍｍｏｌのＢｏｃ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミドを２０ ｍｌの１ Ｎ ＨＣｌ氷酢酸溶液に溶解し、その溶液を室温で４５分間静置した。次におおむね真空濃縮し、その生成物を乾燥ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、フリット（ｆｒｉｔ）上でろ過し、新しいエーテルで再洗浄し、真空乾燥させた。定量反応のため、生成物をさらなる精製をすることなく次の合成段階へ使用した。
【００１６】
１．４　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミド
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｏｒｐｅｇｅｎ社、ハイデルベルグ）の４−アセチルオキサミジノベンジルアミンへのカップリングはＦｒｅｒｏｔら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４７， ２５９ ｆｆ．， １９９１）に従って実施した。このために、２．０６４ ｇ（９．３ ｍｍｏｌ）の４−アセチルオキサミジノベンジルアミン ｘ ＨＣｌと１．６２９ ｇ（９．３ ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを約２５ ｍｌのＤＭＦに溶解した。次に４．８４ ｇ（９．３ ｍｍｏｌ）のＰｙＰＯＰと３．８７８ ｍｌ（２７．９ ｍｍｏｌ）のＴＥＡを０℃にて加え、ＴＥＡを用いてｐＨを９に調整した。室温で１時間かく拌した後、混合物を真空濃縮し、酢酸エチルに溶解し、各３回の酸性、塩基性及び中性洗浄に供し、乾燥及び濃縮をした。収率：３ ｇ（８．２ ｍｍｏｌ）８８％。
【００１７】
１．５　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ＡｃＯＨ
３ ｇ（８．２ ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｇｌｙ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミドを２００ ｍｌの９０％酢酸に溶解した。続いて３００ ｍｇの１０％活性炭担持型パラジウムをアルゴン下にて加えた。アルゴンを水素雰囲気に置換した後、バッチに２４時間勢いよくかく拌しながら水素添加した。触媒をろ過し、ろ液を真空濃縮した。収率：２．９ ｇ（７．９ ｍｍｏｌ）９６％。
【００１８】
１．６　Ｈ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ２ＨＣｌ
２．９ ｇ（７．９ ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミドを１００ ｍｌの１ Ｎ ＨＣｌ氷酢酸溶液に溶解し、その溶液を室温で４５分間静置した。次におおむね真空濃縮し、その生成物を乾燥ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、フリット（ｆｒｉｔ）上でろ過し、生成物を新しいエーテルで再洗浄した。生成物を真空乾燥させた後、さらなる精製をすることなく項１．８での合成に使用した。
【００１９】
１．７　ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−ＯＨ
２２９ ｍｇ（１．１７３ ｍｍｏｌ）のＨ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−ＯＨと４０８μｌ（２．３４５ ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを５０ ｍｌの５０％アセトニトリルに溶解した。続いて３３５ ｍｇ（１．７６ ｍｍｏｌ）のベンジルスルホニルクロライドを加え、混合物を室温で１２時間かく拌した。混合物を真空濃縮し、酢酸エチルに溶解し、各３回の酸性及び中性洗浄に供した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、真空濃縮した。収率： ２８９ ｍｇ（０．８２７ ｍｍｏｌ）７１％。
【００２０】
１．８　ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ＴＦＡ　１５１ ｍｇ（０．４３３ ｍｍｏｌ）のベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−ＯＨと１２１ ｍｇ（０．４３３ ｍｍｏｌ）のＨ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミド ｘ ２ＨＣｌを少量の無水ＤＭＦに溶解した。２２５ ｍｇ（０．４３３ ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰと２３０μｌ（１．３２ ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを氷冷下にて加えた。室温にて１時間かく拌した後、混合物を真空濃縮して生成物をＨＰＬＣ（アセトニトリル／水、０．１％トリフルオロ酢酸、３７．４％アセトニトリルにて溶出）によって精製した。収率： ２３２ ｍｇ（０．３５６ ｍｍｏｌ）８２％。
【００２１】
１．９　ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミドｘ ＨＣｌ
ＨＰＬＣで精製した５０ ｍｇベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｚ）−Ｇｌｙ−４−アセチルオキサミジノベンジルアミド・ＴＦＡを５０ ｍｌの９０％酢酸に溶解し、５０ ｍｇの１０％ 活性炭担持型パラジウムを使用して室温で４８時間加水分解する。この後、触媒をろ過し、ろ液を真空濃縮する。生成物をＨＰＬＣで精製し（アセトニトリル／Ｈ２Ｏ、０．１％ ＴＦＡを含有、分析用ＨＰＬＣで２１．４％ アセトニトリルにて溶出）、イオン交換体を使用してＨＣｌ形態に変化させる。
収率： ２０ ｍｇ （０．０４１ ｍｍｏｌ） ５４％。
【００２２】
１．１０　ベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ（ＣＯＯ−イソブチル）−Ｇｌｙ−４−アミジノ−ベンジルアミドｘ ＨＣｌ
３０ ｍｇ （０．０６２ ｍｍｏｌ）のベンジルスルホニル−Ｄ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−４−アミジノベンジルアミドｘ ＨＣｌを、３ ｍｌのピリジンに１ ｍｌのアセトニトリルを加えたものに室温で溶解する。氷冷しながら１６．１ μｌ （０．１２４ ｍｍｏｌ）のクロロギ酸イソブチルを加える。氷冷しながら混合物を３０分間かく拌し、続いて室温で終夜かく拌する。溶媒を減圧留去し、生成物をＨＰＬＣで精製し（分析用ＨＰＬＣで３７．９％ アセトニトリルにて溶出）で精製し、イオン交換体を使用してＨＣｌ形態に変化させる。
収率： １３ ｍｇ （０．０２２ ｍｍｏｌ） ＝ ３６％。
【００２３】
実施例２
Ｙ ＝ アミジノを有する選択された化合物によるウロキナーゼの阻害
【表１】
2004503526.tif 000002
【００２４】
阻害作用の測定
阻害作用の測定のために、２００μｌのトリスバッファー（０．０５ Ｍ、０．１５４ Ｍ ＮａＣｌ、５％エタノール、ｐＨ ８．０；阻害剤を含む）、２５ μｌの基質（Ｂｚ−βＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ水溶液）及び５０μｌのｓｃウロキナーゼを２５℃でインキュベートした。３分後、２５μｌの酢酸（５０％）の添加によって反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＭＲ ５０００、ダイナテック社）を用いて４０５ ｎｍの吸光度を測定した。Ｋｉ値はＤｉｘｏｎの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ５５， １７０−１７１， １９５３）に従ってコンピュータープログラムを用いて直線回帰により決定した。Ｋｉ値は少なくとも３回の測定の平均を用いた。
【００２５】
使用した略語
Ａｃ　　アセチル
Ｂｏｃ　　ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｂｚ　　ベンジル
ＤＩＥＡ　　ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ　　Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＰｙＢＯＰ　　ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ−オキシトリス（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＥＡ　　トリエチルアミン
ＴＦＡ　　トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ　　テトラヒドロフラン
Ｃｍｅ　　シクロヘキシルメチル
ｉＢｕ　　イソブチル。
【国際公開パンフレット】
2004503526.tif 000005
2004503526.tif 000006
2004503526.tif 000007
2004503526.tif 000008
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2004503526.tif 000010
2004503526.tif 000011
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2004503526.tif 000013
2004503526.tif 000014
2004503526.tif 000015
2004503526.tif 000016
2004503526.tif 000017
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503526.tif 000018
【国際調査報告】
2004503526.tif 000019
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