(57)【要約】本発明は、胃腸管の平滑筋収縮を刺激する単離されたポリペプチドを提供し、これには、ヒトプロキネチシン１ポリペプチドおよびヒトプロキネチシン２ポリペプチドならびにそれらの機能的フラグメントおよび改変物が挙げられる。また、有効量のプロキネチシンポリペプチドを哺乳動物に投与することによって、哺乳動物において胃腸管の平滑筋収縮を刺激する方法が提供される。本発明はまた、プロキネチシンポリペプチドをコードする核酸分子、およびプロキネチシンポリペプチドに選択的に結合する抗体を提供する。さらに、プロキネチシンレセプターのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸管の平滑筋収縮を刺激する単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ヒトプロキネチシン１（配列番号３）の配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含み、該配列は、配列番号３のＮ末端の６つのアミノ酸、配列番号３の１０つの保存されたシステイン残基および配列番号３のＣ末端の９つのアミノ酸うちの０〜９つを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３における残基とは異なるアミノ酸残基が、その保存的置換である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３における残基とは異なるアミノ酸残基が、配列番号６由来の対応する残基から構成される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１３を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３のアミノ酸１〜７７を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
６ＸＨｉｓタグを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
検出可能に標識される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３の、少なくとも１０つ連続したアミノ酸を含む単離されたペプチドであって、該ペプチドが免疫原性である、単離されたペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
哺乳動物において、胃腸管の平滑筋収縮を刺激する方法であって、該方法は、有効量の請求項１に記載のポリペプチドを、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１３】
遺伝子発現のプロモーターに作動的に連結された請求項１２に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドを調製する方法であって、該方法は、該ポリペプチドを発現させるために、請求項１４に記載の宿主細胞を培養する工程、該ポリペプチドを実質的に精製する工程、および該ポリペプチドを再折り畳みする工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
【請求項１７】
胃腸管の平滑筋収縮を刺激する単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ヒトプロキネチシン２（配列番号６）の配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含み、該配列は、配列番号６のＮ末端の６つのアミノ酸、配列番号６の１０つの保存されたシステイン残基および配列番号６のＣ末端の４つのアミノ酸うちの０〜４つを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号６における残基とは異なるアミノ酸残基が、その保存的置換である、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号６における残基とは異なるアミノ酸残基が、配列番号３由来の対応する残基から構成される、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号１４を含む、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号６のアミノ酸１〜７７を含む、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号６を含む、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
６ＸＨｉｓタグを含む、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
検出可能に標識される、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号６の、少なくとも１０つの連続したアミノ酸を含む単離されたペプチドであって、該ペプチドが免疫原性である、単離されたペプチド。
【請求項２６】
請求項１７に記載の単離されたポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
哺乳動物において、胃腸管の平滑筋収縮を刺激する方法であって、該方法は、有効量の請求項１７に記載のポリペプチドを、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項１７に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項２９】
遺伝子発現のプロモーターに作動的に連結された請求項１７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３１】
請求項１７に記載の単離されたポリペプチドを調製する方法であって、該方法は、該ポリペプチドを発現させるために、請求項３０に記載の宿主細胞を培養する工程、該ポリペプチドを実質的に精製する工程、および該ポリペプチドを再折り畳みする工程を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項１７に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
【請求項３３】
プロキネチシンレセプターのリガンドを同定する方法であって、該方法は、プロキネチシンレセプターを含む調製物と、１つ以上の候補化合物とを接触させる工程、および該レセプターに特異的に結合する化合物を同定する工程を包含し、該化合物がプロキネチシンレセプターのリガンドとして特徴付けられる、方法。
【請求項３４】
前記調整物が、腸の平滑筋調製物またはその膜調製物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記調製物が細胞株またはその膜調製物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞株がＭ２Ａ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５００）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
プロキネチシンレセプターシグナル伝達を選択的にアゴナイズするか、またはアンタゴナイズする前記リガンドの能力がさらに決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記シグナル伝達が細胞株において決定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞株がＭ２Ａ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５００）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記シグナル伝達が、カルシウム動員をモニタリングすることによって決定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
平滑筋収縮性を調節する前記リガンドの能力がさらに決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
プロキネチシンレセプターのアゴニストを同定する方法であって、該方法は、プロキネチシンレセプターを含む調製物と、１つ以上の候補化合物とを接触させる工程、およびプロキネチシンレセプターシグナルの産生を選択的に促進する化合物を同定する工程を包含し、該化合物がプロキネチシンレセプターのアゴニストとして特徴付けられる、方法。
【請求項４３】
前記調製物が細胞株である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞株がＭ２Ａ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５００）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記シグナル伝達が、カルシウム動員をモニタリングすることによって決定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
平滑筋収縮性を調節するための前記アゴニストの能力がさらに決定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
プロキネチシンレセプターのアンタゴニストを同定する方法であって、該方法は、プロキネチシンレセプターを含む調製物と、プロキネチシンの存在下で１つ以上の候補化合物とを接触させる工程、およびプロキネチシンレセプターシグナルの産生を選択的に阻害する化合物を同定する工程を包含し、該化合物がプロキネチシンレセプターのアンタゴニストとして特徴付けられる、方法。
【請求項４８】
前記プロキネチシンが、配列番号３のアミノ酸１〜７７および配列番号６のアミノ酸１〜７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記調製物が細胞株である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞株がＭ２Ａ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５００）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記シグナル伝達が、カルシウム動員をモニタリングすることによって決定される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
平滑筋収縮性を調節する前記アンタゴニストの能力がさらに決定される、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
胃腸（ＧＩ）平滑筋の主要な機能は、内腔内内容物を混合し、そして推進することで、この胃腸平滑筋は、効率的な食物の消化、栄養素の吸収の促進、および残留成分の最終的な除去を可能にする。ＧＩ平滑筋の活性は、内因性および外因性の神経シグナル（古典的な神経伝達物質、共存する神経ペプチド、および循環ペプチドホルモンを含む）によって、調節される。さらに、非神経性ＧＩ細胞によって生成される多数の体液因子（ヒスタミン、セロトニン、およびアデノシンを含む）もまた、平滑筋細胞の活性に影響を与える。
【０００２】
多くの臨床的状態が改変されたＧＩ運動に関連し、その状態としては以下が挙げられる：過敏性腸症候群、糖尿病性胃不全麻痺、術後の腸閉塞、慢性便秘、胃小腸反射疾患、慢性下痢、感染症、吸収不良障害、炎症性腸障害、および腸癌。胃腸運動性の調節因子の同定は、胃腸運動性減損または胃腸運動性増強に関する障害のための、新規な治療の開発を促進する。
【０００３】
近年、胃腸運動の２つの潜在的な調節因子が同定された。マンバ腸管毒素（Ｍａｍｂａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｏｘｉｎ）（ＭＩＴｌ）（モルモット回腸の収縮を強力に刺激する低分子タンパク質）は、マンバヘビ毒から精製された（Ｓｃｈｗｅｉｔｚら、Ｔｏｘｉｃｏｎ  ２８：８４７〜８５６（１９９０）およびＳｃｈｗｅｉｔｚら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６１：１８３〜１８８（１９９９））。近年、同様の大きさで、かつＭＩＴｌと４０％よりも高い同一性を有するタンパク質（全１０個の保存性システインを含む）が、カエルの皮膚の分泌物から精製された（Ｍｏｌｌａｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７４：１８９〜１９６（１９９９））。カエルのタンパク質（Ｂｖ８と命名された）もまた、ＧＩ平滑筋の収縮を強力に刺激することが、認められた。
【０００４】
これらのヘビポリペプチドおよびカエルポリペプチドを組換え的に調製する方法、または１０個のシステインを含む他のポリペプチドを組換え的に調製する方法は、以前に記載されておらず、これら調節因子の有用性を治療的使用に限定していない。さらに、ヘビポリペプチドおよびカエルポリペプチドは、これらポリペプチドの治療としての有効性が減少する可能性がある哺乳動物に投与される場合、抗体を誘発し得る。
【０００５】
したがって、胃腸運動を刺激するかまたは阻害する内因性ヒトポリヌクレオチドを同定すること、および治療としてのこれら化合物を組換え的に調製する方法を開発することが、必要である。治療上使用され得る内因性胃腸調節因子の低分子アゴニストおよび低分子アンタゴニストを同定することもまた、必要である。本発明は、この必要性を満たし、そして、さらに、関連した利用を提供する。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、胃腸平滑筋の収縮を刺激する単離されたポリペプチドを提供する。１つの実施形態において、このポリペプチドは、ヒトプロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）１（配列番号３）の配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含み、ここで、この配列は、配列番号３のＮ末端の６個のアミノ酸、配列番号３の１０個の保存性システイン残基、および配列番号３の９個のＣ末端アミノ酸残基のうちの０個〜９個を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、ヒトプロキネチシン２（配列番号６）の配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸残基を含み、ここで、この配列は、配列番号６のＮ末端の６個のアミノ酸、配列番号６の１０個の保存性システイン残基、および配列番号６の４個のＣ末端アミノ酸残基のうちの０個〜４個を含む。
【０００７】
有効量のプロキネチシンポリヌクレオチドを哺乳動物へ投与することによって、哺乳動物中の胃腸平滑筋収縮を刺激する方法もまた、提供される。
【０００８】
本発明はまた、プロキネチシンポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【０００９】
さらに、プロキネチシンポリペプチドに選択的に結合する抗体が提供される。
【００１０】
本発明はまた、プロキネチシンレセプターを含む調製物と１つ以上の候補化合物を接触させることによって、プロキネチシンレセプターリガンドを同定する方法、およびこのレセプターに特異的に結合する化合物を同定する方法を提供する。このような化合物は、プロキネチシンレセプターリガンドとして特徴付けられる。
【００１１】
プロキネチシンレセプターを含む調製物と１つ以上の候補化合物を接触させることによって、プロキネチシンレセプターアゴニストを同定する方法、およびプロキネチシンレセプターシグナルの生成を選択的に促進する化合物を同定する方法もまた、提供される。このような化合物は、プロキネチシンレセプターアゴニストとして特徴付けられる。
【００１２】
プロキネチシンレセプターを含む調製物と１つ以上の候補化合物を、プロキネチシン存在下で接触させることによって、プロキネチシンレセプターアンタゴニストを同定する方法、およびプロキネチシンレセプターシグナルの生成を選択的に阻害する化合物を同定する方法がさらに、提供される。このような化合物は、プロキネチシンレセプターアンタゴニストとして特徴付けられる。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、胃腸（ＧＩ）平滑筋収縮を刺激し得る、単離されたプロキネチシンポリペプチドを提供する。本発明のプロキネチシンポリペプチドは、例えば、障害性のＧＩ運動に関する障害を処置するための治療法において、使用され得る。このようなポリペプチドはまた、例えば、レセプターアゴニストおよびレセプターアンタゴニストを含むプロキネチシンレセプターリガンドを同定するためのスクリーニング法において使用され得、これは、障害性のＧＩ運動性または増強されたＧＩ運動性に関する障害を処置するために、治療的に使用され得る。
【００１４】
本明細書中で使用する場合、用語「プロキネチシンポリペプチド」は、図１Ａ（配列番号３）中で下線を引いていない配列として示されるヒトプロキネチシン１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または図１Ｂ（配列番号６）中で下線を引いていない配列として示されるヒトプロキネチシン２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および、ＧＩ平滑筋収縮活性を有する配列番号３または配列番号６に対する、少数の改変を含むポリペプチド；ならびに、ＧＩ平滑筋収縮活性を有する参照ポリペプチドのフラグメントを、いう。
【００１５】
本明細書中で使用する場合、用語「包含する」「有する」「コードする」および「含む」、ならびにこれらの用語の派生語は、開放型であることが意図される。用語「からなる」は、閉鎖型であることが意図される。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、配列番号３または配列番号６と命名された配列に対する、用語「少数の改変」は、列挙されたアミノ酸配列と比較して、１つ以上の付加、欠失もしくは置換；そのポリペプチドに対する１つ以上の化学修飾もしくは酵素修飾；または、対応するＤ−型アミノ酸による１つ以上のＬ−型アミノ酸の置換を、いう。このような改変は、例えば、そのポリペプチドの安定性、発現、生理活性もしくはレセプター親和性の増強において、またはそのポリペプチドの同定もしくは精製を容易にするために、有利であり得る。
【００１７】
改変されたポリペプチドのＧＩ平滑筋収縮活性は、その改変されたポリペプチドがＧＩ平滑筋収縮活性を有することを確認するための当該分野において公知であるエキソビボ法またはインビボ法（例えば、実施例中に記載されるエキソビボおよびインビボのモルモット回腸バイオアッセイ）によって決定され得る。ＧＩ平滑筋収縮活性を決定するための適切なアッセイが、プロキネチシン１またはプロキネチシン２に応答する他のＧＩ平滑筋組織（例えば、胃底部の筋肉ストリップ（ｆｕｎｄｉｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｒｉｐ）または近位結腸（実施例を参照のこと））を使用して、代わりに実施され得る。同様に、適切なアッセイが、他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、雌ウシおよび霊長類を含む）を使用して、実施され得る。
【００１８】
ＧＩ平滑筋収縮活性を誘発する改変されたプロキネチシンポリペプチドは、同一の条件下で、ヒトプロキネチシン１またはヒトプロキネチシン２の最大ＧＩ平滑筋収縮の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上を誘発し得る。ＧＩ平滑筋収縮活性を誘発する改変されたプロキネチシンポリペプチドは、同一条件下で、ヒトプロキネチシン１またはヒトプロキネチシン２よりも弱い能力、類似の能力またはより強い能力であり得る。例えば、改変されたポリペプチドは、ヒトプロキネチシン１またはヒトプロキネチシン２についてのＥＣ５０よりも５倍、１０倍、５０倍または１００倍高いか、またはその１／５、１／１０、１／５０、１／１００であるＥＣ５０を有し得る。ＧＩ平滑筋収縮活性を誘発する改変されたプロキネチシンポリペプチドはまた、同一条件下で、ヒトプロキネチシン１もしくはプロキネチシン２と同じ期間、またはヒトプロキネチシン１もしくはプロキネチシン２よりもより長い期間もしくはより短い期間、収縮を誘発し得る。
【００１９】
プロキネチシン１のエクソン１およびエクソン２、ならびプロキネチシン２のエクソン３によってコードされるキメラポリペプチド（キメラ１２（配列番号１３）と命名された）（図６を参照のこと）は、プロキネチシン１またはプロキネチシン２と類似の能力で回腸収縮を誘発する、改変されたプロキネチシンの例である（図７Ａを参照のこと）、しかし、このキメラポリペプチドは、プロキネチシン１またはプロキネチシン２と比較して、長い収縮を生じる（図７Ｂを参照のこと）。
【００２０】
プロキネチシン２のエクソン１およびエクソン２、ならびにプロキネチシン１のエクソン３によってコードされるキメラポリペプチド（キメラ２１（配列番号１３）と命名された）（図６を参照のこと）は、プロキネチシン１またはプロキネチシン２の１／８の能力で回腸収縮を誘発する、改変されたプロキネチシンの例であり（図７Ａを参照のこと）、そして、このキメラポリペプチドは、プロキネチシン１またはプロキネチシン２と比較して、長い収縮を生じる（図７Ｂを参照のこと）。
【００２１】
配列番号３または配列番号６と命名されたアミノ酸配列に対する改変は、配列番号３または配列番号６をコードする核酸分子中に、無作為に生成され得る（例えば、ヌクレオチドの無作為な挿入、欠失、または置換によって）。あるいは、改変は、指向され得る（例えば、配列番号３または配列番号６をコードする核酸分子の部位特異的変異によって）。
【００２２】
当該分野において公知のコンピュータープログラムは、ポリペプチドの機能を消失することなしにアミノ酸残基が改変され得ることを予測することにおいて、指針を提供し得る（例えば、Ｅｒｏｓｈｋｉｎら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：４９１〜４９７（１９９３）を参照のこと）。
【００２３】
さらに、活性を保持しながら配列番号３または配列番号６のアミノ酸残基を改変することにおける指針は、配列番号３または配列番号６とそれらの哺乳動物のホモログの配列（例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコ種のホモログ）ならびに非哺乳動物の脊椎動物におけるそれらのホモログの配列（カエルＢｖ８ポリペプチド（配列番号１１）およびヘビＭＩＴ１ポリペプチド（配列番号１２）を含む）（図１を参照のこと）を比較することによって、提供され得る。進化的に保存されたアミノ酸残基およびドメインは、あまり保存されていない残基およびドメインよりも、生物学的活性を維持するためにより重要である可能性があるということは、当該分野において周知である。従って、哺乳動物のプロキネチシン、カエルＢｖ８ポリペプチドおよびヘビＭＩＴ１ポリペプチドの間で高度に保存される残基（例えば、Ｎ末端配列または１０個のシステインのいずれか）を置換することは、活性に悪影響をもたらしそうである一方で、あまり高度に保存されていない残基（例えば、Ｃ末端残基）の置換は許容されそうである、ということが予想される。
【００２４】
実施例において記載されるように、付加、欠失または置換なしにプロキネチシンの６個のＮ末端残基（ＡＶＩＴＧＡ）を保持することは、平滑筋収縮活性を維持するために、明らかに必要である（表１を参照のこと）。しかし、ＡＶＩＴＧＡ配列の改変は、ＧＩ平滑筋収縮活性を示さないが野生型プロキネチシンの平滑筋収縮活性を拮抗するポリペプチドを、生じ得る。配列番号１６および配列番号１８と命名されたＮ末端変異体は、拮抗的活性を有する改変されたプロキネチシンポリペプチドの例である。
【００２５】
プロキネチシンのＮ末端ドメインは、ＧＩ平滑筋収縮活性のために明らかに必要とされる一方で、ＧＩ平滑筋収縮活性に十分でない。特に、プロキネチシンＮ末端ペプチド（配列番号１９）または、コリパーゼもしくはｄｉｃｃｋｏｐｆ  ４のいずれかのシステインリッチなドメインを用いて置換されたプロキネチシンのシステインリッチなドメインを有するポリペプチドは、平滑筋収縮活性を示さなかった。
【００２６】
プロキネチシンのシステインリッチドメインもまた、ＧＩ平滑筋収縮活性のために必要とされることが示された（表１を参照のこと）。詳細には、２つのシステインいずれかでの置換が、活性を無効にする場合、活性を保持するために正確なシステイン対形成が必要とされることが示された。
【００２７】
位置に挿入された６ＸＨｉｓタグを有するプロキネチシンポリペプチドのＧＩ平滑筋収縮活性が、ことによって明らかとされるように、最後のシステインに対するＣ末端の配列は、恐らく必要とされない。さらに、プロキネチシン１および２の類似の活性によって明らかとされるように、４４％のみが同一であるにも関わらず、Ｎ末端および保存されたシステイン残基以外の位置でのアミノ酸配列の置換が、十分に許容される。
【００２８】
配列番号３または６と命名されたアミノ酸配列への置換は、保存的かもしれないし、保存的でないかもしれない。保存的アミノ酸置換としては、無極性のアミノ酸と別の無極性のアミノ酸との置換（例えば、ロイシンと、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、またはメチオニンとの置換）；荷電したアミノ酸と同様に荷電したアミノ酸との置換（例えば、グルタミン酸とアスパラギン酸との置換、またはアルギニンとリジンもしくはヒスチジンとの置換）；非荷電極性アミノ酸と別の非荷電極性アミノ酸との置換（例えば、セリンとグリシン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギンもしくはグルタミンとの置換）；あるいはある残基と類似のサイズおよび形の残基を有する異なる官能基との置換（例えば、セリンとアラニンとの置換；アルギニンとメチオニンとの置換；もしくはチロシンとフェニルアラニンとの置換）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
配列番号３および６と命名されたアミノ酸配列に対して特に意図される置換としては、野生型プロキネチシン１由来の残基とプロキネチシン２由来の残基との置換、およびその逆が挙げられる。この置換は、単一の残基、ポリペプチドに渡った複数の残基または、複数の連続する残基であり得る。配列番号３と６との間のキメラ、すなわち配列番号１３および１４が、野生型プロキネチシンとの比較において延長された収縮活性を示すことが実証されるため、置換されたプロキネチシンが、インビボでの強力な治療剤であり得ることが考えられる。
【００３０】
配列番号３または６と命名されたアミノ酸配列への付加は、「タグ」配列の付加を含むがこれに限定されず、これは、好ましくはＣ末端に加えられる。このようなタグ配列としては、例えば、エピトープタグ、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）など、または選別配列が挙げられる。このようなさらなる配列は、例えば、組換え発現を容易にするため、プロキネチシンの精製または特徴づけのために使用され得る。配列番号３または６と命名された配列に対する付加を含む例示的なポリペプチドは、Ｃ末端システインの後に６ＸＨｉｓタグを挿入することによって、実施例に記載されるように調製される活性プロキネチシンである。
【００３１】
配列番号３または６と命名されたアミノ酸の欠失としては、図１に示される高い保存性の活性ポリペプチドではないＣ末端の１つ以上の残基の欠失が挙げられるが、これに限定されない。欠失された配列は、必要に応じて、前記のようにタグ配列によって置換され得る。
【００３２】
配列番号３または６と命名されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する化学的修飾および酵素的修飾としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：アルキル基、アシル基またはアミノ基による水素の置換；適切なアルキル部分またはアリール部分とのカルボキシル基のエステル化；エーテル誘導体を形成するヒドロキシル基のアルキル化；セリン残基、スレオニン残基またはチロシン残基のリン酸化または脱リン酸化；あるいはＮ結合もしくはＯ結合グリコシル化。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、分子が、その自然環境においてどのように発見されたものからヒトの手助けによって変化されることを示す。好ましくは、「単離された」プロキネチシンポリペプチドは、「実質的に精製された」分子であり得、これは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％、自然に関連する細胞の成分を含まない。単離されたポリペプチドは、任意の形態（例えば、緩衝溶液、懸濁物、凍結乾燥した粉末中）であり得、異種細胞において組み換え的に発現されるか、レセプターに結合されるか、または固体支持に付着される。
【００３４】
本発明は、胃腸の平滑筋収縮を刺激する単離ポリペプチドを提供する。１つの実施形態において、このポリペプチドは、ヒトプロキネチシン１（配列番号３）の配列に少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号３のＮ末端の６個のアミノ酸、配列番号３の１０個の保存されたシステイン残基、および配列番号３の０〜９個の９つのＣ末端アミノ酸を含む。従って、このコードされるポリペプチドは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％同一性を有し得、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％以上の同一性を含む。例示的なポリペプチドは、配列番号３と命名されたアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸１〜７７を含む。
【００３５】
１つの実施形態において、単離されたポリペプチドは、アミノ酸配列ＮＮＦＧＮＧ］ＲＱＥＲＲＫＲＫＲＳＫＲＫＫＥ（配列番号７）を含まない。別の実施形態において、単離されたポリペプチドは、アミノ酸配列ＳＨＶＡＮＧＲＱＥＲＲＲＡＫＲＲＫＲＫＫＥ（配列番号８）を含まない。
【００３６】
別の実施形態において、このポリペプチドは、ヒトプロキネチシン２（配列番号６）の配列に少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号６のＮ末端６個のアミノ酸、配列番号６の１０個の保存されたシステイン残基、および配列番号６の４個のＣ末端アミノ酸の０〜４を含む。従って、コードされるポリペプチドは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％の同一性を有し得、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％以上の同一性を含む。例示的なポリペプチドは、配列番号６と呼ばれるアミノ酸配列またはこれらのアミノ酸１〜７７を含む。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、２つの分子に関する用語「％同一性」は、２つの配列の整列された部分間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数をいうことを意図され、最適化された操作アライメントまたはコンピュータアライメント（例えば、ＢＬＡＳＴ  ２．０アライメント（Ｔａｔｕｓｏｖａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）））を用いて全体の配列を比較することによって決定されるような、整列された残基の総数のパーセンテージとして発現される。
【００３８】
特定の適用について、本明細書中で開示されるようなスクリーニング方法において、プロキネチシンポリペプチドは、検出可能な部分（例えば、放射線標識、蛍光色素、強磁性体の物質、発光タグまたは検出可能な結合剤（例えば、ビオチン））を用いて標識され得る。他の適切な標識化部分は、当該分野において周知である。
【００３９】
本発明はまた、組換えプロキネチシンポリペプチドを発現するために宿主細胞を培養し、そしてタンパク質の凝集を最小化する条件下でポリペプチドを再折り畳みすることによって（以下に記載される）、ＧＩ平滑筋収縮を刺激し得る、単離されたプロキネチシンポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００４０】
複数のシステイン残基を含むポリペプチドの組替え発現は、しばしば分子間および分子内のジスルフィド結合の不正確な形成を生じ、これは、不活性の、凝集された細菌のタンパク質の産生を導く。本明細書中で開示されるように、これらの問題は、発現されるポリペプチドの再折り畳みの間、タンパク質の凝集を最小化する条件を用いて克服され得る。タンパク質の凝集を最小化する例示的な条件は、実施例に記載され、そして１つ以上の以下の再折り畳みの条件を含むことにより、組換えタンパク質を調製するための従来の条件とは異なる：１）タンパク質濃度を低く保つ工程（例えば、約１００μｇ／ｍｌ）；２）変性剤を除くためにペプチドを希釈するよりもむしろ透析する工程；３）緩衝液から酸化剤を除く工程；４）全ての緩衝液中の尿素の高い濃度を維持する工程；５）緩衝液中のグリセロールの高い濃度を維持する工程（例えば、少なくとも約１０％）；ならびに６）ペプチドおよび緩衝液を低い温度に保つ工程（例えば、約４℃）。これらの条件において、低いタンパク質濃度（すなわち、約２５０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは２００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、もしくは５０μｇ／ｍｌ未満）および高い尿素濃度（例えば、少なくとも約１．５Ｍ（例えば、約２Ｍ、４Ｍ、６Ｍ、８Ｍ、より高い）が、活性プロキネチシンの首尾よい再折り畳みにおいて最も重要な因子であることが企図される。
【００４１】
本明細書中で記載される条件と同じまたは類似の条件が、複数のシステインを含む他のポリペプチドを組換え的に発現および再折り畳みするために用いられ得、生物学的に活性なポリペプチドを単離するためにｄｉｃｋｋｏｐｆ、コリパーゼ、ＭＩＴ−１およびＢｖ８を含むことが、予想される。
【００４２】
ＧＩ平滑筋収縮を刺激し得る単離プロキネチシンポリペプチドを調製するための好ましい方法において、プロキネチシンポリペプチドは、タグ（例えば、６ＸＨｉｓタグ）を含む融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合物として）として細菌において組み換え的に発現され、そして親和性単離（例えば、ニッケルカラム上で）によって部分的に精製される。次いで、融合ポリペプチドは、異種タンパク質（例えば、ＧＳＴとプロキネチシンとの間のプロテアーゼ因子Ｘａ切断を用いて）、およびタンパク質の凝集を最小化する上記の条件下で再折り畳みされるプロキネチシンポリペプチドを除くために切断される。より高度に精製されたポリペプチドを得るために、このポリペプチドは、さらにカラムクロマトグラフィー（例えば、逆相ＨＰＬＣ）によって精製され得る。当業者は、活性プロキネチシンポリペプチドを組み換え的に発現、再折り畳みおよび精製するためのこれらの好ましい方法に対する改変が、容易に決定され得る（例えば、代替の異種の配列、切断可能な配列、タグ、宿主細胞および緩衝液の条件を用いて）ことを認識する。
【００４３】
あるいは、単離されたプロキネチシンポリペプチドは、生化学的手順によって調製され得る。本明細書中で開示されるように、プロキネチシン１および２が、種々のヒト組織において発現される（実施例、および特に図２を参照のこと）。それ故、単離されたプロキネチシンポリペプチドは、膜画分化、クロマトグラフィー、電気泳動およびリガンド親和性方法を含む当該分野において慣用的に使用される生化学的手順によってか、または本明細書粒に記載されるプロキネチシン抗体を用いる免疫親和性方法を用いて、これらのポリペプチドを通常発現する組織または細胞から単離され得る。生化学的単離後、不活性プロキネチシンは、活性を回復する上記の方法によって再折り畳みされ得る。
【００４４】
同様に、単離されたプロキネチシンポリペプチドは、当該分野において公知の化学合成手順によって調製され得る。化学合成後、不活性なプロキネチシンは、活性を回復する本明細書中に記載される方法によって再折り畳みされ得る。
【００４５】
その機能的活性、選択性、安定性またはバイオアベイラビリティーを最適化するように、所望される場合、化学的に合成されたポリペプチドは、Ｄ−立体異性体、天然に存在しないアミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を含むように改変され得る。改変されたアミノ酸およびそれらの使用の例が、Ｓａｗｙｅｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９５）、ならびにＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）に示される。特定の適用について、１つ以上の検出可能に標識されたアミノ酸（例えば、放射線標識されたアミノ酸または蛍光標識されたアミノ酸）を、化学合成されたポリペプチドまたはペプチドに組み込むこともまた有用であり得る。
【００４６】
本発明はまた、胃腸の（ＧＩ）平滑筋収縮を刺激し得る（必ずしも必要ではない）配列番号３または６と呼ばれるアミノ酸配列の少なくとも１０個連続するアミノ酸を含むか、またはそれからなる単離されたペプチドを提供する。このような単離されたペプチドは、例えば、本発明のプロキネチシン抗体を調製および精製する際に、有用である。このようなペプチドはまた、プロキネチシンレセプターを介するシグナル伝達をブロックするアンタゴニストとして作用し得、従って、治療的方法およびスクリーニング方法において用いられ得る。従って、単離されたプロキネチシンペプチドは、配列番号３または６の少なくとも１２、１５、２０，２５以上連続するアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、８１または８６あるいはそれ以下の連続するアミノ酸を含む。
【００４７】
１つの実施形態において、単離されたプロキネチシンペプチドは、配列番号３の６および４８のアミノ酸残基内に由来する少なくとも１０個連続する残基を含むか、またはそれからなる。別の実施形態において、単離されたプロキネチシンペプチドは、配列番号６の６および４８のアミノ酸残基内に由来する少なくとも１０個連続する残基を含むか、またはそれからなる。
【００４８】
配列番号３または６の少なくとも１０個連続するアミノ酸を含む単離されたペプチドは、免疫原性であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「免疫原性」は、プロキネチシン特異的抗体を誘導し得るか、またはプロキネチシンに結合するためのプロキネチシン特異的抗体と競合し得るかのいずれかのペプチドをいう。免疫原性である傾向があるペプチドは、当該分野において公知のおよび例えば、ＩｒｎａｔｅｎらによるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：９４９−９５５（１９９８）、およびＳａｖｏｉｅら、Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．１９９９：１８２−１８９（１９９９）に記載される方法およびアルゴリズムを用いて予想され得る。本発明のペプチドの免疫原性は、当該分野において公知の方法によって確認され得る。
【００４９】
本発明の単離されたプロキネチシンポリペプチドおよびペプチドは、その免疫原性を増強する標準的な速結技術を用いて、キャリア（例えば、ＫＬＨ、血清アルブミン、破傷風トキソイドなど）に必要に応じて結合体化され得る。さらに、またはあるいは、単離されたポリペプチドおよびペプチドは、当該分野において公知のアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）を用いて処方され得る。
【００５０】
少なくとも１０個連続する残基の単離されたプロキネチシンペプチドは、化学的合成、または上記のように調製されたより長いペプチドの化学的消化もしくは酵素的消化によって、都合よく調製され得る。少なくとも１０個連続する残基の単離されたプロキネチシンペプチドもまた、組み換え的（例えば、タンパク質タグに融合される）に調製され得る。当業者は、そのサイズ、配列および意図される適用に依存して、単離されたプロキネチシンペプチドを調製する適切な方法を決定し得る。
【００５１】
本発明はまた、ＧＩ平滑筋収縮を刺激し得るプロキネチシンポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、種々のスクリーニング適用、治療的適用および診断的適用に適切である。例えば、本発明の核酸分子は、インビトロで発現され得、そしてコードされるプロキネチシンポリペプチドが、単離され得る。本発明の核酸分子はまた、患者における正常なプロキネチシン活性を回復するためにインビボで発現し得るか、またはこれらを必要とする患者におけるプロキネチシンの発現をブロックするアンチセンス配向で発現され得る。さらに、本発明の核酸分子は、他の種由来のプロキネチシンをコードする核酸分子を同定および単離するか、または構造的に関連する分子を同定するプローブまたはプライマーとして使用され得る。このようなプローブおよびプライマーはまた、ヒト組織におけるプロキネチシンの正常な発現および異常な発現を測定するために診断的に有用であり、従って、変更されたプロキネチシン発現に関連する条件に対する感受性を予想する。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された核酸分子」は、核酸分子が、自然環境において発見されるものから人の手によって、変更されることを意味することが意図される。例えば、単離された核酸分子は、外因性の核酸配列に作動可能に連結される分子であり得る。単離された核酸分子はまた、その通常隣接する核酸配列のいくつかまたは全てから除かれる分子であり得る。
【００５３】
単離された分子は、あるいは、またはさらに「実質的に純粋な」分子であり得る。この場合、この分子は、細胞成分の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が無く、ここでこれは天然に関連する。単離された核酸分子は、任意の形態（例えば、緩衝溶液中、懸濁物、凍結乾燥粉末、個体支持（例えば、ＤＮＡアレイの構成成分として）に付着される、または細胞中）であり得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖であり得、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡに対応し得、そしてセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか、または両方を示し得る、天然または合成起源のポリヌクレオチドをいう。
【００５５】
用語「核酸分子」は、１つ以上の非天然ヌクレオチド（例えば、塩基、糖、またはリン酸部分への改変を有するヌクレオチド、または１つ以上の非天然の連結（例えば、ホスホチオエート連結）を有するヌクレオチド）を含む核酸分子を含むことが意図される。このような改変は、特にハイブリダイゼーションの適用において使用される場合、核酸分子の安定性を増加するのに有利であり得る。
【００５６】
さらに、用語「核酸分子」とは、検出可能な部分（例えば、放射標識、蛍光色素、強磁性物質、発光性タグまたはビオチンのような検出可能な結合因子）を含むように修飾された核酸分子を含有することを意図する。このような部分を含有する核酸分子は、プロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）核酸分子の存在または発現を検出するためのプローブとして有用である。
【００５７】
ＧＩ平滑筋収縮を刺激し得るプロキネチシンポリペプチドは、上記に記載されている。従って、そのようなポリペプチドをコードする単離された核酸分子を調製することは、当業者にとって慣用的である。ＧＩ平滑筋収縮を刺激し得るプロキネチシンポリペプチドをコードする、例示的に単離された核酸分子は、以下を含むか、または以下から構成される：ａ）配列番号１もしくは配列番号４で示されるヌクレオチド配列；ｂ）配列番号３もしくは配列番号６をコードする配列番号１もしくは配列番号４で示されるヌクレオチド配列の一部（すなわち、配列番号１で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５５〜３７０、および配列番号４で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１０〜３３４）；ｃ）配列番号３もしくは配列番号６の活性な改変もしくは活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；およびｄ）ａ）、ｂ）もしくはｃ）のいずれかに関して縮重する配列。
【００５８】
１つの実施形態において、単離された核酸分子は、アミノ酸配列ＮＮＦＧＮＧＲＱＥＲＲＫＲＫＲＳＫＲＫＫＥ（配列番号７）をコードしない。別の実施形態において、単離された核酸分子は、アミノ酸配列ＳＨＶＡＮＧＲＱＥＲＲＲＡＫＲＲＫＲＫＫＥ（配列番号８）をコードしない。なお別の実施形態において、プロキネチシンポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、図１Ａおよび図１Ｂに示されるアミノ酸配列の下線を引かれた部分（ＭＲＧＡＴＲＶＳＩＭＬＬＬＶＴＶＳＤＣ（配列番号９）およびＭＲＳＬＣＣＡＰＬＬＬＬＬＬＬＰＬＬＬＴＰＰＡＧＤＡ（配列番号１０））をコードする核酸分子のような天然に存在するシグナルポリペプチドを除外する。
【００５９】
特定の実施形態において、プロキネチシンポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、一般に入手可能なデータベースに編集される（ｃｏｍｐｉｌｅ）配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ２７７３４９、ＡＡ８８３７６０、ＡＱ４２６３８６、ＡＣ０６８５１９、ＡＣ０２６９７３、ＡＬ３５８２１５およびＡＬ３９０７９７またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１８２０６６、ＡＦ１８２０６４、ＡＦ１８２０６９およびＡＦ１８２０６５を有するアミノ酸配列をコードする配列）のゲノムフラグメントＥＳＴならびにｃＤＮＡのまさにその配列を有する核酸分子を特に除外する。
【００６０】
１つの実施形態において、プロキネチシンポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、配列番号３および配列番号６をコードしない配列を含むＧｅｎＢａｎｋデータベース中に存在する哺乳動物の配列（例えば、第１染色体もしくは第３染色体上に存在する、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、イントロンまたは他のエキソンをコードする核酸分子）を除く。
【００６１】
本発明はさらに、ＧＩ平滑筋収縮を刺激し得るプロキネチシンポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し、ここでこの核酸分子は、遺伝子発現のプロモーターに作動可能に連結される。本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、プロモーターが鋳型として核酸分子を使用してＲＮＡの転写を指示するような様式で、核酸分子が内因性のプロモーター、または異種性のプロモーターのいずれかに関して位置付けられることを意味することを意図する。
【００６２】
核酸分子を異種性のプロモーターに作動可能に連結するための方法は、当該分野において周知であり、例えば、核酸を所望のプロモーターを含むベクター中にクローニングすること、またはＰＣＲを使用してプロモーターを核酸配列に付けることが挙げられる。ＲＮＡ転写のプロモーターに作動可能に連結される核酸分子は、所望の宿主細胞またはインビトロの転写−翻訳系において、プロキネチシンの転写物およびポリペプチドを発現させるために使用され得る。
【００６３】
本発明の核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターの選択は、意図される用途に依存し、そして当業者によって決定され得る。例えば、特定の遺伝子産物が特定の宿主細胞に対して有害であり得る場合、遺伝子発現が作動または停止され得るように本発明の核酸分子を、調節されたプロモーターに連結することが所望され得る。あるいは、弱いかまたは強いかのいずれかの構成的なプロモーターによって作動される発現を有することが好まれ得る。哺乳動物細胞系に対して適した例示的なプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターが挙げられる。細菌細胞系に対して適した例示的なプロモーターとしては、例えば、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ｌａｃおよびｔｒｐプロモーターが挙げられる。
【００６４】
本発明はさらに、プロキネチシンポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含むベクターを提供する。例示的なベクターとしては、ウイルス（例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルスまたはレトロウイルス）に由来するベクター、ならびに細菌に由来するベクター、または細菌の配列および他の生物からの配列の組み合わせ（例えば、コスミドまたはプラスミド）が挙げられる。本発明のベクターは、一般的に、企図される宿主細胞に適合性の複製起点；転写終結およびＲＮＡプロセシングのシグナル；企図される宿主細胞に適合性の１つ以上の選択マーカー；ならびに１つ以上の多重クローニング部位のような要素を含む。必要に応じて、このベクターはさらに、コードされたポリペプチドの発現および精製を容易にする、タグ配列（例えば、ＧＳＴタグ）、および／またはプロテアーゼ切断部位（例えば、Ｘａ因子部位）をコードする配列を含有する。
【００６５】
ベクター中に含むべき特定の要素の選択は、企図される宿主細胞；挿入物サイズ；挿入された配列の発現が所望されるか否か；所望されるコピー数のベクター；所望される選択系などといった因子に依存する。異なる用途に対する宿主細胞とベクターとの間の適合性を確実にすることに関わる因子は、当該分野において周知である。
【００６６】
ベクターがコードされるポリペプチドの組換え発現のために使用されるような用途において、単離された核酸分子は、一般的に、上記に記載されるように、ベクターまたは挿入された核酸分子内に存在され得る、遺伝子発現のプロモーターに作動可能に連結される。細菌細胞における融合タンパク質の発現のために適切な例示的なベクターは、ｐＧＥＸ−３Ｘベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。
【００６７】
プロキネチシンポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含有する細胞もまた、提供される。単離された核酸分子は、一般的に、ベクター中に含まれる。単離された核酸分子は、エピソーム的に維持され得るか、または宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。
【００６８】
本発明の細胞は、例えば、単離された核酸分子の伸長、サブクローニングまたは改変のような分子生物学の用途のために使用され得る。このような用途において、細菌細胞（例えば、実験室株のＥ．ｃｏｌｉ）は有用であり、そしてコードされるポリペプチドの発現は要求されない。
【００６９】
本発明の細胞はまた、コードされるポリペプチドを組換え的に発現および単離するために有利に使用され得る。このような用途のために、以下が挙げられる：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、酵母細胞（例えば、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、および脊椎動物細胞（例えば、哺乳動物の初代細胞および樹立された細胞株）；ならびに両生類細胞（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓの胚および卵母細胞）。プロキネチシンポリペプチドを組換え的に発現するために適した例示的な細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞である。
【００７０】
本発明はさらに、配列番号１もしくは配列番号４（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号６をコードする配列番号１もしくは配列番号４の一部分）に由来するか、またはそれらの相補体に由来する、少なくとも２０個連続するヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。従って、本発明のポリヌクレオチドは、プロキネチシンポリペプチドをコードする核酸分子を検出または単離するための配列決定プライマー、ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な長さであり、そしてまた、プロキネチシンの発現を阻害するための治療的アンチセンス試薬として有用である。本発明のポリヌクレオチドは、必要ではないが、ＧＩ平滑筋収縮を刺激し得るプロキネチシンポリペプチドをコードし得る。当業者は、特定の用途のための本発明のポリヌクレオチドの適切な長さおよび配列を決定し得る。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、参照配列から少なくとも２０個連続するヌクレオチドを含み、必要ではないが、機能的ポリペプチドをコードし得る核酸分子をいう。従って、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号４由来か、あるいはそれらの相補体由来の、少なくとも、２０個、２２個または２５個連続するヌクレオチド、例えば、少なくとも、または多くとも、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、もしくは３００個連続するヌクレオチドを含有し得る。本発明のポリヌクレオチドは、一般に入手可能なデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ２７７３４９、ＡＡ８８３７６０、ＡＱ４２６３８６、ＡＣ０６８５１９、ＡＣ０２６９７３、ＡＬ３５８２１５、およびＡＬ３９０７９７によって示される配列、またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１８２０６６、ＡＦ１８２０６４、ＡＦ１８２０６９およびＡＦ１８２０６５を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む）に存在するＥＳＴのまさにその配列から構成されない。
【００７２】
特定の用途のために（例えば、サンプル中のプロキネチシンの発現を検出するために）、プロキネチシンをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズする、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子を使用することが所望される。用語「特異的にハイブリダイズする」とは、以下に記載されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、プロキネチシンをコードする核酸分子に対してハイブリダイズし、同一の条件下で、プロキネチシンをコードしない核酸分子（例えば、プロキネチシンと同一の短い領域を偶然に含む無関係な分子）と実質的な程度ハイブリダイズしない核酸分子の能力をいう。従って、「特異的にハイブリダイズする」核酸分子とは、十分な長さの核酸分子であり、そして組織（ｔｉｓｓｕｅ）ブロットおよびノザンブロットのような発現分析における使用に対してプロキネチシンを十分に識別する配列を含む（図２を参照のこと）。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」とは、フィルターに結合した核酸分子を、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳを含有する溶液中の核酸分子にハイブリダイゼーションし、続いて６５℃で３０分間０．１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳで２回フィルターを洗浄することと等価な条件をいう。上記に記載されるストリンジェントな条件に等価な条件は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）中に記載される。
【００７４】
本発明はさらに、単一の容器または別々の容器のいずれかに一緒に包装された本発明の一組のポリヌクレオチドを含有するキットを提供する。一組のポリヌクレオチドは、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の用途での使用のために適切である。従って、この一組のポリヌクレオチドは、プロキネチシンをコードする核酸分子の正常または異常な発現を検出または定量化するために使用され得る。この一組のポリヌクレオチドはまた、配列決定、サブクローニングのためか、または配列改変体を調製するために、プロキネチシンまたはその任意の一部分をコードする核酸分子を増幅するために使用され得る。このキットはさらに、ＰＣＲの用途における一組のポリヌクレオチド、またはこのような用途に対して適切な溶液および緩衝液の使用のための書面の使用説明書を含み得る。
【００７５】
本発明の単離されたプロキネチシン核酸分子は、当該分野において公知の方法によって調製され得る。単離されたプロキネチシン核酸分子を調製するための例示的な方法は、プロキネチシンに特異的なプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する核酸分子の増幅に関わる。ＰＣＲを使用して、任意の所望される境界（ｂｏｕｎｄａｒｙ）を有するプロキネチシン核酸分子が、単一の細胞由来のようなほんのわずかなＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子から開始して指数関数的に増幅され得る。縮重したプライマーを使用する他の種における所定の核酸分子のホモログを単離する方法を包含するＰＣＲ法は、当該分野において周知である。
【００７６】
あるいは、単離されたプロキネチシン核酸分子は、検出可能なプロキネチシン核酸分子または抗体を有する、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまたは発現ライブラリーのような、ライブラリーをスクリーニングすることによって調製され得る。ヒトのライブラリー、および多種多様な哺乳動物種由来のライブラリーは、市販であるか、または目的の種もしくは細胞から作製され得る。プロキネチシン核酸分子を含有すると同定されたライブラリークローンは、慣用的な方法によって、単離、サブクローニングまたは配列決定され得る。
【００７７】
さらに、単離されたプロキネチシン核酸分子は、直接的な合成方法によって調製され得る。例えば、一本鎖核酸分子は、当該分野において公知の自動化された合成方法によって、１つの小片またはいくつかの小片に化学的に合成され得る。相補鎖は、同様に１つ以上の小片に合成され得、そして二本鎖分子が相補鎖をアニーリングすることによって作製され得る。直接的な合成は、比較的短い分子（例えば、プローブおよびプライマー）を作製するため、そしてまた、改変されたヌクレオチドまたは連結を含有する核酸分子を作製するために特に有利である。
【００７８】
本発明はまた、プロキネチシンポリペプチドまたはプロキネチシンペプチドに対して特異的な抗体（例えば、配列番号３または配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的な抗体）を提供する。配列番号３または配列番号６の少なくとも１０個連続するアミノ酸を含有する、単離された免疫原性のペプチドに対して特異的な抗体もさらに提供される。
【００７９】
本発明の抗体は、例えば、研究および診断的適用におけるプロキネチシンの発現を検出するために使用され得る。このような抗体はまた、哺乳動物の発現ライブラリー中に存在するプロキネチシンポリペプチドをコードする核酸分子を同定するため、および免疫親和性法によってプロキネチシンポリペプチドを精製するために有用である。さらに、このような抗体は、ＧＩ平滑筋収縮を阻害することが所望される適用におけるような、プロキネチシンに結合して、そしてプロキネチシンの活性をブロックするために治療的に投与され得る。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１×１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１×１０７Ｍ−１、さらに好ましくは少なくとも１×１０９Ｍ−１で、プロキネチシンペプチドまたはプロキネチシンポリペプチドに対して特異的な結合活性を有する分子を含むことが意図される。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびにそのような抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＦｄフラグメントおよびＦｖフラグメントなど）を含む。さらに、用語「抗体」は、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体、ＣＤＲ移植抗体およびヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントを含む、天然に存在しない抗体を包含することを意図される。
【００８１】
ペプチド免疫原およびポリペプチド免疫原を使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む、抗体を調製および単離する方法は、当該分野において周知であり、そして例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）中に記載される。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得るか、組換え的に作製され得るか、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖から構成されるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって入手され得る。このような方法は、例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；およびＢｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）中に記載される。
【００８２】
本発明は、プロキネチシンレセプターリガンドを同定する方法を提供する。この方法は、プロキネチシンレセプターを含有する調製物を１つ以上の候補化合物と接触させること、およびレセプターに特異的に結合する候補化合物を同定することによって実施される。このような化合物は、プロキネチシンレセプターリガントとして特徴付けられる。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、用語「リガンド」は、プロキネチシンと同一または異なる部位で、プロキネチシンレセプターに結合する化合物を含む。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、用語「候補化合物」とは、任意の生物学的または化学的な化合物をいう。例えば、候補化合物は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、リピド、またはそれらのいずれかの組み合わせのような天然に存在する高分子であり得る。候補化合物はまた、このような高分子の部分的もしくは完全に合成的な誘導体、アナログもしくは模倣物、またはコンビナトリアル化学の方法によって調製された有機低分子であり得る。特定のアッセイの形式において所望される場合、候補化合物は、検出可能に標識化され得るか、または固体支持体に結合され得る。
【００８５】
単純な有機分子、複雑な有機分子、金属含有化合物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体などを含む化合物の巨大なライブラリーを調製するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｈｕｓｅの、米国特許第５，２６４，５６３号；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４２２−４２８（１９９８）；Ｔｉｅｔｚｅら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２：３６３−３７１（１９９８）；Ｓｏｆｉａ，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：７５−９４（１９９８）；Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１５：４８１−４９６（１９９５）；などに記載される。多数の天然化合物および合成化合物を含むライブラリーもまた、市販の供給源から入手し得る。
【００８６】
本発明の方法における試験のための異なる候補化合物の数は、この方法の適用に依存する。例えば、手で行うスクリーニング手順において、またはいくつかの予測されるリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストの中で効力を比較することが望まれる場合、１つまたは少数の候補化合物が有利である。しかしながら、候補化合物が多くなるほど、スクリーニングアッセイにおいて、所望の活性を有する化合物を同定する可能性が高くなることが理解される。さらに、多数の化合物は、自動化されたハイスループットのスクリーニングアッセイにおいて処理され得る。従って、「１つ以上の候補化合物」は、例えば、２つ以上、例えば５以上、１０以上、１５以上、２０以上、５０以上または１００以上あるいはそれより多くの異なる化合物、例えば、約１０３、１０５または１０７の異なる化合物であり得る。
【００８７】
プロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）レセプターリガンドを同定するための適切な調製物は、この調製物がＧＩ平滑筋組織上で発現されるプロキネチシンレセプターと類似の親和性および特異性を有するプロキネチシンに結合するための適切なコンフォメーションの、プロキネチシンレセプターを含む場合に限り、組織、細胞、細胞膜、または精製されたプロキネチシンレセプターを使用する。
【００８８】
１つの実施形態において、調製物は、腸管平滑筋調製物、例えば哺乳動物の回腸、胃底部の（ｆｕｎｄｉｃ）筋肉または近位結腸調製物、あるいはそれらの膜調製物である。適切な腸管平滑筋調製物は、本実施例に記載の方法により調製される、モルモット回腸調製物である。
【００８９】
別の実施形態において、調製物は、プロキネチシンレセプターを発現する細胞株かまたはその膜調製物である。プロキネチシンレセプターを発現する細胞株は、実施例に記載される競合結合アッセイのような、当該分野で公知の方法によって同定され得る。プロキネチシンレセプターを発現する例示的な細胞株は、黒色腫細胞株Ｍ２Ａ７である（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５００としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である）。プロキネチシンレセプターを発現する他の細胞株としては、Ｍ２黒色腫細胞（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５；３２５−３２７（１９９２））およびＲＣ−４Ｂ／Ｃ下垂体腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９０３）が挙げられる。
【００９０】
プロキネチシンレセプターを発現しない適切なコントロール細胞株は、ＨＥＫ２９３である（ＣＲＬ−１５７３としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である）。他のコントロール細胞としては、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−１、Ｌｔｋ−、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｃ６、ＮＳ１０ＹおよびＨＴ−２９細胞が挙げられる。
【００９１】
レセプターリガンドを同定するための適切なアッセイは、当該分野で公知である。このようなアッセイは、候補化合物のレセプター調製物への結合を直接決定する工程を包含し得る。プロキネチシンレセプターを含まない適切なコントロール調製物が利用可能である場合、直接的なアッセイが、適切である。このようなアッセイはまた、レセプター調製物への結合についてプロキネチシンポリペプチドと競合する候補化合物の能力を決定する工程を包含し得る。競合アッセイは、候補化合物を検出可能に標識化し、そして標識化されないプロキネチシンポリペプチドとこの化合物とを競合させるか、または検出可能に標識化されたプロキネチシンポリペプチドと標識化されない候補化合物とを競合させることによって実施され得る。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「検出可能に標識化された」とは、任意の分析用手段によって検出可能な部分での誘導またはこの部分との結合のことをいう。例示的な検出可能な部分は、放射性同位元素（例えば、１４Ｃ、１３１Ｉ、３２Ｐまたは３Ｈ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、グリーン蛍光タンパク質）、強磁性体、または発光物質である。このような部分を用いて有機化合物および無機化合物を検出可能に標識化する方法は、当該分野において周知である。
【００９３】
プロキネチシンレセプターリガンドを検出するために適切である例示的な競合結合アッセイが、以下の実施例に記載される。ハイスループットアッセイを含む他の適切なレセプター結合アッセイは、例えば、Ｍｅｌｌｅｎｔｉｎ−Ｍｉｃｅｌｏｔｔｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７２：Ｐ１８２−１９０（１９９９）；Ｚｕｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１１２２−１１１２７（１９９９）；およびＺｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８；１３４−１４２（１９９９）に記載される。
【００９４】
結合を検出するための他の適切なアッセイとして、例えば、シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）（ＳＰＡ）（Ａｌｏｕａｎｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：１３５−４１（２０００））、ＵＶまたは化学的架橋（Ｆａｎｃｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：２８−３３（２０００））、競合結合アッセイ（Ｙａｍａｍｕｒａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １：３９５−４１６（２０００））のような生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）、質量分析法（ＭＳ）（ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１２８９−１２９０（１９９９）およびＤｅｇｔｅｒｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１７３−１８２（２００１））、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）（Ｓｈｕｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１５３１−１５３４（１９９６）、Ｈａｊｄｕｋら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．４２：２３１５−２３１７（１９９９）、およびＣｈｅｎおよびＳｈａｐｉｒｏ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：６６９Ａ−６７５Ａ（１９９９））および蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）（Ｄｅｇｔｅｒｅｖら、上述、２００１）が挙げられる。適切な結合アッセイは、レセプター調製物の性質および純度ならびに候補化合物の数および性質に依存して選択され得る。
【００９５】
プロキネチシンレセプターリガンドであると決定された化合物は、それがプロキネチシンレセプターのアゴニストかまたはアンタゴニストかどうかを決定するために、さらに試験され得る。同様に、プロキネチシンレセプターリガンドであると決定された化合物は、その化合物がＧＩ平滑筋収縮能をポジティブに変調するかまたはネガティブに変調するかどうかを決定するために、本明細書中に記載されるアッセイのような当該分野で公知のインビトロまたはインビボアッセイを使用して、さらに試験され得る。
【００９６】
本発明はさらに、プロキネチシンレセプターアゴニストを同定する方法を提供する。この方法は、プロキネチシンレセプターを含有する調製物を１つ以上の候補化合物と接触させることにより実施され、プロキネチシンレセプターシグナルの生成を選択的に促進する化合物を同定する。このような化合物は、プロキネチシンレセプターアゴニストとして特徴付けられる。
【００９７】
本発明はまた、プロキネチシンレセプターアンタゴニストを同定する方法を提供する。この方法は、プロキネチシンレセプターを含有する調製物を、プロキネチシンの存在下で１つ以上の候補化合物と接触させることにより実施され、プロキネチシンレセプターシグナルの生成を選択的に阻害する化合物を同定する。このような化合物は、プロキネチシンレセプターアンタゴニストとして特徴付けられる。本発明の方法を使用して、配列番号：１６および１８として示されたプロキネチシン変異体は、プロキネチシンレセプターアンタゴニストであると同定された。
【００９８】
本発明の方法は、適切な濃度のプロキネチシンの存在下（例えば、プロキネチシンのＥＣ５０の１０倍以内）で、実施され得る。従って、プロキネチシンレセプターを介するシグナル伝達についてプロキネチシンと競合するアゴニスト、またはプロキネチシンのシグナル伝達活性を間接的に増強するアゴニストは、容易に同定され得る。同様に、プロキネチシンのプロキネチシンレセプターへの結合を阻害するアンタゴニスト、またはプロキネチシンのシグナル伝達活性を間接的に減少させるアンタゴニストもまた、同定され得る。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、用語「プロキネチシンレセプターアゴニスト」とは、プロキネチシンレセプターを介する正常なシグナル伝達を、選択的に活性化または増強させる分子のことをいう。本明細書中で使用される場合、用語「プロキネチシンレセプターアンタゴニスト」とは、プロキネチシンレセプターを介する正常なシグナル伝達を、選択的に阻害または減少させる化合物のことをいう。
【０１００】
治療適用のために、プロキネチシンレセプターアゴニストは好ましくは、約１０−７Ｍ未満、例えば１０−８Ｍ未満、そして好ましくは１０−９または１０−１０Ｍ未満のＥＣ５０を有し、そしてプロキネチシンレセプターアンタゴニストは、好ましくは約１０−７Ｍ未満、例えば１０−８Ｍ未満、そして好ましくは１０−９または１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する。しかしながら、化合物の安定性、選択性および毒性にも依存して、高いＥＣ５０を有するプロキネチシンレセプターアゴニスト、または高いＩＣ５０を有するプロキネチシンレセプターアンタゴニストはまた、治療上有用であり得る。
【０１０１】
本明細書中に記載される場合、内因性のプロキネチシンレセプターは、Ｇタンパク質共役レセプターである。プロキネチシンレセプターを介するシグナル伝達は、細胞内カルシウムイオン動員を促進し、これは、プロキネチシンレセプターが、Ｇαｑ含有Ｇタンパク質と通常結合していることを示唆する。従って、プロキネチシンレセプターを介するシグナル伝達は、細胞内カルシウムイオン動員を検出する、当該分野において公知の任意のアッセイによって検出され得る。このようなアッセイは、プロキネチシンの存在下または非存在下でにおいて、実施され得る。
【０１０２】
カルシウムイオン動員を検出するための適切な調製物は、腸管平滑筋調製物のような、プロキネチシンレセプターを発現する組織もしくは細胞株またはＭ２Ａ７細胞株であり得る。
【０１０３】
カルシウムイオン動員は、蛍光標識指示薬または放射性標識指示薬のような、検出可能に標識化されたＣａ２＋イオン指示薬をおよび適切な検出システムを使用して簡便に測定され得る。例示的なＣａ２＋イオン指示薬として、ＦＬＵＯ−３  ＡＭ、ＦＬＵＯ−４  ＡＭ、ＦＵＲＡ−２、ＩＮＤＯ−１、ＦＵＲＡ  ＲＥＤ、ＣＡＬＣＩＵＭ  ＧＲＥＥＮ、ＣＡＬＣＩＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ、ＣＡＬＣＩＵＭ  ＣＲＩＭＳＯＮ、ＢＴＣおよびＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ  ＢＡＰＴＡが挙げられる（例えば、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３４４０−３４５０（１９８５）；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１４：１２５−１３３、Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｌａｍｂｅｒｔ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９９）；Ｍｉｙａｗａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２１３５−２１４０（１９９９）；およびＣｏｗａｒｄら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：２４２−２４８（１９９９）を参照のこと）。カルシウムイオン動員をモニタリングするための適切な検出システムは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓから入手可能なＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）システムである。
【０１０４】
細胞表面レセプターに対するＧαサブユニットの特異性は、ＧαのＣ末端の５つのアミノ酸により決定される。従って、種々のシグナル伝達経路は、既知のＧαのＣ末端の５残基を含有するかまたはＡＤＰ−グルコースレセプターと結合すると予測されるＧαキメラ（例えばＧαｑまたはＧα１６のような乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）のＧα）を組換え発現することによって、プロキネチシンレセプターによるＧタンパク質共役シグナルの変換を決定するためにアッセイされ得、タンパク質の残部は、アッセイされるシグナル伝達経路と結合するＧαに対応する（例えば、ｃＡＭＰ生成の増加をアッセイするためのＧαｓ、または細胞内Ｃａ２＋動員をアッセイするためのＧαｑ）。Ｇαサブユニットの既知の配列に基づいて、キメラＧαをコードする核酸分子が、構築され得、そして当該分野で公知の方法によって発現され得、これらは例えば、Ｃｏｎｋｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：２７４−２７６（１９９３）、およびＫｏｍａｔｓｕｚａｋｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０６：１６５−１７０（１９９５）に記載される。
【０１０５】
従って、アッセイシステムにおいて内因的にまたは組換えにより発現されるＧαサブユニットに依存しては、決定され得るプロキネチシンレセプターシグナルとして、カルシウムイオン動員；アラキドン酸、アセチルコリン、ジアシルグリセロール、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、イノシトールリン酸およびそのイオンの産生または遊離の増加または減少；細胞膜電位の変化；ＧＴＰ加水分解；アミノ酸の流入または流出；細胞内タンパク質のリン酸化の増加または減少；および内因性遺伝子の転写の活性化または上記に記載される任意のセカンドメッセンジャー経路の下流のプロモーター−レポーター構築物の活性化が挙げられる。
【０１０６】
Ｇタンパク質共役レセプターのアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を検出するための適切なアッセイとして、ハイスループットシグナル伝達アッセイが挙げられ、これは当該分野で周知であり、かつ概観され、例えば、総説として、例えば、Ｔａｔｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：４２６−４３０（１９９６）がある。
【０１０７】
プロキネチシンレセプターに選択的に結合する化合物またはプロキネチシンレセプターを介するシグナル伝達を変調する化合物（例えば、リガンド、アゴニストおよびアンタゴニスト）を同定するためのアッセイ方法は、一般的にコントロールとの比較を包含する。「コントロール」の型の１つは、コントロールが候補化合物に曝露されないことを除いて、試験調製物と同様に処理される調製物である。別の型の「コントロール」は、コントロール調製物がレセプターを発現しないか、またはプロキネチシンに対して選択的に応答しないように改変されていることを除いて、試験調製物と類似する調製物である。このような状況の下、試験調製物の候補化合物に対する応答は、実質的に同一の反応条件の下で、コントロール調製物の同一の化合物に対する応答（または応答の欠如）と比較される。
【０１０８】
プロキネチシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストであると決定される化合物は、それがＧＩ平滑筋収縮能をポジティブに変調するかまたはネガティブに変調するかどうかを決定するために、本明細書中に記載されるアッセイのような当該分野で公知のインビトロまたはインビボアッセイを使用して、さらに試験され得る。
【０１０９】
本発明はまた、プロキネチシンリガンド、アゴニスト、アンタゴニストを同定するためのアッセイにおいて使用するための、適切な組成物を提供する。適切な組成物は、プロキネチシンレセプターおよびプロキネチシンポリペプチド（これらは必要に応じて検出可能に標識され得る）を含有する細胞または組織を含む。例示的な組成物は、回腸平滑筋調製物のようなＧＩ平滑筋調製物を含む。さらなる例示的な組成物は、Ｍ２Ａ７のような細胞株を含む。
【０１１０】
本明細書中に記載されるプロキネチシンポリペプチド、ならびに記載されるスクリーニング方法によって同定された、プロキネチシンリガンド、アゴニストおよびアンタゴニストは、潜在的な治療用の化合物であり、これらは、胃腸の異常な運動性に関連する状態を有する個体、あるいはプロキネチシンまたはそのレセプターの改変された発現または活性に関連する他の状態を有する個体に投与され得る。本発明の化合物は、処置される状態；個体の体重、性、年齢および健康状態；特定の化合物の生物学的性質、生体活性、バイオアベイラビリティ、および副作用に適切な様式および適切な量で；併用処置レジメンと両立し得る様式で処方および投与され得る。ヒトにおける特定の治療適用のための適切な量および処方は、本明細書中に記載されるインビトロでの結合アッセイおよびシグナル伝達アッセイにおける化合物の活性に基づいてか、または特定の障害について認められている動物モデルから推定され得る。
【０１１１】
治療用化合物の総量は、単回の用量としてかまたは比較的短期間にわたる注入によって投与され得、あるいはより長い期間にわたる複数回投与の用量を用いて投与され得る。さらに、この化合物は、徐放性（ｓｌｏｗ−ｒｅｌｅａｓｅ）マトリクスで投与され得、これは全身的な送達のために標的組織部位またはその近くに移植され得る。治療用化合物の制御された放出のために有用な検討されるマトリクスは、当該分野で周知であり、そして例えば、ＤｅｐｏＦｏａｍ（登録商標）、生体高分子、マイクロポンプなどの基質が挙げられる。
【０１１２】
治療用化合物は、以下のような当該分野で公知の経路、例えば：静脈内に、筋肉内に、皮下に、眼窩内に、関節内に、腹腔内に、槽内に（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌｌｙ）、関節腔内に、大脳内に、経口的に、腟内に、直腸内に、局所的に、鼻腔内にまたは経皮的に、哺乳動物に投与され得る。ヒトに投与するための好ましい経路は、経口投与および静脈内投与であり、経口経路は特に好ましい。
【０１１３】
好ましくは、治療用化合物は、化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物として哺乳動物に投与される。薬学的に受容可能なキャリアの選択は、化合物の投与経路ならびにその特定の物理学的性質および化学的性質に依存する。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野において周知であり、そして生理学的に緩衝化した生理的食塩水のような無菌の水性溶媒、およびグリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステルのような他の溶媒またはビヒクルが挙げられる。薬学的に受容可能なキャリアは、さらに、化合物を安定化し、化合物の溶解性を増加させ、または化合物の吸収を増大させる、生理学的に受容可能な化合物を含む。このような、生理学的に受容可能な化合物としては、グルコース、ショ糖またはデキストランのような炭水化物；アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化薬；キレート剤；および低分子量のタンパク質が挙げられる。
【０１１４】
血液脳関門を通過するため、または細胞膜を透過するために、化合物および組成物を必要とする用途については、化合物の親油性を増加する処方物が、特に望ましい。例えば、本発明の化合物は、リポソームに取り込まれ得る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＩＩ巻、第２版（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ（１９９３））。リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、無毒で、生理学的に受容可能な、そして代謝可能な、比較的作製および投与の容易なキャリアである。
【０１１５】
ひとつの実施形態において、プロキネチシンポリペプチドまたはプロキネチシンアゴニストを含有する薬学的組成物は、胃腸運動を刺激するのに有効な量で哺乳動物に投与される。障害されたＧＩ運動は、過敏性腸症候群、糖尿病性胃不全麻痺、術後の腸閉塞、慢性便秘症、および胃腸の逆流疾患を含む種々の障害の共通する臨床的な症状であり、従って、本発明の組成物は、そのような障害の症状を回復させるのに使用され得る。
【０１１６】
別の実施形態において、プロキネチシンアンタゴニストを含有する薬学的組成物は、胃腸運動を阻害するのに有効な量で哺乳動物に投与される。過剰なＧＩ運動は、下痢に関連し、感染症、吸収不全性障害、炎症性腸障害、および腸癌の共通する症状である。従って、本発明の拮抗性の組成物は、そのような障害の症状を回復させるのに使用され得る。
【０１１７】
ラットの脳室へのＢｖ８またはＭＩＴ１の注射は、痛覚過敏を引き起こす（Ｍｏｌｌａｙら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７４：１８９−１９６（１９９９））。従って、プロキネチシンアンタゴニスト（例えば、プロキネチシン抗体、配列番号１６または１８を含有する変異ポリペプチド、および本明細書中に記載される方法によって決定される他の化合物）が、鎮痛剤（ペインキラー（ｐａｉｎ  ｋｉｌｌｅｒ））として作用するのに有効な量で哺乳動物に投与され得る。
【０１１８】
当業者は、本発明の薬学的組成物を投与するのに適切な他の条件を決定し得、そして治療の安全性および有効性をモニターし得る。
【０１１９】
好ましくは、本発明の薬学的組成物を投与される哺乳動物は、ヒトであるが、特定の適用に関しては、その動物は、代わりに獣医学的動物または研究用動物であり得る。例えば、前臨床試験において、本発明の方法は、ヒト疾患の確実なモデルとして役立つ動物（例えば、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ネコ、およびゲッ歯類（例えば、ラット、マウスおよびモルモット））を用いて実施され得る。当業者は、これらの動物が、目的のヒト疾患の適切なモデルとして役立つことを理解する。
【０１２０】
以下の実施例は、例示の目的であって、本発明を制限するものではないことが意図される。
【０１２１】
（実施例Ｉ）
（プロキネチシン１および２の同定、調製および特徴づけ）
この実施例は、ヒトプロキネチシン１および２、ならびにそれらの改変クローニング、組換え発現、精製および生物学的活性、を示す。
【０１２２】
（材料および方法）
（ＲＮＡブロット）
ポリＡ  ＲＮＡの規格化されたサンプルを、含有するヒト多重組織ＲＮＡブロットを、製造業者の説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に記載されるように使用した。無作為なプライマー標識プローブ（プロキネチシン１  ｃＤＮＡおよびプロキネチシン２  ｃＤＮＡのヌクレオチド１〜５５０および１〜１１７８）を用いてブロットをプローブし、シグナルを、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲフィルムに感光させることで可視化した。
【０１２３】
（組換えプロキネチシンの生成、再折り畳みおよび精製）
成熟プロキネチシンのコード配列を、原核細胞（ｐｒｏｋａｃｙｏｔｉｃ）発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にクローン化した。ＧＳＴ（グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ）ｔａｇの第Ｘａ因子プロテアーゼ消化部位と成熟プロキネチシンとの間の延長ヌクレオチドを、部位特異的変異誘発によって除去し、配列決定によって確認した。タンパク質精製を促進するために、６×Ｈｉｓ−ｔａｇを、Ｃ末端に付加し、その結果、融合タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し得た。
【０１２４】
融合タンパク質の生成方法は、以下のようである。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＢＬ２１）を、ＯＤ０．８まで増殖し、そして６００ｎＭのＩＰＴＧを用いて３７℃で２時間誘導した。次いで、その細胞をペレット状にし、洗浄し、そして緩衝液Ａ（６Ｍのグアニジン塩酸塩、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）で溶解した。融合タンパク質をＮｉ−ＮＴＡビーズに結合させ、次いで緩衝液Ｃ（８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．３）および緩衝液Ｄ（８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ５．９）で広範囲に洗浄した。融合タンパク質結合ビーズを第Ｘａ因子消化緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｎＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で平衡状態にした。第Ｘａ因子消化を、１０ｎｇ／μの融合タンパク質を用いて室温で一晩実施した。次いで、切断されたＧＳＴタグを緩衝液Ｄで洗い流した。次いで、成熟プロキネチシンを緩衝液Ｅ（８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ４．５）で溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。次いで、プールされた組換えプロキネチシンを以下のように再び折り畳んだ。タンパク質を緩衝液Ｅで１００μｇ／ｍｌまで希釈し、そして再生緩衝液（４Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０、１０％のグリセロール、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．３）に対して透析した。次いで、新しい再生緩衝液（２Ｍの尿素以外は同じ成分）を加え、そして少なくともあと１度再生緩衝液を換えて、あと４日間透析し続けた。次いで、再び折り畳まれたタンパク質をスピンカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）で脱塩し、レセプター結合アッセイまたはバイオアッセイによって分析した。最終的な精製を逆相ＨＰＬＣ（ＬＫＢ）で実施した。機能性タンパク質を０．０８％のトリフルオロ酢酸および１０〜５０％のアセトニトリル勾配で溶出した。このタンパク質の溶出を２０６ｎｍでモニターした。次いで、トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルを凍結乾燥によってエバポレートした。
【０１２５】
（質量分析法）
エレクトロスプレーイオン化質量分析を６．５Ｔ  ＨｉＲｅｓＥＳＩ  フーリエ変換質量分析器（ＩｏｎＳｐｅｃ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）で、前に記載したように実施した（Ｌｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：２０７７−２０８３（１９９４））。ＲＰ−ＨＰＬＣから溶出されたタンパク質を凍結乾燥し、そしてナノ純水（ｎａｎｏｐｕｒｅ  ｗａｔｅｒ）に溶解し、次いでメタノール−水−酢酸（４９．５％：４９．５％：１％（ｖ／ｖ／ｖ））で１ｎＭの濃度まで希釈した。１００μｌのサンプルを注入した。
【０１２６】
（単離された器官標本中の平滑筋収縮の測定）
モルモットをＣＯ２で安楽死させ、そして盲腸に対して約１０ｃｍ吻側の回腸切片（２〜３ｃｍ）を取り出した。その回腸をクレブスリンガー炭酸水素塩（ＫＲＢ）緩衝液（１２４ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＳＯ４、２６ｎＭのＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、および１０ｍＭのグルコース）できれいに洗浄し、ＫＲＢ緩衝液を含有する器官バスに縦方向に取りつけた。等長性収縮を強制置換トランスデューサーおよびポリグラフで前に記載したように測定した（Ｔｈｏｍａｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１：７７９−７８８（１９９３））。この回腸を１時間インキュベートし、次いで、ムスカリンアゴニスト、オキソトレモリン−Ｍの３回の試験投与を、その収縮が再現可能であり、十分な大きさであることを確実にするために加えた。その回腸を洗浄し、そして各試験投与間は５分おいておいた。その縦方向の底のストリップおよびジグザグ気管の調製物を前記（１５）のように調製した。単離された結腸（近位のおよび遠位の）をＳａｗｙｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８４：２６９−２７７（１９９８）に記載されるように調製した。大動脈および大腿動脈を成体ラットから取り出した。１０ｍｌのバスを大動脈および大腿動脈実験に使用した。張力を腸組織および気管調製物に対しては０．５ｇ、ならびに大動脈および大腿動脈に対しては２ｇの初期負荷でＧｒａｓｓポリグラフに記録した。
【０１２７】
（ヨウ素化）
プロキネチシン１をＦｒａｋｅｒおよびＳｐｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：８４９−８５７（１９７８）に記載されるようなヨウ素化法（ｉｏｄｏｇｅｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によってヨウ素化した。手短に言えば、再び折り畳まれたプロキネチシン１（７．５μｇ）を５０μＬの０．５Ｍ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中の５０μｇのヨウ素と共に、室温で１５分間、インキュベートした。その反応をヨード管から混合物を除去することによって停止させ、１ｍＭのＮａＩを含有する１００μＬのＰＢＳを含むミクロチューブ中に配置した。１ｍＭのＮａＩおよび０．１％のＢＳＡを含む１００μＬのＰＢＳを加えることに続いて、遊離ヨウ素をＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２に対するゲル濾過によって除去し、そして放射能をカウントした。全ての放射能が、回収された（回収率８０％）６．０μｇのプロキネチシン１に取り込まれると仮定すると、比放射能は、８１９ｃｐｍ／ｆｍｏｌまたは３７２Ｃｉ／ｍｏｌｅとして計算された。
【０１２８】
（レセプター結合）
膜を、バックグラウンド結合を減少するのに適用した差次的な遠心分離（８００ｇ、１０，０００ｇ、１００，０００ｇ、４℃、各２０分）のさらなる工程を除いて、Ｌｉら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：４４６−４５２（２０００）に記載されるようにモルモットの回腸から調製した。インキュベーションを室温で、０．１％のＢＳＡを含有する４ｍｌの緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中で実施した。飽和結合のために、１．５〜２００ｐＭの標識されたプロキネチシン１を使用した。非特異性結合を２０ｎＭの標識されていないプロキネチシン１の存在下で規定した。置換実験のために、標識されていないタンパク質を３ｍｌの総反応体積中で１時間、膜と共にプレインキュベートし、次いで１２５Ｉ−プロキネチシン１（２０ｐＭ）を加えた。その膜をさらに３時間、室温でインキュベートした。この結合混合物をＧＦ−Ｃガラスフィルターを通して濾過し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄した。フィルター上に保持された放射能をγカウンターでカウントした。このデータをＬＩＧＡＮＤプログラムで分析した。
【０１２９】
（結果）
（２つの哺乳動物ホモログ（カエル  Ｂｖ８およびヘビ  ＭＩＴ１）の同定および分析）
カエル  Ｂｖ８およびヘビ  ＭＩＴ１の哺乳動物ホモログを同定する試みにおいて、複数データベース（ＥＳＴおよびＨＧＴＳ）を、クエリーとしてこれらのタンパク質配列を用いてＢＬＡＳＴ２．１アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４００（１９９７））を使用して検索した。このＥＳＴデータベースの検索によって２つのヒトＥＳＴ配列（ａｉ２７７３４９およびａａ８８３７６０）の存在が明らかとなった。これらの２つのＥＳＴクローンの配列分析によって、ａａ８８３７６０が、１９アミノ酸のシグナルペプチドおよび８６アミノ酸の成熟タンパク質を有する推定タンパク質（Ｈｅｉｊｎｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））をコードすることが明らかとなった。クローンａｉ２７７３４９は、部分的なｃＤＮＡであることが明らかとなった。ＥＳＴクローンａｉ２７７３４９の全長配列は、鋳型としてヒトの脳のｃＤＮＡと５’ＲＡＣＥによってクローン化され、２７アミノ酸のシグナルペプチドおよび８１アミノ酸の成熟タンパク質を含有することが明らかとなった（図１）。これらのタンパク質をプロキネチシン１およびプロキネチシン２とそれぞれ名付けた（以下参照）。
【０１３０】
配列分析によって、プロキネチシン１および２が、約４４％のアミノ酸同一性を有し、１０個の保存されたシステインを含有することが明らかとなった。両方のプロキネチシンはカエル  Ｂｖ８およびヘビ  ＭＩＴ１と約４３％の同一性を示した。興味深いことに、第１のシステイン（ＡＶＩＴＧＡ）より前のＮ末端配列は、全ての種の間で完全に保存され（図１）、この領域の機能的な意義を示唆した。マウスのプロキネチシン１遺伝子の予備的な分析は、このＮ末端配列ＡＶＩＴＧが、システイン富化された配列が他のエキソン由来であるにも拘わらず、第１エキソンから誘導され、またシグナルペプチド配列を含有することを示す。
【０１３１】
（プロキネチシンは、種々の成体組織および胚性組織において発現される）
プロキネチシン発現の最初の調査のように、ヒトマスターブロット（ｍａｓｔｅｒｒ  ｂｌｏｔ）を、ヒトプロキネチシンｃＤＮＡのフラグメントを使用してプローブした。両方のプロキネチシンは種々の成体組織に広範囲に発現しており、プロキネチシン１は、プロキネチシン２と比較して一般的により高い発現レベルであった（図２Ａ、２Ｂ）。プロキネチシン２の発現は、プロキネチシン１の発現に匹敵するようであるにも拘わらず、例外がＧＩ路、肝臓および脾臓中で見出された。最も高いレベルのプロキネチシン１発現は、精巣および胎盤中で見出された。ヒト胎児組織の間では、その全てが同様のレベルの発現を示し、やはりプロキネチシン１の発現レベルは、プロキネチシン２よりも高かった。
【０１３２】
ヒト脳におけるプロキネチシンの発現を、ノーザンブロット分析によってさらに試験した。図２Ｄは、プロキネチシン１  ｍＲＮＡサイズが、約１．５ｋｂであり、被殻、視床、側頭葉、および脳梁において最も高く発現することを示した。ヒト脳におけるプロキネチシン２発現は、検出不可能であった（データ示さず）。
【０１３３】
（ヒトプロキネチシンの生成、再折り畳みおよび精製）
Ｎ末端配列が完全に保存されていたので（図１）、確証的なＮ末端残基を伴う組換えタンパク質を、まずＧＳＴ融合タンパク質として生成し、続いてプロテアーゼ第Ｘａ因子で消化して、ＧＳＴタグを除去した。図３は、正確な分子量を有するタンパク質がＸａ因子消化によって生成されたことを示す。
【０１３４】
モルモット回腸調製物でのバイオアッセイによって、折り畳まれていない組換えタンパク質が不活性であることが明らかとなった。ＮＭＲ試験は、ＭＩＴ１の１０個のシステインが、５つのジスルフィド結合に形成され（Ｂｏｉｓｂｏｕｖｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８３：２０５−２１９）（１９９８））、そしてこれらの１０個のシステインが、全てヒトプロキネチシンに保存されることを示し、このことは、これらのジスルフィド結合が、おそらくタンパク質生物活性に必須であると考えられた。従って、かなりの試みが、適切なジスルフィド結合形成（９４５の可能な組合せのうち）を保証するために充てられた。
【０１３５】
ほとんど全ての組換えタンパク質が沈殿したので、再折り畳み緩衝液への単一の希釈中での最初の再折り畳みは、失敗であった。これはおそらく分子間のジスルフィド結合の形成に起因する。次いで、タンパク質凝集を制御し、ジスルフィド結合生成を遅くする改変を採用した。これらの改変は以下：１）分子間ではなく分子内のジスルフィド結合を好ましく形成するために、１００μｇ／ｍｌ以下までタンパク質濃度を減少させること；２）直接的な希釈の代わりに透析方法によってタンパク質を再び折り畳むこと；３）全ての透析緩衝液において、より高いレベルの尿素（４Ｍおよび続いて２Ｍ）を使用すること；４）レドックス対から酸化剤シスチンまたは酸化されたグルタチオン省略し、５ｍＭのシステインまたは３ｍＭの還元グルタチオンのみを残すこと；５）タンパク質凝集をさらに減少するためにグリセロールを加えること；６）再折りたたみ工程を始める前に、４℃までタンパク質および緩衝液を冷却すること、を包含する。これらの慎重に制御された工程は、最小のタンパク質凝集を伴う組換えプロキネチシンの再折り畳みを成功させる。
【０１３６】
最後に、再折り畳みされたタンパク質を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した（図３Ａ、レーン５）。質量分析によって、再折り畳みされた組換えプロキネチシン１における５つのジスルフィド結合の生成を確認した。６×Ｈｉｓでタグされたプロキネチシン１の分子量は、フーリエ変換質量分析器で決定され、１０４８０．３０Ｄａであることが明らかとなった（図３Ｃ）。還元された形態中に存在する１０のシステイン全てを有する計算された分子量が、１０４９０．２０であったので、５つの対のジスルフィド結合が、明らかに形成された。
【０１３７】
（再折り畳みされた組換えプロキネチシンは胃腸の平滑筋を強く収縮させる）
次いで、再折り畳みされた組換えプロキネチシンを、単離された平滑筋調製物上で試験した。図４は、組換えプロキネチシン１とプロキネチシン２の両方が、モルモットの回腸縦走筋の収縮を強力に刺激するＥＤ５０値は、それぞれ約０．４６ｎＭおよび０．９０ｎＭであることを示す。プロキネチシン１（５ｎＭ）はまた、底部の筋肉片および近位の結腸の収縮を刺激するが、遠位の結腸においては影響はない（２５ｎＭ、データ示さず）。組換えプロキネチシン１（２５ｎＭ）はまた、大動脈および大腿動脈、気管および胆嚢を含む他の平滑筋組織にも影響を及ぼさない。従って、プロキネチシンの収縮性の影響は、ＧＩ平滑筋に対して特異的であるようである。
【０１３８】
プロキネチシンの可能なシグナル伝達機構をプローブするために、多くのキナーゼおよびイオンチャネルインヒビターを試験した。テトロドトキシン（ＴＴＸ）は、神経の活動電位の伝達をブロックすることが公知であり、プロキネチシン１で刺激された回腸縦走筋収縮に影響を及ぼさず（図４Ｂ）、プロキネチシン１が平滑筋に直接的に作用することを示す。プロキネチシンの収縮機構は、多くの化合物でさらに調査され、その化合物としては以下が挙げられる：プロテインキナーゼＣインヒビターカルフォスチンＣ（１μＭ）、ホスホリパーゼＡ２インヒビター７、７−ジメチル−（５Ｚ，８Ｚ）−エイコサジエン酸（１０μＭ）、チロシンキナーゼインヒビターゲニステイン（５μＭ）、ＭＥＫインヒビターＰＤ０９８０５９（１０μＭ）およびＬ型カルシウムチャネルブロッカーベラパミル。ベラパミルのみが有効であり、１μＭで２ｎＭのプロキネチシン１の収縮性の影響を完全に阻害する（図４Ｃ）。同じ濃度のベラパミルはまた、１００ｎＭのオキソトレモリン−Ｍの収縮作用を完全にブロックした（図４Ｆ）。この結果は、ムスカリン性Ｍ３レセプター類が、回腸の収縮を媒介する（Ｅｇｌｅｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．４８：５３１−５６５（１９９６）およびＥｈｌｅｒｔら、Ｍｕｓｃｕｒｉｎｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ、Ｅｇｌｅｎ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、９２−１４７頁（１９９７））のと同様に、電位開口型のカルシウムチャネルを介して入るカルシウムは、プロキネチシンシグナル伝達に必須の要素であることを示す。
【０１３９】
（膜レセプターによって媒介されるプロキネチシンの生物学的活性）
モルモットのＧＩ平滑筋に対する組換えプロキネチシンの強力な収縮作用およびカルシウムチャネルブロッカーベラパミルの阻害影響は、プロキネチシンのＲセプター−媒介機構を示唆する。プロキネチシンが選択的な膜レセプター、組換えプロキネチシンと相互作用するという直接的な証拠を提供するために、組換えプロキネチシンを１２５Ｉで標識し、そしてレセプター結合実験を実施した。
【０１４０】
スキャッチャード解析は、プロキネチシン１の特異的結合が２つの部位モデルに最良適合であることを示した（Ｆ＝３８．７８、１つの部位モデルに対してＰ＜０．００１；図５Ａ）。高親和性定数および低親和性定数（Ｋｄ）は、それぞれ、５．０±０．８ｐＭおよび２２７±６３ｐＭ（ｎ＝３）であった。高親和性部位および低親和性部位についてのＢｍａｘは、それぞれ、７．８±１．２および２６．４±８．４ｆｍｏｌ／ｍｇのタンパク質であった（ｎ＝３）。競合実験は、特異的結合が組換え型プロキネチシン１によって置換されることを示した。この置換曲線はまた、２つの部位モデルに最良適合であった（高親和性部位および低親和性部位について、それぞれ、８．０±３．９ｐＭおよび１．５０±０．９ｎＭのＫｉ、ｎ＝３）（図５Ｂ）。図５Ｂはまた、プロキネチシン２が、標識されたプロキネチシン１と同様の親和性で置換されることを示す（２回の実験の平均で、高親和性についてのＫｉは４．２ｐＭ、そして低親和性についてのＫｉは１．２２ｎＭ）。
【０１４１】
多くのＧタンパク質共役レセプターに結合するアゴニストは、ＧＴＰによって阻害されるので、ＧＴＰγＳが、特定の１２５Ｉ−標識されたプロキネチシン１結合性の任意の効果を有するかどうかを調べた。図５Ｂに示すように、ＧＴＰγＳは、１２５Ｉ−プロキネチシン１結合性の濃度依存的阻害を引き起こした。最も高濃度（１０μＭ）で試験した場合、ＧＴＰγＳは、回腸膜に結合する特異的プロキネチシンの８５％を置換した。これらの結果は、プロキネチシンレセプターが、Ｇタンパク質共役レセプターファミリーに属することを示唆する。
【０１４２】
（プロキネチシンの安定性）
プロキネチシンの半減期を定量するための実験もまた、行った。静脈内に注射された、ヨウ素標識されたヒトプロキネチシン１の半減期は、モチリンについての１０分と比較して、約３時間であった。このモチリンもまた、ＧＩの運動性を増加させる小さなポリペプチドである。血液循環における適度に長い半減期は、治療効果を得るために欠かせない。従って、プロキネチシンは、治療法として有効であると考えられる。
【０１４３】
（プロキネチシンの構造／活性相関研究）
配列解析は、プロキネチシンが２つの機能ドメイン（すなわち、短いＮ末端およびシステインリッチなＣ末端）を含み得ることを示した。第１のシステインの前にあるこのＮ末端配列は、プロキネチシン内に完全に保存されているので（図１）、この領域は機能的に重要であることが予測された。
【０１４４】
プロキネチシンに加え、１０個のシステインモチーフはまた、コリパーゼ、腸管の脂質消化酵素リパーゼについてのコファクター、およびｄｉｃｋｋｏｐｆ（初期胚発生において重要な役割を有するタンパク質のファミリー）を含む多数の分泌されたタンパク質中においても見出される。
【０１４５】
多数のＮ末端置換変異、欠失変異、および挿入変異が構築され、そして組換えられて、再折り畳みされたタンパク質が産生される。回腸の平滑筋調製物を用いたバイオアッセイは、２５０ｎＭまでの濃度のこれらの変異タンパク質が、収縮を誘発し得ないことを示した（表１）。しかし、Ｎ末端欠失変異体（配列番号１６）およびＮ末端挿入変異体（配列番号１８）は、プロキネチシン１の収縮効果を弱く拮抗し得る。従って、プロキネチシンのＮ末端改変体（例えば、配列番号１６および１８）は、ＧＩ収縮性を阻害するための潜在的な治療法である。
【０１４６】
【表１】
2004532609.tif 000002
プロキネチシン１由来のＮ末端配列とコリパーゼまたはＤｉｃｋｋｏｐｆ  ４のいずれか由来のＣ末端の１０個のシステイン領域を含むキメラ組換えタンパク質がまた、構築された。これらの２つのキメラ組換えタンパク質は、回腸の平滑筋調製物を用いて２５０ｎＭまでの濃度で試験した場合、機能しなかった。また、Ｎ末端ペプチド（配列番号１９）も試験されたが、これもまた機能しなかった。
【０１４７】
これらの結果は、Ｎ末端保存配列およびＣ末端のシステインリッチなドメインの両方が、プロキネチシンの収縮活性に不可欠であることを示す。
【０１４８】
（キメラプロキネチシン）
照会としてプロキネチシンｃＤＮＡを用いたドラフトヒトゲノムデータベースのサーチは、プロキネチシン１およびプロキネチシン２をコードする遺伝子が、３つのエキソンから構成されることを示した。そのシグナル伝達ペプチドとＮ末端領域に保存されたＡＶＩＴＧ配列が第１エキソンにコードされており、一方システインリッチドメインは、エキソン２およびエキソン３によってコードされる。プロキネチシン２の２１個のアミノ酸挿入は、選択的にスプライスされたミニエキソンによってコードされる。プロキネチシン１およびプロキネチシン２の機能的差異を調査するために、スワッピングされたそれらのエキソン３を用いて、キメラポリペプチドが作製された（図６参照のこと）。このキメラポリペプチドは、図６に示すように構築されたキメラ１２（配列番号１３）およびキメラ２１（配列番号１４）であり、スワッピングされたエキソンを示している。
【０１４９】
再折り畳みされたキメラプロキネチシン１２およびキメラプロキネチシン２１の機能アッセイは、これらのキメラポリペプチドの両方が、ＧＩ平滑筋の収縮において活性であることを示した（図７Ａ）。しかし、このキメラプロキネチシン２１（配列番号１４）のＥＣ５０は、プロキネチシン１またはプロキネチシン２より約８倍高かった。さらに、ピーク収縮は影響されなかったが、キメラプロキネチシンポリペプチドは、回腸片の収縮を結果的に延長した（図７Ｂ）。野生型プロキネチシンに関して、中途の収縮に対する時定数（ピーク収縮から持続的な停滞期の中間）は、約１５分であった。対照的に、キメラポリペプチドに関して、これらの時定数は、約４０分まで延長された。
【０１５０】
これらの結果は、キメラプロキネチシンが、野生型のプロキネチシンとは僅かに異なってレセプターと相互作用し、そしてより少なく明白なタキフィラキシーを引き起こすことを示唆する。従って、このキメラプロキネチシン（配列番号１３および１４）は、インビボで、野生型のプロキネチシンよりも強力な薬理学的活性を有し得る。
【０１５１】
（インビボでのモルモットの回腸平滑筋におけるプロキネチシンの影響）
インビボでの回腸平滑筋収縮におけるプロキネチシンの影響をモニターするために、外部管腔（ｅｘｔｒａｌｕｍｉｎａｌ）力トランスデューサは、モルモットの回腸の漿膜表面上に移植された。次いで、組換えプロキネチシン１は、１０秒間にわたり、頸静脈内へのボーラスとして投与された。図８に示すように、プロキネチシン１の静脈内ボーラスは、用量依存様式でモルモットの回腸平滑筋を収縮させた。プロキネチシン１の閾値は、約０．０３μｇ／ｋｇであり、３０μｇ／ｋｇの投与量は、最大の効果を生じる。
【０１５２】
従って、プロキネチシンはまた、エキソビボでの調製物中の回腸平滑筋を収縮させ得ると以上に示され、インビボでも効果的である。
【０１５３】
（プロキネチシンシグナル伝達）
プロキネチシンの潜在的なシグナル伝達機構を調査するために、内因的にプロキネチシンレセプターを発現する細胞株を同定した。ヨウ素標識したプロキネチシン１への結合について、２０を越える細胞株をスクリーニングした。１つの細胞株、Ｍ２Ａ７黒色腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５００；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３２５−３２７（１９９２））は、約１５０ｆｍｏｌｅ／ｍｇタンパク質のレセプターレベルに対し、特異的結合を明瞭に示した。プロキネチシンに特異的に結合する他の細胞株としては、Ｍ２黒色腫細胞（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５；３２５−３２７（１９９２））およびＲＣ−４Ｂ／Ｃ下垂体腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９０３）が挙げられる。プロキネチシンに結合しない細胞株としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＯＳ−１細胞、Ｌｔｋ−細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｃ６細胞、ＮＳ１０Ｙ細胞およびＨＴ−２９細胞が挙げられる。
【０１５４】
Ｍ２Ａ７細胞におけるシグナル伝達を調査するために、ＦＬＩＰＲシステム（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いる、ｆｕｒａ−３蛍光によって、細胞基質のカルシウムを測定した。細胞をＨＥＰＥＳ媒体中に懸濁し、そして２μＭのｆｕｒａ−３  ＡＭと一緒に３１℃で２０分間インキュベートした。次いでこの細胞を遠心し、洗浄し、ｆｕｒａ−３を含まない媒体中に再懸濁し、そして９６ウェル中に１ウェルにつき４×１０４細胞を播種した。この細胞を、０．１％  ウシ胎仔血清を含む標準緩衝溶液（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣ１、１０ｍＭ  グルコース、０．４５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０μＭ  プロベネシド）中のＦｌｕｏ−３  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒に３７℃で１時間ロードし、次いで標準緩衝溶液で洗浄した。プロキネチシン（０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ）によって惹起された［Ｃａ２＋］ｉでの過渡変化を、９６−ウェルプレートにおいて４８８ｎｍで２１０秒間ＦＬＩＰＲシステムを使用して観測した。
【０１５５】
図９に示されるように、プロキネチシンは、Ｍ２Ａ７黒色腫細胞においてカルシウムを動員（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）し得、組換えプロキネチシン１および組換えプロキネチシン２のＥＣ５０は、それぞれ、約１２ｎＭと約２１ｎＭであった。このシグナル伝達は、ＨＥＫ２９３細胞では応答しないので、特異的なものである。プロキネチシンによって動員されるカルシウムシグナル伝達は、コントロールＭＣＨ（メラニン凝集ホルモン）レセプターＳＬＣ１によって活性化されるカルシウムシグナルと同程度である（Ｓａｉｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４００：２６５−２６９（１９９９））。プロキネチシンによって誘発されるカルシウムシグナルは、代表的なレセプターチロシンキナーゼの活性化によって誘導されるわずかな（ｍｏｄｅｓｔ）カルシウムシグナルよりも非常に強力である。この結果は、上記、チロシンタンパク質キナーゼインヒビターであるゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）（５ｍＭ）が、回腸平滑筋でのプロキネチシンの収縮活性を引き起こさないという知見と、一致する。
【０１５６】
これらの結果は、このプロキネチシンレセプターが、ＧＰＣＲであり且つＧαｑを介するシグナルである可能性が高いことを、示す。
【０１５７】
（考察）
上記の結果は、カエルＢＶ８およびヘビＭＩＴ１の哺乳動物のホモログの存在を明らかにする。ＧＩ平滑筋におけるそれらの強力且つ特異的な効果を示すために、これらのタンパク質は、プロキネチシンと名付けられている。ハムスターの回腸平滑筋の収縮を特異的に刺激するが、他の平滑筋（大動脈、大腿動脈、気管および胆嚢を含む）を刺激しない、それらの高い効力は、プロキネチシンがＧＩ運動性の重要な内因性調節因子であり得ることを示す。プロキネチシンは、神経分泌性シグナル伝達分子または神経分泌性循環ホルモン、あるいはパラクリン液性因子としてＧＩ平滑筋を調節し得る。プロキネチシンはまた、ＧＩ系以外でも広く発現されているため、プロキネチシンが遠隔器官から放出され、そしてＧＩ活性を調節し得る得る可能性がある。この点において、プロキネチシンは、プロテアーゼ処理に対して耐性であることが決定され、このことは、プロキネチシンの潜在的な長距離効果（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）および長期的（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ）効果を支持する
プロキネチシンの分子サイズおよびプロセシングは、それらを代表的な神経ペプチドと識別可能にし、そしてそれらがサイトカインに非常に類似していることを示す。病原菌を排除するための１つの機構として、胃腸管の運動性を増強し、そして攻撃した生物を胃腸管の外に押し出すことであり、プロキネチシンがまた、防御免疫応答の一部であり得る、すなわち、ＧＩ運動性を増強させる炎症性サイトカインとして機能し得る。
【０１５８】
ＧＩ収縮性における組換えプロキネチシンの高い効力は、おそらく、プロキネチシンが細胞表面レセプターと相互作用することを示唆する。この考察は、上記のレセプター結合実験によって促進され（ｒｅｉｎｆｏｒｃｅ）、ヨウ素標識された組換えプロキネチシンに対し飽和可能に（ｓａｔｕｒａｂｌｙ）高親和性を示す。さらに、１０μＭのＧＴＰγＳが特異的結合のほとんど全てを置換し得るという知見は、プロキネチシンレセプターのシグナル伝達におけるＧタンパク質の関与を示す。さらに、プロキネチシンの収縮効果におけるカルシウムチャネル遮断薬（ベラパミル）の阻害効果は、プロキネチシンに対するレセプターの介在機構と一致し、そしてまた、ＧＩ平滑筋の収縮における、Ｍ３ムスカリン性レセプターおよびモチリンレセプターのシグナル伝達機構と同様のプロキネチシンのシグナル伝達機構を示唆し：電位型カルシウムチャネルを解するカルシウムの流入は、不可欠な要素である。従って、プロキネチシンレセプターは、おそらく、Ｇタンパク質共役レセプターである。
【０１５９】
しかし、代替的解釈は可能である。例えば、プロキネチシンは直接的に非選択的カチオン性イオンチャネルを活性化することによってか、またはＧＩ平滑筋細胞での阻害性カリウムチャネルを遮断することにより、平滑筋収縮を引き起こし得る。
【０１６０】
配列解析は、プロキネチシンが、２つの機能ドメイン（短いＮ末端領域およびシステインリッチなＣ末端領域）を含み得ることを示す。第１システインの前にあるＮ末端配列は、プロキネチシン内に完全に保存されており（図１）、この領域は、機能的重要性を有する可能性が高い。他の種由来のプロキネチシンとそれらのアイソフォームに加えて、同様の１０個のシステインモチーフはまた、コリパーゼ（腸性脂質消化酵素リパーゼのコファクター）（ｖａｎ  Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：１５９−１６２（１９９２））およびｄｉｋｋｏｐｆ（初期胚発達において重要な役割を有する、タンパク質のファミリー）（Ｇｌｉｎｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：３５７−３６２（１９９８）およびＡｒａｖｉｎｄら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ４７７−４７８  （１９９８））を含む、多数の他の分泌タンパク質において見出される。興味深いことに、ｄｉｃｋｋｏｐｆは、実際的に、鏡面対称を有する１０個のシステインドメイン２つを有する。Ｘ線結晶学および溶液構造解析は、ＭＩＴ１が５対のジスルフィド結合により形成され、そしてコリパーゼと類似の構造に折り込まれることを示している（Ｂｏｉｓｂｏｕｖｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８３：２０５−２１９（１９９８））。
【０１６１】
５対のジスルフィド結合を有するタンパク質の成功した再折り畳みは、これまでは、インビトロでは達成されていなかった。３対より多くのジスルフィド結合を有するタンパク質の再折り畳みは、まだなお興味深く且つ困難であると考えられる（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：１９０−１９７（１９９６）およびＬｉｈｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４９７−５０１（１９９８））。Ｅ．ｃｏｌｉでのこのようなジスルフィド結合リッチなタンパク質の発現は、結果として、しばしばジスルフィド結合を形成し得ないか、あるいはよりおおまかには、分子内または分子間の誤ったジスルフィド結合を形成し得る。これらの事象は、通常、細菌封入体内で不活性な組換えタンパク質の産生およびそれらの凝集を誘導する。
【０１６２】
本研究において、緩徐な置換方法は、５対のジスルフィド結合を有するプロキネチシンの再折り畳みに利用される。多数の因子は、最終的に、プロキネチシンの首尾良い再折り畳みに貢献した：１）低速な変性剤の除去；２）ジスルフィド結合の緩徐な形成を可能にする、レドックスフォールディング混合物中での還元剤のみの使用；３）低い温度；４）タンパク質凝集を防止するための、透析緩衝液中の高濃度の尿素およびグリセロール；５）分子間のジスルフィド結合ではなく、分子内のジスルフィド結合の形成を有利にする、低濃度の組換えタンパク質。これらの再折り畳み条件を用いて、複数のジスルフィド結合を有する他の組換えタンパク質を再折り畳みするためのプロトコルを設計し得る。
【０１６３】
要約すると、２つのプロキネチシンをコードするｃＤＮＡが記載されている。再折り畳みした組換えプロキネチシンは、ＧＩ平滑筋の収縮を強力且つ特異的に刺激する。低下したＧＩ運動性は、過敏性結腸、糖尿性胃不全麻痺、術後の腸閉塞、慢性収縮性心膜炎、および胃食道逆流疾患（Ｌｏｎｇｏら、Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３６：６９６−７０８（１９９３）；Ｔｏｎｉｎｉ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３３：２１７−２２６（１９９６）；ＳａｍｓｏｍおよびＳｍｏｕｔ、Ｄｉｇ  Ｄｉｓ．１５：２６３−２７４（１９９８）；ＡｃｈｅｍおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｄｉｇ  Ｄｉｓ．１６：３８−４６（１９９８）ならびにＢｒｉｅｊｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２０：１−３（１９９９））を含む多数の一般的な疾患において非常に多発する臨床症状であるため、ＧＩ平滑筋の内因性調節因子の発見は、変化したＧＩ運動性によって恩恵を受ける、このような疾患の新規治療の開発を容易にする。
【０１６４】
括弧内、またはその他の上記に記載された全ての学術論文、引用文献および特許引用例は、以前に記載されようとされまいと、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０１６５】
本発明は、上記の例を参照して記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の改変が行われ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ａ）プロキネチシン１前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列；Ｂ）プロキネチシン２前駆体（配列番号４）のアミノ酸配列；Ｃ）カエルＢＶ８（配列番号１１）のアミノ酸配列およびＤ）ＭＩＴ１の部分的配列（配列番号１２）を、示す。１０個の保存性システイン残基に（＊）を付ける。シグナルペプチドに下線を引く。矢印は、イントロンスプライス部位を示す。
【図２】
図２は、プロキネチシンの発現パターンを示す。ヒトＲＮＡマスターブロットを、Ａ）プロキネチシン１、およびＢ）プロキネチシン２  ｃＤＮＡを用いて、プローブした。図２Ｃは、各ドットについてのＲＮＡ供給源を示すブロット図を示す。図２Ｄは、プロキネチシン１を用いたＮｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析を示す。各レーンは、以下に示すような異なる脳組織由来のＲＮＡを含む：１．大脳；２．大脳皮質；３．髄質；４．脊髄；５．後頭極；６．前頭葉；７．側頭葉；８．被殻；９．小脳扁桃；１０．尾状核；１１．脳梁；１２．海馬；１３．脳全体；１４．黒質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉ  ａｎｉｇｒａ）：１５．視床下核；１６．視床。
【図３】
図３は、ヒトプロキネチシンの生成および精製を示す：Ａ）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０を用いて染色したプロキネチシンサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％）。レーン１、分子量標準；レーン２、インキュベーション後の全細菌ライセート；レーン３、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製したプロキネチシン；レーン４、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａで切断したプロキネチシン；レーン５、ＨＰＬＣ精製後に再折り畳みさせたプロキネチシン。各レーンに、１０μｇ〜１５μｇの全タンパク質をロードした。Ｂ）再折り畳みさせたタンパク質混合物の逆相ＨＰＬＣ分離。ピーク２が再折り畳みさせたプロキネチシンを含む。Ｃ）再折り畳みさせたプロキネチシン１のエレクトロスプレー質量分析。
【図４】
図４は、モルモット回腸縦平滑筋の収縮性に対するプロキネチシンの効果を示す。プロキネチシン１（２ｎＭ）に対する収縮応答は、テトロドトキシン（０．１μＭ）およびベラパミル（１μＭ）の非存在下（Ａ）、およびテトロドトキシン（０．１μＭ；Ｂ）存在下およびベラパミル（１μＭ；Ｃ）存在下で、回腸内で測定される。図４Ｄは、プロキネチシンの収縮効果に関する濃度−応答の関係を示す。結果は、最大収縮性のパーセント（％）として与えられる。データは３回の独立した実験からのものである。ベラパミル（１μＭ）の非存在下（Ｅ）およびベラパミル（１μＭ；Ｆ）の存在下での回腸内のオキソトレモリン−Ｍの収縮効果もまた、示される。矢印は、薬物が投与された時を示す。
【図５】
図５Ａは、モルモット回腸膜への１２５Ｉ−プロキネチシンの特異的結合のスキャッチャード分析を示す。図５Ｂは、異なる濃度の非標識プロキネチシン１（黒四角）および非標識プロキネチシン２（白四角）による、１２５Ｉ−プロキネチシン（２０ｐＭ）の結合の阻害を示す。白丸は、異なる濃度のＧＴＰγＳを用いた１２５Ｉ−プロキネチシン１（２０ｐＭ）の置換を示す。
【図６】
図６は、プロキネチシン１とプロキネチシン２との間で構築されたキメラ（キメラ１２（配列番号１３）およびキメラ２１（配列番号１４）と命名された）の説明図を示す。
【図７】
図７は、キメラプロキネチシンの機能的特徴付けを示す。図７Ａは、モルモット回腸を収縮する能力についてアッセイされた、キメラプロキネチシンおよび野生型プロキネチシンの用量応答曲線を示す。図７Ｂは、キメラプロキネチシンおよび野生型プロキネチシンの時定数を示す。この時定数は、ピークの収縮から中間の収縮までの経過時間（ピークから持続するプラトー収縮までの半分の時間）を示す。オキソトレモリンＭ誘導収縮に対して規格化した後、プロキネチシンによって導き出されるピーク収縮および持続するプラトー収縮は、各々約８０％および４０％だった。従って、中間の収縮は、最大収縮の約６０％である。
【図８】
図８Ａは、インビボでのモルモット回腸における収縮に対するＩＶボーラスとしての、種々の用量のプロキネチシン１の投与の効果を示す。図８Ｂは、１０００ｎｇ／ｋｇのプロキネチシン１への収縮応答を示す。
【図９】
図９は、ＦＬＩＰＲアッセイにおいて決定されたように、望ましい濃度のプロキネチシン１またはプロキネチシン２によって、ＨＥＫ２９３細胞またはＭ２Ａ７細胞中で誘導されたカルシウム動員を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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