(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、一以上のドメインが完全長で正しく折り畳まれており、且つＮ末端又はＣ末端の何れかに一以上のマーカー部分が各々タグ標識されたタンパク質を作製する新規方法、このようなタンパク質を含有するアレイ、並びに迅速なスクリーニング用アレイにおけるこのようなタンパク質の使用に関する。
2004509645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一以上のドメインが完全長で正しく折り畳まれており且つＮ末端又はＣ末端の何れかに一以上のマーカー部分が各々タグ標識された一以上のタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）前記タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、５’及び／又は３’非翻訳領域とともに有する一以上のＤＮＡ分子を準備することと、
（ｂ）ｄＮＴＰ及びα−Ｓ−ｄＮＴＰが統計学的に娘ＤＮＡ分子中に取り込まれる条件下で、前記ＤＮＡ分子を増幅させることと、
（ｃ）前記ＤＮＡ分子の５’又は３’末端をヌクレアーゼ消化から特異的に保護することと、
（ｄ）まず５’→３’ヌクレアーゼ又は３’→５’ヌクレアーゼを用いて前記ＤＮＡ分子を処理して一群の入れ子型欠失物を得た後、前記オープンリーディングフレームの開始又は停止コドンを含む前記５’又は３’非翻訳領域を除去せしめる条件下で、一本鎖ヌクレアーゼで処理することと、
（ｅ）一以上の５’又は３’マーカー部分のコード配列を含有する発現ベクターの中に、工程（ｄ）で得た前記断片をクローニングすることと、
（ｆ）前記コードされているタンパク質を発現させることとを備えた方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子の前記増幅が統計学的に単一のα−Ｓ−ｄＮＴＰを取り込む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一のα−Ｓ−ｄＮＴＰがα−Ｓ−ｄＴＴＰ又はα−Ｓ−ｄＡＴＰの何れかである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩＩＩ又はλエキソヌクレアーゼである請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記一本鎖ヌクレアーゼがリョクトウヌクレアーゼ又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼである請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカー部分によって前記オープンリーディングフレームの発現を確認することが可能となる請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカー部分によって前記オープンリーディングフレームの折り畳みを確認することが可能となる請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカー部分が緑色蛍光タンパク質をコードする請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカー部分が、ペプチド配列（例えば、ヘキサヒスチジンタグ）、完全なタンパク質、又はタンパク質ドメイン（例えば、マルトース結合タンパク質ドメイン）である請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記タグが前記アレイ中の各タンパク質の精製を可能とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記各タンパク質の開始又は停止コドンが置換されるように、前記タグが挿入される請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記各タンパク質の末端に近接する折り畳みと機能にとって重要でない領域内に、前記タグがインフレームに挿入される請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
オープンリーディングフレームの中であるが、特定のドメイン境界の外側に位置する折り畳みと機能にとって重要でない領域の中に、前記タグがインフレームに挿入される請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）における前記ＤＮＡ分子の増幅が、非プルーフリーディングポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片）によって行われる請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ｄＮＴＰに対する前記α―Ｓ−ｄＮＴＰの比率が１：１乃至１：３の間にある請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記５’→３’ヌクレアーゼ又は３’→５’ヌクレアーゼがα−Ｓ−ホスホジエステル結合を加水分解できない請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ分子がｍＲＮＡ配列からの逆転写によって得られたｃＤＮＡである請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が複数のＤＮＡ分子に対して平行して行われる請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が単一の容器中に存在するＤＮＡ分子の集団に対して行われる請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法によって得られたタグ標識タンパク質のライブラリー。
【請求項２１】
タンパク質アレイを製造する方法であって、
（ａ）請求項２０の前記ライブラリーの各要素をクローン毎に分離することと、
（ｂ）空間的に離隔されたフォーマットで、前記タグ標識された各タンパク質を発現させることと、
（ｃ）前記マーカー部分によって、タグ標識された各タンパク質を精製することと、
（ｄ）空間的に規定されたアレイに各タンパク質を配置することとを備えた方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法によって調製された、又は請求項２１に記載の方法によって作製されたタンパク質を備えたアレイ。
【請求項２３】
前記アレイの成分が例えば固相表面に固定化される請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２４】
前記各タンパク質がタグ部分によって固定化される請求項２２又は２３に記載のアレイ。
【請求項２５】
一以上の化合物の生物活性をスクリーニングする方法であって、前記一以上の化合物を請求項２２〜２４の何れか１項に記載のタンパク質アレイと接触させる工程と、前記アレイ中の前記タンパク質への前記一以上の化合物の結合を測定する工程とを備えた方法。
【請求項２６】
一以上のタンパク質の特異的なタンパク質−タンパク質相互作用をスクリーニングする方法であって、前記一以上のタンパク質（例えば、細胞表面受容体）を請求項２２〜２４の何れか１項に記載のアレイと接触させる工程と、前記アレイの前記タンパク質への前記一以上の特異的タンパク質の結合を測定する工程とを備えた方法。
【請求項２７】
一以上のタンパク質の特異的なタンパク質−核酸相互作用をスクリーニングする方法であって、前記一以上の核酸プローブを請求項２２〜２４の何れか１項に記載のタンパク質アレイと接触させる工程と、前記アレイ中の前記タンパク質への前記プローブの結合を測定する工程とを備えた方法。
【請求項２８】
化合物、タンパク質、又は核酸の迅速なスクリーニングにおける、請求項２２〜２４の何れか１項に記載のアレイの使用。
【請求項２９】
前記アレイ中の各タンパク質を認識する分子のスクリーニングおける請求項２２〜２４の何れか１項に記載のアレイの使用であって、前記分子が好ましくは抗体である使用。
【請求項３０】
抗体アレイを作製する方法であって、タンパク質アレイ中の一以上のタンパク質が抗体ライブラリー中の少なくとも一つの抗体に結合するように、請求項２２〜２４の何れか１項に記載のタンパク質アレイを前記抗体ライブラリーに接触させることと、未結合の抗体を全て除去することと、前記タンパク質アレイ中のタンパク質に結合した抗体を固定化することとを備えた方法。
【請求項３１】
タンパク質の機能又は量をスクリーニングする方法であって、請求項３０に記載の抗体アレイを一以上のタンパク質の混合物に接触させる工程を備えた方法。
【請求項３２】
請求項２５〜２７又は３０の何れか１項に記載の方法であって、まず請求項２２〜２４の何れか１項に記載のタンパク質アレイを準備する工程も備えた方法。
【請求項３３】
前記アレイ中の前記タンパク質が、単一の工程で精製され固定化される請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
本明細書に記載されている方法によって得られたタグ標識されたタンパク質の使用。
【請求項３５】
発現されたタンパク質と他のタンパク質との相互作用を分析するための、本明細書に記載された方法によって得られたタグ標識されたタンパク質の使用。
【請求項３６】
例えばａ）相互作用するタンパク質、ｂ）ＤＮＡ、又はｃ）化学的化合物のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能とするためにアフィニテイーカラム／担体上に固定化するための、本明細書に記載された方法によって得られるタグ標識タンパク質の使用。
【請求項３７】
診断ツールとして抗体による検査を行うためのアフィニティー精製による固定化（ＥＬＩＳＡアッセイ）における、本明細書に記載の方法によって得られるタグ標識されたタンパク質の使用。
【請求項３８】
ｃＤＮＡマイクロアレイ用のプローブとしての、本明細書に記載された方法によって得られるタグ標識されたタンパク質の使用。
【請求項３９】
ＤＮＡ結合タンパク質を同定するための請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
「プロテオーム」中のタンパク質の種類を明らかにするための、本明細書に記載された方法によって得られるタグ標識されたタンパク質の使用。
【請求項４１】
本発明の方法によって改変された原ライブラリーの被発現タンパク質成分又は初発物質に質量分析法を行う請求項４０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一以上のドメインが完全長で正しく折り畳まれており且つＮ末端又はＣ末端の何れかに一以上のマーカー部分が各々タグ標識されたタンパク質を作製する新規方法、及びこのようなタンパク質を含んでなるするアレイ、並びに迅速なスクリーニングにおけるこのようなアレイの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノムマッピングプロジェクトは、治療における標的の発見過程及びそれを用いた薬物探索過程に大きな変革をもたらしている。新たな治療の標的が同定されるにつれて、既存の化学ライブラリー及びコンビナトリアル化学ライブラリーに対する高速大量処理スクリーニングによって、これらの標的に対して活性を有するリード化合物の候補が数多く提案されるであろう。初期段階の臨床試験を経た場合でさえ、全てのリード化合物を追求することは明らかに非経済的である。しかしながら、このようなリード化合物が示すと思われる活性のプロファイルをある生物中の全てのタンパク質につき迅速に評価する方法は現在のところ存在しない。もしこのような方法が利用できれば、全リード化合物の潜在的毒性プロファイルを初期の段階で評価することが可能となり、この情報によって、何れのリード化合物を追求し、何れのリード化合物を排除すべきかを決定する過程が著しく促進されるであろう。
【０００３】
他方、製薬産業では、既存の薬物（既に市場に出ているか、又は開発途中である）の標的を全て同定することによって、それらの作用機序を明らかにする必要がある。現在、新薬の規制当局が作用機序の解明を殊に重要視していることがさらに明瞭となっているので、そのような情報が利用できれば、新薬の規制認可を得る過程が大幅に短縮されるであろう。さらに、この種の情報により、改良された第二世代の薬物デザインが可能となるであろう。薬物の大多数は、薬物又はその代謝物が望ましくない標的に結合することによって生じると思われる軽微な副作用を少なくとも有しており、改良された薬物をデザインするために必要な基準を明らかにするために、これらの標的タンパク質を全て同定する必要があるからである。しかし、今のところ、この情報を得る簡易な方法は存在せず、何百万ドルもの規模となり得る数多くの薬物が、作用の標的が不明であるというだけで脱落している。
【０００４】
タンパク質−タンパク質相互作用は、内的及び外的ストレスの両者に対する細胞内反応を支配する上で、決定的に重要であることが益々認識されつつある。従って、特異的なタンパク質−タンパク質相互作用は、感染及び他の疾患への薬物による介入に対する標的となる可能性がある。現在のところ、タンパク質−タンパク質相互作用を評価するための信頼するに足る唯一の方法は、酵母のツーハイブリッドアッセイであるが、この種のインビボアッセイは、高速大量処理形式でない場合でも、タンパク質−タンパク質相互作用の特異的アゴニスト又はアンタゴニストを同定するのには余り適していないであろう。機能的プロテオーム発現アレイ、又は「プロテオームチップ」を用いれば、タンパク質−タンパク質相互作用の特異性及び薬物によって媒介される任意の効果の特異性をインビトロ形式で決定することが可能となる。機能的プロテオーム発現アレイは、実際にこの研究分野に多大な変革をもたらすので、非常に大きな発展性を有すると考えられる。
【０００５】
機能的プロテオームアレイを作製できる一つの方法は、特定のプロテオーム中で発現させた全タンパク質を個別にクローニングし、発現させ、精製し、固定化するというものである。しかし、ここで考慮すべき最も重要な問題は、ゲノム全体の配列データが利用可能であるかということと、同時に、所定のゲノムの絶対的大きさに関することである。
【０００６】
ゲノムの大きさの例を挙げると、典型的な細菌ゲノムは、〜５Ｍｂｐであり、既に完全に配列決定されたものも少数存在する（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。真菌ゲノムは、典型的には〜４０Ｍｂｐ、哺乳類ゲノムは〜３Ｇｂｐ、植物ゲノムの場合は〜１０Ｇｂｐである。かかる情報のうちどの程度が公有されるかということは大いに疑問であるが、現時点での推測によれば、ヒトゲノム配列は２００３年頃に完了する予定である。代表的なモデル生物以外の生物のゲノムが現実的な時間の枠内で入手できるようになると予想することが全く非現実的であることは明らかであり、さらに、機能的プロテオミクスの観点から、モデル生物が有する価値は限定的なものにすぎない。それゆえ、原理的には、今から４年のうちに、プライマーをデザインし、合成して、ｃＤＮＡライブラリーからヒトゲノム中に存在する約１００，０００の各遺伝子をクローニングすることが可能かもしれないが、必要な配列データが利用可能であるとしても、実際、これは、多大な費用を要し（プライマーの費用だけで数百万ドルに達するであろう）、且つ非常に手間のかかる過程となろう。
【０００７】
しかし、完全な配列データが利用できない薬物開発に適した生物はどうなるのであろうか。これらの機能的プロテオミクスを単に無視することはできないが、では、いかなる代案を採り得るのであろうか。原理的には、非特異的固定化と共に発現ｃＤＮＡライブラリーを使用してタンパク質アレイを作製できるであろうが、非特異的固定化の過程で、通常、タンパク質の折り畳みが破壊されることにより機能が失われるので、この技術には大きな制約がある。さらに、宿主細胞のタンパク質も全て固定化されることになって、最良の場合でもシグナル−ノイズ比が大きく減少し、最悪の場合には、ポジティブな結果が不明瞭になるであろう。従って、機能に影響を及ぼさず且つ全ゲノム配列を知る必要もなしに、共通のモチーフ又はタグを介して個々のタンパク質が特異的に固定化、精製される機能的プロテオームアレイを作製する技術は、機能的プロテオミクスの分野に大きな進歩をもたらすであろう。
【０００８】
【発明の概要】
本発明者らは、そのタンパク質に対応する遺伝子のＤＮＡ配列を予め知る必要なくして、プロテオーム中の各タンパク質内の所定の位置に共通のマーカーをタグ標識する方法を提供することによって、上記問題を解決する新規アプローチを開発した。次いで、この「タグ」を使用して、その後の固定化と精製手段に共通性及び特異性を与えることがあり、続いて、あるプロテオームに由来する何千ものタンパク質が並べられた、空間的に規定されたアレイの作製が可能となる。
【０００９】
ここで考慮すべき重要な事柄は、「タグ」の正確な位置決定に関するものである。タグが、ある遺伝子の特定しないランダムな位置にインフレームで挿入された場合、得られたタグ付加タンパク質は不特定に末端切断され、殆どの場合、正しい折り畳みが破壊され、このため機能が破壊されることになる可能性がある。完全長のタンパク質には、折り畳み又は機能に影響を与えずに末端切断することができる短いポリペプチドの伸長部分がＮ−末端又はＣ−末端の一方（又は双方）に存在することが多い。しかし、末端切断が何れかのＮ−末端又はＣ−末端伸長部分を除去し、末端切断がドメイン境界を横切れば、通常、タンパク質の折り畳み及び機能に影響が及ぶ。本明細書に記載した方法によれば、アレイに特異的に固定化された時に、各タグ標識タンパク質が正しく折り畳まれて機能を保持するように、正確に各タンパク質のＮ又はＣ末端の何れかに、又はタンパク質の折り畳み及び機能に重要でない何れかの末端に近接した領域内に、タグを正確なリーディングフレームで挿入することが可能となる。個々のドメインが異なる機能を有する複数ドメインタンパク質の場合、本明細書に記載した方法によって、アレイに特異的に固定化された時に個々のタグ挿入ドメインが正しく折り畳まれ、そのタンパク質が機能を保持するように、コード配列全体の内側であるが特定のドメイン境界の外側にタグを挿入することも可能となる。
【００１０】
アレイ中の各タンパク質は完全に機能的であると考えられるので、そのアレイを直接スクリーニングして、薬物の標的及び他の生物学的に関連する分子を同定することが可能である。アレイを空間的に仕切ることにより、各タンパク質の表現型を直接的にその遺伝子型と関連させることが可能となり、「ヒット」を同定できるであろう。
【００１１】
【発明の実施の形態】
このように、第一の側面において、本発明は、一以上のドメインが完全長で正しく折り畳まれており、且つＮ末端又はＣ末端の何れかに一以上のマーカー部分が各々タグ標識された一以上のタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）前記タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを５’及び／又は３’非翻訳領域とともに有する一以上のＤＮＡ分子を準備することと、
（ｂ）ｄＮＴＰ及びα−Ｓ−ｄＮＴＰが統計学的に娘ＤＮＡ分子中に取り込まれる条件下で、前記ＤＮＡ分子を増幅させることと、
（ｃ）前記ＤＮＡ分子の５’又は３’末端をヌクレアーゼ消化から特異的に保護することと、
（ｄ）まず５’→３’ヌクレアーゼ又は３’→５’ヌクレアーゼを用いて前記ＤＮＡ分子を処理して一群の入れ子型欠失物を得た後、前記オープンリーディングフレームの開始又は停止コドンを含む前記５’又は３’非翻訳領域を除去せしめる条件下で、一本鎖ヌクレアーゼを用いて処理することと、
（ｅ）一以上の５’又は３’マーカー部分のコード配列を含有する発現ベクターの中に、工程（ｄ）で得た前記断片をクローニングすることと、
（ｆ）前記コードされているタンパク質を発現させることとを備えた方法を提供する。
【００１２】
好ましくは、前記一又は複数のＤＮＡ分子の前記増幅は統計学的に単一のα−Ｓ−ｄＮＴＰ、より好ましくはα−Ｓ−ｄＴＴＰ又はα−Ｓ−ｄＡＴＰの何れかを取り込む。
【００１３】
前記マーカー部分（ｍａｒｋｅｒ　ｍｏｉｅｔｙ）は、ペプチド配列（例えば、ヘキサヒスチジンタグ）、抗体エピトープ又はビオチン模倣物（ｂｉｏｔｉｎ　ｍｉｍｉｃ）、又は完全なタンパク質、又はタンパク質ドメイン（例えば、マルトース結合タンパク質ドメイン）の何れかであり得る。例えば、ビオチン又は脂質分子を加えることによって前記マーカー部分自体を翻訳後修飾することも可能である。好ましい実施態様では、前記マーカー部分によって、「タグ標識された（ｔａｇｇｅｄ）」タンパク質の精製も可能となるであろう。
【００１４】
このように、本発明の方法は、個々の遺伝子の配列に関する知識に全く依拠せずに、一つの容器内で、ｃＤＮＡライブラリーの全ての要素を特異的に修飾することを可能とする。本発明の方法は、その代わりに、各ｃＤＮＡの５’又は３’非翻訳領域の何れかが除去されるように、ヌクレアーゼによって各ｃＤＮＡを非進行的（ｎｏｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）に末端切断することに依拠している。次いで、得られた各ｃＤＮＡの入れ子型欠失物（ｎｅｓｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ）群に、既知のマーカー部分をコードする既知のＤＮＡ配列をさらに付け足す。このため、前記マーカー部分が個々のｃＤＮＡと同じリーディングフレームの中に存在し、インフレームな停止コドンが先行していなければ、本発明の方法によって作製した遺伝的修飾が施された得られた各ｃＤＮＡは、共通の部分（例えば、そのＮ末端又はＣ末端の何れかに融合されたポリペプチド「タグ」）を有するに至った各タンパク質をコードしているであろう。次いで、正しく折り畳まれたタグ標識タンパク質をスクリーニングすることによって、ドメインの境界を横切って個々のタンパク質の折り畳みに（従って機能に）影響を与える全ての末端切断と前記タグへのフレーム外融合物（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ　ｆｕｓｉｏｎ）とを除去することが可能となる。ｃＤＮＡライブラリーの全ての要素は同様に修飾されると思われるので、最終的には、ｃＤＮＡライブラリーによってコードされる全てのタンパク質のＮ末端又はＣ末端の何れかに共通の部分がタグ標識されるに至るであろう。
【００１５】
一般的に、前記ｃＤＮＡライブラリーから発現される前記タンパク質は「タグ標識」されているものと思われ、即座に同定し単離することができる。一旦精製されると、例えば、マイクロアレイに前記タンパク質を付着させることができる。付着はタグ自体によって行ってもよいし、あるいは、まず前記タンパク質に付着される別の部分によって行ってもよい。
【００１６】
本明細書に記載されている方法によって形成されたアレイは、本発明の第二の側面を成す。このようなアレイは、通常固相支持体上に固定化された「タグ標識」タンパク質発現ライブラリーを備えている。当業者であれば、アレイの分野で、固相支持体となり得る広範な支持体が一般に使用されており、本発明のアレイを製造する際に、これらの「担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」の何れも使用できることが理解できるであろう。
【００１７】
本明細書で使用する「タンパク質アレイ」という用語は、ある表面上に、あるパターンで一以上のタンパク質部分を空間的に規定して配置したものを意味する。好ましくは、前記タンパク質部分は、直接又は間接的に前記表面に付着されるであろう。前記付着は、（例えば、前記表面上への物理的吸収による、又は非特異的な共有結合性相互作用の形成による）非特異的なものであってもよい。好ましい実施態様では、前記タンパク質部分は、本明細書に記載された方法を用いて、各タンパク質に連結された共通のマーカー部分を介して前記表面に付着されるであろう。
【００１８】
別の実施態様では、前記表面に繋留された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）小胞又はリポソーム中に前記タンパク質部分を取り込ませてもよい。
【００１９】
このように、前記パターン中の各位置は、例えば、一コピー以上の
ａ）単一のタンパク種（単量体、二量体、三量体、四量体、又はこれ以上の多量体の形態）のサンプル、
ｂ）相互作用する分子（例えば、ＤＮＡ、抗体、他のタンパク質）に結合された単一のタンパク種のサンプル、
ｃ）合成分子（例えば、ペプチド、化学的化合物）に結合された単一のタンパク種のサンプル、又は
ｄ）前記アレイの前記パターンの各位置に位置する２〜１００の異なるタグ標識タンパク質部分の混合物
を含有し得る。
【００２０】
前記アレイを支える表面は、例えば化学的な処理によってコート／誘導体化してもよい。適切な表面の例には、スライドグラス、ポリプロピレン若しくはポリスチレン、シリカ、金若しくは金属の支持体、又は例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ナイロン、若しくはホスホセルロース製の膜が含まれる。
【００２１】
本明細書に論述されているように、本発明の方法によれば、あるプロテオーム中の全てのタンパク質のＮ末端又はＣ末端の何れかに特異的にタギングすることが可能となる。タンパク質の中にはＮ末端に伸長部を備えられないものや、Ｃ末端に伸長部を備えられないものもあるが、大多数のタンパク質は、このような伸長部のうちの何れかを備え得るであろう。しかしながら、既存のライブラリークローニング法は、完全長の未修飾ｃＤＮＡとして、又は何らかのタンパク質対へのランダム且つほぼ不可避的に末端切断された融合物として遺伝子をクローニングするのでこの課題には全く応えられない。後者と比べて、本発明の方法は、例えば所望のペプチド対への融合によってｃＤＮＡ産物の折り畳み又は機能が影響を受けないように、ｃＤＮＡ産物のＮ末端又はＣ末端残基に又はその近傍に位置する前記配列へ、前記タグの位置を誘導することを可能とする。前者と比べて、本明細書に記載されているアレイにタンパク質を固定化する方法は、非特異的な相互作用ではなく特異的な相互作用を介しており、これらの特異的な相互作用は各ｃＤＮＡの末端に付加されたタグの機能である。加えて、本明細書に記載されている方法は、非細菌性宿主生物中で発現された精製固定化タンパク質をスクリーニングして、正確な折り畳みと翻訳後修飾を通じて機能の維持を補助するために使用することができるのに対して、ファージディスプレー又はλ―ｃＤＮＡ発現ライブラリーのような既存の方法は、不適切な折り畳み又は不正確な翻訳後修飾のために、その中では真核細胞のタンパク質の多くが非機能的形態で合成されることが明らかとなっている細菌性宿主に限定される。
【００２２】
本発明の方法には、広くインビトロでの用途が考えられ、これは大きく主な三つの分野に分けることができる。これらは、タンパク質−リガンド相互作用の研究、タンパク質−タンパク質相互作用の研究、及びタンパク質−ＤＮＡ相互作用の研究である。
【００２３】
タンパク質−リガンド相互作用
本明細書に記載されている方法によれば、ある新規化学物質とあるプロテオーム中に存在する全てのタンパク質との相互作用を迅速に解明することが可能となるであろう。いわば逆高処理量スクリーニング（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎ）において、様々なストリンジェンシーで、新規化学物質（ＮＣＥ）を用いて適切なプロテオームをプローブするだけで、これを達することができる。このようなスクリーニングから得られた計測値は、多くの場面で直接役に立つものと思われ、そのうちの幾つかは以下に示されている。
【００２４】
細胞又は生物全体に対して化合物のライブラリーを調べる高処理量スクリーニングプログラムによって、しばしば、リード化合物が同定され、これは、スクリーニングに先立って標的が知られていなくても表現型に変化をもたらす。しかしながら、これに引き続いて行われる一次標的の同定は極めて骨の折れる作業であり得る。本発明の方法は、対象としている種の機能的なプロテオームアレイを創作した後、リード化合物を用いて該アレイをスクリーニングして、プロテオーム中の何れのタンパク質を標的としているかを明らかにすることが可能と思われるので、この種の課題に直接応用できる。タンパク質−リガンド相互作用を同定するためのこのような大規模な同時並行的アプローチによって、新規化学物質の一次標的を決定することが大幅に加速且つ簡易化され、同じく重要であるかもしれないさらに弱い二次的相互作用を同定することも可能となろう。さらに、本方法は、種間の交差反応性の問題に直接適用することができ、例えば、ヒトのプロテオーム中に存在する全てのタンパク質との抗真菌候補化合物の相互作用を迅速に評価することが可能となる。その後リード化合物に何らかの最適化を行う上で、この種の情報は極めて有用であることが明らかとなるであろう。
【００２５】
現在、高処理量スクリーニング法によれば、それ自体治療の標的となる可能性があることが以前に明らかとされたあるタンパク質に結合する小分子を迅速に同定することが可能である。しかしながら、これらの方法は、何らかの所定の相互作用がどのくらい選択的であるかを知ることが所定のリード化合物の検査を継続するかどうかを決定する上で極めて重要であるかもしれないにもかかわらず、相互作用がどのくらい選択的であるかという問題に応えるものではない。十分な理解を有する者であれば、数多くの関連するタンパク質又は無関連なタンパク質にもヒットする化合物と比べて、単一のタンパク質を標的とする化合物の方が副作用が少ない可能性があると主張するであろう。
【００２６】
臨床試験の第三相に進むことができたにもかかわらず、主たる作用機序が不明であるために、当局の承認を得ることができない化合物の例が数多く存在している。抗うつ剤ミアンセリンとトラザドン及びファイザーの抗関節炎薬テニダップがその例であり、それぞれ何億ドルもの投資が全く回収されていない。このような薬物の主たる標的を発見した後、作用機序を明らかにすることさえできれば、極めて多大なコストを費やした臨床試験のデータが規制当局の認可を得ることができるので、本明細書に記載されている方法は、このような失敗に終わった薬物を復活させるために利用できる可能性がある。既存の薬物は全て、多かれ少なかれ副作用を有しており、それ余の点では有益な抗統合失調症薬であるクロザピンがその例である。このような副作用の分子的な起始点を決定することができれば、最適な主要効果に加えて副作用が最小である次世代の薬物を設計することが極めて容易となるであろう。ある化合物とプロテオーム中の全タンパク質との相互作用のプロファイルを作製する際に、異常な二次的相互作用が同定され、これらの二次的相互作用は、引き続き、既知の副作用と関連しているかどうかという見地から評価することができると思われるので、本明細書に記載の方法はこのような課題にも直接適用することができる。
【００２７】
一般的な阻害剤を有するプロテオームアレイをスクリーニングすることによって、本発明の方法は、セリンプロテアーゼ等のタンパク質のファミリーを同定するために使用することもできる。次いで、この方法を用いれば、より焦点を絞ったリード化合物のスクリーニングを行うために、例えば、全てのヒトセリンプロテアーゼ又は全てのキナーゼ又は全てのｐ４５０酵素を提示するバイオチップを続いて開発することが可能となるであろう。ｐ４５０によって媒介される水酸化は、代謝過程の第一段階であることが多く、患者毎の薬物反応が異なる主な原因の一つと考えられるので、例えば、ｐ４５０バイオチップは、あるリード化合物が代謝される可能性があるか否かを評価する際に有用であろう。現に、現時の薬物設計の最終目標の一つは、最初から代謝されない化合物を作製することであり、この場合にも、ｐ４５０チップは極めて有用性を有する可能性がある。
【００２８】
タンパク質−タンパク質相互作用
タンパク質−タンパク質相互作用及び多タンパク質複合体は、細胞生物学において特に重要である。例えば、シグナル伝達経路は、一般に細胞表面受容体と外部リガンドとの相互作用によって開始され、この後にタンパク質−タンパク質相互作用のカスケードが続き、最終的に特定の遺伝子を活性化させる。各タンパク質−タンパク質相互作用は、特異的なリガンドの存在に依存しているか、あるいは特異的なリガンドによって遮断されることがあるが、多タンパク質複合体の中には、リガンド依存的にしか形成されないものもあろう。
【００２９】
ツーハイブリッド技術を用いて、何千もの新しいタンパク質−タンパク質相互作用が同定されてきた。本明細書に記載されている方法は、このような方法の限界を克服するものであり、各標識タンパク質を用いて、相互作用の相手方のみならず、各相互作用の相対的な強度をも明らかにするためにプロテオームアレイをスクリーニングするために使用することができる。本方法は、多タンパク質複合体の会合がリガンド依存的である場合でさえ、多タンパク質複合体の成分を同定するために使用することもできる。
【００３０】
新規タンパク質−タンパク質相互作用を明らかにする際に、本発明の方法をこのように使用する例には、疾病状態への関与が示唆されている細胞表面受容体の細胞質ドメインのシグナル伝達の相手方を同定することが挙げられるであろう。このようなタンパク質−タンパク質相互作用から治療の標的となり得る標的が直ちに明らかとなる場合があるので、このようなシグナル伝達の相手方を同定することは、薬学的見地から全く適切であろう。
【００３１】
タンパク質−ＤＮＡ相互作用
ヒトゲノム中に存在する全ての遺伝子の概ね１０％が転写因子をコードしていると推定されているが、これらのうち現時点で同定されているものは僅かである。ＤＮＡエンハンサー要素に特異的転写因子が（多くの場合外的な刺激に応じて）結合することは、エンハンセオソーム複合体の形成に必須であり、次いで該複合体が遺伝子発現のスイッチを入れる。原理的に、遺伝子発現が薬物投与によって影響を受け得る様々なポイントが存在する。薬物によっては、タンパク質又は小分子が細胞表面受容体に結合するのをブロックし、これによりシグナル伝達カスケードを元から遮断する場合もあるし、タンパク質−タンパク質相互作用を遮断し、又はシグナル伝達カスケード内の酵素活性を阻害する場合もある。あるいは、薬物によっては、エンハンセオソーム複合体内の特異的なタンパク質−ＤＮＡ相互作用又はタンパク質−タンパク質相互作用の形成を遮断する場合もある。このような例として、転写因子ＮＦ−κＢは、免疫及び炎症反応、四肢の発育、敗血性ショック、喘息、並びにＨＩＶプロペプチドの産生など多岐にわたる細胞のプロセスに関与している。ＮＦ−κＢの活性化における細胞内シグナル伝達カスケードの多くはこれらのプロセス全てに共通しているので、治療的介入を行うための有望な標的とはなり得ない。従って、これらの反応の差異は、最初のリガンド−受容体相互作用に存するか、又は特異的なエンハンセオソーム複合体の形成に存するかの何れかである。ＮＦ−κＢは、少なくとも１４の異なるエンハンサー要素に結合することが知られており、エンハンセオソーム複合体は、従って、治療の標的になり得る可能性がある。しかしながら、それぞれのエンハンセオソーム複合体の概要を把握するためには、関与する各ＤＮＡ結合タンパク質の数およびお互いのタンパク質−タンパク質相互作用をともに知ることが必要となる。本発明の方法は、これらの両課題を直接解決するために使用することができる。プロテオームアレイは、新規ＤＮＡ結合タンパク質を同定するために、特異的なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることができる。あるいは、転写因子のトランス活性化ドメインが相互作用する他のタンパク質を同定するために、転写因子のトランス活性化ドメインを用いて、プロテオームアレイをスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングの相互相関によって、特定のエンハンセオソーム複合体の新規成分の同定が可能となるはずである。
【００３２】
本発明の方法によって得られるタンパク質アレイを用いれば、アレイ中に提示された各タンパク質を認識する分子を選別することも可能となるであろう。好ましい実施態様において、選別される分子は抗体又は抗体様タンパク質が考えられ、ファージ若しくはリボソーム上にディスプレイされるか、又はコードするｍＲＮＡに共有結合されるであろう。
【００３３】
このように、アレイ中の固定化された各タンパク質に、ファージディスプレイされた抗体ライブラリーを与えることができ、未結合の抗体は洗浄によって除去される。続いて、選別されたファージを回収し、通常の操作に従って細菌を感染するために使用することができる。次いで、さらに選別を進めるために、ファージを感染させた細菌には、選別された前記抗体をディスプレイするファージ粒子を産生させるか、又はそのまま使用するために可溶性の抗体断片を産生させることができる。「抗体」又は「抗体断片」という用語は、本明細書において、マウス、ヒト、ラクダ、又はその他の生物から得られる一本鎖Ｆｖｓ、ＦＡＢ断片、各軽鎖又は重鎖断片を意味する。
【００３４】
好ましい実施態様において、選択工程後に、各ウェルに適切な細菌細胞を加えることによって（細菌は選択されたファージ粒子にウェルの中で感染させる）ファージ粒子を回収できるように、前記タンパク質アレイはマイクロフェルフォーマットであり得る。続いて、アレイ中に固定された各タンパク質に対して選別された抗体断片を物理的に隔離し続けながら、各ウェルに増殖培地を加え、感染させた前記細菌を増殖させて、抗体断片を発現させることができる。所望であれば、その後の選別の際に、感染細菌によって産生された新規ファージ粒子を使用することができる。このような操作は、現在では、ポリクローナル又はモノクローナル抗体断片を単一の精製及び固定化タンパク質に選別するための慣用的操作である。実際、その後、元のタンパク質アレイは、ここで、それ以外は標準的なインビトロ抗体選別法を用いつつ、極めて同時並行的に、ポリクローナル又はモノクローナル抗体断片を何千もの正しく折り畳まれたタンパク質にすることができるであろう。
【００３５】
単一の所定位置に固定化された元のアレイ中のタンパク質に対して新しいアレイの各位置に存在する抗体断片自体が選択されるように、空間的に規定された新しいアレイに、元のアレイの各ウェルに由来する選別され可溶状態で発現されている前記抗体断片自体を固定化することができる。このようにして作製された抗体アレイは、可溶性抗体断片の固定化に先立って実施された選択の回数に応じて、各位置に、ポリクローナル又はモノクローナル抗体断片を含有することになるであろう。
【００３６】
このような抗体アレイには、関連するプロテオームの発現差をモニタリングするために、未精製細胞又は組織可溶化液から得られる各タンパク質を捕捉することを含む数多くの用途が存在し得るであろう。あるいは、抗体補足されたタンパク質のリガンド結合機能を直接スクリーニングしてもよい。一般に、標的タンパク質に結合してその機能を阻害するモノクローナル抗体もあるし、標的タンパク質に結合するが機能を阻害しないモノクローナル抗体もある。大規模な同時並行的アプローチにおいては、全てのモノクローナル抗体について、機能に影響を与えずにプロテオーム中の全タンパク質に結合する能力を個別に評価することが非現実的であることは明らかである。しかしながら、プロテオーム中の全てのタンパク質に対する一群のポリクローナル抗体の中には、機能に影響を与えずに結合するという所望の能力を有する個別の抗体が含有されている可能性があり、さらに、あるタンパク質の全ての翻訳後修飾を認識する個別の抗体が含有されているものと思われる。このため、一般的には、既述のごとく作製されたモノクローナル抗体アレイよりポリクローナル抗体アレイの方が、捕捉されたタンパク質の機能を直接スクリーニングする上では有用であろう。
【００３７】
元のタンパク質アレイに比べて、本明細書に記載された方法によって作られる抗体アレイは、アレイ上に固定化された全てのタンパク質が同様の条件下で安定であるという利点を有するであろう。未精製細胞又は組織可溶化液から捕捉されたタンパク質は組換えタンパク質ではなく、天然に発現されたものであろう。さらに、捕捉されたタンパク質は、未精製細胞又は組織可溶化液から捕捉した後に、機能又はリガンド結合等につき直接スクリーニングすることもでき、これによって、機能の維持を助けるはずである。
【００３８】
このように、さらなる側面において、本発明は、
（１）一以上の化合物の生物活性をスクリーニングする方法であって、前記一以上の化合物を本明細書に記載のタンパク質アレイと接触させる工程と、前記アレイ中の前記タンパク質への前記一以上の化合物の結合を測定する工程とを備えた方法、
（２）一以上のタンパク質の特異的なタンパク質−タンパク質相互作用をスクリーニングする方法であって、前記一以上のタンパク質（例えば、細胞表面受容体）を本明細書に記載のタンパク質アレイに接触させる工程と、前記アレイ中の前記タンパク質との前記一以上のタンパク質の結合を測定する工程とを備えた方法、
（３）一以上のタンパク質の特異的なタンパク質−核酸相互作用をスクリーニングする方法であって、前記一以上の核酸プローブを本明細書に記載のタンパク質アレイと接触させる工程と、前記アレイ中の前記タンパク質への前記プローブの結合を測定する工程とを備えた方法、
（４）化合物、タンパク質、又は核酸の迅速なスクリーニングにおける、本明細書に記載のアレイの使用、
（５）前記アレイ中の各タンパク質を認識する分子のスクリーニングおける本明細書に記載のアレイの使用であって、前記分子が好ましくは抗体である使用、
（６）抗体を作製する方法であって、タンパク質アレイ中の一以上のタンパク質が抗体ライブラリー中の少なくとも一つの抗体に結合するように、本明細書に記載のタンパク質アレイを前記抗体ライブラリーに接触させることと、未結合の抗体を全て除去することと、前記タンパク質アレイ中のタンパク質に結合した抗体を固定化することとを備えた方法、及び
（７）タンパク質の機能又は量をスクリーニングする方法であって、本明細書に記載の抗体アレイを一以上のタンパク質の混合物に接触させる工程を備えた方法を提供する。
【００３９】
前記方法（１）、（２）、（３）、及び（４）は、まず、本発明の一以上の方法によって前記アレイを準備する工程を含んでもよい。
【００４０】
本明細書に記載された方法から得られたタンパク質の使用は、本発明の別の側面を構成する。当業者であれば、修飾タンパク質が利用され得る広範な用途が本分野において公知であることが理解できるであろう。
【００４１】
従って、さらなる側面において、本発明は、
（１）多数の発現宿主（すなわち、細菌、酵母、哺乳類細胞）における本発明の方法によって作製されたタグ標識タンパク質の発現（例えば、Ｗａｌｋｅｒ　ＥＡ、Ｃｌａｒｋ　ＡＭ、Ｈｅｗｉｓｏｎ　Ｍ、Ｒｉｄｅ　ＪＰ、Ｓｔｅｗａｒｔ　ＰＭ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　１１−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｔｙｐｅ　１．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２００１　Ｊｕｎ　１５；　２７６（２４）：２１３４３−５０；Ｃａｉ　Ｊ，Ｄａｏｕｄ　Ｒ，Ｇｅｏｒｇｅｓ　Ｅ，　Ｇｒｏｓ　Ｐ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２００１　Ｊｕｌ　１７；４０（２８）：８３０７−１６，ａｎｄ　Ｈａｒａ　Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｈ，Ｕｃｈｉｄａ　Ｓ，Ｔｏｙｏｄａ　Ｙ，　Ａｏｋｉ　Ｍ，　Ｓａｋａｉ　Ｙ，　Ｍｏｒｉｍｏｔｏ　Ｓ，Ｓｈｉｏｋａｗａ　Ｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｓｓｏｃｉｎ，　ａ　ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ（１）．Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　２００１　Ｊｕｌ３０；１５２０（１）：４５−５３参照）、
（２）本明細書に記載されている方法によって得られたタグ標識されたタンパク質の使用、
（３）前記修飾されたＤＮＡ分子を酵母ツーハイブリッド発現ベクター中にクローニングすることを介して酵母ツーハイブリッド系内での発現されたタンパク質と他のタンパク質との相互作用を分析するための、本明細書に記載された方法によって作製されたタグ標識タンパク質の使用（例えば、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ　Ｊ，　Ｐｅｒｒｙ　Ｍ，　Ｅｌｌｅｄｇｅ　ＳＪ，　Ｏｌｓｏｎ　ＥＮ．　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ａｍｏｎｇ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９９３　Ｍａｒ　５；　２６８　（７）：　４６０８−１１，　ａｎｄ　Ｖｏｊｔｅｋ　ＡＢ，　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ　ＳＭ，　Ｃｏｏｐｅｒ　ＪＡ．　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｒａｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｒａｆ．　Ｃｅｌｌ　１９９３　Ｊｕｌ　１６；　７４（１）：　２０５−１４参照）、
（４）アフィニテイーカラム／担体上に固定化して例えばａ）相互作用するタンパク質、ｂ）ＤＮＡ、又はｃ）化学的化合物をアフィニティークロマトグラフィーによって精製できるようにするための、本明細書に記載された方法によって作製されたタグ標識タンパク質の使用（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ　Ｎ，Ｇｉｌｍｅｒ　ＴＭ，Ｌａｎｓｉｎｇ　ＴＪ．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｔｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ．　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ　Ｐｕｒｉｆ　２００１　Ａｕｇ；２２（３）：４６２−６；Ｚｗｉｃｋｅｒ　Ｎ，Ａｄｅｌｈｅｌｍ　Ｋ，　Ｔｈｉｅｒｉｃｋｅ　Ｒ，Ｇｒａｂｌｅｙ　Ｓ，Ｈａｎｅｌ　Ｆ．Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ　ｆｏｒ　ｏｎｅ−ｓｔｅｐ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｅ　ｂＨＬＨｚｉｐ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃ−Ｍｙｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９９９　Ａｕｇ２７（２）：３６８−７５，　ａｎｄ　Ｇｉｕｌｉａｎｉ　ＣＤ，Ｉｅｍｍａ　ＭＲ，　Ｂｏｎｄｉｏｌｉ　ＡＣ，　Ｓｏｕｚａ　ＤＨ，　Ｆｅｒｒｅｉｒａ　ＬＬ，　Ａｍａｒａｌ　ＡＣ，　Ｓａｌｖｉｎｉ　ＴＦ，　Ｓｅｌｉｓｔｒｅ−ｄｅ−Ａｒａｕｊｏ　ＨＳ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｌｙｓｉｎｅ　４９　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ａ（２）　ｍｙｏｔｏｘｉｎ　ａｓ　ａ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｔｏｘｉｃｏｎ　２００１　Ｏｃｔ；３９（１０）：１５９５−６００参照）。
【００４２】
（５）診断ツールとして抗体による精査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を行うためのアフィニテイー精製による固定化（ＥＬＩＳＡアッセイ）における、本明細書に記載の方法によって作製されたタグ標識タンパク質の使用（例えば、Ｄｏｅｌｌｇａｓｔ　ＧＪ，　Ｔｒｉｓｃｏｔｔ　ＭＸ，　Ｂｅａｒｄ　ＧＡ，　Ｂｏｔｔｏｍｓ　ＪＤ，　Ｃｈｅｎｇ　Ｔ，　Ｒｏｈ　ＢＨ，　Ｒｏｍａｎ　ＭＧ，　Ｈａｌｌ　ＰＡ，　Ｂｒｏｗｎ　ＪＥ．　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ　Ａ，　Ｂ，　ａｎｄ　Ｅ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｖｉａ　ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ．　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１９９３　Ｓｅｐ；　３１　（９）：　２４０２−９参照）、
（６）ＤＮＡ結合タンパク質を同定するためのｃＤＮＡマイクロアレイ用のプローブとしての、本明細書に記載された方法によって得られるタグ標識されたタンパク質の使用（例えば、ＤｅＲｉｓｉ　Ｊ，　Ｐｅｎｌａｎｄ　Ｌ，　Ｂｒｏｗｎ　ＰＯ，　Ｂｉｔｔｎｅｒ　ＭＬ，　Ｍｅｌｔｚｅｒ　ＰＳ，　Ｒａｙ　Ｍ，　Ｃｈｅｎ　Ｙ，　Ｓｕ　ＹＡ，　Ｔｒｅｎｔ　ＪＭ　Ｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｔｏ　ａｎａｌｙｓｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃａｎｃｅｒ．　Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ　１９９６　Ｄｅｃ；　１４　（４）：　４５７−６０参照）。
【００４３】
（７）本発明の方法によって改変された原ライブラリー又は初発物質の被発現タンパク質成分の質量分析によって「プロテオーム」中のタンパク質の種類（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を明らかにするための本明細書に記載された方法によって作製されたタグ標識タンパク質の使用（例えば、Ｂｏｒｄｉｎｉ　Ｅ，　Ｈａｍｄａｎ　Ｍ．　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｃｏｖａｌｅｎｔ　ａｎｄ　ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｂｙ　ｍａｔｒｉｘ−　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｍａｓｓ　ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．　Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ　１９９９；　１３　（１２）：１１４３−５１参照）。
【００４４】
本発明の各側面の好ましい特徴は、その他の各側面に対しても互いに当てはまるものである。
【００４５】
【実施例】
ここで、次に挙げる例を参照して本発明を説明するが、これらの例は、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４６】
例１
（ａ）ベクターの構築（図１ａ参照）
本発明者らは、強力なハイブリッドプロモーター（Ｐｔｒｃ）を含有し、該プロモーター配列のすぐ下流に存在するＮｃｏＩサイトにクローニングした遺伝子発現を誘導するｐＵＣ１９由来のベクターｐＭＭ１０６Ｈを構築した。本発明者らは、６７６ｂｐのナンセンスＤＮＡ配列を詰め込み断片としてＮｃｏＩサイトと下流のＨｐａＩサイトとの間に挿入した。ＨｐａＩは、平滑末端カッターであり、リーディングフレームが平滑末端の第一の塩基にある場合、下流のＤＮＡがポリアスパラギン、ヘキサヒスチジンペプチドをコードするように、ベクターを切断するために置かれている。ヘキサヒスチジンタグに続いて、アンバー停止コドン（ＴＡＧ）があり、それに続いてクラゲ、Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が存在する。配列決定によりｐＭＭ１０６Ｈの構築を確認した。
【００４７】
ＮｃｏＩ／平滑末端断片としてｐＭＭ１０６Ｈにクローニングした遺伝子は、クローニングの際に、ＨｐａＩサイトに正確なリーディングフレームが作出された場合にしか、Ｈｉｓ−タグ及びＧＦＰへの融合物を生じない。ここでは、リポーター遺伝子としてＧＦＰを使用し、Ｈｉｓタグを発現しているクローンの可視的スクリーニングを容易にし、同時に、ＧＦＰは正確なコンフメーションに折り畳まれた時にのみ活性を有するので、ＧＦＰは融合タンパク質の正確な折り畳みの指標となる。アンバー停止コドンにより、緑色を呈するコロニーを可視化する全長融合タンパク質が少量得られるが、殆どの融合タンパク質はＨｉｓタグの直後で終わり、それら融合タンパク質を次の固定化及び酵素分析に使用することができる。タンパク質の多くの様々なペプチドのうち、その可溶性発現物がある観察可能な表現型を細胞に付与するペプチドを、タグ標識タンパク質の発現及び折り畳みのマーカーとしてＧＦＰの代わりに使用できるであろうことが理解されるべきである。これらには、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼのｌａｃＺ断片、及びλ−ＣＩリプレッサーのような転写を抑制し得るタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
下記に概説されている方法において使用する鋳型は、ｐＧＳＴＮであった。標準的条件下で、プライマー「ＧＳＴｆｗｄ２」（５’−ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＴＣＣ　ＡＴＧ　ＧＣＣ ＣＣＴ　ＡＴＡ　ＣＴＡ　ＧＧ−３’）及び「ＧＳＴＨｉｎｄＩＩＩ」（５’−ＧＣＧ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＴＣ　ＡＡＴ　ＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣ　Ｇ−３’）を用いて、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ　のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に第一のＰＣＲ増幅を行うことによって、このプラスミドを構築した。これらのプライマーは、ＧＳＴの開始コドンにＮｃｏＩ制限サイトを導入し、ＧＳＴの第二の残基をセリンからアラニンに変異させ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトが後置されたＧＳＴ遺伝子のマルチクローニングサイト３’−に停止コドンを導入する。次に、標準的条件下で、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、前もってＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＰＣＲ産物をクローニングし、ｐＧＳＴＮを作製した。
【００４９】
（ｂ）タギング前の遺伝子のＰＣＲ増幅及びエキソヌクレアーゼ消化（図１ｂ参照）
本発明者らは、ベクターの開始コドンから１５６ｂｐ上流及び停止コドンの８４ｂｐ下流にそれぞれ結合する特注設計したベクター特異的プライマー「ＳＴｆｏｒｗａｒｄ」（５’−ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＴＧＡ　ＧＧＣ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＧＧＣ　ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＡＡＣ　ＡＡＴ　ＴＴＣ　ＡＣＡ　ＣＡＧ　Ｇ−３’）及び「ＳＴｒｅｖｅｒｓｅ」（５’−ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＴＧＣ　ＧＧＣ　ＣＧＣ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＧＴＴ　Ｔ−３’）を用いたポリメラーゼ連鎖反応を利用してコンストラクトｐＧＳＴＮからＧＳＴ遺伝子を増幅した。４個の別々の１００μｌ反応系の中で、３０サイクル（９４℃で１分、５７℃で１分、７２℃で２分）のＰＣＲを行った。各ＰＣＲ反応系には、〜２０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、及び２．５ユニットのＰｗｏポリメラーゼが含有されていた。標準的緩衝液中（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ　ｐＨ８．８、２５ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１０％　ＤＭＳＯ）中で各ＰＣＲ反応を行った。４つの前記ＰＣＲ反応は、それぞれ、以下の非標準的デオキシヌクレオチドトリホスフェート混合液も含有していた。
【００５０】
反応１）２００μＭ　ｄＡＴＰ、２００μＭ　ｄＴＴＰ、２００μＭ　ｄＣＴＰ、１５０μＭ　ｄＧＴＰ、５０μＭ　α−Ｓ−ｄＧＴＰ、
反応２）２００μＭ　ｄＡＴＰ、２００μＭ　ｄＴＴＰ、２００μＭ　ｄＧＴＰ、１５０μＭ　ｄＣＴＰ、５０μＭ　α−Ｓ−ｄＣＴＰ、
反応３）２００μＭ　ｄＡＴＰ、２００μＭ　ｄＧＴＰ、２００μＭ　ｄＣＴＰ、
１５０μＭ　ｄＴＴＰ、５０μＭ　α−Ｓ−ｄＴＴＰ、
反応４）２００μＭ　ｄＧＴＰ、２００μＭ　ｄＴＴＰ、２００μＭ　ｄＣＴＰ、１５０μＭ　ｄＡＴＰ、５０μＭ　α−Ｓ−ｄＡＴＰ
言うまでもなく、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＴａｐ　ポリメラーゼのような温度安定性ポリメラーゼ及び、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片などの非温度安定性ポリメラーゼを含む多くの異なる種類のＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長反応により、α−Ｓ−ｄＮＴＰ存在下での鋳型ＤＮＡの増幅を行うことができる。
【００５１】
各特異的ＰＣＲ混合液に単一のα−チオデオキシヌクレオチドトリホスフェートを添加することにより、適切なα−Ｓ−ｄＮＴＰが、ランダムであるが統計学的に、特定の最終ＰＣＲ産物中に取り込まれる。これらの改変ヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼＩＩＩの基質ではなく、酵素によるヌクレオチド除去の進行を停止させるために使用される。４種類の個々のＰＣＲ混合液を集め、標準的条件下で、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎｕｐ　ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて精製し、制限酵素ＡａｔＩＩで完全に消化した。次に、得られた〜１０００ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製した。ＡａｔＩＩを用いた制限酵素切断により、エキソヌクレアーゼＩＩＩ活性で消化されない３’−突出部が得られるため、前記ＰＣＲ産物の５’末端は分解から保護される。
【００５２】
エキソヌクレアーゼ消化から特異的にＰＣＲ産物の片方の末端を保護するこれ以外の方法は以下のものを含め容易に挙げることができるが、これらに限定されない。必要なサイトがＰＣＲプライマーのデザイン中に取り込まれる限り、４塩基以上の３’−突出部を生ぜしめる任意の制限酵素をＡａｔＩＩの替わりに使用することが可能であろう。５’−突出部を形成する任意の制限酵素も、必要なサイトがＰＣＲプライマーのデザインに取り込まれる限り、ＡａｔＩＩの替わりに使用することが可能であろう。この場合、ＰＣＲ産物の新しい３’−末端がエキソヌクレアーゼ消化から保護されるように、ｄＮＴＰの替わりに適切なα−チオｄＮＴＰを使用するＤＮＡ−ポリメラーゼ媒介性の埋め込み反応（ｆｉｌｌ−ｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）が５’−突出部の形成に続いて行われるであろう。
【００５３】
次に、１５０μｌの反応系で、消化した１０〜１５μｇの前記ＰＣＲ産物を７５ｕｎｉｔｓのエキソヌクレアーゼＩＩＩ／μｇＤＮＡと共に、３７℃で３０分間インキュベーショトした。標準的反応緩衝液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ　ｐＨ８．０、６．６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン）でＥｘｏＩＩＩ消化を行った。これらの条件により、確実に、ＥｘｏＩＩＩによる消化が完全に行われる。次に、７５℃まで１５分間加熱して酵素を不活性化した。ＥｘｏＩＩＩ消化の産物は、前記ＰＣＲ産物の３’から得られる一群の入れ子型欠失物である。
【００５４】
エキソヌクレアーゼＩＩＩはα−チオ−含有ヌクレオチドを加水分解することができない非進行的な３’→５’エキソヌクレアーゼなので、現在のプロトコールでは、ＥｘｏＩＩＩがα−チオ−デオキシヌクレオチド塩基に到達するごとに、ＰＣＲ産物の３’陥凹末端における末端切断の進行が停止する。従って、最終的に得られるのは、これより前の段階で各α−Ｓ−ｄＮＴＰをランダムに取り込んだ結果生じる一群の入れ子型欠失物である。最初のＰＣＲ増幅で使用するｄＮＴＰに対するα−Ｓ−ｄＮＴＰの比率は、入れ子型欠失物のエンベロープが、元の完全長ＰＣＲ産物より約１００ｂｐ短く中心に位置したサイズ４００ｂｐのウインドウにわたるように経験的に決定した。
【００５５】
通常のｄＮＴＰに対するα−Ｓ−ｄＮＴＰの比率を変化させることにより、得られる末端切断の大きさの範囲を調節し得る。真核ｃＤＮＡは最も一般的な３’−ＵＴＲ長が２００〜３００ｂｐの範囲に入るような様々な長さの３’非翻訳領域を有するので、これは、本方法を真核ｃＤＮＡに適用する際に重要である。ポリメラーゼの種類によって４つの各α−Ｓ−ｄＮＴＰの相対的取り込み効率が変化するので、４つの各塩基及び特定のポリメラーゼに最適化されたα−Ｓ−ｄＮＴＰ／通常ｄＮＴＰ比率を使用することが望ましい。典型的には、使用される通常のｄＮＴＰに対するラセミ体α−Ｓ−ｄＮＴＰのモル比は、１：１乃至１：３の範囲内に入るであろう。
【００５６】
（ｃ）一本鎖領域の除去及びクローニングの準備（図１ｃを参照）
エタノール沈殿により、前の段階でエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化により作製した一群の入れ子型欠失物を精製し、１×リョクトウヌクレアーゼ緩衝液（５０ｍＭ　酢酸ナトリウム　ｐＨ５．０、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＺｎＳＯ４）で再懸濁した。１００μｌの反応系中で、３０℃にて３０分間（２ｕｎｉｔｓ／μｇ）３０Ｕｎｉｔｓのリョクトウヌクレアーゼを用いて、消化した前記ＤＮＡを処理した。この工程により、５’−及び３’−突出末端は除去され、平滑末端産物を得た。最終濃度が５ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加して反応を停止した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて、消化した前記産物を精製し、ＮｃｏＩで消化し、標準物質として１００ｂｐ　ＤＮＡラダーを用いて１％のアガロース／ＴＢＥゲルで分離した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから大きさが８００〜１０００ｂｐの範囲の産物を抽出した。明らかに、Ｓ１ヌクレアーゼのような他の一本鎖ヌクレアーゼを使用して、３’→５’−エキソヌクレアーゼにより生成した一群の３’−入れ子型欠失物から５’−突出部を除去することもできる。
【００５７】
（ｄ）入れ子型欠失物の調製の変法
一群の入れ子型欠失物を作製するための多くの他の標準的分子生物学的手法が本来の手技の変法となることが明らかである。これらには、任意の３’→５’エキソヌクレアーゼ、任意の５’→３’エキソヌクレアーゼ、又は線状ＤＮＡ断片の末端から漸進的に末端切断する任意のエンドヌクレアーゼの使用が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＧＳＴ遺伝子の開始位置からおよそ２ｋｂ上流に結合するフォワードプライマーとともに、上記と同じリバースプライマーを使用して、最初のＰＣＲ増幅を行うことができる。これにより、ＧＳＴ遺伝子の５’末端に＞２ｋｂが、３’端には僅かに８４ｂｐが隣接した断片が生じるであろう。次に、精製したＰＣＲ断片をＢａｌ　３１ヌクレアーゼで処理することが可能であり、それにより５’−末端及び３’−末端の両方から漸進的に線状の二本鎖ＤＮＡが分解される。この酵素は非進行的であり、ＤＮＡ分解速度は、ＤＮＡの塩基組成だけでなく反応時間及び温度に依存する。ＰＣＲ産物中のＧＳＴ遺伝子の３’末端のフランキング領域が５’末端のフランキング領域よりも著しく短いので、他方の末端から開始コドンに到達するかなり前に、停止コドンまで、及び停止コドンを越えて分解が進んでいるであろう。時間的経過を調べる実験により、ＰＣＲ産物の３’−端から４００ｂｐまでの長さを除去する至適反応条件を決定できるようになる。続いて、得られた一群の入れ子型欠失物を平滑末端にし、残存する一本鎖領域を全て除去し、元のベクターによって前記遺伝子の５’末端にコードされたユニークな制限酵素で消化し、タグベクターに方向性を持ってクローニングした。或いは、ラムダエキソヌクレアーゼを使用して一群の入れ子型５’−欠失物を生ぜしめることが可能である。この酵素に対する好ましい基質は５’リン酸化二本鎖ＤＮＡであるので、５’ヒドロキシ末端を有することによってＤＮＡ基質の片方の末端を容易に保護することができる。Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ又は、ＲＮＡｓｅ　Ｔ又はエキソヌクレアーゼＴ又はリョクトウヌクレアーゼなどの一本鎖ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼを含む多く様々な酵素により、５’→３−エキソヌクレアーゼにより生じた一群の入れ子型５’−欠失物の一本鎖３’突出部を除去し得る。
【００５８】
（ｅ）改変産物のクローニング及び分析（図１ｃ参照）
ベクターｐＭＭ１０６Ｈ（３μｇ）を制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｐａＩを用いて完全に消化し、２８７０ｂｐのバックボーン断片をゲル精製した。標準的条件下でベクターＤＮＡ及び上記のように調製した制限産物をライゲーションし、ライゲーション混合液を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞を形質転換し、次にこれを回収して１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢプレートに播種した。
【００５９】
前の段階で得られた一群の欠失物全てに対してこのクローニング操作を遂行した。しかし、ＧＳＴ遺伝子の停止コドンを切断しインフレームコドンの直後で終わる欠失物のみが、この操作によるクローニング段階後にヘキサヒスチジンタグ及びＧＦＰに対するインフレーム融合物を生じさせ得るはずであり、このようにしてクローニングした他の欠失産物は全て、ヘキサヒスチジンタグ及びＧＦＰにへの読み枠からはずれた融合物か、ＧＳＴ停止コドンでの翻訳の終結に起因する非融合ＧＳＴタンパク質のみを生じせしめるはずである。これは、ベクターの平滑末端に欠失産物の平滑末端がライゲーションすることによって、下流のベクターＤＮＡの翻訳リーディングフレームがＧＳＴコード領域の元のリーディングフレームにより支配される遺伝子融合が起こるからである。前記欠失産物がＧＳＴ停止コドンを保持していれば、ヘキサヒスチジンタグへのＧＳＴの翻訳可能な融合は起こらないと思われるのに対して、前記欠失産物が不完全なコドンで停止すれば、新しく付加されたヘキサヒスチジン−コード配列は、ＧＳＴ遺伝子に関して読み枠からはずれたものとなろう。従って、上記工程全体から生じ得るヘキサヒスチジン−（及びＧＦＰ−）タグ標識タンパク質のみが必然的にポリアスパラギン、ヘキサヒスチジンタグに対するＧＳＴ融合物となるであろう。これらは、必ずしも完全長のクローンではないであろうが、さらなる工程において、それらが正確に折り畳みを行う能力及び酵素活性の保持についてのスクリーニングが行われることになろう。
【００６０】
形質転換を行ったコロニーをＵＶ光（３６５ｎｍ）下で可視化し、さらに分析を行うために、緑色蛍光を発する３０コロニー（全体のおよそ１０％）を肉眼で選択した。これらのコロニーのレプリカ−プレート作製し、抗−Ｈｉｓ−ｔａｇ及び抗−ＧＳＴ抗体を用いて標準的条件下でコロニーウエスタンブロットによって分析した。抗−Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体は、ヘキサヒスチジン−タグ標識されたタンパク質を発現するコロニーのみと結合するので、ウエスタンブロットによりヘキサヒスチジン−タグに対するインフレーム融合物を発現するコロニー数に関する情報を直接得ることができる。一方、抗−ＧＳＴ抗体は、ＧＳＴタンパク質のＣ−末端近傍に結合するため、全長又はほぼ全長のＧＳＴタンパク質を発現するコロニーのみを認識する。本発明者らは、抗−Ｈｉｓ−ｔａｇ及び抗−ＧＳＴ抗体の両者によってポジティブであると認識されたタンパク質を含有する１９個のコロニー（緑色蛍光を発するコロニーのうち６３％）を同定した。これらコロニーのうち、１２個のコロニー由来のＤＮＡを増幅し、精製して配列決定を行った。配列決定データにより、全長ＧＳＴに対する完璧な２つのインフレーム融合物２及び、ＧＳＴ遺伝子中に短い末端切断を有するが、ヘキサヒスチジンタグに関してはなおインフレームである１０個のクローンの存在が確認された。従って、この操作全体によって本発明者らが得た全長ＧＳＴクローンの単離頻度は、（緑色蛍光を発するコロニーの総数の）およそ１７％であるのに対して、全長又はほぼ全長で、活性を保持すると予想されるＧＳＴクローンの単離頻度は、（緑色蛍光を発するコロニーの総数の）およそ６３％である。
【００６１】
（ｆ）タグ付加タンパク質の固定化及び機能分析（図１ｄ参照）
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞に、上記の方法により作製した全長のヘキサヒスチジンタグ付加ＧＳＴプラスミドのうちの１つを形質転換した。１０ｍｌの液体培地中で、単一のカルベニシリン−抵抗性コロニーを中央対数増殖期まで増殖させ、次に１００μＭのＩＰＴＧを補充してヘキサヒスチジン−タグ付加ＧＳＴの発現を誘導した。さらに４時間培養を行った後、細胞を回収し凍結融解／ライソザイムにより溶菌させた。未精製溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、予想したサイズ（２７ｋＤａ）にタンパク質が過剰発現しており（総可溶性タンパク質のうちおよそ２０％を占めた）、アンバー抑制によって生じた５４ｋＤａのＧＳＴ−ヘキサヒスチジン−ＧＦＰ融合タンパク質も少量存在することが示された。次に、未精製溶菌液（５００μｌ、１００μｇ）をニッケル−ＮＴＡマグネチックビーズ（５０μｌ、結合容量　１５μｇ　ヘキサヒスチジン−タグ標識タンパク質）と混合し、磁場をかけてビーズを沈降させて回収した。上清を捨て、ビーズを洗浄した後、グルタチオン及び１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンをそれぞれ１ｍＭずつ含有するグルタチオンＳトランスフェラーゼアッセイ用緩衝液の中に再懸濁した。室温で３０分後に、３４０ｎｍでの吸光度を測定してエンドポイントアッセイのデータを集めた。この３４０ｎｍという波長は、ＧＳＴ−触媒反応産物のλｍａｘに相当する。
【００６２】
対照として、親ベクター（ｐＭＭ１０６Ｈ）又は無関係なＨｉｓ−タグ付加タンパク質（アラニンラセマーゼ）をコードするプラスミドの何れかを含有するＤＨ５αを培養、誘導、回収、溶菌し、平行してアッセイを行った。Ｈｉｓ−タグ付加ＧＳＴを含有する未精製溶菌液と混合しておいたビーズのみにＧＳＴ活性が検出され、そ観察されたＧＳＴ活性が専ら固定化したＨｉｓタグ付加ＧＳＴによるものであり、さらにそのタンパク質が特異的固定化において活性を保持することが明らかに示している。
【００６３】
酵素アッセイ完了後、１００ｍＭ　イミダゾールを含有する緩衝液を添加してマグネチックビーズからタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析を行った。これにより、ポジティブな活性アッセイの結果を与えた試料がグルタチオンＳトランスフェラーゼ（２７ｋＤａ）に対して予想される正確な分子量を有する単一の固定化タンパク質を含有することが示され、従って、ビーズに対して観察された活性がこの組換えＨｉｓ−タグ付加タンパク質のみによるものであると確認された。
【００６４】
例２
（ａ）ベクターの構築
本発明者らは、第二のベクターであるｐＭＭ１１１を構築した。このｐＭＭ１１１は、６７６ｂｐのＮｃｏＩ／ＨｐａＩナンセンスＤＮＡ詰め込み断片がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｇｄｈＡ遺伝子由来の３００ｂｐのＮｃｏＩ／ＨｐａＩ断片と置換され、ＨｐａＩクローニングサイトがＳｍａＩサイトで置換され、下流のヘキサヒスチジンタグがｇｄｈＡ遺伝子により２ヌクレオチド分フレーム外に移動するように位置しており、ＧＦＰ遺伝子のＡＴＧ開始コドンがアラニン（ＧＣＧ）のコドンに置換されていること以外は、ｐＭＭ１０６Ｈ（例１参照）と基本的に同様である。ＳｍａＩサイトにクローニングされた挿入断片が、その３’末端においてコドンの第一のヌクレオチドを必ず含有して、その挿入断片がヘキサヒスチジンタグ及びＧＦＰと共にフレーム内に置かれるように前記ベクターをデザインしている。ｐＭＭ１１１の構築を配列決定により確認した。
【００６５】
（ｂ）タグを導入するための改変方法
次に、本発明者らは、以下の改変を除き、例１にて記述したのと同様の操作を行った。まず、オリジナルのＰＣＲ増幅、即ちセクション（ｂ）の反応番号３だけにα−Ｓ−ｄＴＴＰを取り込ませた。次に、ベクターｐＭＭ１１１のＮｃｏＩ及びＳｍａＩサイトに最終産物をクローニングした。
【００６６】
この操作には、例１で記述した操作よりも理論的に有利な点がいくつか存在する。これらは、主にオリジナルのＰＣＲ産物に単一のα−チオ　ｄＮＴＰが取り込まれる際の統計に起因するものである。従って、徹底的なエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化を行うと、全ての入れ子型３’陥凹欠失物群は、４個のうち何れかのヌクレオチドで終結するのではなく、３’−チミジン塩基で終結するであろう。３’−Ｔが、ＧＳＴ遺伝子の第一のインフレーム停止コドン中の塩基であるか、又はこれより前に位置し、且つ第一のインフレーム停止コドンの「Ｔ」と同じリーディングフレーム中にある場合には、ｐＭＭ１１１のＳｍａＩサイトへこれらの断片をクローニングすることによって、ヘキサヒスチジンタグ及びＧＦＰに対するインフレーム融合のみが起こるであろう（これは、ＳｍａＩによる消化によって、タグのコード配列の前に２ヌクレオチドのギャップが生じるからである。）。
【００６７】
統計的には、この改変操作におけるエキソヌクレアーゼ加水分解によって得られる入れ子型欠失物は例１の１／４であろう。しかし、停止コドンとなり得る３つのコドンは全てそれらの最初の塩基として「Ｔ」を含有するので、それらは全て前記欠失物群中に含まれることとなり、それ故、完全な欠失物群の４倍高い割合を占めるであろう。任意のある「Ｔ」が、停止コドンの第一の「Ｔ」と同じリーディングフレームである可能性があるならば、この改変操作から得られる全クローンのうち３３％が、ベクターによりコードされるＨｉｓタグへのインフレーム融合物となるはずであるが、折り畳み（その結果として機能に）に影響を及ぼすそのような欠失物からは（例１で述べた理由により）「白い」コロニーが生じる。本発明者らは、この改変操作に続いて、「緑色」のコロニー集団中の正確な完全長のクローンの割合が、例１の操作によって見いだされた割合より有意に高いということを見出した。既知の開始コドン（ＡＴＧ，ＧＴＧ，ＴＴＧ，ＡＴＴ，ＣＴＧ）全てが第二番目に「Ｔ」を含有するので、言うまでもなく、同様の議論が「開始」コドンに対しても当てはまる。
【００６８】
この改変操作の更なる利点は、最初のＰＣＲ増幅時に使用するフォワードプライマーの５’末端にポリＡテイルを取り込みうることである（例えば、フォワードＡ　５’−ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＧＧＡ　ＴＡＡ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＧＧ−３’）。３：１のｄＴＴＰ：α−Ｓ−ｄＴＴＰ比で増幅を行う間に、最低１個のα−Ｓ−ｄＴＴＰ残基が、ＰＣＲ産物の５’−末端で、相補鎖の末端に取り込まれる可能性が高いであろう。取り込まれたこれらのヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化に対して抵抗性を有するので、酵素反応段階においてＰＣＲ産物の５’−末端を分解から特に保護する必要がないであろう。
【００６９】
例３
（ａ）ヘキサヒスチジンタグを用いた第２のタンパク質の改変
例１で記述したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対する操作に続いて、本発明者らは、この操作が、操作対象の遺伝子配列に依存しないことを示した。
【００７０】
従って、ヒト転写因子であるＮＦ−κＢ　ｐ５０をコードするプラスミドを用いて開始し、特に断っていない限り例１で記述した操作に正確に従うことによって、本発明者らは、第一のインフレーム停止コドンが切断され、ポリアスパラギン、ヘキサヒスチジンタグ及びＧＦＰをコードするＤＮＡへのインフレーム融合によって置換されるように、ＮＦ−κＢ　ｐ５０の改変を行うことができた（アンバー停止コドンが抑制される場合）。遠紫外光（３６５ｎｍ）で励起させると緑色蛍光を発するクローンの性質をさらに調べた。抗−Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたコロニーウエスタンブロットにより、ヘキサへキスチジン−タグ標識タンパク質を発現するクローンの同定を行うことができた。これらのクローンの可溶性タンパク質溶菌液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離して、抗−Ｈｉｓタグ抗体で調べた。およそ６５ｋＤａ　Ｍｒ（ヘキサヒスチジンタグ及びＧＦＰに翻訳可能に融合したＮＦ−κＢ　ｐ５０に相当する）、及びおよそ３８ｋＤａＭｒ（ＮＦ−κＢ　ｐ５０−Ｈｉｓタグ）で免疫反応シグナルを観察した。さらに、２７ｋＤａＭｒ近辺にシグナルが観察されたが、これはおそらくＨｉｓタグ標識ＧＦＰタンパク質に対応する分解産物である。配列決定データから、ヘキサヒスチジンタグに対して全長又はほぼ全長のＮＦ−κＢの完全なインフレーム融合物をコードするクローンがいくつか存在することが確認された。一回の実験で、緑色蛍光について１９０個のコロニーをスクリーニングした。遠紫外線光（３６５ｎｍ）で励起したところ、全部で３８個（スクリーニングを行った全クローン数の２０％）が緑色蛍光を発した。抗−Ｈｉｓ　ｔａｇ抗体を用いたコロニーウェスタンブロッティングを行ったところ、３８個のクローンのうち２９個がヘキサヒスチジンタグを発現することが明らかになった。配列決定データにより、これらのクローンのうち１８個が、ヘキサヒスチジンタグに対するＮＦ−κＢ　ｐ５０の全長又はほぼ全長のインフレーム融合物であり、これらのクローンのうち７個が完全に全長のヒスタグ付加ＮＦ−κＢ　ｐ５０遺伝子であり、残りの１１個のＨｉｓ−タグ標識クローンは４〜１アミノ酸残基の短い末端切断を有していることが確認された。
【００７１】
この実験から、タンパク質の発現及び正確な折り畳みを表すリポーター系を有することによる利点が明らかに示される。緑色蛍光を発するクローンのうち大体５０％がＨｉｓ−タグへの完全長インフレーム融合物であるか、又はドメイン境界にまたがらない微小な末端切断を有し、Ｈｉｓ−タグに対してインフレームに融合するものであった。
【００７２】
（ｂ）ヘキサヒスチジンタグ付加ＮＦ−κＢ　ｐ５０の固定化及び機能分析
上記方法により作製した全長ヘキサヒスチジンタグ付加ＮＦ−κＢプラスミドの一つをＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞に形質転換した。１０ｍｌの液体培養系で１個のカルベニシリン抵抗性コロニーを中央対数増殖期まで増殖させ、次に１００μＭのＩＰＴＧを添加してヘキサヒスチジンタグ付加ＮＦ−κＢ　ｐ５０の発現を誘導した。さらに４時間培養した後、細胞を回収し超音波破砕により溶菌した。未精製溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、予想した分子量（３８ｋＤａ）でタンパク質が過剰発現しており、これは全可溶性タンパク質のおよそ５％であることが示された。
【００７３】
κＢモチーフ
５’−ＣＧＴ　ＡＴＧ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣ　ＡＧＣ　ＧＧＡ　ＴＡＡ　Ｃ−３’
３’−ＧＣＡ　ＴＡＣ　ＡＡＣ　ＡＣＣ　ＣＣＴ　ＴＡＡ　ＧＧＧ　ＴＣＧ　ＣＣＴ　ＡＴＴ　Ｇ−５’
ＮＦ−κＢ　ｐ５０結合サイト
ＮＦ−κＢ　ｐ５０に対するパリンドローム結合サイトを含有する二重鎖オリゴヌクレオチド「κＢモチーフ」を、標準的条件下で３−ターミナルトランスフェラーゼを用いて３’−塩基にジゴキシゲニンで標識した。
【００７４】
５ｍＭ　β−メルカプトエタノールを含有するＰＢＳ（リン酸塩類緩衝液、ｐＨ７．５）中でライソザイム／凍結−融解法を用いてタンパク質溶菌液を調製した。各クローン由来の２００μｌの可溶性タンパク質溶菌液をＮｉ−ＮＴＡ被覆マイクロウェルに添加して、室温にて４５分間インキュベーションを行った。インキュベーション終了時に、ＰＢＳＴ（０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ）でウェルを３回洗浄して未結合タンパク質を全て除去した。ＤＮＡ結合緩衝液（５ｍＭ　β−メルカプトエタノールを含有する１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．４，７５ｍＭ　ＫＣｌ）を添加して、１分間浸漬し、そのウェルを３回洗浄した。１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）非−特異的ＤＮＡを含有する２００μｌのＤＮＡ結合緩衝液が入ったウェルに３’ジゴキシゲニン標識したκＢモチーフ（２ｐｍｏｌ）を添加した。さらに３０分のインキュベーションを行った後に、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ　ＫＣｌでウェルを３回洗浄して未結合ＤＮＡを除去した。１５０ｍＵ／ｍｌになるように、０．２％ウシ血清アルブミンを補充した「抗体希釈緩衝液」（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭ　ＫＣｌ）中にアルカリホスファターゼ標識抗−ジゴキシゲニン抗体を、希釈した。次に、希釈した抗体（２００μｌ）をマイクロウェルに添加した。室温で３０分間置いた後、０．０２％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を補充した「抗体希釈緩衝液」でマイクロウェルを洗浄して（３Ｘ３５０μｌ）未結合抗体を除去した。次に、２５０μＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（アルカリホスファターゼの基質）を含有する２００μｌの緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ９．５，１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）をウェルに添加し、室温で一晩反応を進行させた後、４０５ｎｍで各ウェルでの黄色の呈色を定量した（反応産物であるｐ−ニトロフェノールの形成に対応する）。基質ｐＮＰＰの加水分解に対するバックグラウンドの割合は低かったため、従って、ポジティブなアッセイ結果がウェル中における黄色の呈色由来のものであることは明らかであった。このアッセイの対照として、本発明者らは、未精製ライセート又は標識したオリゴヌクレオチド又は抗体の何れかを除去するか、又は２０倍過剰の非標識二重鎖オリゴを添加するか、又はヘキサヒスチジンタグ付加ＮＦ−κＢ　ｐ５０を含有する未精製ライセートを、同じベクターバックグラウンド中にヘキサヒスチジン−タグ付加ＧＳＴを発現するＤＨ５α細胞由来の等量の未精製細胞ライセートと置換した。
【００７５】
この分析において、ＮＦ−κＢ　ｐ５０はまず特異的結合サイトにおいて、標識したオリゴヌクレオチドと結合する。次に、ヘキサヒスチジンタグを介してマイクロウェル中で、タンパク質−ＤＮＡ複合体を固定化し、全ての未結合標識オリゴと共に他の全タンパク質（標識したオリゴと未精製ライセート中に存在する他のＤＮＡ結合タンパク質との複合体を含む）を洗浄除去する。本標識抗体はオリゴ上の標識を認識し、ヘキサヒスチジンタグ標識タンパク質を認識しないので、本アッセイにおけるポジティブなシグナルは、ＮＦ−κＢ　ｐ５０−ＤＮＡ相互作用がタグを介したＮＦ−κＢ　ｐ５０の固定化に維持される場合にのみ観察され得る。この相互作用が維持されない場合は、このオリゴは洗浄段階で除去されるので呈色変化は見られないであろう。
【００７６】
本発明者らは、ヘキサヒスチジン−タグ付加ＮＦ−κＢ　ｐ５０未精製溶菌液とジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドとを含有し、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体が添加されたマイクロウェル中で黄色を呈する産物のみが検出されることを見出した。このことは、観察される色の変化が、専ら固定化されたＮＦ−κＢ　ｐ５０−オリゴヌクレオチド複合体によるものであることと、さらに、特異的固定化の際にＮＦ−κＢ　ｐ５０が活性を保持することを示していた。
【００７７】
例４
（ａ）１０個の遺伝子のプールからの１個のタンパク質の同定
本発明者らは、以下の表に挙げた１０個の種々の遺伝子を含む遺伝子プールに対して、明示した場合を除いて、例１で記述したように正確に前記操作を遂行した。本発明者らは、この操作を用いた結果、アレイにおける各位置が、標識したタグを介して固定化された一個の組換えタンパク質に対応するように、得られた特異的改変タンパク質のアレイを作製した。次に本発明者らは、機能的アッセイによって本アレイをスクリーニングし、前記プールの個々のタンパク質成分を首尾よく同定した。
【００７８】
【表１】
2004509645.tif 000003
まず、同じｐＴｒｃＨｉｓＡベクターバックボーンに１０個の遺伝子全てをサブクローニングしたが、これはとりわけ、ｃＤＮＡライブラリーにより起こる状況を模倣するからである。ｐＴｒｃＨｉｓＡベクターバックボーン内にコードされる遺伝子の増幅に対して、例１で記述したプライマー「ＳＴｆｏｒｗａｒｄ」及び「ＳＴｒｅｖｅｒｓｅ」がユニバーサルプライマーになるように設計した。
【００７９】
次のように多数の制限酵素サイトをコードするように、プライマー「ＳＴｆｏｒｗａｒｄ」を設計した。
【００８０】
５’−ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＧＧＣ ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＣＡ ＣＡＧ Ｇ−３’
ＡａｔＩＩ ＢｓｐＨＩ　　　　ＳｆｉＩ
このように、制限酵素ＡａｔＩＩ又はＳｆｉＩの何れかを使用して、エキソヌクレアーゼからの保護を目的として３’−突出部を形成させ得る。本改変操作の最終段階で、方向が決まったクローニングを行うために、この例において、本発明者らはＢｓｐＨＩを選択したが、これは統計的にはＢｓｐＨＩはライブラリー中で切断する頻度が高いが、ここで使用するタグベクターｐＭＭ１０６ＨのＮｃｏＩクローニングサイトと合致する粘着末端を生ぜしめ、本プール中に存在する１１個の何れの遺伝子中でも切断しないからである。明らかに、原理的には、タグベクターがプロモーター下流に同等のクローニングサイトを含有していれば、制限サイトをコードする任意のプライマーを使用することができるであろう。ＳｆｉＩの認識配列は８ｂｐであり、そのため、ある遺伝子内でのＳｆｉＩサイトのランダムな発生頻度は、ＢｓｐＨＩのように認識部位が６ｂｐであるもの（４，０９６のうち１）よりもかなり低い（６．５Ｘ１０４のうち１）と思われるので、この点で、より大きいライブラリー形式の場合ＳｆｉＩ は非常に大きな利点を有することになるだろう。タグベクターｐＭＭ１０６Ｈは「ＡＴＧベクター」である、つまり５’−クローニングサイト（ＮｃｏＩ）が、ネイティブタンパク質を発現するためのリボソーム結合サイト（ＲＢＳ）の下流に位置するＡＴＧ開始コドンと重なり合っている。しかしながら、本明細書に記述した操作において、本発明者らは、開始コドンに共通の制限サイトを有するクローニング遺伝子に依存してはいない。それよりも、本発明者らは、翻訳の開始がクローニングされた遺伝子そのものによってもたらされるために必要なシグナルにより転写を開始してｍＲＮＡを生成させる、ベクターにコードされたプロモーターのみに依存する。従って、この例で、元のプールの全遺伝子は、ＡＴＧにおけるクローニングサイトの有無に関わりなく、ＲＢＳが直前に位置している開始コドンを有する。初めの１１個のクローン全てにおいてプライマー「ＳＴｆｏｒｗａｒｄ」がＲＢＳの上流に結合するので、プライマーにコードされる任意の制限サイトを用いて行うその後の改変後クローニングによって、新しく改変された遺伝子が、その元のＲＢＳ及びＡＴＧと共にタグベクターに導入され、それにより翻訳開始が確実となるであろう。ｃＤＮＡライブラリー形式において、全ての全長ｃＤＮＡが、真核細胞翻訳開始シグナルを含有するそれ自身の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するという場合に同様の状況が当てはまる。正確な翻訳開始に必要であるのは、転写開始シグナルを与える真核ベクターに対して、各改変ｃＤＮＡをその５’−ＵＴＲと共にクローニングすることのみであるので、配列非依存的に、単一容器内のｃＤＮＡライブラリーの全要素を改変するに際して、この例で使用したものと同等のＰＣＲプライマーのユニバーサルセットを使用できるだろう。
【００８１】
次に挙げる改変を加え、例１で記述したように本実験操作を遂行した。プライマー「ＳＴｆｏｒｗａｒｄ」、「ＳＴｒｅｖｅｒｓｅ」を使用する最初のＰＣＲ増幅に対する鋳型として１０個の遺伝子全てを等モルずつ含有するプールを使用した後、５’末端を保護するためにＡａｔＩＩを用いて断片を消化した。例１のように正確にエキソヌクレアーゼＩＩＩ及びリョクトウヌクレアーゼ−処理断片を生ぜしめ、フォワードＰＣＲプライマー結合サイト内でユニークに断片を制限消化し、ベクターｐＭＭ１０６Ｈにクローニングするために粘着末端を生ぜしめるＢｓｐＨＩで消化した。得られた断片をゲル精製し、該ベクターにライゲーションした。形質転換した細胞をＵＶ光（３６５ｎｍ）で可視化し、ウェスタンブロットによる分析を行うために、緑色蛍光発光コロニーを肉眼で選択した。形質転換した全コロニーのうちおよそ２％が緑色蛍光を発した。これらのうち、１０３個（４２％）が、抗−Ｈｉｓタグ抗体により認識されるタンパク質を発現した。これらのコロニーを、９６穴のディープウェルブロック中の１．５ｍｌの液体培地に各別に植え込み、一晩培養した。遠心によって細胞を回収し、凍結−融解／ライソザイムにより溶菌した。次に個々の未精製溶菌液を、ニッケル−ＮＴＡ−被覆した９６ウェルプレートのそれぞれ別個のウェルに添加して、未結合タンパク質を洗浄により除去したが、各ウェルに固定化した個々のＨｉｓタグ付加タンパク質は残存した。次に、例１及び３で記述したアッセイを用いて、固定化タンパク質のＧＳＴ又はＮＦ−κＢ活性の何れかをアッセイし、各ケースにおいて、それぞれ緑色又は黄色の何れかの呈色によって、ポジティブな「ヒット」を示したウェルを同定した。
【００８２】
最初のアッセイでは、アレイ中の３個のタンパク質がＧＳＴ活性を示し、およそ３％のヒット率であることが分かった。対応するプラスミドの配列から、３個全てがＧＳＴ遺伝子とヘキサヒスチジンタグとＧＦＰ遺伝子との間のインフレーム融合をコードしており、３つのうち２つは完全長ＧＳＴであり、１つは明らかに活性には影響を与えないごく短い末端切断が見られることが明らかになった。
【００８３】
第二のアッセイでは、アレイ中の３個のタンパク質がポジティブな「κＢ−モチーフ」ＤＮＡ結合活性を示した。さらに、これらポジティブクローンの性状を調べたところ、前記クローンのうち２個が、ＮＦ−κＢ　ｐ５０遺伝子のヘキサヒスチジンタグへのインフレーム融合物であり、そのうち１個はほぼ全長（末端のアミノ酸が１個切断されていた）であったのに対して、もう一方は末端切断の程度がこれより大きかったもののＮＦ−κＢ　ｐ５０の完全なＤＮＡ結合ドメインを含有することが示された。興味深いことに、前記アッセイは、同系のＤＮＡ配列への結合を調べるために設計されているので、改変されず、折り畳まれ、機能を有するＤＮＡ結合ドメインをなお有する末端切断断片は本アッセイではポジティブとなるであろう。第３のクローンがマウス転写因子ＮＦＡＴのＤＮＡ結合ドメインのヒスタグに対するインフレーム融合であることが明らかとなった。前記アッセイで用いる３’−ジゴキシゲニン標識「κＢモチーフ」は、ＮＦ−κＢ　ｐ５０に対する特異的、高親和性（ＫｄおよそｐＭ）結合サイトを含有するが、この同じ結合サイトは、およそｎＭオーダーの親和性で、特異的にＮＦＡＴのＤＮＡ結合ドメインによっても認識される。従って、この結果から、この操作によって作製したアレイで機能を精査することによって、特異的相互作用、及びこれより弱い作用ではあるが、なお特異的であり生物学的に有用な相互作用を何れも同定することができるということが示される。
【００８４】
次の実験において、この例の方法に従って、約３４０のＨｉｓ−標識タンパク質を含有するアレイを作製した。ＧＳＴ活性アッセイによるアレイのアッセイにより、アレイ中の全タンパク質のうち８％が強いＧＳＴ活性を保持するということが示された。さらに、遺伝子特異的プライマーを使用して３４０個のコードプラスミドＤＮＡプールに対してＰＣＲ解析を行い、その結果、各遺伝子がＨｉｓ−タグ標識集団に相当するものであることが示された。従って、これらのデータにより、この例の方法が配列非依存的であり、様々な遺伝子の集団に適用しうるということが更に確認される。
【００８５】
要約すると、つまり、本発明者らは、これらの例で記述した方法を使用して、マイクロウェル形式で機能的なタンパク質のアレイを作製し、本発明者らはこれらのアレイを用いて特異的タンパク質−リガンド相互作用（ＧＳＴ活性アッセイ）又は特異的タンパク質−ＤＮＡ相互作用（ＮＦ−κＢ結合分析）の何れかに基づいて、プールから３つの異なるタンパク質を同定することに成功した。
【００８６】
［配列表］
2004509645.tif 000004
2004509645.tif 000005
2004509645.tif 000006
2004509645.tif 000007
2004509645.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
図１ａは、ベクターｐＭＭ１０６Ｈの構造を示す。
【図１ｂ】
図１ｂは、タグ挿入前の、ある遺伝子の例（ＧＳＴ）でのＰＣＲ増幅及びエキソヌクレアーゼ消化の詳細を示す。
【図１ｃ】
図１ｃは、タグを導入するための特異的なライゲーション及びＰＣＲ増幅の詳細を示す。
【図１ｄ】
図１ｄは、ＧＳＴにより触媒されるグルタチオンと１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンとの反応を示す。
【図１ａ】
2004509645.tif 000009
【図１ｂ】
2004509645.tif 000010
【図１ｃ】
2004509645.tif 000011
【図１ｄ】
2004509645.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004509645.tif 000013
2004509645.tif 000014
2004509645.tif 000015
2004509645.tif 000016
2004509645.tif 000017
2004509645.tif 000018
2004509645.tif 000019
2004509645.tif 000020
2004509645.tif 000021
2004509645.tif 000022
2004509645.tif 000023
2004509645.tif 000024
2004509645.tif 000025
2004509645.tif 000026
2004509645.tif 000027
2004509645.tif 000028
2004509645.tif 000029
2004509645.tif 000030
2004509645.tif 000031
2004509645.tif 000032
2004509645.tif 000033
2004509645.tif 000034
2004509645.tif 000035
2004509645.tif 000036
2004509645.tif 000037
2004509645.tif 000038
2004509645.tif 000039
2004509645.tif 000040
2004509645.tif 000041
2004509645.tif 000042
2004509645.tif 000043
2004509645.tif 000044
2004509645.tif 000045
2004509645.tif 000046
2004509645.tif 000047
2004509645.tif 000048
2004509645.tif 000049
2004509645.tif 000050
2004509645.tif 000051
2004509645.tif 000052
2004509645.tif 000053
2004509645.tif 000054
2004509645.tif 000055
2004509645.tif 000056
2004509645.tif 000057
2004509645.tif 000058
2004509645.tif 000059
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509645.tif 000060
2004509645.tif 000061
【国際調査報告】
2004509645.tif 000062
2004509645.tif 000063
2004509645.tif 000064