(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ混合物（例えば、細胞または組織抽出物から単離された全ＲＮＡ）からキャッピングしたｍＲＮＡを調製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、反応混合物中で、キャッピングしたｍＲＮＡを含むＲＮＡと、それに対して結合した高親和性のｅＩＦ４Ｅを有する分離可能な親和性マトリックスとを、この高親和性のｅＩＦ４ＥとこのキャッピングしたｍＲＮＡとの間で結合が生じるのに十分な条件下であわせ、それによってキャッピングしたｍＲＮＡが親和性マトリックスに結合する工程、この反応混合物から該親和性マトリックスを分離する工程、次いで該親和性マトリックスから該キャッピングしたｍＲＮＡを分離する工程、を包含する。既に記載した高親和性ｅＩＦ４Ｅ変異体がこのプロセスにおいて使用される。このｍＲＮＡ調製プロセスは、５’キャッピングしたｍＲＮＡの単離に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャッピングしたｍＲＮＡを調製するためのプロセスであって、以下の工程：
反応混合物中で、キャッピングしたｍＲＮＡを含むＲＮＡと、それに対して結合した高親和性のｅＩＦ４Ｅを有する分離可能な親和性マトリックスとを、該高親和性のｅＩＦ４Ｅと該キャッピングしたｍＲＮＡとの間で結合が生じるのに十分な条件下であわせ、それによってキャッピングしたｍＲＮＡが親和性マトリックスに結合する工程、
該反応混合物から該親和性マトリックスを分離する工程、次いで
該親和性マトリックスから該キャッピングしたｍＲＮＡを分離する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
前記親和性マトリックスと合わせる前に、前記ＲＮＡを変性する追加の工程を包含する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、Ｎ１１８Ａ、Ｋ１１９Ａ，Ｑ１２０Ａ、およびＷ５６Ｙからなる高親和性ｅＩＦ４Ｅ変異体の群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
請求項１に記載のプロセスであって、前記分離可能な親和性マトリックスが本質的に、グルタチオンアガロースビーズであって、それに結合したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ｅＩＦ４Ｅ融合物を有するグルタチオンアガロースビーズからなる、プロセス。
【請求項５】
請求項１に記載のプロセスであって、前記親和性マトリックスに結合した、前記キャッピングしたｍＲＮＡが、ｍ７ＧＤＰまたは７ＧＴＰを用いた溶出によって、該マトリックスから分離される、プロセス。
【請求項６】
請求項１に記載のプロセスであって、前記親和性マトリックスに結合した、前記キャッピングしたｍＲＮＡが、フェノール／クロロホルムを用いた抽出によって、該マトリックスから分離される、プロセス。
【請求項７】
高親和性ｅＩＦ４Ｅに結合したキャッピングしたｍＲＮＡを含む親和性マトリックスからの、キャッピングしたｍＲＮＡのバッチ式の分離によって調製されたキャッピングしたｍＲＮＡのライブラリー。
【請求項８】
前記親和性マトリックスからのキャッピングしたｍＲＮＡの分離のプロセスが、ｍ７ＧＤＰまたは７ＧＴＰを用いた溶出である、請求項７に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、Ｎ１１８Ａ、Ｋ１１９Ａ，Ｑ１２０Ａ、およびＷ５６ＹからなるｅＩＦ４Ｅ変異体の群から選択される、請求項７に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記親和性マトリックスからのキャッピングしたｍＲＮＡの分離のプロセスが、フェノール／クロロホルムを用いた抽出である、請求項７に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合物であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに結合している、請求項７に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、ｅＩＦ４ＥＫ１１９Ａである、請求項１１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
ｃＤＮＡを作成する方法であって、以下の工程：
高親和性ｅＩＦ４Ｅに結合したキャッピングしたｍＲＮＡを含む親和性マトリックスから、キャッピングしたｍＲＮＡを分離することによってキャッピングしたｍＲＮＡを調製する工程、
テンプレートとしてキャッピングしたｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを合成する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記親和性マトリックスからキャッピングしたｍＲＮＡを分離するプロセスが、ｍ７ＧＤＰまたは７ＧＴＰを用いた溶出である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記親和性マトリックスからキャッピングしたｍＲＮＡを分離するプロセスが、フェノール／クロロホルムでの抽出である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、Ｎ１１８Ａ、Ｋ１１９Ａ，Ｑ１２０Ａ、およびＷ５６Ｙからなる高親和性ｅＩＦ４Ｅ変異体の群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合物であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに結合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、ｅＩＦ４ＥＫ１１９Ａである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
キャッピングしたｍＲＮＡに対して相補的な１本の鎖を有する全長二本鎖ＤＮＡから本質的になるｃＤＮＡライブラリー。
【請求項２０】
キャッピングしたｍＲＮＡが、ポリアデニル化されていない、請求項１９に記載のｃＤＮＡライブラリー。
【請求項２１】
テンプレートとしてキャッピングしたｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡから構成されるｃＤＮＡライブラリーであって、該キャッピングしたｍＲＮＡは、高親和性ｅＩＦ４Ｅに結合したキャッピングしたｍＲＮＡを含む親和性マトリックスから、キャッピングしたｍＲＮＡを分離することによって調製されている、ライブラリー。
【請求項２２】
前記親和性マトリックスからキャッピングしたｍＲＮＡを分離するプロセスが、ｍ７ＧＤＰまたは７ＧＴＰを用いた溶出である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、Ｎ１１８Ａ、Ｋ１１９Ａ，Ｑ１２０Ａ、およびＷ５６ＹからなるｅＩＦ４Ｅ変異体の群から選択される、請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記親和性マトリックスからキャッピングしたｍＲＮＡを分離するプロセスが、フェノール／クロロホルムでの抽出である、請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項２５】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合物であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに結合している、請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項２６】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、ｅＩＦ４ＥＫ１１９Ａである、請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項２７】
指定したキャッピングしたｍＲＮＡの細胞における存在または量の新規な上昇または減少によって特徴付けられる病状の診断の方法であって、以下の工程：
該キャッピングしたｍＲＮＡの高親和性ｅＩＦ４Ｅへの結合によって、該細胞の総ＲＮＡから、全てのキャッピングしたｍＲＮＡを分離する工程、および
該全てのキャッピングしたｍＲＮＡにおける指定されたｍＲＮＡの存在または量を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、全てのキャッピングしたｍＲＮＡを分離する工程が、以下の工程：
反応混合物中で、キャッピングしたｍＲＮＡを含むＲＮＡと、それに対して結合した高親和性のｅＩＦ４Ｅを有する分離可能な親和性マトリックスとを、該高親和性のｅＩＦ４Ｅと該キャッピングしたｍＲＮＡとの間で結合が生じるのに十分な条件下であわせ、それによってキャッピングしたｍＲＮＡが親和性マトリックスに結合する工程、
該反応混合物から該親和性マトリックスを分離する工程、次いで
該親和性マトリックスから該キャッピングしたｍＲＮＡを分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記親和性マトリックスと合わせる前に、前記ＲＮＡを変性する追加の工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記高親和性ｅＩＦ４Ｅが、Ｎ１１８Ａ、Ｋ１１９Ａ，Ｑ１２０Ａ、およびＷ５６Ｙからなる高親和性ｅＩＦ４Ｅ変異体の群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、前記分離可能な親和性マトリックスが本質的に、グルタチオンアガロースビーズであって、それに結合したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ｅＩＦ４Ｅ融合物を有するグルタチオンアガロースビーズからなる、プロセス。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、前記親和性マトリックスに結合した、前記キャッピングしたｍＲＮＡが、ｍ７ＧＤＰまたは７ＧＴＰを用いた溶出によって、該マトリックスから分離される、方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、前記親和性マトリックスに結合した、前記キャッピングしたｍＲＮＡが、フェノール／クロロホルムを用いた抽出によって、該マトリックスから分離される、方法。
【請求項３４】
請求項２７に記載の方法であって、前記指定されたＲＮＡの存在または量を決定する前記工程が、前記キャッピングしたｍＲＮＡと該指定されたｍＲＮＡに特異的な標識されたプローブとをハイブリダイズすることによって実行される、方法。
【請求項３５】
請求項２７に記載の方法であって、オリゴ（ｄＴ）カラムへのポリアデニル化ｍＲＮＡの結合によって、全てのキャッピングしたｍＲＮＡからポリアデニル化ｍＲＮＡを分離する追加の工程を包含する、方法。
【請求項３６】
請求項１３に記載の方法であって、前記ｃＤＮＡの合成工程が、以下：全長および部分長のハイブリッドを含む二重鎖ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するように前記キャッピングしたｍＲＮＡを逆転写する工程、一本鎖特異的リボヌクレアーゼを用いて該異種二重鎖のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを処理して、これによってキャッピングした末端を部分長ハイブリッドから除く工程、親和性マトリックスに結合した高親和性ｅＩＦ４Ｅを有する親和性マトリックスへの結合によって全長ハイブリッドを単離する工程、ならびに該全長異種二重鎖ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから全長二重鎖ｃＤＮＡを合成する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
高親和性ｅＩＦ４Ｅ変異体Ｗ５６Ｙ。
【請求項３８】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと、ｅＩＦ４ＥＮ１１８Ａ、ｅＩＦ４ＥＫ１１９Ａ，ｅＩＦ４ＥＱ１２０Ａ、およびｅＩＦ４ＥＷ５６Ｙからなる群から選択される高親和性ｅＩＦ４Ｅ変異体のＮＨ２末端との融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（キャッピングされたｍＲＮＡの調製）
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国仮出願第６０／２３３，６７７号（２０００年９月１９日、出願した）の利益を請求する。
【０００２】
（連邦調査サポートの承認）
本発明に至っている調査のサポートは、ナショナルものによって、部分的には、提供された。健康の学会は、数ＣＡ６３６４０を付与する。米国政府は、本発明の特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、細胞および組織からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡの準備、ｍＲＮＡライブラリおよびｃＤＮＡライブラリの隔離に関する。大多数のｍＲＮＡ配列がポリアデニル化されるという前提に、全ての利用できるｃＤＮＡライブラリは、現在までポリアデニル化されたＲＮＡから造られた。ＰｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄされたｍＲＮＡは、動いているクロマトグラフィによって概して分離されたオリゴ（ｄＴ）。しかし、２つの課題は、クローンおよび配列ｃＤＮＡに捜索している労働者に直面しなければならなかった。ポリアデニル化がＲＮＡの３’−端で起こるという、そして、５’用語ｉｎａｌ配列がしばしばｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ図書館にはなくて、しばしば補助手段にさえよって得るのが困難であるという事実からの第１の茎。２番（より少ない明らかな課題）は、いかなる与えられた時間もの細胞のｍＲＮＡの有意な分数がポリアデニル化されないｍＲＮＡを含むかもしれないということである。多くのｍＲＮＡが単に失敗されたという可能性オリゴ、（ｄＴ）隔離は、現在本願明細書において提示される結果によって確認された。
【０００４】
本発明は、５’末端の一般の特徴に基づいて、ｍＲＮＡを分離することによって、両方の課題を解決するための方法論にｍｇキャップを提供する。真核生物細胞のタンパク質合成の方法に関する研究論文は、翻訳（ｍＲＮＡの配列情報に基づくタンパク質合成の方法）の開始がｍＲＮＡの５’末端の分子の変更態様を必要とすることを示した。変更態様は、ａ”ｃａｐ”ｏｆ　７−メチルグアノシン二リン酸塩（ｍ７ＧＤＰ）のｍＲＮＡの５’末端および開始要因の複合体の次の非共有結合締め具への共有結合追加を含む。ワトソン、ＧｅｎｅのＪ．　Ｄ．ほかＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、４人の編集５６９ページ・ベンジャミン、メンローパーク、１９８７。開始要因をキャッピングされたｍＲＮＡに結合することに関係している主たる構成要素はｅＩＦ４Ｅ（開始要因４Ｅ）と称されるタンパク質である。そして、それは直接ｍＲＮＡキャップのｍ７ＧＤＰと結合して、それから他のタンパク質開始要因で結合するものを容易にするように機能する。
【０００５】
ｅＩＦ４Ｅタンパク質は、クローンをつくられて、配列されて、表されて、精製された。キャップ構造に対するその締め具は、詳細に研究された。一回のアミノ酸置換を有している異型構造（変異体）は、総合された；ｍｇが強化されるか減少する結合し好きであることは、構造（米国特許６，２３２，４４２）をキャッピングする。キャッピングされたｍＲＮＡのためのｅＩＦ４Ｅの結合する親和性が細胞のタンパク質合成の率を調整している重要な要因であることは、生物学的斜視図から明白である。
【０００６】
本発明は、キャッピングされたｍＲＮＡが強化されて結合し好きになっているｅＩＦ４Ｅ異型の実用的なアプリケーションである。キャッピングされたｍＲＮＡを分離するために結合する薬品としてｅＩＦ４Ｅを使用する従来の試みは、報告された［　Ｅｄｅｒｙ（１９９５の）Ｍｏｌ．細胞。生物学１５：
３３６３−３３７１］．しかし、産出高は低かった。その理由は、蓋然的に以下のことにある、−高い親和性その時に、仕事が報告されることは公知でなかった。その結果、締め具はより効率的でなかったそして、カラムクロマトグラフィは、浄化を遂行することを必要としたと、比較級として、本願明細書において記載されている調査が示した。比較を有するオリゴ、（ｄＴ）方法は、研究が有する報告されたおよびいいえ追跡調査であった報告する。
【０００７】
人間のｅＩＦ４Ｅをコード化しているＤＮＡの配列は、決定された［Ｒｅｙｃｈｌｉｋ、Ｗ．ほか（１９８７の）会報国家アカデミＵＳＡ　８４：９４５−９４９］．マウスｅＩＦ４ＥのイーストｅＩＦ４Ｅおよび融合タンパク質は、大腸菌において表された［　Ｅｄｅｒｙ、Ｉ．、ほか（１９９８の）Ｇｅｎｅ　７４：５１７−５２５；Ｅｄｅｒｙ、Ｉ．、ほか（１９９５の）Ｍｏｌ．細胞。生物学１５：３３６３−３３７１］．ハース（Ｄ．　Ｗ．ほか（１９９１の）Ａｒｃｈ．）生化学Ｂｉｏｐｈｙｓ．　２８４：８４−８９は、赤血球から自国のｅＩＦ４Ｅの浄化を報告した。スターン、Ｂ．　Ｄ．その他（１９９３）は、尿素の濃度を変性させることを使用している再結合物ｅＩＦ４Ｅの隔離を報告した。
【０００８】
ｍ７ＧＤＰを有するｅＩＦ４Ｅの共同結晶構造は、ｅＩＦ４Ｅが結合することを示唆する５』、水素結合と同様にｍ７Ｇベースをベースおよび酸性のタンパク質サイドチェーンの間にはさんで、２つのトリプトファン残基間のＴｒ−ｊｒスタッキング相互作用を有するキャップｍＲＮＡ。ｅＩＦ４Ｅ、２つのトリプトファン残基（Ｔｒｐ−５６／Ｔｒｐ−１０２）間のｓ−ｓスタッキング相互作用およびｍ７ＧＴＰ上の部位に誘導された突然変異生成を使用することは、示された。その上、ｅＩＦ４ＥのＧｌｕ−１０３は、ｍ７Ｇに接着している水素のために必要である。哺乳類のｅＩＦ４Ｅのｍ７ＧＴＰ締め具部位は、Ｓ１−Ｓ２てＳ３−Ｓ４ループに沿って住む。［ｔｙ−３２Ｐ　］　８−Ｎ３ＧＴＰを有するｅＩＦ４Ｅの前のｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇしている研究は、ｍ７ＧＴＰ締め具部位から遠く離れているＳ４−Ｈ２ループのＬｙｓ−１１９でクロスリンクすることを提示した。ｅＩＦ４Ｅ／ｍ７ＧＴＰのｃｏｃｒｙｓｔａｌな構造に基づく分子のモデルは、８−Ｎ３ＧＴＰがｍＲＮＡの第２のヌクレオチドによって占有される部位に結合することを示唆した。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、方法をＲＮＡ混合からキャッピングされたｍＲＮＡを準備することに提供する。ｅに、ｇ．、高い親和性ｅＩＦ４ＥおよびキャッピングされたｍＲＮＡが親和性マトリックスに密接に結びつくそれによってキャッピングされたｍＲＮＡの間で起こるために結合することに充分な状況の下で、親和性マトリックスを反応混合から切り離して、高い親和性ｅＩＦ４Ｅを有する分離可能な親和性マトリックスを有するキャッピングされたｍＲＮＡから成る反応混合ＲＮＡにおいて組み合わさることを含む細胞または組織抜粋から分離される全部のＲＮＡは、それに対して結合した。そして、キャッピングされたｍＲＮＡを親和性マトリックスから切り離す。
【００１０】
先に述べた高い親和性ｅＩＦ４Ｅ変異体は、開示される新しい変異体と同様にその過程で使用されて、本願明細書において請求される。高い親和性ｅＩＦ４Ｅタンパク質は、親和性マトリックス（グルタチオン・アガロース）に、取付けを容易にするためにグルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）を有する融合として表された。新しいＧＳＴ−４Ｅ融合タンパク質は、本発明の態様として本願明細書において請求される。ｍＲＮＡ準備プロセスは、５’−ｃａｐｐｅｄされたｍＲＮＡと結合することに基づいてある。このように分離されるｍＲＮＡ分子は、従来の方法によって分離されるそれらとは異なり、それらがコード化するタンパク質のＮＨ２−端子端部をコード化している完全な配列を有する。加えて、ポリアデニル化された３’−端配列と結合することに依存した従来の方法によって、方法の活用法は、ｉｓｏｌａｔａｂｌｅでないｍＲＮＡ配列を分離する。したがって、本発明はキャッピングされたｍＲＮＡおよび新規なｃＤＮＡライブラリの新規なライブラリを提供する誰の部材、それぞれ、それらより異なって役立つ分子の特徴は以前そうするできる。
【００１１】
本発明も、細胞サンプルの指定されたキャッピングされたｍＲＮＡの存在を検出しておよび／または測定することに基づいて診断方法を提供する。キャッピングされたｍＲＮＡを分離する能力は、それをポリアデニル化されないウィルスｍＲＮＡを感染させることを検出して、更に特定の腫瘍および特定の伝染および病理学的状態に特徴的である遺伝子表現の変えられたレベルを定量化することは可能にする。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
公知技術のその通常で慣習的な感覚において本願明細書において用いられる項ｍＲＮＡは、ある。そして、それは標準のテキストから確認されることができる。ｍＲＮＡは、共同転写で転写後の変更態様を受けるそれ‖キャッピングすることを含む、そして、ポリアデニル化。キャッピングすることは、期間、従来技術において、そして、本願明細書において酵素引き起こされた反応を意味するために用いる５』生成するｍＲＮＡおよびｍ’ＧＴＰ［　ｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅな７’−メチル］の端ｍｇユニークな５−５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ結合によるｍＲＮＡ分子の５’末端で結合する。ｍＲＮＡの５’−端に共有結合したｍ’ＧＤＰを有するｍＲＮＡのｍＲＮＡ”ｉｓ値段をキャッピングする。キャップ構造は、ＮがＲＮＡの５’末端のいかなるヌクレオチドでもあるｍ７Ｇ　ｐｐｐ（５』）（５』）Ｎである。人間の細胞を含む真核生物細胞において、ｍＲＮＡは能率的に翻訳されるためにおおわれなければならない。ポリアデニル化は、ｍＲＮＡの３’−端に、ｐｏｌｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ｐｏｌｙＡ）の様々な長さを加える方法に関連する。細胞の大部分のｍＲＮＡは、ポリアデニル化される。従来技術においてｍＲＮＡを真核生物細胞で見つかる他のＲＮＡから切り離すために用いる方法がある標準は、固定されてカラムでクロマトグラフィによってポリアデニル化されたＲＮＡを分離するオリゴ（Ｕ）、または、オリゴ（ｄＴ）。
【００１３】
現在、利用できる全てのｃＤＮＡライブラリは、ポリアデニル化されたｍＲＮＡから公的に作られた。ｍＲＮＡテンプレートからの全身のｃＤＮＡ図書館の建設は、構造上の遺伝子および機能的な研究の挑戦的な技術である。従来は、ＲＮＡおよびそれから第１のふさｃＤＮＡの３’末端からの（Ａ）−尾部が総合されるボリエステル繊維を主成分として、ｍＲＮＡは浄化されるオリゴ（ｄＴ）下塗り。広範囲な第２の構造を含んでいるｍＲＮＡが逆転写酵素の進行を阻害するので、この方法は時々不完全なｃＤＮＡライブラリを生産する。いくつかの方法は、全身のｃＤＮＡライブラリを生成するために開発された。例えば、５’ｃａｐｐｅｄ　ｍＲＮＡは構造またはオリゴおおっている技術が、合成オリゴヌクレオチドがいずれを結さつするかについて使われたキャップに、ビオチン群の化学導入を使用して豊かにされた。そして、ｍＲＮＡはキャップ構造を交換した。
【００１４】
他の方法は、逆転写酵素反応のマンガンを使用した。マンガンの追加は、逆転写酵素によってノーカットｃＤＮＡの３’末端に３の４つの非ｔｅｍｐｌａｔｅｄされたｄＣＭＰ残基への追加を許した。ｃＤＮＡ端は、二倍の要素をもつＤＮＡアダプタに固定された。しかし、これらの方法の全ては、ｃＤＮＡライブラリ構造のための始まっている材料として、ボリエステル繊維（Ａ）尾のあるｍＲＮＡを使用した。
【００１５】
Ｅｄｅｒｙその他（１９９５）は、親和性カラムを使用している完全ＲＮＡから、別々の真核生物ｍＲＮＡまで結合している野生型ｅＩＦ４Ｅを使用している完全で完全なキャッピングされたｍＲＮＡ隔離を示した。
リガンドのための特定の親和性を所有していて、物理的にリガンドがあるかもしれない液体と分離可能ないかなる材料にも対する用語”ｓｅｐａｒａｂｌｅ親和性ｍａｔｒｉｘ”ｒｅｆｅｒｓ。起こるために分離可能な親和性マトリックスにリガンドの中で結合することに適している状況の下で、リガンドは分離可能な親和性マトリックスを有するリガンドを含んでいる液体を接触させることによって液体から浄化されることができる。そして、マトリックスを液体から切り離す。マトリクス材料は、固体位相材料、ゲルまたは身体検査、化学方法または二つの組合せによって切り離されることができる材料の他のいかなるタイプでもありえる。共通して使う材料は、固体位相分子、繊維および連続表層を含む。優先して指定されたリガンドと結合するいかなる物質にもよって、特定の親和性は、提供されることができる。
【００１６】
例えば、酵素は特にその基板を結合することができる、抗体は特にその抗原を結合することができる、レセプタはそのリガンドを結合することができる。マトリクス材料の選択は、親和性リガンド一組の化学自然のような考慮に基づくマトリックスが所望の特定の締め具に適していることがありえてなんて直ちに。本願明細書において例証される分離可能な親和性マトリックスは、グルタチオンが共有結合して結合される（グルタチオン・アガロース）アガロース・ビーズから成る。キャッピングされたｍＲＮＡに特定の締め具を提供するリガンドは、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｅＩＦ４Ｅ（ＧＳＴ−４Ｅ）融合タンパク質である。リガンドはＧＳＴ−４Ｅと結合することは起こることができる状況の下で、グルタチオン・アガロースの溶液を接触させることによって便利にマトリックスに密接に結びつく。そして、遠心分離によってアガロース・ビーズを溶液から切り離す。前述の原理が従われる限り、他のマトリクス材料、一組を結合しているリガンドおよび分離方法が考案されることができることは、明瞭である。物理的な機構に関係なく、非共有結合締め具を含むために本願明細書において用いられる用語”ｂｉｎｄｉｎｇ”ｉｓ。この種の締め具は、リガンドの縛られて解放された状態間の平衡によって特徴づけられる。
結合することは起こることができる状況の下で、平衡で、縛られた状態は、解放された状態を圧倒する。特定の締め具は、所望のリガンドが本質的にまたは主に結合される唯一の物質であるという事実によって特徴づけられる。
【００１７】
従来技術において一般にわかった用語”ｂｉｎｄｉｎｇ”ｉｓの前述の使用。項「コンテキストで本願明細書において、親和性−ｂｏｕｎｄ”ｍｅａｎｓは、特に分離可能な親和性マトリックスに結合した。本発明はキャッピングされたｍＲＮＡをいかなる真核生物細胞もの完全ＲＮＡまたは、起こるためにキャッピングされたｍＲＮＡにｅＩＦ４Ｅの中で結合することに充分な状況の下で、親和性に結び付いたｅＩＦ４Ｅを有する分離可能な親和性マトリックスを有するキャッピングされたｍＲＮＡを含んでいるＲＮＡの準備を結合することから成る組織サンプルから切り離す新規な方法に基づく。そして、それからキャッピングされたｍＲＮＡを親和性マトリックスから切り離して、親和性マトリックスを反応混合から切り離す。
【００１８】
カラムクロマトグラフィなしで、分離はカラムクロマトグラフィまたはバッチ方式によって行われることができる。方法は、ポリアデニル化されたＲＮＡの隔離に基づく従来の方法より高いｍＲＮＡの産出高を提供する。データは、方法がｍＲＮＡが本発明の方法によって分離することを証明した二つを本願明細書において比較することを示した分離されたより、より３−５時間にあったオリゴ材料を始めている完全ＲＮＡの同じ量を使用している（ｄＴ）方法。さらに、本発明の方法によって準備されるｍＲＮＡは５’末端に関して完全である、ところが、分離されるポリアデニル化されたＲＮＡ‖によってオリゴ、（ｄＴ）コラムはまず全長でなくてしばしば行方不明であるだけである、特により長いｍＲＮＡの中で、５’末端。最も有意に、本発明の方法は、ポリアデニル化されないかまたは効果的に結合されないボリエステル繊維（Ａ）尾部を有しないｍＲＮＡ分子のクラスを分離するためにオリゴ不十分な長さまたは他の構造上の特徴のために（ｄＴ）カラム。
【００１９】
本発明の方法は、それをｍＲＮＡのライブラリおよびすでに分離されなかった表された遺伝子の配列を含んでいるｃＤＮＡを準備することは可能にする。方法はしたがって、ジェノミクスを延長するために重要である、そして、以前利用できるより、高い品質のｍＲＮＡについては、含むプロテオミクスは遺伝子およびこれまで到達できないタンパク質を表した。発明によって分離されるｍＲＮＡは、転写スタート・部位・配列に注意していて、完全な５’末端を欠いているＥＳＴｓのための正しい読出フレームを決めている重要な情報を提供する。
【００２０】
真核生物開始要因は、４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、細胞翻訳装置の構成要素である。真核生物ｍＲＮＡ上の翻訳開始は、ｍＲＮＡの５’末端に４０年代ｒｉｂｏｓｏｍａｌなサブユニットの漸増を含む。これは複雑な真核生物４Ｆ（ｅＩＦ４Ｆ）翻訳開始（すなわちｅＩＦ４Ｅを含んでいるｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｔｉｃな複合体）、ｅＩＦ４ＡおよびｅＩＦ４Ｇ．　ｅＩＦ４Ａによって調停される。そして、ｍＲＮＡをほどくＲＮＡに依存するＲＮＡ　ｈｅｌｉｃａｓｅは第２の構造およびｅＩＦ４Ｇである。そして、大きいポリペプチドはｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ３およびタンパク質を結合しているボリエステル繊維（Ａ）の結合する場所を含む。ｅＩＦ４ＥはｍＲＮＡ　５’ｃａｐ構造（ｍ７ＧｐｐｐＮ）に、直接結合することによって翻訳の開始を容易にする。
【００２１】
ｅＩＦ４ＥをキャッピングされたｍＲＮＡに結合することは手段をキャッピングされたｍＲＮＡを完全細胞ＲＮＡから分離することに提供する。ｅＩＦ４Ｅはクローンをつくられて、表されて、浄化されて、また、ＧＳＴ融合タンパク質として備えができられていた。
【００２２】
前の研究において、我々は本願明細書に引用したものとするｅＩＦ４Ｅ　Ｓ４−Ｈ２ループ（スピバク−Ｋｒｏｉｚｍａｎほか、２００１、米国特許６，２３２，４４２）のアラニン突然変異生成を用いて、４つの変異体、Ｎ１１８Ａ、Ｋ１１９Ａ、Ｑ１２０ＡおよびＷ５６Ｙを識別した。これらの変異体は、ｍ７ＧＴＰが野生型ｅＩＦ４Ｅより高く好きだった（０としての＜に対する０．１ｕＭと比較した野生型のための１．２ｕＭのＫｄ。変異体のための０３　Ｍ）。ｍＲＮＡが野生型ｅＩＦ４Ｅを使用して分離されることができるにもかかわらず、高い親和性変異体は好まれる。Ｋ１１９Ａ変異体（米国特許６，２３２，４４２）が本願明細書において記載されている研究のために使われた。但し、野生型より大きいｍ７ＧＴＰが好きになっているｅＩＦ４Ｅの他のバージョンはまた、使用されることができる。ｍ’ＧＴＰのためのｅＩＦ４Ｅの親和性は、分離定数（Ｋｄ）として本願明細書において表される。それ以上親和性、より小さい‖分離定数。高い親和性変異体の使用は、それを、カラムクロマトグラフィに訴えずに、バッチ式浄化を実行することは可能にした。バッチ式浄化はより単純でより高価でない、それでも、そばに入手できるより、全長ｍＲＮＡの産出高は大きいオリゴ（ｄＴ）方法。直接、同じ測定技術によって比較されるときに、高い親和性ｅＩＦ４Ｅは野生型ｅＩＦ４Ｅと比較して本願明細書においてＫａの少なくとも二倍の違いを有する１として定義される。
【００２３】
Ｋｄのための数値は、分析手順および分析状況によって、変化する。用語”ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ”ｉｓは、固有のタンパク質蛍光のＨｓｕ、ＰＣ、その他（２０００）によって記載されているように変化によって、Ｋｄの測定値に基づいたＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３９：１３７３０−１３７３６，本願明細書に引用したものとする。また、米国特許６，２３２，４４２を参照。本願明細書において報告される作業は、人間のｅＩＦ４Ｅおよびそれの変異体を使用して、遂行された。用語”ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ”ｅＩＦ４Ｅは、特にすでに分離されて、特徴づけられる（米国特許６，２３２，４４２）人間のｅＩＦ４Ｅのその多量の形式に関連する。
【００２４】
他の種の周知のｅＩＦ４Ｅｓは、構造的に人間のそれと類似している；しかし、可能性が人間であるか他の種のｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙ　ｅＩＦ４Ｅ　ｉｓｏｆｏｒｍｓの中で存在する。高い親和性ｅＩＦ４Ｅ．の開示された基準を満たすｉｓｏｆｏｒｍｓさえある本願明細書において記載されているｅＩＦ４Ｅの高い親和性異型が変異体であるにもかかわらず、用語”ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ”ｅＩＦ４Ｅが人間であるか人間外の起源のｅＩＦ４Ｆの自然に起こっている異型を除外することを目的としないと理解される。新しい高い親和性変異体Ｗ５６Ｙは、１．１のＫｄ、０．３１７６と比較してｕＭ、野生型のためのｕＭを有することをその中で示して、したがって、本発明の処理ために、適切である。
Ｗ５６Ｙは、米国特許６，２３２，４４２およびＨｓｕ（ＰＣその他）（２０００）に記載されている技術によってなされた。グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質がｅＩＦ４ＥのＮＨ２端に溶けたので、本願明細書において使用されるｅＩＦ４Ｅｓの全ては表されて、浄化された。ｅＩＦ４Ｅに対するＧＳＴの融合はｍ’ＧＤＰと結合することを妨げなかったｍ７ＧＴＰ、または、キャッピングされたｍＲＮＡに、そして、それはＧＳＴをグルタチオンに結合することを妨げなかった。
【００２５】
都合の良いことに、ＧＳＴ−ｅＩＦ４Ｅ（ＧＳＴ−４Ｅ）融合は直ちにグルタチオン・アガロース（それは市販である）に密接に結びつくことができた。そして、それによって分離可能な親和性マトリックスをＲＮＡ混合から結合して、キャッピングされたｍＲＮＡを切り離すことに提供した。部位を結合しているキャップがアガロース・ビーズから離れて正しい位置に置かれるために、グルタチオン・アガロースと結合することは融合タンパク質のＧＳＴ半分で起こる。そして、それは結合するキャッピングされたｍＲＮＡを容易にする。そして、ｍＲＮＡ準備のために一般に、起こるために結合することの条件は、本質的に生物学的材料にあてはまるために従来技術において理解されるそれらである。例えば、ＲＮＡを解体するか、タンパク質を変性させるかまたは特定のタンパク質−リガンド結合する相互作用を崩壊させることは公知である状況を避けることが重要である。
最適結果は、所望の特定の結合する反応を最大にして、非特異性の締め具を最小化する状況を選ぶことによって成し遂げられる。結合する前にＲＮＡを変性させることは、５’ｃａｐ部位をマスキングすることができたＲＮＡの第２の構造を減らすことによって産出高を改善する。結合する反応は、特にイオン強度に影響されなくて、５００ｍＭまで５０ｍＭの範囲の総塩濃度によって、実行されることができる。結合する反応は、少なくとも４０のＣから室温への便利な温度で、実行されることができる。キャリア部材の用途は、マトリクス材料にｍＲＮＡの非特異性の締め具を予防するために必要であるｅ。ｇ．、あるいは、容器壁にとって、アガロース・ビーズ。さまざまなキャリア部材は従来技術において周知である。但し、定義済みの分子のサイズの材料は好まれる。転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は本願明細書において例証される、しかし、他の材料（例えば定義済みの長さの線形アクリルアミド）は使用されることができる。血管壁にＲＮＡの非特異性の付属品を最小化するために、こびりつかない、疎水性の表面をつけられた試験管の使用は、推薦される。混じっている末端−ｏｖｅｒ−末端による実施例のために、分離可能な親和性マトリックスは、穏やかにｍＲＮＡ溶液を混ぜ合わせられる。より、例えばｖｏｒｔｅｘｉｎｇして、活発に混じることは、避けられなければならない。
【００２６】
親和性マトリックスは、短い遠心分離によって便利に反応混合から切り離される一連の洗浄によって続く洗浄溶液および再び分かれること際の再懸濁する遠心分離によって。ＧＤＰを含んでいる緩衝液またはヌクレオチド三リン酸塩の混成によって洗うことは、キャップに特有でないいかなる締め具も減らすために役立つ。（図３を参照）。
【００２７】
結合する緩衝装置の追加的な構成要素は、ＲＮＡｓｅまたはプロテアーゼ活動を減らすかまたは非特異性の締め具を最小化するために提供される。縛られた、キャッピングされたｍＲＮＡを親和性マトリックスから切り離すことは、ｍ７ＧＤＰの過剰を有する溶出によってまず最初に実行された。より多くのｍＲＮＡは、酸性フェノール／クロロホルム抽出物によって取り除かれた。取り除く単一の分離ステップがマトリックスからｍＲＮＡをキャッピングしたので、後のステップが使われることができた。ｍＲＮＡをマトリックスから切り離す他の方法は、当業者にとって明らかである。単離されたｍＲＮＡが、いずれが備えられるｍＲＮＡにすでに知られているそれらの用途と類似しているかについて、さまざまな方法で、少し使われることができるオリゴ他が本発明の方法によって準備されるｍＲＮＡのユニークな所有物を利用すると共に（ｄＴ）方法。本発明の方法は、逆の転写およびＤＮＡポリメラーゼ反応を使用している周知の従来の方法によって、ｃＤＮＡライブラリを準備するために用いることができるｍＲＮＡライブラリを提供する。周知のように、ライブラリの二倍の要素をもつｃＤＮＡの分子は、キャッピングされたｍＲＮＡ配列に補完的な配列の１つのふさを有する。本発明によって生産されるライブラリは、ノーカット・配列の、更に、ＮＨ２−端末配列のためのｃＤＮＡ符号化のより高い割合を有する。ほぼ完全に全長ｃＤＮＡから成るライブラリは、いかなる部分的な長さｈｅｔｅｒｏ−ｄｕｐｌｅｘｅｓ　ＣＲＮＡも取り除くことによって直ちに準備されることができる：単一のふさ特定のリボヌクレアーゼ（５’ｃａｐを保持している全長ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ）を使用しているＤＮＡハイブリッドは、高い親和性ｅＩＦ４Ｅビーズを使用してｒｅｉｓｏｌａｔｅｄされることができるこのことにより豊かにする全長ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ．のためのライブラリの遺伝子の直接の表現および全長塩基配列決定は、本発明のライブラリを使用して、非常に容易になる。加えて、本発明の方法が従来の方法によって分離されないｍＲＮＡ配列を提供することは、本願明細書において示された。したがって、本発明のライブラリは、現在利用できるライブラリで見つからない配列を含む。生物学的であるか臨床細胞サンプルのキャッピングされたｍＲＮＡの存在に基づいて、本発明も新しい機会を診断試験に提供する。セルの小説の存在によって特徴づけられることができるかまたはレベルを上昇することができる多くの病的状態が、ある、キャッピングされたｍＲＮＡ。例えば、ウイルス伝染はおおわれたウィルスＲＮＡの存在を検出することによって診断されることができる。そして、それはしばしばポリアデニル化されない。バッチ式分離によって提供される便宜は、差動の遺伝子表現によって診断により単純で商業上可能な方法を作る。したがって、完全キャッピングされたｍＲＮＡは病理学的状態を有する細胞のＲＮＡから切り離されることができる、そして、存在または指定されたか診断ｍＲＮＡの量は同一化した。指定されたｍＲＮＡは１である。そして、存在または変えられた量は病理学的状態のインジケータであると考慮されて、誰のものである。指定されたｍＲＮＡがポリアデニル化されない所で、キャッピングされたｍＲＮＡがＲＮＡをポリアデニル化される除去によって更に浄化されることができて、従来のオリゴ（ｄＴ）カラム。指定されたｍＲＮＡのユニークであるか特性配列と結合するラベルをつけられた調査によって、指定されたｍＲＮＡは、識別されることができる。様々な蛍光であるか、発光であるか放射性調査は、従来技術において周知である。
【００２８】
あるいは、指定されたｍＲＮＡまたはユニークな部分は、それについてポリメラーゼ連鎖反応を使用して拡大されることができて、深く探る周知の方法および／または雑種形成によってその後特徴づけられることができる。通常の制御セルによって観察される結果と比較すると、存在および要求される場合指定されたｍＲＮＡの相対的な量は、識別されることができる。方法は、ウイルス伝染の差動の診断を成し遂げるかまたは遺伝子表現のパターンを中で評価するために、存在および／または複数の指定されたｍＲＮＡの量を評価するためにｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌプレート、膜またはガラス配列を用いて適していることがありえるｅ。ｇ．、組織または他の複合体がＨＣＶ伝染またはＨＩＶ伝染のような条件づける腫瘍。この種の評価の結果は、治療のまたは疾患予後。
【００２９】
（実施例１）
ＥＸＡＭＰＬＥＳ実施例１を評価するための適当なコースを選択するために価値があることがありえる：ＧＳＴ−４Ｅと結合しているバッチによる急速な隔離ｍＲＮＡ。グルタチオン・アガロース・ビーズ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）は、室温で、２時間のためのｄｉｅｔｈｙｌ　ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅな（ＤＥＰＣ）処理された水によって水和した。ビーズ（１ｍｌ、ボリュームを包装した）は、１０分４つのＣで１時間のためのＢＰＳ緩衝液のＧＳＴ−４Ｅタンパク質（２．８ｍｇ）を精製されるＦＰＬＣを混ぜ合わせられた）混合されて、そして、２００ｕｌの緩衝液（ＢＢ）（１０ｍＭのＫＨＰＯ４［ｐＨ　８．０］、１００ｍＭのＫＣ１、２ｍＭのＥＤＴＡ、５％のグリセロール、１００のｊｕｇ／ｍｌウシ肝臓ｔＲＮＡ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）、６ｍＭのｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１．３％のポリビニルアルコール（シグマ、セントルイス、ＭＯ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２０　０．００５％のＵ　ＲＮａｓｉｎ［ロシュ、バーゼル、スイス］）を結合しているＩＸ　ｍＲＮＡを加えた。
【００３０】
培養は、１．５本のこびりつかない疎水性のｍｉｃｒｏｆｕｇｅチューブ（遺伝子Ｍａｔｅ）の１つの時間間実行された。室温で、混じっている末端−ｏｖｅｒ−末端後の、樹脂が１ｍｌの１Ｘ結合する緩衝液および１ｍｌのいずれの５００のｕＭ　ＧＤＰも含んでいる１Ｘ結合する緩衝液を有する３つの時間によって二回洗われたこと。ｍＲＮＡは、特にビーズに密接に結びついた残留するｍＲＮＡが同等の生産量によって抽出された１ｍＭのｍ’ＧＤＰ．を含んでいる緩衝液を結合している１ｍｌの以下１Ｘによって抜き取られた酸性のフェノール／クロロホルム（Ａｍｂｉｏｎ、オースティン、テキサス）。各々の断片は、集められて、グリコーゲンによって沈殿した（１０その）（３Ｍナトリウム酢酸塩）、そして、エタノール。ＲＮＡは、尿素−ポリアクリルアミド（６％）７Ｍのゲル電気泳動によって分析された。
【００３１】
ＧＳＴ−４Ｅｉｌｄ−ｌｙｐの能力の比較、そして、５’ｃａｐｐｅｄ　ｍＲＮＡを分離するＧＳＴ−４ＥＫｔ９Ａ。分析を結合しているバッチｍＲＮＡは、ＧＳＴ４ＥＷｊｌｄｐｅおよびＧＳＴ−４ＥＫｎ９Ａの結合する親和性を比較するために実行された。５’ｃａｐｐｅｄ　３２Ｐ−ラベルをつけられたｍＲＮＡはＧＳＴ−４Ｅ野生のｔｐｅ（パネルＡ）の量の増加と共に暖められた、そして、記載されているように、ＧＳＴ−４ＥＫｌ９Ａはアガロース・ビーズ（パネルＢ）に結合した。ＧＳＴ−４Ｅアガロース・ビーズに結合されるｍＲＮＡの量は、Ｃｅｒｅｎｋｏｖカウントを計量することで測定された。
ＧＳＴ−４ＥＷｊ（ｄ）で一定の（Ｋｄ）分離、ヘブライ語字母の１７番目の文字およびＧＳＴ４ＥＫ１１９Ａは、それぞれ、キャッピングされたｍＲＮＡのための０．１５ｎＭおよび０．０６ｎＭであった。すでに記載されている（週およびクラザーズ（１９９２））ように、Ｋｄ値は算出された。
【００３２】
結果は、図１Ａおよび図１Ｂに示される。
【００３３】
（実施例２：５’ｃａｐｐｅｄ　ｍＲＮＡのためのＧＳＴ−４ＥＫｍ９Ａの特性）
ｍＲＮＡの迅速なバッチ浄化がＧＳＴ−４ＥＫを使用して、９Ａは、５’ｃａｐｐｅｄおよび脱帽されたｍＲＮＡを結合するその能力を見つけるため検査された。Ｔ７ポリメラーゼを使用しているｖｉｔｒｏにおいて総合される５’ｃａｐｐｅｄおよび上限を取り除かれたｍＲＮＡはＧＳＴ−４ＥＫｎ９Ａアガロース・ビーズ（１Ｘ結合する緩衝液および５００によって洗われる）を混ぜ合わせられたｕＭ　ＧＤＰ、そして、実施例１にて説明したように、１ｍＭのｍ７ＧＤＰを有する抜き取る。ｍ７ＧＤＰ溶出ステップにもかかわらずＧＳＴ−４Ｅに縛られたままだったｍＲＮＡは酸フェノール／クロロホルムを有する摘出によって回復された。ＧＳＴ−４ＥＫ１１９Ａａｇａｒｏｓｅビーズを使用している異なる浄化段階に存在するｍＲＮＡは５’ｃａｐｐｅｄのために示す（図２Ａ）　そして、キャップを取られたｍＲＮＡ（図２Ｂ）。
【００３４】
各々のサンプルに存在するｍＲＮＡは、エタノールによって沈殿して、尿素−ポリアクリルアミド（６％）８Ｍのゲル電気泳動によって分析された。矢は、始まっている材料として使用するノーカットｍＲＮＡ（５０ｎｔ）の容積を示す。
【００３５】
（実施例３：ＧＳＴ−４ＥＫを使用している完全人間の肝臓ＲＮＡからの自国の機能的なｍＲＮＡの浄化、バッチ方法で１９Ａ、そして、オリゴカラム方法で（ｄＴ））
５００（５００）、正常なＨＣＶ−感染した肝臓からの完全ＲＮＡのｕｇは、いずれのＧＳＴ−４ＥＫ１１９Ａも混ぜ合わせられるかまたはあてはまられたオリゴ（ｄＣｌｏＴ３ｏ）カラム。ＧＳＴ−４ＥＫ１１９Ａ（包装された２００ｎｕｌ生産量）に連結されるアガロース・ビーズは、室温で、１時間のための１Ｘ結合する５００ｇｌ緩衝液の完全ＲＮＡによって暖められた。ビーズは５００を含んでいる１Ｘ結合する緩衝液を有する１Ｘ結合する１ｍｌの緩衝液および３つの時間によって二回洗われた実施例１にて説明したように、ｕＭ　ＧＤＰ。ｍＲＮＡは酸フェノール／クロロホルムを有するビーズを直接引き出すことによって回復された。回復されるｍＲＮＡは、グリコーゲンおよびエタノールがある場合には、沈殿した。（Ａ）尾のあるｍＲＮＡが浄化されたボリエステル繊維は、製造業者によってｏｌｉｇｏｔｅｘ（ＱＩＡＧＥＮＴＭ、バレンシア、ＣＡ）を使用することを提案した。ｍＲＮＡの３０％は、１９ＡいずれのＧＳＴ−４ＥＫＩも使用している各々のサンプルから回復した、または、オリゴ（ｄＴ）１％のホルムアルデヒド・アガロース・ゲル電気泳動によって分析した。
【００３６】
図３Ａ：アガロース・ゲル電気泳動を変性させることによるｍＲＮＡ分析。
レーン１：０．２４−９．５本のＫｂ　ＲＮＡラダー；
レーン２（ＧＳＴ−ｅＩＦ４ＥＫ１１９Ａａｇａｒｏｓｅビーズを使用している通常の肝臓からのｍＲＮＡのバッチ浄化）；
レーン３、ｍＲＮＡは通常の肝臓から使用することを純化したオリゴ（ｄＴ）カラム。
【００３７】
図３Ｂ：完全肝臓ＲＮＡからの５’ｃａｐｐｅｄ　ｍＲＮＡの迅速なバッチ浄化のための産出高および％回復。
【００３８】
（実施例４）
ｍＲＮＡの試験管内の翻訳は、ＧＳＴ−４ＥＫ１１９Ａｏｒを使用することを純化したオリゴ（ｄＴ）。ＧＳＴ−４ＥＫｌｌｇＡがバッチ処理するどちらにでもよって分離されるｍＲＮＡ（１ｇ）、そして、オリゴ（ｄＴ）カラム方法が、ｍｅｔｈｉｏｎｅ．を有するウサギｒｅｃｔｃｕｌｏｃｙｔｅ溶解物（３５Ｓ）で表現されたタンパク質製品は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび放射能写真術によって分析された。
図４を参照：
レーン１；ＧＳＴ−４ＥＫ１１９Ａ（５’ｃａｐ選択された）によって浄化される通常の肝臓ｍＲＮＡから合成されるタンパク質；
レーン２；通常の肝臓から浄化されるｍＲＮＡを合成されるタンパク質オリゴ（ｄＴ）（選ばれるボリエステル繊維（Ａ））；
レーン３（ＧＳＴ−４ＥＫｌｌｇＡによって浄化されるＨＣＶ−感染した肝臓ｍＲＮＡから合成されるタンパク質）；
レーン４、タンパク質はＨＣＶ−感染した肝臓からｍＲＮＡを合成したオリゴ（ｄＴ）。
分子の大量の標準は、レーン１に示された。
【００３９】
（実施例５　ｃＲＮＡ．の準備）
６枚の通常の肝臓薄紙は、完全ＲＮＡを抽出するために用いた三試薬（分子の調査センター、シンシナティ、ＯＨ）。完全ＲＮＡまたは５のほぼ２０ｌｌｇ‖ｍＲＮＡのｕｇ（５’ｃａｐｐｅｄかボリエステル繊維（Ａ）尾のある）４２のＣで１時間のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＴを使用しているｃＤＮＡを合成するために使用したオリゴ下塗りおよびそれからｃＤＮＡがテンプレートとして使われた３’ｏｆで、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ・プロモータを含んでいる２４冊の（ｄＴ）入門書が、２時間のための１６のＣで大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを使用している足止めされるｃＤＮＡ合成、大腸菌ＤＮＡリガーゼおよびＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを２倍になるｃＲＮＡの合成は、製造業者のプロトコル（エンツォＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）にて説明したように、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを使用して実行された。ビオチンのラベルが付いたｃＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ回転カラム（Ｑｉａｇｅｎｗ、バレンシア、ＣＡ）を使用して浄化された。２０マイクログラムのｃＲＮＡは、３５分の間の９４Ｃで断片化緩衝装置（４０ｍＭのトリス−酢酸塩、ｐＨ　８．１，１００　ｍＭカリウム酢酸塩、３０ｍＭのマグネシウム酢酸塩）で断片的だった。５’ｃａｐ選択されたおよびボリエステル繊維（Ａ）の遺伝子側面の比較は、オリゴヌクレオチド配列雑種形成を使用しているｍＲＮＡを選んだ。精製されたｍＲＮＡが、ｃＤＮＡおよびｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄされたｃＤＮＡ合成の準備のためのテンプレートとして使われた。それから、記載されていて、配列に雑種を作られるにつれて、ビオチンのラベルが付いたｃＲＮＡは発生した。
配列は、ヒューレット・パッカードＧ２５００Ａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒを使用して走査されるＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ　ＨＧＵ９５ＡＶ２）を使用して読み込まれた。
【００４０】
結果は、図５に示される。
各々の点は個々のｍＲＮＡを表す。面積ＡのｍＲＮＡは結合しているｅＩＦ４Ｅだけによって分離された；面積Ｂ点は、そばに分離されるだけのｍＲＮＡであったオリゴ（ｄＴ）。全ての他は両方の方法によって分離された。但し、個々のおおわれた、非ポリアデニル化されたｍＲＮＡが多分Ａ域の外に存在するだろう。結果は、ポリアデニル化されないキャッピングされたｍＲＮＡの相当な数の存在を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａ、野生のタイプＧＳＴ−４Ｅ融合タンパク質によって結合しているｍＲＮＡのグラフである。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、高い親和性変異体（ＧＳＴ−ｅＩＦ４ＥＫｎ９Ａ融合タンパク質）によって結合しているｍＲＮＡのグラフである。
【図２Ａ】
２Ａが、浄化プロセスの舞台の所産を示して、キャッピングされたｍＲＮＡを含んでいるラベルをつけられたｍＲＮＡ準備のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図は、指示した。
【図２Ｂ】
浄化プロセスの示されるように舞台で、図２Ｂはラベルをつけられた、脱帽されたｍＲＮＡ準備のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図３Ａ】
図３Ａは、本発明（レーン２）の方法によって標準によって準備されるｍＲＮＡのゲル電気泳動のプリントであるオリゴ（ｄＴ）方法（レーン３）。
レーン１は、一組のサイズ標準（Ｋｂ）である。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、示されるように、異なる準備方法から取り戻されるｍＲＮＡの産出高を比較しているテーブルである。
【図４】
図４は、タンパク質のゲルがｍＲＮＡから並進した一組のｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃである：
レーン１、ＧＳＴ−４ＥＫｌｌｇＡ（選ばれる５’−キャップ）によって純化される正常な肝臓ｍＲＮＡ、レーン２、浄化される正常な肝臓ｍＲＮＡオリゴ（ｄＴ）（選ばれるｐｏｌｙＡ）レーン３、感染したより運転中のｍＲＮＡ　５’−キャップが選んだＨｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃウイルス（ＨＣＶ）、レーン４、感染したより生きているｍＲＮＡ　ｐｏｌｙＡが選んだＨＣＶ。
【図５】
図５は、選ばれるｍＲＮＡのプロット線であって、オリゴヌクレオチド配列およびＧｅｎｅ　Ｃｈｉｐ　Ｓｃａｎｎｅｒを使用することを数量化した。
各々の点は、異なるＥＳＴまでハイブリダイゼーションしている異なるｍＲＮＡまたは遺伝子断片をチップにおいて代表する。赤い点は、両方ともによって分離されるＲＮＡであるオリゴ（ｄＴ）、そして、ｅＩＦ４Ｅ．Ｂとラベルをつけられるドットの地域は、そばに分離されるだけのＲＮＡによってふさがっているオリゴ（ｄＴ）。面積Ａ点は、キャッピングされたｍＲＮＡと結合している高い親和性ｅＩＦ４Ｅによって分離されるＲＮＡである。残りの点は、ＲＮＡが両方ともによって分離されることを表すオリゴ（ｄＴ）、そして、ｅＩＦ４Ｅ．によって。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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