(57)【要約】陰イオン交換工程、陽イオン交換工程、および逆相ＨＰＬＣ工程、ならびに必要に応じて、濾過工程、ヘパリン−セファロース工程、および／または逆相ＨＰＬＣ脱塩工程を含むことを特徴とする、骨由来ＴＧＦ−タンパク質を精製する方法。濾過工程は、好ましくは、約１０キロダルトンと約１００キロダルトンの間の呼び分子量を有するタンパク質を選択する。好ましくは、陰イオン交換工程は、第四級アミン官能基を有する強く正に荷電した樹脂を用いる。このましくは、陽イオン交換工程は、スルホン酸官能基を有する強く負に荷電した樹脂を用いる。水性トリフルオロ酢酸と組み合わせてアセトニトリル溶液を用いて、逆相ＨＰＬＣカラムからＴＧＦ−タンパク質を溶出させることができる。精製工程は、高度に濃縮されたＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉱物質が除去された骨抽出物を含有する第１溶液からＴＧＦ−タンパク質を精製する方法において：
前記第１溶液を濾過して、所定の範囲の分子量を有するタンパク質を含有する第２溶液を得る工程；
前記第２溶液を陰イオン交換樹脂に装填する工程；
前記第２溶液を前記陰イオン交換樹脂に装填することによって得られた空隙容量を集める工程；
前記空隙容量を陽イオン交換樹脂に装填する工程；
勾配を有する第1溶出液によって前記陽イオン交換樹脂からタンパク質画分を溶出させて、陽イオン交換分画溶出液を得る工程；
前記陽イオン交換分画溶出液を逆相ＨＰＬＣカラムに装填する工程；および
前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させて、ＴＧＦ−タンパク質を豊富に含むＨＰＬＣ分画溶出液を得る工程；を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＨＰＬＣ分画溶出液をヘパリンセファロースカラムに装填する工程；および前記ヘパリンセファロースカラムからタンパク質画分を溶出させて、ＴＧＦ−タンパク質を豊富に含むヘパリンセファロース溶出液を得る工程；をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヘパリンセファロース溶出液を逆相ＨＰＬＣカラムに装填する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記濾過工程が：
（i）約１００ｋＤの呼び分子量カットオフ値を有する濾過膜を用いて前記第１溶液を濾過して、濾液を作成する工程；
（ii）約１０ｋＤの呼び分子量カットオフ値を有する濾過膜を用いて前記濾液を濾過して、前記第２溶液としての保持液を作成する工程；を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記第２溶液を前記陰イオン交換樹脂に装填する前に、必要に応じて、該第２溶液の伝導度を、約１,３００ｍｈｏｓ（１.３ｘ１０−３）未満の伝導度に調整することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記空隙容量の伝導度が、約９００ｍｈｏｓ（０.９ｘ１０−３Ｓ）から約１３００ｍｈｏｓ（１.３ｘ１０−３Ｓ）までの範囲であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記陽イオン交換分画溶出液が、約１５００ｍｈｏｓ（１.５ｘ１０−３Ｓ）から約４０,０００ｍｈｏｓ（４.０ｘ１０−２Ｓ）までの伝導率を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
３.５ｋＤ分子量カットオフ透析膜を用いて、前記陽イオン交換分画溶出液を脱イオン水に透析する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させてＨＰＬＣ分画溶出液を得る前記工程が、約２５％（ｖ／ｖ）から約７０％（ｖ／ｖ）までの範囲で増加するアセトニトリル濃度の勾配を有する第２溶出液を用いて、前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させて、精製タンパク質混合物を得る工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記第２溶出液の増加するアセトニトリル濃度の勾配が、約２９％（ｖ／ｖ）から約５５％（ｖ／ｖ）まで増加することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させる前記工程が、約３５から３７％（ｖ／ｖ）アセトニトリル濃度で溶出する部分を集めて、ＴＧＦ−１画分を作成する工程を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させる前記工程が、約３８から４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル濃度で溶出する部分を集めて、ＴＧＦ−２画分を作成する工程を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＰＬＣカラムが、プラスチックまたは炭化水素−修飾シリカ充填剤の何れかを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記シリカが、Ｃ４−Ｃ１８炭化水素鎖の付加によって修飾されていることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＰＬＣカラムが、ＶＹＤＡＣ（登録商標）Ｃ４、Ｃ８、およびＣ１８材料より成る群から選択される充填材料を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１６】
前記陰イオン交換樹脂が、第四級アミン官能基を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記陰イオン交換樹脂が、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）(Pharmacia)を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記陽イオン交換樹脂が、スルホン酸官能基を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記陽イオン交換樹脂が、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）(Pharmacia)を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記第２溶液を前記陰イオン交換樹脂に装填する前記工程の前に、前記第２溶液のｐＨが約ｐＨ８から約ｐＨ９であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記空隙容量を前記陽イオン交換樹脂に装填する前記工程の前に、前記空隙容量のｐＨが約ｐＨ８.０から約ｐＨ９.０であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記第２溶液、前記空隙容量、および前記陽イオン交換分画溶出液が、溶液中にタンパク質を保持するのに有効な量の尿素を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記陽イオン交換樹脂に装填する溶液が、約０.０１Ｍ ＮａＣｌ未満の対イオン濃度を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記第１溶出液が、約０.０１Ｍ ＮａＣｌから約０.６Ｍ ＮａＣｌまでの範囲の対イオン濃度を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＰＬＣ分画溶出液が、約０.０５％（ｖ／ｖ）から約０.１５％（ｖ／ｖ）までのトリフルオロ酢酸を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２６】
鉱物質が除去された骨抽出物を含む前記第１溶液が、洗浄し、粉砕し、さらに鉱物質が除去された骨粒子から、グアニジンおよび尿素から成る群より選択される化合物を用いてタンパク質を抽出することによって調製されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２７】
請求項１記載の方法によって作成されたＴＧＦ−タンパク質を含む組成物。
【請求項２８】
請求項１１記載の方法によって作成されたＴＧＦ−１タンパク質を含む組成物。
【請求項２９】
請求項１２記載の方法によって作成されたＴＧＦ−２タンパク質を含む組成物。
【請求項３０】
鉱物質が除去された骨抽出物を含有する第１溶液からＴＧＦ−タンパク質を精製する方法において：
（i）前記第１溶液を濾過して、約１０ｋＤと約１００ｋＤの間の分子量カットオフ値を有するタンパク質を含有する第２溶液を得る工程；
（ii）前記第２溶液を陰イオン交換樹脂に装填する前に、必要に応じて、該第２溶液の伝導度を、約１,３００ｍｈｏｓ（１.３ｘ１０−３）未満の伝導度に調整する工程；
（iii）前記第２溶液を陰イオン交換樹脂に装填する工程；
（iv）前記第２溶液を前記陰イオン交換樹脂に装填することによって得られた空隙容量を集める工程；
（v）ここで、前記空隙容量の伝導度は、約９００ｍｈｏｓ（０.９ｘ１０−３Ｓ）から約１３００ｍｈｏｓ（１.３ｘ１０−３Ｓ）までの範囲である；
（vi）前記空隙容量を陽イオン交換樹脂に装填する工程；
（vii）約１０ｍＭから約６００ｍＭまでの塩化ナトリウム濃度を有する第１溶出液を用いて、前記陽イオン交換樹脂からタンパク質画分を溶出させて、約４００から約５５０ｍＭ ＮａＣｌの濃度の塩化ナトリウムを有する陽イオン交換分画溶出液を得る工程；
（viii）前記陽イオン交換分画溶出液を逆相ＨＰＬＣカラムに装填する工程；および
（ix）約２５％（ｖ／ｖ）から約７０％（ｖ／ｖ）までの範囲で増加するアセトニトリル濃度の勾配を有する第２溶出液を用いて、前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させて、ＴＧＦ−タンパク質を豊富に含むＨＰＬＣ分画溶出液を得る工程；を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させる前記工程が、約３５から３７％（ｖ／ｖ）アセトニトリル濃度で溶出する部分を集めて、ＴＧＦ−１画分を作成する工程を含むことを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させる前記工程が、約３８から４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル濃度で溶出する部分を集めて、ＴＧＦ−２画分を作成する工程を含むことを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
鉱物質が除去された骨抽出物を含有する第１溶液からＴＧＦ−タンパク質を精製する方法において：
（i）前記第１溶液を濾過して、約１０ｋＤと約１００ｋＤの間の分子量カットオフ値を有するタンパク質を含有する第２溶液を得る工程；
（ii）前記第２溶液を陰イオン交換樹脂に装填する前に、必要に応じて、該第２溶液の伝導度を、約１,３００ｍｈｏｓ（１.３ｘ１０−３）未満の伝導度に調整する工程；
（iii）前記第２溶液を、第四級アミン官能基を含む陰イオン交換樹脂に装填する工程；
（iv）前記第２溶液を前記陰イオン交換樹脂に装填することによって得られた空隙容量を集める工程；
（v）ここで、前記空隙容量の伝導度は、約９００ｍｈｏｓ（０.９ｘ１０−３Ｓ）から約１３００ｍｈｏｓ（１.３ｘ１０−３Ｓ）までの範囲である；
（vi）前記空隙容量を、スルホン酸官能基を含む陽イオン交換樹脂に装填する工程；
（vii）約１０ｍＭから約６００ｍＭまでの塩化ナトリウム濃度を有する第１溶出液を用いて、前記陽イオン交換樹脂からタンパク質画分を溶出させて、約４００から約５５０ｍM ＮａＣｌの濃度の塩化ナトリウムを有する陽イオン交換分画溶出液を得る工程；
（viii）前記陽イオン交換分画溶出液を、Ｃ４−Ｃ１８炭化水素鎖−修飾シリカ充填剤を含む逆相ＨＰＬＣカラムに装填する工程；
（ix）約２５％（ｖ／ｖ）から約７０％（ｖ／ｖ）までの範囲で増加するアセトニトリル濃度の勾配を有する第２溶出液を用いて、前記ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させて、精製タンパク質混合物を得る工程；
（x）約３５から３７％（ｖ／ｖ）アセトニトリル濃度で前記ＨＰＬＣカラムから溶出する部分を集めて、ＴＧＦ−１画分を作成する工程；および
（xi）約３８から４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル濃度で前記ＨＰＬＣカラムから溶出する部分を集めて、ＴＧＦ−２画分を作成する工程；を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−）タンパク質は、正常細胞および新生細胞の両方のタイプの広範囲の細胞において、増殖、分化、および形態形成における多機能サイトカイン活性を有する。それら増殖因子は、細胞の走化性誘引、細胞分化の促進、ならびに軟骨および骨成長誘導のような関連する生物活性を共有する。ＴＧＦ−は、９つのジスルフィド架橋によってお互いに結合した２つの１２,５００サブユニットから成る２５,０００ＭＷのホモダイマーである。タンパク質の前駆部分に３つの潜在的なＮ−結合グリコシル化部位があり、それらの全てが用いられていると思われる。少なくとも５つのＴＧＨ−の異なる形態（ＴＧＦ−１からＴＧＦ−５）が同定されており、異なる形態の成熟ＴＧＦ−ペプチド間の配列相同性は、６４−８２％の範囲である。前駆配列間の配列相同性はいくらか低く、平均で約４０％である。ＴＧＦ−受容体結合特性に多少の違いはあるが、全てが機能的に相同である。ＴＧＦ−は、特に上皮細胞に対する有効な細胞増殖プロモーターであり、創傷治癒剤としてのＴＧＦ−の使用が実証されている。哺乳類組織由来のＴＧＦ−の精製方法を提供することが特に望ましい。
【背景技術】
【０００２】
骨は多くのタンパク質を含んでおり、そのいくつかは骨成長を誘導または促進させる。多くの研究が、主に組換えＤＮＡ技術または天然タンパク質の精製によって特異的骨誘導性タンパク質を産生させることに関連する。そのようなタンパク質およびそれらを得る様々な方法は、多くの特許の対象となっている。しかしながら、そのほとんどの研究は、天然タンパク質の経済的な大規模商業生産に関するものではない。
【０００３】
コラーゲンコーポレーション（Collagen Corporation Palo Alto, California）は、骨誘導性タンパク質に関する多くの特許の譲受人である。米国特許第4,434,094号明細書（Seyedin et al., １９８４年２月２８日に発行された）は、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、鉱物質が除去された骨抽出物から骨形成因子を部分的に精製し、３０キロダクトン（ｋＤ）未満の分子量を有する非線維性タンパク質を単離する方法を同定する（特許文献１）。１０から３０ｋＤの部分的精製骨誘導因子、ならびに鉱物質が除去された骨からの抽出、ゲル濾過、およびカルボキシメチルセルロースカラムでの陽イオン交換クロマトグラフィーを含むその精製工程（さらに逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含んでいてもよい）が、米国特許第4,627,982号明細書（Seyedin et al., １９８６年１２月９日に発行された）に記載されている（特許文献２）。１９８８年９月２７日に発行された米国特許第4,774,228号明細書（Seyedin et al.）は、'094特許（Seyedin）で教示されている方法に類似するが逆相ＨＰＬＣまたは酢酸−尿素ゲル電気泳動を含まない方法を用いて精製された、骨においてＴＧＦ−測定法で活性を有することが見出された２つの２６ｋＤタンパク質について記載しており、その精製タンパク質は軟骨形成活性を示す（その称するところによると骨形成に関連する）（特許文献３）。米国特許第4,863,732号明細書（Nathan et al., １９８９年９月５日発行）は、'982特許（Seyedin）に記載されている骨形成因子をアテロペプチドコラーゲンと混合し、共沈殿によってさらに精製して得られた骨形成因子の注射用溶液に関する（特許文献４）。他の特許は、アテロペプチドコラーゲン混合物に関するものである（例えば米国特許第4,789,663号明細書、Wallace et al, １９８８年１２月６日発行；および米国特許第4,795,467号明細書、Piez et al.、１９８９年１月３日発行）（特許文献５および６）。
【０００４】
米国特許第4,804,744号明細書(Sen、１９８９年２月１４日発行)は、分子量約２２から２４ｋＤの主要な骨形成タンパク質（Ｐ３）を同定する（特許文献７）。その特許は、Ｐ３無しでは非骨形成性であるタンパク質Ｐ２およびＰ４も同定し、さらに、抽出、透析、ゲル濾過、およびＨＰＬＣ工程を含む、鉱物質が除去された骨組織からＰ３を単離する方法も同定している。
【０００５】
米国特許第5,290,763号明細書（Poser et al.,）、米国特許第5,371,191号明細書（Poser et al.,）、および米国特許第5,563,124号明細書（Damien et. al.）は、好ましくは、骨を粉砕、洗浄、および鉱物質を除去し、骨タンパク質を抽出し、さらに複数精製工程によって抽出タンパク質を濃縮する工程を含む多工程法による増殖因子の単離について記載している（特許文献８から１０）。
【特許文献１】
米国特許第4,434,094号明細書
【特許文献２】
米国特許第4,627,982号明細書
【特許文献３】
米国特許第4,863,732号明細書
【特許文献４】
米国特許第4,863,732号明細書
【特許文献５】
米国特許第4,789,663号明細書
【特許文献６】
米国特許第4,795,467号明細書
【特許文献７】
米国特許第4,804,744号明細書
【特許文献８】
米国特許第5,290,763号明細書
【特許文献９】
米国特許第5,371,191号明細書
【特許文献１０】
米国特許第5,563,124号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
商業規模で天然源からＴＧＦ−タンパク質を効率的に単離する方法に対する要求がある。そのようなタンパク質の分解を最小にするが産生を最大にするように設計された態様で、そのようなタンパク質を生成できれば有益であろう。また、工程条件の僅かな変化に強い方法において、比較的周知の単位操作を用いてそのようなタンパク質を生成できれば有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの実施形態は、鉱物質が除去された骨抽出物を含有する第１溶液からＴＧＦ−タンパク質を精製する方法である。本方法は、第１溶液を濾過して、例えば１０ｋＤと１００ｋＤとの間の呼び分子量カットオフ値(nominal molecular weight cutoffs)のような、所望の範囲の分子量を有するタンパク質を含有する第２溶液を得る。第２溶液のｐＨは、約ｐＨ８から約ｐＨ９までの値であってよい。第２溶液を陰イオン交換樹脂に装填し、空隙容量(void volume)を集める。陰イオン交換樹脂は、第四級アミン官能基を含んでいてよい。空隙容量のｐＨは、約ｐＨ８から約ｐＨ９、より好ましくは約ｐＨ８.３から約８.７、さらに好ましくは約８.４から約８.６までの値である。空隙容量を陽イオン交換樹脂に装填し、第１溶出液を用いてタンパク質画分を陽イオン交換樹脂から溶出させて、陽イオン交換分画溶出液を得る。陽イオン交換樹脂は、スルホン酸官能基を含んでいてよい。本方法は、次に逆相ＨＰＬＣカラムに陽イオン交換分画溶出液を装填し、さらにＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させて、ＴＧＦ−１またはＴＧＦ−２タンパク質のいずれかを豊富に含むＨＰＬＣ分画溶出液を得る。ＨＰＬＣカラムは、プラスチックまたは炭化水素修飾シリカ充填剤の何れであってもよい。
【０００８】
本方法は、ＨＰＬＣ分画溶出液をヘパリン−セファロースカラムに装填し；さらにヘパリン−セファロースカラムからタンパク質画分を溶出させて、ＴＧＦ−１またはＴＧＦ−２タンパク質のいずれかを豊富に含むヘパリン−セファロース溶出液を得る；各工程をさらに含んでいてもよい。本方法は、ヘパリン−セファロース溶出液を逆相ＨＰＬＣかカラムに装填してタンパク質生成物を脱塩する工程をさらに含んでいてよい。追加工程は、３.５ｋＤ分子量カットオフ（「ＭＷＣＯ」）透析膜を用いて、陽イオン交換分画溶出液を脱イオン水に透析する」ことを含んでいてもよい。
【０００９】
好ましい実施形態において、陰イオン交換樹脂に陰イオン交換装填溶液（本明細書において「第２溶液としても称されている」）を装填する前に、必要に応じて、陰イオン交換装填溶液の伝導度を、約１,３００ｍｈｏｓ（１３００ｘ１０−３Ｓ）未満の伝導度に調整する。空隙画分はカラムによって保持されず、約９００ｍｈｏｓ（９００ｕＳ）から約１３００ｍｈｏｓ（１３００ｕＳ）までの範囲の伝導度を有する；別の好ましい実施形態では、ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出してＨＰＬＣ分画溶出液を得る工程は、約２５％（ｖ／ｖ）から約６０％（ｖ／ｖ）までの範囲でアセトニトリル濃度を高める勾配を有する第２溶出液を用いてＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させて、精製タンパク質混合物を得る工程を含む。さらに詳細には、ＨＰＬＣカラムからタンパク質画分を溶出させる工程は、約３６％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで溶出する部分を集めてＴＧＦ−１画分を作成する工程を含んでいてもよく、および／または約３９％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで溶出する部分を集めてＴＧＦ−２画分を作成する工程を含んでいてもよい。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、本発明によって作成されたＴＧＦ−タンパク質を含有する組成物、さらに詳細には、本明細書に記載の方法によって作成されたＴＧＦ−１および／またはＴＧＦ−２タンパク質を含有する組成物を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、鉱物質が除去された骨抽出物からＴＧＦ−タンパク質を生成する方法は、濾過工程、インイオン交換クロマトグラフィー工程、陽イオン交換クロマトグラフィー工程、および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）工程を含む。別の実施形態は、ヘパリン−セファロース精製工程および／または最終ＨＰＬＣ脱塩工程を含んでいてもよい。本発明の別の実施形態は、得られたＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質組成物である。本方法の好ましい出発原料は、好ましくは骨を粉砕し、洗浄し、さらに鉱物質を除去することによって、タンパク質の抽出用に骨を調製することを含む多工程法によって得られる、鉱物質が除去された骨抽出物である。本方法は、骨タンパク質を抽出し、さらに複数精製工程によってその抽出タンパク質を濃縮する工程を含む。本方法の開始原料の好ましい供給源は哺乳類の骨である。容易に利用可能でありかつコストが安いことから、ウシの骨が通常用いられる。しかしながら、他の哺乳類の骨も本発明を実施するのに適している。例えば全ての軟組織を除去した後骨を粉砕するというような、当業界で公知の慣習的手段によって、骨タンパク質の抽出用に骨を調製する。骨の個々の部分を洗浄した後、鉱物質を除去するための調製において骨を連続的により細かい粒子に粉砕する。好ましくは４ｍｍ未満のサイズ、より好ましくは約０.３ｍｍから約３ｍｍまでのサイズの粒子に骨を粉砕する。
【００１２】
洗浄し粉砕した骨を酸で処理して鉱物質を除去する。任意の適切な酸に骨を浸し、好ましくは室温で撹拌する。酸浸漬溶液のｐＨは通常ｐＨ１.３以下に維持される。希釈ＨＣｌ溶液（例えば約０.６Ｍから約１.２Ｍ）は、骨から鉱物質を除去するのに有効である。あるいは、例えばギ酸のような他の適切な酸を用いてもよい。オクチルアルコールまたは他の消泡剤は、鉱物質を除去する間に過剰な泡立ちが生じるのを防止するのに有用である。
【００１３】
実質的に完全に骨から鉱物質が除去されるまで十分な時間骨を酸に浸す。Ｘ線分析を用いて鉱物質除去の程度を調べてもよい。あるいは、経験を介して標準的方法を改良して、鉱物質が除去された粒子の高温洗浄および続く残りのカルシウムおよびリン酸の測定を含む、鉱物質除去に必要な時間を特定することができる。通常、少なくとも７時間から１２時間が必要である。鉱物質が除去された骨を洗浄して酸を除く。通常、１晩または洗浄流出液のｐＨがｐＨ４以上に達するまで水で骨を洗浄する。当業者に明白であるように、別の洗浄および鉱物質除去方法を用いてもよい。
【００１４】
例えばグアニジンおよび／尿素のようなタンパク質変性剤を用いて、鉱物質が除去された骨からタンパク質を抽出する。１つの実施形態において、好ましくは２０℃より低い温度、より好ましくは１５℃より低い温度で抽出を実施する。他の適切な変性剤を同様に用い得ることに留意すべきである。別の実施形態では、室温で骨タンパク質抽出を実施することができる。塩酸グアニジンは、イオン性であり、従って溶液中にタンパク質を維持するための溶解剤としても機能するため、好ましい変性剤である。４Ｍグアニジン、１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ）（ｐＨ７.４）を含む溶液は好ましい抽出溶液である。より高濃度の塩酸グアニジンを抽出バッファー中において用いてもよい（６Ｍグアニジン、１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ）（ｐＨ７.４））。必要に応じて、鉱物質が除去された骨マトリックスの流動床を通じて抽出溶液を循環させる特殊カラムを用いて、骨からタンパク質を抽出してもよい。
【００１５】
必要に応じて、抽出の間、カオトロピック剤を添加して、抽出タンパク質の溶解性を改善することができる。適切なカオトロピック剤として、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、および塩化セシウム（ＣｅＣｌ２）が挙げられる。
【００１６】
当業界で通常用いられる手段によって、鉱物質が除去された骨からタンパク質を抽出することができる。例えば、タンパク質変性剤を、圧濾器において鉱物質が除去された骨にポンプで通して、回収される変性在中にタンパク質を抽出することができる。適切な低温をもたらすため、変性剤を鉱物質が除去された骨にポンプで通す際に、変性剤を最初に低温、好ましくは約０℃から約４℃に冷却しておいてもよい。変性剤の温度は抽出工程の間に上昇してもよい。必要に応じて、鉱物質が除去された骨マトリックスの流動床を通じて抽出溶液を循環させる特殊カラムを用いて、骨からタンパク質を抽出してもよい。
【００１７】
通常、抽出は、実質的に全ての非コラーゲン骨タンパク質が鉱物質が除去された骨から除かれるまで続けられる。通常の抽出は約４０時間から７２時間掛かる。好ましくは、抽出溶液は中性ｐＨ付近に維持される。次に、鉱物質が除去された骨抽出溶液中のタンパク質を一連の濾過工程によって分離して、１０ｋＤより小さなタンパク質および１００ｋＤより大きなタンパク質を除去する。好ましくは、第１工程として、１００ｋＤより大きなタンパク質が除かれる濾過工程を抽出溶液に施す。好ましい実施形態では、その工程は、１００ｋＤの呼び分子量カットオフフィルターカセット（例えばSartorius Sartocon（登録商標）修飾ポリスルホン膜カセット、それぞれ０.７ｍ２、８カセット、全ての膜で５.６ｍ２に相当するのような）を用いるサルトリアス・タンジェンシャルフローフィルトレーション装置(Sartorius tangential flow filtration apparatus) において実施される。濾過は加圧下で実施して差し支えなく、通常、約５０ｐｓｉ濾過圧力で実施される。タンパク質濃度は、抽出の完全さに依存して変化するであろう。
【００１８】
次に、その濾過工程からの透過液に、１０ｋＤより小さな分子量を除去する第２濾過工程を施す。好ましい実施形態では、１０ｋＤの呼び分子量カットオフフィルターカセット（例えばSartorius Sartocon（登録商標）修飾ポリスルホン膜カセット、それぞれ０.７ｍ２、８カセット、全ての膜で５.６ｍ２に相当するのような）を用いるサルトリアス・タンジェンシャルフローフィルトレーション装置(Sartorius tangential flow filtration apparatus) において実施される。濾過は加圧下で実施して差し支えなく、通常、約５０ｐｓｉ濾過圧力で実施される。タンパク質濃度は、抽出の完全さに依存して変化するであろう。第２濾過によって、所望の範囲内の分子量を有するタンパク質混合物を含む保持液を得る（「濾過タンパク質濃縮物」）。
【００１９】
続くイオン交換樹脂クロマトグラフィー用の調製において、濾過タンパク質濃縮物をイオン性変性溶液から、尿素のような非イオン性変性溶液に移してもよい。例えば塩酸グアニジンのようなイオン性変性剤はイオン交換樹脂が所望のタンパク質を選択的に結合する能力を阻害するため、非イオン性変製剤が続くイオン交換精製工程での使用に好ましい。例えば、濾過タンパク質濃縮物を、２０ｍＭ ｔｒｉｓおよび６Ｍ尿素を含有する約８−１０倍の透析溶液（ｐＨ約８.５）に透析する。その工程の操作は、保持液の伝導度が透析溶液の伝導度（１,３００μｍｈｏｓ（１.３ｘ１０−３Ｓ）の伝導度に達するまで続けられた。ダイアフィルトレーションまたは透析を用いて、溶液からタンパク質を沈殿させることなく、濾過タンパク質濃縮物を適切な変性剤に移すことができる。このやり方は、続く精製を容易にし、さらにタンパク質を沈殿させた場合に生じ得る損失を防ぐため有利である。このやり方は、商業生産規模で使用することができる。
【００２０】
本発明は、抽出骨タンパク質溶液を精製して高度に精製されたＴＧＦ−タンパク質を得るために陰イオン交換工程を含む。陰イオン交換工程の好ましい実施形態において、好ましい開始原料を得るために、上述した工程を用いて開始原料を調製する。陰イオン交換工程を、下記の追加の精製工程と組み合わせる。
【００２１】
イオン交換クロマトグラフィー、すなわち陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、特定イオン交換樹脂での特定タンパク質の親和性は、タンパク質溶液のイオン強度およびｐＨに依存する。その伝導度によって溶液のイオン強度を測定することができる。あるいは、特定の対イオン濃度に関して溶液のイオン強度を測定してもよい。本明細書において用いられている、「対イオン濃度」の用語は、イオン交換樹脂上で結合部位に対してタンパク質と競合する溶液中のイオンのモル濃度を称する。
【００２２】
本発明に基づいて濾過タンパク質濃縮溶液を陰イオン交換カラムに装填する前に、タンパク質溶液の伝導度を、所望のタンパク質が選択的に樹脂に結合するように調整する。その陰イオン交換工程において、タンパク質溶液は６Ｍ尿素および２０ｍＭ Ｔｒｉｓを含む溶液であってよく、その溶液の伝導度を、約１,３００μｍｈｏｓ（１.３ｘ１０−３Ｓ）未満、別の実施形態では対イオン濃度の変化によって約９００マイクロｍｈｏｓ（０.９ｘ１０−３Ｓ）から約１,９００μｍｈｏｓ（１.９ｘ１０−３Ｓ）に調整することができる。陰イオン交換工程によって精製すべき適切な伝導度を有するタンパク質溶液を陰イオン交換カラムに装填し、さらなる処理のためにＴＧＦ−タンパク質を含む空隙容量を集める。その陰イオン交換工程において、陰イオン交換カラムはカラム内側に強く正に荷電した陰イオン交換樹脂を有する。強く正に荷電した陰イオン交換樹脂を用いる陰イオン交換工程は、ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２を含むタンパク質混合物を精製するのに有効である。本明細書において用いられている「強く正に荷電した陰イオン交換樹脂」の用語は、例えば第四級アミン官能基のような強く正に荷電した官能基を有する樹脂を称する。第四級アミン官能基を有する好ましい樹脂は、Ｑ−セファロースファストフロー(Sepharose fast flow（登録商標）)（Pharmacia）である。しかしながら、同様に塩基性官能基を有する他の樹脂も同様に適している。
【００２３】
陰イオン交換樹脂に結合する選択性に影響を及ぼす別の因子は、陰イオン交換カラムに装填されるタンパク質溶液のｐＨである。タンパク質溶液のｐＨは、カラムを通過するときに樹脂がタンパク質溶液中の所望のタンパク質に結合することを可能し、さらに空隙容量中への所望のタンパク質の通過を可能にするのに有効なｐＨである。通常、約ｐＨ８と約ｐＨ９の間のｐＨが本工程において有効である。好ましくは、タンパク質溶液のｐＨを約８.５に調整する。
【００２４】
要求される回収パラメーターによって、陰イオン交換カラムを通過するタンパク質溶液の直線速度を特定する。通常、空隙容量中に通過する望ましくないタンパク質の量を最小にするように、実質的に全ての所望のタンパク質を吸収させるために低速度（約３０ｃｍ／ｈｒ）でこの工程を実施する。直線速度はより大きいものであってもよいが、空隙容量のタンパク質プロファイルが維持され得ることを認識すべきである。
【００２５】
本発明は、陰イオン交換工程の空隙容量からのＴＧＦ−タンパク質組成物の調整に関するものであるが、陰イオン交換樹脂に結合するタンパク質は、生物活性タンパク質でもある。そのような結合タンパク質を使用のために溶出および回収することができる。例えば、米国特許第5,371,191号明細書に記載のような、そのようなタンパク質を回収し、さらに処理して、骨誘導性タンパク質組成物を作成することができる。
【００２６】
空隙容量は、骨タンパク質溶液を陰イオン交換樹脂に装填した後カラムによって保持されないタンパク質画分である。その画分はかなり塩基性のタンパク質（７より大きい等電点を有するタンパク質）であり、特にＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質に富む。ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質のさらなる精製のためにその空隙画分を保持する。
【００２７】
陰イオン交換クロマトグラフィーからの空隙画分を、陽イオン交換クロマトグラフィー用の適切な溶液中にさらに処理することができる。本発明において、空隙画分を最初に濃縮し、その後、タンジェンシャルフローフィルトレーションを用いて、所望の溶液中に透析する。好ましい実施形態では、５ｋＤの呼び分子量カットオフ値を有するMillipore Pellicon-2（登録商標）ミニ修飾ポリエチレンスフホンフィルター（０.１ｍ２表面積、３カセット、全表面積＝０.３ｍ２）を用いて、濃縮して９０％まで容量を減らす。次に、８から１０容量のバッファー中に６Ｍ尿素、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム、および１％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールを含有する溶液（ｐＨ４.６）を用いて保持液を透析する。透析の後、タンパク質溶液は、陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製できる状態にある。
【００２８】
本発明は、溶液中の骨由来タンパク質からＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質をさらに精製するために、陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含み、その工程を上記の陰イオン交換工程および下記のＨＰＬＣ工程と組み合わせて便利に用いることができる。
【００２９】
陰イオン交換工程に関して上述したように、陽イオン交換樹脂に添加されるタンパク質溶液の伝導度を、タンパク質がその樹脂に選択的に結合するように制御する。本発明においてタンパク質溶液を陽イオン交換カラムに装填する前に、陽イオン交換樹脂が所望のタンパク質画分に選択的に結合することを可能にするのに有効となるように、タンパク質溶液の伝導度を調整する。その陽イオン交換工程において、タンパク質溶液の伝導度は、約１０００ｍｈｏｓ（１.００ｘ１０−３Ｓ）から約２０００ｍｈｏｓ（２.０ｘ１０−３Ｓ）であり、より好ましくは１５００ｍｈｏｓ（１.５ｘ１０−３Ｓ）未満である。好ましい実施形態において、陽イオン交換樹脂に添加されるタンパク質溶液の対イオン濃度は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、６Ｍ尿素、および１％ＩＰＡを含有するバッファー８ｐＨ４.６）中、約１０ｍＭ ＮａＣｌである。
【００３０】
陽イオン交換工程によって精製すべき適切な伝導度を有するタンパク質溶液を陽イオン交換カラムに装填する。その陽イオン交換工程において、強く負に荷電した陽イオン交換樹脂が、ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２を含むタンパク質混合物を精製するのに有効であることが分かった。本明細書において用いられている「強く負に荷電した陽イオン交換樹脂」の用語は、例えばスルホン酸官能基のような強く負に荷電した官能基を有する樹脂を称する。スルホン酸官能基を有する好ましい樹脂は、ＳＰ−セファロース（SP-Sepharose（登録商標））（Pharmacia）である。しかしながら、同様に酸性官能基を有する他の樹脂も同様に適している。
【００３１】
陽イオン交換樹脂によって精製されるべきタンパク質溶液のｐＨを、所望のタンパク質が樹脂に効率的に結合するようなｐＨに調整する。その工程において、好ましくは、約ｐＨ４.２と約ｐＨ５の間のｐＨが用いられる。好ましくは、タンパク質溶液のｐＨを約ｐＨ４.６に調整する。
【００３２】
上記の陰イオン交換工程と同様に、要求される回収パラメーターによって、陽イオン交換カラムを介した骨タンパク質溶液の直線速度を特定する。ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質混合物を得るのに適した伝導度を有する溶出液を用いて、陽イオン交換カラムからタンパク質を溶出させる。その陽イオン交換工程において、ＮａＣｌ勾配を用いて陽イオン交換カラムからタンパク質を溶出させる。用いられる勾配は、約７カラム容量のバッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、６Ｍ尿素、１％ＩＰＡ、ｐＨ４.６）中、ＮａＣｌの濃度が１０ｍＭから６００ｍＭまで変化するような勾配である。溶出液の伝導度は、１５００ｍｈｏｓ（１.５ｘ１０−３Ｓ）から約４０,０００ｍｈｏｓ（４.０ｘ１０−３Ｓ）まで変化する。
【００３３】
通常、本工程の溶出液は、例えば尿素のような適切なタンパク質変性剤、および所望の伝導度を達成するのに適切な塩濃度を有する溶液である。好ましい実施形態において、約０.０１Ｍ ＮａＣｌから約０.６Ｍ ＮａＣｌ、より好ましくは０.３Ｍから約０.６ ＮａＣｌ溶出液、さらに好ましくは０.４から０.５５Ｍ ＮａＣｌの対イオン濃度を用いて溶出液を調製して、適切な伝導度を達成する。１つの好ましい溶出液は、６Ｍ尿素、５０ｍＭ酢酸ナと煎るム、１０ｍＭ塩化ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含む溶液（ｐＨ４.６）と、６Ｍ尿素、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、６００ｍＭ塩化ナトリウム、１％イソプロパノール（ｖ／ｖ）を含む溶液（ｐＨ４.６）とを直線勾配で混合することによって調製される。ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質は、約０.３Ｍから約０.６Ｍの塩化ナトリウム濃度、より特異的には、０.４から０.５５Ｍの塩化ナトリウム濃度で溶出する。
【００３４】
ＨＰＬＣでさらに精製する前に、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからのタンパク質溶出液を透析する。１つの実施形態では、３.５ｋＤ分子量カットオフ透析膜を用いて、脱イオン水中にタンパク質溶出液を透析する。次に、透析したタンパク質を凍結乾燥し、さらに０.１％とりフルオロ酢酸中に再溶解させる。好ましくは、ＨＰＬＣカラムでの精製前に、１０−１５ｍｇ／ｍｌの濃度でタンパク質を再溶解させる。
【００３５】
本発明は、逆相ＨＰＬＣ工程をさらに含み、上記の陰イオンおよび陽イオン交換工程と組み合わせて、ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質を分離およびさらに精製することができる。本発明のＨＰＬＣ精製工程において、タンパク質溶液を逆相ＨＰＬＣカラムに装填する。そのカラムは高分子（例えばポリスチレン）またはシリカベースのカラムである。好ましくは、ＨＰＬＣカラムは炭化水素修飾シリカである。好ましくは、Ｃ４−Ｃ１８炭化水素鎖の付加によってシリカ樹脂を修飾し、より好ましくはＨＰＬＣカラムはＶＹＤＡＣ（登録商標）Ｃ１８カラムである。
【００３６】
逆相カラムに装填されるべきタンパク質溶液は、トリフルオロ酢酸または他の適切な溶剤（例えばヘプタフルオロブチル酸またはリン酸）の溶液であってもよい。好ましくは、約０.０５％（ｖ／ｖ）から約０.１５％（ｖ／ｖ）の濃度のトリフルオロ酢酸溶液、さらに好ましくは約０.１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を用いる。
【００３７】
所望のタンパク質を得るのに適している有機溶媒／水／トリフルオロ酢酸混合物を用いて、ＨＰＬＣカラムからＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質を選択的に溶出させる。ＨＰＬＣ工程での好ましい溶出液は、アセトニトリル溶液である。好ましい溶出液は、通常、約２５％（ｖ／ｖ）から約６０％（ｖ／ｖ）まで、より好ましくは約２５％（ｖ／ｖ）から約５５％（ｖ／ｖ）まで、さらに好ましくは２９％（ｖ／ｖ）から約５５％（ｖ／ｖ）まで、溶出の間に変化するアセトニトリル濃度を有する。好ましい実施形態において、溶出液中のアセトニトリル濃度は、所望のアセトニトリルの最大濃度に達するまで、１分当り約０.３％（ｖ／ｖ）と０.４％（ｖ／ｖ）の間の増分で高められる。本実施形態において、約３５−３７％アセトニトリル濃度で溶出するＨＰＬＣ画分を、ＴＧＦ−１タンパク質のさらなる精製および単離のために回収およびプールし、さらに約３０−４０％アセトニトリル濃度で溶出するＨＰＬＣ画分を、ＴＧＦ−２タンパク質のさらなる精製および単離のために回収およびプールする。好ましくは。各ＴＧＦ−溶出に関してプールした画分を、ＨＰＬＣ分析の後にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析で分析して、ＴＧＦ−タンパク質が対応画分中に存在することを確認する。当業界で周知な手段によって、ＨＰＬＣ溶出液からタンパク質を回収することができる。
【００３８】
ＨＰＬＣ分離の後、ＴＧＦ−１含有画分およびＴＧＦ−２含有画分を同一手段によって並行してさらに精製してもよい。タンパク質画分を最初に適切な溶液中に移し、その後、ヘパリン−セファロースカラムに別々に装填する。本発明において、各タンパク質画分を凍結乾燥し、さらに６Ｍ尿素、５０ｍＭリン酸カリウムを含有する溶液（ｐＨ８.０）中に再溶解させてもよい。
【００３９】
各タンパク質画分をヘパリン−セファロースカラムに別々に装填し、高イオン強度を有する適切な溶出媒体を用いて溶出させる。ＴＧＦ−２の精製に好ましい実施形態において、タンパク質は最初にカラムに保持されず、従ってカラム空隙において認められる。ＴＧＦ−１の精製に関して好ましい実施形態では、６Ｍ尿素、および５０ｍＭリン酸カリウムを含有する混合物（ｐＨ８.０）、ならびに６Ｍ尿素、５０ｍＭリン酸カリウム、および７５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する混合物を用いて、ＴＧＦ−１を溶出させる。本実施形態において、ＴＧＦ−１は、約１００ｍＭからの範囲の塩化ナトリウム濃度で溶出する。ＴＧＦ−１画分の後に溶出する高塩化ナトリウム画分は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＮＭＰ−７等の他の増殖因子を含有することが分かっている。好ましくは、本精製工程の後、ヘパリン−セファロースカラムから溶出しプールされた画分のそれぞれの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析で分析して、ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質を含有する画分を陽性として同定する。
【００４０】
必要に応じて、各タンパク質画分に最終ＨＰＬＣ脱塩精製工程を施し、高度に精製されたＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質を得る。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、本発明の様々な精製工程によって得ることができるＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質組成物である。本発明のＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質組成物は、通常、約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％異常の対応ＴＧＦ−タンパク質成分を含有する。
【実施例１】
【００４２】
本発明の原料を調製するためのプロトコルを以下に示す：
１．開始原料：
トランスフォーミング増殖因子１および２（「ＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２」）の精製のための開始原料は、米国特許第5,290,763号に記載の骨誘導性タンパク質混合物の精製からの側流(side stream)である。陰イオン交換（「ＡＸ」）カラムの操作の間、カラムに保持されない部分がある（「空隙」と称する）。そのタンパク質画分はタンパク質装填工程の間に溶出し、例えばＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２のようなかなり塩基性のタンパク質（ｐＨ７.０を越える等電点を有する）を含む。ＡＸカラムの細菌の操作条件下（６Ｍ尿素中の２０ｍＭ ｔｒｉｓ、ｐＨ８.５、伝導度９００−１３００Ｓ）において、空隙画分中のタンパク質の量は、通常、クロマトグラフィーカラムに装填した全タンパク質の約５％である。この画分のｐＨは、ＡＸ工程の平衡バッファーの伝導度に等しい伝導度を有する約８.５でなければならない。
【００４３】
２．濃縮および透析
ＡＸカラム操作で保持されなかったタンパク質（ＡＸ空隙）を製造から得る。通常、２８０ｎｍでの吸光度に基づく濃度は、０.３ｍｇ／ｍｌ未満であり、かつ容量は２カラム容積（「ｃｖ」）すなわち６０Ｌである。
【００４４】
タンジェンシャルフローフィルトレーション装置を用いて空隙溶液を濃縮および透析する。用いられる装置は、３つのMillipore Pelicon 2 Mini、 5K MWCO、ポリエーテルフルホン（「ＰＥＳ」）を有するＭ１２である。「Ａ」型スクリーニング膜（各０.１ｍ２、全体で０.３ｍ２の膜）。
【００４５】
濃縮は、５０％ポンプスピードおよび５ｐｓｉ背圧で、Ｍ−１２を用いて実施する。最初の流速は通常４０ｍｌ／分である。大容量であるため、約２４時間の総処理時間をかけて１晩濃縮を実施する。最終容積が２Ｌになるまでタンパク質溶液を濃縮する。
【００４６】
濃縮工程が完了した後、透析工程を実施する。通常、６−１０容積の透析バッファーを用いて、空隙タンパク質画分を完全に透析する。透析工程に用いられるバッファーは、陽イオン交換工程用の平衡バッファーである（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１％イソプロピルアルコール（「ＩＰＡ」）、ｐＨ４.６、伝導度は約１４００Ｓ）。透析が完了すると、最終的な濃縮を実施して、容積を約１Ｌまで減らす。
【００４７】
通常、２８０ｎｍでのタンパク質吸光度に基づいて、それら工程の総回収率は非常によい（＞９５％）。
【００４８】
３．陽イオン交換：
ＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２の最初の重要な精製工程は、陽イオン交換工程を用いて実施される。カラム操作の詳細を以下に示す：
ハードウェア：
用いられるカラム：          Pharmacia XK50/30（カラムの直径は５ｃｍ）
断面積：                    ｒ２＝１９.６ｃｍ２として特定
クロマトグラフィー樹脂：    Pharmacia SP Sepharose fast flow
カラム容積：                ２６ｃｍ層高＝５１０ｍｌカラム
コントローラー：            フラクションコレクターを有する「BioCard」
カラム操作：
バッファー：
バッファーＡ：  ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、１％ＩＰＡ、ｐＨ４.６、伝導度約１５００Ｓ
バッファーＢ：  ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、６００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、１％ＩＰＡ、ｐＨ４.６、伝導度約４０ｍＳ
バッファーＣ：  ５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１.５Ｍ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、１％ＩＰＡ、ｐＨ４.６、伝導度約８０ｍＳ
平衡化：  ５ｃｖ（またはカラム流出液のｐＨおよび伝導度がバッファーと同じになるまで）のバッファーＡを用いる。流速は約１５０ｍｌ／分である（４５０ｃｍ／時間に相当）
タンパク質装填：  最初に０.４５μｍのメンブランフィルターを通してタンパク質溶液を濾過して粒子を除去する。次に、カラムを「BioCad」プログラム制御精製システムに接続する
完全に平衡化させたカラムに６−１０ｍｌ／分（１８−３０ｃｍ／時間）の流速で空隙画分を装填する。１Ｌ全ての空隙画分をカラムに装填する（約２ｃｖを意味する）。空隙画分の濃度は通常約１０ｍｇ／ｍｌである
装填後洗浄：  １−２ｃｖ（またはカラム流出液のｐＨおよび伝導度がバッファーと同じになるまで）のバッファーＡを用いる
タンパク質溶出：  ６.８ｃｖの総容積中、０％バッファーＢから１００％バッファーＢまでのバッファー勾配を用いて、カラムからタンパク質を溶出させる。溶出プロファイルの一部を図１に示す。ＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２画分は通常４００から５５０ｍＭ ＮａＣｌまでの間に溶出する
３.４ｃｖの溶出サイクルをカラムに通した後、カラム溶出液（２０ｍｌ画分）からタンパク質を集める。通常フラクション番号は１１０−１２０である
カラム再生：  タンパク質溶出の後、最初に３ｃｖのバッファーＣを用いてカラムを洗浄する
２Ｍ ＮａＣｌおよび１Ｍ ＮａＯＨを用いるカラムオフラインでより徹底的な洗浄を実施する
タンパク質プール：  画分の位置を示すクロマトグラムを作成する（図１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とウェスタンブロッティングの組合せによってＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２を含有する画分を同定する。両方の増殖因子を含有する画分をプールする。通常、プールした画分は、６００ｍｌの全容積に対して３０−２０ｍｌの画分を示す。
【００４９】
４．透析／凍結乾燥：
プールした画分を透析バッグ中において脱イオン水に徹底的に透析する(Spectro/pro, 3.5kD MWCO)。透析後、タンパク質を乾燥タンパク質固形物に凍結乾燥する
ＨＰＬＣ精製工程用の調製において、凍結乾燥タンパク質を１０−１５ｍｇ／ｍｌで０.１％トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）を含有する脱イオン水中に溶解させる。この段階で総タンパク質は１０００−２０００ｍｇを示す（２８０ｎｍでの吸光度および１.０の減衰係数に基づく）
ＨＰＬＣ：
逆相ＨＰＬＣカラムを用いて、ＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２に関する第２精製工程を実施する。カラム操作の詳細を以下に示す。本工程は、ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質を豊富に含む２つの別個の画分をもたらす
ハードウェア：
用いられるカラム：          Ｖｙｄａｃ（直径２.２ｃｍｘ高さ２５ｃｍ）カラム
断面積：                    ｒ２＝３.８ｃｍ２として特定
クロマトグラフィー樹脂：    Ｃ１８基で修飾された１０−１５Ｍシリカビーズ
カラム容積：                ２５ｃｍ層高＝９５ｍｌカラム
コントローラー：            フラクションコレクターを有するWaters LC 600 HPLCシステム
カラム操作：
バッファー：
バッファーＡ：  ０.１％トリフルオロ酢酸ＴＦＡを含む脱イオン水
バッファーＢ：  ９０％アセトニトリル（「ＡＣＮ」）、０．１％ＴＦＡを含む９.９％脱イオン水
平衡化：  ３−５ｃｖのバッファーＡ：バッファーＢ（６８：３２、または２９％ＡＣＮ）中でカラムを平衡化させる。流速は約１１.４ｍｌ／分である（１８０ｃｍ／時間に相当）
タンパク質装填：  完全に平衡化させたカラムに１１.４ｍｌ／分（１８０ｃｍ／時間）の流速で透析ＣＸピーク画分（０.１％ＴＦＡ中）を装填する。各実施当たり、１００−１５０ｍｇの総タンパク質をＨＰＬＣカラムに装填する。通常、１０−１５ｍｌ（１０−１５ｍｇ／ｍｌの濃度で）を意味する。従って、各精製サイクルあたり複数回のＨＰＬＣの実施を行う（５−１０回）
装填後洗浄：  溶出サイクルを開始する前に、２ｃｖで洗浄を行う（バッファーＡ：バッファーＢ＝６８：３２、または約２９％ＡＣＮ）
タンパク質溶出：  ２９％（上記のバッファーＡとＢとを混合）から５３％までのＡＣＮ（バッファーＡ：バッファーＢ＝４１：５９）のＡＣＮ勾配を用いて、カラムからタンパク質を溶出させる。勾配の全容積は４.５ｃｖを示す。ＴＧＦ−１は３５−３７％ＡＣＮで溶出するが、ＴＧＦ−２は３８−４０％で溶出する。溶出プロファイルを図２に示す
カラム溶出液から各画分を３０秒ごとに集める（５.７ｍｌ画分）。通常、各タンパク質プールに関して２−４画分をプールする
カラム再生：  タンパク質溶出の後、１−２ｃｖの１００％バッファーＢを用いてカラムを洗浄する
タンパク質プール：  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とウェスタンブロッティングの組合せによってＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２を含有する画分を同定する。各増殖因子を含有する画分をプールする
凍結乾燥：  ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２のプールした画分を凍結乾燥し、ヘパリン−セルロースカラム用の平衡バッファー（下記のバッファーＡ）中に１ｍｇ／ｍｌで再溶解させる。
【００５０】
６．ヘパリンセファロースクロマトグラフィー：
ヘパリンセファロースカラムを用いて、ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２画分の最終主要精製工程を実施する。カラム操作の詳細を以下に示す。本カラム工程を用いて、ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２の別個の画分を精製する
ハードウェア：
用いられるカラム：  高性能ヘパリンセファロース樹脂を含むPharmacia HiTrapカラム。カラムサイズは直径１.６ｃｍｘ高さ２.５ｃｍ
断面積：  ｒ２＝２.０ｃｍ２として特定
クロマトグラフィー樹脂：  高性能ヘパリンセファロース
カラム容積：  ２.５ｃｍ層高＝５.０ｍｌカラム
コントローラー：  Pharmacia AKTA Explorer自動精製システム
カラム操作：
バッファー：
バッファーＡ：  ５０ｍMリン酸カリウム、６Ｍ尿素、ｐＨ８.０
バッファーＢ：  ５０ｍMリン酸カリウム、６Ｍ尿素、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０
平衡化：  ５ｃｖのバッファーＡを用いてカラムを平衡化させる。流速は５.０ｍｌ／分である（１５０ｃｍ／時間に相当）
タンパク質装填：  完全に平衡化させたカラムに１.０ｍｌ／分（３０ｃｍ／時間）の流速で凍結乾燥ＨＰＬＣピーク画分（ＴＧＦ−１またはＴＧＦ−２のいずれか）を装填する。最大７.５ｍｇタンパク質をカラムに装填する（７.５ｍｌまたは１.５ｃｖ）
装填後洗浄：  溶出サイクルを開始する前に、２ｃｖのバッファーＡでカラムを洗浄する。流速は５ｍｌ／分である
タンパク質溶出：  一連の塩「工程」を用いて、カラムからタンパク質を溶出させる。装填後洗浄の間にＴＧＦ−２画分が溶出し、それを集める（図３参照）。１３％バッファーＢ（バッファー中約１００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてＴＧＦ−１画分を溶出させる。ＴＧＦ−１画分の溶出を図４に示す。ＴＧＦ−１溶出の後、１００％バッファーＢをカラムに添加する。この操作によってＢＭＰ−３を含み得る汚染タンパク質を除く
ＴＧＦ−１またはＴＧＦ−２画分を単一ピークとして集める。３.４ｃｖの溶出サイクルをカラムに通した後、カラム溶出液からタンパク質を集める（２０ｍｌ画分）通常、フラクション番号１１０−１２０
カラム再生：  タンパク質溶出の後、３ｃｖのバッファーＣを用いてカラムを洗浄する
タンパク質プール：  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とウェスタンブロッティングの組合せによってＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２を含有する画分を同定する。各増殖因子を含有する画分をプールする。
【００５１】
７．脱塩工程：
逆相ＨＰＬＣカラムを用いて、ＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２の最終精製工程を実施する。カラム操作の詳細を以下に示す。本工程の目的は、迅速で効率的な方法によって、ヘパリンセファロース画分から尿素および塩を除去することである。ヘパリンセファロース工程と同様に、ＴＧＦ−１画分とＴＧＦ−２画分とを別々に処理する
ハードウェア：
用いられるカラム：          Ｖｙｄａｃ（直径２.２ｃｍｘ高さ２５ｃｍ）カラム
断面積：                    ｒ２＝３.８ｃｍ２として特定
クロマトグラフィー樹脂：    Ｃ１８基で修飾された１０−１５Ｍシリカビーズ
カラム容積：                ２５ｃｍ層高＝９５ｍｌカラム
コントローラー：            フラクションコレクターを有するWaters LC 600 HPLCシステム
カラム操作：
バッファー：
バッファーＡ：  ０.１％トリフルオロ酢酸ＴＦＡを含む脱イオン水
バッファーＢ：  ９０％アセトニトリル（「ＡＣＮ」）、０．１％ＴＦＡを含む９.９％脱イオン水
平衡化：  ３−５ｃｖのバッファーＡ：バッファーＢ（９８：２、または１.８％ＡＣＮ）中でカラムを平衡化させる。流速は約１１.４ｍｌ／分である（１８０ｃｍ／時間に相当）
タンパク質装填：  完全に平衡化させたカラムに１１.４ｍｌ／分（１８０ｃｍ／時間）の流速でヘパリンセファロース画分を直接装填する。各実施当たり、３−５ｍｇのタンパク質（２０ｍｌ中）をＨＰＬＣカラムに装填する。最大２０−３０ｍｇタンパク質までタンパク質の複数回の注入を実施してもよい
装填後洗浄：  溶出サイクルを開始する前に、２ｃｖで洗浄を行う（バッファーＡ：バッファーＢ＝９８：２、または約１.８％ＡＣＮ）
（注：複数回の注入を実施した場合、各注入後に装填後洗浄を実施する）
タンパク質溶出：  ８８％ＡＣＮ（上記のバッファーＡとＢとを２：９８で混合）から成る段階勾配を用いて、カラムからタンパク質を溶出させる。ＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２の精製された脱塩画分は２ｃｖ内に溶出する
溶出プロファイルを図５に示す
カラム再生：  タンパク質溶出の後、１−２ｃｖの１００％バッファーＢを用いてカラムを洗浄する
最終タンパク質プール：  ＴＧＦ−１／ＴＧＦ−２を含む凍結乾燥画分を、１ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度で１０ｍＭ ＨＣｌ中に再溶解させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて試料の純度を特定し、さらにウェスタンブロッティングを陽性同定法として用いる。典型的な精製の概要を表１および２に示す。付加的な情報を図６および図７に示す。
【表１】
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【表２】
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【００５２】
本発明の様々な実施形態について詳細に記載したが、当業者がそれら実施形態の変更および適応を考え付くことは明らかである。例えば、例えば歯周病のような様々な適用において、および復顔術において、ならびに他の骨および関節の不具合の治療において、骨誘導性因子を用いることができる。しかしながら、そのような変更および適応が、以下の請求項に示されている本発明の精神および範囲内に含まれることを明白に理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、陽イオン交換カラムからの典型的なタンパク質溶出プロファイルを示す。
【図２】図２は、逆相ＨＰＬＣカラムからの典型的なタンパク質溶出プロファイルを示す。
【図３】図３は、ヘパリン−セルロースカラムからのＴＧＦ−２に関するタンパク質溶出プロファイルを示す。
【図４】図４は、ヘパリン−セルロースカラムからのＴＧＦ−１に関するタンパク質溶出プロファイルを示す。
【図５】図５は、複数注入プロトコルを用いる脱塩ＨＰＬＣカラムからのタンパク質溶出プロファイルを示す。
【図６】図６は、ウェスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によるＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質の精製を示す。
【図７】図７は、ヘパリン−セファロースおよび脱塩ＨＰＬＣクロマトグラフィーに続くＴＧＦ−１およびＴＧＦ−２タンパク質の精製を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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