(57)【要約】ＳＴレセプターについてアフィニティを有するペプチド−キレートコンジュゲートであって、該キレートがテトラデンテートであるものを開示する。低分子量熱安定性毒素を、E. coliのエンテロトキシン株によって生産する。この毒素は、ＳＴペプチドとして知られ、急性下痢疾患を、結腸大腸細胞上のそのレセプターに結合し、グアニレートシクラーゼを刺激することによって介在する。胃腸粘膜細胞は特異的にＳＴレセプターを発現し、該発現は結腸および直腸粘膜細胞が悪性ネオプラシックトランスフォーメーションを経験した後継続する。本発明のペプチド−キレートコンジュゲートは、放射性金属で標識し得、金属錯体を提供し得る。好ましい実施態様では、放射性金属は９９ｍｔｃであり、そしてキレート化剤はジアミンジオキシム、ジアミンジフェノール、Ｎ３Ｓ、Ｎ４、およびＮ２Ｓ２配位子から選択される。該金属錯体を含む放射性医薬組成物を提供し、これは結腸直腸癌の診断的画像化に好適である。また本発明において放射性医薬組成物の調製のためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラデンテートキレート化剤にコンジュゲートされたＳＴレセプターについての特異的を有するペプチドを含むペプチド−キレートコンジュゲートであって、該ＳＴレセプターについてのアフィニティを有するペプチドが１０ないし２５アミノ酸を含む、コンジュゲート。
【請求項２】
該ＳＴレセプターについてのアフィニティを有するペプチドが、１３ないし１９アミノ酸を含む、請求項１のペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項３】
テトラデンテートキレート化剤が、ジアミンジオキシム、Ｎ３Ｓ配位子、Ｎ４配位子、ジアミンジフェノールおよびＮ２Ｓ２配位子から選択される、請求項１または２のペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項４】
該テトラデンテートキレート化剤がジアミンジオキシムおよびＮ３Ｓ配位子から選択される、請求項１ないし３のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項５】
該テトラデンテートキレート化剤が、９９ｍＴｃとの錯体を、塩基性ｐＨで形成するものである、請求項１ないし４のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項６】
該テトラデンテートキレート化剤が式Ａ：
【化１】
2004524323.tif 000016
[式中、Ｒ１−Ｒ６はすべてＣＨ３であり、かつＱは−（ＣＨ２）２ＮＲ（ＣＨ２）２−である]
のものである、請求項１ないし５のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項７】
該テトラデンテートキレート化剤が式Ｂ；
【化２】
2004524323.tif 000017
[式中、Ｒ１およびＲ２は両方Ｈであり、かつＸはチオール保護基である]
のものである、請求項１ないし５のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項８】
該ペプチドが配列番号１ないし７から選択される、請求項１ないし７のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項９】
該コンジュゲーションが、該ペプチドのＮ末端またはＣ末端におけるものである、請求項１ないし８のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項１０】
ペプチドとテトラデンテートキレート化剤の間のリンカー基をさらに含む、請求項１ないし９のペプチドーキレートコンジュゲート。
【請求項１１】
該リンカー基が、５ないし９アミノ酸のペプチド配列を含む請求項１０のペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項１２】
該リンカー基が、−ポリ−Ｌｙｓ−、−ポリ−Ｇｌｕ−、−（Ｇｌｙ）２−Ｇｌｕ−（Ｌｙｓ）３−、−（Ｇｌｙ）２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−、−（Ｐｈｅ）２−（ＣＨ２）５−、（Ｌｙｓ）６−Ｇｌｙ−、−（Ｇｌｙ）３−（ＤＧｌｕ）３−、および−（Ｇｌｙ）−（
アミノカプロン酸）２−から選択される、請求項１０または１１のペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のペプチド−キレートコンジュゲートのテトラデンテートキレート化剤に錯体化された放射性金属を含む、金属錯体。
【請求項１４】
該放射性金属が６４Ｃｕ、６５Ｃｕおよび９９ｍＴｃから選択される、請求項１３の金属錯体。
【請求項１５】
該放射性金属が９９ｍＴｃである、請求項１３または１４の金属錯体。
【請求項１６】
ヒト投与のために好適な形態の放射性医薬組成物であって、請求項１３ないし１５の金属錯体を含む、組成物。
【請求項１７】
該放射性金属が９９ｍＴｃである、請求項１６の放射性医薬組成物。
【請求項１８】
結腸直腸起源の癌を画像化するための、請求項１６および１７の放射性医薬組成物の使用。
【請求項１９】
請求項１６および１７の放射性意約組成物の調製のためのキットであって、
（ｉ）請求項１ないし１２のペプチド−キレートコンジュゲート
（ｉｉ）還元剤
を含むキット。
【請求項２０】
該還元剤がスズ塩である、請求項１９のキット。
【請求項２１】
１または２以上の安定剤、酸化防止剤、凍結乾燥のための充填剤、および可溶化剤をさらに含む、請求項１９または２０のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、放射性医薬に関し、特に本発明は、ＳＴレセプターについてのアフィニティを有するペプチドを含む、ペプチド−キレートコンジュゲートに関する。本発明の化合物は、哺乳動物の結腸直腸癌の診断的画像化に好適である。
【０００２】
本発明は追加的に、ＳＴレセプターについてのアフィニティを有する放射性標識されたペプチドキレートコンジュゲートに関し、ここでペプチド−キレートコンジュゲートの放射性標識付加は、該ペプチドの、該ＳＴレセプターについてのアフィニティに干渉しない。本発明のさらなる側面では、結腸直腸起源の癌の画像化のためのそのような化合物の使用（用途）を提供する。
結腸直腸癌を画像化するための放射性標識されたペプチド−キレートコンジュゲートの生産のためのキットをまた開示する。
【０００３】
背景技術
結腸直腸癌腫（ＣＲＣ）は、肺、乳および前立腺の癌に続く第４の最も普通の悪性の世界的な癌である。ＣＲＣ起源の転移は、結腸直腸原発性腫瘍を有すると診断された患者の死の主要な原因である。近似的に１５００００ないし２０００００新ケースが、ＵＳＡで年間に診断され、そして５００００くらいの死がこの疾患に帰される。病気中に肝臓病変を発症する、６０−８０％の場合で、多くの患者が該疾患の転移性蔓延のために死ぬ。肝臓転移の陽性同定は、したがって致死疾患の明白な指摘である。ずっと一般的ではないが、他の可能な蔓延の部位は肺、脳およびときに骨を含む。
【０００４】
肝臓巻き込みの程度（転移の数および位置）および切除可能性の間の強い相関のため、外科手術ヘの適性についての患者の適当な評価は、より重要になりつつある（Liver Metastasis: Biology, diagnosis and treatment. Garden O.J., Gereghty J.G., Nagorney D.M. eds.1998）。小サイズ（＜１ｃｍ）の転移を検出することの可能な剤の必要性は、ＣＲＣ患者の処置および取り扱いへ深遠な影響を有する。肝臓中の小さい（＜１ｃｍ）転移性病変を特異的に検出する必要性がある。転移性病変の数および位置の早期検出が重要である。また他の可能な病変（嚢胞、良性病変、処置不可能腫瘍）からの干渉がない腫瘍の起源を特徴付けそして特異的に同定する必要性がある。
【０００５】
低分子量熱安定性毒素が、エンテロトキシン性菌株のE. coliによって生産される。この毒素は、ＳＴペプチドとして知られ、結腸直腸細胞上のそのレセプターに結合し、そしてグアニレートシクラーゼを刺激することによって急性下痢疾患を介在する。急性下痢疾患を介在することなくＳＴレセプターに結合する合成ＳＴペプチドが、ＵＳ４５４５９３１およびＵＳ４８８６６６３に記載される。これらの合成的に生産されるペプチドは、治療的および診断的目的のためのヒト投与のため好適である。
【０００６】
結腸直腸起源の腫瘍細胞上に選択的に発現されるレセプターに対して指向されるターゲティング性リガンドは、結腸直腸起源の癌の存在を特異的に検出する手段である。こうして、ＳＴレセプターは、潜在的標的機構である。胃腸粘膜細胞は特異的にＳＴレセプターを発現し、結腸および直腸粘膜細胞が悪性ネオプラシックトランスフォーメーションを経験する後、該発現が存続する。ＳＴペプチドは他のいかなる腸管性組織外にも見出されなかった。したがって、リガンドの、胃腸起源の組織への特異性は、維持される。発現の類似のレベルは、分化および位置の種々の等級で、ヒト原初性および転移性結腸直腸組織に見出された。ＳＴレセプターについての特異的リガンドは、転移性疾患にのみ結合し、もし該化合物が静脈内に注射されるならば、腸管細胞のアピカル側ヘの接近が、回避されるであろうからである。
【０００７】
ＣＲＣ画像化および診断のための放射性標識されたＳＴペプチドが以前報告された。ＵＳ５５１８８８８は、ＳＴペプチドに基づく放射線診断剤を請求する。その発明の１実施態様では、該ペプチドを、放射性画像化剤、例えば放射性ヨウ素、１１１Ｉまたは９９ｍＴｃに連結させ得る。９９ｍＴｃはＤＴＰＡによってキレート化され、これを無水物に変換し、そしてＳＴペプチドと反応させる。その他のキレートは、ＵＳ５５１８８８８に開示されていない。放射性標識付加は、こうして該ペプチドを、転移した結腸直腸癌を放射性画像化することにおける使用のため好適にする。ＵＳ６０６００３７は、そのような放射性標識されたＳＴペプチドを使用して転移性ＣＲＣを放射性画像化する方法を開示する。放射性標識したＳＴペプチドの投与後の放射能の局在化した蓄積または凝集の検出は、ＳＴレセプターを有する細胞の存在を指摘する。ＷＯ９９／２１５８７およびＷＯ９９／３９７４８はまた、診断的画像化のための放射性標識されたＳＴペプチドを開示する。ＷＯ９９／２１５１８７において、放射性金属錯体化剤の好ましいクラスは、テルピリジンおよびフェナントロリンである。ＷＯ９９／３９７４８では、該錯体化剤は、テルピリジン、クアテルピリジン、キンピリジンまたはセキシピリジンの誘導体である巨大環式オリゴ−２，６−ピリジン含有環を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、放射性標識付加反応のｐＨ８．０、８．５および９．０の、種２（ＣＡ−ＳＴ５−１８）の形成に及ぼす影響を示す。
【図２】図２は、放射性標識付加反応の温度の変化の、種２（ＣＡ−ＳＴ５−１８）の形成に及ぼす影響を示す。評価する温度は、４０℃、６０℃および７０℃であった。
【図３】図３は、１２．５μｇ、２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ化合物で試験した、化合物質量の、種２（ＣＡ−ＳＴ５−１８）のパーセント形成に及ぼす影響を示す。
【図４】図４は、Ｔ８４腫瘍を皮下に有するマウスのＳＰＥＣＴ画像を示す。画像は、動物あたり２０ＭＢｑの、ＨＰＬＣ精製された９９ｍＴｃで標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８を使用する、ＬＥＵＨＲコリメーターでの平面後方静止画像である。腫瘍対肝臓比率は；１５分で１．１、６０分で２および１２０分で４であった。画質は、粗調製品を使用したとき、比較可能であった。
【図５】陰性コントロール、ＣＡ１−ＳＴ５−１８（ｃｙｓ−ａｌａ）に対する、ＣＡ１−ＳＴ５−１８の相対的保持を示す。
【図６】図６は、皮下Ｔ８４腫瘍を有するＣＤ−１ヌードマウスにおける、ＨＰＬＣ精製した、９９ｍＴｃで標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８およびＣＡ１−ＳＴ５−１８（ｃｙｓ−ａｌａ）取りこみの比較を示す。動物あたり２０ＭＢｑでの、ＨＰＬＣ精製したＣＡ１−ＳＴ５−１８を使用する、ＬＥＵＨＲコリメーターでの平面後方静止画像。
【図７】Ｔ８４肝臓腫瘍を有するＲＮＵ／ｍｕヌードラットおよびマウスにおける、動物あたり２ＭＢｑの精製したＣＡ１−ＳＴ５―１８の生物分布を示す。データは、相対保持（ＲＲ）および腫瘍の肝臓および腫瘍の筋肉に対する比率として表現する。
【図８】図８は、Ｔ８４肝臓腫瘍を有するＲＮＵ／ｍｕヌードラットの画像を示す。それは、ＬＥＵＨＲコリメーターで２０ＭＢｑの、ＨＰＬＣ精製したＣＡ１−ＳＴ５−１８を使用する、注射後（ｐ．ｉ．）１２０分の平面後方静止画像である。画像は、バックグラウンドカウントが除去され、そして腎臓がマスクされた体全体画像である。画像腫瘍：肝臓比率は、典型的には２．５である。
【図９】図９は、過剰のペプチドの存在および不存在下の、Ｔ８４肝臓腫瘍を有するＲＮＵ／ｍｕヌードマウスの画像を示す。画像は、ＬＥＵＨＲコリメーターで動物あたり２０ＭＢｑのＨＰＬＣ精製したＣＡ１−ＳＴ５−１８の１２０分ｐ．ｉ．の平面後方静止画像である。
【図１０】図１０は、２人のヒトおよび４つの異種移植片ヒト細胞株ＣＲＣ腫瘍のレセプター密度（ＲＤ）を示す（ｎｄ＝レセプター密度データ検出せず）。
【０００９】
発明の記載
ＳＴペプチドは、３つのジスルフィド結合を含む環式ペプチドである。これらのＳＴペ
プチドがいくつかの９９ｍＴｃキレート剤放射性標識付加のために要する塩基性ｐＨ条件下で不安定であり、ジスルフィド架橋の開裂および、潜在力の許容されない喪失を与えることが見出された。この不安定性は、効率的標識付加のためｐＨ約８−９を要する多数の９９ｍＴｃキレートを除外し得る。結果的に、ペプチド−キレートコンジュゲートは、高潜在力を維持するために酸性条件下で標識されなければならない。しかし、そのようなキレートは、複雑な標識付加手法を必要とし、そして貧弱な効験、例えば上昇された肝胆汁性取りこみおよび急速な血液クリアランスしかない９９ｍＴｃのコンジュゲートを生成し得る。本発明は、ＳＴペプチドの潜在力の喪失ない酸性条件下で標識できるペプチド−キレートコンジュゲートを提供し、効率的な画像化剤を提供する。
【００１０】
第１側面では、本発明は、テトラデンテートキレート化剤にコンジュゲートされたＳＴレセプターについてアフィニティを有するペプチドを含む、ペプチド−キレートコンジュゲートを提供し、ここで該ＳＴレセプターについてアフィニティを有するペプチドは、１０ないし２５アミノ酸を含む。「ＳＴレセプターについてアフィニティを有するペプチド」は、ＳＴペプチド配列から誘導された、好適には１０と２５の間、好ましくは１３と１９の間のアミノ酸である生物学的に活性のペプチドであって、高アフィニティでＳＴレセプターに結合するものである。本発明のペプチドは、天然存在または合成起源であり得るが、好ましくは合成である。これらのペプチドを、キレートへ直接的に、または「リンカー基」の手段によってコンジュゲートし得る。「リンンカー基」は、約５ないし９アミノ酸の、他の基、例えば５炭素長までの脂肪族鎖の包含のあるまたはないペプチド配列を含み得る。好ましいリンカー基は、ポリＬｙｓ、ポリＧｌｕ、（Ｇｌｙ）３−（ＤＧｌｕ）３および（Ｇｌｙ）３−（アミノカプロン酸）２である。好適な放射性金属で標識され、本発明のＳＴペプチドは、結腸直腸起源の癌を検出するための画像化剤としての使用のため好適である。本発明の好ましいペプチドは、配列１−７である。
【００１１】
ＳＴレセプターについてのアフィニティを有する特に好ましいペプチドは、配列番号１ないし５であり、含まれる配列表に提示する。
【００１２】
本発明の実験で使用する陰性コントロールは配列番号８すなわちすべてのシステインがアラニンで置換され、したがって結合に要するジスルフィド架橋を欠く配列番号１である。
【００１３】
ここで使用するように、用語「テトラデンテートキレート化剤（tetradentate chelating agents）」は、本発明のペプチド−キレートコンジュゲートの形成のため好適なキレートであって、ここで該放射性金属（radiometal）が、該テトラデンテートキレート化剤の４つの金属供与原子によって配位結合されている。好適な放射性金属イオンは、該放射性金属と少なくとも１つの５−または６員キレート環を形成する４つの金属供与体からなる供与体セットの手段によってテトラデンテートキレート化剤によって錯体化される。好ましくは、該テトラデンテートキレート化剤は、２または３以上のそのような５−または６員キレート環を、該放射性金属と形成する。これらの配位子は、テクネチウム（９９ｍＴｃ）の錯体化に特に好適であるが、他の放射性金属のためまた使用し得る。
【００１４】
テトラデンテートキレート化剤は、コンジュゲートに存在し、診断的画像化のため好適な、ペプチドの放射性標識付加された形態を生産する。好適な放射活性金属イオンを、テトラデンテートキレート化剤での錯体化の手段によってペプチド−キレートコンジュゲートに包含させ得る。ＳＴペプチドの潜在力が、放射性標識付加の方法によって妥協されないことが本発明の重要な特徴である。
【００１５】
本発明のために好適なテトラデンテートキレート化剤は、以下を含むがこれらに限定されない：
（ｉ）式Ａのジアミンジオキシム
【化１】2004524323.tif 000002
ここでＲＡ１−ＲＡ６は、それぞれ独立的にＲ基である；
ここでＲがＨまたはＣ１−１０アルキル、アルキルアリール、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、フルオロアルキル、アミノアルキルまたはカルボキシアルキルである；
そしてＱは式−（Ｗ）ｎ−の架橋基である；
ここでｎは３、４、または５あり、そしてWは独立的に−Ｏ−、−ＮＲ−または−ＣＲ２
−である。ただし（Ｗ）ｎは、−Ｏ−または−ＮＲ−である最大１個のＷ基を含む。
【００１６】
好ましいジアミンジオキシムは、ＲＡ１ないしＲＡ６＝Ｃ１−３アルキル、アルキルアリール、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、フルオロアルキルまたはアミノアルキルである。最も好ましいジアミノジオキシムは、ＲＡ１ないしＲＡ６＝ＣＨ３を有する。
【００１７】
（ｉｉ）式ＢのＮ３Ｓ配位子：
【化２】2004524323.tif 000003
ここでＸはチオール保護基、例えば標識付加工程前または中に開裂されるベンゾイル、アセチル、またはエトキシエチルである；そして
ＲＢ１およびＲＢ２はＨまたは任意のアミノ酸の側鎖であり得る。
【００１８】
（ｉｉｉ）式ＣのＮ４配位子：
【化３】2004524323.tif 000004
ここでＲＣ１−ＲＣ４はＨ、アルキル、アリールまたはそれらの組み合わせであり得、そしてここでＲＣ１−ＲＣ４のいずれかは官能基、例えばアルキルアミン、アルキルスルフィド、アルコキシ、アルキルカルボキシレート、アルキルアリールアミン、またはアリールスルフィドでなければならない。この型の配位子は、Ｃ＝Ｏアミド連結を有するものを含む。式Ｃの巨大環式版は、また例えば、
【化４】2004524323.tif 000005
を含み、ここでＲＣ５は前記のＲＣ１ないしＲＣ４について定義の通りである。
【００１９】
（ｉｖ）式Ｄのジアミンフェノール：
【化５】2004524323.tif 000006
ここでＹはＣまたはＮである；
ＲＤ１およびＲＤ２は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり得、そしてここで、ＲＤ１およびＲＤ２のいずれかは官能基、例えばアルキルアミン、アルキルスルフィド、アルコキシ、アルキルカルボキシレート、アルキルアリールアミンまたはアリールスルフィドでなければならなず、かつ
ｍ＝ｎ＝１または２である。
【００２０】
（ｖ）式ＥのＮ２Ｓ２配位子：
【化６】2004524323.tif 000007
ここでＺはチオール保護基、例えば標識付加工程の前または中に開裂されるベンゾイル、アセチルまたはエトキシエチルであり、そして
ＲＥ１−ＲＥ１２はＨ，アリール基またはアルキル基からそれぞれ選択され、そしてここでＲＥ１−ＲＥ１２のいずれかは官能基、例えばアルキルアミン、アルキルスルフィド、アルコキシ、アルキルカルボキシレート、アルキルアリールアミンまたはアリールスルフィドでなければならず、そして
対ＲＥ３／ＲＥ４、ＲＥ５／ＲＥ６、ＲＥ７／ＲＥ８、ＲＥ９／ＲＥ１０の１または２以上はＣ＝Ｏ結合を示し得る。
【００２１】
本発明の好ましいキレート化剤は、式Ａのジアミンジオキシムであり、ここでＲＡ１−ＲＡ６はすべてＣＨ３であり、そしてＱは−（ＣＨ２）２ＮＲ（ＣＨ２）２−であり、ここでＲは式（Ａ）について定義のようなＲ基である。最も好ましいキレート化剤は、ここで−（ＣＨ２）２ＮＲ（ＣＨ２）２−のＲがアミノアルキルであり、特にＲ＝−（ＣＨ２）２ＮＨ−。後者は、この文書の残りで「キレート化剤１」（ＣＡ１）として言及する。他の好ましいキレート化剤は、式ＢのＮ３Ｓ配位子であり、ここでＲＢ２およびＲＢ２は両方Ｈであり、そしてＸはアセチルである。これは、文書の残りについて「キレート化剤２」（ＣＡ２）として言及する。「キレート化剤３」（ＣＡ３）は、式ＢのＮ３Ｓ配位子であり、ここでＲＢ１はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＝ＯでありＲＢ２はＨでありそしてＸはエトキシエチルである。
【００２２】
本発明の合成ペプチドは、固相方法論によって合成でき、当業界で周知である。ＳＴ５−１８の代表的合成は、実施例に与える。本発明のペプチド−キレートコンジュゲートは、二官能性キレート化剤、すなわちテトラデンテートキレート化剤がペンダント官能基を有する化合物を使用して調製できる。好ましい官能基はアミノまたはカルボキシル官能基であり、これは所望のペプチド上のアミンまたはカルボキシル基、特に該ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端へのアミド結合を介する容易なカップリングを可能とする。
【００２３】
Ｎ３Ｓ二官能性キレート化剤を、Sudhaker et al[Bioconjugate Cem., Vol.9, 108-117(1998)]の方法によって調製できる。ジアミノジオキシム二官能性キレート化剤の合成は実施例３に記載する。ジアミノジフェノール化合物を、Pillai et al[Nucl. Med. Biol, Vol. 20, 211-216(1993)]の方法によって調製できる。ビスアミドジチオール化合物を、Kung et al[Tetr. Lett.,Vol 30, 4069-4072(1989)]の方法によって調製できる。モノアミドモノアミンビスチオール化合物を、Hansen et al[Inorg. Chem.,Vol 38, 5351-5358(1999)]の方法によって調製できる。官能性テトラアミンを、Simmon et al[J. Am. Chem.Soc., Vol 102, 7247(1980)]の方法によって調製できる。ＣＡ１−ＳＴ５−１８コンジュゲートの合成での重要な方法は、以下のページのスキーム１に示すようにまとめることができる。
【００２４】
ペプチドの、キレートへのコンジュゲーションを、標識付加反応に先立ち実施する。コンジュゲーションの直接的方法は、化合物ＣＡ１−ＳＴ５−１８（またはＣＡ１−配列番号１）において例示する。リンカー分子を介するコンジュゲーションは、化合物ＣＡ１−（Ｇｌｙ）３−（Ｄ−Ｇｌｕ）３−ＳＴ５−１８（またはＣＡ１−配列番号５）において例示する。コンジュゲーションをペプチド分子のＮ末端またはＣ末端を介して実施する。これらの構造および本発明の他の好適な化合物の構造について表１を参照。
【００２５】
本発明の化合物は、再現可能に高放射性化学的純度（ＲＣＰ）、有利な薬物動態、例えば減少された胃腸内取りこみ、および腫瘍性動物中の画像化効験を有する。該化合物は、以前開示されたＣＲＣをターゲティングする化合物を越える明瞭な有利性を供し、なぜなら、これらは改善された薬物動態および、バックグラウンド組織と比較して、腫瘍組織での特異的保持を有するからである。
【００２６】
スキーム１  自動化ペプチド合成機を使用するペプチドアセンブリ
【表１】2004524323.tif 000008
【００２７】
第２側面では、本発明はペプチド−キレートコンジュゲートのテトラデンテートキレート化剤へ錯体化された放射性金属を含む金属錯体を提供する。金属錯体のための好ましいキレート化剤は、式Ａのジアミンジオキシムから選択され、ここでＲＡ１−ＲＡ６はすべてＣＨ３であり、そしてＱはー（ＣＨ２）２ＮＲ（ＣＨ２）２−である。特に好ましい式Ａのジアミンジオキシムは、前定義の通りのＣＡ１である。金属錯体のための他の好ましいキレート化剤は、前定義のＮ３Ｓ配位子ＣＡ２およびＣＡ３である。好適な放射性金属は、陽電子エミッター、例えば６４Ｃｕおよび６５Ｃｕまたは９９ｍＴｃのようなガンマエミッターから選択し得る。本発明の好ましい実施態様は、９９ｍＴｃで放射性標識されたペプチド−キレートコンジュゲートである。９９ｍＴｃで放射性標識されたペプチド−キレートコンジュゲート（ここで該放射性標識付加反応が、塩基性ｐＨで実施される）は、本発明の最も好ましい実施態様である。
【００２８】
本発明によって定義さえる放射性標識付加は、放射性金属、例えば前記のようなものの化学的付着である。本発明の好適な放射性標識された化合物は、ＳＴレセプターについてアフィニティを有し、結腸直腸起源の癌の診断的画像化を可能とする。好ましい放射性標識された化合物はこうして、副生成物の最小生産で明確に標識される。そのような副生成物の例は、９９ｍＴｃ標識付加の場合に、還元された加水分解されたテクネチウム（ＲＨＴ）である。本発明の好ましい実施態様では、ペプチド−キレートコンジュゲートを、９９ｍＴｃで標識付加し、高ＲＣＰおよび低ＲＨＴレベルを維持する。実施例に記載の種々の研究の結果は、本発明の好ましい化合物が、標識付加条件に対して安定であり、そして放射性標識付加に続いてそれらの生物学的効験を維持することを示す。
【００２９】
９９ｍＴｃ標識した、本発明のコンジュゲートの場合に特に重要なのがＲＨＴレベルであり、というのは主要な生物学的標的のひとつが肝臓におけるからである。ＲＨＴは肝臓に局在化し、そしてこうして、残存するのを許容するならば、したがってバックグラウンド組織活性を増加させ、標的対バックグラウンド比率を減少させ、そして画質の全体の低下につながる。ＲＨＴの量はすべての調製品中で比較的低い（実施例１０）。種２の形成の率の見地から、１２．５−１００μｇのコンジュゲートレベルのＣＡ１−ＳＴ５−１８の標識付加特性の間の相違はほとんどない。しかし、減少されたコンジュゲートレベルのＲＨＴの増加がある（実施例１０）。
【００３０】
ＨＰＬＣ精製されてない非ろ過調製品に比較して、ろ過およびメチレンジホスホネート（ＭＤＰ、これはＲＨＴレベルを減少させることが知られる）の添加の両方が、肝臓取りこみを減少させる類似の効果を有した（実施例２４）。ＨＰＬＣ精製した調製品で見られるレベルに対するバックグラウンド組織カウントを減少させる方法はないが、肝臓転移の高品質画像はなお、ＨＰＬＣ精製されてない調製品で可能である。
【００３１】
ペプチド−キレートコンジュゲートの放射性標識付加を、好適な緩衝系、例えばカルボネート、ボレート、トリエタノールアミンヒドロクロリド−ＮａＯＨ、ジメチルロイシルグリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−アミノ−２−メチル−１：３−プロパンジオール−ＨＣｌ、ジエタノールアミン−ＨＣｌ、Clark and Lubs溶液（Bower and Bates, J. Res. Natn. Bur. Stand. 55, 191(1957）、グリシン、グリシルグリシンまたはＴＡＰＳ（登録商標）で実施し得る。標識付加反応は好ましくは、塩基性ｐＨ、すなわちｐＨ８．０とｐＨ１０の間、最も好ましくはｐＨ８．５周辺で実施する。実施離５と６は、水酸化ナトリウムまたはボレートバッファーを使用して放射性標識付加反応を実行し、好適なｐＨを維持する。本発明の好ましい方法は、放射性標識付加反応中のボレート緩衝系の使用である。
【００３２】
実施された競合結合実験は（実施例１５に記載のように）、種々のＳＴペプチド化合物の相対的潜在力を調査した。ｎＭ幅のＫｉ値は、競合するリガンドの良好な結合を示唆する。これらのデータは第１に、ＳＴペプチドのファルマコフォア（Pharmacofore）外の変異が、結合へほとんど相違を生じないことを示す（ＳＴ１−１７対ＳＴ５−１８、それぞれＫｉ０．６および０．４ｎＭ）。ＣＡ３の、ＳＴペプチド上の存在は、Ｋｉの小さい増加、すなわち結合の、小さい得られる減少であるという結果となる。ＣＡ１の存在は、Ｋｉ値を２．８ｎＭへ、結合効験のほとんど１０倍の減少へ、さらに減少させることへのより大きい効果を有する。ナノモル幅の結合アフィニティは、許容可能に高いと考えられ、そして得られた減少された結合の相違は、インビボで観察されない。陰性コントロールは結合がないことを実証した（５００μＭまで）。
【００３３】
本発明の好ましい化合物は、１００ｎＭより小さいＫｉ値を実証し、このことは、レセプターについての高いアフィニティを指摘した（実施例１７参照）。試験したすべての化合物のうち、ＣＡ１−ＳＴ５−１８、ＣＡ３−ＳＴ５−１８およびＣＡ１−ｇｌｙ３−Ｄｇｌｕ３−ＳＴ５−１８が、このアッセイで最大の潜在力を示し、それぞれ２．８ｎＭ、０．８ｎＭおよび１．０ｎＭのＫｉ値であった。これらのスクリーニングした化合物のインビボ効験を以下に議論する。
【００３４】
実施例１５で取得されるデータ、およびにせ（ｍｏｃｋ）標識したペプチド（放射性金属の不存在下での放射性標識付加プロトコルに服したペプチド）の高結合（Ｋｉ）は、放射性標識した材料がなおも生物活性であるという事実を支持する。
【００３５】
第３側面では、本発明は、また、放射性薬学的調製品を包含する。用語「放射性薬学的調製品」によって、ヒト投与に好適な形態の本発明の放射性金属錯体を含む組成物を意味する。ヒト投与のために、放射性薬学的調製品は、滅菌性でなければならない。例えば９９ｍＴｃのために、注射可能形態、生食水中の滅菌パーテクネテートとのペプチド−キレートコンジュゲートの再構成が好ましい。
【００３６】
本発明の放射性薬学的調製品はまた、ヒト注射のため容易な単位用量形態で提供し得、そして例えば前充填滅菌シリンジで供し得る。単位用量を含むシリンジはまた、シリンジシールド内で供給する（潜在的放射活性用量から作業者を保護するため）。
【００３７】
本発明の第４側面は、結腸直腸起源の癌の画像化のための本発明の放射性薬学的調製品の使用である。本発明の放射性薬学的調製品を使用する画像化は、放射性金属の性質に依存して、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ画像化の手段によって実施し得る。
【００３８】
第５側面では、本発明は、本発明の放射性薬学的調製品の生産のためのキットを提供する。好適なキットを設計し、ヒト投与、例えば注射により血流へのため好適な滅菌放射性薬学的製品を与える。放射性金属が９９ｍＴｃであるとき、キットは、金属のためのペプチド−キレートコンジュゲートを、薬学的に許容される還元剤とともに含むバイアルを含む。好適なそのような還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ホルムアミジンスルフィン酸、スズイオン、Ｆｅ（ＩＩ）またはＣｕ（Ｉ）である。薬学的に許容される還元剤は好ましくは、スズ塩例えば塩化スズ、またはスズ酒石酸塩である。代替的に、キットは、放射性金属を添加するとトランスメタレーション（すなわち配位子交換）を経験し、望まれる生成物を与える金属錯体を含み得る。９９ｍＴｃのために、キットは好ましくは凍結乾燥し、そして９９ｍＴｃ放射性同位体ジェネレーターから滅菌９９ｍＴｃパーテクネテート（ＴｃＯ４−）と再構成し、さらなる操作なくヒト投与のため好適な放射性薬学的溶液を与えるよう設計される。
【００３９】
ペプチド−キレートコンジュゲートは好ましくは、比較的長時間期間にわたり輸送または貯蔵に従順な形態のキットで存在する。好ましい放射性標識付加条件下での９９ｍＴｃジェネレーターからの溶出液との再構成は、ＳＴレセプターについての特異性を有する９９ｍＴｃ標識されたペプチドという結果となる。そのようなキットで、放射性標識付加反応が、ＳＴレセプターについてのペプチドのアフィニティを変えないことが本発明の重要な特徴である。９９ｍＴｃ標識した本発明のペプチドは、室温で４時間まで、かつ１ＧＢｑまでの活性レベルの存在下で安定であることが示された。
【００４０】
前記キットまたは前充填シリンジは所望により、さらなる成分、例えばバッファー；薬学的に許容される可溶化剤（例えばシクロデキストリンまたは界面活性剤、例えばPluronic（登録商標）、Tween（登録商標）またはリン脂質）；薬学的に許容される安定剤、放射保護剤、または酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、ゲンチシン酸、またはパラ−アミノ安息香酸）または凍結乾燥のための充填剤（例えば塩化ナトリウムまたはマンニトール）を含み得る。
【００４１】
金属錯体が、ＳＴレセプターについての潜在力並びに好適な薬物動態を保持したことが本発明の特徴である。実施例１６で取得のデータは、陽性コントロール、１２５Ｉ−ＳＴ１−１７が添加した放射活性材料の２０％の最高の結合を有することを指摘する。陰性コントロール、ＣＡ３−ＳＴ５−１８（ｃｙｓ−ａｌａ）は、特異的結合を示さなかった（ＮＳＢレベルでの結合、＜１％）。９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８は、陽性コントロールと比較して減少された結合（全添加の６％）を示すが、なお陰性コントロールのそれよりも有意により高い。本発明の化合物はまた、最適血液クリアランス、急速肝臓クリアランス、および急速バックグラウンド組織クリアランスを有する。肝臓クリアランスは、その臓器中のＣＲＣ転移の高発生のため本発明の特に顕著な特徴である。さらに、本発明の化合物は、１ｃｍ直径より小さい結腸直腸癌転移の画像化を可能とすることを実証した。これは焦点および拡散転移の間に誘引されるべき区別を追加的に可能とする特徴である。ＳＴレセプターに向かって指向される剤におけるこれらの特徴を達成することが以前可能でなかった。これはしたがって、先行技術を超える驚異的開発である。
【００４２】
本発明の金属錯体は、尿を介して急速にクリアランスされる（６０分ｐ．ｉ．で＞９０％）。本発明の追加的特徴は、低胃腸取りこみであり、これは望ましくない副作用のリスクを減少させる。画質を妨害し得る、バックグラウンド組織、例えば肝臓での低取りこみが、本発明の金属錯体の有利性である。ＣＡ１−ＳＴ５−１８のために、肝臓取りこみは、２時間ｐ．ｉ．でグラムあたり注射された用量の０．９３％であった（実施例１７）。ＣＡ１−ＳＴ５−１８は、評価したすべての化合物のうちで、最大の腫瘍対バックグラウンド組織比率、最大の取りこみ（％ＩＤ）および相対的保持を示す。これは、試験した全ての化合物の内、ＣＡ１−ＳＴ５−１８がＣＲＣ画像化剤のため最良の薬物動態質を示したことを示す（実施例１７）。
【００４３】
本発明の画像化の好ましい様式は、ＳＰＥＣＴ画像化である。直径０．５−１ｃｎの間の腫瘍を、皮下モデルを使用するＳＰＥＣＴ画像化によって画像化することが可能であることが実証された（実施例１７に記載した）。実施例１８で獲得した画像は、１５分ｐ．ｉ．から画像化が可能であり、そして１２０分Ｐ．ｉ．までに、腫瘍および腎臓のみが可視であることを示す。画像化された腫瘍サイズは、標的手段中に予測される領域のものである。画像は、平面様式で獲得され、２０ＭＢｑ／動物の比較的低放射活性用量を有する。臓器間の空間的解像は、ヒトでよりよいことが知られ、その結果取得した画像は、動物モデルで見られるのと少なくとも同じくらいよいのが予測される。
【００４４】
実施例１８、１９、２１および２３で示されるように、本発明の好ましい化合物は、当業界で以前報告されていないすぐれた画像化特性を呈する。特異的インビボ腫瘍取りこみは、２つの異なる動物モデルで実証した。これらのモデルは、実施例１７および２０に記載する。皮下腫瘍および肝臓転移の両方の画像化は、マウスで＜２時間ｐ．ｉ．で達成した。マウスで１５分ｐ．ｉ．から画像を獲得することが可能であった。これは、１−６時間ｐ．ｉ．のヒトの理想的臨床的画像化ウインドウを支持する。
【００４５】
実施例１８で生産した画像（図４）は、腫瘍対筋肉（示さず）および腫瘍対肝臓についての良好な比率で、１５分ｐ．ｉ．からの腫瘍の明確な同定を一定して示し、これは経時的に改善し、その結果１２０分ｐ．ｉ．までに腫瘍および腎臓のみが可視である。実施例１９で取得したデータは、９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８についての良好な取りこみ、および陰性コントロールについての貧弱な取り込みを実証する（図５）。１２０分ｐ．ｉ．に獲得した同じ動物の平面後方静止画像は、同様のパターン；９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８の良好な画像および陰性コントロールの貧弱な画像（図６）を示す。実施例２１で生産した画像（図８）では、転移が明確に可視であり、ＲＯＩ分析に基づいて１．５−３．０の腫瘍：肝臓比率を有する。画像を一定してかつ大きな操作なく獲得し、両方の処方：ＨＰＬＣ精製および粗調製品である。
【００４６】
実施例２１に記載のように画像化実験は、ＣＲＣ腫瘍への９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８の特異的保持を実証する。これらのデータは、ＳＴレセプターについての９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８の特異性を支持し、そしてＳＴペプチドのコンホメーション構造の重要性をハイライトする。皮下Ｌｅｗｉｓ肺腫瘍を有するマウスに、実施例２２に記載のようにＣＡ１−ＳＴ５−１８を注射したとき、ＣＡ１−ＳＴ５−１８の、結腸直腸腫瘍への、非結腸起源のものへよりも有意により高い取りこみを実証した。
【００４７】
文献研究は、腫瘍サンプル間のレセプター発現の変異がほとんどないことを指摘し、報告されたデータは（８０−１２０ｆｍｏｌ／ｍｇ）は、この研究で見出された平均発現とよく匹敵した。しかし、２つのヒトドナー間で、レセプター発現における大きな区別が見出された（実施例２５）。
【００４８】
種々のＳＴレセプター発現を有する、ある範囲の異種移植片腫瘍についての生物分布研究では、最高の発現がＴ８４細胞に示されたが、ヒト腫瘍での発現に類似した（実施例２５）。ある数の種々の細胞株での相対的発現を分析し、そして以下の順序であるべきと見出された：Ｔ８４＞ＣａＣＯ２＞ＬＳ１８０＞ＨＴ２９＞ＳＷ４８０．データは、高ＳＴレセプターを発現する腫瘍、ＣａＣＯ２およびＴ８４でのＣＡ１−ＳＴ５−１８が、残りと比較して比較的より高い保持を示す。ヒト腫瘍（ＬＳ１８０）で見出されるよりより低いレセプター密度を発現する腫瘍の画像が達成され、その結果ＣＡ１−ＳＴ５−１８が広い範囲のヒト腫瘍を検出できるであろう。
【００４９】
以前に研究から予測された値は、腫瘍の起源または等級の減少で発現の喪失があまりないことを示唆する。したがって、低ＳＴレセプターを発現する転移を有する患者の集団はありそうにない。より重要に、ヒトＣＲＣ腫瘍でのレセプターの発現は、２つの画像可能ＣＲＣ腫瘍のものの間に直接的に横たわり、これはヒト腫瘍でのレセプターの発現が、９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８での画像化のため十分であることを示唆する。腫瘍での低保持が、陰性コントロール、ＣＡ３−ＳＴ５−１８（ｃｙｓ−ａｌａ）で観察された。データはまた、非常に低いレセプター密度にもかかわらず、なおこれらの腫瘍での９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８の特異的保持があることを示す。免疫妥協された動物の皮下にまたは肝臓で成長した、Ｔ８４およびＬＳ１８０細胞からの腫瘍における腫瘍取りこみは、画像化のために十分であり、皮下モデルおよび肝臓転移モデルの両方で実証されるとおりである。そうすることによって、ヒト腫瘍で見出されるＳＴレセプターの発現レベルの領域で小さい腫瘍を画像化することが可能である。
【００５０】
本発明の化合物は、特に臨床的疾患のより挑戦する側面を示すと考えられる動物モデルで腫瘍を首尾良く画像化することにおいて、改善されたＣＲＣ画像化剤について同定されるすべての主要な要求を満たす。例外的効験が、肝臓転移の臨床的効験モデルで実証された。好ましい実施態様は、ＣＲＣからのヒト肝臓転移で見出されるレセプター密度の範囲を示す腫瘍を画像化するのを可能とする。効験は過剰のペプチドの存在下で、潜在的臨床処方で予測されるレベルで維持される。画像化研究は、好ましい化合物が、Ｘ線ＣＴよりもより感受性かつ特異的でありそうであることを示した。本発明の化合物はこうして、疾患の当初診断で、そしてより重要には疾患の程度の適当な段階付けまたは決定、治療ヘの応答を測定することおよび原発性ＣＲＣについて処置される患者のフォローアップで使用し得る。
【００５１】
本発明の化合物はしたがって、他のいかなる報告されたＣＲＣ画像化化合物より優れる。これらは特異的に、ＣＲＣ起源の腫瘍において保持される。画像化潜在力は、望まれる標的腫瘍サイズで臨床的に許容される時間枠で実証した。驚くべき取りこみ、保持、薬物動態、および効験が、塩基性ｐＨでベクターの報告された不安定性の観点から実証された。
【００５２】
実施例
実施例１  ペプチド−キレートコンジュゲート
使用した化合物は表１に与える。コンジュゲートを、実施例２に記載のように、プラスチックバイアル中の１００μｇアリコートとして調製し、そして−１８℃で貯蔵した。該コンジュゲートを、使用前に環境温度に暖めた。
【００５３】
表１：本発明の化合物
【表２】2004524323.tif 000009
【表３】2004524323.tif 000010
【表４】2004524323.tif 000011
【表５】2004524323.tif 000012
【００５４】
実施例２  ＣＡ１−ＳＴ５−１８の合成
２．１  固相合成
ペプチド配列の固相アセンブリを、支持体Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＳＡＳＲＩＮ（１０ｇポリマー；０．６ｍｍｏｌ／ｇ負荷）上で、Advanced Chemtech 90自動化ペプチド合成機を使用して実施した。アミノ酸は９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基で阻止されたαアミノ官能を有するＬ配置のすべてであった。
【００５５】
反応性側鎖官能基は以下の保護基を有した：
トリチル（Ｔｒｔ）−システイン６と１４およびアスパラギンのために、
アセトアミドメチル（Ａｃｍ）−システイン５と１０のために、
４−メトキシベンジル（Ｍｏｂ）−システイン９と１７のために、
ｔｅｒｔ−ブチルエステル−グルタミン酸のために
ｔｅｒｔ−ブチルエーテル−チロシンのために。
【００５６】
２．２  カップリングおよび脱保護反応
二重カップリングサイクルを、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に希釈された５倍過剰の活性化Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体を使用して実施した。第１のカップリングを、Ｆｍｏｃアミノ酸／ＤＩＣ／ＨＯＢｔ活性化で実施し、そして第２のカップリングを、Ｆｍｏｃアミノ酸／ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化で実施した。
【００５７】
過剰の試薬を、ＮＭＰでの３回洗浄によってポリマーから除去し、メタノールで３回およびＮＭＰで３回、次いで２０％ピペリジン／ＮＭＰ中でＦｍｏｃ基を除去した（５分および２０分サイクル実施）。ひとたびアセンブルすると、ペプチド樹脂を、ＮＭＰで３回、ＤＣＭで３回およびメタノールで３回洗浄し、次いで室温で真空オーブンで終夜乾燥した。最終樹脂の重量２０．７６ｇ（収率８４．２％）。
【００５８】
２．３  固体支持体からの部分的に保護されたペプチドの開裂
窒素バブラー中の乾燥ペプチド樹脂に、５％ＴＩＳおよび５％水を含むＴＦＡ（２５ｍｌ）を添加し、そして該混合物を、窒素下で３０分間バブリングした。該ペプチド溶液を、次いで、トルエン（２００ｍｌ）中に排出し、そしてＲＴで減圧で蒸発させた。冷ジエチルエーテルを油状残さに添加し、固体としての生成物を沈殿させた。ジエチルエーテルでの磨砕および乾燥に続き、６００ｍｇの粗ジチオールペプチドを取得した。粗生成物のＨＰＬＣ精製は、ＴＦＡ開裂工程中の変性のためのいくつかの副生成物を有する７０％周辺であるべきことを示した。もっとも顕著な不純物（１０−１５％）は、ＣＡ１オキシムサイドアームのいずれかの開裂によって生じた。
【００５９】
２．４  環形成１：粗ジチオールペプチドの酸化：６,１４ジスルフィド
２．３前記からの粗ジチオールペプチド（０．１３２ｍｍｏｌ、３００ｍｇ）を、フェリシアン酸カリウム（０．３ｍｍｏｌ、１００ｍｇ）を含む水／アセトニトリル（８０：２０）中の０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）の６００ｍＬ中に一部ずつ溶解した。反応物を、１６時間窒素下で撹拌し、次いでＨＰＬＣ分析を使用し、出発ジチオールの酸化生成物への完全な変換を確認した。ペプチド溶液を次いで、ＴＦＡでｐＨ２に酸性化し、０．４５ミクロンフィルター（Millipore)を経由してろ過し、次いで分取HPLCカラム上に直接的にポンピングし、そして勾配溶出を開始させた。＞８０％純度のフラクションを合わせ、そして所望の生成物の１４０ｍｇを凍結乾燥して得た。
【００６０】
２．５  環形成２：Acm基脱保護および環形成６，１４；５，１０
前記２．４からのモノジスルフィド生成物（０．１４ｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）を、０．１ｍＬアニソールを含む酢酸／ＤＭＳＯ（１：１）の１５０ｍＬ中に溶解し、そしてヨウ素（０．１ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、暗黒で３０分間撹拌し、次いで蒸留水で４５０ｍｌの総体積に希釈した。ペプチド溶液を次いで、分離ろうと中でジエチルエーテルで２回抽出し、そして水性相をＨＰＬＣによって分析した。
【００６１】
ＨＰＬＣ分析は、４：１比率で存在する２種の新しい生成物の存在を明かにした。生成物の両方は、２種のコンホメーション異性体に対応され、ＭＳ分析によって証拠付けられるように、望まれる分子量を有した。水性相をもう一度、０．４５ミクロンフィルター（Millipore)を経由してろ過し、次いで分取ＨＰＬＣカラム上に直接的にポンピングし、そして勾配溶出を開始した。＞８０％純度のフラクションを合わせ、そして凍結乾燥し、所望の生成物の４０ｍｇを得た。
【００６２】
２．６  環形成３：Ｍｏｂ基脱保護および環形成
前記２．５からのビスジスルフィド生成物（４０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ)に、０．１ｍＬのアニソールを含む１０％  ＤＭＳＯ／ＴＦＡ（５０ｍｌ）の溶液を添加し、そして混合物を穏やかに振とうした（２０分）。ＴＦＡを、減圧で室温で蒸発させ、そして生成物を、ジエチルエーテルの添加によって沈殿させた。ジエチルエーテルでの磨砕に続いて、２５ｍｇの完全に折り畳まれた生成物を回収した。粗生成物の分取ＨＰＬＣおよび凍結乾燥し、１６ｍｇの所望の生成物を得た（純度＞９８％）。ＬＣＱによるＭＳ分析；実測（Ｍ＋Ｈ）＋＝１８７３、予測（Ｍ＋Ｈ）＋＝１８７３．
【００６３】
２．７：塩交換
前記からの純粋なＴＦＡ塩を、０．１％酢酸アンモニウムを含む水中に溶解した。４０分にわたる１０ないし６０％Ｂ勾配を使用するＣ１８逆相カラム上の勾配溶出により、ここでバッファーＡ＝０．１％酢酸アンモニウム／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝８０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ中０．１％酢酸アンモニウム）を実施した。酢酸塩（１５ｍｇ）を、凍結乾燥に続いて、回収した。
【００６４】
実施例３  キレート化剤１の合成（ＣＡ１）
トリス−（２−アミノエチル）アミン（Aldrich; 2ml,13mmol)の、アセトニトリル（２０ｍｌ）中の溶液に、重炭酸ナトリウムを添加した（２．２ｇ、２６ｍｍｏｌ）。３−クロロ−３−メチル−２−ニトロソブタン（１．８ｇ、１３ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（１０ｍｌ）中の溶液をゆっくりと０℃で添加した。反応混合物を、室温で４時間撹拌し、それからろ過した。ろ液を、アセトニトリルで洗浄しそしてろ液を蒸発させた。粗生成物を、アセトニトリルに溶解し、そしてＨＰＬＣ（Hamilton PRP-1;A:2%水性ＮＨ３、Ｂ：ＭｅＣＮ；２０分で０−１００％Ｂ；３ｍｌ／分）によって精製し、ＣＡ１を得た。収率：０．８８ｇ、１９％。
【００６５】
実施例４  ペプチドの、キレート化剤ヘのコンジュゲーション
４．１  コハク酸リンカーのカップリング
実施例２からのペプチド樹脂のアリコート（１ｇ、約０．３ｍｍｏｌ）を、窒素バブラーに移動し、ここでＤＭＦ（３ｘ１５ｍｌ）中の洗浄のさらなるセットを、実施した。ＤＭＦ（２０ｍｌ）中に溶解された１ｍｍｏｌのコハク酸無水物を含む溶液を次いで添加し、そして混合物を窒素下で３０分バブリングした。ポリマーを、ＤＭＦの５ｘ１５ｍｌ量で洗浄し、樹脂サンプルをKaiser Testによる分析のためとり、遊離アミノ基の不存在を確認した。
【００６６】
４．２  キレート化剤１（ＣＡ１）のカップリング
樹脂結合酸官能性を次いで、ＰｙＡＯＰ（０．５２ｇ，１ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（０．１４ｇ，１ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（０．２ｍｌ，２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１５ｍｌ）中の溶液の添加によってインシチュで前活性化した。樹脂上活性化を、１０分間実施し、次いでＣＡ１（０．４ｇ，１．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の溶液を添加した。混合物を３時間バブリングし、次いで過剰の試薬をろ過によって除去し、次いでＤＭＦ（５ｘ１５ｍｌ）、ＤＣＭ（３ｘ１５ｍｌ）およびエーテル（３ｘ１５ｍｌ）で洗浄した。ペプチド−樹脂を次いで、窒素流で乾燥した。
【００６７】
実施例５  放射性標識付加：水酸化ナトリウム法
アリコートのコンジュゲート（１００μｇ）を、窒素パージ塩水（９００μｌ）中に溶解し、そしてシラン化ペプチドティップを使用してシラン化Ｐ６バイアルへ添加した。溶液のｐＨを、０．０１Ｍの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８．５に調節し、そしてバイアルを蓋した。溶液に、新しく溶出させたジェネレーターからのＮａ９９ｍＴｃＯ４（１ｍｌ、１ＧＢｑ／ｍｌ）を添加した（２より少ない時間齢溶出液）。溶液のＰｈを再び、０．０１Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８．５に調節した。新しく調製した窒素パージＳｎＣｌ２溶液（０．１ｍｌ、１０ｍｇ／１００ｍｌ塩水）を次いで、該溶液に添加した。バイアルをそれぞれの添加後振とうし、混合を確保した。調製品を、室温で静置した。
【００６８】
実施例６  放射性標識付加：ボレートバッファー法
１２．５ｍＭのボレートバッファー（１ｍｌ）を、アリコートのコンジュゲートに添加し、そして３０秒間超音波処理した。得られる溶液を、シラン化Ｐ６バイアルに、シラン化ピペットティップを使用して添加し、そしてバイアルを蓋した。該溶液に、新しく溶出されるジェネレーターからのＮａ９９ｍＴｃＯ４（１ｍｌ、１ＧＢｑ／ｍｌ）を添加した（２より少ない時間齢溶出液）。新しく調製した窒素パージＳｎＣｌ２溶液（０．１ｍｌ、１０ｍｇ．１００ｍｌ塩水）を次いで、溶液に添加した。バイアルをそれぞれの添加後振とうし、混合を確保した。
【００６９】
実施例７：標識付加分析
ＣＡ１コンジュゲートの標識付加特性の調査を、実施例５で概説した水酸化ナトリウム法を使用して、ＣＡ１−ＳＴ５−１８を標識付加することによって実施した。同時的ＨＰＬＣおよびＩＴＬＣ分析を、再構成の近似的に１５、６０および１２０分後に実施した。加えて、分取ＨＰＬＣを実施し、２種の９９ｍＴｃ種の純粋生成物を得た。ＩＴＬＣ分析を、それぞれの精製したサンプルにおいて実施し２種分析技法の間の一致を確認した。さらなる研究を、代替的ＣＡ１コンジュゲートにおいて実施し、観察された標識付加特性を確認した。
【００７０】
標識付加特性の当初調査の結果は、ある数の時間に渡り第２種にほとんど完全に変換する、早期の時点の単一の主要な９９ｍＴｃ種を示した。ＩＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析の間のよい一致が観察された。２種の９９ｍＴｃコンジュゲート種を、両方のＨＰＬＣおよびＩＴＬＣによって分解し、そしてそれぞれの種の相対量は良く相関した。さらなる確認のために、分取ＨＰＬＣを実施し、２種サンプルの純粋サンプルを取得した。
【００７１】
実施例８  ＰＨの放射性標識付加に及ぼす影響
ｐＨの、標識付加特性に及ぼす影響を、ｐＨ８．１、８．５および９．０で、実施例６で概説したボレートバッファー法を使用して、ＣＡ１−ＳＴ５−１８（１００μｇ）を比較することによって調査した。ＩＴＬＣ分析を、再構成１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分後に実施した。比較的狭いｐＨ範囲を、３つのジスルフィド架橋の存在によって引き起こされる、ＳＴ５−１８ベクターの、高ｐＨに対する既知不安定性のため研究した。
【００７２】
ｐＨ８．１、８．５および９．０でのＣＡ１−ＳＴ５−１８の標識付加の比較の結果を示す（図１）。結果は、ＩＴＬＣ（Gelman ITLC/SGpaper, 70:30塩水：アセトニトリル溶出液）分析によって見られるような、形成された種２の％として表現した。
【００７３】
実施例９  温度の放射性標識付加に及ぼす影響
温度の、標識付加特性に及ぼす影響を、前記概説したボレートバッファー（ｐＨ９．０）法を使用して、ＣＡ１−ＳＴ５−１８（１００μｇ）の標識付加を比較し、次いで４０、６０および７５℃で加熱することによって調査した。それぞれの調製品を、再構成後１０分間室温で静置し、次いで２０分間加熱した。ＩＴＬＣ分析を、加熱に先だち実施し（再構成１０分後）、加熱後１０分（再構成４０分後）および加熱後６０分（再構成後１００分）。
【００７４】
４０、６０および７０℃でのＣＡ１−ＳＴ５−１８の標識付加の比較の結果をしめす（図２）。結果を再び、ＩＴＬＣ（Gelman ITLC/SGpaper, 70:30塩水：アセトニトリル溶出液)分析によって測定されるような形成される％ピーク２として表現する。；
【００７５】
実施例１０  コンジュゲートレベルの、放射性標識付加に及ぼす影響。
コンジュゲートレベルの、標識付加特性に及ぼす影響を、前概説ボレートバッファー（ｐＨ９．０）法を使用して、種々の量のＣＡ１−ＳＴ５−１８（１２．５、２５、５０および１００μｇ）の標識付加を比較することによって調査した。ＩＴＬＣ分析を、再構成１５、３０、６０、９０、１２０および１８０分後で実施した。
【００７６】
種々のレベル（１２．５、２５、５０および１００μｇ、６．６ｘ１０−９、１．３ｘ１０−８、２．７ｘ１０−８、および５．３ｘ１０−８に均等）でＣＡ１−ＳＴ５−１８を標識付加することの結果を示す（図３）。ＩＴＬＣ(Gelman ITLC/SGpaper,70:30塩水：アセトニトリル溶出液）分析によって見られるような、形成された種２のパーセンテージとして表現する。ＲＨＴデータは示した（表ＩＩ）。
表ＩＩ：放射性標識した調製品におけるＲＨＴレベル
【表６】2004524323.tif 000013
【００７７】
実施例１１  コンジュゲートの、標識付加条件への安定性
出発材料の、標識付加条件ヘの安定性を確立するために、不活性「ブランク」標識付加実験を実施した。「ブランク」標識は、Ｎａ９９ｍＴｃＯ４での塩水の置換を含む。ＣＡ１−ＳＴ５−１８（１００μｇ）を、ボレートバッファー標識付加法（ｐＨ９．０、６０℃、２０分間）の対象とした。出発材料を、次いで、ＨＰＬＣ精製し、そして競合結合アッセイを実施し、標識付加処理前と比較したレセプターについてのアフィニティの何らかの喪失があったかいなか決定した。ＨＰＬＣ分析を実施し、化合物の任意の分解を検出した。
【００７８】
化合物の分解は、ＨＰＬＣによって観察されず、そして潜在力（競合結合アッセイによって測定した）は有意には変化しなかった。
【００７９】
実施例１２  ＣＡ１−ベンズアミドおよびＳＴ５−１８間の競合
９９ｍＴｃの、ペプチドコンジュゲートヘの配位を調査するため、競合研究を実施した。第１に、ＣＡ１−ベンズアミド（これはＣＡ１−ＳＴ５−１８のＣＡ１部分を模倣するため選択された）およびＳＴ５−１８を、ボレートバッファー法（ｐＨ９．０、６０℃、２０分間）を使用して独立的に標識付加し、そしてＨＰＬＣおよびＩＴＬＣによって特徴付けた。競合研究のために、等モル量のＣＡ１−ベンズアミド（３１μｇ、６．９２ｘ１０−８）およびＳＴ５−１８（１００μｇ、６．９２ｘ１０−８）を、ボレートバッファー法を使用して同じポットで一緒に標識した。実施例１３および１４に概説されるように、ＩＵＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析は、テクネチウムがどこに配位したか決定した。
【００８０】
実施例１３  ＩＴＬＣ
Gelman ITLC/SGpaper塩水で溶出
Gelman ITLC/SGpaperメチルエチルケトン（ＭＥＫ，２−ブタノン）で溶出
Gelman ITLC/SGpaper塩水とアセトニトリルの７０：３０ｖ／ｖ混合物で溶出
Whatman No.1(W1)paper水とアセトニトリルの５０：５０ｖ／ｖ混合物で溶出
【００８１】
実施例１４  ＨＰＬＣ
すべての分析を、GilsonハードウェアおよびUnipointソフトウェアを使用して実施した。
カラム：Phenomenex Luma C-18、４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍ
溶離剤Ａ：９０％水／１０％アセトニトリル中０．１酢酸（アンモニアでｐＨ５．０にｐＨ上昇した）
溶離剤Ｂ：１０％水／９０％アセトニトリル中０．１％酢酸（アンモニアでｐＨ５．０にｐＨ上昇した）
流速：１ｍｌ／分
ＵＶ検出器：λ＝２３０ｎｍ
類似勾配を、種々のコンジュゲートのため使用した。典型的勾配は
Ｔ０：０％Ｂ
Ｔ５：１５％Ｂ
Ｔ２０：１５％Ｂ
Ｔ２１：０％Ｂ
Ｔ３０：０％Ｂ
【００８２】
実施例１５  競合結合アッセイ
化合物を、放射性リガンド結合アッセイによってそれらの潜在力について評価し、結合の潜在力の指標として阻害定数（Ｋｉ）を決定した。方法は別に記載されるが、簡単には[１２５Ｉ]ＳＴ１−１７を、約１μｇラット腸管膜を含む９６ウェルプレート中のコールドＳＴ化合物（０．０００１−５０μＭ）と競合させ、そして１時間３７℃でインキュベートした。サンプルをろ過し（ＧＦ／Ｂフィルター、Whatman)、結合した放射性標識したペプチドを取り戻し、そして％結合／遊離を決定するためカウントした。
【００８３】
化合物の潜在力を、放射性リガンド、[１２５Ｉ]ＳＴ１−１７と競合するそれらの能力について阻害定数（Ｋｉ）によって決定した。スクリーニングした化合物の潜在力を、表ＩＩＩに示す。
表ＩＩＩ：ＣＲＣ化合物についてのＫｉアッセイデータ。示したＫｉ値は、アッセイウェルの３反復値の平均である。非特異的結合はすべてのケースで０．１％より小さいと見積もり、そして全結合（非競合ペプチド）は２０％より大きくない。
【表７】2004524323.tif 000014
【００８４】
実施例１６  放射性活性結合アッセイ
放射性標識化が化合物の結合に影響するか決定するために、標識した化合物をレセプターに結合するそれらの能力について試験した。簡単にはＨＰＬＣ精製した放射性標識した化合物（約０．０５ｎＭ）を、競合ペプチド（５０μＭ  ＳＴ５−１８）の存在および不存在下、６μｇ／１５０μｌ最終体積のラット腸管膜とインキュベートした（１時間）。サンプルをろ過し（ＧＦ／Ｂフィルター,Whatman)、結合した放射性標識したペプチドを取り戻し、そして％結合／遊離を決定するためカウントした。非特異的結合は全ての場合に１％より小さいとみつもる。
潜在力が、標識後維持されたことを確認するため、標識した化合物の結合を測定するアッセイを開発した。
【００８５】
実施例１７  皮下腫瘍モデルにおける生物分布
皮下モデルを適当な当初インビボスクリーニングとして使用した。簡単には、マウス（メスヌードＣＤ−１、約２０ｇ；Charles River)を、Ｔ８４ヒト結腸癌種細胞（０．１ｍｌ、培地中１ｘ１０８細胞／ｍｌ）を首に皮下に、２３ゲージニードルを介して注射し、そして腫瘍が６−８週間発症するにまかせた。
【００８６】
試験点あたり少なくとも３動物を、研究した。結果は組織の、％注射された用量／グラム（％ＩＤ／ｇ）として表現する。９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８の急速なクリアランス（６０分ｐ．ｉ．で尿を介して９０％より多く排出）のため、腫瘍取りこみはまた、相対的保持（ＲＲ）として表現する。
【００８７】
化合物をマウスでの、皮下にＴ８４腫瘍内ヘのそれらの取りこみについてスクリーニングした（表ＩＶ）。このモデルは、腫瘍とバックグランド組織取りこみの間の比較を可能とすることによってＣＡ１−ＳＴ５−１８の画像能力の評価を可能とする。
【００８８】
表ＩＶ：発明の化合物についてのスクリーニングデータ
【表８】2004524323.tif 000015
【００８９】
実施例１８  皮下腫瘍モデルの画像化
腫瘍を実施例１７のように成長させた。動物を、腫瘍が０．５−１ｃｍになるまで、８−１０週間腫瘍成長についてモニタリングした。この時間後、動物に試験アーティクル（０．１ｍｌ、２０ＭＢｑ／ｍｌまたは２００ＭＢｑ／ｍｌ）を、尾部静脈を介する静脈内ボラスとして注射した。種々の時間ｐ．ｉ．で、動物を安楽死させそして全体平面画像を、ガンマカメラ（Paek Medical Isocam-1)を使用して５分および２４時間ｐ．ｉ．の間獲得した。画像獲得時間は典型的には１５−３０分または１５０−２５０Ｋカウントであった（全体、LEUHRコリメーター）。
【００９０】
実施例１９  ９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８およびＶＡ３−ＳＴ５−１８（ｃｙｓ−ａｌａ）（陰性コントロール）の、ＣＲＣ腫瘍への取り込み
ＣＡ３−ＳＴ５−１８（ｃｙｓ−ａｌａ）は、９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８と同じペプチド配列を有する。ただし、すべてのシステインがアラニンアミノ酸によって置換され、結合のために要する３つのジスルフィド架橋が除去されている。ＣＡ３−ＳＴ５−１８（ｃｙｓ−ａｌａ）はまた、ＣＡ１でなくＣＡ３を含み、そしてこのキレートのため好適なプロトコルを使用して標識付加した。ＣＡ３−ＳＴ５−１８（ｃｙｓ−ａｌａ）および９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８の取りこみおよび保持を試験するため、皮下Ｔ８４腫瘍を有するＣＤ−１ヌードマウスに注射し、麻酔しそして種々の時間ｐ．ｉ．で解剖した。データを図５および６に提示する。
【００９１】
実施例２０  肝臓転移モデルでの生物分布
肝臓転移モデルを、マウスおよびラットの両方で使用した。腫瘍を確立することを除き、皮下腫瘍モデルについて、細胞を脾臓を介して注射し、そして循環により肝臓に移動するにまかせた。細胞の注射の２分後、脾臓摘出を実施した。動物を６−８週間にわたり腫瘍生成するにまかせた。
【００９２】
動物を、腫瘍が０．５−１ｃｍサイズになるまで８−１０週にわたり腫瘍成長についてモニタリングした。この時間後、動物に試験アーティクルを、尾部静脈を介する静脈内ボラスとして注射した（０．１ｍｌ，２０ＭＢｑ／ｍｌまたは２００ＭＢｑ／ｍｌ）。種々の時間ｐ．ｉ．で、動物を安楽死させた。筋肉、腎臓、尿、肺、肝臓、胃、小腸、大腸甲状腺、および腫瘍を切除し、そして血液サンプルを取得した。切除した組織、血液サンプルおよび標準を、秤量し、そしてカウントした（Wallac Wizard)。試験点あたり少なくとも３動物を研究した。結果を％ＩＤ／組織のｇとして表現した。９９ｍＴｃ標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８の急速なクリアランスのため（６０分ｐ．ｉ．尿を介して９０％排出）腫瘍取りこみはまた、ＲＲとして表現した（図７）。
【００９３】
実施例２１  肝臓転移モデルでの画像化
腫瘍を実施例２０に記載の用に動物で成長させた。動物を、腫瘍が０．５−１ｃｍサイズになるまで、８ないし１０週間腫瘍成長について監視した。この時間の後、動物に、試験アーティクル（０．１ｍｌ，２００ＭＢｑ／ｍｌ）を、静脈内ボラスとして尾部静脈を経由して注射した。種々の時間ｐ．ｉ．で、動物を安楽死し、そして全体を、ガンマカメラ（Park Medical Isocam-1)を使用して、５分と２４時間ｐ．ｉ．の間平面画像を獲得した。画像獲得時間は典型的には１５−３０分または１５０−２５０Ｋカウントであった（全体、ＬＲＵＨＲコリメーター）。９９ｍＴｃ−標識したＣＡ１−ＳＴ５−１８の、ラット肝臓転移モデルにおける取りこみを示す（図８）。画像は、マスクされた腎臓を有し、画像化された転移の解像を改善する。
【００９４】
実施例２２  ＣＡ１−ＳＴ５−１８の、非結腸腫瘍への取りこみ
本発明の化合物の、結腸癌腫についての特異性を実験するため、皮下Ｌｅｗｉｓ肺腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＡ１−ＳＴ５−１８を注射し、そして種々の時間ｐ．ｉ．でＬｅｗｉｓ肺を切除し、これは元来自発的にＣ５７ＢＬ／６マウスの肺に発生した癌腫であり、したがって結腸起源のものでなく、そしてＳＴレセプターを発現するとは考えられない。
【００９５】
実施例２３  ＳＴレセプター介在の、ＣＡＴ−ＳＴ５−１８の取り込み
本発明の化合物の、結腸癌腫についての特異性をさらに試験するため、実施例１７に記載のようなＴ８４腫瘍を有するヌードマウスを画像化した。ＣＡ１−ＳＴ５−１８との、１００μｇ／マウスのＳＴペプチドの共注射は、取りこみを４０％まで減少させた（図９）。
【００９６】
実施例２４  不純物の影響
ＨＰＬＣ精製しない調製品で観察されたバックグラウンド組織活性の増加があることが観察された；これはいくつかの要因のためであり得る：過剰のペプチドの存在、９９ｍＴｃ標識された不純物（例えばＲＨＴまたはその他）の存在。更なる研究を実施し、ＨＰＬＣ精製してない調製品で見られる増加したバックグラウンドについてのその他の可能な原因を調査し、不純物例えばＲＨＴを減少させる種々のアプローチを試験した。ＲＨＴレベルを減少させることが既知であるように、調製品をろ過（０．２μｍフィルターサイズ）し、またはＭＤＰ添加した。
【００９７】
実施例２５  ヒト組織で使用した腫瘍モデルの比較
Ｔ８４レセプター密度データは、ヒト肝臓転移のものとのよい比較を示す（図１０）。ヒト肝臓転移と、異種移植片腫瘍レセプター密度（Ｂｍａｘ）データの直接的比較は明確に、ヒト腫瘍の平均レセプター密度がＴ８４およびＬＳ１８０腫瘍について見られるものの間にあることを示す。
レセプター密度の相違で取りこみが変わるか決定するために、生物分布研究を、種々のＳＴレセプター発現を有する異種移植片腫瘍のある範囲で企てた。
【図１】
2004524323.tif 000018
【図２】
2004524323.tif 000019
【図３】
2004524323.tif 000020
【図４】
2004524323.tif 000021
【図５】
2004524323.tif 000022
【図６】
2004524323.tif 000023
【図７】
2004524323.tif 000024
【図８】
2004524323.tif 000025
【図９】
2004524323.tif 000026
【図１０】
2004524323.tif 000027
【国際公開パンフレット】
2004524323.tif 000028
2004524323.tif 000029
2004524323.tif 000030
2004524323.tif 000031
2004524323.tif 000032
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2004524323.tif 000076
2004524323.tif 000077
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524323.tif 000078
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月12日(2003.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラデンテートキレート化剤にコンジュゲートされたＳＴレセプターについてのアフィニティを有するペプチドを含むペプチド−キレートコンジュゲートであって、該ＳＴレセプターについてのアフィニティを有するペプチドが１０ないし２５アミノ酸を含む、コンジュゲート。
【請求項２】
該ＳＴレセプターについてのアフィニティを有するペプチドが、１３ないし１９アミノ酸を含む、請求項１のペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項３】
テトラデンテートキレート化剤が、ジアミンジオキシム、Ｎ３Ｓ配位子、Ｎ４配位子、ジアミンジフェノールおよびＮ２Ｓ２配位子から選択される、請求項１または２のペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項４】
該テトラデンテートキレート化剤がジアミンジオキシムおよびＮ３Ｓ配位子から選択される、請求項１ないし３のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項５】
該テトラデンテートキレート化剤が、塩基性ｐＨで脱プロトン化し９９ｍＴｃの結合を可能とする配位子を含む、請求項１ないし４のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項６】
該テトラデンテートキレート化剤が式Ａ：
【化１】
2004524323.tif 000079
[式中、Ｒ１−Ｒ６はすべてＣＨ３であり、かつＱは−（ＣＨ２）２ＮＲ（ＣＨ２）２−であり、かつここでＲは、請求項１の式（Ａ）のために定義されるようなＲ基である]
のものである、請求項１ないし５のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項７】
該テトラデンテートキレート化剤が式Ｂ；
【化２】
2004524323.tif 000080
[式中、Ｒ１およびＲ２は両方Ｈであり、かつＸはチオール保護基である]
のものである、請求項１ないし５のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項８】
該ペプチドが配列番号１ないし７から選択される、請求項１ないし７のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項９】
該コンジュゲーションが、該ペプチドのＮ末端またはＣ末端におけるものである、請求項１ないし８のいずれかのペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項１０】
ペプチドとテトラデンテートキレート化剤の間のリンカー基をさらに含む、請求項１ないし９のペプチドーキレートコンジュゲート。
【請求項１１】
該リンカー基が、５ないし９アミノ酸のペプチド配列を含む請求項１０のペプチド−キレートコンジュゲート。
【請求項１２】
該リンカー基が、−ポリ−Ｌｙｓ−、−ポリ−Ｇｌｕ−、−（Ｇｌｙ）２−Ｇｌｕ−（Ｌｙｓ）３−、−（Ｇｌｙ）２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−、−（Ｐｈｅ）２−（ＣＨ２）５−、（Ｌｙｓ）６−Ｇｌｙ−、−（Ｇｌｙ）３−（ＤＧｌｕ）３−、および−（Ｇｌｙ）−（アミノカプロン酸）２−から選択される、請求項１０または１１のペプチドコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のペプチド−キレートコンジュゲートのテトラデンテートキレート化剤に錯体化された放射性金属を含む、金属錯体。
【請求項１４】
該放射性金属が６４Ｃｕ、６５Ｃｕおよび９９ｍＴｃから選択される、請求項１３の金属錯体。
【請求項１５】
該放射性金属が９９ｍＴｃである、請求項１３または１４の金属錯体。
【請求項１６】
ヒト投与のために好適な形態の放射性医薬組成物であって、請求項１３ないし１５の金属錯体を含む、組成物。
【請求項１７】
該放射性金属が９９ｍＴｃである、請求項１６の放射性医薬組成物。
【請求項１８】
結腸直腸起源の癌を画像化するための、請求項１６および１７の放射性医薬組成物の使用。
【請求項１９】
請求項１６および１７の放射性医薬組成物の調製のためのキットであって、
（ｉ）請求項１ないし１２のペプチド−キレートコンジュゲート
（ｉｉ）還元剤
を含むキット。
【請求項２０】
該還元剤がスズ塩である、請求項１９のキット。
【請求項２１】
１または２以上の安定剤、酸化防止剤、凍結乾燥のための充填剤、および可溶化剤をさらに含む、請求項１９または２０のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
第１側面では、本発明は、テトラデンテートキレート化剤にコンジュゲートされたＳＴレセプターについてアフィニティを有するペプチドを含む、ペプチド−キレートコンジュゲートを提供し、ここで該ＳＴレセプターについてアフィニティを有するペプチドは、１０ないし２５アミノ酸を含む。「ＳＴレセプターについてアフィニティを有するペプチド」は、ＳＴペプチド配列から誘導された、好適には１０と２５の間、好ましくは１３と１９の間のアミノ酸である生物学的に活性のペプチドであって、高アフィニティでＳＴレセプターに結合するものである。本発明のペプチドは、天然存在または合成起源であり得るが、好ましくは合成である。これらのペプチドを、キレートへ直接的に、または「リンカー基」の手段によってコンジュゲートし得る。「リンンカー基」は、約５ないし９アミノ酸の、他の基、例えば５炭素長までの脂肪族鎖の包含のあるまたはないペプチド配列を含み得る。好ましいリンカー基は、−ポリＬｙｓ−、−ポリＧｌｕ−、−（Ｇｌｙ）２−Ｇｌｕ−（Ｌｙｓ）３−、（Ｇｌｙ）２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−、（Ｐｈｅ）２−（ＣＨ２）５−、（Ｌｙｓ）６−Ｇｌｙ−、（Ｇｌｙ）３−（ＤＧｌｕ）３−および−（Ｇｌｙ）３−（アミノカプロン酸）２−である。好適な放射性金属で標識され、本発明のＳＴペプチドは、結腸直腸起源の癌を検出するための画像化剤としての使用のため好適である。本発明の好ましいペプチドは、配列番号１−７である。




【国際調査報告】
2004524323.tif 000081
2004524323.tif 000082
2004524323.tif 000083
2004524323.tif 000084
2004524323.tif 000085
2004524323.tif 000086