(57)【要約】本発明は、対象における脳症を検出する組成物および方法に関する。本発明は、その検出方法の実施において使用するための遺伝子マーカー、核酸調製物またはライブラリー、およびキットにも関する。本発明の組成物および方法は、早期段階を含む脳症、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ、「狂牛病」）を含む伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の、診断、特徴付け、進行のモニタリングなどに使用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における脳症の存在または脳症発症の危険性を検出する方法であって、
（ｉ）対象から核酸を含有する生物学的検体を提供するステップ、
（ｉｉ）配列番号１〜１５から選択される配列の全部もしくは一部の配列またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と、前記生物学的検体を、ハイブリダイゼーション可能な条件下で接触させるステップ、および
（ｉｉｉ）ハイブリッドの存在を確認するステップであり、ハイブリッドの存在が、対象における脳症の存在または発症の危険性を示すステップ
を含む方法。
【請求項２】
接触のステップが、配列番号１の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
接触のステップが、配列番号２の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
接触のステップが、配列番号３の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
接触のステップが、配列番号４の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
接触のステップが、配列番号５の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
接触のステップが、配列番号６の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
接触のステップが、配列番号７の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
接触のステップが、配列番号８の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
接触のステップが、配列番号９の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
接触のステップが、配列番号１０の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
接触のステップが、配列番号１１の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
接触のステップが、配列番号１２の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
接触のステップが、配列番号１３の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
接触のステップが、配列番号１４の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
接触のステップが、配列番号１５の配列の全部もしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
核酸が、チップ、フィルター、メンブレンまたはガラススライドなどの支持体に固定化されている、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
生物学的検体が、血液、血清、唾液、尿、組織検体または細胞検体、好ましくは血液を含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１〜１５もしくはそのフラグメント、それに相補的な配列またはその機能的等価体の群より選択される核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９記載の核酸を含むベクター。
【請求項２１】
少なくとも１つの請求項１９記載の核酸分子または請求項２０記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２２】
少なくとも１つの請求項１９記載の核酸分子または請求項２０記載のベクターを含む、核酸アレイ。
【請求項２３】
請求項１９記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２３記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項２５】
支持体に固定化された、請求項１９記載の核酸分子、請求項２０記載のベクター、請求項２３記載のポリペプチド、および請求項２４記載の抗体より選択される、少なくとも１つの特異的標的分子を含む生成物。
【請求項２６】
支持体が、フィルター、メンブレン、スライド、ポリマー、ガラス、プラスチックおよびバイオマテリアルから選択される、請求項２５記載の生成物。
【請求項２７】
対象における病理学的事象、より好ましくは脳症の存在を検出するための、配列番号１〜１５より選択される配列の全部もしくは一部またはそれに相補的な配列またはその機能的等価体を含む核酸分子の使用。
【請求項２８】
請求項１９記載の核酸分子、請求項２０記載のベクター、請求項２３記載のポリペプチド、および請求項２４記載の抗体より選択される標的と被検化合物を接触させるステップ、および被検化合物のin vivoまたはin vitroでの標的結合能または標的活性調節能を評価するステップを含む、薬物候補化合物を選択する方法。
【請求項２９】
対象における脳症の存在または脳症発症の危険性を検出する方法であって、
（ｉ）対象からタンパク質を含有する生物学的検体を提供するステップ、
（ｉｉ）前記検体を少なくとも１つの請求項２４記載の抗体と接触させるステップ、および
（ｉｉｉ）抗体−抗原複合体の存在を確認するステップであり、複合体の存在が対象における脳症の存在または脳症発症の危険性を示すステップ
を含む方法。
【請求項３０】
対象が、ウシ、ヒツジまたはヤギから選択される哺乳動物である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における脳症を検出する組成物および方法に関する。本発明は、その検出方法の実施に使用する遺伝子マーカー、核酸調製物またはライブラリー、およびキットにも関する。本発明の組成物および方法は、早期段階を含む脳症、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ、「狂牛病」）を含む伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の、診断、特徴付け、進行のモニタリングなどに使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
脳症、より具体的には伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、一群の、致命的な神経障害からなり、ヒトおよび動物の両方を冒し、その特徴は、数ヶ月または数年にも及ぶ長期の発症前潜伏期間、およびプロテアーゼ耐性タンパク質の沈着を伴う脳損傷である。感染因子の性質は、明確には決定されていないが、異常に折りたたまれたタンパク質である、これまでに認知されていないプリオンと呼ばれる病原因子が関与しているとの仮説が優位である。
【０００３】
最も一般的な形態の1つが、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）であり、これはウシを冒すもので、「狂牛病」を引き起こす。ＢＳＥ流行の規模を見極め、公衆衛生を保護するための新たな努力が早急に求められている。昨年１２月、ＥＵ（欧州連合）は、３０月齢を超える、すべての屠殺されたウシに組織的にＢＳＥ診断検査を行うことに同意した。ウシにおけるＢＳＥの潜伏期間は約５年であり、おそらく感染はその間に水平および垂直感染によって拡大され得ることから、生存動物における早期発症前検査の開発が、極めて重要である。このような前臨床診断検査は、感染動物をヒトの食物連鎖から確実に除去する手段を提供する。さらに、感染性ＢＳＥ因子は、ヒツジ特異的ＴＳＥ因子に抵抗性のゲノタイプを含む、ヒツジおよびヤギに感染可能である。後者の観察結果は、ヒトの食物へのさらなる汚染を防止するために、ヒツジの集団におけるＢＳＥの前臨床検査プログラムの必要性を示唆している。現在まで、疾患が臨床的に発症する前にＢＳＥ感染の存在を同定するために利用できる唯一の検査は、汚染された脳組織をマウスに注射し、その後疾患の発症を観察することからなるバイオアッセイである。このバイオアッセイは、終了まで数ヶ月を要するため、組織的な検査を行うには実用的ではない手段である。
【０００４】
２０００年１１月現在、英国で総数１８万頭のウシが感染しており、アイルランド、ポルトガル、スイス、ドイツ、イタリア、スペインおよびフランスではさらに１５００頭のウシが感染していることが明らかにされている。ＥＵで承認された３種の製品（３つの企業由来）を用いて、これまでにおよそ３２万件の診断検査が行われてきた。脳組織検体を得る費用を除く、検査１件当たりの平均費用は、２３ドル（１５〜３０ドルの範囲）である。ＥＵは、５種の他のＢＳＥ検査を評価しているが、既に承認されている３種の検査のように、動物を屠殺しなければ検査を実施することができない。ＥＵは、毎年７百万頭の屠殺されたウシについて、強制的ＢＳＥ検査を２００１年７月に開始するとの指令を発しており、今後１年間にわたり、合計１千万件の検査が販売され、用いられるであろう。
【０００５】
したがって、脳症を検出する新規な方法、特に、動物の生体で実施することができ、迅速で、好ましくは発症前の段階で病状を検出することが可能な方法が必要である。本発明の目的は、動物におけるＢＳＥを含む脳症、特にＴＳＥのためのそのような発症前血液検査を提供することである。本発明により、潜在的には危険にさらされているすべての動物を、動物が生存中、場合により複数回にわたり、容易に検査を行うことが可能になる。本発明は、さらに、この検出方法の実施に使用する遺伝子マーカー、核酸調製物またはライブラリー、およびキットにも関する。
【０００６】
本出願人は、容易に入手可能な生存動物の体液での発症前診断検査を創作した。本出願人は、ＴＳＥのための新規マーカーを同定する革新的なアプローチを用い、広範な研究および開発プログラムに取り組んだ。これらおよび他の態様が、本出願の目的を示すものである。
【０００７】
したがって、本発明は、対象における脳症の存在を検出する方法に関するものであり、その方法は、（ｉ）対象から核酸を含有する生物学的検体、典型的には液体検体（例えば、血液、血清、唾液、尿など）を採取または提供するステップ（ただし、他の組織または細胞検体を使用してもよい）、（ｉｉ）配列番号１〜１５から選択される配列の全部もしくは一部の配列またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と、前記検体を、ハイブリダイゼーション可能な条件下で接触させるステップ、および（ｉｉｉ）ハイブリッドの存在を確認するステップであり、ハイブリッドの存在が対象における脳症の存在を示すステップを含む。
【０００８】
本発明は、脳症を発症する危険性のある対象（例えば哺乳動物）を確認または検出する方法にも関するものであり、その方法は、（ｉ）対象から核酸を含有する生物学的検体、典型的には液体検体（例えば、血液、血清、唾液、尿など）を採取または提供するステップ（ただし、他の組織または細胞検体を使用してもよい）、（ｉｉ）配列番号１〜１５から選択される配列の全部もしくは一部の配列またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と、前記検体を、ハイブリダイゼーション可能な条件下で接触させるステップ、および（ｉｉｉ）ハイブリッドの存在を確認するステップであり、ハイブリッドの存在が、哺乳動物における脳症の発症の危険性を示すステップを含む。
【０００９】
核酸を、チップ、フィルター、メンブレン、スライドガラスなどの支持体に固定化させてもよい。接触ステップは、上記配列のあらゆる組合わせを含んでもよく、典型的には、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つを使用する。
【００１０】
第一の態様では、上記接触ステップは、配列番号１の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させるステップを含む。
【００１１】
配列番号１
ＮＥ２０６９２２  プレプロエラスターゼ
【００１２】
【表１】
2004535165.tif 000002
【００１３】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号２の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００１４】
配列番号２
ＮＥ２０６２３０  キモトリプシン様プロテアーゼ
【００１５】
【表２】
2004535165.tif 000003
【００１６】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号３の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００１７】
配列番号３
ＮＥ２１２４９０  不明
【００１８】
【表３】
2004535165.tif 000004
【００１９】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号４の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００２０】
配列番号４
ＮＥ２１２９１１  キモトリプリノーゲン
【００２１】
【表４】
2004535165.tif 000005
【００２２】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号５の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００２３】
配列番号５
ＮＥ２１１６６２  アミラーゼ−２
【００２４】
【表５】
2004535165.tif 000006
【００２５】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号６の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００２６】
配列番号６
ＮＥ２１６３９１  キナーゼ基質ＨＡＳＰＰ２８
【００２７】
【表６】
2004535165.tif 000007
【００２８】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号７の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させるステップを含む。
【００２９】
配列番号７
ＮＥ２０８３３１  カルボキシルエステルリパーゼ
【００３０】
【表７】
2004535165.tif 000008
【００３１】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号８の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００３２】
配列番号８
ＮＥ２２８０９２  不明
【００３３】
【表８】
2004535165.tif 000009
【００３４】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号９の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００３５】
配列番号９
ＮＥ２３０５１１  不明
【００３６】
【表９】
2004535165.tif 000010
【００３７】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号１０の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００３８】
配列番号１０
ＮＥ２３０５１２  不明
【００３９】
【表１０】
2004535165.tif 000011
【００４０】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号１１の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００４１】
配列番号１１
ＮＥ２３０５５１  不明
【００４２】
【表１１】
2004535165.tif 000012
【００４３】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号１２の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００４４】
配列番号１２
ＮＥ２３０６１２  不明
【００４５】
【表１２】
2004535165.tif 000013
【００４６】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号１３の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００４７】
配列番号１３
ＮＥ２１３８９０  Ｇ−タンパク質β２サブユニット
【００４８】
【表１３】
2004535165.tif 000014
【００４９】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号１４の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させるステップを含む。
【００５０】
配列番号１４
ＮＥ２１４２３２  ミトコンドリオン
【００５１】
【表１４】
2004535165.tif 000015
【００５２】
さらなる態様では、上記接触ステップが、配列番号１５の全てもしくは一部の配列またはその機能的等価体またはそれに相補的な配列を含む少なくとも１つの核酸分子と検体を接触させることを含む。
【００５３】
配列番号１５
ＮＥ２１１６１０  ２型多発性外骨腫症２（ＥＸＴ２；exostoses multiple 2）
【００５４】
【表１５】
2004535165.tif 000016
【００５５】
好ましくは、スクリーニング目的には、生物学的検体を処理して、核酸またはポリペプチドを検出（例えば、ハイブリダイゼーションまたは抗原−抗体反応）に利用できるようにする。処理としては、特に化学的、機械的または物理的手段を用いた細胞溶解があげられる。さらに、検体中の核酸を、例えば慣用の放射性標識、蛍光標識、酵素標識、ケミルミネッセンス標識などによって、ハイブリダイゼーション前に標識してもよい。ハイブリダイゼーションは、当業者に公知であり、当業者が調整することができるあらゆる慣用の技術および条件下で実施することが可能ある。この点から、利用可能な材料の感度、量などの所望のレベルに応じて、ハイブリダイゼーションは、高、中または低ストリンジェンシー条件下で実施することができる。例えば、ハイブリダイゼーションに適した条件として、約６２〜６７℃の範囲の温度で２〜１８時間があげられる。ハイブリダイゼーション後、種々の洗浄を、典型的には、０．１〜１０×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなど、ＳＤＳを含むＳＳＣ緩衝液中で実施して、ハイブリダイズしなかった分子を除去してもよい。
【００５６】
典型的な実験においては、核酸（またはアレイまたはチップまたはフィルター）を、サーモン精子ＤＮＡ１００μg/mlを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（Rapid Hybrid Buffer, Amersham）中で、６５℃で３０分間プレハイブリダイズさせる。その後、検体からの核酸を６５℃で２〜１８時間フィルター（０．５×１０６〜１×１０６cpm/ml）にのせる。フィルターを、５×ＳＳＣ緩衝液、０．１％ＳＤＳで、６５℃で３０分間、次いで０．２×ＳＳＣ緩衝液、０．１％ＳＤＳで洗浄する。ハイブリダイゼーションのプロフィールは、例えばInstantImager（Packard Instruments）で放射活性を測定するなど、公知技術により解析する。ハイブリダイゼーション条件を、慣用技術、特にハイブリダイゼーション温度の低下および/またはハイブリダイゼーション緩衝液中の塩濃度の増大により、調整してもよい。
【００５７】
本発明は、脳症、特にＴＳＥの様々な遺伝子マーカーにも関する。これらのマーカーは、感染哺乳動物から同定されてきたものであり、血液、血清、唾液、尿などの生体液中で、すなわち組織生検の実施を要することなく検出することができる。これらのマーカーは、健常哺乳動物と罹患哺乳動物との定性的遺伝子差異を、より特異的に示す。これらのマーカーは、本明細書に参照として組み込まれたWO99/46403に開示されたＤＡＴＡＳ技術を用いて調製されている。ＤＡＴＡＳは、発現された遺伝子同士の定性的な差異を同定し、二種の条件下での、すなわち健常／罹患、無処置／処置または対照／感染のいずれかの間での選択的ＲＮＡスプライシング事象を系統的に解析する。したがって、ＤＡＴＡＳは、機能的に明確に異なるＲＮＡ変異体、細胞の平衡を担うタンパク質をも同定することになる。その技術は、組織の採取、ＲＮＡの単離および定性的な差異を示す事象のデータベースの構築を含む、３つの異なるステップを含む。ＤＡＴＡＳによる定性的な差異の同定は、従来からのゲノムプロファイリングのアプローチの使用による上方制御または下方制御される配列の同定よりも、診断においては、より強い関心を引きつける。ＤＡＴＡＳに基づく定性的な差異により、所定の病態生理学的状態を特徴付けするために選択される、従前の発現プロフィールによっては示されなかった新規な配列フラグメントが示される。
【００５８】
実施例に記載のように、罹患哺乳動物からの血液中に特異的に存在する、いくつかの異なる特徴（または遺伝子マーカー）が、単離されている。これらの遺伝子マーカーは、より正確には、配列番号１〜１５の核酸配列のいずれか１つの全部もしくは一部またはその機能的等価体を含む。
【００５９】
したがって、本発明は、配列番号１〜１５の配列もしくはそのフラグメント、それに相補的な配列またはその機能的等価体の群より選択される核酸分子にも関する。
【００６０】
本発明は、さらに、上記核酸を含むベクター、およびそのような核酸分子またはベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。
【００６１】
本発明の別の目的は、配列番号１〜１５より選択される配列の全部もしくは一部の配列またはそれらに相補的な配列、またはそれらの機能的等価体を含む核酸分子を、対象における病理学的事象、より具体的には脳症の存在を検出するための使用にある。
【００６２】
本発明において、「配列の機能的等価体」とは、前記配列またはその相補鎖とハイブリダイズし得るまたはこれらを検出し得るあらゆる核酸分子、および前記配列により検出される遺伝子またはＲＮＡ、これらの遺伝子またはＲＮＡにおける、調節解除（deregulation）事象（例えば、スプライシング、再配列、突然変異など）とハイブリダイズし得る、またはこれらを検出し得るあらゆる核酸分子を指す。すなわち、本発明は、標的遺伝子の同定を開示しており、本発明の方法または組成物は、検体中のその遺伝子または制御解除事象を検出し得る、いかなる核酸配列をも含む。このような標的遺伝子として、例えば、配列番号１の配列を含むプレプロエラスターゼ遺伝子またはＲＮＡ、配列番号２の配列を含むキモトリプシン様プロテアーゼ遺伝子またはＲＮＡ、配列番号４の配列を含むキモトリプシノーゲン遺伝子またはＲＮＡ、配列番号５の配列を含むアミラーゼ−２遺伝子またはＲＮＡ、配列番号６の配列を含むキナーゼ基質ＨＡＳＰＰ２８遺伝子またはＲＮＡ、配列番号７の配列を含むカルボキシエステルリパーゼ遺伝子またはＲＮＡ、配列番号１３の配列を含むＧ−タンパク質β２サブユニット遺伝子またはＲＮＡ、配列番号１５の配列を含む２型多発性外骨腫症（exostoses multiple 2）遺伝子またはＲＮＡ、ならびに配列番号３、８〜１２および１４の配列を含むあらゆる遺伝子またはＲＮＡがあげられる。したがって、機能的等価体は、上位配列の１つと重複する配列を含んでもよく、遺伝子もしくはＲＮＡ中の識別可能な領域、またはその遺伝子もしくはＲＮＡ中の識別可能な遺伝子変化に特異的である。機能的等価体としては、（ｉ）異なる種からの対応する核酸、および（ｉｉ）１個または数個の塩基の突然変異、置換、付加または欠失などの１種または数種の配列変異を有する核酸をもあげられる。配列変異が、その配列の５％を超えて影響しないことが好ましい。
【００６３】
核酸分子には、開示された配列の全部または一部を含んでいてもよく、標的遺伝子またはＲＮＡ中に、合成配列（例えばクローニング部位）またはフランキング配列に対応するさらなる配列を含んでいてもよい。核酸は、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲフラグメント、プローブなどであってもよい。一本鎖でも二重鎖でもよい。
【００６４】
本発明においては、上記核酸配列の「一部」は、少なくとも５個の連続する塩基、より好ましくは少なくとも７個の連続する塩基、さらにより好ましくは少なくとも８個の連続する塩基を含む、その配列のあらゆるフラグメントを含む。実際には、フラグメントまたは一部は、高ストリンジェンシー下、ハイブリダイゼーション実験において、配列全体の選択性を発揮するのに十分に長くなければならない。好ましくは、一部は、少なくとも１０個の連続する塩基を含み、一般的には少なくとも１５個の連続する塩基を含む。
【００６５】
上記配列に相補的な配列は、上記配列と完全な相補性または部分的にのみ相補性を有するあらゆる配列を指す。部分的相補性とは、その核酸がハイブリダイゼーション実験において特異性を保持する限り、多少のミスマッチが許容され得ることを示す。例えば、１５塩基ごとに１つミスマッチがあっても、核酸分子のハイブリダイゼーションプロフィール保持能を実質的に変化しないであろう。
【００６６】
本発明は、好ましくは、上記のような遺伝子に特異的な約１０〜約８００個の塩基長の核酸分子を、検体の脳症の検出に使用する。
【００６７】
本発明は、上記で定義した核酸を含むベクターも含む。そのベクターは、プラスミド、エピソーム、クロモソーム、ファージ、ウイルスなどであってもよい。ベクターは、プロモーター、複製起点、選択遺伝子、ポリＡ配列、分泌配列などの制御配列を含んでもよい。プラスミドの典型例として、ｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡなどの市販のプラスミドがあげられる。ウイルスの適切な例として、複製欠損アデノウイルス、レトロウイルス、ＡＡＶまたはヘルペスウイルスがあげられる。
【００６８】
上記で定義した核酸またはベクターを含む組換え宿主細胞として、細菌（例えばE. coli）、イースト（例えば、Saccharomyces、Kluyveromycesなど）、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの原核または真核細胞があげられる。哺乳動物細胞は、げっ歯類、ウシ、サルおよびヒトを含む様々な種に由来してもよい。それらは、初代培養細胞でも、確立した細胞系でもよい。そのような細胞として、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３、ＨｅＬａなどがあげられる。
【００６９】
本発明の組成物および方法は、早期段階を含む脳症、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ、「狂牛病」）を含む伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の診断、特徴づけ、進行モニタリングなどに使用することができる。本発明は、ヒトにおけるｖＣＪＤの検出にも適している。
【００７０】
発症前血液検査法を有することの価値は、特に、以下のとおりである：
−感染した動物を同定し、群れの他の動物との接触を避け、その後の感染を回避する；屠殺後にプリオンタンパク質を検出することによる現行の検査では、疾患の発症後の段階を検出することしかできない；
−屠殺場から疾患動物を隔離する；現在の屠殺場は、検出されたものも未検出のものも含め、感染動物に満ちている；
−屠殺場での動物の複雑な処理および追跡を回避し、市場用に承認された肉と汚染された肉とが誤って混じることを回避する；
−血液検査は、動物を屠殺場に送る数日または１週間前に実施することができるが、現行の検査では、屠殺場での検査の渋・遅滞を生じる。
−脳組織の摘出および処理のための費用がかからない；
−早期から後期の形態まで、疾患の様々な段階を検出する；
−この検査で陰性と認定された動物を再検査して、疾患が存在する場合に、その検出の機会をふやすことができる；
−群れ全体を屠殺することによる社会的および経済的インパクトを防止する；農業従事者は、そのような極端な措置が必要であることを示し、その措置の正当な根拠となりうる、確固たる科学的証左および実証無しに、彼らの動物が殺されるのを目の当たりにしたくないのである。
【００７１】
開示された診断方法は、疾患の存在および早期段階から後期段階までの疾患の進行をマーカーの同定に基づいて診断するため、感染因子の確実な知識を要しない。
【００７２】
本発明の方法は、ＢＳＥの潜伏期間中の動物における、早期の発症前ＢＳＥを検査するために使用することができ、簡単な血液検体から機能するため、有利である。
【００７３】
本発明は、疾患が進行していると疑われる被験動物から単離され、したがって疾患進行に必須の遺伝子によりコードされており、さらに疾患の早期段階と末期段階を識別することができる、循環体液からの遺伝子マーカーを記載する。
【００７４】
−いくつかの哺乳動物種で研究が行われた：
−ＴＳＥ感染の信頼性のある特徴（signatures）が、その種において検出された；
−早期の発症前段階および発症後段階のための遺伝子マーカーが同定された；
−本発明者は、感染したヒツジの血液中に存在する５つの特徴を同定した；
２頭の対照ヒツジと比較すると、研究対象の４頭の感染ヒツジにおいて、これらの５つの特徴が血液中に存在し、上方制御されている；
−マウスにおいて、対照マウスと比較すると、感染マウスでは脾臓中に存在する７つの特徴が同定され、これらは、上方制御されている；
−疾患進行を、多数の時点で調査した：
−疾患の早期段階から後期段階まで様々な時点で特徴を追跡した；
−３つの特徴は、３５日（発症前の早期段階）で高度に発現（上方制御）され、その発現は、２００日（発症後後期段階）までに減少した。
【００７５】
したがって、新規診断検査は、感染個体と未感染個体との間に生じるスプライシング変異体の発現の差異を全ゲノムにわたり解析することに基づいている。ユニークな遺伝子プロファイリング技術であるＤＡＴＡＳ（Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing）を応用することにより、本出願人はここにＴＳＥ感染の遺伝子マーカーを同定した。これらのデータから、本発明者は、ＴＳＥ感染因子によって誘導または阻害される下流での事象の特徴を選択した。すでに選別され、あるいは立証されつつある多数の事象に基づけば、この診断検査は、この伝染病に対処するために現在使用されている、利用可能なプリオン抗体に基づく解析よりも、大きなインパクトや価値がありそうである。
【００７６】
本発明は、上記核酸分子によってコードされるポリペプチド、および診断または治療目的のためのそれらの使用にも関する。より具体的には、本発明の目的は、ポリペプチドにあり、そのポリペプチドは、上記で定義した核酸分子によってコードされているアミノ酸配列を有する。
【００７７】
本発明は、そのポリペプチドに対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、およびその抗体のフラグメントまたは誘導体（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ヒト化抗体など）にも関する。このような抗体は、動物の免疫化、および血清（ポリクローナル）または脾臓細胞（適当な細胞株と融合させることによりハイブリドーマを作製する）の採取を含む、慣用の方法によって調製してもよい。様々な種からポリクローナル抗体を調製する方法は、当分野において周知である。例として、抗原をアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）と組合わせて、典型的には皮下注射によって、動物に投与してもよい。反復注射をしてもよい。血液検体を採取し、イムノグロブリンまたは血清を分離する。様々な種からモノクローナル抗体を調製する方法も、当分野で公知である（Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988）。簡潔に述べると、これらの方法は、抗原で動物を免疫化した後、脾臓細胞を回収し、次いでそれを骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させることを含む。得られたハイブリドーマは、モノクローナル抗体を産生するものであり、限界希釈法により選択して個々のクローンを単離することができる。
【００７８】
本発明の好ましい抗体は、配列番号１〜１５によりコードされるポリペプチド中に含まれるエピトープに特異的に結合する抗体である。
【００７９】
これらの抗体を、治療または診断の目的で使用することができる。具体的には、検査は、生物学的検体中の上記ポリペプチドまたはその一部を、場合により支持体に結合させた上記抗体を用いて検出することに基づく。
【００８０】
この点において、本発明のさらなる目的は、対象における脳症の存在または発症の危険性を検出する方法にあり、その方法は、（ｉ）対象からタンパク質（またはそのフラグメント）を含有する生物学的検体を提供するステップ、（ｉｉ）上記で定義の、少なくとも１つの抗体と検体を接触させるステップ、（ｉｉｉ）抗体−抗原複合体の存在を確認するステップであり、複合体の存在が対象における脳症の存在または発症の危険性を示すステップを含む。
【００８１】
本発明は、上記方法を実施するためのキットにも関する。本発明のキットは、より一般的には、上記で定義の核酸分子もしくは抗体、または上記で定義の核酸アレイ、または上記で定義した核酸調製物もしくはライブラリーを含む。キットは、さらに有利には、検出されたシグナルの較正のための対照クローンを含んでいてもよい。
【００８２】
したがって、本発明の具体的な目的は、支持体に固定化された、上記で定義した核酸分子、ベクター、ポリペプチドおよび抗体より選択される、少なくとも１つの特定の標的分子を含む製品にある。支持体は、フィルター、メンブレン、スライド、ポリマー、ガラス、プラスチックおよびバイオマテリアルなど、様々な形態、性質及び起源のものであってよい。
【００８３】
本発明は、配列番号１〜１５より選択される配列の全部もしくは一部の配列またはそれに相補的な配列またはその機能的等価体を含む、少なくとも１つの核酸分子またはベクターを含む核酸アレイをも包含する。このアレイは、好ましくは上記で定義した少なくとも二つ、より好ましくは３つの、さらにより好ましくは少なくとも４つの明らかに異なる核酸分子を含む。一般的には、アレイは、少なくとも５つ、より具体的には少なくとも８つの上記分子を含み、あるいはすべてを含むことさえある。
【００８４】
核酸アレイは、フィルター、メンブレン、スライド、ポリマー、グラス、プラスチック、バイオマテリアルなどの支持体に結合される核酸分子で構成されることが好ましい。支持体は、平坦でも平坦でなくてもよく、固体でも半固体でもよい。ビーズなども含む。そのようなＤＮＡチップまたはオリゴチップも本発明に含まれる。これらは、公知技術により調製することができる（WO99/46403参照）。
【００８５】
本発明は、上記で定義した核酸分子、ベクター、組換え宿主細胞、ポリペプチドおよび抗体より選択される標的と検査化合物を接触させるステップ、および検査化合物のin vitroまたはin vivoでの標的への結合能または標的活性の調節能を評価するステップを含む、薬物候補化合物の選択方法をも包含する。
【００８６】
本発明は、候補薬物化合物の選択のためのスクリーニングアッセイにおける標的としての上記核酸配列の使用にも関する。スクリーニングアッセイは、例えば、標的（核酸またはそれに相当するポリペプチドもしくはタンパク質）を検査化合物と接触させ、検査化合物のin vitroまたはin vivoでの標的の活性の結合能または調節能を評価することを含む。
【００８７】
結合は、例えばイムノアッセイ、または結合アッセイ（ＲＩＥ、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＡ、ＦＲＥＴなど）などの、あらゆる慣用の技術で測定することができる。活性の調節は、例えば酵素の基質、レポータ遺伝子などを用いる、様々な細胞アッセイまたは無細胞アッセイにおいて評価し得る。
【００８８】
本発明の他の態様を、以下の実施例中に記載するが、それらは説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００８９】
実施例
実施例１．実験感染マウスモデルで得られるＴＳＥマーカー
C57BL/6マウスを、脳内または腹腔内投与により、ヒツジのスクレーピーの自然発生例に由来するマウスC506M3株を含む脳ホモジネートで感染させた。対照マウスには、健常動物の脳ホモジネートを接種した。臨床発症前および発症時（すなわち、発症前および発症後）の様々な時点で、罹患動物を屠殺し、脳および脾臓の全ＲＮＡを調製した。組織検体を腹腔内接種の３５日、７０日、１１１日、１４８日、１９０日および２３０日後に採取し、組織採取は、脳内接種の２８日、６３日、９３日、１２１日、１３５日および１５３日後に行った。
【００９０】
脳検体を研究し、脳浸襲および神経変性に関与する遺伝子を同定した。
【００９１】
PrpSc増殖が免疫系に依存し、脾臓濾胞樹状細胞中に顕著に存在することから、脾臓検体も評価した。脾臓検体から同定された配列は、したがって、免疫系を介するPrpScの増殖に関与するメカニズムについての情報を提供する。脾臓から得られた特徴は、様々なタイプの細胞で生じる、感染および非感染状態を識別する定性的差異のレパートリーを示す。少量（現時点で検出不可能）のPrpScが存在することによっても、その遺伝子発現が変化し得る循環血液細胞も、こうした細胞の一種である。プロフィールの変化した循環細胞、または循環細胞と相互作用する常在性の非循環細胞のいずれにおいてもこのPrpScが発現され得ることから、脾臓で同定された特徴のいくつかは、感染動物の血液細胞に特異的に検出されることが予想される。
【００９２】
１．１感染後の様々な時点での潜在マーカーの同定
ＤＡＴＡＳプロファイリングアッセイを、疾病の様々な段階の感染マウス５匹と対照マウス５匹からの脾臓または脳組織に由来するプールされたＲＮＡの間で実施した。すべてのＤＡＴＡＳフラグメントを含有するマクロアレイを構築した。ＴＳＥに特異的な特徴を同定するために、ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより、ＴＳＥ感染動物を対照動物に対して特徴付けした。感染後の各時点につき、マクロアレイを、対照組織および感染組織由来の最低２種のプローブとハイブリダイズさせた。各ハイブリダイゼーションにおける各クローンのＺスコアを算出した。統計的Ｚスコア解析は、２種の対照プローブおよび２種の感染プローブとのハイブリダイゼーションから得られた結果の間で交差比較することにより、少なくとも９５％以上の確率で差次的に発現されるＤＡＴＡＳフラグメントを同定した。下記図１は、ＴＳＥ感染と特異的に関連する脾臓マーカー（赤色囲みで示す）をＤＡＴＡＳが同定可能であることを示す例である。
【００９３】
Ｚスコア解析の結果を、下記の表に示す。数値＜−２は、クローンの下方制御の確率＞９５％であることを示し、数値＞＋２は、確率＞９５％での上方制御を示す。；
【００９４】
【表１６】
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【００９５】
１．２．選択された診断用候補物の動態研究
ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより選択された候補物を、定量的ＰＣＲを用いて動態研究によりさらに特徴付けした。３つの潜在的候補物の脾臓における発現パターンを、３匹の感染マウスおよび２匹の対照マウスにおいて確認した。そのデータを、疾患の進行中、発現の変化のない基準遺伝子に対して、標準化を行った。感染後の異なる時期における２匹の対照および感染マウスに由来する個々の脾臓検体のノザンブロッティングにより、定量的ＰＣＲにより事前に推定した発現パターンが確認された。図２は、定量的ＰＣＲおよびノザンブロッティング（各レーン全ＲＮＡ２０μgをロードした）により測定された１つの候補物の発現パターンを示す。
【００９６】
これまでに評価した候補物には、その細胞局在に基づいて、解析の優先順位をつけた。すべてが、プロセシングが可能で、正常時細胞により分泌されるタンパク質をコードしていた。これらの明確な上方制御を循環細胞のＲＮＡレベルまたは直接血中のタンパク質レベルで検出することができると仮定することは合理的である。
【００９７】
実施例２．自然感染したロマノフヒツジ群より入手された診断マーカー
ＬＶＫヒツジは、自然にスクレーピーに感染しているか、またはスクレーピーに抵抗性である。スクレーピーの症状は感染後１２ヶ月後に感染動物に現れる。これらの動物の寿命の最初の１年間は、発症前段階に対応する。６ヶ月齢および９ヶ月齢で、これらの動物から脾臓検体を得て、脾臓検体の全ＲＮＡを調製した。さらに、血液の全ＲＮＡを、発症前段階および発症後段階においてスクレーピーに感染したヒツジから調製した。
【００９８】
感染および抵抗性／対照ヒツジの脾臓および前臨床段階の血液検体に由来するＲＮＡについて、ＤＡＴＡＳプロファイリングを行った。ヒツジモデルにおいて単離したすべてのＤＡＴＡＳフラグメントを含有するマクロアレイを、２匹の対照ヒツジおよび前臨床および臨床期の４匹の感染ヒツジから採取した血液検体に由来するプローブとハイブリダイズさせた。６ヶ月齢の４匹の感染ヒツジおよび４匹の抵抗性ヒツジに由来するプールした脾臓検体についても、発現の差異（differential expression）を確認した。血液プローブを負荷したマクロアレイを図３に示すが、この図は、循環マーカーを同定できることを示している。
【００９９】
合計すると、血液検体に由来するプローブで行ったハイブリダイゼーションにより３つの候補物が、脾臓検体とのハイブリダイゼーションにより２つの候補物が単離された。マウスのマクロアレイを個々のヒツジの血液からのプローブで探索したところ、さらに２つの候補物が同定された。以下の表は、Ｚスコア解析の結果を示す。数値＜−２はクローンの下方制御の確率＞９５％を示し、数値＞＋２は確率＞９５％での上方制御を示す。
【０１００】
【表１７】
2004535165.tif 000018
【０１０１】
いくつかの遺伝子については、文献調査に基づき、直接機能にリンクさせた。リバースノザンブロッティングの結果の如何によらず、それらの潜在的マーカーは、その後の研究に含まれる。
【０１０２】
８つの潜在的マーカーについて、ＴＳＥ進行中の発現レベルについて、現在検討中である。さらに、血液中の発現パターンを、スクレーピー因子に対するヒツジの感受性に関連することが知られているプリオンタンパク質の様々な多形に相関させる。ExonHitは、プリオン病に抵抗性のARR/ARRジェノタイプ、スクレーピー感染に高度に感受性のVRQ/VRQジェノタイプ、５％の発症率を有するARR/VRQジェノタイプを有するヒツジの血液検体を入手することができる。さらに、ＢＳＥ因子による早期同定マーカーの誘導性を確認するために、実験的にBSE因子を感染させたヒツジにおける動態研究からExonHitのために、血液検体が採取されている。
【０１０３】
実施例３．発症前段階の循環ＢＳＥマーカーの同定
ヒツジモデルおよびマウスモデルにおけるマーカーの同定は、定量的ＰＣＲおよびノザンブロッティングにより、ＢＳＥ感染ウシにおいて確認することができる。ヒツジおよびマウスの両モデルにおいて単離されたＤＡＴＡＳフラグメントを含有するマクロアレイに、前臨床段階のＢＳＥ感染ウシに由来する血液プローブのパネルを負荷して、新しいＢＳＥに特異的な特徴を同定することができる。
【０１０４】
上記に概説した解析と並行して、様々な発症前段階のＢＳＥ感染ウシの血液検体を使用し、さらなるＤＡＴＡＳ実験を健常動物との比較において行い、さらなる潜在マーカーを同定することができる。同定された候補マーカーは、定量的ＰＣＲを実施することにより評価され、必要に応じ最終診断に加えられる。
【０１０５】
典型的な診断アッセイは、ＤＮＡチップ、ＰＣＲ検出または抗体検出に基づく。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＴＳＥ感染に伴う脾臓マーカーの同定を示す。
【図２】ＴＳＥの遺伝子マーカーの表現パターンを示す。
【図３】マクロアレイを用いた循環マーカーの同定を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004535165.tif 000061
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