(57)【要約】本発明の化合物は、変成された形に治療剤である。本発明の典型的なプロドラッグ化合物は、治療剤、イソロイシンを有するオリゴペプチド、安定化基及び任意には、リンカー基を含んで成る。プロドラッグは、標的細胞に関連する酵素により分解できる。また、前記化合物の製造方法、及び使用方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素による前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物が、標的細胞と関連するＴＯＰ以外の酵素により分解できることを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記化合物が、ＴＯＰによる分解に対して耐性である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記オリゴペプチドのＡＡ１が、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、アラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、セリン、プロリン及びβ−アラニンから選択される請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記オリゴペプチドのＡＡ２が、アラニン、ロイシン、グリシン、セリン、チロシン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン、Ｎ−メチルアラニン、アミノイソ酪酸、トレオニン及びフェニルアラニンから選択される請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記オリゴペプチドのＡＡ４が、β−アラニン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２−チエニルアラニン、２−ナフチルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−アミノメチル安息香酸及びアミノイソ酪酸から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項６】
前記オリゴペプチドが、βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（配列番号１）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ（配列番号２）；Ｔｉｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３）；Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号４）；Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号５）；Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号６）；Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号７）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号８）；Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号９）；Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号１０）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号１１）；Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号１２）；Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号１３）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１４）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号１５）；Ｔｉｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１６）；Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１７）；Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１８）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１９）；Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号２０）；Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号２１）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ（配列番号２２）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ（配列番号２３）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号２４）；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２５）；Ｉｌｅ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２６）；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（配列番号２７）；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ（配列番号２８）；Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号２９）；Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号３０）；Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号３１）；Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号３２）；Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ（配列番号３３）；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３４）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号３５）；及びβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（配列番号３６）から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項７】
前記安定化基が、ジカルボン酸又は高級（ｈｉｇｈ ｏｒｄｅｒ）カルボン酸である請求項１記載の化合物。
【請求項８】
前記安定化基が、琥珀酸、アジピン酸、グルタル酸、フタル酸、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピロクルタミン酸、酢酸、１−ナフチルカルボン酸、２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシ桂皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、ポリエチレングリコール酸、ブタンジスルホン酸、マレイン酸、ニペコット酸、及びイソニペコット酸から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項９】
前記安定化基が、非遺伝的にコードされるアミノ酸である請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
前記安定化基が、β−アラニン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２−チエニルアラニン、２−ナフチルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−アミノメチル安息香酸及びアミノイソ酪酸から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
前記安定化基が、アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるアスパラギン酸、又はグルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるグルタミン酸の１つである請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
前記安定化基が、負に荷電されているか又は中性である請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
前記標的細胞と関連する酵素が、オリゴペプチドのＡＡ１とＡＡ２との間の結合を分解する請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
前記オリゴペプチドが、前記治療剤に直接的に結合される請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
前記オリゴペプチド配列が、アミノカプロン酸、ヒドライド基、エステル基、エーテル基又はスルフィドリル基から選択されたリンカー基を通して、前記オリゴペプチドの第２結合部位で治療剤に間接的に結合される請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
前記治療剤が、アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン類の薬物、タキサン、アントラサイクリン、ドラスタチン、トポイソメラーゼインヒビター、白金配位錯体化学療法剤、及びマイタニソイド成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
前記治療剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアミシン、エトポシド、エトポシドホスフェート、ＣＣ−１０６５、ズオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、メトトレキセート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキセート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、ドラスタチン１０、ドラスタチン１１、ドラスタチン１５、トポテカン、カンフォテシン、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロポリンＡ、マイタンシン、及び前記の誘導体及び類似体から成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１８】
前記治療剤が、細胞内活性部位を有する請求項１記載の化合物。
【請求項１９】
前記標的細胞に関連する酵素による分解の前よりも、前記標的細胞に関連する酵素による分解の後、標的細胞に侵入することができる、少なくとも治療剤を包含する、プロドラッグの活性部分を有するプロドラッグである請求項１記載の化合物。
【請求項２０】
前記プロドラッグの活性部分が、治療剤から成る請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
前記プロドラッグの活性部分が、前記治療剤及び少なくとも前記リンカー基を包含する請求項１９記載の化合物。
【請求項２２】
前記プロドラッグの活性部分が、前記治療剤及び前記オリゴペプチドのＡＡ１を包含する請求項１９記載の化合物。
【請求項２３】
前記化合物が、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ｔｉｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ｔｉｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｄｎｒ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｄｏｘから成る群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項２４】
前記標的細胞が、腫瘍又は炎症細胞である請求項１記載の化合物。
【請求項２５】
前記標的細胞に関連する酵素が、前記治療剤のための標的細胞の細胞外付近に存在する請求項１記載の化合物。
【請求項２６】
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３） （ａ）ジカルボン酸又は高級（ｈｉｇｈｅｒ ｏｒｄｅｒ）カルボン酸、
（ｂ）非遺伝的にコードされるアミノ酸、又は
（ｃ）アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるアスパラギン酸、又はグルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合されるグルタミン酸の１つから選択された安定化基、及び
（４）任意には、トロウアーゼにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物が、標的細胞と関連するトロウアーゼ以外の酵素により分解できることを特徴とする化合物。
【請求項２７】
前記化合物が、トロウアーゼによる分解に対して耐性である請求項２６記載の化合物。
【請求項２８】
前記安定化基が、琥珀酸、アジピン酸、グルタル酸、フタル酸、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピロクルタミン酸、酢酸、１−ナフチルカルボン酸、２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシ桂皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、ポリエチレングリコール酸、ブタンジスルホン酸、及びマレイン酸から成る群から選択される請求項２６記載の化合物。
【請求項２９】
（１）（ａ）標的細胞に導入できる治療剤、
（ｂ）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（ｃ）安定化基、及び
（ｄ）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物が、標的細胞と関連するＴＯＰ以外の酵素により分解できることを特徴とする化合物、及び
（２）医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物。
【請求項３０】
前記化合物が、ＴＯＰによる分解に対して耐性である請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
患者の処理方法であって、治療的有効量の
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がＴＯＰにより分解できることを特徴とする化合物を、前記患者に投与することを含んで成る方法。
【請求項３２】
前記化合物が、ＴＯＰによる分解に対して耐性である請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、静脈内投与される請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記患者が、癌、新形成疾患、腫瘍、炎症性疾患及び感染性疾患から成る群から選択された医学的状態について処理される請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
患者への投与のためのプロドラッグを企画するための方法であって、
（１）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを同定し、
（２）安定化基に前記オリゴペプチドの第１の結合部位でそのオリゴペプチドを連結し、
（３）前記オリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤にそのオリゴペプチドを直接的に又は間接的に連結し、
ここで段階（２）及び（３）はいずれかの順序で又は同時に行われ得、そしてさらに、接合体が段階（１）〜（３）の実施により形成され、
（４）前記接合体がＴＯＰにより分解できるかどうかを試験し、
（５）前記接合体が完全な血液において安定できるかどうかを試験し、そして
（６）前記接合体がＴＯＰによる分解に対して耐性であるか、そして、完全な血液において安定できるかどうかを、プロドラッグとしてのその接合体を選択することを含んで成る方法。
【請求項３６】
前記第１の結合部位が、前記オリゴペプチドのＮ−末端である請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の結合部位が、前記オリゴペプチドのＣ−末端である請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の結合部位が、前記オリゴペプチドのＣ−末端である請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の結合部位が、前記オリゴペプチドのＮ−末端である請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
請求項３５記載の方法により企画されるプロドラッグ。
【請求項４１】
患者への投与のために意図される治療剤の毒性を低めるための方法であって、
オリゴペプチドを、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で安定化基に共有結合し、そして前記治療剤を前記オリゴペプチドの第２の結合部位で直接的に又は間接的に結合することによって、前記治療剤のプロドラッグ形を形成し、ここで前記オリゴペプチドが、式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］を有し、そしてさらに、トロウアーゼによる分解に対して耐性であり、
前記プロドラッグが、トロウアーゼ以外である標的細胞に関連する酵素により分解でき、そしてさらに、トロウアーゼによる分解に対して耐性であり、それにより、前記治療剤のプロドラッグ形が、患者に投与される場合、前記治療剤の低められた毒性を提供することを特徴とする方法。
【請求項４２】
前記プロドラッグが、接合されていない形での治療剤の用量に対して、プロドラッグ形での治療剤の高められた用量の患者への投与を可能にする請求項４３記載の方法。
【請求項４３】
（１）（ａ）マーカー、
（ｂ）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（ｃ）安定化基、及び
（ｄ）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドのＡＡ１は、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物が、標的細胞と関連するＴＯＰ以外の酵素により分解でき、そしてさらに、ＴＯＰによる分解に対して耐性であることを特徴とする化合物、及び
（２）任意には、前記マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬を含んで成る診断又はアッセイのための製品。
【請求項４４】
プロドラッグの製造において、遊離治療剤を除去するための方法であって、
（１）任意に保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を遊離治療剤によりカップリングし、
（２）段階（１）の後に残存する遊離治療剤を結合し、及び治療剤−ポリマー樹脂複合体を形成するために、ポリマー樹脂と段階（１）の反応体とを接触し、そして
（３）前記治療剤−ポリマー樹脂複合体を除去することを含んで成る方法。
【請求項４５】
前記ポリマー樹脂が、ポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロライドである請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記任意に保護された安定化基−オリゴペプチド接合体が、式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを包含する請求項４４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序説：
技術分野：
本発明は、プロドラッグとして有用な新規化合物類に関する。そのようなプロドラッグは、患者における疾病、特に腫瘍の処理のために使用され得る。
【０００２】
背景：
多くの治療剤、例えばアントラサイクリン及びビンカアルカロイドは、癌の処理のために特に効果的である。しかしながら、それらの分子はしばしば、急性毒性、特に骨髄及び粘膜毒性、及びアントラサイクリンの場合、慢性心臓毒性及びビンカアルカロイドの場合、慢性神経学的毒性によりインビボで特徴づけられる。同様に、メトトレキセートは、炎症反応、例えばリウマチ患者の処理のために使用され得るが、しかしその高い毒性がその適用を制限する。より特異的で且つ安全な抗腫瘍剤の開発が、腫瘍細胞に対する高い有効性、及びそれらの生成物の副作用（毒性、非腫瘍細胞の破壊、等）の数及び重症度の低下のために所望される。より特異的に抗炎症剤の開発がまた所望される。
【０００３】
毒性問題を最少にするために、治療剤は好都合には、プロドラッグの形で患者に提供される。プロドラッグは、それらの構造の化学的又は酵素的修飾により、インビボで、薬物（活性治療化合物）に転換できる分子である。毒性を低めるためには、この転換は、循環システム又は非標的組織よりもむしろ作用又は標的組織の部位に制限されるべきである。しかしながら、プロドラッグはしばしば、血液及び血清において低い安定性により特徴づけられる。これは、プロドラッグが患者の身体内の所望する部位に達する前、そのプロドラッグを分解し、そして従って活性化することができる、血液及び血清における酵素の存在による。
【０００４】
そのような問題を克服する所望する種類のプロドラッグは、特許協力条約国際発行ＷＯ９６／０５８６３号及びアメリカ特許第５，９６２，２１６号（それらは引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。しかしながら、さらに有用なプロドラッグ化合物及びそのようなプロドラッグの製造方法が所望される。
権利不在状態で存在する類似する構造のプロドラッグに対して、血液において高い作用特異性、低められた毒性及び改良された安定性を示すプロドラッグが特に所望される。
【０００５】
発明の要約：
本発明の化合物は、安定化基に結合される、３個のアミノ酸のオリゴペプチドに直接的に又は間接的に接合される治療剤のプロドラッグ形である。オリゴペプチドは、Ｃ−末端から数えて３番目の位置（プロドラッグの典型的な配向において）イソロイシン残基を有する。本発明のプロドラッグは、高い作用特異性、低められた毒性、血清及び血液における改良された安定性を示し、そして標的細胞関連の酵素により活性化されるまで、標的細胞中に最少に移動せず、又は最少に移動する。
【０００６】
本発明はまた、本発明の化合物及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、アジュバント、ビークル又は同様のものを含んで成る医薬組成物にも関する。製品、例えば診断又はアッセイのためのキットもまた、記載される。
さらに、プロドラッグの企画方法、及びプロドラッグを創造するために治療剤を変性することによって毒性を低め、そして安全性指数を改良する方法が開示される。そのような変性は、遊離治療剤に比較して、改良された治療指数を提供する。
本発明はさらに、本発明のプロドラッグを、投与することによって、医学的状態を処理するための方法を包含する。
いくつかののプロドラッグ製造方法がまた、包含される。
【０００７】
特定の記載：
略語：
ＡＣＮ＝アセトニトリル；Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸；Ａｌｌ＝アリル；Ａｌｏｃ＝アリルオキシカルボニル；Ａｍｂ＝４−（アミノメチル）安息香酸；ＡＡＰ＝３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸；ＤＣＣ＝Ｎ， Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル；Ｃａｐ＝アミノカプロン酸； ＤＢＮ＝１，５−ジアザビシクロ［４． ３． ０］ノン−５−エン；ＤＢＯ＝１，４−ジアザビシクロ［２． ２． ２］オクタン；ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５． ４． ０］ウンデク−７−エン；ＤＣＭ＝ジクロロメタン；ＤＩＣ＝Ｎ， Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチレンアミン；Ｄｇ＝ジグリコール酸；ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；
【０００８】
Ｄｎｒ＝ダウノルビシン；Ｄｏｘ＝ドキソルビシン； Ｅｔ２Ｏ＝ジエチルエーテル；Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｇｌ＝グルタル酸； ＨＡＴＵ＝Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＨＥＰＥＳ＝ヒドロキシエチルピペリジン；ＨＯＢｔ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー；ＭｅＯＨ＝メタノール；ＭｅＯＳｕｃ＝メチルヘミスクシネート／メチルヘミスクシニル； ＭＴＤ＝最大耐性用量；
【０００９】
ＮＡＡ＝３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸；ＮａＩ＝２−ナフチルアラニン；Ｎａｐｈ＝１，８−ナフタレンジカルボン酸；ＮＩｅ＝ノルロイシン；ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリジン；Ｎｖａ＝ノルバリン；ＰＡＭ樹脂＝４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル； Ｐｙｇ＝ピログルタミン酸；Ｐｙｒ＝３−ピリジルアラニン； ＲＴ，ｒｔ＝室温； Ｓｕｃ＝琥珀酸／スクシニル；ＴＣＥ＝トリクロロエチル；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；Ｔｈｉ＝２−チエニルアラニン；Ｔｈｚ＝チアゾリジン−４−カルボン酸；Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸；ＴＯＰ＝チメット（Ｔｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ。
【００１０】
本発明は、治療剤のプロドラッグ形として記載される化合物を包含する。治療剤は、順に安定化基に結合され得るオリゴペプチドに直接的又は間接的に結合される。治療剤とオリゴペプチドとの間のリンカー基が任意には存在することができる。オリゴペプチドは、３又は４個の長さのアミノ酸であり、そしてそのＣ−末端から３番目のアミノ酸にイソロイシン残基を有することによって、プロドラッグの典型的な配向において特徴づけられる。
【００１１】
プロドラッグ：
本発明のプロドラッグは、治療剤の変性された形であり、いくつかの部分、例えば
（１）治療剤、
（２）オリゴペプチド、及び
（３）安定化基、及び
（４）任意には、リンカー基を含んで成る。
【００１２】
プロドラッグの部分の個々は、下記により詳細に論じられる。プロドラッグのそれらの部分の典型的な配向は次のとおりである：
（安定化基）−（オリゴペプチド）−（任意のリンカー基）−（治療剤）。
安定化基は、オリゴペプチドの第１の結合部位でそのオリゴペプチドに直接的に連結される。オリゴペプチドは、そのオリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤に直接的に又は間接的に連結される。オリゴペプチド及び治療剤が間接的に連結される場合、リンカー基が存在する。
【００１３】
プロドラッグの２種の部分の直接的な結合は、それらの２種の部分間に存在する共有結合を意味する。従って、安定化基及びオリゴペプチドは、オリゴペプチドの第１結合部位、典型的いはオリゴペプチドのＮ−末端で共有化学結合を通して直接激に結合される。オリゴペプチド及び治療剤が直接的に結合される場合、それらはオリゴペプチドの第２の結合部位でもう１つのものに共有結合される。オリゴペプチドの第２の結合部位は典型的には、オリゴペプチドのＣ−末端であるが、しかしオリゴペプチド上の他の位置ででもあり得る。
【００１４】
プロドラッグの２つの部分の間接的結合は、その２つの部分の個々がリンカー基に共有結合されることを意味する。他の態様においては、プロドラッグは、治療剤へのオリゴペプチドの間接的結合を有する。従って、典型的には、オリゴペプチドは、治療剤に共有結合されるリンカー基に共有結合される。
【００１５】
本発明のプロドラッグは、そのオリゴペプチド部分内で分解できる。プロドラッグを効果的にするためには、プロドラッグは、典型的には、標的細胞に侵入できるプロドラッグの一部を生成するインビボ変性を受ける。プロドラッグのオリゴペプチド部分内の第１の分解は、プロドラッグの活性部分、すなわち分解生成物の１つとして、標的細胞中への輸送のための成分であるプロドラッグの部分を残すことができる。他方では、１又は複数のペプチダーゼによるさらなる分解は、プロドラッグの輸送−成分部分をもたらすために必要とされる。プロドラッグの活性部分又は輸送−成分部分は、少なくとも治療剤を有し、そして直接的に、又は標的細胞内のさらなる転換に基づいて治療効果を発揮するために標的細胞内に侵入できるプロドラッグのその部分である。
【００１６】
従って、前記化合物は活性部分を有し、そして活性部分は、標的細胞により結合される酵素による分解の前よりも、標的細胞により結合される酵素による分解の後、標的細胞により侵入することができる。安定化基及びオリゴペプチドの構造は、血液又は非標的組織に存在できる酵素によるプロドラッグのクリアランス及び代謝を制限するよう選択され、そしてさらに、細胞中へのプロドラッグの輸送を制限するよう選択される。
【００１７】
安定化基は、インビボでのエキソペプチダーゼによるプロドラッグの分解を阻止し、そしてさらに、プロドラッグの好ましい電荷又は他の物理的特性の供給において作用することができる。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、トロウアーゼ、すなわち標的細胞に関連し、そして下記により詳細に記載される種類の酵素による分解に対する耐性のために選択される。テトラペプチド及びトリペプチドの両者が、本発明に使用され得る。本発明の好ましい態様においては、イソロイシン−含有ペプチドはトリペプチドである。一般的には、トリペプチドは全身性循環及び正常組織においては良好に分解されず、そして従って、オーバーラップ配列のテトラペプチドに比較して、高い治療指数を有する。
【００１８】
プロドラッグ形への治療剤の変性により不活性化される、治療剤、特に抗腫瘍及び／又は抗炎症性治療剤を製造することが所望される。本発明によれば、標的細胞は通常、腫瘍細胞又は炎症反応に関与する細胞、特にリウマチ性疾患に関連するそれらの細胞、例えばマクロファージ、好中球及び単球である。治療剤のプロドラッグ形への変性は、治療剤の副作用をいくらか減じる。
【００１９】
プロドラッグは、患者に投与され、安定形で血流を通して運ばれ、そして標的細胞の付近にある場合、標的細胞関連酵素により認識され、そして変性される。酵素活性は正常細胞の細胞外付近内に最少に存在するので、プロドラッグは活性化されず、そしてその輸送−成分部分（治療剤を包含する）は最少に正常細胞中に侵入する。しかしながら、腫瘍又は他の標的細胞付近において、局部環境における相当する酵素の存在は、プロドラッグの分解を引き起こす。
【００２０】
プロドラッグからの変性及び標的細胞中への侵入の後、治療剤（任意には、１又は複数のアミノ酸及びたぶんまた、リンカー基に結合される）は、標的細胞を殺害するか又はその増殖を阻害するよう作用する。図２に示される例は、細胞外分解され、そして標的細胞中に侵入する、典型的なプロドラッグを示す。標的細胞内で、それは、治療効果を提供するためにさらに変性され得る。プロドラッグの一部は時折、たぶん有害な正常細胞に接近するが、プロドラッグの輸送−成分部分は主に標的細胞付近で開放される。従って、正常細胞に対する毒性が最少にされる。
【００２１】
この方法は、標的組織が正常細胞又は組織により開放されない酵素を放出する場合、標的細胞破壊のために特に有用であり、そしてそのために企画される。本明細書において、“正常細胞”とは、その意図される使用のために適切な態様で、プロドラッグの投与に基づいてプロドラッグにより遭遇される非標的細胞を意味する。
【００２２】
他の態様においては、プロドラッグの配向は、逆転され、その結果、安定化基がオリゴペプチドのＣ−末端に結合され、そして治療剤がオリゴペプチドのＮ−末端に直接的に又は間接的に結合される。従って、他の態様においては、オリゴペプチドの第１の結合部位は、オリゴペプチドのＣ−末端であり得、そしてオリゴペプチドの第２の結合部位は、オリゴペプチドのＮ−末端であり得る。リンカー基は任意には、治療剤とオリゴペプチドとの間に存在することができる。本発明のプロドラッグのもう１つの態様は、一次態様と同じ態様で機能する。
【００２３】
ＡＡ３位置（下記に記載される番号付けスキームに従って）にイソロイシンを有するオリゴペプチド配列は、ＡＡ３位置に非イソロイシン残基を有するオリゴペプチドのトロウアーゼ配列は、ＡＡ３位置に非イソロイシン残基を有するオリゴペプチドのトロウアーゼによる選択的分解のために、プロドラッグのための良好な候補体を製造しないことが予測された。しかしながら、本明細書に記載されるように、イソロイシン含有プロドラッグ化合物がインビボで試験される場合、そのような化合物が有用なプロドラッグとして実際、作用する驚くべき発見が存在した。
【００２４】
本発明の化合物は、それらが全身性循環及び正常組織において高い安定性、すなわち活性治療剤の低レベルの放出を示すので、良好なプロドラッグである。本発明のペプチドは、血液又は正常組織において高い程度に活性化されないが、腫瘍部位では活性化される。従って、それらは、改良された治療指数、改良された毒物学的プロフィール及び好ましい薬動力学を有する。
特定の理論に制限されないが、そのようなイソロイシン−含有プロドラッグは、トロウアーゼ型酵素以外の酵素により、標的細胞付近で活性化されると思われる。従って、そのようなイソロイシン−含有プロドラッグの創造は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３９３号に示される方法とは別のプロドラッグ企画方法を提供する。
【００２５】
本明細書に記載されるように、本発明の化合物は、
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、トロウアーゼ、例えばＴＯＰ（下記に詳細に記載される）により分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
【００２６】
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物が、標的細胞と関連するＴＯＰ以外の酵素により分解できることを特徴。前記化合物は好ましくは、トロウアーゼ、特にＴＯＰによる分解に対して耐性であり、すなわち生理学的条件下での分解に対して耐性であるオリゴペプチドを含む。トロウアーゼにより分解できない任意に存在するリンカー基は、生理学的条件下で分解できない。
【００２７】
この論議のためには、化合物は、所定の酵素の精製された調製物による分解速度が興味ある化合物と同じ治療剤にカルボキシ末端を通して接合されるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕの分解速度の１５％以下、好ましくは５％以下、及び理想的には１％以下である場合、所定の酵素による分解に対して耐性である。前記速度は、同じアッセイ条件下で比較されるべきである。
化合物は、１０％／時以上、好ましくは５０％／時以上が、化合物及び酵素の混合物により、生理学的条件、特に標的細胞の外部の条件を表す実験条件下で分解される場合、所定の酵素により分解できる。実験におけるその所定の酵素の濃度は、標的組織の細胞外環境下でのその所定の酵素の濃度の代表である。
【００２８】
標的細胞関連酵素：
本発明のプロドラッグは、患者の身体内での標的化される部位で又はその近くで、標的細胞に関連する酵素との相互作用を通して、選択的活性化を利用するよう企画される。本発明の化合物の分解を担当するとは思われないが、たぶん標的細胞に関連する１つのそのような型の酵素又はそのような種類の酵素は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３９３号により詳細に記載されるトロウアーゼである。トロウアーゼは、ある種の酵素であると思われ、この中で、チメット（Ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ（“ＴＯＰ”）は１つのメンバーである。
【００２９】
トロウアーゼは、それらの選択性及び分解において高く区別できる。トロウアーゼは、オリゴペプチド分解部位のカルボキシ側でのロイシンとイソロイシンとの間の著しい程度の区別を示す種類のエンドペプチダーゼである。適切なアッセイ条件下で、トロウアーゼはスクシニル−βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンを容易に分解するが、しかしそれは、スクシニル−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンとは、少なくとも２０倍低い活性を有することを特徴とする。
【００３０】
トロウアーゼにより分解される配列の知識が治療的に有用なプロドラッグの企画のために使用され得るが、前のさほど好ましくないイソロイシン−含有ペプチド配列は、プロドラッグを企画するための予想外に有用な他のペプチドを提供する。トロウアーゼのＰ１分解部位（本明細書に記載される典型的なオリゴペプチドにおけるＡＡ３位置に等しい）でのイソロイシンの存在は、トロウアーゼによるペプチドの分解を妨げるか又は非常に最少にすることが示されている。そのような阻害は、部分的に精製されたトロウアーゼ及び精製されたＴＯＰをインビトロで用いて、及び正常マウスによるインビボ代謝研究を用いて示された。
【００３１】
本発明のプロドラッグの活性化に包含される酵素は、標的細胞により結合されると思われるが、しかし非常に低いレベルでのみ循環に見出される。たぶん、それは、標的細胞自体により、又は標的細胞により結合される正常細胞、例えば、基質細胞、好中球、マクロファージ又はＢ細胞により生成される。その結果、例えば、トロウアーゼは、細胞外表面により結合されるか、又はその表面（少なくとも活性部位）上に結合され、分泌され、開放され、又は標的細胞の細胞外付近に他の態様で存在することができる。多くの場合、本発明のプロドラッグは、癌の処理のための治療剤を含み、そして標的細胞は腫瘍細胞である。従って、酵素は腫瘍細胞により細胞外に分泌され得、又はそれは、一般的には、腫瘍により結合されるかなりの量の細胞溶解物が存在するので、細胞外に存在することができる。
【００３２】
トロウアーゼ及び特にＴＯＰ酵素による分解の欠失にもかかわらず、インビボ研究は、トロウアーゼＰ１分解位置にイソロイシンを有する化合物が、腫瘍増殖速度を遅め、そしてヒト腫瘍異種移植片を移植されたヌードマウスの生存性を延長することにおいて効果的であることを示した。この発見は、腫瘍又は他の標的細胞内での治療剤、通常細胞毒性剤の活性部分の放出を、結果的に導く工程を開始するために、イソロイシン−包含プロドラッグ化合物を分解できる１又は複数の酵素が腫瘍担持の動物に存在することを示す。イソロイシン−含有ペプチドを分解する酵素は、広範囲の種類の正常細胞及び細胞型、並びにヒト癌細胞に存在するＴＯＰよりもより一層、腫瘍−特異的であり得る。従って、プロドラッグのオリゴペプチド部分内での重要な位置にイソロイシンを有するプロドラッグの企画は、トロウアーゼ及び／又はＴＯＰにより分解できる、以前に開示された化合物にとって好ましい。
【００３３】
安定化基：
プロドラッグの重要な部分は、プロドラグが患者に投与される場合、循還血液におけるプロドラッグ化合物の分解を保護するよう作用し、そして比較的損なわれていない標的細胞の付近へのプロドラッグの到達を可能にする安定化基である。安定化基は典型的には、血液、血清及び正常組織に存在するプロテイナーゼ及びペプチダーゼによるプロドラッグの分解を保護する。特に、安定化基はオリゴペプチドのＮ−末端をキャップし、そして従って、時々、Ｎ−キャップ又はＮ−ブロックとして言及されるので、それは、他方では、プロドラッグが敏感であるペプチダーゼに対して保護するよう作用する。
【００３４】
理想的には、安定化基は、それが、ヒト血液において３７℃で２時間のプロドラッグ化合物の貯蔵により試験される場合、変性、すなわち分解からプロドラッグを保護するよう作用し、そして所定のアッセイ条件下で、ヒト血液に存在する酵素によるプロドラッグの分解を、２０％以下、好ましくは２％以下もたらす場合、本発明のプロドラッグにおいて有用である。
従って、十分に形成された接合体は、それが全血において安定するかどうかを見るために素見され得る。
【００３５】
より特定には、全血に存在する酵素によるオリゴペプチドの分解を妨げる安定化基は、好都合には、次のものから選択される：
（１）アミノ酸以外、又は
（２）（ｉ）非遺伝的にコードされるアミノ酸、又は（ｉｉ）アスパラギン酸のβ−カルボキシル基又はグルタミン酸のγ−カルボキシル基で、オリゴペプチドのＮ−末端に結合されるアスパラギン酸又はグルタミン酸。
【００３６】
例えば、ジカルボン酸（又は高級カルボン酸）又は医薬的に許容できるその塩が、安定化基として使用され得る。複数のカルボン酸を有する化学基はまだ、安定化基として使用され得る。複数のカルボン酸を有する化学基がまた、プロドラッグの一部として許容されるので、ジカルボン酸（又は高級カルボン酸）を有する末端基は、典型的なＮ−キャップである。従って、Ｎ−キャップは、アミドがペプチドのアミノ末端に結合され、そして残るカルボン酸が遊離し、そして結合されていない、複数のカルボン酸を有する化学基のモノアミド誘導体であり得る。
【００３７】
このためには、Ｎ−キャップは好ましくは、琥珀酸、アジピン酸、グルタミン酸又はフタル酸であり、そして琥珀酸が最も好ましい。本発明のプロドラッグ化合物において有用なＮ−キャップの他の例は、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピログルタミン酸、酢酸、１−又は２−ナフチルカルボン酸、１，８−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシ桂皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、４−カルボキシフェニルホウ素酸、（ＰＥＧ）ｎ−類似体、例えばポリエチレングルコール酸、ブタンジスルホン酸、マレイン酸、イソニペコチン酸及びニペコチン酸を包含する。
【００３８】
さらに、非遺伝的にコードされるアミノ酸、例えば次のものの１つがまた、安定化基としても使用され得る：β−アラニン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２−チエニルアラニン、２−ナフチルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−アミノメチル安息香酸及びアミノイソ酪酸。
さらに、いくつかの実験においては、マウスにおける凝集する正に荷電されたプロドラッグの静脈内投与は、急性毒性をもたらした。しかしながら、そのような毒性は、このプロドラッグ上の荷電が、負に荷電された安定化基による誘導体化により逆転される場合、観察されなかった。
【００３９】
多くの細胞毒性化合物は本来、低い溶解性を有する。例えば、正に荷電されたアントラサイクリンは、高濃度で凝集体を形成し、そしてそれらの凝集体は、静脈内投与される場合、静脈内凝固を誘発する。多くのペプチドは生理学的ｐＨで、暴露される正に荷電されたアミノ末端を有するので、それらの凝集体はインビボで、多陽性的に荷電された表面を形成し、そして投与の数分以内で、凝固カスケード及び死を誘発する。これは、凝集体を形成する正に荷電されたプロドラッグを、治療使用のために不適切にしるための可能性を有する。
【００４０】
ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３９３号により詳細に記載されるように、そのような可能性ある危険な障害と取り組む１つの手段は、負に荷電されるか、又は中性の官能価のペプチド鎖Ｎ−末端上に安定化基を使用することである。例えば、プロドラッグ上での安定化基としてのスクシニルの使用は、プロドラッグの急性毒性を緩和する。安定化基は、化合物と血管の内面をおおう内皮細胞との間の相互作用を低める。これは、ヒトにおける静脈内使用のための実質的な治療剤としてのペプチドプロドラッグの使用における重要な問題を解決する。
【００４１】
オリゴペプチド：
オリゴペプチドは一般的に、短い長さの、典型的には２０個又はそれよりも少ないポリペプチドとして定義される。本発明のプロドラッグにおいて有用なオリゴペプチドは、３又は４個の長さのアミノ酸である。しかしながら、より長い長さのオリゴペプチドもまた、可能である。
【００４２】
番号付けスキーム：
本発明によれば、プロドラッグのオリゴペプチド部分は、式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］を有する。
【００４３】
オリゴペプチドは、右側でカルボキシル末端及び左側でアミノ末端を伴なって、従来の態様で書かれる。標的細胞により結合される酵素は、オリゴペプチドのＡＡ１とＡＡ２との間の結合を分解すると思われる。特にことわらない限り、すべてのアミノ酸はＬ形状で存在する。常にイソロイシンである、ＡＡ３でのアミノ酸を除いて、いずれのアミノ酸でも、プロドラッグのオリゴペプチド部分に存在することができるが、一定のアミノ酸が好ましい。
【００４４】
オリゴペプチド部分のＡＡ４位置においては、非遺伝的にコードされるアミノ酸、例えば次のアミノ酸の１つが最も好ましくは存在する：β−アラニン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２−チエニルアラニン、２−ナフチルアラニン、アラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、３−アミノ−４，４−ジフェニル酪酸、又はプロリン。ＡＡ４位置においては、アミノ酪酸、４−アミノメチル安息香酸、又はテトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸がまた、可能である。
本発明のプロドラッグのオリゴペプチド部分のＡＡ３は、イソロイシンである。
【００４５】
最も好ましくは、プロドラッグのオリゴペプチド部分のＡＡ２位置においては、次のアミノ酸の１つが存在する：アラニン、ロイシン、グリシン、セリン、チロシン、３−ピリジルアラニン、２−チエニルアラニン又はＮ−メチル−アラニン。ＡＡ２部分におけるアミノ酸はまた、アミノ酪酸、トレオニン又はフェニルアラニンから選択され得る。
ＡＡ１位置に存在するアミノ酸は最も好ましくは、次の１つから選択される：ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシンアラニン、グリシン、チロシン、２−ナフチルアラニン、セリン又はプロリン。β−アラニンがまた、ＡＡ１位置に好ましい。
【００４６】
本発明のプロドラッグにおいて有用なオリゴペプチドは、図１０に示されるそれらのもの、特にβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（配列番号１）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ（配列番号２）；Ｔｉｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号３）；Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号４）；Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号５）；Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号６）；Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号７）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号８）；Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号９）；Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号１０）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号１１）；Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号１２）；Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号１３）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１４）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号１５）；Ｔｉｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１６）；Ｔｈｉ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１７）；Ｎａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１８）；
【００４７】
βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１９）；Ａｍｂ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号２０）；Ａｉｂ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号２１）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ（配列番号２２）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ（配列番号２３）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号２４）；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２５）；Ｉｌｅ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号２６）；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ（配列番号２７）；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ（配列番号２８）；Ｉｌｅ−Ａｉｂ−Ｌｅｕ（配列番号２９）；Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号３０）；Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（配列番号３１）；Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号３２）；Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ（配列番号３３）；Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３４）；βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号３５）；及びβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ（配列番号３６）を包含する。
【００４８】
治療剤：
本発明に従ってプロドラッグに変性するために特に好都合である治療剤は、狭い治療窓を有するそれらの剤である。狭い治療窓を有する薬剤又は治療剤は、その毒性が一般的な医学的基準により明らかである用量が、効能が明らかである用量に非常に接近するものである。
【００４９】
本発明のプロドラッグを形成するために、安定化基及びオリゴペプチド、及び任意には、リンカー基に接合される治療剤は、癌、炎症性疾患、又はいくつかの他の医学的状態の処理のために有用であり得る。好ましくは、治療剤は、次の種類の成分から選択される：アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン種類の薬物、タキサン、アントラサイクリン、ドラスタチン、トポイソメラーゼインヒビター、白金錯体化学療法剤及びマイタニソイド。
【００５０】
特に、治療剤は、好都合には、次の化合物又はその誘導体又は類似体から選択される：ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリケアミシン、エトポシド、エトポシドホスフェート、ＣＣ−１０６５、ズオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、メトトレキセート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキセート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、ドラスタチン１０、ドラスタチン１１、ドラスタチン１５、トポテカン、カンフォテシン、
【００５１】
マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロポリンＡ、及びメイタンシン。誘導体とは、命名された化合物ともう１つの化学的成分との反応に起因し、そして前記命名された化合物の医薬的に許容できる塩、酸、塩基又はエステルを包含する化合物を意味する。類似体とは、前記命名された化合物に類似する構造及び機能性質、例えば生物学的活性を有する化合物を意味する。
【００５２】
リンカー基：
オリゴペプチドと治療剤との間のリンカー基は、例えば次のような理由のために好都合であり得る：
１．ＡＡ１アミノ酸の酵素的開放又は他の酵素的活性化段階を促進するために立体的な考慮のためのスペーサーとして；
２．治療剤とオリゴペプチドとの間に適切な結合化学を提供するために；
３．プロドラッグ接合体を製造する合成方法を改良するために（例えば、収率又は特異性を増強するために、接合の前、リンカー基により治療剤又はオリゴペプチドを予備誘導体化することによって）；
４．プロドラッグの物性を改良するために；
５．薬剤の細胞内開放のための追加の機構を提供するために。
【００５３】
リンカー構造は、必要とされる官能性により指図される。可能性あるリンカー化学の例は、ヒドラジド、エステル、エーテル及びスルフヒドリルである。アミノカプロン酸は、二官能価リンカー基の例である。アミノカプロン酸がリンカー基に使用される場合、それは、オリゴペプチドの番号付けスキームにおいてアミノ酸として数えられない。
任意に存在するリンカー基は、ＴＯＰにより分解できず、すなわちそれは、生理学的条件下でＴＯＰにより分解できない。
【００５４】
プロドラッグの設計：
プロドラッグの企画方法は、本発明のもう１つの観点であり、そして上記に記載されるように、最初に、オリゴペプチドの同定を必要とする。次に、オリゴペプチドが、そのオリゴペプチドの第１の結合部位で、安全な血液に存在する酵素によるオリゴペプチド分解を妨げる安定化基に結合され、そしてオリゴペプチドの第２の結合部位で治療剤に直接的に又は間接的に結合される。治療剤及び安定化基へのオリゴペプチドの結合は、いずれの順序でも又は同時にでも行われ得る。その得られる接合体は、ＴＯＰによる分解性について試験される。ＴＯＰによる分解性に対する耐性の試験化合物が選択される。得られる接合体はまた、全血における安定性について試験され得る。全血において安定する試験化合物が選択される。
【００５５】
第１の結合部位は通常、オリゴペプチドのＮ末端であるが、しかしオリゴペプチドのＣ末端、又はオリゴペプチドのもう１つの部分でもあり得る。第２の結合部位は通常、オリゴペプチドのＣ末端であるが、しかしオリゴペプチドのＮ末端又はオリゴペプチドのもう１つの部分でもあり得る。そのような方法により企画されるプロドラッグはまた、本発明の一部である。
【００５６】
さらに、本発明は、患者への投与のために意図される治療剤の毒性を低めるための方法を包含する。特に、治療剤の変性されたプロドラッグ形は、トロウアーゼにより分解できるか、又はより特定には、トロウアーゼによる分解に対して耐性のオリゴペプチド、又はより特定には、ＴＯＰによる分解に対して耐性のオリゴペプチドに治療剤を直接的に又は間接的に結合することによって形成される。オリゴペプチドはまた、安定化基にも結合される。このようにして形成されるプロドラッグは、患者に投与される場合、治療剤の低められた毒性を提供する。この態様での治療剤の変性はまた、接合されていない形での治療剤の用量に対して、患者への治療剤の高められた用量の投与を可能にする。
【００５７】
医薬組成物：
本発明はまた、本発明の化合物、特にプロドラッグ化合物、及び任意には、医薬的に許容できるキャリヤー、例えば、アジュバント又はビークル、又は同様のものを含んで成る医薬組成物を包含する。
本発明はまた、医薬的状態の処理のために指図される医薬製品の調製のためへの前記医薬組成物の使用にも関する。
【００５８】
例えば、医薬組成物は、患者に非経口、特に静脈内、筋肉内又は腹腔内投与され得る。非経口投与のための本発明の医薬組成物は、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液又はエマルジョンを包含する。医薬的に許容できる溶媒又はビールとして、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、注射できる有機エステル、例えばエチルオレエート、又はシクロデキストリンが使用され得る。等張塩溶液は、医薬組成物の一部であり得る。それらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び／又は分散剤を含むことができる。
【００５９】
殺菌は、いくつかの手段で、例えば細菌学的フィルターを用いて、組成物に殺菌剤を導入することにより、又は照射により行われ得る。それらはまた、無菌水又はいずれか他の無菌の注射用媒体への使用の時点で溶解され得る無菌の固体組成物の形で調製され得る。
医薬組成物はまた、当業界において良く知られており、そしてそれらが投与される医学的状態の処理を改良し、そして延長するために、本発明の化合物を組合して使用され得るアジュバント（例えば、ビタミンＣ、輪後酸、酸化防止剤、等）を含んで成る。
【００６０】
本発明の化合物の患者への投与のための用量は一般的に、Ｂｒｕｃｅ Ａ． Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｅｄ．， ＩＳＢＮ ０−３９７−５０９００−６ （１９９０） に記載される、当業界において知られている治療剤の少なくとも通常の用量であり、又はそれらは、プロドラッグ製剤の卓越した有効性、又は処理される患者の特定の環境を適合するために、処理する医者の判断内で調節され得る。従って、投与される用量は、本発明の化合物の調製のために使用される治療剤に従って変化する。
【００６１】
プロドラッグ化合物による処理：
治療的有効用量の医薬組成物を患者に、特に非経口及びより好ましくは静脈内投与することを包含する、医薬的状態の治療的処理のための方法はまた、本発明の範囲内である。従って、前記方法は一般的に、治療的有効量の
（１）標的細胞に導入できる治療剤、
（２）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
【００６２】
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（３）安定化基、及び
（４）任意には、トロウアーゼにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
【００６３】
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位で前記治療剤に直接的に結合されるか、又は治療剤に前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物がトロウアーゼにより分解できることを特徴とする化合物を、前記患者に投与することを包含する。
【００６４】
プロドラッグ化合物は、多くの医学的状態、例えば癌、新形成性疾患、腫瘍、炎症性患者及び感染性疾患の処理のために有用である。好ましくは疾病の例は、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌及び膵臓癌である。医薬的に許容できるビークル（例えば、等張塩溶液）に配合されるプロドラッグ化合物は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／用量／日〜３００ｍｇ／ｋｇ／用量／日の範囲の静脈内用量で動物又はヒトに投与され得る。それはまた、静脈内点滴又は他の遅い注入方法を通して投与され得る。
ヒト患者は本発明のプロドラッグの通常の受容体であるが、但し獣医学的使用もまた企画される。
【００６５】
診断又はアッセイ：
診断又はアッセイのために製品、例えばキットはまた、本発明の範囲内である。そのような製品は好ましくは、上記のような化合物を使用するが、但し、マーカー例えばクマリンが治療剤の代わりにオリゴペプチド及び安定化基に接合されている。マーカーは、オリゴペプチドに接合され得、そして当業界において知られているいずれかの方法により容易に検出できるいずれかの成分を意味する。マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬が典型的には、キットの一部として包含される。
【００６６】
従って、製品は、次のものを包含する：
（１）（ａ）マーカー、
（ｂ）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチド、
（ｃ）安定化基、及び
（ｄ）任意には、ＴＯＰにより分解できないリンカー基を含んで成る化合物であって、
【００６７】
ここで前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第１の結合部位で前記安定化基に直接的に結合され、そして前記オリゴペプチドは、このオリゴペプチドの第２結合部位でマーカーに直接的に結合されるか、又はマーカーに前記リンカー基を通して間接的に結合され、
前記安定化基は全血に存在する酵素により前記化合物の分解を妨げ、そして
前記化合物が、標的細胞と関連するＴＯＰ以外の酵素により分解でき、そしてさらに、ＴＯＰによる分解に対して耐性であることを特徴とする化合物、及び
【００６８】
（２）任意には、前記マーカーの検出において有用な少なくとも１つの試薬。前記化合物は好ましくは、トロウアーゼ、特にＴＯＰによる分解に対して耐性である。前記製品は、例えば、腫瘍を診断するために、又はプロドラッグ療法による処理に対して敏感な患者を同定するために患者サンプルより使用され得る。
【００６９】
加工化学の一般的方法：
オリゴペプチド：ペプチドの合成のための一般的方法：
本発明のプロドラッグ接合体におけるペプチド又はオリゴペプチド配列は、固相ペプチド合成（Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学のいずれかを用いて）方法により、又は溶液相合成により合成され得る。一般的なＢｏｃ及びＦｍｏｃ方法は広く使用され、そして次の文献に記載されている：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８８： ２１４８ （１９６３）； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ａｎｄ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｔｈｅ Ｐｒｅｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｙ， Ｂｅｒｌｉｎ， ７−１６１ （１９９４）； Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｒｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， （１９８４）。
【００７０】
一般的なＦｍｏｃ固相方法：
好ましい固相合成方法（自動又は手動）を用いて、所望する長さ及び配列のペプチドが、固体樹脂に結合される成長する鎖へのアミノ酸の段階的付加を通して合成される。有用なＦｍｏｃ　適合性樹脂の例は、Ｗａｎｇ樹脂、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡ樹脂、Ｒｉｎｋ酸樹脂又はヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ペプチド鎖のＣ末端はポリマー樹脂に共有結合され、そして保護されたα−アミノ酸が、カップリング試薬と共に段階的態様で添加された。好ましいα−アミノ保護基は、カップリング条件に対して安定し、そして軽いアルカリ性条件下で容易に除去され得るＦｍｏｃ基である。反応溶媒は好ましくは、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＥｔＯＨであるが、しかしそれらだけには限定されない。
【００７１】
カップリング剤の例は、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵである。Ｎ−末端保護基の分解は、０〜４０℃でＤＭＦ中、１０〜１００％のピペリジンにおいて達成され、そして温度は周囲温度が好ましい。合成の最後で、最終Ｆｍｏｃ保護基が、上記Ｎ−末端分解方法を用いて除去される。樹脂上の残るペプチドは、酸性条件下で樹脂を処理することによって、いずれかの酸感受性側鎖保護基と共に樹脂から分解される。例えば、酸性分解条件は、ジクロロメタン中、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合物である。ヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂が使用される場合、分解を誘発するための適切な波長は、λ３６５ｎｍの紫外線である。この工程の図示は、図３に与えられる。
【００７２】
固相合成を通しての一般的Ｎ−キャップ方法：
Ｎ−末端誘導体化されたペプチドの調製は便利には、固相上で達成される。ペプチド合成が完結する場合、末端Ｆｍｏｃが除去され、そしてペプチドはまだ、固体支持体上に存在する。次に、選択のＮ−キャップが、ペプチドのＮ−末端上に、標準のペプチドカップリング条件を用いてカップリングされる。Ｎ−キャップのカップリングの完結に基づいて、ペプチドが、上記方法を用いて、樹脂から分解される。
【００７３】
一般的なＢｏｃ固相方法：
Ｂｏｃ化学を用いての固相方法に関しては、Ｍｅｒｒｉｖｉｅｌｄ樹脂又はＰＡＭ樹脂が有用である。アミノ酸は、カップリング剤により活性化されたＢｏｃ−保護されたアミノ酸の連続的付加により、固相上の成長鎖にカップリングされる。カップリング剤の例は、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵである。反応溶媒は、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びＮＭＰであり得る。Ｂｏｃ保護基の分解は、０〜４０℃で、ＤＣＭ中、１０〜１００％のＴＦＡにおいて達成され、温度に関しては、周囲温度が好ましい。ペプチド鎖アセンブリーの完結に基づいて、Ｎ末端保護基（通常、Ｂｏｃ）が上記のようにして除去される。ペプチドは、ジクロロメタン中、液体ＨＦ又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて、樹脂から除去される。
【００７４】
溶液相合成によるＦｍｏｃオリゴペプチドの一般的調製方法：
他方では、プロドラッグペプチド中間体は、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学を用いて、溶液相合成を通して製造され得る。この方法の図示（図４）においては、Ｃ−末端Ｌｅｕテトラペプチドが一般的に例として使用されるが、しかし類似する反応が他のＣ−末端テトラペプチドにより行われ得ることが理解されるであろう。このペプチドは、固相方法に類似する段階的アセンブリー（Ｎ−末端方向又はＣ−末端方向に）により、又は単一のアミノ酸による２種の適切に保護されたジペプチド又はトリペプチドのカップリングを通して増大され得る。
【００７５】
溶液相合成の１つの方法は、図４に示される、Ｆｍｏｃ化学を用いてのプロドラッグペプチド中間体の段階的増大である。そのＣ−末端は、副生成物の形成を低めるために保護されるべきである。図４におけるＣ−末端Ｒ基は、Ｍｅ， ｔＢｕ， ベンジル又はＴＣＥである。（Ｎ−キャプがメチルスクシニルである場合、Ｃ−末端Ｒ基はメチルであり得ないことを注意すること。）ＤＭＦは溶媒として与えられるが、他の溶媒、例えばＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ又はＮＭＰ（又はそれらの混合物）がそれと置換され得る。
【００７６】
ピリジン、Ｅｔ３Ｎ又は他の塩基が成長するペプチド鎖保護のアミノ末端の保護解除において、ピペリジンにより置換され得る。同様に、ＨＢＴＵは活性剤として上記図に与えられるが、他の活性剤、例えばＤＣＣ、ＤＩＣ、ＤＣＣ＋ＨＯＢｔ、Ｏｓｕ、活性化されたエステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジドが使用され得る。さらに、保護されたペプチド酸クロライド又は酸ブロミドが、アミノ酸又はペプチドフラグメントに直接的にカップリングするために使用され得る。オリゴペプチドアセンブリーの完結に基づいて、Ｎ−末端保護解除された及びＣ−末端保護されたペプチドは所望するＮ−キャップに容易に受容される。
【００７７】
溶液相合成を通してのＮ−キャップオリゴペプチドの一般的調製方法：
溶液相合成により、Ｎ−キャップされたオリゴペプチドを構成する場合、Ｎ−キャップはわずかに改良された方法により合成される必要がある（図４）。最初に、ＦｍｏｃオリゴペプチドのＣ−末端は、Ｎ−キャップ上のＣ−末端の選択的保護解除に適合できる、酸不安定性又は水素化感受性保護基により保護される必要がある。次に、Ｆｍｏｃ保護基は、Ｎ−末端を表すためにオリゴペプチドから除去される必要がある。保護解除されたＮ−末端及び保護されたＣ−末端を有するオリゴペプチドは、所望するＮ−キャップの活性化されたヘミエステルと反応せしめられる。
【００７８】
Ｎ−キャップは、塩基及び適切な溶媒においてアミノ酸、例えばＤＣＣ又はＨＡＴＵを活性化するための方法を用いて活性化され得る。他方では、メチル−ヘミスクシネートが使用される場合、カップリングはまた、有機又は無機塩基、例えばＤＩＥＡ、トリエチルアミン又はＣｓ２ＣＯ３の存在下で不活性溶媒を用いて、メチルヘミスクシニルクロライド（又は他の酸ハロゲン化物）（図４）を通して行われ得る。そのような合成の１つの例は、メチル−ヘミスクシネート及びβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕベンジルエステルを反応することによってであり得る。
【００７９】
カップリング方法は、一般的に当業界において使用される方法のいずれか１つの方法であり得る（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ．， Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １８５ （１９８４）； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １５９ （１９８４） を参照のこと）。次に、ベンジル基が、オリゴペプチドＮｏ８の所望するＮ−キャップメチル−スクシニル形を提供する触媒水素化により除去され得る。適切な、選択的に除去できるＣ−末端保護基の他の例は、ｔＢｕ、アルコキシ−メチル及びＴＣＥであり得るが、但しそれらだけには限定されない。この段階を達成するための他の方法は、文献に記載される。
【００８０】
上記方法のいずれかの組合せ、例えばジ−又はトリペプチドの“フラグメントの縮重”が、考慮され得る。反応条件は、当業界において良く知られており、そして与えられる引例に記載される。上記方法の利点は、溶液相合成により生成される生成物の容易な精製である。
【００８１】
プロドラッグ接合体：
接合及び保護解除段階のための一般的方法：
本明細書に記載されるオリゴペプチド−治療剤のＮ−キャップ形は、ペプチド合成に使用される標準の活性化試薬のいずれかを用いて、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はいずれかの適切な治療剤によりオリゴペプチドのＦｍｏｃ形（ＦｍｏｃがオリゴペプチドのＮ−末端に結合されることを意味する）をカップリングすることにより合成され得る（図５）。溶媒は、トルエン、酢酸エチル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ、ＮＭＰ、ＴＨＦ、ＤＣＭ又は当業界において知られているようないずれかの他の不活性溶媒であり得、そして試薬はそこに溶解できる。
【００８２】
好ましい溶媒は、ＤＭＦ及びＮＭＰである。適切な温度範囲は−２５〜＋２５℃であり、そして周囲温度が好ましい。活性化剤は、次のものの１つから選択され得る：ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＥＤＣ、ＤＩＣ、ＤＣＣ、ＤＣＣ＋ＨＯＢＴ、ＯＳｕ、活性化されたエステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジド。ＨＢＴＵ又はＨＡＴＵが好ましい活性化剤である。他方では、保護されたペプチドの酸クロライド又は酸ブロミドがまた、このカップリング反応のために使用され得る。２〜４当量、好都合には２〜２．５当量の塩基が、カップリング反応のために必要とされる。
【００８３】
塩基は、無機塩基、例えばＣｓＣＯ３、Ｎａ２又はＫ２ＣＯ３、又は有機塩基、例えばＴＥＡ、ＤＩＥＡ、ＤＢＵ、ＤＢＮ、ＤＢＯ、ピリジン、置換されたピリジン、Ｎ−メチル−モルホリン、等、好ましくはＴＥＡ又はＤＩＥＡから選択され得る。反応は、−１５°〜５０℃、好都合には−１０℃〜１０℃の温度で行われ得る。反応時間は、５〜９０分であり、そして好都合には、２０〜４０分である。生成物は、反応混合物を水中に注ぎ、そして形成される沈殿物を濾過することによって単離される。粗生成物は、ＤＣＭ、ＴＨＦ、酢酸エチル、又はアセトニトリル、好ましくはジクロロメタン又はアセトニトリルからの再結晶化により、さらに精製され得る。
【００８４】
次に、オリゴペプチド治療剤接合体の単離されたＦｍｏｃ形が、１０〜１００倍過剰の塩基を用いて、−１０〜５０℃の温度で、２〜９０分間、好ましくは３〜８分間、保護解除される。理想的には、５〜６０当量の塩基が好ましい。ピペチジンは、Ｆｍｏｃ基を保護解除するための好ましい塩基である。オリゴペプチド治療剤接合体の保護解除されたアミノ末端は、オリゴペプチド−治療剤の最終Ｎ−キャップ形を得るために、無水二酸により、又は半保護され、活性化された無水二酸（すなわち、続いて保護解除されるモノエステル）によりアシル化される。
【００８５】
他方では、最終プロドラッグは、オリゴペプチドの保護されたＮ−キャップ形、例えばスクシニル−Ｎ−キャップオリゴペプチドのメチル−ヘミエステルから同様にして調製され、そして治療剤に接合され得る。この方法は図６に例示される。
保護されたＮ−キャップ−オリゴペプチド治療剤は、治療剤の安定性に適合できる方法により保護解除される。例えば、アントラサイクリンは、メチル基により保護され、そしてエステラーゼにより保護解除され得る。他の治療剤に関しては、ベンジル保護基及び触媒水素化が保護解除するために選択され得る。
【００８６】
負に荷電されたＮ−キャップオリゴペプチド治療剤の塩形は、次の群から選択された溶媒により行われ得る：アルコール（例えば、メタノール、エタノール又はイソプロパノール）、水、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジグリメ（ｄｉｇｌｙｍｅ）又は他の極性溶媒。ナトリウム源は、１モル当量のＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＯＡｃ、ＮａＯＣＨ３（一般的に、ナトリウムアルコキシド）又はＮａＨである。Ｎａ＋（例えば、強い又は弱いイオン交換体）により荷電されたイオン交換カラムはまた、適切な場合、Ｎ−キャップオリゴペプチド治療剤の塩形を製造するこの最後の段階のためにも有用である。ナトリウムは、単に例として記載される。
【００８７】
一般的に、プロドラッグは、そのプロドラッグの溶解性を改良するために、医薬的に許容できる塩形に転換され得る。Ｎ−キャップ−オリゴペプチド治療剤は、医薬的に許容できる塩、例えばＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＯＨ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ、ＣＨ３ＮＨ２、（ＣＨ３）２ＮＨ、（ＣＨ３）３Ｎ、アセチルトリエチルアンモニウムにより中和される。プロドラッグの好ましい塩形は、ナトリウムであり、そして好ましい中和化塩はＮａＨＣＯ３である。
【００８８】
アントラサイクリン型分子、例えばドキソルビシン及びダウノルビジンが、非常に低い濃度で有機溶媒においてゲルを形成することは記載されている（Ｍａｔｚａｎｋｅなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０７： ７４７−５５ （１９９２）； Ｃｈａｉｒｅｓ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１： ３９２７−３２（１９８２）；Ｈａｙａｋａｗａなど．， Ｃｈｅｍ． ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３９： １２８２−６ （１９９１）。これは、ペプチドアントラサイクリン接合体を製造する場合、高収率の汚染されていない生成物を得るためには相当の障害であり得る。ゲル形成は、所望しない副反応の形成に寄与する。
【００８９】
この問題を最少にするための１つの手段は、カップリング反応のために非常に希釈した溶液（１〜２％）を使用することであるが、しかしながらそれは工程の環境（多量の廃棄物、複雑な単離）において実際的でない。この問題を克服するためには、ウレア又は他のカオトロピック剤が、ゲルを形成する強い疎水性及び水素結合力を破壊するために使用され得る。従って、カップリング反応がウレア含有溶媒、好都合には、ＤＭＦ又はＮＭＰ中、ウレアの２０％〜飽和溶液において行われる場合、副反応は、反応の濃度が１０％を超える場合でさえ、２％以下に維持され得る。これは、高濃度での接合段階を実際的にし、そして良好な収率を生成する。
【００９０】
一般的な酵素方法：
酸又は塩基により触媒される十分なＮ−キャップ化合物への保護されたＮ−キャップ−オリゴペプチド治療剤の加水分解は、適度な酸性又は塩基性条件下でさえ、多くの治療剤の不安定性のために、複数な反応混合物を誘導する。酵素は基質又は生成物を破壊しないで、加水分解を促進することができる。この反応のために適切な酵素は、エステラーゼ又はリパーゼであり得、そしてそれらの性質的には、水溶性形で存在するか、又は交差カップリング又は結合により、市販の固体支持体材料に固定され得る。
【００９１】
評価される可溶性酵素のうち、カンジダ　アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が特に有用である。交差カップリングにより固定される酵素の例は、ＣｈｉｒｏＣＬＥＣ−ＰＣＴＭ （Ａｌｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ） である。カンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）は、ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）との反応により固定され得る。加水分解の間、その反応混合物のｐＨは、注意して調節され、そしてＮａＨＣＯ３溶液の調節された添加を通して、５．５〜７．５、好都合には５．７〜６．５のｐＨ−開始により維持される。反応が完結される場合、生成物は、濾過された反応混合物の凍結乾燥により単離される。固定された酵素は、フィルターケーク上に存続し、そして所望により、再使用され得る。
【００９２】
一般的なアリル又はアルキルエステル方法：
プロドラッグはまた、治療剤によりＮ−キャップオリゴペプチドのアリル−ヘミエステル又はアルキル−ヘミエステル形をカップリングし、そして接合体から遊離酸形を生成することにより調製され得る。図８は、スクシニル−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンによるこの工程を例示する。
【００９３】
ドキソルビシンによるアリル−スクシニル−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕのカップリングは、オリゴペプチド接合方法のいずれか１つの方法により行われ得る。アリル−スクシニル−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンはまた、ドキソルビシンへの保護されたテトラペプチド前駆体のカップリングが図５に示される前記方法に記載されるように、類似して、βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕと、既知方法（Ｃａｓｉｍｉｒなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３６： ３４０９ （１９９５））を通して調製されたアリルヘミスクシネートとを反応せしめることによって合成され得る。適切な不活性溶媒は、ＴＨＦ、ジクロロメタン、酢酸エチル、トルエン、好ましくは反応が進行するにつれて、生成物酸形が沈殿するＴＨＦである。単離された酸は、前記のようにして、そのナトリウム塩に転換される。反応時間は、０〜６０℃、好ましくは１５〜３０℃の温度で、１０〜１８０分、好都合には１０〜６０分である。
【００９４】
アリル又はアルキル基の除去は、当業界において良く知られており、そして専門文献に記録されているように、受容体分子へのアリル又はアルキル基のＰｄ（０）， 又はＮｉ（０）， 好都合にはＰｄ（０）促進された移行により行われ得る（Ｇｅｎｅｔなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ５０： ４９７ （１９９４）； Ｂｒｉｃｏｕｔ など．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ５４： １０７３ （１９９８）； Ｇｅｎｅｔなど．， Ｓｙｎｌｅｔｔ ６８０ （１９９３）； Ｗａｌｄｍａｎｎなど．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ７： ７４９ （１９９８）； Ｓｈａｐｈｉｒｏなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３５： ５４２１ （１９９４））。触媒の量は、基質に対して０．５〜２５モル％であり得る。
【００９５】
一般的なトリチル又は置換されたトリチル方法：
プロドラッグはまた、図７に示される方法により合成され得る。このアプローチは、Ｒ’−オリゴペプチド（ここで、Ｒ’はトリチル又は置換されたトリチルである）を利用する。治療剤によるＲ’−オリゴペプチドのカップリングは、治療剤による保護されたオリゴペプチドの接合についての前記方法のいずれか１つの方法により、０〜２０℃で３０〜１２０分間、行われ得る。
【００９６】
トリチル又は置換されたトリチル基の除去は、正に荷電されたプロドラッグを得るために、酸性条件下で達成され得る。この正に荷電されたプロドラッグは、図４に示され、そして前述のように、Ｎ−キャップされる。トリチル保護解除は、酢酸、蟻酸及び希塩酸により達成され得る。
プロドラッグは、無水琥珀酸又は無水グルタル酸との反応により、（スクシニル又はグルタリル）−オリゴペプチド−治療剤に転換され、次にさらに、いずれかの医薬的に許容できる塩に転換され得る。カップリング段階のための溶媒、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ、ＮＭＰ、又はいずれかの他の適切な溶媒は、当業界において知られている。
【００９７】
一般的な逆方向固相接合方法：
本発明のプロドラッグ化合物は、“段階的様式”の逆方向（Ｎ−末端からＣ−末端の方向）方法を通して、固相化学を用いることによって合成され得る。
１つの手段は、スクシニル−ヘミエステル、例えばスクシニル−ベンジルエステル又は−アリルエステルを固定するために樹脂を使用することである。選択される樹脂の例は、“Ｗａｎｇ樹脂”（Ｗｏｎｇ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， ９５： １３２８ （１９７３）； Ｚｈａｎｇなど．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３７： ５４５７ （１９９６））、“Ｒｉｎｋ樹脂”（Ｒｉｎｋ， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ２８： ３７８７ （１９８７））、“トリチル−、又は置換された−トリチル樹脂”（Ｃｈｅｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６： ２６１１ （１９９４）； Ｂａｒｔｏｓなど．， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐｒｏｃ． ２２ｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐａｓｉｕｍ （１９９２）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｅｂｅｒｌｅ （Ｅｄｓ．）， Ｅｓｃｏｍ Ｌｅｉｄｅｎ． Ｐｐ． ２８１ （１９９３））である。次に、固定されたエステルが保護解除され、そして例えば、同様にＣ−末端保護されたβ−アラニンと反応せしめられる。
【００９８】
次に、それらの段階が、イソロイシン、アラニン及び最終的にロイシンエステルにより反復され、続いて、固定されたスクシニル−テトラペプチドへのドキソルビシンのカップリングを行う。次に、分子が、遊離プロドラッグ、例えば、遊離Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを形成するために、軽い酸性条件を用いることによって樹脂から生成されるこの方法論は、図９のスキーム上に表される。もう１つのバージョンの相合成は、固定されたスクシニルオリゴペプチドエステルを用いる。次に、これがＣ−末端保護解除され、続いてドキソルビシン又は他の治療剤へのカップリング段階を伴ない、そして最終的に、図９のスキーム上に表されるように、樹脂から生成される。次に、プロドラッグ分子の酸形が最終的に、上記のようにして、そのナトリウム塩に転換され得る。
【００９９】
遊離治療剤の除去：
接合されていない治療剤は、プロドラッグの製造段階の後期に存在することができる。例えば、治療剤としてドキソルビシンを用いての（安定化基）−（オリゴペプチド）接合体のカップリング段階の間、多くの場合、反応は完全には進行しなかったことが見出された。カップリングされた生成物に残存する約２〜４％の残留ドキソルビシンが存在した。酸洗浄により生成物からドキソルビシンを完全に除去するために初期試みは、完全な除去をもたらさなかった。遊離治療剤の完全な除去は、スキャベンジング樹脂又はビーズを用いる、例２１及び図１７に概略される工程によりもたらされた。
【０１００】
中間体及び残留ドキソルビシンを含む粗生成物がＤＭＦに溶解され、そしてポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロライド樹脂又はビーズが添加された。反応は６０分間、撹拌された。ドキソルビシンの遊離アミノ基が、ウレア又はスルホンアミド誘導体を形成するために、ビーズ上のイソシアネート又はスルホニルクロライド基と反応する。次に、固体ビーズに結合されるドキソルビシンを有するそれらのビーズが、濾過により、所望の生成物から分離された。所望する生成物は、ＤＭＦ溶液に残存する。このアプローチは、生成物から残留治療剤を除去するための非常に穏かで且つ効果的な方法であると思われる。
【０１０１】
一般的な大規模化合物合成：
プロドラッグ化合物は、（１）アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を製造するために、活性化剤の存在下で、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴヌクレオチド及び治療剤をカップリングし、（２）前記カップリング段階の後に残存するカップリングされなかった治療剤を除去し、そして（３）安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を製造するために、前記アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を保護解除する、本発明の単純且つ効果的な３−段階方法を用いて合成され得る。
【０１０２】
第１段階は、治療剤へのアルキル−エステル保護されたオリゴペプチドフラグメントのカップリングを包含する。第１段階の好ましい態様は、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基オリゴペプチド治療剤接合体、例えばＭｅＯＳｕｅ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得るために、活性化剤、例えばＨＡＴＵを用いて、治療剤、例えばドキソルビシンによるアルキル又はアリルエステル保護された安定化基オリゴペプチド、例えばＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨのカップリングを包含する。
【０１０３】
この段階の焦点は、加水分解段階が純度に対して有意な影響を有さないことが見出されているので、メチルエステルの純度及びその収率に対してである。好ましくは、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基オリゴペプチド：治療剤のモル比は、２：１〜１：１の間であろう。より好ましくは、モル比は１．７５：１〜１．５：１である。最も好ましくは、モル比は１．６６：１である。
【０１０４】
アルキル又はアリルエステル保護された安定化基オリゴペプチド及び治療剤のカップリングは、（ａ）ＤＭＦにおいてアルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴペプチド及び治療剤を組合し、（ｂ）ＤＩＥＡを添加し、（ｃ）接合体を形成するために活性剤の存在下で、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基、オリゴペプチド及び治療剤を反応せしめ、そして（ｄ）沈殿物を形成するために、ブライン溶液を添加することによって前記接合体を沈殿することによって行われる。好ましくは、ＥＩＥＡ及びアルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチドのモル比は、３：１〜１．５：１である。
【０１０５】
より好ましくは、モル比は、２．５：１〜２：１である。最も好ましくは、モル比は２．１８：１である。反応段階は好ましくは、０℃で３０分間、行われる。好ましくは、活性化剤及びアルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチドのモル比は、１．５：１〜１：１である。より好ましくは、モル比は１．１：１である。前記ブライン溶液は、このましくは、水中、２０％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである。より好ましくは、前記ブライン溶液は、好ましくは、水中、２５％（ｗ／ｖ）〜３５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである。最も好ましくは、前記ブライン溶液は、水中、３０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌである。接合体は好ましくは、ブライン溶液において沈殿され、ここでｐＨは、５．０〜７．０である。最も好ましくは、接合体は、５．８〜６．０のｐＨで沈殿される。
【０１０６】
多くの治療剤は毒性物質であるので、カップリングされた生成物からいずれかの遊離治療剤を排除することが好ましい。除去段階は好ましくは、（ａ）ＤＭＦに前記接合体を溶解し、（ｂ）無水ＤＭＦにスキャベンジャー樹脂を溶解し、（ｃ）接合体−樹脂混合物を形成するために、前記スキャベンジャ−樹脂に、前記カップリング段階で形成される、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を添加し、（ｄ）前記混合物を、０℃〜３０℃で２〜２４時間、維持し、ここでカップリングされていない治療剤が前記樹脂と反応し、（ｅ）前記混合物から樹脂を除去し、そして（ｆ）アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体の沈殿物を形成するために、ブライン溶液を添加することによって前記残存物を沈殿せしめることによって行われる。
【０１０７】
好ましくは、スキャベンジャー樹脂は、ポリスチレン−イソシアネート（ＰＳ−イソシアネート）、ＰＳ−メチルイソシアネート、ＰＳ−チオイソシアネート、ＰＳ−メチルチオイソシアネート、ＰＳ−塩化スルホニル、ＰＳ塩化メチルスルホニル又はＰＳ−ベンズアルデヒドである。最も好ましくは、スキャベンジャー樹脂は、ＰＳ−イソシアネートである。除去段階は好ましくは、アントラサイクリンである遊離治療剤を除去するために行われる。
【０１０８】
第３段階は、好ましくは、少なくとも９０％の最終純度を伴なって良好な収率でプロドラッグ化合物を直接的に付与する、酵素による加水分解を通して、より好ましくはエステラーゼによる加水分解を通して、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を保護解除する。例えば、第３段階は、高い純度を伴なって定量的収率でＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのナトリウム塩を直接的に付与する、酵素、例えばＣＬＥＣ ＣＡＢ（架橋されたカンジダ　アンタルチカＢリポ−ゼ）による、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにおけるメチルエステル基の加水分解であり得る。
【０１０９】
酵素は好ましくは、固体支持体上に架橋されるか又は固定される。エステラーゼは、ブタ肝臓エステラーゼ、カンジダ　アンタルチカＢリパーゼ、カンジダ　ルゴサリパーゼ、シュードモナス　セパシアリパーゼ、セファロース上に固定されたブタ肝臓エステラーゼ、セファロース上に固定されたカンジダ　アンタルチカＢリパーゼ、ＣＬＥＣ−ＰＣＴＭ （シュードモナス セパシアリパーゼ）、ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（カンジダ　アンタルチカＢリパーゼ）又はＣＬＥＣ−ＣＲ（カンジダ　ルゴサリパーゼ）であり得る。
【０１１０】
酵素による加水分解を通しての保護解除は、（ａ）遊離酵素を除去するために前記酵素を洗浄し、（ｂ）前記洗浄された酵素を、アルキル又はアリルエステル保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体に添加し、（ｃ）前記安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を創造するために、前記酵素と前記接合体とを、１５℃〜４０℃で、５．０〜８．０のｐＨで、少なくとも１８時間、反応せしめ、そして（ｄ）前記プロドラッグ化合物から前記酵素を分離することにより行われる。最も好ましくは、追加の洗浄される、架橋されるか又は固定された酵素が、プロドラッグ化合物から酵素を分解する前、酵素と接合体とを反応せしめる段階の後に添加される。
【０１１１】
従って、本発明は、
（１）式 Ｆｍｏｃ−（ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるＦｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドを選択し、
【０１１２】
（２）Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、治療剤の存在下で活性化剤によりＦｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドを活性化することによって、治療剤に前記Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチドをカップリングし、
（３）オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、前記Ｆｍｏｃ−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を、それと塩基とを接触することによって保護解除し、そして
（４）化合物を形成するために、安定化基に前記オリゴペプチド−治療剤接合体をカップリングすることを含んで成る、化合物の製造方法を包含する。
【０１１３】
他方では、化合物の製造方法は、次の段階：
（１）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを選択し、
【０１１４】
（２）アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を形成するために、前記オリゴペプチドをアルキルエステル−保護された安定化基にカップリングし、
（３）アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を、治療剤の存在下で活性剤により活性化することによって、治療剤にアルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体をカップリングし、そして
（４）化合物を形成するために、前記アルキルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド治療剤接合体を保護解除する段階を含んで成る。
【０１１５】
本発明の化合物はまた、次の段階：
（１）式 （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるオリゴペプチドを選択し、
【０１１６】
（２）アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を形成するために、前記オリゴペプチドをアリルエステル−保護された安定化基にカップリングし、
（３）アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体を、治療剤の存在下で活性剤により活性化することによって、治療剤にアリルルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド接合体をカップリングし、そして
（４）化合物を形成するために、前記アリルエステル−保護された安定化基−オリゴペプチド治療剤接合体を保護解除する段階により製造される。
【０１１７】
本発明の化合物のさらにもう１つの製造方法は、次の段階：
（１）式トリチル− （ＡＡ）ｎ−ＡＡ３−ＡＡ２−ＡＡ１：
［式中、個々のＡＡは独立して、アミノ酸を表し、
ｎは、０又は１あり、そしてｎが１である場合、（ＡＡ）ｎはいずれかのアミノ酸を表すＡＡ４であり、
ＡＡ３は、イソロイシンを表し、
ＡＡ２は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
ＡＡ１は、いずれかのアミノ酸を表す］で表されるトリチル−保護されたオリゴペプチドを選択し、
（２）トリチル−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、治療剤の存在下で活性化剤によりトリチル−保護されたオリゴペプチドを活性化することによって、治療剤に前記トリチル−保護されたオリゴペプチドをカップリングし、
【０１１８】
（３）オリゴペプチド−治療剤接合体を形成するために、前記トリチル−保護されたオリゴペプチド−治療剤接合体を、酸性条件下で保護解除し、そして
（４）化合物を形成するために、安定化基に前記オリゴペプチド−治療剤接合体をカップリングすることを含んで成る。
それらの方法のいずれかに関するもう１つの可能な段階は、スキャベンジング樹脂又はビーズの使用により、カップリングされていない治療剤を除去することである。さらに、化合物は、所望により、医薬的に許容できる塩により中和され得る。
【０１１９】
特定の化合物：
本発明の化合物は、表１（例１下の）に特別に列挙されるプロドラッグを包含する。
実施例
例１．可能性あるプロドラッグのスクリーニング
改良された治療指数を有するプロドラッグのための良好な候補体を、完全なヒト血液において比較的安定性である癌細胞により活性化する。３種の異なった癌調製物を用いて、種々の試験化合物をスクリーンした。それらの３種の調製物は次の通りであった：
（ａ）ＭＣＦ７／６（乳癌）細胞ホモジネート；
（ｂ）ＭＣＦ７／６（乳癌）ならし培地；及び
（ｃ）ＨｅＬａ（頸部癌）細胞抽出物アニオン交換画分プール。
【０１２０】
ａ．ＭＣＦ７／６細胞ホモジュネートの調製：
ＭＣＦ７／６細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）、５０ｍｇ／ｌのウシ血清アルブミン、ＩＴＳ−Ｘ（１０ｍｇ／ｌのインスリン、５．５ｍｇ／ｌのトランスフェリン、６．７μｇ／ｌの亜セレン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｌのエタノールアミン）、及び脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ＃２１９００−０３０）を含む血清フリー培地において集密性まで増殖した。１００ｍｌの細胞を、４℃で１０，０００×ｇで２０分間、遠心分離し、そして上清液をデカントすることによって収穫した。
【０１２１】
ペレットを、２ｍｌのリン酸緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、そして１８，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清液をデカントした後、細胞（約３００μｌの湿潤物）を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）（ナトリウム塩）１０ｍｌにおいて粉砕することによって均質化した。そのホモジュネートを、４℃で１８，０００×ｇで５分間、遠心分離し、そして上清液をアリコートし、そして化合物のスクリーニングへの続く使用のために−２０℃以下で貯蔵した。
【０１２２】
ｂ．ＭＣＦ７／６ならし培地の調製：
ＭＣＦ７／６細胞を、１０％ウシ胎児血清、０．０５％（ｗ／ｖ）のＬ−グルタミン、２５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）において集密性まで増殖した。次に、細胞を、リン酸緩衝溶液により２度、洗浄し、そしてＭＤＥＭ／Ｆ１２（１：１）、０．０２％のＢＳＡ、ＩＴＳ−Ｘ（１０ｍｇ／ｌのインスリン、５．５ｍｇ／ｌのトランスフェリン、６．７μｇ／ｌの亜セレン酸ナトリウム、２ｍｇ／ｌのエタノールアミン）において、５％のＣＯ２下で、３７℃で２４時間インキュベートした。次に前記ならし培地をデカントし、そしてＹＭ１０（１０，０００ＭＷのカットオフ）限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた、撹拌された細胞装置を用いて、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）により１度、交換し、そして２０倍に濃縮した。この溶液を、化合物のスクリーニングへの使用のために、−２０℃で、アリコートで貯蔵した。
【０１２３】
ｃ．ＨｅＬａ細胞アニオン交換画分プールの調製：
商業的に生成された３０×１０１０個のＨｅＬａ細胞（ヒト頚部癌、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｅｎｅｆｆｅ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、１０８ｍｌのリシン水溶液において、音波処理機及びＤｏｕｎｃｅホオジナイザーにより均質化した。そのリシン溶液は、０．０２％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．０４％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、及びプロテアーゼのインヒビターのカクテル（２つの錠剤／５０ｍｌのＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ， ＥＤＴＡ−フリーの錠剤、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含んだ。細胞ホモジネートを、５０００×ｇで４℃で３０分間、遠心分離し、そしてペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて、第２の１０８ｍｌのリシン溶液において均質化し、そして前記のように遠心分離した。上清液を組合し、そして１４５，０００×ｇで４℃で９０分間、遠心分離した。
【０１２４】
その超遠心分離上清液の一部を、０．０１％（ｗ／ｖ）のＸ−１００及び０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含む、２０ｍＭのトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）緩衝液（平衡化緩衝液）により２倍に希釈した。約１８０ｍｇのタンパク質に対応する前記の得られる溶液３０ｍｌを、２．６×９．４ｃｍのＳｏｕｒｃｅＴＭ １５Ｑ （Ａｍｅｒｓｈｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） 低圧アニオン交換クロマトグラフィーカラム上に４℃で負荷した（１ｍｌ／分）。次に、カラムを２５０ｍｌの平衡化緩衝液により、１ｍｌ／分の流速で洗浄した。
【０１２５】
タンパク質を、ＮａＣｌ線状濃度グラジエント（平衡化緩衝液において０〜０．５Ｍ；グラジエントの合計体積は１０００ｍｌであった）において、３ｍｌ／分の流速で溶出した。２分の画分を集め、そして基質としてβＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを用いて、酵素活性決定に使用した。Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘへのその転位を、アントラサイクリン成分の蛍光検出を用いて、逆相高性能クロマトグラフィーにより定量化した。最高の活性レベルを含む画分をプールし（画分＃４３〜４６；約０．１３ＭのＮａＣｌ）、プロテアーゼインヒビター（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ， ＥＤＴＡ−フリー錠剤、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充し、そして−８０℃でアリコートとして貯蔵した。
【０１２６】
ｄ．分解アッセイ：
試験化合物を、癌細胞酵素の３種の異なった調製物の個々と共に１２．５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３体積のアセトニトリルを添加し、反応を停止し、そして混合物からタンパク質を除去した。サンプルを、１８，０００ｇで５分間、遠心分離し、そして上清液１００μｌを、ＨＰＬＣによる分析の前、３００μｌの水と共に混合した。ＨＰＬＣ分析のために、５０μｌのサンプルを、４．６×５０ｍｍの２μＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳクロマトグラフィーカラム上に４０℃で注入し、そして２０ｍＭの水性酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）中、２６％〜６８％のアセトニトリルの３分の線状グラジエントにより２ｍｌ／分で溶出した。検出は、２３５ｎｍの励起波長及び５６０ｎｍの発光波長を用いての蛍光によるものであった。
【０１２７】
所定の条件下で酵素調製物により分解されなかった（対照に等しいか又はその５％以下）試験化合物が表１に示されている。少数の例外を伴なって、癌細胞酵素分解についての結果は、Ｈｅｌａ細胞、ＭＦＣ ７／６細胞均質物及びＭＣＦ ７／６ならし培地からの部分的に精製された画分についてと同一であった。
【０１２８】
【表１】
2004510702.tif 000002
【０１２９】
例２．ＬＮＣａＰ、ＨＴ−２９及びＰＣ−３細胞に対する腫瘍活性化されたプロドラッグ活性
粘着細胞、ＬＮＣａＰ（前立腺癌）、ＨＴ−２９（結腸癌）及びＰＣ−３（前立腺癌）を、１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ培地において培養した。研究の日、細胞を、トリプシン溶液によりプレートから分離した。集められた細胞を洗浄し、そして１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭにおいて、０．２５×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートに添加し、そしてプレートを３時間インキュベートし、細胞の付着を可能にした。
【０１３０】
このインキュベーションに続いて、ドキソルビシン又は試験化合物の一連の希釈溶液（３倍の増加）を製造し、そして１００μｌの化合物をウェル当たり添加した。次に、プレートを２４時間インキュベートし、１０μｌの１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンによりパルスし、そしてさらに２４時間インキュベートした（４８時間の合計インキュベーション時間）。プレートを、９６ウェルＨａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて収穫し、そしてＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ Ｃｏｕｎｔｅｒ上で計数した。４パラメーターのロジスティック曲線を、ＩＣ５０値を決定するために、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、薬剤モル濃度の関数として、３Ｈ−チミジン組み込みに適合せしめた。
【０１３１】
【表２】
2004510702.tif 000003
【０１３２】
前立腺癌細胞、ＬＮＣａＰ及びＰＣ−３細胞又は結腸癌細胞ＨＴ−２９を、上昇する濃度の示される化合物と共に４８時間インキュベートし、そして細胞増殖を３Ｈ−チミジンアッセイを用いて測定した。正の対照であるドキソルビシンのＩＣ５０は、使用される細胞系において０．０２〜０．０８μＭであった。そのデータは、複数の細胞系、例えばＰＣ−３及びＨＴ２９が上記に示されるプロドラッグを分解しないことを示す。対照的に、ＬＮＣａＰ細胞に存在する酵素は、いくつかのトリペプチドプロドラッグを分解する。最も可能性ある類似体は、ＬＮＣａＰ細胞に対して約０．１９μＭのＩＣ５０を有する、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより例示される。
【０１３３】
例３．Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは健康なマウスにおいて良好に許容される
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて良好に許容される。最初の単一用量の最大許容用量（ＳＤ−ＭＴＤ）研究においては、５匹の正常マウスのグループが、ボーラス用量のＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを静脈内投与された。マウスを毎日、２８日間、観察し、そして体重を週２度、測定した。試験される用量レベルは、それぞれ、０， １４， ２８， ４２， ５６， 及び７０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい、０， ２３， ４７， ７０， ９３， 及び１１７ｍｇ／ｋｇであった。
【０１３４】
急性毒素は存在せず、そして観察される毒性の唯一の徴候は、この研究を通してビークル対照グループよりも低い、最高用量グループについてのグループ平均体重における低下であった。しかしながら、死亡は存在せず、そして動物は罹病性を示さなかった。２８日でのＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＭＴＤが、この実験においては達成されず、そして従って、試験される最高用量１１７ｍｇ／ｋｇよりも高い。このＭＴＤ（６６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相当する）は、４ｍｇ／ｋｇ以上の用量に続いて死亡をもたらす、ドキソルビシンのみのＭＴＤよりも少なくとも１６倍高い。
【０１３５】
化合物の後−分析は、それらが、水含有及び不純性のために、約７５％の活性化合物を含むことを示した。その結果、上記に言及される用量は、投与される化合物の量を過大評価した。単一用量のＭＴＤ（７０ｍｇのドキソルビシン／ｋｇに等しい）は、１６ｍｇ／ｋｇ以上の用量に続いて死亡をもたらす、ドキソルビシンのみによりも、約３．３倍高い。
上記実験を反復し（例８Ａ）、そして次の結果を得た：Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの単一用量のＭＴＤを、９４ｍｇ／ｋｇ（５６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい）であることが決定され、それはドキソルビシンのみ（１６ｍｇ／ｋｇ）よりも少なくとも３．５倍高い。
【０１３６】
例４．Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは健康なマウスにおいて良好に許容される
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて良好に許容される。最初の単一用量の最大許容用量（ＭＴＤ）研究においては、５匹の正常マウスのグループが、ボーラス用量のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを静脈内投与された。マウスを毎日、２８日間、観察し、そして体重を週２度、測定した。
【０１３７】
試験される用量レベルは、それぞれ、０， １４， ２８， ４２， ５６，及び ７０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい、０， ２５， ５０， ７５， １００及び１２５ｍｇ／ｋｇであった。投与に続いて急性毒素は存在しなかった。毒性、例えば麻痺及び有意な体重の低下（それらの初期体重の２０％以上）が、２つの最高用量グループにおいて観察された。１４日で、１２５ｍｇ／ｋｇの用量グループにおける４匹の動物は、処理関連の毒性のために安楽死された。２１日で、次の高い用量グループ、すなわち１００ｍｇ／ｋｇのグループにおける２匹の動物が、同様に安楽死された。次の用量グループ（７５ｍｇ／ｋｇ）において罹病性は観察されず、そしてグループ−平均体重は、研究の間、上昇した。
【０１３８】
２８日での生存に基づいて、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘについての単一用量ＭＴＤは、７５ｍｇ／ｋｇ（４０ｍｇのドキソルビシン／ｋｇの用量に等しい）であることが推定された。従って、ＭＴＤは、標準の安全な効果的用量（４〜８ｍｇ／ｋｇ）に基づいて４ｍｇ／ｋｇであることが推定される、ドキソルビシンのみのＭＴＤよりも約１０倍高かった。上記実験を再び行った（例９）。
【０１３９】
化合物の後−分析は、それらが水含有及び不純性のために、約７５％の活性化合物を含むことを示した。その結果、上記に言及される用量は、投与される化合物の量を過大評価した。従って、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの単一用量のＭＴＤは、ドキソルビシンのみのＭＴＤ（１６ｍｇ／ｋｇ）よりも約３．７倍高かった。より適切な比較は、単一用量が効果的でないので、反復用量（ＲＤ）のＭＴＤである。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＲＤ−ＭＴＤは、例８における効力研究に基づいて、約５３ｍｇ／ｋｇのＱ７Ｄｘ５（３０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい）であり、これは、ドキソルビシンのＲＤ−ＭＴＤ（４ｍｇ／ｋｇの標準の安全なＲＤ有効用量）よりも少なくとも６．５倍高かった。
【０１４０】
例５．Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの代謝
Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの代謝及びクリアランスを、正常なマウスにおいて研究した。マウスに、１１７ｍｇ／ｋｇで１回の静脈内用量のＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを投与した。血漿サンプルを１及び４時間で得た。１００μｌの血漿サンプルを、マイクロ遠心分離管（１．５ｍｌ）に移し、そしてダウノルビシンの内部標準（０．５ｍｇ／ｍｌでの２０μｌ）を、アセトニトリル（４００μｌ）と共に添加した。管をキャップし、そして短時間かきまぜ、続いて１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。個々の管から４２０μｌを除き、そして真空乾燥した。個々のサンプルを、タンデム質量分光測定と組合しての逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ ＭＳ／ＭＳ）による分析の前、アセトニトリル（２０％）を含む、水性蟻酸アンモニウム６５μｌにおいて再構成した。
【０１４１】
尿を、投与後２及び２４時間で、代謝ケージにおける１対のマウスから集めた。尿サンプルを、アセトニトリル（２０％）を含む蟻酸アンモニウムにより希釈し、ＬＣ ＭＳ／ＭＳアッセイの実際範囲内での標的分析物濃度を得た。３０μｌの個々の希釈されたサンプルを、マイクロ遠心分離管（１．５ｍｌ）に入れ、そして内部標準のダウノルビシン（０．５ｍｇ／ｍｌで２０μｌ）を、アセトニトリル（２０％）を含む蟻酸アンモニウム５０μｌと一緒に添加した。次に個々のサンプルを、ＬＣ ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０１４２】
ＤＡＤ検出器及びＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ＨＰＬＣを、エレクトロスプレーイオン源を備えたＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３６５質量分光計に連結した。ＨＰＬＣを、ＨＡＩＧＵＡＲＤ Ｃ１８ガードディスク（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）及びステンレス鋼フリット（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えた、ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＯＤＳ， ２ｍｍ， ４．６×５０ｍｍ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）逆相カラム上で行った。クロマトグラフィー処理は、室温で行われた。流速は０．５ｍｌ／分であった。注入体積は５０μｌであった。
【０１４３】
グラジエント溶離を、上昇する量の２０ｍＭのアセトニトリルを含む蟻酸アンモニウムの移動相を用いて行った。ＡＰＩ３６を、特定の分析物％−娘イオン対をモニターするために設定された複反応モニターモードで、３６５℃で操作した。クロマトグラムの積算を、ＭａｃＱｕａｎソフトウェア（ＰＥ Ｓｃｉｅｘ）、及び前に得られた検量線への比較により得られた個々の分析物の定量化により行った。ダウノルビシンは、すべての場合、内部標準として使用された。
【０１４４】
表３及び図１１に見られるように、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、循環から非常に急速にクリアランスされ、投与される用量の約１．１％が１時間で検出され、そして４時間までに、それは実質的に検出できなかった。２及び２４時間で、親化合物は、投与される用量の３．９％及び１５．０％で尿において検出され、このことは、腎臓がプロドラッグについての排泄の主要器官であることを示す（図１２）。
【０１４５】
【表３】
2004510702.tif 000004
【０１４６】
投与される用量の％：動物の体重の７％で計算された。血液体積の４０％で評価された血漿体積。
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、血漿又は尿において検出されなかった。主要ペプチド代謝物は、Ｌｅｕ−Ｄｏｘであった。ドキソルビシンは、血漿において実質的に検出できなかったが、しかし２及び２４時間で、低レベルで尿において見出された。親及び代謝物の両者のレベルは、２時間でよりも２４時間で、尿において高かった。これはたぶん、初期の尿採取時間（２時間）に対して、マウスの後での排尿に起因した。尿値は、０〜２時間及び２〜２４時間からの蓄積を表し、従って、後での排尿（２時間後）は、２〜２４時間のサンプルに蓄積された。
【０１４７】
Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘプロドラッグの低レベルの分解及び活性化は、正常なマウスの血液において生じた。試験された高用量レベルでのＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより観察された最少毒性（例２）は、全身的に存在する場合、正常な組織に対して毒素である、活性代謝物ドキソルビシンの全身性生成がほとんど存在しないことを確かめる。
【０１４８】
例６．Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの代謝
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの代謝及びクリアランスを、１１７ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの単一のボーラス用量を静脈内投与された正常マウスにおいて研究した。血清サンプルを、１及び４時間で、別々のマウスから得た。尿を、代謝カゴにおける１対のマウスから、投与後２及び２４時間で採取した。血漿及び尿サンプルを調製し、そして例４に記載のようにして分析した。
【０１４９】
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、循環から非常に急速にクリアランスされた：投与された用量の約１．０％が１時間で、血漿において検出され、そしてそれは、４時間で実質的に検出できなかった（表４及び図１３）。２及び２４時間で、尿は投与された用量の１２．７％及び４８１％を含み、このことは、腎臓がプロドラッグのための主要な排泄器官であることを示す。
【０１５０】
【表４】
2004510702.tif 000005
【０１５１】
＊投与された用量の％。
代謝物Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは血漿において実質的に検出されず、そして２時間で尿において非常に低いレベルで見出された。主要ペプチド代謝物はＬｅｕ−Ｄｏｘであり、これは、１時間で血漿において、及び２及び２４時間で、尿において低レベルで検出され得た。遊離ドキソルビシンは血漿においてはほとんど存在しないが、しかしながら比較的高レベルが尿において検出され、このことは、完全な代謝が存在することを示す。
【０１５２】
それらのサンプルにおいては、親及び代謝物の両者のレベルは、２及び２４時間で、尿において高かった。０〜２時間及び２〜２４時間で採取された、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及び代謝物の合計量は、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのその合計量に類似する（例４を参照のこと）。従って、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘのクリアランス間に生理学的に有意な差異は存在しない。
【０１５３】
例７．マウスにおける比較代謝
第２の研究においては、３つのグループのＩＣＲ正常雌マウスに、約１００μモル／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ又は１０μモル／ｋｇのドキソルビシン（Ｄｏｘ）の１回のＩＶボーラス用量を投与した。血漿を、５分、１，２，４又は６時間で、個々のグループにおける３匹の個々の動物から得た。親、ジペプチジル−ドキソルビシン（ＡＬ−Ｄｏｘ）、α−アミノ−ドキソルビシン（Ｌ−Ｄｏｘ）及びドキソルビシン濃度を、蛍光検出（λｅｘ＝４８０ｎｍ，λｅｍ＝５６０）を用いて、逆相グラジエントＨＰＬＣにより、血漿サンプルの抽出物において分析した。標準が入手できなかったので、Ｇ−Ｄｏｘの場合のピーク保持時間は確かめられなかった。量を、マウスの血漿における１０〜２０００ｎｇ／ｍｌのドキソルビシン溶液の測定値に対する線状標準曲線適合性を用いて決定した。
【０１５４】
濃度時間経過は、代謝パターンが、両プロドラッグ化合物に関して類似した。特に、Ｌ−Ｄｏｘが最初の２時間、主要代謝物であり、そしてジペプチジル−接合体ＡＬ−Ｄｏｘが、Ｌ−Ｄｏｘとほぼ同じ時間で形成されるよりマイナーな生成物であった。ドキソルビシンは、後で出現し、そしてその血漿濃度は、現在及び前に測定されたドキソルビシン薬物動力学プロフィールから、及びドキソルビシン対照グループにより予測されるような他の代謝物よりも、時間にわたってよりゆっくり低下する。これはＴＯＰ／トロウアーゼの連続的分解プロフィールと一致しないが、しかし次のアミノ酸でのある型のエンドペプチダーゼ活性のもう１つの酵素による分解と一致する。
【０１５５】
活性化に続いて、連続的なエキソペプチダーゼ分解が存在する。ドキソルビシンへの暴露における２倍の低下が、その対応するテトラペプチド相対物Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘに比較して、トリペプチドＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより観察される。それらの化合物の投与の後、相対的ドキソルビシン暴露がマウスにおける最大の許容される用量研究において観察される相対的安全性と一致する。ドキソルビシン暴露は、イソロイシンの代わりにロイシンを有するその対応する化合物が同じ実験において試験される場合、少なくとも２倍高かった。これは、他の例に記載されるイソロイシン化合物についての高い許容性が低いドキソルビシン暴露により説明され得ることを示唆する。
【０１５６】
【表５】
2004510702.tif 000006
【０１５７】
例８．Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは腫瘍担持マウスにおいて十分に許容される
プロドラッグＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤は、反復用量条件下で、ドキソルビシンよりも有意に良好に許容される。予測されるように、単一用量のＭＴＤに類似する用量（７５ｍｇ／ｋｇ）（例４を参照のこと）が反復用量として投与される場合、それはやや良好に許容された。腫瘍担持マウスにおける反復用量研究においては、１０匹のマウスの３種のグループを、０，５３又は６８ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（０，３０及び３８ｍｇのドキソルビシン／ｋｇに等しい）により、合計５回の同一用量（Ｑ５Ｄ×５）で投与し、そして６０日間、時折り観察した。
【０１５８】
すべての処理された動物は、研究を通して、前進的に体重を失い、ビークル対照グループは、平均初期体重の１２％まで増加した（図１５）。高い用量グループにおける２匹の処理された動物は、それらの初期体重の２０％以上の低下を包含する毒性の徴候のために停止された。その毒性の徴候は、単一の高い用量に続いて観察されるそれらの徴候に類似し（例４を参照のこと）、そして囓歯動物においてドキソルビシンの既知の毒性プロフィールと一致した。
【０１５９】
従って、累積毒性は、３種の比較的高い用量レベルでの反復用量に起因した。しかしながら、５回の投与の後、２種の用量グループにおける動物のドキソルビシンに対する最大の全体の暴露は、それぞれ１５０及び１９０ｍｇ／ｋｇであり、これは、ドキソルビシンの許容される反復用量レベル（５回の投与の後、４ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇの合計暴露）よりも有意に高い（８〜１０倍）。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘのＲＤ−ＭＴＤは約１５０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しく、これはドキソルビシンの許容される反復用量レベルよりも少なくとも６．５倍高かった（標準の安全なＲＤ有効用量４ｍｇ／ｋｇ、又は５回の投与の後、２０ｍｇ／ｋｇの合計暴露）。
【０１６０】
例９．Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは腫瘍担持のマウスにおいて効果的である
Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤は、ドキソルビシン−耐性結腸直腸癌ＬＳ１７４ｔを用いてのマウス異種移植モデルにおいて、マウスの生存性を延長し、そしてヒト腫瘍の増殖を阻害することにおいて効果的であることがわかっている。例えば、約９０ｍｇへの増殖を可能にされる、ＬＳ１７４ｔの塊りを皮下移植された１０匹のマウスのグループが、合計５回の同一用量（Ｑ５Ｄ×５）で５日の間隔で、０、５３又は６８ｍｇ／ｋｇのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌｅ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（０， ３０又は３８ｍｇのドキソビシンに等しい）により静脈内処理された。腫瘍及び体重を６０日までの間、週２度、測定した。図１６に見られるように、両用量は、ビークル対照動物に比較して、腫瘍の増殖の低下において効果的であった。
【０１６１】
研究の日６０の終点まで生存するマウスの数において、用量依存性上昇性が存在した。ビークル対照グループ（０）に比較して、それぞれ低及び高容量グループにおいて２及び４匹の長期生存体が存在した。日６０の前、腫瘍が１．５ｇに達した動物における平均生存日（ＭＤＳ）は、ビークル対照グループ（１８．２日）よりも、低（２９．７日）及び高（２３．４日）用量グループにおいて有意に良好であった。従って、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、この攻撃的なヒト腫瘍モデルにおいて効果的であり、この用量レジメ下でのその許容される用量（４ｍｇ／ｋｇ）でのドキソルビシンのみは、従来通り無効果である。
【０１６２】
それらの結果の再考は、いくつかの結果が誤って報告されたことを示した。ビークル対照グループ（０）に比較して、それぞれ低及び高容量グループにおいて、日６０の終点まで、４及び２匹の長期生存体が存在した。Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、この攻撃的なヒト腫瘍モデルにおいて効果的であり、この用量レジメ下でのその許容される用量（３ｍｇ／ｋｇ）でのドキソルビシンのみは、従来通り無効果である。
【０１６３】
例１０．Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘはドキソルビシンよりもインビボで良好に許容される
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて良好に許容される。第２の単一用量の最大許容用量（ＳＤ−ＭＴＤ）研究においては、５匹の正常ＩＣＲマウスのグループが、ボーラス用量のＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを静脈内投与された。マウスを毎日、４９日間、観察し、そして体重を週２度、測定した。試験される用量レベルは、それぞれ、０， ５６， ７０， ８４又は９８ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい、０， ９４， １１７， １４０又は１６４ｍｇ／ｋｇであった。２４時間以内に、いずれの用量レベルにおいても急性毒性は存在しなかった。毒性の用量及び時間依存性徴候が、この研究の間、観察された。
【０１６４】
毒性、例えば部分的な後脚の麻痺及び有意な体重の低下（それらの初期体重の２０％以上）が、最も高い用量グループにおいて観察された。毒性の徴候は、日１４までに１６４ｍｇ／ｋｇでの部分的な後脚の麻痺、及び日１４までに１４０ｍｇ／ｋｇでの体重の低下であった。４９日での生存率及び毒性の徴候の欠失に基づいて、Ｓｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのＳＤ−ＭＴＤは、９４ｍｇ／ｋｇ（５６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相当する）であることが決定され、従って、これは、ドキソルビシンのみについてのＳＤ−ＭＴＤ（１６ｍｇ／ｋｇ）よりも、モル濃度に基づいて約３．５倍、高かった。表６を参照のこと。これは、試験される範囲にわたって１４ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン等量の増分での用量の範囲に基づいてのおおよそのＳＤ−ＭＴＤ決定である。
【０１６５】
【表６】
2004510702.tif 000007
【０１６６】
例１１．Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘはドキソルビシンよりもインビボで良好に許容される
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘは、マウスにおいて良好に許容される。第２の単一用量の最大許容用量（ＳＤ−ＭＴＤ）研究においては、５匹の正常ＩＣＲマウスのグループが、ボーラス用量のＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを静脈内投与された。マウスを毎日、４９日間、観察し、そして体重を週２度、測定した。試験される用量レベルは、それぞれ、０， ２８， ４２又は５６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに等しい、０， ５０， ７５又は１００ｍｇ／ｋｇであった。２４時間以内に、いずれの用量レベルにおいても急性毒性は存在しなかった。毒性の用量及び時間依存性徴候が、この研究の間、観察された。
【０１６７】
毒性、例えば部分的な後脚の麻痺及び有意な体重の低下（それらの初期体重の２０％以上）が、最も高い用量グループにおいて観察された。日２１までに、１００ｍｇ／ｋｇの用量における３匹の動物を、体重の低下又は麻痺のために安楽した。７５ｍｇ／ｋｇの用量グループにおいて観察される罹病性又は死亡性は存在しなかった。４９日での生存率及び毒性の徴候の欠失に基づいて、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤｏｘについてのＳＤ−ＭＴＤは、７５ｍｇ／ｋｇ（４２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンに相当する）であることが決定され、従って、これは、ドキソルビシンのみについてのＳＤ−ＭＴＤ（１６ｍｇ／ｋｇ）よりも、モル濃度に基づいて約２．６倍、高かった。表７を参照のこと。これは、試験される範囲にわたって１４ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン等量の増分での用量の範囲に基づいてのおおよそのＳＤ−ＭＴＤ決定である。
【０１６８】
【表７】
2004510702.tif 000008
【０１６９】
例１２．接合されていない治療剤に対するプロドラッグの利点
本発明のプロドラッグは、その接合されない形での治療剤よりも処理利点を提供する。
単一用量最大許容用量（ＳＤ−ＭＴＤ）研究においては、正常なマウスグループが、ポーラス用量のプロドラッグの静脈内投与を受けた。マウスは、２８日間、毎日観察され、そして体重が週２度、測定された。ＳＤ−ＭＴＤは、２８日後、マウスの死を生成しなかった最高の用量に等しいことが推定された。表８に示されるように、プロドラッグの単一の用量ＭＴＤは、ドキソルビシンのみのそのＭＴＤよりも、１０倍〜少なくとも１６倍高い範囲である。
【０１７０】
【表８】
2004510702.tif 000009
【０１７１】
ｎ．ｄ．＝測定されなかった；ｎ．ａ．＝適用できない。（括弧ないの値は、ドキソルビシンに等しい容量である）。
腫瘍担持のマウスにおける反復−用量研究においては、１０匹のマウスのグループに、５日又は１週間の間隔で、合計５回の用量で種々の量のプロドラッグを投与した。６０日間の時おりの観察の後、許容できる毒性限界内であることがわかっており、そして腫瘍サイズの減少を生成する用量を、最適効力反復用量として同定した。表８に見られるように、プロドラッグの最適効力反復用量は、ドキソルビシンのみのその用量よりも約９倍高い。従って、プロドラッグは、全体として、身体への、及び従って、標的細胞の近くへの多くの量の治療剤の供給を可能にする。
【０１７２】
化合物の後−分析は、それらが水含有及び不純性のために約４７％の活性化合物を含むことを示した。その結果、上記に言及される用量は、投与される化合物の量を過大評価した。補正された結果を示す表９に示されるように、イソロイシン含有プロドラッグのＳＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシンのみのそのＳＤ−ＭＴＤよりも１．６倍〜２．５倍高い範囲である。６０日間にわたっての時折の観察の後、許容できる毒性限界内であることがわかっている用量が、最大の許容できる反復用量として同定された。補正された結果を示す表９に見られるように、プロドラッグのＲＤ−ＭＴＤは、ドキソルビシンのそのＲＤ−ＭＴＤよりも約６．５倍高い。それらのＲＤ−ＭＴＤでの又はそれ以下のプロドラッグの反復用量は、ＬＳ１７４ｔ腫瘍担持のマウスの生存性を有意に延長するが、ところがドキソルビシンの反復用量は完全に無効果である。従って、結果は、プロドラッグが全体として身体への及び標的細胞の付近への多量の治療剤の供給を可能にすることにおいて同じのままである。
【０１７３】
【表９】
2004510702.tif 000010
【０１７４】
残る例についての分析方法：
固相又は溶液相アプローチを用いて合成されるペプチド配列は、分析用ＨＰＬＣ（方法Ａ， Ｂ ＆ Ｄ）が８０％以上の純度である粗生成物を示す場合、さらに精製しないで使用された。そうでなければ、材料は分離用ＨＰＬＣ方法Ｃを用いて精製された。
【０１７５】
ＨＰＬＣ方法Ａ：
分析用ＨＰＬＣ分析は、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）及び溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ）のグラジエントにより溶離するＣ−１８カラム（４μｍ， ３．９×１５０ｍｍのＩＤ、１ｍｌ／分の流速）を用いてＷａｔｅｒｓ ２６９０上で行われ、そしてデータはＷａｔｅｒ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを用いてλ２５４ｎｍで処理された。分析用ＨＰＬＣグラジエントは、９０％の溶媒Ａで開始し、そして１４分間にわたって（線状）の１００％の溶媒Ｂで終結した。この方法及び次の方法についての化合物の純度は、ピークの曲線下での相対的％領域として評価された。
【０１７６】
ＨＰＬＣ方法Ｂ：
分析用ＨＰＬＣ分析は、溶媒Ａ（８０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム及び２０％のアセトニトリル）及び溶媒Ｂ（２０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム及び８０％のアセトニトリル）のグラジエントにより溶離するＣ−１８カラム（３．５μｍ， ４．６×１５０ｍｍのＩＤ、１ｍｌ／分の流速）を用いてＷａｔｅｒｓ ２６９０上で行われ、そしてデータはＷａｔｅｒ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍシステムを用いてλ２５４ｎｍで処理された。分析用ＨＰＬＣグラジエントは、１００％の溶媒Ａで開始し、そして１４分間にわたって（線状）の１００％の溶媒Ｂで終結した。
【０１７７】
ＨＰＬＣ方法Ｃ：
粗生成物の分離用精製は、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ）及び溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ）のグラジエントにより溶離するＣ−４カラム（１５μｍ， ４０×１００ｍｍのＩＤ、３０ｍｌ／分の流速）を用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００システムにより達成された。分離用ＨＰＬＣグラジエントは、８０％の溶媒により開始し、そして７０分間にわたって１００％の溶媒Ｂに進行する（線状）。データは、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍを用いてλ２５４ｎｍで処理された。
【０１７８】
ＨＰＬＣ方法Ｄ：
分析用ＨＰＬＣは、ＴＳＫ ｓｕｐｅｒＯＤＳカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ）を用いて、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ装置上で達成された；溶媒Ａ（水中、０．１％のＴＦＡ）；溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．１％のＴＦＡ）；グラジエント：２分での３０〜３６％のＢ、１０分での３６〜４１％のＢ、３分での４１〜９０％のＢ、５分での９０％のＢ、検出波長λ２５４ｎｍ。
【０１７９】
ＮＭＲ及びＭＳ：
追加の構造決定は、ＮＭＲ及びＭＳ技法により行われ、そして結果は、本発明の化合物を支持した。
ＴＬＣ方法：
ＴＬＣ分析は、溶出のためのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／８８％の蟻酸（８５／１５／１／２）を用いて、シリカゲル６０Ｆ−２５４ｎｍ−０．２５ｍｍプレート（Ｍｅｒｃｋ）上で行われた。
【０１８０】
ニンヒドリン試験：
数ミリグラムの生成物を試験に導入し、そして２滴の溶液Ａ（エタノール中、５０ｍｇ／ｍｌのニンヒドリン）、２滴の溶液Ｂ（エタノール中、４ｍｇ／ｍｌのフェノール）、次に、２滴の溶液Ｃ（１００ｍｌのピリジン中、２ｍｌの０．０１ＭのＫＳＣＮ）を添加した。その混合物を、煮沸水浴に５分間放置した。遊離アミンの存在下で、溶液は紫色になる。
【０１８１】
特異的オリゴペプチド合成例：
市販の試薬源：
ドキソルビシン及びダウノルビシンはＭｅｉｊｉ（Ｊａｐａｎ）により、Ｐｄ （ＰＰｈ３）４はＳｔｒｅｍ Ｃｈｅｍ （Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ， ＭＡ） により、ＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ａｌａｂａｍａ）により、溶媒ＨＡＴＵはＡｌｄｒｉｃｈ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ） により供給され；すべての樹脂及びアミノ酸は、ＡＢＩ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）， Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｒｎＴｅｃｈ （Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ， ＫＹ）， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌ， ＫＹ） 又はＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ， ＣＡ）により供給された。
【０１８２】
例１３．Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
トリペプチド（Ｆｍｏｃ− Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ）を、標準のＦｏｍｃ化学と共に固相ペプチド合成を用いて合成した。典型的な合成は、Ｗａｎｇのアルコキシ樹脂（０．６０ｍモル／ｇ負荷量）を使用した。Ｆｏｍｃ−保護されたアミノ酸を、固相ペプチド合成のために使用した。
【０１８３】
樹脂上での１ｍＭのペプチドの規模に関しては、３当量のアミノ酸を、２当量のＤＩＥＡと共に樹脂に添加される５分前、活性剤としてのＨＢＴＵにより予備活性化した。カップリング反応を２時間、行い、そして次に、ＤＭＦ（２５ｍｌ×３）及びＤＣＭ（２５ｍｌ×３）により洗浄した。カップリング反応を、類似する条件下で２当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験を用いてモニターし、そしてニンヒドリン試験が２時間後、不完全な反応を示す場合、カップリング段階を３度、反復した。
【０１８４】
保護解除を、ＤＭＦ中、２０％ピペリシンを用いて、１５〜２０分間、行った。カップリング段階を、所望するペプチドが樹脂上にアセンブリーされるまで、次のアミノ酸により反復した。樹脂からのペプチドの最終分解を、９５％のＴＦＡ及び５％の水の溶液により樹脂を処理することによって達成した。反応混合物を室温で２時間、撹拌した後、樹脂を減圧下で濾過し、そしてＴＦＡにより２度、洗浄した。濾液を組合し、そしてペプチドを、４００ｍｌの冷エーテルを添加することによって沈殿した。ペプチドを減圧下で濾過し、そして乾燥し、Ｆｍｏｃ− Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（方法Ａによる９２％のＨＰＬＣ純度）を得た。粗ペプチドを、ＬＣ／ＭＳにより特徴づけ、そしてさらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０１８５】
例１４．Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
トリペプチド（Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ −ＯＨ）を、標準のＦｏｍｃ化学と共に固相ペプチド合成を用いて合成した。典型的な合成は、Ｗａｎｇのアルコキシ樹脂（０．６０ｍモル／ｇ負荷量）を使用した。Ｆｏｍｃ−保護されたアミノ酸を、固相ペプチド合成のために使用した。樹脂上での１ｍＭのペプチドの規模に関しては、３当量のアミノ酸を、２当量のＤＩＥＡと共に樹脂に添加される５分前、活性剤としてのＨＢＴＵにより予備活性化した。カップリング反応を２時間、行い、そして次に、ＤＭＦ（２５ｍｌ×３）及びＤＣＭ（２５ｍｌ×３）により洗浄した。
【０１８６】
カップリング反応を、類似する条件下で２当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験を用いてモニターし、そしてニンヒドリン試験が２時間後、不完全な反応を示す場合、カップリング段階を３度、反復した。保護解除を、ＤＭＦ中、２０％ピペリシンを用いて、１５〜２０分間、行った。カップリング段階を、所望するペプチドが樹脂上にアセンブリーされるまで、次のアミノ酸により反復した。
【０１８７】
樹脂からのペプチドの最終分解を、９５％のＴＦＡ及び５％の水の溶液により樹脂を処理することによって達成した。反応混合物を室温で２時間、撹拌した後、樹脂を減圧下で濾過し、そしてＴＦＡにより２度、洗浄した。濾液を組合し、そしてペプチドを、４００ｍｌの冷エーテルを添加することによって沈殿した。ペプチドを減圧下で濾過し、そして乾燥し、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（方法Ａによる９２％のＨＰＬＣ純度）を得た。粗ペプチドを、ＭＳにより特徴づけ、そしてさらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０１８８】
例１５．Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
ダウノルビシン・ＨＣｌ（２．３４ｇ， ４．０３ｍモル）及びＦｍｏｃ− Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（２．４ｇ， ４．４８ｍモル）を、室温で無水ＤＭＦ（１５０ｍｌ）に溶解した。この急速に撹拌された溶液に、ＤＩＥＡ（１．５６ｍｌ， ８．６９ｍモル）を、１回で添加し、そしてその反応混合物を室温で１５分間、撹拌した。その反応混合物を、氷浴を用いて０℃に冷却し、そして１．８４ｇ（４．９２ｍモル）のＨＡＴＵを、１０分間にわたってゆっくりと添加した。
【０１８９】
反応混合物を、室温でさらに６０分間、撹拌した。氷冷却された水（２００ｍｌ）を、反応混合物に添加し、赤色の沈殿物の形成をもたらした。沈殿物を、粗フリット上に集め、３×５０ｍｌの水及び３×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｆｍｏｃ− Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（８９％の収率、方法Ａによる９４％のＨＰＬＣ純度）。この生成物を、ＭＳにより特徴づけ、そしてさらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０１９０】
例１６．Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
ダウノルビシン・ＨＣｌ（１．４３ｇ， ２．５ｍモル）及びＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１．６ｇ， ２．６ｍモル）を、室温で無水ＤＭＦ（１５０ｍｌ）に溶解した。この急速に撹拌された溶液に、ＤＩＥＡ（ｍｌ， ５．７ｍモル）を、１回で添加し、そしてその反応混合物を室温で１５分間、撹拌した。その反応混合物を、氷浴を用いて０℃に冷却し、そして１．０７ｇ（２．８ｍモル）のＨＡＴＵを、１０分間にわたってゆっくりと添加した。反応混合物を、室温でさらに６０分間、撹拌した。氷冷却された水（２００ｍｌ）を、反応混合物に添加し、赤色の沈殿物の形成をもたらした。沈殿物を、粗フリット上に集め、３×５０ｍｌの水及び３×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（８８％の収率、方法Ａによる９２％のＨＰＬＣ純度）。この生成物を、ＭＳにより特徴づけ、そしてさらに精製しないで、次の段階のために使用した。
【０１９１】
例１７．Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ からのＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
２０ｍｌの無水ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ− Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４．４ｇ、４．１３ｍモル）の溶液に、ピペリジン（２０．４ｍｌ、２０６ｍモル）を一度に添加し、赤色から紫色への色彩変化をもたらした。その反応混合物を、室温で５分間、撹拌し、そして次に、ドライアイス／アセトン浴を用いて−２０℃に冷却した。次に２１．２ｍｇ（２１０ｍモル）の無水琥珀酸を、前記冷却された混合物に一度に添加した。反応を−５℃で５分間、次に室温でさらに９０分間、急速に撹拌した。７５０ｍｌの無水ジエチルエーテルを反応混合物に添加し、赤色の沈殿物をもたらした。この沈殿物を中位のガラスフリット上で単離し、２×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｓｕｃ− Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（８０％の収率、方法Ｂによる８８％のＨＰＬＣ純度）。ＬＣ／ＭＳは、９３９の分子量（９４０の予測される分子量）を与えた。
【０１９２】
例１８．Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ からのＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成
４０ｍｌの無水ＤＭＦ中、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（４ｇ、３．５３ｍモル）の溶液に、ピペリジン（１７．４ｍｌ、１７６ｍモル）を一度に添加し、赤色から紫色への色彩変化をもたらした。その反応混合物を、室温で５分間、撹拌し、そして次に、ドライアイス／アセトン浴を用いて−２０℃に冷却した。次に１８ｍｇ（１８０ｍモル）の無水琥珀酸を、前記冷却された混合物に一度に添加した。
【０１９３】
反応を−５℃で５分間、次に室温でさらに９０分間、急速に撹拌した。７５０ｍｌの無水ジエチルエーテルを反応混合物に添加し、赤色の沈殿物をもたらした。この沈殿物を中位のガラスフリット上で単離し、２×５０ｍｌのジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、Ｓｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た（７８％の収率、方法Ｂによる８６％のＨＰＬＣ純度）。ＬＣ／ＭＳは、１０１１の分子量（１０１２の予測される分子量）を与えた。
【０１９４】
例１９．Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（２４．３４ｇ、０．０４モル）を、ＤＭＦ（３５０ｍｌ）及び磁気撹拌機と共に丸底フラスコ中に添加した。テトラペプチドを溶解した後、臭化ベンジル（４．７６ｍｌ、０．０４ｍモル）、続いて炭酸セシウム（１３．０４ｇ、０．０４モル）を、前記溶液に撹拌しながら添加した。その反応混合物を室温で１．５時間、撹拌した。次に、反応混合物を、氷水（４５０ｍｌ）を含むフラスコ中にゆっくりと注いだ。多量の白色固体沈殿物を吸引濾過により集めた。生成物を水（２×２００ｍｌ）により洗浄し、そして真空デシケーターに配置した。
【０１９５】
例２０．β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
丸底フラスコにおいて、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｏｂｎ（０．７ｇ、１．０ｍモル）を、無水ＤＭＦ５ｍｌに溶解した。ピペリジン（１．２ｍｌ、１２．１ｍモル）を前記溶液に添加し、そしてその混合物を室温で２５分間、撹拌した。反応を水（６ｍｌ）により停止し、そして酢酸エチル（２×１０ｍｌ）により抽出した。組合された有機層をさらに、水（２×５ｍｌ）、ブライン（５ｍｌ）により洗浄し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。固形物（０．８ｇ）を、溶媒の除去の後に得た。
【０１９６】
例２１．ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎの合成
丸底フラスコ（２５０ｍｌ）において、メチルヘミスクシネート（３．１９ｇ、２４．２ｍモル）を、無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。ＤＩＥＡ（４．２２ｍｌ、２４．２ｍモル）、続いてＨＢＴＵ（９．１７ｇ、２４．２ｍモル）を前記溶液に添加した。その混合物を室温で４５分間、撹拌した。この混合物に、無水ＤＭＦ（１５０ｍｌ）中、βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＢｎ（粗、１０．１４ｇ，２１．３ｍモル）の溶液を添加した。その混合物を、室温で２．５時間、連続して撹拌した。次に、その反応混合物を、氷冷却された水２００ｍｌを有するフラスコ中に、撹拌しながらゆっくりと注いだ。多量の白色固形物が沈殿し、これを酢酸エチル（３×２００ｍｌ）により抽出した。組合された有機層をさらに、水（２×２００ｍｌ）、ブライン（２００ｍｌ）により洗浄し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。
【０１９７】
例２２．ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕの合成
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｏｂｎ（１．０ｇ、１．４６ｍモル）を、メタノール１００ｍｌを含む三角フラスコ中に添加した。メタノール５０ｍｌを添加した。その溶液を水素化反応容器中に移した。この容器に、Ｐｄ−Ｃ（９０ｍｇ、１０％の湿潤、５０％の水；０．０４２ｍモル）を添加した。室温で２時間の水素化の後、反応を停止し、そして触媒を濾過した。
【０１９８】
例２３．“ウレア方法”をもちいてのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びドキソルビシンのカップリング
無水窒素雰囲気下で、ＭｅＯＳｕｃβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（２６．０４ｇ、５２．０ｍモル）、及びドキソルビシン塩酸塩（２３．２６ｇ、４０．２ｍモル）を、８００ｍｌの無水ウレア−飽和（約３０％ｗ／ｖ）ＤＭＦ及びＤＩＥＡに懸濁し／溶解した。この混合物を、約２５分間にわたって、０〜３℃に冷却した。この点で、ＨＡＴＵ（２１．２ｇ、５６．０ｍモル）を、約１００ｍｌのウレア飽和ＤＭＦにおける溶液として、１０分間にわたって添加した（この溶液の体積は最少に維持されるべきである）。反応混合物を−２〜２℃で１０分間、撹拌し、そして２％（ｖ／ｖ）の酢酸を含む氷冷却されたブライン４０００ｍｌ中に、激しく撹拌しながら、約５分間にわたって注いだ。生成物を、中位の多孔性ガラス濾過器上で濾過し、水により十分に洗浄し、そして減圧下で乾燥した。
【０１９９】
例２４．ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の合成の合成
丸底フラスコ（５０ｍｌ）において、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（０．２５ｇ、０．５ｍモル）及びドキソルビシン（０．２９ｇ、０．５ｍモル）を、無水ＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解した。その混合物を５分間撹拌した後、ＤＩＥＡ（０．１７ｍｌ、１．０ｍモル）、続いてＨＡＴＵ（０．１９ｇ、０．５ｍモル）を前記溶液に添加た。その混合物を室温で４時間、撹拌した。ＤＭＦを回転蒸発器により除去し、そして残留物を１：１の塩化メチレン：メタノール４．０ｍｌに採取した。この溶液に、４０ｍｌのエーテルを、撹拌しながら、ゆっくりと添加した。沈殿物を、吸引濾過によりそれを集めた。固形物をエーテル（２×１０ｍｌ）により洗浄し、そして真空デシケーターにおいて乾燥した。
【０２００】
例２５．ＭｅＯＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘからの遊離ドキソルビシンの除去
ＭｅＯＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（２００ｍｇ、０．１９４ｍモル）、ＤＩＥＡ（０．０６８ｍｌ、０．３８８ｍモル）及び無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）を、磁気撹拌棒を備えた５０ｍｌのフラスコに配置した。ＭｅＯＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘが完全に溶解した場合、イソシアネート樹脂（３９０ｍｇ、０．５８２ｍモル；５ｍｌのジクロロメタンにおいて５分間、予備膨潤された）を添加し、そして得られる溶液を室温で２時間、定期的なＨＰＬＣモニターを伴なって、撹拌した。
【０２０１】
ＨＰＬＣ追跡が、Ｄｏｘが完全に除去されたことを示した場合、反応混合物をフリットを通して濾過し、樹脂を除去した。樹脂を１０ｍｌのＤＭＦにより洗浄し、そしてそのＤＭＦ洗浄物を、前記濾過された反応混合物と組合した。次に、濾過された反応混合物を、高い真空ポンプ及び３０℃の水浴を備えた回転蒸発機上で濃縮した。残留物を、５ｍｌのＤＭＦに懸濁し、そして次に、その溶液を、急速に撹拌された無水ジエチルエーテル溶液中にゆっくりと添加した。次に生成物を、フリット上で濾過し、ジエチルエーテルにより洗浄し、そして減圧下で乾燥し、ＭｅＯＳｕｃ−β−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０２０２】
例２６．架橋された酵素の使用によるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の加水分解
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤（１．０ｇ、０．９７５ｍモル）及び１００ｍｌのＤＭＦを、５００ｍｌのフラスコに配置した。その懸濁液を磁気撹拌機により激しく撹拌した。ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤が完全に溶解した場合、４００ｍｌの脱イオン水を添加し、そしえ得られる溶液を３５℃で撹拌した。１ｇの洗浄されたＣＬＥＣ−ＰＣ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）固定された酵素のスラリーを、３アリコートの脱イオン水によりすすぎ、次に使用の前、２０％の水性ＤＭＦ１０ｍｌに再懸濁した。得られる懸濁液を、定期的なＨＰＬＣモニターを伴なって、３５℃で撹拌した。
【０２０３】
すべてのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤が消費された場合、その反応混合物を、０．４５μＭのナイロン膜フィルターを通して濾過し、ＣＬＥＣ−ＰＣ酵素を除去した。ＣＬＥＣ−ＰＣケークを、３×１０ｍｌのメタノールにより洗浄し、そしてメタノール洗浄物を、前記濾過された反応混合物と組合した。次に、濾過された反応混合物及びメタノール洗浄物を、高い真空ポンプ及び３０℃での水浴を備えた回転蒸発器上で濃縮した。次に、赤いゴム状物を、室温で５０ｍｌの脱イオン水に懸濁し、そして機械的撹拌機を通して激しく撹拌した。この懸濁液に、１００ｍｌの脱イオン水中、７７．８ｍｇ（０．９２６ｍモル、０．９５当量）の炭酸水素ナトリウムの溶液を、２分間にわたって添加した。その懸濁液を室温で２０分間、撹拌した。反応混合物を、０．４５μＭのナイロン膜フィルターを通して濾過し、そして凍結乾燥した。
【０２０４】
例２７．可溶性酵素の使用によるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の加水分解
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤（１１．０ｇ、１０．７２ｍモル）を、ＨＰＬＣ品種の水８００ｍｌに懸濁し、そしてＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ Ｔ８ホモジナイザーにより６０分間、均質化し、細かく分割された懸濁液を生成した。この懸濁液を３５℃で撹拌し（５００ｒｐｍ）、そして７６ｍＭの水性炭酸水素ナトリウムによりｐＨ＝６．０５に調節した。次に、１．０ｇのＣ．アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を添加し、そして反応混合物を３５℃で４８時間、撹拌した。４８時間の反応時間の間、ｐＨを、７６ｍＭの炭酸水素ナトリウムの定期的な添加による５．３〜６．２の間に維持し、そして反応をＨＰＬＣにより定期的にモニターした。
【０２０５】
反応がほぼ完結である場合、反応混合物を７６ｍＭの水性炭酸水素ナトリウムによりｐＨ＝７に調節し、そしてセライト５２１のパッドを通して濾過した。次に、透明にされた反応混合物を、５ｍｌの氷酢酸により約３のｐＨに酸性化た。沈殿物をセライト５２１濾過、セライトパッドのメタノールによる続くすすいだ。メタノール溶液を１０〜２０μＭのガラス濾過器を通して濾過しそして回転蒸発により蒸発した。この生成物を、７０ｍｌの７６ｍＭの炭酸水素ナトリウム（０．９５当量）における溶解によりナトリウム塩に転換し、そして凍結乾燥した。生成物は、例２６のものと同一であった。
【０２０６】
例２８．ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の固定されたカンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ加水分解
３０．０ｇのカンジダ　アンタルクチカ“Ｂ”リパーゼ（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、３００ｍｌの水に溶解し、そして３×４Ｌの５０ｍＭの水性炭酸水素ナトリウム（ｐＨ＝６．４）に対して透析した。３６０ｍｌのＦｈａｒｍａｃｉａ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを、粗ガラス濾過器に置き、そして５×４５０ｍｌの氷冷却された１ｍＭの水性ＨＣｌによりすすいだ。そのすすがれたＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、前記透析された酵素溶液と組合した。得られる懸濁液を、周囲温度（約２２℃）で２．０時間、撹拌した。セファロース／酵素接合体を、粗ガラス濾過器上で単離し、そして次に、１０００ｍｌの１００ｍＭの水性ＴＲＩＳ（ｐＨ＝７．４５）において１５分間、撹拌した。
【０２０７】
この懸濁液を濾過し、そしてもう１つの１０００ｍｌの１００ｍＭの水性ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４５）と共に４℃で一晩インキュベートした。朝、固定された酵素を濾過し、そして水による洗浄の後、２０００ｍｌの三ツ首丸底フラスコに配置した。４３ｇのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤を添加し、そして固形物を８００ｍｌの脱イオン水に懸濁した。フラスコに、オーバーヘッド撹拌機、及び注射器ポンプを調節することによって反応混合物のｐＨを５．９〜６．２に維持するよう設定されたｐＨ−安定装置を固定した。注射器ポンプを、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムにより充填した。反応の進行をＨＰＬＣにより追跡した。反応がほぼ完結した後、固定された酵素を濾過し、そして溶液相を凍結乾燥した。次に、乾燥固形物を約１１ｍｌの無水ＴＨＦに懸濁し、そして濾過した。
【０２０８】
例２９．メチルスクシニル−Ｎ−キャップのβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ治療剤の大規模合成
１２０ｍモルのドキソルビシン・ＨＣｌ及び１９９ｍモルのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕを、窒素下で無水ＤＭＦ（１０Ｌ）に溶解した。７６ｍｌのＤＩＥＡ（４３４ｍモル）を、反応混合物に添加し、そしてその反応混合物を、室温で、窒素下で１０分間、撹拌した。次に、反応混合物を、１０分にわたって０℃に冷却した。別々のフラスコにおいて、ＤＭＦ（５００ｍｌ）中、８６４ｇＨＡＴＵ（２２０ｍモル）の溶液を分離した。そのＨＡＴＵ溶液を、前記反応混合物に、その混合物を０℃で維持しながら、２０分間にわたってゆっくりと添加した。反応混合物を３０分間、０℃で撹拌した。
【０２０９】
水（２５Ｌ）中、ＮａＣｌ（７．５ｋｇ、少なくとも３０％ｗ／ｖ）の溶液を分離し、そして０℃に冷却した。次に、反応混合物を、冷却されたブライン溶液に、撹拌しながら１２０分間にわたってゆっくりと添加した。前記溶液の色は赤色を維持し、青色の溶液は、ｐＨが酢酸の添加により、５．８〜６．０にすぐに調節する必要があることを示した。温度を、約５℃で維持した。赤色の沈殿物を、中位の多孔性ガラス濾過器上で濾過し、水により洗浄し、そしてＰ２Ｏ５上で真空下を乾燥し、ＭｅＯＳｕｓ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０２１０】
例３０．微量のドキソルビシンを除去するためにＰｓ−イソシアネートビーズによるＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの処理
１４６．４のＰＳ−イソシアネートビース（２４０ｍモル；Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｌａｂ， Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ， ＣＡにより供給される）を、１．５Ｌの無水ＤＭＦに溶解し、そして室温で５〜１０分間、膨潤した。膨潤されたビーズを、ガラス濾過器を通して濾過し、そして追加の５００ｍｌの無水ＤＭＦにより洗浄した。１１２ｍモルのＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、１０００ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、そして１２ｍモルのＤＩＥＡ、続いて膨潤されたＰＳ−イソシアネートビーズを添加した。
【０２１１】
反応混合物を室温で撹拌し、そしてドキソルビシンピークの量が０．１％以下になるまで、ＨＰＬＣを用いてモニターした。ＨＰＬＣ分析を、Ｗａｔｅｒ ２６９０カラムを用いて行った：Ｗａｔｅｒ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ｓｈｉｅｌｄ Ｃ８ ３．５μＭ ４．６×１５０ｍｍ（カタログ番号ＷＡＴ０９４２６９）、溶媒：Ａ−８０％の２０ｍＭの蟻酸アンモニウム（ｐＨ＝４．５）、２０％アセトニトリル、溶媒：Ｂ−２０％蟻酸アンモニウム（ｐＨ＝４．５）、８０％アセトニトリル。カラム温度：調節された室温、サンプル温度；４℃、運転時間：３７．５分、検出器：２５４ｎｍ， 流速：１．０ｍｌ／分、注入量１０μｇ（０．５ｍｇ／ｍｌ×０．０２ｍｌ）、移動相Ａ及びＢ．グラジエント：１００％移動相〜１００％移動相Ｂの３７．５分の線状グラジエント（７．５分の平衡化遅延を伴なう）。
【０２１２】
ドキソルビシンピークの量が０．１％以下である場合、反応混合物を、粗ガラス濾過を通して濾過し、ビーズを除いた。３．５ｌの水中、１．１ｋｇのＮａＣｌのブライン溶液（少なくとも３０％ｗ／ｖ）を調製し、そして０℃に冷却した。次に、濾過された反応混合物を、冷却されたブライン溶液に撹拌しながら４５分間にわたってゆっくりと添加した。溶液の色彩は赤のままであり、青色の溶液は、ｐＨが酢酸の添加により５．８〜６．０にすぐに調節する必要があることを示した。赤色の沈殿物を中位のガラス濾過器を通して濾過し、水により洗浄し、そしてＰ２Ｏ５上で減圧下で乾燥し、いずれの残留ドキソルビシンも有さないＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。
【０２１３】
ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを、ＩＬのＭｅＯＨに溶解し、そして次に、メタノール溶液を、撹拌しながら、６０分間にわたって、１４Ｌの冷却されたエチルエーテルにゆっくりと添加した。赤色の沈殿物を、中位のガラス濾過器を通して濾過し、エーテル（１Ｌ）により洗浄し、そして真空下で乾燥し、ＭｅＯＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを得た。純度は、例２９に記載のようにして、ＨＰＬＣにより決定された。
【０２１４】
例３１．Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘを生成するためにＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの酵素的加水分解
ＣＬＥＣ−ＣＡＢ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｔｉｃａ “Ｂ” リパーゼ）酵素を、溶液形で購入し（Ａｌｔｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡから）、ここで酵素の濃度は溶液１ｍｌ当たりの乾燥酵素の重量により定義される。粗酵素懸濁液を数分間、振盪し、均質溶液を得た。５０４ｍｌ（３２８ｍモル）のこの均質溶液をフラスコにアリコートした。２．５Ｌの脱イオン水を添加し、そしてこのスラリーを、磁気撹拌機を用いて１０分間、撹拌した。酵素溶液を粗ガラス濾過器を用いて、酵素を乾燥しないで濾過した。酵素をフラスコに戻した。酵素を水に懸濁し、そしてさらに３度、濾過した。
【０２１５】
酵素ケークを、５５０ｍｌの脱イオン水に再懸濁し、そしてＲＢフラスコに移した。この懸濁液に、ＭｅＯＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（１０６ｍモル）を添加し、そしてその反応混合物を室温（２５℃）で撹拌した。反応混合物のｐＨを、１ＮのＮａＨＣＯ３溶液により充填された注射器ポンプを備えたｐＨ−装置により、５．８〜６．１に維持した。反応の進行を、例２９に記載のようにして、定期的なＨＰＬＣモニターにより追跡した。反応は、それがＨＰＬＣにより決定される場合、完全であると思われるまで、続けられた。
【０２１６】
反応を早めるために、追加のＣＬＥＣ酵素を、反応が完結である場合、必要とした。追加のＣＬＥＣ酵素（均質溶液）を、上記のようにカラム型で洗浄した。酵素ケークを、１．１Ｌの脱イオン水に再懸濁し、そして反応混合物に添加した。反応混合物を、定義的にＨＰＬＣによりモニターしながら、室温で撹拌し、そしてｐＨを、５．８〜６．１に維持した。
ＣＬＥＣ酵素を、０．２μＭのフィルターを通しての濾過により反応混合物から除去し、そして５００ｍｌの脱イオンによりすすいだ。次に、濾液を凍結乾燥し、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ・Ｎａを得た。
【０２１７】
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が特異的に且つ個々に引用により組み込まれていることを示されているかのように、同じ程度に引用により本明細書に組み込まれる。
本発明は現在、十分に記載されているが、多くの変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ−１Ｄは、略語、名称及び構造の表である。
【図２】
図２は、標的細胞の細胞外付近及び標的細胞内での本発明のプロドラッグの分解の典型的なスキームである。
【図３】
図３は、本発明の典型的な中間体であるＦｍｏｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕの合成を示す。
【図４】
図４は、本発明の典型的な中間体であるメチル−スクシニル−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕの“Ｆｍｏｃ−路”合成を示す。
【図５】
図５は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの塩形の“Ｆｍｏｃ−路”合成を示す。
【図６】
図６は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの塩形の“エステル−路”合成を示す。
【図７】
図７は、本発明の典型的な中間体であるアミノ保護されたβＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの合成を示す。
【図８】
図８は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの塩形の“アリルエステル路”を示す。
【図９】
図９は、本発明の典型的な化合物であるＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの“樹脂路”を示す。
【図１０】
図１０は、本発明のプロドラッグにおいて有用なオリゴペプチドの表である。
【図１１】
図１１は、単一ボーラス用量のプロドラッグの静脈投与後、１及び４時間でのＳｕｃ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物の血漿レベルのグラフである。
【図１２】
図１２は、単一ボーラス用量のプロドラッグの静脈投与後、０〜２及び２〜２４時間で集められた尿に存在するＳｕｃ− Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物の量のグラフである。
【図１３】
図１３は、単一ボーラス用量のプロドラッグの静脈投与後、１及び４時間でのＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物の血漿レベルのグラフである。
【図１４】
図１４は、単一ボーラス用量のプロドラッグの静脈投与後、０〜２及び２〜２４時間で集められた尿に存在するＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ及びその代謝物の量のグラフである。
【図１５】
図１５は、Ｓｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより処理されたマウス、又はビークル対照を受けるマウスのいずれかの％体重変化のグラフである。
【図１６】
図１６は、ビークル対照を与えられたか又はＳｕｃ−βＡｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘにより処理されたＬＳ１７４Ｔ異種移植されたマウスにおける腫瘍増殖の速度のグラフである。
【図１７】
図１７は、スキャベンジャ−樹脂又はビーズの使用を通しての遊離治療剤の除去を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004510702.tif 000139
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