(57)【要約】ヒトHisRS遺伝子はSREBP経路の調節因子として同定され、その結果、SREBP経路に関連した障害のための治療標的である。HisRSの調節因子を同定し、HisRSの活性を調節する薬剤のスクリーニングを含む方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SREBP経路調節剤の候補を同定する方法であって、前記方法が：
（a）HisRSポリペプチド又は核酸を含むアッセイ系を提供し；
（b）試験薬剤が存在しなければ該系が対照活性を提供する条件下において、試験薬剤を該アッセイ系に接触させ；及び
（c）試験薬剤により偏向された活性と対照の活性との間の差違が、該試験薬剤がSREBP経路調節剤の候補であると同定する、スクリーニングアッセイ系の試験薬剤により偏向された活性を検出する段階を含む方法。
【請求項２】
該アッセイ系がHisRSポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを包含し、候補試験薬剤が小分子調節因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該スクリーニングアッセイが酵素的アッセイである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該アッセイ系がHisRSポリペプチドを含む結合アッセイを包含し、候補試験薬剤が抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該アッセイ系がHisRS核酸を含む発現アッセイを包含し、候補試験薬剤が核酸調節因子である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該核酸調節因子がアンチセンスオリゴマーである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該核酸調節因子がPMOである請求項６の方法。
【請求項８】
該アッセイ系がHisRSを発現する培養細胞又は非ヒト動物を含み、該アッセイ系がSREBP経路、脂質代謝、又は脂質生成に関連した活性における薬剤によって偏向された変化を検出するアッセイを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該アッセイ系が培養細胞を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該アッセイがSREBP転写標的の発現、SREBPタンパク質のプロセッシング、脂質蓄積、脂質代謝から成るグループから選択される現象を検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二のアッセイ系が非ヒト動物を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
該非ヒト動物が糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルを提供するマウスである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該非ヒト動物がSREBP経路遺伝子を誤発現する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該アッセイ系が肝臓性脂質の蓄積、血漿性脂質の蓄積、脂肪性脂質の蓄積、血中のグルコースレベル、インスリンレベル、及びインスリン感受性、及びSREBP転写標的の発現から成るグループから選択される現象を検出するアッセイを包含する請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
該非ヒト動物がアテローム性動脈硬化症のモデルを提供する請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
該アッセイ系が血漿脂質レベル及び動脈障害形成から成るグループから選択される現象を検出するアッセイを包含する請求項１３又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
該アッセイ系が血漿脂質レベルを検出し、検出された脂質がトリグリセリド、コレステロール、又はリポタンパク質である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（d）HisRSを発現する培養細胞又は非ヒト動物を含む第２のアッセイ系を提供し、
（e）試験薬剤又はそれから誘導される薬剤が存在しなければ該系が対照の活性を提供する条件下において、(b)の試験薬剤又はそれから誘導される薬剤を第２のアッセイ系に接触させ；及び
（f）第二のアッセイ系の薬剤により偏向された活性と対照の活性との間の差違が、該試験薬剤又はそれから誘導される薬剤が候補SREBP経路調節薬剤であることを確認し、第二のアッセイ系がSREBP経路、脂質代謝、又は脂肪生成に関連する活性中での薬剤により偏向された変化を検出する第二のアッセイを包含する第２のアッセイ系の薬剤により偏向された活性を検出する：
さらなる段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
第二のアッセイ系が培養細胞を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第二のアッセイが、SREBP転写標的の発現、SREBPタンパク質プロセッシング、脂質蓄積及び脂質代謝から成るグループから選択される現象を検出する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第二のアッセイ系が非ヒト動物を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該非ヒト動物が糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルを提供するマウスである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該非ヒト動物がSREBP経路遺伝子を誤発現する請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該第二のアッセイ系が肝臓性脂質の蓄積、血漿性脂質の蓄積、脂肪性脂質の蓄積、血中のグルコースレベル、インスリンレベル、及びインスリン感受性、及びSREBP転写標的の発現から成るグループから選択される現象を検出するアッセイを包含する請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
該非ヒト動物がアテローム性動脈硬化症のモデルを提供する請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
該アッセイ系が血漿脂質レベル及び動脈障害形成から成るグループから選択される現象を検出するアッセイを包含する請求項２３又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳類動物細胞中のSREBP経路活性を調節する方法であって、該細胞をHisRSポリペプチド又は核酸と特異的に結合する薬剤に接触させることを含む方法。
【請求項２８】
該薬剤が、SREBP経路に関連する病態を呈することが予見される哺乳類動物に投与される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該薬剤が小分子調節因子、核酸調節因子、又は抗体である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
SREBP経路活性が減じられる請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が出典として取込まれ、2001年1月12日に出願された米国仮出願番号：60/261569, に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
医薬業界では、コレステロール合成と代謝、特に分子レベルに関与するメカニズムを理解することに多くの興味が持たれており、その結果アテローム性動脈硬化の治療及び予防のために血中コレステロール低下薬が開発されている。さらに、脂質欠損とインスリン耐性とを結びつける分子機構を理解することに興味が持たれている。高脂血症及び遊離脂肪酸レベルの上昇は、しばしば同一患者において発症し、２型糖尿病及び循環器病疾患へと進行する主たる危険因子である肥満症及びインスリン耐性を含む、幾つかの疾患間の関連において定義される「代謝症候群」と相関する。現在の研究により、グルコースレベルに加えて、脂質レベルのコントロールが２型糖尿病、心臓疾患、及び他の代謝症候群の徴候を治療するのに必要とされることが示唆されている（Santomauro AT等, Diabetes (1999)48:1836-1841）。
哺乳類動物における脂質代謝に関与するあるメカニズムを理解する点において、最近進歩がみられている。重要な構成要素はステロール制御エレメント結合タンパク質（SREBP）経路である。SREBPsはコレステロールと脂肪酸の合成、及び輸送に関与する遺伝子を活性化する転写因子である。SREBPは肝臓におけるインスリン作用における主要なメディエーターであり、SREBPsの発現及び機能における変更について、肥満及びインスリン耐性の患者又は動物モデルに関して記述されている(Shimomura I等, PNAS (1999) 96: 13656-61；Shimomura I等, Journal of Biological Chemistry (1999) 274: 30028-32)。また、SREBPsは脂肪細胞の分化過程、及び特に主要な様式で脂肪生成を促進し得る転写因子としての脂肪細胞の遺伝子発現にも関係する(Spiegelman等, Cell (1996) 87: 377-389により総説されている)。SREBPの機能はステロール又はポリ不飽和脂肪酸（PUFAs）の細胞内レベルによって制御される(Xu J.等, J. Biol. Chem. (1999) 274: 23577- 23583)。
【０００３】
高ステロール又はPUFA状態において、SREBPsは核膜及び小胞体（ER）に結合されることで核から排除されていることにより、不活性化状態が維持される膜結合タンパク質前駆体として維持される。その膜結合形態におけるSREBPは細胞質に面する大きなN末端及びC末端セグメントとオルガネラの内腔に突出する短いループを有している。N末端ドメインは塩基性へリックス−ループ−へリックス−ロイシンジッパー（bHLH-Zip）ファミリーの転写因子であり、多くの転写活性化因子に典型的な「酸ブロブ（acid blob）」を含んでいる (Brown及びGoldstein, Cell (1997) 89: 331-340)。N末端酸ブロブは、その他多くのDNA結合転写制御因子において見出されるものと類似して塩基性へリックス−ループ−へリックス−ロイシンジッパー（bHLH-Zip）の後に存在する。
SREBPシグナル経路の幾つかの構成要素が知られている。低ステロール状態において、SREBPの酸ブロブ／bHLH-Zipドメインは、速やかに核に移行し、転写を活性化するための特異的なDNA配列と結合した後、膜から遊離される。２つの連続したタンパク質分解性の切断が関与する。第一のプロテアーゼはサイト１プロテアーゼ（S1P）と称され、内腔のループのほぼ真中でSREBPを切断する(Sakai等, J. Biol. Chem (1998) 273: 5785-5793)。
サイト１における切断の後、第二のプロテアーゼ、サイト２プロテアーゼ（S2P）はN末端フラグメントを切断し、細胞基質中に成熟したN末端ドメインを放出させ、それは速やかに核内に入るが、明らかに膜貫通ドメインの一部はC末端に結合されたままである(Rawson等, Molec Cell (1997) 1: 47-57)。成熟した、転写活性なSREBPは、プロテオソーム依存的な過程において速やかに分解される。このタンパク質分解過程と速やかな代謝回転の組合わせにより、SREBP系が細胞膜構成要素の変化に素早く対応可能となる。
【０００４】
SREBPsのプロセッシング系の第三の構成要素は、SREBP切断活性化タンパク質（SCAP）と呼ばれる。SCAPはS1Pを低ステロール状態で活性化する大きな膜貫通タンパク質である(Hua等, Cell (1996) 87: 415-426)。これまでに、SREBP経路は主に哺乳類動物の細胞培養を用いて、コレステロール代謝又は細胞内コレステロール輸送の制御に欠損を有する変異細胞を単離することにより研究されてきた。その後は、変異体は機能的相補性による遺伝子クローニングのホストとして役に立つ。これが、S1P、S2P及びSCAP遺伝子の分子クローニングの契機となった(Rawson等, 上掲；Hua等, 上掲；Goldstein等, US Pat. Nos. 5,527,690及び5,891,631及びPCT出願No. WO00/09677)。
SREBP経路の更なるプロセッシングタンパク質及びそれらの活性の制御については比較的あまり知られていない。SREBP機能を制御するタンパク質は、異脂肪血症及び心臓血管性疾患に対する関連した増大した危険性をコントロールするための優れた治療上の標的となるかもしれない。
幾つかのSREBP経路遺伝子が脊椎動物において同定されている。「HLH106」(GI079656)と称されるショウジョウバエのSREBPの単離について記述されている(Theopold等, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1996) 93 (3): 1195-1199)。シー・エレガンスSREBP、並びにその他のショウジョウバエ及びシー・エレガンスSREBP経路遺伝子についてWO00076308A1中に開示されている。
ショウジョウバエ及びシー・エレガンスなどのモデル生物のゲノムを操作及びスクリーニングする能力は、遺伝子、経路、細胞内過程の有意な進化的保存性に起因して、より複雑な脊椎動物生物と直接関連性を有する生化学的過程を解析するための強力な手段を提供する。そのようなモデル生物の特定の経路に関与する遺伝子の新規機能を同定することは、哺乳動物において相関する経路及びそれらを調節する方法の理解に直接貢献する（例えば、Miklos GL及びRubin GM, Cell 1996, 86:521-529を参照のこと）。ショウジョウバエ及びシー・エレガンスはヒトの病理に罹患しないが、種々の実験モデルは病態を模倣することができる。病態モデルとショウジョウバエ又はシー・エレガンス遺伝子の修飾された発現との関連は、ヒト疾患とヒトオルソログとの関連性を同定し得る。
【０００５】
一例において、遺伝学的スクリーニングは、既知遺伝子（「遺伝的エントリーポイント」）の誤発現(mis-expression)−一般に、減少した、増大した又は異所的な発現−の原因となる、変異（一般に可視化可能又は選択可能）表現型を示す脊椎動物モデル生物中で行われる。さらなる遺伝子は、ランダム又はターゲットされた形で変異導入される。さらなる遺伝子変異が、元々の変異表現型を変化させるとき、この遺伝子は直接又は間接的に遺伝的エントリーポイント及びその関連経路と相互作用する「修飾因子」として同定される。遺伝的エントリーポイントが、脂質代謝疾患などヒトの病理に関連するヒト遺伝子のオルソログである場合、スクリーニングにより新規治療のための候補ターゲットである修飾遺伝子を同定することができる。
遺伝的エントリーポイントとしてシー・エレガンスSREBPを用いたスクリーニングでは、我々はヒトヒスチジルtRNAシンテターゼ（HisRS）遺伝子（GI6996014）のシー・エレガンスオルソログであるT11G6.1(GenBank識別番号[GI]7507690)がSREBP機能の修飾因子であることを発見した。
ヒスチジルtRNAシンテターゼ（HisRS）の第一の機能はシスチジンtRNA（tRNAHis）へヒスチジンを結合させることであり、このことはタンパク質にヒスチジンが取り込まれるために必要なことである。HisRSはクラスIItRNAシンテターゼ（Gly, Pro, Ser及びThr tRNAシンテターゼも含む）と共通する特徴的なモチーフを持つホモ二量体酵素である。これらの酵素は、バクテリアからヒトの範囲におよぶ種において進化上保存されている(Amaar, Y. G.及びD. L. Baillie (1993) Nucl. Acids Res. 221: 4344-4347)。それらの第一次的な機能に加えて、HisRSは細胞内シグナル分子であるジアデノシンテトラホスフェートを合成することができる幾つかのaaRSの一つである(Freist, W.等 (1999) Biol. Chem. 380: 623-646；Kisselev, 等 (1998) FEBS Lett. 427: 157-163)。この分子は膵臓細胞中に多く存在し、ATP感受性K+(KATP)チャンネルを阻害すると考えられている(Jovanovic,等 (1997) Biochemical Pharmacology 54: 219-225)。膵臓細胞中で、これらのチャンネルの阻害はグルコースに刺激されたインスリン放出に必要である（これはスルホニル尿素の作用メカニズムである）。
【０００６】
さらに、HisRSは栄養素のセンシング及びp70 S6キナーゼの制御を通じた翻訳のコントロールに関係していた。活性化されると、S6Kは40Sリボソームタンパク質であるS6をリン酸化し、リボソームmRNAsの翻訳開始の増大をもたらす(Kawasome, 等 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 5033-5038)。HisRS中に温度感受性変異を保持する細胞は、非許容温度にシフトさせた場合、S6K活性を減少させることが示された(Iiboshi, Y., 等 (1999) J. Biol Chem. 274: 1092-1099)。このフィードバック機構は解明されていないが、脱アシル化されたtRNAsの蓄積によりS6K活性を阻害するシグナルが生じるようである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明は、HisRSポリペプチド又は核酸を含むアッセイ系を用い；試験薬剤が存在しなければ該系が対照の活性を提供する条件下において、試験薬剤を該アッセイ系に接触させ；及び、試験薬剤により偏向された活性と対照の活性との間の差違が、該試験薬剤がSREBP経路、脂質代謝及び／又は脂肪生成を調節する候補薬剤であると同定する、アッセイ系の試験薬剤により偏向された活性を検出する、SREBP経路、脂質代謝、及び／又は脂肪生成を調節する候補薬剤を同定する方法を提供する。候補試験薬剤は、小分子調節因子、抗体、及び、中でもアンチセンスオリゴマー及びPMOsなどの核酸調節因子を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施態様において、本アッセイ系はHisRSを発現する培養細胞又は非ヒト動物を含み、本アッセイ系はSREBP経路、脂質代謝、及び／又は脂肪生成における薬剤により偏向された変化を検出する。
ある実施態様において、候補HisRS調節剤は、無細胞又は細胞ベースのアッセイにおいて同定され、SREBP経路、脂質代謝、及び／又は脂肪生成に関連した活性における薬剤により偏向された変化を検出する第二のアッセイ系は、候補薬剤の活性を調節するSREBP経路を確認するために用いられる。好ましい実施態様において、第二のアッセイは、SREBP経路と関連した活性における薬剤により偏向された変化を検出する。好ましい第二のアッセイ系は、培養細胞で実施される。
さらに、本発明は、哺乳動物細胞におけるSREBP経路を調節する方法であって、該細胞をHisRSポリペプチド又は核酸と特異的に結合する薬剤と接触させることを含む方法を提供する。好ましい実施態様において、該薬剤は、SREBP経路に関連した症状を呈していることが予見される哺乳動物に対して投与される。好ましい薬剤には、小分子調節因子、核酸調節因子、又は抗体が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の詳細な説明
我々は、HisRSとSREBP経路との関連性を同定するために欠損のあるSREBPシグナルに関するシー・エレガンスのモデルを用いた。また、我々はシー・エレガンスにおけるSREBP活性の減少及び消去（遺伝子変異又はRNA干渉[RNAi]による）の結果、腸における脂質蓄積の減少に起因するpale intestine表現型が生じることを示している。さらに、シー・エレガンスSREBPの強い機能欠損は幼虫での成長停止表現型を引き起こす(W000076308A1)。SREBPのpale intestine表現型の修飾因子（サプレッサー）を同定するために遺伝学的スクリーニングがシー・エレガンス中で行われた。特に、我々は機能欠損SREBP表現型を作成するためのRNAi摂食システムを用い、変異が導入された場合にpale intestine表現型を呈するSREBP遺伝子に対応する二重鎖(ds)RNAを生産する大腸菌を与えても（「SREBP RNAi摂食プレート上にて」）、より正常な表現型シー・エレガンスの回復が生じる遺伝子をスクリーニングした。スクリーニングに関し、野生型の線虫にEMSで変異導入し、２世代が新たに導入された変異に対して同型接合性の線虫を生むために自家受精することを可能ならしめた。生じた同型接合体は、SREBP RNAi摂食プレート上に置かれた。サプレッサー変異を含むシー・エレガンスは、SREBP RNAi摂食プレート上で野生型シー・エレガンスのpale intestineよりさらに暗色に色素化された腸を持つものとして同定された。修飾遺伝子の同一性（identity）は、遺伝学的マッピング、ポジショナルクローニング及び変異体の表現型上のレスキューを通じて明らかにされた。
【００１０】
我々は、シー・エレガンスSREBP表現型のサプレッサー、つまり、SREBP経路のメンバーとしてヒトHisRS遺伝子のオルソログであるT11G6.1(GI7507690)を同定した。従って、HisRS遺伝子（即ち、核酸及びポリペプチド）は、脂質（例えば、脂肪酸及びコレステロール）代謝、脂肪生成、及び／又はその他SREBPシグナル経路に関連した病態に関連した障害の治療に対して魅力的な薬物標的である。一例において、治療は、代謝症候群に関連する病態を治療するためにSREBP経路を介するシグナルを減少させることに関与する。
本発明は、SREBP経路の更なる解明及びSREBP経路に関連する病態に対する診断及び治療様式を開発するために有用な、HisRSの機能の評価方法、及びHisRS活性を調節（一般に阻害又はアゴナイズ）する方法をインビトロ及びインビボにおいて提供する。ここで用いられる場合、SREBPシグナル経路に関連する病態は、SREBP経路が健康状態を維持することに寄与する病態、並びに経過がSREBP経路の調節により変更され得る病態を含む。
【００１１】
HisRS核酸及びポリペプチド
ヒトHisRS核酸（cDNA）及びタンパク質配列は、配列番号：１及び２にそれぞれ提示されている。
「HisRSポリペプチド」という用語は、全長HisRSタンパク質又は断片、又は「機能的に活性のある」、つまりHisRSタンパク質の誘導体又は断片が全長、野生型HisRSタンパク質に関連する一又は複数の機能的な活性を示す、それらの誘導体のことを意味する。一例として、断片又は誘導体は、以下でさらに論じられるように、それが、免疫化、阻害的抗体の作出などの免疫アッセイにおいて使用され得るような抗原性を有してもよい。好ましくは、機能的に活性なHisRS断片又は誘導体は、酵素活性、シグナル活性、天然の細胞内基質と結合する能力などのHisRSタンパク質に関連した一又は複数の生物学的活性を示す。好ましいHisRSポリペプチドは酵素活性を示す。一実施態様において、機能的に活性なHisRSポリペプチドは、細胞ベースの又は動物アッセイなどにおいて、欠損のある内在性のHisRS活性をレスキューすることができるHisRS誘導体である；レスキューする誘導体は、同一又は異なる種に由来するものであってもよい。HisRS断片が調節剤を同定するためのアッセイにおいて使用される場合、その断片は、好ましくはC-又はN-末端又は、特に触媒ドメインなどのHisRSドメインを含み、好ましくは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも２５、及び最も好ましくは少なくとも５０のHisRSタンパク質に隣接するアミノ酸を含む。機能的ドメインは、PFAMプログラム（Bateman A等, 1999 Nucleic Acids Res 27:260-262；ウェッブサイトは pfam,wustl,edu）を用いて同定され得る。
【００１２】
「HisRS核酸」という用語は、HisRSポリペプチドをコードするDNA又はRNA分子を意味する。好ましくは、HisRSポリペプチド又は核酸又はそれらの断片は、ヒト由来であるが、ヒトHisRSと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、及び最も好ましくは９５％の配列同一性を持つそれらのオルソログ又は誘導体であり得る。ここで用いられる場合、特定された対象配列、又はそれらの特定された部分に関する「パーセント（％）配列同一性」は、デフォルト値にセットされたサーチパラメーターを用いたプログラムWU-BLAST-2.0a19（Altschul等, J. Mol. Biol. (1997)215:403-410；http://blast.wustl.edu/blast/README.html）によって作成されるように、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要ならばギャップを導入した後、対象配列（又は特定されたその部分）中のヌクレオチド又はアミノ酸と同一である候補誘導体配列中のヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージとして定義される。HSP S及びHSP S2パラメーターは、ダイナミックな値で、特定の配列の構成及び対象の配列がサーチされる特定のデーターベースの構成に依存するプログラム自体により設定される。「％同一性値」は一致する同一ヌクレオチド又はアミノ酸数をパーセント同一性が報告されている配列長で除することにより決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性を決定するためのものと同一ではあるが、計算上同一のアミノ酸に加えて保存的なアミノ酸置換を含む計算を行うことにより決定される。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸がタンパク質の折り畳み又は活性がそれ程影響を受けないような類似の特徴を有する他のアミノ酸と置換されることである。互いに置換し得る芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンである；交換可能な疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンである；交換可能な極性アミノ酸は、グルタミン及びアスパラギンである；交換可能な塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンである；交換可能な酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸である；及び交換可能な小アミノ酸は、アラニン、セリン、スレオニン、システイン及びグリシンである。
【００１３】
対象の核酸分子の誘導体核酸分子は、配列番号：１の核酸配列にハイブリダイズする配列を含む。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、ハイブリダイゼーション及び洗浄中における、温度、イオン強度、pH、及びホルムアミドなどの変性剤の存在によってコントロールされ得る。通常用いられる条件は、容易に入手可能な手順書（例えば、Current Protocol in Molecular Biology, Vol.1, Chap.2.10, John Wiley & Sons, Publishers (1994)；Sambrook等, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)）中に詳説されている。ある実施態様において、本発明の核酸分子は、：6X 1強度クエン酸（SSC）(1XSSCは、0.15M NaCl, 0.015M クエン酸ナトリウム;pH7.0)、5Xデンハード溶液、0.05% ピロリン酸ナトリウム及び100μg/ml ニシン精子DNAを含む溶液中、8時間から一晩、65℃で核酸を含むフィルターのプレハイブリダイゼーション；6X SSC、1X デンハード溶液、100μg/ml  酵母tRNA及び0.05% ピロリン酸ナトリウムを含む溶液中、18-20時間、65℃でのハイブリダイゼーション；及び0.2X SSC及び0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)含む溶液中、1時間、65℃でのフィルターの洗浄、を含む緊縮なハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１のヌクレオチドを含む核酸分子とハイブリダイズすることができる。他の実施態様において、：35%ホルムアミド、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1% PVP、0.1% フィコール、1% BSA、及び500μg/ml 変性サケ精子DNAを含む溶液中、6時間、40℃での核酸を含むフィルターの前処理；35%ホルムアミド、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02% PVP、0.02% フィコール、0.2% BSA、100μg/ml サケ精子DNA及び10%(重量／体積)硫酸デキストランを含む溶液中、18-20時間、40℃でのハイブリダイゼーション；その後、2X SSC及び0.1% SDSを含む溶液中、1時間、55℃での2度の洗浄を行うこと、を含む中程度の緊縮性なハイブリダイゼーション条件が使用される。あるいは、：20% ホルムアミド、5XSSC、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5X デンハード溶液、10% 硫酸デキストラン、及び20μg/ml 変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中、8時間から一晩、37℃でのインキュベーション；同一のバッファー中18から20時間のハイブリダイゼーション；及び1XSSC中、約37℃、1時間のフィルターの洗浄を含む低い緊縮性の条件が使用される。
【００１４】
ある実施態様において、HisRSはヒトHisRSのオルソログである。これらの遺伝子のヒトオルソログを同定する方法は、当該技術分野において既知である。通常、異なる種におけるオルソログは、一又は複数のタンパク質モチーフ及び／又は3次元構造の存在に起因する同一の機能を保持する。オルソログは、一般に、タンパク質ベイト配列を使用するBLAST分析などの、配列相同性分析によって、通常同定される。フォワードBLASTの結果から得られた最もよく的中した配列が、リバースBLASTにおいて元々の疑問（query）配列を検索する場合（Huynen MA及びBork P, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5849-5856；Huynen MA等, Genome Research (2000)10:1204-1210）、配列が潜在的オルソログであると評価される。CLUSTAL（Thompson JD等, 1994, Nucleic Acids Res 22:4673-4680）などの複数配列のアライメントのためのプログラムは、オルソログタンパク質の保存された領域及び／又は残基を強調し、系統樹を作成するために使用され得る。多様な種に由来する複数の相同配列（例えば、BLAST分析を介して検索される）を表す系統樹において、２つの種に由来するオルソログ配列は、一般に、これら２つの種に由来する全ての他の配列に関し、系統樹上において最も近いようである。タンパク質の折り畳みに関する構造的スレッディング又は他の分析（例えば、ProCeryon, Biosciences, Salzburg, Austriaを用いて）によっても、潜在的オルソログは同定される。進化において、遺伝子の倍化が種分化の後に起こる場合、ショウジョウバエなどのある種における単一遺伝子が他の種、例えばヒトにおける複数遺伝子（パラログ）と一致することもある。ここで用いられる場合、「オルソログ」という用語は、パラログを含む。
【００１５】
HisRS核酸及びポリペプチドの単離、生産、発現及び誤発現
HisRS核酸及びポリペプチドは、HisRSの機能を調節する薬剤を同定し、試験するために、またSREBP経路におけるHisRSの関与に関連した他の用途のために有用である。HisRS核酸は、任意の利用可能な方法を用いて得られる。例えば、DNAライブラリーをスクリーニングし又はポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いることよって対象のcDNA又はゲノムDNA配列を単離する技術は当該技術分野において周知である。
HisRSポリペプチドを得るために多様な方法が利用可能である。通常、ポリペプチドに関して意図された使用により、発現、生産及び精製方法の詳細が決定される。例えば、調節剤のスクリーニングにおける使用のためのポリペプチドの生産には、これらのタンパク質の特異的な生物学的活性を保存する方法が必要であるが、抗体作製のためのポリペプチドの生産には、特定のエピトープの構造的な完全性が要求される。スクリーニング又は抗体作製のために精製されるポリペプチドの発現には、特定のタグの付加が必要である（即ち、融合タンパク質の生産）。脂質代謝における関与などのHisRSの機能を評価するために用いられる細胞ベースのアッセイのためのHisRSポリペプチドの過剰発現には、これらの細胞活性を有する真核細胞株中での発現が必要とされる。タンパク質の発現、生産、及び精製のための技術は、当該技術分野において周知である；従って、何れか適切な手段が使用される（例えば、Higgins SJ及びHames BD(eds) Protein Expression：A Practical Approach, Oxford University Press Inc., New York 1999；Stanbury PF等, Principles of Fermentation Technology, 2nd edition, Elsevier Science, New York, 1995；Doonan S(ed.)Protein Purification Protocols, Humana Press, New Jersey, 1996；Coligan JE等, Current Protocols in Protein Science(eds.), 1999, John Wiley & Sons, New York；U.S. Pat.No.6,165,992）。
【００１６】
HisRSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、挿入されたタンパク質コード化配列の発現のために、任意の適当なベクター中に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含む必要な転写及び翻訳シグナルは、天然のHisRS遺伝子及び／又はその隣接領域に由来してもよく、又は異種性であり得る。多様な宿主−ベクター発現系が利用されるが、例えば、ウィルス（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウィルス（例えば、バキュロウィルス）に感染した昆虫細胞の系；酵母ベクターを含む酵母、又はバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドDNAで形質転換されたバクテリアなどの微生物である。遺伝子産物の発現を調節し、修飾、及び／又は特異的な加工を行う宿主細胞株が使用されてもよい。
HisRSポリペプチドは、場合によっては、異種のタンパク質配列とペプチド結合を介して連結される、融合体又はキメラ産物として発現してもよい。ある適用において、異種の配列は、転写レポーター遺伝子（例えば、GFP又は他の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）をコードする。キメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を適切なコード化フレームとなるように標準的な方法を用いて互いに連結し、キメラ産物を発現することによって調製され得る。また、キメラ産物は、タンパク質合成技術、例えば、ペプチド合成装置（Hunkapiller等, Nature(1984) 310:105-111）の使用などにより調製することもできる。
【００１７】
HisRSポリペプチドは標準的な方法（例えば、イオン交換、アフィニティー及びゲル排除クロマトグラフィー；遠心；溶解度差；電気泳動）を用いて単離及び精製することができる。あるいは、天然のHisRSタンパク質は、標準的な方法により天然資源から精製することができる（例えば、イムノアフィニティー精製）。タンパク質が得られれば、定量化され、イムノアッセイ、バイオアッセイ、又は他の結晶化等の物理的性質の測定などの適当な方法によってその活性が測定される。
また、本発明の方法では、HisRS又はSREBP経路、脂質代謝、及び／又は脂質生成に関連する他の遺伝子の変更された発現（誤発現）のために設計されている細胞を使用してもよい。ここで用いられる場合、誤発現には、異所的な発現、過剰発現、過少発現、及び不発現（例えば、遺伝子ノックアウト又は場合によっては正常に生じる発現をブロックすることによる）を含む。
【００１８】
遺伝学的に修飾された動物
本発明の方法では、HisRS及び／又は脂肪生成、脂質代謝、及び／又はSREBP経路に関与することが知られている他の遺伝子の発現を変更するために遺伝学的に修飾されている非ヒト動物を用いてもよい。好ましくは、遺伝学的に修飾された動物は哺乳動物であり、特にマウス又はラットである。好ましい非哺乳動物種には、ゼブラフィッシュ、シー・エレガンス、及びショウジョウバエが含まれる。好ましくは、変更されたHisRS又は他の遺伝子発現により、変更された遺伝子の正常な発現を示すコントロールの動物と比較した脂質プロファイルなどの検出可能な表現型が生じる。遺伝学的に修飾された動物は、脂肪生成、脂質代謝、及び／又はSREBP経路に関連した病態の動物モデルにおいてSREBP経路をさらに解明するために、また後述するように、候補治療剤のインビボ試験のために使用され得る。
好ましい遺伝学的修飾動物は、トランスジェニックであり、少なくともそれらの細胞の一部は、安定なゲノム挿入又は典型的にはモザイクである余分な染色体エレメントのいずれかとして存在する非天然核酸を有する。好ましいトランスジェニック動物は、子孫の動物の全ての細胞に安定に伝達される生殖系列挿入を有する。
非天然核酸は、都合のよい方法により宿主動物中に導入される。トランスジェニックな非ヒト動物を作製する方法は、当該技術分野において周知である（マウスに関しては、Brinster 等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1985, 82:4438-42；U.S.Pat. Nos.4,736,866, 4,870,009,
4,873,191, 6,127,598；Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1986)を参照のこと；相同組換えに関しては、Capecchi, Science 1989, 244:1288-1292；Joyner等, Nature 1989, 338:153-156を参照のこと；粒子照射に関しては、U.S.Pat.No., 4,945,050を参照のこと；ショウジョウバエに関しては、 Rubin及びSpradling, Science (1982) 218:348-53, U.S.Pat.No.4,670,388；トランスジェニック昆虫に関しては、Berghammer A.J.等, Nature 1999, 402:370-371を参照のこと；ゼブラフィッシュに関しては、Lin S. Methods Mol Biol. (2000);136:375-3830を参照のこと；魚類、両生類、及び鳥類に関しては、Houdebine及びChourrout, Experientia (1991)47:897-905を参照のこと；ラットに関しては、Hammer等, Cell (1990)63:1099-1112を参照のこと；胚幹(ES)細胞に関しては、Teratocaricinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach, E.J. Robertson, ed., IRL Press (1987)を参照のこと；家畜に関しては、Pursel等, Science (1989) 244:1281-1288を参照のこと；非ヒト動物クローンに関しては、Wilmut, I.等. (1997) Nature 385:810-813, PCT公開WO97/07668及びWO97/07669を参照のこと；導入遺伝子の制御された発現に対するリコンビナーゼ系に関しては、Lakso等, PNAS (1992) 89:6232-6236を参照のこと；U.S.Pat.No.4,959,317[cre.loxPに関して]及びO'Gorman等. (1991) Science 251:1351-1355；U.S.Pat.No.5,654,182[FLP/FRTに関して]を参照のこと）。
トランスジェニック動物のゲノム中におけるホモ接合性又は異種接合性の変更により、異所性の発現、過剰発現（例えば、複数遺伝子コピー）過少発現及び不発現（例えば、遺伝子ノックアウト又は場合によっては正常に生じる発現をブロックすることによる）を含む天然遺伝子の誤発現を生じ得る。ある用途において、「ノックアウト」動物は、典型的には、内在性遺伝子中の変更によりその遺伝子の機能低下が誘導され、好ましくは遺伝子発現が検出不能又は僅かなものとなるような相同組換えを用いて作製される。
【００１９】
HisRS 調節剤
本発明はHisRS及び／又はSREBP経路の機能と相互作用し及び／又は調節する薬剤を同定するための方法を提供する。そのような薬剤は、SREBP経路と関連する様々な診断及び治療的適用、並びにHisRSタンパク質及びそのSREBP経路への寄与の更なる解析において有用である。従って、本発明はHisRS相互作用又は修飾剤を投与することによるHisRS活性を特異的に変更する段階を含むSREBP経路を調節するための方法も提供する。
好ましい実施態様において、HisRS調節剤はHisRS活性を阻害又は増強し、場合によっては転写、タンパク質発現、タンパク質局在、及び細胞内又は細胞外活性を含むHisRSの正常な機能に影響を与える。さらなる好ましい実施態様において、候補SREBP経路調節剤は、HisRSの機能を特異的に調節する。「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などの用語は、ここではHisRSポリペプチド又は核酸と直接結合し、好ましくはHisRSの機能を阻害、増強、場合によっては変更する調節剤を意味する。また、その用語は、HisRSと結合相手又は基質との相互作用を変更する（例えば、HisRSの結合相手又はタンパク質／結合相手の複合体との結合及び機能を阻害することにより）調節剤も含む。
好ましいHisRS調節剤は、小分子化学剤、抗体及び他の生物治療剤を含むHisRS相互作用タンパク質、及びアンチセンスオリゴマー及びRNAを含む核酸調節因子を含む。調節剤は、例えば、併用療法などの場合他の活性成分を、及び／又は適切な担体又は賦形剤を含む組成物として、治療的組成物中に製剤化される。化合物の製剤化及び投与に関する技術は、"Remington's pharmaceutical Sciences"Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th edition中に見つけられる。
【００２０】
小分子調節因子
当該技術分野においては、「小分子」化合物と称される化学薬剤は、典型的には有機物で、非ペプチド分子であり、分子量10,000未満、好ましくは5,000未満、より好ましくは1,000未満、最も好ましくは500未満を有する。このクラスの調節因子は、化学的に合成される分子、例えば、コンビナトリアルケミカルライブラリーに由来する化合物を含む。合成化合物は、HisRSタンパク質の既知又は推測された特徴に基づいて合理的にデザインされるか又は同定され、又は化合物ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。このクラスの他の適当な調節因子は、天然の産物、特に植物又は菌類などの生物体に由来する二次代謝物であり、また、HisRS調節活性に対して化合物ライブラリーをスクリーニングすることでも同定される。化合物を生産し、得る方法は、当該技術分野において周知である（Schreiber SL, Science (2000)151:1964-1969；Radmann J及びGunther J, Science (2000)151:1947-1948）。
後述のスクリーニングアッセイから同定された小分子調節因子は、候補臨床化合物が設計され、至適化され、合成されるリード化合物として使用され得る。そのような臨床的化合物は、SREBP経路に関連した病態を治療する場合に有用性を示す。候補小分子調節剤の活性は、さらに後述されるように、構造決定及び候補調節因子の修飾及び試験などの反復性の二次的な機能的妥当性確認を介して数倍改善される。さらに、候補臨床化合物は臨床的及び薬理学的特徴に特に留意して生産される。例えば、試薬は、医薬品の開発に関して活性を至適化し毒性を最小にするインビトロ及びインビボのアッセイを用いて誘導体化され、再スクリーニングされる。
【００２１】
タンパク質調節因子
HisRS相互作用タンパク質は内在性のもの、すなわち、例えば、HisRSの発現、局在化、及び／又は活性を調節するHisRS経路のメンバーのような、通常HisRSと遺伝学的又は生化学的に相互作用するものである。HisRS調節因子には、HisRS相互作用タンパク質及びHisRSタンパク質そのもののドミナントネガティブな形態が含まれる。酵母２ハイブリッド法及び変異体スクリーニングは、内在性のHisRS相互作用を同定するための好ましい方法を提供する(Finley, R. L.等 (1996) in DNA Cloning-Expression Systems: A Practical Approach, eds. Glover D. & Hames B. D (Oxford University Press, Oxford, England), pp. 169-203；Fashema SF等, Gene (2000) 250: 1-14；Drees BL Curr Opin Chem Biol (1999) 3: 64-70；Vidal M及びLegrain P Nucleic Acids Res (1999) 27: 919-29；及びU. S. Pat. No. 5,928,868)。マススペクトロメトリーは、タンパク質複合体の解明に関し、これに代わる好ましい方法を提供する(例えば、Pandley A and Mann M, Nature (2000) 405: 837-846；Yates JR [3D,] Trends Genet (2000) 16: 5-8中に総説されている)。また、HisRS相互作用タンパク質はT細胞レセプターでもよい（Harlow及びLane, 1988, 上掲）。
【００２２】
抗体調節因子
好ましい実施態様において、HisRS相互作用タンパク質は抗体である。HisRSポリペプチドに特異的に結合する抗体は、既知の方法を用いて産生される。好ましくは、抗体は哺乳類HisRSポリペプチドに、より好ましくは、ヒトHisRSに特異的である。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル（mAbs）、ヒト化又はキメラ抗体、単一鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、FAb発現ライブラリーによって産生される断片、抗イデオタイプ（抗Id）抗体、及び上述のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい。108 M-1好ましくは109 M-1から1010 M-1又はさらに強い親和性を持つモノクローナル抗体は、既述のように(Harlow E及びLane D, 1988 Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratory Press； (Harlow E及びLane D, 1999 Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratory Press；Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York； and U. S. Pat. Nos. 4,381,292; 4,451,570；及び4,618,577)、標準的な手順により作製することができる。抗体は、HisRSの粗細胞抽出物又は実質的に精製されたそれらの断片に対して作製してもよい。HisRS断片を用いる場合、好ましくは、HisRSタンパク質の少なくとも10、より好ましくは少なくとも20の連続したアミノ酸を含む。特別な実施態様においては、HisRS特異的抗原及び／又は免疫原は、免疫応答を刺激するキャリアタンパク質と連結される。例えば、対象のポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）キャリアーと共有結合的に連結され、その結合体は、免疫応答を増強するフロイント完全アジュバント中にエマルジョン化される。実験用ウサギ又はマウスなどの適当な免疫系は、従来の手順に従って免疫化される。
【００２３】
異なる動物種由来の異なる部分を含むHisRSポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。例えば、抗体がその生物学的活性をヒト抗体から、その結合特異性をマウス断片から誘導するように、ヒトイムノグロブリンの定常領域をマウスmAbの可変領域に結合させてもよい。キメラ抗体は、各種由来の適切な領域をコードする遺伝子を同時にスプライシングすることによって産生される(Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. (1984) 81: 6851-6855； Neuberger等, Nature (1984) 312: 604-608; Takeda等, Nature (1985) 31: 452-454)。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、マウス抗体の相補性決定領域（CDRs）(Carlos, T. M., J. M. Harlan. 1994. Blood 84: 2068-2101)をヒトフレームワーク領域及び定常領域のバックグラウンド中に、組換えDNA技術を(Riechmann LM,等, 1988 Nature 323: 323-327)用いて移植することにより、産生することができる。ヒト化抗体は、〜10%のマウス配列と〜90%のヒト配列を含むため、抗体特異性を保持しながら、免疫原性をさらに減少又は除去する(Co MS,及びQueen C. 1991 Nature 351； 501-501; Morrison SL. 1992 Ann. Rev. Immun. 10: 239-265)。ヒト化抗体及びそれらの産生方法は、当該技術分野において周知である(US PAT NO: 5,530,101；US PAT NO : 5,585,089；US PAT NO : 5,693,762, 及びUS PAT NO : 6,180,370)。
【００２４】
組換体で、アミノ酸ブリッジを介してFv領域の重鎖及び軽鎖と連結させることにより形成される単一鎖ポリペプチドであるHisRS特異的単一鎖抗体を生産することができる(U. S. Pat. No. 4,946,778；Bird, Science (1988) 242: 423-426；Huston等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 5879-5883；及びWard等., Nature (1989)334: 544-546)。
抗体産生のための他の適切な技術は、インビトロにおいてリンパ球を抗原性ポリペプチド或いはファージ又は類似のベクター中の抗体ライブラリーの選択に曝すことを必要とする(Huse等, Science (1989) 246: 1275-1281)。
ここで用いられる場合、T細胞抗原レセプターは抗体調節因子の範囲に含まれる(Harlow及びLane, 1988, 上掲)。
本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾を行い又は行わずに使用される。しばしば、ポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナルを提供するか又は対象のタンパク質を発現させると細胞に毒性を有する基質と、共有結合的又は非共有結合的に結合させることにより標識化される(Menard S,等, Int J. Biol Markers (1989) 4: 131-134)。様々な標識及び結合技術が知られており、科学的及び特許文献中に広範囲にわたり報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害因子、蛍光成分、蛍光放射ランタニド金属、化学発光成分、生物発光成分、磁気粒子などが含まれる(U. S. Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; and 4,366,241)。また、組換体免疫グロブリンを産生してもよい(U. S. Pat. No. 4,816,567)。細胞質タンパク質に対する抗体は、膜貫通毒素タンパク質との結合により送達されそれらの標的に到達する(U. S. Pat. NO. 6,086,900)。
【００２５】
患者に対して治療上用いられる場合、本発明の抗体は典型的には非経口的に、可能な場合には標的部位に、又は静脈中に投与される。治療上効果的な投与量及び投与計画は臨床試験によって決定される。典型的には、投与される抗体の量は、患者の体重あたり約0.1 mg/kg〜約10 mg/kgの範囲である。非経口的投与に関して、抗体は薬学的に受容可能な媒体と共に単位投与量の注射可能な形態（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。そのような媒体は、本質的に無毒であり治療的なものではない。例として、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び5%ヒト血清アルブミンが挙げられる。不揮発性油、エチルオレイン酸、又はリポソーム担体などの非水系の媒体も使用される。媒体には、バッファー及び保存剤など、等張性及び化学的安定性、又はその他治療的能力を増強するような少量の添加物が含まれる。このような媒体中における抗体の濃度は、典型的には、約1 mg/ml〜約10 mg/mlの範囲内である。免疫療法については、文献中にさらに記載がある(US Pat. No. 5,859,206；WO0073469)。
【００２６】
核酸調節因子
他の好ましいHisRS調節剤には、アンチセンスオリゴマー又は二本鎖RNA(dsRNA)など、一般にHisRS活性を阻害するような核酸分子が含まれる。
好ましいアンチセンスオリゴマーは、HisRS核酸の機能、例えば、DNA複製、転写、HisRS RNA転移、HisRS RNAからのタンパク質の翻訳、RNAスプライシング、及びHisRS RNAが関与する任意の触媒的活性を妨げる。ある実施態様において、アンチセンスオリゴマーは、HisRS mRNAに対して結合するのに十分に相補的であり、好ましくは5'非翻訳領域に結合することによりHisRS mRNAからの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドである。HisRS特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも6から200ヌクレオチドの範囲内である。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは好ましくは少なくとも10，15，又は20ヌクレオチド長である。他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは好ましくは少なくとも50, 40, 又は30ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、DNA又はRNA、DNAとRNAのキメラ混合物、それらの誘導体又は修飾型、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を通過する輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーションをトリガーする切断剤及びインターカレート剤などの他の付加的なグループを含んでもよい。
他の実施態様において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエートモルホリノオリゴマー（PMO）である。PMOは、６つで構成されるモルホリン環と連結された遺伝的塩基（A, C, G,又はT）の一つを各々含む、４つの異なるモルホリノサブユニットから構築される。これらのサブユニットのポリマーは、非イオン的なホスホジアミデートサブユニット間連結によって結合される。PMOs及び他のアンチセンスオリゴヌクレオチドを生産し、使用する方法は、当該技術分野において周知である (例えば、W099/18193； Summerton J,及びWeller D, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1997,7: 187-95；Probst JC, Methods 2000, 22: 271-281；US PAT NO: 5,325,033；US PAT NO: 5,378,841を参照のこと)。
【００２７】
アンチセンスオリゴマーは、通常、研究試薬、診断薬、及び治療薬として使用される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特異的に遺伝子発現を阻害し、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するために用いられる(例えば、US PAT NO 6,165,790を参照のこと)。また、アンチセンスオリゴマーは、例えば、生物学的経路の種々のメンバーの機能同士を区別するためにも用いられる。アンチセンスオリゴマーは、動物及びヒトの疾病状態の治療において治療成分として用いられ、安全で効果的であることが多くの臨床試験により示されてきた(Milligan JF等, 1993, J Med Chem 36: 1923-1937；Tonkinson JL等, 1996, Cancer Invest 14: 54-65)。従って、本発明の一側面において、HisRS特異的アンチセンスオリゴマーは、SREBP経路におけるHisRSの機能をさらに解明するためにアッセイにおいて用いられる。本発明の他の側面において、HisRS特異的アンチセンスオリゴマーは、代謝病態の治療のための治療剤として用いられる。
これに代わる好ましいHisRS調節剤は、RNA干渉（RNAi）を媒介する二本鎖RNA種である。RNAiは、動物及び植物における、配列特異的な、転写後の遺伝子サイレンシング過程であり、サイレンスされる遺伝子と配列上相同である二本鎖RNA（dsRNA）によって開始される。シー・エレガンス、ショウジョウバエ、植物及び哺乳動物において遺伝子をサイレンスするためのRNAiの使用に関連する方法は、当該技術分野において知られている(Fire A,等, 1998 Nature 391: 806-811；Fire, A. Trends Genet. 15,358-363 (1999)；Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15,485-490 (2001)；Hammond, S. M.,等, Nature Rev Genet 2,110-1119 (2001)；Tuschl, T. Chem Biochem. 2,239-245 (2001)；Hamilton, A.等, Science 286,950-952 (1999)；Hammond, S. M.,等, Nature 404,293-296 (2000)；Zamore, P. D.,等, Cell 101,25-33 (2000)；Bernstein, E.,等, Nature 409,363-366 (2001)；Elbashir, S. M.,等, Genes Dev. 15,188-200 (2001)；WO0129058；W09932619, 及びElbashir SM,等, 2001, Nature 411: 494-498)。
【００２８】
アッセイ系
本発明は、HisRS活性の特異的調節因子を同定するためのアッセイ系を提供する。ここで使用される場合、「アッセイ系」には、特定の現象又は複数の現象を検出及び／又は測定するアッセイの結果を実行し、解析するために必要な全ての構成要素が含まれる。一般に、第一のアッセイは、HisRS核酸又はタンパク質に関する調節因子の特異的な生化学的又は分子的影響を同定し又は確認するために使用される。一般に、第二のアッセイは、第一のアッセイによって同定されたHisRS調節剤の活性をさらに評価し、調節剤がSREBP経路、脂質代謝及び／又は脂質生成と関連する様式において、HisRSに影響を与えることを確認する。ある場合において、HisRS調節因子は、「第二のアッセイ」において「第一のアッセイ」で同定され、確認されないまま直接試験されることもある。
好ましい実施態様において、本アッセイ系は、薬剤が存在しなければ該系が対照の活性を提供する条件下において、HisRSポリペプチド又は核酸を含む適切なアッセイ系と候補薬剤を接触させることを含み、該アッセイ系が検出する特定の分子的現象に基づくものである。本方法は、候補薬剤の存在下において同様のタイプの活性（「該系の薬剤により偏向された活性」）を検出することをさらに含む。薬剤によって偏向された活性と対照の活性の差は、候補薬剤がHisRS活性を調節し、結果的にSREBP経路を調節することを示す。ここで用いられる差は、統計学的に有意なものである。本アッセイ系は、一般に、当該技術分野において周知のポジティブ及び／又はネガティブなコントロールを含む。
【００２９】
第一のアッセイ
試験された調節因子のタイプは、一般に第一のアッセイのタイプにより決定される。
小分子調節因子に関する第一のアッセイ
小分子調節因子に関して、スクリーニングアッセイは、候補調節因子を同定するために使用される。スクリーニングアッセイは、細胞ベースであり、又は標的タンパク質の関連する生化学的反応を再現し、保持する無細胞系を用いてもよい(Sittampalam GS等,  Curr Opin Chem Biol (1997) 1: 384-91及びこれに添付の文献中に総説されている）。ここで用いられる場合、「細胞ベース」という用語は、生細胞、死細胞、又は膜、小胞体又はミトコンドリア画分などの特定の細胞内画分を用いたアッセイを意味する。「無細胞」という用語には、実質的に精製されたタンパク質（内在性又は組換え法により作製されたもののいずれか）、部分精製された細胞抽出物、又は粗抽出物を用いるアッセイが含まれる。スクリーニングアッセイは、タンパク質−DNA相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、レセプター−リガンド結合）、転写活性（例えば、レポーター遺伝子を用いたもの）、酵素活性（例えば、基質の性質を介したもの）、第二メッセンジャーの活性、免疫原性及び細胞の形態若しくは他の細胞の性質における変化を含む種々の分子現象を検出する。適切なスクリーニングアッセイは、検出される特定の分子現象に関する出力を提供するために、蛍光による、放射活性による、比色的、分光光度法的な、及び電流測定的な方法を含む広範囲な方法を使用する。
好ましい実施態様において、スクリーニングアッセイは、蛍光偏光、時間分解蛍光、及び蛍光共鳴エネルギー転移を含む蛍光技術を用いる。これらの系は、標識色素分子からの放出シグナルの強度が相手分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質又はDNA−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する(例えば、Selvin PR, Nat Struct Biol (2000) 7: 730-4；Fernandes PB, Curr Opin Chem Biol(1998)2: 597-603；Hertzberg RP及びPope AJ, Curr Opin Chem Biol (2000) 4: 445-451を参照のこと)。
HisRS調節因子をスクリーニングするために適合させた適切なアッセイ形式は、当該技術分野において知られている。HisRSの第一の機能は、ヒスチジンとヒスチジン-tRNAを結合させることである。従って、適切なアッセイでは、この酵素のアミノアシル化活性が検出される（例えば、Yan W等, 1996, Biochemistry 35:6559-68）。好ましいスクリーニングアッセイは、ハイスループット又は超ハイスループットであり、従って、リード化合物に対する化合物ライブラリーをスクリーニングする自動化された費用効率のよい手段を提供する(Fernandes PB, 1998, 上掲； Sundberg SA, Curr Opin Biotechnol 2000, 11: 47-53)。
【００３０】
細胞ベースのスクリーニングアッセイは、通常、HisRS及び特定のアッセイで要求される補助的なタンパク質の組換体発現ための系を必要とする。無細胞アッセイは、しばしば組換えにより生産されて精製された又は実質的に精製されたタンパク質を使用する。組換体タンパク質を産生するための適切な方法は、それらの関連する生物学的活性を保持し、活性を至適化するのに十分な純度であり、アッセイの再現性を保証するタンパク質の十分量を生産する。酵母２ハイブリッド法及び変異体スクリーニング、及びマススペクトロメトリーは、タンパク質−タンパク質の相互作用の決定、及びタンパク質複合体の解明のための好ましい方法を提供する。ある適用において、スクリーニングアッセイ中でHisRS相互作用タンパク質が使用される場合、HisRSタンパク質との相互作用タンパク質の結合特異性は、結合平衡定数（通常、少なくとも約107 M-1, 好ましくは少なくとも約108 M-1、さらに好ましくは少なくとも約109 M-1である）、免疫原性特性を含む様々な既知の方法によってアッセイされる。酵素及びレセプターに関しては、各々基質及びリガンドプロセッシングによってアッセイされる。
スクリーニングアッセイは、HisRSポリペプチド、その融合タンパク質の活性又はポリペプチド若しくは融合タンパク質を保持する細胞又は膜に特異的に結合し、又は調節するための候補薬剤の能力を測定する。HisRSポリペプチドは全長又は機能的なHisRS活性を保持するそれらの断片であってもよい。HisRSポリペプチドは、検出又は固着するためのペプチドタグなどの他のポリペプチド、又はその他のタグと融合してもよい。HisRSポリペプチドは好ましくはヒトHisRSであり、上述したようにそれらのオルソログ又は誘導体である。好ましい実施態様において、スクリーニングアッセイは、候補薬剤に基づくHisRSと結合標的、例えば、内在性又は外来性のタンパク質又はHisRS特異的な結合活性を有するその他の基質との相互作用の調節を検出し、正常なHisRS遺伝子機能を評価するのに使用され得る。
また、あるスクリーニングアッセイが抗体及び核酸調節因子を試験するためにも使用される；核酸調節因子に関し、適切なアッセイ系はHisRS mRNA発現に関与するものである。
【００３１】
抗体調節因子のための第一のアッセイ
抗体調節因子に関し、適切な第一のアッセイはHisRSタンパク質に対する抗体の親和性及び特異性を試験する結合アッセイである。抗体親和性及び特異性の試験のための方法は、当該技術分野において周知である(Harlow及びLane, 1988,1999, 上掲)。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、HisRS特異的抗体を検出するための好ましい方法である；他には、FACSアッセイ、放射性イムノアッセイ、及び蛍光アッセイが含まれる。
核酸調節因子のための第一のアッセイ
核酸調節因子に関し、第一のアッセイは、HisRS遺伝子発現、好ましくはRNA発現を阻害するための核酸調節因子の能力を試験する。一般に、発現解析には、類似の細胞集団中（例えば、内在性又は組換えによりHisRSを発現する２つのプール）、核酸調節因子の存在下及び非存在下においてHisRSの発現を比較することが含まれる。mRNA及びタンパク質発現を解析する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ノザンブロッティング、スロットブロッティング、リボヌクレアーゼプロテクション、定量的RT-PCR（例えば、TaqMan(登録商標)、PE Applied Biosystems）、又はマイクロアレイ解析がHisRS mRNA発現が核酸調節因子で処理された細胞内において減少することを確認するために使用される (例えば、Current Protocols in Molecular Biology (1994) Ausubel FM等, eds., John Wiley & Sons, Inc., chapter 4；Freeman WM等, Biotechniques (1999) 26: 112-125；Kallioniemi OP, Ann Med 2001, 33: 142-147；Blohm DH及びGuiseppi-Elie, ACurr Opin Biotechnol 2001,12: 41-47)。また、タンパク質発現がモニターされてもよい。タンパク質は、最も一般的には、HisRSタンパク質又は特異的ペプチドのいずれかに対する特異的抗体又は抗血清により検出される。ウェスタンブロッティング、エライザ、又はインサイツ検出を含む種々の手段が利用可能である(Harlow E及びLane D, 1988 and 1999, 上掲)。
【００３２】
第二のアッセイ
第二のアッセイは、調節剤がSREBP経路に関連する様式でHisRSに影響を与えることを確認するために上述の方法のいずれかにより同定されたHisRS調節剤の活性をさらに評価するために用いられる。ここで用いられる場合、HisRS調節剤は臨床的候補化合物又は既に同定されている調節剤から誘導された他の薬剤を含む。また、第二のアッセイは特定の遺伝学的又は生化学的経路に対する調節因子の活性を試験し、又は調節因子のHisRSとの相互作用の特異性を試験するために使用されてもよい。
第二のアッセイは、一般に、類似の細胞又は動物集団（例えば、内在性又は組換えによりHisRSを発現する細胞又は動物の２つのプール）を候補調節因子の存在下又は非存在下において比較する。通常、そのようなアッセイは候補HisRS調節剤による細胞又は動物の処理により、未処理（又はモック又は偽薬処理された）細胞又は動物と比較して、SREBP経路、脂質代謝及び／又は脂質生成が変化するか否かを試験する。あるアッセイでは、SREBP又は相互作用経路、又は脂質代謝及び／又は脂肪生成と関連する他の経路における遺伝子の変更された発現に関して操作された細胞又は動物を記述するためにここでは使用される、感作された遺伝学的なバックグラウンドを用いる。
【００３３】
細胞ベースのアッセイ
細胞ベースのアッセイでは、HEK-293細胞、CHO細胞、初代培養肝細胞、又はMcA-RH7777(DeBose-Boyd等, 2001, PNAS 98: 1477-1482）又はHEPG2(Kotzka等, 2000J. Lipid Res. 41: 99-108)などの肝細胞株を含むSREBPシグナルを起こし得る種々の哺乳動物細胞タイプを用いてもよい。細胞ベースのアッセイは、内在性のSREBP経路活性を検出し、SREBP経路構成要素の組換体発現に基づくものであってもよい。細胞ベースのアッセイは、典型的には、低いコレステロール又は低いPUFA状態、又はグルコース若しくはインスリン刺激などのSREBPシグナルを許容する培養状態を用いる。候補調節因子は、典型的には、細胞培養液に添加されるが、細胞にインジェクトされるか又はその他任意の効果的な手段により送達されてもよい。
ある実施態様において、SREBP経路活性はSREBP転写標的の発現を測定するいことにより評価される。多くの転写標的が知られている(例えば、Osborne TF, 2001, J Biol Chem 275: 32379-32382；Horton JD等, 1998, J Clin Invest 101: 2331- 2339；Shimano H等, 1997, J Clin Invest 100: 2115-2124；Shimomura I等, 1999, J Biol Chem 274: 30028-30032)。発現解析に対する任意の利用可能な手段が、すでに記述されているように使用されてもよい。典型的には、mRNA発現が検出される。好ましい適用において、Taqman解析はmRNA発現を直接測定するために使用される。あるいは、発現は、SREBP転写標的遺伝子の制御配列（例えば、エンハンサー／プロモーター領域）のコントロール下において、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、GFP又は他の蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼなど）をコードする配列を含む遺伝子組換えレポーターコンストラクトから間接的にモニターされる。レポーターコンストラクトの作製及び使用方法は周知である (例えば、Chakravarty K.等, 2001J. Biol. Chem. 276 : 34816-34823)。
【００３４】
他の実施態様において、アッセイにより、SREBPの膜結合形態の切断、又はSREBPの活性化形態の核移行若しくは核への蓄積など、SREBPのプロセッシング現象がモニターされる。これらの現象は、タンパク質の膜結合レベル及び切断形態をモニターすることにより直接モニターすることができる。典型的には、細胞は分画され、核及び膜画分中のタンパク質レベルが免疫組織学を使用して測定される。あるいは、SREBP切断はSREBP切断に関する特異的なレポーターを用いて間接的にモニターすることができる。一例において、シグナルペプチドとSREBPのC末端（制御）ドメインにアルカリホスファターゼ（AP）を結合させた可溶性触媒ドメインをコードする配列を含む融合コンストラクトが細胞内に導入される。SREBP切断はAPの分泌としてモニターされるが、標準的なアルカリホスファターゼアッセイを用いて検出される(Sakai J.,等, 1998, Mol. Cell 2: 505-514)。他の例において、融合コンストラクトが作製され、SREBPの転写活性化因子ドメインが他の転写活性化因子ドメイン、例えば、酵母GAL4などにより置換される。置換されたドメインは、好ましくは異なる種由来のものであり、GAL4が使用される場合にはUASなどの応答制御配列のコントロールの下、レポーター遺伝子の転写を特異的に活性化する。
他の実施態様において、アッセイは脂質蓄積及び脂質代謝などのSREBPシグナルの機能的な出力への候補調節因子の影響を測定する。ある好ましい適用において、脂質蓄積はOil Red Oで固定化細胞を染色することにより測定される(Foretz等, 1999, PNAS 96: 12737-12742)。他の好ましい適用において、脂質合成はC14アセテートのコレステロール又は脂肪酸のいずれかへの取込みを測定することによりモニターされる (Pai, J-T等, 1998, J. Biol. Chem. 273: 26138-26148)。
【００３５】
動物アッセイ
脂質代謝疾患の種々の非ヒト動物モデルは、候補HisRS調節因子の試験をするために使用される。このようなモデルは、典型的には、脂質代謝、脂肪生成、及び／又はSREBP経路に関与する遺伝子を誤発現（例えば、過剰発現するか又は発現を欠如する）するように操作された遺伝学的に修飾された動物を用いる。さらに、特定の摂食状態、及び／又は投与又はある種の生物学的に活性な化合物は、脂質及び／又は代謝疾患の動物モデルに貢献し又は作成する。アッセイは、一般に、経口投与、インジェクション（静脈内、皮下、腹腔内）、ボーラスによる投与などにより、候補調節因子の全身的な送達を必要とする。
ある実施態様において、アッセイでは、糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルマウスが使用される。ob（レプチン）又はdb（レプチンレセプター）などレプチン経路において、又はインスリンレセプター（InR）又はインスリンレセプター基質（IRS）などインスリンシグナル経路において遺伝子がノックアウトされているマウスは、糖尿病の症状を示し、肝臓の脂質の蓄積（脂肪肝）、及び、しばしば、増大した血漿脂質レベルを示す(Nishina等, 1994, Metabolism 43: 549- 553；Michael et al., 2000, Mol Cell 6: 87-97; Bruning JC等, 1998, Mol Cell 2: 559-569)。C57BL/6などのある種の感受性の高い野生型マウスは、高脂肪食餌を与えると類似の症状を呈する(Linton及びFazio, 2001, Current Opinion in Lipidology 12: 489-495)。従って、これらのモデルを用いる適切なアッセイでは、候補調節因子の投与により肝臓における脂質の蓄積が変更され、好ましくは減少されるかどうかが試験される。血漿及び脂肪細胞中の脂質レベルも試験される。脂質含有量をアッセイする方法は、典型的にはFPLC又は比色アッセイ(Shimano H等, 1996, J Clin Invest 98: 1575-1584；Hasty等, 2001, J Biol Chem 276: 37402-37408)、及び放射標識基質(Horton JD等, 1999, J Clin Invest 103: 1067-1076)の取り込みのシンチレーション測定などの脂質合成が当該技術分野において周知である。他の有用なアッセイでは、血中グルコースレベル、インスリンレベル、及びインスリン感受性が試験される(例えば、Michael MD, 2000, Molecular Cell 6:87)。さらに、SREBP経路活性は肝臓におけるSREBP標的遺伝子の転写の変動を調べることにより試験されてもよい。典型的な標的遺伝子は脂肪酸代謝に関連し、アセチルCoAカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、ATPクエン酸リアーゼ、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸酵素、及びステアロイルCoAデサチュラーゼ−１などを含む(Shimomura I等, 1999, 上掲)。他の標的遺伝子はコレステロール代謝と関連し、HMG-CoA合成、HMG-CoAリダクターゼ、スクアレンシンターゼ、リポタンパク質リパーゼ、低比重リポタンパク質レセプター（LDLR）などを含む (Horton JD等, 1998, 上掲)。
【００３６】
他の適切な動物モデルは、SREBP経路遺伝子における特異的な変更を有する。例えば、PEPCKプロモーターのコントロール下においてSREBPの構成的に活性な形態を過剰発現させるマウスは、脂肪肝表示を発症する。低比重リポタンパク質レセプター（LDLR）ヌル（null）のバックグラウンドにおいて、血漿脂質がさらに増加する(Horton JD等, 1999, J Clin Invest 103: 10677-1076)。これらのマウスを用いるアッセイは肝臓及び血漿脂質レベルの両方を測定する。
他の実施態様において、アッセイでは、リポタンパク質生物学及び心臓血管疾患のマウスモデルが使用される。例えば、アポリポタンパク質E（apoE）のノックアウトマウスは、上昇した血漿コレステロール及び自発的な動脈障害を示す(Zhang SH, 1992, Science 258: 468-471)。また、コレステロールエステル転移タンパク質（CETP）を過剰発現するトランスジェニックマウスも、増大した血漿脂質レベル（特に、超低比重リポタンパク質[VLDL]及び低比重リポタンパク質[LDL]コレステロールレベル）及び動脈におけるプラーク形成(Marotti KR等, 1993, Nature 364: 73-75)を示す。これらのモデルを使用するアッセイでは、候補調節因子の投与が前アテローム発生のLDL及びVLDLのレベルを減少させ、HDLを増加させ、若しくは全脂質（トリグリセリドを含む）レベルを減少させることにより血漿脂質レベルを変更させるかどうか試験される。さらに、動脈の形態及び障害の形成の組織学的な解析（即ち、障害の数及び大きさ）により、候補調節因子がアテローム性動脈硬化の進行及び／又は重篤さを減じることができるかどうかが示される。Apo-A1、PPARγ、及びLDLR中のスカベンジャーレセプター（SR）-B1のノックアウト又はApoE-nullバックグラウンドを含む、アテローム性動脈硬化に対する多くの他のマウスモデルが利用可能である(例えば、Glass CK及びWitztum JL, 2001, Cell 104: 503-516中に総説されている)。
他の実施態様において、血漿脂質レベル及びアテローム性動脈硬化の進行を変更させる候補調節因子の能力が、多重性脂質障害に関するマウスモデル中で試験される。例えば、レプチン及びLDLレセプター遺伝子の両方がノックアウトされているマウスは、高コレステロール症、高トリグリセリド血症及び動脈障害を示し、障害を受けた燃料代謝、増大した血漿残余リポタンパク質、糖尿病、及びアテローム性動脈硬化同士の関連性のモデルを提供する(Hasty AH等, 2001, 上掲)。
【００３７】
診断方法
HisRSがSREBP経路に関係しているとの発見により、SREBP経路に関連する疾患及び障害の診断的及び予後の評価のため、及びそのような疾患及び障害への素因を持つ患者の同定のために用いられる様々な方法が提供される。既に記述されたように、サンプル中のHisRS発現を評価する任意の方法が用いられる。例えば、そのような方法は、上述されたように：（１）HisRS遺伝子変異の存在の検出、又は非障害状態と比較したHisRS mRNAの過剰又は過少発現のいずれかの検出；（２）非障害状態と比較したHisRS遺伝子産物の過剰又は過少存在量の検出；及び（３）HisRSに媒介される生物学的経路における混乱（perturbations）又は異常性の検出のための、HisRSオリゴヌクレオチド及びHisRSに対する抗体などの試薬を利用してもよい。
特許、特許明細書、公開公報、及びGenbank確認番号を通じてアクセス可能な遺伝子及び配列及び提示されたウェッブサイトを含む全ての出典は、それらの全体がそのまま取り込まれる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004524021.tif 000034