(57)【要約】正常組織に対し、癌組織において示差的発現パターンを示す遺伝子配列に関する。かかる遺伝子配列の同定は、癌の分子マーカー、癌進行の早期指標、及び／又は癌が発生する性向または可能性の予測マーカーとしてのそれら遺伝子配列の使用を可能にする。特に、正常子宮頸部細胞に対し、子宮頸部細胞において、又は無症候性、早発性及び／又は遅発性子宮頸癌に伴って上方制御される発現パターンを示す遺伝子配列に関する。本発明の遺伝子配列は、無症候性、早発性又は遅発性子宮頸癌及び／又は子宮頸癌に関連する癌のマーカーを提供する。本発明のマーカーは、子宮頸癌又は関連する癌の治療又は予防用治療プロトコルの作成のための潜在的標的を提供し、かかるプロトコルは、マーカー発現の阻害又はマーカー発現産物の阻害を対象とする。さらに、子宮頸癌及び／又はその進行の有用な指標である分子マーカーの同定方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の正常または異常組織と関係する分子マーカーを検出する方法であって、
前記異常組織および非異常個体からの対応する組織から全ＲＮＡを単離すること、
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて相補ＤＮＡ分子を作製すること、および
前記ＤＮＡ分子を分離手段にかけて、相補ＤＮＡ分子の有無または相対的有無を、非異常組織と比較して異常組織から検出できるようにすることを含むものであり、
１つのタイプの組織における、もう１つのタイプの組織と比較した上での相補ＤＮＡ分子の有無が、正常または異常組織に関係する分子マーカーを示すものである方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異常組織が子宮頸癌組織である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
分離手段がゲル電気泳動である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３０ＣＡである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項６】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３０ＣＢである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項７】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３０ＣＣである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項８】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３０ＣＤである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項９】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３０ＣＥである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１０】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３０ＣＨである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１１】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３０ＣＩである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１２】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３０ＣＫである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１３】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ４Ｂである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１４】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ４Ｃである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１５】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ５Ｂである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１６】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ５Ｃである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１７】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ５Ｄである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１８】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ５Ｅである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項１９】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ５Ｇである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２０】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ６Ａである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２１】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３１Ｃ６Ｂである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２２】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ２Ａである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２３】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ２Ｂである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２４】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ２Ｃである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２５】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ３Ａである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２６】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ３Ｂである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２７】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ３Ｃである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２８】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ４Ｂである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項２９】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ４Ｄである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項３０】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ５Ａである、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項３１】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ６である、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項３２】
示差的に発現した遺伝子配列がＧ３２Ｃ７である、請求項１または２または３または４に記載の方法。
【請求項３３】
分子マーカーが遺伝子である、請求項１または５に記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする、請求項３４に記載の遺伝子。
【請求項３５】
遺伝子がリボソーム蛋白質Ｓ１２をコードする、請求項３４に記載の遺伝子。
【請求項３６】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが、配列番号１に記載のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７５％の類似性を有する配列または低ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリッド形成することができる配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号１に記載の通りである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが、配列番号２に記載のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７５％の類似性を有する配列または低ストリンジェントな条件下で配列番号２とハイブリッド形成することができる配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号２に記載の通りである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが、配列番号３に記載のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７５％の類似性を有する配列または低ストリンジェントな条件下で配列番号３とハイブリッド形成することができる配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号３に記載の通りである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが、配列番号４に記載のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７５％の類似性を有する配列または低ストリンジェントな条件下で配列番号４とハイブリッド形成することができる配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号４に記載の通りである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物において相当する正常な子宮頸部上皮細胞に対して子宮頸癌細胞で示差的に発現したヌクレオチド配列を含む単離遺伝子配列。
【請求項４５】
哺乳動物がヒトである、請求項４４に記載の単離遺伝子配列。
【請求項４６】
Ｇ３０ＣＡ、Ｇ３０ＣＢ、Ｇ３０ＣＣ、Ｇ３０ＣＤ、Ｇ３０ＣＥ、Ｇ３０ＣＨ、Ｇ３０ＣＩ、Ｇ３０ＣＫ、Ｇ３１Ｃ４Ｂ、Ｇ３１Ｃ４Ｃ、Ｇ３１Ｃ５Ｂ、Ｇ３１Ｃ５Ｃ、Ｇ３１Ｃ５Ｄ、Ｇ３１Ｃ５Ｅ、Ｇ３１Ｃ５Ｇ、Ｇ３１Ｃ６Ａ、Ｇ３１Ｃ６Ｂ、Ｇ３２Ｃ２Ａ、Ｇ３２Ｃ２Ｂ、Ｇ３２Ｃ２Ｃ、Ｇ３２Ｃ３Ａ、Ｇ３２Ｃ３Ｂ、Ｇ３２Ｃ３Ｃ、Ｇ３２Ｃ４Ｂ、Ｇ３２Ｃ４Ｄ、Ｇ３２Ｃ５Ａ、Ｇ３２Ｃ６、およびＧ３２Ｃ７から選択される、請求項４５に記載の単離遺伝子配列。
【請求項４７】
正常組織と子宮頸癌組織を区別する際の、Ｇ３０ＣＡ、Ｇ３０ＣＢ、Ｇ３０ＣＣ、Ｇ３０ＣＤ、Ｇ３０ＣＥ、Ｇ３０ＣＨ、Ｇ３０ＣＩ、Ｇ３０ＣＫ、Ｇ３１Ｃ４Ｂ、Ｇ３１Ｃ４Ｃ、Ｇ３１Ｃ５Ｂ、Ｇ３１Ｃ５Ｃ、Ｇ３１Ｃ５Ｄ、Ｇ３１Ｃ５Ｅ、Ｇ３１Ｃ５Ｇ、Ｇ３１Ｃ６Ａ、Ｇ３１Ｃ６Ｂ、Ｇ３２Ｃ２Ａ、Ｇ３２Ｃ２Ｂ、Ｇ３２Ｃ２Ｃ、Ｇ３２Ｃ３Ａ、Ｇ３２Ｃ３Ｂ、Ｇ３２Ｃ３Ｃ、Ｇ３２Ｃ４Ｂ、Ｇ３２Ｃ４Ｄ、Ｇ３２Ｃ５Ａ、Ｇ３２Ｃ６、およびＧ３２Ｃ７から選択される遺伝子配列の使用。
【請求項４８】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７５％の類似性を有する配列または低ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリッド形成することができる配列を含む単離プライマー。
【請求項４９】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号１に記載の通りである、請求項４８に記載の単離プライマー。
【請求項５０】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７５％の類似性を有する配列または低ストリンジェントな条件下で配列番号２とハイブリッド形成することができる配列を含む単離プライマー。
【請求項５１】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号２に記載の通りである、請求項５０に記載の単離プライマー。
【請求項５２】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７５％の類似性を有する配列または低ストリンジェントな条件下で配列番号３とハイブリッド形成することができる配列を含む単離プライマー。
【請求項５３】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号３に記載の通りである、請求項５２に記載の単離プライマー。
【請求項５４】
配列番号４に記載のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも７５％の類似性を有する配列または低ストリンジェントな条件下で配列番号４とハイブリッド形成することができる配列を含む単離プライマー。
【請求項５５】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号４に記載の通りである、請求項５４に記載の単離プライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
一般的に、本発明は、正常組織に対し、癌組織において示差的発現パターンを示す遺伝子配列に関する。示差的に発現した遺伝子配列の同定は、癌の分子マーカーとして、癌進行の早期指標として、および／または癌が発生する性向または可能性の予測マーカーとしてのそれら遺伝子配列の使用を可能にする。特に、本発明は、正常子宮頸部細胞に対し、子宮頸部細胞において、または無症候性（ｐｒｅ−ｏｎｓｅｔ）、早発性および／または遅発性子宮頸癌に伴ってアップレギュレートされる発現パターンを示す遺伝子配列に関する。本発明の遺伝子配列は、無症候性、早発性もしくは遅発性子宮頸癌および／または子宮頸癌に関連する癌のマーカーを提供する。さらに、本発明のマーカーは、子宮頸癌または関連する癌の治療または予防のための治療プロトコルを作成するための潜在的標的を提供する。このような治療プロトコルは、マーカーの発現を阻害することまたはマーカーの発現産物を阻害することを対象とする。さらに、本発明は、子宮頸癌および／またはその進行の有用な指標である分子マーカーを同定する方法を対象とする。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書において著者によって引用される刊行物の書誌詳細は、説明の最後に集められている。
【０００３】
本明細書におけるどの先行技術への言及も、その先行技術がオーストラリアにおける共通の一般知識の一部を形成することを承認およびいかなる形態であれ示唆するものではなく、またそのように解釈すべきではない。
【０００４】
子宮頸癌は、罹患率と死亡率の双方で世界中の女性に影響を及ぼす最も一般的な腫瘍であり、毎年約４７１，０００の新たな症例が診断され、約２００，０００名の女性がこの疾患で死亡している。（Ｐｉｓａｎｉ、他、１９９３および１９９７）。１９９４年には、米国で１５，０００名と推定される女性が浸潤性子宮頸癌と診断され、スクリーニングに目覚ましい進歩があったにもかかわらずこの年には約４６００名の女性がこの疾患で死亡した（Ｂｏｒｉｎｇ他、１９９４）。１９９５年には、米国における発生率は１５，８００症例と４８００名の死亡に増加した。（Ｗｉｎｇｏ、他、１９９５）。
【０００５】
子宮頸癌は、子宮頸管内または子宮膣部上のどちらかの扁平円柱上皮接合部を起源とする。前駆病変は異形成またはｉｎ ｓｉｔｕの癌腫（頸部上皮内癌［ＣＩＮ］）であり、これは後に浸潤癌になることがある。このプロセスはかなり遅いことがある。胃形成病変の５０％は治療することなく消失し、異形成病変の１０％が、基底組織に浸潤する前の上皮内病変の最終段階に到達すると言われている。異形成の総数の２％のみが、この上皮内癌腫を超えて明らかな浸潤癌まで進行する（Ｏｓｔｏｒ、１９９３；Ｄｕｇｇａｎ、１９９８）。しかしながら、縦断的研究により、治療を受けていないｉｎ ｓｉｔｕの子宮頸癌患者では、１０−１２年の間に３０−７０％が浸潤癌を発症することが分かった。約１０％の患者に限って、１年未満で病変はｉｎ ｓｉｔｕから浸潤性へと進行することがある（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、他、１９８９；Ｖａｎ Ｏｏｒｔｍａｒｓｓｅｎ、他、１９９１）。
【０００６】
細胞タイプに関しては、子宮頸癌は、扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌および小細胞癌に分類することができる。細胞分類扁平上皮細胞（類表皮）癌が約８０％を占めるが、腺扁平上皮癌および小細胞癌は比較的稀である。しかしながら、子宮頸部の悪性疾患の中でも、最近の報告では腺癌の割合が４．９−２０％と増加したようである（Ｂｅｒｅｋ、他、１９８１；Ｇｏｏｄｍａｎ他、１９８９；Ｖｉｚｃａｉｎｏ、他、１９９８）。子宮頸部の腺癌が子宮頸部の扁平上皮細胞癌よりもかなり悪い予後を示すか否かをめぐる論争が依然として続いている（Ｓｔｅｒｅｎ他、１９９３）。腺扁平上皮細胞のタイプが転帰に及ぼす影響に関する矛盾する報告もある（Ｇａｌｌｕｐ他、１９８５；Ｙａｚｉｇｉ他、１９９０）。ある報告は、見かけの扁平上皮腫瘍の約２５％が、明らかなムチン産生を有して正常な扁平上皮細胞よりも激しく挙動し、腺腫性分化が負の予後をもたらすことが示唆されることを明らかにした（Ｂｅｔｈｗａｉｔｅ他、１９９２）。子宮頸部の知られている浸潤性扁平上皮癌患者の研究から、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子の過剰発現が、早期子宮頸癌における悪い予後に伴うことが分かった（Ｓｔｒａｎｇ他、１９８７）。
【０００７】
米国では、６００万人を超える女性がヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に感染していると推定される。疫学的研究は、子宮頸部の前浸潤癌または浸潤癌の発生にとっての主要な危険因子は、ＨＰＶ感染と関係があることを納得のいくように示している。諸研究（Ｂｒｉｓｓｏｎ他、１９９４）から、１６型および１８型ＨＰＶによる急性感染は、高度ＣＩＮの急速な発生に１から１６．９倍の危険性をもたらしたことが示唆されている。これは、多産（ｈｉｇｈ ｐａｒｉｔｙ）、性交相手の数の増加、初交年齢が若いこと、社会経済的地位の低さおよび積極的喫煙歴などの他の知られている危険因子をはるかに上回っている（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ他、１９９３；Ｂｒｉｓｓｏｎ他、１９９４）。ＨＰＶ ＤＮＡを同定するための分子技法は極めて感度がよく特異的であるが、それらのデータの適切な解釈が重要である。一部のＨＰＶ感染患者については、子宮頸部の前浸潤癌または浸潤癌の発生に関する危険が最小の増加にとどまるように見えるが、他の患者については、著しく危険であり、集中的なスクリーニン・プログラムおよび／または早期の介入の候補者であると思われる。しかしながら、患者のより詳細な評価に影響を与える唯一のパラメータとして陽性ＨＰＶ ＤＮＡ検査を用いることは、根拠がなく効果のない治療および／または余計な患者の不安につながることがある。逆に、現在の技術は、余りに感度が悪く、少量の発癌性である可能性のあるＨＰＶタイプを検出することができず、大丈夫だという誤った感覚につながることがある。危険度の高いタイプの異常な子宮頸部細胞を有する患者（Ｂｅｔｈｅｓｄａ分類）にとって現在推奨されることは、コルポスコピーおよび生検で徹底的に調べることであるのは明らかである。しかしながら、それらの試験は費用が高く、侵襲的なことがある。
【０００８】
子宮頸部の発癌は、ヒト乳頭腫ウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｒｎａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）感染および身体の遺伝子変化などの他の因子が悪性の癌の発生に決定的役割を果たしている多段階プロセスとして認識されていた。細胞遺伝子異常および染色体構造異常または対立遺伝子欠失の蓄積は、最終的な腫瘍表現型の選択につながることがあり、最初の感染と腫瘍出現の間に長い時間がかかることと一致する（Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ他、１９９５；Ｌａｚｏ、１９９９）。これらの遺伝子を同定することは癌診断に使用でき、女性を追跡群および治療群に層別化することにも役立つ。
【０００９】
子宮頸癌の予後は、診断時の疾患の広がりにより著しく影響を受ける（Ａｎｔｏｎ−Ｃｕｌｖｅｒ、他、１９９２）。予後に影響を及ぼす主要な因子には、腫瘍の病期、体積および悪性度、組織学的タイプ、リンパ転移、および血管侵襲がある（Ｗｅｒｎｅｒ−Ｗａｓｉｋ、他、１９９５）。しかしながら、子宮頸部異形成につながる分子経路は不明のところが多いままである。腫瘍（ｔｕｒｎｏｕｒ）進行につながる分子事象の全体的視野を得るために、発明者他は、体系的方法として遺伝子ディファレンシャル・ディスプレイを用い、ヒト子宮頸癌および対応する正常組織における遺伝子発現を比較した。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明につながる研究において、発明者他は、様々なステージのヒト子宮頸癌においてより高レベルに蓄積される対応ＲＮＡを有する、示差的に発現したＤＮＡ配列を同定した。早期臨床ステージの子宮頸癌におけるこれらいくつかの遺伝子の活性化は、癌の発症および／または進行に関与する経路にそれらの遺伝子が関与し、子宮頸癌のための診断用マーカーおよび治療的介入のための標的を提供することを示唆している。
【００１１】
（発明の概要）
本明細書を通じ、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、当然ながら、記載された要素もしくは整数または一群の要素もしくは整数の包含を意味するが、その他の要素もしくは整数または一群の要素もしくは整数の除外を意味しない。
【００１２】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列識別番号（配列番号）で呼ばれる。配列番号は、配列識別子配列番号１、配列番号２などと数的に対応する。配列一覧は特許請求の範囲の後に示す。
【００１３】
発明者他は、扁平上皮細胞子宮頸癌の多段階発癌に関与する細胞遺伝子を同定するため、ＲＴ−ＰＣＲ示差的ディスプレイ解析およびｃＤＮＡマイクロアレイを利用する。子宮頸癌生検と相当する正常頸部組織間の示差的遺伝子発現ディスプレイにより、ｃＤＮＡクローンを同定してクローニングする。これらのｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる様々なＦＩＧＯステージの扁平上皮細胞子宮頸癌生検中で一貫して過剰発現する。様々なＦＩＧＯステージの子宮頸癌生検を用いるノーザン・ブロット分析およびＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリド形成試験を用い、疾患進行におけるこれらの遺伝子の役割を評価する。ＧｅｎＢａｎｋデータベースにある配列と比較すると、２種類のクローンが、それぞれＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４およびリボソーム蛋白質Ｓ１２をコードすることが確認された。これら２種類の遺伝子の発現は、後期ＦＩＧＯステージの子宮頸癌生検と一緒に採集した相当する正常組織で上昇する。リボソーム蛋白質Ｓ１２の発現の増加も、早期ＦＩＧＯステージの子宮頸癌患者から採集した組織病理学的に正常な組織の未成熟な基底上皮細胞中に見いだされる。これと比較すると、これら２種類の遺伝子のアップレギュレーションは、非悪性状態で外科手術のために入院した患者から採集された子宮頸部扁平上皮では検出されず、これら２種類の遺伝子の発現は、子宮頸癌患者からの隣接する組織病理学的に「正常な」子宮頸部扁平上皮組織中で変化したことを示唆している。リボソーム蛋白質Ｓ１２およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子は、ヒト子宮頸癌の早期診断用マーカーを提供し、進行性疾患の分子マージン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｇｉｎ）を明らかにすると考えられる。
【００１４】
したがって、本発明の一態様は、哺乳動物からの正常または異常組織と関係する分子マーカーを検出する方法を提供し、前記方法は、前記異常組織および非異常個体からの対応する組織から全ＲＮＡを単離すること、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて相補ＤＮＡ分子を作製すること、および非異常組織に対し、相補ＤＮＡ分子の有無または相対的有無が異常組織から検出できるように前記ＤＮＡ分子を分離手段にかけることを含み、１つのタイプの組織における相補ＤＮＡ分子の有無がもう１つのタイプの組織に対し、正常または異常組織に関係する分子マーカーを示している。
【００１５】
本発明のもう１つの態様は、癌性状態と非癌性状態を区別することができる分子マーカーを同定する方法を提供し、前記方法は、ある個体からの癌組織および別の個体からの相当する非癌組織から全ＲＮＡを単離すること、ＲＴ−ＰＣＲを用いて相補ＤＮＡ分子を作製することならびに前記癌組織および非癌組織からの前記ＤＮＡ分子をゲル電気泳動により比較することを含み、癌または非癌組織における特定のＤＮＡ種の有無が、他の非癌または癌組織に対し、前記癌の分子マーカーを示している。
【００１６】
本発明のさらにもう１つの態様は、相当する正常子宮頸部上皮細胞に対し、子宮頸癌細胞において示差的に発現したヌクレオチドの配列を含む遺伝子配列を提供する。
【００１７】
本明細書を通じて使用する配列識別子の概要を以下に示す。
【表１】
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【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、癌性組織と対応するすなわち「相当する（ｍａｔｃｈｅｄ）」正常組織との間で示差的に発現した遺伝子配列を同定するための技法の使用法について一部述べられている。正常細胞に対して癌細胞中で示差的に発現した、すなわちアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子配列の同定は、有用な診断補佐を提供する。
【００１９】
したがって、本発明の一態様は、哺乳動物からの正常または異常組織と関係する分子マーカーを検出する方法を提供し、前記方法は、前記異常組織および非異常個体からの対応する組織から全ＲＮＡを単離すること、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて相補ＤＮＡ分子を作製すること、および非異常組織に対し、相補ＤＮＡ分子の有無または相対的有無が異常組織から検出できるように前記ＤＮＡ分子を分離手段にかけることを含み、１つのタイプの組織における相補ＤＮＡ分子の有無がもう１つのタイプの組織に対し、正常または異常組織に関係する分子マーカーを示している。
【００２０】
用語「分子マーカー」は最も広範な意味で使用され、遺伝子配列、遺伝子座、遺伝子、テロメラーゼ、プロモーターならびにコーディングまたは非コーディング領域が含まれる。分子マーカーは遺伝子であることが好ましい。本発明の好ましい分子マーカーは、正常または異常組織のどちらかで発現するが両方では発現しない遺伝子であることがより好ましい。用語「発現した」には、実質的な発現または実質的な非発現が含まれ、さらに類似または同一組織のある形態の組織と別の形態と間の示差的発現が含まれる。
【００２１】
本明細書における「正常」または「異常」組織という指示は、最も広範な意味で使用されるが、非癌性組織（正常組織）および癌性または前癌性組織（異常組織）が含まれることが最も好ましい。異常組織タイプには、その異常な組織の存在に伴う疾患状態を有する個体に一般的に存在する組織が含まれるが、同一または類似の状態に苦しんでいない個体には一般的に存在しない。
【００２２】
本発明は、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター）および捕獲野生動物などのすべての哺乳動物にまで及ぶ。哺乳動物はヒトであることが最も好ましい。本明細書における「個体」という指示には、ヒトまたは他の哺乳動物が含まれる。
【００２３】
用語「全ＲＮＡ」は、細胞または個体中のすべてのＲＮＡが存在することを意味しないが、ｍＲＮＡを含むいかなる調製物も含まれる。
【００２４】
「対応する組織」は、対応する組織サンプルを意味する。例えば、生検サンプルは、一般的に個体の癌組織から入手し、対応する（すなわち相当する）組織サンプルは、個体中の同一または類似の癌組織を含まない解剖学的に等価な領域から入手する。
【００２５】
用語「分離手段」は最も広範な意味で使用され、ＤＮＡ分子をサイズ、電荷、長さ、複雑性または上記の一部もしくはすべての組合せに基づいて分離することができるいかなる手段も含まれる。分離は電気泳動またはクロマトグラフィ手段によることが好ましく、分離は電気泳動手段によることが最も好ましい。分離が、異常組織に対し正常組織における相補ＤＮＡ分子の有無の視覚的記録を提供することが好都合である。したがって、一般的に、相補ＤＮＡ、調製物は、異常組織に対して正常組織における分子の有無の比較を可能にする方法で電気泳動またはクロマトグラフィ手段によって分離する。ゲル電気泳動は特に有用な分離手段の１つであり、相補ＤＮＡ調製物は平行なレーンを流される。
【００２６】
本発明は、異常および正常組織について相補ＤＮＡを調製することにより実施することが最も好都合であるが、正常組織における予想ＤＮＡのデータベースを作成してもよい。次いで、特定の種類の相補ＤＮＡの有無を、異常組織から分離したＤＮＡを「正常対照」と比較することにより確認することができる。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、癌性状態と非癌性状態を区別することができる分子マーカーを同定する方法を提供し、前記方法は、ある個体からの癌組織および別の個体からの対応する非癌組織から全ＲＮＡを単離すること、ＲＴ−ＰＣＲを用いて相補ＤＮＡ分子を作製することならびに前記癌組織および非癌組織からの前記ＤＮＡ分子をゲル電気泳動により比較することを含み、他の非癌または癌組織に対し、癌または非癌組織における特定のＤＮＡ種の有無が、前記癌の分子マーカーを示している。
【００２８】
最も好ましい実施形態では、癌は子宮頸癌または関連する癌である。しかしながら、本発明は、いかなる癌または腫瘍についても分子マーカーを検出するための本方法の使用法にまで及ぶ。本明細書における「癌」または「腫瘍」という指示には、すべての肉腫および癌腫という指示が含まれる。
【００２９】
癌のほんの一部では、発現中に多数の遺伝子が変化し、それによって異常な表現型となる。変化した発現パターンは、新生物の発生または進行を容易にし、続いて腫瘍の侵襲的挙動をもたらすことがある。一方、遺伝子発現の一部の変化は腫瘍形成という結果になることがある。前者は、癌につながる分子機構に関する重要な情報を提供するが、後者は、このプロセスの中に存在する具体的ステップのためのマーカーとしての機能を果たすことがある。
【００３０】
本発明によれば、示差的ディスプレイ技法を用い、様々なステージで採集した癌生検から増幅したｃＤＮＡフラグメントのフィンガープリントを、相当する正常組織からのｃＤＮＡと一緒に同一ゲルに表示し、子宮頸癌生検と正常組織の間で特異的な診断上の変化を明確にした。ｃＤＮＡフラグメント（表１）は、プライマーによってＲＴ−ＰＣＲ示差的ディスプレイからクローニングした。逆ノーザン・ブロット分析に基づき、癌生検では２８種類のクローンの発現が著しく増加し、その純増加倍率は１．７から４．３までに及ぶことを確認した（図３）。増幅された遺伝子の中で、同定されたクローンのうち１１種類は、エネルギー消費（Ｇ３２Ｃ３ＢおよびＧ３２Ｃ４Ｂ）；シグナル濾出（ｔｒａｎｓｕｄａｔｉｏｎ） （Ｇ３０ＣＩおよびＧ３１Ｃ６Ａ）；転写調節（Ｇ３２Ｃ２Ｂ）；翻訳（Ｇ３０ＣＡおよびＧ３０ＣＣ）；生合成（Ｇ３２Ｃ７、およびＧ３１Ｃ５Ｅ）；および細胞代謝（Ｇ３０ＣＤおよびＧ３２Ｃ６）に関係していると思われる（表１）。
【００３１】
２８種類のクローンのうち１１種類、すなわちＧ３０ＣＥ、Ｇ３０ＣＫ、Ｇ３１Ｃ４Ｃ、Ｇ３１Ｃ５Ｂ、Ｇ３１Ｃ５Ｃ、Ｇ３１Ｃ５Ｄ、Ｇ３１Ｃ５Ｇ、Ｇ３２Ｃ２Ａ、Ｇ３２Ｃ３Ｃ、Ｇ３２Ｃ４ＤおよびＧ３２Ｃ５Ａは、ＧｅｎｅＢａｎｋまたはＥＳＴデータベースで報告されているどの遺伝子配列にも一致しないことから、新規な遺伝子配列のようである（表１）。
【００３２】
ノーザン・ブロット分析は、本明細書で「Ｇ３０ＣＡ」、「Ｇ３０ＣＣ」、「Ｇ３１Ｃ５Ｇ」、「Ｇ３２Ｃ４Ｂ」、および「Ｇ３２Ｃ７」と呼ぶ７種類の特定の遺伝子が子宮頸癌の発生早期に関与していることを示した（図６−８）。
【００３３】
特に興味深いことに、これらの遺伝子のうち２種類、すなわちＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣは、それぞれＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２をコードする遺伝であることが確認された。子宮頸部の早期浸潤性細胞病変から得られた癌生検におけるこれら２種類の遺伝子の過剰発現は、これら２種類の遺伝子が、ヒト子宮頸部新生組織形成の病因に関与していることを示す（図６）。最も重要なことには、癌病変の他に、隣接する組織学的に正常と推定される子宮頸部組織でＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣの発現が検出されることが観察された。したがって、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２遺伝子は、ヒト子宮頸癌の早期診断マーカーとして重要な価値を提供し、進行する疾患の分子マージンを明らかにすることができる（図９および１０）。
【００３４】
したがって、本発明のもう１つの態様は、相当する正常子宮頸部上皮細胞に対して子宮頸癌細胞で示差的に発現したヌクレオチドの配列を含む遺伝子配列を提供する（表２）。
【００３５】
本発明は、これらの配列ならびにその誘導体にまで及ぶ。誘導体とは、表１に引用した配列に対し、単一または複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失を含む遺伝子配列である。
【００３６】
本発明は、示差的に発現したヌクレオチド配列を検出することにより実施するのが最も好都合であるが、本発明は、翻訳産物および特に示差的に発現したヌクレオチド配列によってコードされるペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質にも及ぶ。特定の翻訳産物の有無によって測定される示差的発現は、正常または異常組織の分子マーカーをスクリーニングする有用な方法でもある。したがって、本発明はさらに、正常または異常組織に伴って示差的に発現した分子マーカーに対する抗体にまで及ぶ。抗体および特にモノクローナル抗体は、示差的に発現した産物の存在をスクリーニングするためのイムノアッセイで特に有用であり、免疫療法でも有用である可能性がある。
【００３７】
イムノアッセイおよび免疫療法におけるモノクローナル抗体の使用が特に好ましいのは、多量に産生できることおよび生成物の均一性のためである。不死の細胞株および免疫原性調製物に対して免疫化したリンパ球の融合により作製されるモノクローナル抗体産生用のハイブリドーマ細胞株の調製は、当業者によく知られている技法によって行うことができる。（例えば、ＤｏｕｉｌｌａｒｄおよびＨｏｆｆｍａｎ、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５；１９７６を参照）。
【００３８】
本発明のもう１つの態様は、対象からの生体サンプル中の正常または異常組織に関係する分子マーカーを検出する方法を企図し、前記方法は、前記生体サンプルを前記分子マーカーに特異的な抗体またはその誘導体もしくはホモログと、抗体−分子マーカー複合体が形成するのに十分な時間および条件下で接触させること、次いで前記複合体を検出することを含む。
【００３９】
分子マーカーの存在は、ウエスタン・ブロット法およびＥＬＩＳＡなどによる多くの方法で実現することができる。米国特許番号４，０１６，０４３、４，４２４，２７９および４，０１８，６５３を参照することにより分かるように、様々なイムノアッセイ技法が利用可能である。言うまでもなく、それらには、非競合タイプの単一部位と二部位すなわち「サンドイッチ」アッセイの両方、ならびに従来の競合結合アッセイが含まれる。これらのアッセイには標識抗体の標的への直接結合も含まれる。
【００４０】
サンドイッチ・アッセイは、最も有用で最も一般的なアッセイの１つであり、本発明で使用することが好ましい。サンドイッチ・アッセイ技法の多くの変形形態が存在し、すべては本発明に包含されることを意図している。手短に言えば、典型的なフォワード・アッセイでは、固体上に非標識抗体を固定し、試験すべきサンプルを結合分子に接触させる。適当なインキュベーション時間の後、抗体−抗原複合体が形成するのに十分な時間、検出可能なシグナルを生み出すことができるレポーター分子で標識された抗原に特異的な第二の抗体を加え、抗体−抗原−標識抗体の別の複合体が形成するのに十分な時間を計算に入れてインキュベートする。未反応材料をすべて洗い流し、レポーター分子により生成されるシグナルを観察することにより抗原の存在を判断する。結果は、定性的で目に見えるシグナルの単純な観察によるもの、または既知量の分子マーカーを含有する対照アンプル（ａｍｐｌｅ）と比較することによって定量することができる。フォワード・アッセイの変形形態には、サンプルと標識抗体を結合抗体へ同時に加える同時アッセイが含まれる。これらの技法は当業者によく知られており、まったく明らかなようにいかなる小さな変形形態も含まれる。本発明によれば、サンプルとは、分子マーカーを含有する可能性のあるサンプルであり、細胞抽出物、組織生検あるいは血清、唾液、粘膜分泌物、リンパ液、組織液および気道液が含まれる。したがって、サンプルは一般的に体液を含む生体サンプルであるが、細胞培養液などからの発酵液および上清にも及ぶ。
【００４１】
典型的なフォワード・サンドイッチ・アッセイでは、分子マーカーまたはその抗原部分に対する特異性を有する第一の抗体は、固体表面と共有結合または受動的に結合する。固体表面は通常ガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスクの形態、またはイムノアッセイを行うのに適当なその他の表面であってもよい。結合プロセスは当技術分野ではよく知られており、一般的には架橋共有結合または物理的吸着からなり、試験サンプルの調製に際してポリマー−抗体複合体を洗浄する。次いで試験すべきサンプルの部分標本を固相複合体に加え、抗体中に存在するどのサブユニットも結合できるのに十分な時間（例えば、２−４０分または都合がよければ一夜）、適当な条件（例えば、２５℃から３２℃までなどの室温から４０℃まで）の下でインキュベートする。インキュベーション時間に続いて、抗体サブユニット固相を洗浄して乾燥し、分子マーカーの一部に特異的な第二の抗体と共にインキュベートする。第二の抗体はレポーター分子と結びつき、これを第二の抗体が分子マーカーと結合していることを示すために使用する。
【００４２】
代替方法は、生体サンプル中の標的分子を固定し、次いで固定された標的を、レポーター分子で標識されている、または標識されていない特異的な抗体に曝露するものである。標的の量およびレポーター分子シグナルの強度に応じ、抗体による直接標識によって結合標的を検出できることがある。
【００４３】
あるいは、第一の抗体に特異的な第二の標識抗体を、標的−第一抗体複合体に曝露し、標的−第一抗体−第二抗体の三成分複合体を形成させる。レポーター分子により放出されるシグナルによって複合体を検出する。
【００４４】
本明細書で用いる「レポーター分子」は、その化学的性質により、抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に特定可能なシグナルを提供する分子を意味する。検出は定性的または定量的のどちらであってもよい。このタイプのアッセイで最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア、または分子（すなわち放射性同位体）および化学発光分子を含む放射性核種のいずれかである。
【００４５】
酵素免疫測定法の場合には、一般的にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩を用い、第二の抗体に酵素を結合させる。しかしながら、よく知られているように、様々に異なる結合技法が存在し、当業者にとって容易に利用することができる。一般的に使用される酵素には、例えばホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、ブドウ糖酸化酵素、−ガラクトシダーゼおよびアルカリ・ホスファターゼが含まれる。特異的酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解により、検出可能な変色を生み出すために選択される。好適な酵素の例には、アルカリ・ホスファターゼおよびペルオキシダーゼが含まれる。上述の色素生産性基質ではなく、蛍光生成物を与える蛍光発生基質を用いることも可能である。いかなる場合でも、第一抗体−分子マーカー複合体に酵素標識抗体を加えて結合させ、過剰の試薬を洗い流す。次いで、適当な基質を含有する溶液を抗体−抗原−抗体の複合体に加える。基質は、第二の抗体と結びついている酵素と反応し、定性的な目で見えるシグナルを与え、これをさらに通常は分光光度法で定量し、サンプル中に存在した分子マーカーの量の指標を得ることができる。また、「レポーター分子」は、ラテックス・ビーズ上の赤血球などの細胞凝集または凝集の阻害などの使用法にも及ぶ。
【００４６】
あるいは、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ）およびローダミンなどの蛍光化合物を、結合能力を変化させることなく抗体と化学的に結合させることができる。特定波長の光の照射により活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子に興奮性の状態を誘導し、光学顕微鏡により視覚的に検出可能な特徴的色で光を発する。ＥＩＡの場合には、蛍光標識抗体を第一抗体−分子マーカー複合体と結合させる。結合していない試薬を洗い流した後、残った三成分複合体を適当な波長の光に曝露し、観察される蛍光は、当該分子マーカーの存在を示す。免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ）およびＥＩＡ技法は共に、当技術分野では十分に確立されており、本方法にとっても特に好ましい。しかしながら、放射性核種、化学発光分子または生物発光分子などの他のレポーター分子を用いることもできる。
【００４７】
発明の本態様による抗体は免疫療法で用いられ、翻訳産物に関係する異常組織にとっての拮抗薬としての機能を果たすことができるが、それに限定されるものではない。例えば、翻訳産物が子宮頸癌組織などの異常組織の形成を容易にする蛋白質である場合には、翻訳産物を対照とする抗体の投与は、異常組織の発生に関係する機能を妨げる際に有用であろう。
【００４８】
したがって、本発明のもう１つの態様は、異常組織を有する個体を治療する方法を企図し、前記方法は、前記異常組織の発生に関係する分子マーカーを対象とする免疫相互作用（ｉｍｍｕｎｏ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）分子を、分子マーカーの機能が損なわれて異常組織発生を容易にする能力を低下させるのに十分な時間および十分な条件の下で投与することを含む。
【００４９】
異常組織が子宮頸癌組織であることが好ましい。
【００５０】
分子マーカーがペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であることが好ましい。
【００５１】
あるいは、発明の本態様は、遺伝子分子を投与し分子マーカーの発現を低下させることによっても実施することができる。適当な遺伝子分子の例には、例えばアンチセンス分子、リボザイムまたはコサプレッションのためのセンス分子が含まれる。
【００５２】
以下の非限定的実施例により、本発明をさらに説明する。
【００５３】
【実施例】
実施例１
組織採集およびＲＮＡ単離
生検は、子宮頸部の扁平上皮癌患者から採集した。組織病理学的評価ならびにＲＮＡ分析のため、ティッシュラー（ｔｉｓｃｈｌｅｒ）鉗子によるパンチ生検を腫瘍病変から採取した。組織病理学的分析の場合には、１０％緩衝ホルマリン中で組織を固定し、パラフィン・ブロックに加工した。マルチプル・ステップ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔｅｐ）切片を作成し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。指示があれば、ジアスターゼ消化およびムチカルミン染色を含む、および含まないＰＡＳを行った。ＲＮＡ分析のために採集した組織は、液体窒素中で素早く冷凍した。可能な限り、腫瘍領域からずっと離れた正常子宮頸部組織を対照として採取した。癌のステージングは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｒｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎａｃｏｌｏｇｙ （ＦＩＧＯ） ［ＦＩＧＯ Ｎｅｗｓ、１９８７］による勧告に従って行った。同一患者における遺伝子発現を評価する際の繰り返しを避けるため、異なる患者は異なる試験に組み入れた。全体で、様々な疾患ステージにある３８名の子宮頸癌患者および５名の非子宮頸癌患者について検討した。すべての実験について、製造者のマニュアルに従ってＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用い、全細胞ＲＮＡを単離し、実験で用いる前は−８０℃で保存した。
【００５４】
実施例２
ＲＴ−ＰＣＲ示差的ディスプレイ
正常生検および子宮頸癌生検から全ＲＮＡを単離し、サンプルをＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ Ｉ （Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で処理し、可能性のある染色体ＤＮＡ汚染物を除去した。正常生検および癌生検からの各々の全ＲＮＡ約１μｇを逆転写に用いた。
【００５５】
プライマーとして一塩基に固定された（ｏｎｅ−ｂａｓｅ ａｎｃｈｏｒｅｄ）オリゴ−ｄＴ Ｐ２１を用いることにより第一鎖ｃＤＮＡを合成し、［α−３３Ｐ］ｄＡＴＰの存在下、個別にＰ３０、Ｐ３１、Ｐ３２プライマーとの３種類の組合せを用いることによりパラレルＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲサイクル・パラメータは下記のとおりとした。９４℃で３０秒間４０サイクル、４０℃で２分間および７２℃で３０秒間と、続いて７２℃で１０分間。次いで、７Ｍ尿素を含有する５．７％ ｗ／ｖ変性ポリアクリルアミド・ゲル上でサイズ・マーカーと一緒にＰＣＲ産物を分離した。シークエンシング・ゲルを実行して、１５０ｂｐから１０００ｂｐまでの大きさのｃＤＮＡフラグメントを分割した。示差的に発現したバンドをゲルから切り取り、Ｈ２Ｏ１００μｌ中でゲル片を１５分間煮沸することによりｃＤＮＡフラグメントを溶離し、次いで前述と同一の条件を用いるＰＣＲ再増幅のためのテンプレートとして用いた。再増幅したＰＣＲ産物の一部を２％ ｗ／ｖアガロース・ゲル上で分析し、再増幅の効率をチェックし、ｃＤＮＡフラグメントのサイズを確認した。逆転写およびＰＣＲに用いたすべてのＰＣＲプライマーは、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から入手した。使用するプライマーは、Ｐ２１ ３′−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡ−５′（配列番号１）； Ｐ３０ ５′−ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡ−３′（配列番号２）； Ｐ３１ ５′−ＡＡＧＣＴＴＡＧＴＣＡＡＧ−３′（配列番号３）；Ｐ３２ ５′−ＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣ−３′（配列番号３）とした。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ． （Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）から購入した。［α−３３Ｐ］ｄＡＴＰ （２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ （Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ．）から入手した。７Ｍ尿素を含有する変性ポリアクリルアミド・ゲル（５．７％ ｗ／ｖ）は、Ｇｅｌ−Ｍｉｘ ６ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて作成した。
【００５６】
実施例２
ｃＤＮＡクローニングおよびシークエンシング
再増幅したｃＤＮＡフラグメントは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によるＴＡクローニング・システムを用いるｐＣＲ２．１ベクターまたはＧｅｎＨｕｎｔｅｒ （ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ． Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）によるｐＣＲ−ＴＲＡＰ Ｖｅｃｔｏｒ中にクローニングした。ＤＮＡシークエンシングは、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ （Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いるか、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ｐｒｅｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．、 Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用いる自動シークエンシングのどちらかで行った。得られたヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴサーチ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により分析した。
【００５７】
実施例３
ｃＤＮＡマイクロアレイ作製およびハイブリッド形成
１００μｌのＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物５μｌを２％ ｗ／ｖアガロース・ゲル上で分析した後、残りのＰＣＲ産物をイソプロパノール沈殿により精製し、３Ｘ ＳＳＣ １５μｌに再懸濁し、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）上にプリントした。Ｇ３ＰＤＨ、β−アクチン、β−２−ミクログロブリン、α−チューブリン、サイクロフィリンおよびユビキチンを含むハウスキーピング遺伝子も、正規化のための内部対照としてスポットした。各スライドを湯気が出ている１００℃の水浴上で２−３秒間水分補給し、１００℃の加熱ブロック上で５秒間乾燥し、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて５５０ｍＪの紫外線照射で架橋させた。次いで、スライドを０．２％ ｗ／ｖ ＳＤＳ中で１０分間洗浄し、蒸留水中で５回洗った後に１００℃の蒸留水中で５分間変性させ、９５％ ｖ／ｖエタノール中で５分間乾燥させ、８０℃のオーブン中で５分間空気乾燥した。
【００５８】
様々な疾患ステージにある１０名の子宮頸癌患者の腫瘍生検および相当する隣接正常組織から単離した全ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを用い、比較ハイブリッド形成を行った。全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、Ｃｙ３ （腫瘍ｃＤＮＡの場合）およびＣｙ５ （正常ｃＤＮＡ）蛍光色素で標識し、３ＤＮＡ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔプロトコルの注意（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ）に従ってスライド上にハイブリッド形成させた。癌および正常組織からの標識ｃＤＮＡは、１０種類の別々のハイブリッド形成で単一のガラス・スライド上へ同時にハイブリッド形成させた。加湿マイクロアレイ・ハイブリッド形成カセットを用い、ハイブリッド形成インキュベーション（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）中にすべてのスライドを収容した。ハイブリッド形成したマイクロアレイは、ＧＭＳ ４１８レーザー・スキャナ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いて走査した。Ｃｙ３およびＣｙ５について別々のイメージを得た。次いで、Ｉｍａｇｅｎｅ ３．０定量ソフトウエア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｃ．、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）でシグナルおよびバックグラウンド・シグナルを定量した。発生したシグナル値を分析し、ＣｌｕｓｔｅｒおよびＴｒｅｅｖｉｅｗプログラム（Ｍ．Ｅｉｓｅｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ； ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／）を用いて可視化した。
【００５９】
シグナルは、限局された各スポット内の平均ピクセル輝度として測定し、バックグラウンドは、特定の四角な場所内で限局されたスポットの直径から外側の平均ピクセル輝度を用いて測定した。蛍光のある小さな染みまたは他の汚れで汚染されたスポット、またはバックグラウンド値がスポットのシグナルより大きな場合には欠測と見なした。Ｃｙ３とＣｙ５チャンネルの双方からのシグナル強度は、各アレイ上の内部対照のシグナル強度が１．０のＣｙ３／Ｃｙ５比を有するように各チャンネルの全シグナル強度の比を取ることによって算出される単一の倍率をかけることによって正規化した。正常対照と比較してシグナルに２．５倍以上の差を有するスポットが、示差的に発現したと見なされるであろう。
【００６０】
実施例４
逆ノーザン・ブロット
各クローンからの遺伝子フラグメント２μｇ、ならびに様々な量のα−アクチン（０．５、１、２、または４μｇ）を、スロット・ブロット（ｓｌｏｔ−ｂｌｏｔ）装置を用いてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン・トランスファー・メンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上にブロットし、α−アクチンは内部対照として用いた。１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨによる室温おける５分間の変性、および１．５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４による室温おける５分間の中和の後、８０℃で２時間のインキュベーションによりＤＮＡを膜に固定した。６名の患者、またはそれらに相当する正常生検のどちらかよりプールした腫瘍生検から単離した全ＲＮＡ ３０μｇによる逆転写によって３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを調製した。反応は、１０００ Ｕ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ （登録商標） ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の存在下に４２℃で１時間、５μＭオリゴ（ｄＴ）１６プライマー（Ｐｒｅｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ． Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰミックス、６０μＣｉ ［α−３３Ｐ］ｄＡＴＰおよび［α−３３Ｐ］ｄＣＴＰ （３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）と共にインキュベートすることにより行った。次いで、７０μｌの反応体積で３Ｎ ＮａＯＨ ９μｌによる６５℃における３０分間のインキュベーションによりＲＮＡを加水分解し、続いて１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．４） ３０μｌ、２Ｎ ＨＣｌ ９μｌおよびＨ２Ｏ ２２μｌを加えて中和した。取り込まれなかったヌクレオチドは、ＮｕｃＴｒａｐプローブＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）によって除去した。ハイブリッド形成は、切断（ｓｈｅａｒｅｄ）サケ精子ＤＮＡ （Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）の存在下に４×１０６ｃｐｍ／ｍｌの正常または癌のどちらかのｃＤＮＡプローブを用いて４０℃で行った。純増加倍率は、α−アクチンによる正規化後の正常組織のＲＮＡから得られたレベルに対する癌性組織のＲＮＡ由来のプローブによって得られた遺伝子発現の比として算出した。
【００６１】
実施例５
ノーザン・ブロット分析
癌生検またはそれらに隣接する組織病理学的に正常な組織から単離した全ＲＮＡ ２０μｇをノーザン・ブロット分析に用いた。電気泳動の後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン・トランスファー・メンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に移し、ハイ・プライム（ｈｉｇｈ ｐｒｉｍｅ） ＤＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてランダムな６個のヌクレオチドのプライマーを含む（ｈｅｘａ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ）３２Ｐ標識ｃＤＮＡクローンで探索した。取り込まれなかったヌクレオチドは、ＮｕｃＴｒａｐプローブＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）によって除去した。ハイブリッド形成および洗浄は前述のように行った（Ｓｏｏｎｇ、他、１９９２）。ハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＤＨ ｃＤＮＡプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）とのハイブリッド形成を用いてＲＮＡの負荷を定量した。ハイブリッド形成および洗浄後、膜を曝露した。分析のために、各バンドの放射性を、ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡを用いるデンシトメーター・スキャニングにより定量した。
【００６２】
実施例６
ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析
ハイブリッド形成および洗浄後、膜を曝露した。分析のために、各バンドの放射性を、ＢｉｏＲａｄ ＦＸ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ （ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いるデンシトメーター・スキャニングにより定量した。
【００６３】
実施例７
ＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成
ＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成は、ＤＩＧ ＲＮＡ標識Ｋｉｔ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、ＤＩＧ （ジゴキシゲニン）標識ｃＲＮＡプローブによって行った。遺伝子フラグメント挿入物が反対方向である２種類のサブクローンを選択し、センスおよびアンチセンス・プローブをさらに作製した。標識反応は、ＤＩＧ ＲＮＡ標識Ｋｉｔを用い、製造者のプロトコルに従って行った。ＢａｍＨ１部位におけるテンプレートＤＮＡの直線化の後、ＤＩＧ−ＵＴＰの存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ７５Ｕを用い、ＤＩＧ標識転写物を合成した。
【００６４】
癌生検およびそれらに相当する正常組織を様々な癌ステージの患者から採集した。生検を厚さ１０μｍの凍結切片に切り、顕微鏡用スライド上に直接マウントした。組織切片は、５０℃で２分間、室温で３０分間インキュベートし、続いて４％ ｖ／ｖパラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳと共に室温で７分間、次いでＰＢＳと共に３分間インキュベートし、続いて２Ｘ ＳＳＣで各５分間２回洗浄することにより固定した。予備ハイブリッド形成（Ｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、５％ ｗ／ｖ脱脂粉乳、４Ｘ ＳＳＰＥ、５０％ ｖ／ｖ脱イオン化したホルムアミド、ニシン精子ＤＮＡ ３０μｇ、１％ ｗ／ｖ ＳＤＳおよびＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏを含有するブロック溶液中、３７℃で１時間インキュベートすることにより行った。次いで、ＤＩＧ標識アンチセンスｃＲＮＡプローブまたはセンスｃＲＮＡプローブ２００ｎｇ／ｍｌを、ハイブリッド形成緩衝液（１６．６％ ｗ／ｖ硫酸デキストラン、５％ ｗ／ｖ脱脂粉乳、４Ｘ ＳＳＰＥ、５０％ ｖ／ｖ脱イオン化したホルムアミド、１％ ｗ／ｖ ＳＤＳおよびＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ）中３７℃で一夜、組織切片と共にインキュベートした。続いて、スライドを室温で５分間、２Ｘ ＳＳＣで２回洗浄した。組織切片を室温で２時間、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５ならびに１％ ｗ／ｖ ＢＳＡおよび０．５％ ｗ／ｖα−アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体（ＢＭ、ＭａｎｎＬｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液と共にインキュベートした。着色のため、組織切片スライドを暗所中室温で一夜、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ ＭｇＣｌ２、３．４％ ＮＢＴ、１．８％ ＢＣＩＰ、２．４％レバミゾールに浸した。スライドを室温で５分間、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８および１ｍＭ ＥＤＴＡ中でインキュベートすることにより呈色反応を停止させ、室温で５分間Ｈ２Ｏに浸した。ヘマトキシリン（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、Ｄｏｒｓｅｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ）中２−５秒間のカウンター染色の後、組織切片スライドを室温でＨ２Ｏで洗浄し、Ｋａｉｓｅｒ’ｓグリセロール・ゼラチン溶液（Ｍｅｒｋ ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、カバーグラス（ｃｏｖｅｒｓｌｐｓ）を用いてマウントした。
【００６５】
ヘマトキシリンおよびエオシン染色の場合には、組織切片をヘマトキシリン（フィルタ処理したヘマトキシリンは１ｍｌ酢酸ｖ／ｖを含有する）に４分間浸し、Ｈ２Ｏで洗浄し、続いて０．５％ ｖ／ｖ酸アルコール（７５％ ｖ／ｖアルコール中の０．５％ ｖ／ｖ ＨＣｌ）に２秒間浸し、続いてＨ２Ｏで洗浄した。次いで、組織切片をエオシン溶液（１％ ｖ／ｖエオシン原液：７０％アルコール＝１：３）に３分間浸し、流水によって洗浄した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ ６０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ）でスライドを見た。
【００６６】
実施例８
ヒト子宮頸癌生検からの示差的に発現したｃＤＮＡフラグメントの同定
様々なＦＩＧＯステージの子宮頸部扁平上皮細胞癌患者より得た６つの生検から単離された全ＲＮＡを用い、ｃＤＮＡを逆転写した。対応する隣接の組織病理学的に正常な上皮組織から単離されたＲＮＡを同様に増幅させ、腫瘍特異的変化を同定するためにそれらの遺伝子発現プロフィールを比較した（図１）。特定のタイプの腫瘍生検から「偽陽性の」示差的に発現したｃＤＮＡフラグメントを単離することを避けるため、様々なＦＩＧＯステージの子宮頸癌生検を利用した（Ｌｉａｎｇ他、１９９４）。発明者他は、発癌にとって重要な真の示差的に発現したバンドは、全部ではないがほとんどの子宮頸癌サンプルでは、隣接する正常サンプルに比べて一般的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートし、それらのバンドは示差的ディスプレイ分析によって再現性よく生成するにちがいないと仮定した。再現性を保証するため、ＲＴ反応を含むすべてのＰＣＲ反応を３回づつ行い、各ＰＣＲ産物を、異なる実行時間に変性したポリアクリルアミド・ゲル中の異なる電気泳動分離に振り向けた。癌生検または相当する組織病理学的に正常な組織からの６つの独立したｍＲＮＡのサンプルからの増幅されたＰＣＲ産物のパターンは、用いた各々のプライマー・セットの同一バンド形成パターンと類似していることが分かった（図１）。
【００６７】
一般的に、癌生検から生成したＰＣＲバンドの大半は、それらの対応する正常対応物より大きな強度を示すことが観察された（図１）。試験した３種類のプライマー・セットＰ２１−Ｐ３０、Ｐ２１−Ｐ３１またはＰ２１−Ｐ３２について、癌生検および対応し相当する正常対照組織のｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡバンド間で、１８本のバンドがはっきりと異なっていることが明らかとなった（図１）。これら１８本のバンドのうち１４本は癌生検中でアップレギュレートされ、４本のバンド（Ｇ３１Ｎ１、Ｇ３１Ｎ２、Ｇ３１Ｎ３およびＧ３２ＣＮ）はダウンレギュレートされることが分かった（図１）。これら１８本のバンドのうち１７本はアクリルアミド・ゲルから首尾よく抽出され、再増幅させてｐＣＲ−ＴＲＡＰまたはｐＣＲ２．１ベクター中のどちらかに個別にクローニングした。全部で４４種類のクローンが同定された。Ｇ３１Ｎ１およびＧ３１Ｎ２からの遺伝子フラグメントは、同一配列を有していることから同一遺伝子と見なした。続いて、すべてのクローン化ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列決定を行い、それらの大きさが長さ１７６から４２５ｂｐであることが分かった（図１）。塩基配列決定により、すべてのクローンがそれぞれの５′および３′末端に予想通りのプライマー配列を有していることが確認された。また、発明者他は、逆ノーザン・ブロット分析のための示差的ディスプレイに用いた６名の患者からのＲＮＡサンプルをプールすることによって入手したプールＲＮＡサンプルを用いた。これは、発現がアップレギュレートされ示差的ディスプレイ試験によって検出されるクローンを確認することであった（図１）。この分析で得られた結果は、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析により得られた結果（図２）と極めて類似していた。
【００６８】
これら４４種類の単離クローンの発現がヒト子宮頸癌で増幅していることを確認するため、逆ノーザン・ブロット分析を行った。単離された４４種類のｃＤＮＡクローンのうち、２８種類のクローンの発現が癌生検中で著しく増加していることが確認され、純増加倍率は１．７から４．３にまで及んだ（図２および３）。これら２８種類のクローンの配列を表２に列挙する。示差的ディスプレイ試験から、クローンＧ３１Ｎ１、Ｇ３１Ｎ３およびＧ３２Ｎの発現は、癌組織に比べて正常組織でより大きいことが観察された（図１）。しかしながら、この観察は、逆ノーザン・ブロット分析では確認されなかった（図２）ことから、発明者他はこれら３種類のクローンを偽陽性と見なした。
【００６９】
実施例９
様々なＦＩＧＯステージにおけるｃＤＮＡクローンの遺伝子発現のプロフィール
ヒト子宮頸癌の病因における４４種類のｃＤＮＡクローンの潜在的役割を研究するため、ｃＤＮＡマイクロアレイを用い、１０検体の子宮頸癌生検におけるこれら４４種類のクローンの遺伝子発現プロフィールをそれらの対応する隣接の正常組織と比較した。ｃＤＮＡマイクロアレイは、４４種類のｃＤＮＡクローンから生成したＤＮＡをコーティングしたガラス製スライド上に２つずつプリントすることによって作製した。試験した１０対の組織生検の中で、３対がステージ１Ｂの癌患者から得られ、ステージ２Ａおよび２Ｂの癌患者からはそれぞれ２対、ステージ３Ｂの癌患者からは３対を得た。
【００７０】
ｃＤＮＡ分析から得られた結果は、１０名すべての子宮頸癌患者における４４種類のクローンのうち２５種類の発現がアップレギュレートされていることを示した（図２）。
【００７１】
発明者他は、診断用マーカーとして用いられる可能性のある遺伝子については、そのＲＮＡは豊富であると推論した。マイクロアレイ分析によってアップレギュレートされていることが確認された２５種類のクローンのうち２２種類は、４種類の子宮頸癌細胞株、ＨｅＬａ、ＣａＳＫｉ、ＳｉＨａおよびＨＴ−３から単離されたＲＮＡを用いるノーザン・ブロット分析用のプローブとして用いた。これらのクローンのうち９種類は、強力なハイブリッド形成シグナルを示した。次いで、様々なＦＩＧＯステージのヒト子宮頸部扁平上皮細胞癌生検から精製されたＲＮＡおよび隣接する正常上皮のＲＮＡの続くノーザン・ブロット分析用のプローブとして選択した。これらのクローンのうち２種類、すなわちＧ３０ＣＣおよびＧ３２Ｃ４Ｂが、早期ＦＩＧＯステージの子宮頸癌生検中で発現のレベルが上昇を示したことが観察された（図５）。隣接する組織病理学的に正常な上皮と比較すると、クローンＧ３０ＣＣの発現はステージ２Ａの癌組織では約５倍までアップレギュレートされ、一方Ｇ３２Ｃ４Ｂもステージ１Ｂの癌組織では同様の大きさでアップレギュレートされていた。これら２種類のクローンの発現は、後期ＦＩＧＯステージの患者から採集した隣接する組織病理学的に正常な上皮でも明らかに上昇していた（図５）。後期子宮頸癌組織にはＦＩＧＯステージが２Ｂおよび３Ｂの患者が含まれ、それらの患者では、癌腫が子宮頸部を超えて広がり、明らかに子宮の近くまで関与していた（ＦＩＧＯ Ｎｅｗｓ、１９８７）。
【００７２】
クローンＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣの正体を研究するため、発明者他は、ＨｅＬａヒト子宮頸癌細胞株に由来するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによる対応する完全長ｃＤＮＡ遺伝子の単離用のプローブとしてこれらのクローンを用いた。ＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ ｃＤＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、プローブとしてＧ３２Ｃ４ＢまたはＧ３０ＣＣを用い、ＨｅＬａ ｃＤＮＡライブラリーから代表的な陽性クローンを単離した。得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定し、それぞれ既知のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ・サブユニット４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２ ｍＲＮＡと相同であることを見いだした。
【００７３】
実施例１０
配列分析
ＢＬＡＳＴＮ配列検索（全米バイオテクノロジー情報センター）により、４４種類のクローン化ｃＤＮＡフラグメントのうち２８種類が、Ｇｅｎｅｂａｎｋですでに報告された遺伝子または発現した配列タグ（ＥＳＴ）のどちらかと相同であることが決定された（表１）。Ｇ３０ＣＣ、Ｇ３０ＣＤ、Ｇ３０ＣＩ、Ｇ３０ＣＪ、Ｇ３１Ｃ５Ｈ、Ｇ３２Ｃ３Ｂ、Ｇ３２Ｃ４ＢおよびＧ３２Ｃ７のｃＤＮＡ配列は、報告された遺伝子配列のコーディング領域内に位置し、クローンＧ３１Ｃ４ＢおよびＧ３２Ｃ２Ｃの配列は、報告された相同配列に関して逆方向であることが分かった。クローンＧ３０ＣＢおよびＧ３１Ｃ６Ｂの配列も、２種類の単離ＥＳＴクローンについて報告された配列に関して逆方向であることが分かった。２８種類のクローンのうち１１種類、すなわちＧ３０ＣＥ、Ｇ３０ＣＫ、Ｇ３１Ｃ４Ｃ、Ｇ３１Ｃ５Ｂ、Ｇ３１Ｃ５Ｃ、Ｇ３１Ｃ５Ｄ、Ｇ３１Ｃ５Ｇ、Ｇ３２Ｃ２Ａ、Ｇ３２Ｃ３Ｃ、Ｇ３２Ｃ４ＤおよびＧ３２Ｃ５Ａは、ＧｅｎｅＢａｎｋまたはＥＳＴデータベースで報告されているどの遺伝子配列にも一致しないことから、新規な遺伝子配列のようである（表１）。
【００７４】
クローンＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣの配列を相同性検索のためにＧｅｎｅＢａｎｋにブラストした（ｂｌａｓｔｅｄ）ところ、検索結果は、クローンＧ３２Ｃ４Ｂが１００％の同一性で既知のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ・サブユニット４遺伝子と相同であることを示した（表１）。一方、クローンＧ３０ＣＣは、９９％の同一性でリボソーム蛋白質Ｓ１２ ｍＲＮＡと相同であった（表１）。
【００７５】
クローンＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣの正体をさらに研究するため、発明者他は、ヒトＨｅｌａ細胞株に由来するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによる対応する完全長ｃＤＮＡ遺伝子の単離用プローブとしてクローンＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣを用いた。プローブとしてＧ３２Ｃ４ＢまたはＧ３０ＣＣのどちらかを用い、Ｈｅｌａ ｃＤＮＡライブラリーからＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ ｃＤＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて得られた代表的な陽性クローンの塩基配列を決定し、それぞれＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ・サブユニット４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２ ｍＲＮＡと相同であることを再度見いだした。次いで得られた完全長ｃＤＮＡクローンをノーザン・ブロット分析用のプローブとして用い、結果は、Ｇ３２Ｃ４ＢまたはＧ３０ＣＣについて得られた結果と類似していた（図４および６）。
【００７６】
実施例１１
様々なＦＩＧＯステージのヒト子宮頸癌におけるクローン化ｃＤＮＡフラグメントの発現
ヒト子宮頸癌の病因における新たに単離されたｃＤＮＡの潜在的役割を研究するため、発明者他は、２８種類の単離クローンのうち９種類を用い、様々な病的ステージのヒト子宮頸癌生検から精製したｍＲＮＡを探索した。発明者他による最も初期の研究では、これら９種類のクローンから、ヒト子宮頸癌細胞株から精製されたＲＮＡとの強力なハイブリッド形成シグナルが得られることが分かっている。
【００７７】
ＦＩＧＯステージ１Ｂ、２Ａ、２Ｂおよび３Ｂの子宮頸癌生検からのｍＲＮＡを相当する正常組織生検と一緒に単離した。クローンＧ３２Ｃ４Ｂが、試験したステージ１Ｂのヒト子宮頸癌サンプルのすべてで強く発現することが観察された（図７）。Ｇ３２Ｃ４Ｂの発現レベルは、対応し相当する正常生検の発現レベルの５倍を超えた（図７）。興味深いことに、クローンＧ３２Ｃ４Ｂの全遺伝子発現は、疾患が進行するにつれて相当する正常組織に比べて減少するように見えた（図７）。Ｇ３２Ｃ４Ｂの発現はステージ２Ａの子宮頸癌では顕著に減少し（図７）、ステージ２Ｂおよび３Ｂのヒト子宮頸癌標本におけるその発現は、相当する正常の発現と同様であった（図７）。これらの結果は、クローンＧ３２Ｃ４Ｂの発現が疾患の早期発生時に最高になったことを示唆している。
【００７８】
ステージ１Ｂの子宮頸癌におけるクローンＧ３０ＣＣの発現は、相当する正常生検の発現の約３倍であった（図７）。この差は、相当する正常生検に比べ、ステージ２Ａの子宮頸癌では約５倍まで増加した（図７）。しかしながら、Ｇ３０ＣＣの発現レベルはステージ２Ａの子宮頸癌で最高になるようであり、疾患の後期ステージにある患者から得た子宮頸癌組織の相当する正常生検の発現レベルと類似の発現レベルまで低下した（図７）。
【００７９】
同様に、クローンＧ３０ＣＡ、Ｇ３２Ｃ７およびＧ３１Ｃ５Ｇの発現は、早期ステージの疾患を有する患者から得られた子宮頸癌組織では対応する正常組織に比べて比較的高かった（図８および９）。しかしながら、疾患の後期ステージから得られた子宮頸癌組織を研究した場合、それらの発現レベルは対応し相当する正常組織の発現レベルと類似していた（図８および９）。
【００８０】
クローンＧ３０ＣＩだけは、様々なステージで得られたヒト子宮頸癌生検と僅かにハイブリッド形成した（図９）。クローンＧ３０ＣＩは、癌および正常組織生検中でいかなる発現も検出できなかった。
【００８１】
実施例１２
ＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成
発明者他のノーザン・ブロット分析から得られた結果は、後期臨床ステージの子宮頸癌生検と一緒に採集した相当する正常組織中ではＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣの発現も上昇したことを示した。後期ＦＩＧＯステージおよび関連する細胞タイプに対し、相当する正常生検中のＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣ増幅の可能性のある意義を探るため、発明者他は、ＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成試験を行った。
【００８２】
Ｇ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣプローブは、材料および方法に記載したアンチセンスとセンスの両方向で合成し、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成試験に用いた。組織学的同定は、切片のＨ＆Ｅ染色後に得られた切片で行った。様々なＦＩＧＯステージの子宮頸癌生検をそられに相当する正常組織と一緒に検討した。各々のＦＩＧＯステージについて２名の患者について検討し、１名の代表的患者の結果を示した。
【００８３】
ＦＩＧＯステージ１Ｂ、２Ａ、２Ｂおよび３Ｂの扁平上皮癌の細胞質では、Ｇ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣに関する強いハイブリッド形成シグナルを一貫して検出することができた（図１０および１１）。それに比較して、試験した様々なステージの子宮頸癌生検のすべてについて隣接する線維筋間質細胞では、弱いハイブリッド形成シグナルが検出できたに過ぎなかった（図１０および１１）。ステージ１Ｂの子宮頸癌患者から得られた相当する隣接組織の正常扁平上皮細胞では、Ｇ３２Ｃ４Ｂアンチセンス・プローブとのハイブリッド形成シグナルは検出できなかった（図１０）。一方、傍上皮細胞層ではＧ３２Ｃ４Ｂプローブとのハイブリッド形成シグナルは検出できなかったが、ステージ２Ａの子宮頸癌患者から得られた相当する隣接組織中の基底および未成熟上皮細胞層内では、かすかに陽性のハイブリッド形成シグナルを検出することができた（図１０）。同様に、Ｇ３０ＣＣアンチセンス・プローブは、ＦＩＧＯステージが１Ｂと２Ａの双方の子宮頸癌患者から得られた相当する正常組織中の傍上皮細胞層とハイブリッド形成せず、陽性のハイブリッド形成シグナルは基底未成熟上皮細胞層内で検出された（図１１）。さらに注目すべきことに、ＦＩＧＯステージが２Ｂおよび３Ｂの子宮頸癌患者から得られた相当する正常組織をＧ３２Ｃ４ＢおよびＧ３０ＣＣアンチセンス・プローブについて検討した場合に、組織学的に正常な上皮細胞層で強いハイブリッド形成シグナルを得ることができた（図１０および１１）。ハイブリッド形成シグナルは、基底未成熟上皮細胞で最も強かった（図１０および１１）。
【００８４】
実施例１３
子宮頸癌組織の隣接する正常組織におけるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ・サブユニット４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２の遺伝子発現のレベル
発明者他のノーザン・ブロット分析から得られた結果は、後期臨床ステージの子宮頸癌生検と一緒に採集した隣接正常上皮においてＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４およびリボソーム蛋白質Ｓ１２遺伝子の発現も上昇したことを示した。癌が進行するにつれて、癌の隣接生検ならびに関連する細胞タイプにおいてＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２遺伝子が徐々にアップレギュレートされる可能性を確認するため、発明者他は、ＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成試験を行った。様々なＦＩＧＯステージの扁平上皮細胞子宮頸癌生検を、それらの対応する隣接正常組織と併せてｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成に用いた。子宮頸部の扁平上皮細胞癌患者合計１４名および対応する隣接正常組織について検討し、代表的な結果を図１２に示した。
【００８５】
リボソーム蛋白質Ｓ１２遺伝子のアップレギュレートされた発現は、早期ステージの子宮頸癌患者（ステージ１Ｂの患者８名およびステージ２Ａの患者６名）の隣接する組織病理学的に正常な上皮１０検体のうち１０検体の基底未成熟上皮細胞層（ＢＬ）内で検出された（図１２Ｂ）。これらすべての組織切片において上部層上皮細胞（ＰＬ）ではハイブリッド形成シグナルを見いだすことはできなかった。全体として、早期ステージの子宮頸癌患者（１０名の患者のうち２名）の隣接する組織病理学的に正常な組織では、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子について基底未成熟上皮細胞層内で弱いハイブリッド形成シグナルを検出することができたに過ぎなかった（図１２Ｂ）。予想通り、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２遺伝子は、すべてのステージの子宮頸癌組織と強くハイブリッド形成した（図１２Ｄ）。それに比較して、後期ステージの子宮頸癌患者の隣接する組織病理学的に正常な組織を試験した場合、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２遺伝子に関する強いハイブリッド形成シグナルは、おそらく組織学的に正常な上皮細胞層のすべてで得られた（試験した患者４名中４名）（図１２Ｃ）。ハイブリッド形成シグナルは、基底未成熟上皮細胞で最も強かった（図１２Ｃ）。陰性対照は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子およびリボソーム蛋白質Ｓ１２遺伝子が、悪性でない状態で外科手術のために入院した患者から得られた正常上皮細胞とはハイブリッド形成しないことを示した（図１２Ａ）。
【００８６】
実施例１４
分子マーカーの臨床上の意義
ＣＩＮ病変は持続性のＨＰＶによって誘発される。危険度の高いＨＰＶ感染の検出は、子宮頸癌を診断するのに有用なマーカーとして考えられてきた。しかしながら、危険度の高いＨＰＶタイプにより誘発される感染が、子宮頸部病変の臨床徴候のない健康で正常な女性の約１０％に見いだされる（Ｋｊａｅｒ他、１９９７）。最も危険度の高いＨＰＶ感染は、通常数ヶ月間続くに過ぎない（Ｈｏ他、１９９８）。最大の発病率は４０歳以上の女性に見られる。しかしながら、ＨＰＶ感染の最大発生率は２０代にあり、ＨＰＶ感染の時点から癌発生の時点までの長い潜伏期間が存在する（Ｌａｚｏ、１９９９）。したがって、ＨＰＶをベースとするスクリーニング・プログラムは、多くの女性の過剰検査をもたらすだけでなく、症例の割合を特定できないであろう。
【００８７】
一方、悪性度の低いＣＩＮ病変の大部分は自然に退縮し、存続するか悪性度の高い子宮頸部過形成まで進行することは極めてわずかに過ぎない。Ｏｓｔｏｒ （１９９３）は、おおよその可能性としてＣＩＮ １の退縮が６０％、存続が３０％、ＣＩＮ ３への進行が１０％、浸潤までの進行が１％であると報告した。対応するＣＩＮ ２についての概算は、それぞれ４０％、４０％、２０％および５％である。ＣＩＮ ３についての可能性は、退縮するが３３％、浸潤まで進行するが１２％を超える。その後の検討は、平均するとＣＩＮ １の１１％がより悪性度の高い異形成まで進行し、残りは退縮または存続するのどちらかであることを示した（Ｄｕｇｇａｎ、１９９８）。
【００８８】
子宮頸部病変の治療は、病変が浸潤性であるか否かの組織学的判断に全体的に左右される。この区別は、特に小さな生検標本および掻爬材料においては評価するのが極めて困難なことがある。したがって、子宮頸部の新生細胞の浸潤能力を判定する感度が良く客観的な診断手順にはかなりの価値があるであろう。あるいは、進行する危険度が低いにもかかわらず、現在のところ悪性度の高いＣＩＮ病変はすべて、浸潤癌の発生を確実に避けるために外科的切除（円錐切除術）により取り除かれているのは、我々が、退縮または存続している病変を、進行する可能性の高い病変と区別できる基準が存在しないためである。すなわち、進行マーカーがないことは、病変が自然に治癒すると思われる女性にかなりの数の過剰治療をもたらしている。形態それ自体はどの病変が進行または退縮するのかを予測しないため、今後の取り組みは、個々の患者で予後を判断するための形態以外の因子を探すべきである。
【００８９】
さらに、残留性、再発性および持続性疾患は、ＣＩＮを完全に摘出した患者におけるよりも、子宮膣部および子宮頸管部ならびに切除の深部でＣＩＮを不完全に摘出した患者に最も一般的であった（Ｚａｉｔｏｕｎ他、２０００）。一報告から、子宮頸部の推定潜在腺癌（ＡＣＩＳ）のための筋膜外（ｅｘｔｒａｆａｓｃｉａｌ）子宮切除術にもかかわらず、残留病巣が残存し、その後も浸潤性腺癌として存在することが示唆された（Ｋｒｉｖａｋ他、２０００）。長期の追跡で、残留疾患を有するＣＩＮ患者は、持続性疾患の危険性が増加し、したがって、定期的に追跡しなければならない。ＡＣＩＳは、子宮頸部の細胞診およびコルポスコピーによって確実には診断されないため、保存療法を受ける患者は、通常パパニコロー・スミアと組み合わせて子宮頸内掻爬（ＥＣＣ）を受けていた。逆に、ＥＣＣが陽性なのは腺病変を有する患者の４３％に過ぎない（Ｐｏｙｎｏｒ他、１９９５）。したがって、ＥＣＣと組み合わせたＰａｐスミアは、子宮頸部腺癌の再発を検出するのには依然として不十分である。
【００９０】
子宮頸癌が診断されると、臨床的ステージングが行われる。早期ステージの腫瘍は、錐体生検または簡単な子宮切除術で管理することができる。それより高いステージの腫瘍は、外科的に、または放射線療法で治療することができる。進行した転移性疾患は、放射線療法および同時化学療法に反応することがある。これらの治療の後、再発の検出に蛋白質マーカーが必要である（Ｃａｎａｖａｎ他、２０００）。
【００９１】
最近の子宮頸癌が極めて不十分な予後であるのは、主に、生存期間を増加させるような有効な体系的治療法が存在しないためである（Ｐｉａｍｓｏｍｂｏｏｎ他、１９９６）。再発子宮頸癌の５年生存率は５％に過ぎない（Ｂｕｒｋｅ他、１９８９）。しかしながら、ステージＩ−ＩＩＡの子宮頸癌に対する根治的な子宮切除術後、女性の１０％−１５％が再発する。これらの再発の６０％は、骨盤だけに位置する（Ｌａｎｃｉａｎｏ、１９９６）。再発までの平均時間は２１．７ヶ月であり、患者の大部分は腺癌、リンパ節転移、および複雑な外科的余地を有する。よくあるフォローアップであるＰａｐスミアは、疾患状態については不完全な指標のようであった（Ｔａｙ他、１９９７）。
【００９２】
したがって、癌患者の診断における主要な問題は、早期の検出、生物学的挙動の正確な予測および予後の正確な評価のための特異的腫瘍マーカーを欠くことである。発明者他による結果は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４およびリボソーム蛋白質Ｓ１２遺伝子が、ヒト子宮頸癌にとっての早期診断用マーカーとして、および進行性疾患の分子マージンを明確にする意義深い価値をもたらすことを示した。さらに、子宮頸部の局在性癌患者の術後フォローアップ中のＮＡＤＨ ４またはリボソーム蛋白質Ｓ１２の測定は、治癒的療法が依然として選択可能である場合に、再発性疾患の早期検出につながるであろう。
【００９３】
当業者が認識しているように、本明細書に記載の発明は、具体的に記載した以外の変形形態および修正形態が可能である。当然のことながら、本発明にはそのようなすべての変形形態および修正形態が含まれる。また、本発明には、本明細書で言及または指示されるすべてのステップ、特徴、組成物および化合物が個別または集合的に含まれ、前記ステップまたは特徴のいずれか２個以上のいかなる組合せも、およびすべての組合せも含まれる。
【００９４】
【表２】
2004503261.tif 000003
2004503261.tif 000004
【００９５】
【表３】
2004503261.tif 000005
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2004503261.tif 000007
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【００９６】
【参考文献】
2004503261.tif 000009
2004503261.tif 000010
2004503261.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】
正常およびヒト扁平上皮細胞癌生検のｃＤＮＡフラグメントの示差的に発現した分析を示す写真表示である。６検体の子宮頸部癌生検およびそれらに相当する正常組織から抽出した全ＲＮＡ１μｇを、Ｐ２１ （３′−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡ−５′［配列番号１］）プライマーを用いて逆転写し、続いて［α−３３Ｐ］ｄＡＴＰ の存在下でＰ２１プライマーとＰ３０ （５′−ＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡ−３′［配列番号２］）； Ｐ３１（５′−ＡＡＧＣＴＴＡＧＴＣＡＡＧ−３′［配列番号３］）； またはＰ３２ （５′−ＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣ−３′［配列番号４］）とのプライマー対を用いることにより、パラレルＰＣＲで増幅させた。ゲル電気泳動後、示差的発現遺伝子フラグメントをオートラジオグラフィにより示した。
【図２】
様々なＦＩＧＯステージのヒト子宮頸部扁平上皮癌生検における示差的ディスプレイにより単離された４４種のｃＤＮＡクローンのうち４０種の発現のｃＤＮＡマイクロアレイ分析を示す図である。データは行列形式で示され、各行は単一ｃＤＮＡクローンから得られた結果を示し、各列は実験サンプルを示す。列１−１０は、生検および相当する正常上皮を採取した１０名の子宮頸部扁平上皮細胞癌患者を示す。疾患のステージを各患者について示す。各サンプルについて、癌生検における各クローンの転写物の存在度と隣接する病理組織学的に正常な上皮細胞で検出された同一クローンの転写物の存在度との比を、対応する細胞の色により行列中に示す。緑色の正方形は、対照より少ない転写物レベルを示し、赤色の正方形は対照の転写物レベルを超える転写物レベルを示すが、黒色の正方形は対照と同じ転写物レベルを示す。用いた対照はβ−２−ミクログロブリン、α−チューブリン、サイクロフィリン、β−アクチン、ユビキチンおよびＧ３ＰＤＨである。灰色の正方形は、行列中の特定な細胞について技術的に不十分なデータまたは欠測値を示す。
【図３】
逆ノーザン・ブロットの定量分析を示す写真表示である。逆ノーザン・ブロットのハイブリッド形成反応性は、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒによって検出した。癌生検に由来するｃＤＮＡプローブによるハイブリッド形成反応性を対応する正常組織に由来するｃＤＮＡプローブによるハイブリッド形成反応性を比較した増加倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）を示した。癌組織では２８種類のクローンが顕著にアップレギュレートされることが分かった。
【図４】
Ｇ３２Ｃ４Ｂの完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするｃＤＮＡライブラリーを示す写真表示である。ＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ ｃＤＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、ビオチン化Ｇ３２Ｃ４Ｂプローブを含むＨｅｌａ ｃＤＮＡライブラリーから５３種類の陽性クローンが得られた（Ａ）。Ｇ３２Ｃ４Ｂプローブによって捕捉された長い挿入物を含む７種類の陽性ｃＤＮＡクローンを配列決定し、全体にわたってＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ・サブユニット４遺伝子と相同（９８％以上一致）であることが判明した。
【図５】
様々なＦＩＧＯステージのヒト子宮頸部扁平上皮細胞癌におけるクローンＧ３０ＣＣおよび Ｇ３２Ｃ４Ｂのノーザン・ブロット分析を示す写真表示である。様々なＦＩＧＯステージの癌生検およびそれらの対応する隣接正常上皮から得られた全ＲＮＡ２０ｍｇをノーザン・ブロット・ハイブリッド形成に用いた。Ｇ３ＰＤＨを内部対照として用い、ＲＮＡの量を正規化した。
【図６】
Ｇ３０ＣＣの完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするｃＤＮＡライブラリーを示す写真表示である。ＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ ｃＤＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、ビオチン化Ｇ３０ＣＣ プローブを含むＨｅｌａ ｃＤＮＡライブラリーから１２２種類の陽性クローンが得られた（Ａ）。Ｇ３０ＣＣプローブによって捕捉された長い挿入物を含む７種類の陽性ｃＤＮＡクローンを配列決定し、全体にわたってリボソーム蛋白質Ｓ１２ ｍＲＮＡと相同（９８％以上一致）であることが判明した。
【図７】
ヒト子宮頸部生検おけるクローンＧ３２Ｃ４ＢおよびクローンＧ３０ＣＣ発現のノーザン・ブロット分析を示す写真表示である。様々なＦＩＧＯステージのヒト子宮頸癌生検およびそれらの隣接正常組織から得られた全ＲＮＡ２０ｍｇをノーザン・ブロット・ハイブリッド形成に用いた。Ｇ３ＰＤＨを内部対照として用い、ＲＮＡの量を正規化した。遺伝子発現における純増加倍率（ｎｅｔ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）は、膜の曝露およびＢｉｏＲａｄ ＦＸ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ （Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いるデンシトメーター・スキャニング（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ）による定量後に決定した。
【図８】
ヒト子宮頸部生検おけるクローンＧ３０ＣＡおよびクローンＧ３２Ｃ７発現のノーザン・ブロット分析を示す写真表示である。様々なＦＩＧＯステージのヒト子宮頸癌生検およびそれらの隣接正常組織から得られた全ＲＮＡ２０ｍｇをノーザン・ブロット・ハイブリッド形成に用いた。Ｇ３ＰＤＨを内部対照として用い、ＲＮＡの量を正規化した。遺伝子発現における純増加倍率は、膜の曝露およびＢｉｏＲａｄ ＦＸ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ （Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いるデンシトメーター・スキャニングによる定量後に決定した。
【図９】
ヒト子宮頸部生検おけるクローンＧ３１Ｃ５Ｇ、クローンＧ３１ＣＩおよびクローンＧ３２Ｃ２Ｂ発現のノーザン・ブロット分析を示す写真表示である。様々なＦＩＧＯステージのヒト子宮頸癌生検およびそれらの隣接正常組織から得られた全ＲＮＡ２０ｍｇをノーザン・ブロット・ハイブリッド形成に用いた。Ｇ３ＰＤＨを内部対照として用い、ＲＮＡの量を正規化した。遺伝子発現における純増加倍率は、膜の曝露およびＢｉｏＲａｄ ＦＸ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ （Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いるデンシトメーター・スキャニングによる定量後に決定した。
【図１０】
Ｇ３２Ｃ４ＢについてのＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成を示す写真表示である。様々なＦＩＧＯステージ（１Ｂ、２Ａ、２Ｂおよび３Ｂ）のヒト子宮頸癌生検ならびに隣接正常組織から、厚さ１０μｍの組織切片を調製した。得られた組織切片は、クローンＧ３２Ｃ４Ｂに由来するＤＩＧ標識アンチセンスまたはセンス・プローブのどちらかとハイブリッド形成させた。組織学的同定にはヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いた。示す倍率は６００Ｘとした。
【図１１】
Ｇ３０ＣＣについてのＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成を示す写真表示である。様々なＦＩＧＯステージ（１Ｂ、２Ａ、２Ｂおよび３Ｂ）のヒト子宮頸癌生検ならびに隣接正常組織から、厚さ１０μｍの組織切片を調製した。得られた組織切片は、クローンＧ３０ＣＣに由来するＤＩＧ標識アンチセンスまたはセンス・プローブのどちらかとハイブリッド形成させた。組織学的同定にはヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いた。示す倍率は６００Ｘとした。
【図１２】
正常子宮頸部扁平上皮、早期または後期ＦＩＧｏおよび扁平上皮細胞癌生検から採集された子宮頸部扁平上皮細胞癌隣接上皮によるクローンＧ３０ＣＣおよびＧ３２Ｃ４ＢについてのＲＮＡ−ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成試験を示す写真表示である。得られた１０μｍの組織切片は、クローンＧ３０ＣＣまたはＧ３２Ｃ４Ｂに由来するＤＩＧ標識アンチセンスまたはセンス・プローブとハイブリッド形成させた。組織学的同定にはヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いた。４種類の異なる子宮頸部組織生検に対するクローンＧ３０ＣＣおよびＧ３２Ｃ４Ｂから得られた代表的な結果を示す。（Ａ）非悪性患者から採集した正常子宮頸部扁平上皮；（Ｂ）早期ステージの子宮頸部扁平上皮細胞癌患者から得られた隣接する組織病理学的に正常な組織；（Ｃ）後期ステージの子宮頸部扁平上皮細胞癌から得られた隣接する組織病理学的に正常な組織；および（Ｄ）扁平上皮細胞生検切片。図中のスケール・バーは８０μｍを表す。（ＢＬ、基底層上皮細胞；ＰＬ、上部層上皮細胞；ＳＴ、間質細胞；ＳＣＣ、扁平上皮細胞癌。）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月16日(2002.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の正常または子宮頚部癌組織と関係する分子マーカーを検出する方法であって、
前記子宮頚部癌組織および正常個体からの対応する組織から全ＲＮＡを単離すること、
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて相補ＤＮＡ分子を作製すること、および
前記ＤＮＡ分子を分離手段にかけて、相補ＤＮＡ分子の有無または相対的有無を、正常組織と比較して子宮頚部癌組織から検出できるようにすることを含むものであり、
前記相補ＤＮＡ分子は、Ｇ３０ＣＡ（配列番号５）、Ｇ３０ＣＢ（配列番号６）、Ｇ３０ＣＣ（配列番号７）、Ｇ３０ＣＤ（配列番号８）、Ｇ３０ＣＥ（配列番号９）、Ｇ３０ＣＨ（配列番号１０）、Ｇ３０ＣＩ（配列番号１１）、Ｇ３０ＣＫ（配列番号１２）、Ｇ３１Ｃ４Ｂ（配列番号１３）、Ｇ３１Ｃ４Ｃ（配列番号１４）、Ｇ３１Ｃ５Ｃ（配列番号１５）、Ｇ３１Ｃ５Ｄ（配列番号１６）、Ｇ３１Ｃ５Ｅ（配列番号１７）、Ｇ３１Ｃ５Ｇ（配列番号１８）、Ｇ３１Ｃ６Ｂ（配列番号２０）、Ｇ３２Ｃ２Ａ（配列番号２１）、Ｇ３２Ｃ２Ｂ（配列番号２２）、Ｇ３２Ｃ２Ｃ（配列番号２３）、Ｇ３２Ｃ３Ａ（配列番号２４）、Ｇ３２Ｃ３Ｂ（配列番号２５）、Ｇ３２Ｃ３Ｃ（配列番号２６）、Ｇ３２Ｃ４Ｂ（配列番号２７）、Ｇ３２Ｃ４Ｄ（配列番号２８）、Ｇ３２Ｃ５Ａ（配列番号２９）、Ｇ３２Ｃ６（配列番号３０）、Ｇ３２Ｃ７（配列番号３１）からなる群より選ばれる配列を含み、
１つのタイプの組織における、もう１つのタイプの組織と比較した上での相補ＤＮＡ分子の有無が、正常または子宮頚部癌組織に関係する分子マーカーを示すものである方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３０ＣＡ（配列番号５）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３０ＣＢ（配列番号６）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３０ＣＣ（配列番号７）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３０ＣＤ（配列番号８）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３０ＣＥ（配列番号９）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３０ＣＨ（配列番号１０）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３０ＣＩ（配列番号１１）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３０ＣＫ（配列番号１２）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３１Ｃ４Ｂ（配列番号１３）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３１Ｃ４Ｃ（配列番号１４）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３１Ｃ５Ｃ（配列番号１５）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３１Ｃ５Ｄ（配列番号１６）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３１Ｃ５Ｅ（配列番号１７）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３１Ｃ５Ｇ（配列番号１８）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３１Ｃ６Ｂ（配列番号２０）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ２Ａ（配列番号２１）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ２Ｂ（配列番号２２）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ２Ｃ（配列番号２３）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ３Ａ（配列番号２４）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ３Ｂ（配列番号２５）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ３Ｃ（配列番号２６）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ４Ｂ（配列番号２７）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ４Ｄ（配列番号２８）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ５Ａ（配列番号２９）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ６（配列番号３０）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ分子が、Ｇ３２Ｃ７（配列番号３１）の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ分子が、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードする、請求項１又は２３記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ分子が、リボソームタンパク質Ｓ１２をコードする請求項１又は４記載の方法。
【請求項３０】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号１に記載の通りである、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号２に記載の通りである、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号３に記載の通りである、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
ＲＴ−ＰＣＲで用いるプライマーが配列番号４に記載の通りである、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
Ｇ３０ＣＥ（配列番号９）、Ｇ３０ＣＫ（配列番号１２）、Ｇ３１Ｃ４Ｃ（配列番号１４）、Ｇ３１Ｃ５Ｃ（配列番号１５）、Ｇ３１Ｃ５Ｄ（配列番号１６）、Ｇ３１Ｃ５Ｇ（配列番号１８）、Ｇ３２Ｃ２Ａ（配列番号２１）、Ｇ３２Ｃ３Ｃ（配列番号２６）、Ｇ３２Ｃ４Ｄ（配列番号２８）、Ｇ３２Ｃ５Ａ（配列番号２９）からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含み、該ポリヌクレオチドは、哺乳動物においてマッチする正常な子宮頸部上皮細胞と比較して子宮頸癌細胞で示差的に発現するものである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３５】
正常組織と子宮頚部癌組織との間の区別における、Ｇ３０ＣＥ（配列番号９）、Ｇ３０ＣＫ（配列番号１２）、Ｇ３１Ｃ４Ｃ（配列番号１４）、Ｇ３１Ｃ５Ｃ（配列番号１５）、Ｇ３１Ｃ５Ｄ（配列番号１６）、Ｇ３１Ｃ５Ｇ（配列番号１８）、Ｇ３２Ｃ２Ａ（配列番号２１）、Ｇ３２Ｃ３Ｃ（配列番号２６）、Ｇ３２Ｃ４Ｄ（配列番号２８）、Ｇ３２Ｃ５Ａ（配列番号２９）からなる群より選ばれる単離された遺伝子配列の使用。
【国際調査報告】
2004503261.tif 000101
2004503261.tif 000102