(57)【要約】アルデヒド固定組織のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析を改良するための方法および組成物が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒド固定剤で固定され包埋剤に包埋された組織標本の組織化学的反応性を改良する方法であって、
（ａ）前記組織標本を、
ｉ）前記包埋剤用の脱ロウ溶媒組成物と、
ｉｉ）アルデヒド遊離試薬組成物と
を含む溶液と接触させるステップと、
（ｂ）前記溶液および前記組織標本を加熱するステップと、
（ｃ）前記加熱を、前記包埋剤の少なくとも一部を可溶化しかつ前記組織標本を固定しているアルデヒド結合の少なくとも一部を遊離させるのに充分な時間にわたって維持するステップと、
（ｄ）前記組織標本上で組織化学反応を行なうステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記脱ロウ溶媒組成物が、組織標本の組織化学的反応性に実質的有害作用を及ぼさずに組織化学的解析が可能となるように、組織標本に結合している包埋剤の充分な部分を遊離させるのに充分な量の、無極性有機溶媒、極性有機溶媒および界面活性剤の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脱ロウ溶媒組成物が、
（ａ）芳香族炭化水素、テルペンおよびイソパラフィン炭化水素からなる群より選択される３０容量％〜５０容量％の少なくとも１つの有機溶媒と、
（ｂ）３０容量％〜５０容量％の少なくとも１つの水溶性極性有機溶媒と、
（ｃ）０．５重量／容量％〜２０重量／容量％の少なくとも１つの水溶性界面活性剤と、
（ｄ）脱ロウ溶媒組成物の容量を満たすのに充分な水と
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
有機溶媒がリモネンである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
有機溶媒がイソパラフィン炭化水素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
有機溶媒がアルキルベンゼンまたはジアルキルベンゼンである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
極性有機溶媒がＣ−１〜Ｃ−５アルコール、Ｃ−３〜Ｃ−５ケトン、およびＣ−２〜Ｃ−６エーテルからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
極性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、エチレングリコール、アリル（ａｌｌｙｌ）アルコール、およびプロピレングリコールからなる群より選択される少なくとも１つの溶媒を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
界面活性剤が陽イオン界面活性剤または陰イオン界面活性剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤が式
【化１】
2004515752.tif 000012
［式中、Ｒ１はメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルかつｎは１または２であり、Ｒ２はＣ８Ｈ１７からＣ３０Ｈ６１までのアルキルまたはベンジル基であり、Ｒ３は（ＣＨ２）ｍかつｍは１〜１０であるか、またはＲ３は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐかつｐは１〜１０である］
を有する陽イオン界面活性剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
陽イオン界面活性剤が塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
界面活性剤が式
【化２】
2004515752.tif 000013
［式中、Ｒ１はＣ６Ｈ１３〜Ｃ３０Ｈ６１であり、Ｒ３はＣＨ２またはフェニル基である］
を有する陰イオン界面活性剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
界面活性剤が非イオン界面活性剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
非イオン界面活性剤が式
【化３】
2004515752.tif 000014
［式中、Ｒは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基であり、Ｘは５〜４０である］
を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非イオン界面活性剤がＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸のポリオキシエチレンエーテルを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触ステップ後に、前記組織標本から残留脱ロウ溶媒組成物の少なくとも一部を除去するのに充分な条件下で、洗浄剤を含む水性洗浄液により前記標本を洗浄するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
アルデヒド遊離試薬組成物がクエン酸塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
クエン酸塩が、前記アルデヒド遊離試薬組成物中、２ｍｇ／ｍＬ〜６ｍｇ／ｍＬの濃度のクエン酸として供給される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
クエン酸塩が、前記アルデヒド遊離試薬組成物中、４ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの濃度のクエン酸として供給される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
アルデヒド遊離試薬組成物が５．５〜７．５のｐＨを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、
（ａ）３容量％〜２５容量％の前記脱ロウ溶媒組成物と、
（ｂ）２容量％〜２０容量％の前記アルデヒド遊離試薬組成物と、
（ｃ）４５容量％〜９５容量％の水と
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）および（ｃ）が、前記包埋剤の少なくとも一部を可溶化しかつ前記組織標本を固定しているアルデヒド結合の少なくとも一部を遊離させるのに充分に複数回にわたって、連続して繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸プローブの、アルデヒド固定剤により固定され包埋剤に包埋された組織標本にハイブリダイズする能力を改良する方法であって、
（ａ）前記組織標本を、
ｉ）前記包埋剤用の溶媒と、
ｉｉ）アルデヒド遊離試薬と
を含む溶液と接触させるステップと、
（ｂ）前記溶液および前記組織標本を加熱するステップと、
（ｃ）前記加熱を、前記包埋剤の少なくとも一部を可溶化しかつ前記組織標本からアルデヒド固定剤の少なくとも一部を遊離させるのに充分な時間にわたって維持するステップと、
（ｄ）前記組織標本を変性溶液に、組織中の核酸鎖の分離を可能とするのに充分な条件下で、組織中の核酸鎖の分離を可能とするのに充分な時間にわたって、室温で暴露するステップと、
（ｅ）前記組織標本を少なくとも１つの核酸プローブに、前記核酸プローブの少なくとも一部が前記組織標本にハイブリダイズすることを可能とするのに充分な条件下で、前記核酸プローブの少なくとも一部が前記組織標本にハイブリダイズすることを可能とするのに充分な時間にわたって、室温で暴露するステップと、
（ｆ）前記組織標本を、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ＡＫＰ）検出系に含まれる一連の試薬に、前記核酸プローブの比色法による検出を可能とするのに充分な条件下で、前記核酸プローブの比色法による検出を可能とするのに充分な時間にわたって暴露するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
核酸プローブの、アルデヒド固定剤により固定され包埋剤に包埋された組織標本とハイブリダイズする能力を改良するため、およびプローブとプローブ検出系との間の組織化学的反応を改良するためのキットであって、
（ａ）ｉ）前記包埋剤用の脱ロウ溶媒組成物と、
ｉｉ）アルデヒド遊離試薬組成物と
を含む溶液が入った第一の容器と、
（ｂ）前記組織標本中の核酸鎖の少なくとも一部を室温で分離させる能力を持つ変性溶液が入っている第二の容器と、
（ｃ）前記核酸プローブの少なくとも一部を室温で組織標本にハイブリダイズさせる能力を持つハイブリダイゼーション溶液が入っている第三の容器と、
（ｄ）前記組織標本にハイブリダイズした前記核酸プローブを検出するための検出系と
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、アルデヒド固定包埋組織切片のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色に関する。
【０００２】
［発明の背景］
臨床検査材料または動物実験から得られる組織切片は、多くの場合、後に光学顕微鏡を使って検査するのに適した形で、固定、包埋および保存される。そのような包埋プロセスには、一般に、標本の固定、脱水、透徹、パラフィン浸透またはパラフィン含浸、パラフィン塊への包埋またはブロッキング、パラフィン塊および標本の薄切片への薄切、スライドへの切片の封入、この目的に使用したパラフィンおよび溶媒の除去（脱パラフィン）、ならびに検鏡解析前の切片の染色という周知のステップが含まれる。組織化学染色試薬、特にモノクローナル抗体および核酸プローブ試薬により、現在、これらの固定組織試料の少なくともいくつかは、特定の抗原化合物またはハイブリダイゼーション部位の存在について検査することができるようになっている。そのような抗原および関心部位は疾患プロセスまたは病理に関係する場合もあるし、それらによって特定の細胞タイプまたは組織が同定される場合もある。新しく作製された生検および剖検試料の場合は、そのような組織化学的解析が即時診断に役立つ。
【０００３】
そのような組織標本を解析するには、組織が組織化学染色試薬に適切に暴露されるように、まず包埋剤の一定部分を除去することが望ましいと考えられる。パラフィンは、組織標本の作製において、ミクロトームでの切出しによって組織学的研究用の標本切片を作製するための包埋剤として、長年にわたって使用されてきた。包埋剤の主目的は、標本を自然の状態で切出して封入することができるようにすることである。より薄い切片の切断を可能にする、より硬い標本を得るために、プラスチック樹脂も包埋剤として使用されている。しかしパラフィン包埋法の使用には、染色に先だってロウを標本から溶かし出すことができるので、切片を生体高分子の裸のスラブの形で染色することが可能になり、除去不可能な樹脂包埋剤の存在に伴う余分な困難および人為的な影響を避けられるという利点がある。
【０００４】
パラフィン包埋組成物における最近の改良によって、その応用範囲は、下流の操作および試料解析との適合性を保ちながら拡大された。例えば、パラフィンと有効量のエチレン−ビニル酢酸コポリマー（パラフィンの０．５％〜５重量％）との混合物を含む改良パラフィン系包埋剤を使用すると、浸透時間を短縮し、より薄い切片を得ることができる（米国特許第４，４９７，７９２号）。もう一つの改良である二重包埋法では、薄い組織膜、例えば通常は厚さがわずか１０ミクロンしかない齧歯類腸間膜などの切片が得られる。この方法では、いくつかの膜を固定し、プラスチック箱の底に置かれた４本の針に載せた後、アガロースに包埋する。アガロースブロックを取り出し、アルコールで脱水し、ＨｉｓｔｏＰｅｔｒｏｌ（イソパラフィン炭化水素の混合物の商標名）で透徹し、パラフィンを浸透させ、切り出す。観察される組織の形態はメタクリレートプラスチック包埋法で得られるものに匹敵するが、所要時間が短く、プラスチック硬化剤および活性化剤を使用しないので危険も少なく、組織化学的研究が容易になる。
【０００５】
したがって、固定（例えばホルマリン固定）パラフィン包埋組織切片の脱パラフィンは、特に病院の組織病理実験室での診断目的に、今なお広く使用されている方法論である。
【０００６】
引火性で揮発性の有毒な有機溶媒であるキシレンは、パラフィンを可溶化して標本切片を脱パラフィンするプロトコールに、現在広く使用されている。通例、顕微鏡スライド封入標本を、パラフィンが可溶化されるまで、キシレン浴に浸漬する。次に、脱パラフィンした標本を、アルコール濃度が漸減するアルコール溶液系列（一般的には標本を浸漬する浴の形）で洗浄することによってキシレンを除去し、最後に水による洗浄を行なう。脱パラフィンプロセスのキシレンを、毒性も揮発性も低い溶媒に置き換える努力がなされている。テルペン油（例えばＢａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（イリノイ州マゴーパーク）からＡｍｅｒｉＣｌｅａｒという商標名で販売されているもの）およびイソパラフィン炭化水素（例えばＭｉｃｒｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（バージニア州フェアファックス）からＭｉｃｒｏ−Ｃｌｅａｒという商標名で販売されているもの）は、キシレンと比較して同等の脱パラフィンをもたらした（Ｊｏｎｅｓら、１９９３）。しかし、ほとんどのタイプの染色、特に組織化学染色に適合させるための水洗に先立って、両溶媒を除去するには、アルコール洗浄液系列が依然として必要だった。その上、染色装置などの自動システムでのパラフィン包埋標本の使用も増えている。
【０００７】
したがって、使用者の危険を最小限に抑え、自動システムへの適合を可能にし、かつ下流の解析との適合性を保ちつつ、組織化学的解析または他の診断的解析に先だって、パラフィンまたは改良型パラフィン系包埋材料を標本から効果的に除去することができる脱パラフィン組成物および脱パラフィン方法が、依然として必要とされている。毒性または発ガン性がないかまたは低く、臭いがないかまたはわずかな臭いしかなく、有毒な溶媒の使用量を減少させ、有害廃棄物を最小限に抑え、そして／または腐食性および引火性を低下させるパラフィン組成物および脱パラフィン方法が必要とされている。
【０００８】
しかし、標本固定中に抗原およびハイブリダイゼーション部位の喪失が起こるために、脱パラフィン後でも、組織標本の組織化学的解析が妨げられることがあった。伝統的な固定方法では、組織タンパク質内および組織タンパク質間の架橋反応を引き起こすことによって組織を固定するアルデヒド固定剤が使用されてきたが、これによって様々な関心構造の改変または遮蔽が起こりうる。
【０００９】
２種類の架橋反応が認識されている。その１つはシッフ塩基型重合反応である。すなわち、ホルムアルデヒドがタンパク質のアミノ酸と縮合することにより、タンパク質の架橋をもたらす迅速な重合を起こすことができるシッフ塩基中間体が生成する。
【００１０】
マンニッヒ反応と呼ばれるもう一つのタイプの反応では、ホルムアルデヒドはアミノ基および活性水素基の両者と反応して、マンニッヒ塩基を生成することができる。マンニッヒ塩基の重合により、タンパク質架橋が起こる。
【００１１】
架橋は組織の形態および完全性を保ち、組織を硬化させて薄切を可能にし、微生物の攻撃を阻止する。残念なことに、架橋プロセスは本来の組織構造の喪失も引き起し、その結果、ホルムアルデヒドなどのアルデヒド試薬を使って固定された組織での組織化学染色試薬の有用性が妨げられる。ホルムアルデヒドによるアミノ酸およびタンパク質の架橋の化学は、ＨａｒｌａｎおよびＦｅａｉｒｈｅｌｌｅｒ，「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｔａｎｎｉｎｇ」ならびにＫｅｌｌｙら、「Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｂｙ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ」（１９７６）に記載されている。ホルムアルデヒドによるタンパク質アミノ基および芳香族アミノ酸の架橋におけるマンニッヒ型反応の役割は、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９４７）１６８：９９−１１８ならびにＦｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＯｌｃｏｔｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９４８）１７４：８２７−８４３で論じられている。アルデヒド架橋反応に関する議論は、Ｆｏｘ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９８５）３３：８４５−８５５、Ｐ．Ｊ．Ｓｔｏｗａｒｄ編，「Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（１９７３）のＪｏｎｅｓ，「組織固定時のアルデヒドと無飽和脂肪酸との反応（原題：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｗｉｔｈ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｉｘａｔｉｏｎ）」、およびＫｕｎｋｅｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）３４：３にも見いだされる。マンニッヒ型反応は、Ｍａｒｃｈ，「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（１９６８）の特に３３３、４２４、６７０〜６７２頁に概説されている。
【００１２】
アルデヒド固定の欠点を回避する試みとして、マイクロ波加熱（Ｍａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９７０）２８：２７３、Ｈｏｐｗｏｏｄら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８４）１６：１１７１）やアルコール浸漬（ＢａｔｔｉｆｏｒａおよびＫｏｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９８６）３４：１０９５）などの代替固定法が開発された。代替固定法にはいくつかの利点があるにもかかわらず、それらは広く使用されているアルデヒド固定に取って代わってはいない。代替固定法が限られた支持しか得ていないのは、これらの代替法が持つ短所を反映しているのかもしれない。例えば、マイクロ波加熱は赤血球を溶解し、膜脂質を乱す。エタノール固定は組織試料の抗原性の改善をもたらすと報告されているが、エタノールは細胞収縮の増加を引き起こす（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ  ａｎｄ  Ｋｏｐｉｎｓｋｉ）。したがって、アルデヒド固定組織に忠実度を回復させる方法は、最新の臨床実務によって作製された標本にとって、依然として有用である。
【００１３】
また、組織忠実度を回復させる方法は、膨大な数のアルデヒド固定組織試料が既に収集されていることからも有用である。これらの保存組織試料は後向き組織化学調査にとって豊富な材料源になる。後から組織化学染色をする適切な方法が利用可能であるなら、新たに作成された組織化学データを、同じ組織に対する伝統的な調査から得られる既存の診断結果と組み合わせることができるだろう。多くの場合、臨床試料は何十年間も保存されているので、患者の基礎病理プロセスの臨床転帰は既にわかっている。例えば毒性試験で動物から得られるような実験組織の場合は、病理学および毒性一般の他の測定は既に行なわれ、記録されているだろう。どちらの場合も、患部組織の組織化学的解析により、重要な相関情報を追加することができるだろう。
【００１４】
過去何十年にもわたる組織化学試薬の開発により、多くの組織が最初に保存された当時には不可能だった解析も、現在では行なうことができる。加えて、疾患プロセスに関する新しい知識または仮説により、保存組織の再調査が促されるかもしれない。保存組織試料に対する組織化学的研究は、統計的に大きい試料集団に対して臨床研究を行なうための、対時間および対費用効果の比較的高い手段になる。したがって、臨床的または実験的に得られるルーチン包埋組織切片への組織化学的解析の適用は、かなり興味深い問題である。
【００１５】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の抗原性を、重金属溶液中で組織をマイクロ波加熱することによって回復させる処置は、Ｓｈｉら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３９（ｂ）：７４１−４８（１９９１）に記載されている。この処置は試験した試料の約３／４に免疫染色の増強をもたらす。記載されている処置は、組織切片の脱パラフィンおよび再水和、内因性ペルオキシダーゼを遮断するための過酸化物水溶液による短時間処理、蒸留水によるスライドの洗浄、蒸留水または重金属溶液によるスライドの被覆、および数分間の短いマイクロ波加熱という各ステップを含むプロセスの一部である。この処置の後、スライドを冷却し、すすぎ洗いし、従来の方法で免疫染色する。
【００１６】
抗原性を回復させるためのこの処置にはいくつかの制約がある。第１に、この処置では組織試料を加熱するためにマイクロ波オーブンを使用しなければならない。多くの実験室にはマイクロ波オーブンの設備がないだろうし、一部の組織試料はマイクロ波加熱に適していないだろう。外部熱源を伴わずに室温で使用することができる抗原賦活法が必要とされている。
【００１７】
また、前述の処置は、パラフィンなどの炭化水素媒質に包埋された組織に特に適している。この処置は、骨組織にとって好ましい包埋剤であるセロイジンに包埋された組織切片にはあまり適していない。セロイジン包埋組織への使用に適した方法も必要とされている。さらに、脱灰組織は前述の処置では対処できないことが多いので、脱灰骨組織試料に使用することができる方法は、特に必要とされている。
【００１８】
［発明の開示］
本発明は、使いやすさの向上、より容易な自動組織標本処理への適応、感度および核酸プローブと組織標本との間の組織化学的反応性の増加をもたらす改良されたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応の方法およびキットを提供する。
【００１９】
一態様として、本発明は、アルデヒド固定剤で固定され包埋剤に包埋された組織標本の組織化学的反応性を向上させる方法であって、その組織標本を、脱ロウ溶媒組成物とアルデヒド遊離試薬組成物とを含む溶液と接触させることを含む方法を提供する。次に、その溶液および組織標本を加熱し、その加熱を、包埋剤の少なくとも一部を可溶化しかつ組織標本を固定しているアルデヒド結合の少なくとも一部を遊離させるのに充分な時間にわたって維持する。その後、組織化学反応をその組織標本上で行なう。
【００２０】
本発明の他の態様には、上記脱ロウおよび遊離方法をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術と結びつけた方法ならびに本方法を行なうための試薬および溶液のキットが含まれる。
【００２１】
［詳細な説明］
本発明は、使いやすさの向上、より容易な自動組織標本処理への適応、感度および核酸プローブと組織標本との間の組織化学的反応性の増加をもたらす改良されたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応の方法およびキットを提供する。
【００２２】
一態様として、本発明は、アルデヒド固定剤で固定され包埋剤に包埋された組織標本の組織化学的反応性を向上させる方法であって、その組織標本を、脱ロウ溶媒組成物とアルデヒド遊離試薬組成物とを含む溶液と接触させることを含む方法を提供する。次に、その溶液および組織標本を加熱し、その加熱を、包埋剤の少なくとも一部を可溶化しかつ組織標本を固定しているアルデヒド結合の少なくとも一部を遊離させるのに充分な時間にわたって維持する。その後、組織化学反応をその組織標本上で行なう。
【００２３】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＩＳＨ）アッセイでは、パラホルムアルデヒド固定またはホルマリン固定組織のマイクロ波加熱により、通常のプロテアーゼ消化と比較してハイブリダイゼーションシグナルの増強およびバックグラウンドの減少が起こることが明らかにされ、いくつかのマイクロ波前処理システムが報告されている（１〜５）。しかし、これらの前処理システムでは、マイクロ波加熱を適用する前にパラフィン包埋組織の脱パラフィンを行なう必要がある。本願発明は、特別に設計された溶液である核酸賦活溶液Ｉ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ＝ＮＡＲ−Ｉ）を使って、マイクロ波加熱により、一段階で脱パラフィンおよびハイブリダイゼーションシグナルの改善をもたらす。
【００２４】
本発明は、組織学実験室におけるキシレン溶媒の使用を最小限に抑えるか、または排除する。本明細書に記載する組成物および方法論は、パラフィンまたは他のロウを組織切片から効果的に除去し、免疫組織化学およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に作製した組織切片の品質または組織学的反応性に有害な影響を及ぼさない。この方法論の応用は、組織切片からの包埋剤の除去が望まれる他の解析用途、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、古典的染料染色および特殊染色などにも拡大することができる。
【００２５】
「包埋剤」とは、室温では固体であり、組織化学技術において、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、特殊染色および古典的染料染色などの組織化学的解析または他の解析のための反応性組織標本を包埋するためまたは他の方法で支持するために使用される任意の組成物を意味する。包埋剤の一例として、ロウは、この目的に使用されることが多い。
【００２６】
「ロウ」とは、組織化学技術において、組織化学的解析または他の解析のための反応性標本を包埋するために使用される組成物であって、室温では固体であり、通常は、高級脂肪酸と高級グリコールとのエステルを含むことが多い高級炭化水素の複雑な混合物からなり、由来は鉱物、天然物または合成物であることができ、脂肪より硬くかつ脆く、油脂に可溶であり、所望によりその標本包埋性を強化する添加剤を含むことができる組成物を意味する。パラフィンは、組織化学分野で最もよく使用されている鉱物ロウの一例である。パラフィンは通例、石油の蒸留によって製造され、主として固形飽和炭化水素の混合物である。
【００２７】
「組織化学」は、免疫組織化学、細胞化学、組織病理学、酵素組織化学、特殊染色、顕微鏡技術、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および分子プローブの使用として知られている技術および方法を包含するものとする。組織化学技術を説明している教科書には、例えばＢａｃｈ，Ｐ．およびＢａｋｅｒ，Ｊ．編，「Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ」（１９９１）Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ（ニューヨーク州ニューヨーク），ｐ．１−９や、Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ編，「Ｓｔａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（１９９３）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州ニューヨーク）などがある。
【００２８】
「包埋剤を除去する」とは、反応性組織標本を解析にかけることができるように、充分な量の包埋剤を除去することを意味する。通例、そのような解析は組織化学的解析であり、除去すべき包埋剤の量は、選択した解析技術が反応性組織標本中の反応部位の少なくとも１つに接近することを可能とするに足りる量になる。
【００２９】
「反応性組織標本」とは、試料採取前の試料採取生物が本来持っている固有の組織学的反応性が検出可能な程度に保存されるように選択および処理される動物または植物の細胞または組織の試料を意味する。通例、そのような標本は、組織化学技術分野では周知の技術に全面的に従って、生検、剖検などにより、組織切片として得られる。
【００３０】
本組成物は通例、組成物の最終体積を正確に決定することなく、または混合時の体積変化を明らかにすることなく、諸成分を混合することによって製造されるので、各成分の百分率は「約」または「およそ」という用語で修飾されるが、これらの値の不正確さは組成物調製の結果として当業者には理解されるだろうと考える。しかし好ましくは、混合時の体積変化が明らかな場合は、百分率値は正確な値を意味すると解釈される。
【００３１】
［脱ロウ溶媒組成物］
一態様として、本発明では、使用者の危険を最小限に抑え、自動使用への適合を可能にし、かつ下流の解析との適合性を保ちつつ、組織化学的解析または他の解析に先立って組織標本から包埋剤、特にロウまたは変性ロウ系包埋剤、特にパラフィンまたはパラフィン系包埋剤を除去するために、脱ロウ溶媒組成物を使用する。この場合、標本の組織化学的反応性に実質的な有害作用を及ぼさずに、組織標本と結合している包埋剤の一部を除去することが重要であると考えられる。さらなる実施形態として、本発明の組成物は所望により水で希釈してもよい。
【００３２】
本脱ロウ溶媒組成物はいくつかの個別成分、例えば、組織標本の組織化学的反応性に実質的有害作用を及ぼさずに組織化学的解析が可能となるように、組織標本に結合している包埋剤の充分な部分を遊離させるのに足りる量の無極性有機溶媒、極性有機溶媒および界面活性剤などを含む。
【００３３】
無極性有機溶媒は、室温より充分に高い沸点、好ましくは１１０℃より高い沸点、より好ましくは約１４０℃〜約２５０℃の沸点を持ち、本発明で使用される温度（通常５〜５０℃）では液相にあり、かつ生物学的標本の包埋に使用されるパラフィンを溶解する能力を持つ炭化水素または炭化水素の混合物（例えば石油留分から得られるもの）である。無極性溶媒は、例えば脂肪酸と高級グルコールとのエステルなどを含む長鎖の直鎖または分枝鎖アルカン炭化水素の複雑な混合物であることができる。包埋剤除去の代表的な一例として、２５℃での溶媒のパラフィン溶解度は、通例、溶媒１リットルあたり少なくともパラフィン０．１グラム、好ましくは溶媒１００ｍＬあたり０．１グラム、より好ましくは溶媒１０ｍＬあたり０．１グラムであり、最も好ましくは溶媒溶液重量の約５０％に相当するパラフィン量を溶解する能力を持つ。さらに無極性溶媒は、本発明の組成物に使用される場合は、極性有機溶媒と混和できる。無極性有機溶媒の例としては、例えば芳香族炭化水素、脂肪族炭化水素、テルペン、他の油、および石油留分などが挙げられる。好ましい無極性有機溶媒は毒性をほとんどまたは全く持たない。さらに、好ましい溶媒は、環境保護局（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）によって有害廃棄物に分類されていないものである。好ましい無極性溶媒はさらに約６０℃より高い引火点を持ち、これにより引火性を最小限に抑える。好ましい溶媒はさらに、毒性、発ガン性および腐食性を欠く。イソパラフィン炭化水素は、一つには毒性、発がん性、腐食性および引火性を持たないことから、好ましい無極性溶媒の例である（Ｍｕｌｌｉｎら、１９９０）。好ましいイソパラフィンはおよそＣ１０からＣ１５までの炭素骨格長を持つ分枝鎖脂肪族炭化水素、またはその混合物である。
【００３４】
ある好ましいイソパラフィン炭化水素混合物は約７４℃の引火点を持つ。もう一つの好ましい無極性溶媒は、沸点１５０℃〜約２５０℃の蒸留範囲を持ち、ＣｎＨ（２ｎ±ｍ）という一般式［式中、ｎ＝１０〜５０かつｍ＝０〜４］を持つＣ１０〜Ｃ５０分枝鎖または直鎖炭化水素鎖の混合物である。ミネラルスピリットはもう一つの好ましい無極性有機溶媒である。好ましいテルペンはリモネンである。使用することができる他のテルペンには、テルペン、テルピネンおよびテルピネオールがある。好適な程度がやや落ちる溶媒は、芳香族炭化水素溶媒、例えばキシレンなどのアルキルベンゼン、またはトルエンなどのジアルキルベンゼンである。トルエンとキシレンには毒性があり、有害廃棄物に分類されているので、好適な程度はやや落ちる。さらに、後述するように、キシレンまたはトルエンを本発明の実施形態に使用した場合でも、その後のアルコール洗浄は省かれ、有害でない水性洗浄液に置き換えられる。
【００３５】
本組成物中の無極性有機溶媒は通例、脱ロウ溶媒組成物の約５容量％〜約５０容量％である。下限パーセント未満の無極性有機溶媒では、組成物の脱ロウ能力が著しく低下する。上限を超える無極性溶媒では、洗浄剤溶解性または水溶性に対して有害な影響が生じ、その後の水洗の効率に有害な影響が及ぶ。有機溶媒の上限は脱ロウ溶媒組成物の５０％、７０％および７５％という上限値から選択することができ、同時に１５％、２５％および３５％という下限値から有機溶媒の下限を選択して、本発明の実施形態として様々な範囲を得ることができる。好ましい量は、脱ロウ溶媒組成物の約３０〜約６０％、より好ましくは約３５％〜約５０％である。
【００３６】
これらの組成物は通例、最終体積を正確に決定せずに、または混合時の体積変化を明らかにせずに、諸成分を混合することによって調製されるので、各成分の百分率は「約」という用語によって修飾されるが、これらの値の不正確さは組成物調製の結果として当業者には理解されるだろうと考える。しかし好ましくは、混合時の体積変化が明らかな場合は、百分率値は正確な値を意味すると解釈される。
【００３７】
極性有機溶媒は、無極性溶媒、界面活性剤および随意に水を溶解するという目的に役立つ。極性有機溶媒は、水１００ｇにつき少なくとも１ｇ程度、好ましくは水１００ｇにつき５ｇ程度、より好ましくは水１００ｇにつき１０ｇ程度まで水に可溶であり、最も好ましくは極性有機溶媒は水と混和できる。極性有機溶媒には、ケトン、低級アルコール（ポリヒドロキシアルコールおよびグリコールを含む）、および低級エーテルが含まれる。好ましいアルコールはＣ１〜Ｃ５アルコールである。エタノール、エチレングリコール、イソプロパノール、プロピレングリコールおよびその混合物は最も好ましい。好ましいケトン溶媒は通例、Ｃ３〜Ｃ５ケトンである。最も好ましいケトン溶媒はアセトンおよびメチルエチルケトンである。好ましいエーテルはＣ２〜Ｃ６エーテルである。
【００３８】
特に好ましい極性有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アリル（ａｌｌｙｌ）アルコール、アセトン、エチレングリコールおよびプロピレングリコール、ならびにその混合物からなる群より選択される。アセトニトリルおよびジメチルホルムアミドは、やや好適な程度が下がる極性有機溶媒である。さらに、極性有機溶媒は極性有機溶媒の混合物であってもよい。
【００３９】
本組成物中の極性有機溶媒は通例、組成物の約３５容量％〜約５０容量％である。しかし、極性溶媒の上限は、脱ロウ溶媒組成物の５０％、７０％および７５％という上限値から選択することができ、同時に脱ロウ溶媒組成物の１５％、２５％および３５％という下限値から極性溶媒の下限を選択して、本発明の実施形態として様々な範囲を得ることができる。好ましい量は約３０％〜約６０％、より好ましくは約３５％〜約５０％である。どのような成分の組み合わせで組成物が混和しまたは分離するかは、様々な相対量の溶液／混合物成分について相分離を示す状態図から容易に決定することができる。
【００４０】
本発明に有用な界面活性剤には、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、および両性イオン界面活性剤が含まれる。例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙのカタログ「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」などには数多くの生物学的洗浄剤（界面活性剤）が列挙されている。界面活性剤は親水性と疎水性の両方を併せ持つので、洗浄剤の目的に役立つ。本発明で使用される界面活性剤は、本発明の組成物に使用される溶媒に可溶である。好ましい界面活性剤は水、エタノールおよびアセトンに可溶な洗浄剤である。下流の組織化学的解析を実質的に妨害しないものが最も好ましく、これは例えばその界面活性剤を含む溶液を使った免疫染色などによって決定することができる。
【００４１】
本発明の組成物に使用することができる界面活性剤には、式
【化４】
2004515752.tif 000002
［式中、Ｒ１はメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルかつｎは１または２であり、Ｒ２はＣ８Ｈ１７〜Ｃ３０Ｈ６１から選択されるアルキル基またはベンジル基であり、Ｒ３は（ＣＨ２）ｍかつｍは１〜１０であるか、またはＲ３は（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐかつｐは１〜１０である］
を有する陽イオン界面活性剤が含まれる。この式の陽イオン界面活性剤は極性有機溶媒に可溶である。本発明の多くの好ましい実施形態は、陽イオン界面活性剤である塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。他の陽イオン洗浄剤は必ずしもこの式を有するわけではなく、例えば臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルベンゼトニウム、および４−ピコリンドデシル硫酸などがある。
【００４２】
本発明の組成物に使用することができる他の界面活性剤には、式
【化５】
2004515752.tif 000003
［式中、Ｒ１はＣ６Ｈ１３〜Ｃ３０Ｈ６１であり、Ｒ３はＯ、ＣＨ２またはフェニル基である］
の陰イオン界面活性剤が含まれる。この式の陰イオン界面活性剤は極性有機溶媒に可溶である。陰イオン洗浄剤の例は、必ずしもこの式を持つわけではなく、アルギン酸、カプリル酸、コール酸、１−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、１−ドデカンスルホン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびタウロコール酸などである。有機硫酸反応生成物の水溶性塩をはじめとする他の陰イオン合成非石けん系洗浄剤は、その分子構造中に、約８〜２２個の炭素原子を含むアルキルと、スルホン酸または硫酸エステル基からなる群より選択される基とを持つ。これらの洗浄剤の例は、獣脂またはヤシ油から誘導されるアルキル硫酸ナトリウムまたはカリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたはカリウム、アルキルグリセリルエーテルスルホン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸モノグリセリドスルホン酸および硫酸ナトリウム、１モルの高級脂肪アルコールと１モルあたり約１〜６モルのエチレンオキシドとの反応生成物の硫酸エステルのナトリウムまたはカリウム塩であって、アルキル基が８〜１２個の炭素原子を含むもの、イセチオン酸でエステル化され水酸化ナトリウムで中和された脂肪酸の反応生成物、メチルタウリド（ｍｅｔｈｙｌ  ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミドのナトリウムまたはカリウム塩、およびＳＯ３スルホン化Ｃ１０−Ｃ２４α−オレフィンのナトリウム塩およびカリウム塩である。
【００４３】
本発明の組成物に使用することができる他の界面活性剤には、式
【化６】
2004515752.tif 000004
［式中、Ｒは直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基であり、Ｘは５〜４０の整数である］
の非イオン界面活性剤が含まれる。最も好ましいＲは
【化７】
2004515752.tif 000005
である。
【００４４】
この式の非イオン界面活性剤は極性有機溶媒に可溶である。非イオン洗浄剤の例は、必ずしもこの式を持つわけではなく、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、脂肪酸、特にＣ１２−Ｃ２０脂肪酸のポリオキシエチレンエーテル（例えばＴｒｉｔｏｎという商標名で販売されているもの）、脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合物（例えばＬｕｂｒｏｌという商標名で販売されているもの）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エーテル（例えばＴｗｅｅｎという商標名で販売されているもの）、およびソルビタン脂肪酸エーテル（例えばＳｐａｎという商標名で販売されているもの）などがある。
【００４５】
アルカリ酸化物基と有機疎水性化合物との縮合によって製造される非イオン合成洗浄剤。典型的な疎水性基には、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合生成物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドとエチレンジアミンとの縮合生成物、炭素原子数８〜２２の脂肪族アルコール、および脂肪酸のアミドなどがある。半極性的性質を持つアミンオキシド、ホスフィンオキシドおよびスルホキシドなどの非イオン洗浄剤も除かれる。
【００４６】
長鎖３級アミンオキシドの具体例には、ジメチルドデシルアミンオキシドおよびビス（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミンなどがある。ホスフィンオキシドの具体例は米国特許第３，３０４，２６３号に記載があり、例えばジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメチル−（２−ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシドなどが挙げられる。好ましい非イオン洗浄剤界面活性剤はトリトンＸ−１００であり、これは脂肪酸（特にＣ１２−Ｃ２０脂肪酸）のポリオキシエチレンエーテルの商標名である。
【００４７】
両性イオン界面活性剤には、式：Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートの公知化合物が含まれる。両性イオン洗浄剤の例としては、３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１］プロパンスルホネート（一般にＣＨＡＰＳと略記される）、３−［（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（一般にＣＨＡＰＳＯと略記される）、Ｎ−ドデシル−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、およびリゾ−α−ホスファチジルコリンが挙げられる。
【００４８】
本発明の溶液中の界面活性剤は通例、溶液の約０．５重量／容量％〜約２０重量／容量％（ｇ／１００ｍＬ）である。下限未満の界面活性剤では、組成物中のロウの溶解度が低くなる。界面活性剤の上限は界面活性剤の溶解度限界の一要因である。界面活性剤の量は、好ましくは溶液の０．５重量％〜約３０重量％、より好ましくは約１．０重量％〜約２５重量％、最も好ましくは約５重量％〜約２０重量％である。
【００４９】
本発明の組成物は水を含むこともできる。最も好ましくは、組成物中の水は飽和量の水である。この上限を超えると組成物の分離が起こる。通例、水は組成物の約１０容量％以下である。本発明の一部の実施形態は、例えば実施例に例示するように、約７容量％未満の水を含み、一部の実施形態は約０．５容量％〜約１．５容量％の水を含み、さらに他の実施形態は約１容量％未満の水を含む。
【００５０】
［アルデヒド遊離試薬組成物］
上述のように、本発明では、アルデヒド固定剤の使用によって生じた組織標本中のアルデヒド結合の少なくとも一部を遊離させる手段としてアルデヒド遊離試薬組成物も使用する。
【００５１】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の抗原性を、重金属溶液中で組織をマイクロ波加熱することによって回復させる処置は、Ｓｈｉら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３９（ｂ）：７４１−４８（１９９１）に記載されている。その後、改良された方法および試薬が開発され、例えば「アルデヒド固定組織における免疫化学的染色の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  ａｌｄｅｈｙｄｅ−ｆｉｘｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ）」と題する米国特許第５，５７８，４５２号（「’４５２号特許」）に開示されている。この特許文献はこの参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。
【００５２】
具体的に述べると、’４５２号特許に開示されているように、組織標本中のアルデヒド結合の少なくとも一部を遊離させることができるアルデヒド遊離試薬はたくさんある。そのような試薬には、例えば求核剤、酸化剤、酸−塩基対および有機酸などがある。
【００５３】
有用な求核剤の中でも塩基性求核剤は好ましい。特に好ましい求核剤は、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどの水酸化アルカリ金属として便利に供給される水酸化物アニオンである。他の便利な求核剤には、１級、２級または３級アミン、特に攻撃時の立体障害が最低限であるもの、例えばピペリジンまたはモルホリンなどがある。ヒドロキシルアミンおよびグリシンは好ましい。他の求核剤としてメルカプトエタノールなどのチオールが挙げられる。さらにもう一つの興味ある求核剤はアジド、例えばアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）である。一般に、逆マンニッヒ反応を促進することができる求核剤はホルムアルデヒドが引き起こす他のタイプの反応の反転も触媒するであろうから、そのような試薬はいずれも、少なくとも一部のタンパク質架橋を切断することができる。求核剤の濃度は広い範囲で変えることができ、濃度が高い溶液ほど速く作用する。暴露時間を短くするには、０．５Ｍ以上の求核剤濃度が通常は好ましい。メタノール中のＮａＯＨの場合は、ほとんどの状況で、飽和濃度の１／１０〜１／２の濃度（約０．６〜３Ｍ）が好ましい。例えばヒドロキシルアミン塩酸塩の形態をとっているヒドロキシルアミンの場合、またはグリシンの場合は、１０％水溶液が好ましい。
【００５４】
本発明の実施に有効な他のアルデヒド遊離試薬は酸化剤である。好ましい酸化剤は次亜塩素酸塩および過ヨウ素酸塩、特に次亜塩素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸ナトリウムである。他の酸化剤には例えばヒドラジン水和物がある。酸化剤の濃度は試薬によって異なるだろう。例えば次亜塩素酸ナトリウムの場合は、約０．０１％〜約０．００５％、好ましくは０．００５％の水溶液（ｖ／ｖ）が適切である。過ヨウ素酸ナトリウムの場合は、約０．１％〜約１．０％、好ましくは０．１％の水溶液（ｖ／ｖ）が適切である。また、ヒドラジン水和物の場合は、約２．０％〜約５．０％、好ましくは５．０％の水溶液（ｖ／ｖ）が適切である。酸化剤による試料の処理は、アルデヒドと組織成分との間の架橋を破壊すると考えられ、遊離されたアルデヒドを、例えばホルムアルデヒドをギ酸に変換することなどによって、非反応性型に変換する。
【００５５】
いくつかの酸／塩基対は、本発明の範囲に包含されるアルデヒド遊離剤として機能する。以下の対はその典型例である。トリクロロ酢酸／ＮａＯＨ、トルエンスルホン酸／ＮａＯＨ、クエン酸／ＮａＯＨ、シュウ酸／ＮａＯＨおよび酒石酸／ＮａＯＨ。しかし、簡単のために、種々の有機酸、例えばクエン酸などを、本アルデヒド遊離試薬組成物に試薬として単独で使用できることがわかった。クエン酸を使用する場合、通常は、本発明の溶液の製造を容易にする濃厚原液から、使用されるだろう。例えばアルデヒド遊離試薬組成物の１０×原液は、約２ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬのアルデヒド遊離試薬組成物、より一般的には約４ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬのアルデヒド遊離試薬組成物を含むことができる。また、原液のｐＨは通常は約５．５〜約７．５、より一般的には約６〜７のｐＨ範囲に調節されるだろう。
【００５６】
アルデヒド遊離試薬溶液の溶媒は、アルデヒド遊離試薬に適合しアルデヒド遊離試薬を溶解する能力を持つ溶媒であればなんでもよい。水溶液も可能であり、アルデヒド遊離試薬が酸化剤、有機酸／塩基対または有機酸単独の場合は水溶液が好ましい。アルデヒド遊離剤が求核剤である場合は有機溶液が好ましい。なぜなら遊離溶液により包埋剤へのより良い浸透が助長されるからである。加えて、タンパク質加水分解断片はほとんどの有機溶媒に不溶性なので、スライド上でその場にとどまる傾向があるからである。本溶液には、脱ロウ溶媒組成物成分が存在するため、改めて調節しなくても、この機能を果たすのに充分な有機溶媒が一般に含まれている。
【００５７】
本発明の一部の実施形態では、脱ロウ溶媒組成物または水性洗浄溶液は、緩衝液、塩類、またはロウの可溶化、洗浄、もしくは後続の組織化学ステップに有用な他の試薬を含む。ただし、そのような随意の試薬は当該組成物のロウ可溶化能、洗浄ステップの効率、または後続の組織化学ステップを妨害しないものとする。後続の処理または組織化学ステップに有用な試薬には、例えばカルボン酸エステル、リパーゼなどの酵素、および米国特許第５，５７８，４５２号に記載の求核試薬などがある。さらなる随意の試薬として、組成物の貯蔵寿命を延ばす抗微生物剤および安定剤が挙げられる。そのような抗微生物剤および安定剤は当分野では周知である。そのような試薬は通例、主成分と比較して極めて低いパーセンテージ（通例０．１％未満）で使用される。好ましい試薬は下流の組織化学的解析を妨害しないものである。
【００５８】
本発明の組成物の個々の成分は、市販されているか、既知の方法で天然源から単離されるか、または既知の方法で合成される。本発明の組成物は通例、表示した量の諸成分の単なる混合によって製造される。
【００５９】
ロウまたはパラフィン含浸によって切出し用の反応性試料を作製する方法は一般によく知られており、容易に実行される。本技術は極めて簡単であり、組織化学的解析に先立って標本に含浸したロウを可溶化するために、ロウ包埋切片を本発明の脱ロウ溶媒組成物と接触させる。所望により、この方法は、脱ロウした標本を、脱ロウ後直ちに、洗浄剤を含む水性洗浄組成物と接触させて、脱ロウ溶媒組成物を除去するステップをさらに含んでもよい。
【００６０】
本脱ロウ法は温度制御された浴を必要としない室温で行なうと便利であり、通例、室温で行なわれるが、温度制御された浴を使用すると、満足のいく脱ロウおよび洗浄に必要な時間をより正確に制御することができる。実施可能な温度範囲は約５°からその溶液の沸点まで、好ましくは約１５℃からその溶液の沸点まで、より好ましくは約２５℃から約４０℃までである。
【００６１】
通例、ロウ包埋標本を、標本を包埋しているロウの全部または一部を可溶化するのに充分な時間にわたって、本発明の組成物と接触させる。可溶化時間に影響を及ぼす要因には、温度、標本切片の厚さ、およびロウ組成が含まれる。どの特定標本タイプについても、最適な時間は実験的に決定される。しかし、顕微鏡スライド上に封入された標本の場合、通常は５分間の接触で充分である。薄切標本（通例、顕微鏡スライドに貼り付けられているもの）と本発明組成物との接触は多くの方法で行なわれる。好ましくは、本組成物を含む浴に標本を浸漬するか、またはロウを可溶化するのに充分な量の組成物を、標本が組成物によって覆われるように、標本の上に置くことができる。ロウの可溶化が起こるのに充分な接触時間が経過した後、標本と組成物との接触を解き、過剰な組成物を標本から、例えば排液、ふき取りまたはブローイングなどによって除去する。所望により、標本からのロウの除去をさらに確実にするために、第２のまたはそれ以上の脱ロウステップを、好ましくは新しい脱ロウ溶媒組成物を使って行なう。
【００６２】
本発明は、脱ロウ後洗浄用のアルコールの必要性を低減または排除する。本発明の組成物では脱ロウ後洗浄は必ずしも必要でない。（例えば染色法がとりわけ敏感であるなどの理由で）そのようなステップが望ましいことが判明したら、脱ロウした標本を、洗浄剤を含む本発明の水性洗浄組成物と接触させることができる。好ましい洗浄溶液は緩衝液および洗浄剤を含む。好ましい洗浄剤は非イオン洗浄剤である。好ましい緩衝液／洗浄剤洗浄溶液は、約１％の非イオン界面活性剤ポリオキシエチレンエーテル、例えばＢＲＩＪ−３５（非イオン界面活性剤ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテルまたはポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルの商標名）などを含むリン酸緩衝食塩水である。通例、洗浄剤の量は約０．１％〜約５％（重量／容量）、好ましくは約０．１％〜２％、最も好ましくは約１％である。
【００６３】
洗浄組成物のｐＨは、下流の組織化学的解析に悪影響を及ぼさないように、最も好ましくは中性である。ｐＨは約２〜約１２、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約５．５〜約７．５、さらに好ましくは６．０〜約６．５の範囲であることができる。好ましい緩衝液は下流の解析を妨害せず、そして／または後続の水洗またはブローイングによって容易に除去することができるものである。リン酸緩衝食塩水またはトリス含有食塩水は好ましい緩衝液の例である。洗浄は、例えば洗浄浴への浸漬、標本上に洗浄溶液を注ぐこと、洗浄溶液を標本全体に核酸または浸透させること、またはブローイングなど、数多くの方法によって行なうことができる。最適な洗浄時間は実験的に決定されるが、通常は５分で充分である。除去される脱ロウ溶液の量が多くなるように、複数回のすすぎおよびより多量の洗浄溶液を使用することができる。ほとんどの目的には１回の洗浄で充分であるが、除去が不充分な場合は２回目の洗浄が好ましい。所望により、標本を最終的に水中で洗浄またはすすぎ洗いする。最も厳密な条件でも通常は３分間の水洗で充分である。洗浄後の標本は、組織化学的解析または他の解析に、すぐに使用することができる。
【００６４】
本発明の組成物は、洗浄溶液を含めて、例えば参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，４３９，６４９号および同第５，９４８，３５９号などに記載の自動染色システムに適合する。脱ロウしたスライドを自動染色装置に供給するか、または自動染色装置に本発明の組成物を供給して、自動解析前にスライドの自動脱ロウを行なわせることができる。
【００６５】
本発明の脱ロウ溶液に使用される好ましい界面活性剤および他の成分は、下流の解析を、特に洗浄操作後に標本上に残っている残留レベルで、通例、妨害しないものであるが、残留界面活性剤（または他の成分）が下流の解析で問題を引き起こす場合は、界面活性剤（または他の成分）の除去を強化するために、技術上知られている方法を適用してもよい。残留界面活性剤を除去するために、界面活性剤を結合することが知られている可溶性化合物を水性洗浄溶液に含めることができる。例えばシクロデキストリンは一定の界面活性剤を結合することが知られており（ＵＳ５，０３２，５０３）、洗浄溶液に含めることができる。残留界面活性剤を結合し除去するために、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質を洗浄溶液に含めることができる。好ましい一実施形態として、下流の解析を妨害しない界面活性剤であって、残留界面活性剤を置換することができる界面活性剤を、水性洗浄溶液に使用することができる。この置換界面活性剤は好ましくは水洗によって容易に除去させる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル型非イオン界面活性剤は好ましい洗浄界面活性剤である。ＢＲＩＪ−３５（ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテルの商標名）はそのような界面活性剤の一例である。
【００６６】
包埋組織標本から包埋剤を脱ロウすると同時に組織学的反応性を妨げるアルデヒド結合を遊離させるためのキットも提供する。この点で、本キットは、アルデヒド固定剤で固定され包埋剤に包埋された組織標本とハイブリダイズするという核酸プローブの能力を向上させ、プローブと組織標本との間の組織化学的反応を改善する手段になる。
【００６７】
本キットは、通例、包埋剤用の脱ロウ溶媒組成物とアルデヒド遊離試薬組成物とを含む溶液が入った第一の容器、前記組織標本中の核酸鎖の少なくとも一部を室温で分離させる能力を持つ変性溶液が入っている第二の容器、核酸プローブの少なくとも一部を室温で組織標本にハイブリダイズさせる能力を持つハイブリダイゼーション溶液が入っている第三の容器、および前記組織標本にハイブリダイズした前記核酸プローブを検出するための検出系を含む。容器は、必ずというわけではないが、一般的には、それらを保持するように特別に適合させた置き場所に配置される。本キットは、より大きい組織化学的解析用キット、例えば自動染色装置用キットの一成分であることができる。本明細書に記載する他の試薬はいずれも、指定した成分と組み合わせて本キットに使用することができる。
【００６８】
本発明の方法およびキットは、種々の組織化学的用途、特に特殊染色を使った免疫化学染色および他の古典的染色に適している。核酸プローブを使ったｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションも、本発明の組成物および方法に適合する特に適切な用途である。
【００６９】
本発明は、組織学実験室における一定の毒性有機溶媒（例えばキシレン、キシレン代替物、アルコールなど）の使用を最小限に抑えるか、または排除する。本明細書に記載する組成物および方法論は、パラフィンおよび他のロウを組織切片から効果的に除去し、組織化学用に作製される組織切片の品質に有害な影響を及ぼさない。この遊離方法の応用は、パラフィンおよび他のロウを組織切片から除去することが必要な他の用途にも拡大することができる。イソパラフィンを用いる好ましい実施形態では、本組成物は、経口、皮膚および吸入経路による急性毒性が極めて低く、実用上無毒である。さらに、本方法により、段階的アルコール洗浄を行なう必要がない遊離方法が可能になる。したがって、本発明の実施形態は、使用者の危険を最小限に抑え有害廃棄物の生成を最小限に抑える組成物および方法を提供するという要求を満たすものである。
【００７０】
以上、本発明を概説したが、以下の詳細な実施例を参照することにより、本発明はより良く理解されるだろう。以下の実施例は例示であって、特に明記しない限り、本発明を限定する記載であるとみなしてはならない。
【００７１】
［実験例］
以下の実験例では、重量は全てグラム（ｇ）、ミリグラム（ｍｇ）、マイクログラム（μｇ）、ナノグラム（ｎｇ）またはピコグラム（ｐｇ）の単位で記載し、量は全てモル、ミリモル（ｍｍｏｌ）、マイクロモル（μｍｏｌ）、ナノモル（ｎｍｏｌ）、ピコモル（ｐｍｏｌ）またはフェムトモル（ｆｍｏｌ）の単位で記載し、濃度は全て容量パーセント（％）、容量比（ｖ：ｖ）、モル濃度（Ｍ）、ミリモル濃度（ｍＭ）、マイクロモル濃度（μＭ）、ナノモル濃度（ｎＭ）、ピコモル濃度（ｐＭ）、フェムトモル濃度（ｆＭ）または規定（Ｎ）として記載し、容量は全てリットル（Ｌ）、ミリリットル（ｍＬ）またはマイクロリットル（μＬ）の単位で記載し、長さの測定値は別段の表示がないかぎりミリメートル（ｍｍ）またはナノメートル（ｎｍ）の単位で記載する。
【００７２】
オリゴヌクレオチドプローブを使ったｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは室温で行なわれていたが（６〜７）、ほとんどのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイは加熱を使った技術によって行なわれ、この場合は変性およびハイブリダイゼーション操作が高温で行なわれる。しかし、これまでに知られている室温アッセイに適用されるプロトコールは長く、複雑であり、終夜ハイブリダイゼーションステップが必要な場合もある。本発明では、簡単で、はるかに短時間な室温ＩＳＨプロトコールを記載する。本ＩＳＨプロトコールは、本脱ロウおよびアルデヒド遊離方法（試薬ＮＡＲ−Ｉなどを使用する方法）との併用により、優れた染色をもたらし、手作業でも自動染色システムでも利用することができる。
【００７３】
［材料およびプロトコール］
核酸賦活溶液Ｉ（ＮＡＲ−Ｉ；ＢｉｏＧｅｎｅｘカタログ番号ＨＫ−８７３）
【００７４】
【表１】
2004515752.tif 000006
【００７５】
抗原賦活Ｃｉｔｒａ  Ｐｌｕｓ溶液（１０×原液）：
クエン酸緩衝液  ｐＨ６．０
ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓカタログ番号ＨＫ０８０
【００７６】
ＥＺ脱ロウ溶液（調製済）：
ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  カタログ番号ＨＫ５８５
【００７７】
変性溶液：
変性溶液は、水酸化ナトリウムなどの強アルカリを含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ、カタログ番号ＨＫ−８２９として入手可能）。
【００７８】
タンパク質ブロック：
タンパク質ブロックは、正常ヤギ血清、青色食品用染料および共通抗体希釈剤（Ｃｏｍｍｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ：ＣＡＢＤ）を含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤であり（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ、カタログ番号ＨＫ−１１２として入手可能）、前記共通抗体希釈剤は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、ウシ血清アルブミンおよびアジ化ナトリウムを水中に含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である。
【００７９】
過酸化物ブロック：
過酸化物ブロックは、過酸化水素および脱イオン水を含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｂｌｏｃｋ、カタログ番号ＨＫ−１１１として入手可能）。
【００８０】
抗フルオレセイン抗体：
抗フルオレセイン抗体は、共通抗体希釈剤（ＣＡＢＤ）および抗フルオレセイン抗体を含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｌｉｎｋ１、カタログ番号ＨＫ−８１８として入手可能）。希釈率が約１：２０００になるようにＣＡＢＤで抗フルオレセイン抗体を希釈する（希釈率は抗体価によって異なりうる）。
【００８１】
ビオチン化抗マウスＩｇＧ：
ビオチン化抗マウスＩｇＧは、ＣＡＢＤで希釈率約１：２００に希釈されたビオチン−ＳＰ−結合Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（希釈率は抗体価によって異なりうる）を含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｌｉｎｋ２、カタログ番号ＨＫ−８２７として入手可能）。
【００８２】
ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン：
ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンは、ＲＧＬＡＤで希釈率約１：２００に希釈されたペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＨＲＰ）と（希釈率はＨＲＰの力価によって異なりうる）、保存剤としてのアニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）とを含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌ、カタログ番号ＨＫ−３３０として入手可能）。ウサギヤギラベリング抗体希釈剤（Ｒａｂｂｉｔ  Ｇｏａｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ：ＲＧＬＡＤ）は、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、硫酸ゲンタマイシン、硫酸ネオマイシン、塩化ナトリウム、チメロサール、ウシ血清アルブミンを脱イオン水中に含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である。
【００８３】
アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン：
アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンは、脱イオン水中の塩化マグネシウム、塩化亜鉛およびＣＡＢＤの溶液で希釈率約１：２００に希釈されたアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ＡＫＰ）（希釈率はＡＫＰの力価によって異なりうる）を含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌ、カタログ番号ＨＫ−３３１として入手可能）。
【００８４】
ＨＲＰ用ＤＡＢ発色基質：
ＨＲＰ用ＤＡＢ発色基質は、ＤＡＢ基質液用緩衝液（Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＭＯＰＳ、ＥＤＴＡおよびトリトンＸ−１００を脱イオン水中に含む、カタログ番号ＨＫ−１２８として入手可能なＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤）中のＤＡＢ発色基質液（Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）（３，３’−ジアミノベンジジン、クエン酸およびグリセロールを含む、カタログ番号ＨＫ−１２４として入手可能なＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤）を含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である。使用前に過酸化水素（カタログ番号ＨＫ−１２６として入手可能）およびＤＡＢ発色基質液をＤＡＢ基質液用緩衝液で希釈する。
【００８５】
ＡＫＰ用ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質：
ＡＫＰ用ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質は、ＢＣＩＰ原液としての脱イオン水中の５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと、ＮＢＴ原液としての脱イオン水中のニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとを、脱イオン水中のＡＭＰＤ、塩化ナトリウムおよびＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含む基質緩衝液中に含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、カタログ番号ＨＫ−１８８として入手可能）。
【００８６】
対比染色剤：
ヘマトキシリン対比染色剤（ＨＲＰ／ＤＡＢ検出系用）は供給業者から即時使用可能な形で、またＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからカタログ番号ＨＫ−１００として、容易に入手できる。
【００８７】
ライトグリーン対比染色剤（ＡＫＰ／ＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出系用）は、ライトグリーンＳＦイエロー、酢酸および試薬用アルコールを脱イオン水中に含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｌｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ、カタログ番号ＨＫ−７２２として入手可能）。
【００８８】
ハイブリダイゼーション溶液（プローブはハイブリダイゼーション溶液に溶解する）：
ハイブリダイゼーション溶液は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、硫酸デキストラン、ノニデットＰ−４０、フィコール・タイプ４０、ポリビニルピロリドン４０、ウシアルブミン・フラクションＶ、サケ精子ＤＮＡおよびホルムアミドをＤＥＰＣ処理水中に含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、カタログ番号ＨＫ−８８１として入手可能）。
【００８９】
パワーブロック：
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ＦＩＳＨ）法専用のタンパク質ブロック溶液をパワーブロック（Ｐｏｗｅｒ  Ｂｌｏｃｋ）として入手することができる。パワーブロックは、カゼインナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、塩化ナトリウム、ゲンタマイシン、硫酸ネオマイシン、およびアジ化ナトリウムを脱イオン水中に含むＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ独自の製剤である（Ｐｏｗｅｒ  Ｂｌｏｃｋ、カタログ番号ＨＫ−０８３として入手可能）。
【００９０】
核酸賦活手順：
（１）使用前にＮＡＲ−Ｉ溶液を室温にし、振とうしてよく混合する。
（２）プラスチックスライド容器（２００〜２５０ｍＬ）をＮＡＲ−Ｉ溶液で満たす。
（３）ＮＡＲ−Ｉ中のスライドにマイクロ波を高出力で３分間照射する。
（４）ＮＡＲ−Ｉを捨てて入れ替え、再びマイクロ波を高出力で３分間照射する。
（５）同じＮＡＲ−Ｉ中に保ち、出力３０％でマイクロ波を１０分間照射する。
（６）ＮＡＲ−Ｉ中に保ち、少なくとも３０分間は冷却する。
（７）Ｏｐｔｉｍａｘ洗浄緩衝液で、少なくとも２回取り替えて、洗浄する。
（８）スライドを染色装置に置き、追加のＯｐｔｉｍａｘ洗浄緩衝液で覆う。
（９）ＩＳＨ染色プロトコールを実行する。
【００９１】
［ＮＡＲを用いる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）］
１．上に詳述した核酸賦活の手順。
２．室温ＦＩＳＨ：
【００９２】
【表２】
2004515752.tif 000007
【００９３】
ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＨＲＰ）検出系を用いる室温ＩＳＨ染色プロトコール：
【００９４】
【表３】
2004515752.tif 000008
【００９５】
アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ＡＫＰ）検出系を用いる室温ＩＳＨ染色プロトコール：
【００９６】
【表４】
2004515752.tif 000009
【００９７】
核酸賦活法およびＨＲＰまたはＡＫＰ検出系を用いる室温ＩＳＨのプロトコールに従った。ＩＳＨ染色にはＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｏｐｔｉｍａｘ自動染色システムを使用した。
【００９８】
核酸賦活付き室温ＩＳＨの初期試験はＨＰＶ６／１１、ＡｌｕおよびＥＢＥＲプローブを使って行なった。これらの試験はＨＲＰ検出系を使って行なった。次にＨＰＶ６／１１、ＥＢＥＲおよびＡｌｕプローブを使ったバリデーションを行なった。これらは主にＨＲＰ検出系を使って行なったが、一部の試験はＡＫＰ検出系を使って行なった。
【００９９】
同じ濃度のプローブを使ってＩＳＨを行い、加熱法または室温（ＲＴ）法と核酸賦活（ＮＡＲ）の有無とを組み合わせて比較した。加熱を使用する方法では、組織標本を９５℃に加熱することによって変性を行い、ハイブリダイゼーションは３７℃で行なった。ＲＴ法では、室温で変性溶液を使用することによって変性を行ない、ハイブリダイゼーションは室温で行なった。
【０１００】
［結果］
結果を以下の表に要約する。これらの結果は、ＮＡＲ付きのＩＳＨをＲＴ法と組み合わせることによって最適な結果が得られたことを示している。
【０１０１】
【表５】
2004515752.tif 000010
【０１０２】
試験した組織切片はいずれも強い特異的シグナルを与え、バックグラウンドはごくわずかだった。シグナル対バックグラウンド比によれば、核酸賦活を室温ＩＳＨと併用することにより、染色の品質は著しく改善された。ＨＰＶ６／１１、ＥＢＥＲおよびＡｌｕプローブの所要プローブ濃度は、核酸賦活なしの室温ＩＳＨに使用される濃度のそれぞれ１／２５、１／２８および１／２００だった。
【０１０３】
本明細書で引用した特許および特許出願は、引用した特許及び特許出願を参照することにより組み込むことを明示したかのように、いずれも参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。
【０１０４】
以上、明解に理解されるように、例示と実施例によって、本発明をいくらか詳細に説明したが、本願特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、上記の説明に一定の改変および変更を加えうることは、本明細書に照らして、当業者には明らかだろう。
【０１０５】
［引用文献］
【表６】
2004515752.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2004515752.tif 000015
2004515752.tif 000016
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2004515752.tif 000049
2004515752.tif 000050
【国際調査報告】
2004515752.tif 000051
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