(57)【要約】本発明は、アテロプロテクティブ脂質プロフィールを向上させるための組成物の製造における、11β-HSD1レベルを低下させる薬剤の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテロプロテクティブ脂質プロフィールを向上させるための組成物の製造における、11β-HSD1レベルを低下させる薬剤の使用。
【請求項２】
内因性11β-HSD1遺伝子の発現を調節する薬剤によって、11β-HSD1レベルを低下させる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
11β-HSD1 mRNA転写または翻訳を調節する薬剤によって、11β-HSD1レベルを低下させる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
11β-HSD1合成または活性を阻害する薬剤によって、11β-HSD1レベルを低下させる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
上記薬剤が、カルベノキソロン、11-オキソプロゲステロン、3α,17,21-トリヒドロキシ-5β-プレグナン-3-オン、21-ヒドロキシ-プレグン-4-エン-3,11,20-トリオン、アンドロスト-4-エン-3,11,20-トリオンおよび3β-ヒドロキシアンドロスト-5-エン-17-オンからなる群より選択される、請求項4に記載の使用。
【請求項６】
上記アテロプロテクティブ脂質プロフィールが、血漿トリグリセリドレベルの低下を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
上記アテロプロテクティブ脂質プロフィールが、HDLコレステロールレベルの上昇を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
11β-HSD1レベルの低下の結果、血清apoCIIレベルが低下する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
11β-HSD1レベルの低下の結果、PPARαレベルが上昇する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
インスリン感受性を増加させるための組成物の製造における、11β-HSD1レベルを低下させる薬剤の使用。
【請求項１１】
グルコース耐性を向上させるための組成物の製造における、11β-HSD1レベルを低下させる薬剤の使用。
【請求項１２】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、アテロプロテクティブ脂質プロフィールを向上させるための組成物の製造における、細胞内11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARαアゴニストの使用。
【請求項１３】
心臓血管疾患発症のおそれがある動物における心臓血管疾患を軽減する方法であって、薬学上有効な量の11β-HSD1活性を低下させる薬剤を該動物に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１４】
内因性11β-HSD1遺伝子の発現を調節する薬剤によって、11β-HSD1レベルを低下させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
11β-HSD1 mRNA転写または翻訳を調節する薬剤によって、11β-HSD1レベルを低下させる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
11β-HSD1合成または活性を阻害する薬剤によって、11β-HSD1レベルを低下させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記薬剤が、Monder CおよびWhite PC Vitamins and Hormones 1993；47: 187-271の表IVに記載されたステロイドからなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記アテロプロテクティブ脂質プロフィールが、血漿トリグリセリドレベルの低下を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
上記アテロプロテクティブ脂質プロフィールが、血漿トリグリセリドレベルの低下を含む、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
上記アテロプロテクティブ脂質プロフィールが、HDLコレステロールレベルの上昇を含む、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
11β-HSD1レベルの低下の結果、血清apoCIIレベルが低下する、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
11β-HSD1レベルの低下の結果、PPARαおよび／またはPPARγレベルが上昇する、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
心臓血管疾患発症のおそれがある動物におけるインスリン感受性を増加させる方法であって、薬学上有効な量の11β-HSD1活性を低下させる薬剤を該動物に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２４】
心臓血管疾患発症のおそれがある動物におけるグルコース耐性を改善する方法であって、薬学上有効な量の11β-HSD1活性を低下させる薬剤を該動物に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、アテロプロテクティブ脂質プロフィールを向上させる方法であって、それを必要とする動物に、11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARαアゴニストを投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２６】
11β-HSD1活性を阻害する薬剤およびPPARαアゴニストを含む、医薬組成物。
【請求項２７】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、アテロプロテクティブ脂質プロフィールを向上させるために、同時に、同時かつ個別または連続的に用いられる、11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARαアゴニスト。
【請求項２８】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、アテロプロテクティブ脂質プロフィールを向上させるために用いられる、11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARαアゴニスト、ならびに使用説明書を含んでなる、キット。
【請求項２９】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、アテロプロテクティブ脂質プロフィールを向上させるために用いられる、11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARαアゴニストを単位用量にパッケージして含む、キット。
【請求項３０】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、心臓血管危険性を制御する方法であって、それを必要とする動物に、11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARγアゴニストを投与することを含んでなる上記方法。
【請求項３１】
11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARγアゴニストを含む、医薬組成物。
【請求項３２】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、心臓血管危険性を制御するために、同時に、同時かつ個別または連続的に用いられる、11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARγアゴニスト。
【請求項３３】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、心臓血管危険性を制御するために用いられる、11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARγアゴニスト、ならびに使用説明書とを含んでなる、キット。
【請求項３４】
インスリン感受性を増加またはグルコース耐性を向上して、心臓血管危険性を制御するために用いられる、11β-HSD1活性を低下させる薬剤およびPPARγアゴニストを単位用量にパッケージして含む、キット。
【請求項３５】
代謝率を高めるための組成物の製造における、11β-HSD1レベルを減少させる薬剤の使用。
【請求項３６】
望ましくない体重増加を予防または逆転するための、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
食欲抑制剤と組み合わせて、11β-HSD1レベルを低下させる上記薬剤を投与する、請求項３５または３６に記載の使用。
【請求項３８】
抗肥満薬と組み合わせて、11β-HSD1レベルを低下させる上記薬剤を投与する、請求項３５または３６に記載の使用。
【請求項３９】
炎症を治療するために、同時に、同時かつ個別または連続的に用いられる、11β-HSD1阻害剤およびグルココルチコイド。
【請求項４０】
グルココルチコイド治療の副作用を予防するための組成物の製造における、11β-HSD1阻害剤の使用。
【請求項４１】
上記副作用が、心臓血管危険性、脂質プロフィール改変、インスリン耐性、高血糖症、肥満および／または高血圧に関連する、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
マクロファージにおけるコレステロール貯蔵を減少させるための組成物の製造における、11β-HSD1阻害剤の使用。
【請求項４３】
マクロファージにおけるコレステロール貯蔵を減少させるために、同時に、同時かつ個別または連続的に用いられる、11β-HSD1阻害剤およびPPARγアゴニスト。
【請求項４４】
肝内脂肪レベルを低下させるための組成物の製造における、11βHSD-1阻害剤の使用。
【請求項４５】
上記脂質プロフィールが改善される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
非アルコール性脂肪肝炎（血清トランスアミナーゼの減少を含む）を有する患者における肝不全が予防またはされる、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
非アルコール性脂肪肝炎から肝硬変への進行が予防される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４８】
肝内脂肪レベルを低下させるために、同時に、同時かつ個別または連続的に用いられる、11β-HSD1阻害剤およびメトフォルミン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテロプロテクティブ効果を得るために、個体の脂質プロフィールを調節する方法に関する。特に、本発明は、アテロプロテクティブ脂質プロフィールの向上を目的とする、11β−ヒドロキシステロイドデヒロゲナーゼ１型（11β-HSD-1）レベルのモジュレーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝症候群は、米国内、また世界的にも主要な医学的および公衆衛生問題の１つとして現れている。これは、高血圧、高トリグリセリド血症、および高血糖症を特徴とし、肥満によって悪化し、冠状動脈性心疾患の危険因子となる。
【０００３】
冠状動脈性心疾患は、心臓発作（心筋梗塞）、心不全または胸の痛み（狭心症）のいずれかとして発現する状態である。これは、冠状動脈の狭窄および硬化（アテローム性動脈硬化）によって起こる。アテローム性動脈硬化の主な特徴の１つは、冠状動脈壁内のコレステロール蓄積である。冠状動脈疾患の危険因子は、アテローム性動脈硬化の根本的原因である。アテローム性冠状動脈硬化の主な原因は、LDLコレステロールの増加、喫煙、および代謝症候群の三つである。これらのうち、LDLコレステロールがアテローム性動脈硬化の第１原因である。LDLの血中レベルが上昇すると、アテローム性動脈硬化が開始し、持続する。しかし、喫煙および代謝症候群も有意な危険因子となる。
【０００４】
代謝症候群は、個々の危険因子から構成され、これらが集まると、冠状動脈性心疾患の危険性を大幅に高めることになる。この症候群を形成する代謝危険因子は、高トリグリセリド、小粒子LDL、低HDLコレステロール、高血圧、高血中グルコース、血餅形成（血栓症）の傾向、および慢性炎症である。上記の危険因子が、増加したLDLコレステロールの存在下で発生した場合、これらが集合すると、アテローム性動脈硬化の発症を速める。LDLコレステロールレベルが非常に低い場合には、代謝症候群の危険因子がアテローム発生に及ぼす影響は少ないであろうが、いったんLDLレベルが上昇すると、上記のような他の危険因子が急速にアテローム発生性となると考えられる。
【０００５】
代謝症候群を有する多くの患者は、II型糖尿病（成人発症糖尿病）も発症する。II型糖尿病は、7.0 mモル／l以上の空腹時血症グルコースレベルを特徴とする。II型糖尿病に罹患した人のほとんどは、２種の代謝異常を有し、これが、血中グルコースを糖尿病レベルまで高める。第１の異常はインスリン耐性であり、もう一つは、膵臓によるインスリン生産の不全である。
【０００６】
II型糖尿病は、典型的に、インスリン耐性が、軽度から中度のインスリン分泌不全と合併したとき、発症する。従って、インスリン耐性は、グルコースの取込みおよび使用を向上させるインスリンの正常な作用を妨害する、組織代謝の不全である。インスリン耐性は、通常、II型糖尿病の発症の何年も前に起こる。インスリン耐性と、代謝症候群の危険因子との間には密接な関係が存在する。この関係の性質についてはまだ十分に解明されていない。１つの因子は、組織の脂肪（脂質）のオーバーロードであると考えられる。インスリン耐性を有する患者は、通常、脂肪組織から放出される遊離脂肪酸のレベルが高い。過剰な脂肪酸が筋肉に侵入すると、脂質のオーバーロードが起こり、これが、インスリン耐性を誘導する。その他の因子もインスリン耐性に寄与する可能性があるが、組織の脂質のオーバーロードが主要な因子であると思われる。このオーバーロードは、様々な様式で、代謝症候群の冠状動脈性危険因子を発生するようだ。
【０００７】
血中LDLコレステロールレベルの上昇は、代謝症候群の不可欠な構成要素であるとは一般に考えられていない。しかし、これは、代謝症候群の他の構成要素がアテローム発生因子として作用できるようになる前に、存在していなければならない主要な独立の危険因子である。代謝症候群の様々な構成要素が存在する世界中の集団において、血中LDLコレステロールレベルが非常に低い場合には、アテローム性冠状動脈心疾患は比較的稀有である。集団調査において、LDLレベルが上昇し始めたときに限り、冠状動脈性心疾患の発生数が増加し始める。さらに、HMGCoAレダクターゼ阻害剤またはフィブラートの投与など、LDLコレステロールを低下させる介入処置を実施すると、冠状動脈性心疾患の優勢が低下する。血中LDLコレステロールレベルと、インスリン耐性との関連は、詳細には研究されていない。明らかに、インスリン耐性以外の多くの因子がLDL上昇に寄与している。しかし、肝臓に脂肪のオーバーロードが起こると、肝臓によるリポタンパク質の生産が増加するようだ。アポリポタンパク質Ｂを含むリポタンパク質の過剰生産は、LDLレベルを幾分上昇させる。例えば、肥満の人は、痩せた人に比べて、LDLコレステロールレベルが高い。従って、代謝症候群から、LDL上昇を完全に排除することはできない。
【０００８】
これ以上に、血中脂質の異常は代謝症候群に特有である。典型的には、３種類の異常があるが、これらをまとめて、「三脂質異常」と呼び、トリグリセリドの上昇、小粒子LDL、および低HDLコレステロールレベルが含まれる。三脂質異常は、アテローム発生性リポタンパク質表現型またはアテローム発生性脂質異常症と称されている。アテローム発生性脂質異常症の各構成要素が、アテローム性動脈硬化を独立に促進させると考えられる。トリグリセリドの上昇は、残存リポタンパク質の存在を示し、これは、LDLと同程度にアテローマを発生するようである。小粒子LDLは、正常な大きさのトリグリセリドより容易に動脈壁に入り込むため、アテローム発生を増大する。
【０００９】
低HDLは、恐らく、様々な様式でアテローム性動脈硬化を向上させる。１つの顕著な例として、HDLが動脈壁からの過剰コレステロールを排除する能力（コレステロール逆輸送）が挙げられ、HDLが低いと、コレステロール逆輸送が阻害される。
【００１０】
上記の三脂質異常には、第４の異常が伴なうことが多い。これは、アポリポタンパク質Ｂ（apoB）の上昇である。apoBは、LDLや、トリグリセリドを豊富に含むリポタンパク質の主要なリポタンパク質である。研究者の中には、全apoB1’レベルがアテローマ発生脂質異常症の存在を最もよく示す単一指標であると考える者もいる。確かに、全apoBレベルが高いと、人における冠状動脈性心疾患の危険性が増加する。インスリン耐性を有する患者は、アテローマ発生性脂質異常症を発症することが多い。肝臓は脂肪オーバーロードになると、リポタンパク質を含むapoBの過剰生産が起こる。これによって、トリグリセリドの上昇、残存リポタンパク質の増加、ならびに、全apoBおよび小粒子LDLの増加が起こる。これらはすべて、過剰脂肪に対処し、これを排除しようとする肝臓による補償応答を呈示する。
【００１１】
加えて、重要な肝臓酵素である、肝リパーゼもまた、インスリン耐性の存在下で増加する。この酵素は、HDLを分解し、インスリン耐性に関連する低HDLに寄与する。
【００１２】
副腎により生産されるグルココルチコイドホルモン（コルチコゾール、コルチコステロン）は、インスリン耐性を引き起こす可能性がある。この作用は、コルチコステロイドの過剰生産による、クッシング症候群（クッシング病など）を有する患者において最も顕著に観察される。クッシング症候群の患者は、インスリン耐性を呈し、その多くは、II型糖尿病を発症する。さらに、疾患の治療で、天然または合成グルココルチコイドを受ける患者も、インスリン耐性を呈示する。
【００１３】
近年、新規で、かつ重要なレベルのグルココルチコイド作用の制御、すなわち、11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β-HSD）による前受容体代謝が明らかになっている。11β-HSDは、活性の生理学的11-ヒドロキシグルココルチコイド（大部分の哺乳動物ではコルチゾール、ラットおよびマウスではコルチコステロン）、ならびに、それらの不活性な11-ケト型（コルチゾン、11-デヒドロコルチコステロン）の変換を触媒する。異なる遺伝子の産物（５、６）である、11β-HSDの２種のアイソザイムがある。11β-HSD２型は、高親和性デヒドロゲナーゼであり、腎臓および結腸におけるコルチコステロンを急速に不活性化するため、他の非選択的鉱質コルチコイド受容体（７、８）からin vivoでグルココルチコイドを排除する。しかし、白色脂肪組織は、単独で11β-HSD１型を発現し（９）、その酵素が特に豊富な肝臓（10、11）も同様である。
【００１４】
11β-HSD-１は、肝細胞（12）、脂肪細胞（13）、ニューロン（14）など、ほとんどのインタクトな細胞、ならびに、ex vivoで単離された肝臓（15）における主要レダクターゼである。この反応方向が、遊離循環不活性11-ケトステロイドから、細胞内に活性グルココルチコイドを再生する。11βHSD-１遺伝子の標的破壊のためのホモ接合性マウスは生存能があり、繁殖可能で、かつ正常の寿命を有する（16）。しかし、11βHSD-１ヌルマウスは、不活性11-デヒドロコルチコステロンからコルチコステロンを再生することはできず、これは、このアイソザイムが、ユニークな11β-レダクターゼであることを示している。驚くことに、ヌル動物は、ストレス時に、減弱した糖新生応答を呈示し、長期にわたる高脂肪給餌により誘導される高血糖症に抵抗する（16）。これは、コルチコステロンの血漿レベルがわずかに上昇しただけでも起こる。この結果は、11βHSD-１レダクターゼ活性が、in vivoでの肝内グルココルチコイド作用の重要な増幅体であることを示唆している。興味深いことには、11βHSD-１活性の組織特異的変化は、肥満のZuckerラット（４）およびヒト（２；54）における肥満症およびインスリン耐性の発症に関与していた。
【００１５】
代謝症候群において、脂質異常症は、高トリグリセリド血症および異常リポタンパク質、ならびに、VLDL1上昇を有するコレステロールプロフィールを特徴とするが、「心臓保護性」HDLコレステロール（17）の低下も特徴とする。血漿脂質プロフィールは、主として、肝臓における遺伝子発現によって決定される。さらに、脂質代謝、合成、パッケージングおよび輸出に関連する多くの肝タンパク質の発現および活性は、グルココルチコイドに対して感受性である。しかし、肝脂質代謝の病因におけるグルココルチコイドの正確な役割は、不明であるが、総合的作用が、ステロイド濃度、その他のホルモンレベル、特にインスリン、ならびに、食事に左右されるのは明らかである。実際に、多くの研究では、短期治療および／または非生理学的レベルのグルココルチコイドを使用しており、改変された細胞内グルココルチコイド代謝の微妙な作用の推定を困難にしている。さらに、グルココルチコイドはまた、間接的作用を有し、脂質代謝を制御するその他の基本的な転写因子を調節し、ペロキシソーム増殖体−活性化受容体−α（PPARα）（18、19）を顕著に誘導する。PPARαは、空腹時に対する酸化適応（20、21）を駆動し、脂質欠乏症のフィブラート系薬剤（22、23）の分子標的として役立つ。
【００１６】
グルココルチコイドには広範な抗炎症および代謝作用があるため、様々な疾患の治療に用いることができる。グルココルチコイド治療の一般的適応症としては、眼病、肝障害、悪性血液疾患、固形癌、腸疾患、ならびに、最も顕著には免疫媒介性および炎症媒介性疾患が挙げられる。しかし、グルココルチコイド投与は、副作用を伴なうため、その治療の使用が限られる可能性がある。脂質プロフィールの調節異常や代謝症候群は、グルココルチコイド投与による一般的副作用である。
【発明の開示】
【００１７】
脂質代謝およびインスリン感受性の肝依存的変化のために、11β-HSD-1-/-マウスは、改変された心臓血管危険性プロフィールを有することがわかっている。これは、循環脂質およびリポタンパク質の分析、脂質代謝および輸送に関与する肝遺伝子の発現、ならびに、心臓血管危険性に関連するフィブリノーゲンや別のグルココルチド感受性肝転写物の分析によって、証明されている。これらの知見から、11β-HSD1が減少すると、インスリン耐性および代謝症候群の作用に対抗するアテロプロテクティブ脂質プロフィールがもたらされることが報告されている。
【００１８】
従って、第１の態様によれば、本発明は、アテロプロテクティブ脂質プロフィールを向上させるための組成物の製造において、11β-HSD1レベルを低下させる薬剤の使用を提供する。
【００１９】
前述したように、HDLレベルの低下、血漿トリグリセリドレベルの増加、LDLの主成分は、心臓血管危険性およびアテローマ性動脈硬化に対する主要な寄与因子である。本発明によれば、11β-HSD1の阻害により、血漿トリグリセリド、従って、LDLを減少させ、HDLを増加させることを可能にする。冠状動脈性心疾患の危険性にさらされた個体、あるいは、その他の心臓血管の病訴、特に、最適以下のコレステロール代謝と関連する病訴を有する個体の脂質プロフィールは、11β-HSD1レベルの低下により改善することができる。
【００２０】
細胞内11β-HSD1活性を低下させる薬剤には、個体の遺伝的プロフィールを改変することにより、11β-HSD1遺伝子発現をダウンレギュレートするものがある。従って、本発明は、内因性11β-HSD1遺伝子を欠失させる、またはダウンレギュレートする遺伝子治療からなる手法を包含する。このような手法としては、in vivoでのmRNAの転写および／または翻訳を減少もしくは抑制することができるアンチセンス核酸法、ならびに、mRNAレベルで作用するその他の遺伝子操作法や、内因性遺伝子の遺伝子操作により、体細胞における該遺伝子の発現レベルを低下させる方法などがある。
【００２１】
好ましくは、11β-HSD1レベルを低下させる薬剤は、11β-HSD1合成または活性の阻害剤である。従って、以下に記載するように、「レベル」とは、11β-HSD1の活性を意味し、必ずしも、組織または細胞に存在する酵素の物理的量を指すとは限らないことに留意されたい。11β-HSD1の阻害剤は、当業者には公知であり、以下にさらに詳しく記載する。
【００２２】
有利なことには、治療を受けた個体の脂質プロフィールは、血漿トリグリセリドの減少および／またはHDLコレステロールの増加を呈示する。このような脂質プロフィールは、アテロプロテクティブであることが知られている。
【００２３】
好ましくは、治療を受けた個体は、血漿フィブリノーゲンの減少も呈示する。従って、本発明は、フィブリノーゲンレベルを減少させるための組成物の製造における、11β-HSD1レベルを低下させる薬剤の使用を提供し、ここで、血清フィブリノーゲンレベルは、11β-HSD1レベルの低下の結果として減少する。フィブリノーゲンは、心臓血管疾患の独立危険因子として認知されている。
【００２４】
有利なことに、本発明はまた、血清apoCIIIレベルの低下も可能にする。apoCIIIは、肝解糖を阻害することにより、血漿トリグリセリドレベルを増加させる。本明細書に記載するように、11β-HSD1を阻害すると、血清apoCIIIが減少する。従って、本発明は、個体内のapoCIIIレベルを低下させる組成物の製造における、細胞内11β-HSD1活性を低減する薬剤の使用を提供する。apoCIIIは、心臓血管疾患と正の相関関係にあることが知られている。
【００２５】
11β-HSD1活性は、細胞内11β-HSD1活性であるのが好ましい。
【００２６】
さらに、本発明は、個体内のPPARαおよび／またはPPARγレベルを増加する組成物の製造における、細胞内11β-HSD1活性を低減する薬剤の使用を提供する。PPARαは、肝臓における脂肪酸酸化を向上させる。以下に示すように、11β-HSD1の阻害により、PPARαのアップレギュレーションが起こり、これがひいては、血漿トリグリセリドの減少をもたらす。11β-HSD1の阻害はまた、脂肪組織内でのPPARγの発現を増強するが、これは、インスリン感受性、脂質プロフィール、グルコース耐性および心臓血管危険性に対して有益な作用を有する。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、インスリン感受性を向上させる組成物の製造における、細胞内11β-HSD1活性を低減する薬剤の使用を提供する。前述したように、インスリン耐性は、心臓血管危険性および代謝症候群に関連している。11β-HSD1レベルが低下すると、インスリン感受性が増加する。
【００２８】
さらに、本発明は、個体内のグルコース耐性を向上させる組成物の製造における、細胞内11β-HSD1活性を低減する薬剤の使用を提供する。11β-HSD1レベルが低下すると、動的血糖制御が改善される。これは、インスリン感受性の改善において観察される効果と一致する。
【００２９】
非常に好ましい実施形態では、本発明は、アテローマ保護性脂質プロフィールを向上させる組成物の製造における、細胞内11β-HSD1活性を低下させる薬剤と、PPARαアゴニストとを組み合わせて用いることを提供する。PPARαアゴニストは、例えば、フィブラートでよい。フィブラートは、PPARαを活性化し、血漿トリグリセリドを低下させると共に、apoCIIIを抑制する。フィブラートと、11β-HSD1活性を低下させる薬剤とを含んでなる併用治療は、極めて好ましい脂質プロフィールをもたらす。
【００３０】
さらに別の実施形態では、心臓血管疾患発症のおそれがある被験者における心臓血管疾患危険性を低減する方法であって、薬学上有効な量の11β-HSD1活性を低下させる薬剤を上記被験者に投与することを含んでなる方法を提供する。本発明はさらに、前述のように、グルコース耐性を改善し、PPARαレベルを増加し、インスリン感受性を高め、血漿トリグリセリドを低下させ、HDLコレステロールレベルを増加し、および／またはapoCIIIレベルを低下させる方法も提供する。
【００３１】
さらには、11β-HSD1阻害剤の投与は、肥満の抑制を可能にすると同時に、代謝率、従って、エネルギー消費を高めることにより代謝上の利益をもたらす。従って、本発明は、被験者における代謝率を高める組成物の製造における、細胞内11β-HSD1活性を低減する薬剤の使用、ならびに、このような薬剤を必要な被験者に投与することを含んでなる、代謝率を高める方法を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、肥満症に関連する状態の治療を目的とする、11β-HSD1阻害剤と、食欲抑制剤または抗肥満症薬の組合せを提供する。従って、食欲障害の治療に、同時に、同時かつ個別または連続的に使用する、食欲抑制剤および11β-HSD1阻害剤；ならびに、肥満症の治療に、同時に、同時かつ個別または連続的に使用する、抗肥満症薬および11β-HSD1阻害剤が提供される。食欲抑制剤としては、シブトラミン、フェンフルラミンおよびフルオエキシチンのような薬剤が挙げられ、抗肥満症薬としては、オルリスタット（orlistat）のような薬剤が挙げられる。このような薬剤と、11βHSD-1阻害剤との組合せ治療は、それらの代謝的利益を増強する。
【００３３】
本発明はさらに、心臓血管疾患発症のおそれがある被験者における心臓血管疾患危険性を低減する方法であって、薬学上有効な量の11β-HSD1活性を低下させる薬剤を、PPARαアゴニストと組み合わせて上記被験者に投与することを含んでなる方法を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、PPARαアゴニストと、11β-HSD1活性を低下させる薬剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明に従う医薬組成物は、PPARαアゴニストと、11β-HSD1活性を低下させる薬剤とを含んでなる、組合せ調製物として、あるいは、キットとして提供され、これらは、同時に、同時かつ個別または連続的に使用する。
【００３５】
本発明はさらに、心臓血管疾患発症のおそれがある被験者における心臓血管疾患危険性を低減する方法であって、薬学上有効な量の11β-HSD1活性を低下させる薬剤を、PPARγアゴニストと組み合わせて上記被験者に投与することを含んでなる方法を提供する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、PPARγアゴニストと、11β-HSD1活性を低下させる薬剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明に従う医薬組成物は、PPARγアゴニストと、11β-HSD1活性を低下させる薬剤とを含んでなる、組合せ調製物として、あるいは、キットとして提供され、これらは、同時に、同時かつ個別または連続的に使用する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、グルココルチコイド投与により一般に治療される炎症およびその他の疾患の治療において、同時に、同時かつ個別または連続的に使用する、グルココルチコイドおよび11β-HSD1阻害剤を提供する。11β-HSD1阻害剤を共投与することにより、グルココルチコイドの副作用を軽減する。特に、11βHSD-1阻害剤の共投与は、副作用に関連する心臓血管疾患、例えば、改変された脂質プロフィール、インスリン耐性、肥満症および高血圧などを軽減する。
【００３８】
本発明に従う方法、使用および組成物は、心臓血管疾患の危険性増加に関連する多様な状態の治療に有用である。
【００３９】
発明の詳細な説明
特に記載のない限り、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、該当技術分野（例えば、細胞培養の場合には、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学）の当業者によって一般に理解されている意味と同じである。分子、遺伝学および生化学的方法（概要については、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelら、Short Protocls in Molecular Biology（1999）第４版、John Wiley & Sons, Inc.を参照：これらの文献は、参照として本明細書に組み込まれる）および化学的方法については、標準的技法を用いる。
【００４０】
定義
本明細書で用いる「薬剤」とは、11β-HSD1活性に対する所望の作用を有するあらゆる物質を意味する。従って、薬剤は、小分子または複合有機化合物のような化学的化合物、タンパク質、抗体、または生物においてDNAもしくはmRNAレベルで作用する遺伝子産物でよい。この薬剤は、直接または間接的のいずれで作用するものでもよく、また、それ自体が11β-HSD1活性を調節する物質の活性を調節するものでもよい。
【００４１】
「脂質プロフィール」とは、血液中に存在する脂質のレベルである。脂質プロフィールは、通常、全コレステロール、高密度リポタンパク質（HDL）コレステロール、トリグリセリド、および算出された低密度リポタンパク質（LDL）コレステロールを含む。本発明では、脂質プロフィールは、少なくとも、１以上のトリグリセリドのレベルと、HDLコレステロールのレベルとを含んでなる。
【００４２】
「アテロプロテクティブ」プロフィールとは、アテローム性動脈硬化の病因を予防、または改善するプロフィールである。
【００４３】
遺伝子発現で用いられる「発現」とは、遺伝子が遺伝子産物（例えば、RNAまたはタンパク質）を産生する、転写および翻訳の過程を意味する。従って、発現の阻害は、転写、転写後プロセッシング、翻訳、翻訳後修飾を含む１以上の様々なレベルで起こすことができる。転写または翻訳などの遺伝子発現を調節する薬剤には、例えば、内因性遺伝子をダウンレギュレートまたはノックアウトする薬剤が含まれ、動物の全部または一部分を発生させる多能性細胞において遺伝子をノックアウトする薬剤などがある。
【００４４】
11β-HSD1「合成または活性」の阻害とは、タンパク質の生産、またはいったん生産されたタンパク質の少なくとも１種の生物活性を阻止もしくはダウンレギュレートすることを目的とする、タンパク質レベルでの11β-HSD1の阻害を意味する。
【００４５】
「心臓血管疾患危険性」とは、動物がさらされている、１種以上の心臓血管徴候または病状に罹患する危険性であり、これは、認められた危険因子に従って測定される。心臓血管疾患（CVD）には、冠状動脈心臓疾患（CHD）および発作が含まれる。危険性自体の測定は、主に統計学的であり、本発明に関しては、統計学的分析に従い、CVDの危険性の増加または減少に寄与することが認められている因子の存在または非存在を、それぞれ、危険性の増加または減少を示すものとして解釈する。
【００４６】
薬学上有効な量とは、動物において所望の効果を達成する組成物の量である。実際の量は、当業者には公知のように、因子の数に応じて変動する。本明細書に記載する指示内容および当分野の知識を用いて、薬学上有効な量の決定は、医師の通常の技術で十分に実施可能である。特定の用途に設計される薬学上有効な量は、単位用量としてパッケージングすることにより、投与を容易にすることができる。
【００４７】
11-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型
11β-HSD1は当業界では公知であり（A.K. Agarwal、C. Monder、B. EcksteinおよびP.C. White. Cloning and expression of rat cDNA encoding corticosteroid 11β-dehydrogenase. J. Biol. Chem. 264:18938-18943, 1989）、通常、白色脂肪組織および肝臓において発現する。11β-HSD1の構造およびこれをコードするヒト遺伝子は知られている（GenBank NM 005525.1 GI:5031764）。11-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型をコードするヒトcDNAクローンは、以前単離されたラット11-HSD cDNAクローン（Tanninら、J. Biol. Chem. 266:16653-16658, 1991）とのハイブリダイゼーションにより、精巣cDNAライブラリーから単離した。上記cDNAは、876ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、これから、292アミノ酸のタンパク質が推定された。この配列は、ラット11-HSDとアミノ酸レベルで77％同一であった。ヒト／ハムスターハイブリッド細胞にヒトcDNAをハイブリダイゼーションさせたところ（72）、11β-HSD1遺伝子は第１染色体に局在化していた。この局在化は、cDNAをプローブとして用いて、第１染色体特異的ライブラリーから上記遺伝子を単離することにより、確認された。上記遺伝子は、６個のエクソンから構成され、長さは少なくとも９kbである。
【００４８】
11β-HSD1発現を調節する薬剤
遺伝子発現のモジュレーションは、当業者には、in vivoおよびin vitroでの多数の様式で達成可能であることが知られている。アンチセンスおよび直接遺伝子操作は、遺伝子発現を調節するのに用いられることが知られている。従って、本発明は、アンチセンス核酸の使用を含んでなり、これには、天然もしくは改変ヌクレオチド、または両方、リボザイム（ハンマーヘッドリボザイム含む）、相同的組換え、ならびに、遺伝子発現レベルを低下させるその他の方法などによる遺伝子ノックアウトが含まれる。
【００４９】
核酸薬剤は、当業者には公知の技法に従って生産および発現させることができる。所望の物質をコードする核酸を操作および発現用のベクターに組み込む。本明細書で用いるベクター（またはプラスミド）とは、発現または複製しようとする異種DNAを細胞に導入するのに用いられる個別のエレメントである。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者の技術で十分に行なうことができる。多数のベクターが利用可能であり、適切なベクターの選択は、意図するベクターの用途、すなわち、DNA増幅用またはDNA発現用のいずれかに応じて、また、ベクターに挿入しようとするDNAのサイズ、ベクターで形質転換させようとする宿主細胞に応じて変わってくる。各ベクターは、その機能（DNAの増幅またはDNAの発現）や、それが適合する宿主細胞に応じて、様々な成分を含む。ベクター成分として、一般に、下記のうち１以上が含まれる：複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列。
【００５０】
発現およびクローニングベクターのいずれも、一般に、１以上の選択された宿主細胞において該ベクターを複製可能にする核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクターの場合、この配列は、宿主の染色体DNAと独立に、該ベクターが複製できるようにするものであり、複製起点または自律複製配列を含む。このような配列は、多種多様な細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。
【００５１】
大部分のグラム陰性菌については、プラスミドpBR322からの複製起点が好適であり、酵母の場合には、2mプラスミド複製起点が好適である。また、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターの場合には、様々なウイルス複製起点（例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス）が有用である。一般に、高レベルDNA複製について受容能を有する哺乳動物細胞（COS細胞など）で用いられるのでない限り、哺乳動物発現ベクターに複製起点成分は必要ではない。
【００５２】
ほとんどの発現ベクターはシャトルベクターである、すなわち、少なくとも１クラスの生物における複製が可能であるが、別のクラスの発現用生物にトランスフェクションすることができる。例えば、たとえ宿主細胞染色体と独立に複製することができなくても、ベクター大腸菌にクローニングした後、同じベクターを酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクションする。DNAは宿主ゲノムへの挿入によっても複製可能である。
【００５３】
発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むのが有利である。この遺伝子は、選択培地で増殖させる形質転換宿主細胞の生存または生育に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換していない宿主細胞は、培地中で生存しないであろう。典型的選択遺伝子は、抗生物質やその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリン、補体栄養要求性欠損、あるいは、複合培地からは取得不可能な供給臨界栄養素（supply critical nutrients）に対する耐性を賦与するタンパク質をコードする。
【００５４】
酵母に適した選択遺伝子マーカーについては、マーカー遺伝子の表現型発現によって、形質転換体の選択を容易にするものであれば、どんなマーカー遺伝子を用いてもよい。酵母に好適なマーカーとしては、例えば、抗生物質G418、ヒグロマイシンもしくはブレオマイシンに対する耐性を賦与するもの、または、栄養要求性酵母突然変異体に原栄養性をもたらすもの、例えば、URA3、LEU2、LYS2、TRP1またはHIS3遺伝子が挙げられる。
【００５５】
ベクターの複製は、大腸菌において行なうのが好都合であることから、大腸菌遺伝マーカーおよび大腸菌複製起点を含有すれば有利である。これらは、大腸菌複製起点と、抗生物質（アンピシリンなど）に対する耐性を賦与する遺伝マーカーとの両方を含む大腸菌プラスミド、例えば、pBR322、Bluescript(C)ベクター、またはpUCプラスミド、例えば、pUC18またはpUC19から取得することができる。
【００５６】
哺乳動物細胞に好適な選択マーカーは、該当する核酸で形質転換しておいた細胞の同定を可能にするものであり、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ、またはG418もしくはヒグロマイシンに耐性を賦与する遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、上記マーカーを取り込み、かつ発現させる形質転換体だけが適応して生存可能であるような選択圧下に置く。DHFRまたはグルタミンシンターゼ（GS）マーカーの場合には、選択圧が段階的に上昇し、これにより、選択遺伝子および結合したDNAの両方が増幅する（その染色体組込み部位で）ような条件下で、形質転換体を培養することによって、選択圧をかけることができる。
【００５７】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、所望の核酸に機能的に連結したプロモーターを含む。このようなプロモーターは、誘導性または構成性のいずれでもよい。このプロモーターは、例えば、制限酵素消化により、供給源DNAから該プロモーターを取り出し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することによって、該当する核酸に機能的に連結することができる。用語「機能的に連結した」とは、記載した成分が、意図するように機能できる関係にある近接並置を意味する。コード配列に「機能的に連結した」制御配列は、制御配列と適合する条件下で、コード配列の発現が達成されるように、連結されている。
【００５８】
原核生物宿主での使用に適したプロモーターは、例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系、ならびに、tacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。それらのヌクレオチド配列は、公表されていることから、当業者は、必要に応じて、リンカーまたはアダプターを用いて、該配列をベクターに機能的に連結することにより、必要な制限部位を供給することができる。細菌系で用いるプロモーターは、一般に、シャイン・ダルガーノ配列も含む。
【００５９】
好ましい発現ベクターは、細菌において機能することができるファージクス（phagex）またはT7などのバクテリオファージのプロモーターを含む細菌発現ベクターである。最も広範に用いられる発現系の１つでは、融合タンパク質をコードする核酸は、T7 RNAポリメラーゼ（73）によりベクターから転写することができる。pETベクターと一緒に用いられる大腸菌BL21（DE3）宿主株では、宿主細菌において、λ−リソゲンDE3からT7 RNAポリメラーゼが生産され、その発現は、IPTG誘導性lac UV5プロモーターの制御下にある。この系は、多数のタンパク質の過剰生産に使用され、成功している。これ以外にも、市販されているCE6ファージ（Novagen、マジソン郡、米国）のようなint-ファージでの感染により、ポリメラーゼ遺伝子をλファージ上に導入してもよい。その他のベクターとして、PLEX（Invitrogen、NL）のようなλPLプロモーターを含むベクター、pTrcHisXpressTm（Invitrogen）またはpTrc99（Pharmacia Biotech、SE）のようなtrcプロモーターを含むベクター、pKK223-3（Pharmacia Biotech）もしくはPMAL（new England Biolabs、MA、米国）のようなtacプロモーターを含むベクターが挙げられる。
【００６０】
酵母宿主で用いるのに適したプロモーター配列は、調節されたもの、または構成性のいずれでもよく、好ましくは、高度に発現された酵母遺伝子、特に、サッカロミセス・セレビシエ遺伝子から誘導されたものである。従って、TRP1遺伝子、ADHIまたはADHII遺伝子、酸性ホスファターゼ（PH05）遺伝子のプロモーター、a-もしくはα−因子をコードするフェロモン遺伝子と対合する酵母のプロモーター；または、解糖酵素をコードする遺伝子から誘導したプロモーター、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAP）、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、チロースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼもしくはグルコキナーゼ遺伝子、S. cerevisiae GAL 4遺伝子、S. pombe nmt 1遺伝子のプロモーター；あるいは、TATA結合タンパク質（TBP）遺伝子からのプロモーターを用いることができる。さらに、１酵素遺伝子の上流活性化配列（UAS）と、別の酵母遺伝子の機能的TATAボックスを含む下流プロモーターエレメントとを含んでなるハイブリッドプロモーター、例えば、酵母PH05遺伝子のUASと、酵母GAP遺伝子の機能的TATAボックスを含む下流プロモーターエレメントとを含んでなるハイブリッドプロモーター（PH05-GAPハイブリッドプロモーター）を用いることも可能である。好適な構成的PH05プロモーターは、例えば、上流調節エレメント（UAS）を欠失した短縮酸性ホスファターゼPH05プロモーター（PH05遺伝子のヌクレオチド-173で開始し、ヌクレオチド-9で終了するPH05（-173）プロモーターエレメントなど）が挙げられる。
【００６１】
哺乳動物宿主におけるベクターからの遺伝子転写は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、レトロウイルスおよびシミアンウイルス40（SV40）などのウイルスのゲノム；アクチンプロモーターのような異種哺乳動物プロモーター；または非常に強力なプロモーター、例えば、リボソームタンパク質プロモーターから誘導したプロモーターにより、制御することができる。
【００６２】
高等真核生物による核酸の転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより、増強することができる。エンハンサーは、比較的、配向および位置に非依存的である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサーが知られている（例えば、エラスターゼやグロビン）。しかし、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。例として、複製起点の後期側にあるSVエンハンサー（100〜270 bp）およびCMV早期プロモーターエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の5’または3’位置で、ベクターにスプライシングすることができるが、プロモーターから5’側に位置するのが好ましい。
【００６３】
真核生物発現ベクターは、遺伝子座制御領域（LCR）を含むのが有利である。LCRは、宿主細胞クロマチンに組み込まれるトランスジーンの高度組込み部位独立発現を指令することができ、これは、特に、ベクターの染色体組込みが行なわれた恒久的トランスフェクション真核生物細胞株に関して、遺伝子治療用に設計されたベクターにおいて、あるいは、トランスジェニック動物において遺伝子を発現させる場合に、重要である。
【００６４】
真核生物発現ベクターはまた、転写の終結、ならびに、mRNAの安定化に必要な配列を含むこともある。このような配列は、通常、真核生物またはウイルスDNAもしくはcDNAの5’および3’末端に位置する非翻訳領域から取得することができる。これらの領域は、mRNAの非翻訳部分において、ポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。
【００６５】
発現ベクターは、このようなDNAの発現が可能な調節配列（プロモーター領域など）と機能的に連結した核酸を発現することができるベクターも含んでいる。従って、発現ベクターとは、組換えDNAまたはRNA構築物（プラスミドなど）、ファージ、組換えウイルスまたはその他のベクターを意味し、これらを適切な宿主細胞へ導入すると、クローン化されたDNAの発現が起こる。適切な発現ベクターは、当業者にはよく知られており、真核生物および／または原核生物細胞において複製可能なもの、エピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものなどが挙げられる。
【００６６】
本発明に従うベクターの構築には、通常の連結技法を用いる。単離されたプラスミドまたはDNA断片を所望の形態に切断、調整、および連結することにより、必要なプラスミドを作製する。所望であれば、構築されたプラスミドにおける適正な配列を確認するための分析を公知の方法で実施する。発現ベクターの構築、in vitroでの転写物の作製、宿主細胞へのDNAの導入、ならびに、発現および機能を評価するための分析を実施する好適な方法は、当業者には公知である。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、例えば、通常のサザンブロット、mRNAの転写を定量するノーザンブロット、ドットブロット（DNAまたはRNA分析）、またはin situハイブリダイゼーションにより、適切に標識付けされたプローブ（本明細書に記載した配列に基づくものなど）を用いて、サンプル中で直接測定することができる。当業者であれば、必要に応じて、これらの方法をどのように改変できるかを容易に考慮できよう。
【００６７】
前述したベクターは、遺伝子治療法に用いたり、疾患の治療に適用したりすることができる。例えば、本発明に従うアンチセンス分子をコードする核酸配列をウイルスまたは非ウイルスベクターに挿入してもよく、その際、該ベクターは、ex vivoまたはin vivoのいずれかで、患者の細胞に核酸を送達するよう設計する。
【００６８】
ウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターの例としては、ネイキッド（naked）DNA、縮合DNA粒子、リポソーム型ベクター（ターゲッティング部分を含むこともある）、ならびに、適用可能であれば、ウイルス由来のエスケープペプチド、およびターゲッティング部分（抗体または細胞表面リガンド）と複合体化したDNA（好ましくは、標的細胞により内在化される）が挙げられる。
【００６９】
11β-HSD1活性を調節することができる薬剤は、当業者には公知である。Monder C, White PC. 11β-ハイドロステロイドデヒドロゲナーゼ。Vitamin and Hormones、1993；47：187〜271は、1993年にこのような阻害剤の広範なリストを記載した。このリスト（該文献中、表IVとして示される）は、参照として本明細書に組み込まれる。特に、11β-HSD1のレダクターゼ活性を有する阻害剤が好ましく、例えば、11-オキソプロゲステロン、３α,17,21-トリヒドロキシ-5β-プレグナン-3-オン、21-ヒドロキシ-プレグン-4-エン-3,11,20-トリオン、アンドロスト-4-エン-3,11,20-トリオンおよび3β-ヒドロキシアンドロスト-5-エン-17-オンが挙げられる。
【００７０】
上記以外の阻害剤、その投与様式は、例えば、Walkerら、”Carbenoxolone Increases Hepatic Insulin Sensitivity in Man: A Novel Role for 11-oxosteroid Reductase in Enhancing Glucocorticoid Receptor Activation”, J. Clin. Endocrinology and Metabolism 80(11)：3155-59（1995）；Gomez-Sanchezら、”Central Hypertensionogenic effects of glycyrrhizic acid and carbenoxolone”, Am J Physiol 263(6 pt 1): E1125-E1130（1992）から知ることができ、これらの文献で、カンゾウ、グリシルリジン酸、およびカルベノキソロンは公知の阻害剤であり、また、グリシルリジン酸およびカルベノキソロンをラットの脳の側脳室に、皮下注入で有効な量より少ない用量で注入すると、高血圧を発生することが証明されており、このことから、このような化合物が皮下、経口、および注入により投与されることがわかる。また、Whorwoodら、”Liquorice inhibits 11 beta-hygroxysteroid dehydrogenase messenger ribonucleic acid levels and potentiates glucocorticoid hormone action”、Endocrinology 132(6): 2287-92（1993）も参照されたい。さらに、詳細には、Hommaら、”A Novel 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Inhibitor Contained in Saiboku-To, a Herbal Remedy for Steroid-dependent Bronchial Asthma”, J. Pharm Pharmacl 46: 305-309（1994）、Zhangら、”Inhibition of 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Obtained from Guinea Pig Kidney by Furosemide, Naringenin and Some Other Compounds”, J Steroid Biochem Molec Biol 49(1): 81-85（1994）、ならびに、Leeら、”Grapefruit juice and its flavenoids inhibits 11β-hydroxysteroid dehydrogenase”, Clin Pharmacol Ther 59:62-71（1996）は、公知の方法（用量および投与経路に関して）で投与することができる、さらに多数の阻害剤を記載しており、例えば、「健康食品およびドラッグストアで錠剤として販売されている」フラベノイドや、薬草または薬草の成分などがある。さらに、Morrisら、”Endogenous 11β-ｈdroxysteroid dehydrogenase inhibitors and their role in glucocorticoid Na+ retention and hypertension”, Endocr Res 22(4):793-801（1996）は、11β-HSD1阻害剤としてプロゲステロン代謝物を記載しているが、プロゲステロンも、用量および投与経路の両方に関して、当業者により問題なく投与することができる物質である。
【００７１】
本発明に従う薬剤は、抗体である。本明細書で用いる抗体とは、選択した標的に結合する能力を有する完全抗体または抗体フラグメントであり、例として、Fv、ScFv、Fab’およびF(ab’)2、モノクローナルおよびポリクローナル抗体や、キメラ、CDR移植およびヒト化抗体のような作製抗体、ならびに、ファージ展示またはその他の技法を用いて生産され、人工的に選択された抗体が挙げられる。FvやScFvのような小さなフラグメントは、そのサイズが小さいことと、その結果、組織分布が優れているために、診断および治療用途に有利な特性を有する。
【００７２】
本発明に従う抗体は、診断および治療用途について記載する。従って、これらは、毒素または標識のようなエフェクタータンパク質を含む、改変された抗体であってもよい。特に、in vivoでの抗体の分布の画像化を可能にする標識が好ましい。このような標識は、患者の身体内で容易に視覚化が可能な放射性同位元素標識または放射線不透過性標識（金属粒子など）でよい。さらに、上記標識は、患者から採取した組織サンプル上で視覚化が可能な蛍光標識またはその他の標識でもよい。
【００７３】
組換えDNA技法を用いて、本発明の抗体を改善することができる。従って、診断または治療用途で、免疫原性を低減するように、キメラ抗体を構築することもできる。さらに、CDR移植［欧州特許第0 239 400号（Winter）参照］および、場合によっては、フレームワーク改変［欧州特許第0 239 400号；国際特許出願WO 90/07861でレビューされている（Protein Design Labs）］により抗体をヒト化することにより、免疫原性を最低限化してもよい。
【００７４】
本発明に従う抗体は、動物血清から取得するか、あるいは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントの場合には、細胞培養物中で生産することもできる。組換えDNA技法を用いて、確立された手順に従い、細菌、または好ましくは、哺乳動物細胞培養物中で、上記抗体を生産することができる。選択した細菌培養系は、抗体産物を分泌するのが好ましい。
【００７５】
従って、本発明は、本発明の抗体の生産方法であって、タンパク質をコードする第２DNA配列と、適正なリーディングフレーム内で連結したシグナルペプチドをコードする第１DNA配列に機能的に連結されるプロモーターを含有する発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換されている宿主、例えば、大腸菌または哺乳動物細胞を培養した後、このタンパク質を単離することを含んでなる、上記方法に関する。
【００７６】
ハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞のin vitroでの増殖は、好適な培地中で実施する。このような培地は、通常の標準的培地、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）またはRPMI 1640培地であり、場合に応じて、哺乳動物血清（例：ウシ胎仔血清）、または微量元素、および増殖保持補足物質（例：正常マウス腹膜滲出細胞のようなフィーダー細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ、2-アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など）で補充する。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖も同様に、当業者には公知の好適な培地において実施するが、細菌の場合には、LB、NZCYM、NZYM、NZM、テリフィックブロス（Terrific broth）、SOB、SOC、2 x YT、もしくはM9最少培地の各培地において、また、酵母の場合には、YPD、YEPD、最少培地、もしくは完全最少ドロップアウト培地（Complete Minimal Dropuout Medium）の各培地で実施する。
【００７７】
in vitro生産は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、スケール拡大を可能にするため、所望の抗体を大量に提供する。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞培養の技法は、当業者には公知であり、例えば、エアリフト反応器もしくは連続攪拌機付き反応器における均質懸濁培養、または、例えば、中空繊維、マイクロカプセルにおいて、あるいは、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上での、固定化もしくは捕獲細胞培養が挙げられる。
【００７８】
哺乳動物細胞をin vivoで増殖することにより、大量の所望する抗体を取得することができる。このために、所望の抗体を生産するハイブリドーマを組織適合性哺乳動物に注射することにより、抗体生産腫瘍を増殖させる。場合によっては、注射の前に、炭化水素、特に、プリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）のような鉱油で、動物を初期感作する。１〜３週間後、上記哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、好適な骨髄腫細胞と、Balb/cマウス由来の抗体生産脾細胞との融合により得られたハイブリドーマ細胞、あるいは、所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞株Sp2/0由来のトランスフェクションした細胞を、必要に応じてプリスタンで前処理したBalb/cマウスに腹腔内注射し、それから１〜２週間後、該動物から腹水を採取した。
【００７９】
前記およびその他の技法については、例えば、KohlerおよびMilstein（1975）Nature 256:495-497；US 4,376,110；HarlowおよびLane、Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor（参照として本明細書に組み込む）に記載されている。組換え抗体分子の調製技法については、前記の参照文献、また、例えば、欧州特許第0623679号；欧州特許第0368684号および欧州特許第0436597号にも記載されており、これらは、参照として本明細書に組み込む。
【００８０】
次に、細胞培養上清を所望の抗体についてスクリーニングするが、これは、免疫ブロットによる所望の抗原を発現する細胞の免疫蛍光染色により、酵素免疫アッセイ、例えば、サンドイッチアッセイもしくはドットアッセイ、または放射免疫アッセイにより、実施するのが好ましい。
【００８１】
抗体の単離のためには、例えば、硫酸アンモニウムを用いた沈降、ポリエチレングリコールのような吸湿性材料に対する透析、選択膜を介した濾過などによって、培養上清または腹水中の免疫グロブリンを濃縮することができる。必要および／または所望であれば、抗体は、通常のクロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE-セルロースおよび／または（免疫）アフィニティークロマトグラフィー（例：11β-HSD1分子またはプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー）により精製する。
【００８２】
本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞に関する。本発明の好ましいハイブリドーマ細胞は、遺伝的に安定していて、所望の特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を分泌するものであり、急速冷凍した培養物から、解凍および再クローニングにより、活性化させることができる。
【００８３】
本発明はまた、11β-HSD1分子を指向するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製方法であって、精製11β-HSD1分子、精製11β-HSD1分子を含む抗原担体、または11β-HSD1を担持する細胞で、好適な哺乳動物、例えば、Balb/cマウスを免疫感作し、免疫感作した哺乳動物の抗体生産細胞を好適なミエローマ細胞と融合させ、融合して得られたハイブリッド細胞をクローニングした後、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する、上記方法に関する。例えば、11β-HSD1を担持する細胞で免疫感作したBalb/cマウスを、ミエローマ株PAIまたはミエローマ株Sp2/0-Ag14の細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングしてから、陽性ハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【００８４】
好ましいハイブリドーマ細胞株の調製方法では、適当なアジュバントを含む11β-HSD1を発現するヒト腫瘍由来の10〜107および108個の細胞を皮下および／または腹腔内に、数回、例えば、４〜６回、数ヶ月、例えば、２〜４ヶ月にわたり、注射することにより、Balb/cマウスを免疫感作し、最後の注射から２〜4日後、免疫感作したマウスから脾細胞を採取し、融合プロモーター、好ましくは、ポリエチレングリコールの存在下で、採取した上記脾細胞を骨髄細胞株PAIの細胞と融合させる。好ましくは、分子量が4,000前後の約30〜50％ポリエチレングリコールを含む溶液において、上記骨髄細胞を３〜20倍過剰量の感作マウス脾細胞と融合させる。融合の後、前述のように、好適な培地中で、選択培地、例えば、HAT培地を定期的に補充しながら、上記細胞を増殖させる。
【００８５】
本発明はまた、細胞内で11β-HSD1レベルを調節するために、細胞内で機能することができる細胞内抗体を提供する。細胞内抗体は、当業者には公知のように、発現ベクターから細胞内で発現されるscFv抗体であるのが有利である。
【００８６】
細胞内抗体、又は、イントラボディ（intrabodies）は、高等生物の細胞内の抗原認識において機能することが証明されている（Cattaneo, A. & Biocca, S.（1997）Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag参照）。この相互作用は、細胞質、核または分泌経路において十分に阻害された細胞タンパク質の機能に影響を及ぼすと考えられる。この効能は、植物バイオテクノロジーで、ウイルス耐性について証明されており（Tavladoraki, P.,ら、（1993）Nature 366: 469-472）、いくつかの応用では、細胞内抗体と、HIVウイルスタンパク質との結合（Mhashikar, A.M.ら（1995）EMBO J 14: 1542-51；Duan, L. & Pomerantz, R. J.（1994）Nucleic Acids Res 22: 5433-8；Maciejewski, J.P.ら（1995）Nat Med 1: 667-73；Levy-Mintz, P.ら（1996）J.Virol. 70: 8821-8832）および癌遺伝子産物との結合（Biocca, S.、Pierandrei-Amaldi、P. & Cattaneo, A.（1993）Biochem Biophys Res Commun 197：422-7；Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N. & Cattaneo, A.（1994）Biotechnology（NY）12: 392-9；Cochet, Oら（1998）Cancer Res 58: 1170-6）が報告されている。
【００８７】
アテロプロテクティブ脂質プロフィール
グルココルチコイドは、代謝症候群にみいだされるいくつかの代謝障害の発症に関与している。グルココルチコイドの前受容体代謝の重要性は、遠位ネフロン（７、８）における11β-HSD2鉱質コルチコイド受容体系について明らかである。肝臓のような高発現部位における活性コルチコイドを再生する上での、11β-HSD1の生物学的役割が提示されているが、これはまだ明らかにされていない。本発明は、11β-HSD1レベルの低下が、少なくとも部分的に、肝臓における鍵酵素および転写因子の発現の変化により、「心臓保護的」血漿脂質およびリポタンパク質表現型を向上させることを証明する。
【００８８】
11β-HSD1-/-マウスでは、食事状態に応じて異なる表現型応答を明らかにすることができる。無制限給餌を受けた11β-HSD1-/-マウスは、肝酸化駆動の明らかな増加と、心臓血管危険性上昇に関連する数種マーカーのレベル減少の結果、「好ましい」脂質プロフィールを呈示する。絶食させた11β-HSD1-/-マウスは、減弱したグルココルチコイド誘導応答を示し、これは、それらの炭水化物代謝に観察されるもの（16）と一致する。絶食後の再給餌により、11β-HSD1-/-マウスで、肝インスリン感受性を増加したことがわかる。有利な代謝プロフィールは、11β-HSD1-/-マウスにおける血糖制御の向上の証明によっても支持される。
【００８９】
無制限給餌の状態では、11β-HSD1-/-マウスは、「心臓保護的」脂質およびリポタンパク質表現型のいくつかの特徴を呈示する。血漿トリグリセリドレベルが低下すると共に、潜在的に有益なHDLコレステロールが上昇する。さらに、11β-HSD1-/-動物では、血清apoCIIIが減少した。apoCIIIは、肝脂肪分解を阻害し（38）、かつ肝臓へのトリグリセリドの輸送を妨害する（34、39）ことにより、血漿トリグリセリドを増加させる。従って、apoCIIIの減少そのものが、トリグリセリドの減少に寄与する。実際、apoCIIIは、心臓血管疾患危険性（40）と正の相関関係を有する。同様に、ヌルマウスは、ApoAI転写物レベル上昇を示し、これは、血漿HDLの上昇と一致する。ApoAIは、HDLの主成分であり、心臓血管危険性と負の関係を有する（35）。
【００９０】
トリグリセリドまたはコレステロール合成の減少が、この表現型に寄与するとは考えにくい。なぜなら、脂肪生合成およびコレステロール生合成の律速鍵酵素の発現は影響を受けないからであり、これは、脂肪生合成転写因子SREBP1c mRNAが野生型レベルでも維持されるという知見と一致している。対照的に、肝脂肪酸酸化の鍵酵素は、11β-HSD1ヌルマウスで増加し、これは、認められる血漿の変化を駆動する機構としての、トリグリセリドの肝異化作用の増加と両立する。
【００９１】
対照的に、11βHSD-1を過剰発現するマウスは、代謝症候群に関連する症状を示す。脂肪特異的脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質（aP2）プロモーター（49）の制御下で、11βHSD-1を発現するマウスを作製した。トランスジーン由来の転写物は、皮下腹水、精巣上体、腸間膜、および肩甲間褐色脂肪組織（BAT）貯留物からの脂肪組織には同等に発現したが、トランスジェニック（Tg）マウスの脳、肝臓、骨格筋、および腎臓には認められなかった。11βHSD-1の過剰発現レベルは、代謝症候群に罹患したヒト患者に観察されるものと類似していた。これらのマウスは、コルチコステロンの脂肪レベルが上昇し、内蔵肥満を発症し、これは、高脂肪給餌によってさらに悪化した。該マウスは、顕著なインスリン−耐性糖尿病、高脂血症、そして、驚くことに、高レプチン血症にも拘わらず、過食症も呈示した。
【００９２】
同様に、肝臓における11βHSD-1の過剰発現を調べるために、肝特異的Apo-Eプロモーターの制御下で11βHSD-1を過剰発現するマウスを作製した。これらのマウスは、野生型と比較して、肝臓で、５倍以上の11β-HSD1活性を呈示する。分析から、雄マウスは、正常のグルコース耐性を有し、これは、11β-HSD1が、通常の条件下でグルコースホメオスタシスについて限定的ではないことが示唆された。しかし、トランスジェニック動物は、血漿インスリンレベル上昇（〜50％）、血漿トリグリセリドの増加（〜２倍）および血漿全コレステロールの増加（20％）を呈示し、これらは主として、非HDL画分（HDL-コレステロール／全コレステロール＝0.62トランスジェニック対0.83野生型）に起因すると考えられる。組織学的分析から、トランスジェニックマウスの肝細胞における脂質の蓄積が明らかにされ、これは、脂質代謝が、肝臓におけるGC再生増加に対して差別的に感受性を有することを示唆している。加えて、雄トランスジェニックマウスの体重は、野生型同腹子よりやや増加しており（６〜８％）、これは生後10週間前後のものから明らかである。データから、肝11βHSD-1の選択性増加が、インスリン感受性をやや低下させ、血漿脂質を不都合に増加させ、肝脂質蓄積を引き起こすことから、代謝症候群の全部ではないがいくつかの症候を発現する。肝臓と脂肪GCレベル間の相互作用は、局部11βHSD-1により決定され、代謝症候群の発現を決定する上で、極めて重要であると考えられる。
【００９３】
PPARα
11βHSD-1-/-マウスに観察されたトリグリセリド異化作用の増加は、PPARαレベルの上昇に起因している可能性があり、これは、脂肪酸酸化CPT-I（31）、ACO（32）およびUCP-2（30、33）が、肝臓におけるPPARαの標的であるという報告と一致している。
【００９４】
実際に、11βHSD-1-/-マウスに観察された多数の変化は、PPARαレベルの上昇が、アテロプロテクティブ表現型に機能的役割を果たすことを示唆している。従って、フィブラートリガンドによるPPARα活性化は、血漿トリグリセリドを低下させ、apoCIII（23）およびAα-フィブリノーゲン発現（41）を抑制する。11βHSD-1-/-マウスに観察されたフィブリノーゲン転写物レベルの25％低下は、フィブラート投与の作用と類似していると共に、この転写物がPPARα抑制性である（41）であることと一致する。Aα-転写物レベルの変化は、ほぼ血漿レベルの変化をたどっており（41）、ここで観察された転写物レベルの低下は、11βHSD-1-/-マウスのアテロプロテクティブプロフィール全体に寄与する可能性があると推論される。高いフィブリノーゲンレベルは、心臓血管危険性の増加と独立に相関する（37）。従って、給餌11βHSD-1-/-動物は、フィブラート処理動物の表現型を部分的に模倣する。
【００９５】
11βHSD-1ヌルマウスは、基礎およびストレス（例えば、絶食）後の血漿コルチコステロンレベルの上昇にも拘わらず、明らかに低い細胞内グルココルチコイドレベルおよび作用を示す（16）。これは、細胞内グルココルチコイド作用を決定する上で、11-デヒドロコルチコステロンからのコルチコステロンの再生の重要性を強調するものである。絶食の場合にPPARαの誘導が欠如していることは、上記の指摘と両立するが、それでは、給餌の場合のPPARαレベル上昇を説明することができない。PPARαは、グルココルチコイドにより誘導され（18）、コルチコステロンリズムと平行する日周期に従う（19）。これは、グルココルチコイドによるPPARα発現の制御が、絶食に対するストレス応答のような極限状態だけではなく、グルココルチコイドおよびインスリンレベルがもっと穏やかな変化を示す通常の日周期でも起こることを意味する。11βHSD-1-/-マウスにおける昼間最下点（8 am）でのPPARα発現の上昇を説明する可能性の１つとして、この時点で該マウスの血漿コルチコステロンレベルが微妙に上昇していることが考えられ（この実験：野生型25.2±7.2 nモル／l対11βHSD-1-/- 47.5±7.8 nモル／L、ｐ＜0.05）、本発明者らの以前の報告（16、24）と十分に一致する。これは、11βHSD-1によって正常に増幅されたHPA軸上での負のフィードバックがいくらか損なわれた結果起こる（16、24）。興味深いことには、11βHSD-1-/-マウスは、ストレス媒介による血漿コルチコステロン増加の悪化にも拘わらず、脳における細胞内グルココルチコイド応答の低下を呈示する（42）。これは、肝遺伝子発現が、恐らく、脳において11βHSD-1が媒介した遺伝子発現の正確な調節に対しては感受性が低く、しかも、優勢の血漿コルチコステロンレベルには感受性が高いことを意味すると思われる。しかし、グルココルチコイド感受性肝結合タンパク質CBGおよび肝GR結合のレベルは、午前中の無制限給餌11βHSD-1-/-マウスおよび野生型マウスと類似している（24）。血漿コルチコステロンレベルの上昇にも拘わらず、11βHSD-1-/-肝臓におけるGR（43）およびCBG（44）のダウンレギュレーションが欠如しているのは、肝臓内の有効なグルココルチコイド作用が、実際に減弱したことを示しており、これは、単なる血漿コルチコステロン濃度以外の因子が、肝PPARα発現増加の原因であることを示唆する。PPARαは、その他のステロイド（45）、脂質（46）、レチノイド（47）およびホルモン（48）（本発明の実験で示すようにインスリンを含む）など、無数の因子により調節される。肝臓における慢性微小グルココルチコイド欠失のこのモデルにおける基礎PPARα上昇の正確な決定因子はまだ決定されていない。
【００９６】
また、PPARαおよびGRは、標的プロモーターに対して、重複する作用、時には反対の作用を及ぼすことも明らかである。例えば、フィブリノーゲンレベルは、グルココルチコイド（36、49）により正の調節を、また、PPARα（41）により負の調節を受ける。同様に、アポリポタンパク質AIはグルココルチコイド（50）により誘導されるが、マウスではapoAI（23）およびapoAIIレベルは、PPARαにより抑制される。本発明者らは、給餌11βHSD-1-/-マウスでApoAI転写物レベルの上昇を観察したが、これは、apoAIプロモーターは、PPARα媒介による抑制よりも、グルココルチコイド媒介による誘導に対する感受性の方が高いことを意味すると考えられる。いくつかのプロモーターでは、GR作用は、他のPPARαに対して優勢であるようだ。あるいは、インスリンは、apoAIプロモーター（85）を正調節することが知られているため、11βHSD-1-/-肝マウスにおけるインスリン感受性の増加も、観察された遺伝子発現における矛盾を説明し得る。apoAI発現パターンの根本的機構を決定するには、さらなる研究が必要である。しかし、HDL逆コレステロール輸送系のこの成分が、心臓血管危険性と負の相関関係を有するため、上昇したレベルがアテロプロテクティブプロフィール全体に寄与すると予想することができる。
【００９７】
PPARγ
PPARγは、特に、血管壁のじゅく状斑において、マクロファージ取込みおよび酸化またはアセチル化LDLコレステロールの輸出を媒介する上で重要である。主な作用は、ABCA1および関連トランスポーター（75、76）を介したコレステロール輸出に及ぼされるようだ。従って、11β-HSD1を阻害すると、PPARγの発現を増加し、泡沫細胞形成およびそれらのアテローム発生への寄与を低減することにより、上記斑におけるマクロファージからのコレステロール輸出が促進される。
【００９８】
11β-HSD1ノックアウトマウスは、マクロファージPPARγ発現のレベル増加を呈示するが、これは、チアゾリジンジオンやN-(2-ベンゾイルフェニル)チロシン類似体のようなPPARγアゴニストの使用が、マクロファージにおけるコレステロール貯蔵および泡沫細胞の形成を低減するのに有用であることを証明している。
【００９９】
II型糖尿病におけるインスリン耐性を治療するのに、ロシグロリタゾンおよびピオグリタゾンのような入手可能なPPARアゴニスト薬が記載されている。PPARγ発現のレベル増加は、11β-HSD1ノックアウトマウスの脂肪組織にも認められ、これは、11β-HSD1阻害剤とPPARγアゴニストの組合せが、インスリン感受性や、代謝プロフィールのその他の作用、例えば、血漿脂質プロフィール、グルコース耐性および心臓血管危険性の治療に有効であることを示している。さらに、チアゾシンジオンのようなPPARγアゴニストによる治療の副作用は、体重増を含むことから、PPARγアゴニスト治療に伴なう脂肪組織の増加を抑制するために、11β-HSD1阻害剤との組合せ治療が示されている。
【０１００】
グルコース代謝
グルココルチコイドの生理学的役割として、長期間にわたる栄養不足に動物を適応させることがある。この応答の際に、上昇したグルココルチコイドレベルは、肝グルコース生産および脂肪酸酸化を増加させると同時に、脂肪組織の脂肪分解を向上させることにより、肝臓が要求する脂肪酸およびグリセロールを提供する。絶食した状態では、11βHSD-1-/-マウスは、グルココルチコイド感受性遺伝子発現の減弱を呈示する。PPARαおよびapoAIは、誘導の低下を示すと共に、GPATは、空腹時抑制の減弱を呈示する。これらの結果は、11βHSD-1-/-マウスにおけるグルココルチコイド誘導性グルコース代謝の減弱に関する以前の知見（16）と一致する。これは、ヌルマウスが、絶食またはストレス下で、細胞内グルココルチコイドの相対的欠如を有することを意味する。この誘導の減弱にも拘わらず、上記マウスは、24時間にわたる絶食中、肝脂肪酸酸化系を維持することができるようである。従って、11βHSD-1-/-マウスにおけるPPARαの空腹時誘導がなくても、ミトコンドリア酸化における主な律速酵素（CPT-I）は、正常に誘導されているようであり、空腹時血漿グルコースレベルは、野生型動物と比較して有意に低くはない。これは、長期間にわたる絶食（20、21）時に重度の低血糖症を呈示する絶食PPARαヌルマウスにおける知見とは対照的である。絶食時、11βHSD-1-/-肝臓には比較的顕著な脂質蓄積があり、これは、絶食PPARαヌルマウス（20、21）に観察された脂肪肝を思い起こさせる。しかし、脂質蓄積は、再給餌時の11βHSD-1-/-マウスでは解決されるようだ。脂質蓄積は、絶食PPARαノックアウトマウスと同様に、PPARα駆動による脂肪酸酸化の増加鈍化によるものかどうかは、まだ決定されていない。実際に、PPARαは、無制限状態（31）におけるCPT-Iレベルを調節し得るが、PPARαノックアウトマウス（83）では、絶食媒介によるCPT-Iの誘導は影響を受けず、これは、この過程が、転写因子とは独立であることを意味する。グルココルチコイド媒介による脂質エステル化酵素GPATの空腹時抑制の減弱という本発明者らの観察から、別の説明を引き出すことができる。脂質合成経路におけるこのような律速酵素のレベル上昇は、観察された脂質蓄積に寄与し得る。実際に、GPATレベルの上昇は、部分的に、野生型と比較して、ヌルマウスにおける絶食時の血漿トリグリセリド減少が何倍も低いことの原因でもあると考えられる。GPATは、インスリン誘導性であるため、この知見は、11βHSD-1-/-肝臓が、絶食時に認められる極めて低いインスリンレベルに対しても、野生型と比較して感受性が高いことを証明する多数の証拠と一致している。PPARα感受性ACOおよびUCP-2転写物は、絶食による誘導の減弱を示しており、絶食時のPPARα調節に対して、CPT-Iのそれと比較し、これらのプロモーターの比較的高い感受性を表していると思われる。絶食時のPPARαレベルの鈍い増加にも拘らず、PPARαによる下流標的遺伝子の部分的誘導は、24時間の絶食時間内でのPPARαのすでに上昇した11βHSD-1-/-レベルの活性化が、11βHSD-1-/-マウスにおける適応代謝応答を向上させるのに十分であることを意味する。これは、内因性脂肪酸が、PPARαを活性化し（84）、絶食時に肝臓への脂肪酸供給が増加していることから、可能性がある。あるいは、その他の過程が、絶食時の酸化的酵素の発現を高めている可能性もある（83）。
【０１０１】
絶食後に再給餌すると、脂質生合成経路および酸化過程の抑制における酵素の肝遺伝子発現に、インスリン媒介によるはっきりとしたオーバーシュートが特徴的に認められる。本発明者らは、これを肝インスリン感受性の測度として用いた。11βHSD-1-/-マウスは、再給餌すると、酸化的および脂質生合成酵素のそれぞれについて転写物レベルの抑制（CPT-I、UCP-2）または誘導（SREBP-1c、FAS、GPAT、HMGCoA-R）の増大がみられることから、明らかに肝インスリン感受性が増加している。
【０１０２】
絶食後に再給餌すると、脂質生合成経路（SREBP-1c、FASおよびGPAT）の顕著な誘導と、酸化的脂質代謝（CPT-I、UCP-2）の抑制増大が同時に起こることも、4時間毎の無制限給餌値へのトリグリセリドの急速な戻り、ならびに、11βHSD-1-/-マウスにおける24時間再給餌時間で認められた血漿トリグリセリドのオーバーシュートの原因である可能性がある。インスリン感受性増加の主張は、11βHSD-1-/-マウスが、血糖制御を改善したことを示す腹腔内グルコース負荷試験によって支持される。しかし、筋肉は、食後の主要なグルコース処理部位であり、11βHSD-1-/-マウスの肝臓におけるインスリン感受性の改善が、グルコース耐性の改善を完全に説明できるか否かは不明である。この問題に取り組むには、11βHSD-1-/-マウス筋肉における直接実験が必要である。明らかに、インスリン耐性は、代謝症候群の発病を引き起こす主な根本的機構の一つであるため、肝インスリン感受性の増加およびグルコース耐性の改善の証明は有益であると判断することができる。
【０１０３】
11βHSD-1酵素をコードする遺伝子に標的破壊を有するマウスは、重要な細胞内グルココルチコイド再増幅機構が欠如したモデル動物となる。11βHSD-1-/-マウスは、ストレスおよび肥満時の高血糖症に抵抗し（16）、肝タンパク質の発現および活性が改変されているために、好ましい代謝および脂肪血症プロフィールを有する。しかし、11βHSD-1はまた、脂質や栄養素ホメオスタシスを調節する重要な部位である、脂肪や脳のようなその他の組織にも発現される。従って、11βHSD-1はまた、中心エネルギー均衡、ならびに、末梢脂肪貯蔵、インスリン作用およびグルコース耐性に対するグルココルチコイド作用も調節すると考えられる。これらの作用は、本明細書に記載した脂質代謝に対する11βHSD-1ノックアウトの肝作用と併せて、脂質プロフィールに関係があるものとして、排除することはできない。しかし、11βHSD-1ヌルマウスにおける給餌および再給餌代謝プロフィールの改善は、この酵素の阻害剤が、複数の心臓血管危険因子に対し好ましい効果を有することを示唆している。これは、特に、肝臓における酵素の発現が、in vivoでの食餌操作による影響を受けないことから、当を得ており、このことは、推定上の薬剤標的が維持されることを示唆している。さらに、11βHSD-1阻害剤とPPARαアゴニストとの組合せは、異常脂肪血症、グルコース非耐性および高フィブリノーゲン血症を治療する上で、極めて有力な治療戦略となる。
【０１０４】
カルベノキソロンは、肥満ラットにおける脂質プロフィールを改善する
カルベノキソロンによる11βHSD-1阻害効果を肥満Zukerラットで調べた。この系統は、11βHSD-1の組織特異的調節障害（脂肪での増加、肝臓での減少）により、ヒト肥満症の変化を表す（４；３；54）。これらの動物における肥満症は、脂肪組織における11βHSD-1の増加と、肝臓におけるダウンレギュレーションに関連する。痩せたラットと同様に、カルベノキソロンは、肝臓における11βHSD-1活性および腎臓における11βHSD-2活性を阻害するのに有効であった。これは、酵素発現および活性の基礎ダウンレギュレーション以外に、肝11βHSD-1活性のさらなる低減が、肥満動物において薬学的に達成可能であることを示している。カルベノキソロンは、痩せたラットと同様に、空腹時血漿グルコースまたはグルコース耐性に何の影響も与えなかった。しかし、肥満ラットでは、カルベノキソロンは、11β-HSD1ノックアウトマウス（55）で観察された、改変脂質プロフィール（トリグリセリドが減少し、HDLコレステロールが増加した）の同じパターンを誘導した。上記マウスモデルでは、これは、肝脂質酸化の増強に起因するものであり、恐らく、肝臓におけるPPARαのアップレギュレーションにより起こると思われる（55）。
【０１０５】
従って、肝臓におけるカルベノキソロンによる11β-HSD1の阻害は、基礎11β-HSD1「標的」活性の低下にも拘わらず、Zucker肥満ラットにおける脂質代謝に有益な効果をもたらす。
【０１０６】
肝臓内脂肪含量の低下
ZIP1-低脂肪マウスにおける実験から、肝臓および骨格筋における異所性脂肪蓄積が、重度のインスリン耐性や、インスリンの刺激を受けたIRS-1およびIRS-2関連PI3-キナーゼ活性（50）の欠損のようなシグナル化不全と関連することが証明された。脂肪移植を有するマウスにおける脂肪異栄養の治療により、インスリン耐性が完全に解消される（51）。ヒトでは、肝臓における異所性脂肪蓄積は、体重およびアルコール消費（52；53）とは独立に、肝インスリン耐性にも関連している。
【０１０７】
11βHSD-1は、特に、肝臓において、不活性コルチゾンの活性コルチゾールへの細胞内変換を触媒することにより、局部的グルココルチコイド作用を増幅する。11β-HSD1欠損マウスは、顕著に低い血清トリグリセリド濃度、ストレスまたは脂肪給餌に対する糖新生応答の低下、ならびに、肝インスリン感受性の増加を呈する。これらのデータは、局部的グルココルチコイド生産が、げっ歯類肝臓におけるインスリン作用を調節することを証明している。ヒトにおいて、カルベノキソロンによる11β-HSD1の阻害は、前腕グルコース取込みを改変することなく、正常血糖を維持するのに必要なグルコースの量を増加するが、これは、肝インスリン感受性の増強を意味している。
【０１０８】
比較的正常な体重を有する人について、プロトン分光学を用いて測定する肝脂肪含量が、体重とは独立のインスリン耐性の特徴と関連するか否かを決定するための実験を行なった。肝脂肪含量は、インスリンに対する内因性グルコース生産の感受性の独立決定因子であることがわかっている。高肝脂肪含量は、体重および内蔵脂肪組織とは独立に、高インスリン血症のようなインスリン耐性、高トリグリセリド血症およびやや高い院外（ambulatory）収縮期血圧のような複数の症候（facet）と関連していた。血清FFAの抑制障害が、低肝脂肪に対し、高肝脂肪のヒトに観察され、これも肥満症全体のあらゆる測定値とは独立であった。肥満症に起こるHPA軸の特徴的変化のいずれも、高肝脂肪の人には観察されなかった。しかし、これらの人は、内因性コルチゾール分泌の抑制中に、より多くの経口酢酸コルチゾンを血清コルチゾールに変換しており、これは、肝11β-HSD-1活性の増加を示唆している。
【０１０９】
脂肪肝は、有害な脂質プロフィールおよびインスリン耐性と共に、ApoE-11β-HSD1肝特異的ノックインマウスにおいても観察され、これは、肝臓において高レベルの11β-HSD1を発現する。従って、肝臓における11β-HSD1の阻害は、肝臓内脂肪含量を低下させ、これにより、トリグリセリドを減少し、かつHDLコレステロールレベルを上昇して、脂質プロフィールを改善し、インスリン感受性を増強し、増加したトランスアミナーゼを減少すると共に、非アルコール性脂肪肝炎または肝硬変への進行の可能性を低減する。抗糖尿病薬メトフォルミンは、肝臓におけるグルココルチコイド受容体レベルを低下させるが、これは、メトフォルミンと11β-HSD1阻害剤の共投与が相乗効果的であることを示している。
【０１１０】
投与
本発明に従う薬剤は、医薬組成物の形態で、通常の投薬方法により送達することができる。本発明に従う医薬組成物は、活性成分として、少なくとも１種の11β-HSD1阻害剤を含む物質の組成物である。本発明の組成物は、PPARαアゴニストと11β-HSD1阻害剤の組合せを含むのが有利である。本発明に従う医薬組成物の活性成分は、例えば、心臓血管疾患を軽減する上で、優れた治療活性を呈示すると考えられる。投薬用量は、最適な治療応答が達成されるように調節することができる。例えば、複数に分割した用量を毎日投与してもよいし、あるいは、治療状況の緊急性に応じて、用量を減少させてもよい。
【０１１１】
活性化合物は、好都合の方式で投与することができ、例えば、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋内、皮下、鼻内、皮内または座薬もしくは移植（例えば、低速放出分子を用いて）により実施する。投与経路によっては、活性成分を不活性化し得る酵素、酸およびその他の自然条件の作用から該活性成分を保護するような材料で該活性成分をコーティングしなければならない場合もある。
【０１１２】
非経口以外の投与により前記組合せ組成物を投与するためには、該組成物をその不活性化から保護するような材料によりコーティングする、または該材料と一緒に投与する。例えば、上記組合せ組成物は、アジュバントに含有させて投与したり、酵素阻害剤と一緒に、またはリポソームに含有させて、共投与したりすることができる。アジュバントは、最も広義で用いられ、インターフェロンのような免疫刺激化合物も含む。本明細書で考慮するアジュバントには、リソルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルやn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン界面活性剤が含まれる。酵素阻害剤としては、膵トリプシンが挙げられる。
【０１１３】
リポソームとしては、水中油中水形CGF乳濁液や、通常のリポソームを挙げることができる。
【０１１４】
活性化合物はまた、非経口または腹腔内投与することも可能である。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに、油中に調製することができる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【０１１５】
注射用に適した医薬形態としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、ならびに、滅菌注射液または分散液をその場で調製するための滅菌粉末がある。いずれの場合でも、上記形態は滅菌され、かつ、容易に注射可能な程度まで液体でなければならない。製造および保存の条件下で安定し、かつ、細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対して保護しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例：グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶剤または分散媒質、それらの好適な混合物、ならびに、植物油でよい。例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用、分散液の場合には、要求される粒度の維持、ならびに、界面活性剤の使用により、適正な流動率を維持することができる。
【０１１６】
微生物の作用の阻止は、各種の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チルメロサル（thirmerosal）などにより達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含有するのが好ましい。注射可能な組成物の吸収の長時間にわたる持続は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成物中に用いることにより達成することができる。
【０１１７】
滅菌注射液は、前述したその他の様々な成分と一緒に、適切な溶剤中に、必要量の活性化合物を導入した後、必要に応じて、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒と、前述したもののうちその他の必要な成分とを含む滅菌ビヒクル中に滅菌した活性成分を導入することにより調製することができる。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥法であり、これらの方法によって、事前に滅菌濾過した溶液から、活性成分および別の所望の成分が得られる。
【０１１８】
ポリペプチドの組合せが前述のように好適に保護されている場合には、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と一緒に、経口投与する、または、硬質または軟質シェルゼラチンカプセル中に被包する、もしくは錠剤に圧縮する、あるいは、食事用の食品と一緒に直接組み込むことができる。経口治療投与の場合には、活性化合物を賦形剤と一緒に組み込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリクシル、懸濁液、シロップ、ワッフルなどの形態で用いることができる。このように治療に有用な組成物における活性化合物の量は、好適な用量が達成されるような量とする。
【０１１９】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどはまた、下記のものを含んでいてもよい：トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのような結合剤；リン酸カルシウムのような賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤。加えて、スクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味料；あるいは、ペパーミント、冬緑油、またはチェリーフレーバーのような香味料を添加してもよい。用量単位形態が、カプセルである場合には、上に挙げた種類の材料以外に、液体担体を含んでもよい。
【０１２０】
その他の様々な材料が、コーティングとして、あるいは、用量単位の物理的形態を改変するために、存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、シェラック、糖またはその両方でコーティングすることができる。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味料として、スクロース、防腐剤として、メチルおよびプロピルパラベン、染料、およびチェリーまたはオレンジ味のような香味料を含有することができる。もちろん、用量単位形態を調製するのに用いられる材料はすべて、薬学上純粋で、かつ、使用される量では実質的に無毒でなければならない。さらに、上記活性化合物を、持続放出調製物および製剤に含有させてもよい。
【０１２１】
本明細書で用いる「薬学上許容される担体および／または希釈剤」とは、あらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。医薬活性物質のための上記媒質および薬剤の使用は、当技術分野ではよく知られている。通常の媒質または薬剤が活性成分と不適合である場合を除き、それらはすべて治療組成物に用いることが考慮できる。補足的活性成分を上記組成物に含有させることも可能である。
【０１２２】
投与しやすくし、かつ投薬の均質性を達成するために、非経口組成物を用量単位形態に製剤化するのが特に有利である。本明細書で用いる「用量単位形態」とは、治療しようとする哺乳動物被験者に対し、単位投薬用量として適した、物理的に個別の単位を意味する。その際、各単位は、必要な医薬担体と共同して、所望の治療効果を生成するように計算された予定量の活性材料を含む。本発明の新規用量単位形態についての詳細は、（ａ）活性材料に特有の特徴および達成しようとする具体的治療効果、ならびに（ｂ）身体の健康を損なった病状を有する、生きた被験者における疾患の治療のための活性材料などを配合する技術に固有の制限事項に従い、かつ、これらに直接左右される。
【０１２３】
主要活性成分は、用量単位形態として、薬学上許容される好適な担体と一緒に、有効な量の好都合かつ効果的投与を達成すべく配合される。組成物が、補足的活性成分を含む場合には、通常の用量、および上記成分の投与方式を参照にして、用量を決定する。
【０１２４】
以下の実施例で、例示を目的として本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【０１２５】
実験手順−11βHSD-1ノックアウトマウス
動物−既報（16）のように飼育した、雄の野生型MF1 11βHSD-1-/-マウスおよび対照を、12時間照明：12時間暗所の周期（７amに点灯）の標準的条件下で収容する。実験のため、動物は１匹ずつ収容し、少なくとも２日間順化させる。無制限の給餌、24時間絶食、24時間の絶食と4時間の再給餌、または24時間の絶食と24時間の再給餌のいずれかに、動物をランダムに割り当てる（１グループ当たりｎ＝６）。絶食はすべて８amに開始した。動物は、ケージから取り出して１分以内に、収容しているのとは別の部屋で、断頭により死なせる。
【０１２６】
８匹の生後５週間の雄肥満ラットと、痩せたZuckラット（Harlan Orkac、Bicester、ＵＫ）からなるグループを表現型により特性化し、照明（0800h〜2000h）および温度（21℃）の制御された条件下に維持し、標準的ラット餌（Special Diet Services、Witham、英国）および飲料水が自由に得られるようにした。
【０１２７】
血漿パラメーター：体幹血液を迅速に採取し、血漿を分離した後、トリグリセリド、遊離脂肪酸、全コレステロールおよびHDLコレステロールの測定まで、サンプルを氷上に保持する。トリグリセリドは、リパーゼに基づく比色計TGキット（Roche、Manheim、GmbH）を用いて測定する。全およびHDLコレステロールは、CHOLおよびHDL C-Plusキット（Roche）を用いて、測定する。グルコースは、グルコースHKキット（Sigma、Poole、英国）で測定する。血漿インスリンは、製造者の指示（Crystalchem、シカゴ、米国）に従い実施するELISAを用いて、測定する。コルチコステロンレベルは、記載されている（24）ように、放射免疫アッセイにより決定する。また、血清を回収し、FPLCにより真正トリグリセリド（FPLC分離によるグリセロール非含有ピーク）およびコレステロールプロフィールについて分析した後、既報（23）と同様に、酵素による方法を実施する。apoAI、apoAII、apoCII、apoBおよびapoEは、代表的サンプルについて特定の抗体を用いて、比濁法により測定する。
【０１２８】
RNA抽出および分析：組織を液体窒素中で急速凍結し、トリゾール（Gibco BRL、Paisley、英国）中で均質化する。結合マトリックス（Rnaid Plusキット、BIO 101、Anachem、英国）を添加することにより、全RNAを精製し、１ml当たり400単位のRNAsin（Promega、Southampton、英国）と10mM DTTを含む、ジエチルピロカルボネート（Sigma）前処理水におけるマトリックスから溶離させる。RNA（５〜20μg）を１％MOPSホルムアルデヒドゲル上で分離し、20 x SSCにおける標準的ノーザンブロット法に従い、Hybond N+膜（Amercham、Little Chalfont、英国）上にブロットする。ランダム初期感作標識付けキット（Roche）を用いて、32Pd-CTPでプローブを標識付けし、ニックカラム（Pharmacia- Amercham、Little Chalfont、英国）を介して精製し、65℃で、１ml当たり0.5 gmの変性サケ精巣DNA（Sigma）を含む高SDS（６％）リン酸バッファー（0.2M NaH2PO4、0.6M Na2HPO4、5mM EDTA）中で一晩ハイブリダイズさせる。ブロットを最大ストリンジェンシー：0.5 x SSC、0.1％SDSまで65℃で洗浄し、りん光体画像化（phosphor imager）フィルム（FLA2000、Fujifilm、ロンドン、英国）に暴露した後、定量りん光体画像化ソフトウエア（Aida、Raytek Scientific、Sheffield、英国）により分析した。ブロットもフィルム（biomax-MR、Kodak、英国）に暴露する。この実験で用いるプローブの詳細は参照文献55に記載されており、Genbankにおける配列に対して設計されたプライマーから作製される。すべてのプローブの正体は、標準的８％アクリルアミド配列決定ゲル上でのThermosequenaseキット（USB、クレベランド、米国）を用いた配列決定により確認した。
【０１２９】
腹腔内グルコース耐性試験：個別実験において、トランスジェニックおよび野生型マウスを一晩絶食させ、２mg／gのD-グルコース（リン酸緩衝食塩水中に25％の原液）を腹腔内注射する。グルコース負荷から０分後（注射前で、かつケージから取り出して1分以内）、ならびに、５、15、30、60および120分後に、尾静脈切開により液体サンプルをEDTA-マイクロチューブ（Sarsteds、Leicester、英国）中に採取する。
【０１３０】
11β-HSD-1酵素活性：肝臓サンプルを記載（12）のように均質化する。反応物は、0.1 mg/mlのタンパク質、25 nMトリチウム標識コルチコステロン、および過剰（２μM）の11βHSD-1特異的補因子NADPを含んでいた（in vitro条件下で、均質化した組織では、さらに安定した脱水素化作用のアッセイにより、11β-HSD1は二方向性である）。このアッセイは、タンパク質濃度および産物形成の線形範囲内で実施する。10分後、酢酸エチルでステロイドを抽出する。薄層クロマトグラフィー（TLC）によりステロイドを分離し、非標識コルチコステロンおよび11-デヒドロコルチコステロン標識と比較した移動により同定し、りん光画像化トリチウムスクリーン（Fujifilm）で定量する。TLCの結果は、各実験グループから得たサンプルの代表的グループのHPLC分析により確認する。
【０１３１】
実験方法−Zuckerラット
薬剤処理：薬剤処理は、動物が生後６週間に達したとき開始した。カルベノキソロン（体重１kg当たり50 mg）または対応する量のビヒクル（水；１ml／kg／日）を毎日0900hに栄養により投与した。正確な用量の投薬を可能にし、体重増の進行を追跡するために、動物を定期的に計量した。４匹からなる各ケージについての食物の摂取を毎日測定した。２週間の処理後、動物を経口グルコース耐性試験に付したが、これは、一晩絶食させた後、0900hに体重１kg当たり２ｇの経口グルコース負荷を実施することからなる。グルコース投与から0.30〜120分後に、尾切開により血液サンプルを採取した。生後9週間で、カルベノキソロンまたはビヒクル処理から３週間後、0900〜1100hに動物を断頭し、体幹血液を採取し、組織を切開し、ドライアイスで急速凍結するか、あるいは、クレブス重炭酸リンガーバッファー（118mM NaCl、3.8 mM KCl、1.19 mM KH2PO4、2.54 mM CaCl2、1.19 mM MgSO4、25mM NaHCO3、pH＝7.4）中で機械的に均質化した。
【０１３２】
血漿アッセイ：集団内放射免疫アッセイ（74）を用いて、0900〜1100hに採取した最終血液サンプルから調製した血漿中のコルチコステロンレベルを測定した。アッセイ間およびアッセイ内の変動定数は＜10％であった。
【０１３３】
ヘキソキナーゼグルコースアッセイキット（Sigma、Poole、英国）を用いて、グルコース濃度を決定した。その際のアッセイ間およびアッセイ内の変動定数は両方共に＜２％であった。ラット[125I]-インスリン放射免疫アッセイキット（Amersham、Buckinghamshire、英国）を用いて、インスリンを測定した。その際のアッセイ間およびアッセイ内の変動定数はそれぞれ、＜15および＜10％であった。
【０１３４】
0900〜1100hに採取した最終血液サンプルから調製した血漿中の脂質レベルを測定した。Roche Diagnostics（マンハイム、ドイツ）製のELISAキット（それぞれ、TG、CHOLおよびHDL C-プラス）を用いて、トリグリセリド、全コレステロールおよびHDLコレステロールを測定した。Wako NEFA C酵素アッセイ（Alpha Laboratories Ltd.、ハンプシャー、英国）を用いて、非エステル化脂肪酸（NEFA）を測定した。
【０１３５】
in vitroでの酵素活性の測定：グルコース（0.2％）、NADP（２mM）および1,2,6,7-[3H]4-コルチコステロン（100 nM）を含むクレブスリンガーバッファー中で、37℃にて２回繰り返しインキュベートすることにより、組織のホモジネート中の11β-HSD1活性を測定した。タンパク質濃度を下記のように調節することにより、一次速度論を確保するように各組織について条件を最適化した：肝臓、10μg／ml；四頭骨格筋、1.5 mg／ml；皮下腰椎脂肪、0.5 mg／ml；および大網脂肪、１mg／ml。60分のインキュベーション後、酢酸エチルでステロイドを抽出し、有機相を窒素下で蒸発させてから、抽出物を移動相（20％メタノール、30％アセトニトリルおよび50％水）中に再懸濁させる。20℃で逆相μ-Bondapak C18カラムを用いたHPLCによりステロイドを分離し、オンライン液体シンチレーション計数により定量する。これらの条件下では、3H-コルチコステロンおよび3H-デヒドロコルチコステロン以外のピークは検出されなかった。
【０１３６】
腎臓における11β-HSD2活性を同様に決定したが、その際、補因子としてのNAD（２mM）と、10 nM[3H]-コルチコステロンと一緒にインキュベートした。酢酸エチルでステロイドを抽出した後、前記と同様にHPLCにより分離した。
【０１３７】
肝臓における5β-レダクターゼ活性を、肝細胞質ゾル調製物における[3H]-コルチコステロンから[3H]- 5β-テトラヒドロコルチコステロンへの変換により評価した。11β-HSD1および5β-レダクターゼの細胞下局在化および補因子プリファランスを変えて、酵素活性が互いに独立に測定できるようにする。肝細胞質ゾルは、Fleischer & Kervina（1974）の方法に従い、反復遠心分離により調製した。酵素活性は、NADPH（１mM）および[3H]-コルチコステロン（150 nM）を含むリン酸バッファー（40 mM Na2PO4、320 mM スクロース、１mM ジチオトレイトール、pH7.5）において、37℃で２回繰り返して細胞質ゾル（100μgタンパク質／ml）をインキュベートすることにより測定した。インキュベーションを60分実施した後、酢酸エチルでステロイドを抽出し、窒素下で有機相を蒸発させ、抽出物を移動相（25％メタノール、10％アセトニトリルおよび65％水）中に再懸濁させた。10℃で逆相C8カラムを用いたHPLCによりステロイドを分離し、オンライン液体シンチレーション計数により定量した。これらの条件下で、3H-11-デヒドロコルチコステロンの生産は、検出範囲に達しなかった（すなわち、＜２％）。
【０１３８】
放射性同位元素標識ステロイドはAmersham（バックス、英国）から取得した。溶剤は、Rathburn Chemicals（ウォーカーバーン、英国）製のHPLCガラス蒸留グレードであった。その他の薬品は、Sigma（プール、英国）から取得した。
【０１３９】
統計学：データはすべて、平均値±標準誤差として表す。データは、分散分析により分析した後、ポストホック最小２乗差分試験（post hoc least squares difference test）に付した。全グループについて、Ｎ＝８である。
【０１４０】
実験方法−肝脂肪蓄積
被験者および実験設計：ヘルシンキ内の職業健康サービスから健康な人を募った。被験者は、履歴および身体検査により健康と判断され、薬物は一切使用していなかった。被験者は、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型肝炎、または自己免疫性肝炎のいずれの血清学的証拠がなく、しかも、先天性代謝異常の臨床上の徴候または症状を呈示せず、脂肪症（15）に関連する毒素もしくは薬剤の使用の履歴も持たない者であった。被験者は、その中央値LFAT（５％）に基づき、「高LFAT」および「低LFAT」グループに区分した。以下に詳細に述べるように、被験者を次の測定に付す：ｉ）in vivoでのコルチゾンからコルチゾールへの変換；ii）[3-3H]グルコースの注入と組み合わせた正常血糖インスリンクランプ技法を用いたグルコースRaおよびRdのin vivoインスリン感受性；iii)プロトン分光学による肝脂肪含量；iv）MRIによる皮下、内臓および全脂肪量；ｖ）VO2最大値；およびvi）24時間院外（ambulatory）血圧。
【０１４１】
実験の目的、種類および潜在的危険性について被験者に説明した後、被験者から書面でのインフォームドコンセントを得た。実験プロトコルは、ヘルシンキ大学病院の倫理委員会により承認を受けた。
【０１４２】
コルチゾール分泌および代謝：内因性コルチゾール生産を抑制するために、被験者が11 p.m.に１mgの経口デキサメタゾンを摂取し、一晩絶食した後、11β-HSD-1の第１回肝臓通過によるコルチゾンからコルチゾールへの変換を測定した（３；54；56）。翌朝、採血のために、肘前静脈にカテーテルを挿入し、被験者は、25 mgの酢酸コルチゾンを摂取した。それから、90分間にわたり、15分毎に血清コルチゾールを測定した。
【０１４３】
グルコース生産および使用のin vivoインスリン感受性：一晩絶食した後の８a.m.に、グルコース、インスリンおよび[3-3H]グルコースの注入、および動脈化した静脈血液のサンプリング用の２本の留置カテーテルを、１本は、肘前静脈に、またもう1本は、後退して、温めた手静脈に配置する。基礎および高インスリン血症条件下で、グルコース生産（Ra）および使用（Rd）の速度を決定するため、初期感作（20μCi）かつ連続的（0.2μCi／分）方式で、合計300分間[3-3H]グルコースを注入した（52；58）。空腹時血清インスリンおよびグルコース濃度の測定、ならびに、図14に挙げた生化学的測定のために、ベースライン血液サンプルを採取した。120分後、以前の記載（52）のように初期感作−連続（0.3 mU／kg.分）方式で、インスリンを注入した。20％グルコースの可変速度注入により、300分まで、血漿グルコースを５mモル／l（90 mg／dl）に維持した（58）。グルコース特異的活性の測定用の血液サンプルは、90、100、110および120分の時点で、また、120〜300分の間は、15〜30分置きに採取した。また、インスリン注入の間、無血清インスリン濃度を60分毎に測定した。
【０１４４】
[3-3H]グルコース特異的活性は、以前記載されている（59）ように決定した。グルコースRaおよびRdは、グルコースのプール画分が0.65で、グルコースの分布量が、200 ml／kgと仮定して（60）、スティール（Steele）等式に従い算出した。全グルコースRaの速度から、高インスリン血症の間に正常血糖を維持するのに必要な外因性グルコース注入速度を差し引くことにより、内因性グルコースRaを算出した。インスリンによる、最後の１時間（240〜300分）の基礎内因性グルコースRaの抑制率（％）は、インスリンに対する内因性グルコース生産の感受性指数（抑制率％）として用いた。
【０１４５】
肝脂肪含量（プロトン分光学）：32励起、ループ表面コイルおよび1.5T磁気共鳴装置（Magnetom Vision、Siemens、Erlangen、ドイツ）を用いて、肝臓からの単ボクセル（2 x 2 x 2 cm3）プロトンスペクトルを取得した。3000分の反復時間と、20分のエコー時間を加えた刺激エコー取得モードを用いて、空間位置確認を達成した。長い反復時間と短いエコー時間を選択したのは、シグナル強度に対するT1およびT2緩和の影響をそれぞれ最小限にするためである。4.8 ppm（Swater）でのウォーターシグナル強度に対して化学シフトを測定した。肝臓における細胞内トリグリセリドを表すメチレンシグナル強度（52）を1.4 ppm（Swater）で測定した。シグナル強度は、時間ドメイン適合の通常VAPRO-MARUI（www.mrui.uba.es/mruiHomePage.html）により取得した。プロトン分光学による肝脂肪（％）の上記測定値は、ヒトにおける肝生検の脂質含量に対してバリデートされている（61）。これはまた、コンピューター連動断層撮影によって実施した肝密度測定値に対してもバリデートされている。後者のバリデーションは、本発明者らによっても既に実施されている（52）。肝脂肪（％）は、100倍のSfatをSfatおよびSwaterの和で割ることにより算出した。
【０１４６】
腹内脂肪（磁気共鳴画像法）：内蔵および皮下脂肪を決定するために、第４および第５腰椎から４cm上方から４cm下方までの領域から、一連のT1-計量トランスアキシャル（trans-axial）スキャンを取得した（16切片、視界：375 x 500 mm2、切片厚さ：10 mm、エコー時間で割った息こらえ反復時間：138.9分／4.1分）。内蔵および皮下脂肪面積は、画像分析プログラム（www.perceptive.com/ALICE.HTM）を用いて測定した。腹内領域のおける画素強度のヒストグラムを表示し、痩身および肥満ピーク間の最下点に対応する強度をカットポイントとして用いた。内臓脂肪組織は、このカットポイントより上方の腹内領域における画素の面積として画定した。皮下脂肪組織面積を計算するためには、以前記載されている（52）ように、皮下脂肪組織および内蔵組織の境界に、目的とする領域をまず手で描いた。
【０１４７】
最大有気仕事率（maximal aerobic power）（VO2max）：呼息ガスおよび微小換気の連続的分析（Vmax229シリーズ、SencorMedics）と組み合わせた電気制動式サイクル力量計（Ergometer Ergoline 900ERG、ドイツ）による増分作業実施垂直運動試験（incremental work-conduted upright exercise test）を直接用いて、最大有気仕事率を測定した。運動は、50ワットの作業負荷から開始した。それから、疲労認識、または1.10ワットの呼吸商に達するまで、作業負荷を３分毎に50ワットずつ増加させた。最大有気仕事率は、最後の30秒間の運動のVO2maxとして決定した。
【０１４８】
24時間院外（ambulatory）血圧：自動院外血圧モニタリング装置（Diasys Integra、Novacor、フランス）を用いて、通常の平日に非侵襲性院外血圧モニタリングを実施した。昼間15分毎に、また、夜間は30分毎に、血圧および心拍数を記録するように、上記装置を設定した。昼間および夜間は、被験者の日誌において覚醒および睡眠時間から決定する。
【０１４９】
その他の測定：ベックマングルコース分析装置II（Beckman Instruments、Fullerton、CA）（63）を用いて、グルコースオキシダーゼ法により、血漿グルコース濃度を２回繰り返して測定した。完全自動化グリコシル化ヘモグロビン分析システム（BioRad、Richmond、CA）を用いて、高圧液体クロマトグラフィー（62）により、HbA1cを測定した。全コレステロール、HDLコレステロール、およびトリグリセリドを、既報（64）のように測定した。ポリエチレングリコールによる沈降（65）後、放射免疫アッセイ（Pharmacia Insulin RIAキット、Pharmacia、Uppsala、スエーデン）を用いて、無血清インスリンを測定した。蛍光比色法（66）を用いて、血清FFAを測定した。体脂肪（％）をバイオインピーダンスプレチスモグラフィー（Bio-Electrical Impedance Analysis System、モデル#BIA-101A、RJL Systems、MI）（67）により測定した。
【０１５０】
統計分析：非対合t-試験を用いて、低および高LFATグループ間の平均値を比較した。反復測定および重線形回帰分析用のANOVAを用いて、経口コルチゾール後の血清コルチゾール濃度変化の原因となる因子を分析した。計算は、Systat統計パッケージ、バージョン10.0（Systat、Evanston、IL）およびGraphPad Prismバージョン2.01（GraphPad Inc、サンディエゴ、CA）を用いて実施した。データはすべて、平均値±平均値の標準誤差として示す。0.05より小さいｐ値は、統計学的に有意であるとみなした。
【０１５１】
実施例１
11βHSD-1-1-マウスは、血漿トリグリセリドが低く、HDLコレステロールが高い
血漿トリグリセリドは、無制限給餌の11βHSD-1ヌルマウスの方が低い（図１Ａ）。無制限給餌の場合の「真正」トリグリセリドの代表的FPLCプロフィール（図１Ｂ）は、グリセロール妨害が、遺伝子型間の相違の原因ではないことを示していた。トリグリセリドは、両遺伝子型において、絶食時に明らかに下降する。２方式のANOVAから、絶食時の11βHSD-1-/-マウスにおけるトリグリセリド減少の程度が、野生型と比較して有意に小さいことがわかる（図１Ａ）。しかし、野生型トリグリセリドレベルは、24時間の再給餌により無制限給餌の値に戻ったが、11βHSD-1-/-トリグリセリド値は、4時間の再給餌で無制限値に戻り、24時間で、無制限給餌グループより有意に高いレベルまでのオーバーシュートを呈示した。全およびHDLコレステロールは、食餌操作によって有意に変動しなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。しかし、遺伝子型の影響は極めて有意に存在し、11βHSD-1-/-マウスの方が、HDLコレステロールレベルは高い（野生型の130％前後；図２Ｂ）。血漿グルコースレベルは、給餌状態での両遺伝子型で類似しており（野生型6.24±0.04対ヌル5.8±0.5 mモル／L）、既報（16）と同様に、11βHSD-1-/-マウス（野生型4.04±0.3対ヌル3.4±0.1 mモル／L）では、より低い空腹時グルコースの傾向がみられた。4時間の再給餌グルコースレベルは、類似している（野生型5.37±0.45対ヌル5.51±0.29 mモル／L）が、絶食後の24時間の再給餌では、11βHSD-1ヌルグルコースレベルに、小さいが、有意な減少が認められる（野生型5.51±0.45対ヌル4.64±0.15 mモル／L、ｐ＜0.05）。これは、11βHSD-1-/-マウスにおけるグルコース耐性の増加を表すと考えられる。血漿インスリンは非常に可変性であるが、両遺伝子型で、すべての給餌状態において類似している。
【０１５２】
給餌11βHSD-1-1-マウスの肝転写物プロフィールは、正常の脂質合成および脂質酸化増加を示す：血漿脂質の改変の原因を調べるために、脂質合成（図３）および脂肪酸酸化経路（図４）に関与する酵素をコードするmRNAの発現をノーザンブロット分析により検定した。脂肪酸シンターゼ（FAS）（図３Ａ）およびグリセロール−リン酸アシルトランスフェラーゼ（GPAT）（図３Ｂ）、トリグリセリド合成およびエステル化にそれぞれ関与する酵素を無制限給餌条件下の11βHSD-1-/-および野生型マウスにおいて同様に発現させる。実際には、脂質合成経路におけるFAS、GPATおよびその他の酵素の発現を駆動する決定的脂質生合成転写因子SREBP-1cのレベル（25、26）は、各遺伝子型間で同等である（図３Ｃ）。これは、トリグリセリド合成およびエステル化が減少しても、11βHSD-1-/-マウスの低下した血漿トリグリセリドプロフィールには影響を及ぼさない可能性があることを意味する。さらには、コレステロール合成における律速酵素、ヒドロキシ−メチル−グルタリル−CoA−レダクターゼ（HMG-CoAAR）をコードするmRNAも、給餌状態での両遺伝子型において同等のレベルで発現する（図３Ｄ）。
【０１５３】
対照的に、脂肪酸酸化の酵素を検定したところ、本発明者らは、カルニチネパルミトイル−トランスフェラーゼ-I（CPT-I）、ミトコンドリアβ−酸化経路における鍵律速酵素（27）、脂肪酸酸化に関与するミクロソーム酵素であるアシル−CoAオキシダーゼ（ACO）（28）、ならびに、脂肪酸の酸化（29）に関与し、かつ肝細胞でも発現する（30）ことが知られているタンパク質である脱共役タンパク質-2（UCP-2）をコードするｍRNAが、すべて、給餌11βHSD-1-/-マウスの肝臓で増加していた（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）ことをみいだした。さらに、PPARαmRNA、すなわち、これらの脂肪酸酸化の遺伝子を調節する鍵肝転写因子も、給餌11βHSD-1-/-マウスで増加していた（図４Ｄ）。CPT-I、ACOおよびUCP-2の発現増強は、これらの遺伝子がPPARαの下流標的であることと一致している（30〜33）。
【０１５４】
実施例２
給餌11βHSD-1-/-マウスは、アテロプロテクティブリポタンパク質およびフィブリノーゲンプロフィールを有する
本発明者らは、トリグリセリドの低下およびHDLレベルの上昇の原因をさらに解明するため、グルココルチコイド感受性リポタンパク質の発現も調べた。給餌状態にある両遺伝子型から得た血清の代表的サンプル上で、特定の抗アポリポタンパク質抗体を用いて、比濁法を実施する。循環トリグリセリドにおける心臓保護性低下と一致して、apoCIIIの血清レベル、すなわち、血漿トリグリセリドレベルを決定するのに重要な役割を果たすVLDLの高トリグリセリド含有成分（34）が、11βHSD-1-/-マウスでは顕著に低下する（野生型0.87±0.14対ヌル0.48±0.1 g／L）。HDL粒子の主要成分をコードするアポリポタンパク質AI mRNA（35）は、給餌11βHSD-1-/-マウス肝臓（図５A）で、循環血漿apoAIレベルの上昇と共に、有意に増加する。興味深いことに、HDL粒子と関連する別のリポタンパク質である血清apoAIIは減少する（野生型0.53±0.1対ヌル0.28±0.1 g／L）。apoBおよびapoEの血清レベルは、遺伝子型間で変わらない。
【０１５５】
リポタンパク質または脂質代謝とは関係のない肝転写物を評価するため、本発明者らは、独立の心臓血管危険因子（37）であるグルココルチコイド感受性血漿因子（36）をコードするAα-フィブリノーゲンmRNAを調べた。Aα-フィブリノーゲン転写物レベルは、給餌11βHSD-1-/-マウスで、25％低下している（図５Ｂ）。
【０１５６】
実施例３
11βHSD-1-/-マウスは、絶食により、グルココルチコイド感受性転写物の誘導の減弱を示す
絶食は、野生型マウス（図４Ｄ）で、PPARαの2倍の誘導を引き起こし、これは、この転写因子が、絶食の間、グルココルチコイド誘導による脂肪酸酸化を媒介するという報告（20、21）と一致している。しかし、無制限給餌条件下では、11βHSD-1-/-肝臓PPARαレベルの方が野生型レベルより高いのに対し、PPARαmRNAの空腹時誘導は、11βHSD-1-/-動物で消滅する（図４Ｄ）。PPARα誘導の消滅にも拘わらず、下流標的遺伝子ACOおよびUCP-2は、空腹時誘導を呈示した。この誘導は、野生型無制限給餌に関しては、空腹時誘導より小さい。このような穏やかな誘導は、マウスにおける比較的上昇した無制限給餌PPARαレベルの存在を表すと考えられ、これは、絶食中、内因性PPARαアクチベーター、すなわち、脂肪酸のレベル上昇により活性化される。グルココルチコイド誘導性転写物apoAIもまた、絶食時の増加減弱を示し、これは、肝細胞における有効なグルココルチコイドレベルの低下（図５Ｂ）と両立している。空腹時応答の減弱と一致して、脂質エステル化酵素GPATの絶食媒介による抑制の鈍化が、野生型マウスと比較して、ヌルマウスに観察される（図３Ｂ）。また、CPT-Iの絶食時誘導（図４Ａ）は、正常のようであり、空腹時血漿グルコースは、遺伝子型間で有意に変わらない。これは、脂肪酸酸化および糖新生に対するグルココルチコイド作用の減弱が、11βHSD-1-/-マウスでの24時間絶食後に低血糖症を引き起こすほど激しくはないことを意味している。
【０１５７】
11βHSD-1は、野生型マウスにおいて絶食／再給餌に急激に応答しない
野生型および11βHSD-1-/-マウス間の相違が、単純に、11βHSD-1活性の給餌に関する改変によるものではないことを調べるために、野生型11βHSD-1の転写物レベルおよび活性を実験グループ間で測定した。11βHSD-1 mRNAまたは活性レベルのいずれも、24時間の急激な絶食またはそれに続く再給餌による影響を受けていない（図７Ａ、７Ｂ）。従って、上記酵素は、活性細胞内グルココルチコイドレベルを調節するのに極めて重要であるが、これは、コルチコステロンの増加によって急激に調節されるわけではないようだ（野生型、無制限給餌25.2 ± 7.2対野生型絶食222±76 nモル／L、ｐ＜0.05）。さらに、11βHSD-1 mRNAおよび活性は、絶食に付随するインスリンレベルの低下（野生型、無制限給餌3131±81対野生型絶食564±36 ng／ml）、またはこれに続く再給餌時のインスリン流入（4時間再給餌値6052±654 ng／ml）による影響を受けない。
【０１５８】
実施例４
11βHSD-1マウスは、絶食後の再給餌時に肝インスリン感受性が増加した
本発明者らは、24時間絶食後の再給餌時のインスリン感受性転写物レベルの相対的変化を評価することにより、肝インスリン感受性を検定した。ノーザン分析により、CPT-IおよびUCP-2のようなインスリン抑制性転写物は、再給餌時に11βHSD-1-/-マウス（図４Ａおよび４Ｃ）において、より顕著に抑制されることがわかった。反対に、インスリン誘導性転写物、例えば、脂質生合成（SREBP-1、FAS、GPAT）およびコレステロール生合成（HMG-CoAR）経路におけるものなどは、再給餌時に11βHSD-1-/-マウス（図３Ａ〜D）において、より顕著に誘導される。
【０１５９】
11βHSD-1マウスは、グルコース耐性が改善する：動的グルコース処理の実験から、11βHSD-1-/-マウスは、血糖症制御が改善していることがわかる（図８）。絶食後の11βHSD-1-/-マウスにおけるゼロ時間グルコースレベルの低下（空腹時グルコース生産におけるストレス反応の減弱（16）を表していると思われる）を考慮に入れて、11βHSD-1-/-マウスのグルコースレベルに関する曲線下の面積は、野生型と比較して、腹腔内グルコース負荷後のグルコース処理が全体的に改善されたことを示している。これは、肝インスリン感受性の改善と一致する。
【０１６０】
実施例５
ヒトにおける脂質プロフィールに対するカルベノキソロンの作用
図６は、健康なヒトおよびII型糖尿病患者における空腹時血漿脂質に対するカルベノキソロン投与の作用を示す。
【０１６１】
II型糖尿病を有する６人の男性と、６人の健康な対照に、当業者には公知のように、無作為二重盲検交差試験方式で、プラセボ（斜線棒）とカルベノキソロン（囲み棒）を投与した。空腹時血漿脂質レベルを示す。カルベノキソロンは、全コレステロールには影響を与えなかったが、トリグリセリドを低下させると共に、HDL（高密度リポタンパク質）コレステロール濃度を高めた。
【０１６２】
実施例６
Zuckerラットにおける脂質プロフィールに対するカルベノキソロンの作用
11βHSD-1を阻害する作用を肥満Zuckerラットにおいて測定し、これによって、11βHSD-1のin vivoでの薬学的操作の代謝作用を確認すると共に、肥満症における治療応答に対する11βHSD-1活性の組織特異的変化の重要性を評価する。これらのアッセイでは、11βHSDの両アイソザイムをin vivoで阻害するカンゾウの誘導体であるカルベノキソロンを用いた。
【０１６３】
肥満症
ビヒクルで処理した肥満Zuckerラットは、痩せたラットと比較して、食物の消費が多く、３週間の処理期間中の体重増加も高かった（図１３）。カルベノキソロン処理は、痩または肥満ラットにおいて、食物消費または体重増のいずれにも何の影響も及ぼさなかった。
【０１６４】
グルコース耐性
ビヒクル処理ラットでは、肥満ラットは、絶食およびグルコース摂取後の両方で、相対的高血糖症および高インスリン血症を有した（図９）。カルベノキソロン処理は、いずれのグループにも血漿グルコースに有意な作用を及ぼさなかった。対照的に、カルベノキソロンは、痩せたラットおよび肥満ラットの両者において、絶食状態と、グルコース摂取の30分後で、また、肥満ラットでは120分後にも、血漿インスリンを増加させた。
【０１６５】
非空腹時血漿脂質レベル
全コレステロールは、痩ラットより肥満ラットの方が高かったが、カルベノキソロンによる影響を受けなかった（図１０）。対照的に、HDLコレステロールは、痩せたラットおよび肥満ラットの両ラット間で、変わらず、肥満ラットにおいてカルベノキソロンにより増加した。トリグリセリドは、痩せたラットより肥満ラットの方が高く、肥満ラットではカルベノキソロン処理により減少した。非空腹時血漿NEFAは、各グループ間で変わらなかった。
【０１６６】
in vitroでの11β-HSD活性
ビヒクル処理ラットにおいて、肥満症における11β-HSD1活性の組織特異的調節異常を確認したところ、肥満ラットは、肝臓での活性は低かったが、大網脂肪組織での活性は高かった（図１１）。カルベノキソロン投与により、痩せたラットおよび肥満ラットの両ラットで、肝11β-HSD1および腎11β-HSD2活性のex vivo阻害が起こり、これは、両者とも、同等かつ測定可能であった。
【０１６７】
視床下部下垂体副腎（HPA）軸
ビヒクル処理ラットにおいて、副腎重量は、痩せたラットより肥満ラットの方が高かった（図１３）。カルベノキソロン処理は、痩せたラットでは副腎重量に影響しなかったが、肥満ラットでは、副腎の肥大を改善した。
【０１６８】
血漿コルチコステロンレベルは、可変であり、恐らく、断頭時の非制御ストレスを反映していると思われる。血漿コルチコステロンレベルには統計的に有意な相違はなかったが、血漿コルチコステロンは、痩せたラットより肥満ラットの方が高く（図１３）、また、カルベノキソロンは、両グループにおいて血漿コルチコステロンを増加する傾向がみられた。
【０１６９】
in vitroでの5β-レダクターゼ活性
カルベノキソロンが誘導されるグリシレチン酸は、5β-レダクターゼなどのその他のステロイド代謝酵素を阻害することが報告されている（70）。5β-レダクターゼは、グルココルチコイドのＡ環を不可逆的に阻害することにより、それらを不活性化する。肝5β-レダクターゼ活性は、痩せたラットより肥満ラットの方が高かった（図１２）。カルベノキソロンは、5β-レダクターゼ活性を阻害するよりもむしろ、肥満ラットでの増加を悪化させた。
【０１７０】
この実験では、肥満症に起こる11β-HSD1の特徴的な組織特異的調節異常を有する動物におけるカルベノキソロンの効能を評価した（４；３；54）。これらの動物における肥満症は、脂肪組織における11β-HSD1の増加と、肝臓におけるダウンレギュレーションとに関連することが確認されている。痩せたラットにおいて、カルベノキソロンは、肝臓における11β-HSD1活性および腎臓における11β-HSD2活性を阻害する上で有効であった。これは、肥満動物において、酵素発現および活性の基礎ダウンレギュレーション以外に、肝11β-HSD1活性の低下を薬学的に達成できることを示している。カルベノキソロンには、空腹時血漿グルコースまたはグルコース耐性に対する作用はなかった。しかし、肥満ラットにおいて、カルベノキソロンは、11β-HSD1ノックアウトマウスに観察された改変脂質プロフィール（トリグリセリドの減少およびHDLコレステロールの増加を含む）（55）と同じパターンを誘導した。マウスモデルでは、これは、脂肪代謝の改変よりもむしろ、肝脂質酸化の増強に起因しており、恐らく、肝臓におけるPPARαのアップレギュレーション（55）によるものであろう。これ以外に、11β-HSD1ノックアウトマウスからわかったのは、肝グルコース代謝の相違が、動的試験（絶食および過剰給餌）（16）の間にだけ出現するのに対し、脂質プロフィールの相違は、これより容易に認められることであった。肝グルコース代謝の動的試験は、肝臓におけるカルベノキソロンのさらに微妙な作用を明らかにしていると考えられる。
【０１７１】
HPA軸は、肥満Zuckerラットにおいて活性化され、副腎皮質肥大および高コルチコステロン血症が、一貫して認められている（71）。高コルチコステロン血症ではなく、副腎肥大は、この実験でカルベノキソロンにより改善された（図１３）。これは、コルチコステロンの腎肝11β-HSD2不活性化の阻害により、非常に容易に説明され、その結果、カルベノキソロンを投与したヒトに観察された（68）ように、グルココルチコイド分泌の補償的ダウンレギュレーションが起こった。
【０１７２】
要約すると、これらのデータから、肝臓におけるカルベノキソロンによる11β-HSD1の阻害は、基礎11β-HSD1「標的」活性が低いにも拘わらず、Zucker肥満ラットにおける脂質代謝に有益な作用をもたらすことがわかる。
【０１７３】
実施例７
肝特異的11βHSD-1発現
GCレベルを増幅する11β-HSD1は、肝臓、脂肪組織および脳において優勢に発現する。マウスにおける遺伝子標的実験により、ストレスまたは肥満時の肝臓における糖新生の誘導に際する11β-HSD1の要件が明らかにされている（16）。11β-HSD1ヌル動物は、グルコース耐性の増強と、血漿トリグリセリドの低下を呈示する（55）。トランスジェニックマウスにおける11β-HSD1の脂肪特異的過剰発現は、中心性肥満、高脂質血症、およびインスリン耐性糖尿病を促進（49）するが、門脈を介した肝臓へのGC送達も増加する。肝細胞内GC含量の増加時だけの代謝上の影響を決定するために、本発明者らは、Apo-Eプロモーターの制御下で、肝臓に特異的に11β-HSD1を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した。
【０１７４】
ラット11β-HSD1用のcDNA（インフルエンザウイルス赤血球凝集素エピトープ（HA）タグの3’末端にオープンリーディングフレームを融合させた）をプラスミドベクター（86）に挿入するが、このベクターは、マウスにおけるトランスジーンの肝特異的発現を目的として既に用いられたものである（87）。肝発現は、挿入されたcDNA上流のヒトapoE遺伝子からの、３kbの5’隣接配列と、第１エキソンとイントロン、および第２エキソンの一部によって駆動した。上記配列はまた、下流に、最終エキソンの一部と770 bpエンハンサーを含み、SV40ポリアデニル化シグナルにより供給される転写終結を有する。このプラスミドから、NotI／部分的EcoRI消化により5.5 kb前後の断片を切除し、F1 CBA/C3H胚の前核に注射することによって、トランスジェニックマウスを作製した。
【０１７５】
結果を図15に示す。これらの線は、野生型と比較して、少なくとも５倍多い肝臓内11β-HSD1活性を呈示する。分析から、雄のマウスが、正常なグルコース耐性を有することがわかり、これは、基礎条件下でのグルコースホメオスタシスについて肝11β-HSD1が制限的要素ではないことを示唆している。しかし、トランスジェニック動物は、血漿インスリンレベルの上昇（〜50％）、血漿トリグリセリドの上昇（〜２倍）、血漿全コレステロールの増加（20％）を示し、これらは主に、非HDL画分（HDL-コレステロール／全コレステロール＝0.62トランスジェニック対0.83野生型）に起因すると考えられる。組織学的分析により、トランスジェニックマウスの肝細胞における脂質の蓄積が明らかになり、これは、脂質代謝が、肝臓におけるGC再生の増加に差別的に感受性であり得ることを示唆している。加えて、雄のトランスジェニックマウスの体重は、野生型同腹子と比較してわずかに増加し（６〜８％）、これは、生後10週前後から明らかである。これらのデータから、肝11β-HSD1の選択的増加は、インスリン感受性をわずかに低下させ、不都合なことには、血漿脂質を増加すると共に、肝脂質の蓄積を発生させるため、代謝症候群の全部ではないがいくつかの症候を発現する。局所11β-HSD1により決定される、肝臓と脂肪GCレベル間の相互作用は、代謝症候群の発現を決定する上で極めて重要であると思われる。
【０１７６】
実施例８
11βHSD-1は代謝均衡に影響を及ぼす
P2プロモーター（49）の制御下で脂肪組織において11βHSD-1を過剰発現するトランスジェニックマウスは、過食症の表現型を提示し、特に高脂肪給餌の間、野生型より食物の消費量が高い。
【０１７７】
11βHSD-1ノックアウトマウス（図１６参照）でも、高脂肪給餌の開始時に、過食が観察される。しかし、これらのマウスでは、過食の結果としての体重増加は起こらない。
【０１７８】
体重増加が起こらないのは、野生型対照（+/+）と比較して、11βHSD-1ノックアウトマウス（-/-）に観察される代謝率の増加に起因すると考えられる。直腸の温度（℃）を約14週間の高脂肪（HF）給餌後に計測した。
【０１７９】
+/+対照食餌：37.1+/-0.2℃（ｎ＝16）、+/+hf：37.6+/-0.2℃（ｎ＝15）
-/-対照：37.7+/-0.2℃（ｎ＝12）、-/-hf：38.3+/-0.2℃（ｎ＝15）
２方式ANOVAによる、表現型の影響：Ｐ＜0.01
食餌の影響：Ｐ＜0.05
高脂肪餌を給餌したノックアウト（-/-）マウスは、代謝率の実質的上昇を示し、これは、過食に応答する体重増加がないことを説明している。
【０１８０】
実施例９
脂肪およびマクロファージPPARγは、11βHSD-1-/-マウスにおいて減少する
肝PPARαのアップレギュレーション、従って、PPARαアゴニストとの推定相乗効果に加えて、PPARγ発現の増強が、11βHSD-1-/-マウスにおける脂肪組織に認められている。データを図１７に示す。これは、インスリン感受性、血漿脂質プロフィール、およびグルコース耐性に対する有益な作用における、PPARγアゴニスト（チアゾリジンジオンなど）との相乗効果を推定させる。チアゾリジンジオンの利点は、体重増によって減弱する。11HSD1阻害と組み合わせることで、増強した代謝率が作用して、体重増を阻止する。
【０１８１】
マクロファージ脂質運用への影響：アテローマ発生疾患における重要な因子は、泡沫細胞、すなわち、じゅく状斑内の脂質蓄積に関わるマクロファージである。当技術分野における近年のデータから、PPARγアゴニストは、マクロファージへのコレステロールの取込みを増加することが明らかにされているが、重要なのは、これらによるコレステロール流出を増加する作用の方が大きいことである（75、76）。11βHSD-1-/-マウス由来のマクロファージにおけるPPARγmRNAのアップレギュレーションが、図１８に示すように、開示されている。特定の理論に束縛されるわけではないが、マクロファージにおける11βHSD-1阻害は、泡沫細胞の形成およびマクロファージにおけるコレステロール貯蔵を減少させるため、アテローム発生疾患に有益な効果をもたらすと考えられる。
【０１８２】
実施例10
肝臓内脂肪含量への11βHSD-1の影響
マウスにおける11β-HSD1の肝臓特異的過剰発現により、肝脂肪含量の増加が起こる。
【０１８３】
通常餌給餌のApoE-11β-HSD-1トランスジェニックマウスから肝臓を採取し、切断し、Oil RedO（55）で染色した。肝臓選択的に11β-HSD-1を過剰発現するトランスジェニックマウスに、脂質蓄積が観察された。
【０１８４】
肝臓および骨格筋のようなインスリン感受性組織における異所性脂肪蓄積は、組織特異的インスリン耐性に関連する。本明細書に示すように、11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（11β-HSD-1）によるコルチゾンからコルチゾールへの過剰な再活性化により、被験者は、肥満症とは独立に、肝臓における脂肪蓄積および肝インスリン耐性が増加した。
【０１８５】
この実験は、糖尿病ではなく、かつ外見上健康な19人の男性について実施した。人体測定および身体組成の測定値を図１４に示す。平均LFAT含量は、高LFATの人では５倍高かった。グループは、年齢、体力良好（VO2max）、およびアルコール摂取のマーカーに関して類似している（MCV 90±対88±fl、AST/ALT 0.81±0.08対1.04±0.09高対低LFAT）。AST（38±4対25±2 U/L、ｐ＜0.02）およびALT（53±9対27±4 U/L、ｐ＜0.02）は、高LFATの人において有意に高かった。ボディマス指数、W/H、内蔵および皮下のMRI測定値、ならびに、内蔵／皮下比を含む肥満症のすべての測定値は、２つのグループで類似していた。
【０１８６】
空腹時血漿グルコースおよびグリコシル化ヘモグロビン濃度は、各グループ間で同等であったのに対し、高LFATの人は、高い空腹時血清インスリン、40％高い空腹時血清トリグリセリド、および高い24時間収縮期血圧を呈示した（図14）。HDLおよびLDLコレステロールの濃度、および24時間拡張期血圧は、グループ間で有意に相違しなかった。
【０１８７】
in vivoでのインスリン活性
内因性グルコース生産および処理に対するインスリンの作用：インスリン注入中、血清インスリン濃度は、LFATの高い人で平均25±２、低い人では21±１mU／lであった（NS）。基礎（basal）を上回る増分はそれぞれ、平均16±２および15±１mU／lであった（NS）。基礎内因性グルコースRaおよびRdの速度は、グループ間で同等であった（低対高LFATでそれぞれ、2.3±0.2対2.5±0.2 mg/kg.分または102±6対111±6 mg/m2.分）。インスリン注入の最後の１時間で、低（91±16％）LFATの人と比較して、高（41±15％）LFATの人で、内因性グルコースRaの抑制が有意に低かった（図１９ａ）。グルコースRdの速度は、高インスリン血症の最後の１時間では変わらなかった（それぞれ、3.0±0.3対3.1±0.3 mg/kg.分、NS）。
【０１８８】
血清FFA濃度に対するインスリンの作用：空腹時血清FFA濃度は、基礎（低対高LFATで、662±62対550±54μモル／l、NS）およびインスリン注入の最後の１時間で、同等であった（図１９ｂ）。インスリン注入の最後の１時間で、血清FFAは、高LFATのグループの方が44％高いままであった（329±41対低LFATでの228±23μモル／l、ｐ＜0.05）。
【０１８９】
コルチゾール分泌および代謝：経口酢酸コルチゾン投与後の血清コルチゾール濃度を図２０に示す。１変量分析では、濃度は75および90分の時点で有意に相違していた。反復測定のためのANOVAでは、LFAT（時間×LFATについては、ｐ＜0.05）およびBMI（時間×BMIについては、ｐ＜0.05）は共に、これらの時点での、独立の、しかし相反する血清コルチゾール濃度の決定因子であった。BMIとLFATは共に、血漿コルチゾール（75〜90分の平均濃度）における分散の57％（ｐ＝0.01）の原因を説明していた。平均血清コルチゾール濃度（75〜90分の平均値）のための回帰式は次の通りである：コルチゾール（nモル／l）＝（1098±180）−（29±７x BMI（kg/m2、ｐ＜0.01）＋（7.4±3.3 x LFAT（％、ｐ＜0.05））。25 kg/m2の一定BMIで観察されたLFATの範囲（１〜23％）にわたって、S-コルチゾールの推定変動は、380〜543 nモル／lであり、これは、一定LFAT％（10％）でのBMIの変動（27〜22 kg/m2）と対応することになる。
【０１９０】
肝臓における異所性脂肪蓄積を有する人は、選択的肝インスリン耐性を呈示し、より多くのコルチゾンをコルチゾールに変換するが、これは、肝11β-HSD-1活性の増強を示唆している。これらのデータは、過剰な組織グルココルチコイド作用が、肝インスリン耐性に寄与するというコンセプトを支持するものである。
【０１９１】
実施例11
11β-HSD-1の阻害が、合成グルココルチコイドの有害な作用を防止する
合成グルココルチコイドは、抗炎症治療（例えば、炎症性腸疾患、関節炎、喘息）に用いることができ、11β-HSD酵素により代謝される。例として、プレドニゾンによるプレドニゾロン変換（78）と、11-デヒドロデキサメタゾンによるデキサメタゾン変換（77）が挙げられる。その結果、不活性11-ケト−ステロイドは、これらの薬剤による治療の間、循環中であり、11β-HSD1が発現される組織において、活性11-ヒドロキシ−ステロイドに再活性化される可能性がある。従って、11β-HSD1の阻害は、これらの部位におけるグルココルチコイドの再活性化を防止し、グルココルチコイドの望ましくない有害な作用を防止し、抗炎症効果を賦与しようとする部位へのグルココルチコイドの作用のターゲッティングを可能にする。
【０１９２】
合成グルココルチコイドベクロメタゾンのグルココルチコイド作用の操作を証明する。ベクロメタゾンは、11β-HSD1による代謝を受ける。図２１ａは、均質化した状態でデヒドロゲナーゼとして機能する11β-HSD1を含む、当業者には公知の条件（82）下で、均質化したラット肝臓と一緒に行なうベクロメタゾンのインキュベーションを示す。ベクロメタゾンの11-ヒドロベクロメタゾンへの変換は、254 nmでのオンライン紫外線検出によるHPLCによって測定した。このインキュベーションの間に観察された変換によって、ベクロメタゾンが11β-HSD1の基質であることが確認される。
【０１９３】
ベクロメタゾンは、グルココルチコイド受容体アゴニストである。また、11β-HSD1の阻害は、ヒト皮膚におけるグルココルチコイド受容体媒介による応答を低下させる（79）。年齢が20〜33歳の12人の健康なヒトに対し、Noonら（1996）に従って、前腕の皮膚にベクロメタゾンを塗布した。皮膚の別の場所に、11β-HSD1阻害剤であるグリシレチン酸と一緒にベクロメタゾンを塗布した（81）。既報（80）のとおり、翌日、ステロイド溶液の塗布順序について知らない２人の観察者によって、皮膚退色の強度を記録した。ベクロメタゾン、またはグリシレチン酸の添加を伴なうベクロメタゾンに関し、用量応答曲線に満たない面積について、合計点を計算した。結果を図２１ｂに示す。グリシレチン酸は、ベクロメタゾンに対する退色応答を低下させた。このことは、特定の理論に拘束されるわけではないが、11β-HSD1による皮膚内グクロメタゾンの再活性化の阻止が、局部グルココルチコイドの能力を減弱させることを示唆している。
【０１９４】
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上記明細書において述べたすべての刊行物は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【０１９５】
以上記載した本発明の方法および装置の様々な改変および変種は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明は、主張するように、このような特定の実施形態に不当に限定すべきではないことに留意されたい。実際に、本発明を実施する前記方法の様々な改変が、分子生物学または関連分野の当業者には明らかであり、これらは、添付の本発明の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】Ａ．食餌操作［AL；無制限給餌、F；24時間絶食、4RF；24時間絶食と4時間の再給餌、24RF；24時間絶食と24時間の再給餌］に付した野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物のトリグリセリドレベルを示す。棒上の小文字は、統計的に類似したグループを示す。  Ｂ．無制限給餌の野生型および11βHSD-1-/-マウスから得られた代表的真正トリグリセリドFPLCプロフィールを示す。11βHSD-1-/-マウスにおける無制限給餌の場合のトリグリセリドレベル低下に注意されたい。
【０１９７】
【図２】Ａ．食餌操作［AL；無制限給餌、F；24時間絶食、4RF；24時間絶食と4時間の再給餌、24RF；24時間絶食と24時間の再給餌］に付した野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物の全コレステロールレベルを示す。  Ｂ．食餌操作［AL；無制限給餌、F；24時間絶食、4RF；24時間絶食と4時間の再給餌、24RF；24時間絶食と24時間の再給餌］に付した野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物の全コレステロールレベルを示す。（＊は、野生型よりも11βHSD-1-/-マウスの値が有意に大きいことを示す）。  Ｃ．野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物の肝アポリポタンパク質AI mRNAレベル（HDL粒子の主成分をコードする）を示す。棒上の小文字は、統計的に類似したグループを示す。11βHSD-1-/-マウスにおける有意に高いHDLコレステロールレベル、ならびに、給餌11βHSD-1-/-マウス肝臓における高い給餌アポリポタンパク質AI mRNAに注意されたい。
【０１９８】
【図３】食餌操作[AL；無制限給餌、F；24時間絶食、4RF；24時間絶食と4時間の再給餌、24RF；24時間絶食と24時間の再給餌]に付した野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物の肝臓における、脂質生合成経路のタンパク質の転写物レベル（Ａ〜Ｃ）およびコレステロール生合成経路のタンパク質の転写物レベル（Ｄ）を示す。転写物レベルは、「材料および方法」に記載されているように、ノーザンブロットにより分析した。  Ａ．脂肪酸シンターゼ転写物レベル。  Ｂ．グリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ転写物レベル。  Ｃ．ステロール調節エレメント結合タンパク質-1c転写物レベル。  Ｄ．ヒドロキシ−メチル−グルタリルCoAシンターゼ転写物レベル。  転写物レベルは、U1小リボ核タンパク質用のcDNAプローブを用いることにより、RNAローディングのために転写レベルを修正した。棒上の小文字は、統計的に類似したグループを示す。11βHSD-1-/-マウスにおけるトリグリセリドおよびコレステロール生合成の鍵酵素のレベルが不変であることに注意されたい。このことは、これが、認められるトリグリセリドの減少の原因ではないことを示唆している。再給餌すると、SREBP-1c、FAS、GPATおよびHMG-CoARは11βHSD-1-/-マウスにおいて、さらに急速および／または顕著に誘導され、これは、11βHSD-1-/-肝臓が、脂質生合成経路に関して、より高いインスリン作用または感受性を有することを意味する。
【０１９９】
【図４】食餌操作［AL；無制限給餌、F；24時間絶食、4RF；24時間絶食と4時間の再給餌、および24RF；24時間絶食と24時間の再給餌］に付した野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物の肝臓における、脂肪酸酸化経路でのタンパク質の転写物レベルを示す。転写物レベルは、「材料および方法」に記載されているように、ノーザンブロットにより分析した。  Ａ．カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ-I（CPT-I）転写物レベル。  Ｂ．アシルcoAオキシダーゼ転写物レベル。  Ｃ．脱共役タンパク質２転写物レベル。  Ｄ．ペロキシソーム増殖体活性化受容体−α転写物レベル。  U1小リボ核タンパク質用のcDNAプローブを用いることにより、RNAローディングのために転写レベルを修正した。棒上の小文字は、統計的に類似したグループを示す。無制限給餌の11βHSD-1-/-マウスにおけるβ−酸化の鍵酵素およびそれらの駆動転写因子PPARαの発現増加に注意されたい。これらのデータは、トリグリセリド代謝の増強が、11βHSD-1-/-マウスに認められる血漿レベルの低下の根本原因であることを示唆している。
【０２００】
【図５】11βHSD-1-/-マウスにおける肝Aα−フィブリノーゲンmRNA発現を示す。AL：無制限給餌、F：24時間絶食に付した野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物の肝臓における、Aα−フィブリノーゲンの転写物レベルを示す。棒上の小文字は、統計的に類似したグループを示す。U1小リボ核タンパク質用のcDNAプローブを用いることにより、RNAローディングのために転写レベルを修正した。独立心臓血管危険因子である、Aα−フィブリノーゲンの転写レベルが、11βHSD-1-/-マウスにおいて低下していることに注意されたい。これも、「心臓保護性」表現型を示している。
【０２０１】
【図６】健康なヒトとII型糖尿病患者における空腹時血漿脂質に対するカルベノキソロン投与の作用を示す。当業者には公知のように、無作為二重盲検交差試験で、６人のII型糖尿病患者と６人の健康な対照にプラセボ（斜線棒）およびカルベノキソロン（囲み棒）を投与した。血漿脂質の空腹時レベルを示す。
【０２０２】
【図７】11βHSD-1-/-マウスにおける血漿コルチコステロンレベル、および野生型11β-HSD-1 ｍRNAおよび活性に対する給餌状態の影響を示す［AL：無制限給餌、F：24時間絶食、4RF：24時間絶食と4時間の再給餌、24RF：24時間絶食と24時間の再給餌］に付した野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物における、  Ａ．コルチコステロンレベル、  Ｂ．11β-HSD-1 ｍRNA、  Ｃ．11β-HSD-1活性（「実験手順」に概要を記載したように、コルチコステロンから11-デヒドロコルチコステロンへの変換率（％））を示す。
【０２０３】
【図８】食餌状態および11β-HSD-1ノックアウトの影響、ならびに、血漿グルコース、インスリン、および腹腔内グルコース投与後の動的グルコース処理を示す。AL：無制限給餌、F：24時間絶食、4RF：24時間絶食と4時間の再給餌、および24RF：24時間絶食と24時間の再給餌に付した野生型（斜線棒）対11βHSD-1-/-(囲み棒)動物における、  Ａ．血漿グルコース、  Ｂ．血漿インスリンを示す。  Ｃ．野生型（●）と11βHSD-1-/-マウス(□)における16時間絶食後の腹腔内グルコース負荷（体重１ｇ当たり２mg）時のグルコース処理の動力学。
【０２０４】
【図９】痩せたZuckerラットおよび肥満Zuckerラットにおけるグルコース耐性へのカルベノキソロン投与の作用を示す。Vehはビヒクル処理動物を、CBXはカルベノキソロン処理動物をそれぞれ表す。データは、平均値±SEMであり、＊は、同じ処理グループにおける痩せたラットおよび肥満ラットを比較した際、ｐ＜0.05であることを意味し、また、＃は、同じ表現型のビヒクル処理グループと比較した際、ｐ＜0.05であることを意味する。
【０２０５】
【図１０】痩せたZuckerラットおよび肥満Zuckerラットにおける血漿脂質プロフィールへのカルベノキソロン投与の作用を示す。Vehはビヒクル処理動物を、CBXはカルベノキソロン処理動物をそれぞれ表す。NEFAは、非エステル化脂肪酸である。データは、平均値±SEMであり、＊は、同じ処理グループにおける痩せたラットおよび肥満ラットを比較した際、ｐ＜0.05であることを意味し、また、＃は、同じ表現型のビヒクル処理グループと比較した際、ｐ＜0.05であることを意味する。
【０２０６】
【図１１】痩せたZuckerラットおよび肥満Zuckerラットにおける11β-HSD1活性へのカルベノキソロン投与の作用を示す。Vehはビヒクル処理動物を、CBXはカルベノキソロン処理動物をそれぞれ表す。11β-HSD活性は、コルチコステロンから11-デヒドロコルチコステロンへの変換率（％）として表示する。データは、平均値±SEMであり、＊は、同じ処理グループにおける痩せたラットおよび肥満ラットを比較した際、ｐ＜0.05であることを意味し、＃は、同じ表現型のビヒクル処理グループと比較した際、ｐ＜0.05であることを意味する。
【０２０７】
【図１２】痩せたZuckerラットおよび肥満Zuckerラットにおける肝5β-レダクターゼ活性へのカルベノキソロン投与の作用を示す。データは、平均値±SEMであり、＊は、同じ処理グループにおける痩せたラットおよび肥満ラットを比較した際、ｐ＜0.05であることを意味し、＃は、同じ表現型のビヒクル処理グループと比較した際、ｐ＜0.05であることを意味する。5β-レダクターゼ活性は、コルチコステロンから5β-テトラヒドロコルチコステロンへの変換率（％）として表示する。
【０２０８】
【図１３】痩せたZuckerラットおよび肥満Zuckerラットにおける代謝および視床下部下垂体副腎軸特性へのカルベノキソロン投与の作用を示す。Vehはビヒクル処理動物を、CBXはカルベノキソロン処理動物をそれぞれ表す。データは、平均値±SEMであり、＊は、同じ処理グループにおける痩せたラットおよび肥満ラットを比較した際、ｐ＜0.05であることを意味し、また、＃は、同じ表現型のビヒクル処理グループと比較した際、ｐ＜0.05であることを意味する。
【０２０９】
【図１４】対照的な肝脂肪含量を有する人のグループにおける身体組成および基礎生化学を示す。*：グループ間でｐ＜0.05、***：ｐ＜0.001。
【０２１０】
【図１５】ApoEプロモーター下での肝臓における11β-HSD1のトランスジェニック過剰発現を有する代謝表現型を示す。これらの表では、３〜６匹の野生型マウス（薄いグレーの符号）および過剰発現マウス（濃いグレーの符号）から得た平均値±SEMとしてデータを示す。第１の表は、腹腔内グルコース負荷後の血漿グルコースを示す。第２の表は、空腹時血漿インスリンを示し、これは、過剰発現マウスの方が高かった（**ｐ＜0.01）。第３の表は、血漿脂質を示し、空腹時トリグリセリド（ｐ＜0.05）および全コレステロール（ｐ＝0.06）は、過剰発現マウスの方が高かった。
【０２１１】
【図１６】長期にわたる高脂肪給餌中の11βHSD-1-/-マウスおよび野生型マウスにおける体重増、食物摂取、および直腸温度を示す。野生型（薄いグレーの符号；円）および11βHSD-1-/-（濃いグレーの符号；正方形）について、１グループ当たりｎ＝７〜８匹のマウスから得た平均値±SEMとしてデータを示す。第１の表は、11βHSD-1-/-マウスにおける体重増および肥満の阻止を示す（野生型に対し*ｐ＜0.05）。第２の表は、11βHSD-1-/-マウスにおける食物消費の初期増加（減少ではない）を示す（*ｐ＜0.05）。第３の表は、対照および高脂肪給餌の両方の条件下で、11βHSD-1-/-マウスの方が、直腸温度（摂氏度）が高いことを示す（*ｐ＜0.05）。
【０２１２】
【図１７】11βHSD-1-/-マウス（黒色の符号）および野生型対照（グレーの符号）における血漿遊離脂肪酸（FFA）およびレプチン、ならびに、レプチン、脱共役タンパク質２（UCP2）およびPPARγについての皮下脂肪mRNAを示す。データは、１グループ当たり６〜８匹のマウスについての平均値±SEMである。＊は、グループ間での相違に関し、0.05を示す。
【０２１３】
【図１８】11βHSD-1-/-マウスは、マクロファージにおいてPPARγmRNAのアップレギュレーションを有する。PPARγは、特に、血管壁におけるじゅく状斑で、酸化またはアセチル化LDL-コレステロールのマクロファージによる取込みおよび輸出を媒介するのに重要である。主な作用は、ABCA1および関連輸送体を介したコレステロール輸出に対して及ぼされるようである。データから、11β-HSD1阻害は、上記斑におけるマクロファージからのコレステロール輸出を促進し、泡沫細胞形成およびそれらのアテローム発生への寄与を低減することがわかる。野生型対照（黒色の符号）および11βHSD-1-/-マウス（グレーの符号）について、１グループ当たりｎ＝６匹のマウスについての平均値±SEMとしてデータを示す。＊：野生型およびノックアウト間でｐ＜0.05。11-DHCは、11-デヒドロコルチコステロンであり、これは、野生型対照においてPPARγをダウンレギュレートするが、11-DHCを活性コルチコステロンに再活性化することができない11βHSD-1-/-マウスでは、ダウンレギュレートしない。
【０２１４】
【図１９】高肝脂肪含量を有する人における肝および末梢インスリン耐性を示す。低および高肝脂肪含量（LFAT）を有する人における高インスリン血症の最後の１時間に出現する内因性グルコースRa率。＊：低対高LFATについてｐ＜0.05。  ｂ）低および高LFATを有する人におけるインスリン注入の開始前（120分）およびインスリン注入中（120〜300分）のベースラインでの血清FFA濃度。低対高LFATについて＊：ｐ＜0.05、＊＊：ｐ＜0.02。
【０２１５】
【図２０】高肝脂肪含量（LFAT）を有する人の肝臓における肝11β-HSD1活性の増加を示す。高対低LFATの人におけるデキサメタゾンによる内因性コルチゾール分泌の抑制中および経口酢酸コルチゾン投与後の血清コルチゾール濃度。＊：低対高LFATについてｐ＜0.05。
【０２１６】
【図２１】11β-HSD1阻害は、外因性合成グルココルチコイドのグルココルチコイド作用を阻止する。  ａ）均質化したラット肝臓と一緒にインキュベートしたベクロメタゾンは11-デヒドロベクロメタゾンに変換されるが、これは、ステロイドが11β-HSD1の基質であることを示している。  ｂ）11β-HSD1阻害剤であるグリシレチン酸（GA）を添加したベクロメタゾン（BDP）すなわちBDPの局所適用は、健康なヒトの皮膚において、in vivoで皮膚退色を誘導する。これは、本明細書では、任意の単位の用量応答曲線より下の面積として測定した。GAは、この生物アッセイにおいてベクロメタゾンの作用を減弱する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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