(57)【要約】本発明は、子宮平滑筋腫の増殖の阻害および子宮平滑筋腫の形成に関する方法、Ｃｙｒ６１遺伝子の誘導を刺激する化合物および組成物、およびＣｙｒ６１の活性を増す化合物に関する。本発明は、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現を調節するリガンドをスクリーニングする方法にも関する。本発明はさらに、Ｃｙｒ６１の発現のダウンレギュレーションに伴う子宮平滑筋腫の患者の診断法に関する。本発明は、抗体および関連する医薬組成物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、該平滑筋腫組織においてＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡのレベルを増すことを含む方法。
【請求項２】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、該平滑筋腫組織においてＣｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳を増すことを含む方法。
【請求項３】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、該平滑筋腫組織においてＣｙｒ６１タンパク質の発現をアップレギュレートすることを含む方法。
【請求項４】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、該平滑筋腫組織においてＣｙｒ６１タンパク質の活性を増すことを含む方法。
【請求項５】
正常な子宮筋層組織において子宮平滑筋腫を予防する方法であって、該子宮筋層組織においてＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持することを含む方法。
【請求項６】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、該子宮筋層組織においてＣｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳活性の子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持することを含む方法。
【請求項７】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、該子宮筋層組織においてＣｙｒ６１タンパク質の発現の子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持することを含む方法。
【請求項８】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、該子宮筋層組織においてＣｙｒ６１タンパク質の活性の子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持することを含む方法。
【請求項９】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、該子宮筋層組織において塩基性繊維芽細胞成長因子またはヘパリン結合表皮成長因子に対するＣｙｒ６１タンパク質のアフィニティの子宮平滑筋腫予防レベルを維持することを含む方法。
【請求項１０】
Ｃｙｒ６１に結合する抗体。
【請求項１１】
図７に示すアミノ酸配列のアミノ酸３７１−３８１を選択的に認識する、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
キメラである、請求項１０記載の抗体。
【請求項１３】
抗−イディオタイプである、請求項１０記載の抗体。
【請求項１４】
医薬上活性な化合物と結合した、請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
医薬上活性な化合物がカリケアマイシンを含むものである、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１０記載の抗体。
【請求項１７】
ヒト化されている、請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
キメラである、請求項１６記載の抗体。
【請求項１９】
抗−イディオタイプである、請求項１６記載の抗体。
【請求項２０】
医薬上活性な化合物と結合した、請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
医薬上活性な化合物がカリケアマイシンを含むものである、請求項２０記載の抗体。
【請求項２２】
子宮平滑筋腫を診断する方法であって、疑わしい子宮筋層組織に存在するＣｙｒ６１のレベルを、当該疑わしい子宮筋層組織に対して自系の正常子宮筋層組織におけるＣｙｒ６１のレベルと比較することを含み、それにより、当該正常組織におけるＣｙｒ６１のレベルよりも当該疑わしい組織においてＣｙｒ６１のレベルが低ければ、当該疑わしい組織が子宮平滑筋腫を含むことを示すところの方法。
【請求項２３】
当該疑わしい組織および当該正常組織をＣｙｒ６１タンパク質を選択的に認識するＣｙｒ６１抗体に曝し、次いで各組織が結合した抗体の量を比較することによりＣｙｒ６１のレベルを決定し、それにより、当該正常組織が結合する抗体のレベルよりも当該疑わしい組織が結合する抗体のレベルが低ければ、当該疑わしい組織が子宮平滑筋腫を含むことを示すところの、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害するか、またはその形成を予防する化合物をスクリーニングする方法であって、当該化合物に曝した平滑筋細胞により発現されるＣｙｒ６１の第一の量を、当該化合物に曝していない当該子宮平滑筋細胞により発現されるＣｙｒ６１の第二の量と比較することを含み、それにより、第二の量よりも第一の量が多ければ、当該化合物が子宮平滑筋腫を阻害または予防し得ることを示すところの方法。
【請求項２５】
子宮を有するヒト以外のトランスジェニック動物であって、誘導されて該子宮においてＣｙｒ６１を過剰発現することができるＤＮＡを含む動物。
【請求項２６】
ＤＮＡがヒトのものである、請求項２５に記載するヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２７】
動物がマウスである、請求項２７記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２８】
請求項１０記載の抗体を含む子宮平滑筋腫を診断するためのキット。
【請求項２９】
レセプターによりＣｙｒ６１ｍＲＮＡの転写を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、細胞の第一集団における、当該細胞を試験化合物と接触させた場合にＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの検出可能量を転写するのに充分なＣｙｒ６１ｍＲＮＡのレベルを、細胞の第二集団における、当該試験化合物と接触していない、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの検出可能量を転写するのに充分なＣｙｒ６１ｍＲＮＡのレベルと比較し、それにより、細胞の当該第二集団においてＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡのレベルよりも、細胞の当該第一集団におけるＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡのレベルが高ければ、当該試験化合物がＣｙｒ６１ｍＲＮＡの転写を調節し得ることを示すところの方法。
【請求項３０】
子宮平滑筋腫の存在を検出する方法であって、疑わしい子宮平滑筋腫組織から単離されたＣｙｒ６１ｍＲＮＡのレベルを、正常な子宮筋層組織から単離されたＣｙｒ６１ｍＲＮＡのレベルと比較することを含み、当該正常組織からのＣｙｒ６１ｍＲＮＡのレベルよりも、当該疑わしい子宮平滑筋腫組織からのＣｙｒ６１ｍＲＮＡのレベルが低ければ、子宮平滑筋腫の存在を示すところの方法。
【請求項３１】
子宮平滑筋腫の存在を検出する方法であって、疑わしい子宮平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１のレベルを、正常な子宮筋層組織におけるＣｙｒ６１タンパク質のレベルと比較することを含み、当該正常組織におけるＣｙｒ６１タンパク質のレベルよりも、当該疑わしい組織におけるＣｙｒ６１タンパク質のレベルが低ければ、子宮平滑筋腫の存在を示すところの方法。
【請求項３２】
抗−平滑筋腫剤に結合した、請求項１０記載の抗体。
【請求項３３】
発現コントロール配列と操作可能な状態で結合している、図６に示す核酸を含む発現ベクター。
【請求項３４】
発現コントロール配列が、エストロゲン応答エレメントである、請求項３３記載の発現ベクター。
【請求項３５】
発現コントロール配列が、塩基性繊維芽細胞成長因子応答エレメントである、請求項３３記載の発現ベクター。
【請求項３６】
Ｃｙｒ６１の治療的有効量を発現するのに有効な量の請求項３３記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
【請求項３７】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、子宮平滑筋腫の予防を要する対象に請求項３６に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３８】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、子宮平滑筋腫の増殖を阻害することを要する対象に、請求項３６記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３９】
図７のアミノ酸配列により示される、Ｃｙｒ６１タンパク質またはそのフラグメントを含む医薬組成物。
【請求項４０】
子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、子宮平滑筋腫の予防を要する対象に、請求項３９記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項４１】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、子宮平滑筋腫の増殖を阻害することを要する対象に、請求項３９記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項４２】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、平滑筋腫組織においてＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成を刺激するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項４３】
化合物がエストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、平滑筋腫組織においてＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの翻訳を刺激するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項４５】
化合物がエストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、平滑筋腫組織においてＣｙｒ６１タンパク質の発現をアップレギュレートするのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項４７】
化合物がエストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、平滑筋組織においてＣｙｒ６１の活性を増すのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項４９】
化合物がエストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、当該子宮筋層組織においてＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成の子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５１】
化合物がエストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、当該子宮筋層組織においてＣｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳活性の子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５３】
化合物が、エストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、子宮筋腫組織においてＣｙｒ６１タンパク質の発現の子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５５】
化合物がエストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、当該子宮筋層組織においてＣｙｒ６１の活性の子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５７】
化合物がエストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
正常な子宮筋層組織における子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、当該子宮筋層組織において塩基性繊維芽細胞成長因子またはヘパリン結合表皮成長因子に対するＣｙｒ６１タンパク質のアフィニティの子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５９】
化合物がエストロゲンレセプターアンタゴニストである、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
化合物が、さらに、ＩＧＦ　ＩおよびＩＧＦ　ＩＩから成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているｍＲＮＡの平滑筋腫組織における合成をダウンレギュレートする、請求項４２記載の方法。
【請求項６１】
化合物が、さらに、ＩＧＦ　ＩおよびＩＧＦ　ＩＩから成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているｍＲＮＡの平滑筋腫組織における翻訳をダウンレギュレートする、請求項４４記載の方法。
【請求項６２】
化合物が、さらに、ＩＧＦ　ＩおよびＩＧＦ　ＩＩから成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているタンパク質の平滑筋腫組織における発現をダウンレギュレートする、請求項４６記載の方法。
【請求項６３】
化合物が、さらに、ＩＧＦ　ＩおよびＩＧＦ　ＩＩから成る群から選択される少なくとも一つのメンバーの子宮筋腫組織における活性を低下させる、請求項４８記載の方法。
【請求項６４】
化合物が、さらに、ＩＧＦ　ＩおよびＩＧＦ　ＩＩから成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているｍＲＮＡの子宮筋層組織における合成をダウンレギュレートする、請求項５０記載の方法。
【請求項６５】
化合物が、さらに、ＩＧＦ　ＩおよびＩＧＦ　ＩＩから成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているｍＲＮＡの当該子宮筋層組織における翻訳をダウンレギュレートする、請求項５２記載の方法。
【請求項６６】
化合物が、さらに、ＩＧＦ　ＩおよびＩＧＦ　ＩＩから成る群から選択される少なくとも一つのメンバーの当該子宮筋層組織における発現をダウンレギュレートする、請求項５４記載の方法。
【請求項６７】
化合物が、さらに、ＩＧＦ　ＩおよびＩＧＦ　ＩＩから成る群から選択される少なくとも一つのメンバーの当該子宮筋層組織における活性を低下させる、請求項５６記載の方法。
【請求項６８】
化合物が、さらに、塩基性繊維芽細胞成長因子およびヘパリン結合表皮成長因子から成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているｍＲＮＡの子宮筋腫組織における合成をダウンレギュレートする、請求項４２記載の方法。
【請求項６９】
化合物が、さらに、塩基性繊維芽細胞成長因子およびヘパリン結合表皮成長因子から成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているｍＲＮＡの子宮筋腫組織における翻訳をダウンレギュレートする、請求項４４記載の方法。
【請求項７０】
化合物が、さらに、塩基性繊維芽細胞成長因子およびヘパリン結合表皮成長因子から成る群から選択される少なくとも一つのメンバーの子宮筋腫組織における発現をダウンレギュレートする、請求項４６記載の方法。
【請求項７１】
化合物が、塩基性繊維芽細胞成長因子およびヘパリン結合表皮成長因子から成る群から選択される少なくとも一つのメンバーの子宮筋腫組織における活性を低下させる、請求項４８記載の方法。
【請求項７２】
化合物が、さらに、塩基性繊維芽細胞成長因子およびヘパリン結合表皮成長因子から成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているｍＲＮＡの当該子宮筋層組織における合成をダウンレギュレートする、請求項５０記載の方法。
【請求項７３】
化合物が、さらに、塩基性繊維芽細胞成長因子およびヘパリン結合表皮成長因子から成る群から選択される少なくとも一つのメンバーをコードしているｍＲＮＡの子宮筋層組織における翻訳をダウンレギュレートする、請求項５２記載の方法。
【請求項７４】
化合物が、さらに、塩基性繊維芽細胞成長因子およびヘパリン結合表皮成長因子から成る群から選択される少なくとも一つのメンバーの子宮筋層組織における発現をダウンレギュレートする、請求項５４記載の方法。
【請求項７５】
化合物が、塩基性繊維芽細胞成長因子およびヘパリン結合表皮成長因子から成る群から選択される少なくとも一つのメンバーの当該子宮筋層組織における活性を低下させる、請求項５６記載の方法。
【請求項７６】
ｍＲＮＡの合成をアンチセンス核酸によりダウンレギュレートする、請求項６０記載の方法。
【請求項７７】
ｍＲＮＡの合成をアンチセンス核酸によりダウンレギュレートする、請求項６４記載の方法。
【請求項７８】
ｍＲＮＡの合成をアンチセンス核酸によりダウンレギュレートする、請求項６８記載の方法。
【請求項７９】
ｍＲＮＡの合成をアンチセンス核酸によりダウンレギュレートする、請求項７２記載の方法。
【請求項８０】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、インテグリンレセプターに結合しているＣｙｒ６１タンパク質を調節するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項８１】
子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、インテグリンレセプターに結合しているＣｙｒ６１タンパク質を調節するのに有効な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項８２】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法であって、平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１のレベルを増すことを含む方法。
【請求項８３】
子宮平滑筋腫の形成を予防する方法であって、平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１のレベルを増すことを含む方法。
【請求項８４】
請求項３９記載の医薬組成物であって、そのフラグメントがＣｙｒ６１の機能活性を保持するもの。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、引用によりその全容を組み込む２００１年９月２９日に出願された仮特許出願出願番号第６０／２３６，８８７号から、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基き優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する、および子宮平滑筋腫の形成を予防する方法、Ｃｙｒ６１遺伝子の誘導を刺激する化合物および組成物ならびにＣｙｒ６１の活性を増す化合物に関する。本発明は、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現を調節するリガンドをスクリーニングする方法にも関する。本発明はさらに、Ｃｙｒ６１の発現のダウンレギュレーションに伴う子宮筋腫を有する患者の診断法に関する。本発明は、それらに関連する抗体および医薬組成物をも開示する。トランスジェニック動物も、本発明により企図される。
【０００３】
（発明の背景）
子宮平滑筋腫、または類繊維腫は、３０−５５歳の年齢にある女性を苦しめる生殖系の最も一般的な腫瘍である。平滑筋腫の病因および病原メカニズムに関してはほとんど知られていない。子宮平滑筋腫は、典型的には、子宮筋層の平滑筋組織の良性腫瘍と定義されている。平滑筋腫細胞は、加速した増殖（ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の結果として高まった有糸分裂活性を示す、子宮筋層中の脱分化した平滑筋細胞から生じると考えられている（Ｒｅｉｎ ａｎｄ Ｎｏｗａｋ， Ｓｅｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １９９２， １０： ３１０−３１９）。良性疾患と考えられているが、子宮平滑筋腫は、合衆国で行われた全子宮摘出の３０％以上の原因であり、女性の間に大きな健康上の重要性を提示する（Ｃｒａｍｅｒ， Ｓｅｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， １９９２， １０： ３２０−３２４）。
【０００４】
発生、細胞増殖、および腫瘍形成において役割を果たす成長因子調節前初期遺伝子の新たな群は、ＣＣＮ（ＣＴＧＦ／Ｃｙｒ６１／Ｃｅｆ１０／ＮＯＶＨ）ファミリーに属する。全ＣＣＮタンパク質は、（１）ファミリーのメンバーの間で、および種を超えて、高い程度の保存を示し、（２）システインに富み、そして細胞外マトリックス関連分子に構造上類似し、（３）多機能分子ドメインから成り、および（４）細胞接着、細胞移動、有糸分裂誘発、細胞の生存および分化などの様々な細胞機能を媒介することが示されている（Ｌａｗ ａｎｄ Ｌａｍ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ， １９９９， ２４８：４４）。
【０００５】
Ｃｙｒ６１は、細胞表面および細胞外マトリックスに結合する、分泌性の、システインに富むヘパリン結合ＣＣＮタンパク質である。詳細には、Ｃｙｒ６１は脈管形成および軟骨形成を含む、発生において調節されるプロセスに関与していることが知られている。Ｃｙｒ６１タンパク質は、Ｗｎｔ−１タンパク質および他の成長因子に似た多くの生化学的特徴を有する（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｌａｗ， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆ， １９９１， ２：３５１）。ヒトのＣｙｒ６１タンパク質は、３８１アミノ酸長であり、約４２キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。図１およびＰＣＴ出願第ＷＯ９７／３３９９５０号を参照されたい。ヒトのＣｙｒ６１遺伝子は、染色体１の短腕（ｌｐ２２−３１）に位置しており（Ｃｈａｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９９１， ８：２３； Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９９７， １４： １７５３）、そして、該遺伝子は血清刺激したＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングにより同定された（図２およびＬａｗ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． １９８７， ８４： １１８２を参照されたい）。ヒトおよびネズミのＣｙｒ６１配列の比較により、それらが９１％類似していることが示されている（ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３３９９５０号）。Ｃｙｒ６１タンパク質の発現が、ステージＩＩの浸潤性乳管癌においてアップレギュレートされることが既に示されている（２０００年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／２１３，１８２号）。
【０００６】
インテグリンは、二価のカチオンの存在下で非共有結合するα：βヘテロダイマーの膜貫通レセプターである。全てではないがいくつかのインテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質のサブセットに存在する標準的なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）結合モチーフの認識を通じて接着性リガンドと相互作用し、そして、成長因子またはサイトカインと共通するシグナリング経路を開始することができる。ＲＧＤモチーフを欠くＣｙｒ６１は、２つのインテグリン：αｖβ３およびαＩＩｂβ３に対して直接結合することが示されている（Ｋｉｒｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９８， ２７３： ３０９０； Ｂａｂｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９９， １９： ２９５８； Ｊｅｄｓａｄａｙａｎｍａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９９， ２７４： ２４３２１）。インテグリンαＶβ３は、インビボでの脈管形成に直接関与していること、および腫瘍の転移を調節することが示されている。それゆえ、脈管形成因子としてのＣｙｒ６１の効果が一部、αｖβ３により媒介されることが提案される。近年の研究により、ヒトの血小板がαＩＩｂβ３による活性化依存様式にてＣｙｒ６１に結合することが示されている（Ｊｅｄｓａｄａｙａｎｍａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ネズミのＣｙｒ６１も、繊維芽細胞で主として発現されるインテグリンであるα６β１、およびヘパリンスルフェートプロテオグリカンに、コ−レセプター様式で結合することが知られている（Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０００， ２７５： ２４９５３）。両レセプターに対する結合は、インビトロでの繊維芽細胞の接着に重要である。突然変異誘発試験により、Ｃ−末端ドメイン（ａ．ａ２５０−３５４）がα６β１に結合するのに必ず必要とされると同定されている。つまり、Ｃｙｒ６１は、細胞外マトリックス内のその所在および、それらに直接結合するその能力に基き、インテグリンリガンドであることは明らかである。
本願発明者らは、Ｃｙｒ６１の発現および活性の検出および調節が、子宮平滑筋腫の予防、診断、および治療に有用であることを見出した。
【０００７】
（発明の概要）
本発明により、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法が提供される。方法は、平滑筋腫組織において、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡのレベルを増すこと、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳を増すこと、ＣｙＲ６１タンパク質の発現をアップレギュレートすること、Ｃｙｒ６１タンパク質の活性を増すこと、またはＣｙｒ６１タンパク質のレベルを増すことを含み得る。本発明は、正常な子宮筋層組織における子宮筋腫を予防するための方法も提供する。方法は、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡ、Ｃｙｒ６１の翻訳活性、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現、Ｃｙｒ６１タンパク質の活性、または塩基性繊維芽細胞成長因子またはヘパリン結合表皮成長因子に対するＣｙｒ６１のアフィニティの、子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持することを含み得る。
【０００８】
これらの方法には、制限されるものではないが、Ｃｙｒ６１タンパク質の細胞への送達、Ｃｙｒ６１タンパク質をコードしている発現ベクターの投与、および治療的有効量の、Ｃｙｒ６１の細胞内タンパク質（例えば、インテグリンレセプター）への結合を調節する化合物の投与が含まれる。
【０００９】
Ｃｙｒ６１タンパク質の部分または全てを認識する抗体も提供される。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、キメラまたはヒト化したもの、および／または抗イディオタイプであってよい。好ましくは、これらの抗体はＣｙｒ６１と同じタンパク質ファミリーに属するタンパク質を認識または結合しない。
【００１０】
本発明により、子宮平滑筋腫を診断する方法がさらに提供される。方法には、疑わしい組織中の細胞におけるＣｙｒ６１のレベルを、疑わしい組織に対して自系の正常平滑筋層組織におけるＣｙｒ６１のレベルと比較することを含むものが含まれる。疑わしい組織における正常組織におけるよりも低レベルのＣｙｒ６１は、疑わしい組織における子宮平滑筋腫の存在を示す。この方法におけるＣｙｒ６１のレベルは、疑わしい組織と正常な組織を、Ｃｙｒ６１タンパク質を認識するＣｙｒ６１抗体へ曝し、次いで各組織に結合した抗体の量を比較することにより決定することができる。疑わしい組織において、正常組織におけるものと比較して結合抗体のレベルが低ければ、疑わしい組織における子宮平滑筋の存在を示す。
【００１１】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害または予防する化合物をスクリーニングするための方法も提供される。これらの方法には、化合物に曝した平滑筋腫細胞により発現されたＣｙｒ６１の量を、化合物に曝していない子宮平滑筋腫により発現されたＣｙｒ６１の量と比較することが含まれる。化合物に曝していない細胞と比較して、化合物に曝した細胞において発現されたＣｙｒ６１のレベルが高ければ、化合物が子宮平滑筋腫を阻害または予防し得ることを示す。
【００１２】
子宮を有し、そして例えば誘導されて子宮においてＣｙｒ６１を過剰発現することができるヒトＤＮＡなどのＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト動物も、本発明により企図される。
子宮平滑筋腫の存在を検出する方法も、本発明において企図される。これらの方法には、疑わしい子宮平滑筋腫組織からのＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、正常な子宮筋層組織からのＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することが含まれる。正常な子宮筋層組織と比較して、疑わしい子宮平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが低ければ、子宮平滑筋腫の存在を示す。
【００１３】
子宮平滑筋腫を診断するためのキットが本発明により企図される。キットには、Ｃｙｒ６１を認識する、またはＣｙｒ６１に結合する抗体が含まれる。
本発明には、発現コントロール配列と操作可能な状態で結合した、図６に示す核酸を含む発現ベクターがさらに企図される。特定の具体例において、発現コントロール配列は、エストロゲン応答エレメントまたは塩基性繊維芽細胞成長因子応答エレメントであってよい。ヘパリン結合表皮成長因子もＣｙｒ６１の発現を調節する。該ベクターまたはタンパク質を含む医薬組成物および該医薬組成物を用いて子宮平滑筋腫の増殖を予防および阻害する方法も企図される。
【００１４】
本発明により、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法が提供される。方法は、治療を必要とする対象に、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１の発現、またはＣｙｒ６１タンパク質の活性を刺激するのに有効な量の化合物を投与することを含み得る。本発明は、平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１タンパク質のトータルのレベルを増すことも企図する。所定の具体例において、子宮平滑筋腫を阻害する化合物は、ＩＧＦ　Ｉおよび／またはＩＧＦ　ＩＩｍＲＮＡの合成、ＩＧＦ　Ｉおよび／またはＩＧＦ　ＩＩｍＲＮＡの翻訳、ＩＧＦ　Ｉおよび／またはＩＧＦ　ＩＩタンパク質の発現、ＩＧＦ　Ｉおよび／またはＩＧＦ　ＩＩの活性、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの合成、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子タンパク質の翻訳、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子タンパク質の発現、または塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子の活性をダウンレギュレートをもする。
【００１５】
本発明により、子宮筋層組織において子宮平滑筋腫を予防する方法がさらに提供される。方法には、子宮筋層組織における子宮平滑筋腫を予防する必要のある対象に、子宮筋層組織における、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡ、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳活性、Ｃｙｒ６１の発現、またはＣｙｒ６１タンパク質の活性の、子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を投与することを含むものが含まれる。所定の具体例において、化合物はエストロゲンレセプターの活性を減じる。
【００１６】
本発明は、子宮平滑筋腫の増殖を予防する方法であって、塩基性繊維芽細胞成長因子またはヘパリン結合表皮成長因子に対するＣｙｒ６１タンパク質のアフィニティを増すのに有効な量の化合物を対象に投与することを含むものが提供される。
【００１７】
子宮平滑筋腫を予防する方法には、子宮平滑筋腫を予防する必要のある対象に、ＩＧＦ　Ｉおよび／またはＩＧＦ　ＩＩｍＲＮＡの合成、ＩＦＧ　Ｉおよび／またはＩＧＦ　ＩＩｍＲＮＡの翻訳、ＩＧＦ　Ｉおよび／またはＩＧＦ　ＩＩタンパク質の発現、またはＩＧＦ　Ｉおよび／またはＩＧＦＩＩの活性の、子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を投与することを含むものも含まれる。子宮平滑筋腫を予防する方法には、子宮平滑筋腫を予防する必要のある対象に、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの合成、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはへパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの翻訳、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはへパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの発現、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子の活性の、子宮平滑筋腫を予防するレベルを維持するのに有効な量の化合物を投与することを含むものが含まれる。特定の具体例において、ＩＧＦ　Ｉ、ＩＧＦ　ＩＩ、塩基性繊維芽細胞成長因子および／またはヘパリン結合表皮成長因子ｍＲＮＡの合成を、アンチセンス核酸によりダウンレギュレートする。
本願は、インテグリンレセプターに対するＣｙｒ６１の結合を調節する化合物を対象に投与することにより子宮平滑筋腫の増殖を阻害または予防するための方法をさらに開示する。
【００１８】
（図面の簡単な記載）
図１（Ａ）−（Ｄ）。ＲＡＤＥ法によるＣｙｒ６１の同定およびノーザン分析による確認。（Ａ）倍化（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）平滑筋腫（Ｌ）および同調（ｍａｔｃｈｅｄ）子宮筋層（Ｍ）組織（ｎ＝４）から抽出した全ＲＮＡから作製された３５Ｓ−放射能標識ｃＤＮＡの典型的なオートラジオグラフ。（Ｂ）平滑筋腫（Ｌ）および同調子宮筋層（Ｍ）組織から単離された全ＲＮＡの典型的なノーザンブロット。矢印は、２．４ｋｂの多い方のＣｙｒ６１転写産物および３．５ｋｂの少ない方のＣｙｒ６１転写産物を示す。（Ｃ）膜を２．０ｋｂの放射能標識したマウスグルタルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）で再プローブして、等量のサンプルローディングを確証した。（Ｄ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒおよび画像診断ソフトウェア（ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＣｙｒ６１ｍＲＮＡレベルの密度分析。＊子宮筋層コントロールと比較した、レベルの有意な低下。
【００１９】
図２（Ａ）−（Ｃ）。平滑筋腫におけるＣｙｒ６１タンパク質の発現の分析。（Ａ）平滑筋腫および同調子宮筋層組織から作製された組織タンパク質抽出物の典型的なウェスタンブロット。（Ｂ）タンパク質ブロットを次いで抗−アクチン単一特異的抗体で再プローブして、等量のタンパク質ローディングを確認した。（Ｃ）Ｂｉｏｒａｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｍａｇｅｒを用いる密度分析により定量されたＣｙｒ６１タンパク質レベル。値は、１０人の患者に関する平均±ＳＤを示す。＊子宮筋層コントロールと比較したレベルの有意な低下。
図３（Ａ）−（Ｂ）。多様なヒト組織（Ａ）およびヒト筋肉組織（Ｂ）におけるＣｙｒ６１のディファレンシャル発現。矢印は、分子量マーカーをｋｂで示す。
【００２０】
図４（Ａ）−（Ｆ）。インサイチュハイブリダイゼーションにより決定される、子宮平滑筋細胞におけるＣｙｒ６１の発現の抑制。典型的な黒のフィールド（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および明るいフィールド（ＣおよびＤ）は、子宮筋層（Ａ、ＣおよびＥ）および平滑筋腫（Ｂ、ＤおよびＦ）組織セクションの顕微鏡写真である。矢印は、Ｃｙｒ６１転写産物を発現する典型的な子宮平滑筋細胞を示す（Ｃ）。センス放射能標識ｃＲＮＡプローブは、バックグラウンドより高いシグナルを示さなかった（ＥおよびＦ）。倍率＝２００×（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および６３０×（ＣおよびＤ）、バー＝１５μｍ（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および５μｍ（ＣおよびＤ）。
【００２１】
図５（Ａ）−（Ｇ）。１７β−エストラジオールおよび塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）によるＣｙｒ６１の、エキソビボ、平滑筋腫における調節欠如。図（Ａ）−（Ｃ）は、採取したての子宮筋層を表し、および図（Ｄ）−（Ｆ）は、エタノールビヒクル、１０ｎＭの１７β−エストラジオール（Ｅ２）、１０ｎＭのＲ５０２０、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎＭのＥ２および１０ｎＭのＭ５０２０の組み合わせ、１μＭのＩＣＩ１８２，７８０、または１０ｎＭのＥ２および１μＭのＩＣＩ１８２，７８０の組み合わせのいずれかの存在下、エキソビボで培養した平滑筋腫組織標本を示す。膜を、ＧＡＰＤＨｃＤＮＡで再プローブし、サンプルローディングＣおよびＦの等量を説明した。矢印は、２．４ｋｂの多い方のＣｙｒ６１および６．２ｋｂのＥＲα転写産物を示す。（Ｇ）は、算定されたデータを示す。値は、８人の患者に関する±ＳＤを示す。＊非処置の子宮筋層組織と比較した、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡレベルの有意な増加。
【００２２】
図６　Ｃｙｒ６１の核酸配列を示す（配列番号：１）。
図７　図６の核酸配列によりコードされるＣｙｒ６１のアミノ酸配列を示す（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＡＢ５８３１９）。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する、子宮平滑筋腫の形成を予防する、子宮平滑筋腫を診断する、および子宮平滑筋腫を阻害または予防する化合物をスクリーニングする方法を開示する。これらの方法は、目的のサンプルにおけるＣｙｒ６１の転写ならびに翻訳、およびＣｙｒ６１タンパク質のレベルの、ステロイドおよび成長因子媒介性の調節を評価する、またはこれらに対するものである。本発明により、スクリーニングアッセイおよびキットも都合よく提供される。本発明のアッセイ系は、高処理量スクリーニングに、例えばアッセイ当たり数千の化合物をスクリーニングするのに適している。
【００２４】
本発明により、Ｃｙｒ６１−特異的抗体、および、Ｃｙｒ６１タンパク質の存在を検出するために、ならびに子宮平滑筋腫に関するＣｙｒ６１のアゴニストのスクリーニングにおいてこれらの物質を用いる方法に関する。
【００２５】
一般的な定義
「単離された」なる用語は、言及される物質が通常見出される環境から取り出されることを意味する。つまり、単離された生物学的物質は、細胞成分、すなわち、物質が見出されるもしくは産生される細胞の構成成分から自由であり得る。核酸分子の場合、単離された核酸には、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは制限フラグメントが含まれる。他の具体例においては、単離された核酸は、それが見出され得る染色体から好ましくは切り出され、およびより好ましくは染色体中に見出される場合に単離された核酸分子により包含される遺伝子の上流または下流に位置する非調節、非コーディング領域または他の遺伝子にはもはや結合しない。さらに別の具体例では、単離された核酸は１またはそれ以上のイントロンを欠いている。単離された核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列が含まれる。すなわち、特定の具体例において、組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞中でそれが結合する他のタンパク質もしくは核酸、またはその両方と結合していてよく、または膜結合タンパク質である場合、細胞膜と結合していてよい。単離された細胞小器官、細胞または組織は、生物体中に見出される解剖学的構造上の部位から取り出される。単離された物質は、精製される必要はないが、精製されてよい。
【００２６】
「精製された」なる用語は、関連のない物質、すなわち、物質が得られる本来の物質を含め、汚染物質の存在を減じるもしくは排除するような条件下で単離された物質を意味する。例えば、精製されたタンパク質は、好ましくは、細胞中でそれが結合している他のタンパク質または核酸分子から実質上遊離しており、精製された核酸分子は好ましくは、細胞内で共に見出されることができるタンパク質または他の関連する核酸分子から好ましくは実質上遊離している。精製は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当該分野で公知の他の方法により評価することができる。
【００２７】
「サンプル」なる用語は、Ｃｙｒ６１タンパク質またはＣｙｒ６１核酸の存在に関して試験することができる生物学的物質を意味する。そのようなサンプルは、ヒトおよび非ヒト動物などの対象から得ることができ、および、組織、特に子宮腺、バイオプシー、血液および血液産物；複数の滲出液（ｐｌｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ）；脳脊髄液（ＣＳＦ）；腹水液；および細胞培養物が含まれる。
【００２８】
「非−ヒト動物」なる用語には、制限されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットなどの実験動物、イヌおよびネコなどのペット、およびヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマおよびウシなどの牧畜が含まれる。
「反応を誘発する能力」なる用語には、リガンドの、レセプターの活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする能力が含まれる。
【００２９】
「形質転換細胞」なる用語は、目的のタンパク質をコードしているベクターから発現される機能タンパク質を発現する、変更された宿主細胞を意味する。いずれの細胞をも用いることができるが、好ましい細胞は、哺乳動物の細胞である。
「アッセイ系」なる用語は、例えばマイクロウェルプレートまたはいくらかの他の培養系におけるそのような細胞の１またはそれ以上の集まりである。細胞における試験化合物の効果の評価を可能とするために、単一アッセイ系における細胞の数は、調節されるＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の検出可能な量を発現するのに十分なものである。本発明の方法は、Ｃｙｒ６１遺伝子の転写および翻訳を調節するリガンドを試験するアッセイ系における使用に特に適している。
【００３０】
「試験化合物」は、Ｃｙｒ６１の発現および／または活性を調節するその能力を試験することができるあらゆる分子、例えばエストロゲン化合物などである。
「平滑筋腫」なる用語は、平滑筋および繊維性結合組織から成る良性腫瘍を意味する。特定の具体例において、平滑筋腫は子宮平滑筋腫である。平滑筋腫は、繊維性腫瘍、繊維筋腫、繊維腫、繊維平滑筋腫（ｆｉｂｒｏｌｅｉｏｍｙｏｍａｓ）、類繊維腫、または筋腫とも呼ばれる。「良性」なる用語は、非癌腫瘍を意味する。
「子宮筋層（ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ）」または「子宮筋層（ｍｙｏｍｅｔｒｉａｌ ｌａｙｅｒ）」なる用語は、子宮の筋肉層を意味する。
【００３１】
生物体または細胞中のＣｙｒ６１のレベルを増すことに関連して本明細書中になされる記載には、制限されるものではないが、Ｃｙｒ６１ＤＮＡの転写を刺激する方法、Ｃｙｒ６１タンパク質の翻訳を刺激する方法、Ｃｙｒ６１タンパク質のプロセシングを刺激する方法、細胞質タンパク質（例えば、インテグリンレセプター）に対するＣｙｒ６１タンパク質の結合を変更する方法、外来Ｃｙｒ６１タンパク質の添加、またはＣｙｒ６１タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターの添加が含まれる。
【００３２】
本発明のＣｙｒ６１は、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、イヌおよびニワトリを含む種々の哺乳動物源において単離、存在または検出されてよい。本発明の好ましい源はヒトである。
「子宮平滑筋腫の増殖を阻害する」なる用語は、子宮平滑筋腫の増加の速度を減じること、またはその増加を完全に停止させることを意味する。好ましい具体例において、平滑筋腫の増加の低下は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、およびより好ましくは少なくとも８０％である。
【００３３】
「子宮平滑筋腫を予防するレベル」なる用語は、正常の平滑筋腫組織における子宮平滑筋腫の形成を阻害するのに必要とされる量を意味する。
「レベル」なる用語は、活性の、ユニット（例えば、細胞）当たりのトータルの量、または速度を意味する。
イタリック体の使用は、一般に核酸分子（例えば、Ｃｙｒ６１　ｃＤＮＡ、遺伝子など）を示し、標準テキストは一般に、ポリペプチドまたはタンパク質を示す。別に、核酸分子またはタンパク質を示しているかどうかは、内容により決定することができる。
【００３４】
ＤＮＡの「増幅」なる用語は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＮＡ配列の混合物中の特定のＤＮＡ配列の濃度を増すことを意味する。ＰＣＲの記載に関しては、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： ４８７， １９８８を参照されたい。
「配列特異的オリゴヌクレオチド」なる用語は、Ｃｙｒ６１遺伝子における対立変種または変異を検出するのに用いることができるオリゴヌクレオチドの関連するセットを意味する。
【００３５】
「核酸分子」なる用語は、リボヌクレオシド（ＲＮＡ分子）またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ分子）のリン酸エステル形態、または一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかの形態の、いずれかのリン酸エステル類似体を意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡへリックスが可能である。核酸分子、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子なる用語は、分子の一次および二次構造のみを意味し、いずれかの特定の三次形態にそれを制限するものではない。つまりこの語には、とりわけ鎖状で見出される二本鎖のＤＮＡ（例えば、制限フラグメント）または環状ＤＮＡ分子、プラスミドおよび染色体が含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じるにつき、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（即ち、ｍＲＮＡに対して相同の配列を有する鎖）にそって５’から３’の方向の配列のみを与える通常の慣例に従って記載されてよい。「組換えＤＮＡ分子」は、分子の生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。分子生物学的操作の無制限の例には、酵素的リン酸化、酵素的脱リン酸化、酵素消化、およびライゲーションが含まれる。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」なる用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中のヌクレオチド塩基（いわゆる「ヌクレオチド」）の連続であり、および２またはそれ以上のヌクレオチドのあらゆる鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、典型的に、タンパク質および酵素を作製する細胞機構により用いられる情報を含む、遺伝子情報を有する。これらの用語には、二本鎖または一本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、いずれかの合成および遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、およびセンスおよびアンチセンス両ポリヌクレオチドが含まれる。これには、一本鎖および二本鎖分子、即ち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにアミノ酸骨格に対して塩基を結合することにより形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには、例えば、チオ−ウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシルなどの変更された塩基を含む核酸が含まれる。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、本来の調節（発現コントロール）配列に隣接していてよく、またはプロモーター、リボソーム内部認識部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’非コーディング領域などを含む異種構造配列と結合していてよい。核酸は当該分野で公知の多くの手段により変更されてもよい。そのような変更の無制限の例には、メチル化、「キャップ」、１またはそれ以上の天然に生じるヌクレオチドの類似体での置換、およびヌクレオチド内での変更、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を用いるものなどが含まれる。ポリヌクレオチドは、１またはそれ以上のさらなる共有結合部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射能活性金属、鉄、酸化金属など）、およびアルキル化剤などを含んでよい。ポリヌクレオチドは、メチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホールアミデート結合の形成により誘導されてよい。さらに、本明細書中のポリヌクレオチドは、検出可能なシグナルを提供することができるラベルで直接的または関節的に変更されてもよい。典型的なラベルには、ラジオアイソトープ、蛍光分子、ビオチンなどが含まれる。
【００３８】
「宿主細胞」なる用語は、細胞による物質の産生、例えば遺伝子またはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の細胞による発現などのための、いずれかの方法で、選択した、変更した、形質転換した、増加した、または用いた、または操作したあらゆる生物体のあらゆる細胞を意味する。宿主細胞はさらにまた、以下に記載するスクリーニングまたは他のアッセイに用いることができる。
【００３９】
一般には、特定のタンパク質または酵素に関する指令を有するＤＮＡ配列が、ＲＮＡの対応する配列に「転写」される。ＲＮＡ配列は次いで、タンパク質または酵素を形成するアミノ酸の配列に「翻訳」される。「アミノ酸配列」は、２またはそれ以上のアミノ酸から成るいずれかの鎖である。各アミノ酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて、１またはそれ以上の三つ組のヌクレオチドにより表現される。各三つ組は、アミノ酸に対応するコドンを形成する。遺伝子コードはいくつかの、いわゆる縮重とも呼ばれる重複を有するが、これはほとんどのアミノ酸が１以上の対応するコドンを有することを意味する。
【００４０】
「コーディング配列」、またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素などの発現産物を「コードしている」配列は、発現された場合にそのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生を生じるヌクレオチド配列であり、すなわち、該ヌクレオチド配列は、ポリペプチド、タンパク質または酵素に関するアミノ酸配列をコードする。
【００４１】
「構造遺伝子」とも呼ばれる「遺伝子」なる用語は、１またはそれ以上のタンパク質または酵素の全部または部分を含むアミノ酸の特定の配列をコードする、またはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば遺伝子が発現される条件などを決定する、調節ＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列を含んでも含まなくてもよい。構造遺伝子でないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへ転写され得るが、アミノ酸配列へは翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子のレギュレーター、またはＤＮＡの転写のレギュレーターとして機能し得る。
【００４２】
「プロモーター配列」は、細胞内にある第二の分子に結合することができ、そしてコーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。
コーディング配列は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡへと転写する場合、転写および翻訳調節配列のコントロール下にあるか、またはそれらと操作可能な状態で結合しており、これは次いでトランスＲＮＡスプライスされ（イントロンを含む場合）、そして、コーディング配列によりコードされたタンパク質へと翻訳される。
【００４３】
「発現する」および「発現」なる用語は、遺伝子またはＤＮＡ配列内の情報を表現すること、または表現させること、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによりタンパク質を作製することを意味する。ＤＮＡ配列は細胞内で、または細胞により発現されて、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば、生じたタンパク質はまた、細胞により「発現される」と言ってよい。発現産物は、細胞内、細胞外、または分泌性のものとして特徴づけることができる。「細胞内」なる用語は、細胞内にあるものを意味する。「細胞外」なる用語は、細胞外にあるものを意味する。物質は、かなりの程度で細胞外に現れる場合、細胞により、細胞のどこかから、または細胞内から「分泌されて」いる。
【００４４】
「トランスフェクション」なる用語は、外来核酸の細胞内への導入を意味する。「形質転換」なる用語は、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して所望の物質、典型的には導入された遺伝子または配列によりコードされるタンパク質または酵素を産生するよう、「外来」（即ち、外部のまたは細胞外の）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞へ導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン化された」または「外来」遺伝子または配列であってもよく、調節またはコントロール配列、例えばスタート、ストップ、プロモーター、シグナル、分泌配列または、細胞の遺伝子機構により用いられる他の配列を含んでよい。遺伝子または配列は、非機能配列または公知の機能を持たない配列を含んでよい。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容および発現する宿主細胞は、「形質転換されて」おり、および「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞へ導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属または種の細胞、または異なる属または種の細胞を含むあらゆる源から得ることができる。
【００４５】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」なる用語は、それによって、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（即ち、転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞内へ導入することができるビヒクルを意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれる。
【００４６】
ベクターの一般的なタイプは、二本鎖ＤＮＡの、通常細菌起源の、容易に追加の（外来）ＤＮＡを受容することができ、そして適当な宿主細胞へ容易に導入することができる完全独立の分子である「プラスミド」である。プラスミドベクターはコーディングＤＮＡとプロモーターＤＮＡを含むことが多く、外来ＤＮＡを挿入するのに適した１またはそれ以上の制限部位を有する。プラスミドおよび真菌ベクターを含む多数のベクターが、種々の真核および原核宿主における複製および／または発現のために記載されている。無制限の例には、本明細書に開示される、または引用されるか、またはさもなくば当業者に公知の他の方法を用いるｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｏｓｎ， ＷＩ）、ｐＲＳＥＴまたはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）および多くの適当な宿主細胞が含まれる。組換えクローニングベクターには、クローニングまたは発現のための１またはそれ以上の複製系、宿主中での選択のための、例えば抗生物質抵抗性の１またはそれ以上のマーカー、および１またはそれ以上の発現カセットが含まれることが多い。
【００４７】
「カセット」は、規定された制限部位にてベクターに挿入されることができる、発現産物をコードするＤＮＡコーディング配列またはＤＮＡのセグメントを意味する。カセット制限部位は、適当なリーディングフレームにおいてカセットの挿入を確保するべく設計される。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１またはそれ以上の制限部位にて挿入され、次いでベクターにより、伝達可能なベクターＤＮＡと共に宿主細胞へと運ばれる。挿入または追加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列、発現ベクターなどは、「ＤＮＡ構築物」とも呼ぶことができる。
【００４８】
「発現系」なる用語は、ベクターにより運ばれ、そして宿主細胞へ導入される外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための、宿主細胞および適当な条件下に適合し得る（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ベクターを意味する。一般的な発現系には、イー．コリ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、および哺乳動物宿主細胞およびベクターが含まれる。
【００４９】
「異種構造」なる用語は、天然には存在しないエレメントの組み合わせを意味する。例えば、異種構造ＤＮＡなる用語は、細胞中、または細胞の染色体部位において天然にはないＤＮＡを意味する。好ましくは、異種構造ＤＮＡには、細胞に対して外来の遺伝子が含まれる。異種構造発現調節エレメントは、本来、それが操作可能な状態で結合しているものとは異なる遺伝子に操作可能な状態で結合しているエレメントなどである。
【００５０】
「自系の」なる用語は、同じ個体から得られる標本を意味する。例えば、自系組織は、同じ個人から得られた異なる組織標本を意味する。特定の具体例において、疑わしい子宮平滑筋腫と自系正常子宮筋層は、同じ個体から得られた異なる子宮組織標本を意味する。
【００５１】
「変異体」および「変異」なる用語は、遺伝子物質、例えばＤＮＡにおけるいずれかの検出可能な変化、またはそのような変化のいずれかのプロセス、メカニズムまたは結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変化した遺伝子変異、いずれかの変異プロセスから生じるあらゆる遺伝子またはＤＮＡ、および変更された遺伝子またはＤＮＡ配列により発現されるあらゆる発現産物（例えば、タンパク質または酵素）が含まれる。「変異体」なる用語は、変更または改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞など、即ち、あらゆる種類の変異体を含んでよい。
【００５２】
核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの他の核酸分子に対し、一本鎖形態の核酸分子が他の核酸分子に適当な温度条件および溶液イオン強度下でアニールすることができる場合、「ハイブリダイズできる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， 既出を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ホモロガスな核酸の予備スクリーニングのためには、５５℃のＴｍ（融点）に対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルクを用い、ホルムアミドは含まない；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いることができる。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応し、例えば４０％ホルムアミドを５×または６×ＳＣＣと用いる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最高のＴｍに対応し、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣを用いる。ＳＣＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　Ｎａ−シトレートである。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的な配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが起こり得る。ハイブリダイズしている核酸の適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当業者に周知の変化に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の類似性またはホモロジーの程度が大きいほど、それらの配列を有している核酸のハイブリッドのためのＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さにして１００ヌクレオチドより大きいハイブリッドに関して、Ｔｍを算出する等式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 既出、９． ５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要となり、そして、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 既出、１１．７−１１．８を参照されたい）。ハイブリダイズ可能な核酸に関して最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、およびより好ましくはその長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００５３】
特定の具体例において、「通常のハイブリダイゼーション条件」なる用語は、５５℃のＴｍを意味し、および前記の条件を用いるものである。好ましい具体例において、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい具体例においては、Ｔｍは６５℃である。特定の具体例において、「高ストリンジェンシー」は、０．２×ＳＳＣ中６８℃にて、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中４２℃にて、またはこれらの２つの条件のいずれかの下で認められるものと同等のハイブリダイゼーションのレベルを提供する条件下でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を意味する。
【００５４】
「オリゴヌクレオチド」なる用語は、一般に、目的の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは他の核酸をコードしているゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは１００以下のヌクレオチドの核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば３２Ｐ−ヌクレオチドまたは、ビオチンなどのラベルを共有結合したヌクレオチドで標識することができる。一具体例において、標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。他の具体例において、オリゴヌクレオチド（その１または両方を標識してよい）は、Ｃｙｒ６１の全長またはフラグメントのクローニングのために、またはＣｙｒ６１をコードしている核酸の存在を検出するために、ＰＣＲプライマーとして用いることができる。一般にオリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸シンセサイザーにて人工的に調製する。
【００５５】
本発明により、細胞中でのＣｙｒ６１の発現を阻害するため、またはＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはＤＮＡを位置付けるために用いられてよいアンチセンス核酸（リボザイムを含む）が提供される。「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子中の相補的な塩基と細胞質条件下でハイブリダイズする際に、後者の役割を阻害する一本鎖の核酸分子またはオリゴヌクレオチドである。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写物である場合、アンチセンス核酸は逆転写産物またはｍＲＮＡ−干渉相補的核酸である。現在用いられているように、「アンチセンス」には、広くＲＮＡ−ＲＮＡの相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡの相互作用、リボザイムおよびＲＮａｓｅ−Ｈ介在性の抑制（ａｒｒｅｓｔ）が広く含まれる。アンチセンス核酸分子は、細胞中での発現のための組換え遺伝子によりコードされることができ（例えば、米国特許第５，８１４，５００号および５，８１１，２３４号）、または別法として、それらは人工的に調製することができる（例えば、米国特許第５，７８０，６０７号）。
【００５６】
平滑筋腫
前記のように、「平滑筋腫」なる用語は、平滑筋および繊維性結合組織から構成される腫瘍を意味する。平滑筋腫は、単細胞の体細胞変異から生じると考えられている。子宮平滑筋腫は、子宮に関連する腫瘍を意味する。子宮平滑筋腫は、腫瘍および侵されている子宮層の位置に基いて分類することができる。子宮平滑筋腫の位置は、（ａ）頚部、（ｂ）峡部、または（ｃ）体部と類別し得る。子宮頚部の平滑筋腫は一般に膣へと進行し、および洞瘻（ｓｉｎｕｓｉｏｒｒａｇｉａ）および感染を引き起こす可能性がある。峡部子宮平滑筋腫は、痛みや泌尿器の問題をしばしば引き起こす。最も一般的な位置の体部子宮平滑筋腫は、無症候性であることが多い。子宮平滑筋腫は、（ａ）漿膜下、（ｂ）粘膜下、または（ｃ）子宮層内壁を冒す可能性がある。内壁平滑筋腫はこの腫瘍の最も一般的な形態であり、子宮壁内に生じる。
【００５７】
疫学研究は、子宮平滑筋腫が３０歳を越す女性の約３０％に存在することを示している。平滑筋腫を有する女性のほとんどは無症候性であり、罹患している患者の３５−５０％のみが問題を感じている。子宮平滑筋腫に伴ういくつかの問題には、制限されるものではないが、異常な子宮の出血、痛み、不妊、泌尿器の症状、腸の症状、および静脈の鬱血が含まれる。急速に増大している平滑筋腫は、良性腫瘍から悪性腫瘍へ変化しているのしるしとなり得る。
【００５８】
ウイルスおよび非ウイルスベクター
特にインビトロおよびインビボでの細胞アッセイに好ましいベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスベクター、および所望の細胞親和性を有する他の組換えウイルスである。つまり、機能タンパク質または変異タンパク質またはそのポリペプチドドメインフラグメントをコードしている遺伝子を、ウイルスベクターを用いてインビボ、エキソビボ、またはインビトロで、またはＤＮＡの直接導入により導入することができる。標的組織における発現は、トランスジェニックベクターを、ウイルスベクターまたはレセプターリガンドを用いるなどして特定の細胞へ標的することにより、または組織特異的プロモーターを用いることにより、またはその両方により成し遂げることができる。標的遺伝子送達は、ＰＣＴ公開第９５／２８４９４号に開示されている。
【００５９】
インビボまたはエキソビボでのターゲッティングおよび治療法に一般に用いられるウイルスベクターは、ＤＮＡに基くベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築する、および用いる方法は、当該分野で公知である（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９２， ７： ９８０−９９０を参照されたい）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損である、すなわち、それらは標的細胞中で自律的に複製することができない。好ましくは、複製欠損ウイルスは、最小の（ｍｉｎｉｍａｌ）ウイルスであり、すなわちそれは、ゲノムをカプセルに入れてウイルス粒子を作製するのに必要なそのゲノムの配列のみを保持する。
【００６０】
ＤＮＡウイルスベクターには、制限されるものではないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピロマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）などの弱毒化もしくは欠損ＤＮＡウイルスが含まれる。ウイルス遺伝子を完全にもしくはほぼ完全に欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞への導入後に伝染しない。欠損ウイルスベクターの使用により、ベクターが他の細胞を感染し得る懸念なく、特定の、局部領域における細胞へ投与することが可能となる。つまり、特定の組織を特異的に標的することができる。特定のベクターの例には、制限するものではないが、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １９９１， ２： ３２０−３３０）、糖タンパクＬ遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター、または他の欠損ヘルペスウイルスベクター（ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２１８０７号および第ＷＯ９２／０５２６３号）；およびＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌにより開示される（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １９９２， ９０： ６２６−６３０； Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２５９： ９８８−９９０も参照されたい）ベクターなどの弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ関連ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｏｌ．， １８９７， ６１： ３０９６−３１０１； Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＶＩｒｏｌ．， １９８９， ６３： ３８２２−３８２８； Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８８， ８： ３９８８− ３９９６）が含まれる。
【００６１】
制限されるものではないが、Ａｖｉｇｅｎ， Ｉｎｃ． （Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ； ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ； レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ， Ｉｎｃ． （Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ， ＰＡ； アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ； アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ； レンチウイルスベクター）、およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ （Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ， Ｆｒａｎｃｅ； アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）を含む種々の会社がウイルスベクターを工業的に製造している。
【００６２】
アデノウイルスベクター．　アデノウイルスは、種々の細胞タイプへと本発明の核酸を有効に送達するために変更することができる、真核生物のＤＮＡウイルスである。種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型の中で、タイプ２またはタイプ５ヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２６９１４号を参照されたい）を用いるよりも好ましいものが、本発明の範囲内で与えられる。本発明の範囲内で用いることができる動物起源のこれらのアデノウイルスには、イヌ、ウシ、ネズミ（例： Ｍａｖ１， Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９０， ７５−８１）、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、およびサル（例：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが含まれる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌのアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株、ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）である。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが開示されている（ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２６９１４号、第ＷＯ９５／０２６９７号、第ＷＯ９４／２８９３８号、第ＷＯ９４／２８１５２号、第ＷＯ９４／１２６４９号、第ＷＯ９５／０２６９７号、第ＷＯ９６／２２３７８号）。本発明による複製欠損組換えアデノウイルスは、当該分野の専門家に公知のいずれかの方法により調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １９９１， １０１：　１９５； 欧州公開第ＥＰ１８５５７３号；Ｇｒａｈａｍ， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９８４， ３： ２９１７； Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， １９７７， ３６：５９）。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の常套の分子生物学的方法を用いて回収および精製する。
【００６３】
アデノ関連ウイルス
アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）は、安定かつ部位特異的方法で、それらが感染する細胞のゲノムへと統合することができる、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の生育、組織形成、または分化にいかなる影響をも誘発することなく、広範囲の細胞に感染することができ、およびそれらはヒトの病気には関与しないと考えられる。ＡＡＶゲノムは、クローン化され、配列決定され、および特徴づけられている。インビトロおよびインビボで遺伝子を輸送するためのＡＡＶ由来のベクターの使用が開示されている（ＰＣＴ公開第９１／１８０８８号、および第ＷＯ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号および第５，１３９，９４１号；欧州公開第ＥＰ４８８，５２８号を参照されたい）。本発明による複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆末端繰り返し（ＩＴＲ）領域に隣接する目的の核酸配列を含んでいるプラスミド、およびＡＡＶエンキャプシデーション遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を有するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）で感染した細胞系統に同時感染することにより調製することができる。作製されたＡＡＶ組換え体は、次いで常套法により精製する。
【００６４】
レトロウイルスベクター．　他の具体例において、遺伝子は、例えば米国特許第５，３９９，３４６号； Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９８３， ３３： １５３； 米国特許第４，６５０，７６４号および第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９８８， ６２： １１２０； 米国特許第５，１２４，２６３号；欧州特許第ＥＰ４５３２４２号および第ＥＰ１７８２２０号；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ．， １９８５， ７： ２３５； ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９８５， ３： ６８９； ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０７３５８号；およびＫｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １９９３， ８２： ８４５に開示されているような、レトロウイルスベクター中に導入することができる。レトロウイルスは、分裂している細胞に感染する完全ウイルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ）である。レトロウイルスゲノムは２つのＬＴＲ、エンキャプシデーション配列および３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクター中、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は全部または部分的に欠失しており、および目的の異種構造核酸配列で置きかえられる。これらのベクターは、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「ネズミＭｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス」ＭＳＶ（「ネズミＭｏｌｏｎｅｙ肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス」；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＡＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびＦｒｉｅｎｄウイルスなどの異なるタイプのレトロウイルスから構築することができる。適当なパッケージング細胞系統が当該分野で開示されており、特に細胞系統ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系統（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０６号）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系統（ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０７１５０号）が開示されている。加えて、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するために、ＬＴＲ内に変更ならびにｇａｇ遺伝子の部分を含んでよい拡張エンキャプシデーション配列を含むことができる（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９８７， ６１： １６３９）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の常套法により精製する。
【００６５】
レトロウイルスベクターを構築して、感染粒子として機能させ、または単一のラウンドのトランスフェクションを行うことができる。前者の場合、発癌性のトランスフェクション特性の原因であるものを除くその遺伝子の全てを保持するよう、そして異種構造遺伝子を発現するようウイルスを変更する。非感染性のウイルスベクターを操作して、ウイルスパッケージングシグナルは破壊し、しかし、異種構造遺伝子およびパッケージングシグナルを含むよう操作された、同時導入されるウイルスをパッケージするのに必要とされる構造遺伝子はそのままにしておく。従って、作製されるウイルス粒子は、更なるウイルスを作製することができない。
レトロウイルスの複製の１サイクルを可能にし、そしてトランスフェクション効率を増すＤＮＡウイルスにより、レトロウイルスベクターを導入することもできる（ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／２２６１７号、第ＷＯ９５／２６４１１号、第ＷＯ９６／３９０３６号、および第ＷＯ９７／１９１８２号を参照されたい）。
【００６６】
レンチウイルスベクター．　他の具体例では、レンチウイルスベクターを、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含む種々の組織タイプの移入遺伝子の直接送達および持続発現のための作用因として用いることができる。ベクターはこれらの組織において効率的に分裂細胞および非分裂細胞を形質導入し、そして、目的の遺伝子の長期発現を維持することができる。概説としては、Ｎａｌｄｉｎｉ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９８， ９： ４５７−６３を参照されたい；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｏｌ．， １９９８， ７２： ９８７３−８０も参照されたい）。レンチウイルスパッケージング細胞系統が入手可能であり、および当該分野で一般に公知である。それらにより、遺伝子治療のための高タイターのレンチウイルスベクターの産生が容易になる。例には、少なくとも３から４日間１０６ＩＵ／ｍｌより大きいタイターでウイルス粒子を作製することができるテトラサイクリン誘導性のＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスパッケージング細胞系統がある（Ｋａｆｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｒｏｌ．， １９９９， ７３： ５７６−５８４）。誘導性細胞系統により作製されたベクターは、インビトロおよびインビボで非分裂細胞を有効に形質導入するのに必要とされる程度に濃縮することができる。
【００６７】
非ウイルスベクター．　他の具体例において、ベクターはインビボで、リポフェクションにより裸のＤＮＡとして、または他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）を用いて導入することができる。合成カチオン脂質を用いて、マーカーをコードしている遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８７， ８４： ７４１３−７４１７； Ｆｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ３３７： ３８７−３８８； Ｍａｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８８， ８５： ８０２７−８０３１； Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２５９： １７４５−１７４８を参照されたい）。核酸を輸送するための有用な脂質化合物および組成物がＰＣＴ特許公開第９５／１８８６３号および第ＷＯ９６／１７８２３号、および米国特許第５，４５９，１２７号に開示されている。脂質はターゲッティングのために他の分子と化学結合させてよい（Ｍａｃｋｅｙ ｅｔ ｌａ．， 既出を参照されたい）。標的ペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子をリポソームに化学結合させることができる。
【００６８】
他の分子、例えばカチオン性オリゴペプチド（例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９６／２５５０８号）またはカチオン性ポリマー（例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９５／２１９３１号）なども、インビボでの核酸のトランスフェクションを容易にするのに有用である。
【００６９】
インビボで、裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは所望の宿主細胞に、当該分野で公知の方法、例えばエレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用により導入することができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９２， ２６７： ９６３−９６７； Ｗｕ ａｎｅ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８８， ２６３： １４６２１−１４６２４； カナダ特許出願第２，０１２，３１１号； Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９１， ８８： ２７２６−２７３０を参照されたい）。レセプター媒介性のＤＮＡ送達法も用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １９９２， ３： １４７−１５４； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８７， ２６２： ４４２９−４４３２）。米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号は、外来ＤＮＡ配列の、トランスフェクション促進剤を用いずに行う、哺乳動物における送達を開示する。近年、比較的低電圧の、高効率のインビボＤＮＡ輸送法であって、電子輸送と呼ばれるものが開示された（Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃ．Ｐ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８８， ３２１： ８９３； ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０１１５７号；第ＷＯ９９／０１１５８号；第ＷＯ９９／０１１７５号）。
【００７０】
抗体およびアンチセンス構築物
本発明は、細胞、特に子宮平滑筋腫などの平滑筋腫細胞におけるＣｙｒ６１の存在を検出するのに用いることができる抗体を開示する。さらに、該抗体（例えば、抗−イディオタイプ抗体）を用いて、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する、またはその形成を予防することができる。治療法において用いられる抗体は、医薬活性化合物に結合していてよい。
【００７１】
本発明に従い、組換えにより、または化学合成により作製されたＣｙｒ６１ポリペプチドおよびフラグメントまたは他の誘導体を免疫原として用いて、Ｃｙｒ６１ポリペプチドまたはその部分を認識する抗体を作製してよい。免疫原として用いられるポリペプチドの部分を特異的に選択して、開発された抗体の免疫原性を変更してよい。そのような抗体には、制限されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。ヒトＣｙｒ６１に特異的な抗体は、Ｃｙｒ６１の野生型または変異体を認識し得る。好ましくは、抗体は、Ｃｙｒ６１と同じタンパク質ファミリーに属するタンパク質を認識せず、またはそれに結合しない。特定の具体例において、抗体は少なくとも８アミノ酸、好ましくは８−１０アミノ酸、およびより好ましくは１５−３０アミノ酸から成る。好ましい抗体は、制限されるものではないが、（図７に記載されている）Ｃｙｒ６１のアミノ酸３７１−３８１に対して作製される。好ましくは、抗体は連続しているＣｙｒ６１ポリペプチドに関するアミノ酸を認識し、またはそれに結合する。
【００７２】
当該分野で公知の種々の方法を、ポリペプチド、誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の作製に用いてよい。抗体の作製のために、制限されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含む種々の宿主動物を、ポリペプチドまたは誘導体（例えば、フラグメントまたは融合タンパク質）での注射により免疫化することができる。ポリペプチドまたはそのフラグメントは、免疫原性のキャリア、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合ことができる。宿主種により、制限されるものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）の、水酸化アルミニウムなどのミネラルジェル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ＫＬＨ、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム　パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどの界面活性剤を含む種々のアジュバントを用いて免疫反応を増してよい。
【００７３】
Ｃｙｒ６１ポリペプチド、フラグメント、その類似体または誘導体に対するモノクローナル抗体は、用いられてよい培地中の継代細胞系統による抗体分子の作製を提供するあらゆる技術により調製されてよい。これらには、制限されるものではないが、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７， １９７５）によりオリジナルに開発されたハイブリドーマ法、ならびにトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２， １９８３； Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０： ２０２６−２０３０， １９８３）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ ７７−９６， １９８５）が含まれる。「キメラ抗体」を、ポリペプチドに特異的な非ヒト抗体分子由来の遺伝子を、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることにより作製してよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５９： ８７０， １９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６０４−６０８， １９８４； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２−４５４， １９８５）。
【００７４】
抗体の作製および使用において、所望の抗体をスクリーニングすること、またはそれを用いて試験することは、当該分野で公知の方法、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、イムノ拡散アッセイ、（例えば、コロイド状の金、酵素またはラジオアイソトープラベルを用いる）インサイチュイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどにより達成することができる。
【００７５】
前述の抗体を、ポリペプチドの位置および活性に関する当該分野で公知の方法において、例えばウェスタンブロッティング、ポリペプチドをインサイチュで画像処理すること、適当な生理学的サンプルにおけるそのレベルを測定することなどのために、前記または当該分野で公知の検出法のいずれかを用いて用いることができる。そのような抗体は、例えば米国特許第５，６７９，５８２号に開示されているようなリガンドの結合のためのアッセイに用いることもできる。抗体の結合は一般に生理学的条件、例えば約７と８の間のｐＨ、および生理学的イオン強度の下で最も容易におこる。バッファー溶液中にキャリアタンパク質が存在するとアッセイが安定化する。例えばイオン強度、温度またはｐＨを増すことまたは減じること、または洗剤またはカオトロピック塩を添加することなど、最適条件の変動に関してある程度の許容度があるが、そのような変動により結合の安定性は減るであろう。
【００７６】
特定の具体例において、Ｃｙｒ６１ポリペプチドの活性をアゴナイズする抗体を作製することができる。特に、細胞内一本鎖Ｆｖ抗体を用いてＣｙｒ６１を調節することができる。そのような抗体は、リガンドを同定することに関する以下に記載のアッセイを用いて試験することができる。
【００７７】
他の特定の具体例において、本発明の抗体は、抗−イディオタイプ抗体である。これらの抗体は、系に存在する他の抗体を認識し、およびまたはそれに結合する。抗−イディオタイプ抗体はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化のものであってよい。さらに、抗体は、医薬上活性な化合物に結合してよい。特定の具体例において、医薬活性化合物はカリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）である。
【００７８】
他の特定の具体例において、制限されるものではないが、抗−イディオタイプなどの抗体を、例えば小分子、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの二次成分に結合する。結合物は、抗体を二次成分に結合させる抗体の化学的変更により作製し得る。結合した抗体により、例えば抗生物質などの二次成分の、目的の部位に対する標的化が可能となる。二次成分は、いかなるサイズまたは長さであってもよい。特定の具体例において、二次成分は医薬活性化合物である。医薬活性化合物は、制限されるものではないが、抗−平滑筋腫剤またはカリケアマイシンであり得る。
【００７９】
本発明のさらなる態様は、既に論じたように、医薬化合物またはＣｙｒ６１ペプチドを標的するための抗体の使用に関する。この具体例において、腫瘍細胞に対して特定の化合物を提示するのに、Ｃｙｒ６１に対する抗体を用いる。化合物、好ましくは抗腫瘍剤は、抗体と結合させる場合、標的化合物または標的剤と呼ばれる。そのような標的化合物および標的剤を作製する方法は、当該分野で公知である。標的化合物およびその調製における典型的な開示は、米国特許第５，０５３，９３４号；５，７７３，００１号；および第６，０１５，５６２号に記載されている。
【００８０】
癌細胞に対する活性を有するあらゆる所望の剤を、標的剤の作製に用いてよい。そのような化合物の例は、米国特許第６，０１５，５６２号に開示されている。特に、米国特許第４，９７１，１９８号；５，０７９，２３３号；４，５３９，２０３号；４，５５４，１６２号；４，６７５，１８７号；および４，８３７，２０６号を参照されたい。これらの公開文献は、標的の医薬化合物として用いられてよい抗腫瘍剤および抗生物質について言及している。
【００８１】
本発明により、抑制タンパク質、特に、細胞増殖におけるＣｙｒ６１の効果を抑制するタンパク質によりＣｙｒ６１の発現を阻害または予防するのに用い得るアンチセンス核酸（リボザイムを含む）が提供される。Ｃｙｒ６１のトータルのレベルを増すアンチセンス核酸を用いて、Ｃｙｒ６１の細胞内タンパク質（例えばインテグリンレセプター）への結合を調節してもよい。さらに、アンチセンス核酸を診断ツールとして用いて、子宮平滑筋腫を含んでいる疑いのあるサンプルにおいて、Ｃｙｒ６１の転写および／または翻訳の変化を測定してもよい。
【００８２】
「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子中の相補的な塩基と細胞質条件下でハイブリダイズすることにおいて、後者の役割を阻害する一本鎖の核酸分子またはオリゴヌクレオチドである。好ましい具体例において、アンチセンス核酸は少なくとも約１０ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、およびより好ましくはその長さは、少なくとも約２０ヌクレオチドである。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写物である場合、アンチセンス核酸は逆転写産物またはｍＲＮＡ−干渉相補的核酸である。現在用いられているように、「アンチセンス」は、広く、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、リボザイムおよびＲＮａｓｅ−Ｈ媒介性の抑制を含む。アンチセンス核酸分子は、細胞中での発現のための組換え遺伝子によりコードされ得（例えば、米国特許第５，８１４，５００号および第５，８１１，２３４号）または別法として、それらは人工的に調製することができる（例えば、米国特許第５，７８０，６０７号）。これらのオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物を含むベクターも企図される。
【００８３】
化合物
卵巣ステロイド
「卵巣ステロイド」は、制限するものではないが、エストロゲンおよびプロゲステロンを含む、生殖器官、特に卵巣から分泌されるホルモン物質の１クラスを言う。
エストロゲン化合物は、例えば、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｔｏｎ Ｎ．Ｈ．からの「ステロイド」第１１版において記載されている。その中に開示されている非ステロイド性のエストロゲンも含まれる。他の化合物には、誘導体、代謝物、およびプレカーサーが含まれる。１以上の化合物の混合物も含まれる。そのような混合物の例は、米国特許第５，５５４，６０１号の表ＩＩ（コラム６を参照されたい）に提供される。単独または他の剤と組み合わせたエストロゲンの例が、米国特許第５，５５４，６０１号に提供されている。
【００８４】
β−エストロゲンは、エストロゲン化合物のβ−異性体である。α−エストロゲンは、エストロゲン成分のα−異性体である。「エストラジオール」なる用語は、特記しない場合、α−またはβ−エストラジオールのいずれかである。
「Ｅ２」なる用語は、１７β−エストラジオールと同義である。
【００８５】
プロゲステロン化合物は、例えば、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．からの「治療に関する薬理学的基礎」の第９版において記載されている。プロゲスチン化合物には、例えば、２１の炭素骨格および１９の炭素（１９−ノルテストステロン）骨格を含むプロゲスチンが含まれる。非ステロイド性のプロゲスチン化合物、誘導体、プレカーサー、および代謝産物も、本明細書中に企図される。
【００８６】
好ましくは、非−女性エストロゲン化合物が、本明細書中に用いられる。非−女性エストロゲン化合物は、対象に女性的な特徴をもたせる効果を生じない化合物を意味する。そのような化合物は、子宮肥大および他の望ましくない副作用を引き起こさないという利点を有し、ゆえに、より高い有効投与量にて用いることができる。非−女性エストロゲンの例には、ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ； Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ； Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、および他の選択的エストロゲンレセプターモジュレーターが含まれる。
【００８７】
成長因子
成長因子は、細胞分裂の刺激に関与しているタンパク質の１クラスである。これらのタンパク質は細胞表面レセプターと相互作用して、細胞の生存を助長する転写因子を誘導する。成長因子レセプターは、高度に保存されたシグナル変換経路であるＲａｓ経路を経てシグナルを出す。Ｒａｓ経路は、放射能治療において細胞の生存を助長するのに機能し、そして、活性化された細胞内生存経路を構造的に生じるこの経路の遺伝子変化は、癌の進行と関連していることが多い。
【００８８】
成長因子には、例えば成長因子レセプターと相互作用して、成長因子ペプチドを用いて認められるものと同じ効果を生じる小分子化合物も含まれる。含まれる他の化合物は、内在性成長因子の誘導体、代謝物、およびプレカーサーである。本発明の特定の具体例において、用いられる特定の成長因子には、制限されるものではないが、表皮成長因子、ヘパリン結合表皮成長因子、および塩基性繊維芽細胞成長因子が含まれる。
【００８９】
アッセイ系
Ｃｙｒ６１アゴニストまたはアンタゴニスト、ステロイド、非ステロイドおよび成長因子レセプターアゴニストおよびアンタゴニストの機能活性を評価するのを可能とするあらゆる細胞アッセイ系が、本発明により企図される。特定の具体例においては、アッセイを用いてステロイドレセプターの特定の異性体形態と相互作用してＣｙｒ６１の転写および翻訳を調節する化合物を同定することができるが、これは、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの転写、Ｃｙｒ６１の翻訳、またはＣｙｒ６１の活性を調節する試験化合物の効果を評価することにより評価することができる。
【００９０】
いずれかの常套法により、発現される生成物の検出が可能となる。例えば、本発明には、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡ産物を検出するためのノーザンブロット分析が包含される。方法は、例えば、アガロースゲル上に全細胞内ＲＮＡを分別し、ＲＮＡを固体の支持膜へと写し、次いで標識したＤＮＡプローブ、ここでＤＮＡプローブは、サンプル中のＤＮＡプローブとＲＮＡ成分間に安定な複合体を形成することができる条件下にてＣｙｒ６１の特定の核酸配列に特異的である、でＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を検出することから成るステップを含む。そのような複合体は、当該分野で公知のいずれかの適当な方法、例えば、ＥＣＬおよび蛍光を用いることにより検出してよく、ここにおいて、複合体の検出により、サンプル中のＣｙｒ６１の存在が示される。
【００９１】
典型的には、イムノアッセイは、標識された抗体か、（例えば、抗体に対する結合に関して、サンプル中の抗原と競合する）標識された抗原性の成分のいずれかを用いる。適当な標識には制限されるものではないが、酵素に基くもの、蛍光、化学ルミネッセント、放射能活性、または色素分子が含まれる。例えば、ビオチンおよびアビジンを用いるもの、およびＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識イムノアッセイなど、プローブからシグナルを増幅するアッセイも公知である。
【００９２】
インビトロスクリーニング法
候補化合物を、当該分野で公知の方法により調製した宿主細胞のインビトロ細胞培養物中に添加し、継いでＣｙｒ６１ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを測定する。種々のインビトロ系を用いて、Ｃｙｒ６１の転写および翻訳における新規化合物の効果を分析することができる。好ましくは、各実験は、１回以上、化合物の多様な異なる希釈の３つ組で行う。
【００９３】
本発明の宿主細胞スクリーニング系により、２種のアッセイ：直接活性アッセイ（アゴニストスクリーン）および阻害アッセイ（アンタゴニストスクリーン）が可能となる。アゴニストスクリーンは、試験化合物と接触した宿主細胞による遺伝子の発現のレベルの変化、一般的には、遺伝子の発現の増加を検出することを含む。Ｃｙｒ６１遺伝子が発現されたら、試験化合物がレセプターの相互作用によりＣｙｒ６１の転写を刺激している。
【００９４】
アンタゴニストスクリーンは、Ｃｙｒ６１の発現を調節する化合物と接触させた場合の宿主細胞によるレポーター遺伝子の発現を検出することを含む。Ｃｙｒ６１の発現が低下したなら、試験化合物は候補アンタゴニストである。レポーター遺伝子の発現に、変化も増加もない場合、試験化合物は有効なアンタゴニストではない。
【００９５】
本明細書中に開示されるアッセイ系は、アゴニストおよびアンタゴニストの高処理量一次スクリーニングに用いられてよく、または、例えばレセプターと相互作用し、そしてＣｙｒ６１の転写に影響を与える化合物を同定する結合アッセイスクリーニングなどの別個の一次スクリーニングにより同定される候補化合物の二次機能スクリーニングとして用いられてよい。
【００９６】
トランスジェニック動物を用いるインビボ試験
トランスジェニック動物、および好ましくは哺乳動物を、Ｃｙｒ６１の分子機構を評価するために調製することができる。好ましくは、ヒトの治療に用いる化合物を評価するために、動物をＣｙｒ６１に対して「ヒト化」する。そのような哺乳動物は、薬物候補をスクリーニングまたは試験するための優れたモデルを提供する。「トランスジェニック」なる用語は、通常、生殖系および体細胞が目的の移入遺伝子、すなわちＣｙｒ６１を含む動物を意味する。しかし、トランジェントなトランスジェニック動物を、本発明の発現ベクターの、エキソビボまたはインビボでの誘導により作製することができる。両タイプの「トランスジェニック」動物が、本発明における使用、例えば、試験化合物のＣｙｒ６１またはＣｙｒ６１の活性における効果を評価するために企図される。
【００９７】
つまり、この系の分子生物学を、ヒトの対象を用いて可能である以上に詳細に評価するために、ヒトのＣｙｒ６１、「ノック−イン」哺乳動物を調製することができる。「ノックアウト」動物において化合物または疾患を評価すること、例えばＣｙｒ６１またはＣｙｒ６１の活性の欠損を補い得る化合物を同定することも可能である。両技術により、細胞ゲノム中のその天然の位置において遺伝子情報の単一ユニットの操作、および最終的に分化した生物体の背景におけるその操作の結果を決定することが可能となる。
【００９８】
ラットおよびマウスならびにウサギは、特にインビボでのタンパク質の機能および遺伝子の調節に関する研究室における試験のためにトランスジェニック動物として最もよく用いられるが、本発明の実施においては、あらゆる動物を用いることもできる。
【００９９】
「ノックイン」哺乳動物は、内在遺伝子が異種構造遺伝子で置換された哺乳動物である（Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ． ３： ３３１， １９９１）。好ましくは、異種構造遺伝子または調節系は、異種構造遺伝子の発現または機能の評価の対象である、目的の位置に「ノック−イン」され（この場合、遺伝子はレポーター遺伝子であってよい。Ｅｌｅｆａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５： １１８９７， １９９８を参照されたい。）、それにより、異種構造遺伝子の発現が適当なプロモーターからの転写と関連づけられる。これは、相同組換え、トランスポゾン（Ｗｅｓｔｐｈａｌ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ７： ５３０， １９９７）により、変異組換え部位（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５： ８６８， １９９７）またはＰＣＲ（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５： ７８４， １９９８）を用いて達成することができる。Ｃｏｆｆｍａｎ， Ｓｅｍｉｎ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １７： ４０４， １９９７； Ｅｓｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４： ９５３， １９９６， Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｕｐｐｌ． ２： ３６， １９９６も参照されたい。
【０１００】
「ノックアウト哺乳動物」は、そのゲノム内に、遺伝子ターゲッティング法により不活性化された特異的遺伝子を含む哺乳動物（例えば、マウス）である（例えば、米国特許第５，７７７，１９５号および第５，６１６，４９１号を参照されたい）。ノックアウト哺乳動物には、ヘテロ接合ノックアウト（即ち、一の欠損対立遺伝子および一の野生型対立遺伝子）およびホモ接合変異体の両方が含まれる。ノックアウト哺乳動物の調製には、まず、特定の遺伝子の発現を抑制するために用いられる核酸構築物を、胎児幹細胞と呼ばれる未分化の細胞タイプに導入することが必要である。この細胞を次いで哺乳動物の胎児に注入する。組み込まれた細胞を有する哺乳動物の胎児を継いで、妊娠期間の維持のためのフォスターマザーへ着床させる。Ｚｈｏｕ， ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ９： ２６２３−３４， １９９５）は、ＰＰＣＡノックアウトマウスを開示する。
【０１０１】
「ノックアウト」なる用語は、細胞中の内在ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現の部分的もしくは完全な抑制を意味する。「ノックアウト構築物」なる用語は、細胞中の内在ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の発現を減じるもしくは抑制するために設計された核酸配列を意味する。ノックアウト構築物として用いられる核酸配列は、典型的には、（１）抑制されるべき遺伝子のいくつかの部分からのＤＮＡ（エキソン配列、イントロン配列、および／またはプロモーター配列）および（２）細胞中でのノックアウト構築物の存在を検出するのに用いられるマーカー配列から典型的に成る。ノックアウト構築物を細胞へ挿入し、そして、本来のＤＮＡ配列の転写を防ぐまたは妨害するような位置に細胞のゲノムＤＮＡと統合させる。そのような挿入は、相同組換えにより起こることが多い（即ち、ノックアウト構築物が細胞内ＤＮＡの対応する位置に組み込まれるようにノックアウト構築物を細胞内に挿入し、そして再度結合させた場合、内在ＤＮＡ配列に対して相同なノックアウト構築物の領域が互いにハイブリダイズする）。ノックアウト構築物の核酸配列は、（１）抑制されるべき遺伝子の１またはそれ以上のエキソンおよび／またはイントロンの完全または部分配列、（２）抑制されるべき遺伝子の完全または部分的プロモーター配列、または（３）その組み合わせを含んでよい。典型的には、ノックアウト構築物を胎児幹細胞（ＥＳ細胞）へ挿入し、継いでＥＳ細胞のゲノムＤＮＡに、通常、相同組換え法により組み込む。このＥＳ細胞を発生中の胎児へ次いで注入し、そして組み込む。しかし、本発明は、トランスジェニック動物を調製するための特別な方法は全く必要としない。
【０１０２】
一般的には、相同組換えのために、ＤＮＡは少なくとも約１キロベース（ｋｂ）の長さおよび好ましくは３−４ｋｂの長さであり、それにより、構築物が導入された場合に、組換えのために十分な相補配列が提供される。トランスジェニック構築物は、ＥＡ細胞のゲノムＤＮＡへ、受精した卵母細胞の雄性生殖核へマイクロインジェクションにより、または例えば米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒにより開示されているような、当該分野で公知のいずれかの方法により導入することができる。トランスジェニック初代動物を用いて、他のトランスフェニック動物を作り出すこともでき、別法として、トランスジェニック初代動物をクローン化して、他のトランスジェニック動物を作製してもよい。
【０１０３】
２またはそれ以上の遺伝子がノックアウトされたか、またはノックインされた哺乳動物、またはその両方がなされた哺乳動物が、本発明の範囲内に含まれる。そのような動物は、各ノックアウト構築物を作製するために本明細書中に記載した方法を反復することにより、またはノックアウトされた単一の遺伝子をそれぞれ有する哺乳動物を飼育し、次いで、ダブルノックアウトゲノタイプでそれらをスクリーニングすることにより作製することができる。
【０１０４】
調整されたノックアウト動物は、ｔｅｔ−レプレッサー系（米国特許第５，６５４，１６８号を参照されたい）またはＣｒｅ−Ｌｏｘ系（米国特許第４，９５９，３１７号および５，８０１，０３０号を参照されたい）などの種々の系を用いて調製することができる。
【０１０５】
Ｃｙｒ６１のクローニングおよび発現
本発明は、いずれかの源、好ましくはヒトからのＣｙｒ６１のいずれかの抗原性フラグメントの分析および単離を企図する。さらに、評価、診断、または治療のための機能または変異ＣＹｒ６１タンパク質の発現も企図する。
当該分野の技術範囲内にある常套の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ法を、本発明の使用に用いてよい。そのような方法は、完全に文献の中に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （本明細書中、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（ Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； Ｍｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）］； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［ Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ． （１９８４）］； Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）］； Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）］； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）； Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）を参照されたい。
【０１０６】
子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法
本発明に従い、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のアップレギュレーションを用いて、例えば子宮平滑筋腫などのＣｙｒ６１に関連する疾患の増大を阻害することができる。本発明により、対象に、平滑筋腫組織におけるＣｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現、またはＣｙｒ６１の活性を刺激する化合物の治療的有効量を投与することにより、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法が提供される。本発明により、細胞中のＣｒｙ６１タンパク質のトータルのレベルを増すことにより、子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法がさらに提供される。これらの方法には、制限されるものではないが、細胞へのＣｙｒ６１タンパク質の送達、Ｃｙｒ６１タンパク質をコードしている発現ベクターの投与、および細胞内タンパク質（例えば、インテグリンレセプター）に対するＣｙｒ６１の結合を調節する化合物の治療的有効量の投与が含まれる。化合物は、対象への投与のための医薬組成物（以下に示す）へと処方されてよい。本発明により、対象に、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現または組換えＣｙｒ６１タンパク質を刺激する組換えＤＮＡの治療的有効量を投与することにより子宮平滑筋腫の増殖を阻害する方法が提供される。特定の具体例において、子宮平滑筋腫の増殖の阻害は、増殖が少なくとも２０％まで、好ましくは少なくとも４０％まで、およびより好ましくは少なくとも８０％まで低下する場合に、認められる。
【０１０７】
ＩＧＦ　Ｉ、ＩＧＦ　ＩＩ、ｂＦＧＦ、およびＨＢ−ＥＧＦのレベルは、平滑筋腫、例えば、子宮平滑筋腫などにおいてアップレギュレートされる。平滑筋腫におけるＣｙｒ６１の低下は、ＩＧＦおよび成長因子の活性を増し、およびゆえに、これらの分子が細胞の増殖を刺激するのにより効果的である可能性がある。それゆえ、本発明のさらなる具体例は、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現、またはＣｙｒ６１の活性を刺激するための、およびＩＧＦ　Ｉ、ＩＧＦ　ＩＩ、ｂＦＧＦ、およびＨＢ−ＥＧＦまたはそのいずれかの組み合わせのｍＲＮＡの合成、ｍＲＮＡの翻訳、発現または活性を減じるための方法を企図する。
【０１０８】
本発明の化合物の有効量は、個人の症状、体重、性および年齢、および投与様式などの種々の要因により変化し得る。化合物のこの量は、投与量および頻度の行列を確立し、次いで実験対象群を行列中の各ポイントへ割り当てることによるなどの、当該分野で周知の方法により、実験的に決定することができる。
【０１０９】
子宮平滑筋腫の形成を予防する方法
本発明によれば、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現は、子宮平滑筋組織と比較して、自系子宮筋層組織においてより高い。本発明により、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現またはＣｙｒ６１の活性を刺激する化合物の対象に治療的有効量を投与することにより、子宮平滑筋腫瘍の形成を予防する方法が提供される。本発明によりさらに、Ｃｙｒ６１タンパク質の細胞中でのトータルのレベルを増すことにより、子宮平滑筋腫の形成を予防する方法がさらに提供される。これらの方法には、制限されるものではないが、Ｃｙｒ６１タンパク質の細胞への送達、Ｃｙｒ６１タンパク質をコードしている発現ベクターの投与、および、Ｃｙｒ６１の細胞内タンパク質（例えば、インテグリンレセプター）への結合を調節する化合物の治療的有効量の投与が含まれる。化合物は、対象への投与のために、医薬組成物（以下に示す）へと処方されてよい。本発明により、対象に、治療的有効量の組換えＤＮＡを投与して、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現または組換えＣｒ６１タンパク質を刺激することにより、子宮平滑筋腫の形成を予防する方法が提供される。
【０１１０】
これまでの報告で示されているように、ＩＧＦ　Ｉ、ＩＧＦ　ＩＩ、ｂＦＧＦ、およびＨＢ−ＥＧＦのレベルは平滑筋腫、例えば子宮平滑筋腫などにおいてアップレギュレートされる。Ｃｙｒ６１の平滑筋腫における低下は、ＩＧＦおよび成長因子の活性を増し得、およびこのゆえ、これらの分子は、細胞増殖を刺激するのにより効果的である可能性がある。それゆえ、本発明のさらなる具体例は、Ｃｙｒ６１をコードしているｍＲＮＡの合成、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡの翻訳、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現、またはＣｙｒ６１の活性を刺激するための、および／またはＩＧＦ　Ｉ、ＩＧＦ　ＩＩ、ｂＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦまたはそのいずれかの組み合わせのｍＲＮＡの合成、ｍＲＮＡの翻訳、発現、または活性を減じるための方法を企図する。これらの化合物の有効量は、個人の症状、体重、性ならびに年齢、および投与様式などの種々の要因により変化してよい。試験化合物のこの量は、投与量および頻度の行列を確立すること、および行列中の各ポイントへ実験対象群を割り当てることによるなどして、当該分野で周知の方法により、実験的に決定することができる。
【０１１１】
診断法
本発明に従い、子宮筋層組織において通常発現されるレベルと比較して低下したＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを検出して、子宮平滑筋腫などのＣｙｒ６１関連疾患を診断することができる。本発明において、疑わしい組織におけるＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、同じ個人から得られた正常の平滑筋層組織（自系子宮筋層組織）に存在するＣｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較する。正常組織と比較した、疑わしい組織におけるＣｙｒ６１タンパク質およびＣｙｒ６１ｍＲＮＡのより低いレベルが、子宮平滑筋腫の存在を示す。好ましくは、疑わしい組織におけるＣｙｒ６１ｍＲＮＡのレベルまたはＣｙｒ６１タンパク質のレベルは、正常組織と等しいか、またはそれより３倍以上低い。より好ましくは、該レベルは、正常組織よりも約９〜約１０倍低い。低いレベルを用いて、本明細書に開示するＣｙｒ６１関連治療に加えて少なくとも２の治療法をさらに含む治療法を開発してよい。疑わしい組織におけるＣｙｒ６１ｍＲＮＡおよびＣｙｒ６１タンパク質のレベルは、細胞中に存在する追加したｍＲＮＡおよびタンパク質（例えば、ＧＡＰＤＨなどの）のレベルを正規化することにより、正常組織と比較する。
【０１１２】
Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のそのような低下したレベルを検出するための種々の方法には、制限されるものではないが、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション試験、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、イムノ拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えばコロイド状の金、酵素またはラジオアイソトープラベルを用いる）、沈降反応、補体固定アッセイ、イムノフルオレセンスアッセイ、タンパク質Ａアッセイ、およびイムノエレクトロフォーレシスアッセイなどが含まれる。
【０１１３】
核酸アッセイ
ＤＮＡは、あらゆる細胞源から得てよい。ＤＮＡは、当該分野で公知の多くの方法のいずれかを用いて、細胞源または体液から抽出する。ＤＮＡを抽出するのに用いられる特定の方法は、源の性質に依存するであろうことが理解されるであろう。一般に、本発明における使用のために抽出される最小量のＤＮＡは、約２５ｐｇ（４×１０９塩基対のゲノムサイズに相当する約５細胞に対応する）である。配列決定法は、既に詳細に前に記載してある。
【０１１４】
他の別の具体例において、ＲＮＡは、例えば、グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出（Ｃｈｏｍｏｃｙｚｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２： １５６， １９８７）などの当業者に公知の方法を用いて、生検組織から単離する。単離されたＲＮＡを次いで、ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による一対の逆転写および増幅に、選択される部位に特異的な特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて供する。プライマーのアニーリングのための条件を選択して、特定の逆転写および増幅を確保する。つまり、増幅産物の様相が、特定の遺伝子の変化の存在を診断的に示す。他の具体例においては、ＲＮＡを逆転写および増幅し、その後、増幅された配列を、例えば直接配列決定により同定する。さらに別の具体例においては、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡをクローン化し、次いで配列決定して、変異を同定することができる。
【０１１５】
タンパク質アッセイ
別の具体例においては、組織を対象から得る。Ｃｙｒ６１に対して特異的に結合することができる抗体を次いで、組織のサンプルと接触させて、抗体により特定されるＣｒｙ６１ポリペプチドの存在または不在を決定する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよいが、好ましくはモノクローナルである。細胞に結合している特異的抗体の測定は、例えば、定量フローサイトメトリー、酵素結合または蛍光結合イムノアッセイ、ウェスタン分析などのいずれかの公知の方法により行われてよい。一般には、本発明における使用のための、イムノアッセイのために抽出されるべきタンパク質の最少量は、約２０μｇである。
例えば、米国特許第５，７４７，２７４号および第５，７４４，３５８号に開示されているようなイムノアッセイ技術、および特に、固相「クロマトグラフィー」型のイムノアッセイが、血液または血液フラクション中のタンパク質を検出するのに好ましい。
【０１１６】
医薬組成物
試験化合物、その塩、抗体、タンパク質、発現ベクターおよびアンチセンス構築物を、医薬組成物中に処方してよい。医薬組成物は、前記の少なくとも一つの治療または刺激有効量を含む。これは、標的細胞内でのＣｙｒ６１の発現または活性、Ｃｙｒ６１遺伝子の転写、またはＣｙｒタンパク質を増すのに有効な量であり得る。組成物は、Ｃｙｒ６１タンパク質または該タンパク質のフラグメントを含み得る。Ｃｙｒ６１タンパク質のフラグメントは好ましくは、全長のタンパク質に伴う機能活性を保持する。特定の具体例において、Ｃｙｒ６１タンパク質のＣ末端領域を、変更、削除、または変異して、Ｃｙｒ６１タンパク質の発現または機能を増加もしくは低下させてよい。
【０１１７】
医薬組成物は、典型的には、エタノール、グリセロール、水などの医薬上許容されるキャリア（または投与ビヒクル）をさらに含む。そのようなキャリアの例および処方の方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９９０）， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに開示されている。
【０１１８】
医薬組成物は、他の添加剤、例えば風味剤、甘味剤、保存剤、色素、結合剤、懸濁剤、着色料、崩壊剤、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、可塑剤、または前記のいずれかのあらゆる組み合わせをさらに含んでよい。適当な結合剤には、制限されるものではないが、スターチ、ゼラチン、天然シュガー、例えばグルコースおよびベータ−ラクトースなど；トウモロコシの甘味剤；天然および合成ゴム、例えばアカシア、トラガカント、およびナトリウムアルギネート；カルボキシメチルセルロース；ポリエチレングリコール；ワックスなどが含まれる。適当な潤滑剤には、制限されるものではないが、ナトリウムオレエート、ナトリウムステアレート、マグネシウムステアレート、ナトリウムベンゾエート、ナトリウムアセテート、ナトリウムクロライドなどが含まれる。適当な崩壊剤には、制限されるものではないが、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれる。
【０１１９】
試験化合物の適当な塩には、制限されるものではないが、酸付加塩、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、琥珀酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、カルボン酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、および２−アセトキシ安息香酸などと作製されるもの、およびサッカリンを用いて作製される塩が含まれる。化合物の他の適当な塩には、制限されるものではないが、アルカリ金属塩、例えばナトリウムおよびカリウム塩など；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムおよびマグネシウム塩など；および有機リガンドと形成される塩、例えば第四アンモニウム塩などが含まれる。
【０１２０】
典型的な塩には、制限されるものではないが、本発明の化合物のアセテート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビスルフェート、ビタートレート、ボレート、ブロマイド、カルシウムエデテート、カムシレート、カルボネート、クロライド、クラブラネート、シトレート、ジヒドロクロライド、エデテート、エジシレート、エストレート、エシレート、フマレート、グルセプテート、グルコネート、グルタメート、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾシネート、ヒドラバミン、ヒドロブロマイド、ヒドロクロライド、ヒドロキシナフトエート、ヨーダイド、イソチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、マレート、マレエート、マンデレート、メシレート、メチルブロマイド、メチルニトレート、メチルスルフェート、ムケート、ナプシレート（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、ニトレート、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレエート、パモエート（エンボネート）、パルミテート、パントテネート、ホスフェート／ジホスフェート、ポリガラクトウロネート、サリチレート、ステアレート、スルフェート、サブアセテート、スクシネート、タンネート、タートレート、テオクレート、トシレート、トリエチオダイド、およびバレレート塩が含まれる。
【０１２１】
本発明には、試験化合物のプロドラッグが含まれる。プロドラッグには、制限されるものではないが、本発明の化合物へとインビボで容易に変換され得る本発明の試験化合物の機能性誘導体が含まれる。適当なプロドラッグ誘導体の選択および調製のための常套の方法は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｈ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」，ｅｄ． Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， １９８５に開示されている。
【０１２２】
医薬組成物は、経口、非経口、鼻腔内、眼、粘膜、経皮、口内、局所、舌下、または直腸用に、錠剤、ピル、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液または懸濁液、滅菌Ｉ．Ｖ．溶液、滅菌Ｉ．Ｍ．溶液、滅菌腹腔内溶液、エリキシル、チンキ、計量エアゾールまたは液体スプレー、ドロップス、アンプル、自己注射器または坐薬などの単位投与製剤として処方されてよい。単位投与製剤は、持続または遅延放出に適した形態、例えば、筋肉内注射のためのデポ調製を提供するべく適合された化合物の不溶塩、例えばデカノエート塩などであってよい。
【０１２３】
固体単位投与製剤は、医薬上許容されるキャリアおよび固体前処方組成物を形成するためのいずれかの他の所望される添加剤と本発明の化合物を混合することにより調製されてよい。固体単位投与製剤に適した添加剤の例には、制限されるものではないが、スターチ、例えばコーンスターチ；ラクトース；スクロース；ソルビトール；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；ジカルシウムホスフェート；ガム、例えば植物性のガム；および医薬希釈剤、例えば水が含まれる。固体前調製組成物は典型的には、組成物が平等に有効な単位投与製剤へと容易に細分できるように、本発明の化合物および添加剤の均一混合物が形成されるまで、すなわち、化合物が組成物全体に均等に分散するまで、混合する。固体の前調製組成物は次いで、前記のタイプの単位投与製剤に細分する。
【０１２４】
錠剤またはピルはコートされ、またはそうでなければ配合されて、例えば時間放出および持続放出単位投与製剤など、長期活性を有する単位投与製剤を形成することもできる。例えば、錠剤またはピルは、内部投与成分および外部投与成分を含むことができ、後者が前者を包む形態となる。２つの成分は、胃での崩壊に抵抗するのに役立つ腸溶層により分離されて、内部成分が十二指腸へとそのまま通過すること、または放出が遅延すること可能となる。化合物は、投与後すぐに放出されてよく、または化合物が、特定のタイムコース、例えば２−１２時間以上持続する様式で放出されるように処方されてよい。
【０１２５】
液体単位投与製剤には、制限されるものではないが、水溶液、適当に風味付けられたシロップ、水性または油性懸濁液、および食用油で風味付けられたエマルジョン、例えば綿実油、ゴマ油、ココナッツオイルまたはピーナッツオイル、ならびにエリキシルおよび同様の医薬ビヒクルが含まれる。水性懸濁液に適した分散および懸濁剤には、制限されるものではないが、トラガカント、アカシア、アルギネート、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニル−ピロリドンおよびゼラチンなどの合成および天然ゴムが含まれる。
【０１２６】
局所製剤に適した医薬上許容されるキャリアには、制限されるものではないが、アルコール、アロエべラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥオイル、ミネラルオイル、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどが含まれる。そのような局所製剤は、液体水薬、アルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、皮膚のゲル、皮膚のローション、およびクリームまたはゲル処方（制限するものではないが、水溶液および懸濁液を含む）のシャンプーであってよい。典型的には、これらの局所製剤は、懸濁剤、例えばベントナイト、および任意に泡止め剤を含む。一般に、局所製剤は、局所製剤の１００％のトータルの重量に基いて約０．００５〜約１０重量％の、および好ましくは約０．０１〜約５重量％の化合物を含む。
【０１２７】
非経口投与のための、および特に注射による本発明の医薬組成物には、典型的には、水などの不活性液体キャリア、制限されるものではないが、ピーナッツオイル、綿実油、ゴマ油などを含む植物性油、およびソルケタール、グリセロールホルマールなどの有機溶媒が含まれる。好ましい液体キャリアは、植物油である。これらの医薬組成物は、本発明の化合物を液体キャリアに溶解または懸濁することにより調製されてよい。一般には、非経口投与のための医薬組成物は、トータルの医薬組成物の１００％重量に基いて、約０．００５〜約１０重量％の本発明の化合物を含む。
【０１２８】
本発明の化合物は、小さな単層ビヒクル、大きな単層ビヒクル、および多層ビヒクルなどのリポソーム送達系の形態でも投与することができる。リポソームは、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどから作製することができる。
【０１２９】
本発明の化合物は、化合物分子が結合する個々のキャリアとしてモノクローナル抗体を用いることにより送達されてもよい。本発明の化合物は、標的可能な薬物キャリアとしての水溶性ポリマーと結合してもよい。そのようなポリマーには、制限されるものではないが、パルミトイル基で置換された、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール、およびポリエチレンオキシドポリリジンが含まれる。さらに、本発明の化合物は、化合物の放出をコントロールするための生物分解可能なポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーと結合してもよい。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、Ｃｙｒ６１の転写または発現を刺激することを必要とする動物、好ましくはヒトに投与して、例えばステロイドまたは成長因子レセプターなどの活性化によるなどして、Ｃｙｒ６１の転写または発現を刺激することができる。
【０１３１】
本発明の医薬組成物の活性剤および活性剤の活性代謝物の有効量は、個人の症状、体重、性および年齢および投与様式などの種々の要因によって変化してよい。試験化合物のこの量は、投与量と頻度の行列を確立すること、および行列中の各ポイントへ実験対象群を割り当てることによるなど、当該分野で周知の方法により実験的に決定することができる。
【０１３２】
本発明の化合物は、潜在的な毒性はいずれも最小に抑えつつ最適の活性を得るために、通常の試験により決定される適当な投与量にて単独で投与されてよい。加えて、他の活性剤の同時投与または連続投与も望まれる。
【０１３３】
本発明の化合物の毎日投与量は、広い範囲で変化してよい。経口投与のためには、医薬組成物は好ましくは、治療される患者に対する投与量の症状に基く調整のために、スコアまたは非スコア錠剤の形態で提供される。所望の効果を達成するために前記のような他の活性剤と組み合わせる場合、投与量は調整されてよい。他方、これらの種々の活性剤の単位投与形態を独立に最適化して、および組み合わせて、いずれかの活性剤が単独で用いられる場合よりも病因を低下させる共同効果を達成してよい。
【０１３４】
都合よくは、医薬組成物は、単一毎日投与にて投与してよく、またはトータルの毎日投与を、一日２、３、または４回に分割投与してよい。
活性剤が別個の投与製剤である１以上の活性剤との組み合わせ治療に関しては、活性剤は、同時投与してよく、またはそれらはそれぞれ別個に時間をずらして投与してよい。
【０１３５】
遺伝子治療
平滑筋腫におけるＣｙｒ６１の発現の欠損は、遺伝子が位置する染色体ｌｐ２２−ｐ３１の対立遺伝子欠損または変更、エストロゲンまたは成長因子シグナリング経路の排除、および／またはＥＲおよびプロモーター領域内に含まれるＥＲおよび成長因子応答エレメントの変異による可能性もある。Ｃｙｒ６１の別のコピーを宿主に提供することにより、天然に生じている可能性のあるあらゆる遺伝子変異を克服できる可能性がある。
【０１３６】
特定の具体例において、本発明のＣｙｒ６１をコードしている配列を含んでいるベクターを投与して、機能性Ｃｙｒ６１タンパク質の発現または変異Ｃｙｒ６１の発現の欠損に伴う疾患または病気が治療もしくは予防される。
当該分野で利用できる遺伝子治療のための方法のいずれも、本発明に従い用いることができる。典型的な方法を以下に示す。
【０１３７】
遺伝子治療法に関する概説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９９３， １２： ４８８−５０５； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｂｉｏｔｈｅｒｐｙ， １９９１， ３： ８７−９５； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １９９３， ３２： ５７３−５９６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２６０： ９２６−９３２； ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９３， ６２： １９１−２１７； Ｍａｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ， １９９３， １１： １５５−２１５を参照されたい。用いることができる組換えＤＮＡ技術の当該分野で一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， １９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； およびＣｈａｐｔｅｒ １２および１３、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹに開示されている。遺伝子治療に適したベクターは、前に記載されている。
【０１３８】
一態様において、治療ベクターは、適当な宿主中でＣｙｒ６１を発現する核酸を含む。特に、そのようなベクターは、Ｃｙｒ６１のコーディング配列に操作可能な状態で結合したプロモーターを有する。プロモーターは、誘導性または構造性であり得、および任意に組織特異的であり得る。本発明の特定の具体例において、プロモーターはエストロゲン応答エレメントまたは繊維芽細胞成長因子応答エレメントである。他の具体例において、抗体コーディング配列およびいずれかの他の所望の配列に、ゲノムの所望の位置での相同組換えを助長する領域が隣接している核酸分子を用いて、Ｃｙｒ６１の染色体内での発現を提供する（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６： ８９３２−８９３５； Ａｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９， ３４２： ４３５−４３８）。
【０１３９】
患者へのベクターの送達は、患者をベクターまたは送達複合体へ直接曝す直接的なものであっても、または細胞をまずインビトロでベクターで形質転換し、次いで患者へ移植する間接的なもののいずれかであってよい。これらの２つの手段はそれぞれ、インビトロおよびエキソビボ遺伝子治療として知られている。
【０１４０】
特定の具体例において、ベクターをインビボで直接投与し、その場合、それはその生物体にて細胞へ入り、そしてＣｙｒ６１の発現を媒介する。これは、当該分野で公知の多くの方法のいずれかにより、例えば、それを適当な発現ベクターの部分として構築し、およびそれをそれが細胞内のものとなるよう、例えば欠損または弱毒化されたレトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いる感染により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、または裸のＤＮＡを直接注入することにより、または微粒子ボンバード（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ， Ｄｕｐｏｎｔ）の使用；または脂質または細胞表面レセプターまたは形質転換剤でコーティングすること、バイオポリマー（例えば、ポリ−＊−１−＊４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリサッカライド；米国特許第５，６３５，４９３号を参照されたい）のカプセル化、リポソーム、微粒子、またはミクロカプセル中のカプセル化により；核へ入ることが公知のヘプチドまたは他のリガンドへ結合させてそれを投与することにより；または、レセプター媒介エンドサイトーシスを受けやすいリガンドに結合させてそれを投与することにより（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８７， ６２： ４４２９−４４３２を参照されたい）、達成することができる。他の具体例では、核酸−リガンド複合体を作製することができ、ここでリガンドは、エンドソームを崩壊し、核酸がリソソームによる崩壊を受けるのを回避させる外来ウイルスペプチドから成る。さらに他の具体例では、核酸は、細胞の特異的取りこみおよび発現のために、特異的レセプターをターゲッティングすることによりインビボで標的することができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号、第ＷＯ９２／２２６３５号、第ＷＯ９２／２０３１６号、および第ＷＯ９３／１４１８８号を参照されたい）。別法として、核酸は、相同組換えによる発現のために、細胞内へ導入し、そして宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる（Ｋｏｏｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８９， ８６： ８９３２−８９３５； Ｚｉｊｌｓｔｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８９， ３４２： ４３５−４３８）。これらの方法は、「Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」と共に前記で論じたものに追加するものである。
【０１４１】
別法として、例えば、標的細胞集団内で一本鎖の抗体をコードしている核酸配列を、例えばＭａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９３， ９０： ７８８９−７８９３に開示されているものなどの方法を用いて発現させることにより、投与することもできる。
使用が想定される治療用核酸の形態および量は、疾患のタイプおよび所望の効果の強さ（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、患者の状態などに依存し、そして当業者が決定することができる。
【０１４２】
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろうが、例として提供されるものであり、制限するものではない。
材料：抗−Ｃｙｒ６１ポリクローナル抗血清を、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（Ｂａｔｏｎ Ｒｏｕｇｅ， ＬＡ）において、ヒトＣｙｒ６１（図７；配列番号２）タンパク質のアミノ酸３７１−３８１（ＲＬＦＮＤＩＨＫＦＲＤ；配列番号３）に対して作製した。システインを、キャリアタンパク質に対するカップリングのためにＮ−末端に付加した。ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応（ＰＥ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９０５０＋）を用いて、自動相ペプチドシンセサイザーを用いて合成した。フォトヨーダイドアレイディテクターを備えたＣ１８Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒカラム（２５０×２１．２０ｍｍ、１０μの直径）と共にＷａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ４００予備クロマトグラフィーシステムを用いて、ペプチドを精製した。１００ｍＬ／分を越すカラムを通す流速により、約４００−５００ｍｇのペプチドが精製される。抗原性ペプチドの同定および精製は、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＤＥ−ＭＡＬＤＩ質量スペクトロメーターを用いて評価した。ペプチドを次いでキーホールリンペットヘモシアニンに結合し、次いで等容積の完全および不完全フレンドアジュバントと混合した。
【０１４３】
混合物を次いで、雌のニュージーランド白ウサギに注射した（２００μｇ抗原およびアジュバント混合物／ウサギ）。１４および２８日目に、最初の注射と同サイズのブースター注射を施した。３８日目、ウサギからの血液を、抗体の存在に関してＥＬＩＺＡ（ストレプトアビジン／ビオチンシステムを用いて）を用いて試験した。強い抗体タイターが必要な場合、ウサギに初期の注射と同じサンプルサイズのブースター注射を４２日目に施した。血清を５２日目にウサギから回収し、次いで凍結した。ポリクローナル抗体を、抗原を結合相（Ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ， Ｐｉｅｒｃｅ）に、システインの側鎖を用いて結合することによりアフィニティ精製した。約３０ｍＬの血清をカラムに乗せ、次いで洗浄して非結合タンパク質を除去した。抗体を、３．５ＭのＭｇＣｌ２／エチルグリコールで溶離した。溶離されたタンパク質を透析し、次いで約１ｍｇ／ｍＬへと濃縮した。濃度は２８０ｍｍのＯＤで決定した。
【０１４４】
１７β−エストラジオール（Ｅ２）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入し、プロゲステロンレセプターアゴニスト、Ｒ５０２０はＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ， Ｉｎｃ． （Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から得、ｂＦＧＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から購入し、そしてＥＲアンタゴニストＩＣＩ１８２，７８０はＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒａｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｄｅｌａｗａｒｅ）により豊富に提供された。
【０１４５】
研究対象および組織の獲得　子宮平滑筋腫および同調させた平滑筋腫標本を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓにより許可されたプロトコールに従い、Ｄｅｐａｔｒｍｅｎｔｏ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｈｏｓｐｉｔａｌでの通常の子宮摘出後に得た。組織サンプルは、ホルモン置き換え治療も、規定のゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストも受けていない３８歳〜５３歳（平均年齢＝４５）の患者から提供された（ｎ＝３８）。一人を除く全ての患者は、手術前、正常の月経周期を体験していた。全ＲＮＡの単離のために、子宮摘出後に液体窒素に組織標本を迅速に凍結し、またはインサイチュハイブリダイゼーションのために、１０％の中性緩衝処理されたホルマリンに固定した。エキソビボ培養のための組織は、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２５０ｎｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢをファンギゾンとして含むフェノールレッド不含ＤＮＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２媒質（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）に入れ、次いで氷上に移した。
【０１４６】
ディファレンシャル発現の迅速分析（ＲＡＤＥ）を用いる、調節遺伝子の同定
ＲＡＤＥをすでに報告されているように行った（Ｌｉａｎｇ Ｐ， Ｐａｒｄｅｅ ＡＢ． １９９７． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ｐａｇｅ １５０）。簡単には、同調平滑筋腫および子宮筋層組織から単離した全ＲＮＡ（ｎ＝４）をＲＡＤＥ分析のために用い、そして各ＲＮＡサンプルは対で分析した。ｃＤＮＡの合成を、Ａ、Ｇ、またはＣのいずれかで終わっているｐ（ｄＴ）１８オリゴヌクレオチドを用いることにより行った。ｃＤＮＡの合成後、遺伝子をランダムオリゴマー、適当なｐ（ｄＴ）１８下流プライマー、および３５Ｓ標識ｄＡＴＰの組み合わせを用いて増幅した。生じた生成物を二倍に増幅し、ＳＤＳポリアクリルアミド配列決定ゲル上で分離し、次いでオートラジオグラフィーにより検出した。処理を繰り返した後、候補のｃＤＮＡフラグメントをポリアクリルアミドゲルスライスから抽出し、次いで適当なプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、ｐＢＲ３２２へとサブクローニングし、ＡＢＩ３７７／３７３シークエンサーを用いて配列決定し、次いでＢＬＡＳＴＮソフトウェアを用いて分析した（Ａｌｔｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７， ２５： ３３８９−３４０２）。
全ＲＮＡのＲＡＤＥ分析により、同調子宮筋層コントロールと比べて、４の平滑筋腫標本の中の４つにおいて、４１０ヌクレオチドのｃＤＮＡフラグメントの低下した発現が立証された。ＢＬＡＳＴＮソフトウェアを用いる配列分析により、該ｃＤＮＡフラグメントがヒトのＣｙｒ６１のＣ末端部分に対して９６％相同であることが立証された。
【０１４７】
Ｃｙｒ６１およびＥＲαのノーザンブロッティング　全細胞質ＲＮＡを、グアニジウムイソチオシアネート分解の後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことにより、子宮筋層および平滑筋組織ホモジェネートから単離した。次いで、全細胞内ＲＮＡ（２０μｇ）を、１Ｍのホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル中で電気泳動に供した。分離したＲＮＡ転写産物を、キャピラリー電気泳動によりナイロン膜上に移し、次いでＲａｐｉｄＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）中で、６０℃にて前ハイブリダイズさせた。０．４１ｋｇのヒトＣｙｒ６１ｃＤＮＡフラグメントを［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用い、ランダムプライマー法（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて放射能標識し、そして、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。放射能標識プローブ（１×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）を、４時間、６０℃にて膜へハイブリダイズした。膜を２回、１×ＳＳＰＥ（０．１５ＭのＮａＣｌ、１μＭのＥＤＴＡ、および０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）および０．１％のＳＤＳにて１５分間２５℃で洗浄し、次いで０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにて５分間６０℃にて最終洗浄した。エストロゲンレセプターα（ＥＲα）の発現に関しては、膜を、［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で放射能標識した１．９６ｋｂのヒトＥＲαｃＤＮＡ（１．９６ｋｂの全長コーディング領域）で再度プローブし、ハイブリダイズさせ、次いで前記のように洗浄した。Ｃｙｒ６１の相対的なレベルを、３２Ｐで放射能標識したオリゴヌクレオチドを製造業者のプロトコル（末端ラベリングキット、ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）に従い用いて膜を再度プローブした後、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。
【０１４８】
１０人の患者から単離された全ＲＮＡを用いてノーザン分析を行った。Ｃｙｒ６１転写産物は、試験した１０人の患者のうちの１０人（図１Ｂ）において、自系子宮筋層と比較して、平滑筋腫標本において懸著に低下した。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに対して正規化したＣｙｒ６１ｍＲＮＡの低下は、自系子宮筋層に存在する高い基本レベルと比較して９倍を越した（図１Ｄ）。
【０１４９】
Ｃｙｒ６１に関するタンパク質抽出およびイムノブロッティング　組織タンパク質抽出物を、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１．０％のトライトン−Ｘ１００、２％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコレート、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１０μｇ／ｍｌのペプスタチン、アプロチニン、およびロイペプチン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含むプロテアーゼインヒビターカクテル中での均質化により、平滑筋腫、および同調子宮筋層組織標本から調製した。タンパク質抽出物（２０μｇ）を、１０％のビス−アクリルアミド中の還元条件下、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、次いでポリビニルジフルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ， Ｂｉｏｒａｄ， Ｒｅｄｄｉｎｇ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に電気泳動により移した。膜を５％の乾燥ミルクでＴＢＳ／０．１％トゥイーン２０（ＴＢＳＴ）上にブロックし、次いで抗−Ｃｙｒ６１ｐＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。結合している一次抗体を、ロバのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させた抗−ウサギＩｇＧ抗体および高機能化学ルミネセンス検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。タンパク質レベルを正規化するために、Ｃｙｒ６１ウェスタンブロットを次いでパン−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）で再度プローブし、次いで、ＨＲＰに結合させたロバの抗マウス二次抗体で検出した。
平滑筋腫および同調子宮筋層コントロールから生じた全細胞溶解物のイムノブロット分析は、試験した１０人の患者のうちの１０人において、Ｃｙｒ６１タンパク質の１０倍以上の低下を示した（図２ＡおよびＣ）。
【０１５０】
インサイチュハイブリダイゼーション　リボプローブ合成のために、０．２８ｋｂのヒトＣｙｒ６１ｃＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ４Ａｆプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に位置クローニングして、ｐＧＥＭ４Ｚｆ／Ｃｙｒ６１を作製した。放射能標識した３５Ｓ−ＵＴＰセンスおよびアンチセンスｃＲＮＡ転写産物をインビトロでＴ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いて、Ｇｅｍｉｎｉ Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写した。インサイチュハイブリダイゼーションを、前記のように、ホルマリンに固定した平滑筋腫および同調子宮筋腫標本を用いて行った。簡単には、加工したスライドを一晩、１００−１５０μｌのアンチセンスまたはセンス（コントロール）リボプローブを、５％デキストランスルフェートおよび２００ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む５０％のホルムアミドハイブリダイゼーション混合液中４．７×１０６ＤＰＭ／スライドにて、５５℃にて、５０％のホルムアミド／６００ｍＭのＮａＣｌを含む加湿チャンバー中でハイブリダイズさせた。スライドを室温で、２×ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）／１０ｍＭのＤＴＴ中で３回洗浄した後、ＲＮａｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）処理を３０分間３７℃で行い、次いで１５分間０．１×ＳＳＣ中で、室温にて洗浄した。スライドをさらに６５℃にて０．１×ＳＳで洗浄し、次いでアルコール：酢酸アンモニウム（７０％、９５％、および１００％）の勾配シリーズで脱水した。空気乾燥したスライドをＸ線フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に３日間、予備試験のために暴露し、次いで、６００ｍＭの酢酸アンモニウムで１：１に希釈したＮＴＢ２原子核エマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に浸した。スライドを次いで３１日間光を通さない、暗い乾燥箱に入れ、感光処理し、クレシルバイオレットにて染色し、次いでカバーグラスをかぶせた。
【０１５１】
子宮と比較して相対的に高いレベルのＣｙｒ６１の発現が脾臓で認められた（図３Ａ）。さらに、子宮筋層に加えて、他のヒト筋肉組織の分析により、骨格筋、心臓および膀胱において高い基本的発現が示されたが、結腸、小腸、胃および前立腺においては相対的に低いレベルが検出された（図３Ｂ）。それゆえ、Ｃｙｒ６１の高い構造性の発現は、平滑筋および骨格筋細胞から主として構成される心臓、膀胱および子宮などの器官の特徴的な態様であると考えられる。Ｃｙｒ６１が子宮で発現されるまさにその細胞タイプを決定するために、さらなるインサイチュハイブリダイゼーション実験を行った。６人の患者のうちの６人において、高レベルのＣｙｒ６１ｍＲＮＡが子宮筋層細胞で検出された（図４ＡおよびＣ）。しかし、Ｃｙｒ６１転写産物は、同じ６人の患者からの平滑筋腫細胞で劇的に低下した（図４ＢおよびＤ）。センスプローブとハイブリダイズした対照のスライドからのシグナルは、明らかなシグナルを示さなかった（図４ＥおよびＦ）。高い基本レベルのＣｙｒ６１転写産物がストロマでも認められたが、子宮の血管内皮または腺上皮細胞では認められなかった（データは示していない）。Ｃｙｒ６１の高い基本的発現は、健康な子宮筋層の子宮平滑筋細胞に対して主に確認されたが、平滑筋腫では認められなかった。
【０１５２】
性ステロイドおよび成長因子を用いた組織の処置　前記のように得た組織標本を１−２ｍｍ片へと、滅菌メスおよびピンセットを用いてすぐに細分し、次いで抗真菌剤および構成物質剤のみを含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２に入れた。標本をエキソビボで、１０ｎＭのＥ２、１０ｎＭのＲ５０２０、１０ｎＭのＥ２および１０ｎＭのＲ５０２０、１μＭのＩＣＩ１８２，７８０（ＩＣＩ）、１０ｎＭのＥ２および１μＭのＩＣＩ１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦの組み合わせ、１０％のチャコールを除いた血清（ＣＳＳ）またはエタノールビヒクルのいずれかで１時間３７℃にて、９５％空気／５％ＣＯ２下でエキソビボ処理した。処理した組織標本を回収し、次いでＲＮＡの単離およびノーザンブロッティングの前に液体窒素中ですばやく凍結した。
【０１５３】
新たに得た平滑筋腫および同調平滑筋層エクスプラント（ｎ＝８）をエキソビボで１０ｎＭのＥ２、１０ｎＭのＲ５０２０、または１０ｎＭのＥ２および１０ｎＭのＲ５０２０の組み合わせで処理した。ポジティブコントロールとして、エクスプラントは、ネズミおよびヒトの繊維芽細胞などの細胞タイプにおいてＣｙｒ６１を誘導する１０ｎｇ／ｍｌのｂＧＦＧで刺激した（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， １９８８， ５３： ８９３−９００）。Ｅ２処理により、子宮筋層組織において１時間以内にＣｙｒ６１転写物のレベルが２倍以上増したが、合成プロゲステロンレセプターアゴニスト、Ｒ５０２０はＣｙｒ６１の発現に影響を持たず、それはＥ２とも共働しなかった（図５ＡおよびＧを参照されたい）。Ｃｙｒ６１のＥ２媒介性の誘導は、それは完全に純粋なＥＲアンタゴニスト、ＩＣＩ１８２，７８０により阻害されるので、ＥＲ依存性であった（図５Ａ）。さらに、Ｃｙｒ６１の発現は、子宮筋層エクスプラントをｂＦＧＦ（図５ＡおよびＧ）または血清（データは示していない）で１時間処理した場合に３倍高まった。しかし、Ｅ２もｂＦＧＦも、子宮筋層コントロールにおいて認められるようには、平滑筋腫組織ではＣｙｒ６１をアップレギュレートすることができなかった（図５ＤおよびＧ）。後者の現象は、自系子宮筋層と比較した場合に、平滑筋腫エクスプラントにおいて一貫して２倍高いＥＲαの発現の欠如によるものではなかった。ゆえに、ｂＦＧＦおよび血清に加えて、Ｃｙｒ６１は、平滑筋腫においてではなくヒト子宮筋層組織において１７β−エストラジオールによって急速に誘導される。
【０１５４】
組換えヒトＣｙｒ６１の合成および精製のためのプロトコル　全オープンリーディングフレームを含むヒトＣｙｒ６１ｃＤＮＡのＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ヌクレオチド１００−１６４９）を、ｐＢｌｕｅＢａｃ４バキュロウイルス発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。組換えバキュロウイルスクローンを得、プラーク精製し、次いで既に記載されているようにＳＦ９昆虫細胞の感染物の培養により増幅した（Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｔｅｘ． Ａｇｒｉｃ． Ｅｘｐ． Ｓｔｎ． Ｂｕｌｌ．： １５５５： １−５５ （１９９７））。Ｓｆ細胞を、血清を含まないｓｆ９００−ＩＩ媒質に２−３×１０６細胞／Ｐ１５０にて単層培養物として播種し、次いで、細胞当たり５プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）の組換えウイルスで感染した。条件培地（組換えヒトＣｙｒ６１タンパク質を含む）を感染４８および９６時間後に回収し、遠心分離（１５，０００×ｇにて５分間）により精製し、次いで５０ｍＭのモルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ＝６．０、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）および１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝８へと調整した。培地をローディングバッファー（５０ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６．０、　１ｍＭのＰＭＳＦ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化したセファロースＳビーズと５ｍｌのセファロースＳ／５００ｍｌの条件培地にて混合し、次いでタンパク質をセファロースＳに、バッチにて、４℃にて一晩、穏やかに攪拌しながら結合させた。セファロースＳビーズを沈降により、攪拌せずに２０分間回収し、次いでカラムに入れた。カラムを、０．３ＭのＮａＣｌへと調整した６倍のローディングバッファーで洗浄し、次いで結合したタンパク質をカラムから、ローディングバッファー中のＮａＣｌ（０．４−０．８Ｍ）の段階希釈で溶離した。
【０１５５】
統計学的分析　ノーザンブロットにて検出されるＲＮＡのバンドの密度測定から得られた値を、ＳＡＳ統計ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｃ．， Ｃａｒｙ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用い、有意性のために一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を要因配置実験のために用いて分析した。変動の一元配置分散分析の多重比較の有意なレベルは０．０５であった。有意性が一元配置分析により達成された場合、平均のポスト−ＡＮＯＶＡ比較を、Ｓｃｈｅｆｆｅ’Ｆ試験（Ｎｏｒｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｔｈｅ Ｖａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ： Ｍｏｓｂｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９４， ５８ｐｐ）を用いて行った。
【０１５６】
本明細書中に示す特許、出願、試験法、および公開文献は、本明細書中にその全容を引用により組み込む。
本発明の多くの変化は、前記の詳細な記載を考慮して、当業者には示唆されるであろう。全てのそのような明らかな変化は、添付の請求項の全企図範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（Ａ）−（Ｄ）は、ＲＡＤＥ法によるＣｙｒ６１の同定およびノーザン分析による確認を示す。（Ａ）倍化した平滑筋腫（Ｌ）および同調した子宮筋層（Ｍ）組織（ｎ＝４）から抽出した全ＲＮＡから作製された３５Ｓ−放射能標識ｃＤＮＡの典型的なオートラジオグラフ。（Ｂ）平滑筋腫（Ｌ）および同調した子宮筋層（Ｍ）組織から単離された全ＲＮＡの典型的なノーザンブロット。矢印は、２．４ｋｂの多い方のＣｙｒ６１転写産物および３．５ｋｂの少ない方のＣｙｒ６１転写産物を示す。（Ｃ）膜を２．０ｋｂの放射能標識したマウスグルタルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）で再プローブして、等量のサンプルローディングを証明した。（Ｄ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒおよび画像診断ソフトウェア（ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＣｙｒ６１ｍＲＮＡレベルの密度分析。＊子宮筋層コントロールと比較した、レベルの有意な低下。
【図２】図２（Ａ）−（Ｃ）は、平滑筋腫におけるＣｙｒ６１タンパク質の発現の分析を示す。（Ａ）平滑筋腫および同調した子宮筋層組織から作製された組織タンパク質抽出物の典型的なウェスタンブロット。（Ｂ）タンパク質ブロットを次いで抗−アクチン単一特異的抗体で再プローブして、等量のタンパク質ローディングを確認した。（Ｃ）Ｂｉｏｒａｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｍａｇｅｒを用いる密度分析により定量されたＣｙｒ６１タンパク質レベル。値は、１０人の患者に関する平均±ＳＤを示す。＊子宮筋層コントロールと比較したレベルの有意な低下。
【図３】図３（Ａ）−（Ｂ）は、多様なヒト組織（Ａ）およびヒト筋肉組織（Ｂ）におけるＣｙｒ６１のディファレンシャル発現を示す。矢印は、分子量マーカーをｋｂで示す。
【図４】図４（Ａ）−（Ｆ）は、インサイチュハイブリダイゼーションにより決定される、子宮平滑筋細胞におけるＣｙｒ６１の発現の抑制を示す。典型的な黒のフィールド（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および明るいフィールド（ＣおよびＤ）は、子宮筋層（Ａ、ＣおよびＥ）および平滑筋腫（Ｂ、ＤおよびＦ）組織セクションの顕微鏡写真。矢印は、Ｃｙｒ６１転写産物を発現する典型的な子宮平滑筋細胞を示す（Ｃ）。センス放射能標識ｃＲＮＡプローブは、バックグラウンド上にはシグナルを示さなかった（ＥおよびＦ）。倍率＝２００×（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および６３０×（ＣおよびＤ）、バー＝１５μｍ（Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）および５μｍ（ＣおよびＤ）。
【図５】図５（Ａ）−（Ｇ）は、１７β−エストラジオールおよび塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）によるＣｙｒ６１の、エキソビボ、平滑筋腫における調節欠如を示す。図（Ａ）−（Ｃ）は、新しい子宮筋層を表し、および図（Ｄ）−（Ｆ）は、エタノールビヒクル、１０ｎＭの１７β−エストラジオール（Ｅ２）、１０ｎＭのＲ５０２０、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎＭのＥ２および１０ｎＭのＭ５０２０の組み合わせ、１μＭのＩＣＩ１８２，７８０、または１０ｎＭのＥ２および１μＭのＩＣＩ１８２，７８０の組み合わせのいずれかの存在下、エキソビボで培養した平滑筋腫組織標本を示す。膜を、ＧＡＰＤＨｃＤＮＡで再プローブし、サンプルローディングＣおよびＦの等量を説明した。矢印は、２．４ｋｂの多い方のＣｙｒ６１および６．２ｋｂのＥＲα転写産物を示す。（Ｇ）は、算定されたデータを示す。値は、８人の患者に関する±ＳＤを示す。＊非処置の子宮筋層組織と比較した、Ｃｙｒ６１ｍＲＮＡレベルの有意な増加。
【図６】図６は、Ｃｙｒ６１の核酸配列を示す（配列番号：１）。
【図７】図７は、図６の核酸配列によりコードされるＣｙｒ６１のアミノ酸配列を示す（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＡＢ５８３１９）。
【図１】
2004509909.tif 000002
【図２】
2004509909.tif 000003
【図３】
2004509909.tif 000004
【図４】
2004509909.tif 000005
【図５】
2004509909.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004509909.tif 000007
2004509909.tif 000008
2004509909.tif 000009
2004509909.tif 000010
2004509909.tif 000011
2004509909.tif 000012
2004509909.tif 000013
2004509909.tif 000014
2004509909.tif 000015
2004509909.tif 000016
2004509909.tif 000017
2004509909.tif 000018
2004509909.tif 000019
2004509909.tif 000020
2004509909.tif 000021
2004509909.tif 000022
2004509909.tif 000023
2004509909.tif 000024
2004509909.tif 000025
2004509909.tif 000026
2004509909.tif 000027
2004509909.tif 000028
2004509909.tif 000029
2004509909.tif 000030
2004509909.tif 000031
2004509909.tif 000032
2004509909.tif 000033
2004509909.tif 000034
2004509909.tif 000035
2004509909.tif 000036
2004509909.tif 000037
2004509909.tif 000038
2004509909.tif 000039
2004509909.tif 000040
2004509909.tif 000041
2004509909.tif 000042
2004509909.tif 000043
2004509909.tif 000044
2004509909.tif 000045
2004509909.tif 000046
2004509909.tif 000047
2004509909.tif 000048
2004509909.tif 000049
2004509909.tif 000050
2004509909.tif 000051
2004509909.tif 000052
2004509909.tif 000053
2004509909.tif 000054
2004509909.tif 000055
2004509909.tif 000056
2004509909.tif 000057
2004509909.tif 000058
2004509909.tif 000059
2004509909.tif 000060
2004509909.tif 000061
2004509909.tif 000062
2004509909.tif 000063
2004509909.tif 000064
2004509909.tif 000065
2004509909.tif 000066
2004509909.tif 000067
2004509909.tif 000068
2004509909.tif 000069
2004509909.tif 000070
2004509909.tif 000071
2004509909.tif 000072
2004509909.tif 000073
2004509909.tif 000074
2004509909.tif 000075
2004509909.tif 000076
2004509909.tif 000077
2004509909.tif 000078
2004509909.tif 000079
2004509909.tif 000080
2004509909.tif 000081
2004509909.tif 000082
2004509909.tif 000083
2004509909.tif 000084
2004509909.tif 000085
2004509909.tif 000086
2004509909.tif 000087
2004509909.tif 000088
2004509909.tif 000089
2004509909.tif 000090
2004509909.tif 000091
2004509909.tif 000092
2004509909.tif 000093
2004509909.tif 000094
2004509909.tif 000095
2004509909.tif 000096
2004509909.tif 000097
2004509909.tif 000098
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509909.tif 000099
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509909.tif 000100
2004509909.tif 000101
2004509909.tif 000102
2004509909.tif 000103
2004509909.tif 000104
2004509909.tif 000105
2004509909.tif 000106
2004509909.tif 000107
2004509909.tif 000108
2004509909.tif 000109
2004509909.tif 000110
2004509909.tif 000111
2004509909.tif 000112
2004509909.tif 000113
2004509909.tif 000114
2004509909.tif 000115
2004509909.tif 000116
2004509909.tif 000117
2004509909.tif 000118
2004509909.tif 000119
2004509909.tif 000120
2004509909.tif 000121
2004509909.tif 000122
2004509909.tif 000123
2004509909.tif 000124
2004509909.tif 000125
2004509909.tif 000126
2004509909.tif 000127
2004509909.tif 000128
2004509909.tif 000129
2004509909.tif 000130
2004509909.tif 000131
2004509909.tif 000132
2004509909.tif 000133
2004509909.tif 000134
2004509909.tif 000135
2004509909.tif 000136
2004509909.tif 000137
2004509909.tif 000138
2004509909.tif 000139
2004509909.tif 000140
2004509909.tif 000141
2004509909.tif 000142
2004509909.tif 000143
2004509909.tif 000144
2004509909.tif 000145
2004509909.tif 000146
2004509909.tif 000147
2004509909.tif 000148
2004509909.tif 000149
2004509909.tif 000150
2004509909.tif 000151
2004509909.tif 000152
2004509909.tif 000153
2004509909.tif 000154
2004509909.tif 000155
2004509909.tif 000156
2004509909.tif 000157
2004509909.tif 000158
2004509909.tif 000159
2004509909.tif 000160
2004509909.tif 000161
2004509909.tif 000162
2004509909.tif 000163
2004509909.tif 000164
2004509909.tif 000165
2004509909.tif 000166
2004509909.tif 000167
2004509909.tif 000168
2004509909.tif 000169
2004509909.tif 000170
2004509909.tif 000171
2004509909.tif 000172
2004509909.tif 000173
2004509909.tif 000174
2004509909.tif 000175
2004509909.tif 000176
2004509909.tif 000177
2004509909.tif 000178
2004509909.tif 000179
2004509909.tif 000180
2004509909.tif 000181
2004509909.tif 000182
2004509909.tif 000183
2004509909.tif 000184
2004509909.tif 000185
2004509909.tif 000186
2004509909.tif 000187
【国際調査報告】
2004509909.tif 000188
2004509909.tif 000189
2004509909.tif 000190
2004509909.tif 000191