(57)【要約】本発明は、真核細胞において免疫グロブリン分子を発現する高効率の方法に関する。本発明は、真核細胞において発現させるために、特に三分子組換え法を用い、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ライブラリーを製造する方法についてさらに開示している。本発明は更に、抗原特異的免疫グロブリン分子及びそれらの抗原特異的断片を選択及びスクリーニングする方法を提供する。本発明は、抗原特異的免疫グロブリン分子を製造、スクリーニング、及び選択するキットも提供する。最終的には、本発明は、本明細書において提供された方法により製造された免疫グロブリン分子及びそれらの抗原特異的断片を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、抗原特異的免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片をコードするポリヌクレオチドを選択する方法：
（ａ）該免疫グロブリン分子の発現が可能な真核宿主細胞の集団に、転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの第一のライブラリーを導入する段階であって、各第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは：
（ｉ）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域からなる群より選択される第一の免疫グロブリンの定常領域、
（ｉｉ）該第一の定常領域に対応する免疫グロブリン可変領域、及び
（ｉｉｉ）該第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの細胞表面発現又は分泌を指示することが可能なシグナルペプチドを含む段階；
（ｂ）該宿主細胞に、転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの第二のライブラリーを導入する段階であって、各第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは：
（ｉ）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域からなる群より選択される、該第一の免疫グロブリン定常領域と同一でない第二の免疫グロブリンの定常領域、
（ｉｉ）該第二の定常領域に対応する免疫グロブリン可変領域、及び
（ｉｉｉ）該第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの細胞表面発現又は分泌を指示することが可能なシグナルペプチドを含み；
ここで該第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは、該第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドと結合して、該宿主細胞の膜表面に付着した免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を形成することが可能である段階；
（ｃ）該宿主細胞から免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現させる段階；
（ｄ）該免疫グロブリン分子を抗原と接触させる段階；並びに
（ｅ）該抗原に特異的な免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現している該第一のライブラリーのこれらのポリヌクレオチドを回収する段階。
【請求項２】
以下の段階を更に含む、請求項１記載の方法：
（ｆ）回収されたポリヌクレオチドを、免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞集団に導入する段階；
（ｇ）該宿主細胞へ該ポリヌクレオチドの第二のライブラリーを導入する段階；  （ｈ）該宿主細胞から免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現させる段階；
（ｉ）該宿主細胞を該抗原と接触させる段階；並びに
（ｊ）該抗原に特異的な免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現している該第一のライブラリーのこれらのポリヌクレオチドを回収する段階。
【請求項３】
段階（ｆ）〜（ｊ）を１回又は複数回繰り返し、それにより免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、該抗原に特異的に結合する第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードする該第一のライブラリーのポリヌクレオチドを濃縮することを更に含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
第一のライブラリーから回収されたそれらのポリヌクレオチドを単離する段階を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
以下の段階を更に含む、請求項４記載の方法：
（ｋ）免疫グロブリン分子を発現することが可能な真核宿主細胞集団へ、ポリヌクレオチドの第二のライブラリーを導入する段階；
（ｌ）該宿主細胞へ、該第一のライブラリーから単離されたこれらのポリヌクレオチドを導入する段階；
（ｍ）該宿主細胞から、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現させる段階；
（ｎ）該宿主細胞を該特異的抗原と接触させる段階；並びに
（ｏ）該抗原に特異的な免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現している該第二のライブラリーのこれらのポリヌクレオチドを回収する段階。
【請求項６】
以下の段階を更に含む、請求項５記載の方法：
（ｐ）回収されたポリヌクレオチドを、免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞集団へ導入する段階；
（ｑ）該宿主細胞へ、該第一のライブラリーから単離されたこれらのポリヌクレオチドを導入する段階；
（ｒ）該宿主細胞から、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現させる段階；
（ｓ）該宿主細胞を該抗原と接触させる段階；並びに
（ｔ）該抗原に特異的な免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現する該第二のライブラリーのこれらのポリヌクレオチドを回収する段階。
【請求項７】
段階（ｐ）〜（ｔ）を１回又は複数回繰り返し、それにより免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、該抗原に特異的に結合する第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードする該第二のライブラリーのポリヌクレオチドを濃縮することを更に含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
第二のライブラリーから回収されたこれらのポリヌクレオチドを単離する段階を更に含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリン分子がヒト免疫グロブリン分子である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖又はそれらの抗原特異的断片である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
免疫グロブリン重鎖又はそれらの抗原特異的断片が、免疫グロブリン重鎖の膜結合型である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
免疫グロブリン重鎖又はそれらの抗原特異的断片が、天然の免疫グロブリン膜貫通ドメインを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
免疫グロブリン重鎖又はそれらの抗原特異的断片が、融合タンパク質の一部として宿主細胞に付着している、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
融合タンパク質が異種膜貫通ドメインを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
融合タンパク質がＦａｓデスドメインを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
免疫グロブリン重鎖又はそれらの抗原特異的断片が、ＩｇＭ重鎖、ＩｇＤ重鎖、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＡ重鎖、ＩｇＥ重鎖、及び該重鎖のいずれかの抗原特異的断片からなる群より選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、変更された免疫エフェクター機能を支持する修飾を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
免疫グロブリン重鎖又はそれらの抗原特異的断片が、ＩｇＭ重鎖又はそれらの抗原特異的断片を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖又はそれらの抗原特異的断片である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
免疫グロブリン軽鎖又はそれらの抗原特異的断片が、該免疫グロブリン重鎖又はそれらの抗原特異的断片に結合し、それにより免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片が生産される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
免疫グロブリン軽鎖が、κ軽鎖及びλ軽鎖からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドの第一のライブラリーが真核ウイルスベクターにおいて構築されている、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドの第二のライブラリーが真核ウイルスベクターにおいて構築されている、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドが、真核ウイルスベクターにより導入される、請求項５記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドの第二のライブラリーが、プラスミドベクターにおいて構築されている、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞が、第一のライブラリーに約１〜約１０の範囲のＭＯＩで感染し、該第二のライブラリーの最大２０個のポリヌクレオチドが各感染宿主細胞により取込まれることが可能な条件下で第二のライブラリーが導入される、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドが、プラスミドベクター内の宿主細胞へ導入される、請求項５記載の方法。
【請求項２８】
真核ウイルスベクターが動物のウイルスベクターである、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
真核ウイルスベクターが動物のウイルスベクターである、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスベクターが、哺乳類細胞における感染性ウイルス粒子を生産することができる、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
ウイルスベクターの天然のゲノムがＤＮＡである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ウイルスベクターの天然のゲノムがＲＮＡである、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
ウイルスベクターの天然のゲノムが、直鎖状の二本鎖ＤＮＡである、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びポックスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ウイルスベクターがポックスウイルスベクターである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ポックスウイルスベクターが、オルトポックスウイルスベクター、アビポックスウイルスベクター、カプリポックスウイルスベクター、レポリポックスウイルスベクター、エントモポックスウイルスベクター、及びスイポックスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ポックスウイルスベクターが、ワクシニアウイルスベクター及びアライグマポックスウイルスベクターからなる群より選択されるオルトポックスウイルスベクターである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
動物ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
宿主細胞が、ウイルスの感染性ウイルス粒子の産生を許容する、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
ワクシニアウイルスが弱毒化されている、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
ワクシニアウイルスベクターがＤ４Ｒ合成において欠損している、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドの第一のライブラリーの転写調節領域が、ポックスウイルスに感染した細胞の細胞質において機能する、請求項３５記載の方法。
【請求項４３】
プラスミドベクターが、転写調節領域との操作可能な結合を介して、ポックスウイルスに感染した細胞の細胞質における第二の免疫グロブリンサブユニットの合成を指示する、請求項２５記載の方法。
【請求項４４】
転写調節領域がプロモーターを含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
プロモーターが構成的である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
プロモーターがワクシニアウイルスｐ７．５プロモーターである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
プロモーターが合成の初期／後期プロモーターである、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
プロモーターが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが発現されている細胞において活性なＴ７ファージプロモーターである、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
転写調節領域が転写終結領域を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
以下の段階を含む方法により、ポリヌクレオチドの第一のライブラリーが真核ウイルスベクターにおいて構築される、請求項２２記載の方法：
（ａ）単離された直鎖状ＤＮＡウイルスゲノムを切断し、第一のウイルス断片及び第二のウイルス断片を製造する段階であって、該第一の断片が、該第二の断片と相同でない段階；
（ｂ）５’フランキング領域及び３’フランキング領域が隣接した転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の免疫グロブリン重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む伝達性プラスミドの集団を提供する段階であって、該５’フランキング領域は該第一のウイルス断片と相同であり、かつ該３’フランキング領域は該第二のウイルス断片と相同であり；かつ、該伝達性プラスミドは、該第一及び第二のウイルス断片との相同的組換えが可能であり、その結果生存可能なウイルスゲノムが形成される段階；
（ｃ）該伝達性プラスミド並びに該第一及び第二のウイルス断片を、伝達性プラスミド及び該ウイルス断片がインビボでの相同的組換えを受ける条件下で、宿主細胞へ導入する段階であって、それにより免疫グロブリン重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む生存可能な修飾されたウイルスゲノムが製造される段階；並びに
（ｄ）該修飾されたウイルスゲノムを回収する段階。
【請求項５１】
以下の段階を含む方法により、ポリヌクレオチドの第二のライブラリーが真核ウイルスベクターにおいて構築される、請求項２３記載の方法：
（ａ）単離された直鎖状ＤＮＡウイルスゲノムを切断して第一のウイルス断片及び第二のウイルス断片を製造する段階であって、該第一の断片が、該第二の断片と相同でない段階；
（ｂ）５’フランキング領域及び３’フランキング領域が隣接した転写調節領域との操作可能な結合を介して、該複数の免疫グロブリン軽鎖をコードする該ポリヌクレオチドを含む伝達性プラスミドの集団を提供する段階であって、該５’フランキング領域は該第一のウイルス断片と相同であり、かつ該３’フランキング領域は該第二のウイルス断片と相同であり；かつ、該伝達性プラスミドは、該第一及び第二のウイルス断片との相同的組換えが可能であり、その結果生存可能なウイルスゲノムが形成される段階；
（ｃ）該伝達性プラスミド並びに該第一及び第二のウイルス断片を、伝達性プラスミド及び該ウイルス断片がインビボでの相同的組換えを受ける条件下で、宿主細胞へ導入する段階であり、それにより免疫グロブリン軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む生存可能な修飾されたウイルスゲノムが製造される段階、並びに
（ｄ）該修飾されたウイルスゲノムを回収する段階。
【請求項５２】
抗原特異的免疫グロブリン分子をコードするポリヌクレオチドが：
（ａ）抗原誘導型細胞死；
（ｂ）抗原誘導型シグナル伝達；及び
（ｃ）抗原特異的結合からなる群より選択される作用の検出により同定される、請求項１記載の方法。
【請求項５３】
抗原特異的免疫グロブリン分子をコードするポリヌクレオチドが：
（ａ）抗原誘導型細胞死；
（ｂ）抗原誘導型シグナル伝達；及び
（ｃ）抗原特異的結合からなる群より選択される作用の検出により同定される、請求項５記載の方法。
【請求項５４】
作用が抗原誘導型細胞死である、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
作用が抗原誘導型細胞死である、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
宿主細胞が、それらの表面に免疫グロブリン分子を発現し、抗原に結合する免疫グロブリン分子を発現している該宿主細胞が、アポトーシスの誘導により抗原特異的免疫グロブリン受容体の架橋結合に直接反応する、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
宿主細胞が、それらの表面に免疫グロブリン分子を発現し、抗原に結合する免疫グロブリン分子を発現している該宿主細胞が、アポトーシスの誘導により抗原特異的免疫グロブリン受容体の架橋結合に直接反応する、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
作用が抗原誘導型シグナル伝達である、請求項５２記載の方法。
【請求項５９】
作用が抗原誘導型シグナル伝達である、請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
宿主細胞が、それらの表面に免疫グロブリン分子を発現し、抗原に結合する免疫グロブリン分子を発現している該宿主細胞が、検出可能なレポーター分子の発現により抗原特異的免疫グロブリン受容体の架橋結合に反応する、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
宿主細胞が、それらの表面に免疫グロブリン分子を発現し、抗原に結合する免疫グロブリン分子を発現している該宿主細胞が、検出可能なレポーター分子の発現により抗原特異的免疫グロブリン受容体の架橋結合に反応する、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
レポーター分子が、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、及びβ−ガラクトシダーゼからなる群より選択される、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
レポーター分子が、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、及びβ−ガラクトシダーゼからなる群より選択される、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
作用が抗原特異的結合である、請求項５２記載の方法。
【請求項６５】
以下の段階を含む、請求項６４記載の方法：
（ａ）、宿主細胞により発現された抗原特異的免疫グロブリン分子が抗原に結合する条件下で、該宿主細胞を該抗原と接触させる段階；及び
（ｂ）該抗原が結合した免疫グロブリン分子を発現している、これらの宿主細胞プールから又は先に取り分けたポリヌクレオチドの複製プールから該第一のライブラリーのポリヌクレオチドを回収する段階。
【請求項６６】
以下の段階を更に含む、請求項６５記載の方法：
（ｃ）回収されたポリヌクレオチドを複数のサブプールに分割し、かつ該サブプールを該免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞の集団に導入する段階；
（ｄ）該宿主細胞から、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現させる段階；
（ｅ）該宿主細胞により発現された抗原特異的免疫グロブリン分子が該抗原に結合する条件下で、該プールを該抗原と接触させる段階；及び
（ｆ）該抗原が結合した免疫グロブリン分子を発現している、これらの宿主細胞プールから又は先に取り分けたポリヌクレオチドの複製プールから、該第一のライブラリーのポリヌクレオチドを回収する段階。
【請求項６７】
段階（ｃ）〜（ｆ）を１回又は複数回繰り返し、それにより免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、抗原に特異的に結合する第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードする第一のライブラリーのポリヌクレオチドを濃縮することを更に含む、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
抗原が、合成粒子、ポリマー、磁気ビーズ、及びタンパク質で被覆した組織培養プレートからなる群より選択される基質に付着している、請求項６４記載の方法。
【請求項６９】
抗原が、抗原発現性の提示細胞の表面上に発現され、該抗原発現性の提示細胞は、該抗原を操作可能にコードするポリヌクレオチドによる抗原フリー提示細胞のトランスフェクションにより構築される、請求項６４記載の方法。
【請求項７０】
抗原発現性の提示細胞が、Ｌ細胞、Ｃｏｓ７細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＮＩＨ ３Ｔ３細胞からなる群より選択される抗原フリー提示細胞において構築される、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
抗原が蛍光タグに結合され、抗原に結合する免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞プールが、蛍光活性化された細胞選別により同定される、請求項６５記載の方法。
【請求項７２】
作用が抗原特異的結合である、請求項５３記載の方法。
【請求項７３】
以下の段階を含む、請求項７２記載の方法：
（ａ）宿主細胞により発現された抗原特異的免疫グロブリン分子が抗原に結合する条件下で該宿主細胞のプールを該抗原と接触させる段階；及び
（ｂ）該抗原が結合した免疫グロブリン分子を発現している、これらの宿主細胞プールから又は先に取り分けたポリヌクレオチドの複製プールから、第二のライブラリーのポリヌクレオチドを回収する段階。
【請求項７４】
以下の段階を更に含む、請求項７３記載の方法：
（ｃ）回収されたポリヌクレオチドを複数のサブプールに分割し、かつ該サブプールを該免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞の集団に導入する段階；
（ｄ）該宿主細胞から、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現させる段階；
（ｅ）該宿主細胞により発現された抗原特異的免疫グロブリン分子が該抗原に結合する条件下で、該プールを該抗原と接触させる段階；及び
（ｆ）該抗原が結合した免疫グロブリン分子を発現している、これらの宿主細胞プールから又は先に取り分けたポリヌクレオチドの複製プールから、該第二のライブラリーのポリヌクレオチドを回収する段階。
【請求項７５】
段階（ｃ）〜（ｆ）を１回又は複数回繰り返し、それにより免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、該抗原に特異的に結合する第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている該第一のライブラリーのポリヌクレオチドを濃縮することを更に含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
抗原が、合成粒子、ポリマー、磁気ビーズ、及びタンパク質で被覆した組織培養プレートからなる群より選択される基質に付着している、請求項７２記載の方法。
【請求項７７】
抗原が抗原発現性の提示細胞の表面上に発現され、該抗原発現性の提示細胞が、該抗原を操作可能的にコードするポリヌクレオチドによる抗原フリー提示細胞のトランスフェクションにより構築される、請求項７２記載の方法。
【請求項７８】
抗原発現性の提示細胞が、Ｌ細胞、Ｃｏｓ７細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＮＩＨ ３Ｔ３細胞からなる群より選択される抗原フリー提示細胞において構築される、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
抗原が蛍光タグに結合され、抗原に結合する免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞プールが、蛍光活性化された細胞選別により同定される、請求項７３記載の方法。
【請求項８０】
（ａ）転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの第一のライブラリーであって、各第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが：
（ｉ）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域からなる群より選択される第一の免疫グロブリン定常領域、
（ｉｉ）該第一の定常領域に対応する免疫グロブリン可変領域、及び
（ｉｉｉ）該第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの細胞表面発現又は分泌を指示することが可能なシグナルペプチドを含む、
真核ウイルスベクターにおいて構築される第一のライブラリー；
（ｂ）転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの第二のライブラリーであって、各々が：
（ｉ）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域からなる群より選択される、該第一の免疫グロブリン定常領域と同一でない第二の免疫グロブリン定常領域、
（ｉｉ）該第二の定常領域に対応する免疫グロブリン可変領域、及び
（ｉｉｉ）該第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの細胞表面発現又は分泌を指示することが可能なシグナルペプチドを含み、
ここで、該第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは、該第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドと結合して、表面免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を形成することができ、かつ真核ウイルスベクターにおいて構築される第二のライブラリー；及び
（ｃ）該免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞の集団
を含む、真核宿主細胞において発現された抗原特異的組換え免疫グロブリンを選択するためのキットであって；
該第一及び第二のライブラリーが、感染性ウイルス粒子及び失活されたウイルス粒子の両方として提供され、該失活されたウイルス粒子は、該宿主細胞に感染し、該第一及び第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの発現を可能にするが、ウイルス複製は受けない；かつ
該宿主細胞により発現された抗原特異的免疫グロブリン分子は、抗原との相互作用を介して選択される、キット。
【請求項８１】
請求項１記載の方法により製造された抗体又はそれらの抗原特異的断片。
【請求項８２】
請求項８１記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項８３】
以下の段階を含む、単一ドメイン抗原特異的免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片をコードしているポリヌクレオチドを選択する方法：
（ａ）転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の単一ドメイン免疫グロブリンポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーを、該免疫グロブリン分子を発現することが可能な真核宿主細胞の集団に導入する段階であって、各免疫グロブリンポリペプチドが：
（ｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域、
（ｉｉ）ラクダ化された免疫グロブリン重鎖可変領域、及び
（ｉｉｉ）該免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの細胞表面発現又は分泌を指示することが可能なシグナルペプチドを含む段階；
（ｂ）該宿主細胞から、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現させる段階；
（ｃ）該免疫グロブリン分子を抗原と接触させる段階；及び
（ｄ）該抗原に結合する免疫グロブリン分子を発現しているこれらの宿主細胞から該ライブラリーのポリヌクレオチドを回収する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、真核細胞において免疫グロブリン分子を発現する高効率の方法、真核細胞において発現するために免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のライブラリーを製造する方法、特異的抗原に結合する免疫グロブリンを単離する方法、並びにこれらの方法のいずれかにより製造された免疫グロブリンに関する。
【０００２】
関連技術
免疫グロブリンの製造
特異性が定義された抗体は、数が増大しつつある多様な治療的用途において使用されている。
【０００３】
自己抗原に対して定義された抗体は、インビボにおける治療及び診断の目的に特に価値がある。多くの齧歯類のモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ技術を用いて単離されており、かつヒトにおけるインビボにおける治療及び診断の目的に利用されている。例えば、これらのマウスのモノクローナル抗体の初期の用途は、腫瘍を殺傷又は造影するための標的化剤としてであった（Ｆ． Ｈ． Ｄｅｌａｎｄ 及びＤ． Ｍ． Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、１９８２年、「放射性核種造影（Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｉｍａｇｉｎｇ）」、Ｄ． Ｅ． Ｋｕｈｌ編集、２８９−２９７頁、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、パリ；Ｒ． Ｌｅｖｙ及びＲ． Ａ． Ｍｉｌｌｅｒ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ．、３４：１０７−１１６（１９８３））。しかし、このような抗体のインビボにおける使用は、問題となり得る。外来免疫グロブリンは、治療を妨害し得る抗免疫グロブリン応答を誘起するか（Ｒ． Ａ． Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、６２９８８−９９５（１９８３））、もしくはアレルギー又は免疫複合体過敏症を引き起すことがある（Ｂ． Ｒａｔｎｅｒ、１９４３年、「アレルギー、アナフィラキシス及び免疫療法（Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、ボルチモア）。従って、それら自身宿主において免疫原性でないような抗体を開発すること、例えば、ヒトにおいてそれら自身免疫原性でないようなヒト抗原に対する抗体を開発することが、このような用途には特に重要である。
【０００４】
自己抗原に対する特異性を伴う抗体断片を単離することは過酷な作業である。動物は、通常自己抗原に対する抗体を産生せず、この現象は免疫寛容と呼ばれる（Ｎｏｓｓａｌ， Ｇ． Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：１４７−１５３（１９８９））。概して、自己抗原によるワクチン接種は、循環血中抗体産生を招かない。従って、自己抗原に対する抗体を生じることは困難である。
【０００５】
先に、「自己」抗原を特異的に認識する免疫グロブリン分子を作成するために、３つの一般的戦略が使用されている。ひとつの方法において、齧歯類抗体配列は、ヒト抗体のフレームワーク領域に選択された齧歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む特定化された相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植することにより、ヒト抗体配列に転換されている（Ｗｉｎｔｅｒら、英国特許第ＧＢ２１８８６３８Ｂ号（１９８７）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ． Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｆｏｏｔｅ， Ｊ．及びＷｉｎｔｅｒ， Ｇ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２４：４８７−４９９（１９９２））。抗体のヒト化と称されるこの方法において、各齧歯類免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の３種のＣＤＲループが、対応するヒト免疫グロブリン鎖の４個のフレームワーク領域の相同の位置に移植される。このフレームワーク残基の一部は、抗体親和性にも寄与しているので、この構造は概して、親和性を増強するために、追加のフレームワーク置換により更に純化されなければならない。これは、労力と経費のかかるプロセスである。
【０００６】
更に最近になって、ヒト免疫グロブリン配列を発現しているトランスジェニックマウスが作出されている（Ｍｅｎｄｅｚ， Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、１５：１４６−１５６（１９９７））。この戦略は、ヒト抗体の選択を促進する可能性があるが、抗体は、ヒトゲノムよりむしろマウスゲノムにおいてコードされたタンパク質により形作られた利用可能なマウスレパトアから選択されるという制限を、抗体ヒト化法と共有している。これは、特異的抗原に対する反応において選択された抗体のエピトープ特異性にバイアスをかける。例えば、マウスホモログが存在するヒトタンパク質によるマウスの免疫感作は、主としてヒト及びマウスにおいて異なるエピトープについて特異的な抗体を生じると予想される。しかし、これらは、最適な標的エピトープではない。
【０００７】
これと同じ制限を受けない別の方法は、バクテリオファージ上に展示された組換えヒト抗体断片のスクリーニングである（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ． Ｊ．ら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：３０９−３１４（１９９６）；Ｂａｒｂａｓ， Ｃ．Ｆ．、ＩＩＩ Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１：８３７−８３９（１９９５）；Ｋａｙ， Ｂ．Ｋ．ら（編集）、「ペプチド及びタンパク質のファージディスプレイ（Ｐｎａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社（１９９６））。ファージディスプレイ法において、機能性免疫グロブリンドメインは、それらをコードしているポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に展示される。典型的ファージディスプレイ法において、免疫グロブリン断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化されたＦｖの免疫グロブリンドメインは、融合タンパク質として展示される、すなわち、ファージ表面タンパク質に融合される。抗体を作成するために使用することができるファージディスプレイ法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ， Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ．Ａ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ， Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ、１８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ， Ｄ．Ｒ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９Ｌ／０１１３４号；国際公開公報第９０／０２８０９号；国際公開公報第９１／１０７３７号；国際公開公報第９２／０１０４７号；国際公開公報第９２／１８６１９号；国際公開公報第９３／１１２３６号；国際公開公報第９５／１５９８２号；国際公開公報第９５／２０４０１号；及び、米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号及び第５，７３３，７４３号に開示されているものを含む（これらの参考文献はその全体が本明細書に参照として組入れられている）。
【０００８】
ファージディスプレイ法は、通常免疫グロブリン分子の抗原結合断片の発現のみを生じるので、ファージ選択後、このファージ由来の免疫グロブリンコード領域は、単離及び再クローニングし、ヒト抗体、又はいずれか他の所望の抗原結合断片を含む、抗体全体を作出し、かつ哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む、いずれか所望の宿主において発現されなければならない。例えば、組換えによりＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を作成する技術も、国際公開公報第９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ， Ｒ．Ｌ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２（６）：８６４−８６９（１９９２）；及び、Ｓａｗａｉ， Ｈ．ら、ＡＪＲＩ、３４：２６−３４（１９９５）；及び、Ｂｅｔｔｅｒ， Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０４１−１０４３（１９８８）に説明されたような、当技術分野において公知の方法を用い使用することができる（これらの参考文献は、その全体が本明細書に参照として組入れられている。）。
【０００９】
バクテリオファージにおいて構築された免疫グロブリンライブラリーは、ナイーブな又は特異的に免疫感作された個体の抗体産生細胞に由来し、かつ原則として、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の新規かつ多様な対形成を含む。この戦略は、固有のレパトア制限（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）により損なわれないが、発現された免疫グロブリン断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）が細菌細胞において合成され、かつ適切に折り畳まれることが必要である。しかし、多くの抗原結合領域は、細菌細胞において融合タンパク質として正確に集成することが困難である。加えてこのタンパク質は、正常な真核細胞の翻訳後修飾を受けないと考えられる。結果として、この方法は、得られた抗体特異性に異なる選択フィルターを課している。
【００１０】
従って、真核細胞において合成され、適切にグリコシル化され、かつ正確に集成されたバイアスのかかっていない免疫グロブリンレパトアから、免疫グロブリン分子、及びそれらの抗原特異的断片を同定する別法の必要性が存在する。
【００１１】
真核細胞発現ライブラリー  分子生物学の分野での基本的ツールは、ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡの二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡへの転換であり、これはその後クローニングベクターに挿入され、かつ適当な宿主細胞において発現される。多くのｃＤＮＡクローニング戦略に共通の方法は、関心のある生物の細胞由来のポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡからのｃＤＮＡクローンの収集である「ｃＤＮＡライブラリー」の構築に関連している。例えば、免疫グロブリン遺伝子を発現しているｃＤＮＡを単離するために、プレＢ細胞、Ｂ細胞、又は形質細胞からｃＤＮＡライブラリーが調製される。繊維状バクテリオファージ、バクテリオファージλ、コスミド及びプラスミドベクターを含む様々な発現ベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、公知である。一般に使用される方法の一部は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「分子クローニング；実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９９０）に説明されている。
【００１２】
ｃＤＮＡライブラリーから標的遺伝子を単離する多くの異なる方法が利用され、様々な成功がもたらされている。これらは、例えば、標的遺伝子のＤＮＡ配列と相補的な配列を有する核酸断片が標識されている、核酸ハイブリダイゼーションプローブの使用を含む。この方法が、形質転換された細菌宿主のｃＤＮＡクローンに適用された場合は、このプローブに強力にハイブリダイズしているコロニー又はプラークは、恐らく標的ＤＮＡ配列を含むと考えられる。しかしハイブリダイゼーション法は、特定のｃＤＮＡクローンが発現されているかどうかは必要とせず、又測定しない。別のスクリーニング法は、細菌宿主における発現に頼っており、例えば、コロニー又はプラークは、関心のあるタンパク質に対して生じた抗体に対する結合の免疫アッセイによりスクリーニングすることができる。しかし細菌宿主における発現のアッセイは、妨げられることが多く、その理由はこのタンパク質は、細菌宿主において十分には発現されず、劣悪なコンホメーションで発現され、かつ真核システムにおいてのようにはプロセシング及び／又は輸送されないからである。これらの問題点の多くは、先に暗示したような、細菌宿主における免疫グロブリン分子作出の試みにおいて遭遇する。
【００１３】
従って、免疫グロブリン分子をコードしているｃＤＮＡを単離するための哺乳類発現ライブラリーの使用は、細菌ライブラリーに勝るいくつかの利点を供すると考えられる。例えば、真核宿主において発現された免疫グロブリン分子、及びそれらのサブユニットは、機能性であるはずであり、かつ通常の翻訳後修飾を受けるはずである。通常細胞内膜システムを通って細胞表面に輸送されるタンパク質は、完全な輸送プロセスを受けるはずである。更に真核システムの使用は、真核ＲＮＡ又はタンパク質の機能発現を基にしたポリヌクレオチドの単離を可能にすると考えられる。例えば、免疫グロブリン分子は、所定の抗原に関するそれらの特異性を基に単離される。
【００１４】
いくつかの最近のＣＯＳ細胞における発現により単離されたリンホカインｃＤＮＡを除き（Ｗｏｎｇ， Ｇ． Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：８１０−８１５（１９８５）；Ｌｅｅ， Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８３：２０６１−２０６５（１９８６）；Ｙｏｋｏｔａ， Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８３：５８９４−５８９８（１９８６）；Ｙａｎｇ， Ｙ．ら、Ｃｅｌｌ、４７：３−１０（１９８６））、ほとんどのｃＤＮＡは哺乳類発現ライブラリーから単離されていない。これにはふたつの主な理由があるように思われ：第一には、巨大なプラスミドライブラリーの構築のための現存する技術（Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２：１６１−１７０（１９８２））は、マスターすることが困難であり、ファージクローニング技術（Ｈｕｙｎｈ， Ｔ．ら、「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第Ｉ巻、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ． Ｍ．（編集）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ社、オックスフォード、（１９８５年）、４９−７８頁）により達成可能なライブラリーサイズには、近づくことが稀であるからである。第二には、現存するベクターは、ひとつの例外（Ｗｏｎｇ， Ｇ． Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：８１０−８１５（１９８５））を除き、高レベル発現への適合が難しいからである。従って、哺乳類宿主における発現は、より従来型クローニング法により単離された遺伝子によりコードされたタンパク質の同一性を証明する手段としてのみ最も頻繁に使用されている。
【００１５】
ポックスウイルスベクター  ポックスウイルスベクターは、真核細胞におけるタンパク質及び抗原の発現のための発現運搬体として広範に使用されている。様々な宿主細胞におけるワクシニアのクローニング及び繁殖の容易さは、外来タンパク質の発現のため、及びワクチン送達運搬体としてのポックスウイルスベクターの広範な使用につながっている（Ｍｏｓｓ， Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１６６２−７（１９９１））。
【００１６】
大きなＤＮＡウイルスは、様々な細胞株においてそれらの未変性型で多くの異なるタンパク質を発現することができるような細胞プロセシングの研究にとって特に有用な発現ベクターである。加えて、組換えワクシニアウイルスにおいて発現された遺伝子産物は、効率的にプロセシングされかつ細胞傷害性Ｔ細胞の刺激についてＭＨＣクラスＩに関連して提示されることが示されている。関心のある遺伝子は、通常プラスミドにおいて、ウイルスの非必須領域に相同の配列にフランキングしたプロモーターの制御下でクローニングされ、かつこのカセットは、相同的組換えによりゲノムへ導入される。発現、選択及び検出のためのベクター一式は、様々なクローニング及び発現の戦略に順応するように考案されている。しかし相同的組換えは、複合体ライブラリーの作成に必要な状況又は関心のあるＤＮＡが大きい場合には、組換えウイルスの作出には無効な手段である。挿入断片へのウイルスのＤＮＡ「アーム」の直接ライゲーション及びそれに続く感染性ウイルスのレスキューに頼った組換えゲノムの構築のための別の戦略は、ポックスウイルスゲノム（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６（１９９２）；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、Ｊ． Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７６：２９５７−２９６２（１９９５）；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：９９７７−９９８１（１９９２））、ヘルペスウイルスゲノム（Ｒｉｘｏｎら、Ｊ． Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１：２９３１−２９３９（１９９０））及びバキュロウイルスゲノム（Ｅｒｎｓｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：２８５５−２８５６（１９９４））の探索である。
【００１７】
ポックスウイルスは、外来タンパク質を高レベルで発現するために容易に構築しかつ操作することができるので、真核細胞研究のための普遍的ベクターである。このウイルスの広範な宿主範囲は、様々な細胞型におけるタンパク質の忠実な発現を可能にする。直接のクローニング戦略が、組換えゲノムが、ＤＮＡ断片のワクシニア「アーム」への直接的ライゲーション及びＤＮＡ混合物のヘルパーウイルスにより感染した細胞へのトランスフェクションによりインビトロにおいて構築されるような、ポックスウイルスのウイルスキメラの適用の範囲を広げるために考案されている（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６（１９９２）；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：９９７７−９９８１（１９９２））。この方法は、外来タンパク質の高レベル発現（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７６：２９５７−２９６２（１９９５））及び長さが２６ｋｂと大きい断片の効率的クローニング（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６（１９９２））に使用される。
【００１８】
裸のワクシニアウイルスＤＮＡは感染性ではなく、その理由は、このウイルスは、細胞転写機構を利用することができず、かつウイルスＲＮＡの合成に関してはそれ自身のタンパク質に頼っているからである。これまでに、温度感受性条件付け致死性（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６（１９９２））又は非相同ポックスウイルス鶏痘（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：９９７７−９９８１（１９９２））が、パッケージングのヘルパーウイルスとして利用されている。理想的なヘルパーウイルスは、インプットＤＮＡからの感染性ウイルスの作成を効率的に促進するが、宿主細胞において複製することもワクシニアＤＮＡ産物と組換えることもないと考えられる。鶏痘ウイルスは、これらの理由により非常に有用なヘルパーウイルスである。これは、哺乳類細胞へ侵入することができ、かつインプットワクシニアウイルスＤＮＡの複製に必要なタンパク質を提供する。しかし、これは、ワクシニアＤＮＡとは組換えせず、かつ感染性鶏痘ビリオンは、哺乳類細胞においては作出されない。従って、これは比較的高い感染多重度（ＭＯＩ）で使用することができる。
【００１９】
慣習的に、外来タンパク質コード配列は、感染性ウイルスによる相同的組換えにより、ポックスウイルスゲノムへ導入される。この従来型の方法において、先に単離された外来ＤＮＡは、ウイルスの複製には必須でないポックスウイルス中の領域に相同である配列によりフランキングされたワクシニアプロモーターの後ろへ伝達性プラスミドにおいてクローニングされる。この伝達性プラスミドは、ポックスウイルス−感染細胞へ導入され、伝達性プラスミド及びポックスウイルスゲノムの、相同的組換えによるインビボ組換えを可能にする。相同的組換えの結果として、外来ＤＮＡは、ウイルスのゲノムへ転移される。
【００２０】
ポックスウイルスにおける従来型相同的組換えは、ポックスウイルスにおける先に単離された外来ＤＮＡの発現に有用であるが、この方法はライブラリーの構築には役に立たず、その理由は、回収されたウイルスの圧倒的多数は、外来ＤＮＡ挿入断片を獲得していないからである。従来型相同的組換えを使用すると、組換え効率は、およそ０．１％又はそれ未満の範囲である。従ってポックスウイルスベクターの使用は、タンパク質発現及びワクチン開発の目的での、先に単離されたＤＮＡ分子のサブクローニングに限られている。
【００２１】
直接的ライゲーションベクターを使用する別法は、相同的組換えに容易に順応し難いキメラゲノムの効率的構築のために開発されている（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６（１９９２）；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：９９７７−９９８１（１９９２））。このようなプロトコールにおいて、このゲノム由来のＤＮＡは、消化され、挿入断片ＤＮＡにインビトロにおいてライゲーションされ、かつヘルパーウイルスに感染した細胞へトランスフェクションされる（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ， Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６（１９９２）；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ， Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：９９７７−９９８１（１９９２））。あるプロトコールにおいて、このゲノムは、独自のＮｏｔＩ部位において消化され、かつキメラゲノムの選択又は検出のためのエレメントを含むＤＮＡ挿入断片は、ゲノムアームにライゲーションされる（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ， Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：９９７７−９９８１（１９９２））。この直接的ライゲーション法は、外来ＤＮＡのワクシニアウイルスゲノムへの挿入について説明されている（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、Ｊ． Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７６：２９５７−２９６２（１９９５））。
【００２２】
あるいは、このワクシニアＷＲゲノムは修飾され、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｆ断片のＮｏｔＩ部位を取除き、かつこの座位での配列の挿入がチミジンキナーゼ遺伝子を破壊し、薬剤選択を使用することによりキメラゲノムの単離を可能にするように、チミジンキナーゼ遺伝子の近傍にＮｏｔＩ部位を再導入することにより、ｖＮｏｔＩ／ｔｋを作出する（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ， Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６（１９９２））。直接的ライゲーションベクターｖＮｏｔＩ／ｔｋは、長さが少なくとも２６ｋｂ対の先に単離されたＤＮＡ挿入断片を効率的にクローニングしかつ繁殖することができる（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ， Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６（１９９２））。大きいＤＮＡ断片は、このゲノムへ効率的にクローニングされるが、ＤＮＡ挿入断片によりコードされたタンパク質は、ワクシニアにおいて比較的弱く発現された初期遺伝子クラス（ｅａｒｌｙ ｃｌａｓｓ ｇｅｎｅ）である、チミジンキナーゼ遺伝子に対応して低レベルで発現されるのみであると考えられる。加えてこのＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位で両方向へ挿入され、その結果全く発現されないであろう。加えて、直接的ライゲーションを使用する組換え効率は、従来型の相同的組換えにより認められるものよりも高いが、得られる力価は比較的低い。
【００２３】
従って、ポックスウイルスベクターは、クローン複合体集団からの関心のあるそれまで未知の遺伝子の同定には今までの所使用されておらず、その理由は高効率、高力価形成のクローニング法はポックスウイルスについては存在しなかったからである。しかしより最近になって、本発明者らは、三分子組換え（ｔｒｉ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を用いて組換えポックスウイルスを作成する方法を開発した。２０００年５月１８日に公開され、その全体が本明細書に参照として組入れられている、Ｚａｕｄｅｒｅｒの国際公開公報第００／０２８０１６号を参照のこと。
【００２４】
三分子組換えは、組換えポックスウイルスを作成するための、新規の高効率で高力価の形成法である。ワクシニアウイルスにおける三分子組換え法を使用し、本発明者らは、少なくとも９０％の組換え効率、及び直接的ライゲーションにより得られるものよりも少なくとも２桁大きい力価を達成した。三分子組換え法に従い、ポックスウイルスゲノムは切断され、２個の非相同断片又は「アーム」を作成する。これら２個のポックスウイルスアームに相同の領域によりフランキングされた異種挿入断片ＤＮＡを保持する導入ベクターが作成される。これらのアーム及び導入ベクターは、レシピエントの宿主細胞へ送達され、これら３種のＤＮＡ分子のインビボにおける組換えを可能にする。この組換えの結果、２種のポックスウイルスアームの各々及び挿入断片ＤＮＡを含む単独のポックスウイルスゲノム分子が作成される。
【００２５】
発明の概要
本発明の一つの局面に従い、真核細胞において発現されたポリヌクレオチドのライブラリーから、抗原特異的免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片をコードしているポリヌクレオチドを同定する方法が提供される。
【００２６】
更に変更されたエフェクター機能を有する免疫グロブリン分子、又はそれらの断片をコードしているポリヌクレオチドを同定する方法も提供される。
【００２７】
同じくウイルスベクターを用い、真核細胞において免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーを構築する方法も提供され、ここでこれらのライブラリーは、三分子組換えにより構築される。
【００２８】
更に、抗原誘導型細胞死、抗原誘導型シグナル伝達、又は抗原特異的結合の選択及び／又はスクリーニングにより、それらの表面上に抗原特異的免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現している宿主細胞を同定する方法も提供される。
【００２９】
同じく、抗原結合による又は免疫グロブリン分子の抗原特異的もしくは生物特異的機能の検出により、可溶性の分泌された免疫グロブリン分子をコードしているポリヌクレオチドのライブラリーを発現している真核宿主細胞から発現された可溶性免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片のスクリーニングする方法も提供される。
【００３０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、真核システムにおいて、機能的抗原特異的免疫グロブリン分子、又はそれらの抗原特異的断片（すなわち、抗原結合断片）を同定および／または製造する方法を広く目的としている。加えて本発明は、そのような免疫グロブリン分子又は断片をコードしているポリヌクレオチドの複合発現ライブラリーから、抗原特異的免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片をコードしているポリヌクレオチドを同定する方法を目的とし、ここでこれらのライブラリーは、真核宿主細胞において構築及びスクリーニングされている。更なる態様は、前記方法のいずれかにより製造された、単離された抗原特異的免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片、並びにこのような単離された免疫グロブリンの作成を可能にするキットを含む。
【００３１】
特に好ましい本発明の局面は、三分子組換えにより構築されたポックスウイルスベクターを用いる、真核宿主細胞における複合免疫グロブリンライブラリーの構築である。ポックスウイルスベースのベクターにおいて複合ｃＤＮＡライブラリーを構築する能力、並びに抗原が誘導した細胞死、抗原が誘導したシグナル伝達、又は抗原特異的結合のいずれかを基にした特異的組換え体を選択及び／又はスクリーニングする能力は、真核細胞において様々な良く定義された特異性を伴う免疫グロブリン、特にヒト免疫グロブリンの同定の基礎となることができる。これは齧歯類における抗体レパトアの選択により付与されるバイアス又はファージもしくは細菌における合成及び集成の制限を克服すると考えられる。
【００３２】
「ある（ａ， ａｎ）」実体という用語は、１種又は複数のその実体を意味し；例えば、「ある免疫グロブリン分子」は、１個又は複数の免疫グロブリン分子を表わしていると理解されるべきである。このように「ある（ａ）」（又は「ａｎ」）、「１個又は複数」及び「少なくとも１個」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００３３】
「真核生物」又は「真核生物」という用語は、原虫、真菌、酵母、緑藻類、単細胞植物、多細胞植物、並びに脊椎及び無脊椎動物の両方の全ての動物を含む、動物界、植物界、及び原生生物界の全ての生体を包含することが意図されている。この用語は、細菌又はウイルスは包含していない。「真核細胞」は、単数の「真核細胞」に加え、複数の「真核細胞」を包含し、かつ真核生物由来の細胞を含むことが意図されている。
【００３４】
「脊椎動物」という用語は、単数の「脊椎動物」に加え、複数の「脊椎動物」を包含し、かつ哺乳類、鳥類に加え、魚類、爬虫類、及び両生類を含むことが意図されている。
【００３５】
「哺乳類」という用語は、単数の「哺乳類」及び複数の「哺乳類」を包含することが意図され、かつヒト；類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジーのような霊長類；イヌ及びオオカミのようなイヌ科；ネコ、ライオン、及びトラのようなネコ科；ウマ、ロバ及びシマウマのようなウマ科；ウシ、ブタ及びヒツジのような食用動物；シカ及びキリンのような有蹄類；マウス、ラット、ハムスター及びモルモットのような齧歯類；並びにクマを含むが、これらに限定されるものではない。好ましい哺乳類は、ヒト対象である。
【００３６】
「組織培養」もしくは「細胞培養」又は「培養物」もしくは「培養」という用語は、インビトロにおける、細胞構造の保存、細胞機能の保存、更には分化、又は３種全てを可能にする条件下での、植物又は動物の組織又は細胞の維持又は成長を意味する。「初代組織細胞」は、組織から直接採取されたもの、すなわち生体において同じ機能を発揮する同じ種類の細胞の集団である。このような組織細胞のタンパク質分解酵素トリプシンによる処理は、例えば、これらを、培養プレート上に播種した場合に、細胞構造が成長又は維持される個々の初代組織細胞へ解離する（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）。組織培養物における初代細胞の操作から生じる細胞培養物は、「二次細胞培養物」と称される。ほとんどの二次細胞は、有限回数分裂し、その後死滅する。しかしわずかな二次細胞は、この「危機的期間」を通過し、その後これらは無限に複製し、継続的「細胞株」を形成することができる。細胞が培養される液体培地は、本明細書において、「培養培地」又は「培養媒質」と称される。望ましい分子、例えば免疫グロブリン分子が細胞の培養時に分泌される培養培地は、本明細書において「馴化培地」と称される。
【００３７】
「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸又は構築物中に存在する、１種又は複数の核酸セグメント、又は核酸分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を意味する。「免疫グロブリンサブユニットをコードしているポリヌクレオチド」は、このようなポリペプチドのコード領域を含むポリペプチドを意味する。加えて、ポリヌクレオチドは、プロモーター又は転写ターミネーターのような調節エレメントをコードすることができるか、もしくは分泌シグナルペプチド又は機能ドメインのような、ポリペプチド又はタンパク質の特異的エレメントをコードすることができる。
【００３８】
本明細書において使用される「同定する」という用語は、所望の分子、例えば所望の特異性又は機能を伴う免疫グロブリン分子をコードしているポリヌクレオチドが、そのような分子の複数の又はライブラリーから識別されるような方法を意味する。同定法は、「選択」及び「スクリーニング」を含む。本明細書において使用される「選択」法は、所望の分子がライブラリーから直接分離されるようなものである。例えば、本明細書に説明されたある選択法において、所望のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、溶解事象を受けることにより、そのライブラリーの残余を含む宿主細胞から直接分離され、かつこれにより宿主細胞の残余が付着した基質から放出される。本明細書において使用される「スクリーニング」法は、所望の分子を含むプールに、この所望の分子を検出することができるようなアッセイが施されるようなものである。この分子が検出されるプールのアリコートは、その後連続してより小さいプールに分割され、これは同様にアッセイされ、これが所望の分子が高度に濃縮されたプールに達するまで続けられる。例えば、本明細書において説明されたひとつのスクリーニング法において、免疫グロブリン分子をコードしているポリヌクレオチドライブラリーを含む宿主細胞のプールは、レポーター分子の発現を介して、抗原結合についてアッセイされる。
【００３９】
免疫グロブリン  本明細書において使用される「免疫グロブリン分子」とは、完全な二分子免疫グロブリンとして定義され、すなわち一般的には、４個の「サブユニットポリペプチド」、すなわち２個の同一重鎖及び２個の同一軽鎖を含む。場合によっては、例えばラクダ科の種に由来する免疫グロブリン分子か、もしくはラクダ科の免疫グロブリン分子を基に操作したような免疫グロブリン分子などの場合、完全な免疫グロブリン分子は、重鎖のみからなり、軽鎖を伴わない。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３：４４６−４４８（１９９３）参照。従って「免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」は、単独の重鎖ポリペプチド又は単独の軽鎖ポリペプチドを意味する。免疫グロブリン分子は「抗体」とも称され、かつこれらの用語は本明細書において互換的に使用される。「単離された免疫グロブリン」は、タンパク質又は他の物質の環境から実質的に除去され、かつ特異的抗原に結合している、ひとつの免疫グロブリン分子、又は２個もしくはそれ以上の免疫グロブリン分子を意味する。
【００４０】
免疫グロブリン分子の「クラス」を決定する重鎖は、比較的大きい２個のサブユニットポリペプチドであり、可変領域及び定常領域を含む。「重鎖」は、完全長の分泌された重鎖型、すなわち細胞から放出されるもの、もしくは膜結合した重鎖型、すなわち膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むもののいずれかを意味する。膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、ある種の重鎖に関連した天然のドメインであり、すなわちこのドメインは、記憶Ｂ細胞上に認められるか、もしくは例えば異なる免疫グロブリンクラス由来又は異種ポリペプチド、すなわち非免疫グロブリンポリペプチド由来のような、異種膜貫通及び細胞内ドメインである。本発明のある局面は、細胞膜に結合した免疫グロブリン分子を用いて実行されることが好ましいが、別の局面は、分泌された免疫グロブリン分子、すなわち膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを欠くものを用いて実行されることが好ましいことが明らかになる。免疫グロブリン「クラス」は、宿主において異なる機能を果たす免疫グロブリンの広範なグループを意味する。例えば、ヒト免疫グロブリンは、５種のクラス、すなわち、γ重鎖を含むＩｇＧ、μ重鎖を含むＩｇＭ、α重鎖を含むＩｇＡ、ε重鎖を含むＩｇＥ、及びδ重鎖を含むＩｇＤに分けられる。免疫グロブリンのあるクラスは更に、「サブクラス」に分けられる。例えば、ヒトにおいて、４種の異なるＩｇＧサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４があり、各々、γ−１、γ−２、γ−３、及びγ−４重鎖を含み、かつ２種類のＩｇＡサブクラス、ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２があり、各々、α−１及びα−２重鎖を含む。免疫グロブリンのこれらのクラス及びサブクラスの表記は、動物種間で変動し、ある動物種は追加の免疫グロブリンクラスを含むことは注意しなければならない。例えば、鳥類は、ＩｇＹを生成し、これは卵黄に認められる。
【００４１】
「軽鎖」は、重鎖のアミノ末端領域に結合している比較的小さい免疫グロブリンサブユニットを意味する。重鎖のように、軽鎖は、可変領域及び定常領域を含む。２種の異なる軽鎖の種類、κ及びλが存在し、これらの対は、様々な重鎖のいずれかの対と結合し、免疫グロブリン分子を形成している。
【００４２】
免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは、各々、定常領域及び可変領域を含む。ほとんどの種において、重鎖可変領域又はＶＨドメイン、及び軽鎖可変領域又はＶＬドメインは一緒に、「相補性決定領域」又はＣＤＲを形成し、これは抗原エピトープを特異的に認識する免疫グロブリン分子の一部である。しかし、ラクダ科の種において、ＶＨＨと称される重鎖可変領域は、全ＣＤＲを形成している。ラクダ科のＶＨＨ可変領域と通常の抗体（ＶＨ）由来のものとの大きな違いは、（ａ）ＶＨＨの対応する領域と比べＶＨの軽鎖接触面におけるより多くの疎水性アミノ酸、（ｂ）ＶＨＨ中のより長いＣＤＲ３、及び（ｃ）頻出するＶＨＨ中のＣＤＲ１とＣＤＲ３の間のジスルフィド結合を含む。完全な免疫グロブリン分子は各々、２個の同一ＣＤＲを含む。重鎖及び軽鎖定常領域に結合された可変領域の大きいレパトアは、所定の可変領域をコードしている遺伝子の形成を生じる一連の生殖系列ＤＮＡセグメントの再構成を通じ、動物の抗体産生細胞の分化時に形成される。重鎖及び軽鎖可変領域の更なる変動は、分化した細胞における体細胞変異を介して生じる。免疫グロブリン分子の構造及びインビボ形成は、免疫学の分野の業者にはよく理解されている。免疫グロブリンの多様性の形成に関する簡潔な検証は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びレーン、「抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９８８）（以後「Ｈａｒｌｏｗ」と称す）；並びに、Ｒｏｉｔｔら、「免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｇｏｗｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ロンドン（１９８５）（以後「Ｒｏｉｔｔ」と称す）に見ることができる。Ｈａｒｌｏｗ及びＲｏｉｔｔは、その全体が本明細書に参照として組入れられている。
【００４３】
免疫グロブリンは更に、エフェクター分子の結合により媒介されたいくつかのエフェクター機能を有する。例えば、免疫グロブリンに対する補体のＣ１成分の結合は、補体システムを活性化する。補体活性化は、細胞病原体のオプソニン作用及び溶解において重要である。補体活性化は、炎症反応も刺激し、かつ自己免疫過敏症に関連することもある。更に免疫グロブリンは、Ｆｃ領域を介して細胞に結合し、抗体のＦｃ領域上のＦｃ受容体部位は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。抗体の異なるクラスに特異的であるＦｃ受容体が多く存在し、これはＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η（ｅｔａ）受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含むが、これらに限定されるものではない。抗体の細胞表面上のＦｃ受容体への結合は、多くの重要かつ多様な生体反応の引き金となり、これは抗体で被覆された粒子の貪食（ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ）及び破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体で被覆された標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性細胞性細胞傷害作用、又はＡＤＣＣ）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）及び免疫グロブリン産生の制御を含む。
【００４４】
本発明の免疫グロブリンは、鳥類、魚類、及び哺乳類を含む、いずれかの動物に起源することができる。好ましくはこれらの抗体は、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、又はニワトリ起源である。好ましい本発明の局面において、「自己」抗原と特異的に相互作用する免疫グロブリン、例えば、ヒト抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリンが、同定される。
【００４５】
本明細書において使用される免疫グロブリン分子の「抗原特異的断片」とは、抗原に結合することが依然可能である免疫グロブリン分子の断片又は変種のいずれかである。抗原特異的断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖免疫グロブリン（例えば、ここでは重鎖又はそれらの一部、及び軽鎖又はそれらの一部が融合されている）、ジスルフィド結合したＦｖ（ｓｄＦｖ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｓｃＦｖミニ抗体、Ｆａｂミニ抗体、及び二量体ｓｃＦｖ、並びに特異的ＣＤＲが形成されるようなコンホメーションでＶＬ及びＶＨドメインを含むいずれか他の断片を含むが、これらに限定されるものではない。抗原特異的断片も、ラクダ抗体由来のＶＨＨドメインを含むことができる。ＶＨＨは、他の種からのＣＤＲ、例えばヒト抗体からのＣＤＲを含むように操作することもできる。あるいは、ヒト由来の重鎖ＶＨ断片は、単鎖ラクダＣＤＲに類似するように操作することができ、このプロセスは「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」と称される。例えば、Ｄａｖｉｅｓ Ｊ．及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３３９：２８５−２９０（１９９４）、並びにＲｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ｓ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．、２３１：２５−３８（１９９９）を参照し、これらは両方とも全体が本明細書に参照として組入れられている。
【００４６】
単鎖免疫グロブリンを含む抗原特異的免疫グロブリン断片は、可変領域（複数）を単独で又は下記の全体もしくは一部と組合わせて含むことができる：重鎖定常ドメイン、又はその一部、例えば重鎖上の、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、膜貫通及び／又は細胞質ドメイン、並びに、軽鎖定常ドメイン、例えば軽鎖上の、ＣκもしくはＣλドメイン、又はそれらの一部。更に本発明には、可変領域（複数）並びにＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｃκ、Ｃλ、膜貫通及び／又は細胞質ドメインの組合せも含まれる。
【００４７】
当技術分野において公知であるように、Ｆｖは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、Ｆａｂは、ＣＨ１及びＬ鎖に結合したＶＨを含み、Ｆａｂミニ抗体は、ＣＨ３ドメインのＦａｂなどへの融合を含む。
【００４８】
当技術分野において公知であるように、ｓｃＦｖは、通常長さが１５〜２０残基であるペプチドリンカーによりＶＬに結合したＶＨを含み、二重特異性抗体は、長さ約５残基のペプチドリンカーを伴うｓｃＦｖを含み、三重特異性抗体は、ペプチドリンカーを伴わないｓｃＦｖを含み、四重特異性抗体は、長さ約１残基のペプチドリンカーを伴うｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖミニ抗体は、ＣＨ３ドメインのｓｃＦｖへの融合を含み、並びに二量体ｓｃＦｖは、別のペプチドリンカーを使用する２個のｓｃＦｖの縦列での融合を含む（検証は、Ｃｈａｍｅｓ及びＢａｔｙ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｓ．、１８９：１−８（２０００））。好ましくは、抗原特異的免疫グロブリン断片は、両方の抗原結合ドメイン、すなわちＶＨ及びＶＬを含む。他の免疫グロブリン断片は、当技術分野において周知であり、本明細書に記されたような周知の参考文献において明らかにされている。
【００４９】
ある態様において、本発明は、抗原特異的免疫グロブリン分子、それらの抗原特異的断片、又は特異的抗原結合機能を持つ免疫グロブリン分子もしくは断片を、単独で又は集合的にコードしているポリヌクレオチドを同定する、すなわち、選択あるいはスクリーニングする方法を描いている。関連した態様において、本発明は、これらの方法により同定されたポリヌクレオチドによりコードされた単離された免疫グロブリン分子を描いている。
【００５０】
好ましい方法は、二段階スクリーニング及び／又は選択プロセスを含む。第一の段階において、第一の免疫グロブリンサブユニット、すなわち重鎖又は軽鎖のいずれかをコードしているポリヌクレオチドは、そのライブラリーを真核宿主細胞集団に導入し、この免疫グロブリンサブユニットを第二の免疫グロブリンサブユニットの１種又は複数種と組合わせて発現することにより、そのサブユニットをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーから同定され、ここで第二の免疫グロブリンサブユニットは、第一の免疫グロブリンサブユニットと同じではなく、すなわち、第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが重鎖ポリペプチドである場合は、第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは軽鎖ポリペプチドであろう。
【００５１】
第一の段階において、１種又は複数の第一の免疫グロブリンサブユニットをコードしている１種又は複数のポリヌクレオチドがライブラリーから一旦単離されたならば、第二の免疫グロブリンサブユニットが、第二の段階において同定される。単離された第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチド（複数）をコードしている単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞へ移され、かつ宿主細胞において発現され、ここで第二の免疫グロブリンサブユニットをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーが発現され、これにより第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの同定が可能であり、これは第一の段階で同定された第一の免疫グロブリンサブユニットと一緒にされた場合には、機能的免疫グロブリン分子、又はそれらの断片を形成し、これは、特異的抗原を認識し及び／又は特異的機能を発揮する。
【００５２】
免疫グロブリン断片がひとつのポリペプチドで構成される、すなわち単鎖断片又はＶＨＨドメインを含む断片であり、その結果ひとつのポリヌクレオチドによりコードされている場合、好ましい方法は、一段階スクリーニング及び／又は選択プロセスを含む。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、もしくはＶＨＨ領域を含む単鎖断片をコードしているポリヌクレオチドは、ライブラリーの真核細胞のような宿主細胞への導入、及び免疫グロブリン断片をコードしているそれらの宿主細胞からの該ライブラリーのポリヌクレオチドの回収により、ライブラリーから同定される。
【００５３】
ある態様において、特定の免疫グロブリン分子は、抗原に対する免疫グロブリン分子をそれらの表面に発現している宿主細胞との接触を介して同定され、これは、以下に説明するような多くの異なる方法での抗原結合細胞の選択及び／又はスクリーニングを可能にする。別の態様において、所望の可溶性の分泌された免疫グロブリン分子は、例えばウイルス中和のような、免疫グロブリン分子の所望の機能特性に関する馴化培地のプールのアッセイにより同定される。
【００５４】
免疫グロブリン分子が宿主細胞表面に結合される場合、第一の段階は、転写調節領域との操作可能な結合を介した複数の第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの第一のライブラリーを、免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞集団へ導入すること、転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを第二のライブラリーの同じ宿主細胞へ導入すること、宿主細胞の膜表面上の免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の発現を許容すること、宿主細胞を抗原と接触すること、並びに抗原に結合しているこれらの宿主細胞から第一のライブラリー由来のポリヌクレオチドを回収することを含む。
【００５５】
免疫グロブリン分子が完全に細胞培地に分泌されている場合、第一の段階は、転写調節領域との操作可能な結合を介した複数の第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの第一のライブラリーを、免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞集団へ導入すること、転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを第二のライブラリーの同じ宿主細胞へ導入すること、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の発現及び細胞培地への分泌を許容すること、所望の抗原に結合した抗体機能についての馴化培地のアリコートをアッセイすること、並びに所望の機能が認められた馴化培地において増殖したこれら宿主細胞プールからの第一のライブラリー由来のポリヌクレオチドを回収することを含む。
【００５６】
本明細書において使用される「ライブラリー」とは、ポリヌクレオチドの代表的部類（ｇｅｎｕｓ）、すなわち例えば、単独の動物種、組織型、臓器、又は細胞型のそれらの起源を通じて関連したポリヌクレオチド群であり、ここでライブラリーは、ポリヌクレオチドの所定の部類内の少なくともふたつの異なる種を集合的に含む。ポリヌクレオチドライブラリーは、好ましくは、ポリヌクレオチドの所定の部類内の少なくとも１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９種の異なる種を含む。より詳細には、本発明のライブラリーは、複数の特定の免疫グロブリンサブユニットポリペプチド、すなわち重鎖サブユニットポリペプチド又は軽鎖サブユニットポリペプチドのいずれかをコードしている。この状況において、本発明の「ライブラリー」は、共通の部類のポリヌクレオチドを含み、この部類は、ある型及びクラスの免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、例えばライブラリーは、ヒトμ、γ−１、γ−２、γ−３、γ−４、α−１、α−２、ε、もしくはδ重鎖、又はヒトκもしくはλ軽鎖をコードし得る。本発明のいずれかひとつのライブラリーの各メンバーは、同じ重鎖又は軽鎖定常領域をコードし、このライブラリーは、集合的に少なくとも２種、好ましくは少なくとも１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９種の異なる可変領域を含み、すなわち「複数」の可変領域が共通の定常領域に結合されていると考えられる。
【００５７】
別の態様において、ライブラリーは、軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のような可変領域を含む、好ましくは軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方を含む複数の免疫グロブリン単鎖断片をコードしている。任意に、このようなライブラリーは、ある型及びクラスの免疫グロブリンサブユニットポリペプチド、又はそれらのドメインをコードしているポリヌクレオチドを含む。
【００５８】
ある局面において、本発明は、免疫グロブリンサブユニットをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーを作成する方法を包含している。更に本発明は、本明細書に記された方法に従い真核発現ベクターにおいて構築された免疫グロブリンサブユニットのライブラリーを包含している。このようなライブラリーは、好ましくは、真核ウイルスベクターにおいて、更により好ましくはポックスウイルスベクターにおいて作成される。このような方法及びライブラリーは、本明細書において説明されている。
【００５９】
「レシピエント細胞」又は「宿主細胞」又は「細胞」は、本発明のポリヌクレオチドライブラリーが導入される細胞又は細胞集団を意味する。本発明の宿主細胞は、好ましくは真核細胞又は細胞株であり、好ましくは植物、動物、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、マウス、霊長類又はヒトの細胞又は細胞株である。「宿主細胞の集団」は、本発明の「ライブラリー」が導入されかつ発現される培養された細胞の群を意味する。所定のベクターにおいて構築された所定のライブラリーからの発現を支持するあらゆる宿主細胞が意図されている。適当かつ好ましい宿主細胞は、本明細書において明らかにされている。更に、特定のベクター並びに特定の選択及び／又はスクリーニング計画との併用が好ましいある宿主細胞が、本明細書において明らかにされている。宿主細胞集団を単独培養すること、すなわち集団内の各細胞が同じ細胞型であることは好ましいが、細胞の混合培養も企図されている。本発明の宿主細胞は、接着性であることができ、すなわち、増殖した宿主細胞は、固形基質に接着するか、あるいはこの宿主細胞は懸濁状態であることができる。宿主細胞は、原発性腫瘍由来の細胞、転移性腫瘍由来の細胞、初代細胞、接触阻害を喪失した細胞、形質転換された初代細胞、不死化された初代細胞、アポトーシスを受ける細胞、及びそれら由来の細胞株であることができる。
【００６０】
前述のように、免疫グロブリン分子を同定する好ましい方法は、宿主細胞集団へのポリヌクレオチドの「第一の」ライブラリーの導入に加え、同じ宿主細胞集団へのポリヌクレオチドの「第二の」ライブラリーの導入を含む。この第一及び第二のライブラリーは相補的であり、すなわち、「第一の」ライブラリーが免疫グロブリン重鎖をコードしているならば、「第二の」ライブラリーは免疫グロブリン軽鎖をコードし、これにより宿主細胞集団における免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の集成が可能である。さらに前述のように、免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片を同定する別法は、単鎖断片をコードしているポリヌクレオチドの単独のライブラリーの宿主細胞集団への導入を含む。従って、ポリヌクレオチドライブラリー、ライブラリー内のポリヌクレオチドの組成、及びポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの説明は、「第一のライブラリー」を含むポリヌクレオチド及び「第二のライブラリー」を含むポリヌクレオチドの両方、並びにこれらによりコードされたポリペプチドを包含している。これらのライブラリーは、いずれか適当なベクターにより構築され得るが、両方のライブラリーが同じベクターで構築されてもよいが、必ずしもではない。第一及び第二のライブラリーのための適当かつ好ましいベクターは以下に明らかにする。
【００６１】
本発明のライブラリーに含まれたポリヌクレオチドは、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドを、「転写調節領域との操作可能な結合」を介してコードしている。所定のポリヌクレオチド内の１個又は複数の核酸分子は、それらが操作可能な関係で配置された場合には、「操作可能に結合され」ている。この関係は、ポリペプチドのコード領域と、適当な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質、ポリメラーゼなど）が調節配列（複数）に結合された場合にこのコード領域の発現を許容する方法で結合された調節配列（複数）の間の関係であることができる。「転写調節領域」は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及び転写終結シグナルを含むが、これらに限定されるものではなく、その転写を指示するためにこのポリヌクレオチドと共に含まれる。例えば、プロモーターが核酸分子の転写に影響することが可能であるならば、プロモーターは、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている核酸分子と操作可能に結合される。一般に、「操作可能に結合された」とは、ＤＮＡ配列がポリヌクレオチドにおいて隣接しているか又は密接に結合されていることを意味する。しかし、一部の転写調節領域、例えばエンハンサーは、隣接していなければならないことはない。
【００６２】
「調節配列」又は「調節領域」は、特定の宿主生物において操作可能に結合されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した調節配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することがわかっている。
【００６３】
様々な転写調節領域が、当業者に公知である。好ましい転写調節領域は、脊椎動物細胞中で機能するものを含み、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、例えばヒトサイトメガロウイルス（好ましくは、前初期プロモーター、好ましくはイントロン−Ａとの複合において）、シミアンウイルス４０（好ましくは初期プロモーター）、レトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）、及びピコナウイルス（特に内部リボソーム結合サイト又はＩＲＥＳ、エンハンサー領域、本明細書においてはＣＩＴＥ配列とも称される）からのプロモーター配列及びエンハンサー配列などであるが、これらに限定されるものではない。他の好ましい転写調節領域は、哺乳類遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、及びウシ成長ホルモン、更には真核細胞における遺伝子発現の制御が可能である他の配列を含む。追加の適当な転写調節領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサーに加え、誘導可能なプロモーター（例えば、テトラサイクリンにより誘導可能なプロモーター、及び温度感受性プロモーター）を含む。より詳細に以下に考察するように、特に好ましいのは、ポックスウイルス感染細胞の細胞質において機能することが可能なプロモーターである。
【００６４】
ある好ましい態様において、各「免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」、すなわち、「第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」又は「第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」のいずれかは、（ｉ）重鎖定常領域、重鎖定常領域の膜結合型又は重鎖定常領域の完全な分泌型のいずれか；並びに、軽鎖定常領域からなる群より選択される、第一の免疫グロブリン定常領域、（ｉｉ）第一の定常領域に相当している免疫グロブリン可変領域、すなわち、免疫グロブリン定常領域が重鎖定常領域である場合には、免疫グロブリン可変領域は、好ましくはＶＨ領域を含み、かつ免疫グロブリン定常領域が軽鎖領域である場合には、免疫グロブリン可変領域は、好ましくはＶＬ領域を含むようなもの、並びに、（ｉｉｉ）膜結合又は完全に分泌された重鎖、又は重鎖に結合した軽鎖のいずれかとして、小胞体を介して及び宿主細胞形質膜を通して、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの輸送を指示することが可能なシグナルペプチドを含む。従って、２種の同一重鎖及び２種の同一軽鎖の結合により、表面免疫グロブリン分子又は完全に分泌された免疫グロブリン分子のいずれかが形成される。
【００６５】
同じく免疫グロブリン断片の状況のある好ましい態様において、単鎖断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域からなる群より選択される免疫グロブリン可変領域を含み、好ましくは両方の可変領域を含む。免疫グロブリン断片が重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含む場合、これらは直接結合される（すなわち、これらはペプチドも他のリンカーも有さない）か、もしくはこれらは別の手段により結合される。これらが別の手段により結合される場合は、これらは以下に考察するように、直接又は発現時に形成されたジスルフィド結合又はペプチドリンカーにより結合される。従って、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の結合を介して、ＣＤＲが形成される。
【００６６】
リンカーの種類に応じて、ひとつの単鎖断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、互いに結合することができるか、もしくはひとつの単鎖断片の重鎖可変領域は、他の単鎖断片の軽鎖可変領域と結合することができ、及びその逆も当てはまる。ひとつの態様において、単鎖断片は、重鎖定常領域、又はそれらのドメイン、及び軽鎖定常領域、又はそれらのドメインからなる群より選択される定常領域も含む。２種の単鎖断片は、それらの定常領域を介して他方に結合することができる。
【００６７】
前述のように、ある態様において、単鎖断片の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドは、リンカーをコードしている。この単鎖断片は、配列ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨを伴う単独のポリペプチドを含むことができる。一部の態様において、リンカーは、単独のポリペプチドの重鎖及び軽鎖が、それらの適切なコンホメーション配向において互いに結合することが許容されるように選択される。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ．Ｓ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．、２０３：４６−１２１（１９９１）参照。従ってこれらの態様において、リンカーは、未変性のＦｖコンホメーションの歪みを伴わずに可変ドメインへ融合するそれらの地点間の距離が３．５ｎｍの幅でなければならない。これらの態様において、リンカーを構成しているアミノ酸残基は、この距離の幅であることができ、かつ５個のアミノ酸又はそれよりも長くなければならない。５個のアミノ酸型のリンカーを伴う単鎖断片は、単量体及び優先的には二量体型で認められる。好ましくは、このリンカーは、長さが少なくとも約１０個又は少なくとも約１５個の残基である。別の態様において、リンカー長は、ｓｃＦｖ四量体（四重特異性抗体）の形成を促進するように選択され、かつ長さ１個のアミノ酸である。一部の態様において、可変領域は、ｓｃＦｖ三量体（三重特異性抗体）の形成を促進するために直接結合される（すなわち、単鎖断片はペプチドリンカーを含まない）。これらの変型は当技術分野において周知である。（例えば、Ｃｈａｍｅｓ及びＢａｔｙ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔｓ．、１８９：１−８（２０００）参照）。このリンカーは、結合部位と立体障害を引き起してはならない。従ってこれは、好ましくは長さが約２５残基又はそれ未満である。
【００６８】
ペプチドリンカーのアミノ酸は、好ましくは、リンカーが親水性であり、その結果抗体に埋もれないように選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号：６）は、十分な柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供するので、これは多くの抗体に広範に適用可能な好ましいリンカーである。他のリンカーとしては以下のものが含まれる：
2004532645.tif 000002
あるいは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号：６）リンカーのようなリンカーは、いずれかの配列を利用することができるが、突然変異誘発されるか、もしくはこのリンカー内のアミノ酸がランダム化され、ファージディスプレイベクター又は本発明の方法を用い、異なるリンカーを伴う抗体が、最高の親和性又は表現型に対する最大の作用に関してスクリーニング又は選択される。より短いリンカーの例は、前記リンカーの断片を含み、かつより長いリンカーの例は、前記リンカーの組合せ、前記リンカー断片の組合せ、及び前記リンカーの前記リンカー断片との組合せを含む。
【００６９】
前述の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの変種又は断片である免疫グロブリンサブユニットポリペプチドも好ましい。免疫グロブリン分子の抗原結合断片を生じるいずれかの変種又は断片も企図されている。このような変種は、宿主細胞表面へ、例えば天然の膜貫通ドメインとの結合を介して、受容体−リガンド相互作用を介して、又は異種膜貫通ドメインとの融合として接着することができるか、もしくは細胞培地へ分泌することができる。免疫グロブリン分子の抗原結合断片の例は、本明細書に説明されている。
【００７０】
免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが重鎖ポリペプチドを含むようなこれらの態様において、いずれかの動物種由来の免疫グロブリン重鎖が意図されている。適当で好ましい免疫グロブリン重鎖は、本明細書において説明されている。鳥類、特にニワトリ、魚類、及び哺乳類のような脊椎動物由来の免疫グロブリン重鎖が含まれ、哺乳類免疫グロブリン重鎖が好ましい。哺乳類免疫グロブリン重鎖の例は、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ラット、ヒツジ、ウシ、ブタ、モルモット、ラクダ、ラマ、及びハムスターの免疫グロブリン重鎖を含む。これらの中で、ヒト免疫グロブリン重鎖が特に好ましい。更にマウス／ヒトハイブリッドの免疫グロブリン重鎖又は「ラクダ化された」ヒト免疫グロブリン重鎖のような１種又は複数種由来の重鎖の一部を含む、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖も企図されている。ヒト免疫グロブリン重鎖の中で、本発明の免疫グロブリン重鎖は、好ましくはμ重鎖、すなわちＩｇＭ免疫グロブリンの重鎖、γ−１重鎖、すなわちＩｇＧ１免疫グロブリンの重鎖、γ−２重鎖、すなわちＩｇＧ２免疫グロブリンの重鎖、γ−３重鎖、すなわちＩｇＧ３免疫グロブリンの重鎖、γ−４重鎖、すなわちＩｇＧ４免疫グロブリンの重鎖、α−１重鎖、すなわちＩｇＡ１免疫グロブリンの重鎖、α−２重鎖、すなわちＩｇＡ２免疫グロブリンの重鎖、及びε重鎖、すなわちＩｇＥ免疫グロブリンの重鎖、並びに、δ重鎖、すなわちＩｇＤ免疫グロブリンの重鎖からなる群より選択される。ある態様において、好ましい免疫グロブリン重鎖は、ヒトのμ、γ−１、γ−２、γ−３、γ−４、α−１、α−２、ε、及びδ重鎖の膜結合型を含む。特に好ましいのは、ヒトμ重鎖の膜結合型である。
【００７１】
免疫グロブリンの膜結合型は典型的には、重鎖ｍＲＮＡの選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）転写終結及びスプライシングを介して重鎖ポリペプチドの一部を形成している膜貫通ドメインにより、細胞表面に係留されている。例えば、Ｒｏｉｔｔの９．１０頁参照。「膜貫通ドメイン」「膜に広がる領域」又は関連用語は、本明細書において互換的に使用され、細胞膜に係留された重鎖ポリペプチドの一部を意味する。典型的膜貫通ドメインは、以下により詳細に考察された疎水性アミノ酸を含む。「細胞内ドメイン」「細胞質ドメイン」「細胞質ゾル領域」又は関連用語は、本明細書において互換的に使用され、細胞膜に係留された又は細胞表面に露出されている部分とは反対側の、細胞の内側にあるポリペプチドの一部を意味する。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの膜結合型は、典型的には約３個のアミノ酸の非常に短い細胞質ドメインを含む。本発明の免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの膜結合型は、好ましくは、通常免疫グロブリン重鎖と結合されている膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、例えば、プレ−Ｂ細胞内のμ及びδ重鎖と結合された膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン、もしくはＢ−記憶細胞内のいずれかの免疫グロブリン重鎖と結合された膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。しかし、異種膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが、所定の免疫グロブリン重鎖ポリペプチドにより結合されること、例えばμ重鎖の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインがγ重鎖の細胞外部分と結合されることも企図されている。あるいは、完全に異種ポリペプチドの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを使用し、例えば、主要組織適合性分子の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、細胞表面受容体、ウイルス表面タンパク質、キメラドメイン、又は合成ドメインが使用される。
【００７２】
免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが軽鎖ポリペプチドを含むようなこれらの態様において、いずれかの動物種由来の免疫グロブリン軽鎖が意図されている。適当で好ましい免疫グロブリン軽鎖は、本明細書において説明されている。鳥類、特にニワトリ、魚類、及び哺乳類のような脊椎動物由来の免疫グロブリン軽鎖が含まれ、哺乳類免疫グロブリン軽鎖が好ましい。哺乳類免疫グロブリン軽鎖の例は、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ラット、ヒツジ、ウシ、ブタ、モルモット、ラクダ、ラマ、及びハムスターの免疫グロブリン軽鎖を含む。これらの中で、ヒト免疫グロブリン軽鎖が特に好ましい。更にマウス／ヒトハイブリッドの免疫グロブリン軽鎖のような１種又は複数種からの軽鎖の一部を含む、ハイブリッド免疫グロブリン軽鎖も企図されている。好ましい免疫グロブリン軽鎖は、ヒトκ及びλ軽鎖を含む。いずれかの軽鎖の対が、重鎖のいずれかの同一対と結合され、当業者によく理解されている特徴的Ｈ２Ｌ２構造を伴う免疫グロブリン分子を形成している。
【００７３】
本発明の好ましい局面に従い、本明細書に記されたようなポリヌクレオチドライブラリー、例えばポリヌクレオチドの第一のライブラリー又はポリヌクレオチドの第二のライブラリーのいずれかのメンバーは、（ａ）このライブラリーの全てのメンバーに共通の免疫グロブリン定常領域をコードしている第一の核酸分子、及び（ｂ）免疫グロブリン可変領域をコードしている第二の核酸分子を含み、ここで第二の核酸分子は、第一の核酸分子の直ぐ上流及びインフレームである。従って、本発明のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーによりコードされた免疫グロブリンサブユニットポリペプチド、すなわち、このようなポリヌクレオチドによりコードされた免疫グロブリン軽鎖又は免疫グロブリン重鎖は、好ましくは、免疫グロブリン可変領域と結合された免疫グロブリン定常領域を含む。
【００７４】
「第一の核酸分子」によりコードされた軽鎖定常領域は、このサブユニットポリペプチドのおよそ半分を含み、かつＣ末端、すなわち軽鎖ポリペプチドの後半に配置される。ＣＬ定常領域、より詳細にはＣκ定常領域又はＣλ定常領域と称される軽鎖定常領域は、鎖内ジスルフィド結合により「ループ」内に互いに維持された約１１０個のアミノ酸を含む。
【００７５】
「第一の核酸分子」によりコードされた重鎖定常領域は、このサブユニットポリペプチドの３／４又はそれ以上を含み、かつＣ末端、すなわち重鎖ポリペプチドの後半部分に配置される。ＣＨ定常領域と称される重鎖定常領域は、３又は４個のいずれかのペプチドループ又は鎖内ジスルフィド結合により各々囲い込まれた約１１０個のアミノ酸の「ドメイン」を含む。より詳細に述べると、ヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域は、Ｃμ定常領域、Ｃδ定常領域、Ｃγ定常領域、Ｃα定常領域、及びＣε定常領域を含む。Ｃγ、Ｃα及びＣδ重鎖は、各々３個の定常領域ドメインを含み、一般にＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と称されるのに対し、Ｃμ及びＣε重鎖は、４個の定常領域ドメインを含み、一般にＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４と称される。ヒト免疫グロブリン定常領域をコードしている核酸分子は、当業者に周知でありかつ下記実施例において説明されているＰＣＲのような方法により、例えばヒトＢ細胞又はそれらの前駆体に由来したｃＤＮＡライブラリーから、容易に得ることができる。
【００７６】
本発明の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは各々、「第二の核酸分子」によりコードされた免疫グロブリン可変領域を含む。ポリヌクレオチドのライブラリー内において、各ポリヌクレオチドは同じ定常領域を含むが、このライブラリーは、複数の、すなわち少なくとも２種の、好ましくは少なくとも１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９種の異なる可変領域を含むと考えられる。当業者に周知であるように、軽鎖可変領域は、再構成された核酸分子によりコードされ、各々は、軽鎖ＶＬ領域、詳細にはＶκ領域又はＶλ領域、並びに軽鎖Ｊ領域、詳細にはＪκ領域又はＪλ領域を含む。同様に、重鎖可変領域は、再構成された核酸分子によりコードされ、各々は、重鎖ＶＨ領域、Ｄ領域及びＪ領域を含む。これらの再構成は、細胞分化時にＤＮＡレベルで生じる。重鎖及び軽鎖可変領域をコードしている核酸分子は、例えば、最終的に分化され特定のエピトープに対する特異性を伴う抗体を発現する成熟Ｂ細胞及び形質細胞からのＰＣＲにより、誘導することができる。更に、特異的抗原に対する抗体が望ましい場合、可変領域は、その抗原で免疫感作された動物の成熟Ｂ細胞及び形質細胞から単離することができ、かつこれにより、この抗原と相互作用する抗体可変領域の拡張されたレパトアが作成される。あるいは、より多様なライブラリーが望ましい場合、可変領域は、前駆体細胞、例えばプレ−Ｂ細胞及び未成熟Ｂ細胞から単離され、これは免疫グロブリン遺伝子の再構成を受けるが、自己又は非自己の抗原には曝されない。例えば、可変領域は、複数のドナーからプールされた正常なヒト骨髄からのＰＣＲにより単離され得る。あるいは可変領域は合成されたものであり、例えば合成オリゴヌクレオチドの作成により実験室において形成されるか、もしくは生殖系列ＤＮＡのインビトロ操作により誘導され、免疫グロブリン遺伝子の再構成を生じる。
【００７７】
各々、免疫グロブリン定常領域及び可変領域をコードしている第一及び第二の核酸分子に加え、先に説明された本発明のポリヌクレオチドライブラリーの各メンバーは、更に可変領域をコードしている第二の核酸分子の直ぐ上流及びインフレームのシグナルペプチドをコードしている第三の核酸分子を含むことができる。
【００７８】
「シグナルペプチド」とは、例えば発生期の免疫グロブリンポリペプチドサブユニットの宿主細胞表面への輸送を指示するポリペプチド配列を意味する。シグナルペプチドは、当技術分野において「シグナル配列」、「リーダー配列」、「分泌シグナルペプチド」又は「分泌シグナル配列」とも称される。シグナルペプチドは、通常完全な又は「未熟な」ポリペプチドの一部として発現され、かつ通常Ｎ末端に位置する。様々なタンパク質由来のシグナルペプチドの共通構造は、一般に、正帯電したｎ−領域、それに続く疎水性ｈ−領域、及び中性であるが極性のあるｃ−領域として説明される。多くの場合において、シグナルペプチドを含むアミノ酸は、このタンパク質が一旦その最終目的地に到達したならば切断され、このポリペプチドの「成熟」型を形成する。この切断は、シグナルペプチダーゼとして公知の酵素により触媒される。（−３，−１）−ルールは、−３及び−１位（切断部位に対して）の残基は、小さくかつ正確に発生する切断に対して中立でなければならないことを説明している。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、３：２７１−２８６（１９８５）、及びｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：４６８３−４６９０（１９８６）を参照のこと。
【００７９】
本発明の宿主細胞を含む全ての細胞は、構成的分泌経路を有し、これは排出される運命にある分泌型免疫グロブリンサブユニットポリペプチドを含むタンパク質が、この細胞から分泌される。これらのタンパク質は、修飾が生じ得るＥＲ−ゴルジプロセシング経路を通過する。更にこのタンパク質上でシグナルが検出されないならば、これは分泌のために細胞表面に向けられる。あるいは免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは、最後には宿主細胞の表面上に発現された内在性膜成分となる。免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの膜結合型は、これらが最初は分泌型と同じ経路を辿り、膜透過停止シグナル又は「膜貫通ドメイン」の存在によりＥＲ膜に維持される場合以外は、ＥＲ管腔を通過する。膜貫通ドメインは、それらが膜を横切るようにα−ヘリックスコンホメーションを採用する約２０個のアミノ酸残基の疎水性の伸長である。膜に埋め込まれたタンパク質は、形質膜のリン脂質二重層内に係留される。分泌タンパク質同様、膜貫通タンパク質のＮ末端領域は、膜を通過し、かつＥＲ管腔へ出る際には、切断されるシグナルペプチドを有する。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの膜貫通型は、分泌型と同じシグナルペプチドを利用する。
【００８０】
本発明のシグナルペプチドは、天然の免疫グロブリンシグナルペプチド、すなわち天然の重鎖又は軽鎖転写産物の一部である配列によりコードされているものか、もしくはこれに操作可能に結合された免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの分泌を指示する能力を維持しているその配列の機能性誘導体であるかのいずれかである。あるいは、異種シグナルペプチド、又はそれらの機能性誘導体を使用することができる。例えば、天然の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドのシグナルペプチドは、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター又はマウスβ−グルクロニダーゼのシグナルペプチドで置換することができる。
【００８１】
シグナル配列、膜貫通ドメイン、及び細胞質ゾルドメインは、多種多様な膜結合タンパク質について知られている。これらの配列は、従って特定のタンパク質の対（例えば、シグナル配列と膜貫通ドメイン、又はシグナル配列と細胞質ゾルドメイン、又は膜貫通ドメインと細胞質ゾルドメイン）、又は３つ組として一緒に使用することができるか、もしくは各成分は、異なるタンパク質から採取されるか、あるいはこれらの配列は、合成することができ、かつ前述のように人工の送達ドメインとしてのコンセンサスに全体が由来することができる。
【００８２】
特に好ましいシグナル配列及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−２、ＩＬ−８Ｒ、ＣＤ４及びＬＦＡ−１に由来するものを含むが、これらに限定されるものではない。追加の有用な配列は、下記由来の配列を含む：１）クラスＩ内在性膜タンパク質、例えばＩＬ−２受容体β−鎖（残基１〜２６はシグナル配列であり、２４１〜２６５は膜貫通残基である；Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：５５１（１９８９）、及びＨｅｉｊｎｅら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７４：６７１（１９８８）参照）、並びにインスリン受容体β−鎖（残基１〜２７はシグナルであり、９５７〜９５９は膜貫通ドメインであり、及び９６０〜１３８２は細胞質ドメインである；Ｈａｔａｋｅｙａｍａ、前掲、及びＥｂｉｎａら、Ｃｅｌｌ、４０：７４７（１９８５）参照）；２）クラスＩＩ内在性膜タンパク質、例えばニュートラルエンドペプチダーゼ（残基２９〜５１は膜貫通ドメインであり、２〜２８は細胞質ドメインである；Ｍａｌｆｒｏｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１４４：５９（１９８７）参照）；３）ＩＩＩ型タンパク質、例えばヒトチトクロムＰ４５０ ＮＦ２５（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ、前掲）；及び、４）ＩＶ型タンパク質、例えばヒトＰ−糖タンパク質（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ、前掲）。これらの代替において、ＣＤ８及びＩＣＡＭ−２が特に好ましい。例えば、ＣＤ８及びＩＣＡＭ−２由来のシグナル配列は、この転写産物の最５’末端に位置する。これらは、ＣＤ８の場合はアミノ酸１〜３２からなり（Ｎａｋａｕｃｈｉら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８２：５１２６（１９８５））、及びＩＣＡＭ−２の場合は１〜２１からなる（Ｓｔａｕｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）、３３９：６１（１９８９））。これらの膜貫通ドメインは、ＣＤ８由来のアミノ酸１４５〜１９５（Ｎａｋａｕｃｈｉ、前掲）及びＩＣＡＭ−２由来の２２４〜２５６（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、前掲）により包含される。
【００８３】
あるいは、膜係留ドメインは、ＧＰＩアンカーを含み、これは例えばＤＡＦにおいて、グリコシル−ホスファチジルイノシトール結合により、この分子と脂質二重層の間に共有結合を生じる（Ｈｏｍａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３３（６１７０）：２６９−７２（１９８８）、及びＭｏｒａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６６：１２５０（１９９１）参照）。これを行うために、Ｔｈｙ−１由来のＧＰＩ配列を、膜貫通配列の代わりに、免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の３’側にカセット化することができる。
【００８４】
同様に、ミリストイル化配列は、膜係留ドメインとして役に立つ。ｃ−ｓｒｃのミリストイル化は、これを形質膜にリクルートすることはわかっている。このタンパク質の最初の１４個のアミノ酸が単にこの機能に寄与している場合は、これは膜局在化の単純かつ効果的方法である（Ｃｒｏｓｓら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、４（９）：１８３４（１９８４）；Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１０１９−１０２４（１９９３）参照）。このモチーフは既に、レポーター遺伝子の局在化に効果があることが示されており、かつＴＣＲのζ鎖の係留に使用することができる。このモチーフは、この構築物を形質膜に局在化するために、免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の５’側に位置している。パルミトイル化のようなその他の修飾を使用し、構築物を形質膜に係留することができ；例えば、Ｇタンパク質−結合した受容体キナーゼＧＲＫ６配列由来のパルミトイル化配列（Ｓｔｏｆｆｅｌら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９：２７７９１（１９９４））；ロドプシン由来のパルミトイル化配列（Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、５（３）：２０７（１９９４））；並びに、ｐ２１ Ｈ−ｒａｓ １タンパク質（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０２：３３（１９８３））がある。
【００８５】
各々免疫グロブリン定常領域及び可変領域をコードしている第一及び第二の核酸分子に加え、先に説明された本発明のポリヌクレオチドライブラリーの各メンバーは、更に異種ポリペプチドをコードしている追加の核酸分子を含む。このような追加のポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードしている別の第三の核酸分子に、またはその代わりとして添加することができる。このような異種ポリペプチドをコードしている追加の核酸分子は、可変鎖領域又は重鎖領域をコードしている核酸分子の上流又は下流であることができる。
【００８６】
追加核酸分子によりコードされた異種ポリペプチドは、レスキュー配列であることができる。レスキュー配列は、免疫グロブリンもしくはそれらの断片又はそれをコードしているポリヌクレオチドのいずれかを精製又は単離のために使用することができる配列である。従って例えば、ペプチドレスキュー配列は、Ｎｉアフィニティーカラムで使用するための６−Ｈｉｓタグ及び検出、免疫沈降、又はＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）のためのエピトープタグのような精製配列を含む。適当なエピトープタグは、ｍｙｃ（市販の９Ｅ１０抗体と共に使用するため）、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、ｆｌｕタグ、ＬａｃＺ、及びＧＳＴを含む。追加の核酸分子は、ペプチドリンカーもコードしている。
【００８７】
好ましい態様において、異種ポリペプチドの組合せが使用される。従って例えば、リンカー配列を伴い又は伴わずに、シグナル配列、レスキュー配列、及び安定化配列のかなり多数の組合せを使用することができる。ひとつは、免疫グロブリン又はそれらの断片をコードしているポリヌクレオチドの異種ポリペプチド５’及び３’をコードしている様々な融合ポリヌクレオチドにカセット化することができる。当業者に理解されるように、これらの配列モジュールは、非常に多数の組合せ及び変型において使用することができる。
【００８８】
第一及び第二のライブラリーに含まれるポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞へ導入される。適当な宿主細胞は、それらの表面に付着した免疫グロブリン分子を発現することが可能であることを特徴としている。ポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法により、宿主細胞へ導入される。適当で好ましい導入法は本明細書に明らかにされている。
【００８９】
容易に理解されるように、導入法は、ポリヌクレオチドライブラリーが構築されたベクターの性質に応じて変動する。例えば、ＤＮＡプラスミドベクターは、宿主細胞へ、例えば、リポフェクション（アニオン性リポソームによるなど（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：７４１３（１９８７）参照）、又はカチオン性リポソーム（例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ， Ｋ．Ｌ．ら、Ａｍ． Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ、２９８（４）：２７８−２８２１（１９８９）；米国特許第４，８９７，３５５号（Ｅｐｐｓｔｅｉｎら）参照））、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降法（例えば全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング；実験マニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９参照）、プロトプラスト融合法、スフェロプラスト融合法、又はＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎら、Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、４：１６４１−１６４３（１９８４）参照）により導入することができる。前記参考文献は、その全体が本明細書に参照として組入れられている。
【００９０】
選択された方法がリポフェクションである場合、この核酸は、カチオン性リポソーム、例えばＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、Ｔｆｘ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ＬｉｐｏＴＡＸＩ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ社）などにより複合され得る。核酸がアニオン性リポソームによりトランスフェクションされる場合は、アニオン性リポソームは、この核酸を封入することができる。好ましくは、ＤＮＡは、製造業者のプロトコールを使用し、リポソームが媒介したトランスフェクションにより導入される（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅについて；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。
【００９１】
プラスミドはウイルスベクターである場合、宿主細胞への導入は、標準の感染により最も都合良く実行される。しかし多くの場合、ウイルスの核酸は、前述のいずれかの方法により細胞に導入され、かつウイルスの核酸は「感染性」であり、すなわちウイルスの核酸の細胞への導入は、より多くではなくとも、細胞が生存可能な子孫ウイルス粒子を産生するのに十分なものである。しかしある種のウイルス核酸、例えばポックスウイルス核酸は、感染性ではなく、従って提供された追加エレメント、例えばウイルスの核酸を封入しているウイルス粒子、必要なウイルスのエレメントを産生するように操作された細胞、又はヘルパーウイルスにより、導入されなければならない。
【００９２】
ポリヌクレオチドの第一及び第二のライブラリーは、いずれかの順、又は同時に、宿主細胞へ導入される。例えば、ポリヌクレオチドの第一及び第二のライブラリーが、ウイルスベクターにおいて構築され、感染性又は失活されたかのいずれかのベクターは、混合物として同時感染により導入されるか、又は連続感染において導入され得る。ひとつのライブラリーがウイルスベクターにおいて構築され、かつ他方がプラスミドベクターにおいて構築されたならば、一方のライブラリーの導入は、他方よりも先に導入されることにより、最も簡便に行われうる。
【００９３】
ポリヌクレオチドの第一及び第二のライブラリーの宿主細胞への導入後、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の発現が許容され、該宿主細胞の膜表面上、又は細胞培地への分泌を通じてのいずれかが生じる。「発現が許容される」とは、宿主細胞に導入されたベクターが、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの転写及び翻訳を受けることが可能になる、好ましくは宿主細胞が完全に集成された免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を膜表面上又は細胞培地へ輸送することが可能になることを意味する。典型的には、発現の許容には、ポリヌクレオチドが導入される宿主細胞の、発現を可能にする適当な条件下でのインキュベーションを必要としている。これらの条件、及び発現を可能にするのに必要な時間は、当業者に周知であるように、宿主細胞の選択及びベクターの選択を基に変動しうる。
【００９４】
ある態様において、それらの表面上への免疫グロブリン分子の発現を可能にしている宿主細胞、又は細胞培地に分泌された可溶性免疫グロブリン分子は、その後抗原と接触される。本明細書において使用される「抗原」は、抗体、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片に特異的に結合することができるいずれかの分子である。「特異的な結合」は、抗原が、抗体のＣＤＲに結合することを意味する。ＣＤＲと特異的に相互作用する抗原の部分は、「エピトープ」、又は「抗原決定基」と称される。抗原は単独のエピトープを含むが、典型的には抗原は少なくとも２種のエピトープを含み、かつ抗原のサイズ、コンホメーション、及び型に応じて、かなり多くのエピトープを含むことができる。
【００９５】
抗原は、典型的にはペプチド又はポリペプチドであるが、分子又は化合物であることもできる。例えば、有機化合物、例えばジニトロフェノール又はＤＮＰ、核酸、糖質、又はこれらの化合物の混合物は、ペプチド又はポリペプチドを伴う又は伴わないのいずれかで、適当な抗原であることができる。ペプチド又はポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチド又はポリペプチドエピトープは、好ましくは、少なくとも７個の、より好ましくは少なくとも９個の、及び最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。ＣＤＲはその三次元型で抗原性ペプチド又はポリペプチドを認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は、非連続である必要があり、場合によっては、同じペプチド鎖上にないことさえある。本発明において、ペプチド又はポリペプチド抗原は、好ましくは少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、及び最も好ましくは約１５〜約３０個のアミノ酸の配列を含む。抗原エピトープを含む、あるいは抗原エピトープからなる好ましいペプチド又はポリペプチドは、長さが少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個のアミノ酸残基である。この抗原は、いずれかの型であることができ、かつ遊離、例えば、溶液中に溶解しているか、又はいずれかの基質に付着していることができる。適当かつ好ましい基質が本明細書において説明されている。ある態様において、抗原は、より詳細に以下に説明されているような、抗原発現性の提示細胞の一部であることができる。
【００９６】
いずれかの抗原に特異的な免疫グロブリン分子は、本発明の方法に従い作成することができることは理解されるはずである。好ましい抗原は、「自己」抗原、すなわち作成される免疫グロブリン分子と同一種に由来する抗原である。例として、ＣＥＡ抗原、ＧＭ２抗原、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ 抗原（ＴＦ）、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原、Ｌｅ（ｙ）抗原、ＭＵＧ１抗原、ＭＵＣ２抗原、ＭＵＣ３抗原、ＭＵＣ４抗原、ＭＵＣ５ＡＣ抗原、ＭＵＣ５Ｂ抗原、ＭＵＣ７抗原、癌胎児性抗原、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβ鎖（ｈＣＧβ）抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、ＰＳＭＡ抗原、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原、ＫＳＡ抗原、ＰＳＡ抗原、ＰＳＣＡ抗原、ＧＰ１００抗原、ＭＡＧＥ１抗原、ＭＡＧＥ２抗原、ＴＲＰ １抗原、ＴＲＰ ２抗原、及びチロシナーゼ抗原などであるが、これらに限定されるものではない、ヒト腫瘍抗原に対するヒト抗体を産生することが望ましいと考えられる。他の望ましい「自己」抗原は、サイトカイン、受容体、リガンド、糖タンパク質、及びホルモンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
感染性物質上の抗原に対する抗体を産生することも企図されている。このような抗原の例は、細菌性抗原、ウイルス性抗原、寄生虫性抗原、及び真菌性抗原を含むが、これらに限定されるものではない。ウイルス性抗原の例は、アデノウイルス抗原、αウイルス抗原、カリチウイルス抗原、例えばカリチウイルスキャプシド抗原、コロナウイルス抗原、ジステンバーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肝炎ウイルス（Ａ−Ｅ）抗原、例えばＢ型肝炎コア又は表面抗原、ヘルペスウイルス抗原、例えば単純ヘルペスウイルス又は水痘ウイルス糖タンパク質抗原、免疫不全ウイルス抗原、例えばヒト免疫不全ウイルスエンベロープ又はプロテアーゼ抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、例えばインフルエンザＡ赤血球凝集素、又はノイラミニダーゼ抗原、白血病ウイルス抗原、マーブルグウイルス抗原、癌ウイルス抗原、オルソミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、例えば赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ抗原、パラミクソウイルス抗原、パルボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコナウイルス抗原、例えばポリオウイルスキャプシド抗原、狂犬病ウイルス抗原、例えば狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、ロタウイルス抗原、更には他の癌を惹起する又は癌に関連したウイルス抗原を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
細菌性抗原の例としては、アクチノミセス抗原、バシラス抗原、バクテロイド抗原、ボルデテラ抗原、バルトネラ抗原、ボレリア抗原、例えば、ボレリア・バルグドルファＯｓｐＡ抗原、ブルセラ抗原、カンピロバクター抗原、カプノチトファーガ抗原、クラミジア抗原、クロストリジウム抗原、コリネバクテリウム抗原、コクシエラ抗原、デルマトフィルス抗原、腸球菌抗原、エールリヒア抗原、大腸菌抗原、フランシセラ抗原、フゾバクテリウム抗原、ヘルモバルトネラ抗原、ヘモフィルス抗原、例えば、ヘルモフィス・インフルエンザｂ型外膜タンパク質抗原、ヘリコバクター抗原、クレブシエラ抗原、Ｌ−型細菌抗原、レプトスピラ抗原、リステリア抗原、マイコバクテリア抗原、マイコプラズマ抗原、ナイセリア抗原、ネオリケッチア抗原、ノカルジア抗原、パスツレラ抗原、ペプトコッカス抗原、ペプトストレプトコッカス抗原、肺炎球菌抗原、プロテウス抗原、ユードモナス抗原、リケッチア抗原、ロシャリメア抗原、サルモネラ抗原、シゲラ抗原、ブドウ球菌抗原、レンサ球菌抗原、例えば化膿レンサ球菌Ｍタンパク質抗原、梅毒抗原、及びエルシニア抗原、例えばイペスチス（Ｙｐｅｓｔｉｓ）Ｆ１及びＶ抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
真菌性抗原の例としては、ユミケカビ抗原、アクレモニウム抗原、アルテルナリア抗原、アスペルギルス抗原、バシディオボルス抗原、ビポラリス抗原、ブラストミセス抗原、カンジダ抗原、コクシディオイデス抗原、コクシディオボラス抗原、クリプトコッカス抗原、クルブラリア抗原、エピデルモフィトン抗原、エキソフィアラ抗原、ゲオトリクム抗原、ヒストプラスマ抗原、マズレラ抗原、マラセジア抗原、小胞子菌抗原、モニリエラ抗原、クサレケカビ抗原、ケカビ抗原、ペシロマイセス抗原、アオカビ抗原、フィアレモニウム（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）抗原、フィアロフォア抗原、プロトテカ抗原、シュードアレシェリア抗原、シュードミクロドキウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）抗原、ピチウム抗原、リノスポリジウム抗原、リゾプス抗原、スコレコバシディウム抗原、スポロトリックス抗原、ステムフィリウム抗原、白癬菌抗原、トリコスポロン抗原、及び乾生菌抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
寄生原生動物の抗原の例としては、バベシア抗原、バランチジウム抗原、ベスノイチア抗原、イヌ糸状虫抗原、エイメリア抗原、エンセファリトズーン抗原、赤痢アメーバ抗原、ランブル鞭毛虫抗原、トキソプラズマ抗原、肝胞子虫抗原、イソスポラ抗原、リーシュマニア抗原、微胞子虫抗原、ネオスポラ抗原、ノセマ抗原、ペンタトリコモナス抗原、マラリア抗原、例えば熱帯熱マラリア原虫の環状スポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、うっ血肝抗原１−Ｃ末端（ＰｆＬＳＡ−１ ｃ−ｔｅｒｍ）、及び排出された（ｅｘｐｏｒｔｅｄ）タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）抗原、ニューモシチス抗原、サルコシスト抗原、住血吸虫抗原、タイレリア抗原、トキソプラズマ抗原、及びトリパノソーマ抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。寄生蠕虫の抗原の例としては、常在糸状虫抗原、アエルロストロンギアラス（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）抗原、鉤虫抗原、広東住血線虫抗原、回虫抗原、ブルジア抗原、ブノストムム抗原、毛頭虫抗原、シャベルチア抗原、クーペリア抗原、クレノソマ（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）抗原、ジクチロカウルス抗原、線虫抗原、デイペタロネーマ抗原、裂頭条虫抗原、瓜実条虫抗原、ディロフィラリア抗原、メジナ虫抗原、蟯虫抗原、フィラリア抗原、ヘモンカス抗原、ラゴキルアスカリス抗原、ロア糸状虫抗原、マンソネラ抗原、ムエレリウス（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）抗原、ナノフィエタス抗原、アメリカ鉤虫抗原、線虫抗原、腸結節虫抗原、回旋糸状虫抗原、オピストルキス抗原、オステルタジア抗原、パラフィラリア抗原、肺吸虫抗原、パラアスカリス抗原、フィサロプテラ抗原、プロトストロンギルス抗原、セタリア抗原、スピロセルカ抗原、スピロメトラ抗原、ステファノフィラリア抗原、糞線虫抗原、ストロンギルス抗原、テラジア抗原、トキサスカリス抗原、トキソカラ抗原、旋毛虫抗原、毛様線虫抗原、鞭虫抗原、鉤虫抗原、及び糸状虫抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
免疫グロブリン分子が宿主細胞の表面に発現されるある選択及びスクリーニングの計画において、本発明の宿主細胞は、宿主細胞の表面に発現された免疫グロブリン分子のＣＤＲを特異的に認識する抗原が、ＣＤＲに結合する方法により、抗原と「接触」され、これにより抗原に特異的に結合する宿主細胞をこの抗原に結合していないそれらの宿主細胞から識別することが可能になる。抗原特異的抗体を発現している宿主細胞をこの抗原と相互作用させるいずれかの方法が含まれる。例えば、宿主細胞が懸濁液中に存在する場合、及び抗原が固形基質に付着されている場合、抗原に特異的に結合する細胞は、固形基質に捕獲され、この抗原と結合していないそれらの細胞を洗浄除去することを可能にし、かつ引き続き結合した細胞が回収される。あるいは、宿主細胞が固形基質に付着されていない場合、特異的に結合している抗原により細胞が基質から放出されることが引き起される場合（例えば細胞死により）、これらは、細胞上清から回収することができる。本発明の宿主細胞が抗原と接触することを可能にする好ましい方法で、特に三分子組換えによりワクシニアウイルスベクターにおいて構築されたライブラリーを使用する方法が、本明細書において明らかにされている。
【０１０２】
宿主細胞の表面に発現された抗原特異的免疫グロブリン分子の検出のための好ましいスクリーニング法において、本発明の宿主細胞は、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）により直接的に標識されるか又はビオチンにより間接的に標識され、その後ＦＩＴＣ−標識されたストレプトアビジンにより検出されるような選択抗原と一緒にインキュベーションされる。当業者になじみがある別の蛍光プローブを、使用することができる。インキュベーション期間に、標識された選択抗原は、抗原特異的免疫グロブリン分子に結合する。特異的蛍光タグ付けした抗原の抗体受容体を発現している細胞は、蛍光標示式細胞分取器により選択され、これにより、抗原に特異的に結合している宿主細胞が抗原に結合していない宿主細胞から識別できるようになる。１時間に１ｘ１０８個を超える細胞の選別が可能な細胞分取器の出現により、選択抗原に対する特異的抗体受容体を発現する細胞サブセットを選択するために、免疫グロブリン遺伝子の組換えワクシニアライブラリーにより感染した多数の細胞をスクリーニングすることが実現可能になっている。
【０１０３】
抗原に特異的に結合した宿主細胞の回収後に、第一のライブラリーのポリヌクレオチドが、これらの宿主細胞から回収される。「回収」は、望ましい成分のこれらの望ましくない成分からの粗分離を意味する。例えば、抗原に結合する宿主細胞は、固形基質からのそれらの脱離を基に「回収」され、かつ第一のライブラリーのポリヌクレオチドが、他の細胞成分からの粗分離によりこれらの細胞から回収される。用語「回収」は、ウイルス及び他の成分からの精製又は単離のいかなる種類も含蓄しないことは注目される。ポリヌクレオチドの回収は、当業者に公知の標準法法により実現することができる。好ましい局面において、ポリヌクレオチドは、感染性ウイルス粒子、例えばそこに第一のライブラリーが構築され、抗原に結合した宿主細胞中に含まれたようなワクシニアウイルスベクター粒子の収集により回収される。
【０１０４】
免疫グロブリン分子が宿主細胞の表面から完全に分泌されるあるスクリーニングの計画において、宿主細胞のプールが培養される細胞培地、すなわち「馴化培地」が、免疫グロブリン分子のＣＤＲを特異的に認識する抗原をＣＤＲに結合することを可能にする方法により、抗原と「接触」され、かつこれが更に抗原−抗体相互作用の検出を可能にする。 このような方法は、イムノブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ、ＲＡＳＴアッセイ、及び免疫蛍光アッセイを含むが、これらに限定されるものではない。あるいは、馴化培地は、特異的抗体に関する機能アッセイが施される。このようなアッセイの例は、ウイルス中和アッセイ（特異的ウイルスに対する抗体について）、細菌のオプソニン作用／食作用アッセイ（特異的細菌に対する抗体について）、抗体−依存型細胞細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイ、ある細胞機能の阻害又は促進に関するアッセイ、マスト細胞からのＩｇＥ−媒介されたヒスタミン放出を検出するアッセイ、赤血球凝集素アッセイ、及び赤血球凝集阻止アッセイを含むが、これらに限定されるものではない。このようなアッセイは、望ましい機能特性を伴う抗原特異的抗体の検出を可能にすると考えられる。
【０１０５】
特異的に抗原に結合する、又は望ましい機能特性を有する免疫グロブリン分子を含む馴化培地プールの同定後に、更なるスクリーニング段階が、望ましい免疫グロブリン分子を産生する宿主細胞が回収されるまで実行され、その後第一のライブラリーのポリヌクレオチドが、それらの宿主細胞から回収される。
【０１０６】
当業者に容易に理解されるように、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの同定には、２回以上の前述のような選択ラウンドを必要とすることができ、２回以上の前述のようなスクリーニングラウンドが必ず必要であると考えられる。１回の選択では、所望の第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの純粋なセットの単離を必ずしも生じず；１回目以降に得られた混合物は、所望のポリヌクレオチドについて濃縮することができるが、非標的挿入断片配列と夾雑することもある。本明細書に記されたスクリーニングアッセイは、反応性宿主細胞、及び／又は免疫グロブリン分子を含有するプールを同定するが、このようなプールは、非反応性種も含むと考えられる。従って、反応性プールは更に分画化され、かつスクリーニングの更なるラウンドが施される。従って、第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドとの結合において望ましい免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の形成を可能にする、第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドコードしているポリヌクレオチドの同定は、選択及び／又はスクリーニングの数回のラウンドが必要であるか、又はこれにより恩恵を受け、結果として望ましいポリヌクレオチドを含む細胞集団を増大する。従ってこの態様は更に、１回目のラウンド後に回収されたポリヌクレオチドの第二の細胞集団への導入、及び２回目の選択ラウンドの実行を提供する。
【０１０７】
従って、説明されたように、第一の選択段階は、１回又は複数回繰り返すことができ、もしくは繰り返さなければならず、これにより所望の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが濃縮される。この態様の第一の段階を反復するために、前述のように回収されたこれらのポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドのプールが、ライブラリー内のポリヌクレオチドによりコードされた免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞の集団に導入される。この宿主細胞は、１回目の選択ラウンドにおいて使用される型と同じであるか、又はそれらが免疫グロブリン分子を発現することができる限りは、異なる宿主細胞であることができる。ポリヌクレオチドの第二のライブラリーも、これらの宿主細胞へ導入され、かつ該宿主細胞の膜表面上の又は細胞培地中での、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の発現がもたらされる。この細胞又は馴化培地は、同様に抗原と接触されるか、又はこの培地は、機能アッセイにおいて試験され、かつ第一のライブラリーのポリヌクレオチドは、抗原に特異的に結合している、及び／又は望ましい機能特性を有する、これらの細胞又は免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞のプールから再度回収される。これらの段階は、１回又は複数回反復され、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、抗原に特異的に結合する及び／又は機能的特性を有するような免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第一のライブラリー由来のポリヌクレオチドの濃縮を生じる。
【０１０８】
前述のような第一のライブラリーからの望ましいポリヌクレオチドの適当な濃縮の後、回収されるこれらのポリヌクレオチドが、「単離」され、すなわち、それらの固有の環境から実質的に除去され、かつ抗原特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしていないライブラリー内のポリヌクレオチドから大部分は分離される。例えば、ベクターに含まれるクローン化されたポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されるとみなされる。同じ抗原に特異的に結合する２種以上の異なる免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが、本明細書に説明された方法により回収することができることは理解される。従って、同じ抗原に結合しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの混合物も、「単離」されているとみなされる。更なる単離されたポリヌクレオチドの例は、異種宿主細胞において維持されたもの又は溶液中の精製（部分的又は実質的に）されたＤＮＡ分子を含む。しかし、混合されたライブラリーのメンバーであり、かつ例えば抗原特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチドのコードによりライブラリーの他のクローンから単離されているようなクローンに含まれたポリヌクレオチドは、本発明の目的に関しては「単離」されていない。例えば、ウイルスベクターに含まれたポリヌクレオチドは、回収された後に、「単離」され、かつプラーク精製され、かつプラスミドベクターに含まれたポリヌクレオチドは、単独の細菌コロニーから増殖された後単離される。
【０１０９】
抗原が２種以上のエピトープを含み得、かついくつかの異なる免疫グロブリン分子がいずれか所定のエピトープへ結合し得るならば、いくつかの適当なポリヌクレオチド、例えば２、３、４、５、１０、１００又はそれ以上のポリヌクレオチドが、この態様の第一段階から回収され、その全ては第二のライブラリーポリヌクレオチドによりコードされた適当な免疫グロブリンサブユニットポリペプチドと一緒にされた場合に、関心のある抗原へ特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子又はそれらの抗原結合断片を形成する免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしていることが企図されている。第一のライブラリーから回収された異なるポリヌクレオチドの各々は、個別に分離されることが企図されている。しかし、これらのポリヌクレオチドは、同じ抗原特異性を伴うポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの群として単離することができ、かつこれらのポリヌクレオチドは互いに「単離」され得る。個別に又は集合的のいずれかで単離されたこのようなポリヌクレオチドの混合物は、以下に説明されるように、第二の段階で宿主細胞へ、個別に、又は２、３、４、５、１０、１００又はそれ以上の互いにプールされたポリヌクレオチドと共に、導入することができる。
【０１１０】
１種又は複数の適当なポリヌクレオチドが第一のライブラリーから一旦単離されると、この態様の第二の段階において、１種又は複数のポリヌクレオチドは、第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドによりコードされた免疫グロブリンサブユニットポリペプチド（複数）と結合することが可能である免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第二のライブラリーにおいて同定され、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原結合断片を形成し、これは 関心のある抗原に特異的に結合するか、もしくは所望の機能的特性を有する。
【０１１１】
従って第二の段階は、第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの第二のライブラリーの、免疫グロブリン分子の発現が可能な宿主細胞集団への導入、先に説明されたような第一のライブラリーから単離された少なくとも１種のポリヌクレオチドの、同じ宿主細胞集団への導入、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の宿主細胞の表面での発現の許容もしくは細胞培地への完全な分泌、これらの宿主細胞、もしくはそこで宿主細胞が増殖している馴化培地との関心のある特異的抗原との接触、又は馴化培地への機能アッセイの実施、かつ関心のある抗原に結合しているこれらの宿主細胞、又は望ましい反応性を示す馴化培地において増殖したそれらの宿主細胞からの、第二のライブラリーのポリヌクレオチドの回収を含む。従って第二の段階は、第二のライブラリーのポリヌクレオチドによりコードされた第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが、第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドのみを伴う宿主細胞と一緒にされることを除いて、第一の段階と非常に類似して実施される。前述のように、第一のライブラリーから単離された単独のクローン化されたポリヌクレオチドを使用されるか、あるいは、第一のライブラリーから単離されたいくつかのポリヌクレオチドのプールが、同時に導入され得る。前述の第一の段階のように、濃縮の１回又は複数回のラウンドが実行され、すなわち連続的により小さいプールの選択又はスクリーニングのいずれかが実行され、これにより、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、関心のある抗原へ特異的に結合する、又は望ましい機能特性を発揮する第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第二のライブラリーのポリヌクレオチドが濃縮される。同じく第一の段階のように、その後第二のライブラリー由来の１種又は複数の望ましいポリヌクレオチドが単離される。単離されたポリヌクレオチドのプールが第二の段階時により早期の濃縮ラウンドにおいて使用されるならば、好ましい引き続きの濃縮段階は、第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドのより小さいプールを使用することができ、又は更により好ましくは第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドが個別にクローニングされる。その後第二のライブラリーのポリヌクレオチドの選択段階に使用される第一のライブラリーから単離された個別のポリヌクレオチドに関して、いくつかの、すなわち２、３、４、５、１０、１００又はそれ以上のポリヌクレオチドが、第一のライブラリーからのポリヌクレオチドによりコードされた第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドと結合することが可能な第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第二のライブラリーから単離されることが可能であり、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原結合断片を形成し、これは関心のある抗原に特異的に結合するか、又は望ましい機能的特性を示す。
【０１１２】
単鎖断片をコードしているライブラリーの選択／スクリーニング法は、第一及び第二のライブラリーよりもむしろ唯一のライブラリーを必要とし、かつ唯一の選択／スクリーニング段階が必要とされる。免疫グロブリンの２段階の各々と同様に、この１段階選択／スクリーニング法も、２回以上の濃縮ラウンドから恩恵を受ける。
【０１１３】
ベクター  真核細胞における抗体ライブラリーの構築において、真核細胞において発現が可能ないずれか標準のベクターを使用することができる。例えば、このライブラリーは、選択された特定のベクターが真核細胞において機能することが可能な転写及び翻訳の調節領域を含む限りは、ウイルス、プラスミド、ファージ、又はファージミドベクターにおいて構築することができる。しかし、前述のような抗体ライブラリーは、好ましくは真核ウイルスベクターにおいて構築される。
【０１１４】
真核ウイルスベクターは、例えば、動物ウイルスベクター又は植物ウイルスベクターのようないずれかの型であることができる。ウイルスベクターの天然のゲノムは、ＲＮＡ、プラス鎖又はマイナス鎖、もしくは二本鎖のいずれか、又はＤＮＡであり、かつこの天然のゲノムは環状又は線状のいずれかであることができる。動物ウイルスベクターの中で、例えば昆虫、原生動物、又は寄生蠕虫のような無脊椎動物に感染するもの；又は、例えば哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、及び両生類のような脊椎動物に感染するものが含まれる。ウイルスベクターの選択は、最大挿入断片サイズ、及び達成されるタンパク質発現レベルによってのみ制限される。適当なウイルスベクターは、酵母及び他の真菌細胞、昆虫細胞、原生動物細胞、植物細胞、鳥類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、又は哺乳類細胞を感染するものであり、哺乳類ウイルスベクターが特に好ましい。標準のウイルスベクターを本発明において使用することができ、これはポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、単純ヘルペスウイルス）、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ピコナウイルスベクター（例えば、ポリオウイルス）、αウイルスベクター（例えば、シンドビスウイルス）、及びエンテロウイルスベクター（例えば、メンゴウイルス）を含むが、これらに限定されるものではない。ＤＮＡウイルスベクター、例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、及びアデノウイルスが好ましい。以下により詳細に説明されるように、ポックスウイルス、特にオルトポックスウイルス、及び特別にはワクシニアウイルスが、特に好ましい。好ましい態様において、ウイルスベクターが選択される限りは、感染性ウイルスの粒子の産生を許容する宿主細胞が利用される。ワクシニアウイルスのような多くの標準ウイルスベクターは、非常に広範な宿主範囲を有し、これにより多種多様な宿主細胞の使用を可能にしている。
【０１１５】
前述のように、本発明の第一及び第二のライブラリーは、同じベクター内で構築することができ、もしくは、異なるベクター内で構築することができる。しかし、好ましい態様において、第一及び第二のライブラリーは、第一の段階において、第一のライブラリーのポリヌクレオチドが、第二のライブラリーのポリヌクレオチドから都合良く回収、例えば分離され、かつ第二の段階において、第二のライブラリーのポリヌクレオチドは、第一のライブラリーのポリヌクレオチドから都合良く回収されるように調製される。例えば、第一の段階において、第一のライブラリーがウイルスベクターにおいて構築され、かつ第二のライブラリーがプラスミドベクターにおいて構築されるならば、第一のライブラリーのポリヌクレオチドは、感染性ウイルス粒子として容易に回収される一方で、第二のライブラリーのポリヌクレオチドは、細胞デブリと共に残留される。同様に、第二の段階において、第二のライブラリーがウイルスベクターにおいて構築される一方で、第一の段階において単離された第一のライブラリーのポリヌクレオチドがプラスミドベクターに導入されるならば、第二のライブラリーのポリヌクレオチドを含有する感染性ウイルス粒子は、容易に回収される。
【０１１６】
ポリヌクレオチドの第二のライブラリー、又は第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドがプラスミドベクター中で宿主細胞へ導入される場合は、このようなプラスミドベクター内に含まれたポリヌクレオチドによりコードされている免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは、他のライブラリーを含むウイルスベクターによりコードされたタンパク質により起動される転写調節領域と操作可能に結合されることが好ましい。例えば、第一のライブラリーがポックスウイルスベクターにおいて構築され、かつ第二のライブラリーがプラスミドベクターにおいて構築されるならば、プラスミドライブラリー内に構築された第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、ポックスウイルス感染細胞の細胞質において機能する転写調節領域、好ましくはプロモーターと操作可能に結合されることが好ましい。第二の段階と同様に、第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドをプラスミドベクターへ挿入し、かつ第二のライブラリーがポックスウイルスベクターにおいて構築されることが望ましい場合は、第一のライブラリーから単離されかつプラスミドに挿入さたポリヌクレオチドが、ポックスウイルス感染細胞の細胞質において機能する転写調節領域、好ましくはプロモーターに操作可能に結合されるれることが好ましい。この方法において、第二のライブラリーのポリヌクレオチドは、ポックスウイルスによっても感染されているこれらの細胞において発現されるのみである。
【０１１７】
しかし、２種の異なるベクターシステムにおいて一方又は両方のライブラリーを維持することよりも、ウイルスベクターのみにおいて、第一のライブラリーから単離されたこのようなポリヌクレオチドに加え、第一及び第二の両ライブラリーを維持することが都合がよい。従って本発明は、ウイルスベクターにおいて維持された第一又は第二のライブラリーの試料が失活され、その結果このウイルスベクターが細胞に感染し、かつウイルスベクターのゲノムは転写されるが、このベクターは複製されない、すなわち、このウイルスベクターが細胞へ導入された場合に、ウイルスゲノム上に保持された遺伝子産物、例えば免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは発現されるが、感染性ウイルス粒子は産生されないことを提供する。
【０１１８】
好ましい局面において、真核ウイルスベクターにおいて構築された第一又は第二のライブラリーのいずれかの失活は、４’−アミノメチル−トリオキサレン（ソラレン）による、ウイルスベクターにおいて構築されたライブラリー試料の処理、その後のウイルスベクターの紫外線（ＵＶ光）への曝露により実行される。ウイルスのソラレン及びＵＶによる失活は、当業者に周知である。例えば、Ｔｓｕｎｇ， Ｋ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７０：１６５−１７１（１９９６）を参照し、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０１１９】
ソラレン処理は、典型的には、ウイルスベクターの細胞−非含有試料の、ソラレン濃度範囲約０．１μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約１７．５μｇ／ｍｌ、約２．５μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約１２．５μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ〜約１２．５μｇ／ｍｌ、又は約９μｇ／ｍｌ〜約１１μｇ／ｍｌと一緒のインキュベーションを含む。従って、ソラレン濃度は、約０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１１μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１３μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ、１９μｇ／ｍｌ、又は２０μｇ／ｍｌであることができる。好ましくは、ソラレン濃度は、約１０μｇ／ｍｌである。本明細書に使用される「約」という用語は、典型的には実験室又は製造施設において測定される時間、化学物質濃度、温度、ｐＨ、及び他の要因の測定値が、決して精密ではなく、測定の種類及び測定のために使用した装置を基に所定の量変動し得ることを考慮している。
【０１２０】
ソラレンとのインキュベーションは、典型的にはＵＶ曝露前に一定時間行われる。この時間は、好ましくはＵＶ曝露前約１分〜約２０分である。好ましい時間範囲は、約２分〜約１９分、約３分〜約１８分、約４分〜約１７分、約５分〜約１６分、約６分〜約１５分、約７分〜約１４分、約８分〜約１３分、又は約９分〜約１２分である。従って、インキュベーション時間は、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１１分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、約１９分間、又は約２０分間である。より好ましくは、インキュベーションは、ＵＶ曝露前１０分間行われる。
【０１２１】
その後ソラレン処理したウイルスを、ＵＶ光に曝露する。ＵＶは、任意の波長であってよいが、好ましくは長波長側ＵＶ光であり、例えば、約３６５ｎｍである。ＵＶへの曝露は、約０．１分〜約２０分の時間実行される。好ましくは、この時間範囲は、約０．２分〜約１９分、約０．３分〜約１８分、約０．４分〜約１７分、約０．５分〜約１６分、約０．６分〜約１５分、約０．７分〜約１４分、約０．８分〜約１３分、約０．９分〜約１２分、約１分〜約１１分、約２分〜約１０分、約２．５分〜約９分、約３分〜約８分、約４分〜約７分、又は約４．５分〜約６分である。従ってインキュベーション時間は、約０．１分間、約０．５分間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１１分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、約１９分間、又は約２０分間である。より好ましくは、ウイルスベクターは、約５分間ＵＶ光に曝露される。
【０１２２】
免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの２種のライブラリーから真核細胞において免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を集成及び発現する能力は、細菌システムにおいて単鎖抗体を産生する方法に勝る顕著な改善を示し、ここで２段階選択プロセスは、様々な特異性を有する免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の選択を基本としている。
【０１２３】
更に例証されるが、本態様を限定するものではない具体的態様の例は、下記実施例において提供される。先に詳細に説明したように、特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の選択は、２相において実現される。最初に、ナイーブドナー又は免疫感作ドナーのいずれかの免疫グロブリン産生細胞由来の多様な重鎖のライブラリーは、例えば、ポックスウイルスベクターのような真核ウイルスベクターにおいて構築され、及び免疫グロブリン軽鎖の同様の多様なライブラリーが、組換え遺伝子の発現は、ウイルスプロモーターにより調節されるプラスミドベクター、又は例えばソラレン及びＵＶ処理により失活された真核ウイルスベクターのいずれかから構築される。免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現することが可能な宿主細胞は、重鎖ライブラリーをコードしているウイルスベクターに感染多重度約１（ＭＯＩ＝１）で感染されている。「感染多重度」は、各宿主細胞の感染に利用可能なウイルス粒子の平均数を意味する。例えば、ＭＯＩが１、すなわち、平均で各細胞が１個のウイルス粒子により感染されることが望ましいならば、感染に使用されるべき感染性ウイルス粒子の数は、感染される細胞数と等しいように調節される。
【０１２４】
この戦略に従い、軽鎖ポリペプチドをコードしている平均で１０又はそれ以上の個別のポリヌクレオチドを各細胞に取込ませかつ発現させることができる条件下で、宿主細胞は、軽鎖プラスミドライブラリーによりトランスフェクションされるか、もしくは失活された軽鎖ウイルスライブラリーにより感染されるかのいずれかである。これらの条件下で、単独の宿主細胞は、各宿主細胞における特徴的Ｈ２Ｌ２構造で同じ重鎖に結合された異なる軽鎖を伴う、複数の免疫グロブリン分子、又はそれらの断片を発現することができる。
【０１２５】
当業者には、細胞に取込まれるプラスミド数の制御は、トランスフェクションの成功は均一でなくかつ可変量のＤＮＡの取込みにつながる細胞のコンピテントな状態の誘導に左右されるので、困難であることは理解されると思われる。従って、各感染された宿主細胞に導入される第二のライブラリーからのポリヌクレオチドの数の慎重な制御が望ましいこれらの態様において、失活されたウイルスベクターの使用が好ましく、その理由は、ウイルスの感染多重度を、より容易に制御することができるからである。
【０１２６】
単一の重鎖に結合された、単一の宿主細胞中の複数の軽鎖の発現は、特異的抗原免疫グロブリンの結合活性を低下する作用を有するが、比較的高親和性の結合部位の選択にとっては有益であろう。本明細書において使用される用語「親和性」は、個々のエピトープの免疫グロブリン分子のＣＤＲへの結合強度の測定を意味する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ、２７−２８ページを参照のこと。本明細書において使用される用語「結合活性」は、免疫グロブリン集団と抗原の間の複合体の全般的安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物の抗原との機能的結合強度を意味する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、２９−３４ページ参照のこと。結合活性は、特異的エピトープと集団中の個々の免疫グロブリン分子の親和性、及び更には免疫グロブリンと抗原の結合価（ｖａｌｅｎｃｙ）の両方に関する。例えば、二価のモノクローナル抗体とポリマーのような高い反復エピトープ構造を伴う抗原の相互作用は、高結合活性の一つであると考えられる。当業者に理解されるように、宿主細胞がその表面に免疫グロブリン分子を発現し、各々が所定の重鎖を含むが、その表面の異なる免疫グロブリン分子が、異なる軽鎖を含むならば、所定の抗原に関するその宿主細胞の「結合活性」は低下されうる。しかし、これらが共通の重鎖を含むが、異なる軽鎖を介して、親和性のスペクトルを伴う特定の抗原と反応する点で関連している免疫グロブリン分子の群を回収する可能性は、増大される。従って、所定の宿主細胞においてある数の重鎖又はそれらの断片と結合させられるような異なる軽鎖、又はそれらの断片の数を調節することにより、本発明は、変動する親和性レベルを伴う、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を選択しかつ濃縮する方法を提供する。
【０１２７】
前述のような免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の選択法の第一段階の戦略を利用することにおいて、第一のライブラリーは、好ましくは真核ウイルスベクターにおいて構築され、かつこの宿主細胞は、第一のライブラリーによりＭＯＩ範囲約１〜約１０で、好ましくは約１で感染されるが、第二のライブラリーは、各感染された宿主細胞により取込まれる該第二のライブラリーの最大２０個のポリヌクレオチドを可能にする条件下で導入される。例えば、第二のライブラリーが失活されたウイルスベクターにおいて構築されるならば、宿主細胞は、第二のライブラリーにより、ＭＯＩ範囲約１〜約２０において感染されるが、使用されるウイルスベクター及び望ましい免疫グロブリン分子の性質によっては、この範囲よりもより高い又はより低いＭＯＩも望ましいことがある。第二のライブラリーがプラスミドベクターにおいて構築される場合は、トランスフェクション条件は、０個のプラスミドから約２０個のプラスミドが各宿主細胞に侵入することがどこでも可能になるように調節される。抗原に対するより低い又はより高い親和性反応の選択は、感染した各細胞への侵入が可能になる第二のライブラリーのポリヌクレオチドの平均数の増加又は減少により制御される。
【０１２８】
より好ましくは、第一のライブラリーがウイルスベクターにおいて構築される場合は、宿主細胞は、第一のライブラリーにより、ＭＯＩ範囲約１〜９、約１〜８、約１〜７、約１〜６、約１〜５、約１〜４、又は約１〜２の範囲で感染される。別の表現をすると、宿主細胞は、第一のライブラリーにより、ＭＯＩ約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、又は約１で感染される。最も好ましくは、宿主細胞は、第一のライブラリーにより、ＭＯＩ約１で感染される。
【０１２９】
第二のライブラリーがプラスミドベクターにおいて構築される場合、プラスミドベクターは、より好ましくは、各感染した宿主細胞による第二のライブラリーの最大約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、又は約１個のポリヌクレオチド（複数）の取込みが可能になる条件下で、宿主細胞へ導入される。最も好ましくは、第二のライブラリーがプラスミドベクターにおいて構築される場合、このプラスミドベクターは、各感染した宿主細胞による第二のライブラリーの最大約１０個のポリヌクレオチドの取込みが可能になる条件下で、宿主細胞へ導入される。
【０１３０】
同様に、第二のライブラリーが、失活されたウイルスベクターにおいて構築される場合、第二のライブラリーが宿主細胞へ、ＭＯＩ範囲約１〜１９、約２〜１８、約３〜１７、約４〜１６、約５〜１５、約６〜１４、約７〜１３、約８〜１２、又は約９〜１１で導入されることがより好ましい。別の表現をすると、宿主細胞は、第二のライブラリーにより、ＭＯＩ約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、又は約１で感染される。最も好ましい局面において、宿主細胞は、ＭＯＩ約１０で第二のライブラリーにより感染される。当業者に理解されるように、失活されたウイルスの力価、従って「ＭＯＩ」は、直接測定することはできないが、しかしこの力価は、引き続き失活される開始の感染性ウイルスストックの力価から推測することができる。
【０１３１】
最も好ましい局面において、第一のライブラリーは、ウイルスベクターにおいて構築され、かつ第二のライブラリーは、失活されたウイルスベクターにおいて構築され、宿主細胞は、該第一のライブラリーによりＭＯＩ約１で感染され、かつこの宿主細胞は、第二のライブラリーによりＭＯＩ約１０で感染されている。
【０１３２】
本発明において、好ましいウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスに由来している。第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第一のライブラリーが、ポックスウイルスベクターにおいて構築され、かつプラスミドベクター又は失活されたウイルスベクターにおいて構築された第二のライブラリーにおいてコードされた第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの発現が、ポックスウイルスプロモーターにより調節されるならば、高レベルの第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドが、核組込みを必要とせずに、ポックスウイルス感染細胞の細胞質において発現される。
【０１３３】
先に説明したような免疫グロブリン選択の第二段階において、この第二のライブラリーは、好ましくは、感染性真核ウイルスベクターにおいて構築され、かつ宿主細胞は、第二のライブラリーによりＭＯＩ範囲が約１〜約１０で感染される。より好ましくは、第二のライブラリーが、ウイルスベクターにおいて構築される場合、宿主細胞は、第二のライブラリーにより、ＭＯＩ範囲約１〜９、約１〜８、約１〜７、約１〜６、約１〜５、約１〜４、又は約１〜２において感染される。別の言い方をすると、宿主細胞は、第二のライブラリーにより、ＭＯＩ約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、又は約１で感染される。最も好ましくは、宿主細胞は、第二のライブラリーによりＭＯＩ約１で感染される。
【０１３４】
免疫グロブリン選択の第二段階において、第一のライブラリー由来のポリヌクレオチドは単離されている。ある態様において、単独の第一のライブラリーポリヌクレオチド、すなわちクローンが、第二のライブラリーからのポリヌクレオチドを単離するために使用される宿主細胞に導入される。この状況において、第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞１個につき少なくとも約１個のポリヌクレオチドを可能にする条件下で、宿主細胞へ導入される。しかし、第一のライブラリーから導入される全てのポリヌクレオチドは同じ、すなわちクローン化されたポリヌクレオチドのコピーであるので、いずれか所定の宿主細胞へ導入されたポリヌクレオチドの数は、余り重要ではない。例えば、第一のライブラリーから単離されたクローン化されたポリヌクレオチドが失活されたウイルスベクターに含まれる場合、このベクターは、ＭＯＩ約１で導入されるが、１より大きいＭＯＩも許容されうる。同様に、第一のライブラリーから単離されたクローン化されたポリヌクレオチドが、プラスミドベクターへ導入される場合、いずれか所定の宿主細胞へ導入されるプラスミドの数は、余り重要ではなく、むしろ、少なくとも１個のポリヌクレオチドが、各宿主細胞へ導入されることを確実にするように、トランスフェクション条件が調節されなければならない。例えばいくつかの異なるポリヌクレオチドが第一のライブラリーから単離される場合には、別の態様を利用することができる。この態様において、第一のライブラリーから単離された２種以上の異なるポリヌクレオチドのプールは、ポリヌクレオチドの第二のライブラリーで感染された宿主細胞を恐らく有利に導入するであろう。この状況において、第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドが、失活されたウイルスベクターに含まれるならば、約１よりも大きい、例えば約２、約３、約４、約５、又はそれ以上のＭＯＩの失活されたウイルス粒子が好ましく、第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドがプラスミドベクターに含まれるならば、少なくとも約２、３、４、５又はそれ以上のポリヌクレオチドを各細胞へ侵入させることが可能な条件が好ましい。
【０１３５】
ポックスウイルスベクター  前述のように、本発明における使用にとって好ましいウイルスベクターは、ポックスウイルスベクターである。「ポックスウイルス」は、ポックスウイルス科のメンバーを含み、これは亜科チョルドポックスウイルス（脊椎動物ポックスウイルス）及びエントモポックスウイルス（昆虫ポックスウイルス）を含む。例えば、Ｂ． Ｍｏｓｓの「ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅら編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ社、２０８０（１９９０）参照。チョルドポックスウイルスは、特に、下記の属を含む：オルトポックスウイルス（例えば、ワクシニア、バリオラウイルス、アライグマポックスウイルス）；アビポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルス）；カプリポックスウイルス（例えば、羊痘）、レポリポックスウイルス（例えば、ウサギ（Ｓｈｏｐｅ）線維腫、及び粘液腫）；及び、スイポックスウイルス（例えば、ブタ痘）。エントモポックスウイルスは、３つの属Ａ、Ｂ及びＣを含む。本発明において、オルトポックスウイルスが好ましい。ワクシニアウイルスは、プロトタイプのオルトポックスウイルスであり、かつ異種タンパク質発現のためのベクターとして開発されており、よく特徴付けられている。本発明において、ワクシニアウイルスベクター、特に三分子組換えを行うために開発されたものが、好ましい。しかし、他のオルトポックスウイルス、特にアライグマポックスウイルスが、ベクターとして開発されており、かつ一部の用途において、優れた品質を有している。
【０１３６】
ポックスウイルスは、それらの大きいサイズ及び複雑性により識別され、かつ同様に大きくかつ複雑なゲノムを含む。とりわけ、ポックスウイルス複製は、宿主細胞の細胞質内全体で生じる。ポックスウイルスゲノムの中心部分は類似しているが、そのウイルスゲノムの末端部分は、比較的大きい可変性により特徴付けられる。従って、ポックスウイルスゲノムの中心部分は、複製のような、全てのポックスウイルスに共通の本質的機能に寄与する遺伝子を保持すると思われる。対照的に、ポックスウイルスゲノムの末端部分は、異なるポックスウイルス間で変動し、恐らく組織培養物中でのウイルス複製にとって余り本質的ではなく、病原性及び宿主範囲のような特徴に寄与するように思われる。ポックスウイルスゲノムがＤＮＡ断片の再構成又は除去により、もしくは外因性ＤＮＡ断片の導入により修飾される場合、外因性ＤＮＡの導入により再構成、除去又は破壊される天然のＤＮＡの一部は、好ましくは、ウイルスの複製及び組織培養物中の感染性ビリオンの産生にとって必須ではないように思われる比較的遠位領域に存在することになる。
【０１３７】
天然のワクシニアウイルスゲノムは、約１８６，０００塩基対（ｂｐ）の、架橋された二本鎖の直鎖状ＤＮＡ分子であり、これは逆方向末端反復配列により特徴付けられている。ワクシニアウイルスのゲノムは、完全に配列決定されているが、ほとんどの遺伝子産物の機能は依然不明である。Ｇｏｅｂｅｌ， Ｓ．Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７９：２４７−２６６，５１７−５６３（１９９０）；Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇ．Ｐ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９６：３８１−４０１。様々な必須でない領域が、ワクシニアウイルスゲノムにおいて同定されている。例えば、Ｐｅｒｋｕｓ， Ｍ．Ｅ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５２：２８５−９７（１９８６）；並びに、Ｋｏｔｗａｌ， Ｇ．Ｊ．及びＭｏｓｓ Ｂ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６７：５２４−３７参照。
【０１３８】
これらのポックスウイルスベクター、特にワクシニアウイルスベクターが免疫サブユニットポリペプチドの発現に使用されるような態様において、いずれか適当なポックスウイルスベクターを使用することができる。免疫グロブリンサブユニットポリペプチドのライブラリーが、ベクターの増殖及び複製に必須でないベクターの領域に保持され、その結果感染性ウイルスが産生されることが好ましい。ワクシニアウイルスゲノムの様々な非必須領域が特徴付けられているが、外来遺伝子の挿入のために最も広範に使用される座位は、ゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＪ断片に位置したチミジンキナーゼ位である。ある好ましいワクシニアウイルスベクターにおいて、ｔｋ位は１個又は２個の独自の制限酵素部位を含むように操作されており、ライブラリー作成の三分子組換え法での使用に都合が良くなっている。下記及びＺａｕｄｅｒｅｒのＰＣＴ公開国際公開公報第００／０２８０１６号も参照のこと。
【０１３９】
免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーは、ポックスウイルス感染細胞の細胞質において機能する転写調節領域との操作可能な結合下で、ポックスウイルスベクター、特にワクシニアウイルスベクターに挿入されている。
【０１４０】
ポックスウイルス転写調節領域は、プロモーター及び転写終結シグナルを含む。ポックスウイルスにおける遺伝子発現は、一時的に調節され、かつ初期、中期及び後期遺伝子のプロモーターは、変動する構造を有する。あるポックスウイルス遺伝子は、構成的に発現されており、かつこれらの「初期−後期」遺伝子のためのプロモーターは、ハイブリッド構造を生じる。合成的初期−後期プロモーターも、開発されている。Ｈａｍｍｏｎｄ Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、６６：１３５−８（１９９７）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ Ｓ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２３：１０９４−７（１９９７）。本発明において、あらゆるポックスウイルスプロモーターを使用することができるが、初期、後期又は構成的プロモーターの使用が、選択された宿主細胞及び／又は選択計画を基に望ましい。典型的には、構成的プロモーターの使用が好ましい。
【０１４１】
初期プロモーターの例は、７．５−ｋＤプロモーター（同じく後期プロモーター）、ＤＮＡ ｐｏｌプロモーター、ｔｋプロモーター、ＲＮＡ ｐｏｌプロモーター、１９−ｋＤプロモーター、２２−ｋＤプロモーター、４２−ｋＤプロモーター、３７−ｋＤプロモーター、８７−ｋＤプロモーター、Ｈ３’プロモーター、Ｈ６プロモーター、Ｄ１プロモーター、Ｄ４プロモーター、Ｄ５プロモーター、Ｄ９プロモーター、Ｄ１２プロモーター、Ｉ３プロモーター、Ｍ１プロモーター、及びＮ２プロモーターを含む。例えば、Ｍｏｓｓ， Ｂ．、「ポックスウイルス及びそれらの複製（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」「ウイルス学」、第２版、Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅら編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ社、２０８８頁（１９９０）参照のこと。ワクシニアウイルス及び他のポックスウイルスにおいて転写された初期遺伝子は、転写終結シグナルＴＴＴＴＴＮＴを認識し、ここでＮは、いずれかのヌクレオチドであることができる。転写は通常、このシグナルのおよそ５０ｂｐ上流で終結する。従って、異種遺伝子がポックスウイルス初期プロモーターから発現されるならば、これらの遺伝子のコード領域内のこのシグナルの出現を排除するように注意しなければならない。例えば、Ｅａｒｌ， Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６４：２４４８−５１（１９９０）参照。
【０１４２】
後期プロモーターの例は、７．５−ｋＤプロモーター、ＭＩＬプロモーター、３７−ｋＤプロモーター、１１−ｋＤプロモーター、１１Ｌプロモーター、１２Ｌプロモーター、１３Ｌプロモーター、１５Ｌプロモーター、１７Ｌプロモーター、２８−ｋＤプロモーター、Ｈ１Ｌプロモーター、Ｈ３Ｌプロモーター、Ｈ５Ｌプロモーター、Ｈ６Ｌプロモーター、Ｈ８Ｌプロモーター、Ｄ１１Ｌプロモーター、Ｄ１２Ｌプロモーター、Ｄ１３Ｌプロモーター、Ａ１Ｌプロモーター、Ａ２Ｌプロモーター、Ａ３Ｌプロモーター、及びＰ４ｂプロモーターを含む。例えば、Ｍｏｓｓ， Ｂ．、「ポックスウイルス及びそれらの複製」「ウイルス学」、第２版、Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅら編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ社、２０９０頁（１９９０）参照のこと。後期プロモーターは明らかに、初期プロモーターにより認識された転写終結シグナルを認識しない。
【０１４３】
本発明における使用にとって好ましい構成的プロモーターは、Ｈａｍｍｏｎｄ及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉにより説明された合成的初期−後期プロモーター、ＭＨ−５初期−後期プロモーター、及び７．５−ｋＤ又は「ｐ７．５」プロモーターである。これらのプロモーター利用の例は本明細書に明らかにされている。
【０１４４】
より詳細に以下に論ずるように、宿主細胞死を基にした選択及びスクリーニングの方法は、細胞死につながる機構が、ウイルス感染により引き起される細胞変性効果（ＣＰＥ）の前に生じることを必要としている。ウイルス感染細胞におけるＣＰＥの始まりの速度論は、使用されるウイルス、感染多重度、及び宿主細胞の種類によって決まる。例えば、ＭＯＩ約１でワクシニアウイルスにより感染した多くの組織培養株において、ＣＰＥは、感染の４８〜７２時間後までは重要ではない。これは、２〜３日の時間枠での免疫グロブリン分子の高レベルの発現、及びベクターにより引き起されるＣＰＥとは無関係の抗原−ベースの選択を可能にする。しかし、この時間枠は、ある選択法にとっては、特に比較的高いＭＯＩが使用される場合、及び更にはＣＰＥ開始前の時間が望ましい細胞株において短縮される場合には、十分ではない。従って、必要な場合に、選択の時間枠を延長することができるように、弱毒化された細胞変性効果を伴うウイルスベクター、特にワクシニアウイルスのようなポックスウイルスベクターの必要性がある。
【０１４５】
例えば、ある弱毒化は、遺伝的変異により実現される。これらは、完全に欠失変異体であり、すなわち感染性ウイルス粒子の作成はヘルパーウイルスを必要とするか、もしくは、これらは条件付け変異体、例えば、温度感受性変異体であることができる。条件付け変異体が、宿主遺伝子発現が必要な期間にわたり、ウイルス感染した宿主細胞を、非許容（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）環境、例えば、非許容温度において維持することができ、その後許容環境、例えば許容温度へシフトされ、ウイルス粒子の作成が可能になる点で、特に好ましい。あるいは完全に感染性のウイルスは、感染サイクルの所定の時点でウイルス複製を可逆的にブロックする化学的インヒビターにより「弱毒化」される。化学的インヒビターは、ヒドロキシ尿素及び５−フルオロデオキシウリジンを含むが、これらに限定されるものではない。ウイルス感染した宿主細胞は、宿主遺伝子発現が必要な期間化学的インヒビターにより維持され、その後化学的インヒビターが除去され、ウイルス粒子が作成される。
【０１４６】
多くの弱毒化されたポックスウイルス、特にワクシニアウイルスが開発されている。例えば、修飾されたワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）は、初代ニワトリ胚繊維芽細胞における５７０を超える継代の間に得られたワクシニアウイルスの高度に弱毒化された株である（Ｍａｙｒ， Ａ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、３：６−１４（１９７５））。回収されたウイルスは、そのウイルスの宿主範囲制限に大いに影響している野生型ワクシニアＤＮＡのおよそ１５％を欠損している。ＭＶＡは、ほとんどの哺乳類細胞株において、複製することができないか、又は極めて非能率に複製する。宿主範囲制限の独自の特徴は、非許容細胞におけるブロックが複製サイクルのかなり後期に発生することである。ウイルスの後期遺伝子の発現は、余り損なわれていないが、ビリオンの形態形成は妨害されている（Ｓｕｔｅｒ， Ｇ．及びＭｏｓｓ， Ｂ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１０８４７−５１（１９９２）；Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｍ．Ｗ．及びＭｏｓｓ， Ｂ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３８：１９８−２１１（１９９７））。たとえ非許容宿主細胞内であっても高レベルのウイルスのタンパク質合成は、ＭＶＡを特に安全かつ効率的な発現ベクターとする。しかしＭＶＡは、ほとんどの哺乳類細胞において感染サイクルを完成することができないので、選択の複数サイクルについて感染性ウイルスを回収するためには、それ自身欠失しておりかつ引き続きのＭＶＡ許容宿主細胞における低ＭＯＩでの示差的拡張により感染性ＭＶＡ組換え体から分離することができるようなヘルパーウイルスによる同時感染又は重感染により、ＭＶＡ欠失を補完することが必要であると考えられる。
【０１４７】
ポックスウイルス感染は、宿主細胞のタンパク質及びＲＮＡ合成に劇的阻害作用を有することができる。これらの宿主遺伝子発現に対する作用は、いくつかの条件下で、宿主細胞に対し限定された生理的作用を有する特異的ポックスウイルス組換え体の選択を妨げると考えられる。必須の初期遺伝子を欠失しているワクシニアウイルス株の一部は、宿主細胞タンパク質合成に対して大きく低下された阻害作用を有することが示されている。限定された必須の初期遺伝子を欠いている弱毒化されたポックスウイルスも、説明されている。例えばＦａｌｋｎｅｒらの米国特許第５，７６６，８８２号、及び第５，７７０，２１２号を参照のこと。欠損性となることができる必須の初期遺伝子の例は、ワクシニアウイルス１７Ｌ、Ｆ１８Ｒ、Ｄ１３Ｌ、Ｄ６Ｒ、Ａ８Ｌ、Ｊ１Ｒ、Ｅ７Ｌ、Ｆ１１Ｌ、Ｅ４Ｌ、Ｉ１Ｌ、Ｊ３Ｒ、Ｊ４Ｒ、Ｈ７Ｒ及びＡ６Ｒ遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。欠損性となる好ましい必須の初期遺伝子は、Ｄ４Ｒ遺伝子であり、これはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素をコードしている。限定された必須の遺伝子を欠損しているワクシニアウイルスは、必須の遺伝子産物を提供する細胞株の補完において容易に繁殖される。
【０１４８】
本明細書において使用される「補完」という用語は、宿主細胞、トランスジェニック動物又はヘルパーウイルスのような、別の供給源によりトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）喪失された機能を回復することを意味する。この機能喪失は、その機能に寄与する遺伝子産物の欠損ウイルスによる喪失により引き起される。従って、欠損ポックスウイルスは、親ポックスウイルスの生存不能型であり、かつ補完の存在下で生存可能となることができる型である。宿主細胞、トランスジェニック動物又はヘルパー ウイルスは、喪失遺伝子産物をコードしている配列、又は「補完エレメント」を含む。この補完エレメントは、宿主細胞、トランスジェニック動物又はヘルパーウイルスにおいて発現可能でありかつ安定して組入れられなければならず、かつ好ましくは、欠損ポックスウイルスのゲノムによる組換えリスクがほとんど又は全くないように施される。
【０１４９】
細胞株を補完することで産生されるウイルスは、非補完細胞の感染が可能であり、更に初期遺伝子産物の高−レベル発現が可能である。しかし、必須の遺伝子産物の非存在下で、感染性ウイルス粒子の宿主シャットオフ（ｈｏｓｔ ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）、ＤＮＡ複製、パッケージング、及び産生は生じない。
【０１５０】
本明細書において説明された特に好ましい態様において、ワクシニアウイルスにおいて構築された複合ライブラリーにおいて発現された望ましい標的遺伝子産物の選択は、補完エレメントの発現の誘導を所望の標的遺伝子産物の発現と組合わせることにより実現される。この補完エレメントは望ましい遺伝子産物を発現しているそれらの宿主細胞において発現されるのみであるので、これらの宿主細胞のみが、容易に回収される感染性ウイルスを産生する。
【０１５１】
ワクシニアウイルスに関連している好ましい態様は、いずれかのポックスウイルスベクターの使用に関して、当業者には明らかな方法により修飾することができる。直接の選択法において、ポックスウイルス又はワクシニアウイルス以外のベクターが使用され得る。
【０１５２】
三分子組換え法  伝統的に、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスベクターは、構築及びスクリーニングライブラリーの高効率、高力価−作出法は、ワクシニアに関して存在しないので、複雑なライブラリーから関心のあるこれまで未知の遺伝子を同定するためには使用されていない。ワクシニアウイルスにおける異種タンパク質発現の標準法は、インビボにおける相同的組換え及びインビトロにおける直接ライゲーションに関連している。相同的組換えを使用すると、組換えウイルス作出の効率は、およそ０．１％又はそれ未満の範囲である。直接ライゲーションを使用する組換えウイルス産生の効率は、比較的高く、得られる力価は、比較的低い。従って、ワクシニアウイルスベクターの使用は、タンパク質発現及びワクチン開発を目的として先に単離されたＤＮＡのクローニングに限定される。
【０１５３】
ＺａｕｄｅｒｅｒのＰＣＴ公開国際公開公報第００／０２８０１６号に開示された三分子組換えは、ワクシニアウイルスのクローニングのための新規の高効率、高力価作出法である。三分子組換え法を使用し、本発明者らは、組換えウイルスの作成を達成し、これは直接ライゲーションにより得られるもの効率が少なくとも９０％、及び力価は少なくとも２桁大きい。
【０１５４】
従って好ましい態様において、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの発現が可能なポリヌクレオチドのライブラリーは、ポックスウイルスベクターにおいて、好ましくはワクシニアウイルスベクターにおいて、三分子組換えにより構築される。
【０１５５】
「三分子組換え」又は「三分子組換え法」は、ウイルスゲノム、好ましくはポックスウイルスゲノムの作出法を意味し、更により好ましくはレシピエント細胞へのウイルスゲノム及び導入ベクター、又は挿入断片ＤＮＡを含む伝達ＤＮＡの２個の非相同断片の導入による、異種挿入断片ＤＮＡを含むワクシニアウイルスゲノムの作出法を意味し、これにより３種のＤＮＡ分子のインビボ組換えが可能になる。この組換えの結果、２個のゲノム断片及び挿入断片ＤＮＡの各々を含む生存可能なウイルスゲノム分子が作出される。従って本発明に使用される三分子組換え法は、下記の段階を含む：（ａ）単離されたウイルスゲノムの、好ましくはＤＮＡウイルスゲノムの、より好ましくは直鎖状ＤＮＡウイルスゲノムの、及び更により好ましくはポックスウイルス又はワクシニアウイルスゲノムの切断による、第一のウイルス断片及び第二のウイルス断片の作成であり、ここで第一のウイルス断片は、第二のウイルス断片と非相同である段階；（ｂ）５’側フランキング領域及び３’側フランキング領域にフランキングされた転写調節領域との操作可能な結合を介して、免疫グロブリンサブユニットポリペプチド、例えば免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、又はいずれかの抗原特異的断片をコードしているポリヌクレオチドを含む伝達性プラスミドの集団を提供する段階であり、ここでこの５’フランキング領域が（ａ）に説明された該ウイルスの断片と相同であり、かつ３’フランキング領域が（ａ）に説明された該第二のウイルスの断片と相同であり；ここで伝達性プラスミドは、第一及び第二のウイルスの断片による相同的組換えが可能であり、その結果、生存可能なウイルスゲノムが形成される段階；（ｃ）（ｂ）に説明された伝達性プラスミド並びに（ａ）に説明された第一及び第二のウイルスの断片を、宿主細胞へ、伝達性プラスミド及び２種のウイルスの断片がインビボにおいて相同的組換えを受ける、すなわち三分子組換えを受ける条件下で導入する段階であり、これにより、 免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む生存可能な修飾されたウイルスゲノムが作出される段階；並びに、（ｄ）この技術により作出された修飾されたウイルスゲノムを回収する段階。好ましくは、回収された修飾されたウイルスゲノムは、感染性ウイルスの粒子内にパッケージングされる。
【０１５６】
「組換え効率」又は「組換えウイルス作出の効率」は、本発明のウイルスライブラリーを作成する間に作出された組換えウイルスの総ウイルスに対する比を意味する。実施例５に示されたように、この効率は、組換えウイルスの力価を、総ウイルスの力価で除算し、かつ１００％に積算することにより算出することができる。例えば、この力価は、選択を伴う（例えば、組換えウイルスについて）又は選択を伴わない（例えば、組換えウイルス＋野生型ウイルスについて）のいずれかの適当な細胞に対する粗ウイルスストックのプラークアッセイにより決定される。選択法は、特に異種ポリヌクレオチドがウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）位に挿入される場合に、当技術分野において周知であり、かつｔｋ遺伝子の破壊によるブロモデオキシウリジン（ＢＤＵＲ）又は他のヌクレオチドアナログに対する耐性を含む。選択法の例は、本明細書に説明されている。
【０１５７】
「高効率の組換え」は、組換え効率が少なくとも１％、及びより好ましくは組換え効率が少なくとも約２％、２．５％、３％、３．５％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を意味する。
【０１５８】
多くの選択システムを使用することができ、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１１：２２３（１９７７））遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、４８：２０２６（１９６２））遺伝子、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ、２２：８１７（１９８０））遺伝子のような、各々、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞を使用することができる、チミジンキナーゼを含むが、これらに限定されるものではない。更に、代謝拮抗耐性を、下記の遺伝子の選択の基本として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセート耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９８１））；及び、ｈｙｇｒｏ、ヒグロマイシン耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ、３０：１４７（１９８４））。
【０１５９】
第一及び第二のウイルス断片又はウイルスゲノムの「アーム」は、前述のように、一緒に、ウイルスの複製及び感染性ウイルスの粒子の作出に必要な全ての遺伝子を含むことが好ましい。ワクシニアウイルスベクターを使用するそれらの作出に関する適当なアーム及び方法の例は、本明細書に明らかにされている。更にワクシニア複製の必須領域に関する指針についてはＦａｌｋｎｅｒらの米国特許第５，７７０，２１２号を参照のこと。
【０１６０】
しかし、ワクシニアウイルスゲノムのような裸のポックスウイルスゲノムＤＮＡは、ウイルスがコードしたタンパク質を伴わない感染性子孫、生じるウイルスの粒子に結合されたタンパク質（複数）／機能（複数）を作出しない。必要なウイルスがコードした機能は、トランスフェクションされたワクシニアＤＮＡを鋳型として認識するＲＮＡポリメラーゼを含み、トランスフェクションされたＤＮＡの転写及び最終的には複製を含む。Ｄｏｒｎｅｒらの米国特許第５，４４５，９５３号を参照のこと。
【０１６１】
従って、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスを使用する三分子組換えにより感染性子孫ウイルスを作出するために、レシピエント細胞は、パッケージング機能を含むことが好ましい。このパッケージング機能は、ヘルパーウイルス、すなわちトランスフェクションされた裸のゲノムＤＮＡと共に、子孫ウイルスの複製及び集成に必要な適当なタンパク質及び因子を提供するウイルスにより提供され得る。
【０１６２】
このヘルパーウイルスは、同じ又は異なる属の密接に関連したウイルス、例えばワクシニアと同じポックスウイルス亜科のポックスウイルスである。このような場合、トランスフェクションされたＤＮＡを鋳型として認識し、これによりトランスフェクションされたＤＮＡの転写、及び最終的には複製を開始するＲＮＡポリメラーゼを提供するヘルパーウイルスを選択することは利点である。密接に関連したウイルスがヘルパーウイルスとして使用される場合、感染性ウイルスの形成が損なわれるように弱毒化されることは利点である。例えば、温度感受性ヘルパーウイルスを、非許容温度で使用することができる。好ましくは、異種ヘルパーウイルスが使用される。例としては、鶏痘ウイルスのようなアビポックスウイルス、又はエクトロメリアウイルス（マウスポックス）ウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。特に、アビポックスウイルスが好ましく、これらは必要なヘルパー機能は提供するが、哺乳類細胞において複製せず、又は感染性ビリオンを生じない（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：９９７７−９９８１（１９９２））。異種ウイルスの使用は、密に関連したウイルスの相同配列がひとつの細胞に存在する場合に生じるようなヘルパーウイルスゲノムとトランスフェクションされたゲノムの間の組換え事象を最小化する。Ｆｅｎｎｅｒ及びＣｏｍｂｅｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５：５３０（１９５８）；Ｆｅｎｎｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８：４９９ （１９５９）参照。
【０１６３】
あるいは、レシピエント細胞において必要なヘルパー機能は、ヘルパーウイルス以外の遺伝的エレメントにより供給される。例えば、宿主細胞を形質転換し、構成的にヘルパー機能を作出するか、又は宿主細胞を、ヘルパー機能を発現しているプラスミドで一過性にトランスフェクションするか、ヘルパー機能を発現しているレトロウイルスで感染するか、もしくは獲得されたヘルパーウイルス機能を発現するのに適したいずれか他の発現ベクターと共に提供するかすることができる。Ｄｏｒｎｅｒら、米国特許第５，４４５，９５３号を参照のこと。
【０１６４】
三分子組換え法に従い、第一及び第二のウイルスのゲノム断片を、互いにライゲーション又は組換えることはできず、すなわち、これらは適合可能な付着末端又は相同領域を含まないか、あるいは付着末端は脱リン酸化酵素により処理されている。好ましい態様において、ウイルスゲノムは、第一の制限エンドヌクレアーゼのための第一の認識部位及び第二の制限エンドヌクレアーゼのための第二の認識部位を含み、かつ第一及び第二のウイルス断片は、ウイルスゲノムの適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化により作成され、ウイルスの「アーム」を作出し、かつ第一及び第二のウイルス断片が標準法により単離される。理想的には、第一及び第二の制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、このウイルスのゲノムにおいて特有であり、あるいは２種の制限エンドヌクレアーゼによる切断は、全ての必須機能に関する遺伝子を含むウイルスの「アーム」を生じ、すなわち、第一及び第二の認識部位は、第一及び第二のウイルス断片の間の伸びる領域がウイルス感染性には必須でないようにウイルスのゲノム内において物理的に配列されている。
【０１６５】
三分子組換え法においてワクシニアウイルスベクターが使用されるような好ましい態様において、ｔｋ遺伝子内に２個の独自の制限部位を伴うウイルスゲノムを含むワクシニアウイルスベクターが使用される。ある好ましいワクシニアウイルスゲノムにおいて、第一の制限酵素はＮｏｔＩであり、これはｔｋ遺伝子内に認識部位ＧＣＧＧＣＣＧＣを有し、かつ第二の制限酵素はＡｐａＩであり、これはｔｋ遺伝子内に認識部位ＧＧＧＣＣＣを有する。更により好ましいのは、ｖ７．５／ｔｋウイルスゲノム又はｖＥＬ／ｔｋウイルスゲノムを含むワクシニアウイルスベクターである。
【０１６６】
この態様に従い、チミジンキナーゼ遺伝子を含むワクシニアウイルスゲノムの領域との相同的組換えが可能なフランキング領域を伴う伝達性プラスミドが使用される。ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｊ断片を含むワクシニアウイルスゲノムの断片は、ｔｋ遺伝子を含むが、これは都合良く使用される。
【０１６７】
ウイルスベクターがポックスウイルスである場合、挿入断片ポリヌクレオチドは、好ましくはポックスウイルス発現調節配列に操作可能に結合され、より好ましくはｐ７．５又は合成初期／後期プロモーターのような強力な構成的ポックスウイルスプロモーターである。
【０１６８】
従って、本発明の伝達性プラスミドは、ワクシニアウイルスｐ７．５プロモーター、又は合成初期／後期プロモーターとの操作可能な結合を介して、免疫グロブリンサブユニットポリペプチド、例えば重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖、又は重鎖もしくは軽鎖の抗原特異的断片をコードしているポリヌクレオチドを含む。
【０１６９】
ワクシニアウイルスｐ７．５プロモーターとの操作可能な結合を介して免疫グロブリン重鎖ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む本発明の好ましい伝達性プラスミドは、ｐＶＨＥであり、これは下記配列を含み：
2004532645.tif 000003
これは本明細書において配列番号：１４と称される。ＰＣＲ−増幅された重鎖可変領域は、前記配列において太字で示されている独自のＢｓｓＨＩＩ部位（配列番号：１５のヌクレオチド９６〜１００）及びＢｓｔＥＩＩ部位（配列番号：１６のヌクレオチド１０６〜１１２）へインフレームで挿入することができる。
【０１７０】
更にｐＶＨＥは、前述のような第二のライブラリーのポリヌクレオチドの引き続きの選択のために、第一のライブラリーから単離されたポリヌクレオチドを、プラスミドベクターへ伝達することが望ましいような態様において使用することができる。
【０１７１】
別のワクシニアウイルスｐ７．５プロモーターとの操作可能な結合を介して、免疫グロブリンκ軽鎖ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む本発明の好ましい伝達性プラスミドは、ｐＶＫＥであり、これは下記配列を含み：
2004532645.tif 000004
本明細書において配列番号：１７と称される。ＰＣＲ−増幅されたκ軽鎖可変領域は、前記配列において太字で示されている独自のＡｐａＬＩ部位（配列番号：１８のヌクレオチド９５〜１００）及びＸｈｏＩ部位（配列番号：１９のヌクレオチド１０５〜１１０）へインフレームで挿入することができる。
【０１７２】
更にｐＶＫＥは、前述のような第一のライブラリーのポリヌクレオチドの選択時に、プラスミドベクター内に第二のライブラリーのポリヌクレオチドを有することが望ましいような態様において使用することができる。
【０１７３】
別のワクシニアウイルスｐ７．５プロモーターとの操作可能な結合を介して、免疫グロブリンλ軽鎖ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む本発明の好ましい伝達性プラスミドは、ｐＶＬＥであり、これは下記配列を含み：
2004532645.tif 000005
これは本明細書において配列番号：２０と称される。ＰＣＲ−増幅されたλ軽鎖可変領域は、前記配列において太字で示されている独自のＡｐａＬＩ部位（配列番号：２１のヌクレオチド９５〜１００）及びＨｉｎｄＩＩＩ部位（配列番号：２２のヌクレオチド１１１〜１１６）へインフレームで挿入することができる。
【０１７４】
更に、ｐＶＬＥは、前述のような第一のライブラリーのポリヌクレオチドの選択時に、プラスミドベクター内の第二のライブラリーのポリヌクレオチドを有することが望ましいような態様において使用することができる。
【０１７５】
「挿入断片ＤＮＡ」は、組換えウイルスベクター内で発現される１種又は複数の異種ＤＮＡセグメントを意味する。本発明に従い、「挿入断片ＤＮＡ」は、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。ＤＮＡセグメントは、天然、非天然、合成、又はそれらの組合せであることができる。本発明の挿入断片ＤＮＡの作成法は、本明細書に明らかにされている。
【０１７６】
「伝達性プラスミド」は、前述のような５’側フランキング領域及び３’側フランキング領域の間に位置した挿入断片ＤＮＡを含むプラスミドベクターを意味する。この５’側フランキング領域は、第一のウイルス断片と相同性を共有し、かつ３’側フランキング領域は、第二のウイルス断片と相同性を共有している。好ましくは、伝達性プラスミドは、挿入断片ＤＮＡの上流に、適当なプロモーター、例えばウイルスベクターがポックスウイルスである場合には、強力な構成的ワクシニアプロモーターを含む。用語「ベクター」は、異種ポリヌクレオチドセグメントを含むポリヌクレオチド構築物を意味し、これはそのポリヌクレオチドセグメントの適当な宿主細胞への伝達に作用することが可能である。好ましくはこのベクターに含まれたポリヌクレオチドは、適当な宿主におけるポリヌクレオチドの発現に作用することが可能な適当な調節配列に操作可能に結合される。このような調節配列は、転写に作用するためのプロモーター、このような転写を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列、及び転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。本明細書において使用されるベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、ｍＲＮＡ、又は単純に可能性のあるゲノム挿入断片であることができる。一旦適当な宿主へ形質転換されたならば、このベクターは、宿主ゲノムとは独立して複製及び機能することができるか、もしくは場合によっては、それ自身のゲノムへ組込まれ得る。哺乳類細胞培養発現に関する典型的プラスミド発現ベクターは、例えば、ｐＲＫ５（欧州特許第３０７，２４７号）、ｐＳＶ１６Ｂ（国際公開公報第９１／０８２９１号）及びｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を基にしている。
【０１７７】
しかし、本明細書において使用される「伝達性プラスミド」は、特定のプラスミド又はベクターに限定されるものではない。環状もしくは線状又は他の適当な形状のいずれかのＤＮＡセグメントは、三分子組換え法における、第一及び第二のウイルスの「アーム」と一緒の、ＤＮＡ挿入断片の宿主細胞への伝達のための運搬体として作用することができる。他の適当なベクターは、本明細書において説明されたもの又は当技術分野において公知の他のもののような、λファージ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ断片等を含む。複数のプラスミドは、λについて本明細書において説明されたもののような、「初代ライブラリー」であることができる。
【０１７８】
三分子組換えの修飾  三分子組換えを使用し、約１０７ｐｆｕの桁の力価を伴うワクシニアウイルスにおいて、ｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。これらのｃＤＮＡライブラリー又は他のライブラリーの複雑性を制限するいくつかの要因がある。これらは以下を含む：プラスミドベクターにおいて構築され、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーのような初代ｃＤＮＡライブラリー又は他のライブラリーのサイズ、並びにウイルス「アーム」、好ましくはワクシニアウイルス「アーム」又は他のポックスウイルス「アーム」の大量精製（数百μｇ）の煩雑さ。バクテリオファージλもしくはそれら由来のＤＮＡ又はファージミドにおいて構築された免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのような、初代ｃＤＮＡライブラリー又は他のライブラリーによる、ワクシニア又は他のウイルスＤＮＡ組換えが可能な三分子組換えの修飾、又はこれは修飾されたウイルスベクターによる感染後にインビボにおいて作成されるべき個別のウイルスＤＮＡアームを可能にする三分子組換えの修飾は、これらの方法を用いて構築される真核ウイルスｃＤＮＡライブラリー又は他のライブラリーの品質及び力価を大きく向上すると考えられる。
【０１７９】
バクテリオファージλライブラリーからワクシニアウイルスへのｃＤＮＡ挿入断片の伝達  λファージベクターは、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのような、ｃＤＮＡライブラリー又は他のライブラリーの構築に関して、プラスミドベクターに勝るいくつかの利点を有している。プラスミドｃＤＮＡ（又は他のＤＮＡ挿入断片）ライブラリー又は直鎖状ＤＮＡライブラリーは、細菌細胞へ、化学的／熱ショック形質転換によるか、又は電気穿孔により導入される。細菌細胞は、より小さいプラスミドにより優先的に形質転換され、ライブラリー中の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのような、比較的長いｃＤＮＡ又は他の挿入断片ＤＮＡの提示を喪失する可能性をもたらす。加えて、形質転換は、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのような、ｃＤＮＡライブラリー又は他のライブラリーを構築するために、高価な市販の調製されたコンピテント細菌の使用を必要とする、外来ＤＮＡ又は他のＤＮＡの細胞への導入に関してかなり非効率的なプロセスである。対照的に、λファージベクターは、いかなるサイズバイアスも伴わない１２ｋｂ又はそれ以上のｃＤＮＡ挿入断片に忍容性があり得る。λベクターは、高効率の市販のパッケージング抽出物を用いて、インビトロにおいて、ビリオンへパッケージングされ、その結果この組換えλゲノムを、感染により、細菌の細胞へ導入することができる。これは、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのような、大きいｃＤＮＡ又は他の挿入断片ＤＮＡの、プラスミドライブラリーで通常得られるものよりも高い力価及びより良い提示を伴う初代ライブラリーを生じる。
【０１８０】
免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのような、ｃＤＮＡ挿入断片又は他の挿入断片ＤＮＡの、λベクターにおいて構築されたライブラリーからワクシニアウイルスのような真核ウイルスベクターへの伝達を可能にするために、このλベクターは、ワクシニアウイルスＤＮＡとの相同的組換えを可能にするワクシニアウイルスＤＮＡ配列を含むように修飾されなければならない。下記実施例は、ワクシニアウイルス相同配列を使用するが、他のウイルスも同様に使用することができる。例えば、プラスミドｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋに含まれたワクシニアウイルスＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片（ワクシニアｔｋ遺伝子を含む）（下記実施例５に説明される）は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｎａＢＩを用いて切出し（ワクシニアＤＮＡ配列３ｋｂ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ３（Ｎｏｖａｇｅｎカタログ番号７００２５−３）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｎａＢＩ部位へサブクローニングされ、ｐＴ７Ｂ３．Ｖｔｋを作出する。ワクシニアｔｋ遺伝子は、このベクターから、ＳａｃＩ及びＳｎａＢＩで切出され、かつλＺａｐ発現（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳａｃＩ／ＳｍａＩ部位へ挿入され、λ．Ｖｔｋを作出する。λ．Ｖｔｋベクターは、ワクシニア７．５ｋプロモーターの下流へのｃＤＮＡ挿入のための独自のＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、及びＳａｌｌ部位を含むと考えられる。このｃＤＮＡライブラリーは、当技術分野において周知の方法を用い、λ．Ｖｔｋにおいて構築され得る。
【０１８１】
λ．Ｖｔｋ、又は相同的組換えを促進するフランキングワクシニアＤＮＡ配列を伴うｃＤＮＡ挿入断片又は他の挿入ＤＮＡを含むいずれか類似のバクテリオファージにおいて構築された、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのような、ｃＤＮＡライブラリー又は他のライブラリー由来のＤＮＡは、ｃＤＮＡ又は他の挿入ＤＮＡ組換えワクシニアウイルスを作出するために使用することができる。ヘルパーファージによる同時感染によりプラスミドをλゲノムから切出す方法は、当技術分野において周知である（ＥｘＡｓｓｉｓｔファージ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社カタログ番号２１１２０３）。λベースのライブラリーからの大量切出しは、同等のｃＤＮＡライブラリー又はプラスミドベクター中の他のライブラリーを作成する。例えばλ．Ｖｔｋ ｃＤＮＡライブラリーから切出されたプラスミドは、ｃＤＮＡ挿入断片又は他の挿入ＤＮＡ、例えば免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドにフランキングしているワクシニアｔｋ配列を含むと考えられる。次にこのプラスミドＤＮＡは、三分子組換えによりワクシニア組換え体を構築するために使用することができる。別の本方法の態様は、λＤＮＡを最初のλ．Ｖｔｋライブラリーから直接精製し、かつ三分子組換えのためにこの組換えウイルスの（λ）ＤＮＡ又はそれらの断片を、２個の大きいワクシニアウイルスＤＮＡ断片によりトランスフェクションすることである。
【０１８２】
インビボにおけるワクシニアアームの作成   ワクシニアＤＮＡ又は他のウイルスＤＮＡ「アーム」もしくは断片の精製及びトランスフェクションは、三分子組換えによるポリヌクレオチドライブラリー構築の制限要因である。インビボにおけるウイルスアーム、特にワクシニアウイルスアームの必要な作成を可能にするためにこの方法を修飾することは、より効率的な真核ウイルスにおけるライブラリーの構築をもたらすと考えられる。
【０１８３】
宿主細胞は、ウイルスベクターゲノムに導入された独自の部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを発現するように修飾することができる。例えば、ワクシニアウイルスがこれらの宿主細胞へ感染する場合、制限エンドヌクレアーゼは、ワクシニアＤＮＡを消化し、三分子組換えにより修復のみ、すなわち再接合される「アーム」を作成する。制限エンドヌクレアーゼの例は、細菌酵素ＮｏｔＩ及びＡｐａＩ、酵母エンドヌクレアーゼＶＤＥ（Ｒ． Ｈｉｒａｔａ、Ｙ． Ｏｈｓｕｍｉ、Ａ． Ｎａｋａｎｏ、Ｈ． Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｋ． Ｓｕｚｕｋｉ、Ｙ． Ａｎｒａｋｕ、Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５：６７２６−６７３３（１９９０））、クラミドモナス・ユーガメトス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｅｕｇａｍｅｔｏｓ）エンドヌクレアーゼＩ−ＣｅｕＩ及び他の当技術分野において周知のものを含む。例えば、ｔｋ遺伝子内に独自のＮｏｔＩ及びＡｐａＩ部位を含むワクシニア株が、既に構築されており、かつｔｋ遺伝子内に独自のＶＤＥ及び／又はＩ−ＣｅｕＩ部位を含む株は、当技術分野において公知の方法により容易に構築することができる。
【０１８４】
制限エンドヌクレアーゼの構成的発現は、その酵素による染色体ＤＮＡの断片化に起因しているので、細胞にとっては致死的であると考えられる。この厄介な問題を避けるために、ひとつの態様において、宿主細胞は、誘導可能なプロモーターの制御下で、制限エンドヌクレアーゼ（複数）の遺伝子（複数）を発現するように修飾される。
【０１８５】
誘導可能な発現に関する好ましい方法は、Ｔｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用する。このシステムにおいて、エンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子の発現は、インデューサー（テトラサイクリン）の非存在下では、サイレントである。これは、毒性遺伝子、すなわちエンドヌクレアーゼを発現するために誘導され得る安定してトランスフェクションされた細胞株の単離を可能にする（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５））。テトラサイクリン誘導体デオキシサイクリンの添加は、エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。好ましい態様において、ＢＳＣ１宿主細胞は、ＮｏｔＩ遺伝子の発現を制御するＴｅｔ−Ｏｎベクターにより安定してトランスフェクションされると考えられる。これらの細胞の集密な単層は、ドキソサイクリンにより誘導され、その後ｖ７．５／ｔｋ（ｔｋ遺伝子内の独自のＮｏｔＩ部位）で感染され、かつｃＤＮＡ又は挿入ＤＮＡ組換え伝達性プラスミド又は伝達ＤＮＡ又はλファージ又はファージミドＤＮＡによりトランスフェクションされると考えられる。例えば、宿主細胞においてコードされたＮｏｔＩエンドヌクレアーゼによるｔｋ遺伝子又は他の配列内での独自のＮｏｔＩ部位での曝露されたワクシニアＤＮＡの消化は、伝達性プラスミド又はファージＤＮＡによる三分子組換えを受けることによってのみ、完全長ウイルスのＤＮＡを生じることができる２種の大きいワクシニアＤＮＡ断片を作出する。宿主細胞染色体ＤＮＡのＮｏｔＩによる消化は、宿主細胞はウイルス複製及びビリオン集成時には増殖を必要としないので、修飾された感染性ウイルスの産生を妨害することは予想されない。
【０１８６】
インビボにおいてワクシニアアームのようなウイルスアームを作成するこの方法の別の態様において、修飾されたワクシニア株は、ｔｋ遺伝子又は他の必須でない遺伝子内に独自のエンドヌクレアーゼ部位を含み、更にはワクシニアゲノムの別の必須でない部位にＴ７バクテリオファージプロモーターの制御下でエンドヌクレアーゼをコードしている異種ポリヌクレオチドを含むように構築される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現している細胞の感染は、エンドヌクレアーゼの発現を生じ、次にワクシニアＤＮＡのこの酵素による消化を生じる。好ましい態様において、ワクシニアのｖ７．５／ｔｋ株は、Ｔ７プロモーターにより制御される発現により、ＮｏｔＩをコードしているｃＤＮＡを含むカセットのＨｉｎｄＩＩＩ Ｃ又はＦ領域への挿入により修飾され（Ｃｏｕｐａｒ， Ｅ．Ｈ．Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ、６８：１−１０（１９８８）；Ｆｌｅｘｎｅｒ， Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：２５９−２６２（１９８７））、ｖ７．５／ｔｋ／Ｔ７ＮｏｔＩを作成する。細胞株は、説明されたように哺乳類プロモーターの制御下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードしているｃＤＮＡにより安定してトランスフェクションされる（０． Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ、Ｂ． Ｍｏｓｓ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７：６７４３−６７４７（１９９０））。このパッケージング細胞株のｖ７．５／ｔｋ／Ｔ７ＮｏｔＩによる感染は、ＮｏｔＩのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存型発現を生じ、その後ワクシニアＤＮＡのアームへの消化を生じる。感染性の完全長ウイルスＤＮＡは、伝達性プラスミド又はファージＤＮＡにより三分子組換えの後、消化されたワクシニアＤＮＡアームから再構築及びパッケージングのみすることができる。この方法の更に別の態様において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、鶏痘ウイルスのような、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ組換えヘルパーウイルスによる同時感染により提供され得る（Ｐ． Ｂｒｉｔｔｏｎ、Ｐ． Ｇｒｅｅｎ、Ｓ． Ｋｏｔｔｉｅｒ、Ｋ．Ｌ． Ｍａｗｄｉｔｔ、Ｚ． Ｐｅｎｚｅｓ、Ｄ． Ｃａｖａｎａｇｈ、Ｍ．Ａ． Ｓｋｉｎｎｅｒ、Ｊ． Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７７：９６３−９６７（１９９６））。
【０１８７】
インビボにおいて大きいウイルスＤＮＡ断片、好ましくはワクシニアＤＮＡ断片を作成するためにこれらの様々な戦略を使用する三分子組換え特有の特徴は、ワクシニアＤＮＡの消化は、組換えに先行することができるが、必ずしも必要ではないことである。これは、単に組換えウイルスが消化による破壊から逃れることで事足りる。これはワクシニアＤＮＡ断片は、組換え前に作成される必要がある、インビトロにおいて消化されたワクシニアＤＮＡのトランスフェクションを使用する三分子組換えとは対照的である。消化前の二分子組換えの機会は、消化後の三分子組換えにより得られるものよりも、より大きい頻度で組換えを生じることは可能である。
【０１８８】
ウイルスベクター、特にポックスウイルスを使用する、組換え免疫グロブリン分子の単離のための選択及びスクリーニング戦略  ある本発明の態様において、三分子組換え法は、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドを発現するポリヌクレオチドのライブラリーの作成において使用される。この態様において、完全長免疫グロブリンサブユニットポリペプチド、又はそれらの断片を含むライブラリーは、免疫グロブリン定常領域及びシグナルペプチドをコードしているカセットの、ワクシニアウイルスに相同な５’及び３’領域を含む伝達性プラスミドへの最初の挿入により調製される。再構成された免疫グロブリン可変領域は、免疫感作した動物由来のＢ細胞又は形質細胞からの、免疫感作されていない動物由来のプレ−Ｂ細胞からのＰＣＲにより単離される。これらのＰＣＲ断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド及び定常領域の間、及びこれらとインフレームでクローニングされ、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドのコード領域を作成する。これらの伝達性プラスミドは、ポックスウイルス「アーム」を伴う宿主細胞へ導入され、かつ三分子組換え法を用いて、ライブラリーが作成される。
【０１８９】
本発明は、望ましい特異性を伴う免疫グロブリン分子を同定する、すなわち選択又はスクリーニングする様々な方法を提供し、ここで免疫グロブリン分子は真核細胞においてインビトロで作成される。これらは、抗原誘導型細胞死及び抗原誘導型シグナル伝達のような宿主細胞作用の選択、抗原特異的結合に関する宿主細胞プールのスクリーニング、並びに望ましい抗原特異性又は望ましい機能特性を伴う可溶性免疫グロブリン分子の存在に関する宿主細胞プールが増殖される培地のスクリーニングを含む。
【０１９０】
本明細書に詳細に開示されたように、抗原誘導型細胞死、抗原誘導型シグナル伝達、抗原特異的結合、又は他の抗原特異的機能のいずれかを基にした、真核細胞において発現された免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を同定する方法が、提供される。本発明の選択及びスクリーニング技術は、齧歯類における抗体の選択によりもたらされるバイアス又は細菌における合成及び集成の制限を排除する。
【０１９１】
本明細書に説明された多くの同定法は、宿主細胞遺伝子の発現又は宿主細胞転写調節領域によって左右され、これは、直接的又は間接的に細胞死を誘導するか、もしくは宿主細胞表面上に発現された免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片へ結合している抗原に反応して検出可能なシグナルを発生する。本発明の最も好ましい態様は、宿主細胞が、真核ウイルスベクター、好ましくはポックスウイルスベクター、及び更により好ましくはワクシニアウイルスベクターにより感染されることを必要とすることに注意することは重要である。一部の細胞株において、更にウイルスの遺伝子発現の非存在下においても、一部の宿主細胞タンパク質合成が、ポックスウイルス感染時に迅速にシャトダウンされることは、当業者には良く理解されることである。これは、抗原誘導型細胞死又は細胞シグナル伝達を誘導するために、宿主細胞遺伝子又は宿主細胞転写調節領域のアップレギュレーションが必要ならば、問題となる。しかしこの問題点は、ある細胞株において、宿主タンパク質合成の阻害は、ウイルスＤＮＡ複製以降までは不完全であり続けるので、解決困難ではない。Ｍｏｓｓ， Ｂ．、「ポックスウイルス及びそれらの複製」「ウイルス学」、第２版、Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅら編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ社、２０９６頁（１９９０）参照のこと。しかし、真核ウイルスベクター、好ましくはポックスウイルスベクター、及び更により好ましくはワクシニアウイルスベクターによる感染の際に、表面−発現された免疫グロブリン分子の架橋時にアップレギュレーションされる遺伝子産物を発現する能力に関して、様々な宿主細胞を迅速にスクリーニングすること；並びに、様々な変異体及び弱毒化されたウイルスによるウイルス感染時の細胞遺伝子の示差的発現について望ましい宿主細胞をスクリーニングすることは必要である。
【０１９２】
従って、順序付けられたｃＤＮＡライブラリーのマイクロアレイにおける特定の宿主細胞の発現プロファイリングを介して、ウイルスベクターによる感染時に、宿主細胞遺伝子の発現及び／又は抗原誘導型細胞死もしくは細胞シグナル伝達に作用する宿主細胞転写調節領域の操作性について様々な宿主細胞をスクリーニングする方法が提供される。マイクロアレイにおける発現プロファイリングは、Ｄｕｇｇａｎ， Ｄ．Ｊ．らの論文（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、２１（１ Ｓｕｐｐｌ）：１０−１４（１９９９））に記されており、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０１９３】
この方法に従い、発現プロファイリングを使用し、未感染宿主細胞と真核ウイルス発現ベクター、好ましくはポックスウイルスベクター、更により好ましくはワクシニアウイルスベクターにより感染した宿主細胞における宿主細胞遺伝子発現パターンを比較するが、ここで具体的真核ウイルスベクターは、本発明のポリヌクレオチドの該第一及び該第二のライブラリーを構築するために使用されるベクターである。この方法において、それらの表面上に免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現することが可能な適当な宿主細胞、及び更に所定のウイルスによる感染時に必要な誘導性タンパク質の発現を受け続ける宿主細胞を、同定することができる。
【０１９４】
同じく発現プロファイリングを使用し、所定の宿主細胞における宿主細胞遺伝子発現パターンが比較され、例えば、宿主細胞が完全な感染性ウイルスベクターにより感染される場合、及び宿主細胞が対応する弱毒化されたウイルスベクターにより感染される場合の発現パターンが比較される。マイクロアレイにおける発現プロファイリングは、様々な弱毒化されたウイルスにより感染した宿主細胞における大規模スクリーニングを可能にし、ここで弱毒化は、様々な異なる方法で達成される。例えばある弱毒化は、遺伝的変異により達成される。多くのワクシニアウイルス変異体が特徴付けられている。これらは、完全な欠損変異体であり、すなわち感染性ウイルス粒子の産生にはヘルパーウイルスを必要とするか、もしくはこれらは条件変異体、例えば温度感受性変異体である。ウイルス感染した宿主細胞は、宿主遺伝子発現が必要な期間にわたり、非許容環境、例えば非許容温度において維持され、その後許容環境、例えば、許容温度にシフトされ、ウイルス粒子の産生を可能にし得る点で、条件変異体が特に好ましい。あるいは、完全な感染性ウイルスは、感染サイクルの所定の時点で、ウイルス複製を可逆的にブロックする化学的インヒビターにより「弱毒化」される。化学的インヒビターは、ヒドロキシ尿素及び５−フルオロデオキシウリジンを含むが、これらに限定されるものではない。ウイルス感染した宿主細胞は、宿主遺伝子発現が必要となる期間、化学的インヒビター中で維持され、その後化学的インヒビターが除去され、ウイルス粒子が産生される。
【０１９５】
この方法を用い、マイクロアレイにおける発現プロファイリングを使用し、本明細書に説明された選択法のいずれかにおいて適当な宿主細胞、適当な転写調節領域、及び／又は適当な弱毒化されたウイルスを同定することができる。
【０１９６】
ある態様において、直接抗原誘導型アポトーシスを基に、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片をコードしているポリヌクレオチドを選択する選択法が提供される。この方法に従い、初期Ｂ細胞性リンパ腫である、感染及び／又は転写のための宿主細胞が選択される。適当な初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞株は、ＣＨ３３細胞、ＣＨ３１細胞（Ｐｅｎｎｅｌｌ， ＣＡ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２：３７９９−３８０３（１９８５））、又はＷＥＨＩ−２３１細胞（Ｂｏｙｄ， Ａ．Ｗ．及びＳｃｈｒａｄｅｒ， Ｊ．Ｗ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２６：２４６６−２４６９（１９８１））を含むが、これらに限定されるものではない。初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞株は、自然発生的増殖阻害の誘導及びアポトーシス性細胞死により、抗原特異的免疫グロブリンの架橋に反応する（Ｐｅｎｎｅｌｌ， Ｃ．Ａ．及びＳｃｏｔｔ， Ｄ．Ｗ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６：１５７７−１５８１（１９８６）；Ｔｉｓｃｈ， Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：６９１１４−６９１８（１９８８）；Ａｌｅｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｊ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：６９１１９−６９２３（１９８８）；Ｗａｒｎｅｒ， Ｇ．Ｌ．及びＳｃｏｔｔ， Ｄ．Ｗ．、Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１５：１９５−２０３（１９８８））。前述の第一及び第二のポリヌクレオチドライブラリーによる感染及び／又はトランスフェクション後、抗体分子の合成及び集成を、約５時間〜約４８時間、好ましくは約６時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４０時間、又は約４８時間、更により好ましくは約１２時間又は約２４時間の時間範囲で進行することができ；この時点で、宿主細胞は、特異的免疫グロブリン受容体（すなわち、膜結合した免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片）と架橋し、かつ増殖阻害及びアポトーシス性細胞死の誘導により抗原特異的免疫グロブリンの架橋に直接反応するこれらの免疫グロブリンを発現している宿主細胞においてアポトーシスを誘導するために、特異的抗原と接触される。そこに含まれる免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む、アポトーシスを受けている宿主細胞又はそれらの成分は回収され、これにより、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として関心のある抗原に特異的に結合する、第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第一のライブラリーのポリヌクレオチドが濃縮される。
【０１９７】
第一のライブラリーのポリヌクレオチドを更に選択及び濃縮する段階、並びにこれらのポリヌクレオチドを単離する段階時に、同様のプロセスが実施され、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、所望の特異的抗原に結合する第二のライブラリーのポリヌクレオチドが回収される。
【０１９８】
この方法の実施例は、図１に示している。ナイーブドナー又は免疫感作ドナーのいずれかの抗体産生細胞由来の多様な重鎖をコードしているポリヌクレオチドの「第一のライブラリー」は、ポックスウイルスベクター、好ましくはワクシニアウイルスベクターにおいて構築され、並びに免疫グロブリン軽鎖をコードしているポリヌクレオチドの同様に多様な「第二のライブラリー」は、このポリヌクレオチドの発現が、ワクシニアプロモーター、好ましくは合成初期／後期プロモーター、例えばｐ１１プロモーター又はｐ７．５プロモーターにより調節されるようなプラスミドベクターにおいて構築される。好ましくはこの態様に関して、ポックスウイルス構築物によりコードされた免疫グロブリン重鎖定常領域は、表面膜上に免疫グロブリン受容体の発現を生じる膜貫通領域を保持するようにデザインされる。真核細胞、好ましくは初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞は、ポックスウイルス重鎖ライブラリーにより感染多重度約１（ＭＯＩ＝１）で感染される。２時間後、感染した細胞は、軽鎖プラスミドライブラリーにより、各細胞において平均１０種又はそれ以上の個別の軽鎖組換えプラスミドが生じかつ発現されることを可能にする条件下でトランスフェクションされる。このプラスミドにおける組換え遺伝子の発現は、ワクシニアウイルスプロモーターにより調節されるので、高レベルの組換え遺伝子産物は、核組込みを必要とせずに、ワクシニアウイルス感染細胞の細胞質において発現される。加えて、ワクシニアウイルス感染細胞の細胞質における環状ＤＮＡの増幅のための配列とは無関係の機構は、更により高濃度のトランスフェクションされた軽鎖組換えプラスミドさえ生じる（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ， Ｍ．及びＭｏｓｓ， Ｂ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ、６：８７−９３ （１９８８））。これらふたつの要因は、過剰な軽鎖合成を生じる高レベルの発現に寄与している。
【０１９９】
別の好ましい態様では、ポックスウイルスベクター、好ましくはワクシニアウイルスベクターにおいて構築される、ナイーブドナー又は免疫感作ドナーのいずれかの抗体産生細胞由来の多様な重鎖をコードしているポリヌクレオチドの「第一のライブラリー」をコードしているポリヌクレオチドの発現を調節するために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが発現された細胞において活性があるＴ７ファージプロモーターを利用し、並びに免疫グロブリン軽鎖をコードしているポリヌクレオチド同様に多様な「第二のライブラリー」は、プラスミドベクターにおいて構築される（Ｅｃｋｅｒｔ Ｄ．及びＭｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ Ｍ．、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．、８０（Ｐｔ６）：１４６３−９（１９９９）；Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ０．、Ｆｕｅｒｓｔ Ｔ．Ｒ．及びＭｏｓｓ Ｂ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６（１６）：６１２６−３０（１９８９）；Ｆｕｅｒｓｔ Ｔ．Ｒ．、Ｅａｒｌ Ｐ．Ｌ．及びＭｏｓｓ Ｂ．、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７（７）：２５３８−４４（１９８７）；Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ０．及びＭｏｓｓ Ｂ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８７（１７）：６７４３−７（１９９０）；Ｃｏｔｔｅｔ Ｓ．及びＣｏｒｔｈｅｓｙ Ｂ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４６（１）：２３−３１）。
【０２００】
当業者には容易に理解されるように、使用されるウイルスベクター、具体的宿主細胞、及び感染多重度に応じて、ポックスウイルス由来の発現ベクターは、約１〜１０日、より一般的には約２〜８日、２〜６日、又は２〜４日の時間枠においてそれ自身細胞変性性であるので、速度論の考察は、本実験のデザインにおいて非常に重要である。好ましい態様において、表面免疫グロブリン架橋に対するアポトーシス反応が、その細胞におけるポックスウイルス感染の自然の細胞変性効果（ＣＰＥ）と比べ迅速であるＢ細胞性リンパ腫が選択される。従って、ＣＰＥの誘導に先立つように、宿主細胞表面上の免疫グロブリン分子の抗原誘導型架橋に反応するアポトーシスが、宿主細胞の抗原との接触後約１時間〜約４日の期間内に生じることが好ましい。より好ましくは、アポトーシスは、宿主細胞の抗原との接触後、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、又は約４８時間以内に生じる。更により好ましくは、アポトーシスは、宿主細胞の抗原との接触の約１２時間以内に生じる。あるいは、細胞変性効果の誘導の非常に遅い速度論を持つ弱毒化されたポックスウイルスベクターが利用される。弱毒化されたポックスウイルスベクターは、本明細書において明らかにされている。
【０２０１】
本方法に従い、抗原特異的免疫グロブリンをその表面に発現している宿主細胞が、アポトーシスを受ける際に選択される。例えば、宿主細胞が固形基質に付着されている場合、アポトーシスを受けているこれらの細胞は、基質から放出され、かつ宿主細胞が培養されている液体培地の収集により回収される。あるいは、宿主細胞は、固形基質に付着され、かつこれらのアポトーシスを受けている細胞は、溶解事象（ｌｙｔｉｃ ｅｖｅｎｔ）を受け、これによりそれらの細胞質内容物を宿主細胞が培養されている液体培地に放出する。これらの細胞から放出されたウイルス粒子は、その後液体培地において収集される。
【０２０２】
免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、溶解、接着不能、生存力喪失、膜完全性喪失、構造安定性喪失、細胞骨格要素の破壊、膜電位維持の不能、細胞周期停止、エネルギー産生不能などを含む、いずれかの機序により「非接着性」又は「生存不可能」となる。従って、標的ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、吸引、洗浄、濾過、遠心分離、細胞選別、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などの物理的手段により、回収、すなわち、残余の細胞から分離することができる。
【０２０３】
例えば、免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、溶解し、これにより組換えウイルス粒子、好ましくはポックスウイルス粒子、更により好ましくはワクシニアウイルス粒子を、培養培地へと放出することができるか、もしくは非接着性となり、その結果固形支持体から取除くことができる。従って好ましい態様において、放出された組換えウイルス及び／又は非接着性細胞は、吸引又は洗浄により、接着細胞から分離される。
【０２０４】
宿主細胞が初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞株である場合、これらの細胞は、基質に結合されているＢ細胞特異的抗体との相互作用を介して、固形基質に接着され得る。適当なＢ細胞特異的抗体は、抗ＣＤ１９抗体及び抗ＣＤ２０抗体を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２０５】
別の好ましい態様において、抗原誘導型細胞死は、その発現が間接的に細胞死を生じる外来ポリヌクレオチドが表面免疫グロブリン分子の架橋時に誘導される転写調節領域に操作可能に結合されているような構築物によりトランスフェクションされた宿主細胞を使用することにより、直接的又は間接的に影響を受ける。
【０２０６】
「表面免疫グロブリン分子の架橋時に誘導される転写調節領域」とは、表面に発現された免疫グロブリン分子の架橋時に宿主細胞においてアップレギュレーションされるような遺伝子を通常調節する領域、例えば宿主細胞プロモーターを意味する。このような転写調節領域の好ましい例は、ＢＡＸプロモーターであり、これは初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞において、表面免疫グロブリン分子の架橋時にアップレギュレーションされる。
【０２０７】
ある態様において、図２Ａ及び図２Ｂに示されたように、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープをコードしている外来ポリヌクレオチドの発現時に細胞死を誘導する方法が提供される。ＣＴＬエピトープをコードしている外来ポリヌクレオチドは、表面免疫グロブリン分子の架橋時に誘導される転写調節領域と操作可能に結合するように配置される。宿主細胞の表面の免疫グロブリン分子の抗原誘導型架橋時に、ＣＴＬエピトープは、指定されたＭＨＣ分子に関連し宿主細胞表面に発現され、更に宿主細胞表面にも発現される。これらの細胞は、指定されたＭＨＣ分子に関連しＣＴＬエピトープを認識するエピトープ特異的ＣＴＬと接触され、かつＣＴＬエピトープを発現している細胞は、迅速に溶解事象を受ける。特異的ＣＴＬエピトープを発現している宿主細胞の選択及び回収の方法は、更に、ＺａｕｄｅｒｅｒのＰＣＴ公開国際公開公報第００／０２８０１６号に開示されている。
【０２０８】
宿主細胞の選択は、細胞死に屈服する及び／又は溶解事象を受けるこれらの細胞又はそれらの内容物の回収により実現される。例えば、固相支持体へ付着された増殖する宿主細胞が選択される場合、これらの宿主細胞で細胞死に屈服する及び／又は溶解事象を受けたものは、支持体から放出され、かつ細胞上清において回収することができる。あるいは、細胞死に屈服する及び／又は溶解事象を受けた宿主細胞から放出されたウイルス粒子は、細胞上清から回収することができる。
【０２０９】
この態様に従い、宿主細胞の表面に発現されたＭＨＣ分子は、クラスＩ ＭＨＣ分子又はクラスＩＩ ＭＨＣ分子のいずれかである。特に好ましい態様において、宿主細胞上に発現されたＭＨＣ分子は、Ｈ−２Ｋｄ分子であり、及び抗原誘導型架橋時に発現されるＣＴＬエピトープは、ペプチドＧＹＫＡＧＭＩＨＩであり、本明細書において配列番号：２３と称される。
【０２１０】
この方法の利用において、その表面に免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を発現することが可能であるいずれかの宿主細胞を使用することができる。適当な宿主細胞は、免疫グロブリン−陰性形質細胞腫細胞株である。このような細胞株の例は、ＮＳ１細胞株、Ｓｐ２／０細胞株、及びＰ３細胞株を含むが、これらに限定されるものではない。他の適当な細胞株は、当業者に明らかであると思われる。
【０２１１】
別の好ましい態様において、同じく図２Ａ及び図２Ｂにおいて図示されたように、「自殺」遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドが表面免疫グロブリン分子の架橋時に誘導される転写調節領域と操作可能に結合されている構築物でトランスフェクションされた宿主細胞を使用することにより、細胞死が間接的に誘導される方法が提供される。「自殺遺伝子」は、発現された場合に細胞死を引き起す核酸分子を意味する。自殺遺伝子として有用なポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の多くの細胞死−誘導配列を含む。好ましい自殺遺伝子は、シュードモナス外毒素Ａ鎖、ジフテリアＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、及びα−サルシンのような毒物をコードしているものである。好ましい自殺遺伝子は、ジフテリアＡ毒素サブユニットをコードしている。宿主細胞の表面の免疫グロブリン分子の抗原が誘導した架橋時に、アポトーシス誘導遺伝子のプロモーターが誘導され、これにより自殺遺伝子の発現が可能になり、かつこれにより細胞死が促進される。
【０２１２】
この方法を利用し、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の発現が可能であり、及び転写調節領域が表面免疫グロブリン分子の架橋時に誘導される発現プロファイリングにより同定されるようなあらゆる宿主細胞を使用することができる。適当な宿主細胞は、初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞株及び免疫グロブリン−陰性形質細胞腫細胞株を含む。このような細胞株の例は、ＣＨ３３細胞株、ＣＨ３１細胞株、ＷＥＨＩ−２３１細胞株、ＮＳ１細胞株、Ｓｐ２／０細胞株、及びＰ３細胞株を含むが、これらに限定されるものではない。他の適当な細胞株は、当業者には明らかであると思われる。
【０２１３】
宿主細胞がＩｇ−陰性形質細胞腫細胞株である場合、これらの細胞は、固形基質へ、基質に結合されている形質細胞腫−特異的抗体との相互作用を介して付着することができる。適当な形質細胞腫−特異的抗体は、抗ＣＤ３８抗体（Ｙｉ， Ｑ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９０：１９６０−１９６７（１９９７））、抗ＣＤ３１抗体（Ｍｅｄｉｎａ， Ｆ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３９：２３１−２３４（２０００））、抗ＣＤ２０抗体（Ｈａｇｈｉｇｈｉ， Ｂ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ．、５９：３０２−３０８（１９９８））、及び抗ＣＤ１０抗体（Ｄｕｎｐｈｙ， Ｃ．Ｈ．、Ａｃｔａ． Ｃｙｔｏｌ．、４０：３５８−３６２（１９９６））を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２１４】
本明細書に記されたような直接及び間接の抗原誘導型細胞死の方法も組合せることができる。例えば、宿主細胞が初期Ｂ細胞性リンパ腫であり並びに抗原架橋が直接アポトーシスを誘導するようなこれらの態様において、抗原誘導型細胞死は、初期Ｂ細胞性リンパ腫宿主細胞の、外来細胞傷害性Ｔ細胞エピトープをコードしているポリヌクレオチドが表面免疫グロブリン分子の架橋時に誘導される転写調節領域に操作可能に結合されている構築物によるトランスフェクションにより加速され得る。説明したような抗原架橋した細胞の特異的細胞傷害性Ｔ細胞との接触時に、細胞死が加速される。同様に、宿主細胞が初期Ｂ細胞性リンパ腫であり並びに抗原架橋が先に説明したように直接アポトーシスに影響を及ぼすような態様において、抗原誘導型細胞死は、初期Ｂ細胞性リンパ腫宿主細胞の、自殺遺伝子が表面免疫グロブリン分子の架橋時に誘導される転写調節領域と操作可能に結合されている構築物によるトランスフェクションにより加速され得る。
【０２１５】
免疫グロブリン重鎖は、特異的抗原が、受容体が特異的抗原により架橋されている細胞において容易に検出可能なシグナルを誘導するように修飾することができる。好ましい態様は、抗原特異的受容体の発現の結果としての細胞殺傷について選択するための、アポトーシス誘導システムの使用である。アポトーシス誘導システムの例には、ヒトＦＡＳ（ＣＤ９５、ＡＰＯ−１）受容体が関与しており、これは、タンパク質分解性カスパーゼのカスケードを活性化する細胞死−誘導シグナル伝達複合体のリクルート及び集成を介して、アポトーシスを調節することにおけるその役割について認められている腫瘍壊死因子−神経成長因子受容体スーパーファミリーの一員である。ＦＡＳ−ベースの誘導可能な細胞死システムを説明するいくつかの報告があり、アポトーシスは、様々な細胞モジュレーターを介してのアポトーシスの誘導を可能にするために、様々な受容体に結合されたＦＡＳの細胞質「デスドメイン」を含むキメラタンパク質により誘導される。Ｉｓｈｉｗａｔａｒｉ−Ｈａｙａｓａｋａらは、マウスのＣＤ４４細胞外ドメインをヒトＦＡＳと共に使用し、多価抗ＣＤ４４抗体との架橋時にアポトーシスを誘導することに成功している（Ｉｓｈｉｗａｔａｒｉ−Ｈａｙａｓａｋａ Ｈ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６３：１２５８−６４（１９９９））。加えてＴａｋａｈａｓｈｉらは、キメラヒトＧ−ＣＳＦＲ／ＦＡＳ（細胞外／細胞質）タンパク質が、抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体との架橋時にアポトーシスを誘導することが可能であることを明らかにしている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１：１７５５５−６０（１９９６））。これらの執筆者らは、このキメラタンパク質が、二量体としては、アポトーシス誘導が不可能であることも明らかにしている。これらの複合体は、少なくとも三量体型でなければならない。
【０２１６】
好ましい態様において、ＦＡＳの膜貫通ドメイン及び細胞質デスドメインが、ヒトＩｇＭ重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に融合されているキメラ遺伝子が構築される（ＣＨ１−Ｆａｓ、図１３（ａ））。多様なＶＨ遺伝子が、本明細書に説明されたようなこの構築物に挿入され、ＶＨ−ＣＨ１−Ｆａｓ組換えワクシニアウイルスのライブラリーを作成している。ＶＨ−ＣＨ１−Ｆａｓを伴う膜受容体は、ＶＨ−ＣＨ１−Ｆａｓ構築物で感染され並びに多様な免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡによりトランスフェクションされた又はソラレン処理された多様な免疫グロブリン軽鎖をコードしている組換えワクシニアウイルスで感染された宿主細胞において集成されている。所望の特異性を持つ重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の組合せを発現しているこれらの細胞は、関心のある特異的に固定された抗原の存在下で架橋されたそれらの膜受容体のいくつかを有すると考えられる。ＶＨＣＨ１／ＦＡＳオリゴマーの操作可能な複合体形成の結果、アポトーシスが誘導されるであろう。三量体形成は、多価抗原との架橋を介して、又は組織培養プレートもしくはビーズへの１種より多い抗原の固定を介して、引き起すことができる。
【０２１７】
別の態様において、ＶＨライブラリーは、ＦＡＳの膜貫通ドメイン及び細胞質デスドメインを含むポリペプチドが、ＩｇＭ重鎖ＣＨ４ドメインのカルボキシル末端に融合されている融合タンパク質において発現される（図１３（ｂ））。更に別の態様においては、ＦＡＳの細胞質デスドメインは、ＣＨ４ドメインの後のＩｇＭ重鎖膜貫通ドメインのカルボキシル末端に融合されている（図１３（ｃ））。
【０２１８】
後のふたつの態様（図１３（ｂ及びｃ））は、アポトーシスシグナルの誘導に必要な三量体複合体の形成を促進し、これにより選択された抗原特異的受容体の数を増大するような既に二量体であるＦａｓデスドメインの合成を生じる。しかし単量体構築物（図１３（ａ））の使用は、より少ないがより高親和性の抗原受容体の選択をもたらし、更に抗原非特異的細胞死のバックグラウンドを低下する。二量体Ｆａｓドメインを伴うこれら２種の受容体は、この融合タンパク質においてコードされた膜貫通領域がＦａｓ由来か又はＩｇＭ由来であるかという点が異なる。ＩｇＭ由来の膜貫通領域は、Ｂリンパ球系細胞の膜受容体発現により効率的に機能することができる。しかしこの態様の利点は、Ｂ細胞に限定されるものではない。特に、単量体Ｆａｓ構築物は、上皮細胞株、Ｈｅｌａ細胞及びＢＳＣ−１細胞を含む、ワクシニアウイルスの高力価を生じることができる広範な細胞型において膜受容体として合成されかつ発現される。
【０２１９】
別の態様において、抗原誘導型細胞シグナル伝達を基にした、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片をコードしているポリヌクレオチドの回収をスクリーニングする方法が提供される。この方法に従い、宿主細胞は、表面免疫グロブリン架橋の結果としてアップレギュレーションされる転写調節領域に操作可能に結合された、例えばルシフェラーゼのような、容易に検出されるレポーターの構築物によりトランスフェクションされる。それらの表面に免疫グロブリン又はそれらの断片を発現している宿主細胞のプールは、抗原と接触され、かつ架橋時に、そのシグナルはそのプール内で検出される。前述の免疫グロブリン同定法の第一の段階を参照し、そのシグナル伝達法を以下のように行うことができる。免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの第一のライブラリーは、複数のプール、例えば約２、５、１０、２５、１５、７５、１００又はそれ以上のプールに分割され、各プールは約１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９個の異なる可変領域を伴う免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている異なるポリヌクレオチドを含む。好ましいプールは、最初に、各々約１０３個のポリヌクレオチドを含んでいる。各プールは拡張され、かつ複製アリコートが後の回収のために取り分けられる。ポリヌクレオチドのプールがウイルスベクター、好ましくはポックスウイルスベクター、更により好ましくはワクシニアウイルスベクターにおいて構築された場合、これらのプールは、例えばウイルスライブラリーの高力価ストックの希釈により、及び低ＭＯＩ、例えばＭＯＩ＜０．１での組織培養細胞のミクロ培養物の感染のためのその一部の使用により調製される。典型的には、ウイルスの力価の１，０００倍より大きい拡張が、感染の４８時間後に得られる。複数の個々のプールにおけるウイルスの力価の拡張は、組換え体のサブセットが、競合するサブセットの比較的迅速な増殖により喪失されるリスクを軽減する。
【０２２０】
その後これらのウイルスプールを使用し、調製されたウイルスプールと同数の宿主細胞プールを感染する。これらの宿主細胞は、表面免疫グロブリン架橋の結果として、レポーター分子を発現するように操作される。各プールにより感染された宿主細胞の数は、そのプールに含まれるポリヌクレオチドの数、及び望ましいＭＯＩによって決まる。ポリヌクレオチドの第二のライブラリーも、宿主細胞プールに導入され、かつ宿主細胞表面上の免疫グロブリン分子又はそれらの断片の発現が許容される。
【０２２１】
その後、その表面に抗原特異的免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞が、該免疫グロブリン分子の架橋時に検出可能なレポーター分子を発現する条件下で、宿主細胞プールは所望の抗原と接触され、かつ様々な宿主細胞プールが、レポーター分子の発現についてスクリーニングされる。レポーター発現が検出されるこれらの宿主細胞プールは収集され、かつそこに含まれる第一のライブラリーのポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドのそのプールの最初の拡張後、先に蓄えられたアリコートから回収される。
【０２２２】
抗原特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第一のライブラリーのポリヌクレオチドを更に濃縮するために、先に回収されたポリヌクレオチドが、複数のサブプールへ分割される。これらのサブプールは、先に使用されたプールよりも少ない異なるメンバーを含むように設定される。例えば、第一のプールの各々が１０３個のポリヌクレオチドを含む場合、サブプールは、平均約１０又は１００個の異なるポリヌクレオチドを各々含むように設定される。これらのサブプールは、前述のように第二のライブラリーと共に宿主細胞に導入され、かつ宿主細胞の膜表面上での免疫グロブリン分子又はそれらの断片の発現が許容される。その後宿主細胞は、前述のように抗原と接触され、かつレポーター分子の発現が検出される宿主細胞のサブプールが同定され、かつそこに含まれる第一のライブラリーのポリヌクレオチドが、前述のような先に取り分けられた複製プールから回収される。当業者には、このプロセスは、抗原特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを適切に濃縮するために、１回又は複数回追加して繰り返すことができることは理解されると思われる。
【０２２３】
第一のライブラリーのポリヌクレオチド更なる選択及び濃縮の段階、並びにそれらのポリヌクレオチドの単離時に、同様のプロセスが、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として所望の特異的抗原に結合する第二のライブラリーのポリヌクレオチドの回収するために実行される。
【０２２４】
任意の適当なレポーター分子をこの方法において使用することができ、その選択は、使用される宿主細胞、利用可能な検出装置、及び望ましい検出の容易さによって決まる。適当なレポーター分子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、及びβ−ガラクトシダーゼを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２２５】
その表面上に免疫グロブリン分子を発現することが可能な任意の宿主細胞を、この方法において使用することができる。好ましい宿主細胞は、免疫グロブリン−陰性形質細胞腫細胞、例えばＮＳ１細胞、Ｓｐ２／０細胞、又はＰ３細胞、及び初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞を含む。
【０２２６】
前述の細胞死の方法と同様に、速度論の考察は、レポーター構築物の発現は、ＣＰＥ誘導の前に生じることを指示している。それにもかかわらず、宿主細胞表面上の免疫グロブリン分子の抗原誘導型架橋に反応する検出可能なレポーター分子の発現は、ＣＰＥの誘導に先行するように、宿主細胞を抗原と接触した後約１時間〜約４日の期間内に生じることが好ましい。より好ましくは、レポーター分子の発現は、宿主細胞が抗原と接触された後約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、又は約４８時間以内に生じる。更により好ましくはレポーター分子発現は、宿主細胞の抗原との接触の約１２時間以内に生じる。
【０２２７】
「表面免疫グロブリン分子の架橋時に誘導される転写調節領域」とは、表面に発現された免疫グロブリン分子の架橋時に宿主細胞においてアップレギュレーションされる遺伝子を通常調節する領域、例えば宿主細胞プロモーターを意味する。このような転写調節領域の好ましい例は、ＢＡＸプロモーターであり、これは初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞において表面免疫グロブリン分子の架橋時にアップレギュレーションされる。
【０２２８】
更に別の態様において、抗原特異的結合を基に、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片をコードしているポリヌクレオチドを選択する、選択又はスクリーニング法が提供される。この態様は、図５に図示されている。この方法に従い、それらの表面上に抗原特異的免疫グロブリン分子又はそれらの断片を発現する宿主細胞は、抗原結合の検出のみを基に回収される。抗原結合は選択法として利用され、すなわち、抗原特異的免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞は、前述の細胞死を基にした選択について説明されたものと同様の方法により、抗原結合によって直接選択される。例えば、抗原が固形基質に結合されているならば、抗原に結合している懸濁液中の宿主細胞は、抗原を介した固形基質への結合により回収され得る。あるいは、抗原結合は、スクリーニングプロセスとして使用することができ、すなわち、宿主細胞のプールは、抗原誘導型細胞シグナル伝達について先に説明したものと同様の方法により検出可能な抗原結合についてスクリーニングされている。例えば、それらの表面に免疫グロブリン又はそれらの断片を発現している宿主細胞のプールは、抗原と接触され、かつ所定のプール内の抗原結合が、イムノアッセイにより、例えば抗原に結合する酵素−抗体複合体の検出により、検出される。
【０２２９】
先に説明した免疫グロブリン同定法の第一段階を参照し、抗原特異的結合法による選択を、下記のように行うことができる。宿主細胞は、その表面に免疫グロブリン分子の高レベルの発現が可能である感染及び／又はトランスフェクションについて選択される。宿主細胞は懸濁液中で増殖することが好ましい。前述のような第一及び第二のポリヌクレオチドライブラリーによる感染後、抗体分子の合成及び集成が進行される。その後宿主細胞が、それらの表面に結合した抗原を有するマイクロタイターウェルに移される。抗原に結合している宿主細胞は、これによりウェル表面に付着され、かつ未結合のこれらの細胞は、ゆるやかな洗浄により除去される。あるいは、抗原に結合している宿主細胞は、例えば、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により回収され得る。ＦＡＣＳは、フローサイトメトリーとも称されるが、これは蛍光を含む、光学特性を基にした個々の細胞の選別に使用される。これは、比較的短時間での細胞の大きい集団のスクリーニングに有用である。最終的に抗原に結合した宿主細胞が回収され、これにより免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、関心のある抗原に特異的に結合する第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第一のライブラリーのポリヌクレオチドを濃縮する。
【０２３０】
更なる第一のライブラリーのポリヌクレオチドの選択及び濃縮の段階、並びにこれらのポリヌクレオチドの単離時に、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、望ましい特異的抗原に結合する第二のライブラリーのポリヌクレオチドの回収が実行される。
【０２３１】
その表面に免疫グロブリン分子を発現することが可能な任意の宿主細胞を、この選択方法において使用することができる。好ましい宿主細胞は、免疫グロブリン−陰性形質細胞腫細胞、例えばＮＳ１細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ｐ３細胞、及び初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞を含む。細胞が懸濁液中で増殖可能であることが好ましい。
【０２３２】
前述の免疫グロブリン同定法の第一の段階を参照し、抗原特異的結合を介したスクリーニング法を以下のように実行することができる。免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているウイルスベクターにおいて構築されるポリヌクレオチドの第一のライブラリーは、前述の方法により複数のプールへ分割される。その後ウイルスプールを用いて、調製されたウイルスプールと同数の宿主細胞のプールが感染される。このスクリーニング法において、宿主細胞は固形基質に接着されることが好ましい。ポリヌクレオチドの第二のライブラリーも、宿主細胞プールへ導入され、かつ宿主細胞の表面上での免疫グロブリン分子又はそれらの断片の発現が許容される。
【０２３３】
その後、宿主細胞プールを所望の抗原と接触させる。抗原とのインキュベーション後、過剰な未結合の抗原が洗浄除去される。最後に、細胞プールが、抗原結合に関してスクリーニングされる。抗原結合は、様々な方法により検出することができる。例えば、抗原は、酵素へ複合することができる。未結合の抗原の除去後、基質が添加され、かつ酵素反応生成物が検出される。この方法は、第二の抗体複合体、又はストレプトアビジン／ビオチンシステムの使用により増強することができる。このようなスクリーニング法は、当業者に周知であり、標準の販売業者からキットの形で容易に入手可能である。更に、抗原が顕微鏡的粒子、例えば金ビーズに結合されている場合は、抗原の宿主細胞への結合は、顕微鏡により検出することができる。前述の細胞シグナル伝達法同様、そこでの抗原結合が検出される宿主細胞のこれらのプールは収集され、かつそれに含まれた第一のライブラリーのポリヌクレオチドが回収される。あるいは、そこでの抗原結合が検出される宿主細胞のプールが同定され、かつそこに含まれる第一のライブラリーのポリヌクレオチドは、ライブラリーの最初の拡張後に取り分けたポリヌクレオチドのプールの複製アリコートから回収される。
【０２３４】
抗原特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第一のライブラリーのポリヌクレオチドを更に濃縮するために、先に回収されたポリヌクレオチドが、複数のサブプールに分割される。これらのサブプールは、第一のラウンドにおいて使用されたプールよりもより少ない異なるメンバーを含むように設定される。例えば、第一のプールの各々が、１０３個の異なるポリヌクレオチドを含む場合、このサブプールは、平均約１０又は１００個の異なるポリヌクレオチドを各々含むように設定される。これらのサブプールは、前記第二のライブラリーと共に宿主細胞へ導入され、かつ宿主細胞の膜表面上の免疫グロブリン分子又はそれらの断片の発現が許容される。その後宿主細胞が、前述のように抗原と接触され、かつそこで抗原結合が検出される宿主細胞のこれらのサブプールが収集されるか、もしくは簡単に同定され、及びそこに、又は複製アリコート中に含まれる第一のライブラリーのポリヌクレオチドが回収される。当業者には、このプロセスは、抗原特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを適切に濃縮するために、１回又は複数回追加して繰り返されることは理解されると思われる。
【０２３５】
第一のライブラリーのポリヌクレオチドの更なる選択及び濃縮の段階、並びにそれらのポリヌクレオチドの単離時に、同様のプロセスが実行され、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の一部として、所望の特異的抗原に結合している第二のライブラリーのポリヌクレオチドが回収される。
【０２３６】
その表面に免疫グロブリン分子の発現が可能な任意の宿主細胞を、この方法で使用することができる。好ましい宿主細胞は、免疫グロブリン−陰性形質細胞腫細胞、例えばＮＳ１細胞、Ｓｐ２／０細胞、又はＰ３細胞、及び初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞を含む。
【０２３７】
関心のある抗原は、本明細書に説明したような直接及び間接の抗原誘導型細胞死の方法を実践する場合に、いずれか通常の方法により宿主細胞と接触させることができる。例えばある態様において、抗原、例えばペプチド又はポリペプチドが、固形基質に付着される。本明細書において使用される「固形支持体」又は「固形基質」は、当技術分野において公知であるような様々な形のいずれかであることができる、細胞又は抗原を結合することが可能な支持体である。周知の支持体は、組織培養用のプラスチック、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、及び磁鉄鉱を含む。本発明の目的のためのこれらの担体の性質は、ある程度可溶性であるか又は不溶性であることができる。これらの支持体材料は、結合した分子が細胞に結合することが可能である限りは、事実上可能性のある構造的形状をとることができる。従ってこの支持体の形状は、ビーズのように球形であるか、又は試験管の内面もしくは棒の外面のように円柱状であることができる。あるいは表面は、シート、試験片などのように、平坦であることができる。好ましい支持体は、ポリスチレンビーズを含む。この支持体の形状は、チューブ、ビーズ、ミクロビーズ、ウェル、プレート、組織培養プレート、ペトリ皿、ミクロプレート、ミクロタイタープレート、フラスコ、スティック、ストリップ、バイアル、パドルなどを含むことができる。固形支持体は、磁性又は非磁性であることができる。当業者は、細胞又は抗原を結合するための多くの他の適当な担体を知っており、これらを容易に確認することができると考えられる。
【０２３８】
あるいは、抗原が、抗原発現性の提示細胞の表面に発現されている。本明細書において使用される「抗原発現性の提示細胞」とは、抗原が、本発明の宿主細胞の表面に付着した免疫グロブリン分子と相互作用することができるような方法で、その表面に関心のある抗原を発現している細胞を意味する。好ましい抗原発現性の提示細胞は、組換えタンパク質として関心のある抗原を発現するように操作されるが、この抗原は、その細胞の固有の抗原であることができる。組換え抗原発現性の提示細胞は、当業者に周知である分子生物学及びタンパク質発現技術を用いるいずれか適当な方法により構築することができる。典型的には、関心のある抗原をコードしているプラスミドベクターが、適当な細胞へトランスフェクションされ、かつこの細胞は、望ましいポリペプチド抗原の発現についてスクリーニングされる。好ましい組換え抗原発現性の提示細胞は、関心のある抗原を安定して発現する。関心のある抗原を発現するように操作されていないこと以外は抗原発現性の提示細胞と同型の細胞は、本明細書において「抗原フリー提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）」と称する。適当な細胞株は、抗原発現性の提示細胞の調製に使用することができる。細胞株の例は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：ＳＶ４０で形質転換されたサル腎ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ １）；ヒト胚性腎株（２９３、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣−細胞−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）、７７：４２１６（１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶＩ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ、３８３：４４−６８（１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）；及び、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１）を含む。さらに別の細胞株は、当業者には明らかであると思われる。多種多様な細胞株が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）から入手可能である。
【０２３９】
当業者に理解されるように、抗原発現性の提示細胞は、関心のある抗原に加え、多くの天然の抗原決定基をその表面に含むと考えられる。それらの表面上に異なる免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片の広いスペクトルを発現している本発明のある種の宿主細胞は、これらの追加の抗原決定基に結合することが予想される。従って、抗原発現性の提示細胞が本発明の宿主細胞と関心のある抗原が接触するために使用される場合、これらの追加の抗原決定基に反応性である免疫グロブリンを発現しているこれらの宿主細胞の宿主細胞集団を最初に枯渇することが必要である。本発明は、抗原フリー提示細胞の天然の表面抗原に対し特異的である免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞の宿主細胞集団を枯渇する方法を提供する。これは図５に図示されている。本質的に、これらの方法は、宿主細胞集団を抗原発現性の提示細胞と接触する前に、宿主細胞集団を抗原フリー提示細胞と接触することを含む。
【０２４０】
ある態様において、この方法は、宿主細胞の集団を、固形基質に結合された抗原フリー提示細胞に吸着することを含む。未結合の細胞及び／又はそこに含まれるポリヌクレオチドは、回収され、かつ回収された宿主細胞又は回収されたポリヌクレオチドが導入されている新規宿主細胞は、次に、抗原発現性の提示細胞と接触される。宿主細胞のプールが抗原と接触させられるこれらの選択法において、宿主細胞のプールは、固形基質に結合された抗原フリー提示細胞に吸着される。未結合のプール中の細胞及び／又はそれに含まれたポリヌクレオチドは回収され、回収された宿主細胞又は回収されたポリヌクレオチドが導入されている宿主細胞は、その後抗原発現性の提示細胞と接触された。
【０２４１】
別の態様において、この方法は、抗原フリー提示細胞上の抗原決定基の表面抗原と反応する表面免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞が、宿主細胞の表面上の免疫グロブリン分子の架橋時の全て先に説明されたような、プログラムされた細胞死、例えばアポトーシス、直接的又は間接的細胞死、又は細胞シグナル伝達、レポーター分子の発現のいずれかを受けるような条件下で、宿主細胞集団を抗原フリー提示細胞と、接触することを含む。これらの宿主細胞、及びより詳細には細胞死を蓄積しないか又はレポーター分子を発現しない宿主細胞からの、第一のライブラリー又は第二のライブラリーのいずれか由来のポリヌクレオチドが、次に回収される。例えば、免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞集団は、固形基質に付着するように維持され、かつ細胞死を受けているこれらの細胞は、この基質から放出され、培養液の内容物が除去及び廃棄され、かつ付着し続ける細胞、及びそこに含まれたポリヌクレオチドが回収される。
【０２４２】
当業者に理解されるように、抗原フリー提示細胞上に保持された決定基と反応性である免疫グロブリンを発現するこれらの宿主細胞の宿主細胞集団の枯渇には、１ラウンドよりも多い枯渇を必要とすると考えられる。更に枯渇の連続ラウンドが、抗原発現性の提示細胞上に発現された関心のある抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞の濃縮の連続ラウンドにより変更され得ることが企図されている。
【０２４３】
更に別の態様において、免疫グロブリン分子の望ましい抗原特異的機能を基に、免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的機能的断片をコードしているポリヌクレオチドを回収するためのスクリーニング法が提供される。この方法に従い、完全に可溶性の免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞のプールが調製される。発現は許容され、かつ得られた細胞培地は、ある種の望ましい抗原特異性を必要とする様々な機能アッセイについて試験される。この方法に従い、試験される「機能」は、例えば、ウイルス中和、オプソニン効果、ＡＤＣＣ、アンタゴニスト／アゴニスト活性、ヒスタミン放出、赤血球凝集、又は赤血球凝集阻害のような、免疫グロブリン分子により保持される標準エフェクター機能であることができる。あるいは、「機能」は、単純に抗原への結合を意味することができる。
【０２４４】
関連した態様において、公知の抗原特異性であるが、変更されたエフェクター機能を伴う免疫グロブリン分子を選択するためのスクリーニング法が提供される。これらの態様に従い、公知の抗原特異性を伴うが、所定のエフェクター機能に関連していることがわかっている定常ドメイン領域に変更を有する免疫グロブリンサブユニットポリペプチドのライブラリーが構築される。この方法に従い、完全に可溶性の免疫グロブリン分子を発現している宿主細胞のプールが調製される。発現が許容され、かつ得られる細胞培地が、改善された又は抑制された活性に関する様々な機能アッセイについて試験される。この方法に従い、試験される「機能」は、例えば、ウイルス中和、オプソニン効果、補体結合、ＡＤＣＣ、アンタゴニスト／アゴニスト活性、ヒスタミン放出、赤血球凝集、又は赤血球凝集阻害のような、免疫グロブリン分子により保持される標準エフェクター機能であることができる。
【０２４５】
前述の免疫グロブリン同定法の第一段階を参照し、エフェクター機能のスクリーニングは下記のように行うことができる。完全に分泌された免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの第一のライブラリーは、前述のように複数のプールへ分割され、各プールは、異なる可変領域を伴う完全に分泌された免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている、約１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９個の異なるポリヌクレオチドを含む。好ましいプールは最初に、約１０３個のポリヌクレオチドを各々含む。各プールは拡張され、かつ複製アリコートが後の回収のために取り分けられる。ポリヌクレオチドのプールがウイルスベクター、好ましくはポックスウイルスベクター、更により好ましくはワクシニアウイルスベクターにおいて構築される場合は、例えばウイルスライブラリーの高−力価ストックを希釈し、かつ組織培養細胞のミクロ培養物を低ＭＯＩ、例えばＭＯＩ＜０．１で感染するためにその一部を使用することにより、これらのプールが調製される。典型的にはウイルス力価の１，０００倍よりも大きい拡張が、感染の４８時間後に得られる。個々のプールを倍加するウイルス力価の拡張は、組換え体サブセットが、競合サブセットの比較的迅速な増殖ために喪失されるリスクを軽減する。
【０２４６】
その後ウイルスプールを使用し、調製されたウイルスプールと同数の宿主細胞のプールが感染される。各プールにより感染された宿主細胞の数は、そのプールに含まれたポリヌクレオチドの数、及び望ましいＭＯＩによって決まる。実際的には使用したウイルスベクターによる感染を許容し、かつ完全に分泌された免疫グロブリン分子の発現を可能にするいずれかの宿主細胞を、この方法において使用することができる。好ましい宿主細胞は、免疫グロブリン−陰性形質細胞腫細胞、例えばＮＳ１細胞、Ｓｐ２／０細胞、又はＰ３細胞、及び初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞を含む。これらの細胞は、懸濁液中で培養するか又は固形表面に付着することができる。ポリヌクレオチドの第二のライブラリーも、宿主細胞プールに導入することができかつ完全に分泌された免疫グロブリン分子又はそれらの断片の発現が許容される。
【０２４７】
その後、宿主細胞プールが培養された馴化培地は回収され、かつ特異的標的抗原に反応したエフェクター機能について標準化された機能アッセイにおいて試験される。
【０２４８】
いずれか適当な機能アッセイを、この方法において使用することができる。例えば、収集された細胞上清を、例えばＨＩＶのような標的ウイルスを中和する能力を伴う免疫グロブリン分子を検出するために、ウイルス中和アッセイにおいて試験することができる。あるいは、収集された細胞上清を、例えばアポトーシスのような、標的細胞機能をブロック又は促進する、すなわちアンタゴニスト又はアゴニストとして作用する能力について試験することができる。適当な機能アッセイの例は、下記実施例に説明されている。本明細書において使用されたように、「機能アッセイ」は、例えば、当業者に周知の標準ＥＬＩＳＡアッセイによるような、抗原結合の単純な検出も含む。
【０２４９】
所定の宿主細胞プールが増殖される馴化培地が所望の機能を発揮する場合、そのプールの宿主細胞に含まれた第一のライブラリーのポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドプールの最初の拡張後に、先に取り分けられたアリコートから回収される。
【０２５０】
更に抗原特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている第一のライブラリーのポリペプチドを濃縮するために、先に回収されたポリヌクレオチドが、複数のサブプールへ分割される。これらのサブプールは、先に利用したプールよりも少ない異なるメンバーを含むように設定される。例えば、第一のプールが各１０３個の異なるポリヌクレオチドを含む場合、このサブプールは、平均で約１０又は１００個の異なるポリヌクレオチドを各々含むように設定される。これらのサブプールは、前述のように第二のライブラリーと共に宿主細胞へ導入され、かつ完全に分泌された免疫グロブリン分子又はそれらの断片の発現が許容される。宿主細胞プールが培養される馴化培地は回収され、かつ前述のような特異的標的抗原に反応するエフェクター機能について標準的機能アッセイについて試験され、所望の機能特性を有する馴化培地の試料が同定され、かつサブプールの宿主細胞に含まれた第一のライブラリーのポリヌクレオチドが、前述のように先に取り分けられたアリコートから回収される。当業者により、抗原特異的免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを適切に濃縮するために、この過程は、更に１回又は複数回繰り返されることは理解されると思われる。
【０２５１】
更なる第一のライブラリーのポリヌクレオチドの選択及び濃縮の段階、並びにこれらのポリヌクレオチドの単離時に、完全に分泌された免疫グロブリン分子又はそれらの断片の一部として、所望の抗原特異的機能を発揮する第二のライブラリーのポリヌクレオチドを回収するために同様のプロセスが実行される。
【０２５２】
キット  本発明は更に、真核宿主細胞において発現された抗原特異的組換え免疫グロブリンの選択のためのキットを提供する。このキットは、本明細書において説明された方法を実行するのに必要な１種又は複数の成分により満たされた１個又は複数個の容器を備えている。ある態様において、キットは以下を含む：（ａ）転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの第一のライブラリーであり、ここで各第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは、（ｉ）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域からなる群より選択される第一の免疫グロブリン定常領域、（ｉｉ）該第一の定常領域に対応する免疫グロブリン可変領域、及び（ｉｉｉ）該第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの細胞表面発現又は分泌を指示することが可能なシグナルペプチドを含み、ここで該第一のライブラリーは、真核ウイルスベクターにおいて構築されているもの；（ｂ）転写調節領域との操作可能な結合を介して、複数の第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの第二のライブラリーであり、ここで各々は、（ｉ）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域からなる群より選択される第二の免疫グロブリン定常領域であり、ここで該第二の免疫グロブリン定常領域は、第一の免疫グロブリン定常領域とは同じではなく、（ｉｉ）該第二の定常領域に対応する免疫グロブリン可変領域、及び（ｉｉｉ）該第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの細胞表面発現又は分泌を指示することが可能なシグナルペプチドを含み、ここで第二の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは、第一の免疫グロブリンサブユニットポリペプチドと組合わせ、宿主細胞の膜に付着した表面免疫グロブリン分子又はそれらの抗原特異的断片を形成することが可能であり、かつここで第二のライブラリーは、真核ウイルスベクターにおいて構築されているもの；並びに、（ｃ）該免疫グロブリン分子の発現が可能な宿主細胞の集団。このキットにおいて、第一及び第二のライブラリーは、感染性ウイルス粒子及び失活されたウイルス粒子の両方として提供され、ここで失活されたウイルス粒子は、宿主細胞を感染し、そこに含まれたポリヌクレオチドを発現することが可能であるが、この失活されたウイルスは、ウイルス複製を受けない。加えて、このキットにより提供される宿主細胞は、抗原との相互作用により選択され得る抗原特異的免疫グロブリン分子を発現することが可能である。キットの使用は、本明細書に説明した方法に従う。ある態様において、このキットは、関心のある特定の抗原の選択のバリデーションを標準化するための対照抗原及び試薬を含むと考えられる。
【０２５３】
単離された免疫グロブリン  本発明は更に、本明細書に記されたいずれかの方法により産生された、単離された抗原特異的免疫グロブリン又はそれらの断片を提供する。このような単離された免疫グロブリンは、診断用又は治療用薬品として有用であると考えられる。更に本発明の単離された免疫グロブリン、及び薬学的に許容できる担体を含有する組成物が提供される。
【０２５４】
本発明の実践は、特に記さない限りは、当技術分野内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の通常の技術を使用する。このような技術は、参考文献に十分に説明されている。例えば、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社：（１９８９）；「分子クローニング：実験マニュアル」Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ（１９９２）、「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ 及びＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４）；「転写及び翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」（Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ及びＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４）；「動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ）」（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ社、１９８７）；「細胞及び酵素固定（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ社、１９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニングの実践ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（１９８４）；全書（ｔｒｅａｔｉｓｅ）「酵素学的方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、Ｎ．Ｙ．）；「哺乳類細胞の遺伝子導入ベクター（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）」（Ｊ． Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ編集、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；「酵素学的方法」第１５４及び１５５巻（Ｗｕら編集）；「細胞及び分子生物学における免疫化学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、ロンドン、１９８７）；「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ及びＣ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編集、１９８６）；「マウス胚の操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．、１９８６）；並びに、Ａｕｓｕｂｅｌら「分子生物学最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ社、ボルチモア、ＭＤ（１９８９）を参照のこと。
【０２５５】
抗体操作の一般的原理は、「抗体操作（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」第２版、Ｃ．Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編集、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ社（１９９５）に記されている。タンパク質操作の一般的原理は、「タンパク質操作：実践法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｒｉｃｋｗｏｏｄ， Ｄ．ら編集、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ社、オックスフォード、英国（１９９５）に記されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般的原理は、下記に記されている：Ｎｉｓｏｎｏｆｆ， Ａ．、「分子免疫学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社、サンダーランド、ＭＡ（１９８４）；及び、Ｓｔｅｗａｒｄ， Ｍ．Ｗ．、「抗体、それらの構造及び機能（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ社、ニューヨーク、ＮＹ（１９８４）。加えて、当技術分野において公知であるが特に説明されていない免疫学の標準法は、一般に「免疫学最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク；Ｓｔｉｔｅｓら編集、「基礎及び臨床−免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ− Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ社、ノーウォーク、ＣＴ（１９９４）、並びにＭｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ編集、「細胞免疫学における選択法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社、ニューヨーク（１９８０）に従っている。
【０２５６】
免疫学の一般的原理を説明する標準の参考研究は、「免疫学最新プロトコール」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク；Ｋｌｅｉｎ， Ｊ．、「免疫学：自己−非自己の識別の科学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ， Ｒ．ら編集、「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析の最新法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ）」Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ａ．「モノクローナル抗体技術（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｂｕｒｄｅｎ， Ｒ．ら編集、「生化学・分子生物学実験技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１３巻、Ｅｌｓｅｖｅｒｅ、アムステルダム（１９８４）に説明されている。
【０２５７】
実施例
実施例１
多様な特異性のヒト免疫グロブリンライブラリーの構築
多様な免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドのライブラリーを、下記のように作成した。ヒトのＶＨ（重鎖可変領域）、ＶＫ（κ軽鎖可変領域）及びＶＬ（λ軽鎖可変領域）の遺伝子を、ＰＣＲ増幅した。３種の可変遺伝子ファミリーの各々について、組換えプラスミドライブラリー及びワクシニアウイルスライブラリーの両方を構築した。これらの可変領域遺伝子を、免疫グロブリンリーダー配列と対応する重鎖又は軽鎖の定常領域配列の間のｐ７．５／ｔｋ−ベースの転移／発現プラスミドへ挿入した。このプラスミドを用い、対応するワクシニアウイルス組換え体を、三分子組換えにより作成し、かつワクシニアウイルス感染した細胞へのトランスフェクション後、更に免疫グロブリン鎖の高レベル発現のために直接使用した。リンパ腫細胞を、最初にワクシニア重鎖ライブラリーで感染し、その後プラスミド軽鎖ライブラリーで一過性にトランスフェクションした。ＩｇＭ及び軽鎖の同時発現は、抗体分子の集成及び表面発現を生じた。
【０２５８】
１．１ ｐＶＨＥ  ヒトμ膜免疫グロブリン定常領域を含む発現ベクターで、本明細書においてｐＶＨＥと称するものを、下記のように構築した。この戦略を図３に示した。膜結合したヒトＩｇＭ重鎖をコードしているｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（パロアルト、ＣＡ）から入手可能なＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを用い、骨髄ＲＮＡから単離した。ＰＣＲを、５’プライマー（ｈｕＣμ５Ｂ）
2004532645.tif 000006
、及び３’プライマー（ｈｕＣμ３Ｓ）
2004532645.tif 000007
を用いて行った。その後ＰＣＲ産物を、位置指定突然変異誘発のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ／ＫＳに、ＢａｍＨＩ部位及びＳａｌＴ部位で挿入し、ＣＨ２及びＣＨ４ドメイン内に位置した２個のＢｓｔＥＩＩ部位を除去した。これらの部位でコードされたアミノ酸を変更しないヌクレオチド置換が選択された。
【０２５９】
プラスミドｐ７．５／ｔｋを、ＺａｕｄｅｒｅｒのＰＣＴ公開国際公開公報第００／０２８０１６号に開示されたように作成し、かつ下記実施例５において、ｐＶＨＥへ転換した。ｐ７．５／ｔｋのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を、ＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ−ＳａｌＩの制限部位を含むカセットと交換し、ｐ７．５／ｔｋ２を作成した。このカセットは、以下の配列
2004532645.tif 000008
を有し、本明細書においては配列番号：２６と称した。ＩｇＭ重鎖のアミノ酸−１９から−３に相当するシグナルペプチド配列をコードしているカセットを、ｐ７．５／ｔｋ２のＮｃｏＩ部位とＢｓｓＨＩＩ部位の間にクローニングし、ｐ７．５／ｔｋ２Ｌを作出した。先に説明したように産生されたＢｓｔＥＩＩ−突然変異誘発したＩｇＭ重鎖を、その後ｐ７．５／ｔｋ２ＬのＢｓｔＥＩＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングし、ｐＶＨＥを作出した。下記のＰＣＲにより作出したアミノ酸−４から１１０をコードしているヌクレオチドを含む重鎖可変領域（ＶＨ）カセットを、その後ｐＶＨＥのＢｓｓＨＩＩ部位とＢｓｔＥＩＩ部位の間にクローニングし、膜結合した重鎖をコードしているポリヌクレオチドのライブラリーを作成した。μ重鎖配列と選択された制限酵素部位の間の重複のために、これは、正確な翻訳リーディングフレーム内にコンティグな膜結合した重鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの発現を生じた。
【０２６０】
１．２ ｐＶＨＥｓ  ヒトμ分泌免疫グロブリン定常領域を含む発現ベクターであり、本明細書においてはｐＶＨＥｓと称されるものは、以下のように構築される。この戦略は、図８に図示されている。分泌ヒトＩｇＭ重鎖をコードしているｃＤＮＡは、ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを使用し、骨髄ＲＮＡから単離される。上流プライマーｈｕＣμ５Ｂは、５’末端に付属した（ａｐｐｅｎｄｅｄ）ＢａｍＨＩ部位及びＢｓｔＥＩＩ部位、それに続くＶＨのアミノ酸１１１〜１１３及びＣμＨ１の第一のアミノ酸を含む。下流プライマーｓｈｕＣμ３Ｓは、分泌されたＣμの最後の６個のアミノ酸、それに続く停止コドン及びＳａｌＩ部位を含む。これらのプライマーは下記の配列を有する：
ｈｕＣμ５Ｂ：
2004532645.tif 000009
及び
ｓｈｕＣμ３Ｓ：
2004532645.tif 000010
【０２６１】
その後このＰＣＲ産物を、部位特異的変異誘発のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ／ＫＳへＢａｍＨＩ部位及びＳａｌＩ部位で挿入し、ＣＨ２及びＣＨ４ドメイン内に位置した２個のＢｓｔＥＩＩ部位を除去した。これらの部位によりコードされたアミノ酸を変更しないヌクレオチド置換を選択した。
【０２６２】
１．１項において作成されたプラスミドｐ７．５／ｔｋ２Ｌを、下記の方法により、ｐＶＨＥｓへ転換した。前述のように作成したＢｓｔＥＩＩ−突然変異誘発した分泌ＩｇＭ重鎖を、次にｐ７．５／ｔｋ２ＬのＢｓｔＥＩＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングし、ｐＶＨＥｓを作成した。後述のようなＰＣＲにより産生されたアミノ酸−４から１１０をコードしているヌクレオチドを含む重鎖可変領域（ＶＨ）カセットを、ｐＶＨＥｓのＢｓｓＨＩＩ部位とＢｓｔＥＩＩ部位の間にクローニングし、分泌された重鎖をコードしているポリヌクレオチドのライブラリーを作成した。μ重鎖配列及び選択された制限酵素部位の間の重複のために、これは、正確な翻訳リーディングフレームの中にコンティグな分泌重鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの発現を生じた。
【０２６３】
１．３ ｐＶＫＥ及びｐＶＬＥ  ヒトκ及びλ免疫グロブリン軽鎖定常領域を含む発現ベクターを、本明細書においてはｐＶＫＥ及びｐＶＬＥと称し、これらを下記のように構築した。戦略を図４に示す。
（ａ）プラスミドｐ７．５／ｔｋを、下記の方法によりｐＶＫＥに転換した。ｐ７．５／ｔｋの２個のＸｈｏＩ部位及び２個のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、フィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）ライゲーションにより除去し、３個のＡｐａＬＩ部位（１個は骨格、１個はＣｏｌＥｌ ｏｒｉ、及び残りはＡｍｐ）を、常法により除去し、かつｐ７．５／ｔｋのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を、ＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ−ＡｐａＬＩ−ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩの制限部位を含むカセットで置き換え、ｐ７．５／ｔｋ３を作出した。このカセットは、以下の配列
2004532645.tif 000011
を有し、本明細書においては配列番号：２９と称した。κ軽鎖のアミノ酸−１９から−２に相当するシグナルペプチド配列をコードしているカセットを、ｐ７．５／ｔｋ３のＮｃｏＩ部位とＡｐａＬＩ部位の間にクローニングし、ｐ７．５／ｔｋ３Ｌを作成した。Ｃκ領域をコードしているｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを用い、前述のように、アミノ酸１０４〜１０７＋Ｃｋをコードしている領域の５’末端にＸｈｏＩ部位、停止コドン、及びその３’末端にＳａｌＩ部位を含むためのプライマーにより、骨髄ＲＮＡから単離した。これらのプライマーは下記の配列を有する：ｈｕＣκ５：
2004532645.tif 000012
ｈｕＣκ３：
2004532645.tif 000013
及び、ｈｕＣκ３：
2004532645.tif 000014
次にＣκカセットを、ｐ７．５／ｔｋ３ＬのＸｈｏＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングし、ｐＶＫＥを作出した。アミノ酸−３から１０５をコードしているヌクレオチドを含むκ軽鎖可変領域カセット（ＶＫ）を、後述のようにＰＣＲにより作成し、その後ｐＶＫＥのＡｐａＬＩ部位とＸｈｏＩ部位の間にクローニングした。κ軽鎖配列と選択された制限酵素部位の間の重複のために、これは、正確な翻訳リーディングフレームの中にコンティグなκ軽鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの発現を生じた。
【０２６４】
（ｂ）プラスミドｐ７．５／ｔｋ３Ｌは、下記の方法によりｐＶＬＥに転換した。Ｃκ領域をコードしているｃＤＮＡを、前述のように、ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを用い、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＶλのアミノ酸１０５から１０７をコードしている領域、及びその３’末端に停止コドン及びＳａｌＩ部位を含むプライマーにより、骨髄ＲＮＡから単離した。これらのプライマーは下記の配列を有する：ｈｕＣλ５：
2004532645.tif 000015
及び、ｈｕＣλ３（配列番号：３１）。次にこれらのＣκカセットを、ｐ７．５／ｔｋ３ＬのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングし、ｐＶＬＥを作出した。アミノ酸−３から１０４をコードしているヌクレオチドを含むλ軽鎖可変領域カセット（ＶＬ）を、後述のようにＰＣＲにより作成し、その後ｐＶＬＥのＡｐａＬＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングした。λ軽鎖配列と選択された制限酵素部位の間の重複のために、これは、正確な翻訳のリーディングフレームの中にコンティグなλ軽鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドの発現を生じた。
【０２６５】
１．４ 可変領域  重鎖、κ軽鎖、及びλ軽鎖可変領域を、下記の方法により、前述のように作成した発現ベクターにおけるクローニングのために、ＰＣＲにより単離した。複数のドナーからプールした正常なヒト骨髄（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可）から単離したＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成に使用した。ｃＤＮＡ調製物のアリコートを、下記プライマーセットから選択したプライマー対と共にＰＣＲ増幅に使用した：ＶＨ／ＪＨ、ＶＫ／ＪＫ又はＶＬ／ＪＬ。可変領域の増幅に使用したプライマーは、表１及び２に列記した。
【０２６６】
（ａ）重鎖可変領域  プラスミド発現ベクターが消化される方法により、ＶＨプライマー、すなわち重鎖Ｖ領域の増幅に使用した対のフォワードプライマーは、下記の一般的配置を有し、ＢｓｓＨＩＩ制限部位を太字で示した：
ＶＨプライマー：
2004532645.tif 000016
これらのプライマーを、アミノ酸−４及び−３をコードしているＢｓｓＨＩＩ部位を伴う、リーダーの最後の４個のアミノ酸をコードしているコドン、それに続くＶＨファミリー特異的ＦＲ１配列を含むようにデザインした。表１及び２は、異なるファミリー特異的ＶＨプライマーの配列を列記している。重鎖可変領域の最後の５個のアミノ酸、すなわちアミノ酸１０９〜１１３は、６個のヒト重鎖Ｊ領域の間と同じであり、プラスミドｐＶＨＥに埋め込まれ、ＪＨプライマー、すなわち重鎖可変領域の増幅に使用したリバースプライマーは、アミノ酸１０９及び１１０（太字で示す）をコードしているＢｓｔＥＩＩ部位を含むように下記の配置を示した：
ＪＨプライマー：ＶＨアミノ酸１０３〜１０８のヌクレオチド配列（Ｇで終結）−ＧＴＣＡＣＣ
これらのプライマーセットを使用し、ＶＨ ＰＣＲ産物は、アミノ酸−４から１１０をコードしているコドンで始まり、アミノ酸−４及び−３であるＢｓｓＨＩＩ、及びアミノ酸１０９及び１１０のコドンのＢｓｔＥＩＩ部位の末端を含む。適当な制限酵素による切断時に、これらのＰＣＲ産物は、ＢｓｓＨＩＩ及びＢｓｔＥＩＩで消化されたｐＶＨＥへクローニングされる。
【０２６７】
最も可能性のある再構成された重鎖可変領域の増幅を達成するために、表１及び２に示したような、ＶＨ及びＪＨプライマーのファミリーを使用した。ＶＨ１、３及び４ファミリーは、ヒトゲノムに存在する５１種のＶ領域中の４４種に相当している。発現ベクター中のアミノ酸１０９〜１１３をコードしているコドンの埋め込みは、単独の共通ＪＨプライマーの使用を除外した。しかし表１及び２に示した５種ＪＨプライマーは、必要なＰＣＲ反応の数を減少するために使用される各ＶＨプライマーについてプールすることができる
【０２６８】
（ｂ）κ軽鎖可変領域  ＶＫプライマー、すなわちκ軽鎖可変領域の増幅に使用した対のフォワードプライマーは、下記の一般的配置を有し、ＡｐａＬＩ制限部位を太字で示した：
ＶＫプライマー：
2004532645.tif 000017
このＶＫプライマーは、アミノ酸−３及び−２をコードしているＡｐａＬＩ部位を伴う、κ軽鎖リーダーの最後の３個のアミノ酸をコードしているコドン、それに続くＶＫファミリー特異的ＦＲ１配列を含む。κ鎖可変領域の最後の４個のアミノ酸（アミノ酸１０４〜１０７）をコードしているコドンが発現ベクターｐＶＫＥに埋め込まれるので、ＪＫプライマー、すなわちκ軽鎖可変領域の増幅に使用される対のリバースプライマーは、下記の配置を示す：
ＪＫプライマー：−ＶＫのアミノ酸９８〜１０３をコードしているヌクレオチド配列−ＣＴＣＧＡＧ
ＸｈｏＩ部位（太字で示す）は、κ軽鎖可変領域のアミノ酸１０４〜１０５をコードしているコドンを含む。κ軽鎖可変領域をコードしているＰＣＲ産物は、アミノ酸−３のコドンで開始し、かつアミノ酸１０５のコドンで終結し、アミノ酸−３及び−２のコドンを含むＡｐａＬＩ部位並びにアミノ酸１０４及び１０５のコドンを含むＸｈｏＩ部位を伴う。ＶＫ１／４及びＶＫ３／６プライマーは各々、２個の縮重ヌクレオチド位置を有する。これらのＪＫプライマー（表１及び２参照）を使用すると、ＪＫ１、３及び４は、アミノ酸１０４にＶａｌからＬｅｕへの変異を有し、並びにＪＫ３はアミノ酸１０５にＡｓｐからＧｌｕへの変異を有すると考えられる。
【０２６９】
（ｃ）λ軽鎖可変領域  ＶＬプライマー、すなわちλ軽鎖可変領域の増幅に使用される対のフォワードプライマーは、下記の一般的配置を有し、ＡｐａＬＩ制限部位は太字で示した：
ＶＬプライマー：
2004532645.tif 000018
ＡｐａＬＩ部位は、アミノ酸−３及び−２のコドン、それに続くＶＬファミリー特異的ＦＲ１配列を含む。ＶＬの最後の５個のアミノ酸（アミノ酸１０３〜１０７）をコードしているコドンは、発現ベクターｐＶＬＥに埋め込まれるので、ＪＬプライマーは、アミノ酸１０３〜１０４をコードしているコドンを含むＨｉｎｄＩＩＩ部位（太字で示す）を含むように下記の配置を示す：
ＪＬプライマー：−ＶＬアミノ酸９７〜１０２のヌクレオチド配列−ＡＡＧＣＴＴ
λ軽鎖可変領域をコードしているＰＣＲ産物は、アミノ酸−３のコドンで開始し、並びにアミノ酸１０４のコドンで終結し、アミノ酸−３及び−２のコドンを含むＡｐａＬＩ部位、及びアミノ酸１０３及び１０４のコドンを含むＨｉｎｄＩＩＩ部位を伴う。
【０２７０】
2004532645.tif 000019
2004532645.tif 000020
2004532645.tif 000021
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【０２７１】
2004532645.tif 000023
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2004532645.tif 000025
2004532645.tif 000026
【０２７２】
実施例２
特異的抗原に結合するヒト免疫グロブリンの選択戦略
いくつかの未同定の軽鎖と共に、定義された抗原に対する特異性を付与する、組換え重鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス発現ベクターを、下記のように選択し、かつ図１に示した。特異的免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の選択は、２相で達成される。第一に、ナイーブドナー又は免疫感作ドナーのいずれかに由来した抗体産生細胞由来の多様な重鎖のライブラリーを、三分子組換え（実施例５参照）により、実施例１に説明されたように構築された伝達性プラスミドｐＶＨＥを用い、ポックスウイルスベースのベクターにおいて構築し、かつ、免疫グロブリン軽鎖の同様に多様なライブラリーを、組換え遺伝子の発現がｐ７．５ワクシニアプロモーターにより調節されている、実施例１に説明されたように構築されたｐＶＫＥ及びｐＶＬＥのようなプラスミドベクターにおいて構築する。ポックスウイルス構築物中の免疫グロブリン重鎖定常領域は、表面膜に免疫グロブリン受容体の発現を生じる膜貫通領域を維持するようにデザインする。宿主細胞、例えば初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞を、ポックスウイルス重鎖ライブラリーにより、感染多重度１（ＭＯＩ＝１）で感染した。２時間後、感染した細胞を、軽鎖プラスミドライブラリーで、平均１０個又はそれ以上の個別の軽鎖プラスミドが各細胞において取込まれかつ発現されることを可能にする条件下で、トランスフェクションされる。このプラスミド中の組換え遺伝子の発現は、ワクシニアウイルスプロモーターにより調節されるので、高レベルの組換え遺伝子産物が、ワクシニアウイルス感染細胞の細胞質において、核組込みを必要とせずに発現される。これらの条件下で、単独の細胞が、各感染細胞において特徴的Ｈ２Ｌ２構造の同じ重鎖に結合された異なる軽鎖を伴う複数の抗体を発現することができる。
【０２７３】
２．１ 直接的抗原誘導型アポトーシス  初期Ｂ細胞性リンパ腫宿主細胞を、説明されたように、組換え重鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている組換えワクシニアウイルスで感染し、かつ組換え軽鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているプラスミドでトランスフェクションした。これらの宿主細胞は、自然発生的増殖阻害及びアポトーシス細胞死の誘導により、抗原特異的免疫グロブリン受容体の架橋に反応する。図１に概説したように、抗体分子の合成及び集成は、１２時間又はそれ以上にわたって進行することが可能であり、この時点で、特異的免疫グロブリン受容体と架橋し、かつインジケーター細胞を発現している選択された抗体のアポトーシスを誘導するために、合成粒子又はポリマー上に、もしくは抗原を発現している細胞の表面上に、特異的抗原が提示される。アポトーシスが誘導されている細胞から抽出された組換えワクシニアウイルスのゲノムは、望ましい特異性を付与する免疫グロブリン重鎖遺伝子をコードしているポリヌクレオチドについて濃縮される。
【０２７４】
２．２ 間接的抗原誘導型細胞死  図２Ａ（下側）及び図２Ｂ（上側）に示したように、初期Ｂ細胞性リンパ腫宿主細胞を、アポトーシス誘導した遺伝子のプロモーター、ここではＢＡＸプロモーターが、外来細胞傷害性Ｔ細胞エピトープの発現を起動する構築物でトランスフェクションする。この宿主細胞は、抗原特異的免疫グロブリン受容体の架橋に反応して、ＣＴＬエピトープを発現し、かつこれらの架橋した細胞は、特異的ＣＴＬの追加時に溶解事象を受けると考えられる。次に説明された安定してトランスフェクションされた宿主細胞を、組換え重鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている組換えワクシニアウイルスで感染し、かつ組換え軽鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているプラスミドでトランスフェクションする。図１に概説したように、抗体分子の合成及び集成は、１２時間又はそれ以上にわたって進行することができ、この時点で、特異的免疫グロブリン受容体と架橋するために、合成粒子又はポリマー上に、もしくは抗原を発現している細胞の表面上に、特異的抗原が提示される。エピトープ−特異的ＣＴＬの追加は、表面免疫グロブリン分子が架橋されているこれらの細胞に溶解事象をもたらし、その結果間接的に細胞死を誘導した。
【０２７５】
２．３ 直接的抗原誘導型細胞死  図２Ａ（上側）及び図２Ｂ（下側）に示したように、初期Ｂ細胞性リンパ腫宿主細胞を、アポトーシス誘導した遺伝子のプロモーター、ここではＢＡＸプロモーターが、ジフテリア毒素の細胞毒性Ａサブユニットの発現を起動する構築物でトランスフェクションする。この宿主細胞は、抗原特異的免疫グロブリン受容体の架橋に反応して、毒素サブユニットを発現し、かつこれらの架橋した細胞は、細胞死に屈服すると考えられる。次に説明されたように、安定してトランスフェクションされた宿主細胞を、組換え重鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしている組換えワクシニアウイルスで感染し、かつ組換え軽鎖免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードしているプラスミドでトランスフェクションする。図１に概説したように、抗体分子の合成及び集成は、１２時間又はそれ以上にわたって進行することができ、この時点で、特異的免疫グロブリン受容体と架橋するために、合成粒子又はポリマー上に、もしくは抗原を発現している細胞の表面上に、特異的抗原が提示される。表面免疫グロブリン分子が架橋されているこれらの細胞は、迅速かつ直接的に細胞死に屈服する。
【０２７６】
２．４ 考察  これらの組換え遺伝子の発現が、表面Ｉｇ受容体の架橋によってアップレギュレーションされる理由は、これら２種の各構築物の発現が、Ｉｇ架橋後にその発現が初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞において天然にアップレギュレーションされるプロモーターにより、調節されるからである。これは、ＢＡＸプロモーターの使用により例証される。プロアポトーシス性遺伝子の例であるＢＡＸは、初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞において通常、これらの条件下でアップレギュレーションされる。他の遺伝子の調節領域（「プロモーター」）は、同様に良く又はより良く利用することができる。このような遺伝子は、例えば膜Ｉｇの架橋前又は後にマイクロアレイ上の初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞の遺伝子発現プロファイルを比較することにより同定される。
【０２７７】
細胞は、ジフテリアＡ鎖（ｄｉｐＡ）の発現につながる構築物によりトランスフェクションされ、Ｉｇ架橋のみにより誘導されるものよりもより迅速なアポトーシスを受けた。更により迅速な細胞死が、その細胞において発現された未変性のＭＨＣ分子に結合し、かつその発現がＢＡＸ又はＢＡＸ−様プロモーターにより調節されるミニ遺伝子によりコードされているようないくつかの標的ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の追加により誘導された。加えて、初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞以外の宿主細胞を、同様に操作し、初期Ｂ細胞性リンパ腫細胞株において抗原架橋時に生じるプログラムされたアポトーシスとは無関係に、表面免疫グロブリン分子の抗原架橋時の細胞死を直接的又は間接的のいずれかで誘導する遺伝子を発現する。
【０２７８】
前記選択プロセスにおいて、様々な基質を使用し、抗原を提示し、かつ特異的膜免疫グロブリン受容体を架橋する。これらは、磁気ビーズ、タンパク質被覆した組織培養プレート、及び標的抗原をコードしている遺伝子でトランスフェクションされた細胞を含むが、これらに限定されるものではない。標的抗原の効率的発現のためにトランスフェクションすることができる細胞の例は、Ｌ細胞及びＮＩＨ ３Ｔ３細胞を含むが、これらに限定されるものではない。しかしトランスフェクションされた細胞を使用し、組換え抗原を発現及び提示する場合、トランスフェクションされない細胞の膜抗原に反応性の抗体を発現するいずれかの宿主細胞の免疫グロブリン発現している宿主細胞集団を最初に枯渇することが必要である。このような枯渇は、固形基質に結合したトランスフェクションされない細胞への吸収の１回又は複数回のラウンドで実現されうる。その後、特異的組換え抗体を発現している細胞の陽性選択のためにトランスフェクタントを発現している抗原を使用することが可能であると考えられる。好ましい態様において、陰性及び陽性選択の交互のサイクルは、望ましい濃縮を達成するのに必要なほど頻繁に繰り返される。
【０２７９】
陽性選択段階の一例において、抗体を発現しているＢリンパ腫細胞の、Ｂ細胞特異的抗ＣＤ１９及び／又は抗ＣＤ２０抗体が結合した固形基質への接着が可能になる。溶解事象を受ける接着インジケーター細胞は、ウイルスの免疫グロブリン重鎖組換え体を含むそれらの細胞質内容物の、培養液への放出を誘導する。培養液において回収された細胞及び細胞断片から収集された組換えウイルスは、未同定の軽鎖のように一部が結合された場合に、抗原の選択のための特異性を付与する免疫グロブリン重鎖をコードしているそれらの組換えウイルスについて濃縮される。この組換えウイルスの濃縮された集団により新たに感染され、及び引き続き多様な軽鎖をコードしている未選択プラスミドの同じ最初の集団によりトランスフェクションされた細胞における抗原が起動した選択の追加サイクルは、所望の重鎖の更なる濃縮につながる。この選択プロセスの複数の繰り返しは、いくつかの未同定の軽鎖と結合された限定された抗原に対する最適な特異性を有する少数の重鎖を単離する。
【０２８０】
先に選択された重鎖との結合において所望の特異性を付与する軽鎖を選択するために、前述のような全体の選択プロセスが、ワクシニアベースのベクターにおける宿主細胞の多様な軽鎖組換え体ライブラリーによるＭＯＩ＝１での感染、それに続くに先に選択された重鎖のひとつに対するプラスミド組換え体によるトランスフェクションより繰り返される。その重鎖にとって最適な軽鎖パートナーは、前述のような抗原起動した選択の複数回のサイクルの後に単離される。
【０２８１】
別の好ましい態様において、同様の戦略が、特異的抗体をその表面膜に発現している細胞に付与された結合特性を探索することにより履行される。インジケーター細胞として受容体の架橋に反応してアポトーシスを受ける初期Ｂ細胞性リンパ腫を利用する代わりに、図５に図示したように、この戦略は、所望の免疫グロブリン特異性を発現している宿主細胞が、抗原が結合された合成粒子又はポリマーとの、もしくはトランスフェクションされた細胞を発現している特異的抗原の表面への結合により選択されることを可能にする。この場合、インジケーター細胞は、膜免疫グロブリン受容体の架橋に対するアポトーシス反応よりもむしろ、膜免疫グロブリン受容体の高レベル発現能について選択される。好ましい細胞株は、免疫グロブリン陰性形質細胞腫を含む。特異性、バックグラウンド及び選択プロセスの効率に関する他の問題点は、先に説明したように処理される。
【０２８２】
実施例３
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の１０９個の組合せライブラリーからの定義された特異性を伴う抗体の選択
ライブラリーから選択することができる特異的抗体の親和性は、そのライブラリーのサイズの関数である。一般に、ライブラリーにおいて提示された重鎖及び軽鎖の組合せが大きくなると、高親和性抗体が存在しかつ選択され得る見込みが増大する。ファージディスプレイ法を用いる先行する研究は、多くの抗原について、１０９個の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖組合せを含むライブラリーは、比較的高親和性の特異的抗体を選択するのに十分なサイズであることを示唆している。原則として、各々独自の重鎖及び独自の軽鎖、又は重鎖及び軽鎖の可変領域を含む組合せ部位を伴う単鎖構築物を発現している１０９個の組換え体を伴うライブラリーを構築することが可能である。しかし最も好ましい方法は、全て可能性のある１０９個の組合せにおいて同時発現することができる、１０５個の免疫グロブリン重鎖及び１０４個の免疫グロブリン軽鎖のふたつのライブラリーの構築により、この数の抗体組合せを作成することである。この例において、より大きい多様性が重鎖プールにおいて提示されるが、その理由は、重鎖は、特異的抗原結合部位に対し結合した軽鎖よりもより大きい寄与をなすとみなされることが多いからである。
【０２８３】
３．１ 重鎖遺伝子  力価約１０６でのワクシニア組換え体のライブラリーは、１００名の骨髄ドナーのプールに由来したＲＮＡから先に説明された方法（実施例１）により合成された最低１０５個の重鎖ｃＤＮＡ伝達性プラスミド組換え体から構築した。後述のように、このライブラリーは、少なくとも１０９個の重鎖組換え体の力価まで更に拡張されなければならない。ライブラリーを拡張する好ましい方法は、およそ５ｘ１０４個のＢＳＣ１細胞のミクロ培養物を、１０３個のワクシニア重鎖組換え体の個別のプールで感染することである。典型的には、ウイルス力価の１，０００倍より多い拡張が、４８時間の感染後に得られる。複数の個別のプールにおけるウイルス力価の拡張は、競合するサブセットの比較的迅速な増殖のために、組換えのサブセットが失われるリスクを軽減する。
【０２８４】
３．２ 軽鎖遺伝子  力価およそ１０５のワクシニア組換え体のライブラリーは、実施例１に説明されたような、骨髄ドナーのプール由来のＲＮＡから合成された１０４個の免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡ伝達性プラスミド組換え体から構築される。後述のような重鎖選択の複数回のサイクルを使用するために、このライブラリーは更に、力価１０１０〜１０１１個の軽鎖組換え体にまで拡張されなければならない。ライブラリーを拡張する好ましい方法は、およそ５ｘ１０４個のＢＳＣ１細胞の１００種ミクロ培養物を、１０３個のワクシニア軽鎖組換え体の個別のプールで感染することである。１００種の各感染された培養物から回収されたウイルス組換え体は、個別のプールとして力価１０８〜１０９個のウイルス組換え体まで更に拡張される。これらの軽鎖プールをＬ１からＬ１００と標識することは都合がよい。
【０２８５】
３．３ 免疫グロブリン重鎖組換え体の選択  非形成性（ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）骨髄腫、好ましくはＳｐ２／０、又は初期Ｂ細胞性リンパ腫、好ましくはＣＨ３３の１０７個の細胞の１００種の培養物を、生存可能なワクシニア重鎖組換え体によりＭＯＩ＝１で感染し、及び同時にソラレン（４’−アミノメチル−トリオキソサレン）で失活されたワクシニア軽鎖組換え体によりＭＯＩ＝１〜１０で感染した（下記参照）。ソラレン失活に関しては、細胞非含有ウイルスの１０８〜１０９ｐｆｕ／ｍｌを、ソラレン１０μｇ／ｍｌで１０分間２５℃で処理し、その後長波長（３６５−ｎｍ）ＵＶ光に２分間曝露した（Ｔｓｕｎｇ， Ｋ．、Ｊ．Ｈ． Ｙｉｍ、Ｗ． Ｍａｒｔｉ、Ｒ．Ｍ．Ｌ． Ｂｕｌｌｅｒ、及びＪ．Ａ． Ｎｏｒｔｏｎ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７０：１６５−１７１（１９９６））。ソラレン処理したウイルスは、複製することはできないが、組換え遺伝子を含む初期ウイルス遺伝子の、初期ウイルスプロモーターの制御下、後期ウイルスプロモーターの非制御下での発現は可能である。これらの条件下で、ソラレン処理した組換え体から合成された軽鎖は、平均して各感染細胞において発現される単独の重鎖との結合において、免疫グロブリン分子に集成されうる。
【０２８６】
ＭＯＩ＝１又はＭＯＩ＝１０でのソラレンで失活された軽鎖組換え体による感染の選択は、ＭＯＩ＝１で高い及びＭＯＩ＝１０で低い（複数の軽鎖の希釈のため）であるような特定のＨ＋Ｌ鎖組合せの単独の陽性細胞における相対濃度に影響を及ぼすと考えられる。細胞表面での特異的免疫グロブリンの低濃度及びそれに対応する低下された密度は、関心のあるリガンドについて比較的高い親和性を伴う抗体を選択すると予想される。他方で、高濃度の特異的受容体は、免疫グロブリン受容体を介した結合又はシグナル伝達を促進すると予想される。
【０２８７】
実施例２に説明された結合又はシグナル伝達による抗原特異的選択の第一サイクル後に、濃縮された組換えウイルス集団が、各培養物から、この最初の選択の間、及びウイルスの非特異的結合又は自然発生的放出のバックグラウンドレベルに左右され、インプットしたウイルス力価の１％〜１０％であるような力価で、回収される。当初の軽鎖組換えプールＬ１からＬ１００からのソラレン処理したウイルスを受け取る第一の選択サイクルにおいて培養物から回収された重鎖組換え体プールを、各々、Ｈ１ａからＨ１００ａまで標識することが都合がよい。
【０２８８】
第一のサイクルと同じ条件下での第二の選択サイクルの実行のためには、回収した重鎖組換え体の力価を１０〜１００倍拡張することが再度必要である。第二の選択サイクルについて、非形成性骨髄腫又は初期Ｂ細胞性リンパ腫は、生存可能なウイルスの重鎖組換え体及びソラレン処理した軽鎖組換え体により再度感染され、その結果例えば、１０７個の細胞の同じ培養物が、プールＨ３７ａにおいて回収された重鎖組換え体及びＨ３７ａ選択に使用された当初のＬ３７プールからのソラレン処理した軽鎖組換え体で感染される。第二の選択サイクルにおいてＨ３７ａプールから回収された重鎖組換え体は、Ｈ３７ｂなどに都合良くラベル付けされる。
【０２８９】
第二の選択サイクル後、特異的ウイルスの組換え体は、恐らく一般に、最初のウイルス集団に対して１０倍以上に濃縮されると考えられる。この場合特異的クローンは、たとえ１０倍低い力価であっても恐らく良く提示されているので、第一及び第二のサイクルと同じ条件下で第三の選択サイクルが行われる必要ない。従って第三の選択サイクルに関して、わずかに１０６個の非形成性骨髄腫又は初期Ｂ細胞性リンパ腫の１００個の培養物が、再度生存可能なウイルスの重鎖組換え体及びコグネイトプールからのソラレン処理した軽鎖組換え体により感染される。別の感染細胞数の１０分の１の低下は、第五の選択サイクル後に効果がある。
【０２９０】
３．４ 抗原特異的重鎖組換え体の同定
（ａ）いずれか所定の選択サイクル後に、当初のＬ３７プールの軽鎖との結合における抗原特異性を試験するために、重鎖プールから１０種の個別のウイルスｐｆｕを採取することにより、抗原特異的重鎖が、特定のプール、例えばＨ３７ｆにおいて、１０％又はそれ以上のレベル濃縮されたかどうかを決定することが可能である。軽鎖集団は、１００種の個別のプールに分散された１０４個の多様なｃＤＮＡを含むので、平均的プールは、およそ１０２種の異なる軽鎖を有する。例え選択された重鎖が、入手可能な軽鎖プール中の単独型の軽鎖との結合においてのみ、所望の抗原特異性を付与するとしても、選択された重鎖組換え体及びランダム軽鎖プールによりＭＯＩ＝１で感染された細胞の１％は、所望の特異性を発現すると考えられる。この頻度は、細胞が軽鎖によりＭＯＩ＝１０で感染された場合には、平均１０％に増大することができる。特異性を確認する好ましい方法は、ＢＡＸのプロモーター、又は膜受容体架橋の結果として活性化される別のＣＨ３３遺伝子により起動される容易に検出されるレポーター構築物、例えばルシフェラーゼによりトランスフェクションされたＣＨ３３初期Ｂ細胞性リンパ腫株の、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のプールによる感染である。プラーク精製した重鎖組換え体及び関連した軽鎖プールによるこのトランスフェクタントの感染は、そのプールにおいて提示された１００個又はそれ以上のいずれかの軽鎖との結合において選択された重鎖が所望の抗原特異性を付与する場合に、容易に検出されるシグナルを生じうる。感染細胞の免疫グロブリン受容体を介した特異的結合又は特異的シグナル伝達により選択されるかどうかの重鎖の分析に、これと同じ方法が適用可能であることに留意されたい。
【０２９１】
（ｂ）最も確約できる抗原特異的重鎖を同定する別の方法は、選択された集団において最も高度に提示されたものに関するスクリーニングである。挿入断片は、挿入部位にフランキングしたベクター特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅により単離することができ、かつこれらの挿入断片は、配列決定し、観察された配列の頻度を決定することができる。しかしこの場合、依然後述のように関連した軽鎖を同定することが必要である。
【０２９２】
３．５ 免疫グロブリン軽鎖組換え体の選択  一旦抗原特異的重鎖が単離されたならば、その重鎖との結合において抗原特異性を付与する軽鎖は、３．４（ａ）に説明されたような重鎖の選択に使用されるプールから単離することができる。あるいは、同じ重鎖との結合において更に親和性を増強することができるようなより大きいライブラリーから更に別の軽鎖を選択することが可能であることができる。この目的のために、ワクシニア組換え体のライブラリーは、およそ１０６の力価で、先に説明した方法（実施例１）で合成された最小１０５免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡ伝達性プラスミド組換え体から構築される。３．３に説明した手順は入れ替えられ、その結果ここでは、非形成性骨髄腫又は初期Ｂ細胞性リンパ腫は生存可能なウイルス軽鎖組換え体によりＭＯＩ＝１で、及び単独の選択されたソラレン処理した特異的重鎖組換え体で感染される。より高親和性の免疫グロブリンの選択を促進するために、軽鎖によるＭＯＩ＝１０での感染により、各特異的Ｈ＋Ｌ鎖対の濃度を希釈することが好ましい。
【０２９３】
３．６ 単一の免疫グロブリン軽鎖の存在下での免疫グロブリン重鎖組換え体の選択  特定の抗体特異性に寄与する免疫グロブリン重鎖の選択は、候補軽鎖が既に同定されている場合には、簡単である。これは、例えばマウスのモノクローナル抗体が先に選択された場合に該当する。マウスの軽鎖可変領域を、ヒト軽鎖定常領域に移植し、ヒト重鎖との対形成を最適化することができ、このプロセスは、ファージディスプレイ法を利用し、「方向付けられた選択（Ｇｕｉｄｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」（Ｊｅｓｐｅｒｓ， Ｌ．Ｓ．、Ａ． Ｒｏｂｅｒｔｓ、ＳＭ． Ｍａｈｌｅｒ、Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ、Ｈ．Ｒ．及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：８９９−９０３（１９９４）；Ｆｉｇｉｎｉ， Ｍ．、Ｌ． Ｏｂｉｃｉ、Ｄ． Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ、Ａ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｍ．Ｉ． Ｃｏｌｎａｇｈｉ、Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒｓ、及びＳ． Ｃａｎｅｖａｒｉ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５８：９９１−９９６（１９９８））として、これまでに別所に説明されている。この分子マッチ法は、原則として、例え更にヒト可変遺伝子フレームワーク領域がマウスの軽鎖可変領域配列へ移植されたとしても、採用することができる（Ｒａｄｅｒ， Ｃ．、Ｄ．Ａ． Ｃｈｅｒｅｓｈ、及びＣ．Ｆ． Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５：８９１０−８９１５）。この修飾された抗原特異的軽鎖の対形成のために選択されたヒト重鎖を、３．５に説明されたようにより多様なプールから最適なヒト軽鎖の選択の基礎とすることができる。
【０２９４】
実施例４
アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はレトロウイルスベクターにおいて構築されたｃＤＮＡライブラリーからの特異的ヒト抗体の選択
４．１ ヘルペスウイルス  組換え体の感染性単純ヘルペスウイルスアンプリコンのストックからヘルパーウイルス非含有ストックを作成する方法が説明されている（Ｔ．Ａ． Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃ．Ａ． Ｓｔｒａｔｈｄｅｅ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２：７１３７−７１４３（１９９８））。プラスミドアンプリコンベクターにおいて構築された単鎖断片を含む、ヒト免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖遺伝子又はそれらの断片のｃＤＮＡライブラリーを、本方法を用い感染性アンプリコン粒子のライブラリーにパッケージングすることは可能である。免疫グロブリン重鎖遺伝子を用いて構築されたアンプリコンライブラリー、及び免疫グロブリン軽鎖遺伝子を用いて構築された別のアンプリコンライブラリーは、非形成性骨髄腫細胞株の同時感染に使用することができると考えられる。望ましい特異性を伴う免疫グロブリン遺伝子組合せを発現している骨髄腫細胞は、関心のある抗原との結合の選択により濃縮することができる。ヘルペスアンプリコンは、感染細胞における安定した導入遺伝子発現が可能である。第一のサイクルにおける結合について選択された細胞は、それらの免疫グロブリン遺伝子組合せを保持し続け、かつこの特異性を伴う抗体を安定して発現しうる。これは、望ましい特異性を伴う免疫グロブリン遺伝子が単離されるまで、選択サイクルを繰り返すことを可能にする。結果的に細胞死を生じる選択戦略も試みることができる。これらの死滅した選択された細胞から回収されたアンプリコンベクターは、新鮮な標的細胞の感染に使用することはできず、その理由は、ヘルパーウイルスの非存在下において、アンプリコンは、複製欠損であり、かつ感染型にパッケージングされないからである。アンプリコンベクターは、プラスミド複製起点及び抗生物質耐性遺伝子を含む。これは、選択された細胞から細菌への精製されたＤＮＡの形質転換により、選択されたアンプリコンベクターを回復することを可能にする。適当な抗生物質による選択は、アンプリコンベクターで形質転換された細菌細胞の単離を可能にすると考えられる。例えばアンピシリン及びカナマイシンなどの、重鎖及び軽鎖アンプリコンベクターでの異なる抗生物質耐性遺伝子の使用は、選択された細胞からの同一集団からの重鎖及び軽鎖遺伝子の個別の選択を可能にすると考えられる。アンプリコンプラスミドＤＮＡは、この細菌から抽出することができ、かつアンプリコンＤＮＡ及びパッケージング欠損ＨＳＶゲノムＤＮＡのパッケージング細胞への同時トランスフェクションにより感染性ウイルス粒子へパッケージングすることができる。その後感染性アンプリコン粒子は、収集され、別の選択ラウンドのための標的細胞の新鮮な集団の感染に使用され得る。
【０２９５】
４．２  アデノウイルス  組換えアデノウイルスの作出法は、説明されている（Ｓ． Ｍｉｙａｋｅ、Ｍ． Ｍａｋｉｍｕｒａ、Ｙ． Ｋａｎｅｇａｅ、Ｓ． Ｈａｒａｄａ、Ｙ． Ｓａｔｏ、Ｋ． Ｔａｋａｍｏｒｉ、Ｃ． Ｔｏｋｕｄａ、Ｉ． Ｓａｉｔｏ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３：１３２０−１３２４（１９９６）；Ｔ．Ｃ． Ｈｅ、Ｓ． Ｚｈｏｕ、Ｌ．Ｔ． Ｄａ Ｃｏｓｔａ、Ｊ． Ｙｕ、Ｋ．Ｗ． Ｋｉｎｚｌｅｒ、Ｂ． Ｖｏｌｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５：２５０９−２５１４（１９９８））。これらの方法のいずれかを用い、ｃＤＮＡライブラリーをアデノウイルスベクターにおいて構築することは可能である。ｃＤＮＡのアデノウイルスのＥ３又はＥ４領域への挿入は、複製コンピテントな組換えウイルスを生じる。このライブラリーは、三分子組換えにより構築されたワクシニアｃＤＮＡライブラリーと同様の用途に使用することができる。例えば、重鎖ｃＤＮＡライブラリーは、アデノウイルスのＥ３又はＥ４領域へ挿入することができる。これは、複製コンピテントな重鎖ライブラリーを生じる。軽鎖ｃＤＮＡライブラリーは、アデノウイルスのＥ１遺伝子へ挿入され、複製欠損ライブラリーを生じることができる。この複製欠損軽鎖ライブラリーは、２９３細胞のような、アデノウイルスＥ１をトランスに提供する細胞の感染により増幅することができる。これらの２種のライブラリーを、複製コンピテントなワクシニア重鎖ライブラリー及びソラレン失活したワクシニア軽鎖ライブラリーを使用することが説明された方法と同様の選択戦略に使用することができる。
【０２９６】
４．３  ワクシニアウイルスの利点  ワクシニアウイルスには、ｃＤＮＡライブラリーの構築に関して、ヘルペスウイルス又はアデノウイルスに勝るいくつかの利点がある。第一に、ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質において複製するのに対し、ＨＳＶ及びアデノウイルスは核において複製する。比較的高頻度のｃＤＮＡ組換え伝達性プラスミドは、ＨＳＶ又はアデノウイルスにおけるパッケージング／組換えのための核への移行を可能にするよりも、ワクシニアによる細胞質における組換えに利用可能である。第二に、ワクシニアウイルスは、配列に無関係の方法でプラスミドを複製することができるが、アデノウイルス又はヘルペスウイルスはできない（Ｍ． Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｂ． Ｍｏｓｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、６：８７−９３（１９８８））。ｃＤＮＡ組換え体伝達性プラスミドのワクシニア複製は、作成される組換えウイルスを比較的高頻度で生じることができる。本発明者らは、ヘルペス又はアデノウイルスベクターにおけるｃＤＮＡライブラリー構築の可能性を説明しているが、これらのウイルスベクターのいずれかにおけるｃＤＮＡライブラリーの構築のためのこれらの方法の使用は報告されていないことは強調しておかなければならない。
【０２９７】
４．４  レトロウイルス  複製欠損レトロウイルスベクターにおけるｃＤＮＡライブラリーの構築は、説明されている（Ｔ． Ｋｉｔａｍｕｒａ、Ｍ． Ｏｎｉｓｈｉ、Ｓ． Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ、Ａ． Ｓｈｉｂｕｙａ、Ａ． Ｍｉｙａｊｉｍａ、及びＧ．Ｐ． Ｎｏｌａｎ、ＰＮＡＳ、９２：９１４６−９１５０（１９９５）；Ｉ． Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、Ｈ． Ｋｉｒｋ、及びＲ． Ｋａｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５：７０４−７１０（１９９５））。レトロウイルスベクターは、標的細胞の感染時に組込まれ、かつ標的細胞を効率的に形質導入するそれらの能力のため、及び安定した導入遺伝子の発現を誘導する能力のために、広範な用途を持つようになった。免疫グロブリン重鎖遺伝子を用いて構築されたレトロウイルスｃＤＮＡライブラリー、及び免疫グロブリン軽鎖遺伝子を用いて構築された別のレトロウイルスライブラリーを使用し、非形成性骨髄腫細胞株を同時感染することができる。望ましい特異性を伴う免疫グロブリン遺伝子組合せを発現している骨髄腫細胞は、関心のある抗原への結合について選択することにより、濃縮することができる。第一のサイクルにおいて結合について選択された細胞は、それらの免疫グロブリン遺伝子組合せを保持し、かつこの特異性を伴う免疫グロブリンを安定して発現すると考えられる。これは、望ましい特異性を伴う免疫グロブリン遺伝子が単離されるまでの、選択サイクルの繰り返しを可能にする。
【０２９８】
実施例５
三分子組換え
５．１  発現ライブラリーの作成  この実施例は、１００％に近い組換えワクシニアウイルスを作成する、修飾されたワクシニアウイルスベクター及び関連した伝達性プラスミドを使用し、かつ初回に、ワクシニアウイルスにおける代表的ＤＮＡライブラリーの効率的構築を可能にする三分子組換え法を説明している。三分子組換え法は図６に例示している。
【０２９９】
５．２  ベクターの構築  先に説明したワクシニアウイルス伝達性プラスミドｐＪ／Ｋは、インフレームにＮｏｔＩ部位を含むワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を伴うｐＵＣ１３由来のプラスミドであり（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ， Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０：５２２−５２６）、これは強力なワクシニアウイルスプロモーター、それに続くＮｏｔＩ及びＡｐａＩ制限部位を取込むように更に修飾されている。ふたつの異なるベクターｐ７．５／ｔｋ及びｐＥＬ／ｔｋは、各々、７．５Ｋワクシニアウイルスプロモーター又は強力な合成初期／後期（Ｅ／Ｌ）プロモーターを含む（図７）。ＡｐａＩ部位には、ＡＴＧコドンを含む強力な翻訳開始配列が先行している。この修飾は、ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子内に導入され、その結果これはウイルスのｔｋ遺伝子の調節配列及びコード配列にフランキングしていた。これらの２種の新規プラスミドベクター内のｔｋ遺伝子内の修飾は、フランキングｔｋ配列中の相同的組換えにより、ｖＮｏｔＩ−ベクター由来のワクシニアウイルスＷＲ株のゲノムへ伝達され、新たなウイルスベクターｖ７．５／ｔｋ及びｖＥＬ／ｔｋを作成した。重要なことに、これらのウイルスベクターのＮｏｔＩ及びＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ消化後に、ふたつの大きいウイルスのＤＮＡ断片が単離され、各々ワクシニアｔｋ遺伝子の個別の非相同セグメントを含み、かつ一緒に感染性ウイルス粒子の集成に必要な全ての遺伝子を含んでいる。これらのベクターの構築及び特徴決定並びにワクシニアウイルスにおけるＤＮＡ断片の直接ライゲーションに関するそれらの代替使用に関する更なる詳細は、実施例１に説明されている。
【０３００】
５．３  ワクシニアウイルス組換え体の作出頻度の増大  ワクシニアウイルスにおける組換え体の作成に関する常法は、組換えワクシニア伝達性プラスミドとウイルスゲノムの間の相同的組換えを活用している。表３は、組換え伝達性プラスミドのワクシニアウイルス感染細胞へのトランスフェクション後の相同的組換えの頻度が、標準条件においてアッセイされる、モデル実験の結果を示している。機能アッセイを促進するために、Ｈ−２Ｋｂと結合してオボアルブミンの免疫優性２５７−２６４ペプチドエピトープをコードしているミニ遺伝子を、伝達性プラスミドｔｋ遺伝子のＮｏｔＩ部位へ挿入した。相同的組換えの結果、組換えウイルスにおいて破壊されたｔｋ遺伝子が、野生型ウイルスのｔｋ＋遺伝子と置換された。ｔｋ−ウイルスにより感染されたｔｋ−ヒト１４３Ｂ細胞は、野生型ｔｋ＋ウイルスにより感染された細胞とは対照的に、ＢｒｄＵの毒性作用に対し抵抗性であるので、これは、組換えのマーカーとして利用される。組換えウイルスは、１２５ｍＭ ＢｒｄＵの存在下で培養された１４３Ｂ細胞におけるウイルスのｐｆｕによりスコア化することができる。
【０３０１】
この様式による組換え頻度は、０．１％の桁である（表３）。
【表３】
2004532645.tif 000027
＊ワクシニアウイルス株 ｖＮｏｔＩ
＊＊％組換え体＝（ＢｒｄＵを伴う力価／ＢｒｄＵを伴わない力価）ｘ１００
【０３０２】
この組換え頻度は、ワクシニアベクターにおけるｃＤＮＡライブラリーの効率的構築をもたらすには余りにも低い。引き続きのふたつの手順を用い、頻度が増大したワクシニアウイルス組換え体を作成した。
【０３０３】
（１）プラスミド導入ベクターのワクシニアウイルス感染細胞へのトランスフェクション後の相同的組換えにより作成されたウイルス組換え体の頻度を制限するひとつの要因は、ウイルス感染が高効率であるのに対して、プラスミドＤＮＡトランスフェクションはかなり非効率であることである。結果として、多くの感染細胞は、組換えプラスミドを取込まず、従って野生型ウイルスのみを産生することが可能である。この組換え体効率の希釈を低下するために、裸のウイルスＤＮＡ及び組換えプラスミドＤＮＡの混合物を、鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）感染した哺乳類細胞にトランスフェクションした。先に別所で説明されたように（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ， Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：９９７７−９９８１（１９９２））、ＦＰＶは、哺乳類細胞において複製しないが、非感染性裸のワクシニアＤＮＡでトランスフェクションされた細胞における成熟ワクシニアウイルス粒子のパッケージングに必要な必須のヘルパー機能を提供する。この相同的組換え技術の修飾は、単独で、ウイルス組換えの体頻度をおよそ３５倍し、３．５％に増大する（表４）。
【０３０４】
2004532645.tif 000028
2004532645.tif 000029
＊％組換え体＝（ＢｒｄＵを伴う力価／ＢｒｄＵを伴わない力価）ｘ１００
【０３０５】
表４、ＢＳＣ１細胞の集密な単層（５ｘ１０５細胞／ウェル）を、鶏痘ウイルス株ＨＰ１のＭＯＩ＝１で感染した。２時間後、上清を取除き、細胞を２Ｘ Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ Ｉ培地で洗浄し、かつリポフェクタミンを用い、６００ｎｇワクシニア株ＷＲゲノムＤＮＡと単独で、又はモル比１：１もしくは１：１０（ワクシニア：プラスミド）のプラスミドｐＥ／Ｌｏｖａと共にのいずれかで使用し、トランスフェクションした。このプラスミドは、オボアルブミンｃＤＮＡの断片を含み、これは、マウスのクラスＩ ＭＨＣ分子Ｋｂに高親和性で結合することがわかっているＳＩＬＮＦＥＫＬエピトープをコードしている。このミニ遺伝子の発現は、強力な合成初期／後期ワクシニアプロモーターにより制御される。この挿入断片は、ワクシニアｔｋ ＤＮＡにフランキングされる。３日後、細胞を収集し、ウイルスをドライアイスイソプロパノール／３７℃水浴における凍結／解凍の３サイクルにより抽出した。粗ウイルスストックを、ＢｒｄＵを伴う又は伴わずにヒトＴＫ−１４３Ｂ細胞についてプラークアッセイにより力価滴定した。
【０３０６】
（２）ウイルス組換え体頻度の更なる顕著な増加は、ＦＰＶ感染細胞の、組換えプラスミド、並びにＮｏｔＩ及びＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化により作成したワクシニアウイルスｖ７．５／ｔｋ ＤＮＡのおよそ８０ｋｂ及び１００ｋｂのふたつの大きい断片との混合物によるトランスフェクションにより得られた。ＮｏｔＩ及びＡｐａＩ部位は、ｔｋ遺伝子に導入されており、これらの大きいワクシニアＤＮＡアームは各々、ｔｋ遺伝子断片を含んでいる。これらふたつのｔｋ遺伝子断片の間に相同性はないので、これらふたつのワクシニアアームが結合される唯一の方法は、組換え伝達性プラスミド中の挿入断片にフランキングしている相同なｔｋ配列を介した橋かけである。表５の結果は、感染ｔｋ−細胞のＢｒｄＵ耐性により決定されるように、三重にトランスフェクションされた細胞において産生された感染性ワクシニアウイルスの＞９９％が、ＤＮＡ挿入断片についての組換え体であることを示している。
【０３０７】
2004532645.tif 000030
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＊％組換え体＝（ＢｒｄＵを伴う力価／ＢｒｄＵを伴わない力価）ｘ１００
【０３０８】
表５  ワクシニア株Ｖ７．５／ｔｋ（１．２μｇ）からのゲノムＤＮＡを、ＡｐａＩ及びＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。消化したＤＮＡは、半分に分割された。これらのプールのひとつを、１：１（ワクシニア：プラスミド）のモル比でｐＥ／Ｌｏｖａと混合した。このプラスミドは、オボアルブミンｃＤＮＡの断片を含み、これは、マウスのクラスＩ ＭＨＣ分子Ｋｂに高親和性で結合することがわかっているＳＩＬＮＦＥＫＬエピトープをコードしている。このミニ遺伝子の発現は、強力な合成初期／後期ワクシニアプロモーターにより制御される。この挿入断片は、ワクシニアｔｋ ＤＮＡにフランキングされる。ＤＮＡを、リポフェクタミンを用い、先にＭＯＩ＝１．０のＦＰＶで２時間感染したＢＳＣ１細胞の集密な単層（５ｘ１０５細胞／ウェル）にトランスフェクションした。ひとつの試料は、６００ｎｇの未処理のゲノムＶ７．５／ｔｋ ＤＮＡでトランスフェクションした。３日後、細胞を収集し、ウイルスをドライアイスイソプロパノール／３７℃水浴における凍結／解凍の３サイクルにより抽出した。粗ウイルスストックを、ＢｒｄＵ選択を伴う又は伴わずにヒトＴＫ−１４３Ｂ細胞についてプラークアッセイした。
【０３０９】
５．４  ワクシニアウイルスにおける代表的ｃＤＮＡライブラリーの構築  ｃＤＮＡライブラリーを、ワクシニアベクターにおいて構築し、公知の細胞ｍＲＮＡ配列の代表的発現を明らかにした。感染細胞における組換え発現効率を増大するために、追加の修飾を、ｐ７．５／ｔｋ伝達性プラスミド及びｖ７．５／ｔｋウイルスベクターに導入した。これらは、３種の異なるリーディングフレーム内の翻訳開始部位並びに翻訳及び転写の両停止シグナルの導入、更にはＤＮＡ挿入のための追加の制限部位の導入を含む。
【０３１０】
第一に、ｐ７．５／ｔｋのＨｉｎｄＩＩＩ Ｊ断片（ワクシニアｔｋ遺伝子）を、このプラスミドからｐＢＳファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＨｉｎｄＩＩＩ部位へサブクローニングし、ｐＢＳ．Ｖｔｋを作出した。
【０３１１】
第二に、ｐＢＳＶ．ｔｋの当初のマルチクローニング部位の一部を、ＳｍａＩ及びＰｓｔＩによるプラスミドの消化により除去し、マングマメヌクレアーゼで処理し、それ自身戻しライゲーションし、ｐＢＳ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−を作出した。この処理は、ｐＢＳ．Ｖｔｋから独自のＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、及びＰｓｔＩ部位を除去した。
【０３１２】
第三に、この時点の目的は、ｐＢＳ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−において新規マルチクローニング部位を７．５ｋプロモーターの下流に導入することであった。新たなマルチクローニング部位は、４種の異なる上流プライマー及び共通の下流プライマーを用い、ＰＣＲにより作成した。まとめると、これら４種のＰＣＲ産物は、ＡＴＧ開始コドンを含まないか、又はＡＴＧ開始コドンを３種の各可能性のあるリーディングフレーム内に含んだ。加えて、各ＰＣＲ産物は、その３’末端に、３種全てのリーディングフレーム内に翻訳停止コドン、及びワクシニアウイルス転写二重停止シグナルを含んだ。これらの４種のＰＣＲ産物は、ｐＢＳ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−のＮｏｔＩ／ＡｐａＩ部位に個別にライゲーションし、４種のベクター、ｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ２／ｔｋ、及びｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋを作出し、図１２にそれらのｐ７．５／ｔｋベクターに対する配列修飾を示した。各ベクターは、ＤＮＡ挿入断片のクローニングのために、独自のＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａｌＩ部位を含み、これはそれら自身の内因性翻訳開始部位（ベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ内）を使用するか、もしくは３種の可能性のあるリーディングフレームのいずれかひとつのベクター翻訳開始部位を使用する（ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ、及びｐ７．５／ＡＴＧ４／ｔｋ）かのいずれかである。
【０３１３】
モデル実験において、本明細書に説明されたもしくは当技術分野において公知の別所に説明されたように、ｃＤＮＡは、マウス腫瘍細胞株（ＢＣＡ３９）のポリ−Ａ＋ ｍＲＮＡから合成され、かつ４種の修飾されたｐ７．５／ｔｋ伝達性プラスミドの各々へライゲーションされる。本発明に記されるか、さもなければ当技術分野において公知であるように、この伝達性プラスミドは、大腸菌のような真核宿主細胞による継代により増幅される。２０μｇのＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化したｖ／ｔｋワクシニアウイルスＤＮＡアーム及び４種の組換えプラスミドｃＤＮＡライブラリーの等モル混合物を、三分子組換えのために、ＦＰＶヘルパーウイルス感染したＢＳＣ−１細胞へトランスフェクションした。収集したウイルスは、総力価６ｘ１０６ｐｆｕを有し、その９０％より多くが、ＢｒｄＵ耐性であった。
【０３１４】
組換えワクシニアライブラリー中のｃＤＮＡ挿入断片のサイズ分布を特徴付けるために、個別の単離されたプラークを、滅菌したパスツールピペットを用いて採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌが入った１．５ｍｌチューブへ移した。ウイルスは、ドライアイス／イソプロパノール及び３７℃水浴の凍結／解凍の３サイクルにより、細胞から放出された。およそ１／３の各ウイルスプラークを使用し、最終容量２５０μｌでｔｋ−ヒト１４３Ｂ細胞を含有する１２ウェルプレートのひとつのウェルを感染した。２時間の感染期間の最後に、各ウェルを、２．５％ウシ胎児血清を伴う１ｍｌ ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−２．５）及び最終濃度１２５μｇ／ｍｌとするのに十分なＢＵｄＲで積層した。細胞を、３７℃で３日間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベーションした。３日目に細胞を収集し、遠心によりペレット化し、かつ５００μｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。ウイルスは、前述の凍結／解凍の３サイクルにより細胞から放出された。各ウイルスストックの２０％を使用し、最終容量３ｍｌのＤＭＥＭ−２．５中で、５０ｍｍ組織培養皿においてＢＳＣ−１細胞の集密な単層を感染した。２時間の感染期間の最後に、細胞にＤＭＥＭ−２．５ ３ｍｌを積層した。細胞を、３７℃で３日間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベーションした。３日目に細胞を収集し、遠心によりペレット化し、かつ３００μｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。ウイルスは、前述の凍結／解凍の３サイクルにより細胞から放出された。粗ウイルスストック１００μｌを、１．５ｍｌチューブに移し、等容量の融解した２％低融点アガロースを添加し、かつウイルス／アガロース混合物を、パルスフィールドゲルサンプルブロックに移した。寒天のウォーム（ａｇａｒ ｗｏｒｍｓ）が固化した場合、これらは、サンプルブロックから除去し、３個の等量の切片に切断した。３個の切片全てを、同じ１．５ｍｌチューブに移し、かつ０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、０．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫの２５０μｌを添加した。このウォームを、この溶液中で、３７℃、２４時間インキュベーションした。ウォームを、０．５ＸＴＢＥ緩衝液５００μｌで数回洗浄し、各ウォームの１切片を、１％低融点アガロースゲルのウェルに移した。これらのウォームを添加した後、ウェルを、追加の融解した１％低融点アガロースを添加することにより、シールした。その後このゲルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社パルスフィールドゲル電気泳動装置により、２００ボルト、８秒パルス時間で、０．５ＸＴＢＥ中、１６時間、電気泳動した。このゲルを、臭化エチジウム染色し、かつワクシニアゲノムｃＤＮＡを含有するアガロース部分を、ゲルから切出し、かつ１．５ｍｌチューブへ移した。ワクシニアＤＮＡを、製造業者の推奨に従いβ−Ａｇａｒａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ社）を用い、アガロースから精製した。精製したワクシニアＤＮＡを、５０μｌ ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。各ＤＮＡストック１μｌを鋳型として用い、ワクシニアＴＫ特異的プライマーＭＭ４２８及びＭＭ４３０（挿入部位にフランキングする）並びにＫｌｅｎｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を製造業者の推奨に従い用い、最終容量２０μｌでポリメラーゼ連鎖反応（��ＣＲ）を行った。反応条件は、最初の変性段階が９５℃で５分間、その後下記を３０サイクルであった：９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３分間。各ＰＣＲ反応液２．５μｌを、１％アガロースゲル上に溶解し、臭化エチジウムで染色した。多様なサイズの増幅断片が認められた。ＰＣＲにおいて増幅したフランキングベクター配列について補正した場合、これらの挿入断片のサイズは３００〜２５００ｂｐの範囲であった。
【０３１５】
このライブラリーの遺伝子産物の代表的発現は、ワクシニアライブラリーにおける特異的ｃＤＮＡ組換え体頻度は、標準プラスミドライブラリーにおいて同じｃＤＮＡの組換え体が生じる頻度から識別不能であることを明らかにすることにより、確立された。これを、マウス腫瘍においてアップレギュレーションされることが先に示されたＩＡＰ配列について表６に図示した。ワクシニアライブラリーからの平均８００又は２００ウイルスｐｆｕのいずれかを伴う２０種の個別のプールを、ＢＤＵＲ存在下における１４３Ｂ ｔｋ−細胞のミクロ培養物の感染により増幅した。ＤＮＡは、３日後各感染培養物から抽出し、配列特異的プライマーによるＰＣＲにより、先に特徴付けた内因性レトロウイルス（ＴＡＰ、イントラシスターブルＡ粒子）配列の存在に関しアッセイした。陽性プールの頻度のポアソン解析は、およそ５００ウイルスｐｆｕ毎に１個のＩＡＰ組換え体頻度を示している（表６）。同様に、プラスミドライブラリーからの平均１，４００又は２７５細菌ｃｆｕのいずれかを伴う２０種の個別のプールは、ＤＨ５細菌の形質転換により増幅した。各プールからのプラスミドＤＮＡは、同じＩＡＰ配列の存在についてアッセイした。陽性プールの頻度のポアソン解析は、４５０プラスミド毎に１個のＩＡＰ組換え体頻度を示している（表６）。
【０３１６】
【表６】
2004532645.tif 000032
Ｆ０＝陰性ウェル画分；μ＝ＤＮＡ前駆体／ウェル＝−ｌｎＦ０
【０３１７】
同様の分析を、ワクシニアライブラリーにおけるαチューブリン配列の提示に関し行い、同様の結果であった。同じ腫瘍ｃＤＮＡから構築したふたつのライブラリーにおける任意選択した配列の同等の頻度は、ワクシニアライブラリーの構築はプラスミドライブラリーの構築よりも、やや複雑でありかつある種一般性は低いが、腫瘍ｃＤＮＡ配列を同等に提示することを示唆している。
【０３１８】
考察
前述の三分子組換え戦略は、ほぼ１００％のウイルス組換え体を生じた。これは、プラスミド伝達ベクターのワクシニアウイルス感染細胞へのトランスフェクションによるウイルスの組換え体の作成について、現行法よりも高度に著しく改善されている。後者の手法は、わずかに０．１％の桁の頻度で、ウイルス組換え体を生じている。三分子組換えにおけるウイルス組換え体の高収率は、１回目に、ワクシニアウイルス由来のベクターにおいてゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを効率的に構築することを可能にする。第一実験シリーズにおいて、力価６ｘ１０６個の組換えウイルスを、２０μｇのＮｏｔＩ及びＡｐａＩ消化したワクシニアベクターアームの、等モル濃度の腫瘍細胞ｃＤＮＡとの混合物によるトランスフェクション後に得た。この技術の利点は、特異的ゲノム及びｃＤＮＡクローンの単離に関する、新規かつ効率的スクリーニング及び選択戦略の可能性をもたらしている。
【０３１９】
本明細書に明らかにされた三分子組換え法は、ワクシニア及びヘルペスウイルスを含む哺乳類ウイルスのような他のウイルスと共に使用することができる。典型的には、相同でない２種のウイルスアームが作成される。これらのウイルスアームが結合することができる唯一の方法は、プラスミドのような導入ベクターの挿入断片にフランキングしている相同配列の橋かけである。２種のウイルスアーム及び導入ベクターが、同じ細胞に存在する場合、作出された感染性ウイルスのみが、導入ベクター内のＤＮＡ挿入断片へ組換えられる。
【０３２０】
本発明の三分子組換え法によりワクシニア及び他の哺乳類ウイルスにおいて構築されたライブラリーは、本発明のＣＴＬスクリーニングシステムにおいて標的抗原を同定する際にワクシニアウイルス及びその使用に関して本明細書に説明されたものと同様の利点を有すると考えられる。同様の利点は、真核細胞においてより複雑なアッセイが行われる場合に、ワクシニア又は他の哺乳類ウイルスにおいて構築されたＤＮＡライブラリーについて期待される。このようなアッセイは、真核細胞における受容体及びリガンドをコードしているＤＮＡのスクリーニングを含むが、これらに限定されるものではない。
【０３２１】
実施例６
伝達性プラスミドの調製
導入ベクターは、公知の手段によるクローニングのために調製される。好ましい方法は、適当な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｍａＩ及びＳａｌＩ又はＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ）による、適当な緩衝液中、適当な温度における、少なくとも２時間にわたる、１〜５μｇのベクターの切断に関する。線状の消化されたベクターは、消化されたベクターの０．８％アガロースゲルによる電気泳動により単離される。線状プラスミドは、ゲルから切り出され、かつ周知の方法を用いて、アガロースから精製される。
【０３２２】
ライゲーション  ｃＤＮＡ及び消化した導入ベクターを、周知の方法を用いて互いにライゲーションした。好ましい方法において、導入ベクター５０〜１００ｎｇを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い、ｃＤＮＡの変動する濃度で、適当な緩衝液、１４℃で１８〜２４時間かけて、ライゲーションした。
【０３２３】
形質転換  ライゲーション反応のアリコートを、周知の方法を用い、ＤＨ１０Ｂ又はＤＨ５αのような大腸菌で電気穿孔により形質転換した。形質転換反応液を、選択的抗生物質（アンピシリン）を含有するＬＢ寒天プレート上に播種し、かつ１４〜１８時間３１℃で増殖した。形質転換された細菌を全て、一緒にプールし、かつ周知の方法を用いプラスミドＤＮＡを単離した。
【０３２４】
本発明の好ましい方法の前記説明において言及した緩衝液の調製は、当業者には明白であると思われる。
【０３２５】
実施例７
三分子組換えのための組織培養細胞へのワクシニアウイルスＤＮＡ断片及び伝達性プラスミドの導入
ｃＤＮＡ又は他のライブラリーを、実施例５において説明したように、又は他の当技術分野において公知の技術により、４種の伝達性プラスミドにおいて構築した。三分子組換えを使用し、このｃＤＮＡライブラリーをワクシニアウイルスへ伝達した。ＢＳＣ１細胞の集密な単層を、鶏痘ウイルスＨＰ１によりＭＯＩ＝１〜１．５で感染した。感染は、０．１％ウシ血清アルブミンを補充した血清非含有培地において行った。ＢＳＣ１細胞は、１２ウェルもしくは６ウェルプレート、６０ｍｍもしくは１００ｍｍ組織培養プレート、又は２５ｃｍ２、 ７５ｃｍ２、もしくは１５０ｃｍ２フラスコに入れた。ｖ７．Ｓ／ｔｋ又はｖＥＬ／ｔｋ由来の精製したＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩ及びＮｏｔＩで消化した。これらの消化後、これらの酵素を熱失活し、かつ消化したワクシニアアームを、セントリコン１００カラムを用い精製した。その後トランスフェクション複合体を、消化したワクシニアＤＮＡと伝達性プラスミドｃＤＮＡライブラリーの間で形成した。好ましい方法は、リポフェクタミン又はリポフェクタミンプラス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、これらのトランスフェクション複合体を形成する。１２ウェルプレート中におけるトランスフェクションは、通常、０．５μｇの消化されたワクシニアＤＮＡ及び１０ｎｇ〜２００ｎｇのライブラリーからのプラスミドＤＮＡを必要としている。より大きい培養容器における細胞へのトランスフェクションは、比例して増大する量のワクシニアＤＮＡ及び伝達性プラスミドを必要とする。３７℃で２時間の感染後、鶏痘を除去し、並びにワクシニアＤＮＡ、伝達性プラスミドのトランスフェクション複合体を添加した。これらの細胞を、トランスフェクション複合体と３〜５時間インキュベーションし、その後トランスフェクション複合体を除去し、かつ２．５％ウシ血清アルブミンを補充した１ｍｌ ＤＭＥＭと置き換えた。細胞を、ＣＯ２中で３７℃で３日間インキュベーションした。３日後、細胞を収集し、かつウイルスをドライアイス／イソプロパノール及び３７℃の水浴の凍結／乾燥の３サイクルにより放出した。
【０３２６】
実施例８
哺乳類細胞のトランスフェクション
本実施例は、ワクシニアＤＮＡ及び伝達性プラスミドで細胞をトランスフェクションする別法を説明している。三分子組換えは、例えば、リン酸カルシウム沈降法を使用する、消化したワクシニアＤＮＡ及び伝達性プラスミドの宿主細胞へのトランスフェクションにより行うことができる（Ｆ．Ｌ． Ｇｒａｈａｍ、Ａ．Ｊ． Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｃ． Ｃｈｅｎ、Ｈ． Ｏｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、７：２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｄ．Ｊ． Ｓｕｓｓｍａｎ、Ｇ． Ｍｉｌｍａｎ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、４：１６４１−１６４３（１９８４））、又は電気穿孔（Ｔ．Ｋ． Ｗｏｎｇ、Ｅ． Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１０７：５８４−５８７（１９８２）；Ｅ． Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｍ． Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ、Ｙ． Ｗａｎｇ、Ｐ．Ｈ． Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、ＥＭＢＯ Ｊ．、１：８４１−８４５（１９８２））。
【０３２７】
実施例 ９
ＭＶＡ三分子組換えベクターの構築
三分子組換えに適した修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ベクターの構築のためには、２種の独自の制限エンドヌクレアーゼ部位が、ＭＶＡ ｔｋ遺伝子へ挿入されなければならない。完全なＭＶＡゲノム配列は公知である（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ９４８４８）。この配列を検索し、制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｆｉＩ、及びＸｍａＩはＭＶＡゲノムを切断しないことが明らかになった。制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩ及びＸｍａＩを、市販の酵素という理由で選択し、ＡｓｃＩ及びＸｍａＩは、各々、８ｂｐ及び６ｂｐの認識配列サイズを有する。これらの部位をＭＶＡ ｔｋ遺伝子に導入するためには、ＸｍａＩ及びＡｓｃＩ部位にフランキングしたレポーター遺伝子（大腸菌ｇｕｓＡ）を含む構築物が作出される。Ｇｕｓ遺伝子は、ｐＣＲＩＩ．Ｇｕｓにおいて入手可能である（Ｍ． Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｄ． Ｅｃｋｅｒｔ、Ｅ． Ｓｍｉｔｈ、Ｍ． Ｚａｕｄｅｒｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３８：４４４−４５１（１９９７））。このレポーター遺伝子構築物を、レポーター遺伝子の発現を制御するために、ワクシニアｔｋ ＤＮＡフランク及び初期／後期７．５ｋプロモーターを含む伝達性プラスミドにクローニングされる。Ｇｕｓ遺伝子は、この構築物から、Ｇｕｓ特異的プライマーを用い、ＰＣＲ増幅される。Ｇｕｓセンス
2004532645.tif 000033
及びＧｕｓアンチセンス
2004532645.tif 000034
その後このＧｕｓ ＰＣＲ産物は、センスプライマー上にＮｏｔＩ及びＸｍａＩ部位、アンチセンスプライマー上にＡｓｃＩ及びＡｐａＩ部位を含むように修飾されているＧｕｓ特異的プライマーによりＰＣＲ増幅される。これらのプライマーの配列は、以下である：
ＮＸ−Ｇｕｓセンス：
2004532645.tif 000035
及び
ＡＡ−Ｇｕｓアンチセンス：
2004532645.tif 000036
【０３２８】
このＰＣＲ産物は、ＮｏｔＩ及びＡｐａＩにより消化され、かつｐ７．５／ｔｋのＮｏｔＩ及びＡｐａＩ部位へクローニングされる（Ｍ． Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｄ． Ｅｃｋｅｒｔ、Ｅ． Ｓｍｉｔｈ、Ｍ． Ｚａｕｄｅｒｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３８：４４４−４５１（１９９７））。７．５ｋ−ＸｍａＩ−ｇｕｓＡ−ＡｓｃＩ構築物は、許容ＱＴ３５又はＢＨＫ細胞において、通常の相同的組換えによりＭＶＡへ導入される。組換え体プラークは、Ｇｕｓ基質Ｘ−Ｇｌｕ（５−ブロモ−３−インドイル−β−Ｄ−グルクロン酸；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により選択的に染色される（Ｍ．Ｗ． Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｂ． Ｍｏｓｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９：３５２−３５５（１９９５））。独自のＸｍａＩ及びＡｓｃＩ部位も含むＭＶＡ−Ｇｕｓクローンは、等質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）にプラーク精製される。ＭＶＡ−Ｇｕｓの大規模培養物は、ＢＨＫ細胞上において増幅され、かつ裸のＤＮＡは、精製されたウイルスから単離される。ＸｍａＩ及びＡｓｃＩによる消化後、ＭＶＡ−Ｇｕｓ ＤＮＡは、ＭＶＡにおけるｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築のための三分子組換えに使用される。
【０３２９】
ＭＶＡは、ほとんどの哺乳類細胞においてその生活環を完了することはできない。この弱毒化は、組換えｃＤＮＡの高レベルの発現の延長を生じるが、生存可能なＭＶＡは、感染細胞から回収することができない。選択された細胞から生存可能なＭＶＡを回収できないことは、関心のある機能性ｃＤＮＡ組換え体を単離するために必要な繰り返しの選択サイクルを妨害する。この問題に対する解決法は、ＭＶＡの宿主範囲欠損を補完ことができるヘルパーウイルスによる、ＭＶＡ感染細胞の感染である。このヘルパーウイルスは、その生活環の補完に必須のＭＶＡが欠損している遺伝子産物（複数）を提供することができる。恐らく別の宿主範囲が制限されたヘルパーウイルス、例えば鶏痘は、哺乳類細胞においても制限されているので、これらのウイルスはＭＶＡ欠損体（複数）を補完することができないと考えられる。ワクシニアウイルスの野生型株は、ＭＶＡを補完することができると考えられる。しかしこの場合、複製コンピテントなワクシニアウイルスの産生は、組換えＭＶＡクローンの選択及び単離の追加のサイクルを完了するであろう。複製コンピテントなウイルスの作成を伴わずに、非許容条件下での哺乳類細胞からの生存可能なＭＶＡの回収に必要なヘルパー機能を提供する条件付き欠損型ワクシニアウイルスを、使用することができる。ワクシニアＤ４Ｒオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素をコードしている。この酵素は、ワクシニアウイルス複製に必須であるが、これは感染後早期に発現され（ＤＮＡ複製前）、この遺伝子の破壊はワクシニアにとって致命的である。ワクシニアＤ４Ｒ遺伝子を発現している安定してトランスフェクションされた哺乳類細胞株は、Ｄ４Ｒ欠失ワクシニアウイルスを補完することができることが明らかにされている（Ｇ． Ｗ． Ｈｏｌｚｅｒ、Ｆ．Ｇ． Ｆａｌｋｎｅｒ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１：４９９７−５００２（１９９７））。Ｄ４Ｒ欠損ワクシニアウイルスは、哺乳類細胞においてＭＶＡを補完するヘルパーウイルスとしての優れた候補であると考えられる。
【０３３０】
Ｄ４Ｒを補完する細胞株を構築するために、Ｄ４Ｒ ｏｒｆを、ワクシニア株ｖ７．５／ｔｋから、プライマーＤ４Ｒ−センス
2004532645.tif 000037
及びＤ４Ｒアンチセンス
2004532645.tif 000038
を用いるＰＣＲ増幅によりクローニングした。このセンスプライマーは、ＢａｍＨＩ部位を含むように修飾され、かつアンチセンスプライマーは、ＮｏｔＩ部位を含むように修飾されている。ＰＣＲ増幅並びにＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩによる消化後に、Ｄ４Ｒ ｏｒｆは、ｐＩＲＥＳＨｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＢａｍＨＩ部位及びＮｏｔＩ部位にクローニングされる。この哺乳類発現ベクターは、強力なＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサー及びＥＣＭＶ内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）含む。このＤ４ＲＩＲＥＳＨｙｇ構築物は、ＢＳＣ１細胞へトランスフェクションされ、かつトランスフェクションされたクローンは、ヒグロマイシンについて選択される。ＩＲＥＳは、５’末端にＤ４Ｒｏｒｆ、及び３’末端にヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むポリシストロン性ｍＲＮＡの効率的翻訳を可能にする。これは、機能性ヒグロマイシン耐性クローンを高頻度で生じる（これらのクローンはＤ４Ｒを発現する）。Ｄ４Ｒを発現しているＢＳＣ１細胞（ＢＳＣ１．Ｄ４Ｒ）は、Ｄ４Ｒ欠損ワクシニアを補完し、この欠損株の作成及び繁殖をもたらすことができると考えられる。
【０３３１】
Ｄ４Ｒ欠損ワクシニアを構築するために、Ｄ４Ｒ ｏｒｆ（ワクシニアゲノムの１００７３２位〜１０１３８８位）並びにフランキング配列の９８３ｂｐ（５’末端）及び６１０ｂｐ（３’末端）が、このワクシニアゲノムからＰＣＲ増幅される。プライマーＤ４Ｒ Ｆｌａｎｋセンス
2004532645.tif 000039
及びＤ４Ｒ Ｆｌａｎｋアンチセンス
2004532645.tif 000040
は、クローニングのためのＳａｃＩ（センス）及びＸｈｏＩ（アンチセンス）部位を含み、ワクシニアゲノムの９９７４９位から１０１９９８位を増幅する。このＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳａｃＩ部位及びＸｈｏＩ部位にクローニングされ、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ．Ｆｌａｎｋを作成する。このＤ４Ｒ遺伝子は、６５７ｂｐ ｏｒｆのヌクレオチド３位から始まる独自のＥｃｏＲＩ部位、及びこのｏｒｆの４３３位のヌクレオチドで始まる独自のＰｓｔＩ部位を含む。Ｇｕｓ発現カセットのＤ４ＲのＥｃｏＲＩ部位及びＰｓｔＩ部位への挿入は、ほどんどのＤ４Ｒコード配列を除去する。７．５ｋプロモーター−Ｇｕｓ発現ベクターが構築されている（Ｍ． Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｄ． Ｅｃｋｅｒｔ、Ｅ． Ｓｍｉｔｈ、Ｍ． Ｚａｕｄｅｒｅｒ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３８：４４４−４５１（１９９７））。７．５−Ｇｕｓ発現カセットは、このベクターから、プライマー７．５Ｇｕｓセンス
2004532645.tif 000041
及び７．５Ｇｕｓアンチセンス
2004532645.tif 000042
を用いるＰＣＲにより、単離される。この７．５Ｇｕｓセンスプライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含み、及び７．５ＧｕｓアンチセンスプライマーはＰｓｔＩ部位を含むと考えられる。ＰＣＲ増幅後、７５Ｇｕｓ分子は、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより消化され、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ．ＦｌａｎｋのＥｃｏＲＩ部分及びＰｓｔＩ部位に挿入され、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ−／７．５Ｇｕｓ＋を作成する。Ｄ４Ｒ−／Ｇｕｓ＋ワクシニアは、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ−／７．５Ｇｕｓ＋構築物のｖ７．５／ｔｋ感染ＢＳＣ１．Ｄ４Ｒ細胞へのトランスフェクションによる通常の相同的組換えにより作成される。Ｄ４Ｒ−／Ｇｕｓ＋ウイルスは、ＢＳＣ１．Ｄ４Ｒ細胞上でのプラーク精製により単離され、かつＸ−Ｇｌｕで染色される。Ｄ４Ｒ−ウイルスは、哺乳類細胞におけるＭＶＡゲノムの補完及びレスキューに使用することができる。
【０３３２】
関連した態様において、ＭＶＡゲノムは、他の欠損ポックスウイルスを伴う哺乳類細胞においてレスキューされ、かつソラレン／ＵＶ−失活された野生型ポックスウイルスによってもレスキューされる。ソラレン／ＵＶ失活はここで考察されている。
【０３３３】
実施例１０
Ｄ４Ｒ三分子組換えベクターの構築及び使用
ポックスウイルス感染は、宿主細胞タンパク質及びＲＮＡの合成に対する劇的な阻害作用を有する。これらの宿主遺伝子発現に対する作用は、一部の条件下で、限定された宿主細胞に対する生理的作用を有する特異的ポックスウイルス組換えの選択を妨害する。必須の初期遺伝子において欠失されているワクシニアウイルスの一部の株は、宿主細胞タンパク質合成に対するより大きく低下された阻害作用を有することが示されている。従って、初期遺伝子機能を欠失しているポックスウイルスベクターにおける組換えｃＤＮＡライブラリーの作成は、一部の宿主遺伝子の生理作用に関するそれらの継続した活性のある発現に依存したある種の組換え体の選択にとって有利であると考えられる。必須のウイルス遺伝子の破壊は、変異体株の繁殖を妨害する。しかしワクシニアの複製欠損株は、宿主細胞におけるトランス補完（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を介した喪失機能の提供により、もしくはこの遺伝子の発現を誘導し得るヘルパーウイルスにより、レスキューされる。
【０３３４】
複製欠失株において構築されたポックスウイルスライブラリーによる細胞集団の感染は、宿主細胞シグナル伝達機能、分化経路、及び転写調節に対する感染の作用を大きく減弱する。この戦略の更なる重要な恩恵は、標的化された転写調節領域の制御下での必須遺伝子の発現が、それ自身、転写調節領域の活性化に直接的又は間接的につながる組換えウイルスの選択によることである。例は、初期Ｂ細胞前駆体上の表面免疫グロブリン受容体の架橋の結果として活性化された遺伝子のプロモーター、又は幹細胞分化後に誘導されたマーカーをコードしている遺伝子のプロモーターを含む。このようなプロモーターが必須のウイルス遺伝子の発現を起動する場合、その結果その転写調節因子の発現を直接的又は間接的に活性化するこれらのウイルス組換え体が、複製しかつ感染性粒子としてパッケージングされる。この方法は、ｄｉｐＡ又はＣＴＬ標的エピトープの発現を基にした選択法よりも（ｔｈｅｎ）はるかに低いバックグラウンドを生じる可能性があり、その理由は、誘導されない細胞は、非特異的バイスタンダー作用を介して放出される複製コンピテントなワクシニアウイルスを含まないからである。これらの選択された組換え体は、更に、補完する細胞株において又は補完するヘルパーウイルスもしくはトランスフェクションされたプラスミドの存在下で拡張することができる。
【０３３５】
多くの必須の初期ワクシニア遺伝子が説明されている。好ましくは、Ｄ４Ｒ遺伝子を欠失しているワクシニア株が使用される。ワクシニアＤ４Ｒオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ酵素をコードしている。この酵素は、ウイルスＤＮＡ複製に必要であり、及びこの遺伝子の破壊はワクシニアにとって致命的である（Ａ．Ｋ． Ｍｉｌｌｎｓ、Ｍ．Ｓ． Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、及びＡ．Ｍ． Ｄｅｌａｎｇｅ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８：５０４−５１３（１９９４））。ワクシニアＤ４Ｒ遺伝子を発現している安定してトランスフェクションされた哺乳類細胞株は、Ｄ４Ｒ欠失ワクシニアウイルスを補完することができることが明らかにされている（Ｇ． Ｗ． Ｈｏｌｚｅｒ、Ｆ．Ｇ． Ｆａｌｋｎｅｒ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１：４９９７−５００２（１９９７））。Ｄ４Ｒが補完されない場合、Ｄ４Ｒ欠失ワクシニアによる感染は、宿主細胞タンパク質合成の阻害の大きい低下を招く（Ｈｏｉｚｅｒ及びＦａｌｋｎｅｒ）。Ｄ４Ｒ欠失ワクシニアのｔｋ遺伝子へ挿入された外来遺伝子は、例えＤ４Ｒ補完を欠いていても、高レベルで発現され続けることも示されている（Ｍ． Ｈｉｍｌｙ、Ｍ． Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ、Ｇ． Ｈｏｌｚｅｒ、Ｕ． Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｅ． Ｈａｎｎａｋ、Ｆ．Ｇ． Ｆａｌｋｎｅｒ、及びＦ． Ｄｏｒｎｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１４：３１７−３２６（１９９８））。従って複製欠失Ｄ４Ｒ株は、一部の宿主遺伝子の生理的作用に関するそれらの継続した活性のある発現に左右されるウイルス組換え体の選択に良く適している。
【０３３６】
Ｄ４Ｒ欠損ワクシニア株において構築された代表的ｃＤＮＡライブラリーからの特異的組換え体の選択のためにこの戦略を実行するためには、下記細胞株及びベクターが必要である：
１． Ｄ４Ｒ発現している補完している細胞株が、Ｄ４Ｒ欠失ウイルスストックの拡張のために必要である。
２． Ｄ４Ｒ遺伝子は、三分子組換えに適したウイルス株において欠損又は失活されなければならない。
３． ＣＨ３３ Ｂリンパ腫細胞上の膜免疫グロブリン受容体の架橋後に誘導されるＢＡＸ又は他の遺伝子の発現を調製するような様々な誘導性プロモーター、又はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２前駆細胞からの軟骨細胞分化の誘導後のＸ型コラーゲンの発現のためのプロモーターの制御下で、Ｄ４Ｒを発現するプラスミド又はウイルスの構築物が作成されなければならない。関連した細胞株におけるこれらの構築物の安定したトランスフェクションは、特異的組換え体をレスキューするために必要である。あるいは、関連のある構築物を発現しているヘルパーウイルスが、細胞株又は初代培養物のいずれかにおける発現の誘導に使用され得る。
【０３３７】
１０．１ Ｄ４Ｒ補完細胞株の構築  Ｄ４Ｒ補完細胞株は、下記のように構築される。第一に、Ｄ４Ｒ ｏｒｆ（ワクシニアゲノムの１００７３２位から１０１３８８位に位置する）は、ワクシニア株ｖ７．５／ｔｋから、下記プライマーを使用するＰＣＲ増幅によりクローニングされる：
Ｄ４Ｒ−センス：
2004532645.tif 000043
本明細書においては配列番号：１０４と称す；及び
Ｄ４Ｒ−アンチセンス：
2004532645.tif 000044
本明細書においては配列番号：１０５と称す。
センスプライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含むように修飾され、アンチセンスプライマーは、ＢａｍＨＩ部位（両方とも下線付き）を含むように修飾された。標準ＰＣＲ増幅及びＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによる消化後、得られるＤ４Ｒ ｏｒｆは、ｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能、パロアルト、ＣＡ）のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この哺乳類発現ベクターは、強力な前初期プロモーター／エンハンサー及びＥＣＭＶ内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を含む。このＤ４Ｒ／ＩＲＥＳｎｅｏ構築物を、ＢＳＣ１細胞へトランスフェクションし、かつトランスフェクションされたクローンを、Ｇ４１８で選択した。このＩＲＥＳは、５’末端にＤ４Ｒ ｏｒｆ、及び３’末端にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むポリシストロン性ｍＲＮＡの効率的な翻訳を可能にする。これは、機能性高頻度のＧ４１８耐性クローンを生じる（このクローンはＤ４Ｒを発現する）。トランスフェクションされたクローンは、高レベルのＤ４Ｒ ｍＲＮＡを発現しているクローンを同定するために、プローブとしてＤ４Ｒ遺伝子を用い、ノーザンブロットにより試験される。Ｄ４Ｒを発現するＢＳＣ１細胞（ＢＳＣ１．Ｄ４Ｒ）は、Ｄ４Ｒ欠失ワクシニアを補完することができ、Ｄ４Ｒ欠損ウイルスの作成及び繁殖をもたらす。
【０３３８】
１０．２． Ｄ４Ｒ欠失ワクシニアベクターの構築  前記実施例５において説明された三分子組換えに適するＤ４Ｒ−欠失ワクシニアウイルスは、下記方法を用いる、大腸菌ＧｕｓＡ発現カセットの３００−ｂｐ欠損への挿入による、Ｄ４Ｒ ｏｒｆ（ワクシニアゲノムの１００７３２位から１０１３８８位）の破壊により構築される。
【０３３９】
ＧｕｓＡ遺伝子を挿入するために、その挿入部位にフランキングする領域を、下記のようにワクシニアウイルスから増幅する。左側フランキング領域は、下記プライマーにより増幅される：
Ｄ４Ｒ左側フランキングするセンス：
2004532645.tif 000045
本明細書において配列番号：１０６と称す；及び
Ｄ４Ｒ左側フランキングするアンチセンス：
2004532645.tif 000046
本明細書において配列番号：１０７と称す。
これらのプライマーは、ワクシニアゲノムの１００１６７位から１００９６０位に広がる領域を増幅し、かつクローニングのためにＨｉｎｄＩＩＩ（センス）及びＰｓｔＩ（アンチセンス）部位を含むように（両方とも下線付き）修飾される。得られるＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、かつｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手）のＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＰｓｔＩ部位にクローニングし、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ．ＬＦを作出した。右側フランキング領域は、下記プライマーにより増幅した：
Ｄ４Ｒ右側にフランキングするセンス：
2004532645.tif 000047
本明細書において配列番号：１０８と称す；及び
Ｄ４Ｒ左側フランキングするアンチセンス：
2004532645.tif 000048
本明細書において配列番号：１０９と称す。
これらのプライマーは、ワクシニアゲノムの１０１２７１位から１０１９７５位に広がる領域を増幅し、かつクローニングのためにＢａｍＨＩ（センス）及びＳａｃＩ（アンチセンス）部位を含むように（両方とも下線付き）修飾される。得られるＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化し、かつｐＢＳ．Ｄ４Ｒ．ＬＦのＢａｍＨＩ部位及びＳａｃＩ部位にクローニングし、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ．ＬＦ／ＲＦを作出した。
【０３４０】
ポックスウイルス合成初期／後期（Ｅ／Ｌ）プロモーターに操作可能に結合されたＧｕｓＡコード領域を含む発現カセットは、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ．ＬＦ／ＲＦに、下記の方法により挿入される。Ｅ／Ｌプロモーター−Ｇｕｓカセットは、Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ， Ｍ．らの論文（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３８：４４４−４５１（１９９７））に説明されたｐＥＬ／ｔｋ−Ｇｕｓ構築物に由来している。Ｇｕｓ ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流のＮｏｔＩ部位は、ｐＥＬ／ｔｋ−ＧｕｓのＮｏｔＩによる消化により除去され、その後クレノウ断片との反応及びそれ自身の再ライゲーションにより満たされ、ｐＥＬ／ｔｋ−Ｇｕｓ（ＮｏｔＩ−）を生じる。Ｅ／Ｌ−Ｇｕｓ発現カセットは、ｐＥＬ／ｔｋ−Ｇｕｓ（ＮｏｔＩ−）から、下記プライマーを使用する標準のＰＣＲにより単離される：
ＥＬ−Ｇｕｓセンス：
2004532645.tif 000049
本明細書において配列番号：１１０と称す；及び
ＥＬ−Ｇｕｓアンチセンス：
2004532645.tif 000050
本明細書において配列番号：１１１と称す。
ＥＬ−Ｇｕｓセンスプライマーは、ＳａｌＩ部位を含み、かつＥＬ−Ｇｕｓアンチセンスプライマーは、ＢａｍＨＩ部位（両方とも下線付き）を含む。ＰＣＲ増幅後、ＥＬ−Ｇｕｓカセットは、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化され、かつｐＢＳ．Ｄ４Ｒ．ＬＦ／ＲＦのＳａｌＩ部位及びＢａｍＨＩ部位に挿入され、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ−／ＥＬＧｕｓを作成する。この伝達性プラスミドは、Ｄ４Ｒ配列により両側がフランキングされたＥＬ−Ｇｕｓ発現カセットを含む。Ｄ４Ｒ ｏｒｆへ操作された３００ｂｐ欠損も存在する。
【０３４１】
三分子組換えに適したＤ４Ｒ−／Ｇｕｓ＋ワクシニアウイルスは、ｐＢＳ．Ｄ４Ｒ−／ＥＬＧｕｓ構築物のｖ７．５／ｔｋ−感染したＢＳＣ１．Ｄ４Ｒ細胞へのトランスフェクション後の通常の相同的組換えにより作出される。Ｄ４Ｒ−／Ｇｕｓ＋ウイルスは、ＢＳＣ１．Ｄ４Ｒ細胞上でのプラーク精製により単離され及びＸ−Ｇｌｕにより染色される（Ｍ．Ｗ． Ｃａｒｒｏｌｌ、Ｂ． Ｍｏｓｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９：３５２−３５５（１９９５））。この新規株は、消化されたｖ７．５／ｔｋ／Ｇｕｓ／Ｄ４Ｒである。
【０３４２】
ｖ７．５／ｔｋ／Ｇｕｓ／Ｄ４Ｒから精製されたＤＮＡを使用し、代表的ワクシニアｃＤＮＡライブラリーを、反応をＢＳＣ１．Ｄ４Ｒ補完している細胞株において行うこと以外は、実施例５に説明した三分子組換えによりを構築した。
【０３４３】
１０．３．  誘導性プロモーターの制御下でのＤ４Ｒを発現している宿主細胞の調製  誘導性プロモーターの誘導時にＤ４Ｒ遺伝子を発現している宿主細胞は、下記のように調製される。誘導性プロモーターの制御下で、ワクシニアＤ４Ｒ遺伝子を発現しているプラスミド構築物が作成される。誘導性プロモーターの例は、ＣＨ３３細胞上の膜免疫グロブリンの架橋後にアップレギュレーションされるプロモーター（抗体選択のため）、例えば実施例２及び３に記載されたＢＡＸプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。ワクシニアＤ４Ｒ ｏｒｆは、１０．１項に記されたプライマーＤ４Ｒセンス及びＤ４Ｒアンチセンスを使用するＰＣＲにより増幅される。これらのＰＣＲプライマーは、所望の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むことを必要とするので修飾される。その後、Ｄ４Ｒ ｏｒｆは、適当な真核発現ベクター（これは安定して形質転換された細胞の選択ができる）へ、当業者に公知の方法を用い、所望のプロモーターの操作可能な結合において、クローニングされる。
【０３４４】
その後この構築物は、例えば実施例２及び３に説明された抗体の選択のため、適当な宿主細胞へトランスフェクションされ、ＢＡＸプロモーターに操作可能に結合されたＤ４Ｒ遺伝子は、適当な細胞株、例えば、ＣＨ３３細胞株、ＣＨ３１細胞株、又はＷＥＨＩ−２３１細胞株に安定してトランスフェクションされる。得られる宿主細胞は、ｖ７．５／ｔｋ／Ｇｕｓ／Ｄ４Ｒにおいて調製されたライブラリーを用い、本質的に実施例３に説明されたように、抗体の産生において利用される。宿主細胞の表面上の膜−発現した免疫グロブリン分子の抗原誘導型架橋は、架橋した細胞におけるＤ４Ｒ遺伝子産物の発現の誘導を生じる。Ｄ４Ｒの発現は、ライブラリーが作成されるｖ７．５／ｔｋ／Ｇｕｓ／Ｄ４Ｒゲノムにおける欠損を補完し、これは感染性ウイルス粒子の産生を可能にする。
【０３４５】
実施例１１
ＤＮＡ合成の可逆的インヒビターによるポックスウイルス媒介型宿主シャットオフの減弱
下記に説明したように、減弱された又は欠損されたウイルスは、細胞変性効果を低下することが望ましいことが多い。ウイルスの感染時の細胞変性効果は、宿主細胞死（例えば、架橋により誘導されたアポトーシス）を利用する方法を用いる免疫グロブリン分子の選択及び同定により妨害される。このような作用は、ＤＮＡ合成の可逆的インヒビター、例えばヒドロキシ尿素（ＨＵ）により減弱することができる（Ｐｏｇｏ， Ｂ．Ｇ．及びＳ． Ｄａｌｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４３（１）：１４４−５１（１９７１））。ＨＵは、デオキシリボヌクレオチド前駆体の複製複合体を奪うことにより、細胞及びウイルスの両ＤＮＡ合成を阻害する（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ， Ｓ．Ｐ．及びＣ．Ｋ． Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ、２７３（４５）：２９５１９−２３（１９９８））。ウイルスＤＮＡ複製の阻害は、後期ウイルスＲＮＡの転写をブロックする一方、初期ワクシニアプロモーターの制御下で遺伝子の転写及び翻訳は可能である（Ｎａｇａｙａ， Ａ．、Ｂ．Ｇ． Ｐｏｇｏ、及びＳ． Ｄａｌｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４０（４）：１０３９−５１（１９７０））。従って、ＨＵのようなＤＮＡ合成の可逆的インヒビターによる処理は、架橋の作用の検出を可能にする。適当なインキュベーション後、ＨＵ阻害が、宿主細胞の洗浄により逆行され、その結果ウイルスの複製サイクルは継続され、かつ感染性組換え体を回収することができる（Ｐｏｇｏ， Ｂ．Ｇ．及びＳ． Ｄａｌｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４３（１）：１４４−５１（１９７１））。
【０３４６】
図９の結果は、ＢＭＰ−２（骨形成タンパク質−２）により処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２前駆細胞における軟骨細胞分化のマーカーであるＸ型コラーゲン合成の誘導は、ワクシニア感染によりブロックされるが、その合成はウイルスＤＮＡ合成のＨＵ媒介された阻害によりレスキューされることを示している。ＨＵが新鮮培地による洗浄により培養物から取除かれる場合、ウイルスのＤＮＡ合成及び感染性粒子の集成は迅速に進行し、その結果感染性ウイルス粒子を、洗浄後２時間足らずで単離することができる。
【０３４７】
Ｃ３Ｈ１ＯＴ１／２細胞を、ＷＲワクシニアウイルスでＭＯＩ＝１で感染し、１時間後、２ｍＭ ＨＵの存在又は非存在下で、培地又は４００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−２のいずれかを添加した。更に３７℃で２１時間インキュベーションした後、ＨＵを新鮮培地による洗浄により除去した。感染性サイクルを、更に２時間継続し、ウイルスＤＮＡ複製及び感染性粒子の集成をもたらした。２４時間後に、ＲＮＡを、４種の異なる培養条件下で維持した細胞から抽出した。ノーザン解析を、Ｘ型コラーゲン特異的プローブを用いて行った。誘導されないＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、間葉前駆細胞表現型を有し、それ自体Ｘ型コラーゲンを発現しない（左側第一のレーン）。正常な未感染のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞へのＢＭＰ−２の添加は、成熟軟骨細胞への分化及びＸ型コラーゲンの発現を誘導する（左から第一及び第二のレーンの比較）が、ＢＭＰ−２のワクシニア感染したＣ３Ｈ１０Ｔ（１／２）細胞への添加は、Ｘ型コラーゲンの合成の誘導に失敗した（左側から第三のレーン）。２ｍＭ ＨＵの存在下において、ＢＭＰ−２は、例えワクシニア感染したＣ３Ｈ１０Ｔ（１／２）細胞においても、Ｘ型コラーゲン合成を誘導する（左側から第四のレーン）。
【０３４８】
このウイルス細胞変性効果を減弱する戦略は、他のウイルス、他の細胞型及び例えば架橋時にアポトーシスを誘導するような免疫グロブリン分子の選択に適用可能である。
【０３４９】
実施例１２
多様な特異性のヒトＦａｂ断片ライブラリーの構築
完全なヒトの多様な免疫グロブリンＦａｂ断片をコードしているポリヌクレオチドのライブラリーは、下記のように産生される。これらのＦａｂ断片は、免疫グロブリン軽鎖と対形成した第一の定常領域ドメインに結合した重鎖可変領域（ＶＨ−ＣＨ１）を含む。ヒトＶＨ（重鎖の可変領域）、ＶＫ（κ軽鎖の可変領域）及びＶＬ（λ軽鎖の可変領域）の遺伝子は、ＰＣＲ増幅される。３種の可変遺伝子ファミリーの各々について、組換えプラスミドライブラリー及びワクシニアウイルスライブラリーの両方が構築される。これらの可変領域遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメイン又はκ軽鎖定常領域ＣＫに相当する定常領域配列のすぐ上流のｐ７．５／ｔｋ−ベースの伝達／発現プラスミドへ挿入される。これらのプラスミドを利用し、三分子組換えにより、対応するワクシニアウイルス組換え体が作成され、かつひとつの免疫グロブリン鎖又はそれらの断片の、第二の免疫グロブリン鎖又はそれらの断片のワクシニアウイルス組換え体に感染した細胞へのトランスフェクション後の、Ｆａｂ断片の高レベルの発現のために直接使用することもできる。これらふたつの鎖は、合成及び集成され、Ｆａｂ断片を形成する。当業者に理解されるように、これらのＦａｂ断片は、シグナル配列、膜貫通ドメイン、及び／又は細胞内ドメインのためのコード配列の付着により、膜結合又は分泌され得る。
【０３５０】
１２．１ ｐＶＨＥｃ  ｐＶＨＥｃと称される、ＣμのＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むヒト重鎖断片をコードしている発現ベクターは、下記のように構築される。プラスミドｐ７．５／ｔｋ２は、前記実施例１．１に説明されたように作成される。ＶＨ及びＣＨ１ドメインのアミノ酸１０９〜１１３、すなわちＣμのアミノ酸１０９〜２２３ＢをコードしているＤＮＡ構築物を、実施例１のように単離されたＩｇＭ重鎖遺伝子から増幅し、かつＰＣＲにより修飾し、アミノ酸１０９〜１１３＋をコードしている領域の５’末端にＢｓｔＥＩＩ部位、及びその３’末端にＣμＣＨ１ドメイン、停止コドンＳａｌＩ部位を含んだ。このＤＮＡは、ｐ７．５／ｔｋ２へ、ＢｓｔＥＩＩ部位とＳａｌＩ部位の間に挿入され、ｐＶＨＥｃを作成する。実施例１．４（ａ）のように作成された重鎖可変領域（ＶＨ）ＰＣＲ産物（アミノ酸（−４）から（１１０））、表１及び２に列記されたプライマーを用い、ＢｓｓＨＩＩ部位及びＢｓｔＥＩＩ部位へクローニングした。ＣＨ１ドメイン配列と選択された制限酵素部位の間の重複のために、これは、 機能的シグナルペプチドを欠いているが、正確な翻訳リーディングフレームは維持しているコンティグ重鎖断片の構築物を生じる。
【０３５１】
１２．２ ｐＶＫＥｃ及びｐＶＬＥｃ  本明細書においてｐＶＫＥｃ及びｐＶＬＥｃと称されるヒトκ及びλ免疫グロブリン軽鎖定常領域をコードしている発現ベクターは、下記のように構築される。プラスミドｐ７．５／ｔｋ３．１は前記実施例１．３のように作成される。
【０３５２】
（ａ）プラスミドｐ７．５／ｔｋ３．１は、下記の方法によりｐＶＫＥｃへ転換される。Ｃκ領域をコードしているｃＤＮＡは、アミノ酸１０４〜ｌ０７＋Ｃκをコードしている領域の５’末端にＸｈｏＩ部位を、並びに３’末端に停止コドン及びＳａｌＩ部位を含むためのプライマーにより、実施例１に説明されたように単離され、これはその後ｐ７．５／ｔｋ３．１へ、ＸｈｏＩ部位及びＳａｌＩ部位でクローニングされ、ｐＶＫＥｃを作成する。κ軽鎖可変領域（ＶＫ）ＰＣＲ産物（アミノ酸（−３）から（１０５））は、表１及び２に列記されたプライマーを用い、実施例１．４（ｂ）に説明されたように作成され、その後ｐＶＫＥｃへＡｐａＬＩ部位及びＸｈｏＩ部位でクローニングされる。κ軽鎖配列と選択された制限酵素部位の重複のために、これは、機能的シグナルペプチドを欠いているが、正確な翻訳リーディングフレームは維持しているコンティグκ軽鎖の構築物を生じる。
【０３５３】
（ｂ）プラスミドｐ７．５／ｔｋ３．１は、下記の方法によりｐＶＬＥｃへ転換される。Ｃκ領域をコードしているｃＤＮＡは、その５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＶλのアミノ酸１０５から１０７、並びにその３’末端に停止コドン及びＳａｌＩ部位を含むプライマーにより、実施例１に説明されたように単離され、これはその後ｐ７．５／ｔｋ３へＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＳａｌＩ部位でクローニングされ、ｐＶＬＥｃを作成する。λ軽鎖可変領域（ＶＬ）ＰＣＲ産物（アミノ酸（−３）から（１０４））は、表１及び２に列記されたプライマーを用い、実施例１．４（ｃ）に説明されたように作成され、その後ｐＶＬＥｃへＡｐａＬＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位でクローニングされる。λ軽鎖配列と選択された制限酵素部位の重複のために、これは、機能的シグナルペプチドを欠いているが、正確な翻訳リーディングフレームは維持しているコンティグλ軽鎖の構築物を生じる。
【０３５４】
１２．３ Ｆａｂの分泌型又は膜結合型  これらの発現ベクター（ｐＶＨＥｃ、ｐＶＫＥｃ及びｐＶＬＥｃ）を、細胞表面又は細胞外空隙へのＦａｂの標的化のために分泌シグナル、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、又はそれらの組合せをクローニングするプロトタイプベクターとして利用する。例えば表７に示されたようなこれらのシグナル及びドメインは、ｐＶＨＥｃのＮｃｏＩ及びＢｓｓＨＩＩの間の（又はｐＶＫＥｃ及びｐＶＬＥｃのＮｃｏＩ及びＡｐａＬＩ）のＦａｂのＮ末端側及び／又はＣ末端側のＳａｌＩ部位のいずれかに挿入することができる。細胞外区画への分泌に関してＦａｂを標的化するために、シグナルペプチドが、Ｆａｂ鎖、ＶＨ−ＣＨ１又は軽鎖のいずれか又は両方のＮ末端に挿入される。細胞外提示のための形質膜におけるＦａｂの係留のために、膜貫通ドメインが、ＶＨ−ＣＨ１鎖及び／又は軽鎖のカルボキシル末端に添加される。細胞質ドメインも添加される。
【０３５５】
【表７】
2004532645.tif 000051
位置の欄の略号：ＥＳ、細胞外間隙；ＰＭ、形質膜
【０３５６】
実施例１３
ヒト単鎖−Ｆｖ（ＳｃＦｖ）抗体ライブラリーの構築
１３．１  ヒトｓｃＦｖ発現ベクターｐ７．５／ｔｋ３．２及びｐ７．５／ｔｋ３．３は、図１０に説明されたように、下記方法により構築される。プラスミドｐ７．５／ｔｋ３は、前記実施例１．３に説明されたように作成された。プラスミドｐ７．５／ｔｋ３は、ＮｃｏＩ部位とＡｐａＬＩ部位の間の４個のヌクレオチドＡＴＡＣを、ＡＴＡＧＣへ代えることにより、ｐ７．５／ｔｋ３．１へと転換し、その結果ＮｃｏＩ中のＡＴＧ開始コドンは、挿入されたシグナルペプチドを伴うことなくＡｐａＬＩとインフレームであった。これは、実施例１．３に説明されたようなＮｏｔＩ−から−ＳａｌＩカセット（配列番号：２９）の、 本明細書において配列番号：１１２と称される、以下の配列
2004532645.tif 000052
を有するカセットによる交換により、簡便に達成される。
【０３５７】
プラスミドｐ７．５／ｔｋ３．１は、配列番号：１１３と称されるＸｈｏＩ及びＳａｌＩ間の領域（すなわち、配列番号：１１２のヌクレオチド３０から５１）の、下記カセットとの置換により、ｐ７．５／ｔｋ３．２へ転換される：ＸｈｏＩ−（Ｖκのアミノ酸１０６〜１０７をコードしているヌクレオチド）−（１０個のアミノ酸リンカーをコードしているヌクレオチド）−Ｇ−ＢｓｓＨＩＩ−ＡＴＧＣ−ＢｓｔＥＩＩ−（ＶＨのアミノ酸１１１〜１１３をコードしているヌクレオチド）−停止コドン−ＳａｌＩ。これは、ｐ７．５／ｔｋ３．１を、ＸｈｏＩ及びＳａｌＩで消化し、かつ配列番号：１１４と称される配列
2004532645.tif 000053
を有するカセットを挿入することにより達成される。ＶκとＶＨの間のリンカーは、最終サイズが１４個のアミノ酸であり、最後の４個のアミノ酸は、下記のように挿入されるＶＨ ＰＣＲ産物に寄与している。このリンカーの配列は、
2004532645.tif 000054
であり、これはアミノ酸
2004532645.tif 000055
をコードしている。
【０３５８】
プラスミドｐ７．５／ｔｋ３．１は、本明細書において配列番号：１１７と称されるＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩの間の領域（すなわち、配列番号：１１２のアミノ酸６〜５１のヌクレオチド）の、下記カセットとの置換により、ｐ７．５／ｔｋ３．３へ転換される：ＨｉｎｄＩＩＩ−（Ｖλのアミノ酸残基１０５〜１０７をコードしているヌクレオチド）−（１０個のアミノ酸リンカーをコードしているヌクレオチド）−Ｇ−ＢｓｓＨＩＩ−ＡＴＧＣ−ＢｓｔＥＩＩ−（ＶＨのアミノ酸１１１〜１１３をコードしているヌクレオチド）−停止コドン−ＳａｌＩ。これは、ｐ７．５／ｔｋ３．１を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化し、かつ配列
2004532645.tif 000056
を有するカセットを挿入することにより達成される。ＶλとＶＨの間のリンカーは、最終サイズが１４個のアミノ酸であり、最後の４個のアミノ酸は、下記のように挿入されるＶＨ ＰＣＲ産物に寄与している。このリンカーの配列は、
2004532645.tif 000057
であり、これはアミノ酸
2004532645.tif 000058
をコードしている。
【０３５９】
１３．２ ｓｃＦｖの細胞質ゾル型  ヒトκ又はλ免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖポリペプチドをコードしている発現ベクターは、ヒト重鎖可変領域とインフレームで融合され、これは下記を構築している：
（ａ）細胞質ゾルＶκＶＨ ｓｃＦｖ発現産物は、下記のように調製される。実施例１．４（ｂ）のように作成されたκ軽鎖可変領域（Ｖκ）ＰＣＲ産物（アミノ酸（−３）から（１０５））は、表１及び２に列記されたプライマーを用い、ＡｐａＬＩ部位及びＸｈｏＩ部位の間でｐ７．５／ｔｋ３．２へクローニングされる。κ軽鎖配列と選択された制限酵素部位の間の重複のために、これは、下流のリンカーと同じ翻訳リーディングフレーム内のコンティグκ軽鎖の構築物を生じる。実施例１．４（ａ）のように作成された重鎖可変領域（ＶＨ）ＰＣＲ産物（アミノ酸（−４）から（１１０））は、表１及び２に列記されたプライマーを用い、ＢｓｓＨＩＩ部位及びＢｓｔＥＩＩ部位の間でｐ７．５／ｔｋ３．２へクローニングされ、完全なｓｃＦｖオープンリーディングフレームを形成する。得られる産物は、１４個のアミノ酸のリンカーにより接続されたＶκ−ＶＨ融合タンパク質の細胞質ゾル型である。このｓｃＦｖも、これらの制限部位及びＶκシグナルペプチドの一部によりコードされたアミノ末端で、６個の余分のアミノ酸に先行される。
【０３６０】
（ｂ）細胞質ゾルＶλＶＨ ｓｃＦｖ発現産物は、下記のように調製される。実施例１．４（ｃ）のように作成されたλ軽鎖可変領域（ＶＬ）ＰＣＲ産物（アミノ酸（−３）から（１０４））は、表１及び２に列記されたプライマーを用い、ＡｐａＬＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でｐ７．５／ｔｋ３．３へクローニングされる。λ軽鎖配列と選択された制限酵素部位の間の重複のために、これは、下流のリンカーと同じ翻訳リーディングフレーム内のコンティグλ軽鎖の構築物を生じる。実施例１．４（ａ）のように作成された重鎖可変領域（ＶＨ）ＰＣＲ産物（アミノ酸（−４）から（１１０））は、表１及び２に列記されたプライマーを用い、ＢｓｓＨＩＩ部位及びＢｓｔＥＩＩ部位の間でｐ７．５／ｔｋ３．３へクローニングされ、完全なｓｃＦｖオープンリーディングフレームを形成する。得られる産物は、１４個のアミノ酸のリンカーにより接続されたＶλ−ＶＨ融合タンパク質の細胞質ゾル型である。このｓｃＦｖも、これらの制限部位及びＶλシグナルペプチドの一部によりコードされたアミノ末端で、６個の余分のアミノ酸に先行される。
【０３６１】
１３．３ ｓｃＦｖの分泌型又は膜結合型  １３．２項に説明された細胞質ゾルｓｃＦｖ発現ベクターを、細胞表面又は細胞外空隙へのｓｃＦｖポリペプチドの標的化のために分泌シグナル、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、又はそれらの組合せをクローニングするプロトタイプベクターとして利用する。シグナルペプチド及び膜係留ドメインの例は、前記表７に示している。細胞外空隙へ分泌されるｓｃＦｖポリペプチドを作成するために、インフレームに分泌シグナルペプチドをコードしているカセットが、ｐ７．５／ｔｋ３．２又はｐ７．５／ｔｋ３．３のＮｃｏＩ及びＡｐａＬＩ部位の間のｓｃＦｖポリペプチドのＮ末端において発現されるように挿入される。Ｉｇ架橋又はＩｇ結合を基にした選択のために膜結合したｓｃＦｖを作成するために、シグナルペプチドに加え、Ｃμの膜結合型をコードしているカセットが、ＶＨのアミノ酸１１１〜１１３をコードしているヌクレオチドの下流及びインフレームで、ＢｓｔＥＩＩ及びＳａｌＩ部位の間のｓｃＦｖのＣ末端にクローニングされる。細胞質ドメインも追加される。
【０３６２】
実施例１４
ラクダ化されたヒト単一ドメイン抗体ライブラリーの構築
ラクダ種は、重鎖のみを使用し、重鎖抗体と称される抗体が作成される。ポックスウイルス発現システムは、分泌型及び膜結合型の両方のヒト単一ドメインライブラリーの作成に改良可能であり、ここでヒトＶＨドメインは、「ラクダ化」、すなわち、ラクダ抗体のＶＨＨドメインに類似するように変更され、その後これは機能アッセイ又はＩｇ−架橋／結合のいずれかを基に選択され得る。ヒトＶＨ遺伝子は、標準の突然変異誘発法によりラクダ化され、よりラクダのＶＨＨ遺伝子に類似する。例えば、表１及び２から選択された適当なプライマー対を用い、実施例１．４に説明された方法を用いて作出されたヒトＶＨ ３遺伝子は、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、及びＷ４７Ｇ又はＩとの置換によりラクダ化される。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ｓ．の論文（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．、２３１：２５−３８）参照のこと。分泌型単一ドメイン抗体ライブラリーを作成するために、ラクダ化されたヒトＶＨ遺伝子をコードしているカセットが、実施例１．２に説明されたように作成されたｐＶＨＥｓへクローニングされ、ＢｓｓＨＩＩ部位及びＢｓｔＥＩＩ部位の間でインフレームで発現される。膜結合型単一ドメイン抗体ライブラリーを作成するために、ラクダ化されたヒトＶＨ遺伝子をコードしているカセットが、実施例１．１に説明されたように作出されたｐＶＨＥへクローニングされ、ＢｓｓＨＩＩ部位及びＢｓｔＥＩＩ部位の間でインフレームで発現される。ベクターｐＶＨＥ及びｐＶＨＥｓは既に、ＮｃｏＩ部位とＢｓｓＨＩＩ部位の間にクローニングされたシグナルペプチドを有している。ラクダ化されたヒトＶＨ遺伝子の３種のＣＤＲ領域のアミノ酸残基に、大規模なランダム化が施され、かつ得られたライブラリーは、本明細書に説明されたようにポックスウイルスにおいて選択することができる。
【０３６３】
実施例１５
増強された免疫エフェクター機能に関するＦｃ修飾した抗体の選択
ヒトモノクローナル抗体は、増大しつつあるヒト疾患の治療のために治療的用途に使用される。ヒト抗体は、特異的細胞受容体を介したシグナル伝達を誘導又はブロックすることができる。一部の用途において、ヒト抗体は、抗体分子のＦｃ部分とこれらのエフェクター細胞上のマッチするＦｃ受容体（ＦｃＲ）の間の相互作用を介して、様々なアクセサリーエフェクター細胞のいずれかを活性化することができる。従って、ＦｃＲを介した結合及びシグナル伝達もしくは補体カスケード成分のような免疫エフェクター機能の他のメディエーターの結合及び活性化を増強又は阻害する免疫グロブリン重鎖定常領域配列の修飾を同定することはかなり興味深い。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｘｕ， Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００：１６−２６（２０００）；及び、米国特許第６，１９４，５５１号を参照し、これらはその全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０３６４】
このような特異的エフェクター機能のひとつは、抗体−依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）であり、その過程において、抗体で覆われた標的細胞がＮＫ細胞又は他の単球により破壊される。ＡＤＣＣは、標的細胞の表面分子を特異的にコードした可変領域及びＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩを特異的にコードした定常領域を伴う抗体分子により媒介される。結晶構造及び位置指定突然変異誘発の解析を通して、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲＩＩＩ結合部位は、主に下側のヒンジ、すなわちＩｇＧ１の約アミノ酸２４７〜２５２、及び隣接するＣＨ２領域に局在していることが決定される。例えば、Ｓａｒｍａｙ Ｇ．ら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２９：６３３−６３９（１９９２）；及び、Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ， Ｔ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ、２９：３１９−２６（１９９２）参照のこと。選択可能な哺乳類発現ベクターにおいて無作為に変異された下側ヒンジ領域を伴う抗体分子をコードしている遺伝子のライブラリーを構築することにより、ＡＤＣＣについて増強された機能を伴う特異的定常領域変種を選択することが実現可能であると考えられる。この戦略の履行を簡略化するために、所望の特異性を付与する定義された免疫グロブリン可変領域配列を伴うライブラリーが構築される。
【０３６５】
１５．１． ｐＶＨＥ−Ｘ及びｐＶＫＥ−Ｘ又はｐＶＬＥ−Ｘの構築  プラスミドｐＶＨＥ−Ｘは限定された可変領域を伴うヒトＶＨ発現ベクターであるり、本明細書においてＸと称されるが、これは下記のように構築される。この構築は、図１１に示される。限定された特異性Ｘを伴う抗体は、常法に従い単離されるか、又は本明細書に説明された方法に従い、ポックスウイルスベクターを用い、真核細胞において産生及び選択される。必要であるならば、この抗体のＶＨ遺伝子は、実施例１．１に記されたように作成されたｐＶＨＥへ、ＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位の間にサブクローニングされ、プラスミドｐＶＨＥ−Ｘを得る。更に必要ならば、抗体のＶＫ又はＶＬ遺伝子が、実施例１．３に記されたように作成されたｐＶＫＥへ、ＡｐａＬＩ／ＸｈｏＩ部位の間にサブクローニングされるか、もしくは、実施例１．３に記されたように作成されたｐＶＬＥへ、ＡｐａＬＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にサブクローニングされ、各々ｐＶＫＥ−Ｘ又はｐＶＬＥ−Ｘを作成する。
【０３６６】
１５．２  ヒトＣγ１カセットの単離  ヒトＣγ１重鎖をコードしているｃＤＮＡを、骨髄ＲＮＡから、ＳＭＡＲ（登録商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを用い、下記プライマーにより単離される：
ｈｕＣγ１−５Ｂ：
2004532645.tif 000059
ｈｕＣγ１−３Ｓ：
2004532645.tif 000060
【０３６７】
このＰＣＲ産物は、下記エレメントを含む：ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＥＩＩ−（ＶＨのアミノ酸１１１〜１１３をコードしているヌクレオチド）−（Ｃγ１のアミノ酸１１４〜４７８をコードしているヌクレオチド）−ＴＧＡ−ＳａｌＩ。この産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｉｔＩＩ／ＫＳへ、ＢａｍＨＩ部位及びＳａｌＩ部位でサブクローニングされ、Ｃγ１のＣＨ１ドメイン中のアミノ酸１９１及び１９２に相当する第二のＢｓｔＥＩＩ部位が、アミノ酸配列に変化を及ぼすことなく、部位特異的変異誘発により除去される。
【０３６８】
１５．３ Ｆｃγ１ライブラリーの構築  Ｃγ１変種は、下記方法による重複ＰＣＲにより作成される。１５．２項に説明されたように作成されたＢｓｔＥＩＩ−突然変異誘発したＣγ１カセットを、鋳型として使用する。第一回のＰＣＲラウンドにおいて、ふたつの個別の反応においてＣγ１−センス／Ｃγ１−内部−Ｒ及びＣγ１−内部−Ｓ／Ｃγ１−リバースプライマーセットを用い増幅が行われる。
Ｃγ１−センス：
2004532645.tif 000061
Ｃγ１−内部−Ｒ：
2004532645.tif 000062
Ｃγ１−内部−Ｓ：
2004532645.tif 000063
Ｃγ１−リバース：
2004532645.tif 000064
（Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｎ＝Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ）
Ｃγ１−内部−Ｒ及びＣγ１−内部−Ｓプライマーは、下側ヒンジにおいて６個のアミノ酸含有残基２４７〜２５２の変種をコードしている縮重配列尾部を有する。第二回のＰＣＲラウンドにおいて、第一回のラウンドの精製産物が、Ｃγ１−センス及びＣγ１−リバースプライマーセットを用いる、重複ＰＣＲにより融合される。
【０３６９】
得られた産物は、サイズおよそ１０００ｂｐであり、６個のアミノ酸位置２４７〜２５２の各々において無作為に２０種全てのアミノ酸をコードしている。このＰＣＲ産物は、ＢｓｔＥＩＩ及びＳａｌＩにより消化され、かつＢｓｔＥＩＩ／ＳａｌＩ−消化された１５．１項に説明されたように作成されたｐＶＨＥ−Ｘへクローニングされ、ｐＶＨＥ−Ｘ−γ１変種のライブラリーを作成する。その後これらの変種は、実施例５に説明されたような三分子組換えを用いて、ワクシニアウイルスへ導入される。軽鎖を収容している組換えワクシニアウイルスとの結合において、Ｆｃγ１ライブラリーは、ＶＨＥ−Ｘ−γ１発現している抗体へ増強されたＡＤＣＣ活性を付与するＦｃ変種の選択に使用される。
【０３７０】
１５．４  その他の用途  アミノ酸２４７〜２５２での変種の作成に加え、他の残基、例えばＩｇＧ１のアミノ酸２７８〜２８２及びアミノ酸３４６〜３５１も、ＦｃγＲＩＩＩへの結合に関連している。増強されたＡＤＣＣ活性を示すアミノ酸２４７〜２５２におけるＦｃγ１変種の同定後、同じ戦略を用い、ＡＤＣＣ機能の相乗的増強を示す他のふたつの領域内の更なる変異を同定することができる。
【０３７１】
同じ原理／技術を適用し、異なるＦｃ受容体に結合する他の免疫グロブリン重鎖定常領域アイソタイプにエフェクター機能を付与する変種を同定することができる。好ましい態様において、標的化されるべきこれらの受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ−Ａ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ１、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ２、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃεＲＩが含まれる。別の好ましい態様において、補体成分のＦｃ領域の結合又は胎盤経由の輸送のための膜様胎盤へのＦｃ媒介した結合を増強する変種が、選択される。
【０３７２】
実施例１６
特異的免疫グロブリン遺伝子組換えワクシニアウイルスに感染した細胞選択を促進するための重鎖融合タンパク質の構築
１６．１ ＣＨ１−Ｆａｓの構築  Ｆａｓの膜貫通ドメイン及びデスドメインに融合されたＣμのヒト重鎖ＣＨ１ドメインを含む融合タンパク質をコードしている発現ベクターは、本明細書においてＣＨ１−Ｆａｓと称されるが、これが下記の方法により構築される。この融合タンパク質は、図１３（ａ）に図示した。
【０３７３】
実施例１．１において説明されたように産生されたプラスミドｐＶＨＥは、ＢｓｔＥＩＩ及びＳａｌＩにより消化され、かつ約１．４Ｋｂの比較的小さいＤＮＡ断片はゲル精製される。この比較的小さい断片は、その後フォワードプライマーＣＨ１（Ｆ）
2004532645.tif 000065
及びリバースプライマーＣＨ１（Ｒ）
2004532645.tif 000066
を使用するＰＣＲ反応における鋳型として使用される。得られた約３２０塩基対のＰＣＲ産物は、ゲルで精製される。
【０３７４】
Ｆａｓの膜貫通ドメイン及びデスドメインを含むＤＮＡ断片は、プラスミドｐＢＳ−ＡＰＯ１４．２から、フォワードプライマーＦＡＳ（Ｆ）
2004532645.tif 000067
及びリバースプライマーＦＡＳ（Ｒ）
2004532645.tif 000068
により増幅される。得られた約５０４塩基対のＰＣＲ産物は、ゲルで精製される。
【０３７５】
その後得られた３２０及び５０４塩基対の断片は、フォワードプライマーＣＨ１（Ｆ）及びリバースプライマーＦＡＳ（Ｒ）を使用するＰＣＲにおいて一緒にされ、約８２４塩基対の融合断片を作成する。この断片は、ＢｓｔＥＩＩ及びＳａｌＩで消化され、かつ得られた８１０塩基対の断片はゲルで精製される。プラスミドｐＶＨＥも、ＢｓｔＥＩＩ及びＳａｌＩで消化され、かつ約５．７Ｋｂの比較的大きい得られた断片がゲルで精製される。これらの２種のＢｓｔＥＩＩ／ＳａｌＩ断片は、その後ライゲーションされ、ＣＨ１−Ｆａｓを作成する。
【０３７６】
１６．２ ＣＨ４−Ｆａｓの構築  Ｆａｓの膜貫通ドメイン及びデスドメインに融合されたＣμのヒト重鎖ＣＨ１−ＣＨ４ドメインを含む融合タンパク質をコードしている発現ベクターは、本明細書においてＣＨ４−Ｆａｓと称されるが、これが下記の方法により構築される。この融合タンパク質は、図１３（ｂ）に図示した。
【０３７７】
実施例１．１において説明されたように産生されたプラスミドｐＶＨＥは、ＢｓｔＥＩＩ及びＳａｌＩにより消化され、かつ約１．４Ｋｂの比較的小さいＤＮＡ断片はゲル精製される。この比較的小さい断片は、その後フォワードプライマーＣＨ４（Ｆ）
2004532645.tif 000069
及びリバースプライマーＣＨ４（Ｒ）
2004532645.tif 000070
を使用するＰＣＲ反応における鋳型として使用される。得られた約２８６塩基対のＰＣＲ産物は、ゲルで精製される。
【０３７８】
Ｆａｓの膜貫通ドメイン及びデスドメインを含むＤＮＡ断片は、プラスミドｐＢＳ−ＡＰＯ１４．２から、フォワードプライマーＦＡＳ（Ｆ−２）
2004532645.tif 000071
及び１６．１項に記したリバースプライマーＦＡＳ（Ｒ）により増幅される。得られた約５０４塩基対のＰＣＲ産物は、ゲルで精製される。
【０３７９】
その後得られた２６８及び５０４塩基対の断片は、フォワードプライマーＣＨ４（Ｆ）及びリバースプライマーＦＡＳ（Ｒ）を使用するＰＣＲにおいて一緒にされ、約７６５塩基対の融合断片を作成する。この断片は、ＳａｃＩＩ及びＳａｌＩで消化され、かつ得られた７５０塩基対の断片はゲルで精製される。プラスミドｐＶＨＥも、ＳａｃＩＩ及びＳａｌＩで消化され、かつ約６．８Ｋｂの比較的大きい得られた断片がゲルで精製される。これらの２種のＳａｃＩＩ／ＳａｌＩ断片は、その後ライゲーションされ、ＣＨ４−Ｆａｓを作成する。
【０３８０】
１６．３ ＣＨ４（ＴＭ）−Ｆａｓの構築  Ｆａｓのデスドメインに融合されたＣμのヒト重鎖ＣＨ１−ＣＨ４ドメイン及び膜貫通ドメインを含む融合タンパク質をコードしている発現ベクターは、本明細書においてＣＨ４（ＴＭ）−Ｆａｓと称されるが、これが下記の方法により構築される。この融合タンパク質は、図１３（ｃ）に図示した。
【０３８１】
実施例１．１において説明されたように産生されたプラスミドｐＶＨＥは、ＢｓｔＥＩＩ及びＳａｌＩにより消化され、かつ約１．４Ｋｂの比較的小さいＤＮＡ断片はゲル精製される。この比較的小さい断片は、その後１６．２項に記されたフォワードプライマーＣＨ４（Ｆ）及びリバースプライマーＣＨ４（Ｒ２）
2004532645.tif 000072
を使用するＰＣＲ反応における鋳型として使用される。得られた約３５６塩基対のＰＣＲ産物は、ゲルで精製される。
【０３８２】
Ｆａｓのデスドメインを含むＤＮＡ断片は、プラスミドｐＢＳ−ＡＰＯ１４．２から、フォワードプライマーＦＡＳ（Ｆ３）
2004532645.tif 000073
及び１６．１項に記したリバースプライマーＦＡＳ（Ｒ）により増幅される。得られた約４４０塩基対のＰＣＲ産物は、ゲルで精製される。
【０３８３】
その後得られた３５６及び４４０塩基対の断片は、フォワードプライマーＣＨ４（Ｆ）及びリバースプライマーＦＡＳ（Ｒ）を使用するＰＣＲにおいて一緒にされ、約７９５塩基対の融合断片を作成する。この断片は、ＳａｃＩＩ及びＳａｌＩで消化され、かつ得られた７８０塩基対の断片はゲルで精製される。プラスミドｐＶＨＥも、ＳａｃＩＩ及びＳａｌＩで消化され、かつ約６．８Ｋｂの比較的大きい得られた断片がゲルで精製される。これらの２種のＳａｃＩＩ／ＳａｌＩ断片は、その後ライゲーションされ、ＣＨ４（ＴＭ）−Ｆａｓを作成する。
【０３８４】
１６．４  多様なＶＨ遺伝子のＩｇ−Ｆａｓ融合タンパク質へのクローニング及び挿入  実施例１．４（ａ）において説明されたように産生された重鎖可変領域（ＶＨ）ＰＣＲ産物（アミノ酸（４）から（１１０））は、表１及び２に列記されたプライマーを用い、ＣＨ１−Ｆａｓ、ＣＨ４−Ｆａｓ及びＣＨ４（ＴＭ）−ＦａｓのＢｓｓＨＩＩ部位及びＢｓｔＥＩＩ部位へクローニングされる。ＣＨ１ドメイン配列と選択された制限酵素部位の間の重複のために、これは、機能性シグナルペプチドは欠いているが、正確な翻訳リーディングフレーム内に維持されているコンティグ重鎖断片の構築物を生じる。
【０３８５】
実施例１７
Ｉｇα及びＩｇβ−発現するＨｅＬａＳ３及びＣＯＳ７細胞株の作成
細胞表面上において特異的ヒトモノクローナル抗体を発現するために、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンは、Ｂ細胞受容体複合体の他のタンパク質と物理的に結合していなければならない。従って宿主細胞がヒト抗体ライブラリーを発現することができるようにするために、これらは、抗体の膜結合した受容体への効率的合成及び集成に必要な分子及び構造を、発現することができなければならない。マウスリンパ腫細胞は、細胞表面上の特異的ヒト抗体の発現に必要な分子及び構造を発現している。しかし、ヒト抗体ライブラリー発現に関するこれらのリンパ腫細胞の使用のひとつの欠点は、内在性に発現された免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖は、トランスジェニック免疫グロブリン鎖と同時に集成され、非特異的な異質分子の形成を招き、これは抗原特異的受容体を希釈することである。ヒト抗体ライブラリーの発現にマウスリンパ腫細胞を使用する際の別の欠点は、ワクシニアウイルスはリンパ系細胞株において余り複製しないことである。従って、特異的ヒト抗体の発現に好ましい細胞型は、高力価のワクシニアウイルス産生を許容するもの及びＢ細胞系統に由来しないものである。好ましい細胞型は、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ７細胞及びＢＳＣ−１細胞を含む。
【０３８６】
Ｂ細胞受容体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、Ｉｇα及びＩｇβ膜貫通タンパク質のヘテロ二量体に物理的に結合している（Ｒｅｔｈ， Ｍ．、 Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０：９７（１９９２））。この物理的結合は、膜結合した免疫グロブリンの細胞表面への効率的輸送、及びＢ細胞受容体を介したシグナル伝達に必要である（Ｖｅｎｋｉｔａｒａｍａｎ， Ａ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：７７７（１９９１））。しかし、Ｉｇα／Ｉｇβヘテロ二量体が異種細胞株における膜結合型免疫グロブリンの発現に必要かつ十分であるかどうかは不明である。従って、ＨｅＬａＳ３及びＣＯＳ７細胞上のヒト抗体の細胞表面発現が、ヒトＩｇα及びＩｇβ ｃＤＮＡによるそれらのトランスフェクション後に評価される。
【０３８７】
１７．１  ヒトＩｇα及びＩｇβ ｃＤＮＡのＰＣＲによるクローニング  ＥＢＶ−形質転換されたヒトＢ細胞から作成されたｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応の鋳型として使用し、ヒトＩｇα及びＩｇβ ｃＤＮＡを増幅した。ヒトＩｇα ｃＤＮＡを、下記プライマーにより増幅した：
ｉｇα５’−
2004532645.tif 000074
本明細書において（配列番号：１３６）と称す；及び
ｉｇα３’−
2004532645.tif 000075
本明細書において（配列番号：１３７）と称す；。
ヒトＩｇβ ｃＤＮＡは、下記プライマーにより増幅した：
ｉｇβ５’−
2004532645.tif 000076
本明細書において（配列番号：１３８）と称す；及び
ｉｇβ３’−
2004532645.tif 000077
本明細書において（配列番号：１３９）と称す；。
【０３８８】
ＩｇαＰＣＲ反応由来の産物は、ｐＩＲＥＳｎｅｏ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に、ＥｃｏＲＩ部位及びＢａｍＨＩ部位においてクローニングし、ＩｇβＰＣＲ反応由来のものは、ｐＩＲＥＳｈｙｇベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）へＢａｍＨＩ部位及びＢｓｔＸＩ部位でクローニングした。クローニングしたＩｇα及びＩｇβの同一性は、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０３８９】
１７．２ Ｉｇα及びＩｇβ−発現するＨｅＬａＳ３及びＣＯＳ７の安定したトランスフェクタントの確立  ＨｅＬａＳ３及びＣＯＳ７細胞（６−ウェルプレート中１ｘ１０６／ウェル）を、精製したｐＩＲＥＳｎｅｏ−Ｉｇα及びｐＩＲＥＳｈｙｇ−ＩｇβプラスミドＤＮＡ各０．５〜１μｇで、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＩＮＥ ＰＬＵＳ試薬（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、トランスフェクションした。開始の２日後、細胞を、Ｇ４１８（０．４ｍｇ／ｍｌ）及びヒグロマイシンＢ（０．２ｍｇ／ｍｌ）で約２週間選択した。薬物耐性ＨｅＬａＳ３コロニーを、直接単離し、かつＣＯＳ７トランスフェクタントを、限定希釈によりクローニングした。これらの各クローンにおけるＩｇα及びＩｇβの発現は、その後ＲＴ−ＰＣＲにより解析し、代表的クローンの結果を、図１４に示した。
【０３９０】
実施例１８
高親和性ヒト抗体の多様なライブラリーの構築
本発明は、免疫グロブリン遺伝子の多様なライブラリーのワクシニア又は他のポックスウイルスにおける構築のための唯一利用可能な方法である。ワクシニアベクターは消化され、高レベルの膜受容体発現を生じ、抗原被覆したマトリックスへの効率的結合を可能にする。あるいは、組換え免疫グロブリン重鎖遺伝子を、操作し、抗原による受容体の架橋時にアポトーシスを誘導することができる。ワクシニアウイルスは、プログラムされた細胞死を受けている細胞からであっても容易かつ効率的に回収されるので、このシステムの独自の特性は、特異的ヒト抗体遺伝子の迅速な選択を可能にする。
【０３９１】
最適な免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、順次選択され、これは全ての利用可能な重鎖及び軽鎖の組合せのスクリーニングにより多様性を最大化する。逐次スクリーニング戦略は、最初に１０４個の多様な軽鎖の小さいライブラリーの存在下で、１０５個のＨ鎖組換え体の小さいライブラリーから最適な重鎖を選択する。この最適化されたＨ鎖は、次に１０６〜１０７個の組換えＬ鎖のより大きいライブラリーからの最適化されたパートナーの選択に使用される。一旦最適なＬ鎖が選択されたならば、１０６〜１０７個の組換えＨ鎖のより大きいライブラリーから更なる最適化されたＨ鎖を戻し選択することが可能である。この繰り返しは、１０１４個と多数のＨ２Ｌ２組合せと特異的に高親和性の抗体の選択を可能にするブートストラップ戦略である。対照的に、ファージライブラリーにおける単鎖Ｆｖの又は単プラスミド上にコードされた個別のＶＨ−ＣＨ１及びＶＬ−ＣＬ遺伝子で構成されたＦａｂの選択は、恐らく１０１１個ファージ粒子という、単ファージライブラリーの実際のサイズの限界により限定される段階プロセスのひとつである。
【０３９２】
１０７個Ｈ鎖及び１０７個Ｌ鎖の１０１４組合せのスクリーニングは実行不可能であるので、最適のＨ鎖の選択は、非感染性ベクター中の１０４個Ｌ鎖の存在下における１０５個Ｈ鎖ワクシニア組換え体のライブラリーから始まる。これらの組合せは、大部分は様々なエピトープに対する低親和性抗体から生じ、かつ例えば、１〜１００個の異なるＨ鎖の選択を招く。基本的抗体に関して１００個のＨ鎖が選択された場合、その後これらは、１００個の最適なＬ鎖パートナーを見つけるために、１０６又は１０７個のワクシニア組換え体Ｌ鎖のより大きいライブラリーによる第二の選択サイクルにおいて使用することができる。その後当初のＨ鎖は取り分けられ、１００個のＬ鎖を使用し、新たに高親和性Ｈ鎖をより大きい１０６又は１０７個のＨ鎖ライブラリーから選択する。
【０３９３】
この戦略は、インビトロ親和性成熟の一種である。通常の免疫応答の場合のように、低親和性抗体が最初に選択され、かつ免疫感作の反復サイクルの間のより高親和性子孫の選択の基礎として利用される。より高い親和性クローンはインビボの体細胞変異に由来するが、このインビトロ戦略は、免疫グロブリン鎖の再結合により同じ目的を達成している。両方の場合において、改善された免疫グロブリン鎖のパートナーは、当初の低親和性抗体のパートナーと同じである。
【０３９４】
この戦略の基礎は、低親和性抗体の最初の選択の活用である。低親和性抗体が選択されることは必須である。Ｈ鎖及びＬ鎖の逐次選択するワクシニア−ベースの方法は、二価抗体の発現から来るアビディティの利点を有するので、これは最初の低親和性選択がうまくいったことを確実にするのによく適している。加えて、抗体発現のレベルは、ワクシニアシステムにおいて様々なプロモーターを使用することにより調節することができる。例えば、ワクシニアに適合されたＴ７ポリメラーゼシステムは、未変性のワクシニアプロモーターに比べ、高レベルの発現を生じる。初回選択ラウンドは、低親和性「基本的抗体」の選択を確実にするために、高レベルのＴ７発現システムを基にし、かつ以降の選択ラウンドは、比較的高親和性誘導体の選択を起動するために、低レベル発現を基礎とすることができる。
【０３９５】
ワクシニアにおける免疫グロブリン遺伝子の多様なライブラリー構築に関する本発明の方法の概略を、以下に示す：
１．  本明細書に記された方法に従い、重鎖ｃＤＮＡライブラリーに結合された免疫グロブリン膜が、ワクシニアウイルスベクターにおいて、ヒトリンパ球から構築される。特に操作された細胞、例えば、ＣＨ３３細胞、マウス骨髄腫細胞、及びヒトＥＢＶ形質転換細胞株、又は好ましくはＨｅＬａ細胞、及び競合する免疫グロブリン鎖を産生せずかつワクシニア複製を効率的に支持する他の非リンパ球様細胞が、ウイルスライブラリーにより、平均で各細胞が１個のウイルスの免疫グロブリン重鎖組換え体で感染されているような希釈で、感染される。
２．  これらの同じ細胞は更に、同じワクシニアウイルスベクターにおいて構築された免疫グロブリン軽鎖ライブラリー由来のソラレン失活された免疫グロブリン軽鎖組換えワクシニアウイルスにより感染される。あるいは、これらの細胞は、プラスミド発現ベクターにおいて、免疫グロブリン軽鎖組換え体によりトランスフェクションされ得る。全体としての細胞集団において、各重鎖は、いずれかの軽鎖に結合することができる。
３．  これらの細胞は、細胞表面上で完全に集成された抗体の最適な発現を可能にするために、適当な期間インキュベーションされる。宿主細胞がリンパ球起源でない場合は、膜抗体発現の効率は、Ｉｇα及びＩｇβタンパク質を発現している遺伝子又はｃＤＮＡにより安定してトランスフェクションされた宿主細胞、例えば、Ｈｅｌａ細胞又はＣｏｓ７細胞の使用により、増強される。
４ａ．  関心のある抗原が、不活性ビーズに結合され、これは次に抗体発現している細胞のライブラリーと混合される。抗原で覆われたビーズに結合する細胞は回収され、かつ結合された免疫グロブリン重鎖組換えウイルスが抽出される。
４ｂ．  あるいは、蛍光タグが、関心のある抗原に、直接又は間接に結合される。抗原に結合する抗体を発現している細胞が、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）により回収される。
４ｃ．  あるいは、抗体受容体の抗原との架橋が細胞死を誘導する宿主細胞を使用することができる。これは、Ｂ細胞系の未成熟細胞である宿主細胞においては自然に生じるか、もしくはこれは免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端へのＦａｓコードされたデスドメインの取込みの結果である。溶解された細胞は、生存細胞から分離され、関連した免疫グロブリン重鎖を保持する組換えウイルスが抽出される。
５．  前記サイクルの段階１〜４を、複数回繰り返し、各回組換え体ウイルスを単離し、かつ更に最適な抗原結合に寄与している重鎖について濃縮する。
６．  一旦特異的抗体重鎖が選択されたならば、全体の手順を、最適の抗原結合に寄与する特異的免疫グロブリン軽鎖を選択するために、所有の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）ワクシニアベクターにおいて構築された免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡライブラリーについて繰り返す。重鎖及び軽鎖の逐次選択は、全ての入手可能な重鎖及び軽鎖の組合せのスクリーニングにより、多様性を最大化する。最終的なＭＡｂ産物は、単鎖Ｆｖ又は単量体Ｆａｂよりもむしろ完全に集成された二価抗体の選択により最適化される。
７．  ＭＡｂ配列が決定され、かつ特異的結合が、標準実験的技法を用い検証される。
【０３９６】
最終的Ｍａｂ産物は、単鎖Ｆｖよりむしろ完全に集成された二価抗体の選択により最適化される。すなわち、選択は、ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片よりもむしろ二価（Ｈ２Ｌ２）抗体を基にしている。全てヒトの完全抗体の合成及び集成は、哺乳類細胞において、免疫グロブリン鎖が通常の翻訳後修飾及び集成を受けるようにする。完全抗体の合成及び集成は、恐らく細菌細胞においては無効であり、かつ多くの特異性が、細菌細胞の異常な生理的環境における多くの抗体の正確な折畳みの失敗のために喪失される。
【０３９７】
機能活性を基にした特異性の選択を含む、比較的広範な抗体エピトープ特異性を選択することができる。具体的には、抗体は、標的細胞に対する特異的生理作用を基に選択することができる（例えば、活性化された単球によるＴＮＦ−分泌阻害のスクリーニング；アポトーシス誘導；など）。機能アッセイを基にした特異的Ｍａｂのスクリーニング法の概略を以下に示す：
１． 分泌型の免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡライブラリーは、本明細書に記された方法に従い調製されたワクシニアウイルスベクターにおいて、ナイーブヒトリンパ球から構築される。例えば、約１００〜約１０００個のような組換えウイルスの複数のプールが、個別に拡張され、かつプロデューサー細胞の、平均で各細胞が１個の免疫グロブリン重鎖組換えウイルスで感染されるような希釈での感染に使用される。これらの同じ細胞も、同じワクシニアウイルスベクターで構築された免疫グロブリン軽鎖ライブラリーからのソラレン失活された免疫グロブリン軽鎖組換えワクシニアウイルスで感染される。あるいは、感染細胞は、プラスミド発現ベクターにおいて、免疫グロブリン軽鎖組換え体によりトランスフェクションされ得る。全体としての細胞集団において、各重鎖は、いずれかの軽鎖に結合することができる。
２．  感染細胞は、完全に集成された抗体が分泌されるのに十分な時間インキュベーションされる。
３．  関心のある機能のインジケーター細胞が分泌された抗体のアリコートの存在下においてインキュベーションされるアッセイウェルを、設定する。これらは、例えば、ＴＮＦαを分泌している活性化された単球を含むことができる。次にＴＮＦαのための簡単なＥＬＩＳＡアッセイを用い、サイトカイン分泌を阻害する活性を含む抗体プールをスクリーニングすることができる。
４．  選択されたプールの個々のメンバーは更に、関連した免疫グロブリン重鎖を同定するために分析される。
５．  一旦特異的抗体重鎖が選択されたならば、最適な抗原結合に寄与する特異的免疫グロブリン軽鎖を選択するために、所有のワクシニアベクターにおいて構築された免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡライブラリーについて全体の手順が繰り返される。
６． ＭＡｂ配列が同定され、かつ特異的結合が、標準実験的技法を用い検証される。機能選択は、標的膜受容体の先験的知識を必要としないので、選択されたＭａｂは、治療的可能性及び関連する膜受容体を同定する道具の発見の両面がある。
【０３９８】
選択は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな結合後にヒト細胞培養物中で行われる。前述のように、これは、細菌における合成の制約に起因するレパトア制限を回避する。これは、マウスにおける相同遺伝子産物に対する免疫寛容に起因する抗体レパトアの制限も回避する。重要なヒトタンパク質のマウスホモログは、ヒト配列と８０％〜８５％同一であることが多い。従って、ヒトタンパク質に応答するマウス抗体は、ヒトとマウスにおいて異なるエピトープの１５％〜２０％に主に焦点を当てていると予想される。本発明は、広範なエピトープ特異性を伴う高親和性の全てヒトの抗体の効率的選択を可能にする。この技術は、限定された生理的意義を伴う未同定の膜受容体に対する抗体の機能選択を含む、多種多様なプロジェクト及び目標に適用可能である。
【０３９９】
本発明は、本発明の個々の局面の一つの例示として意図されている記載された具体的態様、本発明の範囲内である機能的に同等である構築物、ウイルス又は酵素により範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書に示されかつ説明されたものに加え、本発明の様々な修飾が、当業者には先の説明及び添付図面から明らかであると思われる。このような修飾は、添付された「特許請求の範囲」内に収まることが意図されている。
【０４００】
本明細書において言及された全ての刊行物及び特許明細書は、各個別の刊行物及び特許明細書が具体的かつ個別に参照として組入れられていることが示されているのと同程度に、本明細書に参照として組入れられている。１９９７年９月２２日に出願された米国特許出願第０８／９３５，３７７号、及び２０００年３月２８日に出願された米国特許出願第６０／１９２，５８６号の開示及び「特許請求の範囲」は本明細書に参照として組入れられている。
【図面の簡単な説明】
【図１】特異的ヒト抗体の抗原誘導型アポトーシスによる選択。
【図２Ａ】表面免疫グロブリンに架橋している抗原に反応して、直接又は間接に細胞死を受ける宿主細胞の調製。
【図２Ｂ】表面免疫グロブリンに架橋している抗原に反応して、ＣＴＬ−誘導した溶解又は細胞死を受けるようにデザインされた修飾されたＣＨ３３宿主細胞のバリデーション。
【図３】ｐＶＨＥの構築。
【図４】ｐＶＫＥ及びｐＶＬＥの構築。
【図５】抗原−依存型接着による特異的ヒト抗体の選択。
【図６】三分子組換え法の概略。
【図７】ｐ７．５／ｔｋ及びｐＥＬ／ｔｋプロモーターのヌクレオチド配列。ｖ７．５／ｔｋ（配列番号：１４０）及びｖＥＬ／ｔｋ（配列番号：１４２）に関する、プロモーターのヌクレオチド配列及びチミジンキナーゼ遺伝子の始まりが示され、開始コドン及びオープンリーディングフレームの一部を含む対応するアミノ酸配列は、各々、配列番号：１４１及び配列番号：１４３のようにデザインされている。
【図８】ｐＶＨＥの構築。
【図９】ポックスウイルス媒介した細胞変性作用の減弱。
【図１０】ｓｃＦｖ発現ベクターの構築。
【図１１】ｐＶＨＥ−Ｘ−Ｇ１の構築。
【図１２Ａ】ｐ７．５／ｔｋ（配列番号：１）ワクシニア伝達性プラスミドのヌクレオチド配列の修飾。新規ベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ（配列番号：２）は、本文中に説明されたようにｐ７．５／ｔｋワクシニア伝達性プラスミド由来である。
【図１２Ｂ】新規ベクターｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ（配列番号：３）は、本文中に説明されたようにｐ７．５／ｔｋワクシニア伝達性プラスミド由来である。
【図１２Ｃ】新規ベクターｐ７．５／ＡＴＧ２／ｔｋ（配列番号：４）は、本文中に説明されたようにｐ７．５／ｔｋワクシニア伝達性プラスミド由来である。
【図１２Ｄ】新規ベクターｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ（配列番号：５）は、本文中に説明されたようにｐ７．５／ｔｋワクシニア伝達性プラスミド由来である。
【図１３】ＩｇＭ−Ｆａｓ融合産物の構築。
【図１４】トランスフェクションしたＣＯＳ７及びＨｅＬａＳ３細胞株におけるＩｇα及びＩｇβの発現。総ＲＮＡは、（Ａ）ＣＯＳ７−Ｉｇαβ−１、（Ｂ）ＣＯＳ７−Ｉｇαβ−２、（Ｃ）ＨｅＬａＳ３−Ｉｇαβ−１、及び（Ｄ）ＥＢＶ−形質転換したヒトＢ細胞から単離し、逆転写酵素の存在又は非存在下で、ｃＤＮＡへ逆転写し、その後ｉｇα５’／ｉｇα３’及びｉｇβ５’／ｉｇβ３’プライマーセットによりＰＣＲ増幅した。次に、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル上で分析した。ヒトＢ細胞は、Ｉｇα及びＩｇβの両方について別のスプライシングを示すことに注意。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｓ．らの論文（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：６５１（１９９５））参照のこと。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532645.tif 000351
【国際調査報告】
2004532645.tif 000352
2004532645.tif 000353
2004532645.tif 000354
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