(57)【要約】本発明は、本件明細書において“ＬＴＲＰＣ２”（長期過渡受容体電位チャネル）と名付けられたＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）調節カルシウム膜貫通チャネルポリペプチドの新規ファミリーの同定及び分離に関する。これらのポリペプチドを含むチャネルは、マイクロモル領域の細胞質内ＡＤＰＲの濃度に応答して開き、高細胞内レベルのカルシウムの存在下で高められた活性を示し、細胞内カルシウム貯蔵部位の枯渇又は減少に応答しない。本発明は、さらに結合のためのＬＴＲＰＣ２の利用方法、及びＬＴＲＰＣ２活性の調節及びＬＴＲＰＣ２透過性の測定方法に関する。本発明は、さらにＬＴＲＰＣ２の発現の調節方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＴＲＰＣ２と結合できる候補生理活性剤のスクリーニング方法であって、
ａ）ＬＴＲＰＣ２蛋白質又はそのフラグメントを前記候補剤と接触させる工程、及び
ｂ）前記候補剤の前記ＬＴＲＰＣ２蛋白質又はそのフラグメントとの結合を決定する工程を含む前記方法。
【請求項２】
２つ以上の前記候補剤のライブラリーを前記ＬＴＲＰＣ２蛋白質又はそのフラグメントと接触させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＴＲＰＣ２蛋白質が配列番号１の１〜約１５０３までのアミノ酸を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＬＴＲＰＣ２蛋白質が配列番号２の１〜約４５１２までの配列を含む核酸によってコードされる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ａ）ＬＴＲＰＣ２チャネルを候補剤と接触させる工程、及び
ｂ）前記剤が前記ＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオン透過性を調節するかどうかを決定する工程を含む候補生理活性剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記調節作用が前記ＬＴＲＰＣ２チャネルを開く請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記調節作用が前記ＬＴＲＰＣ２チャネルを閉じる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオン透過性を調節できる候補生理活性剤のスクリーニング方法であって、
ａ）ＬＴＲＰＣ２をコードする核酸及びそれと機能可能なように連結し、前記ＬＴＲＰＣ２を発現できる誘導性プロモーターを含む組換え核酸を含み、さらに多価カチオン指示薬を含む組換え細胞を用意する工程、
ｂ）前記組換え細胞を誘導して前記ＬＴＲＰＣ２を発現させる工程、
ｃ）前記組換え細胞を多価カチオン及び前記候補剤と接触させる工程、及び
ｄ）前記多価カチオンの細胞内レベルを前記指示薬により検出する工程を含む前記方法。
【請求項９】
前記接触工程が前記候補剤に続いて前記多価カチオンを接触させる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
調節作用が前記ＬＴＲＰＣ２チャネルの前記多価カチオン透過性を増加させる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
調節作用が前記ＬＴＲＰＣ２チャネルの前記多価カチオン透過性を減少させる請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記指示薬が蛍光性分子を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光性分子がフラ−２を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオン透過性の測定方法であって、
ａ）ＬＴＲＰＣ２を発現する組換え核酸を含み、さらに多価カチオン指示薬を含む組換え細胞を用意する工程、
ｂ）前記組換え細胞を、前記指示薬と選択的に反応してシグナルを生成する多価カチオンと接触させる工程、及び
ｃ）前記指示薬シグナルを検出することによって前記多価カチオンの細胞内レベルを測定する工程を含む前記方法。
【請求項１５】
前記指示薬が蛍光性分子を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光性分子がフラ−２を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、前記組換え細胞を候補生理活性剤と接触させる工程を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記調節作用が前記ＬＴＲＰＣ２チャネルの前記多価カチオン透過性を増加させる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記調節作用が前記ＬＴＲＰＣ２チャネルの前記多価カチオン透過性を減少させる請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定工程が、さらに前記細胞内多価カチオンレベルと組換えＬＴＲＰＣ２を発現しない細胞における細胞内多価カチオンレベルとを比較する工程を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定工程が、さらに前記細胞内多価カチオンレベルと組換えＬＴＲＰＣ２を発現しないが、前記候補剤と接触している細胞における細胞内多価カチオンレベルとを比較する工程を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＬＴＲＰＣ２蛋白質又はそのフラグメントの発現を調節することができる候補生理活性剤のスクリーニング方法であって、
ａ）ＬＴＲＰＣ２蛋白質をコードする組換え核酸を発現できる組換え細胞を用意する工程、
ｂ）前記細胞を前記候補剤と接触させる工程、及び
ｃ）前記候補剤の前記組換え核酸の発現への影響を決定する工程を含む前記方法。
【請求項２３】
前記決定工程が前記細胞の表現型を決定する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記決定工程が前記候補剤の存在下でＬＴＲＰＣ２の発現のレベルを決定し、前記発現のレベルと内在性ＬＴＲＰＣ２レベルとを比較することを含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記候補剤が小分子、蛋白質、ポリペプチド又は核酸を含む請求項１、５、８、１４、又は２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、 “ＬＴＲＰＣ２”（長期過渡受容体電位チャネル）と本明細書で呼ばれるＡＤＰリボース（“ＡＤＰＲ）調節カルシウム膜貫通チャネルポリペプチドの新規ファミリーの同定及び分離に関する。これらのポリペプチドを含むチャネルはマイクロモル領域の細胞質ＡＤＰＲの濃度に応答して開き、カルシウムの高い細胞内レベルの存在下で高められた活性を示し、細胞内カルシウム貯蔵部位の枯渇又は減少に反応しない。本発明は、さらにＬＴＲＰＣ２をコードする組換え核酸及びＬＴＲＰＣ２を利用してＬＴＲＰＣ２活性を調節し、多価カチオンに対するＬＴＲＰＣ２透過性を測定する候補生理活性剤を結合する方法に関する。本発明は、さらにＬＴＲＰＣ２をコードする組換え核酸の細胞発現を調節する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
イオンチャネルは、形質膜の細胞外側から細胞の細胞内領域への特定のイオンの通過を許容する生細胞の細胞形質膜に包埋される膜貫通多サブユニット蛋白質である。特定イオンの輸送は、細孔の高次構造における変化によって開閉可能である中心水溶性細孔（ｃｅｎｔｒａｌ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｒｅ）によって促進される。イオンゲートが開いている場合、イオンは自由にチャネルを通って移動する。イオンゲートが閉じている場合、イオンはチャネルを浸透することができないように妨げられる。イオンチャネルは多数の多細胞真核生物種及び無数の異なる細胞型で見られる。イオンチャネルは電位開口型又はリガンド開口型（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）のいずれであってもよい。チャネルゲーティングは特定のチャネルが開けられ、又は閉じられるプロセスである。イオンチャネルは異なる“開”又は“閉”状態の範囲を占めることができる。従って、ゲーティングプロセスは遷移状態の特定の配列又はチャネルが特定のレベルのゲーティングを達成する前に代替遷移状態の包含を要求するかもしれない。ゲーティングプロセスは物質又は薬剤によって調節され、何らかの方法でチャネルが開き、又は閉じる方法を変え、又は影響を及ぼす。チャネルはニューロトランスミッター、内部１次又は２次メッセンジャー、又はその他の生理活性剤のようなリガンドによって開閉できる。リガンドは、チャネル蛋白質の１つ以上の結合部位に付着し、又はチャネルに関連した受容体に付着する。チャネルが電位開口型である場合、膜電位の変化はチャネル蛋白質内の荷電成分の高次構造上の変化によってチャネルゲーティングを誘発する。チャネルがリガンド開口型又は電位開口型のいずれであっても、チャネルの一部の変化が浸透経路の開閉を生じるチャネルの異なる部分に影響を生じる。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は、マイクロモル領域の細胞質ＡＤＰＲの増加する濃度に応答して開き、カルシウムの高細胞内レベルの存在下で高められた活性を示し、細胞内カルシウム貯蔵部位の枯渇又は減少に反応しない “ＬＴＲＰＣ２”（長期過渡受容体電位チャネル）と本明細書で呼ぶＡＤＰＲ調節カルシウム膜貫通チャネルポリペプチドの新規ファミリーの同定、分離及び使用に関する。さらに、本発明は、ＬＴＲＰＣ２をコードする組換え核酸及びＬＴＲＰＣ２を利用してＬＴＲＰＣ２活性を調節し、多価カチオンに対するＬＴＲＰＣ２透過性を測定する候補生理活性剤を結合する方法に関する。本発明は、さらにＬＴＲＰＣ２をコードする組換え核酸の細胞発現を調節する方法に関する。
本発明の一の実施態様は、ＬＴＲＰＣ２と結合する候補生理活性剤のスクリーニング方法を提供する。この方法において、ＬＴＲＰＣ２、又はそのフラグメントを候補剤と接触させ、候補剤がＬＴＲＰＣ２と結合するかどうかを決定する。本発明の実施態様は、ＬＴＲＰＣ２を２つ以上の候補剤のライブラリーと接触させ、次いで２つ以上の候補剤とＬＴＲＰＣ２との結合を決定することを提供する。
さらなる実施態様において、ＬＴＲＰＣ２はイオンチャネルを含み、ＬＴＲＰＣ２チャネルを結合する候補剤はＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオン透過性を調節する。ある実施態様において、ＬＴＲＰＣ２を結合する候補剤はＬＴＲＰＣ２チャネルを開く。さらに別の実施態様において、ＬＴＲＰＣ２を結合候補剤はＬＴＲＰＣ２チャネルを閉じる。
【０００４】
ある実施態様において、ＬＴＲＰＣ２チャネルは、ＬＴＲＰＣ２をコードする組換え核酸、組換え核酸と機能できるように連結される誘導性プロモーター、及びフラ（ｆｕｒａ）−２のような多価カチオン指示薬を含む組換え細胞にある。組換え細胞はＬＴＲＰＣ２を発現するために誘発し、次いで候補剤と共に多価カチオンを含む溶液と接触させられる。別の実施態様において、組換え細胞を、多価カチオンと接触させる前に、候補剤と接触させる。多価カチオンの細胞内レベルは多価カチオン指示薬を用いて検出される。ある実施態様において、候補剤はＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオン透過性を増加させる。その他の実施態様において、候補剤はＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオン透過性を減少させる。好ましい実施態様において、多価カチオン指示薬は蛍光性分子を含む。本発明のより好ましい実施態様において、多価カチオン指示薬はフラ−２を含む。別の実施態様において、ＬＴＲＰＣ２チャネルの産生を誘導し、多価カチオン細胞内レベルを候補剤の存在下で検出する。そのレベルは候補剤の存在下又は非存在下で非誘発性組換え細胞で検出される多価カチオン細胞内レベルと比較される。
【０００５】
本発明の他の目的は、ＬＴＲＰＣ２チャネルの多価イオン透過性の測定方法を提供することである。この方法において、組換え細胞が提供され、該細胞はＬＴＲＰＣ２をコードする組換え核酸、組換え核酸と機能できるように連結されるプロモーター（構成型又は誘導性、好ましくは誘導性）、及び細胞内カチオン指示薬を含む。組換え細胞を、選択的に指示薬と反応してシグナルを生じる多価カチオンを含む溶液と接触させる。次いで、ＬＴＲＰＣ２が指示薬シグナルを検出することによって発現される場合に多価カチオンの細胞内レベルが測定される。この測定値を組換えＬＴＲＰ２が発現されない内在性レベルと比較する。より広範な実施態様において、細胞は組換えＬＴＲＰＣ２発現細胞に限定されないが、チャネルの活性を調節する薬剤を決定するために任意の組換え発現チャネル蛋白質と共に使用できる任意の細胞を含むことができる。好ましい実施態様において、多価カチオン指示薬はフラ−２のような蛍光性分子を含む。ある実施態様において、多価カチオン剤と共に組換え細胞と接触する候補生理活性剤の活性を調節することは、ＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオン透過性を増加させ、又はそれを減少させる。さらなる実施態様において、多価カチオン剤と接触する前に組換え細胞と接触する候補生理活性剤の活性を調節することはＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオン透過性を増加させ、又はそれを減少させる。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、ＬＴＲＰＣ２の発現を調節できる候補生理活性剤のスクリーニング方法を提供することである。この方法において、組換え細胞が提供され、該細胞は、いくつかの実施態様において一般にＬＴＲＰＣ２と関連した５’及び／又は３’発現調節配列を含むＬＴＲＰＣ２をコードする組換え核酸、そのフラグメントを発現できる。組換え細胞を候補剤と接触させて、候補剤のＬＴＲＰＣ２発現への影響を決定する。ある実施態様において、候補剤は、小分子、蛋白質、ポリペプチド、又は核酸（例えば、アンチセンス核酸）を含んでもよい。本発明の別の実施態様において、ＬＴＲＰＣ２発現レベルを候補生理活性剤の存在下で決定し、これらのレベルを内在性ＬＴＲＰＣ２発現レベルと比較する。
【０００７】
本発明の別の局面は、配列番号１（図６）の１〜約１５０３のアミノ酸配列を有する組換えＬＴＲＰＣ２蛋白質又はそのフラグメントであり、ＬＴＲＰＣ２はマイクロモル領域の細胞内ＡＤＰＲの濃度に応答して開き、カルシウムの高細胞内レベルの存在下で高められた活性を示し、細胞内カルシウム貯蔵部位の枯渇又は減少に応答しない膜貫通チャネルポリペプチドである。
本発明の別の局面は、配列番号１（図６）の１〜約１５０３のアミノ酸配列を有し、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＡ３４７００を有する組換えＬＴＲＰＣ２蛋白質又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子と少なくとも８０％の配列同一性を有する分離された組換え核酸である。本発明の実施態様は配列番号３（図８）の４４６〜約４９５７の配列を含み、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ００１５３５を有する組換え核酸分子である。
本発明の別の局面は、配列番号３（図８）の１〜約６２２０の配列を含み、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ００１５３５を有するＬＴＲＰＣ２遺伝子を含む分離された組換え核酸分子であり、前記組換え核酸分子は、図６（配列番号１）の１〜約１５０３のアミノ酸配列又は前記蛋白質配列と少なくとも８０％の同一性である配列を有する組換えＬＴＲＰＣ２蛋白質又は任意の好ましいそのフラグメントをコードする。
本発明のさらなる実施態様において、ＬＴＲＰＣ２は、配列番号１（図６）を有する１〜約１５０３のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらなる実施態様において、ＬＴＲＰＣ２は配列番号３（図８）の約４４６〜約４９５７のヌクレオチドを含むヌクレオチドの核酸配列によってコードされる。
【０００８】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、一つには、ＬＴＲＰＣ２を結合し、ＬＴＲＰＣ２イオンチャネル活性を調節し、及び／又は細胞内ＬＴＲＰＣ２発現を変更する分子の同定に有用である方法に関する。本明細書に記載されるＬＴＲＰＣ２チャネルは、ＬＴＲＰＣ２核酸によってコードされるＬＴＲＰＣ２ポリペプチドを含む。本明細書に記載されるイオンチャネルは、好ましくはＨＥＫ−２９３細胞で形成され、本明細書に記載される１つ以上の特有のＬＴＲＰＣ２特性を示す１つ以上の新規ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドを含む。
本明細書に記載される用語“ＬＴＲＰＣ２”（長期過渡受容体電位チャネル）はＡＤＰＲ調節性カルシウム膜貫通チャネルポリペプチドの新規ファミリーのメンバーを参照する。ポリペプチドは、また、そのアミノ酸配列、それらをコードする核酸、及びＬＴＲＰＣ２の新規特性で定義される。そのような新規特性としては、マイクロモル領域の細胞内ＡＤＰＲ濃度に応答したＬＴＲＰＣ２チャネルの開放、カルシウムの高細胞内レベルに応答したＬＴＲＰＣ２チャネルの活性の増強、及び細胞内カルシウム貯蔵部位の枯渇又は減少に対するＬＴＲＰＣ２チャネルの非応答性が挙げられる。ＬＴＲＰＣ２チャネルのゲーティングは、細胞内ＡＤＰＲ濃度が６０〜１００マイクロモル領域である場合に始まり、飽和はＡＤＰＲ濃度が３００μモル領域である場合に生じる。
【０００９】
ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド及びチャネルは、国際公開第００／４０６１４号“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｆａｍｉｌｙ”に開示される“ＳＯＣ”（ストア感受性チャネル）及び“ＣＲＡＣ”（カルシウム放出活性チャネル）ポリペプチド及びチャネル基本的に異なる（その開示は本願に引用して援用するものとする）。ＳＯＣ及びＣＲＡＣ蛋白質は、“細胞内貯蔵カルシウムからＣａ２＋の枯渇によって活性化されてもよく”（国際公開第００／４０６１４号第２頁を参照のこと）、さらに“高レベルの細胞内カルシウムによって抑制される”（国際公開第００／４０６１４号第１０頁を参照のこと）。本発明のＬＴＲＰＣ２チャネルは、逆に、カルシウムの高細胞内レベルの存在下で高められた活性を示し、細胞内貯蔵カルシウムの枯渇又は減少によって活性化されず、マイクロモル領域の細胞内ＡＤＰＲ濃度に応答して開く。ＳＯＣ及びＣＲＡＣはこの様式で調節されない。
ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドはＬＴＲＰＣファミリーの新規メンバーである。配列番号１（図６）として本明細書で開示される具体的な配列はヒト脾臓細胞に由来する。しかしながら、ＬＴＲＰＣ２は哺乳動物種、及び線虫のようなその他の多細胞真核生物由来の組織で広く発現されると考えられる。
【００１０】
ＬＴＲＰＣ２は自然源から誘導でき、又はＬＴＲＰＣ２変異体を生成するために組換えによって改変することもできる。用語“ＬＴＲＰＣ２配列”は、特に自然発生切断型又は分泌型（例えば、細胞外領域配列）、自然発生変異型（例えば、代替スプライシング型（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｆｏｒｍｓ）及び自然発生突然変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む。ヒト脾臓細胞由来のＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの未変性配列は、配列番号１（図６）の１〜約１５０３のアミノ酸を含む全長又は成熟未変性配列ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドである。
配列番号１（図６）として本明細書で開示されるＬＴＲＰＣ２ポリペプチドは、アミノ酸配列１−７５７を含むＮ末端細胞内領域、配列７５８−１０７０を含む膜貫通領域、配列１１４３−１３００を含むコイルドコイル領域、配列１６４１−１８２２を含み、ヌクレオシドジホスフェート特異性を有する酵素領域、及び配列７７４−７９３、８９２−８９９、及び９５７−１０２３を含む３つの細胞外領域を含む。
本発明のＬＴＲＰＣ２ポリペプチド、又はそのフラグメントは、また、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。そのようなＬＴＲＰＣ２ポリペプチドは、例えばＬＴＲＰＣ２ポリペプチドを含み、１個又は複数のアミノ酸残基は、配列番号１の配列のＮ−又はＣ−末端で、同様に１つ以上の内部領域内で置換及び／又は欠失される。当業者は、アミノ酸の変更がグリコシル化部位の数又は位置の変更又は膜固着特性の変更のようなＬＴＲＰＣ２ポリペプチド変異体の翻訳プロセス後に生じてもよいことを十分に理解している。しかしながら、すべてのＬＴＲＰＣ２蛋白質は、本明細書で定義されるＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの１つ以上の新規特性を示す。
【００１１】
本明細書で同定されるＬＴＲＰＣ２ポリペプチド配列に関する“パーセント（％）アミノ酸配列同一性”は、配列を整列し、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後、及び配列同一性の一部として任意の同類置換を考慮しないで、配列番号１（図６）のアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。本明細書で使用される％同一性の値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６６：４６０−４８０ （１９９６）； ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ から得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって与えられる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどはデフォルト値にセットされる。調整可能なパラメータは以下の値にセットされる：重複範囲＝１、重複フラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的値であり、特定配列の組成及び所定の配列が検索されている特定のデータベースの組成に依存してプログラム自身によって確立されるが、その値は感受性を増大するために調節してもよい。％アミノ酸配列同一性の値は、整列した領域における“より長い”配列の残基の合計数によって分けられる整合する同一残基の数によって決定される。“より長い”配列は整列した領域の最も現実的な残基を有するものである（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されるギャップは無視される）。
【００１２】
さらなる実施態様において、本明細書で使用される％同一性の値はＰＩＬＥＵＰアルゴリズムを用いて得られる。ＰＩＬＥＵＰは、連続的な対アラインメントを用いて関係する配列の群から複数の配列アラインメントを生成する。また、それは、アラインメントを生成するために使用されるクラスター形成関連性を示すツリーもプロットできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１−３６０ （１９８７）の連続的アラインメント法の単純化を使用し、該方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５］：１５１−１５３ （１９８９）によって記載されるものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、３．００のデフォルトギャップウエイト、０．１０のデフォルトギャップ長さウエイト、及び重みつき末端ギャップが挙げられる。
さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブ又は適したゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを有する変性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を用いて、ヒト又はその他の生物体由来のＬＴＲＰＣ２ポリペプチドを同定及び分離してもよい。当業者には明らかなように、配列番号２（図７）又は配列番号３（図８）のヌクレオチド配列のカルボキシル末端のすべて又は一部を含むＬＴＲＰＣ２特有ＮＵＤＴ９−Ｈ核酸配列は、プローブ及び／又はＰＣＲプライマー配列として特に有用である。技術的に、一般に知られているように、好ましいＰＣＲプライマーは約１５〜約３５ヌクレオチドの長さであり、約２０〜約３０であるのが好ましく、必要に応じてイノシンを含んでもよい。ＰＣＲ反応の条件は技術的によく知られている。
【００１３】
好ましい実施態様において、ＬＴＲＰＣ２は組換え技術を用いて、すなわち組換えＬＴＲＰＣ２核酸の発現により作られる“組換え蛋白質”である。組換え蛋白質は少なくとも１つ以上の特性によって自然発生蛋白質と区別される。例えば、組換え蛋白質は、本来ならその野生型宿主に関係する蛋白質及び化合物の一部又はすべてから離れて分離又は精製してもよく、従って実質的に純粋であってもよい。例えば、分離された蛋白質は、本来ならその天然状態に関連する物質の少なくとも一部を伴っておらず、好ましくは与えられたサンプルの合計蛋白質の少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を含む。実質的に純粋な蛋白質は、合計蛋白質の少なくとも約７５重量％を占め、少なくとも約８０％を占めるのが好ましく、少なくとも約９０％を占めるのが特に好ましい。定義としては、異なる生物体又は宿主細胞において、ある生物体由来の蛋白質の産生が挙げられる。あるいは、組換え蛋白質は、誘導性プロモーター又は高発現プロモーターの使用により、本来予想されるよりも明らかに高い濃度で生成されてもよく、その結果組換え蛋白質は高められた濃度レベルで生成される。あるいは、蛋白質は、下記のエピトープタグ又はアミノ酸置換、付加及び欠失の追加のように、自然状態で本来見られない形態であってもよい。
さらなる実施態様において、ＬＴＲＰＣ２変異体は、ロイシンのセリンとの置換のような１つのアミノ酸を同様の構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸で置換すること、すなわち保存的アミノ酸置換によって組換え操作してもよい。
さらなる実施態様において、置換、欠失、付加又はそれらの任意の組み合わせを使用してＬＴＲＰＣ２変異体を生成してもよい。一般にこれらの変更は、分子の変化を最小限にするためにいくつかのアミノ酸で行われる。しかしながら、大きな変更は、ある特定の状況では、許容される。ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの特性の小さな変更が望まれる場合、置換は、一般に以下の表１に従って行われる。
【００１４】
【表１】
表１
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【００１５】
さらなる実施態様において、機能又は免疫学的同一性の実質的な変更は図１に示されるものよりも少ない保存性である置換を選択することによって行われる。例えば、変更の領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、例えばα−ヘリカル又はβ−シーティング構造、ターゲット部位での分子の変更又は疎水性、又は側鎖の大部分に、より顕著に影響する置換を行ってもよい。一般にポリペプチド特性の最も大きな変化を生じることが期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリル又はトレオニルが疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルに対して置換する（又は、によって置換される）、（ｂ）システイン又はプロリンが任意のその他の残基に対して置換する（又は、によって置換される）、（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えばリジル、アルギニル、又はヒスチジルが電気陰性残基、例えばグルタミル又はアスパルチルに対して置換する（又は、によって置換される）、又は（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが側鎖を有しない残基、例えばグリシンに対して置換する（又はによって置換される）ものである。この実施態様のＬＴＲＰＣ２変異体は、本来本明細書で定義されるＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの１つ以上の特性を示す。
【００１６】
さらなる実施態様において、変異体は、典型的には同じ定性的生物学的活性を示し、自然発生類縁体として同じ免疫応答を誘発するが、変異体は、また、必要に応じてＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの特性を改変するために選択される。あるいは、変異体は、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの生物学的活性を変えるように設計してもよい。例えば、グリコシル化部位を変更又は除去してもよい。核酸変異体によってコードされる蛋白質は、本明細書で定義される新規ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド特性の少なくとも１つを示す。
核酸変異体によってコードされる蛋白質は、本明細書で定義される新規ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド特性の少なくとも１つを示す。
本明細書で使用される“ＬＴＲＰＣ２核酸”又はその文法上の等価物は、すでに記載した新規ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド特性の１つ以上を示すＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードする核酸を参照する。ＬＴＲＰＣ２核酸は配列番号２（図７）又は配列番号３（図８）との配列相同性を示し、相同性は配列を比較することによって、又はハイブリダイゼーションアッセイによって決定される。
【００１７】
ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードするＬＴＲＰＣ２核酸は、図７に示されるｃＤＮＡ（配列番号２）及び／又は図８に示されるゲノムＤＮＡ（配列番号３）と相同的である。そのようなＬＴＲＰＣ２核酸は、約７５％よりも大きい相同性が好ましく、約８０％よりも大きい相同性がより好ましく、約８５％よりも大きい相同性がさらに好ましく、９０％よりも大きい相同性が最も好ましい。実施態様によっては、相同性は約９３〜９５又は９８％と同じ高さである。このような状況における相同性は、配列類似性又は同一性を意味し、同一性を有するのが好ましい。同一性目的の好ましい比較は既知のＬＴＲＰＣ２配列との相違のシークエンシングを含む配列の比較である。この相同性は技術的に知られている標準方法を用いて決定され、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）の類似性検察方法、これらのアルゴリズムのコンピューター処理（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：３８７−３９５ （１９８４）に記載されるベストフィット配列プログラム（好ましくはデフォルト条件を使用する）、又は検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
好ましい実施態様において、本明細書で使用される％同一性の値はＰＩＬＥＵＰアルゴリズムを用いて得られる。ＰＩＬＥＵＰは、連続的な対アラインメントを用いて関連配列の群から複数の配列アラインメントを生じる。また、アラインメントを生成するために使用されるクラスター形成関連性を示すツリーをプロットできる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１−３６０ （１９８７）の連続的アラインメント方法の単純化を使用し、その方法はＨｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３ （１９８９）に記載されるものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００のデフォルトギャップ重み、０．１０のデフォルトギャップ長さ重み、及び重みつき末端ギャップを含む。
【００１９】
好ましい実施態様において、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが使用される。ＢＬＡＳＴはＡｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）及びＫａｒｌｉｎら， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７ （１９９３）に記載される。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６６：４６０−４８０ （１９９６）； ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかのサーチパラメータを使用し、そのほとんどはデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは以下の値に設定される：重なりスパン＝１、重なりフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的値であり、特定配列の組成及び所定の配列が検索されている特定のデータベースの組成に依存してプログラム自身によって確立されるが、その値は感受性を増大するために調節してもよい。％アミノ酸配列同一性の値は、整列した領域における“より長い”配列の残基の合計数によって分けられる整合する同一残基の数によって決定される。“より長い”配列は整列した領域の最も現実的な残基を有するものである（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されるギャップは無視される）。
【００２０】
好ましい実施態様において、“パーセント（％）核酸配列同一性”は配列番号２（図７）及び／又は配列番号３（図８）のヌクレオチド残基配列と同一である候補配列のヌクレオチド残基のパーセントとして定義される。好ましい方法は、それぞれ１及び０．１２５に設定される重なりスパン及び重なりフラクションを有するデフォルトパラメータに設定されるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
アラインメントは整列される配列にギャップを導入することを含んでもよい。さらに、配列番号２（図７）及び／又は配列番号３（図８）の配列よりも多い又は少ないヌクレオシドを含む配列の場合、当然のことながら、相同性のパーセンテージは、ヌクレオシドの合計数に対する相同的ヌクレオシドの数をベースとして決定される。従って、例えば本明細書で定義される配列及び下記配列の相同性よりも小さな配列の相同性は、より短い配列におけるヌクレオシドの数を用いて決定される。
【００２１】
上記の通り、ＬＴＲＰＣ２核酸は、またハイブリダイゼーション研究により決定される相同性によって定義できる。ハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシー条件の下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件の下で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件の下で測定される。そのような相同的核酸によってコードされる蛋白質は本明細書で定義される新規ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド特性の少なくとも１つを示す。従って、例えば高ストリンジェンシー条件下で配列番号２（図７）又は配列番号３（図８）として示される配列を有する核酸及びその補体とハイブリダイズする核酸はＬＴＲＰＣ２核酸配列と考えられるが、ＬＴＲＰＣ２特性を有する蛋白質をコードすることを条件とする。
ハイブリダイゼーション反応の“ストリンジェンシー”は当業者によって容易に決定され、一般にプローブ長さ、洗浄温度、及び塩濃度に依存して実験に基づいて計算される。一般に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高い温度を要求し、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がその融点よりも低い環境に存在する場合、変性ＤＮＡのリアニールする能力に依存する。プローブ及びハイブリダイズ可能な配列の間の所望の相同性の程度がより高ければ、使用できる相対温度はより高くなる。その結果として、より高い相対温度はよりストリンジェントな反応条件をなす傾向にあり、より低い温度はそれを小さくする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの追加の例として、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９９５）を参照のこと。
【００２２】
本明細書で定義される“ストリンジェント条件”又は“高ストリンジェンシー条件”は、（１）洗浄のための低イオン強度及び高温、例えば５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％の硫酸ドデシルナトリウムを使用すること、（２）ハイブリダイゼーションの際、ホルムアミドのような変性剤、例えば０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．５）を含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを、４２℃で７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムと共に使用すること、又は（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケの精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を使用して、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５５℃で５０％のホルムアミドで洗浄し、次いで５５℃でＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行うことによって同定してもよい。
【００２３】
“中程度ストリンジェント条件”は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９に記載される通りに同定されてもよく、上述よりも小さなストリンジェントの洗浄液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度ストリンジェント条件の例としては、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％のデキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性せん断サケの精子のＤＮＡを含む溶液で、３７℃で一晩のインキュベーション、次いで１×ＳＳＣで、約３７〜５０℃でフィルターを洗浄することが挙げられる。当業者は、プローブ長さ等のような因子を適応させるのに必要な温度、イオン強度等をどのように調整するかを理解している。一般に、ストリンジェント条件は、特定の配列について、定義されるイオン強度ｐＨで、融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、ターゲットと相補的であるプローブの５０％が平衡状態（ターゲット配列が過剰に存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％は平衡状態で占められる）でターゲット配列とハイブリダイズする温度（定義されるイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下で）である。ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又はその他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０よりも多いヌクレオチド）の場合少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件は、またホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【００２４】
他の実施態様において、より低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件を使用し、例えば技術的に知られている中程度又は低ストリンジェンシー条件を使用してもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関するさらに詳細な説明について、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９９５）を参照のこと。
【００２５】
本明細書で定義されるＬＴＲＰＣ２核酸は、特定される一本鎖又は二本鎖であってもよく、又は二本鎖又は一本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。当業者によって理解されているように、一本鎖の描写（“ワトソン”）は、またもう一本の鎖の配列（“クリック”）を定義し、従って本明細書に記載される配列は、また配列の補体を含む。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ又はハイブリッドであってもよく、核酸は、デオキシリボ−及びリボ−ヌクレオチドの任意の組み合わせ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の任意の組み合わせを含む。本明細書で使用される用語“ヌクレオシド”は、ヌクレオチド及びヌクレオシド及びヌクレオチド類縁体、及びアミノ変性ヌクレオシドのような変性ヌクレオシドを含む。加えて、“ヌクレオシド”は非自然発生類縁体構造を含む。従って、例えばペプチド核酸の個々の単位（それぞれ塩基を含む。）は、本明細書においてヌクレオシドと称される。
【００２６】
本明細書で定義されるＬＴＲＰＣ２核酸は組換え核酸である。本明細書において用語“組換え核酸”は、一般にポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼによる核酸の操作によってインビトロで本来生成される、天然には本来見られない形態の核酸を意味する。従って、線形形状の分離される核酸又は常態では連結されないＤＮＡ分子を連結することによってインビトロで生成される発現ベクターは、両方とも本発明の目的上、組換え体であると考えられる。当然のことながら、一度組換え核酸を生成し、宿主細胞又は生物体に再導入すると、非組換え的に、すなわちインビトロ操作よりもむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製するが、一方、一度組換え的に生成されたそのような核酸は、後に非組換え的に複製されるが、本発明の目的上、依然として組換え体であると考えられる。ＬＴＲＰＣ２核酸分子の相同体及び対立遺伝子はその定義に含まれる。さらに、一般に改変ＬＴＲＰＣ２核酸分子はこの定義に含まれる。
【００２７】
全長未変性配列ＬＴＲＰＣ２遺伝子（配列番号３）、又はその一部は、その他の多細胞真核生物種由来の全長ＬＴＲＰＣ２遺伝子を分離し、又は特定のＬＴＲＰＣ２核酸コード配列と同一である所望の配列を有するその他の遺伝子（例えば、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの自然発生変異体又はその他の多細胞真核生物種由来のＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードするもの）をさらに分離するために、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。必要に応じて、プローブの長さは約２０〜約５０塩基であってもよい。ハイブリダイゼーションプローブは配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、又はプロモーター、エンハンサー成分及びＬＴＲＰＣ２の特定未変性ヌクレオチド配列のイントロンを含むゲノム配列から誘導してもよい。一例として、スクリーニング法は、約４０塩基の選択されるプローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を用いるＬＴＲＰＣ２遺伝子のコード領域を分離することを含む。
【００２８】
ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓのような放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチンカップリングシステムを介してプローブと結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識を含む種々の標識によって標識化してもよい。本発明のＬＴＲＰＣ２遺伝子の配列と相補的である配列を有する標識化プローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーを選別し、プローブがそのようなライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするかを決定するために使用できる。ハイブリダイゼーションは以下に予め記載されている。
プローブは、またＰＣＲ方法で使用して、非常に密接なＬＴＲＰＣ２ヌクレオチドコード配列の同定のための配列プールを生成してもよい。ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、またそのＬＴＲＰＣ２をコードする遺伝子のマッピング及び遺伝的障害を有する個体の遺伝分析のためにハイブリダイゼーションプローブを作成するために使用できる。本明細書で提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖解析、及びライブラリーによるハイブリダイゼーションスクリーニングのような公知の方法を用いて染色体及び染色体の特定の領域に位置付けられてもよい。
【００２９】
別の実施態様において、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＬＴＲＰＣ２ ｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されるｃＤＮＡライブラリーから得てもよい。従って、ヒトＬＴＲＰＣ２ ＤＮＡは、ヒト組織から調製されるｃＤＮＡライブラリー、又はヒト脾臓組織から調製されるｃＤＮＡ脾臓ライブラリーから適宜得ることができる。ＬＴＲＰＣ２コード遺伝子は、また多細胞真核生物ゲノムライブラリーから、又はオリゴヌクレオチド合成によって得てもよい。
ライブラリーは、所定の遺伝子又はそれによってコードされる蛋白質を同定するために設計されるプローブ（例えば、ＬＴＲＰＣ２ ＤＮＡに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド）によって選別できる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９） に記載されるような標準方法を用いて行ってもよい。ＬＴＲＰＣ２をコードする遺伝子を分離する他に採りうる方法はＰＣＲ方法を用いることである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 同上； Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５））。
【００３０】
以下の実施例はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法を記載する。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性を最小化するのに十分に長く、十分に明白でなければならない。オリゴヌクレオチドは、好ましくは標識化されて、選別されるライブラリーにおけるＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって検出される。標識化方法は技術的によく知られており、３２Ｐ−標識化ＡＤＰＲ、ビオチン標識又は酵素標識化のような放射標識方法の使用が挙げられる。中程度ストリンジェンシー及び高ストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同上）で提供され、すでに記載されている。
そのようなライブラリースクリーニング方法で同定される配列は、ＧｅｎＢａｎｋのような公開データベース又はその他のプライベート配列データベースにあり、入手可能なその他の既知の配列と比較及び整列できる。分子の定義された領域内又は全長配列の全域での配列同一性（アミノ酸又はヌクレオチドレベルで）は、すでに記載したように、相同性を評価するために種々のアルゴリズムを使用するＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２及びＩＮＨＥＲＩＴのようなコンピューターソフトウエアプログラムを用いる配列アラインメントにより決定できる。
【００３１】
本明細書で定義されるＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２（図７）又は配列番号３（図８）のヌクレオチド配列のすべて又は一部を用いる選択されるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングによって得てもよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同上）に記載される従来のプライマー伸長方法は、ｃＤＮＡに逆転写されないかもしれないｍＲＮＡの前駆体及びプロセシング中間体を検出するために使用される。ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその成分）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の技術、染色体及び遺伝子マッピング、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの産生における種々の応用を有する。
別の実施態様において、本明細書で定義されるＬＴＲＰＣ２核酸は、自然発生ＬＴＲＰＣ２核酸を検出する診断利用、同様にスクリーニング利用を含む種々の応用で有用であり、例えばＬＴＲＰＣ２核酸配列に対する核酸プローブを含むバイオチップを生成することができる。最も広い意味において、本明細書の“核酸”又は“オリゴヌクレオチド”又は文法上の等価物は、共有結合的に互いに連結した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。
【００３２】
別の実施態様において、上述の配列番号２（図７）のＬＴＲＰＣ２核酸配列は、より大きな遺伝子のフラグメント、すなわち核酸セグメントである。本明細書において“遺伝子”はコード領域、非コード領域、及びコード及び非コード領域の混合を含む。従って、当業者によって理解されているように、本明細書で与えられる配列を用いてＬＴＲＰＣ２遺伝子の追加の配列を得ることができ、より長い配列又は全長配列のいずれかをクローン化する技術的によく知られた方法を用いることもできる（Ｍａｎｉａｔｉｓら及びＡｕｓｕｂｅｌら（同上）を参照のこと）（参照のため本明細書に組み込まれる）。
一度、上述のＬＴＲＰＣ２核酸が同定されると、それをクローン化でき、必要に応じて、その構成部分は全ＬＴＲＰＣ２遺伝子を形成するために組換えられる。一度、例えばプラスミド又はその他のベクター内に含まれ、又は線形核酸セグメントとしてそこから切除されるその天然の源から分離されると、組換えＬＴＲＰＣ２核酸は、その他のＬＴＲＰＣ２核酸、例えば追加のコード領域をその他の多細胞真核生物から同定及び分離するためのプローブとしてさらに使用できる。また、変性又は変異体ＬＴＲＰＣ２核酸を生成することは“前駆物質”核酸として使用できる。
【００３３】
別の実施態様において、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードする上述のＬＴＲＰＣ２核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローン化（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入してもよい。種々のベクターは公然と入手可能である。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であってもよい。適した核酸配列は、種々の方法によってベクターに挿入してもよい。一般に、ＤＮＡは技術的に知られた方法を用いて適した制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に１つ以上のシグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。１以上のこれらの成分を含む、適したベクターの構築は、当業者に知られる標準連結方法を利用する。
【００３４】
また、そのようなベクターを含む宿主細胞が提供される。一例として、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、ヒト骨髄から分離された細胞、ヒト脾臓細胞、ヒト心臓組織から分離される細胞、ヒト膵臓細胞、及びヒト白血球及び単球細胞を含む哺乳類宿主細胞株であってもよい。宿主細胞のより特異的な例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統 （ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓系統（懸濁培液の増殖でサブクローニングした２９３又は２９３細胞， Ｇｒａｈａｍら， Ｊ． Ｇｅｈ Ｉｉｏｌ．， ３６ ： ５９ （１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４２１６ （１９８０））；ヒト膵臓β−細胞；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３： ２４３−２５１ （１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；及びマウス乳癌細胞（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が挙げられる。適した宿主細胞の選択は、技術におけるスキルの範囲内にあるものとみなされる。好ましい実施態様において、ＨＥＫ−２９３細胞が宿主細胞として使用される。さらに、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの産生方法が提供され、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程及び細胞培養からＬＴＲＰＣ２ポリペプチドを回収する工程を含む。
【００３５】
別の実施態様において、ＬＴＲＰＣ２コード核酸配列と機能可能なように連結されるプロモーター（構成性又は誘導性のいずれか）を通常含む発現及びクローニングベクターがｍＲＮＡ合成に関して使用される。種々の可能性のある宿主細胞によって認められるプロモーターはよく知られている。哺乳動物宿主細胞におけるＬＴＲＰＣ２ ＤＮＡコードベクターの転写は、好ましくは誘導性プロモーター、例えば非相同的哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって調節される。本発明において実施できる誘導性プロモーターの例としては、単一又はバイナリーシステムのいずれかで使用され、熱ショックによって誘導されるｈｓｐ ７０プロモーター、銅又はカドミウムのいずれかによって誘導されるメタロチオネインプロモーター（Ｂｏｎｎｅｔｏｎら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９６ ３８０（１−２）： ３３−３８）、ショウジョウバエレチノイドによって誘導されるショウジョウバエオプシンプロモーター（Ｐｉｃｋｉｎｇら， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． １９９７ ６５（５）： ７１７−２７）、及びテトラサイクリン誘導性全ＣＭＶプロモーターが挙げられる。同定されたすべてのプロモーターの中で、テトラサイクリン誘導性全ＣＭＶプロモーターは最も好ましい。構成性プロモーターの例としては、発現が特定のプロモーター及びエンハンサーによって、又は局所位置効果によって調節されるＧＡＬ４エンハンサートラップライン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｔｒｏｇ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ：７０８１）、及びそれが機能可能なように連結されるプロモーターのタイプに応じて構成性又は誘導性のいずれかであってもよい大腸菌由来のトランス活性化因子応答性プロモーターが挙げられる。
【００３６】
ＬＴＲＰＣ２をコードするＤＮＡのより高度な真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大してもよい。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐの、プロモーターに作用してその転写を増加させるＤＮＡのシス作用性成分である。多くのエンハンサー配列は哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）から今では知られる。しかし、典型的には真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製開始点の遅発側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の遅発側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーはＬＴＲＰＣ２コード配列の位置５’又は３’でベクターにスプライスされてもよいが、好ましくはプロモーターから部位５’で配置される。
【００３７】
本発明の方法は、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド又はＬＴＲＰＣ２と結合する候補生理活性剤を同定するためにＬＴＲＰＣ２ポリペプチドをコードし、ＬＴＲＰＣ２イオンチャネルの活性を調節し、又は細胞内のＬＴＲＰＣ２の発現を変える核酸を利用する。
本明細書で使用される用語“候補生理活性剤”は、ＬＴＲＰＣ２と結合し、ＬＴＲＰＣ２イオンチャネルの活性を調節し、及び／又は細胞内のＬＴＲＰＣ２の発現を変える任意の分子を表す。本明細書に記載される分子は、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、又はポリヌクレオチド等であってもよい。一般に、複数のアッセイ混合を異なる薬剤濃度で平行して実施して、種々の濃度に対する異なる応答を得る。典型的には、これらの濃度の１つはネガティブコントロールとして、すなわちゼロ濃度又は検出レベルよりも低い濃度で提供される。
候補剤は、典型的には有機分子、好ましくは１００ダルトン（Ｄ）よりも大きく２，５００ダルトンよりも小さい分子量を有する小有機化合物であるが、多数の化学分類を包含する。好ましい小分子は、２０００Ｄよりも小さく、又は１５００Ｄよりも小さく、又は１０００Ｄよりも小さく、又は５００Ｄよりも小さい。候補剤は、蛋白質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能基を含む。候補剤は、しばしば１つ以上の上記官能基によって置換された環状炭素又は複素環構造及び／又は芳香族又はポリ芳香族構造を含む。候補剤は、また、ペプチド、多糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、類縁体、構造類縁体又はそれらの組み合わせを含む生体分子の中から見出される。特に好ましくはペプチドである。
【００３８】
候補剤は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む種々の源から得られる。例えば、多くの手段が、ランダム化オリゴヌクレオチド発現を含む種々の有機化合物及び生体分子のランダム及び有向合成で入手される。あるいは、植物及び動物抽出物の形態で天然化合物のライブラリーが入手でき、又は容易に生成できる。さらに、天然又は合成的に生成されるライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段により容易に修飾される。公知の薬物は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような有向又はランダムに化学修飾して構造類縁体を生成してもよい。
【００３９】
好ましい実施態様において、候補生理活性剤は蛋白質である。本明細書において“蛋白質”とは、少なくとも２つの共有結合的に結合したアミノ酸を意味し、蛋白質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドが挙げられる。蛋白質は、自然発生アミノ酸及びペプチド結合、又は合成ペプチド擬態（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）構造で作り上げられている。従って、本明細書で使用される“アミノ酸”又は“ペプチド残基”は自然発生及び合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシン（ｎｏｒｅｌｅｕｃｉｎｅ）は本発明の目的のアミノ酸であると考えられる。“アミノ酸”としては、またプロリン及びヒドロキシプロリンのようなイミノ酸残基が挙げられる。側鎖は（Ｒ）又は（Ｓ）立体配置のいずれであってもよい。好ましい実施態様において、アミノ酸は（Ｓ）又はＬ−立体配置である。非自然発生側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換を、例えばインビボ分解を抑制し、又は遅延させる目的で使用してもよい。
好ましい実施態様において、候補生理活性剤は自然発生蛋白質又は自然発生蛋白質のフラグメントである。従って、例えば蛋白質を含む細胞抽出物、又は蛋白質細胞抽出物のランダム又は有向消化物を使用してもよい。このように、多細胞真核生物蛋白質のライブラリーは、本発明の方法におけるスクリーニングのために作成してもよい。この実施態様において、特に好ましくは、多細胞真核生物蛋白質、及び哺乳動物蛋白質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒト蛋白質が特に好ましい。
【００４０】
好ましい実施態様において、候補生理活性剤は約５〜約３０アミノ酸のペプチドであり、約５〜約２０アミノ酸を有するものが好ましく、約７〜約１５アミノ酸を有するものが特に好ましい。ペプチドは、上述の自然発生蛋白質、ランダムペプチド、又は“偏った”ランダムペプチドの消化物であってもよい。本明細書における“ランダム化”又は文法的等価物は、各核酸及びペプチドがそれぞれ本質的にランダムなヌクレオチド及びアミノ酸からなることを意味する。一般にこれらのランダムなペプチド（又は以下に記載される核酸）は化学的に合成されるため、任意のヌクレオチド又はアミノ酸を任意の位置に組み込むことができる。合成方法はランダム化蛋白質又は核酸を生成するために設計され、配列の長さに対して可能な組み合わせのすべて又はほとんどの形成を認め、従ってランダム化生理活性候補蛋白質剤のライブラリーを形成する。
【００４１】
一の実施態様において、任意の位置で配列の優先性又は定常性を有さないライブラリーは完全にランダム化される。好ましい実施態様において、ライブラリーは偏っている。すなわち、配列内のある位置は、一定に保たれ、又は限られた数の可能性から選択される。例えば、好ましい実施態様において、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、空間的に偏った（小さい又は大きい）残基、核酸結合領域の反応、システインの反応、架橋、ＳＨ３−領域のためのプロリン、セリン、スレオニン、チロシン又はリン酸化部位のためのヒスチジン等、又はプリン等の定義されたクラス内でランダム化される。
好ましい実施態様において、候補生理活性剤は核酸である。
蛋白質について上記で一般に記載されるように、核酸候補生理活性剤は、自然発生核酸、ランダム核酸、又は“偏った”ランダム核酸であってもよい。例えば、原核生物又は真核生物のゲノムの消化は、蛋白質について上記で記載されるように使用してもよい。
好ましい実施態様において、候補生理活性剤は有機化学成分であり、その多くは文献により入手可能である。
【００４２】
好ましい実施態様において、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、インビボで、あるＬＴＲＰＣ２遺伝子の発現をブロックする治療薬として使用できる。既に示されているように、短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜によるその制限された取り込みによって生じるその低細胞内濃度にも関わらず、それらが抑制剤として作用する細胞に移入できる（Ｚａｍｅｃｎｉｋら， （１９８６）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ４１４３−４１４６）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばその負電荷リン酸ジエステル基を無電荷基で置換することによるその取り込みを高めるために改変される。好ましい実施態様において、ＬＴＲＰＣ２アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ｍＲＮＡへのＬＴＲＰＣ２遺伝子転写を防止し、蛋白質へのＬＴＲＰＣ２ ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、及び既存のＬＴＲＰＣ２蛋白質の活性をブロックするために使用できる。
本明細書で使用される多価カチオン指示薬は、細胞膜に容易に浸透できる、又は、例えばリポソーム等を介して、及び細胞に入ることによって細胞に輸送されやすい分子であり、多価カチオンとの接触によって高められ、又は抑制される蛍光を示す。本発明に有用な多価カチオン指示薬の例としては、Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ． Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．， ６ｔｈ ｅｄ． Ｍｏｌｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ， ｐｐ．５０４−５５０ （１９９６）； （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／２０００．ｈｔｍｌ）に示されている（その全内容は本願に引用して援用する）。
【００４３】
結合アッセイに関する好ましい実施態様において、ＬＴＲＰＣ２又は候補生理活性剤は、例えば蛍光体、化学発光体、化学薬品、又は放射性シグナルによって標識化され、候補剤のＬＴＲＰＣ２との結合を検出する手段を提供する。また、標識は、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような、適切な基質を提供した場合に検出される生成物を生成する酵素であってもよい。あるいは、標識は、酵素抑制剤のような、結合するが、酵素によって触媒されず、又は変化させられない標識化化合物又は小分子であってもよい。また、標識は、ストレプトアビジンと特異的に結合するエピトープタグ又はビオチンのような成分又は化合物であってもよい。ビオチンの例の場合、ストレプトアビジンは上述のように標識化され、その結果結合ＬＴＲＰＣ２に検出可能なシグナルを与える。技術的に知られているように、非結合標識化ストレプトアビジンは分析前に除去される。あるいは、ＬＴＲＰＣ２は表面に固定化又は共有結合的に結合され、かつ標識化候補生理活性剤と接触させられる。あるいは、候補生理活性剤のライブラリーはバイオチップに固定化又は共有結合的に結合され、かつ標識化ＬＴＲＰＣ２と接触させられる。バイオチップを利用する手順は技術的によく知られている。
【００４４】
好ましい実施態様において、ＬＴＲＰＣ２のイオン透過性は、無処置の細胞、好ましくはＨＥＫ−２９３細胞で測定され、該細胞はＬＴＲＰＣ２をコードする核酸及びそれと機能可能なように連結された誘導性プロモーターを含むベクターによって形質転換される。細胞内イオンの内在性レベルは誘導前に測定され、次いで誘導後に測定された細胞内イオンのレベルと比較される。フラ−２のような蛍光性分子を使用して細胞内イオンレベルを検出できる。Ｃａ２＋及びその他の多価カチオンのＬＴＲＰＣ２透過性は、このアッセイで測定可能である。
【００４５】
細胞内のＬＴＲＰＣ２の発現レベルを調節する候補生理活性剤のスクリーニングについての好ましい実施態様において、細胞内のＬＴＲＰＣ２の発現を完全に抑制する候補剤が使用でき、その結果細胞表現型を変える。さらに好ましい実施態様において、細胞内のＬＴＲＰＣ２の発現を高める候補剤が使用でき、その結果細胞表現型を変える。これらの候補剤の例としては、アンチセンスｃＤＮＡ及びＤＮＡ、調節結合蛋白質及び／又は核酸、同様に本明細書に記載される、ＬＴＲＰＣ２をコードする核酸の転写又は翻訳を調節するその他の候補生理活性剤のいずれかが挙げられる。
一の実施態様において、本発明は、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドに固有のエピトープ、例えば配列番号１（実施例６）の１〜約１５０３のアミノ酸を含む蛋白質の固有のエピトープと特異的に結合する抗体を提供する。
別の実施態様において、本発明は、配列７７４−７９３又は８９２−８９９又は９５７−１０２３（図６）を含む３つの細胞外領域由来のエピトープと特異的に結合する抗体を提供する。
【００４６】
抗ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド抗体はポリクローナル抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体を調製する方法は当業者によく知られている。ポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤及び、所望により、アジュバントの１回以上の注入によって哺乳動物で産生できる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントは複数の皮下又は腹腔内投与によって哺乳動物に投与してもよい。免疫化剤としては、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド又はその融合蛋白質が挙げられる。免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが知られている蛋白質に対する免疫化剤を結合するのに有用である。そのような免疫原性蛋白質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログログリン、及び大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。使用してもよいアジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノマイコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度の実験なしに当業者によって選択される。
抗ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド抗体は、さらにモノクローナル抗体を含んでもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５ （１９７５） に記載されるもののようなハイブリドーマ方法を用いて調製してもよい。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、又はその他の適した宿主動物は、典型的には免疫化剤で免疫化されて、免疫化剤と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化してもよい。
【００４７】
免疫化剤としては、典型的にはＬＴＲＰＣ２ポリペプチド又はその融合蛋白質が挙げられる。一般に、末梢血リンパ球（“ＰＢＬｓ”）はヒト起源の細胞を望む場合に使用され、又は脾臓細胞又はリンパ節細胞は非ヒト哺乳動物源を望む場合に使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適した融合剤を用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を生成する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６） ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞株は、通常形質転換哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ及びヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラット又はマウスミエローマ細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合不死化細胞の増殖又は生存を抑制する１つ以上の基質を含む、適した培地で培養してもよい。例えば、親の細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマの培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（“ＨＴＡ培地”）を含み、その基質はＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を抑制する。
【００４８】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択される抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベル発現を支持し、ＨＡＴ培地のような培地に対して敏感なものである。より好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ系統であり、それは、例えばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得ることができる。また、ヒトミエローマ及びマウスヒトヘテロミエローマ細胞株は、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３： ３００１ （１９８４）； Ｂｒｏｄｅｕｒら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８７） ｐｐ．５１−６３）。
【００４９】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培地は、ＬＴＲＰＣポリペプチドに向けられるモノクローナル抗体の存在について評価できる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって決定される。そのような技術及びアッセイは技術的に知られている。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７： ２２０ （１９８０）のスキャッチャード分析によって決定できる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは希釈手順を限定することによってサブクローン化し、標準方法（Ｇｏｄｉｎｇ， 同上）によって増殖してもよい。この目的に適した培地としては、例えばダルベッコ修正イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物の腹水のようにインビボで増殖してもよい。
【００５０】
サブクローン化によって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、蛋白質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順によって培地又は腹水から分離又は精製してもよい。
また、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるもののような組換えＤＮＡ方法によって生成してもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に分離及び配列決定できる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として役に立つ。一度分離されれば、ＤＮＡは、他の方法では免疫グロブリン蛋白質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞に形質移入されて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る発現ベクターに配置することができる。また、ＤＮＡは、例えば相同的マウス配列に代えて、ヒト重及び軽鎖定常ドメインの代わりにコード配列を用いることによって（米国特許第４，８１６，５６７号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， 同上）、又は免疫グロブリンコード配列、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべて又は一部と共有結合的に結合することによって修飾してもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに用いることができ、又は本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いて、キメラ二価抗体を産生することができる。
【００５１】
抗ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド抗体は、さらに一価抗体を含んでもよい。一価抗体を調製する方法は技術的によく知られている。例えば、１つの方法は免疫グロブリン軽鎖及び修飾重鎖の組換え発現に関する。重鎖はＦｃ領域の任意の位置で一般に切り詰められて、重鎖架橋結合を防止する。あるいは、関連するシステイン残基を除いて他のアミノ酸残基を代わりに用い、又は関連するシステイン残基を除いて架橋結合を防止する。また、インビトロ方法は、一価抗体を調製するのに適している。抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、技術的に知られるルーチン技術を用いて達成できる。
抗ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含んでもよい。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体のその他の抗原結合配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が所望の特異性、アフィニティー及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ある場合に、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基によって置換される。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は移入ＣＤＲ又はフレームワーク配列のいずれにも見られない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的にすべてを含み、その領域では、非ヒト免疫グロブリンのものに対応するＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべて及びＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。また、ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部を含む（Ｊｏｎｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１： ５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２： ３２３−３２９ （１９８８）； 及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２： ５９３５９６ （１９９２））。
【００５２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は技術的に知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである源由来の抗体に導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば“移入”残基として参照され、典型的には“移入”可変領域から取られる。ヒト化は、基本的にＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１： ５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２： ３２３−３２７ （１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： １５３４−１５３６ （１９８８））に従って、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列を用いることによって行われる。従って、そのような“ヒト化”抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的に無処置であると言えないヒト可変領域は非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかのＣＤＲ残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位由来の残基よって置換されるヒト抗体である。
【００５３】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７： ３８１ （１９９１）； Ｍａｒｋｓら， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１ （１９９１））を含む技術的に知られた種々の方法を用いて産生できる。また、Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用できる（Ｃｏｌｅら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ． ７７ （１９８５） 及びＢｏｅｒｎｅｒら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）： ８６−９５ （１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位のトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化させられているマウスへの導入によって作られる。誘発により、遺伝子再配列、アセンブリ、及び抗体レパートリーを含むすべての点でヒトにおいて見られる非常に似ているヒト抗体産生が観測される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、及び以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇら， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５−９３ （１９９５） に記載されている。
【００５４】
抗ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド抗体は、さらにヘテロ接合抗体を含んでもよい。ヘテロ接合抗体は２つの共有結合的に結合した抗体から構成される。そのような抗体は、例えば免疫系細胞が望まれない細胞を標的にするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０号、国際公開９２／２００３７３号、欧州特許第０３０８９号）提案されている。抗体は、架橋結合剤に関するものを含む合成蛋白質化学の知られた方法を用いてインビトロで調製してもよいことが考えられる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって、作成されてもよい。この目的のための適した試薬の例としては、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。
【００５５】
さらなる実施態様において、抗ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド抗体は種々の有用性を有してもよい。例えば、抗ＬＴＲＰＣ２ポリペプチド抗体は、ＬＴＲＰＣ２ポリペプチドの診断アッセイ、例えば特異的細胞、組織又は血清におけるその発現の検出で使用してもよい。技術的に知られている種々の診断アッセイ方法、例えば不均一又は均一相のいずれかで行われる競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイを使用してもよい（Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８７） ｐｐ． １４７−１５８）。診断アッセイで使用される抗体は検出可能な成分で標識化できる。検出可能な成分は、直接的又は間接的に検出可能なシグナルを生成できなければならない。例えば、検出可能な成分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、又は１２５Ｉのような放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、又はルシフェリンのような蛍光又は化学発光化合物、又はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素であってもよい。Ｈｕｎｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， １４４： ９４５ （１９６２）； Ｄａｖｉｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓｙ， １３： １０１４ （１９７４）； Ｐａｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ４０： ２１９ （１９８１） ； 及びＮｙｇｒｅｎ， Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｎｉ．， ３０： ４０７ （１９８２） に記載されるそれらの方法を含む、抗体を検出可能な成分と結合するための技術的に知られている任意の方法を使用してもよい。
さらに、ＬＴＲＰＣ２抗体を本発明の方法で使用して、ＬＴＲＰＣ２チャネルの多価カチオンに対する透過性を調節するその能力を選別してもよい。
【００５６】
（実施例）
特に明示しない限り、実施例において、参照される商業的に入手可能な試薬を製造者の説明書に従って使用した。
実施例１：発現のＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット分析
ＬＴＲＰＣ２発現のＰＣＲ分析のために、オリゴヌクレオチドとしてＣＡＧＴＧＴＧＧＣＴＡＣＡＣＧＣＡＴＧＡ及びＴＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＴＧを使用して１３８ｂｐのバンドを生成した。ＮＵＤＴ９発現の分析のために、オリゴヌクレオチドとしてＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧ及びＡＴＡＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧを使用して２５２塩基対バンドを生成した。使用した増幅条件は９５℃融解、５５℃アニーリング、及び７２℃伸長を２５サイクルであった。選別したすべてのライブラリーはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供していた。ノーザンブロットの場合、Ａｍｂｉｏｎ ＳｔｒｉｐＥＺ Ｔ７ ＲＮＡプローブキットを製造者の説明書に従って使用し、鋳型としてヒトＬＴＲＰＣ２配列のＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを使用して単鎖プローブを構築した。ＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを示した細胞株から抽出し、標準方法を使用してナイロン膜に移した。Ｕｌｔｒａｈｙｂハイブリダイゼーション緩衝剤（Ａｍｂｉｏｎ）を６５−６８℃で用いて、それ以外は標準方法でハイブリダイゼーションを行った。
【００５７】
実施例２：ＬＴＲＰＣ２及びＮＵＤＴ９のクローニング及び配列決定分析
ジーントラッパーＩＩ溶液ハイブリダイゼーション方法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＬＴＲＰＣ２及びＮＵＤＴ９ ｃＤＮＡの両方を分離した。ＬＴＲＰＣ２の場合、５つのＰＣＲポジティブコロニーを図１ｂのＲＴ−ＰＣＲによるＬＴＲＰＣ２発現に陽性である白血球ライブラリーから得て、これらの中で最も長いもの（４．０ｋｂ）を配列決定した。ＮＵＤＴ９の場合、３５のコロニーを図１ｂのＮＵＤＴ９発現に陽性である脾臓ライブラリーから得た。これらの内の８つを最終配列決定して、それらが同じ転写物を表し、１つが両方の方向に完全に配列決定されたことを確認した。
【００５８】
実施例３：ＦＬＡＧ−タグＬＴＲＰＣ２発現構築物の構築
脳ｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入し、使用して、ＬＴＲＰＣ２コード配列がｃＤＮＡクローニングによって分離される４．０ｋｂのフラグメントに存在しないことをＲＴ−ＰＣＲにより得た。この配列はＬＴＲＰＣ２に存在する内部ＮｏｔＩ部位から終止コドンにわたり、終止コドンの直ぐ内側に追加のＫｐｎＩ部位を含み、その結果ＬＴＲＰＣ２の３’末端に追加の２つのアミノ酸（グリシン及びトレオニン）を追加し、続いて終止コドン及び終止コドンの直ぐ外側にＳｐｅＩ部位を追加した。ＮｏｔＩ部位及びＳｐｅＩ部位を用いて、このＲＴ−ＰＣＲフラグメントを４．０Ｋｂ ｃＤＮＡに消化し、全長ＬＴＲＰＣ２コード配列を産生した。次いで、この全長ＬＴＲＰＣ２鋳型の内部ＮｏｔＩ部位を部位特異的変異誘発によって除去し、ＰＣＲを使用して開始メチオニンの内側５’末端にＮｏｔＩ部位を含むＬＴＲＰＣ２発現構築物を産生した。この構築物を、Ｋｏｚａｋ配列、開始メチオニン、ＦＬＡＧタグ、及びＦＬＡＧタグ及び３’ＳｐｅＩ部位を有する適したフレームに ＮｏｔＩ部位を含むポリリンカーを含む変性ｐＣＤＮＡ４／ＴＯベクターにサブクローニングした。これは、以下の推定配列：ＭＧＤＹＫＤＤＤＤＫＲＰＬＡ−アミノ酸３で始まり、アミノ酸１５０３に及ぶＬＴＲＰＣ２コード配列−ＧＴ、次いで終止コドン、を有する蛋白質を生じる発現プラスミドを産生した。全長ＬＴＲＰＣ２構築物の配列は、もとのＬＴＲＰＣ２／ＴｒｐＣ７配列と異なる４つの単一の塩基対を示した。これらのうち３つは推定アミノ酸配列を変えないが、４番目は公表されたＬＴＲＰＣ２／ＴｒｐＣ７配列に関連があるアミノ酸１３６７でセリンからグリシンへの置換を導入した。これはＬＴＲＰＣ２／ＴｒｐＣ７の可能な多形であると解釈され、従ってその他の点では同一の“野生型”ＬＴＲＰＣ２発現構築物も産生された。ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２及びＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２（Ｓ１３６７Ｇ）構築物を示した種々の各実験で使用し、その生化学的及び生物物理学的挙動の点で識別不可能であった。
【００５９】
実施例４：ＬＴＲＰＣ２のＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９−Ｈ領域のための大腸菌発現構築物の構築
ＮＵＤＴ９のための全長コード配列をＰＣＲによって生成して５’末端にＮｃｏＩ部位及び３’末端にＮｏｔＩ部位を配置し、Ｎｏｖａｇｅｎから提供されるｐＥＴ−２４ｄ Ｔ７発現ベクターにサブクローニングした。ＬＴＲＰＣ２ ＮＵＤＴ９相同的領域のために、構築物は、Ｎｃｏｌ部位、人工的開始コドン、アミノ酸１１９７−１５０３、終止コドン、及び３’ＮｏｔＩ部位を含むように ＰＣＲにより作成した。また、これをｐＥＴ−２４ｄにサブクローニングした。野生型ＬＴＲＰＣ２ ＮＵＤＴ９相同的領域及びＬＴＲＰＣ２（Ｓ１３６７Ｇ）ＮＵＤＴ９相同的領域構築物の両方を評価し、インビトロでの酵素活性の点で識別不能であった。
【００６０】
実施例５：ＬＴＲＰＣ２のＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９相同的領域の大腸菌発現及び精製
各発現プラスミドを含むＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を３７℃で、振盪機のＬＢブロス中で約０．６のＡ６００に増殖させ、１ｍＭの濃度のイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加によって誘導した。細胞をさらに４時間増殖させ、収集し、等張性塩類溶液の懸濁液で洗浄し、予め秤量した遠心管で遠心分離し、充填した細胞を−８０℃で貯蔵した。発現した蛋白質は５０ｍＭのトリス（ｐＨ ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのジチオスレイトールで洗浄した時に凍結融解した細胞から漏出した。ほとんどの内在性蛋白質は細胞内に残り、その結果発現した酵素に富んだ抽出物を得た。ＮＵＤＴ９の場合、酵素は凍結融解画分中に抽出され、硫酸アンモニウムを３５％の最終濃度で添加した。沈殿物を遠心分離後に廃棄し、硫酸アンモニウムを上澄に添加して５０％の最終濃度にした。沈殿物を遠心分離により収集し、溶解し、次いでゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００）で色層分析した。多量の酵素を含む活性画分を貯蔵し、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０で遠心分離することにより濃縮し、透析し、ＤＥＡＥ−セファロースで色層分析した。精製した酵素を貯蔵した活性画分から再度Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０を用いて濃縮した。ＬＴＲＰＣ２のＮＵＤＴ９相同的領域の場合、蛋白質を凍結融解画分中に抽出し、硫酸アンモニウムを添加して３５％の最終濃度にし、遠心分離した。沈殿物を溶解し、透析し、ＤＥＡＥ−セファロースで色層分析した。精製した酵素を７０％の硫酸アンモニウムによる沈殿によって貯蔵した活性画分から濃縮した。
【００６１】
実施例６：ＬＴＲＰＣ２のＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９−Ｈ領域のＮｕｄｉｘ型活性のアッセイ
酵素アッセイ：酵素速度をホスファターゼ非感受性基質（ＡＤＰＲ）のホスファターゼ感受性産物（ＡＭＰ）及びリボース−５−ホスフェートへの変換を測定することによって定量化した。遊離した無機オルトホスフェートをＡｍｅｓ及びＤｕｂｉｎＥＮＲｆｕ２７の手順によって測定した。標準インキュベーション混合物（５０ｍｌ）は５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ ９．０）、１６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＤＰＲ、０．２〜１ミリ単位の酵素及び４単位のアルカリ性腸ホスファターゼを含んでいた。３７℃で３０分後、反応をＥＤＴＡの添加により停止し、無機オルトホスフェートを測定した。これらの条件下で、１単位の酵素は１分当たり１ミリモルの基質を加水分解する。２モルのホスフェートは加水分解されたＡＤＰＲの単位モル当たりで遊離されることに注意されたい。
産物決定：標準アッセイ混合物（マイナスアルカリ腸ホスファターゼ）を３０分間３７℃でインキュベートし、４部のＮｏｒｉｔ（２０％充填容積）及び１部の７％ＨＣｌＯ４の混合物５０ｍｌを添加することにより終結してアデニン含有ヌクレオチドを除去した。遠心分離後、５０ｍｌをアルカリ性ｐＨに調整し、さらに３０分間３７℃で、アルカリ腸ホスファターゼでインキュベートして生成したリボース−５−ホスフェートを加水分解した。続いて遊離ホスフェートを測定し、Ｎｏｒｉｔ処理を行っていないコントロール反応と比較した。２つの間の化学量論的関係は、産物がＡＭＰ及びリボース−５−ホスフェートであることを示唆する。
【００６２】
実施例７：テトラサイクリン調節ＬＴＲＰＣ２を発現するＨＥＫ−２９３細胞の構築
ｐＣＤＮＡ４／ＴＯのＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２及びＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２（Ｓ１３６７Ｇ）構築物を予めｐＣＤＮＡ６／ＴＲ構築物で形質移入したＨＥＫ−２９３細胞に電気穿孔して、テトラサイクリンリプレッサー蛋白質を発現した。細胞をゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）選択下に置き、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）−耐性クローンを正確な分子量のＦＬＡＧ−標識化蛋白質の誘導性発現のために選別した。テトラサイクリン又はドキシサイクリン処理後の最も低レベルの基礎発現（ｂａｓａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）及び最もよい全レベルの蛋白質発現を有するクローンをさらに分析するために選んだ。
【００６３】
実施例８：ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、免疫沈降、免疫ブロッティング及び免疫蛍光
ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、免疫沈降、及び免疫ブロッティングを、すべて標準方法を用いて、又は図面の簡単な説明に記載した通りに行った。免疫蛍光については、２４時間のテトラサイクリン誘導後、ＨＥＫ−２９３細胞を固定し（４％のパラホルムアルデヒド、２０分）、連続してＨｏｅｃｈｓｔ（１ｍｇ／ｍｌ、２分）及びＤｉｏＣ６（０．３ｍｇ／ｍｌ、２分）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）にさらす前に透過させた（０．２％のトリトンＸ−１００、４分）。抗ＦＬＡＧ免疫蛍光のために、次いで細胞をブロックし（０．２％の魚皮（ｆｉｓｈ−ｓｋｉｎ）ゼラチン、２０分）、抗ＦＬＡＧ（ＩＢＩ−Ｋｏｄａｋ）で、続いてＡｌｅｘａ ５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でプローブした（共に０．０５％の魚皮（ｆｉｓｈ−ｓｋｉｎ）ゼラチン、曝露時間３０分）。取りつけたサンプルを単一発光フィルター（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ， ＦＩＴＣ， Ｈｏｅｃｈｓｔ）を用いて描いた。
【００６４】
実施例９：細胞培養
野生型及びテトラサイクリン誘導性ＨＥＫ−２９３ ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２発現細胞を３７℃／５％のＣ０２で、１０％のＦＢＳ及び２ｍＭのグルタミンで補充したＤＭＥＭ中で培養した。培地をブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）（５μｇ／ｍｌ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）（０．４ｍｇ／ｍｌ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充した。細胞を１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地で実験の２４時間前に再懸濁した。
【００６５】
実施例１０：電気生理学
パッチクランプ実験のために、カバーガラス上で増殖させた細胞を記録チャンバーに移し、以下の組成（ｍＭで）：ＮａＣｌを１４５、ＫＣｌを２．８、ＣａＣｌ２を１、ＭｇＣｌ２を２、グルコースを１０、Ｈｅｐｅｓ・ＮａＯＨを１０（ｐＨ ７．２）の標準修正リンゲル液に保持した。細胞内ピペット充填溶液は、（ｍＭで）Ｃｓ−グルタミン酸を１４５、ＮａＣｌを８、ＭｇＣｌ２を１、Ｃｓ−ＢＡＰＴＡを１０（ＣｓＯＨで調整したｐＨ ７．２）を含む。ある実験において、ＢＡＰＴＡをピペット溶液から取り除き、１００μＭのフラ−２を細胞内Ｃａ２＋濃度の蛍光定量的モニタリングの目的で加えた。アデノシン５−ジホスホ（ＡＤＰ）−リボース、環状ＡＤＰＲ、ＡＤＰ、グアノシン５−ジホスホ（ＧＤＰ）−グルコース、ＧＤＰ−マンノース、ウリジンジホスホ（ＵＤＰ）−グルコース、ＵＤＰ−マンノース、ＡＤＰ−グルコース、ＡＤＰ−マンノース、シトシンジホスホ（ＣＤＰ）−グルコース、リボース−５−ホスフェート、アデノシン５−モノホスフェート（ＡＭＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩｎｓＰ３）をＳｉｇｍａから購入した。アゴニストを標準細胞内溶液に溶解した。パッチクランプ実験を、密封ホールセル配置で、２１〜２５℃で行った。高分解能電流記録をコンピューターベースパッチクランプ増幅システム（ＥＰＣ−９， ＨＥＫＡ， Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）により取得した。標準細胞内溶液を充填した後、パッチピペットは２〜４ＭＷの抵抗を有した。ホールセル配置の確立後すくに、−１００〜＋１００ｍＶの電圧範囲に及ぶ５０ｍｓ間の電圧ランプを２００〜４００秒間、０．５Ｈｚで０ｍＶの保持電位から照射した。すべての電圧を外液と内液との間の１０ｍＶの液間電位差で補正した。電流に２．９ｋＨｚでフィルターをかけ、１００μｓ間隔で計数化した。ＥＰＣ−９の自動容量補正を用いて各電圧ランプ前に、容量性電流及び直列抵抗を決定し、補正した。分析のために、電流活性化前に真に最初のランプに２ｋＨｚでデジタル方式のフィルターをかけ、プールし、すべての続く電流記録のリーク除去で使用した。与えられた電位での電流の低分解能時間発展を−８０ｍＶ又は＋８０ｍＶの電圧で電流振幅を測定することによって、個別にリーク補正ランプ電流記録から抽出した。
【図面の簡単な説明】
【図１（Ａ）】ＬＴＲＰＣ２の蛋白質配列分析を示す。ＭＬＳＮ−１、ＬＴＲＰＣ７、ＭＴＲ−１、及び線虫蛋白質Ｃ０５Ｃ１２．３、Ｔ０１Ｈ８．５、及びＦ５４Ｄ１．５を含む種々の関連のある蛋白質のアラインメントに基づくＬＴＲＰＣ２構造モチーフの概略図である。一番下：ＬＴＲＰＣ２、ＥＥＥＤ８．８、及びＮＵＤＴ９のＮＵＤＴ９相同性領域のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント。ＮＵＤＴ９で見られる推定シグナルペプチド又はアンカーは二重下線を引く（ＮＵＤＴ９アミノ酸配列のＳｉｇｎａｌＰ２．０分析に基づく予測）。Ｎｕｄｉｘボックス領域は太い線で囲まれる。
【図１（Ｂ）】ヒト組織の選択におけるＬＴＲＰＣ２及びＮＵＤＴ９発現の定性的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＬＴＲＰＣ２（１３８ｂｐバンド）又はＮＵＤＴ９（２５２ｂｐバンド）のいずれかに特異的なプライマーを使用して指示組織から調製したｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ反応を初期抗原刺激した。正しいサイズのバンドの欠如をネガティブ（−）と解釈し、バンドの存在をポジティブ（＋）と解釈した。続いて、４．０ｋｂ部分的ＬＴＲＰＣ２ ｃＤＮＡ（５’末端を含み、内部ＮｏｔＩ部位で終結する）を、これらのＰＣＲ反応で使用される同じ白血球ｃＤＮＡライブラリーからクローン化した。複数のＮＵＤＴ９ ｃＤＮＡを、これらのＰＣＲ反応で使用した同じ脾臓ｃＤＮＡライブラリーの単一のスクリーニングから得た。
【図２（Ａ）】ＮＵＣＴ９及びＬＴＲＰＣ２ ＮＵＤＴ９−Ｈの細菌発現及び酵素特性を示す。ＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９−ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。ＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９−Ｈの誘導前（ｎｏｎ）、誘導後（Ｉ）の粗細菌フラクション及びＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９−Ｈの精製した標本（Ｐ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により分析した。
【図２（Ｂ）】ＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９−Ｈの酵素活性の特徴である。ＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９−Ｈの精製した標本を方法セクションで記載される基質のパネルに関するＮｕｄｉｘ型活性で選別した。Ｋｍ及びＶｍａｘをラインウィーバー−バークプロットの非線型回帰分析によって計算した。Ｎｕｄｉｘヒドロラーゼファミリーの他のメンバーの基質であることが知られている以下の化合物は、ＮＵＤＴ９及びＮＵＤＴ９−Ｈ：デオキシ−ＡＤＰＲ、デオキシ−ＣＴＰ、デオキシ−ＧＴＰ、デオキシ−ＴＴＰ、ＧＤＰ−マンノース、ＡＤＰ−ルコース（ｌｕｃｏｓｅ）、ＵＤＰ−グルコース、ＡｐｎＡ（ｎ＝２〜６）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋によって加水分解されなかった。
【図３（Ａ）】ＨＥＫ−２９３細胞におけるＬＴＲＰＣ２のテトラサイクリン誘導機能発現を示す。ヒトＬＴＲＰＣ２プローブを用いるノーザンブロットにより分析した野生型（ＷＴ）ＨＥＫ−２９３細胞又は１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで２４時間処理されたＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２のテトラサイクリン調節発現を有するＨＥＫ−２９３細胞株を示す。組換えＬＴＲＰＣ２はテトラサイクリン処理細胞における約５．５ｋｂのｍＲＮＡ種として示されるが、未変性ＬＴＲＰＣ２転写物は非形質導入ＷＴ２９３細胞において検出できない（本明細書で示されるものよりもはるかに長い曝露であってさえも、未変性ＬＴＲＰＣ２転写物はＷＴ細胞において検出できない）。
【図３（Ｂ）】１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで２４時間処理した、又は処理していないＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２のテトラサイクリン調節発現を有するＨＥＫ−２９３細胞株を示す。１０６の細胞を、ＦＬＡＧ−反応性タンパク質の発現について抗ＦＬＡＧ免疫沈降／抗ＦＬＡＧ免疫ブロットによって分析した。いくつかのクローンを続く分析で使用し、すべては識別不能な生化学的及び生物物理学的挙動を示した。
【図３（Ｃ）】は、無処理のまま放置された、又はテトラサイクリンで処理されたＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２の誘導性発現を有するＨＥＫ−２９３細胞を示す。ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２発現のテトラサイクリン誘導後観測される代表的な細胞を示し、モノクローナル抗ＦＬＡＧ（赤色蛍光）、ＤｉｏＣ６（緑色蛍光、核周囲ＥＲ）及びヘキスト（青色蛍光、核）で染色する。末梢赤色染色は原形質膜におけるＬＴＲＰＣ２の存在を示す。テトラサイクリンの非存在下で、ＦＬＡＧ−反応性染色は検出されない（データは示さない）。
【図３（Ｄ）】種々の実験条件の下で、−８０ｍＶで、平均膜電流の時間変化を示すグラフである。１００μＭのＡＤＰＲで灌流した場合、ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２を発現するｔｅｔ−誘導ＨＥＫ−２９３細胞のみが大きな内向きの電流を発生した（ｎ＝５±ｓｅｍ、黒塗り符号）。白抜き符号は、（ｉ）ＡＤＰＲのない標準内部溶液で灌流した野生型ＨＥＫ−２９３細胞（ＷＴ）（ｎ＝３±ｓｅｍ）、（ｉｉ）ＡＤＰＲのない標準内部溶液で灌流した非誘導細胞（ｎ＝５±ｓｅｍ）、（ｉｉｉ）１ｍＭのＡＤＰＲを含む標準溶液で灌流した非誘導ＨＥＫ−２９３細胞、（ｉｖ）ＡＤＰＲのない標準内部溶液で灌流したｔｅｔ−誘導ＨＥＫ−２９３細胞（ｎ＝４±ｓｅｍ）から得られる応答の多重分析を示す。
【図３（Ｅ）】ほとんど線形なカチオン電流をＬＴＲＰＣ２発現ＨＥＫ−２９３細胞におけるわずかに外向きの整流により確実に誘導される３００μのＡＤＰＲの細胞内灌流を示す。このグラフは、代表細胞において、それぞれ−８０ｍＶ及び＋８０ｍＶで測定される内向き及び外向きの電流の同時活性化を示す。黒塗り符号は、個々の高分解能データがトレースされる時点が図３（Ｆ）におけるＩ／Ｖ曲線としての表示のために抽出されることを示す。
【図３（Ｆ）】指示時間で図３（Ｅ）の代表細胞から得られるＡＤＰＲ−依存電流の電流−電圧関係を示す。ランプ電流は標準電圧ランプ刺激に応答して記録された（５０ｍｓで−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶ）。
【図４（Ａ）】ＨＥＫ−２９３細胞におけるＬＴＲＰＣ２発現のＡＤＰＲ依存電流の特性を示す。ＬＴＲＰＣ２のＡＤＰＲ依存性ゲーティングの用量作用曲線を示す。ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２を発現するＨＥＫ−２９３細胞を１０μ〜１ｍＭの範囲で定義されるＡＤＰＲ濃度で灌流し、電流を図３（Ｄ）と同様に−８０ｍＶで測定した。個々の細胞の最大電流振幅を、電流発生の時間経過を分析し（例えば、図３（Ｃ）及び３（Ｄ）を参照のこと。）、ボルツマン曲線を発生するカチオンコンダクタンスの上昇相と適合させることによって導いた。ピーク電流振幅を平均化し、ＡＤＰＲ濃度に対してプロットした（ｎ＝５〜１２±ｓｅｍ）。平均化したデータポイントを用量作用曲線と適合させて、９０μＭの見かけのＥＣ５０及びヒル係数９を得た（４〜８の間のヒル係数で無理に適合させた場合、同様の適した近似値が得られた）。６０μＭのＡＤＰＲ又はそれ以上で灌流したすべての細胞の９１％はコントロールレベルよりも上の電流を生じた（ｎ＝３８）。
【図４（Ｂ）】ＬＴＲＰＣ２のＡＤＰＲ依存性ゲーティングの動力学を示す。ＡＤＰＲゲート電流の時間経過を、ボルツマン曲線を発生するカチオンコンダクタンスの上昇相と適合させることによって図４（Ａ）に記載されるように評価した。この分析の中間点は最大半減電流活性化の時間に相当し、ＡＤＰＲ濃度の関数としてプロットされる。
【図４（Ｃ）】３００μＭのＡＤＰＲによって灌流したＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２を発現するＨＥＫ−２９３細胞を示す。実験は誘導の１６時間後の細胞で行い、より小さな平均電流振幅を得た。バーで示される時間で、等張性ＮＭＤＧ−ＣＩ溶液（１８０ｍＭのＮＭＤＧ−ＣＩ、３３０ｍＯｓｍ）を２０秒間外部から適用した。パネルは３細胞±ｓｅｍからの内向きの電流の平均を示す。等張性ＮＭＤＧ溶液は、おもにＮａ＋イオンによって予め運ばれる電流を完全に抑制することができることに注意されたい。
【図４（Ｄ）】ＬＴＲＰＣ２がカルシウムに対して浸透性のあることを示す。ＦＬＡＧ−ＬＴＲＰＣ２を発現するＨＥＫ−２９３細胞を１００μＭのＡＤＰＲで灌流した。８０秒間の実験で（バーによって示される）、等張性ＣａＣｌ２溶液（１２０ｍＭのＣａＣｌ２、３００ｍＯｓｍ）を２０秒間外部から適用した。パネルは、３細胞±ｓｅｍからの内向きの電流の平均を示す。等張性Ｃａ２＋溶液がおもにＮａ＋イオンによって予め運ばれる電流の約５０％を保持することができることに注意されたい。
【図５（Ａ）】ヒトＵ９３７単球における内在性ＡＤＰＲ依存性電流（ＩＡＤＰＲ）の特性を示す。左レーンは、ノーザンブロット分析がＬＴＲＰＣ２を２４時間１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで処理したＨＥＫ−２９３細胞における６ｋｂのｍＲＮＡ種として同定することを示す。右レーンでは、ブロットは未変性Ｕ９３７細胞におけるＬＴＲＰＣ２ ｍＲＮＡを同定する。このブロットが未変性転写物の最適検出を提供するためにより長く曝露され、それ故右レーンにおいてポジティブコントロール組換え転写物の過度の暴露を特徴付けることに注意されたい。
【図５（Ｂ）】１０ｍＭのＢＡＰＴＡの存在下でＡＤＰＲの異なる細胞内濃度によって活性化される−８０ｍＶでのＵ９３７細胞における内向きの電流の時間経過を示す（それぞれ、ｎ＝４〜１１）。
【図５（Ｃ）】［Ｃａ２＋］ｉを１００ｍＭに緩衝剤で処理される間、ＡＤＰＲの異なる細胞内濃度によって活性化される−８０ｍＶでのＵ９３７細胞における内向きの電流の時間経過を示す（それぞれ、ｎ＝５〜７）。
【図５（Ｄ）】外来性緩衝剤の非存在下でＡＤＰＲの異なる細胞内濃度によって活性化される−８０ｍＶでのＵ９３７細胞における内向きの電流の時間経過を示す（それぞれ、ｎ＝５〜９）。
【図５（Ｅ）】［Ｃａ２＋］ｉを１００ｍＭに緩衝剤で処理される間（黒塗り符号）又は外来性緩衝剤を取り除くことによって自由に変化させておく間（白抜き符号）、定義されたＡＤＰＲ濃度によって灌流されるＵ９３７細胞におけるＩＡＤＰＲとの用量作用相間を示す。平均化されたデータポイントを用量作用曲線と適合させて、緩衝剤処理及び緩衝剤未処理条件について１３０μＭ及び４０μＭの見かけ上のＥＣ５０を得た（両方ともヒル係数は８であった）。
【図５（Ｆ）】Ｕ９３７細胞におけるＡＤＰＲ電流の電流−電圧相間を示す。代表的な電流は５０ｍｓにわたって−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶの範囲の電圧ランプに対応して記録する。その記録は緩衝剤未処理条件下で、１００μＭのＡＤＰＲで灌流した細胞から全細胞確立後、１００秒で得た。
【図６】１〜約１５０３の配列を含む組換えＬＴＲＰＣ２蛋白質のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【図７】配列をコードするＬＴＲＰＣ２ ｃＤＮＡの組換え核酸分子を示す（配列番号２）。
【図８】１〜約６２２０の核酸配列を含むＬＴＲＰＣ２遺伝子の組換え核酸分子を示す（配列番号３）。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図３（Ｄ）】
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【図３（Ｅ）】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図４（Ｃ）】
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【図４（Ｄ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図５（Ｃ）】
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【図５（Ｄ）】
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【図５（Ｅ）】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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