(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞を優先的に標的化するベクターを使用して腫瘍を処置するための方法および組成物に関する。具体的には、本発明は、高親和性ラミニン受容体(HALR)に対する優先的な親和性を有するアルファウイルス型ベクター(好ましくは、シンドビスウイルス型ベクター)および非アルファウイルス型ベクターに関する。これらのベクターは、腫瘍に対して効率的に標的化され、腫瘍の壊死を生じさせる能力を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための方法であって、腫瘍を処置するのに効果的な量の、アルファウイルス型ベクターを腫瘍を有する哺乳動物に投与することを含み、前記ベクターが、細胞の腫瘍特異的決定基を標的化するように改変されていない方法。
【請求項２】
ベクターがシンドビスウイルス型ベクターである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ベクターが複製能欠損アルファウイルスである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
複製能欠損アルファウイルスが複製能欠損シンドビスウイルスである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
ベクターが、抗腫瘍遺伝子を運搬するように改変されていない、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
ベクターが抗腫瘍遺伝子をコードする、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
抗腫瘍遺伝子が、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子、免疫刺激遺伝子、腫瘍抑制エフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、リボザイムをコードする配列、および免疫原性ペプチドをコードする配列からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
抗腫瘍遺伝子がアポトーシス誘導遺伝子である、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
抗腫瘍遺伝子が、サイトカインをコードする遺伝子である、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物が少なくとも部分的に機能的な免疫系を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
固形腫瘍が、肝臓がん、黒色腫、類表皮がん、膵臓がん、脳の悪性腫瘍、乳がん、肺がん、卵巣腺がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がんおよび腎臓がんからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ベクターが非経口的に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための方法であって、腫瘍を処置するために効果的な量の複製能欠損シンドビスウイルス型ベクターを腫瘍を有する哺乳動物に投与することを含み、前記ベクターが細胞の腫瘍特異的決定基を標的化するように改変されていない方法。
【請求項１６】
ベクターが、抗腫瘍遺伝子を運搬するように改変されていない、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ベクターが抗腫瘍遺伝子をコードする、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
抗腫瘍遺伝子が、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子、免疫刺激遺伝子、腫瘍抑制エフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、リボザイムをコードする配列、および免疫原性ペプチドをコードする配列からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
抗腫瘍遺伝子がアポトーシス誘導遺伝子である、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
抗腫瘍遺伝子が、サイトカインをコードする遺伝子である、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物が少なくとも部分的に機能的な免疫系を有する、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物がヒトである、請求項15に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項15に記載の方法。
【請求項２４】
固形腫瘍が、肝臓がん、黒色腫、類表皮がん、膵臓がん、脳の悪性腫瘍、乳がん、肺がん、卵巣腺がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がんおよび腎臓がんからなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
ベクターが非経口的に投与される、請求項15に記載の方法。
【請求項２６】
同じ系統の正常な細胞と比較して、より大きいレベルの高親和性ラミニン受容体(HALR)を発現する腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための方法であって、腫瘍を処置するのに効果的な量のベクターを、腫瘍を有する哺乳動物に投与することを含み、前記ベクターが高親和性ラミニン受容体(HALR)に対する優先的な親和性を有する方法。
【請求項２７】
ベクターがウイルス型ベクターである、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
ウイルス型ベクターがアルファウイルス型ベクターである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
ベクターが、抗腫瘍遺伝子を運搬するように改変されていない、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
ベクターが抗腫瘍遺伝子をコードする、請求項26に記載の方法。
【請求項３１】
抗腫瘍遺伝子が、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子、免疫刺激遺伝子、腫瘍抑制エフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、リボザイムをコードする配列、および免疫原性ペプチドをコードする配列からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
抗腫瘍遺伝子がアポトーシス誘導遺伝子である、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
抗腫瘍遺伝子が、サイトカインをコードする遺伝子である、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物が少なくとも部分的に機能的な免疫系を有する、請求項26に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物がヒトである、請求項26に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項26に記載の方法。
【請求項３７】
固形腫瘍が、肝臓がん、黒色腫、類表皮がん、膵臓がん、脳の悪性腫瘍、乳がん、肺がん、卵巣腺がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がんおよび腎臓がんからなる群から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
ベクターが非経口的に投与される、請求項26に記載の方法。
【請求項３９】
細胞の腫瘍特異的決定基を標的化するように改変されていないアルファウイルス型ベクターと、薬剤として許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための薬剤組成物。
【請求項４０】
ベクターが複製能欠損アルファウイルスである、請求項39に記載の薬剤組成物。
【請求項４１】
複製能欠損アルファウイルスが複製能欠損シンドビスウイルスである、請求項40に記載の薬剤組成物。
【請求項４２】
ベクターが、抗腫瘍遺伝子を運搬するように改変されていない、請求項39に記載の薬剤組成物。
【請求項４３】
ベクターが抗腫瘍遺伝子をコードする、請求項39に記載の薬剤組成物。
【請求項４４】
抗腫瘍遺伝子が、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子、免疫刺激遺伝子、腫瘍抑制エフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、リボザイムをコードする配列、および免疫原性ペプチドをコードする配列からなる群から選択される、請求項43に記載の薬剤組成物。
【請求項４５】
抗腫瘍遺伝子がアポトーシス誘導遺伝子である、請求項43に記載の薬剤組成物。
【請求項４６】
抗腫瘍遺伝子が、サイトカインをコードする遺伝子である、請求項43に記載の薬剤組成物。
【請求項４７】
細胞の腫瘍特異的決定基を標的化するように改変されていない複製能欠損シンドビスウイルス型ベクターと、薬剤として許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための薬剤組成物。
【請求項４８】
ベクターが、抗腫瘍遺伝子を運搬するように改変されていない、請求項47に記載の薬剤組成物。
【請求項４９】
ベクターが抗腫瘍遺伝子をコードする、請求項47に記載の薬剤組成物。
【請求項５０】
ベクターと、薬剤として許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための薬剤組成物であって、ベクターはHALRに対する優先的な親和性を有し、かつ腫瘍を殺すために効果的であるが、ベクターがアルファウイルス型ベクターである場合、ベクターは、細胞の腫瘍特異的決定基を標的化するように改変されていない薬剤組成物。
【請求項５１】
ベクターがウイルス型ベクターである、請求項50に記載の薬剤組成物。
【請求項５２】
ウイルス型ベクターがアルファウイルス型ベクターである、請求項51に記載の薬剤組成物。
【請求項５３】
ベクターが、抗腫瘍遺伝子を運搬するように改変されていない、請求項50に記載の薬剤組成物。
【請求項５４】
ベクターが抗腫瘍遺伝子をコードする、請求項50に記載の薬剤組成物。
【請求項５５】
抗腫瘍遺伝子が、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子、免疫刺激遺伝子、腫瘍抑制エフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、リボザイムをコードする配列、および免疫原性ペプチドをコードする配列からなる群から選択される、請求項54に記載の薬剤組成物。
【請求項５６】
抗腫瘍遺伝子がアポトーシス誘導遺伝子である、請求項54に記載の薬剤組成物。
【請求項５７】
抗腫瘍遺伝子が、サイトカインをコードする遺伝子である、請求項54に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法119条(e)により、米国仮特許出願第60/279,051号(2001年3月27日出願)および同第60/311号(2001年8月10日出願)の優先権を主張する。これらはそれぞれ、その全体が参考として組み込まれる。
【０００２】
本発明に至った研究は、一部が補助金CA68498により国立がん研究所の支援を受けた。従って、連邦政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、特に、in vivoの正常な細胞と比較して、特異的な様式で腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための、がんに対するウイルスベクター治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんの遺伝子治療は、遺伝子発現の効率が高くかつ腫瘍を標的化する能力を有するベクターが利用できれば大きな利益を受けると考えられる。異種の遺伝子をin vivoの腫瘍に送達して、がんの遺伝子治療を研究するためにいくつかのトランスフェクションシステムが開発されているが、そのいずれも様々な制約を有している。例えば、レトロウイルスベクターは、免疫原性が低く、安定な遺伝子移入を媒介するので、遺伝子送達のために使用されている。しかしながら、移入効率は比較的低く(例えば、Di Ianni他、J. Hematother. Stem. Cell Res.、1999、8:645〜652;Morling他、Gene Ther.、1995、2:504〜508;Lam他、Hum. Gene Ther.、1996、7:1415〜1422;Kume他、Stem Cells、1999、17:226〜232を参照のこと)、そして生殖細胞系の変性は潜在的な問題である(Thompson、Science、1992、257:1854を参照のこと)。さらに、レトロウイルスベクターは、ほとんど例外なく、ヒト血液中の血清成分による溶解を受けやすい(Miyao他、Hum Gene Ther、1997、8:1575〜1583;Russell他、Hum Gene Ther、1995、6:635〜641;Rother他、J Exp Med、1995、182:1345〜55を参照のこと)。このことは、in vivoにおけるその適用を大きく制限している。アデノウイルスベクターは、in vivoでの遺伝子移入についてはより効率的であるようであるが、これらのベクターは、血流を介して送達される能力を有していないので、局所的な様式で使用され得るだけであり(Duncan他、J Gen Virol.、1978、40:45〜61;Alemany他、J Gen Virol.、2000、81 Pt 11:2605〜2609;Alemany他、Nat Biotechnol.、2000、18:723〜727を参照のこと)、アデノウイルスタンパク質の非常に大きい免疫原性によって患者に対して毒性を生じさせることがある(Ginsberg、Bulletin of the New York Acad. Med.、1996、73:53〜58;Sparer他、J. Virol.、1997、71:2277〜2284を参照のこと)。
【０００５】
これらの進歩にもかかわらず、がんは、今も依然として、新しい解決策を必要とする主要な公衆衛生問題である。治療用ベクターを開発しようとする現在の様々な努力は、ベクターの安全性および治療遺伝子の発現効率の問題で失敗している。
【０００６】
アルファウイルスベクターの多くの性質により、アルファウイルスベクターは、他のウイルスに由来する開発中の遺伝子送達システムに対する望ましい代替物となっている。そのような性質には、(i)発現構築物を迅速に操作することができること、(ii)感染性粒子の高力価ストックを製造することができること、(iii)非分裂細胞に感染することができること、および(iv)高レベルの発現を得ることができることが含まれる(StraussおよびStrauss、Microbiol. Rev.、1994、58:491〜562;Liljestrom他、Biotechnology、1991、9:1356〜1361;Bredenbeek他、Semin. Virol.、1992、3:297〜310;Xiong他、Science、1993、243:1188〜1191)。欠陥シンドビスウイルスベクターが、原生動物寄生虫、蠕虫寄生虫、体外寄生虫、菌類、細菌およびウイルスから哺乳動物を保護するために使用されている(PCT公開番号WO94/17813)。
【０００７】
ベネズエラウマ脳炎(VEE)をコードするcDNAおよび弱毒化トガウイルスの調製方法が記載されている(米国特許第5,185,440号)。感染性シンドビスウイルスベクターが、異種の配列をゲノムの構造領域に挿入することにより調製されている(米国特許第5,217,879号)。さらに、異種の配列を有するシンドビス欠陥干渉(DI)粒子に基づくRNAベクターはまた記載されている(米国特許第5,091,309号)。アルファウイルス、具体的にはセムリキ森林ウイルスが、異種の遺伝子(例えば、抗原性のエピトープまたは決定基)をコードする外因性RNAを送達するために医学的に使用されていた(PCT公開番号WO95/27069および同WO95/07994)。アルファウイルスの塩基配列から下流の異種配列の増強された発現をもたらすベクターはまた開示されている(PCT公開番号WO95/31565)。アルファウイルスに基づくベクターもまた、免疫化のためのタンパク質産生またはタンパク質配列の発現のために使用されていた(PCT公開番号WO92/10578)。アルファウイルスベクターのためのcDNA構築物を動物細胞またはヒト細胞に導入し、転写させることができる(PCT公開番号WO95/27044)。
【０００８】
シンドビスウイルスは、アルファウイルス属のメンバーであり、世界の様々な地域におけるその発見が1953年から始まって以来、広範囲に研究されている(Taylor他、Egypt. Med. Assoc.、1953、36:489〜494;Taylor他、Am. J. Trop. Med. Hyg.、1995、4:844〜862;Shah他、Ind. J. Med. Res.、1960、48:300〜308を参照のこと)。多くの他のアルファウイルスと同様に、シンドビスウイルスは蚊から脊椎動物宿主に伝染する。アルファウイルスビリオンは、エンベロープタンパク質がその表面に呈示される脂質二重層の内部に包まれたヌクレオキャプシドからなる。エンベロープタンパク質は、ビリオンのエンドサイトーシスをもたらす、宿主細胞受容体に対する結合を媒介する。エンドサイトーシスのとき、キャプシドタンパク質とゲノムのウイルスRNAとの複合体であるヌクレオキャプシドが宿主細胞の細胞質の中に入る。シンドビスウイルスのゲノムは、11703ntからなる一本鎖の49S RNAであり(Strauss他、1984、Virology、133:92〜110)、これは、5'末端がキャップ化され、3'末端がポリアデニル化されている。このゲノムRNAは(+)-センスであり、感染性であり、そして感染細胞においてmRNAとして使用される。ゲノムRNAが翻訳されることにより、ポリタンパク質として産生され、そしてタンパク質分解的にプロセシングされた、nsP1、nsP2、nsP3およびnsP4の非構造タンパク質がもたらされる。感染時の初期において、これらの非構造タンパク質は、おそらくは宿主の因子と会合した状態で、ゲノムの(+)-センスRNAを鋳型として使用して、全長の相補的な(-)鎖RNAを作製する。この(-)鎖が、全長のゲノムRNAを合成するための鋳型である。(-)鎖上の内部プロモーターが、ゲノムRNAの3'末端側の1/3と共通線性である26SサブゲノムmRNAを転写するために使用される。この26SサブゲノムmRNAが翻訳されて構造ポリタンパク質が産生され、これが翻訳と同時にまた翻訳後に切断されてC(キャプシド)、E2およびE1(エンベロープ)の構造タンパク質が生じる。キャプシドタンパク質CはゲノムRNAをキャプシド化して、ヌクレオキ
ャプシドを形成させる。これらは、細胞表面に結合したウイルスのエンベロープタンパク質の細胞質ドメインと相互作用し、その結果、ヌクレオキャプシドが、エンベロープタンパク質を含有する膜二重層の内部に包み込まれ、そして感染細胞からの子孫ビリオンの出芽がもたらされる。シンドビスウイルスの感染は、宿主細胞におけるアポトーシスを誘導することが示されている(Levine他、Nature、1993、361:739〜742;JanおよびGriffin、J. Virol.、1999、73:10296〜10302)。
【０００９】
シンドビスウイルスに基づく遺伝子形質導入がin vitroで広く研究されており(Straus他、Microbiol. Rev.、1994、58:491〜562;Altman-Hamamdzic他、Gene Ther.、1997、4:815〜822;Gwag他、Mole. Brain Research、1998、63:53〜61;Bredenbeek他、J Virol.、1993、67:6439〜6446;Liljestrom他、Biotechnology、1991、9:1356〜1361;Piper他、Meth. Cell Biol.、1994、43:55〜78;Grusby他、Proc. Natl. Acad. Sci USA.、1993、90:3913〜3917を参照のこと)、いくつかの報告により、中枢神経系に対するin vivoでのシンドビスウイルス遺伝子移入(Duncan他、J Gen Virol.、1978、40:45〜61;Alemany他、J Gen Virol.、2000、81 Pt 11:2605〜2609;Alemany他、Nat Biotechnol.、2000、18:723〜727)、ならびに抗原提示細胞に対するin vivoでのシンドビスウイルス遺伝子移入(Tsuji他、J Virol.、1998、72:6907〜6910;Hariharan他、J Virol、1998、72:950〜958;Pugachev他、Virology、1995、212:587〜594;Xiong他、Science、1989、243:1188〜1191を参照のこと)が報告されているが、シンドビスウイルスシステムのin vivoでの使用はかなり限られている。
【００１０】
しかしながら、シンドビスウイルス型ベクターの使用の大きな欠点は、これらのベクターが有用な標的細胞特異性を有していないと(本発明以前には)考えられていたという事実であった。哺乳動物細胞の場合、少なくとも1つのシンドビスウイルス受容体は、高親和性ラミニン受容体(HALR)として以前に同定されていたタンパク質であり、その広い分布および非常に保存された性質により、このウイルスの広い宿主範囲が部分的には説明され得る(StraussおよびStrauss、1994、上掲;Wang他、J. Virol.、1992、66:4992〜5001)。したがって、シンドビスウイルスベクターの向性（親和性）を変化させて、特定の標的細胞タイプに対する特異的な遺伝子送達を可能にすることは望ましいと考えられていた(PCT公開番号WO98/44132を参照のこと)。向性のそのような変更には、例えば、プロテインAのIgG結合ドメインを含むキメラなウイルスエンベロープタンパク質を操作することによって、内因性のウイルス向性を除去し、新規な向性の導入することの両方が必要であることが示唆されていた。
【００１１】
成熟したシンドビスウイルスビリオンにおいて、(+)-センスのウイルスゲノムRNAはキャプシドタンパク質Cと複合体を形成して、2つの膜内在性糖タンパク質(E1およびE2)が埋め込まれている脂質二重層によって取り囲まれる二十面体ヌクレオキャプシドを形成する(StraussおよびStrauss、1994、上掲)。E1およびE2は、1つのユニットとして機能するヘテロ二量体を形成するが、E2ドメインが、細胞に対する結合には特に重要であるようである。ウイルス感染性を中和することができるモノクローナル抗体(mAb)は、通常、E2特異的であり、そしてE1ではなく、E2における変異が、より多くの場合、変化した宿主範囲および毒性に関連している(Stanley他、J. Virol.、1985、56:110〜119;Olmsted他、Virology、1986、148:245〜254;Polo他、J. Virol.、1988、62:2124〜2133;Lustig他、J. Virol.、1988、62:2329〜2336)。また、E2内に挿入を含み、哺乳動物細胞に対する不完全な結合を示すシンドビスウイルス変異体が同定されていた(Dubuisson他、J. Virol.、1993、67:3363〜3374)。
【００１２】
要約すると、がんに対する効果的な処置がこの分野では引き続き求められている。具体的には、この分野では、正常な細胞に対する著しい有害な結果を伴うことなく破壊するために腫瘍細胞を特異的に標的化する効果的な治療が求められている。本発明は、この分野におけるこれらの要求および他の要求に応えるものである。
【特許文献１】
米国仮特許出願第60/279,051号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、特に、in vivoの正常な細胞と比較して、特異的な様式で腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための、がんに対するウイルスベクター治療に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、同じ系統の正常な細胞と比較して、より高レベルの高親和性ラミニン受容体(HALR)を発現する腫瘍に罹患している哺乳動物(例えば、ヒト)を処置するための新規な方法を提供する。本発明の方法は、腫瘍を処置するのに効果的な量のHALRに対して優先的な親和性を有するベクターを、そのような腫瘍を有する哺乳動物に投与することを含む。好ましくは、ベクターはウイルス型ベクターである。本明細書中に開示されるように、本発明の方法において使用される好ましいウイルス型ベクターは、アルファウイルス型ベクター(例えば、複製能欠損アルファウイルス型ベクター)であり、より好ましくは複製能欠損シンドビスウイルス型ベクターである。
【００１５】
本明細書中に開示されるように、HALRに対する天然の親和性および天然のアポトーシス誘導機能を有するアルファウイルス型ベクターに加えて、本発明のベクターは、HALRに対する優先的な親和性を有し、かつ抗腫瘍活性を有するように効果的に改変され得る任意の粒子またはウイルスから得ることができる。したがって、別の実施形態において、本発明は、HALRに対する優先的な親和性を有し、かつ抗腫瘍遺伝子をコードするベクターを使用して、腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための方法を包含する。本明細書中に開示されるように、そのような抗腫瘍遺伝子は、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子、免疫刺激遺伝子、腫瘍抑制エフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、リボザイムをコードする配列、または免疫原性ペプチドをコードする配列であり得る。好ましい実施形態において、そのような抗腫瘍遺伝子は、アポトーシス誘導遺伝子、またはサイトカインをコードする遺伝子である。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、腫瘍を特異的に標的化するように改変されていないアルファウイルス型ベクターを使用して、腫瘍に罹患している哺乳動物(例えば、ヒト)を処置するための方法を提供する。好ましくは、アルファウイルス型ベクターはシンドビスウイルス型ベクターであり、最も好ましくは、複製能欠損シンドビスウイルス型ベクターである。本明細書中に開示されるように、アルファウイルス型ベクターは、異種の抗腫瘍遺伝子をコードするために改変することができる。
【００１７】
本発明はまた、特定の腫瘍を標的化するように改変されるアルファウイルス型ベクターを使用して、腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための方法を包含する。したがって、本明細書中に開示されるように、本発明の方法において使用されるベクターは、腫瘍細胞に存在するリガンドと特異的に相互作用する分子をコードするために改変することができる。特定の実施形態によれば、ベクターは、例えば、腫瘍特異的な受容体結合配列を含有するキメラなエンベロープタンパク質、腫瘍特異的な結合部位に対する親和性を有するペプチド模倣体、腫瘍特異的な抗原を認識する免疫グロブリン分子もしくはそのフラグメント、または抗ウイルス受容体(例えば、抗HALR)抗体と一緒に投与することができるプロテインAのIgG結合ドメインをコードするために改変することができる。
【００１８】
詳細な説明および実施例において示されるように、本発明による方法は、すべての種類の腫瘍および転移を処置するために使用することができる。特定の実施形態において、本発明による方法は、固形腫瘍を処置するために使用することができ、特に、肝臓がん、黒色腫、類表皮がん、膵臓がん、脳の悪性腫瘍(神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、星状膠細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫および髄膜腫など)、乳がん、肺がん(小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんなど)、卵巣腺がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がんおよび腎臓がんを処置するために使用することができる。
【００１９】
本発明によれば、抗腫瘍ベクターは、好ましくは、哺乳動物(例えば、ヒト)に、非経口的に、例えば、腹腔内に投与される。
【００２０】
本発明はさらに、特にアルファウイルスベクターを用いて腫瘍を処置する開示された方法が、処置を受けている哺乳動物が少なくとも部分的に機能的な免疫系を有する場合、特に効率的であるという証拠を提供する。特定の実施形態において、本発明は、シンドビスウイルス型ベクターを使用して腫瘍を処置する方法が、機能的なナチュラルキラー(NK)細胞の存在下でより効率的であるという証拠を提供する。
【００２１】
さらに、本明細書中には、腫瘍細胞を(in vivoまたはin vitroのいずれでも)殺すための方法が提供される。この方法は、腫瘍細胞を腫瘍細胞を殺すための効果的な量のベクターと接触させることを含み、ベクターはHALRに対する優先的な親和性を有し、異種の抗腫瘍遺伝子をコードすることができてもできなくてもよい。好ましくは、ベクターは、複製能欠損アルファウイルス型ベクターであり、より好ましくは複製能欠損シンドビスウイルス型ベクターである。
【００２２】
本明細書中に開示される方法とともに、本発明は、好都合なことに、腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための薬剤組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は、HALRに対する優先的な親和性を有し、かつ腫瘍を殺すために効果的であるベクターと、薬剤として許容されるキャリアまたは希釈剤とを含むが、ベクターがアルファウイルス型ベクターである場合、アルファウイルス型ベクターは、細胞の腫瘍特異的決定基を標的化するように改変されていない。本発明の薬剤組成物は、同じ系統の正常な細胞と比較して、上昇したレベルのHALR発現によって特徴づけられるすべての種類の腫瘍および転移物を処置するために使用することができる。本明細書中に開示されるように、本発明のベクターは、シンドビスウイルスのエンベロープタンパク質のHALR結合ドメインを含むためにその標的化分子を改変することによって、HALRに対する天然の親和性を有しない粒子またはウイルス(例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルス)から得ることができる。あるいは、ベクターは、その天然の標的化性質を有し、かつ細胞の腫瘍特異的決定基を標的化するように改変されていないアルファウイルス型ベクター(最も好ましくは、複製能欠損シンドビスウイルス型ベクター)にすることができる。
【００２３】
本発明の薬剤組成物において使用されるベクターは、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子、免疫刺激遺伝子、腫瘍抑制エフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、リボザイムをコードする配列、または免疫原性ペプチドをコードする配列(これらに限定されない)などの異種の抗腫瘍遺伝子を含むために改変することができる。好ましい実施形態において、そのような抗腫瘍遺伝子は、アポトーシス誘導遺伝子、またはサイトカインをコードする遺伝子である。
【００２４】
本発明の組成物は、様々な固形腫瘍を処置するために使用することができ、特に、肝臓がん、黒色腫、類表皮がん、膵臓がん、脳の悪性腫瘍(神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、星状膠細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫および髄膜腫など)、乳がん、肺がん(小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんなど)、卵巣腺がん、結腸がん、前立腺がん、膀胱がんおよび腎臓がんを処置するために使用することができる。
【００２５】
別の実施形態において開示されるように、本発明の組成物、特に、アルファウイルスベクターを含む組成物は、少なくとも部分的に機能的な免疫系を有する哺乳動物に、好ましくは、機能的なナチュラルキラー(NK)細胞を含む免疫系を有する哺乳動物に(例えば、非経口経路によって)投与された場合、特に効率的である。
【００２６】
本発明は、添付された図面を含む詳細な説明および実施例においてさらに詳しく示されているように、本発明のこれらの目的および他の目的を満たしている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明では、単純なアルファウイルスベクターおよび既存の抗腫瘍ベクターが効果的な抗腫瘍治療のために都合よく利用される。本発明は、部分的には、複製能欠損アルファウイルスベクターが効果的な抗がん治療剤であるという予想外の発見に基づいている。したがって、本発明は、腫瘍を特異的に標的化するように改変されていないアルファウイルス型ベクターを使用して、腫瘍に罹患している哺乳動物(例えば、ヒト)を処置する方法を提供する。好ましくは、アルファウイルス型ベクターはシンドビスウイルス型ベクターであり、最も好ましくは複製能欠損シンドビスウイルス型ベクターである。
【００２８】
具体的には、本発明は、部分的には、構造遺伝子が欠失され、かつ、例えば、コード配列の5'末端の近傍においてシンドビスウイルスのサブゲノムプロモーターと機能的に結合した異種のレポーター遺伝子(β-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼなど)で置換され、コード配列の3'末端がポリアデニル化シグナルで置換されている複製能欠損シンドビスウイルスベクターは、腫瘍細胞をin vivoで効果的に標的化することができるという観測結果に基づいている。シンドビスベクターは、標的化に関して改変されていない場合、in vivoまたはin vitroで増殖している腫瘍細胞に対して大きい親和性を示し、(何らかの異種の抗腫瘍遺伝子の挿入がない場合でさえ)実験的な腫瘍保有動物の腫瘍退行および長期間の生存をもたらすその死を効率的に誘導することができることが予想外にも発見されている。
【００２９】
これに関して、本発明は、ウイルスベクターを使用する標準的な遺伝子治療からの予想外かつ好都合な展開を提供する。遺伝子治療において、ベクターは、治療遺伝子を送達するためのビヒクルである。がんの遺伝子治療の場合、治療遺伝子は、腫瘍細胞に対して有害な影響を及ぼす。がんの遺伝子治療のための典型的な治療遺伝子(「腫瘍治療遺伝子」)の例には、腫瘍抑制因子(例えば、p53およびRB);抗発がん性の細胞内抗体(例えば、抗Ras抗体および抗Raf抗体);腫瘍に対して毒性である化合物にプロドラッグを酵素的に変換することができるタンパク質(例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ[HSV-tk]、これはガンシクロビルとトキシンを形成する;水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ[VZV-tk]、これは6-メトキシプリンアラビノシドとトキシンを形成する;または細菌のシトシンデアミナーゼ、これは5-フルオロシトシンとトキシンを形成する);または抗腫瘍免疫性を高めることができる免疫刺激タンパク質(例えば、FLT-3リガンド、GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-12およびIL-13)が含まれるが、これらに限定されない。本発明のベクターにおける任意のそのような「腫瘍治療遺伝子」の存在は、(例えば、マーカー遺伝子[LacZ]をコードするベクターと、サイトカイン遺伝子[IL12]をコードするベクターとを比較することによって示されるように;下記の実施例1を参照のこと)抗腫瘍効果を高めることができるが、ベクターが、天然にアポトーシス性であるアルファウイルスベクターである場合、そのような遺伝子の存在は、治療効果を得るために必ずしも必要ないことが本明細書中に開示される。したがって、本発明のシンドビスウイルス型ベクターは、何らかの異種のコード配列を運搬することを全く必要としない。しかし、特定の実施形態において、本発明の治療活性なシンドビスウイルスベクターは、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはヒグロマイシン-EGFPなどの異種のマーカー遺伝子をコードする。別の実施形態において、これらのベクターは、アポトーシス誘導遺伝子、またはサイトカインをコードする遺伝子などの異種の抗腫瘍治療遺伝子をコードする。
【００３０】
本発明は、腫瘍細胞、特に、同じ系統の正常な細胞と比較して、より高レベルの高親和性ラミニン受容体(HALR)を発現する腫瘍細胞に対するアルファウイルス(特に、シンドビスウイルス)の天然の親和性を初めて利用する。用語「高親和性ラミニン受容体」または用語「HALR」は、この分野におけるその通常の意味を有しており、すなわち、シンドビスウイルスが細胞内に侵入するための受容体として機能し得る、Mrが67,000であるラミニン受容体である(Wang他、J. Virol.、1992、66:4992〜5001;Strauss他、Arch. Virol. Suppl.、1994、9:473〜84を参照のこと)。この観測結果に基づけば、任意のベクターをHALRに標的化するように改変することは本発明の範囲内であることは明らかである。
【００３１】
したがって、本発明は、同じ系統の正常な細胞と比較して、より高レベルの高親和性ラミニン受容体(HALR)を発現する腫瘍に罹患している哺乳動物(例えば、ヒト)を処置するための方法を提供する。この方法は、HALRに対する優先的な親和性を有するベクターを、腫瘍を処置するのに効果的な量、そのような腫瘍を有する哺乳動物に投与することを含む。ベクターは、HALRに対する優先的な親和性を有し、かつ抗腫瘍活性を有するために効果的に改変され得る任意の粒子またはウイルスから得ることができる。
【００３２】
何らかの特定の理論によってとらわれないが、これまで共に考慮されることのなかった3組の観測結果により、本発明のシンドビスベクターに基づく治療の顕著な抗腫瘍効率を説明することができる。第1に、HALRは、シンドビスウイルスがほとんどの種の細胞に侵入するための受容体として機能することができる(Wang他、J. Virol.、1992、66:4992〜5001;Strauss他、Arch. Virol. Suppl.、1994、9:473〜84)。2番目には、HALR(67,000のMr)の発現が多くのタイプのがんでは顕著に上昇していることが広く認識されている(Menard他、Breast Cancer Res. Treat、1998、52:137〜145)。事実、有意な相関が、Mrが67,000であるHALRの増大した発現と、乳がんとの間(Menard他、1998、上掲;Paolo Viacava他、J. Pathol.、1997、182:36〜44;Martignone他、J. Natl. Cancer Inst.、1993、85:398〜402)、甲状腺がんとの間(Basolo他、Clin. Cancer Res.、1996、2:1777〜1780)、結腸がんとの間(Sanjuan他、J Pathol.、1996、179:376〜380)、前立腺がんとの間(Menard S他、Breast Cancer Res. Treat、1998、52:137〜145)、胃がんとの間(de Manzoni他、Jpn J Clin. Oncol.、1998、28:534〜537)、膵臓がんとの間(Pelosi他、J Pathol.、1997、183:62〜69)、卵巣がんとの間(Menard他、Breast Cancer Res. Treat、1998、52:137〜145;van den Brule他、Eur J Cancer、1996、32A:1598〜1602)、メラニン細胞のがんとの間(Taraboletti他、J Natl. Cancer Inst.、1993、85:235〜240)、肺がんとの間(Menard他、Breast Cancer Res. Treat、1998、52:137〜145)、肝臓がんとの間(Ozaki他、Gut、1998、43:837〜842)、子宮内膜がんとの間、および子宮がんとの間(van den Brule他、Hum Pathol、1996、27:1185〜1191)において明らかにされている。事実、免疫組織化学によって調べた4000例を超える様々な器官の種々の腫瘍に関するデータはすべて、侵襲性、転移および腫瘍成長におけるHALRに対する役割と一致している(Menard他、Breast Cancer Res. Treat、1998、52:137〜145)。シンドビスベクターは、天然では血液により運ばれるので、循環を介して容易に移動することができ、そして増大したレベルのHALRを発現している増殖中の腫瘍および転移腫瘍に特異的に向かうことができる。最後に、シンドビスウイルスは、哺乳動物細胞に対して非常にアポトーシス性であることが広く知られている(Levine他、Nature、1993、739〜742;Jan他、J Virol.、1999、10296〜10302;Jan他、J Virol.、2000、6425〜6432)。細胞死は感染の数時間以内に始まり、そして48時間〜96時間までに、事実上すべての感染細胞が死に至る(Sawai他、Mol Genet Metab.、1999、67:36〜42;Griffin他、Ann. Rev.、1997、Microbiol、51:565〜592)。
【００３３】
シンドビスウイルスにより媒介される腫瘍細胞の感染におけるHALR関与の証拠には注目せざるを得ないが、本発明のシンドビスウイルス型ベクターならびに他のアルファウイルス型ベクターもまた、細胞の他の腫瘍特異的決定基(例えば、受容体)と相互作用することが可能である。すなわち、開示されたベクターは、増大したレベルのHALRを発現する腫瘍細胞を優先的に標的化している一方で、このことは細胞の特徴を表しているかもしれず、これが、ベクターが細胞に感染する機構である必要はない。本発明では、腫瘍細胞のアルファウイルス媒介感染および細胞傷害性に関与する任意の他のそのような機構が包含される。
【００３４】
上記に記されたように、本発明のベクターはまた、必要な場合には細胞傷害能を高めるために使用することができる1つまたは数個の挿入された遺伝子を運搬することができる。したがって、本発明はさらに、抗腫瘍治療遺伝子を送達するために様々なベクターを使用することに関連する。
【００３５】
重要なことに、腫瘍細胞と比較した場合、本発明のベクター(特に、シンドビスベクター)は、正常な細胞にはin vivoで同じ程度に感染しないようである。このことは、ベクター治療における示差的な効果を可能にし、例えば、ベクター治療において、腫瘍細胞の死を生じさせるシンドビスベクターによる感染により、腫瘍の除去が、処置被験者の他の組織および器官に対する明らかな有害作用を伴うことなくもたらされ得る。この現象は、正常な細胞に対して腫瘍における増大した数のHALRにより、非常に多数の露出した受容体または非占有の受容体が腫瘍細胞表面にもたらされるという観測結果によって説明することができる(Liotta、L.A. Cancer Research、1986、46:1〜7;Aznavoorian他、1992、Molecular Aspects of Tumor Cell Invasion and Metastasis、1368〜1383頁)。例えば、乳がんおよび結腸がんの組織は、良性の病巣と比較した場合、より多数の露出(非占有)HALR受容体を含有することが明らかにされている(Liotta他、1985、Exp. Cell Res.、156:117〜26;Barsky他、Breast Cancer Res. Treat.、1984、4:181〜188;Terranova他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1983、80:444〜448)。腫瘍細胞表面におけるこれらの過剰な非占有型HALR受容体は、正常な細胞では見出されていないので、シンドビスウイルスの結合、感染および細胞死の誘導のために利用され得ると考えられる。
【００３６】
細胞特異性が変化していない複製能欠損シンドビスウイルスベクターが固有的な抗腫瘍活性を有するという認識により、シンドビスベクターの数多くの他の重要な性質を利用することが可能になる。したがって、シンドビスベクターは遺伝子移入の極めて高い効率を示す。シンドビスウイルスベクターは、感染細胞の細胞質における増幅プロセスによって、感染後数時間以内に細胞あたり105個以上の活性なRNA種を発現させることができる(+)-鎖のRNAウイルスである。このレベルのRNA増幅はまた、移入された遺伝子の産物の非常に大きい発現レベルを可能にし、これにより、次に、長期間の発現が、ウイルスのアポトーシス性のためではない場合にはもたらされる(Levine他、1993、Nature、361:739〜742;Jan他、J Virol.、1999、73:10296〜10302;Jan他、J Virol.、2000、74:6425〜6432;Balachandran他、J. Virol.、2000、74:1513〜1523)。実験室におけるアルファウイルスおよび他のアルボウイルスの取扱いに関する勧告(The Subcommittee on Arbovirus Laboratory Safety of the American Committee on Arthropod-Borne Viruses、Am. J. Trop. Med. Hyg、1980、29:1359〜1381)に基づいて、シンドビスはかなり安全であると見なされている。大多数のアルファウイルスはレベル3の実施および封じ込めならびに/またはワクチン接種を必要とし、これに対して、シンドビスは、その感染が疾患を生じさせないか、または自身に限定された疾患を生じさせるかのいずれかであるウイルスに指定されているので、レベル2の実施および封じ込めを必要とするだけである。シンドビスウイルスに由来する複製能欠損シンドビスベクターは、本明細書中に例示されているように、さらにより安全であると見なすことができる。これは、感染し、複製して、ウイルス血症または疾患を生じさせるその能力が事実上存在しないからである。感染し、複製して、ウイルス血症を生じさせる能力は、組換えによって再獲得され得るだけであるが、そのような組換えは、最小限に抑えることができ、かつモニターすることができる。シンドビスベクターによりまた、染色体組み込みに関連する潜在的な合併症も回避される(Xiong他、Science、1989、243:1188〜1191)。最近の方法により、非複製的な感染が可能である新しいシンドビスベクター構築物を操作することが実質的に容易になっており、そしてベクターの安全面がさらに強化されている(Straus他、Microbiol. Rev.、1994、58:491〜562、1994)。シンドビスウイルスは、血液によって運ばれるウイルス(Turrell、1988、CRC Press, Inc.、Boca Raton、FL)であり、血液脳関門を通過することができる(Altman-Hamamdzic他、Gene Ther.、1997、4;815〜822)ので、このウイルスに基づくベクターは、血流によって移動して身体のすべての細胞に到達することができる少数の利用可能なベクターである。これに関して、そのようなベクターは、多くの他のベクターを上回る重要な利点を保持しており、例えば、脳の悪性腫瘍(神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、星状膠細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫および髄膜腫など)を処置するために使用することができる。
【００３７】
「天然に標的化された」アルファウイルス型ベクターに加えて、本発明はまた、腫瘍の壊死を誘導するアルファウイルス型ベクターを開示する。この場合、このベクターは、より特異的な腫瘍標的化分子、例えば、腫瘍特異的な受容体結合配列を含有するキメラなエンベロープタンパク質、腫瘍特異的な結合部位に対する親和性を有するペプチド模倣体、腫瘍特異的な抗原を認識する免疫グロブリン分子/フラグメント、または抗ウイルス受容体(例えば、抗HALR)抗体と一緒に投与することができるプロテインAのIgG結合ドメインなどを運搬する。特定の実施形態において、本発明は様々なシンドビス型ベクターを提供するが、これらは、例えば、プロテインAの5個の非常に相同的な58アミノ酸長のFc IgG結合ドメイン(すなわち、ドメインE、ドメインD、ドメインA、ドメインB、ドメインC)の1つもしくは複数を含むように、または2つのアミノ酸置換(Ala1−＞ValおよびGly29−＞Ala)を含有するドメインBの操作されたアナログであるドメインZを含むように改変されたキメラなE2エンベロープタンパク質が存在するために、腫瘍細胞に対して特異的に標的化される(共有のPCT公開番号WO98/44132;Uhlen他、J. Biol. Chem.、1984、259:1659;Moks他、Eur. J. Biochem.、1986、156:637〜43を参照のこと)。さらなる実施形態において、本発明は、キメラなエンベロープタンパク質を含む様々なシンドビスウイルス型ベクターを提供するが、これらは、標的の腫瘍細胞の表面に高レベルに発現する他の種類の決定基(例えば、多くのがん細胞において過剰発現するEGF受容体、または黒色腫細胞表面に過剰発現するαvβ3インテグリン類;Dmitriev他、J. Virol.、2000、6875〜84;Bonnie他、Virol.、2000、269:7〜17を参照のこと)に結合することができるドメインを含むために、あるいは特定のがん細胞タイプ(例えば、乳がんにおける乳管上皮細胞)において比較的より高レベルに発現する受容体と相互作用するドメインを含むために改変されている。したがって、特定の実施形態において、本発明は、(本発明者らによって、SawaiおよびMeruelo、1998、Biochem. Biophys
. Res. Com.、248:315〜323に開示されるように)α-hCG配列およびβ-hCG配列の挿入によって改変されたキメラなE2エンベロープタンパク質を含み、かつLH/CG受容体を有しない細胞に対してではなく、LH/CG受容体を有する絨毛がん細胞ならびに他の腫瘍細胞に選択的に感染して、これらに受容体遺伝子を移入する能力を有するシンドビスウイルス型ベクターを提供する。
【００３８】
キメラな標的化分子を含む多くの他のウイルスベクターとは対照的に、キメラなE2タンパク質を含む本発明のアルファウイルス型ベクターは、E2エンベロープタンパク質に挿入される異種の標的化フラグメントの特定の構造および/またはサイズに対して非常に寛容である。この性質は、機能的な役割が細胞の標的化および融合においてE2タンパク質とE1タンパク質との間で分離しているためであると考えられる。具体的には、詳細な実験により、E2タンパク質が、細胞表面受容体に対するウイルスの結合に主に関与しており、その一方で、ウイルスの侵入には、低いpHにより誘導されるE1における融合ドメインの露出、続く、エンドソーム膜との融合、クラスリン被覆小胞内でのエンドサイトーシス、およびエンドソームへの移入が伴うことが明らかにされている(Hoekstra他、Biosci Rep.、1989、9:273〜305;KielianおよびHelnius、91〜119頁、In S. SchlesingerおよびM.J. Schlesinger (編)、The Togaviridae and Flaviviridae、Plenum Publishing Corp.、New York、1986;Kielian他、J. Virol.、1990、64:4614〜24;Marsh、Biochem J.、1984、218:1〜10;Stegmann他、Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem.、1989、18:187〜211;Helenius他、J. Cell Biol.、1980、84:404〜20;Marsh他、Cell、1983、32:931〜940)。
【００３９】
本発明のベクターのキメラなエンベロープタンパク質に対する腫瘍特異的な標的には、限定されないが、任意の腫瘍細胞特異的なタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、多糖類および小分子リガンドが含まれる。
【００４０】
最も重要なことに、本発明は、天然に標的化されたアルファウイルス由来の抗腫瘍ベクターに限定されない。本明細書中に示されるように、この分野で広く知られている様々な方法を使用して、本発明のベクターは、シンドビスウイルスのエンベロープタンパク質のHALR結合ドメイン(好ましくは、E2のHALR結合ドメイン)、またはHALRを認識する免疫グロブリンフラグメント、または抗HALR抗体と一緒に投与することができるプロテインAのIgG結合ドメイン、またはラミニン(もしくはそのHALR結合部分)を含むためにそれらの標的化分子を改変することによって、HALRに対する天然の親和性を有しない様々なウイルス(レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスなど)または非ウイルス粒子(リポソーム、マイクロスフェア、タンパク質マトリックスなど)から得ることができる。例えば、特定の実施形態において、本発明は抗腫瘍性の様々なアデノウイルス型ベクターを提供するが、これらは、キャプシドタンパク質繊維の末端の節をコードする配列が、CARおよび他のアデノウイルス受容体に対する天然の結合性を除去するために欠失されており、その一方で、HALR結合に関わる配列が同時に挿入されている(例えば、Alemany他、Nat. Biotechnol.、2000、18:723〜727を参照のこと)。代わりの実施形態において、腫瘍特異的なアデノウイルス型ベクターが、CARタンパク質のアミノ末端の細胞外ドメイン(例えば、Dmitriev他、J. Virol.、2000、74:6875〜84;Ebbinghaus他、J. Virol.、2001、75:480〜489)と、シンドビスウイルスのE2のHALR結合ドメイン、またはHALRを認識する免疫グロブリンフラグメント、または抗HALR抗体と一緒に投与することができるプロテインAのIgG結合ドメインとからなる組換え製造された二重特異的なハイブリッドアダプタータンパク質と一緒に投与される。別の実施形態において、本発明は同様に、envタンパク質の受容体結合領域(例えば、マウス白血病レトロウイルス(MLV)型ベクターにおけるenvのN末端領域)をHALR結合ドメインで置換することにより変化した
標的化性質を有するレトロウイルス型抗腫瘍ベクターを提供する(例えば、OhnoおよびMeruelo、Biochem. Mol. Med.、1997、62:123〜127を参照のこと)。
【００４１】
まとめると、本発明は、好都合には、腫瘍に罹患している哺乳動物を処置するための方法を提供する。この場合、腫瘍の細胞は、同じ系統の正常な細胞と比較して、より大きいレベルのHALRを発現している。HALRのレベルが異なることにより、標的媒介の送達、すなわち、腫瘍細胞に対する本発明のベクターの優先的な結合がもたらされる。「より大きいレベル」の発現は、本明細書中では一般に、(非腫瘍細胞と比較して)腫瘍細胞によって発現されるレベルで、そのような優先的な結合、例えば、少なくとも3倍大きい結合、好ましくは少なくとも30倍大きい結合、最も好ましくは少なくとも300倍大きい結合がもたらされるレベルを示す。腫瘍細胞における増大した発現レベルは、絶対的な尺度で、すなわち、記載される任意の他のHALR発現非腫瘍細胞に対して評価することができ、または相対的な尺度で、すなわち、形質転換されたがん細胞と同じ系統における非形質転換細胞(例えば、黒色腫の場合におけるメラニン細胞;肝臓がんの場合における肝細胞;卵巣腺がんの場合における卵巣内皮細胞、腎臓がんの場合における腎臓の内皮細胞または上皮細胞)によって発現されるレベルに対して評価することができる。
【００４２】
一般的な定義
用語「ベクター」、用語「クローニングベクター」、用語「発現ベクター」および用語「ヘルパーベクター」は、DNA配列またはRNA配列(例えば、外来遺伝子)を宿主細胞に導入して、その結果、導入された配列の発現(例えば、転写および/または翻訳)を促進させるようにすることができるビヒクルを意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれる。本発明のウイルスベクターに関して本明細書中で使用される「発現ベクター」は、宿主細胞に感染することができるベクターを示すために最も一般的に使用され、その一方で、用語「ヘルパーベクター」は、ウイルス様粒子への「発現ベクター」の正しいパッケージングを媒介することができるベクターを示すために使用される。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「異種の配列または遺伝子」は、示された分子の核酸配列(例えば、アルファウイルスのゲノム)に関連して天然に見出されない核酸(RNAまたはDNA)配列を意味する。同様に、用語「異種のタンパク質またはペプチド」は、アルファウイルスのゲノムに天然ではコードされていないタンパク質配列、ペプチド配列および/またはアミノ酸配列を意味する。本発明の意味の範囲内において、アルファウイルス型ベクターに含有される異種の遺伝子は、典型的には非ウイルス起源である。しかし、この用語はまた、一次核酸配列における変化(例えば、核酸の欠失、置換および/または付加)を生じさせるための人為的な操作によって、かつ/または天然(例えば、天然に存在する)ウイルス分子に配置することによって変化しているアルファウイルスの配列を含むことができる。本発明の好ましい異種の遺伝子には、レポーター遺伝子(β-ガラクトシダーゼ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子など)、抗腫瘍遺伝子(自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子、免疫刺激遺伝子、腫瘍抑制エフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列、リボザイムをコードする配列、または免疫原性ペプチドをコードする配列など)、および腫瘍標的化分子をコードする遺伝子(腫瘍特異的な受容体結合配列を含有するキメラなエンベロープタンパク質をコードする遺伝子、腫瘍特異的な結合部位に対する親和性を有するペプチド模倣体をコードする配列、腫瘍特異的な抗原を認識する免疫グロブリン分子/フラグメントをコードする遺伝子、または抗ウイルス受容体[例えば、抗HALR]抗体と一緒に投与することができるプロテインAのIgG結合ドメインをコードする遺伝子など)が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「感染性の」は、アルファウイルスに基づくRNA分子を記載するために使用されるとき、自己複製性であり、かつ宿主細胞における転写をもたらすRNA分子を意味する。用語「複製」は、アルファウイルスのゲノムRNA分子または組換えアルファウイルス型ベクターのRNA分子とともに使用されるとき、鋳型として(-)-鎖RNAを使用して(+)-鎖RNAの全長の等価体が産生されることを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「トランスフェクション」は、外因性の核酸分子を宿主細胞に導入するための、吸着、顕微注入、エレクトロポレーション、リポフェクションおよびその他(これらに限定されない)などの任意の手段を含むことが理解される。用語「トランスフェクションされた」または用語「形質転換された」は、細胞を記載するために使用されるとき、外因から導入された核酸分子を含有する細胞、および/または外因性の核酸分子の導入によってその遺伝子組成が変化している細胞を意味する。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「優先的な結合」または用語「優先的な親和性」は、所与の細胞受容体(例えば、HALR)と相互作用し、これにより、この受容体を発現している細胞の増大した感染をもたらすウイルスベクターの能力を示す。HALR受容体に対する優先的な親和性を有する本発明のベクターは、増大した数のHALRを発現している腫瘍細胞に対して特に優先的に感染することになる。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「腫瘍」は、制御されずに増殖する形質転換された細胞を含む悪性の組織を示す。腫瘍には、白血病、リンパ腫、骨髄腫、形質細胞腫など;および固形腫瘍が含まれる。本発明に従って処置され得る固形腫瘍の例には、肉腫および癌腫が含まれ、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、類表皮がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、嚢腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、頸部がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状膠細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および網膜芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。上記に記されたように、本発明の方法は、処置のために標的化された腫瘍の細胞によるHALRの発現に依存する。
【００４８】
用語「細胞の腫瘍特異的決定基」または用語「腫瘍特異的な標的」は、腫瘍細胞の表面における任意の分子で、本発明のベクターによるこの細胞の選択的または優先的な標的化のために使用することができるそのような分子を広く定義するために本明細書中では使用される。本発明のベクターに対する細胞の腫瘍特異的決定基には、限定されないが、任意の腫瘍細胞表面タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、多糖類、そして小分子リガンドが含まれる。本発明の好ましい、細胞の腫瘍特異的決定基は、腫瘍特異的な膜タンパク質であり、例えば、(黒色腫における)ErbB受容体、Melan A [MART1]、gp100、チロシナーゼ、TRP-1/gp75、およびTRP-2;(膀胱がん、頭頸部がんおよび非小細胞がんにおける)MAGE-1およびMAGE-3;(頸部がんにおける)HPVEGタンパク質およびE7タンパク質;(乳がん、膵臓がん、結腸がんおよび前立腺がんにおける)ムチン[MUC-1];(前立腺がんにおける)前立腺特異的抗原[PSA];(結腸がん、乳がんおよび胃腸がんにおける)がん胎児性抗原[CEA]、(絨毛がんにおける)LH/CG受容体、そしてMAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1,2,8、CAGE-3〜7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTVおよびTRP2-INT2などのようなそのような共有される腫瘍特異的抗原などである。HALRならびに他の決定基(例えば、EGF受容体またはαvβ3インテグリン類)は、同じ系統の正常な細胞と比較したとき、ある種の腫瘍細胞の表面においてより高レベルに発現しているので、これらもまた、用語「細胞の腫瘍特異的決定基」によって包含される。
【００４９】
本明細書中で使用される用語「哺乳動物」は、その通常の意味を有しており、具体的には霊長類を含み、より具体的にはヒトを含む。腫瘍の存在について処置され得る他の哺乳動物には、イヌ、ネコ、齧歯類(ラシン(racine)、ネズミ、ルピン(lupine)など)、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタの種が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物(例えば、マウスなどの齧歯類)を示す。特に、この用語はヒトを示す。
【００５１】
用語「約("about"または"approximately")」は、通常、測定値および測定方法のタイプについて許容され得る誤差範囲内であることを意味する。例えば、この用語は、所与の値または範囲の20%以内であること、より好ましくは所与の値または範囲の10%以内であること、最も好ましくは所与の値または範囲の5%以内であることさえ意味することができる。あるいは、特に生物学的システムにおいては、用語「約」は、所与の値の約1対数(すなわち、1桁)の範囲内であることを意味し、好ましくは所与の値の2倍以内であることを意味する。
【００５２】
用語「処置する」は、被験体における疾患の少なくとも1つの症状を軽減または緩和することを意味するために本明細書中では使用される。本発明の意味の範囲内において、用語「処置する」はまた、感染初期無症状期(すなわち、疾患の感染と臨床的発現との間の期間)を長くすることを意味する場合もある。用語「保護する」は、対象における疾患の発症または持続を適するように防止するか、または対象における疾患の発症または持続を適するように処置するか、またはその両方であることを意味するために本明細書中では使用される。本発明の意味の範囲内において、疾患はがんである。
【００５３】
本発明の組成物に関連して使用される表現「薬剤として許容される」は、生理学的に許容可能であり、かつヒトに投与されたときに望ましくない反応を典型的にはもたらさない、そのような組成物の分子的実体および他の成分を示す。好ましくは、本明細書中で使用される用語「薬剤として許容される」は、哺乳動物における使用、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認められる調剤書に載せられていることを意味する。
【００５４】
用量または量に適用される用語「治療上効果的な」は、その必要性のある哺乳動物に投与されたときに所望する活性を生じさせるために十分である、化合物または薬剤組成物の量を意味する。本発明のウイルスベクターに関して本明細書中で使用される用語「治療上効果的な量/用量」は、哺乳動物に投与されたときに効果的な抗腫瘍応答をもたらすために十分である、ベクターまたはベクターを含有する薬剤組成物の量/用量を示す。
【００５５】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望する生物学的活性を示す限り、天然型の抗体だけでなく、単一のモノクローナル抗体(アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ならびに抗体フラグメント(例えば、Fab、F(ab')2、scFvおよびFv)をも包含する。
【００５６】
用語「先天性免疫」または用語「自然免疫」は、抗原との以前の接触によって影響を受けない先天性の免疫応答を示す。先天性免疫の保護機構には、なかでも、微生物およびある種の腫瘍細胞を破壊し、ある種のウイルス感染細胞を攻撃するナチュラルキラー(NK)細胞、そして侵入物を食菌するためにマクロファージおよび樹状細胞などの白血球を動員する炎症応答が含まれる。
【００５７】
ベクター
本発明の最も好ましいベクターはアルファウイルス型ベクターであり、特に、複製能欠損の天然に標的化されたシンドビスウイルス型ベクターである。in vitro、in vivoおよびex vivoにおける本発明の他の好ましいベクターは、望ましい細胞向性(すなわち、高親和性ラミニン受容体(HALR)に対する優先的な結合)を有するか、または望ましい細胞向性(すなわち、高親和性ラミニン受容体(HALR)に対する優先的な結合)を有するために改変されたウイルスベクター、例えば、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、パピローマウイルス、エプスタンバールウイルス(EBV)、バキュロウイルスおよび他の組換えウイルスである。
【００５８】
様々なウイルスベクターの様々な構築方法および使用方法がこの分野では知られている(例えば、MillerおよびRosman、BioTechniques、1992、7:980〜990を参照のこと)。本発明に従って、当業者の範囲に含まれる様々な従来の分子生物学技術および微生物学技術および組換えDNA技術を用いることができる。そのような技術は十分に知られており、文献に詳しく説明されている。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York (本明細書中では「Sambrook他、1989」);DNA Cloning: A Practical Approach、第I巻および第II巻(D.N. Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins編(1985)];Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins編(1984)];Animal Cell Culture [R.I. Freshney編(1986)];Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press、(1986)];B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);F.M. Ausubel他(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照のこと。
【００５９】
様々な企業がウイルスベクターを商業的に製造しており、そのような企業には、Avigen, Inc.(Alameda、CA;AAVベクター)、Cell Genesys(Foster City、CA;レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクターおよびレンチウイルスベクター)、Clontech(レトロウイルスベクターおよびバキュロウイルスベクター)、Genovo, Inc.(Sharon Hill、PA;アデノウイルスベクターおよびAAVベクター)、Genvec(アデノウイルスベクター)、IntroGene(Leiden、オランダ;アデノウイルスベクター)、Molecular Medicine (レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクターおよびヘルペスウイルスベクター)、Norgen(アデノウイルスベクター)、Oxford BioMedica(Oxford、英国;レンチウイルスベクター)およびTransgene(Strasbourg、フランス;アデノウイルスベクター、ワクシニアベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクター)が含まれるが、これらに決して限定されない。
【００６０】
好ましくは、本発明のウイルスベクターは複製能欠損型であり、すなわち、標的細胞において自律的に複製することができない。好ましくは、本発明の複製能欠損ウイルスは最小ウイルスである。すなわち、本発明の複製能欠損ウイルスは、標的細胞の認識およびウイルスゲノムのキャプシド化のために必要であるそのゲノムの配列のみを保持するだけである。複製能欠損ウイルスは、細胞に導入された後、感染性がない。複製能欠損ウイルスベクターの使用により、ベクターが他の細胞に感染し得るということを憂慮することなく、特定の限局化された領域における細胞への投与が可能になる。したがって、特定の組織を特異的に標的化することができる。複製能欠損アルファウイルスベクターに加えて、具体的なベクターの例には、欠陥ヘルペスウイルスのベクター(例えば、Kaplitt他、Molec. Cell. Neurosci.、1991、2:320〜330;特許公報RD371005A;PCT公開番号WO94/21807および同WO92/05263を参照のこと)、欠陥アデノウイルスのベクター(例えば、Stratford-Perricaudet他、J. Clin. Invest.、1992、90:626〜630;La Salle他、Science、1993、259:988〜990;PCT公開番号WO94/26914、同WO95/02697、同WO94/28938、同WO94/28152、同WO94/12649、同WO95/02697および同WO96/22378を参照のこと)、および欠陥アデノ関連ウイルスのベクター(Samulski他、J. Virol.、1987、61:3096〜3101;Samulski他、J. Virol.、1989、63:3822〜3828;Lebkowski他、Mol. Cell. Biol.、1988、8:3988〜3996;PCT公開番号WO91/18088および同WO93/09239;米国特許第4,797,368号および同第5,139,941号;欧州特許公開番号EP488528)が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
上記に示されるように、様々な方法を、HALRに対してベクターを標的化するために実施することができ、そのような方法には、HALR結合配列(例えば、シンドビスウイルスのE2タンパク質)をウイルスに導入することによって、HALR結合配列を含有するようにウイルスのキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質を改変することによって、またはベクターおよびHALRに結合する二重特異的な試薬を使用することによって、またはこれらの方法の組合せを使用することによって、ウイルスベクターを仮タイプ化することが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
アデノウイルス型ベクター。アデノウイルスは、本発明の核酸を様々な細胞タイプに効率的に送達するために改変することができる真核生物性のDNAウイルスである。様々な血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型の中で、本発明の範囲内では、タイプ2もしくはタイプ5のヒトアデノウイルス(Ad2もしくはAd5)または動物起源のアデノウイルスを使用することが好ましい(PCT公開番号WO94/26914を参照のこと)。本発明の範囲内において使用することができる動物起源のそのようなアデノウイルスには、イヌ起源のアデノウイルス、ウシ起源のアデノウイルス、ネズミ起源のアデノウイルス(例えば、Mavl [Beard他、Virology、1990、75:81])、ヒツジ起源のアデノウイルス、ブタ起源のアデノウイルス、トリ起源のアデノウイルス、およびサル起源のアデノウイルス(例えば、SAV)が含まれる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルスであり、より好ましくはCAV2アデノウイルス(例えば、Manhattan株またはA26/61株[ATCC受託番号VR-800])である。様々な複製能欠損アデノウイルスベクターおよび最小アデノウイルスベクターが記載されている(PCT公開番号WO94/26914、同WO95/02697、同WO94/28938、同WO94/28152、同WO94/12649、同WO95/02697、同WO96/22378)。本発明による複製能欠損組換えアデノウイルスは、当業者に知られている任意の方法によって調製することができる(Levrero他、Gene、1991、101:195;欧州特許公開番号185573;Graham、EMBO J.、1984、3:2917;Graham他、J. Gen. Virol.、1977、36:59)。組換えアデノウイルスは、当業者に広く知られている標準的な分子生物学的技術を使用して回収および精製される。
【００６３】
アデノ関連ウイルス型ベクター。アデノ関連ウイルス(AAV)は、感染した細胞のゲノムに安定的かつ部位特異的な様式で組み込まれ得る比較的小さいサイズのDNAウイルスである。アデノ関連ウイルスは、細胞の増殖または形態学または分化に対する作用を何ら誘導することなく広範囲の細胞に感染することができるが、ヒトの病理には関与していないようである。AAVのゲノムはクローン化され、配列決定され、そして特徴づけられている。遺伝子をin vitroおよびin vivoで移入するためにAAV由来のベクターを使用することが記載されている(PCT公開番号WO91/18088および同WO93/09239;米国特許第4,797,368号および同第5,139,941号;欧州特許公開番号488528を参照のこと)。本発明による複製能欠損組換えAAVは、AAVの2つの逆方向末端反復(ITR)領域によって挟まれた目的とする核酸配列を含有するプラスミドと、AAVキャプシド化遺伝子(rep遺伝子およびcap遺伝子)を運搬するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)が感染している細胞株に同時トランスフェクションすることによって調製することができる。得られたAAV組換え体は、その後、標準的な技術によって精製される。
【００６４】
レトロウイルスベクター。別の実施形態において、本発明は、例えば、Mann他、Cell 1983、33:153;米国特許第4,650,764号、同第4,980,289号、同第5,124,263号および同第5,399,346号;Markowitz他、J. Virol.、1988、62:1120;欧州特許公開番号453242および同178220;Bernstein他、Genet. Eng.、1985、7:235;McCormick、BioTechnology、1985、3:689;Kuo他、1993、Blood、82:845に記載されるような、様々なレトロウイルスベクターを提供する。これらのレトロウイルスは、分裂中の細胞に感染する組込み型ウイルスである。レトロウイルスのゲノムは、2つのLTR、キャプシド化配列および3つのコード領域(gag、polおよびenv)を含む。複製能欠損の非感染性レトロウイルスベクターは、ウイルスパッケージングシグナルを破壊するために操作されるが、異種の遺伝子およびパッケージングシグナルを含有するために操作された同時導入ウイルスをパッケージングするために必要とされる構造遺伝子を保持している。したがって、組換えられた複製能欠損レトロウイルスベクターでは、gag遺伝子、pol遺伝子およびenv遺伝子は、一般には、全体または一部が欠失され、目的とする異種の核酸配列で置き換えられている。これらのベクターは、HIV(ヒト免疫不全症ウイルス)、MoMuLV(マウスモロニー白血病ウイルス)、MSV(マウスモロニー肉腫ウイルス)、HaSV(ハーベイ肉腫ウイルス)、SNV(脾臓壊死ウイルス)、RSV(ラウス肉腫ウイルス)およびフレンドウイルスなどの種々のタイプのレトロウイルスから構築することができる。様々な好適なパッケージング細胞株が先行技術において記載されている:具体的には、PA317細胞株(米国特許第4,861,719号);PsiCRIP細胞株(PCT公開番号WO90/02806)およびGP+envAm-12細胞株(PCT公開番号WO89/07150)。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのLTR内の修飾、ならびにgag遺伝子の一部を含み得る長いキャプシド化配列を含むことができる(Bender他、J. Virol、1987、61:1639)。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に知られている標準的な技術によって精製される。
【００６５】
レトロウイルスベクターはまた、DNAウイルスによって導入することができ、これにより、1サイクルのレトロウイルスの複製が可能になり、トランスフェクション効率が増幅される(PCT公開番号WO95/22617、同WO95/26411、同WO96/39036、同WO97/19182を参照のこと)。
【００６６】
本発明の特定の実施形態において、レンチウイルスベクターを、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含むいくつかの組織タイプにおける導入遺伝子の直接的な送達および持続した発現のための媒介因子として使用することができる。このサブタイプのレトロウイルスベクターは、これらの組織における分裂中の細胞および非分裂細胞に効率的に形質導入することができ、そして目的とする遺伝子の長期間の発現を維持することができる(総説については、Naldini、Curr. Opin. Biotechnol.、1998、9:457〜63;Zufferey他、J. Virol.、1998、72:9873〜80を参照のこと)。レンチウイルスの様々なパッケージング細胞株を利用することができ、これらはこの分野では一般に知られている(例えば、Kafri他、J. Virol.、1999、73:576〜584を参照のこと)。
【００６７】
非ウイルスベクター。別の実施形態において、本発明は、HALRと特異的に結合する標的化ペプチド、標的化タンパク質、標的化抗体などが含まれる場合にin vivoで導入され得る非ウイルスベクターを提供する。例えば、合成されたカチオン性脂質の組成物を、抗腫瘍治療遺伝子を運搬するベクターのin vivoでのトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用することができ、そのような組成物が、Felgner他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1987、84:7413〜7417;FelgnerおよびRingold、Science、1989、337:387〜388;Mackey他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1988、85:8027〜8031;Ulmer他、Science、1993、259:1745〜1748に記載されている。核酸を移入するための有用な脂質化合物および組成物が、例えば、PCT公開番号WO95/18863および同WO96/17823ならびに米国特許第5,459,127号に記載されている。標的化ペプチド(例えば、ラミニンまたはHALR結合ラミニンペプチド)および標的化タンパク質(抗HALR抗体など)、または標的化非ペプチド分子は、(例えば、ペプチドをリン脂質またはコレステロールにコンジュゲート化することによって;Mackey他(上掲)もまた参照のこと)共有結合的に、または(例えば、膜の結合ドメインまたは部分を介して二重層膜内に挿入することによって)非共有結合的に、リポソームに結合させることができる。
【００６８】
アルファウイルスベクター、特にシンドビスウイルスベクター
アルファウイルスはこの分野では広く知られており、これには、限定されないが、ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルスおよび関連種;シンドビスウイルス、ならびに組換え種または非分類種が含まれる(StraussおよびStrauss、Microbiol. Rev.、1994、58:491〜562、表1、493頁を参照のこと)。
【００６９】
好ましくは、本発明のアルファウイルスベクターは、複製能欠損ウイルスとして調製される。本明細書中で使用される用語「複製能欠損ウイルス」は、その通常の意味を有しており、すなわち、そのゲノムに対する改変の結果として増殖することができないウイルスである。したがって、そのような組換えウイルスが細胞に感染すると、ウイルスがたどることができる唯一の経過は、そのゲノムに含まれる何らかのウイルスタンパク質および異種タンパク質を発現させることであり、そしてシンドビスベクターおよび他のアルファウイルスベクターの場合にはアポトーシスを誘導することである。特定の実施形態において、本発明の複製能欠損アルファウイルス型ベクターは、非構造タンパク質をコードする遺伝子を含有しており、RNA転写および遺伝子発現のために他のベクターを必要としない。しかし、これらのベクターは、構造タンパク質をコードする遺伝子を有しておらず、その結果、ヘルパーゲノムが、ベクターを感染性粒子にパッケージングさせるためには必要となる。治療上安全なベクターを提供することに加えて、構造タンパク質を除去することにより、これらのベクターの収容能力が大きくなり、6kbを越える異種の配列が取り込まれる。別の実施形態において、本発明のアルファウイルスベクターの増殖不能は、例えば、パッケージングされた細胞株から放出されようとしているビリオンに構造タンパク質がパッケージングされることを可能にするパッケージングシグナルを除くことによって間接的に達成される。
【００７０】
シンドビスウイルスは著しい健康上の有害性を有していないので、シンドビスウイルスはまた、増殖能を有する形態で使用することができる。すなわち、ほとんどのウイルスベクターとは異なり、シンドビスウイルスベクターを欠陥型または複製不能型にすることは必須ではない。だが、シンドビスウイルスベクターを欠陥型または複製不能型にすることは、厳しい安全性の理由のために好ましい。したがって、本発明により、増殖能欠損型および増殖可能型の両方のシンドビスウイルスベクターが考えられる。
【００７１】
上記のように、アルファウイルイスベクター、特にシンドビスウイルスベクターは、「プログラム化された細胞死」とも呼ばれるアポトーシスを自然の状態で誘導する。アポトーシスは、核の破壊、DNAの消化、そして最終的には細胞の壊死および除去をもたらす細胞固有の細胞プロセスである。本発明のベクターのアポトーシス能は、組織培養における細胞(例えば、下記の実施例1において議論される宿主細胞のいずれか)を使用してin vitroで試験するすることができる。
【００７２】
本発明のアルファウイルスベクターを調製するための様々な方法がこの分野では知られている。シンドビスウイルス型ベクターの場合、一般に、ベクターの調製には、パッケージング細胞株を、シンドビスの非構造遺伝子および必要な場合にはシンドビスのサブゲノムプロモーターの制御下にある異種の遺伝子を含むキャップ化されたmRNA、そしてシンドビスの構造遺伝子を発現するヘルパープラスミドベクター(図1を参照のこと)と同時トランスフェクションすることが含まれる。キャップ化されたmRNAは、in vitro転写によって作製することができる。
【００７３】
様々な細胞株をパッケージング細胞として使用することができる。これらには、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)、BHK(ベビーハムスター腎臓)、HuH7(ヒト肝細胞がん)などの哺乳動物細胞株が含まれる。これらの細胞株の欠点の1つは、シンドビスウイルスベクターの産生がアポトーシスを誘導し、それにより、パッケージング細胞の破壊が同時トランスフェクションの数時間以内または数日以内に生じるということである。したがって、新しいパッケージング細胞を継続して調製しなければならない。さらに、哺乳動物細胞において産生されたシンドビスウイルス型ベクターは、負に荷電したグリコサミノグリカンのヘパラン硫酸と効率的に相互作用して、増大したウイルスクリアランスおよび低下した感染性をもたらすようである(例えば、ByrnesおよびGriffin、2000、J. Virol.、74:644〜651を参照のこと)。
【００７４】
これらの問題を避けるために、本発明者らは、昆虫細胞(好ましくは、蚊のC6/36細胞)に由来するシンドビスウイルスパッケージング細胞株を開発している(米国仮特許第60/279,048号(2001年3月27日出願)に基づく共有かつ同時係属中のPCT出願番号PCT/US02/[代理人内部参照番号5986/2H995-WO0](本出願と同一日付で出願)(発明の名称:アルファウイルスベクターを連続的に産生するためのパッケージング細胞株)、これらはともに、その全体が参考として本明細書中に特に組み込まれる)。パッケージング昆虫細胞株を作製するために、本発明者らは、ウイルスRNAを複製するために非構造遺伝子のnsp1〜4をコードするDNAベクターと、構造タンパク質(キャプシドタンパク質C、E1、E2、E3および6K)およびパッケージングシグナルをコードするもう1つの(ヘルパー)DNAベクターとの2つのDNAベクターでC6/36細胞を安定的に形質転換した。本発明者らによって予想外に発見されたように、昆虫に由来するこれらのパッケージング細胞は、アポトーシスにより誘導されるシンドビスベクターの様々な性質に対して実質的に耐性であり、そして安定して高いウイルス力価をもたらす長期間のベクター産生培養を確立するために操作することができる。C6/36蚊細胞に加えて、本発明において使用される他の昆虫細胞株の非限定的な例には、u4.4細胞、High Five（商標）細胞、シュナイダーのショウジョウバエ細胞株2、スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)SF9細胞、およびC7-10細胞が含まれる。
【００７５】
それぞれの場合において、複製能欠損ウイルスのゲノムを含むアルファウイルス粒子(特に、シンドビスウイルス粒子)は、この分野で知られている技術のいずれかによって、パッケージング細胞の培養上清から集めることができ、そして濃縮および精製することができる。これらの技術には、遠心分離および超遠心分離;イオン交換カラム、サイズ排除カラム、疎水性相互作用カラム、親水性相互作用カラムまたは他のタイプのカラムにおけるクロマトグラフィー;ろ過および限外ろ過;アフィニティー精製;またはこの分野で知られている様々な他の技術が含まれるが、これらに限定されない。本発明の単離されたウイルス粒子は、溶液で保存されるか、または好ましいことではあるが、凍結乾燥して、粉末の形態で保存されるか、そのいずれでも可能である。
【００７６】
抗腫瘍治療遺伝子
本発明の治療ベクターは、本明細書中に開示されるように抗腫瘍治療遺伝子を運搬することができる。詳細には、本発明のアルファウイルスベクター(特に、シンドビスウイルスベクター)は、治療遺伝子の挿入物を運搬することができるので、下記に記載される遺伝子治療剤のいずれかを含むために改変することができる。
【００７７】
本明細書中で使用される用語「抗腫瘍遺伝子治療」は、腫瘍の壊死、アポトーシス、成長調節、すなわち、腫瘍の退行または抑制を生じさせる、腫瘍に対して標的化された遺伝子治療を示す。抗腫瘍遺伝子治療の例には、自殺遺伝子の導入、アポトーシス遺伝子の導入、腫瘍抑制遺伝子の導入、およびがん遺伝子のアンタゴニスト遺伝子の導入が含まれるが、これらに決して限定されない。好ましくは、抗腫瘍遺伝子は、動員された樹状細胞を含む免疫エフェクター細胞の腫瘍への呼び寄せおよび活性化を高めるために、免疫刺激遺伝子が補充される。
【００７８】
したがって、「遺伝子治療」は、エフェクター分子をコードする遺伝子を細胞(この場合には腫瘍細胞)に移入することを特に示す。
【００７９】
自殺遺伝子による治療。化学療法剤に対する感受性を腫瘍細胞に与えることができる酵素をコードする遺伝子(自殺遺伝子)の導入は、効果的な抗腫瘍遺伝子治療であることが証明されている。本発明は、部分的には、プロドラッグ(すなわち、非毒性の化合物)を毒性の化合物に酵素的に変換することができるタンパク質をコードする遺伝子ベクターを導入することによってがんを処置する方法を提供する。本発明の方法において、治療核酸配列は、自身で細胞死を生じさせる生成物または他の薬物の存在下で細胞死を生じさせる生成物をコードする核酸である。そのような治療核酸の代表的な例が、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV-tk)をコードする核酸である。さらなる例には、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ(VZV-tk)および細菌遺伝子シトシンデアミナーゼがある。
【００８０】
本発明の方法において有用なプロドラッグは、毒性の生成物(すなわち、腫瘍細胞に対して毒性)に変換され得る任意のプロドラッグである。そのようなプロドラッグの代表的な例には、ガンシクロビルがあり、これはHSV-tkによって毒性の化合物にin vivoで変換される(Chen他、Cancer Res.、1996、56:3758〜3762)。プロドラッグの他の代表的な例には、アシクロビル、FIAU[1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル]、6-メトキシプリンアラビノシド(これらはVZV-tkによって変換される)、および5-フルオロシトシン(これはシトシンデアミナーゼによって変換される)が含まれる。
【００８１】
プロドラッグは、この分野における通常の能力を有する医師によって患者に容易に投与することができる。この分野で知られている方法を使用して、そのような医師はまた、プロドラッグの投与について最も適切な用量および経路を決定することができる。例えば、ガンシクロビルは約1〜20mg/日/kg体重の用量で好ましくは投与され、アシクロビルは約1〜100mg/日/kg体重の用量で投与され、FIAUは約1〜50mg/日/kg体重の用量で投与される。
【００８２】
アポトーシス誘導遺伝子、抗がん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子による治療。多くのがんタイプにおける腫瘍の開始および進行は、がん遺伝子(例えば、ras、myc)および腫瘍抑制遺伝子(例えば、Rb、p53)における変異に関係している。多数の方法が、モノクローナル抗体および単鎖抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アナログならびに免疫原性ペプチドを含む様々な抗がん遺伝子分子および/または腫瘍抑制因子エフェクター分子を使用して現在進められている(Chen、Mol. Med. Today、1997、3:160〜167;Spitz他、Anticancer Res.、1996、16:3415〜3422;Indolfi他、Nat. Med.、1996、2:634〜635;Kijima他、Pharmacol. Ther.、1995、68:247〜267;PCT公開番号WO94/24297および同WO97/16547;フランス国特許出願第08729号)。これらの分子は、腫瘍の増殖を特異的に抑制し、腫瘍細胞におけるアポトーシス速度を増大させる。それらの作用機構では、持続した応答のためには、抑制因子分子または抗がん遺伝子分子が絶えず存在することが要求される。しかしながら、これらの分子は、疾患の再発に対する保護のために必要な記憶能を有する腫瘍特異的な免疫性を誘導することが示されていない。腫瘍増殖に特異的なこれらの方法を免疫刺激治療と組み合わせることは、腫瘍の退行と、保護的な免疫応答の誘導とに対する相乗作用を有する。
【００８３】
免疫刺激治療。本発明はまた、強い抗腫瘍免疫応答を生じさせるために、樹状細胞(DC)の動態化などの免疫細胞刺激を提供する。用語「樹状細胞(DC)動態化剤」は、DCの機能的活性を活性化する分子を示す。広く知られているDC動態化剤は、flt-3リガンド(flt-3L)がある。抗腫瘍に基づく免疫療法の効力は、様々なサイトカインを加えることによって高めることができる。IL-12などのサイトカインは、DCの抗原提示能および免疫調節能を増幅し、腫瘍の血管形成を阻害し、これにより腫瘍の免疫感受性を引き続き誘導することができる。逆に、IL-7などのサイトカインは、より強力なT細胞応答を誘導し、そしてin vivoでのT細胞防御を効果的に逆戻りさせ得る。本明細書中に開示されるように、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、IL-2、IL-3、IL-4、TNF-αおよびc-kitリガンドなどの他のサイトカインはまた、DC動態化剤と組み合わせて使用することができる。
【００８４】
これらのサイトカインは、例えば、可溶性タンパク質またはマイクロ粒子カプセル化タンパク質として、あるいは本発明のベクターを含む様々なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに遺伝子を導入することによって投与することができる。局所的な抗腫瘍遺伝子治療に加えたそのようなサイトカインの全身送達は、これらのサイトカインの腫瘍分布を増大させることができ、これは、T細胞防御および効果的な腫瘍応答を長期間にわたって逆にするために必要であると考えられる。これらのサイトカインは、投与様式に依存して、効率的な抗腫瘍免疫応答のために免疫炎症を利用することにおいて非常に重要な役割を有し得る。
【００８５】
腫瘍増殖阻害剤。用語「腫瘍増殖阻害剤」は、インターフェロン(IFN)-γ、腫瘍壊死因子(TNF)-α、TNF-βおよび類似する様々なサイトカイン(これらに限定されない)などの、腫瘍の増殖を阻害するタンパク質を示すために本明細書中では使用される。あるいは、腫瘍増殖阻害剤は腫瘍増殖因子のアンタゴニストであり得る。そのようなアンタゴニストには、腫瘍増殖因子(TGF)-βおよびIL-10のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。本発明により、腫瘍増殖阻害剤タンパク質を全身に投与すること、または腫瘍増殖阻害剤タンパク質を遺伝子治療によって投与することが考えられる。
【００８６】
抗血管形成因子。腫瘍の血管形成は腫瘍進行の不可欠な部分であり、血管形成を阻害することを目標とする様々な治療が、現在、がん治療として開発中である。抗血管形成治療は、主として腫瘍の増殖/アポトーシスのバランスを逆にし、休眠状態を誘導する。これらの治療の適用が中止されると、血管形成が再び始まることになり、腫瘍の増殖が進行する。抗血管形成は、患者における有害な副作用を伴うことなく腫瘍の塊を特異的に減少させるための強力な機構である。抗血管形成によって誘導される休眠状態治療は、腫瘍を取り除き、腫瘍の微小環境を変化させ、免疫抑制作用を除き、そして免疫により媒介されるクリアランスに対して腫瘍をより感受性にすることによって、他の治療スキームを成功させることができる。
【００８７】
「抗血管形成因子」は、特に内皮細胞の遊走を阻止することによって血管形成を阻害する分子である。そのような因子には、血管形成タンパク質の阻害性フラグメント(ウロキナーゼのアミノ末端フラグメント[PCT公開番号WO93/15199]など);アンギオスタチン(O'Reilly他、Cell、1994、79:315〜328);エンドスタチン;血管形成因子に対する可溶性形態の受容体、例えば、ウロキナーゼ受容体またはFGF/VEGF受容体(Wilhem他、FEBS Letters、1994、337:131〜134)など;内皮細胞増殖因子受容体を阻止する分子(O'Reilly他、Cell、1997、88:277〜285;O'Reilly他、Nat. Med.、1996、2:689〜692)、およびTie-1阻害剤またはTie-2阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明により、抗血管形成因子を全身に投与すること、あるいは抗血管形成因子を遺伝子治療によって投与することが考えられる。好ましくは、本発明において使用される抗血管形成因子は、本発明のベクターに含有される遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドである。
【００８８】
ベクターによる治療
上記に記されるように、本発明のアルファウイルス型ベクター、特にシンドビスウイルス型ベクターは、様々ながんを処置するために使用することができる。また、本発明の非アルファウイルス型ベクターは、増大したレベルのHALRを腫瘍細胞が発現している任意のがんを処置するために使用することができる。
【００８９】
上記に記載されるようにして得られた、単離され、好ましくは精製されたウイルスベクターは、患者に投与される薬剤組成物に配合することができる。本明細書中で使用される「薬剤組成物」は、活性な薬剤(すなわち、ウイルスベクター)と、薬剤として許容されるキャリアまたは賦形剤または希釈剤とを含む。表現「薬剤として許容される」は、生理学的に許容され、かつヒトに投与されたとき、アレルギー反応または類似した望ましくない反応(胃の不調、めまいなど)を典型的にはもたらさない分子的実体および組成物を示す。好ましくは、本明細書中で使用される用語「薬剤として許容される」は、動物における使用、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認められる調剤書に載せられていることを意味する。用語「キャリア」は、化合物が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを示す。そのような薬剤キャリアには、無菌の液体を挙げることができ、例えば、水およびオイル(石油起源、動物起源、植物起源または合成起源を含む)などであり、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などがある。水溶液または水性溶液の生理的食塩水溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液が、好ましくは、特に注射用溶液に対するキャリアとして用いられる。様々な好適な薬学的キャリアが、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００９０】
ヒトの治療の場合、ウイルスベクターは、食品医薬品局(FDA)によって示されるような製造管理および品質管理基準(GMP)の基準に従って調製される。品質保証(QA)基準および品質管理(QC)基準には、複製可能なウイルス(ウイルスベクターが複製能欠損型である場合)、活性(ウイルス粒子数あたりのコロニー形成単位[CFU]、これは、アポトーシスもしくは細胞変性効果(CPE)の誘導によって、またはβ-ガラクトシダーゼなどのマーカー遺伝子の発現によって試験される)、毒性、および他の標準的な評価基準について試験することが含まれる。
【００９１】
腫瘍細胞を処置するために、薬剤組成物は、ベクターを腫瘍細胞に向かわせることを可能にする任意の経路によって投与される。好ましくは、投与は非経口的であり、これには、静脈内投与、細動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、心室(脳室)内投与および頭蓋内投与が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に開示されるように、ウイルスベクターはまた、鼻腔経路または経口経路によって腫瘍保有動物に投与することができる(Hardy、「The Arbiviruses: Epidemiology and Ecology」、第4章、87〜126頁)。しかし、重要なことは、遺伝子治療における他のウイルスベクターとは異なり、HALRが標的化される本発明のアルファウイルスベクターおよび非アルファウイルスベクターの投与は、腫瘍に対して局所的である必要はない。実際、本発明の利点の1つは、標準的な技術(例えば、CAT走査、MRI走査など)によって切除または発見することができない微小転移であっても、がん細胞に対してベクターが大きい特異性および親和性を有することである。
【００９２】
本発明の治療的処置において、ベクターの治療上効果的な量が患者に投与される。本明細書中で使用される用語「治療上効果的な量」は、宿主の活性および機能および応答における臨床的に有意な不足を少なくとも約15パーセント減少させ、好ましくは少なくとも50パーセント減少させ、より好ましくは少なくとも90パーセント減少させ、最も好ましくはそのような不足を防止するために十分である量である。あるいは、治療上効果的な量は、宿主において臨床的に有意な状態における改善を生じさせるために十分である。具体的には、治療上効果的な量は下記の1つまたは2つ以上を生じさせる:腫瘍細胞のアポトーシス;腫瘍細胞の壊死;腫瘍転移の除去または防止;腫瘍増殖速度の低下;腫瘍サイズの減少または腫瘍縮小;皮膚腫瘍を覆う痂皮形成;腫瘍の除去;がんの寛解;がんの再発までの時間の延長;および患者の生存期間の延長。ベクター治療の頻度および投与量は、標準的な用量応答技術を使用して通常の医師によって決定することができるが、一般には、毎日または毎週または2週間毎または毎月少なくとも2回、好ましくは少なくとも3回投与される投与あたり106個〜1012個のウイルス粒子の範囲内である。
【００９３】
混合治療
ワクチン。腫瘍抗原特異的な免疫応答を増大させるために、規定された腫瘍関連抗原(TAA)を系に導入して、抗原レベルを特異的に増大させることができる。これらのTAAは、例えば、タンパク質もしくはペプチドとして、または本発明のウイルスベクターによってコードされる異種の遺伝子として導入することができる。これらの抗原による免疫化を次に行うことができるか、またはこれらの抗原による免疫化をDC動態化および抗腫瘍遺伝子治療スキームのときに行うことができる。本質的には、この方法により、特定の抗原に対する効果的な免疫応答が全体的な免疫応答とともに高められる。特異的な免疫化は、腫瘍の壊死によって放出される抗原に対する応答を促進させることができる免疫増強のサイトカイン環境の発現をもたらし得る。そのような免疫化は、効果をさらに高めるために、免疫活性化サイトカイン(タンパク質または遺伝子)と組み合わせることができる。
【００９４】
規定された抗原型ワクチンのほかに、多数のワクチン法が、現在、臨床だけでなく、研究室において検討中である。動物モデルにおける広く研究されている方法の1つが、サイトカイン遺伝子(例えば、IL-2、GM-CSF、IL-12、IL-4)ならびにいくつかの重要な共刺激分子遺伝子(例えば、B7.1、B7.2)を使用して自己または同種の腫瘍細胞を改変することである。これらの遺伝子により改変された腫瘍ワクチンは、免疫学的機構を使用して末梢寛容性およびアネルギーを破るという考えを証明している(Clary他、Cancer Gene Ther.、1997、4:97〜104;Gilboa、Semin. Oncol.、1996、23:101〜107)。他の類似する方法には、腫瘍溶解物またはタンパク質またはRNAでパルス処理されたDCの使用、および強力な腫瘍免疫応答を誘導するために腫瘍細胞をDCと融合することが含まれる。これらのすべての方法は共通したテーマを有しており、これは、これらの抗原の効率的なプロセシングおよびT細胞への提示を誘導するために抗原性分子をDCに送達することである。これらのスキームはDCの利用性に基づいているので、DCの動態化は、これらの方法を用いて認められる効果を増幅することが期待される。
【００９５】
化学療法剤、放射線および手術(腫瘍切除)。本発明の方法は、腫瘍の増殖および転移を阻害することにおいて効果的であるが、本発明のベクターおよび方法は、好都合なことに、手術、放射線、化学療法および他の遺伝子治療(これらに限定されない)を含む他の処置様式とともに使用される。例えば、本発明のベクターは、血管収縮活性を有し、腫瘍への血流を減少させる一酸化窒素阻害剤と組み合わせて投与することができる。別の実施形態において、本発明のベクターは、化学療法剤とともに投与することができ、例えば、下記に限定されないが、タキソール、タキソテレおよび他のタキソイド(例えば、米国特許第4,857,653号、同第4,814,470号、同第4,924,011号、同第5,290,957号、同第5,292,921号、同第5,438,072号、同第5,587,493号;欧州特許第0253738号;PCT公開番号WO91/17976、同WO93/00928、同WO93/00929および同WO96/01815に開示されるようなもの)、または他の化学療法剤、例えば、cis-プラチン(および白金の他の層間侵入化合物)、エトポシドおよびリン酸エトポシド、ブレオマイシン、マイトマイシンC、CCNU、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、イホスファミドなどとともに投与することができる。
【実施例】
【００９６】
下記の実施例は、本発明を、その範囲を限定することなく例示する。
【００９７】
実施例1:シンドビスベクターは強力な抗腫瘍活性を媒介する
材料および方法
細胞株。ベビーハムスター腎臓細胞(BHK-21、ATCC受託番号CCL-10)および卵巣がん細胞(ES-2、ATCC受託番号CRL-1978)をAmerican Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から得て、5%のウシ胎児血清(FBS、Gemini Bioproducts, Inc.、Calabasa、CA)が補充された最少必須α-改変培地(α-MEM、JRH Bioscience、Lenexa、KS)で維持した。ヒト肝細胞がん細胞株HuH7をH. Yamamoto博士(兵庫医科大学、日本)から得て、10%のFBSが補充されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、JRH Bioscience、Lenexa、KS)で維持した。HT29ヒト結腸直腸腺がん細胞(ATCC受託番号HTB-38)をATCCから得て、10%のFBSを含むマッコイ5A培地(Iwakata & Graceの改変、Mediatech, Inc.、Herndon、VA)で維持した。CFPAC-1膵臓がん細胞(ATCC受託番号CRL-1918)、SKOV-3卵巣腺がん細胞(ATCC受託番号HTB-77)およびA431類表皮がん細胞(ATCC受託番号CRL-2592)をATCCから得て、10%のFBSを含むDMEM/低改変(JRH Bioscience、Lenexa、KS)で維持した。A498腎臓がん細胞(ATCC受託番号HTB-44)、HT1197膀胱がん細胞(ATCC受託番号CRL-1473)およびLS174T結腸がん細胞(ATCC受託番号CL-188)をATCCから得て、10%のFBSが補充された、アール塩およびL-グルタミンを含むイーグル最少必須培地(Mediatech Inc.、Herndon、VA)で維持した。上記のすべての基本培地には、100μg/mLのペニシリン-ストレプトマイシン(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)および0.5μg/mlのアンホテリシンB(Mediatech, Inc.、Herndon、VA)が補充された。
【００９８】
ベクター。図1には、シンドビスウイルス由来発現ベクターおよびヘルパーベクターの概略が示される(Bredenbeek他、J. Virol.、1993、67:6439〜6446もまた参照のこと;Invitrogen Co.、Carlsbad、CA)。シンドビスウイルスに基づく発現ベクターのSinRep/LacZには、ウイルスパッケージングシグナル、RNA転写物を複製するために不可欠な非構造タンパク質のnsp1〜4、サブゲノム転写のためのウイルスプロモーター、およびLacZレポーター遺伝子がコードされる。ヘルパープラスミドのDH-BBには、ウイルスのパッケージングに必要なシンドビスの構造遺伝子、すなわち、キャプシド(C)、E3、E2、6KおよびE1がコードされる。図1には、本実施例において使用された2つの他のシンドビスウイルス型発現ベクターのSinRep/LucおよびSinRep/IL12は示されていない。SinRep/Lucベクターを構築するために、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子(Luc)を含有するDNAフラグメントをpGL3プラスミド(Promega Co.、Madison、WI)のNheI部位およびXbaI部位から切り出して、SinRepベクター(Invitrogen Co.、Carlsbad、CA)のXbaI部位にサブクローン化した。SinRep/IL12ベクターを構築するために、2つのサブゲノムプロモーターを含有するシンドビスベクター(SinRep/2PSG)を、第2のサブゲノムプロモーターDNAを本来のサブゲノムプロモーターの下流のマルチプルクローニング部位(MCS)に挿入することによって最初に構築した。PSG配列5'-CGCGTAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAATAGTGCATG-3'(配列番号1)を含有するデオキシオリゴヌクレオチドをその相補的な配列5'-CACTATTAGGACCACCGTCGAGATGCTTTA-3'(配列番号2)にアニーリングし、その後、MluIおよびSphIで消化されたSinRepプラスミドに連結した。ネズミIL12のα-サブユニット遺伝子(mP35、ATCC受託番号87596)およびIL12のβ-サブユニット遺伝子(mP40、ATCC受託番号87595)をそれぞれSinRep/2PSGの(SphI部位の下流の)MluI部位およびStuI部位にサブクローン化し、そして最終的な構築物をSinRep/IL12と名付けた。
【００９９】
シンドビスウイルスを産生させるためのin vitroでの転写およびトランスフェクション。in vitro転写用のプラスミドを、QIAGENプラスミドキット(QIAGEN、Chatsworth、CA)を用いて調製した。DH-BB、SinRep/LacZおよびSinRep/IL12のプラスミドを、XhoI制限酵素を使用して線状化した。プラスミドSinRep/Lucは、Luc遺伝子が内部にXhoI部位を含むので、NotI制限酵素を使用して線状化された。線状化されたプラスミドを、フェノール/クロロホルム抽出、続くエタノール沈殿によってさらに精製した。SP6プロモーターからのin vitro転写反応を、多量のキャップ化されたmRNA転写物を得るために、InvitroScriptキャップキット(Invitrogen Co.、Carlsbad、CA)またはmMESSAGE mMACHINE（商標）高収率キャップ化RNA転写キット(Ambion Inc.、Austin、TX)を使用することによって行った。mRNAの質を1%アガロースゲルで調べた。ヘルパーDH-BBと、SinRep/LacZまたはSinRep/LucまたはSinRep/IL12のいずれかとのBHK細胞への同時トランスフェクションのために、エレクトロポレーションを以前の記載(Ohno他、Nature Biotechnol.、1997、15:763〜767)のように行った。エレクトロポレーションされた細胞を、5%のFBSを含有する10mlのαMEMに移して、12時間インキュベーションした。その後、細胞をリン酸塩緩衝化生理的食塩水(PBS)で洗浄して、10mlのOpti-MEM I培地(GIBCO-BRL)においてFBSなしにインキュベーションした。24時間後、培養上清を集め、アリコートを-80℃で保存した。
【０１００】
感染アッセイおよびウイルス定量。ウイルス上清の希釈物(300μl)を12ウエルプレートにおいて2x105個の細胞に加えた。室温で1時間インキュベーションした後、細胞をPBSで洗浄して、培地とともに24時間インキュベーションした。ウイルス感染をX-gal染色によって評価した:感染細胞を、0.5%グルタルアルデヒドを含有するPBS中で20分間固定し、その後、PBSで3回洗浄した;その後、細胞を、1mg/mlのX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-β-D-ガラクトピラノシド、Fisher Scientific)、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウムおよび1mMのMgSO4を含有するPBSで、37℃で3時間染色した。ウイルス力価は、1ミリリットルあたりのLacZコロニー形成単位(CFU)として表した。CFUは、X-galにより青く染まっている細胞に関して定義した。SinRep/IL12ベクターについては、相対的なCFUを、シンドビスのゲノムRNAに対して特異的なプライマー対(5'-AGCTTCCCGCAATTTGAGGT-3'(配列番号3)、5'-ACGCATGGGGCAGACACAAT-3'(配列番号4))を用いたRT-PCRによって求めた。ウイルスRNAを、1mlのTRIzol（商標）試薬(GIBCO BRL)を用いて、SinRep/LacZベクター(コントロール)またはSinRep/IL12ベクターのいずれかを含有する300μlのOpti-MEM培地から精製した。エタノール沈殿後、すべてのRNAサンプルを50μlのRNase非含有水に再懸濁した。RT-PCRを、Platinum（商標）定量的RT-PCR ThermoScrip（商標）ワンステップシステム(GIBCO BRL)を使用して行った。相対的なCFU値を、SinRep/LacZ RNAおよびSinRep/IL12 RNAの連続希釈物のRT-PCRバンドの強度を比較することによって得た。その後、RT-PCRの結果を、SinRep/LacZに対するX-gal染色アッセイの結果と相関させた。SinRep/Lucベクターの力価を、BHK細胞を300μlのウイルス含有Opti-MEMの連続希釈物で感染させることによって12ウエルプレートでアッセイした。一晩インキュベーションした後、各サンプルから得られた細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を、LUMI-ONE携帯型ルミノメーター(Bioscan, Inc.、Washington, DC)を使用して30秒間測定した。
【０１０１】
シンドビス感染性のin vitroアッセイ。ハムスターおよびヒトの細胞に対するシンドビスウイルスの感染性を推定するために、300μlのSinRep/LacZウイルスまたはSinRep/Lucウイルスを、約100のMOIで12ウエルプレートで培養したBHK細胞、HuH7細胞、LS174T細胞、ES-2細胞、HT29細胞、CFPAC-1細胞、PC-3細胞、HuH7細胞、SKOV-3細胞、A498細胞、HT1197細胞またはA431細胞の2x105個とインキュベーションした。翌日、細胞をX-gal染色またはSteady-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega Co.)によってアッセイした。Steady-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイにおいて、細胞を吸引し、200μlの基本培地および200μlのSteady-Glo（商標）試薬を加えた。細胞がプレートから剥離するまで、穏やかに振とうしながら、細胞を5分間インキュベーションした。その後、細胞溶解物を12x47mm2のキュベット(PharMingen Co.)に移して、それぞれのルシフェラーゼ活性を、LUMI-ONE携帯型ルミノメーター(Bioscan, Inc.、Washington、DC)を使用して30秒間測定した。それぞれの細胞株について、2回〜4回の独立した実験を行った。
【０１０２】
シンドビス感染後の細胞生存性アッセイ。0日目に、約107個のSinRep/LacZベクターを含有する300μlの培地を、12ウエルプレートで1時間培養したBHK細胞、CFPAC-1細胞、ES-2細胞、HT29細胞、LS174T細胞またはSKOV-3細胞それぞれ2x105個に加えた。プレートをPBSで洗浄し、1mlの基本培地で再び満たして、インキュベーションした。示した日(0日目、1日目、2日目、3日目、4日目)に、細胞培養培地を集め、プレートに残っている細胞を200μlの1XトリプシンEDTA(Mediatech, Inc.)でトリプシン処理した。培地およびプレートの両方から得られた細胞を一緒にし、600rcf(相対的遠心力)で5分間遠心分離した。細胞ペレットを100μlのPBSに再懸濁して、細胞懸濁物の10μlを90μlのトリパンブルー溶液(Mediatech, Inc.)に移した。トリパンブルー細胞混合物の10μlを血球測定法によって計数して、生存率(%)を、透明細胞数/(透明細胞数+青色細胞数)x100%の式を使用して求めた。
【０１０３】
動物モデルおよびin vivoでのトランスフェクション。使用したすべての重症複合免疫不全症(SCID)マウス(C.B-17-SCIDまたはC.B-17-SCID/BG)はTaconic(Germantown、NY)から入手し、実験開始時に6週齢〜8週齢であった。BHK細胞およびES-2細胞を、5x106細胞の最初の接種物からの皮下腫瘍として成長させた。約10日後、腫瘍は少なくとも1cm2のサイズに達したので、処置を開始し、その日を1日目とした。腫瘍保有マウスを、コントロール群(N=5)、SinRep/LacZ群(N=5)およびSinRep/IL12群(N=5)の3つの群に分けた。107CFU〜108CFUのSinREp/LacZベクターまたはSinRep/IL12ベクターを含有する0.5ccのOpti-MEMを実験群に腹腔内(i.p.)注射した。コントロール群は非処置のままであるか、またはPBSを注射した。腫瘍サイズを毎日測定し、(長さ、cm)X(幅、cm)X(高さ、cm)の式を使用して計算した。SinRep/IL12ベクター調製物は高レベル(10ng/ml)のmIL12をOpti-MEMに含有した。
【０１０４】
ヒト腫瘍モデルの場合、LS174T、HT29およびCFPAC-1などの、4x106個の腫瘍細胞を、処置前の約4週間、皮下腫瘍として成長させた。腫瘍保有マウスをコントロール群(無処置)および実験群(107CFU〜108CFUのウイルスを含有する0.5ccのSinRep/LacZで毎日処置)に分けた。腫瘍サイズを、(長さ、cm)X(幅、cm)X(高さ、cm)の式を使用して毎日記録した。LS174Tでの試験およびCFPAC-1での試験では、コントロール群および実験群にはともに4匹のマウスとし、一方、HT29での試験では、コントロール群および実験群にはともに5匹のマウスとした。
【０１０５】
肝臓HuH7腫瘍は、以前に記載された方法(Kozlowski他、Cancer Res.、1984、44:3522〜3529)によって樹立されていた。SCIDマウス(6週齢;Taconic、Germantown、NY)を麻酔して、横切開を、左脇腹において皮膚および腹膜を貫いて行い、脾臓を露出させた。マウスには、10%のFBSを含有する250μlのDMEMにおいて2x106個のHuH7細胞を、27.5ゲージの針(Becton Dickenson)を使用して、脾門を介して門脈内に注入した。腫瘍注入の8週間後、腫瘍を触知することができたので、マウスに、250μlのシンドビスウイルスベクターを1回または3日間連続してi.p.注射した。コントロールマウスには、同じ手順を使用してOpti-MEMを注射した。この実験では、すべてのマウスを最後の注射の翌日に屠殺した。
【０１０６】
β-gal免疫染色。β-ガラクトシダーゼタンパク質(β-gal)の免疫組織化学的検出を、発色原としての3,3-ジアミノベンジジン(DAB)を用いた標準的なストレプトアビジン-ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体検出および自動化された免疫染色装置(NexES、Ventana Medical Systems、Tucson、AZ)を使用して、ホルマリン固定のパラフィン包埋組織について行った。適切な陽性コントロール(β-ガラクトシダーゼベクターでトランスフェクションされた細胞株)および陰性コントロールを使用した。簡単に記載すると、トランスフェクションされた細胞株を、約106細胞/mlの細胞密度に、適切な増殖条件のもとで増殖させた。これらの細胞を穏やかにペレット化し、そして少量の培地に再懸濁した。等しい割合のフィブリンおよびトロンビンをこの懸濁物に加えて、フィブリン/トロンビン/細胞塊を作製し、これを10%中性緩衝化ホルマリン中で固定した。肝臓/腫瘍のサンプルを動物から切除して、10%中性緩衝化ホルマリン中で固定した。細胞塊および組織の両方をホルマリン中で12時間固定し、そしてパラフィン包埋のために加工した。5μm厚の組織切片を、静電的に帯電しているガラス製スライドガラス上に調製し、60℃で一晩ベーキング処理した。スライドガラスを、キシレンでの3回の洗浄によって脱パラフィン処理し、その後、段階的なアルコール(100%、90%および70%)によって再水和した。それぞれのサンプルについて、1枚のスライドガラスをヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、それ以外を、一晩のインキュベーションとともに1:50の希釈度で使用される抗β-ガラクトシダーゼのマウスモノクローナル抗体(BIODESIGN、Kennebunk、ME)を用いて細胞を染色することによるβ-gal検出のために使用した。β-galタンパク質の細胞局在性は細胞質であった。
【０１０７】
β-galアッセイ。組織におけるβ-galタンパク質の発現を、All-in-One（商標）β-galアッセイ試薬キット(PIERCE、Rockford、IL)を使用して調べた。組織を、B型乳棒を使用するパイレックス(登録商標)ガラス製ホモジナイザー(30ストローク)を用いて3mlのPBSにおいてホモジネートした。ホモジネートされたサンプルを、4℃で10分間、1000rcfで遠心分離した。上清を集め、ペレット画分を2mlのPBSに再懸濁し、アリコートを組織成分として集めた。各50μlのアリコートを96ウエルプレートのウエルにおいて50μlのβ-galアッセイ試薬と混合した。37℃で30分間インキュベーションした後、405nmにおける吸光度を、分光光度計を使用して読み取った。それぞれのタンパク質濃度をBIORAD試薬(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)によって測定し、結果を100μgのタンパク質あたりに調節した。
【０１０８】
データの統計学的分析。in vitro感染性データを、標準的なスチューデントt検定を使用して分析した。異なるマウスモデルから得られた腫瘍サイズデータを、マッキントッシュ用GraphPad Prism(バージョン3.0a)(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用して、反復測定による二元ANOVAを用いて分析した。それぞれの変動因子の有意性を、(特定の因子の平均平方)/(残差平均平方)に等しいF比によって求めた。F比は、F分布を決定するF(因子のdf、残差のdf)の形式で示される。P値は、計算されたF比から正の無限までの特定のF分布の積分である。例えば、SinRep/LacZがBHK腫瘍の有意な減少を生じさせるかどうかを明らかにするために、SinRep/LacZの因子に対するF比は、F(1, 32)=5.915であり、F(1, 32)分布に基づくP値は、0.05よりも小さい0.0208であった。したがって、BHK腫瘍に対するSinRep/LacZの効果は有意であると見なされた。他方で、異なる個々の被験体によってもたらされる効果は、F(32, 32)=0.3712およびP=0,9968であるので、有意ではなかった。
【０１０９】
2つの因子の間における統計学的な相互作用もまた、F比によって明らかにすることができる。SinRep/LacZおよび処置時間の両方に由来する効果が付加的であるならば、これらの2つの因子の間には相互作用が認められない。下記に開示されるように、非処置動物における腫瘍サイズの減少をSinRep/LacZ処置の動物と比較することにおいて、SinRep/LacZと処置時間との間における相互作用は有意であった(F(7, 32)=5.14、P=0.0005)。対照的に、SinRep/LacZ処置の動物がSinRep/IL12処置の動物と比較された場合、ウイルスと処置時間との間には有意な相互作用が認められなかった(F(14, 60)=0.8290、P=0.6303)。このことは、腫瘍退行の速度論が類似していることを示している。
【０１１０】
結果
シンドビスベクターはin vitroでヒト腫瘍細胞のいくつかに感染する。シンドビスウイルス型ベクターで、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子を運搬するSinRep/LacZ(図1)と、ホタルのルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を運搬するSinRep/Lucとは、試験されたヒト腫瘍細胞株のほとんど、すなわち、LS174T(結腸)、ES-2(卵巣)、HT29(結腸)、CFPAC-1(膵臓)、PC-3(前立腺)、HuH7(肝臓)およびSKOV-3(卵巣)に効率よく感染した。SinRep/Lucはまた、A498細胞(腎臓)およびHT1197細胞(膀胱)の、低いが、有意な感染性(P＜0.0001)を示し、そしてA431(類表皮がん)細胞の、中程度のレベルの感染性(P＜0.0001)を示した。すべてのヒト細胞株は約100のMOIで感染させられ、そして細胞溶解物におけるマーカー酵素(β-gal)の活性が、翌日に、材料および方法の節に記載されるようにアッセイされた。すべての上記ヒト細胞株のモック感染は、約150の非常に低い相対的発光単位(RLU)読取り値をもたらした。
【０１１１】
シンドビスベクターは、腫瘍細胞に感染したとき、細胞死を誘導する。哺乳動物細胞のシンドビスウイルス感染は、ウイルスにより誘導される細胞のアポトーシスのために極めて細胞傷害性であることが以前に報告されている(Levine他、Nature、361:739〜742、1993;JanおよびGriffin、J. Virol.、73:10296〜10302、1999;Jan他、J. Virol.、74:6425〜6432、2000;Balachandran他、J. Virol.、74:1513〜1523、2000)。腫瘍細胞についてこの観測結果を確認するために、本発明者らは、トリパンブルー排除分析によって感染後の様々な腫瘍細胞株の生存性を調べた。6つの異なる腫瘍細胞株にシンドビスベクターSinRep/LacZを約100のMOIで感染させた後、迅速な細胞死が5日間の期間(0日目〜4日目)で生じた。BHK細胞は、SinRep/LacZにより誘導されるアポトーシスに対して非常に感受性であり、その大部分は感染後2日までに死んだ。類似する結果が、ES-2細胞を用いて得られた。LS174T細胞、CFPAC-1細胞、HT29細胞およびSKOV-3細胞は、BHK細胞を用いて認められた同じレベルの細胞死を達成するためにはさらに2日〜3日を必要とした。コントロール実験では、すべての細胞株が培地でのみインキュベーションされたが、有意な細胞死を示さなかった。
【０１１２】
シンドビスベクターはin vivoで抗腫瘍効果を示す。シンドビスベクターの抗腫瘍効果を評価するために、5x106個のBHK細胞を重症複合免疫不全(SCID)マウス(8週齢〜10週齢)の下部右側腹腔に皮下接種した。BHKの選択は、シンドビスウイルスの感染およびシンドビスにより誘導される細胞死に対するその感受性が大きいことに基づいていた。接種後10日には、BHK腫瘍は、通常、約1cm2のサイズに成長していた。その場合、マウスは実験群およびコントロール分に分けられた。実験群は、β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を運搬するSinRep/LacZベクター、またはネズミIL12の両方のサブユニットをコードする2つの遺伝子(mP35およびmP40)を運搬するSinRep/IL12ベクターの約107個の左側腹腔(腫瘍の遠位部位)への1週間に5回の腹腔内(i.p.)注射を受け、一方、コントロール群のマウスは非処置のままであるか、またはPBSが注射された。コントロール群のマウスはすべて、腫瘍が負担となり、歩行能力ならびに他の機能が損なわれ始めたので、処置の12日目に屠殺された。対照的に、実験群のマウスは、腫瘍の減少を処置の6日目〜7日目に示し始めた。反復測定による二元分散分析(RM二元ANOVA)は、シンドビスベクターにより、BHK腫瘍サイズが劇的に減少したことを示している。事実、ほとんどのBHK腫瘍保有マウスは、処置の30日後には腫瘍がなくなった。SinRep/LacZおよびSinRep/IL12はともに、その抗BHK腫瘍活性の類似した速度論を有していたが、SinRep/IL12は、SinRep/LacZと比較して、BHK細胞に対する増強された抗腫瘍活性を示していた(P＜0.0167)。
【０１１３】
別のマウス組は、5x106個のBHK細胞が接種され、7日後には約5x5mm2の腫瘍を発達させた。腫瘍保有マウスはコントロール群(無処置)および実験群(毎日のSinRep/LacZ処置)に分けられ、3日間連続した処置の後、スライドガラスがコントロール腫瘍および実験腫瘍から調製された。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された切片により、2つの異なる腫瘍群が明らかにされた。一方の腫瘍群は約90%〜95%の壊死を有していたが、もう一方の腫瘍群は約30%までの壊死を有していた。これらは、それぞれ、処置された腫瘍および非処置の腫瘍に対応していた。処置された腫瘍は、非処置の腫瘍よりも小さかった。血管分布が、第VIII因子に対する免疫組織化学を使用して明らかにされた。これらの血管は中程度〜小さいサイズであり、より小さいサイズの血管が生腫瘍領域に存在していた。壊死した腫瘍細胞が、細胞構成および細胞膜を失っている好酸性の染色細胞として同定された。非処置の腫瘍における壊死領域は中心部に位置し、一方、処置された腫瘍では、大きな塊が壊死しており、周縁部のみが生細胞であった。免疫組織化学的なβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)の染色が、処置された動物のみにおいて、そして壊死領域のみにおいて得られた。β-galは、生腫瘍領域では検出されなかった。さらに、β-gal陽性の染色領域は第VIII因子陽性の染色領域と一致していた。このことは、シンドビスウイルスが存在していること、そしてシンドビスウイルスは、血液により運ばれる経路によって腫瘍に送達されることを明らかにしている。さらに、壊死およびβ-galの分布は、生存シンドビスウイルスが、処置された腫瘍の周辺部にだけ存在することを示唆している。処置された腫瘍において、強い限られたトンネル(Tunnel)陽性シグナルが、処置された腫瘍の生存領域と壊死領域との間の境界に沿って観測された。コントロールの腫瘍では、コントロール腫瘍の生存-壊死の境界におけるアポトーシスシグナルは、それほど強くなく、より大きく拡散していた。また、より多数の鮮明で明らかなアポトーシス体が、処置された腫瘍の境界領域において観測された。トンネルシグナルは、コントロールの腫瘍または処置された腫瘍のいずれでも中心の壊死領域において認められなかった。
【０１１４】
SinRep/IL12ベクターの注射もまた、SCIDマウスにおけるBHK腫瘍の増強された減少をもたらした(P=0.0167)。
【０１１５】
ヒト腫瘍細胞のLS174T(結腸)、HT29(結腸)およびCFPAC-1(膵臓)もまた皮下に接種され、規定のサイズにまで成長させられ、その後、処置された。SinRep/LacZによる処置が実験群には1週間に5回施され、そしてコントロール群は非処置のままであるか、またはPBSが注射された。BHK腫瘍を用いた実験の場合のように、処置は、SCIDマウスにおいてLS174T腫瘍およびCFPAC-1腫瘍の著しい減少を生じさせた(P＜0.0001)。約2週間の処置後、シンドビスベクターはLS174T腫瘍およびCFPAC-1腫瘍における著しい成長阻害を生じさせ、そして多数の腫瘍非含有マウスもまた、処置に応答して観測された。SinRep/LacZの抗HT29腫瘍活性は低くなっていたが、依然として有意であった(P＜0.0001)。RM二元ANOVA分析に基づき、すべてのヒト腫瘍モデルは、異なる個々の被験体の中で有意な効果がないことを示した。
【０１１６】
シンドビスベクターはSCIDマウスの肝臓におけるHuH7腫瘍を標的化することができる。HuH7肝臓腫瘍を、脾門経由で門脈を介してヒト肝細胞がんHuH7細胞(2x106個)を埋め込むことによって誘導した。約8週間後、腫瘍の成長が触診によって明らかになったので、マウスにはSinRep/LacZベクターがi.p.注射された(1回または3回)。1回または3日間連続してSinRep/LacZベクターで処置された腫瘍保有マウスを、最後の注射を行った翌日に屠殺した。β-gal陽性細胞は、正常な肝臓組織において、または非感染コントロール切片の腫瘍において見出されなかった。β-galはまた、シンドビスベクターを1回だけ感染させた肝臓腫瘍においても明瞭に検出することができなかった。しかし、β-galは、3日間連続して感染させた肝臓腫瘍では容易に検出することができた。SinRep/LacZが3回注射された腫瘍においては、壊死もまた観測された。
【０１１７】
別の実験では、β-galタンパク質の発現が、1回または3回の処置の後、様々な組織において定量された。前の実験の場合のように、腫瘍細胞では、1回の感染を受けたマウスとコントロールのマウスとの間における著しい差は認められず、一方、3回の処置を受けたマウスは、腫瘍細胞上清においてコントロールのマウスよりも12倍〜18倍大きいβ-galレベルを示し、組織サンプルでは19倍〜38倍大きいレベルを示した。β-gal活性の著しい上昇は、動物がシンドビスベクターの1回または3回の注射を受けたかどうかにはかかわりなく、肝臓、心臓、肺および精巣において観測されなかった。低いが、有意なレベルのβ-galが、注射されたマウスの脳において観測された。脳細胞に対する感染性にもかかわらず、1回または3回のSinRep/LacZの注射で処置されたマウスはすべて、健康のままであり、異常な行動を示さなかった。
【０１１８】
NK細胞はシンドビスベクターの抗腫瘍効果を高める。皮下のBHK腫瘍をC.B-17-SCIDマウスおよびC.B-17-SCID/bgマウスにおいて誘導した。後者は、T細胞およびB細胞の欠損に加えて、マクロファージの損なわれた走化性および運動性ならびにナチュラルキラー(NK)細胞における欠損症をもたらすbeige(bg)常染色劣性変異を含むことを除いて、C.B-17-SCIDに類似している。シンドビスベクターを用いた毎日の処置は、SCID/bgよりも、SCIDマウスにおいてより効果的であるようであった(P＜0.0001)。したがって、腫瘍の完全な退行がSCIDマウスにおいてだけ得られた。
【０１１９】
考察
本明細書中に開示される結果により、シンドビスウイルスに基づく複製能欠損ベクター(すなわち、SinRep/LacZ、SinRep/LucおよびSinRep/IL12)はin vitroおよびin vivoで広範囲のヒト腫瘍細胞に感染できることが示される。本実施例で開示されるように、シンドビスベクターは、哺乳動物の様々な腫瘍細胞株においてin vitroだけでなく、ヒト起源または齧歯類起源の移植された腫瘍においてin vivoでもアポトーシスを誘導する。したがって、異種の遺伝子が何ら加えられない場合でさえ、シンドビスウイルス型ベクターは、悪性腫瘍に対する治療剤として作用することができる。
【０１２０】
実際、この研究では、シンドビスベクターの侵入により、in vivoでの大きな程度のBHK腫瘍のアポトーシスおよび壊死が、腫瘍の完全な退行を伴ってもたらされる。処置は、シンドビスベクターの多数回の注射(3回から15回以上までの範囲にわたる)を含んでいたが、実験動物に対して毒性を有しないようであった。このことは、これらのベクターが、腫瘍細胞に対するほぼ選択的な感染を媒介することを示している。実際、心臓、肺、正常な肝細胞、および腎臓に対する著しい感染は観測されなかった。脳のわずかな感染が検出され得るが、この感染は、シンドビスウイルスによって誘導される神経毒性作用に対して耐性であることが知られている成体(6週齢〜8週齢)の実験マウスにおいて観測可能な臨床的CNS障害を生じさせなかった(Griffin、J. Infect. Dis.、133:456〜464、1976)。
【０１２１】
本明細書中にさらに開示されるように、SinRep/LacZの3回の注射による処置の後のBHK腫瘍を免疫染色することにより、甚だしい壊死の領域が腫瘍の周辺部で明らかにされた。このことは、非処置のマウスにおいて容易に認めることができる、低酸素症および栄養不良によって生じる腫瘍中心部で見られる典型的な壊死とは対照的である。さらに、感染性ベクターおよび血管が腫瘍に同時に局在化することにより、血液により運ばれるシンドビスウイルスの特性がベクター送達において重要な役割を果たしていることが明らかにされる。
【０１２２】
血液におけるベクタークリアランス速度は、ベクターにより媒介される腫瘍標的化の成功を決定する別の重要な因子である。非常に広く使用されているウイルスベクターであるレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターはともに、血流中では不安定であることが示されている(Miyao他、Hum. Gene Ther.、8:1575〜1583、1997;Russell他、Hum. Gene Ther.、6:635〜641、1995;Rother他、J. Exp. Med.、182:1345〜1355、1995;Alemany他、J. Gen. Virol.、81:2605〜2609、2000)。対照的に、血液によって運ばれるアルファウイルスは、シンドビスウイルスベクターならびにシンドビスウイルス型ベクターを含めて、血流中で安定である(ByrnesおよびGriffin、J. Virol.、74:644〜651、2000;Bernard他、Virology、276:93〜103、2000;Klimstra他、J. Virol.、72:7357〜7366、1998)。
【０１２３】
様々な細胞株においてシンドビスにより誘導されるin vitroでの感染性および細胞傷害性における類似性にもかかわらず、in vivoにおける抗腫瘍効力の様々な違いが観測された。これらの違いは、腫瘍組織における血管の数および透過性が異なること、利用できるHALRのレベルが異なること、および/またはウイルスに対するさらなる腫瘍特異的な受容体が存在することから生じていると考えられる。
【０１２４】
本明細書中に開示されるin vivo実験の結果から導かれるように、シンドビスの感染によって誘導される腫瘍細胞の直接的な殺傷に加えて、宿主の免疫系、特に、先天性免疫のためには重要であるナチュラルキラー(NK)細胞もまた腫瘍の除去に寄与している。実際、NK細胞は、腫瘍に対するその細胞傷害性(GumperzおよびParham、Nature、378:245〜248、1995;Trinchieri、Adv. Immunol.、47:187〜376、1989)について、そしてウイルス感染細胞に対するその細胞傷害性(Biron他、Annu. Rev. Immunol.、17:189〜220、1999)について広く知られている。宿主の抗ウイルス機構が活性化されたとき、インターフェロンなどの様々なシグナルが放出され、これらにより、NK細胞の活性化がもたらされることが提案されている(Biron他、1999、上掲)。NK細胞の活性化はまた、腫瘍細胞の壊死および細胞成分の放出によって生じる炎症からも生じ得る。IL12は、強力なNK細胞刺激因子であることが示されており、IL12の投与は、ある種の固形腫瘍に対する強力な抗腫瘍活性および抗転移活性をもたらすことが示されている(Biron他、1999、上掲;Brunda他、J. Exp. Med.、178:1223〜1230、1993;Nastala他、J. Immunol.、153:1697〜1706、1994;Takeda他、J. Immunol.、156:3366〜3373、1996;Tsung他、J. Immunol.、158:3359〜3365、1997)。本明細書中に開示されるように、IL12をコードする組換えシンドビスベクター(SinRep/IL12)は、IL12をコードしないシンドビスベクター(SinRep/LacZ)と比較した場合、増強された抗腫瘍細胞傷害性を有する。本発明のシンドビスベクターは非常に大きいレベルで外因性遺伝子を発現するので、腫瘍抑制因子(細胞傷害性)およびサイトカイン遺伝子などのさらなる抗腫瘍治療遺伝子は、シンドビスベクターの抗腫瘍効力を高めるための理想的な候補であると考えられる。
【０１２５】
上記に記載されるin vivo実験におけるSCIDマウス(これはB細胞およびT細胞の両方を有しない)の使用は、細胞傷害性T細胞および中和抗体が本発明のシンドビスベクターの抗腫瘍活性を促進するか、または低下させるかどうかを結論的に明らかにすることができない。しかし、これらの免疫細胞が負の作用を有する場合でさえ、この作用は、容易に小さくすることができる。例えば、アルファウイルス型ベクターを用いた、以前に報告されている成功した連続的なワクチン接種は、ベクター注射後に誘発される中和抗体のレベルが適正なベクター設計によって低下し得ることを示唆している(Kamrud他、Virology、263:209〜219、1999;Pushko他、Virology、239:389〜401、1997;Pushko他、Virology、239:389〜401、1997)。
【０１２６】
シンドビスウイルス型ベクターにより、(正常な細胞に対して腫瘍におけるHALRの発現において存在する天然の差異を利用することによることが考えられる)腫瘍に対する天然の標的化が明らかにされる。シンドビスベクターのこの天然の長所のほかに、細胞タイプ特異的または腫瘍特異的な細胞表面分子を認識する標的化可能なシンドビスベクターで、大きい感染性および力価を保持するシンドビスベクターが本発明者らによって開発されており(例えば、Ohno他、Nat. Biotechnol.、15:763〜767、1997を参照のこと)、そしてそのようなシンドビスベクターは、in vivoでの標的化のさらなる改善を可能にし得る。上記に示された実験データは、シンドビスベクターが、単独で、または他の既存の処置様式との組合せで、がんの遺伝子治療のための新しい手段として有用であることを示唆している。
【０１２７】
実施例2:ヒト腫瘍を処置するためのシンドビスベクターの使用
複製能欠損シンドビスウイルス型ベクターのSinRep/LacZおよびSinRep/IL12が、実施例1に記載されるように調製され、そして進行(転移)した黒色腫を有する患者に、あるいは腎臓、脳、結腸、前立腺、肝臓、膵臓、膀胱、肺または卵巣の進行(転移)した腫瘍を有する患者に静脈内投与される(107CFU/mlを含有するベクター配合物の約500μl)。処置は、1週間に5回、3週間またはそれ以上にわたって行われる。腫瘍サイズは、MRI走査およびCAT走査によって絶えずモニターされ、その後(可能なときには)、腫瘍の壊死の組織学的分析および腫瘍細胞の転移挙動に対する生検アッセイが行われる。
【０１２８】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されることはない。実際、本明細書中に記載される改変に加えて、本発明の様々な改変が、前記の説明および付随する図面から当業者には明らかになる。そのような改変は、添付された請求項の範囲に含まれるものとする。
【０１２９】
すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、すべての合成濃度およびすべての分子量または分子質量値はおおよその値であり、そして説明のために示されていることをさらに理解しなければならない。
【０１３０】
本明細書中に引用される特許、特許出願、刊行物、試験方法、文献およびその他の資料はすべて、参考として本明細書により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】シンドビスウイルス型発現ベクターおよびヘルパーベクターの概略図である。SinRep/LacZは、シンドビスウイルスに基づく発現ベクターであり、これは、パッケージングシグナル、RNA転写物を複製するための非構造タンパク質遺伝子、およびLacZ遺伝子を含有する。DH-BBは、シンドビスウイルスゲノムのパッケージングのために必要とされる構造タンパク質(キャプシド、E3、E2、6KおよびE1)に対する遺伝子を含有する元のヘルパープラスミドである。略号:PSG、シンドビスウイルスのサブゲノムプロモーター;C、キャプシド;NSP1〜4、非構造タンパク質遺伝子1〜4;POLY A、ポリアデニル化シグナル。SinRep/LacZに概略的には類似するSinRep/LucベクターおよびSinRep/IL12ベクターは示されていない。SinRep/Lucは、LacZの代わりにホタルのルシフェラーゼ遺伝子(Luc)をコードするDNAフラグメントを(SinRepベクターのXbaI部位にサブクローン化されて)含む。SinRep/IL12は、(SphI部位の下流にあるMluI部位とStuI部位とにサブクローン化された)ネズミIL12のα-サブユニット遺伝子およびβ-サブユニット遺伝子と、SinRep/LacZの元のサブゲノムプロモーターの下流にもう1つの第2のサブゲノムプロモーターDNAとを含む。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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