(57)【要約】提供するのは、新規ディスインテグリンポリペプチド、こうしたポリペプチドを作成する方法、およびディスインテグリン関連障害および状態を治療し、そしてメタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチド活性を変調する剤を同定するために、これらを使用する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、３、４、６、８、または１０のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）ディスインテグリン活性を有する（ａ）のポリペプチドの可溶性断片；
（ｃ）少なくとも２０から３０の隣接するアミノ酸を含んでなる（ａ）のポリペプチドの断片；
（ｄ）ディスインテグリン活性を有する（ａ）のポリペプチドの断片；
（ｅ）ディスインテグリンドメインアミノ酸配列を含んでなる（ａ）のポリペプチドの断片；
（ｆ）ほぼアミノ酸７３からほぼ３６０および３６２の間のアミノ酸までの配列番号６；
（ｇ）ほぼ残基１および１６の間のアミノ酸からほぼ２８５および２８７の間のアミノ酸までの配列番号８；
（ｈ）ほぼ残基１および７３の間のアミノ酸からほぼ残基３１４および３２９の間のアミノ酸までの配列番号１０；
（ｉ）少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含んでなり、そして（ａ）−（ｈ）のアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列であって、アミノ酸パーセント同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記アミノ酸配列；並びに
（ｊ）配列番号２５のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド
からなる群より選択される、実質的に精製したポリペプチド。
【請求項２】
第二のポリペプチドに連結した、請求項１記載のディスインテグリン活性を有する可溶性ポリペプチドであって、第二のポリペプチドがロイシンジッパーポリペプチド、Ｆｃポリペプチド、またはペプチドリンカーである、前記可溶性ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
ａ）配列番号２、５、７、または９の配列を含んでなるポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号５のほぼヌクレオチド２４８からヌクレオチド１１１１までの配列番号５の配列を含んでなるポリヌクレオチド；
ｃ）ほぼ８２および１２７の間のヌクレオチドからほぼ核酸９３６までの配列番号７の配列を含んでなるポリヌクレオチド；
ｄ）ほぼ３２および２４８の間のヌクレオチドからほぼ９７３および１０１８の間のヌクレオチドまでの配列番号９の配列を含んでなるポリヌクレオチド；
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）の配列を含んでなるポリヌクレオチドに、中程度にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｆ）配列番号２、５、７、または９の配列に相補的なヌクレオチド配列；並びにｇ）ＴがまたＵであることも可能である、ａ）からｆ）のヌクレオチド配列のいずれか
からなる群より選択される、単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、機能可能であるように連結した、請求項５の配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３、４、または５のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項７】
請求項３、４、または５のポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項８】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で、請求項７の宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法。
【請求項９】
ポリペプチドを精製することをさらに含んでなる、請求項８の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で、請求項７の宿主細胞を培養することによって産生したポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１のポリペプチドに特異的に結合する、実質的に精製した抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体である、請求項１１の抗体。
【請求項１３】
ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１１の抗体。
【請求項１４】
請求項１のポリペプチドの生物学的活性を阻害する、請求項１１の抗体。
【請求項１５】
請求項１のポリペプチドの阻害剤または結合剤を設計する方法であって、ポリペプチドの三次元構造を決定し、基質またはリガンドの結合部位に関して三次元構造を解析し、ポリペプチドと相互作用すると予測される分子を設計し、そして分子の阻害または結合活性を測定することを含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチドの活性を変調する剤を同定する方法であって：
（ａ）剤およびポリペプチドが相互作用するような条件下で、請求項１のポリペプチドと剤を接触させ；そして
（ｂ）対照に比較して、剤の存在下でのポリペプチドの活性を測定する、ここで活性の変化が、ポリペプチドの活性を変調する剤の示標となる
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
剤が、抗体、小分子、ペプチド、およびペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）からなる群より選択される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
血管形成を阻害する治療が必要な哺乳動物において血管形成を阻害する方法であって、哺乳動物に、阻害有効量の可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１９】
可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインポリペプチドが：
（ａ）ほぼアミノ酸７３からアミノ酸３６０または３６２までの配列番号６；
（ｂ）ほぼ残基１および１６の間のアミノ酸からアミノ酸２８５または２８７までの配列番号８；
（ｃ）ほぼ残基１および７３の間のアミノ酸からほぼ残基３１４および３２９の間のアミノ酸までの配列番号１０；並びに
（ｄ）ディスインテグリン活性を有する（ａ）−（ｃ）の断片
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドと組織を接触させることを含んでなる、組織において血管形成を変調する方法。
【請求項２１】
請求項１のポリペプチドと内皮細胞を接触させることを含んでなる、内皮細胞遊走を変調する方法。
【請求項２２】
接触がｉｎ　ｖｉｔｒｏである、請求項２０または２１の方法。
【請求項２３】
接触がｉｎ　ｖｉｖｏである、請求項２０または２１の方法。
【請求項２４】
インテグリンのリガンドへの結合を阻害する方法であって、有効量の可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインポリペプチドと、インテグリンを発現する細胞を接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項２５】
可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインポリペプチドが：
（ａ）ほぼアミノ酸７３からアミノ酸３６０または３６２までの配列番号６；
（ｂ）ほぼ残基１および１６の間のアミノ酸からアミノ酸２８５または２８７までの配列番号８；
（ｃ）ほぼ残基１および７３の間のアミノ酸からほぼ残基３１４および３２９の間のアミノ酸までの配列番号１０；および
（ｄ）ディスインテグリン活性を有する（ａ）−（ｃ）の断片
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項２４の方法。
【請求項２６】
インテグリンのリガンドへの結合を変調する治療が必要な哺乳動物においてインテグリンのリガンドへの結合を変調する方法であって、有効量の可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２７】
哺乳動物が、眼障害；悪性および転移性状態；炎症性疾患；骨粗しょう症、加速された骨吸収障害；再狭窄；不適切な血小板活性化、補充、または凝集；血栓症；並びに組織修復または創傷治癒を必要とする状態からなる群より選択される状態に罹患している、請求項２６の方法。
【請求項２８】
可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインポリペプチドが：
（ａ）ほぼアミノ酸７３からアミノ酸３６０または３６２までの配列番号６；
（ｂ）ほぼ残基１および１６の間のアミノ酸からアミノ酸２８５または２８７までの配列番号８；
（ｃ）ほぼ残基１および７３の間のアミノ酸からほぼ残基３１４および３２９の間のアミノ酸までの配列番号１０；並びに
（ｄ）ディスインテグリン活性を有する（ａ）−（ｃ）の断片
からなる群より選択される配列を含んでなる、請求項２６の方法。
【請求項２９】
可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインが、多量体の形である、請求項１８、２４、または２６の方法。
【請求項３０】
多量体が二量体または三量体である、請求項２９の方法。
【請求項３１】
多量体がＦｃポリペプチド、ロイシンジッパー、またはペプチドリンカーを含んでなる、請求項３０の方法。
【請求項３２】
多量体が配列番号２５に示す配列を含んでなる、請求項３１の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを解析する系であって：
請求項１の１以上のポリペプチド、または請求項４の１以上のポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドおよびポリヌクレオチドの組み合わせの組に相当する、データ組；
コンピューター；並びに
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを解析するため、コンピューター上に実行可能形式である、コンピューターアルゴリズム
を含んでなる、前記系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて、米国仮出願第６０／２２１，８３８号、２０００年７月２８日提出、および米国仮出願第６０／２８２，５５０号、２００１年４月９日提出の優先権を主張し、前記出願の開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒト・メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドファミリーに相同性を有するポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを作成し、そして使用する方法に関する。
【０００３】
背景
本明細書においてＡＤＡＭ（「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン（Ａ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｎｄ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｄｏｍａｉｎ）」）ポリペプチドまたは「ＡＤＡＭｓ」とも称される、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドは、多ドメイン、Ｉ型膜ポリペプチドの関連群である。ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドの特定のメンバーは、例えば生殖組織または筋細胞を含む、いくつかの細胞種で、高発現される。さらに、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーは、一般的に、発生中ずっと、恒常的に発現される。
【０００４】
いくつかのＡＤＡＭ遺伝子が現在同定されており、これらには、ファーティリンαおよびβ（インテグリン仲介結合、並びに卵および精子の融合に関与する；以前、ＰＨ−３０αおよびβとして知られた）、精巣上体尖端タンパク質Ｉ、シリテスティン（ｃｙｒｉｔｅｓｔｉｎ）、ＭＤＣ（ヒト乳癌における腫瘍抑制因子の候補）、メルトリン−α（筋管形成過程において筋芽細胞の融合を仲介）、ＭＳ２（マクロファージ表面抗原）、およびメターギディン（ｍｅｔａｒｇｉｄｉｎ）が含まれる。さらに、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）モチーフと共に、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメインを含有する、ＡＤＡＭＴＳ−１と称される、新規ＡＤＡＭファミリー遺伝子が、多様な炎症過程と共に、癌悪液質の発展に緊密に関与していることが示されてきている（Ｋｕｎｏ，　Ｋ．ら，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２：５５６−５６２（１９９７））。クズバニアン（ｋｕｚｂａｎｉａｎ）遺伝子（「ＫＵＺ」）と呼ばれるショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）中のＡＤＡＭの新規メンバーは、ショウジョウバエ神経形成に関与することが見出された（Ｒｏｏｋｅ，　Ｊ．ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３：１２２７−１２３１（１９９６年８月））。
【０００５】
典型的なＡＤＡＭファミリーポリペプチドは、プロ、メタロプロテアーゼ様、ディスインテグリン様、システインリッチ、上皮増殖因子様反復、膜貫通および細胞質ドメインからなる、細胞表面ポリペプチドである。いくつかのＡＤＡＭでは、メタロプロテイナーゼドメインは、増殖因子、接着タンパク質、および炎症因子の放出など、タンパク質プロセシング機能に関与していると考えられる。ディスインテグリンドメインは、血小板凝集、腫瘍細胞または好中球の遊走、および血管形成など、インテグリン仲介細胞接着（細胞対細胞および細胞対マトリックス）相互作用に役割を果たす可能性がある。ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのこれらの活性は、メタロプロテイナーゼの基質、およびインテグリンとの相互作用を通じて仲介される可能性が最も高く、メタロプロテイナーゼの基質は、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメタロプロテイナーゼ触媒ドメインに結合し、そしてインテグリンはディスインテグリンドメインに結合する。ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドは、増殖因子、接着タンパク質、および炎症因子の放出などのタンパク質プロセシング機能、並びに細胞接着の仲介において役割を果たすと考えられるため、該ファミリーは、炎症、癌、アレルギー、生殖、および血管状態に関連していると考えられる。ＡＤＡＭポリペプチドファミリーの特性および活性は、Ｂｌａｃｋ，　Ｒ．Ａ．およびＷｈｉｔｅ，　Ｊ．Ｍ．，　１９９８，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０：６５４−６５９；およびＳｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ，　Ｊ．およびＢｌｏｂｅｌ，　Ｃ．Ｐ．，　１９９９，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１１２：３６０３−３６１７にさらに記載され；これらの文献は、本明細書に援用される。
【０００６】
発明の概要
本明細書に初めて提供するのは、本明細書において、「ＡＤＡＭ９に相同性を持つディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（Ａ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ａｎｄ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ＡＤＡＭ９）」を表す、「ＡＤＡＭ−Ｈ９」と称される、ＡＤＡＭポリペプチドファミリーに相同性を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、並びにそれらの作成法およびそれらの使用法である。
【０００７】
本発明は、配列番号１、３、４、６、８、および１０に示すようなアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。別の態様において、本発明は、ディスインテグリン活性を有する配列番号１、３、４、６、８、または１０の可溶性断片を提供する。さらに別の態様において、本発明は、ディスインテグリンドメインアミノ酸配列を含んでなる、配列番号１、３、４、６、８、および１０のアミノ酸配列の断片（例えば、ほぼアミノ酸番号７３からほぼ３６０ないし３６２（またはその間のアミノ酸いずれか）までの配列番号６、アミノ酸１または１６（またはその間のアミノ酸いずれか）から２８５ないし２８７（またはその間のアミノ酸いずれか）までの配列番号８、あるいはアミノ酸１または７３（またはその間のアミノ酸いずれか）から３１４または３２９（またはその間のアミノ酸いずれか）までの配列番号１０に示すような配列を含んでなるポリペプチド）を提供する。やはり提供するのは、少なくとも１０から約３０の隣接するアミノ酸を含んでなり、そして配列番号１、３、４、６、８、および１０のアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有するアミノ酸配列であって、アミノ酸パーセント同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、前記アミノ酸配列である。
【０００８】
本発明はまた、第二のポリペプチドに機能可能であるように連結した、ディスインテグリン活性を有する、配列番号１、３、４、６、８、または１０の断片を含んでなるポリペプチドであって、第二のポリペプチドがロイシンジッパーポリペプチド、Ｆｃポリペプチド、またはペプチドリンカー部分である、前記ポリペプチドも提供する。好ましくは、該断片は、ディスインテグリンドメインを含んでなり、そしてアミノ酸番号７３からほぼ３６０ないし３６２までの配列番号６、アミノ酸１−１６から２８５ないし２８７までの配列番号８、あるいはアミノ酸１−７３から３１４−３２９までの配列番号１０に示すような配列を有する。好ましい態様において、Ｆｃポリペプチドに連結したＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンは、配列番号２５に示すような配列を有する。
【０００９】
本発明は、上記ポリペプチドのいずれかをコードする、単離ポリヌクレオチドを提供する。１つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号２、５、７、または９に示すような配列、それらの相補体、および配列番号２、５、７、または９の配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることが可能である。
【００１０】
本発明によってやはり提供されるのは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばロイシンジッパー、Ｆｃポリペプチド、またはペプチドリンカー配列をコードする配列）に、機能可能であるように連結した、配列番号２、５、７、または９に示すような配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチドである。好ましくは、配列番号２、５、７、または９のポリヌクレオチドは、ディスインテグリン活性を有する断片をコードし、そしてほぼアミノ酸番号７３からほぼ３６０までの配列番号６、アミノ酸１または１６から２８５までの配列番号８並びに／あるいはアミノ酸１または７３から３１４または３２９までの配列番号１０に示すようなポリペプチドをコードする。
【００１１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクター、並びに、こうした発現ベクターまたは本発明の組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞を提供する。
【００１２】
本発明は、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの発現を促進する条件下で、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞を培養し、そして該ポリペプチドを精製することを含んでなる、ポリペプチドを産生する方法をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、実質的に精製した抗体を提供する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることが可能である。いくつかの態様において、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。
【００１４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの阻害剤または結合剤を設計する方法も提供する。該方法は、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの三次元構造を決定し、リガンドの結合部位に関してポリペプチドの三次元構造を解析し、ポリペプチドと相互作用すると予測される分子を設計し、そして分子の阻害または結合活性を測定することを含む。
【００１５】
本発明はまた、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性または発現を変調する剤を同定する方法も提供する。該方法は、剤およびポリペプチドまたはポリヌクレオチドが相互作用するような条件下で、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと剤を接触させ、そして対照に比較して、剤の存在下でのＡＤＡＭ−Ｈ９活性または発現を測定することを含み、ここで活性または発現の変化は、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性または発現を変調する剤を示す。
【００１６】
本発明は、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドと組織を接触させることを含んでなる、組織において血管形成を変調する方法をさらに提供する。接触は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏであることが可能である。やはり提供するのは、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに特異的に結合する抗体と内皮細胞を接触させることによって、内皮細胞遊走を変調する方法である。接触は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏであることが可能である。
【００１７】
本発明はまた、インテグリンのリガンドへの結合を阻害する方法であって、有効量のＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインと、インテグリンを発現する細胞を接触させることを含んでなる、前記方法も提供する。いくつかの態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインは、ほぼアミノ酸番号７３からほぼ３６０までの配列番号６、アミノ酸１または１６（またはその間の残基）から２８５までの配列番号８、あるいはアミノ酸１または７３（またはその間の残基）から３１４または３２９（またはその間の残基）までの配列番号１０に示すような配列を含んでなる。
【００１８】
やはり提供するのは、哺乳動物においてインテグリンのリガンドへの結合を変調する方法であって、ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインを含んでなる可溶性ポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる、前記方法である。いくつかの態様において、哺乳動物は、眼障害；悪性または転移性状態；炎症性疾患；骨粗しょう症、および加速された骨吸収に仲介される他の状態；再狭窄；不適切な血小板活性化、補充、または凝集；血栓症；あるいは組織修復または創傷治癒を必要とする状態からなる群より選択される状態に罹患している。
【００１９】
本発明は、哺乳動物において血管形成を阻害する方法であって、哺乳動物に、ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインを含んでなる可溶性ポリペプチドの阻害有効量を投与することを含んでなる、前記方法をさらに提供する。１つの態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインは、ほぼアミノ酸番号７３から３６０までの配列番号６、ほぼアミノ酸１または１６から２８５までの配列番号８、あるいはほぼアミノ酸１または７３から３１４または３２９までの配列番号１０に示すような配列を含んでなる。可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインは、多量体（例えば二量体、三量体、または融合ポリペプチド）の形であることが可能である。１つの態様において、多量体は、Ｆｃポリペプチドまたはロイシンジッパーを含んでなる。別の態様において、ポリペプチドは配列番号２５に示すような配列を含んでなる。
【００２０】
本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０に示すような配列、またはそれらの組み合わせのコンピューター読み取り可能データを含有する、コンピューター読み取り可能媒体をさらに提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明
ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーの多様なメンバーに共通の典型的な構造要素には、ＮからＣの順序で、シグナル配列、プロドメイン、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、システインリッチドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが含まれる。メタロプロテイナーゼドメイン／モチーフ（例えばＨｅｘＧＨｘｘＧｘｘＨＤモチーフ（配列番号２４））内には、これらの非常に保存された残基の置換が、ポリペプチドの機能の改変または機能の欠失に関連する可能性があるような、特定の必須残基がある。配列番号２４の保存されたメタロプロテアーゼ活性部位配列を持つＡＤＡＭには、ＡＤＡＭ１、８−１０、１２−１３、１５−１７、１９−２１、２４−２６、２８、および３０が含まれる。メタロプロテイナーゼ触媒ドメインはまた、ジスルフィド結合を通じて、機能するポリペプチド構造の形成に必要である可能性がある、４つの保存されたシステインも含有する。ディスインテグリンおよびシステインリッチ領域には、３１の非常に保存されたシステインがあり；ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーはほぼすべて、これらの３１のシステインを有する。当業者は、ポリペプチド内のこれらの領域の境界がおおよそのものであり、そしてこうしたドメインの正確な境界（その目的に利用可能なコンピュータープログラムを用いることによって、予測可能である）は、ポリペプチドのＡＤＡＭファミリー内のメンバー間で、異なる可能性があることを認識するであろう。
【００２２】
ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーは、かなりよく保存されており、ヒトファミリーメンバーは、互いに、そしてマウス、ラット、並びにキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）などの他の種由来のＡＤＡＭファミリーメンバーとも似ている（例えばＹａｍａｍｏｔｏら，　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｔｏｄａｙ，　２０（６）：２７８，　１９９９；およびさらなる情報には、以下のインターネットウェブサイト（ｗｗｗ）：ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｕｓｅｒｓ／ｈｅｓｔｅｒ／ｍｅｔａｌｏ．ｈｔｍｌ；ｕｔａ．ｆｉ／〜ｌｏｉｉｋａ／ＡＤＡＭｓ／ＨＡＤＡＭｓ．ｈｔｍｌ；およびｐｅｏｐｌｅ．Ｖｉｒｇｉｎｉａ．ＥＤＵ／〜ｊａｇ６ｎ／Ｔａｂｌｅ＿ｏｆ＿ｔｈｅ＿ＡＤＡＭｓ．ｈｔｍｌを参照されたい）。しかし、ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーのサブファミリーは、配列類似性および関連する生物学的活性に基づいて定義可能である。１つのこうしたサブファミリーは、ポリペプチドのＡＤＡＭファミリー内でこれまでに同定されている他のメンバーに比較して、互いにより高い配列類似性を示す、ＡＤＭ１０およびＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥポリペプチドを含んでなる。ＡＤＡＭ１０および１７は、ディスインテグリン−システインリッチ領域において、他のＡＤＡＭ間のこの領域における３１の保存されたシステインと対照的に、２１のシステインを有する。したがって、ＡＤＡＭは、２０から３１の保存されたシステイン（例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１の保存されたシステイン）を有する可能性がある。ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥおよびＡＤＡＭ−１０はまた「シェダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅｓ）」であり、つまり、他の膜タンパク質の細胞外ドメインを切断し、そして放出すると考えられている。別のサブファミリーの主要な機能は、インテグリンまたは他のタンパク質に結合することである可能性がある。例えばＡＤＡＭ−２は、プロセシングされて、ディスインテグリンドメインが暴露されるように、プロドメインおよびメタロプロテイナーゼ触媒ドメイン両方が除去され、そしてその同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）に結合することが可能になる。定義可能な別のサブファミリーは、精巣特異的であるようであるＡＤＡＭであり；これらのポリペプチドは、ＡＤＡＭ２−３、１６、１８、２０−２１、２４−２６、および２９−３０であり；ＡＤＡＭ５および６が主に精巣特異的である。
【００２３】
ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドは、例えば泌尿生殖組織（例えば腎臓組織および生殖組織）、神経組織、および筋細胞を含む、多くの細胞種で発現される。ＡＤＡＭポリペプチドのいくつかの結合パートナーは、少なくとも部分的にインテグリンとの相互作用を通じて内皮細胞に、そしてＴ細胞に結合する、いくつかのＡＤＡＭファミリーポリペプチドのディスインテグリン−システインリッチドメインに示されるように、例えば、内皮細胞およびＴ細胞に発現される。ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーメンバーおよびそれらの結合パートナー間の相互作用は、生殖組織、神経組織、および筋細胞を含む細胞種、並びに結合パートナーを発現する内皮細胞およびＴ細胞間の相互作用を仲介する際に関与しているようである。
【００２４】
いくつかのＡＤＡＭファミリーポリペプチドのディスインテグリンドメインは、細胞表面インテグリン（例えば、その開示全体が本明細書に援用される、共に係属中の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０５７０１号を参照されたい）などの結合パートナーと相互作用可能である。１以上の結合パートナーに結合することによって、ディスインテグリンドメインポリペプチドは、その結合パートナーへのＡＤＡＭポリペプチドの結合を介して仲介される生物学的活性（例えば血管形成）を阻害可能である。いくつかのＡＤＡＭファミリーポリペプチドは、ディスインテグリンドメインを介して、インテグリン結合活性を示すため、ディスインテグリン活性の変調は、接着、例えば、卵への精子結合におけるＡＤＡＭ１および２の役割、並びに腎組織における基底層と糸球体および尿細管上皮細胞（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ　ａｎｄ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）の相互作用におけるＡＤＡＭ９の役割を変調するであろう。ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーの個々のメンバー、並びにこれらのポリペプチドの断片および他の誘導体が、これらの活性を示す度合いは、ディスインテグリン−Ｆｃ構築物による内皮細胞遊走の阻害等の、標準的アッセイ法によって、決定可能である。ＡＤＡＭポリペプチドおよびそれらの結合パートナー間の結合を検出するかまたは測定するのに特に適したアッセイは、ＦＡＣＳ解析である。ＡＤＡＭファミリーポリペプチドの生物学的活性およびパートナー結合特性を評価するさらなるアッセイを以下に記載する（例えば、実施例５−７を参照されたい）。ＡＤＡＭ−Ｈ９は、メタロプロテイナーゼドメインを欠いているが、他のＡＤＡＭファミリーポリペプチドのメタロプロテイナーゼ活性に関して、優性ネガティブとして作用することが可能である。
【００２５】
ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドは、共通の特徴として、インテグリン関連相互作用を共有する、炎症、癌、アレルギー、生殖、神経障害および疾患、血管形成および血管疾患または状態に関与する。ＡＤＡＭポリペプチドの生物学的活性を伴うことが知られるかまたは伴う可能性がある、炎症、癌、アレルギー、生殖、神経障害および疾患、血管形成および血管状態の例は、慢性関節リウマチ、敗血症ショック、糸球体疾患、急性腎不全、アルツハイマー病、および不適切な骨吸収である。ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーおよびそれらの基質、リガンド、受容体、結合パートナー、または他の相互作用ポリペプチド間の相互作用を遮断するかまたは阻害することは、本発明の側面であり、そしてＡＤＡＭポリペプチド活性の阻害剤または変調因子の使用を通じて、これらの疾患および状態を治療するか、変調するか、または寛解させる方法を提供する。１つの態様において、ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーメンバーおよびそれらの同族体間の相互作用は、ＡＤＡＭファミリーポリペプチドまたはその同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）を含有する試料を、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたは抗体と接触させることによって、影響を受ける。別の態様において、ＡＤＡＭファミリーポリペプチドはＡＤＡＭ−Ｈ９である。
【００２６】
あまりにも低いディスインテグリン活性を伴う特定の状態の場合、これらの状態を治療するかまたは寛解させる方法は、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの量または活性を、こうしたポリペプチドまたはその活性断片もしくは融合ポリペプチドを提供することによって、あるいは内因性または外因性ＡＤＡＭポリペプチドを活性化させる剤を提供することによって、増加させることを含んでなる。ＡＤＡＭポリペプチドファミリーメンバーのさらなる使用には、炎症、癌、アレルギー、生殖、神経障害および血管疾患の診断試薬；インテグリンポリペプチドおよび受精過程の研究、インテグリンおよび／または内皮細胞またはＴ細胞の精製およびプロセシングのための研究試薬；あるいは細胞に療法剤を搬送するキャリアー／ターゲティングポリペプチドとしてのものが含まれる。
【００２７】
本明細書において、「タンパク質」および「ポリペプチド」はどちらも、長さまたは翻訳後修飾（例えば糖鎖形成またはリン酸化）に関わりなく、いかなるアミノ酸鎖も意味し、そして天然タンパク質、合成または組換えポリペプチドおよびペプチド、並びに、１つの部分を含むハイブリッドからなる組換え分子、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９アミノ酸配列のすべてまたは一部および第二のヌクレオチド配列のすべてまたは一部にコードされる第二の部分を有するものを含む。典型的には、タンパク質またはポリペプチドは、天然に通常存在する他の構成要素を実質的に含まない。用語「実質的に純粋」または「精製した」は、ポリペプチドに言及する際、天然に関連するタンパク質および天然存在有機分子を少なくとも３０％含まないポリペプチドを意味する。好ましくは、本発明の実質的に純粋なポリペプチドは、重量にして、少なくとも３５−５０％；好ましくは６０−７０％；より好ましくは少なくとも７５％から９０％；そして最も好ましくは少なくとも９９％、他の天然存在分子から精製している。本発明の実質的に純粋なポリペプチドは、例えば、天然供給源からの抽出によって、該ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの発現によって、または該ポリペプチドを化学的に合成することによって、得ることが可能である。純度は、いかなる適切な方法、例えばクロマトグラフィー、ＰＡＧＥ、またはＨＰＬＣ解析によっても、測定可能である。
【００２８】
本明細書において、「ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド」は、図２に示すようなアミノ酸配列を含有するかまたは含んでなるポリペプチド；配列番号１、３、４、６、８、または１０に示す配列に実質的な相同性または実質的な同一性を有するポリペプチド；前述の配列の断片；および前述の保存的変異体を意味する。本発明は、配列番号１、３、４、６、８、および１０に示すような配列を有するポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、ＡＤＡＭ９ポリペプチドに高い度合いの相同性を有することが示されてきており、そしてしたがって、ＡＤＡＭポリペプチドの予測される機能／活性を有する。したがって、本発明は、配列番号１、３、４、６、８、および１０からなる群より選択される配列を含んでなるＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを提供する。１つの態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドは、ディスインテグリン活性またはメタロプロテイナーゼ阻害活性あるいはその組み合わせを有する。本発明のポリペプチドが、望ましいディスインテグリン活性またはメタロプロテイナーゼ阻害活性を有するかどうか決定する方法は、本明細書に以下に記載する方法のいずれによって、ポリペプチドをアッセイすることによっても達成可能である。例えば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリン活性は、以下の実施例５−７の方法を用いて、測定可能である。
【００２９】
本発明のポリペプチドはまた、図２に示す配列に、十分なまたは実質的な度合いの同一性または類似性を有するアミノ酸配列も含む。実質的に同一の配列は、当業者によって、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドと共通の構造ドメインを有する、および／または生物学的活性を有すると同定可能である。類似性または同一性を決定する方法は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のなどのコンピューターアルゴリズムを使用することが可能である。
【００３０】
句「実質的に同一」は、２つの核酸またはポリペプチドの関連において、例えば配列比較アルゴリズムによって、または手動並列および視覚的検査によって測定されるように、比較ウインドウに渡って、最大対応するよう並列した際、少なくとも６０％、好ましくは８０％または８５％、最も好ましくは９０−９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する配列または下位配列を指す。この定義はまた、試験配列が参照配列に実質的な同一性を有する場合、実質的な配列またはサブ配列相補性を有する、試験配列相補体も指す。「比較ウインドウ」は、本明細書において、２つの配列を最適に並列した後、配列を、同数の隣接位の参照配列に比較することが可能な、２０から１８００、一般的には約５０から２００、より一般的には約７０から１５０からなる群より選択される隣接位の数のいずれか１つの部分への言及を含む。
【００３１】
配列比較のため、典型的には、１つの配列が参照配列として働き、これに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる際、試験および参照配列をコンピューターに入力し、必要であればサブ配列座標を設計し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを設計する。デフォルトプログラムパラメーターを使用することが可能であるし、または代替パラメーターを設計することが可能である。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に比較した、試験配列の配列パーセント同一性を計算する。
【００３２】
比較のための配列の最適並列は、例えばＳｍｉｔｈ　＆　Ｗａｔｅｒｍａｎ，　Ａｄｖ．　Ａｐｐｌ．　Ｍａｔｈ．　２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　＆　Ｗｕｎｓｃｈ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　４８：４４３（１９７０）の相同性並列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ’ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動並列および視覚的検査によって、行うことが可能である。
【００３３】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関係および配列パーセント同一性を示す進行性の対並列を用いて、関連配列群から多数の配列並列を生成する。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ　＆　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｅｖｏｌ．　３５：３５１（１９８７）の進行性並列法の単純化を用いて、そしてＨｉｇｇｉｎｓ　＆　Ｓｈａｒｐ，　ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１（１９８９）に記載される方法に類似である。多数の並列法は、２つの最も類似の配列の対並列で始まり、２つの並列された配列のクラスターを産生する。その後、このクラスターを、次に最も関連する配列または並列配列のクラスターに並列する。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列の対並列の単純な拡張によって並列する。最後の並列は、一連の進行性の対並列によって達成する。例えば、以下のパラメーター：デフォルトギャップ加重（３．００）、デフォルトギャップ長加重（０．１０）、および末端ギャップ加重を用い、参照配列を他の試験配列に比較して、配列パーセント同一性関係を決定することが可能である。
【００３４】
配列パーセント同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３（１９９０）に記載されるようなＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｗｗｗ−ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公的に入手可能である。このアルゴリズムはまず、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、データベース配列中の同一の長さのワードと並列した際、正の数の閾値スコアＴとマッチするかまたはＴを満足させるかいずれかの、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見する検索を開始する種子（ｓｅｅｄ）として働く。ワードヒットを、各配列に沿って、累積並列スコアが増加可能である限り、両方向に拡張する。各方向へのワードヒットの拡張は：累積並列スコアが、最大達成値から量Ｘ、低下するか；１以上の負のスコア残基並列の集積のため、累積スコアが０以下になるか；またはいずれかの配列の末端に到達した際、停止する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ　＆　Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９：１０９１５（１９８９））並列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに提供される類似性の１つの測定値は、最小合計可能性（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが、偶然起こるであろう可能性の指標を提供する。例えば、参照核酸への試験核酸の比較において、最小合計可能性が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似であるとみなされる。
【００３５】
あるいは、２つのアミノ酸または２つの核酸配列のパーセント同一性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２：３８７，　１９８４）により記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループより入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，　ｐｐ．３５３−３５８，　１９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１４：６７４５，　１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００３６】
当業者は、コードされる配列の単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を改変する、付加するまたは欠失させる、核酸配列、ペプチド、またはポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加は、改変が、実質的に同一の生物学的活性（例えばディスインテグリン活性）を有する分子を生じる場合、「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。例えば、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる改変は、保存的に修飾された変異体である。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表が、当該技術分野に知られる。以下の６つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。
【００３７】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが実質的に同一であるという１つの指標は、第一のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが、第二のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対して作成した抗体と、免疫学的に交差反応することである。２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子またはそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００３８】
いかなる種類の改変（例えばアミノ酸の挿入、欠失、または置換；ポリペプチドの糖鎖形成状態の変化；三次元構造または自己会合状態を変化させるリフォールディングまたは異性化；並びに他のポリペプチドまたは分子との会合の変化）によって、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドから派生するポリペプチドもまた、本発明に含まれる。したがって、本発明に提供するポリペプチドには、図２に示すものに類似のアミノ酸配列によって特徴付けられるが、そこに修飾が天然に提供されているかまたは故意に操作されているポリペプチドが含まれる。ディスインテグリン活性および／またはメタロプロテイナーゼ阻害活性を有する配列番号１、３、４、６、８、または１０に示すような配列を含んでなるポリペプチドと、共通の生物学的活性を共有するポリペプチドが、本発明に含まれる。
【００３９】
本発明は、インテグリン結合活性、内皮細胞遊走阻害、および血管形成阻害からなる群より選択される、少なくとも１つの活性（「ディスインテグリン活性」）を保持するＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインの多様な型を含む。用語「ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインポリペプチド」（ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ）は、他のＡＤＡＭドメイン（例えばシステインリッチ領域）を含み、または含まず、ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインのすべてまたは一部を含有するポリペプチドと共に、限定されるわけではないが：（ａ）断片、（ｂ）変異体、（ｃ）誘導体、（ｄ）融合ポリペプチド、および（ｅ）多量体型（多量体）を含む、関連型を含むよう意図される。これらの関連型が、インテグリン結合、内皮細胞遊走、および／または血管形成を阻害する能力は、以下に例示するものなどの方法を用いることによって、または当該技術分野に知られる他のアッセイを用いることによって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで決定可能である。
【００４０】
当業者は、本明細書に記載する方法を用いて、活性に関して、容易にアッセイ可能である。こうした方法は、例えば、限定なしに、細胞接着を含む、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーに示される生物学的活性を測定する。例えば、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性を中和する抗ＡＤＡＭ−Ｈ９抗体を用いて、目的のポリペプチドと抗ＡＤＡＭ−Ｈ９抗体を接触させ、そして目的のポリペプチドに関連する活性が中和されるかどうか決定することによって、類似のポリペプチドに関してアッセイすることが可能である。さらに、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに特異的に結合する抗体の交差反応性は、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドと構造特性（例えば一次、二次、または三次タンパク質特性）を共有するポリペプチドを示す。
【００４１】
本発明は、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの全長および成熟型どちらも提供する。全長ポリペプチドは、最初に翻訳されるようなポリペプチドの完全一次アミノ酸配列を有するものである。全長ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ分子の完全オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）の翻訳によって、得ることが可能である。その遺伝子座から、選択的スプライシングによって、または多数の翻訳開始部位の使用によって、多数のｍＲＮＡ型が産生される場合、単一の遺伝子座に、いくつかの全長ポリペプチドがコードされていてもよい。ポリペプチドの「成熟型」は、あるとすれば、例えばシグナル配列の切断またはプロドメインを除去するタンパク質分解的切断などの、翻訳後プロセシング工程を経たポリペプチドを指す。特定の全長ポリペプチドの多数の成熟型は、例えば、シグナル配列の不正確な切断によって、またはポリペプチドを切断するプロテアーゼの差別的制御によって、産生可能である。こうしたポリペプチドの成熟型（類）は、全長ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞において発現することによって、得ることが可能である。ポリペプチドの成熟型の配列はまた、シグナル配列またはプロテアーゼ切断部位の同定を通じて（例えば配列番号６および１０のＳ６８またはＰ７１はありうるプロセシング部位である）、全長型のアミノ酸配列からも決定可能である可能性がある。本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドはまた、一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が、生物学的に活性であるポリペプチド、例えばポリペプチドの天然存在可溶性型を生じることが可能な選択的ｍＲＮＡプロセシングなどの転写後または翻訳後プロセシング事象から生じるポリペプチドも含む。本発明内にやはり含まれるのは、ポリペプチドからの１以上の末端アミノ酸（一般的には１−５の末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去による、異なる種類の宿主細胞における発現に際する、ＮまたはＣ末端の相違などのタンパク質分解に起因しうる変異である。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを発現するのに適した培養条件下で、形質転換または組換え宿主細胞を培養することによって、調製可能である。生じた発現ポリペプチドをその後、ゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの、既知の精製法を用いて、こうした培養から精製することが可能である。ポリペプチドの精製はまた、ポリペプチドに結合するであろう剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）またはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上の１以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う１以上の工程；あるいは免疫親和性クロマトグラフィーも含むことが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドはまた、精製を容易にするであろう型で発現することも可能である。例えば、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のものなどの融合ポリペプチドとして発現することが可能である。こうした融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ（マサチューセッツ州ビバリー）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）、およびＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから、商業的に入手可能である。ポリペプチドはまた、エピトープでタグ化して、そして続いて、こうしたエピトープに対して向けられる特異的抗体を用いることによって、精製することも可能である。１つのこうしたエピトープ（「Ｆｌａｇ」）は、Ｋｏｄａｋ（コネティカット州ニューヘブン）から商業的に入手可能である。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する、１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチドをさらに精製することが可能である。多様な組み合わせの前述の精製工程のいくつかまたはすべてもまた使用して、実質的に均質な組換えポリペプチドを提供することが可能である。こうして精製したポリペプチドは、他の哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まず、そして本発明にしたがって、「実質的に精製したポリペプチド」と定義される；こうした精製ポリペプチドには、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、変異体等に特異的に結合する抗体が含まれる。本発明のポリペプチドはまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する体細胞または生殖細胞によって特徴付けられる、トランスジェニック動物の産物として、例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの構成要素として、発現することも可能である。
【００４３】
本発明のポリペプチドに対して生成したモノクローナル抗体などのアフィニティーカラムを利用して、発現したポリペプチドをアフィニティー精製することもまた、可能である。これらのポリペプチドは、慣用的な技術を用いて、例えば利用するアフィニティーマトリックスに応じて、高塩溶出緩衝液中で、そしてその後、使用のためより低塩の緩衝液中に透析することによって、またはｐＨもしくは他の構成要素を変化させることによって、アフィニティーカラムからはずす（ｒｅｍｏｖｅ）ことが可能であるし、あるいは本発明から得られるポリペプチドなどの、アフィニティー部分の天然存在基質を用いて、競合的にはずふことが可能である。本発明のこの側面において、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質（例えば本発明の抗ＡＤＡＭ−Ｈ９抗体）は、その表面上に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定するか、分離するかまたは精製するのに適した固相支持体または類似の支持体に結合させることが可能である。例えば、固相表面への本発明の抗ＡＤＡＭ−Ｈ９抗体の付着は、いかなる手段によって達成してもよく、例えば、磁気微小球体を、これらのポリペプチド結合タンパク質でコーディングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器中に保持してもよい。細胞混合物の懸濁物を、こうしたポリペプチド結合タンパク質を有する固相と接触させる。抗ＡＤＡＭ−Ｈ９抗体は、表面上に本発明のポリペプチド（例えばＡＤＡＭ−Ｈ９の細胞外ドメイン）を有する細胞に結合する。未結合細胞（例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを欠く細胞）は、結合細胞から洗い流される。このアフィニティー結合法は、溶液から、こうしたポリペプチド発現細胞を精製するか、スクリーニングするか、または分離するのに有用である。陽性に選択された細胞を固相から放出させる方法は、当該技術分野に知られ、そして例えば、酵素の使用を含む。こうした酵素は、好ましくは細胞に対し非毒性および非傷害性であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するよう指示される。あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含有すると疑われる細胞混合物をまず、ビオチン化した本発明の結合ポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション時間は、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。その後、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに、生じた混合物を通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの高い親和性が、細胞のビーズへの結合を提供する。アビジンでコーティングしたビーズの使用は当該技術分野に知られる（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０Ｄ：２３９，　１９８６を参照されたい）。非結合成分の洗浄および結合細胞の遊離は、慣用法を用いて行う。
【００４４】
本発明のポリペプチドはまた、既知の慣用的な化学合成によっても産生可能である。合成手段によって、本発明のポリペプチドを構築する方法は、当業者に知られる。合成によって構築されたポリペプチド配列は、天然ポリペプチドと一次、二次または三次構造および／またはコンホメーション特性を共有するため、生物学的活性を含め、それと共通の生物学的特性を所持する可能性がある。したがって、合成ポリペプチドは、療法化合物のスクリーニングにおいて、そして抗体発展のための免疫学的方法において、天然の精製ポリペプチドの生物学的に活性であるまたは免疫学的な置換体として、使用可能である。
【００４５】
望ましい純度は、ポリペプチドの意図される使用に依存する。例えば、ポリペプチドをｉｎ　ｖｉｖｏで投与しようとするとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、他のポリペプチドに相当するポリペプチドバンドが検出不能であるように精製される。当業者は、異なる糖鎖形成、異なる翻訳後プロセシング等のため、該ポリペプチドに相当する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることを認識するであろう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一のポリペプチドバンドにより示されるように、実質的に均一に精製される。ポリペプチドバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色によって、または（ポリペプチドが放射標識されている場合は）オートラジオグラフィーによって、視覚化可能である。
【００４６】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの種相同体もまた、本発明により提供される。本明細書において、「種相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」は、既定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのものと起源の異なる種であるが、既定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに有意な配列類似性を持つポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。種相同体は、本明細書に提供するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから、適切なプローブまたはプライマーを作成し、そして望ましい種由来の適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって、単離し、そして同定することが可能である。あるいは、相同体は、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９の配列（例えば核酸またはアミノ酸配列）を利用して、１以上の種由来の配列を含有するゲノムデータベースをスクリーニングすることによって、同定することが可能である。こうしたゲノムデータベースは、いくつかの種に関して容易に入手可能である（例えば、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上、ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ；ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ；ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｂａｌｌ；ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎ１．ｇｏｖ；ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｇ．ｇｏｖ；ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ；およびｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｏｔｈｅｒ／ｂｉｏｌｏｇｙ）。本発明はまた、アミノ酸またはヌクレオチド配列の相違が、遺伝子多型に起因しうるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの天然存在代替型である、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸のアリル変異体（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔ）も含む。
【００４７】
中間配列検索（ＩＳＳ）を用いて、１以上の中間配列を通じて２つのタンパク質を結びつけることによって、緊密に関連する相同体と共に、遠い相同体を同定することが可能である。ＩＳＳは、新たな検索種子として、先のクエリーの結果を反復して使用する。飽和ＢＬＡＳＴは、ＩＳＳを行うパッケージである。タンパク質配列から出発し、飽和ＢＬＡＳＴは、ＢＬＡＳＴ検索を行い、そして次世代の検索のため、代表配列を同定する。該方法は、収束するまで、またはあるあらかじめ定義した判定基準が満たされるまで行う。飽和ＢＬＡＳＴは、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｕｒｎｈａｍ−ｉｎｓｔ．ｏｒｇ／ｘｂｌａｓｔで入手可能である（Ｌｉら，　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　１６（１２）：１１０５，　２０００も参照されたい）。
【００４８】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの断片が本発明に含まれ、そして該断片は直線型であっても、既知の方法を用いて環状化してもよい（例えば、どちらも本明細書に援用される、Ｈ．Ｕ．　Ｓａｒａｇｏｖｉら，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０，　７７３（１９９２）；およびＲ．Ｓ．　ＭｃＤｏｗｅｌｌら，　Ｊ．　Ａｍｅｒ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１１４：９２４５（１９９２）を参照されたい）。本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドのペプチド断片、およびこうした断片をコードするポリヌクレオチドは、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、６０％、または７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）のアミノ酸またはヌクレオチド配列長を含む。好ましくは、こうした配列は、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％−７５％、８０％−８５％、９０％−９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有するであろう。本発明にやはり含まれるのは、好ましくは少なくとも８から１０、またはより好ましくは少なくとも２０、またはさらにより好ましくは少なくとも３０、または最も好ましくは少なくとも４０の隣接するアミノ酸を含んでなるセグメントを含有するかまたはコードする、ポリペプチド、ペプチド断片、およびそれらをコードするポリヌクレオチドである。こうしたポリペプチドおよび断片はまた、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際、ＡＤＡＭファミリーポリペプチドのいずれかのこうしたセグメントいずれかと、少なくとも７０％（少なくとも７５％、８０％−８５％、９０％−９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）共有するセグメントも含有することが可能である。視覚的検査、数学的計算、またはコンピューターアルゴリズムがパーセント同一性を決定することが可能である。
【００４９】
本発明はまた、これらのポリペプチドの特定の断片またはドメインを含んでなる、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの可溶性型も提供する。ディスインテグリン活性を有する可溶性断片が、特に興味深い。例えば、配列番号６の残基７３の非常に保存されたＣＧＮ配列で始まり、そしてほぼ残基３６１まで続く、膜貫通領域を欠くアミノ酸配列は、ディスインテグリン活性を有する。他の可溶性型には、残基１および１６の間であり、そして両残基を含むアミノ酸から始まり、残基２８５までの配列番号８、または残基１および７３の間であり、そして両残基を含むアミノ酸から始まり、３１４および３２９の間の残基までの配列番号１０を含んでなるポリペプチドが含まれる。こうした型では、ポリペプチドが発現された際、細胞から完全に分泌されるように、ポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインの一部またはすべてが欠失される。本発明のポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインは、配列情報からこうしたドメインを決定するために知られる技術にしたがって、同定可能である。例えば、本発明のポリペプチド配列と、既知のドメインを有するポリペプチドのＡＤＡＭファミリーの他のメンバーとの並列は、本発明のポリペプチドのドメインに関する情報を提供するであろう。例えば、配列番号１、３、６、８、および１０は、ＡＤＡＭ９との相同性に基づいて同定されてきており、そしてディスインテグリンドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに属すると予測されるドメインを有する。例えば、配列番号６の残基７３の、非常に保存されたＣＧＮ配列から始まり、そしてほぼ残基３６０まで続く、配列番号６、８、および１０に示す配列は、ＡＤＡＭ９と比較した際、いくつかの保存されたシステイン残基を有し、そしてＡＤＡＭファミリーポリペプチドの予測されるディスインテグリンドメインを含む。当業者は、特定のドメインのある範囲の配列のわずかな修飾は、分子の生物学的活性に影響を与えることなく、作成可能であることを認識するであろう。したがって、同定した配列における、特定のドメインのいずれかの方向での、１、２、３、４、または５アミノ酸の変化は、本発明に含まれる（例えば、配列番号６のディスインテグリンドメインは、残基６８、６９、７０、７１、７２、７４、７５、７６、７７、または７８からほぼ残基３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６１、３６２、３６３、３６４、または３６５までを含むことが可能である）。
【００５０】
本発明の別の側面において、ポリペプチドは、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、または細胞質ドメインなどの、ＡＤＡＭポリペプチドドメインの多様な組み合わせを含んでなることが可能である。したがって、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、メタロプロテイナーゼドメインなどのドメインの２以上のコピー、ディスインテグリンドメインなどのドメインの２以上のコピー、または各ドメインの少なくとも１コピーを含んでなるかまたはコードするものを含み、そしてこれらのドメインは、こうしたポリペプチド内で、いかなる順序で存在してもよい。やはり含まれるのは、組換えポリペプチドが「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」であり、そして第二のポリペプチドに機能可能であるように連結した、配列番号１、３、６、８または１０に示すＡＤＡＭ−Ｈ９配列を含んでなる組換えポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。第二のポリペプチドは、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの機能と独立の、またはそれに関連する活性または機能を有する、いかなる目的のポリペプチドであってもよい。例えば、第二のポリペプチドは、例えば関連ＡＤＡＭポリペプチドの細胞外、細胞質、メタロプロテアーゼ、または膜貫通ドメインなどの、ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーの関連するが別個のメンバーのドメインであってもよい。用語「機能可能であるように連結した」は、ＡＤＡＭ−Ｈ９配列および第二のポリペプチド配列が、互いにインフレームで融合したことを示すと意図する。第二のポリペプチドは、図２に示すようなＡＤＡＭ−Ｈ９配列のＮ末端またはＣ末端に融合することが可能である。例えば、１つの態様において、融合ポリペプチドは、ＡＤＡＭ−Ｈ９配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合した、ＧＳＴ−ＡＤＡＭ−Ｈ９融合ポリペプチドである。こうした融合ポリペプチドは、組換えＡＤＡＭ−Ｈ９配列の精製を容易にすることが可能である。別の態様において、融合ポリペプチドは、Ｎ末端に異種シグナル配列を含んでなるＡＤＡＭ−Ｈ９配列である。特定の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて増加させることが可能である。別の例として、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはその断片を、ヘキサ−ヒスチジンタグに融合して、細菌発現タンパク質の精製を容易にするか、または赤血球凝集素タグに融合して、真核細胞で発現したタンパク質の精製を容易にすることが可能である。さらに、融合ポリペプチドは、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２０４，　１９８８に記載される抗原性同定ペプチドを含んでなることが可能である。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドであり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えポリペプチドの迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ９２５９号でＡＴＣＣに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．，　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネティカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００５１】
本発明に含まれるのは、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを含有するオリゴマーまたは融合ポリペプチドである。融合パートナーとして使用可能なオリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーを含む、共有結合または非共有結合多量体型であってもよい。本発明の１つの側面において、オリゴマーはポリペプチド構成要素の結合能を維持し、そしてしたがって、二価、三価等の結合部位を提供する。別の態様において、本発明は、ポリペプチドに融合しているペプチド部分間の共有または非共有相互作用を介して連結している多数のポリペプチドを含んでなるオリゴマーに関する。こうしたペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であってもよく、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載するように、付着するポリペプチドのオリゴマー化を促進することが可能なペプチドの中に、ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドがある。特に好ましいオリゴマーは、ＡＤＡＭ−Ｈ９のディスインテグリンドメインを含んでなる。こうした好ましいオリゴマーは、Ｆｃドメインまたはロイシンジッパードメインに機能可能であるように連結したＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓに例示される。
【００５２】
典型的なリンカーはペプチドリンカー部分であろう。リンカー部分の長さは、ＡＤＡＭ−Ｈ９配列を有するポリペプチドの生物学的活性を最適にするよう選択し、そして過度の実験を伴わず、経験的に決定することが可能である。リンカー部分は、ＡＤＡＭ−Ｈ９部分が、基質またはリガンドと自由に相互作用可能であるのに十分に長く、そして十分に柔軟でなければならない。好ましいリンカー部分は、長さ約１および３０アミノ酸残基の間の、好ましくは約２および１５アミノ酸残基の間のペプチドである。好ましいリンカー部分は、−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１５）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１６）、またはＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１７）である。連結部分は、例えばＨｕｓｔｏｎ，　Ｊ．Ｓ．ら，　ＰＮＡＳ　８５：５８７９（１９８８）、Ｗｈｉｔｌｏｗ，　Ｍ．ら，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：９８９（１９９３）、およびＮｅｗｔｏｎ，　Ｄ．Ｌ．ら，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５：５４５（１９９６）に記載される。他の適切なペプチドリンカーは、本明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載される。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、いかなる適切な慣用的技術を用い、本発明のＤＮＡ配列の間に、そして該ＤＮＡ配列と同じ読み枠で挿入してもよい。例えば、リンカーをコードする、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを、配列間に連結してもよい。特定の態様において、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって分離された、２から４の可溶性ＡＤＡＭポリペプチドを含んでなる。
【００５３】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの変異体が膜貫通ドメインを含むよう構築される態様において、これらはＩ型膜ポリペプチドを形成するであろう。こうした態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドのＣ末端に融合パートナーを連結することが好ましい。あるいは、膜貫通ポリペプチドを、それに対するリガンドもまた既知である、既知の細胞外受容体ドメインポリペプチドに融合してもよい。その後、こうした融合ポリペプチドを操作して、結合したＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドによって誘発される細胞内シグナル伝達経路を調節することが可能である。細胞膜を貫通するポリペプチドはまた、細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは細胞接着分子と融合して、ＡＤＡＭ−Ｈ９細胞内効果をさらに変調することが可能である。本発明の別の側面において、インターロイキンを、好ましいＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド断片および他の融合ポリペプチドドメインの間に位置させることが可能である。
【００５４】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドはまた、適切な細胞小器官ターゲティングシグナルまたは局在化宿主タンパク質に融合することによって、局在化配列を含んで、特定の細胞部位にポリペプチドを向けることも可能である。局在化配列、またはシグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、シグナルペプチドが、生じる融合ポリヌクレオチド／ポリペプチドのアミノ末端に位置するように、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に連結するかまたは融合することが可能である。真核生物において、シグナルペプチドは、小胞体を横断して、ポリペプチドを輸送するよう機能する。その後、分泌タンパク質は、ゴルジ体を通して、分泌小胞に、そして細胞外空間または外部環境に輸送される。シグナルペプチドには、タンパク質分解酵素認識部位を含有するプレプロペプチドが含まれる。
【００５５】
局在化配列は、核、小胞体、ペルオキシソーム、またはミトコンドリア局在化配列、または局在化タンパク質であってもよい。局在化配列は、例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，　Ｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版），　Ｗ．Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ，　１９９５の“Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”，　第３５章に記載されるターゲティング配列であってもよい。いくつかの重要な局在化配列には、核（例えばＫＫＫＲＫ（配列番号１８））、ミトコンドリア（ＭＬＲＴＳＳＬＦＴＲＲＶＱＰＳＬＦＲＮＩ　ＬＲＬＱＳＴ（配列番号１９））、小胞体（ＫＤＥＬ（配列番号２０））、ペルオキシソーム（ＳＫＦ）、形質膜（ＣＡＡＸ（配列番号２１）、ＣＣ、ＣＸＣ、またはＣＣＸＸ（配列番号２２））、形質膜の細胞質側（ＳＮＡＰ−２５への融合）、またはゴルジ体（フューリンへの融合）をターゲティングするものが含まれる。
【００５６】
別の態様において、ポリペプチド結合部位の結合価を増加させることを含む多様な目的のため、本発明のポリペプチドまたはその断片を、免疫グロブリンなどのキャリアー分子に融合させてもよい。例えば、ポリペプチドの断片を、リンカー配列を通じて、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合することが可能である。ポリペプチドを二価型にするため、こうした融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に対してでもよい。他の免疫グロブリンアイソタイプもまた用いて、こうした融合体を生成することが可能である。例えば、ポリペプチド−ＩｇＭ融合は、本発明のポリペプチドの十価型を生成するであろう。１つの態様において、本発明は、Ｆｃポリペプチドドメイン、およびほぼアミノ酸番号７３からほぼ３６０までの配列番号６、アミノ酸１または１６から２８５までの配列番号８、あるいはアミノ酸１または７３から３１４または３２９までの配列番号１０に示すようなＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド配列を有する融合ポリペプチドを提供する。
【００５７】
本明細書において、用語「Ｆｃポリペプチド」には、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいずれかまたはすべてを含んでなる抗体のＦｃ領域で構成される、ポリペプチドの天然および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）もまた含まれる。好ましいポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペプチドを含んでなる。１つの代替物として、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している特定の異種ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドの調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８８：１０５３５，　１９９１）；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ，　３４４：６７７，　１９９０）；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（“免疫グロブリン融合ポリペプチドの構築”，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，　Ｓｕｐｐｌ．４，　１０．１９．１−１０．１９．１１ページ，　１９９２）に記載されている。免疫グロブリンに基づくオリゴマーの調製および使用法は、当該技術分野に知られる。本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合することによって生成される２つの融合ポリペプチドを含んでなる二量体に関する。ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターまたは組換えポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞でポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質を発現し、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、二価分子を生じるのを可能にする。ＰＣＴ出願ＷＯ　９３／１０１５１（本明細書に援用される）に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、本明細書に援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ　Ｊ．　１３：３９９２，　１９９４）に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ　９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。Ｆｃ部分を含んでなる上述の融合ポリペプチド（およびそれから形成されるオリゴマー）は、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関して置換してもよい。融合ポリペプチドが抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つものＡＤＡＭ−Ｈ９および／またはＡＤＡＭ細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能である。
【００５８】
本発明のオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるポリペプチドのオリゴマー化（二量体および三量体）を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合ポリペプチドで同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１７５９，　１９８８）、そして以来、多様な異なるポリペプチドで見出されてきている。ジッパードメインは、しばしば、他のアミノ酸と共に散らばる４または５のロイシン残基を持つ、７アミノ酸反復を含んでなる。
【００５９】
本発明のキメラまたは融合ポリペプチドは、標準的組換えＤＮＡ技術によって産生可能である。１つの態様において、異なるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド断片を、慣用的技術にしたがって、例えば、連結のため、平滑末端またはジグザグ（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じて付着末端の埋め込み、望ましくない連結を避けるアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することによって、インフレームで共に連結する。ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドの例を図３に示す。別の態様において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置を含む、慣用的技術によって、合成可能である。あるいは、２つの連続した遺伝子断片間の相補的突出を生じ、続いてアニーリングし、そして再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することが可能な、アンカープライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことが可能である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａｕｓｕｂｅｌら監修，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている、多くの発現ベクターが、商業的に入手可能である。
【００６０】
本発明はさらに、結合する天然パターングリコシル化を含むまたは含まない本発明のポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞）で発現したポリペプチドは、発現系の選択に応じて、分子量およびグリコシル化パターンにおいて、天然ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌発現系での本発明のポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。さらに、既定の調製は、多数の異なってグリコシル化されたポリペプチド種を含む可能性がある。グリコシル基は、慣用法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じて、除去可能である。
【００６１】
別の態様において、既知の技術を用いて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド中の修飾を行うことが可能である。ポリペプチド配列中の目的の修飾には、コード配列中の選択したアミノ酸残基の改変、置換、交換、挿入、または欠失が含まれる可能性がある。例えば、１以上のシステイン残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸と交換して、分子のコンホメーションを改変することが可能であり、この改変は、フォールディングまたは再生に際して、正しくない分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことを伴いうる。こうした改変、置換、交換、挿入、または欠失のための技術は、当業者に知られる（例えば米国特許第４，５１８，５８４号を参照されたい）。別の例として、ポリペプチドの細胞外ドメイン中のＮ糖鎖形成部位を修飾して、グリコシル化を妨げてもよく、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ）の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮグリコシル化部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失の結果、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合が防止されるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって交換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎグリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで交換してもよい。ポリペプチドのＮグリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ　２７６，８４６に記載されるものが含まれる。潜在的なＮグリコシル化部位には、配列番号１のＮ２３；配列番号３のＮ３７；配列番号４のＮ５３；配列番号６のＮ１４４およびＮ２７７；配列番号８のＮ１０、Ｎ６９、およびＮ２０２；並びに配列番号１０のＮ１４４、Ｎ２７７が含まれる。
【００６２】
本発明の範囲内のさらなる変異体には、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等の他の化学部分と共有または凝集結合体を形成することによって、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチドが含まれる。共有誘導体は、アミノ酸側鎖上の、あるいはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の、官能基に、化学部分を連結することによって、調製可能である。付着している診断用（検出可能）剤または療法剤を含んでなるコンジュゲートが本明細書に意図される。好ましくは、こうした改変、置換、交換、挿入または欠失は、ポリペプチドの望ましい活性を保持する。
【００６３】
本発明はまた、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。用語「ポリヌクレオチド」は、長さ少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー型を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型であってもよい。該用語には、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖および二本鎖型が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、全長遺伝子およびｃＤＮＡ分子と共に、その断片の組み合わせが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、ヒト供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種に由来するものもまた、含む。
【００６４】
「単離ポリヌクレオチド」は、由来する生物の天然存在ゲノムにおいて、すぐ隣接している（５’端にあるものおよび３’端にあるもの）コード配列両方と、すぐ隣接していないポリヌクレオチドを意味する。該用語にはしたがって、例えば、ベクター、例えば発現ベクターに；自律複製プラスミドまたはウイルスに；あるいは原核または真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれた、あるいは他の配列と独立の別個の分子（例えばｃＤＮＡ）として存在する、組換えポリヌクレオチド分子が含まれる。
【００６５】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチドは、（１）配列番号１、３、４、６、８、または１０に示すような配列を含んでなるポリペプチドをコードし；（２）配列番号２、５、７、または９（例えば図３を参照されたい）に示すような配列を有し；（３）配列番号２、５、７、または９に示すような配列に相補的な配列を有し；（４）中程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ）から非常に（ｈｉｇｈｌｙ）ストリンジェントな条件下で、（２）または（３）のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、配列番号２、５、７、または９の断片、あるいはそれらの相補体であり；そして（５）ＴがまたＵであることも可能な（例えばＲＮＡ配列）、（１）、（２）、（３）、または（４）のポリヌクレオチドである。本発明にやはり含まれるのは、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチドの相補体である。これらのポリヌクレオチドは、適切な供給源からのゲノムまたはｃＤＮＡ分子の単離、あるいは入手可能な配列データベースのコンピューター検索を含む、いくつかの方法で、同定可能である。本明細書に記載するアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド相同体単離のためのプローブまたはプライマーとして、あるいはデータベース検索のためのクエリー配列として、使用可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列は、本発明のアミノ酸配列から「逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」することによって、得ることが可能である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して、ＡＤＡＭポリペプチドまたはＡＤＡＭポリペプチド断片の望ましい組み合わせをコードするＤＮＡ配列を単離し、そして増幅することが可能である。標的ＤＮＡ分子の望ましい末端を定義するオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして使用する。したがって、本発明のポリヌクレオチドの断片は、関連配列を同定するかまたは増幅する、あるいは本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９の全長配列を得る、プローブおよびプライマーとして、有用である。オリゴヌクレオチドは、発現ベクターに、ＤＮＡ断片の増幅された組み合わせを挿入するのを容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を、さらに含有してもよい。ＰＣＲ技術は、当該技術分野に知られる（例えばＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，　Ｉｎｎｉｓら監修，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．（１９９０）を参照されたい）。
【００６６】
本発明にはまた、減少したストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度にストリンジェントな条件、そして最も好ましくは、非常にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載するＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドも含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｅ．Ｆ．　ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，　第９章および第１１章；およびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９９５，　Ｆ．Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌら監修，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ，　セクション２．１０および６．３−６．４、本明細書に援用される）によって示されており、そして例えばポリヌクレオチドの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定可能である。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５ｘＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または約４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、並びに約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中の洗浄条件の使用が含まれる。一般的に、高ストリンジェントな条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件と定義されるが、およそ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳでの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）をＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に対して置換することが可能である；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間行う。当業者に知られるように、そして以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応および二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することによって、必要に応じて、望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するよう、洗浄温度および洗浄塩濃度を調整可能であることを理解すべきである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい）。核酸を未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる際、ハイブリッド長は、ハイブリダイズする核酸のものと仮定される。既知の配列の核酸をハイブリダイズさせる際、ハイブリッド長は、核酸の配列を並列し、そして最適配列相補性を持つ、単数または複数の領域を同定することによって、決定可能である。長さ５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５から１０℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式にしたがって決定する。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）である。長さ１８塩基対を超えるハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、ハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、６０％、または７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）の長さを有し、そしてハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドと、少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。
【００６７】
「保存的に修飾された変異体」は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド両方にあてはまる。特定のポリヌクレオチドに関して、保存的に修飾された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド中のコドンを指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一のポリヌクレオチドが、既定のタンパク質いずれかをコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定されるすべての位で、コードされるポリペプチドを改変することなく、記載した対応するコドンのいずれかに、コドンを改変することが可能である。こうした変異は「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾された変異の１つの種類である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべてのポリヌクレオチド配列はまた、核酸のすべての可能性のあるサイレント変異も記載する。当業者は、ポリヌクレオチド中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を生じることが可能であることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が、記載する配列各々に潜在する。
【００６８】
本発明はまた、Ｈａｃｉａら，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１４：４４１−４４７（１９９６）に記載されるような「ＤＮＡチップ」上の本発明のポリヌクレオチドの解析のための方法論も提供する。例えば、配列番号２、５、７、９に示すような配列、あるいはその変異体または突然変異体を含んでなるオリゴヌクレオチドの高密度アレイを、チップに適用して、そして固定し、そして集団中の配列変動を検出するのに用いることが可能である。試験試料中のポリヌクレオチドを、固定したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。固定したプローブへの標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションプロフィールを定量化し、そして参照プロフィールに比較する。生じた遺伝子情報は、分子診断に使用可能である。ＤＮＡチップ上のオリゴヌクレオチド密度は、必要に応じて修飾可能である。
【００６９】
本発明はまた、本明細書に開示するポリヌクレオチドに対応する遺伝子も提供する。「対応する遺伝子」は、転写されて、ｃＤＮＡ分子が由来するｍＲＮＡを産生する、ゲノム領域であり、そしてこうした遺伝子の制御された発現に必要なゲノムの隣接領域を含むことが可能である。したがって、対応する遺伝子には、限定されるわけではないが、コード配列、５’および３’非翻訳領域、選択的スプライシングされるエクソン、イントロン、プロモーター、エンハンサー、およびサイレンサーまたはサプレッサー要素が含まれる可能性がある。対応する遺伝子は、本明細書に開示する配列情報を用いて、既知の方法にしたがい、単離することが可能である。こうした方法には、適切なゲノムライブラリーまたはゲノム材料の他の供給源における、遺伝子の同定および／または増幅のため、開示される配列情報からのプローブまたはプライマーの調製が含まれる。
【００７０】
本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離、および精製は、限定されるわけではないが、以下の方法を含む、いかなる適切な技術によっても達成可能である。
【００７１】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを組換え的に産生するため、Ｋａｕｆｍａｎら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９：４４８５（１９９１）；およびＰｏｕｗｅｌｓら，　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，　ニューヨーク，　（１９８５および補遺）に開示される、ｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターなどの発現調節配列に、機能可能であるように連結することが可能である。多くの適切な発現調節配列が当該技術分野に知られる。組換えポリペプチドを発現させる一般的な方法もまた知られ、そしてＲ．　Ｋａｕｆｍａｎ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５：５３７（１９９０）に例示される。本明細書において、「機能可能であるように連結した」は、本発明の単離ポリヌクレオチドおよび発現調節配列が、ベクターまたは細胞内で、ベクターまたは調節配列に機能可能であるように連結したポリヌクレオチドで形質転換（トランスフェクション）した宿主細胞によって、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現されるような方式で、位置していることを意味する。
【００７２】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドを産生しようとする宿主細胞の種類などの要因に応じる可能性がある。哺乳動物宿主細胞で機能する、異種シグナルペプチドの例には、インターロイキン（ＩＬ）−７のシグナル配列（米国特許第４，９６５，１９５号を参照されたい）；ＩＬ−２受容体のシグナル配列（Ｃｏｓｍａｎら，　Ｎａｔｕｒｅ　３１２：７６８，　１９８４を参照されたい）；ＩＬ−４受容体シグナルペプチド（ＥＰ　３６７，５６６を参照されたい）；Ｉ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド（米国特許第４，９６８，６０７号を参照されたい）；およびＩＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド（ＥＰ　４６０，８４６を参照されたい）が含まれる。意図される宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌に際し、ポリペプチドから切断される。ポリペプチド調製は、１より多い部位でのシグナルペプチドの切断から生じる、異なるＮ末端アミノ酸を有するポリペプチド分子の混合物を含む可能性がある。
【００７３】
哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が、記載されている（Ｋａｕｆｍａｎ，　Ｒ．Ｊ．，　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，　１９９０，　ｐｐ．１５−６９）。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）などの商業的に入手可能な試薬を用いた、さらなるプロトコルを用いて、細胞をトランスフェクションすることが可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４：７４１３，　１９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　第２版　Ｖｏｌ．１−３，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）におけるもののような慣用法を用いて、哺乳動物細胞をトランスフェクションすることが可能である。安定形質転換体の選択は、例えば細胞傷害性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用いて、行うことが可能である。Ｋａｕｆｍａｎら，　Ｍｅｔｈ．　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５：４８７，　１９９０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性などのいくつかの選択計画を記載する。ＤＨＦＲ選択に適した株は、ＤＨＦＲ不全であるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１でありうる（Ｕｒｌａｕｂら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７：４２１６，　１９８０）。ＤＨＦＲ　ｃＤＮＡを発現しているプラスミドを株ＤＸ−Ｂ１１に導入することが可能であり、そしてプラスミドを含有する細胞のみを適切な選択培地中で増殖させることが可能である。発現ベクターに組込み可能な選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該ベクターを宿する細胞を、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択する。
【００７４】
あるいは、遺伝子産物は、相同組換え、または「遺伝子ターゲティング」技術を介して、得ることが可能である。こうした技術は、ゲノム上の特にあらかじめ決定した部位において、外因性転写調節要素（ＣＭＶプロモーター等）の導入を使用して、本発明の内因性ＡＤＡＭ−Ｈ９の発現を誘導する。宿主染色体またはゲノムへの組込み位置は、遺伝子の既知の位置および配列を考慮すれば、当業者の１人によって容易に決定することが可能である。好ましい態様において、本発明はまた、増幅可能遺伝子と組み合わせた、外因性転写調節要素を導入して、増加した量の遺伝子産物を産生することも意図する。相同組換えまたは遺伝子ターゲティングの実施は、米国特許第５，２７２，０７１号において、Ｃｈａｐｐｅｌによって説明される（Ｓｃｈｉｍｋｅら，　“哺乳動物体細胞における遺伝子増幅，”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５１：８５（１９８７）およびＣａｐｅｃｃｈｉら，　“新マウス遺伝学：遺伝子ターゲティングによるゲノム改変，”　ＴＩＧ　５：７０（１９８９）もまた参照されたい）。
【００７５】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には真核および原核細胞が含まれる。哺乳動物宿主細胞には、例えば、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，　Ｃｅｌｌ　２３：１７５，　１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０）細胞株、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ　ｇｒｅｅｎ　ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎら，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１０：２８２１，　１９９１を参照されたい）、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。あるいは、酵母などのより低次の真核生物において、または細菌などの原核生物において、ポリペプチドが産生可能である可能性がある。潜在的に適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、または異種ポリペプチドを発現することが可能ないかなる酵母株も含まれる。潜在的に適切な細菌株には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または異種ポリペプチドを発現することが可能ないかなる細菌株も含まれる。ポリペプチドが、酵母または細菌で作成される場合、機能するポリペプチドを得るため、そこで産生されるポリペプチドを、例えば適切な部位でのリン酸化またはグリコシル化によって、修飾することが必要である可能性がある。こうした共有結合は、既知の化学的または酵素的方法を用いて、達成可能である。ポリペプチドはまた、本発明のポリヌクレオチドを、１以上の昆虫発現ベクターの適切な調節配列に、機能可能であるように連結し、そして昆虫発現系を使用することによって、産生することも可能である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴからキットの形で（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）商業的に入手可能であると共に、こうした方法は、本明細書に援用される、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）、並びにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：４７（１９８８）に記載される。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示する核酸構築物由来のＲＮＡを用いて、ポリペプチドを産生するのに使用可能である。好ましくは、少なくとも１つの発現調節配列に機能可能であるように連結されている、本発明の単離ポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【００７６】
ある場合、ＡＤＡＭ−Ｈ９の過剰発現または異常な活性が、障害または疾患と関連するならば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの量または活性を減少させるのが望ましい可能性がある。ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを中和するかまたはＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチドの発現（転写または翻訳いずれか）を阻害する方法いずれかを用いて、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの生物学的活性を減少させることが可能である。
【００７７】
１つの態様において、アンタゴニストを設計して、内因性ＡＤＡＭ−Ｈ９発現のレベルを減少させることが可能であり、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９　ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害するかまたは妨げる、既知のアンチセンスまたはリボザイムアプローチ；ＡＤＡＭ−Ｈ９遺伝子の転写を阻害する三重らせんアプローチ；あるいは、ＡＤＡＭ−Ｈ９遺伝子またはその内因性プロモーターもしくはエンハンサー要素を不活性化するかまたは「ノックアウト」する、ターゲティング相同組換えを用いる。こうしたアンチセンス、リボザイム、および三重らせんアンタゴニストを設計して、損なわれた、または適切な場合、突然変異体ＡＤＡＭ−Ｈ９活性いずれかを減少させるかまたは阻害することが可能である。
【００７８】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、ターゲティングするｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてポリペプチド翻訳を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するよう作用する。アンチセンスアプローチは、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）の設計を伴う。絶対の相補性は、好ましいが、必要ではない。メッセージの５’端、例えばＡＵＧ開始コドンまでおよび該開始コドンを含む、５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に働くはずである。アンチセンス核酸は、好ましくは、長さ６から約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物、その誘導体または修飾型であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾し、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善することが可能である。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば宿主細胞受容体をｉｎ　ｖｉｖｏでターゲティングするため）、または細胞膜を横切る輸送を促進する剤（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８６：６５５３，　１９８９；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８４：６４８，　１９８７；ＰＣＴ公報第ＷＯ８８／０９８１０号を参照されたい）、あるいはハイブリダイゼーション誘発切断剤または挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）（例えばＺｏｎ，　Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．　５：５３９，　１９８８を参照されたい）などの他の付随する基を含んでもよい。アンチセンス分子は、例えば、組織または細胞派生部位への直接注入によって、ｉｎ　ｖｉｖｏで、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチド配列を有する転写物を発現する細胞に搬送するか、あるいは望ましい細胞をターゲティングするよう設計した修飾アンチセンス分子（例えば標的細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス）を全身投与することが可能である。好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強いｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下に置かれる、組換えＤＮＡ構築物を利用する。
【００７９】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するよう設計されたリボザイム分子は、ＡＤＡＭ−Ｈ９　ｍＲＮＡの翻訳を妨げる（例えば、ＰＣＴ国際公報ＷＯ９０／１１３６４；米国特許第５，８２４，５１９号を参照されたい）。リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を所持するＲＮＡ分子である。リボザイムは配列特異的であるため、特定の配列を持つｍＲＮＡのみが不活性化される。リボザイムには２つの基本的な種類があり、すなわちテトラヒメナ（ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３３４：５８５，　１９８８）および「ハンマーヘッド」型である。テトラヒメナ型リボザイムは、長さ４塩基の配列を認識し、一方、「ハンマーヘッド」型リボザイムは、長さ１１−１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列がより長ければ、その配列が、標的ｍＲＮＡ種により排他的に存在するであろう可能性がより高くなる。その結果、ハンマーヘッド型リボザイムが、テトラヒメナ型リボザイムより好ましい。アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチドで構成し、そして強い恒常的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を用いて搬送可能である。
【００８０】
あるいは、標的遺伝子の制御領域（すなわち標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なＤＮＡ配列をターゲティングして、標的遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって、内因性ＡＤＡＭ−Ｈ９発現を減少させることが可能である（一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．，　６（６），　５６９，　１９９１；Ｈｅｌｅｎｅら，　Ａｎｎ．　Ｎ．Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　６６０：２７，　１９９２；およびＭａｈｅｒ，　Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４（１２），　８０７，　１９９２を参照されたい）。
【００８１】
本発明のアンチセンス、リボザイム、および三重らせん分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成のため、当該技術分野に知られるいかなる方法によって、調製することも可能であり、そしてこれらには、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから入手可能な自動化ＤＮＡ合成装置を用いた、固相ホスホロアミダイト化学合成などの、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６：３２０９，　１９８８の方法によって、合成可能である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８５：７４４８，　１９８８）の使用によって、調製可能である。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ転写によって、生成可能である。
【００８２】
内因性遺伝子発現はまた、ターゲティング相同組換えを用いて、標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化するかまたは「ノックアウト」することによって、減少させることも可能である（例えば、各々、その全体が本明細書に援用される、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，　Ｎａｔｕｒｅ　３１７：２３０，　１９８５；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，　Ｃｅｌｌ　５１，　５０３，　１９８７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，　Ｃｅｌｌ　５，　３１３，　１９８９を参照されたい）。例えば、内因性標的遺伝子に相同なＤＮＡが隣接する、突然変異体非機能標的遺伝子（または完全に関連しないＤＮＡ配列）を、選択可能マーカーおよび／または陰性選択可能マーカーを伴い、または伴わず、用いてもよい。ターゲティング相同組換えを介した、ＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化を生じる。こうしたアプローチは、胚性幹細胞への修飾を用いて、不活性な標的遺伝子を持つ非ヒト動物子孫を生成することが可能な場合に特に適している（例えばＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、並びにＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９８９、上記を参照されたい；またＧｒｉｓｈｏｋら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７（５４６２）：２４９４，　２０００およびＤｅｒｎｂｕｒｇら，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１４（１３）：１５７８，　２０００の「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）技術も参照されたい）。
【００８３】
本明細書において、「トランスジェニック動物」は、胚性細胞に挿入され、そしてその細胞から発生する動物のゲノムの一部となる導入遺伝子を含む動物、またはこうした動物の子孫である。トランスジェニック技術によって産生可能ないかなる非ヒト動物も、本発明に含まれるが、哺乳動物が好ましい。好ましい哺乳動物には、非ヒト霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、並びにモルモット、ハムスター、ラット、アレチネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）およびマウスなどのげっ歯類が含まれる。
【００８４】
「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物において発現しようとする、１以上の選択される配列（例えばＡＤＡＭ−Ｈ９　ｍＲＮＡを切断するリボザイムをコードするもの、ＡＤＡＭ−Ｈ９　ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子をコードするもの、突然変異体ＡＤＡＭ−Ｈ９配列をコードするもの等）を含んでなるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物に部分的にまたは完全に異種性、すなわち異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）であるか、あるいはトランスジェニック動物の内因性遺伝子に同種であるが、天然遺伝子のものとは異なる位置で、動物ゲノムに挿入されるよう設計されている。導入遺伝子は、選択されるＤＮＡにすべて機能可能であるように連結した、１以上のプロモーター、および選択されるＤＮＡの発現に必要な、イントロンなどの他のＤＮＡ配列いずれかを含むことが可能であり、そしてエンハンサー配列を含むことが可能である。
【００８５】
トランスジェニック動物は、特定の経路または表現型に対する増加したまたは減少したＡＤＡＭ−Ｈ９レベルの影響を同定するために、使用可能である。こうしたトランスジェニック動物を産生するのに有用なプロトコルが当該技術分野に知られる（例えばＢｒｉｎｓｔｅｒら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：４４３８，　１９８５；Ｊａｅｎｉｓｃｈ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７３：１２６０，　１９７６；Ｈｏｇａｎら，　１９８６，　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ｊａｈｎｅｒら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：６９２７，　１９８５；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：６１４８；Ｓｔｅｗａｒｄら，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　６：３８３，　１９８７；Ｊａｈｎｅｒら，　Ｎａｔｕｒｅ，　２９８：６２３，　１９８２を参照されたい）。
【００８６】
別の態様において、本発明のポリペプチドと免疫反応性である抗体を本明細書に提供する。上述のようなＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド等を、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。こうした抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、ポリペプチドに特異的に結合する。特異的結合抗体は、ＡＤＡＭ−Ｈ９ファミリーポリペプチド、相同体、および変異体を特異的に認識し、そしてこれらと結合するが、他の分子とは結合しないであろうものである。１つの好ましい態様において、抗体は、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９アミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的であり、そして他のポリペプチドと交差反応しない。
【００８７】
より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド等は、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含有する。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもまたは高次構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは、該ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分で構成されるが、高次構造的または断続的エピトープは、ポリペプチドフォールディングに際して、ごく近接するポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分で構成される。エピトープは、当該技術分野に知られる方法のいずれによって同定することも可能である。さらに、本発明のポリペプチド由来のエピトープは、アッセイにおいて研究試薬として、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマの上清などの物質から、特異的に結合する抗体を精製するために、使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学または酵素的切断、あるいは組換えＤＮＡ技術の使用など、当該技術分野に知られる技術を用いて、産生することが可能である。
【００８８】
本発明のポリペプチドに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術によって調製可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ，　Ｋｅｎｎｅｔら（監修），　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（米国特許第４，３７６，１１０号）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２，　１９８３；Ｃｏｌｅら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８０：２０２６，　１９８３）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，　１９８５，　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，　Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ．　Ｉｎｃ．，　ｐｐ．７７−９６）を参照されたい。本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。抗体産生のため、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片、変異体、または突然変異体を注射することによって、多様な宿主動物を免疫することが可能である。こうした宿主細胞には、限定されるわけではないが、いくつかのみを挙げると、ウサギ、マウス、およびラットが含まれることが可能である。多様なアジュバントを用いて、免疫学的反応を増加させることが可能である。宿主種に応じて、こうしたアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）および坐瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。こうしたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであってもよい。
【００８９】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｔａｋｅｄａら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３１４：４５２，　１９８５）を用いることが可能である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、ブタｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである。本発明のモノクローナル抗体にはまた、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型も含まれる。こうしたヒト化抗体は、既知の技術によって調製可能であり、そして該抗体をヒトに投与するとき、免疫原性の減少という利点を提供する。例えば、１以上のヒト免疫グロブリン鎖をコードする遺伝子材料が導入されているトランスジェニックマウスを使用することが可能である。こうしたマウスは、多様な方法で、遺伝的に改変可能である。遺伝子操作の結果、免疫の際、ヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖が、動物に産生される少なくともいくつかの（好ましくは、実質的にすべての）抗体中の内因性免疫グロブリン鎖を置換することが可能である。キメラおよびさらなる操作モノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ，　３３２：３２３，　１９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ，　８４：３４３９，　１９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　７：９３４，　１９８９）、並びにＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ，　１４：１３９，　Ｃａｎ，　１９９３）に記載されるものが含まれる。トランスジェニック的に抗体を生成する方法は、ＧＢ　２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号、並びにそれらから優先権を主張する関連特許に見出すことが可能であり、該特許はすべて本明細書に援用される。好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒトであるかまたはヒト化されており；こうしたヒト抗体を生成する技術もまた知られる。ヒト抗体を作成するためのトランスジェニック動物が、例えばＭｅｄａｒｅｘ　Ｉｎｃ（ニュージャージー州プリンストン）およびＡｂｇｅｎｎｉｘ　Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ファーモント）から入手可能である。
【００９０】
細菌宿主におけるヒト化免疫グロブリン配列の発現を用いて、ＣＤＲ領域に突然変異誘発し、そしてＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはその断片に高親和性および／または高特異性結合を所持する、ヒト化免疫グロブリンＣＤＲ変異体に関してスクリーニング可能なバクテリオファージディスプレーライブラリーを産生することによって、より高い親和性のヒト化免疫グロブリン配列を選択することが可能である。こうした親和性強化の１つの潜在的な利点は、改善された結合親和性および／またはＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはその断片以外の分子との減少した交差反応性を有する、ヒト化免疫グロブリンＣＤＲ変異体の生成である。免疫グロブリン可変領域配列を有するファージディスプレーライブラリーを産生する方法は、当該技術分野に提供される（例えばＣｅｓａｒｅｎｉ，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　３０７：６６，　１９９２；Ｓｗｉｍｍｅｒら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９：３７５６，　１９９２；Ｇｒａｍら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９：３５７６，　１９９２；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，　Ｎａｔｕｒｅ　３５２：６２４，　１９９１；Ｓｃｏｔｔ　＆　Ｓｍｉｔｈ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６，　１９９０；Ｇａｒｒａｒｄら，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　９：１３７３，　１９９１を参照されたい；これらはすべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）。生じた親和性強化ＣＤＲ変異体ヒト化免疫グロブリン配列は、続いて、適切な宿主で発現する。
【００９１】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって生成可能である。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが：抗体分子のペプシン消化によって産生可能なＦ（ａｂ’）２断片および（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４６：１２７５，　１９８９）、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速でそして容易な同定を可能にしてもよい。一本鎖抗体の産生に関して記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３，　１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８５：５８７９，　１９８８；およびＷａｒｄら，　Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５４４，　１９８９）を適応させ、ＡＤＡＭ−Ｈ９アミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生することもまた可能である。さらに、当業者に知られる技術を用いて、次いでＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに対する抗体を利用して、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを「模倣」し、そしてＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに結合することが可能な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能である（例えばＧｒｅｅｎｓｐａｎ　＆　Ｂｏｎａ，　ＦＡＳＥＢ　Ｊ　７（５）：４３７，　１９９３；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４７（８）：２４２９，　１９９１を参照されたい）。
【００９２】
こうした抗体を同定するスクリーニング法が知られており、そして例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴う可能性がある。抗体は、アゴニスト（すなわちリガンド模倣）特性に関してスクリーニング可能である。こうした抗体は、細胞表面上のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドへの結合に際して、天然存在ＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーが細胞表面上のポリペプチドに結合した際に誘導される生物学的影響と類似の生物学的影響（例えば生物学的シグナルの伝達）を誘導可能である。アゴニスト抗体を用いて、ＡＤＡＭ−Ｈ９が仲介する共刺激経路または細胞間コミュニケーションを誘導可能である。
【００９３】
さらに、結合パートナーへの本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９配列を有するポリペプチドの結合を遮断する抗体を用いて、ＡＤＡＭ−Ｈ９が仲介する、こうした結合から生じる細胞間コミュニケーションまたは共刺激を阻害する、および／またはＡＤＡＭ−Ｈ９のインテグリン同族体を同定することが可能である。こうした遮断抗体は、いかなる適切なアッセイ法を用いて、例えばポリペプチドに対する結合パートナー（例えばインテグリン）を発現する特定の細胞へのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによって、同定可能である。あるいは、遮断抗体は、標的細胞へのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの結合から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定可能である。１つの態様において、フローサイトメトリーインテグリンｍＡｂに基づく結合阻害アッセイを用いて、内皮細胞表面上に発現されるインテグリンへのＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドの結合を示す。ヒト内皮細胞は、こうしたアッセイに使用可能である。ヒト内皮細胞は、αｖβ３、αｖβ５、β１、β４、α１、α２、α３、α４、α５、およびα６インテグリンを発現する。ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドを内皮細胞に接触させる。ヒトインテグリンαｖβ３（ＬＭ６０９、抗ＣＤ５１／６１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ；Ｂｒｏｏｋｓら，　Ｓｃｉｎｅｃｅ　２６４：５６９，　１９９４）、α２β１（ＢＨＡ２．１、抗ＣＤ４９ｂ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｗａｎｇら，　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ　９：８６５，　１９９８）、α５β１（ＳＡＭ−１、抗ＣＤ４９ｅ、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ；Ａ．　ｔｅ　Ｖｅｌｄｅら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４０：１５４８，　１９８８）、α３β１（ＡＳＣ−６、抗ＣＤ４９ｃ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｐａｔｔａｒａｍａｌａｉら，　Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ．　Ｒｅｓ．　２２２：２８１，　１９９６）、α４β１（ＨＰ２／１、抗ＣＤ４９ｄ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、フランス・マルセイユ；第４回ヒト白血球分化抗原国際会議ワークショップ、オーストリア・ウィーン、１９８９、ワークショップ番号ｐ０９１）、α６β１（ＧｏＨ３、抗ＣＤ４９ｆ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ；第４回ヒト白血球分化抗原国際会議ワークショップ、ワークショップ番号ｐ０５５）、α６β４（４３９−９Ｂ、抗ＣＤ１０４、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ；Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎら，　１９９５　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｖ：Ｗｈｉｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ．　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　ニューヨーク）、およびαｖβ５（ＭＡＢ　１９６１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｗｅｉｎａｋｅｒら，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９：６９４０，　１９９４）に特異的なモノクローナル抗体は、ＨＭＶＥＣ−ｄに特異的に結合可能である。これらの抗体は各々、示されるインテグリンのそのリガンド（例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン）への結合を特異的に遮断することが知られる。インテグリンｍＡｂがＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドの結合を阻害する能力は、どのインテグ���ンにディスインテグリンドメインが結合するか、そして間接的に、どのインテグリン結合活性をディスインテグリンドメインがアンタゴナイズ可能であるかを明らかにする。選択されるインテグリンに結合するＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドを、インテグリン−リガンド相互作用を破壊する能力、並びに内皮細胞機能、血管形成、およびｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの他の生物学的活性を変調する能力に関して、さらに試験する。
【００９４】
このように、細胞表面結合パートナーとＡＤＡＭ−Ｈ９の相互作用によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、ＡＤＡＭ−Ｈ９結合が仲介する生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）にｉｎ　ｖｉｖｏ投与することを伴う。本明細書において、「被験者」は、いかなる動物であってもよく、好ましくは哺乳動物（例えばイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、霊長類等）であり、そして最も好ましくはヒトである。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに対する抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、またはキャリアーを含んでなる組成物を、本明細書に提供する。
【００９５】
本明細書にやはり提供するのは、抗体に付着した検出可能（例えば診断）または療法剤を含んでなるコンジュゲートである。該コンジュゲートは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ法に使用を見出す。本発明の抗体はまた、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏいずれかの、本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するアッセイにおいても使用可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【００９６】
別の態様において、合理的薬剤設計を用いて、目的の生物学的活性ポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子、例えば基質、結合剤、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト等の構造的類似体を産生する。本明細書に提供する方法を用いて、ポリペプチドの、より活性であるかまたは安定な型である剤、あるいはｉｎ　ｖｉｖｏでポリペプチドの機能を増進するかまたは該機能に干渉する剤を形作るかまたは同定することが可能である（Ｈｏｄｇｓｏｎ　Ｊ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：１９，　１９９１、本明細書に援用される）。１つのアプローチにおいて、本発明のポリペプチド、リガンドまたは結合パートナー、あるいはポリペプチド−結合パートナー複合体の三次元構造は、Ｘ線結晶学によって、核磁気共鳴によって、またはコンピューター相同性モデリングによって、あるいは最も典型的には、これらのアプローチの組み合わせによって、決定する。適切な構造情報を用いて、類似の分子を設計するか、有効な阻害剤を同定するか、または本発明のポリペプチドに結合可能である小分子を同定する。分子モデリングソフトウェア系における、ＡＤＡＭポリペプチド構造情報、好ましくはＡＤＡＭ−Ｈ９構造情報の使用は、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性を変調するのに有用な阻害剤または結合剤の設計を提供する。本発明の特定の方法は、基質またはリガンドのありうる結合部位に関して、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの三次元構造を解析し、予測される反応部位を取り込む新規分子を合成し、そして本明細書にさらに記載するように、新規分子をアッセイすることを含んでなる。タンパク質の三次元構造に基づいて、基質または結合剤をモデリングするアルゴリズム、ソフトウェア、および方法の例は、その開示が本明細書に援用される、ＰＣＴ公報ＷＯ１０７５７９Ａ２に記載される。
【００９７】
本明細書にさらに記載するような、機能アッセイによって選択される、標的特異的抗体を単離し、そしてその後、結晶構造を解析し、このようにして、続く薬剤設計の基礎とすることが可能なファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得ることもまた可能である。機能する薬理学的活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を生成することによって、ポリペプチド結晶学を完全に回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位は、元来の受容体の類似体であると予測されるであろう。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に産生したペプチドのバンクからペプチドを同定し、そして単離することが可能である。その後、単離ペプチドは、ファーマコアとして働くであろう。
【００９８】
本発明は、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性または発現を変調する剤を同定する方法を提供する。こうした方法は、試験剤およびポリペプチドまたはポリヌクレオチドが相互作用することを可能にする条件下で、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する試料を、試験剤と接触させ、そして試験剤の存在下または非存在下での、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの発現または活性を測定することを含んだ。
【００９９】
１つの態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチドを含有する細胞を、当該細胞および試験剤が相互作用することを可能にする条件下で、試験剤と接触させる。こうした条件には、典型的には、利用する特定の細胞種に相反せず、そして当該技術分野に知られる、通常の細胞培養条件が含まれる。増加した温度と関連する条件下、または細胞による試験剤の取り込みを促進する試薬の存在下で、試験剤および細胞が相互作用することを可能にするのが望ましい可能性がある。対照を、同様に、しかし試験剤の非存在下で処理する。あるいは、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性または発現は、試験剤との接触前（例えば標準または対照測定）、そしてその後、試験剤との接触後に再び測定可能してもよい。その後、処理細胞を対照に比較し、そして対照に比較したＡＤＡＭ−Ｈ９の発現または活性の相違が、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性または発現を変調する剤を示す。
【０１００】
ＡＤＡＭ−Ｈ９発現を測定する際、細胞中のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量は、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロットによって、定量化可能である。試料中のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド量の変化を測定する場合、既知の技術を用いて、抗ＡＤＡＭ−Ｈ９抗体の使用によるＡＤＡＭ−Ｈ９の検出を使用し、細胞中のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド量を定量化することが可能である。
【０１０１】
試験剤は、タンパク質活性または発現の変調に典型的に用いられるいかなる分子であってもよく、そして例えば、小分子、化学薬品、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、抗体、ペプチド、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンスまたはリボザイム分子）、などを含む。したがって、コンピューターに基づく薬剤設計によって発展された剤を、本明細書に記載するアッセイおよび方法を用いて、実験室で試験し、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性または発現の変調に対する剤の活性を決定することが可能である。ＡＤＡＭ−Ｈ９の変調には、活性または発現の増加または減少が含まれる。
【０１０２】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド（断片、変異体、オリゴマー、および他の型を含む）は、多様なアッセイで有用である。例えば、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９を用いて、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーの結合パートナーを同定することが可能であり、該結合パートナーもまた、細胞間コミュニケーション、共刺激、または免疫細胞活性を変調するのに使用可能である。あるいは、これらを用いて、細胞間コミュニケーション、共刺激経路、または免疫細胞活性を変調する非結合パートナー分子または物質を同定可能である。
【０１０３】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドおよびその断片を用いて、結合パートナーが同定可能である。例えば、これらは、慣用的結合アッセイなどの、いかなる適切なアッセイにおいても、候補結合パートナーに結合する能力に関して、試験可能である。例えば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはその断片を検出可能分子（例えば放射性核種、発色団、および比色または蛍光定量反応を触媒する酵素等）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、候補結合パートナーを発現する細胞と接触させる。その後、細胞を洗浄し、未結合標識ポリペプチドを除去し、そして標識の性質にしたがって選択した適切な技術によって、細胞結合標識の存在を決定する。
【０１０４】
１つの態様において、結合パートナーインテグリンは、抗インテグリン抗体の使用によって同定する。インテグリンｍＡｂにＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドの結合を阻害する能力があると、どのインテグリンにディスインテグリンドメインが結合するか、そして間接的に、どのインテグリン結合活性をディスインテグリンドメインがアンタゴナイズ可能であるかが明らかになる。選択されるインテグリンに結合するＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドを、インテグリン−リガンド相互作用を破壊する能力、並びに内皮細胞機能、血管形成、およびｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの他の生物学的活性を変調する能力に関して、さらに試験する。
【０１０５】
結合アッセイの別の例において、候補結合パートナーｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを、ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞にトランスフェクションする。細胞を多様な濃度の、例えば可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドと、３７℃で１時間インキュベーションする。細胞を洗浄し、そして一定の飽和濃度の１２５Ｉマウス抗ヒトＩｇＧとインキュベーションする。洗浄後、トリプシン処理を介して細胞を遊離させる。上で使用するマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そしてＪａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。該抗体は、細胞に結合しているいかなるＦｃポリペプチドのＦｃ部分にも結合するであろう。細胞結合１２５Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ　Ａｕｔｏｇａｍｍａ計測装置上で定量化する。
【０１０６】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドが、（例えば受容体−リガンド相互作用において）別のポリペプチドに結合するか、または潜在的に結合する場合、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチドはまた、相互作用トラップアッセイ（例えばＧｙｕｒｉｓら，　Ｃｅｌｌ　７５：７９１，　１９９３を参照されたい）に使用して、結合が起こる他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、または結合相互作用の阻害剤を同定することも可能である。これらの結合相互作用に関与するポリペプチドはまた、結合相互作用のペプチドまたは小分子阻害剤またはアゴニストに関して、スクリーニングするのにも使用可能である。
【０１０７】
別の種類の適切な結合アッセイは、競合的結合アッセイである。例えば、変異体の生物学的活性は、変異体が、候補結合パートナーへの結合に関して、天然ポリペプチドと競合する能力に関してアッセイすることによって、決定可能である。競合的結合アッセイは、慣用的方法論によって実行可能である。競合的結合アッセイに使用可能な試薬には、放射標識ＡＤＡＭ−Ｈ９断片または変異体、および細胞表面上にＡＤＡＭ−Ｈ９（内因性または組換え）を発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞が含まれる。損なわれていない細胞の代わりに、Ｆｃ部分とのポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ（固相上）の相互作用を通じて、固相に結合する可溶性結合パートナー／Ｆｃ融合ポリペプチドで代用可能である。ポリペプチドＡおよびＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイより入手可能なものが含まれる。
【０１０８】
細胞間コミュニケーション、共刺激、インテグリン結合、内皮細胞遊走、血管形成または免疫細胞活性に対する、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、ＡＤＡＭ−Ｈ９断片および抗体の影響は、細胞コミュニケーション、共刺激、インテグリン結合、内皮細胞遊走、血管形成または標的細胞における活性を誘導するか、増進するか、抑制するか、または抑止する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストと、細胞または細胞群を接触させることによって、アッセイ可能である。ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストの同定は、当業者に知られる多様なアッセイを介して行うことが可能である。こうしたアッセイに含まれるのは、細胞間コミュニケーション、共刺激、インテグリン結合、内皮細胞遊走、または血管形成に影響を与えるＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの能力を評価するものである。こうしたアッセイは、例えば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはその可溶性ディスインテグリン断片の存在下での、細胞−細胞相互作用（例えばインテグリン関連結合を通じたもの）の解析を伴うであろう。こうしたアッセイにおいて、ＡＤＡＭ−Ｈ９配列を有するポリペプチドの存在下で、細胞−細胞相互作用、細胞マトリックス相互作用、またはインテグリン関連結合の率を決定し、そしてその後、こうした結合または相互作用が、例えば可溶性ディスインテグリンＡＤＡＭ−Ｈ９（ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ）配列の存在下で、改変されるかどうかを決定するであろう。本発明のこの側面のための典型的なアッセイには、内皮細胞遊走アッセイが含まれる。他のアッセイが当該技術分野に知られる。
【０１０９】
別の側面において、本発明は、試験剤が、細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、あるいは細胞または培養に対する、試験剤の血管形成活性に影響を及ぼす能力を検出する方法を提供する。この側面において、方法は：（１）ＡＤＡＭ−Ｈ９配列（例えば、配列番号１、３、４、６、８、または１０；あるいは可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリン部分）を有するポリペプチド、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドのリガンドまたは受容体、あるいはその断片を含めて、試験剤と第一の群の標的細胞を、用いる特定のアッセイに適した条件下で接触させ；（２）標的細胞間の細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、または血管形成活性の正味割合（ｎｅｔ　ｒａｔｅ）を測定し；そして（３）試験剤の非存在下で、それ以外は第一の群の細胞と同一の条件下で、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、そのリガンドまたは断片を含有する、対照細胞間の細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、または血管形成活性の正味割合を観察することを含んでなる。この態様において、対照細胞における細胞間コミュニケーションまたは共刺激の正味割合を、ＡＤＡＭ−Ｈ９分子と共に試験剤でも処理した細胞のものと比較する。比較によって、細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、または血管形成活性の正味割合の相違が提供されるだろうし、これは、剤がＡＤＡＭ−Ｈ９活性を変調することを示すであろう。試験剤は、細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、または血管形成活性を活性化するかまたは上方制御することによって、あるいは阻害するかまたは下方制御することによって、エフェクターとして機能することが可能である。
【０１１０】
本発明のポリペプチドは、サイトカイン産生または阻害活性、細胞増殖（誘導または阻害いずれか）、または細胞分化（誘導または阻害いずれか）活性を示す可能性がある。現在までに発見された多くのポリペプチド因子は、すべての既知のサイトカインを含め、１以上の細胞増殖アッセイにおいて活性を示してきており、そしてしたがって、該アッセイは、サイトカイン活性の好適な確認として働く。本発明のポリペプチドの活性は、限定なしに、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（プレＢ　Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを含む細胞株に関するいくつかの日常的な因子依存細胞増殖アッセイのいずれか１つによって立証される。本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド活性は、以下の方法によって測定可能である：
Ｔ細胞または胸腺細胞増殖に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｃｏｌｉｇａｎら監修，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（第３章，　マウスリンパ球機能に関するｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ　３．１−３．１９；第７章，　ヒトにおける免疫学的研究）；Ｔａｋａｉら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１３７：３４９４，　１９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４５：１７０６，　１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，　Ｃｅｌｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１３３：３２７，　１９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４９：３７７８，　１９９２；Ｂｏｗｍａｎら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５２：１７５６，　１９９４に記載されるものが含まれる。
【０１１１】
サイトカイン産生および／または脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞の増殖に関するアッセイには、限定なしに：Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，　Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，　Ａ．Ｍ．およびＳｈｅｖａｃｈ，　Ｖｏｌ．１　ｐｐ．３．１２．１−３．１２．１４、並びに、マウスおよびヒト・インターフェロンγの測定，　Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，　Ｒ．Ｄ．　Ｖｏｌ　１　ｐｐ．６．８．１−６．８．８．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中．　Ｅ．Ｍ．　Ｃｏｌｉｇａｎ監修　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　トロント．　１９９４；Ｃｏｌｉｇａｎ監修，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　トロント，　１９９４に記載されるものが含まれる。
【０１１２】
造血およびリンパ球新生細胞の増殖および分化に関するアッセイには、限定なしに：ヒトおよびネズミ・インターロイキン２およびインターロイキン４の測定，　Ｂｏｔｔｏｍｌｙら，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中．　Ｃｏｌｉｇａｎ監修　Ｖｏｌ　１　ｐｐ．６．３．１−６．３．１２，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　トロント．　１９９１；ｄｅＶｒｉｅｓら，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１７３：１２０５，　１９９１；Ｍｏｒｅａｕら，　Ｎａｔｕｒｅ　３３６：６９０，　１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８０：２９３１，　１９８３；マウスおよびヒト・インターロイキン６の測定，　Ｎｏｒｄａｎ，　Ｒ．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中．　Ｃｏｌｉｇａｎ監修　Ｖｏｌ　１　ｐｐ．６．６．１−６．６．５，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　トロント．　１９９１；Ｓｍｉｔｈら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８３：１８５７，　１９８６；ヒト・インターロイキン１１の測定，　Ｂｅｎｎｅｔｔら，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中．　Ｃｏｌｉｇａｎ監修　Ｖｏｌ　１　ｐｐ．６．１５．１　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　トロント．　１９９１；マウスおよびヒト・インターロイキン９の測定，　Ｃｉａｒｌｅｔｔａら，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中．　Ｃｏｌｉｇａｎ監修　Ｖｏｌ　１　ｐｐ．６．１３．１，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　トロント．　１９９１に記載されるものが含まれる。
【０１１３】
抗原に対するＴ細胞クローン反応に関するアッセイ（とりわけ、増殖およびサイトカイン産生を測定することによる、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用に影響を与えると共にＴ細胞の影響を導くポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｃｏｌｉｇａｎ監修，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（第３章，　マウスリンパ球機能に関するｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ；第６章，　サイトカインおよびその細胞受容体；第７章，　ヒトにおける免疫学的研究）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７７：６０９１，　１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎ．　１１：４０５，　１９８１；Ｔａｋａｉら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１３７：３４９４，　１９８６；Ｔａｋａｉら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４０：５０８，　１９８８に記載されるものが含まれる。
【０１１４】
胸腺細胞または脾臓細胞傷害性に関するアッセイには、限定なしに、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｃｏｌｉｇａｎ監修，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（マウスリンパ球機能に関するｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ　ｐｐ．３．１−３．１９；第７章，　ヒトにおける免疫学的研究）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７８：２４８８，　１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１２８：１９６８，　１９８２；Ｈａｎｄａら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１３５：１５６４，　１９８５；Ｔａｋａｉら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１３７：３４９４，　１９８６；Ｔａｋａｉら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４０：５０８，　１９８８；Ｂｏｗｍａｎら，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６１：１９９２；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，　Ｃｅｌｌ．　Ｉｍｍ．　１３３：３２７，　１９９１；Ｂｒｏｗｎら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎ．　１５３：３０７９，　１９９４に記載されるものが含まれる。
【０１１５】
Ｔ細胞依存ＩｇＧ反応およびアイソタイプスイッチングに関するアッセイ（とりわけ、Ｔ細胞依存抗体反応を変調するポリペプチドおよびＴｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響を与えるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４４：３０２８，　１９９０；および、Ｂ細胞機能に関するアッセイ：Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗体産生，　Ｍｏｎｄ，　Ｊ．Ｊ．およびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，　Ｍ．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中．　Ｃｏｌｉｇａｎ監修　Ｖｏｌ　１　ｐｐ．３．８．１−３．８．１６，　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　トロント．　１９９４に記載されるものが含まれる。
【０１１６】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（とりわけ、主にＴｈ１およびＣＴＬ反応を生じるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｃｏｌｉｇａｎ監修，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（マウスリンパ球機能に関するｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ　ｐｐ．３．１−３．１９；第７章，　ヒトにおける免疫学的研究）；Ｔａｋａｉら、１９８６、上記；Ｔａｋａｉら、１９８８、上記；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４９：３７７８，　１９９２に記載されるものが含まれる。
【０１１７】
樹状細胞依存アッセイ（とりわけ、未処置Ｔ細胞を活性化する樹状細胞に発現されるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｇｕｅｒｙら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１３４：５３６，　１９９５；Ｉｎａｂａら，　Ｊ．　ｏｆ　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１７３：５４９，　１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５４：５０７１，　１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら，　Ｊ．　ｏｆ　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１８２：２５５，　１９９５；Ｎａｉｒら，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６７：４０６２，　１９９３；Ｈｕａｎｇら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６４：９６１，　１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，　Ｊ．　ｏｆ　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１６９：１２５５，　１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　９４：７９７，　１９９４；およびＩｎａｂａら，　Ｊ．　ｏｆ　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１７２：６３１，　１９９０に記載されるものが含まれる。
【０１１８】
リンパ球生存／アポトーシスに関するアッセイ（とりわけ、スーパー抗原誘導後のアポトーシスを防ぐポリペプチドおよびリンパ球恒常性を制御するポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら，　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　１３：７９５，　１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　７：６５９，　１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５３：１９４５，　１９９３；Ｉｔｏｈら，　Ｃｅｌｌ　６６：２３３，　１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４５：４０３７，　１９９０；Ｚａｍａｉら，　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　１４：８９１，　１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，　Ｉｎｔ．　Ｊ．　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　１：６３９，　１９９２に記載されるものが含まれる。
【０１１９】
Ｔ細胞拘束および発生の初期段階に影響を与えるポリペプチドに関するアッセイには、限定なしに：Ａｎｔｉｃａら，　Ｂｌｏｏｄ　８４：１１１，　１９９４；Ｆｉｎｅら，　Ｃｅｌｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５５：１１１，　１９９４；Ｇａｌｙら，　Ｂｌｏｏｄ　８５：２７７０，　１９９５；Ｔｏｋｉら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８８：７５４８，　１９９１に記載されるものが含まれる。
【０１２０】
胚性幹細胞分化に関するアッセイ（とりわけ、胚性分化造血に影響を与えるポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら，　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１５：１４１，　１９９５；Ｋｅｌｌｅｒら，　Ｍｏｌ．　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１３：４７３，　１９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら，　Ｂｌｏｏｄ　８１：２９０３，　１９９３に記載されるものが含まれる。
【０１２１】
幹細胞生存および分化に関するアッセイ（とりわけ、リンパ造血を制御するポリペプチドを同定するであろうもの）には、限定なしに：メチルセルロースコロニー形成アッセイ，　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，　Ｍ．Ｇ．　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ中．　Ｒ．Ｉ．　Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修，　Ｖｏｌ　ｐｐ．２６５−２６８，　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　ニューヨーク州ニューヨーク　１９９４；Ｈｉｒａｙａｍａら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９：５９０７−５９１１，　１９９２；高増殖可能性を持つ原始的造血コロニー形成細胞，　ＭｃＮｉｅｃｅ，　Ｉ．Ｋ．およびＢｒｉｄｄｅｌｌ，　Ｒ．Ａ．　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ中．　Ｒ．Ｉ．　Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修　Ｖｏｌ　ｐｐ．２３−３９，　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　ニューヨーク州ニューヨーク　１９９４；Ｎｅｂｅｎら，　Ｅｘｐ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．　２２：３５３，　１９９４；丸石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）領域形成細胞アッセイ，　Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ中．　Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修　Ｖｏｌ　ｐｐ．１−２１，　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　ニューヨーク州ニューヨーク　１９９４；間質細胞の存在下での長期骨髄培養，　Ｓｐｏｏｎｃｅｒら，　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ中．　Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修　Ｖｏｌ　ｐｐ．１６３−１７９，　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　ニューヨーク州ニューヨーク　１９９４；長期培養開始細胞アッセイ，　Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ中．　Ｆｒｅｓｈｎｅｙら監修．　Ｖｏｌ　ｐｐ．１３９−１６２，　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　ニューヨーク州ニューヨーク　１９９４に記載されるものが含まれる。
【０１２２】
組織生成活性に関するアッセイには、限定なしに：特許公報第ＷＯ９５／１６０３５号（骨、軟骨、腱）；特許公報第ＷＯ９５／０５８４６号（神経、ニューロン性）；特許公報第ＷＯ９１／０７４９１号（皮膚、内皮）に記載されるものが含まれる。創傷治癒活性に関するアッセイには、限定なしに：ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅｒｔｚ，　Ｊ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｄｅｒｍａｔｏｌ　７１：３８２−８４（１９７８）に修飾されるような、Ｗｉｎｔｅｒ，　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ，　ｐｐ．７１−１１２（ＭａｉｂａｃｈおよびＲｏｖｅｅ監修），　Ｙｅａｒ　Ｂｏｏｋ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｉｎｃ．，　シカゴに記載されるものが含まれる。
【０１２３】
アクチビン／インヒビン活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｖａｌｅら，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　９１：５６２，　１９７２；Ｌｉｎｇら，　Ｎａｔｕｒｅ　３２１：７７９，　１９８６；Ｖａｌｅら，　Ｎａｔｕｒｅ　３２１：７７６，　１９８６；Ｍａｓｏｎら，　Ｎａｔｕｒｅ　３１８：６５９，　１９８５；Ｆｏｒａｇｅら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８３：３０９１，　１９８６に記載されるものが含まれる。
【０１２４】
細胞運動および接着に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｃｏｌｉｇａｎ監修，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（第６．１２章，　αおよびβケモカイン類の測定　６．１２．１−６．１２．２８）；Ｔａｕｂら　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　９５：１３７０−１３７６，　１９９５；Ｌｉｎｄら　ＡＰＭＩＳ　１０３：１４０，　１９９５；Ｍｕｌｌｅｒら　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２５：１７４４；Ｇｒｕｂｅｒら　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５２：５８６０，　１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５３：１７６２，　１９９４に記載されるものが含まれる。
【０１２５】
止血および血栓溶解活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｌｉｎｅｔら，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　２６：１３１，　１９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら，　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ．　４５：４１３，　１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら，　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　５：７１，　１９９１；Ｓｃｈａｕｂ，　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　３５：４６７，　１９８８に記載されるものが含まれる。
【０１２６】
受容体−リガンド活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｃｏｌｉｇａｎ監修，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊行（第７．２８章，　静的条件下での、細胞接着の測定　７．２８．１−７．２８．２２）、Ｔａｋａｉら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４：６８６４，　１９８７；Ｂｉｅｒｅｒら，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１６８：１１４５，　１９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１６９：１４９，　１９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１７５：５９，　１９９４；Ｓｔｉｔｔら，　Ｃｅｌｌ　８０：６６１，　１９９５に記載されるものが含まれる。
【０１２７】
カドヘリン接着および侵襲性抑制因子活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｈｏｒｔｓｃｈら　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７０（３２）：１８８０９，　１９９５；Ｍｉｙａｋｉら　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１１：２５４７，　１９９５；Ｏｚａｗａら　Ｃｅｌｌ　６３：１０３３，　１９９０に記載されるものが含まれる。
【０１２８】
本発明が提供するＡＤＡＭ−Ｈ９配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多くの診断または他の有用な目的に使用可能である。本発明のポリヌクレオチド（例えば配列番号２、５、７、または９）は、対応するポリペプチドを優先的に発現する組織のマーカーとして、サザンゲル上の分子量マーカーとして、染色体を同定するかまたは関連する遺伝子位をマッピングするための染色体マーカーまたはタグとして、潜在的な遺伝子障害を同定するために被験者における内因性ＤＮＡ配列と比較するために、ハイブリダイズしそしてしたがって新規関連ポリヌクレオチドを発見するためのプローブとして、遺伝子フィンガープリンティングのためのＰＣＲプライマーを導くための情報供給源として、他の新規核酸を発見する過程において、既知のポリヌクレオチドを「取り去る（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」ためのプローブとして、抗ＤＮＡ抗体を作成するかまたは別の免疫反応を誘発するための抗原として、そして遺伝子療法のために使用可能である。
【０１２９】
プローブおよびプライマー。開示するＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチドおよびその断片の組み合わせの使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用がある。こうした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドを含んでなる。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６０の隣接するヌクレオチドを含んでなる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に示され、そして上に詳細に記載している。遺伝暗号の知識を、上に示すアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製することが可能である。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ断片を単離しそして増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用である。特定の態様において、非ヒト遺伝子ライブラリー用のプローブとして、縮重プライマーを使用することが可能である。こうしたライブラリーには、限定されるわけではないが、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、およびエレクトロニックＥＳＴ（発現配列タグ）またはＤＮＡライブラリーさえ含まれるであろう。その後、この方法で同定された相同配列をプローブとして用いて、本明細書に同定するＡＤＡＭ−Ｈ９配列の非ヒト相同体を同定するであろう。
【０１３０】
染色体マッピング。当業者は、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチドの開示する断片および組み合わせを用いて、既知の技術を用い、これらの配列がマッピングするヒト染色体を同定することが可能である。有用な技術には、限定されるわけではないが、放射ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｈｙｂｒｉｄ）マッピング（高解像度）、染色体伸展（ｓｐｒｅａｄ）に対するｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の解像度）、および個々のヒト染色体を含有するハイブリッド細胞株に対するサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像度）などの、多様な公知の技術におけるプローブとして、オリゴヌクレオチドを含む配列または部分を使用することが含まれる。以下のウェブサイトは、放射ハイブリッドマッピングに関するさらなる情報を提供する：ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ。
【０１３１】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドの開示する断片および組み合わせを用いて、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに対応する遺伝子と関連する異常（ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）を解析することが可能である。これによって、このマーカーが再配置されているかまたは欠失している状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を識別することが可能になる。さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはその断片は、未知の位置の他の遺伝子をマッピングする、位置マーカーとして使用可能である。本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の不全または不十分な量により（直接または間接的に）仲介されるいかなる障害（例えばＡＤＡＭ−Ｈ９関連障害）に対する治療を開発するのにも、該ポリヌクレオチドは使用可能である。本明細書に開示するポリヌクレオチド配列および関連配列によって、不全遺伝子の検出、および正常遺伝子でのその交換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示するポリヌクレオチド配列と、この遺伝子に不全を宿するか、またはＡＤＡＭ−Ｈ９関連障害を有すると疑われる被験者由来の遺伝子のものとを比較することによって、検出可能である。
【０１３２】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドおよびそのペプチド断片の使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：搬送剤；療法および研究試薬；分子量および等電点電気泳動マーカー；ペプチド断片化の対照；未知のポリペプチドの同定；および抗体の調製。
【０１３３】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド（例えば配列番号１、３、４、６、８、または１０）は、ポリペプチド精製試薬として使用可能である。例えば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを固体支持体素材に付着させ、そしてアフィニティークロマトグラフィーによってその結合パートナー（例えばインテグリン分子）を精製するのに使用可能である。特定の態様において、ポリペプチドは、慣用的方法によって固体支持体に付着させる。１つの例として、ポリペプチドのアミノ酸側鎖と反応するであろう官能基を含有する、クロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。あるいは、ＡＤＡＭ−Ｈ９−Ｆｃポリペプチドを、Ｆｃ部分との相互作用を通じて、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ含有クロマトグラフィーカラムに付着させる。該ポリペプチドはまた、細胞表面上に結合パートナーを発現する細胞を精製するかまたは同定するのにも使用を見出す。ポリペプチドを、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の適切な支持体などの固相に結合させる。例えば、磁気微小球体をポリペプチドでコーティングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器中に保持してもよい。結合パートナー発現細胞を含有する細胞混合物の懸濁物を、ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。細胞表面上に結合パートナーを発現する細胞が固相上のポリペプチドに結合し、そしてその後、未結合細胞を洗い流す。あるいは、検出可能な部分にポリペプチドをコンジュゲート化し、その後、結合パートナー発現に関して試験しようとする細胞とインキュベーションしてもよい。インキュベーション後、未結合標識物質を除去し、そして細胞上の検出可能部分の存在または非存在を測定する。
【０１３４】
キャリアーおよび搬送剤。該ポリペプチドはまた、付着する剤を、同定された結合パートナー（例えばインテグリン）を発現している細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。したがって、該ポリペプチドは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこうした細胞に搬送するのに使用可能である。ポリペプチドに付着させてもよい検出可能な剤（診断用剤）および療法剤には、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞傷害性剤、薬剤、放射性核種、発色団、比色または蛍光定量反応を触媒する酵素等が、意図する適用にしたがって選択される特定の剤と共に含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化ポリペプチド、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒがある。療法使用に適した放射性核種の例は、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕである。こうした剤は、いかなる適切な慣用法によって、ポリペプチドに付着させてもよい。ポリペプチドは、例えば、望ましい剤上の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含んでなる。あるいは、ポリペプチドまたは剤を誘導体化し、望ましい反応性官能基を生成するか、または付着させてもよい。誘導体化には、多様な分子をポリペプチドに付着させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの付着を伴ってもよい。特に興味深いのは、ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリン部分の結合パートナー（例えばインテグリン）を発現する細胞をターゲティングするのに使用可能な、可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンである。こうした可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンは、例えばディスインテグリンの同族体、インテグリンを発現する細胞に、試薬をターゲティングするのに使用可能である。同様に、そして以下により詳細に記載するように、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに特異的な抗体は、診断用剤または療法剤で標識し、そしてＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを発現する細胞に、該診断用剤または療法剤をターゲティングするのに使用可能である。
【０１３５】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドおよびＡＤＡＭ−Ｈ９断片（例えばディスインテグリン活性を有する断片）は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ法において、ＡＤＡＭポリペプチド、特にＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの生物学的活性を変調するのに使用可能である。本発明に含まれるのは、断片として、または融合ポリペプチドの構成要素として発現した際、天然ＡＤＡＭ−Ｈ９活性を含む天然ＡＤＡＭポリペプチド機能の変調因子として作用する、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドドメインである。例えば、本発明の実質的に精製したポリペプチドドメインを用いて、内因性結合パートナーへのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの結合を阻害することが可能である。こうした使用は、効率的に、ＡＤＡＭ−Ｈ９相互作用を遮断し、そしてＡＤＡＭ−Ｈ９活性を阻害するであろう。本発明のさらに別の側面において、ＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーの可溶性型（例えば可溶性インテグリンドメイン）を用いて、内因性ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに結合させ、そして該ポリペプチドの活性化を競合的に阻害する。
【０１３６】
別の態様において、本発明は、そのリガンドへのインテグリンの結合を阻害し、そしてそれによって、インテグリンの生物学的活性を阻害する方法であって、有効量のＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓポリペプチドとインテグリンを接触させることを含んでなる前記方法に関する。本発明はさらに、内皮細胞遊走を阻害する方法および血管形成を阻害する方法であって、有効量のＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓポリペプチドを投与することを含んでなる前記方法に関する。いくつかの態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓポリペプチドは、多量体型、好ましくはロイシンジッパー多量体またはＦｃポリペプチドの形である。あるいは、実質的に精製したかまたは修飾した本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを投与して、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドおよび膜結合でないＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーの間の相互作用を変調することが可能である。
【０１３７】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに結合する抗体は、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド活性を阻害可能であり、そしてアンタゴニストとして働く可能性がある。例えば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの１以上のエピトープ、またはＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの保存された変異体のエピトープ、あるいは断片に特異的に結合する抗体を用いて、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性を阻害することが可能である。「特異的に結合する」によって、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはその断片に対する抗体が、関連しないポリペプチドと交差反応しないであろうことを意味する。好ましくは、こうした抗体は、ＡＤＡＭファミリーの他のメンバーと交差反応しないであろう。
【０１３８】
別の側面において、本発明はさらに、ディスインテグリン活性の増加が有益である疾患の症状を治療するかまたは寛解するための、ＡＤＡＭ−Ｈ９活性のアゴニストの使用を含む。好ましい側面において、本発明は、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチド（例えば配列番号２、５、７、または９を含んでなる）またはその断片、あるいはＡＤＡＭ−Ｈ９アミノ酸配列（例えば配列番号１、３、４、６、８、または１０）またはその断片を含んでなるポリペプチドを含んでなる組成物を投与することを伴う。投与は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの細胞に、ｅｘ　ｖｉｖｏの細胞に、ｉｎ　ｖｉｖｏの細胞に、および／または多細胞生物にであってもよい。好ましい療法型には、ディスインテグリン活性を有するＡＤＡＭ−Ｈ９の可溶性型が含まれる。こうした可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンは、その結合パートナー（例えばインテグリン）に結合し、そして結合パートナーに関連する生物学的活性を刺激するであろう。
【０１３９】
本発明のさらに別の側面において、組成物は、疾患の治療のため、宿主生物において発現させるＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを含んでなる。これに関連して特に好ましいのは、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの異常な（例えば減少した）内因性活性に関連する機能障害を治療するためのヒト被験者における発現である。さらに、本発明は、ＡＤＡＭ−Ｈ９アミノ酸配列を有するポリペプチドの内因性活性を増加させることが見出された化合物の、細胞および／または生物への投与を含む。ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド活性を増加させる化合物の一例は、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに結合し、そして恒常的細胞内シグナル伝達（または「リガンド模倣」）を引き起こすことによって、またはＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド活性の天然阻害剤の結合を妨げることによって、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド活性を増加させるかまたは刺激する抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１４０】
生物学的経路および相互作用の多重度および相互接続性のため、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、変異体、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、および結合パートナーは、本明細書にさらに記載するように、細胞−細胞および細胞マトリックス相互作用に関連する医学的状態および疾患（例えばインテグリン仲介障害）、内皮遊走、血管形成、炎症、癌、アレルギー、生殖、神経および血管状態を治療するのに有用でありうる。用いる単数または複数の療法分子は、治療しようとする異常の原因および関与する生物学的経路に応じるであろうし、そしてＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの異なる変異体、アンタゴニスト、および結合パートナーが、類似のまたは異なる影響を有する可能性があるとみなされるであろう。例えば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドまたはその断片は、ＡＤＡＭ結合パートナーと相互作用し、そしてその基質に対するメタロプロテイナーゼの活性を妨げることによって、（例えばポリペプチドのＡＤＡＭファミリーの他のメンバー由来の）メタロプロテイナーゼのタンパク質プロセシング機能のアンタゴニストとして作用することが可能である。したがって、ＡＤＡＭ−Ｈ９は、増殖因子、接着タンパク質、および炎症因子の放出などのタンパク質プロセシングを変調する可能性がある。
【０１４１】
本明細書に記載する、開示したＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片、抗体、組成物および併用療法は、細菌、ウイルスまたは原生動物感染、およびそれらから生じる合併症を治療する医薬品において、有用である。大動脈瘤；動脈炎；血管閉塞；冠動脈バイパス手術の合併症；虚血／再灌流傷害；心疾患；心不全；および心筋梗塞を含む心臓血管障害が、開示するＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片、抗体、薬剤組成物または併用療法で治療可能である。さらに、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片、抗体、組成物および併用療法を用いて、慢性痛覚状態を治療し、内分泌系の多様な障害、胃腸系の状態、泌尿生殖系の障害、並びに貧血および血液学的障害を治療することが可能である。
【０１４２】
インテグリン（例えばαｖβ３、αｖβ５、β１、β４、α１、α２、α３、α４、α５、およびα６インテグリン）が、癌および癌細胞転移を含む、細胞増殖障害において役割を果たすため、本明細書にやはり提供するのは、多様な血液学的および腫瘍学的障害を治療するための、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片（特にＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓドメインを含んでなるもの、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃオリゴマー）、抗体、組成物または併用療法を使用する方法である。例えば、可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインを用いて、インテグリン関連相互作用を変調することにより、癌関連悪液質、疲労、無力症、悪液質の腫瘍随伴症候群、および高カルシウム血症を含む、急性骨髄性白血病、エプスタイン−バーウイルス陽性鼻咽頭癌腫、神経膠腫、結腸、胃、前立腺、腎細胞、頚および卵巣癌、肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）を含む癌の多様な型を治療することが可能である。
【０１４３】
本発明のポリペプチド、断片、抗体、組成物または併用療法で治療可能なさらなる疾患は、肉腫、骨肉種、並びに腺癌（例えば乳癌）および扁平上皮癌などの癌腫を含む、充実性腫瘍（ｓｏｌｉｄ　ｔｕｍｏｒ）である。可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメインを投与すると、こうした腫瘍細胞の細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用を変調する、および／または血管形成およびこうした腫瘍への血液供給を変調することが可能である。
【０１４４】
さらに、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片、組成物または併用療法は、急性骨髄性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病および毛様細胞性白血病を含む白血病を治療するのに有用である。ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、組成物および併用療法で治療可能な侵襲性転移可能性を持つ他の悪性腫瘍には、多発性骨髄腫、自己免疫リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）などの多様なリンパ球増殖性障害、慢性リンパ芽球性白血病、毛様細胞性白血病、慢性リンパ性白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エプスタイン−バーウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、細網リンパ腫、ホジキン病、びまん性急速進行型リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔガンマリンパ球増殖性疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち菌状息肉腫）、およびセザリー症候群が含まれる。
【０１４５】
少なくとも１つのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片、または抗体、および１以上のさらなる抗血管形成因子または他の療法剤（類）の組み合わせを被験者に投与することが可能である。さらなる療法剤（類）は、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片（特にＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓドメインを含んでなるもの、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃオリゴマー）、または抗体の投与前、投与と同時、または投与後に投与してもよい。１より多い療法剤の使用は、治療している被験者が固形腫瘍を有する際に、特に好適である。本発明のいくつかの態様において、治療はさらに、哺乳動物を放射線で治療することを含んでなる。放射線は、近接照射療法および遠隔療法を含め、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーおよび／またはさらなる療法剤（類）の投与前、投与と同時、または投与後に投与してもよい。
【０１４６】
いくつかの態様において、該方法には、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片（特にＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓドメインを含んでなるもの、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃオリゴマー）、または抗体に加え、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ビンカアルカロイドおよび他の植物由来化学療法剤、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、白金類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモンおよび抗ホルモン剤、抗体、免疫療法剤、放射療法剤、並びに生物学的反応修飾剤からなる群より選択される、１以上の療法剤の投与が含まれる。
【０１４７】
いくつかの態様において、該方法には、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片（特にＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓドメインを含んでなるもの、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃオリゴマー）、または抗体に加え、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、並びにビンブラスチン、インターロイキン類、インターフェロン類（α、β、またはδ）およびＴＮＦなどのリンホカイン類およびサイトカイン類、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、フルオキシメステロン、ＩＬ−８阻害剤、アンジオスタチン、エンドスタチン、クリングル５、アンジオポエチン−２または他のアンジオポエチン−１のアンタゴニスト、血小板活性化因子のアンタゴニスト、塩基性線維芽細胞増殖因子のアンタゴニスト、並びにＣＯＸ−２阻害剤からなる群より選択される１以上の療法剤の投与が含まれる。
【０１４８】
いくつかの態様において、該方法には、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片（特にＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓドメインを含んでなるもの、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃオリゴマー）、または抗体に加え、Ｆｌｔ３リガンド（米国特許第５，５５４，５１２号を参照されたい）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第５，７１６，８０５号を参照されたい）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンド（米国特許第５，６７４，７０４号を参照されたい）、抗４−１ＢＢ抗体、ＴＲＡＩＬ（米国特許第５，７６３，２２３号を参照されたい）、ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＮＦＲ／Ｆｃを含むＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）アンタゴニスト、Ｔｅｋアンタゴニスト（ＰＣＴ公報第ＷＯ００／７５３２３号、２０００年１２月１４日を参照されたい）、ＴＷＥＡＫアンタゴニストおよびＴＷＥＡＫ−Ｒ／Ｆｃを含むＴＷＥＡＫ−Ｒ（ＵＳ第６０／１７２，８７８号および第６０／２０３，３４７号、並びにＦｅｎｇら，　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　１５６（４）：１２５３を参照されたい）アンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体を含むＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２を含む、Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１またはＫＤＲとしても知られる）アンタゴニスト、ＣＤ１４８（ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰ、およびＰＴＰＲＪとも呼ばれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｓｏｃ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１０：２１３５−４５，　１９９９；およびＰＣＴ公報第ＷＯ　００／１５２５８号、２０００年３月２３日を参照されたい）結合タンパク質、並びにネクチン−３（Ｓａｔｏｈ−Ｈｏｒｉｋａｗａら，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５（１４）：１０２９１，　２０００を参照されたい；ヒト・ネクチン−３核酸およびポリペプチド配列のＧｅｎｂａｎｋ寄託番号は、それぞれＡＦ２８２８７４およびＡＡＦ９７５９７である）アンタゴニストからなる群より選択される、可溶性型を含む、１以上の療法ポリペプチドの投与が含まれる。
【０１４９】
いくつかの好ましい態様において、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、その断片（特にＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓドメインを含んでなるもの、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃオリゴマー）、または抗体は、ＢｒｏｗｄｅｒらおよびＫｌｅｍｅｎｔら（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６０：１８７８，　２０００；Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１０５（８）：Ｒ１５，　２０００；Ｂａｒｉｎａｇａ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８８：２４５，　２０００も参照されたい）に記載されるものなどの「メトロノーム療法」の構成要素として、または該療法と組み合わせて用いる。
【０１５０】
本発明は、医学的障害、そして特にＡＤＡＭ−Ｈ９関連障害を患う被験者、好ましくは哺乳動物被験者、そして最も好ましくはヒト被験者を治療するための化合物、組成物、および方法を提供する。こうしたＡＤＡＭ−Ｈ９関連障害には、ＡＤＡＭ−Ｈ９配列（例えば配列番号１、３、４、６、８、または１０）を有するポリペプチドおよびその結合パートナー（例えばインテグリン）間の結合によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される状態が含まれる。本開示の目的のため、用語「疾病」、「疾患」、「障害」、「医学的状態」、「異常な状態」等は、用語「医学的障害」と交換可能に用いられる。用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、本明細書において、治癒的、防御的（例えば予防的）および対症的または寛解的治療が含まれる。こうした療法的使用のため、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドおよび断片、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドをコードするＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチド、および／または抗体などのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、既知の手段を通じて、その必要がある被験者に投与することが可能である。本発明の組成物は、天然ポリペプチド、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的活性断片などの、本明細書に記載するいかなる型のポリペプチドを含有してもよい。特定の態様において、組成物は、可溶性ポリペプチドまたは可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド（例えば可溶性ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリンドメイン）を含んでなるオリゴマーを含んでなる。
【０１５１】
本発明の治療法または使用法を実施する際、本発明の療法剤の療法的有効量を、好ましくはＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの活性に関連する疾患を治療するかまたは寛解するため、治療しようとする状態を有する被験者に投与する。「療法剤」には、限定なしに、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、および変異体；ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、断片、および変異体；抗体などのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド結合パートナー；ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、変異体、および結合パートナーで形成される複合体などのいずれかが含まれる。本明細書において、用語「療法的有効量」は、意味がある目的の利益、例えば相当する医学的状態の治療、治癒、予防または寛解、あるいはこうした状態の治療、治癒、予防または寛解率の増加を示すのに十分な薬剤組成物または方法の各療法剤または他の活性構成要素の総量を意味する。単独で投与する、個々の療法剤または活性成分に適用した場合、該用語は、その成分のみを指す。併用に適用した場合、該用語は、組み合わせて、連続して、または同時に投与するのであっても、療法効果を生じる成分の組み合わせた量を指す。本明細書において、句、療法剤の「療法的有効量を投与する」は、障害の重症度を反映する、少なくとも１つの指標において、改善、そして好ましくは持続した改善を誘導するのに十分な量および時間、前記療法剤で被験者を治療することを意味する。改善は、被験者が、１週間以上離れた、少なくとも２回の機会に改善を示したならば、「持続した」とみなされる。改善の度合いは、徴候または症状に基づいて決定され、そして決定はまた、生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ）アンケートなどの、被験者に実施されるアンケートを使用することも可能である。被験者の疾病の度合いを反映する多様な指標は、治療の量および期間が十分であるかどうか決定するため、評価することが可能である。選択された単数または複数の指標に関するベースライン値は、療法剤の最初の用量の投与前に、被験者を検査することによって、確認する。好ましくは、ベースライン検査は、最初の用量投与の約６０日以内に行う。急性症状を治療するために療法剤が投与される場合、最初の用量は、傷害が生じた後、現実的にできるだけ速やかに、投与する。被験者が、選択された単数または複数の指標のベースラインを越える改善を明示するまで、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーなどの療法剤を投与することによって、改善を誘導する。慢性状態を治療する際、改善のこの度合いは、少なくとも１ヶ月以上、例えば、１、２、もしくは３ヶ月またはそれ以上の期間、あるいは無期限に、この医薬品を反復投与することによって、得られる。１から６週間の期間、または単回用量であっても、しばしば、急性状態を治療するのに十分である。治療後の被験者の疾病の度合いが、１以上の指標にしたがって、改善されているように見えたとしても、同一レベル、あるいは減少した用量または頻度で、無期限に治療を続けてもよい。ひとたび治療を減少させるかまたは中断したら、後に、症状が再出現した場合、元来のレベルで再開してもよい。
【０１５２】
当業者は、適切な投薬量は、治療しようとする障害の性質および重症度、被験者の体重、年齢、全身状態、および以前の疾病および／または治療、並びに投与経路などの要因に応じて、多様であろうことを認識するであろう。予備的用量は、動物試験にしたがって、決定することが可能であり、そしてヒト投与の投薬量決定は、標準的投薬量決定試験などの、当該技術分野に認められた慣例にしたがって行う。例えば、療法的有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから概算することが可能である。投薬量は、化合物の比活性に応じるであろうし、そして日常的な実験によって、容易に決定可能である。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含みつつ、毒性を最小限にする、循環血漿濃度範囲を達成するよう、処方することが可能である。こうした情報を用いて、ヒトにおいて、有用な用量を、より正確に決定することが可能である。最終的には、主治医が、個々の被験者各々を治療する、本発明のポリペプチドの量を決定するであろう。最初に、主治医は、低用量の本発明のポリペプチドを投与し、そして被験者の反応を観察するであろう。被験者にとって最適な療法効果が得られるまで、より多い用量の本発明のポリペプチドを投与することが可能であり、そしてその時点で、投薬量をさらに増加させない。本発明の方法を実施するのに用いられる、多様な薬剤組成物は、ｋｇ体重あたり、本発明のポリペプチド約０．０１ｎｇから約１００ｍｇ（好ましくは約０．１ｎｇから約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１マイクログラムから約１ｍｇ）を含有すべきであることが意図される。本発明の１つの態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを、本明細書に開示される多様な医学的障害を治療するため、週１回投与する。別の態様において、ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを、少なくとも週２回投与し、そして別の態様において、少なくとも週３回投与する。注射する場合、成人用量あたり、有効量のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーは、１−２０ｍｇ／ｍ２の範囲であり、そして好ましくは約５−１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、均一用量を投与してもよく、その量は、５−１００ｍｇ／用量の範囲であってもよい。皮下注射によって投与される均一用量の典型的な用量範囲は、５−２５ｍｇ／用量、２５−５０ｍｇ／用量および５０−１００ｍｇ／用量である。本発明の１つの態様において、以下に記載する多様な徴候を、２５ｍｇ／用量でＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを含有するか、あるいは用量あたり５０ｍｇを含有する、注射に許容しうる調製を投与することによって治療する。２５ｍｇまたは５０ｍｇ用量は、特に慢性状態に対して、反復投与することが可能である。注射以外の投与経路を用いる場合、用量は、標準的医学的慣例にしたがって、適切に調整する。多くの場合、被験者状態の改善は、少なくとも３週間の期間に渡って、週１から３回、約２５ｍｇの用量のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを、あるいは少なくとも３週間（望ましい度合いの改善を誘導するのに、より長い期間の治療が必要である可能性がある）、週１または２回、５０ｍｇの用量のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを注射することによって、得られるであろう。不治の慢性状態では、措置は、被験者の医師によって、こうしたものが必要だと思われたならば、用量および頻度に調整を行ったうえ、無期限に続けてもよい。前述の用量は、１８歳以上の年齢のヒトである、成体被験者に関する例である。小児科被験者（年齢４−１７歳）に関しては、適切な措置は、週あたり１回以上の皮下注射によって投与される、最大用量２５ｍｇまでのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーの０．４ｍｇ／ｋｇの皮下注射を伴う。ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに対する抗体を、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドアンタゴニストとして用いる場合、好ましい用量範囲は、０．１から２０ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇである。抗ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド抗体の別の好ましい用量範囲は、０．７５から７．５ｍｇ／体重ｋｇである。ヒト化抗体が好ましい。こうした抗体は、静脈内注射または投与することが可能である。
【０１５３】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド（限定なしに組換えおよび非組換え供給源を含む、いかなる供給源由来でもよいもの）の有効量を、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、または賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて含んでなる組成物を、本明細書に提供する。用語「薬学的に許容しうる」は、活性成分（類）の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性成分を意味する。投与に適した処方には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性無菌注射溶液；並びに懸濁剤または粘稠化剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁物が含まれる。ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがって、処方可能である。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の活性成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）および／またはキャリアーと混合して組み合わせてもよい。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　第１６版，　１９８０，　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　ペンシルバニア州イーストンに記載されるものが含まれる。いくつかの態様では、吸着または取り込みを補助するため、ポリペプチドがＰＥＧ化を経ることが可能である。例えば、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化しているか、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル類、デキストラン等のポリマー化合物に取り込まれているか、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていてもよい。リポソーム処方に適した脂質には、限定なしに、モノグリセリド類、ジグリセリド類、スルファチド類、リゾレシチン、リン脂質類、サポニン、胆汁酸類等が含まれる。こうしたリポソーム処方の調製は、例えば、すべて本明細書に援用される、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号に開示されるように、当該技術分野の技術レベルの範囲内である。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ　ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ　ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、そしてしたがって、意図される適用にしたがって選択され、そのため、キャリアーの特性は、選択された投与経路に応じるであろう。本発明の１つの好ましい態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの持続放出型を用いる。開示する方法で使用するのに適した持続放出型には、限定されるわけではないが、緩慢溶解生体適合性ポリマー（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されるアルギン酸微小粒子など）に被包されたＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、このようなポリマー（局所適用ヒドロゲル類を含む）と混合されたもの、およびまたは生体適合性半透性移植物中に入れられたものが含まれる。
【０１５４】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドは、多量体（例えばヘテロ二量体またはホモ二量体）、あるいはそれ自体または他のポリペプチドとの複合体中で、活性である可能性がある。その結果、本発明の薬剤組成物は、こうした多量体または複合体型で、本発明のポリペプチドを含んでもよい。本発明の薬剤組成物は、本発明のポリペプチド（類）の複合体の形であってもよい。本発明はさらに、組み合わせて同一被験者に投与される、１以上の他の薬剤と同時に、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを投与することを含み、各薬剤は、その医薬品に適した措置にしたがって、投与される。「同時投与」は、組み合わせの成分での同時または連続治療と共に、薬剤を交互に投与する措置、または一方の成分を長期に投与し、そして単数または複数の他方のものを断続して投与する措置を含む。成分は、同一または別個の組成物中で、そして同一または異なる投与経路によって投与してもよい。本発明の薬剤組成物中に含まれてもよい成分の例は：Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンなどの、サイトカイン類、リンホカイン類、または他の造血因子である。薬剤組成物はさらに、ポリペプチドの活性を増進するか、あるいは治療中のその活性または使用を引き立たせるかいずれかの他の剤を含有してもよい。こうしたさらなる因子および／または剤を薬剤組成物中に含み、本発明のポリペプチドとの相乗効果を生じることも、または副作用を最小限にすることも可能である。逆に、本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤と共に処方中に含み、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤の副作用を最小限にすることが可能である。同時に投与すべき薬剤のさらなる例には、限定されるわけではないが、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症剤、ペントキシフィリン、サリドマイド、並びにアザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ヒドロキシクロロキン硫酸、メトトレキセート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、および経口金、金チオリンゴ酸ナトリウム、および金チオグルコースなどの金化合物などの疾患修飾抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）が含まれる。さらに、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーは、第二のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに対する抗体、または天然ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの競合的阻害剤として作用するＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド由来ペプチドと組み合わせることが可能である。
【０１５５】
いかなる有効な投与経路を用いて、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリヌクレオチドを含んでなる組成物を含む、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを、療法的に投与してもよい。非経口投与には、例えば、多量（ｂｏｌｕｓ）注射によるか、または連続注入による、関節内、静脈内、筋内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介した、注射が含まれる。他の経路には、例えば疾患または傷害部位での局所投与が含まれる。投与の他の適切な手段には、移植物からの持続放出；エアロゾル吸入および／またはガス注入；点眼剤；膣または直腸座薬；頬側調製；丸剤（ピル）、シロップ、ロゼンジまたはチューインガムを含む経口調製；およびローション、ゲル、スプレー、軟膏または他の適切な技術などの局所調製が含まれる。あるいは、ポリペプチドを発現する細胞を移植することによって、例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを発現する細胞を移植することによって、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを、搬送することが可能である。細胞はまた、増殖させるため、またはこうした細胞に対する望ましい効果またはこうした細胞における望ましい活性を生じるため、本発明のポリペプチドの存在下で、ｅｘ　ｖｉｖｏで培養することも可能である。その後、処理した細胞を、療法目的のため、ｉｎ　ｖｉｖｏで導入することが可能である。別の態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーをコードするポリヌクレオチドでの、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｅｘ　ｖｉｖｏのトランスフェクションによって、被験者自身の細胞が、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーを産生するよう、誘導する。該ポリヌクレオチドは、例えば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーをコードする裸のＤＮＡまたはリポソーム被包ＤＮＡを注入することによって、あるいはトランスフェクションの他の手段によって、被験者の細胞に導入することが可能である。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞または生物への核酸（限定なしに、ウイルスベクターの形でのものが含まれる）の導入のための他の既知の方法によっても、被験者に投与することが可能である。
【０１５６】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、または結合パートナーの療法的有効量を経口投与する際、該ポリペプチドは、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形であろう。錠剤型で投与する際、本発明の薬剤組成物は、さらに、ゼラチンまたは佐剤などの固体キャリアーを含有してもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、本発明のポリペプチドを約５から９５％、そして好ましくは本発明のポリペプチドを約２５から９０％含有する。液体型で投与する際、水、石油、ピーナツ油、ミネラルオイル、ダイズ油、またはゴマ油などの動物または植物起源の油、あるいは合成油などの液体キャリアーを添加してもよい。薬剤組成物の液体型はさらに、生理学的生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含有してもよい。液体型で投与する際、薬剤組成物は、本発明のポリペプチドを、重量約０．５から９０％、そして好ましくは、本発明のポリペプチドを、約１から５０％含有する。
【０１５７】
本発明のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、または結合剤の療法的有効量を、静脈内、皮膚または皮下注射する際、ポリペプチドは、発熱物質不含で非経口的に許容しうる水性溶液の形であろう。こうした非経口的に許容しうるポリペプチド溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性等を十分考慮して、当該技術分野の範囲内である。静脈内、皮膚、または皮下注射のための好ましい薬剤組成物は、本発明のポリペプチドに加え、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、乳酸リンゲル注射剤、または当該技術分野に知られるような他のビヒクルを含有すべきである。本発明の薬剤組成物はまた、当業者に知られる、安定化剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤、または他の添加物も含有してもよい。本発明の薬剤組成物を用いた静脈内療法の期間は、治療する疾患の重症度、並びに個々の被験者各々の状態および潜在的な特異体質反応に応じて、多様であろう。本発明のポリペプチドの各適用期間は、連続静脈内投与１２から２４時間の範囲内であろうと意図される。最終的には、主治医が、静脈内療法の適切な期間に関して、決定するであろう。
【０１５８】
組織修復または再生に有用な本発明の組成物に関しては、療法は発熱物質不含で生理学的に許容しうる型の組成物を、局所的に、全身性に、局在的に、あるいは移植物または装置と関連して、投与することを含む。さらに、組成物は、望ましくは、組織損傷部位に搬送するため、粘稠性の型で被包または注射してもよい。さらなる有用な剤がまた、所望により、上述のような組成物中に含まれていてもよいし、あるいは本発明の方法において、組成物と同時にまたは連続して投与してもよい。組成物は、組織損傷部位に、ポリペプチド含有組成物を搬送し、発展する組織のための構造を提供することが可能であり、そして最適には、体に吸収されることが可能であるマトリックスを含むことが可能である。マトリックス素材の選択は、生体適合性、生物分解性、機械的特性、美容的外見および界面特性に基づく。組成物のための潜在的なマトリックスには、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ無水物が含まれる。他の潜在的なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスなどの、非生物分解性で、そして化学的に定義されるものである。マトリックスは、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなど、上述の種類の素材のいずれかの組み合わせで構成されてもよい。経過は、組織／骨増殖および／または修復の定期的な評価、例えばＸ線、組織形態計測的測定およびテトラサイクリン標識によって、監視することが可能である。
【０１５９】
ヒト被験者に加え、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナーは、ペット（イヌ、ネコ、鳥、霊長類等）、飼育農場動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、鳥等）などの、非ヒト動物の疾患状態の治療に有用である。こうした例では、適切な用量は、動物の体重にしたがって決定可能である。例えば、０．２−１ｍｇ／ｋｇの用量が使用可能である。あるいは、用量は、動物の表面面積にしたがって決定され、典型的な用量は、０．１−２０ｍｇ／ｍ２、またはより好ましくは５−１２ｍｇ／ｍ２の範囲である。イヌまたはネコなどの小動物に関しては、適切な用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。１つの態様において、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、抗体、またはＡＤＡＭ−Ｈ９結合パートナー（好ましくは被験者と同じ種由来の遺伝子で構築される）は、動物の状態が改善されるまで、週１回以上、注射または他の適切な経路によって投与するか、あるいは無期限に投与可能である。
【０１６０】
本発明はまた、疾患または障害の予防または療法的治療のための医薬品製造における、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、および変異体；ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、および変異体をコードするポリヌクレオチド；抗体などのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド結合パートナー；ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、断片、変異体、および結合パートナーで形成される複合体等の使用にも関する。
【０１６１】
本発明にさらに含まれるのは、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを解析する系および方法であって、１以上のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド、コードする核酸、および対応する遺伝子を同定および／または性質決定することを含んでなり、好ましくは１以上のＡＤＡＭ−Ｈ９分子の組に相当するデータ組を含んでなる、前記系および方法、またはその使用である。したがって、本発明は、配列番号２、５、７、または９に示すような配列を含んでなるポリヌクレオチド；配列番号１、３、４、６、８、または１０に示すような配列を含んでなるポリペプチド；配列の少なくとも１つが、配列番号２、５、７、または９に示すような配列を含んでなるポリヌクレオチド配列の組；並びに、配列の少なくとも１つが、配列番号１、３、４、６、８、または１０に示すような配列を含んでなるポリペプチド配列の組からなる群より選択されるメンバーをその上に保存する、コンピューター読み取り可能媒体を提供する。
【０１６２】
本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを解析するための計算環境および選択的に実行される複数のアルゴリズムを含んでなる。ＡＤＡＭポリペプチドの解析例には、限定なしに、組中のポリペプチドのアミノ酸配列を示し、組中の１つのポリペプチドのアミノ酸配列を、組中の別のポリペプチドのアミノ酸配列に比較し、組中のポリペプチドの構造を予測し、組中のポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を決定し、そして組中のポリペプチドに対応する遺伝子を同定することが含まれる。
【０１６３】
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の一般的な当業者の１人に通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に提供する、すべての表題および小見出しは、もっぱら読みやすさのためであり、そして本発明を限定するとみなしてはならない。本明細書において、用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに単数形を指示しない限り、複数形を含むよう意味する。本発明を実施するかまたは試験する際に、本明細書に記載するものに類似のまたはそれと同等の方法および材料を使用することが可能であるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書に援用される。対立する場合、定義を含め、本明細書が支配するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は例示のためのみであり、そして限定することを意図しない。以下の実施例は、特定の態様を例示することを意図し、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１６４】
【実施例】
実施例１
ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーの新規メンバー、ＡＤＡＭ−Ｈ９の同定
Ｃｅｌｅｒａ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（メリーランド州ロックビル）から、ヒトゲノムにコードされると予測されるアミノ酸配列を含有するデータ組を受け取った。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてこのデータ組を検索し、ＡＤＡＭファミリーポリペプチドを同定した。配列番号１に示すようなアミノ酸配列は、新規ヒトＡＤＡＭファミリーポリペプチドの部分的アミノ酸配列を含んでなると同定された。このアミノ酸配列を用いて、約１９４ｂｐの第一のエクソンを同定した。この第一のエクソンを用いて、第一のエクソン配列を含有する、隣接ポリヌクレオチドを含有するクローンを同定した。ＡＤＡＭ９（配列番号２３）のコード配列に実質的な相同性が見出されるまで、第一のエクソン上流の隣接配列を解析することによって、第二のエクソンを同定した。実質的な相同性を持つこの領域は、ありうる第二のエクソンと同定され、そしてこれを続いて、リンパ節細胞のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物（配列番号２）は、配列番号３および配列番号４（残基１７から６７）に示すアミノ酸配列を有するＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの部分的配列をコードした。配列番号３の最初の１４アミノ酸は、約４２ｂｐの第二のエクソン（最初に同定されたエクソンのおよそ１．３ｋｂ上流）の翻訳に相当し、そしてどちらのエクソンも、胎盤、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、精巣、胃、骨髄、リンパ節、心臓、骨格筋、脳、肺、結腸、前立腺、胸腺、卵巣、小腸、皮膚、および食道を含む、多様なヒト組織由来のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、そして解析することによって、確認した。胎児起源のいくつかの関連する組織由来のｃＤＮＡもまた、解析した。図２に示すアミノ酸配列は、標準的１文字アミノ酸コードで表し、「Ａ」はアラニンに、「Ｃ」はシトシンに相当し、そして他も同様である。
【０１６５】
実施例２
ＲＡＣＥ解析
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドをコードするさらなるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）解析によって同定した。すべてのＲＡＣＥ産物をベクターにクローニングし、そして配列決定した。ＲＡＣＥ産物の配列解析によって、実質的に同一の配列を有するいくつかのクローンを同定した。ＲＡＣＥ解析キットは、Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓを含む、いくつかの企業から入手可能である。ＲＡＣＥ産物比較によって見出されたコンセンサス配列に基づいて、プライマーを設計した。
【０１６６】
配列番号５のヌクレオチド２５−４９および１４３４−１４６４を含んでなるプライマー対を用いて、リンパ節細胞および骨髄細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ増幅した。標準的プロトコルを用いて、生じたＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定した。これらのクローン内に含有されるポリヌクレオチドは、配列番号５、７、および９に示され、そしてそれぞれ、配列番号６、８、および１０に示すような配列を有するポリペプチドをコードする。３つのクローニングされた配列のうち２つには、予測される膜貫通アンカーおよび細胞質ドメインが含まれる。
【０１６７】
ＡＤＡＭ−Ｈ９配列の解析によって、配列番号１、３、４、６、８、および１０はすべて、ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーのディスインテグリンドメインに相同性を有するアミノ酸領域を含有することが立証される。本発明のディスインテグリンドメインは、配列番号６の残基７３から始まる、非常に保存されたＣＧＮ配列から始まり、そしてほぼ残基３６０ないし３６２まで続く配列を含む可能性があるか；配列番号８のほぼ残基１または１６からほぼ残基２８５ないし２８７までの配列を含む可能性があるか；あるいは、配列番号１０の残基１または７３（またはその間の残基いずれか）からほぼ３１４または３２９（またはその間の残基いずれか）までの配列を含む可能性がある。また、該解析によって、配列番号６のほぼ残基３６１から始まって、そして残基３８２まで続くか、または配列番号８のほぼ残基２８６から残基３０７までの、配列番号６および８に存在する膜貫通配列も同定された。したがって、膜貫通ドメインを欠くポリペプチド（例えば膜貫通ドメインがないかまたは欠失している配列番号６および８の断片）は、ディスインテグリン活性を有する可溶性ポリペプチドであると予測される。本発明によってやはり同定されるのは、膜貫通ドメインを欠く、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの天然存在変異体（例えば配列番号１０を参照されたい）である。さらに、配列番号６、８、および１０のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド配列を、ヒトＡＤＡＭ９配列のものと比較すると、ＡＤＡＭファミリーポリペプチドと一致する、ディスインテグリンおよびシステインリッチドメインにおける、いくつかの保存されたシステイン残基が示される。配列番号６、８、および１０とＡＤＡＭ９配列の並列を、図１に示す。図１において、灰色のバーは、おおよそのディスインテグリンおよびシステインリッチドメインを示し、そして点線はおおよその膜貫通ドメインを示す。保存されるシステイン残基は強調表示し、そして大文字にしている。
【０１６８】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド配列（配列番号１、３、４、６、８、または１０）の一部またはすべてをコードするポリヌクレオチド配列を図３に提供する。上記の配列番号５、７、および９の太字のＡＴＧは、配列番号６、８、および１０の位１の開始コドンまたはメチオニンに相当する。それぞれ、配列番号５、７、および９に示すような、配列番号６、８、および１０のコード配列の解析によって、ディスインテグリン活性を有するドメインは、配列番号５のほぼヌクレオチド２４８からほぼヌクレオチド１１１１；配列番号７のほぼヌクレオチド８２または１２７（またはその間のヌクレオチドいずれか）からほぼヌクレオチド９３６；あるいは配列番号９のほぼヌクレオチド３２または２４８（またはその間のヌクレオチドいずれか）からほぼヌクレオチド９７３または１０１８（またはその間のヌクレオチドいずれか）に対応することが示される。したがって、上記の核酸配列の断片を含んでなるポリヌクレオチドは、ディスインテグリン活性を有する可溶性ポリペプチドのコード配列に相当する。さらに、配列番号６および８の膜貫通ドメインのコード配列は、それぞれ、配列番号５および７のほぼヌクレオチド１１１２からほぼ１１７７またはほぼヌクレオチド９３７からほぼ１００２に相当する。本明細書に論じるように、配列番号６、８、および１０の細胞質ドメインは異なり、そして潜在的に、スプライシング変異体に相当する。
【０１６９】
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド配列の変異体は、本明細書に提供する配列に基づいて、同定可能である。いくつかの変異体が本明細書に提供され（以下により詳細に記載されるとおり）、そして本発明の範囲内に含まれる。例えば、配列番号１は、配列番号３、４、６、８、および１０に存在するが、配列番号８は、配列番号６に比べて、ポリペプチドの予測される細胞質ドメイン中の３９アミノ酸伸長を欠く。ＡＤＡＭ−Ｈ９アミノ酸配列に対するアミノ酸置換および他の改変（欠失、挿入等）は、図１に示すようなアミノ酸配列の保存残基に変化を生じるならば、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド活性を改変するかまたは破壊する可能性がより高いと予測され、そして特にこうした変化が同様の構造のアミノ酸（脂肪族残基、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＶａｌのいずれか１つの、別の脂肪族残基に対する置換など）で置換されない場合、そうである。逆に、変化が、ＡＤＡＭ−Ｈ９アミノ酸配列に対して、他のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド配列の１つから、並列におけるその位の残基の置換を生じるよう行われる場合、こうした改変が、改変されたＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの機能に影響を与えるであろう可能性は、より低い。
【０１７０】
実施例３
本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体
実質的に精製したＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを用い、米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるものなどの慣用的技術を用いて、それと免疫反応性であるモノクローナル抗体を生成することが可能である。完全フロイントアジュバント中で乳化したＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド免疫原でマウスを免疫し、そして１０−１００μｇの範囲の量を、皮下または腹腔内注射する。１０から１２日後、免疫した動物に、不完全フロイントアジュバント中で乳化した、さらなるＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを追加免疫する。その後、毎週から隔週（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）の免疫スケジュールで、マウスに定期的に追加免疫する。後眼窩出血または尾先端切除によって、血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）またはＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド結合パートナーへのＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドの結合阻害によって、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチド抗体に関して試験する。
【０１７１】
適切な抗体力価を検出した後、陽性動物に、生理食塩水中のＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドを最後に一度、静脈内注射する。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５８０）に融合させる。融合によってハイブリドーマ細胞が生成され、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中、マルチマイクロタイタープレートに蒔く。
【０１７２】
ハイブリドーマ細胞は、Ｅｎｇｖａｌｌら（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．　８：８７１，　１９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適応によって、実質的に純粋なＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに対する反応性に関して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４４：４２１２，　１９９０）に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＡＤＡＭ−Ｈ９モノクローナル抗体を含有する腹水を産生することが可能である。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によって、フラスコまたはローラーボトル中、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。マウス腹水中で産生したモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿によって、続いてゲル排除クロマトグラフィーによって、精製可能である。あるいは、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた使用可能であり、ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドへの結合に基づくクロマトグラフィーも使用可能である。
【０１７３】
実施例４
染色体マッピング
ＡＤＡＭ−Ｈ９ポリペプチドに対応する遺伝子は、ＰＣＲに基づくマッピング戦略を用いてマッピングする。最初のヒト染色体割り当ては、実施例１に上述するものなどのＡＤＡＭ−Ｈ９特異的ＰＣＲプライマー、および製造者の指示にしたがって、ＢＩＯＳ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（コネティカット州ニューヘブン）のＢＩＯＳ体細胞ハイブリッドＰＣＲ可能ＤＮＡキットを用いて作成する。より詳細なマッピングは、Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ　４放射ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、アラバマ州ハンツビル（例えばＷａｌｔｅｒ，　ＭＡら，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７：２２−２８，　１９９４を参照されたい））を用いて行う。その後、この解析から得たデータを、含まれる指示にしたがって、ＭＩＴ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｍａｐｐｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）に電子的に提出する。この解析は、特定のマーカー名称を生じ、このマーカーは、電子的にＮＣＢＩ：（ｗｗｗ−ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／ｍａｐ．ｃｇｉ？ＣＨＲ＝８）に提出した際、特定の染色体間隔を生じる。予測される染色体位置は、染色体８上、およそ８ｐ１１．１である。
【０１７４】
実施例５
ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃの生成および角膜ポケットアッセイにおけるＡＤＡＭディスインテグリンドメインポリペプチドの活性
Ｆｃに融合したＡＤＡＭ−Ｈ９細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドを構築するため、配列番号６のアミノ酸残基７３から３６２をコードする核酸を、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分をコードする核酸に連結した。この構築物にコードされるポリペプチドを配列番号２５に示す。この構築物は、配列番号２５の位２０のＣ末端Ｇ（グリシン）アミノ酸の後ろで、シグナルペプチダーゼによって切断される、ｉｇカッパリーダーを用いる。その結果、該分子の可溶性型は、配列番号２５のアミノ酸２１で開始すると予測される。ＴＳ（スレオニン−セリン）配列（配列番号２５のアミノ酸２１および２２）は、Ｆｃドメインに配列番号６のディスインテグリンドメイン（配列番号６のアミノ酸７３から３６２）を連結するのに用いた制限部位の結果である。配列番号６のディスインテグリンドメインは、配列番号２５のアミノ酸２３で始まり、そしてアミノ酸３１２まで続く。アミノ酸３１３−３１４のＲＳ（アルギニン−セリン）配列は、Ｆｃドメインに配列番号６のディスインテグリンドメイン（配列番号６のアミノ酸７３から３６２）を連結するのに用いた制限部位の結果である。Ｆｃ配列はアミノ酸３１５で始まり、そして残基５４２に続くインフレームの停止コドンまで続く。
【０１７５】
マウス角膜ポケットアッセイを用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏで、ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドによって、血管形成の阻害を定量化する。このアッセイでは、血管形成または抗血管形成活性に関して試験しようとする剤を、ヒドロンペレット中、緩慢放出型で固定し、これを麻酔したマウスの角膜上皮に生成した微小ポケットに移植する。血管新生は、通常は無血管である角膜への血管形成角膜縁からの血管内殖の外見、密度、および度合いとして測定する。
【０１７６】
Ｋｅｎｙｏｎら，　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．　＆　ＶｉｓｕａｌＳｃｉｅｎｃｅ　３７：１６２５，　１９９６に記載されるようなヒドロンペレットは、ｂＦＧＦ（９０ｎｇ／ペレット）、ｂＦＧＦおよびＩｇＧ（１１μｇ／ペレット、対照）、またはｂＦＧＦおよびある範囲の濃度の試験しようとする剤（例えばＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチド）を含むスクラルファートを取り込む。ペレットは、６−８週齢オスＣ５７ＢＬマウスの角膜縁の内側から外側に１ｍｍ微小切開することによって生成した角膜間質微小ポケットに、外科的に移植する。５日後、ｂＦＧＦへの新生血管反応のピーク時に、ペレットを含有する経線内の原線から３５−５０°の初期角度で、Ｚｅｉｓｓスリットランプを用いて、角膜の写真を撮影する。画像をデジタル化し、そしてサブトラクティブカラーフィルター（Ａｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　４．０）でプロセシングし、ヘモグロビン含量によって、確立された微小血管を描写する。画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ、テネシー州ナッシュビル）を用いて、血管新生されている角膜画像の部分、血管新生領域内の血管密度、および総角膜内の血管密度を計算する。ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリン−Ｆｃポリペプチド用量の関数としてのｂＦＧＦ誘導角膜血管形成の阻害を決定する。
【０１７７】
実施例６
ネズミ移植モデルにおける、ＡＤＡＭディスインテグリンドメインポリペプチドによる血管新生の阻害
１匹のマウスドナー由来の、遺伝的に同様の別のマウスの耳皮膚への異所（ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）移植心臓組織の生存は、移植された心臓および周囲の組織による、生存および心筋機能のためのエネルギーを促進するための、適切な血管新生を必要とする。移植部位での不適切な血管系は、心臓に対する過剰な虚血、組織損傷、および組織移植の失敗を引き起こす。内皮細胞遊走および血管形成に関与する因子をアンタゴナイズする剤は、移植部位での血管形成を減少させ、それによって、移植組織機能および最終的には移植自体を限定する可能性がある。ネズミ異所心臓同系移植モデルを用いて、血管新生に対するＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドのアンタゴニスト効果を立証する。
【０１７８】
メスＢＡＬＢ／ｃ（＝１２週齢）レシピエントに、同一系統のドナーマウス由来の新生児心臓移植片を与える。ドナー心臓組織は、第０日にレシピエントの左耳介に移植し、そしてマウスを２群に分ける。対照群には、ヒトＩｇＧ（Ｈｕ　ＩｇＧ）を、一方、他方の群には、ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドを、どちらも腹腔内投与する。処置は、連続５日間、続ける。移植片の機能性は、移植後、第７日および第１４日の、可視拍動活性を監視することによって、決定する。ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃの用量の関数として、機能移植片の阻害を決定する。移植部位の浮腫、並びに宿主およびドナー組織血管系に対するＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃの影響を可視化するため、移植心臓の組織像を調べる（例えば因子ＶＩＩＩ染色を用いる）。
【０１７９】
実施例７
ＡＤＡＭ−Ｈ９ディスインテグリン（ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ）ドメインポリペプチドでの腫瘍の処置
ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃを、固形腫瘍の動物モデルにおいて試験する。ＡＤＡＭｄｉｓ−Ｆｃの影響は、腫瘍頻度および腫瘍増殖を測定することによって、決定する。ＡＤＡＭ−Ｈ９ｄｉｓ−Ｆｃの生物学的活性はまた、カルシウム動員アッセイおよび血小板活性化、補充、または凝集を測定するアッセイなどの、当該技術分野に知られる他のｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｅｘ　ｖｉｖｏ、およびｉｎ　ｖｉｖｏアッセイにおいても、立証される。
【０１８０】
前述の本発明は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によって、ある程度詳細に記載してきているが、本発明の解説に照らして、付随する請求項の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変化および修飾を行うことが可能であることが、当業者には容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、配列番号６、８、および１０に示すＡＤＡＭ−Ｈ９配列とＡＤＡＭ９（配列番号２３）の並列を示す。図中に同定するのは、ポリペプチドのＡＤＡＭファミリーへの相同性によって予測されるドメインである。
【図２】図２は、本発明にしたがったポリペプチドのアミノ酸配列を表す表を示す。
【図３】図３は、本発明にしたがったポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を表す表を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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