(57)【要約】本発明は、１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（式（Ｉ））を１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３,２０−ジオン  ２１−アセテート（式（ＶＩ））に変換する新規な方法である。
2004535805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）とΔ１−デヒトロゲナーゼとを接触させて１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を得：
（２）１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）と１１β−ヒドロキシラーゼとを接触させて１１β,１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）を得：
（３）１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）を加水分解して１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン３，２−ジオン（ＩＶ）を得：
（４）１１β，１７−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（ＩＶ）とヨウ素、触媒および温和な塩基とを接触させて１１β，１７α−ジヒドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）を得、次いで、
（５）１１β，１７α−ジヒドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）と酢酸の塩とを接触させることを特徴とする１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２】
該Δ１−デヒドロゲナーゼとの接触がＡ．ｓｉｍｐｌｅｘのΔ１−デヒドロゲナーゼとのものである１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３】
Ａ.ｓｉｍｐｌｅｘのΔ１−デヒドロゲナーゼが発酵物、全細胞濃縮物、全細胞、無細胞または固定化細胞として用いられる請求項２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項４】
Ａ．ｓｉｍｐｌｅｘのΔ１−デヒドロゲナーゼが全細胞濃縮物によって用いられる請求項３記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項５】
該Δ１−脱水素がカタリアーゼの存在下で行われる請求項２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項６】
該Δ１−脱水素が外因性電子アクセプターの存在下で行われる請求項２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項７】
該外因性電子アクセプターがメナジオン、重亜硫酸メナジオン、１，４−ナフトキノン、フェナジンメトスルフェート、フェナジンエトスルフェートおよびビタミンＫ型化合物から選択される請求項６記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項８】
該外因性電子アクセプターがメナジオンである請求項７記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項９】
該Δ１−脱水素が水非混和性有機溶媒の存在下で行われる請求項２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１０】
該水非混和性有機溶媒がトルエン、キシレン、ベンゼン、ヘプタン、塩化メチレン、ｎ−オクタノール、四塩化炭素および高級ｎ−アルコール、およびそれらの混合物から選択される請求項９記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１１】
該水非混和性有機溶媒が塩化メチレンおよびトルエンの混合物である請求項１０記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１２】
１１β−ヒドロキシラーゼがＣ．ｌｕｎａｔａのものである請求項１記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１３】
該１１β−ヒドロキシラーゼが発酵物、細胞濃縮物、全細胞または無細胞の反応によるＣ．  ｌｕnａｔａのものである請求項１２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１４】
該１１β−ヒドロキシラーゼが発酵によるＣ．ｌｕｎａｔａのものである請求項１３記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１５】
該Ｃ．ｌｕｎａｔａが界面活性剤の存在下で培養される請求項１２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１６】
該界面活性剤がエトキシル化アルコール、エトキシル化脂肪酸、エトキシル化脂肪エステルおよび油、エトキシル化アルキルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、アルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル、第一級アルコールのポリエチレングリコールエーテルおよび第二級アルコールのポリエチレングリコールエーテルよりなる群から選択される非イオン性界面活性剤である請求項１５記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１７】
非イオン性界面活性剤がエトキシル化アルキルフェノールである請求項１６記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１８】
該エトキシル化アルキルフェノールがオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである請求項１７記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項１９】
Ｃ．ｌｕｎａｔａが天然油の存在下で培養される請求項１２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２０】
該天然油が大豆油、ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、ラード油、アマニ油、オリーブ油、落花生油、菜種油およびサフラワー種子油よりなる群から選択される請求項１９記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２１】
該天然油が大豆油である請求項２０記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２２】
適時のニトレート添加を用いる請求項１２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２３】
ニトレートの源が硝酸アンモニウム、硝酸アルミニウム、硝酸カルシウム、硝酸ナトリウム、硝酸バリウム、硝酸カリウム、硝酸第二銅、硝酸セシウム、硝酸マグネシウム、硝酸マンガン、硝酸第二鉄、硝酸亜鉛、硝酸コバルト、硝酸リチウムおよび硝酸よりなる群から選択される請求項２２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２４】
ニトレートの源が硝酸アンモニウムである請求項２３記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２５】
温度シフトを用いる請求項１２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２６】
該温度シフトが約２８℃ないし約３７℃へのものである請求項２５記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２７】
該加水分解が炭酸塩、水酸化物およびＣ１−Ｃ４アルコキシドよりなる群から選択される塩基にて行われる請求項１記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２８】
該塩基がメタノール中の炭酸塩、水性メタノール中の水酸化物およびメトキシドよりなる群から選択される請求項２７記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項２９】
該塩基がメトキシドである請求項２９記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３０】
１当量を超える塩基を用いる請求項２７記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３１】
工程（３）の生成物を塩基および臭化物イオンの存在下でヨウ素と接触させる請求項１記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３２】
該塩基が水酸化物およびＣ１−Ｃ４アルコキシドよりなる群から選択される請求項３１記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３３】
該塩基が水酸化物である請求項３２記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３４】
該臭化物を触媒量で存在させる請求項３１記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３５】
工程（４）の生成物をＣＨ３−ＣＯＯ−と接触させる請求項１記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３６】
該生じた１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）が０．１％以下のいずれかの不純物を含有する請求項１記載の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法。
【請求項３７】
式；
【化１】
2004535805.tif 000007
で示されるジヨードステロイド。
【請求項３８】
（１）１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）とΔ１−デヒドロゲナーゼとを接触させて１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を得：
（２）非極性溶媒または溶媒混合物から生じた１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を結晶化させることを特徴とする残存非ヒドロキシル化物質の除去方法。
【請求項３９】
該非極性溶媒または溶媒混合物がベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、ヘプタンおよびイソオクタンよりなる群から選択される請求項３８記載の残存非ヒドロキシル化物質の除去方法。
【請求項４０】
該非極性溶媒または溶媒混合物が０℃のｎ−酢酸ブチルまたはトルエン／イソオクタン（１／１）混合物である請求項３９記載の残存非ヒドロキシル化物質の除去方法。
【請求項４１】
（１）トルエン、ベンゼン、キシレン、酢酸ｎ−ブチルおよびヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、シクロヘキサンおよびメチルシクロヘキサンよりなる群から選択される炭化水素溶媒とのその混合物よりなる群から選択される溶媒から結晶化させることをと特徴とする１１β−ヒドロキシラーゼによって生じた１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）の精製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への総合参照
なし。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、メドロキシプロゲステロンアセテート（Ｉ）を１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）に変換するプロセスである。
【０００３】
２．関連技術の記載
ステロイドの微生物酵素的Δ１−脱水素は当業者に知られている。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３７，９７−１０２（１９９１）は、有機溶媒中でのＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｉｍｐｌｅｘによる６α−メチルヒドロコルチゾン２１−アセテートのΔ１−脱水素を開示する。
【０００４】
米国特許第特許第４，６８４，６１０号は、外因性電子キャリアおよび水非混和性芳香族炭化水素溶媒の存在下で１，２−飽和ステロイドをＡ．ｓｉｍｐｌｅｘまたはＢａｃｉｌｌｉｓ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｄａｎｓと接触させることによって１，２−飽和ステロイドを１，２−デヒドロステロイドに変換するプロセスを開示する。
米国特許第４，７４９，６４９号は、ステロイドの微生物的Δ１−脱水素における毒性酸素種のスカベンジャーの使用を開示する。
【０００５】
Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａのごとき微生物でのステロイドの微生物酵素的１１β−ヒドロキシル化は当業者に知られている。例えば、米国特許第３，４１９，４７０号参照。１１−βヒドロキシル化を受ける基質の濃度はかなり低い。例えば、米国特許第特許第３，５３０，０３８号は、ステロイド基質の１７α−アセトキシプレグン−４−エン−２１−オール−３，２０−ジオンおよび１７α，２１−ジアセトキシプレグン−４−エン−３，２０−ジオンの最大濃度が０．５ｇ／Ｌであることを開示する。欧州特許出願０  ０４２  ４５１  Ａ１は、再度、ステロイド基質濃度の量は０．５ｇ／Ｌを超えないことを開示する。米国特許第４，３５３，９８５号は、具体的な例を与えておらず、１７α，２１−オルトエステルを用いる。米国特許第４，５８８，６８３号は、１７α，２０β，２１−トリヒドロキシプレグン−４−エン−３−オンのステロイド基質濃度が０．５ｇ／Ｌであることを開示する。米国特許第４，８９８，６９３号は６α−フルオロ−１７α−ヒトロキシ−１６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオンのステロイド基質濃度が０．４ｇ／Ｌであることを開示する。前記リストの最後の特許を除く全ては、１１β−ヒドロキシル化生成物の高い収率（８０ないし９２％）をもたらす、望まない１４α−ヒドロキシル化の排除に関する。しかしながら、発酵に対する基質の負荷は０．５ｇ／Ｌを超えない。日本国特許公開昭６２−１１８８９８号は、本発明の基質ではなく、サブスタンスＳおよびそのアナログでの、１０ｇ／Ｌの基質濃度でのＣ．ｌｕｎａｔａ  ＭＣＩ１６９０（微生物産業研究所株Ｎｏ．８５１５で登録）の使用を開示する。本発明のプロセスは特開昭６２−１１８８９８号のそれとは異なる培養を用い、高い基質濃度を用いて高い収率をもたらす。
【０００６】
プレグナンのＣ２１−メチル基を機能性化し、続いて、アセテートで置換して対応する２１−アセテートを得るのは当業者に知られている。ＧＢ２，３１８，７９０は、１つの臭素原子での機能性化、続いてのアセテートでの置換によるΔ１−１１β−ヒドロキシステロイドのＣ２１−メチル基の対応する２１−ヒドロキシステロイドへの変換を開示する。本発明のプロセスは臭素を用いない。
【０００７】
ＧＢ２，３１８，７９０は、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｉｍｐｌｅｘの使用による微生物的Δ１−脱水素、Ｃ．ｌｕｎａｔａの使用による微生物的１１β−ヒドロキシル化および臭素の使用による２１−ヒドロキシル化による、１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）の１１β，１７α−ジヒトドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）への変換を開示する。本発明は１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）を１１β，１７α−ジヒトドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）に変換するが臭素を用いない。
【０００８】
発明の概要
（１）１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）とΔ１−デヒトロゲナーゼとを接触させて１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を得：
（２）１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）と１１β−ヒドロキシラーゼとを接触させて１１β,１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）を得：
（３）１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）を加水分解して１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２−ジオン（ＩＶ）を得：
（４）１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（ＩＶ）とヨウ素、触媒および温和な塩基とを接触させて１１β，１７α−ジヒドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）を得、次いで、
（５）１１β，１７α−ジヒドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）と酢酸の塩とを接触させることを特徴とする１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート（ＶＩ）の製法を開示する。
また、式：
【０００９】
【化１】
2004535805.tif 000003
【００１０】
で示されるジヨードステロイドを開示する。
さらに、（１）１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）とΔ１−デヒドロゲナーゼとを接触させて１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を得：
（２）非極性溶媒または溶媒混合物から生じた１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を結晶化させることを特徴とする残存非ヒドロキシル化物質の除去方法を開示する。
【００１１】
加えて、（１）トルエン、ベンゼン、キシレン、酢酸ｎ−ブチルおよびヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、シクロヘキサンおよびメチルシクロヘキサンよりなる群から選択される炭化水素溶媒とのその混合物よりなる群から選択される溶媒から結晶化させることをと特徴とする１１β−ヒドロキシラーゼによって生じた１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）の精製方法を開示する。
【００１２】
発明の詳細な記載
本発明の最初の２つの個々の工程であるＡ．ｓｉｍｐｌｅｘでの微生物的Δ１−脱水素およびＣ．ｌｕｎａｔａでの１１β−ヒドロキシル化は当業者に知られている。また、プレグナンのＣ２１−メチル基の対応する２１−アセテートへの化学的変換は一般に当業者に知られている。しかしながら、該ジヨードステロイド（Ｖ）の使用は新規である。
【００１３】
Δ１−脱水素工程の詳細な記載
後記し、実施例１ないし１１でより具体的に記載するごとく１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）を脱水素して１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（II）を形成させる。
【００１４】
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）の１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）の変換はＡ．ｓｉｍｐｌｅｘからの異なる酵素調製物で行うことができる。酵素調製物は活発に増殖する培養物、全細胞濃縮物、無細胞抽出物または固定化細胞の形態とできる。好ましくは、全細胞濃縮物を用いる。
【００１５】
二相系においては、全細胞濃縮物を用いるのが好ましい。非水性相は１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）、外因性電子キャリアおよび水非混和性有機溶媒を含有する。使用できる外因性電子アクセプターは、メナジオン、重亜硫酸メナジオン、１，４−ナフトキノン、フェナジンメトスルフェート、フェナジンエトスルフェートおよびビタミンＫ型化合物よりなる群から選択される。外因性電子キャリアはメナジオンおよび１，４−ナフトキノンよりなる群から選択されるのが好ましい；外因性電子キャリアはメナジオンであるのがより好ましい。外因性電子キャリアは触媒量にて、例えば，約４ないし６％（外因性電子キャリア重量／１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）重量）で添加される。外因性電子キャリアは約５％の量で存在させるのがより好ましい。使用できる水非混和性有機溶媒はトルエン、キシレン、ベンゼン、ヘプタン、塩化メチレン、ｎ−オクタノール、四塩化炭素、および高級ｎ−アルコールまたはそれらの混合物よりなる群から選択される。水非混和性有機溶媒は塩化メチレンおよびトルエンの混合物であるのが好ましい。水非混和性有機溶媒が約１ないし約９９％の範囲で存在させるのが好ましく、水非混和性有機溶媒は約６０ないし９５％の範囲で存在させるのがより好ましい。
【００１６】
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）は約１０ｇ／Ｌないし約１２５ｇ／Ｌの濃度で存在させるのが好ましく、１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）は約５０ｇ／Ｌないし約１００ｇ／Ｌの濃度で存在させるのがより好ましい。
水性相はカタラーゼ、水およびＡ．ｓｉｍｐｌｅｘの細胞濃縮物を混合することによって調製される。水性相がカタラーゼを含むのが好ましい。
【００１７】
攪拌してバイオ変換を開始しつつ、水性相を添加する。温度は約３０℃に制御され、ｐＨは塩基、好ましくは水酸化物、より好ましくは水酸化ナトリウムの添加によって８．７および８．９の間に制御される。反応混合物は、好ましくは空気（Ｉ部）および窒素（２部）双方を散布し、約１％未満の残存１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）が残るまで反応させる。要すれば、酵素のさらなる源を加えて、反応の完了を確実とする。
【００１８】
反応が完了すれば、ｐＨの制御、空気および窒素の供給、攪拌を停止する。次いで、相を分離し、さらなる水非混和性有機溶媒を用いて、さらなる回収のために水性相を再度抽出することができる。再度、攪拌を停止し、水性相を分配する。水非混和性有機溶媒相をリアクターから排出し、消費された水性細胞層を捨てる。水非混和性有機溶媒層を濾過して細胞の除去を確実とする。次いで、清澄化された液を濃縮し、所望の１７α−ヒドロキシル−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を当業者によく知られた方法によって単離する。
【００１９】
１１β−ヒドロキシル化工程の詳細な記載
当業者に知られており、より具体的には以下に記載されているごとく、かつより具体的には実施例１２ないし１４に記載されているごとく、１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）をヒドロキシル化して１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（III）を形成する。
【００２０】
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を１１−位にて微生物学的にヒドロキシル化して１１β、１７α―ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジエン  １７アセテート（III）を得る。１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を１１β−ヒドロキシル化できる属Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ，ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｓ）に属するいずれの繊維状真菌も本発明のプロセスで用いることができる。好ましくは、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｃｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ，ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈｓ）を用いる。より好ましくは、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０（ＡＴＴＣ  １２０１７）を用いる。
【００２１】
真菌ヒドロキラーゼを、活発に増殖する培養、全細胞濃縮物または無細胞抽出物の形態で利用することができる。好ましくは、いずれかの当該分野で認められた手法、およびイン・サイチュで行われる１１β−ヒドロキシル化反応を用い、真菌を好気性条件下で液内培養増殖させる。
当業者に知られたごとく、特定された成分、または他の適当な炭素および窒素源を用い、所望の真菌を実施例１２ないし１４で特定された条件下で培養することができる。一般に、一次および二次栄養種子手法を、真菌ステロイド−ヒドロキシル化での調製で用いる。あるいは、一次栄養種子を直接用いて、バイオ変換培地を接種することができる。
【００２２】
約２２°および約３７°の間の温度（好ましくは約２８°）で、約３．０および約７．５間のｐＨにて一次栄養種子培養を約２４ないし約７２時間（好ましくは約４８時間）インキュベートすることができる。二次栄養種子培地は約０．００６％ないし約０．１％（ｖ／ｖ）一次栄養種子培養で、典型的には約０．０１２％（ｖ／ｖ）で接種し、約２２°および約３７°の間の温度（好ましくは、約２８°）で約３６ないし約７２時間（好ましくは、約４８ないし約６５時間）インキュベートする。二次種子培地のｐＨは約２．５および約５．０の間、好ましくは約３．０および約４．０の間とすることができる。二次栄養種子培地と同一または類似なものとすることができるバイオ変換培地は約１％ないし約１０％（ｖ／ｖ）二次栄養種子培養、典型的には約３％（ｖ／ｖ）で接種する。バイオ変換発酵条件は二次栄養種子培養の培養で用いるものと同一とすることができる。約９ないし７２時間（好ましくは、約１８ないし約２４時間）の初期インキュベーションの後、好ましくは超微粉砕した１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３、２０−ジオン  １７アセテート（II）をバイオ変換培養に添加する。該超微粉砕化１７α−ヒドロキシ−６−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）は乾燥した粉末または水性スラリーとして、単一添加、一連の添加、または連続的供給いずれかとして添加することができる。１ｇ／Ｌより大きな、より好ましくは２．５ｇ／Ｌより大きな、なおより好ましくは５ｇ／Ｌより大きな濃度にて、超微粉砕化１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）基質を用いるのが好ましい。１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）の１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（III）へのバイオ変換は約６および約１２日の間、典型的には約９ないし約１０日間進行させる。
【００２３】
１１β−ヒドロキシル化の速度および程度は（ｉ）選択された真菌を培養し、次いで、界面活性剤の存在下でバイオ変換を行うことによって大いに改良することができる。該界面活性剤は非イオン性洗剤よりなる群、好ましくはエトキシル化アルキルフェノールよりなる下位群から選択することができる。より好ましくは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを用い；（ii）選択された真菌を培養し、次いで、天然油の存在下でバイオ変換を行う。天然油は、限定されるものではないがヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、ラード油、アマニ油、オリーブ油、落花生油、菜種油、サフラワー種子油、大豆油、ヒマワリ種子油、麦芽油から選択することができる。好ましくは、（iii）適時のニトレート添加を用い、大豆油を用いる。ニトレートの源は、制限されるものではないが、硝酸アンモニウム、硝酸カルシウム、硝酸ナトリウムよりなる群から選択することができる。好ましくは、硝酸アンモニウムを用いる。ニトレートは、（ｉｖ）約２８°から約３７°への適時な温度シフトを用い、基質添加の後、任意の時点にて、好ましくは基質添加から約１７および約２４時間の間の後に添加することができる。温度シフティングは、（ｖ）（ｉ）ないし（ｉｖ）で特定される方法のいずれかの組合せを用い、基質添加の後任意の時点で、好ましくは基質添加後約１７ないし約２４時間の間に行うことができる。
【００２４】
一旦１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）の１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１,４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（iii）へのバイオ変換が完了すれば、多数の当該分野で認められた手法のうちのいずれか１つを用い、１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（III）を単離することができる。好ましくは、全醸造物は、酢酸エチルまたは酢酸ブチルのごとき非混和性有機溶媒で抽出し、結晶化によって該１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（ｉｉｉ）を単離する。
【００２５】
該粗製１１β−ヒドロキシル化中間体、１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（ｉｉｉ）を非極性溶媒または溶媒混合物からの結晶化によって精製する。結晶化溶媒はトルエン、ベンゼン、キシレン、酢酸ｎ−ブチルおよびヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、シクロヘキサンおよびメチルシクロヘキサンよりなる群から選択される炭化水素溶媒とのその混合物よりなる群から選択される溶媒を含むのが好ましい。好ましい結晶化溶媒はトルエン／イソオクタン（１／１）の混合物である。結晶化は−４０°と低い温度にて約＋２５°と高い温度にて行われる。好ましい結晶化温度は約０°である。
【００２６】
２１−アセテート形成工程の詳細な記載
次いで、精製された１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（III）を脱アセチル化して対応する１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（ＩＶ）を得る。該脱アシル化または加水分解は、炭酸塩、水酸化物またはＣ１−Ｃ４アルコキシドよりなる群から選択される塩基での処理によって達成される。該塩基はエタノール中の炭酸塩、水性メタノール中の水酸化物またはメトキシドよりなる群から選択されるのが好ましい。塩基はメトキシドであるのがより好ましい。好ましい方法は、約２５°にてメタノール中のナトリウムメトキシドで基質を処理することである。エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、および他の低級アルコールが使用できる溶媒である。カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、チタン、アルミニウムのごとき他の電気陽性元素のアルコキシド塩も使用できる。該反応は約−４０°と低い、または約＋６５°と高い温度で行われる。好ましい温度範囲は約０°ないし約２５°である。反応はこの温度で３時間未満に完了するので、最も好ましい温度は約２５°である。
【００２７】
次いで、１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（ＩＶ）を２１−アセトキシル化して所望の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（ＶＩ）を得る。この２１−アセトキシル化は、ヨウ素、臭化カルシウムのごとき触媒、および水酸化カルシウムのごとき温和な塩基での処理によって行われる。メタノール中の酸化カルシウム、水酸化カルシウム、および臭化カルシウムの混合物を用いるのが好ましい。該プロセスは約１．５ない２．５当量のヨウ素および約１．０ないし１０当量の水酸化カルシウムおよび／または酸化カルシウムで使用できる。該プロセスは０．０５当量と少ない臭化カルシウムで使用できる。２．０当量のヨウ素、１．２当量の酸化カルシウム、３．７５当量の水酸化カルシウム、および０．７当量の臭化カルシウムを用いるのが好ましい。１７β−カルボメトキシ−６α−メチル−１１β，１７α−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３−オンを生じる過剰ヨウ素化を回避すべくそれを消費するよりもゆっくりとヨウ素を添加するのが重要である。１７β−カルボメトキシ−６α−メチル−１１β，１７α−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３−オンの形成を回避するためにヨウ素の最初の半分を添加する間、反応温度は＋１０°より高く、より好ましくは＋２５°よりも高く、最も好ましくは＋２５°とすべきである。生成物二ヨウ化物の分解を最小化するためにヨウ素の第２の半分を添加する間、反応温度は＋４０°より低く、好ましくは＋２５°より低く、最も好ましくは０°とすべきである。
【００２８】
１１β，１７α−ジヒドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）を最後に酢酸の塩、好ましくは酢酸トリエチルアンモニウムまたは酢酸カリウムと接触させる。しかしながら、酢酸のナトリウム、マグネシウムおよび他の金属の、またはアミンの塩を使用できる。
【００２９】
定義
以下の定義および説明は、明細書および請求の範囲双方を含めたこの全書類を通じて用いられる用語に対するものである。
全ての温度は度摂氏で表す。
ＲＰＭは分当たりの回転数をいう。
ＳＣＦＭ一分当たりの標準立方フィートをいう。
ＴＬＣは薄層クロマトグラフィーをいう。
ＨＰＬＣは高圧液体クロマトグラフィーをいう。
ｐｓｉｇは平方インチゲージ当たりのポンドをいう。
【００３０】
ＤＯは溶解した酸素をいう。
ＲＯは逆浸透をいう。
ＳＬＭは分当たりの標準リットルをいう。
ＶＶＭは分当たりの容量をいう。
ＯＵＲは酸素取り込み速度をいう。
ＤＤＱは２，３−ジクロロ-５，５−ジシアノ−１，４−ベンゾキノンをいう。
クロマトグラフィー（カラムおよびフラッシュクロマトグラフィー）とは、（支持体、溶離剤）で表した化合物の精製／分離をいう。適当な画分をプールし、濃縮して所望の化合物が得られることが理解される。
【００３１】
医薬上許容されるとは、薬理学的／毒物学的見地より患者に許容される、組成物、処方、安定性、患者許容性および生物学的利用性に関する物理学的／化学的見地から製剤化学者に許容される特性および／または物質をいう。
溶媒対を用いる場合、用いる溶媒の比率は容量／容量（ｖ／ｖ）である。
溶媒中の固体の溶解度を用いる場合、溶媒に対する固体の比率は重量／容量（ｗｔ／ｖ）である。
【００３２】
実施例
さらに工夫することなく、当業者であれば、これまでの記載を用いて本発明を最大限に実施できると信じる。以下の詳細な実施例は種々の化合物を製造する方法および／または本発明の種々のプロセスを実施する方法を記載するもので、単に例示的なものと解釈されるべきであって、断じてこれまでの開示を制限するものではない。当業者であれば、反応体ならびに反応の条件および技術双方に関する手法から適当な変形を直ちに認識するであろう。
【００３３】
実施例１
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）の１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）へのバイオ変換
【００３４】
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ，５００ｇ）およびメナジオン（１０ｇ）をトルエン（２２００ｍＬ）および塩化メチレン（２３００ｍＬ）と混合する。水性相はカタラーゼ（０．２５ｇ）、Ａ．ｓｉｍｐｌｅｘ細胞濃縮物（発酵により得られ、約２０％の乾燥固形物を含有するように濃縮、１０００ｍＬ）および水（１０００ｍＬ）の混合物として調製される。水性相を十分攪拌したトルエン化合物（３６０ＲＰＭ）に添加して、バイオ変換を開始させる。温度は水浴を用いて３０°に制御し、ｐＨは水酸化ナトリウム（２Ｎ）の添加を用いて８．７および８．９の間に制御する。反応混合物を、各々、空気の調節された流れ（０．３  ＳＣＦＨ）および窒素の調節された流れ（０．６  ＳＣＦＭ）を用いて散布する。
【００３５】
１％未満の残存する出発物質（Ｉ）が残るようになるまで、混合物を反応させる。必要であれば、反応の間により多くのＡ．ｓｉｍｐｌｅｘ細胞を添加して完了を確実とする。
反応は完了すると、ｐＨ制御、空気の供給、窒素の供給、および攪拌を停止し、水性相を浮かばせる。トルエン／塩化メチレン混合物をリアクターの底から吸い出す。さらに塩化メチレン（３０００ｍＬ）をバイオ変換容器に添加し、攪拌機を作動させてさらに水性層を抽出する。攪拌を停止し、水性相を上昇させる。希薄な塩化メチレン抽出物をリアクターから排出し、消費された水性細胞層を捨てる。
豊富および希薄抽出物をろ過する。次いで、清澄化した濾液を濃縮して濃厚なスラリーとする。固体をろ過によって集め、分岐オクタン（４５０ｍＬ）で洗浄し、５０°の真空オーブン中で乾燥して表記化合物（II）を得る。
【００３６】
実施例２ないし１１
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（Ｉ）の１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）へのバイオ変換
以下に記載するごとく細胞、水および反応の量を変更する以外は、実施例１の一般的手法に従い、かつ重要でない変形を行い、表記化合物（II）を得る。
【００３７】
【表１】
2004535805.tif 000004
【００３８】
実施例１２
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）の１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）へのバイオ変換
【００３９】
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）の１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）へのバイオ変換は、１０ＬのスケールでＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０（ＡＴＣＣ  １２０１７）の液内培養を用いて行う。
【００４０】
（Ａ）一次−接種段階
Ｃ．ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０の凍結した栄養型細胞を解凍し、ジャガイモ−デキストロース−寒天プレート（ＰＤＡ）に移し、２８°にて７２時間インキュベートする。単一菌糸−プラグ（６ないし７ｍｍ直径）を用いて、１００ｍＬ一次−接種培地を含有するシリコーン処理した５００ｍＭの点状（Stippled）震盪フラスコを接種する。一次−接種培地は（逆浸透水１リットル当たり）：デキストリン、５０ｇ；大豆粉、３５ｇ；セレロース、５ｇ；塩化コバルト六水和物、２ｍｇ；シリコーン系脱泡剤（ＳＡＧ４７１）、０．５ｍＬ；水酸化ナトリウム（２Ｎ）で調整したプレ滅菌ｐＨ７．０ないし７．２よりなる。２８０ｒｐｍに設定された制御された−環境インキュベーター−シェーカー（１分軌道ストローク）を用い、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０を２８°にて４８時間インキュベートする。
【００４１】
（Ｂ）二次−接種段階
栄養型一次−接種培養を用い、１０リットルの二次−接種発酵を接種する（１．２ｍＬ；０．０１２％［ｖ／ｖ］インキュベーション速度）。二次−接種培地は（逆浸透水１リットル当たり）：無水グルコース（２０ｇ）、大豆粉（２０ｇ）、大豆油（３０ｍＬ）；  オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（０．２５ｍＬ）、リボフラビン（１０ｍｇ）、シリコーン系脱泡剤（ＳＡＧ  ４７１，０．５ｍＬ）；  マグネシウム七水和物（１ｇ）、リン酸二水素カリウム（０．７５ｇ）、プレ−滅菌ｐＨ＝２．９５ないし３．００を含み、ｐＨは濃硫酸で調整する。二次−接種培地を含有するパラメーターは、ジャケットおよび注入スチーム双方を用い、１２１°にて２０分間滅菌する。滅菌の間の攪拌速度は２００ｒｐｍである。滅菌の後、無菌硫酸（５％）を用いて培地ｐＨを３．０に調整する。以下の初期バラメーター：攪拌、１００ｒｐｍ；  逆圧＝５ｐｓｉｇ；  気流＝２．５  ＳＬＭ（０．２５  ＶＶＭ）；  低溶解酸素（ＤＯ）設定点、３０％；  ｐＨ制御、無しを用い、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０を２８°にてインキュベートする。ＤＯが最初に３０％まで低下すると、気流を５  ＳＬＭ（０．５  ＶＶＭ）まで上昇させる。培養が再度低いＤＯに到達すると、攪拌制御を用いて３０％ＤＯを維持する。一旦培地の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）の顕著な低下が観察されれば（一般に、１２ないし１４から８ないし９ｍｍｏｌ／Ｌ／時間）、グルコースが枯渇するにつれ、二次−接種培養を５時間後に（接種からほぼ６０ないし６５時間後）収穫する。
【００４２】
（ｃ）ステロイドバイオ変換
３００ｍＬの栄養二次−接種培養（３．０％接種速度）を用い、１０リットルのステロイド−バイオ変換発酵を接種する。オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを０．２５ｍＬ／Ｌから２．５ｍＬ／Ｌまで増加させ、かつ無水グルコースを２０ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌまで減少させる以外は、ステロイド−バイオ変換培地は二次−接種培地と実質的に同一である。滅菌条件およびｐＨ調整は二次−接種培地で記載したとおりである。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０は、初期攪拌速度を１００ｒｐｍから２００ｒｐｍまで上昇させた以外は、二次−接種培養で用いたものと実質的に同一初期パラメーターを用いて２８°でインキュベートする。ＤＯが最初に３０％まで低下すれば、気流を２．５  ＳＬＭ  （０．２５  ＶＶＭ）から５  ＳＬＭ  （０．５  ＶＶＭ）まで上昇させる。この初期気流が変化した後、一旦ＤＯが再度３０％に到達すれば、超微粉砕化１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II，８０ｇ）をオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（０．２％，５００ｍＬ）中でスラリー化し、発酵に添加する。この時点で、培養のＯＵＲは、通常、９．５ないし１０．５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の範囲であろう（一般に、インキュベーションから１８ないし２４時間後）。培養のＯＵＲが６．５ないし６．０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の間まで低下すると（一般に、基質添加から１７ないし１８時間後）、ＲＯ水（５０ｍＬ）に溶解させた硝酸アンモニウム（７．２ｇ）を発酵に加え、インキュベーション温度を徐々に２８°から３７°まで上昇させる（１５分毎に２°）。初期気流変化の後、５５０ｒｐｍの最大までの攪拌制御を発酵を通じて用いて、ＤＯを３０％に維持する。一旦最大攪拌が達成されれば、２ｐｓｉｇ増分の逆圧を用いてＤＯを維持する。バイオ変換は、６８ないし７０ｇの表記化合物１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）を含有する発酵醸造物では９ないし１０日以内に完了する。ＨＰＬＣを用い、バイオ変換培養は、１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）につき毎日のベースでアッセイする。
【００４３】
２容量の暖かいアセトンを用いて全培養抽出を、１時間一定震盪しつつ行う。細胞を遠心（３，０００×ｇ，１０分）によって水性アセトン混合物から分離し、アリコットを窒素下で乾燥する。内部標準として１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテートを含有する適当な容量のメタノールにステロイド抽出物を再度溶解させる。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである：Ｃ１８逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ）カラムを備えたＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓクロマトグラフ；カラム温度、３０°；  移動相、メタノール／アセトニトリル／０．２５％リン酸（１０／６０／３０，ｖ／ｖ／ｖ）；  液速＝１ｍＬ／分；  検出、２４０ｍｍ；  実行時間＝１０分。
【００４４】
（Ｄ）単離手法
収穫する全醸造物を十分に混合する。凝集剤をブロスに添加し、豊富な固体を遠心によって回収する。豊富な固体を酢酸エチルで抽出し、豊富な抽出物を遠心によって回収する。抽出物を仕上げ、蒸留によって特定の容量まで濃縮し、冷却して生成物を結晶化させる。結晶スラリーをろ過し、母液を貯蔵して第二収量結晶を単離する。湿った結晶を熱酢酸ブチルに再度溶解させ、混合物を飽和するまで濃縮し、次いで、冷却して生成物を結晶化させる。結晶スラリーをろ過し、ケーキを分岐オクタンで洗浄し、乾燥する。生成物を酢酸ブチルまたはトルエンで再度結晶化して、品質を向上させる。
【００４５】
豊富な固体はアセトンで抽出することもできる。アセトンスラリーを遠心して細胞マスを除去する。豊富なアセトン抽出物を仕上げ、真空蒸留によって水性スラリーまで濃縮する。次いで、スラリーを酢酸ブチルで抽出し、有機抽出物を仕上げ、真空蒸留によって特定の容量まで濃縮し、冷却して生成物を結晶化させる。結晶スラリーをろ過し、母液を貯蔵して第二収量結晶を単離する。湿った結晶を熱酢酸ブチルに再度溶解させ、溶液を飽和するまで濃縮し、次いで、冷却して生成物を結晶化させる。結晶スラリーをろ過し、ケーキを分岐オクタンで洗浄し、乾燥する。生成物を酢酸ブチルまたはトルエンで再度結晶化して、品質を向上させる。
【００４６】
実施例１３
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）の１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）へのバイオ変換
約６ｇ／Ｌの基質濃度の１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（II）を用いる以外は、実施例１２の一般的手法に従い、かつ重要でない変形を行い、表記化合物を得る。
【００４７】
実施例１４
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）の１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）へのバイオ変換
【００４８】
１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３．２０−ジオン  １７アセテート（II）の１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）へのバイオ変換は震盪フラスコスケールにてＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０（ＡＴＣＣ  １２０１７）の液内培養を用いて行う。
【００４９】
（Ａ）一次−接種段階
Ｃ．ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０にいついての接種培地および接種条件は実施例１２に記載した通りである。
【００５０】
（Ｂ）二次−接種段階
シリコーン処理した５００ｍＬの点状震盪フラスコ中の１００ミリリットル二次接種培地を、栄養型一次−接種培養の一滴を用いて接種する。二次−接種培地は（逆浸透水１リットル当たり）：セルロース，２０ｇ；デキストリン，５０ｇ；大豆粉，３５ｇ；大豆油、３０ｍＬ、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール，０．２５ｍＬ；シリコーン系脱泡剤（ＳＡＧ４７１），０．５ｍＬ；プレ−滅菌ｐＨ＝２．９５ないし３．００、濃硫酸で調整を含む。２７５ｒｐｍに設定した制御された−環境インキュベーターシェーカー（２分軌道ストローク）を用い、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０を２８℃にて４８ないし５０時間インキュベートする。
【００５１】
（Ｃ）ステロイドバイオ変換
シリコーン処理した５００ｍＬの点状震盪フラスコ中の１００ミリリットルステロイド−バイオ変換培地を、３ｍＬの栄養型で二次−接種培養を用いて接種する（３．０％接種速度）。オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを０．２５ｍＬ／Ｌから２．５ｍＬ／Ｌまで増加させ、プレ−滅菌ｐＨを濃硫酸で３．９５ないし４．００に調整する以外は、ステロイド−バイオ変換培地は二次−接種培地と実質的に同一である。二次−接種培養で用いたのと実質的に同一のパラメーターを用い、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ  ＮＲＲＬ  ２３８０を２８℃にて最初にインキュベートする。接種からほぼ１７ないし１８時間後、１ｇの超微粉砕化１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７アセテート（II）を乾燥粉末として発酵に添加する。基質添加からほぼ２２ないし２４時間後、０．５ｍＬの硝酸アンモニウム溶液（５０ｍＬの逆浸透水当たり７．２ｇ）を発酵に添加し、震盪（２７５ｒｐｍ，２分軌道ストローク）しつつ、培養をさらに３７℃でインキュベートする。約０．９０ｇの１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）を含有する発酵醸造物では、バイオ変換は８ないし１１日以内に完了する。実施例１２に記載した手法に従い、バイオ変換培養を１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）につき周期的にアッセイする。
【００５２】
実施例１５
１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）の１１β，１１α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（ＩＶ）への変換
【００５３】
メタノール（２５％，６．０ｍＬ）中のナトリウムメトキシド（１．４１７５ｇ、２６．２４０３ｍＭ、１．０５当量）を、塩化メチレン（２４ｍｌ）およびメタノール（１０ｍｌ）メタノール中に１１β，１１α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III，実施例１２，９．９９６１ｇ，２４．９５７８ｍＭ）の混合物に添加する。混合物を２０ないし２５℃にて２時間攪拌する。次いで、反応を酢酸（１．６ｍｌ，１．６７８ｇ，２７．９５ｍＭ，１．１２当量）でクエンチし、水／メタノール（１／１；４０ｍｌ）で希釈し、２０ないし２５°にて１時間攪拌し、次いで、水（１００ｍｌ）で希釈し、減圧下で濃縮する。残渣をメタノール（２０ｍｌ）および（４０ｍＬ）で希釈した減圧下で濃縮し、スラリーをろ過する。ケーキを水（２０ｍｌ）で洗浄し、窒素気流によって乾燥して標記化合物を得る。
【００５４】
実施例１６
１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（ＩＶ）の１１β，１７α−ジヒドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）への変換
【００５５】
２５℃のメタノール（１１７）中の１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（ＩＶ，実施例１５，３０．００５０ｇ，８３．７００６ｍＭ）、酸化カルシウム（５．７２７５ｇ，１０２．１３ｍＭ，１．２２当量）、水酸化カルシウム（２３．２４８８ｇ，３１３．７９ｍＭ，３．７５当量）および臭化カルシウム（０．５７８６ｇ、２．８９４６ｍＭ，０．０３５当量）のスラリーを、定常速度にて、４時間にわたり、メタノール（１２０ｍｌ）中のヨウ素（４２．５０５２ｇ  １６７．４７ｍＭ，２．００当量）および臭化カルシウム（１０．８９７ｇ，５４．５１ｍＭ，０．６５当量）の混合物で処理する。反応混合物を低下の中途で０°まで冷却する。次いで、反応混合物を水（２．２５Ｌ）中の酢酸（９０ｍＬ）の溶液に注ぐ。得られたスラリーをろ過し、ケーキを窒素気流によって乾燥して、標記化合物を得る。
【００５６】
実施例１７
１１β，１７α−ジヒドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン（Ｖ）の１１β，１７α，２１−トリヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（ＶＩ）への変換
【００５７】
１１β，１７α−ドヒドロキシ−２１−ジヨード−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン(Ｖ，実施例１６,４５．００３３ｇ，７３．７４３３ｍＭ）を、６１０ｍｌアセトン中の酢酸(１１０ｍｌ，１１５．４ｇ，１．９２２モル, ２６．１当量)およびトリエチルアミン(１６７ｍＬ，１２１．２ｇ．１．１９８モル，１６．２当量）の混合物に添加する。得られた混合物を４５°にて２時間攪拌し、次いで、２０ないし２５°まで冷却し、減圧下で濃縮する。残渣を塩化メチレン（５００ｍＬ）中に取り、塩酸（５％，１８０ｍＬ）、続いて、飽和炭酸水素ナトリウム（３００ｍＬ）、続いて、水（３４０ｍＬ）で洗浄し、次いでカートリッジグレードのマグネゾル（９１．７２ｇ）のパッドを通してろ過し、塩化メチレン（１．２Ｌ）、続いてアセトン／塩化メチレン（５／９５；４００ｍＬ）で溶出される。合わせた溶出物を減圧下で約４００ｍＬまで濃縮し、メタノール（１５０ＭＬ）で希釈し、約３００ｍＬまで濃縮する。さらにメタノール（１５０ｍＬ）を添加し、混合物を２５０ｍＬまで濃縮する。さらにメタノール（１００ｍＬ）を添加し、混合物をさらに濃縮し、その際、生成物が結晶化する。スラリーを−１９℃まで冷却し、２時間攪拌し、次いで、ろ過する。ケーキをメタノール／水（１／１；３×２０ｍＬ）で洗浄し、窒素気流によって乾燥して表記化合物を得る。前記固形物の一部（３．９９４ｇ）を塩化メチレン／メタノール（２／１：４０ｍＬ）に溶解させ、減圧下で約３０ｍｌまで濃縮し、メタノール（１０ｍｌ）で希釈し、約１５ｍｌ（２×）まで濃縮してスラリーが得られ、これを−１９°まで冷却し、２時間攪拌し、ろ過する。ケーキをメタノール／水（１／１，０°；２×１０ｍｌ）で洗浄し、窒素気流によって乾燥する。
【００５８】
実施例１８
残存１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテートを除去するための１１β,１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）の結晶化
【００５９】
粗製１１β,１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III，１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（４．１３％）を含有する０．９１９５ｇの物質）をトルエン（１２ｍｌ）中で還流し、次いで、０°まで冷却し、イソオクタン（１２ｍｌ）で希釈し、ろ過する。ケーキをイソオクタン（３×３ｍｌ）で洗浄し、次いで、窒素気流によって乾燥して、９９．５％回収にて、１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（１．１２％，０８７７４ｇ）を含有する標記化合物を得る。濾液を濃縮して、１１β，１７α−ジヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテート（III）の１７．７６／８２．２４混合物よりなる固体とし、残存する１７α−ヒドロキシ−６α−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン  １７−アセテートを除去する。
【００６０】
【化２】
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【００６１】
【化３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004535805.tif 000035
2004535805.tif 000036
2004535805.tif 000037
2004535805.tif 000038