(57)【要約】本発明は、病原性細菌の検出のために使用され得るオリゴヌクレオチドに関する。これらのヌクレオチドを用いて、非病原性細菌から病原性細菌の選択を可能にする方法が適用され得る。好ましくは、細菌の検出にはPCRが含まれる。PCRのための陽性対照として使用され得るオリゴヌクレオチドもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を包含する、試料中のEHEC細菌の検出方法：
試料中のeae遺伝子座および/またはhlyA遺伝子座由来の配列と組み合わせる、Slt遺伝子座由来の核酸配列の存在の検出段階。
【請求項２】
検出段階が少なくとも1回のPCRを包含することを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
検出のために少なくとも1種のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、請求項1または2のいずれか1項記載の方法であって、オリゴヌクレオチドが配列番号：1〜83および93〜98、ならびにそれらの誘導体のいずれか1つから選択される少なくとも1種の配列を含む、方法。
【請求項４】
少なくとも1種のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法であって、オリゴヌクレオチドが、配列番号：1〜45および95〜98、またはそれらの誘導体のいずれか1つ（カテゴリーA〜Cの配列）から選択される少なくとも1つの配列、ならびに配列番号：46〜83および93および94ならびにそれらの誘導体（カテゴリーDおよびEの配列）から選択される少なくとも1つの配列を含む、方法。
【請求項５】
カテゴリーA〜Cのいずれか1つ由来のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、カテゴリーDおよびEのいずれか1つ由来のフォワードプライマーおよびリバースプライマーと組み合わせることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
配列番号：84〜92、およびそれらの誘導体のいずれか1つ（カテゴリーFの配列）から選択される少なくとも1種の配列を含むさらなるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
複数のオリゴヌクレオチドが多重PCRの範囲で、または少なくとも2つの別個の連続的PCRで使用されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
必要に応じて、検出が、増幅後に、試料由来の核酸を、EHECの検出のためのオリゴヌクレオチドを含有するバイオチップと接触させる段階を包含することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
以下から選択される少なくとも1つのさらなる段階を包含することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法：
・検出される核酸の増幅；
・検出される核酸のPCR増幅；
・検出される核酸の、適切なプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーション、ここでプローブが、好ましくは、配列番号：1〜98のいずれか1つを有する少なくとも1つの配列を含む核酸から選択され；
・検出される核酸を用いるリガーゼ連鎖反応；および
・検出される核酸の等温核酸増幅。
【請求項１０】
検出が得られた単位複製配列のオンライン検出を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
検出される核酸の増幅および/または検出をバイオチップ上で行うことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
配列番号：1〜98またはその誘導体のいずれか1つの配列を有する少なくとも1つの配列を含む核酸のいずれか1つから選択される、EHEC細菌の検出のためのオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
カテゴリーA〜Cのいずれか1つから選択される少なくとも1つの配列を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、ならびにカテゴリーDおよびEのいずれか1つから選択される少なくとも1つの配列、好ましくは1つの配列D、およびE由来の1つの配列を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの組み合わせ。
【請求項１４】
カテゴリーFから選択される少なくとも1つの配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項13記載の組み合わせ。
【請求項１５】
請求項12記載のオリゴヌクレオチド、または請求項13もしくは14のいずれか1項記載の組み合わせを含む、EHEC細菌の検出のためのキット。
【請求項１６】
EHEC細菌の検出のための、請求項12記載のオリゴヌクレオチドおよび/または請求項13もしくは14記載の組み合わせの応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、EHEC細菌の検出のための方法、およびこの検出のために適したオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
国際的な輸送および合理的な加工方法の時代において、食品を通して移動する病原性細菌の重要性が増大している。しばしば、その国の多くの異なる地域からの生の材料が集積地に一緒に集められ、徹底的に混合され、加工されて特定の食品を生成する。生の製品の1つが病原性細菌の担体であった場合、その細菌は製造プロセスの間に繁殖し得、大きなバッチの食品の汚染を引き起こし得る。
【０００３】
これに関連して、大腸菌（Escherichia coli）は非常に重要な病原性細菌として浮上してきた。大腸菌は、カンピロバクターおよびサルモネラに続いて、食品を汚染する細菌のうちで3番目に一般的なものである。この細菌は、通常、ヒトの腸内では無害な共生生物として存在する。しかし、大腸菌は、特定の病原性遺伝子を取り込み得、次いで致死的な危険性を示し得る。結果として、一連の大腸菌のサブタイプの全体が、高い潜在的な病原性を有するものと特徴付けられてきた。これらの中には、実際に大腸菌に体系的に分類される志賀菌属（Shigella）株が含まれる。また、言及する価値があるものとしては、特に、新生児/乳児に下痢疾患を引き起こすEPEC(腸病原性大腸菌)、熱安定性の細胞外毒素および熱不安定性の毒素を生成し、旅行者の下痢の主たる原因であるETEC(腸毒性大腸菌)、および小腸粘膜の細胞に侵入し細菌性赤痢を引き起こすEIECがある。
【０００４】
特に危険な病原性大腸菌株群は、EHEC（腸出血性大腸菌）である。EHEC群はまた、特に頻度が高く発生する血清型のO157:H7を含む。これは、この群の他のメンバーと同様に、致命的であり得る溶血性尿毒症症候群（HUS）を引き起こし得る。HUSは、出血を伴う下痢および急性腎不全を伴う。
【０００５】
事実上、EHECの固有の発生は、他の発生源、特にブタが、保有宿主（reservoir）として実証されたとはいえ、大部分はウシに制限されている。結果として、加工された牛肉製品、特に挽き肉は、しばしばEHECで汚染されている。何人かの食品の研究者達によると、挽き肉の試料の50%より多くがEHECに陽性であった。近年、他の食品（例えば、レタス、ダイコン、牛乳、および乳製品）がEHEC感染源として同定されてきた。
【０００６】
米国においては、ここ数十年の間、年間で20,000件を超える大腸菌O157:H7感染が発生し（Boyceら、1995、N.Engl.J.Med.333、364-368）、そのうち約250例が死に至った。しかし、診断が不完全なため、実際の数字はずっと高い可能性がある。欧州および日本では、O157:H7感染は主に夏に報告されている。対照的に、南半球においては、O157ではないEHEC血清型が特に重要性が高い。
【０００７】
EHEC株の潜在的な病原性は、その病原性因子によって決定される。結果として、Slt遺伝子（志賀菌（Shiga）様毒素すなわちvtr＝ベロ毒素の遺伝子）の存在が病原性のための必要条件であるが、これは十分条件ではない。加えて、他の因子が特徴付けられており（NataroおよびKaper、1998、Clin.Microb.Rev.11、142-201）、この因子は宿主に感染することが必要である。これらの因子の多くは、常にゲノム中にコードされているわけではなく、むしろ感染可能なプラスミド上またはファージゲノム中に位置する。従って、EHCE株に病原性因子を付与することはまた、経時的な変動を受けやすい可能性もある。
【０００８】
公知の方法を用いる、EHEC株の信頼できる診断的な検出は、実質的な問題を引き起こす。従って、微生物学的な方法は、信頼できる検出を得るためには適切ではない。非病原性大腸菌株と病原性のEHEC株との間の代謝生理学的な差異はほとんど存在しない。大腸菌O157:H7についてしばしば特徴的なuidA遺伝子（β-グルクロニダーゼ）の欠損（Cebulaら、1995、J.Clin.Microb.、33、248-250）は、EHEC群の特徴的な特徴ではない。この理由のため、診断方法は分子生物学的な特徴を拠り所にしなければならない。
【０００９】
過去において頻繁に使用された方法の1つは、ELISAによる血清型決定であった。しかし、この方法には多くの不利な点があった。なぜなら、この方法は比較的時間がかかり、多くの作業段階を必要とする。加えて、この方法の感度は、多くの診断的な適用のためには不十分である。さらに、血清型単独では病原性についての十分な特徴ではない。
【００１０】
大腸菌の株を区別する別の方法は、DNA配列における差異を調査することである。この技術は、特に、病原性株が特定の毒素の遺伝子を保有しているという事実に基づいている。例えば、志賀菌（Shiga）に類似する毒素遺伝子（志賀菌様毒素、slt遺伝子またはベロ毒素遺伝子、vtx）は、直接的に検出され得る（Takeshiら、1997、Microb.Immun.41、819-822、PatonおよびPaton、1999、J.Clin.Microb.37、3362-3365）。PCRは、この遺伝子の一部を増幅するために適用され得る。これらの断片は可視化され得、その結果これらは診断的な特徴として機能する。
【００１１】
この方法の不利な点は、slt遺伝子が病原性のための十分条件ではないという点である。他のDNA配列の特徴が、遺伝子型と病原性との間の明白な相関を確立するために必要である。slt遺伝子を保有する大腸菌株はVTEC（ベロ毒素生成大腸菌またはSTEC）と名付けられている。結果的に、これらはEHECよりも大きな群を形成している。
【００１２】
EHECまたはその下位集団についての他の遺伝子マーカーもまた試みられてきた。これらの遺伝子マーカーには、fimA遺伝子（Liら、1997、Mol.Cell.Probes、11、397-406）およびfliC遺伝子（Fieldsら、1997、J.Clin.Microb.35、1056-1070）が含まれる。しかし、これらはすべて、EHEC群の一部のみをマッピングするという不利な点を有する。
【００１３】
EHEC群は系統学的に体系的な単位を形成するわけではないので、それを通して明白に特徴付けられるような、遺伝的な多型性を見い出す困難な作業が発生する。このような多型性はまた、信頼できるものであるべきなので、多型性はEHEC遺伝子内での不均一性および遺伝的な不安定性も獲得する。特異的な検出は別として、多型性はまた、EHECの最も感度のよい検出を可能にするべきものである。
【００１４】
EHECとして分類される大腸菌についていくつかの検出系がすでに存在する。しかし、その検出系が免疫学的な検出に基づく場合、その感度は不十分である。加えて、抗体の検出は、外部からの夾雑物に対して非常に敏感である。食品からの抽出物は顕著な問題を提供する。なぜなら、それらは細菌の抗原表面を隠すか、またはそれらを破壊さえする。いくつかの表面抗原が露出した場合であっても、これらは、十分な感度を有する信頼できる検出を保証するには、しばしば少なすぎる。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の目的は、任意の試料中でEHEC細菌の信頼できる検出を保証し、かつ、試料中の他の成分（例えば、PCR阻害剤）、非病原性の細菌のDNAに起因するか、またはクエンチング現象（「オンラインPCRの最適化」の章で言及する）に起因する、起こり得る障害を最も低くする方法を提供することである。本発明の目的はまた、EHEC検出のために必要とされる手段を利用可能にすることである。
【００１６】
第1の問題は、EHEC細菌の検出のための方法によって本発明に従って解決される。検出方法は、試料中の、Slt遺伝子座および/またはeae遺伝子座および/またはhlyA遺伝子座由来の核酸配列の存在の検出段階を包含する。
【００１７】
第2の問題は、配列番号：1〜98および/またはその誘導体のいずれか1つを有する少なくとも1つの配列を含む核酸の1種から選択されるオリゴヌクレオチドによって、本発明に従って解決される。
【００１８】
定義
オリゴヌクレオチドの断片
オリゴヌクレオチドの断片は、オリゴヌクレオチドの5'末端および/または3'末端における1つまたは複数の欠失によって生じる。
【００１９】
遺伝子
本発明の遺伝子には、DNAのオープンリーディングフレームまたはコード領域が含まれる。また、シストロンは1つの遺伝子であるが、1つのmRNA上には他のシストロンが共存している。遺伝子の転写を調節するDNA領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、およびエンハンサーもまた、本発明の遺伝子に属する。
【００２０】
DNA配列の同一性/同一性の割合
DNA配列またはRNA配列の同一性(100%の同一性に対応する、完全なマッチングという意味において）の決定のために、より大きなポリヌクレオチドの部分配列が考慮される。これらの部分配列は、10ヌクレオチドを含み、次に10のモジュールすべてが2つの比較する配列について同一である場合に同一である。ヌクレオチドである、チミジンおよびウリジンは同一である。部分配列として、より大きなポリヌクレオチドのすべての可能な断片が考慮され得る。
【００２１】
例として、20ヌクレオチドを含みかつ5番目のモジュールが異なる2つのポリヌクレオチドが考慮される。配列比較において、同一である6通りの10個のヌクレオチドおよび同一でない5通りの10個のヌクレオチドが見出される。なぜなら、これらは1つのモジュールが異なっているからである。
【００２２】
さらに、同一性は徐々に決定されることが可能であり、そのために単位はパーセントで表される。同一性の程度の決定のために、部分配列もまた考慮され、この部分配列には実際に使用される配列の最低限の長さ（例えば、プライマーまたは20ヌクレオチドとして）が含まれる。
【００２３】
例として、100ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドA、および200ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドBが比較される。14ヌクレオチドの長さのプライマーがポリヌクレオチドBから得られる。同一性の程度の決定のために、ポリヌクレオチドAが、その完全長にわたってそのプライマーと比較される。そのプライマーの配列がポリヌクレオチドA中に存在するが、そのことによって、その配列が1つのモジュールで逸脱する場合、13:14→92.3%の同一性の程度を有する断片が存在する。
【００２４】
2番目の例において、先に言及したポリヌクレオチドAおよびBが全体にわたって比較される。この場合、20ヌクレオチドの長さの、可能性のあるすべての比較ウィンドウが適用され、それらについての同一性の程度が決定される。ポリヌクレオチドAおよびBのヌクレオチド番号50〜69が、ヌクレオチド番号55を除いて同一であれば、19:20→95%の同一性の程度がこれらの断片について生じることとなる。
【００２５】
多重PCR
多重PCRは、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちDNAもしくはRNAの増幅反応であり、ここでは、フォワードおよびリバースのプライマー対として見なされるものではない、3つ以上のプライマーが使用される。検出されるべきすべてのヌクレオチド標的分子の存在に際して、多重PCRは少なくとも2つの異なる単位複製配列の作製をもたらす。これらの単位複製配列は、少なくともプライマーが連結する領域において異なるべきであるが、これらの単位複製配列はまた、完全に異なる遺伝子に配置され得る。EHECの検出の場合、多重PCRは、SltI、SltII、eae、およびhlyAの群からなる、2つまたは3つの遺伝子の同時検出に使用する。
【００２６】
ヌクレオチド
ヌクレオチドはDNAまたはRNAのモジュールである。以下の略号を使用する：
G=グアノシン、A=アデノシン、T=チミジン、C=シチジン、R=GまたはA、Y=CまたはT、K=GまたはT、W=AまたはT、S=CまたはG、M=AまたはC、B=C、G、またはT、D=A、G、またはT、H=A、C、またはT、V=A、C、またはG、N=A、C、G、またはT、I=イノシン。
【００２７】
オンライン検出
本発明に関して、オンライン検出は以下の2つのプロセスの同時実行として定義される：DNAまたはRNAの検出、および検出可能な量のDNAまたはRNAの提供に導くプロセス。このプロセスでは、例えば、細胞からのゲノムDNA/RNAの遊離が含まれ得るか、または複雑な混合物からのDNA/RNAの濃縮もしくはポリヌクレオチドの増幅（例えば、PCRを通しての増幅）が含まれ得る。検出とは、DNA/RNAの存在およびあり得る量と相関するシグナルの認識である。PCRの場合には、このタイプのシグナルは、標的のDNAの増幅の増加とともに増大し得る。オンライン検出は、小型化した形態（例えば、チップ上）でもまた実行され得る。このシグナルは、例えば、プローブの蛍光分子を通して、放射性分子を通して、または酵素と共役した色もしくは蛍光強度を通して、生成され得る。
【００２８】
オンライン検出という用語は、リアルタイム検出と同義語である。
【００２９】
プライマー
プライマーは、PCRの際に開始分子として機能するオリゴヌクレオチドである。ここで、プライマーは標的分子（これは例えばDNAまたはRNAであり得る）にハイブリダイズし、ポリメラーゼによって伸長される。しかし、プライマーはまたプローブとしても機能し得る。
【００３０】
プローブ
プローブは、標的のDNA分子またはRNA分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。プローブは、これらの標的DNA分子またはRNA分子の直接的または間接的検出のために使用される。この目的のために、プローブは蛍光分子または発色剤を含有する分子と結合され得る。さらに、プローブはELISAを用いて間接的に検出され得る。特別なバージョンでは、2つのプローブが一定の様式で隣接してハイブリダイズする場合にのみ、それらのプローブはFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）を介したシグナルを生成する。この場合、プローブ上の発色剤は光ビームによって励起され、隣接したプローブの発色剤にその励起エネルギーを移動する。次いで、一定の波長の光を放射する。プローブは、プライマーとしてもまた使用され得る。
【００３１】
EHECおよびVTEC
EHECは腸出血性大腸菌およびVTECの下位集団である。血清型O157の大腸菌はEHECの下位集団である。
【００３２】
VTECはSltI(vtx1)またはSltII(vtx2)または両方の遺伝子のいずれかを保有することを特徴とする。EHECは、eae遺伝子および/またはhlyA遺伝子（インチミン（Intimine）をコードしている）もまた保有するVTECである。さらに、それらは、他の病原性遺伝子（例えば、hlyB、hlyC、fimA、fliCなど）の存在によって特徴付けられ得る。
【００３３】
Slt遺伝子座
Slt遺伝子座は、SltI遺伝子またはSltII遺伝子（これらはまた、vtxI resp.vtxIIとも呼ばれる）を含有する遺伝子座を意味する。この遺伝子座の核酸配列は、当技術分野の状況から公知である（例えば、Paton,A.W.ら、1995、Gene 153(1)、71-74）。この点において使用される場合、「遺伝子座」という用語は、各々の場合において、開始コドンの5'末端または停止コドンの3'末端に、コード領域とは別に1000ヌクレオチドの部分もまた含む。
【００３４】
eae遺伝子座およびhlyA遺伝子座
eae遺伝子座およびhlyA遺伝子座の配列もまた、当技術分野の状況より公知である（例えば、Makino,K.ら、1988、DNA Res.5(1)、1-9）。
【００３５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドの誘導体
本発明に係るオリゴヌクレオチドの誘導体とは、例えば、少なくとも1塩基の交換、挿入、欠失、または付加による、配列ｓ番号：1〜98に記載の特定の配列からの少なくとも1つのヌクレオチドにおいて異なる配列を意味するとみなされる。オリゴヌクレオチドの誘導体には、配列番号：1〜98の記載の特定の配列の1つに対して少なくとも80％同一であるオリゴヌクレオチド、および比較し得るハイブリダイゼーションの特異性を有するオリゴヌクレオチドもまた含まれる。後者は、核酸を含む特定の試料と同じハイブリダイゼーションのパターンを生じる誘導体（例えば、配列番号：1〜98のいずれか1つを有する特定の配列の1つを有するオリゴヌクレオチド）を意味する。
【００３６】
バイオチップ
バイオチップとは、例えばアフィメトリックス（AFFYMETRIX）によって市販されているハイスループット分析のための担体を意味する。このチップは、1つの担体上で多数の異なる核酸の試験を可能にする。
【００３７】
DNAの分析は、血清学的な検出と比較して実質的な利点を示す。なぜなら、DNA分析のための、標準化された、単純な精製方法が存在し、その方法を用いるとDNAは外部のマトリクスから分離でき、さらに精製が可能であるからである。細菌のゲノムのサイズに起因して、選択もまた、個々の配列モチーフの実質的な数から開始され得るが、一方、以前に言及した、露出した表面抗原の選択は比較的低効率である。
【００３８】
EHEC細菌の特異的検出のための配列として、Slt遺伝子座、eae遺伝子座、およびhlyA遺伝子座由来の配列が適切である。ここで、Slt遺伝子座および引用した別の遺伝子座由来の部分配列が分析試料中で検出され得る場合には、これは特定の試料中でのEHECの検出のために十分である。Slt遺伝子座を用いる場合、実際には2つの異なる遺伝子座（SltIおよびSltII）が含まれるが、それによって多数のEHEC株で2つの遺伝子座のうちの1つのみが生じる。単一の試料中でSlt遺伝子座およびeae遺伝子座の配列の同時検出は、十分に高い検査能力を提供する。Slt遺伝子座とhlyA遺伝子座の配列の同時検出は、同様の高い信頼性を有する。次いで、EHEC汚染に関する、特に高度である信頼性は、3つの異なる遺伝子座（Slt、eae、およびhlyA）の配列が1つの試料中で同時に検出される場合に得られる。
【００３９】
別の好ましい態様では、検査される核酸がPCRに回される。これによってEHEC細菌の核酸が試料中に存在する場合、EHEC特異的な単位複製配列が生成されるという結果になる。ここで、最も単純な場合において、PCRは1つのみのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる単純な直線的PCRとして準備され得るが、好ましくはそのPCRは、増幅される細菌の核酸の各々のゲノム部分についてのいわゆるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて行われる。
【００４０】
別の好ましい態様では、プライマーの組み合わせが使用され、それによって、配列番号：1〜45および95〜98（カテゴリーA〜Cの配列とも呼ばれる）のいずれか1つからの少なくとも1つの配列を含む、少なくとも1つのプライマーが選択され、配列番号：46〜83ならびに93および94（カテゴリーDおよびEの配列とも呼ばれる）のいずれか1つから選択される少なくとも1つの配列を含む、1つのプライマーが選択される。本発明によれば、上記のプライマーの誘導体は、検出のためにもまた使用され得る。その誘導体は、通常、配列番号：1〜98に規定されたプライマーによって示されるのと同じゲノム部分の増幅をもたらす。
【００４１】
別の好ましい態様では、カテゴリーA〜Cから選択されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマー対が、カテゴリーDおよびEから選択されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対とともに使用される。好ましい態様では、カテゴリーA〜Cのいずれか1つからのプライマー対を、カテゴリーDからのプライマー対およびカテゴリーEからの別のプライマー対とを組み合わせて使用する。
【００４２】
さらに好ましい態様では、本検出方法には、カテゴリーFの配列から選択された少なくとも1つの配列を含む別のプライマーの使用が含まれる。これらの配列は、大腸菌の属に特徴的なものである。結果的に、例えば、EHEC検出の好ましいストラテジーでは、分析試料は、最初にカテゴリーFから選択された配列を用いて分析され得る。陽性の結果は、分析試料中での大腸菌の存在を指摘する。第2の段階では、検出された大腸菌がEHEC群のメンバーであるか否かについて、カテゴリーA〜Eからの配列を使用して、より詳細に決定が行われ得る。カテゴリーFからの配列を用いるさらなる分析もまた、カテゴリーA〜Eからの配列を用いた分析の後に、付加的な測定として当然行われ得る。
【００４３】
さらに好ましい態様では、種々のオリゴヌクレオチド、すなわち種々のPCRの実行が多重PCRの形態で実行される。ここで、異なる単位複製配列が、種々のオリゴヌクレオチドの補助を用いる一度に開始される反応でPCRにおいて生成される。または、多重PCRはまた、異なるPCRに再分割され得、それによって連続的な一連のPCRが実行され、それによって各々のPCRは特異的プライマーまたはプライマー対を用いて実行される。両方の場合において、分析試料中にEHEC細菌が存在する場合には、EHEC細菌の存在を示すバンドのパターンが得られる。
【００４４】
さらに好ましい態様では、本発明の検出方法におけるいわゆるチップテクノロジー（バイオチップ）の使用が行われる。ここで、一方では、1つのチップ上の個々のスポットが異なる供給源由来の分析材料を含むという意味で、多数の異なる分析試料が1つのチップ上で分析され得る。他方では、このチップはオリゴヌクレオチドのセットを含み得、それによって各スポットは特定のオリゴヌクレオチドを含み、このオリゴヌクレオチドパターンは分析試料と接触させられる。分析材料がEHEC核酸を含む場合には、この核酸はチップ上に存在するEHECに特異的なプローブとハイブリダイズし、対応するシグナルパターンを生成する。
【００４５】
さらに好ましい態様では、本発明の検出方法は、例えば、検出される核酸の増幅のようなさらなる段階を包含し得、それによってこの方法は、好ましくは、PCRおよび/またはEHEC特異的なプローブを用いるサザンハイブリダイゼーションを使用して行なわれる。これによって、このハイブリダイゼーションは、検出される核酸を事前に増幅することなく、またはその核酸の増幅が完了した後に行われる。さらに、検出される核酸は、リガーゼ連鎖反応を用いて検出され得る。最終的に、検出される核酸は、等温核酸増幅によって濃縮され得る。
【００４６】
さらに好ましい態様では、標的の核酸の増幅はまた、オンライン検出を使用して行われ得る。
【００４７】
さらに好ましい態様では、検出される核酸の増幅および/または含有される単位複製配列の検出はバイオチップ上で行われ、それによって、1つのチップ上での増幅および検出を実行することが特に好ましい。
【００４８】
本発明によれば、上記の方法を実行するための手段として、オリゴヌクレオチドは、配列番号：1〜98もしくはその誘導体のいずれか1つを有する少なくとも1つの配列を含む核酸から選択される。上記のオリゴヌクレオチドは、一方ではPCRの範囲内でプライマーとして使用され得、他方では、プローブとしてもまた（例えば、サザンブロットハイブリダイゼーションの範囲内で）使用され得る。所望される検出の必要に依存して、当業者は、プライマーまたはプローブとしてのオリゴヌクレオチドの適切な組み合わせを作成し得る。
【００４９】
特に好ましい態様では、オリゴヌクレオチドの組み合わせが使用され、それによって少なくとも1つのオリゴヌクレオチドがカテゴリーA〜Cの配列から選択され、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドがカテゴリーDおよびEの配列から選択される。
【００５０】
別の特に好ましい態様では、本発明による組み合わせは、大腸菌の属に特異的であるカテゴリーFの配列から選択されたオリゴヌクレオチドをさらに含む。好ましくは、上記のオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせは、EHEC細菌の検出のためのキットの形態で使用される。そのために、そのキットは細菌の検出のためまたは検出反応を行うための他の試薬もまた含む。この点において、PCRのために必要とされる試薬および酵素、ならびに、適用可能である場合、適切な担体物質（例えば、チップテクノロジーで要求されるようなもの）もまたこのキットに含まれる。
【００５１】
従って、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み合わせは、任意の分析試料中のEHEC細菌の特異的かつ信頼できる検出のための適切な手段である。
【００５２】
本発明のポリメラーゼ連鎖反応では、個々のDNAポリヌクレオチドを増幅すること、および次いで極度に高い感度でこれらを検出することが可能である。この技術は、実質的に新しい機会を開くものであるが、新しい問題を示すものでもある。例えば、DNA増幅では、誤った断片が容易に増幅され得る。このことは、分析において誤った陽性の結果をもたらす。さらに、多数の可能性のある配列から、EHECに特徴的な診断用のDNA配列を選択することは非常に困難である。
【００５３】
2004519225.tif 000002
PCRによるEHECの検出および同時検出のフローチャート
【００５４】
本発明は、EHECの定性的および定量的な検出を可能にする方法およびオリゴヌクレオチドからなる。この方法はまた、大腸菌属および志賀菌属を検出するPCR反応についての陽性のチェックを含む。このことは重要である。なぜなら、陰性のEHECの知見では、PCR反応の正しい配列が保証されなければならないからである。この検出方法は、全部で4つの段階からなる：細菌の増殖、DNA/RNAの精製、ポリヌクレオチドの増幅、およびポリヌクレオチドの検出である。特定の方法において、最後の2つの段階はまた、同時に行われ得る。
【００５５】
細菌の増殖は、研究されるマトリクス（例えば、食品または糞便試料）が、現在利用可能な細菌培地とともにインキュベートされて行われる。細菌培地は市販されており、例えば、タンパク質加水分解的に消化した基本物質（例えば、ダイズブロス、胆汁酸塩）および緩衝剤（例えば、リン酸水素二カリウム）を含み得る。さらに、濃縮培地中で他の細菌と比較してEHECの増殖を促進する、阻害剤を濃縮培地に添加することも有利である。このような阻害剤は抗生物質（例えば、ノボビオシン）であり得る。
【００５６】
第2の段階ではポリヌクレオチドが精製される。この精製を行うために、細菌は、通常、遠心分離および/または濾過によって培地から最初に分離される。さらに洗浄段階を続けてもよい。次いで、細菌を分解する。この分解は、加熱、アルカリもしくは酸の環境、または細菌の細胞壁を不安定化する試薬（例えば、脱イオン化学薬品またはリゾチーム）によって行われる。ここで、ゲノムDNAもしくはRNAはPCR反応において直接使用され得るか、またはさらに精製される。この精製のために、ポリヌクレオチドが結合する表面上の材料（例えば、正に荷電した表面またはシリカ化合物表面）が適切である。この材料はカラムに充填することができ、市販されている。
【００５７】
PCR反応および単位複製配列の検出は、細菌の検出において最大の重要性を表す。すでに説明したように、EHECと他の細菌、特に無害な大腸菌株との間のDNA配列の差異を見出すことは非常に難しい。単一のDNAまたはRNAの領域の増幅を用いる単一のPCR反応単独では、菌株の限定を示すための非常に信頼性の高い根拠を提供することはないようである。本発明の好ましい要素は、EHECゲノムの種々の領域が同時におよび/または連続的に増幅され得ることである。好ましくは、さらなるDNA/RNA配列が分析を実施するための継続的な段階において増幅される。すべての有意な単位複製配列が同時に（例えば、1つのチップ上で）分析され得るならば、「最初の」増幅段階および「継続的な」増幅段階もまた、1回のPCR反応において、または1本のPCR反応容器中で実行され得る。プライマーおよびプローブの増幅のための重要事項（key）は以下に示す。
【００５８】
EHECの検出のためのシステムは、特定の組み合わせにおいてEHEC群を最適にマッピングするプライマーを使用可能にすることである。検出は、例えば、プライマーの多重配置によって実行される2つの独立したPCRで実行される。1回目の実行では、カテゴリーA，B，および/またはCのプライマーおよびプローブが用いられる。2回目の実行では、1回目の実行において陽性であった試料のみが使用される。2回目の実行では、カテゴリーDおよびEのプライマーおよびプローブが使用される。1つのカテゴリー内で、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが、各々の場合において互いに組み合わされ得る。従って、多くの標的DNAまたはRNA断片が1回の反応で同時に増幅される多重PCRが実行される。このプロセスに従って、存在する細菌の集団の非常に区別された画像が得られ得る。EHEC検出の感度に対する実用的な要求に依存して、および同時検出が可能である場合に、すべての検出プライマー（カテゴリーA＋B＋C、およびカテゴリーDまたはE、ならびにあり得るカテゴリーFについて）がまた、1回の多重PCRにおいて使用され得る。
【００５９】
（表１）フォワードプライマー、カテゴリーA
2004519225.tif 000003
【００６０】
（表２）リバースプライマー、カテゴリーA
2004519225.tif 000004
【００６１】
（表３）プローブ、カテゴリーA
2004519225.tif 000005
【００６２】
（表４）フォワードプライマー、カテゴリーB
2004519225.tif 000006
【００６３】
（表５）リバースプライマー、カテゴリーB
2004519225.tif 000007
【００６４】
（表６）カテゴリーC、フォワードプライマー
2004519225.tif 000008
【００６５】
（表７）カテゴリーC、リバースプライマー
2004519225.tif 000009
【００６６】
（表８）プローブ、カテゴリーB
2004519225.tif 000010
【００６７】
（表９）プローブ、カテゴリーC
2004519225.tif 000011
【００６８】
（表１０）カテゴリーD、フォワードプライマー
2004519225.tif 000012
【００６９】
（表１１）カテゴリーD、リバースプライマー
2004519225.tif 000013
【００７０】
（表１２）プローブ、カテゴリーD
2004519225.tif 000014
【００７１】
（表１３）カテゴリーE、フォワードプライマー
2004519225.tif 000015
【００７２】
（表１４）カテゴリーE、リバースプライマー
2004519225.tif 000016
【００７３】
（表１５）プローブ、カテゴリーE
2004519225.tif 000017
【００７４】
EHECの検出に加えて、本発明の方法の正確な配列を制御することは有利である。本発明は、大腸菌の、属特異的な検出を可能にするという点で、この制御を可能にする。特に、腸内細菌（例えば、シトロバクター属）に関する識別が有利である。なぜなら、多くの場合において、これらの細菌は、菌の間の（horizontal）遺伝子移動によって大腸菌から病原性遺伝子を受容したものであるからである。従って、VTECとしての誤った陽性の分類は避けられ得る。
【００７５】
大腸菌および志賀菌属は、分子生物学の観点による1つの単位を形成する。また、多くの分類学による分類では、これらの2つの属は、制御時に分離されない。このことは実際には非常に実用的である。なぜなら、微生物学的な慣用的な診断方法においては、これらの属の識別は通常行われないからである。
【００７６】
表16および17には、大腸菌および志賀菌属の検出を可能にするプライマーが含まれている。研究のために、同じDNA/RNA試料のアリコートがEHEC検出のために使用され得る。さらに、大腸菌制御反応を同時に（すなわち、EHEC検出と一緒に1つの反応容器中で）、または並行して実行することは可能である。さらに、大腸菌/志賀菌属の検出はまた、これらの属を他から識別するために適切である。
【００７７】
（表１６）カテゴリーF、フォワードプライマー
2004519225.tif 000018
【００７８】
（表１７）カテゴリーF、リバースプライマー
2004519225.tif 000019
【００７９】
（表１８）プローブ、カテゴリーF
2004519225.tif 000020
【００８０】
ゲル電気泳動およびDNAバンドの検出を介する単位複製配列の検出が行われ得る。または、単位複製配列は、プローブの補助で検出および定量され得る。プローブを、直接的または間接的に可視化することを可能にするために修飾する種々の方法が存在する。プローブは、リンカーとして機能するアンカー分子に結合され得る。この種のアンカー分子は、例えば、抗体によって認識されるタンパク質であり得る。この抗体は、発色反応を引き起こす酵素と結合され得、それによって検出が提供される。例えば、ペルオキシダーゼまたはカタラーゼが、これらの目的のために使用される。さらに、プローブはまた、放射能によって標識され得、それによって、放射能の測定が検出および定量をもたらす。
【００８１】
別の方法は、プローブに蛍光分子を結合させることである。この場合、この方法は、プローブが単位複製配列の単一鎖に結合した場合にのみ、蛍光が放射または検出されることを保証しなければならない。このことは、プローブ-単位複製配列ハイブリッドが、残存するPCR混合物から分離されることで達成され得る。例えば、プローブは、一本鎖の単位複製配列を「トラップ」する固相表面に結合され得、それによって遊離のプローブは洗い流される。
【００８２】
PCR産物のオンライン検出は、優秀な方法を提供する。この場合において、蛍光シグナルは、蛍光標識したプローブが単位複製配列上に存在する場合にのみ生成される。このことは、単位複製配列-プローブハイブリッドのプローブ部分が酵素によって選択的に分解される場合に行われ得る。また、プローブがそれ自体単位複製配列に結合した場合にプローブが開いた構造を取る（open up）ことによって、蛍光シグナルのクエンチングが打ち消される。
【００８３】
さらなる可能性は、2つの蛍光標識プローブが使用されることである。両方のプローブが隣接して1つの単位複製配列に結合したのみに、いわゆるFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）がシグナルを生成し得る（図1）。この方法は、いくつかの特異性のレベルが検出の構成部分であるという点で、実質的な利点を有する：第1には、プライマーは特定の標的分子に結合し、第2には、両方のプローブは「正しい」単位複製配列に結合しなくてはならず、かつ第3には、それらは正しい順番で隣接して配置されなければならない。この隣接する配置により、プローブ間の距離は、シグナルの首尾よい放射のための決め手となる。これらの要件の各々が、検出の特異性の増大に寄与する。
【００８４】
または、DNAの二重らせんと相互作用してシグナルを放射する蛍光分子もまた、存在する。しかし、PCR産物のこの非特異的な検出は、誤りを含む増幅産物もまた検出されるという点で不利である。
【００８５】
上記の説明に従って、この研究の実行は、多数の構成要素を必要とする。従って、1つまたはそれ以上のキットのパッケージ中でそれらを提供することが特に有利である。そのようなキットはまた、細菌を濃縮するための試薬および化学物質、DNAの単離および精製のための構成成分、ならびにPCRを実行するためおよび検出のための消耗品を含み得る。
【００８６】
以下の例により本発明を説明する
図1〜5は以下の条件下で作成した。
【００８７】
図1：
FRETの模式的過程を示す。ドナーおよびアクセプターについては、多数の組み合わせが使用できる。しかしながら、アクセプターの吸収スペクトルがドナーの発光スペクトルと重なることが重要である。そうしてこそ、ドナーの励起もまたアクセプターに十分強い蛍光をもたらすことが保証される。
【００８８】
図2:
カテゴリーDのプライマーを用いたEHECの検出。試験条件は、「PCRによるEHECの検出」の章における条件とほぼ同一である。アガロースゲルでの検出についても、上記の章に記載したように行う。
【００８９】
図3:
カテゴリーEのプライマーを用いたEHECの検出。試験条件は、「PCRによるEHECの検出」の章における条件とほぼ同一である。アガロースゲルでの検出についても、上記の章に記載したように行う。
【００９０】
図4：
この図は、リアルタイムPCRによるSltIおよびSltII遺伝子の増幅を示す。SltIおよびSltII遺伝子の検出を可能にするプローブを用いている。これらプローブには同じ蛍光色素（ライトサイクラーレッド（Lightcycler RED) 640およびフルオロセイン）を結合してあるので、検出は1つのチャネル(F2)でのみ行われる。SltII遺伝子の増幅とともに、14を超える振幅でシグナル曲線が生じるのが見られる。SltI遺伝子のシグナル曲線は、SltIIより有意に低い。SltIおよびSltII遺伝子の両方が存在するならば、振幅は最高値を示す。よって、これはSltIおよびSltII遺伝子の存在ならびに両遺伝子間の識別の指標となる。
【００９１】
図4より、様々なプローブを適用することにより、SltI遺伝子のシグナル振幅の高さに違いが生じることも認められる。ここで示した実験では、プライマー番号1 + 6および番号18 + 22、ならびにプローブ番号9 + 10（菌株番号1〜10）、プローブ番号95 + 96（菌株番号11〜20）、プローブ番号97 + 98（菌株番号21〜30）、およびプローブ番号34 + 35（菌株番号1〜30）を用いた。プローブは、色素フルオロセインおよびライトサイクラーレッド 640で標識した。検出は、640 nmの光波長で行った。
【００９２】
Slt1遺伝子のみを有する菌株（56ページの表を参照のこと）に関して、プローブ番号97 + 98を用いた時に最も高い振幅を生じたことが認められる。よって、このプローブ-プライマーの組み合わせがオンラインPCRに特に適している。
【００９３】
Slt遺伝子の検出：25（Slt2、eaeなし）// 5、15（Slt2、eaeなし）、3、4（Slt2 + eae）//2（Slt2、eaeなし）、13、14（Slt2 + eae）// 23（Slt2 + eae）// 24（Slt2 + eae）// 22（Slt2、eaeなし）// 12（Slt2、eaeなし）// 28、29、30（Slt1 + eae）、27（Slt1 + eae）、26（Slt1 + Slt2 + eae）// 6、16（Slt1 + Slt2 + eae）、7、8、9、10、17、18、19、20（Slt1 + eae）// 1、11、21（水）。
【００９４】
図5：
この図は、Slt遺伝子（図4）との多重PCRにおける、EHEC株についてのeae遺伝子の増幅およびリアルタイム検出を示す。
【００９５】
多重反応は、図4のプローブおよびプライマーを共に用いて行った。eae遺伝子の検出には、プライマー番号68 + 73およびプローブ番号93 + 94を用いた。プローブ番号93 + 94は、色素フルオロセインおよびライトサイクラーレッド 705を結合させた。検出は、710 nmの光波長で行った。
【００９６】
曲線が2群に分けられるのがわかる。振幅＞5の曲線は、eae遺伝子に関して陽性の結果を示す。この点で、eae遺伝子を有する菌株（図4の説明文、56ページの表を参照のこと）が関係している。振幅＜5の曲線は、陰性の結果を示す（水試料またはeae遺伝子をもたない菌株（試料1、11、21、5、15、25））。
【００９７】
PCRによるVTEC株の検出
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応によるVTEC株の検出に適している。全ゲノムを見ると、VTEC株は従来の大腸菌株とはわずかな違いしかない。従って、VTEC群を明確にマッピングするDNAまたはRNA配列を同定することは容易ではない。VTECは、例えば血清型などそれ自身の中で違いを示すこともあり、単一な配列特性は明確な検出を行う手段として適していない。
【００９８】
本発明は、一部は同時に、必要に応じ一部は連続的に検出に用いられる様々な遺伝子型特性の組み合わせに基づく。さらに、VTEC株の増幅および検出をするPCRの利点を活用するプライマーおよびプローブを提供する。
【００９９】
VTEC株の検出は、細菌の濃縮、DNA/RNAの遊離および単離、PCR、および（または同時に）単位複製配列の検出を含む様々な段階を踏んで行うことができる。
【０１００】
濃縮には、細菌を2 mlのLB培地（水1 lあたり、10 g バクトトリプトン、5 g 酵母エキス、10 g NaCl）に植菌し、37℃で一晩振盪する。次に、細菌培養液を遠心機で10,000×gにて遠心し、水100μlに再懸濁した。50μlの100 mM NaOHを添加し、5分後に細胞を可溶化した。続いて100μlの0.5 M トリス pH 8でこの溶液を中和した。その後、懸濁液を遠心機で10,000×gにて10分間遠心し、不溶性成分を除去した。この溶液のうち1μlを、それぞれのPCR反応に用いた。
【０１０１】
PCR反応は以下のように調製した。
試料量 - 1μl
10×PCR緩衝液 - 2.5μl
10 mM dNTP - 0.25μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーA - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーA - 0.2μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーB - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーB - 0.2μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーC - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーC - 0.2μl
50 mM MgCl2 - 0.75μl
5ユニット/μl Taqポリメラーゼ - 0.3μl
水 - 最終容量25μlとなるよう加える
【０１０２】
上記反応混合液を200μlの反応容器に入れしっかりと蓋を閉じ、以下のプロトコールに従いPCR装置中でインキュベートした。
95℃ - 5分
92℃ - 1分     ）
52℃ - 1分×35 ）
72℃ - 0.5分   ）
72℃ - 5分
【０１０３】
それぞれの反応において、カテゴリーA、B、C（表1〜9）のフォワードプライマー1つおよびリバースプライマー1つを反応混合液に用いた。例えば、以下の表に挙げた菌株の単位複製配列は、プライマー番号1、6、18、22、26、および30を用いて生成されたものである。それぞれの場合においてPCRにより生成されたバンドがエチジウムブロマイド染色した1％アガロースゲルで認められ、血清学的にVTECとして分類されるこれらの菌株について陽性の結果が得られた。
【０１０４】
（表）カテゴリーA〜Cのプライマーを用いたVTEC株の検出
2004519225.tif 000021
2004519225.tif 000022
2004519225.tif 000023
2004519225.tif 000024
【０１０５】
さらに、カテゴリーA、B、およびC由来の蛍光標識したプローブ対を用いて、即ち例えばプローブ配列番号：9、10、34、35、95、96、97、98、および40 + 41のプローブを用いて、単位複製配列を検出することができた。
【０１０６】
PCRによるEHEC株の検出
腸管出血性大腸菌は、食品を汚染する病原菌として重篤な下痢を引き起し得る。これらの大腸菌は、血性下痢および急性腎不全で特徴づけられるHUS（溶血性尿毒症症候群）の原因となる。この疾病は致死的となり得る。
【０１０７】
EHECは、系統的にVTECの亜群と見なすことができる。よって、検出は2段階で行うことができ、まず実施例1に基づきVTECを検出し、次に結果が陽性となったものについてEHECの検出を行う。
【０１０８】
この実施例では、以下の表に挙げた菌株を検査する。
2004519225.tif 000025
【０１０９】
EHEC株の検出は、細菌の濃縮、DNA/RNAの遊離および単離、PCR、および（できる限り同時に）単位複製配列の検出を含む様々な段階で行うことができる。
【０１１０】
濃縮には、細菌を2 mlのLB培地（水1 lあたり、10 g バクトトリプトン、5 g 酵母エキス、10 g NaCl）に植菌し、37℃で一晩振盪する。次に、細菌培養液を遠心機で10,000×gにて遠心し、水100μlに再懸濁した。50μlの100 mM NaOHを添加し、5分後に細胞を可溶化した。続いて100μlの0.5 M トリス pH 8でこの溶液を中和した。その後、懸濁液を遠心機で10,000×gにて10分間遠心し、不溶性成分を除去した。この溶液のうち1μlを、それぞれのPCR反応に用いることとした。
【０１１１】
PCR反応は以下のように調製した。
試料量 - 1μl
10×PCR緩衝液 - 2.5μl
10 mM dNTP - 0.25μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーA - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーA - 0.2μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーB - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーB - 0.2μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーC - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーC - 0.2μl
50 mM MgCl2 - 0.75μl
5ユニット/μl Taqポリメラーゼ - 0.3μl
水 - 最終容量を25μlとなるよう加える
【０１１２】
上記反応混合液を200μlの反応容器に入れしっかりと蓋を閉じ、以下のプロトコールに従いPCR装置中でインキュベートした。
95℃ - 5分
92℃ - 1分     ）
52℃ - 1分×35 ）
72℃ - 0.5分   ）
72℃ - 5分
【０１１３】
それぞれの反応において、カテゴリーA、B、C（表1〜9）のフォワードプライマー1つおよびリバースプライマー1つを反応混合液に用いた。例えば、プライマー番号1、6、18、22、26、および30を用いて単位複製配列を生成した。それぞれの場合においてPCRにより生成されたバンドがエチジウムブロマイド染色した1％アガロースゲルで認められ、血清学的にEHECと分類されるこれらの菌株について陽性の結果が得られた。
【０１１４】
陽性の結果が得られたDNAについては、2回目のPCRにて再び検査した。この反応では、カテゴリーDおよびEのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたPCRを使用する。以下のプロトコールにより行う。
試料量 - 1μl
10×PCR緩衝液 - 2.5μl
10 mM dNTP - 0.25μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーC - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーC - 0.2μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーD - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーD- 0.2μl
50 mM MgCl2 - 0.75μl
5ユニット/μl Taqポリメラーゼ - 0.3μl
水 - 最終容量を25μlとなるよう加える
【０１１５】
上記反応混合液を200μlの反応容器に入れしっかりと蓋を閉じ、以下のプロトコールに従いPCR装置中でインキュベートした。
95℃ - 5分
92℃ - 1分     ）
52℃ - 1分×35 ）
72℃ - 0.5分   ）
72℃ - 5分
【０１１６】
カテゴリーDのプライマーとして、例えば、プライマー番号46および54ならびに68および73の組み合わせが使用できる。このプライマー対を、平行して同時にPCR反応に使用することも可能である。2つの個々のPCR反応の結果を以下に説明する。
【０１１７】
図2および図3のバンドのサイズが異なるため、1回のPCR反応によりゲル中で2本のバンドとして検出することも可能である。さらに、前述のFRET技術でカテゴリーDおよびEのプローブ対を用いることにより、バンドを検出することが可能である。例えば、この目的にはプローブ番号60および61ならびに78および79が使用できる。
【０１１８】
EHEC検出の特異性
前述のように、EHECの検出は、好ましくはカテゴリーA〜CおよびD〜Eのプライマーを用いたPCR反応を含む少なくとも2段階で行う。この場合、1段階目で陽性の結果が得られたものについて、2段階目でさらに検査する。1段階目で陰性となれば、大腸菌が検出される適当な対照によりこの結果を確認する。さらに、カテゴリーA〜Cのプライマーにより、偽陽性の結果を決して示さないことが重要である。そのため、EHECの特異性を徹底的に調べた。結果を以下に示す。
【０１１９】
濃縮には、細菌を2 mlのLB培地（水1 lあたり、10 g バクトトリプトン、5 g 酵母エキス、10 g NaCl）に植菌し、37℃で一晩振盪する。次に、細菌培養液を遠心機で10,000×gにて遠心し、水100μlに再懸濁した。50μlの100 mM NaOHを添加し、5分後に細胞を可溶化した。続いて100μlの0.5 M トリス pH 8でこの溶液を中和した。その後、懸濁液を遠心機で10,000×gにて10分間遠心し、不溶性成分を除去した。この溶液のうち1μlを、それぞれのPCR反応に用いた。
【０１２０】
PCR反応は以下のように調製した。
試料量 - 1μl
10×PCR緩衝液 - 2.5μl
10 mM dNTP - 0.25μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーA - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーA - 0.2μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーB - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーB - 0.2μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーC - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーC - 0.2μl
50 mM MgCl2 - 0.75μl
5ユニット/μl Taqポリメラーゼ - 0.3μl
水 - 最終容量を25μlとなるよう加える
【０１２１】
上記反応混合液を200μlの反応容器に入れしっかりと蓋を閉じ、以下のプロトコールに従いPCR装置中でインキュベートした。
95℃ - 5分
92℃ - 1分     ）
52℃ - 1分×35 ）
72℃ - 0.5分   ）
72℃ - 5分
【０１２２】
それぞれの反応において、カテゴリーA、B、C（表1〜9）のフォワードプライマー1つおよびリバースプライマー1つを反応混合液に用いた。例えば、プライマー番号1、6、18、22、26、および30を用いて、以下の表に挙げた菌株の単位複製配列は生成されなかった。どの場合にも、PCRにより生成される目的サイズのバンドがエチジウムブロマイド染色した1％アガロースゲルで認められず、よって、これらの菌株について陰性の結果が示された。目的のDNA断片が増幅されなかったことから、カテゴリーA〜Cのプローブによる偽陽性も起こり得ない。このことも、実験的に証明された。
【０１２３】
（表）陰性対象として試験した菌種
2004519225.tif 000026
2004519225.tif 000027
【０１２４】
大腸菌陽性対照の使用
前述のように、EHEC株は本発明によると、プライマーA〜CおよびD〜Eを用いて2段階で検出される。1段階目のPCR反応により陽性の結果が得られれば、試料を2段階目でさらに検査する。一方、1段階目で陰性の結果が得られれば、VTECは存在せず、よってEHECも存在しない。しかしここで、実験誤差が排除できていることを保証する必要がある。EHECに関わる食品のほとんどすべてに大腸菌が存在することから、一つの可能性として大腸菌の検出が考えられる。食品に大腸菌株を混入させ、この無害な対照細菌を日常的に用いるという可能性がある。さらに衛生面から考えて、大腸菌の検出は多く望まれている。
【０１２５】
以下の表に挙げた細菌の純粋培養液から、一般的な標準方法によりゲノムDNAを単離した。これら調製品のうちそれぞれ約1〜10 ngを、単一の高濃度反応緩衝液（ライフテクノロジー社）中に各0.4μM等モルオリゴヌクレオチド混合物番号84〜87および0.4μMオリゴヌクレオチド番号88、2mM MgCl2、200μM dNTP（ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）社、dTTPの代わりにdUTPを使用した）、および0.03ユニット/μl Taqポリメラーゼ（ライフテクノロジー社）の存在下でPCRに使用した。以下に示した温度プロファイルにより、パーキンエルマー社製9600サーモサイクラー（Perkin Elmer 9600 Thermocycler）でPCRを行った。
2004519225.tif 000028
【０１２６】
PCR反応終了後、増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分画し、エチジウムブロマイド染色することにより可視化した。大腸菌または赤痢菌属の菌株DNAが存在する場合にのみ、351塩基対長の目的産物が観察された。ゲル内に分画されたDNAを一般の標準方法でナイロンフィルターに転写し、5'末端をビオチン標識したオリゴヌクレオチド番号91および92でハイブリダイズし、特異性を確認した。ハイブリダイゼーションは、5×SSC、2％ブロッキング試薬、0.1％ラウロイルサルコシン、0.02％ SDS、および5 pmol/mlプローブ中で52 ℃にて4時間行った。洗浄は、2×SSC、0.1％SDS中で52℃にて10分間で2回行った。検出は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸および4-ニトロブルーテトラゾリウム塩（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Manheim）社）存在下でアルカリフォスファターゼコンジュゲート（シグマ（Sigma）社製、エキストラビジン（ExtrAvidin)）を用いて、一般の標準方法にて行った。アガロースゲル上に351塩基対のバンドがあらかじめ認められた場合にのみ、フィルター上でバンドが観察された。よって、検査した大腸菌645菌株および赤痢菌32菌株すべてについて、その存在がPCRおよびハイブリダイゼーションにより検出された（以下の表を参照のこと）。一方、この種に属さない菌種については、検査したどの菌株もこのシステムでは検出されなかった。
【０１２７】
（表）大腸菌／赤痢菌群の検査した細菌一覧
2004519225.tif 000029
2004519225.tif 000030
2004519225.tif 000031
（表）大腸菌／赤痢菌群の検査した細菌一覧表
2004519225.tif 000032
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表）大腸菌／赤痢菌群の検査した細菌一覧表
2004519225.tif 000035
ATCC：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cultere Collection）（アメリカ、マナッサス）
BC：バイオテコン（BioteCon GmbH）社の菌株コレクション
DSM : ドイツ微生物コレクション（German Collection of Micro-organisms）（ドイツ、ブラウンシュワイク）
NCTC :ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャーズ（National Collection of Type Cultures）（イギリス、ロンドン）
+ = 陽性反応                  - = 陰性反応
(+) = 弱陽性反応              n.d. = 未検
【０１２８】
（表）大腸菌／赤痢菌群以外の検査した細菌一覧表
2004519225.tif 000036
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【０１２９】
Slt遺伝子の識別
VTECの特性は、2つの遺伝子SltI（志賀様毒素）もしくはSltIIのうちの1つ、または両遺伝子の存在である。これらの遺伝子は、vtx1およびvtx2としても知られている。VTECとEHEC株の型を明確に分類するため、これらの遺伝子またはこれら遺伝子の変異型の存在についてさらなる識別が行われ得る。このようにして、これら病原性大腸菌株の伝播および進化についても重要な情報を得ることができる。さらに、様々なSltIもしくはSltII変異型または両遺伝子の存在によって、病理学的潜在能力が変化するという指摘もある。
【０１３０】
SltI遺伝子とSltII遺伝子を識別するためには、カテゴリーAまたはカテゴリーB + Cのプライマーが利用可能である。
【０１３１】
PCR反応I)は以下のように調製した。
I)
試料量 - 1μl
10×PCR緩衝液 - 2.5μl
10 mM dNTP - 0.25μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーA - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーA - 0.2μl
50 mM MgCl2 - 0.75μl
5ユニット/μl Taqポリメラーゼ - 0.3μl
水 - 最終容量25μlとなるよう加える
【０１３２】
上記反応混合液を200μlの反応容器に入れしっかりと蓋を閉じ、以下のプロトコールに従いPCR装置中でインキュベートした。
95℃ - 5分
92℃ - 1分     ）
52℃ - 1分×35 ）
72℃ - 0.5分   ）
72℃ - 5分
【０１３３】
反応混合液には、カテゴリーA（表1〜9）のフォワードプライマー1つおよびリバースプライマー1つをそれぞれ用いた。
【０１３４】
さらなるPCR反応II)には、以下の混合液を調製した。
II)
試料量 - 1μl
10×PCR緩衝液 - 2.5μl
10 mM dNTP - 0.25μl
10μM フォワードプライマー
カテゴリーB + C - 0.2μl
10μM リバースプライマー
カテゴリーB + C - 0.2μl
50 mM MgCl2 - 0.75μl
5ユニット/μl Taqポリメラーゼ - 0.3μl
水 - 最終容量25μlとなるよう加える
【０１３５】
上記反応混合液を200μlの反応容器に入れしっかりと蓋を閉じ、以下のプロトコールに従いPCR装置中でインキュベートした。
95℃ - 5分
92℃ - 1分     ）
52℃ - 1分×35 ）
72℃ - 0.5分   ）
72℃ - 5分
【０１３６】
反応混合液には、カテゴリーB + C（表1〜9）のフォワードプライマー1つおよびリバースプライマー1つをそれぞれ用いた。
【０１３７】
PCR反応の結果を以下の表にまとめる。約500〜700 bpの大きさのバンドとなる単位複製配列が増幅された場合に、陽性の結果が得られた。このバンドは、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲル上で可視化した。
【０１３８】
（表）SltI遺伝子とSltII遺伝子との識別
2004519225.tif 000039
【０１３９】
カテゴリーA、B + C の各々のプライマーは、コンセンサスプライマーとして、SltI（カテゴリーA）およびSltII（カテゴリーB + C）遺伝子のサブタイプを増幅するためにも用いられる。これらのサブタイプは、カテゴリーA、B + Cそれぞれについて一覧表にしたような特異的プローブを用いて識別され得る。現時点でサブタイプは未知であるが、これらのカテゴリーのプローブを経験的に評価し、サブタイプに割り当てることが可能である。プローブが多数あるため、サブタイプに特有の陽陰性パターンが生じる。さらに、カテゴリーAおよびB + Cのプライマーにより、増幅およびそれに続く単位複製配列の配列決定が容易になる。また、例えば質量分析、バイオチップ上でのハイブリダイゼーション、「分岐点移動阻害」、またはSNP（一塩基多型）解析を可能にしたり専門家に既知の他の技術といったような技術も応用され得る。
【０１４０】
オンラインPCRの最適化
オンラインPCRにより、単位複製配列の増幅および検出が同時に行われる。検出する単位複製配列に応じて、1〜2色の標識プローブをPCR混合物に加える。
【０１４１】
次に、例えば5'ヌクレアーゼアッセイ法（タックマン（Taqman）プローブ）を用いて、分子ビーコン（molecular beacon）、スコーピオン（Scorpion）アッセイ法、または前述のFRET技術を利用して、単位複製配列の検出を行うことができる。
【０１４２】
特に後者において、用いるプローブ対のどれが最適であるかは経験によってのみ決定され得る。得られる蛍光シグナルが弱すぎて、信頼度が高く再現性のある結果を得られないことも多い。さらに、複雑なPCR混合物においてはプローブが他のプローブまたはプライマーと二量体を形成することもあり、そうなるとオンライン検出ができない。
【０１４３】
EHECの検出では、Slt遺伝子（→VTEC）とeae遺伝子の両方を単一の多重PCR反応で増幅し（Slt遺伝子＋eae遺伝子＝EHEC）、続いてそれらを同時に検出することが利点となり得る。この場合、反応成分のきわめて厳密な調和が要求される。ヌクレオチドの消費により、2つのDNAターゲット領域のうち一方の増幅が妨げられ得る。これは、DNAの増幅がもう一方のDNAの増幅により抑制されることを意味する。よって、PCR混合物の成分すべてについて、抑制が起こらないような調和を相互にとる必要がある。
【０１４４】
これは、プライマー濃度が制限される場合にも起こり得る。1つのSlt遺伝子のみの検出がVTECとしての分類に適当であることから、ここでは、抑制はSlt遺伝子間の問題ではないと考える必要がある。従って、SltIおよびSltII特異的プライマーの量は減じて添加できる。その濃度は、プライマー対およびPCR反応あたり300〜200 nMの範囲でよい。一方、より高いSlt DNA濃度の存在下で低いeae DNA濃度も検出できるようにするため、eae遺伝子の場合にはプライマー濃度はより高くすべきである（310〜440 nM）。
【０１４５】
Slt遺伝子の増幅に起因する抑制を防ぐさらなる方法は、eae特異的プライマーには最適でありSltIおよびSltII特異的プライマーには最適とは言えないアニーリング温度を選択することである。より明確に言えば、すべてのSltプライマーの最適温度より最大5℃まで上げることができる。熱力学的融点は、プライマーの最適温度と見なすことができる。
【０１４６】
eae遺伝子がSltIおよびSltII遺伝子に対して過剰に存在する、または他の理由によりSltの検出を抑制する場合には、抑制を防ぐ方法を交換して使用できる。
【０１４７】
以下に、Sltおよびeae遺伝子の同時増幅を可能にするPCR条件を示す。
【０１４８】
PCR反応は以下のように調製する。
試料量 - 1μl
10×PCR緩衝液 - 2μl
安定剤  - 5.53μl
10 mM dNTP - 0.40μl
10〜4μM フォワードプライマー（初期溶液）
配列番号：1、18、68 - 0.2μl
10〜4μM リバースプライマー
配列番号：6、22、73 - 0.2μl
10μM プローブ
配列番号：93、94、95、96、97、98、9、10、35、34
50 mM MgCl2 - 1.6μl
1ユニット/μl Taqポリメラーゼ - 1μl
水 - 最終容量20μlとなるよう加える
【０１４９】
ライトサイクラーにおける温度サイクル。
92℃ - 0分     ）
57℃ - 1分×45 ）
72℃ - 0.5分   ）
72℃ - 5分
【０１５０】
図4は、リアルタイムPCRによるSltIおよびSltII遺伝子の増幅を示す。SltIおよびSltII遺伝子両方の検出を容易にするプローブを使用した。これらプローブにはそれぞれ同じ蛍光色素（ライトサイクラーレッド 640およびフルオロセイン）を結合してあるので、検出は1つのチャネル(F2)でのみ行われた。SltII遺伝子の増幅とともに、14を超える振幅でシグナル曲線が生じるのが確認できる。SltI遺伝子のシグナル曲線は、SltIIより有意に低い。SltIおよびSltII遺伝子の両方が存在するならば、振幅は最高値を示す。よって、これはSltIおよびSltII遺伝子の存在ならびに両遺伝子間の識別の指標として適当である。
【０１５１】
図4より、様々なプローブを適用することにより、SltI遺伝子のシグナル振幅が変化することも認められる。この図では、プローブ番号9 + 10（菌株番号1〜10）、番号95 + 96（菌株番号11〜20）、番号97 + 98（菌株番号21〜30）、および番号34 + 35（菌株番号1〜30）をプライマー番号1 + 6および18 + 22とともに用いた。さらに、eae遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド（以下を参照のこと）は、PCR混合液中に存在する。
【０１５２】
eae遺伝子は、蛍光色素ライトサイクラーレッド 705およびフルオロセインを結合したプローブにより検出した。よって、この場合、Slt遺伝子で用いたチャネル (F2)とは異なるチャネル(F3)で検出される。eaeの検出には、プローブ番号93 + 94およびプライマー番号68 + 73を用いた。図5において、すべてのeae陽性株が5を超えるシグナル振幅を生じることが認められうる。
【０１５３】
（表）リアルタイムPCRで用いたVTEC/EHEC株の病原性遺伝子の存在
2004519225.tif 000040
上記表の同列にある菌株は、それぞれ同一である（例えば、2 = 12 = 22)。
【０１５４】
本発明の目的として、EHECまたはVTECの検出に特に適切なオリゴヌクレオチドを供給する。これらのオリゴヌクレオチドの番号内には、この検出に特に適切なものがいくつかある。それについて、以下の表にまとめる。
【０１５５】
（表）病原性大腸菌の検出に好ましいオリゴヌクレオチドの組み合わせ
2004519225.tif 000041
【０１５６】
アガロースゲル中で単位複製配列の視覚的指標によってのみ検出する場合には、上記表に挙げたプローブは多重混合液から省くことができる。
【０１５７】
（表）リアルタイムEHEC PCRの最適化
2004519225.tif 000042
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】FRET原理を模式的に示す。
【図２】カテゴリーDのプライマーを用いたPCR産物を示す。
【図３】カテゴリーEのプライマーを用いたPCR産物を示す。
【図４】EHEC株についてのSltlおよびSltll遺伝子の増幅およびリアルタイム検出を示す。
【図５】Slt遺伝子との多重PCR反応における、EHEC株についてのeae遺伝子の増幅およびリアルタイム検出を示す。
【図１】
2004519225.tif 000043
【図２】
2004519225.tif 000044
【図３】
2004519225.tif 000045
【図４】
2004519225.tif 000046
【図５】
2004519225.tif 000047
【国際公開パンフレット】
2004519225.tif 000048
2004519225.tif 000049
2004519225.tif 000050
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2004519225.tif 000130
2004519225.tif 000131
2004519225.tif 000132
2004519225.tif 000133
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004519225.tif 000134
【国際調査報告】
2004519225.tif 000135
2004519225.tif 000136
2004519225.tif 000137
2004519225.tif 000138
2004519225.tif 000139
2004519225.tif 000140
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