(57)【要約】ミトコンドリア機能障害に関連する疾患の処置のための化合物、組成物および方法が提供される。この方法は、ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害から生じた症状を処置するために十分な量のピリミジンヌクレオチド前駆体を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。本発明は、ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響を予防するための方法を提供し、この方法は、病態生理学的影響を予防するのに有効な量のピリミジン前駆体を哺乳動物に投与する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響を処置および予防するための方法であって、該方法は、このような処置および予防の必要のある該哺乳動物に、該影響を処置および予防するのに有効な量で組み合わせて、ピリミジン前駆体およびクレアチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記呼吸鎖機能障害が、ミトコンドリアＤＮＡの変異、欠失、または転座によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記呼吸鎖機能障害が、前記ミトコンドリア呼吸鎖の核コードタンパク質成分の欠損によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記呼吸鎖機能障害が、加齢によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記呼吸鎖機能障害が、前記哺乳動物への細胞傷害性癌化学療法剤の投与によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記呼吸鎖機能障害が、ミトコンドリア複合体Ｉの活性の欠損である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記呼吸鎖機能障害が、ミトコンドリア複合体ＩＩの活性の欠損である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記呼吸鎖機能障害が、ミトコンドリア複合体ＩＩＩの活性の欠損である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記呼吸鎖機能障害が、ミトコンドリア複合体ＩＶの活性の欠損である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記呼吸鎖機能障害が、ミトコンドリア複合体Ｖの活性の欠損である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ピリミジンヌクレオチド前駆体が、ウリジン、シチジン、ウリジンのアシル誘導体、シチジンのアシル誘導体、オロチン酸、オロチン酸のアルコールエステル、またはそれらの薬学的に受容可能な塩からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ピリミジンヌクレオチド前駆体が、シチジンのアシル誘導体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ピリミジンヌクレオチド前駆体が、ウリジンのアシル誘導体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウリジンのアシル誘導体が、２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチルウリジンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウリジンのアシル誘導体が、２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ピルビルウリジンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記オチロン酸のアルコールエステルのアルコール置換基が、エタノールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ピリミジンヌクレオチド前駆体が、シチジンジホスホコリンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ピリミジンヌクレオチド前駆体が、経口投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ピリミジンヌクレオチド前駆体が、１日あたり体重１ｋｇあたり１０〜１０００ｍｇの用量で投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ピリミジンヌクレオチド前駆体が、１日あたり体重１ｋｇあたり１００〜３００ｍｇの用量で投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響が、先天性のミトコンドリア性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記先天性のミトコンドリア性疾患が、ＭＥＬＡＳ、ＬＨＯＮ、ＭＥＲＲＦ、ＭＮＧＩＥ、ＮＡＲＰ、ＰＥＯ、リー病、およびキーンズセイアー症候群からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響が、神経変性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経変性疾患が、ハンティングトン病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記神経変性疾患が、認知機能の年齢関連性の減退である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響が、神経筋の変性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記神経筋の変性疾患が、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、慢性疲労症候群、およびフリートライヒ運動失調からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響が、認知機能、運動機能、言語機能、実行機能、または社会的技能の発達遅延である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響が、癲癇、末梢性ニューロパシー、眼性ニューロパシー、自立性ニューロパシー、神経性腸機能障害、感音難聴、神経性膀胱機能障害、片頭痛、および運動失調症からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響が、尿細管性アシドーシス、拡張性心筋症、脂肪蓄積肝炎、肝不全、および乳酸血症からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
以下：
ａ）ピリミジンヌクレオチド前駆体またはそれらの薬学的に受容可能な塩、および
ｂ）クレアチン
を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先行出願の参照）
本願は、米国特許出願０９／１４４，０９６（１９９８年８月３１日出願）の一部継続出願である、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１９７２５（１９９９年８月３１日国際出願）の３５米国特許法§３７１の下の国内段階出願である、米国特許出願番号０９／７６３，９５５の一部継続出願であり、これらの内容は本明細書によって参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ミトコンドリア機能障害に関連する疾患、発達遅延、および症状の処置および予防のための化合物および方法に関する。ピリミジンヌクレオチド前駆体は、ミトコンドリア機能障害の代償の目的およびミトコンドリア機能の改善の目的のために、哺乳動物（ヒトを含む）に投与される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ミトコンドリアは、ほとんどの真核生物細胞に存在する細胞内小器官である。その主な機能の１つは、酸化的リン酸化であり、これは、グルコースまたは脂肪酸のような燃料の代謝に由来するエネルギーをＡＴＰに転換するプロセスであり、次いでこのＡＴＰは、種々のエネルギーを必要とする生合成反応および他の代謝作用を駆動するために使用される。ミトコンドリアは、核ＤＮＡとは別個のミトコンドリア独自のゲノムを有し、これは、ヒト細胞において約１６，０００塩基対を有するＤＮＡのリングを含む。各ミトコンドリアは、多コピーのミトコンドリアＤＮＡを有し得、そして個々の細胞は数百のミトコンドリアを有し得る。
【０００４】
ミトコンドリア機能障害は、種々の疾患状態に寄与する。いくつかのミトコンドリア性疾患は、ミトコンドリアゲノムにおける変異または欠失に起因する。ミトコンドリアは、その宿主細胞よりも速い代謝回転速度で分裂および増殖し、その複製は、核ゲノムの制御下である。細胞における許容限界割合（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）のミトコンドリアに欠陥がある場合、そして組織内の許容限界割合のこのような細胞が欠陥型ミトコンドリアを有する場合、組織または器官の機能障害の症状が生じ得る。事実上、いかなる組織も影響を受け得、異なる組織が含まれる程度に依存して、多様な症状が存在し得る。
【０００５】
受精した卵は、正常ミトコンドリアおよび遺伝的欠陥型ミトコンドリアの両方を含み得る。この卵の分裂の間、異なる組織中への欠陥型ミトコンドリアの分離は、（細胞内でのミトコンドリア代謝回転の間に、欠陥型ミトコンドリアゲノムに対するポジティブ選択またはネガティブ選択が存在し得るが、）所定の組織または細胞内の正常ミトコンドリアに対する欠陥型ミトコンドリアの比率と同じ確立過程である。従って、多様の異なる病理学的表現型は、ミトコンドリアＤＮＡにおける特定の点変異から現れ得る。逆に、類似の表現型は、ミトコンドリアＤＮＡ内で異なる遺伝子に影響する変異または欠失から現われ得る。先天性のミトコンドリア性疾患の臨床的症状は、しばしば、脳、筋肉、視神経および心筋のような高エネルギーを必要とする分裂後組織において現われるが、他の組織（内分泌腺、肝臓、胃腸管、腎臓および造血組織を含む）もまた、発達期間のミトコンドリアの分離、およびミトコンドリアの代謝回転時間の動力学に部分的に依存してさらに関与する。
【０００６】
遺伝的な欠陥型ミトコンドリアに関する先天性障害に加えて、後天性のミトコンドリア機能障害は、疾患、特に、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティング病のような加齢に関連する神経変性障害に寄与する。ミトコンドリアＤＮＡにおける体細胞変異の発生率は、加齢に伴って指数関数的に上昇する：減少した呼吸鎖活性が老人において一般的に見出される。ミトコンドリア機能障害はまた、癲癇または虚血に関係するような、興奮毒性神経損傷に関与する。
【０００７】
これまで、ミトコンドリア機能障害に関与する疾患の処置は、ミトコンドリア呼吸鎖の特定エレメントによって使用されるビタミンおよび補因子の投与を含んだ。補酵素Ｑ（ユビキノン）、ニコチンアミド、リボフラミン、カルニチン、ビオチン、およびリポ酸は、ミトコンドリア性疾患（特に、これらの補因子のうちの１つの主な欠損から直接生じる障害）を有する患者において、特別な利益を伴って使用される。しかし、単一の症例において有用であっても、このような代謝性補酵素またはビタミンは、ミトコンドリア性疾患の処置の臨床的実施における一般的な有用性を有することを示していない。同様に、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）は、ＭＥＬＡＳのようなミトコンドリア細胞病態（ｃｙｔｏｐａｔｈｙ）を処置するために使用される；ＤＣＡは、乳酸の生成を阻害し、そしてミトコンドリア性疾患（過剰な乳酸蓄積自体が症状に寄与する）の症例において主に有用である。しかし、ＤＣＡは、それ自体ミトコンドリア機能不全に関連する症状を説明せず、そして潜在的な分子的欠陥に依存して、幾人かの患者に対して毒性であり得る。
【０００８】
ミトコンドリア性疾患は、（異なる組織における欠陥型ミトコンドリアの確率的分布によってさらに複雑になる疾患の表現型発現を伴う）非常に多様な分子病変または欠陥によって引き起こされる障害を含む。
【０００９】
共有に係る米国特許第、５，５８３，１１７号は、シチジンおよびウリジンのアシル化誘導体を開示する。共有に係る特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ  ９６／１００６７は、化学療法剤および抗ウイルスピリミジンヌクレオシドアナログの毒性を減少させるための、アシル化ピリミジンヌクレオシドの使用を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の目的）
本発明の目的は、哺乳動物（ヒトを含む）において、ミトコンドリア機能障害またはミトコンドリア呼吸鎖機能障害に関係する障害または病態生理学的影響を処置するための組成物および方法を提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、インビボでのミトコンドリア機能障害に対する組織耐性を改善するための化合物および組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の目的は、ミトコンドリア性疾患の処置のための組成物および方法を提供することである。
【００１３】
本発明の目的は、多くの症例において、ミトコンドリア性障害における分子病変の正確な診断が困難であるので、広範な分子病態に関わるミトコンドリアの欠損を広範に代償する薬剤を提供することである。
【００１４】
本発明の目的は、特定の分子失陥にかかわらず、ミトコンドリア電子伝達鎖欠損の場合において有用なミトコンドリア性疾患のための実際の処置を提供することである。
【００１５】
本発明の目的は、ミトコンドリアＤＮＡ欠陥に関係する比較的まれな先天的疾患だけでなく、小児期に現われる重大な神経筋および神経発達の障害、ならびに一般に加齢に関連するアルツハイマー病またはパーキンソン病のような変性疾患についても提供する。
【００１６】
本発明の目的は、神経変性疾患および神経筋疾患の処置および予防のための組成物および方法を提供することである。
【００１７】
本発明の目的は、神経組織に対する興奮毒性損傷の処置および予防のための組成物および方法を提供することである。
【００１８】
本発明の目的は、癲癇の処置および予防のための組成物および方法を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は、片頭痛の処置および予防のための組成物および方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、哺乳動物（ヒトを含む）において、分裂後の細胞の死または機能障害を予防するための組成物および方法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的は、神経発達遅延障害の処置のための組成物および方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、低酸素症または虚血に起因する組織損傷を処置または予防するための組成物を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、卵巣の機能障害、閉経、または閉経の二次的影響（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｍｅｎｏｐａｕｓｅ）を処置または予防するための組成物および方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、化学療法誘導性ミトコンドリア損傷に起因する癌化学療法の副作用を軽減するための組成物および方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、ミトコンドリア性疾患および機能障害を診断するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物において、ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響を処置するための方法を提供し、この方法は、このような処置の必要のある哺乳動物に、病態生理学的影響を低減するのに有効な量のピリミジン前駆体を投与する工程を包含する。さらに、本発明は、ミトコンドリア呼吸鎖の機能障害の病態生理的影響を予防するための方法を提供し、この方法は、病態生理学的影響を予防するのに有効な量のピリミジン前駆体を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００２７】
ミトコンドリア性疾患において、本発明の化合物および組成物は、呼吸鎖欠陥から生じる臨床的後遺症を緩和するために有用である。ミトコンドリア性疾患の基因である呼吸鎖失陥は、種々の因子によって引き起こされる。これらの因子は、ミトコンドリアＤＮＡにおける先天的または遺伝的な変異および欠失、呼吸鎖作用に影響する核コードタンパク質の欠損、ならびに体細胞変異、増加した細胞内カルシウム、興奮毒性、一酸化窒素、低酸素症および軸索輸送欠陥を含む。
【００２８】
本発明は、ミトコンドリア呼吸鎖欠損を有する分裂後細胞の死および機能障害を予防または減少するための化合物、組成物および方法を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、言語機能、運動機能、実行機能、認知技能および神経心理学的社会的技能における神経発達遅延を処置するための化合物、組成物および方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、ミトコンドリア欠陥が寄与する状態として本明細書中に開示される障害および状態を処置すること、このようにしてその状態が、本発明の化合物および組成物を用いて処置を受けることに関する。これらとしては、末梢神経ニューロパシー、ネフロパシー、疲労、および早期閉経、ならびに排卵異常およびその正常な閉経のような、癌化学療法の副作用が挙げられる。
【００３１】
本発明はまた、ピリミジンヌクレオチド前駆体を用いて患者を処置すること、および選択された症状および徴候における臨床的利点を評価することによって、ミトコンドリア性疾患を診断する方法に関する。
【００３２】
本発明、ならびにこの他の目的、特徴および利点は、以下の実施例において考察される実験に伴う結果を参照して読まれる場合、以下の詳細な説明からより明確に、かつ十分に理解される。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ミトコンドリア機能不全（特に、ミトコンドリア呼吸鎖の構成要素の活性における欠損）に対して二次的な種々の臨床的障害を、処置または予防するための、化合物、組成物、および方法に関する。このような障害としては、先天性ミトコンドリア細胞障害、神経発達遅延、加齢性神経変性疾患、ならびに心臓、抹消神経および自律神経、骨格筋、膵臓および他の組織および器官に影響を及ぼす特定の疾患が挙げられる。
【００３４】
（Ａ．定義）
「ミトコンドリア性疾患」とは、哺乳動物におけるこのような障害の病態生理学の発生においてミトコンドリア呼吸鎖活性における欠損が寄与している障害をいう。この種類には、以下が含まれる：１）ミトコンドリア呼吸鎖の１つ以上の構成要素の活性における先天性の遺伝的欠損；２）ミトコンドリア呼吸鎖の１つ以上の構成要素の活性における後天性の欠損、ここで、このような欠損は、とりわけ、ａ）加齢の間の酸化的損傷；ｂ）細胞内カルシウム上昇；ｃ）罹患した細胞の酸化窒素への暴露；ｄ）低酸素または虚血；ｅ）ミトコンドリアの軸策輸送における微小管関連欠陥；またはｆ）ミトコンドリア非結合タンパク質の発現によって引き起こされる。
【００３５】
ミトコンドリア呼吸鎖（電子輸送鎖としても知られる）は、５つの主要な複合体を含む：
複合体Ｉ        ＮＡＤＨ：ユビキノンレダクターゼ
複合体ＩＩ      スクシネート：ユビキノンレダクターゼ
複合体ＩＩＩ    ユビキノール：シトクロムｃレダクターゼ
複合体ＩＶ      シトクロムｃオキシダーゼ
複合体Ｖ        ＡＴＰシンターゼ
複合体ＩおよびＩＩは、代謝燃料様解糖産物および脂肪酸からユビキノン（補酵素Ｑ）への電子の移動を達成し、ユビキノンをユビキノールに変換する。ユビキノールは、複合体ＩＩＩにおけるシトクロムｃへの電子移動により変換されてユビキノンに戻る。シトクロムｃは、分子酸素への電子移動により複合体ＩＶにおいて再酸化されて水を生成する。複合体Ｖは、これらの電子移動によりミトコンドリア膜を横切って生じたプロトン勾配に由来するポテンシャルエネルギーを利用してＡＤＰをＡＴＰに変換し、次いで、これにより細胞中の代謝反応にエネルギーを与える。
【００３６】
ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）は、ウリジンヌクレオチドのデノボ合成に関与する酵素である。ＤＨＯＤＨ活性は、ジヒドロオロテートからユビキノンへの電子移動を介して呼吸鎖につながっており；これらの電子は、次いで、複合体ＩＩＩおよびＩＶをそれぞれ介してシトクロムｃおよび酸素へと移動される。複合体ＩＩＩおよびＩＶのみが、ピリミジン生合成に直接関与する。ＤＨＯＤＨの作用により産生されたオロテートは、ホスホリボシル化および脱炭酸によりウリジン一リン酸に変換される。
【００３７】
本発明の状況下における「ピリミジンヌクレオチド前駆体」は、ピリミジンヌクレオチド合成のデノボ経路またはサルベージ経路のいずれかにおける中間体であり、ＤＨＯＤＨに対していずれかの遠位でピリミジン合成に入るか（例えば、オロテート）、またはピリミジンヌクレオチドへの変換にＤＨＯＤＨ活性を必要としない（例えば、シチジン、ウリジン、またはシチジンもしくはウリジンのアシル誘導体）。ピリミジンヌクレオシドリン酸（例えば、ヌクレオチド、シチジンジホスホコリン、ウリジンジホスホグルコース）もまた本発明の範囲内に含まれ；これらの化合物は、細胞への進入および同化作用の前にウリジンまたはシチジンのレベルまで分解される。シチジンおよびウリジンのアシル誘導体は、親のヌクレオシドまたはヌクレオチドよりも良好な経口バイオアベイラビリティーを有する。オロチン酸およびそのエステルは、ウリジンヌクレオチドに変換され、そしてまた、本発明の目的を達成するために有用である。
【００３８】
（Ｂ．本発明の化合物）
本発明の主要な特徴は、ピリミジンヌクレオチド前駆体の投与が、ミトコンドリア機能不全に関連する多くの種々の症状および疾患状態の処置において有効であるという予期しない発見である。
【００３９】
組織のピリミジンヌクレオチドレベルは、いくつかの前駆体のうちのいずれかの投与により増大する。ウリジンおよびシチジンは、５’位のリン酸化により細胞ヌクレオチドプール中に取り込まれ、そしてシチジンヌクレオチドおよびウリジンヌクレオチドは、酵素によるアミノ化反応および脱アミノ反応により相互変換される。オロチン酸は、ピリミジンヌクレオチドのデノボ生合成における鍵となる中間体である。オロチン酸のヌクレオチドプールへの取り込みは、細胞のホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）を必要とする。あるいは（または外因性ヌクレオチド前駆体の供給に加えて）、組織へのウリジンの利用可能性は、ウリジンホスホリラーゼ（ウリジンの分解の経路における第１の酵素）を阻害する化合物の投与により増加する。ミトコンドリア性疾患および関連障害を処置する際に有用な本発明の化合物としては、ウリジン、シチジン、オロテート、これらのピリミジンヌクレオチド前駆体の経口で生体利用可能なアシル誘導体またはエステル、および酵素ウリジンホスホリラーゼのインヒビターが挙げられる。
【００４０】
シチジンおよびウリジンのアシル誘導体を言及する際には、以下の定義が適切である：
用語「アシル誘導体」は、本明細書中で使用される場合、カルボン酸由来の実質的に非毒性の有機アシル置換基が、オキシ−プリンヌクレオシドのリボース部分の１つ以上の遊離ヒドロキシル基にエステル結合で結合されるか、かつ／またはこのような置換基が、シチジンのプリン環上のアミン置換基にアミド結合で結合される、ピリミジンヌクレオシドの誘導体を意味する。このようなアシル置換基は、カルボン酸から誘導され、このカルボン酸としては、脂肪酸、アミノ酸、ニコチン酸、ジカルボン酸、乳酸、ｐ−アミノ安息香酸およびオロチン酸からなる群から選択される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。有利なアシル置換基は、食物成分または中間代謝物のいずれかとして、体内に通常存在する化合物である。
【００４１】
用語「薬学的に受容可能な塩」は、本明細書中で使用される場合、誘導体の薬学的に受容可能な酸付加塩または塩基付加塩を含む塩を意味し、これらとしては、硫酸、塩酸、もしくはリン酸、またはオロテートの場合は、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、およびカチオン性アミノ酸（特に、リジン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
用語「アミノ酸」は、本明細書中で使用される場合、以下を含むがこれらに限定されない：グリシン；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、カルニチン、および他の天然に存在するアミノ酸のＬ体。
【００４３】
用語「脂肪酸」は、本明細書中で使用される場合、２〜２２個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸を意味する。このような脂肪酸は、飽和していても、部分的に飽和していても、多不飽和でもよい。
【００４４】
用語「ジカルボン酸」は、本明細書中で使用される場合、２つめのカルボン酸置換基を有する脂肪酸を意味する。
【００４５】
本発明の化合物は、以下の構造を有する：
示された場合を除いて全ての場合、本発明の化合物の化学構造中の可変置換基を記号で表す文字および下付き文字を有する文字は、その記号の記載の直前の構造のみに適用される。
【００４６】
（１）下式：
【００４７】
【化１】
2004538326.tif 000002
を有するウリジンのアシル誘導体、またはその薬学的に受容可能な塩であって、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同じかまたは異なり、それぞれは、水素または代謝産物のアシルラジカルであり、ただし、これらのＲ置換基の少なくとも１つは水素ではない。
【００４８】
（２）下式：
【００４９】
【化２】
2004538326.tif 000003
を有するシチジンのアシル誘導体、またはその薬学的に受容可能な塩であって、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同じかまたは異なり、それぞれは、水素または代謝産物のアシルラジカルであり、ただし、これらのＲ置換基の少なくとも１つは水素ではない。
【００５０】
ミトコンドリア性疾患を処置する際に有用な本発明の化合物としては、以下が挙げられる：
（３）下式：
【００５１】
【化３】
2004538326.tif 000004
を有するウリジンのアシル誘導体であって、
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じかまたは異なり、そしてそれぞれは、水素または以下のａ〜ｄのアシルラジカルである：
ａ．２〜２２個の炭素原子を有する非分枝脂肪酸、
ｂ．グリシン；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、シスチン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、カルニチンおよびオルニチンのＬ体からなる群から選択されるアミノ酸；
ｃ．３〜２２個の炭素原子を有するジカルボン酸、
ｄ．グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、エノールピルビン酸、リポ酸、パントテン酸、アセト酢酸、ｐ−アミノ安息香酸、β−ヒドロキシ酪酸、オロチン酸、およびクレアチンからなる群の１つ以上から選択されるカルボン酸。
【００５２】
（４）下式：
【００５３】
【化４】
2004538326.tif 000005
を有するシチジンのアシル誘導体であって、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同じかまたは異なり、それぞれは、水素または以下のａ〜ｄのアシルラジカルである：
ａ．２〜２２個の炭素原子を有する非分枝脂肪酸、
ｂ．グリシン；フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、シスチン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、カルニチンおよびオルニチンのＬ体からなる群から選択されるアミノ酸、
ｃ．３〜２２個の炭素原子を有するジカルボン酸、
ｄ．グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、エノールピルビン酸、リポ酸、パントテン酸、アセト酢酸、ｐ−アミノ安息香酸、β−ヒドロキシ酪酸、オロチン酸、およびクレアチンからなる群の１つ以上から選択されるカルボン酸。
【００５４】
（５）下式：
【００５５】
【化５】
2004538326.tif 000006
を有するウリジンのアシル誘導体であって、
式中、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３の少なくとも１つは、２〜２６個の炭素原子を含むヒドロカルビルオキシカルボニル部分であり、残りのＲ置換基は、独立して、ヒドロカルビルオキシカルボニルまたはヒドロカルビルカルボニル部分またはＨまたはホスフェートである。
【００５６】
（６）下式：
【００５７】
【化６】
2004538326.tif 000007
を有するシチジンのアシル誘導体であって、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つは、２〜２６個の炭素原子を含むヒドロカルビルオキシカルボニル部分であり、残りのＲ置換基は、独立して、ヒドロカルビルオキシカルボニルまたはヒドロカルビルカルボニル部分またはＨまたはホスフェートである。
【００５８】
（７）オロチン酸またはその塩：
【００５９】
【化７】
2004538326.tif 000008
オロチン酸の薬学的に受容可能な塩としては、その塩のカチオン性成分が、ナトリウム、カリウム、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）、メチルグルカミン、コリン、または約１０００ダルトン未満の分子量を有する任意のその他の実質的に非毒性の水溶性カチオンである塩が挙げられる。
【００６０】
（８）アルコール置換オロテート誘導体：
【００６１】
【化８】
2004538326.tif 000009
ここで、Ｒ１は、エステル結合を介してオロテートに連結された１〜２０個の炭素原子を含むアルコールのラジカルである。
【００６２】
上述の化合物の薬学的に受容可能な塩もまた本発明に包含される。
【００６３】
本発明の有利な化合物は、ウリジンまたはシチジンの短鎖（２〜６個の炭素原子）脂肪酸エステルである。特に有利な化合物は、トリアセチルウリジンまたはトリアセチルシチジンである。このような化合物は、親のヌクレオシドよりも良好な経口バイオアベイラビリティーを有し、そして経口投与後に吸収された後急速に脱アセチルされる。
【００６４】
ピルビン酸は、ミトコンドリア機能不全を有する細胞の処置に有用である。ミトコンドリア酸化的リン酸化の能力が減少した細胞は、ＡＴＰ生成を解糖作用に依存しなければならない。解糖作用は、細胞のレドックス状態により調節される。具体的には、ＮＡＤ＋が、最適なグルコースフラックスのために必要であり、このプロセスにおいてＮＡＤＨを生成する。解糖からのエネルギー生成を最大にするために、ＮＡＤＨは、ＮＡＤ＋へと再酸化されなければならない。外因性ピルベートは、一部、形質膜酵素であるＮＡＤＨオキシダーゼを介してＮＡＤＨを再酸化し得る。
【００６５】
ウリジントリピルベート（２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ピルビルウリジン）は、ピリミジンおよびピルベートの両方を単一の化学実体で送達し、そしてピルビン酸の対応する塩においてナトリウム、カルシウム、または他のカチオンの負荷を避けるという、ピリミジンおよびピルベートの両方の利益をもたらす。
【００６６】
（ウリジンホスホリラーゼのインヒビター）
ミトコンドリア性疾患を処置するための代替的または補完的なストラテジーは、酵素ウリジンホスホリラーゼのインヒビターを用いてウリジン異化作用を阻害することを含む。
【００６７】
ミトコンドリア性疾患の処置に有用であるウリジンホスホリラーゼのインヒビターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：５−ベンジルバルビツレートまたは５−ベンジリデンバルビツレートの誘導体（５−ベンジルバルビツレート、５−ベンジルオキシベンジルバルビツレート、５−ベンジルオキシベンジル−１−［（１−ヒドロキシ−２−エトキシ）メチル］バルビツレート、５−ベンジルオキシベンジルアセチル−１−［（１−ヒドロキシ−２−エトキシ）メチル］バルビツレート、および５−メトキシベンジルアセチル−アシクロバルビツレートが挙げられる）、２，２’−アンヒドロ−５−エチルウリジン、５−エチル−２−デオキシウリジンおよびアシクロウリジン化合物、特に、５−ベンジル置換アシクロウリジン同族体（ベンジルアシクロウリジン、ベンジルオキシ−ベンジル−アシクロ−ウリジン、アミノメチル−ベンジル−アシクロウリジン、アミノメチル−ベンジルオキシ−ベンジルアシクロウリジン、ヒドロキシメチル−ベンジルアシクロウリジン、およびヒドロキシメチル−ベンジルオキシ−ベンジル−アシクロウリジンが挙げられるが、これらに限定されない）。ＷＯ８９／０９６０３およびＷＯ９１／１６３１５（本明細書に参考として援用される）も参照のこと。
【００６８】
（Ｃ．本発明の組成物）
本発明の一実施形態において、新規な薬学的組成物は、活性因子として、ウリジン、シチジン、オロチン酸またはその塩もしくはエステル、ならびにこれらのピリミジンヌクレオチド前駆体のアシル誘導体からなる群から選択される１つ以上のピリミジンヌクレオチド前駆体を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む。
【００６９】
この組成物は、意図される用途および投与経路に依存して、液体、懸濁液、散剤（ｓｐｒｉｎｋｌｅ）、ミクロカプセル、錠剤、カプセル、糖剤、注射用液、または坐剤（以下の処方の考察を参照のこと）の形態で製造される。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、この組成物は、少なくとも１つのピリミジンヌクレオチド前駆体と、ウリジンの分解を阻害する薬剤（例えば、酵素ウリジンホスホリラーゼのインヒビター）とを含む。ウリジンホスホリラーゼのインヒビターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：５−ベンジルバルビツレートまたは５−ベンジリデンバルビツレートの誘導体（５−ベンジルバルビツレート、５−ベンジルオキシベンジルバルビツレート、５−ベンジルオキシベンジル−１−［（１−ヒドロキシ−２−エトキシ）メチル］バルビツレート、５−ベンジルオキシベンジルアセチル−１−［（１−ヒドロキシ−２−エトキシ）メチル］バルビツレート、および５−メトキシベンジルアセチル−アシクロバルビツレートが挙げられる）、２，２’−アンヒドロ−５−エチルウリジン、およびアシクロウリジン化合物、特に、５−ベンジル置換アシクロウリジン同族体（ベンジルアシクロウリジン、ベンジルオキシ−ベンジル−アシクロ−ウリジン、アミノメチル−ベンジル−アシクロウリジン、アミノメチル−ベンジルオキシ−ベンジルアシクロウリジン、ヒドロキシメチル−ベンジルアシクロウリジン、およびヒドロキシメチル−ベンジルオキシ−ベンジル−アシクロウリジンが挙げられるが、これらに限定されない）。さらに、ミトコンドリア呼吸鎖機能不全に関連するミトコンドリア性疾患または病態生理学を処置する目的のために、ピリミジンヌクレオチド前駆体を同時投与することなく、ウリジンホスホリラーゼのインヒビター単独を利用することは、本発明の範囲内である。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態は、ミトコンドリアの構造および機能に対して保護的活性または支持的活性を有する１種以上の他の薬剤と組み合わせて、ピリミジンヌクレオチド前駆体を含む。このような薬剤（ミトコンドリア性疾患において推奨される日用量で示される）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ピルベート（１〜１０ｇ／日）、補酵素Ｑ（１〜４ｍｇ／ｋｇ／日）、アラニン（１〜１０ｇ／日）、リポ酸（１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日）、カルニチン（１０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日）、リボフラビン（２０〜１００ｍｇ／日）、ビオチン（１〜１０ｍｇ／日）、ニコチンアミド（２０〜１００ｍｇ／日）、ナイアシン（２０〜１００ｍｇ／日）、ビタミンＣ（１００〜１０００ｍｇ／日）、ビタミンＥ（２００〜４００ｍｇ／日）、ジクロロ酢酸またはその塩、クレアチン（１〜２００ｇ／日、好ましくは１〜５０ｇ／日）。（前の文で示される推奨日用量は、ヒトにおける経口投与についてものである）。ピルベートの場合、この活性薬剤は、ピルビン酸、その薬学的に受容可能な塩、または２〜１０個の炭素原子を含むアルコール部分を有するピルビン酸エステルとして投与され得る。
【００７２】
（Ｄ．本発明の化合物および組成物の治療的用途）
ミトコンドリア呼吸鎖機能不全に関連する疾患は、ミトコンドリア欠損の起源に基づいていくつかのカテゴリーに分けられ得る。
【００７３】
先天性のミトコンドリア性疾患は、ミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡの完全性を調節する核遺伝子、またはミトコンドリア呼吸鎖機能に重要なタンパク質をコードする核遺伝子における遺伝性の変異、欠失またはその他の欠損に関連する疾患である。
【００７４】
後天性ミトコンドリア欠損は、主に、以下を含む：１）酸化プロセスまたは加齢に起因したミトコンドリアＤＮＡの損傷；２）過剰な細胞内およびミトコンドリア内のカルシウム蓄積に起因したミトコンドリア機能不全；３）内因性または外因性の呼吸鎖インヒビターを用いた呼吸鎖複合体の阻害；４）急性または慢性の酸化障害；ならびに５）欠陥性の核−ミトコンドリア相互作用（例えば、微小管欠損に起因した、長軸索におけるミトコンドリアの欠陥性のシャトリング）、ならびに６）脂質、酸化損傷または炎症に対するミトコンドリア非共役タンパク質の発現。
【００７５】
後天性ミトコンドリア欠損に関与し、そして種々の形態の器官または組織の機能不全の病因が潜む、最も基本的な機構としては、以下が挙げれられる：
カルシウム蓄積：  細胞傷害の基本的な機構（特に、興奮性組織における機構）は、形質膜を介した漏れまたは細胞内カルシウム処理機構の欠損のいずれかの結果としての、細胞内への過剰なカルシウム流入を伴う。ミトコンドリアは、カルシウム隔離の主要な部位であり、そして優先的にＡＴＰ合成よりもむしろカルシウム取り込みのために、呼吸鎖からのエネルギーを利用する。このことは、下流の脊髄にミトコンドリア不全を生じる。何故なら、ミトコンドリア内へのカルシウム取り込みはエネルギー輸送のための能力の減衰を生じるからである。
【００７６】
興奮性毒性：  興奮性アミノ酸による神経の過剰刺激は、中枢神経系における細胞死または細胞傷害の一般機構である。グルタミンレセプターの活性化、特にＮＭＤＡレセプターと称されるサブタイプの活性化は、興奮性刺激の間に細胞内カルシウムの上昇を部分的に介して、ミトコンドリア機能不全を生じる。対照的に、ミトコンドリア呼吸および酸化的リン酸化の不足は、興奮性刺激に対して細胞の感受性を高め、結果として、正常細胞に対して無害な、興奮毒性の神経伝達物質レベルまたは毒物レベルへの曝露の間に、細胞死または細胞傷害を生じる。
【００７７】
酸化窒素への曝露：  酸化窒素（約１μＭ）は、シトクロムオキシダーゼ（複合体ＩＶ）を阻害し、これによってミトコンドリアの呼吸を阻害する（Ｂｒｏｗｎ  ＧＣ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：１８９−１９２，１９９７）；さらに、ＮＯへの長期曝露は、複合体Ｉの活性を不可逆的に低減する。これによって、生理濃度および病理濃度のＮＯは、ピリミジン生合成を阻害する。酸化窒素は、中枢神経系の炎症および自己免疫疾患を含む種々の神経変性障害に関係し、そしてニューロンへの興奮毒性損傷および低酸素後傷害の媒介に関与する。
【００７８】
低酸素：  酸素は、呼吸鎖における最終の電子受容体である。酸素の欠乏は電子輸送鎖の活動を損ない、この結果、酸化的リン酸化を介したピリミジン合成の減衰およびＡＴＰ合成の減衰を生じる。ウリジンおよびピルビン酸（または、ＮＡＤＨを酸化して解糖系ＡＴＰ産生を最適化するための、類似の有効な因子）を供給する場合、仮想的な嫌気的条件下で、ヒト細胞は増殖し、そして生存率を維持する。
【００７９】
核−ミトコンドリア相互作用：  呼吸鎖成分をコードするミトコンドリアＤＮＡの転写は、核内因子を必要とする。神経軸索において、ミトコンドリアは、呼吸鎖活性を維持するために、核に行き来しなければならない。軸索の輸送が、微小管の安定性に影響する低酸素またはタキソールのような薬物によって損なわれると、核から離されたミトコンドリアはシトクロムオキシダーゼ活性の消失を受ける。
【００８０】
ミトコンドリア非共役タンパク質：  ミトコンドリアは、特に１つ以上の呼吸鎖成分の欠損が、代謝中間体から分子酸素への電子の秩序立った輸送を損なう場合、ミトコンドリア呼吸鎖からの溢出に起因した、フリーラジカルおよび活性酸素種の主要な供給源である。酸化損傷を低減するために、細胞はミトコンドリア非共役性タンパク質（ＵＣＰ）（これらの内のいくつかは同定されている）を発現することによって代償する。ＵＣＰ−２は、酸化損傷、炎症性サイトカイン、または過剰な脂質充填（例えば、脂肪肝および脂肪蓄積肝炎（ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）に応答して転写される。ＵＣＰは、ミトコンドリア内膜を横切るプロトン勾配を排出することによって、代謝によって生成されるエネルギーを浪費して、そして低減された酸化傷害のトレードオフ（ｔｒａｄｅ−ｏｆｆ）としてエネルギーストレスに対して細胞を脆弱にする作用で、ミトコンドリアからの活性酸素種の溢出を低減する。
【００８１】
神経系において、特に、ミトコンドリア呼吸鎖の欠損は、２つの一般化可能な結果を有する：１）神経系内の神経回路発達の遅滞または異常；および２）ミトコンドリア欠損の重篤度および他の関係要因に依存した、神経および神経回路の変性の加速（急性または数年に亘る）。発達傷害および変性加速の類似の形状は、非神経組織および非神経系のみ保存される。
【００８２】
（ミトコンドリア機能不全およびピリミジン生合成）
重篤なミトコンドリア損傷（ミトコンドリアＤＮＡの全体的な欠失、結果的な呼吸鎖活性の停止、が挙げられる）を有する細胞は、重要なミトコンドリア機能を代償する２つの因子：ウリジンおよびピルビン酸を供給する場合、培養中で生存し得る。ウリジンは、インビトロで必要とされる。なぜなら、ウリジンヌクレオチドのデノボ合成のための限定酵素ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）は、近位の電子受容体としてのユビキノン、中間体としてシトクロムｃ、ならびに終端電子受容体としての酸素を介する、ミトコンドリア呼吸鎖に共役するからである（Ｌｏｆｆｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：１２５−１２９，１９９７）。ＤＨＯＤＨは、オロト酸の合成に必要であり、これは次いで、ホスホリボシル化および脱カルボキシル化されて、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）を生成する。細胞内の全ての他のピリミジンは、ＵＭＰより誘導される。ミトコンドリアＤＮＡの欠損に起因したミトコンドリア性疾患を患う患者由来の細胞は、体外環境で生存するために外部からのウリジンを必要とし、ここで、ピリミジン（これは他の細胞または食物から誘導され、そして循環を介して輸送される）は、細胞の生存を支援するのに明らかに十分である（Ｂｏｕｒｇｅｒｏｎら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．３：６０５−６０８，１９９３）。重要なことに、ＢｒｅｑｕｉｎａｒまたはＬｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅのような薬物を用いたＤＨＯＤＨの内部阻害は、臨床的ミトコンドリア性疾患における神経系および筋肉のような分化組織の優勢な発達とは対照的に、血球系および消化器粘膜に対して用量制限的な細胞毒性損傷を生じる。
【００８３】
（呼吸鎖機能不全の病理学的結果）
ミトコンドリアは、真核生物細胞のほぼ全てのタイプの生存および正常機能に重要である。事実上任意の細胞型におけるミトコンドリアは、その機能に影響する先天的または後天的な欠損を有し得る。従って、臨床的に重要な徴候および呼吸鎖機能に影響するミトコンドリア欠失の症状は、細胞内の欠失性ミトコンドリアの分布およびその欠損の重篤度、ならびに影響される細胞の生理学的要求に依存して、不均一であり、そして変動性である。高エネルギー要求性の非分裂細胞、例えば、神経組織、骨格筋および心筋は、特にミトコンドリア呼吸鎖機能不全に感受性であるが、任意の器官系が影響され得る。
【００８４】
以下に列挙する疾患および症状は、既知のミトコンドリア呼吸鎖機能不全の病理生理学的結果を含み、そしてこのような障害が、本発明の化合物および組成物が治療利用性を有する障害である。
【００８５】
ミトコンドリア機能不全に続発的な疾患症状は、一般的に、以下のためである：１）呼吸鎖からのフリーラジカルの溢出；２）細胞エネルギー不全へと導くＡＴＰ合成欠損、または２）アポトーシスカスケードを開始または媒介するシトクロムｃのようなミトコンドリアシグナルの放出により引き起こされるアポトーシス。本発明の予測しなかった特徴は、本発明のピリミジンヌクレオチド前駆体が、実施例に示すように、ミトコンドリア性疾患を患う患者における非常に多くの症状に対して、治療活性を有することを観察したことである。このことは、ミトコンドリア機能不全を含む疾患の病理の理解、およびこのような疾患の処置方法の理解において、重要なパラダイムシフトを構築する。
【００８６】
（先天的なミトコンドリア細胞病理の処置）
（ミトコンドリアＤＮＡ欠損）
多くの臨床的症状が、ミトコンドリアＤＮＡの変異または欠損と関係している。ミトコンドリアＤＮＡは母親より遺伝され、、体内の実際に全てのミトコンドリアが、卵母細胞によって供給されるミトコンドリアに由来している。卵母細胞において欠損したミトコンドリアおよび正常なミトコンドリアの混合が存在する場合、ミトコンドリアの分布および分離は、確率過程である。従って、ミトコンドリア性疾患はしばしば、多重系障害であり、そして例えばミトコンドリアＤＮＡの特定の点変異は、別々の患者において異なる組みの徴候および症状を生じ得る。逆に、ミトコンドリアＤＮＡにおいて２つの別々の遺伝子の変異は、類似の複合症状を生じ得る。
【００８７】
それにもかかわらず、いくつかの共通した症状形態が、同定されたミトコンドリアＤＮＡ欠損を組み合せて明らかになり、そしてこれらは、古典的な「ミトコンドリア性疾患」を含み、これらのいくつかは直ぐ下に列挙される。それにもかかわらず、本発明の重要な局面は、ミトコンドリア性疾患の概念および本発明の化合物および組成物を用いるその処置が、多くの他の状態へと拡大することを理解することであり、このこともまた、本明細書中に開示される。
【００８８】
ミトコンドリアＤＮＡの変異または欠損に関連する主要なミトコンドリア性疾患のいくつかの分類上の表現系を、以下に挙げる：
ＭＥＬＡＳ：（ミトコンドリア脳筋障害（ｅｎｃｈｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙ）、乳酸酸血症、および発作様エピソード、
ＭＥＲＲＦ：「ぼろぼろの赤い（ｒａｇｇｅｄ  ｒｅｄ）」（筋肉）線維を有するミオクローヌスてんかん、
ＭＮＧＩＥ：ミトコンドリア胃腸神経脳筋障害（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙ）、
ＮＡＲＰ：神経原性筋肉脆弱、運動失調および色素性網膜炎、
ＬＨＯＮ：レーバー遺伝性視神経萎縮
リー症候群（亜急性壊死性脳炎）
ＰＥＯ：進行性外眼筋麻痺症
キーンズセイアー症候群（ＰＥＯ、色素性網膜症、運動失調および心臓ブロック）。
【００８９】
単独で存在し得るかまたはこれらの症状と併発して存在し得るミトコンドリア性疾患の他の一般的症状としては、以下が挙げられる：心筋症、筋肉脆弱および萎縮症、発達性遅滞（運動機能、言語機能、認識機能または実行機能を含む）、運動失調、てんかん、尿細管性アシドーシス、末梢ニューロパシー、眼性ニューロパシー、自律神経性ニューロパシー、神経原性腸機能不全、感音難聴、神経原性膀胱機能不全、拡大性心筋症、片頭痛、肝不全、乳酸酸血症、および糖尿病。
【００９０】
ミトコンドリアＤＮＡによってコードされる遺伝子産物およびｔＲＮＡに加え、ミトコンドリアの呼吸および酸化的リン酸化に関与するかまたは影響する多くのタンパク質が、核内ＤＮＡによってコードされる。実際に、約３０００個のタンパク質、すなわち核内ゲノムによってコードされる全タンパク質のうちの２０％が、ミトコンドリア、ミトコンドリア機能または生合成に、物理的に組み込まれるかまたは関係するが、約１００個のみが呼吸鎖の構造成分として直接関与する。従って、ミトコンドリア性疾患は、ミトコンドリアＤＮＡ遺伝子産物だけでなく、呼吸鎖機能およびミトコンドリア構造に影響する、核でコードされるタンパク質も関連づける。
【００９１】
感染のような代謝性侵襲要因は、正常な条件下では必要とは限らない症状を生じるミトコンドリアの欠損を顕在化し得る。感染の間の神経筋逆流または神経学的逆流は、ミトコンドリア性疾患の特徴である。対照的に、ミトコンドリア呼吸鎖機能不全は、細胞を、それ以外の場合には無害である侵襲要因に対して脆弱にし得る。
【００９２】
先天的なミトコンドリア性疾患の診断は、症状の遺伝性に起因して、同じ分子欠損により影響された患者の間でさえ、取組み甲斐がある。ミトコンドリア機能不全に起因した細胞機能尾および組織機能における障害は、ミトコンドリア機能不全を直接的には関連づけない問題によって引き起こされる組織機能不全を模倣し得る。ミトコンドリア性疾患の診断のためのいくつかの臨床的に有用かつ実践的なスキームは、当該分野で公知である；これらは代表的に、疾患の病因における呼吸鎖機能不全の役割を確立するのに良好な程度の確実性で、いくつかの重要な診断基準（例えば、ＭＥＬＡＳ、ＮＡＲＰまたはリー症候群のような古典的な臨床表現型、新鮮な組織サンプル中の呼吸鎖複合体活性の極端な抑制（＞８０％））、および多数の比較的重要でない判断基準（例えば、呼吸鎖欠損の穏和な生化学的に異常な特性、上記に列挙した古典的表現系のうちの１つの完全な提示のないミトコンドリア性疾患の症状特性）（これらは、Ｗａｌｋｅｒら（Ｅｕｒ  Ｎｅｕｒｏｌ．，３６：２６０−７，１９９６（本明細書により参考として援用される））が記載したように、別個に１つの重要な判断基準ほどは切実ではないが、特定の患者の臨床的な提示に対する呼吸鎖欠損の寄与についての強力な証拠を累積的に提供する）を含む。
【００９３】
実施例において実証されるように、本発明の化合物および組成物は、異なる背景の分子病理学により、ミトコンドリア性疾患における非常に広範な徴候および症状の処置に有用である。これら疾患およびさらなる患者において観察される改善としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：てんかん発作の頻度および重篤度の低減、偏頭痛、および発作様エピソード、「発育不足（ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｏ  ｔｈｒｉｖｅ）」の小児における体重獲得の向上、重炭酸塩の補充の必要性を併発性に低減した腎尿細管アシドーシス、筋肉強度の向上、言語習得の向上、運動失調の改善、洞および耳の感染の頻度および重篤度の低減、記憶の向上、ならびに自律性ニューロパシーおよび末梢ニューロパシ−の症状の緩和。代謝支持物の他の形態（例えば、本来のミトコンドリア機能（これは、ピリミジン支持物が除去された場合に症状の再発を行うような、プラシーボ効果に対する利点の要因に対して立証する）に必須であることが公知のビタミンおよび補因子）に基本的に非応答性である、広範な症状において観察される改善は、機能的または条件的なピリミジン欠損が、ミトコンドリア性疾患を患う患者において広範な優先的症状の根底にあること、およびピリミジン補充がそのような患者における広範な症状の改善または緩和に十分であることという、本発明の重要な予想されない病識を実証する。これまで、ミトコンドリア性疾患の症状は、ＡＴＰ欠損、障害性の呼吸鎖により生成された活性酸素種、またはアポトーシスカスケードのミトコンドリア成分によって誘発される細胞死に、起因していた。デノボピリミジン合成のインヒビターの用量制限的毒性は、代表的に、骨髄幹細胞および腸粘膜幹細胞のような短時間で分裂する細胞型の増殖阻害に起因する。予想外に、患者および実験動物における本発明の化合物および方法の治療的利益が、非分裂性の有糸分裂後細胞を含む組織（例えば、中枢神経および末梢神経、ならびに骨格筋および心筋）において実証された。
【００９４】
本発明の重要な特性は、根底にある種々の分子欠損によって引き起こされるミトコンドリア性疾患を患う患者の処置が、患者においてインビボで多様な分類の症状の臨床上の改善を生じるという予想しなかった結果である（実施例１−４）。ピリミジン生合成に特に必要とされる電子輸送に直接関与する、２つの呼吸鎖複合体（ＩＩＩおよびＩＶ）の正常な活性を有する患者においてさえ、臨床上の利益が見出されたことは、重要であり、そしてさらに予想しなかったことである。
【００９５】
さらに、本発明のピリミジンヌクレオチド前駆体のより高い用量が、代表的に、デノボのピリミジン合成（例えば、Ｉ型オロチン酸尿に対するホモ接合体）において実質的に完全なブロックを有する患者の適切な処置のために必要とされるよりも、ミトコンドリアの細胞障害を患う患者において最適な処置効果について求められることが、予期せぬ本発明の重要な局面である。本発明の化合物、例えば、（小児における先天的なミトコンドリア性疾患の処置のためのトリアセチルウリジン（これは経口投与後効果的に吸収される））の最適用量は、体表面の１ｍ２あたり１−６ｇの範囲である。（５０−３００ｍｇ／ｋｇ、有益には１００−３００ｍｇ／ｋｇ）、一方、ピリミジンの１日の総デノボ合成は、成人において１日あたり約１ｇ（約０．５ｇ／ｍｍ２）である。
【００９６】
本発明の方法の広範な適用可能性は、予想されず、そして企図されるミトコンドリア性疾患の他の治療剤（例えば、補酵素Ｑ、ビタミンＢ、カルニチン、およびリポ酸）とは別に、本発明の化合物および組成物を設定する。これら治療剤は、ミトコンドリア機能に関与する、非常に特異的な反応および補因子を一般的に取扱い、従ってこれら薬剤は孤立したケースにおいてのみ有用である。しかし、呼吸鎖複合体の酸化防止剤および補因子を用いたこのような代謝的介入は、本発明の化合物および組成物を用いた同時処置に適合性であり、そして実際に、本発明の化合物および組成物と組み合せて最も有利となるように使用される。
【００９７】
（神経筋肉変性障害の処置）
（フリートライヒ運動失調）
最も一般的な遺伝性運動失調であるフリートライヒ運動失調（ＦＡ）の根底にある遺伝子欠損が最近同定され、そして「フラタキシン（ｆｒａｔａｘｉｎ）」と名付けられている。ＦＡにおいて、正常発達期の後、麻痺および死へと進行する、協調における障害が、代表的に３０代および４０代との間に発達する。最も重篤に影響される組織は、脊髄、末梢神経、心筋および膵臓である。患者は、代表的に、運動制御を損ない、そして車椅子を余儀なくされ、そして共通して心不全および糖尿病に罹患する。
【００９８】
ＦＡの遺伝子的基因は、フラタキシンをコードする遺伝子のイントロン領域中のＧＡＡトリヌクレオチドリピートを関連づける。これらのリピートの存在は、この遺伝子の転写および発現の低減を生じる。フラタキシンは、ミトコンドリアのイオン含有量の調節に関与する。細胞内フラタキシン含有量が正常を下回る場合、過剰なイオンがミトコンドリア内に蓄積し、酸化的損傷、ならびに結果としてミトコンドリアの変性および機能不全を促進する。
【００９９】
ＧＡＡリピートの中程度の数がフラタキシン遺伝子のイントロン中に存在する場合、運動失調の重篤な臨床的表現型は発達し得ない。しかし、これらの中程度の長さのトリヌクレオチドの広がりは、非糖尿病集団のうちの約５％と比較して、非インスリン依存性糖尿病を患う患者のうちの２５％〜３０％に見出される。
【０１００】
本発明の化合物および組成物は、フラタキシンの欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）または欠損（ｄｅｆｅｃｔ）に関する障害（フリートライヒ運動失調、心筋機能不全、糖尿病および末梢ニューロパシー様の糖尿病の合併症が挙げられる）を患う患者を処置するのに有用である。対照的に、ＧＡＡイントロンリピートについてのＰＣＲ試験を含む、推定のフラタキシン欠損についての診断試験は、本発明の化合物および組成物を用いる処置から利益を得る患者を同定するのに有用である。
【０１０１】
（筋ジストロフィー）
筋ジストロフィーとは、神経筋の構造および機能の変質を含み、しばしば骨格筋萎縮症および心筋の機能不全を生じる、疾患の１ファミリーをいう。デュシェーヌ筋ジストロフィーの場合、特定のタンパク質であるジストロフィンの変異または不足が、その病因学において関係付けられる。これらジストロフィン遺伝子を不活性化されたマウスは、筋ジストロフィーのいくつかの特徴を提示し、そしてミトコンドリア呼吸鎖活性の約５０％の不足を有した。大部分の場合において、神経筋変性についての最終的な共通の経路は、ミトコンドリア機能のカルシウム媒介性の機能不全である。本発明の化合物および組成物は、筋ジストロフィーを患う患者において、筋機能性能力の低下速度を軽減し、そして筋機能性状態を改善するのに有用である。
【０１０２】
（多発性硬化症）
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳白質の病巣炎症および自己免疫変性によって特徴付けられる神経筋疾患である。定期的な増悪または衝撃は、上部気道上およ他の感染（細菌およびウイルスの両方）に有意に関連し、ミトコンドリア機能不全がＭＳにおいて役割を果たすことを示す。酸化窒素（神経膠星状細胞、および炎症に関連する他の細胞により産生される）によって引き起こされる、神経の呼吸鎖活性の減衰は、ＭＳに寄与する分子機構として包含される。
【０１０３】
本発明の化合物および組成物は、予防的におよび失陥増悪のエピソードのその間に、多発性硬化症を患う患者の処置のために有用である。
【０１０４】
（てんかん発作障害の処置）
てんかんはしばしば、ミトコンドリア細胞病理を有する患者において存在し、孤立したエピソードにおいて生じるかまたは１日に多数回生じる、てんかん発作の重篤度および頻度の範囲（例えば、非存在、緊張性、弛緩性、ミオクローヌス性、および状態てんかん性（ｅｐｉｌｅｐｔｉｃｕｓ））を伴う。
【０１０５】
ミトコンドリア機能不全に続発的なてんかん発作を患う患者において、本発明の化合物および組成物は、てんかん発作活性の頻度および重篤度を軽減するのに有用である。
【０１０６】
（偏頭痛の処置および予防）
再発性の偏頭痛を患う患者についての代謝研究より、ミトコンドリア活性の不足が、この障害と通常関係し、このことが障害性の酸化的リン酸化および過剰な乳酸産生として現れることが示される。このような不足は、必ずしもミトコンドリアＤＮＡの遺伝子欠損に基因するわけではない。偏頭痛は、シトクロムｃオキシダーゼの内在性インヒビターである、酸化窒素に対して過敏である。さらに、ミトコンドリア細胞病理（例えば、ＭＥＬＡＳ）を有する患者は、しばしば偏頭痛の再発を経験する。
【０１０７】
再発性偏頭痛を患う患者において、本発明の化合物、組成物および方法は、特に麦角化合物またはセロトニンレセプターアンタゴニストに対して無反応性の頭痛の場合において、予防および処置に有用である。
【０１０８】
実施例１において示されるように、本発明の化合物および組成物は、ミトコンドリア機能不全に関連した偏頭痛の処置に有用である。
【０１０９】
（発達遅延の処置）
神経学的発達または神経心理学的発達における遅延は、しばしばミトコンドリア性疾患を患う小児に見出される。神経接続の発達および再編成は、特に神経膜およびミエリンの合成に関与する、強力な生合成作用を必要とする。その両方は補因子としてピリミジンヌクレオチドを必要とする。ウリジンヌクレオチドは、不活性化および糖脂質および糖タンパク質に対する糖の転移に関与する。シチジンヌクレオチドは、ウリジンヌクレオチドから誘導され、そしてホスファチジルコリン（これは、シチジンヒホスホコリンからそのコリン部分を受ける）のような主要な膜リン脂質構成物の合成に重要である。ミトコンドリア機能不全（ミトコンドリアＤＮＡ欠損または上記の興奮性もしくは酸化窒素媒介性のミトコンドリア機能不全のような後天的もしくは条件的不足のいずれかに起因する）、あるいは欠陥性のピリミジン合成を生じる他の状態の場合、細胞増殖および軸索伸長は、神経間接続および神経網の発達における重要な段階で機能せず、その結果、言語機能、運動機能、社交機能、実行機能、および認知技能のような神経心理学的機能の発達の遅延または停滞を生じる。例えば、自閉症において、大脳のリン酸化合物の磁気共鳴スペクトル測定は、膜合成に関与する、ウリジンジホスホ糖およびシチジンヌクレオチド誘導体のレベルの低減によって示される、膜および膜前駆体の全体的な合成不足（ｕｎｄｅｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）が存在することを示す（Ｍｉｎｓｈｅｗら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ３３：７６２−７７３、１９９３）。
【０１１０】
発達遅延によって特徴付けられる障害としては、レット症候群、広汎発達遅延（またはＰＤＤ−ＮＯＳ：自閉のような特定の下位区分から区別するための、「他に指定されない、広汎発達遅延」）、自閉、アスペルガー（Ａｓｐｅｒｇｅｒ）症候群および注意欠陥／過活動性障害（ＡＤＨＤ）（これは、実行機能の基礎となる神経回路の発達における遅延またはラグとして認識される）が挙げられる。
【０１１１】
本発明の化合物および組成物は、運動機能、言語機能、実行機能、および認知技能を含め、神経発達遅延を有する患者を処置するために有用である。このような状態（例えば、ＡＤＨＤ）についての現行の処置は、影響を受けたいくつかの過少発達回路において、神経伝達を増強するアンフェタミン様刺激剤を含むが、このような薬剤は、破壊行動の制御を改善し得るが、認知機能を改善しない。なぜなら、これらは、関係した神経回路の構造および相互連結性における根底にある欠損と取り組まないからである。
【０１１２】
本発明の化合物および組成物はまた、神経系における神経学的発達および神経心理学的発達の他の遅延または休止、ならびに筋肉および内分泌腺のような非神経組織中の体細胞発達の他の遅延または休止の場合において有用である。
【０１１３】
（神経変性障害の処置）
加齢に関連した最も顕著な２つの重篤な神経変性疾患（アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ））は、両方とも、それらの病因にミトコンドリア機能不全を含む。特に、複合体Ｉ欠損は、パーキンソン病において変性する黒質線条体ニューロンにおいてだけでなく、パーキンソン病患者の末梢組織ならびに筋肉および血小板のような細胞においても頻繁に見出される。
【０１１４】
アルツハイマー病では、ミトコンドリア呼吸鎖活性（特に、複合体ＩＶ（シトクロムｃオキシダーゼ））は、しばしば抑制される。さらに、ミトコンドリア呼吸機能は、結局、加齢の結果として抑制され、呼吸鎖機能に影響を与えるさらなる分子損傷の有害な続発症をさらに増幅する。
【０１１５】
原発性ミトコンドリア機能不全に加えて他の要因は、ＡＤ、ＰＤ、および関連の障害において神経変性の原因である。興奮毒性刺激および一酸化窒素は、両方の疾患に関係しており、ミトコンドリア呼吸鎖欠損を増悪するとともに、そして呼吸鎖機能不全の背景において有害な作用を強調する因子である。
【０１１６】
ハンティングトン病もまた、罹患した脳領域においてミトコンドリア機能不全を含み、ニューロン変性に寄与する、興奮毒性刺激およびミトコンドリア機能不全の協同的相互作用を有する。実施例８では、本発明の化合物であるトリアセチルウリジンは、ハンティングトン病のマウスモデルにおいてニューロン細胞死を予防する。
【０１１７】
本発明の化合物および組成物は、ＡＤおよびＰＤを含め、加齢関連神経変性疾患の処置のためおよび加齢関連神経変性疾患の進行を緩和するために有用である。
【０１１８】
（筋萎縮性側索硬化症）
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリグ病；運動ニューロンの進行性変性、骨格筋萎縮、麻痺および死を必ずもたらす）を有する患者における主な遺伝欠損の１つは、抗酸化酵素である銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）における変異または欠損である。ミトコンドリアは、活性酸素種を産生するとともに、活性酸素種の主な標的でもある。ミトコンドリア中での酸素への非効率的な電子移動は、哺乳動物系におけるフリーラジカルの最も重要な生理学的供給源である。抗酸化剤または抗酸化酵素の欠乏は、ミトコンドリア変性をもたらし得るかまたは増悪し得る。変異したＳＯＤ１についてトランスジェニックなマウスは、ヒトのＡＬＳの症状および病理と類似した症状および病理を発達させる。これらの動物におけるこの疾患の発達は、ミトコンドリアの酸化的破壊、続いて運動ニューロンの機能低下および臨床症状の発症を含むことが示されてきた（ＫｏｎｇおよびＸｕ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：３２４１−３２５０，１９９８）。ＡＬＳ患者由来の骨格筋は、低いミトコンドリア複合体Ｉ活性を有する（Ｗｉｅｄｅｍａｎｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ  １５６：６５−７２，１９９８）。
【０１１９】
本発明の化合物、組成物、および方法は、ＡＬＳの処置のため、臨床症状を逆転させるため、または臨床症状の進行をゆっくりにするために有用である。
【０１２０】
（虚血および低酸素に対する防御）
酸素欠乏は、複合体ＩＶでのシトクロムｃ再酸化についての最終の電子受容体を細胞から剥奪することによる、ミトコンドリア呼吸鎖活性の直接的阻害、ならびに、特に神経系において、二次的な無酸素後興奮毒性および一酸化窒素形成を介した間接的阻害の両方をもたらす。
【０１２１】
大脳無酸素、アンギナまたは鎌状赤血球貧血発症のような状態では、組織は、比較的低酸素性である。このような場合、本発明の化合物は、低酸素の有害な影響からの罹患組織の防御を提供し、二次遅延細胞死を弱め、そして低酸素性組織ストレスおよび傷害からの回復を加速する。
【０１２２】
本発明の化合物および組成物は、脳における虚血性または低酸素性の傷害後に遅延細胞死（大脳虚血のエピソードの約２〜５日後に生じる、海馬または皮質のような領域におけるアポトーシス）を予防するために有用である。
【０１２３】
（尿細管性アシドーシス）
腎臓機能不全に起因したアシドーシスは、基礎をなす呼吸鎖機能不全が先天性のものであろうと、虚血またはシスプラチンのような細胞傷害剤によって誘導されたのであろうと、しばしば、ミトコンドリア性疾患を有する患者において観察される。尿細管性アシドーシスはしばしば、血液および組織のｐＨを維持するために、外因性の重炭酸ナトリウムの投与を必要とする。
【０１２４】
実施例３では、本発明の化合物の投与は、重篤な複合体Ｉ欠損を有する患者において、尿細管性アシドーシスの即時の逆転を引き起こした。本発明の化合物および組成物は、尿細管性アシドーシスおよびミトコンドリア呼吸鎖欠損によって引き起こされる他の形態の腎臓機能不全を処置するために有用である。
【０１２５】
（加齢性神経変性および認知低下）
正常な加齢の間、ミトコンドリア呼吸鎖機能が徐々に低下する。約４０歳に始まって、ヒトにおいてミトコンドリアＤＮＡ欠損の蓄積における指数関数的上昇、およびミトコンドリア呼吸活性の核調節エレメントにおける同時低下が存在する。
【０１２６】
ｄｅ  Ｇｒｅｙ（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１９：１６１−１６７，１９９８）は、多くのミトコンドリアＤＮＡ損傷が（特に、有糸分裂後細胞における）ミトコンドリア代謝回転の間に選択優位性を有するという観察の基礎をなす機構を考察した。提唱された機構は、欠損性呼吸鎖を有するミトコンドリアが、インタクトな機能的呼吸鎖を有するミトコンドリアよりもそれら自体に対して酸化性の低い損傷を生じるということである（ミトコンドリア呼吸は、身体中でのフリーラジカルの主な供給源である）。それゆえ、正常に機能するミトコンドリアは、欠損性ミトコンドリアよりも迅速に膜脂質に対して酸化的損傷を蓄積し、それゆえ、リソソームによる分解について「タグ化」される。細胞内のミトコンドリアは、約１０日間の半減期を有するので、選択優位性は、（特に、ゆっくりと分裂する細胞において）呼吸活性が低下したミトコンドリアによる、機能的ミトコンドリアの迅速な置換をもたらし得る。正味の結果は、一旦、ミトコンドリアに対する酸化的損傷を減らすミトコンドリアタンパク質についての遺伝子における変異が生じると、このような欠損性ミトコンドリアが細胞に迅速に住み着き、その呼吸能力を低下または排除することである。このような細胞の蓄積は、生物体レベルにおいて加齢または変性性疾患をもたらす。これは、シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）活性がほとんどない細胞が、正常な活性を有する細胞中にランダムに分散している、筋肉における欠損性電子伝達活性を有する細胞の進行性モザイク外観、およびより高齢の被験体由来の生検中でのＣＯＸ陰性細胞のより高い発生率と一致している。従って、生物は、加齢の間または種々のミトコンドリア性疾患において、ミトコンドリア呼吸鎖機能における変えられない進行性低下に直面しながらも、かけがえのない有糸分裂後細胞（例えば、ニューロン、骨格筋および心筋）が保存されなければならず、そしてそれらの機能が有意な程度まで維持されなければならない状況と直面する。機能不全ミトコンドリアを有するニューロンは、興奮毒性傷害のような傷害に対して徐々により感受性となる。ミトコンドリア不全は、加齢に伴う大部分の変性性疾患（特に、神経変性）に寄与する。
【０１２７】
先天的ミトコンドリア性疾患はしばしば、正常なミトコンドリアを有して生まれたヒトの加齢の間に生じる障害と基本的機構が類似した早期発症神経変性を含む。本発明の化合物および組成物が、先天性ミトコンドリア性疾患または早期発症ミトコンドリア性疾患の処置に置いて有用であることの、実施例において開示される実証は、加齢性組織変性の処置における本発明の化合物および組成物の有用性に関する直接的支持を提供する。
【０１２８】
本発明の化合物および組成物は、認知低下および他の加齢の変性結果を処置または減弱するために有用である
（ミトコンドリアおよび癌化学療法）
ミトコンドリアＤＮＡは代表的に、いくつかの理由から、核ＤＮＡよりも損傷に対して脆弱である：
１．ミトコンドリアＤＮＡは核ＤＮＡほど洗練された修復系を有さない。
２．ミトコンドリアＤＮＡ鎖の実質的に全てが、重要なタンパク質をコードし、その結果、任意の欠損が、ミトコンドリア機能に対して潜在的に影響を与える。核ＤＮＡは、タンパク質をコードしない長い領域を有し、ここで、変異または損傷は、本質的に取るに足らない。
３．欠損性ミトコンドリアはしばしば、増殖および代謝回転の間の正常な活性ミトコンドリアを越える選択的利点を有する。
４．ミトコンドリアＤＮＡは、ヒストンによって保護されていない。
【０１２９】
経験的に、ミトコンドリアＤＮＡ損傷は、ミトコンドリアＤＮＡの脆弱性がより高くかつ修復効率がより低いことの両方に起因して、酸化的ストレスまたはシスプラチンのような癌化学療法剤に供された細胞において、核ＤＮＡ損傷よりも広範囲にわたりかつより長期にわたって持続する。ミトコンドリアＤＮＡは核ＤＮＡよりも損傷に対してより感受性であり得るとはいえ、これは、いくつかの状況では、化学的発癌物質による変異誘発に対して比較的抵抗性である。これは、ミトコンドリアが、それらの欠損性ゲノムを修復しようとするよりも、それらの欠損性ゲノムを破壊することによっていくつかの種類のミトコンドリアＤＮＡ損傷に応答することによる。これは、細胞傷害性化学療法の期間にわたって、全体的なミトコンドリア機能不全をもたらす。シスプラチン、マイトマイシン、およびサイトキサンのような化学療法剤の臨床用途はしばしば、このような薬剤の血液学的毒性および胃腸毒性からの回復後でさえも持続し得る、消耗性の「化学療法疲労」、長期の衰弱および運動不耐性を伴う。
【０１３０】
本発明の化合物、組成物、および方法は、ミトコンドリア機能不全に関連した癌化学療法の副作用の処置および予防のために有用である。癌化学療法の副作用を弱めるためのピリミジンヌクレオチド前駆体のこの使用は、ピリミジンヌクレオチド前駆体による細胞傷害性抗癌ピリミジンアナログの毒性軽減（これは、ヌクレオチド代謝拮抗物質のレベルでの生化学的競合を通して媒介される）とは機構的および生化学的に異なる。
【０１３１】
実施例５は、ｔａｘｏｌ誘発性ニューロパシーから保護する際の経口トリアセチルウリジンの保護効果を例示する。
【０１３２】
さらに、肝臓のミトコンドリア酸化還元状態は、食欲調節に対する１つの寄与因子である。癌患者はしばしば、「早期満腹」を提示し、食欲不振、体重減少、および悪液質に寄与する。エネルギー代謝はしばしば、癌患者において深刻に混乱し、過活動腫瘍解糖のエネルギー消耗性無益回路によって、循環するラクテートが産生され、これは、肝臓によって、グルコースへと変換し戻される。化学療法誘発性ミトコンドリア傷害はさらに、代謝混乱に寄与する。
【０１３３】
実施例２に示すように、本発明の化合物を用いた処置は、ミトコンドリア性疾患を有する患者において食欲の改善をもたらした。
【０１３４】
（ミトコンドリアおよび卵巣の機能）
卵巣の重大な機能は、卵母細胞におけるミトコンドリアゲノムの完全性を維持することである。なぜなら、胎児に渡されるミトコンドリアは全て、受胎時に卵母細胞中に存在するミトコンドリアに由来するからである。ミトコンドリアＤＮＡの欠損は、閉経期の年齢辺りで検出可能になり、そしてまた異常な月経周期に関連する。細胞はミトコンドリアＤＮＡ中の欠損を直接的に検出できず、それに応答することもできないが、損なわれた呼吸、酸化還元状態、またはピリミジン合成における欠損のような、細胞質に影響を与える二次的影響を検出することだけはでき、ミトコンドリア機能のこのような産物は、卵母細胞選択および濾胞閉鎖、最終的には、ミトコンドリアゲノムの忠実度および機能活性の維持がもはや保証できなくなった場合に、閉経期の誘起についてのシグナルとして関与する。これは、ＤＮＡ損傷を有する細胞におけるアポトーシスと類似する。ＤＮＡ損傷を有する細胞は、ゲノム忠実度が修復プロセスによってもはや達成できない場合、活性な細胞自殺プロセスを受ける。性腺に罹患するミトコンドリア細胞障害を有する女性は、しばしば、早発性閉経を受けるかまたは原発性周期異常を提示する。細胞傷害性癌化学療法はしばしば、早発性閉経を誘発し、その結果、骨粗鬆症の危険性が増加している。化学療法誘発性無月経は一般に、原発性卵巣不全に起因する。化学療法誘発性無月経の発生数は、化学療法を受けている閉経前女性において、年齢の関数として増大し、ミトコンドリアの関与を示す。ミトコンドリア呼吸またはタンパク質合成のインヒビターは、ホルモン誘発性排卵を阻害し、そしてさらに、下垂体ゴナドトロピンに応答した卵巣ステロイドホルモンの産生を阻害する。ダウン症候群を有する女性は代表的に、閉経期を早期に受け、そしてまたアルツハイマー様痴呆の早期発症を受ける。シトクロムオキシダーゼの低活性は、ダウン症の患者の組織および後期発症アルツハイマー病において一貫して見出される。
【０１３５】
それゆえ、ミトコンドリア機能の適切な支持またはミトコンドリア機能不全についての補正は、加齢性または化学療法誘発性の、閉経または月経周期異常もしくは排卵異常からの保護のために有用である。本発明の化合物および組成物（抗酸化剤およびミトコンドリア補因子もまた含む）は、無月経、不規則な排卵、閉経、または閉経の二次的な結果を処置および予防するために有用である。
【０１３６】
実施例１では、本発明の化合物での処置は、月経周期の短縮をもたらした。この患者は持続して黄体期にあったので、この患者の応答は、投与されたピリミジンヌクレオチド前駆体が、下垂体ゴナドトロピンに対する過少応答性を逆転させたことを示す。下垂体ゴナドトロピンはおそらく、ミトコンドリア起源の卵巣過少応答性を補正するために上昇していた。
【０１３７】
（ミトコンドリア性疾患の診断）
ミトコンドリア性疾患を有する患者の、本発明の化合物の投与に対する顕著な応答は、本発明の方法に従って投与されたピリミジンヌクレオチド前駆体に対する臨床応答が、可能なミトコンドリア性疾患を検出する診断的有用性を有することを示す。ミトコンドリア機能不全の基礎をなす分子損傷の分子診断は、（特に、欠損が、ミトコンドリアＤＮＡのより一般的な変異または欠失のうちの１つでない場合）困難であり、そして費用がかかる。ミトコンドリア性疾患の確定的診断はしばしば、筋肉の生検を必要とするが、この侵襲的測定でさえ、ミトコンドリア欠損が筋肉中に存在する場合にのみ役立つ。本発明の化合物および組成物は、本発明の方法に従って投与された場合に安全であるので、ピリミジンヌクレオチド前駆体を用いた治療チャレンジは、（特に、ミトコンドリア機能不全の種々の他の局面についての試験に関連して用いられる場合）疑われるミトコンドリア性疾患についての重要な診断プローブである。
【０１３８】
先天的ミトコンドリア細胞障害の診断について、本発明のピリミジンヌクレオチド前駆体の５０〜３００ｍｇ／ｋｇの毎日の用量は、１〜１２週間の期間にわたって患者に投与され、そして臨床的徴候および症状が変化についてモニタリングされる。実施例において記載された患者およびさらなる患者において観察された改善としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：痙攣、偏頭痛、および発作様エピソードの頻度および重篤度の低下、「成長障害」を有する小児における体重増加の改善、補助的バイカーボネートについての必要性の同時低下を伴う尿細管性アシドーシスの改善、筋肉強度の改善、言語習得の改善、運動失調の改善、低張性の改善、洞（ｓｉｎｕｓ）感染および耳感染の頻度および重篤度の低下、記憶改善、ならびに自律性ニューロパシーおよび末梢性ニューロパシーの症状の改善。本発明の１つの実施形態では、ミトコンドリア機能の他の試験をまた用いて、ミトコンドリア性疾患の診断についての証拠を提供する。診断は代表的に、Ｗａｌｋｅｒら（Ｅｕｒ  Ｎｅｕｒｏｌ．，３６：２６０−７，１９９６）に記載されたような、種々の程度の信頼性を有する多数の実証的試験の累積考慮を必要とする。本発明のピリミジンヌクレオチド前駆体に対する治療応答性は、この診断スキームにおけるさらなるマイナーな判定基準として主に有用である。なぜなら、呼吸鎖欠乏についての補正のみによっては媒介されない治療的利益が、ピリミジンヌクレオチド前駆体の投与後に生じ得ることがあり得るからである。ミトコンドリア性疾患の症状の性質および重篤度は患者間で不均質であり、変動するので、外因性ピリミジンヌクレオチド前駆体の効力は代表的に、患者における主な症状を選択し、そしてそれらの重篤度を、治療経過の間に実行可能であるスケールを用いて定量的にモニタリングすることによって評価される。起こり得るプラシーボ効果が疑われる場合、薬物から適切なプラシーボへの患者の盲検での切り替えが、個々の患者において必要に応じて用いられる。臨床的利益の評価は、かなりの熟練および経験を必要とし得るが、このような技能は、多器官系代謝疾患を有する患者を処置する当業者の範囲内であり、それゆえ、このクラスの疾患の重篤度を考慮すれば、過度の実験を構成しない。ミトコンドリア性疾患を有する患者の、本発明の化合物であるトリアセチルウリジンでの臨床処置の以下に引用した例は、個々の患者において臨床的利益を決定することの実行可能性を例示する。
【０１３９】
（Ｅ．本発明の化合物および組成物の投与および処方）
ミトコンドリア性疾患のピリミジンヌクレオチド前駆体治療についての特定の治療標的の全ての場合において、本発明の化合物は代表的に、１日あたり１〜３回投与される。ウリジンおよびシチジンのアシル誘導体は、１日あたり１０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で（最適な臨床的利益を得るために必要な量に依存して、この範囲内で変動して）経口投与される。一般に、最適な用量は、５０ｍｇ／ｋｇ／日と３００ｍｇ／ｋｇ／日との間（有利には、１００〜３００ｍｇ／ｋｇ／日）であり、６〜１２時間隔てて摂取される、２または３の別個の用量に分割される。ウリジンおよびシチジンは、これらの２つのヌクレオシドのアシル誘導体よりも低い効率で吸収され、その結果、アシル誘導体を用いて達成された治療的利益と匹敵する治療的利益のためには、より高い用量が必要とされる。浸透圧性下痢は、患者に対して投与され得るウリジンまたはシチジン（またはシチジンジホスホコリンのような他の誘導体）の量を制限し、その結果、大部分の場合、シチジンおよびウリジンのアシル誘導体は、親化合物よりも効果が高く、副作用が少ない。本発明の目的を達成するために用いられるシチジンおよびウリジンの用量は、治療効力と耐性との間のバランスに依存して、５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日（有利には、１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日）の範囲である。オロテートまたはオロテートのアルコールエステルは、ミトコンドリア呼吸鎖機能不全を含む特定の疾患状態において最適治療効果を達成するために必要とされる量に再度依存して、２０〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量で経口投与される。特定の疾患または患者について必要とされる本発明のピリミジンヌクレオチド前駆体の用量はまた、疾患の重篤度に部分的に依存する。
【０１４０】
ミトコンドリア機能不全によって特徴付けられるかまたは引き起こされる疾患を有する任意の個々の患者において、本発明のピリミジンヌクレオチド前駆体の有効用量は代表的に、経験的に決定される。ミトコンドリア細胞障害またはミトコンドリア脳筋症としても公知の先天的ミトコンドリア性疾患では、徴候および症状の臨床的提示は一般に、患者間で不均質であり、そして変動する。本発明の化合物の投与後の臨床的利益は、症状のセットをモニタリングし、そしてそれらの重篤度を経時的に（例えば、毎月の間隔で）評価することによって決定される。３〜５の主な症状がこの目的のために選択され、そして臨床的利益を構成すると判断される改善の程度がしばしば、臨床判断の主題である。複合代謝性障害を有する患者の処置において、このような評価は、（特に、ミトコンドリア細胞障害の重篤度（しばしば生命を脅かす）およびそれらの医療の費用のかかる性質を考慮すれば）過度の実験負荷を構成しない。患者の生涯のできる限り早期での、ミトコンドリア欠損または他の代謝性欠損についての補正は、脳および身体の発達が思春期後に停止状態に達した後の介入に対して、非常に大きな差を生じ得る。それゆえ、（特に、発達中の小児において）複合代謝疾患の診断および処置に相当の努力を払うことは価値がある。ミトコンドリア性疾患を有する患者への本発明の化合物の投与後の臨床的改善のうちの以下に引用した例は、このような処置および評価の実行可能性および価値を実証する。
【０１４１】
臨床提示における不均質性が、ミトコンドリア性疾患よりも低い大部分の疾患の場合、当該分野には、薬物処置の効力を決定するために適切な認証された評価測定尺度が存在する。臨床研究を実施して、本明細書中に開示される疾患状態の処置のための本発明のピリミジンヌクレオチド前駆体の用量を決定する前に、個々の患者についての適切な用量が、臨床応答（脳ＭＲＩ画像および患者の症状の単なる観察では必ずしも臨床的に明らかでないかもしれない他の指標（例えば、生化学的測定値）を含む）を、定量的な疾患評価測定尺度に従って、評価することによって決定される。全ての場合、特定の疾患状態の主な症状は、経時的にモニタリングされて、医薬の分野においては一般的であるように、徴候および症状の改善または臨床低下の緩和が生じるか否かが決定される。盲検での臨床研究における用量決定の前に、本発明のピリミジンヌクレオチド前駆体に対する所定の患者の応答は、単に、数週間の期間にわたる、薬物からプラシーボへの盲検での交換によって、可能なプラシーボ効果とは区別される。
【０１４２】
経口薬を受けることができない患者の場合、本発明の化合物（特に、ウリジン、シチジン、およびオロテートエステル）は、必要に応じて、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の日用量を送達する長期静脈内注入によって投与され得る。
【０１４３】
薬理学的に活性な化合物は、必要に応じて、活性な化合物のプロセシングを促進する賦形剤および補助物質を含む適切な薬学的に受容可能なキャリアと合わされる。これらは、錠剤、懸濁剤、液剤、糖衣丸、カプセル剤または坐剤として投与される。これらの組成物は、例えば、経口的に、直腸に、膣に投与されるか、または口腔の頬嚢（ｂｕｃｃａｌ  ｐｏｕｃｈ）を介して放出され、そして経口注射もしくは局所投与によって、溶液の形態で適用され得る。これらの組成物は、約０．１〜９９パーセント、好ましくは約５０〜９０パーセントのこれらの活性化合物を賦形剤とともに含み得る。
【０１４４】
注射または静脈内注入による非経口投与について、これらの活性化合物は、水性媒体（例えば、無菌の水または生理食塩水水溶液）中の懸濁または溶解される。注射可能な溶液または懸濁液は必要に応じて、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンエーテル）または可溶化剤（プロピレングリコールまたはエタノールなど）を含む。この溶液は代表的に、０．０１〜５％のこれらの活性な化合物を含む。
【０１４５】
適切な賦形剤としては、フィラー（例えば、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース調製物および／またはリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム））ならびにバインダー（例えば、（例えば、トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、イネ澱粉またはジャガイモ澱粉を用いた）澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【０１４６】
補助物質としては、流動調節剤および滑沢剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム）および／またはポリエチレングリコールが挙げられる。糖衣丸の核には、適切なコーティング（これは、所望の場合、胃液に抵抗性である）が提供される。この目的のために、濃縮糖溶液が用いられ、これは、必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含む。胃液に耐性のコーティングを生成するために、適切なセルロース調製物（例えば、アセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）の溶液が用いられる。染料または色素は、必要に応じて、例えば、同定のため、または異なる化合物用量を特徴付けるために、錠剤または糖衣丸コーティングに添加される。
【０１４７】
本発明の薬学的調製物は、それ自体公知の様式で（例えば、従来の混合プロセス、顆粒形成プロセス、糖衣丸作製プロセス、溶解プロセスまたは凍結乾燥プロセスによって）製造される。従って、経口用途のための薬学的調製物は、活性化合物を、固体の賦形剤と合わせ、必要に応じて、得られる混合物を粉砕し、そして所望または必要な場合、適切な補助物質を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣丸核を得ることによって得られる。
【０１４８】
経口送達のために有用な他の薬学的調製物としては、ゼラチンから作製された押し込みばめカプセル剤、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製された軟質シールカプセル剤が挙げられる。押し込みばめカプセル剤は、活性な化合物を顆粒の形態で含み、この顆粒は、必要に応じて、フィラー（例えば、ラクトース）、バインダー（例えば、澱粉）および／または滑沢剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）および必要に応じて安定剤と混合されている。軟質カプセル剤では、活性な化合物は好ましくは、適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、またはポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁される。さらに、安定剤が必要に応じて添加される。
【０１４９】
直腸に使用される薬学的調製物としては、例えば、坐剤（これは、活性化合物と坐剤基剤との組合わせからなる）が挙げられる。適切な坐剤基剤は、例えば、天然または合成の、トリグリセリド、パラフィン炭化水素、ポリエチレングリコールまたはより高級なアルカノールである。さらに、活性化合物と塩基との組合わせからなるゼラチン直腸カプセル剤は、有用である。基剤材料としては、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素が挙げられる。本発明の別の実施形態では、浣腸処方物が用いられ、これは、必要に応じて、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ｃａｒｂｏｐｏｌ、グリセリンポリアクリレート、または他のヒドロゲルのような増粘賦形剤を含む。
【０１５０】
非経口投与のために適切な処方物としては、水溶性形態の活性な化合物の水溶液（例えば、水溶性塩）が挙げられる。
【０１５１】
さらに、適切な場合、油性注射懸濁液中の活性な化合物の懸濁液が投与される。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、必要に応じて、懸濁液の粘度を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストラン）を含む。懸濁液は、必要に応じて安定剤を含む。
【０１５２】
（Ｆ．本発明の化合物の合成）
シチジンおよびウリジンのアシル誘導体は、代表的に、シチジンまたはウリジンとの酸塩化物または酸無水物の反応を含む、アシル化方法によって合成される。
【０１５３】
２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ピルビルウリジンの合成を実施例６に示す。
【０１５４】
以下の実施例は例示であるが、本発明の方法および組成物の限定ではない。当業者に明らかである、通常、臨床治療において遭遇する、種々の条件およびパラメーターの他の適切な改変および適応は、本発明の趣旨および範囲内にある。
【実施例】
【０１５５】
（実施例１：トリアセチルウリジンを用いた多器官系ミトコンドリア障害の処置）
部分的複合体Ｉ欠損を有する２９歳の女性およびその息子は、多器官系ミトコンドリア障害を提示する、発作様エピソード、運動失調、および脳障害となるミトコンドリア性疾患を有すると診断された。徴候および症状は、片麻痺性／失語偏頭痛、大発作痙攣、１日あたり約４回のカテーテル法を必要とする、神経原性腸機能不全および神経原性膀胱機能不全、嚥下困難、疼痛のある感覚異常を生じる、自律神経および末梢の多発性ニューロパシー、頻脈／徐脈症候群、および休息のために止まることなく一続きの階段を登ることができない乏しい機能能力、ならびに意識混濁エピソードおよび数時間から数日間持続する乏しい記憶を伴う認知能力低下を含んでいた。
【０１５６】
０．０５ｍｇ／ｋｇ／日の経口トリアセチルウリジンでの処置開始後、および少なくとも６ヶ月間の持続期間にわたって、この患者は、痙攣も偏頭痛も有さなかった；末梢ニューロパシーに関連したこの患者の感覚異常は消散した。この患者は、ほとんどの日に自発排泄することができ、１週間に１回または２回のみカテーテル法必要とする。トリアセチルウリジンでの処置６週間後、この患者は、１マイル全部歩くことができた。この患者は、不充分な機能能力に起因して、過去２年間、１マイル全部歩くことはできなかった。睡眠の間のこの患者の徐脈エピソードおよび労作の間の頻脈エピソードは頻度が減少した；処置前には、単に立ち上がっただけで、１４０ｂｐｍを超える心拍数を有する頻脈が生じ、そしてトリアセチルウリジンで６週間後には、頻脈は、丘および階段でのみ生じた。この患者の意識は澄み渡り、そして記憶欠損が顕著に改善した。
【０１５７】
処置の間、この患者の月経周期は、４週間から２週間へと短縮し、そしてこの患者は、エストラジオール、プロゲステロン、ＦＳＨおよびＬＨの測定値によって評価したところ、持続した黄体期を提示した。数ヵ月後、この患者の周期は、４週間へと正常になった。
【０１５８】
この患者は、以下の点で本発明の重要な特徴を実証する：１）本発明の化合物は、種々の組織において、ミトコンドリア機能不全に関連した複合多器官系疾患の実質的に全ての特徴において改善を引き起こした、および２）本発明の化合物は、部分的複合体Ｉ欠損に関連した疾患状態（これは、デノボでのピリミジン生合成に直接的に関与する電子伝達の順序の外側のミトコンドリア呼吸鎖の一部に影響を与える）を処置するために予想外に有用である。
【０１５９】
この患者の月経周期の一過性の短縮は、神経内分泌系が卵巣の機能不全を補正しようとした過剰なホルモン刺激に遭遇してトリアセチルウリジンによって引き起こされた卵巣機能の改善と解釈される。卵巣と視床下部との間のフィードバックは、周期時間の徐々の正常化をもたらした。
【０１６０】
（実施例２：難治性癲癇の処置）
１１歳の少年は、複数ミトコンドリアＤＮＡ欠損症候群に明らかに起因して、４．５歳のときから難治性癲癇を有していた。１９９７年１２月には、漸増性癲癇のために集中治療室に２回入ったことを含め、この少年の状態は悪化した。標準的な鎮痙治療の攻撃的レジメンを用いてさえ、この患者は、１晩に８〜１０回の大発作痙攣を有し、学校に規則的に通うことができないままであり、しかも運動活動への参加ができないままであった。この患者はまた、上唇自動性を発達させた。
【０１６１】
経口トリアセチルウリジンでの処置（最初、０．０５ｇ／ｋｇ／日の用量で、そして数週間のクールにわたって、０．１ｇ／ｋｇ／日へと、次いで０．２４ｇ／ｋｇ／日へと徐々に増加させた）を始めてから最初の３日間、痙攣はなく、そして不随意の唇の動きが止まった。続いて、（特に、感染エピソードの間）何回かの痙攣の再発が存在したが、トリアセチルウリジンでの処置前よりもずっと低い頻度であった。この患者は、学校に戻ることができ、そして運動への活発な関与を再開できた。この患者の食欲、認知機能、および良好な運動協調は、治療の間改善され、成績の改善および野球のような運動活動での傑出した成績をもたらした。
【０１６２】
（実施例３：尿細管性アシドーシスの処置）
重篤な複合体Ｉ欠損に関連したリー症候群（亜急性壊死性脳障害）を有する２歳の少女は、１日あたり２５ｍＥｑの重炭酸ナトリウムの静脈内投与を必要とする尿細管性アシドーシスを提示した。０．１ｇ／ｍｇ／日のトリアセチルウリジンを用いた胃内処置開始後数時間以内に、この患者の尿細管性アシドーシスは消散し、そして補助的な重炭酸塩は、血液のｐＨを正常にするためにもはや必要ではなかった。トリアセチルウリジンはまた、上昇した循環アミノ酸濃度の迅速な正常化をもたらし、そしてジクロロアセテート処置の中止後、乳酸を低いレベルで維持した。ジクロロアセテート処置は、乳酸アシドーシスを予防するために以前は必要とされた。
【０１６３】
（実施例４：発達遅延の処置）
癲癇、運動失調、言語遅延、および脂肪不耐、ならびにジカルボン酸酸性尿を有する４．５歳の少女を、０．１〜０．３ｇ／ｋｇ／日の日用量にてトリアセチルウリジンで処置した。このような処置は、痙攣頻度の５０％低下、運動失調の改善および運動協調、食餌脂肪耐性の回復、ならびに表現的言語能力の迅速に加速した発達をもたらした。
【０１６４】
（実施例５：ｔａｘｏｌ誘発性ニューロパシーの予防）
末梢ニューロパシーは、シスプラチンおよびｔａｘｏｌのような重要な抗癌剤の、頻繁な、そしてしばしば用量を制限する、副作用である。ｔａｘｏｌの場合、感覚ニューロパシーは、投与後数日で起こる。Ｔａｘｏｌの作用機構は、微小管の安定化を含み、これは、癌を処置するために有用であるが、末梢ニューロンには有害である。微小管安定化は、細胞成分の軸索輸送を損なう。ミトコンドリアは、ニューロンの細胞体と末端との間を往復し、その結果、ミトコンドリア呼吸鎖成分の発現は、核転写因子によって調節され得る。ミトコンドリアの往復阻害の間、核から離れたミトコンドリアは、ｍｔＤＮＡ転写因子に対する不適切な曝露に起因して、ミトコンドリアゲノムによってコードされる呼吸鎖サブユニットの発現における減少を受け、局所的ニューロンエネルギー不足およびミトコンドリア機能不全の他の結果をもたらす。
【０１６５】
各々１０匹の２群のマウスを、ｔａｘｏｌで、２１．６ｍｇ／ｋｇ／日にて連続６日間、腹腔内注射によって処置した。さらなる群の１０匹のマウスは、ビヒクルのみの注射を受けた。ｔａｘｏｌ処置マウスの１つの群は、経口トリアセチルウリジン（４０００ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ．）を受けた。ｔａｘｏｌ処置開始の９日後、侵害受容感覚欠損を、赤外線熱ランプを用いた集中した熱放射に尾の先端を曝露した後のテールフリック潜伏時間を決定することによって試験した。この系では、放射熱に対するテールフリック応答の遅れは、感覚神経の欠損と相関する。
【０１６６】
【表１】
2004538326.tif 000010
Ｔａｘｏｌ処置は、毒性感覚ニューロパシーの指標として、有痛刺激に対する反応を損なった。経口トリアセチルウリジン処置は、テールフリック潜伏時間におけるｔａｘｏｌ誘発性変化を顕著に弱めた。
【０１６７】
（実施例６：ウリジンピルベートの合成）
Ａ．ピルビルクロリドの調製を、ＯｔｔｅｎｈｅｕｍおよびＭａｎ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９７５，１６３頁）の手順を用いて、α，α−ジクロロメチルメチルエーテルとピルビン酸との反応によって達成した。
【０１６８】
Ｂ．ウリジン（３．０ｇ、１２ｍｍｏｌ）を、減圧下でトルエン共沸混合物（３×）によって乾燥し、次いでＤＭＦ（２０ｍＬ）およびピリジン（２０ｍＬ）中に溶解した。得られた溶液を−１０℃まで冷却し、そして６．０ｍＬのピルビルクロリド（上記の工程Ａで産生される）を滴下した。反応混合物を、室温でアルゴン下にて２４時間にわたって撹拌した。ＴＬＣ（５％  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）による分析は、ウリジンの消費を示した。反応混合物を乾固するまでエバポレートし、そしてＣＨ２Ｃｌ２と水性重炭酸ナトリウムとの間で分配した。有機層を、水、水性ＨＣｌ（ｐＨ３．０）、および水で洗浄し；硫酸ナトリウムで乾燥し；濃縮し；そしてフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、５％  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）を用いて精製して、１．４ｇのピルビン酸ウリジン、すなわち２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ピルビルウリジンを得た。
【０１６９】
（実施例７：パーキンソン病（ＰＤ）およびミトコンドリア機能不全のＭＰＴＰモデルにおける経口トリアセチルウリジンの治療効果）
神経毒である１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は、ドパミン作用性細胞喪失を誘導するために用いられる複合体Ｉ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ）ミトコンドリア呼吸鎖インヒビターである（Ｖａｒａｓｔｅｔら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，６３：４７−５６，１９９４）。この毒素は、ＰＤについての動物モデルとして現在広範に用いられる（Ｂｅｚａｒｄら，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，１４８：２８８−９２，１９９７）。
【０１７０】
Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓからの３０ｇ〜４０ｇの体重の６〜９月齢の雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、ＭＰＴＰ研究（ｎ＝７／群）において用いた。ＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を、１．５日間、ｂ．ｉ．ｄ．で与えた。ＴＡＵを、毒素投与の２時間前および屠殺前日まで、２００ｍｇ  ＴＡＵ／ｍＬ溶液にて、０．７５％ヒドロキシプロピル−メチルセルロースビヒクル中、ｂ．ｉ．ｄ．で４ｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．にて投与した。
【０１７１】
ＭＰＴＰ注射の中止８日後、マウスをＣＯ２によって屠殺し、そして両側からの線条体を冷表面上で切開した。線条体を、ドライアイスで凍結した。ドパミン作用性ニューロン生存を、線条体ドパミン（ＤＡ）カウントによって評価した。ドパミンカウントを、ＧＬＰ条件下で放射性酵素法によってアッセイしたが、ＤＡはまた、以前（ＦｒｉｅｄｅｍａｎｎおよびＧｅｒｈａｒｄｔ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ，１３：３２５−３２，１９９２）に記載されたとおりの電気化学的検出を用いた高速液体クロマトグラフィーを用いて測定され得る。ＴＡＵ処置に起因して、ＭＰＴＰ処置マウスにおいては死亡率が減少した。コントロール＋ＭＰＴＰマウスにおける死亡率は、ＴＡＵ＋ＭＰＴＰ処置群における２８．６％と比較して、７１．４％であった。ＭＰＴＰに起因して、ＤＡ含有量の減少に対するＴＡＵ処置の神経保護効果もまた存在した。
【０１７２】
【表２】
2004538326.tif 000011
ＭＰＴＰ（２日間にわたって２５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．ｂ．ｉ．ｄ．）を用いて第二の研究を実施した。Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓからの、３０ｇ〜４０ｇの体重の、６〜９ヶ月齢である雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、ＭＰＴＰ研究（ｎ＝６／群）において用いた。ＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）を、２日間、ｂ．ｉ．ｄ．で与えた。ＴＡＵを、毒素投与の２時間前および屠殺前日まで、２００ｍｇ  ＴＡＵ／ｍＬ溶液にて、０．７５％ヒドロキシプロピル−メチルセルロースビヒクル中、ｂ．ｉ．ｄ．で４ｇ／ｋｇ  ｂｗ  ｐ．ｏ．にて投与した。ＴＡＵまたはビヒクルを、ＭＰＴＰ投与の前日に開始し、８日目に終了して、経口的に与えた（ＴＡＵの用量＝４ｇ／ｋｇ  ｂｗ  ｂ．ｉ．ｄ．）。マウスを９日目に屠殺した。この研究はまた、ＭＰＴＰに起因した線条体ＤＡ損失における減少の弱まりによって示されるように、ＴＡＵがドパミン作用性ニューロンに対して防御効果を示すことを実証した。
【０１７３】
【表３】
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（実施例８：ハンティングトン病（ＨＤ）の３−ニトロプロピオン酸（３ＮＰ）モデルにおけるＴＡＵの治療効果）
ＨＤは、（特に、線条体における）進行性ニューロンの喪失によって特徴付けられる。ＨＤを有する患者は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（複合体ＩＩ）−ユビキノールオキシドレダクターゼ（複合体ＩＩＩ）活性の活性が減少している。Ｂｒｏｗｎｅ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３６１−３８０  （１９９７）。ＨＤの広範に用いられるモデルは、コハク酸デヒドロゲナーゼのインヒビターである３−ニトロプロピオン酸（３ＮＰ）を用いる（Ｆｅｒｒａｎｔｅら，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２２９−２４４，１９９７）。３ＮＰは特に、線条体に対する損傷を誘導する（Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６０：３５６−９，１９９３）。
【０１７４】
雄性の６〜８ヶ月齢のＳｗｉｓｓマウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＮＣＩ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を、ｎ＝８／群で用いて、３ＮＰ（６５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で毎日、４日間処置して、死亡、ニューロン細胞喪失および行動欠陥を誘発した。ＴＡＵを、１日前および８日目まで毎日、２００ｍｇ  ＴＡＵ／ｍＬ溶液にて、０．７５％ヒドロキシプロピル−メチルセルロースビヒクル中、ｂ．ｉ．ｄ．で４ｇ／ｋｇ  ｂｗ  ｐ．ｏ．にてマウスに投与した。９日目に、このマウスを、１０％緩衝化ホルマリンを用いて灌流固定し、そして銀染色してニューロン損傷を検出するために加工した。ＴＡＵで処置したマウスにおいて、３ＮＰに起因した死亡率が、以下に示すように、コントロールと比較して減少した。３ＮＰ＋ＴＡＵ群においては死亡が存在しなかったが、ビヒクル＋３ＮＰ群において８匹のうちの３匹のマウスが死亡した。
【０１７５】
３ＮＰ処置マウスの行動スコア付けは、この研究の間の何時か、何らかの運動欠陥が存在するか否かを決定することである。８８％のコントロール＋３ＮＰ処置マウスに、肉眼での観察によって示された行動欠陥が存在した。ほんの５０％という減少した欠陥発生率が、ＴＡＵ＋３ＮＰ処置マウスにおいて見出された。
【０１７６】
銀染色は、組織サンプルの正体を知らない病理学者が行った。ＴＡＵ＋３ＮＰ処理マウスにおいて、神経損傷の明瞭な徴候は検出されなかった。しかし、コントロール＋３ＮＰ処置マウスにおいて、線条体領域（尾状領域／被殻領域）および黒質におけるシナプス末端の銀染色は、著しかった。視床、深部中脳および／または網様体（髄質）における軸索および／またはシナプス末端の銀浸透をまた、コントロール＋３ＮＰ処置マウスの８０％において見出した。黒質は、線条に突き出し、そしてこれらの領域は、３ＮＰによる損傷に対して特に脆弱である。黒質および線条に対する損傷は、ＴＡＵによって予防される。
【０１７７】
（実施例９：癲癇の３−ニトロプロピオン酸（３ＮＰ）モデルにおけるＴＡＵの治療効果）
３−ニトロプロピオン酸（３ＮＰ）は、呼吸鎖の複合体ＩＩを阻害することによって作用するミトコンドリア毒素であり；これは、ハンティングトン病の特徴に類似する脳損傷を誘導するために使用される。発作はまた、癲癇およびミトコンドリア機能不全のモデルとしての３ＮＰの使用によって、誘導され得る。Ｕｒｂａｎｓｋａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５９：５５−８（１９９８）。２６〜４０ｇの体重である雄性ＣＤ−１マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＮＣＩ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ．ＭＤ）が、終止使用された。マウスを、５つの群に分割し、そして各群について動物を、異なる籠からランダムに選択し、可能な年齢の影響を避けた。マウスを、水および飼料に対して自由に近づけるように、１２時間の明暗周期で維持した。全ての実験を、９：００時間と１６：００時間との間、明期の間に実施した。マウス（ｎ＝１７〜２０）に、１６０ｍｇ／ｋｇの３ＮＰを与え、発作について追跡した。３ＮＰを、滅菌水中に１６ｍｇ／ｍｌまたは１８ｍｇ／ｍｌで作製した（ｐＨ：７．４）。３ＮＰを、体重１０ｇあたり０．１ｍｌの容量でｉ．ｐ．投与した。３ＮＰ投与の２時間前に、０．７５％ヒドロキシプロピル−メチルセルロースビヒクル中に、ＴＡＵを、４ｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．投与した。発作を、前記される方法と類似する方法で評価した（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＆  Ｋｅｉｔｈ，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２７０：５０５−１１，１９９４；Ｕｒｂａｎｓｋａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，３５９：５５−８，１９９８）。
【０１７８】
挙動観察を、３−ＮＰの適用後１２０分以内に実施した。痙攣発作応答の３つの主要な範疇を、考慮しそして記録した：
１．間代性の動き：顔の痙攣を伴う前肢の動き；
２．爆発性の間代性の動き：走行、跳躍および反跳を含む４本全ての肢の動き：
３．持続性応答：４本全ての肢の持続性屈曲および持続性伸長を含む：
死亡率は、３ＮＰ注射の１２０分後に評価された。
【０１７９】
３ＮＰは、一般的に死に至る走行挙動および跳躍挙動を生じ始める数匹のマウスを含む一次間代性発作を誘導した。ＴＡＵは、３ＮＰに起因する、間代性発作、走行発作および致死のパーセント発生率を減少した。一次終点は、間代性発作までの潜伏期であった。ＴＡＵは、間代性発作までの潜伏期を、２５．０〜４０．８分から増加した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
終点                      コントロール＋３ＮＰ      ＴＡＵ＋３ＮＰ
％間代性発作              ９０．０                  ７０．６
％走行発作                ４２．９                    ５．９
％致死率                  ３５                      １１．８
間代性発作までの潜伏期    ２３．８±０．７          ４０．８±４．９
（実施例１０：興奮毒性キノリン酸（ＱＡ）モデルにおけるＴＡＵの治療効果）
キノリン酸は、ハンティングトン病および興奮毒性障害のモデルにおいて使用されてきたＮＭＤＡレセプターアゴニストである（Ｂｅａｌら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１１：１６４９−５９，１９９１；Ｂｅａｌら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１１：１４７−５８，１９９１；Ｆｅｒｒａｎｔｅら、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，１１９：４６−７１，１９９３）。これは、線条に直接投与される場合、ＣＮＳに対する重篤な損傷を誘導し得る。線条体内ＱＡに起因する損傷および／または致死は、ＣＮＳ病因に起因しそうである。
【０１８０】
雄性６〜８月齢のＳｗｉｓｓマウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＮＣＩ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）をＱＡで処理した（両方の線条に、両側に５０または１００ｎｍｏｌを与えた（ｎ＝８／群）。ＴＡＵを、０．７５％  ヒドロキシプロピル−メチルセルロースビヒクル中、２００ｍｇ  ＴＡＵ／ｍＬで、４ｇ／ｋｇ  ｂｗ  ｐ．ｏ．をｂ．ｉ．ｄ．投与し、これを、１日前および第６日目まで毎日マウスに与えた。第７日目、マウスを屠殺した。ＱＡを、前記されるように２μｌ容量で投与した（Ｔａｔｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，６：１１２５−９，１９９５）。
【０１８１】
ＴＡＵ処置マウスにおいて、ＱＡに起因して致死率が減少した。５０ｎｍｏｌのＱＡで処置され、７日間生存するマウスのパーセントは、コントロール  Ｔ  ＱＡにおいて６４％であり、ＴＡＵ＋ＱＡにおいて７３％であり、そして１００ｎｍｏｌのＱＡで処置されたマウスについては、コントロール＋ＱＡ群においてたった４％であり、ＴＡＵ＋ＱＡ群において１９％であった。ＴＡＵは、ＱＡに起因する興奮毒性に対する神経保護効果を示した。
【０１８２】
（実施例１１：ハンティングトン病の３ＮＰモデルにおける、クレアチンまたは補酵素Ｑ１０と同時投与されたＴＡＵの効果）
（動物）
７〜９月齢（株：Ｃｒ：ＮＩＨ（Ｓ）；供給源：ＮＣＩ）、で３０〜４０ｇの重さである、回収された雄性ＣＤ−１マウスを、研究の間中、単に収容した。動物を、１２時間の明／暗周期に維持し、飼料および水を連続的に利用できるようにした。動物を、実験前７日間、本発明者らの設備に順応した。マウスを、ランダムに処置群に指定した。
【０１８３】
（薬物処置）
マウスに、第１日〜第６日において、４０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇの用量で３ＮＰをｉ．ｐ．投与し、第５日〜第１２日において、５０ｍｇ／ｋｇの用量で３ＮＰをｉ．ｐ．投与した。
【０１８４】
（３ＮＰ投与）
マウスに、第１日〜第６日において、４０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇおよび６０ｍｇ／ｋｇの用量で３ＮＰをｉ．ｐ．投与し、第５日〜第１２日において、５０ｍｇ／ｋｇの用量で３ＮＰをｉ．ｐ．投与した。３ＮＰを、滅菌水中に４、５または６．０ｍｇ／ｍｌで作製し（１．０  ＮａＯＨでｐＨを７．４に）、３〜４ＰＭに、各マウスに０．１ｍｌ／１０ｇＢＷを、（ｉ．ｐ．）投与した。
【０１８５】
（ＰＮ４０１、クレアチンまたは補酵素Ｑ１０投与）
ＴＡＵ（Ｎａｇａｓｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，５−１，Ｎｉｈｏｎｂａｓｈｉ  Ｋｏｂｕｎａｃｈｏ，Ｃｈｕｏ−Ｋｕ，Ｔｏｋｙｏ  １０３，Ｊａｐａｎ；Ｌｏｔ  １０３  Ｈ  ００６０）の投与量を、６％重量／重量で、齧歯類飼料に混合した。クレアチン（Ｓｉｇｍａ）を、２％（重量／重量）でこの飼料に混合した（これは、最適投与量であることが以前に報告されている（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｙａｎｇら、１９９８））。補酵素Ｑ１０（Ｓｉｇｍａ）を、投与量２００ｍｇ／飼料１ｋｇで飼料中に提供した（これは、以前に効果的であることが示されている（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｙａｎｇら、１９９８））。
【０１８６】
（実験設計）
実験１：ｎ＝９〜１２匹／群
ビヒクル＋ビヒクル
ビヒクル＋３ＮＰ
ＴＡＵ＋３ＮＰ
クレアチン＋３ＮＰ
ＴＡＵおよびクレアチン＋ビヒクル
実験２：（ｎ＝８〜１０匹／群）
ビヒクル＋ビヒクル
ビヒクル＋３ＮＰ
ＴＡＵ＋３ＮＰ
補酵素Ｑ１０＋３ＮＰ
ＴＡＵおよび補酵素Ｑ１０＋ビヒクル
実験３：（ｎ＝８〜１０匹／群）
ビヒクル＋ビヒクル
ビヒクル＋３ＮＰ
８％  ＴＡＵ＋ビヒクル
２％  ＴＡＵ＋３ＮＰ
４％  ＴＡＵ＋３ＮＰ
８％  ＴＡＵ＋３ＮＰ
（挙動）
マウスを、挙動観察を実施する同じ部屋に、別のプラスチック籠中に収容した。挙動観察を、９：００ＡＭと１：００ＰＭとの間に実施した。
【０１８７】
（運動活性）
Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、自発的活性を測定するために使用した。このシステムは、後ろ足で立ったマウスを識別するための第２レベルのビームを備える長方形構成中に、赤外線ビームを備える。この活性システムは、赤外線ビームの光路が破壊されるたびに計数する。自発的活性は、マウスをＰｈｏｔｏｂｅａｍ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍに３０分間の期間配置することによって定量される。マウスを、一旦活性試験に順応し、２基底線試験を実施し、平均された基底線活性を得た。
【０１８８】
（ロータロッド（Ｒｏｔａｒｏｄ））
Ｒｏｔａｒｏｄ器具（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、前肢および後肢の、運動協調および運動均衡を測定するために使用した。マウスは、６００秒のカットオフ時間の間、５（実験１）ＲＰＭまたは１０（実験２）ＲＰＭでロータロッド上にとどまり得るまで、ロータロッド訓練を受けた。マウスは、６００秒のカットオフ時間まで、ロータロッド上にとどまらなかった場合、研究から除外された。訓練期間の間、各マウスを、ロータロッド上に配置した。この期間内に、ロータロッドから落ちるまでの潜伏期を、記録した。マウスは、連続する４日間、毎日、２つの訓練走行を受けた。訓練後、マウスに、２回の基底線試験を実施し、これらを平均した。
【０１８９】
（統計）
データを、１方向または２方向ＡＮＯＶＡによって分析し、その後、Ｔｕｋｅｙ試験によって処置の比較をした。データを、平均±ＳＥＭとして示す。
【０１９０】
（結果）
（致死率）
ＴＡＵおよび／または補酵素Ｑ１０は、３ＮＰ処置に起因して、致死率を減少した（が、クレアチンは、減少しなかった）（図１および２）。ＴＡＵは、用量依存的に、致死率を減少し、４％および８％  ＴＡＵは、２％  ＴＡＵより多く致死率を減少した（図３）。
【０１９１】
（体重）
実験１〜３において、３ＮＰは、体重を有意に減少した（図４〜６）。ＴＡＵまたはＴＡＵ＋クレアチンは、体重減少を低減した（が有意ではない（ｐ＜０．０５））。実験２において、３ＮＰはまた、体重の有意な減少を誘導した（図５）。ＴＡＵまたは補酵素Ｑ１０は、体重の減少を低減したが、両方を合わせると低減しなかった。
【０１９２】
（活性）
実験１において、３ＮＰ処置に起因する活性の有意（ｐ＜０．００１）な減少があり、これは、ＴＡＵまたはクレアチンでの処置では低減されないが、ＴＡＵとクレアチンとを合わせた場合、妨げた。このことは、これらの２つの化合物の強い正の相互作用を示した（図７）。
【０１９３】
実験２において、３ＮＰ処置に起因する活性の減少があり、これは、ＴＡＵまたは補酵素Ｑ１０での処置によって低減されるが、両方を合わせると低減しなかった（図８）。
【０１９４】
実験３において、３ＮＰ処置に起因する活性の減少が存在し、これは、４％（Ｐ＝０．０５）および８％  ＴＡＵでの処置によって低減されるが、２％  ＴＡＵでは低減されなかった（図９）。
【０１９５】
（ロータロッド）
実験１において、５ＲＰＭでのロータロッドの性能は、３ＮＰの処置に起因して有意（ｐ＜０．０１）に損なわれた（図１０）。クレアチン＋３ＮＰ群はまた、ビヒクル＋ビヒクルコントロール群に比べて有意（ｐ＜０．０１）であった。ＰＮ４０１またはＴＡＵ／クレアチン処置は、３ＮＰに起因する損傷を有意に防止した。
【０１９６】
実験２において、３ＮＰに起因する、１０ＲＰＭでのロータロッド性能における有意（ｐ＜０．００１）な損傷があり、これは、ＴＡＵまたは補酵素Ｑ１０での処置によって低減されるが、両方を合わせては低減しなかった（図１１）。
【０１９７】
実験３において、３ＮＰに起因する、１０ＲＰＭでのロータロッド性能における有意（ｐ＜０．００１）な損傷があり、これは、全ての用量でＴＡＵでの処置によって低減された（図１２）。
【０１９８】
（実施例１２：ＴＡＵは、アジ化物の注入に起因して、ＣＮＳ細胞損失、体重減少および致死に対して保護した）
アルツハイマー病に罹患する患者は、複合体ＩＶのミトコンドリア呼吸鎖酵素であるシトクロムオキシダーゼの活性が減少している（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  １０５：８５５−８７０，１９９８）。アジ化物の注入は、インビボでのシトクロムオキシダーゼを阻害する（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６６：２６０６−２６１１，１９９６）。アジ化物の注入は、アルツハイマー病のモデルとして使用されてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９２；ＢｅｎｎｅｔｔおよびＲｏｓｅ，Ｂｅｈａｖ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ  ５８：７２−７５，１９９２）。
【０１９９】
（実験手順）
マウス（雄性Ｃ５７／ＢＬ／６Ｎマウス（１０〜１２週齢））に、Ａｌｚｅｔ  １００２浸透ミニポンプを用いて、０．９％生理食塩水またはアジ化ナトリウムを注入した（注入速度および時間：０．２５μｌ／時間、２週間）。アジ化ナトリウムは、滅菌生理食塩水（：４０μｇ／０．２５μｌ／（ｘ）時間、６０μｇ／０．２５μｌ／（ｘ）時間または８０μｇ／０．２５μｌ／（ｘ）時間について、それぞれ１６０ｍｇ／ｍｌ、２４０ｍｇ／ｍｌおよび３２０ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。ＴＡＵを、ペレット化された飼料に混合し、ポンプ注入の３日前に、マウスに与えた。
【０２００】
（実験群：（ｎ＝１０〜１８匹／群）
Ａ．生理食塩水
Ｂ．アジ化物  ４０μｇ／．時間    ＋標準的飼料
Ｃ．アジ化物  ４０μｇ／．時間    ＋飼料中６％のＴＡＵ
Ｄ．アジ化物  ６０μｇ／．時間    ＋標準的飼料
Ｅ．アジ化物  ６０μｇ／．時間    ＋飼料中６％のＴＡＵ
Ｆ．アジ化物  ８０μｇ／．時間    ＋標準的飼料
Ｇ．アジ化物  ８０μｇ／．時間    ＋飼料中６％のＴＡＵ
（手術：）
Ａｖｅｎｔｉｎ感覚脱失状態で、皮下的Ａｌｚｅｒ  １００２浸透ミニポンプを、マウスに埋め込んだ。各々の被験体について、約１ｃｍの切開を、首のうなじに作製し、皮膚を、筋肉および筋膜から引っ込め、ミニポンプを１．５ｃｍ挿入することによって、約１ｃｍのポケットを作製した。これらのミニポンプは、１００μｌのレザバを有し、１４日間、０．２５μｌ／時間の定常的注入速度を提供した。
【０２０１】
（組織学：）
全てのマウスを、注入期間の最後（すなわち、第１５日）に屠殺した。マウスを、Ａｖｅｎｔｉｎで麻酔し、微小注入ポンプを使用して、１０ｍｌのＰＢＳを経心臓的に注入し、その後、５０ｍｌの緩衝化４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ＝７．４）を注入した。全ての溶液は、氷冷状態である。脳を取り外し、それを、緩衝化４％パラホルムアルデヒド溶液中で、４時間、後固定し、３０％スクロース溶液中で低温保存した。
【０２０２】
冠状切片（３５μｍ）を、凍結ミクロトーム上で脳全体にわたって切断した。染色する細胞を同定するために、ＴＵＮＥＬ染色を、インサイチュ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号：１  ６８４  ８１７）に関する指示書によって示される手順に従って、実施した。ＴＵＮＥＬ染色は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識反応である。切片を、スライドガラス上にマウントし、付着させた。全ての切片を、給湿チャンバー中でインキュベーションし、インキュベーション期間の間、溶液の損失を防止する。スライドガラスを以下のように処理した。スライドガラスを、ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。ポジティブコントロール切片のみを、ＤＮａｓｅＩ（０．１ｍＭ  ＭｎＣ１２および１％  ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）；ＤＮＡＳ１中に希釈された２Ｕ／ｍｌは、ＤＮＡ鎖切断を誘導する）と共に３７℃で３０分間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄した。全ての切片を、プロテイナーゼＫ（Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。スライドガラスを、ＰＢＳで（３×５分）洗浄した。スライドガラスを、ブロッキング溶液（メタノール中、３％  Ｈ２Ｏ２）と、室温で１０分間インキュベーションした。スライドガラスを、ＰＢＳで（３×５分）洗浄した。スライドガラスを、０．１Ｍクエン酸ナトリウム＋０．１％トリトン中、３７℃で６０分間インキュベートした。スライドガラスを、ＰＢＳで（３×５分）洗浄した。キットの指示書に指示されるように、反応緩衝液中で、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．３１）およびヌクレオチド混合物（フルオレセイン−ｄＵＴＰ標識）を含有する標識溶液を混合する。ネガティブコントロールについて、酵素溶液は含まれず、ヌクレオチド混合物のみが、反応において使用される。この標識溶液を、使用の直前に混合し、必要とされるまで氷上に保持した。スライドガラスを、標識溶液中、３７℃で２時間インキュベートした。スライドガラスを、ＰＢＳで（５分×３）洗浄した。スライドガラスを、Ｖｅｃｔａ−ｓｈｉｅｌｄを用いて保護し、カバーガラスを架けた。フルオレセインによるＴＵＮＥＬ標識は、４５０ｎｍ〜５００ｎｍでの励起を用い、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ  ３００蛍光顕微鏡を使用して可視化し、５１５〜５６５ｎＭの緑の波長で検出した。
【０２０３】
（結果）
ＴＡＵ処置は、アジ化物の皮下注入に起因して、致死率を有意に減少した（図１３）。４０μｇ／時間  アジ化物を注入されたマウスは有意に体重が減少し、これは、ＴＡＵでの処置によって防止された（図１４）。ＴＡＵ処置はまた、ＴＵＮＥＬ染色によって示されるように、大脳皮質（図１５）および腹側脳幹（データは示さず）において細胞損失を減少した。
【０２０４】
（実施例１３：）
ＴＡＵは、高濃度（＞５０μＭ）のウリジンを血漿に送達する。次いで、ウリジンのヒト神経誘導細胞に生存に対する効果のインビトロでの試験を、評価する。通常のヒト神経前駆（ＮＨＮＰ）細胞を、神経膠星状細胞およびニューロンに分化した。細胞を、グルコースの非存在下および漸増濃度のアジ化物の存在下で培養した。
【０２０５】
（ＮＨＮＰ細胞培養物および特徴づけ）
胎児脳に由来するＮＨＮＰ細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；カタログ番号；ＣＣ−２５９８）から得た。ＮＨＮＰ細胞を、ニューロン、グリア細胞、内皮細胞または小グリア細胞に分化し得る。ＮＨＮＰを、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋Ｎ２補充物＋１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号１３２４７−０５１；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびｈＬＩＦ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２５０−Ｌ−０５０．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号１３２５６−０２９）を含む神経幹培地中で培養し、そしてＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋Ｎ２補充物＋１％  ＦＢＳを含む神経幹分化培地中で、１０日間分化した。継体３〜１４のＮＨＮＰ細胞を、９６ウェルプレート中に、１０ｋ細胞／ウェルでプレートし、１０日間分化した。
【０２０６】
ＮＨＮＰ細胞中のニューロンおよび神経膠星状細胞の特徴づけを、免疫細胞学によって確立した。ＮＨＮＰ細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで、室温で２０分間固定し、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７，４）で３回洗浄し、１００％エタノール中での２分間のインキュベーションを使用して浸透性にし、０．１Ｍ  ＰＢＳを用いて再度洗浄した。次いで、培養物を、０．１Ｍ  ＰＢＳ中、５％の正常なヤギ血清（ＮＧＳ）中で、室温で少なくとも１時間インキュベートした。ブロッキングの後、０．１Ｍ  ＰＢＳ中、１％  ＮＧＳ中に希釈した一次抗体中で、室温で１〜２時間または４℃で一晩、インキュベートした。マウス抗−  −チューブリンアイソタイプＩＩＩモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｔ８６６０．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、ニューロンを同定するために使用される一次抗体であった。マウス抗グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）モノクローナル抗体（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ；カタログ番号ＳＭＩ  ２１；Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、神経膠星状細胞を同定するために使用される一次抗体であった。培養物を、ＰＢＳで５〜６回洗浄し、１％  ＮＧＳ中に希釈された二次抗体と、室温で１時間インキュベートした。暗闇において使用される二次抗体は、ヤギ抗−マウス−ＦＩＴＣ（ＧＡＭ−ＦＩＴＣ，１：１２０；Ｓｉｇｍａ  Ｆ０２５７．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であった。
【０２０７】
ＮＨＮＰ細胞は、一般的に、ＮＨＮＰを用いた以前に公開された結果（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｃｕｉら、１９９９）と類似する（データは示さず）、約５０％のＧＦＡＰポジティブな神経膠星状細胞および２０％のβ−チューブリンポジティブなニューロンを有した。
【０２０８】
（細胞生存についてのアッセイ）
実験日において、細胞を、グルコースを含まないＤＭＥＭで洗浄し、次いで、グルコースを含まない１００μｌのＤＭＥＭ中で、２０時間培養し、１％  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２６３００−０６１）に透析した。これらの細胞を、１００μＭのウリジンを含むかまたは含まずに、０ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、および８ｍＭでアジ化ナトリウムと共にインキュベートした。
【０２０９】
細胞生存を、細胞外乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）／細胞内総デヒドロゲナーゼ活性の比によって評価した（ＭＴＴアッセイ）。各条件を、３回または４回アッセイした。
【０２１０】
（培地中のＬＤＨアッセイ：）
インキュベーション後、培地を、Ｖ底９６ウェルプレート中に回収し、１５００ｒｐｍで７分間遠心分離した。細胞外ＬＤＨを、５０μｌの上清を用いて、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ１７８０．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、キットの指示書に従って使用してアッセイし、４９０ｎｍでのＯＤを読み取った。
【０２１１】
（ＭＴＴアッセイ：）
ＮＨＮＰ細胞から培地を除去した後、１００μｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ、グルコースなし、および１％  ＦＢＳに透析された）を、元の細胞に添加した。ＭＴＴを、細胞中で、キットの指示書に従ってＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ４１００、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、アッセイした。色素溶液（１５μｌ）を、各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。停止溶液（１００μｌ）を、各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。ＯＤを、５７０ｎｍで読み取った。
【０２１２】
（結果：）
５０μＭ以上のウリジンを、分化したＮＨＮＰ細胞の頑健な保護に必要とした（図１６）。これらの結果を、細胞外ＬＤＨのみを細胞死のマーカーとして使用する次のアッセイで確認した。
【０２１３】
本発明は、好ましい実施形態によって記載される一方、バリエーションおよび改変が当業者に想起されることが理解される。従って、添付の特許請求の範囲は、全てのこのような等価なバリエーションおよび改変を包含し、これらは、特許請求の発明の範囲内に入ることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】ＴＡＵおよび／またはクレアチンに加えて３ＮＰで処置されたマウスの生存プロット。
【図２】ＴＡＵおよび／または補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ）に加えて３ＮＰで処置されたマウスの生存プロット。
【図３】漸増用量のＴＡＵに加えて３ＮＰで処置されたマウスの生存プロット。
【図４】ベースラインの体重のパーセンテージとしての体重に対する３ＮＰならびにＴＡＵおよび／またはクレアチンの効果。＊は、ビヒクル＋ビヒクル処置群と比較してｐ＜０．０５の差分を示す。
【図５】ベースラインの体重のパーセンテージとしての体重に対する３ＮＰならびにＴＡＵおよび／または補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ）の効果。ビヒクル＋ビヒクルをビヒクル＋３ＮＰ群と比較すると、ｐ＜０．０５の差分が存在した。ビヒクル＋３ＮＰをＴＡＵ＋３ＮＰ群と比較すると、ｐ＜０．０５の差分が存在した。
【図６】ベースラインの体重のパーセンテージとしての体重に対する３ＮＰおよび漸増用量のＴＡＵの効果。食事＋ビヒクルを３ＮＰを用いる全ての群と比較すると、ｐ＜０．００１の差分が存在した。
【図７】活性に対する３ＮＰならびにＴＡＵおよび／またはクレアチンの効果。ビヒクル＋ビヒクル処置群と比較すると、ＴＡＵ＋３ＮＰ群およびクレアチン＋３ＮＰ群についてｐ＜０．００１の差分が存在した。
【図８】活性に対する３ＮＰならびにＴＡＵおよび／または補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ）の効果。ビヒクル＋ビヒクル群と比較してｐ＜０．００１で、３ＮＰに起因する活性の減少があった（全ての群を３ＮＰで処置した）。
【図９】活性に対する３ＮＰおよび漸増用量のＴＡＵの効果。ビヒクル＋ビヒクル群と比較してｐ＜０．００１で、３ＮＰに起因する活性の減少があった（全ての群を３ＮＰで処置した）。ビヒクル＋３ＮＰ群および４％ＴＡＵ＋３ＮＰ群と比較して、ｐ＝０．０５の差分が存在した。
【図１０】５ＲＰＭでのｒｏｔａｒｏｄ動作に対するＴＡＵおよび／またクレアチンを伴う３ＮＰの効果。ビヒクル＋３ＮＰ群またはクレアチン＋３ＮＰ群と比較したビヒクル＋ビヒクル処置群と比較するとｐ＜０．０１の差分が存在した。
【図１１】１０ＲＰＭにおけるｒｏｔａｔｒｏｄ動作に対するＴＡＵおよび／またはクレアチンを伴う３ＮＰの効果。ビヒクル＋３ＮＰ群と比較したビヒクル＋ビヒクル処置群と比較するとｐ＜０．０５の差分が存在した。
【図１２】１０ＲＰＭにおけるｒｏｔａｒｏｄ動作に対する漸増用量のＴＡＵの効果。ビヒクル＋３ＮＰ群と比較したビヒクル＋ビヒクル処置群と比較してｐ＜０．００１の差分が存在した。ＴＡＵで処置された全ての３ＮＰ群と比較して、ビヒクル＋３ＮＰのｐ＜０．０１の差分が存在した。
【図１３】ＴＡＵに加えて、皮下注入により異なる用量のアジドで処置されたマウスの生存プロット。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ試験を使用するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットは、ＴＡＵが、６％ＴＡＵ＋４０μｇ／時または８０μｇ／時のアジドそれぞれと比較した食事＋４０μｇ／時または８０μｇ／時のアジドと比較してｐ＜０．０５生存率を増加したことを示す。ＴＡＵはまた、６０μｇ／時のアジド注入に起因して６０％から３０％に死亡率を低下させた（データは示さず）。
【図１４】ベースラインの体重のパーセンテージとしての体重に対する、アジド注入およびＴＡＵの異なる用量の効果。ビヒクル＋４０μｇ／時アジド群とビヒクル＋生理食塩水とを比較するとｐ＜０．０５の差分が存在した。ＴＡＵ＋４０μｇ／時アジド群とビヒクル＋４０μｇ／時アジドとを比較するとｐ＜０．０５の差分が存在した。食事＋６０μｇ／時および８０μｇ／時アジド群における高い程度の死亡率は、少数の生存動物における体重の高い変動を生じた。
【図１５】８０μｇ／時のアジドを２週間注入したマウスの大脳皮質におけるＴｕｎｅｌポジティブ細胞に対するＴＡＵの効果。６％ＴＡＵでの処置は、死滅する細胞を劇的に減少させた。倍率２００×。
【図１６】グルコースの非存在下および漸増濃度のアジドで培養されたＮＨＮＰ細胞の生存に対する漸増濃度のウリジンの効果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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