(57)【要約】本発明は、不整脈等の心疾患を診断する方法、心疾患を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法、および心疾患を治療または予防するためのこれら化合物の使用方法を提供する。また、スクリーニング法において使用可能な動物モデル系も本発明において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の試料の核酸分子を分析し、該被験者が電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に変異を有するか否かを決定することを含み、変異の存在により該被験者が電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットに関連する疾患を有するまたは発症する危険性があることが示される、被験者が電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットに関連する疾患または病態を有するまたは発症する危険性があるか否かを決定する方法。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の核酸分子増幅のために、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に特異的な核酸分子プライマーを用いる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
被験者由来の電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする核酸分子をシークエンシングすることにより、遺伝子が変異を含むか否かの決定を行う、請求項1記載の方法。
【請求項４】
被験者が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被験者がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
疾患または病態が心疾患である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
心疾患が不整脈ある、請求項6記載の方法。
【請求項８】
不整脈が心房細動である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
変異がアイランドビート変異である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に変異を含み心疾患に特有の表現型を有する生物に化合物を接触させ、該化合物の該表現型への効果を決定することを含み、該表現型における改善の検出により心疾患を治療または予防するのに使用可能な化合物が同定されたことが示される、心疾患を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法。
【請求項１１】
心疾患が不整脈である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
不整脈が心房細動である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
生物がゼブラフィッシュである、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子における変異がアイランドビート変異である、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
請求項10記載の方法を用いて同定される化合物を患者に投与することを含む、患者の心疾患を治療または予防する方法。
【請求項１６】
心疾患が不整脈である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
心疾患が心房細動である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
患者が電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に変異を有する、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
変異がアイランドビート変異である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
電位依存性L型カルシウムチャネルの機能的なα1Cサブユニットまたは該サブユニットをコードする核酸分子を含む発現ベクターを患者に投与することを含む、患者の心疾患を治療または予防する方法。
【請求項２１】
ゼブラフィッシュ電位依存性L型カルシウムチャネルの実質的に純粋なα1Cサブユニット。
【請求項２２】
配列番号：2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項21記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号：2のアミノ酸配列を含む、請求項22記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ゼブラフィッシュ電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする配列を含む、実質的に純粋な核酸分子。
【請求項２５】
配列番号：2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項24記載の核酸分子。
【請求項２６】
配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項25記載の核酸分子。
【請求項２７】
核酸分子がDNAである、請求項24記載の核酸分子。
【請求項２８】
請求項24記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２９】
請求項28記載のベクターを含む細胞。
【請求項３０】
請求項24記載の核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３１】
動物がゼブラフィッシュである、請求項30記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３２】
α1Cサブユニットポリペプチドをコードする対立遺伝子の一方または両方にノックアウト変異を有する非ヒト動物。
【請求項３３】
請求項32記載の非ヒトノックアウト動物由来の細胞。
【請求項３４】
電位依存性L型カルシウムチャネルの変異型α1Cサブユニットをコードする核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３５】
非ヒトトランスジェニック動物ゼブラフィッシュである、請求項34記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３６】
アイランドビート変異を含む、請求項35記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３７】
電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットに特異的に結合する抗体。
【請求項３８】
患者の心疾患を治療または予防するための医薬品の調製における、請求項10記載の方法を用いて同定される化合物の使用。
【請求項３９】
患者の心疾患を治療または予防するための医薬品の調製における、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットまたは該サブユニットをコードする核酸分子を含む発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、心疾患を診断する方法および治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心律動障害（すなわち、不整脈または頻脈性不整脈）は、ヒトの罹患および死亡の一般的な原因である。心房を冒す不整脈は、心房細動、発作性上室性頻拍、および心房粗動の大きく3つの種類に分類されるが、このうち心房細動が最も一般的である。実際にアメリカでは、現在およそ200万人の患者が心房細動と診断されている（Nattelら、Annu. Rev. Physiol. 62:51-77. 2000）。この種類の不整脈では、心房の規則正しいポンプ作用が乱れた効果のない振動に取って代わられ、心臓が十分な量の血液を体に供給することができない。心房細動の原因はまれに遺伝的なものもあるが、通常その原因は不明である。しかし、心房細動は心不全、リウマチ性心疾患、冠動脈疾患、左室肥大、心筋症、高血圧症、および手術と関連していることが多く、心房細動を患う患者は脳卒中を起こす危険性が高いと思われる（Brugadaら、N. Engl. J. Med. 336:905-911, 1997；Gruverら、Am. J. Cardiol. 83:13H-18H, 1999；Ryderら、Am. J. Cardiol. 83:131R-138R, 1999）。
【０００３】
カルシウムチャネル等のイオン透過孔は、心臓の正常な生理的機能に極めて重要な役割を果たす。電位依存性カルシウムチャネルは、例えば心筋の原形質膜をはさんだカルシウムイオンの脱分極依存的流入を媒介し、その結果脱分極を収縮へとつなげる。心臓のヘテロマーのL型カルシウムチャネルは、複数のサブユニットを含む。α1サブユニットはチャネルのCa++透過孔を形成し、4つの膜貫通ドメイン（I〜IV）を含み、各ドメインは活性化の電位センサーとして働く高荷電両親媒性セグメント（S4）を含む6つの膜貫通セグメント（S１〜S6）で構成される（Striessnig, Cell Physiol. Biochem. 9:242-269, 1999；Lehmann-Hornら、Physiol. Rev. 79:1317-1372, 1999）（図1A）。ヒトでは、4つの異なる遺伝子にコードされる少なくとも4種類のα1サブユニット（α1C、α1D、α1F、およびα1S）が、L型カルシウム電流を透過させる。心筋細胞は、L型カルシウムチャネルサブユニットのα1Cのみを発現する(Mikamiら、Nature 340:230-233, 1989；Wellingら、Circ. Res. 81:526-532, 1997)。さらに、α1Cサブユニットは選択的スプライシングを受けることにより3つのアイソフォームを生じ（α1C-A、α1C-B、およびα1C-C）、心臓で発現される主なアイソフォームはα1C-Aであることが知られている。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニット遺伝子における変異が哺乳動物の不整脈、心房細動に類似した表現型をゼブラフィッシュにもたらすという知見に基づく診断法、医薬スクリーニング法、および治療法を提供する。
【０００５】
本発明は、被験者（例えば、ヒト等の哺乳動物）に電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットに関連する疾患または病態（例えば、不整脈(例えば心房細動)等の心疾患）があるか否か、または被験者がその疾患を発症する危険性があるか否かを決定する方法を提供する。この方法は、被験者由来の試料の核酸分子を解析し、被験者がこのタンパク質をコードする遺伝子に変異（例えばアイランドビート(island beat)変異）を有するか否かを決定することを含む。変異の存在により、被験者が電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットに関連する疾患を有するまたは発症する危険性があることが示唆される。
【０００６】
この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の核酸分子増幅のために、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に特異的な核酸分子プライマーを用いる段階をさらに含んでもよい。遺伝子が変異を含むか否かの決定は、被験者由来の電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする核酸分子のシークエンシングによって行うことができる。
【０００７】
第二の局面において、本発明は、心疾患（例えば不整脈(例えば心房細動)）を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法を提供する。この方法は、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に変異（例えばアイランドビート変異）を有し心疾患に特有の表現型を有する生物（例えばゼブラフィッシュ）に化合物を接触させること、およびその化合物の表現型への効果を決定することを含む。その表現型において改善が認められれば、心疾患を治療または予防するのに使用可能な化合物が同定されたことが示される。
【０００８】
第三の局面において、本発明は、患者の心疾患（例えば不整脈(例えば心房細動)）を治療または予防する方法を提供し、これには上述の方法を利用して同定される化合物を患者に投与することを含む。患者は、例えば、アイランドビート変異などの電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子の変異を有しうる。
【０００９】
第四の局面において、本発明は、機能的な電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットまたはそのサブユニットをコードする核酸分子を含む発現ベクターを患者に投与することを含む、患者の心疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００１０】
第五の局面において、本発明は、実質的に純粋なゼブラフィッシュの電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットを提供する。このポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれらの配列を含んでいてよい。
【００１１】
第六の局面において、本発明は、ゼブラフィッシュの電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする配列を含む実質的に純粋な核酸分子（例えばDNA分子）を提供する。この核酸分子は、配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【００１２】
第七の局面において、本発明は、患者の心疾患を治療または予防するための医薬品の調製における、上述の方法を用いて同定される化合物の使用を含む。
【００１３】
第八の局面において、本発明は、患者の心疾患を治療または予防するための医薬品の調製における、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットまたはこのサブユニットをコードする核酸分子を含む発現ベクターの使用を含む。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は上述の核酸分子を含むベクター、このベクターを含む細胞、上述の核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物（例えばゼブラフィッシュ）、α1Cサブユニットポリペプチドをコードする対立遺伝子の一方または両方にノックアウト変異を有する非ヒト動物、この動物由来の細胞、電位依存性L型カルシウムチャネルの変異型α1Cサブユニット（例えばアイランドビート変異）をコードする核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物（例えばゼブラフィッシュ）、および電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットに特異的に結合する抗体を含む。
【００１５】
「ポリペプチド」または「ポリペプチド断片」とは、いかなる翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、二つ以上のアミノ酸の鎖を意味し、これは自然界に存在するまたは自然界に存在しないポリペプチドのすべてまたは一部を構成する。「翻訳後修飾」とは、合成中または合成後のポリペプチドまたはポリペプチド断片に対する何らかの変化を意味する。翻訳後修飾は、（細胞内での合成中等に）自然に起こり得るか、または（組換えまたは化学的手段等によって）人工的に引き起こし得る。「タンパク質」は、一つ以上のポリペプチドで構成され得る。
【００１６】
「α1Cサブユニット」、「α1Cサブユニットタンパク質」または「α1Cサブユニットポリペプチド」とは、ヒト（例えば、配列番号:2を参照のこと）またはゼブラフィッシュ（例えば、配列番号:4を参照のこと）の電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットの配列と少なくとも45％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％、および最も好ましくは少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。α1Cサブユニット遺伝子配列のスプライシング変種および変異を含むα1Cサブユニット遺伝子由来のポリペプチド産物も、この定義に含まれる。本明細書において定義するように、α1Cサブユニットポリペプチドは、心臓の発生、モデリング、および機能に関与している。これは、例えば心房細動といった不整脈等の心疾患のマーカーとして用いることができる。したがって本発明は、本明細書に記載するように、α1Cサブユニットポリペプチドのこれらおよび他の機能のいずれかを有し、ヒト（配列番号:2）またはゼブラフィッシュ（配列番号:4）のα1Cサブユニットポリペプチドとの配列同一性（例えば、少なくとも75％、85％、90％、または95％）を有するタンパク質を含む。
【００１７】
「α1Cサブユニット核酸分子」とは、先に定義したように、α1Cサブユニット（例えば、ヒト（例えば配列番号:1）またはゼブラフィッシュ（例えば配列番号:3）のα1Cサブユニット）、α1Cサブユニットタンパク質、α1Cサブユニットポリペプチド、もしくはその一部をコードするゲノムDNA、cDNA、またはRNA（例えばmRNA）分子等の核酸分子を意味する。α1Cサブユニット核酸分子の変異は、例えば1077コドンの第一塩基におけるCからTへのヌクレオチド転換（CAG→TAG）により特徴付けられ、これによりグルタミンから終止コドンに変化することが予想される、または1352コドンにおけるTからAへのヌクレオチド転換（TTG→TAG）により特徴付けられ、これによりロイシンから終止コドンに変化しうる。本発明は、これらのゼブラフィッシュのアイランドビート変異に加えて、異常なα1Cサブユニットの産生または機能をもたらすいかなる変異も含み、単なる例としてではあるがヌル突然変異および切断を引き起こす変異も含む。
【００１８】
「同一性」という用語は、本明細書において、特定の核酸分子またはポリペプチドの配列とそれと同じタイプの参照分子の配列との関係を示すために用いられる。例えば、整列させた参照分子と比較して、ポリペプチドまたは核酸分子がある位置で同じアミノ酸またはヌクレオチド残基を有する場合、その位置で「同一」であると言う。参照分子に対する核酸分子またはポリペプチドの配列同一性のレベルは、通常、最適な配列比較を行うためのギャップの導入等のそこに規定されたデフォルトパラメーターを使い、配列解析ソフトウェアを用いて測定する（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、ジェネティクスコンピューターグループの配列解析ソフトウェアパッケージ、1710 University Avenue,  Madison, WI 53705、BLAST、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）。これらのソフトウェアプログラムは、様々な置換、欠失、または他の修飾に同一性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を整合させる。保存的置換には、一般的に以下の群内での置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
【００１９】
核酸分子またはポリペプチドは、それが参照分子の配列に対して、その全長にわたって少なくとも51％、好ましくは少なくとも55％、60％、または65％、および最も好ましくは75％、85％、90%、または95％の同一性を示す場合に、参照分子に対して「実質的に同一」であると言う。ポリペプチドに関しては、比較配列の長さは少なくとも16個のアミノ酸、好ましくは少なくとも20個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも25個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも35個のアミノ酸である。核酸分子に関しては、比較配列の長さは少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも110ヌクレオチドである。
【００２０】
α1Cサブユニット核酸分子またはα1Cサブユニットポリペプチドは、その生物活性の決定、またはそれが野生型であるかもしくは変異型であるかの決定をする試験方法が実施された場合に、「解析される」または「解析」に供される。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて動物のゲノムDNAを増幅し、次に、例えばヌクレオチド配列または制限酵素断片解析によって増幅されたDNAが例えばアイランドビート変異等の変異を含むか否かを決定することにより、動物（例えば、ヒトまたはゼブラフィッシュ）のα1Cサブユニット遺伝子を解析することができる。
【００２１】
「プローブ」または「プライマー」は、相補的配列（「標的」）を含む第二のDNAまたはRNA分子と塩基対を形成することができる規定の配列の一本鎖DNAまたはRNA分子を意味する。形成されたハイブリッドの安定性は、塩基対形成の起こる程度に依存する。この安定性は、プローブと標的分子間の相補性の程度、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度等のパラメータによって影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度は、温度、塩濃度、およびホルムアミド等の有機分子の濃度のようなパラメータによって影響を受け、当業者に周知の方法によって決定される。α1Cサブユニット核酸分子に特異的なプローブまたはプライマーは、ヒト（配列番号:1）またはゼブラフィッシュ（配列番号:3）のα1Cサブユニットをコードする遺伝子配列と好ましくは45％を超える配列同一性、より好ましくは少なくとも55〜75％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも75〜85％の配列同一性、さらにこれより好ましくは少なくとも85〜99％の配列同一性、および最も好ましくは100％の配列同一性を有する。
【００２２】
プローブは、当業者に周知の方法により、検出可能な程度に放射性標識または非放射性標識することができる。プローブは、核酸シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）解析、制限断片長多型（RFLP）解析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、および当業者に周知の他の方法等の、核酸ハイブリダイゼーションに関する方法に用いることができる。
【００２３】
分子、例えば、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマー、遺伝子もしくはその断片、cDNA分子、ポリペプチド、または抗体は、その存在が試料中で直接同定され得るように標識される場合に、「検出可能な程度に標識される」と言うことができる。検出可能な程度に分子を標識する方法は当技術分野で周知であり、放射性標識（例えば、32Pまたは35Sのような同位元素）および非放射性標識（例えば、フルオレセインのような蛍光標識）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然に付随するタンパク質および有機分子から分離されているポリペプチド（またはその断片）を意味する。一般に、ポリペプチドは、それが天然に会合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を重量で少なくとも60％含まない場合に、実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチドは重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも99％純粋であるα1Cサブユニットポリペプチドである。実質的に純粋なα1Cサブユニットポリペプチドは、例えば天然源（例えば単離された心臓組織）からの抽出、α1Cサブユニットポリペプチドをコードする組換え核酸分子の発現、または化学合成によって得ることができる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析等の何らかの適当な方法によって測定することができる。
【００２５】
ポリペプチドは、天然状態でこれに付随するタンパク質および有機分子から分離されている場合に、天然に会合する成分を実質的に含まない。このように、化学合成された、またはそれが天然に産生される細胞とは異なる細胞系において産生されたタンパク質は、天然に会合する成分を実質的に含まない。したがって、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に由来するポリペプチドが含まれるのみならず、大腸菌をはじめとする原核生物で合成されたポリペプチドも含まれる。
【００２６】
抗体は、例えば天然にポリペプチドを含む生体試料等の試料において、このポリペプチド（例えばα1Cサブユニットポリペプチド）を認識して結合するが、他の分子（例えば非α1Cサブユニット関連ポリペプチド）を実質的に認識せず結合しない場合に、ポリペプチドに「特異的に結合する」と言う。
【００２７】
「高ストリンジェンシー条件」とは、0.5 M NaHPO4、pH 7.2、7％SDS、1 mM EDTA、および1％BSA（フラクションV）を含む緩衝液において65℃で、または48％ホルムアミド、4.8 × SSC、0.2 Mトリス-Cl、pH 7.6、1 × デンハルツ溶液、10％硫酸デキストラン、および0.1％SDSを含む緩衝液において42℃で、少なくとも500ヌクレオチド長のDNAプローブを用いて起こるハイブリダイゼーションに匹敵するハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。（これらは、高ストリンジェンシーのノーザンまたはサザンハイブリダイゼーションの典型的な条件である。）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはまた、高ストリンジェンシーPCR、DNAシークエンシング、一本鎖DNA高次構造多型解析、およびインサイチューハイブリダイゼーション等の分子生物学者によって日常的に行われる多数の手法の確立に貢献している。ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーションとは対照的に、これらの手法は通常比較的短いプローブを用いて行われる（例えば、PCRまたはシークエンシングに関しては通常16ヌクレオチド以上、およびインサイチューハイブリダイゼーションに関しては40ヌクレオチド以上）。これらの手法において用いられる高ストリンジェンシー条件は分子生物学の当業者に周知であり、その例は例えば、参照として本明細書に組み入れられるAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1998に見ることができる。
【００２８】
「試料」とは、患者または被験者から得られた組織生検、羊水、細胞、血液、血清、尿、便、またはその他の検体を意味する。試料は、当技術分野において周知の方法によって、α1Cサブユニット遺伝子における変異またはα1Cサブユニット遺伝子の発現レベルを検出するために解析することができる。例えば、患者の試料に由来するPCR産物にシークエンシング、一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）解析、または制限断片長多型（RFLP）解析等の方法を用いてα1Cサブユニット遺伝子における変異を検出することができ、ELISAを用いてα1Cサブユニットポリペプチドのレベルを測定することができ、およびPCRを用いてα1Cサブユニット核酸分子のレベルを測定することができる。
【００２９】
「α1Cサブユニット関連疾患」または「α1Cサブユニット関連病態」とは、α1Cサブユニット遺伝子の不適当に高いもしくは低い発現、またはα1Cサブユニット核酸分子もしくはポリペプチドの生物活性を変化させるα1Cサブユニット遺伝子における変異が原因で起こる疾患または病態を意味する。α1Cサブユニット関連疾患および病態は、α1Cサブユニットが出生前または出生後に発現されるいかなる組織においても起こり得る。α1Cサブユニット関連疾患および病態には、不整脈（例えば心房細動）等の心疾患が含まれ得る。
【００３０】
本発明はいくつかの利点を提供する。例えば、本発明の診断方法を用いて、患者における不整脈（例えば心房細動）等の心疾患が起こる可能性の増大を検出することが可能であり、よって何らかの症状が見られる以前に適切な処置を行うことが可能である。これは、例えば不整脈（例えば心房細動、上記参照）の危険性の高い群の患者に有効となり得る。また、本発明の診断方法により、患者における不整脈等の既存の心臓病の病因決定が容易になり、適切な治療法が選択され得る。さらに、本発明のスクリーニング方法は、不整脈（例えば心房細動）等の心臓の病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定するのに用いることが可能である。
【００３１】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなると思われる。
【００３２】
詳細な説明
本発明は、心疾患を診断する方法、心疾患を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定するスクリーニング方法、および該化合物を用いて心疾患を診断または治療する方法を提供する。特に、本発明者らは、ゼブラフィッシュの電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子の変異（アイランドビート変異）が、ヒトの不整脈、心房細動に類似した表現型をゼブラフィッシュにもたらすということを見出した。したがって、本発明の診断方法は、心臓で発現される優勢なアイソフォーム(α1C-A)に影響を及ぼす変異を含む電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子における変異の検出に関連し、化合物の同定方法は、これらのチャネルの該サブユニットをコードする遺伝子に変異を有する生物または他の不整脈モデルの表現型に影響を与える化合物のスクリーニングに関連する。このようにして同定された化合物は、不整脈(例えば心房細動)等の心疾患を治療または予防する方法において用いることができる。
【００３３】
本発明はまた、上述のスクリーニング法に使用可能な動物モデル系（例えば、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に変異（例えばアイランドビート変異）を有するゼブラフィッシュ、または該変異を有するマウス（または他の動物））、ゼブラフィッシュの電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニット、およびこのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。また、ゼブラフィッシュの変異型α1Cサブユニットをコードする遺伝子（例えば、アイランドビート変異を有する遺伝子）およびこれらの遺伝子にコードされるタンパク質も本発明に含まれる。これらのタンパク質（野生型または変異型）に特異的に結合する抗体も、本発明に含まれる。
【００３４】
本発明の診断、スクリーニング、および治療方法、ならびに本発明の動物モデル系、タンパク質、および遺伝子について、以下に詳述する。
【００３５】
診断方法
電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニット(例えばα1C-Aアイソフォーム)をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子によってコードされるポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに特異的な抗体は、このサブユニットをコードする遺伝子における変異またはその不適当な発現に関連する疾患および病態を診断またはモニターする方法において用いることができる。上述のように、ゼブラフィッシュにおけるアイランドビート変異は、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に存在し、ヒトにおける不整脈の表現型と類似の表現型を特徴とする。このように、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子またはその発現における異常の検出は、不整脈(例えば心房細動)等のヒトの心疾患を診断する方法、またはその治療もしくは発症をモニターする方法において用いることができる。
【００３６】
本発明の診断方法は、例えば、不整脈を患う患者にその病因を決定するために用いることができ、そのため適切な治療過程の選択が容易になる。この診断方法はまた、不整脈をまだ発症していないが今後発症する危険性がある患者、または該疾患を発症する初期段階にある患者について用いることができる。同様に、本発明の診断方法は出生前遺伝子スクリーニングに用いることができ、例えば、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子において劣性変異を保因する可能性のある親が同定される。
【００３７】
本発明の方法を用いて診断および治療できる不整脈の例には、心房細動、心房粗動、および発作性上室性頻拍があるが、これらはすべて心房の律動障害である。心房細動は他の種類の心疾患に関連していることも多く、よってこれらの疾患も本発明の方法を用いて診断できる。これらの疾患には、例えば、肺内部または体内の液体貯留を特徴とするうっ血性心不全、心臓弁の永久的な損傷を原因とするリウマチ性心不全、心筋の冠動脈を通る血流が減少する冠動脈心疾患、左室肥大、心臓肥大とそれに伴う心臓壁の薄化、または心筋の肥大、心臓の拡大、心臓壁の硬直と柔軟性の喪失、および心室腔の狭小化のどちらかを特徴とする心筋症、ならびに高血圧症（例えば高血圧）が含まれる。本発明の方法は、いかなる哺乳動物、例えばヒト、ペット、または家畜においても、本明細書に記載の疾患を診断または治療するために用いることができる。
【００３８】
本発明の診断方法を用いて検出できる電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットの異常には、例えば、（i）異常なα1Cサブユニットポリペプチドの産生を起こす変異を含むα1Cサブユニットをコードする遺伝子、（ii）異常なα1Cサブユニットポリペプチド自身、および（iii）異常な量の電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットの産生をもたらす該サブユニットをコードする遺伝子の変異、を特徴とする異常が含まれる。該異常の検出は、不整脈(例えば心房細動)等のヒトの心疾患を診断する方法において利用できる。本発明の方法を用いて検出される電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットの変異の典型的な例はアイランドビート変異である(後述参照)。
【００３９】
電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子の変異は、たとえこのサブユニットが発現されていなくても、被験者のいかなる組織において検出できる。これらのタンパク質が発現されている組織の数は限られているため（例えば、心筋および平滑筋）、およびアッセイのための該組織の試料採取は望ましくないため、血液または羊水試料等のより容易に得られる別のタイプの試料において、変異型遺伝子を検出することが好ましいと思われる。
【００４０】
電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子における変異の検出は、標準的な診断手法のいずれかを用いて行うことができる。例えば、患者から得られた生体試料は、ミスマッチ検出法により、α1Cサブユニットをコードする核酸分子における一つ以上の変異（例えばアイランドビート変異、以下を参照のこと）に関して解析することができる。一般に、この方法には患者の試料からの核酸分子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅が含まれ、それに続いて、ハイブリダイゼーションの変化、異常な電気泳動ゲル移動、結合、もしくはミスマッチ結合タンパク質によって媒介される切断の検出により、または直接核酸分子シークエンシングにより、変異（すなわちミスマッチ）の同定が行われる。電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする変異型遺伝子の検出を容易にするためには、これらの手法のいずれもが利用でき、それぞれ当技術分野で周知である。例えばこれらの手法の例は、Oritaら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2766-2770, 1989）およびSheffieldら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:232-236, 1989）によって記載されている。
【００４１】
変異の検出アッセイ法は、既存の心疾患の診断を容易にする上、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子の変異に関連する心疾患の素因を、症状が発現する前に診断する機会も提供する。例えば、正常な電位依存性L型カルシウムチャネル生物活性または発現を抑制する異常な電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニット（またはその異常な量）をコードする遺伝子に関してヘテロ接合である患者は、該タンパク質に関連した疾患の臨床症状を示さない可能性があるが、なおも不整脈(例えば心房細動)等の心疾患を発症する確率は正常より高い。そのような診断が仮定されれば、患者は有害な環境因子に対する曝露を最小限にするように予防することができ、例えば頻繁に健康診断を受けることにより、その病状を注意深くモニターすることができる。上術のように、このタイプの診断法は、出生前スクリーニングにおいて電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子の変異を検出するためにも用いることができる。
【００４２】
容易に入手できる組織由来のゲノムDNAを使用して、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子の変異を検出する診断方法を実施することが好ましいと思われるが、このサブユニットをコードするmRNAまたはサブユニット自身を、このタンパク質を発現しそれほど容易に入手できないであろう組織試料からアッセイすることもできる。例えば、患者の該組織試料における電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子の発現レベルは、当技術分野で周知の多くの標準的な手法のいずれかを用いて決定することができ、この手法にはノーザンブロット解析および定量的PCR（例えば、Ausubelら、前記；PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Ehrlich, Ed., Stockton Press, NY；Yapら、Nucl. Acids. Res. 19:4294, 1991を参照のこと）が含まれる。
【００４３】
本発明のもう一つの診断方法においては、イムノアッセイを用いて、生体試料中のα1Cサブユニットタンパク質のレベルを検出またはモニターする。電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、例えばα1C-Aサブユニットに特異的な抗体、を標準的なイムノアッセイフォーマット（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、またはRIA；例えばAusubelら、前記を参照のこと）のいずれかにおいて用いることにより、α1Cサブユニットのポリペプチドレベルを測定することができる。これらのレベルは、健常人由来の試料におけるα1Cサブユニットのレベルと比較することができる。この方法を用いてα1Cサブユニットの産生が減少していることが検出されれば、例えば、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットの不十分な生物活性に関与する病態または病態に対する素因があることが示唆されるかもしれない。
【００４４】
患者の試料における電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットの検出には、免疫組織化学的手法も用いることができる。例えば、患者から組織試料を得て、切片にし、抗α1Cサブユニット抗体または抗α1C-Aサブユニット抗体および何らかの標準的な検出系（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素に結合した二次抗体を含む系）を用いて電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットの存在に関して染色することができる。そのような手法に関する一般的な手引きは、例えば、Bancroftら、Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, 1982、およびAusubelら、前記に見ることができる。
【００４５】
不整脈を治療または予防するのに使用可能な分子の同定
不整脈に関連する表現型を引き起こすような電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子における変異を同定することにより、不整脈(例えば心房細動)等の心疾患を治療または予防するのに使用可能な分子（例えば、小さな有機もしくは無機分子、ペプチド、または核酸分子）の同定が容易になる。候補化合物が不整脈にもたらす効果は、例えばゼブラフィッシュの系を用いて調べることができる。ゼブラフィッシュ、Danio rerioは、血管発生の遺伝解析に用いるのに便利な生物である。世代時間が短いことと旺盛な繁殖力に加えて、その胚は扱いやすく透明であることから、発生の初期段階から血管機能を直接観察することができる。以下に詳述するように、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子における変異(例えばアイランドビート変異)を有するゼブラフィシュおよび他の動物は、これらの方法において用いることができ、よって本発明にはこれらの動物も含まれる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法の一例として、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に変異を有するゼブラフィッシュ（例えば、アイランドビート変異を有するゼブラフィッシュ）を候補化合物と接触させ、不整脈に特有の心臓異常の発症に及ぼすその化合物の影響、またはそのような既存の心臓異常の状態に及ぼすその化合物の影響を、未治療の全く同一の変異型対照と比較してモニターする。以下に詳述するように、アイランドビート変異を有するゼブラフィッシュは、個々の心房の心筋の収縮と無関係の、心管の蠕動運動の欠如、虚脱した無症候性の心室、および拡張し肥厚した心房を特徴とする。よって、本発明のスクリーニング方法を用いて、これらの特徴（心疾患の他の特徴に加えて）をモニターすることができる。
【００４７】
ゼブラフィッシュ系において化合物が望ましい効果を有することが示された後、心疾患の他のモデル、例えば電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に変異を有するマウスまたは他の動物において、この化合物を試験することができる。または、ゼブラフィッシュの試験をやらずに、そのような動物モデル系における試験を実施してもよい。
【００４８】
α1Cサブユニットのレベルまたは生物活性を上昇または低下させる分子の同定には、細胞培養に基づくアッセイ法も利用できる。ある方法では、α1CサブユニットmRNAを発現する細胞の培養液に種々の濃度で候補分子を添加する。次に、標準的な手法によりα1Cサブユニットの生物活性を測定する。生物活性の測定には、α1Cサブユニットタンパク質レベルおよびハートオブグラス核酸分子レベルの測定が含まれ得る。
【００４９】
一般に、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子における変異に関連する心疾患の予防または治療に用いられる新規薬剤は、天然物、合成（または半合成）抽出物、および化学物質ライブラリーの大規模ライブラリーから、当技術分野で周知の方法により同定することができる。薬剤の探索および開発分野の技術者には、被験抽出物または被験化合物の詳細な供給源が本発明のスクリーニング法に重要ではないこと、および脱反復(dereplication)法、または心疾患に対する治療活性が既に明らかな物質の反復もしくは繰り返しの除去を必要に応じて行い得ることが理解されると思われる。
【００５０】
被験候補化合物には、精製した（または実質的に精製した）分子または化合物の混合物（例えば、細胞由来の抽出物または上清；Ausubelら、前記）の一つ以上の成分が含まれ、該化合物には、さらに天然型または人工的な化学物質と既存の化合物の修飾物質の両方が含まれる。例えば、候補化合物は、ポリペプチド、合成有機または分子、天然有機または無機分子、核酸分子、およびそれらの成分であってよい。
【００５１】
天然の候補化合物の供給源には、当業者にとって容易に入手できるものが多数ある。例えば、天然化合物は、細胞（植物、真菌、原核生物、および動物を含む）抽出物、哺乳動物の血清、哺乳動物細胞を培養した増殖培地、タンパク質発現ライブラリー、または発酵培養液に見出され得る。さらに、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の状態である天然化合物のライブラリーは多くの業者から市販されており、これには、バイオティックス（Biotics）（英国、サセックス）、ゼノバ（Xenova）（英国、スラウ）、ハーバーブランチ海洋研究所（Harbor Branch Oceanographic Institute）（フロリダ州、フォートピアス）、およびファルママー（PharmaMar）、U.S.A.（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）が含まれる。さらに、例えば標準的な抽出および分画法のような当技術分野で周知の方法により、必要に応じて天然化合物のライブラリーを作製することができる。
【００５２】
人工的に誘導された候補化合物も、当業者にとって容易に入手できる。非常に多くの化合物をランダム合成または標的合成（例えば、半合成または全合成）する方法が多数あり、この化合物には糖類、脂質、ペプチド、および核酸分子に由来する化合物が含まれる。また、合成化合物ライブラリーは、ブランドンアソシエイツ（Brandon Associates）（ニューハンプシャー州、メリマク）およびアルドリッチケミカルズ（Aldrich Chemicals）（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から市販されている。例えば標準的な抽出および分画法のような当技術分野で周知の方法により、必要に応じて合成化合物のライブラリーも作製することができる。さらに、必要に応じて、標準的な化学的、物理的、または生化学的方法により、いかなるライブラリーまたは化合物も容易に修飾することができる。
【００５３】
粗抽出物が心疾患の発症および持続に影響を与えることが判明したら、陽性を示すリード抽出物の分画をさらに行い、観察された効果をもたらす化学成分を単離することができる。つまり、抽出、分画、および精製過程の目的は、所望の活性を有する粗抽出物に含まれる化学物質の特性を慎重に決定して同定することにある。本明細書に記載の、化合物混合物中における活性を検出するアッセイ法と同様のアッセイ法を用いて、活性成分を精製し、それらの化合物の誘導体を試験することができる。このような不均一な抽出物の分画法および精製法は、当技術分野で周知である。治療に有用な薬剤であることが判明した化合物は、必要に応じて、当技術分野で周知の方法に従って化学的に修飾することができる。
【００５４】
動物モデル系
本発明はまた、上述のスクリーニング方法を行うのに用いられる動物モデル系を提供する。これらのモデル系の例には、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に変異（例えばアイランドビート変異）を有するゼブラフィッシュ、およびマウスをはじめとする他の動物が含まれる。例えば、本発明に用いることができるゼブラフィッシュモデルには、α1Cサブユニットを産生しない変異、または切断型（例えば、終止コドンの導入による）もしくは他の変化したα1Cサブユニット遺伝子産物を産生する変異が含まれ得る。具体的な例として、アイランドビート変異を有するゼブラフィッシュを用いることができる（以下を参照のこと）。
【００５５】
不整脈の治療または予防
上記のスクリーニング方法により同定された化合物を用いて、不整脈(例えば心房細動)等の心疾患がある患者またはそのような心疾患を発症する危険性がある患者を治療することができる。電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする核酸分子およびこれらのチャネル自身も、そのような方法において使用できる。治療は短期間必要であるに過ぎないか、または患者の生涯にわたって何らかの形で必要である可能性がある。しかし、治療が継続的に必要であるか否かは、例えば上述の診断方法により決定され得る。様々な治療を考えるに当たって、そのような治療は、好ましくは罹患器官または罹患している可能性のある器官（例えば心臓）を対象に行うことを理解すべきである。
【００５６】
電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする変異遺伝子に起因する疾患の治療または予防は、例えば変異型α1Cサブユニットタンパク質またはそれが生じるチャネルの機能を調節することにより行うことができる。正常なα1Cサブユニットタンパク質を適当な細胞に送達することにより、正常もしくは変異型α1Cサブユニットタンパク質のレベルを変化させることにより、α1Cサブユニットをコードする変異型遺伝子をα1Cサブユニットをコードする正常遺伝子に置換することにより、または電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする正常遺伝子を投与することにより、治療することもできる。同様に、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットが関与する生理的経路（例えばシグナル伝達経路）を修飾することにより、電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子における欠陥の影響を修正することが可能である。
【００５７】
変異型電位依存性L型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットをコードする遺伝子に関してヘテロ接合であると診断された患者、または該変異もしくは異常なα1Cサブユニット発現を起こす可能性がある（たとえ、それらの変異または発現パターンがハートオブグラスの発現または生物活性に未だ変化を生じていなくても）と診断された患者において、本明細書に記載のいずれかの治療をその疾患の表現型が生じる前に行うことができる。特に、α1Cサブユニット変異型の表現型に対して効果を有することが示されている化合物、またはα1Cサブユニットの発現を調節することが示されている化合物は、いずれかの標準的用量およびいずれかの投与経路によって、潜在的な心疾患または実際の心疾患であると診断された患者に投与することができる。
【００５８】
本発明に従って不整脈の治療または予防に有効であることが示された化合物を投与するには、適切な投与経路のいずれかを用いることができる。例えば、投与は、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、脳室内投与、関節内投与、髄腔内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾルによる投与、坐剤による投与、または経口投与が可能である。
【００５９】
本発明の治療用化合物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤に含めて単位剤形として投与することができる。投与は、患者の症状が出現する前または後に行うことができる。当技術分野で周知の製剤化法は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton PA. に記載されている。治療用の剤形は、溶液状または懸濁液状とすることができる。非経口投与用の剤形には、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水のほか、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、植物性油、または水素化ナフタレンが含まれ得る。化合物の放出を制御するには、生体適合性があり生物分解性のある、ラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレン共重合体を用いることができる。本発明の方法を用いて同定される化合物に有用と考えられる非経口送達系には、他に、エチレン‐ビニルアセテート共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが含まれる。経口投与する場合は、錠剤またはカプセル剤とすることができる。吸入用の剤形には、例えばラクトースなどの賦形剤を含むことができ、または例えばポリオキシエチレン‐9‐ラウリルエーテル、グリココール酸、およびデオキシコール酸を含む水溶液とすることができ、または点鼻薬またはゲル剤として投与する油性溶液とすることができる。または、鼻腔内投与用の剤形は、粉末剤またはエアゾル剤とすることができる。
【００６０】
変異型タンパク質を正常タンパク質に置換するため、または十分なもしくは正常なα1Cサブユニットタンパク質を発現しない細胞にタンパク質を加えるためには、α1Cサブユニットタンパク質が発現される培養細胞系から大量の純粋な該タンパク質を得る必要があり得る（例えば以下を参照のこと）。次に、適当なパッケージングまたは投与系を用いて、罹患組織への該タンパク質の送達を行うことができる。
【００６１】
遺伝子治療は、α1Cサブユニット遺伝子の欠陥によって引き起こされる疾患（例えば心房細動などの不整脈）を予防または回復させるためのもう一つの治療アプローチである。野生型α1Cサブユニットをコードする核酸分子を、十分な正常α1Cサブユニット生物活性を欠損する細胞（例えば、α1Cサブユニット遺伝子に変異（例えばアイランドビート変異）を有する細胞）に送達することができる。該核酸分子は、細胞に取り込まれる形でそれらの細胞に送達されなければならず、それにより、有効なα1Cサブユニット機能を提供するのに十分なレベルのタンパク質が産生される。または、いくつかのα1Cサブユニット変異に関して、該遺伝子において第二の変異を有する相同的な遺伝子の別のコピーを導入することにより、結果として生じた疾患の進行を遅らせることもしくはα1Cサブユニット活性を調節すること、変異を変化させること、または負の影響のいずれかを遮断するために別の遺伝子を使用することができるかもしれない。
【００６２】
形質導入するレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターは、特にそれらの感染、安定な組込み、および発現の効率が高いことから、体細胞遺伝子治療に用いることができる（例えば、Cayouetteら、Human Gene Therapy 8:423-430, 1997； Kidoら、Current Eye Research 15:833-844, 1996； Bloomerら、Journal of Virology 71:6641-6649, 1997； Naldiniら、Science 272:263-267, 1996；およびMiyoshiら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997を参照のこと）。例えば、完全長のα1Cサブユニット遺伝子またはその一部をレトロウイルスベクターにクローニングし、その内在性プロモーター、レトロウイルス末端反復配列、または（心筋または他の血管細胞等の）目的の標的細胞のタイプに特異的なプロモーターから発現を開始させることができる。使用可能なウイルスベクターには、他に、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはエプスタイン・バーウイルス等のヘルペスウイルスが含まれる（同様に、例えば、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990； Friedman, Science 244:1275-1281, 1989； Eglitisら、BioTechniques 6:608-614, 1988；Tolstoshevら、Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990；Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991； Cornettaら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987； Anderson, Science 226:401-409, 1984； Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991； Millerら、Biotechnology 7:980-990, 1989； Le Gal La Salleら、Science 259:988-990, 1993；およびJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995のベクターも参照のこと）。レトロウイルスベクターは、特に十分に開発され、臨床状況において用いられてきている（Rosenbergら、N. Engl. J. Med. 323:370, 1990； Andersonら、米国特許第5,399,346号）。
【００６３】
非ウイルスアプローチも同様に、α1Cサブユニットに関連する疾患になりやすいと予測される細胞に治療的DNAを導入するために用いることができる。例えば、α1Cサブユニット核酸分子またはアンチセンス核酸分子は、リポフェクション（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987；Onoら、Neuroscience Letters 17:259, 1990； Brighamら、Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989； Staubingerら、Methods in Enzymology 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド‐ポリリジン結合（Wuら、Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988； Wuら、Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）、または外科的状況下でのマイクロインジェクション（Wolffら、Science 247:1465, 1990）によって細胞に導入することができる。
【００６４】
遺伝子導入は、インビトロでのトランスフェクションを含む非ウイルス手段を用いても行うことができる。そのような方法には、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、およびプロトプラスト融合の使用が含まれる。リポソームもまた、細胞にDNAを送達するためにおそらく有用となり得る。培養可能なタイプの細胞に正常なα1Cサブユニットをエクスビボで導入し、その後、該細胞（またはその子孫）を標的組織に注入することにより、正常な遺伝子を患者の罹患組織に移植することもできる。
【００６５】
遺伝子治療法において用いられるα1CサブユニットcDNA発現は、任意の適当なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、またはメタロチオネインプロモーター）から促すことができ、任意の適当な哺乳類調節エレメントによって調節することができる。例えば、必要に応じて、特定のタイプの細胞において選択的に遺伝子発現を指向することが知られているエンハンサーを用いて、α1Cサブユニット発現を指向することができる。用いるエンハンサーには、組織または細胞特異的エンハンサーとしての特徴を有するエンハンサーが含まれ得るが、これらに限定されない。または、α1Cサブユニットゲノムクローンを治療構築物として用いる場合（本明細書に記載するように、そのようなクローンはα1CサブユニットcDNAとのハイブリダイゼーションによって同定可能である）、同族の調節配列、または必要ならば上述のプロモーターもしくは調節エレメントのいずれかを含む異種起源に由来する調節配列によって、調節することができる。
【００６６】
α1Cサブユニットの遺伝子機能を調べるため、および治療薬デザインの基礎として、アンチセンスに基づく戦略を用いることができる。これらの戦略は、遺伝子発現の（転写または翻訳による）配列特異的抑制が、ゲノムDNAまたはmRNAと相補的アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションによって行われ得るという原理に基づいている。ハイブリッドRNA二本鎖の形成により、標的α1CサブユニットコードゲノムDNA分子の転写、または標的α1CサブユニットmRNA分子のプロセシング、輸送、翻訳、もしくは安定性が妨げられる。
【００６７】
様々な方法により、アンチセンス戦略を実現させることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスRNAは、（例えば、静脈内注射により）細胞に取り込まれる形で被験者に直接投与することができる。または、アンチセンスRNA（またはアンチセンスRNA断片）をコードするウイルスまたはプラスミドベクターを、インビボまたはエクスビボで細胞に導入することができる。アンチセンス効果は対照（センス）配列によって誘導することができるが、表現型の変化の程度は非常に多様である。アンチセンス効果によって誘導される表現型への効果は、タンパク質レベル、タンパク質活性の測定、および標的mRNAレベル等の基準の変化に基づく。
【００６８】
α1Cサブユニット遺伝子治療は、野生型または変異型α1Cサブユニットの発現によって負の影響を受けると予測される細胞に、アンチセンスα1CサブユニットmRNAを直接投与することによっても行うことができる。アンチセンスα1CサブユニットmRNAは、標準的な技術のいずれかにより産生および単離することが可能であるが、効率の高いプロモーター（例えばT7プロモーター）の制御下にあるアンチセンα1CサブユニットcDNAを用いてインビトロ転写することにより、最も容易に産生される。核酸分子を直接投与する上記方法のいずれかにより、アンチセンスα1CサブユニットmRNAを細胞に投与することができる。
【００６９】
遺伝子治療を用いてα1Cサブユニット機能を阻害する方法には、他に、抗α1Cサブユニット抗体または抗α1Cサブユニット抗体の一部を細胞内で発現させることが含まれる。例えば、α1Cサブユニットに特異的に結合し、その生物活性を阻害するモノクローナル抗体をコードする遺伝子（または遺伝子断片）を、組織特異的遺伝子制御配列の転写制御下に置くことができる。
【００７０】
本発明に包含される別の治療法には、罹患している可能性のある組織もしくは実際の罹患組織の部位に直接（例えば、注射によって）、または全身に（例えば、従来の組換えタンパク質投与手法によって）、組換えα1Cサブユニットポリペプチドを投与することが含まれる。α1Cサブユニットの用量は、個々の患者の体格および健康状態を含む多数の要因に依存するが、一般に、薬学的に許容される剤形のいずれかで、一日当たり0.1 mgから100 mgを成人に投与する。
【００７１】
α1Cサブユニットタンパク質、ポリペプチド、およびポリペプチド断片の合成
分子生物学の当業者は、多種多様な発現系を用いて、組換えα1Cサブユニットタンパク質を生産し得ることを理解されよう。以下に詳述するように、使用する宿主細胞の詳細は本発明に重要ではない。α1Cサブユニットタンパク質は、原核生物宿主（例えば大腸菌）、または真核生物宿主（例えば、酵母（S. cerevisiae）、Sf9細胞等の昆虫細胞、またはCOS-1、NIH 3T3、もしくはHeLa細胞等の哺乳類細胞）において産生させることができる。これらの細胞は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州、ロックビルから市販されている（Ausubelら、前記も参照のこと）。形質転換法および発現媒体（例えば発現ベクター）の選択は、選択した宿主系によって変わると考えられる。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えばAusubelら、前記に記載されており、発現媒体は、例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A laboratory Manual, 1985, Supp. 1987において提供される発現媒体から選択することができる。本発明に使用可能な発現系の具体例については、以下に詳述する。
【００７２】
タンパク質を発現させるために、プラスミドをはじめとするベクターにα1Cサブユニット遺伝子配列を導入し、次にこれを用いて生細胞を形質転換するという、真核生物または原核生物の発現系を構築することができる。発現プラスミドに正しい方向に挿入された全読み枠を含む完全長のα1CサブユニットcDNAを有する構築物を用いて、タンパク質を発現させることができる。あるいは、野生型または変異型のα1Cサブユニット配列を含む、α1Cサブユニット遺伝子配列の一部を挿入してもよい。原核生物または真核生物の発現系では、α1Cサブユニットタンパク質の種々の重要な機能ドメインを必要であれば融合タンパク質として回収してから、結合試験、構造試験、および機能試験に使用することが可能であり、さらに抗体作製にも使用できる。
【００７３】
典型的な発現ベクターは、ベクターに挿入された核酸分子に対応する、大量のmRNAの合成を促すプロモーターを含む。ベクターはまた、宿主細胞内における自律的な複製を可能とする真核生物または原核生物に由来する複製起点、ベクターを含む細胞を薬剤存在下で選択可能とする、通常は毒性作用をもたらす薬剤に対する耐性を付与する配列、および合成されたmRNAの翻訳効率を高める配列も含む。長期安定型ベクターは、例えばウイルスの制御エレメント（例えば、エプスタイン・バーウイルスゲノム由来のOriP配列）を用いることで、遊離の複製分子として維持される。ベクターが細胞のゲノムDNAに組み込まれた形で存在する細胞株を作製することも可能であり、この方法では、遺伝子産物を細胞内で連続的に生産することができる。
【００７４】
大腸菌等の細菌内において外来分子を発現させるためには、外来核酸分子、例えばα1Cサブユニット核酸分子を細菌の発現ベクターに挿入する必要がある。そのようなプラスミドベクターには、細菌内におけるプラスミドの増殖、およびプラスミド内に含まれる外来DNAの発現に必要ないくつかのエレメントが含まれる。プラスミドを保持する細菌のみを増殖させるためには、毒性薬剤の存在下でプラスミドを保持する細菌の増殖を可能とする、選択マーカーコード遺伝子をプラスミド内に導入する。該プラスミドは、外来DNAから大量のmRNAの合成を促し得る転写プロモーターも含む。このようなプロモーターは、適切な条件下（例えば、プロモーターを活性化する薬剤の存在下）での培養による誘導に応じて転写を開始する誘導性プロモーターとすることができるが、それ以外のプロモーターでもよい。プラスミドはまた、遺伝子をベクター内で正しい方向に挿入しやすくするポリリンカーを含むことが好ましい。
【００７５】
α1Cサブユニット遺伝子、もしくはその断片、融合体、またはその変異体を含む適切な発現ベクターを構築したら、例えばカルシウムリン酸トランスフェクション、DEAEデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、またはリポソームを用いたトランスフェクション等の形質転換手法により、そのベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。本発明のベクターを導入可能な宿主細胞には、大腸菌をはじめとする細菌、酵母、真菌、昆虫細胞（例えば、発現用バキュロウイルスベクターを使用して）、マウス、ヒトをはじめとする動物由来の細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。哺乳類細胞を使用して、例えばAusubelら、前記に記載されるウイルス発現系（例えばワクシニアウイルス発現系）によりα1Cサブユニットタンパク質を発現させることもできる。
【００７６】
クローン化されたDNAにコードされるα1Cサブユニットタンパク質、融合体、ポリペプチド断片、または変異型は、T7後期プロモーター発現系を用いて、インビトロで発現させることもできる。この系は、バクテリオファージT7のDNAにコードされる酵素である、T7 RNAポリメラーゼの制御型の発現に基づく。T7 RNAポリメラーゼは、T7後期プロモーターと呼ばれる特定の23塩基対のプロモーター配列から転写を開始する。T7後期プロモーターのコピーはT7ゲノム上の複数の部位に位置するが、大腸菌の染色体DNA上には存在しない。その結果として、T7を感染させた大腸菌では、T7 RNAポリメラーゼはウイルス遺伝子の転写を触媒するが、大腸菌遺伝子の転写は触媒しない。この発現系では、最初に、lacプロモーターの隣にT7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子をもつように、組換え大腸菌細胞を操作しておく。これらの細胞はIPTG存在下でT7ポリメラーゼ遺伝子を高率で転写し、大量のT7 RNAポリメラーゼを合成する。次に、これらの細胞をT7後期プロモータータンパク質のコピーを有するプラスミドベクターで形質転換する。これらの形質転換された大腸菌細胞を含む培養液にIPTGを添加すると、大量のT7 RNAポリメラーゼが産生される。このポリメラーゼは次に、プラスミド発現ベクター上のT7後期プロモーターに結合し、挿入されたcDNAの転写を高率で触媒する。個々の大腸菌細胞は多コピーの発現ベクターを含むので、クローン化されたcDNAに対応する大量のmRNAをこの系で産生させることが可能であり、結果として得られるタンパク質は放射性標識することができる。
【００７７】
後期プロモーターを含むプラスミドベクターならびにT3、T5、およびSP6等の類縁バクテリオファージ由来の対応するRNAポリメラーゼを使用して、クローン化したDNAからインビトロでタンパク質を生産することができる。大腸菌はまた、mGPI-2等のM13ファージを用いた発現にも使用することができる。さらに、ラムダファージの制御配列を含むベクター、または融合タンパク質の発現を促すベクター、例えばマルトース結合タンパク質の融合タンパク質もしくはグルタチオンSトランスフェラーゼの融合タンパク質も大腸菌における発現に使用できる。
【００７８】
真核生物の発現系は、発現タンパク質を適切に翻訳後修飾するために有用である。α1Cサブユニット遺伝子を含む真核生物の発現プラスミドを真核生物の宿主細胞に一過性トランスフェクションすることにより、トランスフェクションされた宿主細胞でα1Cサブユニットを一過性に産生させることができる。α1Cサブユニットタンパク質は、安定性トランスフェクションした真核生物（例えば哺乳類）の細胞株で産生させることもできる。哺乳類細胞の安定性トランスフェクションに適した多くのベクターが一般に利用でき（例えば、Pouwelsら、前記を参照のこと）、このような細胞を含む細胞株の構築法についても同様である（Ausubelら、前記を参照のこと）。
【００７９】
一例として、α1Cサブユニットタンパク質、融合体、変異型、またはポリペプチド断片をコードするcDNAを、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子を含む発現ベクターにクローン化する。プラスミドの宿主細胞染色体への組み込み、つまりα1Cサブユニットコード遺伝子の宿主細胞染色体への組み込みは、細胞培養液中に0.01〜300 μMのメトトレキセートを添加することで選択する（Ausubelら、前記）。この優性選択法は、たいていの細胞種で行うことができる。DHFRを用いてトランスフェクションされた遺伝子を増幅することにより、組換えタンパク質の発現を増加させることができる。遺伝子増幅した細胞株の選択法は、Ausubelら、前記に記載されている。このような方法は、一般に、メトトレキセート濃度を徐々に増加させた培養液中で長時間培養することに関連する。最も広く使用されているDHFR含有発現ベクターは、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV(A)である（例えばAusuelら、前記に記載されている）。上述の宿主細胞、または好ましくはDHFR欠損CHO細胞株（例えばCHO DHFR細胞、ATCCアクセッション番号CRL 9096）は、安定にトランスフェクションされた細胞株のDHFR選択またはDHFRによる遺伝子増幅に極めて好ましい細胞株の例である。
【００８０】
真核生物の別の好ましい発現系には、例えばクロンテック（Clontech）（カリフォルニア州、パロアルト）から入手可能なpBacPAK9ベクター等のベクターを用いるバキュロウイルスの系がある。必要であれば、この系は、例えばEvanら（Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985）に記載のmycタグ法等の他のタンパク質発現手法と併せて使用することができる。
【００８１】
組換えタンパク質が発現したら、細胞溶解とそれに続くアフィニティクロマトグラフィー等のタンパク質精製手法により、発現細胞からこの組換えタンパク質を単離することができる。この例では、本明細書に記載の方法で作製可能な抗α1Cサブユニット抗体をカラムに結合させ、組換えα1Cサブユニットタンパク質の単離に使用することができる。アフィニティクロマトグラフィーに先行するα1Cサブユニットタンパク質を有する細胞の溶解および分画は、標準的な方法で行うことができる（例えばAusubelら、前記を参照のこと）。単離後、必要に応じて、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC；例えばFisher、Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, Work and Burden, Eds.,  Elsevier, 1980を参照のこと）により組換えタンパク質をさらに精製することができる。
【００８２】
本発明のポリペプチド、特に短いα1Cサブユニット断片、ならびにα1Cサブユニットタンパク質のN末端およびC末端のより長い断片も、化学合成により（例えばSolid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford ILに記載の方法により）作製することができる。本明細書に記載したように、ポリペプチドを発現させて精製するこれらの一般的な手法を用いても、有用なα1Cサブユニットポリペプチド断片または類似体を作製し単離することができる。
【００８３】
α1Cサブユニット断片
α1Cサブユニットタンパク質の様々な部分を含むポリペプチド断片は、タンパク質間相互作用および転写等の生物学的活性に重要な役割を果たすα1Cサブユニットのドメインを同定する際に有用である。本明細書で提供するヌクレオチド配列を用いてこのような断片を作製する方法は、当技術分野で周知である（例えばAusubelら、前記を参照のこと）。例えば、α1Cサブユニットタンパク質断片は、α1Cサブユニット核酸配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、所望のα1Cサブユニット核酸分子の断片をPCR増幅することにより作製できる。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅後の断片を発現ベクター（例えば哺乳類の発現ベクター、上記を参照のこと）のクローニング部位へ容易に挿入するそれぞれ1か所しかない制限酵素切断部位を含むことが好ましい。このベクターは、次に、本明細書に記載された方法をはじめとする当技術分野で周知の様々な手法のいずれかを用いて、細胞（例えば哺乳類細胞、上記を参照のこと）に導入することができ、その結果、発現ベクターを含む細胞内でα1Cサブユニットポリペプチド断片が産生される。α1Cサブユニットポリペプチド断片（例えばキメラの融合タンパク質）は、例えば後述する方法により、α1Cサブユニットの様々な領域に特異的な抗体を産生させる際にも使用することができる。
【００８４】
α1Cサブユニット抗体
ポリクローナル抗体を調製するためには、α1Cサブユニットタンパク質、α1Cサブユニットタンパク質の断片、またはα1Cサブユニットタンパク質の特定の部分を含む融合タンパク質を、例えば細菌中で適切なクローニング媒体に含まれる対応DNA配列を発現させることによって合成することができる。通常は、抗体産生に用いられる抗原の供給源として融合タンパク質が使用される。大腸菌で広く用いられている発現系には、pURシリーズのベクターを用いるlacZ融合とpATHベクターを用いるtrpE融合の二つがある。タンパク質は精製後に担体タンパク質と結合させ、被接種動物における抗原応答を促進するためにフロイントアジュバントと混合し、ウサギをはじめとする実験動物に注入することができる。または、タンパク質は、α1Cサブユニットを発現する培養細胞から単離することができる。2週間毎に行うブースター注射に続いて、ウサギをはじめとする実験動物から採血して血清を分離する。この血清は直接使用できるほか、プロテインAセファロース、抗原セファロース、および抗マウスIgセファロース等の試薬を用いるアフィニティクロマトグラフィーを含む様々な方法で使用前に精製することができる。次にこの血清を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画したα1Cサブユニット発現組織由来のタンパク質抽出物を精査し、α1Cサブユニットタンパク質を同定することができる。または、タンパク質の抗原性部分に対応する合成ペプチドを作製して、動物への接種に用いることができる。
【００８５】
ペプチドまたは完全長のタンパク質を例えばα1Cサブユニット特異的抗体産生用に作製するためには、α1Cサブユニットをコードする配列をグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST；Smithら、Gene 67:31-40, 1988）とのC末端またはN末端融合体として発現させてもよい。融合タンパク質はグルタチオン‐セファロースビーズ上で精製し、グルタチオンで溶出し、さらにトロンビンまたはファクターXa等のプロテアーゼで（作出された切断部位において）切断し、さらにウサギを良好に免疫化するのに必要な程度まで精製する。初回免疫はフロイント完全アジュバントを用いて実施し、それに続く免疫はフロイント不完全アジュバントを用いて実施するとよい。抗体の力価は、GST−α1Cサブユニット融合タンパク質をプロテアーゼで切断したα1Cサブユニット断片を用いてウェスタンブロットおよび免疫沈降解析することにより、評価できる。免疫血清は、CNBrセファロースに結合させたハートオブグラスタンパク質を用いてアフィニティ精製することができる。抗血清の特異性は、関連のないGST融合タンパク質のパネルを用いて決定することができる。
【００８６】
または、モノクローナルα1Cサブユニット抗体は、α1Cサブユニットを発現する培養細胞から単離されたα1Cサブユニットタンパク質または組織から単離されたα1Cサブユニットタンパク質を抗原として用いることにより、作製することができる。α1Cサブユニットタンパク質を含む細胞抽出物または組換えタンパク質抽出物は、例えば、フロイントアジュバントと共にマウスに注射することができる。注射から数日後にマウスの脾臓を切除し、組織をばらばらにし、脾臓細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）に懸濁する。脾臓細胞はリンパ球の供給源となり、リンパ球の一部は適当な特異性をもつ抗体を産生すると考えられる。次に、これらを永久に増殖するミエローマ細胞と融合し、融合した細胞を多数の組織培養用ウェルにヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT）等の選択薬剤の存在下でプレーティングする。次にこれらのウェルを対象にELISAによりスクリーニングを行い、α1Cサブユニットタンパク質、ポリペプチド断片、またはその変異型に結合可能な抗体を産生する細胞を含むウェルを同定する。次にこれらの細胞を再プレーティングして成長させた後に、同細胞を含むウェルのスクリーニングを再び行って抗体産生細胞を同定する。続いてこれらの細胞を再度プレーティングし、増殖させた後、これらの細胞を含むウェルを再度スクリーニングして抗体産生細胞を同定する。90％を越えるウェルが特異的抗体産生について陽性を示す単一のクローンを含むようになるまで、複数のクローニング法を実施してもよい。この手順により、抗体を産生する安定なクローン株を樹立することができる。次に、プロテインAセファロースを用いるアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ならびにこれらの手法を改変または組み合わせることにより、モノクローナル抗体を精製することができる。モノクローナル抗体の産生が認められたら、ウェスタンブロットまたは免疫沈降解析により、α1Cサブユニットタンパク質に対する認識の特異性についても検討を行う（例えば、Kohlerら、Nature 256:495, 1975；Kohlerら、European Journal of Immunology 6:511, 1976；Kohlerら、European Journal of Immunology 6:292, 1976；Hammerlingら、In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, New York, NY, 1981；Ausubelら、前記を参照のこと）。
【００８７】
GST融合タンパク質に対する代替または補助的な免疫源として、α1Cサブユニットの比較的特有な親水性領域に対応するペプチドを作製し、C末端に導入したリシンを介してキーホールリンペットヘモシニアン（KLH）に結合させることができる。個々のこれらペプチドに対する抗血清は、BSAに結合させたペプチド上で同様にアフィニティ精製することが可能であり、その特異性は、ペプチド複合物を用いるELISAおよびウェスタンブロッティング、ならびに例えばGST融合タンパク質として発現させたα1Cサブユニットを用いるウェスタンブロッティングおよび免疫沈降により調べることができる。
【００８８】
本発明の抗体は、Jamesoら、CABIOS 4:181, 1988のアルゴリズムを用いたペプチド構造プログラム（ジェネティクスコンピューターグループ配列解析パッケージ、Program Manual for the GCG Package, Version 7, 1991）により提供されるような基準に基づく解析から、高度に保存された領域内には存在せず抗原性が強いと考えられるα1Cサブユニットアミノ酸配列を用いて作製することができる。これらの断片は、標準的な手法、例えばPCRやpGEX発現ベクターへのクローン化によって作製することができる。GST融合タンパク質は、大腸菌で発現させ、グルタチオン‐アガロースのアフィニティマトリックス（Ausubelら、前記）を用いて精製することができる。ウサギのポリクローナル抗体を作製するため、およびα1Cサブユニットに対して非特異的な抗血清または親和性の低い結合を示す抗血清が得られる可能性を最小限にするためには、各タンパク質について2、3種の融合体を作製し、各融合体を少なくとも2匹のウサギに注射する。好ましくは少なくとも3回のブースター注射を含む連続的な注射を行うことで、抗血清が得られる。
【００８９】
本発明は、完全な形のモノクローナルおよびポリクローナルの抗α1Cサブユニット抗体に加え、遺伝子操作した様々な抗体、ヒト化抗体、およびF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、およびsFvの各断片を含む抗体断片を扱う。例えば切断型のモノクローナル抗体は、組換え法を使って、所望のモノクローナル抗体断片（断片群）を適切な宿主で発現するプラスミドを作製することにより産生できる。抗体は当技術分野で周知の方法でヒト化することができ、例えば所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体は外注でヒト化できる（スコットジーン（Scotgene）、スコットランド；オックスフォードモレキュラー（Oxford Molecular）、カリフォルニア州、パロアルト）。トランスジェニック動物で発現される抗体等の完全なヒト抗体も、本発明に含まれる（Greenら、Nature Genetics:13-21, 1994）。
【００９０】
Ladner（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）は、1本鎖ポリペプチド抗体の調製法を記載している。Wardら、Nature 341, 544-546, 1989は、彼らが「シングルドメイン抗体」と呼ぶ、高い抗原結合親和性を有する重鎖可変ドメインの調製法を記載している。McCaffertyら、Nature 348:552-554, 1990は、完全な抗体Vドメインがfdバクテリオファージの表面に呈示可能であること、該ファージが抗原に特異的に結合すること、および極めて少数のファージ（100万個に1つ）がアフィニティクロマトグラフィーで単離可能であることを示している。Boss（米国特許第4,816,397号）は、単一の宿主細胞内で、免疫グロブリンならびに少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む免疫学的に機能するそれらの断片を作製するさまざまな方法を記載している。Cabillyら、米国特許第4,816,567号は、キメラ抗体の調製法を記載している。
【００９１】
α1Cサブユニット抗体の使用
上述した通り、α1Cサブユニットタンパク質に対する抗体を用いてα1Cサブユニットタンパク質を検出することができるほか、α1Cサブユニットタンパク質の生物活性を抑制することができる。例えば、抗体または抗体の一部をコードする核酸分子を細胞内で発現させ、α1Cサブユニットの機能を抑制することができる。また、診断または治療に用いるために、抗体を放射性核種およびリポソーム等の化合物に結合させることができる。α1Cサブユニットの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体は、該α1Cサブユニットポリペプチドドメインを表面に呈示する細胞に該結合成分を誘導する際に有用である。本明細書に記載したα1Cサブユニットポリペプチドの活性を抑制する抗体は、野生型または変異型のα1Cサブユニット遺伝子の不適当な発現に起因する疾患の発症を防いだり緩やかにするためにも有用である。
【００９２】
α1Cサブユニット遺伝子発現の検出
上述したように、上記抗体を用いてα1Cサブユニットタンパク質の発現を観察することができる。RNAのインサイチューハイブリダイゼーションにより、α1Cサブユニット遺伝子の発現を検出することができる。RNAインサイチューハイブリダイゼーション手法は、特異的に標識された核酸プローブと、個々の細胞または組織内における細胞RNAとのハイブリダイゼーションに基づく。したがって、RNAインサイチューハイブリダイゼーションは、組織特異的および時間特異的な遺伝子発現を調べる強力な方法である。この方法ではα1Cサブユニット遺伝子の特有の部分に対応するオリゴヌクレオチド、クローン化されたDNA断片、またはクローン化されたDNA断片のアンチセンスRNA転写産物を用いて、例えばマウス等の動物組織内で様々な発生段階において、特定のmRNA種を検出する。当業者に周知の他の遺伝子発現検出手法を用いて、α1Cサブユニット遺伝子の発現を検出することもできる。
【００９３】
さらなるα1Cサブユニット遺伝子の同定
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーション等の標準的な手法を用いて、他の種におけるα1Cサブユニット相同体、およびヒトにおけるα1Cサブユニット関連遺伝子をクローン化することができる。α1Cサブユニット関連遺伝子および相同体は、ヒトのα1Cサブユニットプローブまたはプライマーを用いて、ストリンジェンシーの低いDNAハイブリダイゼーションまたはストリンジェンシーの低いPCRで容易に同定することができる。ヒトのα1Cサブユニットアミノ酸配列またはヒトのα1Cサブユニット関連アミノ酸配列をコードする縮重プライマーを用いてRT-PCRすることにより、さらなるα1Cサブユニット関連遺伝子および相同体をクローン化することができる。
【００９４】
トランスジェニック動物およびノックアウト動物の作製
α1Cサブユニット遺伝子の特性解析を行うことで、相同組換えによりα1Cサブユニットノックアウト動物モデルを作製可能とするための情報が得られる。α1Cサブユニットノックアウト動物は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはマウスである。同様に、α1Cサブユニットを過剰に生産する動物モデルは、標準的なトランスジェニック手法により、一つ以上の複数のα1Cサブユニット配列を動物のゲノムに組み込むことで作製することができる。さらに、α1Cサブユニット遺伝子変異の影響（例えば優性遺伝子突然変異）は、変異したα1Cサブユニットの導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いることで、または標準的な相同組換え法でそのような変異を内在性のα1Cサブユニット遺伝子に導入することで、検討可能である。
【００９５】
ノックアウトモデルの作製に使用可能な置換型の標的ベクターは、例えば129/Sv（ストラタジーン社（Stratagene Inc.）、カリフォルニア州、ラホーヤ）等のマウス系統に由来する同質遺伝子のゲノムクローンを用いて構築することができる。胚幹（ES）細胞の適切に派生された系統に標的ベクターをエレクトロポレーションにより導入することで、末端が大きく切断された型のα1Cサブユニット遺伝子を有するES細胞株を作ることが可能である。キメラの創始マウスを作製するためには、標的細胞株をマウスの胞胚期の胚に注入する。ヘテロ接合の子孫を同系交配することにより、ホモ接合の個体を得ることができる。α1Cサブユニットノックアウトマウスは、α1Cサブユニットが胚発生および疾患に果たす役割を調べるためのツールとなる。またこのようなマウスは、α1Cサブユニットに依存する経路またはα1Cサブユニットが影響を及ぼす経路にかかわる疾患または病態を回復させる治療化合物をインビボにて試験する手段を提供する。
【００９６】
実験結果
アイランドビート（isl）変異は、ゼブラフィッシュ胚において正常な心律動の開始を撹乱させる（Stainierら、Development 123:285-292, 1996；Chenら、Development 123:293-302, 1996）。アイランドビートのゼブラフィッシュ胚は、深刻な心臓欠陥があるにもかかわらず、拡散によって周囲から十分な酸素を得るため数日間行き続ける。アイランドビート対立遺伝子、islm458およびislm379は十分に浸透しており、islm458/m379トランスヘテロ接合であるゼブラフィッシュ胚は、いずれの個々の突然変異対立遺伝子についてホモ接合である表現型と同じ表現型を示す。野生型ゼブラフィッシュ胚では、原始心筒は22受精後時間（hpf）から拍動を開始し、24 hpfから血流を生じ、続いて心房と心室が収縮する（Stainierら、Trends Cardiovasc. Med. 4:207-212, 1994）。変異型islについてホモ接合の胚の心臓は、両房室の機能障害により血流を生じない。特に、isl変異の胚では心室の細胞が拍動しない。心房の筋細胞は収縮するものの非協調的であり、その房室の周辺領域間に明らかな活動電位を伝播しない。isl変異体において、散発性で高率の心房性収縮、房室の拡大、および心房性の血栓の蓄積が機能上見られるということは、その特徴から不整脈、心房細動が連想される。野生型の48 hpf胚と同様に、isl胚の心房と心室の両筋細胞においても、筋原線維の整列および細胞間結合（例えば、デスモソームおよびギャップ結合）が生じることが電子顕微鏡検査により示される。
【００９７】
本発明者らはマイクロサテライトマーカーを用い、酵母人工染色体（YAC）およびバクテリア人工染色体（BAC）上にカバーするマーカーZ11657とZ11566との間の〜0.6 cM区間にあるゼブラフィッシュの連鎖群4にislm458をマッピングした。さらにisl遺伝子を含む区間をBACクローン26g19および23c18にまで絞り込み、これらをシークエンシングしてコンティグを作成した（以下の方法を参照のこと）。ヒト電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα1Cサブユニット（Soldatov, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4628-4632, 1992；Schultzら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6228-6232, 1992；図1A）と相同性の高い一つの遺伝子のみが、これらのBAC内に同定された。islゲノムDNAおよびcDNA配列を概念上翻訳してみることにより、ヒト電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα1Cサブユニット（CCAC_human）と高い相同性（同一＝〜78％、陽性＝〜84％）を有することが確認された（図1B）。電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα1Cサブユニットをコードするゼブラフィッシュおよびヒトの遺伝子は、ゲノムDNAの150,000塩基対（bp）を超える範囲に及ぶ。ゼブラフィッシュのＬ型カルシウムチャネルα1サブユニット遺伝子を同定するゲノムマッピングの詳細を、図2に示す。
【００９８】
islにおける変異を同定するため、野生型遺伝子（配列番号：1および2）および二つの異なるisl対立遺伝子のゼブラフィッシュ電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα1Cサブユニット（CCAC_zebrafish）コード配列をすべてシークエンシングした。islm458対立遺伝子はコドン1077の1つ目の塩基がCからTにヌクレオチド転換しており（CAG→TAG）、アミノ酸グルタミンから終止コドンへの変化が予測される（Q1077X）。よって翻訳が中途終結し、ドメインIIIの膜貫通セグメントS6の前で切断される切断型CCAC_zebrafishが生じることが予測される。islm379対立遺伝子では、コドン1352においてTからAへのヌクレオチド転換が起こり（TTG→TAG）、アミノ酸ロイシンが終止コドンに変化し（L1352X）、ドメインIVの孔形成膜貫通セグメントS5の前で翻訳が中途終結することが予測される（図1Aおよび1B）。
【００９９】
24体節期（21 hpf）において、左右の心臓原基が癒合して原始心筒を形成した時に、ゼブラフィッシュＬ型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットが心臓で限定的に発現される。26 hpfまでは、islの発現は心筒および膵臓に限られている。野生型胚とisl変異胚との間で、islの発現レベルおよび発現場所に違いは見られない。36 hpfから、islはある脳の領域で発現される（以下の方法を参照のこと）。この発現パターンは、他の種について記載されたパターンと類似している（Iwashimaら、Diabetes 42:948-955, 1993；Takimotoら、J. Mol. Cell. Cardiol. 29:3055-3042, 1997）。
【０１００】
isl変異がＬ型カルシウム電流に及ぼす影響を調べるため、本発明者らはisl心筋細胞において細胞全体のCa++電流を記録した（方法を参照のこと）。野生型胚のゼブラフィッシュ心筋細胞は、L型とT型の両方の電位依存性カルシウム電流を有する（Bakerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4554-4559, 1997）。しかしながらislm458心筋細胞では、T型Ca++電流は存在するものの、L型Ca++電流は大幅に減少しているかまたは存在しない。
【０１０１】
したがって、islの表現型は、α1Cサブユニット遺伝子の変異に起因する心筋細胞におけるL型カルシウム電流の消失または著しい減少によるものである。Ｌ型カルシウムチャネルα1Cサブユニットにおける変異が脊椎動物の心臓機能に及ぼす影響は、未だ報告されていない。isl変異のゼブラフィッシュ胚により、Ｌ型カルシウム電流が胚の心拍に必須であることが立証される。
【０１０２】
心臓の細胞では、L型Ca++チャネルを介したカルシウム流入は、活動電位特性を決定する上で重要な役割を果たし、興奮と収縮間の結びつけを担う。L型カルシウムチャネルはまた細胞内のCa++荷電を制御し、このようにしてミトコンドリアおよび細胞内の多くのCa++感受性酵素の活性を決定する（Carmeliet, Physiol. Rev. 79:917-1017, 1999）。α1DサブユニットのL型カルシウム電流と同様に（Platzerら、Cell 102:89-97, 2000）、T型カルシウム電流も結節のペースメーカに重要であると考えられており（Hermsmeyerら、Clin. Ther. 19:18-26, 1997）、筋小胞体からのCa++放出を引き起こすが、L型Ca++電流の場合よりも効率は悪い（Sipidoら、J. Physiol. (Lond) 508:439-451, 1998；Zhouら、Biophys. J. 74:1830-1839, 1998）。
【０１０３】
心臓の房室はそれぞれ異なる発生プログラムと生理機能を有し（Nguyen-Tranら、Heart Development, Harvey and Rosenthal, Eds., pp.255-272, 1999）、α1Cサブユニットの変異に対して違った反応を示す。isl変異胚の心室細胞は活動せず、よって収縮の開始はL型カルシウムチャネルを介するカルシウム電流に依存すると思われる。これはL型カルシウムチャネルα1Sサブユニットにおける常染色体劣性突然変異と類似しており、この場合は「筋肉発育異常」マウスにおいて骨格筋収縮に障害を生じる（Chaudhari, J. Biol. Chem. 267:25636-25639, 1992）。一方、isl変異胚の心房細胞は拍動する。
【０１０４】
方法
islのマッピングとポジショナルクローニング
islm458対立遺伝子の子孫を用いて、islのマッピングとポジショナルクローニングを行った。バルク法（bulked segregant analysis）（Michelmoreら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9828-9832, 1991）によりゲノム全体にわたってマイクロサテライトマーカー（Knapikら、Nat. Genet. 18:338-343, 1998）の分離を調べ、islの位置を連鎖群4上のマーカーZ9247に特定した。さらに詳細に遺伝子マッピングし、isl遺伝子座をマーカーZ11657とZ11566との間の〜0.6 cM区間に特定した。3,240個の変異型islm458胚をスクリーニングし、islm458−マーカーZ11657間にある19個の組換え体とislm458−マーカーZ11566間にある15個の組換え体を同定した。Z11566近傍にあるYACクローン(Zhongら、Genomics 48:136-138, 1998)を単離し、末端の方向はその区間に隣接する変異型islm458胚の減数分裂マッピングにより決定した。YAC 128h3および73g5のT7末端を用いて、さらに4つのYACクローン、161a4、58e5、33d4、および169h8を単離した。開始点として異なるYAC末端を利用し、6つのBAC（リサーチジェネティクス（Research Genetics）社）からBACコンティグを作成した。全BACクローンの長さは、パルスフィールドゲル電気泳動により決定した。続いてBAC末端の組換えに付随する諸現象を調べ、isl遺伝子を含む区間をBACクローン26g9および23c18に限定した。基本的に記述された方法に従い（Zhongら、Science 287:1820-1824, 2000）、これら2つのBACをショットガンシークエンシングし、それぞれBACをカバーする配列の2.5倍のDNA配列が得られた。Phred/Phrap/Consedプラグラム（http://www.phrap,org/）により、配列を18個のコンティグにアセンブルした。エクソン予測アルゴリズム（GENSCAN, Gene Finder、http://web.wi.mit.edu/bio/pub/）またはBLASTサーチ（BLAST 2.0、http://www/ncbi.nlm.nih.gov/blast/）によって同定された遺伝子は、電位依存性L型カルシウムチャネルα1Cサブユニットの遺伝子のみであった。ゼブラフィッシュL型カルシウムチャネルα1Cサブユニットのエクソン1およびエクソン46〜49を除いたすべてのエクソンが、ゲノムDNAコンティグ上に表される。
【０１０５】
isl変異の配列解析
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）およびRACE（cDNA末端の急速増幅法(rapid amplification of cDNA ends)）（クロンテック（Clontech）社）により、CCAC_zebrafishのcDNA配列を決定した。変異型および野生型の全胚または摘出した胚の心臓から、トリゾール（TRIZOL）試薬（ライフテクノロジー（Life Tecnologies）社）を用いてRNAを単離した。オリゴヌクレオチド配列はゲノムコンティグの配列を基にし、PCR産物はTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン（Invitrogen）社）を用いてクローニングした。4つの独立したクローンを、それぞれのクローン化断片としてシークエンシングした。islm458およびislm379対立遺伝子については、変異体、ヘテロ接合体、およびホモ接合体の胚のゲノムDNAから点突然変異の周囲を増幅し、クローニングした後、シークエンシングして検出された変異を確認した。配列は、GCG packageのPileup Version 10を用いて図1Bに示すように整列化し、MacBoxshade 2.15 inによって表した。
【０１０６】
isl発現のインサイチュー解析
胚発生の段階分けは、Kimmelら、Dev. Dyn. 203:253-310, 1995の方法に従って行った。ホールマウントRNAインサイチューハイブリダイゼーションは、記述された方法に従って（Jowettら、Trends. Genet. 10:73-74, 1994）実施した。インビトロ転写（ベーリンガー（Boehringer）社）を行うため、ゼブラフィッシュL型カルシウムチャネルα1Cサブユニットのエクソン17から28を含む1,224塩基対のcDNA断片をpCR II（インビトロジェン社）にサブクローニングした。RNAプローブは、ジゴキシゲニン標識した（ベーリンガー社）。顕微鏡写真による観察には、ニコンカメラの装備されたWild M10解剖顕微鏡（ライカ（Leica）社）を使用した。
【０１０７】
islがカルシウム電流に及ぼす影響の決定
トリカインで麻酔した3日齢の胚から心臓を摘出し、記述のとおり（Bakerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4554-4559, 1997）細胞を調製した。野生型系統AB由来の心筋細胞を対照として用いた。基本的に記述された方法に従い（Bakerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4554-4559, 1997）、室温（21〜23℃）において標準的なホールセル記録（whole-cell recording）を実施した。データはすべて、遺伝子型を隠して解析した。カルシウムによって誘発されるL型Ca++チャネルの不活性化を防ぐため、Ba++を電荷キャリアとして用い、電流はCa++を含まない溶液中で記録した。L型カルシウムチャネルを通過するBa++ 電流は、膜電位が-60 mVの保持電位から-30 mVより正方向の電位に上昇する時に見られる明らかな内向きの電流である。Ba++を電荷キャリアとして用いると、電流はゆっくり時間をかけて低下する。バス溶液（bath solution）には、15 mM BaCl2、5 mM CsCl、10 mM Hepes、10 mMグルコース、および125 mM N-メチル-D-グルカミン（pH 7.4、HClで調整）を含む。ピペット溶液（pipette solution）には、140 mM塩化テトラエチルアンモニウム、0.5 mM MgCl2、10 mM Hepes、10 mM EGTA、5 mM Gatp、および0.1 mM Camp（pH 7.4、CsOHで調整）を含む。ピペットは、抵抗が2〜5 MOになるようにファイヤーポリッシュ加工した。データの収集および解析は、pClamp6ソフトウェア（アクソンインストゥルメント（Axon Instruments）社）を用いて実施した。
【０１０８】
バリウム（Ba++）を電荷キャリアとして用い、野生型（WT）およびislm458 の単一の心筋細胞から電流トレースを得て記録した。細胞膜を-60 mV（VH-60 mV）または-100 mV（VH-100 mV）のどちらかに保持し、-50 mVから+10 mVまで10 mVずつ段階的に膜を脱分極させ、典型的な電流を得た。電流トレースは、1 kHZのフィルターを通した。わずかに脱分極した段階で直線リーク電流が測定され、以後の記録からはすべてこれを差し引いた。Ｌ型カルシウム電流とT型カルシウム電流の区別を最大にするため、それぞれの電圧に対する反応の相違を利用した。T型カルシウム電流は、細胞膜が-100 mVに保持され試験電圧が-30 mVの時に最大となる。L型カルシウム電流は、細胞を脱分極させ-60 mVに保持し、T型カルシウム電流を不活性化して分離する。次に膜の電圧を-10 mVにし、最大のL型電流を誘発する。細胞を-60 mVに保持し-10 mVに脱分極させることにより、400 ms後に得られる内向き電流の平均値はislm458細胞の値（n＝13）（-5.6 pA±3.0 pA SEM）（p＜0.05）よりも野生型細胞の値（n＝13）（-18 pA±5.2 pA SEM）の方が有意に大きいことが示された。保持電圧を-100 mVにした場合にも、同様の結果が得られた。
【０１０９】
その他の態様
本明細書に記載したすべての刊行物および特許出願は、それぞれの独立した刊行物または特許出願が参照として組み入れられることが特におよび個々に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１０】
本発明をその特定の態様とともに説明してきたが、本発明はさらなる改変が可能であり、本出願は、本発明の原理に一般に準拠しつつ、および本発明に関する技術分野の範囲内にある周知または慣習的な実践の中で起こるような本開示からの逸脱を含みつつ、本発明のいかなる変更、使用、または適合にわたることが意図されており、本明細書に上述した基本的な特徴に適用可能であり、添付の特許請求の範囲に従うことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】Ｌ型カルシウムチャネルα1サブユニットのドメイン構造を示す図（図1A）、ゼブラフィッシュおよびヒトislタンパク質の部分的な配列比較を示す図（図1B）、およびisl変異の位置を示す図（図1Aおよび図1B）である。黒四角は同一アミノ酸を示し、星印はisl変異の位置を示す。
【図２】Ｌ型カルシウムチャネルα1サブユニット遺伝子を含むゼブラフィッシュのゲノム領域の図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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