(57)【要約】本発明は、触媒ＲＮＡがエフェクター結合ＲＮＡドメインまたはアプタマーの一部を形成するまたはそれに結合するアロステリック制御モジュールの構築に関する。これらの構築物は触媒ＲＮＡの活性をエフェクターの制御下に置き、活性化または不活性化のために適切なエフェクターの存在を必要とする。本発明は、有用なエフェクター分子を特定するための手段ならびに同種アプタマーを進化させるためのそれらの使用を提供する。本発明は、エフェクターに結合するＲＮＡ配列の進化およびアロステリック制御モジュールがエフェクターの存在下と不在下でのそれらの触媒機能によって特定される選択プロセスの両方を含む。生じる調節可能な触媒ＲＮＡは、制御された方法で標的ＲＮＡ分子の発現を変化させるために使用しうる。
2004504806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクターを特定し、１またはそれ以上の相互作用アプタマーを作製するための方法であって、
ａ）エフェクターに関して一組の所望特性を選択する段階、
該所望特性は、
（ｉ）少なくとも１％のバイオアベイラビリティー、
（ｉｉ）アロステリック制御モジュールを含む組織への生体内分布、
（ｉｉｉ）細胞の核へと通過する能力、
（ｉｖ）非薬剤相互作用、または制御可能な薬剤相互作用、
（ｖ）使用される用量範囲での非毒性または許容される毒性、
（ｖｉ）使用される用量範囲での非副作用または許容される副作用、
（ｖｉｉ）トランスジーンの発現を調節する際に使用される用量範囲での薬理作用の不在または無視しうる薬理作用、および
（ｖｉｉｉ）アプタマーのインビトロでの進化に適した物理的特性、
から成る群から選択され、
該特性は、エフェクターがアプタマーの作製、ヒトでの摂取およびトランスジーン発現の調節のためのアロステリック制御モジュールとの使用に適することを示唆し、
ｂ）該選択したエフェクター特性に関するデータを含む１またはそれ以上のデータベースにアクセスする段階、
ｃ）該選択特性を有するエフェクターのセットを特定する段階、および
ｄ）インビトロでの進化によって該セット中のエフェクターに対するアプタマーを作製し選択する段階
を含む方法。
【請求項２】
該エフェクターが、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、天然に生じる代謝産物および生物学的エフェクター、脂質、炭水化物（多糖類、糖）、脂肪酸、およびポリマーから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該アプタマーの進化と選択が、
ａ）逆転写およびＰＣＲ増幅のために必要な定常領域を有する少なくとも２０個のヌクレオチドを各々含むランダム配列一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のプールを調製する段階
ｂ）ｓｓＲＮＡのプールをエフェクターと接触させる段階、
ｃ）エフェクターに結合しているＲＮＡをエフェクターに結合していないプールの残余ＲＮＡから分離する段階、
ｄ）該分離した、エフェクターに結合しているＲＮＡを増幅してＤＮＡを生成する段階、
ｅ）該増幅したＤＮＡを転写して濃縮ＲＮＡ混合物を形成する段階、
ｆ）ｂ）からｅ）までの段階を必要に応じて１またはそれ以上のサイクルで実施して、該エフェクターに最も良好に結合する１またはそれ以上のアプタマーとして１またはそれ以上のＲＮＡを特定する段階、および
ｇ）該特定したアプタマーをアロステリック制御モジュールにおける使用のために選択する段階
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ランダム配列一本鎖ＲＮＡが、逆転写およびＰＣＲ増幅のために必要な定常領域を有する多くとも２００個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アロステリック制御モジュールにおいて使用するための該アプタマーの選択が、
ａ）該アプタマーを触媒ＲＮＡに連結してアロステリック制御モジュールを形成する段階、および
ｂ）エフェクターとアプタマーの相互作用がインビボで該触媒ＲＮＡの活性を変化させるアロステリック制御モジュールを特定する段階
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該アロステリック制御モジュールの選択をさらに含み、
ａ）ｓｓＲＮＡがアプタマー、提案された触媒ドメインおよび逆転写とＰＣＲ増幅とに適する１またはそれ以上の定常領域を各々含むランダム配列ｓｓＲＮＡプールを調製する段階、
ｂ）触媒活性を持つＲＮＡを特定する段階、
ｃ）該触媒的に活性なＲＮＡを増幅してコードＤＮＡ分子を形成する段階、
ｄ）該増幅したＤＮＡを転写して触媒的に活性なＲＮＡの富化混合物を形成する段階、
ｅ）該混合物をエフェクターに接触させる段階、
ｆ）エフェクターに結合するが、エフェクターに結合したあと触媒活性を保持していないＲＮＡを選択する段階、
ｇ）該選択したＲＮＡを増幅してコードＤＮＡ分子を形成する段階、
ｈ）該増幅したＤＮＡを転写して該エフェクターの存在下で不活性化されるまたは阻害される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの富化混合物を形成する段階、および
ｉ）ｂ）からｈ）までの段階を必要に応じて１またはそれ以上のサイクルで実施して、該エフェクターと選択した該アロステリック制御モジュールとを遺伝子発現の調節において使用したとき、該エフェクターを認識し、該エフェクターと結合し、該エフェクターと相互作用し、且つエフェクター結合によって不活性化または阻害される１またはそれ以上のアロステリック制御モジュールを特定する段階
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該アロステリック制御モジュールの選択をさらに含み、
ａ）ｓｓＲＮＡがアプタマー、提案された触媒ドメインおよび逆転写とＰＣＲ増幅とに適する１またはそれ以上の定常領域を各々含むランダム配列ｓｓＲＮＡプールを調製する段階、
ｂ）該プールをエフェクターに接触させる段階、
ｃ）エフェクターに結合するが、エフェクターに結合したあと触媒活性を示さないＲＮＡを選択する段階、
ｄ）該選択したＲＮＡを増幅してＤＮＡ分子を生成する段階、
ｅ）該増幅したＤＮＡを転写してＲＮＡの混合物を形成する段階、
ｆ）該エフェクターの不在下で触媒作活性を示すＲＮＡを１またはそれ以上のアロステリック制御モジュールとして選択する段階、
ｇ）該選択したＲＮＡを増幅する段階、
ｈ）該増幅したＤＮＡを転写して該エフェクターの存在下で不活性化されるまたは阻害される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの富化混合物を形成する段階、および
ｉ）ｂ）からｈ）までの段階を必要に応じて１またはそれ以上のサイクルで実施して、該エフェクターと選択した該アロステリック制御モジュールとを遺伝子発現の調節において使用したとき、該エフェクターを認識し、該エフェクターと結合し、該エフェクターと相互作用し、且つエフェクター結合によって不活性化または阻害される１またはそれ以上のアロステリック制御モジュールを特定する段階
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該触媒活性が自己開裂活性であり、該自己開裂性アロステリック制御モジュールをエフェクターの不在下での対象遺伝子発現の阻害または低減のために使用する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
該ｓｓＲＮＡが少なくとも２０個のヌクレオチドを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
該アロステリック制御モジュールの選択をさらに含み、
ａ）ｓｓＲＮＡがアプタマー、提案された触媒ドメインおよび逆転写とＰＣＲ増幅に適する１またはそれ以上の定常領域を各々含むランダム配列ｓｓＲＮＡプールを調製する段階、
ｂ）エフェクターの不在下で触媒活性を示さないＲＮＡを特定する段階、
ｃ）該特定したＲＮＡを増幅してコードＤＮＡ分子を形成する段階、
ｄ）該増幅したＤＮＡを転写してＲＮＡの富化混合物を形成する段階、
ｅ）該混合物をエフェクターに接触させる段階、
ｆ）エフェクターに結合し、エフェクターに結合したとき触媒活性を示すＲＮＡを特定する段階、
ｇ）該特定したＲＮＡを増幅してコードＤＮＡ分子を形成する段階、
ｈ）該増幅したＤＮＡを転写して、エフェクターの存在下で活性化される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの富化混合物を形成する段階、および
ｉ）ｂ）からｈ）までの段階を必要に応じて１またはそれ以上のサイクルで実施して、該エフェクターと選択した該アロステリック制御モジュールとを遺伝子発現の調節において使用したとき、該エフェクターを認識し、該エフェクターと結合し、該エフェクターと相互作用し、且つエフェクター結合によって活性化または増強される１またはそれ以上のアロステリック制御モジュールを特定する段階
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該アロステリック制御モジュールの選択をさらに含み、
ａ）ｓｓＲＮＡがアプタマー、提案される触媒ドメインおよび逆転写とＰＣＲ増幅に適する１またはそれ以上の定常領域を各々含むランダム配列ｓｓＲＮＡプールを調製する段階、
ｂ）該プールをエフェクターに接触させる段階、
ｃ）エフェクターに結合し、エフェクターに結合している間触媒活性を示すＲＮＡを特定する段階、
ｄ）該特定したＲＮＡを増幅してコードＤＮＡ分子を形成する段階、
ｅ）該増幅したＤＮＡを転写してエフェクターの存在下で触媒活性を有するＲＮＡの富化混合物を形成する段階、
ｆ）エフェクターの不在下で触媒的に不活性であるＲＮＡを選択する段階、
ｇ）該選択したＲＮＡを増幅してコードＤＮＡ分子を形成する段階、
ｈ）該増幅したＤＮＡを転写してエフェクターの存在下で活性化される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの富化混合物を形成する段階、および
ｉ）ｂ）からｈ）までの段階を必要に応じて１またはそれ以上のサイクルで実施して、該エフェクターと選択した該アロステリック制御モジュールとを遺伝子発現の調節において使用したとき、該エフェクターを認識し、該エフェクターと結合し、該エフェクターと相互作用し、且つエフェクター結合によって活性化または増強される１またはそれ以上のアロステリック制御モジュールを特定する段階
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該ｓｓＲＮＡが少なくとも２０個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該触媒活性が自己スプライシング活性であり、アロステリック制御モジュールの自己スプライシングが対象遺伝子をコードする機能的ｍＲＮＡの形成をもたらす、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
エフェクターを選択する方法であって、
ａ）遺伝子発現の調節において使用するのに適したアロステリック制御モジュールを提供する段階、
ｂ）該アロステリック制御モジュールを１またはそれ以上のエフェクターに接触させる段階、および
ｃ）該アロステリック制御モジュールとエフェクターの相互作用が該アロステリック制御モジュールの触媒活性の変化をもたらすかどうかを判定する段階
を含む方法。
【請求項１５】
該データベースが、
ａ）製薬上活性な成分を含む１個の異性体と、ほとんどまたは全く薬理活性を持たないもう１つの異性体とについて立体選択性を持つ市販薬剤、
ｂ）ほとんどまたは全く活性を持たない既知の薬剤代謝産物、
ｃ）核レセプタ標的分子、
ｄ）臨床試験に入ったが、相対的な効果欠如のために試験が中止された薬剤候補物質、
ｅ）効果の欠如のために市場から撤収された薬剤、
ｆ）有効であるが相対的な利益が低いために市販されていない薬剤、
ｇ）標的ウイルスまたは病原菌に感染していない患者において使用するための、抗ウイルス／抗感染症薬と称される薬剤、
ｈ）十分に特性付けられた食品添加物、
ｉ）周知の作用機序を有する一般薬、および
ｊ）クラスの最良分子に取って代わられたため市場または臨床試験から撤収された薬剤
から成る群から選択されるデータを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該データベースが、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ　Ｄｒｕｇｓデータベース、Ｄｒｕｇ　Ｄａｔａ　Ｒｅｐｏｒｔ、Ｗｏｒｌｄ　Ｄｒｕｇ　Ｉｎｄｅｘ、Ｄｅｒｗｅｎｔ　Ｄｒｕｇ　Ｆｉｌｅ、Ｒ　＆　Ｄ　Ｉｎｓｉｇｈｔ、Ｒ　＆　Ｄ　Ｆｏｃｕｓ、Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ、ＭＥＤＬＩＮＥおよびＥＭＢＡＳＥから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
これまでエフェクターであることが知られていない分子が、対象遺伝子の発現を特異的に変化させるためにアロステリック制御モジュールと組み合わせて使用しうるかどうかを判定する方法であって、
（ａ）該分子が対象遺伝子のモジュレーターとして働くことができる場合、該分子がレポーター遺伝子によって産生される検出可能なシグナルを生じる条件下で、あらかじめ規定された数の真核細胞を含むサンプルを試験される該分子に接触させること、
該細胞各々は、
ｉ）アロステリック制御モジュール、および
ｉｉ）プロモーターに結合して、プロモーターの制御下で検出可能なシグナルを生成するレポーター遺伝子をコードするＤＮＡ構築物を含み、
（ｂ）（ａ）において生成されるシグナルの量を定量的に測定すること、および
（ｃ）（ｂ）で測定されたシグナルの量を、被験分子の不在下で生成され検出されるシグナルの量とまたは（ａ）においてサンプルを他の分子に接触させたときに生成され検出されるシグナルの量と比較し、それによって被験分子を、レポーター遺伝子によって生成される検出可能なシグナルの量の変化を生じさせるエフェクターとして特定し、さらにそれによって被験分子が対象遺伝子の発現を特異的に変化させるかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項１８】
（ａ）プロモーターをコードするＤＮＡ、
（ｂ）所望する産物をコードするＤＮＡ、および
（ｃ）エフェクターがそれに結合することによって該アロステリック制御モジュールの触媒活性が変化する、請求項１のアロステリック制御モジュールをコードするＤＮＡ
を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、１個またはそれ以上のイントロンおよび３’ＵＴＲ、
（ｂ）所望する産物、および
（ｃ）エフェクターがそれに結合することによって該アロステリック制御モジュールの触媒活性が変化する、請求項１のアロステリック制御モジュール、
をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ。
【請求項２１】
細胞において所望産物のインビボ発現を調節する方法であって、
ａ）請求項１８に記載のＤＮＡ構築物を備えた細胞を提供すること、
ｂ）該アロステリック制御モジュールの触媒活性を変化させるエフェクターを細胞に導入すること、を含む方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載のＤＮＡ構築物を備えるウイルスベクター構築物を含む、組換えウイルスベクターの産生のためのパッケージング細胞系統。
【請求項２３】
請求項１８に記載のＤＮＡ構築物を含む組換えウイルスベクター。
【請求項２４】
触媒ドメインが、ハンマーヘッドリボザイム核酸、アクスヘッドリボザイム核酸、ヘアピンリボザイム核酸、デルタ肝炎ウイルスリボザイム核酸、イモリサテライトリボザイム核酸、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リボザイム核酸、ＲＮＡａｓｅ　Ｐについての外部ガイド配列、自己スプライシングイントロン、リガーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼおよびペプチドリガーゼから成る群から選択される核酸を含む、請求項１に記載の触媒ＲＮＡ分子。
【請求項２５】
触媒ＲＮＡがＲＮＡａｓｅ　Ｐについての外部ガイド配列である、請求項１に記載の触媒ＲＮＡ分子。
【請求項２６】
該触媒ＲＮＡが、エフェクターがアプタマーに結合したとき不活性化される、請求項１に記載の触媒ＲＮＡ分子。
【請求項２７】
該触媒ＲＮＡが、エフェクターがアプタマーに結合したとき活性化される、請求項１に記載の触媒ＲＮＡ分子。
【請求項２８】
該エフェクターが、アロステリック制御モジュールとトランスジーンを含む細胞に外因的に投与される、請求項１に記載の触媒ＲＮＡ分子。
【請求項２９】
遺伝子発現の調節のためのアロステリック制御モジュールを調製する方法であって、
（ａ）ランダム核酸ライブラリーをふるい分けして、選択したエフェクター分子に結合するアプタマーを選択すること、および
（ｂ）選択したアプタマーについての配列と対象蛋白質をコードする配列を含む核酸を調製すること
を含み、該エフェクター分子が選択したアプタマーについての配列に結合するときには対象蛋白質をコードする遺伝子が発現されない、上記方法。
【請求項３０】
インビトロでの進化によって選択したアプタマーを至適化することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリヌクレオチドの触媒活性を変化させるための特定されたエフェクターの使用および遺伝子発現の変更におけるこれらの成分の使用方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
以下は、酵素性核酸分子の簡単な説明である。この要約はすべてを含むことを意味せず、下記の本発明のよりよい理解のためにのみ提供するものである。この要約は、以下に述べる研究のすべてが特許請求する本発明の先行技術であることを是認するものではない。
【０００３】
酵素性核酸分子（例えばリボザイム）は、ヌクレオチドの塩基配列特異的に、それ自身または他の別個の核酸分子を開裂する、連結するまたはスプライシングする能力を含めて、様々な反応の１つまたはそれ以上を触媒することができる核酸である。一般に、酵素性核酸分子は、標的核酸に先ず結合することによって作用する。そのような結合は、例えば標的を開裂するように働く該分子の酵素性部分に近接する、酵素性核酸分子の標的結合部分を通じて起こる。それ故、酵素性核酸分子は、相補的塩基対合を通じて標的を先ず認識し、次に標的に結合し、ひとたび正しい部位に結合すると、標的に対して酵素的に作用する。１つの用途においては、酵素活性は開裂反応を含みうる。標的ＲＮＡの戦略的開裂は、例えば、コードされた蛋白質の合成を指令するＲＮＡの能力を破壊する。酵素性核酸は、その標的に結合して開裂したあと、もう１つ別の標的を探索するためにその分子から放出され、繰り返し新しい標的に結合してそれを開裂することができる。核酸分子がシス作用性（例えば自己開裂性、自己相互作用性、自己分解性）である場合、その作用はこの核酸の破壊によって排除される。核酸がトランス作用性（もう１つ別の核酸分子または配列を開裂するまたはそれらと相互作用する）である場合には、活性は必ずしも単一の反応によって排除されない。
【０００４】
癌におけるように、排除すべき遺伝子から転写されるウイルスＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡのような標的ＲＮＡを開裂することによって疾病または遺伝的疾患を治療するために、リボザイムの使用が提案された。これらの手法は、アンチセンス配列の使用によるＲＮＡ転写の遮断に代わる方法として記述されている。一部のリボザイムの酵素的性質により、１個のリボザイム分子を使用して多くの標的ＲＮＡ分子を開裂しうると考えられ、それ故、アンチセンス治療で必要とされるよりも比較的低い濃度の物質で治療作用が達成される。
【０００５】
その配列特異性のゆえに、トランス開裂性核酸分子が検討され、ヒト疾患を治療するための治療薬として記述されている。細胞ＲＮＡの背景において特異的ＲＮＡ標的を開裂するように酵素性核酸分子を設計するまたは選択することができる。そのような開裂事象はｍＲＮＡを機能しないようにし、そのＲＮＡからの蛋白質産生を消失させる。このようにして、疾患状態に関連する蛋白質の合成を選択的に阻害することができる。治療薬としてのリボザイムの使用についてはいくつかの記述があるが（Ｃｏｔｔｏｎｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ、８：１７４−１７８、１９９０；Ｕｓｍａｎ　＆　ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：２８５−２９４，１９９５；ＣｏｕｔｕｒｅとＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，ＴＩＧ，１２（１２）：５１０−５１５，１９９６；ＣｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎとＭａｒｒ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７，１９９５；ＧｉｂｓｏｎとＳｈｉｌｌｉｔｏｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１２５−１３７，１９９７；Ｐｅｒｓｉｄｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：９２１−９２２，１９９７；およびＪａｅｇｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：３２４−３３５，１９９７）、遺伝子発現を変化させるトランスまたはシス作用性酵素性核酸分子の使用（ＣｈｕａｔとＧａｌｉｂｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１６２（３）：１０２５−１０２９，１９８９；Ｉｎｎｏｖｉｒ米国特許第５，７４１，６７９号）あるいは小分子ＲＮＡ相互作用を用いた翻訳阻害による遺伝子発現の制御（ＷｅｒｓｔｕｃｋとＧｒｅｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：２９６−２９８，１９９８）についての試験は比較的少ない。
【０００６】
研究者たちは、ＲＮＡ分子が他のＲＮＡ分子の開裂以外に実施することができる触媒機能の著しい多様性を明らかにした。例えば、ＲｏｂｅｒｔｓｏｎとＪｏｙｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ　３４４：４６７，１９９０；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎとＳｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ　３４６：８１８、１９９０；Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：１４２０、１９９２；Ｎｏｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：１４１６、１９９２；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎとＳｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ　３５５：８５０、１９９２；Ｂｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３５５：５６４，１９９２；ＢｅａｕｄｒｙとＪｏｙｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：６３５、１９９２；およびＯｌｉｐｈｅｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２９４４、１９８９参照。所与の機能、例えば触媒またはリガンド結合機能を有するＲＮＡ分子を、「インビトロ遺伝学（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」（Ｓｚｏｓｔａｋ，ＴＩＢＳ　１９：８９，１９９２）または「インビトロ進化（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」と称されてきた方法で、ランダム分子の複雑な混合物から選択することができる。簡単に述べると、ランダムな配列と定義された配列を担うＲＮＡ分子の大きなプールを合成し、その複雑な混合物、例えば約１０１５の個別配列を選択と濃縮の過程に供する。例えば、アフィニティークロマトグラフィーと、アフィニティーカラム上のリガンドに結合した分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎとＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）は、１０１０ＲＮＡ分子中の１個が所与のリガンドに結合するように折りたたまれると推定した。そのようなリガンド結合挙動を有するＤＮＡ分子が単離された（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎとＳｚｏｓｔａｋ、１９９２、前出；Ｂｏｃｋら、１９９２、前出）。
【０００７】
遺伝子配列の制御または調節は、蛋白質産生、診断、トランスジェニック技術、細胞治療および遺伝子治療の分野において強く所望される目的である。様々な発現制御システムが受容宿主細胞においてトランスジーンの発現を転写的に制御するための手段として記述されている。制御手段または遺伝子スイッチは、次のシステムを含むがこれらに限定されない。
【０００８】
ラパログ（Ｒａｐａｌｏｇｓ）は、ＤＮＡ結合蛋白質または転写活性化蛋白質のような、小分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始させることができるドメインを含むキメラ蛋白質をダイマー化するために使用しうる（ＷＯ９６４１８６５号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８６号）；ＷＯ９７３１８９８号（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７号）およびＷＯ９７３１８９９号（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７号）に述べられているように）。蛋白質のダイマー化を使用してトランスジーンの転写を開始させることができる。
【０００９】
代替的な調節テクノロジーは、対象遺伝子から発現した蛋白質を凝集体またはクラスターとして細胞の内部に貯蔵する方法を用いる。対象遺伝子を、凝集した蛋白質を小胞体内に保持させる条件的凝集ドメインを含む融合蛋白質として発現させる。貯蔵蛋白質は細胞内部で安定であり、不活性である。しかし、条件的凝集ドメインを取り除き、それによって蛋白質が細胞から分泌されうるように凝集体またはクラスターを特異的にばらばらにする薬剤（例えば小分子リガンド）を投与することにより、蛋白質を放出することができる。Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８１６−８１７および８２６−８３０、２０００参照。
【００１０】
ミフェプリストン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）（ＲＵ４８６）はプロゲステロン拮抗物質として使用される。修飾プロゲステロンレセプタリガンド結合ドメインがプロゲステロン拮抗物質に結合すると、２つの転写因子のダイマーを形成することによって転写を活性化し、その後核内へと通過してＤＮＡに結合する。リガンド結合ドメインは、天然リガンドに結合するレセプタの能力を排除するように修飾される。修飾されたステロイドホルモンレセプタ系は、米国特許第５，３６４，７９１号；ＷＯ９６４０９１１号およびＷＯ９７１０３３７号の中でさらに詳細に記述されている。
【００１１】
さらにもう１つの制御システムは、エクジソンレセプタ（細胞質レセプタ）に結合してそれを活性化するエクジソン（ミバエ（ｆｒｕｉｔ　ｆｌｙ）ステロイドホルモン）を使用する。その後レセプタは核に転移して特異的ＤＮＡ応答エレメント（エクジソン−応答遺伝子からのプロモーター）に結合する。エクジソンレセプタは、転写を開始させるトランスアクチベーションドメイン／ＤＮＡ結合ドメイン／リガンド結合ドメインを含む。エクジソンレセプタは米国特許第５，５１４，５７８号；ＷＯ９７３８１１７号；ＷＯ９６３７６０９号およびＷＯ９３０３１６２号の中でさらに詳細に述べられている。
【００１２】
もう１つの制御手段は、ポジティブテトラサイクリン制御可能トランスアクチベーターを使用する。このシステムは、転写を活性化するポリペプチドに結合した突然変異ｔｅｔレプレッサー蛋白質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランスアクチベーター蛋白質を生じる突然変異ｔｅｔＲ−４アミノ酸変化、すなわちテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。そのようなシステムは米国特許第５，４６４，７５８号；５，６５０，２９８号および５，６５４，６８号に述べられている。
【００１３】
ノックアウトおよびトランスジェニック動物は当業者に周知である。Ｓｗａｎｓｏｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：２６５−１７４，１９９４；Ｆａｓｓｌｅｒら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０６：３２３−３３４，１９９５；Ｐｏｌｉｔｅｓ，Ｈ．Ｇ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，７７（６）：２５７−２６２，１９９６；ＨａｒｒｉｓとＦｏｏｒｄ，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，１（４）：４３３−４４３，２０００。ノックアウト動物は、標的遺伝子の発現を破壊して、標的遺伝子産物の排除をもたらすように遺伝的に変化させたものである。ノックアウト動物は対象とする蛋白質の機能を明らかにするために広く使用されている。特に、ノックアウト動物における標的遺伝子の発現の排除は、遺伝子の蛋白質産物を阻害することの効果を示すことができる。このテクノロジーに付随する１つの制限は、標的遺伝子の破壊が、成体動物での標的遺伝子阻害の効果を示すわけではないのに、胚の死亡をもたらす進化障害を引き起こしうることである。それ故、一部の遺伝子機能の破壊は生存動物では検討することができない。現在のノックアウトテクノロジーのもう１つの制限は、標的遺伝子破壊への進化補償の作用である。進化の経過において、他の関連遺伝子産物が破壊された遺伝子の失われた機能を補償し、その結果成体動物におけるその機能をあいまいにすることがある。テクノロジーのこれらの周知の制限は、ノックアウト動物での標的遺伝子破壊の有用性を有意に限定しうる。トランスジェニック動物の場合には、対象遺伝子の付加的なコピーを生物内に導入し、遺伝子産物の過剰発現を生じさせる。進化中の蛋白質の過剰発現は、障害を引き起こすあるいは過剰発現の補償または阻害を導くことがある。これらの問題はトランスジーンの過剰発現の影響をあいまいにし、標的遺伝子過剰発現の生物学的作用を解釈する能力を制限しうる。条件的ノックアウト動物を創造する能力は、これらの制限を克服するために特に重要であり、適切である。
【００１４】
上記で引用した参考文献は、本発明で提供されるように遺伝子発現の制御におけるエフェクターの特定およびそれらの使用を開示および／または想定していないので、ここで特許請求する発明とは異なるものである。またそれらは本発明のアロステリック制御モジュールに言及していない。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１は、自己開裂性ＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。この自己開裂性ＲＮＡドメインの活性は、エフェクターと相互作用することによって阻害され、ｍＲＮＡの翻訳をもたらす。アロステリック制御モジュールが対象遺伝子の５’または３’に位置しうることは当業者に理解されるであろう。
【００１６】
図２は、自己開裂性ＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。この自己開裂性ＲＮＡドメインの活性はエフェクターと相互作用することによって開始される。アロステリック制御モジュールの開裂は、ｍＲＮＡの分解と翻訳の阻害をもたらす。エフェクターの不在下では翻訳が起こる。
【００１７】
図３は、自己スプライシングＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。この自己スプライシングＲＮＡドメインの活性はエフェクターと相互作用することによって開始される。本発明のこの実施形態では、エフェクターの存在は、アロステリック制御モジュールの活性化を提供して、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングが起こり翻訳可能なｍＲＮＡの形成を生じる。
【００１８】
図４は、構築されたイントロン内に自己スプライシングＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する図式的表示である。図示した実施形態では、エフェクターの存在は、アロステリック制御モジュールの活性化を提供し、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングが起こり翻訳可能なオープンリーディングフレームの形成を生じる。
【００１９】
図５は、自己スプライシングＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。この実施形態では、エフェクターと相互作用することによってアロステリック制御モジュールの活性が阻害される。
【００２０】
図６は、スプライセオソーム構築に必要なイントロンの領域に挿入された自己スプライシングＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。この実施形態では、エフェクターの存在下でアロステリック制御モジュールの活性が阻害され、対象遺伝子の発現が生じる。
【００２１】
図７は、ランダム化ヌクレオチドのハンマーヘッドリボザイムへの隣接伸張を通じて接続されたテオフィリン結合アプタマーのステム−ループ構造を含むＲＮＡテンプレート１の二次構造を示す。テオフィリンの分子構造も示す（配列番号６）。
【００２２】
図８は、７回のサイクル後に選択した、ＲＮＡ配列ＴＡ−５０の二次構造を示す。
【００２３】
図９は、テオフィリンの存在下でのＴＡ−５０の自己開裂能力を示す。
【００２４】
（発明の概要）
有用なエフェクター分子を特定する手段、ならびに同種アプタマーを進化させるための特定されたエフェクターの使用を述べる。触媒ＲＮＡがエフェクター結合ＲＮＡドメインまたはアプタマーの一部を形成するかまたはそれに結合して、それによって触媒ＲＮＡの活性をエフェクターの制御下に置き、活性化または不活性化のためにエフェクターの存在を必要とする、アロステリック制御モジュールの構築を述べる。少なくとも一部分がエフェクターと結合することができ、もう１つの部分が触媒ＲＮＡであるＲＮＡ分子を構築する。本発明は、エフェクターに結合するＲＮＡ配列の進化と、エフェクターの存在下と不在下でのそれらの触媒機能によってアロステリック制御モジュールを特定する選択過程を含む。このように、エフェクターの存在下で標的ＲＮＡを開裂する、スプライシングするまたは連結する、あるいはエフェクターの不在下で標的ＲＮＡを開裂する、スプライシングするまたは連結する際に使用するために、調節可能な触媒ＲＮＡを選択することができる。
【００２５】
エフェクターの選択およびアロステリック制御モジュール構築のこれらの方法は、制御された方法で標的ＲＮＡ分子の発現を変化させるのに有用である。標的ＲＮＡ分子がアロステリック制御モジュールと組み合わせて細胞内に形成されるまたは細胞に送達されるときに特に有用である。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
これまでの既知の制御構築物およびそれらの使用に伴う難点として、内因性遺伝子の転写の活性化または抑制、小分子単位が通常調節する蛋白質または細胞過程の活性化または阻害、あるいは制御系の異種蛋白質遺伝子産物に対する免疫応答の誘導を含めて、インビボでの使用の際の潜在的な毒性が含まれる。その上に、一定のウイルスおよび非ウイルスベクターによって対象遺伝子と共に送達することができる制御コード配列には大きさの制限が存在すると考えられる。それ故依然として、対象遺伝子の制御された発現のために代替的な方法と材料を開発することが求められている。さらに、遺伝子発現を制御する手段の開発は、その手段は使用する個々の成分によっても変化しうるが、遺伝子治療の戦略ならびに治療用蛋白質の生成にも有意に寄与するであろう。本発明は唯一これらの問題を解決する。
【００２７】
特定遺伝子の発現は、活性蛋白質を生成する過程のいずれかの段階で変化させることができる。総蛋白質活性の調節は、転写、転写産物のプロセシング、翻訳または翻訳後の機序を通じて起こりうる。転写は、転写開始速度またはＲＮＡポリメラーゼの進行速度を変化させることによって調節しうる。転写産物のプロセシングは、ＲＮＡスプライシングのパターン、細胞質へのｍＲＮＡの送達速度、またはｍＲＮＡの安定性のような環境によって影響されうる。本発明は主としてエフェクター分子の特定と使用、および標的遺伝子の発現を変化させるために協力して働く（例えばＲＮＡプロセシングを変化させることによって標的蛋白質のインビボ濃度を変化させる）アロステリック制御モジュールの創造に関する。本発明は、これまでに記述されていない、遺伝子発現の制御において使用するための適当なエフェクターの特定方法を提供する。
【００２８】
様々なエフェクター制御ＲＮＡ分子についての記述が存在する。例えば、ＣｈｕａｔとＧａｌｉｂｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１６２（３）：１０２５−１０２９，１９８９；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３５５：８５０−８５２，１９９２；Ｐｏｒｔａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３：１６１−１６４，１９９５；およびＳｏｕｋｕｐとＢｒｅａｋｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５８４−３５８９，１９９９参照。しかし、この特定とインビトロでの選択工程は、有害な遺伝子（ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、ＶＥＧＦおよびＴＮＦのような）の発現を制御するためのリボザイムの使用、あるいは特異的リガンドを検出するためのバイオセンサーのために設計され、それらを対象としてきた。アミノグリコシド抗生物質はＲＮＡと反応する最もよく検討されている分子のひとつである（ｖｏｎ　Ａｈｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３５３：３６８−３７０，１９９１；ｖｏｎ　Ａｈｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：９３５−９４１，１９９２；ＭｕｒｒａｙとＡｒｎｏｌｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１７：８５５−８６０，１９９６；ＷｅｒｓｔｕｃｋとＧｒｅｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：２９６−２９８，１９９８）。しかしながら、そのようなこれまでに記述された分子は、天然に生じるリボザイムと直接反応する。本発明は、発現調節構築物において使用するためのアプタマーを進化させるために用いられるエフェクターの新規特定について述べる。
【００２９】
一方、ＷｅｒｓｔｕｃｋとＧｒｅｅｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：２９６−２９８，１９９８）は翻訳を調節するためのエフェクターとアプタマーの使用を記述している。その研究において彼らは、レポーター遺伝子の翻訳を抑制するためのエフェクターとして多数のアプタマーと染料の使用を述べた。その方法は、本発明の触媒ＲＮＡまたはアロステリック制御モジュールの使用を含まなかった。他の開示物は、リガンド、リガンド結合配列および触媒ＲＮＡを使用する、調節された遺伝子配列の使用（Ｉｎｎｏｖｉｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．；発現制御系および核酸構築物は米国特許第５，７４１，６７９号および米国特許第５，８４３，１８６号に述べられている）に関するが、その記述には適当なエフェクターの選択のための方法は含まれていない。
【００３０】
本発明者の知る限りでは、エフェクターの特定、アロステリック制御モジュールの構築のために非天然に生じるアプタマーを選択し、進化させるためのそれらの使用、および遺伝子発現を変化させるためのエフェクターとアロステリック制御モジュールの組合せ使用のための体系的な方法についての報告はこれまでのところ存在しない。このような方法が本発明の目的である。ここで述べる手法はまた、遺伝子発現の調節においてこれまで想定されていなかった分子を生成するためにも使用できる。本発明は、「非治療的」分子が対象遺伝子の発現を特異的に調節するかどうか、そしてそのようなエフェクター分子の最終的な臨床使用が、治療機能を有するこれまでの生物学的製剤または薬剤の使用に比べて利益を提供するかどうかを判定するための手段を提供する。
【００３１】
アロステリック制御モジュールによる標的ＲＮＡ分子の制御された発現のための方法と組成物を述べる。アロステリック制御モジュールの活性は、あらかじめ特定されたエフェクターの存在、不在または量を通して変化する。１つの実施形態では、アロステリック制御モジュールはエフェクターの存在下で活性であり、また別の実施形態ではアロステリック制御モジュールはエフェクターの存在下で不活性である。
【００３２】
本発明の説明においては下記の定義を使用する。
【００３３】
ここで使用するとき「アロステリック制御モジュール」は、少なくとも２つのドメインから成り、一方はあらかじめ特定されたリガンドについてのレセプタであり、他方は触媒ドメインである、非天然に生じるＲＮＡを指す。レセプタドメインまたはエフェクター結合ドメインはアプタマーとも称され、それが結合するリガンドはエフェクターとも称される。触媒ドメインは、標的ＤＮＡと相互作用することができるＲＮＡである。そのような作用は、標的ＲＮＡを開裂する、スプライシングするまたは連結することを含みうる。
【００３４】
遺伝子発現のアロステリック調節は、エフェクターとアロステリック制御モジュールの相互作用による、遺伝子好ましくは遺伝子治療におけるトランスジーンの発現の変更を指す。本発明のエフェクターは、アロステリック制御モジュールのドメインに結合して、モジュールの触媒ドメインの活性を変化させる。特定の理論に縛られることなく、触媒ドメインの活性に対するエフェクターの影響は、エフェクターとエフェクター結合ドメインまたはアプタマーの結合によって誘導されるモジュールの立体配座の変化によってもたらされると考えられる。アプタマーと触媒ＲＮＡドメインの組合せは、立体配座の変化が活性触媒ドメインの形成を妨げるか、または活性触媒ドメインの形成を誘導するように選択する。例えば、エフェクターが誘導する立体配座変化は、アプタマーと触媒ドメインの三次構造間の立体干渉による触媒ドメインの活性の阻害または低下を引き起こすように選択しうる。あるいは、エフェクターが誘導する立体配座変化は、触媒ドメインの活性の開始または上昇を生じさせるように選択することもできる。それ故、「活性化」または「活性化された」の語は、ここでは触媒活性の開始または上昇または増強を表わすために使用される。
【００３５】
アロステリック制御モジュールのドメインはオーバーラップしないか、若しくは１個またはそれ以上のドメインが部分的に同じポリペプチドによってコードされるように部分的にオーバーラップしていてもよいことは、当業者に理解されるであろう。従って、ドメインは主としてそれらの配列ではなく機能によって区別される。さらに、ドメインを別々に調製し、その後連結してアロステリック制御モジュールを形成するか、若しくはアプタマーと触媒ドメインの両方を備えた１個のポリヌクレオチドとしてアロステリック制御モジュールを調製することができる。
【００３６】
これまでに記述されているリボザイムやリボザイム様分子と異なって、本発明のアロステリック制御モジュールは真の「酵素」活性を持たない。本発明のＤＮＡの好ましい構築においては、アロステリック制御モジュールは分子内ベースで作用し、多数のＲＮＡまたはＤＮＡ分子との多数の反応ではなく、１つの反応を提供することしか求められない。さらに、触媒機能のアロステリック調節は、リボザイムのような構造の触媒部位を遮断する阻害因子の調節とは異なる。本発明では、エフェクターは、活性部位とは離れて位置する部位であるアプタマーに結合し、ポリヌクレオチドの活性へのその影響は、アプタマーとエフェクターの相互作用から生じるポリヌクレオチド立体配座の変化によってもたらされると考えられる。本発明のＤＮＡ構築物中のアロステリック制御モジュールの位置が変化しうることも理解されるであろう。アロステリック制御モジュールが、エフェクターによるアロステリック制御モジュールの活性の変化が対象遺伝子の発現の変化を生じさせるように位置することが、求められるすべてである。
【００３７】
ここで使用するとき「アロステリック」または「アロステリー」は、分子とエフェクターの相互作用によるその分子の活性の変化を指す。エフェクターは、分子の触媒ドメインとは異なるドメインと相互作用し、その相互作用が分子の活性の変化を生じさせる。本発明の構築物に関わる典型的な活性は触媒活性と称することができ、ここでさらに詳細に述べる。
【００３８】
ここで使用するとき「アプタマー」または「エフェクター結合ドメイン」は、エフェクターに結合するポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、典型的には少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、少なくとも３００個のヌクレオチドを含みうる。本発明のアプタマーは、化学修飾されていない、天然に生じるポリヌクレオチドを含みうる。好ましくは、アプタマーは合成または非天然に生じるポリヌクレオチドを含む。さらに、アプタマーは、好ましくはこれまでに特定されたエフェクターと相互作用するようにインビトロ進化によって選択されるリボ核酸（ＲＮＡ）である。アプタマーのインビトロ進化は、化学および／または酵素的合成によって創造されるＲＮＡ分子のプールから始まる。典型的には、アプタマーは、エフェクターと相互作用する（例えば認識して結合する）その能力に基づいて選択される。それ故、好ましい実施形態では、エフェクターは、適切なアプタマーを選択し、さらに進化させるために使用されるあらかじめ定められた分子である。あるいは、アプタマーを構築し、分子のライブラリーをふるい分けして、適切なエフェクターを特定して選択することもできる。
【００３９】
遺伝子治療手法での遺伝子発現の制御における使用のためには、アプタマーは単離され、精製された化学単位ではない。その代わりに、アプタマーは細胞に送達されるＤＮＡによってコードされ、宿主細胞においてそのＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの一部となる。さらに、本発明のアプタマーが受容細胞において固有の生理的活性を持たないので、本発明のエフェクターはアプタマーの生物活性を変化させない。
【００４０】
エフェクターに対するアプタマーの相互作用（例えばハイブリダイゼーションまたは結合）のために必要な所定の塩基数というのはない。一般にアプタマーは、特定エフェクターに結合するためにここで述べるように選択した、２０から３００個のヌクレオチドを含む。分子の小さなサイズ（典型的には２００個のヌクレオチドまたはそれ以下、好ましくは２０から３０個のヌクレオチドの長さ）は、はるかに大きなサイズの従来の発現調節構築物に比べて細胞送達に有利である。ここでは「ランダム」配列と称するが、ＲＮＡは本来進化過程で使用されるときにのみランダムであることは明白である。進化過程の産物、すなわちアプタマーはランダム配列ではない。規定されたエフェクターに高度の親和性と特異性で結合する特異的配列である。
【００４１】
ここで述べるアロステリック制御モジュールの特異的アプタマーは本発明において制限的ではない。当業者は、本発明のアプタマーにおいて重要なことのすべては、それが適当なエフェクターと選択的且つ特異的に相互作用すること、そしてアプタマーがエフェクターと相互作用したときにアロステリック制御モジュールの触媒活性を変化させる能力を持つことであることを認識するであろう。多数のエフェクター、さらには多数の異なるエフェクターを使用してアロステリック制御モジュールと反応させ、それによってｍＲＮＡ前駆体を変化させて遺伝子発現を調節するように、多数のアプタマー（ならびに多数のアロステリック制御モジュール）も使用しうる。
【００４２】
ここで使用するとき「ドメイン」の語は、本発明のアロステリック制御モジュールに選択された活性または機能を与えるポリヌクレオチドを指す。
【００４３】
ここで使用するとき「エフェクター」の語は、アプタマーと相互作用する分子を指す。結合は相互作用の結果であり、水素結合、疎水的相互作用、挿入結合（ｉｎｔｅｒｃｏｌｌａｔｉｏｎ）、等々を含みうるが、これらに限定されない。本発明のエフェクターとして使用するための適当な分子は、有機または無機分子、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、天然に生じる代謝産物および生物学的エフェクター、脂質、炭水化物（多糖類、糖）、脂肪酸、およびポリマーを含むが、これらに限定されない。本発明の好ましいエフェクター分子は、本発明のエフェクターが薬理作用を持たないか、若しくは薬理作用が認められないまたは無視しうる濃度で使用されるという点で、先行技術において記述されたものとは異なる。
【００４４】
アロステリック制御モジュールと共に使用するためのエフェクターの「適合性」は、次の特徴を含みうる。（１）エフェクターは、遺伝子発現を変化させるのに使用される用量範囲でほとんどまたは全く薬理作用を持たないか、若しくは無視しうる薬理作用を持つ。これは、エフェクターが作用する細胞の構造またはプロセス（アロステリック制御モジュール以外）の機能の変化の欠如若しくはエフェクターが作用する細胞の構造またはプロセス（アロステリック制御モジュール以外）の機能の有意でない変化の進化を指す。言い換えると、エフェクターが、アロステリック制御モジュール以外の構造またはプロセスへの作用を有する薬剤として使用しうる場合、その作用はその薬剤による治療を必要とする患者にいかなる有害性も引き起こさない。（２）エフェクターは、アロステリック制御モジュールを含む細胞または組織への生体内分布を受ける。（３）エフェクターは、調節された遺伝子発現のための形質転換された細胞の核内の非細胞構造、すなわちアロステリック制御モジュールまで通過する能力を備える。これは、細胞内拡散または送達、最も好ましくは核内拡散または送達によって行われうる。（４）エフェクターは、アプタマーと相互作用する能力を有し、かかる相互作用が高い特異性と高い親和性で起こる。
【００４５】
適切なエフェクターの特定のための付加的な配慮は、さらに次の事柄を含みうる。（１）エフェクターが用量−作用関係を有する分子である場合、この分子は典型的には、承認された適応症に使用するときの分子の通常最小１日量よりも低い、最大１日量で使用される。好ましくはそのようなエフェクターは、薬剤として使用するときの分子の２５％有効量（ＥＤ２５）以下の用量レベルで使用する。しかし、そのような選択性が物質のケースバイケースの評価に基づくことは当業者には理解されるであろう。例えば、抗ウイルス薬であるエフェクターの場合には、エフェクターをウイルスが存在しない用量範囲で使用できるであろう。より好ましくは用量レベルはこの分子のＥＤ１０以下である。最も好ましくは、エフェクターが用量−作用関係を有する分子である場合、分子を薬剤として使用するときの分子の最小有効量（閾値用量）以下である用量で分子を使用する。（２）エフェクターに関連する薬剤の使用は、調節される遺伝子によって治療される状態を有する患者において禁忌ではない。（３）エフェクター自体によって生じる有意の副作用または有害反応は存在せず、またエフェクター自体の過量によって有意の有害反応が起こることはない。典型的には、有意でない作用として、例えば用量調節または他の一般的な処置によって制御することができる、若しくはエフェクターを摂取した個体群の５％以下で起こる、頭痛、めまい感、ふらつき、鎮静、吐気、嘔吐、発疹、便秘、下痢、腹痛、多幸感、不快気分、疲労、関節痛のような事象が含まれるであろう。（４）妊娠、心臓病、または関連薬剤に対する過敏症における既知の禁忌は存在しない。
【００４６】
本発明の一部の好ましい実施形態では、エフェクターは小分子である。エフェクターの性質は、少なくとも標的ＲＮＡを含む細胞に容易に入り込むある種の非毒性分子または薬剤のように、外因的に供給されるように選択することができる。あるいは、制御するエフェクターが、矯正される疾患または発現される遺伝子または生成される分子に直接または間接的に関連するある種の内因性代謝産物または高分子である、完全に内因性の系が使用できる。例えば、標的ＲＮＡによってコードされる蛋白質がエフェクターでありうる。アロステリック制御モジュールの活性が発現蛋白質への結合に依存し、蛋白質のレベルが上昇すると共にモジュールの活性が上昇して発現の低下を引き起こすように構築物を設計することができる。標的ＲＮＡのレベルがアロステリック制御モジュールの変化（例えば開裂）によって低下すると共に、蛋白質（リガンドまたはエフェクターとして）の濃度も低下する。調節可能なＲＮＡ分子がすべて占有されてしまうレベルより下に濃度が低下したときには、変化の速度が低下し始める。様々なアプタマー−エフェクター親和性を選択することにより、所与の状況についてアロステリックを介した標的ＲＮＡ破壊の適切なレベルの調節が達成できる。
【００４７】
分子の「薬理活性」は、薬剤または薬剤としてのその分子の活性を表わすために使用される。
【００４８】
ここで使用するとき「データベース」は、遺伝子発現を制御するのに使用するためのエフェクターの適合性に関する情報を含む、小分子のような潜在的なエフェクターについての情報の集成を指す。
【００４９】
アロステリック制御モジュールの「触媒活性」は、所望するように標的核酸に作用する核酸である「触媒ドメイン」または「触媒配列」の活性を指す。可能な作用の例は、標的の結合、開裂、スプライシングまたはライゲーションなどによって標的または標的の機能的活性を修飾する／変化させるような標的との反応、あるいは標的ともう１つの分子間の反応の促進を含むが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、触媒活性は自己開裂活性、リガーゼ活性、またはスプライシング活性である。そのような活性はしばしばリボザイムに関係する。リボザイム様分子およびそのような分子の部分を含めて、リボザイムは本発明のアロステリック制御モジュールの触媒ドメインを形成するために使用しうる。本発明のアロステリック制御モジュールにおいて使用されるのは、主として天然に生じるリボザイムまたは非天然に生じるリボザイム様分子の触媒的に活性な部分であるが、付加的なドメインも使用しうることは当業者に理解されるであろう。例えば、アロステリック制御モジュールが自己開裂性である場合には、アプタマーおよび触媒ドメインに加えて、モジュールはさらに基質ドメインを含むであろう。本発明のために、アロステリック制御モジュールの「触媒活性」は単に標的ＲＮＡとの相互作用の変化または修飾を指すことも理解されるであろう。触媒ドメインは、プロセスにおいて消費されるまたは消費されないように設計することができ、それ故、ドメインは真の「触媒」である必要はない。
【００５０】
触媒ドメインの調製において本発明に有用であると考えられるリボザイムは、ハンマーヘッド、アクスヘッド、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、アカパンカビ（ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、自己スプライシングイントロン（Ｉ群またはＩＩ群）、リガーゼ、ホスファターゼおよびポリメラーゼのクラスの分子を含むが、これらに限定されない。各々のクラスのリボザイムは異なる作用機序を用いてヌクレオチドの異なる配列を開裂する。さらに、各クラスは、触媒活性のためにいくつのヌクレオチド塩基を必要とするか、また意図する標的配列とリボザイムがどの程度まで特異性を変化させるように操作できるかに基づいてさらに区別される。そこで、天然に生じるリボザイムを、非天然に生じる（完全にユニークであるかまたは修飾されている）リボザイム様構造を創造する基礎として使用することができる。便宜上、リボザイムの語は本発明における触媒ドメインの代わりに使用できるが、触媒ドメインは本発明において使用する天然進化リボザイム構造のすべてを含む必要はないこと、また合成リボザイム様構造を含みうることは理解されるであろう。
【００５１】
ここで使用するとき「ＲＮＡリガーゼ」または「リガーゼドメイン」の語は、ヌクレオチド塩基配列特異的に連結反応（２個のポリヌクレオチドの連結）を触媒する（進化、速度および／または割合を変化させる）ことができるポリヌクレオチドを指す。他の触媒ドメインと同様に、リガーゼドメインは、シス、すなわち分子内反応として、あるいはトランス、すなわち発現を調節される対象遺伝子が別個のＤＮＡ構築物として細胞に提供されるときには分子間反応として、作用しうる。ＲＮＡリガーゼは、基質結合領域において特定標的ポリヌクレオチドに相補性を持つことができ、またその標的中のＲＮＡに特異的に結合する触媒活性を持つ。「相補性」とは、伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプ（例えばＨｏｏｇｓｔｅｅｎタイプ）の塩基対合相互作用によって他のＲＮＡと塩基対合する（例えば水素結合を形成する）ことができる核酸を意味する。この相補性は、反応が起こることを可能にする、リガーゼドメインの標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションを提供するように機能する。１００％の相補性が好ましいが、５０から７５％の低い相補性も有用でありうる。核酸は塩基、糖、および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。アロステリックＲＮＡリガーゼポリヌクレオチドの特異的リガーゼドメインは本発明において制限的ではなく、当業者は、本発明のリガーゼドメインにおいて重要なことのすべては、それが１またはそれ以上の標的ポリヌクレオチド領域に相補的である特異的基質結合部位を持つこと、およびその基質結合部位内またはその周囲に、リガーゼドメインにリガーゼ活性を与える部位を含むことであることを認識するであろう。当業者は、開裂またはスプライシング活性を持つ触媒ドメインはまた、触媒ＲＮＡと所望する標的とを特異的に相互作用させるために、基質結合ドメインにおいて特定標的ポリヌクレオチドへの相補性をも含みうることを認識するであろう。
【００５２】
ここで使用するとき「対象遺伝子」または「所望する遺伝子」は、その発現がエフェクターとアロステリック制御モジュールによって制御される治療上適切な分子をコードすることのような、細胞または生物にとって生理的に適切な利益を提供する遺伝子を指す。例えば、対象治療遺伝子は、基礎となる蛋白質欠損を矯正または代償するか、若しくはその代わりに、特定遺伝子を下方調節することができる遺伝子である。さらに、対象遺伝子は、例えば癌の治療のための遺伝子療法において細胞死を仲介する遺伝子でありうる。ここで使用するとき「トランスジーン」の語は、対象遺伝子のような、細胞に移送される遺伝子を指す。
【００５３】
「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）の語は、ＤＮＡからの情報を細胞のたんぱく質生成系に移送するポリヌクレオチドを指す。「ｍＲＮＡ前駆体」または「プレｍＲＮＡ」の語は、コードＤＮＡ鎖から直接転写されるポリヌクレオチドを指し、１個またはそれ以上のイントロンを含んでいてもよく、逆転双方向メチル化グアノシンヌクレオチドでキャップされているかまたはキャップされていなくてもよい。
【００５４】
ここで使用するとき「非天然」ポリヌクレオチドの語は、天然には生じないポリヌクレオチド配列または構築物を指す。本発明の好ましいアロステリックポリヌクレオチドは天然では生じない。「単離ポリヌクレオチド」の語は、天然に結合している少なくとも１個の汚染核酸分子を含まない、好ましくはその蛋白質生成における使用あるいはその治療上または診断上の使用に干渉する他のいかなる汚染哺乳類核酸分子も実質的に含まない、本発明の核酸分子を指す。
【００５５】
ここで使用するとき「スプライス認識領域」の語は、スプライス供与部位、スプライス受容部位またはスプライセオソーム結合部位として働くＲＮＡ前駆体中の配列を指す。スプライス供与部位は典型的にはエクソンの３’末端の部位（除去されるイントロンの５’末端に位置する）であり、スプライス受容部位は、連結される隣接エクソンの５’末端の部位（除去されるイントロンの３’末端）である。「スプライセオソーム」は、プレＲＮＡに結合して、開裂によるプレＲＮＡのｍＲＮＡへのプロセシング、イントロンの除去およびエクソンの連結を指令する、細胞蛋白質とＲＮＡの大きな多成分複合体を指す。
【００５６】
「イントロン」の語は、ｍＲＮＡ前駆体に含まれるが、翻訳が起こる前に転写されたＲＮＡのプロセシングの際に切り取られる、遺伝子の転写部分に生じるＲＮＡの領域を指す。それ故、イントロン配列はｍＲＮＡには認められず、蛋白質に翻訳されない。
【００５７】
「エクソン」の語は、遺伝子の転写産物中に表示され、細胞でのＲＮＡのプロセシング後も残ってｍＲＮＡの一部となる遺伝子の部分を指すために用いられる。エクソンは一般にＲＮＡ転写産物の３つの異なる機能領域をコードする。蛋白質に翻訳されない５’末端に位置する最初の領域は５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）と称される。５’−ＵＴＲはＲＮＡ転写の開始を指令し、ｍＲＮＡをリボソームに差し向けて蛋白質合成が起こるようにｍＲＮＡをリボソームに結合させる配列を含む。第二の領域はオープンリーディングフレームとして知られ、蛋白質のアミノ酸配列に翻訳されうる情報または生物活性ＲＮＡとして機能することができる情報を含む。３’末端に位置する第三の領域は、翻訳の停止とポリアデニル化テール（ポリ（Ａ））の付加についてのシグナルを含み、蛋白質に翻訳されない（すなわち３’−ＵＴＲ）。特に、３’−ＵＴＲはｍＲＮＡに安定性を与えることができる。イントロン／エクソン境界部は、個々の遺伝子においてイントロン領域がエクソン領域に接続する部分である。「ＴＡＴＡボックス」および「ＣＡＰ部位」の語は、それらが当技術で認識されているように使用される。
【００５８】
「ベクター」の語は、コード情報を宿主細胞に移送するために使用される何らかの分子（例えば核酸、プラスミド、ウイルス、小分子、リポソーム、担体分子、等々）を表わすために使用される。
【００５９】
「制御配列」および「制御エレメント」の語は、対象遺伝子をコードするＤＮＡに作動可能に連結され、レシピエント細胞においてコード配列の転写と翻訳を提供する、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、等を含むがこれらに限定されない非コード調節配列を集合的に表わすために使用される。対象遺伝子をコードする配列が本発明の発現調節手段に従って適切な宿主細胞において転写され、翻訳されうる限り、必ずしもこれらの制御エレメント全部が存在する必要はない。
【００６０】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指令し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列を指すのに使用される。「複製の起点」は、宿主細胞ゲノムとは独立して複製することができるゲノム外エレメント（例えばウイルスまたはプラスミド）を与えるベクターまたは宿主細胞染色体上の配列である。「エンハンサー」は、隣接する遺伝子の転写を刺激するまたは阻害するＤＮＡのシス作用性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも称される。エンハンサーは、いずれの方向にも機能することができ、また数キロベース塩基対までの距離にわたって、転写領域の下流の位置からでも機能できるという点で、プロモーターにおいてのみ認められる配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質についてのＤＮＡ結合部位とは異なる。
【００６１】
「作動可能に連結された」の語は、エレメントがそれらの通常の機能を果たすように配置または構築されている、エレメントの配置を表わすために使用される。それ故、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の複製、転写および／または翻訳を生じさせることができる。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指令することができるとき、そのコード配列はプロモーターに作動可能に連結されている。制御配列は、それが正しく機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。それ故、例えば、まだ転写されていない介在非翻訳配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在することが可能であり、プロモーター配列はそれでもコード配列に「作動可能に連結されている」とみなすことができる。
【００６２】
ここで使用するとき「コエレメント（ｃｏ−ｅｌｅｍｅｎｔ）」の語は、触媒ドメインおよび／またはアロステリック制御モジュールのアプタマーおよび／または触媒複合体を生じるエフェクターと相互作用するまたは複合する、別個の分子またはｍＲＮＡ前駆体中の別個のドメインを指す。例えば、コエレメントは、触媒的に活性になるようにアロステリック制御モジュールの欠失部分を補完しうる。そのようなコエレメントはＷＯ９８０９７４号に述べられている成分を含む。他のコエレメントは、リガンド応答性アロステリックリボザイムを構築するための、ＳｏｕｋｕｐとＢｒｅａｋｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：３５８４−３５８９，１９９９）が述べた架橋エレメントを含みうる。
【００６３】
「遺伝子移送」または「遺伝子送達」の語は、個々のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）を標的細胞内に確実に挿入するための方法および／またはシステムを指すために使用される。遺伝子移送はインビボ（例えばアデノ関連ウイルス遺伝子治療）またはビボ（例えば細胞のレトロウイルスによる細胞外修飾とそれに続く形質転換細胞の宿主への移送または移植のような）で起こりうる。そのような方法は、移送された遺伝物質の標的細胞ゲノムへの組込みを生じさせるか、または移送された遺伝物質は宿主細胞ゲノムとは独立して機能することができる。
【００６４】
ここで使用するとき発現の「低減」、「不活性化」、「阻害」、「開始」および「低下」は、標的ｍＲＮＡの翻訳レベルが本発明の調節手段の不在下で認められるレベルよりも低いことを意味する。従って、遺伝子発現の阻害は、標的ｍＲＮＡの翻訳の低下から、対象遺伝子を発現するために使用される転写産物の完全な不活性化または不能までの範囲におよびうる。
【００６５】
ここで使用するとき発現の「増強」、「活性化」、「誘導」または「上昇」は、標的ｍＲＮＡの翻訳レベルが本発明の調節手段の不在下で認められるレベルよりも高いことを意味する。従って、発現の誘導は、標的ｍＲＮＡの翻訳の開始から、標的ｍＲＮＡの翻訳の上昇までの範囲におよびうる。
【００６６】
ここで使用するとき「対象遺伝子の発現を特異的に制御する」との語句は、（ａ）細胞が生物内に存在する場合には細胞を含む生物に対して有害な作用を引き起こさないように、あるいは（ｂ）細胞が生成される産物の量が対象遺伝子の発現に関連する産物を産生するように増殖されるまたは培養される場合には細胞の増殖または培養に対して有害な作用を引き起こさないように、細胞における他の遺伝子の発現を変化させることなく対象遺伝子の発現を変化させることを意味する。
【００６７】
遺伝子発現の変更
組換えタンパク質またはペプチドの製造はＤＮＡ（またはエピソーム核酸）がｍＲＮＡに転写される効率により影響され得る。通常の調節系は転写事象に影響を及ぼそうとする。しかしながら組換えタンパク質またはペプチドの製造は、前駆体ｍＲＮＡを修飾してタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを形成する効率によっても影響をされ得る。本発明の新規構築物および方法は、プレｍＲＮＡプロセシングの過程を変化させることによる目的の、例えば治療用タンパク質の遺伝子の発現の制御を有利に提供する。
【００６８】
本発明のアロステリック制御モジュールは、エフェクター結合ドメインすなわちアプタマーとエフェクターとの相互作用がアロステリック制御モジュールの活性を変化させるように特に選択された触媒およびエフェクター結合ドメインを含有する。例えば、エフェクターおよびアプタマーの相互作用により、アロステリック制御モジュールにおいてコンフォメーションが変化する。アロステリック制御モジュールの選択に依存して、コンフォメーション変化によりモジュールの触媒ドメインの活性が増加または低下のいずれかに至り得る。今度はこれが、前駆体ｍＲＮＡが適切に修飾されて、目的のタンパク質に翻訳され得るｍＲＮＡを形成する。本発明を限定するものではないが、コンフォメーション変化は、アロステリック制御モジュールの２つの可能なコンフォメーション間の熱力学的バランスをシフトさせるのに用いられるエフェクター−アプタマー相互作用に由来する結合エネルギーにより誘起され得る。設計の様式に依存して、別の実施形態においてより詳細に記載するように、アロステリック制御モジュールはエフェクターにより活性化されるか、または不活性化される。
【００６９】
本発明はアロステリック制御モジュールの触媒ドメインとしてアロステリック的に活性化された自己切断ＲＮＡを含む発現制御様式を包含する。この実施形態の１つの具体例ではアロステリック制御モジュールは目的の遺伝子を有するｍＲＮＡでコードされ得る。例えばＤＮＡ配列はキャップおよびメッセージ配列を分離する自己切断部位をコードするように設計される。本明細書にてさらに詳細に記載するように、エフェクター不在下で触媒ドメインが活性であり、活性によりプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡが切断されるようにアプタマーおよび触媒ドメインを選択できる。従って、ｍＲＮＡが翻訳されることができないので目的の遺伝子が発現されない。エフェクターの存在下触媒ドメインが阻止され、従って不活性であるか、またはＲＮＡ基質に作用できない。従ってＲＮＡが適切にプロセシングされ翻訳されることができるので、目的の遺伝子が発現される。本発明の好ましい実施形態はエフェクターの存在下で遺伝子発現を提供する構築物を含む。
【００７０】
アロステリック的に活性化された自己切断ＲＮＡを含む別の実施形態では、エフェクターの存在下、触媒ドメインが活性であり、活性によりｍＲＮＡが切断されるようにアプタマーおよび触媒ドメインを選択できる。従って、ｍＲＮＡが翻訳されることができないので、目的の遺伝子は発現されない。エフェクターの不在下、触媒ドメインは不活性であり、ＲＮＡ基質で作用することができない。結果的に、ｍＲＮＡは切断されず、目的の遺伝子は発現されない。従って、エフェクターの不存在下、遺伝子が発現される。
【００７１】
さらに別の実施形態では、触媒ドメインが自己切断部位を含有する操作されたイントロンを含むことができる。エフェクターが不在である場合、ドメインが切断されないようにアプタマーおよびエフェクターを選択する。結果的にｍＲＮＡが活性分子として認識されず、翻訳されない。
【００７２】
本発明はまた、切断およびリガーゼ作用を有する触媒ドメインとしてアロステリック的に活性化されたスプライシング核酸を含む発現制御様式をも包含する。この実施形態の１つの具体例では、アロステリック制御モジュールを目的の遺伝子のエクソンに挿入する。これにより図３に示すように「操作されたイントロン」（ｅＩ）を形成するようになる。エフェクターの不在下、アロステリック制御モジュールが不活性であり、従って操作されたイントロンがその位置に残され、タンパク質発現の阻止または低下に至るオープンリーディングフレームの変化を招く。エフェクターの存在下ではアロステリック制御モジュールは活性である。この活性により、操作されたイントロンが除去され、およびエクソンが連結され、タンパク質発現の活性化または増加に至る生産的なオープンリーディングフレームが形成される。
【００７３】
プレｍＲＮＡにおけるｅＩの存在は、別個にまたは一緒に作用し得る種々のメカニズムにより遺伝子発現を阻止し得る。かかるメカニズムには、非限定例としては１）ｅＩが、翻訳を阻止するいくつかの停止コドンを含有するように設計することができる；２）ｅＩが、複数の不活性化変異体を有するタンパク質に至るナンセンスアミノ酸をコードし得る；３）ｅＩの存在は、変化したｍＲＮＡを隔離するかまたは破壊する細胞に元来備わったｍＲＮＡサーベイランスシステムを活性化することができる；などがある。エフェクターの存在下、アロステリック制御モジュールが不活性であり、エフェクターの不在下、モジュールが活性であるように設計された、操作されたイントロンがその様式に含まれることはさらに理解されよう。
【００７４】
本発明はさらに抑制可能なアロステリック自己スプライシングイントロンに関与する発現制御様式を包含する。この実施形態では、自己スプライシングイントロンの作用により正常なスプライシングに必要なヌクレオチド配列を除去するように、スプライセオソーム構築に必要な領域のイントロンにアロステリック制御モジュールを挿入する。この実施形態を図６に示す。エフェクターの不在下でアロステリック制御モジュールが活性であり、従って生体スプライシング認識部位の除去に至る。生体スプライシング認識部位の除去の結果、タンパク質発現の阻止または低下に至るオープンリーディングフレームが変化する。エフェクターの存在下、アロステリック制御モジュールは不活性であり、結果的にスプライシング認識部位で正常なスプライシングを生じ、正確なオープンリーディングフレームが形成され、タンパク質が発現される。
【００７５】
エフェクターの選択
本発明の基本的な具体例は、遺伝子発現を変化させるためにアロステリック制御モジュールと共に使用されるエフェクターの特定である。アロステリック制御モジュールの一部を形成する同種のアプタマーを引き出すためエフェクターの使用はかかる使用と関連している。本発明はエフェクターを特定し、不活性なアプタマー（または複数のアプタマー）を作製するための新規な合成方法を提供する。方法には以下の工程が含まれる。
【００７６】
第１に、エフェクターのとって望ましい特性を選択する。これらの望ましい特性をタンパク質発現および遺伝子治療技術における使用に適した可能なエフェクターを特定するのに有用である、１つまたはそれ以上の以下の属性から選択する：
ａ）少なくとも１％のバイオアベイラビリティーを有する、
ｂ）アロステリック制御モジュールをを含む組織へ生体内分布される、
ｃ）細胞の核へと通過する能力を有する、
ｄ）非薬剤相互作用または制御可能な薬剤相互作用を呈する、
ｅ）使用される用量範囲での非毒性または許容される毒性を呈する、
ｆ）使用される用量範囲での非副作用または許容される副作用を呈する、
ｇ）トランスジーンの発現を調節する際に使用される用量範囲での非薬理作用または無視しうる薬理作用を呈する、および
ｈ）アプタマーのインビトロでの進化に適した物理的特性を有する（望ましい物理学的特性は剛性構造を有する平面分子を含み得る）。
【００７７】
これらの特性は、エフェクターがアプタマー作製、ヒトによる消費および遺伝子発現制御のためのアロステリック制御モジュールと共に使用することに適していることを示している。これらの特性に関する情報は選択された特性に関するデータを含む１つまたはそれ以上のデータベースにアクセスすることにより得ることができる。適切な情報を含むデータベースには、非限定例としては、インベスティゲーショナル・ドラッグズ・データベース（ＩＤｄｂ、カレント・ドラッグズ；カレント・ドラッグズ・リミテッド、フィラデルフィア、ペンシルバニア）、ドラッグ・データ・レポート（ＭＤＤＲ、ＭＤＬインフォメーション・システムズ・インコーポレーティッド、サン・レアンドロ、カリフォルニア；プロウス・サイエンス・パブリッシャーズ、バルセロナ、スペイン）、ワールド・ドラッグ・インデックス（ＷＤＩ、デルウェント・インフォメーション、アレキサンドリア、バージニア）およびデルウェント・ドラッグ・ファイル、アール・アンド・ディー・インサイト（アディス・インターナショナル・インコーポレーティッド、ラングホルネ、ペンシルバニア）、アール・アンド・ディー・フォーカス（ＩＭＳ　ヘルス、ＩＭＳワールド・パブリケーション・リミテッド、ロンドン、英国）、ファルマプロジェクツ（ＰＪＢパブリケーションズ、スレイ、英国）、メッドライン（ザ・ナショナル・ライブラリー・オブ・メディシン）およびエンベース（エルセビア・サイエンス、Ｂ．Ｖ．）などがある。次いで選択された特性を有する一連のエフェクターを特定する。
【００７８】
本明細書で用いる「バイオアベイラビリティー」とは投与後エフェクターがその意図する部位に到達できる能力を意味する。エフェクターは少なくとも１％の利用率を有する。好ましくは、エフェクターは少なくとも５％の利用率を有し、さらに好ましくは、エフェクターは少なくとも１０％の利用率を有する。好ましいエフェクターはまた経口送達でも生物学的に利用送達であるが、送達経路は本発明に限定されないことは理解されよう。エフェクターを非経口的に、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、包膜内または皮下注射により投与することができる。選択されたエフェクターを経口投与（舌下およびバッカルを含む）、肺投与（鼻腔内および吸入）、局所投与、経皮投与、および直腸投与のため組成物として処方することができる。送達には１回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールを含めることができる。
【００７９】
この方法を用いて、適当なエフェクターを、非限定例としては小型有機分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、天然進化代謝物および生物学的エフェクター、脂質、炭水化物（多糖類、糖）、脂肪酸、および重合体などの種々の分子から特定することができる。本発明の好ましい実施形態では、エフェクターは小型分子である。
【００８０】
いずれかのデータベースまたはデータベースの組み合わせを本発明の実施に用いることができることは理解されよう。可能性のあるエフェクターの適当なデータベースには分子、例えば：
ａ）製薬上活性な成分を含む１異性体と、ほとんどまたは全く薬理活性を持たないもう１つの異性体について立体選択性を持つ市販薬剤（後者は目的の可能なエフェクターである）、
ｂ）活性がほとんどまたは全くない既知の薬剤代謝物
ｂ）ほとんどまたは全く活性を持たない既知の薬剤代謝産物、
ｃ）核レセプタ標的分子（例えばビタミンＤ、レチノイン酸、ステロイド）、
ｄ）臨床試験に入ったが、相対的な効果欠如のために試験が中止された薬剤候補物質、
ｅ）効果の欠如のために市場から撤収された薬剤、
ｆ）有効であるが相対的な利益が低いために市販されていない薬剤、
ｇ）標的ウイルスまたは病原菌に感染していない患者において使用するための、抗ウイルス／抗感染症薬と称される薬剤、
ｈ）十分に特性付けられた食品添加物、
ｉ）既知の作用機序を有する一般薬；および
ｊ）クラスの最良分子に取って代わられたため市場または臨床試験から撤収された薬剤などがある。
【００８１】
次いで特定されたエフェクターを用いてインビトロ進化の手段により組になったエフェクターに対するアプタマーを作製および選択することができる。次いでエフェクターおよびアプタマー、並びにエフェクターおよびアロステリック制御モジュールの組み合わせを評価して遺伝子発現の調節に最適なこれらの分子を特定する。
【００８２】
アロステリック制御モジュールへの結合、有効性および細胞浸透性の他に、目的のエフェクターは、エフェクター適性および選択過程の一部として、並びに規制当局の許可の過程の一部として種々の付加的な試験を受ける。かかる試験には医薬的製品の開発および規制当局の許可の一部として典型的に行われるこれらの試験、例えば薬剤動態特性、薬力学特性、製薬特性、毒性、変異誘発性、生殖毒性等がある。
【００８３】
薬剤動態評価にはインビトロ細胞系、動物、動物疾患モデル、正常ヒトおよび患者におけるエフェクターの吸収、分布、代謝および排泄プロファイルの分析などがある。吸収プロファイルには吸収率、達成される最大血漿濃度、吸収に及ぼす処方修飾の影響、異なる塩および結晶形態の影響、食物およびその他の薬剤療法の影響等がある。分布プロファイルには種々組織および体液におけるエフェクターの部位および濃度、タンパク質結合等の決定などがある。代謝プロファイルにはエファクターが例えば肝臓または腎臓の酵素により代謝されるメカニズムの決定、作られた代謝物の構造および活性の決定、別の薬剤の代謝に及ぼすエフェクターおよび代謝物の影響、エフェクターの代謝物に及ぼす食物および別の薬剤の影響等がある。排泄プロファイルには例えば胆汁または腎臓による排泄の分布、クリアランス速度、半減期（投与されたエフェクターの血漿レベルの５０％が消失するのに必要な時間）、蓄積、並びにエフェクターおよびその代謝物のようなものの決定などがある。
【００８４】
薬力学評価にはエフェクターの生理学的活性の分析などがある。かかる分析には活性の期間、投与計画および活性に及ぼす処方の影響、治療閾値（活性に必要な最低エフェクター血漿濃度）および投与様式の影響の評価などがある。
【００８５】
製薬評価にはエフェクターの処方に関するエフェクターの物理学的特性の分析などがある。目的のエフェクター物理学的特性には溶解性、化学的安定性、例えば温度、湿度および光の影響、結晶形態（固体）、塩形態（固体または溶液で）等、溶液の安定性、溶液ｐＨに及ぼす影響、結晶対無晶性固体対油状物対液体、結晶密度等がある。またエフェクター処方特性をも評価する。これらの特性には、非限定例としては安定性、吸収に及ぼす結晶形態および大きさの影響、吸収に及ぼす塩形態の影響、固体圧縮性および展性、固体流動性、結晶の大きさの均一性、別の処方成分との適合性、充填密度、各処方の混和および内容物の均一性などがある。
【００８６】
毒性には、一般に最初は動物で、後にヒトでのエフェクターの有毒性および別の副作用プロファイル、その代謝物およびその処方を決定してエフェクターの投与に随伴する潜在する危険性を確認することなどがある。分析には中枢神経系、心血管系、肺系、胃腸系、腎系、肝系、性尿器系、造血系、免疫系および皮膚系に及ぼす望ましくない影響の評価などがある。分析には有毒用量、最大耐性用量、別の酵素系、レセプタ、結合タンパク質等に対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性、発癌性、免疫原性等の決定などがある。毒性学的分析の手段および方法は当業界で既知である。これらはＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（第３版（１９９４）、Ａ．Ｗａｌｌａｃｅ　Ｈａｙｅｓ編、ラーベン・プレス、ニューヨーク州）およびＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ　Ｂａｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｏｉｓｏｎｓ（ＣａｓｓａｒｅｔｔおよびＤｏｕｌｌ、第５版（１９９６）、Ｃｕｒｔｉｓ　Ｄ　Ｋｌａａｓｓｅｎ編、マックグラウ・ヒル、ニューヨーク州）に記載されている。
【００８７】
エフェクターの開発には、特殊な集団、例えば小児科および老年科における１つまたはそれ以上のこれらの属性の研究および評価なども含まれる。加えて、分析には性および民族の影響の評価も必要である。
【００８８】
前記したように、適切なエフェクターの最終選択にはヒト使用のために提示されたいずれかの新規化合物（ＮＭＥ）に関して実施されたものに類似する試験が含まれる。種々のスクリーニング計画を用いることができる。数年前まではインビボ実験において適切な丸ごとの動物で実施しないで、ＮＭＥの吸収および代謝特性を予測することは不可能であった。しかしながら、近年代謝酵素の分子生物学および機能特異性の理解が進み、吸収および移動メカニズムは「ヒト化」インビトロ系を利用する吸収および代謝データ収集のメカニズムの基礎を提供している。分析装置における進歩と組合わされたこれらのヒト化インビトロ系の開発および利用性は開発過程の速度を速めている。新規分子の高速大量処理薬剤動態スクリーニングを実施できる可能性はますます高まっている。以下の記載は適用されているインビトロおよびインビボ方法および技術に焦点をあてている。
【００８９】
インビトロの方法
吸収アッセイ
理想的な薬剤候補物質は良好な代謝および吸収特性を有していなければならない。一連の化合物の経口生物学的利用性を初期に予測することにより構造活性相関（ＳＡＲ）に関する非常に貴重な情報が提供される。良好な全身の生物学的利用性を有する薬剤選択の本質は消化管による吸収の正確な予測が関与する。最もうまく適用された、ヒトにおける吸収を予測する技術の１つは２１日Ｃａｃｏ−２モデルである。ヒト起源のＣａｃｏ−２細胞はヒト結腸癌細胞に由来している。多孔性の膜上で培養すると、これらの細胞は小腸細胞に類似の特性を有する、高度に機能的な単層に自発的に分化する（Ｐｉｎｔｏら、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ　４７：３２３−３３０（１９８３）；Ｈｉｄａｌｇｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　９６：７３６−７４９（１９８９））。何年もかけて収集したデータにより、このモデルがインビボヒト消化管吸収の良好な予言であることが示された（Ａｒｔｕｒｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７５：８８０−８８５（１９９１））。このモデルによりインビボ吸収の合理的な予測が提供されるが、高速大量処置スクリーニング手段としてのその使用は幾人かの研究者により疑問が提せられている。これらの細胞で実施する試験の労力および時間のかかる性質のために、幾人かの研究者に、生存代替物、例えば成長の著しいＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ　Ｃａｎｉｎｅ　Ｋｉｄｎｅｙ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（Ｉｒｖｉｎｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８（１）：２８−３３（１９９９））または３日Ｃａｃｏ−２培養モデル（Ｃｈｏｎｇら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４（１２）：１８３５−１８３７（１９９７））を捜すように促し、一方Ｃａｃｏ−２吸収評価方法を自動化する試みを行った研究者もいた（Ｇａｒｂｅｒｇら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６（３）：４４１−４４５（１９９９））。Ｉｒｖｉｎｅらは多数の化合物を用いて、膜透過性を予測するためのＣａｃｏ−２細胞の代替としてＭＤＣＫ細胞の使用を評価した。全体として、Ｃａｃｏ−２およびＭＤＣＫ細胞間で見かけの透過性（Ｐａｐｐ）に関して良好な相関性（ｒ２＝０．７９）が観察された。この知見に基づいて、これらの著者は、ＭＤＣＫ細胞が初期発見相における処理量を増加するための実際的な透過性スクリーニング手段であることを示唆している。化合物の透過性を研究するための３日Ｃａｃｏ−２モデルもまた検討された。これらの３日培養により細胞を通過して送達された化合物に関する合理的なＰａｐｐ値が提供される。しかしながら３日培養からの単層は従来の２１日培養細胞よりもおよそ４から６倍漏れやすく、傍細胞的に、または流出により送達される化合物に関するこれらの細胞の予測特性およびキャリヤ媒介のメカニズムはそれほど確固たるものではない（Ｙｅｅ　Ｓ、Ｄａｙ　Ｗ：「薬剤の発見および開発におけるＣａｃｏ−２細胞の適用」Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｗｏｏｌｆ，Ｔ（編）マーセル・デッカー・インコーポレーティッド、ニューヨーク：５０８−５１９）。Ｇａｒｂｅｒｇらは従来のＣａｃｏ−２モデルを用いるスクリーニング相における処理能力を増大させるインビトロ透過性を評価するための自動化セットアップを開発した。実験経過中の全ての必要なピペット工程を実施する液体処理系を組み込むことによりこの自動化を達成した。得られた結果に基づき、これらの著者は自動サンプル処理装置の利用によりインビトロ吸収スクリーニングの能力を実質的に増大させることができることを示唆した。吸収スクリーニング処理量を増進させる別の試験計画が検討されている（Ｔａｙｌｏｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４（５）：５７２−５７７（１９９７））。これらの研究者はＣａｃｏ−２モデルを物理化学的に異なる化合物の混合物と共に用いて吸収実験を行い、経口で生物学的に利用できる可能性のある化合物の選択に成功した。また、単一の化合物または化合物の混合物と共に行った実験から得られたサンプルのプールを、分析手段として質量分析計を用いて検討した（ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３（９）：Ｓ２４２（１９９６））。
【００９０】
物理化学的特性、例えばＮＭＥ吸収に影響し得る溶解性に関してＮＭＥをふるい分けするための新規高処理量法も開発されている（Ｔａｒｂｉｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４１１−４１６（１９９８））。別の研究者はＮＭＥが種々腸管トランスポーター（例えばｐ−グリコプロテイン）の基質であるかどうかを決定する方法を開発している。透過性データを生理学的および送達データと組み合わせて、将来、吸収を予測する能力を増大することになるであろうし、望ましい吸収特性を有するリード候補物質をより迅速に選択できるようになろう。
【００９１】
代謝アッセイ
腸管または肝臓による迅速通過代謝は、インビボ経口生物学的利用性の他の主要な決定因子である。代謝反応をＩ相反応およびＩＩ相反応に大分けに分類できる。Ｉ相反応により、分子上に官能基が創生され、この分子は、さらにＩＩ相酵素とコンジュゲートを形成するか、修飾されて排出される。殆んどの酸化代謝反応は、主に肝臓で見出されるヘム含有酵素のスーパーファミリーであるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素系により行われる。ＣＹＰで触媒される代謝は、短い半減期、低いバイオアベイラビリティー、非直線的動態、薬剤−薬剤相互作用、毒性、効果の欠如、および対象者間における相違に至り得る分子の全体的な性質特性に著明な影響を及ぼし得る。単独でまたは組合わされたこれらの欠点は薬剤開発の失敗の主要な原因であるか、またはある場合には市販されている製品の中止に導く。
【００９２】
これらの問題に対し、このプログラムの初期に代謝研究が設けられている。ＮＭＥの代謝安定性、および薬剤−薬剤相互作用の可能性を予測するための高処理量インビトロスクリーニング法が開発された。代謝安定性試験のための従来の試験管および水浴インキュベーション法が、より自動化されやすい９６ウェルプレート技術にとって代わられている。このインキュベーションは典型的にはプールされたヒトまたは動物肝臓ミクロソームまたはＳ−９分画を用いて行われ、反応は反応ブロックで３７℃で実施される。反応を停止した後、プレートを質量分析計に連結した直接高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）オートサンプラーに直接配置する。９６ウェル様式でのヒト肝細胞の使用もまた提唱されている（Ｌｉ　Ａ．　ＡＡＰＳ、ニュー・オーリンズ、ルイジアナ州（１９９９））。分離および検出並びに自動化データ取得のための液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）と共に９６ウェルプレートからのサンプルプールを用いて代謝安定性データの作成における処理量を増加させた（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎら、「９６ウェル様式で調製されたヒト肝臓ミクロソームサンプルの代謝安定性のＬＣ−ＭＳ分析」ＡＡＰＳ　Ｐｈａｒｍｓｃｉ．１（４）：Ｓ−３００（１９９９））。
【００９３】
データ取得の後、インビトロ半減期（ｔ１／２）または見かけのクリアランス（Ｃｌａｐｐ）を親化合物の喪失速度に基づいて作成する（Ｏｂａｃｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８３（１）：４６−５８（１９９９））。また問題の種のＣｌａｐｐを用いてインビボの生物学的利用性の予測を行うこともできる。次いでＣｌａｐｐまたはインビボの生物学的利用性に基づいてスクリーニングされた化合物の等級序列を実施できる。これらの結果を迅速転回様式で非常に多くの化合物に関して作成でき、構造修飾の手段により薬剤動態（ＰＫ）特性を改善するための構造活性相関の見識が提供される。
【００９４】
薬剤−薬剤相互作用の予測はまた薬剤開発プログラムの必須部分でもある。従来シトクロムＰ４５０媒介薬剤−薬剤相互作用研究が、ヒト肝臓ミクロソームを利用して行なわれ、サンプル分析はＵＶ、または蛍光検出を有するＨＰＬＣ分離技術を用いて達成される。完全なクロマトグラフィー分析は非常に時間がかかり、労力を要するので、従って高処理スクリーニングセットにおける使用には注目されていない。最近、Ｙｉｎら（ＩＳＳＸ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　１５：８７（１９９９））はＮＭＥの阻止能力を評価するためのＣＹＰイソ型の決定に関する迅速処理法に関して記載した。この方法は、ヒト肝臓ミクロソームを利用し、質量分析計と組み合せた高圧液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）定量のために固相抽出およびサンプルプーリングを伴う９６ウェルプラットホームで実施される。Ｃｒｅｐｓｉら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（１）：１５−１９（１９９９））はまた、５つの主要なヒト薬剤代謝ＣＹＰ酵素であるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４の活性に関するマイクロタイター・プレートに基づく蛍光分析アッセイについても記載している。種々のＣＹＰ酵素についてのインビトロ研究からデータを得るための放射分析アッセイもまた報告されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔ．Ｄｉｓ．２４：１２６−１３６（１９９６）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３０９−３２０（１９９４）；およびＲｉｌｅｙ　ＲＪ、Ｈｏｗｂｒｏｏｋ　Ｄ：ＪＰｈａｒｍａｃ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．３８：１８９−１９３（１９９８））。Ｍｏｏｄｙら（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ　９（１）：５３−７５（１９９９））は最近主要ＣＹＰ酵素の触媒活性を分析するための完全自動化方法の開発および適用について報告した。この方法は蛍光分析よび放射分析アッセイに基づき、ロボットサンプルプロセッサにより実施される。
【００９５】
上述の方法により、ＩＣ５０の迅速な推測としたがってＮＭＥの阻害能力の早期決定が上首尾に可能になろう。ＮＭＥの阻害能のさらなる特性付けは確立されたＣＹＰイソフォーム特異的プローブ基質を利用する古典的手法を使用して行うことができよう（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔ．　Ｄｉｓ．　２３（１）：１５４−１５８）。
【００９６】
誘導に基づく薬剤―薬剤相互作用の早期特定は、他の重要な問題である。以前は誘導分析には初代培養物の使用を必要とし、このような研究はヒト組織の入手に強く依存することを意味する。ＰＸＲ核レセプタによるＣＹＰ３Ａ４の誘導についての分子基盤の最近の知識により、迅速で相対的に安価な様式で誘導に基づく薬剤−薬剤相互作用を探求するための新規な手段が提供されている（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２（５）：１０１６−１０２３（１９９８））。
【００９７】
代謝安定性および薬剤−薬剤相互作用に関する高処理スクリーニングにより、「理想的な」分子を開発するために活用できる有用なデータが得られる。既にある情報の利益を最大にするために、このデータはデータを容易に検索でき回収できる様式に編成されなければならない。この目的で、いくつかの薬剤代謝データベースが現在市販により入手できる（Ｅｒｔｈａｒｄｔ　Ｐ：「薬剤代謝データ：過去および現在の状況」Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．８（７／８）：４００−４２１（１９９８））。薬剤相互作用に関する文献報告を系統的に構成した「知識ベース」のデータベースもまたプロフェッサＲｅｎｅ　Ｌｅｖｙらによりワシントン大学（シアトル）において開発されている（Ｌｅｖｙ　ＲＨら、代謝薬剤相互作用、ｗｗｗ．ａｐｐｔｅｃｈｓｙｓ．ｃｏｍ／ｄｒｕｇ／）。この目的指向のデータベース設計はユーザーによる薬剤の代謝における特定のＣＹＰイソ型の関与に関する情報の回収を可能にし、インビトロ−インビボ相関を可能にする別の関連するＰＫパラメーターに関する情報をも含む。これらのデータベースを高処理スクリーニング研究から作成されたデータと一緒に平行使用することによりリード候補物質の指名および開発過程の効率を促進する。
【００９８】
インビボ薬剤動態アッセイ
インビボ吸収および代謝アッセイの開発に成功しても、インビボＰＫ研究は依然薬剤開発において重要な役割を果たす（Ｓｍｉｔｈ　ＤＡ、ｖａｎ　ｄｅ　Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｅｄ　Ｈ：「初期発見における薬剤動態および代謝」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：３７３−３７８（１９９９））。ＮＭＥのＰＫパラメーター値を得るために、ＮＭＥを動物に静脈内および経口の双方で投与し、種々の時点で血液を採取し、次いで目的の化合物に関してＨＰＬＣまたはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析する。丸ごとの動物におけるＮＭＥの吸収および送達について記載するＰＫパラメーター（例えばクリアランス、送達容量、排泄半減期、および経口による生物学的利用性）を血清濃度−時間プロファイルから算出する。構造−ＰＫ相関へのフィードバックは研究の方向づけに重要であり、合成の試みおよびインビボ暴露に関する情報がインビボ薬理学／効果実験の設計に有用である。またインビトロ代謝アッセイがインビボ動態をうまく予測できない場合（例えば化合物が腎臓または胆嚢メカニズムにより主に排泄される場合）、インビボＰＫスクリーニングもまた必要である。薬学者は、インビトロデータからインビボ動態を予測するためのモデルを開発しおよび確認するのに使用するために、およびインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）モデルで使用するために、より多く、インビボＰＫデータを作成している。（Ｔａｒｂｉｔら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４１１−４１６（１９９８）；Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓ．Ｄｅｖ．２（１）：２０−２５（１９９９））。近年、ＮＭＥのＰＫ評価の処理量を増す試みは、生物学的分析の作業負荷を最低にするための混合物投与およびサンプルプールに焦点が集まっている。質量分析計を付したＨＰＬＣ（ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）は、マトリックス中の１つ以上の化合物をモニター観察する能力が大きく高めている。
【００９９】
混合物投与
混合物投与（エヌ・イン・ワン（Ｎ−ｉｎ−Ｏｎｅ）、カセットまたはカクテル投与とも称する）は同一動物への２回またはそれ以上のＮＭＥの同時投与およびＬＣ／ＭＳによる血漿サンプルのアッセイを含む。得られた濃度−時間プロファイルからＰＫパラメーター値を決定する。Ｂｅｒｍａｎら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０（６）：８２７−８２９（１９９７）；およびＯｌａｈら、Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ　１１：１７−２３（１９９７））は薬剤送達の間の候補物質選択の効率を増進する混合物投与研究法の適用の成功について報告した。それ以後、いくつかの出版物でマウス、ラット、イヌおよびサルに静脈内および経口により同時に投与した２から２２個の化合物のＰＫについて報告されている（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓ．Ｄｅｖ．２（１）：２０−２５（１９９９）；Ａｌｌｅｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（１）：９３−９７（１９９８）；およびＧａｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８２８：１４１−１４８（１９９８））。報告では、従来の研究法から得られた値に比較して、混合物投与から得られたＰＫパラメーター値間でうまく合致することが示された。従来の方法に比較して、実験する動物数が少なく、必要な化合物が少なく、作成されるサンプル数が少なくなるので、混合物投与により著明な経費および時間の削減がなされる。混合物投与の別の利点は、ＰＫ実験に伴い、複数のＮＭＥの組織分布（例えば脳・血液比率）、尿排泄パターン（Ｆｒｉｃｋら、Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．Ｔｏｄａｙ　１（１）：１２−１８（１９９８））およびタンパク質結合（Ａｌｌｅｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（１）：９３−９７（１９９８））を試験する能力である。エヌ・イン・ワン投与の不利な点には投与のための処方の開発の困難、動物における副作用の増加の可能性、および方法開発の問題（例えば低用量、代謝物および目的の分析物間の分子量重複のために感受性を高める必要性）などがある。また薬剤−薬剤相互作用（例えば代謝、またはある化合物の別の化合物による別の排泄経路の阻止）はＮＭＥのＰＫを変化させ得るという懸念もある。化合物−化合物相互作用は、強力なシトクロムＰ４５０インヒビターが混合物に導入された場合に、経口混合物投与中および静脈内投与中に生じる（Ｏｌａｈら、Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ１１：１７−２３（１９９７））。全混合物投与期間中に参照化合物を含めることにより相互作用を特定した。誤ったデータを得る機会を最低するように混合物投与実験を設計する場合に考慮される因子のリストおよびＮＭＥが混合物の大きさの関数として化合物−化合物相互作用を経験し得る確率を説明する統計分析はＦｒｉｃｋらによる概説で提供されている（Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．Ｔｏｄａｙ１（１）：１２−１８（１９９８））。混合物投与の将来の進歩は種々の工程、例えば投与用溶液調製、ＭＳチューニングおよびデータ減少の自動化、並びに確立され、順応性のあるクロマトグラフィー法の開発に焦点が当てられる可能性がある（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓ．Ｄｅｖ．２（１）：２０−２５（１９９９）；Ｇａｏら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８２８：１４１−１４８（１９９８））。将来の研究では構造−ＰＫ相関の開発のための方法および使用に付随するＰＫリスク（例えば化合物−化合物相互作用）を定義し最小限にすることにも焦点を当てるべきである（例えば、化学物質アナログのセットに関して混合物投与技術を用いて作成されたデータから構造−薬剤動態相関を誘導できることを示唆しているＳｈａｆｆｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８（３）：３１３−３１８（１９９９）を参照）。
【０１００】
生物学的分析の処理量を増加させるための薬剤動態研究からのサンプルのプール
いくつかの研究室では血漿プール研究法を用いて生物学的分析およびＰＫ処理量を増すことに成功した（Ｏｌａｈら、Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１１：１７−２３（１９９７）；およびＨｏｐら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７（７）：９０１−９０３（１９９８））。プール研究法では、複数の動物に個々のＮＭＥを投与し、共通する時点でのサンプルのアリコートをプールし、ＬＣ／ＭＳにより分析する。プール法の利点は分析するサンプルが少なく、インビボ化合物−化合物相互作用の可能性が排除されることである。しかしながらサンプルのプールは非常に時間がかかり、検出限界はサンプル希釈のために信用できない。
【０１０１】
Ｈｏｐら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７（７）：９０１−９０３（１９９８））は小児科の患者においてＰＫパラメーターを得るために用いられていたプール技術を復活させた。各動物に関して、各時点での血漿アリコートを時間間隔に比例してプールし、それにより曲線下面積（ＡＵＣ）に比例した濃度を有する唯一のサンプルを生じるようになる。この研究法の主要な利点はサンプル数および生物学的分析の作業負荷の著明な減少である。不利な点は濃度−時間の推移（Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、半減期）についての情報がもはや得られなく、プールが非常に面倒である。血漿サンプルの有望化合物についての未使用部分は、いつも再分析されて完全ＰＫプロファイルが得られ、そして、自動化がプールの実施を容易にしよう。研究者らはこの技術を発見プログラムに適用している。そこでは、経口投与後のＡＵＣが主要関心事であった。この技術はまた、化合物のクリアランスおよび生物学的利用性を決定するために使用できよう。
【０１０２】
インビトロ進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）
本発明の目的のために、インビトロ進化ストラテジーを特定されたエフェクターについてアプタマーを進化させるために通常使用する。選択され特定されたアプタマー−エフェクター反応はインビボ適用に有用な手段である：例えばそれにより細胞において天然には見出されない、従って正常細胞機能に悪影響を及ぼすとは予測されない構築物を工作することが可能になる。
【０１０３】
いくつかのインビトロ進化（選択）ストラテジー（Ｏｒｇｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．ロンドン、Ｂ２０５：４３５（１９７９））を用いて、種々の反応、例えばＲＮＡおよびＤＮＡの切断およびライゲーションを触媒できる新規核酸触媒（Ｊｏｙｃｅ、Ｇｅｎｅ　８２：８３−８７（１９８９）；Ｂｅａｕｄｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：６３５−６４１（１９９２）；Ｊｏｙｃｅ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　２６７：９０−９７（１９９２）；Ｂｒｅａｋｅｒら、ＴＩＢＴＥＣＨ　１２：２６８（１９９４）；Ｂａｒｔｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１−１４１８（１９９３）；Ｓｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ　１７：８９−９３（１９９３）；Ｋａｕｆｍａｎｎら、米国特許第５８１４４７６号；Ｋｕｍａｒら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．９：１１８３（１９９５）；Ｂｒｅａｋｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４４２（１９９６）およびＢｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚら、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐ．６：１２９（１９９２））、およびアプタマーとして作用する新規核酸、例えばＡＴＰアプタマー、ＨＩＶ　Ｒｅｖアプタマー、ＨＩＶ　Ｔａｔアプタマーおよびオリゴヌクレオチドエフェクターなどのその他のもの（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ　３４６：８１８−８２２（１９９０）；ＦａｍｕｌｏｋおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：９７９−９８８（１９９２）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４（５）：４２７−４２９（１９９０）；ＰｏｒｔａおよびＬｉｚａｒｄｉ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３１：１６１−１６４（１９９５）；ＴｎａｇおよびＢｒｅａｋｅｒ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４（６）：４５３−４５９（１９９７）；ＴａｎｇおよびＢｒｅａｋｅｒ、ＲＮＡ　３：９１４−９２５（１９９７）；ＷｅｒｓｔｕｃｋおよびＧｒｅｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：２９６−２９８（１９９８）；ＴａｎｇおよびＢｒｅａｋｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２６（１８）：４２１４−４２２１（１９９８）；ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：３５８４−３５８９（１９９９）；およびＲｏｂｅｒｓｔｏｎおよびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１７：６２−６６（１９９９）参照）を進化させた。これらに加えて、インビトロ進化方法のさらなる記載がＩｎｎｏｖｉｒ、米国特許第５７４１６７９号および米国特許第５８３４１８６号、ＷＯ９８４３９９３（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６２３１、エール大学）、ＷＯ９８２７１０４（ＰＣＴ／ＵＳ９７／２４１５８、エール大学）、および米国特許第５８１７７８５号（ネクスター・ファーマシューティカルズ）で提供されている。
【０１０４】
基本的な形態では、この方法は以下の工程を含んでいよう。
【０１０５】
１）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。典型的には候補混合物は固定配列の領域（すなわち候補混合物の各々のメンバーが同一の位置に同一の配列を含有する）および無作為化配列の領域を有する核酸を含む。固定配列領域を、（ａ）以下に記載する増幅工程を補助するため、（ｂ）エフェクターに結合することが知られている配列をまねるため、または（ｃ）候補混合物中の所与の構造的配置の核酸の濃度を増すため、などの種々の理由から使用できる。無作為化配列は全体的に無作為化されているか（すなわちいずれかの位置である塩基を見出す確率は、４つのうちの１つである）または単に部分的に無作為化されて（例えば、いずれかの位置である塩基を見出す確率が、０から１００％のいずれかのレベルで選択できる）いてよい。
【０１０６】
２）候補混合物をエフェクターとおよび候補混合物の核酸との間の相互作用に望ましい条件下で選択されたエフェクターと接触される。これらの環境下では、エフェクターおよび核酸の相互作用は、エフェクターとおよびエフェクターにとって最強の親和性を有するこれらの核酸との間でアプタマー−エフェクター対を形成すると考えられる。
【０１０７】
３）エフェクターにとって最高の親和性を有する核酸を、エフェクターに対する親和性が低いこれらの核酸から分別する。高親和性核酸配列に対応する極度に少数の異なる分子（恐らくただ一つの分子）が候補混合物に存在するだけなので、当初の候補混合物中の核酸の大部分の量（およそ５から５０％）が分別中に保持されるように分別基準を設定するのが望ましい。
【０１０８】
４）次いで、エフェクターに対して相対的に高い親和性を有するとして分別の間に選択されたこれらの核酸を増幅して、エフェクターに関して相対的に高い親和性を有する核酸に富む新規候補混合物を作製する。
【０１０９】
５）これらの分別および増幅工程を繰り返すことにより、新規に形成された候補混合物はより少いユニーク配列を含有し、エフェクターに対する核酸の親和性の程度の平均は一般に増加する。サイクルを繰り返すことにより、エフェクターに対して最高の親和性を有する、元の候補混合物からのこれらの核酸を表すユニーク核酸を１つまたはそれ以上含有する候補混合物が生じる。
【０１１０】
アプタマーおよびエフェクターの相互作用に必要な塩基の数は解っていない。核酸の１次、２次および３次の種々の構造が存在することが知られている。非ワトソン−クリック型相互作用に最も一般的に関与していることが示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称張り出し部分、シュートノットおよびこれらの多数の組み合わせと称する。研究は、これらが３０個未満のヌクレオチドの核酸配列で形成できることを示唆している。この理由により、連続無作為化セグメントを用いるインビボ進化の手法は、約２０から約５０のヌクレオチドを含む核酸配列を用いて開始することがしばしば好まれる。このように、アプタマーは、特定のエフェクターに結合するように進化された、通常約２０から約５０のヌクレオチドを、好ましくは約２０から約３０のヌクレオチドを含有している。この小さいサイズの分子は、サイズがより大きい従来の発現制御構築物と比べて、細胞への移送に好都合である。
【０１１１】
当業者には、種々の異なるアロステリック制御モジュールの構築のために、触媒構造を有するモジュールユニットとして次いで用いることができる他のアプタマーを、インビトロ技術を用いて作成し特定することができることが、理解されよう。あるいは、アロステリック制御モジュールを、アプタマーまたはエフェクター結合ドメイン、触媒ドメイン、並びにある実施形態では非限定例として標的ＲＮＡ認識ドメインおよび基質ドメインなど別個の領域またはドメインを有する単一のユニットとして進化させることができる。
【０１１２】
いずれかの所与のアプタマーについても、化学合成により製造されたエフェクター（例えば有機化合物、ペプチド、小型分子等）の大きなコンビナトリアルライブラリーがアプタマー結合に関して進化させることができることが、理解されよう。またファージを提示するライブラリーを、選択されたアプタマーに結合するエフェクターの存在に関してふるい分けすることもできる。従って、本発明の別の実施形態では、アプタマーを特定し、スクリーニング過程によりエフェクターを選択することができる。
【０１１３】
触媒ドメイン
アロステリック制御モジュールの他の主要な成分は触媒ドメインである。前記したように、インビトロ進化を用いて種々の反応、例えば切断、連結およびスプライシングを触媒することができる新規核酸触媒を進化させることもできる。加えて、この触媒ドメインは、結合の塩基対形成メカニズムのみならず、分子が結合するＲＮＡの発現に影響するメカニズムにも依存する特異的活性を有する、高度に特異的な構築物である。例えば、阻害がＲＮＡ標的の切断により誘起される場合、特異性は、非標的ＲＮＡの切断速度に対する標的ＲＮＡの切断速度の比率として定義する。
【０１１４】
目的の遺伝子
本発明は、１つの実施形態において、患者の標的細胞ゲノム中に欠損または欠落しているタンパク質をコードする望ましい遺伝子の提供を企図する。本発明は、また患者に望ましいタンパク質をコードするように遺伝子操作されたヒト細胞を提供することにより疾病を患う患者を処置する方法をも企図する。さらに別の実施形態は、遺伝子欠損を正す遺伝子の送達である。本発明のこれらの実施形態の各々において、特定されたエフェクターの存在または不在に応答して遺伝子の発現を変化させるように設計されているアロステリック制御モジュールを有する受容細胞に目的の遺伝子を送達する。
【０１１５】
本発明の構築物の使用例には、遺伝子疾患のための遺伝子治療などがある。これらの疾患には、非限定例として：家族性高コレステロール血症またはＩＩ型高脂血症（ＬＤＬレセプタ）、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症またはＩ型高脂血症（リポタンパク質リパーゼ）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、尿素サイクル欠損症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、フォンギルケ病（例えば糖原病、Ｉ型；グルコース−６−ホスホターゼ）、アルファ１−アンチトリプシン欠損症（アルファ１−アンチトリプシン）、嚢胞性繊維症（嚢胞性繊維症膜貫通作動性レギュレーター）、フォン・ウィルブランド病およびＡ型血友病（第ＶＶＩＩＩ因子）、およびＢ型血友病（第ＩＸ因子）、鎌状赤血球性貧血（ベータ・グロビン）、ベータ・サラセミア（ベータ・グロビン）、アルファ・サラセミア（アルファ・グロビン）、スペロサイトシス（スペクトリン）、重症複合免疫不全（アデノシンデアミナーゼ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィンミニ遺伝子）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒドロキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ）、ゴーシェ病（ベータ・グルコセレブロシダーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソーム・ヘクソサミニダーゼ）、およびメープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）；
などがある。
【０１１６】
本発明で使用するのに適したトランスジーンにはさらに、非限定例として、タンパク質、例えば：神経成長因子（ＮＧＦ）、腺毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＴＦ）、ニューロトロフィン３および４／５（ＮＴ−３および４／５）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＴＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）および酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）をコードするもの；チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）および芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードする配列；スーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ１または２）、カタラーゼおよびグルタチオン・ペルオキシダーゼをコードする配列；インターフェロン、リンホカイン、サイトカインおよびそのアンタゴニスト、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＤ４特異的抗体、およびＴＮＦまたはＣＤ４レセプタをコードする配列；ＧＡＢＡレセプタイソ型、ＧＡＢＡ合成酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、カルシウム依存性カリウムチャネルまたはＡＤＰ感受性カリウムチャネルをコードする配列；並びにチミジンキナーゼ、アンジオスタチン、ドーパミン、血液凝固因子、エリスロポイエチン、コロニー形成刺激因子Ｇ−、ＧＭ−およびＭ−ＣＳＦ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒトまたは動物成長ホルモン、ＩＧＦ−１、インスリン、ＫＧＦ、レプチン、ＭＧＤＦ、多剤耐性、オステオプロトゲリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−ｒａ、アルファ・インターフェロン、ベータ・インターフェロン、コンセンサス・インターフェロン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＴＮＦｂｐをコードする配列などがある。
【０１１７】
本発明により企図される目的の別の遺伝子は、ワクチンとして使用するための病原体をコードする。遺伝子の実例を挙げると、非限定例としては：ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２（ｒｅｖおよびｇｐ１６０配列以外の配列）；ヒトＴ−リンパ栄養性ウイルスＩおよびＩＩ型；呼吸系発疹ウイルス；パラインフルエンザウイルス１から４型；麻疹ウイルス；ムンプスウイルス；風疹ウイルス；ポリオウイルス；インフルエンザウイルス；非ヒトインフルエンザウイルス（トリ、ウマ、ブタ）；肝炎ウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ型；ロタウイルス；ノーウォークウイルス；サイトメガロウイルス；エプスタイン・バールウイルス；単純疱疹ウイルス１および２型；水痘・帯状疱疹ウイルス；ヒトヘルペスウイルス６型；アデノウイルス；肝炎ウイルス；狂犬病、口蹄疫ウイルス、クラミジア肺炎；クラミジア・トラコマチス；マイコプラズマ肺炎；結核菌；非定型マイコバクテリア；ネコ白血病ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；ウシ免疫不全ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス；ビスナウイルス；感染性単核細胞症；バラ疹；肺炎および成人呼吸窮迫症候群；上部および下部気道感染；結膜炎；上部および下部気道感染；生殖器官感染；並びにヒツジ肺炎および脳炎などがある。遺伝子生成物が細胞質にある場合（例えば遺伝子生成物がウイルスの組み込みまたは複製を阻止する場合）ワクチンベクターを用いて細胞内免疫を生じさせることができる。また別に、遺伝子生成物が細胞表面で発現されるか、または分泌される場合、細胞外／全身性免疫を生じさせることができる。
【０１１８】
宿主に疾患の原因となる生物のポリペプチドをコードする本発明のベクターの免疫誘導量を投与することにより、このポリペプチドに対して宿主（とりわけヒト宿主）を免疫できる。本発明のベクターによるヒト宿主の免疫には、典型的には、非経口経路による（例えば静脈内、筋肉内、または皮下注射による）、表面乱刺による、または体腔への接種による、免疫誘導量のウイルスの接種による投与が含まれる。典型的には、感受性のあるヒトまたはヒト以外の霊長類細胞系での測定による各々約１０００から約１０００００００感染性ユニットの１回または数回接種がヒト宿主の免疫を生じるのに十分である。
【０１１９】
本明細書に記載する物質および方法のさらなる使用には、非限定例として：
１．ハイブリドーマ細胞、すなわちＢリンパ球と骨髄腫細胞系との融合から得られる細胞系によるモノクローナル抗体の発現を増加させること。組織培養またはインビボでハイブリドーマを成長させることによりモノクローナル抗体を生成することができる；
２．芳香剤および香水、着香化合物または甘味剤において用いられる植物由来の生成物、例えばタウマトコッカス・デニエリ（Ｔａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｅｌｌｉ）に由来する塩基性タンパク質、殺虫剤、抗菌化合物または農薬を増加させること；
３．金属、例えばウラン、銅、銀、マンガン等の生物浸出における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
４．例えばニトロバクター種またはアシネトバクター種により実施されるような、水からの窒素またはリン酸塩または有毒廃棄鉱物の除去における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
５．生物学的廃棄物、典型的にはメタン生成微生物古細菌からのメタン生成を刺激する律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
６．海洋石油流出（例えば脂肪族炭化水素、ハロゲン化脂肪族、ハロゲン化芳香族）の生物分解における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること。一例では、生物分解は石油生成物の乳化脂肪酸への変換により行われる。本発明に有用な細菌には、非限定例としてアルクロモバクター（Ａｒｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノルカルディア（Ｎｏｒｄａｒｄｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えばシュードモナス・オレオボランズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ））およびサイトファガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）などがある。本発明に有用な酵母には、非限定例としてカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えばカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、およびトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）などがある；
７．リグニンの生物分解における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
８．例えばリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コルネバクテリウム）種；によるステロイドおよびステロール；アセトバクター・スボキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｂｏｘｙｄａｎｓ）によるＤソルビトールからＬソルボースへ；ラセミ混合物；プロキラル基質；テルペノイド；脂環式およびヘテロ脂環式化合物；抗生物質；フタル酸エステル、リグノスルホネート、界面活性剤および色素などの芳香族およびヘテロ環式構造；ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種によるナフチリジン；多核芳香族炭化水素；脂肪族炭化水素；アミノ酸およびペプチド；グルコースからフルクトースへ；グルコースからグルコン酸へ；ラフィノースからスクロースおよびガラクトースへ；ラクトース；並びにスクロースの生物形質転換における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
９．微生物からの市販されている重要な酵素の製造、例えばアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、バシラス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのラクターゼの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
１０．糖蜜でのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の成長；亜硫酸バルブ廃液でのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の成長；高級ｎ−アルカンでの酵母の成長；高級ｎ−アルカンでの細菌の成長；メタンまたはメタノールでの細菌または酵母の成長における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
１１．例えばアゾトバクテリア（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、またはシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）による大気中窒素の同化作用における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
１２．バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えばバシラス・チューリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの殺虫剤の製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
１３．デューテロミセテス（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）のごとき昆虫菌類、例えばバーティシリウム・レカニ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｌｅｃａｎｉｉ）およびヒルステラ・ソンプソニ（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ　ｔｈｏｍｐｓｏｎｉｉ）からの殺虫剤の製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
１４．例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種による、セルロース性物質、デンプン作物、サトウキビ、飼料用ビートまたは糖蜜からのエタノールの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
１５．アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種、もしくはグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）種によるエタノールからの酢酸の製造における律速工程、ラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のファミリーによる乳酸の製造における律速工程、例えば糖蜜またはデンプンを用いるカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）によるクエン酸の製造における律速工程、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）種およびアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種によるグルコン酸の製造における律速工程、または細菌もしくは真菌によるアミノ酸の製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
１６．細胞におけるアミノ酸のラセミ混合物の分割を触媒する酵素の発現を増加させること；
１７．例えばコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、またはエルウィニア・タヒチカ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｔａｈｉｔｉｃａ）による細胞外多糖類の製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること。その他の例には；真菌スクレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）ｓｒ．からのスクレログリカン、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）からのプルラン、アルカリゲアンス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅａｎｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）からのクルドラン、およびストレプトバクテリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種またはストレプトカカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｕｓ）種からのデキストランの製造などがある。別の例にはアルスロバクター・ビスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ）からのアニオン性多糖類、アゾトバクター・ビネランジ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）からの細菌性アルギン酸塩、およびキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）からのキサンタンなどがある。
１８．抗菌化合物（例えばグリセオフルビン）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｕｍ）種からのペニシリンの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
１９．真菌による抗生物質、例えばポリエーテル抗生物質、クロラムフェニコール、アンサマイシン、テトラサイクリン、マクロライド、アミノグリコシド、クラバン、セファロスポリン、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からのセファマイシンの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２０．抗腫瘍物質、例えばアクチノマイシンＤ、アントラサイクリン、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からのブレオマイシンの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２１．核酸、ヌクレオチドおよび関連する化合物、例えばブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）による、例えば５‘イノシン酸塩（ＩＭＰ）、５’グアニル酸塩（ＧＭＰ）、ｃＡＭＰの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２２．シュドモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、プロピオニバクテリウム・シェルマニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、またはロドシュードモナス・プロタミカス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｒｏｔａｍｉｃｕｓ）によるビタミン、例えばビタミンＢ１２の製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２３．アシュビア・ゴシッピ（Ａｓｈｂｙａ　ｇｏｓｓｙｐｉ）またはバシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）によるリボフラビンの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２４．酵母、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるエルゴステロールの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２５．クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）種によるエルゴットアルカロイドの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２６．ヒト薬剤において選択された治療用途に有用な２次代謝物、例えばトリコデルマ・ポリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）からのシクロスポリンの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２７．植物細胞培養からの２次生成物、例えばコレウス・ブルメ（Ｃｏｌｅｕｓ　ｂｌｕｍｅ）における桂皮酸誘導体およびリソスペルマム・エリスロフィゾン（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｉｚｏｎ）からのシコニンの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２８．サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種によるワインおよびビールの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
２９．スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種およびプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種によるヨーグルトまたはチーズの製造における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
３０．真菌および細菌によるテオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ）の発酵における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；並びに
３１．真菌および細菌によるコフェア（Ｃｏｆｆｅａ）種からのコーヒー豆の発酵における律速工程に関係するポリペプチドの発現を増加させること；
などがある。
【０１２０】
その発現が多細胞生物内において特定の生理学的または病理学的影響に関係している目的の遺伝子は、植物遺伝子であってもよい。植物遺伝子は農業経済学的に重要な形質をコードし得る。農業経済学的に重要な形質の例は、非限定例として発芽、新芽形成、開花、果物熟成、塩耐性、除草剤抵抗性、殺菌剤抵抗性、温度呈構成および成長などがある。
【０１２１】
さらに本発明の実施において、目的の遺伝子は原生動物遺伝子でよい。原生動物の例には、非限定例としてはトリパノゾーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、レイシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、ギアルディア（Ｇｉａｒｄｉａ）、エンタモエバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、トクソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）、およびクリプトスポリディオシス（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓｉ）からなる群からの選択を含めることができる。さらに、その発現が多細胞生物内において特定の生理学的または病理学的影響に関係する目的の遺伝子は蠕虫遺伝子であってよい。
【０１２２】
明らかに、ポリペプチド自体が市販されているかまたは治療上重要である場合、およびポリペプチドの発現が、市販されているかまたは治療上重要である分子の製造を媒介する場合の双方で、本発明は商業用に適用される。
【０１２３】
本発明のアロステリック制御モジュールのさらなる用途は条件付ノックアウトおよびトランスジェニック動物の作製においてである。条件付ノックアウトでは、遺伝的に変化した動物において標的遺伝子生成物を正常に発現し、発現はエフェクターの存在する場合のみ阻害される。本明細書にて記載したエフェクター、および本明細書にて記載した方法により進化されたアロステリック制御モジュールを条件付ノックアウトに適用する場合、本発明の方法により特定された小型分子エフェクターにより活性化されるアロステリック自己切断ＲＮＡを進化させるのが望ましい。この場合、触媒ドメイン、好ましい実施形態では、リボザイムを遺伝子のイントロンまたは非翻訳領域に含んでなる活性化可能な自己切断アロステリック制御モジュールを配置するように変化している目的の遺伝子生成物をコードするＤＮＡ構築物を作製する。挿入部位の選択は実験的研究により、エフェクター不在時に正常または正常に近いレベルで遺伝子生成物を発現するように行う。
【０１２４】
このように、胚幹（ＥＳ）細胞において部位特異的遺伝子組換え法により、本来の遺伝子の代わりに、本発明のアロステリック制御モジュールを挿入し、続いて変化したＥＳ細胞を胚盤胞にマイクロインジェクションを行うことにより、遺伝的に変化した生物の発育中に目的の遺伝子を正常にまたは正常に近い状態で発現する、変化した生物の作製が可能になる。これにより、遺伝子生成物が発育中に存在することを可能にし、従って胚致死率または発育の代償の問題を排除できる。続いて、シス作用性触媒ドメインを活性化するエフェクター分子で成熟動物を処置することができ、標的遺伝子生成物をコードするＲＮＡの分解をもたらす。
【０１２５】
あるいは、エフェクターの不在時にそれ自体を正常にプロセシングする、阻害性自己スプライシングイントロンを進化させることができる。エフェクターの存在時には、自己スプライシングイントロンの活性は阻害され、イントロンはｍＲＮＡ中に保持され、遺伝子発現の阻害をもたらす。活性化または阻害のいずれの場合でも、成熟動物において標的遺伝子生成物の発現を阻害する生物学的効果を直接評価する。
【０１２６】
トランスジーンの過剰発現の場合、ヒト治療適用のための遺伝子治療法におけるＲＭＳＴの適用に関して記載された様式に非常に類似した様式で、シス作用性の、阻害性自己切断リボザイムまたは活性化可能な自己スプライシングイントロンを進化させるのが望ましい。この特定の適用では、シス作用性の阻害性自己切断アロステリック制御モジュールまたは活性化可能な自己スプライシングイントロンを含有する、変化した遺伝子生成物の挿入を、トランスジェニック動物の作製に用いられる標準的な方法により達成できる。Ｓｗａｎｓｏｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９：２６５−２７４（１９９４）；Ｐｏｌｉｔｅｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７７（６）：２５７−２６２（１９９６）。あるいは、遺伝子治療適用が企図されるものと類似の、ウイルスまたは裸のＤＮＡを移入する方法により、変化した遺伝子構築物を成熟動物に導入できる。いずれの場合にも、ここに述べられた所望のアロステリック制御モジュールの挿入により目的遺伝子の過剰発現が普通阻害されよう。続いてエフェクターを動物に投与することにより、機能結果の評価のための遺伝子産物が過剰発現されよう。
【０１２７】
細胞治療またはエクスビボ遺伝子治療、例えば本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞の移植もまた企図される。この実施形態には、次いで目的の遺伝子の発現を制御するＤＮＡ構築物を含有する細胞の移植が含まれる。免疫学的反応の可能性を最低限にするために、細胞がヒト起源であり、目的のヒト遺伝子を製造するのが好ましい。しかし、送達または移植のために、ベクターを異種供与細胞および外来細胞ならびに自己由来細胞を修飾するために用いることもできよう。
【０１２８】
ある場合には、ベクターを、ここに述べられたような方法を用いて遺伝的に操作された特定の細胞を患者に移植することにより、送達することができ、ポリペプチド、フラグメント、変種または誘導体を発現させることができる。かかる細胞は、動物またはヒト細胞でよく、患者自身の組織（自己由来）またはヒト（同種異型）もしくはヒト以外（異種）の別の供給源に由来してよい。任意に細胞を不死化してよい。免疫学的応答の機会をさらに低減するために、細胞をカプセル化して周辺組織の侵入を避けることができる。カプセル化物質は典型的には、タンパク質生成物の放出は可能であるが、患者の免疫系によるかまたは周辺組織からの別の有害因子による細胞破壊は防御する、生体適合性、半透過性重合性封入体または膜である。
【０１２９】
生存細胞のカプセル化の技術は当分野で既知であり、カプセル化された細胞の調製および患者におけるその移植は過度の実験することなく達成できる。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＷＯ９５０５４５２；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は生物学的に活性な分子の有効な送達のための遺伝子操作された細胞を含有する膜カプセルについて記載している。このカプセルは生体適合性であり、容易に回収可能である。このカプセルは、プロモーターに作動可能に連結された、哺乳動物宿主にインビボ移植したとき下方制御の対象とならない生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡにより形質転換された細胞を内封化している。このデバイスは、生存細胞からの分子を受容細胞の特定の位置に送達することを可能にする。加えて、米国特許第４８９２５３８号、第５０１１４７２号、および第５１０６６２７号を参照されたい。生存細胞をカプセル化するための系についてはＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１１０４２５に記載されている。またＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１１０４７０、Ｗｉｎｎら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−３２９（１９９１）、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−２７５（１９９１）；およびＴｒｅｓｃｏら、ＡＳＡＩＯ　３８：１７−２３（１９９２）をも参照されたい。
【０１３０】
プロモーター
当業者は、目的の遺伝子およびもう１つの作動可能な調節配列と共にプロモーターを提供するのも有利であることを理解するであろう。しかしながら、プロモーターまたは他の作動可能調節配列の選択は、エフェクターの選択、アプタマーの進化または本発明のアロステリック制御モジュールの構築および使用を制限することなくなされる。
【０１３１】
プロモーター領域は、長さおよび配列が異なり、および配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質および／またはエンハンサーもしくはサイレンサーのための１つまたはそれ以上のＤＮＡ結合部位をさらに包含し得る。本発明は例えばＣＭＶプロモーターまたはＰ５プロモーターを用いることができる。かかるプロモーターおよびその変異体は既知であり、当業界で報告されている（例えばＨｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎら、ＥＭＢＯ　Ｊ．５：１３６７−１３７１（１９８６）；Ｌｅｈｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２４９４−２５０２（１９９１）；Ｌａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：３２８７−３２９５（１９９２）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．４５：５５５−５６４（１９８３）；およびＧｒｅｅｎら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．３６：７９−９２（１９８０）を参照されたい）。しかしながらその他のプロモーター、例えばＡｄ２またはＡｄ５主要後期プロモーターおよび３分割リーダー、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）末端反復配列、並びにその他の構成プロモーターも文献に記載されるように用いることができる。例えばヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：１４４−１４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２（１９８２））、酵母または真菌からのプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、およびアルカリ性ホスファターゼプロモーターを用いることができる。同様に、哺乳動物細胞のゲノムからまたはこれらの細胞（例えばＡｄ、ＳＶ４０、ＣＭＶ等）で成長するウイルスから単離されたプロモーターを用いることができる。
【０１３２】
送達
ここに記載したＤＮＡ構築物は細胞に導入するための種々ベクターに組み込むことができる。適切なベクターには、非限定例として裸のＤＮＡ、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター）、ウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）（概説に関してはＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、前出（１９９６））および非ウイルスベクター（例えばカチオン性脂質と複合体形成した、またはリポソームに包括されたＤＮＡ）などがある。発現ベクターは、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終止領域、およびｃ）発現調節配列をも含むことが当業者に理解されよう。別個に生成された成分を組み合わせることによりＤＮＡ構築物およびベクターを生成できることも当業者に理解されよう。例えば化学的合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術によりプロモーター、アプタマーおよび触媒ドメインを別個に製造し、そして組み合わせることができる。
【０１３３】
本発明のＤＮＡ構築物を含有するベクターは、当業者に既知の種々のプラスミド送達方法および非ウイルス送達方法により、例えば非限定例としてリポソーム媒介移入、または別の送達ベヒクル、例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体粘着性マイクロスフェアへの組み込み、裸のＤＮＡ送達（直接注入または直接取り込み）、レセプタ媒介移入（リガンドＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介形質転換、マイクロインジェクション、浸透圧ショック、微粒子ボンバードメンント（例えば遺伝子ガン）、バイオチップ物質および前記の組み合わせにより、細胞に送達することができる。送達材料および送達方法は、非限定例として誘導プロモーター、組織特異的エンハンサー・プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞について選択的利点を提供できるＤＮＡ配列、形質転換された細胞を特定するための標識、陰性選別系（安全基準）、細胞特異的結合物質（細胞標的化用）、細胞特異的内部移行因子、ベクターによる発現を増強し得る転写因子等の成分、ならびにベクターの製造方法を含み得る。遺伝子治療技術を実施するためのかかる追加の方法および物質については、米国特許第４９７０１５４号、エレクトロポレーション技術；ＷＯ９６４０９５８核リガンド；遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系に関連する系米国特許第５６７９５５９号；リポソームキャリヤに関係する米国特許第５６７６９５４号；リン酸カルシウムトランスフェクションの方法に関連する米国特許第５５９３８７５号；および、粒子が細胞の表面を貫通し、細胞内部に組み込まれる速度で、生物学的活性粒子を細胞において推進される米国特許第４９４５０５０号に記載されている。
【０１３４】
本発明の構築物の典型的な使用には受容細胞へのベクターの移入が含まれる。受容細胞または宿主細胞は、典型的にはタンパク質製造技術においては原核細胞であり、遺伝子治療技術においては真核細胞が好ましい。真核宿主細胞はインビトロまたはインビボのいずれかで修飾できる。本発明によれば、本発明のベクターと細胞との「接触」をいずれかの手段により行うことができ、これによりベクターが細胞に導入される。１つの好ましい実施形態では、ウイルスが細胞に侵入する天然の能力（例えばレセプタ媒介エンドサイトシスによりアデノウイルスが細胞に侵入する能力）を用いて感染によりウイルスベクターを導入する。しかしながら、ウイルスベクターおよびプラスミドベクターをいずれもの適切な手段により導入することができる。
【０１３５】
適切なウイルスベクターには、非限定例として、レトロウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、およびパピローマウイルスなどがある。米国特許第５６７２３４４号では組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移入系について記載されている。米国特許第５３９９３４６号はインビトロで処置して治療用タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入したヒト細胞の送達により患者に治療用タンパク質を提供する方法の例を提供している。遺伝子治療技術を実施するための別の方法および物質はアデノウイルスに関連して米国特許第５６３１２３６号、レトロウイルスに関連して米国特許第５６７２５１０号；およびサイトカインを発現するレトロウイルスに関連して米国特許第５６３５３９９号に記載されている。
【０１３６】
好ましくは、ベクターは送達された細胞に持続保持される。また別に、ＤＮＡ構築物の一過性発現を提供するするベクターを用いることもできる。かかるベクターは必要に応じて繰り返し投与されよう。
【０１３７】
組成物および投与
宿主細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで、本発明のベクターをもちいて形質転換することができる。インビボの場合、所望の標的細胞型を対象者から取り出し、これをベクター送達によって組み換え的に改質し、これを対象者に再導入することができる。この改質細胞は、サザンブロットおよび／またはＰＣＲのような通常の方法を使用して、目的とする遺伝子を収容する細胞をふるい分けすることができる。このような改質細胞は、対象者に直接移植するか、または対象者に埋め込まれるデバイスに入れることができる。エキスビボ改質細胞は、直接移植用または間接的移植用の非ヒト細胞系も包含すると考えられる。
【０１３８】
インビボ送達の場合、このベクターは医薬組成物に配合することができる。このベクターは、非経口、例えば、静脈注射、腹膜注射、筋肉注射、髄腔内注射または皮下注射によって投与することができる。他の投与法に好適な他のベクター製剤は、経口（舌下および口内）および肺（鼻腔内および吸入）製剤、局所または経皮製剤、および坐薬を包含する。送達は、単一用量計画または多用量計画を包含する。
【０１３９】
例えば、ＤＮＡ構造を含有するｒＡＡＶ粒子のような、本発明のベクターの筋肉注射は、有糸核分裂後筋肉繊維への有効な形質導入を提供し長期遺伝子導入発現を提供することができる。本発明によれば、大きな炎症または遺伝子導入生成物に対する免疫の活性化を生じさせることなく、これを達成できる。筋肉は、分泌治療タンパク質、例えば、目的とする遺伝子のうち特に因子ＩＸまたはアポリポプロテイン（Ａｐｏ）Ｅ．の産生に特に適している。
【０１４０】
注射によって投与する場合、本発明のベクターを、生物学的相溶性溶液または医薬的に許容される送達賦形剤に一般に懸濁させることは、当業者に理解される。１つのそのような好適かつ一般的な溶液は、滅菌生理食塩水である。他の水性および非水性等張性滅菌注射溶液ならびに水性および非水性滅菌懸濁液も使用することができ、当分野において好適な医薬的に許容される担体としてよく知られている。
【０１４１】
本発明の１つの実施形態において、ベクターは、治療タンパク質をコードする遺伝子を有する。選択タンパク質の充分なレベルの発現を生じるのに充分な量のベクターを投与し、それによって、不当な副作用を伴わず、医学分野の精通者によって測定される医学的に許容される生理学的効果を伴って、治療的利益を得ることができる。ベクターの用量は、治療される疾患、選択されたトランスジーン、患者の年齢、体重および健康のような要因に主として依存し、従って、患者ごとに変化しうる。例えば、本発明のベクターの治療有効用量は、約１×１０８から１×１０１１粒子／ｍＬの本発明のＤＮＡ構造を含有するｒＡＡＶビリオンの濃度を有する約１ｍＬから約５０ｍＬの生理食塩水である。より好ましいヒト用量は、前記濃度における約１から２０ｍＬの生理食塩水である。選択遺伝子の発現のレベルを監視して、投与の選択、調節または頻度を決めることができる。次に、必要であれば、ベクターの投与を繰り返すことができる。
【０１４２】
インビボで行う場合、あらゆる好適な器官または組織または成分細胞を、ベクター送達のための標的とすることができる。好ましくは、使用される器官／組織／細胞は、循環器系（即ち、心臓、血管または血液）、呼吸器系（即ち、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺）、胃腸系（即ち、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢）、泌尿器系（即ち、腎臓、尿管、尿腺、尿道）、神経系（即ち、脳および脊髄、および眼のような空間感覚器官）、および皮膚系（即ち、皮膚）である。さらに好ましくは、標的とされる細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、尿腺および眼の細胞から成る群から選択される。
【０１４３】
従って、本発明は、前記の製剤および投与経路、または当業者に既知の、特定の適用に適した代替経路を使用して、本発明のベクターを投与することを含んで成る、宿主における安定な遺伝子発現を得る方法、または宿主における遺伝子発現を調節する方法も提供する。ベクターまたは医薬組成物の「有効量」は、当業者に既知のいくつかの終末点を使用して監視しうる、宿主における所望効果を生じる量である。例えば、宿主細胞への有効な核酸転移を、治療効果（例えば、治療される疾患または症候に関係したいつかの症状の緩和）に関して、または宿主における転移遺伝子またはコード配列またはその発現のさらなる証拠（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンまたはサザンハイブリッド形成または転写アッセイを使用して、宿主細胞における核酸を検出するか、またはイムノブロット分析、抗体媒介検出または特殊化アッセイを使用して、転移された核酸によってコード化されたかまたはそのような転移によってレベルまたは機能において影響を受けたタンパク質またはポリペプチドを検出する）によって、監視することができる。このような特定のアッセイの一つとして、レポーター遺伝子またはマーカー遺伝子の発現についてのアッセイが含まれる。
【０１４４】
本発明の構築物はあらゆるベクター系に使用することができると考えられるが、ｒＡＡＶ粒子の使用を含む好ましい系を、医薬組成物の下記説明において例示的系として記載する。そのような組成物は、医薬的に許容される担体のような医薬的に許容される薬剤と混合したｒＡＡＶ粒子生成物の治療有効量を含んで成る。例示的担体物質は、注射に関しては水であり、好ましくは、哺乳動物に投与される溶液に一般的な他の物質を添加する。一般に、ｒＡＡＶ粒子治療化合物は、１つまたはそれ以上の生理学的に許容される薬剤と共に粒子を含んで成る組成物の形態である。中性緩衝生理食塩水、または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、適切な担体の例である。必要であれば、他の一般的な医薬的に許容される薬剤を含有することもできる。例えば、他の組成物は、緩衝剤または防腐剤を含有する場合もある。
【０１４５】
ｒＡＡＶ粒子医薬組成物は一般に、投与法への適合性によって選択される１つまたはそれ以上の医薬的および生理学的に許容される配合剤と混合した、治療的または予防的に有効な量のｒＡＡＶ粒子を含有する。好適な配合物質または医薬的に許容される薬剤は、酸化防止剤、防腐剤、稀釈剤（ｄｉｌｕｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ）、沈殿防止剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達賦形剤および稀釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔｓ）を包含するがそれらに限定されない。例えば、好適な賦形剤は、注射用水、生理食塩水または人口脳脊髄液であり、おそらくは非経口投与組成物に一般的な他の物質を添加される。中性緩衝生理食塩水、または血清アルブミンと混合した生理食塩水も、例示的賦形剤である。本明細書において使用される「医薬的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、医薬組成物としてのｒＡＶＶ粒子の送達を達成するかまたは増進するのに好適な配合剤を意味する。
【０１４６】
組成物における主要溶媒は、必然的に水性または非水性であり得る。さらに、賦形剤は、製剤のｐＨ、浸透性、粘性、透明性、色、滅菌性、安定性、溶解速度または臭いを改質するかまたは維持する他の配合物質も含有することができる。同様に、組成物は、ｒＡＶＶ粒子の放出速度を変化させるかまたは維持するか、またはｒＡＶＶ粒子の吸収または浸透を助長する付加的配合物質を含有することができる。
【０１４７】
全身的に投与する場合、本発明に使用される治療組成物は、発熱物質不含の経口的に許容される水溶液の形態にすることができる。ｐＨ、等張性、安定性などに関して、そのような医薬的に許容される溶液の製造は、当分野の技術の範囲である。
【０１４８】
本発明を実施するのに有用なｒＡＶＶ粒子組成物の治療製剤は、所望の純度を有する選択組成物を生理学的に許容される安定剤と混合することによって、保存用に製造することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．　Ｇｅｎｎａｒｏ発行、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　１９９０）。許容される安定剤は、好ましくは受容者に非毒性であり、好ましくは使用される用量および濃度において不活性であり、好ましくは、燐酸、クエン酸または他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸のような酸化防止剤；低分子量ポリベプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノ−スまたはデキストリンを包含する他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；および／またはＴｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなノニオン界面活性剤を包含する。
【０１４９】
最適な医薬処方は、意図する投与経路、送達形式および所望用量に依存して当業者によって決められる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｅａｓｔｏｎ，　ＰＡ　１８０４２，　ｐ．１４３５−１７１２，　１９９０）参照。
【０１５０】
治療に使用されるｒＡＶＶ粒子組成物の有効量は、例えば、ｒＡＶＶ粒子によって送達される遺伝子が使用されている適応症のような治療目的、投与経路、患者の状態に依存する。従って、療法士は、最良の治療効果を得るために必要とされる、用量の滴定（ｔｉｔｅｒ）および投与経路の変更を行う必要がある場合もある。一般に、臨床医は、所望の結果を得るトランスジーン用量に達するまで、組成物を投与する。従って、組成物を、単一用量として投与するか、または２つまたは３つの用量として（同じ量のｒＡＡＶ粒子を含有してもしなくてもよい）時間をかけて投与するか、または移植デバイスまたはカテーテルによって連続注入として投与することもできる。
【０１５１】
さらに試験を行うとともに、種々の患者の種々の疾患の治療に適した用量レベルに関する情報が得られ、当業者は、治療内容、治療されている疾患の種類、受容者の年齢および全身的健康状態を考慮して、適切な投与を確かめることができる。
【０１５２】
非経口注射に特に好適な賦形剤は滅菌蒸留水であり、蒸留水において、ｒＡＶＶ粒子組成物が適切に保存される滅菌等張性溶液として処方される。さらに他の製剤は、製剤の制御放出または持続放出を生じる注射可能微小球、生物腐食性粒子またはビーズ、またはリポソームのような物質を含有するｒＡＶＶ粒子組成物を包含し、従って、デポー注射剤として送達することができる。
【０１５３】
本発明の製剤は、当分野でよく知られている他の成分、例えば、非経口的に許容される防腐剤、緊張剤、補助溶媒、湿潤剤、錯体生成剤、緩衝剤、抗微生物剤、酸化防止剤および界面活性剤を含有することができる。例えば、好適な緊張増加剤は、アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム）、マンニトール、ソルビトール等を包含する。好適な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェニルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸等を包含するがそれらに限定されない。過酸化水素も防腐剤として使用することができる。好適な補助溶媒は、例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールである。好適な錯体生成剤は、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。好適な界面活性剤または湿潤剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート８０のようなポリソルベート、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール等を包含する。緩衝剤は、硼酸、クエン酸、燐酸、重炭酸またはＴｒｉｓ−ＨＣｌのような一般的な緩衝剤である。
【０１５４】
配合成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、生理学的ｐＨまたはそれより僅かに低いｐＨ、一般に約５〜約８のｐＨ範囲に組成物を維持するように使用される。
【０１５５】
医薬組成物は、吸入用に処方することもできる。例えば、ｒＡＶＶ粒子は、吸入用に乾燥粉末として処方することができる。または、ｒＡＶＶ粒子吸入溶液を、エアゾール送達用に液化噴射剤において処方することができる。さらの他の処方において、溶液を霧状にすることもできる。
【０１５６】
他のｒＡＶＶ粒子製剤は当業者に明らかであり、１つまたはそれ以上の治療剤と組み合わせたｒＡＶＶ粒子を含む組成物を包含する。種々の他の持続または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生物腐食性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射剤を配合する方法も当業者に既知である。
【０１５７】
投与法に関係なく、体重、体表面積または器官の大きさに従って治療効果を生じる遺伝子の送達によって、特定用量を算出することができる。前記の各製剤に関係する治療に適した用量を求めるのに必要な計算をさらに精密にすることは、当業者によって日常的に行われ、当業者によって日常的に行われる職務の範囲である。適切な用量は、適切な用量応答データを使用して確かめることができる。
【０１５８】
組成物の投与経路は既知の方法に従い、例えば、吸入、静脈内、腹膜内、大脳内（柔組織内）、大脳室内、筋肉内、眼内、動脈内または病巣内経路による注射または注入、またはカテーテルの使用を含む場合もある持続放出系によって投与される。
【０１５９】
これに関して、形質転換される細胞は、遺伝子転移の目的、例えば、治療される疾患状態に依存する。例えば、ｒＡＡＶ粒子を使用して、幹細胞、前駆細胞および赤血球系細胞を包含する有核細胞；ならびに、種々の白血球、例えば、リンパ細胞、好中球、好酸球、好塩基体、単球；組織特異性細胞、例えば、骨細胞、神経節細胞、上皮および内皮細胞、上衣細胞、細網内皮細胞、樹状および神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞等を包含する肺、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓組織、結合組織、骨組織に由来する細胞に、選択ヌクレオチド配列を送達することができる。本発明の構造は、腫瘍細胞および病原体感染細胞に、目的とする遺伝子を送達するのに有用であるとも考えられる。
【０１６０】
同じ用量計算および投与経路の考察および医薬製剤を、目的とする遺伝子の発現を変化させるのに使用されるエフェクターに適用できることも理解される。
【０１６１】
（実施例）
下記の非制限的実施例は、本発明の例示構築物の特定法および選択法ならびに合成および使用をさらに説明するものである。当業者は、これらは非制限的実施例であり、本発明は、遺伝子発現の調節に関して本明細書に記載したように使用しうる多くの他のエフェクター、アロステリック制御モジュールおよびベクターを提供する手段を開示していることを理解するであろう。
【０１６２】
実施例１
エフェクターの特定
アプタマーの進化および発現遺伝子の変更に使用されるエフェクターを特定する方法は、下記ステップを含む。第一ステップは、エフェクターの所望の特性の組の選択であり、所望の特性は、１つまたはそれ以上の下記特性を含む：
ａ）少なくとも１％のバイオアベイラビリティー、
ｂ）アロステリック制御モジュールを含む組織への生体内分布、
ｃ）細胞の核へと通過する能力、
ｄ）非薬剤相互作用、または制御可能な薬剤相互作用、
ｅ）使用される用量範囲での非毒性または許容される毒性、
ｆ）使用される用量範囲での非副作用または許容される副作用、
ｇ）トランスジーンの発現を調節する際に使用される用量範囲での薬理作用の不在または無視しうる薬理作用、
ｈ）アプタマーのインビトロでの進化に適した物理的特性。
選択特性は、エフェクターが、アプタマー進化、遺伝子発現の変更のためのアロステリック制御モジュールを使用するヒト消費および使用に好適であることを示す。第二に、選択されたエフェクター特性に関する情報を有する１つまたはそれ以上のデータベースにアクセスして、これらの特性を評価し、選択特性を有するエフェクターの組を特定する。次に、エフェクターを使用して、インビトロ進化によってアプタマーを進化させる。
【０１６３】
アプタマーのインビトロ進化に好適なエフェクターの特定をさらに補助する物理的特性は、下記の特性を包含するがそれらに限定されない。
【０１６４】
・高親和性アプタマーの特定のための相互作用部位を提供するのに充分な構造および官能基コンプレキシティ（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）；好ましくは、分子は、硬質、平面存在物である；
・分子進化法を実施することを可能にするレベルの、水溶液への溶解性；
・適切な電荷、即ち、核酸リガンドとの好ましくない相互作用を誘導する過剰数のイオン化しうる基の不足。
従って、高柔軟性、親油性分子は好ましくない。
【０１６５】
本発明に関して、制御しうる薬剤−薬剤相互作用は、薬剤の併用を避けることによって防止することができ、監視および用量調節の組合せによって減少しうる相互作用である。本発明に関して、使用される用量範囲における許容しうる毒性は、毒性でないか、または可逆的毒性を有するか、または所望の治療に照らして許容される用量におけるエフェクターの使用を含む。本発明に関して、使用される用量範囲における許容しうる副作用は、連続使用によって緩和するかまたは停止する副作用、および他の手段によって制御しうる（例えば、他の薬剤の使用、食事などによって防止または抑制される）副作用を含む。
【０１６６】
前記のようなデータベースを使用して、潜在的エフェクターとしての評価のために下記の分子を特定した。
【０１６７】
【表１】
2004504806.tif 000003
【０１６８】
【化１】
2004504806.tif 000004
【０１６９】
【表２】
2004504806.tif 000005
【０１７０】
【化２】
2004504806.tif 000006
【０１７１】
【表３】
2004504806.tif 000007
【０１７２】
【化３】
2004504806.tif 000008
開発状況：　　　　　　　　　Ｄｏｎｇ　Ｗａ、段階ＩＩ終了、開発中
基準：
生体利用性：　　　　　　　　経口吸収
生体分布：　　　　　　　　　筋肉を含む器官への高分布
細胞内局在性：　　　　　　　細胞内、細菌内
毒性／薬剤相互作用：　　　　充分に許容される、極めて低い光毒性
他の薬理活性：　　　　　　　抗感染性、抗微生物性
アプタマーに関する機能性：　塩基性、疎水性
合成／スケールアップ：　　　ヨーロッパおよび韓国において、段階ＩＩに関して充分
追加説明：　　　　　　　　　ＵＳ　５４９６９４７
【０１７３】
【化４】
2004504806.tif 000009
開発状況：　　　　　　　　　Ｂａｙｅｒ、段階ＩＩ　１９９３、より有効な類　　　　　　　　　　　　　　似体に関する特許
基準：
生体利用性：　　　　　　　　経口吸収（Ｔｍａｘ　１．３時間、半減期１１．４時間）
細胞内局在性：　　　　　　　細胞内、細菌内
毒性／薬剤相互作用：　　　　ヒトにおいて異常が認められない
他の薬理活性：　　　　　　　抗感染性、抗微生物性
アプタマーに関する機能性：　塩基性、疎水性
合成／スケールアップ：　　　段階ＩＩ供給
追加説明：　　　　　　　　　ＥＰ　５２０２４０
【０１７４】
【表４】
2004504806.tif 000010
【０１７５】
【表５】
2004504806.tif 000011
【０１７６】
【表６】
2004504806.tif 000012
【０１７７】
【表７】
2004504806.tif 000013
【０１７８】
【化５】
2004504806.tif 000014
現在、好ましいエフェクターは、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を包含する。これらの化合物は良好な経口生体利用性を有し、非毒性であり、ウイルス標的に対する以外に既知の活性を有さない。
【０１７９】
実施例２
インビトロ進化
例示的インビトロ進化法を以下に説明する。核酸のランダムプールを合成し、それにおいて、核メンバーは、２つの部分を含有する：ａ）１つの部分は、規定（既知）ヌクレオチド配列を有する領域から成り；ｂ）第二部分は、縮重（ランダム）配列を有する領域から成る。既知のヌクレオチド配列は、いくつかの利益／用途を与える。例えば、ある種のヌクレオチド配列は、所定のエフェクターに結合することが既知であるか、または結合すると考えられている。または、既知の配列は、エフェクター結合のために選択された分子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成およびＰＣＲ増幅を促進するかまたは供給する。さらの他の局面において、この配列を使用して、クローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位を導入することができる。ランダム配列は、完全にランダムになるように形成することができ（４つの各ヌクレオチドが、ランダム領域内のいずれの位置でも表される）、または縮重が部分的であることができ（前記ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ、１９９２）、論理設計（ｒａｔｉｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ）の使用を含む。被験核酸における配列変化は、選択／増幅の反復の前またはその間に、突然変異誘発によって導入するかまたは増加させることができる。所望の活性（例えば、エフェクター結合および触媒作用）を促進するコンホメーションに核酸を折りたたむことを確実にする条件において、核酸のランダムライブラリーの、インキュベーションを行う。インキュベーション後、核酸を相補的ＤＮＡに変換する（核酸の出発プールがＲＮＡである場合）。
【０１８０】
所望の特性を有する核酸を、種々の方法によって核酸の集団の残りから分離するかまたは分別する。例えば、フィルター結合アッセイを使用して、所望のエフェクターに結合しているフラクションを、結合していないフラクションから分離することができる。エフェクター（例えば）によって結合している集団のフラクションは、所望される集団（活性プール）である。一般に、エフェクターおよびＲＮＡの結合は、アプトマーが特異的に結合するかまたは反応するエフェクターを含有するアフィニティーマトリックスに、ＲＮＡプールまたは混合物を適用することによって評価される。非結合ＲＮＡ種は除去するかまたは洗い流し、特異的結合種はエフェクターから溶離して、進化工程にさらに使用する。新しいＤＮＡ片（ＰＣＲのための新規オリゴヌクレオチドプライマー結合部位、およびクローニングのための制限部位を有する）を活性プール中の分子の末端に導入して（前の選択サイクルからの汚染の機会を減少させる）、ＰＣＲ増幅および（必要であれば）次の進化のサイクルを促進する。
【０１８１】
増幅は、溶離された種のＤＮＡへの逆転写、次に、ポリメラーゼ連鎖反応によって行うのが好ましい。増幅工程の結果、多数の選択されたＲＮＡコード化ＤＮＡ分子が生成される。所望の特性を有する核酸の最終プール（即ち、エフェクターに結合するアプタマー）を、プラスミドベクターにクローン化し、細菌宿主に形質転換する。次に、組換えプラスミドを形質転換細菌から分離し、ＤＮＡ配列法を使用してクローンを特定することができる。
【０１８２】
選択および増幅の多くのサイクルは、エフェクターに堅く特異的に結合するＲＮＡ種の選択的増加を生じなければならない。選択および増幅のサイクルは、所望の目標に達するまで繰り返される。現在の技術および材料を使用した場合、サイクルは一般に５回またはそれ以上繰り返される。最も一般的な場合、サイクルの反復の際に、エフェクターへのＲＮＡの結合強度の有意な向上が得られなくなるまで、選択および増幅の進化ステップを継続する。
【０１８３】
しかし、ある場合には、単一ＲＮＡを特定するまでインビトロ進化の反復ステップを繰り返すことは必ずしも望ましくない。ＲＮＡプールは、多くの保存配列および、核酸分子のエフェクターへの親和性に有意な影響を与えずに置換または付加しうる多くの配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーを含む場合がある。単一アプタマーを特定する前に工程を終了することによって、多くの好適なＲＮＡの配列を決定することができる。
【０１８４】
特異性をさらに向上させるために、負の選択法も使用することができる。負の選択法は、インビトロ進化工程の前、その間、またはその後に行うことができる。負の選択は、緊密に関連しているが異なるエフェクターを識別する能力を付与する。従って、負の選択を導入して、エフェクターに高特異性を有するが、エフェクターのファミリーの他のメンバーまたは他の構造的類似分子を認識しないアプタマーを特定することができる。例えば、テオフィリンに関するアプタマーの進化において、カフェインを使用して、構造的類似分子カフェインと交差反応するアプタマーを逆選択し、除去することができる。
【０１８５】
１つの進化後法は、所望エフェクターに対して、既に進化させたプールにおいて負の選択を行う方法である。この方法は、エフェクターファミリーメンバー、または所望エフェクターに構造的に類似した分子を、負の選択標的として使用することを含む。選択された集団を、負の選択標的を含有するアフィニティーカラムに通し、負の選択標的に結合する核酸を、選択プールから除去する。または、選択された集団を、所望エフェクターを含有するアフィニティーカラムに通し、次に、負の選択標的を添加することによってプールを攻撃する。好ましくは、この方法は、負の選択標的、およびエフェクターを使用して進化した最新ラウンド高進化プールを使用して、２回または３回の負の選択を実施することも含む。負の選択標的へのある種の配列の結合を使用して、進化させたプールからそれらの配列を除くことができる。この方法は、エフェクターおよび類似構造特性を有する分子の両方に高親和性を示す数百から数千の核酸配列を素早く除去することを可能にする。
【０１８６】
「分離」または「分別」は、選択ＲＮＡを、未反応ＲＮＡ候補混合物の残りから分離するあらゆる方法を包含する。分離は、当分野で既知の種々の方法によって行うことができる。フィルター結合、サイズ分離、アフィニティークロマトグラフィー、液体−液体分離、濾過、ゲルシフト、密度勾配遠心分離は、好適な分離法の例である。触媒的に不活性なＲＮＡに残存するＰＣＲプライミング部位の存在によって、分離を行うこともできる。平衡分離法も使用することができる。簡単な分離法は、液体から固体を分離するあらゆる方法、例えば、油使用および不使用の遠心分離、膜分離、および単なる洗浄を包含する。ＲＮＡは、特異性抗体またはリガンドを使用してエフェクターから特異的に溶離することもできる。分離法の選択は、エフェクターおよびＲＮＡの特性に依存し、当業者に既知の原理および特性によって行うことができる。
【０１８７】
増幅法は、分子または分子の種類のコピーの量または数を増加させるどのような方法または方法ステップの組合せであってもよい。好ましい実施形態において、被験混合物のメンバーを分離した後に増幅が起こり、増幅されるのは、所望生成物を伴う促進核酸である。例えば、ＲＮＡ分子の増幅は、一連の３つの反応によって行うことができる：選択ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを形成するための逆転写の使用、各ｃＤＮＡのコピー数を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応の使用、および選択ＲＮＡと同じ配列を有するＲＮＡ分子を得るためのｃＤＮＡコピーの転写。当業者によって理解されるように、直接的ＤＮＡ複製、直接的ＲＮＡ増幅などを包含する当分野で既知のあらゆる適切な反応または反応の組合せを使用することができる。増幅法は、増幅混合物の部分が、増幅前の混合物中の種々の配列の部分を本質的に表すようにしなければならない。
【０１８８】
実施例３
アロステリック制御モジュール
アロステリック制御モジュールは、触媒ドメインと、および前記のように進化させた、アプタマーとアフェクターの相互作用がアロステリック制御モジュールの活性を変化させるように選択されたアプタマーとを含有する。エフェクターとアプタマーとの相互作用は、触媒ドメインの触媒活性の変化を生じうる。成分の選択に依存して、その変化は、モジュールの触媒ドメインの活性の増加または減少を生じうる。
【０１８９】
リボイザイム、リボザイム様分子およびそのような分子の部分を使用して、本発明の触媒ドメインを形成する。本発明に有用なリボザイムは、ハンマーヘッド、アックスヘッド、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、ニューロスポラ、自己スプライシングイントロン（グループＩおよびグループＩＩを包含する）、イモリ（ｎｅｗｔ）サテライトリボザイム、テトラヒメナリボザイム、リガーゼ、ペプチドリガース、ホスファターゼおよびポリメラーゼの種類における分子であるがそれらに限定されない。これらの分子の核酸または分子を、リボザイム様合成非自然進化配列の形成の開始点として使用することができる。
【０１９０】
アロステリック制御モジュールは、基質ドメイン（例えば、自己開裂触媒ドメインの場合）または認識ドメイン（触媒活性が向けられるべき部位の認識を補助する）を包含する付加的な成分またはドメインを含有することができる。アロステリック制御モジュールは、触媒ドメインおよびアプタマーを構造架橋によって連結するように設計することもでき、それにおいて、アプタマーとエフェクターの相互作用は、架橋を変化させ、その結果、触媒ドメインの触媒活性が変化する（ＳｏｕｋｕｐおよびＢｒｅａｋｅｒ、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６：３５８４−３５８９，　１９９９参照）。
【０１９１】
次に、アロステリック制御モジュールをインビトロおよび／またはインビボにおいて試験する。エフェクター活性化発現制御系における最適構造は、エフェクターの不存在下の発現の最大阻害、およびエフェクターの存在下の発現の最大増加を生じる。エフェクター不活性化発現制御系においては、最適構造は、エフェクターの存在下の発現の最大阻害、およびエフェクターの不存在下の発現の最大増加を生じる。
【０１９２】
本発明に限定されないが、触媒ドメインは、Ｕｓｍａｎら、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１０９：７８４５，　１９８７；Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１８：５４３３，　１９９０；およびＷｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２３：２６７７−２６８４，　１９９５に記載されているようなＲＮＡの一般的化学合成の手順によって合成することができる。詳細はここで繰り返さないが、そのような手順は、一般的な核酸保護基およびカップリング基、例えば、５’末端におけるジメトキシトリチルおよび３’末端におけるホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）の使用を含む。
【０１９３】
さらに、分子の触媒活性は、Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ　ＷＯ９３／２３５６９、およびＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ　ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐ．　Ｓｅｒ．　２７：１５−６，　１９９２；Ｔａｉｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９：５１２５−３０，　１９９１；Ｖｅｎｔｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２１：３２４９−５５，　１９９３；およびＣｈｏｗｒｉａら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９：２５８５６，　１９９４に記載されているように最適化することができる。詳細はここで繰り返さないが、リボザイム結合アームの長さを変化させるか、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止し、および／またはそれらの酵素活性を増加させる改質（塩基、糖および／またはホスフェート）を有するリボザイムを化学的に合成することを含む（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際特許出願公開第ＷＯ９２０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４，　５６５，　１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３，　３１４，　１９９１；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　１７，　３３４，　１９９２；Ｕｓｍａｎら、国際特許出願公開第ＷＯ９３１５１８７；およびＲｏｓｓｉら、国際特許出願公開第ＷＯ９１０３１６２号；およびＳｐｒｏａｔ、米国特許第５３３４７１１号参照。これらは全て、酵素ＲＮＡ分子の塩基、ホスフェートおよび／または糖成分に行うことができる種々の化学改質を記載している）。細胞におけるそれらの有効性を高める改質、およびＲＮＡ合成時間を短縮し化学的条件を減少させるステムループ構造からの塩基の除去を行うことができる。
【０１９４】
実施例４
アプタマーの進化および選択
本発明の１つの実施形態は、実施例１によるエフェクターの特定、ならびにアプタマーの進化および選択を含む。アプタマー進化は、逆転写およびＰＣＲ増幅に必要な定常部を有するランダム配列一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のプールまたは混合物を先ず用意することを含む。一般に、個々のｓｓＲＮＡは、少なくとも２０個のヌクレオチドを有するが、より少ないヌクレオチドを使用することもできる。次に、ｓｓＲＮＡの混合物をエフェクターに接触させる。次に、エフェクターに結合するＲＮＡを、エフェクターに結合しないプール中のＲＮＡの残りから分離する。分離したＲＮＡを増幅して、ＤＮＡを形成し、増幅したＤＮＡを使用して、エフェクターに結合するＲＮＡの富化混合物を形成する。エフェクター認識、分離および増幅ステップを、必要に応じて１つまたはそれ以上のサイクルで行って、エフェクターに最もよく結合するアプタマーとして、１つまたはそれ以上のＲＮＡを特定する。
【０１９５】
次に、進化させたアプタマーをアロステリック制御モジュールに使用する。アロステリッック制御モジュールに使用するアプタマーの選択は、先ず、アプタマーを触媒ＲＮＡに結合させてアロステリック制御モジュールを形成し、次に、エフェクターとアプタマーとの相互作用が触媒ＲＮＡに活性を変化させるアロステリック制御モジュールを特定する。この分析は、インビボまたはインビトロで行われる。
【０１９６】
実施例５
テオフィリンに関するインビトロアプタマー進化および選択
この実施例は、テオフィリンに特異的なアプタマーを含んで成るアロステリック調節性ハンマーヘッドリボザイムの進化について説明する。テオフィリンは、特に、１９４０年以来ＦＤＡによる使用が許可されており、その安全性および毒性プロフィールは、許容しうるものであり、よく知られているという理由によって、エフェクターとして選択された。Ｊｅｎｉｓｏｎらは、以前に、テオフィリン結合アプタマーを特性決定し、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：１４２５−１４２９，　１９９４、それに対してＺｉｍｍｅｒｍａｎらはその二次構造を指定している、Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃｔ．　Ｂｉｏｌ．　４：６４４−６４９，　１９９７。ハンマーヘッド触媒ドメインをテオフィリンアプタマードメインに連結する２つのＲＮＡ鎖、いわゆる「コミュニケーションモジュール」は、６個のみのヌクレオチドを有し、完全にランダム化された。このライブラリーのコンプレキシティーは、１．７×１０６各分子である。
【０１９７】
２ｎｍｏｌの合成一本鎖ＤＮＡ鋳型（配列番号１、図１）を使用して選択を開始し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってそれを二本鎖形にした。
【０１９８】
【化６】
2004504806.tif 000015
５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃においてｐＨ９．０）、０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ、および２ｎｍｏｌの２つのプライマー、Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｔ７−１１：
５’ＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ　ＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣ３’（配列番号２）
およびＲｅｖｅｒｓｅＴ７−１１：
５’ＧＡＡＧＴＴＣＴＡＡＴＣ　ＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＣＧＴＴＴ３’（配列番号３）
を含有する５００μＬの反応容量において、５ラウンドのＰＣＲを実施した。
【０１９９】
各ＰＣＲサイクルのパラメーターは、９３℃において３０秒、５５℃において３０秒、および７２℃において１分であった。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ鋳型に関するプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）部位を有する得られた二本鎖ＤＮＡを、エタノール沈殿によって濃縮した。４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃においてｐＨ８．０）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭ　Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）、０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、５ｍＭ　ＤＴＴ、４００ＵのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼおよび４ｍＭ　ＮＴＰを含有する５００μＬの反応容量中、３７℃で一晩にわたって実施したインビトロ転写に、約２５％のＤＮＡを使用した。転写後の混合物中のＤＮＡ鋳型を、短時間ＤＮＡｓｅ　Ｉ処理（２０Ｕ／５００μＬ）によって、３７℃で１５分間にわたって除去した。ステム−ＩＩにおいてランダム配列領域を有するリボザイムライブラリーを、変性条件下に（変性ＰＡＧＥ）、８％のポリアクリルアミドゲル上に転写ＲＮＡを通すことによって分離した。
【０２００】
テオフィリンに反応して開裂しなかったリボザイムを、リボザイム開裂緩衝液（ＲＺＣＬ緩衝液：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ７．５）および１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中で２５℃においてこのＲＮＡをインキュベーションし、８５℃で３０秒間インキュベーションすることを３０分間隔で挿入することによって、除去した。この負の選択は、５サイクルの熱挿入で行った。リガンド非依存性自己開裂に耐性のＲＮＡ集団は、変性ＰＡＧＥによって分離した。リガンド依存性開裂耐性ＲＮＡ集団の正の選択は、２００μＭのテオフィリンを含有するＲＺＣＬ緩衝液中で２５℃において５分間にわたってこのＲＮＡをインキュベーションして、リボザイムのテオフィリン依存性開裂を促進することによって行った。自己開裂後に得られた５’フラグメントの集団を、変性ＰＡＧＥによって分離した。次に、５０ｍＭ　ＫＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．０）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ｄＮＴＰ、１０Ｕの鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、および５００ｐｍｏｌのＲｅｖｅｒｓｅ　Ｔ７−１１プライマーを含有する３０μＬの反応容量における４２℃で３０分間の逆転写のための鋳型として、５’フラグメントＲＮＡ集団を使用した。得られたｃＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として使用して、インビトロ選択の次のラウンドのためのＲＮＡを進化させる鋳型を得た。
【０２０１】
７つの選択サイクルを実施し、その間に、正の選択ステップにおけるテオフィリンおよびＭｇＣｌ２の濃度を、それぞれ２００から２０ｍＭおよび１０から２ｍＭに徐々に減少させた。７つのサイクル後に、富化集団は、テオフィリン依存性自己開裂活性を示した。得られたＰＣＲ生成物を、ゲル濾過およびエタノール沈殿によって精製した。精製したＰＣＲ生成物（０．１ｐｍｏｌ）を、Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ　Ｂｌｕｎｔ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造会社によって供給されたプロトコールに従って使用して、ＥｃｏＲ　Ｖ部位においてｐＴ７Ｂｌｕｅ−３　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）にクローン化した。連結反応混合物を、標準プロトコールを使用して、ＮｏｖａＢｌｕｅ　Ｓｉｎｇｌｅｓ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。形質転換細胞中のプラスミドを分離し、Ｕ１９ベクターに基づくプライマー（配列番号４）（５’ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＴ３’）を使用して配列し、さらに分析した。
【０２０２】
開裂に関してテオフィリンに反応する１つのリボザイムＡＴ−５０の配列の例が、図８に示されており、下記配列（配列番号５）を有する：
【０２０３】
【化７】
2004504806.tif 000016
【０２０４】
リボザイムＴＡ−５０の自己開裂能力は、テオフィリンの存在にかなり依存する（図９）。ＴＡ−５０リボザイムの最も高い開裂活性は、１０から５０μＭのテオフィリン濃度において観察された。テオフィリンのこの濃度は、治療的に得られる範囲であるので、テオフィリン摂取に反応して遺伝子発現を調節するために、ＴＡ−５０または同様の性能特性を有する他のリボザイムを生体内適用しうると考えられる。
【０２０５】
実施例６
アロステリック制御モジュ−ルのエフェクター不活性化
下記の手順は、特定されたエフクターの存在下に、不活性化されるかまたは阻害される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールを製造する。エフェクターの特定を実施例１のように行い、次に、下記のステップを含むアプタマーの進化および選択を行う：
ａ）各々のｓｓＲＮＡがアプタマー、提案された触媒ドメインおよび逆転写とＰＣＲ増幅に適する１またはそれ以上の定常領域を含む、ランダム配列ｓｓＲＮＡのプールを調製するステップ、
ｂ）触媒活性を持つＲＮＡを特定するステップ、
ｃ）触媒的に活性なＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を形成するステップ、
ｄ）増幅したＤＮＡを転写して触媒的に活性なＲＮＡの富化混合物を形成するステップ、
ｅ）混合物をエフェクターに接触させるステップ、
ｆ）エフェクターに結合するが、エフェクターに結合したあと触媒活性を保持していないＲＮＡを選択するステップ、
ｇ）選択したＲＮＡを増幅して、コードするＤＮＡ分子を形成するステップ、
ｈ）増幅したＤＮＡを転写して、エフェクターの存在下で不活性化されるまたは阻害される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの富化混合物を形成するステップ、および
ｉ）ｂ）からｈ）までの段階を必要に応じて１またはそれ以上のサイクルで実施して、エフェクターと選択したアロステリック制御モジュールを遺伝子発現の調節において使用したとき、エフェクターを認識し、エフェクターと結合し、エフェクター相互作用して、且つエフェクター結合によって不活性化または阻害される１またはそれ以上のアロステリック制御モジュールを特定するステップ。
【０２０６】
選択的実施形態において、アロステリック制御モジュールの進化は下記のステップを含む：
ａ）各々のｓｓＲＮＡがアプタマー、提案された触媒ドメインおよび逆転写とＰＣＲ増幅に適する１またはそれ以上の定常領域を含む、ランダム配列ｓｓＲＮＡのプールを調製するステップ、
ｂ）混合物をエフェクターに接触させるステップ、
ｃ）エフェクターに結合しているが、エフェクターに結合したあと触媒活性を示さないＲＮＡを選択するステップ、
ｄ）選択したＲＮＡを増幅してＤＮＡ分子を生成するステップ、
ｅ）増幅したＤＮＡを転写してＲＮＡの混合物を形成するステップ、
ｆ）エフェクターの不在下で触媒作活性を示すＲＮＡを１またはそれ以上のアロステリック制御モジュールとして選択するステップ、
ｇ）選択したＲＮＡを増幅するステップ、
ｈ）増幅したＤＮＡを転写して、エフェクターの存在下で不活性化されるまたは阻害される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの富化混合物を形成するステップ、および
ｈ）増幅したＲＮＡを転写して、エフェクターの存在下に不活性化されるかまたは阻害される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの強化混合物を形成するステップ、および
ｉ）ｂ）からｈ）までの段階を必要に応じて１またはそれ以上のサイクルで実施して、エフェクターと選択したアロステリック制御モジュールを遺伝子発現の調節において使用したとき、エフェクターを認識し、エフェクターと結合し、相互作用して、且つエフェクター結合によって不活性化または阻害される１またはそれ以上のアロステリック制御モジュールを特定するステップ。
【０２０７】
１つの実施形態において、「触媒活性」は自己開裂活性であり、自己開裂アロステリック制御モジュールは、エフェクターの不存在下に、目的とする遺伝子の発現を阻害するか減少させるのに使用される。他の実施形態において、触媒活性はリガーゼ活性またはスプライシング活性を含む。
【０２０８】
実施例７
アロステリック制御モジュールのエフェクター活性化
下記の手順は、特定されたエフクターの存在下に活性化される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールを製造する。エフェクターの特定を実施例１のように行い、次に、下記のステップを含むアプタマーの進化および選択を行う：
ａ）各ｓｓＲＮＡが、アプタマー、指定触媒ドメイン、および逆転写およびＰＣＲ増幅に好適な１つまたはそれ以上の定常部を有して成る、ランダム配列ｓｓＲＮＡの混合物を用意するステップ；
ｂ）エフェクターの不存在下に触媒活性を示さないＲＮＡを特定するステップ；
ｃ）特定したＲＮＡを増幅して、コードするＤＮＡ分子を形成するステップ；
ｄ）増幅したＤＮＡを転写して、ＲＮＡの強化混合物を形成するステップ；
ｅ）混合物をエフェクターに接触させるステップ；
ｆ）エフェクターに結合し、エフェクターに結合した際に触媒活性を示すＲＮＡを特定するステップ；
ｇ）特定したＲＮＡを増幅して、コードするＤＮＡ分子を形成するステップ；
ｈ）増幅したＤＮＡを転写して、エフェクターの存在下に活性化される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの強化混合物を形成するステップ；および
ｉ）ステップｂ）からｈ）を、必要に応じて１つまたはそれ以上のサイクルで実施して、エフェクターを認識し、結合し、相互作用する１つまたはそれ以上のアロステリック制御モジュールであって、エフェクターおよび選択アロステリック制御モジュールを遺伝子発現の調節に使用した場合にエフェクター結合によって活性化されるかまたは強化される、１つまたはそれ以上のアロステリック制御モジュールを特定するステップ。
【０２０９】
選択的実施形態において、アロステリック制御モジュールの進化は下記のステップを含む：
ａ）各ｓｓＲＮＡが、アプタマー、指定触媒ドメイン、および逆転写およびＰＣＲ増幅に好適な１つまたはそれ以上の定常部を有して成る、ランダム配列ｓｓＲＮＡのプールを用意するステップ；
ｂ）プ−ルをエフェクターに接触させるステップ；
ｃ）エフェクターに結合し、エフェクターに結合している間に触媒活性を示すＲＮＡを特定するステップ；
ｄ）特定したＲＮＡを増幅して、コードするＤＮＡ分子を形成するステップ；
ｅ）増幅したＤＮＡを転写して、エフェクターの存在下に触媒活性を有するＲＮＡび強化混合物を形成するステップ；
ｆ）エフェクターの不存在下に触媒的に不活性なＲＮＡを選択するステップ；
ｇ）選択したＲＮＡを増幅して、コードするＤＮＡ分子を形成するステップ；
ｈ）増幅したＲＮＡを転写して、エフェクターの存在下に活性化される触媒活性を有するアロステリック制御モジュールの強化混合物を形成するステップ；および
ｉ）ステップｂ）〜ｈ）を、必要に応じて１つまたはそれ以上のサイクルで実施して、エフェクターを認識し、結合し、相互作用する１つまたはそれ以上のアロステリック制御モジュールであって、エフェクターおよび選択アロステリック制御モジュールを遺伝子発現の調節に使用した場合にエフェクター結合によって活性化されるかまたは強化される、１つまたはそれ以上のアロステリック制御モジュールを特定する。
【０２１０】
１つの実施形態において、「触媒活性」は自己開裂活性であり、アロステエリック制御モジュールの自己開裂は、目的とする遺伝子をコードする機能ｍＲＮＡを形成する。他の実施形態において、触媒活性はリガーゼ活性またはスプライシング活性を含む。
【０２１１】
実施例８
代替的エフェクター選択法
エフェクターを選択する代替法は、下記のステップを含む：
ａ）遺伝子の発現の調節に使用するのに好適なアロステリック制御モジュールを用意するステップ；
ｂ）アロステリック制御モジュールを、１つまたはそれ以上のエフェクターに接触させるステップ；および
ｃ）アロステリック制御モジュールとエフェクターとの相互作用が、アロステリック制御モジュールの触媒活性を変化させるか否かを確定するステップ。
【０２１２】
エフェクターであることが知られていない分子を、アロステリック制御モジュールと組み合わせて使用して、目的とする遺伝子の発現を特異的に変化させうるかを確定する他の方法は、下記のステップを含む：
（ａ）各細胞が、
ｉ）アロステリック制御モジュール、および
ｉｉ）検知可能なシグナルを生じ、プロモーターに結合し、プロモーターの制御下にあるリポーター遺伝子、
をコードするＤＮＡ構造を有して成る、所定の数の真核細胞を含有する試料を、分子が、目的とする遺伝子のモジュレーターとして作用しうる場合、検知可能なシグナルをリポーター遺伝子によって生じさせる条件下に、
被験分子に接触させるステップ；
（ｂ）（ａ）において生じたシグナルの量を定量的に測定するステップ；
（ｃ）（ｂ）において測定したシグナルの量を、被験分子の不存在下に生じ検知されたシグナルの量、または（ａ）における試料を他の分子に接触させた際に生じ検知されたシグナルの量と比較し、それによって、リポーター遺伝子によって生じた検知可能なシグナルの量を変化させる被験分子をエフェクターとして特定し、それによって、被験分子が、目的とする遺伝子の発現を特異的に変化させるかを確定するステップ。
【０２１３】
実施例９
誘導可能な遺伝子発現
図は、遺伝の発現を調節するこの技術のいくつかの特定の実施形態の模式図である。系の有用性は、直接的な医学用途を越えて、より基本的な研究用途、診断用途、および環境試験用途に拡げることができる。
【０２１４】
１つの実施形態において、ウイルスまたは非ウイルスベクターによって細胞に導入される、エフェクター反応性アロステリック制御モジュールおよび目的とする遺伝子を選択することができる。アロステリック制御モジュールが自己開裂触媒ドメインを含む場合、エフェクターとアロステリック制御モジュールとの相互作用は、目的とする遺伝子の発現を生じる。エフェクターの不存在において、ｍＲＮＡは非翻訳性である。系からエフェクターを除去した際に、アロステリック制御モジュールは活性コンホメーションに戻らなければならず、発現レベルは、非翻訳性ｍＲＮＡの存在によって減少する。
【０２１５】
選択的実施形態において、ウイルスまたは非ウイルスベクターによって細胞に導入される、エフェクター反応性アロステリック制御モジュールおよび目的とする遺伝子を選択することができる。アロステリック制御モジュールが自己開裂触媒ドメインを含む場合、エフェクターとアロステリック制御モジュールとの相互作用を、エフェクターの存在下のｍＲＮＡの不活性化および目的とする遺伝子の非発現を生じるように設計することができる。エフェクターの不存在において、ｍＲＮＡは翻訳性である。
【０２１６】
他の実施形態において、ウイルスまたは非ウイルスベクターによって細胞に導入される、エフェクター反応性アロステリック制御モジュールおよび目的とする遺伝子を選択することができる。アロステリック制御モジュールが自己スプライシング触媒ドメインを含む場合、エフェクターとアロステリック制御モジュールとの相互作用は、目的とする遺伝子の発現を生じる。エフェクターの不存在において、ｍＲＮＡは非翻訳性である。
【０２１７】
選択的実施形態において、ウイルスまたは非ウイルスベクターによって細胞に導入される、エフェクター反応性アロステリック制御モジュールおよび目的とする遺伝子を選択することができる。アロステリック制御モジュールが自己スプライシング触媒ドメインを含む場合、エフェクターとアロステリック制御モジュールとの相互作用を、ｍＲＮＡの不活性化および目的とする遺伝子の非発現を生じるように設計することができる。エフェクターの不存在において、ｍＲＮＡは翻訳性である。
【０２１８】
ＤＮＡ構造は、構成プロモーターの制御下に配置される、調節可能なアロステリック制御モジュール（例えば、自己開裂フォーマット）を含みうることは理解される。構造は、目的とする遺伝子のためのコード領域、終止コドンおよびポリ（Ａ）テールを含むことができる。細胞へのベクターの導入は、アロステリック制御モジュールおよび遺伝子の両方をコードするｍＲＮＡを形成する。アロステリック制御モジュールがエフェクターの不存在下に活性である場合、ｍＲＮＡは触媒ドメインによって開裂して、エキソ分解攻撃に使用しうる部分を生じ、即ち、ｍＲＮＡは不活性化される。エフェクターが投与され、細胞に導入された場合、アロステリック制御モジュールは不活性になり、ｍＲＮＡは正常に翻訳される。従って、遺伝子発現は、アロステリック制御モジュールの誘導可能な制御下に置かれる。
【０２１９】
特許、特許出願および公開を含む本明細書に引用した全ての文献は、全体として引用によりここに援用する。
【０２２０】
好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、好ましい実施形態の変化形を製造し使用することができ、本明細書に特に説明した以外の方法で本発明を実施しうることは当業者に明らかである。本発明は、そのような変化形および代替的方法も包含するものとする。従って、本発明は、特許請求の範囲によって規定される本発明の意図および範囲に含まれる全ての変更を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
自己開裂性ＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。
【図２】
自己開裂性ＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。
【図３】
自己スプライシングＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。
【図４】
構築されたイントロン内に自己スプライシングＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する図式的表示である。
【図５】
自己スプライシングＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。
【図６】
スプライセオソーム構築に必要なイントロンの領域に挿入された自己スプライシングＲＮＡドメインを含むアロステリック制御モジュールに関する本発明の図式的表示である。
【図７】
ランダム化ヌクレオチドのハンマーヘッドリボザイムへの隣接伸張を通じて接続されたテオフィリン結合アプタマーのステム−ループ構造を含むＲＮＡテンプレート１の二次構造を示す。
【図８】
７回のサイクル後に選択した、ＲＮＡ配列ＴＡ−５０の二次構造を示す。
【図９】
テオフィリンの存在下でのＴＡ−５０の自己開裂能力を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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