(57)【要約】本発明は分裂促進活性を欠く抗ＣＤ２８抗体（サイレント抗ＣＤ２８抗体）、それを製造する方法、それを含有する組成物、ならびに免疫抑制方法、Ｔ細胞寛容誘導方法、および臓器および／または組織移植拒絶治療法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイレント抗ＣＤ２８抗体。
【請求項２】
キメラ抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ヒト化抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項４】
配列番号２または配列番号４記載のアミノ酸配列を含む可変領域を有する請求項１記載の抗体。
【請求項５】
配列番号２および配列番号４記載のアミノ酸配列を含む可変領域を有する請求項１記載の抗体。
【請求項６】
配列番号６または配列番号８記載のアミノ酸配列を含む可変領域を有する請求項１記載の抗体。
【請求項７】
配列番号６および配列番号８記載のアミノ酸配列を含む可変領域を有する請求項１記載の抗体。
【請求項８】
請求項１記載の抗体をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１０記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
サイレント抗ＣＤ２８抗体の発現に適した条件下に請求項１１記載の宿主細胞を培養し、発現した抗体を当該培養物から回収することを含むサイレント抗ＣＤ２８抗体の製造法。
【請求項１４】
サイレント抗ＣＤ２８抗体の発現に適した条件下に請求項１２記載の宿主細胞を培養し、発現した抗体を当該培養物から回収することを含むサイレント抗ＣＤ２８抗体の製造法。
【請求項１５】
請求項８記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入し、該宿主細胞をサイレント抗ＣＤ２８抗体の発現に適した条件下に培養し、次いで、発現した抗体を当該培養物から回収することを含むサイレント抗ＣＤ２８抗体の製造法。
【請求項１６】
当該ポリヌクレオチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選択される少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１０記載の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞をサイレント抗ＣＤ２８抗体の発現に適した条件下に培養し、次いで、発現した抗体を当該培養物から回収することを含むサイレント抗ＣＤ２８抗体の製造法。
【請求項１８】
請求項１記載のサイレント抗ＣＤ２８抗体および医薬的に許容し得る成分を含む医薬組成物。
【請求項１９】
患者にＴ細胞寛容を誘導する方法であって、当該患者にＴ細胞寛容を誘導するために、請求項１記載の抗体の有効量投与を含む方法。
【請求項２０】
当該投与がさらにもう１種の免疫抑制剤を投与することを含む請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
患者に免疫抑制力を与える方法であって、当該患者に免疫抑制力を与えるために、請求項１記載の抗体の有効量投与を含む方法。
【請求項２２】
当該投与がさらにもう１種の免疫抑制剤を投与することを含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
患者の臓器もしくは組織移植の拒絶を治療する方法であって、当該患者の臓器もしくは組織移植の拒絶を治療するために、該抗体の有効量投与を含む方法。
【請求項２４】
当該投与がさらにもう１種の免疫抑制剤を投与することを含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＨｕＴＮ２２８およびＭｕＴＮ２２８およびそのＦａｂフラグメントおよびそのＦ（ａｂ）’２フラグメントからなる群より選択される抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は分裂促進活性を欠く抗ＣＤ２８抗体およびその使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
免疫反応、特に臓器移植拒絶反応は主にＴリンパ球の活性化によるものである。このＴ細胞の活性化は抗原提示細胞（ＡＰＣ）からのシグナルにより誘導される。ＡＰＣからのシグナルはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を経由する第一シグナルと共刺激性分子を経由する第二シグナル（共刺激性シグナル）からなる。第一シグナルはペプチド抗原の主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）複合体からのものであり、その場合ＡＰＣはＴＣＲを介してＴ細胞抗原を提示する。第二シグナルには数種の共刺激性分子が介在するが、その例として、Ｂ７（Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６））がＡＰＣ側のリガンドとして、またＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４などがＴ細胞側のレセプターとして知られている。リガンドＢ７は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、抗原提示細胞群に属するＢ細胞などで発現される。共通のリガンドとしてＢ７を認識するＣＤ２８とＣＴＬＡ−４は共に免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜透過性糖タンパク質である。従って、Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲを介する第一シグナルと、例えば、Ｂ７およびＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４からの第二シグナルの同時伝達により調整される。Ｂ７からＣＤ２８へのシグナルはＴ細胞活性化を促進し、一方、Ｂ７からＣＴＬＡ−４へのシグナルは活性化を阻害することが知られている［Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０： ９８５−９８８ （１９９５）］。
【０００３】
これまで、免疫抑制または寛容を目的として、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ、抗Ｂ７−１抗体／抗Ｂ７−２抗体、または抗ＣＤ２８抗体などを投与することにより、Ｂ７−ＣＤ２８シグナルをブロックすることが試みられてきた。例えば、ＣＴＬＡ−４ＩｇはＢ７に結合し、それによってＢ７とＣＤ２８との間の反応を阻害し、結果としてＣＤ２８からのシグナルをブロックして免疫抑制活性を示す。しかし、Ｂ７とＣＴＬＡ−４との間の反応もまた同時に阻害されるので、Ｔ細胞の活性化にマイナスに働くＣＴＬＡ−４のシグナルが抑制されて、結果として所望の寛容は誘導されないこととなる（Ｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４： ８７８９−８７９４ （１９９７））。抗Ｂ７抗体も調製されており、Ｔ細胞の活性化を抑制すると報告されているが、ＣＴＬＡ−４Ｉｇの場合のように、同様にＣＴＬＡ−４シグナルを抑制した。抗ＣＤ２８抗体は、インビトロの実験において、Ｔ細胞に分裂促進作用を生じることが判明したが、この抗体による刺激と抗ＣＤ３抗体との組合わせがＴ細胞の増殖と活性化を促進し、サイトカインの産生を上昇させた［ＷＯ９０／０５５４１；Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６， １２８９−１２９６ （１９８６）、など］。さらに、抗ＣＤ２８抗体によるＴ細胞ＣＤ２８レセプターの分裂促進刺激作用がインビトロで刺激され、その結果、第二シグナル同様のＢ７からＣＤ２８へのＴ細胞活性化シグナルが生成する［Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６３： ４３２８−４３３４ （１９９９）］。これらのＴ細胞活性化機能は、抗ＣＤ２８抗体が癌およびＡＩＤＳの治療に免疫増強剤として使用し得ることを示唆した（ＷＯ９０／０５５４１）。
【０００４】
（発明の開示）
常套の技法により調製される抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞に分裂促進作用を及ぼす。この分裂促進活性の理由は、完全には理解されてはいないが、抗ＣＤ２８Ｆｃ領域が抗原提示細胞のＦｃレセプターに結合するとするのが、妥当な理由と信じられる（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３６： １５９ （１９９７））。それ故、我々は遺伝子工学の技法を利用することで、抗ＣＤ２８抗体のＦｃレセプター結合部位に変異を導入して抗体を改変し、分裂促進活性を示さないようにした。本発明者が生成させたかかる抗体の一つがＴＮ２２８ＩｇＧ２Ｍ３であり、ここでのＩｇＧ２Ｍ３はＩｇＧ遺伝子に２つのアミノ酸置換を有する。さらに、我々は得られたサイレント抗ＣＤ２８抗体は分裂促進活性を示さず、Ｔ細胞寛容の誘導に非常に有用であることを証明した。
【０００５】
従って、本発明は分裂促進活性を持たない抗ＣＤ２８抗体（以下、サイレント抗ＣＤ２８抗体という）、および当該抗体を使用することによる免疫反応の抑制方法、特に、移植拒絶の抑制方法、ならびに免疫寛容の誘導方法を提供する。
【０００６】
本発明の目的はサイレント抗ＣＤ２８抗体にあり、この場合の抗ＣＤ２８抗体はキメラ抗体および／またはヒト化抗体であってもよい。抗ＣＤ２８抗体の可変領域は配列番号２、４、６および８に示されるアミノ酸配列ならびにかかるアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドを包含する。例えば、かかるポリヌクレオチドは配列番号１、３、５、および７のものである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、抗ＣＤ２８抗体をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞にある。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、サイレント抗ＣＤ２８抗体の製造法であって、該抗ＣＤ２８抗体をエンコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドの発現を可能とする条件下に培養し、産生された遺伝子産物を収集することからなる方法にある。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、１種以上のサイレント抗ＣＤ２８抗体を含む医薬組成物、好ましくは１種以上の医薬的に許容し得る成分と混合した医薬組成物にある。
【００１０】
サイレント抗ＣＤ２８抗体はＴ細胞寛容の誘導、免疫抑制のために、また臓器もしくは組織移植拒絶の予防／治療用薬として有用である。従って、本発明は１種以上のサイレント抗ＣＤ２８抗体を哺乳動物に投与することによる、Ｔ細胞寛容の誘導、免疫抑制の方法、また臓器もしくは組織移植拒絶に際しての予防もしくは治療の方法を提供する。好ましくは、かかるサイレント抗ＣＤ２８抗体は本明細書記載の医薬組成物として投与するが、さらに適切な場合にはさらなる医薬／薬剤を含んでもよい。
【００１１】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明に関連する用語“サイレント抗ＣＤ２８抗体”は分裂促進活性を欠く抗ＣＤ２８抗体を意味する。より詳しくは、該抗体はＴ細胞表面上の抗原ＣＤ２８レセプターに特異的に結合するが、抗ＣＤ３抗体と組み合わさった刺激によるＴ細胞の増殖または活性化を促進することはない抗体である。
【００１２】
サイレント抗ＣＤ２８抗体は抗ＣＤ２８抗体または抗ＣＤ２８抗体産生ハイブリドーマに基づき、アゴニストの抗ＣＤ２８抗体を遺伝子工学技法または化学修飾により変異または改変させることにより構築することができる。一例として遺伝子工学技法を採る場合、Ｆｃレセプターに対する抗ＣＤ２８抗体の結合親和性は、該抗体のＦｃドメインのアミノ酸配列に変異を導入することにより削減または除去することができる。例えば、サイレント抗ＣＤ２８抗体は、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞からｃＤＮＡを単離し、Ｆｃレセプターへの結合において重要な役割を果たすＦｃドメインに対応する配列領域に変異を導入することにより入手することができる（ＷＯ８８／０７０８９）。変異の部位には、Ｆｃレセプターへの結合が阻害され得る限りにおいて特に制限はない。従って、ＩｇＧクラスの抗体の場合には、例えば、Ｈ−鎖アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、３１８、３２０および３２２が好適であり、サイレント抗ＣＤ２８抗体はこれらアミノ酸の少なくとも１個を異なるアミノ酸で置換することにより構築することができる。
【００１３】
かかるサイレント抗ＣＤ２８抗体の起源は該抗体を使用する動物を考慮して選択することができる。例えば、非ヒトモノクローナル抗体はかなり広い範囲でヒトに抗原性を示すアミノ酸配列を含んでいる。外来抗体を注射した後の該抗体に対するヒトの免疫応答は甚だしく強力であり、抗体を投与した途端に患者を危険な状態とするか、またはその抗体の治療効果が無効となる。従って、該抗体を治療標的動物にとって、比較的相同性の高いＦｃ領域に置き換えるか、可変領域の枠組み部分を置き換えるか、または標的動物の抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物から得られた抗体を使用することが推奨される。例えば、抗体がヒトに投与するものである場合、Ｆｃ領域を置換して利用し得るキメラ抗体（ＥＰ１２５０２３）、枠組み部分を置き換えたヒト化抗体（ＥＰＯ２３９４００、ＥＰＯ４５１２６）またはヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物から得られるヒト抗体（ＥＰ５４６０７３、Ｗ９７／０７６７１）などである。上記のような遺伝子工学技法または化学修飾により、これらの抗体に変異を導入することによって、抗体の分裂促進活性を削減または除去することができる。
【００１４】
サイレントＦｃ領域を有する抗ＣＤ２８抗体の具体例としては、本明細書の実施例に記載した抗体のみではなく、治療標的動物の定常領域遺伝子と配列番号２および４または配列番号６および８に示した可変領域のアミノ酸配列に基づく可変領域ポリヌクレオチドとを用いて合成的に調製した抗体も例示することができる。かかるポリヌクレオチドの例は配列番号１、３、５、および７である。
【００１５】
本発明のより具体的な例はＨｕＴＮ２２８とＭｕＴＮ２２８およびそのＦａｂフラグメント、そのＦ（ａｂ）’２フラグメント、その誘導体などである。
【００１６】
当業者周知のように、第三塩基の縮重のために、殆どすべてのアミノ酸はコードするヌクレオチド配列の少なくとも１組のトリプレットコドンにより表すこが可能である。さらに、マイナーな塩基対の変化は、エンコードされたアミノ酸配列に変化（同類置換）をもたらし得るかもしれないが、必ずしも遺伝子産物の生物学的活性を実質的に変えるとは予期できない。このように、本明細書に開示したようなタンパク質またはペプチドをエンコードする核酸配列は、僅かに配列が改変され得る（例えば、トリプレットコドンのヌクレオチドの置換）が、改変されてもなお、この核酸配列は、同じアミノ酸配列である遺伝子産物をエンコードし続ける。
【００１７】
“発現ベクター”という用語は、本発明のペプチドをエンコードし、選択された宿主細胞においてその発現に必要な配列を提供するポリヌクレオチドをいう。発現ベクターは一般に転写プロモーターとターミネーターを含有するか、または内在性のプロモーターに隣接して組み込まれる。発現ベクターは通常プラスミドであり、さらに複製の開始点及びひとつ又は複数の選択可能なマーカーを含む。しかし、発現ベクターは、あるいは宿主に感染するように設計したウイルス組換え体であってもよいし、または宿主ゲノム内の好適な部位に組み込まれるように設計した組込みべクターでもよい。発現ベクターの例は“分子クローニング：実験室マニュアル、第二版、サムブルーク、フリッシュ、およびマニアティス、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス、１９８９”に開示されている。
【００１８】
サイレント抗ＣＤ２８抗体の発現に適した宿主細胞は、原核生物、酵母、古細菌、および他の真核細胞である。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞性宿主にて使用するのに適したクローニング発現ベクターは技術上周知であり、例えば、パウエルス（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ら、クローニング・ベクター：実験室マニュアル、エルスヴィア、ニューヨーク（１９８５）に記載されている。好ましくは、該細胞は哺乳動物細胞である。該ベクターはプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖ファージベクター、または１本鎖または２本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターなどである。かかるベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するための周知方法により、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとして細胞に導入することができる。該ベクターは、ファージおよびウイルスベクターの場合、感染と形質移入の周知技法により、パッケージウイルスまたは莢膜ウイルスとして細胞に導入することが可能であり、そうするのが好ましい。ウイルスベクターは複製可能なものであっても複製不可能なものであってもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は一般に相補性宿主細胞においてのみ起こる。無細胞翻訳系も、存在するＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを使用して、タンパク質の産生に採用することができた。
【００１９】
サイレント抗ＣＤ２８抗体／タンパク質は、タンパク質化学の分野で一般的に知られるタンパク質に対する単離／精製方法により精製することができる。より詳しくは、例えば、抽出、再結晶、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル透過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、向流分配など、およびこれらの組合わせが例示し得る。
【００２０】
本発明によると、精製した抗体は上記の組換え発現系によって産生させることができる。該方法は、該タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、該タンパク質の発現を促進するのに十分な条件下で培養することからなる。該タンパク質は次いで使用した発現系に応じて培地または細胞抽出物から回収する。当業者周知のように、組換えタンパク質の精製手法は、採用した宿主細胞のタイプ、また組換えタンパク質が培地に分泌されているかどうかなどのファクターによって変わり得る。
【００２１】
医薬組成物に製剤化したサイレント抗ＣＤ２８抗体は、（ａ）臓器または組織の移植、例えば、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、すい臓、小腸、筋肉、神経などの移植後の拒絶反応；（ｂ）骨髄移植における移植片対宿主反応；（ｃ）リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患；および（ｄ）喘息、アトピー性皮膚炎などの免疫性疾患、に使用することができる。
【００２２】
サイレント抗ＣＤ２８抗体はそれ自体が免疫反応および移植拒絶反応を抑制し、免疫寛容を誘導すると期待されるが、他の薬物と組合わせて使用することも可能である。サイレント抗ＣＤ２８抗体との組合せに有用なかかる他の薬物の中では、種々の免疫抑制剤、例えば、ラパマイシン、デオキシスパ−ガウリン、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、プログラフ、サイクロスポリンＡ、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ２レセプター抗体、抗ＩＬ１２抗体、抗ＩＬ１２レセプター抗体、およびＭＭＦなどが挙げられる。ラパマイシンは取分けＩＬ２レセプターからのシグナルの中で、Ｔ細胞の増殖に関係するシグナルの伝達を阻害するが、アポトーシス関連のシグナルの伝達は阻害しないので、ＣＤ２８シグナルの特異的阻害剤と組合わせて使用することは有用であると期待される。
【００２３】
本発明のサイレント抗ＣＤ２８抗体は経口または非経口的に、好ましくは静脈内、筋肉内または皮下ルートにより投与することができる。
【００２４】
本発明のサイレント抗ＣＤ２８抗体は溶液または凍結乾燥粉末の形状に調製可能であり、要すれば、種々の医薬的に許容し得る添加物、例えば、添加剤、希釈剤、安定剤、等張化剤、緩衝剤などにより製剤化してもよい。好適な添加物はマルトースなどの糖類、ポリソルベートなどの界面活性剤、グリシンなどのアミノ酸、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、塩化ナトリウムなどの塩類などである。
【００２５】
また、投与形態としては、例えば、注射用剤（溶液、懸濁液、エマルジョン、用時溶解用固体など）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、リポソーム封入剤、軟膏、ゲル剤、外用粉末剤、スプレー、吸入粉末剤、点眼剤、眼軟膏、座剤、ペッサリーなど、投与方法に対応して適宜選択することが可能であり、従って、本発明のペプチドはそのように製剤化することができる。一般的な製剤については“総合医薬化学”（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｅｄｉｔｏｒ Ｈａｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９０）第５巻２５章の２に記載がある。
【００２６】
本発明医薬組成物の投与用量は、多くの変数の中でも特に、具体的な組成、治療または予防の対象となる疾患のタイプ、投与方法、患者の年齢と症状、および治療期間に左右される。しかし、静脈内、筋肉内または皮下投与の場合、成人に１日０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇを投与する。
【００２７】
本発明のサイレント抗ＣＤ２８抗体を臓器または組織移植での移植拒絶反応の抑制または免疫寛容の誘導に使用する場合、該化合物は、移植直前、移植直後、および移植後３、７、１２、１８、２５、３５、４５および６０日目に、約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、静脈内、筋肉内または皮下注射により投与することができる。投与回数および用量は、移植後の拒絶反応の推移をモニターしながら注意深く増減するとよい。
【００２８】
投与間隔は、様々なファクターの中でも、用いる投与方法と患者の症状に左右されるが、連続投与でも間欠的投与でも実行可能である。従って、本発明のサイレント抗ＣＤ２８抗体は一種の抗体であるため、持続した効果を生じるので、間欠投与が期待通りの有効性をもたらす。治療期間については、一旦、寛容状態が確立した時点で、サイレント抗ＣＤ２８抗体の使用を中止しても、この寛容は維持し得る。この点で、本サイレント抗ＣＤ２８抗体は、中断後免疫抑制効果が低下する他の免疫抑制剤よりも疑いなく優れている。
【００２９】
（実施例）
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の具体例をここに提供するが、これらの例は説明を目的とするものであって、特に断りのない限り、本発明を限定しようとするものではない。以下の実施例は標準的技法を用いて実施するが、これらの技法は当業者にとって周知、かつ日常的なものである。ただし、詳細に別段に記載した場合については例外とする。
【００３０】
実施例１
マウス抗ヒトＣＤ２８抗体のアミノ酸配列
抗ヒトＣＤ２８抗体（クローン：ＴＮ２２８、マウスＩｇＧ１カッパ）産生ハイブリドーマは八木田博士（順天堂大学医学部、日本）より恵与頂いた。精製した抗ヒトＣＤ２８抗体（ＴＮ２２８）約０．２ｍｇを、０．６４ＭグアニジンＨＣＩ、０．２８Ｍトリス−ＨＣＩ、ｐＨ８．５、０．０５５Ｍ−ＤＴ７中、６０℃（アルゴン気流下）で９０分間還元し、ヨード酢酸を０．１３Ｍまで加えて室温（暗所）で４５分間カルボキシメチル化し、次いでＤＴｒを０．３２Ｍまで加え（カルボキシメチル化反応停止のため）、直ちにＰＤ−１０カラム（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ウプサラ、スウェーデン、カタログ番号＃１７−０８５１−０１）を用いて０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．００２Ｍ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０にバッファー交換した。この溶出液を０．００５Ｍ−ＤＴＴ、０．０２％グリセロールに調整し、この溶液の３分の１（約０．３５ｍｌ）を別個のチューブに移し、重鎖のＮ−末端脱ブロックに付した。このサンプルを１８００μＵのピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（宝酒造（株）、東京、日本、カタログ番号＃７３３４）により４５℃で２４時間消化した。脱ブロックサンプルからの軽鎖および重鎖のＮ−末端配列は、モデル２４１タンパク質シーケンサー（ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）、パロアルト、カリフォルニア）上、自動化エドマン分解２０サイクルとＰＴＨ分析により決定した。ＰＴＨ誘導体はハイパージル（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）ＯＤＳＣ１８カラムで分析した。シーケンサーとＨＰＬＣはヒューレット・パッカードから入手した試薬、溶媒、カラムを用いて、メーカーの指図書に従って操作した。
【００３１】
ピログルタミン酸アミノペプチダーゼで脱ブロックしたＴＮ２２８のＮ−末端配列決定結果は以下の通りであった：
【００３２】
【表１】
2004515243.tif 000002
【００３３】
実施例２
可変領域ｃＤＮＡのクローニング
ＴＮ２２８の軽鎖および重鎖用Ｖ領域ｃＤＮＡはコー（Ｃｏ）ら記載のアンカーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりハイブリドーマ細胞からクローン化した（Ｃｏ， Ｍ．Ｓ．， Ｎ．Ｍ． Ａｖａｄａｌｏｖｉｃ， Ｐ．Ｃ． Ｃａｒｏｎ， Ｍ．Ｖ． Ａｖａｄａｌｏｖｉｃ， Ｄ．Ａ． Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ， ａｎｄ Ｃ． Ｑｕｅｅｎ， １９９２。ＣＤ３３抗原に特異性を有するキメラおよびヒト化抗体。Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： １１４９−１１５４）。増幅はｃＤＮＡ上、マウスカッパ鎖とガンマ鎖Ｃ領域にそれぞれアニールする３′プライマー、およびｃＤＮＡの付加Ｇ−尾部にアニールする５′プライマーを使用し、実施した。ＶＬ ＰＣＲ用の３′プライマーは配列番号１３の配列：
５′ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣ  ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴ  ＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡ  ＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴ  ＴＧＧＴＧＣ３′
を持ち、マウスＣκ領域にハイブリダイズする残基１７〜４６を有する。ＶＨ ＰＣＲ用の３′プライマーは配列番号１４、１５および１６の変質配列：
2004515243.tif 000003
を持ち、マウスＩｇＧ ＣＨ１にハイブリダイズする残基１７〜５０を有する。２種のプライマーセットにおける非ハイブリダイズ配列はクローニングに用いられる制限部位を含む。ＶＬとＶＨのｃＤＮＡは配列決定のために、ＴＯＰＯＩＩブラント・ベクター（インビトロゲン・インク（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．）、カールスバッド、カリフォルニア）にサブクローン化した。
【００３４】
数種の軽鎖および重鎖クローンを２つの独立したＰＣＲ反応により配列決定した。軽鎖については、マウス軽鎖可変領域に相同の２つのユニーク配列を同定した。一方のＶＬ配列はフレームシフト突然変異のために非機能的であり、非生産性対立遺伝子と同定した。もう一方のＶＬ配列は典型的な機能的マウスカッパ鎖可変領域であった。重鎖については、典型的なマウス重鎖可変領域に相同のユニーク配列を同定した。それらのヌクレオチド配列とその推定される可変領域のアミノ酸配列を図２および図３に示す。
【００３５】
実施例３
キメラＴＮ２２８−ＩｇＧ２Ｍ３の構築と発現
（方法）
ＴＮ２２８ＶＬおよびＶＨをヒー（Ｈｅ）ら記載のようにＰＣＲによりＸｂａＩ部位に隣接してミニ−エキソン・セグメントに変換し（Ｈｅ， Ｘ．Ｙ．， Ｚ． Ｘｕ， Ｊ． Ｍｅｌｒｏｓｅ， Ａ． Ｍｕｌｌｏｗｎｅｙ， Ｍ． Ｖａｓｑｕｅｚ， Ｃ． Ｑｕｅｅｎ， Ｖ． Ｖｅｘｌｅｒ， Ｃ． Ｋｌｉｎｇｂｅｉｌ， Ｍ．Ｓ．， Ｃｏ， ａｎｄ Ｂ．Ｌ． Ｂｅｒｇ， １９９８。Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン双方に特異性を持つモノクローナル抗体のヒト化と薬物動態学。Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： １０２９−１０３５）、軽鎖および重鎖発現プラスミドにサブクローン化した（図１）。各ミニ−エキソンはシグナルペプチド配列、成熟可変領域配列および殆ど相同のマウスＪ鎖遺伝子に由来するスプライシングドナー配列を含む。かかるスプライシングドナー配列はＶ領域エキソンをヒト抗体の定常領域にスプライスするのに使用する。各ミニ−エキソンは発現ベクターにクローン化した後に配列決定し、正しい配列が得られたこと、およびＰＣＲエラーは発生しなかったことを確認した。軽鎖および重鎖発現プラスミドの定常領域エキソンもまた配列決定により確認した。
【００３６】
本明細書では、ＣｈＴＮ２２８をキメラ抗体とし、マウスＴＮ２２８ＶＬおよびＶＨ可変領域、重鎖のヒトＩｇＧ２Ｍ３、および軽鎖のヒト・カッパ定常領域を含むものとする。重鎖の定常領域は生殖系列ヒト２ゲノムフラグメントから改変し（Ｃｏｌｅ， Ｍ．Ｓ．， Ｃ． Ａｎａｓｅｔｔｉ， ａｎｄ Ｊ．Ｙ． Ｔｓｏ． １９９７。キメラ抗ＣＤ３のヒトＩｇＧ２変異体はＴ細胞に対し非分裂促進性である。Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ３６１３−３６２１）、軽鎖は生殖系列ヒトＫゲノムフラグメントから誘導した。重鎖および軽鎖の遺伝子は共にヒト・サイトメガロウイルスの主要初期プロモーターとエンハンサーにより転写される。重鎖遺伝子はヒト補体遺伝子Ｃ２由来の転写ターミネーターを伴う（Ａｓｈｆｉｅｌｄ， Ｒ．， Ｐ． Ｅｎｒｉｑｕｅｚ−Ｈａｒｒｉｓ， ａｎｄ Ｎ．Ｊ． Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ． １９９１。密着結合したヒト補体遺伝子Ｃ２およびファクターＢ間の転写終結：Ｃ２およびｃ−ｍｙｃの共通終止ファクターか？ ＥＭＢＯ Ｊ． １０：４１９７−４２０７）。軽鎖選択マーカーｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｒ．Ｃ．， ａｎｄ Ｐ． Ｂｅｒｇ． １９８１。キサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする大腸菌遺伝子を発現する動物細胞の選択。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６）および重鎖選択マーカーｄｈｆｒ遺伝子（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ， Ｃ．Ｃ．， ａｎｄ Ａ．Ｄ． Ｌｅｖｉｎｓｏｎ． １９８３。改変マウス・ジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡの単離と発現。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２４９５−２４９９）は共にＳＶ４０初期プロモーターにより転写される。キメラＴＮ２２８を発現させるために、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ；カタログ番号＃１０９６４−０１３）を用いて、ＣＯＳ−７細胞（サル腎臓細胞株）に一時的に形質移入した。一過性形質移入体からの使用培地について、ヒトＩｇＧ２Ｍ３抗体が産生されているかＥＬＩＳＡにより分析した。その際、捕捉試薬としてヤギ抗ヒトＩｇＧガンマ鎖特異抗体を、また発色試薬としてＨＲＰ−結合ヤギ抗ヒトＩｇＧカッパ鎖抗体を使用した。また、使用培地については、ＣｈＴＮ２２８がＰ８１５／ＣＤ２８＋細胞（Ｐ８１５（マウス肥満細胞腫）にＣＤ２８を安定的に形質移入した細胞）に結合する能力についても、間接的免疫蛍光染色とフローサイトメトリー分析により試験した。安定な細胞株の産生については、キメラ発現プラスミドをエレクトロポレーションによりマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０に形質移入し、その形質移入体をｇｐｔ発現用に選択した。安定な形質移入体からの使用培地を一過性形質移入としてＥＬＩＳＡにより分析した。
結果
クローン化ＶＬおよびＶＨ遺伝子をＰＣＲによりミニ−エキソンに変換し（図２および３）、上記のように軽鎖および重鎖発現ベクターにサブクローン化し、図１に示した。
【００３７】
ＣＯＳ−７細胞の一過性形質移入：キメラ発現ベクターを一過性にサル腎臓細胞株ＣＯＳ−７に形質移入し、キメラＴＮ２２８＋抗体を産生させた。形質移入した細胞からの使用培地について、キメラＩｇＧ２Ｍ３抗体の産生についてはＥＬＩＳＡにより、またＰ８１５／ＣＤ２８＋細胞への結合についてはフローサイトメトリーにより試験した。両方のアッセイにおいて使用培地は陽性であった。一過性形質移入によるキメラ抗体の収量は〜０．９μｇ／ｍｌであった。一過性上清からのＣｈＴＮ２２８抗体は濃度依存的にＰ８１５／ＣＤ２８＋細胞に結合した（データ非開示）。
【００３８】
Ｓｐ２／０細胞の安定な形質移入：安定な細胞株産生のために、キメラ発現ベクターをＳｐ２／０細胞に形質移入した。数種の形質移入体からの使用培地は、キメラＴＮ２２８抗体の産生について、また一過性形質移入体をもつものとしてＰ８１５／ＣＤ２８＋細胞への結合について試験した。両方のアッセイにおいて殆どの形質移入体が陽性であった。形質移入体の１つを高抗体産生株として選択し、無血清培地５Ｌ中で増殖拡大させた。使用した培地５ＬからアフィニティクロマトグラフィーによりＣｈＴＮ２２８を精製した。精製抗体の収量は〜２５ｍｇであった。
【００３９】
実施例４
キメラ抗体ＣｈＴＮ２２８のタンパク質精製
安定な形質移入からの高ＣｈＴＮ２２８発現形質移入体の１つ（クローン７Ｈ）をギブコ（ＧＩＢＣＯ）ハイブリドーマ無血清培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ；カタログ番号＃１２０４５−０７６）中で増殖させた。細胞の生存度が１０％以下に達したところで、使用した培地上清を収穫し、５００ｍｌに濃縮し、ファルマシアＰ１ポンプ（２〜３ｍｌ／分）により、プロテインＡセファロース５ｍｌのカラムに負荷した。カラムをＰＢＳで洗浄し、抗体を０．１Ｍグリシンと０．１Ｍ−ＮａＣｌ、ｐＨ２．７で溶出した。溶出したタンパク質は２ＬのＰＢＳを３回交換して透析し、次いで、０．１Ｍ−ＮａＣｌをさらに含有するＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラム上で脱塩した。脱塩したタンパク質溶液を０．２μｍのフィルターで濾過し、４℃で保存した。
【００４０】
実施例５
サイズ排除ＨＰＬＣとＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度測定
サイズ排除ＨＰＬＣは以下の装置からなるパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ＨＰＬＣシステム用いて実施した。ＰＥ ＩＳＳ２００アドバンスドＬＣサンプルプロセッサー、ＰＥシリーズ４１０バイオＬＣポンプ、ＰＥ２３５Ｃダイオードアレー検出器、およびＰＥネルソン６００シリーズＬＩＮＫ。自動試料採取器、ポンプおよび検出器を制御するために、またデータの取得、保存および処理のために、パーキンエルマー・ターボクローム・ナビゲーター・バージョン４．１ソフトウエアを使用した。分離には、東ソーハースＴＳＫ−ゲルＧ３０００ＳＷＸＬサイズ排除ＨＰＬＣカラム２本、７．８ｍｍ×３００ｍｍ、５μｍ粒子径、２５０Å孔径（カタログ番号＃０８５４１、東ソーハース、モンゴメリエイル（ＴｏｓｏＨａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｅｉｌｌｅ）メリーランド）を直列につないで使用した。移動相は２００ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ６．９）とし、流速は１．００ｍＬ／分とした。カラムの溶出液は２２０ｎｍと２８０ｎｍ両方で分光光学的にモニターした。注入容量はＣｈＴＮ２２８サンプル５０μＬ（５０μｇ）とした。
【００４１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは４〜２０％グラジエント・ゲル（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）カタログ番号＃ＥＣ６０２５、サンディエゴ、カリフォルニア）上、標準的手法に従い実施した。
【００４２】
単離したＣｈＴＮ２２８の純度はサイズ排除ＨＰＬＣとＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。この分析に基づくと、該タンパク質は９６．５％のモノマーであり、分子量〜１６０ｋＤのタンパク質に相当する移動度をもつ。ＭｕＴＮ２２８、イソタイプコントロールＭｕＦｄ７９（マウスＩｇＧ１）、ＣｈＴＮ２２８、およびイソタイプコントロールＨｕＥＰ５Ｃ７（ヒトＩｇＧ２Ｍ３）を非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、４種すべての抗体が約１５０〜１６０ｋＤの分子量をもつことを示した。同じ４種のタンパク質を還元条件下に分析すると、分子量約５０ｋＤの重鎖と分子量約２５ｋＤの軽鎖から構成されていることを示した。
【００４３】
実施例６
競合実験
方法
滴定実験は、ＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣ抗体の系列２倍希釈液を用い、２５０ｎｇ／テストから開始し、実施した。Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞（５×１０５細胞／テスト）をＦＩＴＣ−標識抗体と氷上１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗って、フローサイトメトリーで分析した。競合実験のために、２５ｎｇのＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣおよび競合するＣｈＴＮ２２８またはＭｕＴＮ２２８抗体の系列２倍希釈液を８００ｎｇ／テストから開始して、Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞（５×１０５細胞／テスト）に加えた。対照として、Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞（５×１０５細胞／テスト）を２５ｎｇのＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣのみ（すなわち、競合体なし）とインキュベートした。ＨｕＥＰ５Ｃ７およびＭｕＦｄ７９イソタイプコントロール抗体（８００ｎｇ／テスト）についても競合体として試験した。細胞を抗体混合物と共に最終容量１５０μｌとして、氷上（暗所にて）１時間インキュベートし、次いで洗浄して、フローサイトメトリーにより分析した。
結果
ＭｕＴＮ２２８とＣｈＴＮ２２８抗体の結合特異性は、方法の項に記載したように、フローサイトメトリー競合実験により比較した。種々量の非標識ＭｕＴＮ２２８またはＣｈＴＮ２２８を２５ｎｇのＦＩＴＣ標識ＭｕＴＮ２２８抗体と混合し、Ｐ８１５／ＣＤ２８’細胞とインキュベートした。ＭｕＴＮ２２８とＣｈＴＮ２２８の両方を濃度依存的にＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣと競合し、両抗体の結合がＣＤ２８抗体に特異的であることを示した（図４）。イソタイプコントロール抗体ＭｕＦｄ７９およびＨｕＥＰ５Ｃ７はＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣと競合せず、ＭｕＴＮ２２８とＣｈＴＮ２２８抗体がＶ領域特異的相互作用を介してＣＤ２８抗原を認識することを示した。
【００４４】
実施例７
ヒトＦＲに対する親和性の低下したキメラ抗ヒトＣＤ２８抗体は一次混合リンパ球反応を阻害する。
細胞調製
ヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を正常な健常ボランティアからフィコール−パックプラス（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、東京、日本）による濃度勾配遠心分離により調製した。ヒト血液を等容量のＲＰＭＩ１６４０で希釈し、フィコール−パックプラス上に積層した。室温で３０分間遠心分離した後、ＰＢＭＣを採取し、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。その後、ＰＢＭＣを培地（２．５％ヒトＡＢ型血清、２−メルカプトエタノール、および抗生剤を含有するＲＰＭＩ１６４０）で懸濁し、ナイロンファイバーカラム（和光純薬、大阪、日本）に負荷した。５％ＣＯ２中３７℃で１時間インキュベートした後、Ｔ細胞を加温培地で溶出した。
【００４５】
ヒトＢ細胞株（ラジ（Ｒａｊｉ）およびＪＹ）を混合リンパ球反応における刺激性細胞として使用した。これらの細胞を使用前にＸ線照射（２０００Ｒ）した。
一次混合リンパ球反応（１次ＭＬＲ）
精製ヒトＴ細胞（１×１０５細胞／ウエル）および照射したラジ細胞（１×１０５細胞／ウエル）を９６穴平底マイクロプレートに容れた。抗体を培地に加え、細胞を７日間インキュベートした。培養物はすべて１０ｋＢｑ／ウエルの［３Ｈ］チミジン（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク）で最終６時間標識した。細胞を採集し、取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。
【００４６】
一次ＭＬＲに対するＴＮ２２８−ＩｇＧ２ｍ３（ＣｈＴＮ２２８）の作用は図５および６に示した。オリジナルの抗ヒトＣＤ２８抗体ＴＮ２２８（ＭｕＴＮ２２８）は一次ＭＬＲを阻害しなかったが、しかし、キメラ抗体ＴＮ２２８−ＩｇＧ２ｍ３は用量依存的に阻害した。従って、抗ヒトＣＤ２８抗体のＦｃ領域を、ヒトＦｃＲに対して親和性の低下した抗体に変換することは、該抗体をＴ細胞増殖に対して拮抗作用をもつ抗体とすることである。
【００４７】
ヒトＦｃＲに対して低下した親和性をもつキメラ抗ヒトＣＤ２８抗体は、二次混合リンパ球反応においてＴ細胞を低応答性のものとした。
二次混合リンパ球反応（２次ＭＬＲ）
精製ヒトＴ細胞（１×１０５細胞／ウエル）および照射したラジ細胞（１×１０５細胞／ウエル）を９６穴平底マイクロプレートに容れた。抗体を培地に加え、細胞をインキュベートした。５日後に細胞を採集し、新鮮な培地で洗浄した。細胞を新鮮な培地に懸濁し、８日間培養した。細胞を照射したラジ細胞またはＪＹ細胞で再刺激した。さらに７日間培養した後、細胞を１０ｋＢｑ／ウエルの［３Ｈ］チミジンと６時間インキュベートした。細胞を採集し、放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。
【００４８】
ＴＮ２２８−ＩｇＧ２ｍ３は一次ＭＬＲを阻害した（図５および６）。次いで、我々はこの抗体のニ次ＭＬＲに対する作用を分析した。該抗体を一次ＭＬＲ培養に付し、次いで抗体を培養上清から取り出した。細胞は抗体を含まない培地中で培養した後、同じ刺激性細胞（ラジ）または第三の刺激剤（ＪＹ）にて再刺激した。一次ＭＬＲを介してＴＮ２２８−ＩｇＧ２ｍ３で処理した細胞の増殖は未処理細胞に比べて低下していた。しかし、両細胞共に第三の刺激剤（ＪＹ）により殆ど同じ程度まで増殖した（図７）。この結果は、ヒトＦｃＲに対して親和性の低下した抗ヒトＣＤ２８抗体がアロ抗原刺激を介してＴ細胞のエネルギーを誘導することを示している。
【００４９】
実施例８
ヒト化ＴＮ２２８可変領域の設計
ＭｕＴＮ２２８のＶ領域配列をコンピュータモデル化により分析した。カバット（Ｋａｂａｔ）の抗体配列データベース（８． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇ．， ａｎｄ Ｔ．Ｔ． Ｗｕ． ２０００。カバット・データベースとその応用：最初の可変性プロットから３０年。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８： ２１４−２１８）に対する配列相同性検索に基づき、ＩＣ４（Ｍａｎｈｅｉｍｍｅｒ−Ｌｏｒｙ， Ａ．， Ｊ．Ｂ． Ｋａｔｚ， Ｍ． Ｐｉｌｌｉｎｇｅｒ， Ｃ． Ｇｈｏｓｓｅｉｎ， Ａ． Ｓｍｉｔｈ， Ｂ． Ｄｉａｍｏｎｄ． １９９１。抗−ＤＮＡ−会合イディオタイプを有する抗体の分子特性。Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４： １６３９−１６５２）を選択し、ヒト化ＴＮ２２８重鎖および軽鎖の両可変領域に対し、枠組みを与えた。ヒト化ＴＮ２２８重鎖可変ドメインは８５個の枠組み残基の内の６５残基を有し、該枠組み残基はマウスＴＮ２２８重鎖枠組み残基と同一であるか、または７６％の配列同一性である。ヒト化ＴＮ２２８軽鎖可変ドメインは８０個の枠組み残基の内の５６残基を有し、該枠組み残基はマウスＴＮ２２８軽鎖枠組み残基と同一であるか、または７０％の配列同一性である。
【００５０】
コンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔ， Ｍ． １９８３。未変性タンパク質の分子動力学。Ｉ．経路のコンピュータシミュレーション。Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６８： ５９５−６２０）を使用してＴＮ２２８可変ドメインの分子モデルを構築し、それを用いてＣＤＲと潜在的に相互作用するために十分にＣＤＲと接近するマウスＴＮ２２８枠組みのアミノ酸の位置づけを行った。ヒト化ＴＮ２２８重鎖および軽鎖可変領域を設計するために、マウスＴＮ２２８重鎖からのＣＤＲをヒトＩＣ４重鎖の枠組み領域に移植し、マウスＴＮ２２８軽鎖からのＣＤＲをヒトＩＣ４軽鎖の枠組み領域に移植した。コンピュータモデルがＣＤＲとの有意な接触を示唆する枠組みの位置で、マウス抗体由来のアミノ酸が当初のヒト枠組みアミノ酸に置き換えられた。ヒト化ＴＮ２２８について、この置換は重鎖の２７、２９、３０、４８、６７、７１および７８の残基でなされた。軽鎖については置換されなかった（すなわち、ＩＣ４枠組み領域にＭｕＴＮ２２８ＣＤＲが直接に移植された）。さらに、ヒト抗体のデータベースにおいてはそのような位置で滅多に起こらない枠組み残基が、その位置でヒトの共通アミノ酸により置換された。ヒト化ＴＮ２２８の場合、この置換は重鎖の２３、４０、７３、８３および８５の残基で、また軽鎖の６９および７７の残基で起こった。ヒト化ＴＮ２２８抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図９および１０に示す。
【００５１】
実施例９
ヒト化ＴＮ２２８−ＩｇＧ２Ｍ３の構築と発現
方法
ヒト化可変領域のアミノ酸配列を上記のように設計したので、シグナルペプチド、スプライシングドナーシグナルおよび適切な制限酵素部位を含め、それらをエンコードする遺伝子を構築した（図８）。重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子は、長さが約６５ないし８０塩基の範囲の８種の重複した合成オリゴヌクレオチドを用いて構築し、増幅した（Ｈｅ， Ｘ．Ｙ， Ｚ． Ｘｕ， Ｊ． Ｍｅｌｒｏｓｅ， Ａ． Ｍｕｌｌｏｗｎｅｙ， Ｍ． Ｖａｓｑｕｅｚ， Ｃ． Ｑｕｅｅｎ， Ｖ． Ｖｅｘｌｅｒ， Ｃ． Ｋｌｉｎｇｂｅｉｌ， Ｍ．Ｓ． Ｃｏ， ａｎｄ Ｅ．Ｌ． Ｂｅｒｇ． １９９８。Ｅ−セレクチンとＰ−セレクチン両方に特異性を有するモノクローナル抗体のヒト化と薬物動態学。Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： １０２９−１０３５）。オリゴヌクレオチドを対となるようにアニールし、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントにより伸張させ、４種の二本鎖フラグメントとした。得られたフラグメントを変性し、対としてアニールし、クレノウで伸張させ、２種のフラグメントとした。これらのフラグメントを変性し、対としてアニールし、再度伸張させて完全長の遺伝子とした。得られる生成物をＴａｑポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、ゲル精製し、ＸｂａＩで消化し、再度ゲル精製し、重鎖発現用のｐＶｇ２Ｍ３および軽鎖発現用のｐＶｋのＸｂａＩにサブクローン化した。ヒト・ガンマ２重鎖発現用のｐＶｇ２Ｍ３ベクター（Ｃｏｌｅ， Ｍ．Ｓ．， Ｃ． Ａｎａｓｅｔｔｉ， ａｎｄ Ｊ．Ｙ． Ｔｓｏ．１９９７。キメラ抗ＣＤ３のヒトＩｇＧ２変異体はＴ細胞に対し非分裂促進性である。Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ３６１３−３６２１）およびヒト・カッパ軽鎖発現用ｐＶｋベクター（ＣＯ， Ｍ．Ｓ．， Ｎ．Ｍ． Ａｖａｄａｌｏｖｉｃ， Ｐ．Ｃ． Ｃａｒｏｎ， Ｍ．Ｖ． Ａｖａｄａｌｏｖｉｃ， Ｄ．Ａ． Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ， ａｎｄ Ｃ． Ｑｕｅｅｎ。ＣＤ３３抗原に対し特異性をもつキメラおよびヒト化抗体。Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： １１４９−１１５４）はすでに記載されている。
【００５２】
重鎖および軽鎖の最終プラスミドのＶ領域および定常領域エキソンの配列はヌクレオチド配列決定により立証された。最終プラスミドの全体構造は制限マッピングにより立証された。ＤＮＡ操作はすべて標準法により実施した。
【００５３】
本明細書において、ＨｕＴＮ２２８はヒト化抗体であって、ヒト化ＴＮ２２８ＶＨおよびＶＬ可変領域、重鎖用ヒトＩｇＧ２Ｍ３定常領域、および軽鎖用ヒトカッパ定常領域を含むものである。重鎖定常領域は生殖系列ヒト２ゲノムフラグメントから改変し（Ｃｏｌｅ， Ｍ．Ｓ．， Ｃ． Ａｎａｓｅｔｔｉ， ａｎｄ Ｊ．Ｙ． Ｔｓｏ． １９９７。キメラ抗ＣＤ３のヒトＩｇＧ２変異体はＴ細胞に非分裂促進性である。Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ３６１３−３６２１）、軽鎖は生殖系列ヒトＫゲノムフラグメントから誘導した。ヒト・サイトメガロウイルスの主要最初期プロモーターとエンハンサーは、重鎖および軽鎖の遺伝子を共に転写する。重鎖遺伝子にはヒト補体遺伝子Ｃ２から由来する転写ターミネーターが続く（Ａｓｈｆｉｅｌｄ， Ｒ．， Ｐ． Ｅｎｒｉｑｕｅｚ−Ｈａｒｒｉｓ， ａｎｄ Ｎ．Ｊ． Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ． １９９１。密着結合したヒト補体遺伝子Ｃ２およびファクターＢ間の転写終結：Ｃ２およびｃ−ｍｙｃの共通終止ファクターか？ ＥＭＢＯ Ｊ． １０：４１９７−４２０７）。軽鎖選択マーカーｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｒ．Ｃ．， ａｎｄ Ｐ． Ｂｅｒｇ． １９８１。キサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする大腸菌遺伝子を発現する動物細胞の選択。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６）および重鎖選択マーカーｄｈｆｒ遺伝子（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ， Ｃ．Ｃ．， ａｎｄ Ａ．Ｄ． Ｌｅｖｉｎｓｏｎ． １９８３。改変マウス・ジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡの単離と発現。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２４９５−２４９９）は共にＳＶ４０初期プロモーターにより転写される。
【００５４】
ＨｕＴＮ２２８を発現させるために、リポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジー；カタログ番号＃１１６６８−０２７）を用いて、ＣＯＳ−７細胞（サル腎臓細胞株）に一時的に形質移入した。一過性形質移入体からの使用培地について、ヒトＩｇＧ２Ｍ３抗体が産生されているかＥＬＩＳＡにより分析した。その際、捕捉試薬としてヤギ抗ヒトＩｇＧガンマ鎖特異抗体を、また発色試薬としてＨＲＰ−結合ヤギ抗ヒトＩｇＧカッパ鎖抗体を使用した。また、使用培地については、ＨｕＴＮ２２８がＰ８１５／ＣＤ２８−細胞に結合する能力についても、間接的免疫蛍光染色とフローサイトメトリー分析により試験した（データ非開示）。安定な細胞株の産生については、ヒト化発現プラスミドをエレクトロポレーションによりマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０に形質移入し、その形質移入体をｇｐｔ発現で選択した。安定な形質移入体からの使用培地は一過性形質移入体と同様にＥＬＩＳＡにより分析した。
結果
ヒト化Ｖ領域アミノ酸配列の設計に基づいて、重鎖および軽鎖のＶ遺伝子（図９および１０）を方法の項記載どおりに構築した。図８に示すように、重鎖および軽鎖のＶ遺伝子をｐＶｇ２Ｍ３およびｐＶｋベクターにそれぞれクローン化した。数種のクローンをヌクレオチド配列決定により分析し、重鎖および軽鎖発現ベクター双方について正しいクローンを形質移入に使用した。重鎖および軽鎖発現ベクター双方について定常領域もまた配列決定により確認した。
【００５５】
実施例１０
ＨｕＴＮ２２８の発現
ＣＯＳ−７細胞の一過性形質移入：発現ベクターを一過性にサル腎臓細胞株ＣＯＳ−７に形質移入し、ＨｕＴＮ２２８抗体を産生させた。形質移入した細胞からの使用培地について、ヒト化ＩｇＧ２Ｍ３抗体の産生についてはＥＬＩＳＡにより、またＰ８１５／ＣＤ２８＋細胞への結合についてはフローサイトメトリーにより試験した（データ非開示）。両方のアッセイにおいて使用培地は陽性であった。一過性形質移入によるヒト化抗体の収量は〜３．７ｇ／ｍｌであった。一過性上清からのＨｕＴＮ２２８抗体は濃度依存性にＰ８１５／ＣＤ２８＋細胞に結合した（データ非開示）。
【００５６】
Ｓｐ２／０細胞の安定な形質移入：ヒト化発現ベクターを安定な細胞系の産生のためにＳｐ２／０細胞に形質移入した。数種の形質移入体からの使用培地について、一過性の形質移入体の様にＨｕＴＮ２２８抗体の産生を試験した。より高い抗体生産性を有するものについて１つの形質移入体（クローン４）を選択し、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ハイブリドーマ無血清培地にて拡張した。ＨｕＴＮ２２８抗体をアフィニティクロマトグラフィーにより、使用培地５７０ｍｌから精製した。精製抗体の収量は〜７ｍｇであった。
【００５７】
実施例１１
タンパク質精製
安定な形質移入からの高ＨｕＴＮ２２８発現形質移入体の１つ（クローン４）を５７０ｍＬのギブコ（ＧＩＢＣＯ）ハイブリドーマ無血清培地（ライフ・テクノロジー；カタログ番号＃１２０４５０７６）中で増殖させた。細胞の生存度が１０％以下に達したところで、使用した培地上清を回収し、プロテインＡセファロース２ｍｌのカラムに負荷した。カラムをＰＢＳで洗浄し、抗体を０．１Ｍグリシンと０．１Ｍ−ＮａＣｌ、ｐＨ２．５で溶出した。溶出したタンパク質は２ＬのＰＢＳを３回交換して透析し、次いで、０．１Ｍ−ＮａＣｌをさらに含有するＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラム上で脱塩した。脱塩したタンパク質溶液を０．２ｍのフィルターで濾過し、４℃で保存した。
実施例１１
サイズ排除ＨＰＬＣとＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度測定
方法
サイズ排除ＨＰＬＣは以下の装置からなるパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ＨＰＬＣシステム用いて実施した。ＰＥ ＩＳＳ２００アドバンスドＬＣサンプルプロセッサー、ＰＥシリーズ４１０バイオＬＣポンプ、ＰＥ２３５Ｃダイオードアレー検出器、およびＰＥネルソン６００シリーズＬＩＮＫ。自動試料採取器、ポンプおよび検出器を制御するために、またデータの取得、保存および処理のために、パーキンエルマー・ターボクローム・ナビゲーター・バージョン４．１ソフトウエアを使用した。分離には、東ソーハースＴＳＫ−ゲルＧ３０００ＳＷＸＬサイズ排除ＨＰＬＣカラム２本（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、５μｍ粒子径、２５０Å孔径；カタログ番号＃０８５４１、東ソーハース、モンゴメリエイル（ＴｏｓｏＨａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｅｉｌｌｅ）メリーランド）を直列につないで使用した。移動相は２００ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ６．９）とし、流速は１．００ｍＬ／分とした。カラムの溶出液は２２０ｎｍと２８０ｎｍ両方で分光光度的にモニターした。注入容量はＨｕＴＮ２２８サンプル６０Ｌ（６０ｇ）とした。
【００５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは４〜２０％グラジエント・ゲル（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）カタログ番号＃ＥＣ６０２５、サンディエゴ、カリフォルニア）上、標準的手法に従い実施した。
【００５９】
精製抗体のイソタイプはヒトＩｇＧサブクラス・プロフィルＥＬＩＳＡキット（ザイムド・ラボラトリーズ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、南サンフランシスコ、カリフォルニア）により、製造業者の推奨に従い確認した。（結果）
単離したＨｕＴＮ２２８抗体の純度はサイズ排除ＨＰＬＣとＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＨｕＴＮ２８８のＨＰＬＣ溶出プロフィルは開示しない。この分析に基づくと、該タンパク質は〜９８％のモノマーであり、分子量〜１６０ｋＤのタンパク質に相当する移動度をもつ。
【００６０】
ＭｕＴＮ２２８、イソタイプコントロールＭｕＦｄ７９（マウスＩｇＧ１）、ＨｕＴＮ２２８、およびイソタイプコントロールＨｕＥＰ５Ｃ７（ヒトＩｇＧ２Ｍ３）を非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、４種すべての抗体が約１５０〜１６０ｋＤの分子量をもつことを示した。同じ４種のタンパク質を還元条件下に分析すると、分子量約５０ｋＤの重鎖と分子量約２５ｋＤの軽鎖から構成されていることを示した。
【００６１】
イソタイプの試験では、ＨｕＴＮ２２８抗体のイソタイプが予測したＩｇＧ２イソタイプと矛盾しないことを示した。
【００６２】
実施例１２
ＦＡＣＳ競合実験
方法
滴定実験は、ＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣ抗体の系列２倍希釈液を用い、２５０ｎｇ／テストから開始し、実施した。Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞（３×１０５細胞／テスト）をＦＩＴＣ−標識抗体と１００ＬのＦＡＣＳ染色バッファー（ＦＳＢ＝ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、３％正常マウス血清、０．１％ＮａＮ３）中、氷上１時間インキュベートし、２ｍｌのＦＳＢで洗って、フローサイトメトリーで分析した（データ非開示）。
【００６３】
競合実験のために、２５ＬのＦＳＢ中ＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣ（５０ｎｇ／テスト）を、２５ＬのＦＳＢ中競合するＨｕＴＮ２２８またはＭｕＴＮ２２８抗体の系列３倍希釈液（２００ｇ／ｍｌから開始）と組合せ、５０ＬのＦＳＢ中Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞（３×１０５細胞／テスト）に加えた。対照として、Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞をＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣのみ（５０ＬのＦＳＢ中５０ｎｇ／テスト）とインキュベートした。ＨｕＥＰ５Ｃ７（ヒトＩｇＧ２Ｍ３）およびＭｕＦｄ７９（マウスＩｇＧ１）イソタイプコントロール抗体（２００ｇ／ｍｌ）についても２５ＬのＦＳＢ中、非特異的競合体として試験した。細胞を抗体混合物と共に最終容量１００Ｌとして、氷上（暗所にて）１時間インキュベートし、次いで２ｍｌのＦＳＢで洗浄して、フローサイトメトリーにより分析した。本実験は３回繰り返した。
結果
Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞上、ＣＤ２８分子に対するＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８抗体の結合特異性は、方法の項に記載したとおりに、フローサイトメトリー競合実験により比較した。代表的な結果を図５に示す。ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８は共に濃度依存的にＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣと競合し、両抗体の結合がＣＤ２８抗原に特異的であることを示した。ＨｕＴＮ２２８の相対的結合はＭｕＴＮ２２８より２〜３倍低かった。イソタイプコントロール抗体ＭｕＦｄ７９およびＨｕＥＰ５Ｃ７はＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣと競合せず、ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８抗体がＶ領域特異相互作用を介してＣＤ２８抗原を認識することを示した。
【００６４】
実施例１３
ＥＬＩＳＡ競合実験
方法
９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）イムノプレート、ナルジ（Ｎａｌｇｅ）ヌンク、ネイパービル（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ）、イリノイ；カタログ番号＃４３９４５４）に、１００Ｌ／ウエルのｓＣＤ２８−Ｆｃ（ＰＢＳ中０．５ｇ／ｍｌ）（ｓＣＤ２８−Ｆｃは融合タンパク質であり、そのＣＤ２８の細胞外ドメインはＩｇＧｌのＣＨ２およびＣＨ３ドメインと組合わせたものである）を４℃で一夜被覆した。該プレートを、ＴＢＳ中、３００Ｌ／ウエルのスーパーブロック・ブロッキング・バッファー（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、イリノイ；カタログ番号＃３７５３５）により３０分間ブロックし、３００Ｌ／ウエルのＥＬＩＳＡウオッシュ・バッファー（ＥＷＢ＝ＰＢＳ、０．１％トゥイーン−２０）で洗浄した。ＥＬＩＳＡバッファー（ＥＢ＝ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％トゥイーン−２０）１００Ｌ中ＭｕＴＮ２２８−ビオチン（０．５ｇ／ｍｌ）およびＥＢ１００Ｌ中３倍系列希釈したＨｕＴＮ２２８またはＭｕＴＮ２２８競合抗体（１００ｇ／ｍｌから開始）の混合物を最終容量２００Ｌ／ウエルとして１濃度３ウエルあて（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）加えた。イソタイプコントロール抗体ＨｕＥＰ５Ｃ７およびＭｕＦｄ７９（１００ｇ／ｍｌ）についてＥＢ１００Ｌ中、非特異競合体として試験した。非競合体対照として、１００ＬのＥＢを１００ＬのＭｕＴＮ２２８−ビオチン（０．５ｇ／ｍｌ）に加えた。ブランクとして、２００ＬのＥＢを残りのウエル（ＭｕＴＮ２２８−ビオチンを含まない）に加えた。プレートを室温、振とう下に１．５時間インキュベートした。ウエルを３００Ｌ／ウエルのＥＷＢで４回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１ｇ／ｍｌ、ピアース・カタログ番号＃２１１２４）１００Ｌ／ウエルを各ウエルに加えた。プレートを室温、振とう下に１時間インキュベートした。上記同様にウエルを洗浄した後に、ＡＢＴＳ基質（ＫＰＬカタログ＃５０７６０２と５０６５０２；ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド）１００Ｌ／ウエルを各ウエルに加えた。プレートを室温で５〜７分間インキュベートし、光学吸光度を４１５ｎｍで読み取った。本実験は３回繰り返した。
結果
ＨｕＴＮ２２８およびＭｕＴＮ２２８抗体のｓＣＤ２８−Ｆｃに対する結合特異性を方法の項記載どおりに、ＥＬＩＳＡ競合実験において比較した。代表的な結果を図１２に示す。ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８は共に濃度依存的にＭｕＴＮ２２８−ビオチンと競合した。イソタイプコントロール抗体ＭｕＦｄ７９およびＨｕＥＰ５Ｃ７はＭｕＴＮ２２８−ビオチンと競合せず、ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８抗体がＶ領域特異相互作用を介してＣＤ２８抗原を認識することを示した。３回の実験すべてについて、ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８のＩＣ５０値を表２に示す。ＨｕＴＮ２２８の相対的結合は平均してＭｕＴＮ２２８よりも２．６倍低かった。
【００６５】
【表２】
表２  ＥＬＩＳＡ競合のまとめ
ＩＣ５０（ｇ／ｍｌ）
2004515243.tif 000004
【００６６】
実施例１４
１２５Ｉ−標識抗体の競合実験
方法
ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８抗体の相対的結合親和性は、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）らの方法に従って決定した（Ｑｕｅｅｎ， Ｃ．， Ｗ．Ｐ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｈ．Ｅ． Ｓｅｌｉｃｋ， Ｐ．Ｗ． Ｐａｙｎｅ， Ｎ．Ｆ． Ｌａｎｄｏｌｆｉ， Ｊ．Ｆ． Ｄｕｎｃａｎ， Ｎ．Ｍ． Ａｖｄａｌｏｖｉｃ， Ｍ． Ｌｅｖｉｔｔ， Ｒ．Ｐ． Ｊｕｎｇｈａｎｓ， Ｔ．Ａ． Ｗａｌｄｍａｎｎ， １９８９。インターロイキン２レセプターに結合するヒト化抗体。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： １００２９−１００３３）。簡単に説明すると、結合バッファー（ＢＢ＝ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、１ｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ、０．１％ＮａＮ３）中、〜１０ｎｇの１２５Ｉ−標識ＭｕＴＮ２２８を、５０ＬのＢＢ中、ＭｕＴＮ２２８またはＨｕＴＮ２２８競合抗体の３倍系列希釈液（４００ｇ／ｍｌから開始）と、１濃度３チューブあて組合せ、インキュベーション・チューブ（スカトロン・マクロウエル・チューブ・ストリップ（Ｓｋａｔｏｒｏｎ Ｍａｃｒｏｗｅｌｌ Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐｓ）、カタログ番号＃１５７７３、モレキュラー・ディバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア）中のＰ８１５／ＣＤ２８＋細胞（２．５×１０５細胞／テスト）１００Ｌに加え、緩やかに振とうしながら４℃で９０分間培養した。イソタイプコントロール抗体ＨｕＥＰ５Ｃ７およびＭｕＦｄ７９（４００ｇ／ｍｌ）についても、非特異的競合体として、５０ＬのＢＢ中で試験した。インキュベーションした後、該細胞−抗体混合物を、０．１ｍｌの８０％フタル酸ジブチル／２０％オリーブ油を容れた遠沈管（サーステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）マイクロチューブ、カタログ番号＃７２．７０２、サーステッド、ニュートン、ノースカロライナ）に移し、インキュベーションチューブは５０ＬのＢＢで１度洗い、結合カウントと遊離カウントとを記載どおりに遠心分離により分離した（Ｋｕｚｉｅｌ， Ｗ．Ａ．， Ｓ．Ｊ． Ｍｏｒｇａｎ， Ｔ．Ｃ． Ｄａｗｓｏｎ， Ｓ．Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｏ． Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｋ． Ｌｅｙ， Ｎ． Ｍａｅｄａ． １９９７。ＣＣケモカイン欠損マウスにおける白血球接着と単球血管外遊出の激しい減少。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４： １２０５３−１２０５８）。本実験は３回繰り返した。
結果
ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８抗体の相対的親和性を、方法の項記載のように、１２５Ｉ−標識抗体の競合実験により比較した。代表的な結果を図１３に示す。ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８は共に濃度依存的に１２５Ｉ−標識ＭｕＴＮ２２８と競合した。イソタイプコントロール抗体ＭｕＦｄ７９は高濃度で弱いが反復可能な競合を示したが、イソタイプコントロール抗体ＨｕＥＰ５Ｃ７は１２５Ｉ−標識ＭｕＴＮ２２８と競合せず、ＨｕＴＮ２２８抗体がＶ領域特異相互作用を介してＣＤ２８抗原を認識することを示した。３回の実験すべてについて、ＭｕＴＮ２２８およびＨｕＴＮ２２８のＩＣ５０値を表３に示す。ＨｕＴＮ２２８の見かけ上の結合親和性はＭｕＴＮ２２８抗体よりも大よそ２．４倍低かった。
【００６７】
【表３】
表３  Ｉ−１２５競合のまとめ
ＩＣ５０（ｎＭ）
2004515243.tif 000005
【００６８】
実施例１５
ハムスター抗マウスＣＤ２８抗体のアミノ酸配列決定
方法
ハイブリドーマと抗体：アルメニア・ハムスター抗マウスＣＤ２８ハイブリドーマＰＶ１はＡＴＣＣから入手した（ＡＴＣＣ ＨＢ−１２３５２）。精製ＰＶ１、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合ＰＶ１はサザーン・バイオテクノロジー（バーミンガム、アラバマ）から購入した。シリア・ハムスター抗ＣＤ２８抗体３７．５１はファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入した。二次抗体蛍光（ＦＩＴＣ）結合ロバ抗アルメニア・ハムスターＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＦＩＴＣ−結合ロバ抗シリア・ハムスターＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＦＩＴＣ−結合ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｒ−ＰＥ−Ｆ（ａｂ’）２ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は、ジャクソン・イムノリサーチ（ウエスト・グローブ、ペンシルバニア）から購入した；また、ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウス・カッパ、Ｒ−ＰＥ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ３、および西洋わさび（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスカッパはサザーン・バイオテクノロジーから購入した。ヤギ抗マウスＩｇＧ３およびマウスＩｇＧ３イソタイプコントロールＦＬＯＰＣ２２は、シグマ・ケミカルズ（セントルイス、ミズーリ）から購入した。アルメニア・ハムスター抗マウスＣＤ３抗体１４５．２Ｃ１１およびそのハムスター／マウス・キメラ・バージョン１４５．２Ｃ１１−ＩｇＧ３は、我々の研究室にて生成させた。ＦＩＴＣ−結合１４５．２Ｃ１１はベーリンガー・マンハイム（インディアナポリス、イリノイ）から購入した。
【００６９】
可変領域ｃＤＮＡのクローニング：ＰＶ１の軽鎖および重鎖のＶ領域ｃＤＮＡはコー（Ｃｏ）ら記載のアンカーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりハイブリドーマ細胞からクローン化した（Ｃｏ， Ｍ．Ｓ．， Ｎ．Ｍ． Ａｖａｄａｌｏｖｉｃ， Ｐ．Ｃ． Ｃａｒｏｎ， Ｍ．Ｖ． Ａｖａｄａｌｏｖｉｃ， Ｄ．Ａ． Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ， ａｎｄ Ｃ． Ｑｕｅｅｎ， １９９２． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： １１４９−１１５４）。増幅はｃＤＮＡ上、ハムスター・カッパ鎖とガンマ鎖Ｃ領域にそれぞれアニールする３′プライマー、およびｃＤＮＡの付加Ｇ−尾部にアニールする５′プライマーを使用し、実施した。ＶＬＰＣＲ用の３′プライマーは：５′ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣ（配列番号２０）の配列を有し、ハムスターのＣκ領域にハイブリダイズする残基１１〜２４を有する。ＶＨＰＣＲ用の３′プライマーは変質配列（配列番号１７、１８および１９の配列）：
2004515243.tif 000006
を有し、殆どのげっ歯類のＩｇＧ ＣＨ１にハイブリダイズする残基１９〜５０を有する。２つのプライマーセットにおける非ハイブリッド形成配列はクローニングに使用する制限部位を含む。ＶＬおよびＶＨｃＤＮＡをｐＵＣ１９ベクターにサブクローン化し、配列決定用とした。ＰＣＲ−生成エラーを避けるために、各ｃＤＮＡの５種の独立クローンの配列を決定し、その配列が共通配列と一致したクローンのみを選択してキメラＰＶ１を発現した。
結果
ＰＶ１ Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング：ＰＶ１軽鎖と重鎖のＶ領域ｃＤＮＡは、方法の項に記載したとおりに、ハイブリドーマ細胞からクローン化した。ＶＬＰＣＲでは、ハムスターＣγ領域に相当する３′プライマーのみがＰＶ１からＶＬｃＤＮＡ産物を産生し得た。他方、ハムスターＣγ領域からの３′プライマーはＰＣＲ産物を産生しなかった。これらの結果は、ハイブリドーマＰＶ１はその軽鎖にカッパを使用することを示した。数種の軽鎖および重鎖のクローンを配列決定し、それらがそれぞれ同一のＶＬおよびＶＨを含むことが見出された。限られたＣＨ１およびＣγ配列のデータは、クローン化された重鎖および軽鎖がマウス起源ではないことを示した。
【００７０】
実施例１６
キメラＰＶ１−ＩｇＧ３の構築と発現
方法
ＰＶ１ ＶＬおよびＶＨをＰＣＲによりＸｂａＩ部位に隣接してミニ−エキソン・セグメントに記載どおりに作製し（Ｈｅ， Ｘ．Ｙ．， Ｚ． Ｘｕ， Ｊ． Ｍｅｌｒｏｓｅ， Ａ． Ｍｕｌｌｏｗｎｅｙ， Ｍ． Ｖａｓｑｕｅｚ， Ｃ． Ｑｕｅｅｎ， Ｖ． Ｖｅｘｌｅｒ， Ｃ． Ｋｌｉｎｇｂｅｉｌ， Ｍ．Ｓ．， Ｃｏ， ａｎｄ Ｂ．Ｌ． Ｂｅｒｇ， １９９８．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： １０２９−１０３５）、それらを個々に軽鎖と重鎖の発現プラスミドに導入した（図１４）。各ミニ−エキソンはシグナルペプチド配列、成熟可変領域配列および殆ど相同のマウスＪ鎖遺伝子から誘導された５′スプライシングドナー配列を含む。かかるスプライシングドナー配列はＶ領域エキソンをマウス抗体の定常領域にスプライスするのに使用する。各ミニ−エキソンは発現ベクターにクローン化した後に再び配列決定し、正しいスプライシングシグナルが得られたこと、およびＰＣＲエラーは発生しなかったことを確認した。
【００７１】
単一のプラスミドからキメラＰＶ１−ＩｇＧ３の重鎖および軽鎖遺伝子の両方を発現するためにベクターを構築した。この報告において、ＰＶ１−ＩｇＧ３とは、ハムスターＰＶ１のＶＬおよびＶＨ可変領域、重鎖のマウスＩｇＧ３定常領域、および軽鎖のマウス・カッパ定常領域を含むキメラ抗体をいう。発現ベクターｐＶ１．ｇ３．ｒｇ．ｄＥ（図１４）はコールらの記載に類似の２段階クローニング工程により入手した（Ｃｏｌｅ， Ｍ．Ｓ．， Ｃ． Ａｎａｓｅｔｔｉ， ａｎｄ Ｊ．Ｙ． Ｔｓｏ． １９９７．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ３６１３−３６２１）。重鎖定常領域はマウスγ３ゲノム・フラグメントから誘導し、軽鎖はκフラグメントから誘導した。重鎖および軽鎖の遺伝子は共にヒト・サイトメガロウイルスの主要最初期プロモーターとエンハンサーにより駆動され、またそれらはヒト補体遺伝子Ｃ２由来の転写ターミネーターにより分離される（Ａｓｈｆｉｅｌｄ， Ｒ．， Ｐ． Ｅｎｒｉｑｕｅｚ−Ｈａｒｒｉｓ， ａｎｄ Ｎ．Ｊ． Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ． １９９１．ＥＭＢＯ Ｊ． １０：４１９７−４２０７）。選択マーカーｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｒ．Ｃ．， ａｎｄ Ｐ． Ｂｅｒｇ． １９８１．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６）は、改変ＳＶ４０初期プロモーターにより転写させる。キメラＰＶ１−ＩｇＧ３の発現のために、単一のプラスミド・ベクターをマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０に形質移入し、形質移入体をｇｐｔの発現で選択した。形質移入体からの使用培地について、マウスＩｇＧ３抗体が産生されているかＥＬＩＳＡにより分析した。その際、捕捉試薬としてヤギ抗マウスＩｇＧ３を、また発色試薬としてＨＲＰ−結合ヤギ抗マウス・カッパ鎖を使用した。該アッセイはマウスＩｇＧ３に特異的である；他のマウスＩｇＧイソタイプはこの分析で陰性である。
結果
キメラＰＶ１−ＩｇＧ３の発現：クローン化ＶＬとＶＨを、材料と方法の項および図１５に記載したように、ミニ−エキソンに導入し（図１５）、発現ベクターに組込んだ。次いで、発現ベクターをマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０に移入し、キメラＰＶ１−ＩｇＧ３を産生させた。数種の形質移入体からの使用培地について、マウスＩｇＧ３抗体が産生されているかＥＬＩＳＡによりアッセイし、ＥＬ４細胞への結合についてはＦＡＣＳによりアッセイした。殆どの形質移入体が両アッセイにおいて陽性であった。抗体生産性の高い形質移入体の一つを選択し、無血清培地１Ｌ中で増殖させた。ＰＶ１−ＩｇＧ３は１Ｌの使用培地からアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。収量は＞１０ｍｇ／Ｌであった。
【００７２】
実施例１７
ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製キメラＰＶ１−ＩｇＧ３のキャラクタリゼーション
方法
タンパク質精製：ＩｇＧ３高発現形質移入体の一つ（クローン＃１）を１Ｌのギブコ（ＧＩＢＣＯ）無血清ハイブリドーマ培地にて増殖した。細胞の生存度が３０％以下に達したところで、使用した培地上清を収穫し、２００ｍｌに濃縮し、ファルマシアＰ１ポンプ（２〜３ｍｌ／分）により、プロテインＡセファロース５ｍｌのカラムに負荷した。次いで、カラムをさらに０．１Ｍ−ＮａＣｌを含むＰＢＳ（ＮａＣｌの最終濃度は０．２５Ｍ）で洗浄し、抗体を３．５Ｍ−ＭｇＣｌ２で溶出した。次いで、０．１Ｍ−ＮａＣｌをさらに含有するＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラム上で脱塩した。脱塩したタンパク質溶液を０．２μｍのフィルターで濾過し、４℃で保存した。マウスＩｇＧ３すべてと同様に、高濃度のＰＶ１−ＩｇＧ３（＞１ｍｇ／ｍＬ）を冷所で沈殿させ、次いで３７℃に加温して溶液に戻した。抗体は室温で溶液のままである。冷却沈殿を数回繰り返しても抗体の抗原結合活性に影響するように見えない。
【００７３】
サイズ排除ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度測定：サイズ排除ＨＰＬＣは以下の装置からなるパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。ＰＥ ＩＳＳ２００アドバンスドＬＣサンプルプロセッサー、ＰＥシリーズ４１０バイオＬＣポンプ、ＰＥ２３５Ｃダイオードアレー検出器、およびＰＥネルソン６００シリーズＬＩＮＫ。自動試料採取器、ポンプおよび検出器を制御するために、またデータの取得、保存および処理のために、パーキンエルマー・ターボクローム・ナビゲーター・バージョン４．１ソフトウエアを使用した。分離には、東ソーハースＴＳＫ−ゲルＧ３０００ＳＷＸＬサイズ排除ＨＰＬＣカラム２本（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、５μｍ粒子径、２５０Å孔径；カタログ番号＃０８５４１、東ソーハース、）を直列につないで使用した。移動相は２００ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ６．９）とし、流速は１．００ｍＬ／分とした。カラムの溶出液は２２０ｎｍと２８０ｎｍ両方で分光光学的にモニターした。注入容量は未希釈のＰＶ１−ＩｇＧ３サンプル５０μＬ（６３．５μｇ）とした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは標準的手法に従い実施した。
結果
単離したＰＶ１−ＩｇＧ３の純度はサイズ排除ＨＰＬＣとＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＰＶ１−ＩｇＧ３のＨＰＬＣ溶出プロフィルを図１６に示す。この分析に基づくと、該タンパク質は９９％がモノマーであり、分子量１５０ｋＤに相当する移動度を有する。ＰＶ１、ＰＶ１−ＩｇＧ３およびイソタイプコントロールを非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、３種すべての抗体が約１５０ｋＤの分子量をもつことを示した（図１７Ａ）。図１７Ａに見られるマイナーなバンドは非還元ＳＤＳ中サンプルを沸騰させたことによるアーチファクトであった。それらは抗体中の不完全な鎖間ジスルフィド結合の数を反映していた。しかし、同じ３つのタンパク質を還元条件下で分析すると（図１７Ｂ）、ＰＶ１−ＩｇＧ３またはイソタイプコントロールではなく、ＰＶ１が通常ＩｇＧで見られる分子量５０ｋＤを僅かに超える分子量の重鎖をもつことを示した。ハムスター抗体ＰＶ１もまたＣＨ３のＡｓｎ２９７に重糖鎖をもつか、または重鎖の別の場所に余分の糖鎖形成部位をもつ。後に検討するように、この異常な糖鎖形成パターンは、多分、レクチン／糖質相互作用によってＥＬ４細胞とＰＶ１の非特異的結合に関与しているであろう。
【００７４】
実施例１８
方法
フローサイトメトリー：マウスＴ細胞株ＥＬ４細胞（２．５×１０５細胞／０．２ｍｌ）を１μｇ／ｍｌのＰＶ１、３７．５１またはＰＶ１−ＩｇＧ３により４℃で３０分間染色し、２ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄し、次いで２０μｌの特異蛍光色素−結合二次抗体（１０μｇ／ｍｌ）で染色した。暗所、４℃で２０分間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳキャン（ベクトン・ディッケンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、ミルピタス、カリフォルニア）で分析した。
【００７５】
競合実験において、ＥＬ４細胞（２．５×１０５細胞／０．２ｍｌ）を１μｇ／ｍｌのＲ−ＰＥ−ＰＶ１および２５μｇ／ｍｌのＰＶ１、ＰＶ１−ＩｇＧ３またはＩｇＧ３イソタイプコントロールにより、暗所、４℃で３０分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳキャンにより分析した。同様の競合反応は種々バージョンの１４５．２Ｃ１１でも実施した。逆競合実験においては、ＥＬ４細胞（２．５×１０５細胞／０．２ｍｌ）を１μｇ／ｍｌのＰＶ１−ＩｇＧ３および２５μｇ／ｍｌのＰＶ１により４℃で３０分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ−結合ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で染色し、洗浄後、ＦＡＣＳキャンにより分析した。ＰＶ１に対する二次抗体の非特異的結合を制御するために、ＥＬ４細胞をＰＶ１−ＩｇＧ３不含の過剰のＰＶ１で染色し、分析した。
【００７６】
マウスＴ細胞染色のために、ＢＡＬＢ／ｃマウス膵臓細胞（２．５×１０５細胞／０．２ｍｌ）を１μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ３イソタイプコントロール（ＦＬＯＰＣ２１）またはＰＶ１−ＩｇＧ３により４℃で３０分間染色し、２ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄し、２０μｌのＦＩＴＣ−結合１４５．２Ｃ１１（１０μｇ／ｍｌ）および２０μｌのＲ−ＰＥ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ３（１０μｇ／ｍｌ）により染色した。暗所４℃で２０分間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳキャンにより分析した。
結果
フローサイトメトリーによるＰＶ１とＰＶ１−ＩｇＧ３のキャラクタリゼーション：ＰＶ１を使用してＣＤ２８陽性Ｔ細胞株ＥＬ４細胞を染色し、ＦＡＣＳキャンにより分析した。染色パターンはＰＶ１が２つの異なる部位でＥＬ４細胞に結合することを示した（図１７Ａ）。さらに、ＰＶ１ならびに数種のアルメニア・ハムスター抗マウスＴ細胞抗体（１４５．２Ｃ１１、抗ＣＤ３；Ｈ５７−５９７、抗ＴＣＲ；およびＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、抗ＣＴＬＡ４）もまたＣＤ２８−陰性骨髄細胞株ＮＳ０に非特異的に結合する（データ非開示）。他方、シリア・ハムスター抗ＣＤ２８抗体３７．５１はＥＬ４細胞の一箇所にのみ特異的に結合する（図１７Ｂ）。ＣＤ２８の結合の外に、ＰＶ１もまた他の部位に非特異的に、恐らく糖質／レクチン型の相互作用を介して結合すると思われる。図１７Ｃに示すように、キメラＰＶ１−ＩｇＧ３はこの非特異的結合活性を含んでいない。該抗体は３７．５１と同様のパターンでＥＬ４細胞に結合し、ＣＤ２８陰性ＮＳ０細胞には結合しない（データ非開示）。従って、ＰＶ１の非特異結合性はこの特定抗体の重鎖定常領域に存在し、キメラ化することで除去される。
【００７７】
ＰＶ１−ＩｇＧ３がＣＤ２８特異結合活性を含むことを証明するために、我々はＦＡＣＳキャン競合アッセイを使用した。これらの実験において、Ｒ−ＰＥ結合ＰＶ１は過剰（２５倍）の非標識ＰＶ１、ＰＶ１−ＩｇＧ３またはマウスＩｇＧ３対照と混合し、その混合物をＥＬ４細胞の染色に用いた。図１８Ａに示すように、イソタイプコントロールではないＰＶ１およびＰＶ１−ＩｇＧ３双方が、Ｒ−ＰＥ結合ＰＶ１がＥＬ４細胞に結合するのを妨げた。ＰＶ１−ＩｇＧ３による阻害はＰＶ１によるよりも低く、我々はこれらのデータについて、ＰＶ１−ＩｇＧ３がＣＤ２８に対してＲ−ＰＥ結合ＰＶ１と競合するが、非特異部位に対しては競合しないと解釈した。同様に、１４５．２Ｃ１１（アルメニア・ハムスター抗マウスＣＤ３）およびキメラ１４５．２Ｃ１１−ＩｇＧ３は共にＲ−ＰＥ結合１４５．２Ｃ１１がＥＬ４細胞に結合するのを妨げる（図１８Ｂ）が、キメラ抗体はＲ−ＰＥ−１４５．２Ｃ１１の細胞に対する非特異的結合を除去できないためにその効果は劣る。
【００７８】
我々はまた、ＥＬ４細胞への結合に対してＰＶ１−ＩｇＧ３と競合する過剰（２５倍）のＰＶ１を用いて、逆の競合実験を行った。この場合、ＰＶ１−ＩｇＧ３は標識しなかったが、このものはＦＩＴＣ−結合ロバ抗マウス抗体により特異的に認識された。図１８Ｃの結果は、過剰のＰＶ１によるＥＬ４細胞に対するＰＶ１−ＩｇＧ３の結合阻害が殆ど競合によるものであることを示したが、このことはＰＶ１とＰＶ１−ＩｇＧ３が同じエピトープに結合することを証明するものである。
【００７９】
最後に、ＰＶ１−ＩｇＧ３を用いてマウス脾臓細胞を染色した。ＰＶ１−ＩｇＧ３被覆膵臓細胞は二次抗体Ｒ−ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ３が特異的に認識した。同時に、ＦＩＴＣ−結合１４５．２Ｃ１１もまた脾臓細胞に添加し、ＣＤ３陽性細胞を標識した。二色フローサイトメトリー分析において、ＰＶ１−ＩｇＧ３は特異的にＣＤ３陽性細胞を染色したが、ＣＤ３陰性細胞は染色しなかった（図１９Ｂ）。他方、マウスＩｇＧ３イソタイプコントロールはＣＤ３陽性細胞を染色しなかった（図１９Ａ）。従って、キメラＰＶ１−ＩｇＧ３はマウスＴ細胞上に発現される抗原を認識し、その抗原結合活性は抗ＣＤ２８抗体と矛盾がない。
【００８０】
実施例１９
コラーゲン誘発関節炎の誘導
方法
ウシＣＩＩ（コラーゲン技術研究会、日本）１２５μｇを等容量のＣＦＡ（和光、日本）で乳化し、マウスの尾根部に皮内投与して免疫した。２１日目にウシＣＩＩ／ＣＦＡ１２５μｇを皮内注射して追加免疫した。最初の免疫から７日間、抗ＣＤ２８抗体（ＰＶ１−ＩｇＧ３）１ｍｇ／ｋｇ／日の用量により、浸透圧ポンプを介して継続注入し、マウスを処理した。２度目の免疫から１１日目に四肢の関節炎の発症を精査チェックし、四肢の炎症についてすでに記載されているように０から３まで配点した（Ｔａｄａ， Ｙ．， Ａ． Ｈｏ， Ｄ．−Ｒ． Ｋｏｈ， Ｔ．Ｗ． Ｍａｋ． １９９６． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６： ４５２０．  Ｔａｄａ， Ｙ．， Ａ． Ｈｏ， Ｔ． Ｍａｔｓｕｙａｍａ， Ｔ．Ｗ． Ｍａｋ． １９９７． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５： ２３１）。各足に配点し、４つのスコアを加算してマウス１匹あたりの最大スコアが１２となるようにした。実験マウスの合計スコアを合計マウス数で割って関節炎指数を計算した。
結果
マウスをウシＣＩＩで免疫し、関節炎の発症について観察した。二回目の免疫後１１日目に、関節炎指数は、抗ＣＤ２８抗体で処理したマウスにおいて、対照（７．５０±０．６６）に対して有意に低下した（０．６３±０．５０）（ｐ＜０．０１）。
【００８１】
実施例２０
方法
マウス：動物
メスＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈマウスはチャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）ジャパン・インク（横浜、日本）から入手した。動物はすべて特別の病原菌のない設備において、エアフィルター付きの飼料飲料水に自由に接近できる小型隔離ケージで飼育した。マウスはすべて実験開始時に６〜８週令であった。
抗体：
抗マウス・サイレントＣＤ２８（ＰＶ１−ＩｇＧ３）はＰＶ−１クローンのものに特異性を有しているが、インビトロで強いアゴニスト活性はもたない（Ｆｃ→ＩｇＧ３）。抗マウスＣＤ１５４（ＴＲＡＰ１、ＩｇＧ１）はＢＤファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）（サンティエゴ、カリフォルニア）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ）はジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ）から購入した。
尾部皮膚移植：
供与マウス（ＢＡＬＢ／ｃ：Ｈ−２ｄ）の尾部からの完全な厚さの皮膚移植片を受容マウス（Ｃ３Ｈ：Ｈ−２ｂ）の胸郭部に移植し、バンドエイドで７日間保持した。生存した移植片は毎日目視精査した。拒絶は生存表皮移植組織の＞８０％が失われた場合とした。ダンネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の多重比較試験を用い、統計分析を実施した。ｐ＜０．０５の値を有意と見なした。
処理プロトコール：
皮膚移植片受容者を１０、５０、および２５０μｇの抗マウス・サイレントＣＤ２８、２５０μｇの抗マウスＣＤ１５４および１００μｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇにより、移植した日（０日）および術後３日目および６日目に腹腔内投与で処理した。
結果
抗マウス・サイレントＣＤ２８および抗マウスＣＤ１５４の投与によるＣＤ４０およびＣＤ２８Ｔ細胞の共刺激経路を同時に遮断すると、Ｃ３Ｈマウスにおいて皮膚同種間移植の生存を効果的に促進する。対照動物は９日目でその移植片を拒絶した。抗ＣＤ４０ＬｍＡｂのみでは同種間移植の生存を適度に延長した（平均生存時間（ＭＳＴ）１０日）が、ＣＤ２８と併用した場合、生存が劇的に改善され、平均生存時間（ＭＳＴ）が３３日を越える延長を認めた。この戦略はＣＴＬＡ−４−Ｉｇと抗マウスＣＤ４０ＬｍＡｂの投与では顕著に効果が低下し、ＭＳＴは１２日である。
実施例２１
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントならびに抗ＣＤ２８抗体の調製
抗ＣＤ２８抗体のＦａｂフラグメントの調製
抗ヒトＣＤ２８抗体（ＨｕＴＮ２２８）を固定化フィシン（ピアース、米国）により消化した。固定化フィシンは５ｍＭ−ＥＤＴＡおよび１１．５ｍＭシステインＨＣｌ含有の５０ｍＭトリスＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）にて活性化し、カラムに詰めた。抗体溶液をカラムに加え、３７℃にて２〜３日間インキュベートした。カラムをＰＢＳで洗浄し、消化物は超遠心により濃縮した。濃縮した消化物をゲル濾過カラム（ＴＳＫゲル−３０００Ｗｘ１、東ソー、日本）に付し、適切なフラクションを集めて超遠心により濃縮した。タンパク質濃度は２８０ｎｍ（Ａｂｓ２８０＝１．４、１ｍｇ／ｍＬ）での吸光度により決定し、フラグメントのサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
抗ＣＤ２８抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントの調製
抗ヒトＣＤ２８抗体はＦａｂフラグメントの場合と同じ方法で調製したが、その際、システイン濃度（１．１５ｍＭ）およびインキュベーション時間（一夜）は例外とした。
【００８２】
上記の教示に照らして、本発明を様々に修正および改変することは明らかに可能である。従って、本発明は上記の請求項の範囲内で、具体的に本明細書に記載した以外でも実施し得ることを理解すべきである。
【００８３】
本明細書に記載したすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の文献はその全体を参照により本明細書の一部とする。
【００８４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１．  ＣｈＴＮ２２８抗体発現用プラスミドの構造。マウスＴＮ２２８のＶＬおよびＶＨはＸｂａＩ部位の隣接するミニ−エキソンとして構築した。ＶＬ配列は発現ベクターｐＶｋに組み込ませ、またＶＨ配列は発現ベクターｐＶｇ２Ｍ３に組み込ませた。
【図２】
図２．  ミニ−エキソンのＣｈＴＮ２２８軽鎖のヌクレオチド配列とその推定アミノ酸配列。シグナルペプチド配列はイタリックで示す。ＣＤＲには下線を付す。成熟軽鎖はアスパラギン酸残基（太字）から始まる。非翻訳イントロン配列は小文字で示す（配列番号１および２）。
【図３】
図３．  ミニ−エキソンのＣｈＴＮ２２８重鎖可変領域のヌクレオチド配列とその推定されるアミノ酸配列。シグナルペプチド配列はイタリックで示す。ＣＤＲには下線を付す。成熟重鎖はグルタミン残基（太字）から始まる。非翻訳イントロン配列は小文字で示す（配列番号３および４）。
【図４】
図４．  競合実験。Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞を２５ｎｇのＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣおよびＣｈＴＮ２２８またはＭｕＴＮ２２８の２倍系列希釈液と記載のようにインキュベートした。Ｐ８１５／ＣＤ２８’細胞もまた競合体なしに、ＭｕＴＮ２２８−ＦＩＴＣのみとインキュベートした。各試料の平均蛍光強度を競合体の濃度に対してプロットした。
【図５】
図５．  ヒト一次ＭＬＲ（１）に対するＴＮ２２８−ＩｇＧ２ｍ３の阻害作用。４人の個体からの一次ＭＬＲの阻害率（％）を個々に示した。
【図６】
図６．  ヒト一次ＭＬＲ（２）に対するＴＮ２２８−ＩｇＧ２ｍ３の阻害作用。４人の個体からの一次ＭＬＲの阻害率（％）を個々に示した。
【図７】
図７．  二次ＭＬＲに対するＴＮ２２８−ＩｇＧ２ｍ３の作用。ボランティア２名からのデータを個々に示した。［３Ｈ］−チミジンの二次ＭＬＲ取り込みは、一次ＭＬＲを１００としてラジ（Ｒａｊｉ）刺激のみのｄｐｍのパーセントで表した。ＴＮ２２８−ＩｇＧ２ｍ３：０．１μｇ／ｍＬ。
【図８】
図８．  ＨｕＴＮ２２８抗体発現用のプラスミドの構造。ヒト化ＴＮ２２８のＶＬおよびＶＨはＸｂａＩ部位の隣接するミニ−エキソンとして構築した。ＶＬ配列は発現ベクターｐＶｋに組み込ませ、またＶＨ配列は発現ベクターｐＶｇ２Ｍ３に組み込ませた。
【図９】
図９．  ミニ−エキソンのＨｕＴＮ２２８重鎖可変領域のヌクレオチド配列とその推定されるアミノ酸配列。シグナルペプチド配列はイタリックで示す。ＣＤＲには下線を付す。成熟重鎖はグルタミン残基（太字）から始まる（配列番号５および６）。
【図１０】
図１０．  ミニ−エキソンのＨｕＴＮ２２８軽鎖可変領域のヌクレオチド配列とその推定されるアミノ酸配列。シグナルペプチド配列はイタリックで示す。ＣＤＲには下線を付す。成熟軽鎖はアスパラギン酸残基（太字）から始まる（配列番号７および８）。
【図１１】
図１１．  ＦＡＣＳ競合アッセイ。ＦＩＴＣ−標識ＭｕＴＮ２２８が種々量の競合体ＭｕＴＮ２２８またはＨｕＴＮ２２８抗体の存在下で、Ｐ８１５／ＣＤ２８′細胞に結合するのを、実施例記載のように、フローサイトメトリー競合実験により分析した。
【図１２】
図１２．  ＥＬＩＳＡ競合アッセイ。ビオチン化ＭｕＴＮ２２８が種々量の競合体ＭｕＴＮ２２８またはＨｕＴＮ２２８抗体の存在下で、ｓＣＤ２８−Ｆｃに結合するのを実施例記載のように、ＥＬＩＳＡ競合実験により分析した。
【図１３】
図１３．  Ｉ−１２５競合アッセイ。１２５Ｉ−標識ＭｕＴＮ２２８が種々量の競合体ＭｕＴＮ２２８またはＨｕＴＮ２２８抗体の存在下で、Ｐ８１５／ＣＤ２８＋細胞に結合するのを、実施例記載のように、１２５Ｉ−標識抗体競合実験により分析した。
【図１４】
図１４．  ＰＶ１−ＩｇＧ３抗体発現用のプラスミドの構造。ＰＶ１のＶＬおよびＶＨはＸｂａＩ部位の隣接するミニ−エキソンとして構築した。ＶＬ配列は発現ベクターｐＭＶｋ．ｒｇ．ｄＥに組み込ませ、またＶＨ配列は発現ベクターｐＭＶｇ３．Ｄ．Ｔｔに組み込ませた。この２つのプラスミドにつき組換えを行って、ＰＶ１−ＩｇＧ３の重鎖および軽鎖を同時発現する単一のプラスミドを生成させた。
【図１５】
図１５Ａ．  ミニ−エキソンの軽鎖および重鎖のｃＤＮＡ配列とその推定されるアミノ酸配列。ＣＤＲには下線を付す。成熟軽鎖は２０位のアスパラギン酸残基（二重下線）から始まる（配列番号９および１０）。
【図１６】
図１５Ｂ．  ミニ−エキソンのＰＶ１の可変領域のｃＤＮＡ配列とその推定されるアミノ酸配列。ＣＤＲには下線を付す。成熟重鎖は２０位のグルタミン（二重下線）から始まる（配列番号１１および１２）。
【図１７】
図１６．  方法の項に記載したＨＰＬＣ使用のサイズ排除クロマトグラフィーによるＰＶ−１−ＩｇＧ３の分析。タンパク質は２８０ｎＭでの吸光度によりモニターした。
【図１８】
図１７．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。マウスＩｇＧ３イソタイプコントロール（レーン１）、ＰＶ１（レーン２）、およびＰＶ１−ＩｇＧ３（レーン３）。パネルＡのタンパク質は非還元条件下に、またパネルＢは還元条件下に泳動させた。ＭＷは分子量マーカーを表す。数値はｋＤで示したＭＷ標準品である。
【図１９】
図１８．  ＰＶ１（Ａ）、３７．５１（Ｂ）、またはＰＶ１−ＩｇＧ３（Ｃ）で染色し、フローサイトメトリーで分析したＥＬ４細胞。使用した二次抗体は、ＰＶ１用ＦＩＴＣ結合ロバ抗アルメニ・アハムスターＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、３７．５１用ＦＩＴＣ結合ロバ抗シリア・ハムスターＩｇＧ，およびＰＶ１−ＩｇＧ３用ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスカッパであった。実線プロフィルは二次抗体のみで染色した細胞を表す。点線のプロフィルは方法の項に記載した一次抗体および二次抗体の両方で染色した細胞を表す。マウスＩｇＧ３イソタイプコントロールはＥＬ４細胞を染色しなかった（データ非開示）。
【図２０】
図１９．  （Ａ）過剰のＰＶ１、またはＰＶＩ−ＩｇＧ３はＥＬ４細胞へのＲ−ＰＥ結合ＰＶ１の結合と競合する。フローサイトメトリー・ヒストグラムの細い実線（黒）は染色しない細胞を表し、太い実線（濃紺）はＲ−ＲＥ−ＰＶ１のみで染色した細胞、細い点線（赤紫）はＲ−ＰＥ−ＰＶ１と過剰の非結合ＰＶ１で染色した細胞、細い二重点線（淡青）はＲ−ＰＥ−ＰＶ１と過剰の非結合ＰＶ１−ＩｇＧ３で染色した細胞をそれぞれ示す。過剰のマウスＩｇＧ３イソタイプコントロールはＥＬ４細胞に結合するＲ−ＰＥ−ＰＶ１に影響しなかった（データ非開示）。（Ｂ）過剰の１４５．２Ｃ１１、または１４５．２Ｃ１１−ＩｇＧ３はＥＬ４細胞へのＲ−ＰＥ結合１４５．２Ｃ１１の結合と競合する。細い実線（黒）は染色しない細胞を表し、太い実線（濃紺）はＲ−ＲＥ−１４５．２Ｃ１１のみで染色した細胞、細い点線（赤紫）はＲ−ＰＥ−１４５．２Ｃ１１と過剰の非結合１４５．２Ｃ１１で染色した細胞、細い二重点線（淡青）はＲ−ＰＥ−１４５．２Ｃ１１と過剰の非結合１４５．２Ｃ１１−ＩｇＧ３で染色した細胞をそれぞれ示す。（Ｃ）過剰のＰＶ１はＥＬ４細胞へのＰＶ１−ＩｇＧ３の結合と競合する。ＥＬ４細胞は過剰のＰＶ１の存在下または不存在下にＰＶ１−ＩｇＧ３により染色された。細胞を洗浄し、マウスＩｇＧ３特異ＦＩＴＣ結合ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で染色した。細い実線（黒）は二次抗体のみで染色した細胞を表し、太い実線（濃紺）はＰＶ１−ＩｇＧ３と二次抗体で染色した細胞、細い点線（赤紫）はＰＶ１−ＩｇＧ３と過剰のＰＶ１と二次抗体で染色した細胞をそれぞれ示す。
【図２１】
図２０．  ＰＶ１−ＩｇＧ３および１４５．２Ｃ１１で染色したマウス脾臓細胞。マウスＩｇＧ３イソタイプコントロール（Ａ）またはＰＶ１−ＩｇＧ３（Ｂ）で細胞を染色し、Ｒ−ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ３で染色し、次いでＦＩＴＣ結合１４５．２Ｃ１１で染色して、材料と方法の項に記載したように、二色フローサイトメトリーにより分析した。リンパ球ゲートの細胞のみを分析した。ＰＶ１−ＩｇＧ３陽性細胞は上部四半分にあり、ＣＤ３陽性細胞は右側四半分にある。各四半分中の数値はその特定した四半分中の細胞の百分比を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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