(57)【要約】本発明のスクリーニング方法によると、γ-セクレターゼ活性の供給源及び基質をテスト物質と共にインキュベートすること、並びに前記基質から遊離したC-末端断片を検出することによって、γ-セクレターゼ活性を調節し得る物質が同定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ-セクレターゼ活性を調節し得る物質をスクリーニングする方法であって、
- γ-セクレターゼ活性の供給源を提供する工程；
- γ-セクレターゼ活性の基質を提供する工程であって、前記基質がγ-セクレターゼ基質C99（配列番号２）のアミノ酸49とアミノ酸50との間の天然に存在する切断部位に対応する切断部位を含む前記工程；
- γ-セクレターゼ活性の酵素活性を可能にする条件下で、前記供給源及び前記基質をテスト物質と共にインキュベートする工程；及び
- 前記基質から遊離したC-末端断片であって、CTFγ/50（配列番号１）のN-末端配列に対応する配列で開始される前記C-末端断片を検出することによって、γ-セクレターゼ活性を決定する工程；
を含む前記方法。
【請求項２】
テスト物質の存在なしにインキュベーションを行うことによって得られた活性に対して、決定したγ-セクレターゼ活性を比較する工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
テスト物質がγ-セクレターゼ活性に対する阻害効果についてスクリーニングされる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
γ-セクレターゼ活性の供給源がヒト胚性腎(HEK)293細胞である、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
γ-セクレターゼ活性の基質がヒト野生型βAPP770、野生型βAPP695、swAPP695、C99及びC83からなる群より選択される、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
γ-セクレターゼ活性を決定する工程がCTFγ/50の遊離を測定することを含む、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
CTFγ/50がイムノブロッティング又はELISAによって測定される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
テスト物質が、Aβ遊離に基づくアッセイにおいて阻害効果を示す物質から選択される、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ハイスループットスクリーニング（HTS）形式で行われる、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
γ-セクレターゼ活性を阻害し得る物質を同定するためのキットであって、γ-セクレターゼ活性の供給源及びγ-セクレターゼ活性の基質を含む前記キット。
【請求項１１】
γ-セクレターゼ活性を阻害し得る物質を同定するための、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法又は請求項１０記載のテストキットの使用。
【請求項１２】
請求項１−９のいずれか１項に記載の方法又は請求項１０記載のテストキットを用いて同定される、γ-セクレターゼ活性を阻害し得る物質。
【請求項１３】
請求項１２記載の物質を含む医薬組成物。
【請求項１４】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための医薬品を調製するための、請求項１２記載の物質の使用。
【請求項１５】
図３Ａ（配列番号１）に示すアミノ酸配列を有するCTFγ/50。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病において重要な役割を果たす新規ペプチド、前記新規ペプチドの検出に基づくスクリーニングアッセイ及びテストキット、並びにγ-セクレターゼ活性のモジュレーターを同定するための前記ペプチド、スクリーニングアッセイ及びテストキットの使用に関する。本発明はさらに、前記スクリーニングアッセイによって同定される阻害物質及び前記阻害物質を含む医薬組成物に関する。
複数の文献が、本明細書の本文全体にわたって引用されている。本明細書で引用される文献の各々（製造者の仕様書及び指示書等のいずれをも含む）は、参照により本明細書に含まれるものとする；しかしながら、引用されるどの文献も本発明の事実上の先行技術であるとは認められない。
アルツハイマー病（AD）は、世界中で最も患者数の多い神経変性疾患である。アミロイドβ-ペプチド（Aβ）で構成される老人斑は、AD患者の脳における主要な病理変性であると考えられている（Selkoe, 1999）。ほぼ全ての家族性AD（FAD）に付随する変異は、高度にアミロイドを生じる42アミノ酸の変種(variant)の生成を増加することによって、Aβ産生に影響を与える（Selkoe, 1999）。Aβはエンドタンパク質分解(endoproteolysis)によってβ-アミロイド前駆タンパク質（βAPP）から生成され、そのため少なくとも2つのタンパク質分解活性がAβ産生に必要とされる：ベータ-セクレターゼ（β-セクレターゼ；BACE）は、C99又はCTFβ（配列番号２）と呼ばれるβAPP膜付随型C-末端断片を生成するN-末端切断を媒介する（Vassar and Citron, 2000）。C99は、その次のタンパク質分解プロセッシング過程のための直接の前駆体である：その過程では、γ-セクレターゼにより（おそらくは膜内で）C99が切断されてAβ及びC-末端断片となる。この切断はプレセニリンPS1及びPS2によって促進され、プレセニリン自体がγ-セクレターゼ切断を媒介する珍しいアスパルチルプロテアーゼであり得ることの証拠が存在している（Steiner and Haass, 2000；Wolfe and Haass, 2001）。βAPPの別のプロセッシング経路はα-セクレターゼのエンドタンパク質分解活性によって開始され、βAPP膜付随型C-末端断片を生じる。前記断片は83アミノ酸（C83）の長さを有する。γ-セクレターゼによるC83の切断は、（非斑形成）p3及びC-末端断片の形成を生じる。
【０００２】
C99のγ-セクレターゼ切断は、Aβの生物体液への分泌を生じる。その切断のC-末端生成物は、以前にはp7として記載され（Haass and Selkoe, 1993）C-末端断片ガンマ（CTFγ）とも呼ばれており、これまでin vivoで観察されていなかった。しかしながらAβのC-末端は、Aβがその前駆体C99の位置40又は位置42で終わり得るという理由で、不均一であることが知られている。従って、γ-セクレターゼ切断から生じる2種のCTFγ、すなわち59アミノ酸からなるC-末端断片（CTFγ/59；Aβ40産生に由来する）及び57アミノ酸からなるC-末端断片（CTFγ/57；Aβ42産生に由来する）はそれぞれ、先行技術において予測されていた。最近、CTFγ/59又はCTFγ/57であろうと推定されるペプチドがin vitroで観察された（McLendon et al., 2000；Pinnix et al., 2001）。
医学上の観点から、アルツハイマー病の治療的処置に有用な手段及び方法に対する強い必要性が存在している。これに関して、Aβ斑形成において主要な役割を果たすγ-セクレターゼ活性は、治療的、特に薬理学的な新しいアプローチのための主要な標的となり得る。
Wolfeら（1999）の文献には、γ-セクレターゼ活性を評価するためのin vitroテストシステムが記載されている。PS1を安定に発現している細胞の膜が調製された。βAPPシグナル配列に融合したC99をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクションすることによって、C99が提供された。インキュベーションの後、遊離したAβの量を評価することによって、γ-セクレターゼの活性が決定された。
Pinnixら（2001）の文献には、モルモット脳に由来するβAPP C-末端断片を検出するために設計した実験が記載されている。そこで得られた断片は、57アミノ酸からなるペプチドとして特徴付けられている。
本発明の基礎となる技術的課題は、アルツハイマー病、並びにAβ斑形成及び/又はγ-セクレターゼ活性が関与する他の神経変性疾患の治療法を開発するための新規な方法及び手段を提供することである。
【０００３】
（発明の開示）
本発明の上記課題は、γ-セクレターゼの活性を調節し得る物質を同定する方法によって解決される。その方法は、以下の工程を含む：
γ-セクレターゼ活性の供給源を提供する工程；
基質C99のアミノ酸49とアミノ酸50との間の天然に存在する切断部位に対応する切断部位を有するγ-セクレターゼ活性の基質を提供する工程；
前記γ-セクレターゼ活性の酵素活性を可能にする条件下で、前記供給源及び前記基質をテスト物質と共にインキュベートする工程；及び
前記γ-セクレターゼ活性のタンパク質分解活性により遊離したC-末端断片（及び、特にその量）を検出することによって、γ-セクレターゼ活性を決定する工程。
これまで未知のC-末端断片のN-末端は、C99のアミノ酸50に対応する。
下で（実施例１）詳細に説明されるように、本発明は、C99のアミノ酸49とアミノ酸50との間の酵素切断がC99のAβへのプロセッシングに関与しているという驚くべき発見に基づいている。本発明者らは、今ではCTFγ/50（アミノ酸配列：VMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN；配列番号１；N-末端がC99のアミノ酸50に対応している）と呼ばれる前記プロセッシング過程の生成物を発見して、特徴付けた。また本発明者らは、γ-セクレターゼ活性が前記プロセッシング過程を担うことを実証した。そのうえ、CTFγ/50はC99に作用するγ-セクレターゼ活性の直接の生成物であり、先に記述したCTFγ/57又はCTFγ/59の更なる分解の生成物でないことが示された。従ってこれらの結果から、γ-セクレターゼ活性はC99のこれまで未知の切断部位で作用することが明らかに実証される。このタンパク質分解活性の同定は、Aβ生成に関与する酵素反応の医薬的調節に新規アプローチを提供し、それによって治療的処置に新規アプローチを提供する。
【０００４】
先行技術では、Aβの遊離を測定することによってγ-セクレターゼ活性が決定されていた（Wolfe et al., 1999；WO 01/16355）。しかしながら、既知のAβ変種であるAβ40（C-末端がC99の位置40である）及びAβ42（C-末端がC99の位置42である）の形成は、それぞれC99のアミノ酸40とアミノ酸41との間及びアミノ酸42とアミノ酸43との間の切断を反映している。従ってそれらの方法では、アミノ酸49とアミノ酸50との間の切断部位におけるタンパク質分解活性の評価が不可能である。Aβ40及びAβ42の遊離は、決定すべきγ-セクレターゼ活性に干渉し得る付加的（エキソ）ペプチダーゼ活性をおそらく必要とすることから、前記の相違が非常に重大である。言い換えると、γ-セクレターゼ活性のモジュレーターを検出するためのスクリーニングアッセイは、前記活性の直接の生成物でなく更なる切断事象から生じる切断生成物の決定に基づいており、前記モジュレーターが前記γ-セクレターゼ活性に作用するのか又はAβ形成に関与する他の酵素活性に作用するのか不明であることから、誤ったデータを与えるであろう。
BACE/γ-セクレターゼ経路だけでなくα-セクレターゼ/γ-セクレターゼ経路のプロセッシング生成物でもあるCTFγ/50は、例えばイムノブロッティング又はELISAといったin vitroアッセイで容易に評価され得る。従って、遊離するCTFγ/50の量の決定は、簡便かつ費用効率が高い読み出しとして、γ-セクレターゼ活性を調節する物質を同定する方法に用いることができる。
さらに、Aβ40生成のAβ42生成に対する調節は、不透明な問題である。特に、幾つかの候補阻害物質は、Aβ40遊離を阻害するがAβ42分泌を刺激するようである。そのような物質は、γ-セクレターゼ活性の下流に作用する、すなわちAβ42をAβ40へと更に分解する（エキソ）ペプチダーゼを特異的に阻害し得ると仮定することができる。本発明の方法は、γ-セクレターゼ活性を特異的に阻害する物質のみが検出され得ることから、前記のような現象によって影響され得ない。
従って要約すると、本発明の方法は、これまで未知のC99のアミノ酸49とアミノ酸50との間の切断に干渉するが、βAPPプロセッシング経路に関与し得る他のエンド-又はエキソタンパク質分解(exoproteolytic)活性に干渉しない物質の特異的同定を可能にする。
【０００５】
（発明の詳細な説明）
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書及び添付したクレームにおいて文脈が明らかに他を指示しない場合、単数形“a”、“an”及び“the”が複数の参照を含むことに注意すべきである。従って、例えば“細胞株(a cell line)”についての言及は、一つ又は二つ以上の細胞株についての言及であり、その他同様である。
アミノ酸の略語は、標準的な1文字表記又は3文字表記に従う。Aβ、C99の他の断片、及びC99自体におけるアミノ酸の番号付けはC99に基づいている、すなわちC99のN-末端アミノ酸はアミノ酸番号1であり、以下同様である。C99の配列は：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN（配列番号２）である。
さらに本明細書及びクレームにおいて、幾つかの用語について参照がなされ得るが、それらの用語は次の意味を有することが定義される：他に指示がない限り、“βAPP”という用語は、以下に記述するアッセイにおいてγ-セクレターゼ活性の基質として役立ち得る、すなわち本発明者らによって発見された切断部位を含み得る限りは、天然に存在するヒト完全長βAPP、その既知のスプライス変種全て（例えば、スプライス変種APP695、APP751及びAPP770；例えばNCBIデータベースエントリーP05067を参照）、その天然に存在する全ての異型(variation)又は変異（いわゆる“Swedish変異”βAPP、swAPP（Citron et al., 1992）のような）、及び他の種の対応する分子を含むことを意味する。文脈が明らかに他を指示しなければ、“βAPP”はγ-セクレターゼ活性の本物の基質、すなわちC99及びC83並びにそれぞれの変種及び誘導体も含むことを意味する。本発明の文脈上の前記定義の理由は、本発明の方法に最も適するアッセイ形式が内因性のα-セクレターゼ活性及び/又はβ-セクレターゼ活性を含むという事実である。従ってC99及びC83は、直接C99又はC83の形態で、あるいはC99又はC83へ“in situ”プロセッシングされる完全長βAPPの形態で、アッセイに提供され得る。
【０００６】
さらに、“βAPP”は、以下に記述するアッセイにおいてγ-セクレターゼ活性の基質として役立ち得る断片又は誘導体である限りは、完全長βAPP、C99又はC83の断片及び改変（例えば、遺伝的に操作した又は化学的に改変した）誘導体も表し得る。遺伝的に操作したβAPPは、上に定義する意味におけるβAPP及びアミノ酸の置換、欠失又は挿入によって改変したβAPPであって、但しそれに加えて本発明のスクリーニング法をそれでもなお行うことができる前記βAPPであり得る。例えば、本発明者らによって同定された切断部位に対応する切断部位を含まない改変βAPP、又はγ-セクレターゼ活性が存在しない細胞区画を標的にする改変βAPPは、本発明の方法に適さないであろう。そのうえ、遺伝的に操作したβAPPは、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ等のようなレポータータンパク質と融合したβAPPであってもよい。
swAPP695は、以下に記述するアッセイにおいて特に好ましい。なぜなら、swAPP695は野生型APPより優れたβ-セクレターゼの基質であり、従ってγ-セクレターゼ活性の直接の基質であるC99を高レベルで提供するからである。
“γ-セクレターゼ活性”という用語は、本発明の文脈上、基質C99をアミノ酸49とアミノ酸50との間で切断し得るタンパク質分解活性であって、生理学的環境における（例えば、細胞膜において）その生理学的基質がC99である前記タンパク質分解活性を意味する。従って“γ-セクレターゼ活性”は、未だ完全に特徴付けられていないγ-セクレターゼ活性自体、一つ以上のプレセニリンと組合わさっているγ-セクレターゼのタンパク質分解活性、又は妥当な場合はプレセニリン自体に現在割り当てられているタンパク質活性であり得る。
“γ-セクレターゼ活性の供給源”という用語は、細胞、ホモジェナイズした細胞、濃縮した膜画分、精製した膜、タンパク質画分、膜上に再構成したタンパク質等のようなγ-セクレターゼ活性を有する生物材料のいずれをも含む。好ましくは、前記供給源はヒト胚性腎（HEK）293細胞であり、より好ましくは、例えば実施例１に記述するように得られ得るHEK293細胞の膜調製品である。膜の精製の方法は、本技術分野で既知である（例えばMethods in Enzymology, Vol.219：“Reconstitution of intracellular Transport”及びT.G. Cooper：“Biochemische Arbeitsmethoden”, De Gruyter Verlag, 1981を参照）。
【０００７】
“γ-セクレターゼ活性の基質”という用語は、上の定義に従う“βAPP”及び人工的に設計されたタンパク質“βAPP”であって、本発明者らによって検出された切断部位を含むものを意味する。前記切断部位は、配列ITLVML（配列番号３）又はVIVITLVMLKKK（配列番号４）によって規定され得る。好ましくは、例えばHEK293細胞において（過剰）発現される（かつ、内因性切断されてC99となる）swAPP695が、γ-セクレターゼ活性の基質である。
“γ-セクレターゼ活性を調節し得る物質”という用語は、上に定義するγ-セクレターゼ活性を酵素的に活性化し得る又は阻害し得る天然に存在する化合物及び合成化合物を意味しており、そのため酵素反応に非特異的に干渉する物質（例えばタンパク質の分解を引き起こす薬剤のような）は勿論含まれるべきでない。当業者であれば、酵素活性の特異的阻害又は活性化と非特異的な阻害又は活性化との間を区別できるであろう。
“CTFγ/50のN-末端配列に対応する配列で始まる断片”という用語は、勿論CTFγ/50自体を含む。しかしながら、本発明者らによって同定された切断部位のC-末端を改変したβAPPがγ-セクレターゼ活性の基質として用いられる場合は、生じる改変C-末端断片は本発明の方法に従って検出される必要があるであろう。言い換えると、前記断片は、上に定義するβAPPの本発明者らによって同定された切断部位、すなわちC99のアミノ酸49及びアミノ酸50に対応する部位でのタンパク質分解切断から生ずる。
“γ-セクレターゼ活性の酵素活性を可能にする条件”という用語は、γ-セクレターゼ活性によるタンパク質分解切断が可能となる反応条件が選択されることを意味する。そのような条件の例は、下で与えられる。
本発明の一態様によると、γ-セクレターゼ活性の基質は、細胞内で構成的に発現される内因性βAPPである。本発明の別の態様によると、外因性βAPPを発現している細胞が用いられる。特に好ましくは、外因性swAPP695である。外因性βAPPの発現は、適切な発現ベクター中にβAPPをコードする遺伝子でトランスフェクションされた細胞によって達成され得る。内因性及び外因性の基質は、WO 01/16355で詳細に説明されている。
【０００８】
本発明の更なる態様では、βAPP基質が、例えば野生型βAPP、swAPP又はC99とレポータータンパク質との融合タンパク質である。前記基質及びその生成は、WO 01/16355で詳細に説明されている。通常用いられるレポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ等である。
下の実施例で用いられる細胞株は、HEK293である。しかしながら、H4、U373、NT2、PC12、COS、CHO、繊維芽細胞、メラノーマ細胞、神経芽腫細胞、ハイブリドーマ細胞、卵母細胞、胚性幹細胞等のような他の細胞及び細胞株を同様に用いることもできる。神経若しくはグリア由来の細胞及び細胞株、又は繊維芽細胞が、特に好ましい。さらに、脳の細胞及び組織、並びにそれらのホモジェネート及び膜調製品を用いてもよい。
CTFγ/50の検出又はCTFγ/50のN-末端配列に対応する配列で始まる断片の検出は、イムノブロッティング/ウエスタンブロッティング、ELISA及び本技術分野で既知である他の適切なペプチド又はタンパク質検出法によって行われ得る。
より高感度な検出は、免疫沈降とそれに続くイムノブロッティング/ウエスタンブロッティングによって達成され得る。代表的プロトコルは、例えばIdaらの文献(1996)において見出すことができる。CTFγ/50の検出に有用な抗体は、例えば、βAPPのC-末端の最後の20アミノ酸に結合するポリクローナル抗体6687、及びLABGEN（登録商標）から入手可能なSAD3128である。
上述のようなレポータータンパク質に融合したβAPPが用いられる場合は、レポータータンパク質の検出によって、切断された基質の量を評価することが可能である。その場合、切断された基質と未切断基質との分離に続いて、レポータータンパク質に依存するそれぞれの検出法が行われ得る。
【０００９】
本発明の方法では、γ-セクレターゼ活性の供給源及び基質は、γ-セクレターゼ活性の供給源の酵素活性を可能にする条件下で、テスト物質と共にインキュベートされる。インキュベーションの後、生成したCTFγ/50（C99又はβAPPの誘導体が基質として用いられる場合は、CTFγ/50又はその誘導体それぞれ）の量を測定することによって、テスト物質の存在下で切断された基質量が決定される。インキュベーション工程の間に遊離するCTFγ/50（又はCTFγ/50誘導体）の量は、上に定義するβAPPの切断部位に作用するγ-セクレターゼ活性の活動を反映する。大部分の場合は対照実験がアッセイに含まれ、前記対照実験では上記と本質的に同じ条件下であるが、前記テスト物質を添加しないか又はγ-セクレターゼ活性に反応しないことが知られている物質を添加して上述する実験が行われ得る。その場合は両方の実験の結果が比較されて、遊離CTFγ/50（又は誘導体）の量が減少することがγ-セクレターゼ活性に対するテスト物質の阻害効果を示し（阻害物質）、一方CTFγ/50の量が増加することは、テスト物質が前記活性を活性化することを示す（活性化物質）。両方の場合において、前記テスト物質は“モジュレーター”として分類される。
使用すべき反応条件に関して、広い範囲の緩衝液を用いることができる。特に、5-10の範囲、より好ましくは6-8の範囲、最も好ましくは6.3-6.9の範囲のpHを有する反応緩衝液が用いられ得る。適切な緩衝液の一例は、150 mMのクエン酸ナトリウム、pH 6.4である。反応温度は、例えば20℃-37℃の範囲で選択され得る。より高い温度はタンパク質の変性を生じることがあり、より低い温度は反応速度の減少を生じることがある。反応混合物は、スクロース及びソルビトールのような膜安定化剤を好ましくは200-1000 mM、より好ましくは200-500 mM、最も好ましくは200-300 mMの量で更に含み得る。さらに反応緩衝液は、例えばRoche（登録商標）から入手可能な“PI コンプリート(Complete)”ミックス、及びEDTAといったプロテイナーゼ阻害物質を含み得る。EDTAは、CTFγの分解を担うメタロプロテイナーゼを阻害するのに役立つ。前記プロテイナーゼ阻害物質ミックスは、γ-セクレターゼ活性の阻害物質であるペプスタチンを含まない。
【００１０】
本発明の別の態様によると、本発明の方法に基づくアッセイは、テスト物質の2段階分析において用いられ得る：上で記述するように、Aβの遊離を評価することによってγ-セクレターゼ活性を測定する幾つかのアッセイが本技術分野において既知である（Wolfe et al., 1999；“Aβ release based assays”）。上でも記述するように、Aβ遊離は少なくとも2段階の切断過程の結果であろう：一つの切断は本発明者らによって同定された部位（C99のアミノ酸49/50）で起り、他の切断はC99の部位40/41（Aβ40を生じる）又は部位42/43（Aβ42を生じる）で起る。従って、Aβ遊離に基づくアッセイは、それら2つの切断活性の阻害物質（又は、より一般的にはモジュレーター）を区別しない。既知のAβ遊離に基づくアッセイを本発明のアッセイに結び付けることによって、前記区別を行うことが可能になる。例えば、Aβ遊離に基づくアッセイを行うことによって阻害物質を第一に同定することができ、その後、前記第一アッセイにおいて効果があることを示されたテスト物質は、本発明の方法に基づく第二アッセイに含められる。前記第二アッセイにおいて効果がない物質は、アミノ酸40/41又はアミノ酸42/43に作用するタンパク質分解活性を調節する物質として分類することができ、一方両方のアッセイで効果があることを見出された物質は、切断部位49/50に作用する。
上に概要を述べた2段階アッセイは、次の理由から非常に重要である：本発明者らによって発見されたC99における切断部位49/50は、Notchタンパク質の既知のS3切断部位（Schroeter et al., 1998）に対して類似性を示す。両方の切断事象が同じ又は非常に近縁なプロテイナーゼによって媒介される場合は、C99の部位49/50における切断を阻害する物質はNotchタンパク質切断も阻害することがあり、最終的に、それぞれの物質に由来する医薬品の深刻かつ望ましくない副作用を生ずる可能性が予測される。従って、新規スクリーニング法は、Notchタンパク質のタンパク質分解に影響することが疑われる物質と、前記分解に影響することが予測されない物質とを区別するための手段を提供するという更なる利点を有する。
【００１１】
本発明の更に別の重要な態様は、ハイスループットスクリーニング（HTS）法であることによって特徴付けられる本発明の方法である。HTSは、多数の化合物を同時にテストする実験構成に関する。好ましくは前記HTS構成が、マイクロプレートで行われてもよく、部分的又は完全に自動化されてもよく、データ保存、分析及びバイオインフォマティクスを用いる解釈のためのコンピュータのような電子装置に連結されてもよい。好ましくは、前記自動化が、多数のマイクロプレートを取り扱うことができて一日あたり数千ものテストを行い得るロボットを含み得る。好ましくは、所望の調節機能又は阻害機能を示すことが知られているテスト化合物も、ポジティブコントロールとしてアッセイに含まれ得る。HTSという用語は、ウルトラハイスループットスクリーニング形式（UHTS）も含む。好ましくは、前記UHTS形式が384ウェル又は1536ウェルマイクロプレート、マイクロリットル以下又はナノリットル以下のピペッター、改良型プレートリーダー及び蒸発に対応するための処理を用いて行われ得る。HTS法は、例えば米国特許第5,876,946号及び米国特許第5,902,732号において開示されている。本分野の専門家であれば、創意に富む工程を行う必要なく、下に記述する方法をHTS形式又はUHTS形式に応用することができる。
γ-セクレターゼ活性の供給源（例えば膜調製品）、γ-セクレターゼ活性の基質（例えば、C99又は上に概要を述べるような改変誘導体）、反応緩衝液、及び反応生成物CTFγ/50（又はそれぞれの誘導体）を特異的に検出する手段は、テストキットに集められ得る。前記検出手段は、CTFγ/50と特異的に反応するモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又は誘導体であってもよい。テストキットは、マイクロタイタープレート、イムノブロッティング/ウエスタンブロッティング技術（本技術分野で既知）に用いられる標識した二次抗体、反応容器、ブロッティングメンブレン、緩衝液等を更に含み得る。
本発明の方法はγ-セクレターゼ活性の阻害物質及び活性化物質の両方の検出に有用であるが、阻害物質の同定を対象にするスクリーニング法及びテストキットは特に興味深い。
【００１２】
また、本発明の方法によって同定され得るγ-セクレターゼ活性を調節する物質、特にγ-セクレターゼ活性の阻害物質は、本発明により包含される。DAPT(N-［N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル］-S-フェニルグリシン t-ブチルエステル)及び“化合物1”（N-［(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル］-L-バリル-(4S,5S)-4-アミノ-2,2-ジフルオロ-5-メチル-3-オキソヘプタノイル-L-バリル-L-イソロイシン メチルエステル；CM256とも呼ばれる）のような既知の阻害物質が保護の範囲から排除されるであろうことは、理解される。
本発明の更なる側面によると、本発明の方法を用いて同定される物質、及び医薬として許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。医薬として許容される担体は生理学的に許容される化合物を含んでもよく、前記化合物は例えばγ-セクレターゼ活性を阻害し得る物質の吸収を安定化すること又は増加することに作用する。そのような生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物；アスコルビン酸又はグルタチオンのような抗酸化剤；錯化剤；低分子量タンパク質；又は他の安定剤若しくは賦形剤（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences (1990), 18th ed., Mack Publ., Eastonに記載されているような）が挙げられる。生理学的に許容される化合物を含む医薬的に許容される担体の選択が、例えば前記組成物の投与経路に依存することは、当業者であれば知っているであろう。
本発明の更に別の側面によると、本発明の方法を用いて同定される物質は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療のための医薬品の調製に用いられる。
さらに本発明は、これまで未知のCTFγ/50（配列番号１）を提供する。その対立形質異型及び機能的に等価な誘導体も本発明により包含され得ることは、明らかである。
【００１３】
（実施例）
実施例１：CTFγ/50の同定
以下に概要を述べる実験では、次の材料及び方法を用いた。
細胞株、細胞培養及びcDNAトランスフェクション：
swAPPを発現しているヒト胚性腎293（HEK293）細胞を、記述されるように（Steiner et al., 2000）作製して培養した。
CTFγ/50がCTFγ57と同一でないことを実証する対照実験のために、供給元の指示に従ってDOTAP（非陽イオン性脂質N-［1-(2,3-ジオレオイルオキシ)］-N,N,N,-トリメチルアンモニウムプロパンメチルスルフェートを水に含むリポソーム製剤；Roche）を用い、組換えCTFγ57をコードするcDNAでHEK293細胞を一過性トランスフェクションした。
cDNA構築物：
組換えCTFγ57をコードするcDNAを、PCRによって増幅して、Hind III及びXbaI断片としてpcDNA3ベクター（Invitrogen）にクローン化した。組換えCTFγ57は、N-末端メチオニンとそれに続くβ-アミロイドドメインの位置43で始まるβAPPのC-末端で構成される。
抗体類：
βAPPのC-末端の最後の20アミノ酸に対するポリクローナル抗体6687（Steiner et al, 2000）及びAβ1-42に対するポリクローナル抗体3926（Wild-Bode et al., 1997）が記述されている。Aβ1-17に対するモノクローナル抗体6E10は、Senetek(USA)から入手した。
γ-セクレターゼ活性の阻害：
DMSOの保存液から記述する濃度に希釈したDAPT(N-［N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル］-S-フェニルグリシン t-ブチルエステル）(Dovey et al., 2001)及び先に“化合物１”と称したCM256(N-［(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル］-L-バリル-(4S,5S)-4-アミノ-2,2-ジフルオロ-5-メチル-3-オキソヘプタノイル-L-バリル-L-イソロイシン メチルエステル；Dr. M.Wolfeから寄贈された)（Esler et al., 2000）を用いて、γ-セクレターゼ活性を阻害した。
【００１４】
分泌Aβの分析：
Aβを、収集したコンディションドメディウムから抗体3926を用いて4時間免疫沈降し、トリス-トリシン ゲル上で分離して、化学発光検出システム（Tropix, USA）を用いて抗体6E10でイムノブロッティングすることによって検出した。
in vivoでのCTFγの分析：
安定にトランスフェクションしたHEK293細胞由来又はマウス脳由来の膜抽出物の抗体6687を用いる免疫沈降/ウエスタンブロッティングの併用によって、CTFγを分析した。簡単に言うと、細胞又は脳組織のホモジェネートを、記述されるように（Steiner et al., 1998）1×プロテアーゼ阻害物質（PI）(Complete, Roche)を含む低張緩衝液（10 mMトリス、pH 7.4、1 mM EDTA、1 mM EGTA、pH 7.0）中に調製した。ホモジェナイズしたのに続いて、16,000 gで45分間、4℃の遠心分離によって、膜を除核(postnuclear)上清（PNS）から単離した。その膜をRIPA緩衝液（150 mM NaCl、10 mMトリス、1％ NP-40、0.5％コール酸、0.1％ SDS、5 mM EDTA、pH 8.0、1×PI）に再懸濁し、続いて16,000 gで10分間、4℃のスピンで不純物を除去して、抗体6687で免疫沈降を行った。
組換えCTFγ57の発現を分析するために、トランスフェクションから48時間後にRIPA緩衝液でライセートを調製し、抗体6687で免疫沈降を行った。
【００１５】
in vitroでのCTFγの産生及び分析：
先に記述された手順（McLendon et al., 2000；Pinnix et al., 2001）に続いて、swAPPで安定にトランスフェクションしたHEK293細胞の膜調製品から、in vitroでCTFγを産生させた。簡単に言うと、細胞をホモジェナイズ緩衝液（10 mM MOPS、pH 7.0、10 mM KCl、1×PI）に再懸濁した（0.5 ml/10 cmディッシュ）。記述されるように（Steiner et al., 1998）、細胞ホモジェネート及びPNSを調製した。16,000 g、4℃で20分間の遠心分離によって、前記PNSから膜をペレット状にし、ホモジェナイズ緩衝液で洗滌し、アッセイ緩衝液（150 mMクエン酸ナトリウム、pH 6.4、1×PI）に再懸濁した（50 μl/10 cmディッシュ）。CTFγの産生を可能にするため、サンプルをアッセイあたり25 μlの体積で、指示時点までの間37℃にてインキュベートした。対照サンプルを氷上に静置した。氷上でアッセイ反応を終結した後、サンプルを100,000 g、4℃で1時間の超遠心分離によってペレット（P100）画分と上清（S100）画分に分離した。10-20％トリス-トリシン ゲル（Invitrogen）上のSDS-PAGEに続いて、抗体6687を用いるイムノブロッティングによって、サンプルをCTFγについて分析した。
CTFγのラジオシークエンシング：
10 cmディッシュ中の集密的なswAPPトランスフェクションHEK293細胞を、メチオニンを含まないMEM中で4時間、1.4 mCi/ディッシュの35S-メチオニン（Promix, Amersham Pharmacia Biotech）により放射能標識した。次に、CTFγ産生を終結した後にアッセイ反応物を16,000 gで30分間、4℃にてペレット（P16）画分と上清（S16）画分に分離したことを除いて、上述のとおりにin vitroで膜調製品からCTFγを産生させた。抗体6687を用いる免疫沈降によってCTFγをS16から単離した後、免疫複合体を10-20％トリス-トリシン ゲル（Invitrogen）上でSDS-PAGEによって分離し、PVDFメンブレン上にブロットした。オートラジオグラフィーの後、CTFγのバンドを切出して、記述されるように（Haass et al., 1992）自動化Edman分解によってラジオシークエンシングを行った。
【００１６】
結果：
上に記述するように、PS媒介性γ-セクレターゼ切断は、可溶性Aβの産生だけでなく、Aβの対応物を表すβAPP C-末端断片（CTFγ）の産生も生じる。Aβの既知の不均一なC-末端配列に基づき、CTFγの2つの種、CTFγ/57及びCTFγ/59それぞれを推定した。
前記切断を生細胞において調査するために、Swedish変異を有するβAPP695（swAPP）で安定にトランスフェクションしたヒト胚性腎293（HEK293）細胞の膜画分から、βAPP C-末端断片を免疫沈降した（Citron et al, 1992）。これにより、α-セクレターゼ及びβ-セクレターゼによって産生した主要なβAPP CTFの下に移動している、およそ6 kDaのC-末端断片が存在することが明らかになった（図１Ａ；左パネル）。類似する分子量のCTFは、マウス脳のホモジェネートでも見出された（図１Ａ；右パネル）。
そのポリペプチドがγ-セクレターゼにより産生したCTFγを表すかどうかを調査するために、swAPPをトランスフェクションした細胞を、先に記述するγ-セクレターゼ阻害物質DAPTで処理した（Dovey et al., 2001）。図１Ｂに示すように、βAPP CTFβ及びβAPP CTFαの増加（上位のパネル；CTFαはα-セクレターゼのタンパク質分解活性の切断生成物である）と同時に、CTFγ産生の濃度依存性阻害が観察された（中位のパネル）。このことは、前記細胞のコンディションドメディウムに由来するAβの免疫沈降によって更に確かめられ、大幅に減少したAβ産生を示した先の結果（Dovey et al., 2001）と一致した（図１Ｂ；下位のパネル）。
前記切断のPS依存性を実証するために、PS1 D385Nを発現している細胞から、βAPP及びそのタンパク質分解断片を免疫沈降した。先に示されたように（Steiner et al., 1999；Wolfe et al., 1999）、PS1 D385Nはドミナントネガティブ変異のように作用し、βAPPのγ-セクレターゼ切断に必要とされるPSの生物学的機能を阻害する。予測されるようにβAPP CTFβ及びβAPP CTFαの強い増加が観察され、γ-セクレターゼ切断の有意な阻害が示されている（図１Ｃ）。さらに、CTFγの産生を強く減少させた（図１Ｃ）。これらの結果から、観察された低分子量のβAPP C-末端切断生成物はγ-セクレターゼ切断により産生されるものの基準を満たしていることが実証される。しかしながら、かなり少量の前記断片がin vivoで蓄積し、このことはおそらく前記断片の非常に急速な分解に起因するであろう。従って本発明者らは、種々のプロテアーゼ阻害物質の使用により前記断片の効果的安定化を可能にし得るin vitroアッセイにおいてCTFγを産生することを試みた。
【００１７】
swAPPを安定に発現しているHEK293細胞に由来する膜を、プロテアーゼ阻害物質カクテルの存在下、上の“in vitroでのCTFγの産生及び分析”の項で記述した条件のもとでインキュベートした（McLendon et al., 2000；Pinnix et al., 2001）。in vitroアッセイを終結した後、超遠心分離によって膜を分離した。そのペレット（P100）画分及び上清（S100）画分を、βAPP CTFの存在について分析した。CTFα及びCTFβはP100画分の中に顕著に観察された（図２Ａ；上位のパネル）が、CTFγはS100画分で有意に濃縮されていた（図２Ａ；下位のパネル）。細胞質画分の中のCTFγの顕著な蓄積は、この断片が膜から遊離されることを実証している。インキュベーションを延長することにより、高レベルのCTFγ産生を生じた（図２Ａ；下位のパネル）。CTFγの最大生成は、およそ1-2時間後に観察された（図２Ａ）。in vitroで産生したCTFγが実際に真のPS依存性γ-セクレターゼ切断の生成物であることを示すために、先に記述する既存の2つのγ-セクレターゼ阻害物質、DAPT（Dovey et al., 2001）及びCM256（Esler et al., 2000）の存在下で膜画分をインキュベートした。図２Ｂに示されるように、両方のγ-セクレターゼ阻害物質は、CTFγのin vitro産生を効果的に減少させた。さらに、swAPP及び機能的に不活性なPS1 D385N変異を同時発現するHEK293細胞から上述のように膜を単離した場合にも、CTFγ産生は有意に減少した（図２Ｃ）。CTFγの残存する微量生成物は、γ-セクレターゼ阻害物質DAPTの添加によって更に減少した（図２Ｄ）。総合するとこれらの結果から、in vitroアッセイは、非常に高レベルのCTFγをPS及びγ-セクレターゼ依存性の様式で生成することが実証される。さらに、同様な断片はin vivoでも生成され、マウス脳でも見出され得る。
【００１８】
次に本発明者らはin vitroアッセイを用いて、前記ペプチドの更なる構造的特徴付けを可能にするのに充分な量のCTFγを単離した。しかしながら、単離したペプチドを用いて質量分析を行う試みは、不明な理由によって成功しなかった。更なるアプローチで、本発明者らは、ラジオシークエンシングによって前記ペプチドのN-末端の配列を決定することを試みた。swAPPを安定に発現しているHEK293細胞を、35S-メチオニンで代謝的に標識した。上述のように、放射性標識したCTFγをin vitroで産生させた。超遠心分離の後、βAPPの最後の20アミノ酸に対する抗体6687を用いて、CTFγをS100画分から免疫沈降した。次に、放射性標識したCTFγに自動化Edman分解を行った（Haass et al., 1992）。驚くべきことに、放射能の主要なピークは画分2に存在し、位置41又は43で始まるCTFγについて予測され得る画分9及び11には存在しないことが明らかとなった（図３Ａ）。このことから、CTFγはアミノ酸49とアミノ酸50との間のタンパク質分解切断によって産生することが示される（図３Ａ）。従って画分2の放射能ピークは、メチオニン51に対応している。バリン50で始まるタンパク質分解断片と一致して、放射能の第二ピークが位置32で観察され、従ってCTFγはアミノ酸50で優勢に始まることが確認された。前記のような短縮型CTFγがin vivo条件（シークエンシングに充分な量を得ることが不可能である）下でも産生されることを実証するために、アミノ酸43で始まる組換えCTFγをHEK293生細胞で生成したCTFγと共に同時移動させた。図３Ｂに示されるように、in vivoで産生したCTFγは、組換えCTFγより低分子量に移動したことが明らかとなった。図１で説明する実施例と一緒にすると、βAPPの主要なPS依存性切断は、アミノ酸40及びアミノ酸42の後方であって、真のγ-セクレターゼ切断のC-末端で起ることが確認される。さらに、組換え断片が前記条件下で同様に切断されたはずであるから、より小さいCTFγは単に非特異的分解によって生じるものでないことも実証された。
従って驚くべきことに、CTFγの生化学的特徴付けにより、βAPPのβ-アミロイドドメインのアミノ酸49に対応するアミノ酸645の後ろでのβAPP695の主要な切断が明らかとなった（図３）。この切断は、生物学的に活性なプレセニリンに充分に依存する（図２）。さらに、Aβ40産生及びAβ42産生の効果的な遮断について両方とも記述される2つの独立なγ-セクレターゼ阻害物質は、β-アミロイドドメインのアミノ酸49の後ろでの切断も阻害した（図２Ｂ及び２Ｄ）。従って、前記切断はγ-セクレターゼ自体によって起るであろうと考えられる。よって上の結果から、γ-セクレターゼがβAPPのC-末端ドメイン内部で少なくとも3つの異なる切断を媒介することが示唆される。
【００１９】
興味深いことに、CTFγのN-末端は、NotchのPS依存性S3切断と一致する位置に配置される（図４）。NotchのS3切断は、正確に膜の細胞質境界で起こっている（Schroeter et al., 1998）。さらに、βAPPの新規切断部位も、膜の細胞質境界の近くで起り得る。Tischlerらによる結果（Tischler and Cordell, 1996）に基づくと、アミノ酸49とアミノ酸50との間の切断は、細胞質ドメイン内部で実際に起こっているであろう。前記のような細胞質切断は、リン脂質二重層内部の高度な疎水性環境によって阻害され易い膜内タンパク質分解切断よりも、起こる可能性が高いであろう。実際に細胞質切断は、残存する切れ残りの細胞質への移動を促進する。前記細胞質では、前記切れ残りが最終的なγ-セクレターゼ切断によって容易に攻撃され得る。実際、Murphyら(1999)は、そのようなモデルに対する証拠を提供した。さらにこのことから、βAPPの細胞質尾部は、最終的なγ-セクレターゼ切断を受ける前/受ける間に“分断(shedding)”を必要とすることが示され得る。前記分断は、必要とされるγ-セクレターゼ基質の外部ドメイン分断と非常に類似する現象である（Struhl and Adachi, 2000）。そのうえ、in vivoでのCTFγの同定は、Notch細胞内細胞質ドメイン（NICD）に類似する前記断片がシグナル伝達において生物学的機能を有し得るという興味深い可能性も高め得る。NICD及びCTFγの産生に関与する生物学的メカニズムの著しい類似性、並びにシグナル伝達における類似して機能する可能性に基づいて、AICDという用語がアミロイド前駆タンパク質細胞内ドメイン(Amyloid precursor protein intracellular domain)に提唱される。
両方の切断はPS依存性であり、γ-セクレターゼ阻害物質によって遮断され得る（De Strooper st al., 1999；De Strooper et al., 1998）。従って、βAPPの位置49におけるγ-セクレターゼ切断及びNotchのS3切断は、同じPS依存性酵素によって媒介されるという可能性がある。NICD（Schroeter et al., 1998）及びCTFγ（データ提示せず）の両方についてN-末端不均一性が観察されなかったという事実は、2つのγ-セクレターゼ切断の間にさらなる類似性を描く。そのうえ、類似する部位でのβAPP及びNotchのPS依存性切断は、γ-セクレターゼ/S3切断におけるプレセニリンの直接的機能に対して更なる証拠を提供する。
膜貫通領域の推定される境界の近くでの更なるγ-セクレターゼ切断の発見は、β-アミロイドドメインの位置40/42の後ろで最終的なγ-セクレターゼ切断を受ける前/受ける間に、βAPPの細胞質尾部が“分断”を必要とすることを示し得る。あるいは、γ-セクレターゼがβアミロイドドメインの位置40/42で最初に切断し、続いて位置49の後ろで2番目の切断が起こって膜からCTFγが遊離され得る。しかしながら、β-アミロイドドメインの位置41/43で始まるAβ49の種もCTFγも見出されていないことから、データは、3つの部位全部における同時切断を示し得る。
【００２０】
実施例２：スクリーニングアッセイ-中処理量
次に、スクリーニングアッセイを詳細に説明する。しかしながら、本発明は勿論変化し得る具体的なアッセイ形式、材料又は試薬そのものに制限されないことが理解されるべきである。本明細書で用いる技術は、特定の態様のみを説明する目的のためのものであって、制限されることを意図しないことも理解されるべきである。
Swedish変異を有するβAPP695（swAPP）で安定にトランスフェクションしたHEK293細胞を、Citronら(1992)の文献に記述されるように、すなわち10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトアビジン、200 μg/ml G418を含むグルタマックス(Glutamax)(Gibco BRL)を添加したDMEM中で増殖させた。その細胞を、ホモジェナイズ緩衝液（10 mM MOPS、pH 7.0、10 mM KCl、1×PI）に再懸濁した（0.5 ml/10 cmディッシュ）。2500 gで15分間の遠心によって、細胞ホモジェネート及び除核上清（PNS）を調製した。16,000 g、4℃で20分間の遠心分離によってPNSから膜をペレット状にし、ホモジェナイズ緩衝液で洗滌して、アッセイ緩衝液（150 mMクエン酸ナトリウム、pH 6.4、1×PI）に再懸濁した（50 μl/10 cmディッシュ）。CTFγの産生を可能にするため、テスト物質を添加していない対照サンプル、及び異なる濃度のスクリーニングすべき物質を含むサンプルを37℃で、例えば1時間インキュベートした。それらを4℃まで冷却することによって、反応を停止させた。
反応を終結した後、100,000 g、4℃で1時間の超遠心分離によって、サンプルをペレット（P100）画分と上清（S100）画分に分離した。CTFγ/50のN-末端配列に特異的な抗体を用いるELISAによって、CTFγ/50を検出して定量した。対照サンプルと比較して減少したシグナルは、それぞれのテスト化合物がC99のアミノ酸49/50に作用するγ-セクレターゼ活性を阻害することを示している。
実施例３：スクリーニングアッセイ-中処理量
スクリーニングアッセイは、超遠心分離工程の代わりにSTEN溶解緩衝液（50 mMトリス、pH 7.6；150 mM NaCl；2 mM EDTA；1％ NP-40（最終濃度））の添加によって膜を可溶化したことを除いて、実施例２に記述するように行った。実施例２に記述するように、ELISAによって前記溶液中でCTFγ/50を検出して定量した。
実施例４：スクリーニングアッセイ-低処理量
スクリーニングアッセイは、CTFγ/50の遊離をCTFγ/50の免疫沈降及びイムノブロッティング、並びに生じたバンドの濃度測定分析によって決定したことを除いて、実施例２に記述するように行った。対照サンプルと比較して減少したシグナルは、それぞれのテスト化合物がC99のアミノ酸49/50に作用するγ-セクレターゼ活性を阻害することを示している。
（参考文献）
【００２１】
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【００２２】
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【００２３】
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【００２４】
2004535206.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１に記載する、ヒト細胞及びマウス脳においてin vivo生成したCTFγの同定である。（Ａ）Swedish変異体βAPP695（swAPP）で安定にトランスフェクションしたHEK293細胞の膜画分を、βAPPのC-末端に対する抗体6687を用いる免疫沈降/イムノブロッティングの併用によって分析した。3つのβAPP CTFが検出された（C99(＝CTFβ)、C83(＝CTFα)及びおよそ6 kDaのCTFγ）。およそ6 kDaのCTFγを含む同様のβAPP CTFが、抗体6687を用いるイムノブロッティングによってマウス脳でも観察された。（Ｂ）γ-セクレターゼ阻害物質DAPTが、CTFγ生成を阻害している。swAPPで安定にトランスフェクションしたHEK293細胞を、指示濃度のDAPTで4時間処理した。上位及び中位のパネル：膜画分を調製して、抗体6687を用いる免疫沈降/イムノブロッティングの併用によってβAPP CTFについて分析した。DAPT濃度の増加は、CTFβ及びCTFαの増加をもたらす（上位のパネル）と同時にCTFγ産生の有意な遮断をもたらす（中位のパネル）。下位のパネル：抗体3926/6E10を用いる免疫沈降/イムノブロッティングの併用によって、コンディションドメディウムを分泌Aβについて分析した。Aβ産生について、DAPTによる同様なCTFγ生成の濃度依存性阻害が観察された。（Ｃ）CTFγ生成は、生物学的に活性なプレセニリンに依存している。野生型PS1を発現している対照細胞に由来する膜画分、又はPS1 D385Nを安定に発現している細胞に由来する膜画分を、抗体6687を用いる免疫沈降/イムノブロッティングの併用によって分析した。非機能的PS1 D385N変種の発現は、CTFγ生成を有意に減少した。
【図２】実施例１に記載する、CTFγのin vitro産生である。（Ａ）CTFγの時間依存性in vitro生成である。膜調製品を、指示時点までの間37℃でインキュベートした。次に超遠心分離によって、反応混合物を可溶性画分（S100；下位パネル）とペレット画分（P100；上位パネル）に分離した。それらの画分を、抗体6687でイムノブロットした。1-2時間のインキュベーションの後のS100（下位パネル）画分におけるCTFγの選択的蓄積が注目される。P100画分では、非常に微量のCTFγが検出された。このことは、高度に疎水性なCTFγの膜への固着、又は微量の可溶性タンパク質によるP100画分の汚染に起因し得る。（Ｂ）2つの独立なγ-セクレターゼ阻害物質（DAPT及び“化合物１”）は、CTFγのin vitro生成を阻害する。膜調製品を、250 nM DAPT（左パネル）又は50 μM CM256（右パネル）と共に（＋）又は伴わずに（−）インキュベートした。反応混合物のS100画分を、抗体6687でイムノブロットした。両方の阻害物質がCTFγ産生を有意に減少したことが注目される。（Ｃ）CTFγのin vitro産生は、生物学的に活性なプレセニリンに依存する。左パネル：野生型PS1を発現している細胞に由来する膜調製品による、CTFγの時間依存性in vitro生成である。右パネル：生物学的に不活性なPS1 D385N変異を発現している細胞に由来する膜調製品における、CTFγ生成の阻害である。in vitro反応を終結した後、抗体6687を用いるイムノブロッティングによって、βAPP CTFを同定した。（Ｄ）γ-セクレターゼ阻害物質DAPTは、Ｃにおいて観察された残存するin vitro CTFγ生成を減少する（右パネル）。左パネル：野生型PS1を発現している細胞に由来する膜調製品による、250 nM DAPTの存在下(＋)又は非存在下(−)での、CTFγの時間依存性in vitro生成である。右パネル：生物学的に不活性なPS1 D385N変異を発現している細胞に由来する膜調製品における、250 nM DAPTの存在下(＋)又は非存在下(−)での、CTFγ生成の阻害である。in vitro反応を終結した後、抗体6687を用いるイムノブロッティングによって、βAPP CTFを同定した。
【図３】実施例１に記述する、CTFγのラジオシークエンシング及び質量分光分析である。（Ａ）swAPPを安定に発現している35S-メチオニン標識したHEK293細胞の膜調製品からin vitroで産生したCTFγに、ラジオシークエンシングを行った。主要なメチオニンのピークがEdman分解のサイクル2で観察され、第二のピークがEdman分解のサイクル32で観察された。バリン50で始まるCTFγの対応するアミノ酸配列を下に示す。（Ｂ）swAPPを安定に過剰発現しているHEK293生細胞における短縮型CTFγのin vivo検出である。swAPPを安定に過剰発現しているHEK293細胞に由来する細胞ライセート、及びアミノ酸43で始まる組換えCTFγを同時移動した。抗体6687を用いるイムノブロッティングによって、CTFを検出した。in vivo生成したCTFγは、組換え断片よりも速く移動することが注目される。
【図４】実施例１で記述するβAPP及びNotchのエンドタンパク質分解プロセッシングの類似性を図示する。ヒトβAPPはおそらく、β-アミロイドドメインの位置40、42及び49の後ろで切断される。マウスNotch1は、アミノ酸1743の次でPS依存的に切断される（Schroeter et al., 1998）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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