(57)【要約】本発明は、血液および他の生物学的材料の抽出物における特徴的なタンパク質を測定することによって特定細胞のサブタイプの量（例えば、白血球の特定サブタイプの数）を推定することに関する。白血球の特定サブタイプの数または量を知ることは、感染性疾患を含む炎症性疾患、ガン、アレルギー／喘息などの被験体の臨床診断および監視において重要である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）前記サンプルの一部を抽出すること、および
ｂ）前記抽出サンプルにおける細胞特異的分子（１つまたは複数）の濃度を免疫学的アッセイによって測定すること
を含む、細胞特異的分子が、特定細胞の計測数を計算するために使用される、患者サンプル中の特定細胞の量をインビトロで推定するための方法。
【請求項２】
前記抽出が、カチオン性界面活性剤を用いるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記界面活性剤がＣＴＡＢ（Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム臭化物）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記患者サンプルが全血である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
細胞特異的分子（１つまたは複数）が細胞内および細胞外のタンパク質（抗原）ならびに細胞表面マーカーなどである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記細胞特異的分子（１つまたは複数）の前記濃度がそれぞれの細胞のサブタイプの数と相関させられる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
２つの細胞特異的分子が工程ｂ）で測定され、前記分子の濃度比が決定される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞特異的分子（１つまたは複数）が、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＨＮＬ（ヒト好中球リポカリン）またはラクトフェリンなどの好中球タンパク質である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞特異的分子（１つまたは複数）がＥＰＸ（好酸球タンパク質ｘ）、ＥＰＯ（好酸球ペルオキシダーゼ）などの好酸球タンパク質である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞特異的分子（１つまたは複数）がＢＢ１などの好塩基球タンパク質である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞特異的分子が血小板を測定するためのβ−トロンボグロブリンなどの血小板タンパク質である、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞特異的分子（１つまたは複数）がＢリンパ球およびＣＤ３  Ｔリンパ球を測定するためのＣＤ２０などの細胞表面マーカーである、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細胞特異的分子が種々のリンパ球集団を測定するためのＣＤ４およびＣＤ８などの細胞表面マーカーである、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
細胞特異的分子（１つまたは複数）が単球を測定するためのＣＤ１４またはリゾチームである、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液および他の生物学的材料の抽出物における特徴的なタンパク質を測定することによって特定細胞のサブタイプの量（例えば、白血球の特定サブタイプの数）を推定することに関する。白血球の特定サブタイプの数または量を知ることは、感染性疾患を含む炎症性疾患、ガン、アレルギー／喘息などの被験体の臨床診断および監視において重要である。
【背景技術】
【０００２】
血液および他の体液における様々な白血球の数を推定することは、医療における最も広く使用されているツールの１つである。この情報を得る従来の方法は、光学顕微鏡のもとで細胞を計数し、区別することである。この技術は、流体中の粒子数を計数するという原理、そしてサイズ、前方散乱および側方散乱などの様々な物理的パラメーターの測定、ならびに本発明者による細胞の組織学的染色に基づく細胞カウンターにおける自動化された計数によって補完される。これらの技術は、その細胞表面抗原に基づいて、または細胞の透過性化処理の後における細胞内抗原の含有量に基づいて、個々の細胞を同定するために抗体が使用されるフローサイトメーターの原理に拡張されている。
【０００３】
国際特許出願公開ＷＯ００／５８７２６には、全血中の白血球数を定量するための方法が記載されている。しかし、この方法では、白血球の異なる特定のサブタイプが数または比率に関して定量されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
血液および他の体液における好中球および好酸球などの様々な白血球の数を推定するための、容易に使用できる安価かつ確実な試験で、治療状況で適用可能であり、従って、医師をその即座の意思決定において助ける試験が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、例えば、ＣＴＡＢ（Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム臭化物）などの界面活性剤を用いた全血の抽出、続く、好中球タンパク質のＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）またはＨＮＬ（ヒト好中球リポカリン）またはラクトフェリンの特異的な免疫アッセイによる測定、あるいはＥＰＸ（好酸球タンパク質ｘ）またはＥＰＯ（好酸球ペルオキシダーゼ）などの好酸球タンパク質の特異的な測定により、血液中に存在する好中球または好酸球の数が正確に同定されることを見出した。好中球の数を推定することは、感染症、リューマチ様疾患などの炎症性疾患の被験体の診断およびモニタリングにおいて有用であり、のみならず、好中球の減少した産生（すなわち、好中球減少症）が処置の重篤な有害作用として生じ得る医学的処置（特に、細胞増殖抑制処置）との関係においてもまた有用である。好酸球数の推定は、アレルギー疾患、慢性炎症性疾患、寄生虫疾患、ホジキン病などのある種のガンの患者では有用であり、のみならず同様に、好酸球数の上昇が原因不明の多数の疾患で生じ得るので疾患の一般的な指標としても有用である。
【０００６】
最も広い意味において、本発明は、体液における任意の所与の細胞集団の数が、推定されようとする細胞集団について特徴的である分子に対する免疫アッセイが利用可能である限り、推定可能であり得るということを意味する。従って、本発明は、例えば、ＨＩＶ感染患者、ガン患者、自己免疫疾患患者におけるリンパ球集団を推定することに対して採用することができ、のみならず、いくつかの細胞内タンパク質は主に未熟な細胞によって産生され、いくつかのタンパク質が主により成熟した細胞によって産生されるので、骨髄系細胞の様々な成熟化段階にある集団を推定するためにもまた採用することができる。
【０００７】
従って、本発明は、量をインビトロで推定するための方法に関する。この場合、この量は、患者サンプルにおける特定の細胞サブタイプの数または比率のいずれかを示す。この方法は、
ａ）前記サンプルの一部を抽出すること、および
ｂ）前記抽出サンプルにおける細胞特異的分子（１つまたは複数）の濃度を測定すること
を含む。
【０００８】
特定の細胞サブタイプは白血球のサブタイプであり得る。
【０００９】
細胞特異的分子は、例えば、細胞外および細胞内のタンパク質または抗原、細胞表面マーカーなどであり得る。
【００１０】
サンプルは、好ましくは血液または他の体液である。非常に少量のサンプル、例えば、１μｌから１０μｌのサンプルが抽出されるが、より大きい容量も考慮され得る。
【００１１】
抽出は、好ましくは、カチオン性界面活性剤が用いられる。抽出時間は非常に短く、例えば、１分である、好ましくは、界面活性剤はＣＴＡＢである。
【００１２】
好ましくは、工程ｂ）における測定は、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＦＥＩＡ、ＲＩＡなどの免疫アッセイによって行われる。
【００１３】
本発明の方法において、前記細胞特異的分子（１つまたは複数）の前記濃度はそれぞれの細胞タイプ（１つまたは複数）の数と相関させることができる。
【００１４】
１つの実施形態において、２つの細胞特異的分子が工程ｂ）で測定され、前記分子の濃度比が決定される。
【００１５】
細胞特異的分子（１つまたは複数）は、好中球を測定するための、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＨＮＬ（ヒト好中球リポカリン）またはラクトフェリンなどの好中球タンパク質であり得る。
【００１６】
細胞特異的分子はまた、好酸球を測定するための、ＥＰＸ（好酸球タンパク質ｘ）、ＥＰＯ（好酸球ペルオキシダーゼ）などの好酸球タンパク質であり得る。
あるいは、細胞特異的分子（１つまたは複数）は、ＢＢ１などの好塩基球タンパク質、または血小板を測定するためのβ−トロンボグロブリンなどの血小板タンパク質である。
【００１７】
別の代替法において、細胞特異的分子（１つまたは複数）は、Ｂリンパ球およびＣＤ３  Ｔリンパ球を測定するためのＣＤ２０などの細胞表面マーカー、または種々のリンパ球集団を測定するためのＣＤ４およびＣＤ８などの細胞表面マーカーである。
【００１８】
さらなる代替法において、細胞特異的分子（１つまたは複数）は、単球を測定するためのＣＤ１４またはリゾチームである。
【００１９】
本発明は、添付された図面との組合せで下記においてより詳しく記載される。
【００２０】
実験区分
ヒトの好中球タンパク質および好酸球顆粒タンパク質の単離および精製
顆粒を、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、４０（１９８８）、４１５〜４２３）により記載される手法の改変を使用して、健康な献血者から得られた顆粒球の軟膜から調製した。簡単に記載すると、赤血球を、デキストランＴ−５００を使用して沈降させ、その後、白血球が濃縮された血漿を集めた。白血球を０．３４Ｍスクロースで２回洗浄し、５倍容量の０．３４Ｍスクロースに懸濁した。白血球を、＋４℃で３０分間、Ｎ２を７５０ｐｓｉの圧力で使用してキャビテーション処理した（Ｋｌｅｍｐｎｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８６（１９８０）、２１〜２８；Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９７（１９８３）、５２〜６１）。キャビテーション処理物を０．３４Ｍスクロース／０．１７Ｍ  ＮａＣｌに懸濁し、＋４℃において４５０ｘｇで２０分間遠心分離した。
上清を＋４℃において１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、顆粒を沈降させた。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を、Ｏｌｓｓｏｎら（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、９（１９７２）、４８３〜４９１）およびＣｏｏｒａｙら（Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、３８（１９９３）、２６１〜２７２）に従って顆粒抽出物から精製した。最終調製物は、０．８０である吸光度比（Ａ４３０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ）により完全に均一であった（Ａｇｎｅｒ  Ａｃｔａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．、１２（１９５８）、８９〜９４）。
ヒト好中球のリポカリン（ＨＮＬ）を、記載（Ｘｕら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、５４（１９９４）、３６５〜３７９）のように精製した。ＨＮＬは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀染色により均一に精製され、この抗原は、他の好中球タンパク質のＭＰＯ、ラクトフェリン、カテプシンＧ、エラスターゼおよびリゾチームに対する抗体と反応しなかった。
【００２１】
ラクトフェリンを、記載（Ｒｅｉｔｅｒ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅａｃｔ．、５（１９８３）、８７〜９６）のように精製した。
【００２２】
好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）を、記載（Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．、１３４（１９８５）、１８７５〜１８７９）のように精製した、最終調製物は、１．１５である吸光度比（Ａ４１５ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ）により均一であった。
【００２３】
好酸球タンパク質（ＥＰＸ）を、記載（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５０（１９８３）、１９〜２６）のように均一に精製した。最終調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で１本のバンドとして現れ、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、ＭＰＯおよびＥＰＯに対する抗体とは反応しなかった。
【００２４】
抗体の作製
ポリクローナル抗体
ＭＰＯ、ＨＮＬ、ＥＰＯおよびＥＰＸに対する抗体を、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントに懸濁された合計で５０μｇから１００μｇの精製タンパク質をウサギに多数の部位で皮下注射することによってウサギにおいて惹起させた。抗体の特異性をアガロースでの二重免疫拡散（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、２６（１９４９）、５０７〜）によって評価し、好中球および好酸球顆粒の抽出物ならびに下記の精製タンパク質に対して調べた：カテプシンＧ、エラスターゼ、ＭＰＯ、リゾチーム、ラクトフェリン、ＥＣＰ、ＥＰＸ、ＥＰＯ。
【００２５】
モノクローナル抗体
メスＢａｌｂ／ｃマウスを精製タンパク質で皮下に免疫化した。初回免疫刺激を、フロイント完全アジュバントと混合された５０μｇの純粋なタンパク質を注射することによって行った。３回の追加刺激を、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）における約５０μｇの純粋なタンパク質を用いて行った。脾臓細胞を、Ｓｐ２／０ミエローマ細胞と、記載（Ｇａｌｆｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、２６６（１９７７）、５５０〜５５２）のように融合した。細胞培養物に由来する上清を、抗原コーティングされたウエルを用いたＥＬＩＳＡ技術を使用して抗体についてスクリーニングした。上清中の抗体はまた、それぞれの顆粒タンパク質に対する特異性についてスクリーニングされ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スェーデン）でエピトープについてマッピングされた。ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ実験およびＢＩＡｃｏｒｅ実験に従って選抜し、そしてクローン化し、拡大培養して、精製した。選択された抗体はすべてがＩｇＧ１サブタイプであった。
【００２６】
免疫アッセイ
ＨＮＬを、記載（Ｘｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７１（１９９４）、２４５〜２５２）のように放射免疫アッセイを使用して評価した。アッセイ間およびアッセイ内の変動は１０％未満であり、検出限界は４μｇ／ｌ未満であった。
【００２７】
ＥＰＸおよびミエロペルオキシダーゼは、市販されている放射免疫アッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スェーデン）を使用して測定された。アッセイ間およびアッセイ内の変動は１０％未満であり、検出限界はそれぞれ３μｇ／ｌ未満および８μｇ／ｌ未満であった。
【００２８】
ＥＰＯは、記載（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ａｌｌｅｒｇｙ、５３（１９９８）、７７８〜７８５）のようにＰｈａｒｍａｃｉａ  ＣＡＰシステム（登録商標）を利用する原型の免疫蛍光測定アッセイを使用して測定された。アッセイ間およびアッセイ内の変動は８％未満であり、検出限界は０．５μｇ／ｌ未満であった。
【００２９】
ラクトフェリンは、記載（Ｏｌｏｆｓｓｏｎら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１８（１９７７）、７３〜８０）のように推定された。アッセイ間およびアッセイ内の変動は８％未満であり、検出限界は２μｇ／ｌ未満であった。
【００３０】
血液サンプル
患者から採血されたＥＤＴＡ含有血液サンプルを大学病院（Ｕｐｐｓａｌａ、スェーデン）において無作為に集めた。血液細胞の計数をＣｏｕｌｔｅｒ  ＳＴＫＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）細胞カウンターによってそれぞれのサンプルに対して行った。
【００３１】
顆粒タンパク質を、ＣＴＡＢ（Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム臭化物）を０．０５％から０．５％の最終濃度で少量の血液（１μｌから１０μｌ）に添加することによって顆粒球から抽出した。その場合、混合物は少なくとも１分間インキュベーションされ、その後、分析まで−２０℃で凍結保存された。
【００３２】
統計学的評価
回帰分析を、統計学パッケージＳｔａｔｉｓｔｉｃａ（Ｓｔａｔｓｏｆｔ、Ｔｕｌｓａ、アメリカ）を使用して行った。
【実施例１】
【００３３】
血中好中球数の推定
本発明は、少量の血液（１μｌから１０μｌ）をＣＴＡＢ（０．０５％から０．５％の最終濃度）で少なくとも１分間抽出し、続いて、好中球タンパク質ＭＰＯを特異的な免疫アッセイによって測定することにより、血液中の好中球数が正確に推定されることを示す。
【００３４】
図１に示されるように、抽出物におけるＭＰＯ濃度は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＳＴＫＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）細胞カウンターにより推定されるような、抽出された血液における好中球の数に有意かつ直線的に相関した（ｒ＝０．９６）。回帰直線の式から、原点（ｏｒｉｇｏ）からの偏差が最小であったことが明かである。このことは、測定が細胞特異的であることを示している。結果は、好中球の上昇した血中レベルおよび低下した血中レベルの両方を含む入院患者の混合集団（ｎ＝２７５）から得られた。従って、一部の患者では、急性細菌感染症のために大きく上昇したレベルを有しており、一部の患者では、白血病または細胞増殖抑制薬物処置のために重度に低下したレベルを有していた。これらの極端な場合が計算に含まれたにもかかわらず、好中球数とＭＰＯ濃度との関係は測定範囲全体にわたって直線的であった。ＨＮＬが測定されたとき、対応する相関はｒ＝０．９３であり、同様に、好中球数に対する直線的な関係が範囲全体に存在した。ラクトフェリンの測定値もまた、範囲全体にわたる直線的な関係と、ｒ＝０．８２の相関係数とを示した。
【実施例２】
【００３５】
好中球集団の成熟化度の評価
ＭＰＯが好中球の一次顆粒に貯蔵され、これに対して、ラクトフェリンおよびＨＮＬが二次顆粒に貯蔵されることが広く知られている。これは、ＭＰＯの産生が、初期の成熟化段階のとき、すなわち、骨髄芽球および前骨髄球によって主に行われ、これに対して、ラクトフェリンおよびＨＮＬは、より後期の成熟化段階のとき、すなわち、骨髄球によって主に産生されるからである。ＭＰＯの産生は、急性感染症の際などの循環中の好中球の要求が増大することによって受ける影響がラクトフェリンおよびＨＮＬの産生の場合よりも小さいこともまた知られている。従って、二次顆粒のいずれかの含有量とＭＰＯとの比率により、血液中の好中球の様々な成熟化段階の相対的なサイズの推定値、および好中球の骨髄代謝回転の目安が得られる。
【００３６】
抽出された全血におけるＭＰＯ濃度とラクトフェリン濃度との比率が患者間で約２０倍変動し、骨髄性白血病患者が非常に大きい比率を有することが図２に示されている。
【実施例３】
【００３７】
血中好酸球数の推定
本実施例では、少量の血液（１μｌから１０μｌ）をＣＴＡＢ（０．０５％から０．５％）で少なくとも１分間抽出し、続いて、好酸球タンパク質ＥＰＯを特異的な免疫アッセイによって測定することにより、血液中の好酸球数が正確に推定されることが示される。
【００３８】
図３に示されるように、抽出物におけるＥＰＯ濃度は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＳＴＫＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）細胞カウンターにより推定されるような、抽出された血液における好酸球の数に有意かつ直線的に相関した（ｒ＝０．９５）。回帰直線の式から、原点（ｏｒｉｇｏ）からの偏差が最小であったことが明かである。このことは、測定が細胞特異的であることを示している。結果は、好酸球の上昇した血中レベルおよび低下した血中レベルの両方を含む入院患者の混合集団（ｎ＝２７５）から得られた。従って、一部の患者では、アレルギーおよび喘息、慢性的な炎症性疾患、ガンなどのために数が上昇しており、一部の患者では、特に急性感染症のために数が低下していた。これらの極端な場合が計算に含まれたにもかかわらず、好酸球数とＥＰＯ濃度との関係は測定範囲全体にわたって直線的であった。ＥＰＸが測定されたとき、対応する相関はｒ＝０．９３であり、同様に、好中球数に対する直線的な関係が範囲全体に存在した。
【００３９】
上記の実施例１から実施例３では、好中球、好中球の種々の成熟化形態、および好酸球が記載される。しかし、本発明は、これらの細胞タイプに限定されるとして解釈すべきではない。
【００４０】
例えば、好塩基球タンパク質のＢＢ１により、好塩基球を測定することができる。
【００４１】
ＣＤ２０などの細胞表面マーカーにより、Ｂリンパ球およびＣＤ３  Ｔ細胞を測定することができる。
【００４２】
ＣＤ４およびＣＤ８の細胞表面マーカーは、種々のリンパ球集団を測定するために使用することができる。
【００４３】
単球を、ＣＤ１４またはリゾチームによって測定することができる。
【００４４】
血小板を、β−トロンボグロブリンによって測定することができる。
【００４５】
比率の決定は、実施例２に記載されるように骨髄系細胞について、ならびにリンパ球の様々な部分集団についても特に注目される。
【００４６】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】界面活性剤で抽出された全血における血中好中球の数とＭＰＯタンパク質の濃度との相関を示す。
【図２】界面活性剤で抽出された全血におけるＭＰＯとラクトフェリンとの比を示す。
【図３】界面活性剤で抽出された全血における好酸球の数とＥＰＯタンパク質の濃度との相関を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004532994.tif 000022