(57)【要約】本発明は、構造式（Ｉ）の化合物の代謝転換によって形成された新規化合物、このような化合物を含む製薬組成物、およびανβ３インテグリン受容体アンタゴニストとしてのこれらの使用に関する。本発明の化合物は、骨吸収、再発狭窄症、血管形成、糖尿病性網膜症、黄斑変性、炎症性関節炎、ガン、および転移腫瘍成長の阻害に有用である。これらは、骨吸収の阻害および骨粗しょう症の治療および予防に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）：
【化１】
2004509123.tif 000028
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシまたはオキソである）の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩。
【請求項２】
【化２】
2004509123.tif 000029
である、請求項１に記載の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩。
【請求項３】
【化３】
2004509123.tif 000030
である、請求項２に記載の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩。
【請求項４】
【化４】
2004509123.tif 000031
である、請求項１に記載の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩。
【請求項５】
【化５】
2004509123.tif 000032
である、請求項４に記載の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩。
【請求項６】
構造式：
【化６】
2004509123.tif 000033
の化合物、または医薬適合性の塩。
【請求項７】
【化７】
2004509123.tif 000034
である、請求項１に記載の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩。
【請求項８】
【化８】
2004509123.tif 000035
である、請求項７に記載の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩。
【請求項９】
構造式：
【化９】
2004509123.tif 000036
の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩。
【請求項１０】
【化１０】
2004509123.tif 000037
である、請求項９に記載の化合物または医薬適合性の塩。
【請求項１１】
請求項１に記載の化合物の治療的有効量と製薬的に許容しうるキャリヤとを含む製薬組成物。
【請求項１２】
それを必要としている哺乳動物における、ανβ３インテグリン受容体拮抗作用の誘発方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１３】
このανβ３インテグリン受容体拮抗作用が、骨吸収、再発狭窄症、血管形成、糖尿病性網膜症、黄斑変性、炎症性関節炎、ガン、および転移腫瘍成長の阻害から成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
このανβ３インテグリン受容体拮抗作用が、骨吸収の阻害である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
それを必要としている哺乳動物における、骨粗しょう症の治療または予防方法であって、請求項１に記載の組成物の治療的有効量をその哺乳動物に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
米国特許第６，０１７，９２６号（２０００年１月２５日発行）は、構造式（１）：
【０００２】
【化１１】
2004509123.tif 000002
の化合物であって、プロピオン酸側鎖のＣ−３位（＊印が付けられている）において２つの鏡像異性体形態を含む化合物を開示している。
【０００３】
これらの化合物は、インテグリン受容体ανβ３のアンタゴニストであり、したがって骨吸収、再発狭窄症、血管形成、糖尿病性網膜症、黄斑変性、炎症性関節炎、ガン、および転移腫瘍成長の阻害に有用である。これらは、骨吸収の阻害、および骨粗しょう症の治療および予防に特に有用である。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、３−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（５，６，７，８−テトラヒドロ［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸（１）の新規誘導体、これらの調製方法、このような化合物を含む製薬組成物、およびανβ３インテグリン受容体アンタゴニストとしてのこれらの化合物の使用方法に関する。これらの誘導体は、式（Ｉ）の化合物の代謝転換によって形成される。
【０００５】
ανβ３インテグリン受容体アンタゴニストとしてのこれらの活性のために、本発明の化合物はとりわけ、骨吸収の阻害、および骨粗しょう症の治療および予防に有用である。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つの実施形態において、構造式（Ｉ）：
【０００７】
【化１２】
2004509123.tif 000003
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシまたはオキソである）の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩が提供される。
【０００８】
本発明のこの実施形態の１つの種類は、構造式（ＩＩ）：
【０００９】
【化１３】
2004509123.tif 000004
の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。
【００１０】
この種類の下位分類は、構造式（ＩＩＩ）：
【００１１】
【化１４】
2004509123.tif 000005
の化合物、およびテトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン環のヒドロキシル化Ｃ−５位（＊＊印がついている）における個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。
【００１２】
本発明のこの実施形態の第二の種類は、構造式（ＩＶ）：
【００１３】
【化１５】
2004509123.tif 000006
の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。
【００１４】
この種類の下位分類は、構造式（Ｖ）：
【００１５】
【化１６】
2004509123.tif 000007
の化合物、およびテトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン環のヒドロキシル化Ｃ−７位（＊＊印がついている）における個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。
【００１６】
本発明のこの実施形態の第三の種類は、構造式（ＶＩ）：
【００１７】
【化１７】
2004509123.tif 000008
の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。この種類の下位分類は、構造式（ＶＩＩ）：
【００１８】
【化１８】
2004509123.tif 000009
の化合物、およびテトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン環のヒドロキシル化ベンジル位（＊＊印がついている）における個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。
【００１９】
本発明のこの実施形態の第四の種類は、構造式（ＶＩＩＩ）：
【００２０】
【化１９】
2004509123.tif 000010
の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。この種類の下位分類は、構造式（ＩＸ）：
【００２１】
【化２０】
2004509123.tif 000011
の化合物、または医薬適合性の塩を目的とする。
【００２２】
本発明の第二実施形態は、構造式（Ｘ）：
【００２３】
【化２１】
2004509123.tif 000012
の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。この実施形態の１つの種類は、構造式（ＸＩ）：
【００２４】
【化２２】
2004509123.tif 000013
の化合物、または医薬適合性の塩を目的とする。
【００２５】
本発明の第三実施形態は、構造式（ＸＩＩ）：
【００２６】
【化２３】
2004509123.tif 000014
の化合物、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩を目的とする。この実施形態の１つの種類は、構造式（ＸＩＩＩ）：
【００２７】
【化２４】
2004509123.tif 000015
の化合物、または医薬適合性の塩を目的とする。
【００２８】
本発明のこれらの化合物のさらにもう１つの実施形態において、構造式ＸＩＶ〜ＸＶＩ：
【００２９】
【化２５】
2004509123.tif 000016
のビス−ヒドロキシル化誘導体、および個々のその立体異性体、または医薬適合性の塩が提供される。
【００３０】
医薬への使用の場合、この発明の化合物の塩は、非毒性の「医薬適合性の塩」のことを言う。しかしながらその他の塩も、本発明による化合物またはこれらの医薬適合性の塩の調製において有用でありうる。「医薬適合性の塩」という用語に包含される基本的な化合物の塩は、一般に遊離塩基と適切な有機または無機酸とを反応させて調製される、この発明の化合物の非毒性塩のことを言う。本発明の基本的な化合物の代表的な塩には下記のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、カムシレート、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エディシレート、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシレート、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、蓚酸塩、パモエート（エムボネート）、パルミテート、パントテネート、リン酸塩／ジホスフェート、ポリガラクツロネート、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート、トシレート、トリエチオダイド、および吉草酸塩である。さらには本発明の化合物が酸性部分を含んでいる場合、これらの適切な医薬適合性の塩には、下記のものを含む無機塩基に由来する塩が含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、亜マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛等である。特に好ましいものは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、およびナトリウム塩である。製薬的に許容しうる有機非毒性塩基に由来する塩には次のものが含まれる。すなわち、第一、第二、および第三アミン、環式アミン、および塩基性イオン交換樹脂の塩、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂；プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等である。
【００３１】
本発明の化合物は、キラル中心を有していてもよく、したがってラセミ酸塩、ラセミ混合物、単一鏡像異性体、ジアステレオ異性体混合物、および個々のジアステレオ異性体として生じてもよく、すべての異性体形態が本発明に含まれる。したがって化合物がキラルである場合、実質的にもう一方のものを含まない別々の鏡像異性体またはジアステレオ異性体は、本発明の範囲内に含まれる。加えて、これらの２つの鏡像異性体の混合物すべてが含まれる。
【００３２】
本発明の化合物は、適切な溶媒、例えばメタノールまたは酢酸エチルまたはこれらの混合物からの例えば分別結晶によって、ジアステレオ異性体の鏡像異性体ペアに分けられてもよい。このようにして得られた鏡像異性体ペア（ラセミ混合物）は、通常の手段によって、例えば分解剤として光学活性酸を使用することによって、あるいはキラル固定相を用いたＨＰＬＣによって、単一鏡像異性体に分解されてもよい。あるいはまた、本発明の化合物のあらゆる立方異性体は、光学的に純粋な出発原料または既知の立体配置の試薬を用いた立体特異性合成によって得られてもよい。
【００３３】
同様に、本発明の化合物の多形体および水和物も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
「治療的有効量」という用語は、研究者または臨床医によって追求されている組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する薬品または薬剤の量を意味するものとする。
【００３５】
本明細書において用いられる「インテグリン受容体アンタゴニスト」という用語は、ανβ３受容体に結合して拮抗する化合物のことを言う。
【００３６】
本明細書において用いられる「骨吸収」という用語は、破骨細胞が骨を劣化させるプロセスのことを言う。
【００３７】
本発明の化合物は、１００ナノモル未満のανβ３インテグリン受容体への親和性を示す。したがってこの発明の化合物は、骨吸収の増加によって引起こされるかまたは仲介された骨の状態を患っていて、このような治療を必要としている哺乳動物の治療に有用である。医薬適合性の塩を含むこれらの化合物の薬理学的有効量が、哺乳動物の破骨細胞の活性を阻害するためにこの哺乳動物に投与される。
【００３８】
本発明の化合物は、ανβ３受容体を拮抗させるのに有効な投薬量で、このような治療が必要とされる場合、例えば骨粗しょう症の予防または治療において投与される。
【００３９】
本発明が例証するものは、ανβ３拮抗作用の誘発方法である。より詳細には、このανβ３拮抗作用は、骨吸収、再発狭窄症、血管形成、糖尿病性網膜症、黄斑変性、炎症性関節炎、ガン、および転移腫瘍成長の阻害から選ばれる。この方法の１つの実施形態において、ανβ３拮抗作用は、骨吸収の阻害である。
【００４０】
より詳細には、本発明が例証するものは、前記化合物のいずれかと、製薬的に許容しうるキャリヤとを含む製薬組成物である。本発明のもう１つの例は、前記化合物のいずれかと製薬的に許容しうるキャリヤとを組合わせて製造された製薬組成物である。本発明のもう１つの例は、前記化合物のいずれかと製薬的に許容しうるキャリヤとを組合わせることを含む製薬組成物の製造方法である。
【００４１】
本発明がさらに例証するものは、それを必要としている哺乳動物における、ανβ３インテグリン受容体の拮抗作用によって仲介される状態の治療および／または予防方法であって、前記化合物のいずれかの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む方法である。好ましくはこの状態は、骨吸収、骨粗しょう症、再発狭窄症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、血管形成、アテローム性動脈硬化症、炎症性関節炎、ガン、および転移腫瘍成長から選ばれる。より好ましくはこの状態は、骨粗しょう症およびガンから選ばれる。最も好ましくはこの状態は骨粗しょう症である。
【００４２】
より特定すれば、本発明が例証するものは、それを必要としている哺乳動物における、ανβ３インテグリン拮抗作用の誘発方法であって、前記化合物のいずれかまたは前記製薬組成物のいずれかの治療的有効量をこの哺乳動物に投与することを含む方法である。好ましくはこのανβ３拮抗作用は、骨吸収の阻害、再発狭窄症の阻害、アテローム性動脈硬化症の阻害、血管形成の阻害、糖尿病性網膜症の阻害、黄斑変性の阻害、炎症性関節炎の阻害、ガンまたは転移腫瘍成長の阻害から選ばれる。より好ましくは、このανβ３拮抗作用は、骨吸収の阻害である。
【００４３】
本発明のさらなる例は、それを必要としている哺乳動物における、骨吸収の阻害および骨粗しょう症の治療および／または予防方法であって、前記化合物のいずれか、または前記製薬組成物のいずれかの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む方法である。
【００４４】
本発明のその他の例は、それを必要としている哺乳動物における、悪性高カルシウム血症、骨転移による骨減少症、歯周病、副甲状腺機能亢進症、慢性関節リウマチにおける関節周囲びらん、パジェット病、不動化誘発骨減少症、およびグルココルチコイドの治療方法であって、前記化合物のいずれか、または前記製薬組成物のいずれかの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む方法である。
【００４５】
より詳細には、本発明が例証するものは、それを必要としている哺乳動物における、骨粗しょう症の治療および／または予防のための薬剤の調製における前記化合物のいずれかの使用である。さらにもう１つの本発明が例証するものは、骨吸収、ガン、転移腫瘍成長、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、黄斑変性、炎症性関節炎、および／または血管形成の治療および／または予防のための薬剤の調製における前記化合物のいずれかの使用である。
【００４６】
同様に、本発明を例証するものは、下記のものから成る群から選択される活性成分をさらに含む組成物である：
ａ）有機ビスホスホネートまたは医薬適合性の塩またはエステル、
ｂ）エストロゲン受容体モジュレーター、
ｃ）アンドロゲン受容体モジュレーター、
ｄ）細胞障害／抗増殖剤、
ｅ）マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、
ｆ）表皮由来、線維芽細胞由来、または血小板由来成長因子の阻害剤、
ｇ）ＶＥＧＦの阻害剤
ｈ）成長因子または成長因子受容体への抗体、
ｉ）Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１、Ｔｃｋ／Ｔｉｅ−２、またはＴｉｅ−１の阻害剤、
ｊ）カテプシンＫ阻害剤、
ｋ）成長ホルモン分泌促進薬、
ｌ）破骨細胞プロトンＡＴＰａｓｅの阻害剤、
ｍ）ウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕ−ＰＡ）の阻害剤、
ｎ）腫瘍特異的抗体−インターロイキン−２−融合タンパク質、
ｏ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害剤、および
ｐ）プレニル化阻害剤、例えばファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、またはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤、または二重ファルネシル／ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤
およびこれらの混合物。
（Ｂ．Ｍｉｌｌａｕｅｒら、「Ｆｌｋ−１の優性ネガティブ阻害が、インビボで多くの腫瘍型の成長を抑制する（Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｌｋ−１　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｔｈｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｍａｎｙ　Ｔｕｍｏｒ　Ｔｙｐｅｓ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ）」、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６、１６１５−１６２０（１９９６）参照。この文献は、その全体が参照して本明細書に組込まれる）。
【００４７】
好ましくは、この活性成分は、下記のものから成る群から選択される：
ａ）有機ビスホスホネートまたは医薬適合性の塩またはエステル、
ｂ）エストロゲン受容体モジュレーター、
ｃ）アンドロゲン受容体モジュレーター、
ｄ）破骨細胞プロトンＡＴＰａｓｅの阻害剤、
ｅ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害剤、および
ｆ）カテプシンＫ阻害剤、
およびこれらの混合物。
【００４８】
このようなビスホスホネートの非限定例には、アレンドロネート、エチドロネート、パミドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、および製薬的に許容しうるこれらの塩およびエステルが含まれる。特に好ましいビスホスホネートは、アレンドロネート、特にアレンドロネート一ナトリウム三水和物である。
【００４９】
エストロゲン受容体モジュレーターの非限定例には、エストロゲン、プロゲステリン、エストラジオール、ドロロキシフェン、ラロキシフェン、およびタモキシフェンが含まれる。
【００５０】
細胞障害／抗増殖剤の非限定例は、タキソール、ビンクリスティン、ビンブラスティン、およびドキソルビシンである。
【００５１】
以前にカテプシンＯ２として知られていたカテプシンＫは、システインプロテアーゼであり、次の特許に記載されている。すなわち、１９９６年５月９日に公開されたＰＣＴ国際出願公報第ＷＯ９６／１３５２３号；１９９６年３月３日に発行された米国特許第５，５０１，９６９号；および１９９８年４月７日に発行された米国特許第５，７３６，３５７号である。これらのすべては、その全体が参照して本発明に組込まれる。システインプロテアーゼ、特にカテプシンは、いくつかの疾病状態、例えば腫瘍転移、炎症、関節炎、および骨改造作用に関連している。酸性ｐＨにおいて、カテプシンはＩ型コラーゲンを分解しうる。カテプシンプロテアーゼ阻害剤は、コラーゲン線維の分解を阻害して、破骨細胞骨吸収を阻害することができ、したがって骨吸収病、例えば骨粗しょう症の治療に有用である。
【００５２】
「スタチン」として知られているＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の種類のメンバーは、新しい骨の成長を引起こし、骨粗しょう症の結果として失われた骨量に取って代わることが発見された（Ｔｈｅ　Ｗａｌｌ　Ｓｔｒｅｅｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９年１２月３日金曜日、Ｂ１ページ参照）。したがってスタチンは、骨吸収の治療のために期待できる。スタチンの非限定例は、ロバスタチン、シムバスタチン、アトルバスタチン、およびプラバスタチンである。
【００５３】
血管形成、腫瘍浸潤、炎症、および傷治療中のマトリックス改造作用におけるウロキナーゼ−ウロキナーゼ受容体（ｕ−ＰＡ−ｕ−ＰＡＲ）の決定的な役割の証拠が提示されている［Ｙ．Ｋｏｓｈｅｌｎｉｃｋら、「ウロキナーゼ受容体および細胞応答を通じたシグナリングのメカニズム（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　８２：３０５−３１１（１９９９）、およびＦ．Ｂｌａｓｉ、「タンパク質分解、細胞接着、走化性、および侵襲性は、ｕ−ＰＡ−ｕ−ＰＡＲ−ＰＡＩ−１系によって調節される（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ，Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ，ａｎｄ　Ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ　Ａｒｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｕ−ＰＡ−ｕ−ＰＡＲ−ＰＡＩ−１　Ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　８２：２９８−３０４（１９９９）参照］。したがってｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの結合の特異的アンタゴニストは、インビトロおよびインビボモデルの両方において、細胞表面プラスミノゲン活性化、腫瘍成長、および血管形成を阻害することが発見されている。
【００５４】
Ｈ．Ｎ．Ｌｏｄｅおよび共同研究者らは、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ９６：１５９１−１５９６（１９９９）において、自然発生腫瘍転移の根絶における、抗血管形成ανインテグリンアンタゴニストと腫瘍特異的抗体−サイトカイン（インターロイキン−２）融合タンパク質との間の相乗作用を観察している。これらの結果は、この組合わせが、ガンおよび転移腫瘍成長の治療への可能性を有することを示唆した。
【００５５】
破骨細胞の頂端膜上に見られるプロトンＡＴＰａｓｅは、骨吸収プロセスにおいて有意な役割を果たすと報告されている。したがってこのプロトンポンプは、骨粗しょう症および関連代謝疾患の治療および予防に潜在的に有用な骨吸収の阻害剤の設計への魅力的な標的である（Ｃ．Ｆａｒｉｎａら、「新規抗骨吸収剤としての破骨細胞液胞プロトンＡＴＰａｓｅの選択的阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｖａｃｕｏｌａｒ　ｐｒｏｔｏｎ　ＡＴＰａｓｅ　ａｓ　ｎｏｖｅｌ　ｂｏｎｅ　ａｎｔｉｒｅｓｏｒｐｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔｓ）」、ＤＤＴ、４：１６３−１７２（１９９９））。
【００５６】
アンドロゲンステロイドが男性および女性における骨量の発達において生理学的役割を果たし、アンドロゲンが直接骨に作用するという証拠が提示されている。アンドロゲン受容体は、ヒトの骨芽細胞様細胞系において証明されており、アンドロゲンは骨細胞増殖および分化を直接刺激することが証明されている。考察のために、Ｓ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ、「女性におけるアンドロゲンの治療のための使用（Ｔｈｅ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｕｓｅ　ｏｆ　ａｎｄｒｏｇｅｎｓ　ｉｎ　ｗｏｍｅｎ）」、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、６９：１７７−１８４（１９９９）、およびＫ．Ａ．ＨａｎｓｅｎおよびＳ．Ｐ．Ｔ．Ｔｈｏ、「アンドロゲンおよび骨の健康（Ａｎｄｒｏｇｅｎｓ　ａｎｄ　Ｂｏｎｅ　Ｈｅａｌｔｈ）」、Ｓｅｍｉｎａｒ　ｉｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６：１２９−１３４（１９９８）が参照される。したがってアンドロゲン受容体モジュレーターは、女性における骨損失の治療および予防において有用性を有しうる。
【００５７】
ペルオキシソーム増殖剤活性化された受容体−γ（ＰＰＡＲγ）の活性化剤、例えばチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）は、インビトロでの破骨細胞様細胞形成、および骨吸収を阻害する。Ｒ．ＯｋａｚａｋｉらによってＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０：５０６０−５０６５、（１９９９）において報告された結果は、骨髄細胞への局所的メカニズム、ならびにグルコース代謝に対する全身的メカニズムを指し示している。ＰＰＡＲγ活性化剤の非限定例には、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、およびＢＲＬ４９６５３が含まれる。
【００５８】
本発明はまた、本発明の化合物と、骨粗しょう症の予防または治療に有用な１つまたはそれ以上の薬剤との組合わせも目的とする。例えば本発明の化合物は、その他の薬剤、例えば有機ビスホスホネート、エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、成長ホルモン分泌促進薬、カテプシンＫ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＰＰＡＲγ活性化剤、または破骨細胞プロトンＡＴＰａｓｅの阻害剤の有効量と組合わせて効果的に投与されてもよい。
【００５９】
本発明のその他の例は、それを必要としている哺乳動物における、腫瘍成長または転移の治療方法であって、前記化合物の治療的有効量および細胞障害／抗増殖性であると知られている１つまたはそれ以上の薬剤をこの哺乳動物に投与することを含む方法である。同様に、本発明の化合物は、ガンおよび転移腫瘍成長の治療のために、放射線治療と組合わせて投与することもできる。
【００６０】
さらには本発明のインテグリンανβ３アンタゴニスト化合物は、カルシウムまたはリン酸塩代謝の障害およびそれに伴なう疾患の治療的または予防的治療において、成長ホルモン分泌促進薬と組合わせて効果的に投与されてもよい。これらの疾患には、骨吸収の減少から利益を得ることができる状態が含まれる。骨吸収の減少は、吸収と形成との間のバランスを改良し、骨損失を減少させるか、または骨の増加を結果として生じさせるべきである。骨吸収の減少は、溶骨性障害に伴なう痛みを軽減することができ、これらの障害の発生および／または成長を減少させることができる。これらの病気には、骨粗しょう症（エストロゲン欠乏、不動化、グルココルチコイド誘発性、および老人性）、骨形成異常症、パジェット病、骨化性筋炎、ベクテリエフ病、悪性高カルシウム血症、転移骨疾患、歯周病、胆石症、腎結石症、尿路結石症、尿結石、動脈の硬化（硬化症）、関節炎、滑液包炎、神経炎、およびテタニーが含まれる。骨吸収の増加は、血漿中への病的高カルシウムおよびリン酸塩濃度を伴なうことがある。これは、この治療によって軽減されるであろう。同様に本発明は、成長ホルモン欠乏患者における骨量の増加において有用であろう。したがって好ましい組合わせは、本発明のανβ３受容体アンタゴニストと、成長ホルモン分泌促進薬との同時または交互治療であり、場合によっては、有機ビスホスホネート、好ましくはアレンドロネート一ナトリウム三水和物を含む第三成分が含まれる。
【００６１】
本発明の方法によれば、この組合わせの個々の成分は、治療経過中の異なる時間に別々に投与されてもよく、あるいは分けられたまたは単一の組合わせ形態において同時に投与されてもよい。したがって本発明は、このようなすべての同時または交互治療法を包含するものと理解すべきであり、「投与する」という用語は、それに応じて解釈されるべきである。この発明の化合物と、インテグリン仲介された状態の治療に有用なその他の薬剤との組合わせの範囲には、原則的に、骨粗しょう症の治療に有用なあらゆる製薬組成物とのあらゆる組合わせが含まれると理解される。
【００６２】
本明細書において用いられる「組成物」という用語は、特定の成分を特定量で含む生成物、ならびに特定量における特定の成分の組合わせの結果直接または間接的に生じるあらゆる生成物を包含するものとする。
【００６３】
本発明の化合物は、例えばタブレット、カプセル（これらの各々は、徐放性または指定時刻に放出する配合物を含む）、ピル、粉末、グラニュール、エリキシル、チンキ、懸濁液、シロップ、およびエマルジョンなどの経口投薬形態で投与されてもよい。同様にこれらはまた、静脈内（注射または注入）、腹膜内、局所（例えば点眼薬）、皮下、筋肉内、または経皮（例えばパッチ）形態で投与されてもよい。すべては、製薬業の業者によく知られた使用形態である。望まれている化合物の有効であるが非毒性的な量を、ανβ３アンタゴニストとして用いることができる。
【００６４】
本発明の化合物を用いる投薬計画は、患者の種類、種、年齢、体重、性、および医学的状態；治療される状態の重症度；投与経路；患者の腎臓および肝臓の機能；および用いられる特定の化合物またはその塩を含む多様な要因にしたがって選択される。通常の技術を有する医師、獣医師、または臨床医なら、この状態の進行を防ぎ、これに対処するか、または停止させるのに必要とされる薬剤の有効量を容易に決定し、処方することができる。
【００６５】
本発明の経口投薬量は、指示された効果のために用いられる時、１日につき体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは０．１から５．０ｍｇ／ｋｇ／日であろう。経口投与の場合、これらの組成物は好ましくは、治療される患者への投薬量の症候による調節のために、活性成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、および５００ミリグラムを含むタブレットの形態で提供される。薬剤は一般的には、活性成分約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは活性成分約１ｍｇ〜約１００ｍｇを含む。静脈内の場合、最も好ましい用量は、一定速度の注入の間、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／分であろう。有利には本発明の化合物は、単一の一日用量として投与されてもよく、あるいは一日の投薬量全体が、毎日２、３、または４回の分割用量として投与されてもよい。さらには本発明に好ましい化合物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所使用による鼻腔内形態で、または当業者によく知られている経皮パッチの形態を用いて経皮的に投与されてもよい。経皮送出し系の形態で投与されるために、この投薬量投与は、当然ながら、この投薬計画全体を通じて断続的であるよりは連続的であろう。
【００６６】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記載されている化合物は、活性成分を形成することができ、一般的には、意図された投与形態、すなわち、経口タブレット、カプセルエリキシル、シロップ等に関連して、かつ通常の製薬慣習と一致して適切に選ばれた、適切な製薬希釈剤、賦形剤、またはキャリヤ（本明細書では集合的に「キャリヤ」物質と呼ばれる）と混合して投与される。
【００６７】
例えば、タブレットまたはカプセルの形態における経口投与の場合、活性薬剤成分は、製薬的に許容しうる経口非毒性不活性キャリヤ、例えばラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール等と組合わされてもよい。液体形態における経口投与の場合、これらの経口薬剤成分は、製薬的に許容しうる経口非毒性不活性キャリヤ、例えばエタノール、グリセロール、水等と組合わされてもよい。さらには所望であるか、または必要である場合、適切なバインダー、潤滑剤、崩壊剤、および着色剤が、この混合物中に組込まれてもよい。適切なバインダには、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコースまたはベータラクトース、コーン甘味料、天然および合成ゴム、例えばアカシアゴム、トラガカントゴム、またはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が含まれる。これらの投薬形態に用いられる潤滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤には、非限定的に、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。
【００６８】
本発明の化合物はまた、リポソーム送出し系、例えば小さい単層小胞、大きい単層小胞、および多層小胞の形態で投与されてもよい。リポソームは、多様なリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンから形成されていてもよい。
【００６９】
本発明の化合物はまた、モノクローナル抗体の使用によって、これらの化合物分子が組合わされる個々のキャリヤとして送り出されてもよい。本発明の化合物はまた、標的可能な薬剤キャリヤとしての可溶性ポリマーと組合わされてもよい。このようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルタミド−フェノール、またはパルミトイル残渣で置換されたポリ酸化エチレン−ポリリシンを含めることもできる。さらには本発明の化合物は、薬剤の制御された放出を得るのに有用な種類の生物分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーと組合わされてもよい。
【００７０】
調製方法
式ＩからＸＶＩの化合物は、式（Ｉ）の化合物の胆管代謝産物である。これらはインビトロで、シトクロムＰ−４５０駆動バイオリアクター中の懸濁によって；ラット、イヌ、サル、またはヒト肝臓ミクロソームでのインキュベーションによって；またはラット、イヌ、サル、またはヒト肝細胞でのインキュベーションによって得られる。これらはまた、この技術においてよく知られている方法、例えば逆相高性能液体クロマトグラフィーを用いて、式（Ｉ）の化合物を摂取した個人の胆汁から単離することもできる。
【００７１】
例証すれば、化合物２の代謝産物の調製および特徴決定は、下記スキームにおいて示され、下記実施例に記載されている。
【００７２】
【化２６】
2004509123.tif 000017
【００７３】
実施例１
３（Ｓ）−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（５Ｒ）−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸、および３（Ｓ）−（６−メトキシ−ピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（５Ｓ）−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸（３Ａ、３Ｂ）
Ｐ−４５０駆動代謝産物の生産に用いられるバイオリアクター系は、「薬品代謝におけるバイオリアクター系：シトクロムＰ−４５０発生代謝産物の合成（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ−４５０−Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）」、Ｔ．Ｈ．Ｒｕｓｈｍｏｒｅら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２（２０００）１−１１に記載されており、この文献は、その全体が参照して本明細書に組込まれる。
【００７４】
３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（５，６，７，８−テトラヒドロ［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸（２）（２の調製法については、米国特許第６，０１７，９２６号参照）（１００μＭ）が、インビトロで２７℃において２４時間、細胞（ヒトＣＹＰ４５０　２Ｄ６で感染させられたＳｆ２１昆虫細胞）でインキュベーションされた。細胞は、バキュロウイルスエンコードヒトＣＹＰ４５０　２Ｄ６またはオキシドレダクターゼで感染させることによって調製され、２７℃において４８時間成長させられた。最終インキュベーション容積は、１リットルであり、ＣＹＰ４５０　２Ｄ６濃度は、約１００ｐモル／ｍＬ細胞であった。インキュベート物が遠心分離され、まず上澄み液が、固相抽出カラムを用いて精製された。これらの上澄み液は、バリアンメガボンドエリュート（Ｖａｒｉａｎ　Ｍｅｇａ　Ｂｏｎｄ　Ｅｌｕｔ）Ｃ１８（２０ｍＬ）カラムに装入され、掲題化合物が、アセトニトリル−水（１：１）を用いてカラムから溶離され、この溶離液は、さらなる単離のためにＨＰＬＣ系上に注入された。代謝産物単離に用いられたＨＰＬＣは、ウオーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）６００ＨＰＬＣ系であった。掲題化合物は、フェノメネックスルナ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｌｕｎａ）Ｃ１８−２分取カラム（２１．２ｍｍ×１５０ｍｍ、５ミクロン）を用いて分離された。移動相は、水（溶媒Ａ）中０．１％蟻酸と、アセトニトリル（溶媒Ｂ）中０．１％蟻酸とから成っていた。溶離勾配は、２分間１５％Ｂの無勾配状態から開始され、ついで１０分で２０％Ｂへの直線増加が行なわれた。Ｂの濃度は、次の１分で８０％Ｂまで増加され、カラムは、８０％Ｂにおいて２分間洗浄され、その後１分間かけて１５％Ｂまで戻された。この系は、次の注入の前に１０分間１５％Ｂにおいて平衡された。すべての分析に、２０ｍＬ／分の一定流量が用いられた。これらのＨＰＬＣ条件下、異性体３Ａは約５．５分のところで溶離され、異性体３Ｂは約６．２分のところで溶離された。３Ａおよび３ＢのＮＭＲおよびマススペクトルが測定された。
【００７５】
１ＨＮＭＲ　ｄａｔａ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）ｆｏｒ３Ａおよび３Ｂ：δ８．１０（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７，２．６Ｈｚ）；６．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）；６．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），４．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．４１（ｍ，１Ｈ），３．２９（ｍ，１Ｈ），３．２０（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５，８．０Ｈｚ），２．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５，８．０Ｈｚ），２．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．８０（ｍ，１Ｈ），および１．７７（ｍ，１Ｈ）。
マススペクトル：実測値４５６（Ｍ＋Ｈ）＋；４３８（Ｍ−Ｈ２Ｏ）。
【００７６】
下に構造が示されている化合物４から９も、これらのマススペクトルおよびＮＭＲスペクトルと、スキーム２から５に示され、かつ下記実施例２から６に記載されているような明白な化学合成によって調製された基準物質のものとの比較によって、基質２の代謝産物として同定された。基質２、および合成変換における出発原料として用いられたそのエチルエステル誘導体１０の調製は、米国特許第６，０１７，９２６号に記載されている。この特許は、その全体が参照して本明細書に組込まれる。
【００７７】
【化２７】
2004509123.tif 000018
2004509123.tif 000019
【００７８】
【化２８】
2004509123.tif 000020
【００７９】
実施例２
３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（７−ヒドロキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸（４）
室温において水（２０ｍＬ）中の基質２（０．８８ｇ、２ミリモル）の溶液に、１Ｎ　ＮａＯＨ溶液（２．０ｍＬ、２ミリモル）を添加し、ついでＫＭｎＯ４（０．３１６ｇ、２ミリモル）を添加し、混合物を１６時間攪拌した。濾過後、溶液をＨＰＬＣクロマトグラフィー（デルタパックＣ−１８カラム；０．１％ＮＨ４ＨＣＯ３（水性）およびアセトニトリル；勾配溶離）によって精製した。第二溶離ピークの収集ついで凍結乾燥によって、掲題化合物４が白色固体として得られた（７−ヒドロキシエピマーの１：１混合物）。
【００８０】
１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１．７０（１Ｈ，ｍ），１．８６（１Ｈ，ｍ），２．０７（１Ｈ，ｍ），２．１２（１Ｈ，ｍ），２．６１（１Ｈ，ｍ），２．７１（２Ｈ，ｍ），２．７５−３．０（６Ｈ，ｍ），３．１７（１Ｈ，ｑ），３．４８（１Ｈ，ｍ），３．６２（１Ｈ，ｍ），３．９０（３Ｈ，ｓ），４．７３（１Ｈ，ｍ），５．４６（１Ｈ，ｂｒｄ），６．６９（１Ｈ，ｄ），６．８０（１Ｈ，ｄｄ），７．５４（１Ｈ，ｍ），７．６７（１Ｈ，ｄｄ），８．０９（１Ｈ，ｄ）；
マススペクトル：実測値４５６．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８１】
実施例３
３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（７−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸（５）
４について記載されている手順にしたがうが、粗生成物のＨＰＬＣクロマトグラフィー後に第一溶離生成物を収集し、ついで濃縮、その後凍結によって、５が白色固体として得られた。
【００８２】
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１．９０（２Ｈ，ｍ），２．５７（２Ｈ，ｍ），２．６５（２Ｈ，ｍ），２，８７（２Ｈ，ｍ），２．９３（３Ｈ，ｍ），３．１３（１Ｈ，ｍ），３．２６（３Ｈ，ｍ），３．４０（１Ｈ，ｑ），３．８９（３Ｈ，ｓ），５．３７（１Ｈ，ｔ），６．７８（１Ｈ，ｄ），６．８２（１Ｈ，ｄ），７．３９（１Ｈ，ｄ），７．６７（１Ｈ，ｄｄ），８．１１（１Ｈ，ｄ）．；
マススペクトル：実測値４５４．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８３】
【化２９】
2004509123.tif 000021
【００８４】
実施例４
３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸（６）
室温においてピリジン（５ｍＬ）中の基質２（０．４４ｇ、１ミリモル）の溶液に、ＣｒＯ３（０．１ｇ、１ミリモル）を添加し、混合物を１６時間攪拌した。この混合物を水（１００ｍＬ）で希釈し、セリートを通して濾過し、溶媒を真空除去すると、油を生じた。ＨＰＬＣクロマトグラフィー（デルタパックＣ−１８カラム；０．１％ＮＨ４ＨＣＯ３（水性）およびＭｅＯＨ；勾配溶離）による精製によって、（溶媒の真空除去後）、薄い黄色の残渣が得られた。この残渣を水に取り、凍結乾燥すると、固体として６を生じた。
【００８５】
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ２．１２（２Ｈ，ｍ），２．６５−２．８５（４Ｈ，ｍ），３．０３（２Ｈ，ｔ），３．１−３．４（４Ｈ，ｍ），３．７５（３Ｈ，ｓ），５．３８（１Ｈ，ｔ），６．７５（１Ｈ，ｄ），７．５３（１Ｈ，ｄ），７．５７（１Ｈ，ｄｄ），７．６４（１Ｈ，ｄｄ），８．０９（１Ｈ，ｄ），８．２２（１Ｈ，ｄ），８．３６（１Ｈ，ｄｄ），８．９８（１Ｈ，ｄｄ）；
マススペクトル：実測値４３６．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８６】
【化３０】
2004509123.tif 000022
【００８７】
実施例５
３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３（ＲまたはＳ）−［３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−３−ヒドロキシプロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩、および３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３（ＳまたはＲ）−［３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−３−ヒドロキシプロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩（７Ａおよび７Ｂ）
工程Ａ：３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（１Ｎ−オキシド−５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸エチルエステル（１１）
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中のエチルエステル１０（調製法については、米国特許第６，０１７，９２６号参照）（１．５１ｇ、３．２ミリモル）の溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（７０％；０．９６ｇ、３．９ミリモル）を添加し、混合物を室温で４時間攪拌した。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、ＮａＨＣＯ３（×５）、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ９７：３）によって精製すると、掲題化合物１１が粘性油として得られた。
マススペクトル：実測値４８４．１；（Ｍ＋Ｈ）計算値：４８４．３
【００８８】
工程Ｂ：３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（８−アセチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−３−アセトキシプロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸エチルエステル（１２）
無水酢酸（２ｍＬ）中Ｎ−オキシド１１（０．２４ｇ、０．５ミリモル）の溶液を、７．５時間９０℃まで加熱し、ついで氷上に注ぎ、ＮａＨＣＯ３で中和した。この混合物を、ＥｔＯＡｃ（×３）で抽出し、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ９７：３）による残渣の精製によって、掲題化合物１２が粘性油として得られた。
マススペクトル：実測値５６８．２；（Ｍ＋Ｈ）計算値：５６８．３
【００８９】
工程Ｃ：３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３（ＲまたはＳ）−［３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−３−ヒドロキシプロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩、および３（Ｓ）−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−｛２−オキソ−３（ＳまたはＲ）−［３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−３−ヒドロキシプロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩（７Ａおよび７Ｂ）
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中ジエステル１２（０．７５ｇ、１．３２ミリモル）の溶液に、１Ｎ　ＮａＯＨ（６ｍＬ、６ミリモル）を添加し、この溶液を、４時間還流にいたるまで加熱した。混合物を真空濃縮し、ついで逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム；水／アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ；勾配）によって精製すると、（凍結乾燥後）ＴＦＡ塩およびジアステレオマーの混合物として７を生じた。
【００９０】
マススペクトル：実測値４５６．１；（Ｍ＋Ｈ）計算値：４５６．２
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１．８５−２．０（４Ｈ，ｍ），２．８２（２Ｈ，ｔ），３．０１（２Ｈ，ｍ），３．０７（１Ｈ，ｍ），３．２−３−４（４Ｈ，ｍ），３．４４（１Ｈ，ｍ），３．５１（２Ｈ，ｔ），３．９（３Ｈ，ｓ），４．７１（１Ｈ，ｔ），５．３７（１Ｈ，ｔ），６．７１（１Ｈ，２　重なり合った　ｄ），６．８２（１Ｈ，２　重なり合った　ｄ），７．６１（１Ｈ，２　重なり合った　ｄ），７．７２（１Ｈ，２　重なり合った　ｄｄ），８．１１（１Ｈ，２　重なり合った　ｄ）。
【００９１】
ジアステレオマー７の混合物を、ヘキサン＋０．２％ＴＦＡ／２−プロパノール／エタノール７０／２５／５で溶離するキラルパック（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ）ＡＤカラムを用いたＨＰＬＣクロマトグラフィーによって分離すると、（凍結乾燥後）早く溶離するジアステレオマー７ＡがＴＦＡ塩として生じた。
【００９２】
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１．８８（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ），１．９５（３Ｈ，ｍ），２．８２（２Ｈ，ｔ），３．０１（２Ｈ，ｍ），３．０８（１Ｈ，ｑ），３．３−３−４（４Ｈ，ｍ），３．４５（１Ｈ，ｍ），３．５１（２Ｈ，ｔ），３．９（３Ｈ，ｓ），４．７１（１Ｈ，ｄｄ），５．３７（１Ｈ，ｔ），６．７２（１Ｈ，ｄ），６．８２（１Ｈ，ｄ），７．６１（１Ｈ，ｄ），７．７２（１Ｈ，ｄｄ），８．１２（１Ｈ，ｄ）。
【００９３】
溶離の続行によって、（凍結乾燥後）遅く溶離するジアステレオマー７ＢがＴＦＡ塩として得られた。
【００９４】
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ１．８９（１Ｈ，ｓｅｐｔｅｔ），１．９５（３Ｈ，ｍ），２．８２（２Ｈ，ｔ），３．０１（２Ｈ，ｄ），３．０７（１Ｈ，ｑ），３．２４（１Ｈ，ｍ），３−３４（３Ｈ，ｍ），３．４５（１Ｈ，ｍ），３．５１（２Ｈ，ｔ），３．９（３Ｈ，ｓ），４．７１（１Ｈ，ｄｄ），５．３７（１Ｈ，ｔ），６．７１（１Ｈ，ｄ），６．８２（１Ｈ，ｄ），７．５９５（１Ｈ，ｄ），７．７２（１Ｈ，ｄｄ），８．１２（１Ｈ，ｄ）。
【００９５】
【化３１】
2004509123.tif 000023
【００９６】
実施例６
３（Ｓ）−（２（１Ｈ）−ピリドン−５−イル）−３−｛２−オキソ−３−［３−（５，６，７，８−テトラヒドロ−［１，８］ナフチリジン−２−イル）−プロピル］−イミダゾリジン−１−イル｝−プロピオン酸（８）
酸２（米国特許第６，０１７，９２６号；１００ｍｇ、０．２３ミリモル）とピリジン塩酸塩（３００ｍｇ）との混合物を、１２５℃において２．５分間密封ビン中で加熱し、ついで室温まで冷ました。残渣を水中に溶解し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム；水／アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ；勾配）によって精製すると、凍結乾燥後、掲題化合物８をＴＦＡ塩として生じた。
高分解能マススペクトル：実測値４２６．２１４１：計算値（Ｍ＋Ｈ）＝４２６．２１３６
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤ３ＯＤ）：δ１．８６（２Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｍ），２．６６（２Ｈ，ｔ），２．８１（２Ｈ，ｔ），２，９６（１Ｈ，ｍ），３．１５（１Ｈ，ｍ），３．２３（２Ｈ，ｔ），３．３５−３．５５（５Ｈ，ｍ），５．２３（１Ｈ，ｔ），６．５５（１Ｈ，ｄ），６．６４（１Ｈ，ｄ），７．４４（１Ｈ，ｄ），７．５８（１Ｈ，ｄ），７．６５（１Ｈ，ｄｄ）。
【００９７】
生物活性の測定のためのアッセイ
【化３２】
2004509123.tif 000024
2004509123.tif 000025
2004509123.tif 000026
2004509123.tif 000027
【００９８】
Ｎ−（４−ヨード−フェニルスルホニルアミノ）−Ｌ−アスパラギン（Ａ−２）
酸Ａ−１（４．３９ｇ、３３．２ミリモル）、ＮａＯＨ（１．４９ｇ、３７．２ミリモル）、ジオキサン（３０ｍｌ）、およびＨ２Ｏ（３０ｍｌ）の０℃における攪拌溶液に、塩化ピプシル（１０．３４ｇ、３４．２ミリモル）を添加した。約５分後、１５ｍｌのＨ２Ｏ中に溶解されたＮａＯＨ（１．４９ｇ、３７．２ミリモル）を添加し、ついで冷却浴を除去した。２．０時間後、この反応混合物を濃縮した。残渣をＨ２Ｏ（３００ｍｌ）中に溶解し、ついでＥｔＯＡｃで洗浄した。水性部分を０℃まで冷却し、ついで濃縮ＨＣｌで酸性化した。この固体を回収し、ついでＥｔ２Ｏで洗浄すると、酸Ａ−２を白色固体として生じた。
【００９９】
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ７．８６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）３．７０（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｍ，２Ｈ）。
【０１００】
２（Ｓ）−（４−ヨード−フェニルスルホニルアミノ）−β−アラニン（Ａ−３）
ＮａＯＨ（７．１４ｇ、１８１．８ミリモル）およびＨ２Ｏ（４０ｍｌ）の０℃における攪拌溶液に、１０分間にわたってＢｒ２（１．３０ｍｌ、２４．９ミリモル）を一滴ずつ添加した。約５分後、酸Ａ−２（９．９ｇ、２４．９ミリモル）、ＮａＯＨ（２．００ｇ、４９．８ミリモル）、およびＨ２Ｏ（３５ｍｌ）を組合わせ、０℃まで冷却し、ついで単一ポーションとしてこの反応物に添加した。０℃で２０分間の攪拌後、この反応物を３０分間９０℃まで加熱し、ついで０℃まで再冷却した。濃縮ＨＣｌの一滴ずつの添加によってｐＨを約７に調節した。この固体を回収し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、ついで真空乾燥すると、酸Ａ−３を白色固体として生じた。
【０１０１】
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ８．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．３６（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，１３Ｈｚ），３．２１（ｍ，１Ｈ）。
【０１０２】
エチル２（Ｓ）−（４−ヨード−フェニルスルホニルアミノ）−β−アラニン塩酸塩（Ａ−４）
ＨＣｌガスを、０℃で１０分間ＥｔＯＨ（５０ｍｌ）中の酸Ａ−３（４．０ｇ、１０．８１ミリモル）の懸濁液を通して急速にバブリングさせた。冷却浴を除去し、この反応物を６０℃まで加熱した。１８時間後、この反応物を濃縮すると、エステルＡ−４を白色固体として生じた。　１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．２５（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ），３．９２（ｍ，２Ｈ），３．３３（ｍ，１Ｈ），３．０６（ｍ，１Ｈ），１．０１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）。
【０１０３】
エチル４−［２−（２−アミノピリジン−６−イル）エチル］ベンゾエート（Ａ−５ａ）
エステルＡ−５（７００ｍｇ、２．６３ミリモル）（調製法については、１９９５年１２月７日に公開されたＰＣＴ国際出願公報第ＷＯ９５／３２７１０号のスキーム２９参照）、１０％Ｐｄ／Ｃ（３５０ｍｇ）、およびＥｔＯＨの混合物を、１気圧のＨ２下に攪拌した。２０時間後、この反応物を、セリートパッドを通して濾過し、ついで濃縮すると、エステルＡ−５ａを褐色油として生じた。
【０１０４】
ＴＬＣＲｆ＝０．２３（シリカ、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ７．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．２６（ｍ，３Ｈ），６．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），６．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．３７（ｍ，４Ｈ），３．０５（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）。
【０１０５】
４−［２−（２−アミノピリジン−６−イル）エチル］安息香酸塩酸塩（Ａ−６）
６Ｎ　ＨＣｌ（１２ｍｌ）中のエステルＡ−５ａ（６２５ｍｇ、２．３１ミリモル）の懸濁液を６０℃まで加熱した。約２０時間後、この反応物を濃縮すると、酸Ａ−６を黄褐色固体として生じた。
【０１０６】
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．８０（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．８４（ｄ，１Ｈ，１＝９Ｈｚ），６．６９（ｄ，１Ｈ，１＝７Ｈｚ），３．０９（ｍ，４Ｈ）。
【０１０７】
エチル４−［２−（２−アミノピリジン−６−イル）エチル］ベンゾイル−２（Ｓ）−（４−ヨード−フェニルスルホニルアミノ）−β−アラニン（Ａ−７）　ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の酸１５−６（４００ｍｇ、１．４３ミリモル）、アミンＡ−４（６８６ｍｇ、１．５７ミリモル）、ＥＤＣ（３５８ｍｇ、１．８６ミリモル）、ＨＯＢＴ（２５２ｍｇ、１．８６ミリモル）、ＮＭＭ（６３２μｌ、５．７２ミリモル）の溶液を、約２０時間攪拌した。この反応物を、ＥｔＯＡｃで希釈し、ついで飽和ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、ＥｔＯＡｃ、ついで５％イソプロパノール／ＥｔＯＡｃ）は、アミドＡ−７を白色固体として生じた。
【０１０８】
ＴＬＣＲｆ＝０．４（シリカ、１０％イソプロパノール／ＥｔＯＡｃ）
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７９（ｄ，２Ｈ，１＝９Ｈｚ）７．６１（ｄ，２Ｈ，１＝８Ｈｚ），７．５２（ｄ，２Ｈ，１＝９Ｈｚ），７．２９（ｍ，１Ｈ），７．２７（ｄ，２Ｈ＝８Ｈｚ），４．２０（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．６６（ｄｄ，１Ｈ，１＝６Ｈｚ，１４Ｈｚ），３．４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ，１３Ｈｚ），３．０１（ｍ，２Ｈ），２．８６（ｍ，２Ｈ），１．０８（ｔ，３Ｈ，１＝７Ｈｚ）。
【０１０９】
４−［２−（２−アミノピリジン−６−イル）エチル］ベンゾイル−２（Ｓ）−（４−ヨードフェニル−スルホニルアミノ）−β−アラニン（Ａ−８）
エステルＡ−７（２００ｍｇ、０．３２１３ミリモル）および６ＮＨＣｌ（３０ｍｌ）の溶液を６０℃まで加熱した。約２０時間後、この反応混合物を濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：２０：１：１ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ）は、酸Ａ−８を白色固体として生じた。
【０１１０】
ＴＬＣＲｆ＝０．４５（シリカ、２０：２０：１：１ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ）
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．４０（ｍ，１Ｈ），８．１４（Ｂｓ，１Ｈ），７．８１（ｄ，２Ｈ，１４Ｈｚ），７．６２（ｄ，２Ｈ，１＝８Ｈｚ），７．４８（ｄ，２Ｈ，１＝８Ｈｚ），７．２７（ｍ，３Ｈ），６．３４（ｄ，１Ｈ，１＝７Ｈｚ），６．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．８５（ｂｓ，２Ｈ），３．８９（ｂｓ，１Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），２．７９（ｍ，２Ｈ）。
【０１１１】
４−［２−（２−アミノピリジン−６−イル）エチル］ベンゾイル−２（Ｓ）−（４−トリメチルスタニル−フェニルスルホニルアミノ）−β−アラニン（Ａ−９）
ヨウ化物Ａ−８（７０ｍｇ、０．１１７８ミリモル］、［（ＣＨ３）３Ｓｎ］２（４９μｌ、０．２３５６ミリモル）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（５ｍｇ）、およびジオキサン（７ｍｌ）の溶液を、９０℃まで加熱した。２時間後、この反応物を濃縮し、ついで分取ＨＰＬＣ（デルタパックＣ１８１５μＭ１００Ａ°、４０×１００ｍｍ；９５：５ついで５：９５Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）によって精製すると、トリフルオロアセテート塩を生じた。この塩をＨ２Ｏ（１０ｍｌ）中に懸濁し、ＮＨ４ＯＨ（５滴）で処理し、ついで凍結乾燥すると、アミドＡ−９を白色固体として生じた。
【０１１２】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．４０（ｍ，１Ｈ），８．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．６７（ｍ，５Ｈ），７．５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．２９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），６．９５−７．５２（ｍ，２Ｈ），６．４５（ｂｓ，２Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｍ，１Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），２．８６（ｍ，２Ｈ）。
【０１１３】
４−［２−（２−アミノピリジン−６−イル）エチル］ベンゾイル−２（Ｓ）−４−１２５ヨード−フェニルスルホニルアミノ−β−アラニン（Ａ−１０）
ヨードビーズ（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））を、５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉ（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＩＭＳ３０）の発送用ガラスビン（ｓｈｉｐｐｉｎｇ　ｖｉａｌ）に加え、室温で５分間攪拌した。０．０５ｍＬの１０％Ｈ２ＳＯ４／ＭｅＯＨ中の０．１ｍｇのＡ−９溶液を作り、直ちにＮａ１２５Ｉ／ヨードビーズガラスビンに加えた。室温で３分間攪拌した後、約０．０４から０．０５ｍＬのＮＨ４ＯＨを添加し、したがってこの反応混合物はｐＨ６から７になった。反応混合物全体を、精製のためにＨＰＬＣ上に注入した［バイダック（Ｖｙｄａｃ）ペプチド−タンパク質Ｃ−１８カラム、４．６×２５０ｍｍ、３０分にわたり１ｍＬ／分で、１０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）〜９０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）：Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）の直線勾配］。Ａ−１０の保持時間は、これらの条件下１７分である。放射能の大部分を含むフラクションをプールし、凍結乾燥し、エタノールで希釈すると、約１ｍＣｉのＡ−１０を生じた。これを、ＨＰＬＣ分析上でＡ−８の基準試料と共溶離した。
【０１１４】
計測：レオダイン（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）７１２５インジェクターを備えた０．１ｍＬヘッドを有するウオーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）６００Ｅパワーラインマルチソルベントデリバリー装置およびギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）ＦＣ２０３ミクロフラクションコレクターを備えたウオーターズ９９０フォトダイオードアレイデテクターを用いて、分析分取ＨＰＬＣを実施した。分析分取ＨＰＬＣのために、バイダックペプチド−タンパク質Ｃ−１８カラム、４．６×２５０ｍｍを、Ｃ−１８ブラウンリー（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）モジュラーガードカラムと共に用いた。ＨＰＬＣ分析に用いられたアセトニトリルは、フィッシャーオプティマ（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｏｐｔｉｍａ）グレードであった。ＨＰＬＣラジオデテクターは、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）１７０ラジオアイソトープデテクターであった。バイダックＣ−１８タンパク質およびペプチドカラム、３．９×２５０ｍｍを、分析分取ＨＰＬＣのために用いた。放射能の溶液は、スピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）真空遠心分離機を用いて濃縮した。校正曲線および化学的濃度は、ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）モデル８４５２Ａ　ＵＶ／ビスダイオードアレイスペクトロフォトメーターを用いて測定した。サンプル放射能は、パッカードＡ５５３０ガンマカウンターで測定した。
【０１１５】
ανβ３およびανβ３結合および本発明の化合物の骨吸収阻害活性を測定するために用いられたテスト手順を、次に記載する。
【０１１６】
骨吸収−陥凹（ｐｉｔ）アッセイ
破骨細胞が骨吸収に参加する時、これらは、これらが作用する骨の表面に陥凹の形成を引起こすことがある。したがって、破骨細胞を阻害する能力について化合物をテストする場合、阻害化合物が存在する時に破骨細胞がこれらの吸収陥凹を作る能力を測定することは有用である。
【０１１７】
ウシ大腿骨の骨幹の６ｍｍ円筒から、連続した２００ミクロン厚さの断面を、低速ダイアモンドのこぎりでカットする（イリノイ州レイクブラフのイソメット、ブーラー社（Ｉｓｏｍｅｔ，Ｂｅｕｌｅｒ，Ｌｔｄ．，Ｌａｋｅ　Ｂｌｕｆｆ，Ｉｌ））。骨スライスをプールし、１０％エタノール溶液中に入れ、その後の使用まで冷蔵する。
【０１１８】
実験に先立ち、ウシの骨スライスを、Ｈ２Ｏ中で各々２０分間２回超音波処理する。きれいになったスライスを、２つの対照レーンと各々の薬剤投薬量用の１つのレーンが利用できるように、９６ウエルプレートに入れる。各レーンは、三重または四重培養を表わす。９６ウエルプレート中の骨スライスを、ＵＶ照射によって滅菌する。破骨細胞でのインキュベーションに先立ち、これらの骨スライスを、５％胎児ウシ血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンとを含む０．１ｍｌαＭＥＭ、ｐＨ６．９の添加によって水和する。
【０１１９】
生後７〜１４日のウサギ（ニュージーランド白ウサギ）からの長骨を切り裂き、軟組織を取除き、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むαＭＥＭに入れる。これらの骨は、はさみを用いて、１片が＜１ｍｍになるまで細かく刻み、２５ｍｌの容積における５０ｍｌ管に移し替える。この管を６０サイクルの間、手で静かに揺り動かし、この組織を１分間沈殿させ、上澄み液を除去する。さらに２５ｍｌの培地をこの組織に添加し、もう一度揺り動かす。第二上澄み液を、第一上澄み液と組合わせる。細胞数を、赤血球を除いて計数する（一般的に約２×１０７細胞／ｍｌ）。５％胎児ウシ血清、１０ｎＭ１．２５（ＯＨ）２Ｄ３、およびペニシリン−ストレプトマイシンを含む、αＭＥＭ中の５×１０６／ｍｌから成る細胞懸濁液を調製する。２００ｍｌのアリコートを、ウシの骨スライス（２００ｍｍ×６ｍｍ）に添加し、３７℃で、湿潤５％ＣＯ２雰囲気中に２時間インキュベーションする。この培地を、ミクロピペッターで静かに除去し、テスト化合物を含む新鮮な培地を添加する。これらの培養物を４８時間インキュベーションし、培養培地用のクロスラップ（Ｃｒｏｓｓｌａｐｓ）（デンマーク国ハーレブ（Ｈｅｒｌｅｖ，Ｄｅｎｍａｒｋ））によって、ｃ−テロペプチド（Ｉ型コラーゲンのａｌ鎖の断片）について検定する。
【０１２０】
ウシの骨スライスを、２０から２４時間破骨細胞に暴露し、染色のために処理する。組織培養培地を各骨スライスから除去する。各ウエルを、２００ｍｌのＨ２Ｏで洗浄し、ついでこれらの骨スライスを、２．５％グルタルアルデヒド、０．１Ｍカコジレート、ｐＨ７．４中に２０分間固定する。固定後、あらゆる残留細胞屑を、０．２５ＭのＮＨ４ＯＨの存在下における２分間の超音波処理、ついでＨ２Ｏ中の２×１５分間の超音波処理によって除去する。骨スライスを、濾過された１％トルイジンブルーおよび１％ホウ砂で６から８分間速やかに染色する。
【０１２１】
これらの骨スライスが乾燥した後、テストスライスおよび対照スライスにおいて吸収陥凹を計数する。吸収陥凹は、偏光ニコンＩＧＳフィルターキューブを用いて、マイクロフォト（Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ）ＦＸ（ニコン）蛍光顕微鏡で見る。テスト投薬量結果を対照と比較し、その結果生じたＩＣ５０値を、テストされた各々の化合物について決定する。
【０１２２】
哺乳動物（ヒトを含む）の病気の状態に対するこのアッセイから推定するデータの適切さは、Ｓａｔｏ，Ｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１、ｐｐ．３１−４０、１９９０に見られる教示によって裏付けられる。この文献は、その全体が参照して本明細書に組込まれる。この論文は、あるいくつかのビスホスホネートが臨床的に用いられ、パジェット病、悪性高カルシウム血症、骨転移によって生じた溶骨障害、および不動化または性ホルモン欠乏による骨損失の治療に有効であるように見えることを教示している。ついでこれらの同じビスホスホネートを、前記吸収陥凹アッセイにおいてテストすると、これらの既知の有用性とこのアッセイにおける肯定的な成績との相関関係が確認される。
【０１２３】
ＥＩＢアッセイ
Ｄｕｏｎｇら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８：Ｓ３７８（１９９３）は、ヒトインテグリンανβ３を発現するための系について記載している。このインテグリンは、破骨細胞の骨マトリックスへの接着を刺激するが、その理由は、インテグリンに対する抗体、またはＲＧＤ含有分子、例えばエキスタチン（欧州公報第３８２，４５１号）が、骨吸収を効果的に阻止しうるからであると示唆されている。
【０１２４】
反応混合物：
１．１７５μｌＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリス・ＨＣｌｐＨ７．２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）；
２．２５ｍｌ細胞抽出物（１００ｍＭオクチルグルコシド緩衝液で希釈して２０００ｃｐｍ／２５μｌを生じる）；
３．１２５Ｉ−エキスタチン（２５μｌ／５０，０００ｃｐｍ）（第ＥＰ３８２，４５１号参照）；
４．２５μｌ緩衝液（全結合）または非標識エキスタチン（非特異的結合）。
【０１２５】
ついでこの反応混合物を、室温で１時間インキュベーションした。これらの非結合および結合ανβ３を、スカトロンセルハーベスター（Ｓｋａｔｒｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を用いた濾過によって分離した。ついでこれらのフィルター（１．５％ポリ−エチレンイミン中で１０分間予湿潤したもの）を、洗浄緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ　ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２）で洗浄した。ついでこのフィルターをガンマカウンターで計数した。
【０１２６】
ＳＰＶ３アッセイ
材料：
１．小麦麦芽アグルチニンシンチレーションプロキシミティビーズ（ＳＰＡ）：アマーシャム社；
２．オクチルグルコピラノシド：カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；
３．ＨＥＰＥＳ：カルビオケム社；
４．ＮａＣｌ：フィッシャー社（Ｆｉｓｈｅｒ）；
５．ＣａＣｌ２：フィッシャー社；
６．ＭｇＣｌ２：シグマ社（ＳＩＧＭＡ）；
７．フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）：シグマ社；
８．オプティプレート：パッカード社；
９．化合物Ａ−１０（比活性５００から１０００Ｃｉ／ミリモル）；
１０．テスト化合物；
１１．精製インテグリン受容体：ανβ３を、Ｐｙｔｅｌａ（「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１４４：４７５、１９８７）にしたがって、ανβ３を過発現する２９３細胞から精製した（Ｄｕｏｎｇら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．，８：Ｓ３７８（１９９３））；
１２．結合緩衝液：５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ；
１３．結合緩衝液中の５０ｍＭオクチルグルコシド：５０−ＯＧ緩衝液。
【０１２７】
手順：
１．ＳＰＡビーズの前処理：
まず５００ｍｇの凍結乾燥ＳＰＡビーズを、２００ｍｌの５０−ＯＧ緩衝液で４回、１００ｍｌの結合緩衝液で１回洗浄し、ついで１２．５ｍｌの結合緩衝液中に再懸濁した。
【０１２８】
２．ＳＰＡビーズおよび受容体混合物の調製：
各アッセイ管において、２．５μｌ（４０ｍｇ／ｍｌ）の前処理ビーズを、９７．５μｌの結合緩衝液および２０ｍｌの５０−ＯＧ緩衝液中に懸濁した。５ｍｌ（約３０ｎｇ／μｌ）の精製受容体を、室温で３０分間攪拌しつつ懸濁しているビーズに添加した。ついでこの混合物を、４℃で１０分間ベックマンＧＰＲベンチトップ遠心分離機において２，５００ｒｐｍで遠心分離した。ついでこれらのペレットを、５０μｌの結合緩衝液および２５μｌの５０−ＯＧ緩衝液中に再懸濁した。
【０１２９】
３．反応：
下記のものを、対応ウエルにおいてオプティプレートの中に連続的に添加した：
（ｉ）受容体／ビーズ混合物（７５μｌ）；
（ｉｉ）下記のものの各々２５μｌ：テストされる化合物、全結合のための結合緩衝液、または非特異的結合のためのＡ−８（最終濃度１μＭ）；
（ｉｉｉ）結合緩衝液中のＡ−１０（２５μｌ、最終濃度４０ｐＭ）；
（ｉｖ）結合緩衝液（１２５μｌ）；
（ｖ）各プレートを、パッカード社のプレートシーラーで密封し、４℃で揺り動かしつつ一晩インキュベーションした。
【０１３０】
４．パッカードトップカウント（ＰＡＣＫＡＲＤ　ＴＯＰＣＯＵＮＴ）を用いて、プレートを計数した。
【０１３１】
５．％阻害を下記のように計算した。
Ａ＝総計数
Ｂ＝非特異的計数
Ｃ＝サンプル計数
％阻害＝［｛（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｂ）｝／（Ａ−Ｂ）］／（Ａ−Ｂ）×１００。
【０１３２】
ＯＣ形態（ＯＣＦＯＲＭ）アッセイ
もともとマウスの頭蓋冠に由来する骨芽細胞様細胞（１．８細胞）を、リボ−およびデオキシリボヌクレオシド、１０％胎児ウシ血清、およびペニシリン−ストレプトマイシンを含むαＭＥＭ培地中のコーニング（ＣＯＲＮＩＮＧ）２４ウエル組織培養プレートにおいて培養した。朝、細胞を４０，０００／ウエルで植付けた。午後に、骨髄細胞を、下記のようにして生後６週間のオスのバルブ／Ｃマウスから調製した。
【０１３３】
マウスを犠牲にし、脛骨を除去し、前記培地に入れた。末端部を切除し、骨髄を、２７．５ゲージ針を備えた１ｍＬ注射器を用いて、空洞から管の中へ流し出した。この骨髄を、ピペットで吸上げて落とし、懸濁させた。この懸濁液を、＞１００ｍｍナイロン細胞ストレーナに通過させた。その結果生じた懸濁液を、３５０×ｇで７分間遠心分離した。ペレットを再懸濁させ、サンプルを、２％酢酸中に希釈して、赤血球を溶解した。残留細胞を、血球計で計数した。これらの細胞をペレット化し、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μＬを、１．８細胞の各ウエルに添加して、５０，０００細胞／ウエルを生じ、１．２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３（Ｄ３）を、最終濃度１０ｎＭまで各ウエルに添加した。これらの培養物を、湿潤５％ＣＯ２雰囲気中において３７℃でインキュベーションした。４８時間後、培地を変えた。骨髄の添加の７２時間後、テスト化合物を、Ｄ３を含む新鮮培地と共に四重ウエルに添加した。再び化合物を、４８時間後、Ｄ３を含む新鮮培地と共に添加した。さらに４８時間後、培地を除去し、細胞を、室温で１０分間リン酸塩緩衝塩水中の１０％ホルムアルデヒドと共に固定し、ついでエタノール：アセトン（１：１）で１から２分処理し、空気乾燥した。ついでこれらの細胞を、下記のように酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼのために染色した。
【０１３４】
これらの細胞を、室温で１０から１５分間、３０ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬファストレッドバイオレットＬＢ塩、および０．１ｍｇ／ｍＬナフトールＡＳ−ＭＸホスフェートを含む、５０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５．０で染色した。染色後、これらのプレートを、脱イオン水で徹底的に洗浄し、空気乾燥した。多核陽性染色細胞の数を、各ウエルにおいて計数した。
【０１３５】
本発明の構造式（Ｉ）の化合物をテストすると、ヒトανβ３インテグリンに結合することが分かった。これらの化合物は、ＳＰＡＶ３アッセイにおいて１００ｎＭ未満のＩＣ５０値を有することが分かった。
【０１３６】
製薬配合物の例
経口組成物の特別な実施形態として、１００ｍｇの実施例１を、５８０から５９０ｍｇの総量を生じてサイズＯハードジェルカプセルに充填するのに十分なほど細かく分割されたラクトースと共に配合する。
【０１３７】
本発明は、あるいくつかの好ましい実施形態を参照して記載され、例証されてはいるが、当業者なら、様々な変更、修正、および置換を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行なうことができることが分かるであろう。吸収によって引起こされた重症の骨障害のために、あるいは前記の本発明の化合物についてのその他の兆候のために治療される哺乳動物の応答性における差異の結果として、例えば上記において示されているような好ましい用量以外の有効な投薬量も適用可能である。同様に、観察された特別な薬理学的応答は、選択された特別な活性化合物、あるいは製薬キャリヤが存在するかどうか、ならびに配合物の種類、および用いられる投与方法にしたがって、およびこれに応じて、様々に変えることができ、これらの結果におけるこのような変化または差は、本発明の目的および実施にしたがって考慮される。したがって本発明は、クレームの範囲によってのみ限定されるものとし、このようなクレームは、合理的である程度に幅広く解釈されるものとする。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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