(57)【要約】本発明は、新規ペプチドおよび新規免疫抑制剤を同定するためのアッセイにおけるそれらの使用に関する。さらに特に、本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ基質とそれらの細胞内リガンドとの相互作用、ならびにそれらの細胞内リガンドとシグナル伝達経路の他のメンバーとの間の相互作用を調整するであろうところの化合物を同定するための方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物であって、
Ｒ１−Ｔｙｒ−Ｒ２　　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
式中
Ｒ１はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２ＣＯ−またはＲ３−Ａｓｐ−であり、ここで、Ｒ３は水素、アミノアシル残基もしくはオリゴペプチジル残基であり；そして
Ｒ２はアミノ酸もしくはオリゴペプチドであるが；
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４で表される化合物を除くという条件付きである、化合物。
【請求項２】
式ＩＩａもしくはＩＩｂの化合物であって、
2004505991.tif 000007
式中
Ｘ６、Ｘ５、Ｘ４、Ｘ３、Ｘ２、Ｘ１’、Ｘ２’、Ｘ３’、Ｘ４’、Ｘ５’およびＸ６’のそれぞれはアミノ酸であり；
Ｙ１は連結基もしくは一重結合であり；
Ｒ４は水素、標識基、Ｃ１〜Ｃ８−アルコキシカルボニル，Ｒａ−Ｃ（Ｏ）−、Ｒａ−ＯＣ（Ｏ）−もしくはＲａ−ＮＨＣ（Ｏ）−、であるが、式中Ｒａは直鎖もしくは分岐のＣ１〜Ｃ８−アルキル、カルボキシ−Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、アリールまたはアラルキルであり、ここで、該アリール基は非置換であるかまたはハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルまたはＣ１〜Ｃ８−アルコキシにより置換されている；
Ｒ５はＮＲ７Ｒ８もしくはＯＲ９であるが、式中Ｒ７およびＲ８は独立して水素、Ｃ１〜Ｃ８−アルキルであるか、またはＲ７およびＲ８は、それらが結合している窒素原子と一体となって複素環式残基を形成し、ならびにＲ９は水素もしくはＣ１〜Ｃ８−アルキルであり；
Ｒ６はアミノ酸側鎖であり；ならびに、
（ａ）ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは１であり；
（ｂ）ａは０ならびにｂ、ｃ、ｄおよびｅは１であり；
（ｃ）ａおよびｂは０ならびにｃ、ｄおよびｅは１であり；
（ｄ）ａ、ｂおよびｃは０ならびにｄおよびｅは１であり；
（ｅ）ａ、ｂ、ｃおよびｄは０ならびにｅは１であり；もしくは
（ｆ）ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは０であり；ならびに
（ａ’）ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒは１であり；
（ｂ’）ｎは０ならびにｏ、ｐ、ｑおよびｒは１であり；
（ｃ’）ｎおよびｏは０ならびにｐ、ｑおよびｒは１であり；
（ｄ’）ｎ、ｏおよびｐは０ならびにｑおよびｒは１であり；
（ｅ’）ｎ、ｏ、ｐおよびｑは０ならびにｒは１であり；もしくは
（ｆ’）ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒは０である、化合物。
【請求項３】
ＸａａがＨ３ＣＣ（Ｏ）−である配列番号２１、ならびにＸａａがＬ（＋）−ビオチニル−アミノヘキサノイルである配列番号１２、およびＸａａがＬ（＋）−ビオチニル−アミノヘキサノイルである配列番号２５により表される化合物。
【請求項４】
（ａ）ＺＡＰ−７０タンパク質および／もしくはＳｙｋタンパク質を式Ｉの化合物、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）およびテスト化合物と共にインキュベートすること；ならびに
（ｂ）テスト化合物がタンパク質チロシンキナーゼＳｙｋおよび／もしくはＺＡＰ−７０とそれらの基質との相互作用をテスト化合物の不存在下でもたらされる相互作用と比較して調整する能力を評価すること、
を含む、ＺＡＰ−７０もしくはＳｙｋの阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項５】
（ａ）ＺＡＰ−７０タンパク質および／もしくはＳｙｋタンパク質を式Ｉの化合物、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）およびテスト化合物と共にインキュベートすること；ならびに
（ｂ）テスト化合物がタンパク質チロシンキナーゼＳｙｋおよび／もしくはＺＡＰ−７０とそれらの基質との相互作用をテスト化合物の不存在下でもたらされる相互作用と比較して調整する能力を評価すること、
を含む、ＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋの阻害剤を同定するためのアッセイ。
【請求項６】
請求項４に記載の方法もしくは請求項５に記載のアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに特異的な免疫抑制剤。
【請求項７】
請求項４に記載の方法もしくは請求項５に記載のアッセイにより同定されるＴ細胞に特異的なもしくはＴ細胞およびＮＫ細胞に特異的な免疫抑制剤。
【請求項８】
請求項４に記載の方法もしくは請求項５に記載のアッセイにより同定されるＴ細胞阻害剤および／もしくはＢ細胞阻害剤および／もしくはＮＫ細胞。
【請求項９】
請求項４に記載の方法もしくは請求項５に記載のアッセイにより同定される炎症性疾患の調整剤。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法もしくは請求項５に記載のアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤の有効量を被験者に投与することを含む、そのような阻害を必要とする該被験者においてＴ細胞の機能およびＴ細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の方法もしくは請求項５に記載のアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤の有効量を被験者に投与することを含む、そのような阻害を必要とする該被験者においてＮＫ細胞の機能およびＮＫ細胞の増殖を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規ペプチドおよび新規免疫抑制剤を同定するためのアッセイにおけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、化合物をスクリーニングしそしてＳｙｋファミリータンパク質チロシンキナーゼＳｙｋおよびＺＡＰ−７０とそれらの基質との相互作用を調整する化合物を同定することを意図する。
【０００２】
Ｔ細胞は、移植拒絶反応、自己免疫疾患および炎症反応の開始に重要な役割を果たし、それゆえにこれらの適応症における医薬関与（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の一次標的である。Ｔ細胞の活性化は、細胞の成長および分化をもたらす複雑なプロセスである。成熟周辺Ｔ細胞へのＴ細胞受容体の関与が、細胞の増殖および複雑な機能の獲得に至る多重細胞内シグナルを開始する。受容体結合をこれらの細胞内イベントに結びづける生化学的機構は徹底的に検討されている（Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ， Ｊ． Ｅ． Ｍ． ａｎｄ Ｓａｍｅｌｓｏｎ， Ｌ． Ｅ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１， ２４２−２４８， １９９９）。ＳｙｋおよびＺＡＰ−７０を含む、タンパク質チロシンキナーゼのＳｙｋファミリーは、受容体シグナル形質導入の開始および増幅に本質的な役割を果たしている（Ｃｈｕ， Ｄ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １６５， １６７−１８０， １９９８）。ＺＡＰ−７０は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）中でのみ発現されるが、そこではそれはその特異的基質ＬＡＴ（Ｔ細胞活性化リンカー）をリン酸化し、それからそれが数多くの下流エフェクター分子を補充する。ＳｙｋはＢ細胞、肥満細胞、好中球、マクロファージおよび血小板中に見出され、そしてＢ細胞受容体およびＦｃ受容体シグナル形質導入に関与する。
【０００３】
一つの実施態様において、本発明は、活性化され、リン酸化されたＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋキナーゼとＬＡＴとの相互作用を調整しそしてそれ故に免疫抑制剤として作用するところの化合物を同定することを意図する。
好ましい実施態様において、開示したＬＡＴは、活性化されたＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋキナーゼとそれらの基質との特異的結合を妨害し、それによりシグナル形質導入をさらにブロックする薬剤を同定するようにデザインした薬剤スクリーニングアッセイに有用である。
他の実施態様において、この発明は、ＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋキナーゼ−特異的結合親和性を持つＬＡＴポリペプチドを提供する。この発明はまた、細胞内に導入する発現ベクターの部分として開示したＬＡＴをコード化する核酸を提供する。
【０００４】
本発明は、第一の態様において、式Ｉの化合物を提供するが、
Ｒ１−Ｔｙｒ−Ｒ２　　　　　　　　　　　（Ｉ）
式中
Ｒ１はＨＯＯＣ（ＣＨ２）２ＣＯ−またはＲ３−Ａｓｐ−であり、ここで、Ｒ３は水素、アミノアシル残基もしくはオリゴペプチジル残基であり；そして
Ｒ２はアミノ酸、優先的に天然由来のアミノ酸もしくはオリゴペプチド、優先的に天然由来のアミノ酸から作られたオリゴペプチドであるが；
配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４で表される化合物を除くという条件付きである。
【０００５】
式Ｉの化合物は、スクシノイル−Ｔｙｒ−もしくは−Ａｓｐ−Ｔｙｒモチーフに加えて、いかなるアミノ酸、優先的に天然由来のアミノ酸、を含んでもよい。オリゴペプチジル残基もしくはオリゴペプチドは好ましくは２〜７アミノ酸残基の長さであり得る。さらに好ましい数のアミノ酸は５〜７アミノ酸残基の長さであり得る。式Ｉの化合物は、遊離でもよくもしくは固体支持体、例えば、ポリスチレン（例えばポリ−リシン被膜ポリスチレンのマイクロタイタープレート）、ポリアミド（例えばポリアクリルアミドのピンもしくはビーズまたはセルロース、例えば紙）；標識基、例えばビオチン、特にＬ（＋）−ビオチン（また他の、例えばオリゴ−リシンもしくはアルギニン（Ｌｙｓおよび／もしくはＡｒｇ）ｎ，ｎ＝２〜６）、発色性もしくは蛍光性基（例えば２，４−ジニトロフェニル）；または高分子担体、例えばもう一つのペプチド、例えばペネトラチンもしくはリポペプチドのような膜透過性ペプチドまたはタンパク質（例えばウシ血清アルブミン）のいずれかに結合してもよい。結合は、スクシノイル−Ｔｙｒ−中のチロシンのもしくは−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−モチーフ中のアスパラギン酸もしくはチロシンのを除いて、式Ｉの化合物に含まれるアミノ酸の側鎖のいずれか一つを経由するか、または、直接もしくはリンカー、例えばアミノヘキサノイルもしくはスクシニル、を経由して、末端のアミノもしくはカルボキシ基を経由してもよい。式Ｉの化合物のアミノ基は遊離でもよくまたはペプチド化学における当業者に公知の保護基のいずれかにより、例えば、アシル、ウレタンもしくは尿素基、さらに好ましくはアセチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルもしくは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）により保護されてもよい。末端カルボキシ基は、官能性誘導体、例えばエステル、例えばアルキルもしくはアラルキル、例えばメチルもしくはベンジルエステル、未置換アミドまたはモノ−もしくはジ−置換アミド、例えばＮ−メチル、Ｎ，Ｎ−ジエチルもしくはＮ−フェニル、Ｎ−エチルアミド、により置換されてもよい。
【０００６】
式Ｉの化合物の例としては、式ＩＩａもしくはＩＩｂの化合物が挙げられるが、
2004505991.tif 000002
式中
Ｘ６、Ｘ５、Ｘ４、Ｘ３、Ｘ２、Ｘ１’、Ｘ２’、Ｘ３’、Ｘ４’、Ｘ５’およびＸ６’のそれぞれはアミノ酸、優先的に天然由来のアミノ酸であり；
Ｙ１は連結基もしくは一重結合であり；
Ｒ４は水素、標識基、Ｃ１〜Ｃ８−アルコキシカルボニル，Ｒａ−Ｃ（Ｏ）−、Ｒａ−ＯＣ（Ｏ）−もしくはＲａ−ＮＨＣ（Ｏ）−、であるが、式中ＲａはＣ１〜Ｃ８−アルキル、カルボキシ−Ｃ１〜Ｃ８−アルキル、アリールもしくはアラルキルであり、ここで、該アリール基は非置換であるかまたはハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルもしくはＣ１〜Ｃ８−アルコキシにより置換されている；
Ｒ５はＮＲ７Ｒ８もしくはＯＲ９であるが、式中Ｒ７およびＲ８は独立して水素、Ｃ１〜Ｃ８−アルキルであるか、またはＲ７およびＲ８は、それらが結合している窒素原子と一体となって複素環式残基を形成するが、そこで複素環式残基は５−もしくは６−員環でありそして優先的にその環中のさらなる残基がＮ、ＯもしくはＳであり、ならびにＲ９は水素もしくはＣ１〜Ｃ８−アルキルであり；
Ｒ６はアミノ酸側鎖であり；どちらにおいても、
（ａ）ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは１であり；もしくは
（ｂ）ａは０ならびにｂ、ｃ、ｄおよびｅは１であり；もしくは
（ｃ）ａおよびｂは０ならびにｃ、ｄおよびｅは１であり；もしくは
（ｄ）ａ、ｂおよびｃは０ならびにｄおよびｅは１であり；もしくは
（ｅ）ａ、ｂ、ｃおよびｄは０ならびにｅは１であり；もしくは
（ｆ）ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは０であり；ならびにどちらにおいても
（ａ’）ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒは１であり；もしくは
（ｂ’）ｎは０ならびにｏ、ｐ、ｑおよびｒは１であり；もしくは
（ｃ’）ｎおよびｏは０ならびにｐ、ｑおよびｒは１であり；もしくは
（ｄ’）ｎ、ｏおよびｐは０ならびにｑおよびｒは１であり；もしくは
（ｅ’）ｎ、ｏ、ｐおよびｑは０ならびにｒは１であり；もしくは
（ｆ’）ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒは０である。
アリールアルキル基もしくは部分は直鎖もしくは分岐であってもよい。
【０００７】
式ＩＩａにおいては、以下の意義が独立して、一括してまたはいかなる組合せもしくはサブ−組合せで好ましい：
Ｒ４は水素、アセチル、スクシノイルもしくはＬ（＋）−ビオチニルであり；
Ｙ１はアミノヘキサノイル、スクシニルもしくは直接結合であり；
Ｘ６はＧｌｕ、ＳｅｒもしくはＧｌｙ、好ましくはＧｌｕであり；
Ｘ５はＧｌｕ、Ａｌａ、もしくはＰｈｅ、好ましくはＧｌｕであり；
Ｘ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＧｌｙもしくはＬｅｕ、好ましくはＡｓｐ、ＳｅｒもしくはＧｌｙであり；
Ｘ３はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、ＡｌａもしくはＡｓｐ、好ましくはＧｌｕ、ＩｌｅもしくはＡｌａであり；
Ｘ２はＰｒｏ、ＡｓｐもしくはＧｌｙ、好ましくはＰｒｏもしくはＡｓｐであり；
Ｘ１’はＧｌｕ、Ｈｉｓ、ＶａｌもしくはＭｅｔ、好ましくはＧｌｕであり；
Ｘ２’はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＰｈｅ、好ましくはＡｓｎもしくはＰｈｅであり；
Ｘ３’はＰｒｏ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＮｌｅ、好ましくはＰｒｏ、ＶａｌもしくはＬｅｕであり；
Ｘ４’はＭｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、ＧｌｙもしくはＮｌｅ、好ましくはＧｌｙ、ＰｒｏもしくはＧｌｎであり；
Ｘ５’はＧｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＶａｌ、好ましくはＧｌｕであり；
Ｘ６‘はＧｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｅｕもしくはＡｓｐ、好ましくはＬｅｕであり；
Ｒ５は−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２もしくはＮＨＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｒ６は（ＣＨ３）２−ＣＨ−ＣＨ２−、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−もしくはＨＯＯＣ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−、好ましくはＨ２Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−であり；そして
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒは上に規定した通りである。
【０００８】
式ＩＩｂにおいては、以下の意義が独立して、一括してまたはいかなる組合せもしくはサブ−組合せで好ましい：
Ｘ１’はＧｌｕ、Ｈｉｓ、ＶａｌもしくはＭｅｔ、好ましくはＧｌｕであり；
Ｘ２’はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＰｈｅ、好ましくはＡｓｎもしくはＰｈｅであり；
Ｘ３’はＰｒｏ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＮｌｅ、好ましくはＰｒｏ、ＶａｌもしくはＬｅｕであり；
Ｘ４’はＭｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、ＧｌｙもしくはＮｌｅ、好ましくはＧｌｙ、ＰｒｏもしくはＧｌｎであり；
Ｘ５’はＧｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＶａｌ、好ましくはＧｌｕであり；
Ｘ６‘はＧｌｕ、Ｇｌｎ、ＬｅｕもしくはＡｓｐ、好ましくはＬｅｕであり；
Ｒ５は−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２もしくはＮＨＣＨ２ＣＨ３であり；
Ｒ６はＬｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｙもしくはＧｌｕ、好ましくは、Ａｓｎの側鎖であり；そして
ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒは上に規定した通りである。
好ましくは、Ｒ５は、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒが１であるときには−ＯＨであり、ならびにｎ、ｎおよびｏ、ｎ、ｏおよびｐ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑ、もしくはｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒが０であるときにはＮＨ２またはＮＨＣＨ２ＣＨ３である。
【０００９】
好ましいペプチド配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号２４であるが、
式中、Ｎ−末端のＸａａはＲ４−Ｙ１−を表しそしてＣ−末端のＸａａは−ＮＨＣＨ（Ｒ６）Ｃ（Ｏ）−Ｒ５を表すが、式中、Ｒ４、Ｙ１−およびＲ５は上に規定した通りであり、ならびにＲ６は、配列番号５および配列番号８の場合にはＡｓｎ側鎖であり、配列番号６および配列番号７の場合にはグリシン側鎖であり、そして配列番号９、配列番号１０および配列番号２４の場合にはロイシン側鎖である。
さらに好ましいペプチド配列は配列番号５である。
【００１０】
式ＩＩａおよびＩＩｂの好ましい化合物は、Ｒ５はＯＨもしくはＮＨ２、特にＯＨであり、またはＹ１は直接結合でありそしてＲ４は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３でありもしくはＹ１はアミノヘキサノイルでありそしてＲ４はビオチニルである、化合物である。
式Ｉの最も好ましい化合物は、ＸａａがＨ３ＣＣ（Ｏ）−である配列番号２１およびＸａａがＬ（＋）−ビオチニル−アミノヘキサノイルである配列番号１２により表されるものである。
【００１１】
式１の化合物は、例えばペプチド合成の技術上公知のようなもしくは以下の実施例に説明されるような既知方法の類似により調製され得る。望ましい場合には、当業者に公知の保護基を、存在する官能基の一つもしくはそれ以上に一時的に結合してもよい。保護基としてはまた、適切な官能基を持つポリマー樹脂が挙げられる。典型的なプロトコールにしたがい、この発明の化合物を、例えば、樹脂支持体、例えばポリスチレンをベースとする樹脂支持体上で段階的様式により合成し得る。α−アミノ基を、例えば、Ｆｍｏｃにより保護しそして側鎖の官能基は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルもしくはトリフェニルメタン（Ｔｒｔ）により保護してもよい。段階的固相合成は通常、α−アミノ基の脱保護、洗浄、カップリング（即ち、成長するペプチド鎖の次のアミノ酸残基の結合）および洗浄の繰返しサイクルからなる。ペプチド鎖の完全な組み立て後に、末端の保護基を除去しそして、任意に、標識基を末端アミノ基にカップリングしてもよい。ペプチドを樹脂支持体から切断し、側鎖の保護基を除去し、そして生成物をペプチド化学の確立された方法にしたがい精製し得る。
【００１２】
さらなる態様において、この発明は、
（ａ）ＺＡＰ−７０タンパク質および／もしくはＳｙｋタンパク質を式Ｉの化合物、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）およびテスト化合物と共にインキュベートすること；ならびに
（ｂ）テスト化合物がタンパク質チロシンキナーゼＳｙｋおよび／もしくはＺＡＰ−７０とそれらの基質との相互作用をテスト化合物の不存在下でもたらされる相互作用と比較して調整する能力を評価すること、
を含む、ＺＡＰ−７０もしくはＳｙｋの阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。
この評価ステップ（ｂ）は、好ましくは、
（ｃ）式Ｉのリン酸化化合物の量を測定すること；および
（ｄ）テスト化合物との結果をテスト化合物の不存在下における結果と比較し（実施例Ｃ−１〜Ｃ−４を参照）、ＺＡＰ−７０もしくはＳｙｋの阻害を示すテスト化合物の存在下におけるリン酸化の減少を得ること、により実施される。
【００１３】
ステップａ）でＺＡＰ−７０を用いるときには、この発明の方法は、ＺＡＰ−７０阻害剤、好ましくは免疫抑制剤、特にＺＡＰ−７０に特異的な免疫抑制剤、さらに特にＴ細胞の機能、Ｔ細胞の増殖もしくはナチュラルキラー細胞の機能およびナチュラルキラー細胞の増殖を阻害する免疫抑制剤、を同定するのに有用である。
ステップａ）でＳｙｋを用いるときには、この発明の方法は、Ｓｙｋ阻害剤、好ましくは免疫抑制剤、特にＳｙｋに特異的な免疫抑制剤、さらに特にＢ細胞の機能および／もしくはＢ細胞の増殖を阻害する免疫抑制剤、を同定するのに有用である。
【００１４】
前述の事項にしたがい、本発明はさらに以下の項目を提供する：
１．（ａ）ＺＡＰ−７０タンパク質および／もしくはＳｙｋタンパク質を式Ｉの化合物、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）およびテスト化合物と共にインキュベートすること；ならびに
（ｂ）テスト化合物がタンパク質チロシンキナーゼＳｙｋおよび／もしくはＺＡＰ−７０とそれらの基質との相互作用をテスト化合物の不存在下でもたらされる相互作用と比較して調整する能力を評価すること、
を含む、ＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋの阻害剤を同定するためのアッセイ。
２．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＴ細胞阻害剤。
３．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＮＫ細胞阻害剤。
４．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＢ細胞阻害剤。
５．この発明の方法もしくはアッセイにより同定される免疫抑制剤。
６．この発明の方法もしくはアッセイにより同定される炎症性疾患の調整剤。
【００１５】
７．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤の有効量を被験者に投与することを含む、そのような阻害を必要とする該被験者においてＴ細胞の機能およびＴ細胞の増殖を阻害する方法。
８．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤の有効量を被験者に投与することを含む、そのような阻害を必要とする該被験者においてＮＫ細胞の機能およびＮＫ細胞の増殖を阻害する方法。
９．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤の有効量を被験者に投与することを含む、そのような阻害を必要とする該被験者においてＢ細胞の機能およびＢ細胞の増殖を阻害する方法。
１０．この発明の方法もしくはアッセイにより同定されるＺＡＰ−７０および／もしくはＳｙｋに対する阻害剤を、そのための一つもしくはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤もしくは担体と共に含む、医薬組成物。
１１．式Ｉの化合物をＬＡＴの基質として使用。
１２．例えば少なくとも一つのＴｙｒ残基においてリン酸化される、式Ｉの化合物。
【００１６】
以下の実施例において、全ての温度は℃である。以下の略号を使用する：ＤＭＦ＝ジメチルフォルムアミド；Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン；ｔＢｕ＝ｔｅｒｔブチル；ＤＩＰＣＤＩ＝Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン；ＲＴ＝室温；ＭＳ＝電子スプレー質量分析法により測定される分子イオン（例えばＭ＋Ｈ１＋）；ＡＰＣ＝アロフィコシアニン；ＺＡＰ−７０＝７０ｋＤのゼータ鎖−関連タンパク質；Ｓｙｋ＝ｐ７２ｓｙｋタンパク質チロシンキナーゼ；ＩＲＫ＝インスリン受容体キナーゼ；ＳＡ＝ストレプトアビジン；Ｌｃｋ＝ｐ５６ｌｃｋとも呼ばれて、５６，０００の相対的分子質量を持ちそしてチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーに属する。それはリンパ球様細胞中で、優先的に胸腺リンパ球および周辺Ｔ細胞中で、もっぱら発現される。
【００１７】
実施例Ａ１：Ｌ（＋）−ビオチニル−アミノヘキサノイル−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号１２）の調製
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−オキシメチル−４−フェノキシメチル−共（ポリスチレン−１％−ジビニルベンゼン）、Ａｓｎの含量は約０．５ｍｍｏｌ／ｇ、のＮ−α　Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて切断する。側鎖で保護されたＦｍｏｃ−アミノ酸［Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）およびＴｙｒ（ｔＢｕ）］についてアミノ基当り４当量をＤＩＰＣＤＩおよびＨＯＢｔをＤＭＦ中で用いてカップリングさせる。ペプチド鎖の完全な組み立て後に、末端のＦｍｏｃ−保護基を、上述のように、ＤＭＦ中ピペリジンで除去する。それから、Ｌ（＋）−ビオチニル−アミノヘキサン酸を４当量の試薬を用いてＤＭＦ中でＤＩＰＣＤＩおよびＨＯＢｔを用いて末端アミノ基へＲＴで４日間カップリングさせる。ペプチドを樹脂支持体から切断し、そして全ての側鎖の保護基を、ＴＦＡ中で５％ドデシルメチルスルフィドおよび５％水からなる試薬をＲＴで２時間用いて同時に除去する。樹脂粒子をろ過し、ＴＦＡで洗浄し、そして、１０〜２０容量のジエチルエーテルの添加により、合併したろ液から生成物を沈澱させ、エーテルで洗浄しそして乾燥する。２％リン酸水溶液中でアセトニトリルの勾配を用いるＣ−１８広−孔シリカカラム上のクロマトグラフィーにより、生成物を精製する。純粋な化合物を含有するフラクションを集め、陰イオン交換樹脂（Ｂｉｏｒａｄ、ＡＧ４−Ｘ４酢酸塩形）を通してろ過しそして凍結乾燥して、タイトル化合物を得る。ＭＳ：１９５８．０（Ｍ−Ｈ）−１
【００１８】
実施例Ａ１で記した手順を用いるが、適切なアミノ酸および樹脂支持体に取り替えることにより、表１の配列を持つ化合物を調製する：
【表１】
2004505991.tif 000003
【表２】
2004505991.tif 000004
【表３】
2004505991.tif 000005
【表４】
2004505991.tif 000006
Ａ：配列番号
Ｒ：Ｌ（＋）−ビオチニル−アミノヘキサノイル
【００１９】
式１の化合物は、スクリーニングアッセイに、特にタンパク質チロシンキナーゼＺＡＰ−７０のもしくはタンパク質チロシンキナーゼＳｙｋの阻害剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおける成分として有用である。タンパク質チロシンキナーゼＺＡＰ−７０および／もしくはタンパク質チロシンキナーゼＳｙｋをブロックしそれ故にＴ細胞の活性化および／もしくはナチュラルキラー細胞の活性化および／もしくはＢ細胞の活性化をブロックする、これらの阻害剤はまた、望ましくない細胞の成長、分化、特に免疫細胞の分化、および過敏症／アレルギーに関連する疾病を処置するのに使用を見出す。加えて、これらは、自己反応性Ｔ細胞の阻害、有害なＴ細胞生成物（サイトカイン、リンホカインのような）の生成、Ｔ細胞の活性、ナチュラルキラー細胞の活性および／もしくはＢ細胞の活性の阻害、に使用を見出す。これらの阻害剤は、炎症性疾患の調整剤としてさらに有用である。かくして、それは、免疫性疾患、例えば自己免疫疾患、Ｔ細胞の免疫調整および移植拒絶反応の予防と処置に、しかしまた、そこでＺＡＰ−７０またはＳｙｋが役割を果たすところの細胞のシグナル化が妨げられる、癌にも適切であるであろう。
【００２０】
治療的使用については、本発明の阻害組成物を医薬組成物として投与することができる。本発明にしたがって使用するためのそのような医薬組成物は、一つもしくはそれ以上の生理的に許容される担体もしくは添加物を用いて従来の方式により製剤化し得る。かくして、化合物およびそれらの生理的に許容される塩および溶媒和物は、吸入法もしくは通気法（口もしくは鼻を通じるかのどちらかで）または局所、経口、バッカル、注射もしくは直腸投与による投与のために製剤化され得る。
【００２１】
ＺＡＰ−７０タンパク質もしくはＳｙｋタンパク質は、天然資源から、または例えば適切なプライマーを調製し、ならびにゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡから構成されるライブラリー中でＺＡＰ−７０もしくはＳｙｋをコード化するヌクレオチドを含む核酸をスクリーニングし、該核酸の多重コピーを調製しそして適切な宿主細胞、例えばバキュロウイルス、内へ、導入するための適切なベクター内に該核酸を挿入するかもしくは直接に核酸を宿主細胞に導入し、得られた宿主細胞を培養しそして望ましい酵素を精製することを伴う遺伝子工学技法を応用することにより、調製し得る。
【００２２】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、これらの実施例は例示の目的のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【００２３】
実施例Ｂ１：組換えＺＡＰ−７０キナーゼのクローン化、発現および精製
完全長ヒトＺＡＰ−７０（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｌ０５１４８）をコード化する核酸をＪｕｒｋａｔ　ｃＤＮＡライブラリーからＲＴ−ＰＣＲにより増幅しそして ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｃａ．）内にクローン化する。ＺＡＰ−７０　ｃＤＮＡインサートの真実性は完全配列分析によりバリデートされる。それから、このドナープラスミドを用いて、加えてＮ−末端ヘキサヒスチジンタグを特徴づけるプラスミドｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｃａ．）に基づく組換えバキュロウイルス転移ベクターを構築する。ＡｃＮＰＶウイルスのＤＮＡとの共−トランスフェクションに引き続き、１０個の独立したウイルスの分離株をプラ−ク精製により誘導化し、小規模で増幅し、続けて市販の抗−ＺＡＰ−７０抗体（Ｃｌｏｎｅ ２Ｆ３．１， Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるウエスタンブロットにより組換えＺＡＰ−７０発現について分析する。一つの陽性組換えプラ−クのさらなる増幅で、量の決まったウイルスのストックを調製しそして、規定化し最適化した条件下に、血清無添加のＳＦ９００　ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で成長するＳｆ９細胞の感染に使用する。
Ｎｉ−ＮＴＡカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより、感染したＳｆ９細胞の溶菌液からＺＡＰ−７０タンパク質を単離する。
組換え完全長ヒトＳｙｋ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｚ２９６３０）、完全長ヒトブルトンチロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）（ＥＭＢＬ ＃Ｘ５８９５７）、完全長ヒトＬｃｋ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｘ０６３６９）およびヒトＩＲＫ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｍ１００５１）の細胞質ドメインを類似の方法により生成する。
【００２４】
ＺＡＰ−７０もしくはＳｙｋによる適切な基質のリン酸化量を測定するアッセイは以下の技法を伴う：放射性標識ＡＴＰ、例えば３３Ｐを含む、を利用して、式Ｉの化合物中に取込まれた放射能をシンチレーション計数により測定し得る。残存する３３Ｐ　ＡＴＰからリン酸化生成物を分離する方法としては、ホスホセルロースもしくは膜−連鎖ストレプトアビジン上の捕獲またはポリアクリルアミドゲル電気泳動が挙げられる。シンチレーション近接法のように、分離ステップを必要としない、均一アッセイは、検出のために固相に取込まれたシンチラントを使用する。
【００２５】
非放射性技法は、抗−ホスホチロシン抗体を用いて、式Ｉの固定化化合物のリン酸化レベルを定量化する、エンザイムイムノアッセイに基づき得る。さらに、蛍光検出法、例えば、蛍光偏光法、蛍光共鳴エネルギー移動、時間分解蛍光、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動および蛍光相関分光法、を使用し得る。フルオレセイン−接合抗−ホスホチロシン抗体を用いて、チロシンキナーゼ活性をアッセイし得る。
【００２６】
実施例Ｃ１：時間分解蛍光共鳴エネルギー移動により測定されるＺＡＰ−７０による式Ｉの化合物のリン酸化
ＺＡＰ−７０キナーゼアッセイ：１０ｎＭ　ＺＡＰ−７０単独もしくは１０ｎＭ　ＺＡＰ−７０プラス４２ｎＭ　Ｌｃｋ、２５０ｎＭの式Ｉのビオチン化した化合物および１μＭ　ＡＴＰを４０μｌのＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０μＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＭｎＣｌ２、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中でマイクロタイタープレート中ＲＴで５時間インキュベートする。検出緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中の１０ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液１０μｌでキナーゼ反応を終結させる。
検出緩衝液中へ５０μｌのユウロプウム−標識抗−ホスホチロシン抗体（例えばＥＵ−ＰＴ６６：０．１２５ｎＭの最終濃度；Ａｄｖａｎｔ／Ｗａｌｌａｃ）および５０μｌのストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＳＡ−ＡＰＣ；４０ｎＭの最終濃度）の添加により、検出段階を実施する。ＲＴで１時間インキュベーション後に、例えば Ｖｉｃｔｏｒ２ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ （Ｗａｌｌａｃ） 上で６６５ｎｍにおいて蛍光を測定する。
このアッセイにおいては、式Ｉの化合物、特に配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４もしくは配列番号２５で表される化合物、は、ＺＡＰ−７０によりおよびＬａｃにより活性化されたＺＡＰ−７０によりリン酸化されて、２０，０００〜４６，０００蛍光単位をもたらす。
【００２７】
実施例Ｃ２：ＺＡＰ−７０および３３Ｐ−ＡＴＰによる式Ｉの化合物のリン酸化
ＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液１５μｌ中Ｌａｃ（１００ｎＭ）およびＡＴＰ（１０μＭ）で、ＺＡＰ−７０（２０ｎＭ）をインビトロで活性化する。この反応は、シリコン化したマイクロタイタープレート中ＲＴで１時間実施される。５μＭの選択的Ｌｃｋ阻害剤ＰＰ２（４−アミノ−５−（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；１μＭの最終濃度）および３０ｎＭの３３Ｐ−ＡＴＰ（１１０　Ｔｂｑ／ｍｍｏｌ）を含むＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液５μｌの添加後に、混合液をＲＴでさらに１０分間インキュベートする。
それから、ＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液５μｌ中の０．４〜１００μＭの式Ｉの化合物（０．０８〜２０μＭの最終濃度）を加えそしてＲＴで２時間インキュベートする。７．５ｍＭ塩酸グアニジン１２．５μｌの添加によりキナーゼ反応を終結させる。
３０μｌを、ウェル当り１００μｌのリン酸−緩衝生理食塩水でインキュベートしている、個々のＳＡＭ２（商標）ビオチン捕獲プレートウェル（Ｐｒｏｍｅｇａ）へ移す。１分間のインキュベーション後に、真空マニホールドシステム中で以下のように洗浄を実施する：ウェル当り２００μｌの２Ｍ　ＮａＣｌで５回、ウェル当り２００μｌの２Ｍ　ＮａＣｌ／１％Ｈ３ＰＯ４で６回、ウェル当り２００μｌの脱イオン水で２回およびウェル当り２００μｌの９５％エタノールで２回。プレートを風乾しそしてプレートの底に不透明なシールを敷き、ウェル当り１５μｌのシンチレーション流体（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ， Ｐａｃｋａｒｄ）を加えそしてプレートを透明なトップシールでカバーする。液体シンチレーション分光計（例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔ， Ｐａｃｋａｒｄ）で放射能を測定する。例えば、配列番号１２、配列番号１３もしくは配列番号１４の化合物がＺＡＰ−７０によりリン酸化される。最高のｃｐｍは１２，０００〜１６，０００の範囲にある。Ｋｍ値は０．４〜２．０μＭの範囲にある。
【００２８】
実施例Ｃ３：時間分解蛍光共鳴エネルギー移動により測定されるＳｙｋによる式Ｉの化合物のリン酸化
Ｓｙｋキナーゼアッセイ：１０ｎＭ　Ｓｙｋ、３７０ｎＭの式Ｉの化合物および２０μＭ　ＡＴＰを４０μｌのＳｙｋキナーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０μＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で混合しそしてＲＴで４時間インキュベートする。キナーゼ反応の終結、検出段階および蛍光の測定を実施例Ｃ１に記載のように実施する。
このアッセイにおいては、式Ｉの化合物、特に配列番号１２、配列番号１３もしくは配列番号１４で表される化合物、は、Ｓｙｋによりリン酸化されて、２０，０００〜３０，０００蛍光単位をもたらす。
【００２９】
実施例Ｃ４：時間分解蛍光共鳴エネルギー移動により測定されるＬｃｋ、ＢｔｋもしくはＩＲＫによる式Ｉの化合物のリン酸化の欠如
Ｌｃｋアッセイ：４２ｎＭ　Ｌｃｋ、２５０ｎＭの式Ｉの化合物および１μＭ　ＡＴＰを４０μｌのＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液（実施例Ｃ１を参照）中でインキュベートする。キナーゼ反応の終結、検出段階および蛍光の測定を実施例Ｃ１に記載のように実施する。
Ｂｔｋアッセイ：５０ｎＭ　Ｂｔｋ、３７０ｎＭの式Ｉの化合物および２０μＭ　ＡＴＰを４０μｌのＢｔｋ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０μＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で混合しそしてＲＴで１時間インキュベートする。検出緩衝液１００μｌ中のＥｕ−ＰＴ６６（２ｎＭ）およびＳＡ−ＡＰＣ（８０ｎＭ）を加えそして、１時間後に、蛍光を実施例Ｃ１に記載のように測定する。
ＩＲＫアッセイ：０．３ｎＭ　ＩＲＫ、１２０ｎＭの式Ｉの化合物および２０μＭ　ＡＴＰを４０μｌのＩＲＫ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０μＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　ＭｎＣｌ２、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中ＲＴで５時間インキュベートする。
キナーゼ反応の終結、検出段階および蛍光の測定を実施例Ｃ１に記載のように実施する。
このアッセイにおいては、式Ｉの化合物、例えば配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４を持つ化合物、は、Ｌｃｋ、ＢｔｋもしくはＩＲＫにより殆んどリン酸化されないで、１，３００〜５，６００蛍光単位（実施例Ｃ１における２０，０００〜４６，０００蛍光単位に対して）をもたらす。
【００３０】
実施例Ｃ５：競合アッセイで測定されるＺＡＰ−７０による式Ｉの化合物のリン酸化
ＺＡＰ−７０キナーゼ緩衝液中８０ｎＭ　Ｌａｃおよび４μＭ　ＡＴＰで、８０ｎＭ　ＺＡＰ−７０（２）をシリコン化したポリプロピレンチューブ中ＲＴで１時間インキュベートする。それから、選択的Ｌｃｋ阻害剤ＰＰ２（実施例Ｃ２を参照）を加え（１．２μＭの最終濃度）を加えそしてさらに１０分間インキュベートする。この溶液１０μｌを、例えば配列番号１２（１μＭ）のビオチン化した化合物の１０μｌおよび例えば配列番号２１、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７（０．２８〜２００μＭの逐次希釈）、の式Ｉの化合物の非−ビオチン化ペプチドの２０μｌと混合し、そしてＲＴで４時間インキュベートする。キナーゼ反応の終結、検出段階および蛍光の測定を実施例Ｃ１に記載のように実施する。
このアッセイにおいては、式Ｉの化合物、例えば配列番号２１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２３もしくは配列番号２４で表される化合物、は、配列番号１２で表される化合物のＺＡＰ−７０によるリン酸化を阻害する。ＩＣ５０値は０．６〜２１μＭの範囲にある。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004505991.tif 000039
2004505991.tif 000040
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