(57)【要約】本発明は、有効量のテストステロン代謝の非エストロゲン阻害剤（この阻害剤は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）を提供することにより細胞の集団に対して神経保護を付与すること及び神経変性性障害を治療することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の細胞の集団に対して神経保護を付与する方法であって、以下の工程：
（ａ）医薬製剤中の有効量の非エストロゲンテストステロン阻害剤（この阻害剤は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）を用意する工程；及び
（ｂ）神経保護を付与するように、前記対象に前記阻害剤を投与する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記テストステロン阻害剤が、ホルモン、ステロイド性抗アンドロゲン、非ステロイド性抗アンドロゲン、アンドロゲン合成阻害剤、黄体形成ホルモンレセプターアンタゴニスト、黄体形成ホルモンレセプターアゴニスト及び５−α−レダクターゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、雄性の対象である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）が、経口、筋内、経皮、口内、静脈内及び皮下から選択される経路によって前記阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
対象中の細胞の集団に対して神経保護を付与する方法であって、以下の工程：
（ａ）医薬製剤中の有効量の複数の非エストロゲンテストステロン阻害剤（この阻害剤は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）を含有する混合物を用意する工程；及び
（ｂ）神経保護を付与するように、前記対象に前記阻害剤を投与する工程
を含む方法。
【請求項６】
対象における神経変性性障害を治療する方法であって、以下の工程：
（ａ）医薬製剤中の有効量の非エストロゲンテストステロン阻害剤（この阻害剤は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）を用意する工程；及び
（ｂ）前記障害の不利益な影響を遅延させるように、前記対象に前記製剤を投与する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、有効量の少なくとも１つのテストステロン阻害剤を投与することに依存する、対象に対して神経保護を付与する新規な方法に関する。
【０００２】
発明の背景
神経変性疾患は、社会に対して重大な影響を有する。例えば、約３００万〜４００万の米国人がアルツハイマー病として知られる慢性神経変性疾患に罹患している。慢性神経変性疾患の他の例としては、糖尿病性末梢神経障害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病及びパーキンソン病が挙げられる。すべての神経変性疾患が慢性ではない。いくつかの急性状態は、卒中、精神分裂症、外科手術に起因する脳虚血及び癲癇、ならびに脳、末梢神経又は脊髄の損傷をもたらす低血糖症及び外傷から生じる。これらの状態の各々に付随するニューロン損傷を逆行又は遅延させるための改良された治療剤及び方法に対する需要が存在する。
【０００３】
神経変性疾患及び老化は、個体ごとに重症度及び範囲が異なる広い範囲の症状を特徴とする。例えば、アルツハイマー病は、憂鬱、攻撃性、短期記憶の障害、知的能力の障害、動揺、興奮性及び落ち着きの無さのような症状を特徴とする。
【０００４】
動物における神経変性性の障害及び老化の過程の共通の特徴は、ニューロン活性の喪失及び細胞死をもたらす中枢神経系（ＣＮＳ）内のニューロンの進行性の細胞損傷である。この活性の喪失は、記憶喪失及び認識の欠損を含む不利益な行動症状と相関づけられている。ニューロン活性の喪失を遅延させるために開発された治療剤は、有害な副作用を有するか、血液脳関門を通過できないことにより標的部位への到達が妨害されるか、のいずれかである。血液脳関門は、大きい分子及び荷電した小さい分子の両方の通過を遅延させ、それによって脳の細胞への接近を制限する、形態学的及び酵素的成分の複合体である。血液脳関門を通過して容易に移送される新規な治療剤、ならびに損傷部位を直接標的とする非毒性の神経変性性の障害の新規な治療方法に対する需要が存在する。
【０００５】
神経学的症状を治療する従来の方法は、ニューロン間を及びニューロンに沿って移動する電気的インパルス自体の改変；又は神経伝達物質の放出又は分解の改変に焦点を当ててきた。現在、ニューロン細胞密度は、機能に対して重要な影響を有することが認識されている。種々の病理学的状態において、加速されたニューロン細胞死によってもたらされる細胞密度の低下が観察されてきた。ニューロンの分解のパターンは、典型的には神経終末から生じ、細胞体に向かって「後ろ向きに」進行する（逆行性分解）。いくつかの系においては、ある種の脳領域の障害発生は、軸索の代償性芽（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）をもたらす。ニューロンのこの可塑性は、少なくとも部分的には、栄養性成長因子の存在を原因とする。
【０００６】
これらの知見は、損傷した領域の構造的完全性を改良するように、残っている細胞の軸索及び樹状突起の出芽を刺激することによって細胞喪失を補償する治療剤を同定するための努力を奨励してきた。しかし、ニューロン及びニューロン伸長の最適な密度は、欠乏及び過剰の微妙なバランス、すなわち細胞の環境とともに変化するバランスである。このバランスは、治療剤が正常組織又は不適切な組織に作用する場合に崩壊し得る。したがって、治療的用量の治療剤を、それらを必要とする領域に特異的にターゲティングするか、あるいは、標的部位のみに対する天然の特異性を有する薬剤又は非毒性用量で有効な薬剤を同定する需要が存在する。
【０００７】
中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞ならびに末梢神経系の交感神経及び知覚神経ニューロンの成長及び維持を促進する神経栄養因子は、治療剤としての用途について研究されてきた。特に、神経成長因子（ＮＧＦ）、すなわち海馬状隆起から中隔コリン作動性細胞体へ、ならびに皮質から基底核へ、インタクトな脳において通常逆行的に移送されるタンパクの投与は、コリン作動性ニューロンに栄養的支持を提供し、動物モデルにおいて外傷、疾患又は老化による神経変性の影響を低減させることにおいて有用性があることが示されている。治療剤としてのＮＧＦの用途が直面する主要な問題の１つは、適切な標的部位でＮＧＦのレベルを増大させる適切な方法を見つけることである。ＮＧＦは、大きな分子であり、そのままでは通常血液脳関門を通過できず、したがって、脳の細胞に対するアクセスが非常に限られている。血液脳関門を通過させて神経成長因子を投与する現在の方法としては、ポリマー移植物、浸透圧ミニポンプ、脳への移植のためにＮＧＦを分泌する遺伝子操作された自己由来又は異種細胞を用いる細胞療法、及び血液脳関門の透過性を増大させ、それによって脳内細胞へのこれらの分子の拡散を可能にする方法が挙げられる。外来性ＮＧＦを用いる場合、比較的大量の比較的高価な組換えタンパクが必要である。非局在性ターゲティングは、標的部位で利用可能なタンパクの量を低減させるだけでなく、対象にとって潜在的に有害な影響を生じる不適切な部位でのニューロンの成長の刺激をももたらす。
【０００８】
神経学的症状を治療するためのさらなるアプローチは、ある種のアミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）がＮ−メチルＤ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）レセプターに結合する興奮性神経伝達物質として作用するという観察にしたがってきた。これらのアミノ酸の過剰な放出（ＥＡＡ）は、神経変性疾患ならびに低血糖症又は外傷の状態においてニューロンの過剰刺激を引き起こし、ニューロンの喪失及び行動機能不全をもたらす。ＮＭＤＡは、グルタメートの強力で有害なアナログであり、動物での研究において、頭部の外傷、低血糖症、無酸素症、低酸素症及び他の状態に付随するニューロン死の多くを媒介し、中枢神経系への血液、酸素又はグルコースの流れを妨害することが示された。
【０００９】
このレセプターのアンタゴニストとして作用する多くの合成化合物が記載され、動物モデルにおいて試験されてきた。これらの化合物がヒトにおいて有害である可能性は、解明されていない。多年にわたる臨床研究にもかかわらず、これらのアンタゴニストは、患者の治療のための治療生成物としては未だに利用可能ではない。
【００１０】
エストロゲン化合物は、神経保護効果を有することが見出された（Ｓｉｍｐｋｉｎｓら、米国特許第５，５５４，６０１号、参照によりここに援用される）。さらに、４環シクロペンタノフェナントレン（ｆｏｕｒ  ｒｉｎｇ  ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）化合物として同定された化合物のクラスは、神経保護効果を有することが見出された（Ｓｉｍｐｋｉｎｓら、米国出願番号第０８／６８５，５７４号、参照によりここに援用される）。これらの観察は、神経変性についての多様なインビトロ及びインビボでのモデルにおいて確認されてきた（Ｃ．  Ｂｅｈｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．、  ｖｏｌ．２１６（１９９５）、ｐｐ．４７３−４８２；  Ｊ．  Ｂｉｓｈｏｐら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、  ｖｏｌ．５（１９９４）、ｐｐ．３０３−３０８；  Ｙ．  Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、  ｖｏｌ．６６（１９９６）、ｐｐ．１８３６−１８４４；  Ｐ．Ｓ．  Ｇｒｅｅｎら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、  ｖｏｌ．１７（１９９７）、ｐｐ．５１１−５１５；  Ｊ．Ｗ．  Ｓｉｍｐｋｉｎｓら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、  ｖｏｌ．１５（１９９４）、ｐｐ．Ｓ１９５−Ｓ１９７；  Ｃ．Ａ．  Ｓｉｎｇｅｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔ．、  ｖｏｌ．２１２（１９９６）、ｐｐ．１３−１６）。
【００１１】
神経変性疾患の疾患進行ならびに外傷および老化において有意な役割を果たす、ニューロン喪失を遅延させるための神経保護剤を同定する継続的な需要が存在する。
【００１２】
発明の概要
好ましい態様において、医薬製剤中の有効量のテストステロン代謝の非エストロゲン阻害剤を用意する工程（ここで、この阻害剤は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）；及び神経保護を付与するように対象に前記阻害剤を投与する工程を含む、対象内の細胞の集団に対して神経保護を付与する方法を提供する。好ましい態様においては、対象は男性（雄性）個体である。
【００１３】
好ましい態様においては、本方法は、ホルモン、ステロイド性抗アンドロゲン、非ステロイド性抗アンドロゲン、アンドロゲン合成阻害剤、黄体形成ホルモンレセプターアンタゴニスト、黄体形成ホルモンレセプターアゴニスト及び５−α−レダクターゼ阻害剤からなる群から選択されるテストステロン代謝の阻害剤をさらに含み、その化合物は、好ましくは、経口、筋内、経皮、口内、静脈内及び皮下から選択される経路によって投与される。
【００１４】
本発明のさらなる態様においては、医薬製剤中の有効量の複数のテストステロン代謝の非エストロゲン阻害剤を含有する混合物を用意する工程（ここで、前記阻害剤は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）；及び神経保護を付与するように前記阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象内の細胞の集団に対して神経保護を付与する方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる態様においては、対象における神経変性障害を治療する方法は、医薬製剤中の有効量のテストステロン代謝の非エストロゲン阻害剤を用意する工程（ここで、前記阻害剤は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）；及び前記障害の不利益な影響を遅延させるように前記製剤を対象に投与する工程を含む。
【００１６】
発明の詳細な説明
ニューロン喪失は、疾患の進行に関連し、したがって、ニューロン喪失を遅延させる方法は、疾患の管理のために望ましい。ある種のクラスの化合物がニューロン喪失を遅延させることにおいて有効であることが示されている一方で、疾患の進行及び老化ならびに外傷の後遺症を遅延させることについて効果的であることが証明され得るさらなる化合物を同定することが望ましい。老化する集団においては、神経変性疾患、老化及び外傷によって引き起こされる細胞死からニューロンを保護する方法に対する特別の需要が存在する。
【００１７】
エストロゲンは、神経保護特性を有することが見出されている（Ｓｉｍｐｋｉｎｓら、１９９６年）が、その一方で、その雄性対応物、すなわちテストステロンの神経保護に関する作用についてはほとんど知られていない。
【００１８】
テストステロンは、ストレスに応答して血管収縮神経薬物質である神経ペプチドＹの放出を増大させる（Ｚ．  Ｓｕｋｏｗｓｋａ−Ｇｒｏｊｅｃ、  Ａｎｎ，  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、  ｖｏｌ．７７１（１９９５）、ｐｐ．２１９−３３）。さらに、テストステロンは、大動脈組織において血管拡張神経薬であるプロスタサイクリン（ｐｒｏｔａｃｙｃｌｉｎ）の合成を阻害すること（Ｊ．  Ｎａｋａｎｏら、  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、  ｖｏｌ．３９（１９８１）、ｐｐ．２０３−２０９）、トロンボキサンＡ２により誘導される冠状動脈の収縮を増強すること（Ｋ．  Ｓｃｈｏｒら、Ｅｕｒｏ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓ．、  ｖｏｌ．２４  Ｓｕｐｐ．（１９９４）、ｐｐ．５０−５２）、及び大動脈中のトロンボキサンＡ２レセプターを低減させること（Ｋ．  Ｍａｔｓｕｄａら、Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ．、  ｖｏｌ．２６７（１９９４）、ｐｐ．Ｈ８８７−Ｈ８９３）が示された。テストステロンはまた、血小板凝集（Ｗ．Ｉ．  Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．４５（１９８７）、ｐｐ．７１９−７２８）及びアラキドン酸により誘導される血栓症（Ａ．Ｄ．  Ｕｚｕｎｏｖａら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ、  ｖｏｌ．１３（１９７７）、ｐｐ．９９５−１００２）を増大させることも示された。
【００１９】
Ａｒｏｏｎｓａｋｕｌは、アルツハイマー病の患者の症状を治療するための混合物中にテストステロンを特異的に含有させ、テストステロンは治療剤として有益な効果を有し得ることを示唆した（Ａｒｏｏｎｓａｋｕｌ（１９９０）、米国特許第４，８９７，３８９号）。しかし、他の者は、内在性テストステロンは中脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を有する雄ラットにおいてニューロンの生存を減少又は向上させないことを報告した（Ｔｏｕｎｇら、Ｓｔｒｏｋｅ、１９９８：２９：１６６６−１６７０）。
【００２０】
前記とは対照的に、テストステロンがニューロン喪失の遅延に対して不利益な効果を有することがここで初めて明らかにされている（実施例を参照されたい）。結果として、この観察は、神経保護を増強させるようにニューロン喪失に対するテストステロンの負の影響を逆転させるためのテストステロン阻害剤の用途を提供する。当該技術分野で公知のテストステロン阻害剤は、前立腺ガンを治療するための化合物を含む。本発明の１つの好ましい態様においては、これらの化合物及び以下に定義する他のテストステロン阻害剤についての新規な用途が提供される。
【００２１】
本発明によれば、テストステロン阻害剤は、傷害又は疾患に続いて起こるニューロン喪失を防止するために単独で又は組み合わせて用いることができる。テストステロン阻害剤は、卒中、一過性虚血事象、くも膜下出血、心臓又は神経手術に二次的なニューロン喪失、ショック、頭部外傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＩＤＳ、痴呆、老化及び精神分裂症を含むがそれらに限られない状態において、ニューロン喪失を治療するために用いることができる。
【００２２】
「テストステロン阻害剤」は、本明細書中及び特許請求の範囲においては、テストステロンの活性又は濃度を低減させる、あるいは、そうでなければニューロン喪失をもたらすであろうテストステロンの代謝又は活性を不活性化させる又は他の方法で弱める又は阻害する化合物として定義される。この定義にしたがえば、このクラスの化合物は、４環シクロペンタノフェナントレン化合物又はエストロゲン化合物を含まない。テストステロン阻害剤分子は、テストステロンの作用を打ち消すテストステロンのアゴニスト及びアンタゴニストを含む。科学的理論によって制限されることを望まないが、本発明において用いられるテストステロン阻害剤は、例えば、アンドロゲンレセプターに結合すること、活性レセプター−ホルモン複合体の核内蓄積に干渉すること、テストステロン合成をダウンレギュレーションすること、又はテストステロンの代謝に作用することにより、作用することができる。本発明にしたがって用いられるテストステロン阻害剤分子は、前立腺ガンを治療することにおいて有効であることが見出されている化合物を含んでいてもよい。テストステロン阻害剤は、以下のものによって例示されるが、それらに限られない：（１）性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の視床下部放出を阻害するホルモン；（２）ＧｎＲＨアナログ（例えばゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）Ｚｏｌａｄｅｘ）、ロイプロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ）（Ｐｒｏｓｔａｐ）、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）（Ｓｕｐｒｅｆａｃｔ）、トリプロレリン（ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）（Ｄｅ−ｃａｐｅｐｔｙｌ）、（ｎａｆａｒｅｌｉｎ）；（３）ステロイド性抗アンドロゲン（例えば、サイトプロテロン（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｒｏｎｅ）アセテート、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）アセテート）；（４）純抗アンドロゲン（例えば、フルタミド（Ｄｒｏｇｅｎｉｌ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）（Ｃａｄｏｄｅｘ）；（５）アンドロゲン合成阻害剤（例えば、ケトコナゾール）；（６）５−α−レダクターゼ阻害剤、例えばフィナステロイド（ｆｉｎａｓｔｅｒｏｉｄ）又はＰｒｏｓｃｅｎ、そして前立腺ガンの治療のための阻害剤を含む；（７）サイトプロテロン、フルタミド、サイメチジン（ｃｙｍｅｔｉｄｉｎｅ）、ラニチジン及びスピロノラクトンを含む、アンドロゲンレセプターアンタゴニスト；（８）黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）のアゴニスト及びアンタゴニスト。
【００２３】
「エストロゲン化合物」は、本明細書中及び特許請求の範囲において、米国特許第５，５５４，６０１号にしたがって定義される。
【００２４】
「多環式フェノール化合物」は、本明細書中及び特許請求の範囲において、Ｓｉｍｐｋｉｎｓらの米国出願番号第０８／６８５，５７４号（参照によりここに援用される）に列挙された化合物によって定義される。
【００２５】
本発明の１つの好ましい態様は、雄性動物におけるテストステロンの量は卒中の後の虚血損傷の程度と相関するという観察に向けられている。記載されている実施例において明らかにされた脳血管虚血の結果におけるネガティブなリスク因子としてのテストステロンの相関は、新規である。
【００２６】
データは、血漿テストステロン濃度が、中脳動脈閉塞からの虚血脳損傷の増大と高度に相関することを示す。このデータは、ラットにおいて焦点虚血損傷を生じるために中脳動脈（ＭＣＡ）閉塞を用いたラットモデルを用いて得られている。このモデルは、ヒト脳におけるニューロン喪失の研究のために好ましい実験モデルである。精巣除去又はエストラジオールでの処理のいずれかを通じた実験的ＭＣＡラットモデルにおける血漿テストステロンの低減は、虚血損傷サイズの約５０％の低減と関連している。
【００２７】
雄ラットにおけるＭＣＡ閉塞によって作製した損傷は、前頭及び頭頂部皮質及び脳幹神経節において生じ、損傷の最大の広がりは、嗅球の後方７〜９ｍｍで見られた。低減された虚血損傷は、これらの領域に対して吻側及び尾側においてさらに検出され、そこでは、それぞれ前及び後大脳動脈もまた組織に供給している（Ｓ．Ａ．  Ｍｅｎｚｉｅｓら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、  ｖｏｌ．３１（１９９２）、ｐｐ．１００−１０６）。対照ラットにおいてＭＣＡ損傷の予測された領域から採取した脳試料は、ＭＣＡ閉塞の予測された影響を明らかにした。精巣除去された試料ラットにおいては、精巣除去は、虚血損傷のサイズの５９％の低減をもたらした。テストステロンでの置き換えは、置き換え療法の後の血漿テストステロンのレベルから予測された程度まで損傷サイズを回復させた。血漿テストステロンレベルと損傷サイズとの間の強い正の関係は、０．９２２というｒ２値で観察された。これらのデータは、他の内分泌因子にかかわらず、血漿テストステロンが雄ラットにおけるＭＣＡ閉塞後の虚血損傷のサイズの主要な決定要因であることを示唆する。雌ラットにおいては、ＭＣＡ閉塞後の虚血損傷を約５０％、卵巣切除は増大させ、エストロゲン処理は低減させる（Ｓｉｍｐｋｉｎｓ、出願番号第０８／７４９，７０３号、参照により援用される）。実施例においては、１７β−エストラジオールは、インタクトな雄ラットにおいて深い保護効果を呈し、それは、血漿テストステロン濃度の顕著な低減と関連していた。Ｓｉｌａｓｔｉｃ（登録商標）移植物からのテストステロンの存在下で、エストラジオールは、損傷サイズの低減に部分的にのみ有効であった。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
実施例
動物及び生殖腺切除術：
約２５０ｇの重さの雄のＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒラットを、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡコロニーから購入し、生殖腺切除術の前に１週間、ＡＡＡＬＡＣ認定飼育器中で維持した。すべての動物操作手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｉｔｔｅｅによって承認されたものであった。ＭＣＡ閉塞の７日前に、メトキシフルラン（Ｍｅｔｏｐｈａｎｅ（登録商標）  Ｐｉｔｍａｎ  Ｍｏｏｒｅ、  Ｃｒｏｓｓｉｎｇｓ，  ＮＪ）の吸入麻酔下で両側の生殖腺切除を行った。
【００３０】
ステロイド処理：
１７β−エストラジオールを長さ５ｍｍのＳｉｌａｓｔｉｃ（登録商標）管に入れ、テストステロンを長さ１０ｍｍのＳｉｌａｓｔｉｃ管に入れ、それらをＳｉｌａｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ（登録商標）（Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ）で一方の端で閉じた。シャム（空）のペレットを同様に調製した。すべてのペレットをメタノールで洗浄し、管の外側に付着しているステロイドを除去した。続いて、ペレットを生理食塩水中で洗浄した。これは、生理学的に適切な濃度を達成するためのエストラジオールの一次インビボ放出を確保する手順である（Ｍ．  Ｓｉｎｇｈら、  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ｖｏｌ．６４４（１９９４）、ｐｐ．３０５−３１２）。精巣除去の時に（ＭＣＡ閉塞の１週間前）ペレットを皮下（ｓｃ）移植した。
【００３１】
テストステロンアッセイ：
テストステロンのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のためのラットの血液を、殺す直前に心臓内穿刺によってヘパリンを入れたチューブ中に集めた。遠心によって血漿を分離し、ＲＩＡ時まで８０℃で保存した。Ｃｏａｔ−Ａ−Ｃｏｕｎｔ  ＲＩＡキットを、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，  ＣＡから購入した。トレーサーは、約３０〜４０％の最大結合の高い比活性を有していた。用いた抗血清は、テストステロンに対して非常に特異性が高く、他の化合物に対する交差反応性はほとんどなかった。Ｃｏａｔ−Ａ−Ｃｏｕｎｔ総テストステロンアッセイは、４〜１６００ｎｇ／ｄｌの広い報告可能範囲を有しており、同じ物の５０μｌをＲＩＡのために２組のチューブで用いた。未知の試料の濃度は、標準検量曲線（その相関係数は０．９９８９であった）から読み取った。
【００３２】
中脳動脈閉塞：
生殖腺切除及びステロイド移植の７日後に、動物をケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉｐ））及びザイラジン（ｚｙｌａｚｉｎｅ；１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔した。手術中、直腸温度を加熱ランプによって３６．５〜３７．０℃に維持した。顕微鏡を操作している間、左の頚動脈を頚部の中線切開を通じて露出させた。胸骨舌骨筋、二腹筋（後腹）及び肩甲舌骨筋を分割し、収縮させた。次に、舌骨の大角を、遠位外頚動脈（ＥＣＡ）を露出させるために除去した。総頚動脈（ＣＣＡ）を迷走神経から切り離し、ＥＣＡ及びその枝分れ（後頭動脈及び上甲状腺動脈）を遠位で切り離した。内頚動脈（ＩＣＡ）を、ＥＣＡのすぐ下で迷走神経及び舌咽神経から注意深く分離した。頭蓋骨の基底付近で、ＩＣＡは頭蓋外分岐である翼突口蓋動脈を有する。この分岐点を越えて、ＩＣＡは頭蓋中心軸に入る。動脈及びそれらの分岐を切り離した後に、遠位ＥＣＡ及びその分岐、ＣＣＡ及び翼突口蓋動脈を完全に焼灼した。ＥＣＡ及び後頭大動脈を切断し、次に頭蓋の基底近くの内頚動脈（ＩＣＡ）上に微小血管クリップを置いた。
【００３３】
長さ２．５ｃｍの３−０モノフィラメントのナイロン縫糸の先端を加熱し、血管の内腔の遮断及び容易な移動のための球を作った。この縫糸を、穿刺を通してＥＣＡの内腔に導入し、クリップを着けた位置に達するまで遠位ＩＣＡに静かに前進させた。次に微小血管クリップをはずし、縫糸を、抵抗が感じられるまで挿入した。ＣＣＡ分岐点と抵抗地点との距離は、１．８ｃｍであった。この抵抗は、縫糸が中脳動脈起点を通過し、前大脳動脈の基部セグメントに達したことを示した。手術手順は、最小限の血液喪失で１０分以内に完了した。閉塞時から４０分後、縫糸をＩＣＡから引き出し、遠位ＩＣＡを直ちに焼灼した。
【００３４】
死亡率及び虚血面積の定量：
予定された殺し時点（ＭＣＡ閉塞後２４時間）まで生存した動物を、断頭により殺した。殺す前に、心臓穿刺を用いて後の血漿テストステロン濃度の評価のための血液試料を得た。ＭＣＡ閉塞後２４時間で脳を取り出し、スライスするために金属の脳マトリックス（ＡＳＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗａｒｒｅｎ，  ＭＩ）中に置いた。２ｍｍ厚さの頭頂切片を嗅球の後ろ５、７、９、１１及び１３ｍｍで作製した。これらのスライスを、生理食塩水中の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の２％溶液中で、３７℃で３０分間インキュベートした。染色されたスライスを写真撮影し、続いて、損傷の虚血面積の評価のためにＩｍａｇｅ  １．４７ソフトウェアプログラムを備えたＭｃＩｎｔｏｓｈ  Ｑｕａｔｒａ  ８００コンピュータを用いて画像化した。スライスされた脳全体の領域の輪郭を描き、測定した。次に、虚血領域の輪郭を描き、測定した。虚血面積対総脳面積の比を算出して、各脳スライスについての虚血面積パーセントを得た。各脳スライスにおける虚血面積を各動物について平均し、その数字を記録した。これを、各群の各動物について行って、平均虚血面積を得た。これらの画像及び虚血の算出された面積を後日の取り出し及びデータ換算のために保存した。
【００３５】
データの統計学的評価：
６つの処理群間での損傷サイズの差異の有意性をＡＮＯＶＡによって決定し、ポストホック解析のためにＦｉｓｃｈｅｒ試験を用いた。ｐ＜０．５を有意と考えた。テストステロンと損傷サイズとの間の相関は、回帰解析によって解析した。殺す前のラットの死亡率の有意性をカイ２乗（χ２）解析によって解析した。
【００３６】
ＭＣＡ閉塞後の虚血損傷に対する精巣除去及びテストステロン置き換えの効果を図１に示す。インタクトなラットは、予測された虚血損傷の吻側から尾側への広がりを示し、ピーク虚血損傷は嗅球に対して尾側７ｍｍ及び９ｍｍで観察された。損傷サイズは、より吻側及び尾側の脳切片では小さかった。ＭＣＡ閉塞損傷は、ＭＣＡによって供給される、予測された脳領域、すなわち前及び頭頂皮質及び脳幹神経節を占めている（Ｓ．Ａ．  Ｍｅｎｚｉｅｓら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，  ｖｏｌ．３１（１９９２）、ｐｐ．１００−１０６）。成雄ラットの精巣除去により、評価した各切片における虚血損傷サイズが低減され（図１）、全体的な平均虚血面積がインタクトなラットの１７±３％から精巣除去ラットの８±２％に低減された（図２）。精巣除去ラットのテストステロンでの置き換えは、評価したすべての切片において損傷サイズを増大させ、全体的な平均虚血面積を１４±２％に増大させた（図２）。
【００３７】
エストロゲンは、雌ラットにおいて、ＭＣＡ閉塞により誘導された虚血脳損傷に対して神経保護的である（米国出願第０８／７４９，７０３号、参照により援用される）。ここで、本発明者らは、雄におけるエストロゲン処理の効果を評価した。１７β−エストラジオールでのインタクトな雄ラットの処理は、全体的な平均虚血面積を１７±３％から８±２％に低減させた（図２）。エストラジオールでの精巣除去雄ラットの処理は、ＭＣＡ閉塞により誘導された損傷の既に減少したサイズを変化させなかった（図２）。精巣除去ラットにおけるテストステロン及びエストラジオールの両方での同時処理は、１２±２％の虚血損傷をもたらし、これは、精巣除去＋Ｔ（１４±２％）及び精巣除去＋Ｔ（１４±２％）及び精巣除去＋Ｅ２（７±２％）のそれの中間であった（図２）。
【００３８】
精巣除去＋Ｅ２処理は、血漿テストステロン濃度をインタクトな雄ラットの１．５５６±０．４０９ｎｇ／ｍｌから精巣除去ラット及びインタクト＋Ｅ２処理動物のそれぞれ０．０６９±０．０２９ｎｇ／ｍｌ及び０．０５４±０．０１０ｎｇ／ｍｌに、顕著に低減させた（表１）。精巣除去ラット及び精巣除去＋Ｅ２ラットにおけるテストステロンでの置き換えは、血漿テストステロン濃度をそれぞれ０．６６８±０．０６７ｎｇ／ｍｌ及び０．５９０±０．０５５ｎｇ／ｍｌに増大させた（表１）。
【００３９】
本発明者らは、共分散の解析を行って、血漿テストステロンと全体的な平均虚血面積パーセントとの関係を評価した（図３）。虚血面積を血漿テストステロン濃度に基づいて解析した場合、０．９２２というｒ２が観察された。
【００４０】
死亡率（予定された２４時間後の殺し時点以前の死）は、インタクト群（４６％）及びインタクト＋Ｅ２群（３０％）で高かったが、ホルモンの置き換えにかかわらず、すべての精巣除去群で低かった（９〜１５％）（表１）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、雄ラットにおける虚血損傷サイズに対するアンドロゲン環境の効果を示す。インタクトな生殖腺の動物（「インタクト」）、精巣除去された動物（「精巣除去」）及び精巣除去されテストステロンで置き換えられた動物（「精巣除去＋Ｔ」）からの嗅球に対して尾部の増大する距離で採取された種々のスライスにおける脳の横断面積のパーセンテージ（平均パーセント虚血面積±ＳＥＭ）が描かれている。＊は、個々の脳切片についてインタクトなラットに対してｐ＜０．０５を示す。
【図２】
図２は、雄ラットにおける平均パーセント虚血面積（平均±ＳＥＭ）に対する内分泌操作の効果を示す。＊は、「インタクト」に対してｐ＜０．０５を示す。＊＊は、「精巣除去」群及び「精巣除去＋Ｅ２」群に対してｐ＜０．０５を示す。インタクトなラット、精巣除去されたラット、テストステロン処理された精巣除去ラット、エストラジオール処理されたインタクトなラット、エストロゲン処理された精巣除去ラット、及びエストラジオール及びテストステロン処理された精巣除去ラットからのデータを示す。
【図３】
図３は、雄ラットにおける血漿テストステロン濃度及び平均パーセント虚血面積の関係を示す。評価した６つの処理群についての血漿テストステロン濃度及びパーセント平均虚血面積の両方についての平均±ＳＥＭが描かれている。この関係についてのｒ２値は、０．９２２である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成11年6月23日(1999.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の細胞の集団に対して神経保護を付与する方法であって、以下の工程：
（ａ）医薬製剤中の有効量の非エストロゲンテストステロン阻害剤（この阻害剤は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）を用意する工程；及び
（ｂ）神経保護を付与するように、前記対象に前記阻害剤を投与する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記テストステロン阻害剤が、５−α−レダクターゼ阻害剤である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記５−α−レダクターゼ阻害剤が、フィナステライドである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、雄性の対象である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、経口、筋内、経皮、口内、静脈内及び皮下から選択される経路によって前記阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
対象中の細胞の集団に神経保護を付与する方法であって、以下の工程：
（ａ）医薬製剤中の有効量の５−α−レダクターゼ阻害剤を含む複数の非エストロゲンテストステロン阻害剤を含有する混合物（この混合物は、さらに４環シクロペンタノフェナントレン化合物を除く）を用意する工程；及び
（ｂ）神経保護を付与するように、前記対象に前記混合物を投与する工程
を含む方法。
【請求項７】
対象における神経変性性障害を治療する方法であって、以下の工程：
（ａ）医薬製剤中の有効量の５−α−レダクターゼ阻害剤を用意する工程；及び
（ｂ）前記障害の不利益な影響を遅延させるように、前記対象に前記製剤を投与する工程
を含む方法。
【国際調査報告】
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