(57)【要約】本発明は、細胞増殖性疾患の化学療法による治療に関する方法を提供する。具体的には、ある種の化学療法剤に対する臨床反応を予測する方法を提供する。神経系およびリンパ系の腫瘍を含む、ある種の腫瘍の治療に使用されるアルキル化剤は、腫瘍細胞のＤＮＡに及ぼす損傷が、細胞のＤＮＡ修復機構によって修復されない場合に有効な薬剤となる。本発明は、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の活性を決定することでアルキル化剤に対する臨床反応を予測する方法を提供する。
2004509643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から単離されたＤＮＡ修復酵素をコードする核酸のメチル化状態を判定する段階を含む、治療を必要とする被験者における化学療法剤を用いた治療法に対する臨床反応を予測する方法であって、
治療を必要としない被験者に由来する核酸のメチル化状態と比較して、核酸のメチル化状態が、酵素レベルの予測因子であることを示し；
核酸が、化学療法剤の活性を阻害する酵素をコードし；
このために、化学療法剤を用いた治療法に対する臨床反応を予測する方法。
【請求項２】
ＤＮＡ修復酵素がＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチル基転移酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸のメチル化状態が、核酸の調節領域内で判定される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
調節領域がプロモーター領域である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
治療を必要としない被験者に由来する核酸のメチル化状態と比較して、核酸のメチル化状態が過剰メチル化である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
被験者から単離された核酸が、腫瘍細胞に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
腫瘍が脳腫瘍である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
脳腫瘍が、神経膠腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、低悪性度の星細胞腫／膠芽腫、髄芽腫、乏突起細胞腫、または神経芽腫である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
腫瘍がリンパ腫である、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
リンパ腫がびまん性大細胞型リンパ腫である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
びまん性大細胞型リンパ腫がＢリンパ球を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍が肺腫瘍、結腸腫瘍、または頭頚部腫瘍である、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
メチル化核酸と非メチル化核酸を区別する少なくとも一本のセンスプライマー、および少なくとも一本のアンチセンスプライマーを含むプライマー対で核酸を増幅する段階を含む、メチル化状態を判定する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
プライマー対を含むプライマーが、配列番号：１および配列番号：２、または配列番号：３および配列番号：４に記載された配列を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
核酸にメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを接触させる段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、およびＮｏｔＩからなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
臨床反応が、腫瘍の退縮、無病生存、または生存である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
化学療法剤がアルキル化剤である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
アルキル化剤が、カルムスチン、ロムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、ダカルバジン、テモゾロミド、またはプロカルバジンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
被験者から単離された核酸のメチル化状態を判定することにより、治療法に対する臨床反応を予測する段階を含む、被験者の細胞増殖性疾患を、アルキル化化学療法剤で治療する方法であって；
核酸がアルキル化化学療法剤の活性を阻害するＤＮＡ修復酵素をコードし；
治療を必要としない被験者に由来する核酸のメチル化状態と比較した場合の核酸のメチル化状態が、酵素レベルの予測因子であることを示す方法。
【請求項２１】
ＤＮＡ修復酵素がＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチル基転移酵素である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
核酸のメチル化状態が核酸の調節領域内で評価される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
調節領域がプロモーター領域である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
核酸のメチル化状態が、治療を必要としない被験者の核酸のメチル化状態と比較して過剰メチル化である、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
被験者から単離された核酸が腫瘍細胞に由来する、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍が脳腫瘍である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
脳が神経膠腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、低悪性度の星細胞腫／膠芽腫、髄芽腫、乏突起細胞腫、または神経芽腫である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍がリンパ腫である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
リンパ腫がびまん性大細胞型リンパ腫である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
びまん性大細胞型リンパ腫がＢリンパ球を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍が肺腫瘍、結腸腫瘍、または頭頚部腫瘍である、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
メチル化核酸と非メチル化核酸を区別する、少なくとも一本のセンスプライマー、および少なくとも一本のアンチセンスプライマーを含むプライマー対により核酸を増幅する段階を含む、メチル化状態を判定する、請求項２０記載の方法。
【請求項３３】
プライマー対を含むプライマーが、配列番号：１および配列番号：２、または配列番号：３および配列番号：４に記載された配列を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
臨床反応が、腫瘍の退縮、無病生存、または生存である、請求項２０記載の方法。
【請求項３５】
アルキル化剤がカルムスチン、ロムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、ダカルバジン、テモゾロミド、またはプロカルバジンである、請求項２０記載の方法。
【請求項３６】
以下を含む、被験者の細胞増殖性疾患の化学療法による治療に対する反応を予測するためのキット：
（ａ）非メチル化シトシンヌクレオチドを修飾する試薬；
（ｂ）プライマー対が、メチル化核酸と非メチル化核酸を区別する、少なくとも一本のセンスプライマー、および少なくとも一本のアンチセンスプライマーを含み、またプライマー対を含むプライマーが、配列番号：１および配列番号：２、または配列番号：３および配列番号：４に記載された配列を有する、ＤＮＡ修復酵素の調節領域中のＣｐＧ含有核酸を増幅するための少なくとも１組のプライマー対。
【請求項３７】
ＤＮＡ修復酵素がＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチル基転移酵素である、請求項３６記載のキット。
【請求項３８】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４に記載されたヌクレオチド配列を有する、単離された核酸配列。
【請求項３９】
プライマー対を含むプライマーが、配列番号：１および配列番号：２、または配列番号：３、および配列番号：４に記載された配列を有し、メチル化核酸と非メチル化核酸を区別する、少なくとも一本のセンスプライマー、および少なくとも一本のアンチセンスプライマーを含むプライマー対により核酸を増幅する段階を含む、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチル基転移酵素（ＭＧＭＴ）をコードする核酸のメチル化状態を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、化学療法による治療の分野、具体的には、ある種の腫瘍の治療用のアルキル化剤を用いた化学療法による治療に対する臨床反応を予測する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
全身化学療法は、ある種の腫瘍および悪性疾患に利用可能な初期治療である。治療目的の化学療法の処方および対症化学療法の処方が、数種の腫瘍に対して開発されており、生存率の改善をもたらしてきた。化学療法は、治療目的であれ、対症的な目的であれ、複数の治療サイクルを通常必要とする。適切な用量で行われるあらゆる化学療法の処方は、正常な宿主組織に対してある程度の悪性副作用をもたらす。
【０００３】
化学療法の有効性、すなわち化学療法のもつ、致死的な宿主毒性を引き起すことなく腫瘍細胞を根絶する能力は、薬剤の選択に依存する。抗癌剤選択の基礎は完全には理解されていない。抗癌剤の一種アルキル化剤は、ＤＮＡに結合して、ＤＮＡのらせん構造を構造的に歪め、ＤＮＡの転写および翻訳を妨げることで細胞死を誘導する。正常細胞では、アルキル化剤の損傷作用は、細胞のＤＮＡ修復酵素、具体的にはＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチル基転移酵素（ＭＧＭＴ）によって修復されることがある。ＭＧＭＴのレベルは腫瘍細胞によって変わり、さらには同じ種類の腫瘍であっても変わる。ＭＧＭＴをコードする遺伝子には一般に変異も欠失も生じない。むしろ腫瘍細胞のＭＧＭＴのレベルが低い理由は後成的修飾による。すなわちＭＧＭＴ遺伝子がメチル化されることでＭＧＭＴの発現が妨げられる。
【０００４】
メチル化は、遺伝子の活性、細胞分化、腫瘍形成、Ｘ染色体不活性化、ゲノムインプリンティング、および他の主要な生物学的過程に役割を果たすことが一連の証拠から明らかにされている。真核細胞では、グアノシンの５’側に接して存在するシトシン残基のメチル化は、シトシン−グアニン（ＣＧ）が少ない領域に主に存在する。これとは対照的にＣｐＧ島は、正常細胞では非メチル化状態のままである。ただし５’側の調節領域のメチル化が転写抑制を誘導可能なＸ染色体不活性化中、および親に特異的なインプリンティング中は例外である。腫瘍抑制遺伝子の発現も、通常はメチル化されていないＣｐＧのデノボのＤＮＡメチル化により消失することがある。
【０００５】
ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の過剰メチル化は、ある種の癌治療法に対する臨床反応を予測するマーカーとなりうる。ある種の化学療法剤は、ＤＮＡを架橋して細胞死を誘導することで細胞増殖を抑制する。このような薬剤を用いた治療の取り組みは、ＤＮＡ修復酵素が架橋構造を除去することから、阻まれることがある。多くの化学療法薬に悪性副作用があること、またある種の薬剤がさまざまな治療法に有効でないことを考えれば、化学療法剤を用いた治療法に対する臨床反応を予測することが望ましい。本発明は、このような必要性を満足させる。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子のメチル化状態が、ある種の化学療法剤を用いた治療法に対する臨床反応の予測因子となるという知見に基づく。ＤＮＡ修復酵素Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチル基転移酵素（ＭＧＭＴ）が過剰にメチル化されると、ＭＧＭＴのレベルは低下する。ＤＮＡに損傷を及ぼす化学療法剤で処理された腫瘍細胞は、ＭＧＭＴが損傷修復に利用されないために生存することができない。
【０００７】
本発明の一つの態様では、治療を必要とする被験者における化学療法剤を用いた治療法に対する臨床反応を予測する方法が提供される。この方法は、被験者から単離されたＤＮＡ修復酵素をコードする核酸のメチル化状態を判定する段階を含む。ＤＮＡ修復酵素は化学療法剤の活性を妨げる。治療を必要とする被験者から単離された核酸のメチル化状態を、治療を必要としない被験者に由来する同じ酵素をコードする核酸のメチル化状態と比較する。メチル化状態に差がみられれば、ある治療薬を用いた治療法に対する臨床反応の予測因子となる。
【０００８】
本発明の別の態様では、被験者から単離されたＤＮＡ修復酵素をコードする核酸のメチル化状態を判定することによって治療法に対する臨床反応を予測する段階を含む、被験者の細胞増殖性疾患をアルキル化化学療法剤で治療する方法が提供される。ＤＮＡ修復酵素は、化学療法剤の活性を妨げる。治療を必要としない被験者に由来する核酸のメチル化状態と比較した場合の被験者の核酸のメチル化状態は、酵素のレベル、および治療に対する反応の予測因子となる。
【０００９】
本発明のさらに別の態様では、被験者における細胞増殖性疾患の化学療法による治療に対する反応を予測するためのキットが提供される。このキットは、メチル化されていないシトシンヌクレオチドを修飾する試薬、およびＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチル基転移酵素の調節領域にＣｐＧ含有核酸を増幅するためのセンスプライマー、および少なくとも一本のアンチセンスを含む少なくとも１組のプライマー対を含む。このようなプライマーは、修飾されたメチル化核酸と非メチル化核酸を区別することができる。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ある遺伝子の核酸、具体的には調節配列の核酸のメチル化状態が、化学療法剤を用いた治療法に対する臨床反応の予測因子になるという発見に基づく。より具体的には、ＣｐＧ島内に局在するあるヌクレオチドの過剰メチル化は、ＣｐＧ島に関与する遺伝子の発現に影響を及ぼすことが報告されている。すなわち通常は、このような過剰にメチル化された遺伝子は主に、転写が抑制されるために発現が低下するか、または消失する。ＤＮＡ修復酵素の調節領域の過剰メチル化は、化学療法剤を用いた治療法に対する臨床反応を予測することができる。最近開発されたメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）と呼ばれる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を元にした手法を用いることで、ＭＧＭＴの過剰にメチル化した腫瘍細胞を同定することが可能なので、治療薬を用いた治療法に対する腫瘍細胞の反応を予測することができる。この方法は、個々の全内容が参照として本明細書に組み入れられる、１９９８年７月２８日に公表された米国特許第５，７８６，１４６号；２０００年１月２５日に公表された米国特許第６，０１７，７０４号；２００１年３月１３日に公表された米国特許第６，２００，７５６号；および２００１年７月２４日に公表された米国特許第６，２６５，１７１号に記載されている。
【００１１】
ＤＮＡ修復酵素は、変異誘発、発癌性、および遺伝毒性薬剤耐性に重要な役割を果たしている。ＤＮＡ修復酵素は、ＤＮＡ上の損傷を認識して修正する。変異発生率は、ＤＮＡに生じる損傷現象の数と、修正された現象の数との間のバランスを反映している。ＤＮＡに対する損傷は、ＤＮＡの通常の二重らせん構造からの逸脱である任意の変化を含む。ＤＮＡ損傷には二つの主なクラスがある。一塩基変化はＤＮＡ鎖の配列に影響を及ぼすが、鎖の構造には影響しない。構造的な歪みは、複製または転写に対する物理的障害となる。例えば紫外光照射は異常なチミン二量体を生じる。またアルキル化剤は塩基にアルキル基を付け加える。
【００１２】
アルキル化剤は、ＤＮＡに結合することで細胞死を誘導する反応性の高い分子である（Ｔｅｉｃｈｅｒ ＢＡ． 「抗腫瘍アルキル化剤（Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）」、ＤｅＶｉｔａ ＶＴ Ｊｒ、 Ｈｅｌｌｍａｎ Ｓ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ編、「癌：腫瘍学の原理と実際（Ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ）」、第５版、第１巻、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、１９９７：４０５〜１８；およびＣｏｌｖｉｎ Ｍ、Ｈｉｌｔｏｎ Ｊ、「シクロホスファミドと代謝産物の薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ （１９８１） ６５：Ｓｕｐｐｌ ３：８９〜９５）。ＤＮＡ中で最も頻繁にアルキル化が生じる部位はグアニンのＯ６位である。この部位で生じるアルキル化は、隣接するＤＮＡ鎖の間に架橋を形成する。Ｒ１はニトロソ尿素、テトラジン、およびプロカルバジンが細胞を死滅する機構を説明する。アルキル化剤による二本鎖ＤＮＡの架橋は、細胞のもつＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチル基転移酵素（ＭＧＭＴ）によって阻害される。ＤＮＡ修復酵素Ｏ６−メチルグアニンＤＮＡメチル基転移酵素（ＭＧＭＴ）をコードする遺伝子は、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫の一部を含むヒトの複数の癌で不活性化されることがわかっている。Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）としても知られるＭＧＭＴタンパク質（Ｅ．Ｃ．２．１．１．６３）は、グアニンのＯ６位を標的とすることが多いアルキル化剤の毒性から細胞を守る（Ｌｕｄｌｕｍ ＤＢ． Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ． １９９０；２３３：１１７〜２６；Ｐｅｇｇ ＡＥら、Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９５；５１：１６７〜２２３）。ＭＧＭＴタンパク質は、アルキル付加物をタンパク質内のシステイン残基に移して、致死的な架橋の形成および他の変異原性作用を回避することによって、グアニンのＯ６位における付加物の形成を速やかに無効にする。したがって、酵素ＭＧＭＴの存在および活性は、アルキル化剤などの化学療法剤の活性を抑制する。この機構により、ＭＧＭＴはアルキル化剤に対する耐性を生じる。例示的なアルキル化剤には、カルムスチン、ロムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、ダカルバジン、テモゾロミド、またはプロカルバジンなどがある。
【００１３】
ＭＧＭＴのレベルは、腫瘍の種類によって大きく変わり、さらには同じ種類の腫瘍の間でも変わる。例えば、神経膠腫の約３０パーセントはＭＧＭＴをもたない（Ｓｉｌｂｅｒ ＪＲら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３） ５３：３４１６〜３４２０；Ｓｉｌｂｅｒ ＪＲら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９８） ５８：１０６８〜１０７３）。同酵素の欠損は、アルキル化剤に対する脳腫瘍の感受性を高める可能性がある。ＭＧＭＴ遺伝子には通常、変異がなく、欠失しないので、ＭＧＭＴの欠損は、細胞の遺伝情報を変えない変化によって引き起される可能性がある。
【００１４】
本発明の方法は、被験者から単離された一種または複数の核酸のメチル化状態を判定する段階を含む。本明細書に用いられる「核酸」または「核酸配列」という表現は、一本鎖もしくは二本鎖の場合があり、またセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合があるオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかの断片、ゲノム由来または合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡを意味するほか、天然もしくは合成起源の任意のＤＮＡ様もしくはＲＮＡ様の材料を意味する。当業者に理解されるように、核酸がＲＮＡの場合、デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴは、それぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵで置き換えられる。
【００１５】
核酸は、異なってメチル化されたＣｐＧ島の存在を検出するのに望ましい任意の核酸の場合がある。ＣｐＧ島とは、核酸配列のＣｐＧに富む領域である。このような核酸は例えば、酵素ＭＧＭＴをコードする核酸を含む。対象となる核酸は、酵素遺伝子の調節領域、ならびにタンパク質コード領域をコードする。
【００１６】
精製状態または未精製状態の任意の核酸試料は、標的座位を含む核酸配列（例えばＣｐＧを含む核酸）を含む場合、または含むことが疑われる場合に本発明で使用される。異なってメチル化されうる一つの核酸領域が、ジヌクレオチドＣｐＧの密度が他の核酸領域に対して高い核酸配列であるＣｐＧ島である。二重のＣｐＧは、脊椎動物のＤＮＡに、Ｇ・Ｃ塩基対の比率から予測される頻度の約２０％でしか存在しない。ある領域では、二重ＣｐＧの密度は予測値に近い。すなわち、ゲノムの他の領域に対して１０倍高い。ＣｐＧ島の平均Ｇ・Ｃ含量は約６０％である。これに対して、バルクＤＮＡでは平均４０％である。この島は、典型的には約１〜２ ｋｂの長さの連続したＤＮＡの形状をとる。ヒトゲノムには約４５，０００か所のこのような島がある。
【００１７】
多くの遺伝子では、ＣｐＧ島はプロモーターのすぐ上流から始まり、転写領域の下流方向に広がる。プロモーターにおけるＣｐＧ島のメチル化は通常、その遺伝子の発現を妨げる。この島は、遺伝子のコード領域の５’側の領域、ならびにコード領域の３’側の領域の周囲に存在する場合もある。したがってＣｐＧ島は、プロモーター領域を含む調節領域におけるコード配列の上流を含む核酸配列、コード領域（例えばエキソン）、またコード領域の下流、例えばエンハンサー領域、およびイントロンの複数の領域に見出される場合がある。
【００１８】
通常ＣｐＧ含有核酸はＤＮＡである。しかし本発明の方法は例えば、ＤＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡを含む）を含む試料を使用する場合があり（ＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖の場合もあれば２本鎖の場合もある）、ＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドが試料に含まれる場合がある。核酸の混合物が使用される場合もある。検出対象となる特定の核酸配列は、大きな分子の一部分である場合があるほか、この特定の配列が核酸全体になるように最初は別個の分子として存在することができる。調査対象の配列が最初から純粋な状態で存在する必要は必ずしもない。このような核酸は、ヒトのＤＮＡ全体に含まれるような、複合混合物のわずかな部分である場合がある。試料に含まれる核酸のメチル化状態の決定、またはメチル化ＣｐＧ島の検出に使用される核酸含有試料は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（参照として全体が本明細書に組み入れられる、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に記載された手法を始めとするさまざまな手法で抽出される場合がある。
【００１９】
ポリペプチドおよびタンパク質をコードする多くの核酸分子は、核酸の転写を誘導したり制御したりする情報をコードするＤＮＡの領域である調節領域を含む。調節領域は少なくとも一つのプロモーターを含む。「プロモーター」は、転写を誘導して、細胞種特異的、組織特異的に制御されうる、または外部のシグナルまたは薬剤によって誘導されうるプロモーター依存性の遺伝子発現を可能とするために十分な最小の配列である。プロモーターは、遺伝子の５’領域または３’領域に位置する場合がある。いくつかの核酸のプロモーター領域の全体または一部を、ＣＧ島のメチル化の部位に関して調査することができる。
【００２０】
被験者から単離される核酸は、被験者に由来する生物試料から得られる。核酸は、腫瘍組織、脳組織、脳脊髄液、血液、血漿、血清、リンパ液、リンパ節、脾臓、肝臓、骨髄、または他の任意の生物試料から単離することができる。腫瘍組織、血液、血漿、血清、リンパ液、脳組織、脳脊髄液、および骨髄は、当業者に周知のさまざまな医学的手順で得られる。
【００２１】
本明細書に記載されている細胞増殖性疾患は新生物の場合がある。このような新生物は良性または悪性である。「新生物」という用語は、細胞の新しくて異常な成長、または正常細胞より速やかに増殖する異常な細胞の成長を意味する。新生物は、明確な構造をもたない腫瘤（腫瘍）を形成し、これは良性または悪性の場合がある。「良性」という表現は非癌性の腫瘍を意味し、例えば、その細胞は周囲組織に浸潤したり遠隔部位に転移したりしない。「悪性」という表現は、転移性で、隣接組織に浸潤したり、もはや正常な細胞成長の制御下ではない腫瘍を意味する。
【００２２】
中枢神経系の組織または器官に関与する腫瘍は、本明細書では「脳腫瘍」と呼ばれる。脳腫瘍には例えば、神経膠腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、低悪性度の星細胞腫／膠芽腫、髄芽腫、乏突起細胞腫、または神経芽腫であることができる。
【００２３】
リンパ球が関与する腫瘍は、本明細書では「リンパ腫」と呼ばれる。リンパ腫は、リンパ節、脾臓、肝臓、および骨髄に主に関与するが、任意の器官または組織に浸潤したり拡散したりする場合がある。悪性リンパ腫は、Ｂリンパ球またはＴリンパ球の細胞分化の特定の段階で停止した１個のリンパ球の悪性形質転換のクローンに由来する。新生物のリンパ球は、正常リンパ球の機能および増殖の特徴を示すことがある。例えば、低悪性度のＢ細胞リンパ腫の細胞は濾胞性パターンを示すこともある。より成熟したＴヘルパー細胞のリンパ腫は、高γグロブリン血症を示すことがある。良好に分化したＢ細胞型およびＴ細胞型のリンパ腫は通常、正常なリンパ腫の移動性およびホーミング特性を残している。したがって低悪性度のＢ細胞リンパ腫は診断時に拡散しており、処置は当初、リンパ節および脾臓のＢ細胞依存性領域に制限されることが少なくない。中悪性度または高悪性度のリンパ腫の細胞は、正常な活性型リンパ球と似たところがある。びまん性大細胞型リンパ腫の３分の１は、診断時に臨床的に局在した疾患であり、これは正常なリンパ球の移動性の喪失を反映していると考えられる。びまん性大細胞型リンパ腫の一種で、中悪性度のリンパ腫である、びまん性大細胞型Ｂリンパ腫は、米国で最も一般的なリンパ腫である（Ｂｏｎｎｅｒ、Ｈら、血液とリンパ組織（Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｏｒｇａｎｓ）、「病理学（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、第３版、Ｅ ＲｕｂｉｎおよびＪ Ｌ． Ｆａｒｂｅｒら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、１９９９を参照）。
【００２４】
本発明の方法は、結腸直腸腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍（好ましくは非小細胞肺腫瘍）、および頭頚部腫瘍を対象とした、化学療法剤を用いた治療法に対する臨床反応の予測に有用である。
【００２５】
本明細書で用いられる「臨床反応」という表現は、化学療法剤を用いた治療法に対する腫瘍の反応を意味する。治療法に対する反応を決定する際の基準は広く受け入れられており、別の有効な治療法との比較が可能である（ＳｌａｐａｋおよびＫｕｆｅ、癌治療の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）、「ハリソンの内科の原理（Ｈａｒｒｉｓｏｎｓ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、第１３版、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ． １９９４を参照）。完全反応（すなわち完全寛解）とは、検出可能な悪性疾患がすべて消失することである。部分反応とは、生成物において一つまたは複数の病変の垂直方向の最大直径が約５０パーセントが低下することである。任意の病変の大きさの拡大、または新しい病変の出現はない。疾患の進行とは、生成物において一つの病変の垂直方向の最大直径の少なくとも約２５％の上昇、または新病変の出現を意味する。治療法に対する反応は、被験者が治療を完了した後に評価される。
【００２６】
神経膠腫の治療法に対する反応に関しては、完全反応は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）検査、または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）検査による腫瘍の存在を示すあらゆる証拠がないこと、例えばステロイド療法の必要がないこと、また被験者の全身状態が改善されることと定義される。ＣＴ検査で持続的に異常が認められるが、腫瘍の直径および体積の低下が５０％を上回り、ステロイド療法の必要性が低く、また神経障害が安定している被験者は、部分反応を示しているとみなされる。この疾患は、腫瘍の直径および体積の両方が最初の測定値と比較して２５％またはそれ以上上昇した場合に、新しい病変がＣＴ検査またはＭＲＩ検査で明らかに認められる場合に、または被験者の神経障害が悪化してステロイド用量の増加が必要な場合に、進行しているとみなされる。
【００２７】
リンパ腫であると診断された被験者に関して、完全寛解（ＣＲ）は、検出可能なあらゆる疾患が存在しないことと定義される。ＣＴ検査で持続的に異常が認められるが、初期腫瘍体積と比較して約７５％を上回る退縮が認められ、活性疾患の徴候または症状がない被験者は、放射線検査による異常がその後少なくとも３か月間安定している場合に、完全に寛解しているとみなされる。部分寛解（ＰＲ）は、腫瘍体積の約５０％またはそれを上回る低下と定義される。治療失敗は、ＰＲに満たないすべての状態、疾患の進行、または治療に関連する死亡と定義される。
【００２８】
本発明の一つの局面では、被験者から得られ、酵素をコードする核酸のメチル化状態は、化学療法による治療を必要としない被験者の核酸の同じ領域と比較して過剰にメチル化している。本明細書で用いられる「過剰メチル化」は、一つまたは複数の核酸中にメチル化された対立遺伝子が存在することを意味する。化学療法による治療を必要としない被験者に由来する、ＤＮＡ修復酵素をコードする核酸は、同じ核酸を調べた場合に検出可能なメチル化対立遺伝子を含まない。
【００２９】
核酸のメチル化状態を判定する方法は、個々の全体が参照として本明細書に組み入れられ、一部が本明細書に記載されている、米国特許第６，０１７，７０４号および米国特許第５，７８６，１４６号に記載されている。核酸のメチル化状態を判定する段階は、メチル化核酸と非メチル化核酸を区別するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅する段階を含む。
【００３０】
２種またはそれ以上のマーカーは１回の増幅反応で多重化して、治療薬を用いた治療に対する臨床反応を予測する低コストで信頼できる方法を作ることもできる。一種または複数の核酸について一つまたは複数のＣｐＧに富む領域に対するＤＮＡマーカーの組み合わせは１回の増幅反応で増幅することができる。このようなマーカーは例えば、複数の座位に対するプライマーを組み合わせることで、１回の増幅反応で多重化される。反応産物は例えば、変性ポリアクリルアミドゲルで分離され、次にフィルムを感光させるか、臭化エチジウムで染色することで画像化して解析される。一連のマーカーを解析することで、被験者における、より有用なメチル化プロファイルが得られる確率が大きくなる。
【００３１】
試料が純粋でない場合（例えば、試料が対象外の組織または細胞を含む場合）、試料の体液、組織、または動物細胞膜に含まれる細胞を溶解するために、またこれらに含まれる核酸を露出するために、有効な試薬で処理してから増幅を行う場合がある。試料から核酸を精製する方法、または部分的に精製する方法は当技術分野で周知である（例えば参照として本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）。
【００３２】
プライマーは、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリッドを形成する。ＭＧＭＴをコードするメチル化遺伝子および非メチル化遺伝子、および関連するＣｐＧ島を特に標的とする説明目的のオリゴヌクレオチドプライマーには、配列番号：１〜配列番号：４などがある。配列番号：１
2004509643.tif 000003
および配列番号：２
2004509643.tif 000004
はそれぞれ、非メチル化ＭＧＭＴを認識する順方向プライマーおよび逆方向プライマーであり、また配列番号：３
2004509643.tif 000005
および配列番号：４
2004509643.tif 000006
はそれぞれ、メチル化ＭＧＭＴを認識する順方向プライマーおよび逆方向プライマーである。
【００３３】
メチル化の差の検出は、非メチル化核酸の切断を可能とする条件および時間において、非メチル化ＣｐＧ部位のみを切断するメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを核酸試料に接触させることで達成することができる。この試料をさらに、メチル化核酸の切断を可能とする条件および時間において、メチル化ＣｐＧ部位および非メチル化ＣｐＧ部位の両方を切断するメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのイソ制限酵素に接触させる。核酸試料にオリゴヌクレオチドを、制限エンドヌクレアーゼで切断された核酸とオリゴヌクレオチドの連結を可能とする条件および時間に添加し、また切断された核酸を、同オリゴヌクレオチドに相補的なプライマーを用いるＰＣＲなどの従来の方法で増幅する。同定に続き、メチル化ＣｐＧを含む核酸を当業者に周知の方法でクローンニングすることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照）。
【００３４】
本明細書で用いられる「メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ」は、認識部位の一部にＣＧを含み、Ｃがメチル化されていない場合と比較してＣがメチル化された場合に変化する活性を有する制限エンドヌクレアーゼである。好ましくは、このようなメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、Ｃがメチル化されていると活性が阻害される（例えばＳｍａＩ）。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの特定の非制限的な例には、ＳｍａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、またはＨｐａＩＩ、ＭｓｐＩ、ＢＳＴＵＩ、およびＮｏｔＩなどがある。これらの酵素は、単独で使用されるほか、組み合わせて使用される。他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが当業者に周知であり、例えばＳａｃＩＩおよびＥａｇＩが含まれるがこれらに限定されない。メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの「イソ制限酵素」は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと同じ認識部位を認識するが、メチル化ＣＧと非メチル化ＣＧの両方を切断する制限エンドヌクレアーゼである。当業者であれば、制限エンドヌクレアーゼが核酸を切断する適切な条件を容易に決定することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照）。
【００３５】
対象となる核酸を、メチル化感受性エンドヌクレアーゼで切断する。メチル化感受性エンドヌクレアーゼで切断されると、対象核酸に十分なオーバーハングが生じる。イソ制限酵素による切断でも、切断産物には十分なオーバーハングが生じる場合がある。「オーバーハング」とは、鎖の末端において一方の鎖の数塩基がもう一方の鎖と塩基対を形成していない二本の鎖を有する核酸を意味する。「十分なオーバーハング」とは、対象オリゴヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションを可能とする十分な長さのオーバーハングを意味する。十分なオーバーハングは、長さが少なくとも２塩基、または４塩基もしくはそれ以上の塩基である。対象核酸上の特定配列のオーバーハングは、対象オリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する際に望ましい場合がある。この場合、イソ制限酵素を用いて、対象核酸に所望の配列を有するオーバーハングを作ることができる。
【００３６】
メチル化感受性エンドヌクレアーゼによる切断で、平滑末端、すなわち十分でないオーバーハングを有する対象核酸の反応産物が得られる。平滑末端とは、二本の鎖、すなわち核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の平らな末端を意味する。十分なオーバーハングが対象核酸上に作製されると、オリゴヌクレオチドは、メチル化特異的制限エンドヌクレアーゼによって切断された対象核酸に連結される。「連結」は、二つの核酸配列が、実質的に相補的な配列の塩基対合によって、および／または、二つの核酸配列間における共有結合の形成によって結合されることを意味する。
【００３７】
所望の配列およびオーバーハングを有するＤＮＡ末端を作る際には、アダプターを使用することができる。「アダプター」は、一方の末端または両端に十分な一本鎖オーバーハングを有する一端がある二本鎖核酸配列であり、アダプターは、メチル化感受性制限酵素もしくはメチル化感受性制限酵素のイソ制限酵素によって切断された対象核酸上の十分なオーバーハングと塩基対合により連結される。アダプターは市販品を入手することができるほか、２種のオリゴヌクレオチドを用いてアダプターとすることができる。したがって、２種のオリゴヌクレオチドを使用してアダプターを作ることができる。このようなオリゴヌクレオチドは、一本鎖のオーバーハングを形成する５’末端および／または３’末端における領域（群）を除いて配列全体が実質的に相補的である。一本鎖オーバーハングは、メチル化感受性制限酵素、またはメチル化感受性制限酵素のイソ制限酵素によって切断された核酸のオーバーハングに相補的であり、対象核酸のオーバーハングは、アダプターの３’側または５’側の一本鎖末端と適切な条件下で塩基対を形成する。このような条件は、配列の組成（ＧＣ対ＡＴ）、長さ、および核酸の種類によって変わる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９９８を参照）。
【００３８】
オリゴヌクレオチドの連結に続き、オリゴヌクレオチドに相補的なプライマーを用いて対象核酸を増幅する。具体的には、本明細書に用いられる、「プライマー」という表現は、２種またはそれ以上の、好ましくは３種を超える、またより好ましくは８種を超える、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む配列を意味する（この配列は、アダプターまたは連結したオリゴヌクレオチドなどの核酸に実質的に相補的な、プライマー伸長産物の合成を開始することが可能である）。合成につながる環境条件には、ヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合用試薬の存在、ならびに適切な温度およびｐＨなどがある。このようなプライマーは好ましくは、増幅に最大の効率を有する一本鎖であるが、二本鎖の場合もある。二本鎖の場合、プライマーの鎖を最初に分離する処理を行ってから、伸長産物の調製に使用する。このようなプライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドの場合がある。このようなプライマーは、重合を誘導する薬剤の存在下で伸長産物の合成を開始するために十分長くなくてはならない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液、およびヌクレオチド組成を含む多くの因子によって変わる。オリゴヌクレオチドプライマーは通常１２〜２０ヌクレオチド、またはそれ以上の長さのヌクレオチドであるが、これより少ないヌクレオチドの場合がある。
【００３９】
本発明のプライマーは、増幅されるオリゴヌクレオチドの各鎖に「実質的に」相補的になるように設計され、上述した適切なＧまたはＣヌクレオチドを含む。これはプライマーが、薬剤が重合を行える条件下で、その個々の鎖とハイブリッドを形成するためには十分相補的でなければならないことを意味する。言い替えると、プライマーは、５’側および３’側のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成するために、また核酸配列を含むＣｐＧの増幅を可能とするために十分な相補性をもつべきである。
【００４０】
本発明のプライマーは、関与する反応段階の数に対して指数関数的な量の標的座位を作る酵素反応を利用した連鎖反応である増幅過程（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲ）に使用される。通常は、一本のプライマーは、座位の負（−）鎖に相補的であり（アンチセンスプライマー）、別の一本は正（＋）鎖に相補的である（センスプライマー）。変性核酸とプライマーのアニーリングに続き、ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片（クレノウ）などの酵素およびヌクレオチドによる伸長により、新しく合成された、標的座位配列を含む＋鎖および−鎖が得られる。新しく合成された配列は鋳型でもあるので、変性、プライマーアニーリング、および伸長の反復サイクルによって、プライマーで決められた領域（すなわち標的座位の配列）が指数関数的に作られる。連鎖反応の産物は、使用された特定のプライマーの末端に対応する末端をもつ別個の核酸二本鎖である。
【００４１】
本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、従来のホスホトリエステル法およびホスホジエステル法、またはこれらが自動化された態様などの任意の適切な方法で作製することができる。このような自動化の態様の一つでは、ジエチルホスホラミダイトが出発材料として使用され、ボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９〜１８６２、１９８１）に記載された手順で合成される場合がある。修飾型固相支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する一つの方法は、参照として全体が本明細書に組み入れられる米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【００４２】
メチル化ＣｐＧを含む核酸を検出する別の方法は、核酸を含む試料を非メチル化シトシンを修飾する薬剤に接触させる段階、試料中にＣｐＧを含む核酸をＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより増幅する段階（オリゴヌクレオチドプライマーは修飾型メチル化核酸と非メチル化核酸を区別する）、およびメチル化核酸を検出する段階を含む。増幅段階は任意選択で行われ、望ましいが不可欠ではない。この方法は、修飾型（例えば化学的に修飾された）メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを区別するＰＣＲ反応そのものに依存する。
【００４３】
本明細書に用いられる「修飾する」という表現は、非メチル化シトシンとメチル化シトシンを区別する方法を容易にする、非メチル化シトシンの別のヌクレオチドへの変換を意味する。好ましくは、このような薬剤は非メチル化シトシンをウラシルに修飾する。好ましくは、非メチル化シトシンの修飾に使用される薬剤は亜硫酸水素ナトリウムであるが、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンを同様に修飾する他の薬剤もこの方法に使用することができる。亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、シトシンの５，６−二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとはほとんど反応しない。シトシンは亜硫酸水素イオンと反応して、脱アミノ化に感受性のあるスルホン化シトシン反応中間体を形成し、スルホン化ウラシルを生じる。スルホン基がアルカリ性条件下で除去されることでウラシルが得られる。ウラシルはＴａｑポリメラーゼによってチミンとして認識されるので、ＰＣＲの結果として得られる産物は、出発物質の鋳型ＤＮＡ中において５−メチルシトシンが生じる位置においてのみシトシンを含む。
【００４４】
試料内に含まれるＣｐＧを含む核酸の増幅用に本発明で使用されるプライマーは、亜硫酸水素塩による修飾後に、未処理ＤＮＡすなわち未修飾ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、および非メチル化ＤＮＡを特異的に区別する。非メチル化ＤＮＡ用のＭＳＰプライマーは好ましくは、３’側のＣＧ対にＴを有し、メチル化ＤＮＡに保持されるＣと区別し、その相補物はアンチセンスプライマー用に設計される。ＭＳＰプライマーは通常、配列中に比較的小数のＣまたはＧを含む。これはＣがセンスプライマー中に存在せず、Ｇがアンチセンスプライマー中に存在しないためである（Ｃは修飾されてＵ（ウラシル）となる。Ｕは増幅産物中でＴ（チミジン）として増幅される）。
【００４５】
本発明のプライマーは、十分な長さのオリゴヌクレオチドおよび適切な配列を含み、多型座位中のかなりの数の核酸において重合の特異的な開始をもたらす。対象となる核酸配列が二本鎖を含む場合、増幅過程の鋳型として使用する前に核酸の鎖を分ける必要がある。鎖の分離は、別個の段階として、またはプライマー伸長産物の合成と同時に実施することができる。このような鎖の分離は、物理的、化学的、または酵素学的な手段を含む、さまざまな適切な変性条件で達成することができる。「変性する」という表現は、このような手段のすべてを含む。核酸の鎖を分離する一つの物理的方法では、核酸を加熱して変性させる。典型的な加熱変性は、約８０〜１０５℃の温度で約１〜１０分かけて行う。鎖の分離は、ヘリカーゼとして知られる酵素群の酵素により、またはヘリカーゼ活性をもつ酵素ＲｅｃＡにより、またＤＮＡを変性させることが知られているリボＡＴＰの存在下で誘導することもできる。ヘリカーゼによる核酸鎖の分離に適した反応条件は、ホフマン−バーリング（Ｋｕｈｎ Ｈｏｆｆｉｎａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ）（ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３：６３、１９７８）に記載されており、またＲｅｃＡを使用する手法は、ラディング（Ｃ．Ｒａｄｄｉｎｇ）（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：４０５〜４３７、１９８２）に概説されている。
【００４６】
核酸の相補鎖を分離する際は、核酸が本来二本鎖であるか一本鎖であるかにかかわらず、分離された鎖は、さらなる核酸鎖の合成用の鋳型として使用できる状態にある。このような合成は、鋳型とプライマーのハイブリダイゼーションを可能とする条件下で進む。一般に合成は、緩衝水溶液中で通常約７〜９のｐＨで進む。好ましくは、モル過剰（ゲノム核酸の場合はプライマー：鋳型が通常約１０８：１）の二本のオリゴヌクレオチドプライマーを、分離された鋳型鎖を含む緩衝液に添加する。しかし相補鎖の量は、本発明のこの過程が診断的応用に使用される場合には知られていない場合があると考えられている。このため相補鎖量に対するプライマー量を正確に決定することはできない。しかし実際問題として、付加されるプライマー量は通常、増幅対象配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物に含まれる場合に、相補鎖（鋳型）量に対してモル濃度過剰な状態にあるので、同過程の効率を高めるためには大過剰のモル濃度が好ましい。
【００４７】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを合成混合物に個別に、またはプライマーとともに適量を添加し、結果として得られる溶液を約９０〜１００℃に約１〜１０分、好ましくは１〜４分かけて加熱する。加熱後に、同溶液をほぼ室温まで冷やす。こうすることでプライマーのハイブリダイゼーションが起こりやすくなる。冷えた混合物に対し、プライマー伸長反応を起こさせる適切な試薬（本明細書では「重合用試薬」と呼ぶ）を添加すると、この反応は当技術分野で周知の条件下で進む。このような重合用試薬は、熱に安定な他の試薬とともに添加することもできる。このような合成（または増幅）反応は、室温から、最大、重合用試薬が機能を失う温度までにおいて進む場合がある。したがって例えば、ＤＮＡポリメラーゼを試薬として使用する場合は、温度は一般に約４０℃を越えない。最も簡便には、同反応は室温で進む。
【００４８】
重合用試薬は、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能する、酵素を含む任意の化合物または系の場合がある。この目的に適切な酵素には例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼのムテイン、逆転写酵素、および熱安定性の他の酵素（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのような、変性させるために十分高い温度におかれた状況でプライマー伸長を進める酵素）などがある。適切な酵素は、各座位の核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を適切に生成するヌクレオチドの組み合わせを促す。一般に、このような合成は、各プライマーの３’端で開始され、鋳型鎖に沿って５’方向に進み、合成が終了するまでに、さまざまな長さの分子を作る。しかし、前述の同じ過程で合成を５’端から開始して逆方向に進む重合用試薬もある。
【００４９】
好ましくは、増幅する方法は、本明細書に記載されているような、また当業者に一般に使用されているＰＣＲである。しかし、別の増幅法が文献に記載されており、使用される場合もある。ＰＣＲの手法およびＰＣＲの多くの変形形態が知られている。基本的なＰＣＲの手法は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７〜４９１）、および参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号に記載されている。
【００５０】
ＰＣＲに通常求められる条件には、元の切断された断片（ｍａｓｔｅｒ−ｃｕｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の効率のよい複製に必要な温度、塩、陽イオン、ｐＨ、および関連する条件などがある。ＰＣＲの条件には、加熱変性の反復周期（すなわち少なくとも約９５℃までの加熱）、およびプライマー：アダプターのハイブリダイゼーションを可能とする温度おけるインキュベーション、および元の切断されたＤＮＡ断片の増幅酵素による複製などがある。各変性サイクル後に酵素を加える必要がないサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼのような熱に安定な増幅用酵素が市販されている。酵素が関与する増幅活性に必要な塩、陽イオン、ｐＨ、および関連因子は、増幅用酵素の製造業者から購入することができる。
【００５１】
本明細書に記載されているように、増幅用酵素は、インビトロにおける核酸増幅に、例えば上述の手順で使用可能な任意の酵素である。このような増幅用酵素には、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ））のＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ、トリ骨芽球症ウイルスの逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌のＤＮＡリガーゼ、またはＱβレプリカーゼなどがある。好ましい増幅用酵素は、ｐｗｏポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼである。ｐｗｏ酵素は、ＤＮＡを忠実に複製するので特に好ましい。
【００５２】
増幅後、核酸は、メンブレンなどの固相支持体に結合させることが可能であり、また任意の対象プローブとハイブリッドを形成させて任意の核酸配列を検出することができる。核酸配列と結合する複数のメンブレンが当業者に知られている。このようなメンブレンの特定の非制限性の例には、ニトロセルロース（ＮＩＴＲＯＰＵＲＥ）、またはポリ塩化ビニル、ジアゾペーパー、およびジーンスクリーン（ＧＥＮＥＳＣＲＥＥＮ）、ゼータプローブ（ＺＥＴＡＰＲＯＢＥ）（Ｂｉｏｒａｄ）、およびニトラン（ＮＹＴＲＡＮ）などの他の市販のメンブレンなどの、遺伝子発現の検出に使用される他のメンブレンなどがある。このようなメンブレンに核酸を結合させる方法は当業者によく知られている。あるいはスクリーニングは液相中で実施されることがある。
【００５３】
核酸ハイブリダイゼーション反応では、特定レベルのストリンジェンシーを達成するために用いられる条件は、ハイブリッドを形成する核酸の性質によって変動する。例えば、核酸のハイブリッドを形成する領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えばＧＣ含量対ＡＴ含量）、および核酸の種類（例えばＲＮＡかＤＮＡ）が、ハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮されることがある。他に考慮される事項は、核酸の一種が例えばフィルター上に固定化されているか否かということである。
【００５４】
ストリンジェンシーを段階的に高くする条件の例を以下に示す：ほぼ室温における２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温における０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃における０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（中程度のストリンジェンシー条件）；および約６８℃における０．１×ＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。洗浄は、これらの条件の一つ、例えば高ストリンジェンシー条件で実施することが可能であり、各条件は例えば各１０〜１５分かけて上記の順序で、記載された段階の一部またはすべてを繰り返し実施することができる。しかし上述したように、関与する特定のハイブリダイゼーション反応によって最適条件は変動するので、経験的に決定される場合がある。一般に、対象プローブのハイブリダイゼーションには高ストリンジェンシーの条件が使用される。
【００５５】
対象プローブは検出目的で、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素で標識することができる。当業者であれば、プローブに結合する他の適切な標識を理解しており、それらを常用の実験法で確認することができると思われる。
【００５６】
本発明の別の態様は、被験者から単離された核酸のメチル化状態を判定することで、治療法に対する臨床反応を予測する段階を含む、アルキル化化学療法剤で被験者の癌を治療する方法を提供する。このような核酸は、アルキル化化学療法剤の活性を阻害する酵素をコードする。このような酵素をコードする核酸のメチル化状態は、治療を必要としない被験者に由来する酵素をコードする核酸のメチル化状態と比較する。メチル化状態は、このような酵素レベルの予測因子となる。
【００５７】
本明細書で用いられる「〜を必要とする被験者」は、化学療法による治療を必要とする個人を意味する。このような被験者は、当業者に周知で、血液検査、ｘ線検査、および生検を含むさまざまな方法によって、化学療法剤を用いた治療法に感受性のある疾患を有すると診断される場合がある。このような疾患には、癌を含む細胞増殖性疾患などがある。
【００５８】
本発明の方法は、キットを製造するのに極めて適している。したがって本発明の別の態様では、被験者の細胞増殖性疾患の化学療法による治療に対する反応を予測するためのキットが提供される。本発明のキットは、非メチル化シトシンを修飾する試薬を含む第一の容器、およびＣｐＧを含む核酸増幅用のプライマー（このプライマーは、修飾されたメチル化核酸と非メチル化核酸を区別する）を含む第二の容器を含む。本発明で使用されるプライマーには、配列番号：１〜配列番号：４に記載された配列を有するプライマーなどがある。このキットは、対照核酸増幅用のプライマーをさらに含む。このキットはまた、核酸増幅用の緩衝液を含む場合がある。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾する試薬は亜硫酸水素塩である。
【００５９】
本発明のキットは、ＤＮＡ試料の化学的修飾およびＰＣＲ増幅を実施して、そのメチル化状態を判定するために必要な試薬を提供することが意図される。キットに含まれるプライマーセットには、化学的に修飾された非メチル化ＤＮＡにアニーリングするセット；化学的に修飾されたメチル化ＤＮＡにアニーリングするセット；および化学的修飾の効率の対照となるプライマーセットが含まれる。対照のプライマーセットは、化学的なメチル化を受けていない任意のＤＮＡ（非メチル化ＤＮＡおよびメチル化ＤＮＡ）にアニーリングすべきである。不完全な化学的修飾（最大約５０％）の場合、データの解釈が続行される場合がある。
【００６０】
運搬手段は、バイアルやチューブなどの一つまたは複数の容器を含むことが適しており、個々の容器は、方法で使用される個別の要素の一つを含む。本発明の方法に関して本明細書で提供される記述に関して、当業者は、容器に必要な試薬の配分を容易に決定することができる。例えば、容器の一つは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで切断される核酸を連結するためのオリゴヌクレオチドを含む容器を含むことができる。オリゴヌクレオチドに相補的なプライマーを含む一種または複数の容器も含まれうる。また、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを含む一つまたは複数の容器も含まれうる。メチル化感受性制限酵素のイソ制限酵素を含む一つまたは複数の容器も含まれうる。
【００６１】
上記の開示は一般に、本発明の内容を説明している。全体的な理解は、本明細書において説明する目的でのみ提供されるものであって、本発明の範囲を制限することを意図しない、特定の実施例を参照することで得られる。
【００６２】
実施例１
メチル化の解析
ＤＮＡは、当業者に周知の標準的なプロトコルで抽出した（例えば、参照として本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９９８を参照）。ＭＧＭＴのＣｐＧ島におけるメチル化パターンは、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンのウラシルへの化学的修飾により決定した。メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、文献に記載された、メチル化ＤＮＡ、または修飾された非メチル化ＤＮＡのどちらかに特異的なプライマーを用いて行った（参照として全体が本明細書に組み入れられるＥｓｔｅｌｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９；５９：７９３〜７９７；および参照として全体が本明細書に全体が組み入れられるＨｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：９８２１〜９８２６）。ＤＮＡ（１ μｇ）を水酸化ナトリウムで変性させ、亜硫酸水素ナトリウムで修飾した。次にＤＮＡ試料をウィザードＤＮＡ精製樹脂（Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を用いて精製し、水酸化ナトリウムで再び処理し、エタノールで沈殿させて水に再懸濁した。非メチル化反応用のプライマー配列は、
2004509643.tif 000007
（順方向プライマー；配列番号：１）および
2004509643.tif 000008
（逆方向プライマー；配列番号：２）とし、メチル化反応用のプライマーは、
2004509643.tif 000009
（順方向プライマー；配列番号：３および
2004509643.tif 000010
（逆方向プライマー；配列番号：４）とした。アニーリング温度は５９℃とした。ＳｓｓＩメチル基転移酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）でインビトロで処理した胎盤ＤＮＡを、ＭＧＭＴのメチル化対立遺伝子の正の対照として使用し、正常リンパ球に由来するＤＮＡを負の対照として使用した。ＤＮＡを含まない対照を、各セットのメチル化特異的ＰＣＲアッセイ法に使用した。各５０ μｌのメチル化特異的ＰＣＲ産物のうち１０ μｌを、非変性６％ポリアクリルアミドゲルに直接ロードし、臭化エチジウムで染色し、紫外光を照射して検討した。
【００６３】
実施例２
統計解析
連続変数は、スチューデントｔ検定で比較した。分割表は、フィッシャーの直説法で解析した。無病生存率および総生存率の曲線は、カプラン−マイヤー法で推定し、ログランク検定で比較した。多変量生存率解析はコックス（Ｃｏｘ）比例危険モデルで行い、比例危険推定は、シェーンフェルド（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ）残差および図示法で調べた。記述的解析または層別分析を、モデルの基礎となる推定が適合することを確認するために常にパラメトリックモデリングに先行させた。結果は、信頼区間９５％で両側Ｐ値で表す。解析はＪＭＰソフトウェア（バージョン３．１、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、Ｎ．Ｃ．）およびステイタ（Ｓｔａｔａ）ソフトウェア（バージョン６．０、Ｓｔａｔａ、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ．）を用いて行った。
【００６４】
実施例３
脳腫瘍の被験者および試料
１９９３年４月〜１９９８年１１月にナバラ大学病院（Ｐａｍｐｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）に紹介された被験者４７人の脳腫瘍試料を調べた。すべての被験者から書面による同意を得た。全員が組織学的に腫瘍を有することが確認された。１８人には未分化星状細胞腫が認められ、２９人には多形性膠芽腫が認められた。被験者は３８〜７０歳（診断時の年齢中央値は５５歳）で、男性が３０人と女性１７人であった。腫瘍試料は切除するか生検で採取した後に、照射および化学療法による処置を開始し、直ちに−８０℃で凍結保存した。すべての被験者に、シスプラチンの動脈内投与（体表面積１ｍ２あたり５０ ｍｇ）、脳全体を対象とした放射線療法、および中央値３コースのカルムスチン（１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素、またはＢＣＮＵ；１００ ｍｇ／ｍ２）の４週間隔の静脈内投与を行った。１５人の被験者には、自家骨髄移植＋高用量化学療法による治療（３回用量のカルムスチンの静脈内投与；３００ ｍｇ／ｍ２）／１日、および１回用量のシスプラチンの動脈内投与（１００ ｍｇ）も行った。
【００６５】
治療に対する反応は、被験者が治療を完了した後に評価した。完全反応は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）検査および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）による検査における腫瘍のあらゆる証拠が存在しないこと、ステロイド療法の必要性がないこと、および被験者の全身状態が改善していることと定義した。ＣＴ検査における異常が持続するが、腫瘍の直径および体積の両方において５０％を超えるの低下がみられること、ステロイド療法の必要性が低下していること、また神経障害が安定していることは、部分反応を示しているとみなした。腫瘍の直径と体積の両方が初期測定値の２５％またはそれ以上上昇した場合、新しい病変がＣＴ検査またはＭＲＩ検査で明らかに認められる場合、または被験者の神経障害が悪化してステロイド用量の増加が必要な場合は、疾患が進行しているとみなした。
【００６６】
実施例４
神経膠腫の臨床反応の予測
ＩＩＩ度またはＩＶ度の神経膠腫と新規に診断された４７人（未分化星状細胞腫に分類された１８人と多形性膠芽腫に分類された２９人）の解析を行った。被験者の特徴は表１に示す。ＭＧＭＴプロモーターのメチル化は、過去の研究（Ｅｓｔｅｌｌａｒ、１９９９、前記）で認められたものに高頻度で似ており、また他の報告（Ｓｉｌｂｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９３；５３：３４１６〜３４２０；およびＳｉｌｂｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８；５８：１０６８〜１０７３）の結果と矛盾がない４７例の腫瘍のうち１９例（４０％）で認められた。メチル化は、被験者の年齢、活動度（ＰＳ）のカルノフスキー（Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ）スコア、または腫瘍の悪性度と関連していなかった（各比較についてＰ＞０．３）。
【００６７】
【表１】
2004509643.tif 000011
【００６８】
単変量解析では、プロモーターのメチル化は、臨床反応、ならびに総生存率および無病生存率と正に相関していた。カルムスチンに対して部分反応または完全反応を示したのは、メチル化腫瘍をもつ被験者１９人中１２人（６３パーセント）に対して、非メチル化腫瘍をもつ被験者２８人中１人（４パーセント）であった（Ｐ＜０．００１；表２）。メチル化が存在しないことは、かなり高い死亡リスクと関連していた（危険比、９．５；９５％信頼区間、３．０〜４２．７；Ｐ＜０．００１）（図３Ａ）。単変量解析では、他の因子は生存率と統計学的に有意に関連していなかった。疾患の進行までの時間の中央値は、メチル化神経膠腫で２１か月であり、非メチル化神経膠腫で８か月であり（Ｐ＜０．００１）、非メチル化と関連した危険比は１０．８であった（９５％信頼区間、４．４〜３０．８）（図３Ｂ）。メチル化されたプロモーターを含む神経膠腫を有する被験者の死亡例は少数（４人）であったので、多変量解析は信頼できなかった。非メチル化神経膠腫に関連する危険比は変化がないか、または他の予測因子をモデルに個別に加えると上昇した。
【００６９】
【表２】
2004509643.tif 000012
【００７０】
クロロエチルニトロソ尿素が投与された被験者の神経膠腫におけるＭＧＭＴの喪失は、総生存率に中程度の影響しかなく、疾患進行までの時間は、わずかに影響を受けるか、全く受けないことが報告されている（Ｂｅｌａｎｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９６；５６：７８３〜７８８；Ｊａｅｃｋｌｅら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９９８；１６：３３１０〜３３１５；およびＳｉｌｂｅｒら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９；５：８０７〜８１４）。ＭＧＭＴ遺伝子状態を評価する別の方法を用いたところ、本明細書に記載されている試験では、同酵素の有無の影響がかなり強いことが認められた。腫瘍内における正常細胞（浸潤性リンパ球を含む）の蓄積は、ＭＧＭＴの正確な評価を複雑にしているかもしれない。正常細胞の混合物は、腫瘍ホモジネートで測定される生化学的活性と、腫瘍細胞に含まれるＭＧＭＴを対象とした直接的な免疫組織化学的検査の結果との差を部分的に説明する可能性がある。メチル化特異的ＰＣＲの使用により、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化の評価が可能となる。メチル化状態は、神経膠腫細胞における遺伝子の転写活性、ひいてはＤＮＡ修復酵素の有無の予測因子となる。
【００７１】
本明細書に記載されている試験では、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化は、カルムスチンに対する応答性、および総生存率の上昇および疾患進行時間の延長に関連していた。また、同プロモーターのメチル化状態は、腫瘍の悪性度、カルノフスキー活動度（ＰＳ）、または被験者の年齢と比較して、カルムスチン治療の結果の優れた予測因子であった。ＭＧＭＴプロモーターのメチル化により、カルムスチンに対する応答性を予測することができるので、このアルキル化剤の使用は、プロモーターがメチル化されている神経膠腫に罹患した被験者を対象とすると考えられる。また、ＭＧＭＴ酵素を阻害する薬剤の使用により、耐性腫瘍（メチル化がない）の感受性が上昇することがありうるかもしれない。このような阻害剤の一種Ｏ６−ベンジルグアニンは、この目的で検討が進んでいる。これは、ＭＧＭＴ酵素を不活性化するＭＧＭＴの基質である。Ｏ６−ベンジルグアニンは、アルキルニトロソ尿素に対する反応をインビトロおよびインビボで促進することがわかっている（ＤｏｌａｎおよびＰｅｇｇ、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７；３：８３７〜８４７、ならびにＤｏｌａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９０；８７：５３６８〜５３７２）。耐性腫瘍のみにおける、カルムスチンに対する神経膠腫の感受性を上昇させるこのような薬剤の使用は、カルムスチンに既に感受性をもつ被験者の正常組織に及ぼす、これらの薬剤の組み合わせによる毒性作用を防ぐ可能性がある。
【００７２】
実施例５
リンパ腫被験者集団と試料の入手
１９８６〜１９９７年にイタリアの３か所の施設において継続的に診断されていて治療が行われており、またそのＤＮＡが入手できる、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｂ−ＤＬＣＬ）が未治療の被験者８４人を本研究の対象とした。臨床追跡調査は、１９９９年８月３１日まで、または被験者が死亡するまで行った。打ち切り例の被験者の治療開始からの追跡期間の中央値は６１か月であった。診断は、組織変化、細胞表面マーカーの免疫表現型解析、および免疫グロブリン遺伝子再編成の免疫遺伝子型解析を元に行われた。Ｂ−ＤＬＣＬの組織病理学的な定義は、リアル（ＲＥＡＬ）分類（Ｈａｒｒｉｓ ＮＬら、Ｂｌｏｏｄ． １９９４；８４：１３６１〜９２）に拠った。ヒト免疫不全ウイルスが陽性を示した被験者は検討対象から除外した。病期分類には、全被験者を対象とした常用の血液化学検査；血液数、および白血球百分率；ＥＫＧ；胸部ｘ線；胸部、腹部、および骨盤のＣＴ検査；ならびに両側性骨髄生検を含めた。疾患状態は、アナーバー基準（Ｃａｒｂｏｎｅ ＰＰら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９７１；３１：１８６０〜１）で評価した。国際予後指標（ＩＰＩ）は、文献に記載された手順で計算し（国際非ホジキンリンパ腫予後因子プロジェクト（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）。「攻撃性非ホジキンリンパ腫の予測モデル（Ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｉｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）」、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． １９９３；３２９：９８７〜９４）、被験者は、低リスク群、低−中等度リスク群、高−中等度リスク群、および高リスク群に分類した。
【００７３】
治療法は、病期、診断日、施設、および予後因子で異なった。しかし全被験者は、シクロホスファミドおよびアントラサイクリンを含むレジメンで治療が行われていた。有害な予後因子がみられない限局病変の病期に分類された９人の被験者を対象に、短期化学療法、ＡＣＯＰＢ（アドリアマイシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン）、または３コースのＣＨＯＰ（シクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）で治療を行った後に、局所限局的な放射線療法を３６ Ｇｙの線量で実施した。限局病変のステージにあって有害な予後因子、または進行期のステージにある被験者４２人は、ＣＨＯＰ（２９人）、またはＭＡＣＯＰＢ（メトトレキセート、アドリアマイシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン）（６人）、またはＶＡＣＯＰＢ（エトポシド、アドリアマイシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン）（７人）などの第３世代の化学療法スキームによる治療を受けた。６５歳を超える高齢被験者１５人は、ＰＶＥＢＥＣ（プレドニゾン、ビンブラスチン、エピルビシン、ブレオマイシン、エトポシド、シクロホスファミド）による治療を受けた。進行期にあり、有害な予後因子を示す被験者１８人は、短いコースの標準化学療法（ＭＡＣＯＰＢまたはＣＨＯＰ）による治療を受けた後に、末梢血幹細胞採取、および自家幹細胞移植を伴う高用量化学療法ＢＥＡＭ（カルムスチン、エトポシド、ＡＲＡ−Ｃ、メルファラン）による強化化学療法を受けた。
【００７４】
治療に対する反応は、治療プログラムの完了後に評価した。再病期決定目的の検査には、全被験者を対象に血液化学検査、および胸部、腹部、および骨盤のＣＴ検査が含まれ、ならびに異常な診断が下された場合は骨髄生検が繰り返し実施された。完全寛解（ＣＲ）は、あらゆる検出可能な疾患の非存在と定義された。ＣＴ検査における異常が持続しているが、退縮が初期腫瘍体積の７５％を上回り、活性型疾患の徴候または症状のない被験者は、放射線検査による異常がその後少なくとも３か月間安定している場合に完全寛解とみなされた。部分寛解（ＰＲ）は、腫瘍体積の５０％またはそれ以上の低下と定義された。治療失敗は、ＰＲに満たないすべての状態、疾患の進行、または治療に関連する死亡と定義した。
【００７５】
実施例６
免疫組織化学によるリンパ腫におけるＭＧＭＴ発現の解析
ＭＧＭＴのメチル化状態とＭＧＭＴタンパク質の発現間の相関は、２６個のリンパ腫の代表的なパネルを対象に評価を行った。ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した組織切片をキシレンで３０秒かけて脱パラフィン処理し、段階的エタノールで水分を除き、２５０Ｗの電子レンジ内で３０分かけてＴＥＣ（トリス−ＥＤＴＡ−クエン酸）溶液（ｐＨ ７．８）中で処理した。免疫組織化学はＡＢＣ法で行った（ＡＢＣ−Ｅｌｉｔｅ ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。色素源としてジアミノベンジジンを用いた免疫ペルオキシダーゼ染色法は、自動免疫染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を用いて業者のプロトコルにしたがって実施した。市販のマウス抗ＭＧＭＴモノクローナル抗体（クローンＭＴ３．１；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｌ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を１：１００で使用した（Ｂｒｅｎｔ ＴＰら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９０；５０：５８〜６１）。この抗体は、免疫組織化学に有用であること、およびＭＧＭＴ活性と相関することが過去に明らかにされている（Ｒｅｅｓｅ ＪＳら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９６；９３：１４０８８〜９３）。核染色は、試料の分子解析に関する知識をもたない著者の２人（Ａ．Ｇ．およびＡ．Ｃ．）により決定された。
【００７６】
実施例７
ＭＧＭＴプロモーターの過剰メチル化を、Ｂ−ＤＬＣＬの被験者８４人を対象に調べた（対象集団の臨床的記述については表３を参照）。ＭＧＭＴの過剰メチル化は、Ｂ−ＤＬＣＬの８４人中３０人（３６％）に認められた。脳腫瘍被験者の調査と同様に、ＭＧＭＴの過剰メチル化は、ＭＧＭＴタンパク質の発現がないことと相関していた。これは、ＭＧＭＴの過剰メチル化が認められるすべて（ｎ＝１７）のリンパ腫試料で、免疫組織化学検査で検討した際にタンパク質の発現が認められなかったためである。逆に、非メチル化ＭＧＭＴ対立遺伝子を有するすべて（ｎ＝９）のリンパ腫試料は、免疫組織化学検査で検討したところ、ＭＧＭＴタンパク質を発現していた。
【００７７】
ＭＧＭＴのメチル化の存在は、臨床的段階、活動度（ＰＳ）、またはＬＤＨレベルにおける任意の差と関連していなかった（表３参照、全ｐ値＞０．１５）。ＭＧＭＴがメチル化されている被験者では、ＣＲが７７％、ＰＲが１３％、ＮＲが１０％（Ｎ＝３０）であったのに対し、メチル化されていない被験者ではＰＣＲが６３％、ＰＲが１５％、ＮＲが２２％（Ｎ＝５４）であった。ＭＧＭＴのメチル化を含む腫瘍をもつ被験者で反応が改善する傾向は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．３）が、ＭＧＭＴがメチル化されているリンパ腫の感受性の上昇と一致していた。
【００７８】
【表３】
2004509643.tif 000013
【００７９】
しかし、高悪性度の神経膠腫を示す被験者で観察されたように、これらのリンパ腫被験者におけるＭＧＭＴのメチル化状態は、総生存率および無進行生存率と強く相関していた。総生存率は、ＭＧＭＴがメチル化されているリンパ腫被験者で有意に高く、死亡までの期間の結果に対する非メチル化の危険比は２．８であった（９５％ ＣＩ、１．２〜７．５、ｐ＝０．０１）（図２Ａ）。同様に、メチル化されていない被験者とメチル化されている被験者間における疾患進行の危険比は２．６であった（９５％ ＣＩ、１．３〜５．８、ｐ＝０．００５、図２Ｂ）。
【００８０】
国際リンパ腫研究グループによる分類を形成する非ホジキンリンパ腫の従来の予後マーカー、すなわち活動度（ＰＳ）、ＬＤＨ、および病期は、生存率に対して弱いか、もしくは中程度の単変量の関連性があった。これとは対照的に多変量の生存率モデルでは、ＭＧＭＴのメチル化状態が一貫して最も重要な予測因子であり、病期のみが統計的に有意であった。病期を二分する（病期１および病期２対、病期３および病期４）モデルでは、進行した病期に対する、死亡までの時間の危険比の結果は２．４（ＣＩ、１．１〜６．６、ｐ＝０．０３）であり、また非メチル化については、単変量の結果と本質的に同一であった（ＨＲ＝２．７、ＣＩ １．２〜７．２、ｐ＝０．０２）。同様の結果は、病期に対する進行するまでの時間について（ＨＲ＝２．５、ＣＩ １．２〜５．８、ｐ＝０．０１）、また非メチル化状態（ＨＲ＝２．５、ＣＩ １．２〜５．５、ｐ＝０．０１）について得られている。
【００８１】
国際予後指標（ＩＰＩ）では、これらの個々の因子（年齢、病期、骨髄病変、ＬＤＨ、および活動度（ＰＳ））が有用な予後因子に統合されている。ＭＧＭＴのメチル化が生存率の予測因子の地位にあるか否かを判定するために、ＭＧＭＴをＩＰＩとの関連性について調べた。過去に明らかにされているように（国際非ホジキンリンパ腫予後因子プロジェクト（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）。「攻撃性非ホジキンリンパ腫の予測モデル（Ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｉｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、１９９９；３２９：９８７〜９４）、ＩＰＩは、死亡までの時間の予測因子であり、ＩＰＩを連続変数としてコード化した場合に危険比は１．６となった（ＣＩ １．１〜２．３、ｐ＝０．００９）。ＭＧＭＴは現時点でも、このような多変量解析における総生存率の予測因子であった（ＨＲ＝２．３、ＣＩ １．０〜６．２、ｐ＝０．０５）。進行するまでの時間に関しては、連続変数としてのＩＰＩも予後的に重要であった（ＨＲ＝１．４、ＣＩ １．０〜２．０、ｐ＝０．０２）が、この多変量解析において、ＭＧＭＴのメチル化が、進行までの時間に依存しない予測因子であることに変わりはなかった（ＨＲ ２．２、ＣＩ １．０６〜４．９、ｐ＝０．０３）。
【００８２】
複数の仮説で、Ｂ−ＤＬＣＬの生存率の予測にＭＧＭＴが果たす予後的な役割を説明できる可能性がある。第一の仮説は、ＭＧＭＴの過剰メチル化が、より好ましい結果を示すリンパ腫の特異的な病原性サブセットを同定する自然歴の予後マーカーである可能性があるというものである。この説明を完全に無視することはできないが、他に報告された予後マーカーに依存しない可能性がある。経験的に、ＭＧＭＴのメチル化が正の予後因子ではなく、おそらく負の因子になるとは予測しにくい。というのは、ＭＧＭＴの過剰メチル化が、いずれも負の予後マーカーであることの多いｋ−ＲＡＳおよびｐ５３の変異の形成と関連づけられているからである（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１；６１：４６８９〜９２）。ＭＧＭＴの過剰メチル化が予後に果たす役割は、全般的なメチル化表現型を示すＢ−ＤＬＣＬの臨床上の利益に帰することはできない。というのは、Ｂ−ＤＬＣＬでメチル化されていることの多い他の遺伝子、すなわち細胞死関連タンパク質キナーゼ遺伝子のプロモーターの過剰メチル化（Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ ＲＡら、Ｂｌｏｏｄ １９９９；９３：４３４７〜４３５３）は、結果と相関していないからである（発明者らの未発表の観察）。
【００８３】
ＭＧＭＴの過剰メチル化の予後的重要性を説明する別の仮説が、ＭＧＭＴの不活性化がＢ−ＤＬＣＬ細胞を、アルキル化剤による遺伝毒性作用を受けやすい状態にするというものである。これは、神経膠腫に関して最近提案されている（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ Ｍら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０００；３４３：１３５０〜４）。実際には、ＤＮＡ修復タンパク質ＭＧＭＴは、このような薬剤に対する耐性にかかわる重要な要素の一つであり、ＭＧＭＴがシクロホスファミド活性の調節に少なくともインビトロで役割を果たしていることが複数の報告で示唆されている。これは肺癌（Ｍａｔｔｅｒｎ Ｊら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、１９９８；７７：９１９〜２２）、髄芽腫（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＨＳら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９９；４３：８０〜５）、および卵巣（ＣＨＯ）細胞系列（Ｃａｉ Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９；５９：３０５９〜６３）で明らかにされている。したがって、ＭＧＭＴはメチル化剤およびクロロエチル化剤に対する耐性と長く関連づけられてきたものの、シクロホスファミドの細胞毒性作用および変異原性作用に対する耐性に寄与する可能性もある（Ｇａｍｃｓｉｋ ＭＰら、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ． １９９９；５：５８７〜６０５）。ＭＧＭＴ活性は、シクロホスファミドの代謝物の一つであるアクロレインの毒性に対する防御に重要であるが、他の代謝物ホスホラミダイトマスタードに由来する毒性はＭＧＭＴによって修飾されないと考えられている。ＭＧＭＴの不活性化によってもたらされるアルキル化剤に対する感受性の上昇は、すべての形質転換細胞の除去か、そうでなければ疾患の再発を招く恐れがある。過剰メチル化を伴うＢ−ＤＬＣＬと、過剰メチル化を伴わないＢ−ＤＬＣＬの初期反応に統計的な差がないことは、神経膠腫被験者にみられる挙動とは異なり、Ｂ−ＤＬＣＬの標準的な治療に使用される他の強力かつ有効な抗癌剤（メチル化群と非メチル化群との間における反応における大きな差をマスクしてしまう恐れがあるアドリアマイシン、ビンクリスチン、およびエトポシドなど）の存在に起因する可能性がある。
【００８４】
以上の知見にかかわらず、ＭＧＭＴの過剰にメチル化しているＢ−ＤＬＣＬ被験者における生存率の改善は、シクロホスファミドに対する感受性に確実に帰することはできない。このような結論は、この薬剤が単独で使用された場合に、また非治療対照を調査した場合にのみ現実のものになると思われる。しかし、このような治療法は、Ｂ−ＤＬＣＬに対する多剤療法の有効性を考えれば適切ではない。ＭＧＭＴの状態と、シクロホスファミドに対するＢ−ＤＬＣＬの感受性との関連を説明するための仮想的な間接的アプローチは、ＭＧＭＴ阻害剤Ｏ６−ベンジルグアニン（Ｏ６−ＢＧ）の使用であると考えられる（Ｄｏｌａｎ ＭＥ、およびＰｅｇｇ ＡＥ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７：３：８３７〜４７）。Ｏ６−ＢＧはＭＧＭＴの基質であり、細胞死反応で同タンパク質に結合することでＭＧＭＴを不活性化する。この阻害剤は主に、アルキル−ニトロソ尿素に対する反応をインビトロとインビボの両方で高めるために使用されてきたが（Ｄｏｌａｎ ＭＥら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９０；８７：５３６８〜７２）、Ｏ６−ＢＧが、シクロホスファミド代謝物に対する感受性を高めることもわかっている（Ｃａｉ Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１；６０：５４６４〜９）。Ｏ６−ＢＧの安全性は、第Ｉ相臨床試験で使用可能であることを示している（Ｓｃｈｉｌｓｋｙ ＲＬら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０００；６：３０２５〜３１）。本明細書に記載されている結果は、Ｏ６−ＢＧが、メチル化されていないＭＧＭＴ遺伝子を有するＢ−ＤＬＣＬの治療に役割を果たすか否かを判定することを試みるための、動物モデルを対象とした前臨床試験の実施を促すものである。
【００８５】
本明細書に記載されている研究から、ＭＧＭＴプロモーターの過剰メチル化が、Ｂ−ＤＬＣＬの生存率の予後評価に対する新しい独立マーカーとなることがわかる。ＭＧＭＴプロモーターの過剰メチル化は、ＢＣＮＵで治療される神経膠腫の被験者における臨床反応の改善、ならびに総生存率および無病生存率の上昇とも相関する。酵素活性ではなく、プロモーターの過剰メチル化の評価は、ヒトの癌におけるＭＧＭＴの状態を評価する、より正確な方法になる可能性がある。実際に、正常な浸潤性リンパ球を含む正常細胞の存在は、腫瘍そのものにおけるＭＧＭＴ活性の判定を困難なものとする恐れがある。本明細書に記載されているＰＣＲによるアプローチでは、浸潤性の正常細胞を除外することで、ＭＧＭＴが不活性化されている腫瘍と、不活性化されていない腫瘍が、より正確に分けられる可能性がある。ＭＧＭＴの過剰メチル化は、ｍＲＮＡの発現の喪失と相関し、ＭＧＭＴ活性の喪失に関連する唯一の機構であると考えられる（Ｑｉａｎ ＸＣら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７；５７：３６７２〜７；Ｗａｔｔｓ ＧＳら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９７；１７：５６１２〜９；Ｄａｎａｍら、Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ． １９９９；２４：８５〜９；およびＥｓｔｅｌｌｅｒ Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０００；６０：２３６８〜７１）ので、プロモーターの過剰メチル化を評価することでＭＧＭＴの機能喪失を調べることができる。このようなアプローチでは、変化の影響（タンパク質発現および酵素活性の喪失）というよりも、病変そのもの（プロモーターの後成的な不活性化）を調べることになる。
【００８６】
本発明は、現時点において好ましい態様に関して記載したが、本発明の精神から解離することなく、さまざまな変形形態が可能であると理解されるべきである。したがって本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、カルムスチンを投与した、神経膠腫に罹患した被験者を対象とした、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態別の総生存率を示す。図１Ｂは、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態別の、疾患進行までの時間。総生存率も疾患進行までの時間も、ＭＧＭＴプロモーターがメチル化されている被験者群の方が、メチル化されていない被験者群と比べて有意に大きい値を示した。このような関連は、腫瘍の種類、被験者の年齢、および活動度（ＰＳ）に関するカルノフスキースコアに依存していなかった。
【図２】シクロホスファミドが投与された、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫における、ＭＧＭＴプロモーターの過剰メチル化と、それが生存率に及ぼす影響の解析を示す。図２Ａは、総生存率がＭＧＭＴのメチル化状態の関数であることを示す。図２Ｂは、不全無しの（ｆａｉｌｕｒｅ−ｆｒｅｅ）生存率がＭＧＭＴのメチル化状態の関数であることを示す。２Ａおよび２Ｂでは、生存率の有意な上昇が、ＭＧＭＴのメチル化が異常な被験者で認められ、この有意性は、病期、活動度（ＰＳ）、およびＬＤＨレベルに無関係であった。
【図３】びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化およびＩＰＩ（国際予後指標）が生存率に依存しないことを示す解析を示す。ＩＰＩにしたがって低リスク（Ｌ）、低−中等度リスク（ＬＩ）、高−中等度リスク（ＨＩ）、または高リスク（Ｈ）に分類された被験者と、視覚的明瞭さに関してはＬを上回る被験者を統合した。図３Ａは、総生存率が、ＭＧＭＴのメチル化状態およびＩＰＩの関数であることを示す。図３Ｂは、不全無しの生存率が、ＭＧＭＴのメチル化状態およびＩＰＩの関数であることを示す。統計解析はＩＰＩを連続変数として行った。
【図１】
2004509643.tif 000014
【図２】
2004509643.tif 000015
【図３】
2004509643.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004509643.tif 000017
2004509643.tif 000018
2004509643.tif 000019
2004509643.tif 000020
2004509643.tif 000021
2004509643.tif 000022
2004509643.tif 000023
2004509643.tif 000024
2004509643.tif 000025
2004509643.tif 000026
2004509643.tif 000027
2004509643.tif 000028
2004509643.tif 000029
2004509643.tif 000030
2004509643.tif 000031
2004509643.tif 000032
2004509643.tif 000033
2004509643.tif 000034
2004509643.tif 000035
2004509643.tif 000036
2004509643.tif 000037
2004509643.tif 000038
2004509643.tif 000039
2004509643.tif 000040
2004509643.tif 000041
2004509643.tif 000042
2004509643.tif 000043
2004509643.tif 000044
2004509643.tif 000045
2004509643.tif 000046
2004509643.tif 000047
2004509643.tif 000048
2004509643.tif 000049
2004509643.tif 000050
2004509643.tif 000051
2004509643.tif 000052
2004509643.tif 000053
2004509643.tif 000054
2004509643.tif 000055
2004509643.tif 000056
2004509643.tif 000057
2004509643.tif 000058
2004509643.tif 000059
2004509643.tif 000060
2004509643.tif 000061
2004509643.tif 000062
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509643.tif 000063
2004509643.tif 000064
【国際調査報告】
2004509643.tif 000065