(57)【要約】本発明は、セイヨウアブラナ植物体から得ることができる構成的プロモーターを提供する。本発明に従って、構成的プロモーターを持つＤＮＡフラグメントが提供され、上記ＤＮＡフラグメントは、ＣＢＳ  第１０９２７２号という名称で２００１年２月６日にＣｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（オランダ国、バールン）に寄託されたクローンｐＪＢ１１７８−２９に存在する。本発明に記載のＤＮＡフラグメントはさらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７により表される配列の全体または一部を含むことが特徴である。さらに、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８により表されるようなシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の相同体配列を含む。
2004528854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＢＳ  第１０９２７２号という名称で２００１年２月６日にＣｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（オランダ国、バールン）に寄託されたクローンｐＪＢ１１７８−２９のＥｃｏＲＩフラグメント内にあり、結合したＤＮＡ配列を植物に再導入する場合に構成的発現を促進することができる、ＤＮＡフラグメント。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１により表されるヌクレオチド配列を含むことが特徴である、請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７により表されるヌクレオチド配列を含むことが特徴である、請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８により表されるヌクレオチド配列を含むことが特徴であり、ＤＮＡ配列を植物に再導入する場合に構成的発現を促進することができる、ＤＮＡフラグメントまたはその一部。
【請求項５】
ヌクレオチド４、ヌクレオチド３４、ヌクレオチド３４１、ヌクレオチド５８８、ヌクレオチド６５０、ヌクレオチド７８２、ヌクレオチド８２５、ヌクレオチド９３７、ヌクレオチド１２４６、ヌクレオチド１５５６、ヌクレオチド１７８０、ヌクレオチド１８４９、ヌクレオチド１９１２、ヌクレオチド１９６０、ヌクレオチド２０４４、ヌクレオチド２２４３、ヌクレオチド２４０８およびヌクレオチド２６３８からなる群から選択されるヌクレオチドで始まり；ヌクレオチド３４１、ヌクレオチド５８８、ヌクレオチド６５０、ヌクレオチド７８２、ヌクレオチド８２５、ヌクレオチド９３７、ヌクレオチド１２４６、ヌクレオチド１５５６、ヌクレオチド１７８０、ヌクレオチド１８４９、ヌクレオチド１９１２、ヌクレオチド１９６０、ヌクレオチド２０４４、ヌクレオチド２２４３，ヌクレオチド２４０８、ヌクレオチド２６３８およびヌクレオチド２６５４からなる群から選択されるヌクレオチドで終わる、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるヌクレオチド配列を含むことが特徴である、ＤＮＡ配列を植物に再導入する場合に構成的発現を促進することができる、ＤＮＡフラグメント。
【請求項６】
転写の方向に：
ａ）請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡフラグメント；および
ｂ）本来前記ＤＮＡフラグメントによる転写制御下になく、前記ＤＮＡフラグメントの制御下で発現されるＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項６に記載のキメラＤＮＡ配列を含むレプリコン。
【請求項８】
請求項７に記載のレプリコンを含む微生物。
【請求項９】
請求項６に記載のキメラＤＮＡ配列を含む植物細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞を含む植物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の植物から得られる、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉および木部から選択される植物の部分。
【請求項１２】
植物における発現を促進することができる相同体の同定における請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡフラグメントの使用。
【請求項１３】
請求項６に記載のキメラＤＮＡ配列を使用して植物を形質転換する方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡフラグメントが選抜可能マーカー遺伝子の発現を駆動していることが特徴である、植物を形質転換する方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかに記載のフラグメントまたは前記ＤＮＡフラグメントの相同体を使用してハイブリッド調節ＤＮＡ配列を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規植物プロモーター、より具体的には構成的に作用するプロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示における、‘プロモーター’または‘プロモーター領域’という用語は、通常構造遺伝子のコード配列上流（５′）のＤＮＡ配列を表し、かかる配列は正しい部位で転写を開始するために必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子の認識をすることによりコード領域の発現を調節する。
【０００３】
一般に２つの型のプロモーター、誘導および構成的プロモーターがある。誘導プロモーターはインデューサに反応して１以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化することができるプロモーターである。インデューサ非存在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されないであろう。一般に、特に誘導プロモーターに結合して転写を活性化する蛋白質因子は不活性型で存在し、その後インデューサにより直接的または間接的に活性型に変換される。インデューサは化学物質；環境状態により引き起こされた生理的ストレスであってもよく、または植物の生長における変化に反応して内因性に生成される化合物であってもよい。
【０００４】
構成的プロモーターはＤＮＡ配列（遺伝子）の発現に関係し、それらは植物の各種部分にわたり、そして植物の成長中に継続してそれらの発現を制御する。しかしながら、本明細書で使用する‘構成的’という用語は、遺伝子がすべての細胞型で同じレベルで発現されることを必ずしも示さないが、多くの変動がしばしば観察されるけれども、遺伝子が広範な細胞型において発現されることを示す。
【０００５】
植物蛋白質発現の分野において最も初期の、そして最も重要な発明の一つは、（植物）ウイルスおよびアグロバクテリウム由来プロモーターの使用であり、それらはトランスジェニック植物において異種遺伝子の強力な構成的発現を提供する。これらのプロモーターのいくつかは植物遺伝研究において非常に集中的に使用されていて、そして今もなお迅速で、簡単な、そして低リスクの発現研究に好まれるプロモーターである。最も有名なものは１９８４年にすでに実用的であることが見出された（ＥＰ  ０  １３１  ６２３）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター、ならびにノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）およびオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）プロモーター（ＥＰ  ０  １２２  ７９１、ＥＰ  ０  １２６  ５４６、ＥＰ  ０  １４５  ３３８）のような、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに見出すことができるプロモーターである。類似した特徴を有する植物由来のプロモーターはユビキチンプロモーター（ＥＰ  ０  ３４２  ９２６）である。
【０００６】
しかし、上記のすべてのプロモーターは構成的プロモーターとして公知であるが、それにもかかわらず器官‐または生長段階に特異的な発現パターンを示し、これらのプロモーターによる発現のパターンはしばしばいくつかの適用には好都合ではない。また、ＤＮＡ‐依存的サイレンシングのために、２つの異なる遺伝子の発現を駆動するためのプロモーターの重複は問題を引き起こす可能性があることが見出されている。このリスクはとりわけ、いくつかの遺伝子が同時に発現される必要があるジーン‐スタッキング法に見出される。さらに、ウイルスまたはアグロバクテリウム由来プロモーターは調節という観点からはあまり魅力的ではない。
【０００７】
したがって、植物由来の新しい、構成的に活性なプロモーターの必要性が今もなお存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、植物由来の新しい構成的プロモーターを提供することが本発明の目的である。
本発明に記載のプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントを提供することが本発明のさらなる目的である。
【０００９】
トランスジェニック植物由来の植物体（または植物体の部分）および種子を含む、本発明に記載のプロモーターを含む上記トランスジェニック植物（またはその部分および／または種子）を提供することが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物体から得ることができる構成的プロモーターを提供する。
【００１１】
本発明に従って、構成的プロモーターを持つＤＮＡフラグメントが提供され、上記ＤＮＡフラグメントは、ＣＢＳ  第１０９２７２号という名称で２００１年２月６日にＣｅｎｔｒａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（オランダ国、バールン）に寄託されたクローンｐＪＢ１１７８−２９に存在するＥｃｏＲＩフラグメントに存在する。
【００１２】
本発明に記載のＤＮＡフラグメントは、さらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜６４１により表されるヌクレオチド配列を含むことが特徴である。さらに、ＤＮＡフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７により表されるヌクレオチド配列を含むことが特徴である。
【００１３】
また、本発明の一部は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８により表されるヌクレオチド配列を含むことが特徴であるＤＮＡフラグメントまたはその一部であり、ここで上記フラグメントまたはその一部は、植物に再導入する場合にＤＮＡ配列の構成的発現を促進することが可能である。
【００１４】
より詳細には、本発明は、ヌクレオチド４、ヌクレオチド３４、ヌクレオチド３４１、ヌクレオチド５８８、ヌクレオチド６５０、ヌクレオチド７８２、ヌクレオチド８２５、ヌクレオチド９３７、ヌクレオチド１２４６、ヌクレオチド１５５６、ヌクレオチド１７８０、ヌクレオチド１８４９、ヌクレオチド１９１２、ヌクレオチド１９６０、ヌクレオチド２０４４、ヌクレオチド２２４３、ヌクレオチド２４０８およびヌクレオチド２６３８からなる群から選択されるヌクレオチドで始まり；ヌクレオチド３４１、ヌクレオチド５８８、ヌクレオチド６５０、ヌクレオチド７８２、ヌクレオチド８２５、ヌクレオチド９３７、ヌクレオチド１２４６、ヌクレオチド１５５６、ヌクレオチド１７８０、ヌクレオチド１８４９、ヌクレオチド１９１２、ヌクレオチド１９６０、ヌクレオチド２０４４、ヌクレオチド２２４３，ヌクレオチド２４０８、ヌクレオチド２６３８およびヌクレオチド２６５４からなる群から選択されるヌクレオチドで終わる、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるヌクレオチド配列を含むことが特徴である、植物に再導入する場合のＤＮＡ配列の構成的発現を促進することができるＤＮＡフラグメントを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、転写において、少なくとも１つの先に記載のＤＮＡフラグメントおよび上記ＤＮＡフラグメントの転写制御下で発現される少なくとも１つのＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ配列を含み、ここで発現されるＤＮＡ配列は本来ＤＮＡフラグメントの転写制御下にない。
【００１６】
本発明はさらに先に記載のキメラＤＮＡ配列を含むレプリコンを提供する。
また、そのようなレプリコン、とりわけｐＪＢ１１７８−２９を含む微生物、先に記載のキメラＤＮＡ配列がそれらのゲノムに組み込まれた植物細胞および本質的に上記細胞からなる植物が本発明に含まれる。そのような植物は双子葉植物または単子葉植物であってもよい。また、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉および木部から選択される上記植物の部分は本発明の一部を形成する。
【００１７】
本発明の別の態様に従い、植物の形質転換におけるキメラＤＮＡ配列の使用、およびハイブリッド調節ＤＮＡ配列作製のための本発明に記載のＤＮＡフラグメントの一部または変異体の使用が提供される。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、セイヨウアブラナ（ナタネ）に本来存在するプロモーターまたは調節配列に関する。これらのプロモーターまたは調節配列の調節制御下にある遺伝子は、異なる生長段階において多くの植物組織に発現され、構成的発現を示唆する。とりわけ、本発明のプロモーターは、ＣＢＳ  第１０９２７２号という名称で２００１年２月６日にＣｅｎｔｒａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（オランダ国、バールン）に寄託された、構築物ｐＪＢ１１７８−２９のｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子を駆動するプロモーターである。
【００１９】
初めに、ｐＪＢ１１７８−２９の配列の約６００塩基対が決定され（１本鎖）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜６４１）、ＢＬＡＳＴＮ探索により解析された。この結果はシロイヌナズナクローンＢＡＣＦ９Ｄ２４（３ｅ−３９）とシロイヌナズナｃＤＮＡクローン７０１５４９９８５（３ｅ−２８）の著しい相同性を明らかにした。このｃＤＮＡはフェニルアラニンｔＲＮＡシンセターゼ蛋白質様と表す。さらに、挿入物の完全な配列が決定された（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）。
【００２０】
本発明のプロモーターのヌクレオチド配列は機能性、すなわちプロモーターの特異性に著しい影響を与えずに変化できることが強調される。プロモーターを変化させる可能性の一つは、特異性に必須のエレメントを維持しながら、プロモーターの一定のフラグメントを欠失させることである。このことは、いくつかのプロモーターの欠失変異体を作製し、それらを構築物中でレポーター遺伝子（たとえば、ｇｕｓ遺伝子またはオワンクラゲのＧＦＰ遺伝子のような、蛍光蛋白質をコードする遺伝子）と連結し、そしてその後上記構築物により形質転換された植物で発現研究を行うことにより成し遂げることができる。したがって、主に構成的発現を駆動する構築物ｐＪＢ１１７８−２９のプロモーター配列のフラグメントも本発明の一部である。さらに、構築物ｐＪＢ１１７８−２９のプロモーター配列のヌクレオチドの置換または添加によるヌクレオチド配列の小さな変化により形成されるプロモーター配列も本発明に包含される。他の種の植物体においても、本発明の配列と同じ機能を有する相同配列を見出せることが予想される。
【００２１】
相同性または同一性の程度を調べるために核酸配列を比較する場合、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰ（両方ともＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｋａｇｅに由来する）のようなプログラムを使用することができる。たとえば、ＢＥＳＴＦＩＴは２つの配列を比較し、最も類似した部分の最適アラインメントを生み出す。ＧＡＰは、配列がそれらの全長に沿って配列されることを可能にし、適宜いずれかの配列に空間を挿入することにより最適なアラインメントを見出す。適切には、核酸配列の相同性を説明する場合、本発明ではそれらの全長に沿った配列のアラインメントにより比較が行われる。
【００２２】
好ましくは、実質的な相同性を有する配列は、好みの程度の増大に従って、上記配列と少なくとも５０％の配列相同性、好ましくは少なくとも７０％の配列相同性そしてより好ましくは少なくとも８０％、９０％または少なくとも９５％の配列相同性を有する。いくつかの場合には、配列相同性は９９％以上であってもよい。
【００２３】
好ましくは、‘実質的な同一性’という用語は、上記配列が先行技術における核酸配列よりも、本明細書に記載の配列のいずれかと程度の高い同一性を有することを示唆する。
“調節配列”または“調節領域”および“プロモーター”という用語は本明細書では互換性がある。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のＤＮＡフラグメントを含むキメラＤＮＡ配列を提供する。本明細書で使用する発現キメラＤＮＡ配列は、本来見られないＤＮＡ配列を含むいずれかのＤＮＡ配列を包含することになる。たとえば、植物体ゲノムが通常は本来の染色体位置に調節領域のコピーを含むという事実にもかかわらず、本明細書で使用するキメラＤＮＡは上記植物体ゲノムの本来存在しない位置に誘導性の上記調節領域を含むＤＮＡを包含することになる。同様に、上記調節領域は本来見られない場合、植物ゲノムの一部に組み込まれてもよく、または本来見られない場合、細菌プラスミドまたはウイルスベクターのようなレプリコンまたはベクター中にあってもよい。本明細書で使用する“キメラＤＮＡ”は宿主において複製可能なＤＮＡ分子に限定されないが、たとえば本発明に記載の調節領域に物理的に結合した具体的アダプター配列により、レプリコンに結合することができるＤＮＡも包含することになる。調節領域はその本来の下流オープンリーディングフレームに結合してもよく、またはしなくてもよい。
【００２５】
本発明の調節領域により発現が駆動される遺伝子のオープンリーディングフレームは、ゲノムライブラリー由来であってもよい。この場合、それは本発明に記載の蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを構成するエキソンを切り離す、１以上のイントロンを含んでいてもよい。オープンリーディングフレームはまた、１つの連続エキソン、または本発明に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡによりコードされていてもよい。本発明に記載のキメラＤＮＡ配列はまた、１以上のイントロンが人工的に除去されるか、または添加されているものを包含してもよい。これらの変異体のそれぞれは本発明に包含される。
【００２６】
宿主細胞で発現が可能なように、本発明に記載の調節領域は通常、選択された宿主細胞に発現可能ないずれかの遺伝子に適切に由来してもよい転写開始領域、およびリボソーム認識および結合のための転写開始領域により提供される。真核細胞では、発現カセットは上記オープンリーディングフレームの下流に位置し、転写を終了させ、一次転写物をポリアデニル化させる転写停止領域を含む。また、細胞下コンパートメントへの遺伝子発現産物のターゲティングに関与するシグナル配列がコードされることがよくある。選択した宿主細胞において、キメラＤＮＡ構築物の発現を支配する原則は当業者に公知である。さらに、発現可能なキメラＤＮＡ構築物の構築は現在、原核細胞または真核細胞のいずれの種類の宿主細胞でも常法である。
【００２７】
キメラＤＮＡ配列が宿主細胞に維持されるためには、かかる配列は通常ＤＮＡに結合した（本発明に記載の）上記キメラＤＮＡ配列を含むレプリコンの形状で提供され、それが選択された宿主細胞によって認識され、複製される。したがって、レプリコンの選択は大部分選択した宿主細胞により限定される。具体的な選択宿主細胞に適切なレプリコンの選択を支配する原則は、明らかに当業者の分野内である。
【００２８】
レプリコンの具体的な型は、植物細胞のような別の宿主細胞にそれ自体、またはその一部を転移させ、それによって植物細胞にオープンリーディングフレームを共転移させることができるものである。そのような能力を有するレプリコンは本明細書ではベクターと呼ばれる。そのようなベクターの例としては、Ｔｉ‐プラスミドベクターが挙げられ、かかるベクターはアグロバクテリウム  ツメファシエンスのような適切な宿主細胞中に存在する場合、それ自体の一部、いわゆるＴ‐領域を植物細胞に転移することができる。異なる型のＴｉ‐プラスミドベクター（ＥＰ  ０  １１６  ７１８  Ｂ１を参照されたい）は、現在キメラＤＮＡ配列を植物細胞、またはプロトプラストに転移するために常用されていて、それらから上記キメラＤＮＡをゲノムに安定して組み込む新規植物細胞を作製することができる。Ｔｉ‐プラスミドベクターのとりわけ好ましい形状は（ＥＰ  ０  １２０  ５１６  Ｂ１およびＵＳ  ４，９４０，８３８）に記載されたいわゆるバイナリーベクターである。本発明に記載のＤＮＡを植物宿主に導入するために使用される他の適切なベクターはウイルスベクター、たとえば、２本鎖植物ウイルス（たとえば、ＣａＭＶ）および１本鎖ウイルス、ジェミニウイルスなどに由来するような、非組み込み植物ウイルスベクターから選択することができる。そのようなベクターの使用は、とりわけ植物体宿主を安定に形質転換することが困難な場合、好都合である。木質種、とりわけ樹木および蔓植物をそのような例として挙げることができる。
【００２９】
“本発明に記載のキメラＤＮＡ配列をそれらのゲノムに組み込む宿主細胞”という表現は以下のような細胞を含むか、または本質的にそれらからなる細胞および多細胞生物を包含することになり、かかる細胞はそれらのゲノムに上記キメラＤＮＡを安定して組み込み、それによってキメラＤＮＡを維持し、そして好ましくは有糸分裂または減数分裂を介して子孫細胞にそのようなキメラＤＮＡのコピーを伝達する。本発明の好ましい態様に従って、本質的に上記キメラＤＮＡの１以上のコピーをゲノムに組み込み、そして好ましくはメンデルの法則において、それらの子孫にコピーまたは複数のコピーを伝達することができる細胞からなる植物体が提供される。植物細胞のいくつか、またはすべてにおける本発明のキメラＤＮＡの転写および翻訳により、上記調節領域を含む細胞は創傷に反応し、調節領域の制御下にあるオープンリーディングフレームにコードされた蛋白質を産生することになる。本発明の具体的な態様において、この蛋白質は病原体感染に抵抗性を与えることができる抗病原性プラスミドであろう。
【００３０】
当業者に公知のように、植物遺伝子の調節領域は遺伝子発現に関して興味深い特性を有する、異なる小領域からなる。そのような小領域の例としては、転写のエンハンサーおよびサイレンサーが挙げられる。これらのエレメントは、共通の（構成的）様式、または組織特異的様式で作用することができる。本発明に記載の調節ＤＮＡ配列中に欠失が作製されてもよく、関連するＤＮＡの発現パターンに対してサブフラグメントが試験されてもよい。そのようにして得られた各種サブフラグメント、またはそれらの組み合わせでさえ、植物における異種ＤＮＡの発現を伴う方法または適用に有用であってもよい。機能的小領域を同定するための本発明に記載のＤＮＡ配列の使用、およびその後の植物における遺伝子発現を促進または抑制するためのそれらの使用も本発明に包含される。
【００３１】
さらに、転写ターミネータ領域の使用は植物細胞における転写の信頼性および効率を促進すると一般に考えられる。したがって本発明ではそのような領域の使用が好ましい。
本願明細書はセイヨウアブラナおよびジャガイモにおける例を含むだけであるが、本発明の適用は好都合にはある植物種だけに限定されない。任意の植物種が本発に記載のキメラＤＮＡ配列によって形質転換されてもよい。
【００３２】
本発明の態様のいくつかの態様は、たとえばいくつかの植物種がまだ遺伝的形質転換されにくいため、現在実行可能でないかもしれないが、そのような遺伝的形質転換のし易さが本発明の基礎をなす態様に関連性がないため、そのような植物種における本発明の実行は単に時間の問題であり、原理の問題ではない。
【００３３】
植物の形質転換は現在、双子葉植物および単子葉植物の両方を含む、多数の植物種に対して常法である。原則として、細胞が完全な植物体に再生されることが可能である限り、任意の形質転換法を使用して適切な先祖細胞へ本発明に記載のキメラＤＮＡを導入することができる。方法は、好都合には、プロトプラストのためのカルシウム／ポリエチレングリコール法（Ｋｒｅｎｓ，Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，７２−７４，１９８２；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８，３６３−３７３，１９８７）、プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ  Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．３，１０９９−１１０２，１９８５）、植物材料へのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．，Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２，１７９−１８５，１９８６）、各種植物材料のＤＮＡ（またはＲＮＡ‐被覆）パーティクルガン法（Ｋｌｅｉｎ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０，１９８７）、（非組み込み）ウイルスなどによる感染から選択することができる。本発明に記載の好ましい方法は、アグロバクテリウム‐媒介ＤＮＡ導入を含む。ＥＰ  Ａ  １２０  ５１６および米国特許第４，９４０，８３８号に開示された、いわゆるバイナリーベクター技術の使用がとりわけ好ましい。形質転換のさらに好ましい方法は、Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：７３４−７４３に本質的に開示されたフローラルディップ（ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ）法である。
【００３４】
トマト形質転換は好ましくは本質的にＶａｎ  Ｒｏｅｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１２，６４４−６４７，１９９３）に記載される。ジャガイモ形質転換は好ましくは本質的にＨｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，２７３−２７８，１９８９）に記載される。
【００３５】
一般に、形質転換後、本発明に記載の蛋白質をコードする核酸配列とともに導入される、植物発現可能遺伝子によりコードされる１以上のマーカーの存在に関して植物細胞または細胞グループが選択され、その後、形質転換された材料が完全な植物体に再生される。
【００３６】
単子葉植物はいくぶん遺伝的形質転換されにくいと考えられるが、形質転換に従順であり、形質転換された細胞もしくは胚、または他の植物材料から稔性トランスジェニック植物を再生することができる。現在、単子葉植物形質転換に好ましい方法は胚、外植片もしくは懸濁細胞のパーティクルガン法および直接ＤＮＡ取込またはエレクトロポレーションである（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８，２７４−２７６，１９８９）。トランスジェニックトウモロコシ植物体は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（除草剤ホスフィノトリシンを不活性化する酵素）をコードするストレプトミセスヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子をパーティクルガン法によりトウモロコシ懸濁培養物の胚形成細胞に導入することにより得られている（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２，６０３−６１８，１９９０）。コムギおよびオオムギのような他の単子葉作物のアリューロンプロトプラストへの遺伝子材料の導入が報告されている（Ｌｅｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，２１−３０，１９８９）。胚形成性懸濁培養物の樹立のために、加齢の緻密でこぶ状の胚形成性カルス組織だけを選択することにより、胚形成性懸濁培養物からコムギ植物体が再生されている（Ｖａｓｉｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．８，４２９−４３４，１９９０）。これらの作物のための形質転換系との組み合わせが、単子葉植物への本発明の適用を可能にする。
【００３７】
コメおよびトウモロコシのような市販の重要な作物を含む、単子葉植物はまた、アグロバクテリウム株によるＤＮＡ導入を受けやすい（ＷＯ９４／００９７７；ＥＰ  ０  １５９  ４１８  Ｂ１；Ｇｏｕｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５，４２６−４３４，１９９１を参照されたい）。
【００３８】
ＤＮＡ導入および再生後に、たとえば本発明に記載のキメラＤＮＡの存在、コピー数および／またはゲノム構成をモニターするためのサザン解析を使用して、形質転換されたと推定される植物を評価してもよい。さらに、またはあるいは、新しく導入されたＤＮＡの発現レベルは、当業者に公知の技術であるノーザンおよび／またはウェスタン解析を使用して評価してもよい。
【００３９】
そのような評価後、形質転換された植物体を直接育ててもよいが、通常それらは新しい品種の育種、またはハイブリッドなどの作製において親系統として使用することができる。
【００４０】
１以上のキメラ遺伝子を構成的に発現することができるトランスジェニック植物を得るために、以下のものを含む多数の選抜方法が利用できる：
Ａ．  選抜可能マーカー遺伝子に物理的に結合した多数の改変遺伝子を持つ、バイナリープラスミド状のＴ‐ＤＮＡのようなＤＮＡの使用。この方法の利点は、キメラ遺伝子が物理的に結合して、単一のメンデル遺伝子座として移動することである。
Ｂ．  それぞれがすでに、好ましくは選抜可能マーカー遺伝子に結合した１以上のキメラ遺伝子を発現することが可能なトランスジェニック植物体と、別の選抜可能マーカーに結合した１以上のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物体の花粉の他家受粉。この交配により得られた種子は、おそらく２種の選抜可能マーカー遺伝子の存在を基にするか、またはキメラ遺伝子自体の存在を基にして選抜された。選抜された種子から得られた植物は、その後別の交配に使用することができる。原則として、キメラ遺伝子は単一の遺伝子座上にはなく、したがって遺伝子は独立遺伝子座として分離することができる。
Ｃ．  多数の複数のキメラＤＮＡ分子、たとえばそれぞれが１以上のキメラ遺伝子および選抜可能マーカーを有するプラスミドの使用。共形質転換の頻度が高い場合、ただ１つのマーカーを基にした選抜で十分である。他の場合では、１以上のマーカーを基にした選抜が好ましい。
Ｄ．  すでに第１、第２などのキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物の、場合により選抜可能マーカー遺伝子を持つ新規キメラＤＮＡによる連続形質転換。方法Ｂのように、キメラ遺伝子は原則として単一遺伝子座上にはなく、したがってキメラ遺伝子は独立遺伝子座として分離することができる。
Ｅ．  上記の方法の組み合わせ。
【００４１】
実際の研究方法は、親系統の目的（直接栽培、交配計画における使用、ハイブリッド作製のための使用）のような、いくつかの容易に限定される理由に依存してもよい。実際の研究方法は記載された発明に関して重要ではない。
【実施例】
【００４２】
概説
植物材料
記載されたすべてのセイヨウアブラナの形質転換実験は、セイヨウアブラナの品種‘Ｗｅｓｔａｒ’の胚軸部分により行われた。組織培養条件は、本質的にＢａｄｅ  ａｎｄ  Ｄａｍｍ（１９９５，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ；Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．編．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ；ｐｐ３２−３８）により記載されたものと同様であった。種子産生または染色体ＤＮＡ単離のために、トランスジェニック植物体は以下の条件で温室中のポット（直径１５ｃｍ）で栽培した：２１〜２４℃、湿度６０〜８０％および光周期１６時間。
【００４３】
形質転換実験に使用されるジャガイモ材料は、ジャガイモの品種‘Ｄｅｓｉｒｅｅ’のｉｎ  ｖｉｔｒｏ茎外植片であった。
菌株
大腸菌株ＤＨ５α（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）およびＤＨ１０Ｂ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を細菌クローニングに使用した。菌株は、プラスミドの型に依存して、カルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）またはスペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を補足したＬＢ培地中、３７℃で培養した。アグロバクテリウム  ツメファシエンス株ＭＯＧ３０１（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：２０８−２１８）はＣ５８染色体バックグラウンド中に非発癌性ノパリンＴｉ‐ヘルパープラスミドを持ち、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（２０ｍｇ／Ｌ）を補足したＬＢ培地中、２９℃で培養した。
【００４４】
プラスミド構築
構築物ｐＭＯＧ２２はＧｏｄｄｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４（５）：８６３−８７３）により記載された。ベクターｐＭＯＧ４４８は、２段階で作製された。第１段階では、ｐ３５ＳＧＵＳ．ＩＮＴのＨｉｎｄＩＩＩ  ３５Ｓ‐ｇｕｓイントロンフラグメント（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２０：２４５−２５０）をｐＭＯＧ２２にクローニングした。次に、ｐＧＨ１の５．８ｋｂ  ＸｂａＩフラグメント（Ｈａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１１：２６６−２７１）をｈｐｔとｇｕｓ‐イントロン部分の間にクローニングした。この具体的フラグメントは変異シロイヌナズナアセトラクテートシンターゼ遺伝子（ｃｓｒ‐１）を含み、それが除草剤クロルスルフロンに抵抗性を与える。変異ａｌｓ遺伝子のコード領域はさらにそれ自体の５′（２．５ｋｂ）および３′（１．３ｋｂ）調節配列を伴う。
【００４５】
タギング構築物ｐＭＯＧ１１７８および対照物ｐＭＯＧ９６４はプラスミドレスキューの特徴（Ｋｏｎｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８６：８４６７−８４７１）を持つが、セイヨウアブラナ形質転換プロトコールへの適用には特にいくつかの改変が行われた。アグロバクテリウムを制御するための抗生物質としてカルベニシリンを常用するため、ａｍｐ遺伝子の機能を破壊し、そのかわりスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を添加することが決定された。構築物は以下のように作製した。
【００４６】
ｐＵＣ９のＥｃｏＲＩ部位（Ｖｉｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８２，Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８）はオリゴＬＳ２１６
【００４７】
【化１】
2004528854.tif 000003
【００４８】
から作製されたアダプターを挿入することにより改変した。次にプラスミドＣｅｌ３６９から単離された細菌スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む３ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントの挿入にＢｇｌＩＩ部位を使用した（非開示、Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）．ａｍｐ抵抗性遺伝子はＡｖａＩＩによる部分的消化により破壊した。スペクチノマイシンへの抵抗性およびカルベニシリンへの感受性に関して陽性のクローンを選択した。
【００４９】
ｐ３５Ｓ‐ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ‐ｔｎｏｓ融合遺伝子（Ｄａｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  １０１：２３９−２４６）はｐＢＩ４２６（Ｃｈａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：１８９−１９３）からＨｉｎｄＩＩＩ‐ＢｇｌＩＩフラグメントとして単離され、本発明者らのスペクチノマイシンベクター中に導入され、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにより消化された。この中間ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩを使用して直鎖状にし、バイナリーベクターｐＭＯＧ２２中にクローニングし、ｐＭＯＧ９６４と命名した。
【００５０】
上記中間ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位はプライマーＳＶ５
【００５１】
【化２】
2004528854.tif 000004
【００５２】
およびＳＶ６
【００５３】
【化３】
2004528854.tif 000005
【００５４】
から作製されたアダプターを使用してＥｃｏＲＩに変換した。得られたベクターはＢｓｔＢＩおよびＥｃｏＲＩにより消化され、同様に消化されたタギングベクターｐＭＯＧ５５３（Ｇｏｄｄｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，；ＥＭＢＬ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ８４１０５）に連結された。このようにして、ｐＭＯＧ５５３の１０３８塩基対の伸長物は、ライトボーダーの構造（ｇｕｓ‐イントロンおよびオクトピン境界）を変化させずに約８ｋｂの新規配列により置換された。新規ベクターｐＭＯＧ１１７８は望ましい配列の大腸菌では不安定であった。そのため、最終クローニング段階はアグロバクテリウムで行われた。
【００５５】
構築物ｐＪＢ１１７８−２１、ｐＪＢ１１７８−２９およびｐＪＢ１１７８−４３はそれぞれトランスジェニック系統１１７８−２１、２９および４３からプラスミドレスキュー（以下を参照されたい）により得た。これらのマルチコピープラスミドは直鎖状にし（ＥｃｏＲＩ）、ｐＭＯＧ２２のフラグメントとしてクローニングし、それぞれバイナリーベクターｐＪＢ１１７８−２１、ｐＪＢ１１７８−２９およびｐＪＢ１１７８−４３を得た。
【００５６】
バイナリーベクターはエレクトロポレーション（プロトコールＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、アグロバクテリウム株ＭＯＧ３０１に導入した。
植物形質転換
胚軸部分はＢａｄｅ  ａｎｄ  Ｄａｍｍ（１９９５，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ；Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．編．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ；ｐｐ３２−３８）に記載の手順に従って形質転換した。以下のようにわずかな改変を行った。カイネチンはカルス誘導培地（ＣＩＭ）から除去し、ＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）を再生培地（ＳＩＭ）に添加した。選択剤としてのカナマイシンの濃度は１５ｍｇ／Ｌであった。再生培地のショ糖レベルは、１０ｇ／Ｌに下げ、野生型とトランスジェニックカルス間の視覚的相違を増大させた。シュート伸長は非選抜培地（ＳＥＭ）上で行った。産生された植物体のトランスジェニック性は、ヒグロマイシン（５ｍｇ／Ｌ）含有培地上での発根により確認した。
【００５７】
ジャガイモのｉｎ  ｖｉｔｒｏ茎外植片はアグロバクテリウム接種の前日に単離した。それらは液体カルス誘導培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、ショ糖  ３０ｇ／ｌ、ゼアチンリボシド  ０．５ｍｇ／ｌおよび２，４−Ｄ  １．４ｍｇ／ｌ）中で培養した。アグロバクテリウム接種（ＯＤ６００  ０．２、２０分間）後、外植片は固化カルス誘導培地（寒天  ８ｇ／ｌ）上で２日間共培養し、その後再生培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、ショ糖  ３０ｇ／ｌ、セフォタキシム  ２００ｍｇ／ｌ、バンコマイシン  １００ｍｇ／ｌおよびゼアチンリボシド  ３．０ｍｇ／ｌ）に移した。形質転換１週間後、外植片はヒグロマイシン（１０ｍｇ／ｌ）またはカナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）を補足した新鮮な再生培地に移した。この培地は２週間に１度交換した。茎は８週間後に収穫し、選抜発根培地（１／２濃縮ＭＳ塩、１／２濃縮Ｂ５ビタミン、ショ糖  １０ｇ／ｌ、ＩＢＡ  ０．１ｍｇ／ｌおよびヒグロマイシン  ５ｍｇ／ｌ）上に置いた。
【００５８】
ＧＵＳ組織化学的アッセイ
トランスジェニック系統の異なる植物体部分におけるＧＵＳ活性は、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ５：３８７−４０５）に記載のように組織化学的解析を使用して検討した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける植物体の試料は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニカシド−シクロヘキシルアンモニウム塩（０．５ｍｇ／ｌ）；Ｎａ−Ｐ−バッファー（５０ｍＭ  ｐＨ７）；Ｎａ２−ＥＤＴＡ（５ｍＭ  ｐＨ８．０）；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．０５％  ｖ／ｖ）；フェロシアン化カリウム（０．５ｍＭ）；フェリシアン化カリウム（０．５ｍＭ）を含む溶液中で５分間減圧浸潤させた。試料は、３７℃で一晩インキュベートし、その後エタノール（７０％）で洗浄することにより、クロロフィルを除去した。ＧＵＳ活性の分類（０〜５＝ゼロ〜非常に高い）は、青色染色の強度を基に行った。
【００５９】
カルス誘導アッセイ
セイヨウアブラナｉｎ  ｖｉｔｒｏ植物体の小リーフディスク（５＊５ｍｍ）を向軸面を上にして２，４−Ｄ（１ｍｇ／Ｌ）で補足した再生培地（ＳＩＭ）上に置いた。培地のショ糖レベルは、１０ｇ／Ｌに維持した。培養３週間後に、切断縁において新規緑色カルスが形成され、完全な外植片はＧＵＳ活性に対して組織化学的に染色した。トランスジェニックジャガイモ系統の葉試料は２，４−Ｄ（１．０ｍｇ／ｌ）で補足したジャガイモ再生培地上に同様に置いた。これらの外植片は２週間後にＧＵＳ活性を測定した。
【００６０】
オーキシン誘導アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ植物体のノード部分はＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）を補足したホルモンフリー培地（ＳＥＭ）、または補足しないＳＥＭ上で継代培養した。３週間後に新しい葉および根が形成された。その時点で、完全な植物体をＧＵＳ活性に対して組織化学的に染色した。
【００６１】
ＰＣＲ解析
トランスジェニック植物体は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｙ（１９９５）に記載されたＤＮＡ試料調製法を使用してＰＣＲにより解析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生長した小植物体から小葉片（±２ｍｍ２）を採取し、マイクロチューブ（１．５ｍＬ）中に密封し、液体窒素中で凍結させた。２０マイクロリットル抽出バッファー（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＬ  ｐＨ９．５；１Ｍ  ＫＣＬ；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、試料を９５℃で１０分間加熱した。氷上で冷却後、試料は直接使用するか、または使用まで４℃で保存した。ＰＣＲプライマーは：
【００６２】
【化４】
2004528854.tif 000006
【００６３】
および
【００６４】
【化５】
2004528854.tif 000007
【００６５】
であった。プライマーアニーリング部位は図１に示す。５′９５℃、５′℃、５′７２℃の１ＰＣＲサイクル後、１′９５℃、１′５５℃、１′７２℃を３０サイクル行った。最後のサイクルは、１′９５℃、１′５５℃、１０′７２℃であった。反応容積は１μｌ  ＤＮＡ試料、Ｔａｑバッファー、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２＊２５ｐｍｏｌ  プライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰｓおよび２．５単位  白金Ｔａｑポリメラーゼを含む５０μｌであった。ＰＣＲ試料はアガロースゲル中で電気泳動を使用して分析した。
【００６６】
プラスミドレスキュー
個々のトランスジェニック系統のＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡフラグメント約５μｇをＨ２Ｏ  ２５μｌに溶解した。Ｔ４リガーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）５μｌ、Ｔ４リガーゼバッファー  ６０μｌおよび２１０μｌ  Ｈ２Ｏを添加し、混合物を１４℃で２０時間インキュベートした。連結ＤＮＡをフェノール‐クロロホルム抽出（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を使用して一度除去し、その後１０μｌ  ＴＥに溶解した。溶液１μｌを、Ｃｅｌｌ  ｐｏｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、１試料ＤＨ１０Ｂ  ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）コンピテント細胞のエレクトロポレーションに使用した。設定は取扱説明書に従った。ＳＯＣ培地に１時間置き、細胞を遠心分離し、１００μｌ  ＬＢに溶解し、スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地に播いた。３７℃で２４〜４８時間インキュベーション後、コロニーは可視化された。平板上および液体ＬＢ（Ｓｐｅｃ  ５０ｍｇ／Ｌ）中の個々のコロニーの継代培養を使用して、レスキューされたクローンの真の抵抗性を確認した。
【００６７】
配列決定
ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子から植物体ゲノムへの転移領域は、ＡＢＩ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ）および単一プライマーとして
【００６８】
【化６】
2004528854.tif 000008
【００６９】
を使用して配列決定した。レスキューされたプラスミドまたはバイナリーベクターを鋳型ＤＮＡとして使用した。条件は取扱説明書に従って適用した。約５００〜６００ｂｐの配列を決定した。配列データはＢＬＡＳＴＮ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇを使用して解析した。
【００７０】
実施例１  タギング構築物によるセイヨウアブラナの形質転換
セイヨウアブラナの胚軸外植片はタギング構築物ｐＭＯＧ１１７８（図１）により形質転換し、抵抗性細胞クラスターと非トランスジェニック組織を識別する最低濃度であるカナマイシン  １５mg/Ｌを含む培地に播いた。形質転換実験では、外植片の一部は、３５Ｓ‐ｈｐｔカセットの発現を選択するためにヒグロマイシン含有培地に播いた。ヒグロマイシン抵抗性カルスが得られる頻度を具体的な実験におけるＴ−ＤＮＡ組み込みの有効性の尺度として使用した。構築物ｐＭＯＧ４４８（図１）はカナマイシン選択の陰性対照として使用した。同じ構築物および構築物ｐＭＯＧ９６４（図１）はヒグロマイシン選択の陽性対照として使用した。後者の構築物はまた、カナマイシン選択の陽性対照として使用した。
【００７１】
一連の１５形質転換実験から、３つの代表的なタギング実験を表１に示す。ｐＭＯＧ１１７８による形質転換後にヒグロマイシン抵抗性カルスが形成される頻度（抵抗性カルス数／外植片＊１００％）は、５５〜９９パーセントの範囲であった。陽性対照ｐＭＯＧ４４８およびｐＭＯＧ９６４のカルス頻度は３７〜６６パーセントの範囲であった。カナマイシン選択後、陰性対照ｐＭＯＧ４４８のカルス頻度はゼロであった。陽性対照ｐＭＯＧ９６４により得られた頻度は８１〜１１９％であった。低いが有意な数のカナマイシン抵抗性カルス（１．４〜３．５％）がタギング構築物ｐＭＯＧ１１７８により形質転換された外植片上で産生された。
【００７２】
相対的タギング頻度は一定のタギング実験内でのカナマイシンおよびヒグロマイシン抵抗性カルス形成間の比である。この数はカルス組織中で活性なゲノムプロモーター配列の後ろに組み込まれたＴ−ＤＮＡ挿入物の割合を表す。異なる実験間の相対的タギング頻度は２．６〜３．８パーセントの範囲であった。
【００７３】
【表１】
2004528854.tif 000009
【００７４】
すべてのタギング実験から８７のカナマイシン抵抗性カルスが得られた。全部で３６のカルスが首尾よく再生された。このカルス再生頻度（４１％）は通常得られる範囲内であった。最初のシュートを単離し、カナマイシンを除いた培地で継代培養した。非選抜段階を使用して、分化後に限定的ｎｐｔＩＩ発現をするか、または全くｎｐｔＩＩ発現をしないタグ系統を生長させた。再生植物体３６のうち２０がヒグロマイシン含有培地（５ｍｇ／ｌ）上で正常な根を形成し、このことは根における３５Ｓ‐ｈｐｔカセットの発現を示唆した。この結果がカナマイシン選択によるプロモーターレスｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタギング構築物の成功した導入を確証した。ヒグロマイシン‐感受性系統はその後の解析から除外した。
【００７５】
実施例２  分化した植物組織におけるＧＵＳ活性
３５Ｓ‐ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ構築物（ｐＭＯＧ９６４）を含むカナマイシン抵抗性対照植物体は高レベルの構成的ＧＵＳ活性を示した（データは示さない）。したがって、ある植物組織において標識ゲノムプロモーターが依然として活性である場合、トランスジェニックｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタグ系統はＧＵＳ染色を示すと予想された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび温室植物体の葉、茎および根組織を組織化学的にアッセイした（表２）。２０のうち１５系統が温室またはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかの植物体の１以上の部分において、検出可能な発現レベルを示した。青色染色は通常非常に弱く、葉および茎の維管束組織にしばしば限定された。一般に、温室条件下での発現はｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件に比べて低かった。４系統（１１７８−１、２６、２９および４５）は葉、茎および根において中〜高レベルのＧＵＳ活性を示した。１系統（１１７８−２６）だけが土壌への移植後も高い構成的発現パターンを示した。いくつかのシュート（１１７８−２および３０）または根分裂組織（１１７８−２１、２９、３３、４３および４５）で促進された発現が観察された。
【００７６】
７．１．１  再誘導カルスにおけるＧＵＳ活性
対照として、再誘導カルスにおけるＧＵＳ酵素レベルを検討するために１組の分析を行った。元のプロモーターレスｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ挿入物がカナマイシン抵抗性カルスを生じるため、大部分の系統はこの段階においてあるレベルのＧＵＳ活性を示すと予想された。すべての系統のリーフディスクは２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｌ）で補足したシュート誘導培地に置き、その結果外植片の端に緑色非再生カルスが形成された。２０のうち１８系統は上記２，４−Ｄ含有培地上での培養１４日後に検出可能なレベルのＧＵＳ活性を示した。発現は、外植片の端に新規に形成されたカルス組織中に主に局在した（図２ａ＋ｂ）。外植片の残りに比較した、カルス中の相対的アップレギュレーション発現は１２系統に見出された（１１７８−２、５、１０、１１、１８、２１、２２、３０、３７、４０、４３および４５）。検討した他の植物体組織には、検出可能な酵素レベルは見られなかった（以下を参照されたい）。
【００７７】
カルスにおけるアップレギュレーション発現はまた、タグ系統のＴ１胚軸部分を再生培地に置いた場合に観察された（図２ｃ＋ｄ）。
【００７８】
【表２】
2004528854.tif 000010
【００７９】
７．１．２  オーキシン処置によりアップレギュレーションされたＧＵＳ活性
Ｔ−ＤＮＡ組み込みは、ゲノムの活発に転写された領域に起こり（Ｋｏｎｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８６：８４６７−８４７１）、そしてこの場合プロモーターのないｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタギング構築物の組み込みはオーキシン含有培地（２，４−Ｄとの共培養およびＮＡＡによる選択）上での培養中に起こると考えられるため、本発明者らは、オーキシンによるタグプロモーターのアップレギュレーションをチェックしようと考えた。すべてのタグ系統のｉｎ  ｖｉｔｒｏ植物体材料がクローニングされた。少なくともそれぞれの系統の１ノード部分はＮＡＡ（０．１ｍｇ／ｌ）含有培地上で生長させた。上記培地上で生長させた小植物体はより多く、太い根を有意に発生したが、他の点ではホルモンフリー培地上で生長させた対照クローンに匹敵した。組織化学的ＧＵＳアッセイは継代培養後４週間目に行った。６系統（１１７８−５、１８、２１、３３、４３および４５）は葉にＮＡＡ誘発ＧＵＳ活性を示した。
【００８０】
ＧＵＳ発現データの概要は表２に示す。２つのトランスジェニック系統（１１７８−３４および１１７８−４２）では、ＧＵＳ染色は見られなかった。
７．１．３  実施例３  ゲノム‘プロモーター’配列
タギング構築物上流のゲノム配列の実際の単離の前に、ＰＣＲによるスクリーニングを行い、スクランブルした可能性のあるＴ−ＤＮＡ挿入物を検出した。３５Ｓ‐ｇｕｓプライマー‐セットを使用して、２つの系統（１１７８−１および２６）が、おそらく３５Ｓ‐ｈｐｔカセットに由来し、プロモーターレスｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子上流の３５Ｓ‐ｇｕｓプロモーターの一部を含むことを見出した。このことは、増幅されたフラグメントの配列決定により確認した（データは示さない）。これらの系統はその後の解析から除外した。
【００８１】
残った系統のゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＩ（図１）により消化し、サザンブロット解析に使用した。単一Ｔ−ＤＮＡ挿入物が１１７８−２１、２９および４３系統に検出された。Ｔ−ＤＮＡライトボーダーフラグメントは大きさが１２ｋｂ（データは示さない）で、Ｔ−ＤＮＡとＥｃｏＲＩ制限部位間の±３ｋｂゲノム配列を示した。他の系統の結果は、ＥｃｏＲＩフラグメントサイズが非常に大きいため、説明することが困難であった。
【００８２】
消化されたＤＮＡはまた、プラスミドレスキュー実験に使用した。サザンブロット解析で観察された大きなフラグメントサイズにもかかわらず、スペクチノマイシン抵抗性コロニーは容易に得られた。レスキュープラスミドは制限酵素解析により確かめた。これらの解析はＥｃｏＲＩを使用して行い、プラスミドを直鎖状にすると推測した。ＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩによる二重消化を使用して新規に単離されたゲノム配列から９ｋｂの元のＴ−ＤＮＡ（ベクター）を単離した（図１）。単一コピーＴ−ＤＮＡ系統（１１７８−２１、２９および４３）由来のプラスミドレスキューは系統内で同一のクローンを生じるが、他の系統は２以上の異なる制限パターンを示した（データは示さない）。これらの異なる制限パターンが、異なるＴ−ＤＮＡ挿入物のレスキューフラグメントを表すと考えられる。酵素の組み合わせにより消化されたレスキュープラスミドのいくつかの例を図３に示す。単一コピー系統（１１７８−２１、１１７８−２９および１１７８−４３）からレスキューされたプラスミドを示し、元のタグ系統に従って命名する（ｐＪＢ１１７８−２１（＝ｐＭＯＧ２００１）、ｐＪＢ１１７８−２９（＝ｐＭＯＧ２００２）およびｐＪＢ１１７８−４３（＝ｐＭＯＧ２００３））。
【００８３】
直鎖状フラグメント（ＥｃｏＲＩ）のサイズは、±１１ｋｂ（クローン１）から±４０ｋｂ（クローン４および５）までの範囲である。単一コピーＴ−ＤＮＡ系統由来のプラスミド（ｐＪＢ１１７８−２１、ｐＪＢ１１７８−２９およびｐＪＢ１１７８−４３）のフラグメントサイズ（±１２ｋｂ）は、サザンブロット法により得られた結果に適合する（上記参照）。いくつかの場合（クローン７、９および１１）、レスキュープラスミドをＥｃｏＲＩ消化により直鎖状にすることは不可能であった。明らかにＥｃｏＲＩ部位は破壊された。二重消化された系統から、大部分のクローンは予想される９ｋｂベクターバンドを示すと考えることができる（図３）。上記のＥｃｏＲＩ部位のないクローンおよびｐＪＢ１１７８−４３は例外である。他のすべてのクローンは、９ｋｂフラグメント以外に、単離された植物体ＤＮＡに由来する１〜３の他のバンドを含む。
【００８４】
ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子上流のＤＮＡ配列は、３つの単一コピー系統（１１７８−２１、１１７８−２９および１１７８−４３）のそれぞれに対して決定された。ｐＭＯＧ１１７８の元のライトボーダーおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（図１）は３つの系統すべてに見られなかった（図４）。１１７８−４３系統では、ＢａｍＨＩ部位（図１）ももはや見られず、ＥｃｏＲＩ＊ＢａｍＨＩ消化後に予想される９ｋｂフラグメントがないことを説明する（上記参照）。
【００８５】
セイヨウアブラナのタグプロモーター配列の解析
１１７８−２９系統のレスキューされたセイヨウアブラナプロモーター配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）を、シロイヌナズナゲノム配列（ＴＩＧＲ：ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｅ２ｋｌ／ａｔｈｌ／）に対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７；２５：３３８９−３４０２）探索において使用した。シロイヌナズナゲノムのある部分に広範な相同性が見出された。２６２４ｂｐのセイヨウアブラナ配列は、シロイヌナズナＢＡＣ  Ｆ９Ｄ２４のクロモソーム３の領域と高い相同性を示す。相同性は、１０エキソンを持つ予言されたＯＲＦ  Ｆ９Ｄ２４．５０（フェニルアラニン‐ｔＲＮＡシンターゼ‐様蛋白質）を表すシロイヌナズナＢＡＣ  Ｆ９Ｄ２４上のほとんど全領域を包含する。セイヨウアブラナ配列との相同性は、予言されたエキソンが位置する領域において最も強いが、相同性は、より限定されるが、（予言された）イントロン領域にも存在する。セイヨウアブラナ１１７８−２９に対応するシロイヌナズナ配列はＳＥＱＩＤＮＯ：８として示される。
【００８６】
シロイヌナズナエコタイプＣｏｌｕｍｂｉａとセイヨウアブラナの品種Ｗｅｓｔａｒ間に見出される高い相同性は、これらの密接に関連した植物種間の高レベルのゲノム共直線性を示す。
【００８７】
オーキシン誘発、病原体誘発（植物防御ホルモン反応性）および構成的遺伝子発現において調節的役割を果たすことが公知のプロモーターモチーフの存在に対して、プロモーター配列を分析した。両プロモーターは、カルス組織において活性が高く、オーキシン処理に反応する。この証明されたプロモーター活性の隣に、遺伝子発現の調節において、創傷への暴露およびＡ．ツメファシエンス感染中のプロモーター捕捉実験において同定されたこのプロモーター配列により駆動される病原体および創傷反応性エレメントが含まれてもよい。かかるプロモーターにおいて同定されたプロモーターエレメントを図６に示す。エレメントは、ダイズＧＨ３プロモーターのオーキシン反応性に必要なオーキシン反応性エレメント（ＡｕｘＲＥｓ）のコア配列（ＴＧＴＣＴＣ）を含むことが見出された（Ｕｌｍａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９９５  Ｏｃｔ；７（１０）：１６１１−１６２３）。これらのオーキシン反応性の存在の隣に、ＲｏｌＢオンコジーンプロモーターに見られるタバコＤｏｆ蛋白質ＮｔＢＢＦ１結合部位に等しい配列が見出される。ＮｔＢＢＦ１は、おそらく植物体においてＲｏｌＢの組織特異的、オーキシン誘導性発現の媒介に関与する蛋白質である（Ｂａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９９９  Ｍａｒｃｈ；１１（３）３２３−３３４）。Ｄｏｆジンクフィンガー蛋白質はまた、オーキシン誘導性蛋白質であると考えられる（Ｋａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２０００；２１：３２９−３３４）。病原体および／またはストレス誘導性の、遺伝子内に高頻度に出現するエレメントは、両プロモーター配列でも同定された。転写因子の植物ＷＲＫＹファミリーのメンバーに結合することができるＷ‐ボックスモチーフが両プロモーター配列に存在する（それぞれ８および４コピー）。高頻度のＷ‐ボックス配列（ＴＴＧＡＣｎ）の存在は病原体、エリシターおよびサリチル酸反応性に関連する（Ｅｕｌｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２０００；５（５）：１９９−２０６）。Ｌｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８９；８（６）：１６４１−１６４８）およびＦｉｓｃｈｅｒ（ｐｈ．Ｄ．論文，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ，１９９４）に記載のＨ‐ボックスコンセンサス（ＣＣＴＡｎＣ）に非常に類似した配列が見出され、これらのボックスは植物最少プロモーターにマルチマーとして融合した場合、真菌エリシターおよび創傷誘導性発現をすることが公知である（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９９；１８（４）：３８３−３９３）。また、いわゆるＧ‐ボックス調節モチーフ（ＣＡｍＧＴＧ，Ｌｏａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２；８９：９２３０−９２３４）および、植物ホルモンエチレンによりアップレギュレーションされる遺伝子の５′‐上流領域に主に見出されるＧＣＣ‐ボックス（ＡＧＣＣＧＣＣ）（Ｏｈｍｅ‐Ｔａｋａｇｉ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｓｈｉ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １９９５  Ｆｅｂ；７７（２）：１７３−１８２）に類似したボックスが同定された。拡大Ｇ‐ボックスモチーフのテトラマーは、最少プロモーターに結合した場合、トランスジェニック植物体において高レベルな構成的発現をする（Ｉｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９９；１８：４４３−４４８）。Ｓ‐ボックスは非常に強いエリシター反応性エレメントであり、非常に強い誘導能を与えることができる（ＷＯ  ００／２９５９２）。１１７８−２９プロモーター融合体における転写開始部位は地図が作製されていないので、推定ＴＡＴＡボックスの位置を予言することは依然として困難である。それにもかかわらず、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合部位として非常によく機能できる配列が存在する。
【００８８】
７．１．４  実施例４  単離された‘プロモーター’‐ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩプラスミドの評価
プロモーター活性のさらに進んだ解析のために、単一コピーＴ−ＤＮＡ系統（１１７８−２１、２９および４３）からレスキューされた３種のプラスミドが選択された。バイナリーベクターは二重選択法を使用して構築した。レスキュープラスミドの直鎖状フラグメント（ＥｃｏＲＩ）はバイナリーベクターｐＭＯＧ２２（図１）の直鎖状フラグメント（ＥｃｏＲＩと連結させ、大腸菌に形質転換された。連結が成功したことを示唆するカナマイシンおよびスペクチノマイシン抵抗性コロニーが選択された。しかし、大部分のバイナリークローンは元の９ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩベクターフラグメントサイズの減少によって証明されるように、一定の欠失を含むのは明らかである（データは示さない）。新規バイナリーベクターのプロモーターｇｕｓ融合体の配列解析は、ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子のすぐ上流の未変化ゲノム配列の存在を示した。
【００８９】
レスキュープラスミドごとに３〜５のバイナリーベクターが選択された。この選択はＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを使用した予想される制限パターンとの高い類似性に基づいて行われた。１２クローン（４＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２１、５＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２９および３＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−４３）がアグロバクテリウム株ＭＯＧ３０１に導入され、その後セイヨウアブラナに形質転換された。すべての形質転換はそれぞれ±１００胚軸外植片を使用してデュプリケートで行った。ｐＭＯＧ９６４およびｐＭＯＧ１１７８（図１）による形質転換は、これらの実験で対照として使用した。形質転換後５日目に、構築物につき約２０の外植片の一過性ＧＵＳ活性を評価した。２０のうち５のクローンがヒグロマイシン抵抗性カルスにおいてＧＵＳ活性を示した。形質転換後３週間目には、１つの１１７８−４３バイナリークローンを除いて、すべての形質転換体においてヒグロマイシン抵抗性カルスが産生された。この時点で、１２クローンのうち８がヒグロマイシン抵抗性カルスにおいてＧＵＳ活性を示した（図５）。とりわけ、タグ系統１１７８−２１および２９由来のクローンは組織化学的ＧＵＳ活性において、暗青色の染色を示した。
【００９０】
６つのバイナリーベクター（２＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２１、２＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２９および２＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−４３）はまた、ジャガイモ形質転換に使用した。形質転換後、これらのうち４つが一過性ＧＵＳ活性を示した。６のうち５のベクターが生長中のヒグロマイシン抵抗性カルスにおいて安定なＧＵＳ活性を示した。選択剤としてカナマイシンを使用した形質転換実験では、構築物ごとに約５０のジャガイモ外植片を使用した。トランスジェニックシュートと思われるものを収穫し、ヒグロマイシン含有発根培地にそれらを置いた。ゲノムに組み込まれた活性な３５Ｓ‐ｈｐｔカセットを持つシュートだけが、正常な根系を産生することになる。６のうち５の形質転換構築物が１以上のトランスジェニックジャガイモ系統を産生した。形質転換頻度（外植片ごとのトランスジェニック植物の数＊１００％）は２〜１１パーセントの範囲であり、陽性対照構築物ｐＭＯＧ９６４で得られたレベル（５％）に匹敵する。
【００９１】
予備的結果は、トランスジェニックジャガイモ系統葉試料におけるＧＵＳ活性はゼロから比較的高い活性にまで変化することを示した。トランスジェニック系統のいくつかは葉において低ＧＵＳ活性だけを示すが、このレベルは葉外植片をカルス誘導培地に置いた場合、アップレギュレーションされてもよい（図５）。セイヨウアブラナおよびジャガイモ形質転換の結果の概要を表３に示す。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
【表４】
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【００９４】
【表５】
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【００９５】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】セイヨウアブラナにおいてプロモータータギングのために使用される構築物のＴ−ＤＮＡの概略図。  すべてのバイナリーベクターはｐＭＯＧ２２（Ｇｏｄｄｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）のように３５Ｓ‐ｈｐｔ‐ｎｏｓカセットを含む。構築物ｐＭＯＧ４４８は選択対照として使用した（＋ヒグロマイシン、−カナマイシン）。構築物ｐＭＯＧ９６４は二重促進３５Ｓプロモーターと結合したｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ融合遺伝子（Ｄａｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）を含むが、タギング構築物ｐＭＯＧ１１７８は同じコード領域のプロモーターレス形を持つ。ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子は、Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）に記載のようにｇｕｓ部分にイントロンを含む。スペクチノマイシン抵抗性およびＣｏｌＥｌ起源の複製がプラスミドレスキューの特徴として包含される。カルベニシリンに対するアグロバクテリウムの抵抗性を回避するために、アンピシリン遺伝子は破壊される（Δ）。サザンブロット解析およびプラスミドレスキュー実験に使用される制限部位を示す（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ）。波線はライトボーダーに隣接するゲノム植物体ＤＮＡを表す。ＬＢ  レフトボーダー、ＲＢ  ライトボーダー、ｐ  プロモーター、ｔ  転写ターミネータ配列、ｈｐｔ  ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ａｌｓ  アセトラクテートシンターゼ遺伝子、ｇｕｓ−Ｉ  ＧＵＳレポーター遺伝子＋イントロン、ｎｐｔＩＩ  ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ｓｐｅｃ  スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む３ｋｂフラグメント、Δａｍｐ  アンピシリン抵抗性遺伝子（機能しない）、ＣｏｌＥｌ  複製のＣｏｌＥｌ起源。
【図２】トランスジェニックセイヨウアブラナ系統１１７８−２９の葉および根部分のＧＵＳ活性。
【図３】レスキュープラスミドの限定解析。ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタギング領域上流の１１の異なるゲノム配列フラグメントをプラスミドレスキューにより単離した（図１を参照されたい）。ＤＮＡは細菌培養物から単離し、ＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩにより消化し、アガロースゲル上で分離した（セット１〜１１）。１ｋｂマーカー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の位置を示す。３種の単一コピー系統から単離したゲノムフラグメント（１１７８−２１、１１７８−２９、１１７８−４３）を配列解析、バイナリーベクターの構築および野生型セイヨウアブラナへの再形質転換に使用した。
【図４】タギング構築物ｐＭＯＧ１１７８と３種のトランスジェニック系統（１１７８−２１、１１７８−２９および１１７８−４３）のｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩコード領域上流のヌクレオチド配列の比較。Ｔ−ＤＮＡライトボーダー、制限部位（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ）およびｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩの開始コドン（ＡＴＧ）は下線で示す。それぞれの系統（１本鎖）に関して配列の約６００塩基対を決定し、ＢＬＡＳＴＮ探索により解析した。シロイヌナズナの３種のＢＡＣクローンならびにシロイヌナズナおよびセイヨウアブラナのｃＤＮＡクローンの相同性が見出された。相同配列の開始は（破線で）示す。
【図５】プロモーター活性を持つ新規ゲノム配列により駆動される若いカルスのＧＵＳ活性。セイヨウアブラナのゲノムに組み込まれたｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタギング遺伝子上流のフラグメント（ｐＭＯＧ１１７８、図１）は、プラスミドレスキューにより単離し、バイナリーベクターｐＭＯＧ２２（３５Ｓ−ｈｐｔ−ｎｏｓ、図１）にクローニングし、セイヨウアブラナ胚軸外植片に再形質転換された（表３）。ヒグロマイシン含有培地で３週間培養後、組織化学的ＸＧｌｕｃ染色（２４時間）を行った。Ａ：３５Ｓ‐ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ対照構築物ｐＭＯＧ９６４（図１）の非常に高い発現；Ｂ：十分な発現（ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２１）；Ｃ：十分な発現（ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２９）；Ｄ：適度の発現（ｐＪＢＢＩＮ１１７８−４３）。
【図６】プロモーターおよびプロモーターエレメントを含む配列ボックスの概略図。
ボックスの説明は、実施例７を参照されたい。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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