(57)【要約】本発明は、胸腺への性ステロイド・シグナル伝達を妨害すること、および対象に骨髄もしくは造血幹細胞（ＨＳＣ）を導入することを含む、対象のＴ細胞障害を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における胸腺への性ステロイド・シグナル伝達を妨害すること、および対象に骨髄もしくは造血幹細胞（ＨＳＣ）を導入することを含む、対象のＴ細胞障害を治療する方法。
【請求項２】
Ｔ細胞障害が、ウイルス感染、Ｔ細胞増殖疾患、およびＴ細胞の数的もしくは機能的低下を引き起こす任意の疾患からなる群から選択された請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルス感染がヒト免疫不全ウイルス感染である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象がＡＩＤＳを有している任意の請求項３に記載の方法。
【請求項５】
対象に導入する前にＨＳＣに遺伝子改変を施す請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＨＳＣおよびその子孫がＨＩＶウイルスへの感染および／またはそれによる破壊に抵抗性になるように、ＨＳＣに遺伝子改変を施す請求項５に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子改変が、ＨＳＣに、抗ウイルスタンパク質をコードする核酸分子、アンチセンス構築物、リボザイム、ｄｓＲＮＡ、および触媒的な核酸分子からなる群から選択された１種または複数の核酸分子を導入することを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
注射によって対象にＨＳＣを導入する請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象が思春期後である請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
性腺摘除または性ステロイド類似体投与のいずれかによって性ステロイド産生の阻害を実現する請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
性ステロイド類似体投与によって性ステロイド産生の阻害を実現する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
性ステロイド類似体が、ユーレキシン、ゴセレリン、リュープロリド、ジオキサラン誘導体、および黄体ホルモン放出ホルモン類似体からなる群から選択された請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ジオキサラン誘導体が、トリプトレリン、メテレリン、ブセレリン、ヒステレリン、ナファレリン、ルテレリン、およびリュープロレリンからなる群から選択された請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
性ステロイド類似体が黄体ホルモン放出ホルモン類似体である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
黄体ホルモン放出ホルモン類似体がデスロレリンである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
徐放性ペプチド製剤によって性ステロイド類似体を投与する請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
対象に濃縮ＨＳＣを移植することを含む請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＳＣが自己由来である請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、胸腺への性ステロイド・シグナル伝達を妨害すること、および対象に骨髄もしくは造血幹細胞（ＨＳＣ）を導入することを含む、対象のＴ細胞障害を治療する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
胸腺は、それと神経内分泌系との双方向の情報伝達に影響されるところが大きい（Ｋｅｎｄａｌｌ、１９８８年）。特に重要なのは、栄養作用（ＴＳＨおよびＧＨ）と萎縮作用（ＬＨ、ＦＳＨ、およびＡＣＴＨ）の両方を含む、胸腺機能と、下垂体、副腎、および性腺との相互作用である（Ｋｅｎｄａｌｌ、１９８８年；Ｈｏｍｏ−Ｄｅｌａｒｃｈｅ、１９９１年）。実際、胸腺の生理を特性付ける特徴の１つは、思春期頃の循環性ステロイド産生の増加と相応した、構造および機能の進行性の減退である（ＨｉｒｏｋａｗａおよびＭａｋｉｎｏｄａｎ、１９７５年；Ｔｏｓｉ等、１９８２年；およびＨｉｒｏｋａｗａ等、１９９４年）。ホルモンの正確な標的および胸腺の萎縮を引き起こす機序はまだ特定されていない。胸腺は、末梢Ｔ細胞プールの生成および維持のための第一の部位であるので、胸腺萎縮は、高齢者の免疫性障害の発生を増加させる主因であると一般に仮定されている。特に、晩年になっての免疫不全、自己免疫、および腫瘍負荷発生の増加は、細胞溶解性Ｔ細胞の活動や分裂促進的な応答など、Ｔ細胞依存的な免疫機能の低下に例えられるような免疫系の不全を反映するものである（Ｈｉｒｏｋａｗａ、１９９８年）。
【０００３】
胸腺萎縮の影響は、末梢では、Ｔ細胞プールへの胸腺からの投入が減少することに表れ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの多様性の減少をもたらす。サイトカイン・プロフィールの変更（Ｈｏｂｂｓ等、１９９３年；Ｋｕｒａｓｈｉｍａ等、１９９５年）、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットの変化、ならびにナイーブＴ細胞に対立するものとしての記憶細胞への偏向（Ｍａｃｋａｌｌ等、１９９５年）も観察されている。さらに、胸腺形成（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｓｉｓ）の効率が加齢に伴って損なわれて、免疫系がＴ細胞の欠乏後に正常なＴ細胞数を再生させる能力が結局失われる（Ｍａｃｋａｌｌ等、１９９５年）。しかし、Ｄｏｕｅｋ等による最近の研究（１９９８年）は、年配のヒトでも胸腺からの産出が起こるという推測を示している。摘出したＴＣＲ遺伝子再編成ＤＮＡ産物を使用すると、ＨＩＶ感染後の年配の患者において、新たに産生されたナイーブＴ細胞が循環することが実証された。この産出速度、およびその後の末梢Ｔ細胞プールの再生速度には、さらに傾注する必要がある。化学療法を受けている思春期後の患者では、Ｔ細胞プール、特にＣＤ４＋Ｔ細胞の再生速度が思春期前の患者よりも大幅に低下するからである（Ｍａｃｋａｌｌ等、１９９５年）。このことは、ＴｉｍｍおよびＴｈｏｍａｎによる最近の研究（１９９９年）でもさらに例証され、骨髄移植後の高齢マウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞が再生されるものの、胸腺のナイーブＴ細胞の産生が弱いことと関連した末梢微小環境の老化のために、免疫記憶細胞に偏向するようであることが示されている。
【０００４】
胸腺の本質は、微小環境を構成し、かつＴ細胞が最適に発達するために必要な成長因子を供給し、細胞相互作用をもたらす多様な間質細胞（大部分は上皮細胞サブセット）内に散在する発達段階の胸腺細胞からなる。胸腺細胞と上皮サブセットの発達上の共生関係がその分化および成熟を制御する（Ｂｏｙｄ等、１９９３年）ということは、一方の細胞型がその後他方の状態に影響を及ぼすレベルで性ステロイドによる抑制が起こり得ることを意味する。放射線キメラを利用するこれまでの調査によって、ＢＭ幹細胞が年齢による影響を受けないこと（Ｈｉｒｏｋａｗａ、１９９８年；ＭａｃｋａｌｌおよびＧｒｅｓｓ、１９９７年）、および潜在する胸腺の再増殖能力が若いＢＭ細胞と同程度であることが示されているので、胸腺細胞自体に固有の欠陥があるとはあまり考えられない。さらに、高齢の動物の胸腺細胞は、少なくともある程度は分化する能力を保持している（ＭａｃｋａｌｌおよびＣｒｅｓｓ、１９９７年；ＧｅｏｒｇｅおよびＲｉｔｔｅｒ、１９９６年；Ｈｉｒｏｋａｗａ等、１９９４年）。しかし、Ａｓｐｉｎａｌｌ（１９９７年）による最近の研究は、ＴＣＲβ鎖遺伝子再編成の段階で起こる、前駆体ＣＤ３−ＣＤ４−ＣＤ８−三重陰性（ＴＮ）集団内の欠陥を示している。
【０００５】
ＡＩＤＳの特定の症例では、免疫系の主たる欠陥は、ＣＤ４＋細胞、および程度はそれほどでないが、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）といった骨髄系列の細胞が破壊されることである。これらなしでは、免疫系が麻痺し、患者は、共通する成り行きとして死を伴う日和見感染に極めてかかりやすくなる。現在のＡＩＤＳ治療は、ＨＩＶウイルスを死滅または激減させるための多数の抗ウイルス薬に基づくものである。このような治療は、現在ではより有効になってきており、患者が寛解にあると考えられる段階までウイルス負荷を劇的に低減する。しかし、機能性のＴ細胞がほとんど存在しないままであり、回復に当たる細胞の働きが非常に緩慢であるので、免疫不全の主要な問題が存在したままである。したがって、免疫不全の期間は、依然として長期間であり、免疫の防御機構が十分に回復しない場合もある。その理由は、思春期後の者の胸腺が萎縮していることにある。
【０００６】
胸腺が新たなＴリンパ球を産生するためには、前駆体細胞が必要であり、我々は３〜４週間までであると示しているが、短期間で、この臓器自体の中から得られ、その細胞が欠乏すると、新たなＨＳＣを取り込まなければならない（正常な環境下では、骨髄から血液を介してということになる）。しかし、正常な機能の若い胸腺においてさえ、そのような細胞の取り込みは非常に少ない（恒常性によって制御されるレベルでＴ細胞の産生を維持するのに十分である）。実際、胸腺への細胞の侵入は、極めて制限されており、事実上ＨＳＣ（またはせめてＴ細胞系列に従ってすでに優先的に発達している前胸腺細胞）に限られる。性ステロイドによる抑制が喪失したために復活しつつある胸腺の事例において、我々は、胸腺がその時に、血中を循環する新たな前駆体細胞に対して非常に受容性になって、新たなＴ細胞が胸腺内と外部の両方の前駆体から発達するようになることを実証した。血中前駆体細胞の濃度を上昇させることによって、これに由来するＴ細胞が段々とＴ細胞プールを支配するようになる。これは、この前駆体（ＨＳＣ）に導入された何らかの遺伝子が、すべての子孫Ｔ細胞に伝わり、結局ほぼすべてのＴ細胞プールに存在するようになることを意味する。内在する宿主ＨＳＣ由来細胞に対するこのような細胞の優位性のレベルは、単に移動する外来ＨＳＣ数を増加させることによって、非常に高いレベルまで高めることも容易である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
当該発明者等は、性ステロイドの産生を阻害することによって、（加齢誘発性、または化学療法や放射線療法などの条件の結果としての）胸腺萎縮を深部から逆転させ、胸腺の構造および機能をほぼ完全に修復できることを実証した。当該発明者等は、このように胸腺が再生する基盤が、一部分、胸腺内と血流経由の両方から得られる前駆体細胞の最初の増殖にあることも発見した。この発見は、対象に注射した外来造血幹細胞（ＨＳＣ）が胸腺に供給され得ることを示唆するものである。
【０００８】
性ステロイドによる胸腺へのシグナル伝達を妨害することによって胸腺に遺伝子改変または外来のＨＳＣを供給できることは、Ｔ細胞（および胸腺で発達する骨髄細胞）の異常を治療するために、ＨＳＣにおける遺伝子治療をより効率よく利用できることを意味する。ＨＳＣ幹細胞治療は、胸腺が休止状態であるので、多くのＨＳＣを取り出すことができず、できたとしてもＨＳＣのＴ細胞産生が正常レベルの１％より少ないために、現在のところほとんどまたは全く成功していない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明の第一の態様では、対象のＴ細胞障害を治療する方法を提供するが、この方法は、対象において性ステロイドによる胸腺へのシグナル伝達を妨害すること、および対象に骨髄またはＨＳＣを移植することを含む。
【００１０】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞障害は、ヒト免疫不全ウイルス感染などのウイルス感染、Ｔ細胞増殖疾患、またはＴ細胞の数もしくは機能を直接もしくは間接に低下させる何らかの疾患からなる群から選択される。対象はＡＩＤＳであり、かつウイルス負荷が抗ウイルス治療によって低減されていることが好ましい。
【００１１】
さらに好ましい実施形態では、対象は思春期後である。
【００１２】
性ステロイド産生の阻害は、性腺摘除または性ステロイド類似体投与のどちらかによって実現することが好ましい。
【００１３】
好ましい性ステロイド類似体には、ユーレキシン（ｅｕｌｅｘｉｎ）、ゴセレリン、ロイプロリド；トリプトレリン、メテレリン（ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）、ブセレリン、ヒステレリン、ナファレリン、ルトレリン、リュープロレリンなど、ジオキサラン（ｄｉｏｘａｌａｎ）誘導体、および黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体が含まれる。一般に、性ステロイド類似体が黄体ホルモン放出ホルモンの類似体であることが好ましい。黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体がデスロレリン（ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）であることがより好ましい。
【００１４】
さらに別の好ましい実施形態では、徐放性ペプチド製剤によって性ステロイド類似体を投与する。徐放ペプチド製剤の例は、ＷＯ９８／０８５３３に提示されており、この全内容を参照により本明細書に組み込む。
【００１５】
好ましい実施形態では、この方法は、対象に濃縮ＨＳＣを移植することを含む。ＨＳＣは、自己由来でも異種性でもよいが、ＨＳＣが自己由来であることが好ましい。
【００１６】
対象がＨＩＶに感染している場合では、ＨＳＣに遺伝子改変を施して、ＨＳＣおよびその子孫、特にＴ細胞、マクロファージ、および樹状細胞がＨＩＶウイルスへの感染および／またはそれによる破壊に抵抗性になるようすることが好ましい。遺伝子改変には、ウイルスの複製、構築、および／または感染を妨げる１種または複数の核酸分子をＨＳＣに導入することが含まれる。核酸分子は、抗ウイルスタンパク質をコードする遺伝子、アンチセンス構築物、リボザイム、ｄｓＲＮＡ、および触媒的な核酸分子でよい。
【００１７】
対象が欠陥のあるＴ細胞を有する場合、ＨＳＣに遺伝子改変を施して、その欠陥を正常にすることが好ましい。Ｔ細胞白血病などの疾患では、遺伝子改変には、ＨＳＣを正常にし、それが癌細胞になる可能性を阻止または低減する核酸構築物または遺伝子を導入することが含まれる。
【００１８】
当該方法が、遺伝的根拠が確定している何らかのＴ細胞障害の治療に有用であることは、当分野の技術者に認められるであろう。好ましい方法は、性ステロイドを阻害することによって、胸腺機能を再活性化させて、血液由来の造血幹細胞（ＨＳＣ）の取り込みを増大させることを含む。一般に、胸腺は、思春期の到来後、性ステロイドの影響下で甚だしく萎縮し、その細胞産生が思春期前の胸腺の１％未満に低下する。本発明は、性ステロイド産生を阻害することによって胸腺の抑制が解除され、血液由来ＨＳＣの取り込みの増大を含む、その機能の完全な再生が可能になるという発見に基づくものである。基になるＨＳＣ源は、直接に注射から得ても、前もって注射しておいた骨髄から得てもよい。改変されたＨＳＣに由来する血液細胞によって、自己再生に由来するＨＳＣを含むその子孫細胞にその遺伝子改変が伝わること、さらに胸腺でのＴ細胞および樹状細胞系列に従うＨＳＣの発達が、性ステロイドの阻害による胸腺機能の再活性化によって、完全には促進されないとしても大幅に増強されることが予想される。
【００１９】
本発明の方法は、特にＡＩＤＳ治療向けであり、その治療が、ウイルス負荷を低減すること、性ステロイドの阻害によって胸腺機能を再活性化すること、および遺伝子改変を施して、すべての子孫（特にＴ細胞、ＤＣ）が更なるＨＩＶ感染に抵抗性になるようにした（自己または第二当事者ドナーから得た）ＨＳＣを患者に移植することを含むことが好ましい。これは、Ｔ細胞が正常レベルに戻っているので患者のＨＩＶウイルスが激減し、一般の感染にかかりにくくなるだけでなく、ＨＩＶに抵抗性のある新たなＴ細胞によって、残存するウイルスに感染した細胞を除去できることも意味する。原則として、Ｔ細胞の何らかの欠陥、またはＴ細胞を標的とする何らかのウイルス感染を対象とするＨＳＣの遺伝子治療にも、同様の戦略を適用することができる。
【００２０】
定義
表現「Ｔ細胞集団の構造改変」は、機能上、かつ特徴のある分子の発現によって定義付けされたＴ細胞サブセットの性質および／または比率を変更することを指す。これらの特徴のある分子の例には、それだけに限らないが、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ６９が含まれる。
【００２１】
表現「Ｔ細胞数を増加させる」は、胸腺中、および／または循環系中、および／または脾臓中、および／または骨髄中、および／またはリンパ節、消化管、泌尿生殖器系、呼吸器系など、末梢組織中における対象のＴ細胞数の絶対的な増加を指す。この表現は、たとえばＢ細胞に対するＴ細胞の相対的な増加も指す。
【００２２】
「Ｔ細胞の集団または機能が低下状態または異常である対象」には、ヒト免疫不全ウイルスに感染した個体、特にＡＩＤＳ、またはＴ細胞を攻撃する他の何らかのウイルスもしくは感染、または欠陥遺伝子が特定された何らかのＴ細胞疾患を患う個体が含まれる。
【００２３】
さらに、この表現には、思春期後の任意の個体、特に思春期後の胸腺萎縮の結果として免疫応答性が低下し、疾患発生率の高まった高齢者も含まれる。
【００２４】
本明細書の全体にわたって、語句「含む」、または「含むこと」などの変形語が、記載の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を含むことを意味し、他の何らかの要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を除外するものではないことは理解されよう。
【００２５】
性ステロイドシグナル伝達についての説明
容易にわかることであるが、胸腺への性ステロイドシグナル伝達は、ある範囲の方法、たとえば、性ステロイド産生の阻害または胸腺内の性ステロイド受容体の遮断という形で妨害することができる。性ステロイド産生の阻害は、たとえば性腺摘除、性ステロイド類似体の投与、および他のよく知られている技術によって実現できる。臨床例によっては、物理的な性腺摘除による性腺の永久的な除去が適用されることもある。好ましい実施形態では、性ステロイド類似体、好ましくは黄体ホルモン放出ホルモン類似体を投与することによって胸腺への性ステロイドシグナル伝達を妨害する。この類似体が（米国特許４２１８４３９号に記載されている）デスロレリンであることが一般に好ましい。
【００２６】
性ステロイド類似体
性ステロイド類似体、ならびにそれを治療および「化学的性腺摘除」において使用することはよく知られている。そのような類似体の例には、（ＦＲ７９２３５４５、ＷＯ８６／０１１０５、およびＰＴ１００８９９に記載されている）ユーレキシン、（ＵＳ４１００２７４、ＵＳ４１２８６３８、ＧＢ９１１２８５９、およびＧＢ９１１２８２５に記載されている）ゴセレリン、（ＵＳ４４９０２９１、ＵＳ３９７２８５９、ＵＳ４００８２０９、ＵＳ４００５０６３、ＤＥ２５０９７８３、およびＵＳ４９９２４２１に記載されている）リュープロリド；ＥＰ４１３２０９に記載されているもの、（ＵＳ４０１０１２５、ＵＳ４０１８７２６、ＵＳ４０２４１２１、ＥＰ３６４８１９、およびＵＳ５２５８４９２に記載されている）トリプトレリン、（ＥＰ２３９０４に記載されている）メテレリン、（ＵＳ４００３８８４、ＵＳ４１１８４８３、およびＵＳ４２７５００１に記載されている）ブセレリン、（ＥＰ２１７６５９に記載されている）ヒステレリン、（ＵＳ４２３４５７１、ＷＯ９３／１５７２２、およびＥＰ５２５１０に記載されている）ナファレリン、（ＵＳ４０８９９４６に記載されている）ルテレリン、（Ｐｌｏｓｋｅｒ等に記載されている）リュープロレリンなど、ジオキサラン誘導体；およびＥＰ１８１２３６、ＵＳ４６０８２５１、ＵＳ４６５６２４７、ＵＳ４６４２３３２、ＵＳ４０１０１４９、ＵＳ３９９２３６５、およびＵＳ４０１０１４９号に記載されているものなど、ＬＨＲＨ類似体が含まれる。上記事項に関連した各参照文献の開示を相互参照により本明細書に組み込む。
【００２７】
当分野の技術者には、胸腺への性ステロイドシグナル伝達を妨害する手段の少なくともいくつかは、相応する化合物が投与される間に限って、有効であることが理解されよう。そのため、本発明のある実施形態の利点は、一度本発明の所望の免疫学的効果が実現されれば（２〜３カ月）、治療を止めることができ、対象の生殖系も正常に戻ることである。
【００２８】
造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子改変
幹細胞および前駆細胞を単離し、形質導入する方法は、当分野の技術者によく知られているはずである。この種の方法の例は、たとえばＷＯ９５／０８１０５、ＵＳ５，５５９，７０３、ＵＳ５，３９９，４９３、ＵＳ５，０６１，６２０、ＷＯ９６／３３２８１、ＷＯ９６／３３２８２、ＵＳ５，６８１，５５９、およびＵＳ５，１９９，９４２に記載されている。
【００２９】
アンチセンスポリヌクレオチド
本明細書で使用する用語「アンチセンス」は、本発明のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配列を指す。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモータに逆配向の問題の遺伝子を連結することによって合成することを含む何らかの方法によって作製すればよい。一度細胞に導入すれば、この転写された鎖が細胞によって産生された自然配列と合わさって、二重鎖が形成される。次いでその二重鎖が更なる転写または翻訳をブロックする。この方式では、変異表現型が生じることもある。
【００３０】
触媒的な核酸
用語触媒的な核酸は、別個の基質を特異的に認識し、かつその基質の化学修飾を触媒する（当技術分野で「デオキシリボザイム」もしくは「ＤＮＡｚｙｍｅ」としても知られている）ＤＮＡ分子もしくはＤＮＡ含有分子、または（「リボザイム」としても知られている）ＲＮＡもしくはＲＮＡ含有分子を指す。触媒的な核酸中の核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ、ならびにこれらの誘導体とすることができる。これらの塩基の誘導体は、当技術分野でよく知られている。
【００３１】
通常、触媒的な核酸は、標的の核酸を特異的に認識するためのアンチセンス配列、および核酸を切断する酵素活性を含む。触媒鎖は、標的核酸中の特定の部位を切断する。本発明において特に有用なリボザイムの型は、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８年；Ｐｅｒｒｉｍａｎ等、１９９２年）およびヘアピンリボザイム（Ｓｈｉｐｐｙ等、１９９９年）である。
【００３２】
ｄｓＲＮＡ
ｄｓＲＮＡは、あるタンパク質の産生を特異的に阻害するのに特に有用である。特定の理論に拘泥するものではないが、ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＰａｒｋｓ（１９９５年）は、ｄｓＲＮＡを使用してタンパク質産生が低減できる機構のモデルを提示している。このモデルは、最近改変され、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等が発展させている（１９９８年）。この技術は、問題の遺伝子のｍＲＮＡ、すなわちこの場合では本発明の第一の態様に従うポリペプチドをコードするｍＲＮＡと本質的に同一な配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在を利用するものである。好都合なことに、ｄｓＲＮＡは、組換え型ベクターまたは宿主細胞中の単鎖のオープンリーディングフレーム内で産生することができるが、そこでは、センス配列およびアンチセンス配列が無関係の配列に隣接しており、これにより無関係の配列がループ構造を形成し、センス配列とアンチセンス配列がハイブリッド形成して、ｄｓＲＮＡ分子の形成が可能になる。本発明に適するｄｓＲＮＡ分子の設計および産生は、当分野の技術者の力量範囲内で、特にＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＰａｒｋｓ（１９９５年）、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等（１９９８年）、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、およびＷＯ０１／３４８１５を考慮すれば十分である。
【００３３】
抗ＨＩＶ構築物
当分野の技術者なら、本発明での使用に適する抗ＨＩＶ構築物を開発できるはずである。実際、いくつかの抗ＨＩＶアンチセンス構築物およびリボザイムがすでに開発されており、たとえばＵＳ５，８１１，２７５、ＵＳ５，７４１，７０６、ＷＯ９４／２６８７７、ＡＵ５６３９４／９４、およびＵＳ５，１４４，０１９に記載されている。
【００３４】
【実施例】
実施例１−加齢誘発性胸腺萎縮の逆転
材料および方法
動物
モナッシュ大学Ｃｅｎｔｒａｌ Ａｎｉｍａｌ ＳｅｒｖｉｃｅｓからＣＢＡ／ＣＡＨおよびＣ５７Ｂ１６／Ｊオスのマウスを入手し、従来の条件下で収容した。年齢は、生後４〜６週間の範囲から２６カ月であり、関係のある場合は表示する。
【００３５】
性腺摘除
食塩水に含ませた０．３ｍｇのキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ； Ｂａｙｅｒ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｌｔｄ．、オーストラリアＮＳＷ Ｂｏｔａｎｙ）および１．５ｍｇの塩酸ケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ； Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ、オーストラリアＮＳＷ Ｃａｒｉｎｇｂａｈ）０．３ｍ１を腹腔内注射することによって、動物に麻酔をかけた。外科的な性腺摘除は、陰嚢切開して、精巣を露出させ、これを縫合材で結び、次いで周囲の脂肪組織と共に除去することによって行った。
【００３６】
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込み
マウスに、４時間間隔で２回、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）（ＰＢＳ１００μｌ中１００ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射を施した。対照マウスには、賦形剤のみの注射を施した。２回目の注射から１時間で、胸腺を解剖し、ＦＡＣＳ解析に向けて細胞懸濁液を作製し、またはＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（Ｏ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ、Ｍｉｌｅｓ ＩＮＣ．米国インディアナ州）中に直ちに包埋し、液体窒素中で急速冷凍（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）し、使用するまで−７０℃で保存した。
【００３７】
フローサイトメトリー解析
ＣＯ２で窒息させることによってマウスを死亡させ、胸腺、脾臓、および腸間膜リンパ節を取り出した。冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．０２％アジド中、臓器を静かに２Ｏ０μｍのふるいにかけ、遠心分離（６５０ｇ、５分間、４℃）し、いずれかのＰＢＳ／ＦＣＳ／Ａｚに再懸濁させた。脾臓細胞を赤血球溶解緩衝液（８．９ｇ／リットルの塩化アンモニウム）中、４℃で１０分間インキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ／ＦＣＳ／Ａｚに再懸濁させた。血球計算器および臭化エチジウム／アクリジンオレンジを使用して、細胞の濃度および生存度を正副二通り測定し、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツＯｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）で調べた。
【００３８】
三重染色免疫蛍光法では、抗αβＴＣＲ−ＦＩＴＣもしくは抗γδＴＣＲ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４−ＰＥ、および抗ＣＤ８−ＡＰＣ（すべて米国カリフォルニア州サンディエゴＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手した）で胸腺細胞を型どおりに標識してから、フローサイトメトリー解析にかけた。脾臓およびリンパ節懸濁液は、αβＴＣＲ−ＦＩＴＣ／ＣＤ４−ＰＥ／ＣＤ８−ＡＰＣ、またはＣＤ４−ＰＥおよびＣＤ８−ＡＰＣ添加Ｂ２２０−Ｂ（Ｓｉｇｍａ）のどちらかで標識した。Ｂ２２０−Ｂは、米国カリフォルニア州バーリンゲームＣａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したストレプトアビジン３色素コンジュゲートで可視化した。
【００３９】
ＢｒｄＵ検出では、細胞の表面をＣＤ４−ＰＥおよびＣＤ８−ＡＰＣで標識してから、これまでに述べられているとおりに（ＣａｒａｙｏｎおよびＢｏｔｈ、１９８９年）、固定および透過化処理を施した。手短に述べれば、染色した細胞を１％ＰＦＡ／Ｏ．Ｏ１％Ｔｗｅｅｎ−２０中、４℃で一晩かけて固定した。細胞を洗浄し、５００μｌのＤＮａｓｅ（１００Ｋｕｎｉｔｚ ｕｎｉｔｓ、ドイツＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中、３７℃で３０分間インキュベートして、ＤＮＡを変性させた。最後に、細胞を抗−ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と共にインキュベートした。
【００４０】
四重染色免疫蛍光法では、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２Ｏ、およびＭａｃ−１について胸腺を標識し、抗ラットＩｇ−Ｃｙ５（英国Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって集合的に検出し、陰性細胞（ＴＮ）は分析にかけた。陰性細胞は、これまでに述べられているとおりに（ＧｏｄｆｒｅｙおよびＺｌｏｔｎｉｋ、１９９３年）、ＣＤ２５−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＣＤ４４−Ｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、その後ストレプトアビジン３色素（米国カリフォルニア州Ｃａｌｔａｇ）でさらに染色した。次いで上述のとおりにＢｒｄＵ検出を行った。
【００４１】
試料をＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。０°および９０°の光散乱プロフィールに従って生存可能なリンパ球にゲートをかけ、Ｃｅｌｌ ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してデータを解析した。
【００４２】
免疫組織学
クリオスタット（Ｌｅｉｃａ）を使用して凍結胸腺を切片（４μｍ）に切断し、直ちに１００％のアセトン中で固定した。
【００４３】
二重染色免疫蛍光法では、この実験室で産生された単クローン抗体：ＭＴＳ６、１０、１２、１５、１６、２０、２４、３２、３３、３５、および４４（Ｇｏｄｆｒｅｙ等、１９９０年；表１）のパネルで切片を二重に標識し、多価ウサギ抗サイトケラチンＡｂ（Ｄａｋｏ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ）を用いて上皮細胞決定因子の同時発現を評価した。結合したｍＡｂをＦＬＴＣ接合ヒツジ抗ラットＩｇ（Ｓｉｌｅｎｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で可視化し、抗サイトケラチンをＴＲＩＴＣ接合ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｓｉｌｅｎｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で可視化した。
【００４４】
ブロモデオキシウリジン検出では、切片を抗サイトケラチン、続いて抗ウサギＴＲＩＴＣまたは特定のｍＡｂのどちらかで染色し、次いでそれを抗ラットＩｇ−Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で可視化した。次いで、これまでに述べられているとおりに（Ｐｅｎｉｔ等、１９９６年）ＢｒｄＵ検出を行った。手短に述べれば、切片を３０分間７０％エタノール中で固定した。半乾燥切片を４ＭのＨＣｌ中でインキュベートし、ホウ酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中で洗浄することによって中和してから、ＰＢＳ中で２回洗浄した。抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＢｒｄＵを検出した。
【００４５】
三重染色免疫蛍光法では、特定のＭＴＳｍＡｂ、ならびに抗サイトケラチンで切片を標識した。次いで、上述のとおりにＢｒｄＵ検出を行った。
【００４６】
ライカ蛍光顕微鏡およびニコン共焦点顕微鏡を使用して、切片を解析した。
【００４７】
遊走研究
食塩水に含ませた０．３ｍｇのキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ； Ｂａｙｅｒ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｌｔｄ．、オーストラリアＮＳＷ Ｂｏｔａｎｙ）および１．５ｍｇの塩酸ケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ； Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ、オーストラリアＮＳＷ Ｃａｒｉｎｇｂａｈ）０．３ｍ１を腹腔内注射することによって、動物に麻酔をかけた。
【００４８】
胸腺細胞のＦＩＴＣ標識技術の詳細は、他で記載されているもの（Ｓｃｏｌｌａｙ等、１９８０年； Ｂｅｒｚｉｎｓ等、１９９８年）と同様である。手短に述べれば、胸腺葉を露出させ、各葉に３５０μｇ／ｍｌの（ＰＢＳ中）ＦＩＴＣ約１０μｍを注射した。傷を外科用ステープルで閉じ、麻酔から完全に回復するまでマウスを暖めた。注射してからおよそ２４時間目に、ＣＯ２で窒息させることによってマウスを死亡させ、分析用にリンパ系臓器を取り出した。
【００４９】
細胞をカウントした後、試料を抗ＣＤ４−ＰＥおよび抗ＣＤ８−ＡＰＣで染色し、次いでフローサイトメトリーによって解析した。（自己蛍光性細胞およびダブレットを除くために）ＣＤ４またはＣＤ８のどちらかを発現している、生きているＦＩＴＣ＋細胞を遊走細胞として識別した。ＦＩＴＣ＋ＣＤ４およびＣＤ８細胞の百分率を加味して、リンパ節および脾臓についてのそれぞれの総遊走百分率を得た。１日毎の送出速度の算出は、Ｂｅｒｚｉｎｓ等（１９９８年）が記載しているとおりに行った。
【００５０】
データは、独立スチューデント「ｔ」検定を使用して解析し、またはノンパラメトリックなＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、少なくとも３通り実施した実験について、対照の結果と試験結果の統計学的有意性を判定した。対照の値と有意に相違する実験値を、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、および＊＊＊ｐ≦Ｏ．００１と示す。
【００５１】
結果
加齢が胸腺細胞集団に及ぼす影響
（ｉ）胸腺重量および胸腺細胞数
加齢に伴って、胸腺重量（図１Ａ）および総胸腺細胞数（図１Ｂ）の両方に有意性の高い（ｐ≦０．０００１）減少が見られる。若年成体の相対的胸腺重量（ｍｇ胸腺／ｇ体重）の平均値は、３．３４であるが、１８〜２４カ月の年齢では０．６６に減少する（脂肪沈着によって正確な算出には限界がある）。胸腺重量の減少は、総胸腺細胞数が減少した結果であると言える。１〜２カ月の胸腺は〜６．７×１０７個の胸腺細胞を含有しているが、２４カ月までに〜４．５×１０６個の細胞に減少するのである。性腺摘除によって胸腺への性ステロイドの影響を取り払うと、再生が起こり、性腺摘除後４週間までに、胸腺の重量と細胞密度の両方が若年成体と同等になる（図１Ａおよび１Ｂ）。興味深いことに、性腺摘除後２週間で胸腺細胞数が有意に（ｐ≦０．００１）増加し（約１．２×１０８）、性腺摘除後４週間目までに正常な若年の水準に回復する（図１Ｂ）。
【００５２】
胸腺によって産生されるＴ細胞数の減少は、末梢には表れず、脾臓細胞数は、加齢に従って一定のままである（図２Ａ）。脾臓およびリンパ節におけるＢ細胞対Ｔ細胞の比は、加齢、およびその後Ｔ細胞数の減少が末梢に到達することによる影響を受けず、末梢における恒常性の機構が明らかになった（図２Ｂ）。しかし、ＣＤ４＋対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、２カ月の加齢で２：１であったのが２年の加齢で１：１となり、加齢と共に有意に低下した（ｐ≦０．００１）（図２Ｃ）。性腺摘除に従い、かつその後Ｔ細胞数の上昇が末梢に到達しても、末梢Ｔ細胞数の変化は観察されなかった。脾臓およびリンパ節の両方におけるＴ細胞数およびＢ細胞：Ｔ細胞の比が、性腺摘除に従って変化しなかったのである（図２ＡおよびＢ）。加齢に伴う末梢でのＣＤ４：ＣＤ８比の低下は、性腺摘除後２週間では依然として歴然としていたが、性腺摘除後４週間までに完全に逆転した（図２Ｃ）。
【００５３】
（ｉｉ）αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、ＣＤ４、およびＣＤ８の発現
加齢に伴って見られる胸腺細胞数の減少が特定の細胞集団が欠乏した結果であったかを判定するために、胸腺細胞を定義付けマーカーで標識して、別々の亜集団を分析した。さらにこれによって、性腺摘除後に胸腺が再増殖する動態を解析することも可能になった。主な胸腺細胞亜集団の割合を正常な若年胸腺と比較すると（図３）、年齢に対しては変化しないままであることが判明した。その上、αβＴＣＲおよびγδＴＣＲの発現によって胸腺細胞をさらに細区画しても、これらの集団の加齢に伴う比率の変化は明らかにならなかった（データ非表示）。性腺摘除後２および４週間でも、胸腺細胞亜集団は同じ比率のままであり、性腺摘除後に胸腺細胞数が最高で１００倍まで増加したので、これは、増殖の進行が発達していくというよりも、すべての胸腺細胞サブセットが同時期に増殖したことを示唆している。
【００５４】
したがって、高齢の動物の胸腺で見られる細胞数の減少は、すべての細胞表現型がバランスよく減少した結果であると思われ、Ｔ細胞集団の有意な変化も検出されいない。胸腺の再生は、すべてのＴ細胞亜集団が連続してというよりも同時に補充され、同時期に起こるものである。
【００５５】
胸腺細胞の増殖
図４．１に示すとおり、４〜６週間の加齢で１５〜２０％の胸腺細胞が増殖している。これらの大多数（〜８０％）はＤＰであり、ＴＮサブセットが約６％で、次に大きな集団を構成している（図４．２Ａ）。したがって、免疫組織学によって、分裂の大部分がサブカプセルおよび皮質に見られる（データ非表示）。髄質領域に見られる分裂もあり、ＦＡＣＳ解析によって、ＳＰ細胞（ＣＤ４Ｔ細胞が９％およびＣＤ８Ｔ細胞が２５％）が分裂する割合が明らかになっている（図４．２Ｂ）。
【００５６】
高齢の胸腺では細胞数が有意に減少したが、胸腺細胞の増殖は、２年で１２〜１５％に減少しながらも一定したままであり（図４．１）、増殖集団の表現型は、２カ月の胸腺と似ている（図４．２Ａ）。免疫組織学によって、１年の加齢での分裂は若年成人で見られるものを反映するが、２年では、増殖が主に皮質の外側に見られ、脈管構造を取り巻いていることが明らかになった（データ非表示）。性腺摘除後２週間では、胸腺細胞数が有意に増加するが、増殖する胸腺細胞の割合に変化はなく、細胞が同時期に増殖することが重ねて示唆される（図４．１）。免疫組織学によって、性腺摘除後２週間までに、胸腺細胞の増殖の局在性、および分裂細胞の程度が生後２カ月の胸腺の状態に似てくることが明らかになった（データ非表示）。増殖集団に相当する各亜集団の割合を分析すると、増殖集団に含まれるＣＤ８Ｔ細胞の百分率が有意に（ｐ＜０．００１）増加していた（２年２カ月の加齢で１％であったのが性腺摘除後２週間で約６％に増加）（図４．２Ａ）。
【００５７】
図４．２Ｂは、若年、高齢、および性腺摘除マウスの各サブセット内での増殖の程度を示している。ＤＮサブセット内の増殖には、有意な（ｐ≦０．００１）低下が見られた（２カ月での３５％が２年までに４％になった）。高齢の胸腺の髄質でははっきりとした分裂がないという免疫組織学（データ非表示）による発見を反映して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖も有意に（ｐ≦０．００１）低下した。ＤＮの増殖の低下は、性腺摘除後４週間でも正常な若年の水準に戻らない。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの範囲内では、性腺摘除後２週間で有意に（ｐ≦０．００１）増殖が増大し、性腺摘除後４週間で正常な若年の水準に戻りつつある。
【００５８】
マーカーのＣＤ４４およびＣＤ２５を使用して、ＤＮサブセットの範囲内の増殖低下をさらに分析した。ＤＮ亜集団は、胸腺細胞前駆体に加え、αβＴＣＲ＋ＣＤ４−ＣＤ８−胸腺細胞を含み、ＳＰ細胞への遷移期では両方の補助受容体をダウンレギュレートしていると考えられている（Ｇｏｄｆｒｅｙ ＆ Ｚｌｏｔｎｉｋ、１９９３年）。これらの成熟細胞にゲートをかけることによって、真のＴＮ区画（ＣＤ３−ＣＤ４−ＣＤ８−）を解析することが可能になったが、これらの細胞は、加齢または性腺摘除後の増殖速度に差がなかった（図４．２Ｃ）。しかし、ＣＤ４４およびＣＤ２５を発現している亜集団の解析では、ＴＮ１サブセット（ＣＤ４４＋ＣＤ２５−）の増殖が、正常な若年の２０％から１８カ月の加齢での約６％へと有意に（ｐ≦０．００１）低下し（図４．２Ｄ）、性腺摘除後４週間までに回復した。ＴＮ１サブセットの増殖の低下は、ＴＮ２亜集団（ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋）の増殖が有意に（ｐ≦０．００１）増大することによって補償され、性腺摘除後２週間までに正常な若年の水準に戻った（図４．２Ｄ）。
【００５９】
加齢が胸腺微小環境に及ぼす影響
ポリクローナル抗サイトケラチンＡｂで二重標識したＭＴＳシリーズから得たｍＡｂ類の広範なパネルを使用する免疫蛍光法によって、加齢に伴う胸腺微小環境の変化を調べた。
【００６０】
そのようなｍＡｂによって認識された抗原は、３つの群、すなわち胸腺上皮サブセットと、血管性抗原と、間質細胞および胸腺細胞に存在するものとに細分できる。
【００６１】
（ｉ）上皮細胞抗原
２才のマウスの胸腺に抗ケラチン染色（全上皮）を施すと、上皮細胞の甚大な組織崩壊を伴い、かつ皮髄境界部が不明瞭になる胸腺構造全体の損害が明らかになった。ＭＴＳ１０（髄質）およびＭＴＳ４４（皮質）のｍＡｂを使用する別の分析では、加齢に伴って皮質サイズが明らかに縮小したことが示され、髄質上皮の縮小はそれほどでもなかった（データ非表示）。無上皮細胞領域、すなわちケラチン陰性区域（ＫＮＡ’ｓ、ｖａｎ Ｅｗｉｊｋ等、１９８０年； Ｇｏｄｆｒｅｙ等、１９９０年； Ｂｒｕｉｊｎｔｊｅｓ等、１９９３年）ではより明白であり、抗サイトケラチン標識で明らかであったように、高齢の胸腺ではサイズが縮小した。高齢胸腺では、特に髄質領域で顕著であるが、胸腺上皮の「嚢胞様（ｃｙｓｔ−ｌｉｋｅ）」構造も出現している（データ非表示）。脂肪沈着、胸腺サイズの甚大な縮小、および皮髄境界部の完全性の低下が、抗サイトケラチン染色によって決定的に示されている（データ非表示）。胸腺は、性腺摘除後２週間で再生し始める。これは、胸腺葉のサイズ（ａ）、ＭＴＳ４４によって明らかになる皮質上皮の増大（ｂ）、および髄質上皮の局在性（ｃ）において明らかである。髄質上皮をＭＴＳ１０によって検出すると、２週間では、ＭＴＳ１０で染まった上皮サブポケットがまだ皮質全体に散在している。性腺摘除後４週間までには、髄質と皮質が明瞭になり、皮髄境界部が見分けられる。
【００６２】
マーカーのＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４は、始原上皮細胞を検出するので（Ｇｏｄｆｒｅｙ等、１９９０年）、さらに高齢胸腺の変性を示すことが想定される。これらのマーカーは、Ｅ１４に豊富に存在し、４〜６週間目に孤立した髄質上皮細胞クラスターを検出するが、高齢胸腺で再び度合が増す（データ非表示）。性腺摘除の後、このような抗原がすべて若年成人の胸腺と同等の水準で発現し、ＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４は、皮髄境界部に位置する上皮の別個のサブポケットに戻る（データ非表示）。
【００６３】
（ｉｉ）血管性抗原
血液胸腺関門は、胸腺へのＴ細胞前駆体の移入および胸腺から末端への成熟Ｔ細胞の移出を担っていると考えられる。
【００６４】
ｍＡｂのＭＴＳ１５は、胸腺血管の内皮に特異的であり、粒状の散乱する染色パターン（Ｇｏｄｆｒｅｙ等、１９９０年）を示す。高齢の胸腺では、ＭＴＳ１５の発現が大幅に増加し、血管および血管周囲腔の出現率およびサイズが増大したことが反映される（データ非表示）。
【００６５】
コラーゲン、ラミニン、フィブリノゲンなど、重要な構造分子および細胞接着分子を含む胸腺の細胞外基質は、ｍＡｂのＭＴＳ１６によって検出する。正常な若年胸腺全体に散在しているので、ＭＴＳ１６の発現性は、高齢胸腺でより広範かつ相互連結的になる。性腺摘除後２週間ではＭＴＳ１６の発現がさらに増加するが、性腺摘除後４週間ではこの発現が２カ月の胸腺の状態になる（データ非表示）。
【００６６】
（ｉｉｉ）共有抗原
正常若年胸腺でのＭＨＣＩＩの発現は、ｍＡｂのＭＴＳ６によって検出したところ、皮質上皮で著しく陽性（粒状）であり（Ｇｏｄｆｒｅｙ等、１９９０年）、髄質上皮の染色はそれよりも弱い。高齢胸腺では、ＭＨＣＩＩの発現が減少し、性腺摘除後２週間で発現がかなり増加する。性腺摘除後４週間までには、発現が再び減少し、生後２カ月の胸腺と同じようになってくる（データ非表示）。
【００６７】
胸腺細胞の移出
若年マウスでは、毎日およそ１％のＴ細胞が胸腺から移出する（Ｓｃｏｌｌａｙ等、１９８０年）。我々は、その数は有意に（ｐ≦０．０００１）減少したものの、１４カ月、さらには２年の加齢でも正常な若年マウスと同等の比例速度で移出が起こっていたことを発見した（図５ａおよび５ｂ）。性腺摘除後２週間までに、高齢マウスに比べてＲＴＥが有意に低下したことが認められた（ｐ≦０．０１）。移出する細胞数が変化したにもかかわらず、移出速度（ＲＴＥ／総胸腺細胞）は加齢に従って一定のままであった（図５ｂ）。しかし、性腺摘除後２週間では、これが有意に低下しており（ｐ≦０．０５）、この時に総胸腺細胞数が増加したことを反映している。興味深いことに、ＲＴＥのＣＤ４：ＣＤ８比が、２カ月の約３：１から２６カ月の約７：１増大した（図５ｃ）。性腺摘除後１週間までに、この比が正常になった（図５ｃ）。
【００６８】
実施例２−化学療法もしくは放射線誘発性胸腺萎縮の逆転
性腺摘除マウスは（処置の１週間前または処置当日）、照射またはシクロホスファミド処置後に胸腺再生速度の有意な上昇を示した。
【００６９】
照射を受けたマウスの胸腺では、急速分裂細胞が欠乏すると同時に、胸腺構造が著しく崩壊する。皮質の崩壊は、加齢／ヒドロコルチゾン処置胸腺を連想させるものであり、ＤＮおよびＤＰ胸腺細胞の喪失を示す。ＣＤ４＋ＳＰ胸腺細胞およびＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞上のαβ−ＴＣＲの発現がダウンレギュレートされているが、これは細胞にアポトーシスが起こっている証拠である。それに比べると、シクロホスファミドで処置した動物では、胸腺構造の崩壊がそれほど甚大でなく、ＤＮおよびＤＰ胸腺細胞の再生速度がより速い。
【００７０】
性腺摘除マウスでは、治療後１週間までに、その初期段階でさえ有意に胸腺が再生した（図６、７、および８）。それに比べると、非性腺摘除動物では、ＤＮおよびＤＰ胸腺細胞（急速分裂細胞）の喪失が甚大であり、その後ＣＤ４およびＣＤ８細胞（放射線抵抗性）の割合が増大した。性腺摘除後１週間でさえ胸腺サイズが少なくとも４倍増大する性腺摘除動物との胸腺細胞数の差が、これを最もよく例示する。２週間までには、ＤＮおよびＤＰの両方の胸腺細胞が再生し、非性腺摘除動物の胸腺細胞が相対的に正常になった。しかし、胸腺細胞の割合は、依然として若年成体の対照胸腺と同等でなかった。実際、２週間では、性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスの制御速度の大幅な差が最大になった（４週間までには、処置群同士で胸腺細胞数が同等になった）。
【００７１】
興味深いことに、胸腺サイズが、対照胸腺の基線を「超え過ぎ」ているように思われる。胸腺内での急速な増殖が示唆されるが、これらの新たに得られた胸腺細胞の遊走はまだ起こっていない（胸腺細胞が遊走し、末梢へ出て行くのに約３〜４週間かかる）。したがって、末梢に放出される前では、各亜集団範囲内の割合は等しいものの、胸腺細胞数は確立途中にある。
【００７２】
図９は、Ｔ細胞の再生を増強する場合において、外科的性腺摘除と化学的性腺摘除の使用を比較したものを示している。化学的性腺摘除の動態は、外科的なものよりずっと緩慢であり、すなわち、マウスがその循環性ステロイドレベルを低下させるのに３週間長くかかるのである。しかし、図９に示すとおり、化学的性腺摘除は、胸腺の再生において有効であることに変わりない。
【００７３】
実施例３−性ステロイド阻害後に胸腺が再生した結果、末梢Ｔ細胞機能の欠陥が回復する
性腺摘除によって免疫応答が向上し得るかを判定するために、疾患の進行およびＣＴＬ（細胞障害性）Ｔ細胞の役割を調査することが可能なので、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）による免疫化を調べた。性腺摘除マウスでは、応答性が質的にも量的にも向上する。足蹠および膝窩（流入領域）リンパ節においてマウスに免疫化を施し、免疫化後５日で分析を行った。さらに、足蹠を取り出し、均質化して、実験中の特定の時点でウイルス力価を決定した。
【００７４】
免疫化後５日では、性腺摘除マウスのリンパ節細胞密度が、高齢マウスより有意に高い（図ｌ０ａ）。加齢後でも性腺摘除後でも活性化（ＣＤ８＋ＣＤ２５＋）細胞の割合に差は見られないが、高齢対照と比べると、性腺摘除によってリンパ節内の活性化細胞数が有意に増加している（図１０ｃ）。さらに、活性化細胞数は、若年成体マウスで認められる細胞数と相関しており、性腺摘除マウスでＣＴＬがより高い程度に活性化されていることを示すが、若年成体マウスは、Ｂ細胞の活性化により拡大したリンパ節を有することもある。加齢および性腺摘除後に見出される特定の溶解の割合を検出するＣＴＬアッセイによって、これを確認した（図１１）。高齢マウスでは、作動体：標的比が１０：１および３：１であり、若年成体（２カ月）マウスと比べて、標的細胞の溶解が有意に低減した（図１１）。性腺摘除によって、マウスがＨＳＶ感染後に特定のＣＴＬ応答を発生させる能力が回復した（図１１）。
【００７５】
免疫化後では、ＨＳＶに応答するＣＴＬのために、Ｖβ１０の利用に４０％の偏りがある。Ｖβの発現について高齢および性腺摘除マウスを分析すると、これが優勢であることが判明した（図１２ａ）。しかし、高齢マウスの試料では、このような偏りは認められなかった（図１３）。さらに、若年成体マウスおよび性腺摘除マウスと比べて、加齢に伴って流入領域（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節でのＣＤ４＋Ｔ細胞の減少が見られた（図１２ｂ）。これは、生涯にわたり胸腺からのＴ細胞産生を増大させて、免疫応答を最大にすることが生命維持に必要であることを示すものである。
【００７６】
実施例４−性ステロイドの阻害によって胸腺への新たな造血前駆細胞の取り込みが向上し、これによって宿主とドナーのリンパ球（Ｔ、Ｂ、および樹状細胞）のキメラ混合物が得られる
これまでの実験によって、臓器移植が受容される際、微小キメラの形成が重要な役割を担うことが示されている。移植片抗原に対して寛容になる際に樹状細胞が不可欠な役割を担うことも示されている。したがって、性腺摘除が胸腺のキメラ形成および樹状細胞数に及ぼす影響を調査した。
【００７７】
同系の実験では、処置群あたり生後３カ月のマウス４匹を用いた。対照はすべて年齢一致させ、処置を行わなかった。類遺伝子実験では、処置群あたり生後８カ月のマウス３〜４匹を用いた。対照はすべて年齢を一致させ、処置を行わなかった。
【００７８】
同系マウスの致死的照射、胎児肝組織再構築、および性腺摘除後の胸腺の変化　性腺摘除および非性腺摘除再構築マウスの総胸腺細胞数を、未処置の年齢一致対照と比較したので、図１４に要約する。処置後２週間と４週間の両方において、性腺摘除マウスでは非性腺摘除マウスに比べてリンパ球数が有意に増加した（ｐ≦０．０５）。６週間では、細胞数は依然として対照のレベルを下回っていたが、性腺摘除マウスの細胞数は、非性腺摘除マウスより３倍多かった（ｐ≦０．０５）（図１４Ａ）。
【００７９】
致死的照射、同系胎児肝組織再構築、および性腺摘除後の脾臓の変化
性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方において、照射および再構築後４週間および６週間目で脾臓の総細胞数が大幅に減少した。２週間では、性腺摘除処置群と非性腺摘除処置群の総脾臓細胞数に差は見られなかったが、ここでも、その調査時の性腺摘除マウスのリンパ球数が非性腺摘除マウスに比べて増加していた（ｐ≦０．０５）（図１４Ｂ）。
【００８０】
致死的照射、同系胎児肝組織再構築、および性腺摘除後の腸間膜リンパ節
性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスの両方において、照射および再構築後２週間で腸間膜リンパ節細胞数が減少した。しかし、４週間の調査時までに、細胞数が対照の水準に達した。性腺摘除処置群と非性腺摘除処置群のリンパ節細胞数に統計的な有意差はなかった（図１４Ｃ）。
【００８１】
類遺伝子マウスの致死的照射、胎児肝組織再構築、および性腺摘除後の胸腺の変化
非性腺摘除マウスでは、再生の兆候がほとんどまたは全くなく、４週間の期間にわたり胸腺細胞数の減少が深刻であった（図１５Ａ）。しかし、性腺摘除群では、２週間までにすでに胸腺が大きく形成され、４週間までには、これが非性腺摘除マウスの１０倍の大きさになり、対照の水準に戻った。その胸腺をＣＤ４５．２（ドナー由来抗原）についてのフローサイトメトリー分析にかけると、４週間の非性腺摘除群では検出可能なドナー由来細胞がなかったが、注目すべきことに、その調査時の性腺摘除マウスでは事実上すべての胸腺細胞がドナー由来であったことが実証された（図１５Ｂ）。ドナー由来造血前駆体からの胸腺形成がこのように広範に増強されたことを受けて、Ｔ細胞の分化が正常に進行したかを判定することが重要になった。フローサイトメトリーによって、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＴＣＲで定義付けされたサブセットを分析した。再構築後２週間の胸腺細胞サブセットの割合に比例的な差はなかった（図１６）。非性腺摘除マウスではドナー由来細胞による再構築がなされなかったので、４週間目ではこれを観察することができない。しかし、この調査時の性腺摘除マウスにおける胸腺細胞の割合は、正常なようである。
【００８２】
胎児肝組織再構築後２週間の性腺摘除マウスでは、ドナー由来の（ＣＤ４５．２＋Ｍａｃ１＋ＣＤ１１Ｃ＋と定義付けされた）骨髄系樹状細胞が非性腺摘除マウスよりも有意に多く存在し、その差は４倍（ｐ＜０．０５）であった。処置後４週間の性腺摘除マウスでは、ドナー由来骨髄系樹状細胞数が対照を上回ったままであった（図１７Ａ）。胎児肝組織再構築後２週間の性腺摘除マウスでは、胸腺中の（ＣＤ４５．２＋Ｍａｃ１−ＣＤ１１Ｃ＋と定義付けされた）ドナー由来リンパ系樹状細胞数は、非性腺摘除マウスで見られるものの２倍であった。処置後４週間の性腺摘除マウスでは、ドナー由来リンパ系樹状細胞数が対照を上回ったままであった（図１７Ｂ）。
【００８３】
ＣＤ１１Ｃ、上皮（抗ケラチン）、およびＣＤ４５．２（ドナー由来マーカー）に免疫蛍光染色を施すことよって、再構築および性腺摘除後４週間の胸腺の皮髄境界部および髄質区域に向かう樹状細胞の起源を突き止めた。ｃｏｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、これらの細胞のドナー誘導度を確認した（データ非表示）。再構築後４週間の胸腺細胞の約８５％がドナー由来であることを示唆するフローサイトメトリーのデータによって、これが裏付けられた。
【００８４】
致死的照射、胎児肝組織再構築、および性腺摘除後の骨髄の変化
性腺摘除および非性腺摘除再構築マウスの骨髄中細胞数を、未処置の年齢一致対照と比較したので、図１８Ａに要約する。再構築後２週間および４週間の性腺摘除マウスでは、骨髄細胞数が正常であった。非性腺摘序マウスの細胞数は２週間では正常であったが、４週間で劇的に減少した（ｐ＜０．０５）。とはいえ、その調査時の非性腺摘除マウスでは、ドナー由来細胞による再構築がなされていなかったのである。
【００８５】
ＣＤ４５．２（ドナー由来抗原）について、骨髄をフローサイトメトリー分析にかけることによって、再構築後４週間の非性腺摘除マウスの骨髄では、検出可能なドナー由来細胞がなかったが、その調査時の性腺摘除マウスではほとんどすべての細胞がドナー由来であったことが確定した（図１８Ｂ）。
【００８６】
再構築後２週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方のドナー由来Ｔ細胞数が、対照マウスで見られたものより著しく少なかった（ｐ＜０．０５）。４週間では、非性腺摘除マウスの骨髄中にはドナー由来Ｔ細胞が存在せず、性腺摘除マウスのＴ細胞数は対照の水準を下回っていた（図１９Ａ）。
【００８７】
再構築後２週間の非性腺摘除マウスおよび性腺摘除マウスの骨髄では、ドナー由来の骨髄系およびリンパ系樹状細胞が対照レベルで見出された。処置後４週間の性腺摘除マウスでは数がさらに減少し、非性腺摘除群ではドナー由来細胞が見られなかった（図１９Ｂ）。
【００８８】
致死的照射、胎児肝組織再構築、および性腺摘除後の脾臓の変化
性腺摘除および非性腺摘除再構築マウスの脾臓細胞数を、非処置の年齢一致対照と比較したので、その結果を図２０Ａに要約する。処置後２週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方の脾臓細胞数が対照の約５０％であった。４週間までに、性腺摘除マウスの数は正常レベルに近づきつつあったが、非性腺摘除マウスでの数は減少したままであった。（ドナー由来）ＣＤ４５．２のフローサイトメトリーのデータを解析すると、再構築後２週間の性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスのドナー由来細胞数に有意差があったことが実証された（図２０Ｂ）。４週間の非性腺摘除マウスの脾臓では検出可能なドナー由来細胞がなかったが、性腺摘除マウスでは脾臓細胞のほとんどすべてがドナー由来であった。
【００８９】
再構築後２週間および４週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方のＴ細胞数が著しく減少していた（ｐ＜０．０５）（図２１Ａ）。胎児肝組織再構築後２週間では、非性腺摘除マウスおよび性腺摘除マウスにおいてドナー由来の骨髄系およびリンパ系樹状細胞が対照の水準で見出された（それぞれ図２１ＡおよびＢ）。４週間では、非性腺摘除マウスの脾臓に検出可能なドナー由来樹状細胞はなく、性腺摘除マウスでは数が減少したままであった。
【００９０】
致死的照射、胎児肝組織再構築、および性腺摘除が腸管膜リンパ節の数に及ぼす影響
性腺摘除および非性腺摘除再構築マウスのリンパ節細胞数を未処置の年齢一致対照と比較したので、これを図２２Ａに示す。再構築後２週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方の細胞数が対照の水準であった。再構築後４週間の性腺摘除マウスの細胞数は対照の水準のままであったが、非性腺摘除マウスでは有意に減少した（図２２Ｂ）。ＣＤ４５．２についてのフローサイトメトリー分析によって、再構築後２週間の性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスのドナー由来細胞数に有意差がなかったことが示唆された（図２２Ｂ）。再構築後４週間の非性腺摘除マウスでは、検出可能なドナー由来細胞がなかった。しかし、同じ調査時の性腺摘除マウスでは、事実上すべてのリンパ節細胞がドナー由来であった。
【００９１】
再構築後２週間および４週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方のドナー由来Ｔ細胞数が対処の水準より少なかった。４週間の性腺摘除マウスではその数が依然として少なく、非性腺摘除マウスのリンパ節にはドナー由来Ｔ細胞が存在しなかった（図２３）。胎児肝組織再構築後２週間の非性腺摘除マウスおよび性腺摘除マウスでは、ドナー由来の骨髄系およびリンパ系樹状細胞が対照レベルで見出された（それぞれ図２３ＡおよびＢ）。処置後４週間では、ドナー由来骨髄系樹状細胞数が対照より少なく減少したが、リンパ系樹状細胞数は変化しないままであった。
【００９２】
実施例の総括的考察
我々は、高齢の胸腺が、甚だしく萎縮しながらも、加齢と共にその機能上の能力を維持しており、Ｔ細胞の増殖、分化、および遊走が若年成体マウスと同等の水準で見出されることを示してきた。胸腺の機能は、神経内分泌免疫軸間のいくつかの複雑な相互作用によって調節されるが、リンパ球および上皮細胞サブセットの両方について性腺摘除後に胸腺が再生した程度が示すように、性ステロイドの産生によって引き起こされる萎縮が最も重大かつ長引く作用を発揮する。
【００９３】
これまでに示されているように（ＨｉｒｏｋａｗａおよびＭａｋｉｎｏｄａｎ、１９７５年、Ａｓｐｉｎａｌｌ、１９９７年）、胸腺重量は、加齢に伴って有意に減少し、胸腺細胞数の有意な減少と相関する。性腺摘除技術によって引き起こされるストレスが、副腎皮質ステロイドの作用のために更なる胸腺萎縮をもたらすこともあるが、２週間の性腺摘除胸腺の細胞密度が性腺摘除前胸腺から２０〜３０倍まで上昇しており、性ステロイドの影響が取り払われることの方が優勢である。性腺摘除後３週間までに、高齢胸腺では、胸腺サイズおよび細胞数の両方が有意に増大し、若年成体の胸腺に優っているのは、おそらく生後２カ月のマウスでは性ステロイドの作用がすでに発揮されているためである。
【００９４】
我々のデータは、胸腺細胞が分化し、サブセットの割合を加齢に従って一定に保つ能力が維持されることを強調するこれまでの発見（Ａｓｐｉｎａｌｌ、１９９７年）を確かにするものである。さらに、我々は、性腺摘除後に胸腺細胞の分化が同時に起こることを示したが、これは、胸腺細胞サブセットが同時期に増殖することを示唆している。加齢に伴って胸腺細胞数が有意に減少するので、胸腺細胞の増殖を分析して、これが胸腺萎縮に寄与する要因であるかを判定した。
【００９５】
胸腺細胞の増殖は、加齢誘発性の胸腺萎縮によっても、性腺摘除後に性ステロイドの影響が取り払われても影響を受けず、全胸腺細胞の約１４％が増殖している。しかし、その分裂の局在性は年齢によって異なおり、２カ月のマウスの胸腺では、サブカプセル領域および皮質領域（ＴＮおよびＤＰＴ細胞）に渡って盛んな分裂が示され、髄質中でも若干の分裂が見出される。加齢に伴う胸腺上皮の組織崩壊のために、増殖の局在性を見分けるのは難しかったものの、パターンが若年のものよりも一様でなく、外側の皮質に退けられているようであった。性腺摘除後２週間までに、分裂する胸腺細胞が皮質全体で検出され、髄質でもはっきりわかり、分布が２カ月の胸腺と類似していた。
【００９６】
ＣＤ４およびＣＤ８の分析によって特定された増殖集団の表現型は、加齢または性腺摘除後に変化しなかった。しかし、胸腺細胞亜集団内の増殖を分析することによって、加齢と共にＴＮ細胞およびＣＤ８＋細胞の増殖が有意に低下したことが明らかになった。ＴＮサブセット内をマーカーＣＤ４４およびＣＤ２５に基づいてさらに分析すると、ＴＮ１（ＣＤ４４＋ＣＤ２５−）集団の増殖が有意に低下し、これがＴＮ２（ＣＤ４４−ＣＤ２５＋）集団の増加によって補償されたことが明らかになった。ＴＮ集団内のこのような異常は、Ａｓｐｉｎａｌｌ（１９９７年）による発見を反映している。驚くことに、ＴＮサブセットは、性腺摘除後２週間までに正常なレベルで増殖しており、この集団が、性ステロイド作用の阻害に迅速に応答したことを示唆した。さらに、性腺摘除後２週間および４週間では、増殖しているＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が対照の胸腺から著しく増大しており、末梢Ｔ細胞プールの再確立における役割を示唆しているのかもしれない。
【００９７】
胸腺細胞の遊走は、加齢に従って一定の胸腺細胞割合で起こることが示され、胸腺細胞の末梢への遊走速度が１０倍低下することを示したＳｃｏｌｌａｙ等（１９８０年）のこれまでのデータと矛盾していた。これらの結果の相違はおそらく、２才の胸腺の胸腺内ＦＩＴＣ標識が難しく、または脂肪沈着がＦＩＴＣの取り込みに影響を及ぼすためであると思われる。しかし、遊走するＴ細胞の絶対数は、Ｓｃｏｌｌａｙが見出したように有意に減少し、ＲＴＥ対末梢Ｔ細胞プールの比が有意に低下することになった。これが、末梢に変化をもたらし、主にＴ細胞レパートリーに影響を及ぼす（Ｍａｃｋａｌｌ等、１９９５年）。これまでの論文（Ｍａｃｋａｌｌ等、１９９５年）では、Ｔ細胞レパートリーが加齢に伴ってナイーブＴ細胞の表現型よりも記憶細胞にそれることが示されている。しかし、縮小したＴ細胞レパートリーでは、おそらく高齢者では免疫不全が激しくなることが原因で、個体が新しい病原体に遭遇すると対抗できない。免疫無防備状態の個体のＴ細胞プールを再確立することが求められているのは明らかである。性腺摘除により、ナイーブＴ細胞の産生を有意に増加させることによって、胸腺が末梢の細胞数を回復することが可能になる。
【００９８】
末梢では、脾臓およびリンパ節のＢ：Ｔ細胞比が証明するように、Ｔ細胞数のレベルがおそらくは末梢の恒常性のために一定のままである（Ｍａｃｋａｌｌ等、１９９５年；Ｂｅｒｚｉｎｓ等、１９９８年）。しかし、高齢の胸腺では、ＣＤ４：ＣＤ８比が若年成体での２：１から２才のマウスで１：１に有意に低下しており、末梢での細胞組成の崩壊が明白であるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞が年齢の影響をより受けやすい性質であること、または胸腺外の供給源からのＣＤ８＋Ｔ細胞の産生が増加したことを示唆している可能性がある。性腺摘除後２週間までに、この比は正常になり、外科的性腺摘除に対して免疫系が迅速に応答したことがここでも表れている。
【００９９】
上記の発見では、最初に、高齢の胸腺が思春期前の胸腺と同等の性質で機能し得ることが示された。この点で、Ｔ細胞数は有意に減少しても、胸腺細胞が分化する能力は妨げられない。胸腺細胞が増殖し、その結果末梢に遊走する全体的な能力もまた加齢に随伴する胸腺萎縮の影響を受けない。しかし、２点の重要な発見に言及した。第一に、Ａｓｐｉｎａｌｌ（１９９７年）の発見に関連するが、ＴＮ細胞が増殖する能力への有害作用があるようである。この欠陥は、胸腺細胞自体の固有の欠陥にあるとすることができる。なお我々のデータおよびこれまでの研究によって、胸腺細胞の分化が縮小しながらもまだ起こり、ＢＭからの幹細胞の侵入も年齢の影響を受けないことが示されている（Ｈｉｒｏｋａｗａ、１９９８年；ＭａｃｋａｌｌおよびＧｒｅｓｓ、１９９７年）。これは、性ステロイド作用の標的としての胸腺間質、ひいてはこのＴ細胞前駆体サブセットの異常な調節を示唆するものである。第二に、加齢に伴ってＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能力が有意に低下するが、性腺摘除の後では、増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が２カ月のマウスに比べて有意に増加した。成熟Ｔ細胞の増殖は、遊走前の最終ステップであると考えられている（ＳｕｄａおよびＺｌｏｔｎｉｋ、１９９２年）ので、ＣＤ８＋の増殖が有意に低下することは、その遊走の潜在性の低下を示唆することになる。この仮説は、ＲＴＥにおけるＣＤ４Ｔ細胞：ＣＤ８Ｔ細胞比が加齢に伴って増大し、遊走するＣＤ８Ｔ細胞が減少したことを示唆した我々の発見によって裏付けられる。あるいは、胸腺上皮がＣＤ８Ｔ細胞を維持するための重要な要因を提供しているとすれば、リンパ間質分子の影響であろうとサイトカインの影響であろうと、この要因によって性ステロイド産生の増加が妨げられるかもしれない。性ステロイドの影響を取り払うことによって、ＣＤ８Ｔ細胞集団が再び最適に増殖し得る。したがって、性腺摘除前後の胸腺上皮細胞の状態を詳細に特定することが必要であった。
【０１００】
皮質は、上皮の網状組織を拡大するのに利用できる胸腺細胞が欠乏するために、加齢に伴って「崩壊する」ようである。性腺摘除後の胸腺上皮の最も劇的な変化は、ＭＴＳ４４によって検出された、皮質上皮の網状組織の増大であり、胸腺細胞数が有意に増加したことを示した。性腺摘除後２週間では、ＫＮＡが豊富に存在し、増殖する胸腺細胞に対処するようであり、胸腺細胞の発達が、上皮が対処できる速度より速く起こることを示唆している。免疫蛍光法によるＢｒｄＵ染色において上皮の増殖が認められなかったので、皮質上皮の増大は、このサブタイプの増殖というよりも胸腺構造が伸展するためのようである。
【０１０１】
髄質上皮が年齢の影響をそれほど受けやすくないのは、この区域に蓄積するＴ細胞の数がより少ないためである可能性が最も高い（選別の事象のためにＤＰ期に胸腺細胞の＞９５％が失われる）。しかし、高齢の胸腺では、皮質上皮が髄質上皮に組み込まれ、皮髄境界部の区別ができないことによって判別される上皮細胞の崩壊が甚大となる。ＭＴＳ１０染色によって検出したところ、性腺摘除後２週間までに、髄質上皮がある程度まで再構築されるが、皮質上皮内にまだサブポケットが存在している。性腺摘除後４週間までには、皮髄境界部が若年成体の胸腺と同様に明瞭になり、皮質上皮および髄質上皮が完全に再構築される。
【０１０２】
性腺摘除後の微細な変化も観察されており、性腺摘除前の胸腺に比べて、ＭＨＣクラスＩＩおよび血液胸腺関門抗原の発現が減少したことが最もわかりやすい。高齢の胸腺では、おそらく発達段階の胸腺細胞の数が減少したためにそれによる制御が弱まることに関連して、（ＭＴＳ６によって検出される）ＭＨＣＩＩの発現が増加する。あるいは、ＤＰ胸腺細胞が欠乏した照射後の胸腺でも示されている（ＲａｎｄｌｅおよびＢｏｙｄ、１９９２年）が、単に胸腺細胞による遮蔽がなくなるためかもしれない。性腺摘除後に胸腺細胞数が一度増加すれば、胸腺細胞の蓄積によって抗原結合部位が再び塞がれるので、免疫蛍光法による検出が弱まる。高齢の胸腺では、血液胸腺関門を検出する抗原（ＭＴＳ１２、１５、および１６）もまた増加し、やはり性腺摘除後に若年成体の胸腺の発現に逆戻りする。胸腺細胞による遮蔽がなくなり、胸腺萎縮のために抗原が密に近接することが、こうして発現が増加することの説明になるといえる。あるいは、発達段階の胸腺細胞が、このような抗原の発現に対する必要な制御機構をもたらしているので、これが欠如すると、発現が制御されないかもしれない。高齢の胸腺では、ＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４によって検出される始原上皮抗原の発現が増加するが、性腺摘除後の皮髄境界部では、上皮サブポケットに戻る。これは、高齢マウスでは、この上皮前駆体サブタイプが分化するためのシグナルを欠いていることを示唆するものである。性ステロイドによって配置される閉塞物を除去すると、これらの抗原が分化して、皮質上皮抗原の発現が可能になる。
【０１０３】
上記の発見は、それが発達段階の胸腺細胞に発達に必要な刺激を供給するのを不可能にする胸腺上皮の欠陥を示唆している。しかし、胸腺上皮と胸腺細胞は共生する性質であるので、性ステロイドの影響による崩壊の厳密な経路を突き止めることが難しくなる。髄質上皮には、自身が適切に発達し、維持されるために皮質Ｔ細胞が必要である。したがって、この集団が減少すれば、髄質胸腺細胞は、発達するための十分なシグナルを受け取れない。このことは特に、ＣＤ８＋集団に影響を及ぼすように思われる。ＩＲＦ−／−マウスではＣＤ８＋Ｔ細胞数が減少した。したがって、これらの細胞の増殖能力を特定することに関心が向くはずである。
【０１０４】
ＴＮ１サブセットの増殖に欠陥が認められたことは、皮質上皮の損失が、皮質上皮がＩＬ−７およびＳＣＦなど胸腺形成に必要な因子を供給する、ＴＣＲ遺伝子再編成の決定的な段階で胸腺細胞の発達に影響を及ぼすことを示唆する（ＧｏｄｆｒｅｙおよびＺｌｏｔｎｉｋ、１９９０年；Ａｓｐｉｎａｌｌ、１９９７年）。実際、ＩＬ−７−／−およびＩＬ−７Ｒ−／−マウスでは、胸腺の形態が高齢マウスで見られるものと類似している（Ｗｉｌｅｓ等、１９９２年；ＺｌｏｔｎｉｋおよびＭｏｏｒｅ、１９９５年；ｖｏｎ Ｆｒｅｅｄｅｎ−Ｊｅｆｆｒｙ、１９９５年）。加齢に伴うＩＬ−７およびＩＬ−７Ｒの変化を特定するためには、更なる研究が必要である。
【０１０５】
結論として、高齢の胸腺では、その機能的な能力が保たれたままであるが、高齢マウスで発達する胸腺細胞は、胸腺微小環境の構造が不完全であるために、正常な若年マウスで見られるような胸腺上皮細胞による厳重な制御を受けない。したがって、このような細胞の増殖、分化、および遊走は、最適に調節されなくなり、末梢で自己反応性／免疫機能不全Ｔ細胞の放出が増大するようになるのかもしれない。ＴＮおよび、特にＣＤ８＋集団の両方の範囲内での欠陥が、加齢に伴って末梢Ｔ細胞プール内で見られる変化をもたらすともいえる。我々はさらに、性腺摘除が胸腺上皮細胞の発達および再構築に及ぼす影響を詳細に述べてきた。ステロイド受容体結合アッセイを利用しての、胸腺萎縮の基礎をなす機構、および性腺摘除後の胸腺の再生における胸腺上皮サブセットの役割は、目下研究中である。性腺摘除による胸腺機能の修復は、免疫が抑制された個体における末梢Ｔ細胞プールの再生、ひいては免疫の再確立に不可欠な手段となろう。
【０１０６】
胸腺の構造およびＴ細胞の産生に対する性腺摘除の影響力を免疫衰弱動物モデルで調査した。具体的には、実施例２によって、亜致死的照射およびシクロホスファミド処置後の免疫系の回復に性腺摘除が及ぼす影響を調べた。このような形の免疫衰弱が働くと、ＤＮＡ合成が阻害され、したがって急速分裂細胞が標的になる。胸腺中では、この細胞は大部分が未成熟な皮質胸腺細胞であるが、すべてのサブセットが影響を受ける（ＦｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎおよびＢａｓｃｈ、１９９４年）。健常な高齢マウスでは、末梢Ｔ細胞の質的かつ量的な偏向が病理学的状態をもたらすことはまれである。しかし、Ｔ細胞が甚だしく欠乏した後では、胸腺のＴ細胞再生能力が低下するので、重大な問題が起こる。このような障害は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、および特に癌治療中の化学療法および放射線療法の後に起こる（Ｍａｃｋａｌｌ等、１９９５年）。
【０１０７】
亜致死的照射を施したマウスおよびシクロホスファミドで処置したマウスの両方で、胸腺の再生が性腺摘除によって著しく増強された。性腺摘除を免疫衰弱化の当日およびその７日前に実施して、主に副腎皮質ステロイドが引き起こす、外科的性腺摘除に応じるストレスが胸腺の再生に及ぼす影響を査定した。免疫衰弱化後早くも１週間で胸腺の細胞密度および構造の増強が見られるが、重大な差は性腺摘除後２週間で認められた。これが、性腺摘除を行うのが免疫衰弱化の当日かその１週間前かの実例であった。
【０１０８】
免疫組織学では、すべての例で、性腺摘除後２週間の胸腺の構造は、表現型に関して正常に見えたが、非性腺摘除マウスでは組織崩壊していたことが実証された。全上皮のマーカーによって、非性腺摘除マウスの胸腺では、免疫衰弱化によって皮質上皮の弱体化および胸腺構造の総体的な崩壊が引き起こされたことが実証された。髄質のマーカーによってこの発見が裏付けられた。性腺摘除によって胸腺再生が誘発された最初の特徴の１つが、ＭＴＳ１６によって識別された、細胞外基質の著しいアップレギュレーションであったことは興味深い。
【０１０９】
フローサイトメトリー分析のデータは、性腺摘除マウスのすべての胸腺細胞サブセットにおいて細胞数が増加したことを例示しており、免疫蛍光法と一致した。免疫衰弱化および性腺摘除後の各調査時において、ＣＤ４、ＣＤ８、およびαβ−ＴＣＲによって定義付けされたすべてのサブセットが同時期に増加していた。これは普通ではないが、整合性のある結果であり、Ｔ細胞の発達は、進行性のプロセスであるので、（ＣＤ４−ＣＤ８−ゲート内に含まれる）前駆体細胞は最初に増加し、これが最初の調査時の前に起こっていたことが予想された。その上、前駆体に相当するのは、全胸腺細胞のうちの非常に少ない割合であるので、その数の移行が検出可能でなかったのかもしれない。性腺摘除がマクロファージおよび顆粒球を含む他の細胞に及ぼす影響も分析した。一般に、胸腺内のマクロファージおよび顆粒球の数にはほとんど変化がなかった。
【０１１０】
照射およびシクロホスファミドの両方の免疫衰弱化モデルにおいて、どれも処置後２週間で胸腺細胞数が最高点に達し、４週間で減少した。照射または化学療法のほとんど直後に、胸腺重量および細胞密度が劇的に低下し、およそ５日後に、胸腺再生の最初の段階が始まった。再構築の第一波（５〜１４日）は、すべての胸腺細胞サブセットのもとである放射線抵抗性胸腺細胞（大部分が二重陰性）の増殖によって起こった（ＰｅｎｉｔおよびＥｚｉｎｅ、１９８９年）。１６日と２２日の間に観察された２回目の減少は、（これも照射の影響を受けて）骨髄による胸腺前駆体の産生が低下したことに関連して、放射線抵抗性細胞の増殖能力が制限されたためであった。再生の第二相は、胸腺が骨髄由来前駆体で補充されたためであった（Ｈｕｉｓｋａｍｐ等、１９８３年）。
【０１１１】
成体マウスでは、ＨＳＣから成熟Ｔ細胞に発達するのにおよそ２８日かかることに留意することが重要である（Ｓｈｏｒｔｍａｎ等、１９９０年）。したがって、最高で処置後４週間までは、末梢Ｔ細胞にほとんど変化が見られなくても驚くことではない。末梢は、若干胸腺からの送出を支えとすることになるが、最高で処置後４週間までに末梢で見出されるＴ細胞の大多数は、細胞が欠乏ているときに増殖する、シクロホスファミドまたは放射線抵抗性の増殖性クローンになることが予想されるはずである。性腺摘除後の末梢では、最も重要なものとして、胸腺からの送出増加によるＴＣＲレパートリーの多様化を含む、いくつかの長期的な変化が予想されるはずである。性腺摘除は、Ｂ細胞、マクロファージ、および顆粒球を含む他の白血球についての末梢の回復には影響を及ぼさない。
【０１１２】
実施例４は、性腺摘除が同系および類遺伝子性骨髄移植に及ぼす影響を示している。Ｓｔａｒｚｌ等（１９９２年）は、リンパ系および非リンパ系組織中でマイクロキメラがはっきりと現われることが、同種移植の良好な予後兆候であることを報告している。すなわち、移植片に対する寛容性を誘導するためにこれが必要であると仮定された（Ｓｔａｒｚｌ等、１９９２年）。ドナー由来樹状細胞は、このようなキメラ中に存在し、これが移植片拒絶反応を回避する際に不可欠な役割を担うと考えらた（ＴｈｏｍｓｏｎおよびＬｕ、１９９９年）。樹状細胞は、胸腺のネガティブ選択プロセスにおけるキー・プレイヤーであることが知られており、レシピエントの胸腺にドナー由来の樹状細胞が存在していれば、移植片反応性のＴ細胞が除去される。
【０１１３】
性腺摘除によってキメラの形成を増加させることができるか判定するために、同系胎児肝組織移植を利用する調査を行った。結果は、性腺摘除マウスの胸腺の再生が向上したことを示した。類遺伝子性（Ｌｙ５）マウスを使用して実験を繰り返すと、再びこのような傾向が見られた。類遺伝子性マーカーが存在したために、マウスのキメラ状態の評価が可能であった。胎児肝組織再構築後早くも２週間で、胸腺中に検出可能なドナー由来樹状細胞が存在し、性腺摘除マウスでのその数は、非性腺摘除マウスの４倍であった。再構築後４週間の非性腺摘除マウスでは、ドナー由来細胞で再構築がなされなかったようであり、実際に性腺摘除によってキメラが形成される見込みが増大することが示唆された。性腺摘除は、致死的照射および胎児肝組織再構築後の胸腺の再生を増強するだけでなく、胸腺中のドナー由来樹状細胞の数も増加させことを考えると、この手法は、幹細胞移植と並び、移植片が受容される確率を向上させるものである。
【０１１４】
上記の明細書中で言及した刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込む。当分野の技術者には、本発明の範囲および精神から外れることのない、記載した本発明の方法およびシステムの様々な変更および変形形態が見出せるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して述べてきたが、特許請求する本発明が、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでなことを理解されたい。実際に、本発明の実践を想定して記載した方式を様々に変更するものであって、分子生物学または他の関連分野の技術者にわかるものは、以下の特許請求の範囲に含めるものとする。
【０１１５】
「参考文献」
2004509979.tif 000002
2004509979.tif 000003
2004509979.tif 000004
2004509979.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】
高齢（２才）マウスに外科的性腺摘除を施し、（ａ）体重に対する胸腺重量、および（ｂ）性腺摘除後２〜４週間の胸腺１個あたりの総細胞数について分析したものを示すグラフである。加齢に伴い若年成体（２カ月）のマウスに比べて胸腺重量および細胞密度の有意な減少が見られた。これは、性腺摘除によって回復した。性腺摘除後３週間では、胸腺の肥大が観察され、性腺摘除後４週間までに若年成体の水準に回復した。結果は、１群につき４〜８匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。若年成体マウスおよび性腺摘除後マウスに対して、＊＊＝ｐ≦０．０１、＊＊＊＝ｐ≦０．００１である。
【図２】
高齢（２才）マウスに外科的性腺摘除を施し、性腺摘除後２週間および４週間目に末梢リンパ球集団を分析したものを示すグラフである。（ａ）脾臓中の総リンパ球数。末梢の恒常性のために、総脾臓細胞数に加齢または性腺摘除後の変化は認められなかった。（ｂ）Ｂ細胞とＴ細胞の比は、加齢後にも性腺摘除後にも変化しなかったが、（ｃ）ＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞の比に有意な増加が見られた。これは、性腺摘除後４週間までに回復した。データは、１群につき４〜８匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。若年成体（２カ月）マウスおよび性腺摘除後４週間のマウスに対して、＊＊＊＝ｐ≦０．００１である。
【図３】
高齢（２才）マウスに性腺摘除を施し、マーカーＣＤ４およびＣＤ８に基づいて胸腺細胞サブセットを分析した。ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ、ＣＤ４＋ＣＤ８−、およびＣＤ４−ＣＤ８＋ＳＰ胸腺細胞について、ＣＤ４／ＣＤ８ドットプロットの代表的なＦＡＣＳプロフィールを示す図である。ＣＤ４／ＣＤ８によって定義付けされたどのサブセットの割合も、加齢後または性腺摘除後に相違が見られなかった。
【図４．１】
高齢（２歳）マウスに性腺摘除を施し、１パルスのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を注射して、増殖レベルを決定した。加齢および性腺摘除後の胸腺内ＢｒｄＵ＋細胞の増殖を表すヒストグラムプロフィールを示す図である。加齢後でも性腺摘除後でも、胸腺全体の増殖細胞の割合に相違は認められなかった。
【図４．２】
高齢（２才）マウスに性腺摘除を施し、１パルスのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を注射して、増殖レベルを決定した。胸腺内のＣＤ４およびＣＤ８の発現に基づいて分析した異なる胸腺細胞サブセットの増殖を示すグラフである。（ａ）ＢｒｄＵ＋集団における各胸腺細胞サブセットの割合は、加齢後にも性腺摘除の後にも変化しなかった。（ｂ）しかし、加齢に伴ってＤＮ（ＣＤ４−ＣＤ８−）胸腺細胞の増殖の割合に有意な上昇が見られた。性腺摘除後、これは回復し、ＣＤ４−ＣＤＢ＋ＳＰ胸腺細胞の増殖に有意な増大が認められた。（ｃ）加齢後でも性腺摘除後でも、ＴＮサブセットのＢｒｄＵ＋細胞の全体の割合に変化は見られなかった。しかし、（ｄ）加齢に伴って、ＴＮ１（ＣＤ４４＋ＣＤ２５−）の増殖が有意に低下し、ＴＮ２（ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋）サブセットの増殖が有意に増大した。これは、性腺摘除後に回復した。結果は、１群につき４〜８匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。若年成体（２カ月）マウスに対して、＊＝ｐ≦±０．０５、＊＊＊＝ｐ≦０．００１である。
【図５】
高齢（２才）マウスに性腺摘除を施し、胸腺内にＦＩＴＣを注射して、胸腺送出速度を決定した。２４時間後に算出した末梢のＦＩＴＣ＋細胞数を示すグラフである。（ａ）加齢に伴って、新規胸腺遊出（ｒｅｃｅｎｔ ｔｈｙｍｉｃ ｅｍｉｇｒａｎｔ）（ＲＴＥ）細胞数に有意な増加が認められた。性腺摘除の後、この値が、性腺摘除後２週間までに有意に増加した。（ｂ）移出速度（送出胸腺細胞密度／総胸腺細胞密度）は、加齢に従って一定のままであったが、性腺摘除後２週間では有意に低下した。（ｃ）加齢に伴って、ＣＤ４＋ＲＴＥとＣＤ８＋ＲＴＥの比に有意な増大が見られたが、これは、性腺摘除後１週間までに正常になった。結果は、１群につき４〜８匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。若年成体マウスに対して、＊＊＝ｐ≦０．０１、＊＊＊＝ｐ≦０．００１であり、性腺摘除マウスと比較して、＾ｐ≦０．００１である。
【図６】
シクロホスファミドを使用して、若年（生後３カ月）マウスのリンパ球を欠乏させた。シクロホスファミド処置と同じ日に、マウスに偽性腺摘除または性腺摘除を施した。（ａ）偽性腺摘除マウスに比べて、性腺摘除マウスの胸腺細胞数が有意に増加したことが認められた。（ｂ）性腺摘除マウスは、シクロホスファミド処置後１週間で脾臓細胞数の有意な増加も示した。（ｃ）処置後１週間の性腺摘除マウスでは、リンパ節の細胞密度が有意に増大したことも認められた。結果は、１群につき４〜８匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。性腺摘除マウスに対して、＊＊＊＝ｐ≦０．００１である。
【図７】
亜致死的（６２５Ｒａｄ）照射を使用して、若年（生後３カ月）マウスのリンパ球を欠乏させた。照射と同じ日に、マウスに偽性腺摘除または性腺摘除を施した。性腺摘除マウスは、対応する偽性腺摘除マウスに比べて胸腺再生速度が有意に速かった（ａ）。性腺摘除マウスでは、胸腺（ｂ）またはリンパ節（ｃ）の細胞数に差が見られなかった。リンパ節細胞数は、処置後２週間では依然として対照マウスに比べ慢性的に少なかった。結果は、１群につき４〜８匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。対照マウスに対して、＊＝ｐ≦０．０５であり、対照および性腺摘除マウスに対して、＊＊＊＝ｐ≦０．００１である。
【図８】
亜致死性の（６２５Ｒａｄ）の照射を使用して、若年（生後３カ月）マウスのリンパ球を欠乏させた。照射より１週間先に、マウスに偽性腺摘除または性腺摘除を施した。性腺摘除によって、胸腺の再生に有意な増大が認められた（ａ）。性腺摘除マウスでは、脾臓（ｂ）またはリンパ節（ｃ）の細胞数に差が見られなかった。リンパ節細胞数は、処置後２週間では依然として対照マウスに比べ慢性的に少なかった。結果は、１群につき４〜８匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。対照マウスに対して、＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．０１であり、対照および性腺摘除マウスに対して、＊＊＊＝ｐ≦０．００１である。
【図９】
化学療法薬であるシクロホスファミドでの処置、および外科的もしくは化学的性腺摘除を同じ日に行った後の、胸腺、脾臓、およびリンパ節細胞数の変化を示すグラフである。性腺摘除動物の胸腺が、治療後１週間および２週間で、非性腺摘除（シクロホスファミドのみ）群に比べて急速に増大したことに注目されたい。さらに、性腺摘除群の脾臓およびリンパ節数も、シクロホスファミドのみの群に比べて確かに増大していた（処置グループおよび調査時毎ｎ＝３〜４）。化学的性腺摘除は、シクロホスファミド処置後の免疫系再生において外科的性腺摘除に匹敵する。
【図１０】
高齢マウス（２才）に性腺摘除を施し、１型単純ヘルペスウイルスに対する応答を分析したものを示す図である。（ａ）感染後の高齢マウスは、若年で、かつ性腺摘除したマウスと比べて、リンパ節の全細胞密度が有意に低下していた。（ｂ）ＨＳＶ−１に感染したマウスのＬＮにおける活性化（ＣＤ８＋ＣＤ２５＋）細胞の代表的なＦＡＣＳプロフィールを示す図である。加齢後によるか、または性腺摘除後でも、活性化ＣＴＬの割合に差は見られなかった。（ｃ）高齢マウスのリンパ節内の細胞密度減少は、活性化ＣＴＬ数の有意な減少に反映されていた。高齢マウスに性腺摘除を施すことによって、活性化細胞数が若年マウスと同等になり、ＨＳＶ−１に対する免疫応答が回復した。結果は、１群につき８〜１２匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。若年（２カ月）マウスと性腺摘除マウスの両方と比較して、＊＊＝ｐ≦０．０１である。
【図１１】
ＨＳＶ−１で免疫化したマウスから膝窩リンパ節を取り出し、３日間培養した。溶解のバックグラウンドレベルについての対照として非免疫化マウスを用い、ＣＴＬアッセイを実施したものを示すグラフである（５１Ｃｒの放出によって測定するもの。結果はマウス８匹×３通りの平均＋１ＳＤとして示す）。高齢マウスでは、１０：１および３：１のＥ：Ｔ比でＣＴＬ活性が有意に低下し、リンパ節内に存在する特定のＣＴＬの百分率が減少したことを示唆した。高齢マウスに性腺摘除を施すことによって、ＣＴＬの応答が若年成体の水準に回復した。若年成体マウスおよび性腺摘除後高齢マウスに対して、＊＊＝ｐ≦０．０１である。
【図１２】
ＨＳＶ−１感染に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の補助およびＶβＴＣＲの応答の分析を示すグラフである。ＨＳＶ−１に感染させてから後５日目に膝窩リンパ節を取り出し、（ａ）ＣＤ２５、ＣＤ８、および特異的なＴＣＲＶβマーカーと、（ｂ）ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の発現についてｅｘ−ｖｉｖｏで分析した。（ａ）Ｖβ１０またはＶβ８．１を発現している活性化（ＣＤ２５＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を、１群につき８匹のマウスについての平均±１ＳＤとして示す。加齢後でも性腺摘除後でも差は認められなかった。（ｂ）加齢に伴って静止ＬＮ集団にＣＤ４／ＣＤ８比の低下が見られた。これは、性腺摘除後に回復した。結果は、１群につき８匹のマウスの平均±１ＳＤとして示す。若年および性腺摘除マウスに対して、＊＊＊＝ｐ≦０．００１である。
【図１３】
ＨＳＶ−１接種後の活性化ＬＮ中ＣＴＬにおけるＶβ１０の発現を示すグラフである。高齢マウスでは全体的にＶβ１０の応答が正常であったにもかかわらず、Ｖβ１０の完全な喪失が認められたマウスもいた。代表的なヒストグラムプロフィールを示す。高齢マウスにおいてクローンの応答が縮小し、性腺摘除後に予想通りの応答が再開されたことに注目されたい。
【図１４】
Ｌｙ５類遺伝子マウスに骨髄移植をした後の、胸腺、脾臓、リンパ節、および骨髄細胞数の変化を示すグラフである。性腺摘除動物の胸腺が、処置後の全調査時の非性腺摘除群と比べて、急速に増大したことに注目されたい。さらに、性腺摘除群の脾臓およびリンパ節の数が、シクロホスファミドのみの群と比べて確かに増加している（処置群および調査時毎ｎ＝３〜４）。性腺摘除マウスでは、非性腺摘除動物に比べて類遺伝子（Ｌｙ５．２）細胞が有意に増加していた（データ非表示）。
【図１５】
胎児肝組織再構築後の性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの胸腺細胞数の変化を示すグラフである（各試験群についてｎ＝３〜４。）。（ａ）２週間目の性腺摘除マウスの胸腺細胞数は正常レベルであり、非性腺摘除マウスより有意に高かった（＊ｐ＜０．０５）。４週間後の性腺摘除マウスの胸腺には、肥大が認められた。非性腺摘除の細胞数は、対照の水準を下回ったままである。（ｂ）ＣＤ４５．２＋細胞−ＣＤ４５．２＋は、ドナー誘導度を示すマーカーである。再構築後２週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方にドナー由来細胞が存在していた。処置後４週間では、性腺摘除胸腺中の細胞の約８５％がドナー由来であった。非性腺摘除胸腺には、ドナー由来細胞が存在しなかった。
【図１６】
致死的照射および胎児肝組織再構築、次いで外科的性腺摘除後のＣＤ４対ＣＤ８ドナー由来胸腺細胞集団のＦＡＣＳプロフィールを示す図である。各象限の百分率を各プロットの右に示す。年齢を一致させた対照のプロフィールは、生後８カ月のＬｙ５．１類遺伝子マウスの胸腺のものである。性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスのプロフィールは、ＣＤ４５．２＋細胞にゲートをかけてあり、ドナー由来細胞のみを示す。再構築後２週間の性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスの胸腺亜集団は、相違していない。
【図１７】
致死的照射、胎児肝組織再構築、および性腺摘除後の骨髄系リンパ系樹状細胞（ＤＣ）の数を示すグラフである（各試験群についてｎ＝３〜４匹のマウス。）。続くグラフの対照（白色）のバーは、未処置の年齢一致マウスで見られる正常な樹状細胞数に基づいている。（ａ）ドナー由来骨髄系樹状細胞−−−再構築後２週間の非性腺摘除マウスでは、ＤＣが正常レベルで存在している。同じ調査時の性腺摘除マウスでは、ＤＣが有意に多かった（＊ｐ＜０．０５）。４週間の性腺摘除マウスでは、ＤＣ数が対照の水準を上回ったままであった。（ｂ）ドナー由来リンパ系樹状細胞−−−再構築後２週間の性腺摘除マウスのＤＣ数は、非性腺摘除マウスの２倍であった。処置後４週間のＤＣ数は、対照の水準を上回ったままであった。
【図１８】
胎児肝組織再構築後の性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの総骨髄細胞数およびＣＤ４５．２＋骨髄細胞数の変化を示すグラフである。各試験群についてｎ＝３〜４匹のマウス。（ａ）総細胞数−−−再構築後２週間では、骨髄細胞数が正常になっており、性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスの細胞数に差がなかった。再構築後４週間では、性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスの細胞数に有意差があった（＊ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ＣＤ４５．２＋細胞数。再構築後２週間では、骨髄のＣＤ４５．２＋細胞数に関して性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスに有意差はなかった。４週間では、性腺摘除マウスのＣＤ４５．２＋細胞数が依然として多かった。同じ調査時の非性腺摘除マウスでは、ドナー由来細胞が存在しなかった。
【図１９】
胎児肝組織再構築後の性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウス骨髄中Ｔ細胞および骨髄系リンパ系由来樹状細胞（ＤＣ）の変化を示すグラフである（各試験群についてｎ＝３〜４匹のマウス。）。続くグラフの対照（白色）のバーは、未処置の年齢一致マウスで見られる正常なＴ細胞および樹状細胞数に基づくものである。（ａ）Ｔ細胞数−−−性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方において、再構築後２週間および４週間で数が減少した。（ｂ）ドナー由来骨髄系樹状細胞−−−再構築後２週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方のＤＣ細胞数が正常であった。この調査時の性腺摘除マウスと非性腺摘序マウスの数には、有意差がなかった。（ｃ）ドナー由来リンパ系樹状細胞−−−再構築後２週間および４週間の数は、正常レベルであった。２週間では、性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスの数に有意差がなかった。
【図２０】
胎児肝組織再構築後の性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの総脾臓細胞数およびドナー（ＣＤ４５．２＋）脾臓細胞数の変化を示すグラフである（各試験群についてｎ＝３〜４匹のマウス。）。（ａ）総細胞数−−−再構築後２週間では、細胞数が減少しており、性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスの細胞数に有意差はなかった。再構築後４週間では、性腺摘除マウスの細胞数が正常レベルに近づきつつあった。（ｂ）ＣＤ４５．２＋細胞数−−−再構築後２週間では、ＣＤ４５．２＋細胞数に関して性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスに有意差はなかった。４週間では、性腺摘除マウスのＣＤ４５．２＋細胞数が依然として多かった。同じ調査時の非性腺摘除マウスには、ドナー由来細胞が存在しなかった。
【図２１】
胎児肝組織再構築後の脾臓Ｔ細胞および脾臓骨髄系リンパ系由来樹状細胞（ＤＣ）を示すグラフである（各試験群についてｎ＝３〜４匹のマウス。）。続くグラフの対照（白色）のバーは、未処置の年齢一致マウスで見られる正常なＴ細胞および樹状細胞に基づくものである。（ａ）Ｔ細胞数−−−再構築後２週間および４週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方で数が減少した。（ｂ）ドナー由来（ＣＤ４５．２＋）骨髄系樹状細胞−−−再構築後２週間および４週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方のＤＣ数が正常であった。２週間の性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスの数には有意差がなかった。（ｃ）ドナー由来（ＣＤ４５．２＋）リンパ系樹状細胞−−−最構築後２週間および４週間の細胞数が正常であった。２週間の性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの数には有意差がなかった。
【図２２】
胎児肝組織再構築後性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの総リンパ節細胞数およびドナー（ＣＤ４５．２＋）リンパ節細胞数の変化を示すグラフである（各試験群についてｎ＝３〜４。）。（ａ）総細胞数−−−再構築後２週間では、細胞数が正常レベルであり、性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスとに有意差はなかった。再構築後４週間の性腺摘除マウスの細胞数は、正常レベルであった。（ｂ）ＣＤ４５．２＋細胞数−−−再構築後２週間のリンパ節では、ドナーＣＤ４５．２＋細胞数に関して性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスとに有意差はなかった。４週間目の性腺摘除マウスでは、ＣＤ４５．２細胞数が依然として多かった。同じ調査時の非性腺摘除マウスでは、ドナー由来細胞が存在しなかった。
【図２３】
胎児肝組織再構築後性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの腸管膜リンパ節中Ｔ細胞および骨髄系リンパ系由来樹状細胞（ＤＣ）の変化を示すグラフである（各試験群についてｎ＝３〜４匹のマウス。）。対照（白色）のバーは、未処置の年齢一致マウスで見られるＴ細胞数および樹状細胞数である。（ａ）再構築後２週間および４週間では、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方においてＴ細胞数が減少した。（ｂ）ドナー由骨髄系樹状細胞は、性腺摘除マウスおよび非性腺摘除マウスの両方で正常であった。４週間では、これが減少した。２週間の性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスでの数には、有意差がなかった。（ｃ）ドナー由来リンパ系樹状細胞−−−再構築後２週間および４週間の数は、正常レベルであった。２週間の性腺摘除マウスと非性腺摘除マウスでの数には、有意差がなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４．１】
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【図４．２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004509979.tif 000109