(57)【要約】本発明は、一つ以上のタンパク質特性をエンコードする親一本鎖ポリヌクレオチド・シーケンスからポリヌクレオチド・シーケンスまたはシーケンスの集団を生成する方法を提供する。この方法は、ａ）親ポリヌクレオチド・シーケンスのプラス鎖とマイナス鎖を構成する一本鎖ＤＮＡを準備する工程と、ｂ）一本鎖フラグメントの集団を生成するためにエキソヌクレアーゼを用いて一本鎖ポリヌクレオチド・シーケンスを消化する工程と、ｃ）プラス鎖から生成された前記フラグメントをマイナス鎖から生成されたフラグメントと接触させる工程と、且つ場合によって、親ポリヌクレオチドの少なくとも一つの３’端末と５’端末にアニーリング条件下でアニールするプライマー・シーケンスを添加する工程と、ｄ）前記親ポリヌクレオチドによりエンコードされた一つ以上のタンパク質特性に比較して改変された特徴を持つ一つ以上のタンパク質特性をエンコードする少なくとも一つのポリヌクレオチド・シーケンスを生成するために相互にアニールするフラグメントを増幅する工程と、を有する。好ましくは、エキソヌクレアーゼはＢＡＬ３１である。
2004515248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のタンパク質特性をエンコードした親一本鎖ポリヌクレオチド・シーケンスから、ポリヌクレオチドのシーケンス或いはシーケンスの集団を生成する方法であって、
ａ）  親ポリヌクレオチド・シーケンスのプラス鎖とマイナス鎖を構成する一本鎖ＤＮＡを準備する工程と；
ｂ）  一本鎖フラグメント集団を生成するために前記一本鎖ヌクレオチド・シーケンスをエキソヌクレアーゼで消化する工程と；
ｃ）  前記プラス鎖から発生された前記フラグメントを前記マイナス鎖から発生された前記フラグメントに接触させる工程と、場合によっては、少なくとも一つの親ポリヌクレオチドの３’末端と５’末端にアニーリング条件下でアニールするプライマー・シーケンスを加える工程と；
ｄ）  前記親ポリヌクレオチドによりエンコードされた前記一つ以上のタンパク質特性に比較して改変された特徴を持つ一つ以上のタンパク質特性をエンコードした少なくとも一つのポリヌクレオチド・シーケンスを生成するために、互いにアニールする前記フラグメントを増幅する工程とを有する方法。
【請求項２】
前記エキソヌクレアーゼがＢＡＬ３１、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ７遺伝子６、バクテリオファージ・ラムダ・エキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼＲｅｃ Ｊｆから選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記エキソヌクレアーゼがＢＡＬ３１である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
一つまたは複数の親ポリヌクレオチド・シーケンスが突然変異誘発を受けている、請求項１、２及び３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）において生成した前記フラグメント集団が突然変異誘発を受けている、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記突然変異誘発がエラー・プロウンＰＣＲである、請求項５あるいは６記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）が、異なる長さの一本鎖フラグメントの集団を生成するために実施される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）が、５０のヌクレオチド以上の平均長を持つ一本鎖フラグメントの集団を生成するために制御される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記エンコードされたポリペプチドを産出するために、工程ｄ）で生成した少なくとも１つのポリヌクレオチド・シーケンスを発現する工程を有する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エンコードされたポリペプチドを所望の特性に関して試験する工程を有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記親ポリヌクレオチド・シーケンスがその抗体あるいは抗体フラグメントをエンコードする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記親ポリヌクレオチド・シーケンスが酵素をコードする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記親ポリヌクレオチド・シーケンスが抗原をエンコードする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
所望の特性を持つポリヌクレオチド及び／或いはエンコードされたポリペプチドを請求項１乃至１３のいずれか１項による方法により同定した後、前記ポリヌクレオチド及び／或いはエンコードされたポリペプチドを薬剤的に受容できるキャリヤーに加える工程を有する薬組成物を調整する方法。
【請求項１５】
所望の特性を持つポリヌクレオチド及び／或いはエンコードされたポリペプチドを請求項１乃至１３のいずれか１項による方法により同定した後、前記ポリヌクレオチド及び／或いはエンコードされたポリペプチドの全部或いは一部分を薬に使用する工程を有する方法。
【請求項１６】
前記薬での使用が病気の処置、治療及び／或いは診断用である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法に従った、所望の特性を持つポリヌクレオチドを同定した後に、前記ポリヌクレオチドを試料中の標的ポリヌクレオチドの検出及び／或いは増幅に使用する工程を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質機能のインビトロ分子進化方法に関し、特にヌクレアーゼを用いて得られた一本鎖ＤＮＡセグメントのシャフリングによる方法に関する。
【０００２】
タンパク質機能は、部位の命令付き突然変異誘発（アルバー外（Ａｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ），Ｎａｔｕｒｅ，５；３３０（６１４３）：４１−４６，１９８７）、組み合わせクローニング（ハス外（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１，１９８９；マークス外（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３，１９９２）及び適した選択システムと組み合わせたランダム突然変異誘発（バーバス外（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ），ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１，１９９２）を含め、種々の方法によりインビトロで修正・改良することができる。
【０００３】
選択を伴うランダム突然変異誘発の方法は，タンパク質機能を改良するために多くに場合に使用されてきており、２つの異なる方策が存在する。第一に、願望される性質を持つ変異体の（突然変異の）タンパク質の選択と共同する全遺伝子シーケンスのランダム化は新ラウンドのランダム突然変異誘発と選択に伴われる。従って、この方法は、最適と考えられるタンパク質変異体を見出すまで繰り返すことができる（シーア外（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６  ２６３（４）：５５１−５６７）。ここでは、突然変異を導入する従来からのルートは、約０．７％の突然変異比率で、エラー・プロウンＰＣＲ（レング外（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ），Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５，１９８９）による。第二に、遺伝子の限られた領域を、変質したプライマーで突然変異を誘発することができる。このプライマーが１００％までの突然変異比率をもたらす（グリフィス外（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ），ＥＭＢＯ．Ｊ，１３：３２４５−３２６０，１９９４；ヤング外（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３，１９９５）。使用する突然変位比率が高ければ高いほど、突然変異を受けることができる遺伝子の領域がそれだけ大きく限定される。
【０００４】
ランダム突然変異は抗体工学の分野で広く用いられてきた。インビボで形成された抗体遺伝子をインビトロでクローニングすることができ（ラリック外（Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０−１２５６，１９８９）、かつ、種々の重い遺伝子と軽い遺伝子をエンコードする遺伝子のランダムな組み合わせが選択を受けることができる（マークス外（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３，１９９２）。選択された機能性抗体フラグメントは、ランダム突然変位誘発と選択の追加のラウンドとを用いてさらに改良することができる（シーア外（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６  ２６３（４）：５５１−５６７）。
【０００５】
ランダム突然変異誘発の方策は選択を伴う。興味深い性質を持つ変異体を選択することができ、かつ、各々が興味深い性質を持ち、異なる変異体から突然変異したＤＮＡ領域が一つのコーディング・シーケンスに組入れられる（ヤング外（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３，１９９５）。これは多段シーケンス方法であり、異なる領域における異なる突然変異の潜在的相乗効果が失われる可能性がある。これらが共同して選択を受けないからである。このようにして、これらの二つの方策は、限定領域の同時突然変異誘発とこれらの領域の組み合わせの選択とを含まない。別の方法は、例えば抗体親和性を改良するために使用することがある遺伝子の組み合わせの対合を伴う（マークス外（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３，１９９２）。ここでは、各々異なる遺伝子の三つのＣＤＲ領域が固定され、この技法は、クローン間で、例えばＣＤＲ領域を含む種々のドメインに対して遺伝子の個々の遺伝子セグメントのシャフリングをもたらさない。
【０００６】
ＤＮＡシャフリング（ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ），Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１，１９９４）の概念は、ＤＮＡのランダムなフラグメント化と機能性コーディング・シーケンス中へのフラグメントの集合とを利用する。この方法では、化学合成ＤＮＡシーケンスを導入することと、このようにしてＤＮＡシーケンスが既知である遺伝子において限定された場所に変化をねらうこととが可能である（クラメリ外（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１８：１９４−１９６，１９９５）。ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）と共同研究者はこのインビトロ方法を開発した。この方法は、現実にタンパク質の普通に起きる進化プロセスをリアセンブルする。ＤＮＡシャフリングは、個々の遺伝子から有用な突然変異を組入れる組換えにより多様性を生成する。それは、例えば酵素とサイトカインのような異なるタンパク質の人為的進化に対して首尾よく使用されてきた（チャン外（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，７９３−７９７，１９９９；ザン外（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，４５０４−４５０９，１９９７；クリスチャン外（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌｌ），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，２５９−２６４，１９９９）。遺伝子は、デオキシリボヌクレアーゼを用いてランダムにフラグメント化され、次に相互組換えによりリアセンブルされる。出発物質は、シングル遺伝子（エラー・プロウンＰＣＲを用いて始めにランダムに突然変異化された）であるか、あるいはファミリ・シャフリングと呼ばれる自然発生の相同シーケンスである。デオキシリボヌクレアーゼＩは、ピリミジン・ヌクレオチドに隣接する部位で選択的にＤＮＡを加水分解する。それ故、それはＤＮＡのタンダム・フラグメント化に適する選択である。しかしながら、活性度はＭｇイオン、又はＭｎイオンに依存し、Ｍｇイオンはフラグメント・サイズを５０ｂｐに制限し、一方Ｍｎイオンは５０ｂｐ以下のフラグメント・サイズを与えるであろう。それ故、組換えのために全ての可能性のサイズを持つために、問題の遺伝子は、二つの異なるイオンの両方の存在下でデオキシリボヌクレアーゼＩにより少なくとも２回処理し、引き続きこれらのイオンを除去する必要がある。
【０００７】
理論では、任意のクローン間でＤＮＡをシャフルすることが可能である。しかしながら、シャフルされた遺伝子が発現と活性度の点で機能的になる場合、シャフルされようとするクローンは、好ましくは、低水準のランダム突然変異の例外と関連するあるいは同一である必要がある。遺伝子的に異なるクローン間のＤＮＡシャフリングは一般的に非機能性遺伝子を生成する。しかしながら、種間融合ライブラリーは、ＤＮＡレベルで５０％の相同性しかない大腸菌と人間のグリシンアミド・リボヌクレオチド・トランスフォーミラーゼ遺伝子とのフラグメント間でつくることができることがイッチイ（ＩＴＣＨＹ）の方法研究により立証された（オスターマイヤー外（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７，１２０５−９，１９９９）。
【０００８】
二つの異なる遺伝子間の好結果の組換えはヘテロ二本鎖分子の形成を必要とする。幾つかのケースでは、ファミリ・シャフリングは、低頻度の組換えで発生するホモ二本鎖を形成するに過ぎないことが多い。この問題はデオキシリボヌクレアーゼＩで消化された一本鎖化ＤＮＡの使用により焦点が当てられてきた（菊地外  Ｇｅｎｅ  ２４３，１３３−１３７  ２０００）。
【０００９】
一本鎖化ＤＮＡは本質的に異なる二つの方法で得ることができる。第一に、ＰＣＲ反応においてビオチン化プライマーを例えばダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）、ノルウェー）またはアフィニティップ・ストレプタビジン・カプチャー・マイクロ・カラム（ＡｆｆｉｎｉＴｉｐ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｌｕｍｎｓ）（ゲノシ・バイオテクノロジ社（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ウッドランド、米国）と組み合わせて使用することによる。第二に、一本鎖化ＤＮＡをパックすることができるバクテリオファージを利用することによる（最近の微生物学におけるウイルス及び関連生物、原理と応用、１７１頁−１９２頁、バージ（Ｅｄ． Ｅ．Ａ．Ｂｉｒｇｅ）、ブラウン出版社（Ｗｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９９２；サムブルック外（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ）、分子クローニング、研究所マニュアル・第二版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）研究所出版、１９８９）。
【００１０】
改変され改良された性質をもつ酵素の選択は酵素の実際の機能に基づくことが多い。例えば、酵素の耐熱性の増加は、野生型酵素を不活性にする温度でトランスフォームされたコロニーを培養することにより選択することができ、また、改良されたβ−グルコシダーゼ活性は基質としてＰＮＰＧを使用することにより見分けることができる（アリズビエタ外（Ａｒｒｉｚｕｂｉｅｔａ ｅｔ ａｌ）  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｊｕｎ  ２７，２０００）。
【００１１】
分子ライブラリーからの機能性タンパク質の選択は、ファージ・ディスプレイ技法の開発により大刷新された（パームリイ外（Ｐａｒｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ），Ｇｅｎｅ，７３：３０５‐３９１  １９８８；マッカフェティ（ＭｃＣａｆｆｅｔｙ ｅｔ ａｌ），Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４，１９９０；バーバス外（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ），ＰＮＡＳ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２，１９９１）。ここでは、表現型（タンパク質）はその対応する遺伝子型（ＤＮＡ）に直接リンクしており、このことにより、タンパク質機能を改良するためにさらに修飾を受けることができる遺伝子型物質を直接クローニングすることができる。ファージ・ディスプレイは、１０１１に達するサイズの形質転換体をもつ多様な分子ライブラリーから機能性バインダーをクローンするために使用される（グリフィス外（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ），ＥＭＢＯ．Ｊ，１３：３２４５−３２６０，１９９４）。このようにして、ファージ・ディスプレイは分子ライブラリーから機能性バインダーを直接クローンするために使用することができ、始めに選択されたクローンをさらに改良するためにも使用することができる。タンパク質ライブラリーの表面発現に使用される別の型のウイルスおよびその選択はバキュロウイルス（ボーブリック外（Ｂｏｕｂｌｉｋ ｅｔ ａｌ）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３：１０７９−１０８４，１９９５；モターヘッド外（Ｍｏｔｔｅｒｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ  ２３８：７１７−７２２，１９９７；グラブヘア外（Ｇｒａｂｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：７３０−７３５，１９９７）とレトロウイルスである（バッハホルツ外（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：９５１−９５４，１９９８）。
【００１２】
分子ライブラリーからの機能性タンパク質の選択はセル表面ディスプレイによっても行うことができる。またここでは、表現型はその対応する遺伝子型に直接リンクしている。バクテリア・セル表面ディスプレイは、例えば、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣａｓｅ）の改良変異体のスクリーニングに使用されてきた（キム外（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６６：７８８−９３，２０００）。この目的に使用することができる別のセルは酵母セル（ボダーとウィトラップ（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ）  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：５５３−５５７，１９９７）、ＣＯＳセル（樋口外  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２０２：１９３−２０４，１９９７）、及び昆虫セル（グランツェリオ外（Ｇｒａｎｚｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ  ２０３：１３１−１３９，１９９７；エルンスト外（Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ  ２６：１７１８−１７２３，１９９８）である。
【００１３】
願望する機能の選択と組み合わせた、突然変異した異なるクローンからのＤＮＡのランダム組み入れは、シーケンスの選択と選択したクローンの組み入れとに比較して、シーケンス・スペースの全域を探索するのに、より効率の良い方法である。
【００１４】
この発明は、インビトロでのタンパク質進化の改良方法を提供しようとするものである。特に、本発明は、より効率的な組換えとシャフリング方法の提供を目的とする。これらは、より改変された分子を生じさせ、これにより願望する特性を有する分子を見つける確率を改善する。
【００１５】
本発明の一つの局面によると、一つ以上のタンパク質特性をエンコードした親一本鎖ポリヌクレオチド・シーケンスからポリヌクレオチドのシーケンスあるいはシーケンス集団を生成するための方法を提供する。この方法は以下の工程を有する。
ａ）親ポリヌクレオチド・シーケンスのプラス鎖とマイナス鎖を構成する一本鎖ＤＮＡを準備する工程と、
ｂ）一本鎖フラグメントの集団を生成するためにエキソヌクレアーゼを用いて一本鎖ポリヌクレオチド・シーケンスを消化する工程と、
ｃ）プラス鎖から生成したフラグメントをマイナス鎖から生成したフラグメントと接触させる工程、かつ、場合よっては、少なくとも一つの親ポリヌクレオチドの３’末端と５’末端とにアニーリング条件でアニールするプライマー・シーケンスを加える工程と、
ｄ）親ポリヌクレオチドによりエンコードされた一つ以上のタンパク質特性に比較して改変された特徴をもつ一つ以上のタンパク質特性をエンコードした少なくとも一つのポリヌクレオチド・シーケンスを生成するために、相互にアニールするフラグメントを増幅する工程。
【００１６】
それ故、代表的には、願望された特徴を持つ、ポリヌクレオチドのシーケンスあるいはシーケンス集団を生成するためにポリヌクレオチド・フラグメントを組み入れる方法が提供される。この方法は以下の工程を有する。
ａ）異なる長さの一本鎖フラグメント集団を生成するために、一つ以上のタンパク質特性をエンコードする線状親一本鎖ポリヌクレオチドをデオキシリボヌクレアーゼＩ以外のヌクレアーゼを用いて消化する工程と、
ｂ）工程（ａ）に由来するシーケンスからポリヌクレオチド・シーケンスをアセンブルする工程。
【００１７】
好ましくは、この方法は、（ｃ）アセンブルされたポリヌクレオチド・シーケンスによりエンコードされた生成タンパク質を発現する工程、及び（ｄ）願望された特徴を求めてタンパク質をスクリーニングする工程を有する。
【００１８】
ヌクレアーゼの反応時間を制御することにより、ポリヌクレオチド・フラグメントの大きさを制御することができる。このようにしてポリヌクレオチド・フラグメントの長さを決めることによって願望する長さのフラグメントをゲルから精製するような追加の工程を備えなければならないという必要性が回避される。
【００１９】
願望する特徴をもつポリヌクレオチド・シーケンスを生成するために、一つ以上のタンパク質特性をエンコードする親ポリヌクレオチドが、異なって突然変異したその誘導体をつくるための突然変異誘発を受けることがある。同様に、未知のシーケンスの複数の変異体タンパク質特性を既にエンコードした親ポリヌクレオチドを得ることがある。ランダム突然変異は上述のように任意の従来からの方法で行うことができるが、適切な方法はエラー・プロウンＰＣＲである。
【００２０】
一本鎖ポリヌクレオチド・フラグメントを二本鎖ポリヌクレオチド・シーケンス中にアセンブルするために、ＰＣＲ技法を使用することが好ましい。
【００２１】
ポリヌクレオチド・シーケンスは、好ましくはＤＮＡであり、ＲＮＡを使うこともある。簡単のため、用語ポリヌクレオチドは、ここでは以下の記述でＤＮＡに関して使用されるが、本発明がＲＮＡとＤＮＡの両方に適用可能であることを認識すべきである。
【００２２】
好ましくは、ポリヌクレオチドを５’プライム末端から３’プライム末端へ、３’プライム末端から５’プライム末端へ、あるいは両方の３’と５’末端とから消化する任意のエキソヌクレアーゼを使用することができる。本発明に従って使用することができる適切なエキソヌクレアーゼの実例はＢＡＬ３１、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ及びエキソヌクレアーゼＲｅｃ  Ｊｆを含む。
【００２３】
好ましくは、エキソヌクレアーゼはＢＡＬ３１である。
【００２４】
本発明のＤＮＡシャフリング方法にＢＡＬ３１ヌクレアーゼを使用すると、迅速・容易で且つ制御可能なシステムが提供される。この酵素により、あらゆる大きさの遺伝子フラグメントを得ることができ、酵素の活性度は、種々の時点で消化を停止することにより容易に制御することができる。ＢＡＬ３１は、主として、線状ＤＮＡの二本鎖の両３’末端からモノヌクレオチドを取り除く３’プライム・エキソヌクレアーゼである。このようにして、３’プライム・エキソヌクレアーゼ活性により生成した一本鎖ＤＮＡはエンドヌクレアーゼにより減成する。３’プライム・エキソヌクレアーゼの酵素活性はエンドヌクレアーゼよりも約２０倍有効に働く。従って、酵素濃度は得られるＤＮＡフラグメントに重要である。高濃度の酵素は平滑末端付きＤＮＡを有利にするけれども、低濃度で一本鎖ＤＮＡ末端が極めて長いことがある。ＢＡＬ３１は反応速度論的に異なる二つの酵素形態からなり、これらは迅速形態（Ｆ）と緩慢形態（Ｓ）である。Ｓ形態はＦ形態のタンパク質分解酵素の減成生成物である。さらに、ＢＡＬ３１は非同期的に働き、その末端が種々の程度に切除され且つその一本鎖尾部が長さにおいて変化するＤＮＡ分子の集団を生成する。両方の形態が、また、高度に進歩的様式でエキソヌクレオリティックな形でｓｓＤＮＡ上で作用する。攻撃の方向は、二本鎖ＤＮＡの減成のモードと対照的に、５’末端からである。ヌクレアーゼ分子は、当初５’末端から離れて非生産的に結合され、容易に拡散して生産的な（ターミナルで結合される）酵素基質錯体を生じることが示唆された（ル及びグレイ（Ｌｕ Ｔ ａｎｄ Ｇｒａｙ ｊｒ． ）ＨＢ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ  １９９５，ｖｏｌ．  １２５１，ｐ１２５−１３８）。酵素はコ・ファクターとしてＣａ２＋を使用する。これは、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−四酢酸）との錯体に結合されることがある。線状ＤＮＡシーケンスはＢＡＬ３１で消化され、反応はＥＧＴＡの添加により異なる時点で停止される。
【００２５】
消化された個々のフラグメントは精製され、混合され、ＰＣＲ技法でリアセンブルされる。アセンブルされた（再構成された）遺伝子は、次に、タンパク質を発現するため発現ベクター中にクローンされる。タンパク質は、次に、改良した特徴を求めて分析される。
【００２６】
本発明の方法は既知のシャフリング技法を超える幾つかの利点を提供し、これらには組み換えの比率増加とフラグメントの大きさの制御とが含まれる。
【００２７】
本発明の方法は、ＢＡＬ３１処理からＤＮＡ試料を引き出す各時点で一組の累進的に短縮されたＤＮＡフラグメントを生成する。ＤＮＡ試料は集められ、一緒にプールされることがあり、あるいは、場合によっては、個別の試料が選択され、この方法に使用されることがある。このようにして、本発明は、どんなＤＮＡ試料を組み換えシステムに使用することになるか選択できることによってより良好な制御を提出する。
【００２８】
本発明の方法は、例えば抗体又は抗体の一部、酵素又は受容体のような結合性又は触媒性を有する任意のタンパク質で例示される特別な生成物にコードする任意のポリヌクレオチドに実施されることがある。さらに、例えば触媒ＲＮＡに改変されることがある機能を有する任意のポリヌクレオチドが本発明に従ってシャフルされることがある。一つ以上のタンパク質特性をエンコードする親ポリヌクレオチドが少なくとも１２個のヌクレオチド長さであることが好ましく、より好ましくは少なくとも２０個以上のヌクレオチド長さであり、さらにより好ましくは少なくとも５０個以上のヌクレオチド長さである。少なくとも１００個のヌクレオチド長さである、あるいは少なくとも２００個のヌクレオチド長さであるポリヌクレオチドが使用されることがある。酵素あるいは抗体のような大きなタンパク質をエンコードする親ポリヌクレオチドが使用される場合、これらは数百あるいは数千の塩基長さを有する。本発明は任意の大きさの親ポリヌクレオチドに実施されてよい。
【００２９】
本発明は、また、上述の方法により生成され、願望される特徴を有するポリヌクレオチド・シーケンスを提供する。これらのシーケンスは、遺伝子治療ベクター、及び、複製欠陥のある遺伝子治療構成体、あるいは、ＤＮＡベースの種痘用種痘ベクターの生成に使用されることがある。さらに、ポリヌクレオチド・シーケンスは研究の道具として使用されることがある。
【００３０】
本発明は、また、願望される特徴を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが選択され、上述の方法で生成される、シーケンスのポリヌクレオチド・ライブラリを提供する。ポリヌクレオチド・ライブラリがａＤＮＡまたはｃＲＮＡのライブラリであることが好ましい。
【００３１】
本発明は、また、上述の方法により生成した野生種のものとは異なる特徴を有する、酵素、抗体、及び受容体のような、タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、個別に、あるいはワクチンとして薬剤的に受容される担体内に、あるいは例えば免疫体、抗原または特定の抗体を得る別のものとして治療用医薬内に使用されることがある。これらは研究の道具として使用されることがある。
【００３２】
本発明により生成されるポリヌクレオチドまたは本発明により生成されるポリヌクレオチドによりエンコードされるタンパク質の願望される特徴は、野生種（親）ポリヌクレオチド、あるいはポリペプチド、タンパク質、あるいはそれがエンコードするタンパク質特性の通常の活性における任意の変化または改変であることがある。例えば、酵素の触媒活性を減少又は増加すること、あるいは抗体の結合特異性を改良または低減することが望ましいことがある。さらに、タンパク質またはポリヌクレオチドが免疫体である場合、それに対する固有の抗体を得るためにその性能を減少または増加することが望ましいことがある。親ポリヌクレオチドは好ましくは一つ以上のタンパク質特性をエンコードする。これは、特徴的タンパク質機能を有するまたは潜在的に有するポリペプチド・シーケンスをエンコードする、ポリヌクレオチドの領域により決定される。例えば、タンパク質特性は、全体タンパク質の一部、すなわちエピトープまたは開裂部位または触媒部位等を決めることがある。しかしながら、本発明の範囲内では、発現したタンパク質特性は活性度をディスプレイするまたは「正しく」折畳まれている必要はない。
【００３３】
一部のエピトープの立体配座を改変するようにタンパク質を修飾することによりその抗原性を改良する及び／又は交さ反応を低減することが望ましいことがある。例えば、そのようなタンパク質が抗原として使用されると仮定すると、修飾が、同様のタンパク質と出現した抗体の任意の交さ反応を低減することがある。
【００３４】
用語「酵素」が使用されるけれども、これは、酵素様活性すなわち触媒機能を有する任意のポリペプチドをも含むとして説明されるべきである。例えば、酵素の一部であるポリペプチドはなお触媒機能を所有する。その上、インターフェロンおよびサイトカインのようなタンパク質が含まれる。同じように、用語「抗体」は、要求される特異性と共に結合ドメインを有する任意の結合物質を含むとして解釈されるべきである。これは抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能性等価体及び同族体を含むとともに、合成分子とその形状が、それに抗体またはエピトープを結合することを可能にする抗体の形状を模写する分子とを含む。抗体または別の結合パートナーを結合することができる抗体フラグメントの実例は、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１及びＣＨ１の各ドメインからなるＦａｂフラグメント、ＶＨ及びＣＨ１の両ドメインからなるＦｄフラグメント、抗体のシングル・アームのＶＬ及びＶＨの両ドメインからなるＦｖフラグメント、ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント、隔離されたＣＤＲ領域及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ区域でジスルフィド・ブリッジによりリンクされる二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである。シングル・チェーンＦｖフラグメントも含まれる。
【００３５】
生成したポリヌクレオチド・シーケンスの発現を得るために、そのシーケンスが、その発現を制御するために、ポリヌクレオチド・シーケンスに操作可能にリンクした制御シーケンスを有するベクターに組み入れられることがある。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチド・シーケンスの発現を推進するためにプロモーターまたはエンハンサーのような別のシーケンスを含むことがあり、ポリヌクレオチドでエンコードされたタンパク質が融合体として生産されるようにそれ以上のポリヌクレオチド・シーケンスを含むことがあり、及び／又は、宿主細胞内で生産されたタンパク質がその細胞から分泌されるように分泌シグナルをエンコードする核酸を含むことがある。ポリヌクレオチド・シーケンスでエンコードされたタンパク質は、次に、ベクターが機能性である宿主細胞内にベクターをトランスフォームすること、タンパク質が生産されるように宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞または取り巻く媒質からタンパク質を受容することによって得ることができる。原核生物の細胞と真核生物の細胞が当該技術でこの目的に使用され、これらは大腸菌の株、酵母及びＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のような真核生物の細胞を含む。宿主細胞の選択は、例えばタンパク質が宿主細胞内でデポジトされるまたはグリコシレーションのような性質に影響を及ぼす場所を制御する、それらの細胞に発現したタンパク質の性質を制御するために使用することができる。
【００３６】
ポリヌクレオチド・シーケンスでエンコードされたタンパク質は、当該技術で公知の方法により発現されることがある。便宜的には、発現は、タンパク質の発現を引起すまたは与える適切な条件下でそのようなベクターを含む宿主細胞を培養により成長させることにより達成されてもよい。
【００３７】
種々の異なる宿主細胞内のタンパク質のクローニングと発現のためのシステムが公知である。適切な宿主細胞は、バクテリア、哺乳動物と酵母のような真核生物の細胞、及びバキュロウイルス・システムを含む。また、クローニングと発現のためにレトロウイルス・システムを使用することは、良好な代替案である。この理由は、このウイルスが多くのセルの型と共に使用することができるためである。異類変性のポリペプチドのために当該技術で利用できる哺乳動物細胞系統は、中国ハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、赤子ハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞及び多くの他の細胞を含む。一般的な、好ましいバクテリア宿主は大腸菌である。
【００３８】
適切なベクターを選択するあるいは組み立てることができる。適切なベクターは、プロモーター・シーケンス、ターミネーター・フラグメント、ポリアデニレーション・シーケンス、エンハンサー・シーケンス、マーカー遺伝子及び適切な他のシーケンスを含む適当な調整シーケンスを含んでいる。ベクターは、適切な、プラスミド、例えばファージのようなウイルス、またはファージミドであることがある。さらに詳細には、例えば、分子クローニング：研究所マニュアル：第二版、サムブルック外（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ）、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照ください。ポリヌクレオチド・シーケンスを操作するための多くの公知の技法と報告が、例えばポリヌクレオチド構成体の調製、突然変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞内への導入及びタンパク質の分析において、分子生物学における最近の報告、アウスベル外（Ａｕｓｕｂｅｉ ｅｔ ａｌ）編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年に詳細に記述される。
【００３９】
システムは、多くの方法で願望されるタンパク質機能を求めてスクリーニングすることができる種々のシーケンスを有するＤＮＡライブラリをつくるために使用することができる。酵素機能は、例えばカルボキシメチルセルラーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性及び熱安定性のような実際的酵素機能に特有の方法でスクリーニングすることができる。さらに、ファージ・ディスプレイおよびセル表面ディスプレイが、酵素機能を求める（クラメリ外（Ｃｒａｍｅｒｉ Ａ． ｅｔ ａｌ），Ｎａｔｕｒｅ  １９９８  １５；３９１（６６６４）：２８８−２９１；ザーン外（Ｚｈａｎ Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ），ＰＮＡＳ． ＵＳＡ  １９９７  ９４（９）：４５０４−４５０９；ワーレン外（Ｗａｒｒｅｎ Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６，９；３５（２７）：８８５５−８８６２；キム外（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ），Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６６：７８８−９３，２０００）と同様に例えば抗体の改変された結合性を求める（グリフィス外（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ），ＥＭＢＯ Ｊ． １１３：３２４５−３２６０，１９９４）スクリーニングに使用されることがある。
【００４０】
本発明により提供されるタンパク質は、活性又は機能に影響を与えるまたは調節する分子を求めるスクリーニングに使用されることがある。そのような分子は治療の関係（おそらく予防を含めて）に有用なことがある。
【００４１】
本発明は、また、上述の方法で生成したポリヌクレオチド・シーケンスを有するベクターを提供する。
【００４２】
本発明は、また、ポリヌクレオチド・シーケンス、ポリヌクレオチド・シーケンスを有するベクター、あるいは、上述の方法で生成するタンパク質と薬剤的に受容できるキャリヤー、あるいは、研究目的に適するキャリヤー、を有する組成物を提供する。
【００４３】
本発明は、また、上述の方法により願望する特徴を有する、ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドの同定に引続いて、場合によっては付加的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと共に、このポリペプチドまたはポリヌクレオチドの全体または一部を製造することを含む方法を提供する。
【００４４】
願望する特徴を有するポリヌクレオチドあるいはポリペプチドの同定に引続いて、これらが、次に、ＰＣＲ、クローニング及び宿主細胞内の発現のような公知の技法により、より多くの量を提供するために製造される。
【００４５】
得られたポリペプチドあるいはポリヌクレオチドは、例えば低温度でより高い活性が好ましい、クリーニング店の洗浄性酵素のような工業用酵素の製造に使用されることがある。あるいは、製造されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは研究道具として使用されることがある。すなわち、抗体が免疫検定に使用されることがあり、ポリヌクレオチドがハイブリダイゼイション・プローブまたはプライマーとして使用されることがある。あるいは、得られたポリペプチドあるいはポリヌクレオチドは、以下に述べるように、診断用途、製剤用途、治療等用の医薬の調製に使用されることがある。
【００４６】
本発明の方法で生成され、望ましい特徴を有するとして同定されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、医薬組成物に配合することができる。この組成物は、上述の物質の一つに加えて、当業者に公知で医薬的に受容される賦形剤、キャリヤー、緩衝剤、安定剤または他の物質を有することがある。そのような物質は、無毒性であらねばならず、活性成分の効能と干渉してはならない。キャリヤーまたは他の物質の正確な性質は、例えば経口、静脈、皮膚または皮下、鼻、筋肉内、腹腔内の経路の投与経路によることがある。
【００４７】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末及び液体の形態であることがある。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体キャリヤーを含むことがある。液体薬剤組成物は、一般的に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油のような液体キャリヤーを含む。生理的食塩水、ブドウ糖、または他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのようなグリコールが含まれることがある。
【００４８】
静脈、皮膚または皮下注射、あるいは苦痛部位での注射用には、活性成分は、ピロゲンを含まず、且つ適切なｐＨ、アイソトニシティ及び安定性を有し、非経口で受容できる水溶液の形態である。当業者は、例えば、食塩注射剤、リンゲル液注射剤、乳酸加リンゲル液注射剤のようなアイソトニックな分散媒を使用する適切な溶液を調製することが十分にできる。保存剤、安定剤、緩衝材、抗酸化剤及び／又は別の添加剤が、必要に応じて、含まれることがある。
【００４９】
個人に与えられるべきものが、本発明による生成に引続いて同定された、例えば抗体及びそのフラグメントのようなポリペプチド、酵素、ポリヌクレオチドまたは核酸分子である場合、投与は、好ましくは、「予防的に有効な量」であり、あるいは「治療に有効な量」（事情により、予防処置が治療と考えられることもあるけれども）である。これは個人に利益を示すに十分である。投与された実際の量、及び投与の速さとタイム・コースは、治療する対象の性質と重さに依るであろう。例えば投与量等の決定のような治療の処方は、一般医と他の医者の責任範囲内にあり、治療されるべき障害、個々の患者の状態、到達の部位、投与の方法及び開業医に公知の別の因子が、代表的に、考慮される。上述の技法と報告の実例は、レミングトン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）の医薬の科学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ  編集、１９８０に見出すことができる。
【００５０】
あるいは、標的をねらう治療は、抗体または細胞特定リガンドのような標的システムにより、有効薬剤をある種の細胞により多く特定して配送するために使用されることがある。標的をねらうことは種々の理由のために望ましいことがある。これは、例えば、薬剤が、受容できないほど有毒である場合、または薬剤が、そうしなければ、高すぎる投与量を必要とする場合、あるいは薬剤が、そうしなければ、標的細胞に入れることができない場合である。
【００５１】
これらの薬剤を直接に投与する代わりに、これらは、例えばウイルス・ベクター内のような細胞中に導入されたエンコード遺伝子からの発現により標的細胞内で生産することができる（ＶＤＥＰＴ技法の変異体、すなわち、例えば酵素のような活性剤は、ウイルス・ベクター内のエンコードＤＮＡからの発現によりベクター内に産出する）。ベクターは、治療されようとしている特定の細胞を標的にすることができるであろう。あるいは、ベクターは、標的細胞により多少選択的に切り換えられる調節要素を含むことができるであろう。
【００５２】
あるいは、治療されようとする細胞にて活性剤により生産される、活性形態へ転換するための薬剤を前駆体の形態で投与することが、または、治療されようとする細胞を標的にすることができるであろう。この種類の取り組みはＡＤＥＰＴまたはＶＤＥＰＴとして知られる場合が多い。前者は、細胞特異性抗体への接合により細胞に活性剤をねらいをつけることを含み、一方、後者はウイルス・ベクター内にＤＮＡをエンコードすることから発現によりベクター内に、例えば酵素のような活性剤を産出することを含む（例えば、欧州特許第４１５７３１号明細書及び国際公開第９０／０７９３６号明細書を参照ください）。
【００５３】
組成物は、それのみで、あるいは、治療されようとする状態によって同時にまたは順番に別の治療と組み合わせて、投与されることがある。
【００５４】
さらに別のこととして、本発明の方法による生成に引続いて望ましい特徴を持つとして同定されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによりエンコードされた活性ポリペプチドを合成することができない、あるいは、正常な水準ではそれを合成することができない、患者に対して遺伝子治療の方法で使用することにより、対応する野生型タンパク質により与えられる効果を提供することができるであろう。
【００５５】
ウイルス・ベクターのようなベクターは、ポリヌクレオチドを広範囲の異なる標的細胞中に導入するために従来技術で使用されてきた。代表的には、ベクターが標的細胞に露出される結果として、トランスフェクションが十分な割合の細胞で起きて、望まれるポリペプチドの発現から治療のまたは予防の有用な効果を与えることができる。トランスフェクションされた核酸は、標的の各腫瘍細胞のゲノム中に永久に組み込まれ、長期に継続する効果を与えることがある。あるいは治療は定期的に繰り返さなければならないことがある。
【００５６】
種々のベクターは、ウイルス・ベクター及びプラスミド・ベクター共に、当該技術に公知であり、米国特許第５，２５２，４９２号明細書及びＰＣＴ国際公開公報９３／０７２８２号明細書に見られる。特に、多くのウイルスが、遺伝子転移ベクターとして使用されてきた。これには、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニア・ウイルス、ヘルペス・ウイルス、ＨＳＶ及びＥＶＢ、レトロウイルスが含まれる。既存技術における多くの遺伝子治療報告では、不活性化されたネズミのレトロウイルスが使用されてきた。
【００５７】
ウイルス・ベクターを使用する代わりとして、細胞中に核酸を導入する別の既知の方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、細胞内注入のような機械的技法、リポソームに媒介される転移、直接的ＤＮＡ取り込み及びレセプター媒介ＤＮＡ転移を含む。
【００５８】
上述のように、ポリペプチドまたはその活性部をエンコードする核酸を用いる遺伝子治療の狙いは、野生型ポリペプチドが存在しないあるいは低水準で存在するに過ぎない細胞において核酸の発現産物の量を増加することである。そのような治療は、病気にかかりやすい対立遺伝子を有する従って例えばがん素質を有することがスクリーニングにより既知である個人の治療において、既にガンにかかっているまたは予防する細胞の治療に有効であることがある。
【００５９】
本発明は、また、ｓｓＤＮＡ調製用試薬、エキソヌクレアーゼ及び例えば熱安定性ＤＮＡ（ヌクレオチド）のようなＰＣＲ技実施用成分及び例えばＥＧＴＡのような停止用品を有し、望まれる特徴を有するポリヌクレオチドのシーケンスまたはシーケンス集団を生成するキットを提供する。
【００６０】
先に概述したように、本発明は、突然変異した酵素遺伝子シーケンスと、望ましい特徴を有する機能性酵素へのそのランダム組み入れとの創作を使いやすく備える。本発明のこの側面の実例として、酵素遺伝子は、約０．７％の突然変異比率の結果になるエラー・プロウンＰＣＲにより突然変異する。突然変異した酵素遺伝子の得られた供給源は、次に、エキソヌクレアーゼ、好ましくはＢＡＬ３１、により消化され、反応は、異なる時点でのＥＧＴＡの添加により停止され、異なる大きさの一組のＤＮＡフラグメントが得られる。これは、上述のようにＰＣＲベースのリアセンブリを受けることがある。得られたアセンブルされたＤＮＡフラグメントは、次に、クローニングされ、遺伝子ライブラリが構成される。次に、クローンがこのライブラリから選択され、シーケンス化されることがある。
【００６１】
この技法の更なる用途は、さらなる選択と分析に使用することができる種々のＤＮＡシーケンスの集団の生成である。例えば抗体フラグメントと酵素のようにより大きなタンパク質をエンコードするに加えて、ＤＮＡは、分子の機能性の特徴が異なる選択システムの設計に使用することができるペプチドをエンコードすることがある。ペプチドをエンコードする、組み換えられたＤＮＡシーケンスの選択は既に記述した（フィシュ外（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ），ＰＮＡＳ． ＵＳＡ  １９９６  Ｊｕｌ  ２３；９３（１５）：７７６１−７７６６）。加えて、種々のＤＮＡ集団は、例えば触媒活性を持つＲＮＡ分子の集団の産出に使用することがでできる。バイシュ外（Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ）（ＰＮＡＳ． ＵＳＡ  １９８６  Ｍａｒ  ３；９５（５）：２１５８−２１６２）は触媒性ＲＮＡの選択用機能性システムの設計を示した。エクスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ）（Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍｐ．１９９７；２０９；２０７−２１２）は細胞内触媒性ＲＮＡの特異的導入による触媒性ＤＮＡの応用を概説した。システムは、組み換えられたＤＮＡシーケンスをベースとする触媒活性を持つ機能性ペプチド／分子の選択におけるシーケンス・スペースを通じたさらなる研究に使用することがある。
【００６２】
本発明の特徴と実施例が、これから、付属の図を参照しながら具体例により説明されるであろう。それ以上の特徴と実施例が当業者に明らかであろう。
【００６３】
【実施例】
ＤＮＡシャフリング手法は、図１乃至５に示す工程で説明することができる。ここでは、プラスミドｐＦａｂ５ｃｈｉｓ中の所定のタンパク質（Ｘ）をエンコードする遺伝子を例に用いる。変異性ＰＣＲにより、ランダム変異を導入する。一本鎖ＤＮＡを作製する。これは、上述のとおり、ビオチン化プライマーにより、若しくは一本鎖ＤＮＡを包むことができるファージを使用することにより実施可能である。エンコードするｓｓＤＮＡとエンコードしないｓｓＤＮＡのらせん構造を異なる反応（Ａ及びＢ）で作製する。どちらの反応によるｓｓＤＮＡのらせん構造も、別々の酵素処理を、例えばＢＡＬ３１を用いて施される。等モルの一本鎖ＤＮＡフラグメントの二つの供給源を混合することにより、二つの連続したＰＣＲ反応物を用いて、シャッフルされた形の多くのバージョンの遺伝子をリアセンブルすることができるが、そこでは最初の反応ではプライマーを含まない。このリアセンブルしたｐＹ内の遺伝子のライブラリーをクローニングした後、改良された所定の分子を得る選択をすることができる。
【００６４】
本発明の例を以下に更に詳しく説明する。
【００６５】
実施例１
試薬
アンプリタック  （ＡｍｐｌｉＴａｑＲ（登録商標））ポリメラーゼをパーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）より、ｄＮＴＰをベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）（ドイツ国マンハイム）より、そしてヌクレアーゼＢＡＬ３１をニューイングランド・バイオラブ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）（アメリカ合衆国ビバリー）より購入した。制限酵素は全てニューイングランド・バイオラブ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）（アメリカ合衆国ビバリー）より購入した。臭化エチジウムは、バイオラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（アメリカ合衆国カリフォルニア州ヘラクレス、バイオ・ラッド、ラボラトリーズ）から購入した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランド・バイオラブ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）（アメリカ合衆国ビバリー）より購入した。ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡはケボ・ラブ（Ｋｅｂｏ Ｌａｂ）（スウェーデン国）より購入した。
【００６６】
全てのプライマーは、ラボで設計されてライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） ［スウェーデン国テビー（Ｔａｂｙ）］及びＳＧＳ−ＤＮＡ［スウェーデン国ケピング（Ｋｏｐｉｎｇ）］から入手した。
【００６７】
ＰＣＲ
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は全て、自動サーモサイクラー［パーキンエルマーＣｅｔｕｓ４８０ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ４８０）、アメリカ合衆国コネチカット州ノーウォーク］の中で行なった。核酸増幅のＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号明細書に記載されている。ＰＣＲ技術の一般的用途における参考文献として、Ｍｕｌｌｉｓら「定量的生物学に関するコールド・スプリング・ハーバー・シンポジア」第５１巻２６３頁（１９８７）［Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１：２６３ （１９８７）］、ニューヨークのストックトン・プレスよりＥｈｒｌｉｃｈ編「ＰＣＲ技術」（１９８９）［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９８９）］、Ｅｈｒｌｉｃｈら「サイエンス」第２５２巻１６４３頁乃至１６５０頁（１９９１）［Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５２：１６４３−１６５０ （１９９１）］、ニューヨークのアカデミック・プレスよりＩｎｎｉｓら編「ＰＣＲプロトコル；メソッド及びアプリケーションへの指針」（１９９０）［”ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９０）］を含む。
【００６８】
配列決定
全ての構築体は、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）（アメリカ合衆国カリフォルニア州エルマービル在パーキンエルマー）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｅｌｍｅｒｖｉｌｌ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて配列した。配列決定はＡＢＩプリズム３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて行なった。
【００６９】
アガロース電気泳動
ＤＮＡのアガロース電気泳動は、トリス酢酸バッファー（ＴＡＥ−ｂｕｆｆｅｒ ０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ， ０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）中の臭化エチジウムが０．２５μｇ／ｍｌである２％アガロースゲル（アガロース、アメリカ合衆国メイン州ロックランドＦＭＣバイオプロダクツ）［ＡＧＡＲＯＳＥ （ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ， ＵＳＡ）］を用いて行なった。電気泳動用サンプルは、２５％フィコールとブロモフェノールブルーからなる滅菌、ろ過済みの添加バッファーに混合し、２％アガロースゲルのウェルに添加した。電気泳動は、０．２５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムのトリス酢酸バッファー中で、他に指定のない限り９０Ｖで４５分行なわれた。必要に応じて、適切なサイズのバンドをキアクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ドイツ国ヒルデン，キアゲン社）（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲル精製した。分子量標準として、ＤＮＡ分子量マーカー１ｋｂラダー （ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒ １ｋｂ ｌａｄｄｅｒ） （ギブコＢＲＬ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用した。ゲル抽出生成物のＤＮＡ濃度は、分光光度計を用いて推定した。
【００７０】
細菌株
形質転換の細菌宿主として、ＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株を使用した。化学的な適格細胞であるこの株を、基本的に１９８３年生物学ジャーナルのＤ．ハナハン著「プラスミドによる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）の形質転換の研究」第１６６巻５５７頁乃至５８０頁（Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ． １９８３． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６：５５７−５８０） に記述されるとおりに産生した。この細菌株の電気反応性細胞を産生した（１９８８年、Ｗ．Ｊ．ダウアー、Ｊ．Ｆ．ミラー及びＣ．Ｗ．ラグスデール著「高電圧エレクトロポレーションによる大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の高効率形質転換」、核酸リサーチ代１６巻６１２７頁）（Ｄｏｗｅｒ， Ｗ．Ｊ．， Ｊ．Ｆ． Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｃ．Ｗ． Ｒａｇｓｄａｌｅ．  １９８８： Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ｈｉｇｈ ｖｏｌｔａｇｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：６１２７）
プラスミド
遺伝子操作は全て、「ラボラトリーマニュアル、分子クローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ； ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）（１９８９年コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスより第二版）（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に従い、ｐＦａｂ５ｃｈｉｓ中で行なった。このベクターは、ＳｆｉＩ部位（サイト）とＮｏｔＩサイトの間に挿入されたいかなるｓｄＦｖ遺伝子もかばう（ｈａｒｂｏｕｒ）ように設計されている。ＳｆｉＩサイトはｐｅｌＢ始端部に位置し、ＮｏｔＩサイトはＶＬ領域のすぐ後ろに位置し、それ故ＶＨ−ＶＬリンカーが挿入される。このケースでは、ＣＤ４０へ導く抗体を使用する。
【００７１】
プライマー
ｐＦａｂ５ｃｈｉｓの抗体遺伝子を囲む二つのビオチン化プライマーは、指定された独自の制限酵素認識部位を含む以下の配列で設計した。
１７３６ ＳｆｉＩ フォワードプライマー
2004515248.tif 000003
及び１７３５ＮｏｔＩ リバースプライマー
2004515248.tif 000004
ｐＦａｂ５ｃｈｉｓの抗体遺伝子を囲む二つの非ビオチン化プライマーは、指定された独自の制限酵素認識部位を含む以下の配列で設計した。
１６６４ ＳｆｉＩ フォワード・プライマー
2004515248.tif 000005
及び１６３５ ＮｏｔＩ リバース・プライマー
2004515248.tif 000006
標準ＰＣＲ
標準ＰＣＲ反応は、次のプロフィールにて２５サイクルで行なった。変性（９４℃で１分間）、プライマー・アニーリング（５５℃で１分間）及び伸長（７２℃で３分間）である。各々のＰＣＲ反応物は、Ｐｈ８．３のトリス塩酸を１０ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ、ｄＮＴＰを２００μＭ、フォワード・プライマーを１μＭ、リバース・プライマーを１μＭ、アンプリタック熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑＲ（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（パーキンエルマー社）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）を１．２５Ｕ、及び鋳型５０ｎｇを最終容積１００μｌ中に含んだ。
【００７２】
変異性ＰＣＲ
変異性ＰＣＲ反応を、ＮａＣｌを５００ｍＭ、ｐＨ８．８のトリス塩酸を１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２を５ｍＭ、ゼラチンを１００μｇを含む１０ｘ緩衝剤中で行なった。［カイパーら著、１９９１年８月２５日「核酸リサーチ」第１９（１６）巻４５５８頁（Ｋｕｉｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９１， Ａｕｇ ２５；１９（１６）：４５５８）に準じるが、ＭｇＣｌ２濃度は２ｍＭから５ｍＭに増加した。］
１００μｌの反応毎に以下を混合した。
【００７３】
2004515248.tif 000007
ｐＦａｂ５ｃｈｉｓベクター中の鋳型を５０ｎｇの量で添加した。１０ｍＭのＭｎＣｌ２を１０μｌを添加し、管にＭｎＯ２の沈殿が生じていないことを確認した。最後に５単位のＴａｑ酵素を添加した。変異性ＰＣＲを次の温度で２５サイクル、ホットスタート無しで作動した。９４℃で１分間、４５℃で１分間、７２℃で１分間更に７２℃で７分間である。得られた生成物は、ほぼ７５０ｂｐのタンパク質上にわたる変異性のインサートであった。更に処理を行なう前に、このインサートをギブコＰＣＲ精製キット（Ｇｉｂｃｏ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）で精製した。
【００７４】
ビオチン化プライマーによる一本鎖ＤＮＡの生成
所定のフラグメントを、別個の二つのＰＣＲ反応によって増幅した。これらの反応は、上述した標準ＰＣＲ、または同様に上述した変異性ＰＣＲであり得る。プライマーは、一つの反応でフォワード・プライマーをビオチン化し、もう一つの反応でリバース・プライマーをビオチン化するよう設計すべきである。例えば、ｐＦａｂ５ｃｈｉｓ抗体を鋳型として、上述のプロフィールによってＡ）プライマー１７３６と１６３５、及びＢ）プライマー１６６４と１７３５を用いたＰＣＲ反応を２５サイクル行なった。これによりほぼ７５０ｂｐのＰＣＲ産生物を生じ、Ａ）では上のらせん構造がビオチン化し、Ｂ）では下のらせん構造がビオチン化した。
【００７５】
ビオチン化していないらせん構造は、例えばダイナビーズのようなストレプトアビジンでコートした固体マトリックスを用いて精製して取り出した。この磁性ビーズは、ＰＢＳ１％のＢＳＡと、ｐＨ７．５のトリスを５ｍＭ、ＮａＣｌを１Ｍ及びＥＧＴＡを０．５ｍＭ含むＢ＆Ｗバッファーで洗浄し平衡化する。各ＰＣＲ産生物の１００μｌを２ｘＢ＆Ｗバッファーに溶解しているビーズ１００μｌと混合し、室温で１５分間、回転で培養する。解放されたＰＣＲ産生物は、Ｂ＆Ｗで入念に２回洗浄して取り除く。捕獲したＤＮＡのビオチン化していないらせん構造は、ＤＮＡを０．１ＭのＮａＯＨを２５μｌ用いて室温で１０分間培養することにより、アルカリ変性によって溶出する。この溶解液は、ビーズと分離し、０．３３ＭのＨＣｌを７．５μｌ及びｐＨ８の１Ｍトリスを２．５μｌ用いて中和する。
【００７６】
ファージを用いる一本鎖ＤＮＡの生成
制限酵素ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用して、所定のフラグメントをバクテリオファージＭ１３のベクターであるＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９中にクローン化した。これらのバクテリオファージは、ＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）株を用いた従来の方法で繁殖した。上のらせん構造の一本鎖ＤＮＡはバクテリオファージベクターＭ１３ｍｐ１８から作製し、下のらせん構造の一本鎖ＤＮＡはバクテリオファージベクターＭ１３ｍｐ１９から作製した。１．５ｍｌの感染した細菌培養液を１２０００ｇ、４℃で５分間、簡単に遠心分離機にかけた。浮遊物は、２００μｌの２０％ＰＥＧ８０００と２．５Ｍ ＮａＣｌにより沈殿させた。ペレット化したバクテリオファージは、１００μｌのＴＥ中に再懸濁した。トリス塩酸（ｐＨ８．０）によって平衡化したフェノールを５０μｌ添加し、サンプルを渦攪拌した。遠心分離機に１２０００ｇ、ＲＴで１分間かけた後、ＤＮＡを含む上相は、エタノールによって移動し沈殿した。ＤＮＡペレットは、５０μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）中に溶解させ、２０℃で保管した（１９８９年コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスよりチャプター４、サムブルックら著、「ラボラトリーマニュアル第二版、分子クローニング」）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ． １９８９， ｃｈａｐｔｅｒ ４）。ファージから作製した一本鎖ＤＮＡは、環状であり、ＢＡＬ３１処理に先立って開いていなければならない。これは、一本鎖ＤＮＡを開裂し得るエンドヌクレアーゼを用いて行なうことができる。
【００７７】
ＢＡＬ３１を用いる一本鎖切断ＤＮＡの生成
いずれかの反応（それぞれ上または下のらせん構造を含む）によるｓｓＤＮＡは、例えばＢＡＬ３１を用いる別個の酵素処理を受けた。各々の消化反応では、０．０２μｇ／μｇのｓｓＤＮＡ、６００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス塩酸、１２ｍＭのＣａＣｌ２、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのｐＨ８．０のＥＤＴＡ及び０．１〜５Ｕ／ｍｌの範囲で様々な酵素濃度のＢＡＬ３１が含まれた。この反応物は３０℃で培養され、消化したｓｓＤＮＡのフラグメントは、１０、３０、６０及び１２０秒またはそれ以上の間隔で順次回収した。ＥＤＴＡを添加することで反応を停止させ、１０分間６５℃で熱処理した。フェノール・クロロフォルム抽出及びエタノール沈殿によって、このｓｓＤＮＡフラグメントを精製した。このｓｓＤＮＡはｐＨ８．０のトリス１０ｍＭ中に再懸濁する。
【００７８】
消化パターンは１％アガロースゲル電気泳動によって評価した。
【００７９】
消化により生成したフラグメントの精製
消化したＤＮＡフラグメントは、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出により精製した。５０μｌの緩衝フェノールを、クロロホルム及びイソアミルアルコールの混合液（２４：１）５０μｌと共に１００μｌのサンプル各管に添加した。これらの管を３０秒間渦攪拌した後、微量遠心において１４０００ｒ．ｐ．ｍ．で１分間遠心分離機にかけた。次に、上相を回収し、２．５容積の９９．５％エタノール（１／１０はｐＨ５．２の３Ｍ酢酸ナトリウムであった）と混合した。ＤＮＡは−８０℃で１時間沈殿させた。次に、このＤＮＡを、微量遠心において１４．０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心することによりペレット化した。このペレットは、７０％エタノールで１回洗浄し、１０μｌの滅菌水に再溶解した。
【００８０】
消化により生成した精製フラグメントのアガロースゲル上における分析
各時点及びブランクからの溶解したペレット５μｌを、２．５μｌの添加緩衝液（２５％フィコール及びブロモフェノールブルー）と混合し、２％アガロースゲル中のウェルに添加した。異なる時点の電気泳動は、上述の通りに行なった。
【００８１】
完全長フラグメントのリアセンブリ
ｓｓＤＮＡフラグメントのリアセンブリを、二つの連続したＰＣＲ反応によって実現した。第一のＰＣＲ反応では、ｐＨ８．３のトリス塩酸を１０ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２えを１．５ｍＭ、ｄＮＴＰを２００μＭ、Ｔａｑポリメラーゼを０．３Ｕ及びＢＡＬ３１処理サンプルを２μｌ、これら全てを最終容積の２５μｌに含み、次のプロフィールによって５サイクル行なった。９４℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間更に７２℃で５分間である。第二のＰＣＲ反応では、ｐＨ８．３のトリス塩酸を１０ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ、ｄＮＴＰを２００μＭ、Ｔａｑポリメラーゼを０．６Ｕ、フォワード・プライマーを１μＭ、リバース・プライマーを１μＭ、及び第一のＰＣＲ反応からサンプルを５μｌ、これら全てを最終容積の５０μｌに含み、次のプロフィールによって１５サイクル行なった。９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間更に７２℃で７分間である。得られた生成物は、アガロースゲル電気泳動によって評価した。
【００８２】
ＳｆｉＩとＮｏｔＩによるリアセンブルしたフラグメント及びプラスミドの制限消化
リアセンブルしたフラグメント及びプラスミドｐＦａｂ５ｃｈｉｓは、ＢＳＡと１１Ｕ酵素／μｇのＤＮＡを含むＮＥＢバッファー２を使用してまずＳｆｉＩで開裂した。この反応は、５０℃で４時間行なった。この後、変換バッファー（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）と６Ｕ酵素／μｇのＤＮＡを添加し、このＤＮＡをＮｏｔＩで開裂した。この反応は、３７℃で一晩行なった。
【００８３】
制限消化したベクター及び制限消化したリアセンブル・フラグメントのゲル精製
開裂反応物を１％アガロースゲルで分析した。制限消化したインサートは、約７５０ｂｐの開裂生成物を示した。これは、予想されるサイズとかなり一致する。開裂したインサートのバンドとプラスミドを切り出し、前述のとおりゲル抽出した。
【００８４】
制限消化したｐＦａｂ５ｃｈｉｓによるリアセンブル制限消化フラグメントのライゲーション
精製、開裂したｐＦａｂ５ｃｈｉｓを、精製しリアセンブルした制限消化フラグメントにより１２℃の水浴で１６時間ライゲートした。このベクター５０μｌを５０μｌのインサート及び１５μｌの１０×バッファー（酵素と共に供給）、７．５μｌのリガーゼ（５Ｕ／μｌ）及び最終容積１５０μｌになるまで滅菌水と混合した。いかなるインサートも用いない制限消化したｐＦａｂ５ｃｈｉｓのライゲーションも、同様の方法で行った。
【００８５】
ライゲートしたリアセンブル・インサート及びｐＦａｂ５ｃｈｉｓによる化学的に適格なＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の形質転換
ライゲーション反応物を、上述のとおりフェノール・クロロホルム抽出によって精製した。この抽出から上相を回収し、２．５容積の９９．５％エタノール（１／１０はｐＨ５．２の３Ｍ酢酸ナトリウムであった）と混合した。このＤＮＡを−８０℃で１時間沈殿させた。次に、そのＤＮＡを、微量遠心において１４．０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心することによりペレット化した。ペレットは、７０％エタノールで１回洗浄し、次に１０μｌの滅菌水に再溶解した。ライゲーション物を各々５μｌ別個に、９５μｌの化学的に適格なＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）と混合し、氷上で１時間培養し、形質転換した（１９８９年コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスより、サムブルックら著、「ラボラトリーマニュアル第二版、分子クローニング」）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）。１時間の増殖後、これら２つの形質転換からの細菌を、アンピシリン含有寒天プレート（１００μｇ／ｍｌ）上に塗布した。これらのプレートは、上下面を逆にして３７℃の培養器内で１４時間増殖した。
【００８６】
実施例２―  組換え頻度；  ｄｓＤＮＡとｓｓＤＮＡとの比較
更なる比較実験において、３個のｓｃＦｖ抗体フラグメントがｄｓＤＮＡ或いはｓｓＤＮＡのいずれかとして組替え実験に使われた。
【００８７】
ｄｓＤＮＡ
上記の３個のｓｃＦｖ遺伝子は、それぞれフォワード・プライマーとリバース・プライマーを使用し、標準ＰＣＲ手順を使用したＰＣＲで増殖された。バンドの大きさはアガロース電気泳動により確認され、他の増殖されたＰＣＲ生成物は協奏的ＰＣＲ精製装置（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を使用して精製された。３個のｓｃＦｖから得られたｄｓＤＮＡは等モル量で混合され、ＢＡＬ３１で処理された。各加水分解反応は異なる酵素濃度（４ウリジン酵素／ｍｌ反応容積、２０ウリジン酵素／ｍｌ反応容積と１００ウリジン酵素／ｍｌ反応容積を使用）で０．０２（ｇ／（ｌ反応容積濃度のｄｅＤＮＡ，６００ ｍＭのＮａＣｌ， ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ， １２ｍＭのＣａＣｌ２， １２ｎＭのＭｇＣｌ２， １ＭｍのＥＤＴＡｐＨ８．０とＢＡＬ３１とを含んでいた。反応は３０（Ｃで加温放置し、加水分解されたｄｓＤＮＡの断片は１０分、２０分、３０分の順で集められた。反応は，ＥＤＴＡ熱処理（代替に、ＥＤＴＡを使用しない熱失活プロトコールを使用してもよい； 下記参照）で停止され、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿を使用して精製された。ｄｓＤＮＡ試料は１０ｍＭトリスｐＨ８．０で再度懸濁された。
【００８８】
各時点を分離したままで、試料にプロトコルに従ってリアセンブリＰＣＲ（このリアセンブリには６０（ｇＤＮＡが使われる）と増幅ＰＣＲがおこなわれ、試料はｐＧＥＭ（生成物Ｎｏ． Ａ３６２Ａ，プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マヂソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国）でクローン化された。各時点から１８のクローンが配列決定され、組替えの数と頻度が定量された。
【００８９】
エキソヌクレアーゼ加水分解の熱失活化
ＢＡＬ３１反応をＥＤＴＡを使わずに停止させるプロトコルは確立されている。この熱失活プロトコルは、健康に危険でありまた材料を損失させるフェノール／クロロフォルム抽出の使用をしないようにする。
【００９０】
簡単に言えば、試料は１０分間９５（Ｃで加熱放置され、次に直接に氷に漬けて酵素反応を停止させる。この後、試料をエタノールを使用して直接に沈殿させる。
【００９１】
ｓｓＤＮＡ
上記の３個のｓｃＦｖ遺伝子がそれぞれ、フォワード／リバース・ビオチンのプライマー対とフォワード・ビオチン／リバースのプライマー対とを使用し、標準ＰＣＲ手順を使用した２個のＰＣＲ反応で増幅された。バンドの大きさはアガロース電気泳動により確認され、他の増殖されたＰＣＲ生成物は協奏的ＰＣＲ精製装置（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を使用して精製された。一本鎖ＤＮＡがプロトコルに従った磁気球を使用して得られ、３個のセンス鎖と３個のアンチセンス鎖が形成された。各３個のｓｃＦｖからのセンス鎖とアンチセンス鎖は等モル量で混合されプロトコル（１．２５ウリジン酵素反応容積或いは１１Ｕ酵素反応容積と０．０１５（ｇ／（ｌ反応容積濃度のｓｓＤＮＡを使用）に従ってＢＡＬ３１で処理され、試料が０分（即ち、加水分解されず）、１０分、３０分と５０分で取り出された。反応はＥＤＴＡと熱処理で停止され、フェノール／クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を使用して精製された。各時点を離したままで、センス鎖とアンチセンス鎖を混合して、試料にはプロトコルに従ったリアセンブリＰＣＲ（このリアセンブリには６０ｎｇＤＮＡが使用される）と増殖ＰＣＲがなされて試料はｐＢＥＭでクローン化された。各時点から１８クローンが配列決定され、組替えの数と頻度が定量された。
【００９２】
結果
ｄｓＤＮＡを使用した組替えの最も高い頻度が２０ウリジン酵素／ｍｌ反応容積（０．０２（／（ＤＮＡを含む）を使用し、１０分間処理を行い達成された。これにより、３９％の一乗り換えのあるクローンとなり（図６）、１７％の二乗り換えのあるクローン（図７）となった。４ウリジン酵素／ｍｌの使用はフラグメンテ―ションの時間に関係なく乗り換えを発生させず、１００ ウリジン酵素／ｍｌの使用は、リアセンブリの間に全長を取り戻すことができなかったことに示されているように、完全なフラグメンテ―ションとなり非常に小さい断片を発生させた。
【００９３】
ｓｓＤＮＡを使用した実験から得られた結果は図８乃至図１０に示されている。図８は１．２５ウリジン／ｍｌＢＡ３１と一乗り換えを持ったするクローンを示している。図９は１．２５ウリジン／ｍｌＢＡ３１と二乗り換えを持ったクローンを示している。図１０は１．２５ウリジン／ｍｌＢＡ３１と一乗り換えを持ったクローンを示している。図１１は１．２５ウリジン／ｍｌＢＡ３１と二乗り換えを持ったクローンを示している。
【００９４】
一乗り換えを発生させたｓｓＤＮＡを使用した組替えの最高頻度は、１１ウリジン酵素／ｍｌを使い１０分間の処理により達成された（第１０図）。５９％のクローンが一乗り換えを持っていた。二乗り換えを発生させたｓｓＤＮＡを使用した組替えの最高頻度は、１．２５ウリジン酵素／ｍｌを使い３０分間の処理により達成された（第９図）。２０％のクローンが二乗り換えを持っていた。
【００９５】
結論と見解
これらのデータは、組替えの頻度がｓｓＤＮＡを使用しすると高くなることを示している。使用された３個のｓｃＦｖは同じ骨格配列を持ち、記載された乗り換えの数は配列相違が結果として起こらない領域での乗り換えによりより高くなり得ることを示している。ｓｓＤＮＡを使ったこれらの実験は、３個のすべての分子からのすべての鎖が混合されているため、最大の組替えを示すのに最適ではない態様で行われた。１個のｓｃＦｖからのセンス鎖を１個のｓｃＦｖからのアンチセンス鎖と混合すると乗り換えの頻度をより高くなる。下記の実施例３を参照。また、ここでは各時点が離されており、異なる時点、即ち異なる断片の大きさが混合されれば乗り換えの頻度は高くなると推定するのは論理的であろう。
【００９６】
実施例３  −  組替え頻度；  ｓｓＤＮＡを使用した相同性依存度
乗り換えを達成するのに必要とされる相同性を調べるために、私達は、次のように異なる相同体と３対を作っている４個のｓｃＦｖ（ＳＭＵＣ１５９， ＣＴ１７，ＡＥ１１、 ＭＯ１５２と呼ぶ）を組替える実験を用意した。
【００９７】
2004515248.tif 000008
上記の４個のｓｃＦｖ遺伝子がそれぞれ、フォワード／リバース‐ビオチンプライマ対とフォワード‐ビオチン／リバースのプライマー対を使用した２個のＰＣＲ反応で標準ＰＣＲ手順を使用して増殖された。バンドの大きさはアガロース電気泳動により確認され、他の増殖されたＰＣＲ生成物は協奏的ＰＣＲ精製装置（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を使用して精製された。一本鎖ＤＮＡがプロトコルに従った磁気球を使用して得られ、４個のセンス鎖と４個のアンチセンス鎖が形成された。各鎖はプロトコル（４．２ウリジン酵素／ｍｌあるいは１２．５ウリジン酵素／ｍｌを使用）に従ってＢＡＬ３１で処理され、試料が０分、１０分、３０分と５０分或いは０分、１５分、３０分と６０分で取り出された。反応はＥＤＴＡと熱処理で停止され、フェノール／クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を使用して精製された。各時点を離し、上記の対を作っているセンス鎖とアンチセンス鎖を混合し、試料にプロトコルに従ってリアセンブルＰＣＲと増殖ＰＣＲがなされて試料はｐＢＥＭでクローン化された。各時点から１５個のクローンが配列決定され、組替えの数と頻度が定量された。
【００９８】
結果
乗り換えはｓｃＦｖのすべての組み合わせに見られ、６０％と低い相同性で組替えを達成するのに十分であることを示している。
【００９９】
実施例４  ―  エキソヌクレアーゼを使用する、断片の大きさの
改良された制御
（Ａ）  エキソヌクレアーゼ
私達は、本発明の方法におけるフラグメンテ―ションにエキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶ， エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＴ７遺伝子６、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼＲｅｃ Ｊｆを使用する。これらの酵素は一時に１個のヌクレオチドを５’末端か３’末端から或いは両末端から切断する。反応は使用された酵素次第でＥＤＴＡ或いは熱失活（上記参照）を使用して停止される。これは、ただ１個のヌクレオチドで相違するあらゆる可能な大きさの断片が得られることを意味する。
【０１００】
次の実施例は、どの様にしてエキソヌクレアーゼの加水分解が、使われる条件次第で様々の制御可能の大きさの断片をどのようにして作ることができるかを実証する。
【０１０１】
ＢＡＬ３１
一本鎖ＤＮＡは実施例１におけるプロトコルに従ってＢＡＬ３１により４．２ウリジン／ｍｌ反応容積酵素濃度と０．００８（ｇ／（ｌ反応容積ｓｓＤＮＡ濃度で加水分解された。
【０１０２】
代表的な実験において、約３００ｎｇＤＮＡがＢＡＬ３１処理の各時点で分離される。図１２は、未処理ｓｓＤＮＡによる当実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージをレーン４に、１０分間処理されたｓｓＤＮＡによる当実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージをレーン３に、３０分間処理されたｓｓＤＮＡによる当実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージをレーン２に、５０分間処理されたｓｓＤＮＡによる当実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージをレーン１に、分子量（ＭＷ）標準をレーン５に示す。
【０１０３】
図１３乃至図１５はそれぞれ、レーンの対応するゲルクロマトグラムを示している。図１３は未処理物質であり、多数のピークはｓｓＤＮＡの異なる立体配座を示す。図１４はレーン３と１０分間処理された物質に対応する。物質は熱処理されて酵素反応を停止し、従って異なる立体配座を分解し、はっきりとした大きさの１ピークが示される。図１５はレーン２と３０分間処理された物質に相当する。
【０１０４】
大きな断片に対応するピークが減り、小さいＤＮＡ断片のピークが現れたことがここに明らかである。
【０１０５】
エキソヌクレアーゼＶＩＩ
１本鎖ＤＮＡはエキソヌクレアーゼＶＩＩにより７．７ウリジン／ｍｌ反応容積酵素濃度と０．００８（ｇ／（ｌ反応容積ｓｓＤＮＡ濃度で加水分解された。反応緩衝液は６７ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ７．９）  １０ｍＭｍメルカプトエタノール、６．７ｎＭＭｇＣｌ２と８．３ｎＭＥＤＴＡからなった。
【０１０６】
反応を、熱失活（９５（Ｃで５分間）により停止される前に３７（Ｃで１０分間、２０分間、３０分間進行させた。
【０１０７】
図１６に、エキソヌクレアーゼＶＩＩを使用したフラグメンテーションパターンが示されている。レーン１はＭＷ標準、レーン２は未処理ｓｓＤＮＡ、レーン３はエキソヌクレアーゼＶＩＩで１０分間フラグメンテーションされたｓｓＤＮＡ、レーン４はエキソヌクレアーゼＶＩＩで２０分間フラグメンテーションされたｓｓＤＮＡ、
レーン５はエキソヌクレアーゼＶＩＩで３０分間フラグメンテーションされたｓｓＤＮＡである。これは断片の大きさは時間の経過により小さくなることを示している。
【０１０８】
エキソヌクレアーゼＲｅｃ Ｊｆ
一本鎖ＤＮＡが、０．３６ウリジン酵素／（ｇＤＮＡと１．４ウリジン酵素／（ｇＤＮＡにそれぞれ対応して２．５ウリジン／ｍｌ反応容積酵素濃度或いは１０ウリジン／ｍｌ反応容積酵素濃度と０．００７（／（ｌ反応濃度をしようしてエキソヌクレアーゼＲｅｃ Ｊｆで加水分解された。反応緩衝液は塩化ナトリウム５０ｍＭ、トリス塩化水素１０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭとジチオトレイトール１ｎＭからなり、ｐＨ７．９であった。
【０１０９】
反応を熱失活（９５（Ｃで５分間）により停止される前に３７（Ｃで１０分間、２０分間３０分間進行させた。
【０１１０】
図１７にはエキソヌクレアーゼＲｅｃ Ｊｆを０．３６ウリジン酵素／（ｇｓｓＤＮＡにおいて使用するフラグメンテ―ションパターンが示されている。レーン１は未処理ｓｓＤＮＡ、レーン２はエキソヌクレアーゼＲｅｃ Ｊｆで１０分間フラグメンテーションされたｓｓＤＮＡ、レーン３はエキソヌクレアーゼＲｅｃ Ｊｆで２０分間フラグメンテーションされたｓｓＤＮＡ、レーン４はエキソヌクレアーゼＲｅｃ Ｊｆで３０分間フラグメンテーションされたｓｓＤＮＡである。これは断片の大きさは時間と共に小さくなることを示している。第１８図において、酵素濃度は４倍に増え（１．４ウリジン／（ｇｓｓＤＮＡ）、フラグメンテーションパターンは０分から３０分までのものであり、第１７図に比べて高いフラグメンテーション率を示している。これは時間と酵素濃度とがフラグメンテーションを制御するのに使用できることを示している。
【０１１１】
（Ｂ） エンドヌクレアーゼ
従来ＤＮＡをシャフリングする方法はフラグメンテーションにＤｎａｓｅ Ｉを代表的に使用する（例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、１９９４、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ） ３７０：３８９−３９１参照）。ＤＮａｓｅはＤＮＡをピリミジンに隣接する部位でエンドヌクレアーゼ様式でＤＮＡを分断する。結果として、断片の可能なすべての大きさは得られない。
【０１１２】
更に、反応緩衝液にマグネシウムを使い、モノマーとオリゴマーの相同混合が得られる。従って、異なる大きさの断片を分離するためには、ゲルアガロース電気泳動精製あるいはゲルろ過のような異なる方法が使われなければならない。小さい大きさの断片、あるいは小さい断片と大きい断片の混合が組替えを最適にするのに望ましいことがある。しかし、これらの精製方法は一本鎖ニックを二本鎖ＰＣＲ生成物に導入する。ゲル上で精製された特定の大きさの断片はこのようにして多くの一本鎖ニックをもったｄｓＤＮＡからなるであろう。このことは変性の際に多くの小さい断片を発生させるであろう。このことは、変性の際に発生された一本鎖断片の多くは短すぎてアニーリング中にプライマーとして機能できず、生成物の大量損失となることを意味している。
【０１１３】
反応緩衝液中にマンガンを使用すると５０ｂｐより小さい大きさの断片を作り、ゲル精製は必要でない。しかし、ここであなたが小さい断片だけしか使用できず、これらの小さい断片が大きい断片と混合できないとすると、それが組替え頻度を幾分高めるであろう。
【０１１４】
エンドヌクレアーゼの使用に関連する問題が次の実験で証明される。
【０１１５】
Ｄｎａｓｅ Ｉ
ＤＮＡはＤｎａｓｅ Ｉで５分間０．１５ウリジン／（ｇＤＮＡの濃度で加水分解された。
マグネシウム緩衝液とマンガン緩衝液とが、ＤＮａｓａｅ Ｉによりフラグメンテーションされた際に比較され、結果は図９に示されている。レーン１はＭＷ標準、レーン２はＭｇ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ、レーン３はステーＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ）３７０：３８９−３９１によるＭｇ緩衝液中のＤＮａｓｅ ＩによりフラグメンテーションｓｓＤＮＡ，レーン４はＭｎ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ、レーン５は菊地他Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．）（２０００）遺伝子（Ｇｅｎｅ）２４３：１３３−１３７によるＭｎ緩衝液中のＤＮａｓｅによりフラグメンテーションされたｓｓＤＮＡである。ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）と菊地論文によるＭｇ緩衝液と条件を使うと、フラグメンテーションは起こらないことが図１９から明白である。更に、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）と菊地論文によるＭｇ緩衝液と条件を使うと、物質の全部がほんの数分内に完全にフラグメンテーションされる。
【０１１６】
異なる大きさの断片を得ようと私達はＭｇ緩衝液を使い酵素の濃度を高くするすることにした。図２０はＤＮａｓｅ Ｉを使用したこのような実験のアガロース電気泳動ゲル・イメージを示す。レーン１はＭＷ標準、レーン６は未処理ｓｓＤＮＡ、レーン１２は０．１５ウリジン酵素／（ｇＤＮＡを使用してステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）と菊地論文に従って処理されたｓｓＤＮＡ、レーン１３は１ウリジン酵素／（ｇＤＮＡ（即ち、６倍以上の酵素）で処理された同じ物質である。
【０１１７】
図２１乃至図２３は対応するクロマトグラムである。未処理ＤＮＡは熱処理されているので、図２１では１個のピークしか現れていない（矢印でしめされている）。図２２では、Ｄｎａｓｅ Ｉをステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）と菊地論文に従ったＤｎａｓｅ Ｉの量で使用すると、未処理ｓｓＤＮＡのピークは幾分下がる（矢印で示されている）が、フラグメンテーションされたＤＮＡにははっきりとしたピークが見られずただぼやけている。６倍以上の酵素を使用すると、未処理ｓｓＤＮＡは完全に使えなくなり（図２３）、断片の見えるピークはここでもまったくない。
【０１１８】
マング・ビーン・ヌクレアーゼ
一鎖ＤＮＡがマング・ビーン・ヌクレアーゼ（製品番号ＭＱ２５０Ｓ、ニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で、０．３７５ウリジン／ｍｌ反応容積とｓｓＤＮＡ ０．００７（ｇ／（ｌ反応容積濃度のいずれかの酵素濃度を使用して加水分解された。反応緩衝液は酢酸ナトリューム５０ｍＭ、ＮａＣｌ３０ｍＭとＭＺｎＳＯ４１ｍＭからなり、ｐＨ５．０であった。
【０１１９】
反応は熱失活（９５（Ｃで５分間）により停止される前に、２５（Ｃで１０分間進められた。
【０１２０】
図２４はもうマング・ビーン・ヌクレアーゼを使用したフラグメンテーションを示す。レーン１は未処理ｓｓＤＮＡ、レーン２は１０分間処理された同じ物質、レーン３はＭＷ標準を示す。
【０１２１】
結果は、酵素を製造者が薦める濃度よりも低い濃度で使用したにもかかわらずほんの１０分のマング・ビーン・ヌクレアーゼ加水分解の後にすべてのＤＮＡが完全にフラグメンテーションされた（レーン２参照）ことを示している。
【０１２２】
結論と見解
上述の実施例は、断片の大きさがエキソヌクレアーゼを使用し、反応条件即ち時間、反応容積、酵素濃度を変えてどのように制御されることができるかを示す。異なるピークをゲル・イメージ・クロマトグラムを使用して可視化される。
【０１２３】
対照的に、ＤＮａｓｅ Ｉのようなエンドヌクレアーゼを使うと制御が難しい反応を起こす。文献に参照されている条件を使うと、ＭｇかＭｎを含む緩衝液を使うとすべてがフラグメンテーションされるかあるいは何もフラグメンテーションされない場合の状態が起きる、特に第２０図を参照。もう１つのエンドヌクレアーゼ（マング・ビーン・ヌクレアーゼ）を使用する実験でこれらの観察された事柄を確認できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は鋳型分子から改良分子を得る方法の原理を示す。
【図２】
図２はビオチンを用いる一本鎖ＤＮＡの調製の原理工程を示す。
【図３】
図３はファージを用いる一本鎖ＤＮＡの調製の原理工程を示す。
【図４】
図４はエキソヌクレアーゼ処理を用いて一本鎖ＤＮＡフラグメントを生成する原理工程を示す。
【図５】
図５はＰＣＲを用いる一本鎖ＤＮＡのアセンブリのための原理工程を示す。
【図６】
図６は種々の期間の時間で２０Ｕ／ｍｌＢＡＬ３１を用いてｄｓＤＮＡの消化に引続く一乗り換えを有する、形成された組み換え体の％を示す。
【図７】
図７は種々の期間の時間で２０Ｕ／ｍｌＢＡＬ３１を用いてｄｓＤＮＡの消化に引続く二乗り換えを有する、形成された組み換え体の％を示す。
【図８】
図８は種々の期間の時間で１．２５Ｕ／ｍｌＢＡＬ３１を用いてｓｓＤＮＡの消化に引続く一乗り換えを有する、形成された組み換え体の％を示す。
【図９】
図９は種々の期間の時間で１．２５Ｕ／ｍｌＢＡＬ３１を用いてｓｓＤＮＡの消化に引続く二乗り換えを有する、形成された組み換え体の％を示す。
【図１０】
図１０は種々の期間の時間で１１Ｕ／ｍｌＢＡＬ３１を用いてｓｓＤＮＡの消化に引続く一乗り換えを有する、形成された組み換え体の％を示す。
【図１１】
図１１は種々の期間の時間で１１Ｕ／ｍｌＢＡＬ３１を用いてｓｓＤＮＡの消化に引続く二乗り換えを有する、形成された組み換え体の％を示す。
【図１２】
図１２はＢＡＬ３１を用いた５０分（レーン１）、３０分（レーン２）、および１０分（レーン３）の３００ｎｇ  ｓｓＤＮＡの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロス電気泳動ゲル・イメージを示す。未処理ｓｓＤＮＡがレーン４に示される。分子量マーカーがレーン５に示される。
【図１３】
図１３は図１２のレーン４の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図１４】
図１４は図１２のレーン３の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図１５】
図１５は図１２のレーン２の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図１６】
図１６はエキソヌクレアーゼＶＩＩを用いた１０分（レーン３）、２０分（レーン４）、および３０分（レーン５）の３００ｎｇ  ｓｓＤＮＡの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロス電気泳動ゲル・イメージを示す。未処理ｓｓＤＮＡがレーン２に示される。分子量マーカーがレーン１に示される。
【図１７】
図１７はエキソヌクレアーゼ  Ｒｅｃ  Ｊｆ（９Ｕ／ｍｇ  ｓｓＤＮＡ）を用いた１０分（レーン２）、２０分（レーン３）、および３０分（レーン４）の３００ｎｇ  ｓｓＤＮＡの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロス電気泳動ゲル・イメージを示す。未処理ｓｓＤＮＡがレーン１に示される。分子量マーカーがレーン５に示される。
【図１８】
図１８はエキソヌクレアーゼ  Ｒｅｃ  Ｊｆ（３６Ｕ／ｍｇ  ｓｓＤＮＡ）を用いた１０分（レーン３）、２０分（レーン４）、および３０分（レーン５）の３００ｎｇ  ｓｓＤＮＡの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロス電気泳動ゲル・イメージを示す。未処理ｓｓＤＮＡがレーン２に示される。分子量マーカーがレーン６に示される。
【図１９】
図１９はデオキシリボヌクレアーゼＩ（０．１５Ｕ酵素／ｍｇＤＮＡ）を用いた３００ｎｇ  ＤＮＡの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロス電気泳動ゲル・イメージを示す。レーン試料は以下の通りである。
レーン１：分子量マーカー
レーン２：Ｍｇ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ
レーン３：Ｍｇ緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼＩでフラグメント化されたｓｓＤＮＡ
レーン４：Ｍｎ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ
レーン５：Ｍｎ緩衝液中のデオキシリボヌクレアーゼＩでフラグメント化されたｓｓＤＮＡ
レーン６：（空）
レーン７：（空）
【図２０】
図２０はデオキシリボヌクレアーゼＩを用いた３００ｎｇ  ＤＮＡの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロス電気泳動ゲル・イメージを示す。レーン試料は以下の通りである。
レーン１：  分子量マーカー
レーン２：  Ｍｇ緩衝液中の未処理ｄｓＤＮＡ
レーン３：  Ｍｇ緩衝液中の未処理ｄｓＤＮＡ
レーン４：  Ｍｇ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ（フォワード・ストランド）
レーン５：  Ｍｇ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ（フォワード・ストランド）
レーン６：  Ｍｇ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ（リバース・ストランド）
レーン７：  Ｍｇ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ（リバース・ストランド）
レーン８：  Ｍｇ緩衝液中の、デオキシリボヌクレアーゼＩ（０．２４Ｕ酵素／μｇＤＮＡ）を用いてフラグメント化されたｄｓＤＮＡ
レーン９：  Ｍｇ緩衝液中の、デオキシリボヌクレアーゼＩ（１．３Ｕ酵素／μｇＤＮＡ）を用いてフラグメント化されたｄｓＤＮＡ
レーン１０：  Ｍｇ緩衝液中の、デオキシリボヌクレアーゼＩ（０．２４Ｕ酵素／μｇＤＮＡ）を用いてフラグメント化されたｓｓＤＮＡ（フォワード・ストランド）
レーン１１：  Ｍｇ緩衝液中の、デオキシリボヌクレアーゼＩ（１．３Ｕ酵素／μｇＤＮＡ）を用いてフラグメント化されたｓｓＤＮＡ（フォワード・ストランド）
レーン１２：  Ｍｇ緩衝液中の、デオキシリボヌクレアーゼＩ（０．２４Ｕ酵素／μｇＤＮＡ）を用いてフラグメント化されたｓｓＤＮＡ（リバース・ストランド）
レーン１３：  Ｍｇ緩衝液中の、デオキシリボヌクレアーゼＩ（１．３Ｕ酵素／μｇＤＮＡ）を用いてフラグメント化されたｓｓＤＮＡ（リバース・ストランド）
【図２１】
図２１は図２０のレーン６の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図２２】
図２２は図２０のレーン１２の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図２３】
図２３は図２０のレーン１３の対応ゲル・クロマトグラムを示す。
【図２４】
図２４はマング・ビーン・ヌクレアーゼを用いた３００ｎｇ  ＤＮＡの消化に引続き生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲルを示す。
レーン１：Ｍｇ緩衝液中の未処理ｓｓＤＮＡ
レーン２：マング・ビーン・ヌクレアーゼで１０分フラグメント化されたｓｓＤＮＡ
レーン３：分子量マーカー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004515248.tif 000109
2004515248.tif 000110
【国際調査報告】
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2004515248.tif 000112
2004515248.tif 000113
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