(57)【要約】本発明は、環境室（２）、サンプルまたはキャリヤーのためのホルダー（１５’）、および液体を吸収するための媒体が取り付けられておりまたは取り付けられ得るところの少なくとも１の吸い取り要素（１２）、ここで（１５’、１２）は共に環境室（２）中に配置されている、およびサンプルを冷却するための冷却媒体（５）を含む、低温電子顕微鏡用試料を作製するためのデバイス（１）に関する。該吸い取り要素（１２）は、制御された様式でサンプルまたはキャリヤーの方へ移動され得る。【選択図】図３
2004524535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境室（２）、サンプルまたはキャリヤーのためのホルダー（１５’）、および液体を吸収するための媒体が取り付けられておりまたは取り付けられ得るところの少なくとも１の吸い取り要素（１２）、ここで（１５’、１２）は共に環境室（２）中に配置されている、ならびにサンプルを冷却するための冷却媒体（５）を含む、低温電子顕微鏡用試料を作製するためのデバイス（１）において、該吸い取り要素（１２）が制御された様式でサンプルまたはキャリヤーの方へ移動され得ることを特徴とするデバイス（１）。
【請求項２】
１または複数の吸い取り要素（１２）がサンプルまたはキャリヤーに対して押し付けられるところの圧力が調整可能である、請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
１または複数の吸い取り要素（１２）がサンプルまたはキャリヤーの方に移動されるところの速度が調整可能である、請求項１または２記載のデバイス。
【請求項４】
吸い取り要素（１２、１２’）がサンプルまたはキャリヤーの両側に備えられている、請求項１〜３の何れか１項記載のデバイス（１）。
【請求項５】
１または複数の吸い取り要素（１２）が、吸い取りサイクルの間に自動的に回転しおよび／または移動するように適合されている、請求項１〜４の何れか１項記載のデバイス（１）。
【請求項６】
１または複数の吸い取り要素（１２）が、液体を吸収するための媒体がそれに取り付けられておりまたは取り付けられ得るところのパッドまたはクッション（１３）を含む、請求項１〜５の何れか１項記載のデバイス（１）。
【請求項７】
１または複数の吸い取り要素（１２）が斜めに取り付けられている、請求項１〜６の何れか１項記載のデバイス（１）。
【請求項８】
冷却要素が、環境室（２）の内部に配置されている、請求項１〜７の何れか１項記載のデバイス（１）。
【請求項９】
１または複数の吸い取り要素（１２）がＰＣまたは他の駆動手段（４）に操作可能に結合されており、該駆動手段が、所定の圧力で１回以上、サンプルまたはキャリヤーを吸い取りに付すように吸い取り要素（１２）の動きを制御するように配置されている、請求項１〜８の何れか１項記載のデバイス（１）。
【請求項１０】
手段（４）が、吸い取り要素（１２）の動きの少なくともいくつかの速度を制御するように配置されている、請求項９記載のデバイス（１）。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項記載のデバイス（１）によって試料を作製するための方法であって、サンプルまたはキャリヤーは、サンプルまたはキャリヤーの両側から同時に吸い取りが行われるところの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境室、サンプルまたはキャリヤーのためのホルダー、および液体を吸収するための媒体がそれに結合されているまたは結合され得るところの少なくとも１の吸い取り要素、ここでホルダーおよび吸い取り要素の両方は環境室中に配置されている、ならびにサンプルを冷却するための冷却媒体、好ましくは流体用容器、を含む、低温電子顕微鏡用試料を作製するためのデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
表面を調べるために走査電子ビームが主に使用される走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）のほかに、種々の型の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）が使用されている。そのような顕微鏡のいくつかの場合、サンプル、例えば生体組織または細胞懸濁物、は、固定および脱水によって作製される。サンプルを樹脂に埋め込んだ後、超薄切片（例えば５０ｎｍ）が切断され、それが次いで染色され、電子ビームに暴露され得る。
【０００３】
低温電子顕微鏡では、いわゆるグリッドを使用することが一般に好ましい。例えば、直径数十ミクロンの六角形の開口部を含むグリッドが、調べられるべき粒子、例えばタンパク質分子または細胞、の懸濁物中に浸漬される。その後、過剰の懸濁物が、「吸い取り」によって、すなわち液体を容易に吸収する吸い取り紙または他の媒体をグリッドに対してその片側または両側上に押し付けることによって、除去される。吸い取りの結果、グリッドの開口部に存在する膜の厚さが例えば３〜４μｍ乃至１００ｎｍに低下される。そのような最小厚さの膜には、空気／流体境界層のロンドン／ファンデルワールス引力の影響下で膜の中央にさらに薄い領域が生じる。その領域は、外側方向に、すなわちグリッドの各々の開口部の端部の方向にゆっくり広がる。このプロセス（これは、水きり（draining）とも言う）の間、懸濁された粒子は、流体表面の間にトラップされる。次の工程として、サンプルが非常に急速に冷却され、その結果、流体がガラス状になる。こうして作製された試料が、低温電子顕微鏡において低温（例えば−１７０℃）で調べられ、そして追加の操作を何ら必要とすることなく撮影され得る。
【０００４】
低温電子顕微鏡用試料を作製するためのデバイスは、例えばS. Trachtenberg, 「動的低温電子顕微鏡研究に適する、格納式環境室を有する高速凍結デバイス」, Journal of Structural Biology 123, 45-55 (1998)から公知である。上記文献は、透明なポリカーボネート壁を有する環境室を含むデバイスを記載している。上記室の下には、液体エタンのバッチが配置されている。上記室中の温度および（高い）空気湿度は、加熱要素および超音波空気加湿器によって制御される。グリッドにサンプルが付与された後、手動でまたは独立した装置によって自動的に、吸い取りが行われる。次いで、上記室の底部にあるバルブが開けられ、そしてグリッドが高速でエタン中に落ち、その結果、サンプルが非常に急速に冷却する、すなわちガラス化する。その後、上記室が上に移動され、そして試料の準備ができる。
【０００５】
同様のデバイスが、J BednarによるPhD 論文「ＤＮＡおよびクロマチンの低温電子顕微鏡」、Lausanne 1995から公知である。この論文は、（特に図７．１と共に第７章において）「主要部品としてスタンド、湿気のある室、ピペットホルダー、および吸い取りパッドから成るプランジャー」を記載している。吸い取りパッドは、写真ワイヤリモートシャッターを介して駆動磁石と結合されている。
【０００６】
そのような配置および方法は、試料が、凍結の瞬間まで、温度および空気湿度のレベルにおける変化に敏感であるという知見に適する。しかし、既存の装置は、多数の試料を再現性のある方法で充分に作製することができないことが明らかになった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、試料がそれによってより容易に再現性のある方法で作製され得るところの、第１段落に記載された種類の改善されたデバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
その目的を達成するために、本発明に従うデバイスは、上記吸い取り要素が、制御された様式でサンプルまたはキャリヤーの方に移動され得ることを特徴とする。サンプルまたはキャリヤーの方に夫々移動された吸い取り要素が押し付けられるところの圧力および／または速度が調整可能であることが好ましい。
【０００９】
試料作製法の再現性は、今まで想定していたよりもはるかに強く吸い取りに依存することが見出された。さらに、本発明に従うデバイスを使用するとき、試料の作製が（比較的）簡単なかつ大体自動化された方法で行われ得る。
【００１０】
従って、吸い取り要素は、駆動手段、例えばパーソナルコンピューター（ＰＣ）、に操作可能に結合されることが好ましい。駆動手段は、所定の圧力で１回以上、サンプルまたはキャリヤーを吸い取りに付すように吸い取り要素の動きを制御し、また好ましくは吸い取り要素の動きの少なくともいくつかの速度を制御するように配置される。
【００１１】
本発明は、さらに、本明細書に記載されたデバイスによって試料を作製するための方法に関し、ここで、サンプルまたはキャリヤーは、サンプルまたはキャリヤーの両側から同時に吸い取りが行われる。すなわち、吸い取り要素によってサンプルまたはキャリヤーに及ぼされる力は、よりバランスが良く、従ってより制御可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の枠組み内において、「キャリヤー」は、サンプルを運ぶために適するいずれかのデバイスを含む。そのようなデバイスの例は、サンプルまたはサンプルを含む懸濁物がそれにくっつくであろうところの比較的簡単な金属ピン、クアンティホイル（quantifoil）、および上記グリッドを含む。グリッドは、種々の形状、例えば六角形、丸、四角などの形状の穴が付与され得、および／またはそのような穴が付与された支持膜が片側または両側に付与され得る。
【００１３】
「制御された様式で」は、吸い取りパラメーターの少なくともいくつか、好ましくは少なくとも、吸い取り要素によって及ぼされる圧力、が吸い取りの前および／または間に調整されおよび／または制御され得ることを意味する。
【００１４】
次に、本発明に従うデバイスの例示的実施態様を模式的に示す、添付した図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【００１５】
図１および２は、環境室２、環境室２中の構成要素のための、これから論じられる作動装置が収容されるところの前方区画室３、および上記作動装置のための電子および／または空気式制御装置または外部制御装置と連絡するための手段がその中に存在し得る後方区画室４を含む、低温電子顕微鏡用試料を作製するためのデバイス１を示す。環境室２の下には、試料がそれによってガラス化され得るところの冷却媒体、例えば液体エタン、を受け取るための中心空洞を含む、自体公知の容器５が配置されている。容器５は、第２の冷却媒体、例えば液体窒素、がその中に導入され得るところの、中心空洞を取り囲む環状チャネルをさらに含み得る。上記媒体は、エタンを冷却するためにおよび／または完成された試料を一時的に貯蔵するために使用され得る。容器５は、テーブル６および関連した作動装置（図示していない）によって上方および下方に移動することができる。環境室２の内部は、窓と適合されているドア８によって接近可能である。
【００１６】
環境室２の内部が図３および４に示されている。なぜならば、側壁およびドア８がこれらの図から取り除かれているからである。環境室２は、２つの平行な管９を含む。これらは、環境室２中の他の構成要素の一部を支持するために機能する。管９には、クロスビーム１０およびサブフレーム１０Ａが結合されており、それらは、２つの旋回可能なアーム１１、１１’のための支持を提供する。上記アーム１１、１１’の末端には、円形の吸い取り要素１２、１２’が回転可能にかつ斜めに取り付けられている。上記吸い取り要素１２、１２’は夫々、パッドまたはクッション１３、１３’を含み、それに、吸い取り紙または他の液体吸収媒体が取り付けられ得る。吸い取り要素１２、１２’は各々、中央に開口部が付与されており、さらに、クッション１３、１３’は、吸い取り紙の位置を安定化するための、放射状に伸びたチャネル（上記吸い取り紙によって被覆される）が付与され得る。上記開口部は、アーム１１、１１’によって減圧チャネルに結合されており、上記チャネルは、デバイス１の後方区画室４中の減圧ポンプ（図示していない）に結合される。
【００１７】
アーム１１、１１’の前方部分、および従って吸い取り要素１２、１２’は、アーム１１、１１’の後方部分の間に位置しそしてこれらの後方部分を離れさせている、調節可能なバネ１１Ａの作用に対して離れて移動し得る。上記移動は、（右）アーム１１’の後方部分（の右側）に隣接する作動装置、例えば、自体公知でありかつ図３に示す空気パイプ１４に結合した空気式作動装置１１Ｂ、によって行われる。バネ１１Ａは、（左）アーム１１の後方部分（の左側）における調節スクリュ１１Ｃによって調節され得る。さらに、右アーム１１’の何らかの運動は、クロスビーム１０および両方のアーム１１、１１’に旋回可能に結合している２アーム式レバー１１Ｄによって、直ちにかつ対称的に左アーム１１へ伝えられる。
【００１８】
作動装置１１Ｂから調節可能なベント（Festo製、図示していない）を通って空気が逃げることを可能にすることによって、吸い取り要素１２、１２’は、上記バネの影響下で再び互いに移動し得る。吸い取りが行われるときの圧力は、上記バネによって調節され得、吸い取り要素の速度は、バネおよび上記ベントの両方によって調節され得る。
【００１９】
環境室２の前方部分には、管９に平行に延びる管１５が存在し、これは、例えば空気式作動装置によって大きい速度で下方に落とされ得、そして次いでステッピングモーターによって再び上方に（比較的ゆっくり）移動され得る。上記管１５の端部には、グリッドのための（間接的）ホルダーが取り付けられており、このホルダーは、この実施態様では、ピンセット（tweezers）１６のためのクランプ１５’から成る。
【００２０】
さらに、三角形要素１７が管９に結合している。これは、ピンセット１６、クランプ１５’および管１５を案内するために、その頂点に、環状ガイド１８を含む。
【００２１】
ピンセット１６の他に、およびピンセット１６の下には、調べられるべき粒子の懸濁物のための容器またはバイアル２０のためのホルダーが配置されている。さらに、環境室２の下には、貯蔵器（その外壁なしで示す）が配置されており、その貯蔵器中には、超音波空気加湿器２１が存在し、その空気加湿器は、環境室２の下部プレートを通って延びている。上記貯蔵器の上部にはカバー２２が存在し、そのカバーは、空気加湿器２２からの（過度に）大きい滴を捕まえる。さらに、環境室２は、それによって温度が制御され得るところの加熱および／または冷却要素（図示していない）、例えば夫々、抵抗ヒーターおよび／またはペルティエ（Peltier）要素、を含む。
【００２２】
低温電子顕微鏡用試料の作製全体は、自動的に、例えばＰＣの制御下で、行われ得る。調べられるべき粒子であって自体公知の方法で作製される粒子の懸濁物が存在するところのバイアル２０を配置し、そして、例えばその間に上記バイアル２０および上記懸濁物が順化し得るところの２０〜３０分の静止期間の後、そのジョーの下方側でグリッド（Stork Veco製、図示していない）がクランプされるところのピンセト１６が下方に移動され、そして上記懸濁物中に浸漬される。上記浸漬の代わりに、例えばピペットまたはスプレーデバイスによって、一方の側に少量の懸濁物を施与することも可能である。このために、環境室２の一方の側壁にエアロック２５（図１）が備えられ得る。
【００２３】
懸濁物が施与された後、吸い取り要素１２、１２’がピンセット１６の端部に対しておよび従ってグリッドに対して押し付けられ得るところの位置までピンセット１６が移動される。環境、例えば特定のグリッドの特性、使用される懸濁物の粘度および温度、に応じて、吸い取り操作が１回以上繰り返され得、一方、上記吸い取りが行われるときの圧力を調整することがさらに可能である。さらに、この方法で、グリッド開口部における膜の厚さを調節することが可能である。
【００２４】
吸い取り要素１２、１２’は各々、その後方側に円形の直立端２３を有し、その端は、吸い取り要素１２の残りと同心であり、かつ歯、例えば１６の歯、が付与されている。上記アーム１１、１１’は各々、プレート形状体２４を含み、その端部に弾力的なカムが存在し、そのカムは、夫々のアーム１１の戻る移動の後、上記歯の１に対して押し付け、その結果、吸い取り要素１２が１／１６回転移動する。モーメントアーム１１が再び内側に移動し、上記カムが、次の歯の後ろに入る。その結果、吸い取りが行われるごとに、プロッティング要素１３が所定の距離を回転し、従って、グリッドの近くに未使用の吸い取り紙片が提供される。吸い取りが充分な程度まで行われた後、グリッドにおける上記排水プロセスを生じさせるように、待機期間が続き得る。
【００２５】
原則として、試料が今完成され、そして、環境室２の下のエタン中に、あるいは冷却された固体物体、例えば液体冷却剤（例えば、液体窒素またはヘリウム）中に置かれた銅ブロック、の上に滴下されまたは急に落とされる（いわゆるスラム凍結（slam-freezing））。このために、容器５が、環境室２の下部プレートに近い位置まで上に移動される。次いで、バルブとしても機能する、バイアル２０のためのホルダー１９が、例えば空気式作動装置（そのうちの空気パイプ１４’のみを図３に示す）によって片側に振り動かされ、その結果、その下に配置された開口部が解放され、ピンセット１６が管１５と共に下方に落とされる。グリッド中に存在するサンプルはほとんど同時にガラス化し、その後、それは、容器５中の上記環状チャネルに移動され得、または別の方法で貯蔵され得る。次いで、別の、好ましくは滅菌したグリッドがピンセット１６中に置かれ、ピンセット１６はステッピングモーターによって上方に移動され、その後、次の試料が作られ得る。
【００２６】
本発明および上記の好ましい実施態様は、低温電子顕微鏡用の多数の試料を再現性のある方法でかつ（比較的）短時間で作製することを可能にする。主な吸い取りパラメーター、例えば圧力、速度、期間、吸い取り媒体、および／または吸い取りサイクル数、が制御可能であり、吸い取りが環境室２中の環境の乱れを招かないので、上記吸い取りおよび続く排水の間のその最も無防備な状態にある試料上の負荷が最小にされる。さらに、上記パラメーターは各々個々に、特定の（種類の）サンプルに関して最適化され得る。
【００２７】
９７％より上、好ましくは１００％の空気湿度レベルの使用は、この効果をさらに高める。試料を作製するための既存のデバイスは高い空気湿度レベルを使用するが、９７％以上の空気湿度レベルを検出することができるセンサーを使用しおよび／または環境室の壁上のミストおよび／または凝縮の存在をチェックすることによって、試料作製プロセスを妨害し得る大きい滴を生じることなく、１００％の空気湿度レベルを調整することが可能であることが明らかになった。
【００２８】
環境室中の成分を操作するための上記作動装置の例は、特に、空気式作動装置、ステッピングモーター、およびリニアモーターである。
【００２９】
本発明は、もちろん、上記実施態様に制限されず、特許請求の範囲において定義された本発明の範囲から逸脱することなく、いくつかの方法で変えられ得る。例えば、環境室は、空気の変わりに、または空気のほかに、他の気体で満たされ得る。また、調べられるべき粒子を懸濁させるために水以外の媒体が使用されるならば、環境室中の気体は好ましくは、水で飽和されるのではなく、上記媒体で飽和される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】低温電子顕微鏡用試料を作製するためのデバイスの正面図である。
【図２】低温電子顕微鏡用試料を作製するためのデバイスの側面図である。
【図３】図１および２に従うデバイスの環境室の内側の一部の透視図である。
【図４】図３における吸い取り機構の後方からの透視図である。
【符号の説明】
【００３１】
１    デバイス
２    環境室
３    前方区画室
４    後方区画室
５    容器
１１  アーム
１２  吸い取り要素
１３  パッド
１６  ピンセット
【国際公開パンフレット】
2004524535.tif 000003
2004524535.tif 000004
2004524535.tif 000005
2004524535.tif 000006
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2004524535.tif 000009
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2004524535.tif 000011
2004524535.tif 000012
2004524535.tif 000013
2004524535.tif 000014
2004524535.tif 000015
2004524535.tif 000016
2004524535.tif 000017
2004524535.tif 000018
【国際調査報告】
2004524535.tif 000019
2004524535.tif 000020
2004524535.tif 000021