(57)【要約】本発明はフルクトシル転移酵素活性を有する修飾ポリペプチドをコードする核酸、原核及び真核細胞で修飾フルクトシル転移酵素を発現するためにこの核酸を含むベクター、このベクターを含む宿主細胞及び／又は形質転換植物、主としてβ−１，２−結合を有し、分枝が極めて少ない高分子ポリフルクタン、特にイヌリンの調製方法、本発明に基づき調製されたイヌリンを使用し又はサッカロースを使用するジフルクトース二無水物の調製方法、イヌリンエーテル及びイヌリンエステルの調製のための本発明に基づき調製されたイヌリンの使用及び食品添加物、特にダイエット食品としてのフルクトオリゴ糖又は水素化フルクトオリゴ糖及びジフルクトース二無水物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示された核酸配列又は配列番号２に示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を有し、核酸配列がフルクトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードし、核酸配列の５’−又は３’−領域に少なくとも１つの欠失があり、この欠失が
ａ）ヌクレオチド４から２２２の欠失、
ｂ）ヌクレオチド１から１０４の欠失及び
ｃ）ヌクレオチド２２５４から２３８５の欠失
からなるグループから選ばれたものである核酸分子。
【請求項２】
核酸配列が
ａ）配列番号３に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｂ）配列番号４に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖、
ｃ）配列番号７に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｄ）配列番号８に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖、
ｅ）配列番号９に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｆ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖
及び
ｇ）ａ）からｆ）の核酸分子の単数又は複数の塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失によって得られる核酸分子又はその相補鎖
からなるグループから選ばれた請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ｆｔｆ遺伝子の核酸配列の５’−領域に欠失がある配列を他の遺伝子の少なくとも１つの領域で置き換えた請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
ｆｔｆ遺伝子の核酸配列の５’−領域に欠失がある配列をｌａｃＺα遺伝子の配列で置き換え、その際核酸分子が
ａ）配列番号５に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、及び
ｂ）配列番号６に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖、
ｃ）配列番号１１に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｄ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖
及び
ｅ）ａ）からｄ）の核酸分子の単数又は複数の塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失によって得られる核酸分子又はその相補鎖
からなるグループから選ばれた請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である請求項１から４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、リポソーム又はウイルスである請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
少なくとも１つの核酸分子が、原核又は真核細胞でポリペプチド又はタンパク質への翻訳可能ＲＮＡの転写及び／又はＲＮＡの翻訳を保証する少なくとも１つの調節要素により機能的に調節される上記調節請求項６又は７に記載のベクター。
【請求項９】
少なくとも１つの調節要素がプロモーター、エンハンサー、サイレンサー又は３’−転写ターミネーターである請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
少なくとも１つの調節要素が、核酸分子によってコードされたポリペプチド又はタンパク質を特定の細胞小器官、区画又は細胞外領域に局在化するためのシグナル配列である請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１１】
少なくとも１つの調節要素が大腸菌のＬラムノースオペロンに由来する請求項８から１０のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの核酸分子又は請求項６から１１のいずれか１つに記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が原核又は真核細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
細菌、酵母細胞及び植物細胞から選ばれた請求項１２又は１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ジャガイモ、キクイモ、アーティチョーク、チコリ、カッサバ又はテンサイの細胞である請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
その細胞の少なくとも１つに請求項１から５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの核酸分子又は請求項６から１０のいずれか１つに記載の少なくとも１つのベクター又は請求項１５に記載の少なくとも１つの細胞を含む植物。
【請求項１７】
ジャガイモ、キクイモ、アーティチョーク、チコリ、カッサバ又はテンサイ植物である請求項１６に記載の植物。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の植物から得られる種子、果実、増殖物、収穫物及び植物組織。
【請求項１９】
フルクトシル転移酵素活性を有し、サッカロースから主としてβ−２，１−結合を有するポリフルクタンへの転化を触媒し、請求項１から５のいずれか１つに記載の核酸分子の発現によって得られるタンパク質。
【請求項２０】
請求項１２から１５のいずれか１つに記載の宿主細胞又は請求項１６又は１７に記載の植物での発現によって得られる請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のタンパク質を特異的に認識して結合する抗体。
【請求項２２】
モノクロナール、ポリクロナール及び／又は修飾抗体である請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載の抗体に対する抗体。
【請求項２４】
ａ）請求項６から１０のいずれか１つに記載のベクターによる単数又は複数の植物細胞の形質転換、
ｂ）ベクターに含まれるフルクトシル転移酵素遺伝子の、単数又は複数の形質転換細胞のゲノムへの組込み及び
ｃ）ポリフルクタンを生産する無傷の植物の再生
を包含する遺伝子工学的に変異したポリフルクタン生産植物の調製方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載の宿主細胞もしくは請求項１６又は１７に記載の植物又は請求項１８に記載の植物細胞をポリフルクタンの調製に適した条件で培養し、ポリフルクタンを分離して精製するポリフルクタンの調製方法。
【請求項２６】
下記の諸段階、即ち
ａ）適当な培地で適当な培養条件のもとでの請求項１２から１５のいずれか１つに記載の宿主細胞の培養及び増殖、
ｂ）生じた細胞材料の適当な物理的、化学的及び／又は酵素的方法による破壊及びフルクトシル転移酵素活性を有するタンパク質の粗抽出物としての又は高度に精製された形及び／又は固形担体に固定化した形の分離及び／又は精製、
ｃ）ｂ）で得たフルクトシル転移酵素活性を有するタンパク質によるサッカロース溶液の処理及び
ｄ）生成されたポリフルクタンの反応調合物からの分離及び精製
を包含するポリフルクタンの調製方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法により調製したポリフルクタン。
【請求項２８】
重合度＞１００、分枝度＜３％のイヌリンである請求項２７に記載のポリフルクタン。
【請求項２９】
請求項２８に記載のイヌリンを適当な条件で固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼで処理し、続いて生じたフルクトオリゴ糖を反応調合物から分離して精製するフルクトオリゴ糖の調製方法。
【請求項３０】
サッカロース溶液を適当な条件で請求項１９又は２０に記載の固定化又は非固定化タンパク質及び固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼで同時に処理し、続いて生じたフルクトオリゴ糖を反応調合物から分離して精製するフルクトオリゴ糖の調製方法。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載の方法により調製したフルクトオリゴ糖。
【請求項３２】
請求項３１に記載のフルクトオリゴ糖の水素化により調製した水素化フルクトオリゴ糖。
【請求項３３】
請求項２８に記載のイヌリンを適当な条件で固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼ及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｕｌｏｂｉｆｏｒｍeｓ又はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓの固定化又は非固定化細胞で同時に処理し、続いて生じたジフルクトース二無水物を反応調合物から分離して精製するジフルクトース二無水物の調製方法。
【請求項３４】
サッカロース溶液を請求項１９又は２０に記載の固定化又は非固定化タンパク質及び固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼ及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｕｌｏｂｉｆｏｒｍeｓ又はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓの固定化又は非固定化細胞で同時に処理し、続いて生じたジフルクトース二無水物を反応調合物から分離して精製するジフルクトース二無水物の調製方法。
【請求項３５】
請求項３３又は３４に記載の方法で調製したジフルクトース二無水物。
【請求項３６】
イヌリンエーテル及びイヌリンエステルの調製のための請求項２８に記載のイヌリンの使用。
【請求項３７】
食品添加物、ダイエット食品又は動物飼料添加物としてのフルクトオリゴ糖の使用。
【請求項３８】
食品添加物、ダイエット食品又は動物飼料添加物としての請求項３１に記載の水素化フルクトオリゴ糖の使用。
【請求項３９】
食品添加物、ダイエット食品又は動物飼料添加物としての請求項３５に記載のジフルクトース二無水物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフルクトシル転移酵素活性を有する修飾ポリペプチドをコードする核酸、修飾フルクトシル転移酵素を原核又は真核細胞に発現するためにこの核酸を含むベクター、このベクターを含む宿主細胞及び／又は形質転換植物、主としてβ−１，２−結合と極めて低い分枝度を有する高分子ポリフルクタン、特にイヌリンの調製方法、本発明に基づき調製したイヌリンを使用し又はサッカロースを使用するフルクトオリゴ糖の調製方法、本発明に基づき調製されたイヌリンを使用し又はサッカロースを使用するジフルクトース二無水物の調製方法、イヌリンエーテル及びイヌリンエステルの調製のための本発明に基づき調製されたイヌリンの使用並びに食品添加物、特にダイエット食品としてのフルクトオリゴ糖及びジフルクトース二無水物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子サッカリド、単糖例えばグルコース及びオリゴ糖例えばサッカロースは生物工学的プロセスのための基質として、又は修飾形態で種々の産業部門のための補助材料として使用される。例えば大量のグルコースが例えばソルビット及びグルタミン酸塩の化学合成のために、また技術的目的のため、とりわけアルコール発酵のために使用される。国民経済的に極めて重要な糖類であるサッカロースは主として料理用及び食品保存用に使用されるが、プラスチックやワニスに、タンパク質、アミノ酸、抗生物質等の合成のために、また硬質ポリウレタンフォームの添加剤としても使用することができる。
【０００３】
天然又は修飾形態の多糖例えばセルロース及びデンプンは、工業ではるかに頻繁に使用される。デンプンは人間の最も重要な食品にとどまらない。工業的に製造されたデンプンは製紙業でとりわけボール箱の製造のために、又は紙の補助物質として例えば紙のサイジングのために、繊維産業では例えばサイジング剤として又は新しい織物の仕上及び増量のために、又は洗濯物の硬化剤として、製薬業では錠剤の増量剤及び充填剤、散剤の潤滑剤及び充填剤、軟膏の基剤等として使用される。セルロースは多数の工業部門の最も重要な原料の１つである。その場合極めて大量のセルロースが製紙業及び繊維産業によって消費され、例えば最も普及している繊維織物はさまざまな純度の天然の又は人工的に転化されたセルロースからなる。多糖又は多糖誘導体は建設業でも添加材として益々重要である。
【０００４】
多数の用途がすでに確立されているにかかわらず、セルロースもデンプンも重大な欠点がある。例えば化学セルロース誘導体、即ち例えばエステル化及び／又はエーテル化反応、置換、酸化又は架橋反応によって生じる産物の製造は多数の化学薬品の使用、特に溶剤の使用を必要とし、溶剤のその後の処分は一部で多額の費用を伴うのである。従ってセルロース誘導体の製造は一般にデンプン誘導体の製造よりはるかに割高である。これに対してデンプン誘導体の製造は、デンプンが線状構造のアミロースと著しく分枝したアミロペクチンからなる不均質な化合物であるという問題がある。この不均質性により化学的デンプン誘導体合成を再現性をもって的確に行うことはまったく又は条件付でしかできない。そこでアミロース含有デンプンだけを提供する植物を栽培することが数年来試みられているが、これまでに成果は乏しい。従って工業的使用に適した主として線状構造の安価な多糖は目下のところ市場に出ていない。
【０００５】
従って特に炭水化物重合体の直線状構造が所望の特性のために決定的な前提であるような用途にとって、長鎖ポリフルクタンは重要な代替物である。ポリフルクタンは主として単位フルクトースが互いに連結された多糖である。ポリフルクタンは単位フルクトースの連結の仕方で区別される。例えば最も重要なポリフルクタンであるイヌリンでは、単位フルクトースはβ−１，２−結合を有するフラノシド形である。ポリフルクタン、レバンでは単位フルクトースがβ−２，６−結合で連結されている。ポリフルクタンは一連の単子葉及び双子葉植物、例えばキク科植物、イネ科植物、穀草、さらには藻類及び幾つかのグラム陽性及びグラム陰性細菌に見られる貯蔵炭水化物である。
【０００６】
イヌリンは主として直線状構造を有するポリフルクタンであり、単位フルクトースはβ−１，２−結合により連結され、鎖はおそらく非還元性α−Ｄ−グルコース単位体で終結される。イヌリンは単独で又はデンプンと共に貯蔵炭水化物としてとりわけダリアの塊茎、チコリの根及びオオグルマその他のキク科植物（    Ｃｏｍｐｓｉｔａｅ）、まれに近縁植物科（キキョウ、サワギキョウ）の細胞に存在する。異なる植物種のイヌリンはおおむね平均重合度で区別される。例えばキクイモのイヌリンは５−７の平均重合度、チコリのイヌリンは１０−１２の平均重合度、アーティチョークのイヌリンは約２５の平均重合度を有する（Ｒ．Ｈ．Ｆ．Ｂｅｃｋ及びＷ．Ｐｒａｚｎｉｋ，Ｉｎｕｌｉｎｈａｌｔｉｇｅ  Ｐｆｌ−ａｎｚｅｎ，Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｅｒｋｅ，３８（１９８６），３９１−３９４）。直線状構造に基づきこれらのイヌリンから誘導体を比較的問題なく調製することができ、これらの誘導体はほとんど生物学的に分解される。ところがこのようなイヌリン又はこれから作られた誘導体は比較的短鎖であるため重合界面活性剤、乳化剤及び軟化剤としての使用には適さない。また「充填剤」（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）又は脂肪代替物としてイヌリンを使用することも知られている。
【０００７】
またイヌリンを加水分解してフルクトオリゴ糖を作り、これを前生物的食品添加物として使用することも知られている（Ｘ．Ｗａｎｇ及びＧ．Ｒ．Ｇｉｂｓ−ｏｎ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７５（１９９３），３７３−３８０）。しかしこのフルクトオリゴ糖の重大な欠点はグルコース分が比較的多いことである。即ちキクイモのイヌリンから作られたフルクトオリゴ糖は約４０から２０％のグルコースを含み、一方、チコリのイヌリンから作られたフルクトオリゴ糖は約８から１０％のグルコースを含む。このようなフルクトオリゴ糖は糖尿病患者の食事に限られた範囲でしか適合しない。
【０００８】
水素化フルクトオリゴ糖の調製と使用が欧州特許公開第６５７１０６号により知られている。この場合も使用されるフルクトオリゴ糖のグルコース分が比較的高いことが欠点である。
【０００９】
特に興味深いのはジフルクトース二無水物である。これもイヌリンから作ることができ、食品添加物として使用される。特に大腸で際立った前生物的効果を発揮し、それによって健全な腸内細菌及び腸壁に持続的に寄与するという特徴がある。それ故業界にはジフルクトース二無水物の低廉な製造に大きな関心がある。ジフルクトース二無水物の調製方法は周知である（Ｋ．Ｓｅｋｉら、Ｓｔａｒ−ｃｈ／Ｓｔａｅｒｋｅ，４０（１９８８），４４０−４４２；ドイツ国特許第１９５４７０５９号；Ｔ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｃｈｎ−ｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｒｕｃｔａｎｓ（Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ及びＮ．Ｊ．Ｃｈａ−ｔｔｅｒｔｏｎ，Ｎ．Ｙ．監修）（１９９３）所載、ＣＲＣ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔ−ｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ）。しかしこのように調製されたジフルクトース二無水物でも高いグルコース分が欠点である。
【００１０】
ポリフルクタン含有植物が幾つかの微生物フルクトシル転移酵素と同様に、線状又は分枝フルクトース重合体の重合を触媒する（Ｆｔｆ）−タンパク質を発現することが知られている。微生物性フルクトシル転移酵素は例えば連鎖球菌、桿菌、シュードモナス、キサントモナス、アセトバクター、エルウィニア及びアクチノミセス株で検出された。微生物性ポリフルクタンではフルクトース残基がβ−１，２−及び／又はβ−２，６−結合により連結されている。即ち微生物性フルクトシル転移酵素はイヌリンスクラーゼであるか、又はレバンスクラーゼである。植物性ポリフルクタンは比較的低い分子量を有し、分子当り約１０から３０個の単位フルクトースが連結されているが、微生物性ポリフルクタンは１０6から１０8に及ぶ分子量を有し、１０００００を超える単位フルクトースが連結されていることがある。またポリフルクタン生合成の研究が明らかにしたところでは、細菌での生合成は一般に植物の場合よりはるかに簡単に行われる。上記の理由から特に細菌性フルクトシル転移酵素をポリフルクタンの調製に利用することに強い関心がある。
【００１１】
ところが現在知られているのは細菌性フルクトシル転移酵素、即ち出発分子としてサッカロースをベースとするイヌリン生成を触媒することができるグラム陽性菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓのフルクトシル転移酵素だけである（Ｓｈｉｒｏｚａ及びＫｕｒａｍｉｔｓｕ，Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．，１７０（１９８８），８１０−８１６；Ｋ．−Ｇ．Ｒｏｓｅｌｌ及びＤ．Ｂｉｒｋｈｅ−ａｄ，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，２８（１９７４），５８９）。Ｓ．ｍ−ｕｔａｎｓ−フルクトシル転移酵素によりサッカロースから作られたイヌリンは２０−６０×１０6ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。このためイヌリンのグルコース含量は無視できるから、このイヌリンは原則としてフルクトオリゴ糖の調製に適しているようである。ところが他方、こうして作られたイヌリンは約７％の分枝を有し、このため以後の化学的誘導体合成のための原料として使用するにはあまり適当でない。さらに微生物Ｓ．ｍｕｔａｎｓはヒト病原性細菌であるから、酵素の製造のための工業的規模の使用と増殖は大きな問題を伴う。
【００１２】
微生物性フルクトシル転移酵素をコードするｆｔｆ遺伝子、例えばＳ．ｍｕ−ｔａｎｓのフルクトシル転移酵素を使用して形質転換植物で炭水化物重合体、特にポリフルクタンを調製する方法も周知である。
【００１３】
ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２７２９は形質転換植物で炭水化物重合体、特にデキストラン又はポリフルクタンを生産する方法を記載する。この植物の調製のために種々の微生物のレバンスクラーゼ又はデキストランスクラーゼを使用することが提案される。
【００１４】
ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２１１０はグラム陰性菌のレバンスクラーゼのｌｓｃ遺伝子を含み、ポリフルクタンを生産する形質転換植物の調製方法を開示する。
【００１５】
ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２７７８は形質転換植物で炭水化物重合体を合成し蓄積する方法を記載する。その場合とりわけレバンスクラーゼをコードする細菌性フルクトシル転移酵素遺伝子が使用される。
【００１６】
ＰＣＴ／ＮＬ９３／００２７９は枯草菌のｓａｃＢ遺伝子又はＳｔｒｅｐｔ−ｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓのｆｔｆ遺伝子を含むキメラ遺伝子による植物の形質転換を開示する。レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子の場合は、形質転換植物での発現レベルを高めるために細菌遺伝子の５’−非翻訳領域の修飾が推奨される。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓのフルクトシル転移酵素遺伝子については配列修飾が記載されていないから、フルクトシル転移酵素の発現レベルは比較的ごく低い。
【００１７】
ＰＣＴ／ＮＬ９５／００２４１は形質転換植物でのオリゴ糖の生産方法を記載する。その場合Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（Ｓｈｉｒｏｚａ及びＫｕｒａｍｉｔｓｕ,１９８８年）が使用された。さらに植物起源の他のフルクトシル転移酵素遺伝子が使用された。また形質転換植物で産生されるオリゴ糖の砂糖代用品、食品補充剤、食品のビフィズス生成剤及び動物飼料のビフィズス生成剤としての使用が記載されている。
【００１８】
ところが異種発現系即ち異種の細菌性発現系及び植物性発現系でＳｔｒｅｐ−ｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓのフルクトシル転移酵素遺伝子を使用すると、極めて少量の未変性タンパク質が産生され、従ってイヌリン生産はごく限られた規模でしか起こらないことが判明した。異種宿主細胞でのこの僅かな酵素生産は宿主細胞の重大な成長障害を伴う。
【発明の開示】
【００１９】
そこで本発明の根底にあるのは、ポリフルクタンの簡単で安価な大量生産を可能にし、先行技術の上記の問題、特に異種宿主系での細菌性フルクトシル転移酵素遺伝子の僅少な発現を克服する、β−１        ，２−結合及びおおむね線状の構造を有し、グルコース含量が極めて少ない高分子ポリフルクタン特にイヌリンの調製のための方法及び手段、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓのフルクトシル転移酵素遺伝子に基づく方法及び手段を提供するという技術的問題である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は特に配列番号１の核酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの修飾フルクトシル転移酵素遺伝子を提供することによってこの技術的問題を解決する。上記のフルクトシル転移酵素遺伝子はＮ末端及び／又はＣ末端が修飾された、フルクトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードし、特にポリペプチドはＮ末端及び／又はＣ末端に少なくとも１個の欠失を有する。特に本発明はフルクトシル転移酵素（ｆｔｆ）活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号１に示された核酸配列又は配列番号２に示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列に、
ａ）ヌクレオチド４から２２２の欠失、
ｂ）ヌクレオチド１から１０４の欠失及び
ｃ）ヌクレオチド２２５４から２３８５の欠失
からなるグループから選ばれた少なくとも１個の欠失を有する、とりわけ分離され完全に精製された主請求項の核酸分子を提供する。
【００２１】
ヌクレオチド４から２２２又はヌクレオチド１から１０４の欠失によってＳ．ｍｕｔａｎｓの未変性フルクトシル転移酵素遺伝子のシグナル配列の全部又は一部が除去されるから、未変性Ｓ．ｍｕｔａｎｓフルクトシル転移酵素のコードされたシグナルペプチドの全部又は一部が除去される。こうして得られる細胞内酵素生産によって、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのフルクトシル転移酵素の発現に原因する異種宿主細胞例えば大腸菌の成長障害が取り除かれ、この細胞から酵素を高い容積収量で得ることができる。
【００２２】
意外なことに、ヌクレオチド２２５４から２３８５を包含するフルクトシル転移酵素のＣ末端の欠失が異種宿主細胞の成長の大幅な改善をもたらすことも確認された。未変性タンパク質の欠失疎水性領域の機能は不明である。本発明によればＣ末端領域内のこの欠失も異種宿主細胞の成長の大幅な改善と発現タンパク質の高い容積収量をもたらす。
【００２３】
また本発明に基づきｆｔｆ遺伝子の核酸配列の５’−領域に欠失がある配列を他の遺伝子の少なくとも１つの配列領域で置き換られることが確認された。その場合他の遺伝子はとりわけｌａｃＺα遺伝子である。このような突然変異も異種宿主細胞の成長の改善と発現タンパク質の高い容積収量をもたらす。
【００２４】
そこで本発明に基づく上記の核酸分子を使用して、フルクトシル転移酵素活性を有する修飾ポリペプチドの原核及び／又は真核細胞での高い発現を保証するベクターが調製される。５’−末端及び／又は３’−末端が欠失した本発明の核酸分子又は５’−欠失配列を他の遺伝子の配列領域で置き換えた核酸分子を大腸菌ベクターｐＪＯＥ２７０２の発現カセット（Ｖｏｌｆｆら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒ−ｏｂｉｏｌ．，２１（１９９６），１０３７−１０４７；Ｓｔｕｍｐｐら、Ｂｉ−ｏｓｐｅｋｔｒｕｍ，１（２０００），３３−３６）に組込むならば、細菌性宿主系で発現タンパク質の特に高い容積収量が得られることが確認された。このベクターはＬラムノースによって誘導され、正に調節される。
【００２５】
本発明に基づき調製された原核及び真核宿主細胞は、β−１，２−結合を有するポリフルクタンの調製方法で使用することができる。その場合この宿主細胞の培養と増殖の後に細胞からフルクトシル転移酵素活性を有するタンパク質が分離され、分離されたタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏでサッカロース溶液の処理のために使用される。続いて酵素により生成されたポリフルクタンを反応調合物から分離し精製することができる。別の好ましい実施形態では本発明の核酸分子を含む宿主細胞から、又は本発明の核酸分子の１つを含む形質転換植物からポリフルクタンを直接分離することができる。こうして調製されたポリフルクタンはとりわけ重合度＞１００、分枝度＜８％とりわけ＜３％のイヌリンである。
発明の別の好ましい実施形態では、本発明に基づき調製されたイヌリンがフルクトオリゴ糖又はジフルクトース二無水物の調製のために使用される。フルクトオリゴ糖の好ましい調製方法は、本発明に基づき調製されたイヌリンをエンドイヌリナーゼで処理し、続いて生じたフルクトオリゴ糖を反応調合物から分離するものである。別の好ましい実施形態ではサッカロース溶液を本発明に基づくフルクトシル転移酵素及びエンドイヌリナーゼで同時に処理し、続いて酵素により生成されたフルクトオリゴ糖を反応調合物から分離し精製する。
【００２６】
発明の別の好ましい実施形態はジフルクトース二無水物の調製方法に関する。一実施形態では、本発明に基づき調製されたイヌリンをエンドイヌリナーゼ及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｕｌｏｂｉｆｏｒｍeｓ又はＡｒｔｈｒｏｂａ−ｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓの細胞で処理する。別の好ましい実施形態ではサッカロース溶液を本発明のフルクトシル転移酵素及びエンドイヌリナーゼ及びＡ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍeｓ又はＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓの細胞で処理し、続いて生じたジフルクトース二無水物を反応調合物から分離し、精製する。
【００２７】
発明のその他の好ましい実施形態はその他の従属請求項で明らかである。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明に基づき細菌性フルクトシル転移酵素（ｆｔｆ）遺伝子であり、フルクトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードし、５’−末端及び／又は３’−末端に少なくとも１個の欠失を含む、とりわけ分離及び精製された核酸分子が提供される。
【００２９】
本発明に関連して細菌性フルクトシル転移酵素遺伝子又はフルクトシル転移酵素活性を有する細菌性ポリペプチドをコードする核酸分子とは、遺伝子産物がサッカロース：２，１−β−Ｄ−フルクトシル転移酵素（ＥＣ２．４．１．９）の活性を有し、起源は細菌とりわけＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓに由来する遺伝子のコーディングＤＮＡ配列を意味する。本発明に関連して「フルクトシル転移酵素」又は「β−Ｄ−フルクトシル転移酵素」の概念は、反復する単位フルクトースからなる高分子炭水化物重合体の合成を触媒するポリペプチド又はタンパク質を意味し、その場合サッカロースはその後の重合のための出発基質として使用される。こうして合成された重合産物では、反復する単位フルクトースがβ−１，２−結合によって互いに連結されているから、この産物の合成を触媒するフルクトシル転移酵素はイヌリンスクラーゼと呼ぶこともできる。反復する単位フルクトースからなる合成された高分子重合体はとりわけ線状構造を有し、サッカロース分子に由来する末端グルコース残基を含むことが可能であり、少なくとも２個のフルクトース残基を包含する。本発明に関連してこの炭水化物はポリフルクタンと呼ばれる。合成されたポリフルクタンはとりわけイヌリンである。
【００３０】
核酸はＤＮＡ配列、例えばゲノムＤＮＡ配列の一部もしくはＲＮＡ配列、例えばｍＲＮＡ配列又はその一部である。核酸は天然起源であり、即ち例えばＳｔ−ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ細胞から分離することができ、また合成起源であることも可能である。
【００３１】
本発明に基づく核酸分子は配列番号２に示されたアミノ酸配列をコードする配列番号１に示された核酸配列に、ａ）ヌクレオチド４から２２２、ｂ）ヌクレオチド１から１０４及びｃ）ヌクレオチド２２５４から２３８５からなるグループから選ばれた少なくとも１個の欠失を有する。本発明に関連して「欠失」の概念は、野生型遺伝子に存在する核酸配列の一部が欠如する突然変異を意味する。欠失が生じる領域に適当な制限部位が隣接するならば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで制限酵素を使用して欠失を生じることができる。また特定のエンドヌクレアーゼにより、例えば酵素ＢＡＬ−３１を使用して、欠失突然変異が挿入される。このような酵素は制限酵素切断によって生じた末端を分解する。ＰＣＲ反応で突然変位プライマーを使用して欠失突然変異を得ることもできる。その場合このようなプライマーの配列は欠失を生じさせようとする領域にまたがっており、プライマーは欠失が生じる領域に隣接する標的区域の２つの領域に結合する。従って増幅の際にプライマーがまたがる領域は捕捉されず、このため増幅が行われない。
【００３２】
本発明に基づくフルクトシル転移酵素の欠失は、とりわけＳｔｒｅｐｔｏｃ−ｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓの未変性フルクトシル転移酵素遺伝子の５’−領域及び３’−領域に関する。
【００３３】
ヌクレオチド４から２２２を包含する欠失が５’−領域にある特に好ましい実施形態は、配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、配列番号３に示された核酸配列である。起源生物Ｓ．ｍｕｔａｎｓではシグナル配列が細胞質からの酵素の分泌を仲介し、その場合シグナル配列は分泌過程でシグナルペプチターゼによって切断される。グラム陽性菌及びグラム陰性菌で同様に進行するシグナルペプチド依存性のタンパク質輸出は、多数の可溶の膜結合タンパク質が関与した複雑なエネルギー依存性過程である（Ｓｃｈａｔｚ及びＢｅｃｋｗｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２４（１９９０），２１５）。異種宿主生物でフルクトシル転移酵素タンパク質の過剰生産を得ようとする場合、シグナル配列が異種宿主でも機能し、タンパク質生産量が分泌機構の能力を超えるならば、及び／又はその他の生理的細胞内又は細胞外過程が細胞膜領域で組換えタンパク質自体により又は組換えタンパク質の分泌により妨げられるならば、シグナル配列が宿主の成長の阻害、それと共に産物の収量の減少を招くことがある。
【００３４】
シグナルペプチドをコードする、配列番号３の核酸の核酸配列を完全に除去すれば、シグナルペプチドが完全に除去されるから、異種宿主での修飾フルクトシル転移酵素タンパク質の発現が遺伝子産物の細胞内生産をもたらす。フルクトシル転移酵素の細胞内生産によって、未変性フルクトシル転移酵素タンパク質を発現する宿主系で成長障害がほぼ完全に取り除かれ、所望のタンパク質産物を高い容積収量で得ることができる。
【００３５】
未変性フルクトシル転移酵素遺伝子の３’−領域の欠失に関する特に好ましい実施形態は、配列番号８に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号７に示された核酸配列の核酸分子である。この核酸分子ではヌクレオチド２２５４から２３８５が欠失している。Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔ−ｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７（１９８２），１０５−１４２）によって示されたように、この領域は高い疎水親水指数を有する。この疎水性領域に直接的機能を配属することはできないが、異種宿主系はこのような修飾フルクトシル転移酵素タンパク質の発現のもとで、未変性フルクトシル転移酵素タンパク質を発現する宿主細胞に比してはるかに改善された成長挙動を示す。また修飾タンパク質を高い容積収量で分離することができる。
【００３６】
別の好ましい実施形態ではフルクトシル転移酵素遺伝子の５’−領域に欠失がある配列を他の遺伝子の配列領域で置き換える。特に好ましい実施形態では他の遺伝子はｌａｃＺα遺伝子である。本発明に関連して「置き換える」という概念は、シグナルペプチドをコードするｆｔｆ配列の全部又は一部を他の遺伝子の相当配列で置き換えることができることを意味する。従ってｌａｃＺα遺伝子を使用すれば、この遺伝子の相当配列は５’−領域に欠失があるフルクトシル転移酵素と融合される。特に好ましいその一例は、配列番号６に示されたアミノ酸配列をコードする、配列番号５に示された核酸配列の核酸分子である。このｆｔｆ遺伝子変異型では未変性フルクトシル転移酵素の核酸配列のヌクレオチド１から１０４がｌａｃＺα遺伝子のヌクレオチド１から８３と交換された。従って核酸分子は未変性ｆｔｆ配列に比して、ヌクレオチド１から１０４の欠失を有する。異種宿主系で融合タンパク質を発現するとき、５’−領域の交換は細胞周辺腔に遺伝子産物を局在化させる。従ってこのようなプラスミドで形質転換した宿主細胞は野生型ｆｔｆ遺伝子を含む宿主細胞に比して明らかに改善された成長を示し、融合タンパク質を同じく高い容積収量で得ることができる。
【００３７】
別の好ましい実施形態は配列番号１０に示されたアミノ酸配列をコードする、配列番号９に示された核酸分子を有する核酸分子及び配列番号１２に示されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１１に示された核酸配列の核酸分子である。配列番号９の核酸分子は５’−末端にヌクレオチド４から２２２の欠失、３’−末端にヌクレオチド２２５４から２３８５の欠失を有する。配列番号１１の核酸分子ではヌクレオチド１から１０４がｌａｃＺα−遺伝子のヌクレオチド１から８３で置き換えられ、３’−末端は同じくヌクレオチド２２５４から２３８５の欠失を有する。２つのｆｔｆ遺伝子変異型は、異種宿主系で当該の遺伝子産物を発現すれば成長の明らかな改善をもたらし、当該の遺伝子産物を高い容積収量で得ることができる。
【００３８】
また本発明は本発明に基づく核酸分子の単数又は複数の塩基の例えば置換、付加、逆位及び／又は欠失によって得られる修飾核酸分子、即ち本発明に基づく核酸分子の突然変異体、誘導体及び機能的相当物即ち異構造だが同一機能又は類似機能を持つ変態と呼ぶことができる核酸分子を包含する。例えば核酸配列の中に適当な制限部位を生じ、又は不要な配列部分を除去するために、核酸分子の配列を一層的確に修飾することができる。本発明に基づく核酸分子の修飾は微生物学／分子生物学の標準的方法によって行うことができる。そのために当該の核酸をプラスミドに挿入し、突然変異誘発法又は組換えによる配列変更を行う。挿入、欠失又は置換、例えばトランジション又はトランスバージョンを生じるために、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発法「プライマー修復法」及び制限及び／又は連結反応法が適している（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌ−ａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２版（１９８９年），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ−ｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡを参照）。また天然又は合成核酸配列の付加によって一層の配列変更が得られる。
【００３９】
また本発明は本発明に基づく核酸分子を含むベクターに関する。このベクターはとりわけプラスミド、コスミド、ウイルス、リポソーム、バクテリオファージ、シャトルベクター及び遺伝子工学で慣用のその他のベクターである。本発明に基づくベクターは、宿主細胞でベクターの安定化及び／又は複製を生じさせ、又は少なくともそれに寄与するその他の機能要素を含むことができる。
【００４０】
本発明の特に好ましい実施形態は、少なくとも１個の本発明に基づく核酸分子が少なくとも１個の調節要素の機能的制御を受けるベクターを包含する。本発明によれば「調節要素」の概念は、ポリペプチド又はタンパク質が発現されるように、原核及び／又は真核宿主細胞での核酸分子の転写及び／又は翻訳を保証する要素を意味する。調節要素はプロモーター、エンハンサー、サイレンサー及び／又は転写終結シグナルである。本発明に基づく核酸配列、特にこの核酸配列のタンパク質コーディング部位と機能的に結合された調節要素は、タンパク質コーディングヌクレオチド配列自体と異なる生物又は異なる遺伝子に由来するヌクレオチド配列である。その一例はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７、Ｔ３、ＳＰ６及びその他の慣用の調節要素、大腸菌での発現のためのＰLAC、ＰLtet及びその他の慣用の調節要素、パン酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現のためのＧＡＬ１−１０、ＭＥＴ２５、ＣＵＰ１、ＡＤＨ１、ＡＦＨ１、ＧＤＨ１、ＴＥＦ１、ＰＭＡ１及びその他の調節要素、バキュロウイルス系での発現のためのポリへドリン、哺乳動物細胞での発現のためのＰCMV、ＰSV40及びその他の慣用の調節要素、植物系での発現のための組織又は器官特異的、特に貯蔵器官特異的プロモーター例えばエンドウのＶｉｃｉｌｌｉｎプロモーター、シロイヌナズナ・プロモーターＡｔＡＡＰ１又はＰａｔａｔｉｎ−Ｂ３３−プロモーターである。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、植物細胞の小胞体に吸収し、液胞に転送するためにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と本発明に基づく核酸分子を融合したものである。遺伝子産物の液胞局在化は特に好都合である。本発明によれば、例えばオオムギのレクチンの液胞局在化ためのシグナルペプチド、ジャガイモのＰａｔａｔｉｎ遺伝子のシグナル配列又はマメの成熟したフィトヘマグルチニンのシグナル配列を使用することができる。
【００４２】
好ましい実施形態では調節要素は大腸菌のＬラムノースオペロンに由来する。特に好ましい実施形態では本発明に基づく核酸分子はベクターｐＪＯＥ２７０２の発現カセット（Ｖｏｌｆｆら、１９９６；Ｓｔｕｍｐｐら、２０００）に組込まれている。発現カセットは大腸菌の２段階調節ＬラムノースオペロンｒｈａＢＡＤに由来するプロモーターｒｈａPを包含する（Ｅｇａｎ及びＳｃｈｌｅｉｆ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４３（１９９４），８２１−８２９）。ベクターｐＪＯＥ２７０２は２段階で正の調節が可能なＬラムノース誘導性発現ベクターであって、宿主細菌大腸菌に高いコピー数で存在する。転写物の転写終結と翻訳開始もベクターに含まれる発現カセットの配列によって行われる。多くの市販の大腸菌発現ベクターに比して、ｐＪＯＥ２７０２は２つの決定的な利点を有する。第一にベクターは非誘導状態で、発現されるポリペプチドの塩基発現が極めて低い。第二に発現カセットの転写が遅れて誘導される。従ってこのベクターは宿主細胞の活力と成長特性に否定的影響を及ぼすタンパク質、例えば細菌性フルクトシル転移酵素のクローニング及び生産に特に適している。完全なＳ．ｍｕｔａｎｓフルクトシル転移酵素遺伝子を有するベクターｐＪＯＥ２７０２を含む大腸菌細胞は誘導の後に完全な成長阻害を示すが、このベクターは５’−末端及び３’−末端に本発明に基づく欠失の少なくとも１つを含む本発明の核酸分子の発現に特に適している。
【００４３】
もちろん本発明は単数個だけでなく複数個の本発明核酸分子を含むベクターも包含する。その場合本発明に基づくヌクレオチド配列、特に配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１に記載された配列の場合によっては１個、２個又は数個がただ１組の調節要素によって調節されるように、ヌクレオチド配列を配列することができる。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施形態は、単数個又は複数個の本発明に基づく核酸分子もしくは単数個又は複数個の本発明に基づくベクターを包含し、核酸分子によってコードされた、フルクトシル転移酵素活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞に関する。本発明に基づく宿主細胞は原核及び真核細胞である。原核細胞の好ましい例は細菌、例えば大腸菌又は枯草菌である。本発明に基づき選ばれる真核細胞の例は酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞を包含する。本発明に基づく宿主細胞は、挿入される本発明のヌクレオチド配列が形質転換細胞に対して異種であること、即ち挿入される本発明のヌクレオチド配列がこの細胞に天然に現われないか又は天然に現われる当該の配列と異なるコピー数又は配向でこの細胞のゲノムに局在化されていることを特徴とする。
【００４５】
本発明の特に好ましい実施形態では宿主細胞はグラム陰性細胞、特に大腸菌細胞である。また別の有利な実施形態ではグラム陽性細胞、例えば枯草菌細胞を取り上げることができる。
【００４６】
別の好ましい実施形態では本発明に基づく宿主細胞は真核宿主細胞である。特に好ましい実施形態では本発明に基づく宿主細胞は酵母細胞、例えば酵母菌細胞である。別の好ましい細胞は昆虫細胞、例えば昆虫細胞ラインＩＰＬＢ−Ｓｆ２１である。特に好ましい実施形態では宿主細胞は植物細胞、特に天然にポリフルクタン、特にイヌリンを産生する植物の細胞、例えばキクイモ、アーティチョーク又はチコリ細胞もしくはその他の単糖、オリゴ糖及び／又は多糖を天然に産生する農業上重要な植物の細胞、例えばジャガイモ、カッサバ又はテンサイ細胞である。
【００４７】
また本発明は本発明に基づく宿主細胞の少なくとも１つを有する細胞培養に関する。その場合本発明に基づく細胞ラインはフルクトシル転移酵素活性を有するポリペプチド又はタンパク質もしくはその断片を生産する能力を有する。
【００４８】
また本発明はその細胞の少なくとも１つに少なくとも１個の本発明に基づく核酸分子又は少なくとも１個の本発明に基づくベクターを含み、もしくは本発明に基づくフルクトシル転移酵素又はこれを含むベクター又はプラスミドを有する少なくとも１個の、但し好ましくは多数の宿主細胞を含み、その結果高分子ポリフルクタン、特に高分子イヌリンを産生することができる植物に関する。このようにして本発明は本発明に基づく核酸分子の挿入により高分子イヌリンを産生することができる様々な種、属、科、目及び綱の植物の調製を可能にする。天然でイヌリンを産生することができる少数の植物に比して、生成されるイヌリンの意図的な局在化が可能であり、しかも発現率及び生成されるイヌリンの量の増加が得られるという利点が生じる。さらにこの形質転換植物で産生されたイヌリンは天然に生成される植物性イヌリンより高い分子量を有する。天然に産生される植物性イヌリンは分子当り平均１０から３０の単位フルクトースを有するが、形質転換植物で生成されるポリフルクタンは１０００００を超える単位フルクトースを有することが可能である。
【００４９】
また本発明は植物の本発明核酸分子を含む形質転換収穫物及び増殖物並びに本発明に基づく植物の部分又はカルス例えば貯蔵器官、果実、塊茎、塊根、種子、葉、花等に関する。
【００５０】
本発明によれば特に形質転換される植物は天然にポリフルクタン、特にイヌリンを産生することができる植物、とりわけキクイモ、アーティチョーク又はチコリ植物もしくは天然に単糖、オリゴ糖又は多糖を産生することができる農業上重要な有用植物、とりわけジャガイモ、カッサバ又はテンサイ植物である。
【００５１】
また本発明は本発明のベクターによる単数又は複数の植物細胞の形質転換、このベクターに含まれる核酸分子の単数又は複数の植物細胞のゲノムへの組込み及び高分子ポリフルクタン特にイヌリンを産生することができる無傷の形質転換植物への単数又は複数の植物細胞の再生を包含する上記植物の調製方法に関する。
【００５２】
また本発明はフラノシドβ−１，２−結合を有するポリフルクタン特にイヌリンへのサッカロースの転化を触媒することができる、フルクトシル転移酵素活性を有する修飾ポリペプチド又はタンパク質に関する。本発明は、特に本発明の宿主細胞又は本発明の植物での本発明の核酸分子又はその断片の発現によって得られ、上記の生物学的活性を有する、とりわけ分離され完全に精製されたタンパク質に関する。このタンパク質は、とりわけ配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされ、アミノ酸配列が配列番号２に示されているタンパク質と同じ性質、特に同じフルクトシル転移酵素活性を有する。
【００５３】
また本発明は分離され完全に精製されたモノクロナール又はポリクロナール抗体もしくはその断片を包含する。上記のモノクロナール又はポリクロナール抗体もしくはその断片は本発明のポリペプチド又はタンパク質と特異的に、かつこのモノクロナール又はポリクロナール抗体もしくはその断片を使用して慣用の免疫学的方法で例えば本発明のタンパク質の検出ができるようなアフィニティーで反応する。そこで発明の好ましい実施形態はフルクトシル転移酵素活性を有する本発明のポリペプチド又はタンパク質の構造を特異的に同定し、及び／又はこれに結合することができるモノクロナール及びポリクロナール抗体を包含する。このような構造で問題になるのは、本発明のタンパク質の一部であるか又はこれと特異的な関係にあるタンパク質、ペプチド、炭水化物、プロテオグリカン及び／又は脂質複合体である。また本発明は本発明のタンパク質の翻訳後修飾の結果生じた構造に向けられた抗体を包含する。また本発明は例えばこのような抗体の断片例えばＦｃ−もしくはＦ（ａｂ’）2−又はＦａｂ−断片を包含する。
【００５４】
また本発明は本発明の抗体に向けられた、即ち本発明の抗体を同定し、これに結合することができ、本発明の抗体の特異的検出が可能な抗体に関する。
【００５５】
また本発明は線状構造を有し、鎖の中の単位フルクトースがβ−１，２−結合によって連結された、重合度１００超、分枝度３％未満の長鎖ポリフルクタンの調製方法に関する。有利な実施形態では本発明に基づき形質転換された形質転換植物、特にその液胞からポリフルクタンを分離して精製する。特にポリフルクタンをジャガイモ、キクイモ、アーティチョーク、チコリ、カッサバ又はテンサイ植物の貯蔵器官から分離して採取することが好ましい。本方法は例えばＷａｒ−ｉｎｇ  Ｂｌｅｎｄｅｒのタービンミキサーによる大きな植物細胞塊の機械的粉砕を包含し、その際粉砕は大量の含水媒質中で低温例えば＋４℃で行われる。その後の分解は物理的分解法により、例えば超音波、「フレンチプレス」装置、ミル又はプレスにより、化学的分解法例えば凍結乾燥により又は洗浄剤を使用し又は浸透圧の変化を応用して、又は生物学的分解法により、例えば細胞壁に作用する酵素を使用して、又は酸／アルカリ処理により行うことができる。特に好ましい実施形態では特に貯蔵器官の含水抽出物を調製し、続いてアルコールで沈殿させることにより高分子ポリフルクタンの採取が行われる。
【００５６】
ポリフルクタンの調製方法の別の有利な実施形態では本発明の宿主細胞、例えば植物宿主細胞又は微生物宿主細胞例えば大腸菌細胞を適当な栄養培地で適当な培養条件で培養し、増殖する。続いて生じた細胞材料を適当な物理的、化学的及び／又は酵素的方法により分解し、フルクトシル転移酵素活性を有するタンパク質を分解物から精製する。専門分野で周知の慣用の方法により酵素活性をさらに純化する。粗抽出物を得るために分解溶液を例えば抽出法、遠心分離法及び濾過法によって処理する。粗抽出物からのタンパク質の沈殿及び限外濾過法は大量の液からタンパク質を濃縮するための効率的な方法である。沈殿剤としてとりわけ無機塩例えば硫酸ナトリウム及びアンモニウム、有機溶剤例えばアルコール及びポリマー例えばポリエチレングリコールが使用される。使用した沈殿剤を分離するために、続いて透析法を実施することができる。クロマトグラフィー法及び例えば水相系を使用した分配法によりさらに精密精製を行うことができる。この方法にはとりわけ吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【００５７】
分離されたフルクトシル転移酵素を場合によっては不活性又は荷電無機又は有機担体材料に吸着して固定化することができる。担体材料として無機材料例えば多孔質ガラス、シリカゲル、酸化アルミニウム、水酸リン灰石又は種々の金属酸化物、天然ポリマー例えばセルロース、デンプン、アルギン酸塩、アガロース又はコラーゲンもしくは合成ポリマー例えばポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルアクリレート、ナイロン又はオキシランが使用される。その場合固定化は物理的結合力例えばファンデルワールス力、疎水性相互作用及びイオン結合によって行われる。フルクトシル転移酵素の固定化を担体材料との共有結合によって行うこともできる。そのために担体はアミノ酸側鎖と等極結合することができる反応基を持たなければならない。適当な基は例えばカルボキシ基、ヒドロキシ基およびスルフィド基である。多孔質ガラスの表面を例えばシランで処理して活性化し、続いてタンパク質と反応させることができる。天然ポリマーのヒドロキシ基はブロムシアンで、カルボキシ基は塩化チオニルで活性化し、続いて酵素と結合することができる。フルクトシル転移酵素の固定化の別のやり方は、三次元網目構造に封入することである。その利点は、酵素が網目構造の内部で結合されない自由な形で存在することである。その場合周囲の基質の細孔は酵素を拘束するために十分に小さくなければならない。
【００５８】
本発明に基づく宿主細胞からフルクトシル転移酵素を粗抽出物として、又は高度に精製された形で及び／又は固形担体に固定化した形で得た後、分離された酵素によりサッカロース溶液を適当な条件のもとで処理すれば、ポリフルクタンがｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される。なお適当な条件は適当な温度とりわけ３０℃、適当なｐＨ値、適当な緩衝液及び適当な基質濃度を包含する。生成されたポリフルクタンを続いて反応調合物から分離して精製する。
【００５９】
また本発明は上記の方法で調製された高分子ポリフルクタンに関する。こうして調製されたポリフルクタンは主として線状の構造を特徴とし、その鎖の内部ではフルクトース単位がβ−１，２−結合によって連結され、かつ鎖は非還元性α−Ｄ−グルコース単位を末端として有する。このポリフルクタンは＞１００の極めて高い重合度と＜３％の極めて低い分枝度が特徴である。こうして調製されたポリフルクタンは分枝が少ないため、末端グルコース単位をごく僅かしか含まない。好ましくはこのポリフルクタンは１５０万ダルトンを超える高い分子量を特徴とするイヌリンである。
【００６０】
本発明に基づき調製されたポリフルクタン、特にイヌリンはグルコース含量が少ないため、規定食に適したフルクトオリゴ糖の生成のために使用することができる。
【００６１】
そこで発明の好ましい実施形態はフルクトオリゴ糖の調製方法に関する。発明の特に好ましい実施形態では本発明に基づき調製されたイヌリンを適当な固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼにより適当な条件下で処理し、次に、生じたフルクトオリゴ糖を反応調合物から分離して精製する。本発明に係る「エンドイヌリナーゼ」とは、イヌリンのフルクトオリゴ糖への分解を触媒する２，１−β−Ｄ−フルクタン−フルクタン加水分解酵素のことであり、その際酵素作用は特に重合鎖の内部に働く。本発明に関連してフルクトオリゴ糖とは、互いにβ−グリコシド結合された２〜１０個のフルクトース単位からなるサッカリドである。なお使用されるエンドイヌリナーゼは固定化又は非固定化形態で存在する。その場合エンドイヌリナーゼの固定化は、本発明のフルクトシル転移酵素について前述したようにして行うことができる。また適当な条件には適当な温度とりわけ３０℃、適当なｐＨ値、適当な緩衝液及び適当な基質濃度を包含する。
【００６２】
フルクトオリゴ糖の調製方法の別の好ましい実施形態では、サッカロース溶液をｉｎ  ｖｉｔｒｏで適当な条件で、本発明に基づき調製された固定化又は非固定化フルクトシル転移酵素及び固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼにより同時に処理し、生じたフルクトオリゴ糖を続いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応調合物から分離して精製する。
【００６３】
そこで本発明は上記の方法の１つによって調製されたフルクトオリゴ糖にも関する。本発明の方法によって調製されたフルクトオリゴ糖は特に極めて低いグルコース含量が特徴であり、従って特に糖尿病患者のための規定食として特に適している。キクイモのイヌリンから作られたフルクトオリゴ糖は約１４〜２０％のグルコース含量を有し、チコリのイヌリンから作られたフルクトオリゴ糖は約１０％のグルコース含量を含むが、本発明に基づき調製されるフルクトオリゴ糖は、３％未満、とりわけ１％未満のグルコース含量を有する。
【００６４】
本発明に基づき調製されたフルクトオリゴ糖はさらに水素化することができ、それにより同じく規定食として特に適した水素化フルクトオリゴ糖が調製される。本発明に基づき調製されたフルクトオリゴ糖の水素化は、例えば高圧を適用し、触媒を使用して行うことができる。
【００６５】
最後に本発明はジフルクトース二無水物の調製方法に関する。ジフルクトース二無水物は小腸で消化されにくく、大腸で際立った前生物的効果を発揮し、それによって健全な腸内細菌叢と腸壁に持続的に寄与するため、食品添加物として特に興味深い。
【００６６】
発明の一実施形態では本発明に基づき調製されたイヌリンを適当な条件のもとで固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼ及びアースロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）又はアースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）の固定化又は非固定化細胞により同時に処理する。その場合エンドイヌリナーゼは前述のようにイヌリンのフルクトオリゴ糖への転化を触媒する。続いてフルクトオリゴ糖をＡ．グロビフォルミス（Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）又はＡ．ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）のイヌリンフルクト転移酵素（Ｓｅｋｉら、Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｅｒｋｅ，４０（１９８８），４４０−４４２）により転化する。有利な実施形態によればＡ．グロビフォルミス（Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）又はＡ．ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）の細胞は固定化した形で存在する。微生物の固定化のために、培養した不活性化細胞を、例えば中性タンパク質を添加し、さらにグルタルジアルデヒドで架橋することにより好適に共重合した後、生体触媒として直接使用することができる。また生きた微生物をポリマー例えばカラゲナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎ）に封入し、続いて適当な栄養培地中でインキュベートすることも可能である。ポリマー粒子を次に実際のプロセスに使用し、さらに場合によっては再びインキュベートすることにより再生することもできる。また微生物を光架橋ポリマーの形で使用することも可能である。その場合、例えば昼光電球で照射することにより、微生物懸濁液を可溶性プレポリマーを用いて薄膜として重合させる。
【００６７】
なおジフルクトース二無水物の調製のための適当な条件には、適当な温度とりわけ３０℃、適当なｐＨ値、適当な緩衝液及び適当な基質濃度を包含する。
【００６８】
ジフルクトース二無水物の調製方法の別の好ましい実施形態は、サッカロース溶液を本発明の固定化又は非固定化フルクトシル転移酵素、固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼ及びアースロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）又はアースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）の固定化又は非固定化細胞により同時に処理し、続いて生じたジフルクトース二無水物を反応調合物から分離して精製するものである。
【００６９】
発明の別の実施形態では、本発明に基づき調製されたイヌリンの種々の非食品用途での使用が意図される。その場合本発明に基づき調製されたイヌリンを適切な誘導体化に供し、それによりイヌリンエーテル及びイヌリンエステルが調製される。こうして調製されたイヌリンエーテル及びイヌリンエステルは例えば高分子界面活性剤、柔軟剤又は乳化剤として使用することができる。
【００７０】
また本発明によれば本発明に基づき調製されたフルクトオリゴ糖、本発明に基づき調製された水素化フルクトオリゴ糖及び本発明に基づき調製されたジフルクトース二無水物が食品添加物、規定食及び動物飼料添加物として使用される。
【００７１】
後述の図面と実施例は本発明を詳しく説明するものであるが、発明の保護範囲を限定するものではない。
【００７２】
本発明に係る教示に関する配列記録は以下のものを包含する。
【００７３】
配列番号１はミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）  ＤＳＭ２０５２３のｆｔｆ遺伝子のＤＮＡ配列を含む２３８８ヌクレオチドを示す。
【００７４】
配列番号２は本発明に基づくフルクトシル転移酵素タンパク質のアミノ酸配列を含む、配列番号１に由来する７９５アミノ酸を示す。
【００７５】
配列番号３は改変フルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ４→２２２）のＤＮＡ配列を含む２１６９ヌクレオチドを示す。
【００７６】
配列番号４は改変されたフルクトシル転移酵素タンパク質のアミノ酸配列を含む、配列番号３に由来する７２２アミノ酸を示す。
【００７７】
配列番号５は融合遺伝子ｌａｃＺα（１→８３）：：ｆｔｆ（１０５→２３８８）のＤＮＡ配列を含む２３６７ヌクレオチドを示す。
【００７８】
配列番号６は本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を含む、配列番号５に由来する７８８アミノ酸を示す。
【００７９】
配列番号７は改変されたフルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ２２５４→２３８５）のＤＮＡ配列を含む２２５６ヌクレオチドを示す。
【００８０】
配列番号８は本発明に基づき改変されたフルクトシル転移酵素タンパク質のアミノ酸配列を含む、配列番号７に由来する７５１アミノ酸を示す。
【００８１】
配列番号９は本発明に基づき改変されたフルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ４→２２２，Δ２２５４→２３８５）のＤＮＡ配列を含む２０３７ヌクレオチドを示す。
【００８２】
配列番号１０は本発明に基づき改変されたフルクトシル転移酵素タンパク質のアミノ酸配列を含む、配列番号９に由来する６７８アミノ酸を示す。
【００８３】
配列番号１１は本発明の融合遺伝子ｌａｃＺα（１→８３）：：ｆｔｆ（１０５→２３８８，Δ２２５４→２３８５）のＤＮＡ配列を含む２２３５ヌクレオチドを示す。
【００８４】
配列番号１２は本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を含む、配列番号１１に由来する７４４アミノ酸を示す。
【００８５】
配列番号１３はプライマーｆｔｆ１（ｕｐｐｅｒ）の配列を示す。
【００８６】
配列番号１４はプライマーｆｔｆ２（ｌｏｗｅｒ）の配列を示す。
【００８７】
配列番号１５はプライマーｆｔｆ３（ｕｐｐｅｒ）の配列を示す。
【００８８】
配列番号１６はプライマーｆｔｆ４（ｕｐｐｅｒ）の配列を示す。
【００８９】
配列番号１７はプライマーｆｔｆ５（ｕｐｐｅｒ）の配列を示す。
【００９０】
配列番号１８はプライマーｆｔｆ６（ｌｏｗｅｒ）の配列を示す。
【実施例】
【００９１】
実施例１
ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）  ＤＳＭ２０５２３のｆｔｆ遺伝子のクローニング
ミュータンス菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）  ＤＳＭ２０５２３のフルクトシル転移酵素遺伝子のクローニングのためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、その際配列：５’−ＴＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＡＡＡＧＴＴＡＧ−３’のプライマーｆｔｆ１（ｕｐｐｅｒ）及び配列：５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＣＣＡＡＴＧＣＴ−３’のプライマーｆｔｆ２（ｌｏｗｅｒ）を使用した。なおプライマーｆｔｆ１（ｕｐｐｅｒ）はＮｄｅＩ制限部位を含み、プライマーｆｔｆ２（ｌｏｗｅｒ）はＢａｍＨＩ制限部位を含んでいた。市販の精製キットを使用して単離したミュータンス菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）  ＤＳＭ２０５２３の染色体ＤＮＡをＰＣＲ反応で鋳型として利用した。ＰＣＲ反応は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ値８．８５、２５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ4）ＳＯ4、２ｍＭのＭｇＳＯ4、５％のジメチルスルホキシド、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ及び０．２ｍＭのｄＣＴＰ中に各々８ｐｍｏｌのプライマー、５０ｎｇのＤＮＡ鋳型及び２．５単位のＰｗｏポリメラーゼを含む４０μｌの反応容量で行った。その場合ＰＣＲ反応には下記の工程を含めた。即ち９６℃で５分間の変性、次いでそれぞれ６３℃で１分間の変性、４０℃で３０秒間のプライマー付加及び６８℃で２分３０秒間の重合からなる５サイクル、それぞれ９２℃で１分３０秒間の変性、４９℃で１分３０秒間のプライマー付加及び６８℃で２分３０秒間の重合からなる別の２５サイクル、さらに６８℃で５分間の最終重合反応。ＰＣＲ反応によって約２．４ｋｂの大きさの断片が増幅された。単離した断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じ制限酵素で切断されたベクターｐＪＯＥ２７０２（Ｖｏｌｆｆら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２１（１９９６），１０３７−１０４７；Ｓｔｕｍｐｐら、Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｕｍ，１（２０００），３３−３６）と連結した。こうしてｆｔｆ遺伝子のコーディング配列を正しい読み枠で、ベクターに含まれるＬラムノース誘導性発現カセット中にクローニングし、挿入された核酸の転写がベクターｐＪＯＥ２７０２に含まれるプロモーターｒｈａPの制御を受けるようにした。ｆｔｆ遺伝子の転写終結と転写物の翻訳開始もベクターの配列を介して行われる。続いて大腸菌株ＪＭ１０９を、連結によって得られるプラスミドｐＤＨＥ１１３で形質転換した。その場合形質転換細胞をアンピシリン耐性により選択した。
【００９２】
実施例２
ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）  ＤＳＭ２０５２３からクローニングしたｆｔｆ遺伝子の改変
Ｎ末端シグナルペプチドの領域でｆｔｆ遺伝子産物を改変するために、ｆｔｆ遺伝子の５’−ＯＨ末端で欠失を導入し又は配列領域を置換した。
【００９３】
改変フルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ４→２２２）を作製するために、配列：５’−ＴＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＣＣＧ−３’のプライマーｆｔｆ３（ｕｐｐｅｒ）及びプライマーｆｔｆ２（ｌｏｗｅｒ）を用いてＰＣＲ反応を行った。プライマーｆｔｆ３（ｕｐｐｅｒ）はＮｄｅＩ部位を含む。鋳型として、ミュータンス菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）  ＤＳＭ２０５２３のクローン化完全ｆｔｆ遺伝子を含むプラスミドｐＤＨＥ１１３の精製ＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ値８．８５、２５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ4）ＳＯ4、２ｍＭのＭｇＳＯ4、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ及び０．２ｍＭのｄＣＴＰ中に各々８ｐｍｏｌのプライマー、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ鋳型及び２．５単位のＰｗｏポリメラーゼを含む４０μｌの反応容量で行った。ＰＣＲ反応には下記の工程を含めた。即ち９４℃で２分間の変性、次いでそれぞれ９３℃で１分間の変性、５５℃で１分３０秒間のプライマー付加、６８℃で２分２０秒間の重合からなる２５サイクル、さらに６８℃で５分間の最終重合反応。得られた約２．２ｋｂのＰＣＲ産物を単離し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じ制限酵素で切断されたベクターｐＪＯＥ２７０２に連結した。続いて大腸菌株ＪＭ１０９を、連結によって得られるプラスミドｐＤＨＥ２２５で形質転換した。変異型ｆｔｆ（Δ１→２２２）の遺伝子産物は野生型配列に比してＮ末端が７３アミノ酸だけ短縮されている。
【００９４】
改変融合遺伝子ｌａｃＺα（１→８３）：：ｆｔｆ（１０５→２３８８）を作製するために、配列：５’−ＡＴＡＴＡＴＧＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣ−３’のプライマーｆｔｆ４（ｕｐｐｅｒ）及びプライマーｆｔｆ２（ｌｏｗｅｒ）を用いてＰＣＲ反応を行った。プライマーｆｔｆ４（ｕｐｐｅｒ）はＳａｌＩ部位を含む。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  ＤＳＭ２０５２３の完全ｆｔｆ遺伝子の挿入体を含むプラスミドｐＤＨＥ１１３の精製ＤＮＡを、鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は前述のように行った。得られた約２．３ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を単離し、制限酵素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋中にクローニングした。その際短縮されたｆｔｆ読み枠の５’末端を、ベクターに含まれるｌａｃＺα読み枠の先頭領域と融合させた。次に、得られたプラスミドｐＤＨＥ１６６により大腸菌株ＪＭ１０９を形質転換した。第２のＰＣＲ工程でベクターｐＤＨＥ１６６に含まれる融合遺伝子ｌａｃＺα（１→８３）：：ｆｔｆ（１０５→２３８８）を発現ベクターｐＪＯＥ２７０７に再クローニングした。そのために配列：５’−ＴＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣ−３’のプライマーｆｔｆ５（ｕｐｐｅｒ）及びプライマーｆｔｆ２（ｕｐｐｅｒ）を用いてＰＣＲ反応を行った。プライマーｆｔｆ５（ｕｐｐｅｒ）は制限酵素ＮｄｅＩ部位を含む。鋳型としてプラスミドｐＤＨＥ１６６の精製ＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応は前述のように行った。得られた約２．４ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を単離し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じ制限酵素で切断されたベクターｐＪＯＥ２７０２に連結した。続いて大腸菌株ＪＭ１０９を連結によって得られるプラスミドｐＤＨＥ１７１で形質転換した。
【００９５】
改変フルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ２２５４→２３８５）の調製のために、配列：５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧ−３’のＰＣＲプライマーｆｔｆ６（ｌｏｗｅｒ）を、別の上記プライマーと組み合わせて使用した。プライマーｆｔｆ６（ｌｏｗｅｒ）は制限酵素ＢａｍＨＩ部位を含む。鋳型としてプラスミドｐＤＨＥ１１３の精製ＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応は前述のように行った。次に増幅産物を単離し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じ制限酵素で予め切断したベクターｐＪＯＥ２７０２に連結した。こうしてｆｔｆ１（ｕｐｐｅｒ）／ｆｔｆ６（ｌｏｗｅｒ）のプライマー組み合わせを使用して、上記の改変ｆｔｆ遺伝子を含むプラスミドｐＤＨＥ１３２を得た。
【００９６】
改変フルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ４→２２２，Δ２２５４→２３８５）を作製するために、鋳型としてのプラスミドｐＤＨＥ１１３のＤＮＡ並びにプライマーｆｔｆ３（ｕｐｐｅｒ）及びｆｔｆ６（ｌｏｗｅｒ）を使用してＰＣＲ反応を行った。増幅産物をベクターｐＪＯＥ２７０２中に組み込んで、プラスミドｐＤＨＥ１７２を得た。
【００９７】
改変フルクトシル転移酵素遺伝子ｌａｃＺα（１→８３）：：ｆｔｆ（１０５→２３８８，Δ２２５４→２３８５）の調製のために、ベクターｐＤＨＥ１１３のＤＮＡ並びにプライマーｆｔｆ４（ｕｐｐｅｒ）及びｆｔｆ６（ｌｏｗｅｒ）を使用してＰＣＲ反応を行った。得られた約２．２ｋｂの大きさのＰＣＲ産物をＳａｌＩ部位及びＢａｍＨＩ部位にてベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋に組み込み、それによりプラスミドｐＤＨＥ１４０を得た。続いて第２のＰＣＲ反応を行い、その際プライマーｆｔｆ５（ｕｐｐｅｒ）及びｆｔｆ６（ｌｏｗｅｒ）並びに鋳型としてのプラスミドｐＤＨＥ１４０のＤＮＡを使用した。得られた約２．３ｋｂの大きさのＰＣＲ産物を単離し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じ制限酵素で予め切断したベクターｐＪＯＥ２７０２に連結した。これによりプラスミドｐＤＨＥ１４３を得た。
【００９８】
実施例３
種々の変異型のｆｔｆ遺伝子の、大腸菌での異種発現
発現のために使用した大腸菌株ＪＭ１０９の粗抽出物中の遺伝子産物の検出のために、前述のように調製されたプラスミドの１つ又は対照のためのプラスミドｐＪＯＥ２７０２を含有する大腸菌株を培養し、誘導を行った。菌株をローリングインキュベーターで１００μｇアンピシリン／ｍｌを含む５ｍｌのｄＹＴ完全培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９），ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中で、３０℃で一晩かけて前培養した。この一晩培養は、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）が約０．０２となるように、各々５０ｍｌのｄＹＴ培地に接種した。次に三角フラスコ中に入れた細胞を振とう培養機でＯＤ600が０．２となるまで培養した。Ｌラムノース誘導性プロモーターの誘導のために０．２％（重量／体積）のＬラムノースを培地に加えた。続いて細胞をさらに７時間培養した。７時間の誘導の後に、遠心分離、５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4緩衝液（ｐＨ値６．５）での細胞の洗浄、続いて同じ緩衝液中への細胞の再懸濁を行い、細胞を回収した。次に懸濁液をＯＤ600値１０に調整した。細胞を超音波処理又はフレンチプレス処理によって破壊した。続いてすべての抽出物を１００００×ｇで２０分の遠心分離により処理した。次に全タンパク質含量をＢｒａｄｆｏｒｄにより（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２（１９７６），２４８−２５４）決定し、その際Ｂｉｏｒａｄ（Ｂｉｏｒａｄ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｅｎｃｈｅｎ）のウシ血清アルブミン検定試薬を使用した。得た粗抽出物のタンパク質パターンと非誘導対照物のタンパク質パターンの比較のために、抽出物を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離した（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７（１９７９），６８０−６８５）。
【００９９】
粗抽出物におけるＦｔｆ比活性を測定することによりＦｔｆ活性の定量的決定を行った。細胞培養、細胞破壊及び粗抽出物の調製は前述のように実施した。サッカロース１分子の転化のつどそれぞれグルコース１分子が遊離することから、単位時間当りに遊離するグルコース量を確かめることによって活性を決定した。５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ６．５）中に１００ｍＭのＳｃｒを含む容量１ｍｌに、約１〜３ｍＵのフルクトシル転移酵素を含む粗抽出物量を使用して、３０℃で６０分間にわたりＦｔｆ活性の決定を行った。その場合の１単位は、１００ｍＭのサッカロースの存在下、３０℃、ｐＨ値６．５における毎分１μｍｏｌのグルコースの遊離に相当する。１時間のインキュベーションの後に１００℃で１０分間加熱して反応を終了させた。次に１００００×ｇで１０分間遠心分離した。続いてグルコース酸化酵素（ＧＯＤ）／ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）酵素共役試験（Ｗｅｒｎｅｒら、Ｚ．Ａｎａｌｙｔ．Ｃｈｅｍ．，２５２（１９７０）２２４−２２８）により、１００μｌアリコート中の遊離グルコース量を測定した。この場合、色素２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホネート）（ＡＢＴＳ(R)）の酸化を測光法で検出するＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ(R)テスト（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用した。この試験は、５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ値６．５）中に８０μｇ／ｍｌのＧＯＤ、１０μｇ／ｍｌのＰＯＤ及び１μｇ／ｍｌのＡＢＴＳ(R)を含む全容量１ｍｌ中で実施し、３０分後に５７８ｎｍで吸光度を測定した。グルコース標準溶液を用いて試験の校正を行った。種々の粗抽出物について発現株を試験した結果を表１にまとめた。
【表１】
2004524826.tif 000002
【０１００】
表から明らかなように、ベクターｐＪＯＥ２７０２に含まれる本発明のｆｔｆ−ヌクレオチド分子で形質転換した大腸菌株は６時間の誘導の後に、完全ｆｔｆ遺伝子を含む大腸菌株に比して明らかに高い細胞密度を示す。即ちこの株の増殖は明らかに向上している。同時に発現タンパク質の体積収量も完全ｆｔｆ遺伝子を有する大腸菌株に比して明らかに増加している。
【０１０１】
実施例４
フルクトシル転移酵素の単離と固定化
前培養１：  ５ｍｌの培地（水（ｐＨ７．０）１０００ｍｌにつきトリプトン  １６ｇ、酵母抽出物  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ及びアンピシリン１００ｍｇ）に、大腸菌株ＪＭ１０９（ｐＤＨＥ１４３）を接種し、３７℃で振とうしつつ（１５０ｒｐｍ）１２〜１５時間インキュベートした。
【０１０２】
前培養２：  同じ培地２００ｍｌに、１ｍｌの前培養１を接種し、３７℃で振とうしつつ１２〜１５時間インキュベートした。
【０１０３】
発酵槽での培養及びフルクトシル転移酵素の発現：  フルクトシル転移酵素を発現させるために、０．２％Ｌラムノースを加えた１６リットルの培地に、２００ｍｌの前培養２を接種し、３０℃、４００ｒｐｍ及び０．５ｖｖｍの空気で約１２時間、即ち光学密度（ＯＤ578）約０．６以上になるまで培養した。
【０１０４】
細胞の回収及び破壊：  細胞を連続遠心分離機，例えばＣｏｎｔｉｆｕｇｅ（Ｈｅｒａｅｕｓ）により４℃、２４３００×ｇで遠心分離した。細胞材料を２０００ｍｌの１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ値６．５で１回洗浄し、次に１００ｍｌのリン酸緩衝液中に再懸濁した。続いて細胞をホモジェナイザーで８００ｂａｒにて破壊した。次に上清に存在する酵素から細胞破片を分離するために、懸濁液を１７３６０×ｇで２０分間遠心分離した。
【０１０５】
固定化：  粗抽出物をまず凍結乾燥した。凍結乾燥物のうち２３．６ｇ（タンパク質約１０ｇ）を５００ｍｌの１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ値６．５に溶解し、１００ｇのＥＵＰＥＲＧＩＴ(R)Ｃ（Ｒｏｅｈｍ）を加えた後、振とうしつつ室温で９４時間インキュベートした。次にＦｔｆ固定化物を５０ｍＭのリン酸緩衝液で洗浄した。
【０１０６】
実施例５
ポリフルクタンの調製のためのＦｔｆタンパク質によるサッカロースの転化
６０リットルの１０％サッカロース溶液、ｐＨ値６．５に、調合物溶液１リットル当り６４０単位のフルクトシル転移酵素を添加した後、３０℃で攪拌しつつ２８時間インキュベートした。その際大腸菌株ＪＭ１０９（ｐＤＨＥ１４３）の粗抽出物を使用した。続いて溶液に直接限外濾過（Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｍｉｎｉ；分子保持能１０００００ダルトンのモジュール３）を行った。得た４．５リットルの保持液をそれぞれ６リットルの脱塩水で２倍に希釈し、最後に４．５リットルに濃縮した。続いてイヌリンをイソプロパノール（最終濃度６２重量％）で沈殿させた。分離した沈殿物を５リットルの同じイソプロパノール溶液で洗浄し、続いて４５℃で穏やかに乾燥した。これにより乾燥物（ＴＳ）含量９３％の白色の産物０．３６ｋｇを得た。サッカロース消費量に対して８．５％の収量が得られた。ＨＰＬＣ−ＧＰＣ法を使用して確かめたイヌリンの分子量は４０×１０6ｇ／ｍｏｌであり、分枝度は３ｍｏｌ％である。
【０１０７】
実施例７
フルクトオリゴ糖の調製のためのエンドイヌリナーゼによるＦｔｆ−イヌリンの転化
実施例６で得た、乾燥物含量９５％のＦｔｆ−イヌリン２０ｇを用いて１％溶液を調製し、９５℃で１５分加熱し、０．１モル濃度の酢酸を使用してｐＨ値を５．０に調整した後、エンドイヌリナーゼ（０．１３ｍｌ／調合物；ＳＰ１６８、Ｎｏｖｏ社）とともに５０℃で８時間攪拌しつつインキュベートした。９５℃で１５分加熱して酵素を不活化した後、生成されたフルクトオリゴ糖を限外濾過（Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｍｉｎｉ、分子保持能１００００ダルトンのモジュール）により分離した。透過液は７．５ｇのフルクトオリゴ糖を含み、一方、１リットルに希釈した保持液はそれに対応して１１．６ｇの乾燥物を含んでいた。続いて再びｐＨ値を調整してから、保持液をエンドイヌリナーゼとともに一定の酵素／基質比で前述のようにインキュベートした。この操作を合計５回繰り返した。ゲル浸透クロマトグラフィーにより、１つに合わせた透過液中の鎖長分布が次のように決定された。
【０１０８】
2004524826.tif 000003
【０１０９】
炭水化物組成を次のように決定した：  １つに合わせた透過液（乾燥物１％）の０．５ｍｌを、０．５ｍｌの１％シュウ酸を添加した後に６５℃で２．５時間加水分解した。ＨＰＡＥＣ法による分析は、フルクトースが唯一の炭水化物成分であることを示した。即ち単離されたオリゴ糖はｎ＝１〜２５のＦn型ホモオリゴマー・フルクトオリゴ糖である。
【０１１０】
実施例８
Ｆｔｆ−タンパク質及び固定化エンドイヌリナーゼによるサッカロースの転化
エンドイヌリナーゼ（例えばＳＰ１６８；ＮＯＶＯ）を、実施例５でフルクトシル転移酵素について説明したようにして、ＥＵＰＥＲＧＩＴ(R)Ｃ（Ｒｏｅｈｍ）に固定化した。３０℃で１リットルの１０％サッカロース溶液、ｐＨ値６．５に５０ｇの固定化フルクトシル転移酵素（実施例２を参照）及び２０ｇの固定化エンドイヌリナーゼを加え、ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。１時間ごとに試料を採取し、サッカロース含量を試験した。サッカロースが検出されなくなったら直ちに反応を終了させて、酵素を調合物から濾過して取り除いた。そのとき得られた生成溶液の組成はゲル浸透クロマトグラフィーにより次のように決定された。
【０１１１】
2004524826.tif 000004
【０１１２】
実施例７で得られたものに比してフルクトース含量がはるかに高い産物が得られた。
【０１１３】
実施例９
水素化フルクトオリゴ糖の調製
実施例７及び８で得た平均重合度１〜平均重合度２５の鎖長のホモオリゴマー・フルクトオリゴ糖混合物を、蒸発によりそれぞれ乾燥物含量１０％に調整した。４５０ｍｌの各溶液を、実験室オートクレーブでラネーニッケルの存在下で１５０ｂａｒ、３０℃で水素により１０時間かけて水素化した。得られた溶液をオートクレーブからポンプで汲み出して濾過し、イオン交換体で精製した。分析が示すところでは、その溶液は、出発液中に含まれていたフルクトースから生成されたマンニトール及びソルビトールに加えて、（フルクトシル）n−マンニトール、（フルクトシル）n−ソルビトール（ｎ＝１〜２４）を含んでいた。マンニトールとソルビトールを周知のクロマトグラフィー法で分離除去し、（フルクトシル）n−マンニトール及び（フルクトシル）n−ソルビトールからなる産物を得た。
【０１１４】
実施例１０
ジフルクトース二無水物ＩＩＩの生成のための、フルクトシル転移酵素、エンドイヌリナーゼ及びアースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）による、サッカロースの転化
アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ株ＡＴＣＣ２１１２４の細胞を、４個の振とうフラスコに入れた、脱塩水中にチコリ・イヌリン（Ｒａｆｔｉｌｉｎｅ(R)）  ８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4  ２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  １ｇ、Ｎａ4ＮＯ3  １ｇ、ＭｇＳＯ4  ０．５ｇ、Ｆｅ2ＳＯ4  ０．０１ｇ、ＣａＳＯ4  ０．０３ｇ、酵母抽出物  ０．５ｇを含む１００ｍｌの栄養液に、接種した。次に１５０ｒｐｍで振とうしつつ２７℃で２４時間のインキュベーションを行った。次に細胞を遠心分離によって分離し、ポリビニルアルコールゲル粒子中に固定化した。
【０１１５】
３０℃で１リットルの１０％サッカロース溶液、ｐＨ値６．５に５０ｇの固定化フルクトシル転移酵素（実施例５を参照）、２０ｇの固定化エンドイヌリナーゼ及び固定化したＡ．ウレアファシエンス（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）細胞を加えた。次に３０℃でゆるやかに攪拌しながらインキュベーションを行った。１時間ごとに試料を採取し、サッカロース含量を試験した。サッカロースがもはや検出されなくなったら直ちに反応を終了させて、酵素を調合物から濾過して分離除去した。
【０１１６】
得た生成溶液のＨＰＬＣ分析により、１８ｇのジフルクトース二無水物ＩＩＩの生成が示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】配列番号１に示された核酸配列を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ−ｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＤＳＭ２０５２３の完全フルクトシル転移酵素（ｆｔｆ）−遺伝子をＬラムノース誘導性大腸菌発現ベクターｐＪＯＥ２７０７に含むプラスミドｐＤＨＥ１１３の制限地図を示す。
【図２】５’−末端が２１９ヌクレオチドだけ短縮された配列番号３に示す核酸配列を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＤＳＭ２０５２３の修飾フルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ４→２２２）を発現ベクターｐＪＯＥ２７０７に含むプラスミドｐＤＨ１７１の制限地図を示す。
【図３】配列番号５に示された核酸配列を有する融合遺伝子ｌａｃＺα（１→８３）：：ｆｔｆ（１０５→２３８８）を発現ベクターｐＪＯＥ２７０２に含み、融合遺伝子がベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋のｌａｃＺα遺伝子の８３ヌクレオチド及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＤＳＭ２０５２３の５’−末端が１０４ヌクレオチドだけ短縮された修飾フルクトシル転移酵素遺伝子からなるプラスミドｐＤＨ１７１の制限地図を示す。
【図４】配列番号７に示された核酸配列を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ−ｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＤＳＭ２０５２３の修飾フルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ２２５４→２３８５）を発現ベクターｐＪＯＥ２７０２に含み、フルクトシル転移酵素遺伝子がヌクレオチド２２５４から２３８５の欠失を有するプラスミドｐＤＨ１３２の制限地図を示す。
【図５】配列番号９に示された核酸配列を有する修飾フルクトシル転移酵素遺伝子ｆｔｆ（Δ４→２２２，Δ２２５４→２３８５）を発現ベクターｐＪＯＥ２７０２に含み、フルクトシル転移酵素遺伝子がヌクレオチド４から２２２及びヌクレオチド２２５４から２３８５の欠失を有するプラスミドｐＤＨＥ１７２の制限地図を示す。
【図６】配列番号１１に示された核酸配列を有する融合遺伝子ｌａｃＺα（１→８３）：：ｆｔｆ（１０５→２３８８，Δ２２５４→２３８５）を発現ベクターｐＪＯＥ２７０２に含み、フルクトシル転移酵素遺伝子がヌクレオチド１から１０４及びヌクレオチド２２５４から２３８５の欠失を有し、欠失した５’−領域がｌａｃＺα遺伝子の８３ヌクレオチドに融合しているプラスミドｐＤＨＥ１４３の制限地図を示す。
【図１】
2004524826.tif 000005
【図２】
2004524826.tif 000006
【図３】
2004524826.tif 000007
【図４】
2004524826.tif 000008
【図５】
2004524826.tif 000009
【図６】
2004524826.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004524826.tif 000011
2004524826.tif 000012
2004524826.tif 000013
2004524826.tif 000014
2004524826.tif 000015
2004524826.tif 000016
2004524826.tif 000017
2004524826.tif 000018
2004524826.tif 000019
2004524826.tif 000020
2004524826.tif 000021
2004524826.tif 000022
2004524826.tif 000023
2004524826.tif 000024
2004524826.tif 000025
2004524826.tif 000026
2004524826.tif 000027
2004524826.tif 000028
2004524826.tif 000029
2004524826.tif 000030
2004524826.tif 000031
2004524826.tif 000032
2004524826.tif 000033
2004524826.tif 000034
2004524826.tif 000035
2004524826.tif 000036
2004524826.tif 000037
2004524826.tif 000038
2004524826.tif 000039
2004524826.tif 000040
2004524826.tif 000041
2004524826.tif 000042
2004524826.tif 000043
2004524826.tif 000044
2004524826.tif 000045
2004524826.tif 000046
2004524826.tif 000047
2004524826.tif 000048
2004524826.tif 000049
2004524826.tif 000050
2004524826.tif 000051
2004524826.tif 000052
2004524826.tif 000053
2004524826.tif 000054
2004524826.tif 000055
2004524826.tif 000056
2004524826.tif 000057
2004524826.tif 000058
2004524826.tif 000059
2004524826.tif 000060
2004524826.tif 000061
2004524826.tif 000062
2004524826.tif 000063
2004524826.tif 000064
2004524826.tif 000065
2004524826.tif 000066
2004524826.tif 000067
2004524826.tif 000068
2004524826.tif 000069
2004524826.tif 000070
2004524826.tif 000071
2004524826.tif 000072
2004524826.tif 000073
2004524826.tif 000074
2004524826.tif 000075
2004524826.tif 000076
2004524826.tif 000077
2004524826.tif 000078
2004524826.tif 000079
2004524826.tif 000080
2004524826.tif 000081
2004524826.tif 000082
2004524826.tif 000083
2004524826.tif 000084
2004524826.tif 000085
2004524826.tif 000086
2004524826.tif 000087
2004524826.tif 000088
2004524826.tif 000089
2004524826.tif 000090
2004524826.tif 000091
2004524826.tif 000092
2004524826.tif 000093
2004524826.tif 000094
2004524826.tif 000095
2004524826.tif 000096
2004524826.tif 000097
2004524826.tif 000098
2004524826.tif 000099
2004524826.tif 000100
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524826.tif 000101
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月1日(2003.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示された核酸配列又は配列番号２に示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を有し、核酸配列がフルクトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードし、核酸配列の５’−又は３’−領域の１つの欠失もしくは５’−領域の１つの欠失及び３’−領域の１つの欠失を有し、この欠失が
ａ）ヌクレオチド４ないし２２２の欠失、
ｂ）ヌクレオチド２２５４ないし２３８５の欠失
ｃ）ヌクレオチド１ないし１０４の欠失及びヌクレオチド２２５４ないし２３８５の欠失並びに
ｄ）ヌクレオチド４ないし２２２の欠失及びヌクレオチド２２５４ないし２３８５の欠失
からなるグループから選ばれたものである核酸分子。
【請求項２】
核酸配列が
ａ）配列番号３に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｂ）配列番号４に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖、
ｃ）配列番号７に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｄ）配列番号８に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖、
ｅ）配列番号９に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｆ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖及び
ｇ）ａ）からｆ）の核酸分子の単数又は複数のヌクレオチドの置換、付加、逆位及び／又は欠失によって得られ、この核酸分子と同一又は類似の機能を有する核酸分子又はその相補鎖
からなるグループから選ばれた請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ｆｔｆ遺伝子の核酸配列の５’−領域に欠失がある配列を他の遺伝子の少なくとも１つの領域で置き換えた請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
ｆｔｆ遺伝子の核酸配列の５’−領域に欠失がある配列をｌａｃＺα遺伝子の配列で置き換え、その際核酸分子が
ａ）配列番号１１に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖及び
ｃ）ａ）又はｂ）の核酸分子の単数又は複数のヌクレオチドの置換、付加、逆位及び／又は欠失によって得られ、この核酸分子と同一又は類似の機能を有する核酸分子又はその相補鎖
からなるグループから選ばれた請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である請求項１ないし４のいずれか１つに記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、リポソーム又はウイルスである請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
少なくとも１つの核酸分子が、原核又は真核細胞でポリペプチド又はタンパク質への翻訳可能ＲＮＡの転写及び／又はＲＮＡの翻訳を保証する少なくとも１つの調節要素により機能的に調節される請求項６又は７に記載のベクター。
【請求項９】
少なくとも１つの調節要素がプロモーター、エンハンサー、サイレンサー又は３’−転写ターミネーターである請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ベクターが、核酸分子によってコードされたポリペプチド又はタンパク質を特定の細胞小器官、区画の内部又は細胞外領域に局在化するためのシグナル配列を有する請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１１】
少なくとも１つの調節要素が大腸菌のＬラムノースオペロンに由来する請求項８ないし１０のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１ないし５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの核酸分子又は請求項６ないし１１のいずれか１つに記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が原核又は真核細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
細菌、酵母細胞及び植物細胞から選ばれた請求項１２又は１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ジャガイモ、キクイモ、アーティチョーク、チコリ、カッサバ又はテンサイの細胞である請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
その細胞の少なくとも１つに請求項１ないし５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの核酸分子又は請求項６ないし１０のいずれか１つに記載の少なくとも１つのベクター又は請求項１５に記載の少なくとも１つの細胞を含む植物。
【請求項１７】
ジャガイモ、キクイモ、アーティチョーク、チコリ、カッサバ又はテンサイ植物である請求項１６に記載の植物。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の植物から得られる種子、果実、増殖物、収穫物及び植物組織。
【請求項１９】
フルクトシル転移酵素活性を有し、サッカロースから主としてβ−２，１−結合を有するポリフルクタンへの転化を触媒し、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の核酸分子の発現によって得られるタンパク質。
【請求項２０】
請求項１２ないし１５のいずれか１つに記載の宿主細胞又は請求項１６又は１７に記載の植物での発現によって得られる請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のタンパク質を特異的に認識して結合する抗体。
【請求項２２】
モノクロナール、ポリクロナール及び／又は修飾抗体である請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項２１又は２２に記載の抗体の特異的検出ができるように、請求項２１又は２２に記載の抗体を識別し、これに結合することができる抗体。
【請求項２４】
ａ）請求項６ないし１０のいずれか１つに記載のベクターによる単数又は複数の植物細胞の形質転換、
ｂ）ベクターに含まれるフルクトシル転移酵素遺伝子の、単数又は複数の形質転換細胞のゲノムへの組込み及び
ｃ）ポリフルクタンを生産する無傷の植物の再生
を包含する遺伝子工学的に変異したポリフルクタン生産植物の調製方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載の宿主細胞もしくは請求項１６又は１７に記載の植物又は請求項１８に記載の植物細胞をポリフルクタンの調製に適した条件で培養し、ポリフルクタンを分離して精製するポリフルクタンの調製方法。
【請求項２６】
下記の諸段階、即ち
ａ）適当な培地で適当な培養条件のもとでの請求項１２ないし１５のいずれか１つに記載の宿主細胞の培養及び増殖、
ｂ）生じた細胞材料の適当な物理的、化学的及び／又は酵素的方法による分解及びフルクトシル転移酵素活性を有するタンパク質の粗抽出物としての又は至純な形及び／又は固形担体に固定化した形の分離及び／又は精製、
ｃ）ｂ）で得たフルクトシル転移酵素活性を有するタンパク質によるサッカロース溶液の処理及び
ｄ）生成されたポリフルクタンの反応調合物からの分離及び精製
を包含するポリフルクタンの調製方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法により調製したポリフルクタン。
【請求項２８】
分子量４０×１０6、分枝度＜３％のイヌリンである請求項２７に記載のポリフルクタン。
【請求項２９】
請求項２８に記載のイヌリンを適当な条件で固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼで処理し、続いて生じたフルクトオリゴ糖を反応調合物から分離して精製するフルクトオリゴ糖の調製方法。
【請求項３０】
サッカロース溶液を適当な条件で請求項１９又は２０に記載の固定化又は非固定化タンパク質及び固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼで同時に処理し、続いて生じたフルクトオリゴ糖を反応調合物から分離して精製するフルクトオリゴ糖の調製方法。
【請求項３１】
平均重合度２−５のオリゴ糖３５％ない５０％、平均重合度６−１０のオリゴ糖１４％ないし１８％、平均重合度１１−２５のオリゴ糖１８．５％ないし２３．５％からなる請求項２９又は３０に記載の方法により調製したフルクトオリゴ糖。
【請求項３２】
請求項３１に記載のフルクトオリゴ糖の水素化により調製した水素化フルクトオリゴ糖。
【請求項３３】
請求項２８に記載のイヌリンを適当な条件で固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼ及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｕｌｏｂｉｆｏｒ−ｍｉｓ又はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓの固定化又は非固定化細胞で同時に処理し、続いて生じたジフルクトース二無水物を反応調合物から分離して精製するジフルクトース二無水物の調製方法。
【請求項３４】
サッカロース溶液を請求項１９又は２０に記載の固定化又は非固定化タンパク質及び固定化又は非固定化エンドイヌリナーゼ及びＡｒｔｈ−ｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｕｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ又はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓの固定化又は非固定化細胞で同時に処理し、続いて生じたジフルクトース二無水物を反応調合物から分離して精製するジフルクトース二無水物の調製方法。
【請求項３５】
請求項３３又は３４に記載の方法で調製したジフルクトース二無水物。
【請求項３６】
イヌリンエーテル及びイヌリンエステルの調製のための請求項２８に記載のイヌリンの使用。
【請求項３７】
食品添加物、ダイエット食品又は動物飼料添加物としての請求項３１に記載のフルクトオリゴ糖の使用。
【請求項３８】
食品添加物、ダイエット食品又は動物飼料添加物としての請求項３１に記載の水素化フルクトオリゴ糖の使用。
【請求項３９】
食品添加物、ダイエット食品又は動物飼料添加物としての請求項３５に記載のジフルクトース二無水物の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月26日(2003.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
核酸配列が
ａ）配列番号３に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｂ）配列番号４に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖、
ｃ）配列番号７に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖、
ｄ）配列番号８に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖、
ｅ）配列番号９に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖及び
ｆ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖
からなるグループから選ばれた請求項１に記載の核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
ｆｔｆ遺伝子の核酸配列の５'−領域に欠失がある配列をｌａｃＺα遺伝子の配列で置き換え、その際核酸分子が
ａ）配列番号１１に示された核酸配列を有する核酸分子又はその相補鎖及び
ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその相補鎖
からなるグループから選ばれた請求項３に記載の核酸分子。
【国際調査報告】
2004524826.tif 000102
2004524826.tif 000103
2004524826.tif 000104
2004524826.tif 000105
2004524826.tif 000106
2004524826.tif 000107