(57)【要約】本発明は、微生物バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）から抽出した新規なデンプン分解酵素、デンプン分解機能を有する十分に類似したタンパク質、これらの製造方法、ならびに、これらタンパク質の種々の応用分野に関する。また、これらを、他の特に技術的目的のために、実施されている応用分野を越えて、さらに開発することができる。特に本発明は、上記した種類のデンプン分解タンパク質を含有する洗浄剤および清浄剤、該デンプン分解タンパク質または類似物質の使用を含む織物または硬表面の清浄化方法、ならびに、織物または硬表面を清浄化するためのこれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と、３２〜５１６位において、少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と、３２〜５１６位において、少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するデンプン分解タンパク質。
【請求項５】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と、より具体的には配列番号２中のアミノ酸３２〜５１６に対応する部分領域にわたり、少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列から導かれるデンプン分解タンパク質。
【請求項６】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列と、より具体的には配列番号２中のアミノ酸３２〜５１６に対応する部分領域にわたり、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列から導かれるデンプン分解タンパク質。
【請求項７】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と、全体としておよび／または３２〜５１６位において同一であり、そして／または、配列番号１で示されるヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列と、全体としておよび／または３２〜５１６位において同一であるデンプン分解タンパク質。
【請求項８】
欠失突然変異によって得られる請求項１〜７のいずれかに記載のデンプン分解タンパク質またはデンプン分解タンパク質フラグメント。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質またはフラグメントと同一のタンパク質のデンプン分解活性部分から、少なくとも部分的に構成されるデンプン分解キメラタンパク質または挿入突然変異によって得られるデンプン分解タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質のデンプン分解活性誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の１つと共通する、少なくとも１つの抗原決定基を有するデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１２】
微生物から天然に得られることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１３】
微生物がグラム陽性細菌であることを特徴とする請求項１２に記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１４】
グラム陽性細菌がバシラス属のいずれかであることを特徴とする請求項１３に記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１５】
バシラス種が、バシラス種Ａ７−７、より具体的にはバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）であることを特徴とする請求項１４に記載のデンプン分解タンパク質または誘導体。
【請求項１６】
デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と、より具体的には配列番号２中のアミノ酸３２〜５１６に対応する部分領域にわたり、少なくとも８５％同一である核酸。
【請求項１７】
デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と、より具体的には配列番号２中のアミノ酸３２〜５１６に対応する部分領域にわたり、少なくとも９０％同一である核酸。
【請求項１８】
デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と、より具体的には配列番号２中のアミノ酸３２〜５１６に対応する部分領域にわたり、１００％同一である核酸。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体のいずれかをコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体のいずれかを生成するか、または、これらタンパク質または誘導体をコードする核酸を含有する天然生物。
【請求項２１】
微生物、好ましくは細菌であることを特徴とする請求項２０に記載の生物。
【請求項２２】
細菌がグラム陽性細菌であることを特徴とする請求項２１に記載の生物。
【請求項２３】
グラム陽性細菌が、バシラス属のいずれか、より具体的にはバシラス種Ａ７−７、最も具体的にはバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）であることを特徴とする請求項２２に記載の生物。
【請求項２４】
請求項１６〜１９のいずれかに記載の核酸領域、あるいは、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体のいずれかをコードする核酸領域を含有するベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のクローニングベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれかに記載のベクターを含有する細胞。
【請求項２８】
好ましくは請求項２６に記載の発現ベクターを用いて、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体のいずれかを発現するか、あるいは、該タンパク質または誘導体を発現するように刺激しうる宿主細胞。
【請求項２９】
細菌、より具体的には、生成したタンパク質または誘導体を周囲培地に分泌する細菌であることを特徴とする請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
バシラス属の細菌、より具体的には、バシラス・リケニホルミス種、バシラス・アミロリクエファシエンス種、バシラス・スブチリス種またはバシラス・アルカロフィラス種の細菌であることを特徴とする請求項２８または２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
グラム陰性細菌であることを特徴とする請求項２８または２９に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
エシェリキア属、好ましくはエシェリキア・コリ種、より好ましくはエシェリキア・コリＪＭ１０９株、エシェリキア・コリＤＨ１００Ｂ株またはエシェリキア・コリＤＨ１２Ｓ株のいずれかに属することを特徴とする請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
真核細胞、より具体的には生成したタンパク質を翻訳後修飾する真核細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の製造方法であって、
請求項１６〜１９のいずれかに記載の核酸を用いて、および／または、請求項２４〜２６のいずれかに記載のベクターを用いて、および／または、請求項２８〜３３のいずれかに記載の宿主細胞を用いて、または、タンパク質または誘導体を天然に生成する細胞、より具体的には請求項２０〜２３のいずれかに記載の細胞を用いて製造する方法。
【請求項３５】
請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体を含有することを特徴とする洗剤またはクリーナー。
【請求項３６】
０．０００００１〜５重量％、より具体的には０．００００１〜３重量％のデンプン分解タンパク質または誘導体を含有することを特徴とする請求項３５に記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項３７】
１またはそれ以上の他のデンプン分解タンパク質、より具体的にはα−アミラーゼをさらに含有することを特徴とする請求項３５または３６に記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項３８】
他の酵素、より具体的には１またはそれ以上のプロテアーゼ、リパーゼ、β−グルカナーゼおよび／またはセルラーゼをさらに含有することを特徴とする請求項３５〜３７のいずれかに記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項３９】
１を越える相からなることを特徴とする請求項３５〜３８のいずれかに記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項４０】
固体であり、かつ、少なくとも２つの異なる粉末または顆粒が全体として緩やかな形態で互いに混合して存在することを特徴とする請求項３５〜３９のいずれかに記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項４１】
少なくとも２つの固相が互いに、より具体的には通常の圧縮工程後に結合されることを特徴とする請求項３９に記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項４２】
少なくとも１つの相が、アミラーゼ感受性材料、より具体的にはデンプンを含有するか、あるいは、該材料により少なくとも部分的に囲まれているかまたは該材料で被覆されていることを特徴とする請求項３９〜４１のいずれかに記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項４３】
液体、ゲル状またはペースト状であり、かつ、存在するタンパク質および／または存在する少なくとも１つの酵素および／または存在する少なくとも１つの他の成分が、それ自体でまたは他の構成成分と共に、好ましくはマイクロカプセル中に、より具体的にはアミラーゼ感受性材料のマイクロカプセル中に封入されていることを特徴とする請求項３５〜４２のいずれかに記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項４４】
デンプン分解活性が、洗剤／クリーナーの他の構成成分の１つによって修飾されている、より具体的には安定化されており、そして／または洗剤／クリーナーの洗浄／清浄性能への寄与が増大されていることを特徴とする請求項３５〜４３のいずれかに記載の洗剤またはクリーナー。
【請求項４５】
請求項１〜１５のいずれかに記載のデンプン分解タンパク質または誘導体が、少なくとも１つの工程において活性になることを特徴とする織物または硬表面を清浄化するための方法。
【請求項４６】
請求項３５〜４４のいずれかに記載の洗剤／クリーナーを、少なくとも１つの工程において使用することを特徴とする織物または硬表面を清浄化するための方法。
【請求項４７】
デンプン分解タンパク質または誘導体を、該工程において、適用あたり０．０１〜２００ｍｇの量で、好ましくは適用あたり０．０２〜１００ｍｇの量で使用することを特徴とする請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１〜１５のいずれかに記載のデンプン分解タンパク質または誘導体の、それ自体でのまたは少なくとも１つの他の洗浄剤または清浄効果を維持する活性物質と一緒での使用であって、織物または硬表面を清浄化するための使用。
【請求項４９】
織物または硬表面を清浄化するための、請求項３５〜４４のいずれかに記載の洗剤の使用。
【請求項５０】
デンプン分解タンパク質または誘導体を、適用あたり、好ましくは食器洗浄機または洗浄機における適用あたり、０．０１〜２００ｍｇの量で、好ましくは０．０２〜１００ｍｇの量で使用することを特徴とする請求項４８または４９に記載の使用。
【請求項５１】
１を越える相からなる洗剤またはクリーナーにおける、請求項１〜１５のいずれかに記載のデンプン分解タンパク質または誘導体の、それ自体でのまたは少なくとも１つの他の洗浄剤または清浄効果を維持する活性物質と一緒での使用であって、これらまたは他の相を活性化するための使用。
【請求項５２】
封入された成分を含む洗剤またはクリーナーにおける、請求項１〜１５のいずれかに記載のデンプン分解タンパク質または誘導体の、それ自体でのまたは少なくとも１つの他の洗浄剤または清浄効果を維持する活性物質と一緒での使用であって、カプセルから成分を放出させるための使用。
【請求項５３】
織物製造における粗原料または中間生成物を処理するため、より具体的には綿の糊抜きをするための、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項５４】
デンプンを液化するため、より具体的にはエタノールを製造するための方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体をそれに使用することを特徴とする方法。
【請求項５５】
直鎖および／または短鎖オリゴ糖の製造のための、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項５６】
シクロデキストリンの加水分解のための、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項５７】
多糖担体またはシクロデキストリンから低分子量化合物を放出させるための、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項５８】
食品および／または食品成分の製造のための、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項５９】
動物飼料および／または動物飼料成分の製造のための、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項６０】
デンプン含有の接着結合を溶解するための、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体の使用。
【請求項６１】
一時的に結合する方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質または誘導体をそれに使用することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、微生物バシラス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からの新規なデンプン分解酵素およびデンプン分解活性を有する十分に類似したタンパク質、その製造方法、ならびに、これらタンパク質の種々の可能性ある用途に関する。これら可能性ある用途に加えて、さらにこれらを、他の、特に工業的な目的に展開することができる。より具体的には、本発明は、このようなデンプン分解タンパク質を含有する洗剤／クリーナー、これらデンプン分解タンパク質または対応する組成物を用いて織物または硬表面を清浄化する方法、ならびに、織物または硬表面を清浄化するためのこれらの使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプンおよびデンプン様ポリマー（例えば、アミロース、アミロペクチンまたはグリコーゲン）の内部α−１，４−グリコシド結合を加水分解して、デキストリンおよびβ−１，６−分岐オリゴ糖を生成する。これらは、最も重要な工業的に使用されている酵素である。これには２つの理由が存在する。第１には、これらは、多くの基質分解酵素と同様に、微生物からその周囲培地に放出されるので、これらを、発酵および精製によって工業的スケールで比較的容易に、その培養培地から単離しうることが挙げられる。第２には、アミラーゼが広範囲の用途に必要とされていることが挙げられる。
【０００３】
α−アミラーゼの１つの重要な工業的使用は、グルコースシロップの製造である。他の用途は、例えば、洗剤／クリーナー中の活性成分としての用途、織物製造における粗原料の処理、接着剤の製造、ならびに、糖含有の食品または食品成分の製造である。
【０００４】
プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼまたはセルラーゼなどの酵素が、数十年間にわたり、洗剤／クリーナー中の活性成分として使用されている。特定の組成物の洗浄／清浄性能に対するこれら酵素の特定の寄与は、プロテアーゼの場合にはタンパク質含有汚れを分解する能力であり、アミラーゼの場合にはデンプン含有の汚れの分解であり、リパーゼの場合にはその脂肪分解活性である。特に、洗剤の多数回洗浄サイクル性能への寄与のゆえに、および織物に対するその繊維効果のために、セルラーゼを洗剤において使用するのが好ましい。特定の加水分解生成物は、洗剤の他の成分によって攻撃されるか、溶解されるか、乳化されるか、または懸濁されるか、あるいは、その比較的高い溶解性のゆえに、洗浄液により洗い出されるので、酵素と他の構成成分の間で相乗効果が生じる。
【０００５】
洗剤／クリーナーにおいて普通に使用されるα−アミラーゼは、バシラス・リケニホルミスからのα−アミラーゼである。例えば、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ ［Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク］およびＧｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔ．［Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク、米国］の対応する生成物は、それぞれＴｅｒｍａｍｙｌＲおよびＰｕｒａｓｔａｒＲとして市販されている。バシラス・スブチリスまたはバシラス・アミロリクエファシエンスから単離され、米国特許出願ＵＳ１，２２７，３７４に開示されている同族体は、ＢＡＮＲの名称のもとで、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓから市販されている。
【０００６】
このアミラーゼ分子またはその密接な関連物は、種々の分子−生物学的修飾により特定用途のためにその酵素特性を最適化することを課題とする多くの発明において、さらに開発が進められている。このような最適化は、例えば、その基質特異性、種々の反応条件下での酵素の安定性、あるいは、酵素活性それ自体に関するものであることができる。特定用途のためのこのような最適化の例として、以下の特許出願が挙げられる。即ち、織物の糊付けに関するＥＰ０４１０４９８およびデンプンの液化に関するＷＯ９６／０２６３３が挙げられる。
【０００７】
しかし、特に、α−アミラーゼが、洗剤／クリーナーにおけるその使用に関連して、さらに開発が進められている。以下の特許出願が、まさにこの例として挙げられる。即ち、ＷＯ９９／０２７０２のアミラーゼは、比較的高い温度において出発分子よりも安定である。ＷＯ９９／２３２１１の酵素は、高いｐＨ値において、カルシウムイオンの存在下において、および比較的高い温度において安定である。ＷＯ９７／４３４２４のα−アミラーゼは、カルシウムイオンに対して改変された結合能力を示し、従って改変された酵素特性を示す。ＷＯ９９／２０７６８の突然変異誘発法は、洗剤成分の存在下で特に安定であるα−アミラーゼ変異体を導く。この種の改変に伴い、個々の酵素特性における変化は、特定の酵素の洗浄性能および他の特性に対して、ほとんど常に影響を有する。このようにして得られ、現在市販されている最適化生成物の１つの例は、酸化に対する感受性が低下したＤｕｒａｍｙｌＲ（ＷＯ９４／０２５９７）［Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク；ＳＯＥＦＷ−Ｊｏｕｒｎａｌ １２３、（１９９７）、ｐ．７２３−７３１］である。
【０００８】
いくつかの既知の出発酵素のみの最適化だけを含む開発は、恐らくは、得られる結果が限定されるであろうため、他の天然供給源からの同等の酵素について、平行した集中的な探索が行われている。この探索により、デンプン開裂酵素が同定された。例えば、食品製造、化粧品および医薬生成物のために、Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＴｈｅｒｍｕｓから（ＥＰ０６３６６９３）、高温または高酸性の反応条件でのデンプン液化のために、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓから（ＥＰ０６２８６３０）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓから（ＷＯ９４／１９４５４）ならびにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓから（ＥＰ０７２７４８５およびＷＯ９６／０２６３３）、デンプン開裂酵素が同定された。アルカリ性のｐＨ値で使用するために、バシラス種からのアミラーゼが発見された（ＷＯ９５／２６３９７およびＷＯ９７／００３２４）。洗剤に対するその低い感受性のゆえに、種々のバシラスからの他のアミラーゼ（ＥＰ０６７０３６７）が、洗剤／クリーナーにおいて使用するのに適している。
【０００９】
その起源のゆえに、新規に明らかになった生物からの酵素が、特定の用途に対してさらに開発するためには、いくつかの確立された酵素よりも適しているであろう。この１つの例は、Ｔｈｅｒｍｏａｌｃａｌｉｂａｃｔｅｒからのアミラーゼ（ＷＯ９８／１３４８１）であり、その天然の活性はカルシウムイオンに対してほとんど影響を受けないので、最初から、この酵素は洗剤において使用するのに適する能力を有している。
【００１０】
特定の用途のための、天然供給源から単離した酵素のさらなる最適化を、例えば、分子生物学的な方法（例えば、ＵＳ５，１７１，６７３またはＷＯ９９／２０７６８による）によって、または化学的修飾（ＤＥ４０１３１４２）によって行うことができる。例えば、特許出願ＷＯ９９／４３７９３は、既知のＮｏｖａｍｙｌＲα−アミラーゼのさらなる開発を記載している。この文献においては、ＮｏｖａｍｙｌＲと既知のシクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）の間の配列類似性を用いて、微生物学的方法によって関連分子の宿主を構築している。これらの関連分子は、追加のＣＧＴアーゼ特異的なコンセンサス配列（ボックス）および機能を有するα−アミラーゼ、またはそれとは逆の、α−アミラーゼに典型的な追加の領域および機能を有するＣＧＴアーゼ、あるいは、これら両分子のキメラである。この開発の目的は、ＮｏｖａｍｙｌＲをその応用のために最適化することである。
【００１１】
特許出願ＷＯ９９／５７２５０は、洗剤酵素（例えば、リパーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、さらにはＣＧＴアーゼ）の洗浄性能を改善するための別の方法を開示している。これに記載されている原理は、特定の酵素を細菌起源のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）に、非アミノ酸リンカーを介して共有結合させることにある。これにより、酵素が織物表面により強く作用することが確保される。ＷＯ９９／５７２５２は、このコンセプトにおける他の可能なリンカーを包含しており、一方、ＷＯ９９／５７２５４は、キメラタンパク質を形成するようにまたはＷＯ９９／５７２５２に記載されているリンカーを介して、ＣＢＤに結合される他の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼまたはアシルトランスフェラーゼなど）を包含している。
【００１２】
洗剤に使用されるそれぞれのアミラーゼは、それ自身の性能プロフィールを有しており、このことが、ある種の汚れはある酵素によってより効率的に除去され、一方、他の汚れは別の酵素によってより効率的に除去されるという事実に反映される。このことは、当分野を、それ自身の性能スペクトルをも有する他のデンプン分解酵素により豊かにする必要性をさらに示すものである。また、この必要性は、消費者の変化する習慣および要求（これによれば、例えば、低い温度および中程度の温度で清浄化するための洗剤に対する要求が増大している）からも生じる。
【００１３】
さらに、この目的のために、これまで開発されていなかった生物から得ることができる新規な酵素を、「タンパク質工学」によるさらなる遺伝子工学修飾のための出発生成物として使用することができる。この目的は、これまで既知の酵素またはそれから誘導される洗剤酵素が保持していなかったかまたは保持しえなかった性質を得ることである。
【００１４】
しかし、他方において、通常の洗剤成分と組合わせて、最初からある種の洗浄または清浄化性能を示す天然酵素が、上記のような最適化のための特に適する候補であると考えられる。
【００１５】
しかし、これら全ての開発にもかかわらず、工業的スケールで実際に使用されているいくつかの天然デンプン分解酵素（それ自体で、またはさらに開発された形態で使用される）に加えて、広い応用スペクトルを有し、かつ、特定のさらなる開発のための出発点として使用しうる他のデンプン分解酵素を見い出す必要性がなお存在している。
【００１６】
（発明の開示）
即ち、本発明が指向する課題は、これまで記載されていない天然のα−アミラーゼであって、工業的応用のために、より具体的には洗剤／クリーナーにおいても適するか、または用途特異的なさらなる開発のためのベースとして使用しうるα−アミラーゼを同定することであった。
【００１７】
二次的な課題は、このようなα−アミラーゼをコードしている核酸を得ることであった。その理由は、これが、上記酵素のバイオテクノロジーによる製造および上記酵素のさらなる開発のために必須であるためである。
別の二次的な課題は、特定のα−アミラーゼを天然に産生する生物を見い出すことであった。
別の二次的な課題は、見い出したα−アミラーゼをバイオテクノロジーにより製造することを可能にすることであった。
別の二次的な課題は、見い出されたα−アミラーゼによって洗浄または清浄化性能が改善された洗剤／クリーナー、即ち、洗浄または清浄化性能を少なくとも部分的に本発明のデンプン分解タンパク質に帰することができる洗剤／クリーナーを提供することであった。
別の二次的な課題は、対応する洗浄／清浄化方法を提供し、対応する可能性ある用途を挙げることであった。
別の二次的な課題は、主に洗剤／クリーナーにおいて使用するのに適すると考えられるα−アミラーゼの別の可能性ある工業的用途を明らかにすることであった。
【００１８】
上記課題の解決、従って本発明の第１の態様は、デンプン分解タンパク質であって、そのアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、より具体的には配列番号２のアミノ酸３２〜５１６に対応する領域にわたって、少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは１００％同一であるデンプン分解タンパク質にある。
【００１９】
これには、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と、より具体的には配列番号２のアミノ酸３２〜５１６に対応する領域にわたって、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは１００％同一であるヌクレオチド配列から導かれるデンプン分解タンパク質が含まれる。また、これには、これらのデンプン分解タンパク質に十分に類似しているか、あるいは、自体既知の方法によって導くことができるタンパク質分解酵素も含まれる。好ましい代表例は、微生物から、より具体的にはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のグラム陽性細菌から、特にバシラス種Ａ７−７から、より具体的にはバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）から天然に単離することができる。
【００２０】
本発明の第２の態様は、デンプン分解タンパク質をコードする核酸であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と、より具体的には配列番号２のアミノ酸３２〜５１６に対応する領域にわたって、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは１００％同一である核酸である。これには、好ましくは本発明の第１の態様の特定のタンパク質をコードする核酸が対応して含まれる。
【００２１】
本発明の第３の態様は、第１の態様のタンパク質または誘導体を生成するか、あるいは、該タンパク質または誘導体をコードする核酸を含有する天然の生物である。特に好ましい態様は、ＤＳＭ名称（１２３６８）のもとで寄託されているバシラス種Ａ７−７の菌株である。
【００２２】
本発明の第４の態様は、第２の態様の核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換した宿主細胞、ならびに、本発明の第１の態様のタンパク質または誘導体を製造するためのあらゆるバイオテクノロジーによる方法である。
【００２３】
本発明の第５の態様は、第１の態様のタンパク質または誘導体を含有することを特徴とする洗剤／クリーナーである。これには、好ましくは、デンプン分解タンパク質または誘導体を０．０００００１〜５重量％、より具体的には０．００００１〜３重量％の量で含有する洗剤／クリーナーであって、自体既知の供給形態で存在する他の酵素を含有するか、あるいは、デンプン分解活性が洗剤／クリーナーの成分を放出させるための機能を発揮するかまたはそれ自体が制御されている洗剤／クリーナーが含まれる。
【００２４】
本発明の第６の態様は、織物または硬表面を清浄化するための方法であって、第１の態様のデンプン分解タンパク質または誘導体が少なくとも１つの工程において活性になることを特徴とする方法である。第５の態様の洗剤／クリーナーをこの目的に使用するのが好ましく、デンプン分解タンパク質または誘導体を、好ましくは適用あたり０．０１〜２００ｍｇの量で、より具体的には特定の工程における適用あたり０．０２〜１００ｍｇの量で使用する。
【００２５】
本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様のタンパク質または誘導体あるいは本発明の第５の態様の洗剤／クリーナーの対応する可能性ある適用であって、織物または硬表面を清浄化するため、あるいは、対応する洗剤／クリーナーの成分を放出させるための適用である。デンプン分解タンパク質または誘導体は、食器洗浄機または洗浄機における適用あたり、好ましくは０．０１〜２００ｍｇ、より具体的には０．０２〜１００ｍｇの量で使用する。
【００２６】
本発明の第８の態様は、見い出されたα−アミラーゼのさらに可能性ある工業的使用である。これには、デンプン液化のため、より具体的にはエタノール製造のための方法、一時的に結合する方法および種々の可能性ある応用、より具体的には織物製造における粗原料または中間生成物を処理するため、より具体的には綿の糊抜きをするため、直鎖および／または短鎖オリゴ糖の製造のため、シクロデキストリンの加水分解のため、多糖担体またはシクロデキストリンからの低分子量化合物の放出のため、食品および／または食品成分の製造のため、動物飼料および／または動物飼料成分の製造のため、ならびに、デンプン含有の接着結合の溶解のための方法および応用が含まれる。
【００２７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明におけるタンパク質とは、天然アミノ酸から構成される実質的に直鎖のポリマーであり、その機能を発揮するために通常は３次元構造をとる。本明細書においては、１９個のタンパク質形成性の天然Ｌ−アミノ酸が、国際的に受け入れられている１文字および３文字コードによって示されている。
【００２８】
本発明における酵素とは、ある種の生化学機能を発揮するタンパク質である。デンプン分解タンパク質またはデンプン分解機能を有する酵素とは、多糖のα−１，４−グリコシド結合、より具体的には多糖中に存在する該結合を加水分解するものと解される。従って、これらは、α−１，４−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）とも称される。
【００２９】
多くのタンパク質が、いわゆるプレタンパク質として、即ち、シグナルペプチドを伴って形成される。これは、タンパク質のＮ−末端部分を意味し、その機能は、通常、産生細胞から細胞周辺または周囲培地への生成タンパク質の放出および／またはその正しい折畳みを保証することである。次いで、このシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼにより天然条件下でタンパク質の残りから切り離されるので、その実際の触媒活性は、最初に存在したＮ−末端なしで発揮される。バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からの天然のα−アミラーゼは、例えば、配列番号２に示されるように、５１６個のアミノ酸の長さである。配列番号１に示されるように、この酵素のシグナルペプチドは、３１個のアミノ酸からなるので、成熟酵素は４８５個のアミノ酸の長さを有する。
【００３０】
その酵素活性のゆえに、成熟ペプチド（即ち、その産生後にプロセッシングを受けた酵素）が、工業的応用のためにはプレタンパク質よりも好ましい。
プロタンパク質は、タンパク質の不活性前駆体である。シグナル配列を有するこれらの前駆体は、プレプロタンパク質として知られている。
【００３１】
本発明において、核酸とは、ヌクレオチドから天然に構成される分子であり、情報担持体として働き、タンパク質または酵素における直鎖アミノ酸配列をコードしている。これらは、１本鎖として、該１本鎖に相補性の１本鎖として、または２本鎖として存在することができる。天然のより永久的な情報担持体として、核酸ＤＮＡが分子生物学的研究のために好ましい。対照的に、天然環境（例えば発現細胞）において本発明を実施するためには、ＲＮＡが生成されるので、本発明に必須であるＲＮＡ分子も、本発明の態様である。
【００３２】
ＤＮＡを用いて、３つ全ての読み枠における両相補鎖の配列を考慮しなければならない。考慮すべき別の因子は、異なるコドントリプレットが同じアミノ酸をコードしうるので、あるアミノ酸配列を、いくつかの異なるヌクレオチド配列（最少の同一性のみを有することもある）から導きうることである（遺伝コードの縮重）。さらに、異なる生物は、このコドンの使用における相違を示す。これらの理由から、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の両方を、保護範囲の考慮に含ませなければならず、また、開示したヌクレオチド配列を、あるアミノ酸配列をコードする単なる例とみなすべきである。
【００３３】
また、あるタンパク質に対応する情報の単位も、本明細書においては遺伝子と称する。
【００３４】
現在広く知られている方法の助けを借りて、例えば化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを、分子生物学的および／またはタンパク質化学的な標準法と組合わせて、当業者なら、既知のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列に基づいて、全遺伝子までおよび全遺伝子を含む対応する核酸を製造することができる。このような方法は、例えば、「Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ」［Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９９９、Ｖｏｌ．１、ｐ．２６７−２７１ および Ｖｏｌ．２、ｐ．２２７−２２９］から既知である。
【００３５】
ヌクレオチド配列の変更、例えば自体既知の分子生物学的方法によって生成させることができる変更は、突然変異と称される。変更の種類に依存して、突然変異は、例えば、欠失、挿入または置換突然変異あるいは種々の遺伝子または遺伝子の一部が一緒に融合された突然変異（「シャッフル」）として知られている。これらは遺伝子突然変異である。これに関連する生物は突然変異体として知られている。突然変異させた核酸から導かれるタンパク質は、変異体と称される。例えば、欠失、挿入または置換突然変異あるいは融合は、欠失−、挿入−、置換−突然変異したかまたは融合した遺伝子を導き、タンパク質レベルでは、対応する欠失、挿入または置換変異体あるいは融合タンパク質を導く。
【００３６】
フラグメントとは、天然タンパク質または完全に翻訳された遺伝子に対応するものよりも小さく、例えば合成によっても得ることができるあらゆるタンパク質またはペプチドであると解される。そのアミノ酸配列に基づいて、これらを、特定の完全タンパク質に割当てることができる。例えば、これらは同じ構造を有することができるか、またはタンパク質分解活性または部分活性（例えば、基質の複合化など）を発揮することができる。出発タンパク質のフラグメントおよび欠失変異体は、基本的には同一である。フラグメントは比較的小さな断片であるが、欠失突然変異体は短い領域のみを欠いており、従って個々の部分的な機能のみを欠いている。
【００３７】
本発明において、キメラまたはハイブリッドタンパク質とは、同じ生物または異なる生物に由来する異なるポリペプチド鎖から天然に得られる要素から構成されるタンパク質である。この操作は、シャッフルまたは融合突然変異誘発としても知られている。このような融合の目的は、例えば、タンパク質の融合した部分の助けを借りて、ある種の酵素機能を生成させるかまたは修飾することであってよい。
【００３８】
挿入突然変異によって得られるタンパク質は、自体既知の方法により、出発配列への核酸またはタンパク質フラグメントの挿入によって得られた変異体であると解される。これらは基本的に同一であるので、これらをキメラタンパク質に割当てることができる（キメラタンパク質とは、タンパク質の未変更部分と全タンパク質のサイズのサイズ比においてのみ異なっている）。挿入突然変異させたタンパク質においては、外来タンパク質の割合がキメラタンパク質の場合よりも少ない。
【００３９】
逆転突然変異誘発（即ち、部分的な配列逆転）は、欠失と挿入の両方の特別の形態であるとみなすことができる。同じことが、元のアミノ酸配列とは異なる分子の種々の部位の再編成に当てはまる。これらは、元のタンパク質の欠失変異体、挿入変異体およびシャッフル変異体とみなすことができる。
【００４０】
本発明における誘導体とは、純粋なアミノ酸鎖が化学的に修飾されているタンパク質である。このような誘導体化は、例えば、宿主生物によるタンパク質生合成と関連させて生物学的に行うことができる。この目的に、分子生物学的方法を使用することができる。また、これを、例えば、アミノ酸側鎖の化学的変換により、またはタンパク質への別の化合物の共有結合により、化学的に行うこともできる。この化合物は、例えば、２官能の化学的化合物により、本発明のタンパク質に結合した別のタンパク質であってよい。また、誘導体化は、巨大分子担体への共有結合を包含するものと解される。
【００４１】
本発明においては、全ての酵素、タンパク質、フラグメントおよび誘導体が、タンパク質の総称のもとに分類される（これらが、明らかな言及を必要としないとき）。
【００４２】
本発明におけるベクターとは、興味ある遺伝子を特徴的な核酸領域として含有する核酸からなる要素であると解される。これらは、種またはセルラインにおいて、いくつかの世代または細胞分裂にわたり、ゲノムの残りとは独立して複製する安定な遺伝要素として、これを確立することができる。ベクターは、特にそれが細菌において使用されるときには、特別のプラスミド、即ち環状の遺伝要素である。遺伝子工学においては、一方において、保存のため、従って言わば遺伝研究のために使用されるベクター（いわゆるクローニングベクター）、ならびに、他方において、宿主細胞において興味ある遺伝子を産生させる（即ち、特定のタンパク質の発現を助ける）機能を発揮するベクターの間で区別が為される。これらのベクターは発現ベクターとして知られている。
【００４３】
例えば誰でもアクセスできるデータバンクに寄託されている既知の酵素との比較により、特徴的な分子部分（例えば、構造要素など）または研究している酵素の酵素活性を、アミノ酸またはヌクレオチド配列から推定することができる。このような比較を、研究しているタンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列中の類似配列を互いに割当てることによって行う。これは相同比較（ｈｏｍｏｌｏｇｉｚｉｎｇ）として知られている。特定位置の平面割当ては、整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）として知られている。ヌクレオチド配列の分析においては、両相補鎖および３つ全ての可能な読み枠を、遺伝コードの縮重および生物特異的なコドン利用と同様に、考慮に入れなければならない。整列は、現在ではコンピュータープログラムによって、例えばＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる。この操作は、例えば、Ｄ．Ｊ．ＬｉｐｍａｎおよびＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ［Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２２７、ｐ．１４３５−１４４１ （１９８５）］により記載されている。比較した配列において一致した全位置の集成物は、コンセンサス配列として知られている。
【００４４】
また、このような比較は、互いに比較した配列の類似性または相同性に関する情報を与える。これは、同一性率（％）、即ち、同じ位置における同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合で表される。より広く規定された相同性の概念には、この値における保存アミノ酸交換が含まれる。このとき、同一性率（％）は類似性率（％）になる。このような断言は、全タンパク質または遺伝子について、あるいは個々の領域のみについて行うことができる。
【００４５】
異なるタンパク質の相同領域は、通常は同じ構造要素および／または機能（一次アミノ酸配列における一致によって認識することができる）を有する領域である。それは、わずか数個のアミノ酸からなり、通常は全体活性のための必須の機能を発揮する、非常に小さい領域（いわゆるボックス）における完全な同一性に及んでいる。この相同領域の機能とは、タンパク質全体によって発揮される機能の非常に小さい部分的機能、例えば、遷移複合体または基質の複合化のための個々の水素架橋結合の形成などを意味する。
【００４６】
酵素活性を、実際の反応に関与しないタンパク質の他の領域により、定性的または定量的に修飾することができる。これは、例えば、酵素の安定性、活性、反応条件または基質特異性に関連する。
【００４７】
従って、本発明のデンプン分解タンパク質の定義は、α−１，４−グリコシド結合の加水分解（可能性の高い触媒活性中心の数個のアミノ酸残基に起因すると考えられる）を行う純粋な機能を有するものだけに当てはまるものではない。それは、α−１，４−グリコシド結合の加水分解を支える全ての機能をも包含する。このような機能は、例えば、タンパク質の１またはそれ以上の個々の部分により、および個々のペプチドにより、実際の触媒活性領域に作用することによって発揮されうる。デンプン分解機能の定義は、このような修飾機能単独をも包含する。これは、一方において、本発明のタンパク質のどのアミノ酸残基が実際に加水分解を触媒するのかが正確に知られておらず、また他方において、ある種の個々の機能を最初から触媒作用における関与から明確に排除することができないためである。補助機能または部分活性には、例えば、基質、中間または最終生成物の結合、加水分解活性に対する制御作用の付与または抑制または活性化が含まれる。また、これには、例えば、活性中心から遠くに存在する構造要素またはシグナルペプチド（その機能は、生成したタンパク質の細胞からの放出に関係する）の形成および／またはその正しい折畳みが含まれ、これらがなければ、通常、機能しうる酵素はインビボで形成されない。しかし全体として、デンプンまたはデンプン様ポリマーのα−１，４−グリコシド結合が加水分解されなければならない。
【００４８】
酵素の性能とは、考慮下の技術分野におけるその有効性であると解される。これは、実際の酵素活性に基づくが、同時に、特定の過程に関連する他の因子にも依存する。これらには、例えば、安定性、基質結合、基質を担持する物質との相互作用あるいは他の成分との相互作用（より具体的には相乗作用）が含まれる。例えば、ある酵素が洗剤において使用するのに適するか否かの考慮には、他の構成成分と共に配合された洗剤またはクリーナーの洗浄または清浄化性能に対するその寄与の評価も含まれるであろう。酵素を、自体既知の分子生物学的方法、より具体的には上記の方法を用いて、種々の技術的応用のために、さらに開発および最適化することができる。
【００４９】
１９７７年４月２８日の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約のもとで、微生物：バシラス種Ａ７−７を、本発明のために、ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ 微生物 ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ）に寄託した。この微生物は、受託番号ＤＳＭ１２３６８（ＤＳＭ９８−５８７）を保持している。この生物学的材料の特徴に関する重要データ（寄託日にＤＳＭＺにより測定）を、以下の表１および表２に示す。
【００５０】
【表１】
2004504837.tif 000002
【００５１】
【表２】
2004504837.tif 000003
【００５２】
ここに驚くべきことに、この特性化に加えて、この菌株によって産生されるデンプン分解酵素が、多くの工業的過程における使用を運命づける性質を有することを見い出した。さらに、この菌株は、培養性に好ましい影響を与える性質を有する。
【００５３】
実施例２に詳しく示すように、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）菌株の本発明のデンプン分解酵素を、次のように生化学的に特性化することができる。成熟タンパク質として、それは、変性ＳＤＳポリアクリレートゲル電気泳動において見掛け分子量 ５８ｋＤを有し、一方、分子量 約５９ｋＤを、５１６個のアミノ酸のタンパク質配列（配列番号２）から導くことができ、分子量 ５５．５ｋＤを、３１個のアミノ酸からなるシグナルペプチドの除去後に導くことができる。等電点電気泳動によれば、成熟タンパク質の等電点は６．０である。これはデンプン分解活性を有する。これは、ｐＨ１０／５０℃での１０分間のインキュベートに対して安定である。５０％の残留活性が６０℃で観察される。この酵素は、４０℃／ｐＨ５〜１２での１０分間のインキュベートに対してほぼ安定であり、最良の安定性がｐＨ９で観察される。０．１％ＳＤＳの存在下に、この酵素は、ｐＨ１０／５０℃での１５分間のインキュベート後に９８％の残留活性を示す。追加の１０ＨＰＥ／ｍｌプロテアーゼ活性の存在下およびｐＨ１０／５０℃での１５分間のインキュベート後に、この酵素は７４％の残留活性をなお有する。
【００５４】
従って、本発明は天然の酵素を提供するものであり、この酵素は、これまで既知の酵素に対するその配列相同性およびその酵素活性の強さにおいてα−アミラーゼとみなされなければならない。原則的に、これは、デンプン分解機能を必要とするあらゆる用途に使用することができる。これは、アルカリ性ｐＨ値および中程度の温度範囲（より具体的には、９を越えるｐＨ値および／または４０℃を越える温度）を含む用途に特に適する。この用途スペクトルは、洗剤およびプロテアーゼに対する酵素の比較的高い安定性によって広がる。従って、これは、洗剤／クリーナーにおいて使用するのに特に適するようである。
【００５５】
この酵素のヌクレオチド配列を、配列番号１の配列プロトコールに示す。従って、例えば、自体既知の分子生物学的方法を用いるさらなる開発のために、これを利用することができる。酵素のアミノ酸配列を、配列番号２の配列プロトコールに示す。
【００５６】
また、同等のデンプン分解タンパク質も本発明の態様であり、それらが、配列番号１および／または配列番号２に示される配列に類似する範囲内にあるタンパク質またはＤＮＡ配列を有している限り、本発明に含まれる。この類似性の範囲には、アミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％または１００％同一である全てのタンパク質が含まれる。また、この類似性の範囲には、ヌクレオチド配列が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である全てのタンパク質も含まれる。これは、特に、アミノ酸３２〜５１６位に関係するタンパク質の部分的範囲に当てはまる。
【００５７】
２０００年３月１７日に既知である最も近い類似タンパク質は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンク［Ｇｅｎｅｖａ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （ＧｅｎｅＢｉｏ） Ｓ．Ａ．、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｓｐｒｏｔ．ｈｔｍｌ］において登録番号Ｐ１９５７１を有するバシラス・アルカロフィラスからのα−アミラーゼである。このタンパク質は、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からの本発明のデンプン分解酵素に対して、タンパク質レベルで９３．４％同一の配列相同性を有する。本発明のタンパク質は、その相同領域により、明らかにα−アミラーゼと特徴付けられる。代表的な関連タンパク質を、図１に整列させて示す。
【００５８】
この整列に基づいて、ほぼ同一の二次および三次構造を、相同比較に用いたタンパク質に対すると同様に、本発明のタンパク質に対して仮定することができる。その構造要素を、誰でもアクセスできるデータバンク［例えば、ＥＭＢＬ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＥＢＩ）、ケンブリッジ、英国（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔまたはＧｅｎＢａｎｋ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）］から検索することができる。異なる構造が現れたとき、または、異なるデンプン分解特性を有する種々の折畳み変異体が存在することがわかったときには、例えば最適反応条件または基質特異性に関する限り、これらは全て本発明の保護の範囲内に含まれる。これは、第１には、折畳みが、例えばリーダーペプチドの存在下または不存在下で産生条件に依存することがあるためである。第２には、これらの変異体が、種々の可能性ある用途に対して、例えばデンプンの定量的液化に対して、シクロデキストリンの加水分解に対して、または洗剤／クリーナーにおける使用に対して特に適することがあるためである。
【００５９】
配列番号２で示される配列のアミノ酸３２〜５１６位に対応する部分配列が特に重要である。これは、アミノ酸配列から結論することができるように、最初の３１個のアミノ酸がシグナルペプチド（対応する微生物における産生において、恐らくは細胞内部から細胞周囲の培地へのタンパク質の放出を開始する）を表すためである。この放出の後、このシグナルペプチドはインビボで切り離されて、実際のデンプン分解活性がタンパク質の残りの部分によって発揮される。
【００６０】
従って、実際のデンプン分解機能のためには、アミノ酸１〜３１位は、恐らくはあまり重要ではなく、産生のためおよび特に所望の折畳みのために重要である。このため、これらを本発明の保護の範囲から排除することはできない。
【００６１】
例えば、ある細菌株または他の細菌株による産生中に、シグナルペプチドおよび／または成熟タンパク質の長さの変異が存在することがわかったときには、配列番号２の１〜３１位または３２〜５１６位に関連する特許請求の範囲は、それに応じて、対応する変異体に当てはまる。例えば、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのタンパク質の遷移体は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の前に、６個程度のヌクレオチドを使用することができる。この可能性の高い冒頭部の前に、６個のヌクレオチド ＡＴＧ ＡＣＧ が存在する。これらはＭｅｔ−Ｔｈｒとして翻訳されうるので、シグナルペプチドは２個のアミノ酸によってＮ−末端が長くなっており、図１の番号２で示されるバシラス種＃７０７からのアミラーゼに対してある種の類似性が得られる。また、このシグナルペプチドの切り離しが変異を導く。
【００６２】
上記の類似性の範囲内にある変異体の中で、意図する可能性ある用途に対して最適の性質を有する変異体が特に好ましい。冒頭に説明したように、このような変異体は、自体既知の方法、好ましくは分子生物学的方法によって製造することができる。例えば、ＷＯ９４／１８３１４の教示に従って、本発明のタンパク質のメチオニン、トリプトファン、システインおよび／またはチロシン残基を削除および／またはこれらを容易に酸化されないアミノ酸残基で置換することもできる。このようにして、酸化安定性、ｐＨ活性プロフィールおよび／または熱安定性を改善することができる。また、例えばＷＯ９９／０９１８３およびＷＯ９９／２３２１１に従って、ポイント突然変異誘発によるさらなる開発を行うこともできる。
【００６３】
本発明のフラグメントとは、配列番号１または配列番号２のタンパク質に対応するタンパク質よりも小さいが、その対応する部分配列においてそれらと十分に相同である、あらゆるタンパク質またはペプチドであると解される。これらが、デンプン分解機能または少なくともα−１，４−グリコシド結合の加水分解を助ける機能を発揮するときには、これらはデンプン分解活性フラグメントとみなされ、本発明の態様を表す。このことは、例えば、基質の複合化または加水分解に必要な構造要素の形成に寄与するフラグメントに当てはまる。このフラグメントは、例えば、個々のドメインまたは該ドメインと一致しないフラグメントであってよい。このようなフラグメントは、比較的安価に製造することができるか、出発分子のある種の恐らくは好ましくない特徴（例えば、活性を低下させる調節機序）をもはや持たないか、あるいは、より好ましい活性プロフィールを現すことができる。また、このようなタンパク質フラグメントは、例えば生合成によるよりもむしろ化学的に製造することができる。例えば、合成後に化学的修飾を行うときには、化学合成が有利になりうる。
【００６４】
その基本的な類似性のゆえに、欠失突然変異によって得られるタンパク質も、フラグメントに分類することができる。このようなタンパク質は、生化学的に出発分子にほぼ対応しているか、または、もはや個々の機能を持たないものであってよい。これは、例えば抑制領域の削除において、特に適切であるようである。最終的な分析において、この欠失をタンパク質の応用範囲の拡大または特殊化の両方に使用することができる。最も広い意味でのデンプン分解機能が、このようにして最初の位置において維持され、修飾され、特異化され、あるいは達成されるときには、この欠失変異体およびフラグメントは本発明のタンパク質である。これに関連する唯一の追加の要件は、なお存在している相同な部分配列に加えて、これらが、配列番号１および配列番号２の配列に対して上記の類似性の範囲内にあることである。
【００６５】
例えば、ＷＯ９９／５７２５０に従って、ペプチドまたは非ペプチドリンカーを介して他のタンパク質に由来する結合ドメインを有する本発明のタンパク質またはその部分を供することができ、従って、基質の加水分解をより効果的にすることができる。このような構築物は、これらがデンプン分解活性を発揮し、この機能を発揮する構築物の部分が、本発明に従う上記配列に十分に類似しているときに、本発明の保護の範囲内にある。同様に、本発明のデンプン分解タンパク質を、例えばプロテアーゼに結合して、二重の機能を発揮させることができる。
【００６６】
また、Ｎ−末端アミノ酸の切り離しによってプレタンパク質から得られるタンパク質およびシグナルペプチドも、天然に形成されるフラグメントまたは欠失突然変異したタンパク質とみなすことができる。また、このような切り離し機序を、シグナルペプチダーゼによって認識されるある種の配列領域の助けを借りて、組換えタンパク質中の特異的な切断部位を予め決定するために使用することもできる。このように、本発明のタンパク質をインビトロで活性化および／または不活性化することができる。本発明の保護の範囲は、これらタンパク質のそれぞれを包含する（それが、本発明の保護の範囲内にあり、デンプン分解活性を付与するとき）。
【００６７】
本発明のキメラまたはハイブリッドタンパク質とは、種々のポリペプチド鎖から天然に生じる要素から構成されるタンパク質であると解される。この操作は、シャッフルまたは融合突然変異誘発としても知られている。融合によって得られるタンパク質が、最も広い意味でデンプン分解活性を有するときに、タンパク質は本発明のキメラタンパク質である。本発明のタンパク質から導かれ、本発明の類似性の範囲にある分子の一部により、これを開発または修飾することができる。このような融合の目的は、例えば、本発明のタンパク質の融合部分の助けを借りて、デンプン分解機能またはα−１，４−グリコシド結合の加水分解を助ける機能を創製または修飾することであってよい。本発明においては、このようなキメラタンパク質が、単一のポリペプチド鎖またはいくつかのサブユニット（その中に種々の機能を分布させることができる）からなるかどうかは問題ではない。この第２の態様を実現するために、例えば、翻訳後または精製工程後に、制御されたタンパク質分解切断によって、単一のキメラポリペプチド鎖をいくつかに切断することができる。また、本発明は、キメラタンパク質の構築のゆえに、本発明の類似性の範囲について上に定義したものよりも、全アミノ酸および／またはヌクレオチド配列にわたって、場合により低い同一性を有するが、融合によって導入された少なくとも１つの領域において本発明の類似性の範囲に割当てることができ、この部分において、全長さにわたって上記の相同性の範囲内にあるアミラーゼと同じ機能を発揮するキメラタンパク質に関する。
【００６８】
挿入突然変異によって得られる本発明のタンパク質は、全配列長さにわたり、配列番号１または配列番号２の配列の上記の保護範囲内にあり、それぞれの配列への核酸またはタンパク質フラグメントの挿入によって得られたタンパク質の変異体である。ハイブリッド形成の場合と同様に、挿入突然変異誘発の目的は、本発明のタンパク質の個々の性質を、他のタンパク質の性質と組み合わせることである。相同性により配列番号１または配列番号２の配列に帰される領域が、対応する相同性の値を有しており、タンパク質が、この領域のゆえに最も広い意味でデンプン分解機能を有しているときに、タンパク質は、キメラタンパク質または挿入突然変異によって得られる本発明のタンパク質である。
【００６９】
従って、逆転突然変異誘発によって得られるタンパク質ならびに元のアミノ酸配列とは異なる分子の種々の部位の再編成を有するタンパク質は、本発明の保護の範囲内に含まれる。これは、元のタンパク質の欠失変異体、挿入変異体またはシャッフル変異体とみなすことができる。
【００７０】
本発明のデンプン分解活性誘導体は、例えば、宿主生物によるプロセッシングによりタンパク質性合成に関連して、または化学的に、例えばアミノ酸側鎖の転換によって、またはタンパク質への別の化合物の共有結合によって修飾されたデンプン分解タンパク質であると解される。この化合物は、例えば２官能の化学的化合物によって本発明のタンパク質に結合した他のタンパク質からなることができる。このような修飾は、例えば、基質特異性または基質に結合する強さに影響を与えることができるか、あるいは、結合させた物質が抑制剤であるときには酵素活性を一時的にブロックすることができる。これは、例えば、貯蔵期間のためには適切であろう。別の態様は、巨大分子担体（例えば、ポリエチレングリコールまたは多糖など）への共有結合によって得られた誘導体である。
【００７１】
本発明が指向する課題に対する他の解決は、上記のタンパク質または誘導体の１つと共通する少なくとも１つの抗原決定基を有するデンプン分解タンパク質または誘導体である。
【００７２】
これは、酵素活性の出現は、タンパク質の純粋なアミノ酸配列によってのみ決定的に決まるのではなく、その二次構造要素およびその３次元折畳みによっても決定されるためである。従って、一次構造が互いに明らかに異なるドメインが、空間的に実質的に一致する構造を形成することができ、こうして同じ酵素挙動を与えることができる。このような二次構造における共通の特徴は、通常は、抗血清または純粋なもしくはモノクローナル抗体の対応する抗原決定基として認識される。従って、構造的に類似するタンパク質または誘導体は、免疫化学的交差反応によって検出および割当てすることができる。
【００７３】
従って、本発明の保護の範囲は、デンプン分解活性を持ち、免疫化学的関係により上記定義の本発明のタンパク質または誘導体に割当てすることができるが、一次構造における相同性値によってはそれができないタンパク質または誘導体をも包含する。
【００７４】
天然供給源から得られる本発明のタンパク質は、特にそれらが単細胞菌類または細菌などの微生物から得られるときに、好ましい本発明の態様である。これは、このような微生物が、多細胞生物またはそれから導かれる細胞培養物よりも取扱いが容易であるためである。これらは、特別の態様の適切な任意選択事項である。
【００７５】
グラム陽性細菌からの本発明のタンパク質または誘導体が、特に好ましい。これは、これらが外部膜を持たず、従って分泌されたタンパク質を周囲培地に直接放出するためである。
【００７６】
バシラス属のグラム陽性細菌からの本発明のタンパク質または誘導体が、最も好ましい。これは、これらが工業的方法において特に高い産生性能を有する産生生物として確立されているためである。
【００７７】
バシラス種からの本発明のタンパク質または誘導体の中で、好アルカリ性バシラスからのものが好ましく、バシラス種Ａ７−７からのものが特に好ましく、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）菌株からのものが最も好ましい。これは、本発明の酵素の態様（その関連配列が配列プロトコールに示され、その酵素特性が実施例に記載されている）が該菌株から初めて得られたためである。
生成したデンプン分解タンパク質をその周囲培地に放出する菌株が、製造の理由から好ましい。
【００７８】
天然の産生体は本発明のデンプン分解酵素を産生することができるが、最初に決めた条件下で、これら産生体が酵素を産生するだけおよび／または酵素を周囲培地に最少量で放出するだけにすることができる。これらは、適当な周囲条件または低分子量または他の因子（これらの影響下に、経済的利用を適切なものにするレベルで、本発明のタンパク質を産生するように産生体を刺激することができる）を実験的に決定することができる限り、なお本発明の保護の範囲内にある。このような調節機序を、バイオテクノロジーによる製造のため、例えば応答性プロモーターを調節するために、目的を持って使用することができる。
【００７９】
その単離、後処理または調製に依存して、タンパク質を、種々の他の物質と結合させることができる（特に、それを、タンパク質の天然産生体から回収したとき）。次いで、または独立して、ある種の他の物質をそれに目的を持って付加して、例えばその貯蔵安定性を増大させることができる。従って、本発明のタンパク質の定義には、本発明に必須である実際のタンパク質の全ての調製物も含まれる。また、このことは、この酵素活性がある種の調製物において実際に出現するか否かとは無関係である。これは、タンパク質が、貯蔵時に活性を持たないかまたはわずかしか持たす、その使用時にデンプン分解活性を出現させるのが望ましいことがあるためである。これは、例えばタンパク質の折畳み状態に依存することができるか、あるいは、該調製または別の制御機序からの１またはそれ以上のコンパニオン物質の可逆的結合に起因することができる。
【００８０】
本発明のタンパク質（特に貯蔵時）を、例えば物理的影響、酸化またはタンパク質分解切断による、例えば変性、分解または不活性化に対して、安定剤により保護することができる。微生物から得られるタンパク質の場合には、タンパク質加水分解の抑制が特に重要である。これは、ほとんどの微生物が種々のプロテアーゼを消化性酵素として周囲培地に分泌するためである。このような酵素は、その後の精製工程中に、所望のタンパク質に重大な損傷を与えることができる。
【００８１】
安定剤の１つの群は、可逆性プロテアーゼ阻害剤、例えばベンズアミジン塩酸塩およびロイペプチン、ホウ砂、ホウ酸、ホウ素酸、その塩またはエステル、ペプチドアルデヒドまたは純粋なペプチド性抑制剤、例えばオボムコイドまたは特異的なスブチリシン抑制剤である。他の通常の酵素安定剤は、アミノアルコール、例えばモノ−、ジ−、トリ−エタノールアミンおよびプロパノールアミン、Ｃ１２までの脂肪族カルボン酸、ジカルボン酸、低級脂肪アルコール、特にポリオール、例えばグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはソルビトールである。また、カルシウム塩、例えば酢酸カルシウムまたはギ酸カルシウム、マグネシウム塩、種々のポリマー、例えばリグニン、セルロースエーテル、ポリアミドまたは水溶性ビニルコポリマーを用いて、特に物理的影響またはｐＨ変動に対して、酵素調製を安定化する。還元剤および酸化防止剤、例えば亜硫酸ナトリウムまたは還元糖は、酸化分解に対するタンパク質の安定性を増大させる。
【００８２】
また、本発明は、対応する核酸が、最も広い意味でデンプン分解タンパク質をコードし、配列番号１の配列に対して、より具体的には配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸３２〜５１６位の部分領域に対応するタンパク質をコードする核酸において、上記定義の十分な類似性を示すならば、該対応する核酸をその態様とするものである。
【００８３】
特に好ましい態様は、上記の本発明のデンプン分解タンパク質のいずれかをコードする核酸である。また、これには、全配列長さにわたっては配列番号１に規定される類似性の範囲内にはないが、個々の領域において類似性の範囲内にある変異体も含まれる。これらには、例えば、上で説明したように、挿入または欠失突然変異、キメラタンパク質またはタンパク質フラグメントによって得られたヌクレオチド配列が含まれる。しかし、いわゆるアンチセンス構築物（例えば、個々の部分セクションによる）も、これらをデンプン分解活性を調節するために使用することができるので、本発明の態様である。
【００８４】
核酸は、分子生物学的研究およびさらなる開発のための出発点を構成する。このような方法は、例えば、Ｆｒｉｔｓｃｈ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓのマニュアル「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」［Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９］に記載されている。また、従来技術においてタンパク質工学の項目のもとに入る全ての遺伝子工学およびタンパク質−生化学的方法が、遺伝子、特にクローンされた遺伝子に基づいている。本発明のタンパク質を、このような方法によって、例えばポイント突然変異誘発によって、または他の遺伝子に由来する配列との融合によって、種々の用途に対してさらに最適化することができる。
【００８５】
自体既知の分子生物学的方法によって得られるタンパク質の本発明の変異体には、特に、個々の特異的なアミノ酸交換またはランダム化ポイント突然変異、個々のアミノ酸または部分配列の削除、他のフラグメントまたは他の酵素との融合、挿入または逆転（即ち、部分配列の逆転）を含むものが包含される。このような突然変異または修飾は、特定の用途のための好ましい態様であることができる。このような突然変異誘発を、目的を持ってまたはランダム法によって行うことができる。これを、例えば、クローンされた遺伝子に対するその後の活性指向性のスクリーニングおよび選択法と組合わせることができる。突然変異によって得られる遺伝子は、これらが、最も広い意味でデンプン分解タンパク質をコードし、少なくとも相同性および機能的に関連する領域において、上記の類似性の範囲内にあるならば、本発明の保護の範囲内にある。
【００８６】
本発明が指向する課題に対する別の解決、従って本発明の別の態様は、本発明のタンパク質または誘導体を天然に生成するか、あるいは、本発明のタンパク質または誘導体をコードする核酸を含有する生物である。これは、その発見が、本発明のコンセプトの実施を可能にするためである。このような生物は、広く知られている方法によって、例えば天然の生育環境から菌株を単離することによって、または遺伝子バンクのスクリーニングによって得ることができる。配列番号１で示されるヌクレオチド配列を、例えば、スクリーニングプローブとして、または対応するＰＣＲプライマーの構築のための原型として使用することができる。同様に、配列番号２のアミノ酸配列を有する短鎖または完全ペプチドを用いて、対応する抗血清を生成させることができ、これを用いて、対応する生物またはそれから放出されるタンパク質を同定することができる。
【００８７】
上記の観察によれば、微生物、好ましくは細菌、特にグラム陽性細菌［バシラス属、より具体的にはバシラス種Ａ７−７、最も具体的にはバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）の細菌を含む］が、特にその培養性のゆえに好ましい。
【００８８】
本発明の別の態様は、第２の態様の核酸領域のいずれかを含有するベクターである。
これは、核酸を使用するために、ＤＮＡがベクター中に適切にクローン化されるためである。このようなベクターには、例えば、細菌プラスミドから、ウイルスから、あるいは、バクテリオファージまたは多くが合成のベクターまたはプラスミド（種々起源の要素を含む）から導かれるベクターが含まれる。存在する他の遺伝要素と共に、ベクターを、数世代にわたりそれぞれの宿主細胞において安定なユニットとして確立することができる。本発明においては、これらが、独立したユニットとして染色体外に確立されるか、あるいは、染色体中に組込まれるかは重要ではない。従来技術から既知である多くの系のどれを選択するかは、特定の個々の場合に依存するであろう。これに関連する重要因子には、例えば、可能なコピー数、利用可能な選択系（特に、抗生物質に対する耐性を含む）、ならびに、ベクターを収容しうる宿主細胞の培養性が含まれる。
【００８９】
これらベクターは、特定遺伝子または関連タンパク質の分子生物学的および生化学的研究のため、本発明に係るさらなる開発のため、ならびに、最終的に本発明のタンパク質の増幅および製造のための適当な出発点を構成する。これらは、存在する本発明の核酸領域の配列が、上に詳しく定義した相同性の範囲内にある限り、本発明の態様である。
【００９０】
本発明の好ましい態様はクローニングベクターである。貯蔵、生物学的増幅および目的遺伝子の選択に加えて、クローニングベクターは、例えば制限地図の作成または配列決定により、特定遺伝子の特徴付けに適する。また、クローニングベクターは、これらが本発明のＤＮＡの輸送可能および貯蔵可能な形態であるので、本発明の好ましい態様である。また、これらは、細胞に制限されない分子生物学的方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）のための好ましい出発点である。
【００９１】
発現ベクターは、タンパク質産生のために最適化した宿主生物において複製することができ、宿主生物中に存在する遺伝子を発現することができる部分配列を有する。好ましい態様は、発現に必要な遺伝要素をそれ自体で保持する発現ベクターである。発現は、例えば、遺伝子の転写を調節するプロモーターによって影響を受ける。即ち、遺伝子の前に元来位置する天然プロモーターによって、また遺伝子操作融合の後に、発現ベクターに供される宿主細胞のプロモーターによって、および修飾されたプロモーターまたは別生物の全く異なるプロモーターによって、発現が起こりうる。
【００９２】
本発明の好ましい態様は、培養条件の変化またはある種の化合物の添加（例えば、細胞密度または特別の因子）によって調節することができる発現ベクターである。発現ベクターは、関連タンパク質の異種産生、即ち、該タンパク質を天然に得ることができる生物以外の生物における産生を可能にする。また、適当なベクターにより遺伝子を天然に発現する宿主生物からの同種タンパク質産生も、本発明の保護の範囲内にある。これは、翻訳に付随する天然の修飾反応を、それが天然に起こると同様に、生成したタンパク質において行いうるという利点を有することができる。
【００９３】
本発明の他の態様は、タンパク質の生合成をインビトロで完結させたときの細胞不含の発現酵素であることができる。このような発現系も、従来技術において確立されている。
【００９４】
本発明の別の態様は、上記定義のベクターのいずれか、より具体的にはクローニングまたは発現ベクターを含有する細胞でである。これは、例えばベクターの突然変異誘発、配列決定または貯蔵に必要な分子生物学的研究の過程において、それが対応する細胞に導入されるためである。方法に依存して、例えばグラム陽性細菌、しかし特にグラム陰性細菌がこの目的に適することができる。
【００９５】
別の態様は、好ましくは上に定義した種類の発現ベクターを用いて、第１の態様のタンパク質または誘導体を発現するか、あるいは、該タンパク質または誘導体の発現を刺激しうる宿主細胞である。
【００９６】
これは、本発明のデンプン分解酵素の好ましいインビボ合成が、関連遺伝子の宿主細胞中への移動を必要とするためである。適当な宿主細胞は、原則的には、あらゆる生物、即ち、原核生物、真核生物または藍藻類である。好ましい宿主細胞は、例えば発現ベクターによる形質転換およびその安定な確立に関する限り、遺伝的に取り扱いが容易である細胞、例えば単細胞菌類または細菌である。さらに、好ましい宿主細胞は、容易な微生物学的および生物工学的取扱いによって区別される。これには、例えば、容易な培養、高い増殖率、最少の発酵培地要求ならびに外来タンパク質の良好な産生および分泌率が含まれる。特定の個々の場合の最適発現系は、従来技術において利用可能な多数の異なる系から、実験的に決定しなければならないことが多い。このようにして、本発明のそれぞれのタンパク質を、多数の宿主生物から得ることができる。
【００９７】
好ましい態様は、例えば発現ベクターにおいて利用可能であり、細胞に最初から存在しうる遺伝子調節要素によって活性を調節することができる宿主細胞である。このような宿主細胞は、例えば、活性化物質として働く化学的化合物の制御された添加によって、培養条件を変化させることによって、または特定の細胞密度に到達することによって、発現を刺激することができる。これは、所望のタンパク質の極めて経済的な産生を与える。
【００９８】
この実験原理の変法は、追加の遺伝子（例えば、他のベクターにおいて利用可能になった遺伝子）が本発明のタンパク質の産生に影響を与える発現系である。これらは、修飾性遺伝子生成物または本発明のタンパク質と共に精製される生成物であってよい（例えば、そのデンプン分解機能に影響を与えるため）。これらは、例えば、他のタンパク質または酵素、抑制剤、または種々の基質との相互作用に影響を与える要素であってよい。
【００９９】
好ましい宿主細胞は原核または細菌細胞である。通常、細菌は、比較的短い世代時間および培養条件要求が少ないことによって、真核生物とは区別される。本発明のタンパク質を製造するための安価な方法を、このようにして確立することができる。
【０１００】
生成したタンパク質または誘導体を周囲培地に分泌し、従って本発明の発現されたタンパク質を直接的に精製することができる宿主細胞および特に細菌が、特に好ましい。
【０１０１】
本発明の１つの態様は、本発明のタンパク質を同種発現させるために、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）それ自体を使用する。これを、例えば、既に内生的に存在する遺伝子またはその本発明の修飾体をこれらの細胞中に、例えば複数コピーで導入した導入ベクターにより行うことができる。これは、合成後にタンパク質を、その細胞自体により行うのが適当である修飾にかけるときに特に有利になりうる。
【０１０２】
対照的に、異種発現が好ましい。グラム陽性細菌［例えば、アクチノマイセテス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）またはバシラス（ｂａｃｉｌｌｉ）］は、外部膜を有していないので、これらは、分泌されたタンパク質を直接的にその周囲培地に放出する。従って、異種発現に好ましい細菌には、バシラス属の細菌、より具体的には、バシラス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種、バシラス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）種、バシラス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種またはバシラス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）種の細菌が含まれる。
【０１０３】
また、グラム陰性細菌を異種発現に使用することもできる。この場合には、多数のタンパク質が、細胞周辺腔に、即ち細胞周囲の２つの膜の間の区画に分泌される。これは、特別の応用に対して有利になりうる。グラム陰性細菌には、例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、好ましくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種、より好ましくはエシェリキア・コリＪＭ１０９株、エシェリキア・コリＤＨ１００Ｂ株またはエシェリキア・コリＤＨ１２Ｓ株の細菌が含まれる。
【０１０４】
また、真核細胞も、本発明のデンプン分解タンパク質の製造に適する。その例には、酵母、例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。これは、例えば、タンパク質を、その合成に関連して、その系が行いうる修飾にかけるときに特に有利になりうる。これには、例えば、低分子量化合物の結合、例えば膜アンカーまたはオリゴ糖の結合が含まれる。
【０１０５】
上で説明した要素の全てを、本発明のタンパク質を製造するための方法に組入れることができる。本発明のそれぞれのタンパク質のために、多数の可能な工程の組合わせが存在する。これらの全てが、本発明の基礎を構成する概念の実施態様である。即ち、関連の遺伝情報の助けを借りて、タンパク質種の代表例（デンプン分解機能によって、同時に、配列プロトコールに示す配列に対する高い相同性によって規定される）を定量的に製造する実施態様である。最適な方法は、それぞれの実際の個々の場合に対して、実験的に決定しなければならない。
【０１０６】
原則的に、以下の操作が採用される。本発明の核酸、即ち、配列番号１の配列に対して上記の類似性の範囲内にある核酸を、適当な発現ベクター中に、ＤＮＡの形態で適切に連結する。これを、宿主細胞、例えば培養が容易な細菌株の細胞に導入する［この細胞は、タンパク質（その遺伝子は、対応する遺伝要素の制御下にある）を周囲の栄養培地に放出する；このための調節要素は、例えば発現ベクターによって利用可能になる］。本発明のタンパク質は、いくつかの精製工程（例えば、沈殿またはクロマトグラフィー）によって周囲培地から精製することができる。当業者なら、実験室において実験的に最適化した系を、工業的スケールでの製造まで規模拡大をすることができる。
【０１０７】
本発明のタンパク質の最も重要な産業上の用途を以下に挙げる。デンプン分解酵素の多くの確立された産業上の用途が、例えば、Ｈ．Ｕｈｌｉｇの「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」と題する本［Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９９８］などのマニュアルに記載されている。以下に挙げるリストは、いかなる意味においても完全なものではなく、多くの理論的に可能な用途の選択を単に示すものである。本発明の個々のタンパク質が、本明細書の特許請求の範囲に明確に記載されていない追加の用途に適することがわかったときには、これらの用途は本発明の保護の範囲内に包含される。
【０１０８】
デンプン分解酵素の重要な用途は、織物または硬表面を清浄化するための洗剤／クリーナーにおける活性成分としての使用である。このような用途においては、デンプン分解活性を、炭水化物含有の汚れ、より具体的にはデンプン様の汚れを加水分解により溶解するため、および／または、それを基材から除去するために使用する。この目的のために、酵素をそれ自体で、適当な媒体中で、さらに洗剤／クリーナー中で使用することができる。これらの組成物は、例えばデンプン分解タンパク質の加水分解生成物が組成物の他の成分（例えば、界面活性剤など）により可溶化されることによって、デンプン分解酵素および他の成分が汚れの除去に相乗的に作用するということにより区別される。本発明のタンパク質は、施設または産業ユーザー用の組成物および家庭消費者用の製品の両方において使用することができる。
【０１０９】
従って、本発明の別の態様は、本発明のデンプン分解タンパク質またはその誘導体を含有することを特徴とするあらゆる洗剤／クリーナーである。
【０１１０】
これにより、産業スケールで、洗浄機において、あるいは、手による洗浄または清浄化において使用するための全ての可能な種類の清浄化組成物、希釈することなく使用される組成物および濃厚物の両方が意図される。このような組成物には、例えば、織物、カーペットまたは天然繊維のための洗剤が含まれる（本明細書においては、「洗剤」なる用語をこれらのために使用する）。また、これら組成物には、例えば、食器洗浄機または手による食器洗浄のための洗剤あるいは硬表面（例えば、金属、陶磁器、セラミック、タイル、石、塗装表面、プラスチック、木材または皮革）のためのクリーナーが含まれる（本明細書においては、「クリーナー」なる用語をこれらのために使用する）。あらゆる種類の清浄化組成物が、それが本発明のタンパク質によってより有用なものになるなら、本発明の態様である。
【０１１１】
本発明の態様は、従来技術において確立された本発明の組成物の全ての供給形態および／または本発明の組成物の全ての適当な供給形態を包含する。これらには、例えば、固体、粉末形態、液体、ゲル形態またはペースト形態の組成物が含まれる（これらは、所望によりいくつかの相からなり、圧縮されているか、または圧縮されていない）。また、これら供給形態には、押出物、顆粒、タブレットならびに大きな容器に充填された袋および少量ずつ充填された袋も含まれる。
【０１１２】
本発明に必須である酵素に加えて、本発明の組成物は、所望により他の成分、例えば界面活性剤、例えば非イオン性、陰イオン性および／または両性界面活性剤、および／または漂白剤および／またはビルダーならびに所望により他の通常の成分を含有する。
【０１１３】
好ましい非イオン性界面活性剤は、アルコキシル化（有利にはエトキシル化）した、より具体的には第一アルコールであり、好ましくは８〜１８個の炭素原子およびアルコール１モルあたりに平均して１〜１２モルのエチレンオキシド（ＥＯ）を含むアルコールである。このアルコール基は、直鎖または好ましくは２−メチル分岐していてよく、あるいは、オキソアルコール基に普通に存在する混合物の形態で直鎖の基およびメチル分岐した基を含有していてよい。しかし、１２〜１８個の炭素原子を含む天然起源のアルコール（例えば、ヤシ油アルコール、パーム油アルコール、獣脂アルコールまたはオレイルアルコール）の直鎖基ならびにアルコール１モルあたりに平均して２〜８個のＥＯを含有するアルコールエトキシレートが特に好ましい。好ましいエトキシル化アルコールには、例えば、３ＥＯまたは４ＥＯを含むＣ１２−１４アルコール、７ＥＯを含むＣ９−１１アルコール、３ＥＯ、５ＥＯ、７ＥＯまたは８ＥＯを含むＣ１３−１５アルコール、３ＥＯ、５ＥＯまたは７ＥＯを含むＣ１２−１８アルコールおよびこれらの混合物（例えば、３ＥＯを含むＣ１２−１４アルコールと５ＥＯを含むＣ１２−１８アルコールの混合物）が含まれる。上記したエトキシル化度は統計学的平均値であり、特定の生成物に対して整数または端数のいずれかになりうる。好ましいアルコールエトキシレートは狭い同族体分布を有する（狭範囲のエトキシレート、ＮＲＥ）。これらの非イオン性界面活性剤に加えて、１２個以上のＥＯを含む脂肪アルコールを使用することもできる。このような脂肪アルコールの例は、１４ＥＯ、２５ＥＯ、３０ＥＯまたは４０ＥＯを含む獣脂アルコールである。
【０１１４】
唯一の非イオン性界面活性剤として、または他の非イオン性界面活性剤と組合わせて使用される別群の好ましい非イオン性界面活性剤は、アルコキシル化された、好ましくはエトキシル化またはエトキシル化およびプロポキシル化された脂肪酸アルキルエステル（好ましくは、アルキル鎖に１〜４個の炭素原子を含む）、より具体的には脂肪酸メチルエステルである。
【０１１５】
有利に使用することができる別群の非イオン性界面活性剤は、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）である。適当なアルキルポリグリコシドは、一般式：ＲＯ（Ｇ）ｚ ［式中、Ｒは、８〜２２個（好ましくは、１２〜１８個）の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖（より具体的には、２−メチル分岐鎖）の飽和または不飽和の脂肪族基であり、Ｇは、５または６個の炭素原子を含むグリコース単位（好ましくは、グルコース）である］で示される。グリコシド化度ｚは、１．０〜４．０、好ましくは１．０〜２．０、より好ましくは１．１〜１．４である。直鎖アルキルポリグルコシド、即ち、ポリグリコシル部分がグルコース単位であり、アルキル部分がｎ−アルキル基であるアルキルポリグリコシドを使用するのが好ましい。
【０１１６】
また、アミンオキシド型の非イオン性界面活性剤、例えばＮ−ヤシ油アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−獣脂アルキル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアミンオキシド、ならびに、脂肪酸アルカノールアミド型の非イオン性界面活性剤も適している。これら非イオン性界面活性剤の使用量は、好ましくはエトキシル化脂肪アルコールの使用量を越えることはなく、特にその半分を越えることはない。
【０１１７】
他の適当な界面活性剤は、以下の式（ＩＩ）で示されるポリヒドロキシ脂肪酸アミドである：
【化１】
2004504837.tif 000004
［式中、ＲＣＯは、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪族アシル基であり、Ｒ１は、水素、１〜４個の炭素原子を含むアルキルまたはヒドロキシアルキル基であり、［Ｚ］は、３〜１０個の炭素原子および３〜１０個のヒドロキシル基を含む直鎖または分岐鎖のポリヒドロキシアルキル基である］。
これらポリヒドロキシ脂肪酸アミドは既知の物質であり、通常は、アンモニア、アルキルアミンまたはアルカノールアミンによる還元糖の還元的アミノ化、および、その後の脂肪酸、脂肪酸アルキルエステルまたは脂肪酸クロリドによるアシル化によって得ることができる。
【０１１８】
また、ポリヒドロキシ脂肪酸アミドの群には、以下の式（ＩＩＩ）で示される化合物も含まれる：
【化２】
2004504837.tif 000005
［式中、Ｒは、７〜１２個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖のアルキルまたはアルケニル基であり、Ｒ１は、２〜８個の炭素原子を含む直鎖、分岐鎖または環式のアルキル基またはアリール基であり、Ｒ２は、１〜８個の炭素原子を含む直鎖、分岐鎖または環式のアルキル基またはアリール基またはオキシアルキル基であり（Ｃ１−４アルキルまたはフェニル基が好ましい）、［Ｚ］は、直鎖のポリヒドロキシアルキル基（アルキル鎖が、少なくとも２個のヒドロキシル基で置換されている）またはこのような基のアルコキシル化（好ましくは、エトキシル化またはプロポキシル化）誘導体である］。
【０１１９】
［Ｚ］は、還元糖（例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、マンノースまたはキシロース）の還元的アミノ化によって得るのが好ましい。次いで、Ｎ−アルコキシまたはＮ−アリールオキシ置換された化合物を、例えば、触媒としてのアルコキシドの存在下に脂肪酸メチルエステルと反応させることによって、所望のポリヒドロキシ脂肪酸アミドに変換することができる。
【０１２０】
適当な陰イオン性界面活性剤は、例えば、スルホネートおよびスルフェート型の界面活性剤である。適当なスルホネート型の界面活性剤は、好ましくはＣ９−１３アルキルベンゼンスルホネート、オレフィンスルホネート、即ちアルケンおよびヒドロキシアルカンスルホネートの混合物、ならびに、例えば内部または末端二重結合を有するＣ１２−１８モノオレフィンから、三酸化イオウガスによるスルホン化およびその後のスルホン化生成物のアルカリ性または酸性加水分解によって得られるジスルホネートである。他の適当なスルホネート型の界面活性剤は、Ｃ１２−１８アルカンから、例えばスルホクロロ化またはスルホ酸化およびその後の加水分解または中和によって得られるアルカンスルホネートである。また、α−スルホ脂肪酸のエステル（エステルスルホネート）、例えば水素化ヤシ油、パーム核油または獣脂脂肪酸のα−スルホン化メチルエステルも適している。
【０１２１】
他の適当な陰イオン性界面活性剤は、スルホン化脂肪酸グリセロールエステルである。本発明における脂肪酸グリセロールエステルは、モノエステル、ジエステル、トリエステルおよびその混合物であり、１〜３モルの脂肪酸によるモノグリセロールのエステル化によって、または、０．３〜２モルのグリセロールによるトリグリセリドのエステル交換によって得られる。好ましいスルホン化脂肪酸グリセロールエステルは、６〜２２個の炭素原子を含む飽和脂肪酸（例えば、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはベヘン酸）のスルホン化生成物である。
【０１２２】
好ましいアルキル（アルケニル）スルフェートは、Ｃ１２−１８脂肪アルコール（例えば、ヤシ油脂肪アルコール、獣脂脂肪アルコール、ラウリル、ミリスチル、セチルまたはステアリルアルコール）またはＣ１０−２０オキソアルコールの硫酸半エステルならびに同じ鎖長の第二アルコールの対応する半エステルのアルカリ金属塩、特にナトリウム塩である。他の好ましいアルキル（アルケニル）スルフェートは、石油化学に基づく合成の直鎖アルキル鎖を含み、油化学原料に基づく対応する化合物と分解挙動が類似している、上記鎖長のスルフェートである。Ｃ１２−１６アルキルスルフェート、Ｃ１２−１５アルキルスルフェートおよびＣ１４−１５アルキルスルフェートが、洗浄性能の観点から好ましい。他の適当な陰イオン性界面活性剤は２，３−アルキルスルフェートである。
【０１２３】
また、１〜６モルのエチレンオキシドでエトキシル化された直鎖または分岐鎖のＣ７−２１アルコール、例えば、平均して３．５モルのエチレンオキシド（ＥＯ）を含む２−メチル分岐したＣ９−１１アルコールまたは１〜４個のＥＯを含むＣ１２−１８脂肪アルコールの硫酸モノエステルも適している。これらの高い発泡能力に鑑みて、これらは、クリーナーにおいて比較的少量でのみ、例えば１〜５重量％の量で使用される。
【０１２４】
他の適当な陰イオン性界面活性剤は、アルキルスルホコハク酸の塩である（これらは、スルホスクシネートまたはスルホコハク酸エステルとしても知られ、スルホコハク酸とアルコール、好ましくは脂肪アルコール、より具体的にはエトキシル化脂肪アルコールとのモノエステルおよび／またはジエステルである）。好ましいスルホスクシネートは、Ｃ８−１８脂肪アルコール残基またはその混合物を含有する。特に好ましいスルホスクシネートは、エトキシル化脂肪アルコール（これは、独立して考慮すると、非イオン性界面活性剤である；その説明については以下を参照）に由来する脂肪アルコール部分を含有する。これらのスルホスクシネートの中で、脂肪アルコール部分が狭範囲のエトキシル化脂肪アルコールに由来するものが特に好ましい。また、好ましくはアルキル（アルケニル）鎖に８〜１８個の炭素原子を含むアルキル（アルケニル）コハク酸またはその塩を使用することもできる。
【０１２５】
他の適当な陰イオン性界面活性剤は、特に石鹸である。適当な石鹸は、飽和脂肪酸の石鹸（例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、水素化エルカ酸およびベヘン酸の塩）、ならびに、特に天然の脂肪酸（例えば、ヤシ油、パーム核油または獣脂脂肪酸）から導かれる石鹸混合物である。
【０１２６】
陰イオン性界面活性剤（石鹸を含む）は、そのナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩の形態で、および有機塩基（例えば、モノ、ジまたはトリエタノールアミン）の可溶性塩として存在することができる。陰イオン性界面活性剤は、好ましくはそのナトリウムまたはカリウム塩の形態で、さらに好ましくはそのナトリウム塩の形態で存在する。
【０１２７】
界面活性剤は、本発明の洗剤中に、最終の洗剤を基準に、好ましくは５〜５０重量％、より具体的には８〜３０重量％の合計量で存在することができる。
【０１２８】
本発明に従って、漂白剤が存在することができる。水中でＨ２Ｏ２を生成する化合物（これらは漂白剤として働く）の中で、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム・四水和物および過ホウ酸ナトリウム・一水和物が特に重要である。他の有用な漂白剤は、例えば、ペルオキソピロホスフェート、クエン酸塩・過水和物、およびＨ２Ｏ２を生成する過酸塩または過酸、例えば過硫酸塩および過硫酸である。また、式：Ｈ２Ｎ−ＣＯ−ＮＨ２・Ｈ２Ｏ２で示すことができる尿素ペルオキソヒドレート パーカルバミドを使用することもできる。所望により、本組成物は、特にそれを硬表面の清浄化のために、例えば食器洗浄機において使用するときには、有機漂白剤の群からの漂白剤を含有することもできるが、原則的に有機漂白剤は、洗濯洗剤において使用することもできる。代表的な有機漂白剤は、過酸化ジアシル、例えば過酸化ジベンゾイルなどである。他の代表的な有機漂白剤は、ペルオキシ酸であり、その中で特にアルキルペルオキシ酸およびアリールペルオキシ酸が例として挙げられる。好ましい代表例は、ペルオキシ安息香酸およびその環置換誘導体、例えばアルキルペルオキシ安息香酸、さらにペルオキシ−α−ナフトエ酸およびモノ過フタル酸マグネシウム、脂肪族または置換脂肪族ペルオキシ酸、例えばペルオキシラウリン酸、ペルオキシステアリン酸、ε−フタルイミドペルオキシカプロン酸［フタロイミノペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）］、ｏ−カルボキシベンズアミドペルオキシカプロン酸、Ｎ−ノネニルアミド過アジピン酸およびＮ−ノネニルアミド過スクシネートおよび脂肪族およびアリール脂肪族ペルオキシジカルボン酸、例えば１，１２−ジペルオキシカルボン酸、１，９−ジペルオキシアゼライン酸、ジペルオキシセバシン酸、ジペルオキシブラシル酸、ジペルオキシフタル酸、２−デシルジペルオキシブタン−１，４−二酸、Ｎ，Ｎ−テレフタロイル−ジ（６−アミノ過カプロン酸）である。
【０１２９】
漂白剤の含有量は、１〜４０重量％であってよく、特定の態様においては、１０〜２０重量％であり、過ホウ酸塩・一水和物または過炭酸塩が有利に使用される。アミラーゼと過炭酸塩またはアミラーゼと過カルボン酸の相乗的な使用が、ＷＯ９９／６３０３６およびＷＯ９９／６３０３７に開示されている。
【０１３０】
洗浄を６０℃またはそれ以下の温度で、特に洗濯物の前処理において行う場合に、改善された漂白効果を得るために、本組成物は漂白活性化剤を含有することができる。適当な漂白活性化剤は、過加水分解の条件下で、所望により置換された過安息香酸および／または脂肪族ペルオキソカルボン酸（好ましくは１〜１０個の炭素原子、より好ましくは２〜４個の炭素原子を含む）を生成する化合物である。Ｏ−および／またはＮ−アシル基（上記した炭素原子数を有する）および／または所望により置換されたベンゾイル基を有する物質が適している。好ましい漂白活性化剤は、ポリアシル化アルキレンジアミン、より具体的にはテトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、アシル化トリアジン誘導体、より具体的には１，５−ジアセチル−２，４−ジオキソヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（ＤＡＤＨＴ）、アシル化グリコルリル、より具体的には１，３，４，６−テトラアセチルグリコルリル（ＴＡＧＵ）、Ｎ−アシルイミド、より具体的にはＮ−ノナノイルスクシンイミド（ＮＯＳＩ）、アシル化フェノールスルホネート、より具体的にはｎ−ノナノイルまたはイソノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ｎ−またはイソ−ＮＯＢＳ）、アシル化ヒドロカルボン酸、例えばトリエチル−Ｏ−アセチルシトレート（ＴＥＯＣ）、カルボン酸無水物、より具体的にはフタル酸無水物、イサト酸無水物および／またはコハク酸無水物、カルボン酸アミド、例えばＮ−メチルジアセトアミド、グリコリド、アシル化多価アルコール、より具体的にはトリアセチン、エチレングリコールジアセテート、イソプロペニルアセテート、２，５−ジアセトキシ−２，５−ジヒドロフランおよびエノールエステル（ドイツ特許出願ＤＥ１９６１６６９３およびＤＥ１９６１６７６７から既知）、アセチル化ソルビトールおよびマンニトールおよびこれらの混合物（ＳＯＲＭＡＮ）（欧州特許出願ＥＰ０５２５２３９に記載）、アシル化糖誘導体、より具体的にはペンタアセチルグルコース（ＰＡＧ）、ペンタアセチルフルクトース、テトラアセチルキシロースおよびオクタアセチルラクトース、およびアセチル化し、所望によりＮ−アルキル化したグルカミンおよびグルコノラクトン、トリアゾールまたはトリアゾール誘導体および／または粒状カプロラクタムおよび／またはカプロラクタム誘導体、好ましくはＮ−アシル化ラクタム、例えばＮ−ベンゾイルカプロラクタムおよびＮ−アセチルカプロラクタム（これらは、国際特許出願ＷＯ−Ａ−９４／２７９７０、ＷＯ−Ａ−９４／２８１０２、ＷＯ−Ａ−９４／２８１０３、ＷＯ−Ａ−９５／００６２６、ＷＯ−Ａ−９５／１４７５９およびＷＯ−Ａ−９５／１７４９８から既知である）である。また、置換された親水性アシルアセタール（ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−１９６１６７６９から既知）およびアシルラクタム（ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−１９６１６７７０および国際特許出願ＷＯ−Ａ−９５／１４０７５に記載）を使用するのも好ましい。また、ドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−４４４３１７７から既知である通常の漂白活性化剤の組合せを使用することもできる。さらに、ニトリル誘導体、例えばシアノピリジン、ニトリルクアット（ニトリル ｑｕａｔ）、例えばＮ−ア��キルアンモニウムアセトニトリル、および／またはシアナミド誘導体を使用することもできる。好ましい漂白活性化剤は、ナトリウム−４−（オクタノイルオキシ）−ベンゼンスルホネート、ｎ−ノナノイルまたはイソノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ｎ−またはイソ−ＮＯＢＳ）、ウンデセノイルオキシベンゼンスルホネート（ＵＤＯＢＳ）、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＯＢＳ）、デカノイルオキシ安息香酸（ＤＯＢＡ、ＯＢＣ１０）および／またはドデカノイルオキシベンゼンスルホネート（ＯＢＳ１２）およびＮ−メチルモルホリニウムアセトニトリル（ＭＭＡ）である。このような漂白活性化剤は、組成物全体を基準に、０．０１〜２０重量％の通常量で、好ましくは０．１〜１５重量％の量で、より好ましくは１〜１０重量％の量で存在する。
【０１３１】
上記した通常の漂白活性化剤に加えて、またはその代わりに、いわゆる漂白触媒を導入することもできる。漂白触媒は、漂白を促進する遷移金属塩または遷移金属錯体、例えば、マンガン−、鉄−、コバルト−、ルテニウム−もしくはモリブデン−サレン錯体またはカルボニル錯体である。また、マンガン、鉄、コバルト、ルテニウム、モリブデン、チタン、バナジウムおよび銅錯体（窒素含有の三脚配位子を含む）ならびにコバルト−、鉄−、銅−およびルテニウム−アンミン錯体を、漂白触媒として使用することもできる（ＤＥ１９７０９２８４Ａ１に記載されている化合物を使用するのが好ましい）。さらに、ＷＯ９９／６３０３８によればアセトニトリル誘導体が、また、ＷＯ９９／６３０４１によれば漂白活性化遷移金属化合物が、アミラーゼとの組合わせにおいて漂白活性化効果を現すことができる。
【０１３２】
通常、本発明の組成物は、１またはそれ以上のビルダー、より具体的にはゼオライト、シリケート、カーボネート、有機共ビルダー、および使用に関して環境的な問題がなければホスフェートを含有する。ホスフェートが、食器洗浄機洗剤において特に好ましいビルダーである。
【０１３３】
適当な結晶性の層状ケイ酸ナトリウムは、一般式：ＮａＭＳｉｘＯ２ｘ＋１・ｙＨ２Ｏ［式中、Ｍはナトリウムまたは水素であり、ｘは１．９〜４の数であり、ｙは０〜２０の数であり、好ましいｘの値は２、３または４である］で示される。このような結晶性の層状ケイ酸塩は、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０１６４５１４に記載されている。上記の式で示される好ましい結晶性の層状ケイ酸塩は、Ｍがナトリウムであり、ｘが２または３の値であるケイ酸塩である。β−およびδ−二ケイ酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５ ・ｙＨ２Ｏ）が特に好ましい。このような化合物は、例えば、ＳＫＳＲ（Ｃｌａｒｉａｎｔ）として市販されている。即ち、ＳＫＳ−６Ｒは、主に、式：Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５・ｙＨ２Ｏで示されるδ−二ケイ酸ナトリウムであり、一方、ＳＫＳ−７Ｒは、主にβ−二ケイ酸ナトリウムである。酸（例えば、クエン酸または炭酸）との反応によって、δ−二ケイ酸ナトリウムは、ＳＫＳ−９ＲおよびＳＫＳ−１０Ｒ（Ｃｌａｒｉａｎｔ）として市販されているカネマイト（ｋａｎｅｍｉｔｅ）ＮａＨＳｉ２Ｏ５・Ｈ２Ｏを与える。また、これら層状ケイ酸塩の化学修飾体を使用するのが有利であることもある。例えば、層状ケイ酸塩のアルカリ度に適切に影響を与えることができる。このδ−二ケイ酸ナトリウムと比較すると、ホスフェートまたはカーボネートでドープ処理された層状ケイ酸塩は、修飾された結晶形態を持ち、より迅速に溶解し、カルシウム結合能力の増大を示す。一般実験式：ｘＮａ２Ｏ・ｙＨ２Ｏ・ｚＰ２Ｏ５［式中、ｘ／ｙ比は０．３５〜０．６の数であり、ｘ／ｚ比は１．７５〜１２００の数であり、ｙ／ｚ比は４〜２，８００の数である］で示される層状ケイ酸塩が、特許出願ＤＥ１９６０１０６３に記載されている。また、層状ケイ酸塩の溶解性を、特に微細な粒子の層状ケイ酸塩を用いて増大させることもできる。さらに、結晶性層状ケイ酸塩と他の成分とのコンパウンドを使用することもできる。セルロース誘導体とのコンパウンド（これらは、崩壊作用において利点を有しており、特に洗剤タブレットにおいて使用される）、ならびに、ポリカルボキシレート（例えばクエン酸）またはポリマーポリカルボキシレート（例えばアクリル酸のコポリマー）とのコンパウンドが特に挙げられる。
【０１３４】
他の有用なビルダーは、モジュラス（Ｎａ２Ｏ：ＳｉＯ２比）が１：２〜１：３．３、好ましくは１：２〜１：２．８、より好ましくは１：２〜１：２．６であり、遅延して溶解し、複数洗浄サイクル特性を示す無定形ケイ酸ナトリウムである。通常の無定形ケイ酸ナトリウムに関連する溶解の遅延は、種々の方法によって、例えば表面処理、コンパウンド化、圧縮または過乾燥によって得ることができる。本発明において、「無定形」なる用語は、「Ｘ線無定形」をも包含すると解される。換言すると、このようなケイ酸塩は、Ｘ線回折実験において結晶性物質に典型的な鋭いＸ線反射を生じず、数度の回折角の幅を有する散乱Ｘ線の１またはそれ以上の最大値をせいぜい生じるにすぎない。しかし、特に良好なビルダー特性は、ケイ酸塩粒子が、電子回折実験において湾曲したかまたは鋭い回折最大値を生じるときに達成することができる。これは、生成物が、１０〜数１００ｎｍの大きさの微結晶性領域を有していることを意味すると解することができる（高くとも５０ｎｍまで、より具体的には高くとも２０ｎｍまでの値が好ましい）。圧縮した無定形ケイ酸塩、コンパウンド化した無定形ケイ酸塩、および過乾燥したＸ線−無定形ケイ酸塩が特に好ましい。
【０１３５】
本発明に従って使用する結合水を含む微結晶性の合成ゼオライトは、好ましくはゼオライトＡおよび／またはゼオライトＰである。ゼオライトＭＡＰＲ（Ｃｒｏｓｆｉｅｌｄ）が特に好ましいＰ型ゼオライトである。しかし、ゼオライトＸならびにＡ、Ｘおよび／またはＰの混合物も適している。本発明によれば、例えば、市販されているゼオライトＸとゼオライトＡの共結晶化物（約８０重量％のゼオライトＸ）を使用するのが好ましい。これは、ＣＯＮＤＥＡ Ａｕｇｕｓｔａ Ｓ．ｐ．Ａ．からＶＥＧＯＢＯＮＤ ＡＸＲの名称のもとで市販されており、以下の式：
【化３】
2004504837.tif 000006
で表すことができる。適当なゼオライトは、平均粒子サイズが１０μｍ未満（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ法で測定したときの体積分布）であり、好ましくは１８〜２２重量％、より好ましくは２０〜２２重量％の結合水を含有する。
【０１３６】
広く知られているリン酸塩を、ビルダーとして使用することも勿論可能である（その使用が、環境的な理由から回避すべきでないとき）。多数の市販リン酸塩の中で、アルカリ金属リン酸塩が、洗剤工業において最も重要であり、三リン酸五ナトリウムおよび三リン酸五カリウム（トリポリリン酸ナトリウムおよびカリウム）が特に好ましい。
【０１３７】
「アルカリ金属リン酸塩」は、種々のリン酸［メタリン酸（ＨＰＯ３）ｎおよびオルトリン酸（Ｈ３ＰＯ４）ならびにより高分子量のものを含む］のアルカリ金属（より具体的にはナトリウムおよびカリウム）塩の包括的用語である。これらのリン酸塩はいくつかの利点を合わせ持つ。即ち、これらは、アルカリ性の供給源として働き、機械部品への石灰の堆積および織物における石灰外皮を防止し、さらに、洗浄効果に寄与する。
【０１３８】
リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）は、二水和物（密度１．９１ｇ／ｃｍ３、融点６０℃）および一水和物（密度２．０４ｇ／ｃｍ３）として存在する。両塩は、白色の易水溶性の粉末であり、加熱時に結晶水を失い、２００℃において弱酸性の二リン酸塩（二リン酸水素二ナトリウム、Ｎａ２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）に変換され、さらに高い温度において、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｐ３Ｏ９）およびＭａｄｄｒｅｌｌ塩（以下を参照）に変換される。ＮａＨ２ＰＯ４は、酸性の反応を示す。これは、リン酸を水酸化ナトリウムでｐＨ４．５に調節し、得られた「マッシュ」を噴霧することによって形成される。リン酸二水素カリウム（第一または一塩基性リン酸カリウム、二リン酸カリウム、ＫＤＰ）、ＫＨ２ＰＯ４は、密度２．３３ｇ／ｃｍ３の白色塩であり、融点２５３℃［ポリリン酸カリウム（ＫＰＯ３）ｘの生成を伴って分解］を有し、水に易溶性である。
【０１３９】
リン酸水素二ナトリウム（第二リン酸ナトリウム）、Ｎａ２ＨＰＯ４は、無色の易水溶性の結晶性塩である。これは、水を含まない形態ならびに２モルの水（密度２．０６６ｇ／ｃｍ３、９５℃で水損失）、７モルの水（密度１．６８ｇ／ｃｍ３、５Ｈ２Ｏの損失を伴って融点４８℃）および１２モルの水（密度１．５２ｇ／ｃｍ３、５Ｈ２Ｏの損失を伴って融点３５℃）を含んで存在し、１００℃で水を含まないようになり、さらに強く加熱すると、二リン酸塩Ｎａ４Ｐ２Ｏ７に変換される。リン酸水素二ナトリウムは、指示薬としてフェノールフタレインを用いて、ソーダ溶液によってリン酸を中和することによって調製される。リン酸水素二カリウム（第二または二塩基性リン酸カリウム）、Ｋ２ＨＰＯ４は、水に易溶性である無定形の白色塩である。
【０１４０】
リン酸三ナトリウム、第三リン酸ナトリウム、Ｎａ３ＰＯ４は、無色の結晶からなり、１２水和物として密度１．６２ｇ／ｃｍ３および融点７３〜７６℃（分解）、１０水和物（１９〜２０％のＰ２Ｏ５に相当する）として融点１００℃、ならびに、水を含まない形態（３９〜４０％のＰ２Ｏ５に相当する）で密度２．５３６ｇ／ｃｍ３を有する。リン酸三ナトリウムは、アルカリ反応により水に易溶性であり、蒸発により正確に１モルのリン酸二ナトリウムと１モルのＮａＯＨの溶液を濃縮することによって調製される。リン酸三カリウム（第三または三塩基性リン酸カリウム）、Ｋ３ＰＯ４は、密度２．５６ｇ／ｃｍ３の白色の潮解性の顆粒状粉末であり、融点１３４０℃を有し、アルカリ反応により水に易溶性である。これは、例えば、Ｔｈｏｍａｓスラグを石炭および硫酸カリウムと共に加熱したときに生成する。比較的高価であるにもかかわらず、より容易に溶解することができ、従って有効性の高いリン酸カリウムが、対応するナトリウム化合物よりも洗剤工業において好まれることが多い。
【０１４１】
二リン酸四ナトリウム（ピロリン酸ナトリウム）、Ｎａ４Ｐ２Ｏ７は、水を含まない形態（密度２．５３４ｇ／ｃｍ３、融点９８８℃、８８０℃という数字も挙げられている）で、ならびに、１０水和物（密度１．８１５〜１．８３６ｇ／ｃｍ３、水の損失を伴って融点９４℃）として存在する。両物質は、無色結晶であり、アルカリ反応により水に溶解する。Ｎａ４Ｐ２Ｏ７は、リン酸二ナトリウムを＞２００℃に加熱したとき、あるいは、リン酸とソーダを化学量論比で反応させ、この溶液を噴霧乾燥することにより生成する。１０水和物は、重金属塩および硬度塩を錯化し、従って、水の硬度を低下させる。二リン酸カリウム（ピロリン酸カリウム）、Ｋ４Ｐ２Ｏ７は、三水和物の形態で存在し、密度２．３３ｇ／ｃｍ３の無色の吸湿性粉末であり、水に可溶性であり、２５℃での１％溶液のｐＨ値は１０．４である。
【０１４２】
比較的高分子量のリン酸ナトリウムおよびカリウムが、ＮａＨ２ＰＯ４またはＫＨ２ＰＯ４の縮合によって生成する。これらは、環タイプ（即ち、メタリン酸ナトリウムおよびカリウム）および鎖タイプ（即ち、ポリリン酸ナトリウムおよびカリウム）に分類することができる。特にこの鎖タイプは、種々の異なる名称（融合または焼成したリン酸塩、Ｇｒａｈａｍ塩、Ｋｕｒｒｏｌ塩およびＭａｄｄｒｅｌｌ塩）で知られている。全ての高級リン酸ナトリウムおよびカリウムは、包括的に、縮合リン酸塩として知られている。
【０１４３】
工業的に重要な三リン酸五ナトリウム、Ｎａ５Ｐ３Ｏ１０（トリポリリン酸ナトリウム）は、非吸湿性の白色の水溶性塩であり、これは、水なしでまたは６Ｈ２Ｏを伴って結晶化し、一般式：ＮａＯ−［Ｐ（Ｏ）（ＯＮａ）−Ｏ］ｎ−Ｎａ ［式中、ｎ＝３］で示される。約１７ｇの結晶水を含まない塩が、水１００ｇに室温で溶解し、約２０ｇが６０℃で溶解し、約３２ｇが１００℃で溶解する。溶液を１００℃で２時間加熱した後に、約８％のオルトリン酸塩および１５％の二リン酸塩が、加水分解によって生成する。三リン酸五ナトリウムの製造において、リン酸を、ソーダ溶液または水酸化ナトリウムと化学量論比で反応させ、この溶液を噴霧乾燥する。Ｇｒａｈａｍ塩および二リン酸ナトリウムと同様に、三リン酸五ナトリウムは、多くの不溶性金属化合物（石灰石鹸などを含む）を溶解する。三リン酸五カリウム、Ｋ５Ｐ３Ｏ１０（トリポリリン酸カリウム）は、例えば５０重量％溶液（＞２３％Ｐ２Ｏ５、２５％Ｋ２Ｏ）の形態で市販されている。ポリリン酸カリウムは、洗剤工業において広く使用されている。トリポリリン酸ナトリウムカリウムも存在し、これを、本発明に従って使用することもできる。これらは、例えば、以下のようにトリメタリン酸ナトリウムをＫＯＨで加水分解したときに生成する：
【化４】
2004504837.tif 000007
【０１４４】
本発明によれば、これらを、トリポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウムまたはこれらの混合物と全く同様に使用することができる。また、トリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウムカリウムの混合物あるいはトリポリリン酸カリウムとトリポリリン酸ナトリウムカリウムの混合物あるいはトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとトリポリリン酸ナトリウムカリウムの混合物を、本発明に従って使用することもできる。
【０１４５】
本発明の洗剤／クリーナーにおいて使用しうる有機共ビルダーには、特に、ポリカルボキシレートまたはポリカルボン酸、ポリマー性ポリカルボキシレート、アスパラギン酸、ポリアセタール、所望により酸化されたデキストリン、他の有機共ビルダー（以下を参照）およびホスホネートである。これらの群の物質を以下に説明する。
【０１４６】
有用な有機ビルダーは、例えば、ナトリウム塩の形態で使用しうるポリカルボン酸である。ここで、ポリカルボン酸とは、１を越える酸官能基を有するカルボン酸であると解される。これには、例えば、クエン酸、アジピン酸、コハク酸、グルタル酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、糖酸、アミノカルボン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）（その使用が環境的に安全であるとき）およびこれらの混合物が含まれる。好ましい塩は、ポリカルボン酸、例えばクエン酸、アジピン酸、コハク酸、グルタル酸、酒石酸、糖酸およびこれらの混合物の塩である。
【０１４７】
酸それ自体を使用することもできる。そのビルダー効果に加えて、通常、酸は、酸性化成分の性質をも有しており、従って、洗剤またはクリーナーにおいて比較的低いｐＨ値および中程度のｐＨ値を確立することをも助ける（他の成分の混合によって得られるｐＨ値が所望ではないとき）。これに関連して、系に適合し、かつ環境的に安全な酸、例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、マレイン酸、乳酸、グリコール酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、グルコン酸およびこれらの混合物が特に挙げられる。しかし、無機酸（特に、硫酸）または塩基（特に、水酸化アンモニウムまたはアルカリ金属）を、ｐＨ調節剤として使用することもできる。このような調節剤は、本発明の組成物に、２０重量％以下の量で、より具体的には１．２〜１７重量％の量で存在する。
【０１４８】
他の適当なビルダーは、ポリマー性ポリカルボキシレート、例えばポリアクリル酸またはポリメタクリル酸のアルカリ金属塩、例えば相対分子量が５００〜７０，０００ｇ／モルのものである。
【０１４９】
ポリマー性ポリカルボキシレートのために本明細書中に挙げた分子量は、特定の酸形態の重量平均分子量Ｍｗであり、これは、基本的には、ＵＶ検出器を用いるゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定される。この測定は、外部ポリアクリル酸標準（この標準は、調べるポリマーに類似した構造のゆえに、実際的な分子量の値を与える）に対して行った。これらの値は、標準としてのポリスチレンスルホン酸に対して測定した分子量とは明らかに異なる。ポリスチレンスルホン酸に対して測定した分子量は、本明細書中に挙げた分子量よりも高いのが普通である。
【０１５０】
特に適するポリマーは、好ましくは２，０００〜２０，０００ｇ／モルの分子量を有するポリアクリレートである。その優れた溶解性のゆえに、この群の好ましい代表例は、２，０００〜１０，０００ｇ／モル、より具体的には３，０００〜５，０００ｇ／モルの分子量を有する短鎖のポリアクリレートである。
【０１５１】
また、適するポリマーは、コポリマー性ポリカルボキシレート、特に、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマーならびにアクリル酸またはメタクリル酸とマレイン酸のコポリマーである。５０〜９０重量％のアクリル酸および５０〜１０重量％のマレイン酸を含むアクリル酸／マレイン酸コポリマーが特に適することがわかった。これらの相対分子量は、遊離酸を基準に、通常は２，０００〜７０，０００ｇ／モルの範囲内、好ましくは２０，０００〜５０，０００ｇ／モルの範囲内、より好ましくは３０，０００〜４０，０００ｇ／モルの範囲内である。（コ）ポリマー性ポリカルボキシレートは、粉末形態または水溶液形態のどちらかで使用することができる。洗剤中の（コ）ポリマー性ポリカルボキシレートの含量は、０．５〜２０重量％、より具体的には１〜１０重量％である。
【０１５２】
水への溶解性を改善するために、これらポリマーは、アリルスルホン酸、例えばアリルオキシベンゼンスルホン酸およびメタアリルスルホン酸を、モノマーとして含有することもできる。
【０１５３】
他の特に好ましいポリマーは、２を越える異なるモノマー単位の生分解性ポリマー、例えば、アクリル酸およびマレイン酸の塩およびビニルアルコールもしくはビニルアルコール誘導体をモノマーとして含有するポリマー、または、アクリル酸および２−アルキルアリルスルホン酸の塩および糖誘導体をモノマーとして含有するポリマーである。
【０１５４】
他の好ましいコポリマーは、好ましくはアクロレインおよびアクリル酸／アクリル酸の塩またはアクロレインおよび酢酸ビニルをモノマーとして含有するコポリマーである。
【０１５５】
他の好ましいビルダーは、ポリマー性アミノジカルボン酸、その塩または前駆体である。ポリアスパラギン酸またはその塩および誘導体（これらは、共ビルダーの性質に加えて漂白安定化作用を有する）が特に好ましい。
【０１５６】
他の適当なビルダーは、ジアルデヒドとポリオールカルボン酸（５〜７個の炭素原子および少なくとも３個のヒドロキシル基を含む）との反応によって得ることができるポリアセタールである。好ましいポリアセタールは、ジアルデヒド（例えば、グリオキサール、グルタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドおよびこれらの混合物）およびポリオールカルボン酸（例えば、グルコン酸および／またはグルコヘプトン酸）から得られる。
【０１５７】
他の適当な有機ビルダーは、デキストリン、例えばデンプンの部分加水分解によって得ることができる炭水化物のオリゴマーまたはポリマーである。この加水分解は、常法によって、例えば酸触媒法または酵素触媒法によって行うことができる。最終生成物は、好ましくは、平均分子量が４００〜５００，０００ｇ／モルの加水分解生成物である。デキストロース当量（ＤＥ）が０．５〜４０、より具体的には２〜３０である多糖が好ましい（このＤＥは、ＤＥ＝１００のデキストロースとの比較による、多糖の還元作用の受け入れられた尺度である）。ＤＥ＝３〜２０のマルトデキストリンおよびＤＥ＝２０〜３７の乾燥グルコースシロップ、ならびに、いわゆる黄色デキストリンおよび白色デキストリン（比較的高い分子量２，０００〜３０，０００ｇ／モルを有する）を使用することができる。
【０１５８】
このようなデキストリンの酸化誘導体は、それと、糖環の少なくとも１つのアルコール官能基をカルボン酸官能基に酸化することができる酸化剤との反応生成物である。本発明の組成物のための特に好ましい有機ビルダーは、ＥＰ４７２０４２、ＷＯ９７／２５３９９およびＥＰ７５５９４４に記載の酸化デンプンまたはその誘導体である。
【０１５９】
他の適当な共ビルダーは、オキシジスクシネートおよびジスクシネートの他の誘導体、好ましくはエチレンジアミンジスクシネートである。エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジスクシネート（ＥＤＤＳ）は、そのナトリウムまたはマグネシウム塩の形態で使用するのが好ましい。これに関連して、グリセロールジスクシネートおよびグリセロールトリスクシネートも好ましい。ゼオライト含有および／またはシリケート含有の配合物における使用量は、３〜１５重量％である。
【０１６０】
他の有用な有機共ビルダーは、例えば、アセチル化したヒドロキシカルボン酸およびその塩であり、これらは、所望によりラクトン形態で存在していてよく、少なくとも４個の炭素原子、少なくとも１個のヒドロキシ基および多くとも２個の酸基を含有する。
【０１６１】
共ビルダー特性を有する別群の物質は、ホスホネート、より具体的にはヒドロキシアルカンおよびアミノアルカンホスホネートである。これらヒドロキシアルカンホスホネートの中で、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホネート（ＨＥＤＰ）が、共ビルダーとして特に重要である。これは、ナトリウム塩、二ナトリウム塩（中性反応を示す）および四ナトリウム塩（アルカリ反応を示す；ｐＨ９）の形態で使用するのが好ましい。好ましいアミノアルカンホスホネートは、エチレンジアミンテトラメチレンホスホネート（ＥＤＴＭＰ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホネート（ＤＴＰＭＰ）およびこれらの高級同族体である。これらは、中性で反応するナトリウム塩の形態で、例えばＥＤＴＭＰの六ナトリウム塩として、またはＤＴＰＭＰの七および八ナトリウム塩として使用するのが好ましい。これらホスホネートの中で、ＨＥＤＰをビルダーとして使用するのが好ましい。さらに、これらアミノアルカンホスホネートは、顕著な重金属結合能力を有している。従って、特に組成物が漂白剤をも含有しているときには、アミノアルカンホスホネート、より具体的にはＤＴＰＭＰ、または上記したホスホネートの混合物を使用するのが有利になることもある。
【０１６２】
さらに、アルカリ土類金属イオンと錯体を形成することができるあらゆる化合物を、共ビルダーとして使用することができる。
【０１６３】
本発明の組成物は、所望により、ビルダーを９０重量％までの量で、好ましくは７５重量％までの量で含有することができる。本発明の洗剤は、特に５〜５０重量％のビルダー含量を有する。本発明の硬表面クリーナー、特に食器洗浄機洗剤においては、ビルダー含量は、特に５〜８８重量％である。好ましい態様においては、このような組成物は水溶性ビルダーを含まない。別の好ましい態様においては、本発明の組成物、特に食器洗浄機洗剤は、２０〜４０重量％の水溶性有機ビルダー、より具体的にはアルカリ金属クエン酸塩、５〜１５重量％のアルカリ金属炭酸塩および２０〜４０重量％のアルカリ金属二ケイ酸塩を含有する。
【０１６４】
洗剤／クリーナーの液体またはゲル形態の組成物において使用することができる溶媒は、例えば、一価または多価アルコール、アルカノールアミンまたはグリコールエーテルの群に属する（これらが、示した濃度範囲において水と混和するとき）。これら溶媒は、エタノール、ｎ−またはｉ−プロパノール、ブタノール、エチレングリコールメチルエーテル、エチレングリコールエチルエーテル、エチレングリコールプロピルエーテル、エチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコール メチル、エチルまたはプロピルエーテル、ジプロピレングリコール モノメチルまたはモノエチル エーテル、ジイソプロピレングリコール モノメチルまたはモノエチル エーテル、メトキシ、エトキシまたはブトキシ トリグリコール、１−ブトキシエトキシ−２−プロパノール、３−メチル−３−メトキシブタノール、プロピレングリコール ｔ−ブチル エーテルならびにこれら溶媒の混合物から選択するのが好ましい。
【０１６５】
溶媒は、液体またはゲル形態の本発明の洗剤／クリーナー中に、０．１〜２０重量％の量で、好ましくは１５重量％以下の量で、より具体的には１０重量％以下の量で存在することができる。
【０１６６】
１またはそれ以上の増粘剤、例えば増粘系を、本発明の組成物に添加して、その粘度を調節することができる。これらの高分子量物質（これらは膨潤剤としても知られる）は、通常、液体を吸収し、過程において膨潤し、最終的に粘稠な真のまたはコロイド状の溶液に変化させる。
【０１６７】
適当な増粘剤は、無機またはポリマー性有機化合物である。無機増粘剤には、例えば、ポリケイ酸、粘度無機物、例えばモンモリロナイト、ゼオライト、シリカおよびベントナイトが含まれる。有機増粘剤は、天然ポリマー、修飾天然ポリマーおよび全合成ポリマーの群に属する。天然ポリマーの例は、寒天、カラゲーン、トラガカント、アラビアゴム、アルギネート、ペクチン、ポリオース、グアールゴム、イナゴマメゴム、デンプン、デキストリン、ゼラチンおよびカゼインである。増粘剤として使用しうる修飾天然物質は、特に、修飾デンプンおよびセルロースの群に属し、例えば、カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロースエーテル、ヒドロキシエチルおよびヒドロキシプロピルセルロースならびにエーテルゴムを包含する。全合成増粘剤には、ポリマー、例えばポリアクリルおよびポリメタクリル化合物、ビニルポリマー、ポリカルボン酸、ポリエーテル、ポリイミン、ポリアミドおよびポリウレタンが含まれる。
【０１６８】
これらの増粘剤は、最終組成物を基準に、５重量％までの量で、好ましくは０．０５〜２重量％の量で、より具体的には０．１〜１．５重量％の量で使用することができる。
【０１６９】
本発明の洗剤／クリーナーは、所望により、金属イオン封鎖剤、電解質および他の助剤、例えば、蛍光増白剤、再付着抑制剤、銀腐食抑制剤、染料移行抑制剤、発泡抑制剤、研磨剤、染料および／または芳香剤、ならびに、抗微生物剤および／またはＵＶ吸収剤を、さらなる成分として含有することができる。
【０１７０】
本発明の洗濯洗剤は、ジアミノスチルベンジスルホン酸の誘導体またはそのアルカリ金属塩を、蛍光増白剤として含有することができる。適当な蛍光増白剤は、例えば、４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−モルホリノ−１，３，５−トリアジニル−６−アミノ）−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸の塩、またはモルホリノ基の代わりにジエタノールアミノ基、メチルアミノ基、アニリノ基または２−メトキシエチルアミノ基を含有する同様組成の化合物である。また、置換ジフェニルスチリル型の増白剤、例えば、４，４’−ビス−（２−スルホスチリル）−ジフェニル、４，４’−ビス−（４−クロロ−３−スルホスチリル）−ジフェニルまたは４−（４−クロロスチリル）−４’−（２−スルホスチリル）−ジフェニルのアルカリ金属塩も存在することができる。さらに、上記した増白剤の混合物も使用することができる。
【０１７１】
再付着抑制剤の機能は、洗浄液中に浮遊している繊維から分離した汚れを維持することである。適当な再付着抑制剤は、水溶性の通常は有機コロイドであり、例えば、デンプン、ニカワ、ゼラチン、デンプンまたはセルロースのエーテルカルボン酸またはエーテルスルホン酸の塩あるいはセルロースまたはデンプンの酸性硫酸エステルの塩である。また、酸性基を含む水溶性ポリアミドもこの目的に適している。上記した誘導体以外のデンプン誘導体、例えばアルデヒドデンプンなどを使用することもできる。セルロースエーテル、例えばカルボキシメチルセルロース（ナトリウム塩）、メチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、および、混合エーテル、例えばメチルヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロースならびにこれらの混合物を、組成物を基準に、例えば０．１〜５重量％の量で使用するのが好ましい。
【０１７２】
腐食から銀器を保護するために、銀腐食抑制剤を、本発明の食器洗浄洗剤において使用することができる。銀腐食抑制剤は従来技術から既知であり、例えば、ベンゾトリアゾール、塩化鉄（ＩＩＩ）およびＣｏＳＯ４を包含する。欧州特許ＥＰ０７３６０８４Ｂ１から既知のように、例えば、酵素と共に使用するのに特に適する銀腐食抑制剤は、マンガン、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、コバルトまたはセリウムの塩および／またはこれら金属が酸化数ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのいずれかで存在する錯体である。このような化合物の例は、ＭｎＳＯ４、Ｖ２Ｏ５、Ｖ２Ｏ４、ＶＯ２、ＴｉＯＳＯ４、Ｋ２ＴｉＦ６、Ｋ２ＺｒＦ６、Ｃｏ（ＮＯ３）２、Ｃｏ（ＮＯ３）３およびこれらの混合物である。
【０１７３】
通常、汚れ遊離剤または汚れ剥離剤は、洗濯洗剤において使用したときに、洗濯物繊維に汚れ剥離特性を付与し、そして／または洗剤の他の成分の汚れ懸濁能力を助けるポリマーである。同等の効果を、硬表面クリーナーにおいて使用したときにも観察することができる。
【０１７４】
特に効果的であり、以前から認められている汚れ遊離剤は、ジカルボン酸、アルキレングリコールおよびポリアルキレングリコール単位を含むコポリエステルである。その例は、ポリエチレンテレフタレートおよびポリオキシエチレングリコール（ＤＴ１６１７１４１またはＤＴ２２００９１１）のコポリマーである。ＤＥ−ＯＳ２２５３０６３は、特に２塩基性カルボン酸およびアルキレンまたはシクロアルキレンポリグリコールのコポリマーを含有する酸性組成物を挙げている。エチレンテレフタレートおよびポリエチレンオキシドテレフタレートのポリマーならびに洗剤におけるその使用は、ＤＥ−ＰＳ２８５７２９２およびＤＥ−ＰＳ３３２４２５８ならびにＥＰ０２５３５６７に記載されている。欧州特許ＥＰ０６６９４４は、特定のモル比のエチレングリコール、ポリエチレングリコール、芳香族ジカルボン酸およびスルホン化芳香族ジカルボン酸のコポリエステルを含有する組成物に関する。欧州特許ＥＰ０１８５４２７は、エチレンおよび／またはプロピレンテレフタレート単位およびポリエチレンオキシドテレフタレート単位を含有するメチルまたはエチル末端のポリエステルならびにこのような汚れ遊離ポリマーを含有する洗剤を記載している。欧州特許ＥＰ０２４１９８４は、オキシエチレン基およびテレフタル酸単位に加えて、置換エチレン単位およびグリセロール単位をも含有するポリエステルに関する。欧州特許ＥＰ０２４１９８５は、オキシエチレン基およびテレフタル酸単位に加えて、１，２−プロピレン、１，２−ブチレンおよび／または３−メトキシ−１，２−プロピレン基およびグリセロール単位を含有し、Ｃ１−４アルキル基を末端とするポリエステルを記載している。欧州特許出願ＥＰ０２７２０３３は、ポリプロピレンテレフタレートおよびポリオキシエチレンテレフタレート単位を含有する少なくとも部分的にＣ１−４アルキルまたはアシル末端のポリエステルを記載している。欧州特許ＥＰ０２７４９０７は、スルホエチル末端のテレフタレート含有の汚れ遊離ポリエステルを記載している。欧州特許出願ＥＰ０３５７２８０によれば、テレフタレート、アルキレングリコールおよびポリＣ２−４グリコール単位を含有する汚れ遊離ポリエステルが、不飽和末端基のスルホン化によって製造されている。国際特許出願ＷＯ９５／３２２３２は、酸性芳香族汚れ遊離ポリエステルに関する。国際特許出願ＷＯ９７／３１０８５は、いくつかの機能単位［第１の単位（例えば、陽イオン性であってよい）は、静電相互作用によって綿表面に吸着することができ、第２の単位（疎水性である）は、水／綿の界面に残存する活性物質の原因を為す］を含有する綿織物のための汚れ剥離剤を記載している。
【０１７５】
本発明の洗濯洗剤において使用するのに適する染料移行抑制剤には、特に、ポリビニルピロリドン、ポリビニルイミダゾール、ポリマー性Ｎ−オキシド、例えばポリ−（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）およびビニルピロリドンとビニルイミダゾールのコポリマーが含まれる。
【０１７６】
本組成物を機械洗浄過程において使用するときには、通常の発泡抑制剤をそれに添加するのが有利であることもある。適当な発泡抑制剤は、例えば、Ｃ１８−２４脂肪酸の含有率（％）が高い天然または合成起源の石鹸である。適当な非界面活性の発泡抑制剤は、例えば、オルガノポリシロキサンおよびそれと微細な所望によりシラン化したシリカとの混合物、ならびに、パラフィン、ワックス、微結晶性ワックスおよびそれとシラン化シリカまたはビス−ステアリルエチレンジアミンとの混合物である。異なる発泡抑制剤の混合物、例えば、シリコーン、パラフィンおよびワックスの混合物を、有利に使用することもできる。これら発泡抑制剤、より具体的にはシリコーン含有および／またはパラフィン含有の発泡抑制剤は、顆粒状の水溶性または水分散性の支持体に固定するのが好ましい。パラフィンおよびビス−ステアリルエチレンジアミンの混合物が特に好ましい。
【０１７７】
さらに、本発明の硬表面クリーナーは、研磨成分、より具体的にはシリカ粉末、木材粉末、プラスチック粉末、白亜およびガラスミクロビーズならびにこれらの混合物からなる群からの研磨成分を含有することができる。研磨剤は、本発明のクリーナー中に、好ましくは２０重量％以下の量で、より具体的には５〜１５重量％の量で存在する。
【０１７８】
染料および芳香剤を、本発明の洗剤／クリーナーに添加して、製品によって創製される美的印象を改善し、消費者に所望の洗浄および清浄化性能だけでなく、視覚的および感覚的に「典型的かつ紛れのない」製品をも提供する。適当な芳香油または芳香物質には、個々の芳香化合物、例えばエステル、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルコールおよび炭化水素型の合成生成物が含まれる。エステル型の芳香化合物は、例えば、酢酸ベンジル、イソ酪酸フェノキシエチル、シクロヘキシル酢酸ｐ−ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸リナリル、酢酸ジメチルベンジルカルビニル、酢酸フェニルエチル、安息香酸リナリル、ギ酸ベンジル、エチルメチルフェニルグリシネート、シクロヘキシルプロピオン酸アリル、プロピオン酸スチラリルおよびサリチル酸ベンジルである。エーテルには、例えばベンジルエチルエーテルが含まれ、アルデヒドには、例えば８〜１８個の炭素原子を含む直鎖アルカナール、シトラール、シトロネラール、シトロネリルオキシアセトアルデヒド、シクラメンアルデヒド、ヒドロキシシトロネラール、リリアルおよびボルゲオナールが含まれる。ケトンには、例えば、イオノン、α−イソメチルイオノンおよびメチルセドリルケトンが含まれ、アルコールには、アネトール、シトロネロール、オイゲノール、ゲラニオール、リナロール、フェニルエチルアルコールおよびテルピネオールが含まれ、炭化水素には、特にテルペン、例えばリモネンおよびピネンが含まれる。しかし、種々の芳香剤の混合物（これらは一緒になって魅力的な芳香を生じる）を使用するのが好ましい。このような芳香剤は、植物供給源から得られる天然芳香混合物、例えばパイン、カンキツ、ジャスミン、パチョリ、ローズまたはイランイラン油を含有することもできる。また、サルビア油、カミツレ油、チョウジ油、メリッサ油、ミント油、シナモン葉油、ライム花油、ビャクシン果実油、ベルベチソウ油、オリバヌム油、ガルバヌム油、ラブダナム油、オレンジ花油、ネロリ油、オレンジ果皮油およびビャクダン油も適している。洗剤／クリーナーの染料含量は、通常は０．０１重量％以下であり、一方、芳香剤は、配合物全体の２重量％程度を構成することができる。
【０１７９】
芳香剤を、洗剤／クリーナー中に直接導入することができるが、芳香剤を支持体（洗浄／清浄化する物品への芳香剤の付着を強化し、特に処理した織物に、比較的遅い芳香剤の放出により長期持続性の芳香を与える）に適用するのが有利であることもある。適当な支持体物質は、例えば、シクロデキストリン、シクロデキストリン／芳香剤複合体（所望により、他の助剤で被覆する）である。芳香剤のための別の好ましい支持体は、上記したゼオライトＸであり、これは、界面活性剤の代わりにまたはそれと混合して、芳香剤を吸収することもできる。従って、上記のゼオライトＸおよび芳香剤（好ましくは、少なくとも部分的にゼオライト上に吸収させた）を含有する洗剤／クリーナーが好ましい。
【０１８０】
好ましい染料（これは、当業者により困難なく選択される）は、高い貯蔵安定性を有し、組成物の他の成分および光によって悪影響を受けず、織物繊維に対して顕著な染色性を示さないのでそれを着色しない。
【０１８１】
微生物を制御するために、洗剤／クリーナーは抗微生物剤を含有することができる。抗微生物スペクトルおよび作用機序に依存して、抗微生物剤は、制細菌剤および殺細菌剤、制菌剤および殺菌剤などとして分類される。これら群の重要な代表例は、例えば、ベンズアルコニウムクロリド、アルキルアリールスルホネート、ハロフェノールおよびフェノール水銀アセテートである。本発明の教示において、「抗微生物活性」および「抗微生物剤」なる表現は、例えば、Ｋ．Ｈ．Ｗａｌｌｈａｅｕｓｓｅｒにより「Ｐｒａｘｉｓ ｄｅｒ Ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔｉｏｎ、Ｄｅｓｉｎｆｅｋｔｉｏｎ−Ｋｏｎｓｅｒｖｉｅｒｕｎｇ：Ｋｅｉｍｉｄｅｎｔｉｆｉｚｉｅｒｕｎｇ−Ｂｅｔｒｉｅｂｓｈｙｇｉｅｎｅ」［第５版、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｔｈｉｅｍｅ、１９９５］に定義されているような通常の意味を有し、これに記載されている抗微生物活性を有するあらゆる物質を使用することができる。適当な抗微生物剤は、好ましくは、アルコール、アミン、アルデヒド、抗微生物酸およびその塩、カルボン酸エステル、酸アミド、フェノール、フェノール誘導体、ジフェニル、ジフェニルアルカン、尿素誘導体、酸素および窒素アセタールおよびホルマール、ベンズアミジン、イソチアゾリン、フタルイミド誘導体、ピリジン誘導体、抗微生物性の界面活性化合物、グアニジン、抗微生物両性化合物、キノリン、１，２−ジブロモ−２，４−ジシアノブタン、ヨード−２−プロピルブチルカルバメート、ヨウ素、ヨウ素担体、ペルオキソ化合物、ハロゲン化合物およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１８２】
抗微生物剤は、以下のものから選択することができる：即ち、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ブタン−１，３−ジオール、フェノキシエタノール、１，２−プロピレングリコール、グリセロール、ウンデシレン酸、安息香酸、サリチル酸、ジヒドロ酢酸、ｏ−フェニルフェノール、Ｎ−メチルモルホリンアセトニトリル（ＭＭＡ）、２−ベンジル−４−クロロフェノール、２，２’−メチレン−ビス−（６−ブロモ−４−クロロフェノール）、４，４’−ジクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテル（Ｄｉｃｈｌｏｓａｎ）、２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテル（Ｔｒｉｃｈｌｏｓａｎ）、クロロヘキシジン、Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−３，４−ジクロロフェニル）−尿素、Ｎ，Ｎ’−（１，１０−デカンジイルジ−１−ピリジニル−４−イリデン）−ビス−（１−オクタンアミン）−二塩酸、Ｎ，Ｎ’−ビス−（４−クロロフェニル）−３，１２−ジイミノ−２，４，１１，１３−テトラアザテトラデカン ジイミドアミド、グルコプロタミン、抗微生物の界面活性第四化合物、グアニジン、例えばビおよびポリグアニジン、例えば、１，６−ビス−（２−エチルヘキシルビグアニドヘキサン）−二塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−フェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 四塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−フェニル−Ｎ１，Ｎ１’−メチルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 二塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−ｏ−クロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 二塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−２，６−ジクロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 二塩酸、１，６−ジ−［Ｎ１，Ｎ１’−β−（ｐ−メトキシフェニル）−ジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’］−ヘキサン 二塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−α−メチル−β−フェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 二塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−ｐ−ニトロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 二塩酸、ω：ω−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−フェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ジ−ｎ−プロピルエーテル 二塩酸、ω：ω’−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−ｐ−クロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ジ−ｎ−プロピルエーテル 四塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−２，４−ジクロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 四塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−ｐ−メチルフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン二塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−２，４，５−トリクロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 四塩酸、１，６−ジ−［Ｎ１，Ｎ１’−α−（ｐ−クロロフェニル）−エチルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’］−ヘキサン 二塩酸、ω：ω−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−ｐ−クロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ｍ−キシレン 二塩酸、１，１２−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−ｐ−クロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ドデカン 二塩酸、１，１０−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−フェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−デカン 四塩酸、１，１２−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−フェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ドデカン 四塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−ｏ−クロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５��）−ヘキサン 二塩酸、１，６−ジ−（Ｎ１，Ｎ１’−ｏ−クロロフェニルジグアニド−Ｎ５，Ｎ５’）−ヘキサン 四塩酸、エチレン−ビス−（１−トリルビグアニド）、エチレン−ビス−（ｐ−トリルビグアニド）、エチレン−ビス−（３，５−ジメチルフェニルビグアニド）、エチレン−ビス−（ｐ−ｔｅｒｔ−アミルフェニルビグアニド）、エチレン−ビス−（ノニルフェニルビグアニド）、エチレン−ビス−（フェニルビグアニド）、エチレン−ビス−（Ｎ−ブチルフェニルビグアニド）、エチレン−ビス−（２，５−ジエトキシフェニルビグアニド）、エチレン−ビス−（２，４−ジメチルフェニルビグアニド）、エチレン−ビス−（ｏ−ジフェニルビグアニド）、エチレン−ビス−（混合アミルナフチルビグアニド）、Ｎ−ブチルエチレン−ビス−（フェニルビグアニド）、トリメチレン−ビス−（ｏ−トリルビグアニド）、Ｎ−ブチルトリメチレン−ビス−（フェニルビグアニド）、ならびに、これらの対応する塩、例えば酢酸塩、グルコン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、クエン酸塩、重亜硫酸塩、フッ化物、ポリマレイン酸塩、Ｎ−ヤシ油アルキルサルコシン塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、パーフルオロオクタン酸塩、ケイ酸塩、ソルビン酸塩、サリチル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、イミノ二酢酸塩、ケイ皮酸塩、チオシアン酸塩、アルギン酸塩、ピロメリト酸塩、テトラカルボキシ酪酸塩、安息香酸塩、グルタル酸塩、モノフルオロリン酸塩、パーフルオロプロピオン酸塩、ならびに、これらの混合物から選択することができる。また、ハロゲン化キシレンおよびクレゾール誘導体、例えばｐ−クロロ−ｍ−クレゾールまたはｐ−クロロ−ｍ−キシレン、ならびに、植物起源（例えば、スパイスまたはハーブ由来）、動物および微生物起源の天然の抗微生物剤も適している。好ましい抗微生物剤は、抗微生物性の界面活性第四化合物、植物起源の天然の抗微生物剤および／または動物起源の天然の抗微生物剤であり、最も好ましくは、カフェイン、テオブロミンおよびテオフィリンおよび精油（例えば、オイゲノール、チモールおよびゲラニオール）からなる群からの少なくとも１つの植物起源の天然の抗微生物剤、および／または、酵素（例えば、ミルクからのタンパク質、リゾチームおよびラクトペルオキシダーゼ）からなる群からの少なくとも１つの動物起源の天然の抗微生物剤、および／または、アンモニウム、スルホニウム、ホスホニウム、ヨードニウムまたはアルソニウム基を含む少なくとも１つの抗微生物性の界面活性第四化合物、ペルオキソ化合物および塩素化合物である。また、微生物起源の物質、いわゆるバクテリオジン（ｂａｃｔｅｒｉｏｚｉｎｅ）を使用することもできる。
【０１８３】
抗微生物剤として適する第四アンモニウム化合物［クアット（ＱＵＡＴ）］は、一般式：（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）（Ｒ４）Ｎ＋Ｘ− ［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、同一または異なって、Ｃ１−２２アルキル基、Ｃ７−２８アラルキル基、または複素環式基（２個またはピリジンなどの芳香族化合物の場合には３個の基が、窒素原子と一緒になって複素環、例えばピリジニウムまたはイミダゾリニウム化合物を形成する）を表し、Ｘ−は、ハライドイオン、スルフェートイオン、ヒドロキシドイオンまたは同様の陰イオンを表す］で示される。最適の抗微生物活性のためには、少なくとも１つの置換基は、８〜１８個、より好ましくは１２〜１６個の炭素原子の鎖長を有しているのが好ましい。
【０１８４】
クアットは、第三アミンとアルキル化剤（例えば、塩化メチル、塩化ベンジル、硫酸ジメチル、臭化ドデシル、さらにエチレンオキシドなど）との反応によって得ることができる。１つの長いアルキル鎖および２つのメチル基による第三アミンのアルキル化が特に簡単である。また、２つの長い鎖および１つのメチル基を含む第三アミンの第四級化は、塩化メチルを用いて穏やかな条件下で行うことができる。３つの長いアルキル鎖またはヒドロキシ置換アルキル鎖を含むアミンは、反応性を欠いており、硫酸ジメチルを用いて第四級化するのが好ましい。
【０１８５】
適当なＱＵＡＴは、例えば、ベンズアルコニウムクロリド（Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ＣＡＳ Ｎｏ．８００１−５４−５）、ベンザルコンＢ（ｍ，ｐ−ジクロロベンジルジメチル−Ｃ１２アルキルアンモニウムクロリド、ＣＡＳ Ｎｏ．５８３９０−７８−６）、ベンズオキソニウムクロリド（ベンジルドデシル−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−アンモニウムクロリド）、セトリモニウムブロミド（Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド、ＣＡＳ Ｎｏ．５７−０９−０）、ベンズエトニウムクロリド（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２−［２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ］−エチル］−ベンジルアンモニウムクロリド、ＣＡＳ Ｎｏ．１２１−５４−０）、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド、例えばジ−ｎ−デシルジメチルアンモニウムクロリド（ＣＡＳ Ｎｏ．７１７３−５１−５−５）、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＣＡＳ Ｎｏ．２３９０−６８−３）、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド、１−セチルピリジニウムクロリド（ＣＡＳ Ｎｏ．１２３−０３−５）およびヨウ化チアゾリン（ＣＡＳ Ｎｏ．１５７６４−４８−１）ならびにこれらの混合物である。特に好ましいＱＵＡＴは、Ｃ８−１８アルキル基を含むベンズアルコニウムクロリド、より具体的にはＣ１２−１４アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドである。
【０１８６】
ベンズアルコニウムハロゲン化物および／または置換ベンズアルコニウムハロゲン化物は、例えば、ＬｏｎｚａからＢａｒｑｕａｔＲとして、ＭａｓｏｎからＭａｒｑｕａｔＲとして、Ｗｉｔｃｏ／ＳｈｅｒｅｘからＶａｒｉｑｕａｔＲとして、ＬｏｎｚａからＨｙａｍｉｎｅＲとして、およびＬｏｎｚａからＢａｒｄａｃＲとして市販されている。他の市販の抗微生物剤は、Ｎ−（３−クロロアリル）−ヘキサミニウムクロリド、例えばＤｏｗからのＤｏｗｉｃｉｄｅＲおよびＤｏｗｉｃｉｌＲ、ベンズエトニウムクロリド、例えばＲｏｈｍ ＆ ＨａａｓからのＨｙａｍｉｎｅＲ １６２２、メチルベンズエトニウムクロリド、例えばＲｏｈｍ ＆ ＨａａｓからのＨｙａｍｉｎｅＲ １０Ｘ、セチルピリジニウムクロリド、例えばＭｅｒｒｅｌｌ Ｌａｂｓからのセパコール（ｃｅｐａｃｏｌ）クロリドである。
【０１８７】
抗微生物剤は、０．０００１〜１重量％の量で、好ましくは０．００１〜０．８重量％の量で、より好ましくは０．００５〜０．３重量％の量で、最も好ましくは０．０１〜０．２重量％の量で使用される。
【０１８８】
さらに、本組成物は、所望により、処理した織物上に吸収され、繊維の光安定性および／または他の配合物成分の光安定性を改善するＵＶ吸収剤を含有することができる。ＵＶ吸収剤は、紫外線を吸収することができ、吸収したエネルギーを、より長い波長の放射（例えば、熱）の形態で放出することができる有機物質（光フィルター）である。
【０１８９】
このような所望の性質を有する化合物は、例えば、放射のない不活性化によって作用する化合物ならびに２位および／または４位に置換基を有するベンゾフェノンの誘導体である。他の適当なＵＶ吸収剤は、置換ベンゾトリアゾール、３−フェニル置換アクリレート（所望により２位にシアノ基を有するケイ皮酸誘導体）、サリチレート、有機Ｎｉ錯体および天然物質、例えばウンベリフェロンおよび身体自体のウロカニン酸である。特に重要な物質は、ビフェニル、特に、スチルベン誘導体（例えば、ＥＰ０７２８７４９Ａに記載されている）であり、これは、ＴｉｎｏｓｏｒｂＲ ＦＤおよびＴｉｎｏｓｏｒｂＲ ＦＲ ｅｘ Ｃｉｂａとして市販されている。適当なＵＶ−Ｂ吸収剤には、以下のものが含まれる：即ち、３−ベンジリデンカンファーまたは３−ベンジリデンノルカンファーおよびこれらの誘導体、例えば３−（４−メチルベンジリデン）−カンファー（ＥＰ０６９３４７１Ｂ１に記載）；４−アミノ安息香酸誘導体、好ましくは４−（ジメチルアミノ）−安息香酸−２−エチルヘキシルエステル、４−（ジメチルアミノ）−安息香酸−２−オクチルエステルおよび４−（ジメチルアミノ）−安息香酸アミルエステル；ケイ皮酸のエステル、好ましくは４−メトキシケイ皮酸−２−エチルヘキシルエステル、４−メトキシケイ皮酸プロピルエステル、４−メトキシケイ皮酸イソアミルエステル、２−シアノ−３，３−フェニルケイ皮酸−２−エチルヘキシルエステル（Ｏｃｔｏｃｒｙｌｅｎｅ）；サリチル酸のエステル、好ましくはサリチル酸−２−エチルヘキシルエステル、サリチル酸−４−イソプロピルベンジルエステル、サリチル酸ホモメンチルエステル；ベンゾフェノンの誘導体、好ましくは２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４’−メチルベンゾフェノン、２，２’−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン；ベンザルマロン酸のエステル、好ましくは４−メトキシベンズマロン酸 ジ−２−エチルヘキシルエステル；トリアジン誘導体、例えば、２，４，６−トリアニリノ−（ｐ−カルボ−２’−エチル−１’−ヘキシルオキシ）−１，３，５−トリアジンおよびオクチルトリアゾン（ＥＰ０８１８４５０Ａ１に記載）またはジオクチルブタミドトリアゾン（ＵｖａｓｏｒｂＲ ＨＥＢ）；プロパン−１，３−ジオン、例えば、１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）−プロパン−１，３−ジオンケトトリシクロ（５．２．１．０）デカン誘導体（ＥＰ０６９４５２１Ｂ１に記載）が含まれる。他の適当なＵＶ−Ｂ吸収剤は、２−フェニルベンズイミダゾール−５−スルホン酸ならびにそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム、アルカノールアンモニウムおよびグルクアンモニウム塩；ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体、好ましくは２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸およびその塩；３−ベンジリデンカンファーのスルホン酸誘導体、例えば、４−（２−オキソ−３−ボルニリデンメチル）−ベンゼンスルホン酸および２−メチル−５−（２−オキソ−３−ボルニリデン）−スルホン酸およびその塩である。
【０１９０】
通常のＵＶ−Ａフィルターは、特に、ベンゾイルメタンの誘導体、例えば、１−（４’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）−プロパン−１，３−ジオン、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン（Ｐａｒｓｏｌ １７８９）、１−フェニル−３−（４’−イソプロピルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンならびにＤＥ１９７１２０３３Ａ１（ＢＡＳＦ）に記載のエナミン化合物である。これらＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂフィルターを、もちろん混合物の形態で使用することもできる。上記した可溶性物質に加えて、不溶性の光遮断顔料、即ち、微細に分散させた好ましくは「ナノ化」した金属酸化物または塩を、この目的に使用することもできる。適当な金属酸化物の例は、特に、酸化亜鉛および二酸化チタンならびに鉄、ジルコニウム、ケイ素、マンガン、アルミニウムおよびセリウムの酸化物ならびにこれらの混合物である。ケイ酸塩（タルカム）、硫酸バリウムおよびステアリン酸亜鉛を、塩として使用することもできる。これらの酸化物および塩を、皮膚ケアおよび皮膚保護エマルジョンならびに化粧品のための顔料の形態で使用する。これらの粒子は、１００ｎｍ未満、好ましくは５〜５０ｎｍ、より好ましくは１５〜３０ｎｍの平均直径を有しているべきである。これらは、球形であってよいが、楕円形の粒子または他の非球形の粒子を使用することもできる。また、これら顔料は、表面処理、即ち親水性化または疎水性化されていてもよい。その代表例は、被覆された二酸化チタン、例えば、Ｔｉｔａｎｄｉｏｘｉｄ Ｔ８０５（Ｄｅｇｕｓｓａ）およびＥｕｓｏｌｅｘＲ Ｔ２０００（Ｍｅｒｃｋ）である。適当な疎水性の被覆材料は、特にシリコーンであり、とりわけ、トリアルコキシオクチルシランまたはシメチコーンである。ミクロ化した酸化亜鉛を使用するのが好ましい。他の適当なＵＶフィルターは、Ｐ．Ｆｉｎｋｅｌの概説［ＳＯＥＦＷ−Ｊｏｕｒｎａｌ １２２、５４３ （１９９６）］中に見ることができる。
【０１９１】
ＵＶ吸収剤は、通常は０．０１〜５重量％、好ましくは０．０３〜１重量％の量で使用される。
【０１９２】
また、本発明のタンパク質および／または他のタンパク質は、洗剤およびクリーナーにおいて特別の保護を必要とすることもある。本発明の組成物は、この目的のために安定剤を含有することができる。
【０１９３】
安定剤の１つの群は、洗浄液において組成物を希釈したときに解離する可逆性プロテアーゼ阻害剤である。ベンズアミジン塩酸塩およびロイペプチンが、この目的に確立されている。ホウ砂、ホウ酸、ホウ素酸またはこれらの塩もしくはエステル、特に、例えばＷＯ９５／１２６５５に従って芳香族基によりオルト置換された、ＷＯ９２／１９７０７に従って芳香族基によりメタ置換された、およびＵＳ５，９７２，８７３に従って芳香族基によりパラ置換されたフェニルホウ素酸またはその塩もしくはエステルが、この目的に使用されることが多い。ＷＯ９８／１３４６０およびＥＰ５８３５３４は、洗剤プロテアーゼの可逆性の阻害のために、ペプチドアルデヒド、即ち還元されたＣ末端を有するオリゴペプチド、特に２〜５０モノマーのオリゴペプチドを開示している。これらペプチド性の可逆性プロテアーゼ阻害剤には、特にオボムコイド（ＷＯ９３／００４１８）が含まれる。例えば、ＷＯ００／０１８２６は、プロテアーゼ含有の組成物において使用するための、プロテアーゼ スブチリシンの特異的な可逆性ペプチド阻害剤を開示しており、一方、ＷＯ００／０１８３１は、対応するプロテアーゼと阻害剤の融合タンパク質を開示している。
【０１９４】
他の酵素安定剤は、アミノアルコール、例えばモノ、ジ、トリエタノールアミンおよびモノ、ジ、トリプロパノールアミンおよびこれらの混合物、例えばＥＰ０３７８２６１およびＷＯ９７／０５２２７から既知であるＣ１２までの脂肪族カルボン酸、例えばコハク酸、他のジカルボン酸またはこれら酸の塩である。末端キャップした脂肪酸アミドアルコキシレートが、この目的にドイツ特許出願ＤＥ１９６５０５３７に開示されている。ビルダーとして使用されるある種の有機酸が、ＷＯ９７／１８２８７に開示されているように、存在する酵素をさらに安定化することができる。
【０１９５】
低級脂肪アルコール、特にポリオール、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはソルビトールが、他の頻繁に使用される酵素安定剤である。より最近の出願（ＥＰ０９６５２６８）によれば、ジグリセロホスフェートも、物理的影響による変性に対して安定化する。この目的にＥＰ００２８８６５に開示されているカルシウム塩、例えば酢酸カルシウムまたはギ酸カルシウム、ならびに、例えば欧州特許出願ＥＰ０３７８２６２に記載されているマグネシウム塩も使用される。
【０１９６】
ポリアミドオリゴマー（ＷＯ９９／４３７８０）またはポリマー性化合物、例えばリグニン（ＷＯ９７／００９３２）、水溶性ビニルコポリマー（ＥＰ８２８７６２）、あるいは、ＥＰ７０２７１２に開示されているように、セルロースエーテル、アクリルポリマーおよび／またはポリアミドは、特に物理的影響またはｐＨ変動に対して酵素調製物を安定化する。ポリアミン−Ｎ−オキシド（ＥＰ５８７５５０およびＥＰ５８１７５１）を含有するポリマーは、酵素安定剤および染料移行抑制剤として同時に作用する。他のポリマー安定剤は、ＷＯ９７／０５２２７に、他の構成成分に加えて開示されている直鎖Ｃ８−１８ポリオキシアルキレンである。アルキルポリグリコシドは、ＷＯ９７／４３３７７およびＷＯ９８／４５３９６に開示されているように、本発明の組成物の酵素成分を安定化し、さらに、その性能を高めることができる。架橋したＮ−含有化合物は、ＷＯ９８／１７７６４に開示されているように、汚れ遊離剤および酵素安定剤として二重の役割を果たす。ＷＯ９７／３２９５８に記載の、疎水性の非イオン性ポリマーと他の安定剤との混合物は、セルラーゼに対して安定化作用を有するので、これらまたは同様の構成が、本発明に必須の酵素にも適しうる。
【０１９７】
還元剤および酸化防止剤は、特にＥＰ７８０４６６に開示されているように、酸化分解に対する酵素の安定性を増大させる。イオウ含有の還元剤が、例えば、ＥＰ００８０７４８およびＥＰ００８０２２３から既知である。他の例は、亜硫酸ナトリウム（ＥＰ５３３２３９）および還元糖（ＥＰ６５６０５８）である。
【０１９８】
多くの場合に、安定剤の組合わせも使用される。例えばポリオール、ホウ酸および／またはホウ砂の組合わせ（ＷＯ９６／３１５８９）、ホウ酸またはボレート、還元性塩およびコハク酸または他のジカルボン酸の組合わせ（ＥＰ１２６５０５）、あるいは、ホウ酸またはボレートとポリオールまたはポリアミノ化合物との、および還元性塩との組合わせ（ＥＰ０８０２２３）が使用される。ＷＯ９８／１３４６２によれば、ペプチド／アルデヒド安定剤の効果が、ホウ酸および／またはホウ酸誘導体およびポリオールとの組合わせによって高められ、ＷＯ９８／１３４５９によれば、カルシウムイオンの追加使用によってさらに高められる。
【０１９９】
安定化された酵素活性を有する組成物は、本発明の好ましい態様である。上記した方法のいくつかで安定化された酵素を含有する組成物が特に好ましい。
【０２００】
本発明の組成物は、本発明に必須のタンパク質または誘導体を、好ましくは０．０００００１〜５重量％の量で、さらに好ましくは０．００００５〜４重量％、０．００００１〜３重量％、０．０００１〜２重量％の量で、最も好ましい態様においては０．００１〜１重量％の量で含有する。タンパク質濃度は、既知の方法、例えばＢＣＡ法（ビシンコニン酸；２，２’−ビキノリル−４，４’−ジカルボン酸）またはビウレット法［Ａ．Ｇ．Ｇｏｒｎａｌｌ、Ｃ．Ｓ．ＢａｒｄａｗｉｌｌおよびＭ．Ｍ．Ｄａｖｉｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １７７、（１９４８）、ｐ．７５１−７６６］によって測定することができる。
【０２０１】
本発明に必須のタンパク質に加えて、本発明の組成物は、他のデンプン分解酵素、より具体的にはα−アミラーゼを含有することができる。また、これら酵素には、冒頭に挙げた洗剤／クリーナーにおける使用が確立されている酵素も含まれる。市販アミラーゼの例は、ＢＡＮＲ、ＴｅｒｍａｍｙｌＲ、ＰｕｒａｓｔａｒＲ、Ａｍｙｌａｓｅ−ＬＴＲ、ＭａｘａｍｙｌＲ、ＤｕｒａｍｙｌＲおよび／またはＰｕｒａｆｅｃｔＲ Ｏｘ−Ａｍである。これは、種々の酵素が互いに相補することができるときに望ましい。このような相補は、例えば調節の意味で、例えば相互の活性化または不活性化により起こることができる。これは、例えば、本発明に必須ではないデンプン分解活性に対して影響を有する、既知のα−アミラーゼに相同ではない、本発明に必須の酵素の少なくとも一部によって起こりうる。
【０２０２】
しかし、組合わせ使用は、異なる基質特異性の観点から適切になることもある。両方が本発明の態様である。
【０２０３】
特に化学的に異なる汚れについては、洗剤／クリーナーにおいてデンプン分解酵素を、他の洗浄性酵素および／または清浄化活性を有する酵素と共に使用するのが有利であることもある。従って、本発明のタンパク質に加えて他の酵素により特徴付けられる洗剤／クリーナーが、本発明の好ましい態様である。
【０２０４】
他のアミラーゼに加えて、例えばプロテアーゼ、これら他の酵素には、例えば、リパーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよび／またはキシラナーゼおよびこれらの混合物が含まれる。プロテアーゼ、リパーゼ、β−グルカナーゼおよび／またはセルラーゼが特に好ましい。他の酵素は、その特定の特異的な酵素活性により、対応する組成物に清浄化性能を付加する。これらには、例えば、酵素漂白系の成分としてのオキシドレダクターゼまたはペルオキシダーゼ、ラッカーゼ（ＷＯ００／３９３０６）、β−グルカナーゼ（ＷＯ９９／０６５１５およびＷＯ９９／０６５１６）またはペクチン溶解酵素（ＷＯ００／４２１４５）（これらは、特に特殊洗剤において使用される）が含まれる。
【０２０５】
本発明の組成物において使用するための市販酵素の例は、プロテアーゼ、例えばスブチリシンＢＰＮ’、ＰｒｏｐｅｒａｓｅＲ、ＢＬＡＰＲ、ＯｐｔｉｍａｓｅＲ、ＯｐｔｉｃｌｅａｎＲ、ＭａｘａｔａｓｅＲ、ＭａｘａｃａｌＲ、ＭａｘａｐｅｍＲ、ＡｌｃａｌａｓｅＲ、ＥｓｐｅｒａｓｅＲ、ＳａｖｉｎａｓｅＲ、ＤｕｒａｚｙｍＲ、ＥｖｅｒｌａｓｅＲおよび／またはＰｕｒａｆｅｃｔＲ ＧまたはＰｕｒａｆｅｃｔＲ ＯｘＰ、およびリパーゼ、例えばＬｉｐｏｌａｓｅＲ、ＬｉｐｏｍａｘＲ、ＬｕｍａｆａｓｔＲおよび／またはＬｉｐｏｚｙｍＲである。
【０２０６】
このような組成物におけるプロテアーゼ活性を、Ｔｅｎｓｉｄｅ、Ｖｏｌ．７ （１９７０）、ｐ．１２５−１３２に記載されている方法によって測定することができる。これによれば、活性はＰＵ（プロテアーゼ単位）で表される。好ましい組成物のプロテアーゼ活性は、約１，５００，０００プロテアーゼ単位／ｇ調製物［ＰＵ、Ｔｅｎｓｉｄｅ、Ｖｏｌ．７ （１９７０）、ｐ．１２５−１３２に記載の方法によって測定したとき］であることができる。
【０２０７】
その単離に関する限り、適当な酵素は、特に微生物から、例えば細菌または菌類から、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａから得られる酵素、より具体的にはこれらの菌株または他の菌株との混合物によって天然に生成される酵素混合物である。これらは、例えば、ドイツ特許出願公開ＤＥ１９４０４８８およびＤＥ２１２１３９７、米国特許ＵＳ３，６２３，９５７およびＵＳ４，２６４，７３８、欧州特許出願ＥＰ００６６３８ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７９２に記載されている適当な微生物から、発酵法により既知のように単離される。
【０２０８】
また、これらの所望による追加の酵素を、例えば欧州特許ＥＰ０５６４４７６または国際特許出願ＷＯ９４／２３００５に記載されているように、担体上に吸着させ、そして／または膜材料中に封入して、これらを早すぎる不活性化から保護することもできる。これらは、洗剤中に好ましくは１０重量％まで、より具体的には０．２〜２重量％の量で存在し、例えば国際特許出願ＷＯ９４／１８３１４から既知のように、酸化分解に対して安定化された酵素が特に好ましい。
【０２０９】
本発明の組成物は、例えば存在する活性成分を時間的または空間的に互いに独立して放出させるために、いくつかの相からなっていてよい。これらの相は、種々の集合状態にあってよいが、特定の態様においては、同じ集合状態の２相にある。
【０２１０】
いくつかの固体成分から構成される本発明の組成物は、全体として緩やかな形態で、種々の成分および／または互いに異なる放出挙動を有する種々の粉末または顆粒を混合することによって容易に製造することができる。固体、単相または多相の本発明の組成物の製造は、例えば噴霧乾燥または顆粒化によって、既知のように行うことができ、酵素および所望による他の熱感受性成分（例えば、漂白剤など）は、所望により後の段階で別に添加する。高い嵩密度、より具体的には６５０〜９５０ｇ／Ｌの範囲内の嵩密度を有する本発明の組成物は、ＥＰ０４８６５９２から既知の押出し工程を含む方法によって製造するのが好ましい。顆粒化に基づく別の好ましい製造方法は、欧州特許ＥＰ０６４２５７６に記載されている。
【０２１１】
タンパク質を、固体の洗剤／クリーナーのために、例えば、乾燥、顆粒化または封入した形態で、あるいは、封入およびさらに乾燥した形態で使用することができる。これを、独立して、即ち独立した相として、あるいは、他の構成成分と共に同じ相中に、圧縮してまたは圧縮せずに添加することができる。ミクロ封入される酵素を固体形態で処理すべきときには、例えば噴霧乾燥、遠心または再可溶化により、後処理によって得られる水溶液から水を除去することができる。このようにして得られた粒子は、通常は５０〜２００μｍの粒子サイズを有する。
【０２１２】
封入された形態は、他の構成成分（例えば、漂白剤など）から酵素を保護するため、あるいは、制御された放出を容易にするために適している。そのサイズに依存して、カプセルは、ミリカプセル、マイクロカプセルまたはナノカプセルとなり、酵素にはマイクロカプセルが特に好ましい。マイクロカプセルは、例えば、特許出願ＷＯ９７／２４１７７およびＤＥ１９９１８２６７に記載されている。酵素溶液とデンプンまたはデンプン誘導体の溶液または懸濁液との混合物から出発する別の可能な封入法においては、洗剤またはクリーナーにおいて使用するのに適する酵素を、デンプンまたはデンプン誘導体中に封入する。１つのこのような封入法が、ドイツ出願ＤＥ１９９５６３８２「ミクロ封入された酵素の製造方法」に記載されている。
【０２１３】
本発明の固体組成物を製造する別の方法は、タブレット化または圧縮である。製造されるタブレットは、単相または多相タブレットであってよい。即ち、この供給形態は、本発明の固体組成物を２つの固相で製造するのを可能にする。単相または多相、単色または多色タブレット（これは、いくつかの層からなることができる）の形態にある本発明の組成物を製造するために、全ての構成成分（場合により、層あたりの構成成分）を、ミキサー中で一緒に混合し、得られた混合物を、通常のタブレットプレス（例えば、偏心プレスまたは回転プレス）において、約５０〜１００ｋＮ／ｃｍ２、好ましくは６０〜７０ｋＮ／ｃｍ２の適用圧力下でタブレット化することができる。特に多層タブレットについては、少なくとも１つの層を予備圧縮するのが有利であることもある。これは、５〜２０ｋＮ／ｃｍ２、より具体的には１０〜１５ｋＮ／ｃｍ２の適用圧力によって行うのが好ましい。このようにして製造されたタブレットは、１０〜５０ｇ、より具体的には１５〜４０ｇの重量を有するのが好ましい。これらタブレットは、円形、卵形または角形およびこれらの変形を含む任意の形状のものであってよい。
【０２１４】
本発明に必須の酵素およびタンパク質（濃縮した水溶液または非水溶液において、通常のように行ったタンパク質の単離および調製から出発する）を、液体、ゲル形態またはペースト形態の本発明の組成物に、例えば、液体形態で、即ち溶液、懸濁液またはエマルジョンとして、さらにゲル形態で、または封入された形態で、または乾燥粉末として添加することができる。通常の溶媒中の溶液の形態にある本発明のこのような洗剤またはクリーナーは、各成分をそのまままたは溶液の形態で自動ミキサーに導入し、各成分を単純に混合することによって製造されるのが普通である。
【０２１５】
本発明の１つの態様は、本発明に必須のタンパク質および／または存在する他のタンパク質のいずれかおよび／または存在する他の成分のいずれかが、マイクロカプセルの形態で添加された、液体、ゲル形態またはペースト形態の組成物である。アミラーゼ感受性材料のカプセルを含有する対応する組成物が特に好ましい。アミラーゼ感受性材料および本発明に必須のデンプン分解酵素を、洗剤またはクリーナーにおいて一緒に使用すると、例えば、デンプン解裂酵素がマイクロカプセルの解裂を助け、従って封入された成分の放出を助けるので、それが、貯蔵中ではなく、そして／または清浄化過程の開始時ではなく、ある一定の時間にのみ放出されるという相乗効果を有することができる。この機序は、種々の成分および種々の種類のカプセルを含有する複合洗剤または清浄化系の基礎を構成することができ、これが本発明の好ましい態様を表す。
【０２１６】
同等の効果が、洗剤またはクリーナーの成分を、少なくとも２つの異なる相、例えば、２またはそれ以上の固体、タブレット形態の洗剤またはクリーナーの一緒に結合させた相、あるいは、同じ粉末形態の洗剤／クリーナー中の種々の顆粒中に分布させたときに観察される。食器洗浄機および洗剤の両方に使用するための２相または多相クリーナーが既に知られている。先に活性化される相中のデンプン分解酵素の活性が、後の相の活性化のために必須である（それがアミラーゼ感受性の膜または被覆によって囲まれているとき、またはアミラーゼ感受性材料が固相の構成部分であり、その部分的または完全な加水分解中に該相が崩壊するとき）。従って、この目的のための本発明に必須の酵素の使用は、本発明の好ましい態様である。
【０２１７】
洗剤／クリーナーの成分は、その性能において互いに適切に助け合うことができる。清浄化性能を増大させるためのアミラーゼおよび染料移行抑制剤の相乗使用が、例えば特許出願ＷＯ９９／６３０３５に開示されている。また、共ビルダーとして同時に使用することができるポリマー（例えば、アルキルポリグリコシドなど）が、存在する酵素の活性および安定性を増大および安定化させうることも知られている（特許出願ＷＯ９８／４５３９６を参照）。さらに、本発明に必須のデンプン分解活性を、上記した他の構成成分のいずれかによって、修飾することもできる（より具体的には、安定化および／または増大させることができる）。従って、本発明の組成物のためにこのように適合させた配合物は、本発明の特に好ましい態様である。これは、特に組成物の洗浄または清浄化性能をこのようにして増大させるときに当てはまる。
【０２１８】
また、本発明の基本的コンセプトは、本発明のデンプン分解タンパク質または誘導体が少なくとも１つの工程において活性になることを特徴とする織物または硬表面を清浄化するための方法に具体化される。
【０２１９】
機械清浄化方法は、多段階清浄化プログラムによって、即ち、清浄化活性を有する種々の成分が互いに異なる時間に清浄化される物品に適用されるということによって区別される。このような方法は、例えば、施設食品調製ユニットの清浄化において適用される。他方において、本発明に必須のタンパク質は、その酵素活性のゆえに、洗剤あるいは洗剤またはクリーナーに特徴的な他の成分の部分的または完全な不存在下であっても、それ自体が炭水化物含有の汚れを攻撃することができる。従って、本発明の１つの態様においては、本発明に必須のタンパク質が、他の清浄化活性の成分なしに、ある一定期間にわたり汚れに作用することからなる、織物または硬表面のための機械清浄化方法を選択することもできる。
【０２２０】
本発明の好ましい態様は、本発明に必須のデンプン分解タンパク質または誘導体が、少なくとも１つの工程において活性になることを特徴とする、あらゆる清浄化方法（手による方法、特に機械清浄化方法を含む）である。このような方法は、織物または適合材料を清浄化するための方法および硬表面を清浄化するための方法の両方であってよい。
【０２２１】
実施例に示すように、本発明に必須のバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのα−アミラーゼは、適当な洗剤またはクリーナーに導入したときに、織物用機械洗剤の洗浄性能を増大させるため、ならびに、食器洗浄機洗剤の清浄化性能を増大させるための両方に適する。
【０２２２】
従って、本発明の他の好ましい態様は、本発明の組成物を少なくとも１つの工程で使用することを特徴とする、あらゆる清浄化方法（手による方法、特に機械清浄化方法を含む）である。このような方法は、織物または同等の材料を清浄化するための方法ならびに硬表面を清浄化するための方法の両方であってよい。
【０２２３】
清浄化方法において、例えば、通常の家庭用食器洗浄機または家庭用洗浄機において使用するのに特に適する本発明のタンパク質またはフラグメントの量は、適用あたり、０．０２〜４００ｍｇのデンプン分解タンパク質またはフラグメント、好ましくは０．０１〜２００ｍｇ、より具体的には０．０２〜１００ｍｇのデンプン分解酵素またはフラグメントである。
【０２２４】
織物または硬表面のための機械清浄化方法の１つの可能な態様においては、０．０００５〜１０ｍｇ／Ｌ洗浄液、好ましくは０．００５〜８ｍｇ／Ｌ洗浄液の活性濃度が、本発明に必須のタンパク質に特に適することがわかった。従って、これらが本発明の好ましい態様である。他の適する態様においては、特に、実質的に同じ量の洗剤に対して５〜５０Ｌの洗浄液を消費する機械が機械清浄化方法に使用されるということを考慮に入れたときには、対応する値は、上記の数字から大きく異なることができる。
【０２２５】
本発明のタンパク質または本発明の組成物の使用が、本発明の別の態様である。この使用は、機械によって、またはあらゆる他の方法（より具体的には、手による方法）において生じうる。これは、全ての種類の材料（より具体的には、織物または硬表面）の清浄化に関する。本発明に必須のタンパク質を、他の洗浄性物質の配合物中に封埋することができるか、あるいは、その性質に依存して、そのようなコンパウンドにほとんど伴われないようにすることもできる。
【０２２６】
別の対応する態様は、織物または硬表面を清浄化するための、より具体的には多段階清浄化方法における、本発明のタンパク質それ自体の使用である。
【０２２７】
好ましい態様は、織物または硬表面を清浄化するために本発明の組成物を使用するあらゆる可能性ある適用である。
【０２２８】
重要な使用は、デンプン分解タンパク質またはフラグメントを、食器洗浄機または洗浄機における適用あたり、０．０２〜４００ｍｇ、好ましくは０．０１〜２００ｍｇ、より具体的には０．０２〜１００ｍｇの量で使用することを特徴とする。
【０２２９】
固体の洗剤またはクリーナーの構成成分の周りの保護層を完全または部分的に溶解するため、あるいは、その中に存在するかまたはそれを取り囲むアミラーゼ感受性材料を有する固相を崩壊させるための、本発明のタンパク質または誘導体の使用が本発明の別の態様である。また、同じことが、デンプン分解タンパク質が、これらの相のいずれかに、それ自体でまたは少なくとも１つの他の洗浄性物質または活性物質（清浄化作用を助ける）と共に存在する態様にも当てはまる。この範囲において、デンプン分解タンパク質は、１を超える相からなる洗剤またはクリーナー中の関連の相または他の相を活性化することが意図されている。硬表面または織物様材料において成分の清浄化効果を生じさせるための成分の放出は、この視点からも特に好ましい。
【０２３０】
液体、ゲル形態またはペースト形態の組成物中の炭水化物含有のカプセル（より具体的には、ナノカプセル、マイクロカプセルまたはミリカプセル）の部分的または完全な溶解を達成するための本発明の酵素の使用は、本発明の態様であり、組成物の封入成分の制御された放出の重要性は、既に上に記載した通りである。この態様は、成分を放出させて硬表面または織物様材料において清浄化効果を生じさせるときに、本発明の特に好ましい態様となる。
【０２３１】
別の態様は、織物製造における粗原料または中間生成物を処理するため、より具体的には綿の糊抜きをするための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０２３２】
織物製造のための粗原料および中間生成物（例えば、綿に基づくもの）は、より良好な加工を容易にするために、その製造中およびさらなる加工中にデンプンで仕上げされる。糸および中間生成物ならびに織物に適用されるこの過程は、サイジングとして知られている。本発明のデンプン分解タンパク質は、サイズ剤、即ちデンプン含有の保護層を除去するのに適している（糊抜き）。
【０２３３】
本発明の別の態様は、デンプンを液化するため、より具体的にはエタノールを製造するための方法であり、この方法は、本発明のタンパク質または誘導体を使用することを特徴とする。
【０２３４】
デンプンを液化するために、水または緩衝液中に膨潤させたデンプンを、デンプン分解酵素と共にインキュベートして、多糖を、より小さな構成成分に解裂させ、最終的には主にマルトースに解裂させる。本発明の酵素は、その生化学的性質が対応する製造方法への容易な組込みを可能にするときに、このような方法またはその工程の１つに使用するのが好ましい。これは、例えば、同じ反応条件を必要とする他の酵素に加えて、方法の工程に導入すべきである場合でありうる。本発明のデンプン分解タンパク質は、生成する生成物が興味の対象であるときに特に好ましい。また、このデンプンの液化は、エタノールまたはその誘導体（例えば、酢酸）を製造するための多段階法における１工程であることもできる。
【０２３５】
本発明の別の態様は、直鎖および／または短鎖オリゴ糖の製造のための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０２３６】
その酵素活性のゆえに、本発明のデンプン分解タンパク質は、比較的短いインキュベート期間の後に、デンプン様ポリマーから比較的高分子量のオリゴ糖（例えば、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースまたはマルトオクタオースなど）を主に生成する。比較的長いインキュベート期間の後に、反応生成物中の低級オリゴ糖（例えば、マルトースまたはマルトトリオースなど）の割合が増加する。ある種の反応生成物が特に重要であるときには、本発明のタンパク質の対応する変異体および／または反応条件を、それに応じて変えることができる。これは、純粋な化合物が主に所望されるのではなく、例えば、ある種の物理的性質だけを有する溶液、懸濁液またはゲルの生成の場合のように、同様の化合物の混合物が所望されるときに、特に重要になる。
【０２３７】
別の態様は、シクロデキストリンの加水分解のための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０２３８】
シクロデキストリンは、α−１，４−グリコシド環式オリゴ糖であり、その中で、６、７または８個のグルコースモノマーのオリゴ糖、α−、β−およびγ−シクロデキストリン（または、シクロヘキサ−、シクロヘプタ−またはシクロオクタ−アミロース）が、最も経済的に重要である。疎水性のゲスト分子（例えば、芳香剤、香味剤または薬学的活性成分など）と共に、これらは、封入化合物を形成することができ、これからゲスト分子を必要に応じて放出することができる。成分の適用分野に依存して、このような封入化合物は、例えば、食品、医薬または化粧品製品の製造のために、例えば、末端消費者のための対応する製品において重要である。従って、シクロデキストリンからの成分の放出は、本発明のタンパク質の実際的な用途である。
【０２３９】
別の態様は、多糖担体またはシクロデキストリンから低分子量化合物を放出させるための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０２４０】
その酵素活性のゆえに、本発明のデンプン分解タンパク質は、他のα−１，４−グリコシド多糖から低分子量化合物を放出させることもできる。シクロデキストリンの場合と同様に、これは、分子レベルで、ならびに、さらに大きい系（例えば、マイクロカプセルの形態で封入された成分など）においても起こることができる。例えばデンプンは、貯蔵中に、例えば酵素（これは、規定量で反応混合物中に導入されるべきである）などの化合物を封入するための確立された材料である。このようなカプセルからの制御された放出過程を、本発明のデンプン分解酵素によって助けることができる。
【０２４１】
別の態様は、食品および／または食品成分の製造のための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０２４２】
動物飼料および／または動物飼料成分の製造のためのタンパク質または誘導体の使用が、本発明の別の態様である。
【０２４３】
デンプンまたはデンプン由来の炭水化物が食品または動物飼料の成分としての役割を果たすときには、デンプン分解活性を、これら物品の製造のために使用することができる。これにより、ポリマー糖に対するモノマーまたはオリゴマーの割合が増加し、これが、食品の味覚、消化性または稠度を有益なものにすることができる。これは、ポリマー糖のレベルを減少させ、甘味のレベルおよび／またはより易溶性の糖を増加させる場合に、ある種の動物飼料の製造のために、さらに、例えばフルーツジュース、ワインまたは他の食品の製造において必要になるであろう。デンプンの液化および／またはエタノールの製造のための上記した応用は、この原理の工業的な変法とみなすことができる。
【０２４４】
さらに、アミラーゼは、新鮮さを失うことによるパンおよび菓子からの味覚の損失を相殺する（失新鮮さ防止効果）。この目的のために、アミラーゼを、パン生地に焼く前に適切に添加する。従って、本発明の好ましい態様は、本発明のタンパク質を、パンおよび菓子の製造に使用する態様である。
【０２４５】
別の態様は、デンプン含有の接着結合を溶解するための、本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０２４６】
本発明のタンパク質または誘導体を使用することを特徴とする、一時的に結合する方法が本発明の別の態様である。
【０２４７】
他の天然物質に加えて、デンプンが、紙製造ならびに異なる紙および板紙の結合におけるバインダーとして、数世紀にわたり使用されている。これは、例えば図および本に当てはまる。長期間の間に、このような紙は、好ましくない影響（例えば、湿気など）のもとに、波状になるかまたは破れることがあり、完全な破壊につながる。このような紙および板紙を回復させるために、接着層を溶解することが必要になることもあるが、これは、本発明のデンプン分解タンパク質の使用によって極めて容易に行われる。植物ポリマー（例えば、デンプンまたはセルロースおよびその水溶性誘導体）が、接着剤またはペーストとして使用されている。この目的のために、これを、初めに水中で膨潤させ、次いで、接着すべき表面に適用した後に乾燥させ、それを基材に固定しなければならない。生成したペーストの接着特性に影響を与えるために、本発明の酵素を、このような水性懸濁液に添加することができる。しかし、この機能の代わりにまたはそれに加えて、乾燥後に長時間にわたり、例えば数年間にわたり、表面において不活性なままにするために、それをペーストに添加することもできる。周囲条件の制御された変化（例えば、湿らせることによる）を用いて、後に酵素を活性化することができ、従ってペーストの溶解を誘導することができる。このようにして、接着した表面を、基材から分離するのが比較的容易になる。この方法において、本発明の酵素は、そのデンプン分解活性により、一時的に結合する方法において分離剤として、あるいは、接着した物品を分離するためのいわゆる「スイッチ」として働く。
【０２４８】
（実施例）
実施例１
唯一の炭素供給源としてデンプンを含む寒天プレートにおいて、選択基準増殖およびハロー形成を有するアミラーゼ生成微生物の微生物学的スクリーニングのための候補は、ＤＳＭＺ（ＤＳＭ ＩＤ９８−５８７、受託番号ＤＳＭ１２３６８）に寄託されているバシラス株であるバシラス種（ＲＮＡ群ＶＩ、好アルカリ性）Ａ７−７を含んでいた。
使用した培養培地は、１５ｇ／Ｌの可溶性デンプン、４ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４および０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏを含有するＹＰＳＳ培地であった。オートクレーブ処理した後、ｐＨを、２０％炭酸ナトリウム溶液で１０．３に調節した。２５ｍｌ量の培地を、シケイン（ｃｈｉｃａｎｅ）を有する滅菌１００ｍｌ三角フラスコに入れ、ＹＰＳＳ寒天プレートにおいて増殖させておいたバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）の培養物を接種した。３０℃／２００ｒｐｍで４８時間にわたり、振盪しながら培養を行った。
【０２４９】
実施例２
唯一の酵素が、以下の精製工程により培養培地から得られた。即ち、培養液上清をエタノールで沈殿させ；タンパク質ペレットを５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中に取り；５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析し；５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を溶離液として用いるＦａｓｔ−ｆｌｏｗ−Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）において陽イオン交換クロマトグラフィーを行い；ＰＤ １０Ｒカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）において、２０ｍＭグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）に対してアミラーゼ含有の通抜けを再緩衝化し；０〜１Ｍ ＮａＣｌの漸増性塩勾配を用い、溶離液として同じ緩衝液を用いて、Ｍｏｎｏ−ＱＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）において陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。アミラーゼは約０．２５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。
【０２５０】
ＢＣＡ法（ビシンコニン酸；２，２’−ビキノリル−４，４’−ジカルボン酸）によって測定したときに、２．６ｍｇのタンパク質が、このようにして２５０ｍｌの培養培地から得られた。このタンパク質は、ＳＤＳゲル電気泳動および銀による着色によって純粋であることが示された。
ＰＨＡＳＴＲ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）における８〜２５％ゲルでの変性ＳＤＳポリアクリルゲル電気泳動において、および、関連のサイズマーカーとの比較において、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのデンプン分解酵素は、分子量５８ｋＤを有する。
ＰＨＡＳＴＲ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）におけるｐＨ３〜９の等電点電気泳動によれば、その等電点は６．０にある。
【０２５１】
精製した酵素のデンプン分解活性を、いわゆるＤＮＳ法によって、即ちジニトロサリチル酸を用いて測定した。この目的のために、デンプンの加水分解において酵素により放出されるオリゴ糖、二糖およびグルコース単位を、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）による還元末端の酸化によって検出する。発色の強さは、生成した切断生成物の数に比例する。この試験は、次のように行う。即ち、トリス／マレイン酸緩衝液（ｐＨ６．５）［１２．１１ｇのトリス＋１１．６１ｇのマレイン酸を１Ｌまで、ｐＨは０．２Ｎ ＮａＯＨで調整する］において、５０℃で１５分間、５０μｌの酵素溶液を１００μｌの１％可溶性デンプンと共にインキュベートした後、還元された糖を、１００℃で２０分間、３００μｌのＤＮＳ溶液（８．８ｇのジニトロサリチル酸、９１５ｍｌの蒸留水、２５０ｇの酒石酸Ｋ−Ｎａ、３３４ｍｌの４．５％ＮａＯＨ、６．３ｇの重亜硫酸ナトリウム）で酸化した。氷浴中で冷却した後、吸収を、光度計によりブランク値に対して５４０ｎｍで検出した。このアッセイは、マルトース濃度系列によって検量する。活性は、μモル還元糖（マルトース基準で）／分・ｍｌで表される。
【０２５２】
この試験によれば、実施例のタンパク質は、明らかにデンプン分解活性を有する。以下において、このようにして測定した活性は、種々の条件下での酵素の安定性のパラメーターとして働く
酵素の温度安定性を、ｐＨ１０での１０分間インキュベートにおいて測定した。室温、３０℃、４０℃および５０℃において、活性は、少なくとも８５％である。４０℃において、このアミラーゼは、９０％残留活性の最大値を有する。６０℃において、この酵素は５０％の活性を有する。６０℃を越える温度においては、この酵素は重大な活性の損失を受けるが、８０〜９０℃において１０％の残留活性をなお有している。
バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのデンプン分解酵素は、４０℃で１０分間インキュベートしたときに、ｐＨ値５〜１２において非常に安定である。ｐＨ値８〜９において、このアミラーゼは１００％まで安定である。より高いｐＨ値およびより低いｐＨ値においては、その活性は徐々に低下するが、この酵素は、ｐＨ５およびｐＨ１２において６５％以上の残留活性をなお有している。
【０２５３】
さらに特徴付けるために、酵素活性に対して妨害の可能性のある因子（例えば、プロテアーゼまたは洗剤）の悪影響を調べた。１０ＨＰＥ／ｍｌのプロテアーゼ ＳａｖｉｎａｓｅＲ［Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク；ＨＰＥ単位は、Ｔｅｎｓｉｄｅ ７ （１９７０）、ｐ．１２５−１３２に報告されている方法によって測定することができる］および０．１％ＳＤＳに、ｐＨ１０／５０℃で１５分間暴露した後に、この酵素は７４％の残留活性を示す。同じ条件下（ｐＨ１０、１５分間、５０℃）で０．１％ＳＤＳに暴露した後に、この酵素は９８％の残留活性を有する。さらにこれらの条件下において、この酵素は、３ｍＭ ＥＤＴＡの存在下に１０％の残留活性を有し、１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下に６５％の残留活性を有する。
【０２５４】
実施例３
全ての分子生物学的方法の工程は、例えば、Ｆｒｉｔｓｃｈ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」と題するマニュアル［Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９］などに記載されている標準的な方法に従った。
内部アミノ酸配列を決定するために、実施例１に従って得られ、実施例２に従って精製したタンパク質を、初めにエタノールで沈殿させ、次いで変性ＳＤＳポリアクリルゲル電気泳動によって分離した。対応するバンドを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから切出した後、その場でトリプシン消化を行い、
得られたペプチドをＨＰＬＣによって分離し、Ｅｄｍａｎ分解およびＭＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって分析した。このようにして得られた多数のトリプシンフラグメントから、以下の２つのフラグメント（Ｄ１およびＤ６）を選択した：
【化５】
2004504837.tif 000008
【０２５５】
対応する縮重ＰＣＲプライマーを、これらのアミノ酸配列から構築した（左側に示す）。これらのヌクレオチド配列を右側に示す（Ｎは任意の塩基を示し；ＨはＡ、ＣまたはＴを示し；ＲはＡまたはＧを示し；ＤはＡ、ＧまたはＴを示す）。
マトリックスとして、普通に調製したバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）の染色体ＤＮＡから、約１，０００ｂｐの大きいフラグメントを、通常のＰＣＲにおいて上記のプライマー対を用いて増幅した。保存のために、このＰＣＲフラグメントを、ベクターｐＧＥＭ−ＴｅａｓｙＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）中にクローン化した。
【０２５６】
実施例４
非放射活性のＤＩＧ−Ｈｉｇｈ−ＰｒｉｍｅＲラベル化キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ、製品Ｎｏ．１２４５８３２）を用いて、精製したＰＣＲフラグメントが、ＤＮＡプローブとして働くようにラベルした。後のハイブリダイゼーションのために、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）菌株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩで開裂させ、０．９％アガロースゲルにより分離した。このＤＮＡを、真空ブロッターにより、正に荷電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に移した。プローブとして使用したＰＣＲフラグメントのＤＮＡハイブリダイゼーションおよび免疫学的検出を、ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ−ＰｒｉｍｅＲ Ｌａｂｅｌｉｎｇ−ａｎｄ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔｓ ＩＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示書に従って行った。標的遺伝子は、見掛けで約３，０００〜４，０００の大きさのＤＮＡ切片に存在することがわかった。このサイズのフラグメントを、０．９％アガロースゲルにより精製し、次いで、制限酵素ＸｂａＩおよびＮｈｅＩで切断したベクターｐＣＢ５６Ｃ（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＢ １０４由来；国際出願ＷＯ９１／０２７９２に記載）中に連結した。アミラーゼ陰性のバシラス・スブチリス菌株に導入した後、アミラーゼ陽性のクローンを、デンプン含有の寒天プレート上でのハロー形成によって同定した。代表的な単離体は、所望の挿入体を保持していた。
【０２５７】
実施例５
得られたプラスミドの配列決定を、標準的な鎖末端法によって行った。このプラスミドは、２，０１５ｂｐのサイズを有する挿入体を含有していた。先端に、所望の酵素のための１，５４５ｂｐの大きさの遺伝子が存在し、これを、本出願の配列プロトコール中の配列番号１として示す。これに、５１６個のアミノ酸のポリペプチドが対応しており、その配列を、配列プロトコール中の配列番号２に示す。このアミノ酸配列から導かれる分子量は５９ｋＤであるか、または、３１個のアミノ酸を含むシグナルペプチドを開裂除去することによって得られる成熟タンパク質については、５５．５ｋＤである。
【０２５８】
２０００年３月１７日に行ったＢＬＡＳＴ法［Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５ （１９９７）、ｐ．３３８９−３４０２］による配列比較は、この酵素をα−アミラーゼと特徴付ける。タンパク質レベルにおいて、このタンパク質の既知タンパク質に対する相同性は、以下の表３に示すように、７１〜９５％同一性である。
【表３】
2004504837.tif 000009
【０２５９】
代表的なタンパク質との整列を図１に示す。全てのタンパク質がα−アミラーゼであるので、実質的な一致に基づいて、本発明の酵素もα−アミラーゼであると考えなければならない。これは、デンプン分解性微生物（実施例１）からの遺伝子の最初の単離ならびに挿入体保持プラスミド（実施例４）を含む形質転換体のデンプン分解活性の発見との線状にある。この産生菌株から得られるデンプン分解タンパク質の性質は、野生型菌株のもの（実施例２）と一致する。このような産生菌株は、実施例４に従って得ることができる。
【０２６０】
実施例６
綿織物を、規格化した条件下に、４種類の異なる汚れＡ（チョコレートムース）、Ｂ（ココアを含むオートムギフレーク）、Ｃ（ココアおよび少量のミルクを含むオートムギフレーク）およびＤ（ジャガイモデンプン）で処理し、このように調製した材料を用いて、種々の洗剤配合物の洗浄性能を、洗濯メーター（ｌａｕｎｄｅｒｏｍｅｔｅｒ）試験にかけた。この試験のために、１：１２の液比を調整し、織物を、３０℃で３０分間洗浄した。用量は、５．８８ｇの特定の洗剤／Ｌ（リットル）洗浄液であった。水硬度は１６°ドイツ硬度であった。
【０２６１】
Ａ、ＢおよびＣのための対照洗剤は、以下の組成（重量％）を有する基本洗剤であった。即ち、４％の直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ナトリウム塩）、４％のＣ１２−１８脂肪アルコールスルフェート（ナトリウム塩）、５．５％のＣ１２−１８脂肪アルコールｘ７ＥＯ、１％のナトリウム石鹸、１１％の炭酸ナトリウム、２．５％の無定形二ケイ酸ナトリウム、２０％の過ホウ酸ナトリウム・四水和物、５．５％のＴＡＥＤ、２５％のゼオライトＡ、４．５％のポリカルボキシレート、０．５％のホスホネート、２．５％の顆粒状発泡抑制剤、５％の硫酸ナトリウム、１％のプロテアーゼ顆粒、残りが水、蛍光増白剤、芳香剤、塩の組成を有していた。種々の試験系列のために、種々のアミラーゼを対照洗剤に添加して、最終濃度が４４ＴＡＵのデンプン分解活性／Ｌ洗浄液になるようにした。
【０２６２】
デンプン分解活性（ＴＡＵによる）を、修飾ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドを用いて測定した。この修飾体の末端グルコース単位は、ベンジリデン基によってブロックされており、これがアミラーゼによって遊離のｐ−ニトロフェニルオリゴ糖に切断され、次いでこれが補助酵素グルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼと反応して、グルコースおよびｐ−ニトロフェノールを生成する。従って、放出されたｐ−ニトロフェノールの量は、アミラーゼ活性に比例する。この測定を、例えば、Ａｂｏｔｔ Ｑｕｉｃｋ−ＳｔａｒｔＲ Ｔｅｓｔｋｉｔ （Ａｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、イリノイ、米国）を用いて行う。試験混合物における吸収（４０５ｎｍ）の増加を、光度計を用いてブランク値に対して３７℃で３分間にわたり検出する。既知活性の酵素標準を、検量に使用する（例えば、２，９００ＴＡＵ／ｇの活性を有するＧｅｎｅｎｃｏｒのＭａｘａｍｙｌＲ／ＰｕｒａｓｔａｒＲ）。評価は、標準の酵素濃度に対して、吸収差ｄＥ（４０５ｎｍ）／分をプロットすることによって行う。
【０２６３】
バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からの本発明のデンプン分解酵素を、ＴｅｒｍａｍｙｌＲ、ＤｕｒａｍｙｌＲおよびＢＡＮＲ（製造元：Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク）と比較した。汚れＤのために使用した洗剤は、同じ基本配合物であったが、Ａ〜Ｃのための対照として使用したプロテアーゼを含まないか、または追加のアミラーゼを含んでいた。
【０２６４】
この実施例においては、ＣＩＥＬＡＢ系における織物の白色度を、標準（これを１００％標準とした）と比較して、Ｍｉｎｏｌｔａ ＣＲ ３１０を用いて洗浄の前後に測定した。得られた結果の差を、それぞれの試験について、以下の表４に示す。５回の測定の平均値が示されている。これらの結果は、使用した洗剤の洗浄性能に対する、存在酵素の寄与を直接的に示すものである。
【表４】
2004504837.tif 000010
【０２６５】
バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのα−アミラーゼが、３種類の参照酵素のどれよりも、汚れＢに対して明らかに良好な洗浄性能を与えることがわかるであろう。他の汚れに対しては、わずかに改善された洗浄性能（誤差限界の範囲内）を示すが、これは、デンプン分解酵素を含まない比較値をなお十分に越えている。この結果は、試験した全ての洗剤配合物が漂白剤（これに、野生型酵素は極めて感受性が高いのが普通である）を含有する限り、なおいっそう明確である。
【０２６６】
実施例７
綿織物を、規格化した条件下に、汚れＢ（ココアを含むオートムギフレーク）およびＣ（ココアおよび少量のミルクを含むオートムギフレーク）で処理した。洗濯メーター試験を、別の洗剤配合物を用いて、実施例１と同様に行った。即ち、ここでの配合物は、以下の組成（重量％）を有していた：１４％のアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、６％の脂肪アルコール硫酸ナトリウム、６％の７ｘエトキシル化Ｃ１２−１８脂肪アルコール、１％の石鹸、２５％のゼオライトＮａＡ、１０％の炭酸ナトリウム、５％のポリマー性ポリカルボキシレート（ＳｏｋａｌａｎＲ ＣＰ５）、１１％のクエン酸三ナトリウム・二水和物、４％のクエン酸、１％の粒状発泡抑制剤、１％のプロテアーゼ顆粒、５％の硫酸ナトリウム、残りが水および塩。種々の試験系列のために、種々のアミラーゼを、この基本配合物に添加して、最終濃度を、３３．５ＴＡＵのデンプン分解活性／Ｌ洗浄液にした（実施例１に記載した方法によって測定した）。バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からの本発明に必須のデンプン分解酵素を、ＴｅｒｍａｍｙｌＲ、ＤｕｒａｍｙｌＲおよびＢＡＮＲ（製造元：Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク）と比較した。用量は、４．４５ｇの特定の洗剤／Ｌ洗浄液であった。
【０２６７】
洗浄後に、織物の白色度を、上記実施例と同様にして測定した。得られた差を表５に示すが、これは５回の測定の平均値である。ここでも、これらの結果は、洗剤の洗浄性能に対する特定酵素の寄与を直接的に示すものである。
【表５】
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【０２６８】
この漂白剤を含まない洗剤配合物中のバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのα−アミラーゼが、参照酵素のどれよりも、汚れＢおよびＣに対して良好な洗浄性能を与えることがわかるであろう。
【０２６９】
実施例８
綿織物を、規格化した条件下に、２種類の異なる種類の市販のミルクココア（ＥおよびＦ）で汚した。次いで、洗濯メーター試験を、実施例１に記載したように行った。使用した対照洗剤は、実施例２の基本洗剤配合物であったが、プロテアーゼを含んでいなかった。種々の試験系列のために、種々のアミラーゼを実施例２と同様に添加した。洗剤を同じ用量で使用した。
【０２７０】
洗浄後に、織物の白色度を、硫酸バリウム（これを１００％標準とした）の白色度と比較して測定した。測定は、４６０ｎｍ（ＵＶ遮断フィルター）、３０ｍｍオリフィス、光沢なし、光の種類Ｄ６５、１０°、ｄ／８°において、Ｄａｔａｃｏｌｏｒ ＳＦ５００−２ 分光計を用いて行った。得られた結果を、％反射として、即ち、硫酸バリウムと比較したときの百分率（％）として、以下の表５に示す。この表は、特定の出発値をも示している。示した値は、５回の測定の平均値であり、使用した洗剤の洗浄性能に対する、存在するデンプン分解酵素の寄与を直接的に示すものである。
【表６】
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【０２７１】
この配合物中のバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのα−アミラーゼが、Ｅの場合には、試験した参照系のどれよりも明らかに良好な洗浄性能を与え、Ｆの場合には、同等の洗浄性能を与えることがわかるであろう。
【０２７２】
実施例９
用途指向性の清浄化試験のために、硬く滑らかな表面を有する容器に、規格化した条件下に、以下の汚れを供した。即ち、Ａ（ＤＩＮオートムギフレーク）、Ｂ（水中で膨潤させたオートムギフレーク）およびＣ（混合デンプン）を供した。この容器を、家庭用食器洗浄機（ＭｉｅｌｅＲ Ｇ ５７５）の通常のプログラムを用いて４５℃で洗浄した。洗剤用量は２０ｇ／清浄化サイクルであり、水硬度は１６°ドイツ硬度であった。
【０２７３】
以下の基本配合物を洗剤として使用した（全ての量が重量％）：５５％のトリポリリン酸ナトリウム（水を含まないものとして表示）、４％の無定形二ケイ酸ナトリウム（水を含まないものとして表示）、２２％の炭酸ナトリウム、９％の過ホウ酸ナトリウム、２％のＴＡＥＤ、２％の非イオン性界面活性剤、１．４％のプロテアーゼ顆粒、残りが水、染料、芳香剤。種々の試験のために、種々のアミラーゼ、即ち、ＴｅｒｍａｍｙｌＲ、ＤｕｒａｍｙｌＲ、ＢＡＮＲ（製造元：Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク）、またはバシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのデンプン分解酵素を、基本配合物に、１５０ＴＡＵのデンプン分解活性／清浄化サイクルの有効量で添加した（実施例１に記載した方法によって測定した）。
【０２７４】
洗浄後に、汚れＡの除去を、ヨウ素／デンプン反応によってヨウ素で着色した後に評価した。評価は、０（＝変化せず、即ち非常に顕著な汚れ）〜１０（＝認識しうる汚れなし）の尺度で視覚的に行った。汚れＢおよびＣの除去を、重量測定により％で測定した。この目的のために、汚した後に清浄化した容器の重量と容器の出発重量の間の差を、清浄化しなかった容器とその出発重量の間の重量差と関連させた。この関連を、除去率（％）とみなすことができる。
【０２７５】
得られた結果を、以下の表７に示す。この表において、結果を、ＡおよびＢについては９回の測定の平均値として、Ｃについては１８回の測定の平均値として示す。これらの結果は、使用した洗剤の清浄化性能に対する、存在酵素の寄与を直接的に示すものである。
【表７】
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【０２７６】
これらの結果は、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのα−アミラーゼが、４５℃の食器洗浄機洗剤において３種全ての汚れに対して、試験した全ての他のアミラーゼよりも、その清浄化性能において優れていることを示すものである。
【０２７７】
実施例１０
硬く滑らかな表面を有する容器に、上記実施例のものと同じ汚れを供し、５５℃で洗浄した。使用した清浄化条件および洗剤の配合も、上記実施例のものと一致していた。
【０２７８】
洗浄後に、汚れＡの除去を、実施例４と同様に、ヨウ素／デンプン反応を用いて、０〜１０の尺度で視覚的に評価した。汚れＢおよびＣの除去は、実施例４と同様に、重量測定により％で測定した。得られた結果を、以下の表８に示す。この表において、結果を、Ａについては９回の測定の平均値として、Ｂについては１０回の測定の平均値として、Ｃについては１８回の測定の平均値として示す。これらの結果は、使用した洗剤の清浄化性能に対する、存在酵素の寄与を直接的に示すものである。
【表８】
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【０２７９】
これらの結果は、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのα−アミラーゼが、５５℃の食器洗浄温度であっても、食器洗浄機洗剤において３種全ての汚れに対して、試験した全ての他のアミラーゼよりも、その清浄化性能において優れていることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からの本発明のデンプン分解酵素と３つの最も類似するアミラーゼの整列図である。図中、１は、バシラス種Ａ７−７（ＤＳＭ１２３６８）からのアミラーゼであり、２は、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ、Ｋｉｍｕｒａ、Ｉｓｈｉｉ、ＴａｋａｎｏおよびＹａｍａｎｅ ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ． １５１ （１９８８）、ｐ．２５−３１］のバシラス種＃７０７からの成熟アミラーゼであり、３は、ＷＯ９６／２３８７３からの配列番号１のアミラーゼであり、４は、ＷＯ９６／２３８７３からの配列番号２のアミラーゼである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004504837.tif 000120
2004504837.tif 000121
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