(57)【要約】治療を必要とする患者の肺へのエアロゾルの送達に適した、生物学的に活性なタンパク質の安定な懸濁物が開示され、これはエタノール中に懸濁された生物学的に活性なタンパク質の粒子を含む。好ましい実施形態において、本発明は、治療を必要とする患者の肺へのエアロゾルの送達に有用な、エタノール中に懸濁された医薬的に有効な量のインシュリンの粒子を含むインシュリンの安定な懸濁物を記載する。患者の気道へ治療に有効な量のタンパク質を送達する方法が記載され、これは電気流体力学的な噴霧手段を使用してタンパク質の安定な懸濁液のエアロゾルを生成することを含み、ここで該懸濁液は、エタノール中に懸濁されたタンパク質の粒子を含む。本発明の安定な該エタノール懸濁物は、より少量（約０．０５％〜約５．０％（Ｗ／Ｖ））の医薬的に許容可能な付形剤と共に、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような、約２０％（Ｖ／Ｖ）までの医薬的に許容可能な処方添加物を任意に含有してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者の気道へエアロゾルを送達させることに適した生物学的に活性なタンパク質の安定な懸濁物であって、エタノール中に懸濁されたタンパク質の粒子を含む当該懸濁物。
【請求項２】
前記エタノールが実質的に無水である請求項１に記載の安定な懸濁物。
【請求項３】
前記エタノールが５％未満の水を含有する請求項１に記載の安定な懸濁物。
【請求項４】
前記エタノールが３％未満の水を含有する請求項１に記載の安定な懸濁物。
【請求項５】
前記生物学的に活性なタンパク質が、酵素、抗体、抗原、ホルモンおよびサイトカインを含む群より選択される請求項１に記載の安定な懸濁物。
【請求項６】
前記治療的に活性なタンパク質がホルモンである請求項５に記載の安定な懸濁物。
【請求項７】
前記治療的に活性なタンパク質がインシュリンである請求項６に記載の安定な懸濁物。
【請求項８】
前記治療的に活性なタンパク質がサイトカインである請求項５に記載の安定な懸濁物。
【請求項９】
前記治療的に活性なタンパク質が第VIII因子である請求項５に記載の安定な懸濁物。
【請求項１０】
前記タンパク質の粒子の大きさが約０．０１μｍ〜約１０．０μｍである請求項１に記載の安定な懸濁物。
【請求項１１】
前記タンパク質の粒子の大きさが約５．０μｍ〜約１０．０μｍである請求項１０に記載の安定な懸濁物。
【請求項１２】
前記タンパク質の粒子の大きさが約０．０１μｍ〜約３．０μｍである請求項１１に記載の安定な懸濁物。
【請求項１３】
前記懸濁物が２０％Ｖ／Ｖまでの処方添加物を含有する請求項１に記載の安定な懸濁物。
【請求項１４】
前記懸濁物の処方添加物が、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択される請求項１３に記載の安定な懸濁物。
【請求項１５】
前記懸濁物が約０．５％〜約５．０％の医薬的に許容可能な付形剤を含有する請求項１に記載の安定な懸濁物。
【請求項１６】
治療を必要とする患者の肺へエアロゾルを送達させるのに役立つインシュリンの安定な懸濁物であって、エタノール中に懸濁された医薬的に有効な量のインシュリンの粒子を含む当該懸濁物。
【請求項１７】
前記インシュリンが、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２００．０ｍｇ／ｍｌの懸濁物の濃度にて懸濁物中に存在する請求項１６に記載の安定な懸濁物。
【請求項１８】
前記インシュリンの粒子の大きさが約０．０１μｍ〜約５．０μｍである請求項１６に記載の安定な懸濁物。
【請求項１９】
前記懸濁物が２０％Ｖ／Ｖまでの処方添加物を含有する請求項１６に記載の安定な懸濁物。
【請求項２０】
前記懸濁物の処方添加物が、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択される請求項１９に記載の安定な懸濁物。
【請求項２１】
前記懸濁物が約０．５％〜約５．０％の医薬的に許容可能な付形剤を含有する請求項１６に記載の安定な懸濁物。
【請求項２２】
治療を必要とする患者の気道へ治療的に有効な量のタンパク質を送達させる方法であって、該方法は静電的な噴霧手段を使用して、前記タンパク質の安定な懸濁液のエアロゾルを生成させることを含み、ここで前記懸濁液がエタノール中に懸濁された前記タンパク質の粒子を含む当該方法。
【請求項２３】
前記タンパク質が、酵素、抗体、抗原、ホルモンおよびサイトカインを含む群より選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療的に活性なタンパク質がホルモンである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ホルモンがインシュリンである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質がサイトカインである請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記サイトカインが第VIII因子である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質の粒子の大きさが約０．０１μｍ〜約１０．０μｍである請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質の粒子の大きさが約５．０μｍ〜約１０．０μｍである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質の粒子の大きさが約０．０１μｍ〜約３．０μｍである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記懸濁物が２０％Ｖ／Ｖまでの処方添加物を含有する請求項２２に記載の安定な懸濁物。
【請求項３２】
前記懸濁処方添加物が、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群より選択される請求項３１に記載の安定な懸濁物。
【請求項３３】
前記懸濁物が約０．５％〜約５．０％の医薬的に許容可能な付形剤を含有する請求項２２に記載の安定な懸濁物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２０００年１２月１日に出願された米国仮出願第 60/250,491 号（代理人整理番号第 22112(1)P）の利益を請求する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は一般的に、エタノール中におけるタンパク質のエアロゾル化可能で安定な懸濁物に関する。本発明の懸濁物は、エアロゾルを生成するための静電的または電気流体力学的なエアロゾル装置を使用する吸入送達に特に適している。
【０００３】
吸入されるエアロゾルによる治療剤の肺送達は、バイオテクノロジーや製薬産業において、益々重要な分野になってきている。ある種の好ましい性質を持った吸入可能なエアロゾルを発生可能な静電的または電気流体力学的な装置は、水のような１種類以上の水性溶媒、アルコールのような有機溶媒、または水性および有機溶媒の混合物を含有する液体処方物をしばしば要求する。
【０００４】
有機溶媒は溶液中のタンパク質の安定性を弱める傾向があるので、タンパク質のような生物学的分子は、ある種の溶媒または溶媒系（例えば、水と有機溶媒との混合物）中で処方することがしばしば難しい。液体溶媒系中に溶解または懸濁されたタンパク質は、化学的または物理的な分解を典型的には受け、このことによって、保管寿命の僅かなまたは全くない処方物になってしまう。与えられた溶媒系中でのタンパク質の安定化は、それ故与えられたタンパク質の活性を維持するために必要である。
【０００５】
医薬的な適用で役立つためには、タンパク質は、そのタンパク質の生物学的機能を減退させない加工および保管条件を要求する。本来の立体構造の消失を妨げるために、タンパク質は、化学的な分解（例えばアミド分解による）と非共有結合的相互作用の崩壊によりもたらされる物理的な不安定化とから保護されなくてはならない。凝集、沈殿、および吸着（特に疎水性表面において）は、そのような崩壊の例である。
【０００６】
最も重要であり普通に使用される治療用タンパク質の１つはインシュリンである。インシュリンは多量体化して凝集体を形成する傾向があり、これはある種の薬物送達系におけるインシュリンの送達を妨げてしまう。この凝集したインシュリンには、要求された薬理学的な特性がないかもしれず、また異常な免疫応答を誘導するかもしれない（Chawla et al., Diabetes 34: 420-425, 1985）。従って持ち運び可能な／移植可能な持続的点滴ポンプ、および制御された放出を行うポリマー製の装置および系のようなより従来型のインシュリン投与にとっては、インシュリンの生物学的活性の維持が不可欠である。更にインシュリン凝集は、生物学的潜在能力における重大な低下および送達経路の閉塞を引き起こし、これによって薬物送達系に関して深刻な合併症を生じ、その患者の血中グルコースレベルを制御する能力を低下させてしまう（Sluzky et al., Biotechnology and Bioengineering 40: 895-903 (1992)）。従って静電的または電気流体力学的なエアロゾルの薬物送達系で利用される液体処方物においてインシュリンおよび他のタンパク質を安定化するための方法に対する要請がある。
【０００７】
ある種の生物学的分子のための安定化の方法論は、当業界で既知である。例えば、WO98/29097 は、粘膜送達を通しての生体有効性を上昇させるための組成物を開示しており、これは生物活性物質と粉末形態の疎水的に誘導された炭水化物との混合物を包含する。同様に、WO99/33853 は誘導炭水化物を開示しており、これは様々な物質を形成することに使用でき、これには固体送達系が包含される。
【０００８】
Hooper et al. (1984) に対して発行された米国特許第 4,439,421 号は、乾燥形態の安定化されたγグロブリン濃縮物を開示しており、これは５および／または６炭糖の、分岐したおよび分岐のないポリマーを包含する多糖を利用する。Magneson et al. (1996) に対して発行された米国特許第 5,547,873 号は、長期の乾燥保管のためにタンパク質を安定化するための組成物を開示しており、これはガラス形成糖を包含している。
【０００９】
関連技術が、ある種の生体分子をある条件下で安定化することにおいて有効である一方、乾燥粉末または他の固体系を主として取り扱い、静電的または電気流体力学的なエアロゾル装置および系における使用に適した液体溶媒系中で、生体分子を安定化するための方法または組成物を提案していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
先行する技術のこれらのおよび他の欠陥は本発明により克服され、本発明は、エアロゾル化したエアロゾルの薬物送達装置であってもよい、液体エタノール処方物中でタンパク質を安定化するための方法および組成物を提供する。これらの新規処方物は拡張された期間に渡って安定であり、このようにして、エアロゾルの薬物送達装置と相容れる、液体中でタンパク質を処方する他の方法よりも明確な利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、治療を必要とする患者の気道（respiratory tract）へのエアロゾルの送達に適した生物学的に活性なタンパク質の安定な懸濁物であって、エタノール中に懸濁された前記タンパク質の粒子を含む懸濁物を指向したものである。好ましい実施形態では、本発明は、治療を必要とする患者の肺へのエアロゾルの送達に有用な、エタノール中に懸濁された医薬的に有効な量のインシュリンの粒子を含むインシュリンの安定な懸濁物を記載している。本発明の安定なエタノール懸濁物は、より少量（約０．０５％〜約５．０％Ｗ／Ｖ）の医薬的に許容可能な付形剤と共に、約２０％（Ｖ／Ｖ）までのグリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような医薬的に許容可能な処方添加物を任意に含有してもよい。
【００１２】
本発明は更に、電気流体力学的な噴霧手段を使用してタンパク質の安定な懸濁液のエアロゾルを生成させることを含む、治療の必要な患者の気道へ治療に有効な量の前記タンパク質を送達する方法を指向し、ここで前記懸濁液は、エタノール中に懸濁された前記タンパク質の粒子を含む。
【００１３】
本発明によれば、エタノール中でタンパク質を安定化するための１つの方法は、タンパク質でエタノールを過飽和にすることによってエタノール中にタンパク質の懸濁物を作り、これによってタンパク質の結晶の形成を促進する段階を含む。他の方法では、タンパク質の結晶が高濃度でエタノールに加えられて懸濁物を形成し、このことによって、該タンパク質は結晶化したままで溶解しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、治療を必要とする患者の気道へのエアロゾルの送達に適した生物学的に活性なタンパク質の、エタノール中に懸濁された前記タンパク質の粒子を含む安定な懸濁物を指向したものである。好ましい実施形態では、本発明は、治療を必要とする患者の肺へのエアロゾルの送達に有用な、エタノール中に懸濁された医薬的に有効な量のインシュリンの粒子を含むインシュリンの安定な懸濁物を記載している。本発明の安定なエタノール懸濁物は、より少量（約０．０５％〜約５．０％Ｗ／Ｖ）の医薬的に許容可能な付形剤と共に、約２０％（Ｖ／Ｖ）までのグリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような、医薬的に許容可能な処方添加物を任意に含有してもよい。
【００１５】
本発明は更に、治療を必要とする患者の気道へ治療に有効な量のタンパク質を送達する方法であって、該方法は電気流体力学的な噴霧手段を使用して、前記タンパク質の安定な懸濁液のエアロゾルを生成することを含み、ここで前記懸濁液がエタノール中に懸濁された前記タンパク質の粒子を含む当該方法を指向したものである。
【００１６】
本発明によれば、エタノール中でタンパク質を安定化するための１つの方法は、タンパク質でエタノールを過飽和にすることによって、インシュリンのようなタンパク質のエタノール中の懸濁物を作ることを含む。好ましくはタンパク質分子は、タンパク質の結晶の形成を促進する濃度で、エタノール中に溶解または懸濁される。他の方法では、タンパク質の結晶は高濃度でエタノールに加えられて懸濁物を形成し、このことによって、タンパク質は結晶化したままであって溶解しない。本発明の好ましい実施形態では、この生物学的分子はインシュリンである。
【００１７】
明細書中で使用されるように、文言「安定な」または「安定性」は、タンパク質の生物学的活性の保存を意味するのに使用される。
【００１８】
明細書中で使用されるような文言「懸濁物」は、その通常の意味を与えられており、液体中に懸濁されたタンパク質の粒子、またはタンパク質の粒子の凝集体（アグリゲート）のことをいう。
【００１９】
本発明の安定な懸濁物は、治療用タンパク質の気道への送達のためのエアロゾルを調製するのに有用である。文言「気道（respiratory tract）」は、中咽頭および喉頭を包含する上気道と、これに続き気管支および細気管支への分岐に及ぶ気管を包含する下気道とを包含する。上および下気道は、通動気道と呼ばれる。末端の細気管支はそれから呼吸細気管支へと分岐し、これはそれから最終の呼吸領域である肺胞、即ち深部肺へ至る。Gonda, I., 治療用薬物担体系における臨床総説中の「気道への治療剤および診断剤の送達用エアロゾル」, 6: 273-313, (1990）。通常、深部肺即ち肺胞は、全身送達のための吸入治療用エアロゾルの主要な標的である。
【００２０】
文言「生物学的に活性なタンパク質」は、疾病または状態の処置のための活性薬物として患者へ投与されるタンパク質およびポリペプチドと、診断および試薬目的のために使用されるタンパク質およびポリペプチドとを包含する。酵素（例えば、アスコルビン酸酸化酵素、過酸化酵素、カタラーゼ、グルコース酸化酵素、キモトリプシン、乳酸脱水素酵素およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素）、抗体（例えば Herceptin(登録商標)(trastuzumab)、Orthoclone OKT(登録商標)3(muromonab-CD3)）、ホルモン（例えば、インシュリンおよびヒト成長ホルモン(ＨＧＨ)）、成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)、神経成長因子(ＮＧＦ)、ヒト成長ホルモン放出因子(ＨＧＨＲＦ)）、ならびにサイトカイン（例えば、白血病阻害因子(ＬＩＦ)、顆粒球−コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球巨大食細胞−コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、インターロイキン−６(ＩＬ−６)、インターロイキン−１１(ＩＬ−１１)、インターロイキン−９(ＩＬ−９)、オンコスタチン−Ｍ(ＯＳＭ)）および第VIII因子のような、タンパク質およびポリペプチドが、本発明の組成物中で使用されるために考えられる。
【００２１】
診断試験または in vitro アッセイにおいて使用される酵素および抗体に加えて、文言「生物学的に活性」は、疾病または状態を処置するのに「医薬的に有効な量」で患者へ投与されるタンパク質を包含する。当業者によって認識されるであろうが、「医薬的に有効な量」によって、処置されるべき疾病または状態における治療に適切な効果を持つ医薬タンパク質の量が意味される。治療に妥当な効果は、患者における疾病または状態の１種類以上の症状をある程度和らげ、あるいは疾病または状態に関連または原因となっている１種類以上の生理学的または生化学的パラメータを部分的または完全に正常に戻す。特定の活性なタンパク質薬剤の投薬量の特別な詳細は、そのラベル、つまり米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されたパッケージ挿入物（21 CFR § 201.56 および 201.57 を参照）に見出されることがある。
【００２２】
本発明の安定なタンパク質の懸濁物は、約２０．０％（Ｖ／Ｖ）までの、好ましくは約 １０．０％（Ｗ／Ｖ）未満の処方添加物を任意に含有してもよい。文言「処方添加物」は、医薬的に許容可能な有機物の液体のことであり、これは、静電的な噴霧手段を使用して、タンパク質懸濁液の噴霧能力を高めるために、本発明のエタノール懸濁物に加えられてもよい。多価アルコール、例えばグリセロールおよびプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのようなポリグリコールが、本発明の安定なタンパク質の懸濁物における処方添加物として使用するために考えられる。該処方添加物は医薬的に許容可能であるべきで、つまり米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、ヒトにおける使用にとって安全であると認められるべきである。
【００２３】
当業者によって認識されるであろうように、本発明の安定なタンパク質の懸濁物は、「より少量」つまり約０．０５％〜約５．０％Ｗ／Ｖ、好ましくは約０．０５％〜約１．０％の医薬的に許容可能な付形剤を任意に包含してもよい。医薬的に許容可能な付形剤は、ヒトにおける使用に安全であるとＦＤＡによって認められたものである。界面活性剤（例えばエトキシル化されたドデシルアルコール）、抗酸化剤（例えばビタミンＥおよびアスコルビン酸）、抗菌剤（例えばパラベン）ならびに懸濁剤（例えばポビドン）のような添加物が、本発明での使用のために考えられる。
【００２４】
いかなる特別な付形剤の選択も当業界の技術の範囲内であるが、認識されるであろうように、付形剤を加えるか否か、もしそうならばどの付形剤にするかについての決定は、タンパク質の特別なエタノール懸濁物中での付形剤の目的を考慮に入れながらなされるであろう。
【００２５】
医薬的に許容可能であるためには、本発明の安定な懸濁物中において使用されるいかなる処方添加物または付形剤も、ＦＤＡによってヒトでの使用に安全であると認められるべきである。加えて付形剤は、エタノール懸濁物におけるタンパク質の安定性における、または静電的な噴霧手段を使用しての該懸濁物の噴霧能力における効果を全く持たないか、または最小の効果しか持たないべきである。
【００２６】
タンパク質のエタノール中の懸濁物を含む処方物は、標準的な結晶化技術を使用するか、または単に該タンパク質で該処方物を過飽和することによって調製されてもよい。これらの処方物は保管条件下において、および種々のタンパク質の治療用送達のために使用される条件下において、タンパク質の安定化に有用である。結晶懸濁物は、半固体のスラリーの形態の高濃度（つまり投薬量）の特定のタンパク質を送達するのにも有用である。
【００２７】
一般に、本発明の懸濁物中で使用されるタンパク質の結晶および／またはアグロメレートの粒子の大きさは、直径で約０．０１μｍ〜約１０．０μｍの範囲であろう。もし深部肺へタンパク質を送達することが目的であれば、タンパク質の粒子の大きさは、好ましくは直径で約０．０１μｍ〜約５．０μｍ、より好ましくは直径で約０．０１μｍ〜約３．０μｍの範囲であるべきである。もし上気道へタンパク質を送達することが目的ならば、タンパク質の粒子の大きさは、直径で約５．０μｍ〜約１０．０μｍの範囲でもよい。
【００２８】
本発明の懸濁物中では、無水エタノールを使用するのが好ましいが、「実質的に」無水のエタノール、つまりエタノール中に約５％までまたはこれより少ない水、および好ましくは約３％までまたはこれより少ない水を含有するエタノールを使用してもよい。
【００２９】
本発明の方法は、明細書中で請求される懸濁液を微粉砕するための分配装置を利用する。静電的な手段で（時々「電気流体力学的な」手段として言及される）液体小滴の細かく分割された噴霧を生成する分配装置が知られている。電気流体力学的な（「ＥＨＤ」）噴霧器は、吸入による医薬の投与のための医療において特に役立つ。様々なＥＨＤの装置が当業界で既知であり、例えば米国特許第 6,105,877 号および米国特許第 6,068,199 号に記載されているようなものである。
【００３０】
このようなＥＨＤの装置における小滴噴霧は、噴霧ヘッドまたは噴霧端に位置される液体に対して電場をかけることによって発生する。電場のポテンシャルは、噴霧ヘッドから電荷を帯びた液体小滴の微粉砕物をもたらすのに充分高い。小滴上の電荷は、相互の反発を介して、それらが凝固することを妨げる。
【００３１】
患者へのエアロゾルの吸入の前に、制御された様式で電気流体力学的な微粉砕装置によって生成されたエアロゾル小滴噴霧から、電荷を部分的または全体的に通常取り除く必要がある。
【００３２】
他の方法が使用されてもよいが、微粉砕物の効果的な放電に使用される主要な方法は、鋭いかまたは尖った端を持ち、ＥＨＤ装置の噴霧ヘッドから下流に位置される放電電極を利用する。放電電極は、微粉砕された液体噴霧（エアロゾル）上と等しい大きさの反対電荷を持つ周囲の気体から、電荷を帯びたイオンの雲を生成する。使用において、イオンの雲は引き寄せられて衝突し、これによって液体のエアロゾル噴霧を中和する。
【００３３】
本発明のタンパク質／エタノール懸濁物は、当業者によって認められるであろうＥＨＤ装置と共に使用するのに特に適するが、このような懸濁物は、ネブライザーのような他のエアロゾル発生装置を使用してエアロゾル化することが可能である。肺投薬系、および前もって決定された量の呼吸可能で治療的に活性な物質を患者へ提供するための方法を記載している WO99/44664 を参照のこと。
【００３４】
本発明の様々な実施形態が以下の実施例によって例示されるが、これらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００３５】
（実施例１）
ロシュ・バイオケミカル社から供給された凍結乾燥ヒトインシュリンを使用した。所望のｐＨを得るために、１００ｍｇのインシュリンを、まず２．６６７ｍｌのｐＨ７．４の１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（シグマから供給、Ｐ３８１３）に溶解した。この溶解したインシュリン３５６μｌを、１５ｍｌのポリプロピレンのコニカルチューブ中へ分取し、これを後に２０ｍｇ／ｍｌの懸濁試料に使用した。１．５ｍｇ／ｍｌの濃度でインシュリン懸濁試料を作るために、２６．６７μｌの溶解した該インシュリンを、１５ｍｌのポリプロピレンのコニカルチューブ中へ分取した。該コニカルチューブを、それから細孔のあるパラフィルムで封じ、−１５℃〜−２０℃にて終夜凍結した。翌日に該凍結インシュリン試料を凍結乾燥し、ストッパートレイ（Stoppering Tray）付きのベンチトップ（bench top, Labconco Freeze Dry System）を使用して、細かくて自由に流動する粉末とした。この工程は、本実験の開始２、３日前に開始した。１００％エタノール性のインシュリン試料が、２通り調製された。各試料に対し、４つの時点のものが調製された。凍結乾燥インシュリン粉末を、スペクトルム・ケミカルズ社から供給された、６６７μｌの２００標準濃度エタノール中に懸濁した。「０」日目の試料は、直ちに９．３３ｍｌの０．１％ＴＦＡで希釈し、そうであれば該インシュリン試料の最終濃度は、ＨＰＬＣ標準曲線の範囲内に収まるであろう。該希釈試料はその後、当業界で既知の標準的な技術を使用する逆相ＨＰＬＣ法により分析された。他の時点のものは、パラフィルムで封じられた。４つの異なる条件が検討された。（ｉ）および（ii）の試料は、振とうしながら、および振とうせずに３７℃に維持され、（iii）の試料は振とうしながら４０℃に維持され、および（iv）の試料は振とうせずに室温に維持された。Labline environmental incubator/shaker を、３７℃および４０℃にて、２２０ｒｐｍにて振とうしながら使用した。次の時点に達したら、試料を再び９．３３ｍｌの０．１％ＴＦＡで希釈し、インシュリン活性を求めるために分析した。インシュリンを含有する全ての試料の調製において、沈殿の可能性のため、いかなるインシュリン調製物も音波をかけたり激しく振とうしたりしないよう注意を払った。逆に加える方法を使用して、穏やかに混合した。
【００３６】
表１は、本発明のこの実施形態の利用に由来する安定性データを表す。保持された活性の百分率は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定した。
【００３７】
【表１】
2004535357.tif 000002
【００３８】
（実施例２）
ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社から供給された牛膵臓由来の２級（ＧｒａｄｅII）デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）を使用した。プロテアーゼ阻害剤シグマＰ２７１４を、１バイアルを１００ｍｌのミリＱ水で溶解することによって調製した。シグマにより供給された塩化カルシウムを、ミリＱ水を使用して、７．５ｍｇ／ｍｌの保管溶液中へ入れた。３ｍｇのＤＮａｓｅＩをガラス容器、つまり１型反応バイアル中へ量り取った。各試料につき、４つの時点のものを調製した。試料は、１０ｍｇ／ｍｌか ３０ｍｇ／ｍｌで２通り調製された。１０ｍｇ／ｍｌのインシュリンでのＤＮａｓｅＩの試料については、３００μｌの２００標準濃度エタノールを該反応バイアルに加えた。３０ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ試料を、スペクトルム・ケミカルズ社から供給された１００μｌの２００標準濃度エタノールで懸濁した。「０」日目には、該１０ｍｇ／ｍｌの試料を９．７ｍｌの緩衝液Ａで希釈し、これに対し該３０ｍｇ／ｍｌの試料は９．９ｍｌの緩衝液Ａで希釈した。緩衝液ＡはｐＨ７．７にて、以下の特定された濃度下での化学物質、２４ｍＭのＨｅｐｅｓ（シグマＨ３３７５）、２．４ｍＭ塩化マグネシウム（シグマＭ２６７０）、２．４ｍＭ塩化カルシウム（シグマＣ３８８１）、０．０６％ＢＳＡ（シグマＡ９６４７）、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマＰ７９４９）から構成される。これらの試料をその後、基質としてＤＮＡ−メチルグリーン（シグマＤ２３７６）を利用する染色法を使用して分析した。全ての他の時点のものを密封し、その次の測定時点に達するまで、光およびいかなる振動からも保護されて引き出し中に置かれた。
【００３９】
（試料アッセイの分析）
標準曲線は、以下の濃度１２００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび１２．５μｇ／ｍｌで作成した。該標準曲線は、各９６穴マイクロタイタープレート上のものである。各標準および希釈試料５０μｌを、以前に考案されたプレートマップに従って３通り加えた。該標準および希釈試料に、１５０μｌの０．０８％ＤＮＡ−メチルグリーンを加えた。各希釈試料はそれ自体のブランクを持ち、これはＤＮａｓｅＩを除き、該試料が含有する全てのものを含有する。これらも該プレート上に置かれるが、１５０μｌの緩衝液Ａを、ＤＮＡ−メチルグリーンの代わりにこれらの穴に加えた。全ての穴が適切な溶液を含有したら、それを封じ、１時間のインキュベーションの間ＶＷＲ軌道振とう器上に置いた。
【００４０】
この１時間のインキュベーションの間に、反応停止溶液を調製しておき、水中で５０ｍＭ過酸化水素／５０ｍＭのＥＤＴＡを調製した。１時間のインキュベーション期間が終わった後、該反応停止溶液５０μｌを各穴に加えた。該プレートを回収し、更に２時間のインキュベーションの間、再び軌道振とう器上に設定した。
【００４１】
計３時間のインキュベーション終了時に、該プレートを Molecular Devices（SpectraMAX 380 マイクロタイタープレート読み取り機）を使用して読み取った。標準は、Molecular Devices（Softmax Pro(登録商標) 3.1.2. 版）を使用して、４−パラメータの曲線に適合させた。このソフトウェアはその後データを分析するのに使用され、未知の試料の吸収率を標準の吸収率に関連付けて、それから濃度を割り出した。
【００４２】
ＤＮａｓｅＩに関する安定性データを表２にまとめる。比較のために、その標準保存緩衝液（Ｈｅｐｅｓ）中のＤＮａｓｅＩに関する、および商業製品（Pulmozyme）に関するデータは表２に包含される。Pulmozyme(登録商標)(dornase alfa)吸入溶液は、ＤＮＡを選択的に切断する１種の酵素である組み換えヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ（ｒｈＤＮａｓｅ）の、無菌的で透明な、無色の非常に精製された溶液である。Pulmozyme は、ネブライザー系により圧縮された空気により生成されるエアロゾルの霧の吸入により投与される。Pulmozyme は、ジェネンテック社（Genentech, Inc., 1 DNA Way, South San Francisco, CA 94080-4990）により上市されている。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
本発明はこのように記載され、同じものが多様に変えられてもよいことは明らかであろう。このような変更は、本発明の精神および範囲から逸脱するものとして認識されるべきではなく、当業者にとって明らかであろうこのような全ての改良は、請求項の範囲内に包含されるように意図されるものである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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