(57)【要約】本発明は、少なくとも２つの核酸固定化用ユニットと、電気的な検出回路とを備える核酸検出用の生体検出器に関するものである。上記ユニットに、１本鎖分子として存在し、検出される第２核酸を結合できる第１核酸分子が備えられている。捕獲分子に、検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識が備えられている。電気的な検出回路は、標識を用いて、捕獲分子と結合したどの核酸分子でも検出するように適用されている。
2004519248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットを用いて核酸を検出する方法であって、
上記少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、導電性であって、電気的に相互に絶縁されており、
上記少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、捕獲分子として機能する第１核酸分子を備えており、上記第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、検出すべき第２核酸分子と結合でき、また、上記捕獲分子として機能する１本鎖の第１核酸分子は、検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識を備えており、
検討対象の試料を、少なくとも２つの核酸固定化用ユニットと接触させ、この検討対象の試料は、検出すべき第２核酸分子を含むことがあり、
検討対象の試料に含まれる第２核酸分子が、上記捕獲分子と結合して２本鎖ハイブリッド分子を形成し、
上記第２核酸分子を、酸化還元活性標識により生じる信号を用いて検出し、
上記信号を個別に検出するために固定化用ユニットを選択する方法。
【請求項２】
上記酸化還元活性標識によって生成される信号を、電流、抵抗、または伝導率を測定することにより検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記酸化還元活性標識が、光により誘導可能な酸化還元活性標識、または、化学的に誘導可能な酸化還元標識である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記光により誘導可能な酸化還元標識が、光合成細菌の反応中心、シクロファン、または、少なくとも２分子の電子供与体／電子受容体複合体である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記生体分子の電子供与体／電子受容体複合体の電子供与体および電子受容体が、電荷移動錯体、または、遷移金属錯体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記核酸として、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または、ＰＮＡ分子を検出する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記核酸分子として、所定のヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ１本鎖を検出し、
捕獲分子として、所定のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡプローブ分子を使用する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
結合していないＤＮＡプローブ分子を、少なくとも２つの固定化用ユニットから取り除く請求項７に記載の方法。
【請求項９】
結合していないＤＮＡプローブ分子を取り除くために、核酸分解酵素作用を有する酵素を、固定化用ユニットに接触させる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸分解酵素作用を有する酵素として、以下の物質：
緑豆の核酸分解酵素、
核酸分解酵素Ｐ１、
核酸分解酵素Ｓ１、あるいは、
５’→３’エキソヌクレアーゼ作用または３’→５’エキソヌクレアーゼ作用に基づき、１本鎖ＤＮＡを分解することが可能なＤＮＡポリメラーゼ、
のうち、少なくとも１つを使用する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記固定化用ユニットが金を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記少なくとも２つの固定化用ユニットを半導体チップ上に配置する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記半導体チップが、ＣＭＯＳチップである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２つの核酸固定化用ユニット、および、電気的な検出回路を備える核酸検出用の生体検出器であって、
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、導電性であり、電気的に相互に絶縁されており、
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットには、捕獲分子として機能する第１核酸分子が備えられており、この第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、検出すべき第２核酸分子と結合でき、また、捕獲分子として機能する１本鎖の第１核酸分子に、検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識が備えられており、
上記電気的な検出回路は、捕獲分子と結合した核酸分子を、上記標識を用いて検出するように形成されており、
上記電気的な検出回路は、少なくとも１つの固定化用ユニットを個別に選択するための選択電子装置を備える生体検出器。
【請求項１５】
複数の核酸固定化用ユニットが、規則的配列を有する請求項１４に記載の生体検出器。
【請求項１６】
上記電気的な検出回路が、半導体チップに集積されている請求項１４または１５に記載の生体検出器。
【請求項１７】
上記固定化用ユニットが、半導体チップ上に配置されている請求項１６に記載の生体検出器。
【請求項１８】
上記半導体チップが、ＣＭＯＳチップである請求項１６または１７に記載の生体検出器。
【請求項１９】
上記電気的な検出回路が、各固定化用ユニットのために検出される信号を増幅する前置増幅器を備える請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の生体検出器。
【請求項２０】
上記電気的な検出回路が、各固定化用ユニットのために検出される信号を変換するアナログ／デジタル変換機を備える請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の生体検出器。
【請求項２１】
上記電気的な検出回路が、各固定化用ユニットのために検出される信号用の評価ユニットを備える請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の生体検出器。
【請求項２２】
各固定化用ユニットのための上記電気的な評価ユニットは、各固定化用ユニットに引き渡された電荷量を合計するための１つのユニットを備える請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の生体検出器。
【請求項２３】
少なくとも２つの核酸固定化用ユニット、および、電気的な検出回路を有する生体検出器を備える核酸検出装置であって、上記生体検出器においては、
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットが、導電性であり、電気的に相互に絶縁されており、
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットには、捕獲分子として機能する第１核酸分子が備えられており、当該第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、検出すべき第２核酸分子と結合でき、捕獲分子として機能する１本鎖の第１核酸分子には、電気化学的に検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識が備えられており、
上記電気的な検出回路は、捕獲分子と結合した核酸分子を、上記標識を用いて検出するように形成されており、
上記電気的な検出回路は、少なくとも１つの固定化用ユニットを個別に選択するための選択電子装置を備える装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸を検出するために少なくとも２つの核酸固定化用ユニット（Einheiten）を用いる生体検出器（Biosensor）、方法、および装置に関するものである。
【０００２】
後述する特許文献［１］〜［５］に示すように、核酸オリゴマーハイブリダイズ結合を検出するための電気化学方法、すなわち、簡単に言えば、核酸の検出方法がしられている。この方法は、図２を参照しながら詳しく説明するように、１本鎖の核酸と２本鎖の核酸との伝導性の違いに基づいている。
【０００３】
さらに、特許文献［６］に示すように、所定の分子標的構造（molekulare Targetstruktur）と結合できるプローブ分子が検出部位（Teststellen）に用いられている装置が知られている。この特許文献［６］に記載の装置の場合、信号を印加（Anbringen）した後、検出部位の特定の電気的、機械的、または、光学的な特性が、プローブ分子と標的構造との結合を検出するために使用される。
【０００４】
さらに、特許文献［７］に示すように、核酸ハイブリダイゼーション（Hybridisierungen）などの分子生物学的な反応を行うために、個別アドレス可能な極めて小さな部位（Mikrostellen）を用いる装置が知られている。この極めて小さな部位は、その下に直流微小電極（Gleichstrom-Mikroelektrode）を配置することにより、アドレス可能（Adressierbarkeit）となる（極めて小さな場所のアドレス可能性は、その下に配置されている直流微小電極（Gleichstrom-Mikroelektrode）により引き出される。）。その目的は、結合ユニットまたは反応物質の電気泳動的な引力または斥力を提供し、分子生物学的な反応を制御することである。
【０００５】
図２ａおよび図２ｂは、特許文献［１］〜［５］に記載の機能的な原則を図式的に示す。検出器２００は、統一的に設計されている伝導性の表面層２０１を備え、この表面層２０１上の特定の位置に、１本鎖の核酸／ＤＮＡ分子２０２が固着されている。１本鎖核酸分子２０２は、検出すべき核酸（検出される核酸）のための捕獲分子として機能する。表面層２０１に、電気端子２０４がさらに備えられている。
【０００６】
検出器２００は、調査される試料（図示せず）（例えば、液状の電解質）と接触する。
【０００７】
上記電解質に、ＤＮＡ捕獲分子２０２の配列に対して相補的な配列を有するＤＮＡ鎖２０５が含まれる場合、このＤＮＡ鎖２０５は、ＤＮＡ捕獲分子２０２とハイブリダイズする（図２ｂ参照）。
【０００８】
ＤＮＡ捕獲分子２０２とＤＮＡ鎖２０５とのハイブリダイズは、各ＤＮＡプローブ分子２０２と対応するＤＮＡ鎖２０５との配列が互いに相補的である場合に生じる。そうでない場合、ハイブリダイズは生じない。従って、所定の配列のＤＮＡプローブ分子は、特定のＤＮＡ鎖、すなわち、それぞれ相補的な配列を有するＤＮＡ鎖とだけ結合、つまりハイブリダイズできる。
【０００９】
ハイブリダイズにより、図２ｂから明らかに分かるように、２本鎖核酸分子が生成される。
【００１０】
特許文献［１］〜［５］に基づく方法の場合、洗浄工程（図示せず）の後、適切な波長の光が、矢印２０６で示すように、検出器２００に照射される。酸化還元活性化標識（redoxaktive Markierung）２０３は、入射光により励起されて、電子を連続的に遊離させる。上記標識がＤＮＡ捕獲分子２０２と検出される核酸２０５との２本鎖ハイブリッドに存在する場合、２本鎖ハイブリッドは、電子ポンプのように機能し、電子を矢印２０７で示すように、標識２０３から伝導性の表面２０１まで伝導する。その結果、この部位において電流を測定できる（図２ｂ、図２ｃ参照）。しかし、ハイブリダイズが行われない場合、１本鎖の捕獲分子２０２は、近似的に絶縁体(naeherungsweise einen Isolator)である。従って、電流は表面２０１に流れない。
【００１１】
特許文献［３］の図４に相当する図２ｃは、酸化還元活性化標識として、光合成細菌の反応中心が使用されるが、この分子を詳しく説明した正確な図を示す。
【００１２】
２本鎖分子により引き起こされる電流の流は、特許文献［１］〜［５］では、絶縁性の支持物質（例えば、ガラス小板／白雲母小板）２０８上に一貫性の電気的な伝導性金薄膜２０１が形成されるように設計されている検出器２００によって検出される（例えば、［３］、２０ページ、章「調整表面／電子（Modifizierte Oberflaechen／Elektroden）、および、５４ページ、第４節、５６ページ、例２、および、２９ページ、第１節を参照」）。このとき、１つあるいはそれ以上のいわゆる「検出部位（Test-Sites）」、すなわち、捕獲分子が固着されている所定の位置または検出器領域が、金薄片上に存在する。このような、全面的に形成されており、様々な検出部位２０９が備えられている金表面２０１と物質２０８とを備える検出器２００を、図２ｄに示す。さらに、図２ｄに、生体検出器２００上の調査対象の検体２１０を示す。
【００１３】
従って、特許文献［１］〜［５］に基づく検出器は、純粋な受動構造（passive Anordnung）、すなわち、信号を検出／評価するために外部測定装置に接続される必要のある検出器として作動する。
【００１４】
このような検出器の長所として、個々の検出部位を、電気的に相互に絶縁されており、電位の印加、および、読み出しのために個別に制御できる個々の（微小）電極の上に形成しなくてもよいということが非常に重要である（例えば、［３］、５５ページ、第１節参照）。むしろ、適切な波長の光を、目的を絞って照射することにより、個々の場所がアドレスされる。
【００１５】
しかし、外部評価ユニットを有する、このような「受動的な」検出器は、不利であるように思われる。
【００１６】
全面的な表面により、高容量が生じる。なぜなら、常に全ての検出器領域が、外部電気的読み出しユニットと接続されているからである。この方法の場合、通常、わずかな信号では、このような比較的高い負荷容量によって負荷がかけられることがあるため、外部電流測定装置を用いての検出が困難であるか、あるいは、少なくとも非常に大きな時定数によって行われる。
【００１７】
さらに、光入射により選択される位置から暗電流、すなわち、寄生電流は生じない。この暗電流は、信号電流を超えることがあり、このことは、最大限可能な数の検出器領域を制限することがある。
【００１８】
さらに、このようなアレイでは、検出される電流が非常に小さい場合、特に、各検出器領域の間の混信（Uebersprechen）が問題である。
【００１９】
光学的にアドレスできる受動的なチップの場合、外部読み装置は、非常に小さなアナログ信号を処理できなければならない。このことは、他の電気機器を伴う環境において影響を受けやすい。
【００２０】
最後に、光が検出器に入射される精度も問題があるように思える。入射される光は、隣り合う領域に入ることなく選択された個々の検出器領域に選択的に照射されなければならない。このことにより、複雑な光学的配列が、検出器の読み出しの際に必要となる。
【００２１】
従って、本発明の目的は、このような不利な点のない、核酸検出用の他の方法、生体検出器、および装置を提供することである。
【００２２】
本目的は、独立特許請求項に記載の特徴を有する方法、生体検出器、および装置により達成される。
【００２３】
核酸を検出するための方法は、少なくとも２つの核酸固定化用ユニットを使用する。この場合、少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、導電性であり、相互に電気的に絶縁されている。
【００２４】
この方法では、上記少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、捕獲分子として機能する第１核酸分子を備えている。上記第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、第２の検出される核酸分子と結合できる。さらに、捕獲分子として機能する第１の１本鎖の核酸分子には、検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識が備えられている。
【００２５】
上記標識化は、少なくとも２つの固定化用ユニット上に捕獲分子が固着される前、あるいは、少なくとも２つの固定化用ユニット上に捕獲分子が固着された後のどちらかで行われる。
【００２６】
この方法では、調査される試料が、少なくとも２つの核酸固定化用ユニットと接触する。この調査される試料は、第２の検出される核酸分子を含んでいることがある。この場合、調査される試料に含まれる第２の核酸分子は、捕獲分子と結合し、これにより、２本鎖のハイブリッド分子を形成する。従って、ハイブリダイズ変化（Hybridisierungsereignis）は、酸化還元活性標識により引き起こされる信号を用いて検出される。
【００２７】
ここに開示される核酸検出用生体検出器（Biosensor zum Erfassen von Nukleinsaeuren）は、少なくとも２つの核酸固定化用ユニット、および、電気的な検出回路を備えている。生体検出器の少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、導電性であり、相互に電気的に絶縁されている。この生体検出器の場合、上記少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、捕獲分子として機能する第１核酸分子を備えている。また、第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、第２の検出される核酸分子と結合できる。捕獲分子として機能する１本鎖の第１核酸分子に、検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識が備えられている。電気的な検出回路は、核酸分子と捕獲分子とのハイブリダイズ変化を、上記標識によって検出するように設計されている。
【００２８】
核酸検出用装置（Vorrichtung zur Erfassung von Nukleinsaeuren）は、少なくとも２つの核酸固定化用ユニットと電気的な検出回路とを有する生体検出器を備えている。この場合、この生体検出器では、少なくとも２つの核酸固定化用ユニットが、導電性であり、電気的に相互に絶縁されている。少なくとも２つの核酸固定化用ユニットには、捕獲分子として機能する第１核酸分子が備えられている。この場合、第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、検出する第２核酸分子と結合できる。捕獲分子として機能する１本鎖の第１核酸分子に、検出可能な信号を生成できる酸化還元活性印が備えられている。電気的な検出回路は、核酸分子と捕獲分子とのハイブリダイズ変化を、標識により検出するように設計されている。
【００２９】
具体的に記載すれば、本発明は、特許文献［１］〜［５］に示す公知の検出方法とは異なり、捕獲分子の固定化、および、２本鎖ハイブリッド分子の形成は、電流（elektrischen Strom）を伝導する一貫性の表面（durchgaengigen Oberflaeche）（電極）には生じない。その一方、表面は、個々に伝導性はあるが、電気的に相互に接触していない領域にそれぞれ分割されている。
【００３０】
本発明の生体検出器では、これら領域に分割することにより複数の利点がある。第１に、このことにより、電子ポンプとして機能する分子が備えられている各領域、または、各位置は、個々の検出器領域の容量によってのみ負荷をかけられる。第２に、このことにより、測定装置の配置（Messanordnung）は、ノイズを少なく、妨害の無いように設計できる。
【００３１】
本発明の方法の場合、上記分割により、固定化用ユニット、または、これら複数のユニットが信号を別々に検出するために選択されるという利点が生じる。
【００３２】
上述の検出器面の領域は、ここでは、固定化用ユニットとも呼ばれる。
【００３３】
「固定化用ユニット」を、本発明の意義では、捕獲分子を固定化（固着）できる（すなわち、捕獲分子が、物理的、または、化学的な相互作用により結合できる）導電性の表面を備える１つの構造と解釈する。この相互作用は、疎水性相互作用、親水性相互作用、ファン・デル・ワールスの相互作用、または、イオン性（静電性）相互作用、および、共有結合を含む。少なくとも１つの固定化用ユニットとして使用できる適切な表面物質の例は、金属（金、パラジウム）、または、導電性のポリマーなどである。本発明では、固定化用ユニットが、電極または電極構成部品として構成されている。
【００３４】
上記ユニット上への固定化は、固定化用ユニットの全表面に、捕獲分子を備えるという方法により行える。しかし、固定化を、固定化用ユニットの個々の領域／点（「スポット」）に限定することもできる。後者を達成するため、固定化用ユニットは、適切に形成されている。例えば、固定化のために化学的に活性化された領域を用いることによって形成されていることがある。
【００３５】
ここでは、「酸化還元活性標識」という表現は、特許文献［１］〜［５］における「酸化還元ユニット」という表現に属するものであり、例えば、特許文献［３］の９ページ、第３節；２２ページ、第４節〜２３ページ第３節に記載されているような意味がある。
【００３６】
このことは、本発明の意義として、酸化還元活性標識が、特定の外部環境において、電子を適切な酸化剤に引き渡す、または、適切な還元剤から受け取るという特性、あるいは、特定の外部環境において、適切な電子受容体に電子を引き渡す、あるいは、適切な電子供与体から電子を受け取るという特性を有し、複数の分子を含む、化学的な結合、組、または、ユニットであるということを意味する。
【００３７】
従って、酸化還元活性標識は、本発明の意義では、捕獲分子として機能する核酸１本鎖分子と少なくとも１つの結合によって結合（共有結合）しており、［１］〜［５］に定義される化学的に誘導（誘発）可能な、または、光により誘導（誘発）可能な、酸化還元活性ユニット（［３］の１０ページ、第２節〜１２ページ、第２節の光により誘発可能な酸化還元活性ユニットの定義、および、１２ページ、第２節、１３ページ、第１節の化学的に誘発可能なユニットを参照）を含む。
【００３８】
従って、本発明に使用できる、光により誘発可能な酸化還元標識の例は、光合成細菌の反応中心（ＲＣ）、シクロファン（cyclophanes）、または、少なくとも２分子の（bimolekularer）電子供与体／電子受容体錯体（Donor/Elektronen-Akzeptor-Komplex）である（一番最後のものについては、当然［１］〜［５］に記載のその意味、［３］の１４ページ、第２節、１５ページ、第１節を参照）。最後に述べた錯体の場合、生体分子の（biomolekularen）電子供与体／電子受容体錯体の電子供与体および電子受容体が、電荷移動錯体、または、遷移金属錯体でもよい。
【００３９】
従って、化学的に誘発可能な酸化還元活性標識の例は、化学的に誘発可能な少なくとも生体分子の電子供与体／電子受容体錯体（例えば、シトクロム-ｂｃ-錯体、光合成を促進する細菌のシトクロム-ｃ2-錯体、または、適切なシクロファン）である（［３］、３１ページ、第２節参照）。
【００４０】
一般的に、ここに記載の方法では、酸化還元活性標識により生成される信号が、核酸検出のために使用される。好ましくは、電流（電流の流れ）（Stromflusses）、抵抗、または、伝導性を測定することにより、検出が行われる。
【００４１】
方法の好ましい実施形態では、信号を個別に検出するために固定化用ユニットが選択される。
【００４２】
ここでは、核酸を、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、例えば１０〜４０の塩基対（ｂｐ）を有するオリゴヌクレオチドなどのより短い断片とも解釈することもできる。核酸は、２本鎖のこともあるが、少なくとも１本鎖領域を備えていることもあり、あるいは、例えば、その検出のために先行して熱により変性（鎖分離）することにより１本鎖として存在してもよい。検出される核酸の配列は、この場合、少なくとも部分的に、または、全てが所定のもの、すなわち、公知であってもよい。
【００４３】
所定のヌクレオチド配列のＤＮＡ分子（核酸、または、オリゴヌクレオチド）を、ここに記載の方法により検出する場合、それを、１本鎖の形状で検出することが好ましい。すなわち、それは、検出前に、既に説明したような変性によって、１本鎖に変化されていることがある。従って、この場合、１本鎖領域に対して相補的な配列を有するＤＮＡプローブ分子を、捕獲分子として使用することが好ましい。同じく、ＤＮＡプローブ分子は、オリゴヌクレオチド、または、プローブ分子と検出対象の核酸とのハイブリダイズを妨害する分子間の構造のどちらをも形成しない程度の長さである、より長いヌクレオチド配列を有していることもある。
【００４４】
方法の一実施形態、および、特許文献［１］〜［５］に示される公知の方法の発展形態では、結合していないＤＮＡプローブ分子を、調査対象の試料の１つと接触した後、少なくとも２つの固定化用ユニットから取り除く。このことにより、標識の付けられた１本鎖プローブ分子により引き起こされて生じることもある背景電流（hintergrundstrom）を、少なくとも減少できる。除去は、核酸分解酵素作用を有する酵素を、固定化用ユニットと接触させることにより行う。
【００４５】
除去のために、核酸分解酵素作用を有する酵素として、以下の物質：マグビーン（緑豆の）核酸分解酵素（Nuklease aus Mung-Bohnen）、核酸分解酵素Ｐ１、核酸分解酵素Ｓ１、あるいは、５’→３’エキソヌクレアーゼ（エキソ核酸分解酵素）作用または３’→５’エキソヌクレアーゼ作用に基づき、１本鎖ＤＮＡを削除することが可能なＤＮＡポリメラーゼの少なくとも１つを使用できる。
【００４６】
本方法の好ましい実施形態では、固定化用ユニットが、金を含むか、あるいは、金製であることが好ましい。
【００４７】
本方法では、他の設計の場合に少なくとも２つの固定化用ユニットが、半導体チップ上に配置されている。このような半導体チップは、ＣＭＯＳチップであることが好ましい。
【００４８】
ただし、当然、上記方法は、１つの測定で、１種類の核酸だけを検出するものではないといえる。複数種類の核酸を、同時、または、連続して検出できる。この目的を達成するために、固定化用ユニット上に、複数の種類の捕獲分子を結合する方法が挙げられる。これらの各捕獲分子は、特定の検出対象の核酸に対して（特定の）結合親和性を備えており、上記固定化用ユニット上に結合する。また、ただ１種類の捕獲分子が結合されている、複数の固定化用ユニットを用いることもできる。この多重検出（Mehrfachbestimmungen）の場合、例えば、望ましくない副作用を回避するため、検出対象のそれぞれの核酸に対して、他の標識と区別できる標識を使用することが好ましい。
【００４９】
それを、このような多重確定の場合に使用できるように、ここに記載の生体検出器は、複数の、つまり、２個以上の、核酸固定化用ユニットを、規則的な配列で備えることが好ましい。
【００５０】
生体検出器の有利な設計では、電気的な検出回路が、半導体チップに集積されている。このことにより、全体の測定構造を簡易化でき、より高い測定感度を達成できるという利点がある。
【００５１】
固定化用ユニットを半導体チップ上に配置するように設計した生体検出器の場合、さらに簡易化が行われる。
【００５２】
この生体検出器の場合には、半導体チップとして、原則的には、適切などの半導体部品も使用できる。
【００５３】
トランジスタチップを使用することが好ましい。例えば、ＣＭＯＳチップでもよい。
【００５４】
生体検出器の発展形では、電気的な検出回路は、各固定化用ユニットのために検出された信号を増幅するための前置増幅器を備えている。
【００５５】
他の設計では、電気的な検出回路が、少なくとも１つの固定化用ユニットを別々に選択するための選択電子装置（Auswahlelektronik）を備えている。このことにより生じる長所は、一方では、光により誘発可能な測定のために不可欠な、検出器への光照射の間の位置決定問題が回避されるということである。なぜなら、位置選択、すなわち、どの検出器領域／どの固定化用ユニットが起動されるかということは、電子的に行われるからである。これにより、特に、生体検出器を、いわゆる「手持ち式装置」として設計でき、例えば、医療診療所、病院、救急医療、または、集中医療、または、「在宅医療分野」において（携帯可能に）使用できる。他方では、選択電子装置が、混信、すなわち、選択された検出器位置の撹乱影響を完全に抑制できるという長所を有している。最大数の駆動可能な検出器位置は、混信によってもはや制限されない。
【００５６】
生体検出器のほかの実施形態では、電気的な検出回路が、各固定化用ユニットのために検出された信号を変換するアナログ／デジタル変換機を備えている。このことにより、外部電子に対するインターフェースを形成できる。従って、電磁気の妨害を非常に受けにくい。
【００５７】
他の実施形態として、生体検出器の電気的な検出回路は、各固定化用ユニットのために検出された信号を評価する評価ユニットを備えている。この場合、評価ユニットを、以下のようなユニットと解釈する。以下のようなユニットとは、例えば、入力された測定信号を、ユニットにより既に検出された他の信号に追加、または、減少させ、検出された信号を記憶し、他の信号と比較し、これにより、ハイブリダイズ変化が生じたかどうかについての情報を生成し、場合によっては表示することにより、入力された測定信号を処理する（weiterverarbeitet）ユニットのことである。従って、この評価ユニットによって、「オンチップ信号処理」が可能になる。
【００５８】
他の設計では、生体検出器の電気的な検出回路は、各固定化用ユニットのために、各固定化用ユニットに引き渡された負荷量を蓄積するためのユニット、すなわち、積分器を備えている。
【００５９】
本発明の実施例を、図に示し、さらに詳しく説明する。
【００６０】
図１ａおよび図１ｂは、様々な方法状態のときの本発明の生体検出器を示す図である。図２a〜図２ｄは、核酸を検出するための特許文献［１］〜［５］に示される公知の方法、および、特許文献［１］〜［５］に示される公知の生体検出器を示す図である。図３は、個々に記載の生体検出器を有する装置を示す図である。
【００６１】
図１は、ここに記載の生体検出器の実施例に基づく生体検出器１００の断面を示す図である。
【００６２】
図１ａは、絶縁物質を含む絶縁層１０２に配置されている固定化用ユニット１０１を有するバイオ検出器１００を示す図である。
【００６３】
固定化用ユニット１０１は、電気的な端子１０３を介して、電気的な検出ユニット１０４と接続されている。固定化用ユニット１０１は、金製である。
【００６４】
生体検出器１００の電気的な検出回路１０４は、各固定化用ユニットのために検出された信号を増幅する前置増幅器１０５、少なくとも１つの固定化用ユニットを個別に選択するための選択電子装置１０６、および、各固定化用ユニットのために検出された信号を変換するアナログ／デジタル変換機１０７を備えている。
【００６５】
生体検出器１００は、まず、ＣＭＯＳを製造するための標準的な方法を用いて構成し、続いて、固定化用ユニットを形成するための金の層を、チップ上に形成するという２つの段階からなる方法により形成されてもよい。
【００６６】
固定化用ユニット１０１上には、酸化還元活性標識１０９を備える１本鎖ＤＮＡプローブ分子１０８が形成されている（図１ｂ）。この標識１０９は、例えば、光合成細菌の反応中心でもよく、特許文献［３］の５０ページ、第４節〜５２ページ、第１節に記載のように、プローブ分子と結合できる（図２ｃも参照）。
【００６７】
核酸を検出するために、生体検出器１００を、調査対象の試料（例えば、電解質）（図示せず）と接触させる。
【００６８】
図１ｂは、電解質にＤＮＡプローブ分子１０８の配列に対して相補的な所定のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖１１０が含まれている場合の生体検出器１００を示す。
【００６９】
この場合、ＤＮＡプローブ分子１０８に対して相補的なＤＮＡ鎖１１０は、固定化用ユニット１０１上にもたらされるＤＮＡ鎖１０８とハイブリダイズする。
【００７０】
図１ｂから明らかなように、ハイブリダイズ後の結果は、ユニット１０１上にハイブリダイズされた分子が存在している、すなわち、その場所において、２本鎖ＤＮＡ分子が固着されている。
【００７１】
他の工程では、場合によっては、（例えば、ＤＮＡ核酸分解酵素を電解質に加えることによる）生物化学的な方法を用いて、ユニット１０１上における１本鎖ＤＮＡプローブ分子１０８の加水分解を引き起こすことができる（図１ｂ参照）。
【００７２】
このとき、分解酵素の選択性を、１本鎖ＤＮＡのために考慮する必要がある。ハイブリダイズしていないＤＮＡ１本鎖を分解するために選択される酵素が、この選択性を有していない場合、２本鎖ＤＮＡとして存在し検出されるべき核酸が、同じく（望ましくないが）分解される。このことにより、測定結果が誤りとなってしまう。
【００７３】
１本鎖ＤＮＡプローブ分子を取り除いた後、検出されるＤＮＡ分子１１０と、これに対して相補的な第１ＤＮＡプローブ分子１０８とにより構成されるハイブリッドのみが存在する。
【００７４】
例えば、結合していない１本鎖ＤＮＡプローブ分子１０８を、固定化用ユニット１０１から除去するために以下の物質の１つ：マグビーン核酸分解酵素、核酸分解酵素Ｐ１、核酸分解酵素Ｓ１を加えることができる。
【００７５】
この目的のために、５’→３’エキソヌクレアーゼ作用または３’→５’エキソヌクレアーゼ作用に基づき、１本鎖ＤＮＡを削除することが可能なＤＮＡポリメラーゼも使用できる。
【００７６】
その後、図示していない光源（例えば、レーザー）を用いて、標識１０９（例えば、細菌の反応中心）を刺激（励起）するのに適切な波長を有する、矢印１１１により表される光が入射される。これにより、反応中心の共同因子（補足因子）内において、光により誘発された電荷分離（Ladungstrennung）、および、分子間の電子移動が生じる。
【００７７】
（選択電子装置により決定された）固定化用ユニット１０１に、適切な電位が存在する場合、２本鎖ハイブリッド分子からユニット１０１上への電子移動、すなわち、電流の流れが生じ、この電流の流れを、電気的な検出回路１０４が検出する。
【００７８】
このようにして、ＤＮＡ分子１１０の存在が検出される。ここに記載した生体検出器１００を使用することにより、１つあるいはそれ以上の固定化用ユニットを個別に（局所的に分解して）検出でき、測定感度が上昇することの他に、全測定配列（gesamten Messanordnung）が非常に簡易化される。
図３は、実施例１に基づく生体検出器に相当するように構成されている生体検出器３０１を備える核酸検出用装置３００を示す。すなわち、生体検出器３０１は、絶縁物質を含む絶縁層３０３に配置されている固定化用ユニット３０２を備えている。
固定化用ユニット３０２は、金によって形成されており、電気的端子３０４を介して電気的な検出回路３０５と接続されている。生体検出器３０１の電気的な検出回路３０５は、各固定化用ユニットのための検出された信号を増幅する前置増幅器３０６、少なくとも１つの固定化用ユニットを個別に選択するための選択電子装置３０７、および、各固定化用ユニットのための検出された信号を変換するアナログ／デジタル変換機３０８を備えている。
【００７９】
装置３００は、検出器３０１固定し、例えば、試料の準備、あるいは捕獲分子の塗布のために、検出器上で移動できる支持台３０９を備えている。さらに、調査対象の試料、例えば、液状の検体が検出器上にもたらされている。
【００８０】
さらに、装置３００は、矢印３１２により表される光を検出器に照射できる光源３１１を備えている。光源３１２は、同じく可動式でもよい。最後に、装置３００は、実験経過（例えば、捕獲分子の塗布、調査される溶液の塗布、溶液の除去など）を自動化できる制御ユニット（図示せず）、および、流体排出手段などをさらに備えている。
【００８１】
なお、本書類では以下の刊行物（特許文献）を引用した。
［１］ＤＥ １９９ ０１ ７６１ A１
［２］ＤＥ １９９ ２６ ４５７ A１
［３］ＷＯ ００／４２２１７ A１
［４］ＤＥ １９９ ２１ ９４０ Ａ１
［５］ＷＯ ００/３１１０１ A１
［６］ＵＳ５，６３５，９３９
［７］ＵＳ６，０１７，６９６
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１ａ】図１ａは、様々な方法状態のときの本発明の生体検出器を示す図である。
【図１ｂ】図１ｂは、様々な方法状態のときの本発明の生体検出器を示す図である。
【図２ａ】図２ａは、核酸を検出するための特許文献［１］〜［５］に示される公知の方法、および、特許文献［１］〜［５］に示される公知の生体検出器を示す図である。
【図２ｂ】図２ｂは、核酸を検出するための特許文献［１］〜［５］に示される公知の方法、および、特許文献［１］〜［５］に示される公知の生体検出器を示す図である。
【図２ｃ】図２ｃは、核酸を検出するための特許文献［１］〜［５］に示される公知の方法、および、特許文献［１］〜［５］に示される公知の生体検出器を示す図である。
【図２ｄ】図２ｄは、核酸を検出するための特許文献［１］〜［５］に示される公知の方法、および、特許文献［１］〜［５］に示される公知の生体検出器を示す図である。
【図３】個々に記載の生体検出器を有する装置を示す図である。
【符号の説明】
【００８３】
１００    生体検出器
１０１    固定化用ユニット
１０２    絶縁層
１０３    電気的な端子
１０４    電気的な検出回路
１０５    前置増幅器
１０６    選択電子装置
１０７    アナログ／デジタル変換機
１０８    ＤＮＡプローブ分子
１０９    酸化還元活性標識
１１０    ＤＮＡ鎖
２００    検出器
２０１    伝導性表面層
２０２    １本鎖核酸分子
２０３    酸化還元活性標識
２０４    電気的な端子
２０５    ＤＮＡ鎖
２０６    矢印により表す光
２０７    矢印
２０８    検出部位
２０９    支持部材
２１０    検体
３００    核酸検出用装置
３０１    検出器
３０２    固定化用ユニット
３０３    絶縁層
３０４    電気的な端子
３０５    電気的な検出回路
３０６    前置増幅器
３０７    選択電子装置
３０８    アナログ／デジタル変換機
３０９    支持台
３１０    検体
３１１    光源
３１２    矢印によって表す光
【図２ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年9月12日(2003.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットを用いて核酸を検出する方法であって、
上記少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、導電性であって、電気的に相互に絶縁されており、
上記少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、捕獲分子として機能する第１核酸分子を備えており、上記第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、検出すべき第２核酸分子と結合でき、また、上記捕獲分子として機能する１本鎖の第１核酸分子は、検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識を備えており、
検討対象の試料を、少なくとも２つの核酸固定化用ユニットと接触させ、この検討対象の試料は、検出すべき第２核酸分子を含むことがあり、
検討対象の試料に含まれる第２核酸分子が、上記捕獲分子と結合して２本鎖ハイブリッド分子を形成し、
上記第２核酸分子を、酸化還元活性標識により生じる信号を用いて、半導体チップに集積されている電気的な検出回路により検出し、
上記信号を個別に検出するために固定化用ユニットを選択する方法。
【請求項２】
上記酸化還元活性標識によって生成される信号を、電流、抵抗、または伝導率を測定することにより検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記酸化還元活性標識が、光により誘導可能な酸化還元活性標識、または、化学的に誘導可能な酸化還元標識である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記光により誘導可能な酸化還元標識が、光合成細菌の反応中心、シクロファン、または、少なくとも２分子の電子供与体／電子受容体複合体である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記２分子の電子供与体／電子受容体複合体の電子供与体および電子受容体が、電荷移動錯体、または、遷移金属錯体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記核酸として、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または、ＰＮＡ分子を検出する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記核酸分子として、所定のヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ１本鎖を検出し、
捕獲分子として、所定のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡプローブ分子を使用する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
結合していないＤＮＡプローブ分子を、少なくとも２つの固定化用ユニットから取り除く請求項７に記載の方法。
【請求項９】
結合していないＤＮＡプローブ分子を取り除くために、核酸分解酵素作用を有する酵素を、固定化用ユニットに接触させる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸分解酵素作用を有する酵素として、以下の物質：
緑豆の核酸分解酵素、
核酸分解酵素Ｐ１、
核酸分解酵素Ｓ１、あるいは、
５’→３’エキソヌクレアーゼ作用または３’→５’エキソヌクレアーゼ作用に基づき、１本鎖ＤＮＡを分解することが可能なＤＮＡポリメラーゼ、
のうち、少なくとも１つを使用する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記固定化用ユニットが金を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記少なくとも２つの固定化用ユニットを半導体チップ上に配置する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記半導体チップが、ＣＭＯＳチップである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２つの核酸固定化用ユニット、および、電気的な検出回路を備える核酸検出用の生体検出器であって、
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットは、導電性であり、電気的に相互に絶縁されており、
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットには、捕獲分子として機能する第１核酸分子が備えられており、この第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、検出すべき第２核酸分子と結合でき、また、捕獲分子として機能する１本鎖の第１核酸分子に、検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識が備えられており、
上記電気的な検出回路は、捕獲分子と結合した核酸分子を、上記標識を用いて検出するように形成されており、
上記電気的な検出回路は、少なくとも１つの固定化用ユニットを個別に選択するための選択電子装置を備えており、上記電気的な検出回路は、半導体チップに集積されている生体検出器。
【請求項１５】
複数の核酸固定化用ユニットが、規則的配列を有する請求項１４に記載の生体検出器。
【請求項１６】
上記固定化用ユニットが、半導体チップ上に配置されている請求項１５に記載の生体検出器。
【請求項１７】
上記半導体チップが、ＣＭＯＳチップである請求項１６に記載の生体検出器。
【請求項１８】
上記電気的な検出回路が、各固定化用ユニットのために検出される信号を増幅する前置増幅器を備える請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の生体検出器。
【請求項１９】
上記電気的な検出回路が、各固定化用ユニットのために検出される信号を変換するアナログ／デジタル変換機を備える請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の生体検出器。
【請求項２０】
上記電気的な検出回路が、各固定化用ユニットのために検出される信号用の評価ユニットを備える請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の生体検出器。
【請求項２１】
各固定化用ユニットのための上記電気的な評価ユニットは、各固定化用ユニットに引き渡された電荷量を合計するための１つのユニットを備える請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の生体検出器。
【請求項２２】
少なくとも２つの核酸固定化用ユニット、および、電気的な検出回路を有する生体検出器を備える核酸検出装置であって、上記生体検出器においては、
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットが、導電性であり、電気的に相互に絶縁されており、
少なくとも２つの核酸固定化用ユニットには、捕獲分子として機能する第１核酸分子が備えられており、当該第１核酸分子は、１本鎖分子として存在し、検出すべき第２核酸分子と結合でき、捕獲分子として機能する１本鎖の第１核酸分子には、電気化学的に検出可能な信号を生成できる酸化還元活性標識が備えられており、
上記電気的な検出回路は、捕獲分子と結合した核酸分子を、上記標識を用いて検出するように形成されており、
上記電気的な検出回路は、少なくとも１つの固定化用ユニットを個別に選択するための選択電子装置を備えており、電気的な検出回路は、半導体チップに集積されている装置。
国際出願時の特許請求の範囲の全文を、請求項１〜２２に補正いたしました。なお、補正による変更箇所には、下線を付しております。
【国際調査報告】
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