(57)【要約】皮下液中の分析対象物を検出するか又は定量するために使用する体内埋め込み可能なセンサーであって、体内において生分解可能であるか又は加水分解可能である該センサー。該センサーには、当該分析対象物のための分析装置を組み込み、その読み取りが、検出可能又は測定可能な光学信号であって、なお該信号は、センサーが皮下位置に置いて作動中は、外部光学的手段によって経皮的に問い合わせすることが出来るものである。
2004510527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物を生体内で測定するためのセンサー及び前記センサーを皮膚の上層内に埋め込み、かくして皮膚の成長とその後の皮膚外層の代替・置換により経時的に自然に皮膚上層から排出されるようにした手段とを含んで成る、アッセイ体内埋め込み装置。
【請求項２】
前記体内埋め込み手段が、２００μｍ以下の皮膚内に貫通可能な一定長さの注射針を少なくとも一本を含んで成る、請求項１において記載された装置。
【請求項３】
前記センサーを皮膚内に射出して、皮膚内部の所定の深さにまで貫通させるための手段を含んで成る、請求項１において記載された装置。
【請求項４】
前記センサーが、それぞれが前記分析対象物のアッセイを含んで成るミクロ粒子の複数から成るに際して、該アッセイが、問い合わせがあった場合は直ちに、外部光学手段によって経皮的に検出可能又は測定可能な光学信号としての読み出しを行うものである、前記請求項のうちの何れか一項において記載された装置。
【請求項５】
前記アッセイが、結合アッセイであり、またその読み出しが、検出可能又は測定可能な光学信号である、前記請求項の何れかにおいて記載された装置。
【請求項６】
前記結合アッセイが、その構成成分として分析対象物結合性薬剤と分析対象物類縁体とを含む競争的結合アッセイである、請求項５において記載された装置。
【請求項７】
前記分析対象物類縁体が、第一の発色団で標識化され、また前記分析対象物結合薬剤が、第二の発色団で標識化されるが、ここにおいて前記第一の発色団の発光スペクトルが、前記第二の吸収スペクトルと重複するものである、請求項６において記載された装置。
【請求項８】
該結合剤が、抗体、Ｆａｂ断片、レクチン、ホルモン受容体、薬剤受容体、アプテーマー（ａｐｔａｍｅｒ）又は分子状の刷り込みが為されたポリマーである、請求項５又は６において記載された装置。
【請求項９】
前記した検出可能又は測定可能な光学的信号が、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光偏向・分極、蛍光消光、りん光、ルミネッセンス増光、ルミネッセンス消光、回折又はプラズモン共鳴である、請求項５乃至８のうちのいずれか一項において記載された装置。
【請求項１０】
該センサーが、一種のマトリックス材料を含んで成り、なお前記アッセイの構成成分が、前記マトリックス材料中に懸濁される、請求項１乃至９のうちの何れか一項において記載された装置。
【請求項１１】
前記センサーが固体ミクロ粒子を含んで成る、また前記アッセイの構成成分が、前記固体ミクロ粒子中に一様に分散されるものである、前記請求項の何れか一項において記載された装置。
【請求項１２】
前記センサーが、中空状ミクロ粒子を含んで成り、また前記アッセイの構成成分が、前記中空状ミクロ粒子の内部にカプセル化されるものである．請求項１乃至１０のうちの何れか一項において記載された装置。
【請求項１３】
前記センサーが、複数のリポソームを含んで成り、また前記アッセイの構成成分が、前記リポソームの内部にカプセル化されるものである．請求項１乃至９のうちの何れか一項において記載された装置。
【請求項１４】
前記センサーが、前記アッセイの構成成分が装荷された空の赤血球を複数を含んで成る、請求項１乃至９のうちの何れか一項において記載された装置。
【請求項１５】
皮膚液中の分析対象物を検出するか又は定量測定するための分析システムであって、前記請求項のうちの何れか一項において記載されたアッセイ体内埋め込み装置を前記センサーに対する経膚的問い合わせを行うのに適した光学的手段と共に含んで成る、前記分析システム。
【請求項１６】
センサーを皮膚の上層内に載置し、該センサーが、皮膚の成長及びその後の皮膚外層の漸進的置換・代替によって経時的に自然な状態で皮膚上層から排出されるようにしたことから成る、分析対象物を生体内でアッセイするための方法。
【請求項１７】
該センサーが、角質層の下方で且つ表皮内部に載置される、請求項１６において記載された方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、光学的操作・技法を用いて皮膚液内における分析対象物を測定するか又はモニターするために使用するセンサー及びかかるセンサーを使用した分析対象物モニターシステムに係わる。該センサーは、分析対象物の数値を厳密にモニターする必要がある、例えば医薬によって狭い治療ウインドー内に維持しなければならない場合又は例えば糖尿病の管理の場合など分析対象物を繰り返し測定しなければならない場合に使用するのに特に適している。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病の管理を行う上で、血液中のグルコースを定期的に測定することは、正確なインシュリン投与を確保するために必須である。更には、糖尿病患者を長期に渉って治療看護するに際しては、血中グルコース数値をより良好に管理することによって、往々にして糖尿病に関連することが多い網膜症、循環系疾患及びその他の退行性疾病の発症を、仮に防止はできないにしてもこれを遅延させることが出来る。即ち、血中グルコース濃度を信頼性が高くしかも正確に自己モニーターすることに対する、糖尿病患者からの要望が強い。
【０００３】
現在のところ、血中グルコースは、市販の発色試験片又は電気化学的バイオセンサー（例えば酵素電極など）を用いて、糖尿病患者自らがモニターしているが、これら両者とも、測定を行うその都度適量の血液を採取するためにランセット状の器具を使用する必要がある。平均すると、糖尿病患者の大半は、一日当り二回血中グルコースの測定値を計るためにかかる器具を使用しているはずである。しかしながら、アメリカ合衆国国立健康研究所は、血中グルコース試験は、一日当り少なくとも四回行うことを推奨しており、かかる推奨は、アメリカ糖尿病学会によって支持されている。血中グルコース試験の頻度をこれだけ増やすことは、糖尿病患者に相当大きな負担を経済的費用及び苦痛と不快感の双方において強いるものであり、特に指先から血液を採取するためにランセットを定期的に使用せざるを得ない長期糖尿病患者にとってそうである。即ち、患者からの血液採取を伴なわない、より優れた長期間に渉るグルコースモニターリングシステムに対する要請が強いのである。
【０００４】
当該患者から採血することを必要としないグルコース測定方法については近年数多くの提案がなされている。酵素バイオセンサー電極を針又はカテーテルの先端部に載置して、これを血管中に挿入するようにした装置を構築するために種々の努力が為されている（Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅ． ａｎｄ Ａｔａｎａｓｏｖ，Ｐ．， Ｍｅｄ． Ｅｎｇ． Ｐｙｓ．（１９６６））１８：２７３−２８８）。かかるセンサー装置自体は、血管内に配置されるのであるが、当該針又はカテーテルは、外部環境との関連を保持している。実務においては、このような装置は、ヒトの患者に使用するには適していないのであって、その理由としては先ず第一に、針又はカテーテルを血管内に挿入することは、感染危険性をもたらしまた患者にとって不快であり、従って継続使用数には適していないからである。第二に、この形式の装置は、装置自体が、針又はカテーテルの先端部を有しているために、患者の循環系内に血栓を剥離・投入する原因となる可能性があるため、患者への使用について承認が得られてないことが挙げられる。このことは、患者の健康に対して極めて深刻な危険性を及ぼすものであることは明らかである。
【０００５】
Ｍａｎｓｏｕｒｉ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９８４）、Ｍｅａｄｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ （Ａｎａｌ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ．（１９９３） ２８０：ｐｐ２１−３０）及びＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，３４４，４３８は全て、光学的手段により血中の低分子量化合物をインシツでモニターするための装置を記載している。これらの装置は、血管内に挿入するか又は経皮的に載置するよう設計されており、外部光源及び外部検出器とのファイバーによる光学的連結を必要とする。この場合にも矢張り、装置を血管内に載置するため、血栓形成を促進するという、必然的に関連した危険性が生じ、またそのうえある実施態様においては、外部環境とのファイバーによる光学的連結を保持する必要性があるため、長期間使用するうえで実際的でなく、また感染の危険性を伴なうことになる。
【０００６】
より侵襲性の少ない、グルコースモニターリング技法を探索する過程で、例えば耳たぶや指先など、比較的“光透明性”が高く而も皮膚表面に近接して血管が位置する組織における血管内の血中グルコースの濃度を直接測定するために赤外線分光学を利用することにある程度の注目が集められている（Ｊａｒｅｍｋｏ，Ｊ． ａｎｄ Ｒｏｒｓｔａｄ， Ｏ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ １９９８ ２１：４４−４５０ ａｎｄ Ｆｏｇｔ， Ｅ．Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．（１９９０） ３６：１５７３−８０）。このようなアプローチは、侵襲度が最低限に低下されるものであることは明らかであるが、血中のグルコースの赤外線スペクトルが、それを囲む組織の赤外線スペクトルと極めて類似しているため、実際的な意味において、これら二種類のスペクトルを分解・解像することは事実上不可能であるため、実際的な価値は殆どないことが判明している。
【０００７】
皮下液中の分析対象物の濃度は、血液中の分析対象物の濃度と相関関係があり、従って皮下の場所に配置したグルコースモニタリング装置を使用することに関しては幾つかの報告がある。具体的には、Ａｔａｎａｓｏｖ ｅｔ ａｌ． （Ｍｅｄ． Ｅｎｇ． Ｐｙｓｃ．（１９９６） １８： ｐｐ６３２−６４０）は、体内埋め込み可能なグルコース検知装置（寸法が５．０ Ｘ ７．０ Ｘ １．５ｃｍ）を使用して、イヌの皮下液中のグルコースをモニターしたことについて記載している。この装置は、電流アッセイに基くグルコースセンサー、ミニチュア電位差計、ＦＭ信号送信機、及び電源から成るものであり、コンピュータを用いたデータ獲得システムに接続したアンテナ及び受信機を解して遠隔操作により問い合わせを行うことが出来、而も外部環境との接続の必要は全くないものである。しかしながら、この装置は寸法が大きいため、ヒトの患者に使用するうえでは実用的ではないことが明らかであろう。
【０００８】
Ｒｙａｎ Ｊ． Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．７１， Ｎｕｍｂｅｒ １５，３１２６−３１３２は、蛍光性イソチオシアネ―トデキストラン（ＦＩＴＣ−テキストラン）及びテトラメチルローダミンイチオシアネートコンカバリンＡとを皮膚内埋め込みを行うためにヒドロゲルネットワークに化学的に接合して含有するポリエチレングリコールを用いた体内埋め込み可能なヒドロゲルを記載報告している。体内に埋め込みしたこのヒドロゲル球状体は、経皮的に問い合わせを行うこととなる。
【０００９】
Ｒ．Ｂａｌｌｅｒｓｔａｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，３４５ （１９９７）， ２０３−２１２は、二つのポリマー（デキストラン）分子が、第一及び第二の蛍光体でそれぞれ標識化され且つ多価のレクチン分子で一体に結合されて消光を生じるようにしたアッセイシステムを記載報告している。グルコースは、このレクチンの結合部位を飽和させ、かくして該二つのポリマーを解離させて蛍光を増大させるのである。
【００１０】
Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ２７１（１９９３）， １５５−１６４は、位相変調蛍光光度法の使用について記載報告している。これは、蛍光寿命に基いた測定法によって上記した当該技術分野に教示されている蛍光強度に基いた測定法を代替・置換するものである。
【００１１】
蛍光寿命は、１乃至２００ＭＨｚに強度を変調した光を用いて蛍光を励起し、次いで入射光を基準とした放射光の位相変異及び放射光の変調とを測定することによって、位相変調技法により測定することが出来る。
【００１２】
ＷＯ９１／０９３１２においては、光学的手段によりグルコースのアフィニティアッセイを用いる、皮下による方法及び装置が記載されている。ＷＯ９７／１９１８８においては、体内埋め込み可能なグルコース測定装置の別の例が記載されているが、このものは、光学信号を発生させ、これを遠隔で読み取ることが出来るものである。ＷＯ９１／０９３１２及びＷＯ９７／１９１８８において記載された装置は、アッセイ化学が正確に作動できなくなった後でも長期間体内で存在するはずのものであり、このことが、長期間の使用を行ううえで大きな欠点となるものである。この装置を取り外すには、外科手術が必要である。
【００１３】
ＷＯ００／０２０４８は、当該分析法試薬を封入する為に生分解性材料を使用することによってこの問題に対処している。しかしながら、この方法は、最適の結果を得るために、生分解性の封入システムを入念・細心に設計することが必要である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
感度が高く而も正確な血中グルコースをモニターする方法であって、患者から定期的な採血を必要とせず、感染や不快感を惹起する危険性を伴なわずまた前記した生体内埋め込み可能な装置にまつわる実務面での欠点を有さない方法に対する明確な要請かある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
従って本発明の第一の局面においては、本発明は、分析対象物を生体内で測定するためのセンサー、及び前記センサーを皮膚の上層内に埋め込みして、かくして皮膚の成長とその後の皮膚外層の代替・置換により経時的に自然に皮膚上層から排出されるようにした手段とを含んで成る、アッセイ体内埋め込み装置を提供するのである。
【００１６】
本発明に従えば、該センサーは、皮膚表面に充分近接した状態で皮膚の厚さ以下に位置するように注入され、その結果時間の経過とともに、該センサーは皮膚表面に接近し、最終的には喪失される。皮膚は、幾つかの明瞭な層から構成される。角質層は、厚さがほぼ１０乃至２５μｍの、死滅細胞の層である。この角質層の直下に表皮が存在する。表皮の上端に位置する細胞は、漸進的に死滅し、角質層の基礎を形成する。新規の細胞が、表皮の底部に付加され、角質層の上部細胞は、連続的に摩滅する。即ち、表皮内に埋め込みされた粒子は（近傍の表皮細胞のように）、徐々に盛り上がって表皮の厚さを貫通し、遂には角質層に変化し、最終的には脱落する。これに対して表皮を経由して真皮内に注入された粒子は、従来公知の刺青におけると同様に永久に保持される。本発明におけるセンサー全体を表皮内に埋め込みすれば、使用済みのセンサーが体内に残留するのを防止することが出来るであろう。この表皮の厚さは、身体全体に渉って変化し、まぶたでは５０μｍにまで薄く、手のひら又は足の裏では８００μｍもの厚さになる。
【００１７】
体内埋め込み手段は、当該センサーを２００μｍ以下、さらに好ましくは１００μｍ以下、最も好ましくは５０μｍ以下の厚さに埋め込むように適合させればよい。
【００１８】
粒子は、短い皮下注射針、例えば針の長さが所定の埋め込み装置の動作深度に近似している皮下注射針を使用して表皮内に注入すればよい。
【００１９】
かかる目的のために好ましくは、ＷＯ−Ａ−９９／６５４８０において記載されているようなミクロ針アレーを使用すればよい。このようなアレーは、例えば反応性イオンエッチングなどのエッチング法によりマイクロマシーン加工して、例えば４００μｍ径の針から成る１０ｍｍ平方のアレーを作製すればよい。これらのアレーの外面に、必要なセンサー粒子又はセンサー材料を装荷するか、又はセンサー粒子又はセンサー材料の懸濁液の内部貫通させるための個別の孔を設ければよい。通常の貫通孔の代りに、ミクロ針に多孔性性質を持たせて、センサー材料を細孔を経由して注入することが出来るようにしてもよい。
【００２０】
又はその代りに、粒子を所謂“針なし注射器（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｓｙｒｉｎｇｅｓ）”によって皮膚内に射出してもよいのであるが、この針なし注射器は、種々の方法を用いてミクロ粒子に対して角質層を貫通するに充分な速度を賦与するのである。ＷＯ９４／２４２６３は、かかる装置であって、ガス圧を一枚の膜の後方に蓄圧して、膜の破裂によってガスを爆発的に解放し、そのガス内に粒子を引き込んで注入させる装置を記載している。かかる目的のための爆発性装置は、ＵＳ−Ａ−５１４９６５５において記載されている。
【００２１】
センサー粒子と併せて、公知のかかる皮膚注入システムの如何なるものをも本発明において使用することが出来る。
【００２２】
本発明のセンサーは、分析対象物検出するか又は分析対象物の量を測定するーなお、当該測定の読み取りが光学的信号であるーための測定手段を組み込んで成る。当該センサーは、皮膚内部に配置されているため、当該センサー内で生成した光学的信号は、経皮的に（即ち、皮膚の上層を経由して）検出され、かくしてセンサーと外部環境との直接的な接続・関連を必要とする要求を回避することが出来るのである。センサーが一旦皮膚内位置に収まると、分析愛称物の測定値が、必要な頻度で読み取られるが、一切副作用はない。このことは、糖尿病患者の長期間治療看護に関連して特別な利点となる。その理由は、グルコース測定値の読み取りをより頻繁にすれば、それだけ血中グルコース数値についてのコントロールを一層厳密に行うことが出来ることになり、また例えば網膜症、関節炎や循環悪化など血中グルコースの制御の拙さに関連した症状を発症する危険性が低減されることになる。
【００２３】
本発明のセンサーは、それ自体アッセイの読み出しに問い合わせを行うのに必要な光学的構成成分（これらは、別個に提供されて而も体外に配置される）を一切含有しないので、当該センサーは、患者の体内に不快感を最小限にして注入可能である形状として用意に提供することが出来る。好ましい実施態様においては、かかるアッセイの構成成分は、皮膚液に対して透過性であるマトリックス材料内に組み込まれ、かくしてグルコースなどの分析対象物が拡散減少によりセンサーに侵入し且つまた当該アッセイの構成成分と相互作用を及ぼすことを可能ならしめるのである。このマトリックス材料は、患者の皮膚内における注入個所においてゲルを形成する、注入可能な製剤化物であってもよい。又はその代りに、該センサーは、本アッセイの構成成分を配合・組み入れた、皮膚内に注入される固体のポリマー状マトリックス材料から形成されていてもよりが、かかるポリマー状材料は、典型的には患者の不快感を最小限とするため口径値の小さい針を介して注入するのに適した大きさとする。上皮内に載置された場合、かかる固体のポリマー状材料は、水を吸収して膨張し、ゲルを形成することによって分析法の構成成分を水和するに到る。
【００２４】
本発明の装置は、生体内において生分解性であるか又は加水分解可能であればよいが、このことは、必ずしも必要ではない。その理由は、皮膚内部における自然の成長プロセス及び置換プロセスによって、当該センサーが埋め込まれた表皮が脱落する結果、このセンサーも表皮と共に最終的には排出・脱落することになるからである。このセンサーが一旦分析対象物をモニターする上で有効な機能を発揮しなくなった場合、新たなセンサーを注入するか又は体内埋め込みをしさえすればよく、古いセンサーを外科手術により除去する必要は全くない。
【００２５】
かかるセンサーを構築するのに適した材料としては、生分解性ブロックコポリマー、例えばＪｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８８： ｐｐ ８６０−８６２によって記載されているものなどが挙げられる。このような材料の水性溶液体は感熱性であるので、温度依存性で、可逆性のゲルーゾル転移を示す。かかるポリマー材料には、ゾルを形成する高温において本アッセイの構成成分を装荷することが出来る。このような形態では、当該材料は、注入可能となり、皮膚注入し、次いで体温を急速に冷却すると、当該材料はゲルマトリックスを形成する。このアッセイの構成成分は、このゲルマトリックス中において懸濁されているので、皮膚液中の分析対象物を検出するか又は測定するのに適したセンサーとなるのである。低分子量の分析対象物、例えばグルコースなどは、周囲の皮膚液体から自由にこのゲルマトリックス中に拡散することが出来る、ゾル相材料を皮膚注入しても、有意な痛覚又は組織損傷は起きない。
【００２６】
上記したゲルに基いたセンサーの代替センサーとして、分析法の構成成分を内部に分布させた、固体又はゲル様の生分解性ポリマーマトリックス材料から構築してもよい。皮膚に注入又は埋め込み下場合、かかる固体のポリマーセンサーは、水和して、膨潤するための、分析対象物は、この構造物中を貫通してアッセイ構成成分と遭遇するに到る。
【００２７】
かかる固体ポリマーのセンサー及び中空チャンバーセンサーは、以下において記載する注入・注射によって皮膚内個所に導入すればよい。
【００２８】
かかる中空チャンバーセンサー及び固体ポリマーセンサーを構築するために使用出来る生分解性材料としては、架橋タンパク質、例えばヒトアルブミン、フィブリンゲルなど、多糖類、例えばデンプン又はアガロース、ポリ（ＤＬ−ラクタイド）やポリ（ＤＬ−グリコライド）など、ポリアンハイドライド類、半固体状誘導体を形成する脂肪酸／コレステロール混合物、ヒアルロン酸塩類及びモノオレインと水との液晶などが挙げられる。非生分解性の材料も使用することが出来る。
【００２９】
又別の実施態様においては、かかるセンサーは、直径が好ましくは＜１００μｍ，さらに好ましくは１０乃至１００μｍ，例えば１０乃至５０μｍであるミクロ粒子の懸濁液として形成してもよい。しかしながら、かかる粒子は、１０μｍ以下であってもよい。かかるミクロ粒子のそれぞれが、中空ミクロ粒子内部にカプセル化されル化又は固体ミクロ粒子の構成材料中に分散された状態で当該アッセイの構成成分を包含していてもよい。このようなミクロ粒子の懸濁液は、皮膚内に容易に注入される。選択的には、かかるミクロ粒子は、生体内で生分解性であるか又は加水分解性である材料から形成される。又はその代わりに、本アッセイ構成成分を含有したリポソームを使用することも出来る。直径が０．３乃至２．０μｍであるリポソームは、注入部位で残留することが判明しており（Ｊａｃｋｓｏｎ Ａ．Ｊ．， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ．１９８１ ９， ５３５−５４０）、そのため当該センサーに使用するのに適しているはずである。また別の実施態様においては、当該センサーは、予め本アッセイの構成成分を装荷しておき、次いで表皮内に注入した複数の空の赤血球から成るものである。空の赤血球は、また赤血球ゴーストとしても知られているが、健全な赤血球を低張性溶液に暴露して、赤血球を膨張させて、破裂させその原形質内容物を放出させることによって調製することが出来る。この空の赤血球は、次に分析法構成成分を装荷して、原形質膜を再度シールさせればよい。
【００３０】
かかるセンサーの好ましい実施態様においては（即ち、ゲル、固体ポリマー、中空状又は固体状のミクロ粒子）、当該アッセイ構成成分は、センサーからの逸失を最小限とするため限定された拡散性とすることが有利である。このことは、ゲル又は封入材料が低分子量の分析対象物の拡散は許容するが、アッセイ構成成分自体の拡散は許容しないだけの粒径を有することを確保することによって実現することが出来る。これらの構成成分は、経時的に当該材料又はゲルが分解するにつれて散逸するに過ぎない。つまりアッセイ構成成分は好ましくは、センサーからの散逸を制限するために例えばタンパク質又はポリマーなど高分子量のものである。
【００３１】
センサーに使用するのに適したアッセイとしては、例えば経皮的に観察することが出来る、検出可能な光学的変化、即ち蛍光増光又は消光をもたらす加水分解や酸化などの反応が挙げられる。本発明のセンサーに使用することが出来る好ましいアッセイは、読み出しが、検出可能であるか又は測定可能である光学信号であって、光学的手段を用いて経皮的に問い合わせできる前記光学信号であるような結合アッセイである。かかる光学信号を発生する結合アッセイは、好ましくは変動する対象分析物の濃度・数値を連続的にモニターすることが出来るように可逆性であればよい。かかる可逆性は、本アッセイの構成成分が消費されない結合アッセイ方式を使用するうえで特別な利点の一つである。結合アッセイは、酵素反応又は電気化学的反応により生成されるような、望ましくない生成物を生じないので、アン税制の理由で本発明のセンサーの使用するのに好ましい。
【００３２】
本発明のセンサーに使用出来る好ましい結合アッセイ構成とは、例えば可逆性の、試薬限定競争結合アッセイであって、その構成成分として、分析対象物類縁体及び目標とする分析対象物と分析対象物類縁体との双方に可逆的に結合することが出来る分析対象物結合薬剤とを包含する前記アッセイである。目標とする分析対象物と分析対象物類縁体とは、この分析対象物結合薬剤上の同じ結合部位に結合するために競争するのである。このような競争結合アッセイ構成は、臨床診断の分野においては公知であり、例えばＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ｅｄ． Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ， Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ １９９４において記載されている。本アッセイに使用出来る適当な分析対象物結合薬剤としては、抗体類又は分析対象物結合部位を保持している抗体断片（たとえば、Ｆａｂ断片など）、レクチン類（例えばコンカナバリンＡなど）、ホルモン受容体、アプテーマー（ａｐｔａｍｅｒ）及び分子として刷り込みされたポリマー類が挙げられる。例えば、グルコースアッセイは、分析対象物の類縁体として高分子量のグルコースポリマー、例えばデキストランを使用すればよいであろう。
【００３３】
本発明に従って分析法読み出しとして使用することが出来る適当な光学信号としては、例えば蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光分極、蛍光消光、りん光法、ルミネセンス増強、ルミネセンス消光、回折又はプラズモン共鳴、など当業界においてそれ自体公知である近似アッセイによって発生させることが出来る全ての光学信号が挙げられる。
【００３４】
本発明に係わるセンサーの最も好ましい実施態様は、蛍光共鳴エネルギートランスファー法を用いた光学的読み取りを発生する試薬限定競争結合アッセイを組み込むものである。このアッセイ方式においては、分析対象物類縁体は、第一の発色団で標識化され、、また分析対象物結合薬剤は、第二の発色団で標識化される。第一と第二の発色団のうちの一つは、ドナー発色団として機能し、また他はアクセプター発色団として機能する。このドナー発色団の蛍光放射スペクトルがアクセプター発色団の吸収スペクトルと重なり合い、その結果これらドナーとアクセプター発色団を結合薬剤によって緊密に近接させた場合、通常ドナー発色団により放射される（ドナー発色団により吸収される一定波長の入射光で照射した後）蛍光を生成させるエネルギーの一部が、当業界において蛍光共鳴エネルギートランスファーとして知られるプロセスによって、非放射的に隣接するアクセプター発色団に転移されることになり、その結果ドナー発色団によって放射された蛍光信号の一部が消光されることになり、また場合によっては、アクセプター発色団が蛍光を放射することとなるということが、本分析法の一つの必須の特徴である。蛍光共鳴エネルギートランスファーは、ドナー発色団及びアクセプター発色団とが、分析対象物類縁体が分析対象物結合薬剤に結合することによって緊密に近接させられた場合にのみ生起するのであろう。即ち、分析対象物結合薬剤との結合で分析対象物類縁体と競合する分析対象物の存在下では、消光量は、減少する（その結果、ドナー発色団が放射する蛍光信号の強度は増加する、又はアクセプター発色団が放射する傾向信号の強度は低下することになる）のであるが、その理由は、標識化された分析対象物類縁体が、分析対象物結合薬剤との結合から変位排除されるからである。ドナー発色団から放射される蛍光信号の強度又は寿命はかくして、センサーを浸す皮下液中における分析対象物の濃度と相関関係を有することになる。
【００３５】
かかる蛍光共鳴エネルギートランスファー分析法の持つもう一つの有利な特徴は、アクセプター発色団が、アクセプター発色団の吸収スペクトル内のある波長を持った入射光ビームによって励起された後から放射する蛍光信号は何れも、かかる蛍光共鳴エネルギートランスファープロセスによっては一切影響を受けることがないという事実から生じるものである。従って、内部参照信号としてアクセプター発色団が放射する蛍光信号の強度を例えば当該センサーの継続的な補正を行なうために使用することが可能となり、又は当該センサーの劣化・分解度合いをモニターし、従って新たなセンサーを埋め込むか又は注入する必要性を明示することが可能となる。センサーが劣化・分解するにつれて、センサー中に存在するアクセプター発色団の量は減少し、従ってアクセプター発色団の励起により検出される蛍光信号の強度もまた減少するであろう。この信号が受容可能なベースライン値以下にまで低下した場合、このことは、新たなセンサーを埋め込むか又は注入する必要があることを示す。蛍光共鳴エネルギートランスファー法を用いた競争的結合分析法は、本発明のセンサーに使用出来るように適合させることが可能であって、当業界においては公知である。ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．３，９９６，３４５は、抗体及び蛍光体―消光体発色団ペアーとの間における蛍光共鳴エネルギートランスファーを用いたイムノアッセイを記載している。Ｍｅａｄｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ （Ａｎａｌ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９３ ２８０： ｐｐ２１−３０）は、標識化グルコース類縁体（ＦＩＴＣ標識化デキストラン）と標識化グルコース結合薬剤（ローダミン標識化コンカナバリンＡ）との間における蛍光共鳴エネルギートランスファーに基いたグルコース測定方法を記載している。これらの構成の全てにおいて、アクセプター発色団とドナー発色団／消光体は、結合薬剤又は分析対象物類縁体に結合させることが出来る。
【００３６】
本明細書の導入部において引用された、背景技術において記載された種々の蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）化学は、使用することが出来る。
【００３７】
蛍光寿命又は蛍光強度の測定をおこなうことが出来る。Ｌａｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．において記載されているように、蛍光寿命は、相変調法によって測定することが出来る。
【００３８】
蛍光共鳴エネルギートランスファーに代わる代替法が、蛍光消光法である。この場合、蛍光消光能力のある化合物を、特異的なアクセプター発色団の代わりに使用し、また競争結合アッセイにおける光学的信号が、分析対象物の増大と共に高くなるであろう。強力で且つ非特異的な蛍光消光体の例は、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９８）１８： ｐ４９によって与えられている。
【００３９】
本発明のセンサーは、皮下液中に存在する分析対象物の検出又は定量を行うように適合させることが出来る。好ましい分析対象物としては、グルコース（糖尿病患者の長期間モニターリングに関連して）、尿素（腎臓病又は腎臓機能不全に関連して）、乳酸塩（スポーツ医学における筋肉性能・能力の評価に関連して）、例えばナトリウム、カルシウム又はカリウムなどのイオン類及び血中濃度を厳密にモニターしなければならない治療用医薬、例えばジゴキシン（ｄｉｇｏｘｉｎ）、テオフィリン又は免疫抑制剤などが挙げられる。上記分析対象物は、例としてのみ列挙したものであり、測定されるべき測定対象物の正確な本質は、本発明にとって重要ではない旨了解されるべきである。
【００４０】
このセンサーは、センサー及び光学的手段を用いて経皮的に問い合わせを行う。即ち、これらのセンサーと光学的手段との間には物理的な接続は一切必要ではない。このセンサーに、蛍光共鳴エネルギートランスファー技術を用いた、反応試薬制限型の競争結合アッセイが組み込まれている場合は、かかる光学的手段は、ドナー発色団の吸収スペクトル内に収まる一定波長を有する入射光の第一のビーム及び好ましくはアクセプター発色団の吸収スペクトル内に収まる一定波長を有する入射光の第二のビームを供給するものでなくてはならない。更には、この光学的手段は、二つの異なる波長においてセンサー内で発生せしめた光学信号を測定することが出来るものでなくてはならない；即ち波長１として、ドナー発色団の放射スペクトル内の波長であり、また波長２は、アクセプター発色団の放射スペクトル（これは、分析対象物信号、内部参照又は補正信号のいずれかであるはずである）内の波長である。
【００４１】
本発明の装置の遠隔問い合わせを行うために使用するに適した光学的手段としては、励起光源、例えば発光ダイオード（青色、緑色又は赤色＞１０００ｍＣａ）など、励起光フィルター（二色性又は色素フィルタ−）及び蛍光検出器（ＰＩＮダイオード構成）とを含んで成る単純なスループット蛍光計が挙げられる。かかる特性を有する蛍光計は、ピコモル乃至フェムトモルまでの蛍光発生体の濃度に対する感度を有するものであればよい。
【００４２】
適当な蛍光計の構成は、添付する図面１に示すが、本明細書の実施例においても記載する。この蛍光計は、下記するパラメーターを別々に測定する：
波長１において（ドナー発色団）；
励起光強度、Ｉ（１，０）
周囲環境光強度、Ｉ（１，１）
蛍光と周囲環境光との合算強度、Ｉ（１，２）
波長２において（アクセプター発色団）；
励起光強度、Ｉ（２，０）
周囲環境光強度、Ｉ（２，１）
蛍光と周囲環境光との合算強度、Ｉ（２，２）
【００４３】
測定は、蛍光計を皮膚に近接して且つセンサーと軸心を併せて保持することによって行う。センサー内部で発生した蛍光信号を経皮的に測定する場合、皮膚による信号の吸収を考慮することが必要であり、ヒト皮膚の吸収率は、実験によって４００ｎｍから９００ｎｍまでの範囲において最低であることが判明している。得られた最終出力は、二つの蛍光発生団からの、下記式（式１）によって定義される蛍光強度間の正規化比率である：
最終出力＝（Ｉ（１，２）−（（１，１））＊Ｉ（２，０）／（Ｉ（２，２）−Ｉ（２，１））＊Ｉ（１，０）　　　　（１）
【００４４】
第四の局面において、本発明は、下記する工程を含んで成る、哺乳動物の皮膚液中の分析対象物を検出するか又は定量する方法を提供する：
（ａ）表皮内又は皮膚内部の分析対対象物を検出するか又は定量するためのセンサーを経時的に自発的に排出されるように注入するか又は埋め込む工程；
（ｂ）前記測定装置を熱力学的平衡に達するに至らしめる工程；
（ｃ）光学的手段を用いて前記測定装置の読み取りを問い合わせする工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた測定値を分析対象物の濃度に関連づける工程。
式１で与えられる光学的手段（例えば蛍光計）からの最終出力は、下記において詳述する原理に基いて得られる検量線を使用して好ましくはコンピュータにより分析対象物濃度に変換される。
【００４５】
検量線は、経験的には生理学的に関連該当する分析対象物濃度範囲について応答対分析対象物濃度の関係を測定することによって決定することが出来るものである。好ましくは、このことはインビトロでは、センサー装置の一部として行われる。かかる検量操作手法は、以下のようにして誘導される競争的アフィニティセンサーにおける応答と分析対象物濃度との間における数学的関連・関係を用いることによって大幅に単純化することが出来る：
【００４６】
競争的アフィニティセンサーの応答は、下記する反応によって支配される：
ＲＣ　←→　　Ｒ　＋　Ｃ
ＲＬ　←→　　Ｒ　＋　Ｌ
これらの反応は、分析対象物結合薬剤（Ｒ）と分析対象物（Ｌ）又は分析対象物類縁体（Ｃ）との結合によって生成した複合体、ＲＣ及びＲＬの解離を示すものである。
【００４７】
相当する解離平衡定数は以下に示す：
Ｋ１　＝　ＣＲＣＣ／ＣＲＣ
Ｋ２　＝　ＣＲＣＣ／ＣＲＬ
本式において、Ｃは、センサー内の化学種のモル数をセンサー容積で除したものを表わす。この濃度の尺度を用いて、固定化された化学種及び溶液中の化学種を同様に取り扱うのである。
【００４８】
物質収支式は、以下の通りである：
分析対象物の全濃度について、
ＴＣ　＝　ＣＣ　＋　ＣＲＣ
また分析対象物結合薬剤の全濃度について、
ＴＲ　＝　ＣＲ　＋　ＣＲＣ　＋　ＣＲＬ
【００４９】
上記した式を用いて、応答と分析対象物濃度との関係を以下の通り誘導する：
（ＴＣ―ＣＣ）／ＣＣＫ１＝｛ＴＲ−（ＣＣ−ＣＣ）｝／｛１＋（ＣＬ／Ｋ２）｝ （２）
【００５０】
この関係を使用することによって、検量に必要なデータ量を二つの主要パ
ラメータにまで還元することが出来る：即ち、分析対象物結合薬剤の全濃度及び分析対象物類縁体の全濃度である。検量線はかくして、曲線上の二つの点によって決まる。
【００５１】
本発明は、添付する図面と共に以下の制限されない実施例を参照すればさらに理解される。なお添付した図面について述べる。
【００５２】
【発明の好ましい実施態様】
図３において示したように、注入器１として適当な公知の型のものは、シリコン基材１１の一面に、ミクロ針の配列１２を光リソグラフィー及び反応性イオンエッチング又は類似プロセスにより長方形面全体に渉って形成したものから成る。適当には、これらの針は、長さが１と８００μｍとの間、例えば５０μｍであり、また図示したようにソリッドであるか又はセンサー物質を通過させるための貫通孔を有する中空状である。
【００５３】
図３において概略図として示したように、ミクロ針のそれぞれは、被験者の皮膚に押し付けられて、角質層１４を貫通して表皮内１６に達するが、真皮１８の手前で停止する。
【００５４】
【実施例】
実施例１
Ｍｅａｄｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ　（Ｔａｌａｎｔａ，３５，１４５−１５０，　１９８８）に従ったグルコースアッセイをコンカナバリンＡ−ローダミン及びデキストランーＦＩＴＣ（何れもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．，　Ｏｒｅｇｏｎ，　ＵＳＡから販売）を用いて開発した。このアッセイの原理は、二つの蛍光発光体が極めて近接した場合両者の間において生じる蛍光共鳴エネルギートランスファーである；即ち、グルコースの存在下では、この蛍光共鳴エネルギートランスファーは、抑制・阻害され、ＦＩＴＣ（フルオレセイン）からの蛍光信号が増大する。即ち、蛍光増大は、グルコースの増加と相関関係を有する。このグルコースアッセイは、Ｓｃｈｕｌｔｚによって報告されているようにグルコースに応答し、２０ｍｇ／ｄＬのグルコースにおいてフルオレセインの蛍光信号の回復率はほぼ５０％である。蛍光は、シッピング装置（ｓｉｐｐｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）を用いたフロースルー測定に適合させた、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ蛍光計で測定した。
【００５５】
実施例２
実施例１のグルコースアッセイの構成成分を１％、１．５％及び２ｗ／ｖ％の低温溶融アガロース（Ｔｙｐｅ ＩＸ， Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）の溶液に撹拌しながら加えた。分散させた後、温度を２０℃にまで下げ、撹拌を停止した。ゲルを形成したら（ほぼ３時間後）、セラミック製乳鉢に移し、平均粒径が同一のポリスチレンビーズ製品を目視で参照して、粒径５０乃至１００μｍにまで摩砕した。この粒子製品を０．９ｗ・ｖ％の食塩水に懸濁し、ナイロンふるいでろ過して、より大きい粒子を除去した。このふるいを通過した粒子をベンチスケールの遠心分離機で５００ｇで遠心分離処理し、細粉を含む上澄み液を廃棄した。この工程中、粒子はその蛍光を保持していたが、これは目視による検査及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ蛍光計でのローダミン蛍光測定によって確認した。２０ｍｇ／ｄＬのグルコースをこの懸濁粒子の一部試料に添加したところ、フルオレセイン蛍光信号は３０分間に渉って増大した。即ち、アガロースゲルを封入したこのアッセイ構成成分は、グルコースに対して応答するものであった。
【００５６】
実施例３
光ファイバー蛍光計を以下のように組み立てた：
光ファイバー蛍光計の光学部分をミクロベンチ上で標準構成成分を用いて作製した。この組み立て装置は、光源として赤色ＬＥＤ、レンズ、二色性ビームスプリッターとフィルター及び検出器ダイオードとから成るもので、図１に示す通りである。簡潔に言えば、この蛍光計は、励起光ビームを出す発光ダイオード（１）を含んで成るもので、この励起光ビームは、励起フィルター（３）を含むコンデンサー（２）を貫通し、ビームスプリッター（４）に入射する。励起ビームの一部は、ランチング光学系内（５）で偏向され、光ファイバー（６）内に入る。蛍光計が使用中である場合は、励起光のビームがセンサーに入射するように皮膚センサーと軸心を合わせて皮膚末端に経皮設置されたセンサーの問い合わせを行うに際しては、励起後にセンサーから放射された光学信号の一部は、この光ファイバー（６）内に入り、それによって蛍光計内に伝送され、蛍光計内でブロッキングダイオード（７）を貫通する。この蛍光計もまた、参照検出器ダイオード（９）を包含しており、このダイオードから、ＬＥＤ（１）から放射された励起光の参照測定値が得られる。直径が０．５ｎｍで、開口数が０．６５である１メートル長のＥｎｓｉｇｎ Ｂｅｃｋｆｏｒｄ光ファイバーの両端をグラスペースト上のダイアモンドペーストを用いて研磨処理して、鏡面仕上げした。このファイバーの一端を２０倍率の顕微鏡対物レンズの前のＸＹＺホルダー内に載置した。これらのダイオード（ＬＥＤ（１）及び検出器ダイオード（７）と（９））を図２に示した、カスタム―メイドの励振器／増幅器回路に接続した。この回路は、センダ（１０）、電流増幅器（１１）と（１２）、マルチプレクサ（１３）と（１４）、積算器（１５）と（１６）及びアナログ励振器（１７）とから成るものである。この励振器回路は、ＬＥＤを２３８Ｈｚで励振させるようセットされ、検出器ダイオード（７）及び（９）からの信号は、励振信号とシンクロナイズされた接地と記憶キャパシター（時定数が１秒である積算器）との間でスイッチされた。これら二つの積算された信号は、バックグラウンド補正された蛍光信号とバックグラウンド補正された励起光レベル（ＬＥＤ強度）とに相当する。前者を後者で分割することは、図２において示したアナログデバイダーで支持されていた。試験目的で、このファイバー（６）の遠位端部をローダミンの希釈溶液中に浸漬し、この光学系をアナログデバイダーからの信号が最大となるように調節した。
この蛍光計は、バッテリで作動し（典型的な電力消費量は９ｖで１５０ｍＡである）、便宜上、ペンの形状と寸法で構築することが出来る。
【００５７】
実施例４
上記アッセイ構成成分（実施例２において記載した）を含む、１．５％ｗ／ｖの直径がほぼ５０μｍのアガロース粒子を遠心分離処理し次いで０．９％ｗ／ｖ食塩水中に懸濁させることによって数回洗浄した。この洗浄操作によって、ゲル構造内に捕集されなかった過剰の反応試薬を除去する。得られた粒子は、この工程中は強度に蛍光性を保持する。次いでこの粒子懸濁液を、皮膚表面からの貫入深度が１００μｍである、直径が１μｍのミクロ針４００本から成る１０ｍｍ平方のアレーを設けたシリコンマイクロマシン加工したパッドに装荷し、次いでヒトのボランティアの手のひらの皮膚下にまで経皮的又は皮膚内注入を行う。光ファイバー蛍光計（実施例３を参照）をこの皮膚部に向けて、ローダミン蛍光信号を採取し、従来公知法による血中グルコース測定値と相関関係づけた結果、埋め込みセンサーによる経皮的測定が実施可能であることが明らかとなった。このセンサー粒子は、一ヵ月後に皮膚から喪失する。
【図面の簡単な説明】
【図１】光ファイバー蛍光計のうちの光学部の概略図である；
【図２】光ファイバー蛍光計の光学部と組み合わせて使用する励振器／増幅器の概略図である；及び
【図３】ＷＯ９９／６４５８０から引用したもので、側面から見た、本発明に使用するのに適した複数針注入器を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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