(57)【要約】本発明は、癌を含む広範囲にわたる疾患及び容態に関する。本発明はこのような疾患又は容態を検出するためのプローブを提供する。該プローブは、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別することができる。該プローブは種々の方法でこのことを行うことができる。その一つは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレセプターへの結合に関しての変化を検出することである。また、本発明は、該プローブを使って疾患又は容態を検出する方法を提供する。本発明は、抗体又はその抗体を産生することができるエピトープを使って、疾患又は容態を処置することにも及ぶ。ここで、抗体は、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別することができて、非機能性レセプターに結合するものである。処置方法、薬学的組成物、及びプローブ及び抗体の使用も、本発明に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患又は容態を検出するためのプローブであって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している前記プローブ。
【請求項２】
プローブが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレセプターへの結合に関しての変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
プローブが、Ｐ２Ｘ７レセプター内の孔形成のために必要な一つ以上のタンパク質の結合の変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
プローブが、結合ＡＴＰの不在下で晒されたレセプターの一つ以上の部分を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
部分が、Ｐ２Ｘ７モノマーを含む、請求項４に記載のプローブ。
【請求項６】
天然型又は人工型である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
疾患又は容態が、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌、他の上皮細胞癌、悪性リンパ腫、他の血液癌、過敏性腸症候群、及びウイルス又は他の病理学的生物体による感染、から成る群より選択される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項８】
ＡＴＰ結合部位に隣接した細胞外ドメインに位置する各レセプターのエピトープに対して、抗体が向けられている、請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
レセプターが、哺乳類のＰ２Ｘ７レセプターであり、且つ、アミノ酸２１０にあるプロリンがトランスコンフォメーションである配列を有する機能性レセプターと、アミノ酸２１０にあるプロリンがシスコンフォメーションである配列を有する非機能性レセプターとを区別するようにプローブが適合している、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１０】
レセプターが、哺乳類のＰ２Ｘ７レセプターであり、且つ、アミノ酸１９９にあるプロリンがトランスコンフォメーションである配列を有する機能性レセプターと、アミノ酸１９９にあるプロリンがシスコンフォメーションである配列を有する非機能性レセプターとを区別するようにプローブが適合している、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１１】
プローブが、Ｇｌｙ２００からＴｈｒ２１５まで伸張するＰ２Ｘ７レセプターのエピトープ配列に対して生産された抗体であるか、該抗体を含む、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１２】
疾患又は容態が、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌、他の上皮細胞癌、悪性リンパ腫、他の血液癌、過敏性腸症候群、及びウイルス又は他の病理学的生物体による感染、から成る群より選択される、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１３】
ウイルス又は生物体が、ＨＩＶ又は結核症ミコバクテリウムである、請求項１２に記載のプローブ。
【請求項１４】
容態が過敏性腸症候群であり、且つ、抗体が、機能性状態による変化のないＰ２Ｘ７レセプターの他の領域をも検出することができる、請求項７に記載のプローブ。
【請求項１５】
容態が過敏性腸症候群であり、且つ、抗体が、全Ｐ２Ｘ７発現を検出することができる二次抗体との組み合わせで使用される、請求項７又は１４に記載のプローブ。
【請求項１６】
疾患又は容態を検出する方法であって、
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のプローブを使って、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するステップと、
レセプター発現プロフィールを提供するステップと、
レセプター発現プロフィールを、正常プロフィールと比較するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
レセプター発現プロフィールが、非機能性レセプターのプロフィールである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
プローブが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレセプターへの結合に関しての変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
プローブが、Ｐ２Ｘ７レセプター内の孔形成のために必要な一つ以上のタンパク質の結合の変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
プローブが、結合ＡＴＰの不在下で晒されたレセプターの一つ以上の部分を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
部分が、Ｐ２Ｘ７モノマーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
レセプター発現プロフィールが、インシツ・イメージング法を使って提供される、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
レセプター発現プロフィールが、顕微鏡法、共焦点顕微鏡法又は活性化細胞蛍光ソーティングを使って提供される、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
疾患又は容態の検出における、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のプローブの使用。
【請求項２５】
請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のプローブと複合化している、単離された細胞又は組織サンプル。
【請求項２６】
過敏性腸症候群を診断する方法であって、細胞及び／又は組織のＰ２Ｘ７発現プロフィールを検出するステップと、正常細胞及び／又は組織の予め決定されている発現プロフィールと該プロフィールとを比較するステップと、を含む前記方法。
【請求項２７】
Ｐ２Ｘ７発現プロフィールの検出が、一つ以上の抗体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
過敏性腸症候群の診断における一つ以上の抗体の使用。
【請求項２９】
過敏性腸症候群を処置する方法であって、Ｐ２Ｘ７レセプター機能を回復させるように適合している組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３０】
疾患又は容態を処置又は予防するための抗体であって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合しており、且つ、非機能性レセプターのみに結合する、前記抗体。
【請求項３１】
抗体が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレセプターへの結合に関しての変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
抗体が、Ｐ２Ｘ７レセプター内の孔形成のために必要な一つ以上のタンパク質の結合の変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３３】
抗体が、結合ＡＴＰの不在下で晒されたレセプターの一つ以上の部分を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３４】
部分が、Ｐ２Ｘ７モノマーを含む、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３５】
請求項３０乃至３４のいずれか一項に記載の抗体であって、ポリクローナル、モノクローナル、組み換え、ヒト化抗体又はこれらの適切な断片である、前記抗体。
【請求項３６】
レセプターが、哺乳類のＰ２Ｘ７レセプターであり、且つ、アミノ酸２１０にあるプロリンがトランスコンフォメーションである配列を有する機能性レセプターと、アミノ酸２１０にあるプロリンがシスコンフォメーションである配列を有する非機能性レセプターとを区別するように抗体が適合している、請求項３０乃至３４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３７】
Ｇｌｙ２００からＴｈｒ２１５まで伸張するＰ２Ｘ７レセプターのエピトープ配列に対して生産された、請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
レセプターが、哺乳類のＰ２Ｘ７レセプターであり、且つ、アミノ酸１９９にあるプロリンがトランスコンフォメーションである配列を有する機能性レセプターと、アミノ酸１９９にあるプロリンがシスコンフォメーションである配列を有する非機能性レセプターとを区別するように抗体が適合している、請求項３０乃至３４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３９】
疾患又は容態が、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌、他の上皮細胞癌、悪性リンパ腫、他の血液癌、過敏性腸症候群、及びウイルス又は他の病理学的生物体による感染、から成る群より選択される、請求項３０乃至３７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４０】
ウイルス又は生物体が、ＨＩＶ又は結核症ミコバクテリウムである、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
請求項３０乃至４０のいずれか一項に記載の抗体産生を起こすように適合しているエピトープ。
【請求項４２】
化学架橋剤マレイミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＣＳ）を介してジフテリア毒素に架橋結合しているＣｙｓ残基がＣ末端に付いている、請求項４１に記載のエピトープ。
【請求項４３】
正常（機能性）Ｐ２Ｘ７レセプターをそのままにしておく一方で、細胞表面で発現される異常型又は非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを標的とすることによって、プログラム化された細胞死を調節するための、患者の疾患又は容態を処置する治療用ベヒクルとしての、請求項３０乃至３４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項４４】
請求項３０乃至３４のいずれか一項に記載の抗体産生を起こすための、請求項４１又は４２に記載のエピトープの使用。
【請求項４５】
患者の疾患又は容態を処置又は予防するための薬学的組成物であって、その表面に発現された異常型又は非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを有する細胞のプログラム化された細胞死を調節することができる、請求項３０乃至３４のいずれか一項に記載の抗体の薬学的有効量、又はこのような量の産生を引き起こすエピトープ、を含む前記組成物。
【請求項４６】
患者の疾患又は容態を処置又は予防するための製剤であって、患者の細胞又は組織のＰ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼの発現を調節するように適合している一つ以上の物質を含む、前記製剤。
【請求項４７】
患者の疾患又は容態を処置又は予防するための方法であって、患者の細胞又は組織のＰ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼの発現を調節するように適合している一つ以上の物質を含む製剤を患者に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項４８】
疾患又は容態が、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌、他の上皮細胞癌、悪性リンパ腫、他の血液癌、過敏性腸症候群、及びウイルス又は他の病理学的生物体による感染、から成る群より選択される、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４９】
疾患又は容態が、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌、他の上皮細胞癌、悪性リンパ腫、他の血液癌、過敏性腸症候群、及びウイルス又は他の病理学的生物体による感染、から成る群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を含む疾患の診断及び処置に関する。本発明が関係する疾患のタイプには、上皮細胞及び悪性リンパ腫に由来する癌が含まれる。本発明は、新生物発生前状態、過敏性腸症候群、並びに、ウイルス性その他の感染等の他の容態にも関する。本発明がその他の疾患及び容態にも適用できることは非常に可能である。
【背景技術】
【０００２】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、Ｐ２Ｘ７レセプターとして知られるリガンド・ゲート制御されたプリン作動性レセプターを活性化することができる。レセプターサブタイプＰ２Ｘ１からＰ２Ｘ７が同定されている。異なるＰ２Ｘレセプターサブタイプが、リンパ球、胸腺細胞、マクロファージ及び樹状細胞を含む白血球及び上皮細胞等の多くの細胞に存在することが既知である。
【０００３】
Ｐ２Ｘは、幾つかの他のカチオン（カルシウム及びナトリウム等）に対してと同様に、カルシウムイオンに対しても透過性である。Ｐ２Ｘレセプターを介しての細胞中へのカルシウムイオンの流れ込みは、細胞死と関連する。
【０００４】
Ｐ２Ｘ７サブタイプが、多くのタイプの細胞でのアポプトーシス（又はプログラム化された細胞死）に関与していると信じられている。ＡＴＰの存在下、細胞の表面上で発現されるＰ２Ｘ７レセプターは、細胞膜を通るカルシウムチャンネルを１秒内に開放することができる。ＡＴＰへ晒し続けられると、大きな孔が形成されて、数秒乃至数十秒内で、過剰のカルシウムが流れ込み、アポプトーシスが誘発されることになる。
【０００５】
一般に、ＡＴＰへの暴露は、例えば上皮癌細胞の場合にはアポプトーシスの結果にはならない。このような細胞は、孔を形成することができないＰ２Ｘ７レセプターを発現することが見出されている。これらは、非機能性レセプターと考えられている。
【０００６】
前立腺ＰＣ３及び乳ＭＣＦ７等のヒト癌細胞株並びに齧歯動物ハイブリドーマを含む動物細胞株では、Ｐ２Ｘ７レセプターは、細胞表面上で非機能性コンフォメーションをとっていることが見出されている。
【０００７】
悪性リンパ腫を持つ患者のＢ細胞は、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを発現する。リンパ腫は、細胞溶解破壊を逃れる悪性腫瘍クローンから成長する。この過程により、悪性リンパ腫が累積的に蓄積され、リンパ節腫脹及び／又は脾腫に導かれる。
【発明の概要】
【０００８】
第一の態様では、本発明は、疾患又は容態を検出するためのプローブを提供する。該プローブは、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している。好ましくは、該プローブは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレセプターへの結合に関しての変化を検出することによって、又は、Ｐ２Ｘ７レセプター内の孔形成のために必要な一つ以上のタンパク質の結合の変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している。代替する態様では、該プローブは、結合ＡＴＰの不在下で晒されたレセプターの一つ以上の部分を検出する。このようなレセプター部分には、Ｐ２Ｘ７モノマーが含まれる。
【０００９】
また、本発明は、疾患又は容態を検出する方法を提供する。該方法には、本発明のプローブを使って機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するステップと、レセプター発現プロフィールを提供するステップと、レセプター発現プロフィールを、正常プロフィールを比較するステップと、が含まれる。プローブそのものと関連して、例えば上述のように、変化を検出することができる。
【００１０】
プローブは、天然又は人工のものである。好ましくは、プローブは抗体であり、ポリクローナル、モノクローナル、組み換え、ヒト化抗体又はこれらの適切な断片である。抗体は、ＡＴＰの結合部位に隣接する細胞外ドメインに位置するエピトープに対してのものであることが好ましい。ヒトＰ２Ｘ７レセプターの場合には、プローブは、アミノ酸２１０にあるプロリンがトランスコンフォメーションである配列を有する機能性レセプターと、アミノ酸２１０にあるプロリンがシスコンフォメーションである配列を有する非機能性レセプターとを区別するように適合していることが好ましい。
【００１１】
プローブは、当業者には容易に明らかなように、いかなる適当な技術を使っても調製することができる。
【００１２】
ＡＴＰの結合部位で起こっている他のコンフォメーション変化を検出することを介して、プローブが、機能性レセプターと非機能性レセプターとを区別することができることは、本発明の範囲内である。例えば、検出される変化は、上記で言及されているプロリン以外のアミノ酸であってもよい。このようなアミノ酸の例として、Ｐｒｏ１９９が挙げられる。他に例えれば、検出される変化は、幾つかの他の関連であってもよい。
【００１３】
プローブは、機能性状態による変化のないＰ２Ｘ７レセプターの他の領域をも検出することができるように適合していてもよい。結合ＡＴＰを欠いているモノマーサブユニットのコンフォメーションは、プローブを使って検出することができる。選択されるエピトープは、ＡＴＰが結合していない場合にのみアクセス可能なレセプターの表面領域の形状を特異的に検出することができるからである。プローブは、孔形成に必要な一つ以上のタンパク質（アクセサリー又は他のタンパク質）の結合の変化を検出することができる。このようなタンパク質の非限定的例示として、ラミニン、インテグリン、ベータ-アクチン、アルファ-アクチン及びスーパービリンがある。
【００１４】
本発明では、Ｐ２Ｘ７サブタイプに特異的抗体は、新形成前組織（preneoplastic tissue）、非常に早期の新生物形成組織（neoplastic tissue）、後期の新生物形成組織の部分を形成する細胞内又は細胞上、並びに、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを発現しているいかなる新生物形成細胞上で発現される非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを特異的に検出する又は結合するために使用される。従って、Ｐ２Ｘ７レセプターは、通常は細胞膜で発現されるか、そうでなければチャンネルとして部分的に機能することができるにもかかわらず、ゲートが閉じられている場合又は非機能性コンフォメーションにある場合のみに検出されるか結合される。さらに、抗体を用いて、結合したＡＴＰを欠いているモノマーサブユニットのコンフォメーションを検出することもできる。なぜなら、選択されるエピトープは、ＡＴＰが結合していない場合にのみアクセス可能な表面領域の形状を特異的に検出するからである。
【００１５】
本発明では、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターは、機能性レセプターに存在する構造からコンフォメーション変化を行うエピトープに対しての抗体を使って、検出又は結合され得る。非機能性レセプターのアミノ酸配列は、機能性レセプターのアミノ酸配列と同一であることが見出されている。よって、レセプターのコンフォメーション変化の原因は、レセプターとＡＴＰとの相互作用に関係する。上述のように、ＡＴＰ分子は、レセプターアゴニストとして作用する。そこで、ＡＴＰがレセプターに結合している場合には、レセプターは、カルシウムイオンの流入のために細胞膜を通るチャンネルを開くことができる。故に、非機能性は、レセプターへのＡＴＰアゴニストの適切な結合の欠如によって生じる。その理由として、生産の欠乏又は分解速度の増加を介しての、ＡＴＰの局所的利用率の欠乏が挙げられる。レセプターへのＡＴＰ結合が途絶されると、レセプターのコンフォメーションが変わる。これは、ＡＴＰ結合によって影響を受けるタンパク質の領域に結合するように特別に考案された抗体を使うことによって検出される。
【００１６】
ヒトＰ２Ｘ７レセプターの場合、コンフォメーション変化に関与する特異的配列には、Ｐｒｏ２１０が含まれる。Ｐｒｏ２１０は、結合ＡＴＰの不在の下で、トランス型からシス型へとコンフォメーションが変化する。従って、ヒトレセプターの場合、抗体が産生されるための適切なエピトープ配列には、Ｐｒｏ２１０が含まれ、この残基のいずれかの側に抗体反応を誘発するに必要である適切な範囲に伸張してよい。非限定的な例示としては、Ｇｌｙ２００からＴｈｒ２１５に伸張するセグメントが挙げられる。更に、他の哺乳動物（例えばラット）からの相同的セグメントも、ヒト組織とクロス反応する場合には、使用され得る。例として、ヒト配列と比較してラットの配列には２つのアミノ酸置換があるけれども、ラットのＧｌｙ２００からＴｈｒ２１５までの同一セグメントが使用され得る。
【００１７】
非ヒトレセプターの場合には、適切な実験によって特異的配列を確かめることができる。
【００１８】
本発明に従い非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを検出することにより、機能性レセプター（及び、故に正常な細胞）が本質的にはラベル化されないままにある分布パターンを示すことができる。しかし、２Ｘ７レセプターの非機能性コンフォメーションは、新形成前の非常に初期段階で、細胞の核及び細胞質の中に、まずは検出され得る。例えば、上皮細胞癌の場合、本発明の方法を使えば、生検される組織のヘマトキシリ及びンエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色スライドによって癌の普通の病理学的外観が検出される数年前に、新形成前を検出することが可能である。従って、前立腺癌、皮膚癌及び乳癌等の癌を、早期治療の導入の利益とともに、現在の場合に比べてかなり早期に検出することができる。
【００１９】
本発明のプローブ及び方法によって検出される疾患及び容態の全範囲については、まだ確かめられていない。しかし、これらには、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌等の上皮細胞癌、並びに、悪性リンパ腫、過敏性腸症候群及びＨＩＶ等のウイルス又は他の病理学的生物体（ミコバクテリウム結核症等）による感染を含む血液の癌が含まれると信じられている。感染は、機能性に必要な補助因子の阻害を介して直接的に、又は、上皮細胞又は他の細胞へのＰ２Ｘ７機能を阻害するように働く補助因子をアップレギュウレートすることを介して、非機能性レセプターの発現を起こさせる。これにより、感染した細胞は、アポプトーシスによる破壊に敏感に反応しなくなる。
【００２０】
特に明記しない限り、本明細書で使用される用語「疾患及び容態」は、先行する段落で示される全ての特異的な疾患及び容態を含むと意図されている。
【００２１】
過敏性腸症候群（「ＩＢＳ」）の特別の場合には、この容態を持つ患者では、腸粘膜（上皮の下にある基質に存在する広範囲に分布するリンパ球でＰ２Ｘ７レセプターを通常は発現する）がアップレギュウレートされることが現在は見出されている。影響を受けた患者では、この増大した発現は、単離された領域で見出されるか、より極端な場合には腸管の全長にわたって一般に増大する。
【００２２】
最小に影響を受けた場合には、全２Ｘ７レセプターがアップレギュウレートされるが、これらの全てが機能的で上皮には侵入しない。さらにひどい場合には、全２Ｘ７レセプター発現はより高く、腸のうち最大に影響を受けた区域は、非機能性のレセプターを発現する。これらは、例えば盲腸の粘膜に局所化され、上皮に侵入する。最高にひどい場合では、全２Ｘ７レセプター発現が更に増大し、レセプターのほとんどが、増大した上皮細胞の侵入とともに、非機能性である。
【００２３】
既に議論されてきたように、２Ｘ７レセプターの非機能性は、レセプターへのＡＴＰアゴニストの適切な結合の欠如によって生じる。その理由としては、生産欠如を介してのＡＴＰの局所的な利用率の欠如又はＡＴＰのエクトＡＴＰアーゼ（ect-ATPase）酵素分解を介しての分解速度の増加がある。レセプターへのＡＴＰ結合が途絶されると、レセプターのコンフォメーションが既に議論されてきたように変わる。そして、これは、本発明のプローブを使って検出される。しかし、全２Ｘ７レセプター分布の検出は、ＡＴＰ結合によって影響を受けない２Ｘ７レセプターの細胞外ドメインの他の領域へのエピトープを使って最大に達成することができる。
【００２４】
全２Ｘ７分布と、非機能性であって腸粘膜で発現されるレセプターの比率とを特異的に区別するために、一つ又は二つの２Ｘ７サブタイプ特異的抗体を使うことは、本発明の範囲内である。従って、一緒に使われる二つの抗体は、全レセプター数及び閉じられたゲート又は非機能性コンフォメーションにのみ存在するそれらのレセプターチャンネルの両方を検出することができる。第一の抗体は、全Ｐ２Ｘ７レセプター発現を検出するように適合している。本発明の抗体を含むプローブ又はそれに付けられたプローブは、ＩＢＳの検出のための第二抗体を提供することができ、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するだけでなく、レセプターが機能性状態によっては変わらない他の領域の検出を許容する。抗体は、別々に使われてもよいし、一緒に使われてもよい。好ましくは、抗体は、組み合わせで使われる。
【００２５】
全Ｐ２Ｘ７レセプターを、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとは別に検出することで、容態のひどさが決定される。胃腸粘膜での非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターの発現は、正常な細胞が実質的にはラベル化されていないパターンで起こる。その後、Ｐ２Ｘ７レセプターの非機能性のコンフォメーションが上皮の下にある基質で、症候群がマイルドな場合には単離されたパッチ状から、非機能性レセプターの上皮への単離されたパッチ状の浸潤を伴う胃腸路の長さにわたる広範囲な発現の範囲でまず検出される。
【００２６】
また、本発明は、過敏性腸症候群を診断する方法を提供する。該方法には、細胞及び／又は組織のＰ２Ｘ７発現プロフィールを検出するステップと、そのプロフィールを、正常な細胞及び／又は組織の予め決定された発現プロフィールと比較するステップとが含まれる。好ましくは、Ｐ２Ｘ７発現プロフィールの検出には、一つ以上の抗体の使用が含まれる。更に、このような抗体（単数）又は抗体（複数）は、Ｐ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの結合と関連する変化を検出しないという点で、本発明のプローブとは異なることが好ましい。このような抗体の調製は、当業者には容易に明らかであろう。
【００２７】
本発明は、一つ以上の抗体を使用して、過敏性腸症候群を診断することを含む。
【００２８】
診断は、標準的な免疫組織化学手法を利用する標準的な顕微鏡法において使用され得る。
【００２９】
この容態の治療的処置は、本発明の第三の態様との関連で以下で議論される。
【００３０】
本発明のプローブ及び方法を使う診断は、インシツのイメージング法を使って、身体組織における分布を検出するために実施される。加えて、標準的顕微鏡法、共焦点顕微鏡法及び活性細胞の蛍光ソーティングを使うことができる。リンパ、前立腺、乳、皮膚、肺、子宮、膀胱、頚、胃、食道及び同様の生検、乳組織及びその他の組織の細針吸引液、及び頚癌の検出用に取られた細胞スミアについて試験するために、普通の免疫組織化学的手法が使われる。本発明のプローブ及び方法を用いて、その他の手法が使われてもよい。
【００３１】
本発明は、疾患又は容態を処置するための抗体を提供する。該抗体は、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合しており、且つ、非機能性レセプターにのみ結合するように適合している。好ましくは、該抗体は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレセプターへの結合に関しての変化を検出することによって、又は、Ｐ２Ｘ７レセプター内の孔形成のために必要な一つ以上のタンパク質の結合の変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別し、且つ、非機能性レセプターにのみ結合するように適合している。もう一つの実施形態では、抗体は、結合ＡＴＰの不在下で晒されたレセプターの一つ以上の部分を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別する。
【００３２】
疾患及び容態を処置するための抗体は、疾患及び容態の診断をするためのプローブとして使われる抗体と同一であってよい。このような抗体は、例えば、時事問題として、皮膚癌の処置に使うことができる。癌の全身性処置については、抗体又はその活性断片は、望ましくない免疫反応副作用を最小にするためにヒト化されているべきである。
【００３３】
本発明の抗体は、ヒトを含む哺乳類の疾患又は容態を処置するために使われてもよい。疾患又は容態の例としては、本発明のプローブとの関連で上述されている。
【００３４】
また、本発明は、本発明の第二の態様の抗体の産生を引き起こすことができるエピトープを提供する。該エピトープは、Ｐｒｏ２１０を含み、（ヒトレセプターのＰ２Ｘ７配列にある）Ｇｌｙ２００からＴｈｒ２１５までのセグメントを囲んでいることが好ましい。該エピトープは、好ましくは、化学架橋剤マレイミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＣＳ）を介してジフテリア毒素に架橋結合しているＣ末端Ｃｙｓ残基に付けられているべきである。これにより、付けられたエピトープペプチドによって適合されるコンフォメーションは、安定したシスのプロリン形状を占める。
【００３５】
この特異的なペプチドのコンフォメーションは、一つ以上の疾患又は容態（特に、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌等の上皮細胞癌、並びに、悪性リンパ腫、過敏性腸症候群及びＨＩＶ等のウイルス又はミコバクテリウム結核症等の他の病理学的生物体による感染）を持つヒト又は動物に現されると意図される。患者は、コンジュゲートされたエピトープの適用に対して免疫反応を開始し、影響を受けた細胞の表面に現れた非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを認識する抗体を産生するので、それらへ結合して、複雑になった細胞を破壊するように適切な免疫細胞を変えることが好ましい。細胞死のために初回抗原刺激を受けている他の細胞も影響を受けることが好ましい。
【００３６】
上述されている配列は、本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。本発明は、好ましくは非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターのみに対して、好ましくは細胞表面に発現された全機能性レセプターを無視して、そして副作用を防ぐことによって、特異的免疫反応を同様に引き起こす互生配列及びキャリヤー及び架橋剤を含む。
【００３７】
また、この第二の態様において、本発明は、患者の疾患又は容態を処置するための治療学的ベヒクルとして本発明の抗体を使用して、正常（機能性）レセプターを発現している全細胞をそのままにしておく一方で、細胞表面に発現される異常型又は非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを標的にすることによってプログラム化された細胞死を調節することを提供する。本発明は、また、本発明のエピトープを使用して、上述のように抗体産生を起こすことにも及ぶ。
【００３８】
また、本発明は、患者の疾患又は容態を処置又は予防するための薬学的組成物を提供する。該組成物は、異常型又は非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを表面上に発現している細胞のプログラム化された細胞死を調節することができる抗体の薬学的有効量（又は、このような量の産生を起こすエピトープ）を含む。
【００３９】
抗体又はエピトープの薬学的有効量は、患者及び疾患又は容態の性質により異なる。これらの変化は、当業者によって確かめられ得る。
【００４０】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容されるキャリヤーとともに投与される。薬学的に許容されるキャリヤーは、本技術分野において既知のもの又は今後案出されるもので意図される使用に適切なものであってもよい。キャリヤーと同様に、本発明の薬学的組成物は、他の成分（例えば、色素、保存剤、緩衝剤及び抗酸化剤）を含んでよい。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、望ましい型をとってよく、例えば、軟膏、クリーム、溶液、懸濁液、粉末、錠剤、カプセル、坐薬又はペッサールの型で投与されてよい。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、いかなる適切な方法で投与されてもよく、経口投与、非経口投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、局所的投与が含まれる。
【００４３】
また、本発明は、患者の疾患又は容態を処置又は予防するための方法を提供する。該方法は、本発明に従い薬学的組成物を患者に投与するステップを含む。
【００４４】
また、本発明は、患者の疾患又は容態の処置又は予防において、本発明の薬学的組成物の使用を提供する。
【００４５】
最適効果のために本発明の薬学的組成物の使用パターンを変える必要があることは、当業者には明らかであろう。疾患又は容態の性質並びにそのひどさを考慮する必要があろう。
【００４６】
本発明の第三の態様では、Ｐ２Ｘ７レセプター（例えば、悪性リンパ腫を持つ患者のＢ細胞のもの）へのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼ（酵素）に焦点が置かれる。白血球上のＰ２Ｘ７レセプターのチャンネル開放は、エクトＡＴＰアーゼ及びエクトＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（エクトＡＴＰＤアーゼ）によるＡＴＰアゴニストの迅速な加水分解を介して終了する。これらの酵素は、ＡＴＰに依存する数々の生理学的過程を調節する。白血球に対するＡＴＰアーゼ及びＡＴＰＤアーゼ活性の基質特異性は、白血球上に一以上の細胞表面（ＣＤ３９を含む）が存在することを示唆する。一つ以上のこれらのＡＴＰアーゼ又はＡＴＰＤアーゼの激増は、Ｐ２Ｘ７孔形成を制御するのに必要なＡＴＰの供給と、それに引き続く、Ｂ細胞数を調節するために必要なプログラム化された細胞死とを制限することができる。
【００４７】
同様にして、ＩＢＳの場合には、ＡＴＰアーゼの激増は、Ｐ２Ｘ７レセプターへのアゴニストＡＴＰの適切な結合の欠如に寄与するだろうと信じられている。
【００４８】
従って、この第三の態様では、本発明は、患者の疾患又は容態を処置又は予防するための製剤を提供する。該製剤は、患者の細胞又は組織のＰ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼの発現を調節するように適合している一つ以上の物質を含む。また、本発明は、患者の疾患又は容態を処置又は予防するための方法を提供する。該方法は、患者の細胞又は組織のＰ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼの発現を調節するように適合している一つ以上の物質を含む製剤を患者に投与するステップを含むものである。
【００４９】
このようなＡＴＰアーゼの例示として、ＣＤ３９又はＣＤ７３がある。
【００５０】
このような物質は、ＡＴＰ類似体の型をとってよく、好ましくは、加水分解できないもので、Ｐ２Ｘ７に特異的であるか、又は、Ｐ２Ｘ７結合部位のためのＡＴＰ利用率を減少させる局所的ＡＴＰアーゼの作用を阻害する他の物質であってよい。製剤は、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターに対して特異的に向けられたヒト化抗体の型であってよい。
【００５１】
疾患又は容態は、悪性リンパ腫又はＩＢＳであることが好ましいが、本発明は、他の疾患又は容態にも及ぶことができ、他の上皮細胞又は血液癌や、ウイルス性及び他の病理学的感染も含まれる。
【００５２】
悪性リンパ腫の場合には、ＡＴＰアーゼは、Ｐ２Ｘ７レセプターへの結合に利用可能なＡＴＰの濃度を減らし、それらを不活性化させるように、Ｐ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの局所的供給を制御する。これにより、プログラム化されたＢ細胞死がかなり減少することになる。このようなＡＴＰアーゼは、Ｂ細胞の表面で特異的に発現され、悪性リンパ腫でアップレギュウレートされるように思われる。好ましくは、特異的ＡＴＰアーゼ阻害剤の適用を、Ｐ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの利用可能性を調節して、プログラム化されたＢ細胞死を調節するために使用することができる。
【００５３】
悪性リンパ腫の処置に対しては、物質は、ＡＴＰアーゼ又はＡＴＰＤアーゼをブロックすることができる合成アゴニストを、加水分解されないＰ２Ｘ７アゴニストの型で含むことができる。
【００５４】
過敏性腸症候群に関しては、本発明の製剤の投与は、影響を受けている粘膜領域の下に横たわる筋肉の過活動を介して減少するレセプター機能を回復されるように意図されている。本発明の製剤は、粘膜に直接に作用して、このような非機能性レセプターを除去する。これにより、局所的正常な胃腸分泌メカニズムが回復する。治療学的処置は、正常なレセプター機能が回復するように、非機能性レセプターへのＡＴＰの局所的供給を回復させることを目的とする。レセプター機能を制御することの結果としては、胃腸の分泌及び蠕動の正常な制御の回復がある。これは、合成Ｐ２Ｘ７特異的アゴニスト（ＡＴＰアーゼによって加水分解されないものが好ましい）の経腸又は全身性供給の適用によって、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターに対する抗体（非機能性レセプターを除去するための小さなヒト化特異的抗体であることが好ましい）の全身性の適用によって達成され、機能性レセプターのみが残される。
【００５５】
もし、下に横たわる平滑筋の蠕動の異常状態が、正常Ｐ２Ｘ７レセプターへの結合についてＡＴＰの局所的利用可能性を減少させる役割を果たしている場合には、処置には、腸運動を一時的に制限させるための処置の適用を介して平滑筋によるＡＴＰのアップテイク又は使用を制限する手段によってアゴニストのこの自然的な供給を回復することが含まれる。
【００５６】
また、本発明は、疾患又は容態の処置のための薬学的組成物を提供する。該組成物は、Ｐ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼ（酵素）の発現を調節するように適合した一つ以上の物質の薬学的有効量を含むものである。
【００５７】
全ての点において、本発明は、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターをアップレギュウレートすることによって感染された細胞でウイルスが保護される場合か、正常な細胞状態からこのようなレセプターがアップレギュウレートされる場合の、異常型Ｐ２Ｘ７レセプターがウイルス感染の結果として関与する他の医学的容態においても成される同様の適用にまで及ぶ。
【００５８】
また、本発明は、過敏性腸症候群を処置する方法を提供する。該方法は、先に定義されたように、薬学的組成物を患者に投与するステップを含む。
【００５９】
また、本発明は、このような薬学的組成物を、過敏性腸症候群の処置において使用することを提供する。
【００６０】
最適効果を得るためには、上述の薬学的に有効な作用剤の一つ以上を使用するパターンを変えることができる。
【００６１】
もう一つの表現法では、本発明は、過敏性腸症候群を処置する方法を提供する。該方法は、Ｐ２Ｘ７レセプター機能を回復させるように適合した組成物を投与するステップを含むものである。レセプター機能は、影響を受けた粘膜領域の下に横たわる筋肉の過活性を介して減少し得る。組成物は、本発明の製剤に含まれる上述した物質と同一のものであってよい。
【００６２】
更なる態様においては、本発明は、選択されたコンフォメーションを持つタンパク質の全メンバーに結合することから、特異的薬剤結果（能動的並びに受動的な免疫化）をもたらすために、抗体産生を引き起こすことができるエピトープ（又は抗体そのもの）を使って、タンパク質の異なるコンフォメーションを区別する方法を提供する。この例示としては、ｖＣＪＤ容態をもたらすコンフォメーションにあるプリオンタンパク質がある。タンパク質の異常型は、特異的抗体又はその抗体を産生するためのエピトープ（好ましくは、ヒト化されていて、最適の薬学的効果のためにサイズが減少しているもの）によって、標的とされる。
【発明の説明】
【００６３】
診断への適用
本明細書では、動物において特異的非機能性Ｐ２Ｘ７抗体を使い、ヒト及び他の哺乳動物でのほとんどの癌を診断するために本発明のプローブ及び方法の一般的な適用を実証するという例示により説明がなされている。
【００６４】
ヒト及び哺乳動物（ネコ及びイヌ等）の前立腺組織では、本発明の抗体が診断に使われると、癌又は前癌性病変の不在の下ではラベル化が成されない。しかし、本発明の診断方法によると、新生物発生前変化（neoplastic change）の最初の兆候が明らかにされる。その一方で、Ｈ＆Ｅ染色によって検出される形態学的変化は、いまなお付随しない。
【００６５】
この段階では、上皮細胞の核に最初に現れるレセプターユニットを染色する必要がある。これらは、疾患の後期段階では細胞質に移動し、前立腺全体にわたってフィールド効果として作用するので、癌の存在を確かめるために生検される必要があるのは、より少ない組織である。疾患の後期の段階では、染色は上皮先端により限定される。
【００６６】
同様にして、他の上皮細胞癌（ヒト及びネコやイヌ等の他の哺乳動物では、乳癌、肺癌、大腸癌及び皮膚癌）が、マージンを持って検出される。これらの他の組織においては、はっきりしたフィールド効果がないからである。
【００６７】
これらの他の組織（乳部組織、頚部組織等）においては、正常組織は染色されない一方で、核染色が細胞質染色に先行するという同一段階の成長が観察される。正常な形態により癌のないことが示唆される場合であっても、乳部で影響を受けている管路系の個々の内の局所的フィールド効果により、乳部組織において影響を受けた管路と腺小葉を容易に検出することができる。隣接する影響を受けていない管路は、染色されないように見える。同様に、影響を受けたリンパ節（癌を含んでいる直接的に消耗している組織）は、影響を受けた白血球のフィールド効果を介して癌の兆候を示す。従って、センチネル節は、節への転移細胞の広がりがなくても検出され得る。
【００６８】
基底細胞癌及び扁平上皮癌並びに悪性黒色腫等の皮膚癌は、ケラチノサイトとメラノサイト層の非機能性レセプター及びチャンネル成分（モノマー）に対して、はっきりしたマージンを持って陽性染色を示す。このマージンを超えると、正常皮膚は、表皮及び真皮深部の両方においてラベル化されない。
【００６９】
ヒト前立腺（ＰＣ３）及び乳（ＭＣＦ７）及び齧歯動物ハイブリドーマは、細胞表面上の非機能性レセプターについて陽性であるので、これらの癌細胞ではアポプトーシスが阻害される。この診断の一般的な適用は、ヒト以外の他の動物タイプのレセプターの遍在する性質を示すマウスハイブリドーマ細胞上の同一ラベル法によって見受けられる。正常なヒトＢ細胞リンパ球は、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターが細胞表面上で発現されることを示し、必要なときにアポプトーシスを可能にする。一方で、悪性リンパ腫を持つ患者からのヒトＢ細胞リンパ球は、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターが細胞表面で発現され、アポプトーシスが削減されることを示す。
【００７０】
治療的な適用
アポプトーシスを起こそうと企てている癌細胞の細胞表面上で発現される、この明らかに偏在するＰ２Ｘ７非機能性レセプターを、ヒト及び他の動物のほとんどの癌の処置に使うことができる。以下に例示がある。
【００７１】
実施例１
非機能性Ｐ２Ｘ７へのアフィニティー精製抗体の存在下及び不在下の両方で、マクロファージベース上にマウスハイブリドーマ細胞を増殖した。４日間を超えたとき、精製された正常ＩｇＧのみが存在する中で増殖した細胞数は１〜７×１０４である一方で、非機能性Ｐ２Ｘ７抗体の存在下では、細胞数はほんの１．５×１０４であった。
【００７２】
コントロールとしての正常ＩｇＧとともに、又は非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターへのアフィニティー精製抗体とともに、ハイブリドーマ細胞をマウスの中に注入した。非機能性（ＡＴＰ減少）Ｐ２Ｘ７レセプター（精製されているが、アフィニティー精製はされていないＧタンパク質）又はＩｇＧのいずれかとともに、０．５ｍｌ容量中同一の濃度で、１０６ハイブリドーマ細胞を、６時間にわたって予めインキュウベートし、それをマウスのグループに注入した。２日目に、第二の同一の注入を実行した。
【００７３】
１１日目に、腫瘍重量を測定した。１０匹のマウスのコントロールグループ（そのうち９匹が腫瘍の成長をおこした）の平均腫瘍重量は４．０ｇであった。その一方で、Ｐ２Ｘ７抗体に晒された１０匹のマウスのグループでも９匹が腫瘍の成長を起こしたが、平均腫瘍重量はほんの１．１ｇであった。
【００７４】
実施例２
特異的なアフィニティー精製抗体（特異性を大きく改善するためのもの）を、７日間にわたって液体中で、又はジメチコン・クリーム基剤に懸濁してのいずれかで、３つのヒト基底細胞癌（「ＢＣＣ」）に適用した。コントロール皮膚は、タンパク質標的の不在により、全体的に影響を受けなかった一方で、処置後にＢＣＣ病変の痕跡は検出されなかった。
【００７５】
一般に患者に適用することは、局所的適用を用いて明らかにされたように、内部の癌が同じ効率で処置されるように、ヒト化モノクローナル抗体（ヘルセプティン等）の生産を含むことと信じられている。リンパ球等の細胞の細胞表面で発現される全ての正常な機能性Ｐ２Ｘ７は、副作用を避けるために、抗体の存在によっても影響を受けないままである必要がある。よって、抗体は、アポプトーシスを企てているが、それを開始することのできない細胞の細胞表面で発現されるタンパク質にのみ結合するべきである。従って、標的化された全ての細胞は、プログラム化された細胞死を介して自身を殺そうと企てているもののみであり、これには、癌細胞が含まれる。これらの細胞（特に癌細胞）上のＰ２Ｘ７レセプターは、非機能性であるか、ＡＴＰ−減少状態である。
【００７６】
能動的免疫化
治療学的目的に能動的免疫化もまた使うことができる。この場合には、ヒト又は他の哺乳動物は、細胞表面で非機能的（ＡＴＰが減少した）形状にあるレセプターによってのみ適合されるコンフォメーションを模倣したコンフォメーションにある特異的エピトープ（単数）又はエピトープ（複数）に対して免疫化される必要がある。機能性レセプターに存在するエピトープの形状の部分的な暴露を含むコンフォメーションの柔軟性は避けられるべきである。例としてのエピトープＧｌｙ２００−Ｔｈｒ２１５のシスコンフォメーションは、適切な手段で使われる前に固定されるべきである。この概念が堅実であることについての追加証拠としては、抗体を造るために使われたマウス、ウサギ及びヒツジを含む数々の動物の免疫力が低下していないという観察がある。これらの多くの動物では、これまで腫瘍の成長はない。
【００７７】
産業上の利用可能性
本発明は、その全ての面において、疾患の早期且つ正確な診断及び効果的な処置（多くの場合には、従来技術で利用可能なものに比べて、はるかに侵襲性又は外傷性でない）をすることができる可能性とともに、ヒト及び動物の医学及び健康の分野に適用を有する。
【国際公開パンフレット】
2004528286.tif 000002
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2004528286.tif 000025
2004528286.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成14年7月17日(2002.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を含む疾患の診断及び処置に関する。本発明が関係する疾患のタイプには、上皮細胞及び悪性リンパ腫に由来する癌が含まれる。本発明は、新生物発生前状態、過敏性腸症候群、並びに、ウイルス性その他の感染等の他の容態にも関する。本発明がその他の疾患及び容態にも適用できることは非常に可能である。
【背景技術】
【０００２】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、Ｐ２Ｘ７レセプターとして知られるリガンド・ゲート制御されたプリン作動性レセプターを活性化することができる。レセプターサブタイプＰ２Ｘ１からＰ２Ｘ７が同定されている。異なるＰ２Ｘレセプターサブタイプが、リンパ球、胸腺細胞、マクロファージ及び樹状細胞を含む白血球及び上皮細胞等の多くの細胞に存在することが既知である。
【０００３】
Ｐ２Ｘは、幾つかの他のカチオン（カルシウム及びナトリウム等）に対してと同様に、カルシウムイオンに対しても透過性である。Ｐ２Ｘレセプターを介しての細胞中へのカルシウムイオンの流れ込みは、細胞死と関連する。
【０００４】
Ｐ２Ｘ７サブタイプが、多くのタイプの細胞でのアポプトーシス（又はプログラム化された細胞死）に関与していると信じられている。ＡＴＰの存在下、細胞の表面上で発現されるＰ２Ｘ７レセプターは、細胞膜を通るカルシウムチャンネルを１秒内に開放することができる。ＡＴＰへ晒し続けられると、大きな孔が形成されて、数秒乃至数十秒内で、過剰のカルシウムが流れ込み、アポプトーシスが誘発されることになる。
【０００５】
ヒト及びラットのＰ２Ｘ７レセプターのアミノ酸配列は既知であり、例えば、米国特許第６１３３４３４号（Buell et al）からのものがある。本明細書の図１を参照せよ。
【０００６】
一般に、ＡＴＰへの暴露は、例えば上皮癌細胞の場合にはアポプトーシスの結果にはならない。このような細胞は、孔を形成することができないＰ２Ｘ７レセプターを発現することが見出されている。これらは、非機能性レセプターと考えられている。
【０００７】
前立腺ＰＣ３及び乳ＭＣＦ７等のヒト癌細胞株並びに齧歯動物ハイブリドーマを含む動物細胞株では、Ｐ２Ｘ７レセプターは、細胞表面上で非機能性コンフォメーションをとっていることが見出されている。
【０００８】
悪性リンパ腫を持つ患者のＢ細胞は、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを発現する。リンパ腫は、細胞溶解破壊を逃れる悪性腫瘍クローンから成長する。この過程により、悪性リンパ腫が累積的に蓄積され、リンパ節腫脹及び／又は脾腫に導かれる。
【０００９】
【発明の概要】
第一の態様では、本発明は、疾患又は容態を検出するためのプローブを提供する。該プローブは、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している。好ましくは、該プローブは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレセプターへの結合に関しての変化を検出することによって、又は、Ｐ２Ｘ７レセプター内の孔形成のために必要な一つ以上のタンパク質の結合の変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合している。代替する態様では、該プローブは、結合ＡＴＰの不在下で晒されたレセプターの一つ以上の部分を検出する。このようなレセプター部分には、Ｐ２Ｘ７モノマーが含まれる。
【００１０】
また、本発明は、疾患又は容態を検出する方法を提供する。該方法には、本発明のプローブを使って機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するステップと、レセプター発現プロフィールを提供するステップと、レセプター発現プロフィールを、正常プロフィールを比較するステップと、が含まれる。プローブそのものと関連して、例えば上述のように、変化を検出することができる。
【００１１】
プローブは、天然又は人工のものである。好ましくは、プローブは抗体であり、ポリクローナル、モノクローナル、組み換え、ヒト化抗体又はこれらの適切な断片である。抗体は、ＡＴＰの結合部位に隣接する細胞外ドメインに位置するエピトープに対してのものであることが好ましい。ヒトＰ２Ｘ７レセプターの場合には、プローブは、アミノ酸２１０にあるプロリンがトランスコンフォメーションである配列を有する機能性レセプターと、アミノ酸２１０にあるプロリンがシスコンフォメーションである配列を有する非機能性レセプターとを区別するように適合していることが好ましい。
【００１２】
プローブは、当業者には容易に明らかなように、いかなる適当な技術を使っても調製することができる。
【００１３】
ＡＴＰの結合部位で起こっている他のコンフォメーション変化を検出することを介して、プローブが、機能性レセプターと非機能性レセプターとを区別することができることは、本発明の範囲内である。例えば、検出される変化は、上記で言及されているプロリン以外のアミノ酸であってもよい。このようなアミノ酸の例として、Ｐｒｏ１９９が挙げられる。他に例えれば、検出される変化は、幾つかの他の関連であってもよい。
【００１４】
プローブは、機能性状態による変化のないＰ２Ｘ７レセプターの他の領域をも検出することができるように適合していてもよい。結合ＡＴＰを欠いているモノマーサブユニットのコンフォメーションは、プローブを使って検出することができる。選択されるエピトープは、ＡＴＰが結合していない場合にのみアクセス可能なレセプターの表面領域の形状を特異的に検出することができるからである。プローブは、孔形成に必要な一つ以上のタンパク質（アクセサリー又は他のタンパク質）の結合の変化を検出することができる。このようなタンパク質の非限定的例示として、ラミニン、インテグリン、ベータ-アクチン、アルファ-アクチン及びスーパービリンがある。
【００１５】
本発明では、Ｐ２Ｘ７サブタイプに特異的抗体は、新形成前組織（preneoplastic tissue）、非常に早期の新生物形成組織（neoplastic tissue）、後期の新生物形成組織の部分を形成する細胞内又は細胞上、並びに、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを発現しているいかなる新生物形成細胞上で発現される非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを特異的に検出する又は結合するために使用される。従って、Ｐ２Ｘ７レセプターは、通常は細胞膜で発現されるか、そうでなければチャンネルとして部分的に機能することができるにもかかわらず、ゲートが閉じられている場合又は非機能性コンフォメーションにある場合のみに検出されるか結合される。
【００１６】
さらに、抗体を用いて、結合したＡＴＰを欠いているモノマーサブユニットのコンフォメーションを検出することもできる。なぜなら、選択されるエピトープは、ＡＴＰが結合していない場合にのみアクセス可能な表面領域の形状を特異的に検出するからである。
【００１７】
本発明では、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターは、機能性レセプターに存在する構造からコンフォメーション変化を行うエピトープに対しての抗体を使って、検出又は結合され得る。非機能性レセプターのアミノ酸配列は、機能性レセプターのアミノ酸配列と同一であることが見出されている。よって、レセプターのコンフォメーション変化の原因は、レセプターとＡＴＰとの相互作用に関係する。上述のように、ＡＴＰ分子は、レセプターアゴニストとして作用する。そこで、ＡＴＰがレセプターに結合している場合には、レセプターは、カルシウムイオンの流入のために細胞膜を通るチャンネルを開くことができる。故に、非機能性は、レセプターへのＡＴＰアゴニストの適切な結合の欠如によって生じる。その理由として、生産の欠乏又は分解速度の増加を介しての、ＡＴＰの局所的利用率の欠乏が挙げられる。レセプターへのＡＴＰ結合が途絶されると、レセプターのコンフォメーションが変わる。これは、ＡＴＰ結合によって影響を受けるタンパク質の領域に結合するように特別に考案された抗体を使うことによって検出される。
【００１８】
ヒトＰ２Ｘ７レセプターの場合、コンフォメーション変化に関与する特異的配列には、Ｐｒｏ２１０が含まれる。Ｐｒｏ２１０は、結合ＡＴＰの不在の下で、トランス型からシス型へとコンフォメーションが変化する。従って、ヒトレセプターの場合、抗体が産生されるための適切なエピトープ配列には、Ｐｒｏ２１０が含まれ、この残基のいずれかの側で抗体反応を誘発するに必要である適切な範囲にわたって伸張してよい。非限定的な例示としては、Ｇｌｙ２００からＴｈｒ２１５に伸張するセグメントが挙げられる。更に、他の哺乳動物（例えばラット）からの相同的セグメントも、ヒト組織とクロス反応する場合には、使用され得る。例として、ヒト配列と比較してラットの配列には２つのアミノ酸置換があるけれども、ラットのＧｌｙ２００からＴｈｒ２１５までの同一セグメントが使用され得る（例えば、米国特許番号第６１３３４３４号を参照）。
【００１９】
非ヒトレセプターの場合には、適切な実験によって特異的配列を確かめることができる。
【００２０】
本発明に従い非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを検出することにより、機能性レセプター（及び、故に正常な細胞）が本質的にはラベル化されないままにある分布パターンを示すことができる。しかし、２Ｘ７レセプターの非機能性コンフォメーションは、新形成前の非常に初期段階で、細胞の核及び細胞質の中に、まずは検出され得る。例えば、上皮細胞癌の場合、本発明の方法を使えば、生検される組織のヘマトキシリ及びンエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色スライドによって癌の普通の病理学的外観が検出される数年前に、新形成前を検出することが可能である。従って、前立腺癌、皮膚癌及び乳癌等の癌を、早期治療の導入の利益とともに、現在の場合に比べてかなり早期に検出することができる。
【００２１】
本発明のプローブ及び方法によって検出される疾患及び容態の全範囲については、まだ確かめられていない。しかし、これらには、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌等の上皮細胞癌、並びに、悪性リンパ腫、過敏性腸症候群及びＨＩＶ等のウイルス又は他の病理学的生物体（ミコバクテリウム結核症等）による感染を含む血液の癌が含まれると信じられている。感染は、機能性に必要な補助因子の阻害を介して直接的に、又は、上皮細胞又は他の細胞へのＰ２Ｘ７機能を阻害するように働く補助因子をアップレギュウレートすることを介して、非機能性レセプターの発現を起こさせる。これにより、感染した細胞は、アポプトーシスによる破壊に敏感に反応しなくなる。
【００２２】
特に明記しない限り、本明細書で使用される用語「疾患及び容態」は、先行する段落で示される全ての特異的な疾患及び容態を含むと意図されている。
【００２３】
過敏性腸症候群（「ＩＢＳ」）の特別の場合には、この容態を持つ患者では、腸粘膜（上皮の下にある基質に存在する広範囲に分布するリンパ球でＰ２Ｘ７レセプターを通常は発現する）がアップレギュウレートされることが現在は見出されている。影響を受けた患者では、この増大した発現は、単離された領域で見出されるか、より極端な場合には腸管の全長にわたって一般に増大する。
【００２４】
最小に影響を受けた場合には、全２Ｘ７レセプターがアップレギュウレートされるが、これらの全てが機能的で上皮には侵入しない。さらにひどい場合には、全２Ｘ７レセプター発現はより高く、腸のうち最大に影響を受けた区域は、非機能性のレセプターを発現する。これらは、例えば盲腸の粘膜に局所化され、上皮に侵入する。最高にひどい場合では、全２Ｘ７レセプター発現が更に増大し、レセプターのほとんどが、増大した上皮細胞の侵入とともに、非機能性である。
【００２５】
既に議論されてきたように、２Ｘ７レセプターの非機能性は、レセプターへのＡＴＰアゴニストの適切な結合の欠如によって生じる。その理由としては、生産欠如を介してのＡＴＰの局所的な利用率の欠如又はＡＴＰのエクトＡＴＰアーゼ（ect-ATPase）酵素分解を介しての分解速度の増加がある。レセプターへのＡＴＰ結合が途絶されると、レセプターのコンフォメーションが既に議論されてきたように変わる。そして、これは、本発明のプローブを使って検出される。しかし、全２Ｘ７レセプター分布の検出は、ＡＴＰ結合によって影響を受けない２Ｘ７レセプターの細胞外ドメインの他の領域へのエピトープを使って最大に達成することができる。
【００２６】
全２Ｘ７分布と、非機能性であって腸粘膜で発現されるレセプターの比率とを特異的に区別するために、一つ又は二つの２Ｘ７サブタイプ特異的抗体を使うことは、本発明の範囲内である。従って、一緒に使われる二つの抗体は、全レセプター数及び閉じられたゲート又は非機能性コンフォメーションにのみ存在するそれらのレセプターチャンネルの両方を検出することができる。第一の抗体は、全Ｐ２Ｘ７レセプター発現を検出するように適合している。本発明の抗体を含むプローブ又はそれに付けられたプローブは、ＩＢＳの検出のための第二抗体を提供することができ、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するだけでなく、レセプターが機能性状態によっては変わらない他の領域の検出を許容する。抗体は、別々に使われてもよいし、一緒に使われてもよい。好ましくは、抗体は、組み合わせで使われる。
【００２７】
全Ｐ２Ｘ７レセプターを、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとは別に検出することで、容態のひどさが決定される。胃腸粘膜での非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターの発現は、正常な細胞が実質的にはラベル化されていないパターンで起こる。その後、Ｐ２Ｘ７レセプターの非機能性のコンフォメーションが上皮の下にある基質で、症候群がマイルドな場合には単離されたパッチ状から、非機能性レセプターの上皮への単離されたパッチ状の浸潤を伴う胃腸路の長さにわたる広範囲な発現の範囲でまず検出される。
【００２８】
また、本発明は、過敏性腸症候群を診断する方法を提供する。該方法には、細胞及び／又は組織のＰ２Ｘ７発現プロフィールを検出するステップと、そのプロフィールを、正常な細胞及び／又は組織の予め決定された発現プロフィールと比較するステップとが含まれる。好ましくは、Ｐ２Ｘ７発現プロフィールの検出には、一つ以上の抗体の使用が含まれる。更に、このような抗体（単数）又は抗体（複数）は、Ｐ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの結合と関連する変化を検出しないという点で、本発明のプローブとは異なることが好ましい。このような抗体の調製は、当業者には容易に明らかであろう。
【００２９】
本発明は、一つ以上の抗体を使用して、過敏性腸症候群を診断することを含む。
【００３０】
診断は、標準的な免疫組織化学手法を利用する標準的な顕微鏡法において使用され得る。
【００３１】
この容態の治療的処置は、本発明の第三の態様との関連で以下で議論される。
【００３２】
本発明のプローブ及び方法を使う診断は、インシツのイメージング法を使って、身体組織における分布を検出するために実施される。加えて、標準的顕微鏡法、共焦点顕微鏡法及び活性細胞の蛍光ソーティングを使うことができる。リンパ、前立腺、乳、皮膚、肺、子宮、膀胱、頚、胃、食道及び同様の生検、乳組織及びその他の組織の細針吸引液、及び頚癌の検出用に取られた細胞スミアについて試験するために、普通の免疫組織化学的手法が使われる。本発明のプローブ及び方法を用いて、その他の手法が使われてもよい。
【００３３】
本発明は、疾患又は容態を処置するための抗体を提供する。該抗体は、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別するように適合しており、且つ、非機能性レセプターにのみ結合するように適合している。好ましくは、該抗体は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレセプターへの結合に関しての変化を検出することによって、又は、Ｐ２Ｘ７レセプター内の孔形成のために必要な一つ以上のタンパク質の結合の変化を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別し、且つ、非機能性レセプターにのみ結合するように適合している。もう一つの実施形態では、抗体は、結合ＡＴＰの不在下で晒されたレセプターの一つ以上の部分を検出することによって、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターと非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターとを区別する。
【００３４】
疾患及び容態を処置するための抗体は、疾患及び容態の診断をするためのプローブとして使われる抗体と同一であってよい。このような抗体は、例えば、時事問題として、皮膚癌の処置に使うことができる。癌の全身性処置については、抗体又はその活性断片は、望ましくない免疫反応副作用を最小にするためにヒト化されているべきである。
【００３５】
本発明の抗体は、ヒトを含む哺乳類の疾患又は容態を処置するために使われてもよい。疾患又は容態の例としては、本発明のプローブとの関連で上述されている。
【００３６】
また、本発明は、本発明の第二の態様の抗体の産生を引き起こすことができるエピトープを提供する。該エピトープは、Ｐｒｏ２１０を含み、（ヒトレセプターのＰ２Ｘ７配列にある）Ｇｌｙ２００からＴｈｒ２１５までのセグメントを囲んでいることが好ましい。該エピトープは、好ましくは、化学架橋剤マレイミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＣＳ）を介してジフテリア毒素に架橋結合しているＣ末端Ｃｙｓ残基に付けられているべきである。これにより、付けられたエピトープペプチドによって適合されるコンフォメーションは、安定したシスのプロリン形状を占める。
【００３７】
この特異的なペプチドのコンフォメーションは、一つ以上の疾患又は容態（特に、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、頚癌、子宮癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、大腸癌及び膣癌等の上皮細胞癌、並びに、悪性リンパ腫、過敏性腸症候群及びＨＩＶ等のウイルス又はミコバクテリウム結核症等の他の病理学的生物体による感染）を持つヒト又は動物に現されると意図される。患者は、コンジュゲートされたエピトープの適用に対して免疫反応を開始し、影響を受けた細胞の表面に現れた非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを認識する抗体を産生するので、それらへ結合して、複雑になった細胞を破壊するように適切な免疫細胞を変えることが好ましい。細胞死のために初回抗原刺激を受けている他の細胞も影響を受けることが好ましい。
【００３８】
上述されている配列は、本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。本発明は、好ましくは非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターのみに対して、好ましくは細胞表面に発現された全機能性レセプターを無視して、そして副作用を防ぐことによって、特異的免疫反応を同様に引き起こす互生配列及びキャリヤー及び架橋剤を含む。
【００３９】
また、この第二の態様において、本発明は、患者の疾患又は容態を処置するための治療学的ベヒクルとして本発明の抗体を使用して、正常（機能性）レセプターを発現している全細胞をそのままにしておく一方で、細胞表面に発現される異常型又は非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを標的にすることによってプログラム化された細胞死を調節することを提供する。本発明は、また、本発明のエピトープを使用して、上述のように抗体産生を起こすことにも及ぶ。
【００４０】
また、本発明は、患者の疾患又は容態を処置又は予防するための薬学的組成物を提供する。該組成物は、異常型又は非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを表面上に発現している細胞のプログラム化された細胞死を調節することができる抗体の薬学的有効量（又は、このような量の産生を起こすエピトープ）を含む。
【００４１】
抗体又はエピトープの薬学的有効量は、患者及び疾患又は容態の性質により異なる。これらの変化は、当業者によって確かめられ得る。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容されるキャリヤーとともに投与される。薬学的に許容されるキャリヤーは、本技術分野において既知のもの又は今後案出されるもので意図される使用に適切なものであってもよい。キャリヤーと同様に、本発明の薬学的組成物は、他の成分（例えば、色素、保存剤、緩衝剤及び抗酸化剤）を含んでよい。
【００４３】
本発明の薬学的組成物は、望ましい型をとってよく、例えば、軟膏、クリーム、溶液、懸濁液、粉末、錠剤、カプセル、坐薬又はペッサールの型で投与されてよい。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、いかなる適切な方法で投与されてもよく、経口投与、非経口投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、局所的投与が含まれる。
【００４５】
また、本発明は、患者の疾患又は容態を処置又は予防するための方法を提供する。該方法は、本発明に従い薬学的組成物を患者に投与するステップを含む。
【００４６】
また、本発明は、患者の疾患又は容態の処置又は予防において、本発明の薬学的組成物の使用を提供する。
【００４７】
最適効果のために本発明の薬学的組成物の使用パターンを変える必要があることは、当業者には明らかであろう。疾患又は容態の性質並びにそのひどさを考慮する必要があろう。
【００４８】
本発明の第三の態様では、Ｐ２Ｘ７レセプター（例えば、悪性リンパ腫を持つ患者のＢ細胞のもの）へのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼ（酵素）に焦点が置かれる。白血球上のＰ２Ｘ７レセプターのチャンネル開放は、エクトＡＴＰアーゼ及びエクトＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（エクトＡＴＰＤアーゼ）によるＡＴＰアゴニストの迅速な加水分解を介して終了する。これらの酵素は、ＡＴＰに依存する数々の生理学的過程を調節する。白血球に対するＡＴＰアーゼ及びＡＴＰＤアーゼ活性の基質特異性は、白血球上に一以上の細胞表面（ＣＤ３９を含む）が存在することを示唆する。一つ以上のこれらのＡＴＰアーゼ又はＡＴＰＤアーゼの激増は、Ｐ２Ｘ７孔形成を制御するのに必要なＡＴＰの供給と、それに引き続く、Ｂ細胞数を調節するために必要なプログラム化された細胞死とを制限することができる。
【００４９】
同様にして、ＩＢＳの場合には、ＡＴＰアーゼの激増は、Ｐ２Ｘ７レセプターへのアゴニストＡＴＰの適切な結合の欠如に寄与するだろうと信じられている。
【００５０】
従って、この第三の態様では、本発明は、患者の疾患又は容態を処置又は予防するための製剤を提供する。該製剤は、患者の細胞又は組織のＰ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼの発現を調節するように適合している一つ以上の物質を含む。また、本発明は、患者の疾患又は容態を処置又は予防するための方法を提供する。該方法は、患者の細胞又は組織のＰ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼの発現を調節するように適合している一つ以上の物質を含む製剤を患者に投与するステップを含むものである。
【００５１】
このようなＡＴＰアーゼの例示として、ＣＤ３９又はＣＤ７３がある。
【００５２】
このような物質は、ＡＴＰ類似体の型をとってよく、好ましくは、加水分解できないもので、Ｐ２Ｘ７に特異的であるか、又は、Ｐ２Ｘ７結合部位のためのＡＴＰ利用率を減少させる局所的ＡＴＰアーゼの作用を阻害する他の物質であってよい。製剤は、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターに対して特異的に向けられたヒト化抗体の型であってよい。
【００５３】
疾患又は容態は、悪性リンパ腫又はＩＢＳであることが好ましいが、本発明は、他の疾患又は容態にも及ぶことができ、他の上皮細胞又は血液癌や、ウイルス性及び他の病理学的感染も含まれる。
【００５４】
悪性リンパ腫の場合には、ＡＴＰアーゼは、Ｐ２Ｘ７レセプターへの結合に利用可能なＡＴＰの濃度を減らし、それらを不活性化させるように、Ｐ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの局所的供給を制御する。これにより、プログラム化されたＢ細胞死がかなり減少することになる。このようなＡＴＰアーゼは、Ｂ細胞の表面で特異的に発現され、悪性リンパ腫でアップレギュウレートされるように思われる。好ましくは、特異的ＡＴＰアーゼ阻害剤の適用を、Ｐ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの利用可能性を調節して、プログラム化されたＢ細胞死を調節するために使用することができる。
【００５５】
悪性リンパ腫の処置に対しては、物質は、ＡＴＰアーゼ又はＡＴＰＤアーゼをブロックすることができる合成アゴニストを、加水分解されないＰ２Ｘ７アゴニストの型で含むことができる。
【００５６】
過敏性腸症候群に関しては、本発明の製剤の投与は、影響を受けている粘膜領域の下に横たわる筋肉の過活動を介して減少するレセプター機能を回復されるように意図されている。本発明の製剤は、粘膜に直接に作用して、このような非機能性レセプターを除去する。これにより、局所的正常な胃腸分泌メカニズムが回復する。治療学的処置は、正常なレセプター機能が回復するように、非機能性レセプターへのＡＴＰの局所的供給を回復させることを目的とする。レセプター機能を制御することの結果としては、胃腸の分泌及び蠕動の正常な制御の回復がある。これは、合成Ｐ２Ｘ７特異的アゴニスト（ＡＴＰアーゼによって加水分解されないものが好ましい）の経腸又は全身性供給の適用によって、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターに対する抗体（非機能性レセプターを除去するための小さなヒト化特異的抗体であることが好ましい）の全身性の適用によって達成され、機能性レセプターのみが残される。
【００５７】
もし、下に横たわる平滑筋の蠕動の異常状態が、正常Ｐ２Ｘ７レセプターへの結合についてＡＴＰの局所的利用可能性を減少させる役割を果たしている場合には、処置には、腸運動を一時的に制限させるための処置の適用を介して平滑筋によるＡＴＰのアップテイク又は使用を制限する手段によってアゴニストのこの自然的な供給を回復することが含まれる。
【００５８】
また、本発明は、疾患又は容態の処置のための薬学的組成物を提供する。該組成物は、Ｐ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの供給を制御するＡＴＰアーゼ（酵素）の発現を調節するように適合した一つ以上の物質の薬学的有効量を含むものである。
【００５９】
全ての点において、本発明は、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターをアップレギュウレートすることによって感染された細胞でウイルスが保護される場合か、正常な細胞状態からこのようなレセプターがアップレギュウレートされる場合の、異常型Ｐ２Ｘ７レセプターがウイルス感染の結果として関与する他の医学的容態においても成される同様の適用にまで及ぶ。
【００６０】
また、本発明は、過敏性腸症候群を処置する方法を提供する。該方法は、先に定義されたように、薬学的組成物を患者に投与するステップを含む。
【００６１】
また、本発明は、このような薬学的組成物を、過敏性腸症候群の処置において使用することを提供する。
【００６２】
最適効果を得るためには、上述の薬学的に有効な作用剤の一つ以上を使用するパターンを変えることができる。
【００６３】
もう一つの表現法では、本発明は、過敏性腸症候群を処置する方法を提供する。該方法は、Ｐ２Ｘ７レセプター機能を回復させるように適合した組成物を投与するステップを含むものである。レセプター機能は、影響を受けた粘膜領域の下に横たわる筋肉の過活性を介して減少し得る。組成物は、本発明の製剤に含まれる上述した物質と同一のものであってよい。
【００６４】
更なる態様においては、本発明は、選択されたコンフォメーションを持つタンパク質の全メンバーに結合することから、特異的薬剤結果（能動的並びに受動的な免疫化）をもたらすために、抗体産生を引き起こすことができるエピトープ（又は抗体そのもの）を使って、タンパク質の異なるコンフォメーションを区別する方法を提供する。この例示としては、ｖＣＪＤ容態をもたらすコンフォメーションにあるプリオンタンパク質がある。タンパク質の異常型は、特異的抗体又はその抗体を産生するためのエピトープ（好ましくは、ヒト化されていて、最適の薬学的効果のためにサイズが減少しているもの）によって、標的とされる。
【発明の詳細な説明】
【００６５】
非機能性Ｐ２Ｘ７への抗体を作出するにあたって使用されるエピトープは、図１の２００−２１６の配列であって、２１６にＣｙｓを含むものであった。
【００６６】
機能性及び非機能性の両方のＰ２Ｘ７への抗体を作出するにあたって使用されるエピトープは、図１の６５−８１の配列であり、Ｎ末端にＣｙｓが追加されたものであった。
【００６７】
エピトープ上のＣｙｓ残基は、マレイミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＣＳ）架橋剤を介して、ジフテリア毒素（ＤＴ）キャリアに結合しており、各ＤＴキャリアに対して１０個のペピチドエピトープが付いている状態になっている。これは、コンフォメーションの安定性を維持し、大きな抗原的構造を提供するためである。これらのコンジュゲートされたエピトープは、通常の方法で、エピトープに特異的な抗体を作出するために、幾つかの動物種（ヒツジ、ウサギ及びマウス）内へ注射される抗原として使われる。
【００６８】
抗体を作出する手法は、特定の時期に動物内へ注射される抗原／アジュバントの混合物を使うことによって、従来技術において十分に文書化されている。抗体を作出するための特定の例示が以下に示されている。
【００６９】
実施例１
ヒツジ抗Ｐ２Ｘ７抗体
５００μｇのコンジュゲート（Ｐ２Ｘ７レセプター約１００μｇ）を、リン酸緩衝食塩水中で希釈して０．８ｍｌとし、フロイントの完全アジュバント１．２ｍｌを用いて乳状にした。抗原／アジュバントの乳濁液を用いて、数箇所において、ヒツジに皮下及び筋内注射した。８週間後、フロイントの不完全アジュバントで乳化された同量のコンジュゲートをヒツジに再び注射した。４週間後にこれを繰り返し、動物の頸静脈から血を取った。集めた血清を、抗体特異性について検査した。その後、特定の抗体を含んでいる血清のプールを提供するために、８週間の間隔で、ヒツジに注射と採血を通常通り行った。
【００７０】
異なるアジュバントを使った以外は上のスケジュールと同様のコンジュゲートされた抗体の同一用量を用いて他のヒツジに注射した。これらの動物では、０．７ｍｌの希釈された抗原を、０．１ｍｌのQuill A/DEAE デキストラン溶液（１ｍｌのＰＢＳ当たり、２．５ｍｇ Quill A ＋ ２５ｍｇDEAE デキストラン）と１．２ｍｌのＩＳＡ５０ Montanide とに混合した。乳濁液を、数箇所において皮下及び筋内注射した。このアジュバントを使って生産された抗体は、フロイントのアジュバントを使って生産された抗体と同じ特異性を生じた。
【００７１】
実施例２
ウサギ抗Ｐ２Ｘ７抗体
ヒツジの場合と同じ２つのアジュバント及び同じ注射スケジュールを使って、ウサギで抗体を作った。唯一の異なる点は、注射に際して３００μｇの量のコンジュゲートを使ったことであった。作られた抗体は、ヒツジで作られた抗体と同じ特異性を持っており、その作出に対抗するエピトープ間を容易に区別することができるものであった。
【００７２】
実施例３
マウス抗Ｐ２Ｘ７抗体
コンジュゲートされたエピトープに対してマウスで抗体を作り、また、非機能性Ｐ２Ｘ７エピトープのコンジュゲートされてないエピトープ（孔を形成できないことによりアポプトーティックになれないレセプターを区別することができる）に対してもマウスで抗体を作った。
【００７３】
これらの実験において使用したアジュバントは、イムノ刺激性産物 CpG DNAを含むQAIGEN Pty Ltd 産物、IMMUNEASYTM（Coley Pharmaceutical Group Inc.の商標）であった。
【００７４】
５μｇのエピトープ又はコンジュゲートされたエピトープを、７０μｌのＰＢＳ及び３０μｌのIMMUNEASYTMアジュバント中に希釈した。数箇所において、マウスに皮下及び筋内注射した。このレジメを、２週間後に繰り返し、更にその２週間後に繰り返した。３回目の注射から８日後に、マウスから血を取った。この方法によりマウスで作られた抗体によっても、異なるＰ２Ｘ７エピトープについて区別することができ、Ｐ２Ｘ７非機能性エピトープに対する抗体は、ヒツジとウサギで作られた抗体と同じ結果をもたらした。更に、コンジュゲートされていない非機能性エピトープに対して作られた抗体もまた、腫瘍組織におけるこのエピトープを認識することができた。
【００７５】
上記の実施例により例示されるように、異なる種でのＰ２Ｘ７レセプターの種々のエピトープへの抗体を、異なるアジュバントを使って、一貫して作ることができる。特に、非機能的状態（この状態では、通常の生理学的条件下、孔を形成することができず、アポプトーシス機能を実行することができない）にあるレセプターを識別するＰ２Ｘ７レセプターのエピトープへの抗体を、通常通り作ることができる。
【００７６】
実施例４
非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを検出する抗体について、Ｐ２Ｘ７のエチジウム又はルビジウム取込み能力を介して明らかにされた既知の機能を備えたＰ２Ｘ７（ヒト）発現細胞にその抗体を結合させることによって検査した。これらのＰ２Ｘ７タンパク質チャンネルは、これらのチャンネルがアポプトーシスの孔を形成しないように、塩基対１５１３で突然変異していてもよい。これらのレセプター及び悪性腫瘍Ｂリンパ球上で発現された同様の非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターもまた、フローサイトメトリーと標準免疫組織化学において、抗体に結合した。一方で、（大流量のカルシウム、エチジウム及びルビジウムの取込みができる）正常の機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを発現している細胞は、抗体に結合することができなかった。これは、機能性レセプターにおいては、非機能性レセプターを検出するために選択されたエピトープが利用できないという理由によった。Ｐｒｏ２１０は、非機能性レセプターにおいてはシス型コンフォメーションをとり、特にこのコンフォメーションが抗体の作出に使われたコンジュゲートされたエピトープで安定化されていた。機能性があると示されたレセプターにおいては、Ｐｒｏ２１０はトランス型コンフォメーションをしていた。これは、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）がＰ２Ｘ７レセプターに結合した結果である。ＡＴＰが結合すると、ＡＴＰ結合部位に直に隣接しているセグメント上のＰｒｏ２１０は、トランス型のコンフォメーションをとった。
【００７７】
このことは、トランス型コンフィギュレーションに固定されたＡｌａにＰｒｏ２１０を変える部位方向付け突然変異誘発（site directed mutagenesis）を使うことによって確かめられた。この突然変異タンパク質は、完全に機能性であり、非機能性レセプターを検出するために作出された抗体には結合できないことが分かった。
【００７８】
実施例５
非機能性レセプターを検出するための抗体特異性についての更なる確認は、Ｐ２Ｘ７を発現しているラベル化されたマクロファージの実験に至った。マクロファージは、一般的Ｐ２Ｘ７抗体を使ってＰ２Ｘ７レセプターへの抗体に結合したが、マウス・ハイブリドーマ細胞等の癌細胞にそれらが晒されるまでは、非機能性Ｐ２Ｘ７には結合しなかった。マクロファージとハイブリドーマ細胞との接触により、一般的Ｐ２Ｘ７抗体と同様に非機能性Ｐ２Ｘ７への抗体によって検出される、マクロファージ上に非機能性Ｐ２Ｘ７発現が誘発された。
【００７９】
悪性リンパ腫の患者から抽出されたマクロファージ及びＢ細胞リンパ球を検査した。これらの全ての細胞が非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターへの抗体と同様に一般的Ｐ２Ｘ７への抗体にも結合した。これにより、検出された全ての癌細胞にＰ２Ｘ７が非機能性であることが確かめられた。機能性Ｐ２Ｘ７によって形成されるアポプトーシス孔は形成されず、癌細胞においてアポプトーシスを誘発させることができない。
【００８０】
前立腺、乳、腸、皮膚、胃、頸その他の、ヒトにおける全ての上皮細胞癌、並びに悪性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び脳腫瘍、並びに、テストされた他の哺乳類における同一の腫瘍（イヌの乳房と前立腺及びネコの皮膚並びに全てのマウス・ハイブリドーマ細胞を含む）からの癌細胞の全ては、同一の非機能性Ｐ２Ｘ７を発現する。選択されたエピトープでの、ヒト、ラット、ネコ、イヌ及びマウスにおいての配列の類似性は、上記の全ケースにおいて為される肯定的な確認に十分である。このことは、活性化された場合に、通常は細胞を殺すアポプトーシス孔を形成することができない非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを全ての癌細胞が発現するという点で、これらの動物での癌のメカニズムが同一であることを示す。
【００８１】
実施例６
影響を受けたＢ細胞リンパ球等の癌細胞がＰ２Ｘ７機能を介してアポプトーシスを誘発することができないということの更なる確認として、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターを含んでいる白血病患者からのＢ細胞を、培養中で２時間にわたり、５ｍＭのＡＴＰと一緒にインキュウベートした。非機能性レセプターの全てが過剰ＡＴＰによって開放及びアポプトーシス誘発を強いられ、影響を受けた細胞が殺されたという結果が得られた。
【００８２】
実施例７
抗体が癌細胞に選択的に結合することの更なる確認として、基底細胞癌（ＢＣＣ）の患者からの皮膚を、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターへの抗体を用いて処置し、不活性クリーム基剤に懸濁して、病変とその周囲の皮膚に適用した（下記の実施例１０を参照）。局所的な抗体を毎日適用して１週間以内で、ＢＣＣの全ての痕跡が消えた。正常皮膚はそのレセプターを欠いているので、周囲の皮膚への影響は無かった。
【００８３】
診断への適用
本明細書では、動物において特異的非機能性Ｐ２Ｘ７の抗体を使い、ヒト及び他の哺乳動物でのほとんどの癌を診断するために本発明のプローブ及び方法の一般的な適用を実証するという例示により説明がなされている。
【００８４】
ヒト及び哺乳動物（ネコ及びイヌ等）の前立腺組織では、本発明の抗体が診断に使われると、癌又は前癌性病変の不在の下ではラベル化が成されない。しかし、本発明の診断方法によると、新生物発生前変化（neoplastic change）の最初の兆候が明らかにされる。その一方で、Ｈ＆Ｅ染色によって検出される形態学的変化は、いまなお付随されない。
【００８５】
この段階では、上皮細胞の核に最初に現れるレセプターユニットを染色する必要がある。これらは、疾患の後期段階では細胞質に移動し、前立腺全体にわたってフィールド効果として作用するので、癌の存在を確かめるために生検される必要があるのは、より少ない組織である。疾患の後期の段階では、染色は上皮先端により限定される。
【００８６】
同様にして、他の上皮細胞癌（ヒト及びネコやイヌ等の他の哺乳動物では、乳癌、肺癌、大腸癌及び皮膚癌）が、マージンを持って検出される。これらの他の組織においては、はっきりしたフィールド効果がないからである。
【００８７】
これらの他の組織（乳部組織、頚部組織等）においては、正常組織は染色されない一方で、核染色が細胞質染色に先行するという同一段階の成長が観察される。正常な形態により癌のないことが示唆される場合であっても、乳部で影響を受けている管路系の個々の内の局所的フィールド効果により、乳部組織において影響を受けた管路と腺小葉を容易に検出することができる。隣接する影響を受けていない管路は、染色されないように見える。同様に、影響を受けたリンパ節（癌を含んでいる直接的に消耗している組織）は、影響を受けた白血球のフィールド効果を介して癌の兆候を示す。従って、センチネル節は、節への転移細胞の広がりがなくても検出され得る。
【００８８】
基底細胞癌及び扁平上皮癌並びに悪性黒色腫等の皮膚癌は、ケラチノサイトとメラノサイト層の非機能性レセプター及びチャンネル成分（モノマー）に対して、はっきりしたマージンを持って陽性染色を示す。このマージンを超えると、正常皮膚は、表皮及び真皮深部の両方においてラベル化されない。
【００８９】
ヒト前立腺（ＰＣ３）及び乳（ＭＣＦ７）及び齧歯動物ハイブリドーマは、細胞表面上の非機能性レセプターについて陽性であるので、これらのがん細胞ではアポプトーシスが阻害される。この診断の一般的な適用は、ヒト以外の他の動物タイプのレセプターの遍在する性質を示すマウス・ハイブリドーマ細胞上の同一ラベル法によって見受けられる。正常なヒトＢ細胞リンパ球は、機能性Ｐ２Ｘ７レセプターが細胞表面上で発現されることを示し、必要なときにアポプトーシスを可能にする。一方で、悪性リンパ腫を持つ患者からのヒトＢ細胞リンパ球は、非機能性Ｐ２Ｘ７レセプターが細胞表面で発現され、アポプトーシスが減少することを示す。
【００９０】
治療的な適用
アポプトーシスを起こそうと企てているがん細胞の細胞表面上で発現される、この明らかに偏在するＰ２Ｘ７非機能性レセプターを、ヒト及び他の動物のほとんどの癌の処置に使うことができる。以下に例示がある。
【００９１】
実施例８
マウス・ハイブリドーマ細胞を、非機能性Ｐ２Ｘ７へのアフィニティー精製抗体の存在下及び不在下で、マクロファージのベース上に成長させた。細胞数の計算により、４日間にわたって、精製された正常ＩｇＧと一緒にインキュウベートされた細胞は１×１０４から７×１０４にまで増えた一方で、非機能性Ｐ２Ｘ７抗体と一緒のインキュベーションでは細胞数はほんの１．５×１０４に維持されることが明らかになった。
【００９２】
実施例９
本実施例は、Ｐ２Ｘ７レセプターの非機能性エピトープに対して作出された抗体がインビボにおいて腫瘍形成を阻害することができることを示す。
【００９３】
先に示されたように、非機能性Ｐ２Ｘ７エピトープに対してヒツジで作出された抗体は、マウス・ハイブリドーマ細胞の表面上で、この非機能性Ｐ２Ｘ７アポプトーシス・レセプター（apoptopic receptor）を識別した。この抗体をハイブリドーマ細胞培養物へ加えることにより、細胞の成長が遅れた。マウス・ハイブリドーマ細胞は、調製された同系繁殖マウス株内へ注射されると、腫瘍形成を生じさせる。
【００９４】
この実験において、１０匹のＢａｌｂ−ｃ雌マウスからなる３グループ各々は、以下の処置を受けた：
グループ１：
１０匹のマウスの各々の腹膜内に、第一日目に、細胞培地０．５ｍｌ中にある１×１０６のハイブリドーマ細胞を注射した。第二日目及び第三日目に、マウスは、０．５ｍｌの細胞培地の腹膜内注射を受けた。
グループ２：
１０匹のマウスの各々の腹膜内に、第一日目に、精製されたヒツジＩｇＧを１ｍｇ含む細胞培地０．５ｍｌ中にある１×１０６のハイブリドーマ細胞を注射した。第二日目及び第三日目に、マウスは、精製されたヒツジＩｇＧを１ｍｇ含む細胞培地０．５ｍｌの注射を受けた。
グループ３：
１０匹のマウスの各々の腹膜内に、第一日目に、精製されたヒツジ抗Ｐ２Ｘ７非機能性エピトープＩｇＧを１ｍｇ含む細胞培地０．５ｍｌ中にある１×１０６のハイブリドーマ細胞を注射した。第二日目及び第三日目に、マウスは、精製されたヒツジ抗Ｐ２Ｘ７ＩｇＧを１ｍｇ含む細胞培地０．５ｍｌの注射を更に受けた。
【００９５】
全グループからのマウスを第１１日目に殺して、腫瘍の存在について調べた。腫瘍を摘出して重さを量った。
【００９６】
その結果を以下に示す：
【表１】
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【００９７】
分散分析は、グループ間における腫瘍重量の有意差を示す（確率＜０．０１）。抗Ｐ２Ｘ７非機能性抗体で処置された実験グループは、２つのコントロールグループから有意に異なった（ｐ＜０．０１）。つまり、Ｐ２Ｘ７非機能性エピトープに対する抗体を用いた処置により、実験動物における腫瘍の量が減少した。
【００９８】
実施例１０
（特異性を大きく改善するために）アフィニティー精製された特異的抗体を、７日間にわたって箇所に保持される液体として、又は、ジメチコン・クリーム基剤に懸濁して、３人のヒト基底細胞癌（「ＢＣＣ」）に適用した。処置の後は、ＢＣＣ病変の痕跡は検出されなかった。一方、コントロールの皮膚は、タンパク質標的が不在のため、全体的に影響を受けなかった。
【００９９】
一般に患者に適用することは、局所的適用を用いて明らかにされたように、内部の癌が同じ効率で処置されるように、ヒト化モノクローナル抗体（ヘルセプティン等）の生産を含むことと信じられている。リンパ球等の細胞の細胞表面で発現される全ての正常な機能性Ｐ２Ｘ７は、副作用を避けるために、抗体の存在によっても影響を受けないままである必要がある。よって、抗体は、アポプトーシスを企てているが、それを開始することのできない細胞の細胞表面で発現されるタンパク質にのみ結合するべきである。従って、標的化された全ての細胞は、プログラム化された細胞死を介して自身を殺そうと企てているもののみであり、これには、癌細胞が含まれる。これらの細胞（特に癌細胞）上のＰ２Ｘ７レセプターは、非機能性であるか、ＡＴＰ−減少状態である。
【０１００】
能動的免疫化
治療学的目的に能動的免疫化もまた使うことができる。この場合には、ヒト又は他の哺乳動物は、細胞表面で非機能的（ＡＴＰが減少した）形状にあるレセプターによってのみ適合されるコンフォメーションを模倣したコンフォメーションにある特異的エピトープ（単数）又はエピトープ（複数）に対して免疫化される必要がある。機能性レセプターに存在するエピトープの形状の部分的な暴露を含むコンフォメーションの柔軟性は避けられるべきである。例としてのエピトープＧｌｙ２００−Ｔｈｒ２１５のシスコンフォメーションは、適切な手段で使われる前に固定されるべきである。この概念が堅実であることについての追加証拠としては、抗体を造るために使われたマウス、ウサギ及びヒツジを含む数々の動物の免疫力が低下していないという観察がある。これらの多くの動物では、これまで腫瘍の成長はない。
【０１０１】
産業上の利用可能性
本発明は、その全ての面において、疾患の早期且つ正確な診断及び効果的な処置（多くの場合には、従来技術で利用可能なものに比べて、はるかに侵襲性又は外傷性でない）をすることができる可能性とともに、ヒト及び動物の医学及び健康の分野に適用を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】ヒトＰ２Ｘ７レセプター（従来技術）のアミノ酸配列である。６５から８１及び２００から２１６の配列が強調されており、本明細書で言及されている。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１】
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【国際調査報告】
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