(57)【要約】本発明は、ペリリピンの活性または発現をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。本発明はまた、ペリリピンの活性または発現をモジュレートする化合物を被験者に投与することを含む、体重障害または糖尿病を予防または治療するための方法ならびに治療用組成物に関する。一つの態様において、本発明は、肥満または糖尿病を治療および／または予防すること、また、脂質代謝および筋量を高めることを目的とした、ペリリピンの活性にアンタゴナイズする方法ならびに組成物に関する。別の態様では、本発明は、体重を増やすために脂質の蓄積を高めることを目的とした、ペリリピンの活性にアゴナイズする方法ならびに組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体重、体脂肪または筋量を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームまたはその断片と候補薬剤とを、ペリリピンアイソフォームまたは断片／薬剤複合体を形成させるのに十分な時間にわたり接触させ、
（ｂ）　ペリリピンアイソフォームまたは断片／薬剤複合体のレベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、体重、体脂肪または筋量を調節する能力について試験すべき薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項２】
糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームまたはその断片と候補薬剤とを、ペリリピンアイソフォームまたは断片／薬剤複合体を形成させるのに十分な時間にわたり接触させ、
（ｂ）　ペリリピンアイソフォームまたは断片／薬剤複合体のレベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項３】
脂質代謝を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームまたはその断片と候補薬剤とを、ペリリピンアイソフォームまたは断片／薬剤複合体を形成させるのに十分な時間にわたり接触させ、
（ｂ）　ペリリピンアイソフォームまたは断片／薬剤複合体のレベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、脂質代謝を調節する能力について試験すべき薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項４】
体重、体脂肪または筋量を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の集団と候補薬剤とを、ペリリピンアイソフォーム／薬剤複合体を形成させるのに十分な時間にわたり接触させ、
（ｂ）　ペリリピンアイソフォーム／薬剤複合体のレベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、体重、体脂肪または筋量を調節する能力について試験すべき薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項５】
糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の集団と候補薬剤とを、ペリリピンアイソフォーム／薬剤複合体を形成させるのに十分な時間にわたり接触させ、
（ｂ）　ペリリピンアイソフォーム／薬剤複合体のレベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項６】
脂質代謝を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の集団と候補薬剤とを、ペリリピンアイソフォーム／薬剤複合体を形成させるのに十分な時間にわたり接触させ、
（ｂ）　ペリリピンアイソフォーム／薬剤複合体のレベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、脂質代謝を調節する能力について試験すべき薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項７】
体重、体脂肪または筋量を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の集団と候補薬剤とを接触させ、
（ｂ）　細胞性第２メッセンジャーの誘導レベルまたはペリリピンアイソフォームのリン酸化レベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、体重、体脂肪または筋量を調節する能力について試験すべき化合物が同定されたこととする、上記方法。
【請求項８】
糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の集団と候補薬剤とを接触させ、
（ｂ）　細胞性第２メッセンジャーの誘導レベルまたはペリリピンアイソフォームのリン酸化レベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき化合物が同定されたこととする、上記方法。
【請求項９】
脂質代謝を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の集団と候補薬剤とを接触させ、
（ｂ）　細胞性第２メッセンジャーの誘導レベルまたはペリリピンアイソフォームのリン酸化レベルを測定する、
ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、脂質代謝を調節する能力について試験すべき化合物が同定されたこととする、上記方法。
【請求項１０】
前記体重を調節する能力が体重を減少させる能力である、請求項１、４または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記体重を調節する能力が体重を増加させる能力である、請求項１、４または７に記載の方法。
【請求項１２】
前記体脂肪を調節する能力が体脂肪を減少させる能力である、請求項１、４または７に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力が、血糖値を下げる、インスリン感受性を低下させる、または糖尿病と関連する１以上の徴候もしくは症状を抑制する能力である、請求項２、５または８に記載の方法。
【請求項１４】
前記筋量を調節する能力が筋量を増やす能力である、請求項１、４または７に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質代謝を調節する能力が脂質代謝を低下させる能力である、請求項３、６または９に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質代謝を調節する能力が脂質代謝を増加させる能力である、請求項３、６または９に記載の方法。
【請求項１７】
動物の体重または体脂肪を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　動物または動物群に、１以上のペリリピンアイソフォームと結合する、１以上のペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする、または１以上のペリリピンアイソフォームの１以上の活性をモジュレートする候補薬剤を投与し、
（ｂ）　候補薬剤が、未処理の対照動物または動物群と比べて、該動物または動物群において体重または体脂肪を調節するかを判定する、
ことを含んでなり、その結果として、候補薬剤が体重または体脂肪を調節すれば、動物の体重または体脂肪を調節する薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項１８】
動物における筋量を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　動物または動物群に、１以上のペリリピンアイソフォームと結合する、１以上のペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする、または１以上のペリリピンアイソフォームの１以上の活性をモジュレートする候補薬剤を投与し、
（ｂ）　候補薬剤が、未処理の対照動物または動物群と比べて、該動物または動物群において筋量を調節するかを判定する、
ことを含んでなり、その結果として、候補薬剤が筋量を調節すれば、動物における筋量を調節する薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項１９】
動物における糖尿病の発生、発達または進行を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　動物または動物群に、１以上のペリリピンアイソフォームと結合する、１以上のペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする、または１以上のペリリピンアイソフォームの１以上の活性をモジュレートする候補薬剤を投与し、
（ｂ）　候補薬剤が、未処理の対照動物または動物群と比べて、該動物または動物群において血糖値、インスリン感受性、または糖尿病の１以上の徴候もしくは症状を調節するかを判定する、
ことを含んでなり、その結果として、候補薬剤が血糖値、インスリン感受性、または糖尿病の１以上の徴候もしくは症状を調節すれば、動物における糖尿病の発生、発達または進行を調節する薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項２０】
動物における脂質代謝を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）　動物または動物群に、１以上のペリリピンアイソフォームと結合する、１以上のペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする、または１以上のペリリピンアイソフォームの１以上の活性をモジュレートする候補薬剤を投与し、
（ｂ）　候補薬剤が、未処理の対照動物または動物群と比べて、該動物または動物群において脂質代謝を調節するかを判定する、
ことを含んでなり、その結果として、候補薬剤が脂質代謝を調節すれば、動物における脂質代謝を調節する薬剤が同定されたこととする、上記方法。
【請求項２１】
動物または動物群が家畜、家禽、またはコンパニオン動物である、請求項１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
動物または動物群がヒトである、請求項１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
被験者における体重増加に特徴がある障害を予防または治療する方法であって、そのような治療が必要なまたは望ましい被験者に、治療に有効な量の、ペリリピン発現または活性のアンタゴニストとして機能する１種以上の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項２４】
被験者における体重減少に特徴がある障害を予防または治療する方法であって、そのような治療が必要なまたは望ましい被験者に、治療に有効な量の、ペリリピン発現または活性のアゴニストとして機能する１種以上の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項２５】
被験者における糖尿病を予防または治療する方法であって、そのような治療が必要なまたは望ましい被験者に、治療に有効な量の、ペリリピン発現または活性のアンタゴニストとして機能する１種以上の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項２６】
前記体重障害が肥満である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記障害が悪液質または食欲不振である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
被験者における脂質代謝を高め、筋量を増やす方法であって、そのような処置が必要なまたは望ましい被験者に、治療に有効な量の、ペリリピン発現または活性のアンタゴニストとして機能する１種以上の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項２９】
被験者における脂質の蓄積を高める方法であって、そのような処置が必要なまたは望ましい被験者に、治療に有効な量の、ペリリピン発現または活性のアゴニストとして機能する１種以上の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３０】
前記被験者がヒトである、請求項２３、２４、２５、２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験者が家畜または家禽である、請求項２３、２４、２５、２７または２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．序
本発明は、脂質ホメオスタシス、筋量および体重を調節するための新規な標的としてのペリリピン（ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ）に関する。本発明は、本発明の新規標的であるペリリピンの活性または発現をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。本発明はまた、ペリリピンの活性または発現をモジュレートする化合物を被験者に投与することを含む、体重障害を治療するための方法ならびに治療用組成物に関する。一つの態様において、本発明は、肥満または糖尿病を治療および／または予防すること、また、脂質代謝および筋量を高めることを目的とした、ペリリピンの活性または発現にアンタゴナイズする方法ならびに組成物に関する。別の態様では、本発明は、体重を増やすために被験者における脂質蓄積を高めることを目的とした、ペリリピンの活性にアゴナイズする方法ならびに組成物に関する。
【０００２】
２．発明の背景
高等生物において、脂肪細胞の主な機能は、過剰なエネルギーをトリアシルグリセロールとして細胞内脂質小滴に蓄え、必要なときにそのエネルギーを脂肪酸として放出することである（Ｙｅａｍａｎら、１９９０， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０５２： １２８−１３２）。炭水化物貯蔵物（特にグリコーゲン）の代謝に関する情報の豊富さとは裏腹に、脂質貯蔵物がパッケージされて加水分解される作用機序の詳細はよくわかっていない。脂肪分解、すなわちトリアシルグリセロールが脂肪酸とグリセロールに加水分解される過程、の律速段階は、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）により触媒される。ＨＳＬ活性のホルモン刺激には、この酵素の脂質貯蔵小滴の表面への移動が関係している。ペリリピンは豊富な脂肪細胞タンパク質であり、単一の遺伝子から異なってスプライシングされた転写産物である３つのアイソフォーム（Ａ、ＢおよびＣ）として存在している。基底状態のもとでは、ペリリピンは脂質小滴を被覆して、どういうわけかＨＳＬが脂質小滴に接近するのを妨げていると推測されている（Ｌｏｎｄｏｓら、１９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ２３：６１１−６１５； Ｌｏｎｄｏｓら、１９９９， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １０：５１−５８； Ｓｏｕｚａら、１９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２４６６５−２４６６９）。脂肪細胞の脂肪分解活性化は、プロテインキナーゼＡが介在するペリリピンのリン酸化と関連しており、これは脂肪小滴表面を変化させて脂質微小滴を出現させ、コア脂質へのＨＳＬの接近を可能にする（Ｌｏｎｄｏｓら、１９９９， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １０：５１−５８）。しかしながら、ペリリピンがｉｎ ｖｉｖｏにおいて脂質ホメオスタシスおよびエネルギー代謝に果たす役割はかなり不確実である。
【０００３】
３．発明の概要
本発明は、脂質ホメオスタシスを調節し、また、筋量および体重増加を調節するための標的としてのペリリピンに関する。本発明は、体重に関係した障害および／または脂質代謝の不適切な調節を治療するのに有用な化合物を同定する手段としての、ペリリピンタンパク質の活性および／または発現をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを包含する。本発明はまた、体重に関係した障害および／または脂質代謝の不適切な調節を治療するための、ペリリピンタンパク質の活性および／または発現をモジュレートする化合物を含有する医薬組成物を包含する。
【０００４】
本発明は、一部には、本発明者らがｉｎ ｖｉｖｏにおいて脂質ホメオスタシス、筋量およびエネルギー代謝に果たすペリリピンタンパク質の重要な役割を発見したことに基づいている。以下の実施例において、マウスのペリリピン遺伝子を破壊すると（ｐｌｉｎ−／−マウス）、構成的に活性化されたホルモン感受性リパーゼを示すマウスが得られることを示す。ｐｌｉｎ−／−マウスはより多くの食餌を消費することができるが、対照マウスと比べて正常な体重を維持している。ｐｌｉｎ−／−マウスは基礎脂肪分解の上昇、代謝の増加を呈し、食餌に起因する肥満に抵抗を示す。さらに、ｐｌｉｎ−／−マウスは運動を行わなくとも筋量が増加する。これらの結果から、ペリリピンは脂肪分解およびエネルギーバランスを調節するための、そして抗肥満薬物投与のための標的となることが実証される。
【０００５】
本発明は、ペリリピンタンパク質の活性、発現、および／またはリン酸化状態をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。特に、本発明は、組換えにより発現されたペリリピン、１以上のペリリピンアイソフォームを内因的に発現する細胞（例えば、脂肪細胞）、またはペリリピンでトランスフェクトされた細胞系を使って、ペリリピン結合性化合物を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを提供する。前記ペリリピン−トランスフェクト細胞系はさらにリポーター遺伝子（その発現レベルがペリリピンによって調節されるもの）を含んでいてもよい。
【０００６】
本発明は、ペリリピンアイソフォームまたはその断片と相互作用する薬剤をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、（ａ） ペリリピンアイソフォームまたはその断片と候補薬剤とを接触させ、（ｂ） 該候補薬剤がペリリピンアイソフォームまたはその断片と相互作用するか否かを判定する、ことを含んでなる。これらの方法に従って、ペリリピンアイソフォームまたはその断片をステロイド形成細胞や脂肪細胞などの細胞から内因的に発現させることができ、また、ペリリピンアイソフォームまたはその断片を発現するように細胞を遺伝子操作することもできる。
【０００７】
本発明はまた、ペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする薬剤をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、（ａ） ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の第１の集団を候補薬剤と接触させ、（ｂ） 該ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の第２の集団を対照薬剤と接触させ、（ｃ） 第１および第２の細胞集団における該ペリリピンアイソフォームのレベルまたは該ペリリピンアイソフォームをコードするｍＲＮＡのレベルを比較する、ことを含んでなる。ペリリピンアイソフォームの発現レベルまたはペリリピンアイソフォームをコードするｍＲＮＡのレベルが第２の細胞集団よりも第１の細胞集団において高いと、ペリリピンのアゴニストが同定されたことになる。ペリリピンアイソフォームの発現レベルまたはペリリピンアイソフォームをコードするｍＲＮＡのレベルが第２の細胞集団よりも第１の細胞集団において低いと、ペリリピンのアンタゴニストが同定されたことになる。
【０００８】
本発明はまた、ペリリピンアイソフォームの活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、（ａ） ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の第１の集団を候補薬剤と接触させ、（ｂ） 該ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の第２の集団を対照薬剤と接触させ、（ｃ） 第１および第２の細胞集団における該ペリリピンアイソフォームのリン酸化レベルまたは細胞性第２メッセンジャーの誘導レベルを比較する、ことを含んでなる。第２の細胞集団よりも第１の細胞集団においてリン酸化レベルが高いか、または細胞性第２メッセンジャーの誘導レベルが高いと、ペリリピンのアゴニストが同定されたことになる。第２の細胞集団よりも第１の細胞集団においてリン酸化レベルが低いか、または細胞性第２メッセンジャーの誘導レベルが低いと、ペリリピンのアンタゴニストが同定されたことになる。
【０００９】
本発明はさらに、体重、体脂肪、筋量、脂質代謝、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養）の発生、発達または進行、体重障害（例えば、肥満）の発生、発達または進行、脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化）の発生、発達または進行、あるいは糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ） ペリリピンアイソフォームまたはその断片と候補薬剤とを、ペリリピンアイソフォームまたは断片／薬剤複合体を形成させるのに十分な時間にわたり接触させ、（ｂ） ペリリピンアイソフォームまたは断片／薬剤複合体のレベルを測定する、ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、体重、体脂肪、筋量、脂質代謝、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養）の発生、発達または進行、体重障害（例えば、肥満）の発生、発達または進行、脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化）の発生、発達または進行、あるいは糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤が同定されたことになる。
【００１０】
本発明はさらに、体重、体脂肪、筋量、脂質代謝、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養）の発生、発達または進行、体重障害（例えば、肥満）の発生、発達または進行、脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化）の発生、発達または進行、あるいは糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ） ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の集団と候補薬剤とを、ペリリピンアイソフォーム／薬剤複合体を形成させるのに十分な時間にわたり接触させ、（ｂ） ペリリピンアイソフォーム／薬剤複合体のレベルを測定する、ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、体重、体脂肪、筋量、脂質代謝、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養）の発生、発達または進行、体重障害（例えば、肥満）の発生、発達または進行、脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化）の発生、発達または進行、あるいは糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤が同定されたことになる。
【００１１】
本発明はさらに、体重、体脂肪、筋量、脂質代謝、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養）の発生、発達または進行、体重障害（例えば、肥満）の発生、発達または進行、脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化）の発生、発達または進行、あるいは糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ） ペリリピンアイソフォームを発現する細胞の集団と候補薬剤とを接触させ、（ｂ） ペリリピンアイソフォームのリン酸化レベル、細胞性第２メッセンジャーの誘導レベル、またはトリアシルグリセロール、非エステル化脂肪酸もしくはβ−ヒドロキシ酪酸のレベルを測定する、ことを含んでなり、その結果として、測定したレベルが候補薬剤の不在下で測定したレベルと相違すれば、体重、体脂肪、筋量、脂質代謝、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養）の発生、発達または進行、体重障害（例えば、肥満）の発生、発達または進行、脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化）の発生、発達または進行、あるいは糖尿病の発生、発達または進行を調節する能力について試験すべき化合物が同定されたことになる。
【００１２】
本発明はまた、ペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする薬剤をスクリーニングまたは同定する方法を提供し、この方法は、（ａ） 候補薬剤を第１の動物または動物群に投与し、（ｂ） 対照薬剤を第２の動物または動物群に投与し、（ｃ） 第１および第２の動物におけるペリリピンアイソフォームの発現レベルまたはペリリピンアイソフォームをコードするｍＲＮＡの発現レベルを比較する、ことを含んでなる。前記発現レベルが第２の動物よりも第１の動物において高いと、ペリリピンのアゴニストが同定されたことになる。前記発現レベルが第２の動物よりも第１の動物において低いと、ペリリピンのアンタゴニストが同定されたことになる。
【００１３】
本発明はまた、ペリリピンアイソフォームの１以上の活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングまたは同定する方法を提供し、この方法は、（ａ） 候補薬剤を第１の動物または動物群に投与し、（ｂ） 対照薬剤を第２の動物または動物群に投与し、（ｃ） 第１および第２の動物における細胞性第２メッセンジャーの誘導レベル、ペリリピンアイソフォームのリン酸化レベル、またはトリアシルグリセロール、非エステル化脂肪酸もしくはβ−ヒドロキシ酪酸のレベルを比較する、ことを含んでなる。かかる活性は当技術分野で公知の技法または本明細書に記載の技法により評価することが可能である。細胞性第２メッセンジャーの誘導レベル、ペリリピンアイソフォームのリン酸化レベル、またはトリアシルグリセロール、非エステル化脂肪酸もしくはβ−ヒドロキシ酪酸のレベルが第２の動物よりも第１の動物において高いと、ペリリピンアイソフォームのアゴニストが同定されたことになる。細胞性第２メッセンジャーの誘導レベル、ペリリピンアイソフォームのリン酸化レベル、またはトリアシルグリセロール、非エステル化脂肪酸もしくはβ−ヒドロキシ酪酸のレベルが第２の動物よりも第１の動物において低いと、ペリリピンアイソフォームのアンタゴニストが同定されたことになる。
【００１４】
本発明はまた、動物の体重、体脂肪または筋量を調節する薬剤の同定方法を提供し、この方法は、（ａ） 動物または動物群に、１以上のペリリピンアイソフォームと結合する、１以上のペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする、または１以上のペリリピンアイソフォームの１以上の活性をモジュレートする候補薬剤を投与し、（ｂ） 候補薬剤が、未処理の対照動物または動物群と比べて、該動物または動物群において体重、体脂肪または筋量を調節するかを判定する、ことを含んでなり、その結果として、候補薬剤が体重、体脂肪または筋量を調節すれば、動物の体重、体脂肪または筋量を調節する薬剤が同定されたことになる。体重、体脂肪または筋量は、当業者に公知の技法または本明細書に記載の技法を用いて評価することが可能である。
【００１５】
本発明はまた、動物において糖尿病の発生、発達または進行を調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ） 糖尿病になったまたは糖尿病になる素因がある動物または動物群に、１以上のペリリピンアイソフォームと結合する、１以上のペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする、または１以上のペリリピンアイソフォームの１以上の活性をモジュレートする候補薬剤を投与し、（ｂ） 候補薬剤が、未処理の対照動物または動物群と比べて、該動物または動物群において血糖値、インスリン感受性、または糖尿病の１以上の徴候もしくは症状を調節するかを判定する、ことを含んでなり、その結果として、候補薬剤が血糖値、インスリン感受性、または糖尿病の１以上の徴候もしくは症状を調節すれば、動物において糖尿病の発生、発達または進行を調節する薬剤が同定されたことになる。
【００１６】
本発明はまた、動物において脂質代謝を調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法、（ａ） 動物または動物群に、１以上のペリリピンアイソフォームと結合する、１以上のペリリピンアイソフォームの発現をモジュレートする、または１以上のペリリピンアイソフォームの１以上の活性をモジュレートする候補薬剤を投与し、（ｂ） 候補薬剤が、未処理の対照動物または動物群と比べて、該動物または動物群において脂質代謝を調節するかを判定する、ことを含んでなり、その結果として、候補薬剤が脂質代謝を調節すれば、動物における脂質代謝を調節する薬剤が同定されたことになる。脂質代謝は当技術分野で公知の技法または本明細書に記載の技法により評価することが可能である。
【００１７】
本発明はさらに、ペリリピンの活性、発現および／またはリン酸化状態をモジュレートする医薬組成物を提供する。特に、医薬組成物はペリリピンのアゴニストまたはアンタゴニストでありうる。アンタゴニストは、別のペリリピンアゴニストもしくはアンタゴニストを競合的に阻害することにより、活性化ペリリピンとその下流のシグナル伝達経路との相互作用を遮断することにより、ペリリピン遺伝子の転写を阻害することにより、ペリリピンｍＲＮＡのプロセッシングもしくは翻訳を阻害することにより、またはペリリピンの翻訳後プロセッシングを阻害することにより作用することが可能である。アゴニストは、ペリリピンシグナル伝達経路の天然の生物学的効果またはその発現を活性化および／または増強することにより作用することが可能である。
【００１８】
別の態様において、本発明は動物における異常なペリリピン発現および／または活性を特徴とする疾患および障害を予防および／または治療するための方法ならびに組成物を提供する。本発明は動物、好ましくはコンパニオン動物、家畜および家禽、より好ましくはヒトにおける体重障害を予防および／または治療する方法を提供し、この方法は、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートする医薬製剤を投与することを含んでなる。特に、体重および効率を増大させる医薬組成物、または体重を減少させかつ肥満と関連した徴候もしくは症状を軽減させる医薬組成物がヒトに投与される。さらに、体重および効率を増大させる医薬組成物、または体重を減少させかつ肥満を軽減させる医薬組成物は家畜や家禽にも投与できる。
【００１９】
本発明はまた、動物、好ましくはコンパニオン動物、家畜および家禽、より好ましくはヒトにおける糖尿病の予防および／または治療方法を提供し、この方法は、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートする医薬製剤を投与することを含んでなる。特に、糖尿病（例えば、肥満と関係のあるまたは関係のない糖尿病）の発生、発達もしくは進行を遅らせるまたは防止する医薬組成物が動物、好ましくはコンパニオン動物、家畜および家禽、より好ましくはヒトに投与される。
【００２０】
本発明はまた、動物、好ましくはコンパニオン動物、家畜および家禽、より好ましくはヒトにおける脂質代謝障害（すなわち、不適切な脂質代謝を特徴とする障害）および脂質沈着を特徴とする障害の予防および／または治療方法を提供し、この方法は、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートする医薬製剤を投与することを含んでなる。特に、前記障害の発生、発達もしくは進行を遅らせるまたは防止する医薬組成物が動物、好ましくはコンパニオン動物、家畜および家禽、より好ましくはヒトに投与される。
【００２１】
別の態様において、本発明は、異常なペリリピンの発現および／または活性を特徴とする疾患または障害、例えば、脂質代謝障害、体重障害（例えば、肥満）、および糖尿病の発生または進行を検出、診断またはモニタリングするための方法ならびに組成物を提供する。さらに別の態様において、本発明は、本発明のスクリーニングアッセイで同定された１種以上の薬剤および使用説明書を含んでなるキットを提供する。
【００２２】
３．１．　定義
用語「Ｌｅｐｏｂ／ｏｂ」および「ｏｂ／ｏｂ」は、レプチン欠損マウスを指すために本明細書では相互交換可能に使用される。
【００２３】
用語「Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ」および「ｄｂ／ｄｂ」は、レプチン抵抗性マウスを指すために本明細書では相互交換可能に使用される。
【００２４】
ペリリピンの発現に関して本明細書で用いる「異常」という用語は、細胞、組織または被験者における１以上のペリリピンアイソフォームの発現レベルが、正常な被験者、または脂質代謝障害、体重障害もしくは糖尿病になっていない被験者から得られた細胞または組織における発現レベル（すなわち、参照レベル）と比べて、増加または低下していることを意味する。１以上のペリリピンアイソフォームの発現レベルは、本明細書に記載の方法または当業者に公知の方法により測定することが可能である。
【００２５】
ペリリピンの活性に関して本明細書で用いる「異常」という用語は、被験者から得られた細胞または組織における１以上のペリリピンアイソフォームの活性レベルが、正常な被験者、または脂質代謝障害、体重障害もしくは糖尿病になっていない被験者から得られた細胞または組織における活性レベル（すなわち、参照レベル）と比べて、増加または低下していることを意味する。１以上のペリリピンアイソフォームの活性レベルは、本明細書に記載の方法または当業者に公知の方法により測定することが可能である。
【００２６】
ポリペプチドに関して本明細書で用いる「類似体」という用語は、第２のポリペプチド（例えば、ペリリピンアイソフォームまたは抗ペリリピン抗体）と類似したまたは同一の機能をもつが、必ずしも第２のタンパク質と類似したまたは同一のアミノ酸配列を含まないか、あるいは、必ずしも第２のタンパク質と類似したまたは同一の構造をもたない第１のポリペプチドをいう。類似したアミノ酸配列をもつポリペプチドは、次のうちの少なくとも１つを満たすポリペプチドをさす。すなわち、（ａ） 第２のポリペプチド（例えば、ペリリピンアイソフォームまたは抗ペリリピン抗体）と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、（ｂ） 少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基の第２のポリペプチド（例えば、ペリリピンアイソフォームまたは抗ペリリピン抗体）をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる第１のポリペプチド、および（ｃ） 第２のポリペプチド（例えば、ペリリピンアイソフォームまたは抗ペリリピン抗体）をコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる第１のポリペプチドである。第２のポリペプチドと類似した構造をもつ第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドと類似した二次、三次または四次構造をもつ第１のポリペプチドをさす。ポリペプチドの構造は、ペプチド配列決定、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、円偏光二色性、結晶構造解析電子顕微鏡検査を含むがこれらに限らない当業者に公知の方法により決定することが可能である。
【００２７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、配列同士を最適なアラインメントのために整列させる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入する）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められていれば、その分子同士はその位置では同一となる。２つの配列間の同一性パーセントはそれらの配列が共有する同一の位置の関数である（同一性％＝同一位置の数／全位置数（例えば、オーバーラップする位置）×１００）。一つの実施形態において、２つの配列は同じ長さのものである。
【００２８】
２つの配列間の同一性パーセントは数学的アルゴリズムを使って求めることができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい例は、限定するものではないが、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ２２６４−２２６８に記載されるアルゴリズムを、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５８７７に記載されるように改変したものである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施する。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことが可能である。比較のためにギャップ付きアラインメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２に記載のとおりに利用することができる。あるいはまた、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うためにＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することが可能である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００２９】
配列比較のために利用される数学的アルゴリズムのもう一つの好ましい例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ， ＣＡＢＩＯＳ （１９８９）に記載されるアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合は、ＰＡＭ１２０加重残基テーブル、ギャップ長ペナルティー １２、ギャップペナルティー ４を使用することが可能である。配列解析のための別のアルゴリズムは当技術分野で公知であり、例えば、ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ （１９９４） Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， １０：３−５に記載されるＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４−８に記載されるＦＡＳＴＡがある。ＦＡＳＴＡに含まれるｋｔｕｐは、検索の感度と速度を設定するコントロールオプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合は、比較される２つの配列中の類似領域が整列残基の対を見ることにより見出される。ｋｔｕｐ＝１の場合は、単一の整列アミノ酸が検討される。タンパク質配列の場合はｋｔｕｐを２または１に、ＤＮＡの場合は１〜６に指定することができる。ｋｔｕｐを指定しない場合のデフォルトは、タンパク質では２、ＤＮＡでは６である。ＦＡＳＴＡパラメーターのさらなる説明については、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｄｏｃｓ／ｍａｎ／ｍａｎ／ｆａｓｔａ．１．ｈｔｍｌ＃ｓｅｃｔ２を参照されたい。この内容を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【００３０】
２つの配列間の同一性パーセントは、上記の手法と類似した手法を使って、ギャップ有りまたはギャップ無しで、決定することができる。同一性パーセントを算出するには、一般に、正確な一致をカウントする。
【００３１】
ポリペプチドに関して本明細書中で用いる「誘導体」という用語は、第２のポリペプチド（例えば、ペリリピンアイソフォームまたは抗ペリリピン抗体）のアミノ酸配列を含むが、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により、あるいはいずれかのタイプの分子の第２のポリペプチドへの共有結合により改変されている第１のポリペプチドをさす。例えば、限定するものではないが、タンパク質加水分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への結合などによってポリペプチドを改変することができる。ポリペプチドの誘導体は、当業者に公知の技法を用いる化学的修飾（例えば、アシル化、リン酸化、カルボキシル化、グリコシル化、セレン修飾および硫酸化）により修飾することが可能である。さらに、ポリペプチドの誘導体は、１個以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。ポリペプチド誘導体の機能は、その起源となるポリペプチドと同じまたは類似であっても、そうでなくともよい。特定の実施形態では、ペリリピンアイソフォームの誘導体は、その起源となるペリリピンアイソフォームの機能を少なくとも１つ保有する。他の特定の実施形態では、ペリリピンアイソフォームの誘導体がその起源となるペリリピンアイソフォームのどのような機能も保有しない。
【００３２】
本明細書中で用いる「断片」という用語は、別のペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、好ましくは、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも２７５個、少なくとも３００個、少なくとも３２５個、少なくとも３５０個、少なくとも３７５個、少なくとも４００個またはそれ以上の連続したアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドをさす。ポリペプチドの断片はそのポリペプチドの機能活性をもっていても、もっていなくてもよい。特定の実施形態では、ペリリピンアイソフォームの断片はペリリピンアイソフォームの機能を少なくとも１つ保有する。他の特定の実施形態では、ペリリピンアイソフォームの断片がその起源となるペリリピンアイソフォームのどのような機能も保有しない。
【００３３】
本明細書中で用いる「機能性断片」という用語は、別のペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、好ましくは、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも２７５個、少なくとも３００個、少なくとも３２５個、少なくとも３５０個、少なくとも３７５個、少なくとも４００個またはそれ以上の連続したアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつ該別のペプチドまたはポリペプチドの機能または活性を少なくとも１つ保有しているペプチドまたはポリペプチドの断片をさす。例えば、ペリリピンアイソフォームの機能性断片は、抗ペリリピン抗体と結合する能力、脂質小滴と結合する能力、ＰＫＡと相互作用する能力、またはプロテインホスファターゼ１と相互作用する能力を保有しうる。
【００３４】
本明細書中で用いる「融合タンパク質」という用語は、（ｉ）第１のポリペプチド（例えば、ペリリピンアイソフォームまたはその断片）のアミノ酸配列、および（ｉｉ）第２の異種ポリペプチドのアミノ酸配列、を含むポリペプチドをさす。本明細書中で用いる「ペリリピン融合タンパク質」という用語は、（ｉ）ペリリピンアイソフォームまたはその断片のアミノ酸配列、および（ｉｉ）異種ポリペプチド（すなわち、非ペリリピンポリペプチドまたはその断片）のアミノ酸配列、を含むポリペプチドをさす。一つの実施形態において、ペリリピン融合タンパク質は、ペリリピンアイソフォームまたはその断片とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのドメインとを含む。別の実施形態では、ペリリピン融合タンパク質は、ペリリピンアイソフォームまたはその断片と抗体のフラグメント（好ましくは、抗体のＦｃドメイン）とを含む。ペリリピン融合タンパク質は当業者に周知の技法を用いて調製することができる。標準的な組換えＤＮＡ技法により融合タンパク質を生産することも可能である。
【００３５】
本明細書中で用いる「条件下でハイブリダイズする」という用語は、典型的には、互いに少なくとも６０％（６５％、７０％、好ましくは７５％）同一であるヌクレオチド配列同士が互いとハイブリダイズした状態で存在しているハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件のことである。そのようなストリンジェント条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に見出せる。一つの非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中約６８℃での１回以上の洗浄からなる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、６Ｘ ＳＳＣ中約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中５０〜６５℃での１回以上の洗浄（すなわち、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃での１回以上の洗浄）からなる。本発明の核酸は、これらの条件下で、単にＡまたはＴヌクレオチドのみからなるヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸分子を含まないことが理解されよう。特定の実施形態では、ポリペプチドはその全長にわたってペリリピンアイソフォームとハイブリダイズし、そして、そのポリペプチドはペリリピンアイソフォームの少なくとも１つの機能または活性をもつことが好ましい。
【００３６】
本明細書中で用いる「アイソフォーム」という用語は、同一の遺伝子によってコードされるが、アミノ酸組成において相違するペリリピンの変異体をさす。ペリリピンには３種類のアイソフォームが知られており、ペリリピンＡ、ペリリピンＢ、およびペリリピンＣである。
【００３７】
核酸分子またはヌクレオチド配列を説明するために本明細書中で用いる「単離された」または「精製された」とは、その核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子またはヌクレオチド配列をさす。好ましくは、「単離された」核酸分子は、その起源となる生物のゲノムＤＮＡ中で該核酸に隣接している配列（すなわち、該核酸の５’および３’末端に位置する配列）（好ましくは、タンパク質をコードする配列）を含まないものである。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え法で生産したときには他の細胞性物質や培地を実質的に含まず、また、化学的に合成したときには化学前駆物質や他の化学薬品を実質的に含まない。
【００３８】
タンパク質またはその生理活性部分（すなわち、ポリペプチド、ペプチドまたはアミノ酸断片）を説明するために本明細書中で用いる「単離された」または「精製された」とは、タンパク質またはその生理活性部分が、該タンパク質の起源となる細胞源または組織源に由来する細胞性物質や他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または、化学的に合成したときには化学前駆物質や他の化学薬品を実質的に含まないことをさす。細胞性物質を実質的に含まないタンパク質またはその生理活性部分（すなわち、ポリペプチド、ペプチドまたはアミノ酸断片）として、異種タンパク質（本明細書では混入タンパク質ともいう）含量が約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量基準）より低いタンパク質調製物が含まれる。
【００３９】
本明細書中でペリリピンの発現または活性に関して用いられる「モジュレートする」という用語は、ペリリピンの発現または活性のあらゆる変化（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）をさす。本開示に基づいて、そのようなモジュレーションは当業者に公知のまたは本明細書に記載のアッセイを用いて測定することが可能である。
【００４０】
本明細書中で用いる「核酸」および「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の組合せ、つまりハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、およびＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体を含む。かかる類似体は、限定するものではないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含めて、ヌクレオチド類似体を使って作製することができる。さらに、かかる類似体には、例えば、ヌクレアーゼ耐性、あるいは細胞膜を通過する能力の向上といった有益な特質を分子に付与する修飾バックボーンを含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子も含まれる。核酸またはヌクレオチド配列は一本鎖でも二本鎖でもよく、また、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含んでいても、三本鎖部分を含んでいてもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。一つの実施形態において、ヌクレオチド配列はペリリピンアイソフォームまたはその断片をコードする連続したオープンリーディングフレームを含むものであり、例えば、ｃＤＮＡ分子である。
【００４１】
本明細書中で用いる「予防する」および「予防」という用語は、体重障害（例えば、肥満）、糖尿病（タイプ１またはタイプ２）、または脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化症）、あるいは脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養症）と関連した１以上の徴候または症状の発生または再発を予防することを意味する。
【００４２】
本明細書中で用いる「予防に有効な量」とは、体重障害（例えば、肥満）、糖尿病（タイプ１またはタイプ２）、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養症）、または脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化症）と関連した１以上の徴候または症状の発生または再発を予防するのに十分な、１以上のペリリピンアイソフォームの発現および／または活性をモジュレートする薬剤の量、または１以上のペリリピンアイソフォームの発現および／または活性をモジュレートする薬剤を含む組成物の量を意味する。
【００４３】
本明細書中で用いる「治療する」および「治療」という用語は、体重障害（例えば、肥満）、糖尿病（タイプ１またはタイプ２）、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養症）、または脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化症）と関連した１以上の徴候または症状の重症度の軽減；動物におけるインスリン耐性の軽減；動物におけるインスリン分泌の改善；体重の増加を特徴とする体重障害（例えば、肥満）になっている動物の体重減少；低体重を特徴とする体重障害（例えば、食欲不振、悪液質）になっている動物の体重増加；動物における筋量の増加；動物における脂質代謝の増加；動物におけるグルコース不耐性の減少をさす。
【００４４】
本明細書中で用いる「治療に有効な量」とは、体重障害（例えば、肥満）、糖尿病（タイプ１またはタイプ２）、脂質代謝障害（例えば、脂肪異栄養症）、または脂質沈着を特徴とする障害（例えば、アテローム性動脈硬化症）と関連した１以上の徴候または症状の重症度を軽減する；動物におけるインスリン耐性を軽減する；動物におけるインスリン分泌を改善する；体重の増加を特徴とする体重障害（例えば、肥満）になっている動物の体重を減少させる；低体重を特徴とする体重障害（例えば、食欲不振、悪液質）になっている動物の体重を増加させる；動物における筋量を増加させる；動物における脂質代謝を増加させる；動物におけるグルコース不耐性を減少させる；のに十分な、１以上のペリリピンアイソフォームの発現および／または活性をモジュレートする薬剤の量、または１以上のペリリピンアイソフォームの発現および／または活性をモジュレートする薬剤を含む組成物の量を意味する。
【００４５】
４．図面の説明
図１Ａ〜１Ｃ．　ｐｌｉｎ−／−マウスの作製。Ａ．　ターゲッティング戦略。エキソン１〜６を黒塗りのボックスで表してある。ＢｓｔＸＩ部位とＡｐａＩ部位の間のエキソン２およびイントロン２の一部を、ＩＲＥＳ−β−ガラクトシダーゼおよびｎｅｏｒ遺伝子で置換する置換ベクター。エキソン２の中断はＢｓｔＸＩ部位のコドン１８３で起こる。このターゲッティングベクターの３’末端にチミジンキナーゼカセット（ＴＫ）を結合させた。Ｈ， ＨｉｎｄＩＩＩ； Ｘｂ， ＸｂａＩ； Ａｐ， ＡｐａＩ； ＢＸ， ＢｓｔＸＩ； ＴＫ， チミジンキナーゼ。Ｂ．　ＸｂａＩ消化後の尾ＤＮＡのサザンブロッティング。３’ ＤＮＡプローブ（上記Ａを参照）を使用すると、野生型ＤＮＡではエキソン２〜６を含む８．５−ｋｂバンドが検出され、ｐｌｉｎ−／−ＤＮＡではｎｅｏ遺伝子の一部およびエキソン３〜６を含む７．０−ｋｂバンドが検出される。Ｃ．　精巣上体および皮下の脂肪（左）ならびに精巣（右）からの細胞抽出物のウェスタンブロッティング。脂肪組織ではペリリピンＡおよびＢが検出され、精巣では野生型においてペリリピンＡおよびＣが検出される（Ｌｏｎｄｏｓら、１９９９， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １９：５１−５８）。これらのアイソフォームはすべてｐｌｉｎ遺伝子の産物であり、ｐｌｉｎ−／−サンプルでは検出不能である。野生型マウスにおいては、ペリリピン発現は精巣よりも脂肪組織のほうが高い。
【００４６】
図２Ａ〜２Ｆ．　ペリリピンの不活性化がｐｌｉｎ−／−マウスにおいて体重、脂肪蓄積、脂質含量、および筋量に及ぼす表現型効果。Ａ．　雄ｐｌｉｎ＋／＋（ｎ＝１１）、ｐｌｉｎ＋／−（ｎ＝１５）、およびｐｌｉｎ−／−（ｎ＝８）マウスの体重。Ｂ．　雌ｐｌｉｎ＋／＋（ｎ＝６）、ｐｌｉｎ＋／−（ｎ＝２４）、およびｐｌｉｎ−／−（ｎ＝１２）マウスの体重。Ｃ．　ｐｌｉｎ−／−およびｐｌｉｎ＋／＋マウスにおける脂肪蓄積量。Ｄ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの総死骸脂質含量。Ｅ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの総死骸トリアシルグリセロール含量。Ｆ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの総死骸タンパク質含量。Ｇ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおける摘出した腓腹筋の重さ（総体重に対する％）。
【００４７】
図３Ａ〜３Ｄ．　ペリリピンの不活性化が脂肪組織に及ぼす効果。Ａ．　脂肪組織の組織学。ｐｌｉｎ＋／＋（左）およびｐｌｉｎ−／−（右）マウスにおける白色脂肪組織（ＷＡＴ、皮下、精巣上体）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ、肩甲間）貯蔵所の切片。ＷＡＴとＢＡＴでは倍率に差があることに注意。Ｂ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおける精巣上体脂肪貯蔵所の脂肪細胞のサイズ分布。個々の脂肪細胞の面積は精巣上体脂肪の切片で測定した。Ｃ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおける精巣上体脂肪のＤＮＡ含量。Ｄ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおける肩甲間脂肪貯蔵所の褐色脂肪細胞の平均サイズ。
【００４８】
図４Ａ〜４Ｅ．　Ａ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおいて４８時間の断食が体重および血漿パラメーターに及ぼす影響。Ｂ．　精巣上体脂肪から抽出されたＨＳＬのウェスタンブロッティング。Ｃ．　分離した脂肪細胞のＨＳＬ活性。ＨＳＬ活性は、「方法」に記載したように、ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスから分離した皮下および精巣上体の脂肪の全細胞溶解物において測定した。この活性は脂肪組織の重さ（ｇ）につき表される。Ｄ．　分離した脂肪細胞における脂肪分解率。脂肪細胞はｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの精巣上体脂肪から分離した。脂肪分解活性は、「方法」に記載したように、ＣＬ ３１６，２４３（ＣＬ）（２μＭ）の不在下および存在下で測定した。Ｅ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおける脂肪分解。血漿中の脂肪分解産物であるグリセロールと非エステル化（遊離）脂肪酸（ＮＥＦＡ）をイソプロテルネオール（ｉｓｏｐｒｏ）（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ、上）およびＣＬ ３１６，２４３（ＣＬ）（０．１ｍｇ／ｋｇ ＩＰ、下）の前および後に測定した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。
【００４９】
図５Ａ〜５Ｅ．　Ａ．　２１℃に保ったｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの体温。試験した動物数：雄ｐｌｉｎ＋／＋ １６， ｐｌｉｎ−／− １２； 雌ｐｌｉｎ＋／＋ ６， ｐｌｉｎ−／− １１。Ｂ．　食餌を与えないで４℃の周囲温度に曝したマウスの体温。マウスがこの温度に最初に曝されたときに絶食を開始した（両群ともｎ＝６、全てが雄マウス）。Ｃ．　食餌を与えた状態で４℃の周囲温度に曝したマウスの体温（両群ともｎ＝５、全てが雄マウス）。＊ ｐｌｉｎ−／−がｐｌｉｎ＋／＋と有意に異なり、ｐ＜０．００５。Ｄ．　３５％の脂肪を含む食餌を与えたｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおける間接熱量測定からの代表的酸素消費（ＶＯ２）トレーシング。ＶＯ２ピークは活動期に一致し、ベースラインは休止時の値を表す。Ｅ．　通常の食餌を与えた１４週齢のｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスにおける代表的ＶＯ２トレーシング。
【００５０】
図６Ａ〜６Ｄ．　Ａ．　通常の食餌または３５％脂肪（ＨＦ）食餌を３．５か月間与えた後のｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウス群の精巣上体脂肪パッド量（雄マウス、１群につきｎ＝５）。ＨＦ食餌を与える前のデータは図２Ｃに示したものと同じであった。Ｂ．　通常の食餌または３５％脂肪（ＨＦ）食餌を３．５か月間与えた後のｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの総死骸脂肪含量（雄マウス、１群につきｎ＝５）。ＨＦ食餌を与える前のデータは図２Ｄに示したものと同じであった。Ｃ．　ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋、ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−、ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの写真。Ｄ．　体脂肪分布の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）。上、ｐｌｉｎ＋／＋（左パネル）およびｐｌｉｎ−／−（右パネル）マウスのＭＲＩ。下、ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋（左パネル）およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（右パネル）マウスのＭＲＩ。４つのｉｎ ｖｉｖｏ ＭＲＩはそれぞれ異なる遺伝子型の代表的マウスの腹部領域からの横断面を表す。スピンエコーＭＲＩは、反復時間２．５秒、エコー時間１２ミリ秒、視野６− ｘ ６−ｃｍ、スライス１．５−ｍｍ、および１２８−または２５６−位相エンコードステップを用いて得られたマルチスライスのセットから選ばれた。運動アーチファクトを軽減するために呼吸ゲーティングを適用した。各画像の上に示したプロトンＮＭＲスペクトルはマウス全身からの水および脂質シグナルを表す。このスペクトルはシングルパルス取り込みシーケンスにより得られた。各スペクトルは６．５ｐｐｍ〜３．５ｐｐｍおよび３．５ｐｐｍ〜０．５ｐｐｍの領域において積分し、全身に対する水および脂質の濃度を概算した。
【００５１】
図７Ａ〜７Ｂ．　Ａ．　４〜１７週にわたる雄ｄｂ／ｄｂ（三角）、ｐｌｉｎ＋／＋（四角）、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（円）マウスの体重。Ｂ．　４〜２２週にわたる雌ｄｂ／ｄｂ（三角）、ｐｌｉｎ＋／＋（四角）、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（円）マウスの体重。
【００５２】
図８Ａ〜８Ｂ．　Ａ．　６〜２７週にわたる雄ｄｂ／ｄｂ（四角）、ｐｌｉｎ＋／＋（菱形）、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（三角）マウスの体重。Ｂ．　６〜２４週にわたる雌ｄｂ／ｄｂ（四角）、ｐｌｉｎ＋／＋（菱形）、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（三角）マウスの体重。
【００５３】
図９．　β−酸化のステップ。
【００５４】
図１０．　脂肪アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの発現。野生型（ｐｌｉｎ＋／＋）マウスおよびｐｌｉｎ−／−マウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、および筋肉におけるβ−酸化酵素である脂肪アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、特に極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＡＤ）および長鎖脂肪アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＬＣＡＤ）のｍＲＮＡ発現（ノーザンブロット分析により測定）。
【００５５】
図１１．　三官能性タンパク質の発現。野生型（ｐｌｉｎ＋／＋）マウスおよびｐｌｉｎ−／−マウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、および筋肉におけるチオラーゼ（三官能性タンパク質β）およびＬＣＨＡＤ（三官能性タンパク質α）のｍＲＮＡ発現（ノーザンブロット分析により測定）。
【００５６】
図１２．　脱共役タンパク質（ＵＣＰ）の発現。野生型（ｐｌｉｎ＋／＋）マウスおよびｐｌｉｎ−／−マウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、および筋肉におけるＵＣＰ−１およびＵＣＰ−２のｍＲＮＡ発現（ノーザンブロット分析により測定）。
【００５７】
図１３Ａ〜１３Ｂ．　Ａ．　絶食時血漿グルコースレベル。１０時間絶食させた後のＬｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ＋／＋マウス、Ｌｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ−／−マウス、Ｌｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ＋／＋マウス、およびＬｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスの血漿中のグルコース濃度。Ｂ．　絶食時血漿インスリンレベル。１０時間絶食させた後のＬｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ＋／＋マウス、Ｌｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ−／−マウス、Ｌｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ＋／＋マウス、およびＬｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスの血漿中のインスリン濃度。
【００５８】
図１４Ａ〜１４Ｂ．　グルコース不耐性試験。グルコース不耐性試験のためにグルコースを投与する前に、Ｌｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ＋／＋マウス、Ｌｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ−／−マウス、Ｌｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ＋／＋マウス、およびＬｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスを１０時間絶食させた。Ａ．　Ｌｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ＋／＋マウス（菱形）、Ｌｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ−／−マウス（四角）、Ｌｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ＋／＋マウス（三角）、およびＬｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウス（円）に１．５ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内投与した直後（０分）、３０分、６０分および９０分後の血漿グルコース濃度。Ｂ．　Ｌｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ＋／＋マウス（菱形）、Ｌｅｐ＋／＋／ｐｌｉｎ−／−マウス（四角）、Ｌｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ＋／＋マウス（三角）、およびＬｅｐｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウス（円）に１．５ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内投与した直後（０分）、３０分、６０分および９０分後の血漿インスリン濃度。
【００５９】
５．発明の開示
本発明は、体重に関係した障害および／または脂質代謝の不適切な調節の予防および／または治療に有用な薬剤を同定する手段としての、ペリリピンの活性および／または発現をモジュレートする薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイを包含する。特に本発明は、１以上のペリリピンアイソフォームの発現および／または活性をモジュレートする化合物を同定するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを提供する。本発明はまた、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートし、それによってペリリピンの発現および／または活性に影響を与える、酵素（例えばホスファターゼ、キナーゼもしくはホスホジエステラーゼ）などのシグナル伝達分子の発現および／または活性をモジュレートする化合物を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを提供する。
【００６０】
本発明はまた、体重に関係した障害および／または脂質代謝の不適切な調節の予防および／または治療のための、ペリリピンタンパク質の活性および／または発現をモジュレートする化合物を含有する医薬組成物を包含する。特に、その医薬組成物はペリリピンのアゴニストまたはアンタゴニストとすることができる。アンタゴニストは活性化されたペリリピンとその下流のシグナル伝達経路との相互作用をブロックするか、ペリリピン遺伝子の転写を抑制するか、ペリリピンｍＲＮＡのプロセッシングもしくは翻訳を抑制するか、または１以上のペリリピンアイソフォームの翻訳後プロセッシングを抑制することによって、別のペリリピンアゴニストもしくはアンタゴニストと競合してこれを抑制する作用をすることができる。アゴニストはペリリピンシグナル伝達経路の天然の生物学的効果もしくはその発現を活性化および／または増強することによって作用することができる。１実施形態において、アゴニストが１以上のペリリピンアイソフォームのリン酸化を増加させる。
【００６１】
本発明は、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートする医薬組成物を投与することを含む、動物、好ましくはコンパニオン動物、家畜および家禽、そしてさらに好ましくはヒトにおける体重障害の予防および／または治療方法を提供する。１実施形態において、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートすることによって動物の体重および性能（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を増強する、１種以上の化合物を含む医薬組成物の有効量を動物に投与する。別の実施形態において、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートすることによって体重を減少させ、肥満に関係する症状を改善する、１種以上の化合物を含む医薬組成物の有効量を、これを必要とする動物に投与する。別の実施形態において、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートすることによって動物の脂質代謝を高め、また筋量を増やす化合物の有効量を、これを必要とする動物に投与する。別の実施形態において、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートすることによって動物の脂質蓄積を高める、１種以上の化合物を含む医薬組成物の有効量を、これを必要とする動物に投与する。さらに別の実施形態において、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートすることによって糖尿病の発生もしくは進行を改善または遅延させる、１種以上の化合物を含む医薬組成物の有効量を、これを必要とする動物に投与する。
【００６２】
本発明はまた、脂質代謝障害、体重障害および糖尿病などの、１以上のペリリピンアイソフォームの異常な発現および／または活性に特徴がある疾患および障害の発生もしくは進行を検出、診断またはモニタリングする方法をも提供する。特に、本発明はペリリピンの発現および／または活性のレベルを検出することによる、動物の肥満の素質を診断または検出する方法を提供する。
【００６３】
５．１．　ペリリピンの活性および／または発現をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、ペリリピンに結合するか、あるいはペリリピンの発現および／また
は活性に対して促進または抑制効果を持つ薬剤（例えば候補化合物または試験化合物）を同定するための方法を提供する。特定の１実施形態において、１以上のペリリピンアイソフォームのリン酸化をモジュレートし、それによって１以上のペリリピンアイソフォームの活性に影響を与える薬剤を同定するための方法を提供する。本発明はまた、１以上のペリリピンアイソフォームのリン酸化状態の調節に関与する、ホスファターゼもしくはキナーゼなどの酵素の発現および／または活性をモジュレートする薬剤を同定するための方法を提供する。薬剤、化合物、候補化合物または試験化合物の例として、限定するわけではないが、核酸（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプチド（環状ペプチドを含む）、ペプチド模倣体、抗体、抗体フラグメント、小分子およびその他の物質が含まれる。小分子として、限定するわけではないが、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が約１０，０００ ｇ／ｍｏｌｅ以下の有機もしくは無機化合物（すなわちヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、分子量が約５，０００ ｇ／ｍｏｌｅ未満の有機もしくは無機化合物、分子量が約１，０００ ｇ／ｍｏｌｅ未満の有機もしくは無機化合物、分子量が約５００ ｇ／ｍｏｌｅ以下の有機もしくは無機化合物、ならびにこうした化合物の塩、エステル、およびその他の製薬上許容される形態が含まれる。特定の１実施形態において、薬剤は小分子である。
【００６４】
本明細書に記載する方法において試験および同定することができる化合物として、限定するわけではないが、以下のようないずれかの販売元から取得した化合物が含まれる：Ａｌｄｒｉｃｈ（１００１ Ｗｅｓｔ Ｓｔ．Ｐａｕｌ Ａｖｅ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ５３２３３）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １４５０８， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ ６３１７８）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓｔｒａｓｓｅ ２５， ＣＨ−９４７１ Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（９８０ Ｓｏｕｔｈ ２ｎｄ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ， ＮＹ １１７７９）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ４３１， Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ， ＴＮ ３７６６２）、およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ（Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １１６， Ｄ−６８２９８ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。本発明の方法を使用して、微生物、菌類、植物および動物抽出物を含む、どのような種類の天然産物でもスクリーニングすることができる。
【００６５】
ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートする能力について試験することができる化合物として、限定するわけではないが、ペリリピンのリン酸化をモジュレートする薬剤が含まれ、ＰＫＡ活性をモジュレートする薬剤およびタンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）活性をモジュレートする薬剤などがある。こうした薬剤の例として限定するわけではないが、βアドレナリン性アゴニスト（例えばイソプロテレノール）およびホスホジエステラーゼインヒビター（例えばテオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、およびパパベリン）が含まれる。いくつかの実施形態において、試験すべき化合物にはＰＫＡ活性をモジュレートする薬剤、タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）活性をモジュレートする薬剤、またはホスホジエステラーゼ活性をモジュレートする薬剤が含まれない。別のいくつかの実施形態において、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートする能力について試験する薬剤には、イソプロテレノール、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、またはパパベリンが含まれない。別のいくつかの実施形態において、ペリリピンの発現および／または活性をモジュレートする能力について試験する薬剤には、体重障害、不適切な脂質代謝に特徴がある障害、脂質蓄積に特徴がある障害または糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善において知られていたか、すでに使用された化合物は含まれない。
【００６６】
さらに、小分子を含む薬剤の多様なライブラリーを利用することができる。こうしたライブラリーは例えば以下の販売元から入手することができる：Ｓｐｅｃｓ ａｎｄ ＢｉｏＳｐｅｃｓ Ｂ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｏｌｇｏｐｒｕｄｇｙ， Ｍｏｓｃｏｗ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｒｕｓｓｉａ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＰＬ２４ ＯＨＷ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、およびＡｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ， Ｒｕｓｓｉａ）。
【００６７】
その上さらに、以下のような当分野で知られたコンビナトリアルライブラリー法における膨大な手法のいずれかを使用して、薬剤を取得することができる：生物ライブラリー；空間的にアドレす可能な並行固相もしくは液相ライブラリー；デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要とする合成ライブラリー；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物ライブラリー手法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の４手法は化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５；米国特許第５，７３８，９９６号；および米国特許第５，８０７，６８３号、これらのそれぞれを全体として参照により本明細書に組み入れる）。
【００６８】
分子ライブラリーの合成方法の例を当分野で知ることができ、例えば以下の文献がある：ＤｅＷｉｔｔら、１９９３， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら、１９９４， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９４４， Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９４４， Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら、１９４４， Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら、１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３、これらのそれぞれを全体として参照により本明細書に組み入れる。
【００６９】
化合物のライブラリーを例えば以下の状態で提供することができる：溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ， １９９２， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ，１９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら、１９９２， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、もしくはファージ上（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２；およびＦｅｌｉｃｉ， １９９１， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）。これらのそれぞれを全体として参照により本明細書に組み入れる。
【００７０】
５．１．１．　ペリリピンと相互作用する薬剤のアッセイ
１実施形態において、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）もしくはその断片（例えば機能的に活性な断片）またはペリリピン融合タンパク質と相互作用する（すなわち結合する）薬剤（すなわち候補化合物）を細胞に基づくアッセイ系で同定する。この実施形態によれば、ペリリピン、その断片またはペリリピン融合タンパク質を発現する細胞と候補化合物または対照化合物とを接触させ、候補化合物がペリリピン、その断片またはペリリピン融合タンパク質と相互作用する能力を判定する。所望ならば、このアッセイを使用して、複数の候補化合物（例えばライブラリー）をスクリーニングすることができる。
【００７１】
これらのアッセイで使用する細胞は例えば原核生物起源（例えば大腸菌）または真核生物起源（例えば酵母もしくは哺乳動物）とすることができる。細胞は１以上のペリリピンアイソフォームを内因的に発現できるもの（例えばステロイド形成細胞および脂肪細胞）とするか、１以上のペリリピンアイソフォームもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質を発現するように、遺伝子操作することができる。初代細胞または細胞系を本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。さらに、細胞を組換え体、トランスジェニック細胞系から取得することができる。例えば、細胞をｄｂ／ｄｂマウスまたはｏｂ／ｏｂマウスから取得して、連続細胞系へ形質転換することができる。トランスジェニック動物から連続細胞系を誘導するために使用することができる技法の例は当業者に知られているが、例えばＳｍａｌｌら、１９８５， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：６４２−６４８を参照されたい。
【００７２】
具体的な例において、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）もしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質を標識して、候補化合物のペリリピン、ペリリピン断片またはペリリピン融合タンパク質への結合を、複合体中の標識化合物を検出することによって、判定することができるようにする。別の具体的な例において、候補化合物を標識して、候補化合物のペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）、ペリリピン断片またはペリリピン融合タンパク質への結合を、複合体中の標識候補化合物を検出することによって、判定することができるようにする。標識の例として限定するわけではないが、放射性標識（３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなど）、蛍光標識（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドもしくはフルオレスカミンなど）、および酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはルシフェラーゼなど）が含まれる。候補化合物のペリリピン、その断片、ペリリピン融合タンパク質と直接または間接的に相互作用する能力は、当業者に知られた方法によって判定することができる。例えば、候補化合物とペリリピン、その断片またはペリリピン融合タンパク質との間の相互作用を、フローサイトメトリー、シンチレーションアッセイ、免疫沈降またはウエスタンブロット分析によって判定することができる。
【００７３】
別の実施形態において、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）もしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質と相互作用する（すなわち結合する）薬剤を無細胞アッセイ系で同定する。この実施形態によれば、天然または組換えペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）、その断片またはペリリピン融合タンパク質と候補化合物または対照化合物とを接触させ、候補化合物がペリリピン、その断片またはペリリピン融合タンパク質と相互作用する能力を判定する。所望ならば、このアッセイを使用して、複数の候補化合物（例えばライブラリー）をスクリーニングすることができる。ペリリピンまたは候補／対照化合物のいずれかを固定化して、複合体化ペリリピンの非複合体化形態のものからの分離を容易にするとともに、アッセイの自動化に適応させることができる。好ましくは、ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質を最初に固定化する。これは例えば、ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質とこれを特異的に認識して結合する固定化抗体とを接触させるか、あるいはペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質の精製調製物とタンパク質に結合するように設計した１表面とを接触させることによる。当業者に知られた技法を使用して、ペリリピンまたは候補化合物を任意の好適な容器（例えばマイクロタイタープレート、試験管、およびミクロ遠心管）に固定化することができる。ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質は部分的にまたは完全に精製した（例えばその他のポリペプチドを部分的にまたは完全に含まない）ものでも、あるいは細胞溶解物の一部でもよい。候補化合物のペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質と相互作用する能力は当業者に知られた方法によって判定することができる。
【００７４】
別の実施形態において、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）もしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質と競合的に相互作用する（すなわち結合する）薬剤を競合結合アッセイで同定する。この実施形態によれば、ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質を発現する細胞と候補化合物およびペリリピンと相互作用することがわかっている化合物（例えばプロテインキナーゼＡ）とを接触させ、次に候補化合物がペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質と競合的に相互作用する能力を判定する。あるいは、ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質と競合的に相互作用する（すなわち結合する）候補化合物を、ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質と候補化合物およびペリリピンと相互作用することがわかっている化合物とを接触させることによって、無細胞アッセイ系で同定する。上述のように、候補化合物がペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質と競合的に相互作用する能力を、当業者に知られた方法によって判定する。細胞ベースでも細胞フリーでも、これらのアッセイを使用して、複数の候補化合物（例えばライブラリー）をスクリーニングすることができる。
【００７５】
ペリリピンと競合的に相互作用する化合物に関するアッセイは不均質系または均質系の方式で実施することができる。不均質系アッセイでは、ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質、あるいはペリリピンと相互作用することがわかっている対照化合物（「結合相手」）のいずれかを固相上に定着させ、反応の終了時に固相上に定着された複合体を検出することを含む。均質系アッセイでは、全反応を液相で実施する。いずれの手法においても、反応物の添加の順序を変更して、試験する化合物に関して別種の情報を取得することができる。例えば、ペリリピンと結合相手との間の相互作用に例えば競合によって干渉する候補化合物を、この候補化合物の存在下で反応を実施することによって（すなわち、候補化合物をペリリピンおよび相互作用性結合相手より前、またはこれらと同時に反応混合物中に添加することによって）同定することができる。あるいは、形成された複合体を破壊する候補化合物、例えばさらに高い結合定数を持っていて複合体から構成成分の１つを置換するような化合物は、この候補化合物を複合体が形成された後に反応混合物に添加することによって、試験することができる。多様な方式について以下で簡単に説明する。
【００７６】
不均質系アッセイ系において、ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質、あるいは結合相手のいずれかを固相表面に定着させ、一方で定着させない方の物質は直接または間接的に標識する。実施上は、マイクロタイタープレートを利用するのが便利である。定着させる物質は非共有結合または共有結合によって固定化することができる。非共有結合による固定化は、単純に固相表面をペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質、あるいは結合相手の溶液でコーティングし、乾燥することによって達成することができる。あるいは、定着させるべき物質に特異的な抗体を固定化して、物質を固相表面に定着させるのに使用することができる。この表面はあらかじめ調製して保存しておくことができる。
【００７７】
このアッセイを実施するため、固定化した物質の相手を、候補化合物を含むまたは含まないコーティング表面に曝露する。反応が完了した後、未反応成分を（例えば洗浄によって）除去し、形成された複合体があれば、固相表面上に固定化されて残るはずである。固相表面に固定された複合体の検出は多くの方法によって達成することができる。非固定化物質を事前に標識する場合は、表面に固定化された標識の検出が、複合体が形成されたことを指示する。非固定化物質を事前に標識しない場合は、間接的標識を使用して、例えば当初固定化されていない物質に特異的な標識抗体（この抗体は直接標識することも、標識した抗Ｉｇ抗体で間接標識することも可能である）を使用して、表面に定着された複合体を検出することができる。反応成分の添加順序に応じて、複合体の形成を阻害するか、形成された複合体を破壊する候補化合物を検出することができる。
【００７８】
別法として、反応を候補化合物の存在もしくは不在下で液相中で実施し、反応生成物を非反応成分から分離し、複合体を検出することができる。これは例えば、溶液中で形成された複合体を定着させるために結合成分の一方に特異的な固定化抗体、また、定着された複合体を検出するために他方の相手に特異的な標識抗体を使用することによる。この場合も、液相への反応物の添加順序に応じて、複合体を阻害するか、形成された複合体を破壊する候補化合物を同定することができる。
【００７９】
本発明の別の実施形態においては、均質系アッセイを使用することができる。この手法では、ペリリピン、その断片またはペリリピン融合タンパク質、あるいは結合相手のいずれかが標識されている、ペリリピン、その断片またはペリリピン融合タンパク質と結合相手との複合体を事前に形成させて調製するが、標識から生じるシグナルが複合体の形成によって消失するようにする（例えばＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、米国特許第４，１０９，４９６号を参照されたい。ここではイムノアッセイにこの手法を利用している）。予め形成した複合体中の物質の１つと競合してこれを置換する候補化合物を添加すると、バックグラウンド値を超えるシグナルの発生があるはずである。この方法によって、ペリリピン、その断片またはペリリピン融合タンパク質／結合相手の相互作用を破壊する候補化合物を同定することができる。
【００８０】
別の実施形態において、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）もしくはその断片を２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおいて「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用して、ペリリピンと結合または相互作用する別のタンパク質を同定することができる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３， Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＰＣＴ公開番号 ＷＯ９４／１０３００、参照）。当業者ならば、このような結合性タンパク質が、例えばペリリピンが関与するシグナル伝達経路の上流もしくは下流要素として、ペリリピンによるシグナルの伝播にも関与するらしいことを理解するであろう。
【００８１】
５．１．２．　ペリリピンの発現もしくは活性をモジュレートする薬剤のアッセイ
別の実施形態において、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）の発現をモジュレートする薬剤（すなわち候補化合物）を、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）を発現する細胞（例えば原核生物起源もしくは真核生物起源の細胞）と候補化合物もしくは対照化合物（例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））とを接触させ、ペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡの発現を判定することによって同定する。候補化合物の存在下でのペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡの発現レベルを、候補化合物の不在下（例えば対照化合物の存在下）でのペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡの発現レベルと比較する。次にこの比較を基礎として、候補化合物をペリリピンの発現のモジュレーターとして同定する。例えば、ペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡの発現が、候補化合物の存在下の方が不在下よりも有意に多い場合、その候補化合物をペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡの発現の促進剤として同定する。あるいは、ペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡの発現が、候補化合物の存在下の方が不在下よりも有意に少ない場合、その候補化合物をペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡの発現の抑制剤として同定する。ペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡの発現のレベルは、当業者に知られた方法によって測定することができる。例えば、ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって評価することができ、タンパク質のレベルはウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによって評価することができる。本発明の特定の実施形態では、ペリリピンＡ、ペリリピンＢ、ペリリピンＣ、またはこれらの組合せの発現を測定する。
【００８２】
別の実施形態において、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）の活性をモジュレートする薬剤を、ペリリピンを含有する調製物またはペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）を発現する細胞（例えば原核もしくは真核細胞）と候補化合物もしくは対照化合物とを接触させ、ペリリピンの活性をモジュレート（例えば促進または抑制）する候補化合物の能力を判定することによって同定する。ペリリピンの活性は、以下の検出によって評価することができる：ペリリピンのリン酸化の検出；ペリリピンの細胞性シグナル伝達経路（例えば細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３その他）の誘導の検出；ペリリピンによって活性が調節される酵素の活性（例えばホルモン感受性リパーゼ活性）の検出；リポーター遺伝子（例えばペリリピン応答性で、検出し得るマーカーの１つ、例えばルシフェラーゼをコードする核酸に機能し得るように連結された調節エレメント）の誘導の検出；あるいは細胞応答、例えば脂質加水分解（例えばＯ２消費もしくは脂肪細胞からのグリセロール放出の変化の検出による）または脂質小滴の分布の検出。これらの活性の測定のためには、当業者に知られた技法および本明細書に記載する技法を使用することができる（例えば、Ｈｏｌｍｅｓら、１９９７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８６：４５−６７およびＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｏｔａｓら、２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：４７４−４７９参照、これらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れる）。次に、候補化合物の効果を対照化合物と比較することによって、候補化合物をペリリピンの活性のモジュレーターとして同定することができる。好適な対照化合物としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および標準生理食塩水（ＮＳ）が含まれる。
【００８３】
さらに別の実施形態において、ペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）の発現、活性または発現と活性の両方をモジュレートする薬剤を動物、好ましくは哺乳動物中で同定する。好適な動物の例として限定するわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、サル、モルモット、イヌおよびネコが含まれる。好ましくは使用する動物は以下のような肥満モデルである：レプチン抵抗性動物（例えばｄｂ／ｄｂマウス）、メラノコルチン−４受容体ノックアウトマウス（ＭＲ−４−／−）、レプチン欠損マウス（ｏｂ／ｏｂマウス）、タビー（ｔｕｂｂｙ）マウス（タビータンパク質欠失）、ｆａ／ｆａ（Ｚｕｃｋｅｒ Ｄｉａｂｅｔｉｃ ＦａｔｔｙもしくはＺＤＦ）ラット、メラノコルチン−３受容体ノックアウトマウス、ＰＯＭＣ欠損マウス、およびｆａｔ／ｆａｔマウス（例えば以下を参照されたい：Ｂａｒｓｈら、２０００， Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６４４−６５１；Ｆｉｓｈｅｒら、１９９９， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２３ Ｓｕｐｐｌ：５４−５８；Ｇｉｒｉｄｈａｒａｎ， １９９８， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．１０８：２２５−２４２；Ｚｈａｎｇら、１９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７２：４２５−４３２；Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８０：５３４−５３８；Ｉｉｄａら、１９９６， ＢＢＲＣ ２２４：５９７−６０４；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３：１８−１９；Ｃｈｅｎら、２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：９７−１０２ ；Ｂｕｔｌｅｒら、２０００， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１：３５１８−３５２１；Ｙａｗｅｎら、１９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１０６６−１０７０；およびＮａｇｇｅｒｔら、１９９５， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：１３５−１４２）。この実施形態によれば、候補化合物または対照化合物を好適な動物に（例えば経口、経直腸または皮下、筋内、腹腔内もしくは静脈内などの腸管外）投与し、ペリリピンの発現、活性または発現と活性の両方に対する影響を判定する。ペリリピンの発現を変更する候補化合物は、候補化合物で処置した動物もしくは動物群中でのペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡのレベルを、対照化合物で処置した動物もしくは動物群中でのペリリピンまたはペリリピンをコードするｍＲＮＡのレベルと比較することによって、同定することができる。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを判定するためには、当業者に知られた技法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用することができる。ペリリピンの活性を変更する候補化合物は、対照化合物で処置した動物中および候補化合物で処置した動物中のペリリピン活性をアッセイすることによって、同定することができる。ペリリピンの活性は、以下の検出によって評価することができる：ペリリピンのリン酸化の検出；ペリリピンの細胞性第２メッセンジャー（例えば細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３その他）の誘導の検出；リポーター遺伝子の誘導の検出；あるいは細胞応答（例えば脂質小滴上のペリリピンの分布、またはＯ２消費の変化もしくは脂肪細胞からのグリセロール放出の��化の検出による脂質加水分解などの脂質代謝）の検出。ペリリピンの活性の変化を検出するためには、当業者に知られた技法および本明細書に記載する技法を使用することができる。
【００８４】
５．１．３．　コンピュータモデル化化合物
コンピュータモデル化および検索技術によって、ペリリピン遺伝子発現および／または活性をモジュレートすることができる化合物の同定、あるいはすでに同定された化合物の改善が可能になる。こうした化合物もしくは組成物を同定した後、活性部位または領域を同定するのが好ましい。活性部位は例えば、ペプチドのアミノ酸配列、核酸のヌクレオチド配列、または関連がある化合物もしくは組成物と天然の結合相手との複合体の研究などの、当分野で知られた方法を使用して同定することができる。例えば、化学的方法またはＸ線結晶解析を使用して、複合体化した結合相手がその因子のどこに存在するかを見出だすことによって、活性部位を発見することができる。
【００８５】
次にその活性部位の幾何学的三次元構造を決定するのが好ましい。これは、完全な分子構造を決定することができるＸ線結晶解析などの既知の方法によって実施することができる。また、固相または液相ＮＭＲを使用して、活性部位内および／または結合相手との複合体中の所定の分子内距離を決定することができる。部分的もしくは完全な幾何学的構造を取得するために、構造決定のその他のどのような実験的方法でも使用することができる。幾何学的構造は、天然または人工の複合体化されるリガンドを用いて測定することもでき、これによって決定された活性部位の構造の正確さを高めることができる。
【００８６】
コンピュータに基づく数値モデル化の方法を使用して、（例えば不完全なまたは精度が不十分な構造が決定された実施形態において）その構造を完成させるか、精度を改善することができる。この分野で認められたモデル化方法はどれも使用することができる。これらとして限定するわけではないが、タンパク質もしくは核酸などの特定の生体ポリマーに特異的なパラメーター化したモデル、分子運動のコンピュータ計算に基づく分子動力学モデル、熱アンサンブル（ｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ）に基づく統計力学モデル、または複合モデルが含まれる。大部分のタイプのモデルの場合、構成原子および構成基間の力を表す標準分子間力場が必要であり、物理化学において既知の力場から選択することができる。当分野で既知であってこうしたモデルにおいて使用することができる代表的な力場として限定するわけではないが、一定原子価力場（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｖａｌｅｎｃｅ Ｆｏｒｃｅ Ｆｉｅｌｄ： ＣＶＦＦ）、ＡＭＢＥＲ力場およびＣＨＡＲＭ力場が含まれる。不完全なまたは精度が低い実験構造はこれらのモデル化方法によって算出される完全でより正確な構造に対する制約条件として役立ち得る。
【００８７】
最後に、実験によるか、モデル化によるか、その組合せのいずれかによって、活性部位の構造を決定した後、化合物と共にそれらの分子構造に関する情報を含有するデータベースを検索することによって、候補モジュレーター化合物を同定することができる。こうした検索では、決定した活性部位構造に一致し、その活性部位を規定する基と相互作用する構造を持つ化合物を探索する。こうした検索はマニュアルでもよいが、好ましくはコンピュータの支援を得る。この検索で見出された化合物は、潜在的な標的もしくは経路遺伝子産物をモジュレートする化合物である。
【００８８】
あるいは、これらの方法を使用して、すでに知られたモジュレーター化合物もしくは結合相手から改善されたモジュレーター化合物を同定することができる。既知の化合物の組成を改変し、その新しい組成に上記の実験およびコンピュータモデル化法を適用して使用して、改変の構造的影響を判定することができる。次に変更された構造をその化合物の活性部位構造と比較して、改善されたフィットまたは相互作用がもたらされるかどうかを判定する。このようにして、側鎖基を変更するなどによる、組成の系統的な変更を迅速に評価することによって、改善された特異性または活性がある改変されたモジュレーター化合物または結合相手を取得する。
【００８９】
標的もしくは経路遺伝子または遺伝子産物の活性部位ならびに関連する形質導入および転写因子の同定に基づくモジュレーター化合物の同定に有用な、別の実験およびコンピュータモデル化法は当業者にとって明らかであろう。
【００９０】
分子モデル化システムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最少化および分子動力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、図式モデル化および解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡによって分子挙動の相互作用構造、改変、可視化および解析が可能となる。
【００９１】
以下のように、多数の文献で特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデル化が概説されている：Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７：１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ， （Ｊｕｎｅ １６，１９８８）， Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７；ＭｃＫｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ， １９８９， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９：１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ．１８９−１９３（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．１９８９）；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｄｅａｎ， １９８９ Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６：１２５−１４０ ａｎｄ １−１６２；ならびに核酸成分のためのモデル受容体に関しては、Ａｓｋｅｗら、１９８９， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１０８２−１０９０。化学物質をスクリーニングし、図式で示すその他のコンピュータプログラムが、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ， Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ， ＣＡ．） 、Ａｌｌｅｌｉｘ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ， Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｏｎｔａｒｉｏ）などの会社から入手し得る。これらは本来は特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するために設計されているが、ＤＮＡもしくはＲＮＡの領域が同定された後、これらの領域に特異的な薬物を設計するために、これらを応用することができる。
【００９２】
結合を変更し得る化合物の設計および作製に言及して上に一般的に記載したが、抑制剤もしくは活性化剤となる化合物について、天然産物または合成化学物質、およびタンパク質などの生物学的活性物質を含む既知の化合物のライブラリーをスクリーニングすることも可能である。
【００９３】
５．２．　ペリリピンアンタゴニスト
上記第５．１節に記載したアッセイによって同定された、ペリリピン発現および／または活性レベルを低下させるか抑制することによってペリリピン（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）にアンタゴナイズ（拮抗）する化合物を本発明にしたがって使用して、肥満に関係する１以上の徴候もしくは症状を予防、治療または改善することができる。その上、こうした化合物を使用して、糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状を予防、治療または改善することができる。さらに、こうした化合物を使用して、脂質代謝障害（例えば脂肪異栄養症）または脂質蓄積に特徴がある障害（例えばアテローム性動脈硬化症）に関係する１以上の徴候もしくは症状を予防、治療または改善することができる。その上さらにこうした化合物を、脂質代謝を高め、筋肉量を増やすために使用することができる。上記第５．１節で考察したように、こうした化合物として限定するわけではないが、核酸（例えばアンチセンス核酸および三本鎖ヘリックス分子）、ペプチド、ホスホペプチド、有機もしくは無機小分子、または抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラもしくは一本鎖抗体、さらにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、ならびにそれらのエピトープ結合性フラグメントを含む）が含まれる。特定の実施形態において、ペリリピン発現および／または活性を抑制するか低下させる薬剤は、ペリリピンが正常に機能するのを内因的に妨害する、１以上のペリリピンアイソフォームの断片もしくはその誘導体、または１以上のペリリピンアイソフォームの断片もしくはその誘導体を含む融合タンパク質である。
【００９４】
５．２．１．　ペリリピンの核酸アンタゴニストおよびこれに基づく医薬組成物
本発明は、ペリリピン発現を標的とするペリリピンアンチセンス核酸、リボザイム、三本鎖ヘリックス分子を提供する。本発明はさらに、１以上のペリリピンアンチセンス核酸、三本鎖ヘリックス分子、および／またはリボザイムと製薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物を、肥満および脂質代謝の能力低下もしくは不能を伴う障害の予防または治療のために使用することができる。さらに、こうした医薬組成物を糖尿病（例えば真性糖尿病）の予防または治療のために使用することができる。その上さらに、こうした医薬組成物を、動物、好ましくは家畜および家禽、さらに好ましくはヒトの脂質代謝および筋肉量を高めるために使用することができる。
【００９５】
５．２．１．１．　ペリリピンアンチセンス核酸
特定の実施形態においては、ペリリピンアンチセンス核酸の使用によって、ペリリピン発現を抑制する。本発明は、ペリリピンもしくはその断片をコードする遺伝子またはｃＤＮＡに対してアンチセンスである少なくとも６ヌクレオチドを含む核酸の、治療もしくは予防のための使用を提供する。本明細書で使用する、ペリリピン「アンチセンス」核酸とは、ペリリピンをコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部との配列相補性によってハイブリダイズすることができる核酸を意味する。アンチセンス核酸はペリリピンをコードするｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域に相補性であればよい。具体的な実施形態において、ペリリピンアンチセンス核酸は１以上のペリリピンアイソフォームの発現を抑制するか減少させる。好ましい実施形態において、ペリリピンアンチセンス核酸はペリリピンＡの発現を抑制するか低下させる。こうしたアンチセンス核酸はペリリピン発現を抑制する化合物としての有用性があり、肥満、脂質代謝障害（例えば脂肪異栄養症）または脂質沈積に特徴がある障害（例えばアテローム性動脈硬化症）の予防または治療において、そして脂質代謝を高め、筋肉量を増やすために使用することができる。
【００９６】
代表的な、限定的でないペリリピンアンチセンス分子の例として、以下のものが含まれる：
５’ＡＧＧＴＧＡＧＧＣＣＴＴＴＧＴＴＧＡＣＴＧＣＣＡＴ３’（配列番号１）
５’ＣＴＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧ３’（配列番号２）
【００９７】
ペリリピンアンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドで、好ましくは６〜約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、ペリリピンアンチセンス核酸は、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。ペリリピンアンチセンス核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのキメラ混合物または誘導体もしくは改変体でもよく、また一本鎖でも二本鎖でもよい。ペリリピンアンチセンス核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改変することができる。ペリリピンアンチセンス核酸は以下のような他の付属基を含んでいてもよい：ペプチド；細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２ ；ＰＣＴ公開番号 ＷＯ ８８／０９８１０， １９８８年１２月１５日公開、参照）または血液−脳関門（例えばＰＣＴ公開番号 ＷＯ ８９／１０１３４， １９８８年４月２５日公開、参照）を通過する輸送を促進する薬剤；およびハイブリダイゼーションが引き金となる開裂剤（例えばＫｒｏｌら、１９８８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６参照）またはインターカレート剤（例えばＺｏｎ， １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．５：５３９−５４９参照）。
【００９８】
本発明の好ましい態様において、ペリリピンアンチセンス核酸は一本鎖ＤＮＡである。そのオリゴヌクレオチドは構造上の任意の位置で当分野で一般に知られた置換基により改変されていてもよい。
【００９９】
ペリリピンアンチセンス核酸は以下の改変された塩基成分を１個以上含んでいてもよい：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリン、およびその他の塩基類似体。
【０１００】
別の実施形態において、ペリリピンアンチセンス核酸は改変された糖成分、例えば以下の糖成分を１個以上含んでいてもよい：アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシリロース、およびヘキソース。
【０１０１】
別の実施形態において、ペリリピンアンチセンス核酸は以下の改変されたリン酸骨格を１個以上含んでいてもよい：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ホルムアセタール、またはホルムアセタールの類似体。
【０１０２】
さらに別の実施形態において、ペリリピンアンチセンス核酸はαアノマーオリゴヌクレオチドである。αアノマーオリゴヌクレオチドは相補的ＲＮＡと特定の二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは通常のβユニットとは異なって、鎖が互いに平行になっている（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。
【０１０３】
ペリリピンアンチセンス核酸は別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションが引き金となる架橋剤、輸送剤またはハイブリダイゼーションが引き金となる開裂剤にコンジュゲートさせてもよい。
【０１０４】
ペリリピンアンチセンス核酸などの本発明の核酸を、当分野で公知の標準的方法、例えば自動ＤＮＡ合成装置（例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、その他から購入して利用し得るものなど）の使用によって、合成してもよい。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをＳｔｅｉｎらの方法（１９８８， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）によって合成することができ、またメチルホスホネートオリゴヌクレオチドを制御された微細孔性ガラスポリマー支持体の使用（Ｓａｒｉｎら、１９８８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７４４８−７４５１）によって調製することができる。
【０１０５】
特定の実施形態において、ペリリピンアンチセンス核酸を、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびリン酸カルシウム沈降などの当業者に知られた技法を使用して、細胞に直接投与することができる。別の特定の実施形態においては、本発明のペリリピンアンチセンス核酸を外因性配列からの転写によって細胞内で産生させる。例えば、ベクターが細胞に取り込まれるようにこれをｉｎ ｖｉｖｏで導入し、その細胞内でベクターもしくはその一部が転写されて、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生するようにする。こうしたベクターにペリリピンアンチセンス核酸をコードする配列を含ませるようにする。こうしたベクターは転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができるならば、エピソームのままでいても、染色体に組み込まれてもよい（すなわち染色体の一部になる）。前記ベクターは当分野で標準的な組換えＤＮＡ技術によって構築することができる。ベクターはプラスミド、ウイルス、または哺乳動物細胞中での複製および発現に使用されるその他のものでもよい。ペリリピンアンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞中で作動することが当分野で知られているどのようなプロモーターによる発現でもよい。こうしたプロモーターは誘導性、構成性、または組織特異性のものとすることができる。
【０１０６】
ペリリピンアンチセンスの発現を調節するために使用することができるプロモーターの例として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター、例えばβラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２：７４−９４中の「組換え細菌からの有用なタンパク質」も参照されたい；ノパリンシンセターゼプロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９−２１３）もしくはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９８１， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：２８７１）を含む植物発現ベクター、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１１５−１２０）；Ｇａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母またはその他の真菌類からのプロモーターエレメント。さらに以下のような組織特異性を持ち、トランスジェニック動物において利用されてきた動物転写制御領域が含まれる：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら 、１９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）； リンパ系細胞中で活性なイムノグロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞中で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）；肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓中で活性なαフェトプロテイン遺��子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓中で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄細胞中で活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳内の希突起グリア細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）；および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。特定の実施形態において、ペリリピンアンチセンス発現はステロイド形成細胞もしくは脂肪細胞中で活性であるか主として活性である調節エレメント（例えばレプチンプロモーター）によって調節される。
【０１０７】
本発明のペリリピンアンチセンス核酸は、ペリリピンをコードする遺伝子、好ましくはペリリピンをコードするヒト遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対的な相補性は好ましいことではあるが、必ずしも必要ではない。本明細書で用いる「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ストリンジェント条件下でそのＲＮＡとハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することが可能になる十分な相補性を持つ配列を意味する。二本鎖ペリリピンアンチセンス核酸の場合は、したがって二本鎖ＤＮＡの一本鎖を試験するか、または三本鎖の形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は相補性の程度とアンチセンス核酸の長さの両方によって決まる。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ペリリピンをコードするＲＮＡとの塩基ミスマッチを多く含んでも、なお安定な二本鎖（または場合によって三本鎖）を形成する。当業者はハイブリダイズした複合体の融点を測定する標準的操作法を使用することによって、ミスマッチの容認できる程度を確認することができる。
【０１０８】
本発明は、有効量の本発明のペリリピンアンチセンス核酸と以下に記載するような製薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、１以上のペリリピンアンチセンス核酸を含む医薬組成物をリポソーム、ミクロ粒子またはマイクロカプセルによって投与する。本発明の各種の実施形態において、こうした組成物を使用して、ペリリピンアンチセンス核酸の持続放出を達成することができる。
【０１０９】
別の実施形態において本発明は、本発明のペリリピンアンチセンス核酸を含む組成物の有効量を細胞に供給することを含む、真核細胞（例えばステロイド形成細胞もしくは脂肪細胞）中でのペリリピン核酸配列の発現を抑制するための方法を提供する。
【０１１０】
ペリリピンアンチセンス核酸を使用して、脂質代謝障害、体重障害（例えば肥満）および糖尿病などの異常なペリリピン発現に特徴がある疾患および障害を予防または治療することができる。さらに、ペリリピンアンチセンス核酸を使用して、脂質代謝および筋量を高めることができる。好ましい実施形態においては、一本鎖ＤＮＡアンチセンスペリリピンオリゴヌクレオチドを使用する。
【０１１１】
有効量の１以上のペリリピンアンチセンス核酸を製薬上許容される担体中に含む本発明の医薬組成物を、脂質代謝障害および肥満などの体重障害があるか、その素質があるとされた被験者に投与することができる。有効量の１以上のペリリピンアンチセンス核酸を製薬上許容される担体中に含む本発明の医薬組成物を、糖尿病（例えば真性糖尿病）であるか、その素質があるとされた被験者に投与することができる。有効量の１以上のペリリピンアンチセンス核酸を製薬上許容される担体中に含む本発明の医薬組成物を、脂質蓄積に特徴がある障害を持つか、その素質があるとされた被験者に投与することができる。肥満もしくは糖尿病の治療または予防に有効と見られる１以上のペリリピンアンチセンス核酸の量は、標準的臨床技術によって決定することができる。
【０１１２】
５．２．１．２．　抑制性リボザイムおよび三本鎖ヘリックス手法
別の実施形態において、ペリリピンをコードする遺伝子配列を、周知の遺伝子「ノックアウト」法、リボザイム法または三本鎖ヘリックス法と共に使用して、ペリリピンの遺伝子発現を減少させることにより、ペリリピンの活性レベルを低下させて、肥満、脂質代謝障害もしくは脂質蓄積に特徴がある障害または糖尿病を予防または治療し、かつ／あるいは脂質代謝および筋量を高めることができる。この手法において、リボザイムもしくは三本鎖ヘリックス分子を使用してペリリピンをコードする遺伝子の活性、発現または合成をモジュレートし、それによって肥満、脂質代謝障害もしくは脂質蓄積に特徴がある障害または糖尿病を予防または治療し、かつ／あるいは脂質代謝および筋量を高める。突然変異型もしくは非突然変異型の標的遺伝子の発現を低下させるか抑制するように、こうした分子を設計することが可能である。かかる分子の製造および使用技術は当業者に周知である。
【０１１３】
ペリリピンアイソフォームをコードする遺伝子ｍＲＮＡの転写物を触媒的に切断するように設計したリボザイムを使用して、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を妨害し、したがってその遺伝子産物の発現を妨害することができる（例えばＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日公開；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５、参照）。
【０１１４】
リボザイムはＲＮＡの特定の切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である（総説について、Ｒｏｓｓｉ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４， ４６９−４７１、参照）。リボザイム作用の機序にはリボザイム分子の相補的標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のヌクレオチド内での切断が含まれる。リボザイム分子の組成には標的遺伝子ｍＲＮＡ（すなわち１以上のペリリピンアイソフォーム）に相補的な１以上の配列が含まれていなければならず、またｍＲＮＡ切断に関与する周知の触媒性配列が含まれていなければならない。この配列については、例えば米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい（この全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１１５】
ペリリピンをコードするｍＲＮＡを破壊するためには、部位特異的認識配列の位置でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって指令される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、ｍＲＮＡが以下の２個の塩基の配列：５’−ＵＧ−３’を持つことである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および製造は当分野で周知であり、Ｍｙｅｒｓ， １９９５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（特に図４、８３３ページ参照）およびＨａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４， ５８５−５９１、にさらに詳しく記載されている（これらの全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１１６】
好ましくは、リボザイムを操作して、切断認識部位をペリリピンアイソフォームをコードするｍＲＮＡの５’末端の近くに位置させることによって、効率を増大させ、また非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最少にする。
【０１１７】
本発明のリボザイムとしては、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同研究者によって詳細に記載されている、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ中に存在するもの（ＩＶＳもしくはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られている）などのＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後「Ｃｅｃｈ型リボザイム」という）も含まれる（Ｚａｕｇら、１９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４， ５７４−５７８ ；Ｚａｕｇ ａｎｄ Ｃｅｃｈ， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３１， ４７０−４７５；Ｚａｕｇら、１９８６， Ｎａｔｕｒｅ， ３２４， ４２９−４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による公開された国際特許出願番号 ＷＯ ８８／０４３００；およびＢｅｅｎ ａｎｄ Ｃｅｃｈ， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４７， ２０７−２１６）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対の活性部位を持ち、その先での標的ＲＮＡの切断が発生する。本発明はペリリピンをコードする遺伝子中に存在する８塩基対の活性部位配列を標的とする、これらのＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【０１１８】
アンチセンス手法と同様に、リボザイムも（例えば安定性、ターゲッティングなどの改善のために）改変オリゴヌクレオチドを含むことができ、ｉｎ ｖｉｖｏでペリリピンを発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達方法としては、強力な構成性ｐｏｌ ＩＩＩもしくはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下にリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用する方法があり、結果的に、トランスフェクトされた細胞は十分量のリボザイムを産生してペリリピンをコードする内因性ｍＲＮＡを破壊し、また翻訳を抑制する。リボザイムはアチセンス分子とは違って触媒性であるので、効力のために必要な細胞内濃度は比較的低くてよい。
【０１１９】
内因性ペリリピン発現は、標的相同組換えを使用してペリリピンをコードする遺伝子またはそうした遺伝子のプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって、低下させることもできる（例えばＳｍｉｔｈｉｅｓら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９， Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８参照、これらの全部を参照により本明細書に組み入れる）。例えば、内因性遺伝子（ペリリピンをコードする遺伝子のコード領域もしくは調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡによって挟まれた非機能性ペリリピンをコードする突然変異遺伝子（または完全に無関係なＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／または陰性選択マーカーとともに、あるいはこれを含まずに使用して、標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞にトランスフェクトする。標的相同組換えによるＤＮＡ構築物の挿入の結果、標的遺伝子が不活性化される。こうした手法は、農産物分野で特に適しており、かかる分野では、ＥＳ（胚性幹）細胞の改変を使用して不活性な標的遺伝子を持つ動物子孫を作出している（例えばＴｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８７、およびＴｈｏｍｐｓｏｎ， １９８９、前掲参照）。しかし、適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物をｉｎ ｖｉｖｏで必要な部位に直接投与するか、その部位をターゲッティングするならば、この手法をヒトに応用することも可能である。
【０１２０】
あるいは、ペリリピンをコードする遺伝子の内因性発現を、その遺伝子の調節領域（すなわち遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲッティングして、体内の標的細胞中でのペリリピンをコードする遺伝子の転写を妨害する三本鎖ヘリックス構造を形成させることによって、低下させることができる（一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ， １９９１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６（６）， ５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２， Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ６６０， ２７−３６；およびＭａｈｅｒ， １９９２， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）， ８０７−８１５を参照されたい）。
【０１２１】
転写の抑制のための三本鎖ヘリックス形成において使用する核酸分子は一本鎖であって、デオキシヌクレオチドで構成されているべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成則によって三本鎖ヘリックスの形成を促進するように設計しなければならない。これは一般的に、二本鎖の一方の鎖上に手ごろな大きさのプリンまたはピリミジンのストレッチが存在することを必要とする。ヌクレオチド配列はピリミジンを基礎とするものでもよく、これは結果的に、生成する三本鎖ヘリックスの３本の会合した鎖間にＴＡＴおよびＣＧＣ＋のトリプレットをもたらす。ピリミジンに富む分子は、二本鎖の一方の鎖のプリンに富む領域に対する塩基相補性をこの鎖と平行な方向に提供する。さらに、プリンに富む（例えばＧ残基のストレッチを含む）核酸分子を選択することができる。これらの分子は、ＧＣ対に富むＤＮＡ二本鎖（ここではプリン残基の大部分が標的二本鎖の一方の鎖に位置する）と三本鎖ヘリックスを形成し、その結果三本鎖の３本の鎖間にＧＧＣトリプレットが生成する。
【０１２２】
あるいはまた、三本鎖ヘリックスの形成のための標的となる可能がある配列を、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって、増加させることができる。スイッチバック分子は、交互に５’−３’，３’−５’様式で合成され、その結果、それらは初めに二本鎖の一方の鎖と塩基対合し、次に他方と塩基対合するようになり、二本鎖の一方の鎖に手ごろな大きさのプリンもしくはピリミジンのストレッチを存在させる必要がなくなる。
【０１２３】
本明細書に記載したアンチセンス、リボザイムもしくは三本鎖ヘリックス分子を利用して突然変異遺伝子の発現を抑制する事例では、その技術はペリリピンの正常な対立遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの転写（三本鎖ヘリックス）もしくは翻訳（アンチセンス、リボザイム）を非常に効果的に低下または抑制するので、存在するペリリピンの濃度が正常な表現型に必要とされる量よりも低くなると考えられる。このような場合、ペリリピンをコードする遺伝子の活性レベルが実質的に正常に維持されることを確実にするため、遺伝子治療を使用して、正常な遺伝子活性を示すペリリピンをコードしかつ発現させる核酸配列（しかし、どのようなアンチセンス、リボザイムもしくは三本鎖ヘリックス治療が利用されていても、それらに影響を受けやすい配列を含まない核酸分子）を細胞中に導入することができる。ペリリピンをコードする核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（例えばヒトペリリピンをコードする核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ００５２９３参照）もしくは類似のデータベースから、刊行物から、または慣用のクローニングおよび配列決定によって、取得することができる。あるいは、遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合には、必要なレベルのペリリピン活性を維持するために、正常なペリリピンを同時投与することができる。
【０１２４】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、ならびに三本鎖ヘリックス分子は、上述のようなＤＮＡおよびＲＮＡの合成について当分野で知られている任意の方法で調製することができる。これらとして、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成などの、当分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドの化学合成のための技術が含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子を、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写によって、作製することができる。こうしたＤＮＡ配列を、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多岐にわたるベクター中に組み込むことができる。あるいは、使用するプロモーターに応じて、アンチセンスＲＮＡを構成的にもしくは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞系中に安定して導入することができる。
【０１２５】
５．３．　ペリリピンのアゴニスト
上記第５．１節のアッセイによって同定した、ペリリピンの発現および／または活性を増大させることによってペリリピンにアゴナイズする化合物（すなわち１種以上のペリリピンアイソフォーム）を、本発明にしたがって使用して、体重減少に特徴がある障害（例えば悪液質および食欲不振）に関係する１種以上の徴候もしくは症状を予防、治療または改善することができる。さらに、ペリリピンのアゴニストを使用して体重増加のための脂質蓄積を高めることができる。上記第５．１節で考察したように、こうした化合物として限定するわけではないが、核酸、タンパク質、ペプチド、ホスホペプチド、小分子、または抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラもしくは一本鎖抗体、さらにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、ならびにそれらのエピトープ結合性フラグメントを含む）が含まれる。
【０１２６】
特定の１実施形態において、１種以上のペリリピンアイソフォームもしくはその機能性断片を、例えばｉｎ ｖｉｖｏでペリリピンの機能を模倣することによって、ペリリピンの活性をｉｎ ｖｉｖｏで増加させるのに十分な用量を、動物に投与する。別の特定の実施形態において、ペリリピンアイソフォームもしくはその機能性断片の類似体または誘導体を、例えばｉｎ ｖｉｖｏでペリリピンの機能を模倣することによって、ペリリピンの活性をｉｎ ｖｉｖｏで増加させるのに十分な用量を、動物に投与する。別の実施形態において、ペリリピンアイソフォーム、ペリリピンアイソフォームの機能性断片、またはそれらの類似体もしくは誘導体を含む融合タンパク質を、例えばｉｎ ｖｉｖｏでペリリピンの機能を模倣することによって、ペリリピンの活性をｉｎ ｖｉｖｏで増加させるのに十分な用量を、動物に投与する。
【０１２７】
こうした方法において使用することができるタンパク質およびペプチドとしては、天然に存在するタンパク質およびペプチドと同様に、合成（例えば組換えまたは化学合成された）タンパク質およびペプチドが含まれる。このタンパク質およびペプチドは天然に存在するおよび／または天然に存在しないアミノ酸残基（例えばＤ−アミノ酸残基）、ならびに／あるいは１種以上の非ペプチド結合（例えばイミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジドおよびアゾ結合）を持っていてもよい。このタンパク質またはペプチドはアミノおよび／またはカルボキシ末端に、例えばそのペプチドの安定性、バイオアベイラビリティーおよび／または抑制活性が増強されるように存在する、その他の化学基（例えば機能性基）をも含んでいてもよい。代表的な機能性基として、疎水性基（例えばカルボベンゾキシル、ダンシル、およびｔ−ブチルオキシカルボニル基）、アセチル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基、ならびに巨大分子キャリアー基（例えば脂質−脂肪酸コンジュゲート、ポリエチレングリコールもしくは炭水化物）が含まれ、ペプチド基も含まれる。１実施形態において、こうした方法に使用するタンパク質およびペプチドはコードされたタンパク質もしくはペプチド中に１種以上のアミノ酸の置換、付加または欠失が導入されている。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ仲介突然変異誘発などの標準的技法によって、突然変異を導入することができる。好ましくは、１以上の予測される非必須アミノ酸残基の位置に保存的アミノ酸置換を実施する。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を持つアミノ酸残基で入れ替えるものである。あるいは、飽和突然変異誘発などによってコード配列の全体または一部に無作為に突然変異を導入し、生成した突然変異体をその生物学的活性についてスクリーニングし、活性を保持するかこれに拮抗する突然変異体を同定することが可能である。突然変異誘発後、コードされたタンパク質を組換え発現させて、そのタンパク質の活性を判定することができる。
【０１２８】
投与すべき化合物がペプチド化合物の場合には、そのペプチド化合物をコードするＤＮＡ配列を直接動物に投与することができる。化合物の細胞内投与（例えばリポソーム投与など）を実施する、以下に考察する技法のいずれも、こうしたＤＮＡ分子の投与に利用することができる。ＤＮＡ分子は例えば周知の組換え技法などによって産生させることができる。
【０１２９】
異常なペリリピン遺伝子が障害に関与する場合には、その動物を遺伝子置換療法によって治療することができる。正常なペリリピン遺伝子、または正常なペリリピン遺伝子機能を持つ正常なペリリピンの産生へと導く該遺伝子の一部を１コピー数以上で細胞内に挿入することができる。特定の実施形態では、核酸配列を直接ｉｎ ｖｉｖｏ投与し、それを発現させてコード化産物を産生させるようにする。これは当分野で公知の多数の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、適切な核酸発現ベクターの一部としてこれらを構築し、欠損レトロウイルスもしくは弱毒化レトロウイルスまたはその他のウイルスベクターを使用する感染などによって、それらが細胞内に入るように投与する（米国特許第４，９８０，２８６号参照）；ネイキッドＤＮＡを直接注入する；ミクロ粒子ボンバードメント（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ， Ｄｕｐｏｎｔ）、脂質もしくは細胞表面受容体によるコーティング、トランスフェクト剤、またはリポソーム、ミクロ粒子もしくはマイクロカプセル内への封入を使用する；あるいは核内に侵入することが知られているペプチドに連鎖させて、または受容体介在エンドサイトーシスを受けるリガンドに連鎖させて投与する（例えばＷｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９８７， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２参照 ）（これはその受容体を特異的に発現する細胞型をターゲッティングするために使用することができる）；その他がある。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体を形成させるが、その場合リガンドはエンドソームを分解するための融合性ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避できるようにする。さらに別の実施形態では、特定の受容体をターゲッティングすることによって、細胞特異的な取込みおよび発現のために核酸をｉｎ ｖｉｖｏで標的化することができる（例えばＰＣＴ公開 ＷＯ ９２／０６１８０（１９９２年４月１６日発行）（Ｗｕら）；ＷＯ ９２／２２６３５（１９９２年１２月２３日発行）（Ｗｉｌｓｏｎら）；ＷＯ ９２／２０３１６（１９９２年１１月２６日発行）（Ｆｉｎｄｅｉｓら）；ＷＯ ９３／１４１８８（１９９３年７月２２日発行）（Ｃｌａｒｋｅら）；ＷＯ ９３／２０２２１（１９９３年１０月１４日発行）（Ｙｏｕｎｇ）参照）。あるいは、核酸を細胞内に導入して、相同組換えによって宿主細胞ＤＮＡ内に組み込んで、発現させることができる（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， １９８９， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。
【０１３０】
一つの実施形態において、ペリリピンＡ、ペリリピンＢ、ペリリピンＣ、またはこれらの任意の組合せをコードする核酸を含有するウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる。遺伝子治療に使用するペリリピンをコードする核酸を、患者への遺伝子の送達に役立つ１種以上のベクター中にクローン化する。レトロウイルスベクターについてさらに詳細がＢｏｅｓｅｎら、１９９４， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２から知ることができるが、ここには幹細胞を化学療法に対してより耐性にする目的で、造血幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスの使用を説明するその他の参照文献として以下のものがある：Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍら、１９９４， Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ， １９９３， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ， １９９３， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． ３：１１０−１１４。
【０１３１】
レンチウイルスも遺伝子治療に使用することができる。遺伝子治療におけるレンチウイルスの使用についての詳細を例えば以下の文献から知ることができる：Ｅｖａｎｓら、１９９９， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１４７９−１４８９；Ｈａｎら、１９９９， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１８６７−１８７３；およびＺｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８７１−８７５。
【０１３２】
アデノウイルスは遺伝子治療において使用することができる別のウイルスベクターである。アデノウイルスは遺伝子を呼吸器上皮に送達するための特に魅力的な運搬体である。アデノウイルスは自然に呼吸器上皮に感染し、そこで軽度の疾病の原因となる。アデノウイルス系の送達システムのためのその他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスには非分裂細胞に感染する能力があるという利点がある。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ， １９９３， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３には、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説が提示されている。Ｂｏｕｔら、１９９４， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０では、赤毛サルの呼吸器上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用が実証されている。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用のその他の例を以下の文献から知ることができる：Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２， Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４；ＰＣＴ公開 ＷＯ ９４／１２６４９；Ｗａｎｇら、１９９５， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３；Ｃｈａｎ， １９９５， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．６：３３５−３４０；およびＯｋａら、２０００， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１１：１７９−１８６。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターを使用して１以上のペリリピンアイソフォームまたはそれらの断片を発現させる。
【０１３３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた遺伝子治療での使用が提案された（Ｗａｌｓｈら、１９９３， Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ． ２０４：２８９−３００；および米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０１３４】
遺伝子治療のための別の手法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在トランスフェクションまたはウイルス感染などの方法による組織培養中の細胞への遺伝子の導入が含まれる。通常、導入の方法には、選択マーカーの細胞への導入が伴う。次に導入した遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離するために、細胞を選別にかける。これらの細胞をその後患者に送達する。
【０１３５】
この実施形態においては、核酸を細胞中に導入してから、得られる組換え細胞をｉｎ ｖｉｖｏ投与する。こうした導入は、当分野で知られたどのような方法によっても実施することができる。限定するわけではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスもしくはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体介在遺伝子導入、マイクロセル介在遺伝子導入、スフェロプラスト融合その他がある。外来遺伝子の細胞内への導入のための多数の技法が当分野で知られており（例えばＬｏｅｆｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｅｈｒ， １９９３， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎら、１９９３， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；およびＣｌｉｎｅ， １９８５， Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２参照）、レシピエント細胞の不可欠な発生および生理的機能が破壊されないことを条件として、本発明にしたがって使用することができる。その技法は細胞への核酸の安定した導入を提供すべきであり、その結果、核酸がその細胞によって発現されて、好ましくはその後代細胞に受け継がれて発現され得るようにする。
【０１３６】
得られた組換え細胞は当分野で公知の多様な方法によって患者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば造血幹もしくは前駆細胞）を静脈投与するのが好ましい。使用のために意図される細胞の量は、目的とする効果、患者の容態などによって左右され、当業者が決定することができる。
【０１３７】
遺伝子治療の目的で核酸を導入することができる細胞はあらゆる所望の利用可能な細胞型を包含し、限定するわけではないが以下のものが含まれる；ステロイド形成細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン細胞、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、および顆粒球などの血液細胞；ならびに各種の幹もしくは前駆細胞、特に造血幹もしくは前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓その他から取得されるもの。好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用する細胞は脂肪細胞またはステロイド形成細胞である。別の好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用する細胞は患者に対して自己由来のものである。
【０１３８】
遺伝子治療に組換え細胞を使用する場合の一つの実施形態においては、ペリリピンをコードする核酸配列を、細胞もしくはその子孫によって発現され得るように細胞中に導入し、その後この組換え細胞を治療効果があるようにｉｎ ｖｉｖｏ投与する。特定の実施形態では、幹または前駆細胞を使用する。単離可能で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持することができる幹および／または前駆細胞ならばいずれも、本発明のこの実施形態にしたがって使用できる可能性がある（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ ９４／０８５９８（１９９４年４月２８日発行）；Ｓｔｅｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９２， Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ， １９８０， Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９；およびＰｉｔｔｅｌｋｏｗ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ， １９８６， Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１参照）。
【０１３９】
ある実施形態においては、遺伝子治療の目的で導入される核酸が、ペリリピンのコード領域に機能し得るように連結された構成性プロモーターを含み、核酸の発現が構成的となるようにする。別の実施形態においては、遺伝子治療の目的で導入される核酸が、ペリリピンのコード領域に機能し得るように連結された誘導性プロモーターを含み、適切な転写インデューサーの存在もしくは不在を制御することによって、核酸の発現が制御され得るようにする。本明細書に記載したまたは当業者に知られた構成性もしくは誘導性プロモーターの例を使用して、遺伝子治療を目的として、ペリリピンもしくはその断片またはペリリピン融合タンパク質をコードする核酸分子の発現を調節することができる。
【０１４０】
５．４．　ペリリピンのアンタゴニストまたはアゴニスト
以下に記載するのは、それらを利用する特定の適用例に応じて、１種以上のペリリピンアイソフォームのアンタゴニストもしくはアゴニストのいずれかとして機能することができる化合物である。
【０１４１】
具体的な実施形態において、ペリリピンのアンタゴニストもしくはアゴニストとして機能する化合物は、ペリリピンＡ、ペリリピンＢ、ペリリピンＣもしくはそれらのいずれかの組合せと特異的に結合し（すなわち、当業者が周知のイムノアッセイで判定して、ほとんどもしくは全く交差反応性を示さずに関連抗原と結合し）、かつ／またはこれらを認識するものである。別の実施形態において、ペリリピンのアンタゴニストもしくはアゴニストとして機能する化合物は、ペリリピンＡ、ペリリピンＢ、ペリリピンＣもしくはそれらのいずれかの組合せの発現および／または活性を特異的にモジュレートするものである。
【０１４２】
５．４．１．　抗体
アンタゴニストもしくはアゴニストとして機能する抗体を利用して、体重に関係する障害（例えば肥満）、脂質代謝障害（例えば脂肪異栄養症）、脂質蓄積に特徴がある障害（例えばアテローム性動脈硬化症）または糖尿病に関係する徴候または症状の１つ以上を予防、治療または改善することができる。特定の抗体に応じて、その抗体がアンタゴニストもしくはアゴニストとして機能することができる。
【０１４３】
１以上のペリリピンアイソフォームのアンタゴニストとして機能する抗体とは、１以上のペリリピンアイソフォームと特異的に結合して、その作用を妨害する抗体である。例えば、こうした抗体の１つとして、ペリリピンアイソフォームを活性化しないで、そのペリリピンアイソフォームが天然のリガンドに結合する能力を破壊する様式で、ペリリピンアイソフォームと特異的に結合することが可能である。こうした抗体として、限定するわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、ヒト、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、キメラ抗体などが含まれる。
【０１４４】
１以上のペリリピンアイソフォームのアゴニストとして機能する抗体とは、ペリリピンと特異的に結合し、そして結合することによって、１以上のペリリピンアイソフォームの機能を直接または間接的に活性化するように作用する抗体である。例えば、こうした抗体の１つは、あたかも内因性リガンドの１つが結合していて、それによって例えばシグナル伝達経路の１つを活性化しているかのように、ペリリピンアイソフォームが機能する原因となる様式で、ペリリピンアイソフォームと結合することができる。こうした抗体として、限定するわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、ヒト、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体、キメラ抗体などが含まれる。
【０１４５】
１実施形態において、ペリリピンのアンタゴニストもしくはアゴニストとして使用する抗体はペリリピンＡ、ペリリピンＢ、ペリリピンＣもしくはそれらのいずれかの組合せを特異的に認識し、かつ／またはこれと結合する。抗体のフラグメントを使用する場合は、ペリリピンと結合する最小の阻害性フラグメントが好適である。例えば、ペリリピンと結合する抗体の可変領域のドメインに相当するアミノ酸配列を持つペプチドを使用することができる。こうしたペプチドは当分野で周知の方法を使用して、化学的に合成するか、または組換えＤＮＡ技法によって製造することができる（例えば Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３、前掲；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前掲、参照）。あるいは、中和抗体などの、細胞内エピトープと結合する一本鎖抗体を投与することもできる。こうした一本鎖抗体は、例えばＭａｒａｓｃｏらによって記載されている技法（Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．ら、１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：７８８９−７８９３）を利用することによって、例えば一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を標的細胞集団内で発現させることによって、投与することができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、１以上のペリリピンアイソフォームもしくはその断片と特異的に結合する市販の任意の抗体を本発明にしたがって使用することができる。ペリリピンと特異的に結合する抗体の１例は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｆｌａｎｄｅｒｓ， ＮＪ）から市販されているポリクローナルモルモット抗ペリリピン抗体である。別のいくつかの実施形態では、１以上のペリリピンアイソフォームもしくはその断片と特異的に結合する市販の抗体を本発明において使用しない。
【０１４７】
５．４．１．１．　抗体の製造
１以上のペリリピンアイソフォームもしくはその断片を免疫原として使用して、１以上のペリリピンアイソフォームと免疫特異的に結合する抗体を作製することできる。こうした免疫原は当分野で公知の好都合な手段のいずれによっても単離することができる。本発明の抗体として、限定するわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれる。本明細書で使用する用語「抗体」は、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原の１つと特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子をさす。イムノグロブリン分子はイムノグロブリン分子の任意のクラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）またはサブクラスのものであってよい。
【０１４８】
抗ペリリピン抗体には、改変されている（すなわち任意のタイプの分子が共有結合している）類似体および誘導体が含まれるが、ただし、かかる共有結合は免疫特異的結合を損なわないことを条件とする。例えば、限定するわけではないが、抗体の誘導体および類似体には、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮蔽基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドもしくはその他のタンパク質への連結などによってさらに改変されているものが含まれる。多数の化学的改変のどれも公知の技法によって実施することができる。限定するわけではないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化などが含まれる。さらに、上記類似体もしくは誘導体は１個以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。
【０１４９】
抗体の製造においては、所望の抗体のスクリーニングを当分野で知られた技法、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）によって達成することができる。例えば、ペリリピンの特定の領域を認識する抗体を選択するために、こうしたドメインを含有するペリリピン断片と結合する産物について、生成したハイブリドーマをアッセイすればよい。例えばペリリピンＡには特異的に結合するが、ペリリピンＢもしくはＣには特異的に結合しない（かまたは結合が弱い）抗体を選択するためには、ペリリピンＡへの陽性結合とペリリピンＢもしくはＣへの結合の欠如（または低結合）を基準にして選択することができる。こうして、本発明はペリリピンの別のアイソフォームに対するよりも特定のペリリピンアイソフォームの方に高い親和性（好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上の親和性）で結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を提供する。
【０１５０】
本発明の方法において使用することができるポリクローナル抗体は、免疫した動物の血清に由来する抗体分子の不均質な集団である。分画しない免疫血清も使用することができる。ペリリピンアイソフォームもしくはその断片に対するポリクローナル抗体の製造のために、当分野で知られた様々な手法を使用することができる。特定の実施形態において、ペリリピンアイソフォームのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体を取得することができる。例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の製造のために、天然のペリリピンアイソフォームもしくはその断片またはその合成（例えば組換え）変異体の注入によって、各種の宿主動物、限定するわけではないがウサギ、マウス、ラットその他など、を免疫することができる。宿主の種に応じて、免疫学的応答を増強するために、各種のアジュバントを使用することができる。これらとして限定するわけではないが、以下のものが含まれる：完全もしくは不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）もしくはコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などのアジュバント。その他のアジュバントも当分野で周知である。
【０１５１】
ペリリピンアイソフォームもしくはその断片に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の調製のためには、培養下での連続細胞系による抗体分子の産生をもたらすどのような技法を使用してもよい。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に開発されたハイブリドーマ技法（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）、ならびにトリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体の製造のためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、１９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６）がある。こうした抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含むどのようなイムノグロブリンのクラスおよびサブクラスのものであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。本発明の別の実施形態において、公知の技法（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５、参照により本明細書に組み入れる）を利用して無菌動物でモノクローナル抗体を生産することができる。
【０１５２】
モノクローナル抗体としては、限定するわけではないが、ヒトモノクローナル抗体およびキメラモノクローナル抗体（例えばヒト−マウスキメラ）が含まれる。キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種に由来している分子であって、ヒトイムノグロブリン不変領域とマウスｍＡｂに由来する可変領域を持つものなどである（例えばＣａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら、米国特許第４，８１６３９７号参照、これらを全体として参照により本明細書に組み入れる）。ヒト化抗体とは、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒトイムノグロブリン分子由来のフレームワーク領域とを持つ非ヒト種由来の抗体分子である（例えばＱｕｅｅｎ， 米国特許第５，５８５，０８９号参照、その全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１５３】
キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば以下に記載された方法を使用する、当分野で知られた組換えＤＮＡ技法によって製造することができる：ＰＣＴ公開 ＷＯ ８７／０２６７１；欧州特許出願 １８４，１８７：欧州特許出願 １７１，４９６；欧州特許出願 １７３，４９４；ＰＣＴ公開 ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願 １２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら、１９８７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら、１９８７， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら、１９８７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７， Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら、１９８８， Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら、１９８６， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら、１９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら、１９８８， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０。
【０１５４】
完全にヒトのものである抗体がヒト被験者の治療処置にとって特に望ましい。こうした抗体はトランスジェニックマウスを使用して製造することができる。かかるマウスは内因性イムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現する能力はないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができる。このトランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えばペリリピンアイソフォームの全部もしくは一部、を用いて普通の様式で免疫する。この抗原に対して特異的なモノクローナル抗体は常套的なハイブリドーマ技法を使用して取得することができる。トランスジェニックマウスが保有するヒトイムノグロブリンのトランスジーンはＢ細胞の分化中に再配列して、その後クラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。このように、こうした技法を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するためのこの技法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ（１９９５， Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体の製造のためのこの技法ならびにこれらの抗体の製造プロトコルの詳細な考察については、例えば以下を参照されたい；米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）などの会社が受注して、上記と同様の技法を使用して所定の抗原に対する特異的ヒト抗体を供給することができる。
【０１５５】
所定のエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導された選択」（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）と称される技法を使用して作製することができる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４） Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【０１５６】
抗ペリリピン抗体もまた、当分野で知られた各種のファージディスプレイ法を使用して作製することができる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが該ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保有しているファージ粒子の表面にディスプレイされる。特に、こうしたファージを利用して、レパートリーもしくはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトもしくはマウス）から発現された抗原結合ドメインをディスプレイさせることができる。対象の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば標識抗原または固相表面もしくはビーズに結合または捕捉させた抗原を使用して、選択または同定することができる。これらの方法で使用するファージは典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えで融合させたＦａｂ、Ｆｖもしくはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを持つファージから発現させたｆｄおよびＭ１３結合性ドメインを含む繊維状ファージである。本発明の抗体を製造するのに使用することができるファージディスプレイ法として以下に開示されたものが含まれる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開 ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２ ；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許番号 ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３；および５，９６９，１０８；これらのそれぞれを全体として参照により本明細書に組み入れる。
【０１５７】
上記の参照文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離して、ヒト抗体を含む完全抗体、またはその他の所望の抗原結合性フラグメントを作製するのに使用し、例えば以下に詳細に記載するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む所望の宿主中で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えにより製造するための技法も、以下に開示されているような当分野で公知の方法を使用することができる：ＰＣＴ公開 ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；Ｓａｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（これらの引用文献の全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１５８】
一本鎖Ｆｖおよび抗体を製造するために使用することができる技法の例として、以下に記載されているものが含まれる：米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；ならびにＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）。
【０１５９】
本発明はさらに二重特異性抗体の使用を提供する。これは当分野で知られた方法によって製造することができる。完全長二重特異性抗体の従来からの製造は、２つのイムノグロブリン重鎖−軽鎖対（この２つの鎖が別の特異性を持つ）の同時発現を基礎としている（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９）。イムノグロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ））は可能性として１０種の抗体分子の混合物を産生し、その中で１種のみが正しい二重特異性構造となる。正しい分子の精製（通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によって実施する）はかなり煩雑で、生産物の収量が低い。同様の操作法がＷＯ ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１， ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９に開示されている。
【０１６０】
別のさらに好ましい手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を持つ抗体の可変ドメインがイムノグロブリン不変ドメイン配列に融合される。この融合体は好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含むイムノグロブリン重鎖不変ドメインを持っている。軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖不変領域（ＣＨ１）を、融合体の少なくとも一方に存在させて持つものが好ましい。イムノグロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、および所望ならばイムノグロブリン軽鎖をコードするＤＮＡ、を別々の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主生物に同時トランスフェクトする。この方法は、構築に使用する３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適収率をもたらす実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相対的比率を調整する際に大いに融通のきく方法である。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖が等しい比率で発現する結果として高収率が得られる場合、または、その比率が特に重要でない場合には、３つのポリペプチド鎖のうち２つまたは全部のコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することも可能である。
【０１６１】
この手法の好ましい実施形態においては、二重特異性抗体は、一方のアームに第１結合特異性を持つハイブリッドイムノグロブリン重鎖を、そして他方のアームにハイブリッドイムノグロブリン重鎖−軽鎖対（第２結合特異性を提供する）を含む。この非対称構造は、不要なイムノグロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することがわかった。なぜならば、イムノグロブリン軽鎖が二重特異性分子の半分にのみ存在することにより、容易な分離法が可能になるからである。この手法はＷＯ ９４／０４６９０（１９９４年３月３日公開）に開示されている。二重特異性抗体の作製のためのこれ以上の詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９８６，１２１：２１０を参照されたい。
【０１６２】
本発明は抗ペリリピンイムノグロブリン分子の機能的に活性なフラグメント、誘導体もしくは類似体を提供する。「機能的に活性な」とは、フラグメント、誘導体もしくは類似体が、そのフラグメント、誘導体もしくは類似体が誘導される抗体によって認識されるものと同じ抗原を認識する抗−抗イディオタイプ抗体（すなわち三次抗体）を誘発する能力があることを意味している。具体的には、好ましい実施形態において、イムノグロブリン分子のイディオタイプの抗原性を、その抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列のＣ末端側にあるフレームワークおよびＣＤＲ配列を欠失させることによって増強する。どのＣＤＲ配列が抗原と結合するかを調べるために、当分野で公知の任意の結合アッセイ法において、そのＣＤＲ配列を含む合成ペプチドを使用することができる。
【０１６３】
本発明は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメントなどの抗体フラグメントを提供する。特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技法によって作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖不変領域および重鎖のＣＨ１ドメインで構成され、抗体分子のペプシン消化によって作製することができる。ＦａｂフラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製する。本発明は本発明の抗体の重鎖および軽鎖二量体、またはＦｖもしくは一本鎖抗体（ＳＣＡ）などのその任意の最小フラグメント（例えば以下に記載されている：米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ， １９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら、１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４）、あるいは本発明の抗体と同一の特異性を持つその他の任意の分子をも提供する。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋によって連結して一本鎖ポリペプチドとすることによって形成される。大腸菌中での機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技法を使用することができる（Ｓｋｅｒｒａら、１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１）。
【０１６４】
別の実施形態において、本発明は抗ペリリピン抗体（または機能的に活性なそのフラグメント）の融合タンパク質を提供する。例えば、この場合において、抗体が抗体ではない別のタンパク質（またはその部分、好ましくはそのタンパク質の少なくとも１０、２０もしくは５０アミノ酸部分）のアミノ酸配列にＮ末端もしくはＣ末端のいずれかで共有結合（例えばペプチド結合）によって融合している。好ましくは、イムノグロブリンまたはそのフラグメントを別のタンパク質に不変ドメインのＮ末端で共有結合させる。こうした融合タンパク質は精製を容易にするか、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させることができる。
【０１６５】
５．４．１．２．　抗体の発現
抗ペリリピン抗体は抗体合成のための当技術分野で知られたいずれの方法によっても、特に化学的合成または組換え発現によって生産することができ、組換え発現技法によって生産するのが好ましい。
【０１６６】
抗体またはそのフラグメント、誘導体もしくは類似体の組換え発現には、その抗体をコードする核酸の構築が必要である。その抗体のヌクレオチド配列が既知の場合、（例えばＫｕｔｍｅｉｅｒら、１９９４， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２に記載されているように）化学的に合成したオリゴヌクレオチドからその抗体をコードする核酸を組み立てることができる。簡単に言えば、これにはＰＣＲによる、抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびにその後の連結したオリゴヌクレオチドの増幅が含まれる。
【０１６７】
あるいは、抗体をコードする核酸を、その抗体をクローニングすることによって取得することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手可能ではなくても、その抗体分子の配列が既知ならば、その抗体をコードする核酸を、好適な供給源（例えば抗体ｃＤＮＡライブラリー、またはその抗体を発現する組織もしくは細胞のいずれかから作製したｃＤＮＡライブラリー）から、その配列の３’および５’末端にハイブリダイズし得る合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によるか、その特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって、取得することができる。
【０１６８】
特定のペリリピンアイソフォームを特異的に認識する抗体分子（またはこうした抗体をコードする核酸をクローニングするためのｃＤＮＡライブラリーの供給源）が入手できない場合は、特定のペリリピンアイソフォームに特異的な抗体を、当技術分野で公知のいずれかの方法、例えばポリクローナル抗体を作製するようにウサギなどの動物を免疫するか、さらに好ましくはモノクローナル抗体を作製することによって、作製することができる。あるいは、その抗体の少なくともＦａｂ部分をコードする１クローンを、（例えばＨｕｓｅら、１９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１に記載されるように）Ｆａｂ発現ライブラリーを特異的抗原に結合するＦａｂフラグメントのクローンについてスクリーニングするか、または抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、取得することができる（例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、１９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４；およびＨａｎｅら、１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７参照）。
【０１６９】
抗体分子の少なくとも可変ドメインをコードする核酸を取得した後、これをこの抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含有するベクター中に導入することができる（例えばＰＣＴ公開公報第ＷＯ ８６／０５８０７号；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ ８９／０１０３６号；および米国特許第５，１２２，４６４号参照）。この核酸と同時発現して完全抗体分子の発現が可能になる、完全軽鎖もしくは重鎖を含有するベクターも入手可能である。次に、この抗体をコードする核酸を使用して、スルフヒドリル基を含有しないアミノ酸残基との鎖内ジスルフィド結合に関与する可変領域の１個以上のシステイン残基を置換（または欠失）するのに必要なヌクレオチド置換または欠失を導入することができる。こうした改変は、１ヌクレオチド配列内の特定の突然変異もしくは欠失の導入のための、当技術分野で公知のいずれの方法によっても実施することができる。例えば限定するわけではないが、化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７８， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１）、ＰＣＴに基づく方法、その他がある。
【０１７０】
その上、適切な抗原特異性があるマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物学的活性があるヒト抗体分子の遺伝子とともにスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４）を使用することができる。上記文献に記載されているように、キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、マウスｍＡｂに由来する可変領域とヒト抗体定常領域を持つもの、例えばヒト化抗体などである。
【０１７１】
抗ペリリピン抗体分子をコードする核酸が得られた後、その抗体分子の生産のためのベクターを、当技術分野で周知の技法を使用する組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。こうして、抗体分子配列を含有する核酸を発現させることによる、本発明のタンパク質を調製する方法については、本明細書に記載する。当業者に周知の方法を使用して、抗体分子をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９９０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（編， １９９８， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ）に記載された技法を参照されたい。
【０１７２】
この発現ベクターを従来技法によって宿主細胞に導入し、次にトランスフェクトした細胞を従来技法によって培養し、本発明の抗体を生産する。
【０１７３】
本発明の組換え抗体を発現させるために使用する宿主細胞は細菌細胞のいずれか、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）など、または好ましくは特に組換え抗体分子全体の発現のためには真核細胞であってよい。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞とヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターとの組合せは抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８， Ｇｅｎｅ ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら、１９９０， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２）。
【０１７４】
抗ペリリピン抗体分子を発現させるため、多様な宿主−発現ベクター系を利用することができる。こうした宿主−発現系とは、目的のコード配列を生産した後精製することができるビヒクルの意味ばかりでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換もしくはトランスフェクトした時に本発明の抗体分子をｉｎ ｓｉｔｕ発現することができる細胞をも意味する。これらには、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：抗体をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；抗体をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；抗体をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させるか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有している哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。
【０１７５】
細菌系において、発現させる抗体分子の意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子を含む医薬組成物の作製用に、こうしたタンパク質を大量に生産したい場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルでの発現を指令するベクターが望ましくありうる。こうしたベクターには、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：大腸菌発現ベクター ｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３， ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１）、この場合、抗体をコードする配列をベクター中にｌａｃＺコード領域とともにインフレームで個々に連結することによって、融合タンパク質を産生させる；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ， １９８５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；およびＶａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， １９８９， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）；など。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用することができる。一般的に、こうした融合タンパク質は可溶性で、溶解させた細胞から、グルタチオン−アガロースビーズマトリックスに吸着および結合させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶離させることによって、容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンもしくは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含ませるように設計して、クローン化した標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されるようにすることができる。
【０１７６】
昆虫系においては、外来遺伝子を発現させるベクターとして、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用する。このウイルスはスポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。抗体をコードする配列をこのウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）内に個々にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスに基づく発現系（例えばアデノウイルス発現系）を利用することができる。
【０１７７】
上記考察のように、所望される特定の様式で、挿入された配列の発現をモジュレートするか、または遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）はタンパク質の機能にとって重要でありうる。
【０１７８】
組換え抗体の長期間の高収量での産生のためには、安定した発現が好ましい。例えば、目的の抗体を安定して発現する細胞系は、その抗体のヌクレオチド配列および選択マーカー（例えばネオマイシンもしくはハイグロマイシン）のヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、その選択マーカーの発現について選択することによって、生産することができる。このように遺伝子操作した細胞系は、その抗体分子と直接または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用でありうる。
【０１７９】
抗体分子の発現レベルはベクターの増幅によって増大させることができる（総説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，「ＤＮＡクローニングにおける哺乳動物細胞でのクローン化遺伝子の発現のための、遺伝子増幅に基づくベクターの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ）」，第３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）参照 ）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在するインヒビターのレベルが増加すればマーカー遺伝子のコピー数が増加することになろう。増幅された領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の産生も増加することになろう（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
【０１８０】
宿主細胞に本発明の２つの発現ベクター（第１ベクターが重鎖に由来するポリペプチドをコードし、第２ベクターが軽鎖に由来するポリペプチドをコードするもの）を同時トランスフェクトしてもよい。２つのベクターに同一の選択マーカーを含ませることによって、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現が可能になる。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用してもよい。こうした状況においては、過剰の毒性遊離重鎖を回避するために、軽鎖を重鎖の前に位置させなければならない（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２；およびＫｏｈｌｅｒ， １９８０， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７）。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからなっていてもよい。
【０１８１】
本発明の抗体分子を組換え発現させた後、抗体分子の精製について当技術分野で知られたいずれの方法によっても精製することができる。例えば、クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡもしくは特異的抗原などによるアフィニティクロマトグラフイー、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質精製のためのその他の任意の標準的技法などによる。
【０１８２】
あるいは、いずれの融合タンパク質も、発現している融合タンパク質に特異的な抗体を利用することによって、容易に精製することができる。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系によって、ヒト細胞系中で発現させた未変性融合タンパク質の即時精製が可能となる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミド内に、この遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基で構成されるアミノ末端タグに融合して翻訳されるように 、サブクローン化する。このタグは融合タンパク質のためのマトリックス結合ドメインとして作用する。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムにローディングし、イミダゾール含有バッファーによってヒスチジンタグ付けタンパク質を選択的に溶出させる。
【０１８３】
５．４．１．３．　コンジュゲート抗体
好ましい１実施形態において、抗ペリリピン抗体もしくはそのフラグメントを診断用または治療用部分とコンジュゲートする。抗体を診断用に、または所定の治療処方計画の効力の判定用に使用することができる。抗体と検出可能な物質をカップリングすることによって、検出を促進することができる。検出可能な物質の例には、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放射金属（陽電子放射断層撮影法用）、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。本発明にしたがって診断薬として使用するための抗体とコンジュゲートすることができる金属イオンについての全般について、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジンおよびビオチンが含まれ、好適な蛍光物質には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドおよびフィコエリトリンが含まれ、好適な発光物質には、ルミノールが含まれ、好適な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれ、そして好適な放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９Ｔｃが含まれる。
【０１８４】
抗ペリリピン抗体もしくはそのフラグメントを治療薬または薬物部分とコンジュゲートして、所定の生物学的応答を改変することができる。治療薬または薬物部分としては、伝統的な化学治療薬に限定することを想定するものではない。例えば、薬物部分は所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドでもよい。こうしたタンパク質には、例えば以下のものが含まれうる：アブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン、もしくはジフテリアトキシンなどのトキシン；腫瘍壊死因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓症薬、または抗血管形成薬、例えばアンギオスタチンもしくはエンドスタチン；あるいはリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）もしくはその他の成長因子などの生物学的応答改変剤。
【０１８５】
こうした治療用部分を抗体とコンジュゲートさせる技法は周知であり、例えば以下の文献を参照されたい：Ａｒｎｏｎら、「癌治療における薬物のイムノターゲティングのためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）， ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「薬物送達のための抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」， ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）， Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）， ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ， 「癌治療における細胞毒性薬剤の抗体担体：総説（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ）」， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）， ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「癌治療における放射性標識抗体の治療的使用の分析、結果および今後の展望（Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｂａｌｄｗｉｎら（編）， ｐｐ．３０３−１６ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）， およびＴｈｏｒｐｅら、「抗体−トキシンコンジュゲートの調製および細胞毒性特性（Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」， Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．， ６２：１１９−５８（１９８２）。
【０１８６】
あるいは、Ｓｅｇａｌによって米国特許第４，６７６，９８０号に記載されているように、抗体を第２の抗体にコンジュゲートさせて、抗体ヘテロコンジュゲートを形成させることができる。
【０１８７】
治療用部分とコンジュゲートするか、していない抗体を単独で、または細胞毒性因子および／もしくはサイトカインと併用して投与する、治療薬として使用することができる。
【０１８８】
５．５．　体重および／または脂質代謝の不適切な調節に関係する障害の治療方法
本発明は、１以上のペリリピンアイソフォームの発現および／または活性をモジュレートする１種以上の化合物を含む１以上の医薬組成物の投与による、肥満などの体重障害、不適切な脂質代謝に特徴がある障害（例えば脂肪異栄養症）、脂質蓄積に特徴がある障害（例えばアテローム性動脈硬化症）、および糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善を提供する。好ましい１実施形態において、肥満に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善のため、医薬組成物を被験者（すなわち動物）に投与する。別の好ましい実施形態において、糖尿病（例えば１または２型真性糖尿病）に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善のため、医薬組成物を被験者（すなわち動物）に投与する。これらの実施形態については、医薬組成物は１以上のペリリピンアイソフォームの活性および／または発現にアンタゴニストとして機能する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）１種以上の化合物、ならびに製薬上許容される担体を含む。
【０１８９】
別の好ましい実施形態において、悪液質、多食症および食欲不振などの体重減少に特徴がある障害に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善のため、医薬組成物を被験者（すなわち動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒト）に投与する。この実施形態については、医薬組成物は１以上のペリリピンアイソフォームの活性および／または発現にアゴニストとして機能する（ａｇｏｎｉｚｅ）１種以上の化合物、ならびに製薬上許容される担体を含む。
【０１９０】
特定の実施形態において、被験者に以下の量の本発明の組成物を投与する：脂質代謝を高めるのに有効な量；または筋量を増加させるのに有効な量；または体重を増加させる量；または体脂肪を低下させる量；またはインスリン分泌を増加させるのに有効な量；またはインスリン耐性を低下させるのに有効な量；またはグルコース不耐性を低下させるのに有効な量；または肥満、不適切な脂質代謝に特徴がある障害、脂質蓄積に特徴がある障害または糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善に有効な量。他の特定の実施形態において、被験者に以下の量の本発明の組成物を投与する：悪液質および食欲不振などの体重減少に特徴がある障害に関係する１以上の徴候もしくは症状の治療、予防または改善に有効な量；または体脂肪を増加させるのに有効な量；または体重を増加させるのに有効な量；または脂質蓄積を高めるのに有効な量。
【０１９１】
本発明は、脂肪の局在化の影響が関与する、体重障害および／または不適切な脂質代謝に関係する１以上の徴候もしくは症状の治療、予防または改善のための方法を提供する。こうして、本発明の方法は、肥満などの体重障害の治療のためのその他の標的について観察される有害副作用の危険が少ない。
【０１９２】
特定の実施形態において、体重障害（例えば肥満）、不適切な脂質代謝に特徴がある障害、脂質蓄積に特徴がある障害および糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善に使用する、本発明の方法にしたがって同定される化合物は、知られていなかったか、またはこうした障害の予防、治療または改善において以前に使用されていなかった化合物である。別の実施形態において、体重障害（例えば肥満）、不適切な脂質代謝に特徴がある障害、脂質蓄積に特徴がある障害および糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善に使用する、本発明の方法にしたがって同定される化合物は、１種類のペリリピンアイソフォームの発現もしくは活性に優先的に影響し、その他の２種類のアイソフォームの発現もしくは活性には影響しない、化合物である。別の実施形態において、体重障害（例えば肥満）、不適切な脂質代謝に特徴がある障害、脂質蓄積に特徴がある障害および糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善に使用する、本発明の方法にしたがって同定される化合物は、ペリリピンＡの発現もしくは活性に優先的に影響する化合物である。
【０１９３】
５．６．　家畜および家禽の増強方法
本発明は、動物の体重および／または行動力の増強のための、好ましくはコンパニオン動物（例えばイヌ、ネコおよびウマ）、家畜（例えばウシ、ウマおよびブタ）ならびに家禽（例えばニワトリおよびシチメンチョウ）に対する方法および組成物を提供する。また本発明は、動物における肥満などの体重障害の予防または治療のための、好ましくはコンパニオン動物（例えばイヌ、ネコおよびウマ）、家畜（例えばウシ、ウマおよびブタ）ならびに家禽（例えばニワトリおよびシチメンチョウ）に対する方法および組成物をも提供する。また本発明は動物における不適切な脂質代謝に特徴がある障害、脂質蓄積に特徴がある障害または糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の予防、治療または改善のための、好ましくはコンパニオン動物（例えばイヌ、ネコおよびウマ）、家畜（例えばウシ、ウマおよびブタ）ならびに家禽（例えばニワトリおよびシチメンチョウ）に対する方法および組成物を提供する。本発明はさらに、動物の健康の改善のための、好ましくはコンパニオン動物（例えばイヌ、ネコおよびウマ）、家畜（例えばウシ、ウマおよびブタ）ならびに家禽（例えばニワトリおよびシチメンチョウ）に対する方法および組成物に関する。
【０１９４】
１実施形態において、家畜または家禽にそれらの体重および／または行動力を増強するため、１以上のペリリピンアイソフォームの１種以上のアンタゴニストを含む医薬組成物を投与する。別の実施形態において、家畜または家禽に、その脂質代謝の増強および／または筋量の増加のため、１以上のペリリピンアイソフォームの１種以上のアンタゴニストを含む医薬組成物を投与する。別の実施形態において、家畜または家禽に、肥満、脂質代謝障害、脂質蓄積に特徴がある障害または糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の治療、予防または改善のため、１以上のペリリピンアイソフォームの１種以上のアンタゴニストを含む医薬組成物を投与する。さらに別の実施形態において、家畜または家禽に、悪液質もしくは食欲不振などの体重減少に特徴がある体重障害に関係する１以上の徴候もしくは症状の治療、予防または改善のため、１以上のペリリピンアイソフォームの１種以上のアゴニストを含む医薬組成物を投与する。
【０１９５】
５．７．　医薬製剤および投与経路
本発明は、有効量の本発明の化合物を被験者に投与することを含む、治療（および予防）方法を提供する。好ましい１態様において、化合物を実質的に（例えばその効果を制限するか、または望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まないように）精製する。被験者は好ましくは、限定するわけではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌその他などの動物を含む動物であり、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。特定の１実施形態において、家禽または非ヒト哺乳動物が被験者または動物となる。別の特定の実施形態において、被験者または動物はヒトである。
【０１９６】
化合物が核酸を含む場合に利用することができる製剤および投与方法を上記したが、その他の適切な製剤および投与経路を以下に記載する。
【０１９７】
多様な送達系が知られており、これらを本発明の化合物を投与するために使用することができる。例えば、リポソーム内のカプセル化、ミクロ粒子、マイクロカプセル、その化合物を発現することができる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えばＷｕおよびＷｕ， １９８７， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照）、レトロウイルスもしくはその他のベクターの一部としての核酸の構築、その他である。導入の方法は経腸および非経口とすることができ、限定するわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外および経口の経路が含まれる。化合物を好都合な経路で投与してもよいが、例えば注入もしくはボーラス注射、上皮もしくは粘膜皮膚内層（例えば口粘膜、直腸および腸粘膜、その他）による吸収などがあり、その他の生物学的活性薬剤とともに投与してもよい。投与は全身的または局所的でもよい。
【０１９８】
特定の１実施形態において、本発明の医薬組成物を治療が必要な部位に局所的に投与するのが望ましい場合がある。これは例えば、限定するわけではないが、手術中の局所注入によるか、局所適用、例えば注射によるか、カテーテルによるか、またはインプラントによって、達成することができる。このインプラントは多孔質、非多孔質、またはゼラチン物質で、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜、または繊維が含まれる。
【０１９９】
別の実施形態において、化合物を小胞内、特にリポソームに入れて送達することができる（例えばＬａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）， Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， 同書、ｐｐ．３１７−３２７、参照；全般について、同書参照）。
【０２００】
さらに別の実施形態において、化合物を持続または制御放出系で送達することができる。１実施形態において、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ， １９８７， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９， Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４参照）。別の実施形態において、ポリマー物質を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ， Ｊ．， １９８３， Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙら、１９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９， Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；およびＨｏｗａｒｄら、１９８９， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５参照）。さらに別の実施形態において、持続または制御放出系を治療標的の近傍、すなわち脂肪組織内に置き、これによって全身投与量のごく一部を要するだけとすることができる（例えばＧｏｏｄｓｏｎ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， 上記、第２巻， ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
【０２０１】
その他の制御放出系がＬａｎｇｅｒによる総説で考察されている（１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）。
【０２０２】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である場合の特定の１実施形態において、その核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば以下のようにしてこれが細胞内のものになるように投与することによって、この核酸にコードされたタンパク質の発現を促進するようにｉｎ ｖｉｖｏ投与することができる：レトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照）；直接の注射；ミクロ粒子のボンバードメント（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ， Ｄｕｐｏｎｔ）または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤によるコーティングの使用；核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させて投与（例えばＪｏｌｉｏｔら、１９９１， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８参照）、その他。あるいは、核酸を細胞内に導入して、相同組換えによって、発現するように宿主細胞ＤＮＡ内に組み込ませることができる。
【０２０３】
また本発明は医薬組成物をも提供する。こうした組成物は予防上または治療上有効な量の化合物および製薬上許容される担体を含む。特定の１実施形態において、用語「製薬上許容される」は、動物、およびさらに特定するとヒトにおける使用のために、連邦もしくは州政府の規制当局に承認されているか、合衆国薬局方もしくはその他の一般に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」は治療薬とともに投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはベヒクルを意味する。こうした医薬用担体は水および油などの無菌液体であることができ、これらには、石油、動物、植物もしくは合成起源の油、例えば落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などが含まれる。水は、医薬組成物を静脈内投与する場合、好ましい担体である。生理食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体として、特に注射可能な溶液のために使用することができる。好適な医薬用賦形剤には、スターチ、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。また所望ならば、組成物に少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含ませてもよい。これらの組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉剤、持続放出製剤などの形態とすることができる。組成物を常用の結合剤およびトリグリセリドなどの担体とともに坐剤として製剤化することができる。経口製剤には医薬等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムその他などの標準的担体を含ませることができる。好適な医薬担体の例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎの「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。こうした組成物に治療上有効な量の化合物を、好ましくは精製された形態で、好適な量の担体とともに含ませることで、被験者に適した投与用の形態を提供できるようになるだろう。製剤は投与様式に適合するものでなければならない。好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は無菌性である。
【０２０４】
好ましい１実施形態において、ヒトへの静脈内投与に適応させた医薬組成物として、慣用の手順にしたがって、組成物を製剤化する。典型的には、静脈内投与用の組成物は無菌等張水性バッファー中の溶液である。必要な場合は、また組成物には可溶化剤、および注射部位の痛みを緩和するためのリドカインなどの局所麻酔剤をも含ませてもよい。一般的に、成分は、例えば活性薬剤の量を指示したアンプルもしくは分包（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器に入れた、凍結乾燥粉末もしくは無水濃縮物として、別々に、または単位剤形中に混合して供給される。組成物を注入によって投与する場合、無菌医薬等級の水もしくは生理食塩水を含有する注入ビンに調剤することができる。組成物を注射によって投与する場合、注射用無菌水もしくは生理食塩水のアンプルを提供して、投与前に成分を混合するようにすることもできる。
【０２０５】
本発明の化合物を中性もしくは塩形態で製剤化することができる。製薬上許容される塩には、遊離アミノ基とともに形成する塩で、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸その他から誘導されるものなど、および遊離カルボキシル基とともに形成する塩で、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄（ＩＩＩ）、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインその他から誘導されるものなど、が含まれる。
【０２０６】
化合物の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療有効量）の判定について、細胞培養物または実験動物において、標準的医薬用手順によって、判定することができる。毒性および治療効果の間の用量比が治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０で表現することができる。大きな治療指数を提示する化合物が好ましい。毒性副作用を提示する化合物を使用することができるが、非感染細胞の損傷の危険を最少にし、それによって副作用を減少させるために、罹患した組織部位にこうした化合物を標的化する送達系を設計するように、注意を払わなければならない。
【０２０７】
細胞培養物アッセイおよび動物研究から取得したデータを、ヒトでの使用のための投与量範囲およびある投与量の投与頻度を方式化するために使用することができる。こうした化合物の投与量は好ましくは毒性をほとんどまたは全く持たないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内のものとする。投与量はこの範囲内で、使用する剤形および利用する投与経路に応じて変更することができる。本発明の方法において使用するいずれの化合物についても、治療上有効な用量は最初に細胞培養物アッセイから概算することができる。細胞培養物において判定したＩＣ５０（すなわち症状の最大抑制の半分を達成する候補化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を動物モデルにおいて達成するための用量を製剤化することができる。こうした情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルを、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２０８】
静脈内投与に好適な投与量範囲は一般的に体重１ｋｇあたり活性化合物が約２０〜５００マイクログラムである。坐剤は一般的に活性成分を０．５重量％〜１０重量％の範囲で含有する。経口製剤は好ましくは活性成分を１０％〜９５％含有する。
【０２０９】
抗体については、好ましい投与量は０．１ ｍｇ／ｋｇ〜１２５ ｍｇ／ｋｇ（さらに好ましくは、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜７５ ｍｇ／ｋｇ、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜５０ ｍｇ／ｋｇ、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜２５ ｍｇ／ｋｇ、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜２０ ｍｇ／ｋｇ、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜１５ ｍｇ／ｋｇ、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜１０ ｍｇ／ｋｇ、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜５ ｍｇ／ｋｇ、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜２．５ ｍｇ／ｋｇ、または０．１ ｍｇ／ｋｇ〜１ ｍｇ／ｋｇ）である。一般的に、部分的ヒト抗体および完全ヒト抗体はその他の抗体よりも人体内での半減期が長い。したがって、より低い投与量およびより低い頻度の投与が可能となることが多い。リピド化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）などの改変を使用して、抗体を安定化させ、また取り込みおよび組織貫通を増強することができる。抗体のリピド化の方法はＣｒｕｉｋｓｈａｎｋら、１９９７， Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １４：１９３に記載されている。
【０２１０】
治療上有効な量のタンパク質もしくはポリペプチド（すなわち、有効な用量もしくは有効な投与量）は、約０．００１〜３０ ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは約０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、またさらに好ましくは約１〜１０ ｍｇ／ｋｇ体重、２〜９ ｍｇ／ｋｇ体重、３〜８ ｍｇ／ｋｇ体重、４〜７ ｍｇ／ｋｇ体重、または５ 〜６ ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【０２１１】
当業者ならば、被験者を効果的に治療するために必要とされる投与量に特定の要因が影響し得ることを理解できるであろう。これらには、限定するわけではないが、疾病または障害の重篤度、既往の治療、被験者の全般的健康状態および／または年齢、ならびにその他の現存する疾病が含まれる。その上、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチドもしくは抗体による被験者の治療は、１回の治療を含むか、または好ましくは一連の治療を含むことができる。好ましい１例において、被験者を１週間に１回、約０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体、タンパク質もしくはポリペプチドで、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、さらに好ましくは約３〜７週間、そしてよりさらに好ましくは約４、５もしくは６週間、治療する。治療のために使用する抗体、タンパク質もしくはポリペプチドの有効な投与量を、特定の治療経過にわたって増加もしくは減少し得ることも理解されるであろう。投与量の変更も、本明細書に記載する診断アッセイの結果から、当業者には明らかであることができる。
【０２１２】
小分子薬剤の適切な用量は通常の熟練度の実務医、獣医もしくは研究者の知識の範囲内にある多数の要因に依存すると理解される。小分子の用量は例えばその実体、サイズおよび処置する被験者もしくはサンプルの状態に応じて、さらには適用可能ならばその組成物を投与する経路、および実務医がその小分子について求める本発明の核酸もしくはポリペプチドに対する効果に応じて変更されることとなろう。代表的な用量としては、被験者もしくはサンプルの重量１ｋｇあたりミリグラムもしくはマイクログラムの小分子が挙げられる（例えば約１μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２５０ ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２５ ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５ ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ）。小分子の適切な用量はモジュレートする発現もしくは活性についての小分子の効力に依存することが理解されるであろう。こうした適切な用量は当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されたアッセイを使用して、決定することができる。１以上のペリリピンアイソフォームの発現もしくは活性をモジュレートするために、１種以上の小分子を動物（例えばヒト）に投与する場合、実務医、獣医もしくは研究者は例えば最初に比較的低い用量を処方し、その後適切な応答が得られるまで用量を増加して行くことができる。さらに、特定のいずれかの動物被験者に対して特定された用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、被験者の年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路、排出速度、任意の薬剤との併用、ならびにモジュレートする１以上のペリリピンアイソフォームの発現もしくは活性の程度に依存するだろうことが理解される。
【０２１３】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１種以上の成分を充填した１個以上の容器を含む、医薬パックもしくはキットをも提供する。場合によって、これらの容器に、医薬もしくは生物学的産物の製造、使用もしくは販売を規制する政府機関によって規定された形式の注意書を添付することができる。この注意書は、（ａ） 当局によるヒトに対する投与用の製造、使用もしくは販売の承認、（ｂ） 使用指示書、または両方を表示する。
【０２１４】
５．８．　治療的有用性の評価方法
また本発明は、体重障害（例えば肥満、悪液質および食欲不振）、脂質代謝障害、脂質蓄積に特徴がある障害および糖尿病の治療もしくは予防のための化合物の同定または効力の実証を目的として、薬物発見において使用するアッセイをも提供する。候補化合物について、体重障害がある被験者中のペリリピン発現レベルを、こうした障害がない被験者中に見られるレベルまでモジュレートするそれらの能力をアッセイすることができる。体重減少に特徴がある体重障害を持つ被験者中の１以上のペリリピンアイソフォームの発現レベルを、体重障害がない被験者中に見られるレベルまで回復する能力がある化合物を、さらなる薬物発見のためのリード化合物（ｌｅａｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として使用するか、または治療に使用することができる。さらに、体重増加に特徴がある体重障害（例えば肥満）を持つ被験者中の１以上のペリリピンアイソフォームの発現レベルをこの体重障害がない被験者中に見られるレベルまで低下させる能力がある化合物を、さらなる薬物発見のためのリード化合物として使用するか、または治療に使用することができる。ペリリピンアイソフォームの発現はイムノアッセイ、ゲル電気泳動後の可視化、ペリリピンのリン酸化の検出、ペリリピンの活性の検出、または本明細書で教示するかまたは当業者に知られたその他の任意の方法によって、アッセイすることができる。こうしたアッセイを使用して、ペリリピンアイソフォームの存在度が臨床上の障害の代替マーカーとして役立ち得る場合には、臨床的モニタリングもしくは薬物の開発における候補薬物をスクリーニングすることができる。
【０２１５】
各種の特定の実施形態において、ある障害に関与する細胞型の代表的な細胞によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施し、こうした細胞型に対してある化合物が所望の効果を持つかどうかを判定することができる。例えば、肥満などの体重障害を持つ動物由来のステロイド合成細胞および脂肪細胞を使用して、こうした細胞に対してある化合物が所望の効果を持つかどうかを判定することができる。
【０２１６】
治療で使用するための化合物をヒトにおいて試験する前に、限定するわけではないがラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギその他を含む好適な動物モデル系で試験することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ試験については、ヒトに投与する前に、当技術分野で知られたいずれの動物モデル系も使用することができる。体重障害の動物モデルの例には、限定するわけではないが以下のような肥満モデルが含まれる：レプチン耐性動物（例えばｄｂ／ｄｂマウス）、メラノコルチン−４−受容体ノックアウトマウス（ＭＲ−４−／−）、レプチン欠損マウス（ｏｂ／ｏｂ）、ｔｕｂｂｙマウス（ｔｕｂｂｙタンパク質欠損）、ｆａ／ｆａ（Ｚｕｃｋｅｒ Ｄｉａｂｅｔｉｃ ＦａｔｔｙもしくはＺＤＦ）ラット、メラノコルチン−３−受容体ノックアウトマウス、ＰＯＭＣ欠損マウス、およびｆａｔ／ｆａｔマウス（例えば、Ｂａｒｓｈら、２０００， Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６４４−６５１；Ｆｉｓｈｅｒら、１９９９， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２３ Ｓｕｐｐｌ：５４−５８；Ｇｉｒｉｄｈａｒａｎ， １９９８， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．１０８：２２５−２４２；Ｚｈａｎｇら、１９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７２：４２５−４３２；Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８０：５３４−５３８；Ｉｉｄａら、１９９６， ＢＢＲＣ ２２４：５９７−６０４；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３：１８−１９；Ｃｈｅｎら、２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：９７−１０２；Ｂｕｔｌｅｒら、２０００， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１：３５１８−３５２１；Ｙａｗｅｎら、１９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１０６６−１０７０；およびＮａｇｇｅｒｔら、１９９５， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：１３５−１４２参照）。また本開示に基づいて、ペリリピンをコードする遺伝子の「ノックアウト」突然変異を持つトランスジェニックマウスを生産することも、当業者には明らかである。１遺伝子の「ノックアウト」突然変異とは、突然変異された遺伝子が発現されないか、異常型もしくは低レベルで発現されて、その遺伝子産物に関係する活性がほとんどもしくは全く無くなる結果となる突然変異である。好ましくは、トランスジェニック動物は哺乳動物、さらに好ましくはトランスジェニック動物はマウスである。
【０２１７】
１実施形態において、ペリリピンアイソフォームのレベルもしくは発現をモジュレートする候補化合物を肥満、悪液質もしくは食欲不振などの体重障害、脂質代謝障害、脂質蓄積に特徴がある障害または糖尿病を持つヒト被験者において同定するか、あるいは実証する。この実施形態にしたがって、候補化合物もしくは対照化合物をヒト被験者に投与し、生物学的サンプル（例えば血清もしくは血漿）中でのペリリピンまたはこれをコードするｍＲＮＡの発現を分析することによって、ペリリピン発現に対する試験化合物の効果を判定する。対照化合物で処置した被験者もしくは被験者群中の１以上のペリリピンアイソフォームまたはこれをコードするｍＲＮＡのレベルを、候補化合物で処置した被験者もしくは被験者群のものと比較することによって、１以上のペリリピンアイソフォームの発現を変更する候補化合物を同定することができる。あるいは、候補化合物の投与前および後の被験者もしくは被験者群中の１以上のペリリピンアイソフォームまたはこれをコードするｍＲＮＡのレベルを比較することによって、１以上のペリリピンアイソフォームの発現の変更を同定することができる。当業者に知られた技法を使用して、生物学的サンプルを取得し、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現を分析することができる。
【０２１８】
別の実施形態において、ペリリピンの活性をモジュレートする候補化合物を、体重障害、脂質代謝障害、脂質蓄積に特徴がある障害または糖尿病を持つヒト被験者において同定するか、あるいは実証する。この実施形態にしたがって、候補化合物もしくは対照化合物をヒト被験者に投与し、ペリリピンの活性に対する候補化合物の効果を判定する。対照化合物で処置した被験者からの生物学的サンプルを候補化合物で処置した被験者からのサンプルと比較することによって、１以上のペリリピンアイソフォームの活性を変更する候補化合物を同定することができる。あるいは、候補化合物の投与前および後の被験者もしくは被験者群中の１以上のペリリピンアイソフォームの活性を比較することによって、１以上のペリリピンアイソフォームの活性の変更を同定することができる。ペリリピンの活性は以下のようにして評価することができる：ペリリピンのリン酸化の検出；生物学的サンプル（例えば血清もしくは血漿）中でのペリリピンの細胞シグナル伝達経路の誘導（例えば細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３その他）の検出；活性がペリリピンによって調節される酵素の活性（例えばホルモン感受性リパーゼ活性）の検出；リポーター遺伝子、または細胞応答、例えば脂質代謝の誘導の検出（例えばトリアシルグリセロール、非エステル化脂肪酸またはβ−ヒドロキシ酪酸のレベルの変化の検出による）。ペリリピンのリン酸化の変化、ペリリピンの第２メッセンジャーの誘導の変化または細胞応答の変化を検出するために、当業者に知られた技法を使用することができる。例えば、細胞の第２メッセンジャーの誘導の変化を検出するためにはＲＴ−ＰＣＲを使用することができ、ペリリピンのリン酸化の変化を検出するためには、免疫沈降後のウエスタンブロット分析を使用することができる。
【０２１９】
好ましい１実施形態において、１以上のペリリピンアイソフォームの発現のレベルを対照被験者（例えば体重障害がないヒト）中で検出されるレベルの方へ変化させる候補化合物を、その後の試験もしくは治療的使用のために選択する。別の好ましい実施形態において、１以上のペリリピンアイソフォームの活性を対照被験者（例えば体重障害がないヒト）中で見られる活性の方へ変化させる候補化合物を、その後の試験もしくは治療的使用のために選択する。
【０２２０】
別の実施形態において、体重障害を持つヒト被験者において、体重障害に関係する１以上の徴候もしくは症状の重篤度を低下させる候補化合物を同定する。この実施形態にしたがって、候補化合物もしくは対照化合物を体重障害があるヒト被験者に投与し、体重障害の１以上の徴候もしくは症状に対する候補化合物の効果を判定する。対照化合物で処置した被験者を試験化合物で処置した被験者と比較することによって、１以上の徴候もしくは症状を低下させる候補化合物を同定することができる。候補化合物が体重障害に関係する１以上の徴候もしくは症状を低下させるかどうかを判定するためには、体重障害に詳しい実務医に知られた技法を使用することができる。例えば、肥満の被験者の治療のためには、脂質代謝を高める候補化合物が有益となろう。
【０２２１】
別の実施形態において、糖尿病を持つヒト被験者において、血糖値を低下させるか、インスリン感受性を増大させるか、インスリン分泌を増大させるか、他の抗糖尿病薬の必要用量を低下させるか、または糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の重篤度を低下させる候補化合物を同定する。この実施形態にしたがって、候補化合物もしくは対照化合物を糖尿病があるヒト被験者に投与し、血糖値、インスリン感受性、インスリン分泌、他の抗糖尿病薬の必要用量、または糖尿病の１以上の徴候もしくは症状に対する候補化合物の効果を判定する。対照化合物で処置した被験者を試験化合物で処置した被験者と比較することによって、血糖値を低下させるか、インスリン感受性を増大させるか、他の抗糖尿病薬の必要用量を低下させるか、または糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状を低下させる候補化合物を同定することができる。候補化合物が糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状を低下させるかどうかを判定するためには、糖尿病に詳しい実務医に知られた技法を使用することができる。
【０２２２】
好ましい１実施形態において、体重障害があるヒトにおいて、体重障害に関係する１以上の徴候もしくは症状の重篤度を低下させる候補化合物を、その後の試験もしくは治療的使用のために選択する。別の好ましい実施形態において、糖尿病があるヒトにおいて、糖尿病に関係する１以上の徴候もしくは症状の重篤度を低下させる候補化合物を、その後の試験もしくは治療的使用のために選択する。
【０２２３】
５．９．　診断およびモニタリング技法
本発明にしたがって、脂質代謝障害、脂質蓄積に特徴がある障害または異常ペリリピン発現に特徴がある体重障害を持つと疑われるか、持つことがわかっている被験者から取得した脂肪組織、血清もしくは血漿の試験サンプルを、診断またはモニタリングに使用することができる。１実施形態において、（脂質代謝障害または体重障害がない被験者からの）対照サンプルまたは事前に決定した基準範囲と比較した、試験サンプル中の１以上のペリリピンアイソフォーム（もしくはそれらの任意の組合せ）の存在度の減少は、脂質代謝障害または肥満などの体重増加に特徴がある体重障害の存在を示す。別の本発明の実施形態において、対照サンプルまたは事前に決定した基準範囲に比較した、試験サンプル中の１以上のペリリピンアイソフォーム（もしくはそれらの任意の組合せ）の存在度の増加は、悪液質もしくは食欲不振などの体重減少に特徴がある体重障害の存在を示す。さらに別の実施形態において、対照サンプルまたは事前に決定した基準範囲と比較した、試験サンプル中の１以上のペリリピンアイソフォーム（もしくはそれらの任意の組合せ）の相対的存在度は、脂質代謝障害、脂質蓄積に特徴がある障害、糖尿病または体重障害（例えば肥満）の程度または重篤度を示す。前記の方法のいずれにおいても、本明細書に記載した１以上のペリリピンアイソフォームの検出を、場合によって、例えばレプチンおよびニューロペプチドＹなどの脂質代謝障害または体重障害の１種以上のさらなる生物マーカーの検出と組合せることができる。ペリリピンアイソフォームのレベルを測定するためには、当技術分野の好適ないずれの方法も使用してもよい。これらとしては限定するわけではないが、ペリリピンアイソフォームの検出および／または可視化のためのイムノアッセイが挙げられる（例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫組織化学、その他）。さらに、好適なハイブリダイゼーションアッセイのいずれかを使用して、ペリリピンアイソフォームをコードするｍＲＮＡの検出および／または可視化によって、ペリリピンアイソフォームの発現を検出することができる（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、その他）。
【０２２４】
本発明の別の実施形態において、脂質代謝障害または異常ペリリピン発現に特徴がある体重障害を検出、診断またはモニタリングするための診断目的で、ペリリピンアイソフォームに特異的に結合する標識抗体、その誘導体および類似体を使用することができる。好ましくは、こうした障害を動物中、さらに好ましくは哺乳動物中、そして最も好ましくはヒト中で検出する。
【０２２５】
５．１０．　キット
本発明はまた、本発明のスクリーニングアッセイによって同定された１種以上の薬剤、および使用のための指示書を含むキットを提供する。１実施形態において、キットは１個以上の容器に入れた、１以上のペリリピンアイソフォームの１以上のアゴニストを含む。別の実施形態において、キットは１個以上の容器に入れた、１以上のペリリピンアイソフォームの１以上のアンタゴニストを含む。好ましくは、本発明のキットはさらに、１以上のペリリピンアイソフォームの発現および／または活性にアゴニストとして機能することも、またはアンタゴニストとして機能することもない対照を含む。
【０２２６】
特定の１実施形態において、本発明のキットは１以上のペリリピンアイソフォームの標識したアゴニストもしくはアンタゴニストを含む。好ましい実施形態において、本発明のキットは治療薬とコンジュゲートさせた、１以上のペリリピンアイソフォームのアゴニストもしくはアンタゴニストを含む。別の好ましい実施形態において、本発明のキットは診断薬とコンジュゲートさせた、１以上のペリリピンアイソフォームのアゴニストもしくはアンタゴニストを含む。
【０２２７】
特定の実施形態において、本発明のキットは、体重障害（例えば肥満）、脂質代謝障害、脂質蓄積に特徴がある障害もしくは糖尿病の治療、予防または診断用抗体の使用のための指示書を含む。
【０２２８】
本明細書に記載した本発明をさらに十分理解できるように、以下の実施例を示す。これらの実施例は説明のみの目的であって、本発明をどんな意味でも限定する意図はないものと理解されたい。
【０２２９】
６．実施例：ペリリピンの不在はｄｂ／ｄｂマウスの遺伝的低脂肪性をもたらし、肥満を逆行させる
この実施例では脂質ホメオスタシス、筋量およびエネルギー代謝においてｉｎ ｖｉｖｏでペリリピンが果たす重要な役割を示す。
【０２３０】
６．１．　材料および方法
ｐｌｉｎ−／−マウスの作製および維持
ＰＣＲによって取得したマウスペリリピンｃＤＮＡを使用して、マウス１２９ゲノムライブラリーからλファージクローンを単離した。このクローンはペリリピン遺伝子のエキソン１〜７を含んでいた。図１に示すような置換ベクターを生産した。エレクトロポレーション（Ｃｈａｎｇら、１９９９， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：６０５１−６０５５）によって、この構築物をマウスＥＳ細胞中に導入した（Ｒ１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＴｏｒｏｎｔｏのＤｒ．Ａｎｄｒａｓ Ｎａｇｙより入手）。８個の独立した組換えＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６Ｊに由来する未分化胚芽細胞中に注入した。ＸｂａＩ制限酵素を使用して、テールブロット（ｔａｉｌ ｂｌｏｔ）によって遺伝子型決定を実施した。すべての実験をＣ５７ＢＬ／６Ｊと戻し交雑したＦ３およびＦ４マウスで実施した。マウスを４週間で離乳し、通常の固形飼料（４．５％の脂肪を含有する標準Ｐｕｒｉｎａ Ｒｏｄｅｎｔ Ｃｈｏｗ）または高脂肪（ＨＦ）飼料（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ， Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ， ＮＪからのＦ３２８２、３５％の脂肪、２１％のタンパク質、および３８％の炭水化物を含有）を給餌した。
【０２３１】
イムノブロッティング
等量のタンパク質ホモジネートを４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ポリクローナル抗ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）（抗ＨＳＬ抗体はＤｒ．Ｃ．Ｈｏｌｍ， Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌｕｎｄ （Ｓｗｅｄｅｎ）、の好意により寄贈された）および抗ペリリピン抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｆｌａｎｄｅｒｓ， ＮＪ）でプロービングした。一次抗体を増強した化学発光（ＥＣＬキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって可視化した。イムノブロットバンドの相対強度をＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ ＴＭ ２０００ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）によって定量した。
【０２３２】
身体組成
５匹のｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−雄マウスを頚椎脱臼法（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ）によって屠殺した。精巣上体脂肪パッド（ｐａｄ）および腓腹筋を切除して秤量した。次に死骸全体をブレンダーでホモジナイズした。事前秤量した磨砕死骸の一部から、脂肪をエチルエーテルおよびエチルアルコールで抽出し、抽出手順後に残った物質の量から脂肪の割合が計算できるようにした。死骸のトリアシルグリセロール（Ｓｉｇｍａ）およびタンパク質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）を測定した。
【０２３３】
グルコース耐性およびインスリン感受性試験
グルコース耐性については、マウスを４時間絶食させ、その後体重１ ｋｇあたりグルコース ３ ｇの用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。血糖値ストリップ（ｓｔｒｉｐ）（ＦａｓＴａｋｅ， ＬｉｆｅＳｃａｎ Ｉｎｃ．， Ｍｉｌｐｉｔａｓ， ＣＡ）を使用して、注射前および後のグルコースレベルをモニタリングした。インスリン感受性については、マウスを４時間絶食させ、最終濃度が０．７５ Ｕ／ｋｇ体重になるように通常のインスリン １００単位／ｍｌを腹腔内注射した。注射前および注射の１５、３０、６０および１２０分後に、血液を採取した。血糖値ストリップを使用して、グルコースを測定した。
【０２３４】
血液化学
動物をイソフルラン（Ｖｅｄｃｏ， Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ， ＭＯ）で麻酔した後、眼窩神経叢（ｏｒｂｉｔａｌ ｐｌｅｘｕｓ）から血液を採取した。血清をアリコートで凍結し、−２０℃で保存した。血清非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ Ｃ， Ｗａｋｏ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＶＡ）、グリセロール、グルコース、コレステロール、βヒドロキシ酪酸および総トリアシルグリセロール（Ｓｉｇｍａ）の測定のための酵素アッセイキットを使用した。血清インスリンはラジオイムノアッセイ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ）を使用して測定した。グルコースおよびインスリン耐性については、グルコースを血糖値ストリップ（ＦａｓＴａｋｅ）によって測定した。コルチコステロン（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ．， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ）およびレプチン濃度（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ）は一晩の絶食後の正午に取得した血漿におけるラジオイムノアッセイによって測定した。
【０２３５】
ホルモン感受性リパーゼアッセイ
組織を、組織１グラムあたりバッファー（０．２５ ショ糖、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＥ、２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）３ ｍｌ中でホモジナイズし、１１０，０００ｘｇ、４℃で４５分間、遠心分離した。脂肪を枯渇した下層部（ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ）を使用し、本質的にはＨｏｌｍおよび共同研究者によって記載されている（Ｈｏｌｍら、１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８６：４５−６７；およびＯｓｔｅｒｌｕｎｄら、１９９６， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１９：４１１−４２０）ようにして、基質としてジオレイン類似体 １（３）−モノ−［３Ｈ］オレオイル−２−Ｏ−モノ−オレイルグリセロール（ＭＯＭＥ）を使用して、ＨＳＬ活性を測定した。酵素活性１単位を３７℃で１分間あたりに放出されるオレイン酸１μｍｏｌとして定義し、リパーゼ活性を組織１ｍｇあたりの単位として表現した。
【０２３６】
単離した脂肪細胞中の脂肪分解
記載されている（Ｒｏｄｂｅｌｌ，Ｍ．， １９８４， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９：３７５−３８０）ようにして、精巣上体脂肪パッドからアデノシンの存在下でのコラゲナーゼ消化によって、脂肪細胞を単離した。細胞をアデノシンの不在かつ１Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼの存在下でＫｅｒｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ Ｈｅｐｅｓ中に再懸濁させた。０．３５０ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞を２μＭ ＣＬ ３１６，２４３の存在もしくは不在下で１時間インキュベートし、脂肪分解の指示物質として細胞外グリセロールの放出を測定した。
【０２３７】
ｉｎ ｖｉｖｏ脂肪分解
マウスを４時間絶食させ、ＣＬ ３１６，２４３（０．１ ｍｇ／ｋｇ 体重）またはイソプロテレノール（１０ ｍｇ／ｋｇ 体重）をｉ．ｐ．注射した。注射前および注射の１５分後に眼窩神経叢から血液を採取し、ＮＥＦＡおよびグリセロールを測定した。
【０２３８】
組織学
組織を中性緩衝化したホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＳｉｇｍａＳｃａｎ（Ｊａｎｄｅｌ， Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ， ＣＡ）で画像を捕捉し、分析を実施した。各脂肪細胞の輪郭を手動でたどり、細胞質の面積を測定した。ｐｌｉｎ−／−マウスの細胞の境界を脂質小滴が妨害するため、褐色脂肪細胞のサイズおよび分布を正確に測定することができなかった。総表面積を核の数で割ることによって、平均サイズを概算した。
【０２３９】
酸素消費量の測定
空気流速０．５１ ｍｉｎ−１および室温２３℃でのコンピュータ制御したオープンサーキット間接熱量測定法（Ｏｘｙｍａｘ， Ｃｏｌｏｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．， Ｃｏｌｕｍｂｕｓ， ＯＨ）を使用して、普通飼料または３５％の脂肪飼料を給餌したマウスについて個別に酸素消費量を評価した。３０分後、マウスを代謝チャンバーに入れた。ＶＯ２を５分間隔で２０〜２４時間評価した。マウスに夜間１２時間の間は水および食物を自由に摂らせた。総酸素消費量は実験中に採取した全サンプルの平均で表示する。
【０２４０】
磁気共鳴イメージング
２セットの磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）実験を実施した。第１セットは「脂肪」もしくは「脂質」画像および「水」画像を判定するためのものであった。これはホルマリンで固定したｐｌｉｎ−／−およびｐｌｉｎ＋／＋マウスについて実施した。保存した検体を２５ ｍｍ ＮＭＲチューブの内側に確実に配置して、垂直ボア、９．４ Ｔｅｓｌａ ＭＲＩシステム（Ｖａｒｉａｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）で画像化した。各回後にクラッシャーグラジェント（ｃｒｕｓｈｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を伴う一連の３つの４．０ ｍｓ ｓｉｎｃパルスを使用して、水ピーク（４．８ ｐｐｍ）もしくは脂質ピーク（１．２ ｐｐｍ）のいずれかの化学シフト選択的飽和を達成した。２５−スライススピンエコーイメージングパルス系列を使用した。励起および再焦点あわせのため、４ ｍｓ ｓｉｎｃパルスを使用して、連続した１−ｍｍスライスを選択した。２５６位相エンコーダー（ＰＥ）ステップのそれぞれを、１ＰＥステップあたり繰り返し時間４秒、エコー時間３０ミリ秒、および平均３２シグナルで、取得した。選択したスライスでの脂肪含有％の定量評価を心臓および肝臓のレベルで実施した。脂肪画像から測定した脂肪の断面積を水画像から決定したスライス中のマウス組織の総断面積で割った。断面積は、シグナル強度にしたがって組織を分割し、そのピクセルを計数する、画像解析ソフトウェアを使用して、定量した。
【０２４１】
実験の第２セットにおいて、マウスをアベルチンで麻酔し、図６Ｄの説明に記載したように生体ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスについて、水および脂質シグナルを示すＭＲＩスペクトルを測定した。
【０２４２】
６．２．　結果
図１Ａおよび１Ｂに示すストラテジーを使用する、ペリリピン遺伝子の標的を定めた破壊によって、ペリリピン（ｐｌｉｎ）ヌル突然変異マウスを生産した。ターゲティングベクターでエキソン２およびイントロン２の部分をＩＲＥＳ−β−ｇａｌおよびｎｅｏ遺伝子で置換した。複数の標的化ＥＳ細胞クローンを取得した。その８個のキメラのうち、５個は標的化対立遺伝子を子孫に伝達した。ホモ接合性およびヘテロ接合性マウスが予測した割合で回収した。ノーザンブロッティングではペリリピンｍＲＮＡが検出不可能であることがわかり（データは示していない）、一方ウエスタンブロッティングではペリリピンタンパク質が脂肪細胞（ペリリピンＡおよびＢ）および精巣（ペリリピンＡおよびＣ）中で不在であることが示された（図１Ｃ）。ｐｌｉｎ−／−マウスには明白な異常表現型はなく、多産で、その仔に正常に授乳した。随意に給餌したとき、これらのマウスはｐｌｉｎ＋／＋同腹対照よりも有意に多く餌を消費した（ｐｌｉｎ−／−は０．４２９±０．０５４ ｋｃａｌ／日／ｇ体重、およびｐｌｉｎ＋／＋は０．３３２±０．０３７ ｋｃａｌ／日／ｇ体重、ｐ＝０．０１１）。食物摂取が増加したにもかかわらず、体重についてｐｌｉｎ−／−マウスはｐｌｉｎ＋／＋マウスと差異がなく（図２Ａおよび２Ｂ）、それらの肝臓、腎臓、脾臓および心臓の重量も類似していた（データは示していない）。ｐｌｉｎ−／−は野生型（ｐｌｉｎ＋／＋）マウスよりも体脂肪が少なかった。それぞれの脂肪蓄積量はｐｌｉｎ＋／＋マウスよりもｐｌｉｎ−／−マウスにおいて重量が３７〜３８％少なかった（図２Ｃ）。しかしながらノックアウトマウスはそれらのｐｌｉｎ＋／＋マウスよりも低脂肪性で、ｐｌｉｎ−／−マウスの全死骸脂質含量は５８％低下し（図２Ｄ）、トリアシルグリセロール含量は４６％低下した（図２Ｅ）が、一方で、ｐｌｉｎ−／−マウスの総タンパク質含量は実際には２１％増大した（図２Ｆ）。精巣上体脂肪パッド重量と全身トリアシルグリセロール含量との間には良好な相関性があった（ｒ＝０．９２０、ｐ＜０．００１）が、体重と脂肪パッド重量（ｒ＝０．１９９、ｐ＝０．５８２）もしくはトリアシルグリセロール含量（ｒ＝０．０５２、ｐ＜０．８８７）間には相関性がなかった。ｐｌｉｎ−／−マウスは悪液質でないばかりか、実際には筋量の増加があったので、このマウスは体脂肪が減少しても正常体重を維持することが可能になった。ｐｌｉｎ−／−マウスの腓腹筋の重量はｐｌｉｎ＋／＋対照よりも７．８％高かった （ｐ＜０．０５、両グループについてｎ＝９、図２Ｇ）。
【０２４３】
ｐｌｉｎ−／−マウスからの脂肪細胞はｐｌｉｎ＋／＋同腹個体のものより実質的に小さかった（図３Ａ）。ｐｌｉｎ＋／＋の組織学的切片の平均の白色脂肪細胞サイズ（面積）（図３Ｂ）は３７５７±１２７２μｍ２で、一方ｐｌｉｎ−／−マウスからのものは１４００±４８μｍ２で、 サイズが６２％減少した。ｐｌｉｎ−／−マウス中でのはるかに小さい白色脂肪貯蔵物は個々の脂肪細胞のサイズの縮小の結果であって、脂肪細胞の数の減少によるものではなかった。なぜならば、細胞密度はｐｌｉｎ＋／＋マウスよりもｐｌｉｎ−／−の方がずっと高く（図３Ｃ）、また脂肪組織の総ＤＮＡ含量はｐｌｉｎ−／−およびｐｌｉｎ＋／＋動物中で同様だったからである（ｐｌｉｎ＋／＋中１４０±８５μｇに対してｐｌｉｎ−／−中１５２±５６μｇ、両グループについてｎ＝６）。肩甲間褐色脂肪はｐｌｉｎ＋／＋マウスよりもｐｌｉｎ−／−中で小さかった（図３Ｄ）。肩甲間褐色脂肪組織中の脂肪細胞の平均サイズはより小さくなる傾向があったが、差異は有意ではなかった（ｐｌｉｎ＋／＋中３．４６８±１．０１８μｇに対してｐｌｉｎ−／−中２．６０７±０．２０９μｍ２、ｐ＝０．０７１）。しかし、組織学的外観は非常に異なっていた。なぜならば、ｐｌｉｎ−／−褐色脂肪細胞中の脂質小滴はｐｌｉｎ＋／＋褐色脂肪細胞中のものよりもはるかに小さかったからである（図３Ａ）。ｐｌｉｎ−／−マウスの総体脂肪の減少は対応するその血漿レプチン濃度の低下を反映していた（雄マウスについて、ｐｌｉｎ＋／＋中３．６４±１．４０ ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝７に対してｐｌｉｎ−／−中２．２６±１．２３ ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝１０、ｐ＝０．０５６；および雌マウスについて、ｐｌｉｎ＋／＋中３．０２±１．４０ ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝８に対してｐｌｉｎ−／−中１．７８±０．５８ ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝１０、ｐ＝０．００１）。ｐｌｉｎ−／−マウス中で、異常な肝臓組織はなく、また肝臓内の脂肪浸潤の証拠はなかった（データは示していない）。
【０２４４】
ｐｌｉｎ−／−マウス中の総体脂肪の大きな低下にもかかわらず、以下のパラメーターではｐｌｉｎ−／−とｐｌｉｎ＋／＋動物との間での有意な差異は検出されなかった：基礎血漿コレステロール（ｐｌｉｎ−／− ９７±１８．１ ｍｇ／ｄｌに対してｐｌｉｎ＋／＋ ８９．７±１１．４ ｍｇ／ｄｌ）およびトリアシルグリセロールレベル（ｐｌｉｎ−／− ２９．１±６．４ ｍｇ／ｄｌに対してｐｌｉｎ＋／＋ ３５．６±６．８ ｍｇ／ｄｌ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィーで分析した血漿リポタンパク質プロファイル（データは示していない；Ｃｌｉｆｆｏｒｄら、２０００， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４６６５−２４６６９）、絶食時血漿グルコース（ｐｌｉｎ−／− ８１．９５±１１．２４ ｍｇ／ｄｌに対してｐｌｉｎ＋／＋ ８１．９５±２０．０３ ｍｇ／ｄｌ）およびインスリン（ｐｌｉｎ−／− ０．２０６±０．０９６ ｎｇ／ｍｌに対してｐｌｉｎ＋／＋ ０．１７９ ±０．０８１ ｎｇ／ｍｌ）、標準腹腔内（ｉ．ｐ．）インスリン用量 ０．７５ Ｕ／ｋｇを使用するインスリン耐性試験に対する２時間にわたる血漿グルコース応答（データは示していない）、ならびにｉ．ｐ．投与した３ ｇ／ｋｇグルコースを使用する標準グルコース耐性試験に対する２時間にわたる血漿グルコースおよびインスリン応答（データは示していない）。血漿コルチコステロンレベルもｐｌｉｎ−／−（雄について １１８．２８±５４．４５ ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝１０、および雌について ２２８．９２±５６．２８ ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝９）とｐｌｉｎ＋／＋（雄について １０８．４９±６２．２５ ｎｇ／ｍｌ 、ｎ＝１０、および雌について １８８．５５±８６．３１ ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝１０）との間で差異がなかった。
【０２４５】
いくつかの血漿パラメーターに対する４８時間の絶食の効果を図４Ａに示す。絶食の開始時にはどのパラメーターについても差異がなかった。絶食に対する応答の主な差異は脂質分解代謝物、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、およびケトン体、β−ヒドロキシ酪酸のレベルにあった。野生型マウスは絶食後に血漿ＮＥＦＡおよびβ−ヒドロキシ酪酸を増加させることができた。対照的に、ｐｌｉｎ−／−マウスは脂肪分解応答を立ち上げることができても、ＮＥＦＡのレベルを増加させるには十分でなかった。絶食後、血漿β−ヒドロキシ酪酸の増加も実質的に微弱となった（図４Ａ）。ｐｌｉｎ−／−マウスでは、基準条件下ですでに最大刺激を受けて、脂肪貯蔵物がずっと小さいので、ＮＥＦＡの放出を増加させることができなかったことが最も考えられる（下記参照）。それによって、ＮＥＦＡの供給が制限されるので、脂肪酸のβ酸化を介するアセチルＣｏＡからのケトン体の産生が損なわれた。
【０２４６】
ペリリピンはホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）活性をモジュレートすることが報告されているので、その不在はＨＳＬ活性化に影響し、それによって細胞での脂肪分解の割合およびエネルギーバランスを変化させるものと見られる（Ｌｏｎｄｏｓら、１９９９， Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９：５１−５８）。ウエスタンブロッティングによれば（図４Ｂ）、ｐｌｉｎ＋／＋とｐｌｉｎ−／−マウスとの間で免疫反応性ＨＳＬに有意な差異は検出されなかった。皮下脂肪および精巣上体脂肪中でのｐｌｉｎ−／−マウス由来の細胞溶解物中のＨＳＬ活性は、ｐｌｉｎ＋／＋対照の対応する脂肪貯蔵物のそれぞれ２８７％および６５２％だった（図４Ｃ）。ｐｌｉｎ−／−中で構成的に活性化されたＨＳＬは、ペリリピンが正常では脂肪ＨＳＬ活性を制御することによって機能することを示す。正常量のタンパク質の存在下で減少したＨＳＬ活性は、ペリリピンがおそらくＨＳＬの総量の産生ではなく、脂肪小滴中のトリアシルグリセロールへのＨＳＬの接近に影響することによって、ＨＳＬ活性を調節することを示す（Ｌｏｎｄｏｓら、１９９９， Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９：５１−５８）。
【０２４７】
次に、単離した脂肪細胞の総脂肪分解活性を測定した。ｐｌｉｎ−／−マウスの単離した脂肪細胞からの基礎グリセロール放出はｐｌｉｎ＋／＋マウスの脂肪細胞からのものの約３７５％だった（図４Ｄ）。げっ歯類動物の脂肪組織中で主として発現するβ−アドレナリン作動性受容体の特異的アゴニストである、ＣＬ ３１６，２４３（Ｍｕｚｚｉｎら、１９９１， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２４０５３−２４０５８）の添加（２μＭ）は、ｐｌｉｎ＋／＋脂肪細胞中でのグリセロール放出を約３００％刺激し、未処理のｐｌｉｎ−／−脂肪細胞中のものにほぼ等しい数値となった。対照的に、ｐｌｉｎ−／−マウスからの脂肪細胞中では、脂肪分解活性は基礎条件下ですでに最大であったので、ＣＬ ３１６，２４３はそれ以上の刺激をもたらさなかった。
【０２４８】
これらのｉｎ ｖｉｔｒｏでの観察結果は脂質代謝に対するペリリピンの不活性化のｉｎ ｖｉｖｏでの影響の試験を喚起した。基礎条件下、および一般的β−アドレナリン作動性アゴニストのイソプロテレノール（１０ ｍｇ／ｋｇ ＩＰ）およびＣＬ ３１６，２４３（０．１ ｍｇ／ｋｇ ＩＰ）の投与後の、脂肪分解産物であるグリセロールおよびＮＥＦＡを測定することによって、ｐｌｉｎ−／−およびｐｌｉｎ＋／＋マウスの脂肪分解速度を研究した。いずれかの化合物のｉ．ｐ．投与前および最大血漿グリセロールおよびＮＥＦＡ応答に一致する時間であるその１５分後に血液を採取した（図４Ｅ）。処置前は、ｐｌｉｎ−／−マウスの体脂肪含量の方がはるかにより低いのに、基礎血漿グリセロールおよびＮＥＦＡレベルはｐｌｉｎ−／−およびｐｌｉｎ＋／＋マウスともほぼ類似していた。イソプロテレノール処置後、ｐｌｉｎ＋／＋マウスでは、血漿グリセロールのレベルで約８００％の増加、および血漿ＮＥＦＡのレベルで約３００％の増加があった。ｐｌｉｎ−／−マウスではこれに相当する増加ははるかに微弱であり、グリセロールおよびＮＥＦＡレベルはそれぞれ約３００％および０％となった。ＣＬ ３１６，２４３処置について、同様の観察結果が明らかになった。これらの実験で基礎グリセロールおよびＮＥＦＡレベルはやはり極めて類似していた。ｐｌｉｎ＋／＋マウスにおいて、ＣＬ処置によって、グリセロールおよびＮＥＦＡレベルはそれぞれ約１１００％および約４２０％刺激された。ｐｌｉｎ−／−マウスにおいて、ＣＬ ３１６，２４３による刺激はずっと低く、それぞれ約２００％および約１４０％となった（図４Ｅ）。基礎および刺激レベルの差異は、ｐｌｉｎ＋／＋対照に比較して非常に低下したｐｌｉｎ−／−マウスの脂肪組織量を考慮に入れることによって、容易に説明することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ脂肪分解実験（図４Ｄ）はｐｌｉｎ−／−脂肪細胞が基礎条件下で最大に近い脂肪分解を提示することを示している。したがって、著しく低下した脂肪量にもかかわらず、ｐｌｉｎ−／−マウスは比較的正常な基礎血漿グリセロールおよびＮＥＦＡレベルを維持することができた。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ実験で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察されたことが確認された。すなわち、ｐｌｉｎ−／−脂肪細胞はβ−アドレナリン作動性アゴニストへの曝露によって不十分にしか刺激されない。
【０２４９】
周囲温度２１℃では、ｐｌｉｎ−／−およびｐｌｉｎ＋／＋マウスは同様の体温だった（図５Ａ）。ｐｌｉｎ−／−マウスはその顕著に低下した皮下脂肪のため、環境温度の変化からの断熱が弱い可能性がある。したがって、ｐｌｉｎ−／−マウスが冷気への曝露に対してその体温を維持する能力を試験した。マウスを絶食状態で周囲温度４℃に供したとき（図５Ｂ）、ｐｌｉｎ−／−マウスの体温はｐｌｉｎ＋／＋同腹個体のものよりずっと早く低下し、乏しい熱保存性と一致する観察結果だった。しかし、実験を給餌状態で繰り返したとき（図５Ｃ）、ｐｌｉｎ−／−動物はｐｌｉｎ＋／＋同腹個体と同様に（少なくとも９時間）冷気に耐えることができたので、これらが熱発生応答によって、乏しい熱保存性を克服することが示された。実際、給餌状態では、ｐｌｉｎ−／−マウスの体温はｐｌｉｎ＋／＋のものよりもわずかに高い傾向にあり、乏しい断熱性による熱損失の増大にもかかわらず、正常な高温範囲に体温を維持するのに十分な熱が食物（および酸素）の代謝で生成されることが示された。
【０２５０】
ｐｌｉｎ−／−マウスの代謝速度が増加したかどうかを検証するため、直接の熱量測定によって、ｐｌｉｎ−／−およびｐｌｉｎ＋／＋マウスの総酸素消費量を試験した。これらに通常の食物を与えたとき、ｐｌｉｎ−／−マウスは野生型動物よりもわずかに多く（約１１％）Ｏ２を消費した（ｐｌｉｎ＋／＋１１週齢マウスで４２．８±３．０ ｍｌ／ｋｇ／分に対してｐｌｉｎ−／−で４７．６±３．６ ｍｌ／ｋｇ／分、ｎ＝５；ｐ＝０．０５２；１動物基準では、これらはｐｌｉｎ＋／＋で１．１６１±０．０７４ ｍｌ／分に対してｐｌｉｎ−／−で１．２５０±０．１７９；ｐ＝０．３３４、となった）。その差異は高脂肪食のときの方が、実質的により大きかった（２０％）（ｐｌｉｎ＋／＋１１週齢マウスで５０．０±１．９ ｍｌ／ｋｇ／分、ｎ＝６に対してｐｌｉｎ−／−で５９．２±３．２ ｍｌ／ｋｇ／分、ｎ＝４；ｐ＜０．００１；１動物基準では、これらはｐｌｉｎ＋／＋で１．３４０±０．０８８ ｍｌ／分に対してｐｌｉｎ−／−で１．４８６±０．０７７ ｍｌ／分；ｐ＝０．０２４、となった）。ｐｌｉｎ−／−とｐｌｉｎ＋／＋マウスとの間のＯ２消費量の差異は、マウスが起きて食べているときの方が眠っているときよりも大きかった（図５Ｄ）。
【０２５１】
高脂肪（３５％）食を３．５ヵ月摂った後、ｐｌｉｎ＋／＋マウスは肥満になったが、一方ｐｌｉｎ−／−マウスは食事誘発肥満に対して比較的耐性だった（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの条件下で、野生型マウスは巨大な精巣上体脂肪パッドを生じた。ｐｌｉｎ−／−マウスの精巣上体脂肪パッドのサイズも増加したが、通常の給餌食の野生型動物で観察されるものと差異がない相対重量となった（図６Ａ）。さらに、高脂肪食給餌後、総身体（死骸）脂肪含量はｐｌｉｎ＋／＋マウスに比較してｐｌｉｎ−／−マウスにおいてほぼ５０％低かった（ｐｌｉｎ−／−で２１．７％、ｐｌｉｎ＋／＋で４１．４％、図６Ｂ）。
【０２５２】
またペリリピン遺伝子の不活性化は、レプチン耐性に起因する肥満の遺伝モデルであるｄｂ／ｄｂマウス（Ｃｈｅｎら、１９９６， Ｃｅｌｌ ８４：４９１−４９５）を肥満の発生から保護した。２つの型の動物の交雑によって、ｐｌｉｎ−／−対立遺伝子が遺伝しているｄｂ／ｄｂマウスを取得した。注目すべきことに、これらのマウスは肥満表現型を喪失していた（図６Ｃおよび６Ｄ）。ペリリピンの不在の保護効果は一生の早期に明白だった。６週間目に、野生型マウスの重量は１７．５９±２．５９ ｇ（ｎ＝１１）、ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋の重量は３３．４５±１．６１ ｇ（ｎ＝４）、そしてｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−の重量は２４．９０＋２．１６ ｇ（ｎ＝３）だった。ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−とｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋との間の重量の著しい差異はマウスが成長しても続いた。１２週目には、重量が３０．２ ｇのｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスに比較して、野生型（ｎ＝１１）およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋（ｎ＝５）の重量がそれぞれ２４．９３±１．３７ ｇおよび４９．８３±４．１４ ｇだった。２０週目には、重量は野生型（ｎ＝１１）について２８．７８＋２．１４ ｇ、ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋（ｎ＝５）について６０．７５＋２．０９ ｇ、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスについて３３．５ ｇだった。図７Ａおよび７Ｂに示すように、ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／− マウスの体重はこのｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスの年齢が進むにつれて野生型マウスの体重に近付いていく。このように、ｄｂ／ｄｂマウス中のペリリピン対立遺伝子のノックアウトはｄｂ／ｄｂ遺伝子型に関係する肥満表現型を少なくとも部分的に逆行させる。さらに、ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスはｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋マウスに比較して、糖尿病の発症の遅延を提示した。
【０２５３】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して、ｐｌｉｎ−／−マウスおよびｐｌｉｎ＋／＋対照の断面の脂肪面積を定量した。脂肪画像はｐｌｉｎ＋／＋動物では約１５％だったのに対してｐｌｉｎ−／−の心臓領域を通じたスライスの総断面積が約７．６％を示した。肝臓領域のスライスでは、脂肪面積はｐｌｉｎ＋／＋の約９．２４％に対して、ｐｌｉｎ−／−では約３．５％だった。このように、個々の断面の脂肪面積の減少は５０〜６５％だった（データは示していない）。しかし、全身ＭＲＩを使用した時、ｐｌｉｎ−／−の総脂質含量（図６Ｄ、上右パネル）はｐｌｉｎ＋／＋マウス（図６Ｄ、上左パネル）に比較して、約３６％減少した。ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスの同様の分析から、ｄｂ／ｄｂの皮下および内蔵脂肪が顕著に減少し、総脂質シグナルがｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋で約６３％からｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−で約２７％に減少し、野生型のものに近い数値（約２４％）となったことが明らかになった（図６Ｄ、下部パネル）。これらのＭＲＩ分析から、マウス中のペリリピンの不活性化はｄｂ／ｄｂマウスの肥満表現型を逆行させることが確認される。二重ノックアウトマウスの過剰体脂肪の喪失は酸素消費量によって評価したように、代謝速度の増加に関係があった。マウスが食べている時かまたは眠っている時のいずれで測定をするかで、ＶＯ２の差異が明白だった（図５Ｅ）。
【０２５４】
６．３．　考察
出願人はｐｌｉｎ−／−マウスを作製したが、これは健康で、筋肉質で低脂肪性である。これらのマウスは食事誘発性肥満に抵抗性であり、ｄｂ／ｄｂマウス中でのｐｌｉｎ−／−対立遺伝子の遺伝はその肥満表現型を逆行させる。ｐｌｉｎ−／−マウス中の肥満耐性表現型はその高代謝速度の結果である。これらのマウス中の増加したエネルギー消費に関する機構の１つは、これらがより低脂肪の身体を持つことであり、これは代謝上活性である。考えられる別の機構は、脂肪細胞中に産生される遊離脂肪酸をｉｎ ｓｉｔｕで再エステル化することができ、ＡＴＰを消費し、酸素消費量の増加を導く、脂質生成および脂肪分解の空転サイクルがあることである。
【０２５５】
ｐｌｉｎ−／−マウスは、最近記載された矮小表現型を持つ肥満耐性Ｈｍｇｉｃ欠失マウスとは非常に異なっている（Ｚｈｏｕら、１９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７７１−７７４；Ａｎａｎｄら、２０００， Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３７７−３８０；Ｈｉｒｎｉｎｇ−Ｆｏｌｚら、１９９８， Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ ２３：３５０−３５７；およびＢｅｎｓｏｎら、１９９４， Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．６４：２７−３３）。脂肪細胞はＨｍｇｉｃ欠失によって影響される多くの間葉組織の１つである。野生型同腹個体よりも＞５０％軽いＨｍｇｉｃ−／−マウス（Ａｎａｎｄら、２０００， Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３７７−３８０）とは違って、ｐｌｉｎ−／−マウスは脂肪含量が低下しても正常な体重と増加した筋量を持つ。
【０２５６】
ｐｌｉｎ−／−マウスはアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールトランスフェラーゼが不活性化されたマウス（Ｄｇａｔ；Ｓｍｉｔｈら、２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：８７−９０）およびプロテインキナーゼＡ ＲＩＩβサブユニットが不活性化されたもの（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８２：６２２−６２６）と何らかの表面上の類似性を示している。３つのすべての型のマウスは増加したエネルギー消費と構成的な低脂肪性を示す（Ｓｍｉｔｈら 、２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：８７−９０；およびＣｕｍｍｉｎｇｓら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８２：６２２−６２６）。正常な乳の産生の欠陥を含む、Ｄｇａｔ不活性化の表現型の顕示の機構は、不明確である（Ｓｍｉｔｈら、２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：８７−９０）。プロテインキナーゼＡ ＲＩＩβサブユニットの不活性化は、明らかにプロテインキナーゼＡ ＲＩαサブユニットの代償的増加の結果として、脂肪分解を刺激する（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８２：６２２−６２６）。プロテインキナーゼＡ ＲＩＩβサブユニットは脂肪組織および脳内で発現され、他の場所でも低レベルで発現される。不活性化したプロテインキナーゼＡ ＲＩＩβサブユニットを持つマウスからのデータの可能な解釈の１つは、ＲＩＩβ不活性化の低脂肪表現型は脂肪ＲＩＩβの不活性化からよりも「プロテインキナーゼＡ活性のニューロン変化により直接的に由来する」ことである（Ｐｌａｎａｓら、１９９９， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６２８１−３６２８７）。対照的に、ペリリピンはもっぱら脂肪組織で、そしてステロイド合成組織で非常に低レベルで発現される。脂肪細胞内でのその不活性化は脂肪分解活性の増加、基礎代謝速度の上昇、および構成的低脂肪性の直接の原因であると見られる。
【０２５７】
７．実施例：ペリリピンの不在はｏｂ／ｏｂマウスの肥満を逆行させる
この実施例では脂質およびエネルギー代謝においてｉｎ ｖｉｖｏでペリリピンが果たす重要な役割を示す。この実施例ではまた、ペリリピンの発現もしくは活性のダウンレギュレーションの結果である有益な効果をも示す。
【０２５８】
７．１．　材料および方法
ｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウス
ｏｂ／ｏｂマウスおよびｐｌｉｎ−／−マウスを交雑することによって、ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスを作製した。
【０２５９】
ノーザンブロット分析
Ｂｉｏｔｅｃｚ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴｅｘａｓのＵｌｔｒａｓｐｅｃ ＲＮＡ単離キットによって、各種の組織からＲＮＡを単離した。使用したハイブリダイゼーションプローブは３２Ｐ標識クローン化した対応するマウスｃＤＮＡであった。ＲＮＡ（２０μｇ）を１％のアガロースゲル上で電気泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜フィルターに転写した。フィルターを対応する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブ（図１０〜１２参照）と４２℃で１６時間ハイブリダイズさせ、その後２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％のＳＤＳおよび２Ｘ ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで順次、そして最後に０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１ ％のＳＤＳで６５℃で３０分、洗浄した（１Ｘ ＳＳＣ＝１５ ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ９．０）。フィルターを−８０℃で２４〜７２時間、２つの増感スクリーンを持つＸ線フィルムに露光した。
【０２６０】
グルコース耐性試験
グルコース耐性については、マウスを１０時間絶食させ、その後体重１ ｋｇあたりグルコース １．５ ｇの用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。血糖値ストリップ（ＦａｓＴａｋｅ， ＬｉｆｅＳｃａｎ Ｉｎｃ．， Ｍｉｌｐｉｔａｓ， ＣＡ）を使用して、注射前および後のグルコースレベルをモニタリングした。Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬＬ）のＥＬＩＳＡキットを使用して、注射前および後のインスリンレベルをモニタリングした。
【０２６１】
７．２．結果
ペリリピン遺伝子の不活性化は、肥満の遺伝モデルであるｏｂ／ｏｂマウスを肥満の発生から保護した。ペリリピンの不在の保護効果は一生の早期に明白だった。図８Ａおよび８Ｂに示すように、ｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスの体重はｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ＋／＋マウスの体重に比較して低下した。ｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスの体重はこのｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスの年齢が進むにつれて野生型マウスの体重に近付いていく。このように、ｏｂ／ｏｂマウス中のペリリピン対立遺伝子のノックアウトはｏｂ／ｏｂ遺伝子型に関係する肥満表現型を少なくとも部分的に逆行させる。
【０２６２】
次に、ノーザンブロットアッセイを実施して、β−酸化に関与する酵素の発現に対するペリリピン不活性化の影響を判定した。図９にβ−酸化のステップを示す。図１０および１１に示すように、主要β−酸化酵素のためのｍＲＮＡレベルの増加が主として脂肪組織、心臓および筋肉中で検出された。これらの結果は、ペリリピンの不活性化から脂肪の分解が導かれる機構の１つが活性化されたβ−酸化によるものであることを示唆している。有効な仮説の１つは、ｐｌｉｎ−／−マウスでは、トリアシルグリセロールの合成が変更されないか、またはわずかな程度に二次的に変更されるだけであって、トリアシルグリセロールが合成されても即座に脂肪分解によって分解されて、ＡＴＰを浪費する空転サイクルを形成するというものである。
【０２６３】
ＵＣＰ類は「ＡＴＰを浪費」して熱エネルギーを生成することによって、エネルギー消費効率を低下させることが知られているので、脱共役タンパク質（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＵＣＰ）活性の刺激に対するペリリピン不活性化の影響を評価した。３つの相同性が高いＵＣＰ類、ＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２およびＵＣＰ−３、ならびにその他の実質的に相同性が低い２，３のものがある。図１２に示すように、ノーザンブロット分析を使用したとき、褐色脂肪組織中ではＵＣＰ−１ ｍＲＮＡ発現の濃度には差異がなかったが、褐色および白色脂肪組織ならびに心臓中で、ＵＣＰ−２ ｍＲＮＡの濃度の増加が検出された。これらの結果は、代謝速度および酸素消費量の増加に関してｐｌｉｎ−／−マウスが持つ可能性のある機構の１つがＵＣＰ類の誘導であることを示唆している。
【０２６４】
ｏｂ／ｏｂマウスのグルコース不耐性（真性糖尿病）に対するペリリピン不活性化の影響を評価した。野生型およびペリリピン対立遺伝子を有するかまたは有しないｏｂ／ｏｂマウスの血漿由来のグルコースおよびインスリン濃度を１０時間の絶食後に測定した。図１３Ａおよび１３Ｂにマウス中で検出した絶食時血漿グルコースおよび絶食時血漿インスリン濃度をそれぞれグラフによって示す。図１４Ａに示すように、ｏｂ／ｏｂマウスへのグルコースのｉ．ｐ．投与後の血糖値レベルは糖尿病性曲線を示した。対照的に、ｏｂ／ｏｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスの血糖値レベルは野生型対照と識別し得ないわけではないが、有意な差異はなかった。図１４Ｂに示すように、ｏｂ／ｏｂマウスへのグルコースのｉ．ｐ．投与後の血中インスリンレベルは野生型対照に比較して上昇した。ペリリピン対立遺伝子の不活性化はグルコースｉ．ｐ．投与３０分後にｏｂ／ｏｂマウスにおいて血中インスリンレベルを低下させた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。これらの結果は、ｏｂ／ｏｂマウス中で、ペリリピンの不活性化がグルコース不耐性を逆行させ、インスリン分泌異常を逆行させることを示唆している。ペリリピンのダウンレギュレーションの有益な効果のための以下の２つの機構がある：（ｉ） 体脂肪の量を減少させることによって、ｏｂ／ｏｂマウスのインスリン耐性を低下させる；および（ｉｉ） インスリンの分泌を改善する。
【０２６５】
本発明は、本発明の１つの態様を説明することを意図した代表的な実施形態によって、その範囲を限定すべきではない。実際、前記の説明および添付する図面から、本明細書で示し、かつ説明したものの他に、本発明の各種の改変が当業者に明らかになるであろう。こうした改変は添付する特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０２６６】
本明細書に引用した刊行物の全ては、それらの全体が参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐｌｉｎ−／−マウスの作製を示す。Ａ．　ターゲッティング戦略。Ｂ．　ＸｂａＩ消化後のテイルＤＮＡのサザンブロッティング。Ｃ．　精巣上体および皮下の脂肪（左）ならびに精巣（右）からの細胞抽出物のウェスタンブロッティング。
【図２】
ペリリピンの不活性化がｐｌｉｎ−／−マウスにおいて体重、脂肪蓄積、脂質含量、および筋量に及ぼす表現型効果を示す。
【図３】
ペリリピンの不活性化が脂肪組織に及ぼす効果を示す。
【図４】
Ａ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおいて４８時間の断食が体重および血漿パラメーターに及ぼす影響を示す。Ｂ．　精巣上体脂肪から抽出されたＨＳＬのウェスタンブロッティングを示す。Ｃ．　分離した脂肪細胞のＨＳＬ活性を示す。Ｄ．　分離した脂肪細胞における脂肪分解率を示す。Ｅ．　ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおける脂肪分解を示す。
【図５】
Ａ．　２１℃に保ったｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの体温を示す。Ｂ．　食餌を与えないで４℃の周囲温度に曝したマウスの体温を示す。Ｃ．　食餌を与えた状態で４℃の周囲温度に曝したマウスの体温を示す。Ｄ．　３５％の脂肪を含む食餌を与えたｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスにおける間接熱量測定からの代表的酸素消費（ＶＯ２）トレーシングを示す。Ｅ．　通常の食餌を与えた１４週齢のｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−マウスにおける代表的ＶＯ２トレーシングを示す。
【図６】
Ａ．　通常の食餌または３５％脂肪（ＨＦ）食餌を３．５か月間与えた後のｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウス群の精巣上体脂肪パッド量を示す。Ｂ．　通常の食餌または３５％脂肪（ＨＦ）食餌を３．５か月間与えた後のｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの総死骸脂肪含量を示す。Ｃ．　ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ＋／＋、ｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−、ｐｌｉｎ＋／＋およびｐｌｉｎ−／−マウスの写真を示す。Ｄ．　体脂肪分布の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を示す。
【図７】
Ａ．　４〜１７週にわたる雄ｄｂ／ｄｂ（三角）、ｐｌｉｎ＋／＋（四角）、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（円）マウスの体重を示す。Ｂ．　４〜２２週にわたる雌ｄｂ／ｄｂ（三角）、ｐｌｉｎ＋／＋（四角）、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（円）マウスの体重を示す。
【図８】
Ａ．　６〜２７週にわたる雄ｄｂ／ｄｂ（四角）、ｐｌｉｎ＋／＋（菱形）、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（三角）マウスの体重を示す。Ｂ．　６〜２４週にわたる雌ｄｂ／ｄｂ（四角）、ｐｌｉｎ＋／＋（菱形）、およびｄｂ／ｄｂ／ｐｌｉｎ−／−（三角）マウスの体重を示す。
【図９】
β−酸化のステップを示す。
【図１０】
脂肪アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの発現を示す。
【図１１】
三官能性タンパク質の発現を示す。
【図１２】
脱共役タンパク質（ＵＣＰ）の発現を示す。
【図１３】
Ａ．　絶食時血漿グルコースレベルを示す。Ｂ．　絶食時血漿インスリンレベルを示す。
【図１４】
グルコース不耐性試験を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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