(57)【要約】金属カルボニルが、例えば血管拡張及び移植後の拒絶反応の抑制等の、生物学的活性を有するＣＯを放出するために、用いられる。このカルボニルの金属には、一般的に、第７群乃至１０群のもの、例えばＦｅ及びＲｕが用いられる。また、かかるカルボニルは、ＣＯの放出特性及び溶解性を調節する為に、例えばアミノ酸等の、ＣＯ以外の配位子を、１つ又は複数有していることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属カルボニル化合物若しくはその薬学的に許容可能な塩、及び、少なくとも一つの薬学的に許容可能なキャリヤを含む、生理学的対象に一酸化炭素を放出するための薬剤組成物にして、該金属カルボニルが、以下の何れかの方法のうち少なくとも一つにより、生理学的効果に適したＣＯを利用可能としているものである：
１）該金属カルボニルの解離により放出されたＣＯが、該組成物中に、溶解形態にて存在している；
２）溶媒との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
３）組織、器官又は細胞との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
４）照射により、該金属カルボニルがＣＯを放出する。
【請求項２】
前記金属カルボニル化合物が、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｎｉ、Ｍｏ又はＣｏのうち少なくとも一つと、少なくとも一つのカルボニル配位子とから成る錯体である請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記金属が、ＣＯ以外の少なくとも一つの基に結合されている請求項１又は請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記ＣＯ以外の基が調節的な基であり、それによって前記化合物の溶解性及び／又は該化合物からのＣＯの放出が調節される請求項３に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
口、静脈、皮下、鼻、吸入、筋肉、腹膜、又は座薬を経由した投与に適合せしめられた請求項１乃至請求項４の何れかに記載の薬剤組成物。
【請求項６】
反応性成分として、式：Ｍ（ＣＯ）xＡy [但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、各Ａは原子、若しくはイオン結合、共有結合、或いは配位結合によってＭに結合した基であり、ｙ＞１の時、各Ａは、同じ若しくは異なる物である]で表される化合物、又は、該化合物の薬学的に許容可能な塩を含有する、ＣＯを放出するための薬剤組成物。
【請求項７】
前記Ｍが、遷移金属である請求項６に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
前記Ａが、ハロゲン類、Ｍに配位結合するための孤立電子対を有するＮ、Ｐ、Ｏ若しくはＳ原子を有する基、及び共役炭素基の中から選択された請求項６又は７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
口、静脈、皮下、鼻、吸入、筋肉、腹膜、又は座薬を経由した投与に適合せしめられた請求項６乃至請求項８の何れかに記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れかに記載の薬剤組成物を投与する工程を含む、ＣＯを生理学的に効果的な薬剤として哺乳類に導入する方法。
【請求項１１】
グアニル酸シクラーゼ活性による刺激の為の請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
神経伝達若しくは血管拡張の刺激の為の、又は、高血圧、放射線障害、内毒素性ショック、炎症、炎症に関わる疾病、酸素過剰が要因の負傷、アポトーシス、癌、移植による拒絶反応、動脈硬化、虚血後の臓器障害、心筋梗塞、アンギナ、出血性ショック、セプシス、陰茎勃起性機能不全、及び成人の呼吸障害症候群の何れかの治療の為の請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
口、静脈、皮下、鼻、吸入、筋肉、腹膜、若しくは座薬を経由した投与の為の、生理学的に効果的な薬剤としてＣＯによる神経伝達若しくは血管拡張の刺激を行なう為の、又は、高血圧、放射線障害、内毒素性ショック、炎症、炎症に関わる疾病、酸素過剰が要因の負傷、アポトーシス、癌、移植による拒絶反応、動脈硬化、虚血後の臓器障害、心筋梗塞、アンギナ、出血性ショック、セプシス、陰茎勃起性機能不全、及び成人の呼吸障害症候群の何れかの治療の為の薬剤の製造における金属カルボニル化合物の使用。
【請求項１４】
前記金属カルボニル化合物が、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｎｉ、Ｍｏ又はＣｏのうち少なくとも一つと、少なくとも一つのカルボニル配位子とから成る錯体である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
神経伝達若しくは血管拡張の刺激の為の、又は、高血圧、放射線障害、内毒素性ショック、炎症、炎症に関わる疾病、酸素過剰が要因の負傷、アポトーシス、癌、移植による拒絶反応、動脈硬化、虚血後の臓器障害、心筋梗塞、アンギナ、出血性ショック、セプシス、陰茎勃起性機能不全、及び成人の呼吸障害症候群の何れかの治療の為の薬剤の製造における請求項６乃至請求項８の何れかに記載の金属カルボニル化合物の使用。
【請求項１６】
生存する哺乳類の器官を体外にて処置する為の方法にして、請求項６乃至請求項８の何れかに記載の薬剤組成物に該器官を接触させることを含む方法。
【請求項１７】
式：Ｍ（ＣＯ）xＡyＢz [但し、ＭはＦｅ、ＣＯ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ若しくは少なくとも１であり、各Ａは、ＣＯ以外の配位子であり且つＭに対する一座配位子若しくは多座配位子であり且つ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 及びＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 の中から選択されるものであり、またＢは、任意、且つ、Ａがシステイン又はシステインのエステルである場合のＦｅ（ＣＯ）xＡy、及びＡがプロリンである場合のＲｕ（ＣＯ）xＡyを除いた、ＣＯ以外の配位子である]にて表される金属カルボニル化合物。
【請求項１８】
蟻酸、蟻酸塩、蟻酸エステル若しくは蟻酸アミド、蓚酸塩若しくは蓚酸エステル若しくは蓚酸アミド、又はそれらの薬学的に許容可能な塩である化合物、及び、少なくとも一つの薬学的に許容可能なキャリヤを含有し、そして該化合物が、生理学的効果に適したＣＯを利用可能とする、生理学的対象物に一酸化炭素を放出するための薬剤組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の薬剤組成物を投与する段階を含む、ＣＯを哺乳類に導入するための方法。
【請求項２０】
神経伝達若しくは血管拡張の刺激の為の、又は、高血圧、放射線障害、内毒素性ショック、炎症、炎症に関わる疾病、酸素過剰が要因の負傷、アポトーシス、癌、移植による拒絶反応、動脈硬化、虚血後の臓器障害、心筋梗塞、アンギナ、出血性ショック、セプシス、陰茎勃起性機能不全、及び成人の呼吸障害症候群の何れかの治療の為の、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化炭素を、人間及びその他の哺乳類に治療目的で放出する為の薬剤組成物や化合物に関するものである。これらの組成物及び化合物は、その他、臓器潅流において用いられる。
【背景技術】
【０００２】
一酸化炭素（ＣＯ）は、一般的な定義によると、無色、無臭、無味、非腐食性の、空気とほぼ同じ密度を有する気体であって、我々を取り巻く環境において最も一般的に遭遇する、浸透力の有る毒物である。それは、通常は、天然ガス、プロパン、石炭、ガソリン及び木材等の化石燃料の不完全燃焼によって産出される。大気中における、世界的な平均値は、０．１９ parts per million (ｐ．ｐ．ｍ)であると見積られており、そのうちの９０％は、海洋の微生物による産出を含めた自然源に由来しており、１０％は、人間の活動により産出されている。そのため、例え少量であれ、ＣＯの吸引は、生命体にとって避け得ないものである。
【０００３】
露呈の度合と時間により、ＣＯは、生物に対して無数の衰弱及び有害な後遺の影響を招来する（非特許文献１）。これらの影響のうち、最も迅速、且つおそらく最も悪評の高いものは、血流中のヘモグロビンとの結合であり、それによって心臓血管系の酸素運搬能力は急速に低下する。逆説的には、半世紀以上前には、ＣＯは人体の体内にて、少量ずつ絶え間なく形成されることが見出され（非特許文献２）、またある特定の病態生理学的条件の下においては、この内因性のＣＯの産出量が、かなり増加する場合があることが見い出された（非特許文献３−５）。ヘム依存性たんぱく質(heme-dependent protein)であるヘモグロビンが、生体内でのＣＯの産出のための基材として必要とされることの発見（非特許文献６、７）、及び、ヘムオキシゲナーゼ (heme-oxygenase) 酵素が、哺乳類の体内におけるこの気体分子の発生にとっての重要な経路であるとの判別（非特許文献８）は、血管系におけるＣＯの、予期せぬ、且つ未確認の役割についての、初期の調査の基礎となった（非特許文献９）。それに続くクローニング（非特許文献１０）及びヘムオキシゲナーゼの構成（ＨＯ−２）並びに誘導（ＨＯ−１）イソ型の特性化（非特許文献１１−１３）の他、前記酵素の動力学並びに組織についての研究（非特許文献１４）により、ヘムの生理学的分解における、かかる経路の、主な重要性が明らかになり始めた。すなわち、ヘム分解の最終産物（ＣＯ、ビリベルジン及びビリルビン）が、結局は、重要な生物学的活性を有しているかもしれないということである（非特許文献１５−１７）。
【０００４】
心臓血管系に関して、ＣＯが血管拡張の特性を有しているとの認識（非特許文献１８−２０）は、ＣＯに薬理学的機能があると考える上で、おそらくは最も重要な証拠となっている。ＣＯによって媒介されるシグナルを、特有の生物学的効果に変換するのに必要な分子のメカニズム及び化学修飾について、完全に解明する必要があるとはいうものの、説得力のある科学レポートが、近年、内因的に発生するＣＯのシグナル特性について強調している（非特許文献２１−２４）。
【０００５】
一酸化窒素（ＮＯ）の生理学的若しくは病態生理学的機能を再現する為の、自発的にＮＯを放出し、且つ簡単に入手可能な広範囲の有機化合物が開発されたことにより、ＮＯについての生理学的影響についての実験的研究が、容易になった。現在は、異型のＮＯ供給体、及びＮＯ放出薬剤についての豊富な文献があるので、それらの安定性並びに半減期に合わせて、前記の重要なシグナル分子の生物学的活動をシミュレートするための異種の生体内外のモデルに用いることができる（非特許文献２５、２６）。臨床診療においては、ニトロプルシドナトリウムや三硝酸グリセリン等の循環に、ＮＯを放出する化合物が、血圧を下げたり、特定の心臓血管疾患の治療を行なうために、用いられている（非特許文献２７）。選択的に一つの器官又は組織を対象とすることのできる機能性ＮＯ基を含む薬品が、特定の病態生理学的状態の治療のため、現在開発途中若しくは臨床試験中にある（非特許文献２８、２９）。しかし、今日迄、ＣＯを治療目的で放出することのできる化合物は、明らかにされていなかった。
【０００６】
ＵＳ５８８２６７４は、ペンタカルボニル鉄やエンネアカルボニル鉄のような金属カルボニル錯体を含有する、経皮放出システムによるＣＯの投与について提案している。しかし、この文献は、実験的データを何ら提供しておらず、特定の装置についての説明も無いことから、どのようにすれば、この提案を実施可能にできるのかは、不明である。特に、体内でＣＯを放出するように、鉄カルボニル錯体がパッチから吸収されることが意図されているのかどうか、又は該錯体がパッチ内で分解することでＣＯを放出し、皮膚を通じて吸収された後にＣＯが血流に入るのかどうか、ということは記載されていない。もし、この文献が、一酸化炭素を体内にて実用的且つ効果的に放出するための薬剤装置、組成物、及び方法を利用可能にするために考案されているのであるならば、かかる装置、組成物、及び方法は、本発明の範囲から除外される。
【０００７】
金属カルボニルに関する文献の中でも、ＷＯ９８／４８８４８は、フェイシャル金属トリカルボニル（facial metal tricarbonyl)化合物及び生物学的に活性な基質のラベリングにおける使用について記載している。該金属、好ましくは放射性核種は、第７群のものであり、Ｍｎ、99mＴｃ、186Ｒｅ、及び188Ｒｅとして同定されるものである。化合物：ｆａｃ−［Ｍ（ＣＯ）3（ＯＨ2）3］+ [但し、Ｍは金属である]が、生物学的に活性な基質を標識付けするために提案されており、その結果、生物学的に活性な様々な配位子を有する金属カルボニル化合物が得られる。その例では、放射性Ｔｃが用いられている。この文献は、診断用及び治療用の組成物の調製については記載しているが、特定の治療用組成物について、及び前記の治療による如何なる条件に対する如何なる治療についても、記載してはいない。一酸化炭素を生理学的対象物に放出するための該化合物の使用についても、開示されていない。もし、この文献が、該カルボニル化合物の治療目的での使用又は治療目的での投与の様式について開示しているとみなされるならば、この主題（subject-matter)については、本発明の範囲から除外される。少なくとも、この文献に開示されているフェイシャルカルボニル化合物の使用については、本発明から除外することが好ましい。
【０００８】
ＷＯ９１／０１１２８及びＷＯ９１／０１３０１は、光による老化の影響の修復の為の局所適用、又は、にきび或いは乾癬の治療の為の局所若しくは経口投与による皮膚治療用の組成物について記載している。前記活性化合物は、ポリエンエステル及びその鉄カルボニル錯体である。特に、鉄カルボニルの鉄は、ポリエン鎖に配位結合されている。鉄カルボニルを含める理由については、記されていない。これら二つの文献に開示されている、カルボニル化合物の治療目的での用法又は組成物に限っては、この用法及び組成物を、本発明の範囲から、特に除外する。
【０００９】
ＷＯ９８／２９１１５は、恒温動物の平滑筋を、特定の遷移金属のニトロシル化合物を投与することによって弛緩する為の、組成物及び方法について記載している。高血圧、狭心症、うっ血性心不全、及び勃起不全の治療について記載されている。この化合物の中には、ＮＯに加えて、配位子としてＣＯを含有しているものもある。特に、そのようなＣＯを含む化合物は、式：Ｌ3Ｍ（ＮＯ）yＸ3-y ［但し、Ｌは二電子のルイス塩基であるか、又は、Ｌ3が六電子のルイス塩基であり、Ｍは第６群若しくは第８群の遷移金属であり、ｙが１の場合にはｘは一酸化炭素である］にて表される。この文献の重要な教示内容は、ニトロシル錯体による治療効果である。ＣＯ配位子が存在する場合の、ＣＯを生理学的対象物に放出することによる治療効果については、何ら開示されていない。ここで開示されているＣＯを含有する金属ニトロシル錯体は、本発明の新規な金属カルボニルからは除外され、前記治療目的の用法についても、本発明から除外される。少なくとも、ＣＯを含有する遷移金属のニトロシル錯体は、本発明の範囲から除外されることが好ましい。
【００１０】
ＨＵ−Ｂ−２１１０８４は、ある組成物について記載しているが、それは、経口投与用の、骨強化のためのものであり、リン酸カルシウム、有機酸の少なくとも一つのカルシウム塩、及び任意にてペンタカルボニル鉄を含んでいる。本発明は、ペンタカルボニル鉄を、この文献にて特定されているカルシウム化合物と組み合わせて、この文献に記載されている治療目的の用法、及び投与の様式に関連した用法で用いることには言及しておらず、少なくとも、鉄カルボニル、及び鉄並びにＣＯを含む錯体を、リン酸カルシウム及び／又は有機塩のカルシウム塩と組み合わせて用いる用法について、解釈を広げないことが好ましい。
【００１１】
ＷＯ９５／０５８１４（ＵＳ６２８４７５２）及びＷＯ００／５６７４３は、共に、非常に広範囲な金属錯体の、反応性酸素種の過剰生産、特にＮＯの過剰生産に関係する病気の治療目的での使用について開示している。ここに記載されている目的は、ＮＯを、そのままの位置でスカベンジング又は除去することによって、体内のＮＯレベルを調節することである。血管収縮が内因性の一酸化窒素を除去したことによる直接的な結果であることを示す為に、生体外での試験データが記載されている。一酸化炭素が、配位子となりうるものとして記載されているが、一酸化炭素を含んだ錯体の例は、何も挙げられておらず、何の効果についても、ＣＯに帰されてはいない。これらの文献が、該特定の目的のために、ＣＯを含有する錯体の実用的な用法について開示していると考えられる限りは、かかる使用は、本発明の一部を構成しない。
【００１２】
【特許文献１】
ＵＳ５８８２６７４
【特許文献２】
ＷＯ９８／４８８４８
【特許文献３】
ＷＯ９１／０１１２８
【特許文献４】
ＷＯ９１／０１３０１
【特許文献５】
ＷＯ９８／２９１１５
【特許文献６】
ＨＵ−Ｂ−２１１０８４
【特許文献７】
ＷＯ９５／０５８１４（ＵＳ６２８４７５２）
【特許文献８】
ＷＯ００／５６７４３
【非特許文献１】
Piantadosi CA. Toxicity of carbon monoxide: hemoglobins vs. histotoxic mechanisms. In: Carbon monoxide. (Edited by Penney DG).1996; Chapter 8.
【非特許文献２】
Sjostrand T. Endogenous formation of carbon monoxide in man under normal and pathological conditions. Scan J Clin Lab Invest 1949;1:201-14.
【非特許文献３】
Coburn RF, Blakemore WS, Forster RE. Endogenous carbon monoxide production in man. J Clin Invest 1963;42:1172-8.
【非特許文献４】
Coburn RF, Williams WJ, Forster RE. Effect of erythrocyte destruction on carbon monxide production in man. J Clin Invest 1964;43:1098-103.
【非特許文献５】
Coburn RF, Williams WJ, Kahn SB. Endogenous carbon monoxide production in patients with hemolytic anemia. J Clin Invest 1966;45:460-8.
【非特許文献６】
Sjostrand T. The formation of carbon monoxide by in vitro decomposition of haemoglobin in bile pigments. Acta Physiol Scand 1952;26:328-33.
【非特許文献７】
Coburn RF, Williams WJ, White P, Kahn SB. The production of carbon monoxide from hemoglobin in vivo. J Clin Invest 1967;46:346-56.
【非特許文献８】
Tenhunen R, Marver HS, Schmid R. Microsomal heme oxygenase. Characterization of the enzyme. J Biol Chem 1969;244:6388-94.
【非特許文献９】
Scharf SM, Permutt S, Bromberger-Barnea B. Effects of hypoxic and CO hypoxia on isolated hearts. J Appl Physiol 1975;39:752-8.
【非特許文献１０】
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【非特許文献１２】
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【非特許文献１３】
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【非特許文献１５】
Marks GS, Brien JF, Nakatsu K, McLaughlin BE. Does carbon monoxide have a physiological function? Trends Pharmacol Sci 1991;12:185-8.
【非特許文献１６】
Stocker R, Yamamoto Y, McDonagh AF, Glazer AN, Ames BN. Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance. Science 1987;235:1043-6.
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【非特許文献１９】
Vedernikov YP, Graser T, Vanin AF. Similar endothelium-independent arterial relaxation by carbon monoxide and nitric oxide. Biomed Biochim Acta 1989;8:601-3.
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Furchgott RF, Jothianandan D. Endothelium-dependent and -independent vasodilation involving cGMP: relaxation induced by nitric oxide, carbon monoxide and light. Blood Vessels 1991;28:52-61.
【非特許文献２１】
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【非特許文献２２】
Christodoulides N, Durante W, Kroll MH, Schafer AI. Vascular smooth muscle cell heme oxygenases generate guanylyl cyclase-stimulatory carbon monoxide. Circulation 1995;91:2306-9.
【非特許文献２３】
Sammut IA, Foresti R, Clark JE, Exon DJ, Vesely MJJ, Sarathchandra P, Green CJ, Motterlini R. Carbon monoxide is a major contributor to the regulation of vascular tone in aortas expressing high levels of haeme oxygenase-1. Br J Pharmacol 1998;125:1437-44.
【非特許文献２４】
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【非特許文献２５】
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【非特許文献２６】
Feelisch M. The use of nitric oxide donors in pharmacological studies. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 1998;358:113-22.
【非特許文献２７】
Luscher TF. Endogenous and exogenous nitrates and their role in myocardial ischaemia. Br J Clin Pharmacol 1992;34 Suppl 1:29S-35S.
【非特許文献２８】
Saavedra JE, Billiar TR, Williams DL, Kim YM, Watkins SC, Keefer LK. Targeting nitric oxide (NO) delivery in vivo. Design of a liver-selective NO donor prodrug that blocks tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis and toxicity in the liver. J Med Chem 1997;40(13):1947-54.
【非特許文献２９】
Saavedra JE, Southan GJ, Davies KM, Lundell A, Markou C, Hanson SR, Adrie C, Hurford WE, Zapol WM, Keefer LK. Localizing antithrombotic and vasodilatory activity with a novel, ultrafast nitric oxide donor. J Med Chem 1996;39(22):4361-5.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以下に詳記する実験データによって例証されているように、本発明者らは、生理学的効果を与えるべく、ＣＯを生理学的対象乃至は標的 (physiological target) に放出するために、金属カルボニル化合物の利用が可能であることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、本発明は、金属カルボニル化合物若しくはその薬学的に許容可能な塩、及び、少なくとも一つの薬学的に許容可能なキャリヤ (carrier) を含む、生理学的対象物に一酸化炭素を放出するための薬剤組成物において、該金属カルボニルが、以下の何れかの方法のうち少なくとも一つにより、生理学的効果に適したＣＯを利用可能としているものである：
１）該金属カルボニルの解離により放出されたＣＯが、該組成物中に、溶解形態にて存在している；
２）溶媒との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
３）組織、器官又は細胞との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
４）照射により、該金属カルボニルがＣＯを放出する。
【００１５】
ここにおいて、特定の金属カルボニル化合物は、適切な溶媒との接触により、ＣＯを放出可能である。前記薬剤組成物が、液状にて投与される場合には、この溶媒は、該薬剤組成物の構成成分の一部を成すことがある。従って、本発明のこの態様においては、該薬剤組成物は、前記金属カルボニルから放出されたＣＯを、溶解した形態にて含有していることになる。前記薬剤の調製中に、該カルボニル化合物が該溶媒に溶解している状態は、そのようにして放出されたＣＯが溶液中に保持されるように制御され得る。これは、解離した構成成分と、解離していないカルボニルとの間に平衡が存在する場合には、促進され得る。
【００１６】
母体のカルボニルから解離した構成成分自身が、更に、ＣＯを放出可能な金属カルボニル化合物である場合もある。例えば、［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2 がＤＭＳＯに溶解している場合、ＣＯは溶液中に遊離し、トリカルボニル及びジカルボニルの錯体の混合物が形成され、これら自身が更にＣＯを放出可能である。
【００１７】
本発明の別の態様においては、前記薬剤組成物自身は、解離したＣＯを含有していないものの、適切な溶媒又は媒体に接触することによって、ＣＯを放出するように調製することもできる。例えば、該組成物には、水との接触、すなわち血液やリンパ液のような水性の生理的液体との接触によって、ＣＯを放出することの出来る金属カルボニル化合物を含有させることができる。あるいは、該薬剤組成物は、投与の前に水中に溶解せしめられるようにすることもできる。このような薬剤組成物は、溶液の形態、又は錠剤形態等の固体形態で調製することができる。もし、これが溶液の形態にある場合には、適切な溶媒との接触があった場合にのみＣＯの放出が起きるように、一般的には、金属カルボニル化合物の解離を助けることのない溶媒にて、調製される。
【００１８】
その代わりに、又はそれに加えて、前記錯体からのＣＯの放出は、例えば該錯体からのＣＯの損失を引き起こす、該錯体の配位子の一つを置換する、溶液中の配位子との反応によって、刺激され得る。
【００１９】
本発明の別の態様においては、前記薬剤組成物には、組織、器官、若しくは細胞との接触によってＣＯを放出する金属カルボニル化合物を含めることができる。以下に示すように、ある特定の金属カルボニル化合物は、溶液中にはＣＯを放出しないものの、血管内皮のような生理学的な細胞性物質 (cellular material) 若しくは組織にはＣＯを放出することが可能である。例えば、［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（２，２’−bipyridine）（ＣＯ）2］は、以下に示す如く、溶液中のミオグロビンにＣＯを放出することは無いが、予め萎縮した大動脈環状部の拡張を促進させることが可能である。特定の理論に限定されたくは無いが、ＣＯは、シトクロムのような細胞性成分を介在させることにより、酸化還元反応の結果として、前記のような化合物から放出され得るのである。
【００２０】
しかし、酸化還元が起きなくとも、少なくとも該錯体から最初のＣＯの損失が起きるために、本発明は、ＣＯ放出のメカニズムとしての酸化還元反応に限定されるものではないのである。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、該薬剤組成物には、照射によってＣＯを放出する金属カルボニル化合物を含めることができる。この化合物には、例えば溶解したＣＯの溶液を作製する為に、投与の前に照射を行なうことが可能であり、又は、投与の後に原位置 (in situ) にて照射することも可能である。このような組成物は、ＣＯを制御し、局所的に放出することができると考えられる。例えば、この種の薬剤組成物は、手術中に投与することができ、例えば血管拡張を促す場合等、特にＣＯを必要とする箇所に、レーザー、或いは紫外線等その他の放射エネルギー源による局所的な放射により、ＣＯを放出することができる。
【００２２】
本発明の薬剤組成物は、一般的には、治療の対象物に対して溶解された形態において利用可能となるような方法にて、ＣＯを放出するものである。しかし、ある状況下では、ＣＯは、金属カルボニルから、非溶媒アクセプター分子に対して、直接に放出される。
【００２３】
本発明に従う薬剤組成物が、上記作用形態の一つ又はそれ以上によって、治療用にＣＯを放出可能であることが明白となる。
【００２４】
概して、該金属カルボニル化合物は、遷移金属、好ましくは第７群若しくは第８群乃至第１０群の遷移金属の錯体から構成されるものである（本明細書では、周期表の群には、ＩＵＰＡＣ命名法に従い、１乃至１８までの番号が付けられている）。少なくとも一つのカルボニル配位子が存在していることが条件である他は、カルボニル配位子の数は限定されていない。好適な金属は、分子量の低い遷移金属、中でも特に、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏ及びＲｈである。その他に使用可能な二種の金属は、Ｐｄ及びＰｔである。本発明で用いられる金属カルボニル錯体の金属は、概して、酸化状態が低いもの、即ち、０、Ｉ又はIIのものである。好適な金属は、概して、ＦｅII、ＲｕII、ＭｎI、ＣｏII、好ましくはＣｏI、ＲｈIII、更に好ましくはＲｈI、ＮｉII、ＭｏII、よりも酸化状態が高くないものである。この金属は、放射性核種では無いことが、好ましい。Ｆｅは、哺乳類に多量に存在するため、特に適した金属である。
【００２５】
前記金属カルボニル化合物は、錯体であるとみなされる。なぜなら、それは、金属中心に配位結合したＣＯ基を有しているためである。しかし、該金属は、配位結合以外、例えばイオン又は共有結合によって、その他の基にも結合しても良い。そのため、該金属カルボニル組成物の一部を形成するＣＯ以外の基は、孤立電子対を介して金属中心に配位結合されるという点において、厳密に「配位子」である必要は無いが、ここでは、参照し易くする為に、「配位子」として言及する。
【００２６】
従って、金属への配位子は、例えば、［Ｍｎ2（ＣＯ）10］のように、全てカルボニル配位子であっても良い。その代わりに、該カルボニル化合物には、少なくとも一つの調節的な配位子を含めても良い。これによって、ＣＯでは無いが、該錯体特有の特性、例えばＣＯを放出する傾向、溶解性、疎水性、安定性、電気化学ポテンシャル等を調節する配位子が意味される。そのため、配位子の適切な選択は、該化合物の性質を調節するために、行なわれる。例えば、有機及び／又は水性溶媒における該化合物の溶解性、細胞膜を通過する能力、特定の溶媒若しくは細胞種類と接触した際或いは放射時のＣＯの放出率、を調節することが望ましい。
【００２７】
このような配位子は、一般的に、ハロゲン化物のように、中性若しくは陰イオン性の配位子であり、又はルイス塩基から誘導され、配位原子としてＮ、Ｐ、Ｏ若しくはＳ、或いは共役炭素基を有するものである。好適な配位原子は、Ｎ、Ｏ、及びＳである。例としては、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド、例えば、グリシン、システイン、プロリン等の天然及び合成アミノ酸とそれらの塩、ＮＥｔ3 並びにＨ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 等のアミン、ｂｉ−２，２’−ピリジル、インドール、ピリミジン並びにシチジン等の芳香族塩基並びにその類似化合物、ビリベルジン並びにビリルビン等のピロール、ＹＣ−１（２−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインダゾール）等の薬物分子、ＥｔＳＨ並びにＰｈＳＨ等のチオール並びにチオレート (thiolates)、塩化物、臭化物並びにヨウ化物、蟻酸塩、酢酸塩並びに蓚酸塩等のカルボン酸塩、Ｅｔ2Ｏ並びにテトラヒドロフラン等のエーテル、ＥｔＯＨ等のアルコール、及びＭｅＣＮ等のニトリルが含まれるが、それらに限定される訳ではない。特に好適なものは、アミノ酸等の配位結合の配位子で、水溶液中の該カルボニル錯体を安定化させるものである。その他の利用可能な配位子は、ジエン等の共役炭素基である。本発明において有用な金属カルボニル化合物を与え得ることが可能な配位子の一種は、シクロペンタジエン（Ｃ5Ｈ5）、及び置換シクロペンタジエンである。置換されたシクロペンタジエンにおける置換基には、例えば、アルカノール、エーテル若しくはエステル、例えば、−（ＣＨ2）nＯＨ［但し、ｎは１乃至４である］、特に、−ＣＨ2ＯＨ、−（ＣＨ2）n ＯＲ［但し、ｎは１乃至４であり、Ｒは、炭化水素、好適には１乃至４の炭素原子を有するアルキルである］、−（ＣＨ2）n ＯＯＣＲ［但し、ｎは１乃至４であり、Ｒは、炭素原子、好適には１乃至４の炭素原子を有するアルキルである］等がある。シクロペンタジエン又は置換シクロペンタジエンのカルボニル錯体における好適な金属は、Ｆｅである。シクロペンタジエンカルボニル錯体は、塩化物等のアニオンに会合するカチオンであることが好ましい。
【００２８】
上記のように、ＷＯ９８／２９１１５にて開示されている特定の金属ニトロシル錯体、及び開示されているそれらの用法は、本発明から除外され、本発明は、少なくともＮＯ（ニトロシル）を含有する金属カルボニル錯体に対して、解釈を広げないことが好ましい。更に、上記のように、ＷＯ９１／０１１２８及びＷＯ９１／０１３０１にて開示されている特定の鉄カルボニル錯体、及びそこで開示されている用法については、本発明から除外される。本発明は、鉄カルボニルポリエン錯体の、局所又は経口での投与に対して、また、これらの錯体自体に対しても、解釈を広げないことが好ましい。
【００２９】
本発明から更に除外されるものは、ＷＯ９８／４８８４８に開示されているＭｎ及び放射性核種の錯体である。本発明では、それらＭｎ錯体の、治療目的での使用を、除外することが好ましい。いかなる場合でも、本発明では、放射性金属のカルボニルについて、除外することが好ましい。
【００３０】
グアニル酸シクラーゼ活性による刺激を通じて、ＣＯが、少なくとも一部において機能することが示されている。従って、該金属カルボニル化合物には、グアニル酸シクラーゼに対するＣＯの影響を調節する配位子が含有されていることが望ましいと言える。例えば、薬品ＹＣ−１（３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインドール）は、ＣＯによるグアニル酸シクラーゼの刺激を強めるものとして考えられている。従って、ＹＣ−１又はその誘導体等の配位子を、金属カルボニル化合物に混合することにより、放出されたＣＯの、生物学的効果を変更又は拡大することができる。
【００３１】
そのため、本発明の薬剤組成物の特性は、該金属カルボニル化合物中における金属中心、及び結合されている配位子の数や種類を適切に選択することによって、要求されるように調整することができる。
【００３２】
そのような金属カルボニル化合物は、更に、適切な部位でのＣＯの放出を容易にするため、標的となる成分 (targeting moiety) を含むことができる。この標的となる成分は、必要とされた部位でのＣＯの放出を促進させるため、一般的に、特定の目標となる細胞の表面上で、レセプターを結合することが可能である。この標的となる成分は、前記標的となる細胞の表面上に見られるレセプターに結合可能な調節配位子の一部であってもよく、例えば適切なリンカー (linker) によって該錯体につながっている、特定のレセプターに対して向けられた抗体のような別の分子から誘導され得る。
【００３３】
本発明は、活性成分として、式：Ｍ（ＣＯ）xＡy ［但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、Ａは原子、若しくはイオン結合、共有結合、或いは配位結合によりＭに結合した基であり、ｙ＞１の時、各Ａは、同じであっても異なっていても良い]で表される化合物、或いは、該化合物の薬学的に許容可能な塩を含有する、ＣＯを放出するための薬剤組成物も、提供するものである。一般的には、Ｍは、遷移金属、特に、第７群又は第８群乃至第１０群のものであり、Ａは、ハロゲン類、Ｍに配位結合するための孤立電子対を与えるＮ、Ｐ、Ｏ若しくはＳ原子を有する基、及び共役炭素基 (conjugated carbon groups)の中から選択され得るものである。好適な金属及び配位子についての更なる詳細については、上記に記載されている。該カルボニル錯体は、薬学的に許容可能なもの、特に、毒性の無いもの、又は適用量から考えた時の毒性が許容範囲であるものにすべきである。
【００３４】
本発明の前記薬剤組成物は、概して、薬学的に許容可能なビヒクル、キャリヤ、緩衝剤、安定剤、又は当業者に公知のその他の材料を含有している。このような材料は、毒性の無いものであるべきであり、活性成分の効力に対して過度に妨げないものにすべきである。前記キャリア又はその他の材料の正確な性質は、例えば、口、静脈、皮下、鼻、吸入、筋肉、腹膜、又は座薬のルート等、投与の経路に合ったものにすることができる。
【００３５】
経口投与のための薬剤組成物は、錠剤、カプセル、粉末、又は液体の形態にすることができる。錠剤には、ゼラチン又はアジュバンド（佐剤）又は遅放出性のポリマー等のキャリヤを含めても良い。液状の薬剤組成物は、一般的に、水、石油、動物性若しくは植物性オイル、鉱油、又は合成油等のキャリヤを含んでいる。生理食塩水、ブドウ糖若しくはその他の糖類の溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコール等のグリコール類を含めることができる。薬学的に許容可能な量のその他の溶媒も、特に組成物に含まれる特定の金属カルボニル化合物を解離させるために必要である場合には、含有させることができる。
【００３６】
静脈、皮膚若しくは皮下注射、又は苦痛がある部位への注射のため、前記活性成分は、一般的に、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性、並びに安定性を有する、非経口的に許容可能な溶液形態であるものが用いられる。関連の当業者であれば、例えば、生食注射、リンゲル注射、乳酸加リンゲル注射等の等張性のビヒクルを用いて適切な溶液を調製する能力を十分に備えている。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、及び／又はその他の添加剤も、必要に応じて加えることができる。針を用いない注入による放出システムについても知られており、かかるシステムと共に用いる組成物についても、それに応じて調製することができる。
【００３７】
投与は、予防効果のある量、又は治療効果のある量（但し、場合により、予防も治療と考えられることがある）にすることが好ましく、各個人に利益を示すのに十分なものとする。投与される実際の量、及び、投与の割合並びに時間毎の量は、治療内容の性質及び重症度に左右される。治療の処方、例えば投与量の決定等については、一般開業医及びその他の医師の責任の範囲内であり、一般的には、治療対象となる異常症、個々の患者の健康状態、放出部位、投与の方法、及び医師が知るその他の要因が考慮される。上記の専門技術及びプロトコルの例については、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980 に記されている。
【００３８】
本発明に従う薬剤組成物を処方する際には、活性成分及び／又は溶媒の毒性について考慮しなければならない。医学的効果と毒性とのバランスを、考慮に入れるべきである。該組成物の投与量及び処方は、通常は、構成要素の毒性によるあらゆるリスクに勝る医学的効果が得られるように、決定される。
【００３９】
ここでは更に、本発明に従う薬剤組成物を投与する工程を含めた、ＣＯを哺乳類に導入する方法についても示される。ＣＯは、少なくとも、その一部が、グアニル酸シクラーゼの刺激又は活性を通じて作用すると考えられている。ＣＯは、とりわけ、神経伝達物質及び血管拡張剤としての機能を有すると考えられている。それゆえ、ここでは、グアニル酸シクラーゼ活性を刺激するためにＣＯを哺乳類に放出する方法についても、提供する。ここでは更に、神経伝達又は血管拡張を刺激するためにＣＯを哺乳類に放出する方法についても、提供する。しかし、本願は、理論に束縛されることは好んでおらず、又、ＣＯが他のメカニズムによって作用する可能性を、除外するものでも無い。
【００４０】
ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）経路は、長波長紫外線（ＵＶＡ）の放射、発癌性物質、虚血再潅流による障害、内毒素性ショック、及び酸素フリーラジカルの生成によって特徴付けられるいくつかの他の状態 (condition) を含む、ストレス刺激に対する、中枢の内因性の誘導防衛システムを代表するものであると考えられている（参考文献３０−３２）。ＨＯ−１の保護効果は、強力な酸化防止剤であるビリベルジン並びにビリルビン、及び血管に作用する気体状ＣＯの発生に、起因している。ＨＯ−１の発現は、心臓の異種移植片の生存（参考文献３３）、移植による動脈硬化の抑制（参考文献３４）、及び虚血後の心筋の機能不全の改善（参考文献３５）に関連付けられてきた。ＨＯ−１は、ラットにおける急性の炎症の消散時期にも、直接的に影響している（参考文献３６）。敗血症の他、脳並びに肝臓内の出血性ショックのような、その他の病理的状況（参考文献３７−３９）は、ＨＯ−１遺伝子の誘導によって特徴付けられるが、これは、こうした病理学的状態が原因にて起きる、血管機能障害を妨げる上で、重要な役割を果たしている。ＨＯ−１の誘導の結果である、ＣＯ発生量の増加は、血管の収縮性に著しい影響を与え、生物全体の急性の高血圧を減少させる（非特許文献２３、参考文献４０）。動物を、濃度の低いＣＯを含む大気に晒したり、又はＨＯ−１遺伝子のトランスフェクションを行なうと、生体内の酸素過剰が原因による肺疾病から保護することができるが、このメカニズムは、好中球炎症及び肺アポトーシス（細胞死）の両方を弱めることによるものである（参考文献４１、４２）。外因性のＣＯガスにも、体内外にて、炎症前のサイトカインを抑制し、抗炎性分子であるＩＬ−１０の発現を、調整する能力がある（参考文献４３）。従って、本発明に従うＣＯの投与は、炎症状態の調整、及び癌を含めたその他の病理学的状態の緩解のため、これらの症状の何れに対しても、用いることができる。
【００４１】
そのため、ここでは、急性の、肺の、並びに慢性の高血圧等の高血圧症、放射線障害、内毒素性ショック、炎症、喘息並びに慢性関節リウマチ等の炎症に関わる疾病、酸素過剰が原因による疾病、アポトーシス、癌、移植による拒絶反応、動脈硬化、虚血後の臓器障害、心筋梗塞、アンギナ、出血性ショック、セプシス、陰茎勃起障害、及び成人呼吸窮迫症候群の治療の為の、本発明に従う薬剤組成物を投与する工程を含めた、ＣＯを哺乳類に導入する方法を開示する。
【００４２】
本発明は、ここに記載されている金属カルボニル化合物を用いた、生理的効果、例えば神経伝達若しくは血管拡張の刺激の為の、又は、急性の、肺の、並びに慢性の高血圧等の高血圧症、放射線障害、内毒素性ショック、炎症、喘息並びに慢性関節リウマチ等の炎症に関わる疾病、酸素過剰が要因の疾病、アポトーシス、癌、移植による拒絶反応、動脈硬化、虚血後の臓器障害、心筋梗塞、アンギナ、出血性ショック、セプシス、陰茎勃起障害、及び成人呼吸窮迫症候群の何れかの治療の為の生理的効果を与えるように、ＣＯを生理学的な対象物、特に哺乳類に放出するための薬剤の製造のための用法についても提供する。かかる薬剤は、口、静脈、皮下、鼻、吸入、筋肉、腹膜、又は座薬ルート等を経由しての投与に、適用することができる。本発明は、金属カルボニル、又はその分解生成物の、皮膚又は粘膜を通じた生物への放出については、除外することが好ましい。
【００４３】
本発明は、更に、ここに記載の該金属カルボニルの、例えば、移植手術の為に、臓器を保管及び／又は輸送している間等に、活性能力のある哺乳類の器官を体外にて (extracorporally) 処置する場合、例えば潅流によって処置する場合における用法についても、提示するものである。この目的のため、該金属カルボニルは、溶解形態、好ましくは水溶液の状態とする。該活性能力のある器官とは、例えば、心臓、腎臓、肝臓、皮膚、又は筋肉皮弁等、生きた細胞を含んだあらゆる組織のことである。
【００４４】
本発明は、また、式：Ｍ（ＣＯ）xＡyＢz［但し、ＭはＦｅ、Ｃｏ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ又は少なくとも１であり、各ＡはＣＯ以外の配位子であり且つＭに対する単座配位子若しくは多座配位子であり且つ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 及びＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 の中から選択されるものであり、またＢは、任意であり、且つ、ＣＯ以外の配位子で、Ａがシステイン又はシステインのエステルである場合のＦｅ（ＣＯ）xＡy、及びＡがプロリンである場合のＲｕ（ＣＯ）xＡyを除いてある]で表される金属カルボニル化合物から成るものである。
【００４５】
ｘは好ましくは３であり、ｙは好ましくは１であり、ｚは好ましくは１である。
【００４６】
ここで用いられる、アミノ酸という用語には、グリシナト（glycinato) のように、酸性水素の損失によって得られる種も含まれる。
【００４７】
Ｂzは、一つ又はそれ以上の、任意による、その他の配位子を意味する。Ｂについては、特に制限は無く、塩化物、臭化物並びにヨウ化物等のハロゲン化物、及び酢酸塩等のカルボン酸塩の配位子を、用いることができる。
【００４８】
Ｍは、Ｆｅ、Ｒｕ、及びＣｏの中から選ばれる。これらの金属は、前記の通り、酸化状態が低いものであることが、好ましい。
【００４９】
［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（２，２’−bipyridine）（ＣＯ）2］及び［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）（ＣＯ）2］で表される公知の鉄化合物の使用についても、本発明には、考慮に入れられている。
【００５０】
更に、上記に記載の該金属カルボニル化合物の代わりに、本発明の薬剤組成物に、蓚酸塩化合物、蟻酸、又は蟻酸塩化合物といった、生理学的対象に同様にＣＯを放出することができる成分を含有せしめることについても考慮される。例えば、ビス−（２，４−ジニトロフェニル）蓚酸塩は、水中で分解することにより、ＣＯが溶液中に遊離することで知られている。従って、本発明は、更に、一酸化炭素を生理学的対象物に放出するための、蟻酸、蟻酸塩、蟻酸エステル若しくは蟻酸アミド、蓚酸塩若しくは蓚酸エステル若しくは蓚酸アミド、又はそれらの薬学的に許容可能な塩、及び、少なくとも一つの薬学的に許容可能なキャリヤを含有する薬剤組成物も、提供するものであり、該蟻酸、蟻酸塩、蓚酸塩、若しくはそれらのアミド若しくはエステルは、生理学的効果に適したＣＯを利用可能とするものである。
【００５１】
ビス−（２，４−ジニトロフェニル）蓚酸塩のニトロフェニル基は、良好な離脱基であると考えられているが、それは、ニトロ基に、電子吸引効果があり、それによって、蓚酸塩の分解が促進され、ＣＯが産出されるからである。
【００５２】
そのため、それ自身の中に酸性基を有する蓚酸塩又は蟻酸塩は、例えばエステル結合等によって、トシル基等の電子吸引性置換基と共に芳香族基に結合するものであり、本発明に従う薬剤組成物における使用に、特に適していると考えられる。
【００５３】
ここでは、更に、蟻酸、蟻酸塩、蟻酸エステル若しくは蟻酸アミド、又は、蓚酸塩、蓚酸エステル若しくは蓚酸アミド、又はそれらの薬学的に許容可能な塩、及び、少なくとも一つの薬学的に許容可能なキャリヤを含有する薬剤組成物を投与する工程乃至は段階を含めた、一酸化炭素を哺乳類に導入する方法についても、提示する。
【００５４】
金属カルボニル化合物に関する、上記全ての記載及び開示内容は、蟻酸、蟻酸塩、蓚酸塩、並びに蟻酸若しくは蓚酸のアミド若しくはエステルも、関係するものであると考えられる。
【００５５】
本願を通して、医療への言及は、人間の治療及び獣医学的な治療の両方を含めることが意図されているため、薬剤組成物への言及も、人間の治療及び獣医学的治療での使用のための組成物を包含することが、意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明を説明する実験データは、添付図面を参照することにより、明らかにされるであろう。
【００５７】
ここに記載の実験のために、鉄五カルボニル、［Ｆｅ（ＣＯ）5］、二マンガンデカカルボニル (dimanganese decacarbonyl)、［Ｍｎ2（ＣＯ）10］、トリカルボニルジクロロルテニウム（II）二量体、［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2、及び、塩化ルテニウム（III）水和物、ＲｕＣｌ3が、Sigma-Aldrich Company Ltd. (Poole, Dorset, UK) から購入された。その他のカルボニル錯体は、以下に記載の通り合成した。金属カルボニル錯体のストック溶液 (stock solution)は、該化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、水、又は塩水中に溶解することにより、各実験前に新しいものを調製した。ヘミン（フェリプロトポルフィリン  IX  塩化物）及びスズプロトポルフィリン IX (ＳｎＰＰＩＸ)は、Porphyrin Products Inc. (Logan, Utah, USA)からのものである。両方のポルフィリンのストック溶液は、０．１  Ｍ  ＮａＯＨに、該化合物を溶解することによって調製し、その後、０．０１Ｍリン酸緩衝液を加えることで、そのｐＨが７．４になるよう調整した。該グアニル酸シクラーゼ阻害剤、[１Ｈ−[１，２，４]オキサジアゾール［４，３−ａ］キノキサリン−１−オン]（ＯＤＱ）は、Alexis Corporation (Bingham, Nottingham, UK)より入手し、ウサギの抗ＨＯ−１の多クローン性抗体は、Stressgen (Victoria, Canada) から購入した。馬の心臓のミオグロビン、ＮG−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエーテル（Ｌ−ＮＡＭＥ）及び、その他全ての試薬は、特に記載が無い限りは、Sigmaからのものである。
【００５８】
全てのデータは、平均値±標準誤差（推定量の標準偏差）で示してある。分析を行なったグループ間の違いについては、両側検定のt-テスト（Student's two-tailed t-test）による評価が行なわれ、２つを越える治療について比較する場合には、変量分析（ＡＮＯＶＡ）が実施された。結果は、ｐ＜０．０５と、統計的に有意のものであった。
【００５９】
Ａ．遷移金属カルボニル錯体から遊離したＣＯの検出
金属カルボニル錯体からのＣＯの遊離について、デオキシミオグロビン（デオキシ−Ｍｂ）から一酸化炭素ミオグロビン（ＭｂＣＯ）への転化を分光学的に測定することによって評価した。ＭｂＣＯは、５００乃至６００ｎｍの間に、特有の吸収スペクトルを有しており、遊離したＣＯの量を定量する為に、５４０ｎｍの時の変化が用いられた。該たんぱく質を、０．０４Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解することによって、ミオグロビン溶液（最終濃度  ６６μＭ）を、新しく調製した。ミオグロビンをデオキシ−Ｍｂに転化させるため、各リーディングの前に、亜ジチオン酸ナトリウム（０．１％）を添加した。全てのスペクトルは、Helios α 分光光度計を用いて測定した。
【００６０】
鉄五カルボニル、［Ｆｅ（ＣＯ）5］、二マンガンデカカルボニル、［Ｍｎ2（ＣＯ）10］の、ミオグロビン溶液への直接的な添加では、時間が経過しても、一酸化炭素ミオグロビン（ＭｂＣＯ）が、はっきりと検知できるほどに形成することは無かった（データは添付していない）。これは、これら二つの遷移金属カルボニル錯体は、光によって刺激を与えない限りは、ＣＯを放出しないとの認識と矛盾がない（参考文献４４、４５）。従って、ＣＯの放出は、図１に示されているように、これらの金属カルボニル錯体を冷光源に露呈し、ミオグロビンとの反応が起きる前に、膜組織を通じて該気体を拡散させることによって、誘発されるものである。
【００６１】
５００マイクロリットルの鉄五カルボニル（［Ｆｅ（ＣＯ）5］、９９．９％）、又は１ｍｌの二マンガンデカカルボニル（［Ｍｎ2（ＣＯ）10］、ＤＭＳＯ中１３ｍＭ）（化学構造についても参照のこと）を、カルボニル溶液２として、プラスチックチューブ１の中に置いた。該溶液２と挿入膜組織（insert membrane) ６（AnaporeTM ０．４μｍ）との間に、０．６ｃｍの空間をあけて、分離した二つのチャンバーを作る為、細胞培養挿入部（cell structure insert） 3 (Costar)を、その上部において、封止した。１．５ｍｌのデオキシ−Ｍｂ溶液（６６μＭ）を、ParafilmTM ５でカバーした該挿入部の中に配置した。このカルボニル溶液には、その後、ＣＯ放出を刺激するため、光源７からの冷光による照射を行い、該気体が細胞膜６を通じてミオグロビン溶液４内に拡散するようにした。ミオグロビン溶液４のアリコートを、異なる時間に採取し、デオキシ−ＭｂからＭｂＣＯへの転化を、分光測光により、測定した。
【００６２】
デオキシ−ＭｂからＭｂＣＯへの転化によるスペクトルの変化を、デオキシ−Ｍｂの溶液にＣＯガスをバブリングすることで、測定した（図２ａ）。照明を当てることにより、［Ｆｅ（ＣＯ）5］及び［Ｍｎ2（ＣＯ）10］は、ミオグロビンの吸収スペクトルにおいて、時間の経過によりＭｂＣＯの形成が漸次増加するという、同様の変化を起した。両方の場合とも、明確に同定されたスペクトルは、ＭｂＣＯに典型的なものであった（図２ｂ及び２ｃ）。ここで用いた実験条件の下で、該ミオグロビン溶液の完全な飽和は、［Ｍｎ2（ＣＯ）10］（１３μｍｏｌ／ｍｌ）まで、約４０分間連続して露光することによって、起きた（図２ｄ）。
【００６３】
様々な金属カルボニル錯体がデオキシ−Ｍｂ溶液に直接的に添加された時、ＭｂＣＯ形成を導きだす能力についての試験を、様々な金属カルボニル錯体を用いて行なった。程度は異なるが、［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2、［Ｒｕ（ＣＯ）2（ＤＭＳＯ）2 Ｃｌ2］、［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2（シトシン）］、及び［Ｒｕ（ＣＯ）3（glycinate）Ｃｌ］は、全て、Ｍｂ溶液に直接添加した際に、ＣＯを放出した。［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（２，２’−ビピリジン）（ＣＯ）2]及び［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（Ｈ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）（ＣＯ）2 ］の場合には、ＭｂＣＯは全く検出されなかったが、以下に示すように、これらの化合物は、共に、血管拡張効果を与えた。
【００６４】
トリカルボニルジクロロルテニウム（II）二量体［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 は、図２ｅに示されている。該金属カルボニル錯体は、ＤＭＳＯ（９．７ｍＭストック溶液）内で可溶化し、２〜３２μｌの部分標本 (aliquot)を、１ｍｌのデオキシ−Ｍｂ溶液（６６μＭ）に直接添加し、そして反転によってサンプルを混合した後、直ちに吸収スペクトルを測定した。ＭｂＣＯの飽和曲線の、線形回帰分析 (linear regression analysis) により、［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 の各モルに対し、約０．７モルのＣＯが遊離されたことが分かった（図２ｆ）。
【００６５】
同様の試験手順によって測定されたＣＯ放出に関する更なるデータが、以下のセクションＨに記載されている。
【００６６】
Ｂ．［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 のＮＭＲによる研究
遷移金属カルボニルの該化学的性質についての更なる研究を、ＮＭＲ分光法を用いて実施した。13Ｃ  ＮＭＲスペクトルによると、新たにＤＭＳＯに溶解した［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 は、ニ量体としては存在しておらず、実際には、公知のトリカルボニル（１）、及びジ−カルボニル（２）モノマーに類似する、明確な二組のシグナルを同定することができた（図３の式を参照のこと）。このＮＭＲ分析は、可溶化の工程中には、ＤＭＳＯがルテニウムに配位した配位子のようにふるまい、それによって前記モノマーの形成が促進されるということを、明らかにしている。
【００６７】
図３ａは、最初の２３分間の新たに調製した［ＲｕＣｌ2（ＣＯ）3］2 及びｄ6−ＤＭＳＯとの間の反応の間に得られた、１００．６２ＭＨｚ  13Ｃ｛1Ｈ｝ＮＭＲスペクトルを示している。この溶液は、化合物２の形成によって含まれた、おそらくはＣＯであると思われる、気体の細かい泡を、非常にゆっくりと発生させた。初めに該金属錯体をＤＭＳＯに溶解し、その後にＣＤＣｌ3 を用いて希釈することによって、この実験を繰り返した時、前記シグナルの割当量は、ｆａｃ−［ＲｕＣｌ2（ＣＯ）3（ＤＭＳＯ）］（１，δ１８３．０，１８６．８）、シス，シス，トランス−［ＲｕＣｌ2（ＣＯ）2（ＤＭＳＯ）2］（２，δ１８５．０）及びシス，シス，シス−［ＲｕＣｌ2（ＣＯ）2（ＤＭＳＯ）2］（３，δ１８６．０、１９１．９）の、公表されている13Ｃ（ＣＯ）の化学シフトと一致した（参考文献４６）。図３ｂは、ｄ6−ＤＭＳＯ中の［ＲｕＣｌ2（ＣＯ）3］2 を、５０℃で５分間温め、集積が起きるよう一晩置いた後に得られた、１００．６２ＭＨｚ  13Ｃ[1Ｈ]  ＮＭＲスペクトルを示している。化合物１、２、及び３に割り当て得られるピークに加えて、判別されていない種が原因で、δ１８７．９及び１９０．５にカルボニルのシグナルがあった。
【００６８】
ジ−カルボニルモノマーの検出により、ＣＯが遊離していることが示されている。前記13Ｃ ＮＭＲスペクトルは、化合物１と２との比率が、４０：６０であることも、示している。
【００６９】
以下のセクションＣ及びＤでは、便宜上［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 について言及するが、ここで説明しているように、ＤＭＳＯに溶解した時には、その他の種も実際に存在する。
【００７０】
Ｃ．細胞の生存度における［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 の効果
生体系における金属カルボニル化合物の利用、使用についての先行の研究がないため、これらの化合物の、潜在的な細胞毒性効果について、評価する必要があった。そのため、様々な濃度の金属カルボニルに、短期又は長期の露光を行なった後、培養基中の細胞の生存率について測定した。
【００７１】
ラットの血管の平滑筋細胞は、Coriell Cell Repository (Camden, NJ, USA)から入手し、ダルベッコ最小必須培地（ＭＥＭ）内にて、２０％の子牛の胎児の血清を２０％、２ｘＭＥＭのビタミン、２ｘＭＥＭの非必須並びに必須アミノ酸、ペニシリン（１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を追加して、培養した。集密的な細胞を、異なる濃度の金属カルボニル（ＤＭＳＯ溶液として導入する−セクションＢを参照のこと）と共に、様々な回数処理し、Promega (Madison, WI, USA) 製の比色検査用キット(colorimetric assay kit)を用いて、以前に記述された通り（参考文献４７）、３若しくは２４時間のインキュベーションの後、又は、３時間の露光した後に完全な培地中で２１時間インキュベーションした時の、細胞の生存率について評価した。結果については、６回の独立した実験の平均±標準誤差にて示してあり、その差は、ｐ＜０．０５（*）と、統計的に有意のものであった。
【００７２】
［Ｆｅ（ＣＯ）5］を露光することにより、除々に緑褐色の析出物の沈殿が起きたため、この金属カルボニルにおける生存率の研究を続行することはできなくなった。しかし、［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（２，２’−bipyridine）（ＣＯ）2］は、著しい血管拡張効果を発現することが証明された（以下を参照のこと）。
【００７３】
図４ｂに示されているように、［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2（最終的濃度は０−４２０μＭ）を用いた、３時間の、血管の平滑筋細胞の処理によって、検出可能な細胞毒性は、何ら促進されることは無かった。同様に、細胞の生存率は、この金属カルボニルを３時間露光した後に、更に２１時間、培地の中で培養を行なった後も、十分に保たれていた。明白な細胞毒性の効果（細胞の生存率の損失が＞５０％）は、非常に高い濃度（＞４００μＭ）の［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2 に、長期に渡って（２４時間）露光した場合にのみ見られた。
【００７４】
同量のビヒクル（ＤＭＳＯ）又は当量のモル濃度のルテニウム（ＲｕＣｌ3）を用いた細胞の処置では、時間が経過しても、はっきりと検知可能なほど、細胞の生存率が低下することは無く（それぞれ、図４ａ及び４ｃを参照のこと）、該ビヒクル及び該金属の何れも、観察された［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2 の細胞毒性効果の原因では無かったことが示されている。
【００７５】
［Ｍｎ2（ＣＯ）10］（０−１００μＭ）の場合には、完全な培養基での２４時間の露光後も、平滑筋に対する重大な細胞毒性は、何も検出されなかった（データは添付されていない）。
【００７６】
Ｄ．［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2  から放出されたＣＯの血管拡張効果
ラットの大動脈での、ＨＯ−１誘導が原因による、内因性のＣＯの増加は、血管収縮を顕著に減ずることについては、既に証明されている（非特許文献２３）。金属カルボニル錯体から放出されたＣＯが、特定の生物活性を呼び起こしているかどうかを調査するために、我々は、まず、分離された大動脈の環状部のモデルを用いて、血管の収縮性におけるこれらの錯体の影響についての評価を行なった。
【００７７】
胸大動脈の横断環状部を、オスのルイス（Lewis）・ラットから隔離し、以前に記述したように、酸素処理した３７℃のKrebs-Henseleit 緩衝剤を含有した臓器槽内に、２ｇの張力をかけて吊り下げた（非特許文献２３）。金属カルボニル（ＤＭＳＯに溶解したもの  −  セクションＢを参照のこと）の、蓄積量に対応する弛緩について、フェニレフリン（３μＭ）で事前に収縮させた大動脈の環状部を用いて評価した。実験対照となる環状部についても、臓器槽に同量のＤＭＳＯ（ビヒクル）を加えて、同様の処置を行なった。その結果は、表１及び図５に示してある。
【００７８】
図５に示されているように、［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2（最終的濃度は２２２μＭ）を、フェニレフリンを用いて事前に収縮させた大動脈の環状部に、連続的に加えたところ、急速且つ顕著な血管拡張（ｐ＜０．０５）が誘発され、弛緩の程度は、最初に該化合物を添加した後に、既に認められた（実験対照よりも４５％多い）。興味深いことには、拡張させながらの洗浄を行なった後には、フェニレフリンによって誘導された収縮は、実験対照物の場合は、完全に元に戻ったが、［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2  で処理された血管ではそのようなことは無かったため、この化合物には、長期持続性の効果があることが示された。
【００７９】
金属カルボニルによって介在される血管拡張レスポンスは、少ない量のＭｂ（１５０μＭ）を緩衝剤に加えた場合には、ＣＯと貪欲に結合するため、ほとんど完全に破壊された。全体的に、これらの知見は、金属カルボニルから放出されたＣＯには、血管に作用する特性を有している事実と矛盾がない。
【００８０】
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 に比べると、効果は少ないことが認められるが、表１に示されているように、［Ｒｕ（ＣＯ）2（ＤＭＳＯ）2 Ｃｌ2］も、血管拡張効果を招来していた。興味深いことに、［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2（シトシン）］は、この実験を行なっている時間の間には、何の効果も見せなかったが、［Ｒｕ（ＣＯ）3 （グリシナト）Ｃｌ］は、ＭｂＣＯの検査で検出された高度のＣＯ放出と矛盾しない、顕著な血管拡張効果を誘導した。注目すべき点は、ミオグロビンに対して、検出可能なＣＯを放出しなかった［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（２，２’−ビピリジン）（ＣＯ）2］も、血管弛緩を促進させる点で効果的であった。一方、［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（Ｈ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）（ＣＯ）2]の効果は、これほど顕著ではなかった。
【００８１】
【表１】
2004532244.tif 000002
【００８２】
ＣＯは、ｃＧＭＰの発生量が増えることにより、情報伝達のメカニズムを調節すると考えられているため、我々は、血管収縮性における、グアニル酸シクラーゼ（ＯＤＱ、１０μＭ）の選択的な阻害剤の効果についての調査を行なった。予期した通り、ＯＤＱは、［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 の最初の二回の添加の後に、観察された血管拡張を、著しく減少させた。しかし、興味深いことに、［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2 の三回目の添加では、ＯＤＱが存在するにも関わらず、実質的な血管拡張作用を誘導した。従って、グアニル酸シクラーゼ−ｃＧＭＰ経路が、この金属カルボニル錯体によって生ずる弛緩には、関わっていると考えられる。
【００８３】
Ｅ．ラットの組織におけるヘムオキシゲナーゼの発現
以下の実験の背景として、我々は、ヘミンを用いて動物を治療することにより、内因的にＣＯの生産を刺激する効果について示すため、下記の手順を行なった。
【００８４】
免疫組織化学的分析のため、心筋の切片（５μｍ厚）が、内因性のペルオキシターゼ活性を防ぐためメタノール中で０．３％のＨ2Ｏ2にて処理された。ＨＯ−１（１：１０００  希釈）に対するウサギの多クローン抗体を用いて、免疫組織化学的染色を実施した（非特許文献２３）。茶色の色が発生したため、ＨＯ−１が存在していることが示された。ノーザンブロット（Northern blot）分析のため、心臓の組織が液体窒素下において乳鉢で潰し、グアニジニウムチオシアネートを溶解した緩衝剤の中に吊るした。その後、チョムシンキ（Chomczynki）及びサッチ（Sacchi）の文献（参考文献４９）に記載された方法による修飾を用いてＲＮＡを全て抽出した。ＲＮＡは、２．２Ｍのホルムアルデヒドを含有する１．３％の変性アガロースゲル上で走らせ、一晩かけてナイロン膜へと移動させた。この膜は、前述のようにラットＨＯ−１に対する［α−32Ｐ］ｄＣＴＰとラベルされたｃＤＮＡプローブ、ＧＰＡＤＨ遺伝子、並びに濃度計を用いて分析された帯状組織を用いて交雑された（非特許文献２３、参考文献５０）。
【００８５】
ビヒクル（実験対照）又はヘミン（７５μｍｏｌ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を用いた処理の後、２４時間で、ルイス・ラットから心臓を取り除き、ＨＯ−１における免疫染色 (immunostaining) についての評価を行なった。ノーザンブロット分析のため、ラットをヘミン（７５μｍｏｌ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を用いて処理し、ＨＯ−１  ｍＲＮＡのレベル（＋ｖｅ，陽性の対照（positive control）) を評価するため、異なる時点で心臓の除去を行なった。
【００８６】
図７は、ＨＯ−１たんぱく質（７ａ）及びｍＲＮＡ（７ｂ）が、ヘミン処理後２４時間で心臓内で高度に発現したことを示している。興味深いことには、ＨＯ−１たんぱく質に対する免疫染色は、初めは心筋の血管に限られているのである（図７ａ、右パネル）。
【００８７】
Ｆ．潅流を行なった心臓における金属カルボニルによる血管収縮の弱化
金属カルボニルの、血管活動に対する、生体内での生物学的活性を測定するため、追加的実験を行い、隔離したラットの心臓の冠動脈潅流圧（ＣＰＰ）の変化に対する影響を調査することにより、ＨＯ−１によって誘発されたＣＯとの比較を行なった。
【００８８】
当グループにて以前に記載された方法により、オスのルイス・ラット（３００−３５０ｇ）を用いて、ランゲンドルフ（Langendorff）心臓を準備した（参考文献３５）。心臓は、刺激され、大動脈にカニューレを挿入し、Kregs-Henseleit緩衝剤（ｍＭ：１１９ＮａＣｌ、４．７ＫＣｌ、２．５ＣａＣｌ2、１．６６ＭｇＳＯ4、２４．９ＮａＨＣＯ3、１．１８ＫＨ2ＰＯ4、５．５５グルコース、２．００ピルビン酸ナトリウム、０．５ＥＧＴＡ）を用いて、９５％のＯ2及び５％のＣＯ2にて３７℃（ｐＨ７．４）で泡立たせることで、１５ｍｌ／分の一定の逆行性の潅流を形成した。冠状動脈の収縮性を示すパラメータである冠動脈潅流圧（ＣＰＰ）を、大動脈カニューレに接続した圧力変換器によって連続的に測定し、Acknowledge Software（BIOPAC System Inc.)を用いてデータの分析を行なった。
【００８９】
実験対照用のラット（ビヒクル処理）又は、ヘムオキシゲナーゼ−１を誘発するヘミン（７５μｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ）にて前日に前もって処置しておいたその他の動物を、始めにランゲンドルフ装置上で２０分間均衡に保った後、Ｌ−ＮＡＭＥ（最終濃度  ２５μＭ）を用いて潅流を行うことで、血管収縮を顕在させた。Ｌ−ＮＡＭＥによるＣＰＰの増加範囲についても、心臓刺激の１時間前にヘムオキシゲナーゼ抑制剤（ＳｎＰＰＩＸ、４０μｍｏｌ／ｋｇ）を受け、ヘミンで処置した動物、及び［Ｍｎ2（ＣＯ）10］（最終濃度  １３μＭ）を追加した緩衝剤にて潅流を行なった実験対照の心臓について、時間内に監視を行なった。［Ｍｎ2（ＣＯ）10］は、光解離によってのみ、ＣＯを放出するため、［Ｍｎ2（ＣＯ）10］を含有するKrebs緩衝剤は、大動脈のカニューレに挿入する直前に冷光源に露光した。
【００９０】
血管収縮は、Ｌ−ＮＡＭＥを用いた潅流によって、時間内に測定されたＣＰＰの増加の程度、誘発された。図６に示されているように、Ｌ−ＮＡＭＥは、時間に応じてＣＰＰの増加を引き起し、これは３０分後に最高（３倍）に達した。注目すべき点は、光による刺激を行なった心臓の潅流［Ｍｎ2（ＣＯ）10］（１３μＭ）により、血管の収縮は著しく遅れ、潅流の終わり頃にはＣＰＰをかなり低いレベルに保っていた。［Ｍｎ2（ＣＯ）10］を含有する緩衝剤を光に露光しない場合、つまりＣＯによって誘発される放出の工程が省かれる場合には、Ｌ−ＮＡＭＥを媒介とする収縮の程度には影響が現れず（データは添付されていない）、更に、塩化マンガナーゼを用いた潅流の陰性の対照（negative control）は、心筋のＣＰＰに、何ら影響を及ぼすことは無かった（データは添付されていない）。
【００９１】
［Ｍｎ2（ＣＯ）10］を用いて観察された影響は、心臓の組織のＨＯ−１をヘミンによって事前に処置することによる誘発でも、同様に再現することができた。ヘミンを用いたラットの処置によって、内因的に発生したＣＯと等モルの、心臓のビリルビンの生産量が増加することについては、以前に報告があった（参考文献３５）。ヘミンで処置した心臓における、Ｌ−ＮＡＭＥによって媒介されたＣＰＰの増加量は、［Ｍｎ2（ＣＯ）10］を用いて生産された場合と同様に、著しく弱められた（ｐ＜０．０５）（図６）。これから予測すると、ヘミンの効果は、ヘムオキシゲナーゼ抑制剤である、プロトポルフィリンスズＩＸ（ＳｎＰＰＩＸ）によって、完全に逆転するということである。従って、ＨＯ−１／ＣＯの経路の血管作用は、［Ｍｎ2（ＣＯ）10］によって、模擬実験することができる。
【００９２】
結果は、６回の独立した実験の平均値±標準誤差である。ビヒクルで処置したグループ（実験対照）に対して、*ｐ＜０．０５。
【００９３】
Ｇ．動物による研究
ＨＯ−１によって放出されたＣＯも、生体内で、急性の高血圧を防ぐということについては、これまでに報告があるため（参考文献４０）、動物の平均大動脈圧の調節において、金属カルボニルの有効性を試験する実験を行なった。
【００９４】
ルイス・ラット（２８０−３５０ｇ）に、１ｍｌ／ｋｇのヒプノーム（Ｈｙｐｎｏｒｍ）（フェンタニール ０．３１５ｍｇ／ｍｌ及びフルアニソン １０ｍｇ／ｍｌ）を筋肉注射し、その５分後に５ｍｇ／ｋｇのジアゼパムを腹膜内に注射することで、麻酔をかけた。次いで、特別に設計した、大腿部の動脈及び静脈カテーテルを、前述のように、手術によって移植した（参考文献４０）。動脈のカニューレは、グラス（Grass）圧力変換器に接続し、ポリグラフレコーダーを用いて、連続的に血圧の測定を行なった。実験は、麻酔をかけた動物に対して行い、手術の工程の３０分以内に記録を行なった。
【００９５】
血圧を観察する２４時間前に、ヘミン（７５μｍｏｌ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を用いて前もって処置した実験対照のラット（ビヒクルにて処置）及び動物に、平均大動脈圧の増加を顕在させるため、３０μｍｏｌ／ｋｇのＬ−ＮＡＭＥを静脈注射にて投与を行なった。また、Ｌ−ＮＡＭＥによる血圧上昇の程度についても、ＳｎＰＰＩＸ（４０μｍｏｌ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を受けた、ヘミンで処置した動物について、一定時間観察した。実験対照のラットには、事前に、［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2（６０μｍｏｌ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）の注射を行なった。これらの２つのグループにおいて、ＳｎＰＰＩＸ又は［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2  を、Ｌ−ＮＡＭＥ注射の１時間前に、動物に投与した。その結果は、図８に示してある。
【００９６】
ラットにおけるＬ−ＮＡＭＥの静脈注射によって、血圧が急激に且つ著しく上昇した（ｐ＜０．０５）。この効果は、Ｌ−ＮＡＭＥの投与の前に、［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2  を一回注入する動物の予備処置によって、著しく抑制された。更に、隔離した心臓における冠動脈の収縮に基づくデータと類似して、ヘミンを用いて動物を処置することによって、Ｌ−ＮＡＭＥを媒介とする高血圧の反応は著しく抑制される結果となり、ここでも、ＳｎＰＰＩＸのヘムオキシゲナーゼの経路の封鎖によって、逆になった。結果は、５回の独立した試験の平均値±標準誤差である。ビヒクルにて処置したグループ（実験対照）に対して*ｐ＜０．０５。集めると、これらの生体内での発見は、金属カルボニルが、ＣＯを運び、放出する能力を通じて、一貫した、且つ再現可能な生物学的活性を有していることを証明している。
【００９７】
Ｈ．ＣＯ放出に関する更なる研究
上記セクションＡの、ミオグロビン分析の工程を、その他の多くの金属カルボニル錯体に対して実施し、ＣＯの放出量及びＣＯ放出の動力学の情報を決定した。組成物及び結果については、図９ａ乃至図９ｆで、表にしてある。この組成物には、セクションＡでも試験した［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2、及びそれに関連の錯体が含まれる。便宜上、出願人の内部用の参照番号を用いている。
【００９８】
図９ａ乃至図９ｆのデータを得るため、カルボニル化合物（ＣＯ−ＲＭｓ）を、水又はＤＭＳＯに可溶し、即座に、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）のミオグロビン溶液（６６μＭ）に加えた。各ＣＯ−ＲＭ毎に、２種類の濃度（２０及び４０μＭ）について、試験を行ない、ミオグロビンから一酸化炭素ミオグロビン（ＭｂＣＯ）への転化について、異なった時間帯（０、１０、２０、及び３０分）に、分光光度計にて測定した。ＭＷ＝分子量である。ＰＰＴは、形成された沈殿物である。Ｎ．Ｄ．＝検知不能（not detectable）である。
【００９９】
セクションＡ、及び図９ａ乃至９ｆにおけるＣＯ放出データは、配位子の選択によって、放出量及び放出率の両方において、ＣＯの放出が調節されるため、放出特性を選択することができるようになるわけだが、これは、特定の生物学的効果を目標とする際に重要なことである。
【０１００】
Ｉ．麻酔をかけたラットにおける、全身系の血圧及び心拍数に対する、ＣＯ−ＲＭ−３（Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト））の効果
大人のオスのSprague-Dawleyラット（２８０−３５０ｇ、８−１０週齢）を、Northwick Park Institute for Medical Research (Harrow, UK)において、屋内で育てた。ラットは、昼／夜の１２時間のサイクルとなっているケージの中に３つのグループで入れ、飲料水は自由に取りに行けるようにし、えさも任意に食べられるようにした。全ての外科的な工程は、英国内務省の規定（U.K. Home Office regulation）に従って、行なった。ラットには、マスク上に移行させる前に、ポリカーボネートのチャンバー内で、酸素中でEnfluraneTM（Abbot, UK)の流れの中で、麻酔器(anaesthetic machine)（Airmed, UK)を用いて麻酔をかけ 、実験中を通して連続的にEnfluraneTM を与えた。この外科的工程の間、これらのラットの体温は、手術を行なう面の下に置いたヒートパッドによって、３７℃に一定に保たれた。その後、前述のように、外科的処置により、特別に設計された大腿部の動脈及び静脈のカテーテルを手術にて移植した（参考文献４０）。平均大動脈圧（ＭＡＰ）及び心拍数（ＨＰ）を観察する為、動脈に入れたカテーテルは、ルアーコネクター (luer connector)及び三方タップを通じて圧力変換器(Gould model P23ID Statham, USA) に接続した。専用の尾部血圧計バンド付き変圧計（tail-cuff pressure transducer) (ADInstruments, UK）も、ラットの尻尾及び圧力変換器の上に配置し、尾部血圧計を、事前にミリメートルＨｇ（ｍｍＨｇ）にて目盛設定したポリグラフレコーダーに接続した (Grass Model 7D, Astra-med, UK)。アナログ出力にて、コンピュータベースのデータ収集システム（PowerLabTM, ADInstruments, UK) 用のデータを得た。コンピュータベースのシステムは、平均大動脈圧（ＭＡＰ）をｍｍＨｇにて、及び心拍数（ＨＲ）を心拍数／分（ｂｐｍ）にて、実験の時間を通じて記録するようにセットした。手術後の２０分間は、麻酔の供給を調節する時間として割り当て、そうすることで、各動物が、約８０ｍｍＨｇ（ｎ＝１６、平均＝８１．５ｍｍＨｇ）の安定した静止ＭＡＰを有するようにした。ひとたび、安定した圧力に達すると、各カテーテルには、塩水を含んだヘパリンが流され、それ以上の変化は、麻酔の供給には起きなかった。塩水中で化合物を可溶化することにより、２０、６０、及び１２０μ moles.ml-1 のストック溶液中で、（Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）（ＣＯ−ＲＭ−３）を調製した。シス−ＲｕＣｌ2（ＤＭＳＯ）4 は、如何なるカルボニル基も含んでいないものであるが、「陰性の対照 (negative contorl)」として用いられた。その後、大腿部の血管のカテーテルを通じて、ＣＯ−ＲＭ−３（若しくは陰性の対照）を、巨丸薬として、動物に注入することにより、最終的な注入濃度が、体重に対して１０、３０、又は６０μ moles.kg-1となるようにした。実験全体を通じて、ＭＡＰ及びＨＲが、連続的に記録され、観察された。１０、３０、又は６０μ moles.kg-1 の濃度にて、各動物に注入したとはいえども、結果的に動物体内の濃度は累積されている。従って、動物の体内で最終的に到達した濃度は、それぞれ、１０、４０、又は１００μ moles.kg-1 であった。
【０１０１】
この結果は、表２に示されており、ここで示されているデータは、ベースライン（化合物の注入の直前）、及び１０、３０、又は６０μ moles.kg-1  を注入した直後に得られたサンプルについて示している。全てのデータは、平均値±標準誤差である。ｎ＝３回の独立した実験である。ベースラインに対し、*ｐ＜０．０５である。
【０１０２】
シス−ＲｕＣｌ2（ＤＭＳＯ）4（実験対照）は、使用した何れの濃度（１０、３０、又は６０μ moles.kg-1）の場合にも、ＨＲ又はＭＡＰの何れに対しても、著しい効果は見せなかった。シス−ＲｕＣｌ2（ＤＭＳＯ）4  の最終的な注入（６０μ moles.kg-1）の後にも、ベースラインの測定値（ＭＡＰが８０±２ｍｍＨｇ、ＨＰが２５７±７ｂｐｍ）と比べ、ＭＡＰ（８１±４ｍｍＨｇ）及びＨＲ（２５６±９ｂｐｍ）は、十分に維持されていた。該化合物の各巨丸薬を投与している間、ＭＡＰには、わずかな増加（５．５±１ｍｍＨｇ）が見られた。しかし、この効果は、挿入の工程中に塩水を注入した際にも発生したため、体積の増加にも関連していると考えられる。対照的に、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）の投与は、濃度に応じて一時的にＭＡＰが減少した後、１０分間の間、ベースラインに戻り、１０、３０、及び６０μｍｏｌｅｓ．ｋｇ-1 の巨丸薬の注入により、それぞれ、６±２、８±３、及び１４±０．３（ｐ＜０．０５）ｍｍＨｇの減少となった。前記の場合と同様に、ベースライン（２７０±２０ｂｐｍ）と比較して、ＨＲには変化が起きなかった（２５３±２３ｂｐｍ）。これらのデータは、ＣＯ−ＲＭ−３から遊離したＣＯは、血圧を調節することが可能で、急性及び慢性の高血圧性の反応を生体内で治療するために用いることが可能であることを示している。これらのデータは、活性化したヘムオキシゲナーゼ−１によって生み出された、内因性のＣＯが、強力な血管拡張神経薬であり、急性の高血圧を、生体内で抑圧するとの証拠と、相似するものである（非特許文献２３、参考文献４０）
【０１０３】
【表２】
2004532244.tif 000003
【０１０４】
Ｊ.  マウスにおける、心臓移植による拒絶反応に対するＲｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）の影響
オスのＢＡＬＢ／ｃマウス（２５−３０ｇ）の心臓が、オスのＣＢＡマウス（２５−３０ｇ）に移植を行なうための、ドナー臓器として用いた。これらのマウスは、昼／夜の１２時間サイクルの下、ケージ内に３つのグループで入れられ、飲料水は自由に取りに行けるようにされ、えさも任意に食べられるようにした。全ての外科的な工程は、英国内務省の規定に従って行なった。動物には、全工程中、ケタミン／キシラジン (ketamine/xylazine)を腹膜内に注射して、麻酔をかけた。外科的技術は、前述のように、受容体の頚部への心臓の同種移植片を含むものであった（参考文献５１）。移植片の生存状態について、毎日触診によって評価し、心室の収縮停止により、拒絶反応を診断した。
【０１０５】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）を、０．１ｍｌの塩水に溶解し、腹膜内に投与した。用量は、全て、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）の４０ｍｇ／ｋｇであった。ドナーは、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）を、心臓の採集の１日前及び１５分前の、合計二回の用量の投与を受けた。受容体は、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）を、手術の１日前、心臓再潅流の３０分前、及び移植の１時間後（０日目）に、用量の投与を受けた。その後、移植片の受容体には、手術後の第一日目から第八日目（この日を含む）までの間、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）の一日量を毎日投与した。実験対照のグループでは、受容体には、同量の塩水（ビヒクル）を、心臓移植の一日前、及び一日毎に（第一日目から第八日目まで）投与した。移植の直後に、痛み止めのため、カルプロフェン (carprofen)（０．０１ｍｇ）を、該当する動物全てに、皮下より与えた。この研究の結果は、図１０に示されている。各グループ毎にｎ＝５。実験対照に比べて、*ｐ＜０．００２。塩水での治療の後ＣＢＡマウスに移植されたＢＡＬＢ／ｃの心臓（実験対照のグループ）では、非常に頻繁に、拒絶反応が起きた。それらの心臓の１００％が、移植後９日以内に脈を停止した。対照的に、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）を投与したマウスに移植した心臓の生存時間は、これよりも著しく長く（ｐ＜０．００２）、これらの心臓の１００％が、移植後１８日たっても、脈を打ち続けていた。心臓移植から２５日後になっても、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）で処置したマウスのうちの６０％は、何の拒絶反応も見せず（ｐ＜０．００２）、３０日目になっても、移植された心臓の４０％が、生存していた。これらのデータは、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）が、ネズミ科の動物の心臓移植片の生存時間を延長させ、臓器の拒絶反応を減らす為に、非常に効果的であることを示している。この結果は、最近発行された、マウスからラットへの心臓移植のモデルにおいて、ＣＯガス（吸入による）で処置したマウスが、移植片の拒絶反応に対する影響を、他の場合よりもかなり受けにくいことを示すレポートの内容に相似している（参考文献５１）。
【０１０６】
ＣＯの放出及び血管緊張低下に関する上記の知見に基づき、本セクションのデータは、カルボニル錯体から放出されたＣＯが、抗拒絶反応の過程を調整することを示している。
【０１０７】
Ｋ．内毒素の攻撃に続く、大食細胞内の一酸化窒素の生成に対するＲｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）の影響
哺乳類の体内で、構成性（ｎＮＯＳ並びにｅＮＯＳ）及び誘引性（ｉＮＯＳ）のＮＯシンターゼ (synthase) 酵素の族にて発生せしめられる、信号分子の一酸化窒素（ＮＯ）は、心臓血管、神経、及び免疫システム内で起こる、生理学的並びに病態生理学的な様々な過程において、重要な調節の役割を果たしている（参考文献５２）。ＮＯの過剰生産は、感染、炎症、及び癌に対する宿主防衛において、強力な細胞毒の武器として確立されてきた。シトキン、エンドトキシン（内毒素）若しくはリポ多糖類（ＬＰＳ）、又は無酸素基 (oxygen free radical) 若しくはその他のストレスの多い刺激によって、好適当に誘引された時、活性化したｉＮＯＳから、かなりの量のＮＯが発生され得る（参考文献５３）。特に、大食細胞は、ｉＮＯＳを高度に発現し、そして重要な細胞増殖抑制性／殺菌の活動を調整するために過度の量のＮＯを発生可能であるため、炎症前の刺激に対する特定の目標である。未発表のデータから、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）／ビリルビン／ＣＯ経路の誘引が、ＮＯの過剰生産によって顕在化される、心身に有害な作用に対する、調節力に対抗するシステムを表していることが、仮定される。特に、ＣＯ及びビリルビンは、ＮＯＳ活性の抑制剤として行動することによってＮＯの発生を阻害し、またＮＯのスカベンジャーになり得るものである。ＣＯガスは、様々な組織においてＮＯＳ活性を抑制することが示されており（参考文献５４）、ビリルビンは、直接にＮＯ及びＮＯ関連の種と相互作用し得ることが、指摘されている（参考文献５５）。
【０１０８】
本研究は、内毒素によって刺激された大食細胞からのＮＯ生産に関し、Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グリシナト）（ＣＯ−ＲＭ−３）の効果について評価するために、実施された。マウスＲＡＷ２６４．７大食細胞は、ＤＭＥＭ媒体を用いて、２４個のウェル（ｗｅｌｌ）の中で培養された。融合性の細胞は、大腸菌リポ多糖類（ＬＰＳ、３μｇ／ｍｌ）と共に、ＣＯ−ＲＭ−３（１０、５０及び１００μＭ）の増大した濃度の存在下、及び非存在下で、２４時間培養された。実験対照の細胞用には、培養基のみを用いた。この培養基内の亜硝酸塩は、ＮＯ生産量の指標として、グリース試薬法（Griess reagent method）を用いて測定した（参考文献５６）。細胞の生存性についても、参考文献４７に記載の、様々な薬剤を用いた処置から２４時間後に、大食細胞内にて評価を行なった。ＬＰＳを用いた大食細胞の処置は、２４時間の培養の後、亜硝酸塩のレベルを著しく増加させた（ｐ＜０．０５）（図１１を参照のこと。この棒グラフは、６回の独立した実験の平均値±標準誤差を示している。実験対照に対して、*ｐ＜０．０５、ＬＰＳに対して†ｐ＜０．０５）。ＣＯ−ＲＭ−３が存在することにより、亜硝酸塩の発生は、濃度に従って著しく弱められた。図１２に示されているように（この棒グラフは、６回の独立した実験の平均値±標準誤差を示している。）、培養期間の終わりにも、毒性の作用は観察されなかったため、これらの投与は細胞の生存能力には影響を及ぼしていないことになる。
【０１０９】
これらのデータは、ＣＯ−ＲＭ−３からのＣＯの放出能力は、ｉＮＯＳに誘導されたＮＯの生産を抑制することにより、大食細胞内の炎症反応を防ぐということを示している。更に、そしてＣＯ−ＲＭ−３に示される、血圧及び心臓の移植片の拒絶反応に対する有益な効果と合わせることにより、これらの結果は、水溶性のＣＯのキャリヤを、血管及び炎症に関連する病理学的状態の調整のために、治療目的に適用できる可能性があることを示している。
【０１１０】
Ｌ．合成
ＣＯ放出のための試験を行なった図９ａ乃至図９ｆの化合物を得るための合成方法について、以下に記す。生成物の純度については、詳細な調査に調べていない。立体異性体が存在することが予想される。
【０１１１】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ2[ＣＨ2ＳＨ]ＣＯ2）［ＭR  ３４０．５］の調製
Ｌ−システイン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−２６
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＬ−システイン（０．０３９ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。この黄色の溶液を蒸発させて、オレンジ色の固体（０．１２０ｇ、７０％）を得た。
【０１１２】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ2ＣＯ2）［ＭR  ２９４．５］の調製
グリシン錯体。参照番号ＣＯ−ＲＭ−３。
[Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ]2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びグリシン（０．０３９ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。この黄色の溶液を蒸発させて、薄い黄色の固体（０．１４２ｇ、９６％）を得た。
【０１１３】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ[ＣＨＭｅＣＨ2ＣＨ3｝ＣＯ2）［ＭR  ３５０．５］の調製
ＤＬ−イソロイシン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−３８。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＤＬ−イソロイシン（０．０６６ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解し、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。この黄色の溶液を蒸発させて、黄色の固体（０．０８６ｇ、４９％）を得た。
【０１１４】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ[ＣＨ2ＯＨ｝ＣＯ2）［ＭR  ３２４．５］の調製
Ｌ−セリン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−３９。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＬ−セリン（０．０５３ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。この黄色の溶液を蒸発させて、薄い黄色の固体（０．０９５ｇ、５９％）を得た。
【０１１５】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ[ＣＨ3｝ＣＯ2）［ＭR  ３０８．５］の調製
Ｌ−アラニン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−４０。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＬ−アラニン（０．０４５ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。その溶液を蒸発させて、オレンジ色の固体（０．１４５ｇ、９４％）を得た。
【０１１６】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ[ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2｝ＣＯ2）［ＭR  ３６５．５］の調製
Ｌ−グルタミン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−４２。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＬ−グルタミン（０．０７３ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応を行なった。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過した。その溶液を蒸発させて、黄色のオイルを得、更に高度の真空下で固化させて薄い黄色の固体（０．１７０ｇ、９３％）を得た。
【０１１７】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ[ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ2｝ＣＯ2）［ＭR  ３９３．５］の調製
Ｌ−アルギニン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−４３。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＬ−アルギニン（０．０８７ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（４：１）に溶解して、フィルターで濾過した。その溶液を蒸発させて、オレンジ色の固体（０．１８５ｇ、９４％）を得た。
【０１１８】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ[ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2]ＣＯ2）［ＭR  ３６５．５］の調製
Ｌ−リジン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−４６。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＬ−リジン（０．０７３ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（３：１）に溶解して、フィルターで濾過した。その溶液を蒸発させて、黄色のオイルを得、更に高度の真空下で固化させて、オレンジ色の固体（０．１６３ｇ、８９％）を得た。
【０１１９】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ[ＣＨ（ＣＨ3)2]ＣＯ2）［ＭR  ３３６．５］の調製
Ｌ−バリン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−６７。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＬ−バリン（０．０５９ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。その溶液を蒸発させて、白色の固体（０．１１４ｇ、６８％）を得た。
【０１２０】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ[ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3｝ＣＯ2）［ＭR  ３３８．５］の調製
Ｌ−スレオニン錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−７４。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2（１．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びＬ−スレオニン（０．０６０ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。その溶液を蒸発させて、白色の固体（０．１４９ｇ、８８％）を得た。
【０１２１】
［Ｆｅ（g−Ｃ5Ｈ5）（ＣＯ）3 ］Ｃｌ［ＭR  ２４０．５］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−７０。
シュレンクチューブ（Schlenk tube)内で、窒素下、金属ナトリウム（２．０４ｇ）を水銀（１８ｃｍ3）に溶解することにより、ナトリウムアマルガムを調製した。これを、室温まで冷まし、テトラヒドロフラン（４０ｃｍ3）を加えた。その後、テトラヒドロフラン（６０ｃｍ3）中の［ＦｅＣｐ（ＣＯ）2 ］2（７．０８ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）を加え、そして４５分間、フラスコを激しく振った。
【０１２２】
その後、窒素でパージした、大きいサイズの三つ口フラスコの中に、ＴＨＦ（３００ｃｍ3）及びエチルクロロホルメート（４０ｍｍｏｌ、４．３４ｇ、３．８４ｃｍ3）を入れ、０℃に冷却した。次いで、分割された (cleaved) 二量体の赤味がかった黄色の溶液を、丸底フラスコに移し、体積が凝縮する前に、低温で１時間攪拌した。赤茶色の残留物を、ベンゼン（５ｘ２０ｃｍ3）で抽出した後、その抽出物をフィルターで濾過し、その溶液に１５分間ＨＣｌガスを吹き込んだ。直ちに、沈殿が観察され、その溶液の容量は減少した。オレンジ色の沈殿物を集め、ジエチルエーテル（２０ｃｍ3）を用いて洗浄した後、乾燥させた（４．８４ｇ、５０％）。
【０１２３】
［Ｆｅ（g−Ｃ5Ｈ5）（ＣＯ）3 ］ＰＦ6［ＭR  ３５０］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−７１。
［Ｆｅ（g−Ｃ5Ｈ5）（ＣＯ）3 ］Ｃｌ（３．００ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を、水（５０ｃｍ3）に溶解し、そして水（５０ｃｍ3）に入れたヘキサフロロリン酸ナトリウム（２．００ｇ、ｌｅｑ）を加えた。即座に、オレンジ色の沈殿物が形成された。この反応を１５分間攪拌して行い、吸気下に、オレンジ色の沈殿物を採集した（３．０４ｇ、７０％）。
【０１２４】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2（グアノシン）［ＭR  ５４０］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−１７。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びグアノシン（０．１４２ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、窒素下に丸底フラスコ内に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。この溶液をフィルターで濾過し、約１０ｃｍ3になるまで体積を減らした。過剰のジエチルエーテルを加え、白色の沈殿物が形成されるように、フリーザーの中に一晩置いた。その溶媒を、ピペットで取り、白色の固体を残して、それを高真空度下で乾燥した（０．１３０ｇ、４８％）。
【０１２５】
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グアノシン）2 ］／Ｃｌ［ＭR  ８２４］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−１８。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びグアノシン（０．２８４ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。そして、その溶液をフィルターで濾過し、約１０ｃｍ3 に体積を減らした。過剰のジエチルエーテルを加え、白色の沈殿物が形成されるように、フリーザーの中に一晩置いた。かかる溶媒を、ピペットで取り去り、白色の固体を残し、そしてそれを高真空下で乾燥した（０．２２０ｇ、５３％）。
【０１２６】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2（トリアセチル−グアノシン）［ＭR  ６６６］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−２９。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及び２，３，５−トリアセチルグアノシン（０．２０５ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。それから、その溶液をフィルターで濾過し、約１０ｃｍ3になるまで体積を減らした。過剰のジエチルエーテルを加え、白色の沈殿物が形成されるように、フリーザーの中に一晩置いた。そして、その溶媒を、ピペットで取り去り、白色の固体を残し、そしてそれを高真空下で乾燥した（０．２１２ｇ、６３％）。
【０１２７】
Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2（グアニン）［ＭR  ４０８］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−２２。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びグアニン（０．０７６ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。テトラヒドロフラン（７５ｃｍ3）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。それから、その溶液をフィルターで濾過し、約１０ｃｍ3になるまで体積を減らした。過剰の４０−６０の軽油を加え、沈殿物が形成されるように、フリーザーの中に一晩置いた。その溶媒を、ピペットで取り去り、薄い黄色の固体を残し、そしてそれを高真空下で乾燥した（０．０８２ｇ、３９％）。
【０１２８】
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ（グアニン）2］Ｃｌ［ＭR  ５５８］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−２３。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2（０．１２９ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びグアニン（０．１５２ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。テトラヒドロフラン（７５ｃｍ3）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。この溶液をフィルターで濾過し、約１０ｃｍ3 になるまで体積を減らした。過剰の４０−６０の軽油を加え、沈殿物が形成されるように、フリーザーの中に一晩置いた。その溶媒を、ピペットで取り去り、クリーム色の固体を残し、そしてそれを高真空下で乾燥した（０．１７０ｇ、６１％）。
【０１２９】
ｆａｃ−ＲｕＣｌ2（ＣＯ）3（ＴＨＦ）［ＭR  ３２８］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−１１。
［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2  ］2 （０．３８０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン（５ｃｍ3）を、円錐形のフラスコに入れ、そしてその黄色の溶液を、１５分間攪拌した。その後、かかる溶媒を、減圧下で除去して、黄色の油を残し、そしてそれを静置して、凝固させた。そこに、ジエチルエーテル（２０ｃｍ3）を加えて超音波分解し、白色の沈殿物と黄色の溶液ができるようにした。固形物を集め、真空下で乾燥させた（０．１３４ｇ、２８％）。
【０１３０】
［ＲｕＣｌ2 （ＣＯ）2 ］n ［ＭR  不明］の調製
参照番号：ＣＯ−ＲＭ−１０。
ＲｕＣｌ3 ｘＨ2Ｏ（５．００ｇ）、濃塩酸（２５ｃｍ3）、及び蟻酸（２５ｃｍ3）を、三つ口の丸底フラスコの中に入れ、その混合物を、１８時間還流させた。そして、その黄色い透明な溶液の体積を、黄色／オレンジ色の沈殿物が残るようになるまで減らした。この沈殿物を、ソックスレー濾紙（Soxhlet thimble) に移し、メタノールを用いて一晩抽出を行なった。そして、その溶液の体積を減らして、オレンジ色の油を残し、そしてそれを高真空下で固化させ、オレンジ色の沈殿物（５．３０ｇ）を得た。
【０１３１】
Ｒｕ（ＣＯ）3（Ｏ[ＣＨ2ＣＯ2]2）［ＭR  ３１７］の調製
ジグリコール酸錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−９９。
［Ｒｕ（ＣＯ）3  Ｃｌ2  ］2 （０．１２９ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、及びジグリコール酢酸（０．０６７ｇ）、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０６８ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、その溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。この黄色の溶液を蒸発させて、白色の固体（０．１４２ｇ、８５％）を得た。
【０１３２】
Ｒｕ（ＣＯ）3（ＮＨ[ＣＨ2ＣＯ2]2）［ＭR  ３１７］の調製
イミノ２酢酸錯体。参照番号：ＣＯ−ＲＭ−９７。
［Ｒｕ（ＣＯ）3  Ｃｌ2  ］2 （０．１２９ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、及びイミノ２酢酸（０．０６６ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０６８ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、そしてその黄色の残留物を、再度ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（４：１）に溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０の軽油を加えた。この黄色の溶液を蒸発させて、オフホワイトの固体（０．１４０ｇ、８９％）を得た。
【０１３３】
ＣＯ−ＲＭ−１ａ、ＣＯ−ＲＭ−１ｂ、及びこれらの組成物の陰性の対照の合成については、参考文献５７に記されている。ＣＯ−ＲＭ−１６の合成については、参考文献５８に記されている。
【０１３４】
本発明については、上記した模範的な具体例に関連付けて記載してきたが、当業者であれば、ここで開示した内容を得た時に、数多くの同様な修正や変形を加え得ることは、明らかであろう。従って、上記で示した本発明の模範的な具体例は、あくまでも例示的なものであり、本発明を限定するものでは無いことが考慮されるべきである。記載された具体例には、本発明の精神や範囲を逸脱することなく、様々な変更を加えることができるのである。
［参考文献３０］  Abraham NG, Drummond GS, Lutton JD, Kappas A. The biological significance and physiological role of heme oxygenase. Cell Physiol Biochem 1996;6:129-68.
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【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】[Ｍｎ2（ＣＯ）10 ]及び[Ｆｅ（ＣＯ）5 ]の構造と、照射時の金属カルボニルによるＣＯの放出を測定するための装置とを示す図である。
【図２ａ】１％ＣＯガス吹込によるデオキシミオグロビン及びＣＯ−ミオグロビンの吸収スペクトルを示す図である。
【図２ｂ】Ｆｅ（ＣＯ）5 を用いたときのデオキシミオグロビンとＣＯ−ミオグロビンの吸収スペクトルを示す図である。
【図２ｃ】Ｍｎ2（ＣＯ）10を用いたときのデオキシミオグロビンとＣＯ−ミオグロビンの吸収スペクトルを示す図である。
【図２ｄ】Ｍｎ2（ＣＯ）10 を用いたときのＭｂＣＯの生成量と時間との関係を示す図である。
【図２ｅ】［Ｒｕ（ＣＯ）3（Ｃｌ）2］2 の各種濃度下におけるデオキシミオグロビンとＣＯ−ミオグロビンの吸収スペクトルを示す図である。
【図２ｆ】［Ｒｕ（ＣＯ）3（Ｃｌ）2］2 の濃度とＭｂＣＯとの関係を示す図である。
【図３】ＤＭＳＯ中での［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2 ］2の溶解を示す、ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】金属カルボニル化合物を用いて治療された細胞の、生存能力についてのデータを示す図である。
【図５】金属カルボニル錯体を用いた治療時の、大動脈環状部の弛緩について示す図である。
【図６】潅流されたラットの心臓に関する、様々な治療の効果を示す図である。
【図７】ラットの心臓内のヘムオキシゲナーゼ１の発現について示す図である。
【図８】ラットの平均動脈圧に関する様々な治療が与える影響について示す図である。
【図９ａ】金属カルボニル錯体のＣＯ放出データを示す表である。
【図９ｂ】金属カルボニル錯体のＣＯ放出データを示す表である。
【図９ｃ】金属カルボニル錯体のＣＯ放出データを示す表である。
【図９ｄ】金属カルボニル錯体のＣＯ放出データを示す表である。
【図９ｅ】金属カルボニル錯体のＣＯ放出データを示す表である。
【図９ｆ】金属カルボニル錯体のＣＯ放出データを示す表である。
【図１０】先の実施例に記載された、移植による拒絶反応後の生存率を示すグラフである。
【図１１】先の実施例に記載された、大食細胞内のＮＯの生成研究において生じた亜硝酸塩のグラフである。
【図１２】大食細胞内のＮＯの生成研究における、細胞の生存能力についてのグラフである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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