(57)【要約】原核生物発現系で機能的哺乳動物１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体および真核生物または原核生物発現系で機能的ヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体を生成する方法が記載される。これらの複合体は特異的ＣＴＬクローンに限定された特異的抗原性ペプチドを提示することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドの上流に並進して（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）融合されている、機能的ヒトβ−２ミクログロブリンをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１核酸配列を包含する核酸構築物。
【請求項２】
前記第１核酸配列は前記第１および前記第２ポリヌクレオチドの間に内挿されたリンカーペプチドをコードするインフレームリンカーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記リンカーペプチドは配列番号１０に示される、請求項２記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記第１核酸配列は結合部分を含むように酵素的に変性されることが可能であるペプチドをコードするインフレームタグ配列をさらに含む、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項５】
抗原性ペプチドをコードする第２核酸配列をさらに包含し、前記抗原性ペプチドはヒトＭＨＣクラスＩ複合体を結合することが可能である、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記第２ポリヌクレオチドは前記ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖のα１−３ドメインをコードする、請求項１記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記第１核酸配列の発現を制御する第１シス作用制御配列をさらに包含する、請求項２記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記第２核酸配列の発現を制御する第２シス作用制御配列をさらに包含する、請求項５記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記シス作用制御配列は、細菌宿主において機能的である、請求項７記載の核酸構築物。
【請求項１０】
配列番号４に示される核酸配列を含む核酸構築物。
【請求項１１】
請求項１記載の核酸構築物を含む形質転換細胞。
【請求項１２】
細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞および原生動物細胞からなる群から選択される真核生物細胞である、請求項１１記載の形質転換細胞。
【請求項１３】
細胞は細菌細胞である、請求項１１記載の形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項５記載の核酸構築物を含む形質転換細胞。
【請求項１５】
細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞および原生動物細胞からなる群から選択される真核生物細胞である、請求項１４記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
細胞は細菌細胞である、請求項１４記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖に直接または間接に共有結合された機能的ヒトβ−２ミクログロブリンを含むアミノ酸配列を包含する組換えポリペプチド。
【請求項１８】
前記機能的ヒトβ−２ミクログロブリンと前記機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖との間に内挿されたリンカーペプチドをさらに包含する、請求項１７記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号５に示されるアミノ酸配列を包含する組換えポリペプチド。
【請求項２０】
機能的哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖に直接または間接に共有結された機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンを含むアミノ酸配列を含む３０重量％以上の組換えポリペプチドを包含する細菌由来の封入体の調製法。
【請求項２１】
（ａ）機能的ＭＨＣクラスＩ重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドの上流に並進して融合されている、機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１発現構築物；および（ｂ）抗原性ペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドを含む第２発現構築物で共形質転換された宿主細胞であって、前記第１、第２および第３ポリヌクレオチドが宿主細胞中で共発現されるとき、ＭＨＣクラスＩ−抗原性ペプチド複合体が形成される宿主細胞。
【請求項２２】
前記第１発現構築物は前記第１および前記第２ポリヌクレオチド間に内挿されたリンカーペプチドをコードするインフレームリンカーポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２１記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記細胞は真核生物細胞である、請求項２１記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記細胞は細菌細胞である、請求項２１記載の宿主細胞。
【請求項２５】
（ａ）（ｉ）機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンをコードする第１ポリヌクレオチド；および（ｉｉ）機能的哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドを含む第１核酸配列（ただし、前記第２ポリヌクレオチドは前記第１ポリヌクレオチドの下流に並進して融合されている）、および（ｂ）細菌中で前記第１核酸配列の発現を指示することができるように選択されているシス作用制御配列を含む核酸構築物。
【請求項２６】
前記シス作用制御配列は、細菌由来シス作用制御配列およびファージ由来シス作用制御配列からなる群から選択される、請求項２５記載の核酸構築物。
【請求項２７】
前記第１核酸配列は前記第１および前記第２ポリヌクレオチド間に内挿されたリンカーペプチドをコードするインフレームリンカーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２５記載の核酸構築物。
【請求項２８】
前記リンカーペプチドは配列番号１０に示される、請求項２６記載の核酸構築物。
【請求項２９】
抗原性ペプチドをコードする第２核酸配列をさらに包含し、前記抗原性ペプチドは哺乳動物ＭＨＣクラスＩ複合体を結合することが可能である、請求項２５記載の核酸構築物。
【請求項３０】
前記第２ポリヌクレオチドは前記哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖のα１−３ドメインをコードする、請求項２５記載の核酸構築物。
【請求項３１】
請求項２５記載の核酸構築物を包含する形質転換細胞。
【請求項３２】
細胞は真核生物細胞である、請求項３１記載の形質転換細胞。
【請求項３３】
細胞は細菌細胞である、請求項３１記載の形質転換細胞。
【請求項３４】
請求項２７記載の核酸構築物を包含する形質転換細胞。
【請求項３５】
（ａ）細菌中で、機能的哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列に直接または間接に共有結合された機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンアミノ酸配列を含む１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを発現し；そして（ｂ）前記１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを単離する工程を包含する機能的ＭＨＣクラスＩ分子を生産する方法。
【請求項３６】
（ｃ）前記１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドに結合することができる抗原性ペプチドの存在下に前記１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドをリフォールドし、それによってＭＨＣクラスＩ−抗原性ペプチド複合体を生成する工程をさらに包含する、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
（ｄ）サイズ排除クロマトグラフィーにより前記ＭＨＣクラスＩ−抗原性ペプチド複合体を単離する工程をさらに包含する、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記抗原性ペプチドは前記細菌中で前記１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドとともに共発現される、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
工程（ａ）は前記１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドが前記細菌中で封入体を形成するように行われる、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
前記抗原性ペプチドおよび前記１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドは前記細菌中で封入体を形成する、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドを単離する前記工程は、（ｉ）前記封入体からタンパク質分子を放出するように、前記封入体を変性し；そして（ｉｉ）前記タンパク質分子を再生する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質分子を再生する前記工程は、前記１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを結合することができる抗原性ペプチドの存在下に行われる、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記抗原性ペプチドは前記細菌中で前記１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドとともに共発現される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物β−２ミクログロブリンアミノ酸配列はヒトβ−２ミクロブロブリンアミノ酸配列であり、さらに前記哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列はヒトＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列である、請求項３５記載の方法。
【請求項４５】
機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖に直接または間接に共有結合された機能的ヒトβ−２ミクログロブリンをそれぞれ含む複数の組換えポリペプチド単量体を包含する多量体ＭＨＣクラスＩ複合体。
【請求項４６】
前記複数の組換えポリペプチド単量体は共通基質に結合される、請求項４５記載の多量体ＭＨＣクラスＩ複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野および背景
本発明は原核生物発現系で機能的哺乳動物１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体および真核生物または原核生物発現系で機能的ヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体を生成する方法に関する。これらの複合体はクラスＩＭＨＣに制限され、かつ特異的ＣＴＬクローンまたはＣＤ＋８Ｔ細胞により認識され得る特異的抗原性ペプチドを提示することが可能である。本発明はさらに真核生物、または好ましくは原核生物細胞系で機能的哺乳動物１本鎖ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体を生成する方法、前記１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体をコードする核酸構築物および新規なヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドに関する。
【０００２】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は集合的にマウスのＨ−２およびヒトのＨＬＡと呼ばれる１群の連結遺伝子座によってコードされる抗原の複合体である。ＭＨＣ抗原の２つの基本的クラス、クラスＩおよびクラスＩＩはそれぞれ、組織型および移植適合性を決定する役割を果たす１連の細胞表面糖タンパク質を包含する。移植反応では、細胞毒性Ｔ−細胞（ＣＴＬ）は外来クラスＩ糖タンパク質に対して主に反応し、一方、ヘルパーＴ細胞は外来クラスＩＩ糖タンパク質に対して主に反応する。
【０００３】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子はほとんど全ての細胞の表面上で発現される。これらの分子は、内因性合成タンパク質から主に誘導されるペプチドをαβＴ−細胞受容体との相互作用によってＣＤ８＋Ｔ細胞に提示する機能を有する［１−４］。クラスＩＭＨＣ分子は１２ｋＤａ軽鎖β−２ミクログロブリンに非共有結合されている４６ｋＤａ重鎖から構成されるヘテロダイマーである。典型的には、８〜１０アミノ酸長であるクラスＩＭＨＣ−制限ペプチドはＭＨＣ分子中の対応する結合ポケットと相互作用する２つまたは３つのアンカー残基によって重鎖α１−α２溝に結合する。β−２ミクログロブリン鎖はＭＨＣクラスＩ細胞内輸送、ペプチド結合および立体配置安定性において重要な役割を果たす［５］。ほとんどのクラスＩ分子では、ＭＨＣクラスＩ重鎖、ペプチド（自己または抗原性）およびβ−２ミクログロブリンからなるヘテロダイマーの形成は、生合成成熟および細胞表面発現において要求される［５］。
【０００４】
クラスＩＭＨＣ分子に結合するペプチドについて行われた研究は、潜在的に免疫原性であり、また細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からの特異的反応を誘発するウイルス性または腫瘍性抗原から誘導されたペプチドのディスプレーにおいて、機能的である特異的ＭＨＣモチーフを明らかにすることができる［６，７］。
【０００５】
ＣＴＬがＡＩＤＳおよび癌などの慢性ウイルス性疾患を含む多くの疾患の制御に重要な役割を有するとの認識は、機能的および構造的研究における充分な量の安定なクラスＩＭＨＣ複合体を生産する大きな必要性につながっている。
【０００６】
種々のペプチドに結合された可溶性ＭＨＣ分子は、疾患関連の免疫反応の研究において、ＭＨＣ−Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）相互作用の特性化において［６］、構造研究において［４］、およびより最近は抗原−特異的Ｔ細胞の直接可視化において［８］、価値ある手段である。これらの分子はまた、インビトロで特異的ＣＴＬを活性化し、ならびにその表現型特徴を研究するために使用され得る。
【０００７】
近年、ウイルス性および腫瘍性抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞の誘発におけるインビトロプロトコールを開発しようとする試みにおいて、種々のアプローチが使用されている［９−１０］。Ｔ細胞を有効に活性化するには、抗原提示細胞の表面上に高密度のＭＨＣ−ペプチド複合体が使用されなければならない［７−１０］。すなわち、インビトロのＴ細胞活性化における所望のアプローチは可溶性ＭＨＣ−ペプチド複合体を使用することであろう。
【０００８】
可溶性ＭＨＣ分子へのＴＣＲの低親和結合性を克服するために、および有効なＴ細胞活性化をもたらすように、ＭＨＣ−ペプチド複合体の多量体化が行われなければならない。
【０００９】
可溶性ＭＨＣ多量体はそれらのＭＨＣ−ペプチドリガンドとＴＣＲとのマルチポイント結合をもたらすから、これらはＴ細胞へのより高い結合力を有する。ＭＨＣ−ペプチド複合体の多量体形（四量体）は、正常ならびに病原性状態でＴ細胞反応の直接的表現型特性において使用され、それゆえ、病態生理学および種々の疾患のメカニズムへの洞察をもたらすから、近年、多くの関心のまととなっている。
【００１０】
しかしながら、このような研究は多量の可溶性および機能的多量体ＭＨＣ−ペプチド複合体を生産する再生可能な方法を必要とする。すなわち、可溶性であり、かつ、多量に生産され得る組換えＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ複合体［１１−２３］を生産する試みがなされていた。
【００１１】
組換え技術を使用する初期の研究は、大腸菌でＭＨＣ複合体の重鎖およびβ−２ミクログロブリン成分を別個に発現し、続いて抗原性ペプチドの存在下にインビトロでこれらをリフォールドした［１１］。
【００１２】
さらに近年、組換えＭＨＣ複合体は真核生物発現系で発現され、そして目的のペプチドに続いて結合され得る、安定でかつ機能的なＭＨＣ複合体を形成するβ−２ミクログロブリン鎖に共有結合された重鎖を含む１つのポリペプチドの形でこれらから分泌された［１２−１５，１９，２１−２３］。真核生物細胞中の機能的ＭＨＣ複合体の発現は、いくつかの固有の制限を受ける。発現されたポリペプチドは機能的ＭＨＣ複合体を形成するから、これらは発現のために使用される細胞から内因的に誘導されたペプチドに結合し、精製されたＭＨＣ複合体はペプチド交換工程、続いて精製に付されなければならない［１３］。さらに、これらの１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の生産収率は限定され、典型的には培養上清１リッター当たり、数百ミクログラム程度に達する。
【００１３】
本発明は１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドの高濃度細菌発現または１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドとＭＨＣクラスＩ制限抗原性ペプチドの共発現を使用し、続いてレドックス−シャフリングによるｓｃＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体のインビトロ再構成および抗原性ペプチドの存在下にリフォールドすることによる、先例のない多量の可溶性で安定かつ機能的なＭＨＣ−ペプチド複合体の生産に関する新規なアプローチを提供する。
【００１４】
本発明は機能的であって、かつ、それゆえに種々の起源からのＣＴＬクローンまたはＣＤ８＋Ｔ細胞へＭＨＣクラスＩ制限抗原性ペプチドを提示する、単量体または好ましくは多量体形のいずれかで使用され得る新規なヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドをさらに提供する。
【００１５】
発明の要約
本発明の１つの態様によれば、機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドの上流に並進して融合されている、機能的ヒトβ−２クログロブリンをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１核酸配列を包含する核酸構築物が提供される。
【００１６】
以下に記載される本発明の好ましい実施態様の別な態様によれば、核酸構築物は抗原性ペプチドをコードする第２核酸配列を包含し、抗原性ペプチドはヒトＭＨＣクラスＩ複合体を結合することができる。
【００１７】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、第２ポリヌクレオチドはヒトＭＨＣクラスＩ重鎖のα１−３ドメインをコードする。
【００１８】
本発明の他の態様によれば、（ａ）（ｉ）機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンをコードする第１ポリヌクレオチド；および（ｉｉ）機能的哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドを包含する第１核酸配列（ただし、第２ポリヌクレオチドは第１ポリヌクレオチドの下流に並進して融合される）；および（ｂ）細菌中で第１核酸配列の発現を指示することができるように選択されているシス作用制御配列を含む核酸構築物が提供される。
【００１９】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、シス作用制御配列は細菌由来シス作用制御配列およびファージ由来シス作用制御配列からなる群から選択される。
【００２０】
本発明のなお他の態様によれば、本明細書中に記載される核酸構築物のいかなるものも含む形質転換細胞が提供される。細胞はたとえば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、および原生動物細胞などの真核生物細胞であるか、あるいは細胞は細菌細胞である。
【００２１】
本発明のなおも他の態様によれば、（ａ）機能的ＭＨＣクラスＩ重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドの上流に並進して融合されている、機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１発現構築物；および（ｂ）抗原性ペプチドをコードする第３ポリヌクレオチドを含む第２発現構築物で共発現される宿主細胞が提供される。その際、第１、第２および第３ポリヌクレオチドが宿主細胞中で共発現されるとき、ＭＨＣクラスＩ−抗原性ペプチド複合体が形成される。
【００２２】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、第１核酸配列は第１および第２ポリヌクレオチドの間に内挿されたリンカーペプチドをコードするインフレームリンカーポリヌクレオチドをさらに含む。
【００２３】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、第１核酸配列は結合部分を含むように酵素的に変性され得るペプチドをコードするインフレームタグ配列をさらに含む。
【００２４】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、リンカーペプチドは配列番号１０に記載されるものである。
【００２５】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、核酸構築物は第１核酸配列の発現を制御する第１シス作用制御配列をさらに含む。
【００２６】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、核酸構築物は第２核酸配列の発現を制御する第２シス作用制御配列をさらに含む。
【００２７】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、シス作用制御配列は細菌宿主内で機能的である。
【００２８】
本発明のなお他の態様によれば、機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖に直接または間接に共有結合された機能的ヒトβ−２ミクログロブリンを含むアミノ酸配列を包含する組換えポリペプチドが提供される。
【００２９】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、組換えポリペプチドは機能的ヒトβ−２ミクロブロブリンと機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖との間に内挿されているリンカーペプチドをさらに含む。好ましくは、組換えポリペプチドは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明のなお他の態様によれば、機能的哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖に直接または間接に共有結合された機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンを含むアミノ酸配列を含む３０重量％以上の組換えポリペプチドを包含する細菌由来の封入体の調製法が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、（ａ）細菌内で機能的哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列に直接または間接に共有結合された機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンアミノ酸配列を含む１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを発現し、そして（ｂ）１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプドを単離する工程を包含する機能的ＭＨＣクラスＩ分子を生産する方法が提供される。
【００３２】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、この方法は（ｃ）１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドに結合することができる抗原性ペプチドの存在下に１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドをリフォールドする工程をさらに含み、それによって、ＭＨＣクラスＩ−抗原性ペプチド複合体を生成する。
【００３３】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、この方法は（ｄ）サイズ排除クロマトグラフィーによりＭＨＣクラスＩ−抗原性ペプチド複合体を単離する工程をさらに包含する。
【００３４】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、抗原性ペプチドは細菌内で１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドとともに共発現される。
【００３５】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、工程（ａ）は１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドが細菌内で封入体を形成するように行われる。
【００３６】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、抗原性ペプチドおよび１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドは細菌内で封入体を形成する。
【００３７】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、ポリペプチドを単離する工程は、（ｉ）封入体からタンパク質分子を放出するように封入体を変性し；そして（ｉｉ）タンパク質分子を再生する工程をさらに含む。
【００３８】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、タンパク質分子を再生する工程は、１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを結合することができる抗原性ペプチドの存在下に行われる。
【００３９】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、抗原性ペプチドは細菌内で１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドとともに共発現される。
【００４０】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、哺乳動物β−２ミクログロブリンアミノ酸配列はヒトβ−２ミクログロブリンアミノ酸配列であり、さらに哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列はヒトＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列である。
【００４１】
本発明のなおも他の態様によれば、機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖に直接または間接に共有結合された機能的ヒトβ−２ミクログロブリンをそれぞれ含む複数の組換えポリペプチド単量体を包含する多量体ＭＨＣクラスＩ複合体が提供される。
【００４２】
記載される好ましい実施態様のなお別な態様によれば、複数の組換えポリペプチド単量体は共通基質に結合される。
【００４３】
本発明は、ＣＴＬクローンへ抗原性ペプチドを提示する単量体または多量体形で使用され得る多量の純粋な１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを生成する方法を提供することによって、現在公知の構成の欠点を首尾よく解消する。本発明は、ＣＴＬクローンへ抗原性ペプチドを提示する単量体および多量体形の両方で機能的であるヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを初めて提供することによって、現在公知の構成の欠点をさらに解消する。
【００４４】
図面の簡単な説明
本発明は添付する図面を参照して実施例によって本明細書中に記載される。図面を特に詳細に参照して、詳細なことは実施例によって示され、かつ、本発明の好ましい実施態様の説明のみを目的とすることが強調される。そしてこれらは本発明の原理および概念的態様のもっと有用であり、かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供する。この点では、本発明の基本的理解に必要であるよりも、より詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされていないが、図面を参照した記載は、いかにして本発明のいくつかの形態が実際に具体化されるかを当業者にはっきりとさせる。
【００４５】
図１は細菌発現ベクター中へクローン化された本発明の種々の発現カセットを示す。β２−Ｍ−ヒトβ−２ミクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ２−ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖、ＢｉｒＡ−ビオチンタンパク質リガーゼ−ＢｉｒＡ酵素認識配列を含むペプチドをコードする配列。
【００４６】
図２ａ〜ｂは、図１の種々の構築物の発現産物の分析を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。β−２ミクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ２およびｓｃＭＨＣポリペプチドは大腸菌ＢＬ２１細胞中で発現され、ポリペプチドが不溶性封入体として蓄積した。封入体は精製され、１０％ゲル上の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析された。β−２−ヒトβ−２ミクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ２−ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖、Ｓ．Ｃ．β２−Ａ２−ヒトｓｃＭＨＣクラスＩおよびＳ．Ｃ．β２−Ａ２−ＢｉｒＡヒトｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ。矢印は分子サイズマーカーを示す。全ての場合、発現された組換えポリペプチドは全封入体タンパク質の９０％以上を含んでいた。
【００４７】
図３ａ〜ｃは、リフォールドされた精製１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の分析を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体は、実施例の章に記載されるように抗原性ぺプチドの存在下に精製され可溶化された封入体をリフォールドすることによって生成された。リフォールドされた複合体はサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製され、そして画分は１０％ゲル上の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。Ｇ９−２０９−２Ｍ（図３ａ）およびＧ９−２８０−９Ｖ（図３ｂ）ｇｐ１００由来ペプチドと複合されたｓｃＭＨＣ、およびＧ９−２８０−９Ｖペプチド（図３ｃ）と複合化されたｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡの代表的画分が示される。
【００４８】
図４は以下の実施例の章に記載されるように、収集および分析されたリフォールドされた１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体のＣＤスペクトル分析である。
【００４９】
図５ａ〜ｂは１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の抗体分析を示すグラフである。リフォールドされ、かつ精製されたｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体への立体配置特異的抗体の結合性は、実施例の章にさらに記載されるように捕捉二重サンドイッチＥＬＩＳＡ分析によって実施された。抗ＨＬＡ−Ａ２特異的ｍＡｂ　ＢＢ７．２抗体は可溶性ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を捕捉するために使用され、完全に蓄積されたＨＬＡ−Ａ２を含むペプチドに特異的なビオチン化ｍＡｂ　Ｗ６／３２は検出のために使用された（図５ａ）。反応はストレプトアビジン−パーオキシダーゼ共役を使用して行われた。Ｗ６／３２抗体による１本鎖ＭＨＣ−ＢｉｒＡペプチド複合体の特異的認識はまた、ストレプトアビジン−被覆磁性ビーズへ固定化されたビオチン化または未ビオチン化複合体において測定された（図５ｂ）。
【００５０】
図６ａ〜ｃは１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の質量分光分析を示す。ｓｃＭＨＣ２０９−複合体はＣ−８疎水性カラム上のＨＰＬＣによって解析され、ＴＦＡ中のアセトニトリルの一次勾配で抽出された。試料はエレクトロスプレーイオントラップ（ＥＳＩ）質量分光計（ＬＣＱ）中にＨＰＬＣカラムから直接にマイクロスプレーされ、ポジティブイオンモードで分析された。図６ａは溶出されたペプチドの質量分光分析を示し、図６ｂ〜ｃはタンパク質の質量推定を示す。
【００５１】
図７ａ〜ｃは特異的ＣＴＬクローンからのＩＦＮｇの放出を測定して決定された１本鎖ＭＨＣ−ペプチドの生物学的活性を示すグラフである。図７ａはＧ９−２０９−２Ｍ特異的ＣＴＬクローンＲ６Ｃ１２を活性化するマイクロタイタープレート上に被覆された種々のｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体の性能を示す。同時放出（Ｓｐｏｎｔ）は種々の複合体で被覆されなかったウェル中でＣＴＬをインキュベーションして決定された。図７ｂはＣＴＬ活性化のペプチド特異性の役割を示す。Ｇ９−２０９−２Ｍペプチドと複合されたｓｃＭＨＣ四量体は、実施例の章で説明されるようにして生成された。可溶性四量体は２０９−特異的ＣＴＬクローンＲ６Ｃ１２またはＭａｒｔ−１−特異的クローンＪＢ２Ｆ４とともにインキュベートされた。同時ＩＦＮｇ放出は、未ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体（四量体形成を支持しない）とともにＣＴＬクローンをインキュベートして決定された。図７ｃは四量体形成におけるＣＴＬ活性化の依存性を示す。２０９−特異的ＣＴＬクローンＲ６Ｃ１２は種々のビオチン化または未ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド複合体およびストレプトアビジンとともにインキュベートされた。同時放出はＢｉｒＡタグを含まないｓｃＭＨＣ−２０９複合体とともにＣＴＬをインキュベートして決定された。
【００５２】
図８ａ〜ｅは、ビオチン化され、そして四量体を形成するｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−２０９複合体、または四量体を形成することができず、かつ、コントロールの役目を果たすビオチン化されていないｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−２０９複合体とともにインキュベートされたＧ９−２０９−２Ｍ−特異的ＣＴＬクローンＲ６Ｃ１２を含むマイクロタイタープレートウェルの顕微鏡画像である。細胞凝集はペプチド特異的であり、かつ、ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−２０９四量体の濃度に依存していた（図８ｂ）。四量体の濃度が増加するにつれて、増加された細胞凝集（ロゼット形成）が観察された（図８ｃ〜ｅ）。未ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−２０９複合体とともにインキュベートされたＣＴＬおよびストレプトアビジンは細胞凝集を示すいかなる形態学的外観も示さなかった（図８ａ）。
【００５３】
図９ａ〜ｂは、ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ／ＭＡＲＴ−１ＰＥ標識化四量体（図９ａ）またはｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ／ＴＡＸＰＥ−標識化四量体（図９ｂ）のいずれかとともにインキュベートされ、そしてＦＩＴＣ−標識化抗ＣＤ８抗体で共染色されたＭＡＲＴ−１ペプチド２７−３５に特異的なＣＴＬクローンのＦＡＣＳ分析画像である。高結合力のＣＴＬの特異的染色は、特異的および機能的ＭＡＲＴ−１ペプチド含有ｓｃＭＨＣ四量体を使用したときにのみ観察された。
【００５４】
図１０ａ〜ｂはＴＡＸペプチドで免疫化されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスから得られたＴ細胞の異質集団のＦＡＣＳ画像である。図１０ａはｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ／ＴＡＸ四量体で染色された非免疫化マウスから得られたＴ細胞のＦＡＣＳ画像であり、図１０ｂは四量体で染色されたＴＡＸ−免疫化マウスから得られたＴ細胞のＦＡＣＳ画像である。両方の調製物はまた、抗ＣＤ８で二重染色された。
【００５５】
好ましい実施態様の説明
本発明は原核生物発現系で機能的哺乳動物１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体および真核生物または原核生物発現系で機能的ヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体を生成する方法に関し、これらの複合体は特異的ＣＴＬクローンに制限された特異的抗原性ペプチドを提示することが可能である。本発明はさらに、真核生物、または好ましくは原核生物発現系で機能的哺乳動物１本鎖ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体を生成する方法に関する。本発明はまた前記１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体をコードする核酸構築物および新規なヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドに関する。
【００５６】
本発明の原理と操作は添付する図面を参照してより良く理解される。
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明はその明細書中において以下の記述に示され、または実施例の章に記載された図面に示される、構築の詳細および成分の組み合わせに限定されないことを理解すべきである。本発明は他の実施態様も可能であり、または種々の方法で実行されるか、あるいは実施され得る。また、本明細書中に使用される表現および用語は記述のためであって、限定とみなされるべきでないことが理解される。
【００５７】
可溶性クラスＩＭＨＣ−ペプチド複合体はＣＴＬに関与する免疫反応を特性化し、ＭＨＣ−ＴＣＲ相互作用の親和性を測定し、かつ抗原特異的Ｔ細胞を可視化するための非常に貴重な試薬である。
【００５８】
組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を生成し、かつ使用する限界の１つは比較的低い生産効率である。本研究のほとんどは、細胞培養培地へｓｃＭＨＣまたは複合化されたＭＨＣのいずれかを発現し、そして分泌するＭＨＣ構築物を細胞に形質移入することに基づく生産方法を使用する［１２−２３］。これらの複合体は、複合体中でディスプレーされる所望ペプチドと続いて交換されなければならない内因的に発現されたタンパク質から得たペプチドを含む［１３］。
【００５９】
組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を効率的に生産する別な方法は、大腸菌内で重鎖およびβ−２ミクログロブリンを別個に発現し、続いて抗原性ペプチドの存在下にインビトロでコリフォールドすることによる［８，１１］。このような方法は上記された真核生物方法に比べていくつかの利点を示すけれども、それによって生産されたＭＨＣ複合体の量および純度は、種々の研究において必要である量及び純度以下になおも低下する。
【００６０】
本発明を実施化する間に、大腸菌内で生産された組換え１本鎖（ｓｃ）ＭＨＣ−ペプチド複合体が先例のない大量（例えば、グラム）の高度に精製され、かつ機能的であるＭＨＣ−ペプチド複合体、ならびにＭＨＣ−ペプチド四量体の生成のための効率的な新規な方法を構成することが明らかになった。
【００６１】
大腸菌から生成されたヒトｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体に続いて、実施例の章にさらに記載されるように、抗原性ペプチドの存在下にインビトロでリフォールドすることによる封入体は高度に純粋で、かつ、機能的である。
【００６２】
すなわち、本発明の１つの態様によれば、機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドの上流に並進して融合された機能的ヒトβ−２ミクログロブリンをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
【００６３】
本明細書中に使用されるように、１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体のβ−２ミクログロブリンおよび重鎖ポリペプチド領域に関して使用される場合、「機能的」との用語は機能的１本鎖ＭＨＣクラスＩ複合体の構築に寄与することができる（すなわち、複合体化されたとき、ＣＴＬ特異的抗原性ペプチドへ結合および提示することができる）それぞれの部分を呼ぶ。
【００６４】
好ましくは、第１ポリヌクレオチドはβ−２ミクログロブリンポリペプチド全てをコードし、一方、第２ポリヌクレオチドは重鎖のα１−３ドメインをコードする。
【００６５】
本明細書中に交換可能に使用される「並進して融合された」および「インフレーム」との成句は、結合されたポリヌクレオチドのコード配列の長さをスパニングする１つの連続オープンリーディングフレームを形成するように共有結合されるポリヌクレオチドを呼ぶ。このようなポリヌクレオチドはスペーサーまたはリンカー領域により直接または好ましくは間接に共有結合され得る。
【００６６】
すなわち、本発明の好ましい実施態様によれば、核酸配列はインフレームリンカーポリヌクレオチドをさらに含む。このリンカーポリヌクレオチドはリンカーペプチドをコードし、かつ、第１および第２ポリヌクレオチドの間に内挿される。
【００６７】
リンカーペプチドは、第１および第２ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドがその発現後に独立して、かつ自然にフォールドし、したがって、機能的１本鎖（ｓｃ）ヒトＭＨＣクラスＩ複合体の形成を容易にするような本質的に柔軟であるアミノ酸配列から選択される。
【００６８】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、リンカーペプチドは配列番号１０に示される。
【００６９】
すなわち、本発明のこの態様の第１核酸配列は、機能的ヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードする。好ましくは、第１核酸配列は配列番号４に示される。
【００７０】
本発明の他の好ましい態様によれば、第１核酸配列は結合部分を含むように酵素的に変性され得るペプチドをコードするインフレームタグ配列（配列番号２０に記載されるものなど）をさらに含む。以下の実施例の章にさらに記載されるように、例えば、ビオチンである結合部分は、ｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドの共通付着部分として作用するアビジンまたはストレプトアビジンなどのリガンドを提供することによって、複数のｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドを多量体中に構築するために本発明で使用され得る。ＭＨＣクラスＩ多量体は、以下の実施例の章にさらに記載されるペプチド仲介ＣＴＬ活性化において特に有利である。
【００７１】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、核酸構築物は第１シス作用制御配列をさらに含む。シス作用制御配列は、宿主細胞中に導入されたとき、核酸配列の発現を容易にするためにその全てが作用するプロモーター配列およびさらなる転写または翻訳エンハンサー配列を含むことができる。プロモーターの特別な例は、以下の種々の真核生物および原核生物発現系の項およびそれに続く実施例の章に記載される。
【００７２】
すなわち、本発明のこの態様の核酸構築物は、宿主細胞中で機能的ヒトβ−２ミクログロブリンおよび機能的ヒトＭＨＣクラスＩ重鎖およびそれらの間に内挿されたリンカーペプチドを含む組換えヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを発現することができる。好ましくは、発現可能な組換えポリペプチドは配列番号５に示される。
【００７３】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、核酸構築物はまた、抗原性ペプチドをコードする第２核酸配列を含む。抗原性ペプチドはヒトＭＨＣクラスＩ複合体を結合できるように選択される。以下の実施例の章にさらに記載されるように、種々のＣＴＬ特異的抗原性ペプチドは、癌細胞由来抗原性ペプチド、ウイルス由来抗原性ペプチドなどを含む第２核酸配列によってコードされ得るが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、核酸構築物は宿主細胞中に導入されたとき、第２核酸配列を発現することに作用する第２シス作用制御配列を含む。
【００７５】
１本鎖シス作用制御配列は、第１および第２核酸配列を含む１つの転写物の転写を指示する核酸構築物によって使用され得ることが理解されるであろう。このような場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が内部に位置する核酸配列の翻訳を可能とするように利用され得る。
【００７６】
１つの核酸構築物からｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドおよび抗原性ペプチドを共発現することは、宿主細胞を形質転換するとき有利であるけれども、２つの核酸配列は１つの細胞を共形質転換するために使用され得る２つの別個の核酸構築物に二者択一的に含まれ得る。
【００７７】
いずれの場合にも、核酸構築物はｓｃＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体の効率的な構築を可能とするように、ｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドおよびその結合ペプチドの両方の発現程度が化学量論的に正しい（ｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドに対するペプチド比１：１が好ましい）ように配置されなければならないことが理解されるであろう。
【００７８】
好ましくは、本発明の核酸構築物によって使用されるプロモーターは、宿主細胞形質転換に続いて高濃度発現が第１および第２核酸配列において達成されるような強い構成的プロモーターである。
【００７９】
高濃度発現もまた、コピー数の多い核酸構築物で宿主細胞を形質転換するか、または得られた転写物を安定化するシス作用配列を使用することによって行われ、そして、このような転写物の分解または「代謝回転（ｔｕｒｎ−ｏｖｅｒ）」を減少することが理解されるであろう。
【００８０】
本発明の他の態様によれば、上記された核酸構築物を含む形質転換宿主細胞が提供される。
【００８１】
本明細書で使用されるように、「形質転換細胞」との成句は、外来性核酸配列が導入されて、それによって安定にまたは過渡的に宿主細胞を遺伝的に変性する細胞をいう。これは、そのいくつかが宿主細胞の特別な実施例の項に以下に詳細に記載される、当該技術分野で周知である種々の方法を使用して、天然または人工的条件下に生じる。
【００８２】
形質転換宿主細胞は例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞および原生動物細胞などの真核生物細胞であり、またはこの細胞は細菌細胞である。
【００８３】
真核生物宿主細胞発現を使用する場合、本発明の核酸構築物は大腸菌内（構築物が適当な選択マーカーおよび複製オリジンを有する）で増殖でき、かつ、真核生物宿主細胞内の発現において適合性を有するシャトルベクターである。本発明の核酸構築物は例えばプラスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体である。
【００８４】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、宿主細胞は例えば哺乳動物細胞培養物の哺乳動物細胞である。好適な哺乳動物発現系としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能であるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能であるｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能であるｐＴＲＥＳ、およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
昆虫細胞培養物もまた、本発明の核酸配列を発現するために使用され得る。好適な昆虫発現系としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｍａｘＢａｃＴＭ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＢａｃＰａｋＴＭ）、またはＧｉｂｃｏ（Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃＴＭ）などの数多くの供給者から市場で入手可能であるバキュロウイルス発現系およびその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の核酸配列の発現はまた植物細胞中でも行われ得る。本明細書中で使用されるように、「植物細胞」との成句は、植物原形質体、植物組織培養物の細胞、植物由来組織の細胞、または全植物の細胞を呼ぶことができる。
【００８７】
植物細胞中へ核酸構築物を導入する種々の方法が存在する。このような方法は植物細胞のゲノム中への核酸構築物またはその部分の安定な組み込み、またはこれらの配列が植物細胞のゲノム中に安定して組み込まれない場合の核酸構築物の過渡的発現のいずれかに依拠する。
【００８８】
植物細胞ゲノム中へ本発明の核酸構築物内に含まれるものなど、外来性核酸配列の安定なゲノム組み込みを行う２つの基本的な方法が存在する。
【００８９】
（ｉ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介遺伝子伝達：
【外１】
2004503213.tif 000002
【００９０】
（ｉｉ） 直接ＤＮＡ取り込み：
【外２】
2004503213.tif 000003
2004503213.tif 000004
【００９１】
アグロバクテリウム系は植物ゲノムＤＮＡ中に組み込む所定ＤＮＡセグメントを含むプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の播種方法は、植物種およびアグロバクテリウム輸送系によって異なる。広く使用される方法はリーフディスク方法である。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、「植物分子生物学マニュアルＡ５」、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）， １−９頁参照。補充方法はアグロバクテリウム輸送系を真空浸潤と組み合わせて使用する。アグロバクテリウム系は安定に形質転換された双子葉植物の創生において実行可能である。
【００９２】
植物細胞中への直接ＤＮＡ移送には種々の方法が存在する。電気穿孔法では、原形質体が強い電場に短く暴露される。微量注入法では、ＤＮＡが非常に小さなマイクロピペットを使用して細胞中に直接、機械的に注入される。微粒子投射法では、ＤＮＡが硫酸マグネシウム結晶、タングステン粒子または金粒子などの微投射物上に吸収され、そして、この微投射物が物理的に細胞または植物組織中へ加速される。直接ＤＮＡ移送はまた、過渡的に植物細胞を形質転換するために使用され得る。
【００９３】
いかなる場合にも、第１および第２核酸配列の植物細胞発現において使用され得る好適な植物プロモーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ユビキノンプロモーター、および構成的または組織特異的方法で核酸配列を発現できる他の強いプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
植物ウイルスもまた、形質転換ベクターとして使用され得る。植物細胞宿主の形質転換に有用であることが示されているウイルスとしては、ＣａＶ、ＴＭＶおよびＢＶが挙げられる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換は、米国特許第４８５５２３７号（ＢＧＶ）、ＥＰ−Ａ６７５５３（ＴＭＶ）、特開昭６３−１４６９３号（ＴＭＶ）、ＥＰＡ１９４８０９（ＢＶ）、ＥＰＡ２７８６６７（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙら、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１７２−１８９ 頁（１９８８）に記載される。植物を含む多くの宿主で外来性ＤＮＡを発現するために使用する偽ウイルス粒子は、ＷＯ８７／０６２６１に記載される。
【００９５】
非ウイルス性外因性核酸配列の植物への導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参考文献ならびにＤａｗｓｏｎ， Ｗ．Ｏ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９） １７２：２８５−２９２； Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ Ｊ． （１９８７） ６：３０７−３１１； Ｆｒｅｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８６） ２３１：１２９４−１２９７；およびＴａｋａｍａｔｓｕら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０） ２６９：７３−７６に示されている。
【００９６】
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、構築はウイルス自体へ行われ得る。または、上記された核酸配列を使用して所望ウイルスベクターを容易に構築するには、ウイルスはまず、細菌プラスミド中へクローン化され得る。次いで、ウイルスはプラスミドから切除される。もしもウイルスがＤＮＡウイルスであるなら、細菌の複製起点がウイルス性ＤＮＡに付着され、次いで、これが細菌によって複製される。このＤＮＡの転写および翻訳はウイルス性ＤＮＡをキャプシド形成するコートタンパク質を生産するであろう。もしもウイルスがＲＮＡウイルスであるなら、ウイルスはｃＤＮＡとして一般的にクローン化され、プラスミド中へ挿入される。次いで、プラスミドは構築の全てを行うために使用される。ＲＮＡウイルスは次いでプラスミドのウイルス性配列を転写し、そしてウイルスＲＮＡをキャプシド形成するコートタンパク質を生産するウイルス遺伝子を翻訳することによって生産される。
【００９７】
本発明の構築物に含まれるような非ウイルス性外因性核酸配列の植物中への導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参考文献ならびに米国特許第５３１６９３１号に示されている。
【００９８】
酵母細胞もまた本発明で宿主細胞として使用され得る。酵母中で本発明の核酸配列の発現に適した酵母発現ベクターの多くの例は当該技術分野で公知である。このようなベクターは通常、当該技術分野で周知である化学的または電気穿孔形質転換法によって酵母宿主細胞中に導入される。市場で入手可能な系としては、例えば、ｐＹＥＳＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＹＥＸＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）発現系が挙げられる。
【００９９】
核酸構築物が上記されたような真核生物発現系で発現される場合、これは好ましくはシグナルペプチドコード配列を含み、そのため、第１および第２核酸配列から生産されたポリペプチドは付属されるシグナルぺプチドを経て分泌経路中に向けられることが理解されるであろう。例えば、哺乳動物、昆虫および酵母宿主細胞では、発現されたポリペプチドは成長培地へ分泌され、一方、植物発現系では、ポリペプチドがアポプラスト中に分泌されるか、または亜細胞オルガネラ中に向けられ得る。
【０１００】
本発明の目下、好ましい実施態様によれば、宿主細胞は例えば大腸菌などの細菌細胞である。細菌宿主は、例えば化学的形質転換法（例えば、ＣａＣｌ２）または電気穿孔法を含む当該技術分野で周知である形質転換方法によって核酸配列で形質転換され得る。
【０１０１】
本発明の核酸配列を発現するために使用され得る細菌発現系の多くの例は当該技術分野で公知である。市場で入手可能な細菌発現系としては、ｐＥＴＴＭ発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳＥＴＭ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＧＥＸＴＭ発現系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
以下の実施例の章でさらに記載されるように、細菌発現は発現されたポリペプチドが発現されたポリペプチドの回収および精製を容易に受け入れる（ａｍｅｎａｂｌｅ）実質的に純粋な封入体を形成するから、特に有利である。
【０１０３】
すなわち、本発明のなお他の態様によれば、３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７５重量％以上、もっとも好ましくは９０重量％以上の本発明の組換えヒトｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドから構成される細菌由来封入体の調製法が提供される。このような封入体の単離およびこれから得たｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドの精製は、以下の実施例の章に詳細に記載される。
【０１０４】
実施例の章に示されるように、ｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドの細菌発現は多量の純粋で、かつ機能的なｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドをもたらすことができる。このように、本発明の方法はまた、真核生物発現系のみに限られた成功でもって今日までに発現されている哺乳動物ｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドを細菌内にて発現するために適用され得る。
【０１０５】
すなわち、本発明の他の態様によれば、機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンをコードする第１ポリヌクレオチドを含む核酸配列を含む核酸構築物が提供される。核酸構築物は第１ポリヌクレオチドの下流に並進して融合される機能的哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖をコードする第２ポリヌクレオチドをさらに含む。本発明のこの態様による核酸構築物は、細菌内で核酸配列の発現を指示することができるシス作用制御配列をさらに含む。本発明のこの態様の核酸配列を発現するために使用され得る好適なプロモーターおよび細菌発現系は、上述される。
【０１０６】
本発明のこの態様による核酸配列は、マウス、ラット、ブタおよびウサギなどの哺乳動物のＭＨＣクラスＩコード配列から誘導されるか、または合成され得る。
【０１０７】
ヒトｓｃＭＨＣクラスＩ構築物について上文に記載された種々の実施態様、すなわち本発明のこの態様の哺乳動物ｓｃＭＨＣクラスＩ核酸構築物の細菌発現に適用し、かつ有用である実施態様もまた、本明細書中に導入されることが理解されるであろう。
【０１０８】
すなわち、本発明は、真核生物または好ましくは細菌発現系でそのペプチドを好ましくは結合するとともに、ｓｃＭＨＣクラスＩポリヌクレオチドペプチドを発現するために使用され得る種々の発現構築物を提供する。
【０１０９】
本発明のさらなる態様によれば、機能的ＭＨＣクラスＩ分子を生産する方法が提供される。本発明のこの態様による方法は、機能的哺乳動物ＭＨＣクラスＩ重鎖アミノ酸配列に直接または間接に共有結合された機能的哺乳動物β−２ミクログロブリンアミノ酸配列を含む１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを細菌内で発現するために記載された核酸構築物のいずれをも使用する。
【０１１０】
発現後、１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドは単離され、かつ、以下に説明するように精製される。
以下の実施例の章にさらに記載されるように、発現されたポリペプチドは当該技術分野で周知である分画技術によって容易に単離され、かつ、例えば変性−再生工程により精製される純粋な封入体を実質的に形成する。
【０１１１】
好ましくは、１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドは１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを結合することができる抗原性ペプチドの存在下に再生され、そしてリフォールドされる。実施例の章にさらに記載されるように、これはサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製され得る実質的に純粋なＭＨＣクラスＩ−抗原性ペプチド複合体を生成することができる。
【０１１２】
リフォールディングに使用される抗原性ペプチドは細菌内で１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドとともに共発現され得ることが理解されるであろう。このような場合、発現されたポリペプチドおよびペプチドは、ＭＨＣクラスＩ−抗原性ペプチド複合体形成において単離され、そして使用され得る封入体を共形成する。
【０１１３】
本発明のさらなる目的、利点および新規な態様は、以下の実施例の試験時に当業者に明らかになるであろう。これらは限定されることを意図されていない。さらに、上記文に描写され、かつ請求項の章に記載される本発明の種々の実施態様および態様のそれぞれは、以下の実施例中に実験的支持を見出す。
【０１１４】
実施例
上記記載とともに非限定的方法にて本発明を説明する下記実施例が参照される。
【０１１５】
一般的には、本明細書中に使用される命名法および本発明に使用される実験手法は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、
【外３】
2004503213.tif 000005
これらの全ては、本明細書中に完全に示されるように参考として導入される。他の一般的な参考文献はこの資料中に提供される。その中の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。その中に含まれる情報の全ては参考として本明細書中に導入される。
【０１１６】
実施例１
材料と方法
ペプチド：
メラノーマ抗原ｇｐ１００［２４−２６］由来の癌細胞関連ペプチドＧ９−２０９−２Ｍ（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ、配列番号１）およびＧ９−２８０−９Ｖ（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ、配列番号２）の両方は、ＭＨＣ結合のために使用された。これらのペプチドはＭＨＣアンカー位２（Ｇ９−２０９−２Ｍ）および９（Ｇ９−２８０−９Ｖ）で変性されて、ＨＬＡ−Ａ２［２６］の結合親和性を改良する。ＴＡＸ１１−１９ＨＴＬＶ−１ペプチド（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ、配列番号３）はコントロールとして使用された［５３］。
【０１１７】
ペプチドは標準フルオレニルメトキシカルボニル化学によって合成され、逆相ＨＰＬＣによって９５％以上まで精製された。精製後、これらのペプチドは１本鎖ＭＨＣ（ｓｃＭＨＣ）−ペプチド複合体のリフォールディングおよび以下にさらに記載されるｓｃＭＨＣ−ペプチドの形成に使用された。
【０１１８】
プラスミド構築物：
ＨＬＡ−Ａ２の最初の３つの細胞外ドメイン（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、アミノ酸１〜２７５、配列番号６）を含む１本鎖（ｓｃ）ＭＨＣポリペプチド（配列番号５）およびヒトβ２−ミクログロブリンポリペプチド（配列番号７）をコードするｃＤＮＡ構築物（配列番号４）が、ヒトＴ−Ｂ細胞ハイブリッドＴ２セルライン［２７］から誘導されたα１−３およびβ−２ミクログロブリンｃＤＮＡから組み立てられた。ヒトβ−２ミクログロブリンはｂ２Ｍ−５、
【外４】
2004503213.tif 000006
（配列番号８）およびｂ２Ｍ−３、
【外５】
2004503213.tif 000007
（配列番号９）を使用してＰＣＲ増幅され、１５残基フレキシブルリンカー（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ４）３（配列番号１０）により、Ａ２−５、
【外６】
2004503213.tif 000008
（配列番号１１）およびＡ２−３、
【外７】
2004503213.tif 000009
（配列番号１２）プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅されたＨＬＡ−Ａ２重鎖のＮ−末端に連結された。両鎖のｃＤＮＡは、β−２ミクログロブリンの３’−末端がＨＬＡ−Ａ２遺伝子の５’−末端に結合された２工程ＰＣＲ重複伸長反応に使用された。
【０１１９】
２工程ＰＣＲ重複伸長反応を実施するには、リンカー配列の３分の２がＰＣＲプライマーｂ２Ｍ−Ｌ５、
【外８】
2004503213.tif 000010
（配列番号１３）およびｂ２Ｍ−Ｌ３、
【外９】
2004503213.tif 000011
（配列番号１４）を使用して、β−２ミクログロブリン配列中へ導入され、一方、ＰＣＲプライマーＡ２−Ｌ５、
【外１０】
2004503213.tif 000012
（配列番号１５）およびＡ２−Ｌ３、
【外１１】
2004503213.tif 000013
（配列番号１６）がＨＬＡ−Ａ２のために使用された。
【０１２０】
増幅後、β−２ミクログロブリンおよびＨＬＡ−Ａ２ＰＣＲ産物が１：１の比にて結合され、反応はｂ２Ｍ−Ｌ５およびＡ２−Ｌ３プライマーを使用してＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ産物は精製され、ｐＥＴ系発現ベクター中へサブクローン化された。
【０１２１】
上記されたＨＬＡ−Ａ２およびβ−２ミクログロブリンコード配列はまた、独立した発現として、ｐＥＴ２１で別個にクローン化された。
ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡコード配列は、短いリンカー（ＱＳＴＲＧＧＡＳＧＧＧ、配列番号１８）によりＨＬＡ−Ａ２のＮ−末端に連結された部位特異的ビオチン化のためのペプチド配列（ＬＧＧＩＦＥＡＭＫＭＥＬＲＤ、配列番号１７、下線部はビオチン化されたリジン残基）を含んでいた。
【０１２２】
ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡコード配列は、Ｂ２Ｍ−ＢｉｒＡ−３、
【外１２】
2004503213.tif 000014
（配列番号１９）および上記されたｂ２Ｍ−Ｌ５プライマーを使用してＰＣＲ増幅された。ＢｉｒＡ認識配列（配列番号２０）を含む得られたＰＣＲ産物は図１に示されるように精製され、消化されそして細菌発現ベクター中にサブクローン化された。
【０１２３】
ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体の発現、リフォールディングおよび精製：
ＨＬＡ−Ａ２、β−２ミクログロブリン、およびｐＥＴ２１中にサブクローンされたｓｃＭＨＣ構築物はＩＰＴＧ誘発下に発現され、ＢＬ−２１ＤＥ３細胞中に細胞内封入体を形成した。封入体は誘発されたＢＬ２１細胞から単離され、精製され、そして６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ７．４中に可溶化された。６５ｍＭ　ＤＴＥで還元された後、封入体はｇｐ１００または上記されたＨＴＬＶ−１ウイルス性ペプチド［２６，５２］から誘導された５〜１０モル過剰量の抗原性ペプチドの存在下に、レドックス−シャフリング緩衝液系（０．１Ｍトリス、０．５Ｍアルギニン、０．０９ｍＭ酸化グルタチオン、ｐＨ８．０）中でリフォールドされた。リフォールディング後、タンパク質は１０Ｋカットオフカセットを使用するミニセットシステム（Ｆｉｌｔｒｏｎ， Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ）によって透析され、濃縮された。可溶性ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体は、溶出緩衝液としてＰＢＳを使用して、ＴＳＫ３０００カラム（ＴＯＳＯＨＡＡＳ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）上でサイズ排除クロマトグラフィーにより精製された。
【０１２４】
組換えｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体および四量体ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体のビオチン化
上記されたようにして発現されたｓ．ｃ−ｂ２−Ａ２−ＢｉｒＡ（ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ）構築物はペプチド２０９または２８０の存在下にリフォールドされ、そして、ＴＳＫ３０００カラム（溶出緩衝液、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）上でサイズ排除クロマトグラフィーにて精製された。ｓｃＭＨＣ−ペプチド−ＢｉｒＡ複合体はセントリコン３０（Ａｍｉｃｏｎ）によって２０〜３０ｍＭ（１〜１．５ｍｇ／ｍｌ）まで濃縮され、次いで、ビオチンタンパク質リガーゼ−ＢｉｒＡ酵素（ＡＶＩＤＩＴＹ）を使用して、２５℃で１６時間、酵素的ビオチン化に付された。緩衝液の交換およびビオチン化された複合体からの過剰ビオチンの除去は、セントリコン３０限外濾過を使用して実施された。ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体の四量体アレーは、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体：ストレプトアビジンがそれぞれ、４：１のモル比にて、添加して形成された。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡ分析：
マキシソーブ免疫プレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＩＬ）は、１ｍｇ／ｍｌ抗−ＨＬＡモノクローナル抗体ＢＢ７．２（ＡＴＣＣ　ＨＢ８２）でもって、４℃で一夜、被覆され、そして３％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用してブロックされた。ビオチン化抗−ＨＬＡ　Ｗ６／３２モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ　ＨＢ９５）は、ストレプトアビジン−パーオキシダーゼ共役によるＨＬＡ複合体の検出のために使用された。
【０１２６】
さらに、ビオチン化または未ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド複合体は、洗浄されたＭａｇｎａＢｉｎｄＴＭストレプトアビジンビーズ（ＰＩＥＲＣＥ）とともに室温で３０分間、インキュベートされた。外部磁場を使用して、ビーズに結合されたビオチン化複合体を未結合物質から分離した。上清は結合された試料から別に分離され、ビーズは室温で３０分間、２％ＭＰＢＳ（ＰＢＳ＋２％半脱脂乳粉末）でブロックされた。ビオチン化複合体は続いて、構造依存性抗体Ｗ６／３２を使用して分析され、抗−マウスＩｇＧ−パーオキシダーゼを使用して検出された。
【０１２７】
円偏光二色性スペクトル：
ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体の円偏光二色性スペクトルは、感度０．５ｍｄｅｇ／ｃｍおよびスキャン速度１０ｍｍ／分に調整された分光偏光計（ＪＡＳＣＯ５００）により室温で測定された。スキャンはタンパク質濃度０．２７ｍｇ／ｍｌで１９５〜２７５ｎｍにて実施された。二次構造計算は、公表されたプログラム［２９］を使用して測定された。
【０１２８】
ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体の質量スペクトル分析：
ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体は、２．１×３０ｍｍＣ−８カラム（ＡＱＵＡＰＯＲＥ ＲＰ−３００， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＨＰＬＣにより解像され、そして０．０５ＴＦＡ中の１５〜６５％アセトニトリル（ＡＣＮ）の一次勾配を使用し、１．２５％／分で、かつ、流速１５０ｍｌ／分で溶出された。試料はエレクトロスプレー（ＥＳＩ）イオントラップ質量分析計（ＬＣＱ， Ｆｉｎｎｉｇａｎ）中にＨＰＬＣカラムから直接にマイクロスプレーされ、陽イオンモードで分析された。タンパク質の質量推定は、質量対電荷比率に対する相対量であるＥＳＩ質量スペクトルスポットを、質量に対する相対量のスポット中に移動する、逆重畳積分アルゴリズムを使用してなされた。１つの試料成分に対応する取得された質量スペクトルの多電荷イオンピークの各配列は、逆重畳積分されたスペクトルの分子質量Ｍに位置された１つのピーク中に変換される。
【０１２９】
ＣＴＬクローンおよびＣＴＬ刺激分析：
メラノーマペプチドに特異的なＣＴＬクローンは、Ｄｒ．Ｓｔｅｖｅｎ ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＤｒ．Ｍａｒｋ Ｄｕｄｌｅｙ（Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ＮＩＨ）から提供された。これらのＣＴＬクローンは、ペプチド免疫化を受けた患者から取得されたＰＢＭＣの大量培養からクローン化して生成された［２４］。ＣＴＬは、続いて５０ＣＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下に、照射されたＰＢＭＣおよびＯＫＴ３抗体（３０ｎｇ／ｍｌ）を使用して増大された。
【０１３０】
ＣＴＬクローン（１×１０５／ウェル）は、組織培養培地中で洗浄され、そして、組織培養培地中で、３７℃で２４時間、種々の濃度のｓｃＭＨＣ−ペプチド四量体とともに、２倍または３倍にインキュベートされた。また、ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体は４℃で一夜、マキソーブ免疫プレート上に固定化され、培養培地中のＣＴＬクローンは続いてウェルに添加され、３７℃で２４時間、インキュベートされた。インキュベーション後、上清は遠心分離によって収集され、そして培養上清中に存在するＩＬ−２およびＩＦＮｇは、二重サンドイッチ抗体−捕捉酵素免疫分析（Ｆｌｅｘｉａ， ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ， Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ）を使用して分析された。培養上清中のＩＬ−２およびＩＮＦγの濃度は、組換えヒトＩＬ−２およびＩＮＦγの較正曲線をもとに測定された。
【０１３１】
実験結果
組換え１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の発現、リフォールディングおよび精製：
可溶性１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体を生産するために、発現がファージＴ７プロモーターによって駆動されるｐＥＴ系発現ベクター中に１本鎖ＭＨＣをコードする遺伝子をサブクローン化した。
【０１３２】
本研究に使用されたプラスミド構築物は、図１に説明される。大腸菌ＢＬ２１細胞中でのｓｃＭＨＣ遺伝子の発現は非常に効率的であり、組換えタンパク質は不溶性細胞内封入体として蓄積した。１本鎖ＭＨＣは可溶化された全細胞（図示されない）、ならびに単離され精製された封入体（図２ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で主要なバンドとして検出された。ｓｃＭＨＣタンパク質の発現は別個の成分、すなわち膜貫通ＨＬＡ−Ａ２重鎖およびβ−２ミクログロブリンの発現と比較され得た（図２ａ）。ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡタンパク質においても極めて効率的な発現が得られた（図２ｂ）。精製された封入体は８０〜９０％の組換えｓｃＭＨＣを含んでいた。封入体は精製され、６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化され、そして抗原性ペプチドの存在下にインビトロのレドックス−シャフリング緩衝液系によってリフォールドされた。３種の異なったペプチドがｓｃＭＨＣ分子のリフォールディングのために使用された。２種のペプチド（Ｇ９−２０９−２ＭおよびＧ９−２８０−２Ｖ）はメラノーマ共通抗原ｇｐ１００から誘導された腫瘍関連抗原であり［２６］、１種はＨＴＬＶ−１（ＴＡＸ）から誘導されたウイルス性ペプチドである［５３］。これらのペプチドは制限されたＨＬＡ−Ａ２であると先に示されていた［２６，５３］。
【０１３３】
リフォールドされた複合体は透析され、そして濃縮された後、ＴＳＫ３０００カラム上でサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製された。リフォールドされた精製ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体の非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１セットの分子量マーカーに対する相対的遊走にしたがって計算して見かけ分子量４５ｋＤａであるｓｃＭＨＣ分子に対応する均一な１つのバンドとして遊走した分子の同質単量体集団を明らかにした（図３ａ〜ｂ）。図３ａ〜ｂに示されるように、精製された同質ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体は試験された３種のペプチド全てで得られた。ｓｃＭＨＣはペプチドの不在下にリフォールドされた場合、高度に凝集されたタンパク質が観察された。これはサイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されるように分子の異質集合体から構成されていた；これは不適切にフォールドされた分子の不安定な集団の存在を示す（データは示されない）。すなわち、単量体の均一な集団がペプチド誘発されたリフォールディング調製物中にのみ見い出され得た。リフォールドされたｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体は−７０℃で貯蔵され、そして解凍時に再使用された。リフォールドされた精製１本鎖ＭＨＣ複合体の収率は２０〜２５％であり、すなわち、２０〜２５ｍｇの精製可溶性複合体が１００ｍｇのリフォールドされた封入体タンパク質から得られた。
【０１３４】
同様な結果は、ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド複合体で得られた。これは部位特異的ビオチン化のためのＨＬＡ−Ａ２のＣ−末端にタグ配列を含む（図３ｃ）。見かけ分子量４８ｋＤａがこの分子について観察された。これはＢｉｒＡペプチドタグとこれをＨＬＡ−Ａ２に結合するリンカーを添加して予測されるｓｃＭＨＣ分子の大きさにおける増加を反映する。
【０１３５】
従って、３つの結果は、ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体が抗原性ペプチドの存在下に大腸菌封入体のリフォールディングによってインビトロで生産され得ることを示す。リフォールディング方法は効率的であり、そして、複合体の同質集団が高収率および純度でもって得られうる。
【０１３６】
１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の生化学的および生物物理的特性化：
図３ａ〜ｃに示されるように、ｓｃＭＨＣペプチド複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥから判断されるように純粋でかつ同質であった。ＴＳＫ３０００カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーは、精製されたｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体が４５ｋＤａの分子質量を有する単量体として溶出された（示されていない）。精製された複合体が０．１５ｍＭ（〜６ｍｇ／ｍｌ）まで限外濾過によって濃縮され、そしてＰＢＳ中でサイズ排除ＴＳＫ３０００カラム上のその分子形について分析されたとき、二量体化または凝集の徴候は観察されなかった。
【０１３７】
１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体二次構造を評価するために、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製されたタンパク質は円偏光二色性（ＣＤ）分光法で試験された（図４）。複合体のスペクトルは大部分がβ−シート構造と一致して、２１８ｎｍで最小特性値を示した。二次構造計算において分析されたとき、スペクトルは６２％β−シート、５％β−ターン、８％α−ヘリックスおよび１８％芳香族側鎖寄与を含む二次構造の特異的パターンを示していた。８０℃で変性されたとき、スペクトルプロフィールは特徴的β−シート構造のほとんどが失われ、ＣＤシグナルが増加されることを示し、ランダム螺旋が変性の結果として生成されたことを示した。溶融曲線はペプチドＧ９−２０９−２Ｍを含む複合体が約６０℃の溶融温度で熱的に安定であることを示した（データは示されない）。これらの結果は、２１８ｎｍのＣＤシグナルの変化によってモニターされたインフルエンザウイルスペプチドと複合体化されたＨＬＡ−Ａ２における熱的変性曲線と類似している［３１］。従って、これらの二次構造態様は正しくフォールドされたＭＨＣ−ペプチド複合体の特性であると結論される［３１］。
【０１３８】
リフォールドされたｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体はまた、正しくフォールドされたとき、ＭＨＣ−ペプチド複合体のみを認識する構造特異的抗体を使用して分析された。図５ａに示されるように、抗−ＨＬＡ−Ａ２特異的ｍＡｂ断片ＢＢ７．２および完全に組み立てられたペプチド含有ＨＬＡ−Ａ２に対して特異的なｍＡｂ断片Ｗ６／３２は、可溶性ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を検出した。Ｗ６／３２抗体は、複合体が正しくフォールドされ、ペプチドを含み、かつ、構造的に機能的であることを示す２種のｇｐ１００由来ペプチドのいずれをも含む、リフォールドされ、かつ精製されたｓｃＭＨＣ複合体を濃度依存的方法で特異的に認識した。
【０１３９】
Ｗ６／３２抗体によるｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド複合体の特異的認識は、ストレプトアビジンで被覆された磁性ビーズに固定化されたビオチン化複合体において試験されたときも行われた（図５ｂ）。ビオチン化されたｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド複合体で被覆されたビーズから得たＥＬＩＳＡシグナルは、ＢｉｒＡ酵素によるビオチン化に付されなかったｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド複合体よりも５〜６倍高かった（図５ｂ）。
【０１４０】
質量スペクトル分析はｓｃＭＨＣ複合体が正しくフォールドされ、そしてペプチドを含むことを明白に示すために実施された。リフォールドされ、かつ精製された複合体は６ｍｇ／ｍｌまで濃縮され、試料は電子スプレー質量分光測定法による分析に付された。複合体試料はまず、Ｃ−８カラム上でＨＰＬＣによって解像され、続いてカラムからペプチドとｓｃＭＨＣタンパク質の連続溶出を分離する、ＴＦＡ中のアセトニトリルの一次勾配で溶出された。溶出された試料は、イオントラップ（ＥＳＩ）質量分光計で電子スプレー中にＨＰＬＣカラムから直接にマイクロスプレーされ、陽イオンモードで分析された。図６ａに示されるように、溶出されたペプチドはｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体をリフォールドするために使用されたＧ９−２０９−２Ｍペプチドの質量に対応する１０３５ダルトンの期待質量を有する。これはリフォールドされた複合体が１つの特異的ペプチドを含む分子の同質集合体であることを示す、検出された唯一のペプチドであった。１０５７ダルトンの質量を有する小さなピークも観察され、そのピークは複合体が精製され、そして分析に先立って濃縮されるＰＢＳ緩衝液からおそらく生じたナトリウムイオンを含むＧ９−２０９−２Ｍに対応する。
【０１４１】
ｓｃＭＨＣ複合体の質量推定は、質量対電荷比率に対する相対量であるＥＳＩ質量スペクトルスポットを、質量に対する相対量のスポット中に移動する逆重畳積分アルゴリズムを使用して行われた（図６ｂ〜ｃ）。１つの試料成分に対応する取得された質量スぺクトルの多重に荷電されたイオンピークの各配列（図６ｂ）は、逆重畳積分スペクトル中の分子質量（Ｍ）に位置する１つのピーク中に変換される（図６ｃ）。図６ｃに示されるように、逆重畳積分スペクトルはｓｃＭＨＣタンパク質の期待される分子量に対応する４４．６ｋＤａの質量を有する１つのピークを明らかにした。このペプチドについて上記図に示されるように、これはタンパク質がフォールドされた複合体の極めて同質な集合体からなることを示す分析されたスペクトル中に唯一同定されたタンパク質ピークであった。質量分光分析データにより実施された溶出ペプチドの化学量論的推定は、リフォールドされ、そして精製されたｓｃＭＨＣ分子全てがペプチドと複合体化されていることを明らかにした。
【０１４２】
１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の生物学的活性
Ｇ９−２０９−２Ｍペプチドに特異的なクローン化されたＣＴＬを使用するＣＴＬ刺激分析は、ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体の生物学的活性を試験するために使用された。
【０１４３】
３種の異なったペプチド（Ｇ９−２０９−２Ｍ、Ｇ９−２８０−９Ｖ、およびＴＡＸ）を用いて生産された組換え精製ｓｃＭＨＣ複合体は、マイクロタイター上に固定され、そしてＣＴＬ活性化を誘発する能力について試験された。図７ａに示されるように、Ｇ９−２０９−２Ｍペプチドに結合された１本鎖ＭＨＣ分子は、インターフェロンｇ濃度によって測定されるように、Ｇ２０９−特異的ＣＴＬクローンＲ６Ｃ１２の特異的活性化を誘発した。他方、Ｇ２８０およびＴＡＸペプチドに結合された複合体は、特異的活性化を誘発しなかった。
【０１４４】
溶液中でＴ細胞活性化を誘発する可溶性ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体の能力は、部位特異的ビオチン化のタグ配列を含むｓｃＭＨＣ−ペプチド分子から構成されるｓｃＭＨＣ−ペプチド四量体を生成することによって全て試験された。ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ複合体を含むリフォールドされそして精製されたペプチドは、ＢｉｒＡ酵素を使用してビオチン化された。ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ複合体の精製後、四量体はストレプトアビジンとのインキュベーションによって形成された。ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド四量体の生物学的活性は対応するＣＴＬクローンを活性化するその能力によって試験された。図７ｂに示されるように、Ｇ９−２０９−２Ｍペプチドを含む四量体は、２０９−特異的ＣＴＬクローンＲ６Ｃ１２を活性化したが、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＴＬクローンＪＢ２Ｆ４を活性化しなかった。これはリフォールドされたｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体が機能的であり、かつ、特異的であることを示す。図７ｃに示されるように、２０９−特異的ＣＴＬクローンを活性化する１本鎖ＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド複合体の能力は、ｓｃＭＨＣタンパク質をビオチン化するか、あるいはしないで、続いてストレプトアビジンとともにインキュベーションして試験された。この図から明らかなように、四量体複合体を形成することができるビオチン化されたＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチドのみが、溶液中の２０９−特異的ＣＴＬクローンを活性化する。すなわち溶液中のＴ細胞活性化はＭＨＣ−ＴＣＲ相互作用の結合力を増加する四量体の形態であるＭＨＣ複合体の多量体化を必要とする。
【０１４５】
特異的Ｇ９−２０９−２Ｍ　ＣＴＬクローンの四量体により誘発された活性化は、四量体がｎｇ／ｍｌ濃度で、特異的ＣＴＬ活性化をなおも誘発できるから、マイクロタイタープレートの高密度被覆によって誘発された活性化に比べてより効率的であった（図７ａおよび７ｃ）。
【０１４６】
２０９−含有ＭＨＣ四量体とともにインキュベートされた活性化ＣＴＬクローンの顕微鏡観察は、細胞が凝集されたことを示した（図８ｂ）。これはＴＣＲ−ＭＨＣ結合力の有意な増加および高濃度のＭＨＣ四量体により引き起こされる多点結合および架橋結合によって行われた細胞間の増強された接触による。これらの形態学的効果はペプチド特異的であり、かつｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−ペプチド四量体の濃度に依存する（図８ｂ）。四量体の濃度が増加するにつれて、増加された細胞凝集（ロゼット形成）が観察された（図８ｃ〜ｅ）。
【０１４７】
コントロールとして作用する未ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ−２０９複合体およびストレプトアビジンとともにインキュベートされたＣＴＬは、細胞凝集を示す形態学的外見を示さなかった（図８ａ）。
【０１４８】
さらに、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＴＬクローンが同じ濃度のＧ２０９−特異的ｓｃＭＨＣ四量体とともにインキュベートされた場合、凝集は観察されなかった（データは示されない）。
【０１４９】
ｓｃＭＨＣ四量体はまた、ＭＡＲＴ−１特異的ペプチド２７−３５を認識するＣＴＬクローンを特異的に染色した。図９ａに示されるように、ｓｃＭＨＣ／Ｍａｒｔ四量体は、ｓｃＭＨＣ／ＴＡＸ四量体により認識されなかった特異的ＣＴＬクローンを特異的に認識した（図９ｂ）。
【０１５０】
ｓｃＭＨＣ四量体はまた、ＴＡＸペプチドとともに免疫化されたトランスジェニックマウスの脾臓（ＨＬＡ−Ａ２を発現する）からＴ細胞の異質集団を染色するために使用された。図１０ａ〜ｂに示されるように、特異的高結合力ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、非免疫化および免疫化されたマウスが比較された場合、２倍に増加した。従って、上記に明白に示されるように、本発明の教示によって生成されたｓｃＭＨＣ四量体は、Ｔ細胞の抗原−特異性亜集団を検出し、そして単離するために使用され得る。
【０１５１】
本明細書中に示された結果は、本発明の教示により生成された組換えｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体が、単量体および複合化された四量体の両方の形態で機能的であることを示唆する。
【０１５２】
組換えＭＨＣ−ペプチド四量体は免疫反応の分子特性化のための非常に重要な手段である。
蛍光発生性四量体はＣＴＬ反応の特性化のために広く使用されていて、先行技術以上の多くの利点、特に、直接に数量化する能力および表現型Ａｇ−特異的ＣＴＬをエキソビボで生じている［３２−３５， ３８−５３］。
【０１５３】
ペプチド−ＭＨＣの多量体化によって与えられた増大された結合力は、リガンドによって誘発される生理学的反応をこれまで生成するにはあまりに低い親和性でもって、ＴＣＲへの結合を可能とするであろうことも示唆されている。ＭＨＣ−ペプチド四量体は、ＨＩＶおよびＥＢＶ感染の抗原特異的ＣＤ８＋細胞の直接可視化のためのウイルス感染の場［３３，４０，４１，４５，５２］、ウイルス感染の動物モデル［４１−４３］およびヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルスに関連する脊髄症患者のウイルス特異的ＣＤ８＋細胞の直接分析［５３］に使用され得る。
【０１５４】
ＭＨＣ−ペプチド四量体は低頻度の抗腫瘍ＣＤ８＋免疫反応を確認するために使用され得るから、抗癌免疫および免疫治療の場に革命を起こすであろう。これは、ヒト腫瘍がＣＴＬによる溶解を受けやすくさせる抗原をしばしば発現するという無視できない証拠が存在するメラノーマにおいて既に証明されている［３２，３６，３７，４８，５０］。最近、メラノーマ特異的ＣＴＬをエキソビボで特性化するための四量体化可溶性クラスＩＭＨＣ−ペプチド複合体の使用が報告されている［３６］。免疫治療の場での重要な進歩は、養子免疫治療においてこの技術を使用する能力であろう。ＭＨＣ−ペプチド四量体の使用は、四量体によって誘導される細胞ソーティングを使用して、混合されたＣＴＬ集団から１つのメラノーマエピトープに特異的なＣＴＬの単離を可能とするであろう［３６］。ポリクローナルＣＴＬラインは、直接四量体誘導ＣＴＬクローニング法を使用して異なったメラノーマエピトープに対するモノクローナルＣＴＬラインを生成して、自己由来腫瘍細胞を有効に溶解するために使用され得る［２４，３６］。
【０１５５】
１つの疾患（例えば、メラノーマ）に関する全ての組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を、きわめて多種の抗原性ペプチドを使用して有効に生成する能力は、免疫治療の改良された機序を導く。従って、個々の患者によって発現された腫瘍関連ペプチドの特異的ＰＣＲタイピングを伴う、種々のペプチドに特異的な腫瘍−特異性ＣＴＬクローンをエキソビボで同時に単離およびクローニングすることが可能となるであろう。特異的クローンは次いで、患者の腫瘍関連抗原（ペプチド）発現プロフィールにより、養子免疫細胞移入のために拡大され得る。
【０１５６】
組換えＭＨＣ−ペプチド複合体の有効性は、ＭＨＣ四量体の生成のみならず、高親和性ＭＨＣ結合Ｔ細胞エピトープを確認する急速で、感受性があり、かつ、信頼性あるＭＨＣ−ペプチド結合分析のために関心がもたれている。これらの複合体はまた、種々のＭＨＣ結合体の中で、免疫原性であるこれらのペプチドを限定するインビトロでの一次ＣＴＬ誘発研究にも使用され得る。
【０１５７】
これらはＣＴＬインビトロ誘発、ならびにＭＨＣ−ペプチド四量体の生成および特異的免疫反応の分析または四量体によって誘導される細胞ソーティングおよび分析による異種リンパ球集団からのＣＴＬの直接選択に使用される。
【０１５８】
組換えｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体はまた、ファージディスプレー技術によって特異的抗体を生成するために使用され得る［５４］。ＴＣＲ様特異性を有するこのような抗体は、腫瘍細胞による抗原提示を研究し、ならびに免疫治療における新規な標的薬剤を開発する価値ある手段である。
【０１５９】
現在まで、そのいくつかが上記されるＭＨＣ複合体を使用する研究は、必要量の可溶性で、かつ機能的な単量体または多量体のＭＨＣ−ペプチド複合体を生産できないＭＨＣ精製方法に限定されている。
【０１６０】
すなわち、本発明の発現方法は、先行技術の方法で使用されたペプチド交換などの骨の折れる、かつ時間のかかる精製工程を必要としない、多量の極めて純粋で、かつ機能的な単量体または多量体のｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を生産する容易で、かつ迅速な方法を提供することによって、ＭＨＣ複合体を使用する研究を前進させる計り知れない手段を提供する。さらに、本発明は単量体または多量体のいずれかとして使用されるとき、ＣＴＬクローンを活性化することにおいて機能的である新規なヒト１本鎖ＭＨＣクラスＩポリペプチドを提供する。
【０１６１】
実施例２
ｓｃＭＨＣ複合体およびペプチドの共発現
上記された種々のｓｃＭＨＣ構築物および哺乳動物ｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドはまた、大腸菌または他の原核生物または真核生物発現系で、そのそれぞれの結合ペプチドとともに共発現され、結合ペプチドを別個に提供する必要性を否定する。従って、本発明のこの方法によれば、１つの構築物がｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドおよびそれぞれの結合ペプチドのコード配列の両方を、例えば２つの別個のプロモーターまたは内部リボソーム侵入部位を使用して、同じ細胞内で発現するように配置され得る。または、原核生物または真核生物発現系の細胞は、それぞれが１つのコード配列を発現し、かつ、それぞれが特異的選択マーカーを有する２つの発現構築物で共形質転換され得る。
【０１６２】
好適な真核生物発現系としては、哺乳動物または昆虫細胞培養物、植物プロトプラスト、植物細胞培養物、全植物、酵母細胞または原生動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真核生物発現系で発現されたとき、生産されたｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドは好ましくは遷移ペプチド（シグナルペプチド）を含み、そのため、発現されたポリペプチドが内因性ペプチドとの相互作用を避けるように細胞外へ（植物細胞培養物または全植物のアポプラスト中へ）分泌されることが理解されるであろう。
【０１６３】
構築物は、ｓｃＭＨＣクラスＩポリペプチドおよびその結合ペプチドの両方の発現濃度が化学量論的に正しいように配置されなければならないことが理解されるであろう。
【０１６４】
すなわち、両コード配列を発現する細胞は、当該技術分野で周知である好適な単離プロトコールにより精製され得る完全に機能的なｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を生産することができる。この場合、細菌発現系は、それによって発現されたｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体が好適な発現条件が使用されるとき実質的に純粋な封入体を形成することができるから、特に有利であることが理解されるであろう。従って、たとえｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体が封入体を溶解するために使用される変性条件下に分解されても、好適な再生条件が機能的なｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を再形成するように使用され得る。
【０１６５】
本発明はその特定の実施態様とともに記載されるけれども、多くの代替、修正および変更が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付される請求項の広い範囲内に入るこのような代替、修正および変更の全てを包含することが意図される。本明細書中に引用された全ての文献は、その全体を参考として導入される。本明細書中のいかなる参考文献の引用または認識も、このような参考文献が本発明にとって先行技術として入手可能であるとの認容として解釈されるべきでない。
【参考文献】
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「配列表フリーテキスト」
配列番号１は合成ペプチドの配列である。
配列番号２は合成ペプチドの配列である。
配列番号３は合成ペプチドの配列である。
配列番号５はＭＨＣクラスＩ重鎖に結合されたヒトβ−２ミクログロブリンの配列である。
配列番号８は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号９は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１０はリンカーペプチドの配列である。
配列番号１１は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１２は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１３は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１４は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１５は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１６は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１７は特異的なビオチン化ペプチド配列である。
配列番号１８はリンカー配列である。
配列番号１９は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号２０はＢｉｒＡ認識タグ配列である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
細菌発現ベクター中へクローン化された本発明の種々の発現カセットを示す。
【図２】
図１の種々の構築物の発現産物の分析を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図３】
リフォールドされた精製１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の分析を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図４】
収集および分析されたリフォールドされた１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体のＣＤスペクトル分析である。
【図５】
１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の抗体分析を示すグラフである。
【図６】
１本鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の質量分光分析を示す。
【図７】
特異的ＣＴＬクローンからのＩＦＮｇの放出を測定して決定された１本鎖ＭＨＣ−ペプチドの生物学的活性を示すグラフである。
【図８】
Ｇ９−２０９−２Ｍ−特異的ＣＴＬクローンＲ６Ｃ１２を含むマイクロタイタープレートウェルの顕微鏡画像である。
【図９】
ＭＡＲＴ−１ペプチド２７〜３５に特異的なＣＴＬクローンのＦＡＣＳ分析画像である。
【図１０】
ＴＡＸペプチドで免疫化されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスから得られたＴ−細胞の異質集団のＦＡＣＳ画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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