(57)【要約】本発明は、血管増殖因子の制御された産生のための新規な刺激デバイスを提供する。より詳細には、血管内皮細胞増殖因子の局所的な産生のための閾下パルス発生器を提供する。
2004523312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．）電源装置と、
ｂ．）前記電源装置と相互接続されて、対象となる細胞または組織に閾下パルスを送達する制御機構と、
を備える閾下パルス発生器。
【請求項２】
前記制御機構は、前記電源装置からの電気パルスの、電圧振幅、刺激期間、充電バランス、および周波数からなる群から選択される少なくとも１つの機能を制御する、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項３】
前記制御機構は、刺激タイマ、出力振幅制御、充電バランスが保たれたパルスタイマ、刺激閾値モニタ、およびリード線導通モニタから選択される構成要素からなる少なくとも１つの追加の組を有する、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項４】
定電圧源を有する、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項５】
前記電源装置からの前記電気パルスの送達の振幅は、約１Ｖ／ｃｍの可変電界を有する、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項６】
前記電源装置からの前記電気パルスの送達の振幅は、約０．５Ｖ／ｃｍの電界を提供する、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項７】
前記電源装置からの前記電気パルスの送達の振幅は、約０．１Ｖ／ｃｍである、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項８】
前記可変電界は、約±３０％である、請求項５，請求項６、または請求項７のいずれか１項に記載の閾下パルス発生器。
【請求項９】
前記可変電界は、約±２０％である、請求項５，請求項６、または請求項７のいずれか１項に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１０】
前記可変電界は、約±１０％である、請求項５，請求項６、または請求項７のいずれか１項に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１１】
前記可変電界は、約±５％である、請求項５，請求項６、または請求項７のいずれか１項に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１２】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約２０ミリ秒未満である、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１３】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約１０ミリ秒未満である、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１４】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約５ミリ秒未満である、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１５】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約１ミリ秒未満である、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１６】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約３ミリ秒未満である、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１７】
前記刺激の周波数は、約１０Ｈｚである、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１８】
前記刺激の周波数は、約２５Ｈｚである、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１９】
前記刺激の周波数は、約４０Ｈｚである、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２０】
前記刺激の周波数は、約５０Ｈｚである、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２１】
前記刺激の周波数は、約７０Ｈｚである、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２２】
前記刺激の周波数は、約８５Ｈｚである、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２３】
前記刺激の周波数は、約１００Ｈｚである、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２４】
前記対象となる細胞または組織に前記閾下パルスの送達を行う複数の電極をさらに備える、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２５】
少なくとも１つの電極を、カテーテルに配置することができ、対象の器官に経管的に届けることができる、請求項１８に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２６】
前記電極が、前記対象となる細胞または組織と接触しているか、または、前記対象となる細胞または組織の近傍に位置する場合に、前記細胞または組織に刺激を供給する、請求項３に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２７】
前記振幅および前記送達の継続期間は、血管新生を刺激するのに十分である、請求項２に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２８】
前記送達される閾下パルスは、充電バランスが保たれている、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２９】
前記電源装置と電子的に通信するコンピュータ処理ユニットをさらに備え、該コンピュータは、該閾下パルス発生器に、所定の量の電流または電圧を、所定の送達期間にわたって、前記対象となる細胞または組織に送達させるようにプログラミング可能である、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項３０】
前記電気パルス発生器は、体内に埋め込まれる、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項３１】
前記電気パルス発生器は、体外に置かれる、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項３２】
所定の時間帯にわたって、対象となる組織または細胞に電界を送達し、ＶＥＧＦ発現の産生を刺激する、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項３３】
前記電気パルス発生器は、外部で制御される、請求項１に記載の閾下パルス発生器。
【請求項３４】
哺乳類の細胞または組織に作用可能に結合される閾下パルス発生器を備える治療送達システム。
【請求項３５】
前記閾下パルス発生器は、閾下刺激を供給する、請求項３４に記載の治療送達システム。
【請求項３６】
複数の電極をさらに備え、前記閾下パルス発生器は、複数の電極から前記細胞または組織に刺激を供給する、請求項３４に記載の治療送達システム。
【請求項３７】
前記電気パルス発生器は、電極が、前記対象となる細胞または組織と接触しているか、または、前記対象となる細胞または組織の近傍に位置する場合に、前記細胞または組織に刺激を提供する、請求項３４に記載の治療送達システム。
【請求項３８】
刺激を受ける前記組織は、筋肉組織である、請求項３４ないし３７のいずれか１項に記載の治療送達システム。
【請求項３９】
刺激を受ける前記組織は、心筋組織である、請求項３４ないし３７のいずれか１項に記載の治療送達システム。
【請求項４０】
刺激を受ける前記組織は、骨格筋組織である、請求項３４ないし３７のいずれか１項に記載の治療送達システム。
【請求項４１】
刺激を受ける前記細胞は、平滑筋細胞である、請求項３４ないし３７のいずれか１項に記載の治療送達システム。
【請求項４２】
刺激を受ける前記細胞は、血管筋肉細胞である、請求項３４ないし３７のいずれか１項に記載の治療送達システム。
【請求項４３】
刺激を受ける前記細胞は、血管内皮細胞である、請求項３４ないし３７のいずれか１項に記載の治療送達システム。
【請求項４４】
前記電極は、単極電極構成、二極電極構成、および多極電極構成からなる群から選択されるように構成される、請求項３７に記載の治療送達システム。
【請求項４５】
前記電気パルス発生器は、埋め込まれる、請求項３４に記載の治療送達システム。
【請求項４６】
前記電気パルス発生器は、体外に置かれる、請求項３４に記載の治療送達システム。
【請求項４７】
前記電気パルス発生器は、外部で制御される、請求項３４に記載の治療送達システム。
【請求項４８】
前記閾下パルスの送達期間をオプションで再調整するか、または同期させる検知電極をさらに備える、請求項３４に記載の治療送達システム。
【請求項４９】
所定の時間帯にわたって、対象となる細胞または組織に電界を送達し、ＶＥＧＦ発現の産生を刺激する、請求項３４に記載の治療送達システム。
【請求項５０】
対象となる哺乳類の細胞または組織に作用可能に結合される閾下パルス発生器を患者に提供することを含む、患者を処置する方法。
【請求項５１】
血管新生を改善する緊急の閾下刺激治療のために前記組織に作用可能に結合される閾下パルス発生器を患者に提供することを含む、患者を処置する方法。
【請求項５２】
所定の時間帯にわたって、対象となる細胞または組織に、ＶＥＧＦ発現の産生を刺激するために、電界を送達することを含む、患者を処置する方法。
【請求項５３】
対象となる筋肉組織に閾下刺激パルスを提供することを含む、対象となる組織における血管新生を増加する方法。
【請求項５４】
閾下刺激パルスが、血管筋肉組織を標的とする、対象となる組織における血管新生を増加する方法。
【請求項５５】
閾下刺激パルスが、心筋組織を標的とする、対象となる組織における血管新生を増加する方法。
【請求項５６】
閾下刺激パルスが、骨格筋組織を標的とする、対象となる組織における血管新生を増加する方法。
【請求項５７】
閾下刺激治療のために筋肉組織に作用可能に結合される閾下パルス発生器を患者に提供することを含む、患者を処置する方法。
【請求項５８】
前記刺激を受ける組織は、筋肉組織である、請求項５７に記載の患者を処置する方法。
【請求項５９】
前記刺激を受ける組織は、心筋組織である、請求項５７に記載の患者を処置する方法。
【請求項６０】
前記刺激を受ける組織は、骨格筋組織である、請求項５７に記載の患者を処置する方法。
【請求項６１】
前記刺激を受ける細胞は、筋肉細胞である、請求項５７に記載の患者を処置する方法。
【請求項６２】
前記刺激を受ける細胞は、心筋細胞である、請求項５７に記載の患者を処置する方法。
【請求項６３】
刺激を受ける細胞は、骨格筋細胞である、請求項５７に記載の患者を処置する方法。
【請求項６４】
刺激を受ける細胞は、血管筋肉細胞である、請求項５７に記載の患者を処置する方法。
【請求項６５】
刺激を受ける細胞は、血管内皮細胞である、請求項５７に記載の患者を処置する方法。
【請求項６６】
ａ．閾下電界により培養された細胞を刺激するステップと、
ｂ．刺激された前記細胞を、対象となる生体組織に注入するステップと、
を含む、対象となる組織における血管新生を改善する方法。
【請求項６７】
注入された前記細胞を刺激することをさらに含む、請求項６６に記載の対象となる組織における血管新生を改善する方法。
【請求項６８】
ａ．対象となる生体組織に細胞を注入するステップと、
ｂ．注入された前記細胞領域を閾下刺激により刺激するステップと、
を含む、対象となる組織における血管新生を改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管増殖因子の制御された産生のための新規な刺激デバイスを提供する。より詳細には、本発明は、血管内皮細胞増殖因子の局所的な産生のための閾下（subthreshold）パルス発生器を提供する。
【背景技術】
【０００２】
冠動脈疾患（ＣＡＤ：coronary artery disease）は、心臓のために働く血管の動脈硬化の結果、発生する。動脈硬化は、動脈の硬化および狭窄である。多くの場合、心臓の動脈は、突然、非常にひどく閉塞されることがあるので、心臓の領域に十分な血液が供給されず、その結果、心筋梗塞が発生する。血流が減少し、損傷を受けた領域は、虚血領域と呼ばれる。心臓の虚血領域は、十分な血流が得られないので、酸素および栄養素が欠乏する。この閉塞は、迅速に処置されないと、深刻な組織の損傷につながる可能性がある。多くの場合、外科的処置が用いられて、新しい血管が虚血領域に移植され、血液の循環が改善される。あるいは、血管形成術または閉塞した血管のステント留置術が、血流を再開または維持するために行われる。しかしながら、動脈のバイパスまたは再開は、現在の方法論の限界および外科的処置による患者へのリスクのため、実行できないことが多い。
【０００３】
不十分な血液循環から生じる虚血による損傷は、心臓の末梢の血管にも起こる可能性がある。末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ：peripheral arterial occlusive disease）は、動脈硬化または糖尿病などの疾患による血管内の血栓の形成によって引き起こされ、外部の四肢の喪失につながることが多い。
【０００４】
虚血組織への血流を改善する必要性に対処する１つの方法は、新しい血管を生成することである。新しい血管の形成に直接関与する血管新生因子が知られている。塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ：basic fibroblast growth factor）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor）といった組み換え型血管増殖因子の局所投与により、動物モデルの心筋組織および骨格筋組織の虚血領域を救済することができる。新しい血管の成長を期待して、多くの手法が、これらの因子を虚血領域に送達するために開発されてきている。これらの手法には、直接注入法、電気穿孔法（electroporation）、およびレトロウィルスベクターを用いた送達法（delivery）が含まれる。
【０００５】
血管増殖因子の直接注入法は、当該方法に関連した多くの課題を有し、最も顕著な課題は、細胞内に因子を効果的に送達することに関連するものである。電気穿孔法は、血管新生因子をコードする遺伝物質を送達することが可能な方法である。しかしながら、トランスフェクション効率がまだ非常に低く、組織に向けられた高エネルギーパルスが、多くの健康な細胞を殺すことが多い。これらに代わるべきものとして、血管新生因子をｉｎ ｖｉｖｏで直接産生する、ウィルスに基づく遺伝子送達システムを開発しようと努力してきた者もいる。しかしながら、この手法は、安全で有効な治療とみなされるまでに、より一層の開発を必要とする。遺伝子送達の分野では、広範囲な研究が続いているが、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子発現を制御し、かつ、調節する方法については、ほとんど報告されていない。したがって、対象となる組織にこの薬剤を有効に送達することが不可能であることが、このような薬剤の使用の主な制約の１つである。血管新生因子の送達中に、有効性が破壊されるか、または、失われることが多い。
【０００６】
電界を用いて血管増殖因子の自然産生を刺激することに関係した最近の研究が、公開された。ＷＯ ００／２７４６６号は、血管新生を刺激する電界を発生するのに定電圧源を用いることを記載している。記載された電圧は、およそ５０〜３００ボルト／ｃｍ程度であり、この電圧は、刺激を与えている間に収縮反応も刺激することになる。筋収縮反応を引き起こすことなく血管新生を刺激できる方が有利である。最近の刊行物（Circulation, 1999;99:2682-2687）では、骨格筋の低電圧電気刺激が、ＶＥＧＦタンパク質のｄｅ ｎｏｖｏ合成を誘発し、血管新生を促進することが報告された。この研究分野におけるさらなる研究が必要とされる。この技術分野におけるこれらの既知の方法によっても、まだ、血管増殖因子の送達を制御して、筋肉組織内の血管新生を促進するための更なるより有効な閾下デバイスおよびより効率的な方法、ならびに、心臓組織および血管組織内の血管新生を刺激するのに用いることができる方法論が、必要とされている。
[発明の概要]
本発明は、血管新生因子の制御された局所送達に関する、従来技術に存在する多くの問題に取り組む。本発明のさまざまな実施形態は、血管新生因子の送達に関する、従来技術に存在する１つまたは複数の問題に解決法を提供する。本発明は、血管新生および血管増殖因子の産生のための新規な電気パルス発生器を提供する。
【０００７】
本発明は、閾下パルスを提供する電気パルス発生器を提供する。本デバイスは、所与の刺激の時間、周波数、および送達を調節することによって、閾下パルスの範囲に適合することができる。本発生器は、可変の電界強度を許容することによって、電極間の距離にかかわらず、定電圧の使用を可能とする。本発生器は、電圧の振幅に対する制御を可能とし、送達される充電パルスおよび回復される充電パルスの充電バランスを保つことを可能とする。
【０００８】
別の実施形態では、閾下パルス発生器は、体外で用いることができるが、埋め込み可能に設計および構成されることが好ましい。この閾下パルス発生器は、電源装置と、この電源装置に相互接続された制御機構とを含む。任意に、パルス発生器は、電源装置と電気的に通信する複数の電極と共に用いることができる。また、本発生器は、予め指定された時刻にリード線の導通をチェックすることもできる。
【０００９】
また、本発明は、閾下パルス発生器を、当該閾下パルス発生器を必要とする患者に提供することも行う。一態様では、本発明は、血管増殖因子の産生を調節する手段を提供することによって、組織の障害もしくは疾患の軽減または修復を行う方法を含む。別の態様では、提供される閾下刺激は、対象となる生体組織における血管新生を刺激するのに十分である。さらに別の態様では、本発明は、血管新生因子の制御された発現のために細胞または組織を刺激することができるペーシングの新規な方法を提供する。
【００１０】
本発明のこれらの目的および特徴ならびに他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を、添付図面と共に読むことにより、より十分に明らかになる。
図面は、本発明の所定の実施形態を示している。それら図面は、単なる例示にすぎず、本発明を、本明細書に開示されたように限定するものではない。
[発明を実施するための最良の形態]
定義
「血管新生因子」は、組織内の血管新生を促進する物質からなる群である。これらの因子には、これらに限定されるわけではないが、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：fibroblast growth factor）、ならびに、これらの因子に構造的および／または機能的に関連した要素である、患者のゲノム内でコードされる、発見されたすべての自然の類似体が含まれる。
【００１１】
本明細書で用いられる用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」は、哺乳類の細胞内での発現によって産生されるタンパク質の形態（複数可）をいう。一般に、粗面小胞体の全体にわたって成長するタンパク質鎖の搬出が開始されると、哺乳類の細胞によって分泌されたタンパク質は、完全なポリペプチドから切断されるシグナル配列を有し、そのタンパク質の「成熟した」形態を産生すると仮定される。多くの場合、分泌されたタンパク質の切断は、均一ではなく、その結果、２種類以上の成熟タンパク質が産生されることがある。分泌されたタンパク質の切断部位は、完全タンパク質の一次アミノ酸配列によって決定され、一般に、完全な正確さで予測することはできない。しかしながら、分泌されたタンパク質の切断部位を、精製されたタンパク質の調製物内に発見される１種類または複数種類の成熟タンパク質のアミノ末端基配列によって、実験的に決定することができる。
【００１２】
「作用可能に結合された（operably coupled）」とは、閾下パルス発生器による組織への電気刺激の移動をいう。組織または細胞との閾下パルス発生器の作用可能な結合は、電気刺激が組織または細胞に送達されて、利用可能な血管新生因子の増加を引き起こす場合の配置をいう。通例、この刺激は、閾下パルス発生器からリード線を通して、組織に取り付けられた電極へ送達される。
【００１３】
用語「処置を行うこと」、「処置」、および「治療」は、ここでは、根治治療、予防的治療（prophylactic therapy）、および予防治療（preventive therapy）をいうのに用いられる。「予防治療」の一例は、対象となる疾患または当該疾患に関連する症状の予防または緩和である。例えば、閾下刺激は、予防努力として血管新生を促進し、心筋梗塞の発生を回避するために予防的に用いることができる。処置を必要とする人々には、疾患または症状をすでに有する人々だけでなく、予防の対象となる疾患または症状を有する傾向にある人々も含まれる。また、本明細書で用いられる用語「処置を行うこと」、「処置」、および「治療」は、疾患または関連する症状と戦う目的で、患者を管理および介護することも表し、組織への血流を改善するために、少なくとも１つの閾下電気パルスを虚血領域へ投与することを含む。
【００１４】
「長期」投与は、長期間にわたって初期治療効果（作用）を維持するために、緊急モードとは対照的な連続モードで電気刺激を投与することをいう。
「間欠」投与は、間断なく連続して行うのではなく、時間の経過と共に繰り返される処理である。
【００１５】
「虚血」は、ある特定の器官または組織への血液の供給が不十分な状態と定義される。血液の供給が減少した結果、器官または組織への酸素および／または栄養素の供給が不十分となる。虚血が長期に及ぶと、その結果、影響を受けた器官または組織は障害を受けることがある。「酸素欠乏症」は、器官または組織の酸素が実質的には完全に欠乏したことをいい、長期に及ぶと、その結果、器官または組織が死に至ることがある。
【００１６】
「虚血障害（ischemic injury）」は、虚血期間および／または虚血と続いて起こる再潅流の期間の結果、器官または組織に対して起こる細胞および／または分子の損傷をいう。
【００１７】
「低酸素状態」は、ある特定の器官または組織が、十分な酸素の供給を受けていない状態と定義される。
「無酸素状態」は、ある特定の器官または組織への酸素の供給が中断した状態をいう。
【００１８】
「再潅流」は、虚血期間に続いて起こる、組織の血流の回復をいう。
本明細書で用いられる用語「患者」は、あらゆる哺乳類をいい、人間や、牛（例えば乳牛）、馬、犬、羊、豚、ウサギ、ヤギ、猫などの家畜、および動物園の動物、スポーツ動物、またはペット動物、ならびに、マウスおよびラットといった家畜でない動物を含む。本発明の好ましい実施形態では、哺乳類は、人間、犬、ウサギ、またはマウスである。
【００１９】
本明細書でいう「治療有効量（therapeutically effective amount）」は、治療的利益または望ましい生物学的作用を患者に与える必要のある閾下刺激の最小量である。例えば、虚血を患っている患者の「治療有効量」は、利用可能な血管新生因子の量の改善を誘発する量か、改良する量か、そうでなければ改善する量か、あるいは、組織の血液循環を改善する量である。例えば、「治療有効刺激」は、治療的利益を提供するか、または、血液循環の少なくとも１つの測定可能な改善を提供する量のうち、血管新生タンパク質の治療有効量を発現するのに必要な電気刺激の量である。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ペース（pace）」は、閾下パルス発生器によって細胞組織に送達される電気閾下刺激を送出する行為である。「ペーシング（pacing）」は、通常、電気刺激を組織に繰り返し送出する行為をいい、ここでは、一連の閾下刺激を組織に送達する行為をいう。
【００２１】
「薬理有効刺激（pharmacologically effective stimulus）」は、所望のレベルの血管新生タンパク質を患者に提供するのに必要な刺激の量である。正確な刺激の量または必要なペーシングは、例えば、関連する具体的な血管新生因子、用いられる送達刺激、提供される刺激の特徴、その使用目的、および患者の考慮といった多数の因子に依存することになる。これらの判断は、ここに提供される情報を考慮すれば、当業者によって容易に行うことができる。
【００２２】
用語「電気刺激の投与」は、電気刺激を組織に送達することを意味する。本発明で適用されるように、電気刺激は、閾下パルス発生器によって組織に送達される。
「閾値」対「閾下」刺激は、適用される刺激の相対的なレベルをいう。本明細書で用いられる「閾値」刺激は、興奮した組織における全体的な組織の電気的反応または機械的反応を引き出す刺激のレベルをいい、例えば、心収縮のために心臓の脱分極をむらなく引き出すのに必要な最小の電気刺激、または、骨格筋運動を引き出すのに必要な最小の電気刺激をいう。一般に、閾値刺激は、１．０ボルトより大きい。閾下刺激は、全体的な電気的反応または機械的反応を組織から引き出さないほど十分低いレベル、例えば心臓の脱分極または筋肉の収縮を引きこさないほど十分低いレベルで、組織に電気刺激を加えることをいう。閾下刺激は、電気パルスの電圧振幅および／または持続時間を、全体的な運動反応または神経反応の閾値反応レベルより小さく維持することによって達成することができる。一般に、閾下刺激は、１．０ボルト以下である。閾下刺激によって、神経細胞または筋肉細胞を刺激することによる不必要な副作用を生じることなく、電気刺激を組織に送達して、利用可能な血管新生タンパク質のレベルを増加させることが可能になる。不必要な副作用は、例えば、不必要な収縮および／または不快な感触などである。
【００２３】
本明細書で用いられるように、測定される物理パラメータについてのいくつかの用語は、略記されている。すなわち、振幅は、ボルト（Ｖ）またはミリボルト（ｍＶ）で表現されることがある。電流は、アンペア（ａｍｐ）またはミリアンペア（ｍａｍｐ）で表現されることがある。パルス幅、周波数、またはタイミングは、ミリ秒（ｍｓｅｃ）で表現されることがある。エネルギーは、ジュール（Ｊ）またはミリジュール（ｍＪ）で表現されることがある。
【００２４】
説明
一般に、本発明は、対象となる生体組織の近傍または生体組織内に電界を生成する閾下パルス発生器、および、血管新生を刺激することによって損傷を受けた組織または虚血組織の処置を行う方法に関する。一実施形態では、電界は、複数の電極間に位置する対象領域に直接送達される。一例として、図１は、一対のリード線２および一対の電極３を通じて、心臓４の心室下部に閾下電界５を生成する閾下パルス発生器１を示している。
【００２５】
閾下刺激は、血管増殖因子の産生を促進すると実証されている。これによって、本デバイスによる血管新生反応の促進は、虚血組織領域への血液循環を回復する処置である現在の外科的方法を上回る重要な補助物としての機能を果たす。
【００２６】
閾下パルスの目的
本発明は、新規な閾下電気パルス発生器（本明細書では、閾下パルス発生器、パルス発生器、または発生器ともいう）を提供する。このパルス発生器は、１つの電気刺激もしくは一連の電気閾下刺激すなわちパルス（ペーシング）を提供できるという極めて重要な特徴を有する。閾下電気刺激すなわちパルスは、対象となる細胞または組織の血管新生を誘発するために用いられる。一実施形態では、この電気刺激装置は、少なくとも１つの血管新生因子の転写を活性化する閾下刺激を提供する。閾下刺激の目的は、機械的な収縮のために組織を興奮させることではなく、血管新生を選択的に活性化させることである。
【００２７】
種々の刺激治療が、閾下刺激治療のコースと併せて与えられ得ることが想定される。時には、従来のペースメーカの閾値電気刺激の利点と共に検討した場合には特に、従来のペースメーカの特徴を、閾下刺激の構成要素と組み合わせることは有利となることがある。
【００２８】
パルス発生器の動作パラメータ
閾下電気パルス発生器からの制御された出力電圧は、例えば３５Ωから無限大に至るような広範囲の組織のインピーダンスに対して調整することができる。電圧およびタイミング設定のさまざまなユニークな組み合わせによって、本デバイスは、収縮反応を引き出さないで血管新生因子の産生を増加させるユニークな機構を提供する。
【００２９】
本発生器では、可変の電界強度を与えることにより、電極間の距離にかかわらず、一定の電圧を使用することができる。本発生器では、電圧の振幅に対する制御が可能であり、送達および再生される充電パルスの充電バランスを保つことが可能である。特定の実施形態では、閾下パルス発生器は、目標電圧の約３０％、より好ましくは目標電圧の約２０％、さらにより好ましくは目標電圧の約１０％、最も好ましくは目標電圧の約５％の可変の電界強度を与えることによって、一定の電圧を用いることができる。後に説明するように、閾下電圧は、一定のレベルであり、電界強度が、組織の至る所で変化することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで電界強度を可変の状態にしたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、有効な結果が得られた（実験１、表１参照）。同様にして、ｉｎ ｖｉｖｏのＶＥＧＦ産生を刺激することにより、有効な結果が得られた（実験２、図７参照）。
【００３０】
一実施形態では、閾下パルス発生器は、０．１Ｖずつの幅で、０から１．５Ｖ出力の電界を対象となる生体組織に送達することができる。ここで、電界は、一般に、約１Ｖ／ｃｍ以下であり、約０．５Ｖ／ｃｍ未満であることがより好ましく、約０．１Ｖ／ｃｍであることがより一層好ましい。
【００３１】
さらに別の実施形態では、閾下電界を、約１０Ｈｚから約１００Ｈｚの周波数を有するいくつかのパルスによって生成することができる。周波数は、約２５Ｈｚから約８５Ｈｚであることが好ましく、約４０Ｈｚから約７０Ｈｚであることがより好ましく、約５０Ｈｚから約６０Ｈｚであることがより一層好ましく、約５０Ｈｚであることが最も好ましい。
【００３２】
さらに別の実施形態では、刺激期間は、パルス周期（１／周波数）よりも短い。刺激期間は、約１００ミリ秒〜０．０１ミリ秒、約５０ミリ秒〜約０．０５ミリ秒、および３ミリ秒〜０．１ミリ秒となるように選択することができる。ここで、実際の値は、約２０ミリ秒未満とすることができ、約１０ミリ秒未満であることが好ましく、約３ミリ秒未満または０．１ミリ秒〜３．０ミリ秒の任意の値であることがより好ましい。
【００３３】
閾下刺激
図２の出力回路構成の概略図は、閾下パルス発生器の動作回路構成の概略を示す簡略化した説明図である。図２は、閾下パルス発生器の基本設計要件を設定するのに役立つ。Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３は、動作サイクルの間、開閉されるスイッチであり、Ｒは回路抵抗器であり、Ｖｓはバッテリであり、ＣＨおよびＣＣはコンデンサである。例えば、構成要素の値を、次の値、すなわちＶｓ＝２．８ボルト、Ｒ＝２５Ω、ＣＣ＝ＣＨ＝１０μＦと選ぶことができる場合には、ＣＨは、図４に示すような１０ミリ秒の充電フェーズの終了時には、０．１１０ボルトを有すると計算することができる。この説明図により、当業者は、任意の所与の組の閾下出力電圧でＣＨを提供するいくつかの設定を選ぶことができる。図３は、刺激フェーズの期間中における出力段の等価回路を示している。ＶＣは、ＣＨの初期状態を表している。この場合、ＣＨ、ＣＣおよびＲＴｉｓｓｕｅは、直列に接続されているので、ＣＨおよびＣＣを、ＣＥｑ＝５μＦに合成することができる。電極で見られる電圧は、次式により与えられる。
【００３４】
【数１】
2004523312.tif 000003
【００３５】
例えば、出力電圧が、１０％だけ変化できる場合には、ＶＴｉｓｓｕｅ（ｔ）は、０．１１０ボルト〜０．０９０ボルトで変化することになる。それは、ＶＣＨ（０）＝０．１１０、およびＶＴｉｓｓｕｅ（ｔ）（０．３ミリ秒）＝０．０９０であることを示す。この方程式を組織の電圧用に書き換えると、以下のようになる。
【００３６】
【数２】
2004523312.tif 000004
【００３７】
ＲＴｉｓｓｕｅについて解くと、ＲＴｉｓｓｕｅ＝３５Ωを求めることができる。換言すると、出力電圧が９０〜１１０ｍＶの範囲にある状態では、駆動できる最小の組織のインピーダンスは、３５Ωとなる。パルス発生器に上記設定を用いることにより、（１）閾下刺激用のパルス発生器、（２）広範囲の組織のインピーダンス（３５Ωから無限大）に対する制御された出力電圧、（３）機械的な収縮のために組織を興奮させるのではなく、１．０Ｖの閾下刺激以下の一組の変量を提供することによって、利用可能な血管新生因子の量を増加させることが目的である閾下刺激用のペーシング出力、についての一例が提供される。
【００３８】
図４は、一組の閾下刺激パラメータを例示している。図４は、図示されたパルス列を提供するための、電気パルスおよびコンデンサの充電のタイミング図を示している。このパルス列では、パルス周波数が、５０Ｈｚ（２０ミリ秒）であり、組織への刺激パルス（ＶＴｉｓｓｕｅ）が、０．３ミリ秒であり、放電（充電バランスのため、逆極性で再充電）が、６．７ミリ秒である。パルス周期の残りの１３ミリ秒の間、電極は、電源装置に接続されていない状態（floating）であり、コンデンサは、再充電される。
【００３９】
図５は、長期的な動物の研究で用いられた閾下刺激装置のブロック図である。５０Ｈｚの基本的な刺激の繰り返し周波数が、左上のクロック／タイマによって生成される。これは、それぞれの出力パルスの１ミリ秒の放電フェーズおよび５ミリ秒の再充電フェーズを制御するタイマ（中央上）をトリガする。パルス振幅は、４ビットＤＡＣ（中央左）によって制御される。パルス出力回路（中央）は、タイミングおよび振幅情報を利用して、実際の出力パルスを発生する。次に、この出力パルスは、電極および組織（中央右）に送達される。パルス出力回路は、リード線および電極の機能不良をチェックするリード線導通モニタ（中央下）をオプションとして組み込む。出力振幅は、電極抵抗の増加状況に基づいて調整することができる（破線）か、または、リード線が断線または短絡した場合にはオフにすることができる。出力振幅制御と共に、刺激の安全マージン（ペーシング閾値）を評価するために、別の２Ｈｚの刺激の設定（左上）が用いられる。
【００４０】
図６は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験において用いられる刺激装置の回路を示している。この回路図に用いられる一般的な記号の説明は、以下の通りである。
Ｕ：集積回路
Ｒ：抵抗器
Ｃ：コンデンサ
ＳＷ：スイッチ
Ｄ：ダイオード
Ｖｃｃ：電源装置（バッテリ）の正極端子
Ｖｅｅ：電源装置（バッテリ）の負極端子
ＪＰ：オフボード接続用のジャンパ端子
以下は、具体的にラベル付けされた構成要素のリストである。
（１）Ｕ２：５０Ｈｚ（２０ミリ秒）の刺激タイミングを維持するメイン発振器。
（２）Ｕ１Ｂ：刺激パルス幅を制御するタイマ。このタイマは、（１３）として示されるＳ２を閉じる。
（３）Ｕ１Ａ：放電期間を制御するタイマ。このタイマは、（７）として示されるＳ３を閉じる。
（４）Ｃ１１は、１０マイクロファラッドの値を有する保持コンデンサＣＨである。
（５）Ｃ１０は、６．８マイクロファラッドの値を有する結合コンデンサＣＣである。
（６）ＪＰ２は、刺激電極が取り付けられるヘッダである。
（７）Ｕ５：閉じられると、結合コンデンサを放電するスイッチＳ３。
（８）Ｒ９：刺激を与えられる組織と直列に配置される、刺激電流強度を測定するために用いられる抵抗器。
（９）ＳＷ２：（１０）として示されるリード線完全性インディケータを用いて、リード線の完全性を検査するスイッチ。
（１０）ＬＥＤ：リード線完全性インディケータとして用いられる発光ダイオード。
（１１）Ｕ７Ｃ：（１４）として示される刺激振幅Ｖａｄｊを設定するために用いられるディジタル／アナログ変換器。
（１２）Ｕ７Ｄ：（１１）によって決定される調整可能な刺激振幅のインバータ／ドライバ。
（１３）Ｕ３：閉じられると、保持コンデンサから、（６）に接続された組織へ電荷を送達するスイッチＳ３。
（１４）Ｖａｄｊ：（１１）によって決定される調整可能な刺激振幅。
【００４１】
図６Ａおよび図６Ｂに続いて示される閾下刺激装置回路は、本質的には、図２に示す刺激波形を生成するように動作する。発生される刺激は、周期的な信号である。この周期的な信号は、５０Ｈｚのディジタルパルスを生成するように設定され、メインクロックを提供するメイン発振器（１）に基づいて生成される。タイマ（２）およびタイマ（３）は、同様に図２に示すようなクロックから、刺激パルスおよび放電パルスをそれぞれ生成する。これらのパルスは、スイッチ（１３）およびスイッチ（７）を閉じるのに用いられ、これらのスイッチは、図２のＳ２およびＳ３に対応する。オンボードコネクタ（６）の端子１および端子４は、組織に向かうリード線が取り付けられる箇所である。刺激を与えている間、保持コンデンサ（６）に蓄えられたエネルギーは、組織に到達する前に、スイッチ（１３）、結合コンデンサ（５）、および直列抵抗器（８）を通過して端子（６）に到達する。直列抵抗器（８）における電圧降下は、組織を通過する電流の表示を得るために、端子（６）からモニタリングすることができる。スイッチ（９）は、リード線完全性インディケータ（１０）を用いてリード線の完全性をモニタリングするために使用することができる。調整された刺激振幅（１４）は、インバータ／ドライバ（１２）が後段に続くディジタル／アナログ変換器（１１）によって設定される。
【００４２】
閾下パルス発生器の付加的特徴
別の実施形態では、閾下パルス発生器は、体外で用いることができるが、埋め込み可能に設計され、構成されることが好ましい。本デバイスは、体内に埋め込むことができ、電気構成要素は、生体組織および体液から密封することができる。理想的には、この埋め込み可能デバイスは、約５０ｃｍ３の体積を有するが、体積は、約４０ｃｍ３が好ましく、約３０ｃｍ３がより好ましく、約２０ｃｍ３がより一層好ましく、約１０ｃｍ３が最も好ましい。
【００４３】
電気パルス発生器は、埋め込むこともできるし、体外に置くこともできることが想定される。理想的には、閾下パルス発生器は、埋め込まれる。
電極およびリード線
閾下パルス発生器は、電源装置および当該電源装置と相互接続された制御機構を含む。任意に、パルス発生器は、電源装置と電気的な通信を行う電極と共に用いることができる。別の実施形態では、提供される閾下刺激は、対象となる生体組織において血管新生を刺激するのに十分な量である。また、本発生器は、予め指定された時刻に、リード線の導通をチェックすることもできる。他の好ましい実施形態では、電極およびリード線は、閾下パルス発生器と共に用いることができる。好ましい実施形態では、電極は、二極電極構成または多極電極構成からなるように構成される。
【００４４】
電極は、伝導性の金属もしくは有機高分子化合物、またはこれら２つの合成物から製造される。例えば、電極は、プラチナ、金、ジルコニウム、イリジウム、チタニウム、特定のカーボン、ステンレス鋼、銀、銅、スズ、ニッケル、鉄、もしくはリチウム、またはそれらのさまざまな混合物、合金、もしくはアマルガムから製造することができる。電極の設計は、対象の組織の特質に応じて、多くの異なる形状およびサイズを取ることができる。心筋組織またはそれ以外の筋肉組織の場合に、電極は、ストレートピン、ネジ、当て板などで構成することができ、さらに、電極を固定しておくためのさまざまな返し、フック、または代替構造を備えることができる。
【００４５】
さらに別の実施形態として、本明細書に例示されたものと同様のさまざまなタイプの電気リード線、または、他の埋め込み可能なパルス発生器と共に共通に使用されるさまざまなタイプの電気リード線を、電源装置に接続するために用いることができる。
【００４６】
いくつかの適切な電極は、電気刺激を提供するように機能することができる。一特徴では、電極は、表面コイル電極、または心臓ワイヤである。この表面電極は、プラチナ合金または他の生体適合性金属から構成されることがある。この電極は、コイル、円筒、ワイヤ、または他の任意の形状とすることができる。
【００４７】
電極の配置は、２つの方法の一方で行うことができる。すなわち、好ましい実施形態では、電極は、静脈系を用いて、血管新生が望まれる心臓の組織の近傍に進められ、所定の位置に置かれる。あるいは、侵襲性の外科的処置の使用を最低限にして、所定の位置に電極を配置することができ、これは、血管構造内のカテーテルの届かない場所にアクセスすることができる。いずれの場合でも、二極性刺激または単極性刺激を加えて、組織に電界を発生させ、電気的に反応するプロモータをトリガすることができる。二極性刺激は、好ましい方法である。
【００４８】
電極の配置は、主として、電極の埋め込みに用いられる方法によって決定されることになる。電極が経静脈法の経路を介して配置される場合には、患者の解剖学的構造が、電極の接近を許容しないことがあることを理解しつつ、電極は、移植された細胞、虚血組織、または血管新生の対象領域のできるだけ近くに配置されるべきである。経静脈法でない埋め込み技法が用いられる場合には、通例、刺激電極は、虚血領域の非常に近い位置に配置することができる。
【００４９】
患者または細胞の閾下刺激
提供される閾下刺激は、患者の対象となる生体組織において血管新生を刺激するのに十分である。一実施形態として、パルス発生器は、閾下電界の送達により、血管増殖因子の転写を調節するために用いられる。
【００５０】
また、本発明は、閾下刺激治療を必要とする患者にも閾下パルス発生器を提供する。一実施形態では、本発明は、血管増殖因子の産生を調節する手段を提供することにより、組織の障害の軽減または修復を行う方法を含む。一態様では、パルス発生器は、例えば虚血障害が発生した箇所といった、障害を受けた筋肉組織の修復を取り持つ閾下パルスを送達するのに有効である。この方法は、損傷を受けた心筋組織または末梢筋肉組織の周囲の心筋組織もしくは筋肉組織または細胞に治療的な刺激を提供することにより、損傷を受けた心筋組織または末梢筋組織に適用することができる。別の実施形態では、血管筋肉組織が、閾下パルス発生器を用いて刺激を受ける。血管組織の閾下刺激には、患者の動脈および静脈の刺激が含まれる。
【００５１】
本発明の一特徴では、本システムは、閾下刺激の治療有効量を送達することにより、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）もしくは冠動脈疾患（ＣＡＤ）または脳卒中（stroke）を処置するのに用いることができる。末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）または冠動脈疾患（ＣＡＤ）の処置は、ＶＥＧＦおよびＦＧＦといった血管新生タンパク質を刺激して、血管形成（血管新生）を高めることにより達成されることが想定される。
【００５２】
また、本発明は、血管新生因子の制御された発現を行うために、細胞を刺激する新規な方法も提供する。ある好ましい実施形態では、刺激を受ける細胞は、筋肉細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は、筋肉細胞であり、より好ましくは、心筋細胞、平滑筋細胞、または骨格筋細胞である。好ましい実施形態として、閾下パルスは、移植された細胞の内因性血管増殖因子の細胞産生を高めることが実証される。別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞に事前に刺激を与えるために、本デバイスを用いることができる。事前に刺激を与えられた細胞は、その後、心臓に移植することができる。このプロセスでは、培養中の細胞が、閾下領域で刺激を与えられ、移植に用いられる。このプロセスでは、細胞は、その患者から取り出すか（自家細胞移植）、または、同じ種類の異なる患者（同種細胞移植）もしくは異なる種類（異種細胞移植）からのものを使用することができる。
【００５３】
移植細胞または移植片は、自家移植源（auto-graphic source）、同種移植源（allo-graphic source）、または異種移植源（xeno-graphic source）から得ることができる。事前の閾下刺激または事後の閾下刺激に用いられる心臓組織の移植細胞は、成人心筋細胞、小児心筋細胞、胎児心筋細胞、成人繊維芽細胞、胎児繊維芽細胞、成人平滑筋細胞、胎児平滑筋細胞、内皮細胞、および骨格筋肉芽細胞からなる群から選ぶことができる（米国特許第６，０９９，８３２号および本明細書に記述されたさまざまな細胞タイプの単離の手順を参照されたい）。この技術分野では、さまざまな一次細胞のタイプを単離するための多くの付加的な手順が知られており、また、記述されている。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、具体的な実施形態を参照することにより、本発明を例証するためにのみ提供される。これらの例示は、本発明の所定の具体的な側面を例証するが、本発明の限定を表すものでもなく、本発明の範囲を定めるものでもない。
【００５５】
材料およびアッセイ
サンプル内のヒトＶＥＧＦを、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）によるヒトＶＥＧＦ免疫測定法を用いて定量化した。従ったプロトコルは、基本的には、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）のカタログ（番号ＤＶＥ００）に記述された通りであった。ヒトＶＥＧＦ免疫測定法は、サンドイッチ型酵素免疫測定技法を使用する。ＶＥＧＦに特異的なモノクローナル抗体を、マイクロタイタープレート上で予備被覆した（pre-coated）。標準規格品およびサンプルを、ピペットでウェルに取り、存在するあらゆるＶＥＧＦを、不動化した抗体により固定する。固定されていないあらゆる物質を洗い流した後、ＶＥＧＦに特異的な酵素結合したポリクローナル抗体を、ウェルに加える。洗浄して、固定されていないあらゆる抗体−酵素試薬を除去した後、基質溶液を、ウェルに加えると、最初のステップで固定されたＶＥＧＦの量に比例した着色が起こる。着色が停止し、色の強度が測定される。
【００５６】
実施例１：
無菌の６ウェル培養プレート（Corning）に、ＳｍＧＭ増殖培地を用いて、６つのウェル培養インサート上に細胞を接種した。Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞）を、７．５×１０３／ｃｍ２で接種した。ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ：Human Coronary Smooth Muscle Cell）を、２．５×１０３／ｃｍ２で接種した。２日間の増殖（密集）の後、ウェルを、電気刺激培地（１％のウシ血清アルブミンを有するＤＭＥＭ）により２度洗浄した。２．０ｍｌの無血清培地を加えたが、培地には、ウシ胎仔血清は存在しなかった。ウェルは、内側ウェルインサートに約２．０ｍｌおよび外側ウェルインサートに約２．０ｍｌの合計約４ｍｌの増殖培地を含んだ。細胞に、円形のグラファイト電極を用いて、各刺激条件につき８時間の間、電気的刺激を与えた。細胞に、刺激試験槽内で、４ミリ秒の放電パルス幅を有する１ミリ秒の刺激パルス幅の間、１ボルトで刺激を与えた。エスケープ（逸脱）期間を、望ましい周波数を達成するように調整した。サンプルを、２２時間の事後刺激の後採取した。細胞培養の上清を、ウェルから除去した。−８５℃でサンプルを凍結することに先立って、いかなるデブリまたは浮遊した細胞も、５分間、３００ＲＰＭで上清を遠心分離することにより除去した。細胞のカウントを、培養プレートのすべてのウェルで行った。
【００５７】
凍結された上清を解凍し、サンプル内のＶＥＧＦの量を、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅのヒトＶＥＧＦ免疫測定法を用いて定量化した。結果（表１）は、閾下刺激がサンプル内に見出されるＶＥＧＦの量を増加させたことを示した。
【００５８】
【表１】
2004523312.tif 000005
【００５９】
実施例２：局所的な虚血性心筋症のイヌモデルのｉｎ  ｖｉｖｏ閾下刺激
最初に、筋肉内硫酸モルヒネ（４ｍｇ／ｋｇ）によって、イヌを麻酔した。ペントサルのボーラス注射（２０ｍｇ／ｋｇ）を与え、続いて、気管内挿管後に、連続したイソフルレン（酸素の０．５％〜２％）の吸入を行った。左側の開胸術を行い、心外膜を開いた。マイクロ血圧計の圧力トランスデューサ（テキサス州ヒューストンのMillar InstrumentsのＭＰＣ−５００）を、心尖部の切開箇所を通して左心室に挿入した。また、５ＭＨｚの超音波水晶振動子の対も、冠動脈血流の測定の最初の対角枝のちょうど末端部にある末梢の左前下行枝（ＬＡＤ：left anterior descending - artery）および左回旋枝（ＬＣＸ:left circumflex - artery）によって血液が供給される領域に埋め込んだ。２つの心臓ワイヤ電極を、ＬＡＤ潅流領域に挿入した。着色された１５μｍの微小球を注入して、局所的な心筋の血流を測定するために、カテーテルを、左心房に挿入した。アメロイドコンストリクタを、血流プローブに近接したＬＡＤ枝に配置した。すべてのワイヤおよびチューブを、皮下に通し、首背部の皮膚を通して引き出した。開胸術による切開部を、層を成して閉じ、再潅流期間の間中、広域抗生物質および微麻酔の投与を開始した。
【００６０】
外科手術後の実験プロトコルの基本的な年表は、３つの期間に分割した。第１の期間（回復期間）は、外科手術後の最初の週に現れた。イヌに器具を取り付ける外科手術の後、イヌは回復することができた。第１週の間、冠動脈血流（ＣＢＦ:coronary blood flow）を１週間で評価するために、微小球を注入した。第２の期間は、外科手術後の第２週から第５週の間に現れ、休止しているＣＢＦを評価するための微小球の注入に加えて、局所的な仕事量、ＣＢＦ（ＬＡＤおよびＬＣＸ）、ならびに左心室の圧力（ＬＶＰ：left ventricular pressure）の毎週のモニタリングを含んた。第３の期間は、第５週から第６週にかけて現れ、５日間の間、刺激を行った。
【００６１】
第６週の間、すべての血行動態信号（hemodynamic signal）を、２５０Ｈｚでサンプリングを行うアナログ／ディジタル変換器を用いて記録した。回復フェーズ（第１の期間）、次の虚血の発症（第２の期間）、および次の電界刺激（field stimulation）（第３の期間）の終わりに、局所的な血流を、着色された微小球（１５μＭ）を用いて評価し、心筋外膜および心筋内膜の血流を定量化した。組織のサンプルおよび基準血液のサンプルを、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ２５０マイクロプレートリーダ分光光度計で分析した。心筋の血流を、非虚血区域および虚血区域の心外膜下領域および心内膜下領域で計算した。慢性的な虚血後の組織による微小球の潜在的損失が、非虚血組織のベースライン流のレート係数を用いて、虚血組織の血流データ（例えば虚血／非虚血流）に提供されることにより訂正される。
【００６２】
第６週の開始時に、５０Ｈｚ、０．１Ｖで動作し、０．３ミリ秒のパルスを発生する閾下刺激装置を用いて、閾下パルスを心臓に送達した。閾下刺激装置は、全部で１６の可能な設定について０．１Ｖのステップで変化する０〜１．５Ｖ出力の動作範囲を有する。パルス幅は、０．１、０．３、１．０、および３．０ミリ秒であり、一連の４つのスライドスイッチによって切り換えられる。このパルス出力の柔軟性の結果、この刺激装置は、ペーシング閾値を決定する機能も有し、したがって、０．１Ｖ、５０Ｈｚのパルスが閾下となるマージンすなわち範囲を有していた。これは、振幅をステップアップして、ＶＯＯペーシング捕捉を探している間、このデバイスを１〜３Ｈｚの評価モードに設定することにより行われる。刺激は、一組の心筋ペーシングワイヤ、すなわち「心臓ワイヤ」を介して送られた。このワイヤは、二極ＩＳ−１コネクタに接続された一組の単極ＩＳ−１リード線を通して刺激装置に接続されていた。さらに、パルス発生器は、結合バッテリレベルがＯＫであること、および、ペーシングワイヤの連続性がＯＫであることを示すインディケータを含み、このインディケータは、視認できるＬＥＤライトを有する。
【００６３】
ＬＡＤ心臓領域には、実験終了前の第６週の５日間刺激を与えた。サンプルの心臓組織は、刺激を受けたイヌおよび刺激を受けていないイヌの双方から収集した。心臓組織のサンプルは、ＶＥＧＦ抗体を用いるウェスタンブロット分析用に採取し、調製した（図７）。全タンパク質を、実験後の心臓組織から抽出した。１００μｇのタンパク質を、ＳＧＳ−Ｐａｇｅゲルの各レーンにロードし、２００ボルトで１５分間、溶解した。レーンを、ヒトＶＥＧＦ用のポリクローナル抗体（Santa Cruz）にさらした。この抗体は、抗体の結合エピトープ（データは図示せず）を阻止する分子によって阻止された。したがって、この抗体は、ＶＥＧＦの部位に特異的なものである。レーン８〜レーン１１＝制御グループ。レーン８（非虚血領域全層）、レーン９（虚血心外膜下）、レーン１０（虚血心内膜下）、レーン１１（右心室）。レーン１２〜レーン１５は、処置（刺激領域）グループである。レーン１２（非虚血領域全層）、レーン１３（虚血心外膜下）、レーン１４（虚血心内膜下）、レーン１５（右心室）。ＶＥＧＦについてのバンドは、約２６ｋＤ分子量で現れる。ＶＥＧＦについて見られる２つの断片に典型的な２つのバンドが現れる。ＶＥＧＦと一致するバンドは、レーン１２〜レーン１５、すなわち処置グループにのみ現れることに留意されたい。ゲルは、変異性を回避するために同じ日に処理した。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＶＥＧＦ産生のための心臓組織の閾下刺激  図１は、心臓組織の閾下刺激用動作の１つのモードの概要である。
【図２】閾下刺激用の出力回路の簡略概略図  図２は、パルス発生器用の閾下刺激デバイスの出力回路構成の概略図を示す。
【図３】出力段階にある閾下刺激の等価回路  図３は、出力段階にあるパルス発生器用の閾下デバイスの出力回路構成の概略図を示す。
【図４】閾下刺激シーケンス  図４は、一連の閾下刺激を提供するペーシング方式を示す。
【図５】閾下刺激用のパルス発生器  図５は、対象となる組織細胞に電気刺激を送達することができるパルス発生器用の回路のブロック図を示す。
【図６】閾下刺激用の出力回路の概略図  図６は、閾下パルス発生器用の閾下刺激デバイスの出力回路構成の概略図を示す。
【図７】刺激を受けた組織および刺激を受けていない組織のＶＥＧＦ産生  図７は、刺激を受けた血管組織および刺激を受けていない血管組織におけるＶＥＧＦタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図４】
2004523312.tif 000006
【図５】
2004523312.tif 000007
【図６】
2004523312.tif 000008
【図７】
2004523312.tif 000009
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月1日(2003.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．）電源装置と、
ｂ．）前記電源装置と相互接続されて、約１Ｖ／ｃｍ以下の連続周期の閾下パルスを心臓組織に直接送達する制御機構と、
を備える閾下パルス発生器。
【請求項２】
心臓の血管新生を高めるための請求項１に記載の閾下パルス発生器の使用。
【請求項３】
ａ．培養された細胞を、対象となる生体組織内に注入する前または注入した後に、該細胞を閾下パルス発生器により刺激するステップ、
を備える、対象となる組織における血管新生を改善する方法。
【請求項４】
前記制御機構は、前記電源装置からの電気パルスの、電圧振幅、刺激期間、充電バランス、および周波数からなる群から選択される少なくとも１つの機能を制御する、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項５】
前記制御機構は、刺激タイマ、出力振幅制御、充電バランスが保たれたパルスタイマ、刺激閾値モニタ、およびリード線導通モニタから選択される構成要素からなる少なくとも１つの追加の組を有する、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項６】
定電圧源を有する、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項７】
前記電源装置からの前記電気パルスの送達の振幅は、約１Ｖ／ｃｍの可変電界を有する、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項８】
前記電源装置からの前記電気パルスの送達の振幅は、約０．５Ｖ／ｃｍの電界を提供する、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項９】
前記電源装置からの前記電気パルスの送達の振幅は、約０．１Ｖ／ｃｍである、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１０】
前記可変電界は、約±３０％である、請求項７ないし９のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項１１】
前記可変電界は、約±２０％である、請求項７ないし９のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項１２】
前記可変電界は、約±１０％である、請求項７ないし９のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項１３】
前記可変電界は、約±５％である、請求項７ないし９のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項１４】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約２０ミリ秒未満である、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１５】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約１０ミリ秒未満である、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１６】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約５ミリ秒未満である、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１７】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約１ミリ秒未満である、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１８】
前記電源装置からの前記電気パルスの前記刺激期間は、約３ミリ秒未満である、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項１９】
前記刺激の周波数は、約１０Ｈｚである、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２０】
前記刺激の周波数は、約２５Ｈｚである、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２１】
前記刺激の周波数は、約４０Ｈｚである、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２２】
前記刺激の周波数は、約５０Ｈｚである、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２３】
前記刺激の周波数は、約７０Ｈｚである、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２４】
前記刺激の周波数は、約８５Ｈｚである、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２５】
前記刺激の周波数は、約１００Ｈｚである、請求項４に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２６】
前記対象となる細胞または組織に前記閾下パルスの送達を行う複数の電極をさらに備える、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項２７】
少なくとも１つの電極を、カテーテルに配置することができ、対象の器官に経管的に届けることができる、請求項２６に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２８】
前記電極が、前記対象となる細胞または組織と接触しているか、または、前記対象となる細胞または組織の近傍に位置する場合に、前記細胞または組織に刺激を提供する、請求項２６に記載の閾下パルス発生器。
【請求項２９】
前記振幅および前記送達の継続期間は、血管新生を刺激するのに十分である、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項３０】
前記送達される閾下パルスは、充電バランスが保たれている、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項３１】
前記電源装置と電子的に通信するコンピュータ処理ユニットをさらに備え、該コンピュータ処理ユニットは、当該閾下パルス発生器に、所定の量の電流または電圧を、所定の送達期間にわたって、前記対象となる細胞または組織に送達させるようにプログラミング可能である、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項３２】
前記電気パルス発生器は、体内に埋め込まれる、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項３３】
前記電気パルス発生器は、体外に置かれる、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項３４】
所定の時間帯にわたって、対象となる組織または細胞に電界を送達し、ＶＥＧＦ発現の産生を刺激する、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項３５】
前記電気パルス発生器は、外部で制御される、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項３６】
前記電極は、単極電極構成、二極電極構成、および多極電極構成からなる群から選択されるように構成される、請求項２６に記載の閾下パルス発生器。
【請求項３７】
前記電気パルス発生器は、外部で制御される、請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器。
【請求項３８】
前記電極の１つは、前記閾下パルスの送達の期間を任意に再調整するか、または、同期させる検知電極である、請求項２６に記載の閾下パルス発生器。
【請求項３９】
所定の時間帯にわたって、対象となる細胞または組織に電界を送達し、ＶＥＧＦ発現の産生を刺激する、請求項３６に記載の閾下パルス発生器。
【請求項４０】
ＶＥＧＦ発現の産生が高められる、請求項２に記載の使用。
【請求項４１】
心臓における血管増殖因子の産生を高めるための請求項１ないし３のいずれかに記載の閾下パルス発生器の使用。
【請求項４２】
注入後に前記細胞を刺激することをさらに含む、請求項３に記載の対象となる組織における血管新生を改善する方法。
【国際調査報告】
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