(57)【要約】α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の遺伝子治療における補充法としての使用を明細書に開示している。１つの態様では、遺伝子治療ベクターはα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を発現する核酸を含む。炎症または免疫応答遺伝子プロモーターはα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の発現を制御できる。この配列は内部リボゾームエントリー部位配列を使用し、治療遺伝子とともに発現できる。別の態様では、薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、適当な遺伝子を担持する遺伝子治療ベクター投与の前、後または同時に投与できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの治療遺伝子または核酸を有する遺伝子治療ベクター、およびその遺伝子治療ベクターに関連するα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の薬理学的有効量を含む、遺伝子治療システム。
【請求項２】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、遺伝子治療ベクター投与の前、後または同時に投与する、請求項１記載の遺伝子治療システム。
【請求項３】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、遺伝子治療ベクターが担持する核酸から発現させる、請求項１記載の遺伝子治療システム。
【請求項４】
遺伝子治療ベクターが担持する核酸が治療遺伝子または核酸を含む、請求項３記載の遺伝子治療システム。
【請求項５】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、炎症または免疫応答遺伝子プロモーターの制御下に発現させる、請求項３記載の遺伝子治療システム。
【請求項６】
炎症遺伝子プロモーターがインターロイキン−６のプロモーターである、請求項５記載の遺伝子治療システム。
【請求項７】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、少なくとも１つの内部リボゾームエントリー部位配列を有する核酸から発現させる、請求項３記載の遺伝子治療システム。
【請求項８】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、少なくとも１つの分泌シグナルペプチドを有する核酸から発現させる、請求項３記載の遺伝子治療システム。
【請求項９】
遺伝子治療ベクターがウイルスベクターである、請求項１記載の遺伝子治療システム。
【請求項１０】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項９記載の遺伝子治療システム。
【請求項１１】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、少なくとも１つの治療遺伝子または核酸を有する遺伝子治療ベクター投与の前、後または同時に投与する遺伝子治療方法。
【請求項１２】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、遺伝子治療ベクターが担持する核酸から発現させる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子治療ベクターが担持する核酸が治療遺伝子または核酸を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、炎症または免疫応答遺伝子プロモーターの制御下に発現させる、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
炎症遺伝子プロモーターがインターロイキン−６のプロモーターである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、少なくとも１つの内部リボゾームエントリー部位配列を有する核酸から発現させる、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、少なくとも１つの分泌シグナルペプチドを有する核酸から発現させる、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子治療ベクターがウイルスベクターである、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は遺伝子治療の分野に属する。
【０００２】
【発明の背景】
種々の疾患は、環境因子によって生存中に改変または遺伝される欠陥遺伝子をその原因とする。このような疾患の例としては、種々の型の癌、血友病またはＬＤＬ受容体欠損症などがある。遺伝子治療または遺伝子補充療法は上記の欠陥遺伝子を置換、増強または阻害することにより、これらの疾患を根本的に治癒することを約束する。
【０００３】
治療遺伝子または核酸を導入するための通常のベクターにはウイルスおよび非ウイルスベクターがある。ウイルス供給システムは遺伝子を細胞に供給するうで最も効率的と考えられてきたが、それは炎症または免疫応答を引き起こす危険性があることから限定的となる場合がある。Ｆｏｒｂｅｓ， Ｓ．Ｊ． Ｒｅｖｉｅｗ Ａｔｒｉｃｌｅ： Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １１：８２３−８２６（１９９７）。
【０００４】
ペンシルベニア大学ヒト遺伝子治療機関（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）における遺伝子治療の臨床試験に参加中、１９９９年９月１７日に死亡したボランティアであったジェシー・ゲルシンガー（Ｊｅｓｓｅ Ｇｅｌｓｉｎｇｅｒ）の死亡により、最近、遺伝子治療の使用および安全性についての論争が激しくなっている。この臨床試験は改変アデノウイルスベクターを用いたオルニチントランスカルボミラーゼ（ＯＴＣ）の処置を目的としていた。しかし、ゲルシンガーにベクターを投与すると、「異常かつ致死的な免疫系の応答が誘発され、多臓器不全と死をもたらした」。予備的所見；１９９９年１２月２日、ペンシルベニア大学健康システム、ヒト遺伝子治療機関＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｉｈｇｔ／ｆｉｎｄｉｎｇｓ．ｈｔｍｌ＞。アデノウイルスベクターは広範な細胞に感染でき、レトロウイルスベクターのように複製細胞にだけ限定されない点において他のウイルスベクターに比べて幾つかの利点を提供するが、ゲルシンガーの場合に見られるように免疫系を活性化させることがあり、初期用量や反復導入の効果はそれが生命に危険を及ぼさない場合、低くなることがある。Ｆｏｒｂｅｓ， Ｓ．Ｊ．（前掲）を参照。
【０００５】
さらに、遺伝子治療に対する免疫応答の可能性は使用するベクターに限定されない。ベクターは「外来性」と認識され得るタンパク質、ポリペプチド、酵素をコードする遺伝子配列を宿主に導入するので、そのような配列を発現する細胞および発現産物に対する免疫応答が遺伝子治療の有効性を制限する。例えば、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子遺伝子を治療遺伝子として使用する血友病実験では、新たに発現されたタンパク質に対して抗体が生成され、それが治療の有効性を制限することがあった。Ｆｏｒｂｅｓ， Ｓ．Ｊ．（前掲）：またＨｅｒｚｏｇ， Ｒ．， Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ５：３２１−３２６（１９９８）も参照。好中球などの細胞傷害性Ｔ細胞も「外来」遺伝子またはウイルスベクター遺伝子を発現する細胞を攻撃することがあり、ここでも遺伝子治療の有効性が長期にわたって制限を受けることになる。
従って、免疫系の有害作用の幾つかを緩和することにより遺伝子治療の安全性および効能を増大させる要求が存在する。
【０００６】
【発明の概要】
本発明は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を補助的に遺伝子治療に使用するものである。本発明の１つの態様では、遺伝子治療ベクターはα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を発現する核酸配列、およびその発現を制御できる炎症または免疫応答遺伝子プロモーターを含む。その核酸配列はまた、内部リボゾームエントリー部位配列を使用して治療遺伝子とともに発現させることができる。別の態様では、適当な遺伝子を担持する遺伝子治療ベクターの投与の前、後および／または同時に、薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を投与できる。
【０００７】
【発明の一般的な説明】
以下に引用する文献はその引用により本明細書に完全に記載されているものとする。本発明は、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）および／またはその誘導体を補助療法として使用する遺伝子治療のための方法およびシステムに関する。α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体はその抗炎症および解熱活性のため、遺伝子治療ベクターまたは発現タンパク質に対する患者の炎症応答を制限することにより遺伝子治療応用を補充（補完）することができる。他の免疫抑制剤とは異なり、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は、同時に生体を感染から防ぐことのできる抗微生物特性をも有しており、かつ免疫系の陰性効果を制限できる。
【０００８】
本発明の１つの態様では、薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を、適当な治療遺伝子または核酸を担持する遺伝子治療ベクターを投与する前、後および／または同時に投与することができる。あるいは、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は、遺伝子治療ベクターとともにカクテルとして投与することもできる。遺伝子治療ベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクター、およびリポソーム、リン酸カルシウム、抗体または受容体基本導入ベクター、エレクトロポレーション、または核酸の直接注入などの非ウイルスベクターの両者が包含され得る。
【０００９】
本発明の別の態様では、遺伝子治療ベクターはα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を宿主細胞において発現するための配列を含むＤＮＡ分子を担持する。通常の分子クローニング技術により、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の遺伝子配列をウイルスベクターまたは発現プラスミドベクターにクローニングできる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの構成プロモーターまたは誘導プロモーターにより発現させることができる。好ましくは、誘導プロモーターは、インターロイキン、具体的にはＩＬ−６プロモーターなどの炎症遺伝子プロモーター、または補体系遺伝子プロモーターを利用する。他の炎症遺伝子プロモーターには、ＴＮＦ−αまたはＮＦ−κＢ応答因子のプロモーターがある。
【００１０】
α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を担持する遺伝子治療ベクターはまた、目的とする適当な治療遺伝子または核酸を担持できる。これはα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の発現を、目的の治療遺伝子が発現する領域に局在させる。α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体のこの局在効果により、宿主の全身免疫系を損なうことなく、局所炎症応答を阻害することができる。これはさらに、遺伝子治療ベクターが導入された細胞を、好中球またはＴ細胞の炎症細胞傷害作用から防護する。本発明の好ましい態様では、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の遺伝子および関連プロモーターを、目的の治療遺伝子を担持する同じＤＮＡベクターにクローニングし、これによりこの同時局在効果を得ることができる。
【００１１】
あるいは、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は内部リボゾームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を用いて発現させることができる。ＩＲＥＳ配列は治療遺伝子とα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の遺伝子との間に配置できる。従って、これら２つの遺伝子は二重シストロン性ｍＲＮＡ転写体として単一のプロモーターから転写され、次いでこの二重シストロン性ｍＲＮＡ転写体は５’末端およびＩＲＥＳ配列において同時に翻訳され得る。治療遺伝子由来のタンパク質とα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体とはともに単一の転写体から産生されるので、単一の細胞がこれら両タンパク質を発現する可能性は高いであろう。ＩＲＥＳ配列およびベクターは市販されており、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， パロアルト、カリフォルニアから入手可能である（ｐＩＲＥＳ、カタログＮｏ．６０２８−１）。
【００１２】
さらに、多重ＩＲＥＳ配列を用いたα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体のストリンジング多重遺伝子により、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の産生を増大させることができる。α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の遺伝子上流に分泌シグナルペプチドをクローニングすることにより、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体をそれらを必要とする細胞外環境に輸送させることもできる。このような分泌ペプチドシグナルの例としては、上皮成長因子、塩基性フィブロブラスト成長因子またはインターロイキン−６のシグナルペプチドが挙げられる。
【００１３】
実施例１
この実施例は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の抗炎症、解熱および抗微生物活性を説明する。
α−ＭＳＨは古くからの１３アミノ酸ペプチド、ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（α−ＭＳＨ（１−１３））であり、これは比較的大きな前駆体分子であるプロピオメラノコルチンの翻訳後プロセッシングにより産生される。α−ＭＳＨは、これもプロピオメラノコルチンから誘導される副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）と１−１３アミノ酸配列を共有している。α−ＭＳＨは、下垂体細胞、単球、メラニン細胞およびケラチノサイトなどの多くの細胞型から分泌されることが知られている。これは、ラットの皮膚、ヒトの表皮、または無傷および下垂体切除ラットの消化管の粘膜バリアーにおいて観察できる。例えば、Ｅｂｅｒｉｅ， Ａ．Ｎ．， Ｔｈｅ Ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｈｉｎｓ， Ｋａｒｇｅｒ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ （１９９８）； Ｌｉｐｔｏｎ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ． ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ α−ＭＳＨ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８， １４０−１４５ （１９９７）； Ｔｈｏｄｙ， Ａ．Ｊ．， ｅｔ．ａｌ．， ＭＳＨ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｒｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｋｉｎ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ４， ８１３−８１５ （１９８３）； Ｆｏｘ， Ｊ．Ａ．， ｅｔ．ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ， Ｉｔｓ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ ａｎｄ Ｈｙｐｏｐｈｙｓｅｃｔｏｍｉｚｅｄ Ｒａｔｓ， Ｌｉｆｅ． Ｓｃｉ． １８， ２１２７−２１３２ （１９８１） を参照のこと。
【００１４】
α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は強力な解熱作用および抗炎症作用を有していることは知られているが、それに加え、これらは毒性が極めて低い。α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は宿主細胞の炎症誘発性メディエーターの産生をインビトロにおいて減少でき、さらに炎症の動物モデルにおいて局所および全身反応の生成をも減少させることができる。「コア」α−ＭＳＨ配列（４−１０）は例えば、学習および記憶行動効果を有しているが、解熱活性および抗炎症活性は殆ど有していない。対照的に、解熱活性および抗炎症活性の活性メッセージ配列はα−ＭＳＨのＣ末端アミノ酸配列、即ちリジン−プロリン−バリン（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＶａｌまたはＫＰＶ）に存在する。このトリペプチドは親分子と同等なインビトロおよびインビボ活性を有している。α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の抗炎症活性は以下の２つの特許および文献に記載されている（これらは引用により本明細書に包含される；１９９１年７月２日発行のＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，０２８，５９２、発明者：Ｌｉｐｔｏｎ， Ｊ．Ｍ．， 名称：Ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ａｎｄ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｅ； １９９２年１０月２０日発行のＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，１５７，０２３， 発明者 Ｌｉｐｔｏｎ， Ｊ．Ｍ．， 名称： Ａｎｔｉｐｒｅｙｔｉｃ ａｎｄ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｅ、また次も参照のこと： Ｃａｔａｎｉａ， Ａ．， ｅｔ． ａｌ．， α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｓｔ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １４， ５６４−５７６ （１９９３）； Ｌｉｐｔｏｎ， Ｊ． Ｍ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ −ＭＳＨ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８， １４０−１４５ （１９９７）； Ｒａｊｏｒａ， Ｎ．， ｅｔ．ａｌ．， α−ＭＳＨ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ Ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ， ｉｎ ａ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ５９， ２４８−２５３ （１９９６）； Ｓｔａｒ， Ｒ．Ａ．， ｅｔ．ａｌ．， Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｙ α−ＭＳＨ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９２， ８０１５−８０２０ （１９９５）； Ｌｉｐｔｏｎ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ α−ＭＳＨ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｃｈｒｏｎｉｃ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７４１， １３７−１４８ （１９９４）； Ｆａｊｏｒａ， Ｎ．， ｅｔ．ａｌ．， α−ＭＳＨ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｌｏｃａｌ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｏｓｃｉ， １７， ２１８１−２１８６ （１９９５）； Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｄ．Ｂ．， ｅｔ．ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ α−ＭＳＨ （１１−１３） （ｌｙｓｉｎｅ−ｐｒｏｌｉｎｅ−ｖａｌｉｎｅ） ｏｎ Ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｂｂｉｔ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ５， ８１５−８１７ （１９８４）； Ｈｉｌｔｚ， Ｍ．Ｅ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ＣＯＯＨ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ α−ＭＳＨ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ３， ２２８２−２２８４ （１９８９））。
【００１５】
α−ＭＳＨ誘導体としては、次のアミノ酸配列を有するペプチド：アミノ酸配列ＫＰＶ（α−ＭＳＨ（１１−１３））、ＭＥＨＦＲＷＧ（α−ＭＳＨ（４−１０））またはＨＦＲＷＧＫＰＶ（α−ＭＳＨ（６−１３））が挙げられるが、これらに限定されない。これらの誘導体には上記ペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体も含まれるが、これらは上記ポリペプチドのＮ末端にシステイン残基を付加し、２つのポリペプチドのシステインにジスルフィド結合を形成させることにより得ることができる。これらのペプチドはＮアセチル化および／またはＣアミド化されていてもよい。
【００１６】
特定のアミノ酸残基を置換または欠失させることにより、生物学的に機能的な誘導体をペプチドの効能を改変することなく、作製することができる。例えば、α−ＭＳＨ配列を安定化させれば、ペプチドの活性を大幅に増大させることができ、Ｄ−アミノ酸体をＬ−体に置換することによりペプチドの効能を改善または減少させることができることが知られている。α−ＭＳＨの安定アナログである［Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７］−α−ＭＳＨはメラニン細胞およびメラノーマ細胞に対して顕著な生物活性を有することが知られており、これは解熱作用において親ペプチドよりもおよそ１０倍も強力である。さらに、α−ＭＳＨ（１１−１３）配列のＣ末端にアミノ酸を付加することにより、解熱作用を減少または増大させることができる。グリシンを付加してこの１０−１３配列を形成させると、その強度が若干減少した：９−１３配列は活性を殆ど欠いていたが、８−１３配列の強度は１１−１３配列よりも大きかった。Ａｃ−［Ｄ−Ｋ１１］−α−ＭＳＨ１１−１３−ＮＨ２はトリペプチドα−ＭＳＨ（１１−１３）のＬ体と同じ一般的強度を有していることが知られいてる。しかし、このトリペプチドの１２位のＤ−プロリンを置換すると、不活性になった。例えばＨｏｌｄｅｍａｎ， Ｍ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ Ｐｏｔｅｎｔ α−ＭＳＨ Ａｎａｌｏｇ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ６， ２７３−５ （１９８５）．　Ｄｅｅｔｅｒ， Ｌ．Ｂ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌｌｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ α−ＭＳＨ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｂｂｉｔ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ９， １２８５−８ （１９８９）．　Ｈｉｌｔｚ， Ｍ．Ｅ．， Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ α−ＭＳＨ （１１−１３） Ａｎａｌｏｇｓ： Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １２， ７６７−７１ （１９９１） を参照のこと。
【００１７】
類似しているハイドロパシー（疎水性親水性指標）値を有するアミノ酸と置換することにより、生物学的に機能的な等価体を得ることができる。例えば、疎水性親水性指標＋４．５および＋３．８をそれぞれ有するイソロイシンおよびロイシンは、疎水性親水性指標＋４．２を有するバリンと置換することができ、同様の生物活性を有するタンパク質を得ることができる。あるいは、別のスケール方面では、リジン（−３．９）をアルギニン（−４．５）などと置換することができる。一般に、あるアミノ酸が成功裏に置換できるのは、そのようなアミノ酸が、置換されるアミノ酸の疎水性親水性指標単位がおよそ＋／−１の範囲内の疎水性親水性スコアを有する場合と考えられる。
【００１８】
α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の抗微生物特性については、ＷＯ００／５９５２７として公開されているＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／０６９１７（発明の名称：α−メラニン細胞刺激ホルモンから誘導される抗微生物性アミノ酸配列（Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｌｐｈａ−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、２０００年３月１７日出願、発明者：Ｃａｔａｎｉａ， Ａ．およびＬｉｐｔｏｎ， Ｊ．、発明の名称：α−メラニン細胞刺激ホルモンから誘導される抗微生物性アミノ酸配列（Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｌｐｈａ−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）として１９９９年３月２４日出願の米国仮出願番号６０／１２６，２３３の優先権を主張）に記載されている。このＰＣＴ公開および仮出願は引用によって本明細書に包含される。
【００１９】
実施例ＩＩ
この実施例は、遺伝子治療とともにα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を使用することを説明する。
α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の調製および精製には、通常の固相ペプチド合成手法および逆相高速液体クロマトグラフィー手法を使用できる。遺伝子治療を受ける患者には注射または経口投与のいずれによっても、薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を投与できる。例えば、注射は遺伝子治療が標的とする特定部位に応じて、静脈内、腹腔内または皮内に行うことができる。次いで、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体の投与後、医師の監督下に、目的の治療遺伝子または核酸を含有する遺伝子治療ベクターの薬理学的有効量を通常の遺伝子治療プロトコールに従って患者に投与することができる。要すれば、遺伝子治療ベクターの投与後、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を追加的に投与してもよい。
あるいは、遺伝子治療ベクターの供給カクテルは、協働してまたは同時に患者に投与される薬理学的有効量のα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を含むことができる。
【００２０】
実施例ＩＩＩ
この実施例は、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を発現する遺伝子治療ベクターの構築を説明する。
α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を発現する遺伝子配列の調製および精製には、数ある手法の中でも、通常のオリゴヌクレオチド合成手法を使用できる。相補的オリゴヌクレオチドを作製しアニーリングすることで、クローニングできる二本鎖ＤＮＡ分子が形成される。適当な制限酵素部位を有する付加的な配列をオリゴヌクレオチドそれぞれの末端に施すことができる。好ましくは、α−ＭＳＨ配列の下流のオリゴヌクレオチド配列には終止コドン（ＴＡＧ）を含む。
【００２１】
さらに、ポリメラーゼ鎖反応を使用し、ＩＬ−６ｃＤＮＡのシグナルペプチドに想到する断片、ヌクレオチド３３−１２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｊ０３７８３）を合成し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， サンジェゴ、ＣＡ）などのベクターにクローニングできる。同様に、ＩＬ−６またはＮＦ−κＢのプロモーター領域も適当なマッチング制限酵素部位を有するオリゴヌクレオチドを使用して合成でき、それを、シグナル配列を担持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの上流にクローニングできる。標準的な制限酵素消化およびＤＮＡ連結により、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体配列をシグナル配列およびプロモーターに連結できる。
【００２２】
内部リボゾームエントリー部位（ＩＲＥＳ）配列が所望であれば、上記のオリゴヌクレオチド配列はそのような配列を含むことができ、またはそれは通常のＰＣＲ手法によってＰＣＲプライマーに組込み、連結できる。あるいは、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体配列はＣｌｏｎｔｅｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのｐＩＲＥＳベクターにクローニングできる。多重α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体は、所望であれば多重ＩＲＥＳ配列を用いて構築できる。これらの構築物および目的の治療遺伝子を含む発現プラスミドの有効量は、リポソームなどの非ウイルスベクター、エレクトロポレーションまたは遺伝子銃を用いて、直接的に患者に注射または導入できる。
【００２３】
さらに、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体構築物は、標準的な制限酵素および連結手法、平滑末端クローニングまたはＰＣＲ手法によって適当な複製欠陥レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノウイルス関連ウイルスベクターに挿入できる。
【００２４】
組換えウイルスの力価をまず測定し、適当量のウイルス粒子を患者または宿主に導入すればよい。ウイルスベクターは既に、α−ＭＳＨおよび／またはその誘導体に加えて、治療遺伝子または核酸を含有している場合があると考えられる。
【００２５】
組換えウイルスを細胞に導入すると、細胞はα−ＭＳＨおよび／またはその誘導体を発現し、次いで炎症を阻害する。ＮＦ−κＢ活性化の阻害を介した細胞におけるα−ＭＳＨ発現の抗炎症効果がＩｃｈｉｙａｍａ， ｅｔ． ａｌ．， Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＦ−κＢ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｉｏｍａ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ５８：６８４−６８９ （１９９９）に報告されており、これも引用によって本明細書に包含される。
【００２６】
上記実施例を改変しても、本発明の精神を逸脱しないことは理解されよう。また、各実施例はそれぞれ単独でまたは相互に組み合わせて実施できることも理解されよう。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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