(57)【要約】本発明は転移性腫瘍細胞の同定及び治療のための方法に関する。更に本発明は潜在的に転移性であるヒトの細胞及び／又は組織を同定するため腫瘍マーカーとして使用するため、及び癌疾患の治療のための転移特異的な遺伝子のｃＤＮＡ集団に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性腫瘍細胞の同定方法において、図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択される少なくとも１種のｃＤＮＡ配列又はそれらから導かれる完全な遺伝子配列、その機能的遺伝子断片又はそれらのホモログ又はアレルを腫瘍組織とのハイブリダイゼーションのために使用することを特徴とする転移性腫瘍細胞の同定方法。
【請求項２】
図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡ配列が膵臓腫瘍組織の転移に関与し、かつ／又は図Ａによる集団から選択されるｃＤＮＡ配列が胸部腫瘍組織の転移に関与している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
図ＣによるｃＤＮＡ配列がヒトの胸部腫瘍組織及び／又は大腸腫瘍組織の転移に関与している、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
腫瘍治療のための化合物の同定方法において、
ａ）図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡの少なくとも１種から導かれる転移特異的遺伝子配列をヒトではないホニュウ類動物細胞中で発現させ、
ｂ）化学的、生物学的及び／又は製薬学的に活性な化合物を前記の細胞と一緒にインキュベートし、
ｃ）腫瘍転移に関連する遺伝子の発現に対して、又はこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性に対して調節作用を示す化合物を選択する
ことを特徴とする腫瘍治療のための化合物の同定方法。
【請求項５】
図Ａ及び／又は図ＢによるｃＤＮＡ配列に由来する腫瘍転移に関連する遺伝子の少なくとも１種並びに少なくとも１種の化学的、生物学的及び／又は製薬学的に活性な化合物を含有する、腫瘍治療のための化合物を同定するための測定系。
【請求項６】
図Ａ及び／又は図ＢによるｃＤＮＡ配列に由来する遺伝子によってコードされる腫瘍転移に関連する少なくとも１種のタンパク質並びに少なくとも１種の化学的、生物学的及び／又は製薬学的に活性な化合物を含有する、請求項５記載の測定系。
【請求項７】
請求項４記載の方法によるか、又は請求項５又は６に記載の測定系を用いて同定される化合物。
【請求項８】
図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡ配列又はそれから導かれる完全な遺伝子配列、機能的な遺伝子断片、それらのホモログ又はアレルから選択される、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法又は請求項５又は６に記載の測定系において使用するためのｃＤＮＡ配列。
【請求項９】
請求項８記載の少なくとも１種のｃＤＮＡ配列を使用して製造される遺伝子生成物。
【請求項１０】
請求項８記載の少なくとも１種のｃＤＮＡ配列又は請求項９記載の少なくとも１種の遺伝子生成物を含有する遺伝的に改変されたヒトではないホニュウ類動物細胞。
【請求項１１】
請求項８記載の少なくとも１種のｃＤＮＡ配列又は請求項９記載の遺伝子生成物を使用して製造される、請求項９記載の遺伝子生成物に特異的に結合させるための抗体。
【請求項１２】
腫瘍組織と特異的にハイブリダイゼーションさせるためのプローブにおいて、これを請求項８記載の少なくとも１種のｃＤＮＡ配列から出発して製造し、検出のために適当な標識を有し、かつ／又は３０ヌクレオチド長、有利には１５〜２０ヌクレオチド長、特に有利には１０ヌクレオチド長であることを特徴とする腫瘍組織と特異的にハイブリダイゼーションさせるためのプローブ。
【請求項１３】
請求項８記載の少なくとも１種のｃＤＮＡ配列、請求項１２記載のプローブの製造のための手引き書並びに腫瘍組織からのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション及び検出のための手引き書を有する試験キット。
【請求項１４】
癌疾患の治療のための医薬品の製造のための、請求項７記載の化合物の使用。
【請求項１５】
癌疾患の治療のための医薬品の製造のための、請求項１１記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は転移性腫瘍細胞の同定方法並びに腫瘍の治療のための化合物の同定に関する。
【０００２】
細胞増殖又は器官形成は高等動物においては複雑に分化的な遺伝子発現によって制御される。特に腫瘍細胞の発生に関与する分子機構の解明は、多大な医学的意義に基づいて重要な調査の対象である。
【０００３】
しかしながら、原発腫瘍組織からの侵襲性の腫瘍の発生（転移形成）に関与しているプロセスはあまりよく調査されていない。腫瘍が侵襲性になりうるためには幾つかの基本的な必要条件を満たさねばならないことは公知である。これは、細胞の微小環境の変化、すなわち細胞のタンパク質分解並びに付着特性及びマイグレーションの変化である。これまで腫瘍プログレッションの間に分化的に発現される僅かな数の遺伝子だけが同定されているにすぎない。例えば、幾つかのプロテアーゼ遺伝子、例えばｕＰａ又はマトリックス−メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が挙げられる（Ｍａｔｒｉｓｉａｎ Ｌ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ２４： ２１９−２５９及びＭａｔｒｉｓｉａｎ， Ｌ． Ｍ．， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ， １９９２， １４： ４５５−４６３）。付着特性に関しては、種々のインテグリン（Ｒｉｕｚ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ． Ａｄｈｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １： ６７−８１）又はいわゆるリンパ球ホーミング受容体ＣＤ４４が公知である（Ｐｏｎｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， １９９８， ３： ６５０−６５６）。
【０００４】
しかしながら転移過程に必要とされる遺伝子の大多数及び性質はまだ充分に知られていない。腫瘍プログレッションに関連するプロセスのより良い理解はできるだけ多数の転移特異的遺伝子を明確に同定するためには必要不可欠である。
【０００５】
更に、いままでに支持しうる費用及び充分な信頼性を伴って癌細胞状態及び腫瘍転移の可能性に関する証明を可能にする適当な系は提供されていなかった。
【０００６】
本発明の対象は、転移性の腫瘍細胞を同定するにあたり、マーカーとして、図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択される少なくとも１種のｃＤＮＡ配列又はそれから相応して導かれる完全な遺伝子配列又はその機能的断片、それらのホモログ又はアレルを腫瘍組織とのハイブリダイゼーションのために使用する方法である。
【０００７】
本発明はまた図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡ配列又はそれから相応して完全な遺伝子配列又はその機能的断片、それらのホモログ又はアレルから導かれる遺伝子生成物（ポリペプチド）を包含する。本発明によれば該遺伝子生成物には、改変されたアミノ酸配列を有するが、その機能において保証されているこれらのポリペプチドのアイソフォームも該当する。
【０００８】
更に本発明の対象は、前記のｃＤＮＡ配列の使用下に製造される前記の遺伝子生成物への特異的な結合を有する抗体及び／又はその遺伝子生成物である。
【０００９】
本発明によれば、完全な遺伝子配列はコーディングヌクレオチド配列の他に、該コーディング領域の前方及び後方に属する調節領域も含まれる。調節領域とは、機能的構造、例えばプロモーター、ターミネーター、目的配列又はターゲット配列、停滞シグナル（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｓｓｉｇｎａｌ）、翻訳増強因子、スプライスエレメント又はポリアデニル化シグナルを意味する。
【００１０】
機能的断片は、本発明によれば対応する全長のタンパク質の比活性を有する相応のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。更に機能的断片とは、本発明によればストリンジェントな条件下に特異的なハイブリダイゼーションシグナルをもたらすヌクレオチド配列を意味する。この場合には、機能的断片の長さは少なくとも１０ヌクレオチド乃至数百ヌクレオチドの範囲で変更できる。同様のことは、長さにおいて少なくとも１０〜２５０アミノ酸の範囲で変更できるコードされるタンパク質の機能的断片に関しても該当する。
【００１１】
ホモログとは、本発明によれば相補的な又は図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡ配列又はそれから導かれる完全な遺伝子配列又は機能的な遺伝子断片とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を意味する。ハイブリダイゼーションする配列は、ストリンジェントな条件下に本発明によるｃＤＮＡ配列と特異的に相互作用するＤＮＡ又はＲＮＡの群から選択される類似の配列を含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の有利な制限されない例は４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムバッファー（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、引き続いての６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄工程である。
【００１２】
アレルは、異なるヌクレオチド配列にもかかわらず望ましい機能を有するような配列である、従って機能的等価物である。機能的等価物は、従って本願に記載される配列の自然発生性の変異体並びに人工的な、例えば化学合成により得られるその生物のコドン利用に適合されたヌクレオチド配列を包含する。機能的等価物（アレル）とは、特に腫瘍転移に関連するポリペプチドをコードし、更に望ましい機能を示す、本来単離された遺伝子配列又はその対応する完全な遺伝子配列の天然又は人工的な突然変異又はそれらのホモログを意味する。突然変異は、１つ以上のヌクレオチド前記の置換、付加、欠失、交換又は挿入を含む。突然変異は遺伝子の調節領域の機能的な改変と同様に、その活性において改変されたタンパク質も引き起こす。
【００１３】
従って例えば、本発明によるｃＤＮＡ配列又はそれらの完全な遺伝子配列、それらの機能的断片又はそれらのホモログの修飾によって得られるかかるヌクレオチド配列は一緒に本発明によって包含される。かかる修飾の目的は、例えばコーディング配列の局在化又は例えば更なる制限酵素切断部位の挿入であってよい。機能的等価物は、調節領域が改変され、それによって例えば遺伝子発現が出発遺伝子もしくは出発断片と比較して弱められている又は強められている変異体でもある。
【００１４】
本発明によれば、転移特異的なポリペプチド又はそれらのアイソフォームをコードするヌクレオチド配列は天然の、化学的に合成された、改変された又は人工的に作成されたヌクレオチド配列であってよい。更に前記のヌクレオチド配列は異種のヌクレオチド配列並びに前記のヌクレオチド配列の混合物からなってよい。更に機能的に等価な配列は、改変されたヌクレオチド配列を有し、これらによってコードされる遺伝子生成物に弱められているか又は強められていてよい変更された活性を与えるような配列を含む。
【００１５】
更に人工的なヌクレオチド配列は、前記に記載のように該配列が望ましい特性をもたらす限りは本発明の対象である。かかる人工的なヌクレオチド配列は、例えば分子モデリングによって構築されたタンパク質の“逆翻訳”又はインビトロ選択によって得ることができる。ヒトに特異的なコドン利用によるポリペプチド配列の逆翻訳によって得られるコーディングヌクレオチド配列が特に適当である。特異的なコドン利用は、遺伝子工学的方法に関して熟知した当業者は別の公知の遺伝子のコンピュータ評価によって容易に調査できる。
【００１６】
前記のｃＤＮＡの単離は、本発明によればラットの定義された腺癌から行われる。本発明の有利な実施形においては、該系はラット腫瘍系１３７６２ＮＦ（Ｍａｍｍａ−Ｋａｒｚｉｎｏｍ； Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， ＪＮＣＩ， １９８２， Ｖｏｌ． ６８（３）， ５０７−５１７）である。転移性でない細胞系統としては細胞系統ＭＴＰが選択される。転移性細胞系統は本発明によれば細胞系統ＭＴＬＹによって表される。他の本発明により有利な系は細胞系統１ＡＳもしくは１０ＡＳ及びＡＳＭＬを有するラット−膵臓癌系Ｂｓｐ７３である（Ｍａｔｚｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ， １９８３， （３）： １０９−１２３）。ラット−膵臓癌系のための例としては、細胞系統Ｇ−亜系もしくはＡＴ−１、ＡＴ−３、ＭａｔＬｕ及びＭａｔＬｙＬｕが非転移性もしくは転移性の細胞系統として挙げられる（Ｉｓａａｃｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ， １９８９， （９）： ２６１−２８１）。しかしながらこの選定は本願について限られるものではなく、別の適当な細胞系統もしくは癌系の使用も含まれる。
【００１７】
ラット−細胞系統の使用の相応の利点は、転移性細胞がインビボでヒトの癌細胞と類似の転移挙動を示すことである（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， １９８１， ２８： ７３１−７３８； Ｍａｔｚｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ， １９８３： １０９−１２３）。更にこれらの細胞系統はヒトの腫瘍組織としてより容易に取り扱うことができる。定義されたラット細胞系統の使用は、ヒトの腫瘍組織に対して更に結果の高い再現性の利点を提供する。特にこの系においては細胞系統の遺伝的改変の可能性及び試験系における後天的なもしくは失われた特性の再調査の可能性が存在する。更に同質遺伝子動物への簡単な伝達が可能であり、他方ではヒトの腫瘍組織を、妨害する免疫応答に基づいて免疫不全の受容者の高価な人工的な系に変換せねばならなかった。更にヒトの乳癌細胞系統との幾らかのハイブリダイゼーションも行われた。例えば使用される細胞系統は、例えばクロスハイブリダイゼーションによって、使用される“ラット試料”がヒトの腫瘍材料の分析のために適当であることを示すためにＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｃａｉｌｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， １９７４， ６６１−６７４及びＣａｉｌｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ， １９７８（１４）： ９１１−９１５）などを使用した。
【００１８】
本発明によれば多数の、転移特異的な遺伝子の分化的に発現される転写物の同定は自体公知の方法により行われる。ここで特に稀な転写物の同定のために適当な分化分析ＳＳＨ（抑圧応答遺伝子差し引きハイブリダイゼーション（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）； Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９６， ９３： ６０２５−６０３０）並びにそれに引き続いて高い試料処理量及び高い信頼性を伴って不適当なポジティブクローン又は不適当なネガティブクローンを殆ど排除する効果的な後選択法が挙げられる（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．による、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７， ２５（１３）： ２５９８−２６０２）。転移性の腫瘍細胞を同定するために選択されたｃＤＮＡクローンの本発明による転移特異的な発現の測定のための更なる選択法としては、本発明に制限をもたらさないノーザンブロット分析及びＲＴ−ＰＣＲ分析が挙げられる。
【００１９】
本発明による方法の特定の変法は更に以下の工程：
Ａ）全ｍＲＮＡ集団から出発して転移性及び非転移性の腫瘍細胞からのＰＣＲに基づくサブトラクティブｃＤＮＡ遺伝子バンクの作成、
Ｂ）各ｃＤＮＡ配列が個々の（潜在的に）転移特異的な遺伝子を表す種々のｃＤＮＡクローンの集団の同定、
Ｃ）これらのｃＤＮＡクローンをベースとする完全な遺伝子配列の作成、
Ｄ）前記のｃＤＮＡ集団又はそれらから相応して導かれる遺伝子配列、特に図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択される少なくとも１種の配列から出発する“センス”ＲＮＡプローブ及び“アンチセンス”ＲＮＡプローブの作成、
Ｅ）調査されるべき腫瘍材料の適当な薄層調製物の製造、
Ｆ）調査されるべき腫瘍材料と前記の“センス”ＲＮＡプローブ及び“アンチセンス”ＲＮＡプローブとのインサイチューハイブリダイゼーション、及び
Ｇ）ポジティブなハイブリダイゼーション生成物の検出による転移性の腫瘍細胞の同定
を含む。
【００２０】
本発明の他の実施変法において、腫瘍細胞の転移に関連するマーカー遺伝子の同定は以下の工程：
ａ）全ｍＲＮＡ集団から出発して転移性及び非転移性の腫瘍細胞からのＰＣＲに基づくサブトラクティブｃＤＮＡ遺伝子バンクの作成、
ｂ）各ｃＤＮＡ配列が個々の（潜在的な）転移特異的な遺伝子を表す種々のｃＤＮＡクローンの集団の同定、
ｃ）これらのｃＤＮＡクローンをベースとする完全な遺伝子配列の作成、
ｄ）“センス”読み方向と同様に“アンチセンス”読み方向のいずれにおけるｃＤＮＡ遺伝子配列及び／又は完全な遺伝子配列の、発現ベクター中へのクローニング、
ｅ）ヒトではないホニュウ類細胞系統、有利にはラット細胞系統への前記ベクターの移送及び引き続いての発現、
ｆ）侵襲性の腫瘍の同定による、工程ｂ）で同定された遺伝子の腫瘍細胞の転移との関連性の確認
によって行われる。
【００２１】
更に本発明による転移性の腫瘍細胞の同定のための方法は、図Ｂによる集団から選択される少なくとも１種のｃＤＮＡ配列が膵臓腫瘍組織の転移に関連し、かつ図Ａによる集団から選択される少なくとも１種のｃＤＮＡ配列が乳癌組織の転移に関連していることに優れている。
【００２２】
本発明の主な特徴は、種々のｃＤＮＡクローン、相応して多数の種々の、すなわち個々の転移特異的な遺伝子を代表するｃＤＮＡクローンの極めて大規模な集団を提供することであるので、高い信頼性を伴って癌疾患の種々の臨床的な徴候形態の分子的類別を行うことができる。同様に、経過検査、すなわち種々の徴候形態の癌細胞段階に関する証明及び、特に調査されるべき腫瘍組織の転移可能性に関する証明を行うことができる。
【００２３】
従って本発明は多数の潜在的なマーカー配列、マーカー遺伝子及び／又は対応するタンパク質を侵襲性の腫瘍細胞及び／又は腫瘍組織もしくは高い転移能を有する細胞及び／又は組織の同定及び／又は治療のために提供する。
【００２４】
本発明の他の実施態様において、本発明による方法は、有利には図ＣによるｃＤＮＡ配列をマーカーとして転移性のヒトの胸部腫瘍組織及び／又は大腸腫瘍組織の同定のために適当であることに優れている。例えば、本願では特に図ＣにおいてＣＤ２４及びＳ７で示されており、かつヒトの腫瘍組織で最も良好なクロスハイブリダイゼーション結果を示す配列を指摘する。ＣＤ２４は、Ｂリンパ球及びＴリンパ球の成熟の間に生じる分化特異的タンパク質である（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｇ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４４： ６３８−６４１）。ＣＤ２４ｍＲＮＡを用いて、転移性のヒト大腸組織の検出が可能である。リボソームタンパク質Ｓ７の主要な役割は１６Ｓ−ＲＮＡを正確に折り畳むことである（Ｗｉｍｂｅｒｌｅｙ， Ｂ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ５： １１８７−１１９８）。従来ではＳ７の腫瘍プログレッションへの関与は知られていなかった。本発明はＳ７ｍＲＮＡを用いて転移性の胸部細胞組織のための新規の腫瘍マーカーを提供することである。侵襲性の胸部細胞癌から出発するリンパ節組織からの転移は両者の腫瘍マーカーの高められた発現によって示される。
【００２５】
異なる転移能を有する細胞系統における遺伝子の遺伝子発現及び腫瘍関連分子の比較は図Ｄに示されている。インサイチューハイブリダイゼーションの結果は図Ｅに示されている。
【００２６】
腫瘍組織の転移に関連するｃＤＮＡクローンの本発明により明らかな同定は、完全な遺伝子の広範囲のクローニングと同様に、ヒトにおいて転移性の表現型の顕現に関連する遺伝子の機能的な分析も可能にする。これは同時に、多数の転移特異的な調節配列を調査する可能性をもたらす。得られた認識は、特に腫瘍転移のための分子的調節メカニズムを更に明らかにする際に非常に役立つ。
【００２７】
本発明の認識は、更に癌疾患のより良好な診断のために適当であり、特に腫瘍細胞段階の類別及び引き続いての効果的な治療可能性の診断のために適当である。腫瘍疾患を治療するために、前記に挙げたｃＤＮＡ配列から出発して相補的な（“アンチセンス”）ｍＲＮＡ配列、特に短いオリゴヌクレオチドを導き、かつこれらの“アンチセンス”ｍＲＮＡ配列を腫瘍細胞に導入することによって転移特異的な遺伝子の発現を転写後に低下又は阻止することが考えられる。更に翻訳後のレベルで物質又はリガンドを転移特異的なポリペプチドに特異的に結合させることによって該ポリペプチドをその機能において阻害又は遮断し、かつ腫瘍転移を低下又は阻止する腫瘍疾患の治療が考えられる。
【００２８】
更に本発明は、腫瘍治療のための化合物を同定するにあたり、図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡの少なくとも１種から導かれる転移特異的な遺伝子配列を、ヒトではないホニュウ類動物細胞、例えばラット細胞系統において発現させ、化学的、生物学的及び／又は製薬学的に活性な化合物、例えばタンパク質、ペプチド又は低分子化合物を前記の細胞と一緒にインキュベートし、かつ引き続き腫瘍転移に関連する遺伝子の発現に関して又は該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性に関して変更された作用を示す化合物を選択する方法に関する。これらの化合物から出発して、腫瘍治療のために使用できる医薬品の製造が考えられる。
【００２９】
変更された作用とは、本発明によれば強化又は減衰を意味する。これに関しては、本発明によれば細胞表面上での調節的相互作用の他に細胞内での相互阻害も含む。
【００３０】
本発明によればヒトではないホニュウ類動物細胞における転移特異的な遺伝子配列の導入及び発現は、例えば図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡ配列から導かれる少なくとも１つの本発明による遺伝子配列、完全な遺伝子配列又はその機能的断片、例えばコーディング配列、更に調節ヌクレオチド配列、特にプロモーター、ターミネーター、目的（ターゲット）配列、停滞シグナル及び翻訳増強因子の群からの調節ヌクレオチド配列、スプライスエレメント、ポリアデニル化シグナル又は耐性を付与するヌクレオチド配列並びに相応の目的細胞中での複製又はゲノムへの組み込みのためのヌクレオチド配列を有する適当な組み換えベクターを用いて行うことができる。
【００３１】
更に本発明の対象は、図Ａ及び／又は図ＢによるｃＤＮＡ配列又はそのアレル又はホモログに由来する腫瘍転移に関連する少なくとも１つの遺伝子並びに少なくとも１種の化学的、生物学的及び／又は製薬学的に活性な化合物を有する腫瘍治療のための化合物の同定のための測定系である。
【００３２】
本発明による測定系は広範囲の調節研究及び結合研究を実施する可能性を提供し、第１の対象によって、そのどちらか及び場合によりどの範囲において該化合物が遺伝子発現に対して効果を発揮するか、すなわち発現を減衰又は強化することを確認できる。本発明により使用される測定系は、例えばヒトではないホニュウ類動物細胞、有利には定義されたラット細胞系統であってよい。
【００３３】
本発明の他の変法は、図Ａ及び／又は図ＢによるｃＤＮＡ配列に由来する遺伝子配列又はそのホモログによってコードされる腫瘍転移に関連する少なくとも１種のタンパク質又はそれらのアイソフォーム並びに化学的、生物学的及び／又は製薬学的に活性な化合物を含有する測定系に関する。また本発明による測定系は、広範囲の調節研究及び結合研究を実施する可能性を提供し、第１の対象によって、そのどちらか及び場合によりどの範囲において該化合物が腫瘍転移に関連するタンパク質に結合し、かつ該タンパク質はその活性において変化する、すなわち減衰又は強化することを確認できる。
【００３４】
更にその化合物自体が本発明の対象であり、かつ／又は腫瘍疾患の治療のための、前記の方法により又は前記の測定系を用いて同定された化合物を含有する医薬品の製造のためのその使用が本発明の対象である。
【００３５】
更に本発明は、前記の方法又は測定系における使用のための図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡ配列又はそれらから導かれる完全な遺伝子配列、そのホモログ又は機能的に等価な配列である。これはまた本発明によるｃＤＮＡ配列の混合物の使用も包含する。
【００３６】
本発明の対象は、本発明によるｃＤＮＡ配列を使用して製造され、又はそれらから導くことができる遺伝子生成物（ポリペプチド）である。
【００３７】
同様に、図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択される少なくとも１種の本発明によるｃＤＮＡ又はそれらから導かれる完全な配列、機能的断片、そのホモログ又はアレル又は前記の種類の組み換えベクター又は前記に挙げた種類の遺伝子生成物を含有する遺伝的に改変されたヒトではないホニュウ類動物細胞も本発明の対象である。
【００３８】
本発明は更に前記の本発明による遺伝子生成物に特異的に結合する抗体を含み、その際、これらの抗体は本発明によるｃＤＮＡ配列及び／又は遺伝子生成物を使用して製造できる。
【００３９】
更に本発明によれば、腫瘍組織との特異的なハイブリダイゼーションのためのプローブが使用され、その際、該プローブは図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択されるｃＤＮＡ配列又はこれらから導かれる完全な遺伝子配列、そのホモログ又は機能的に等価な配列から出発して製造され、検出のために適当な、有利には非放射性標識を有し、かつ／又は３０ヌクレオチド長、有利には１５〜２０ヌクレオチド長、特に有利には１０ヌクレオチド長である。
【００４０】
更に図Ａ及び／又は図Ｂによる集団から選択される少なくとも１種のｃＤＮＡ配列又はこれらから導かれる完全な遺伝子配列、その機能的遺伝子断片又はそのホモログ又はアレル、前記のプローブの製造のための手引き書及び腫瘍組織からのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション及び検出のための手引き書を有する試験キットが本発明の対象である。複数の関連のｃＤＮＡ配列の混合物の使用が有利である。
【００４１】
更に本発明は、本発明による方法及び／又は本発明による測定系により同定される腫瘍治療のために使用できる医薬品の製造のための化合物の使用に関する。同様に本発明は腫瘍治療のために使用できる医薬品の製造のための本発明による抗体の使用を包含する。更に本発明によるｃＤＮＡ配列、遺伝子生成物、抗体及び／又はその一部及び／又は腫瘍転移の発生に関連する化合物が腫瘍転移診断及び／又は腫瘍転移治療の範囲で使用するために適当である。これは、例えば腫瘍診断の範囲においてヒト由来の更なる転移−腫瘍マーカーの同定を包含する。
【００４２】
本発明を、以下の実施例によって詳細に特徴付けるが、これらは本発明に制限をもたらすものではない：
一般的方法
核酸の単離及び分析、一般的なクローニング技術、ＤＮＡ配列決定、ＲＮＡ技術、核酸の移行及びハイブリダイゼーションのための方法は、一般的な細胞培養のための方法様式及び組織学的技術と同様にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００４３】
分化的に発現された遺伝子のサブトラクティブクローニング（ＳＳＨ）
いわゆる抑圧応答遺伝子差し引きハイブリダイゼーション（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の原理による分化的なｃＤＮＡバンク（サブトラクションバンク）の作成はＤｉａｔｃｈｅｎｋｏ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９３： ６０２５−６０３０に記載されている。サブトラクション反応はクロンテック社（Ｆｉｒｍａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＵＳＡ）のＣＬＯＮＴＥＣＨ−ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡサブトラクションキットを用いて製造者の指示に従って行った。
【００４４】
ラット細胞系統１３７６２の例のサブトラクションバンクのｃＤＮＡクローンの分析
サザンブロット分析によるサブトラクションの効率の調査のために、ドライバーのＭＴＰａの増幅されたＲｓａＩ断片を作成した。それというのも差し引かれたバンクＭＬはＲｓａＩ消化されたｃＤＮＡ断片であるからである。ＭＴＰａ−ｃＤＮＡのＲｓａＩ消化の後にアダプタ（Ｅｃｏリンカー）を該断片にライゲーションさせ、かつＳＳＨの第２のＰＣＲの条件により相応のＰＣＲプライマー（ＥｃｏＬｉｎｋｅｒプライマー）を用いて増幅させる。ＭＴＬＹはテスターフラクション１ｃ（ＳＳＨハンドブック参照）の形で使用した。
【００４５】
ＴＡベクターへのライゲーション
ＳＳＨの第２のＰＣＲサイクルのＰＣＲ生成物のライゲーションをＴＡベクター（ｐＣＲＩＩ．１、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で行った。ｐＣＲ．ＩＩ．１−ベクターへのインサートのクローニングはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のコーディング配列を遮断するので、組み換えられたクローン（白色）は空のベクター（青色）とを区別できる。使用されるＴａｑポリメラーゼはプルーフリーディング活性を有するので、ＰＣＲ生成物を先立つフェノール／クロロホルム抽出の後に該ＰＣＲ生成物を更なる段階において７２℃で１５分間ｄＡＴＰ及び別のＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＥｕｒｏｂｉｏＴａｑポリメラーゼ）と一緒にインキュベートし、かつ再びフェノール／クロロホルム抽出を行うことが必要である。該ライゲーションは該ベクターに付加されるＴ４−ＤＮＡリガーゼ（インビトロゲン）によって比１：１（ベクター及び差し引かれたバンク２５ｎｇごとに）で行った。
【００４６】
電気的コンピテント化された細菌における形質転換及び青色／白色選別
ｐＣＲＩＩ．１ベクターにライゲーションされたバンクを電気的コンピテント化された細菌（ＥＬＥＫＴＲＯＭＡＸ， 菌株ＤＨ１０Ｂ、インビトロゲン）に形質転換し、かつ１５ｃｍの大きさの細菌シャーレにプレーティングした。該シャーレはＬＢアガーの他に選択抗生物質アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）並びに１００μＭのＩＰＴＧ及びＸ−Ｇａｌ（５０μｇ／ｍｌ）を青色／白色選別のために含有した。これらの細菌シャーレを小さなコロニーが確認できるまで３７℃でインキュベートした。白色及び青色のコロニーをより良好に調査するために、これらのプレートを引き続き４℃でインキュベートした。
【００４７】
クローンの採取及びコロニー−ＰＣＲ
１９８５個のクローンの全体数を青色／白色選別下に採取し、ＬＢ培地及びアンピシリン（１００μｇ／μｌ）を含有する滅菌９６ウェルマイクロタイタープレート中に移した。これらのプレート中の細菌を軽い振盪下に室温で１４時間洗浄した。コロニーＰＣＲの実施のために、多管ピペットを用いて各細菌培地１０μｌを取り、かつ９６ウェル−ＰＣＲプレートに移し、そこで各９０μｌの滅菌水と混合した。変性のために、これらのプレートをＰＣＲ機器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）中で９５℃において５分間インキュベートした。各溶解物５μｌを多管ピペットを用いて、それぞれ９０μｌのＰＣＲ混合物が装入されている第２の９６ウェル−ＰＣＲプレート中に移した。該ｃＤＮＡ断片をサブトラクションのネステッドプライマー１及び２を用いて増幅させた。
【００４８】
ＰＣＲ−混合物（５０μｌのバッチ）：
０．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ）、５μｌの１０×ＰＣＲ−バッファー（プロメガ）、２００μＭのｄＮＴＰ、各１０マイクロモルのサブトラクション反応のネステッドプライマー１及び２＋５μｌの細菌溶解物。
【００４９】
ＰＣＲ条件：
９４℃で３０秒−６８℃で３０秒−７２℃で３０秒。
【００５０】
リバース−ノーザンブロット分析
クローンが実際に分化的に発現されるｃＤＮＡ断片を有することの調査は、リバース−ノーザンブロット分析によって行われた。このために増幅されたｃＤＮＡ断片（コロニーＰＣＲ）を同一の配置で２つの高密度アガロースゲル（ＣｅｎｔｉｐｅｄｅＴＭ−ゲル電気泳動チャンバ， Ｏｗｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＵＳＡ）に施与した。ゲルあたり２×９６試料（２つのマイクロタイタープレート）を施与した。この場合、両者のゲルを正確に同一に負荷することがより非常に重要である。最後の場所において、それぞれ１つのＧＡＰＤＨコントロールをシグナル強度の後の定量のために施与した。アルカリ性ブロット（サザンブロット分析参照）の後に、膜レプリカを３２Ｐ標識されたテスター（ＭＴＬＹ）−ｃＤＮＡもしくはドライバー（ＭＴＰａ）−ｃＤＮＡ（それぞれＲｓａＩ消化されている）とハイブリダイゼーションさせ、かつオートラジオグラフィーで評価した。
【００５１】
単離されたｃＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションプローブの作成
該ｃＤＮＡ断片をプローブ作成のためにコロニーＰＣＲの原理に従ってサブトラクションのネステッドプライマー１及び２を用いて相応の細菌クローンから増幅させた。
【００５２】
ＰＣＲ混合物（５０μｌバッチ）：
０．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ）、５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（プロメガ）、２００μＭのｄＮＴＰ、それぞれ１０マイクロモルのサブトラクション反応のネステッドプライマー１及び２＋５μｌの細菌溶解物。
【００５３】
ＰＣＲ条件：
９４℃で３０秒−６８℃で３０秒−７２℃で３０秒。
【００５４】
得られた分化的に発現されるｃＤＮＡ断片の結果を図Ａ及び図Ｂにまとめる。その際、図Ａは乳癌特異的ライブラリ（ＭＬＳＳＨ）からのｃＤＮＡ断片を表し、かつ図Ｂは膵臓特異的ライブラリ（ＰＬＳＳＨ）からのｃＤＮＡ断片を表す。
【００５５】
図面の記載
図Ａ：
抑圧応答遺伝子差し引きハイブリダイゼーションによって得られる乳癌特異的ライブラリ（ＭＬＳＳＨ）のｃＤＮＡ配列の一覧
図Ｂ：
抑圧応答遺伝子差し引きハイブリダイゼーションによって得られる膵臓特異的ライブラリ（ＰＬＳＳＨ）のｃＤＮＡ配列の一覧
図Ｃ：
侵襲性のヒトの胸部腫瘍組織及び／又は大腸腫瘍組織のための腫瘍マーカーとしてのＣＤ２４及びＳ７のｃＤＮＡ配列
図Ｄ：
種々の転移能を有する細胞系統における新規遺伝子の遺伝子発現及び腫瘍関連分子の比較。該図面は４つの種々のラット腫瘍系及び２つのヒトの乳癌細胞系統のノーザンブロットからなる。ペアＭＮ０８１／ＭＴ４５０の他に、全ての使用される腫瘍系は原発腫瘍に由来しかつその転移能力において異なるクローン細胞系統からなる。この転移能は示されている。ノーザンブロットの各レーンを２μｇのポリ−Ａ＋ＲＮＡでそれぞれ負荷した。これらのブロットを種々の分化的に発現される、ＭＬＳＳＨ及びＰＬＳＳＨサブトラクションバンク（スクリーニング）において単離されたｃＤＮＡとハイブリダイゼーションした。使用されるハイブリダイゼーションプローブは偶然にも、ＭＬＳＳＨ及びＰＬＳＳＨスクリーンで単離された転移特異的遺伝子から選択された。これらはそれぞれの場合において単離された遺伝子の１０％を表す。おおまかな分類（相関指数）は遺伝子の発現及び調査される細胞系統の転移能の間の相関で記載される。発現が全ての転移性細胞系統において高く調節され、かつ全ての非転移性の細胞において存在しないか、もしくは大きく低減されている遺伝子を＋＋＋で示した。明らかに分化的であるが、主に転移性細胞において発現されない遺伝子を＋＋又は＋で、転移能との発現の相関の強度に依存して示した。幾つかのクローンの発現は１つだけの腫瘍プログレッションモデルにおいて転移能との強い相関を示した。
【００５６】
図Ｅ：
インサイチューハイブリダイゼーション。ホルムアルデヒド固定され、かつパラフィン埋設されたヒトの癌腫の切片（６μｍ）を３５Ｓ−ＵＴＰ又は蛍光標識された“センス”及び“アンチセンス”ＲＮＡとハイブリダイゼーションさせ、かつ引き続きヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ及びＥ）で染色した。これらの癌腫をＵＩＣＣの方針に相応して評価した。これらの尺度は１００μｍ（ａ，ｂ，ｅ，ｆ）、４０μｍ（ｃ，ｄ）及び２０μｍ（ｇ，ｈ）である。
【００５７】
ａ−ｂ（ａ、“センス”コントロール；ｂ、“アンチセンス”放射線標識されたＣＤ２４プローブ）：
適度に分化された大腸の腺癌におけるＣＤ２４発現をｐＴ３Ｃ；ｐ２１；ｐＮＯ；ｐＭ１として評価する。この切片は導管内の癌腫細胞における重大なＣＤ２４過剰発現を示す（細胞質における局在化）が、非腫瘍性粘膜は弱くポジティブであるにすぎない（一定の基礎的な発現）。
【００５８】
ｃ−ｄ（ｃ、“センス”コントロール；ｄ、“アンチセンス”放射線標識されたＣＤ２４プローブ）：
適度に侵襲性の導管内の、適度に分化された乳癌におけるＣＤ２４発現をｐＴ２；ｐＮ１ｂｉｉとして評価する。ポジティブなシグナルは癌腫において検出できるが、周辺の間質においては検出できなかった。
【００５９】
ｅ−ｆ（ｅ，“センス”コントロール；ｆ、“アンチセンス”放射線標識されたＳ７プローブ）：
適度に分化された大腸の腺癌におけるＳ７発現をｐＴ３Ｃ；ｐ２１；ｐＮＯ；ｐＭ１として評価する。該切片は癌腫において重大なＳ７過剰発現（核における優勢的な局在化）を示すが、非腫瘍性粘膜においては非常に弱い発現を示す。
【００６０】
ｈ−ｇ（ｈ、“センス”コントロール；ｇ、“アンチセンス”蛍光標識されたＳ７プローブ）：
僅かに分化された侵襲性の導管内の乳癌におけるＳ７の発現をＰＴ−１Ｃ；Ｇ３、Ｎ−１Ｂ１又はＩ、Ｒ−Ｏ、Ｌ−１として評価する。強い核のシグナルが導管内癌腫において確認されるが、間質においてシグナルは殆ど観察されなかった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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