(57)【要約】本発明は、ペプチドをＸａａ−Ｐｒｏ配列で認識して切断するペプチダーゼを投与することによって鼻炎または副鼻腔炎に関連した粘膜炎症を治療する方法に向けられる。さらに、本発明には前記ペプチダーゼを含有する医薬組成物を鼻腔内から送達する薬剤に適した装置に予め装填した治療用包装物が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鼻炎、副鼻腔炎またはその両方に関連した粘膜炎症の患者を治療する方法であって、前記患者に治療有効量のＸａａ−Ｐｒｏ配列を切断するペプチダーゼを鼻腔内投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶ、休止細胞プロリンジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ８およびアトラクチンから成る群から選択されたエキソペプチダーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エキソペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エキソペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼ８であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記エキソペプチダーゼは休止細胞プロリンジペプチダーゼであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記エキソペプチダーゼはアトラクチンであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記エキソペプチダーゼを１μｇと１ｍｇの間の用量で投与することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記鼻炎、副鼻腔炎またはその両方はアレルギーまたは喘息の結果であることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｘａａ−Ｐｒｏ配列で切断するペプチダーゼを含む溶液または粉末を予め装填した、患者の鼻腔内から薬剤を送達するための装置を含むことを特徴とする治療用包装物。
【請求項１０】
前記ペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶ、休止細胞プロリンジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ８およびアトラクチンから成る群から選択されたエキソペプチダーゼであることを特徴とする請求項９に記載の治療用包装物。
【請求項１１】
前記エキソペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶであることを特徴とする請求項９に記載の治療用包装物。
【請求項１２】
前記エキソペプチダーゼは休止細胞プロリンジペプチダーゼであることを特徴とする請求項９に記載の治療用包装物。
【請求項１３】
前記エキソペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼ８であることを特徴とする請求項１０に記載の治療用包装物。
【請求項１４】
前記エキソペプチダーゼはアトラクチンであることを特徴とする請求項９に記載の治療用包装物。
【請求項１５】
前記エキソペプチダーゼが１μｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で溶液中に存在することを特徴とする請求項１０に記載の治療用包装物。
【請求項１６】
鼻炎、副鼻腔炎またはその両方に関連した粘膜炎症の患者の治療方法であって、前記患者に治療有効量の、ＳＰのＮＫ１受容体への結合を阻害する薬剤を鼻腔内投与することを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者に鼻腔内からペプチダーゼを送達することによって鼻炎または副鼻腔炎に関連した炎症を治療する方法を指向する。本発明はまた、鼻腔内に薬剤を送達するために設計された器具にペプチダーゼを予め装填した治療包装物を含む。
【背景技術】
【０００２】
鼻炎、すなわち鼻の粘膜の炎症は、くしゃみ、鼻漏、鼻づまり、および鼻分泌物の増加により特徴づけられる。これには、副鼻腔炎、すなわち副鼻腔の炎症を伴うことも多い。これらの症状が３週間を超えて続くと、「慢性」と称する。３７００万人を超えるアメリカ人、特にアレルギーまたは喘息の人はこれらの症状を患っており、米国において最も一般的な慢性的な健康上の問題となっている。
【０００３】
慢性「鼻副鼻腔症」または副鼻腔炎は、完全に治療することが困難である。治療は一般的に、抗生物質と鬱血除去剤または抗ヒスタミン剤の組み合わせから成る。さらに、炎症を抑えるために通常ステロイドの鼻腔内噴霧が使用される。重症の慢性副鼻腔炎患者には、経口ステロイド、たとえばプレドニゾンもまた処方することができる。しかし、ステロイド投与の長期安全性は、特に子供については完全に理解されておらず、経口ステロイドは重大な副作用を伴うことが多い。薬剤治療では不十分な場合、唯一の他の方法は通常手術である。
【０００４】
【特許文献１】
米国特許第６０５４４６２号明細書
【特許文献２】
米国特許第４９４６８７０号明細書
【特許文献３】
米国特許第５８９７８５８号明細書
【特許文献４】
米国特許第４４７６１１６号明細書
【特許文献５】
米国特許第６１４５７０３号明細書
【特許文献６】
国際公開第９５／００１９５号パンフレット
【特許文献７】
米国特許第５３０７９５３号明細書
【特許文献８】
欧州特許出願公開第０３８８６５１号明細書
【特許文献９】
米国特許第４０１７００７号明細書
【特許文献１０】
米国特許第５３０１８４６号明細書
【特許文献１１】
米国特許第３１７６８８３号明細書
【特許文献１２】
米国特許第４２８６７３５号明細書
【非特許文献１】
Alving, et al., Cell Tissue Res. 264:529-538 (1991)
【非特許文献２】
Saria, et al., Am. Rev. Respir. Dis. 147:1330-1335 (1988)
【非特許文献３】
Stead, et al., Immunol. Rev. 10:333-359 (1987)
【非特許文献４】
Mygind, et al., Eur. J. Respir. Dis. 64(S128):1-379 (1983)
【非特許文献５】
Lundblad, et al., Acta. Physiol. Scand. 529:1-42 (1984)
【非特許文献６】
Mentlein, et al., Regul. Peptides 49:133-144 (1993)
【非特許文献７】
Heymann, et al., FEBS Lett. 91:360-364 (1978)
【非特許文献８】
Beauvais, et al., Fum. Infect. Immun. 65:3042-3047 (1997)
【非特許文献９】
Underwood, et al., J. Biol. Chem. 274:34053-34058 (1999)
【非特許文献１０】
Abbott, et al., Eur. J. Biochem. 267:6140-6150 (2000)
【非特許文献１１】
Duke-Cohan, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S. A. 95:11336-11341 (1998)
【非特許文献１２】
Misumi, et al., Biochim. Biophys. Acta 15:1131 (1992)
【非特許文献１３】
Darmoul, et al., J. Biol. Chem. 267:4824-4833 (1992)
【非特許文献１４】
Abbott, et al., Immunogenetics 40:331-338 (1994)
【非特許文献１５】
Nagase, et al., DNA Res. 5:31-39 (1998)
【非特許文献１６】
Remington's Pharmaceutical Science, 16th ed. A. Oslo Editor, Easton Pa (1989)
【非特許文献１７】
Clin. Chim. Acta 195: 125-132 (1990)
【非特許文献１８】
Acta Physiol. Scand. 136:1-63 (1989)
【非特許文献１９】
Alving, Acta. Physiol. Scand. 597:1-64 (1991)
【非特許文献２０】
Alving, et al., Acta. Physiol. Scand. 138:49-60 (1990)
【非特許文献２１】
Tani, et al., Neurosci. Lett. 115:171-176 (1990)
【非特許文献２２】
Hua,et al., Neurosci. 19:313-319 (1986)
【非特許文献２３】
Stjarne, et al., Regul. Pept. 33:251-262 (1991)
【非特許文献２４】
Svensson, et al., J. Allergy Clin. Immunol. 85:828-833 (1990)
【非特許文献２５】
Hua, et al., Can. J. Physiol., Pharmacol. 73:999-1006 (1995)
【非特許文献２６】
Vasco, et al., J. Neurosci. 14:4987-4997 (1994)
【非特許文献２７】
Sannes, J. Histochem. Cytochem. 31:684-690 (1983)
【非特許文献２８】
Van. Der. Elden, et al., Clin. Exp. Allergy 28:110-120 (1998)
【非特許文献２９】
J. Allergy Clin. Immunol. 4 pt1:646-652 (1992)
【非特許文献３０】
Sakurada, et al., J. Pharm. Sci. 88: 1127-1132 (1999)
【非特許文献３１】
Nakata, et al., J. Neurochem. 37:1529-1534 (1981)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
鼻および副鼻腔路の内側を覆う粘膜組織には感覚ニューロンが密集している（非特許文献１、２）。活性化されると、これらのニューロンは様々な生体活性ペプチドを放出し、これらは血管拡張を引き起こし、粘膜の腺分泌を刺激し、炎症性肥満細胞、リンパ球および好酸球による浸潤を促進することによって炎症の一因となる（非特許文献３、４）。放出される生体活性ペプチドの中には、サブスタンスＰ、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、神経ペプチドＹおよび血管作用性腸ペプチドが含まれる（非特許文献５）。これらのペプチドの活性を制御する手段により、鼻炎および副鼻腔炎の両方に関連した炎症の有効な治療がもたらされるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、すなわちポリペプチドのＮ末端からＸａａ−Ｐｒｏジペプチドを切断するエキソペプチダーゼが炎症に反比例したレベルでヒト鼻粘膜に存在するという発見に由来する。したがって、低レベルのジペプチジルペプチダーゼＩＶは、高密度の炎症細胞と関連し、高レベルのジペプチジルペプチダーゼＩＶは、低密度の炎症細胞と関連する。ジペプチジルペプチダーゼＩＶは鼻炎、副鼻腔炎および喘息の病態生理に寄与するペプチドを分解するので、このことは重要である（非特許文献６、７、８）。炎症に関連するペプチドの中で、ＮＰＹ、ＳＰ、およびｄｅｓＡｒｇ１ブラジキニンが切断される。これらの観察および他の実験に基づいて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを鼻腔内投与すると鼻腔および副鼻腔の両方を覆う粘膜組織の炎症を減少させることができるという考えが出された。同様の蛋白質分解活性を有するその他のプロテアーゼもまた、陽性の治療効果をもたらすであろう。これらのプロテアーゼには、休止細胞プロリンジペプチダーゼ（非特許文献９）、ジペプチジルペプチダーゼ８（非特許文献１０）、およびアトラクチン（非特許文献１１）が含まれる。
第１の態様では、本発明は患者の鼻粘膜または副鼻腔粘膜の炎症の治療方法を指向する。この方法には、Ｘａａ−Ｐｒｏ残基（Ｘａａは動物に通常見いだされる２０個のアミノ酸のいずれかを表す）で切断するペプチダーゼ（好ましくはエキソペプチダーゼ）を治療有効量鼻腔内に投与することが含まれる。「治療有効」用量とは、粘膜組織の炎症細胞数を減少させるか、または炎症に関連した１種または複数の症状を有意に改善させるということからわかるような炎症の有意な減少を生じさせるために十分な量と定義する。たとえば、鼻炎または副鼻腔炎の場合、治療有効量はくしゃみ、咳、鼻炎に関連した頭痛、鼻づまり、粘膜分泌、またはその他のこれらの症状に関連した不快感の有意な減少を生じさせるために十分な量である。炎症細胞には肥満細胞、リンパ球および好酸球が含まれる。一般的に、使用したプロテアーゼはいずれも、治療有効量は１マイクログラムと１ミリグラムとの間であり、典型的には５マイクログラムと５００マイクログラムとの間であることが予測される。
【０００７】
この方法で使用する好ましいペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶである。使用できるその他のペプチダーゼには、休止細胞プロリンジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ８、およびアトラクチンが含まれる。いずれの場合も、好ましいのはヒト型のペプチダーゼである。しかし、Ｘａａ−Ｐｒｏ配列を切断する能力を有するならば、その他の種から得られたペプチダーゼ（たとえば、アスペルギルス−フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  Ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）が分泌したもの、実施例項参照）もまた使用することができる。この方法はいずれかの疾患または症状によって引き起こされた鼻炎および副鼻腔炎に効果があるが、最も一般的な原因はアレルギーまたは喘息であることが予測される。
【０００８】
他の態様では、本発明は患者の鼻腔内に薬剤を送達するための器具に、１種または複数の前述のペプチダーゼを含有する溶液または粉末を予め装填した治療包装物を指向する。本発明は、いかなる鼻腔内送達器具（カプセル化剤形を含む）にも、鼻腔によって薬剤を送達するために記載された数々のいかなる組成物にも適合する。液体組成物を器具で使用するとき、ペプチダーゼは１μｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間の濃度、より典型的には１０μｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在することが予測される。
【０００９】
本発明はまた、ＳＰが肺および鼻粘膜の炎症を引き起こすのに特に重要であるという考えを含む。このペプチドの局所活性を低下させる任意の方法が、鼻炎または副鼻腔炎の治療に有用であろう。活性の低下は、ＳＰを分解するペプチダーゼ（たとえば、前述のペプチダーゼの１種）を使用するか、またはＳＰのＮＫ１受容体への結合を阻害する薬剤の投与（実施例項を参照）によって実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
Ａ．ペプチダーゼの調製
本発明は、Ｘａａ−Ｐｒｏ部位での切断を共通の特徴とするペプチダーゼを使用する治療方法を指向する。これらは、市販品を購入するか、関連文献に記載されたいずれかの手順を使用して得ることができる。たとえば、ペプチダーゼに対応する遺伝子を単離して、組換え蛋白質産生に使用することができる。特に好ましいペプチダーゼを、単離および組換え体産生に関連した文献と共に示すと、本明細書に配列番号１として示したヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶ（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）、本明細書に配列番号２として示したヒト休止細胞プロリンジペプチダーゼ（非特許文献９）、本明細書に配列番号３として示したヒトアトラクチン（非特許文献１１、非特許文献１５）、本明細書に配列番号４として示したヒトジペプチジルペプチダーゼ８（非特許文献１０）である。組換えによる産生に加えて、これらの蛋白質は当業界で周知の方法を使用して合成することができる。
【００１１】
Ｂ．医薬組成物の作製
鼻腔内に送達するためのペプチダーゼの組成物は、当業界で標準的な方法（非特許文献１６参照）に従って作製することができる。酵素は一般的に通常の賦形剤と混合して調製する。適切な担体には、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたは澱粉のような炭水化物、タルク、ヒドロキシメチルセルロースなどが含まれるが、これらに限定されない。医薬品調製物は、滅菌することができ、所望するならば、保存剤または安定剤などの補助剤と混合することができる。本発明は、鼻に送達するために当業界で開示された数々のいかなる組成物にも適合する。（たとえば、特許文献１、２、３、４参照）。存在するペプチダーゼの濃度は広範囲に変化させることができる。一般的に、液体調合物の場合、ペプチドは１μｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間の量、より一般的には１０μｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在させる。
【００１２】
治療方法
本発明は、鼻内または副鼻腔路を覆う粘膜に存在する炎症の治療方法を指向する。これは、炎症に関わることが知られているペプチドを蛋白質分解により分解するのに十分なペプチダーゼを直接投与することによる。患者に投与されるペプチダーゼの総用量は、少なくとも、炎症に関連する症状の減少または除去によって反映されるこの目的を実現するために必要な量である。たとえば、鼻副鼻腔炎を治療する患者には、鼻炎頭痛の頻度または強度を減少させるか除去し、咳、鼻づまり、くしゃみ、気道閉塞またはその他のこの症状に関連した不快感を減少させるために十分な化合物を投与する。
【００１３】
一般的に、患者は化合物を比較的少量、自己投与することから開始し、その後必要があれば繰り返し投与することができる。たとえば、患者は１日当たり０．１ｍｇの投与から開始し、次に炎症関連症状の変化を指標として使用して、より多く用量を増加させることができる。一般的に、患者に１日当たり１μｇと１ｍｇとの間、より一般的には５μｇと５００μｇとの間の一日用量を投与することが期待される。日用量は、単回または複数回で処方することができるが、後者が一般的に好ましい。実際的な用量は様々な臨床要素に基づいて患者および医師によって決定されるので、これらは簡単な指針である。
【００１４】
治療用包装物
前述の医薬組成物に加えて、本発明には、組成物を鼻腔内送達するための治療用包装物が含まれる。治療用包装物には、１種または複数の前述のペプチダーゼを含有する医薬組成物を予め装填した薬剤の鼻腔内吸入のために設計した器具が含まれる。一般的に、開示されたものなどの噴霧器具が好ましい（たとえば、特許文献５、６、７、８、９、１０、１１、１２）。粉末または鼻内用滴剤を投与するための器具もまた使用することができる。医薬組成物が溶液形態であるとき、ペプチダーゼは一般的に１μｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間の濃度、より一般的には１０μｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間の濃度で存在させる。
【実施例】
【００１５】
Ｉ．材料および方法
組換えジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）
アスペルギルス  フミガーツス（Ａｐｅｒｇｉｌｕｓ  Ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）から分泌された可溶型ＤＰＰＩＶは既に特徴づけられており、この実験で使用した（非特許文献８）。この酵素は９５ｋＤａの見かけ上の分子量を有する。これは酵母ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させ、電気泳動およびゲル濾過によって評価して９９％を超える純度まで精製し、比活性は４０単位／ｍｇ蛋白質に達していた。ＤＰＰＩＶ０．０１６μｇと一緒に３７℃で１０分間インキュベートしたＳＰ（１．８μｇ）は、質量分析によって同定されるようにＳＰ５〜１１に分解される。過剰のＳＰを添加すると（３．５μｇ）、ペプチドの部分的消化が認められる。
【００１６】
患者
１８ヶ月を超えて鼻づまり、鼻漏および頭痛に苦しんでいる４５人の患者（男性２３人、女性２２人）をこの研究に含めた。術前の鼻鏡検査によって中鼻甲介の水泡症を伴う中隔偏位が明らかになった。全患者に、全身麻酔下に内視鏡で制御しながら鼻中隔形成術および部分的中鼻甲介切除術を行った。患者の年齢範囲は１４才から６４才で、平均年齢は３９才であった。アレルギー、鼻ポリープ、または腫瘍の患者は除外した。
【００１７】
組織処理
部分的鼻甲介切除術を受けた患者の中鼻甲介粘膜の試料を、直ちに、フェニルメチルスルホニルフルオリド２ｍＭおよびヨードアセトアミド２０ｍＭを入れた氷冷アセトンで固定し、−２０℃で一晩インキュベートした。生検標本をグリコールメタクリレート樹脂に包埋し、４℃で一晩重合させた。
【００１８】
抗体
以下のモノクローナル抗体を使用した。１：２０に希釈した、ＤＰＰＩＶプロテアーゼに対するＣＤ２６（クローンＢＡ５、ＤＡＫＯ）、１：２０に希釈した、樹状細胞に対するＣＤ１Ａ（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）、１：２０に希釈した、内皮細胞上の接着分子ＰＥＣＡＭを認識するＣＤ３１（ＤＡＫＯ）、および１：２０に希釈した、Ｔ細胞に対するポリクローナル抗体ＣＤ３（ＤＡＫＯ）を使用した。
【００１９】
免疫組織化学染色
ガラスナイフを備えたＲｅｉｃｈｅｒｔ−ｕｎｇミクロトーム刀を使用して、厚さ２ｍｍの連続切片を切断した。免疫組織化学染色は、アミノエチル−カルバゾール（ＡＥＣ）を基質として用いるストレプトアビジン  ビオチン−ペルオキシダーゼ法を使用して実施した。
【００２０】
鼻生検の炎症および症状の強度の定量
両側の中鼻甲介粘膜試料（Ｎ＝９０）をホルムアルデヒドで固定し、脱水し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン−エオジンによって染色した。次に、ツァイス顕微鏡で４０倍の倍率で調べた。組織学的分析には、疑似成層化された円柱上皮の完全性の確認、浮腫の有無の注意、粘膜下組織内の炎症細胞の数の定量が含まれた。これは、０から＋＋＋の等級分けした尺度を使用して実施し、０は炎症細胞がないことを意味し、＋＋＋は炎症細胞が豊富であることを示す。スピアマンの順位相関試験を使用して、ＤＰＰＩＶと鼻粘膜の炎症程度との相関を調べた。鼻づまり、鼻漏および頭痛の強度は、視覚による０から５までの等級のアナログ尺度によって記録し、０は症状がないことに対応し、５は非常に激しい症状に対応する。鼻の気道抵抗は、前鼻気圧測定法ライノテスト（ｒｈｉｎｏｔｅｓｔ）によって記録した。
【００２１】
ヒト粘膜生検のＤＰＰＩＶ活性の測定
ＤＰＰＩＶ活性を、Ｓｃｈａｒｐｅ他（非特許文献１７）に以下の変更を加えて測定した。鼻生検を０．５ｍｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８の存在下で、氷上において２分間Ｂｒａｎｓｏｎ超音波器（出力４）を使用して超音波処理し、小型微量遠心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で１５０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。上清を回収し、ペレットを２％トリトンＸ１００を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．５ｍｌで処理した。この懸濁液を１分間ボルテックスし、小型微量遠心機で４℃で１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を回収し、既に得られたものと一緒に集め、−２０℃で保存した。上清１、２．５および５μｌについて、ＤＰＰＩＶ活性を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、２５μｌ中で最終濃度５ｍＭのＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して、３７℃で６０分間エッペンドルフサーモミキサで攪拌し、蛍光測定法によって測定した。純粋な酢酸２．５μｌを添加することによって反応を停止した。インキュベーション混合物を水３ｍｌ中に回収した。ブランク値は、酵素なしで基質をインキュベートすることによって得、標準曲線は蛍光計でのＡＭＣ蛍光測定を使用して決定した。ＤＰＰＩＶ活性は組織の湿重量に基づいて標準化し、比活性は１分当たりの組織ｍｇ当たりで変換される基質ｐｍｏｌとして表した。
【００２２】
ブタを使用したｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験
両方の性別のブタ（体重１８〜２５ｋｇ）について実験を実施した。全動物にアトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｍ．）を予め投与した。動物をチオペントン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で麻酔した。気管切開後、動物に挿管し、体積を調節した人工呼吸器によって人工呼吸を行った。手術中、動物にリンゲル溶液、臭化パンクロニウム（０．２５ｍｇ／ｋｇ）およびヘパリンを連続的に静脈点滴した。各実験を約８時間続けた。全身血圧および心拍をモニターするために大腿動脈に、チオペントン、ヘパリンおよび液体を投与するために（３００ｍｌ／時間）大腿静脈にカテーテルを入れた。反対側の大腿静脈には血液試料を得るためにカニューレを入れた。Ｌａｃｒｏｉｘに従って外科的に内顎動脈の標本を準備した（非特許文献１８）。蝶口蓋動脈周囲に入れた直径２．４ｍｍの遷音速流プローブ（プローブ２．４ＲＢ１４３）で、鼻動脈血流の選択的記録を実施した。流速プローブは、Ｔ２０２Ｓ超音波血流計に接続した。流速プローブの下流にある動脈枝全てを結紮し、注入または注射用ＰＥ９０カテーテルを挿管した浅側頭動脈以外は切断した。
【００２３】
平均動脈血圧および全身血流曲線の両方から得られた蝶口蓋動脈の血管抵抗（Ｖｒ）の曲線下面積（ＡＵＶ）の変化を経時的に分析した。血管抵抗の応答期間を比較して、結果は全てベースラインのパーセントで表した。血管変数を６ペン式記録計を使用して同時に記録した。
【００２４】
動物全てにＤＰＩＶ（５０μｇ、２６．５ｐｍｏｌｅ／ｋｇ）を鼻腔内投与し、交感神経を刺激し（ＳＮＳ、１５Ｖ、５ｍｓ、１０Ｈｚを２分間）、次いで条件制御下で浅側頭動脈にヒスタミン（０．１〜２５μｇ）、カプサイシン（０．０１〜２５μｇ）、ブラジキニン（０．００１〜１０μｇ）、ＳＰまたはそのＣ末端断片ＳＰ５〜１１、ＤＰＰＩＶ、またはＮＫ１拮抗薬Ｌ７３３０６０を注入した。それぞれの場合について、動物の血管応答を測定した。次に、α−アドレナリン受容体拮抗薬フェノキシベンザミン（１ｍｇ／ｋｇ）を局所的に動脈内前投与した後、この手順全体を繰り返した。
【００２５】
家畜ブタのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤＰＰＩＶに対する血管応答
対照条件下でのブタの上顎動脈の基準血流量は４．９２＋／−０．７ｍｌ分−１ｋｇ−１であった。左側の交感神経を切断した後、同側鼻動脈流量は６．１＋／−０．２６ｍｌ分−１ｋｇ−１であった（１９．３４％＋／−４．３％の増加を示す）。平均動脈血圧（ＭＡＰ）は、交感神経の切断によって変化しなかった。交感神経の電気的刺激によって、ＳＶＲの周波数依存性増加が誘導されたが、ＭＡＰは有意に変化しなかった。１０Ｈｚで５分間交感神経を刺激すると、上顎動脈の血流が４．９２＋／−０．７ｍｌ分−１ｋｇ−１から１．４０＋／−０．４７ｍｌ分−１ｋｇ−１に減少し、ＳＶＲが７１．５％増加し、６分間以上続いた。フェノキシベンザミンの動脈内注入によってＭＡＰの１０＋／−２％の減少が誘導された。蝶口蓋動脈の基準血流、心拍数およびＭＡＰは、外来性のジペプチジルペプチダーゼＩＶの投与によって有意な影響を受けなかった。
【００２６】
統計学的分析
値は全て平均＋／−ＳＥＭによって表した。統計学的分析は、分散分析、ＡＮＯＶＡによって実施した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。
【００２７】
ＩＩ．結果
ＤＰＰＩＶは患者の内皮細胞および粘膜下混合腺で発現する。
【００２８】
免疫組織化学を使用して、ＤＰＰＩＶ様免疫反応（−ＬＩ）を粘膜下混合腺および白血球で検出した。粘膜下混合腺では、ＤＰＰＩＶ−ＬＩは先端部に局在するようであった。血管内上皮細胞では、ＤＰＰＩＶ−ＬＩが弱く発現した。ヒト鼻粘膜に局在する上皮細胞の中にはまた、ＤＰＰＩＶ陽性のものもあった。しかし、これらの細胞はＣＤ１Ａおよび蛋白質１００に対して免疫反応が陽性を示さず、ランゲルハンス細胞ではないことが示唆された。
【００２９】
ヒト鼻粘膜におけるＤＰＰＩＶと炎症との相関
鼻粘膜生検標本を鼻副鼻腔炎に罹患している患者４５人の両鼻孔から採取して、ＤＰＰＩＶ活性が粘膜炎症によって影響を受けるかどうかを調べた。ＤＰＰＩＶ活性は、検出不可能から７０７ｐｍｏｌ／分／ｍｇまで変化することがわかった。組織学的分析によって、研究した鼻生検の粘膜下内の炎症細胞の密度には著しい差があることがわかった。ＤＰＰＩＶ活性の低さは、慢性鼻副鼻腔炎の患者の鼻粘膜の高密度の炎症細胞と関連していた。観察された炎症細胞の密度をＤＰＰＩＶ活性に対してプロットすると、統計学的有意な退行的関係が認められた（ｐ＜０．００１）。喫煙者から得られた鼻粘膜試料では、同様の低い炎症細胞密度を有する非喫煙者から得られた試料よりも有意にＤＰＰＩＶ活性が低いことが示された（ｐ＜０．０１）。
【００３０】
各生検の炎症細胞の密度を鼻づまりの自覚的評価に対してプロットすると、データには統計学的相関が見られ（ｐ＜０．０１）、鼻炎症は自覚的鼻づまりの重篤さと並行して増加することが示された。さらに、鼻内手術後６ヶ月で症状が有意に改善された（ｐ＜０．００１）患者１０人から鼻粘膜生検を得た。そのＤＰＰＩＶ活性は、術前状態と比較したところ、研究した試料全てについて有意に増加しており（Ｐ＜０．００１）、慢性鼻副鼻腔炎が治癒したときＤＰＰＩＶ活性は回復できることが示された。ＤＰＰＩＶ活性と鼻粘膜炎症との間には明らかに負の相関があるので、組換えＤＰＰＩＶ存在下でのＳＰの血液動態学的影響をブタ鼻粘膜で研究した。
【００３１】
ＤＰＰＩＶはブタにおいてヒスタミンによって媒介される炎症応答を調節する。
【００３２】
ヒスタミンは早期アレルギー反応の原因であり、鼻粘膜の感覚神経、腺および血管に直接的および間接的影響を及ぼす（非特許文献１９）。ヒスタミンがＨ１−受容体を活性化することによって、肺においてカプサイシン感受性感覚神経からペプチドを放出させることができるという直接的証拠がある（非特許文献２０）。さらに、内因的または外因的ヒスタミンは、おそらく特異的受容体に作用することによって感覚繊維を刺激し、ＣＧＲＰおよびＳＰの放出を増加させる（非特許文献２１）。
【００３３】
１０Ｈｚで５分間交感神経を刺激した（ＳＮＳ）後、ヒスタミンを動脈内局所注射すると、対照条件と比較して５．４×１０−０９モル（３３％）および１．４×１０−０７モル（３２％）での持続時間で有意な減少が示された。ＤＰＰＩＶ５０μｇの動脈投与およびＳＮＳの後、ヒスタミンチャレンジすると、対照と比較して曲線下面積（ＡＵＣ）または血管抵抗（Ｖｒ）の有意な変化は見られなかった。しかし、ヒスタミン効果の持続時間は用量５．４×１０−０８モルでは３３．７％（ｐ＜０．０５）および用量１．４×１０−０７モルでは５０．７％（ｐ＜０．０１）減少した。フェノキシベンザミン（ＰＢＺ）で予め処理した後では、ＤＰＰＩＶおよびＳＮＳ、ヒスタミン血管拡張効果は著しく減少した。対照と比較すると、ＡＵＣは、用量５．４×１０−０８モルでは８１．９％（ｐ＜０．００１）の減少を、そして用量１．４×１０−０７モルでは８１．８％（Ｐ＜０．００１）の減少を示した。Ｖｒは、５．４×１０−０８モルでは６７．９％の減少を（ｐ＜０．０１）、そして用量１．４×１０−０７モルでは６１．１％の減少（ｐ＜０．０５）を示した。効果の持続時間もまた、用量５．４×１０−０９モル（４２．６％、ｐ＜０．０１）、用量５．４×１０−０８モル（５５．６％、ｐ＜０．００１）、用量１．４×１０−０７モル（６２．５％、ｐ＜０．００１）で減少した。
【００３４】
ＤＰＰＩＶはブタにおいてカプサイシンによって引き起こされる血管拡張を変化させる
カプサイシン（８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド）は、無髄感覚Ｃ線維を活性化することによって、ヒスタミンのように多くの面で作用する。カプサイシンはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方でタキキニン（非特許文献２２）並びにＣＧＲＰ（非特許文献２３）を放出することが示されている。ＳＮＳ後のカプサイシン注射で、対照条件下で観察されたものと同様に用量に依存したＶｒの減少が示された。ＳＮＳおよびＰＢＺで予め処理した後のカプサイシンによる血管拡張効果は、いかなる用量でも有意な変化を示さなかった。しかし、８．２×１０−０８モルで引き起こされる血管拡張の持続期間は、有意に減少し（３９．９％、ｐ＜０．０１）、ＡＵＣは８．２×１０−０８モルで２６．６％減少した（ｐ＜０．０５）。カプサイシンの効果は、ＤＰＰＩＶおよびＳＮＳ後にも変化した。用量８．２×１０−０８モルで観測されたＡＵＣは、５６．６％の減少を示した（ｐ＜０．０１）。Ｖｒ応答は３４．８％（ｐ＜０．０５）減少し、効果の持続時間は３．３×１０−０９モルと８．２×１０−０８モルの用量で、それぞれ５５．４％（ｐ＜０．０５％）と５０．５％（ｐ＜０．００１）であった。ＰＢＺ、ＤＰＰＩＶおよびＳＮＳ後では、Ｖｒ、効果持続時間およびＡＵＣが著しく減少した。８．２×１０−０８モルでのＶｒは３９．９％（ｐ＜０．０１）減少した。３．３×１０−０９モルおよび８．２×１０−０８モルでは、血管応答の持続時間は６４．３％（ｐ＜０．０５）および５６．８％（ｐ＜０．００１）減少した。８．２×１０−０８モルでは、ＡＵＣは６６．７％（ｐ＜０．０１）減少した。
【００３５】
ＤＰＰＩＶはブタにおいてブラジキニンによって引き起こされる血管拡張を変化させる
ブラジキニン（ＢＫ）は痛覚、および血管緊張および透過性のホルモン制御に関与するポリペプチドである。ＢＫは著しい血管拡張を引き起こし、毛細管透過性を増加させ、鼻炎を含めたほとんどの炎症反応に関与する（非特許文献２４）。ヒスタミンおよびカプサイシンのように、ＢＫは侵害受容性感覚神経を刺激し、ＣＧＲＰおよびＳＰを生じる（非特許文献２５、２６）。
【００３６】
ＳＮＳ後のＢＫ注射によって対照条件下で観察されたものと同様に用量依存性のＶｒの減少が示された。ＤＰＰＩＶおよびＳＮＳ後、ＢＫは９．４×１０−１１モル（３４％、ｐ＜０．０１）および９．４×１０−０９モル（３８．３％、ｐ＜０．００１）の用量で効果持続時間の変化のみを示した。ＰＢＶ、ＤＰＰＩＶおよびＳＮＳ後、血管のパラメータはヒスタミンおよびカプサイシンで見られたものよりも小さい程度まで減少した。たとえば、ＢＫの動脈内投与後のＡＵＣは、９．４×１０−０９モルでは２９．３％（ｐ＜０．０１）、９．４×１０−１１モルでは４０％（ｐ＜０．０１）減少した。９．４×１０−１０モルでの効果の持続時間は３２．２％（ｐ＜０．０５）に減少し、９．４×１０−０９モルでは持続時間は３９．４％（Ｐ＜０．００１）に減少した。
【００３７】
ＤＰＰＩＶはブタにおいてＳＰによって媒介される血管拡張応答を変化させる
高用量のＳＰを繰り返し注射すると蝶口蓋血管抵抗の再現可能な減少が引き起こされ、ニューロキニン（ＮＫ）受容体の脱感作が生じないことが示された。したがって、同動物を使用してＤＰＰＩＶでの前処理前後の両方でＳＰによる用量応答曲線を実施した。血管拡張持続時間の用量応答曲線および曲線下面積は、１ｐｇから０．１μｇの範囲の用量のＳＰを使用して構成された。ＳＰの６回投与を用い、４５分かけて、再現可能な用量応答曲線を得た。血管拡張は、ＳＰを１ｐｇおよび１００ｎｇを局所動脈内投与した後でそれぞれ１５．１％＋／−３．３％から３７．３％＋／−３．３％の範囲であった。ＳＰによって引き起こされる血管拡張がＤＰＰＩＶでの前処理によって影響を受けるかどうかを決定するために、２種類のＳＰ用量（１００ｐｇおよび１ｎｇ）を投与し、１３．１％および１４．９％のＳＶＲの減少が観測された。ＤＰＰＩＶ５０μｇ（５３０ｐｍｏｌｅ）を投与された同動物に同用量のＳＰを注射した。組換えＤＰＰＩＶは、それ自体血管に影響を及ぼさなかった。その後のＳＰ投与によって対照と比較してＳＰ誘発性の血管拡張応答の劇的な減少が引き起こされた（それぞれ６６％および７１％）。ＤＰＰＩＶはＳＰをＳＰ５〜１１に切断するので、ＳＰ５〜１１もＳＶＲを減少させることができるかどうかを測定するために実験を実施した。ＳＰに関して観察されたのと同様に、１０ｐｇから１μｇのＳＰ５〜１１で用量応答曲線が得られた（それぞれＳＶＲが５から３５％に減少した）。しかし、ＳＰ５〜１１の血管拡張効果は、ＳＰと比較してかなり低かった。モルベースで、ＳＰは血管拡張剤としてＳＰ５〜１１よりも２００倍強力である。したがって、ブタにＤＰＰＩＶを投与するとほとんどすぐにＳＰ５〜１１への変換が生じるのだろう。
【００３８】
ＳＶＲの減少に関与するニューロキニン受容体サブタイプの性質をさらに特徴づけるために、ブタをＮＫ１拮抗薬、Ｌ−７３３０６０を１１４ｎｍｏｌ／ｋｇで前処理し、ＳＶＲのＳＰで誘導される減少の阻害を評価した。この拮抗薬は血管収縮効果を有することがわかった。明らかなＳＰ効果の阻害が、１００ｎｇ以外の全用量のＳＰについて観測された。したがって、ＳＶＲに対するＳＰの効果は、ＮＫ１受容体によって媒介されるようである。
【００３９】
ＩＩＩ．考察
混合腺の鼻外分泌細胞の先端部分に酵素ＤＰＰＩＶが局在していることによって、鼻粘液の保護機能におけるこの酵素の役割が示唆される。血管内皮細胞およびＴ細胞にＤＰＰＩＶが存在することは、以前のほ乳類組織中のＤＰＰＩＶの組織化学的研究（非特許文献２７）並びにヒトＤＰＰＩＶの分布に関するより最近の報告（非特許文献２８）と矛盾しない。ＤＰＰＩＶ免疫反応はまた、鼻粘膜のいくつかの粘膜上皮細胞で観察される。これらの細胞は、その表面上でＣＤ１Ａおよび蛋白質１００の免疫反応性を示さなかったので、おそらくランゲルハンス細胞ではないであろう。
【００４０】
ＤＰＰＩＶ活性と鼻粘膜炎症との相関によって、重症の炎症が存在すると酵素活性が著しく減少することが示された。ＤＰＰＩＶ活性が非喫煙者と比較して健康な喫煙者の血清で減少していることを示したＶａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅｎ他（Ｉｄ．）と一致して、ＤＰＰＩＶ活性は重症の炎症の鼻試料で減少していた。対照的に、高いＤＰＰＩＶ酵素活性は鼻粘膜の少数の炎症細胞と相関した。慢性鼻副鼻腔炎を治療した後、この酵素活性が増加するという事実はまた、この病理においてこの酵素が関与していることと一致する。ＤＰＰＩＶ５０μｇで前処理すると、ＤＰＰＩＶを単独で、またはアドレナリン受容体遮断薬フェノキシベンザミンと共に使用したとき、血管拡張持続期間および蝶口蓋動脈血管抵抗が有意に減少した。
【００４１】
ＤＰＰＩＶはＳＰによって引き起こされる血管拡張のピークおよび持続期間の両方を有意に減少させた。ＳＰ５〜１１は血管拡張を引き起こす場合、ＳＰの少なくとも１００分の１の能力を有することがわかった。これらの結果から、慢性鼻副鼻腔炎の間はＤＰＰＩＶ発現の消失が生じ、得られたＳＰ分解の減少は鼻粘膜炎症が持続する一因となることが示唆された。この点に関してＮｉｅｂｅｒ他は、アレルギー患者は非アレルギー対照者よりも鼻洗浄液中のＳＰ−ｉｒのベースラインレベルが高いこと、および、鼻腔内アレルゲンが稲科植物花粉アレルギーの患者においてのみ鼻洗浄液中のＳＰレベルを増加させることを示した（非特許文献２９）。Ｎｉｅｂｅｒの研究においてＳＰアッセイに使用した抗体は、完全なＮ末端およびＣ末端両方のペプチド配列を必要とした。このデータは本明細書に挙げたものと一致しており、正常なボランティアよりもＤＰＰＩＶ発現が少ないアレルギー患者は抗体によって測定できる完全なＳＰを生成するという事実によって説明できた。対照的に、正常なボランティアはＳＰをＳＰアッセイではもはや検出されないＳＰ５〜１１断片に切断する。鼻粘膜の血管床に対するＳＰ効果は、鼻アレルギーの患者（すなわち、ＤＰＰＩＶのない患者）においてアレルギー刺激が持続するときのみ維持される。
【００４２】
ＤＰＰＩＶによるＳＰのＳＰ５〜１１への切断と並行して、Ｎ末端断片、すなわちＳＰ１〜４が生じ、ＳＰ作用に対して拮抗作用を示すことが報告された（非特許文献３０）。したがって、ＤＰＰＩＶは活性の少ないＮＫ１作動薬を生じることによってだけでなく、ＳＰ効果を妨害することによってもＳＰ作用を変更することができる。ＳＰ５〜１１は細胞摂取されやすい（しかし、ＳＰはされにくい）ので、ＤＰＰＩＶはまた細胞過程で除去される形態に変換することによってＳＰの作用を停止するように働くことができる（非特許文献３１）。一旦ＳＰがＤＰＰＩＶによってＳＰ５〜１１に切断されると、この断片はアミノペプチダーゼＭによって、高効率で不活性な断片にさらに加工される。したがって、ＤＰＰＩＶによってＳＰは、まずより活性の少ない型、ＳＰ５〜１１に変換され、次にアミノペプチダーゼＭの作用によって完全に不活性化される。最終的に、ＤＰＰＩＶは炎症の促進に関与することが知られており、この酵素による分解に向いた構造を有する他のペプチドに作用することが可能である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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