(57)【要約】設計された微粒子ならびにこれに関連する方法およびシステム。この微粒子は、導電性コア、および導電性コアを取り囲んで微粒子を誘電泳動力に対して応答性にするのに十分な厚さを有する絶縁層を含む。設計された微粒子であって、導電性コア；および該導電性コアをコーティングする絶縁性の自己会合性単分子層であって、該微粒子を誘電泳動によって操縦可能にするための十分な厚さを有する該単分子層、を含む、設計された微粒子。さらに、分析物に結合するための装置であって、該装置は、設計された微粒子（導電性コア；導電性コアをコーティングする絶縁層であって、該装置を誘電泳動によって操縦可能にするための十分な厚さを有する該絶縁層、を含む）、および設計された微粒子に結合する連結要素、を含む装置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
設計された微粒子であって、以下：
導電性コア；および
該導電性コアをコーティングする絶縁性の自己会合性単分子層であって、該微粒子を誘電泳動によって操縦可能にするための十分な厚さを有する、単分子層、を含む、設計された微粒子。
【請求項２】
前記導電性コアが、導電性シェルを用いてコーティングされる絶縁体を含む、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３】
前記導電性コアが、金、銀、白金、または銅を含む、請求項１に記載の設計された微粒子。
【請求項４】
前記自己会合性単分子層が、アルカンチオールの自己会合性単分子層を含む、請求項１に記載の設計された微粒子。
【請求項５】
前記自己会合性単分子層が、リン脂質の自己会合性単分子層を含む、請求項１に記載の設計された微粒子。
【請求項６】
前記微粒子に結合する連結エレメントをさらに含む、請求項１に記載の設計された微粒子。
【請求項７】
請求項６に記載の設計された微粒子であって、前記連結エレメントが、抗体、単鎖抗体、ペプチド、ホルモン、核酸配列、治療用薬物、抗生物質、または化学的に反応性の化合物を含む、設計された微粒子。
【請求項８】
分析物に結合するための装置であって、該装置は以下：
設計された微粒子であって、以下：
導電性コア；
該導電性コアをコーティングする絶縁層であって、該装置を誘電泳動によって操縦可能にするための十分な厚さを有する、絶縁層、を含む微粒子；および
該設計された微粒子に結合する連結エレメント、
を含む、装置。
【請求項９】
請求項８の装置であって、前記連結エレメントが、抗体、単鎖抗体、ペプチド、ホルモン、核酸配列、治療用薬物、抗生物質、または化学的に反応性の化合物を含む、装置。
【請求項１０】
前記連結エレメントに結合する標識をさらに含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
前記標識が、蛍光マーカー、発色団、発光マーカー、または酵素を含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
誘電泳動によって操縦可能な装置であって、以下：
導電性シェルを用いてコーティングされた絶縁性コア；
該導電性シェルをコーティングする第１自己会合性単分子層；および
該第１自己会合性単分子層をコーティングする第２自己会合性単分子層、
を含む、装置。
【請求項１３】
前記第１自己会合性単分子層が、アルカンチオールの自己会合性単分子層を含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記第２自己会合性単分子層が、リン脂質の自己会合性単分子層を含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記絶縁性コアが、ポリスチレンを含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記装置に結合する連結エレメントをさらに含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項１７】
請求項１６に記載の装置であって、前記連結エレメントが、抗体、単鎖抗体、ペプチド、ホルモン、核酸配列、治療用薬物、抗生物質、または化学的に反応性の化合物を含む、装置。
【請求項１８】
前記連結エレメントに結合する標識をさらに含む、請求項１６に記載の装置。
【請求項１９】
サンプル内の複合体を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
サンプルと、第１誘電性を有しかつ導電性コアと、該微粒子を誘電泳動によって操縦可能にするための十分な厚さを有する絶縁層と、さらに連結エレメントとを含む設計された微粒子とを混合する工程；
該設計された微粒子と、標的分析物とを会合させ、第２誘電性を有する複合体を形成する工程；および
該第１導電性と該第２導電性とを識別することによって該複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、血液、尿、唾液、羊水、生検材料、細胞懸濁物、細胞溶解産物、クロマトグラフィーの画分、または馴化培地を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが、水、食物、食品加工物、食品分布、鉱物、または鉱石を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記連結エレメントが、抗体、単鎖抗体、ペプチド、ホルモン、核酸配列、治療用薬物、抗生物質、または化学的に反応性の化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記絶縁層が、１つ以上の自己会合性単分子層の層を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
サンプル中の複合体を操作するための方法であって、該方法は、以下の工程：
サンプルと、設計された微粒子とを混合する工程であって、該設計された微粒子が、導電性コア、該導電性コアをコーティングしかつ該設計された微粒子を誘電泳動によって操縦可能にするための十分な厚さを有する絶縁層、および連結エレメントを有する、工程；
設計された微粒子と標的分析物とを会合させ、複合体を形成する工程；および　誘電泳動を用いて該複合体を操作する工程、を包含する、方法。
【請求項２５】
前記サンプルが、血液、尿、唾液、羊水、生検材料、細胞懸濁物、細胞溶解産物、クロマトグラフィーの画分、または馴化培地を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルが、水、食物、食品加工物、食品分布、鉱物、または鉱石を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記操作工程が、選別工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記操作工程が、分離工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記操作工程が、前記サンプルの精製工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記操作工程が、捕捉工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記連結エレメントが、抗体、単鎖抗体、ペプチド、ホルモン、核酸配列、治療用薬物、抗生物質、または化学的に反応性の化合物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記絶縁層が、１つ以上の自己会合性単分子層の層を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
サンプル中の１つ以上の複合体を同定するための方法であって、該方法は、以下：
該サンプルと、複数の設計された微粒子であって、各々が異なる誘電性を有する微粒子とを混合する工程；
複数の該設計された微粒子と１つ以上の標的分析物とを会合させ、１つ以上の複合体を形成する工程；および
異なる誘電性間を識別することによって１つ以上の複合体を同定する工程、を包含する方法。
【請求項３４】
複数の前記設計された微粒子の各々が、導電性コアおよび絶縁層を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記絶縁層が、１つ以上の自己会合性単分子層の層を含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
政府は、国防総省国防高等研究事業局令Ｅ９３４の下に、ＳＰＡＷＡＲからの契約番号Ｎ６６００１−９７−Ｃ−８６０８により、本発明の権利を所有し得る。
【０００２】
本出願は、仮特許出願番号６０／２１１，５１５号、２０００年６月１４日出願、Ｆｒｅｄｒｉｃｋ　Ｆ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｐｅｔｅｒ　Ｒ．Ｃ．Ｇａｓｃｏｙｎｅ，Ｊｏｄｙ　Ｖｙｋｏｕｋａｌ、およびＸｉａｏｂｏ　Ｗａｎｇによる、名称「ＤＩＥＬＥＣＴＲＩＣＡＬＬＹ−ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ　ＭＩＣＲＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ」に対する優先権を主張する。図面を含む上に参照された開示の全文は、放棄することなく、本明細書中に参考として詳細に援用される。
【０００３】
以下の登録された米国特許は、本明細書によって参考として援用される：米国特許第５，８５８，１９２号、同第５，８８８，３７０号、同第５，９９３，６３０号、同第５，９９３，６３２号、および同第５，８８８，３７０号。以下の特許出願は、本明細書によって参考として援用される：係属中の米国特許出願番号０９／２４９，９５５号、「Ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｆｌｕｉｄｉｃ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」、１９９９年２月１２日出願；係属中の米国特許出願番号０９／３９５，８９０号、「Ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｆｏｒ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｆｉｅｌｄ　ｆｌｏｗ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」、１９９９年９月１４日出願；仮米国特許出願番号６０／２１１，７５７号、「Ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｆｏｒ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｍａｇｎｅｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎａｌｙｔｅ　ｍｉｘｔｕｒｅｓ」、２０００年６月１４日出願；仮米国特許出願番号６０／２１１，５１４、「Ｓｙｓｔｅｍｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｃｅｌｌ　ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ」、２０００年６月１４日出願；および仮米国特許出願番号６０／２１１，５１６、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｆｌｕｉｄ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」２０００年６月１４日出願。
【０００４】
（１．発明の分野）
本発明は、一般的に化学およびライフサイエンスの分野に関する。さらに詳細には、本発明は、誘電的に設計された微粒子（本明細書中ではＤＥＭＰという）を用いる、標的分析物の操作、分離、精製、および指標付けのための技術に関する。
【０００５】
（２．関連技術の説明）
化学品、細胞および生体分子を分離して同定するための改良法は、化学およびライフサイエンスにおける多くの進歩のための基本である。発見の過程の多くは、特定の化学品、細胞、生体分子または他の分析物についての定性的な情報および定量的な情報の決定に基づいている。濾過、遠心分離、分光法および光学顕微鏡のような分析法は、典型的には、分析物の分離および／または検出を達成するために分析物の固有の物理的特性の違いを活用する。
【０００６】
これらの基本的な方法の改良は、一般的に２つのカテゴリーに分類される：（ｉ）その方法の分離能、または感度は、分析物間の微妙な物理的な違いをよりよく区別するために改良され、あるいは（ｉｉ）容易に識別可能な特定の特性を有する物質、または標識は、分析物に結合して、分析物を検出可能にするか、または間接的に分離することをより容易にする。勾配遠心分離および高速液体クロマトグラフィーは、既存の方法の感度を向上させることに基づく方法の例である；蛍光抗体を用いる細胞染色および生体分子放射能標識は、分析物の分離度を上げるために分析物に結合する結合標識に基づく改良法の例である。これらの改良は、当該分野においてある程度の成功を示すが、問題は残る。特に、これらの方法は、依然として、分析物が同時に指標付けされ検出されそして操作され得る方法を考慮に入れていないし、一度に多くの異なる型の分析物を分離する操作も考慮に入れていない。
【０００７】
標識を利用する従来の分析の１つの型は、「ワンポット」反応と呼ばれる。ワンポット反応は、試薬が、単一の試験管またはビーカー中のサンプルのアリコートに単に添加される反応である。サンプル中に存在する標識分析物の任意の分子は、添加された指示薬と反応して、比色性の、蛍光性の、または化学発光性の生成物もしくは複合体を生成する。次いで、この反応生成物または複合体は検出され、そして通常は定量される。このような方法の決定的な特徴は、標的分析物がサンプル中に実際に存在する場合にのみ、検出可能な種が存在することである。
【０００８】
ワンポット分析のための有用な標識の１つの例は、分子ビーコンである。分子ビーコンは、組込まれた発蛍光団およびクエンチャーを有する分子を利用する。発蛍光団およびクエンチャーは、分子が標的に結合する時までは、非常に接近して保持される。結合した時、発蛍光団およびクエンチャーは、十分にずっと引き離されて、その結果、発蛍光団が、蛍光を発する。クエンチャーがもはや消光しない場合、標識は蛍光によって観察され得る。
【０００９】
ワンポットアッセイの他の例としては、比色ｐＨ検出または臭化エチジウムのような挿入色素を使用する核酸の非特異的標識が挙げられる。核酸に対するサザンブロット法およびノーザンブロット法、ならびにタンパク質に対するＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法のような技術は、特定の生化学分析物に結合し、そしてその検出を容易にする、標識プローブを使用する。これらの抗体または核酸プローブは、それらが標的分析物に結合しているといないとにかかわらず、放射活性であるか、蛍光性であるか、または酵素活性である。
【００１０】
しかし、上述の方法に関して有用な結果を得るために、結合していない分析物と遊離プローブと、分析物−プローブ複合体とを識別することが必要である。これは、分析物−プローブ複合体を固体支持体に固定して、次いで遊離の、結合していない分子を洗い流して、固体支持体に結合した標識分析物−プローブ複合体のみを残すことによって達成される。残念なことに、このプロセスは、多少複雑であり得、そして時間がかかり得る。
【００１１】
従来の分析物の同定および分離に固有な問題の少なくともいくつかを解決するために、特定の微粒子が使用された。１９７０年代後期において、１ミクロン未満〜１００ミクロンのサイズ範囲の、均一なサイズの微粒子の比較的簡単な生成を可能にする技術が発達した。後に、磁気特性を有する微粒子を作製するための技術もまた、発達した。これらの技術を用いて生成される微粒子は、特定の標的分析物もしくは分析物のクラスと相互作用するかまたはそれらに結合して、微粒子−分析物複合体を形成する種々のプローブに連結される。この方法において、微粒子は、標的分析物に対して特異的な標識として作用するように作製し得る。
【００１２】
既存の微粒子標識は、おおまかに２つのカテゴリー、すなわち、分析物検出のための標識、および分析物操作のための標識、に分割され得る。両方のカテゴリーにおいて、特定の標的分析物に対して感作される標識が、サンプルに添加され、そしてサンプル中に存在する場合、標的分析物が微粒子に基づく標識に結合するのを容易にする条件下でインキュベートされて、微粒子−分析物複合体を形成する。
【００１３】
既存の分析物検出プロトコルにおいて、蛍光、光または他の照射に対する不透明度、または放射線の発光のような微粒子の特定の物理的特性は、微粒子−分析物複合体の存在を推論するためのリポーターとして活用されている。例えば、細胞中で抗体プローブを介して標的タンパク質と複合体化する金属性微粒子またはナノ粒子は、電子顕微鏡によって観測および定量され得、そして標的タンパク質分析物が細胞中の特定の位置にあることを推定するのに使用され、そしてこの粒子は、検出プロトコルで使用される標識の１例である。
【００１４】
検出プロトコルにおいて、直接的に検出されるのは分析物ではない。そのかわりに、分析物の存在は、微粒子リポーターとの会合、プローブと分析物との相互作用によって媒介される会合によって推測される。検出プロトコルはまた、２段階標識法を含み得、ここで、二次標識は、微粒子−分析物複合体の存在を示すために使用される。この場合において、分析物は、微粒子の一次プローブに結合して、次いでその分析物は特異的な二次標識を用いて続けて標識され、ここで、この二次標識は、次いで分析物の存在の推測を可能にするリポーターとして使用される。この分析物は、最終的に微粒子と二次リポーター標識との間に効果的にはさまれる形になるため、このような２重標識のプロトコルは、当該分野で「サンドイッチアッセイ」と呼ばれてよく知られている。
【００１５】
操作プロトコルにおいて、微粒子に基づく標識は、分析物の物理的操作を補助するための「ハンドル」として使用されている。このようなプロトコルにおいて、微粒子の特定の物理的特性（例えば、密度、電荷、またはサイズ）は、微粒子−分析物複合体を単離するか、分離するか、またはそうでなければ操作するかのために活用される。このような方法において、分析物は、直接的に操作されない。そのかわりに、微粒子（すなわち、「ハンドル」）が操作され、そしてその微粒子に結合する任意の分析物が、微粒子との会合に基づいて間接的に操作される。微粒子標識に基づく操作プロトコルは、残念ながら、標的分析物を同定するためにさらなる分析が必要である。
【００１６】
上記の微粒子に基づくシステムは、当該分野で少なくともある程度の有用性を示すが、標的を同定する必要な追加の工程（標的の操作を除く）は、科学者またはエンジニアに対する余分な時間およびコストを意味する。さらに、微粒子を使用しながらも、微粒子自体の検出は、標的分析物の存在を必ずしも推測しない場合が時々ある。さらにまた、従来の微粒子は、分析物の多くの異なる型を同時に、個々に操作し得ない。簡潔に言うと、従来の微粒子は、異なる分析物の指標付け、その後の同時操作、検出および／または同定を可能にしない。言い換えると、従来の技術は、各々が異なる標的と結合するプローブ作成し得ることも、異なる種の同時操作、同定、および検出を可能にすることもない。
【００１７】
上記の特定の問題、弱点、または欠点は、網羅していることを意味しない；他の問題は、当該分野内に存在することが公知である。しかし、上記の議論は、分析物の操作、分離、精製、および指標付けに関する改良された方法論の必要性が存在することを示す。
【００１８】
（発明の要旨）
本開示によって作製され、そして使用される設計された微粒子標識は、上述の制限を克服するために設計され得る。なぜならば、分析物の指標付けが達成され得るからである。特に、本開示は、異なっていて識別可能な誘電特性を有するＤＥＭＰのライブラリーの使用を通じて、種々の異なる標的分析物を同時に同定、操作、および検出し得る。あるいは、本開示は、この微粒子標識が、検出されるべき分析物に結合し得るため、当該分野における制限を克服する。詳細には、分析物の結合に感受性の誘電特性を有する微粒子標識は、結合後の標識のＡＣ界面導電挙動の変化を感知することによって分析物の結合を確認するために使用され得る。
【００１９】
本明細書中に開示される実施形態による、設計された微粒子の使用としては、広大であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血液分析；疾患の検出および特性決定；純粋な細胞母集団の臨床的調製；食品加工、公共の水配給システム、農業、および環境における病原体の検出および同定；細胞成分区画の分離、骨髄移植のための幹細胞の精製、および診断の目的および研究の目的の両方のための、異常細胞の浄化もしくは収集。さらに、設計された微粒子は、タンパク質および核酸のような種々の材料の単離、分離、精製および同定を含む、分子の分析に適用され得る。さらに、本明細書中に開示される技術は、流動細胞光度測定法のような細胞を分離する現行の方法とともに使用し得る。
【００２０】
（具体的な実施形態の説明）
本開示は、微粒子における新しい技術を記載し、ここでこの微粒子は、ＡＣ界面導電（従来の誘電泳動（ｃＤＥＰ）、進行波誘電泳動（ｔｗＤＥＰ）、進行波誘電泳動（ｇＤＥＰ）、または電気回転（ＲＯＴ）を含む）挙動、ならびに磁気泳動（ＭＡＰ）挙動が、少なくとも部分的に計算可能であるか、または制御可能であるように、ある所定の、または設計された、誘電特性および／または磁気特性を有して設計されそして生成される。
【００２１】
これらの設計された微粒子は、当該分野で公知の方法によって、抗体、核酸または化学リガンドのような種々のプローブを用いて感作され得、そして細胞、細胞成分、および生体分子が挙げられるが、これらに限定されない種々の異なる分析物型を標識するために、対応して使用され得る。次いで、このような設計された微粒子を用いて標識された分析物は、既存のＡＣ界面導電法または磁気泳動法（あるいはこれらの組み合わせ）を用いて操作され得る。
【００２２】
設計された微粒子の異なるクラスは、異なるＡＣ界面導電応答および／または磁気泳動応答を用いて設計され得るため、混合物中の種々の異なる分析物は、１つ以上のプローブを用いて同時に標識され得、次いで個別に（または異なるプローブの各々の型によって規定される群として）対処され得、操作され得、および／または同定され得る。この能力は、指標付けといわれ得、そして既存の技術を超えて顕著な進歩を表し得る。さらに、新しいＡＣ界面導電分析法および磁気泳動分析法が開発されるにつれて、本明細書中で議論された、設計された微粒子標識は、分析物を対処して、操作して、そして同定するための上記の方法を用いて使用され得る。
【００２３】
さらに、誘電泳動電場フロー分別法（ＤＥＰ−ＦＦＦ）、進行波ＤＥＰ（ｔｗＤＥＰ）法、およびスパイラル電極法（ｓｐｉｒａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ｍｅｔｈｏｄ）のような、以前に開示されたＡＣ界面導電分析法は、本明細書中で議論される設計された微粒子標識の使用を通じて向上され得る。これらの以前に開示された方法は、典型的には、分析物の操作および同定を達成するために分析物の「固有の」誘電特性における違いを活用する。一方、プローブ感作性の設計された微粒子は、公知でないかもしくは無差別の誘電特性を用いて分析物を分離するための技術、ならびに分析物結合後の設計された微粒子の挙動における変化を感知することによって分析物を同定するための技術を提供する。そのために、設計された誘電性微粒子標識および磁性微粒子標識は、多くの異なる分野において分析物を分離して同定するための強力な新しい方法を提供し得る技術を可能にする。
【００２４】
設計された微粒子のいくつかの型は、複数の標的分析物に関するサンプルを同時に標識かつプローブするために使用され得る。各微粒子型は、特定の、識別可能な誘電応答および／または磁気応答を有するように設計され得るために、混合物中の異なる標的分析物は、独立してか、連続してかまたは並行して操作され得る。
【００２５】
さらに、本開示による設計された微粒子は、当該分野で公知の方法論によって、感作され得、そしてそのために同定され得る。
【００２６】
さらに、設計された微粒子は、ＡＣ界面導電法および／または磁気泳動法によって識別され得、並べられ得、そして加工され得る。いくつかのＡＣ界面導電に基づく方法での識別は、既存の単離方法よりも数桁良好であり、この方法での識別は、電気的手段によって制御可能であり、既存の方法とは違って、化学的分析および生物学的分析のための統合されかつ自動化された微小システムに適用可能であるため、本開示の設計された微粒子は、この分野における既存の技術に関する上述の欠点の全てではないにしても、多くを解決するために使用し得る。
【００２７】
独自で固有の誘電特性を有して各々設計された、設計された微粒子の異なる型は、その誘電特性に基づいて指標付けされ得、そして、異なる分析物を同時に操作するための、周波数に依存する「誘電性のハンドル」（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｈａｎｄｌｅ）として使用し得る。次いで、設計された微粒子のライブラリーは、異なる誘電特性を用いて開発し得る。このようなライブラリーは、指標付けを行なうために使用され得る。このライブラリーはまた、ミクロフルーム（ｍｉｃｒｏｆｌｕｍｅ）のような、いくつかの異なる適用型のための、ビーズに基づく生化学アッセイを開発するために使用され得る。
【００２８】
１つの実施形態において、「サンドイッチ」プロトコルを用いて分析物は検出され得る。このようなシステムにおいて、ビーズ蛍光における変化は、特定の分析物の存在によって媒介される２つの個別の結合事象の結果である。設計された微粒子は、最初に特定の分析物に対して高い結合アフィニティーを有する「捕捉プローブ」を用いて感作され（または連結され）得る。次いでこれらの感作された、設計された微粒子は、サンプルの液滴とともにインキュベートされ得、その結果、設計された微粒子−分析物複合体を形成する。次いで、分析物上の第２のエピトープまたは核酸配列に対して高いアフィニティーを有する「標識プローブ」を含む液滴は、反応混合物に添加され得、その結果、設計された微粒子−分析物−発蛍光団複合体を形成する。これらの複合体は、正の誘電泳動を用いて反応表面に引き寄せられ得、そしてインサイチュで保持され得、一方懸濁液滴は引き離される。次いで、異なる試薬の液滴は、設計された微粒子複合体の周りに移動され得、そしてＤＥＰ力が除去され得る。設計された微粒子は、自然に解放され得、そして新しい試薬と熱力学的に混合し得、その結果、緩衝液の変化または洗浄操作を生じる。ミクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）デバイスにおいて、デバイスの表面に永久的に連結するプローブを使用することなく、分析物を可逆的に固定するようなこの能力は、ミクロ流体に基づく化学分析において大きな進歩を示す。
【００２９】
当該分野で公知のキャリブレーション、サンプルのキャリーオーバー、および交差汚染の問題は、分子認識および設計された微粒子に結合するセンサーエレメントを用いることによって対処し得、その結果、感作された設計された微粒子の新しいアリコートは、一つ一つのアッセイのために使用され得る。後で微粒子を配置することによって、各サンプル間に「ブランク」を作動することによって、および洗浄サイクルを可能にすることによって、キャリブレーションの問題は、解決され得、そしてキャリーオーバーおよび交差汚染が存在しないことを確認し得る。生物学的に活性な成分を設計された微粒子に配置することはまた、単一の流体デバイスが、広範囲のサンプル調製、および異なる設計された微粒子／プローブの組み合わせを用いることによる分子分析問題に適用し得ることを意味する。最後に、生物学的成分は固定表面に結合することが必要でないため、これらの表面は、生体分子の付着およびキャリーオーバー問題を低減するために、例えば、ＰＴＦＥでコーティングされ得る。これは、本開示の設計された微粒子を使用することを決定することが、複数の用途を有する単一のデバイスを考慮に入れることによって、技術の潜在的な適用性を向上し得る。
【００３０】
本開示の設計された微粒子を製造することで、異なる設計された微粒子／プローブの組み合わせの混合物を用いて並行して分子の分析を行なう機会を作ることになる。設計されたビーズを用いるアッセイは、サンプルの量が最少量しか必要でない。例えば、直径が５μｍの設計された微粒子は、約７８μｍ２の比較的大きな表面積を有しながら、典型的な腫瘍細胞の約１５分の１である、６５ｆＬの体積しか占有していない。１００個の腫瘍細胞および１０種類の異なる設計された微粒子型を含有する２５０個の設計された微粒子は、ＤＥＰを介する集束を用いて直径５０μｍの球形の領域に密集し得る。これは、分子プローブを有する２×１０９個／ｍｌの設計された微粒子と接触してほぼ１０９個の細胞／ｍｌが保持されることに相当する。磁性微粒子表面上で標的ｍＲＮＡプローブがｃＤＮＡプローブに対してハイブリダイゼーションするための時間は、濃縮された細胞溶解物中で、ほんの数分間であることが示されている。そのために、本明細書中で記載された設計された微粒子に基づくアプローチは、このような高濃度の細胞および設計された微粒子を用いて、組込まれたシステム中の分子マーカーのための迅速なアッセイを可能にする潜在能力を有する。
【００３１】
本開示の設計された微粒子に基づく指標付けの技術の発展において、１０の減少したパネルまたはその鍵分子マーカーは、疾患状態の疑いのある特定のサブセットに対するスクリーニングの目的で、利用可能なマーカーのライブラリーから選択され得る。サンプル調製および分子分析を合わせて、単一で自動化されたプロセスにすることによって、このシステムは、遺伝子チップから誘導された分子の疫学的なデータの活用を可能にし、そしてこのシステムを広範囲の個体群に利用可能にする。
【００３２】
（設計された微粒子）
本開示の１つの実施形態による設計された微粒子の構造は、図１に示される。ここで、薄い、不十分な導電性の誘電性シェルによって取り囲まれた導電性コアが示されている。この導電性コアは、広範囲の材料で作製され得る。さらに、この導電性コアは、中実であっても中空であってもよい。なおさらに、この導電性コアは、導電性の外側領域によって完全にかまたは部分的に取り囲まれた、絶縁性の内部領域から形成され得る。
【００３３】
内部コアの形状は、いくらか変形し得るが、その形状は１つの実施形態において球状であり得る。しかし、他の実施形態において、その形状は、楕円形または任意の他の適切な形状であり得る。
【００３４】
誘電性シェルは、所望の誘電特性（詳細には、所定の周波数で誘電泳動応答を提供される特性）を生じるために適切な多くの材料から形成され得る。この誘電性シェルは、当該分野で公知の任意の様式によって、内部の導電性コアに結合し得る。
【００３５】
外側の誘電性シェルの形状は、同様に変形し得るが、１つの実施形態において、その形状は一般的に球状であり得るか、または一般的に、内部の導電性コアの形状に従い得る。
【００３６】
導電性コアおよび／または誘電性シェルのサイズ、組成、厚さ、および形状は全て、所望の誘電特性および／または磁気特性を達成するように調節および最適化され得る。特に、サイズ、厚さ、および組成は、設計された微粒子が、特定の範囲の誘電泳動力によって操作されるために適切な誘電特性を有するように調節され得る。
【００３７】
１つの実施形態において、ポリスチレンでコーティングされた銀微粒子が、設計された微粒子として使用され得る。これらの設計された微粒子は、非導電性状態から導電性状態までの周波数に依存する変化に耐える。このことは、適切な周波数のＡＣ場が、非導電性のポリスチレンシェルを介して進入する、誘電性の分散の結果である。
【００３８】
別の実施形態において、金または銀でコーティングされた中空ガラス微粒子（またはポリスチレンまたは他の微粒子）上にアルカンチオレートの自己会合性単分子層（ＳＡＭ）を用いる製造プロセスは、改良された生体模倣粒子を製造するために使用され得る。これらの設計された微粒子の誘電泳動挙動は、当該分野で公知の確立された誘電泳動モデルおよび複数シェルモデルを用いて予測され得、そして設計された微粒子の性質（例えば、粒子径および絶縁層の厚さおよび組成）が変化することの効果は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。
【００３９】
図１の設計された微粒子は、哺乳動物の細胞を模倣するように設計され得る。詳細には、この微粒子は、そのＡＣ界面導電挙動が哺乳動物細胞のＡＣ界面導電挙動を模倣するように設計され得る。この挙動は、細胞について広く特徴付けされており、そして当該分野で公知の、十分に規定されそして比較的シャープな周波数依存によって識別される。これらの微粒子の例は、種々の厚さのポリスチレンの非導電性シェルを用いて銀の導電性コア粒子をカプセル化することによって製造されている。これらの粒子のｃＤＥＰ応答が研究されており、そして確立されたＡＣ界面導電理論の予測に従って変動し得ることが示されている。
【００４０】
図１に示される微粒子と異なる設計された微粒子のクラスは、当該分野で公知の製造原理によって設計および製造され得る。また、各々の微粒子の構造的クラスにおいて、ある範囲の異なる誘電性応答は、個々の微粒子を含む層の組成物、厚さ、および／または他の性質を変えることによって達成され得る。この方法において、十分に規定されていて、さらに明確に識別が可能な誘電特性および／磁気特性を有する設計された微粒子のライブラリーが、製造され得る。異なる誘電特性および／または磁気特性を有する異なる微粒子型を設計および製造することによって、各々の設計された微粒子型は、それが複数の型の設計された微粒子の混合物の一部である場合であっても、独立して対処され得、操作され得、そして特徴付けられ得る。
【００４１】
（連結エレメント）
１つの実施形態によって、上述の設計された微粒子は、設計された微粒子標識として作用するために、１個以上の連結エレメント、すなわちプローブに結合し得る。異なる連結エレメントの一般的な使用は、当該分野で公知である。しかし、以下の章で、上述の設計された微粒子と組み合わせて使用し得る、異なる連結エレメントに関するいくつかの具体的な実施形態を説明する。しかし、本開示の利点を有する当業者は、他の連結エレメントを使用し得ることを理解する。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「連結エレメント」または「プローブ」は、本明細書で「標的分析物」と呼ばれる別のエレメントに対してアフィニティーを有する任意のエレメントをいう。標的分析物に対する連結エレメントの結合は、２つのエレメント間にアフィニティーペアを形成する。
【００４３】
例えば、このようなアフィニティーペアとして、例えば、以下が挙げられる：ビオチンとアビジン／ストレプトアビジン、抗原もしくはハプテンと抗体、重金属誘導体とチオ基、ホモポリヌクレオチドのような種々のポリヌクレオチド（例えば、ポリｄＧとポリｄＣ、ポリｄＡとポリｄＴ，およびポリｄＡとポリＵ）。お互いに強力なアフィニティーを有する任意のエレメントペアは、アフィニティーペアとして使用され得る。適切なアフィニティーペアはまた、免疫学的方法において使用されるリガンドおよび接合体の間に見い出される。
【００４４】
連結エレメントの選択は、明らかに、微粒子および標的分析物の性質に依存する。例えば、核酸種（標的分析物）を微粒子に捕捉したい場合、連結エレメントは、通常は、標的分析物の核酸またはそれらの一部に相補的な配列を有する核酸または核酸アナログオリゴマーであるように選択される。
【００４５】
連結エレメントは、最初に微粒子に結合し得、次いで標的分析物に対するアフィニティーを有する種であり得る。好ましくは、標的分析物に関するアフィニティーは、微粒子と標的分析物との間の複合体の形成が選択的であり、少なくともある程度の標的分析物の同定を提供するような、選択的なアフィニティーである。好ましくは、アフィニティーは、高度に特異的であり、従って、標的分析物に対する選択的なアフィニティーを提供する粒子に結合する連結エレメントは、抗体活性を有する抗体または抗体フラグメント、抗原、相補的な核酸配列に選択的アフィニティーを有する核酸プローブまたは核酸アナログプローブ、あるいはアビジンまたはストレプトアビジンのようなアビジン様分子であり得る。
【００４６】
（連結エレメントとしての核酸）
核酸に基づく連結エレメントは、合成オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、およびＲＮＡであり得る。より短いオリゴヌクレオチドは、作製が容易であり得るけれども、多くの他の要因は、ハイブリダイゼーションの特異性を決定することと関連がある。オリゴヌクレオチドのその相補性標的に対する結合アフィニティーおよび配列特異性の両方は、その長さが長くなるにつれて増加する。８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれを超える塩基対の例示的なオリゴヌクレオチドが使用されることが意図されるが、その他のオリゴヌクレオチドも意図される。２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１５００、１９２２、２０００、３０００、４０００塩基およびそれより長い塩基をコードする、より長いポリヌクレオチドは、同様に意図される。
【００４７】
（連結エレメントとしての抗体）
抗体に基づく連結エレメントは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、一本鎖抗体、または組換え操作された抗体をいう。明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、任意の免疫性の結合薬剤（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）を広範囲にいうことが意図される。用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子に言及するために使用され、そして抗体としては抗体フラグメント（Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）など）が挙げられる。一般的に、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。なぜならば、これらは、生理学的状況において最も一般的な抗体であり、そして実験室の設備で最も容易に作製されるからである。抗体を調製し、特徴付けるための方法は、当該分野で周知である（例えば、本明細書中で参考として援用する、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと）。
【００４８】
ポリクローナル抗体を生成するための方法は、当該分野で周知である。手短に言えば、ポリクローナル抗体は、抗原性の組成物を用いて動物を免疫して、この免疫された動物から抗血清を収集することによって調製される。広範囲の動物種が、抗血清の産生のために使用され得る。典型的に、抗血清の産生のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギは比較的大量の血液を有するために、ウサギは、ポリクローナル抗体の産生のための好ましい選択である。
【００４９】
当該分野で周知のように、所定の組成物は、その免疫原性において変動し得る。従って、キャリアに対してペプチド免疫原またはポリペプチド免疫原を結合することによって達成され得る場合、宿主免疫系を追加免疫することがしばしば必要である。例示的でかつ好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルビミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして使用し得る。キャリアタンパク質に対してポリペプチドを接合するための手段は、当該分野で周知であり、そしてこの手段としては、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス−ビアゾ化されたベンジジンが挙げられる。
【００５０】
また、当該分野で周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的刺激剤の使用によって向上され得る。例示的かつ好ましいアジュバントとしては、完全なフロイントのアジュバント（死んだＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全なフロイントのアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【００５１】
ポリクローナル抗体の産生において使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質および免疫化のために使用される動物に依存して変動する。種々の経路は、免疫原を投与するために使用され得る（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化後の種々の点で免疫された動物の血液をサンプリングすることによって観察され得る。第２の、追加免疫注射もまた、与えられ得る。追加免疫および滴定のプロセスは、適切な力価が達成されるまで繰り返される。免疫原性の所望のレベルが得られる場合、免疫された動物から、血を取り、そして血清を単離し、そして保存し得、そして／またはある場合には、その動物は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するために使用され得る。ウサギのポリクローナル抗体の産生のために、動物は、耳の静脈を介してか、またはかわりに心臓の穿刺によって血を取り得る。取り出された血液を、凝固され得、次いで細胞全体および血餅から血清成分を分離するために遠心分離し得る。血清は、種々の適用のためにとして使用され得るか、または所望の抗体フラクションが周知の方法（例えば、固体マトリックスに結合する別の抗体またはペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィー）によって精製され得る。
【００５２】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、本明細書中で参考として援用する、米国特許明細書第４，１９６，２６５号中に例示されるような、周知の技術の使用を通じて容易に調製され得る。典型的には、この技術は、適切な動物を選択された免疫原組成物（例えば、精製されたかまたは部分的に精製された発現タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド）を用いて免疫することを含む。免疫組成物は、抗体産生細胞を効果的に刺激する様式で投与される。
【００５３】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するための方法は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同系列に沿って開始する。ネズミ（例えば、マウスおよびラット）が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、またはカエルの細胞の使用もまた、可能である。ラットの使用は、確実な利点を提供し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６，ｐｐ．６０−６１）が、マウスが好ましく、その中でＢＡＬＢ／ｃが最も好ましいマウスである。なぜならばこのマウスは、最も普通に使用され、そして一般的により高い割合の安定な融合を与えるからである。
【００５４】
動物は上述の抗原を用いて注射される。抗原は、必要な場合、キーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリア分子に対して結合し得る。抗原は、典型的には、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントのようなアジュバントと混合される。同じ抗原を用いる追加免疫注射は、約２週間のインターバルで行なう。
【００５５】
免疫化の後、抗体を産生するための能力を有する体細胞、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）は、ＭＡｂを生成するプロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、バイオプシー用の脾臓、扁桃腺、またはリンパ節由来、あるいは末梢血液サンプル由来で得られ得る。脾臓細胞および抹消血液細胞が好ましい。なぜならば、脾臓細胞は、形質芽球段階の分割における抗体産生細胞の豊富な原料であり、そして抹消血液細胞は、抹消血液は容易に利用可能であるからである。しばしば、動物のパネルは、免疫され、そして、最も高い抗体力価を有する動物の脾臓は、取り出されて、そして脾臓のリンパ球は、シリンジを用いて脾臓をホモジェナイズすることによって得られる。典型的には、免疫されたマウス由来の脾臓は、約５×１０７〜２×１０８のリンパ球を含む。
【００５６】
免疫された動物由来の抗体産生Ｂリンパ球は、次いで、不死の骨髄腫細胞の細胞、一般的には免疫された動物と同じ種の細胞のうちの１つと融合される。ハイブリドーマを産生する融合手順における使用に適する骨髄腫細胞株は、好ましくは抗体を産生せず、高い融合効率を有し、そして細胞株が、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）の増殖しか補助しない特定の選択的な培地中で、増殖するのを不可能にする酵素欠乏を有する。
【００５７】
多くの骨髄腫細胞の任意の１つは、当業者に公知であるように使用され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６）。例えば、免疫された動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ　４　１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ　１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ　１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０　Ｂｕｌを使用し得る；ラットに関しては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ　１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を使用し得る；そしてＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６が、ヒト細胞融合と組み合わせて、全て有用である。
【００５８】
１つの好ましいネズミ骨髄腫細胞は、ＮＳ−１骨髄腫細胞株（これはまたＰ３−ＮＳ−１−ＡＧ４−１と呼ばれる）であり、この株は、ＮＩＧＭＳ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから、細胞株保存番号ＧＭ３５７３を依頼することによって、容易に入手可能である。使用され得る別のマウス骨髄腫細胞株は、８−アザグアニン耐性マウスネズミ骨髄腫ＳＰ２／０非産生細胞株である。
【００５９】
抗体産生脾臓もしくはリンパ節の細胞ならびに骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は、通常は、それぞれ、細胞膜の融合を促進する１種以上の薬剤（化学的または電気的）の存在下、体細胞と骨髄腫細胞を２：１の比率（しかし、比率は約２０：１〜約１：１まで変動し得る）で混合する工程を包含する。センダイウイルスを用いる融合法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）によって記載されており、３７％（ｖ／ｖ）のＰＥＧのようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる融合法は、Ｇｅｆｔｅｒらによって記載されている（１９７７）。電気的に誘導される融合法の使用もまた、適切である。
【００６０】
融合手順は、たいてい、生存能力のあるハイブリッドを約１×１０−６〜１×１０−８の低周波数で産生する。しかし、この低周波数は、選択的な培地で培養することによって、生存能力のある、融合されたハイブリッドが、親の、融合されていない細胞（特に、通常は無制限に分割し続ける融合されていない骨髄腫細胞）から分化されないので、問題を引き起こさない。この選択的な培地は、一般的に、組織の培地中でヌクレオチドの新規合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的でかつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方の新規合成をブロックし、一方、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地は、ヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンが追加される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンが追加される。
【００６１】
好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を行なうことのできる細胞のみが、ＨＡＴ倍地中で生存可能である。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の鍵となる酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ））が欠けており、従って生存することができない。Ｂ細胞は、この経路を行ない得るが、培養物中での寿命に制限があり、一般的に約２週間以内に死ぬ。そのために、選択培地中で生存し得る細胞のみが、骨髄腫細胞およびＢ細胞から形成されるハイブリッドである。
【００６２】
特定のハイブリドーマ由来のハイブリドーマの集団を与える培養が、選択される。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中の単一のクローンの希釈によって細胞を培養し、その後（約２〜３週間後）に、所望の反応性について、個々のクローン上清を試験することによって行なわれる。アッセイは、高感度で、単純でかつ迅速な、例えば、放射線免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞障害性アッセイ、プラークアッセイ（ｐｌａｑｕｅ　ａｓｓａｙ）、ドット免疫結合アッセイ（ｄｏｔ　ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）などであるべきである。
【００６３】
次いで、選択されたハイブリドーマは、連続的に希釈され、そして個々の抗体産生細胞株へとクローン化され、次いで、この細胞株は、ＭＡｂを提供するために無制限に増殖され得る。この細胞株は、２つの基本的な方法でＭＡｂ産生のために活用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、本来の融合に関して、体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の組織適合性の動物へと（しばしば腹腔へと）注射され得る。注射された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって産生された特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。次いで、この動物の体液（例えば、血清または腹水）は、高濃度でＭＡｂを提供するために穿刺され得る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得、この場合ＭＡｂは自然に培地へと分泌され、ＭＡｂは、その培地から容易に高濃度で得られ得る。どちらかの方法によって産生されたＭＡｂは、所望な場合、濾過、遠心分離および種々のクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）を用いてさらに精製され得る。
【００６４】
大量のモノクローナル抗体はまた、インビボでハイブリドーマ細胞を増殖することによって得られ得る。細胞クローンは、親細胞と組織適合性である哺乳動物（例えば、抗体産生腫瘍の増殖を生じる同系マウス）へと注射される。必要に応じて、動物は、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）のような油を注射の前に飲まされる。
【００６５】
本開示によれば、モノクローナル抗体のフラグメントは、上述の方法によって産生されるモノクローナル抗体から得られ得、この方法は、ペプシンもしくはパパインのような酵素を用いる消化、ならびに／または化学的還元によるジスルフィド結合の開裂を含む。あるいは、本発明によって包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、自動化されたペプチド合成機を用いてか、またはＥ．Ｃｏｌｉの遺伝子全体または遺伝子フラグメントの発現によって合成され得る。
【００６６】
（他の連結エレメント）
他の連結エレメントとしては、ペプチド、抗腫瘍薬剤、抗生物質、および他の治療用化合物が挙げられる。さらに、これらの連結エレメントに必要とされることは、標的分析物に対して、ある程度の特異性で結合する能力である。ペプチド、抗腫瘍薬剤、抗生物質および他の治療用化合物の使用は、この能力により、レセプター、補助因子、酵素、または連結エレメントに対して結合可能な任意の他の標的としての標的分析物を、同定または精製し得る。
【００６７】
ペプチド連結エレメントの例としては、以下が挙げられる：ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト（米国特許第４，０８６，２１９号、同第４，１２４，５７７号、同第４，２５３，９９７号および同第４，３１７，８１５号を参照のこと）、インスリン、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ　ｄｅｒｕｖａｔｉｖｅ）（米国特許第４，０８７，３９０号、同第４，０９３，５７４号、同第４，１００，１１７号および同第４，２５３，９９８号を参照のこと）、成長ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、これらの塩および誘導体（ＪＰ−Ａ５０−１２１２７３およびＪＰ−Ａ５２−１１６４６５を参照のこと）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、バソプレシン、バソプレシン誘導体、オキシトシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、パンクレオチミン、コレシストキニン、アンギオテンシン、ヒト胎盤性ラクトゲン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、エンケファリン、エンケファリン誘導体（米国特許第４，２７７，３９４号およびＥＰ−Ａ　３１，５６７を参照のこと）；およびポリペプチド（例えば、エンドルフィン、キョートルフィン（ｋｙｏｔｏｒｐｈｉｎ）、インターフェロン（α型、β型、γ型）、インターロイキン（Ｉ〜ＸＩ）、タフトシン、サイモポイエチン、チモシン（ｔｙｍｏｓｉｎ）、チモスチムリン（ｔｈｙｍｏｓｔｈｙｍｌｉｎ）、胸腺ホルモン因子（ｔｈｙｍｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｆａｃｔｏｒ）（ＴＨＦ）、血清胸腺因子（ｓｅｒｕｍ　ｔｈｙｍｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）（ＦＴＳ）およびそれらの誘導体（米国特許第４，２９９，４３８号を参照のこと）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）（ＣＳＦ）、モチリン、デイノルフィン（ｄｅｉｎｏｒｐｈｉｎ）、ボンベシン、ニューロテンシン、セルレイン、ブラジキニン、ウロキナーゼ、アスパラギナーゼ、カリクレイン、サブスタンスＰ、神経発育因子、血液凝固因子（ｂｌｏｏｄ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）ＶＩＩＩおよびＩＸ、塩化リゾチーム、ポリミキシンＢ、コリスチン、グラミシジン、バシトラシン、タンパク質合成−刺激ペプチド（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ）（英国特許第８，２３２，０８２号を参照のこと）、胃抑制性ポリペプチド（ＧＩＰ）、血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ、ソマトクリニン（ｓｏｍａｔｏｃｌｉｎｉｎｅ））、骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈａｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＭＰ）、上皮増殖ホルモン（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＥＧＦ）など。
【００６８】
抗腫瘍薬剤の例としては、以下が挙げられる：塩酸ブレオマイシン、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、塩酸ダウノルビシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、テトラヒドロフリル−５−フルオロウラシル、ピシバニル、レンチナン、レバミゾール、ベスタチン、アジメキソン、グリチルリジン、ポリＡ：Ｕ、ポリＩＣＬＣなど。
【００６９】
抗生物質の例としては、以下が挙げられる：ゲンタマイシン、ジベカシン、カネンドマイシン、リビドマイシン、トブラマイシン（ｔｏｂｒｏｍｙｃｉｎ）、アミカシン、フラジオマイシン、シソマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン（ｒｏｌｉｔｅｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ドキシサイクリン、アンピシリン、ピペラシリン、チカルシリン、セファロチン、セファロリジン、セフォチアム、セフスロジン、セフメノキシム、セフメタゾール、セファゾリン、セフォタキシム、セフォペラゾン、セフチゾキシム、モキサラクタム（ｍｏｘｏｌａｃｔａｍｅ）、チエナマイシン、スルファゼシン（ｓｕｌｆａｚｅｃｉｎｅ）、アズスレオナム（ａｚｕｓｌｅｏｎａｍ）、これらの塩など。
【００７０】
治療用薬物の例としては、以下が挙げられる：解熱剤、鎮痛薬、および抗炎症薬剤（例えば、サリチル酸、スルピリン、フルフェナム酸、ジクロフェナク（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃｅ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔａｃｉｎ）、モルヒネ、ペチジン、酒石酸レボルファノール、オキシモルホンなど）；鎮咳去痰薬（例えば、エフェドリン、メチルエフェドリン、ノスカピン、コデイン、ジヒドロコデイン、アロクラミド、クロロフェジアノール（ｃｈｌｏｒｐｈｅｚｉａｎｏｌ）、ピコペリダミン（ｐｉｃｏｐｅｒｉｄａｍｉｎｅ）、クロペラスチン（ｃｌｏｐｅｒａｓｔｉｎｅ）、プロトキロール、イソプロテレノール、サルブタモール、テレブタリン（ｔｅｒｅｂｕｔａｌｉｎｅ）、これらの塩など）；鎮静薬（例えば、クロルプロマジン、プロクロルペラジン（ｐｒｏｃｈｌｏｐｅｒａｚｉｎｅ）、トリフルオペラジン、アトロピン、スコポラミン、これらの塩など）；筋弛緩薬（例えば、プリジノール、ツボクラリン、パンクロニウムなど）；鎮痙薬剤（例えば、フェニトイン、エトスクシミド、アセタゾラミド、クロルジアゼポキシドなど）；抗潰瘍薬剤（例えば、メトクロプラミド、ヒスチジンなど）；抗うつ薬（例えば、イミプラミン、クロミプラミン、オンキシプチリン（ｏｎｘｉｐｔｉｌｉｎｅ）、フェネルジンなど）；抗アレルギー薬剤（例えば、塩酸ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、塩酸トリペレナミン、塩酸メトジラジン、塩酸クレミゾール、塩酸ジフェニルピラリン、塩酸メトキシフェナミン（ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｅｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）など）；強心薬（例えば、トランスピエオキソカンファー（ｔｒａｎｓｐｉｅｏｘｏｃａｍｐｈｏｒ）、テレフィロール（ｔｅｒｅｐｈｙｌｏｌ）、アミノフィリン、エチレフリン（ｅｔｉｌｉｆｒｉｎｅ）など）；抗不整脈薬（例えば、プロプラノロール、アルプレノロール、ブフェトロールオキシプレノロール（ｂｕｆｅｔｏｌｏｌｏｘｙｐｒｅｎｏｌｏｌ）など）；血管拡張薬（例えば、オキシフェドリン、ジルチアゼム、トラゾリン、ヘキソベンジン、バメタンなど）；降圧利尿薬（例えば、臭化ヘキサメトニウム、ペントリニウム、メカミラミン、エカラジン、クロニジンなど）；抗糖尿病薬剤（例えば、グリミジン、グリピジド、フェンホルミン、ブホルミン、メトホルミンなど）；抗血液凝固薬（例えば、ヘパリン、クエン酸など）；止血剤（例えば、トロンボプラスチン、トロンビン、メナジオン、アセトメナフトン、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、カルバゾクロムスルホン酸、アドレノクロム・モノアミノグアニジンなど）；抗結核薬剤（例えば、イソニアジド、エタンブトール、パラアミノサリチル酸など）；ホルモン性薬剤（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベータメタゾン、ヘキセストロール、メチマゾールなど）；麻酔アンタゴニスト（ｎａｒｃｏｔｉｃ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）（例えば、レバロルファン、ナロルフィン、ナロキソン、これらの塩など）。
【００７１】
（設計された微粒子に対する連結エレメントの付着）
本発明の性質は、元の設計された微粒子を、認識エレメントへと、連結エレメントを用いて合成することによって変換するために使用され、この性質は、連結エレメントの性質によって広範囲に変動し得る。
【００７２】
いくつかの場合において、複合体は、設計された微粒子および連結エレメントを接続する架橋剤、を含み得る。複合体は、必要に応じて二次連結エレメントを介して、連結エレメントまたは微粒子に接続される標識をさらに含み得る。複合体は、粒子に結合する多くの連結エレメントを含み得る。
【００７３】
抗体および抗体の性質を有する抗体フラグメントは、付着のために使用され得る。抗体を微粒子の表面上にコーティングするための適切な技術が存在し、この技術は当業者に周知である。粒子にコーティングされた抗体は、微生物細胞またはいくつかの他の標的分析物上に存在し得る対応する抗原を認識可能で、そしてこの抗原に結合可能である。
【００７４】
オリゴ核酸プローブを微粒子（例えば、本明細書中に記載される設計された微粒子）に結合するための方法はまた、公知である。適切な技術は、特許出願番号ＷＯ９３／０４１９９中に一例として記載される。連結エレメントが核酸プローブまたは核酸アナログプローブである場合、得られる微粒子は、もちろん相補的な核酸配列を認識して結合するために適切である。
【００７５】
連結エレメントを微粒子に付着する他の方法は、官能基化された架橋剤の使用を含む。このような架橋剤は、当業者に周知である。この範囲の架橋剤を記載する有用な参考文献は、一般的に入手可能で、その参考文献およびそれらの使用および制限は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中に見い出し得る。
【００７６】
（標識）
さらなる標識の使用は、設計された微粒子の検出感度をさらに増加させ、そしてその磁気特性および界面動電特性を変えるために、利用され得る。例えば、発蛍光団または発色団（ｃｈｒｏｍａｐｈｏｒｅ）を有する抗体を、設計された微粒子に結合し得、その結果、そのように形成された複合体を、磁気的手段および／または界面動電的手段、ならびに蛍光または色による検出によって、最初の設計された微粒子とはさらに区別し得る。
【００７７】
このような標識は、微粒子または連結エレメントに結合し得、その前か、同時か、あるいはその後のいずれかに標的分析物と設計された微粒子との間の複合体を形成する。標識は、標識によって運ばれる二次連結エレメントを含み得る。再度、二次連結エレメントによってもたらされる標的分析物に対するアフィニティーが選択的であるのが好ましく、好ましくはこのアフィニティーが高度に特異的であって、そして二次連結エレメントはまた、抗体、抗体活性を有する抗体フラグメント、抗原、核酸プローブ、核酸アナログプローブ、アビジンまたはアビジン様分子であり得る。この性質の標識の使用は、複合体の検出の準備を補助するために所望され得、そして／または微粒子と標的分析物との複合体が、それ自身では特有の磁気特性および界面動電特性を十分に所有しない場合は、従って磁気特性および界面動電特性は、標識の複合体中の含有物によって、さらに変わり得る。このために、この標識は、発蛍光団または発色団、あるいは微生物、金属粒子、ポリマービーズまたは磁性粒子であり得る。適切な材料は、抗体に容易に結合して（二次種として）、標識を形成する、コロイド状の金である。コロイド状の金に結合する抗体は、市販されており、そして抗体をコロイド状の金に結合するための方法は、例えば、Ｇｅｏｈｅｇａｎら（１９７８）中に記載されている。しかし、他の金属粒子（例えば、銀粒子および鉄粒子）が使用され得る。
【００７８】
上述の種類の標識の使用は、リガントと粒子との複合体が特有の磁気特性および界面動電特性を十分に有して、観測されるべきこのような複合体の形成を可能にする場合であっても、適切であり得る。より高いレベルの特異性は、特定の場合において、このような複合体中の標識の使用によって得られ得る。従って、例えば、抗原Ａを発現する微生物と、抗原ＡおよびＢを発現する微粒子とを識別することを望み得る。これは、連結エレメントとしてＡに対する抗体を有する設計された微粒子、およびその連結エレメントがＢに対する抗体である場合に有する標識の使用によって達成され得る。標識された複合体（設計された微粒子と微生物と標識との間）と、標識されていない複合体（設計された微粒子と微生物の間）の特徴の違いが、観測され得、そして抗原Ａのみを発現する微生物を、ＡおよびＢを発現する微生物と識別するために使用され得る。
【００７９】
細胞およびより小さな粒子の両方のための標識は、蛍光マーカーを含み得、例えば、この蛍光マーカーは、ＦＩＴＣまたはローダミン、発色団、発光マーカーまたは酵素分子であって、これらは検出可能な信号を生成し得る。酵素分子の例としては、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。これらのマーカーは、当業者に周知の分光学的技術を用いて検出し得る。
【００８０】
（具体例としての微粒子に基づく標識およびこれらの使用）
以下の設計された微粒子に基づく標識は、本開示の使用をさらに詳細に示すために挙げられる。以下の特許出願および刊行物のほとんどにおいて、本発明に使用し得る連結エレメント、架橋剤、あるいは連結エレメントを微粒子、標的分析物に結合または付着する方法、ならびに他の方法論を記載し、これらは本明細書中で参考として援用される。
【００８１】
生物学的液体（例えば、薬物、ホルモン、ビタミン、および酵素）の物質の濃度を決定するための方法であって、その中で磁気応答性で、浸透性で、固体で、水不溶性な微粒子が使用されることが、米国特許第４，１１５，５３４号で開示されている。
【００８２】
米国特許第４，２８５，８１９号は、キレートの形成によって余分な水性の流れから溶解したイオンを除去するために使用し得る微粒子を記載する。米国特許第３，９３３，９９７号は、抗ジゴキシン抗体が磁気応答性粒子に結合する場合に、ジゴキシンに関する固相放射免疫アッセイを記載する。
【００８３】
抗体層でコーティングされた小さな磁性粒子は、米国特許第３，９７０，５１８号で使用され、選択器官および細胞をそれらの母集団から区別して分離するための、大きくて広範囲に分布された表面積を提供する。米国特許第４，０１８，８８６号は、選択タンパク質をそれらの検出可能な溶液から分離するための大きくて広範囲に分布された表面積を提供するために使用される小さな磁性粒子を開示する。この粒子は、選択タンパク質と特異的に相互作用するタンパク質でコーティングされている。
【００８４】
米国特許第４，０７０，２４６号は、安定な、水不溶性のコーティングを基材上に含む組成物を記載し、この組成物に対して、生物学的に活性なタンパク質が共有結合的に結合され得、その結果、得られる生成物は、タンパク質の生物学的特性および基材の機械的特性（例えば、金属支持体の磁気特性）を有する。
【００８５】
通常は分離可能なタンパク質でコーティングされた粒子の混合物を使用する診断方法は、米国特許第４，１１５，５３５号で議論されている。アクロレインホモポリマーの微粒子、および親水性コモノマー（例えば、メタクリル酸および／またはヒドロキシエチルメタクリレート（ｈｙｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））とのコポリマーの微粒子は、米国特許第４，４１３，０７０号で議論されている。米国特許第４，４５２，７７４号は、磁性の鉄−デキストラン微粒子を開示し、この微粒子は、抗体、酵素および他の生物学的分子に共有結合的に結合し得、そして磁場によって、細胞ならびに他の生物学的粒子および分子を標識かつ分離するために使用し得る。コーティングされた磁化可能な微粒子、これらの可逆的な懸濁液、およびこれらに関するプロセスが、米国特許第４，４５４，２３４号で開示されている。各々のイオンビーズと複雑に混合した強磁性材料を使用する混合樹脂ビーズ中のアニオンビーズからカチオンビーズを分離する方法は、米国特許第４，５２３，９９６号中に記載されている。磁性粒子のコロイドを利用する磁気的な分離方法は、米国特許第４，５２６，６８１号で議論されている。英国特許出願ＧＢ２，１５２，６６４Ａは、磁性アッセイ試薬を開示する。
【００８６】
鉄−デキストラン粒子の抗体分子への共有性結合によって作製される高電子密度の抗体接合体は、Ｄｕｔｔｏｎら（１９７９）によって報告される。Ｉｔｈａｋｉｓｓｉｏｓら（１９７７）は、放射能アッセイでのタンパク質を含有する磁性微粒子の使用を記載する。高傾斜磁場クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いる、免疫特異的な鉄デキストラン微粒子で標識された細胞の分離は、Ｍｉｌｄａｙら（１９８４）に開示される。Ｍｏｌｄａｙら（１９８２）は、細胞の標識および磁気的分離のための免疫特異的な強磁性の鉄−デキストラン試薬を記載する。細胞の標識および分離における磁性微粒子の適用はまた、Ｍｏｌｄａｙら（１９７７）によって開示される。ヒトアルブミンおよび生物学的液体の固体相蛍光免疫アッセイは、Ｍａｒｇｅｓｓｉら（１９７８）によって議論される。Ｎｙｅら（１９７６）は、固体相磁性粒子放射免疫アッセイを開示する。磁性液体は、Ｒｏｓｅｎｗｅｉｇ（１９８３）によって記述される。細胞分離のための方法における磁性タンパク質Ａ微粒子およびこれらの使用は、Ｗｉｄｄｅｒら（１９７９）によって開示されている。
【００８７】
米国特許第５，２７９，９３６号は、混合物の他の成分からの目的の成分の、分離を、目的の成分の磁性粒子への結合を生じることによって行なう方法に関する。本発明の実施形態において、この方法は、他の成分を含む混合物から細胞を分離するための方法であって、この方法は、細胞および他の成分を含む第１の液体培地と第２の培地（第１の液体培地と比べて異なる密度および／または異なる粘度である）とを層状にする工程を包含する。細胞は、常磁性粒子に結合される。層状の第１の液体培地および第２の液体培地は、磁場の傾斜にさらされ、この傾斜によって細胞粒子が第２の培地へと移動する。次いで、細胞を第２の液体培地中に単離する目的は、さらなる実施形態によって、第２の液体培地から細胞を分離することである。
【００８８】
米国特許第４，９３５，１４７号は、有機生化学分析物および無機生化学分析物、特に体液の分析における目的のこれらの分析物のアッセイにおける磁気的分離の適用を特異的に標的する方法である。本発明の方法は、このような粒子の磁性粒子に対する化学的に制御される非特異的な可逆的結合によって、非磁性粒子を培地から分離する方法を提供する。磁性粒子のサイズが小さいために、この方法はまた、分離されるべき基材の非常に迅速な結合を提供する。次いで粒子を凝集することによって、以前の方法によって達成されるよりも非常に迅速でかつ完全な磁気的分離が、提供される。
【００８９】
細胞分離に関する分野における他の現行の実施は、例えば、中空線維、フラットシート膜、またはベッドに充填されたビーズ、または選択的な細胞分離のために物理的に吸着されるかまたは共有結合された化学物質または抗体を有する粒子材料のマトリックス材料を利用する。これらのデバイスは、連続的に全血または血液成分が流入および戻され得るように設計される。これらの装置は、所望の細胞の濃度が、他の細胞型に比較して非常に低くあり得るような条件下で、正常な血液流速で作動するため、分離プロセスはしばしば効果的でない。さらに、これらのシステムを用いて、生存能力のある状態において、選択された細胞を収集することは難しい。
【００９０】
常磁性ビーズの開発は、標的分析物の磁気的分離の予想を提供する。磁性粒子および常磁性粒子を製造するための種々の方法は、以下の米国特許に開示されている：米国特許第４，６７２，０４０号；米国特許第５，０９１，２０６号；米国特許第４，１７７，２５３号；米国特許第４，４５４，２３４号；米国特許第４，５８２，６２２号；米国特許第４，４５２，７７３号；米国特許第５，０７６，９５０号；米国特許第４，５５４，０８８号；および米国特許第４，６９５，３９２号。
【００９１】
種々の方法は、アッセイのための磁性粒子を使用するために考案された。例えば、以下の米国特許を参照のこと：米国特許第４，２７２，５１０号；米国特許第４，７７７，１４５号；米国特許第５，１５８，８７１号；米国特許第４，６２８，０３７号；米国特許第４，７５１，０５３号；米国特許第４，９８８，６１８号；米国特許第５，１８３，６３８号；米国特許第４，０１８，８８６号；および米国特許第４，１４１，６８７号。
【００９２】
生物学的成分（細胞を含む）を分離するために磁性粒子を使用する試みが行なわれた。以下は、本出願人に公知の米国特許の一覧であり、これらは磁気分離機およびその方法に関すると考えられる：米国特許第４，８５５，０４５号；米国特許第４，６６４，７９６号；米国特許第４，１９０，５２４号；米国特許第４，７３８，７７３号；米国特許第４，９４１，９６９号；米国特許第５，０５３，３４４号；米国特許第５，２００，０８４号；米国特許第４，３７５，４０７号；米国特許第５，０７６，９１４号；米国特許第４，５９５，４９４号；米国特許第４，２９０，５２８号；米国特許第４，９２１，５９７号；米国特許第５，１０８，９３３号；米国特許第４，２１９，４１１号；米国特許第３，９７０，５１８号；および米国特許第４，２３０，６８５号。
【００９３】
多くの技術が、因子（例えば、ウイルス、細菌、および真菌）の、迅速でかつ正確な検出のための、ならびに正常な遺伝子および異常な遺伝子の検出のための要求を満たすために、微粒子に基づく方法を用いて最近開発されている。このような技術としては、試験サンプル中の微量の標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の増幅および検出（および後に続く測定）が一般的に挙げられ、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら、１９８５；１９８８；ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｎｒｙ　Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、１９９３）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙ、１９９１）、ストランド置換増幅（ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２）、Ｑβレプリカーゼ増幅（Ｑβ　ｒｅｐｌｉｃａｓｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＱβＲＡ）（Ｗｕら、１９９２；Ｌｏｍｅｌｉら、１９８９）および自律増幅（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０）が挙げられる。
【００９４】
このような技術の他の適用としては、個々および集団における、単一の遺伝子の遺伝的障害の検出および特性決定が挙げられる（例えば、単一の遺伝子欠損（点変異を含む）を検出するための連結技術を開示する、Ｌａｎｄｅｒｇｒｅｎら、１９８８を参照のこと）。このような技術は、疾患（例えば、鎌状赤血球貧血）および欠失した遺伝子配列または重複した遺伝子配列（例えば、サラセミア）を生じ得る単一のヌクレオチドの相違（点変異）を明確に識別し得るべきである。
【００９５】
（ハンドル）
異なる型の設計された微粒子が、特定の分析物に指向する異なるプローブに連結される場合、異なる標的分析物は、同時に標識され得、さらに分析物混合物内で個別に操作され得る。その標的分析物に結合する状態で、感作される設計された微粒子標識（１個以上の連結エレメントまたは追加の標識に結合する設計された微粒子）は、分析物を細胞溶解物（例えば、血清または他の生物学的サンプル）から引き出すために使用され得る「ハンドル」として作用する。多数の標識された分析物は、切り替え可能な、周波数に依存する様式で、同時に操作され得る。
【００９６】
ハンドルとしての作用に加えて、プローブで感作される設計された微粒子はまた、「検出」のために使用され得、そして１つの実施形態において、同時に、またはほぼ同時に、分析物の検出のために使用され得る。この開示の利点を用いて、設計された微粒子は、誘電特性および、それによる誘電泳動挙動が、分析物の結合に対して非常に高感度であるように設計され得る。サンプル中の標的分析物の存在は、ＡＣ界面動電挙動におけるこの変化を観測することによって検出され得る。
【００９７】
上記の点に鑑みて、本開示の設計された微粒子は、細胞および生体分子のＡＣ界面動電操作のために使用され得、一体化され、そして自動化されたミクロシステム（これは、遠心分離または免疫検出のような従来の方法では、実施するのが困難であるかまたは実現不可能である）のための改良された分離方法および検出方法の開発のための技術を可能にする技術を提供することは、当業者には明らかである。これらの改良法を利用するデバイスは、前述のように、種々の診断および研究への適用に有用であり得る。
【００９８】
１つの実施形態において、混合された細胞懸濁液からの疑わしい細胞の単離、同定など、そして誘電的に指標付けされた設計された微粒子の混合物の操作が、一体型デバイスの中で全て、達成され得る。これらの工程を達成することは、究極的には、それを懸濁する溶液に関して物質を移動する方法（誘電泳動が理想的に適合する問題）に依存する。誘電泳動の原理は、当該分野で公知であるが、本明細書中で議論される設計された微粒子に対する特定のこれらの原理は、以下の章で説明し、適用する。
【００９９】
（ＡＣ界面動電現象）
ＡＣ界面動電現象は、交互の電場が粒子上に力を誘導する、関連する一群の効果である。これらの力は、粒子および周囲の誘電特性に依存する。最も知られた界面動電現象は、従来の誘電泳動（ｃＤＥＰ）である。用語「誘電泳動（ＤＥＰ）」は、最初にＰｏｈｌによって使用され、不均一性の電場中における最小の誘電電位に向かう分極性粒子の運動を記述する（Ｐｏｈｌ、１９７８；Ｓａｕｅｒ、１９８５；ＫａｌｅｒおよびＪｏｎｅｓ、１９９０；Ｈｏｌｚｅｌら、１９９１；Ｇａｓｃｏｙｎｅら、１９９３）。この現象は、細胞を「パールチェーン（ｐｅａｒｌ　ｃｈａｉｎ）」形成を通じて密接に接触させるために、細胞融合および電気穿孔デバイスにおいて活用される（Ａｂｉｄｏｒら、１９９４；Ｗｕら、１９９４）。より最近には、他の界面動電現象（電気回転（ＲＯＴ、回転電場によって粒子に働くトルクから生じる粒子の回転）（ＡｒｎｏｌｄおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ、１９８２および１９８８；Ｆｕｈｒら、１９９０；Ｈｕら、１９９０；Ｇｉｍｓａら、１９９１；ＨｏｌｚｅｌおよびＬａｍｐｒｅｃｈｔ、１９９２；Ｈｕａｎｇら、１９９２；Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖら、１９９３；Ｗａｎｇら、１９９４ｃ）および進行波誘電泳動（ｔｗＤＥＰ、空間全体を掃引する電場によって生じる粒子の横方向の移動）（Ｍａｓｕｄａら、１９８８；Ｈａｇｅｄｏｒｎら、１９９２；Ｈｕａｎｇら、１９９３、Ｇａｓｃｏｙｎｅら、１９９４ａ）を含む）が、細胞および生体分子の非侵襲性の特性決定および操作における、それらの適用に関して研究されている。
【０１００】
ＡＣ界面動電現象は、電場と、その電場により粒子に誘導される分極との間の相互作用から生じる。この効果は、いくつかのグループによって詳細に研究されており、そしてその理論はかなり明確に確立されている（Ｐｅｔｈｉｎｇ、１９７９；Ｊｏｎｅｓ、１９９５）。誘電泳動、およびさらによく知られている「電気泳動」は両方とも界面動電現象を記述するが、これらはいくつかの基本的な違いによって区別されることに注意することが重要である。誘電泳動において、粒子の運動は、適用される電場によって粒子中に誘導される電荷の大きさ、極性、位相によって決定される。粒子が、誘電泳動を受けるための固有の正味の電荷を保有することは必要でない。しかし、電気泳動は、粒子が固有の正味の電荷を保有することを必要とする。粒子の運動を引き起こすのは、この固有の電荷と、電場との間の相互作用である。さらに、電気泳動は、典型的には、均質な、直流電場を利用する。誘電泳動は、直流かまたは交流のいずれかであり得る不均一な電場の使用を必要とする。ＡＣ界面動電現象、ｃＤＥＰ、ｔｗＤＥＰ、ｇＤＥＰおよびＲＯＴは、一般的に使用される電気泳動法よりも、本来は、ずいぶん汎用性であるという事実にもかかわらず、化学およびライフサイエンスにおける分離および分析についてほとんど考慮していない。ＡＣ界面動電法の以下の利点を考慮のこと：
（１）　粒子中に誘導される電荷の大きさおよび符号は、粒子の誘電特性に強く依存する。設計された微粒子の場合において、これは、粒子コーティングおよびコア材料の特性を含む。広範囲の誘電特性を有する粒子は、コーティングの厚さおよび組成、ならびにコア粒子の組成を変えることによって作製され得る。
【０１０１】
（２）　粒子中に誘導される電荷の大きさおよび符号は、固定されないが、適用される電場の周波数および粒子が懸濁される媒体の特性に非常に依存する。この理由のために、設計された微粒子は、周波数に依存する様式で個別に取り扱われ得る。
【０１０２】
（３）　ＡＣ界面動電現象は、単に直線移動の１つの型を具体化するのではなく、二次元における種々の運動効果を具体化し、この現象は、粒子を操作するためだけではなく、それらの誘電特性を特徴付けるためにも活用され得る。
【０１０３】
（４）　（１）および（２）に記載したように、粒子のＡＣ界面動電応答は、粒子の誘電特性に対して高感度である。設計された微粒子は、それらの誘電特性が、分析物の結合に対して非常に感度がいいように製造され得る。このような設計された微粒子は、結合していない設計された微粒子と、分析物−微粒子の複合体を識別する方法を提供する。この型の設計された微粒子は、定性的に、ある場合は定量的に、分析物の同定のために使用され得る。
【０１０４】
（５）　細胞の二次元での運動が、電場の構成、電場の周波数、および懸濁する媒体の誘電特性に強く依存することは、種々の異なる適用で目標とされる粒子分離技術の汎用性を約束する。
【０１０５】
これらの現象の全ては、適切に適用される電場の構成による、粒子の誘電特性を完全に活用するために、個別にかまたは同時に使用され得る。
【０１０６】
（一般化された誘電泳動理論）
課された電場ベクトル
【０１０７】
【数１】
2004503758.tif 000002
に起因する粒子に作用する誘電泳動力は、電場が粒子中に誘導する効果的な双極子モーメントベクトル
【０１０８】
【数２】
2004503758.tif 000003
の観点から
【０１０９】
【数３】
2004503758.tif 000004
として非常に一般的に書かれ得る（Ｈｕａｎｇら、１９９２および１９９３；Ｇａｓｃｏｙｎｅら、１９９４ｂ；Ｗａｎｇら、１９９４ａ）。
【０１１０】
周波数ドメインにおいて、誘導された粒子双極子モーメントは、
【０１１１】
【数４】
2004503758.tif 000005
によって与えられる。
【０１１２】
ここで、ωは、適用される電場の角振動数であり、ｒは、粒子径であり、そしてｆＣＭは、
【０１１３】
【数５】
2004503758.tif 000006
として規定されるクラウジウス−モソッティ因子である。
【０１１４】
ここで、ε＊ｐおよびε＊ｍは、それぞれ、粒子およびその懸濁媒体の複素誘電率である。最近まで、ｃＤＥＰおよびｔｗＤＥＰ（Ｈｕａｎｇら、１９９３）を含む異なる界面動電現象を記載する式は、適切な空間式を
【０１１５】
【数６】
2004503758.tif 000007
の代わりに使用して、力の式の特別な場合に帰着することによって、誘導された。しかし、空間および時間に対する電場の混合偏導関数は、電場が連続なままであるために、シュワルツの関係に従わなければならない（Ｇｅｌｌｅｒｔら、１９７７）という事実を利用することによって、時間平均誘電泳動力が、
【０１１６】
【数７】
2004503758.tif 000008
で表され得ることが最近誘導された（Ｗａｎｇら、１９９４ａおよび１９９４ｂ）。
【０１１７】
ここで、Ｅ（ｒｍｓ）は、電場強度のｒｍｓ値である。Ｅｉ０およびφｉ（ｉ＝ｘ；ｙ；ｚ）は、それぞれ、主軸方向の電場成分の大きさ、および位相である。以前の分析とは異なり、この式は、適用される電場の任意の形態から生じる力を研究するのに使用され得る。この式は、初めて、ｇＤＥＰ運動に対して寄与する２つの独立した力が存在することを認識し得る２つの項を含む。
【０１１８】
（ｉ）　左側の項は、粒子中の誘導された双極子モーメントの実数（同相）部分（Ｒｅ（ｆＣＭ））、および電場の大きさの空間不均一性、▽Ｅ（ｒｍｓ）２に関する。この力は、Ｒｅ（ｆＣＭ）が正であるか負であるかに依存して、粒子を強い電場領域または弱い電場領域に向かうようにする（図２ａ）。これは、従来のＤＥＰ項である（Ｈｕａｎｇら、１９９２；ＪｏｎｅｓおよびＫａｌｌｉｏ、１９７９）。
【０１１９】
（ｉｉ）　右側の項は、誘導された双極子モーメントの虚数（違相）成分、および電場相の電場の空間不均一性（▽φｘ、▽φｙおよび▽φｚ）に関する。Ｉｍ（ｆＣＭ）の極性に依存して、この力は、粒子を電場成分の相がより大きい（Ｉｍ（ｆＣＭ）＞０）またはより小さい（Ｉｍ（ｆＣＭ）＜０）領域に向かうようにする（図２ｂ）。進行する電場に関する拘束条件下、式４は、ｔｗＤＥＰ力の式を減少させる（Ｈｕａｎｇら、１９９３）。
【０１２０】
式４は、ＡＣ電場中の粒子によって受けた力が、Ｐｏｈｌ（１９７８）によって推測されるような電場の「大きさの」不均一性だけから生じるのではなく、電場の「位相の」不均一性からも生じることを示す。発明者らは、大きさの不均一性および位相の不均一性の両方によって生じる粒子の運動を「一般化した誘電泳動」と呼んだ。全ての電場誘導性の細胞運動は、式４によって理解可能であるため、位相および大きさの不均一性を両方とも有する精巧な（ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｅｄ）電場構造は、当該分野で公知の方法論によって探求され得る。
【０１２１】
（ＲＯＴによる、設計された微粒子の特性決定）
設計された微粒子を含む粒子の誘電特性は、電気回転によって確立され得る。電気回転において、粒子は回転する電場にさらされ、そして本質的に安定な軸の周りを回転するように誘導される。この方法は、他の特性決定方法よりも適切である。というのも、この方法は、比較的直接的であり、良好な再現性を示し、そして個々の粒子を特徴付けるための手段を提供するからである。粒子の誘電特性は、任意の界面動電現象によって非侵襲的に調べられ得るが、ＲＯＴは、ほとんどの目的に関して、空間に静止しているとみなされ得る軸の周りの粒子回転を誘導するという顕著な利点を示す。従って、この粒子は、一定の電界強度の状態のままである。ＲＯＴトルク、
【０１２２】
【数８】
2004503758.tif 000009
は、電場の不均一性に依存しない（ＡｒｎｏｌｄおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ、１９８２および１９８８；Ｆｕｈｒ、１９８５）が、
【０１２３】
【数９】
2004503758.tif 000010
のクロス乗積に依存し、周波数領域において、このトルクの大きさは、
【０１２４】
【数１０】
2004503758.tif 000011
で書かれ得る（ＡｒｎｏｌｄおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ、１９８２および１９８８；Ｆｕｈｒ、１９８５）。
【０１２５】
３種類の異なる粒子、またはこの場合の細胞、型に関して誘導された典型的なＲＯＴスペクトルが、図３に示される。式６は、各スペクトルの形状が、各粒子型に関するＩｍ（ｆＣＭ）を反映していることを示す。適切な誘電モデルを適用することによって、設計された微粒子の誘電特性を、ＲＯＴスペクトルから直接誘導することが可能である。粒子特性の明確な誘電モデルは、誘電性シェルモデル（Ｈｕａｎｇら、１９９２；Ｆｕｈｒ、１９８５；Ｉｒｉｍａｊｒｉら、１９７９）、を用いてほとんど頻繁に行なわれ、そして、発明者（Ｈｕａｎｇら、１９９２；Ｗａｎｇら、１９９４ｃ；Ｇａｓｃｏｙｎｅら、１９９４ｂ）、およびその他（ＨｏｌｚｅｌおよびＬａｍｐｒｅｃｈｔ、１９９２）は、粒子に関する誘電データがＲＯＴから誘導され得る与え得る理論に貢献している。
【０１２６】
発明者らはまた、誘電パラメータがＲＯＴ分析から誘導され得る精度を分析した（Ｇａｓｃｏｙｎｅら、１９９４ｂ）。これによって、本発明者らが、微粒子の本質的な誘電的局面および構造的局面を理解し得るだけでなく、また、式４と組み合わせて、全ての電場構造に関して全ての懸濁液条件下で、微粒子の界面動電挙動を予想し得る。類似の磁気回転実験はまた、微粒子の磁気特性を特性決定するために行なわれ得る。
【０１２７】
（設計された微粒子の誘電性モデル）
図１に図示され、そして添付の文章で説明されるような、設計された微粒子の構造は、誘電特性の点において、薄い、不十分な導電性シェルによって囲まれた球状の導電性内部によって、近似され得る（たとえ、内部が、今度は、導電性シェルによって囲まれた誘電性コアとしても）。このような粒子の複素誘電率ε＊ｐは、
【０１２８】
【数１１】
2004503758.tif 000012
によって与えられる（Ｉｒｉｍａｊａｒｉら、１９７９；Ｈｕａｎｇら、１９９２）。
【０１２９】
ここで、ε＊ｉｎｔｅｒｉｏｒおよびε＊ｓｈｅｌｌは、粒子内部および絶縁性シェルの複素誘電率の導電率および誘電率であり、ｒは、粒子径であり、そしてｄは、絶縁層の厚さである。設計された微粒子のｃＤＥＰおよびｔｗＤＥＰのＡＣ界面動電応答は、式４および式７を用いて当該分野で公知の方法論に従って、モデリングされ得る。
【０１３０】
図４は、約１ｎｍと１０ｎｍとの間で変動するシェル厚さを用いて設計された微粒子のｃＤＥＰおよびｔｗＤＥＰ応答を示す。異なる組成の設計された微粒子は、種々の周波数のＡＣ電場に対して実質的に異なる応答を示すことが、図４から明らかである。単一の微粒子型の周波数応答は、「誘電指紋（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）」といわれ、異なる構造を有する微粒子を識別し得る。
【０１３１】
より複雑な誘電指紋を有する設計された微粒子は、コア材料の上に制御された厚さの複数の材料層を適用することによってか、または分散性であるコア材料を用いることによって、製造され得る。これらのより複雑な設計された微粒子のＡＣ界面動電応答は、当該分野に公知の複数シェルの誘電性モデルの使用を通じて予測され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｊｏｎｅｓ（１９９５）によって記載される）。さらに、他の非同心性の構造は、球状のシェル等価体によって製造され得、そしてモデリングされ得る。
【０１３２】
異なる誘電指紋を有する設計された微粒子のライブラリーは、異なる物理的組成物および構造を用いて設計された微粒子を製造することによって、容易に構築され得る。固有の誘電指紋を有する微粒子は、独立してアドレス可能であり得、サンプル混合物中のいくつかの異なる分析物を操作するための、周波数に依存するハンドルとして使用され得る。
【０１３３】
（磁気泳動）
不均一な磁場に置かれた体積νおよび透磁率μ＊ｐの粒子は、
【０１３４】
【数１２】
2004503758.tif 000013
の磁気泳動力を受ける。
【０１３５】
ここで、μｓは、懸濁媒体の透磁率であり、Ｒは、粒子径であり、ｋｃｍ（μ＊ｓ，μ＊ｐ，ωＨ）は、懸濁媒体に対する粒子の磁気分極率を記載する磁気クラウジウス−モソッティ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｃｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ）因子であり、そして、▽Ｈ（ｘ，ｙ，ｚ）２は、磁場強度の二乗のグラディエントである。ここで、ωＨは、適用される磁場の周波数であり、そして静的磁場について０の値を有する。誘電の式（式２）と同様に、μ＊ｓおよびμ＊ｐは、それぞれ懸濁媒体および粒子の複素透磁率である。静的磁場の場合において、これらはそれぞれ、実数の、静的透磁率パラメータμｓおよびμｐになる。
【０１３６】
式８は、式２の磁気類似式であることに着目のこと。かわりに、粒子が永久体積磁化（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ　ｖｏｌｕｍｅ　ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）ｍを有する場合、磁気誘電力は、
【０１３７】
【数１３】
2004503758.tif 000014
である。
【０１３８】
粒子が、永久性および誘導性の磁気分極、成分の両方を有することが可能である。この場合において、式８および式９の組み合わせが適用され得る。例えば、粒子は、高い透磁率を有し得、そして同時に磁気レマネンス（ｒｅｍｎａｎｃｅ）を示し得る。磁気泳動の正式な議論については、読者は、Ｊｏｎｅｓ（１９９５）を参照する。
【０１３９】
磁気的に感受性の微粒子を収集するための磁気泳動の使用は、当該分野で周知である。Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ　Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）およびＭｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）のような出所からの製品は、免疫磁気分離（ＩＭＳ）および磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）として公知の磁気泳動に基づく分離技術のために慣用的に使用される。
【０１４０】
磁気微粒子は、多くの出所から容易に入手可能であるけれども、向上した分離のための磁気微粒子特性および誘電微粒子特性の同時活用は、新規なアプローチである。設計された微粒子を識別し、操作して、そして／または単離するために使用されるデバイスは、ＡＣ界面動電エレメントおよび磁気泳動エレメントの両方を含む。例えば、設計された微粒子のＡＣ界面動電操作は、ＡＣ信号が切り替えられる電極アレイを用いるｃＤＥＰ、ｔｗＤＥＰ、ｇＤＥＰおよびＲＯＴを含み得る。設計された微粒子の磁気泳動操作は、強力な磁石を用いて行なわれ得、この磁石は、この電極アレイの付近に局所的な磁場の不均一性を提供するための手段に適する。このようなデバイスにおいて、設計された微粒子は、ＡＣ界面動電操作力および磁気泳動操作力の両方を受ける；微粒子の誘電特性および磁気特性は、共にそれによって、高められた識別能力および操作能力を提供するために同時に活用され得る。
【０１４１】
（粒子の誘電特性の変化に対するＤＥＰ−ＦＦＦの感受性）
本発明者らは、平行な電極形状に関して、流体媒体に懸濁された誘電粒子に関する誘電泳動浮上力が、電極の上の高さを用いて指数関数的に低下することを理論的および実験的にの両方で示している（Ｗａｎｇら、１９９８）。この粒子が、電極面に対して沈降する傾向のあるような密度を有する場合、安定な誘電泳動浮上は、
【０１４２】
【数１４】
2004503758.tif 000015
によって与えられる平衡高さで生じる。
【０１４３】
ここで、Ｕは、電極アレイに印加される電気的ポテンシャルであり、Ａは、幾何的な項であり、ｐは、電極分極によって遮蔽されていない印加電場の比率であり、εｍは、懸濁媒体の誘電率であり、（ρｃ−ρｍ）ｇは、沈降の項であり、そして粒子−媒体界面で生じる誘電分極は、いわゆるクラウジウス−モソッティ因子Ｒｅ（ｆＣＭ）の実数部分によって記載される。
【０１４４】
ＤＥＰ−ＦＦＦにおいて、浮上は、流体力学的フロープロフィールに従って薄いチャンバー中を流れる流体内で生じる。従って、粒子の速度は、フローの流れ中の粒子の浮上高さｈｅｑに依存し、そして異なるｈｅｑ値を有する粒子は、結果的に、浮上の生じるチャンバーの長さに沿って、異なる速度で流れるので、始めの混合物から、分離され得る。
【０１４５】
ＤＥＰ−ＦＦＦ実験において、粒子の速度が、粒子の誘電特性の小さな変化に依存することを認識するために、誘電的な変化の前に、平衡高さの関数として粒子の速度を最初に記載することが有用である。誘電特性について式（１）の式を微分すると、
【０１４６】
【数１５】
2004503758.tif 000016
が得られる。
【０１４７】
分離チャンバーにおける流体力学的フロープロフィールが放物線である場合、粒子速度は、
【０１４８】
【数１６】
2004503758.tif 000017
に従って、その浮上高さに依存する。
【０１４９】
ここで、Ｈは、チャンバーの厚さであり、＜ν＞は平均流体速度である。
【０１５０】
従って、
【０１５１】
【数１７】
2004503758.tif 000018
として高さの増分変化に対応する、速度の増分変化を記載し得る。
【０１５２】
さらに、式（３）を６＜ν＞に関して変形すると、
【０１５３】
【数１８】
2004503758.tif 000019
が得られ得る。
【０１５４】
そして次いで、式（２）を用いて、
【０１５５】
【数１９】
2004503758.tif 000020
として、粒子の誘電特性における増分変化を粒子速度の対応する変化に関連付ける。
【０１５６】
ここで、再び、
【０１５７】
【数２０】
2004503758.tif 000021
である。
【０１５８】
式（６）の検査は、高さの増分変化に対する粒子速度の感度が、ｈｅｑおよびＲｅ（ｆＣＭ）が両方とも小さい場合、最大になるということを示す。ＤＥＰ−ＦＦＦ現象の極度の感受性は、これら２つの状態が、相互の関係にある傾向があるという事実から誘導される。例えば、本発明者らは、式（１）から、浮動が少しでも生じる
【０１５９】
【数２１】
2004503758.tif 000022
の閾値状態が存在することに着目する。
【０１６０】
このことは、誘電泳動力が、浮上のための電極面での沈降力を超えなければならないことを主張する。明らかに、
【０１６１】
【数２２】
2004503758.tif 000023
で一般化する条件に関して、印加される電圧Ｕは、浮動が実際に生じるが、それでも小さいものであることを確実にするために選択され得る。本発明者らは、Ｒｅ（ｆＣＭ）の大きさがより小さいこともまた、より小さな浮上高さを確実にすることに着目する。もちろん、実際の適用においてＵの大きさがどれくらいであり得るかということ、そしてそのためにＲｅ（ｆＣＭ）がどれくらい小さくなり得るかということに、実際的な制限がある。
【０１６２】
ｈｅｑおよびＲｅ（ｆＣＭ）は、式（６）の分母を支配するため、適切な条件が選択される場合、ＤＥＰ−ＦＦＦの増加する速度の、粒子の誘電特性における変化に対する感度は、そのために、非常に大きくなり得る。実際には、Ｒｅ（ｆＣＭ）の変化は、−０．０００１程度の小ささで、検出可能であり得、これは正に驚くべき感度である。
【０１６３】
これを説明するために、ヒトＨＬ−６０白血病細胞に対して、２０ミクロンの電極幅および空間を有する電極アレイ上で行なわれた実験において、以下のパラメータが得られることを観測した：
【０１６４】
【数２３】
2004503758.tif 000024
　式（１）から、浮上高さは、
【０１６５】
【数２４】
2004503758.tif 000025
として計算され、そして、速度感度パラメータは、
【０１６６】
【数２５】
2004503758.tif 000026
である。
【０１６７】
図７は、これらの実験的に確認されたパラメータに関して、粒子速度の感度の依存度は、出発値が−０．０１、−０．０２、−０．０４、−０．０８、−０．１６および−０．３２のＲｅ（ｆＣＭ）の小さな変化に対する、粒子速度の％変化として表現されることを示す。０．０２５の大きさのＲｅ（ｆＣＭ）への増加（図中で示される最大値）は、まだ非常に小さいものであるとみなされることに注目する。
【０１６８】
図７は、粒子／媒体の組み合わせのＲｅ（ｆＣＭ）が、小さい場合、ＤＥＰ−ＦＦＦ速度の、誘電特性の変化に対する感度は、実際に非常に大きいことを示す。例えば、出発値Ｒｅ（ｆＣＭ）＝−０．０１に関して、−０．００５のＲｅ（ｆＣＭ）の変化は、粒子速度を１２０％増加させる（マゼンタ曲線（ｍａｇｅｎｔａ　ｃｕｒｖｅ））。粒子速度の変化は、２％の小ささまで確実に測定し得る。というのは、感度は、わずか−０．０００１のＲｅ（ｆＣＭ）の変化を検出するのに十分であるからである。一方、Ｒｅ（ｆＣＭ）の出発値が、−０．３２である場合、粒子速度の変化の検出は、約−０．０３を超えるＲｅ（ｆＣＭ）の増加しか確実に検出できない。ＤＥＰ−ＦＦＦ検出アッセイにおける最も高いレベルの感度に関して、誘電性粒子および懸濁媒体は、Ｒｅ（ｆＣＭ）→０になるように明確に選択されるべきである。そのために、以下で、これが達成され得る条件について考察する。
【０１６９】
（クラウジウス−モソッティ因子ｆＣＭ）
電場が適用されている誘電性の媒体の中に置かれた粒子について考察する。誘電性の懸濁媒体および粒子は、電場に応答して分極する。しかし、粒子の誘電特性が、懸濁媒体の誘電特性と異なる場合、粒子および媒体は、異なる程度の分極を示し、これら２つの間の界面は、局所的な局在化を受け、界面を横切る誘電変位Ｄが連続している中ことを確実にする。図８において、卵形の粒子は、低い誘電率を有し、感知できるほどに分極しない。一方、高い誘電率を有する支持媒体は、分極し、そして粒子／媒体界面で界面分極して、誘電変位の連続性を維持する。このことは、水性懸濁液における空気の泡の場合をかなり正確に示す。また、水に懸濁されたポリマービーズの、ＤＥＰ−ＦＦＦ実験における単純化された考え方を示す（しかし、非常に重要な矛盾に関しては以降を参照のこと）。誘電分極の全ての組み合わせは、適用される電場が不均一な場合、粒子の誘電泳動応答を決定する。クラウジウス−モソッティ因子ｆＣＭは、懸濁媒体中の粒子の全体の分極を表し、そしてそのためにｆＣＭは、粒子および媒体の両方の分極の項を含む。ＡＣ界面動電の中心的な問題は、誘電泳動力が、モデリングされ得るように所定の粒子および媒体の組み合わせに関するｆＣＭを決定することである。
【０１７０】
球状粒子に関して、クラウジウス−モソッティ因子は、
【０１７１】
【数２６】
2004503758.tif 000027
によって与えられる。
【０１７２】
ここで、εｐは、粒子の有効誘電率であり、εｍは、媒体の有効誘電率である。図において、示される粒子は、非極性であって、その結果、εｐ＜＜εｍである。この場合、
【０１７３】
【数２７】
2004503758.tif 000028
であって、また、その結果、
【０１７４】
【数２８】
2004503758.tif 000029
である。誘電泳動実験において、これは、最大の負の誘電泳動に関する条件に対応する。Ｒｅ（ｆＣＭ）に関するこの値を、式（１）および（６）に代入すると、粒子の誘電特性εｐの大きな変化が、これらの条件下の粒子速度のかなりの変化を作り出すために要求されることを示し、そしてＤＥＰ−ＦＦＦは、粒子の誘電特性の変化の検出に関してそれほど高感度ではないことが結論付けられる。一方、ＤＥＰ−ＦＦＦ感度は、Ｒｅ（ｆＣＭ）→０になるにつれて増加すると以前に知った。このことは、
【０１７５】
【数２９】
2004503758.tif 000030
を意味する。
【０１７６】
そのため、粒子の標的因子に対する誘電特性の小さな応答を検出するためのＤＥＰ−ＦＦＦの最適化は、粒子およびそれらの懸濁媒体が非常に近い、同様に有効比誘電率を有するという条件を探索することに帰着する。
【０１７７】
（設計された微粒子に関するクラウジウス−モソッティ因子）
εｐは、有効粒子誘電率であることに注目する。空気泡の場合には、εｐは、自由空間の誘電率と等しい一定値としてモデリングされ得る。しかし、問題の粒子型の構造および組成に依存して、εｐに関する式およびその対応する誘電モデルは、やや複雑になり得る。例えば、図３に示されるような設計された微粒子に関する単純モデルは、εｐは、誘電率εｓおよび導電率σｓを有する非常に薄い絶縁層によって取り囲まれる誘電率εｃおよび、導電率σｃを有する導電性の内部から構成される同心状のシェルシステムから生じるものとして得られる。
【０１７８】
このいわゆるシェルシステムの対応する有効誘電率は、非常に周波数に依存する。この周波数依存は、ＡＣ界面動電法によって、異なる型の微粒子が特徴付けられ得、識別され得、分類され得るように、非常に効果的に活用され得る。さらに、適切な懸濁媒体の誘電率εｍ、導電率σｍ、および適用される周波数条件は、設計された微粒子型の有効誘電率が懸濁媒体の有効誘電率と非常に近いように容易に選択され得る。この方法において、微粒子は、ＤＥＰ−ＦＦＦによって、粒子自身に高い識別を与える。
【０１７９】
哺乳動物の細胞に合わせて設計された微粒子に関して、シェルの導電率σｓは、非常に小さく、その影響は、εｓからのキャパシタンス効果に比較して無視し得る。逆に、１０ｋＨｚから１ＭＨｚ未満の周波数範囲に関して、キャパシタンス効果は重要であり、懸濁媒体σｍの導電率の影響は、誘電率εｍの影響よりもかなり大きい。これらの条件下、哺乳動物の細胞に合わせて設計された微粒子のクラウジウス−モソッティ因子の実数部分は、
【０１８０】
【数３０】
2004503758.tif 000031
として概算され得る。
【０１８１】
ここで、Ｃは、Ｆ／ｍ２における微粒子の特定の膜キャパシタンスであり、ｒは微粒子の半径であり、そしてｆは、印加される電場の周波数である。この場合のＤＥＰ交差条件において、Ｒｅ（ｆＣＭ）→０の場合、
【０１８２】
【数３１】
2004503758.tif 000032
であることに着目する。
【０１８３】
ＤＥＰ−ＦＦＦによる微粒子の２つの異なる型を識別し得るために満足されなければならない基本的な条件は、この２つの粒子型が異なる高さで浮上することである。クラウジウス−モソッティ因子が妥当である場合、この条件は、式（１）
【０１８４】
【数３２】
2004503758.tif 000033
を用いて表わされ得る。
【０１８５】
ここで、下つき文字の１、２は、それぞれ、分離される２つの微粒子に言及する。この式は、
【０１８６】
【数３３】
2004503758.tif 000034
に従う。
【０１８７】
この式は、３つの方法、すなわち２つのＤＥＰ交差周波数の項のいずれか（角括弧内に定義される）が０に近づき、一方他は０でない場合（１および２）と、
【０１８８】
【数３４】
2004503758.tif 000035
である場合（常に満足され得る条件）、または
【０１８９】
【数３５】
2004503758.tif 000036
である場合（周波数がいずれの交差周波数よりかなり小さい場合（３））で、、満足され得る。
【０１９０】
この３番目の場合、微粒子のサイズ、密度およびシェルキャパシタンスは全て、微粒子の分離性能を決定する因子として組み合わされる。
【０１９１】
（実施例）
以下の実施例は、本開示の具体的な実施形態を示すために含まれる。以下の実施例中に開示される技術は、本発明の実施においてよく機能することが、発明者によって発見された技術を表し、従って、本発明の実施のための具体的な様式を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示の観点において、多くの変化は、開示される具体的な実施形態においてなされ得、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同じもしくは同様の結果が依然として得られることを理解すべきである。
【０１９２】
（実施例１　設計された微粒子設計の考察）
ライフサイエンス研究は、通常、直径が約１００ｎｍ〜１０μｍのサイズに分布する粒子の分析を必要とする。このサイズ範囲の粒子に作用する主要な力は、沈降力およびブラウン運動に起因するランダム化力である。半径１μｍかつ密度１．０５ｇ／ｃｍ３の粒子が水性媒体（ρ＝１．００ｇ／ｃｍ３）中、２５℃で懸濁される場合、沈降力およびブラウン力はそれぞれ、約２×１０−１５Ｎの大きさを有する。
【０１９３】
従来の誘電泳動を操作力として効果的に使用するために、ｃＤＥＰ力は、粒子に作用する他の力に比べて非常に大きくなければならず、そして１つの実施形態において、粒子に作用する他の力に比べて約１桁大きい。式４によれば、Ｒｅ（ｆＣＭ）＝０．５の場合、▽Ｅ（ｒｍｓ）２は、沈降力またはブラウン力と比べて１０倍大きいｃＤＥＰ力を与えるために、約９×１０１２Ｖ２／ｍ３であるべきである（ＰｅｔｈｉｎｇおよびＭａｒｋｘ、１９９７）。
【０１９４】
微小電極および当該分野で公知の方法論を用いて、約１０Ｖ以下の印加電圧を用いてこの大きさの場を発生させることは可能である。沈降力および従来の誘電泳動力は、両方ともｒ３に比例し、一方でブラウン運動のランダム化力は、ｒ−１に比例する。１μｍより大きな粒子については、沈降力およびｃＤＥＰ力が、粒子に作用する主要な力であって、そして従来の誘電泳動は、直径が約１０μｍ以上の粒子を操作するために使用され得る。より小さな粒子については、ブラウン力が沈降力より支配的である。ミクロン以下の幾何学を有する電極を用いることによって、ある人は、ウイルスおよび直径が約１００ｎｍ以下の他の粒子を操作可能なｃＤＥＰ力を発生し得る（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９６）。
【０１９５】
本開示の利点を用いて、設計された微粒子は、ＡＣ界面導電操作および磁気泳動（ｍａｇｎｅｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）操作の影響を受けやすい性質を有するように設計され得る。粒子のｃＤＥＰ操作の具体的な例に関して以前に記載したように、ｃＤＥＰ力の大きさは、この系において粒子に作用する他の力の影響に打ち勝つために十分でなければならない。これは、任意のＡＣ界面導電操作または磁気泳動操作について真実である。粒子に作用する力は、一般的に沈降力およびブラウン運動により誘導されるランダム化力である。これらの力の大きさは、粒子特性に依存するため、競合する力の影響を適切に増減させることによって、ＡＣ界面導電力の効果が最大化するように、設計された微粒子は、設計され得る。
【０１９６】
沈降力は、例えば、約１．０と２．０ｇ／ｃｍ３との間の有効密度を有する設計された微粒子を生成することによって測定され得る。この密度の１０μｍ粒子が水性媒体中に懸濁される場合、小さな沈降力（＜１．５×１０−１２Ｎ）が、粒子に作用する。ほとんどの適用にとって、この特性は好ましい。なぜなら、微小加工されたＡＣ界面導電デバイスは、このデバイスのより低い表面上の微小電極を用いて通常設計されるからである。電界強度、およびそれによるＡＣ界面導電力は、電極面付近に最も現れる。
【０１９７】
負の浮力は、正のｃＤＥＰによって保持され得るか、または負のｃＤＥＰによって浮揚され得る電極面に、微粒子が落下することを確実にするために使用され得る。ブラウン力は、直径が約１０〜２０μｍである微粒子の設計によって減少し得る。このサイズの粒子へのブラウン力の影響は、設計された微粒子の操作のために通常用いられるＤＥＰ力の大きさと比較した場合、無視できる。類似の議論は、磁性微粒子特性および磁場の設計に対して適用可能である。
【０１９８】
特定の範囲における最終的な有効密度を達成する１つのアプローチは、下記の通りであり得る：カスタム設計された微粒子は、低密度（＜１．３ｇ／ｃｍ３）の球形の基材上への、導電性材料、絶縁性材料、および／または磁気的に影響を受けやすい材料の薄膜蒸着によって製造され得る。導電性の球形シェルは、外部に適用される電場に応答して、中実の導電性の球と識別不可能であることは、電磁気学のマクスウェルの法則から公知である。導電層は、約１０〜１００ｎｍの厚さの金、銀、白金または銅のような金属の薄膜であり得る。
【０１９９】
この層は、当該分野で公知の原理に従って、物理蒸着法（ＰＶＤ）または無電解めっき法（ＥｌｓｈａｂｉｎｉおよびＢａｒｌｏｗ、１９９８）によって基材上に適用され得、導電性コアが形成され得る。絶縁性材料は、Ａｌ２Ｏ３のような金属酸化物またはポリスチレンもしくはＰＴＦＥのようなポリマー材料の薄膜であり得る。このような材料は、例えば、ＰＶＤまたはマイクロカプセル化技術（Ｌｉｍ、１９８４）を介して適用され得る。
【０２００】
導電層および絶縁層の密度は、８．９〜２１．４ｇ／ｃｍ３および１．１〜２．２ｇ／ｃｍ３の範囲であり得るため、対応する基材は、所望の密度範囲において仕上げられた微粒子を生産するために低い密度を有さなければならない。直径が約１０〜１０００μｍのポリスチレン微粒子および中空ガラス微粒子は、Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ　Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）、Ｃｏｒｔｅｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）、およびＢｉｏＳｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，　ＣＡ）を含むいくつかの企業から、約１．０ｇ／ｃｍ３の密度を有して市販されている。
【０２０１】
同様の考察を、適切な微粒子密度が達成され得るように、微粒子磁気特性の設計に適用する。微粒子コアまたは層構築のための適切な磁性材料として、フェライト、希土類含有セラミックおよびガラス、ならびに鉄、コバルト、チタンおよび非補償電子スピンを有する原子または分子を含有する他の材料が挙げられる。
【０２０２】
微粒子の誘電性を決定する特性として、微粒子のサイズ、表面電荷、密度、組成および導電率が挙げられる。本開示の利点および当該分野で公知の技術を用いて、これらのパラメータの全ては、所望の誘電フィンガープリントを達成するために改変され得る。特に、設計された微粒子は、コーティング、内部層および表面層ならびに内部区画および／またはコア（各々誘電性、導電性、磁性または非磁性であり得る）の使用を介して、表面および内部の規定された誘電特性、磁気特性、および密度特性を組込むように加工され得る。微粒子表面の誘電特性および電気特性ならびにコーティング、層、区画およびコアそれぞれの誘電特性および電気特性は、異なり得る。微粒子の全体的な誘電特性および磁気特性は、その各エレメント部分の相乗的な誘電的寄与および電気的寄与によって、そしてこれらのエレメント部分における磁気的に感受性の物質の存在によって決定される。適切な誘電特性および電気特性を有する構造的エレメントを組み合わせることによって、明確でかつ識別可能な誘電特性を有する異なる種類の微粒子が、合成され得る。
【０２０３】
誘電性および磁性の物理学は、１つより多くの方法で、本質的に同様の誘電特性および／または磁気特性を有する微粒子の製造を可能にさせる。本発明の目的のために、目的の規定された周波数範囲において同様の誘電特性および磁気特性を有する全ての微粒子は、根源的な物理的組成が異なっている場合であっても、同一の微粒子とみなされるべきである。
【０２０４】
微粒子構造の例としては、制御された表面特性やコーティングを有するか有さないかに関わらず、ラテックス、金属、ガラス、半導体、プラスチック材料または磁性材料の単純球が挙げられる。さらに複雑な構造としては、以下の１つ以上の特徴を有する微粒子が挙げられる：（ｉ）電気的により導電性の内部を有する電気的に非導電性の膜様コーティング；（ｉｉ）目的の周波数範囲内に誘電散乱を有する誘電性材料を含む層またはコア；（ｉｉｉ）高度に導電性の表面層またはコア；（ｉｖ）誘電性媒体との相互作用を介して微粒子の性質に寄与する正味の電荷を有する表面；（ｖ）磁化率を有する１つ以上の層またはコア。本開示は、全体的な誘電特性および磁気特性が、微粒子が単離、同定、特徴づけ、またはＡＣ界面導電法またはＡＣ界面導電法および磁気的方法を組み合わせた方法を介して標的分析物の他の操作のために使用され得るように特に選択される任意の微粒子型に関する。
【０２０５】
（実施例２　実験的研究）
銀コーティングされた中空ガラス球を、Ｐｏｔｔｅｒｓ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｖａｌｌｅｙ　Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）から得、そして活性剤を含まないマイクロカプセル化プロトコルを用いて、Ｔｈｅｉｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって、注文により種々の厚さのポリスチレンでカプセル化された。得られた微粒子構造は、図１に描写された構造と類似であった。ギザギザのある、櫛形電極配列からの不均一な電場の適用において、微粒子操作を、電場の周波数および電圧を切り替えることによって達成した。誘電応答は、式４および式７の予測に従って変動した。この結果は、ここで示された分析を確認し、そして予想されたように、ポリスチレンコーティングの誘電特性および導電特性の両方が微粒子の挙動を規定することを示す。Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ　Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）からの誘電性フェライト微粒子を使用する実験はまた、磁力およびＤＥＰ力が、微粒子操作のために同時に使用され得ることを確認した。
【０２０６】
（実施例３　設計された微粒子技術の適用）
標的細胞の同定、操作および単離のための微粒子に基づく技術の有用性は、一般的である。最近、分子生物学における微粒子の使用は、広範囲になり、そしてあらゆる箇所での細胞もしくは分子の標的化もしくは認識が必要とされるライフサイエンス研究において使用する方法論を再定義することを期待させる。まだ現在のアプローチは、一次元的であり、そしてほとんど融通性を示さない。例えば、複数の標的の並行探索は、可能ではなく、標的は、負の選択（いくらかの選別適用における優先）が、不可能ではないにしても、困難であるように、収集部位に対して引き付けられるのみであり得る。そして選別は、本質的にデジタルである（標的は、結合の有効性に従って識別し得ず、一千から一万の範囲の多数の微粒子を結合するかどうかによってしか識別し得ない）。本明細書に記載された方法は、これらの制限を克服し、そして種々の標的を混合物から同時に分離するための、正の選択および負の選択の両方を使用して単離された画分の純度を顕著に向上させるための、そして標的がそれらの結合効率に従って識別され得るための、可能性を提供する（従って、細胞は、「何らかの」結合部位を有しているかどうかによって単に選別され得るだけではなく、その表面上の抗体結合部位の「数」によって選別され得る）。
【０２０７】
設計された微粒子技術のための即時適用として、以下が挙げられる：
１）ＣＤ抗原、増殖因子レセプター、および／または他の膜関連タンパク質もしくはその部分を含む表面マーカーの濃度に従う細胞の選別；
２）高純度の血液細胞部分母集団の単離；
３）幹細胞収集物からの腫瘍細胞および／またはＴ細胞の除去；
４）血液、尿、および他の患者サンプルからの病原体の単離および同定；
５）公共の供給水における、ならびに調理および食品加工施設における、病原体の単離および同定；
６）小胞および細胞小器官のような非細胞区画の単離；
７）非常に小容積のサンプルを含む生物学的サンプルからの核酸、タンパク質、および他の生体分子の単離および同定。
【０２０８】
（実施例４　細胞の表面に見い出されるＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原に基づく分析物の単離および分析物の同定のための設計された微粒子技術）
３種類の異なる微粒子を、図５においてａ、ｂ、およびｃと標識されるような、各々異なるｃＤＥＰ挙動を有するように設計する。ａと標識されたｃＤＥＰ挙動を有する設計された微粒子に対してＣＤ３のためのプローブを、ｂと標識されたｃＤＥＰ挙動を有する設計された微粒子に対してＣＤ４のためのプローブを、そしてｃと標識されたｃＤＥＰ挙動を有する設計された微粒子に対してＣＤ１８のためのプローブを連結することによって、３種の異なる設計された微粒子標識を、作製し得る。これらの３種の異なる標識の混合物は、次いで、多くの異なる細胞部分母集団を含む血液サンプルを、「一回の」標識工程において、同時に標識するために使用され得る。
【０２０９】
ＤＥＰ−ＦＦＦのようなＡＣ界面導電に基づく分離方法を用いて、３種類の異なる微粒子、および従ってＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ１８＋細胞は、一回のＤＥＰ−ＦＦＦ分離工程において分離され得る（図５）。この方法を用いて、それらのサイズ、密度または表面固有静電容量（ｓｕｒｆａｃｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）特性のみによる他の細胞部分母集団から識別可能ではない細胞部分母集団の分析が利用可能にされる。
【０２１０】
ＤＥＰ−ＦＦＦ分離において、異なる微粒子型は十分に規定されたバンドに分画し、それぞれの画分は、単一の、十分に規定された溶出ピークとして現れる（図５）。遊離の、結合していない微粒子標識の場合において、ピークの形は、比較的狭くシャープである。しかし、微粒子の誘電性が分析物の結合の際に乱されるため、分析物−標識複合体のピークの形は、よりブロードとなり、そして／または溶出時間のシフトを示す（図６）。この乱れの程度は、分析物の性質および分析物結合の程度に依存し得る。このような溶出ピークの変化は、分析物の検出の定量的な方法のための基準として使用され得ることに注目すべきである。
【０２１１】
（実施例５　設計された微粒子）
微粒子は、銀または金で金属化された中空ガラスコア上でアルカンチオレートの自己会合性単分子層（ＳＡＭ）を用いて加工され得る。アルカンチオールＣＨ３（ＣＨ２）ｎＳＨは、金表面上へ自然に化学吸着してアルカンチオレート：
【０２１２】
【数３６】
2004503758.tif 000037
を形成する。アルカンチオレートは、密集して充填された、丈夫な単分子層膜へと自己組織化する。このような膜を、広範囲にわたって特徴づけし、そしてそれらの絶縁性を達成した。アルカンチオールＳＡＭ膜の厚さは、アルキル鎖中のメチレン基の数ｎに依存する。異なるアルカン鎖長を用いて作製された、設計された微粒子の誘電特性が、観測され得る。実験を、自己会合性のアルカンチオレート単分子層と脂質小胞との融合によって形成されるハイブリッド二分子膜を用いて行ない得る。アルカンチオールのヘッドの基Ｘを変更する効果が、決定され得る。さらに、チオレート化ＤＮＡのような他の分子が金属化された微粒子表面に吸着され得る。最後に、タンパク質およびオリゴヌクレオチド捕捉プローブをアルカンチオレートのヘッド基に連結するためのプロトコルを開発し得る。
【０２１３】
（実施例６　生物化学兵器薬剤の検出）
明細書中で記載される設計された微粒子は、ＣＢＷ薬剤の検出から医療用、化学用、農学用および環境用の分析物の検出までにわたる莫大な範囲のアッセイに適用可能であり得る。微粒子に基づくサンドイッチアッセイを、コレラ毒素βサブユニット（ＣＴＢ）およびブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）のような特定のタンパク質シミュラント（ｓｉｍｕｌａｎｔ）を検出するために開発し得る。さらに、微粒子に基づくサンドイッチアッセイを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、障害を持った宿主免疫系の早期指標のために開発し得る。これらのタンパク質に対して指向されたモノクローナル抗体が利用可能であり、この抗体を、捕捉プローブおよび標識プローブを構築するために使用し得る。設計された微粒子に基づくサンドイッチアッセイを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ血清型Ｏ１５７：Ｈ７のような細菌性シミュラント由来の特定の核酸配列を検出するために開発し得る。これらの生物中に見い出されるｍＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、容易に得られる。分析物−微粒子複合体を、密集して充填された球形の領域へと集めるために誘電泳動を利用することによって、局所的な分析物濃度は、数桁上昇し得、核酸増幅の必要性をなくし得、そしてアッセイの感度を向上させ得る。既存のワンポットアッセイは、ＰＥＰプラットフォームに対して適応され得る。適応のための良好な候補物は、Ｐｉｅｒｃｅのビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）タンパク質アッセイおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＰｒｏｂｅｓのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　生育可能／細胞障害性アッセイを含む。
【０２１４】
（実施例７　指標付け）
図９〜１５は、異なる誘電特性を有する設計された微粒子を示す。また、これらの粒子について、応答対周波数との関係も示す。
【０２１５】
１つの実施形態において、これらの粒子は、指標ライブラリーとして使用され得る。特に、各々の異なる微粒子は、異なる分析物への結合に結合し、次いで図９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂ、１３Ｂ、１４Ｂ、および１５Ｂに示されるライブラリーの異なる応答性に従って、同時に操作され、同定され、感知され、そして検出されるように作成され得る。
【０２１６】
（実施例８　サンドイッチアッセイ）
図１６は、本発明の開示による研究において、タンパク質およびｍＲＮＡを検出するために使用され得るサンドイッチ（二重標識）アッセイを示す略図である。例示されるように、図１６の設計された微粒子は、タンパク質および／またはｍＲＮＡと相互作用するように設計された連結エレメントを含み得る。発蛍光団または生物発光標識のような標識は、二次プローブとして作用し得る。
【０２１７】
本開示の利点を用いて、図１６の設計された微粒子は、微粒子に結合した標的分析物（および標識）とともに、誘電泳動力を用いて操作され得ることを当業者は理解する。特に、図１６の複合体は、誘電泳動を用いて選別され得、分離され得、捕捉され得、選別され得、そして一般的に処理され得る。この処理は、反応表面（例えば、本明細書中で参考としてすでに援用されている、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ　Ａｎｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｆｌｕｉｄｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」で係属中の米国出願第０９／２４９，９５５号（１９９９年２月１２日出願）に開示されている表面）、および／または、これもまた参考として援用されている、米国特許第５，９９３，６３０号に開示されているフィールドフローフラクショネーション装置で行なわれ得る。反応表面で行なわれ得る処理の具体的な実施例は、（ａ）図１６に示されるような複合体を溶液から引っ張り、そして（ｂ）反応表面上でこれらの複合体を処理する、ために誘電泳動を用いることである。
【０２１８】
図１６の複合体の形成は、複合体の形成前および形成後に誘電性の違いに注目することによって、検出され得る。この違いは、当該分野で公知のインピーダンスセンサーの１つ、あるいは、誘電特性、電気特性または物理特性を測定するための当該分野で公知の任意の他の方法論を用いて測定され得る。プラズモン共鳴は、１つのこのような方法論の例である。
【０２１９】
本開示の１つの実施形態に従って、各々の微粒子が異なる誘電特性を有するように、異なる設計された微粒子が、製造され得る。例えば、各々の設計された微粒子は、その絶縁層の異なる厚さおよび／または組成を有して作製され得る。同時に、この微粒子の群が、ライブラリーを形成し得る。
【０２２０】
このライブラリーの各々の異なる微粒子に対して、異なる連結エレメントが適用され得る。この微粒子は、次いで、１つ以上の標的分析物を含むサンプルと混合され得、１つ以上の複合体を形成し得る。各微粒子の誘電特性は、適切なインピーダンスセンサーを用いて、対応する複合体の誘電特性から識別され得る。誘電特性のこの識別は、複合体が形成されたか否かを、検出可能である。さらに、各微粒子の誘電特性は、互いに識別され得る。この識別により、検出される微粒子の同一性を決定することが可能となる。
【０２２１】
（実施例９　１つ以上の自己会合性単分子層を有する設計された微粒子）
図１７〜２１は、本開示の実施形態による多層の設計された微粒子を示す。
【０２２２】
図１７は、単層の設計された微粒子を示す。これは、導電性の金シェルでコーティングされたポリスチレンコアを含む。自己会合性単分子層（アルカンチオールの自己会合性単分子層が示されている）のような絶縁体が、導電性の金シェルをコーティングし得る。例えば、絶縁層および／または導電層のサイズおよび／または組成を変動させることによって、設計された微粒子の誘電特性を変動させ得る。
【０２２３】
図１８において、二層の設計された微粒子が示されている。これは、以下の層を含む：ポリスチレンコア、金シェル、アルカンチオールの自己会合性単分子層、およびリン脂質の自己会合性単分子層。
【０２２４】
図１９において、リン脂質自己集積性単分子層は、架橋されている。酸化される場合、不飽和脂質は、架橋してポリマー構造を形成する。架橋されているために、親水性の「頭」および疎水性の「尾」を有するリン脂質層は、有機溶媒中でより安定である。
【０２２５】
図２０および２１は、連結エレメントを含む二層の設計された微粒子を示す。図２０において、連結エレメントは、核酸プローブである。図２１において、連結エレメントは、タンパク質プローブである。これらの図の各々において、連結エレメントは、金の導電性コアに結合している。しかし、連結エレメントは、外側の絶縁層または内側の絶縁層に結合され得ることが理解される。
【０２２６】
本開示の利点を用いて、図１７〜２１の微粒子が、これより多くのまたはこれより少ない層を含み得ることは明らかである。例えば、金のシェル層（一様である必要はない）および示されるＳＡＭ層の上に、１つ以上の追加のＳＡＭまたは他の層が、加えられ得る。１つ以上の層は、架橋され得、そして１つ以上の標識が、連結エレメントにたいして加えられ得る。
【０２２７】
さらに、図１７〜２１の導電性の金シェルは、導電性ポリマーなどを含む任意の適切な導体で置換され得ることを理解する。さらに、ポリスチレンコアは、任意の他の適切な材料で置換され得る。
【０２２８】
（実施例１０　加工に関する考察事項）
本明細書中に開示されるアルカンチオレートは、頑丈な、密集して充填された再現性のある厚さの単分子層膜へと確実に自己組織化する。さらに、生体模倣ハイブリッド二分子膜（ＨＢＭ）は、すでにアルカンチオレート単分子層を用いてコーティングされた設計された微粒子コアとリン脂質小胞とを融合させることによって形成され得る。設計された誘電性微粒子のコアを取り囲む絶縁層の厚さは、ハイブリッド二分子膜を形成するために使用されるアルカンチオールＳＡＭ膜のアルキル鎖におけるメチレン基の数、およびリン脂質の脂質の尾中のメチレン基の数との両方に依存する。
【０２２９】
従って、本明細書中で示される設計された微粒子のアルカンチオレート層およびリン脂質層中の炭化水素鎖の長さを単に変化させることによって、異なる厚さおよび異なる誘電特性の絶縁層を有する粒子のライブラリーを生成し得る。
【０２３０】
金でコーティングされたポリスチレン微粒子は、Ｄｙｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈから得られ得、この粒子は、２．２ｇ／ｃｍ３の密度を有する、直径が９．６μｍの均一なものである（変動係数＜５％）。本発明者らは、金でコーティングされたポリスチレンコア粒子に、アルカンチオレートおよびリン脂質の自己会合性単分子層を形成することによって、４種の異なる種類の設計された誘電性微粒子を構築した。比較的薄い絶縁層を有する、設計された微粒子は、以下の単一のアルカンチオレート単分子層を用いてコア粒子をコーティングすることで作製した：
（ｉ）Ｃ９の絶縁層を与えるためのノニルメルカプタン［ＣＨ３（ＣＨ２）８−ＳＨ］、または
（ｉｉ）Ｃ１８の絶縁層を与えるためのオクタデシルメルカプタン［ＣＨ３（ＣＨ２）１７−ＳＨ］。
【０２３１】
さらに厚い絶縁層を有する設計された微粒子は、以下に示すアルカンチオレート層の上に、ＤＭＰＣ［１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン］リン脂質の第２の絶縁単分子層を形成することによって作製した：
（ｉｉｉ）Ｃ２３の絶縁層を与えるためのノニルメルカプタンおよびＤＭＰＣ
または
（ｉｖ）Ｃ３２の絶縁層を与えるためのオクタデシルメルカプタンおよびＤＭＰＣ。
【０２３２】
設計された誘電性微粒子の各サンプルは、最初に微粒子の金表面を、清浄化するために、金でコーティングされた微粒子１０ｍｇを、ガラス管中で、無水エタノール１０ｍｌ中で洗浄することによって、作製した。数分の混合後、微粒子をベンチトップ型の遠心分離機を用いて、遠心分離によってペレット化し、エタノールをデカンテーションで除去し、そして洗浄された微粒子を無水エタノール中の１ｍＭのノニルメルカプタン溶液またはドデシルメルカプタン溶液１０ｍｌと混合した。十分に組織化された、高度に整合した自己集積性単分子層（ＳＡＭ）の形成を確実にするために、この懸濁液を、穏やかに少なくとも１２時間混合した。
【０２３３】
アルカンチオールの中程度の濃度（１ｍＭ）の吸着プロセスは、数分以内にアルカンチオールの厚さがその最大の８０〜９０％になる迅速な初期段階によって特徴付けられる。この初期段階には、数時間続くより遅い期間が続き、この期間の間に、アルカンチオールの層がその最終的な厚さを達成する。金上のアルカンチオール単分子層は、空気中または液体の水もしくはエタノールとの接触状態で、室温で永久的に安定であるようであることが当該分野で報告されている。アルカンチオレートでコーティングされた微粒子は、遠心分離によって回収され、無水エタノールで２回洗浄し、３回蒸留した水中で２回洗浄し、そして３回蒸留した水１ｍｌ中で４℃で保存した。
【０２３４】
リン脂質層は、アルカンチオレートコーティングされた微粒子と、ＤＭＰＣの小さな単層小胞の水性懸濁液とを混合することによって、アルカンチオール層の上に形成された。ＤＭＰＣ小胞は、丸底フラスコ内に２０ｍｇ／ｍｌのＤＭＰＣのクロロホルム脂質溶液１ｍｌを入れ、そして減圧ロータリーエバポレーターを用いて数時間、溶媒をエバポレートすることによって作製した。乾燥した脂質を５０μｌのイソプロパノールに再懸濁させ、そして大きな多層小胞の懸濁液を形成するためにボルテックスしながら、３回蒸留した水１０ｍｌに注入した。大きな小胞の溶液は、超音波浴中で数分間、超音波処理し、大きな小胞を小さな２０〜１００ｎｍの単層小胞に崩壊させた。この小さな小胞の１０ｍｌ懸濁液を、１０ｍｇのアルカンチオレートコーティングされたビーズと混合し、室温で３０分、穏やかに混合した。アルカンチオレート−リン脂質でコーティングされた微粒子は、遠心分離によって回収し、３回蒸留した水で２度洗浄し、３回蒸留した水中で保存した。
【０２３５】
（実施例１１　設計された微粒子の試験）
単一シェルの誘電性モデルの分析は、外側の絶縁シェルの厚さと設計された誘電性微粒子の誘電特性との間の明確な関係を予測する。電導性内部物の上の薄い絶縁シェルの適切な組成の設計された微粒子は、１０２〜１０４Ｈｚの間の周波数で強力な負の誘電泳動を受けることが予測される。この周波数範囲において、電場は、外側の絶縁シェルを貫通することができず、誘電的観点から、微粒子は、高いＡＣインピーダンスを有し、比較的非分極性を表す。１０７〜１０９Ｈｚ範囲における周波数で、設計された微粒子は、強力な正の誘電泳動を受けることが予測される。この周波数範囲において、電場は、容量結合を介して、薄い外側の絶縁シェルを貫通し、そして、コアの特性が支配的であり、誘電的微粒子は、誘電的に低いＡＣインピーダンスを有し、高い分極性を表す。
【０２３６】
過渡期の１０５〜１０６Ｈｚ範囲において、周波数の増加は、負の減少から正の増加まで、設計された微粒子に作用する誘電泳動力における変化と相関があると予測される。交差周波数ｆｃで、微粒子に作用する正味の誘電泳動力は、０である。ｆｃより下の周波数で、粒子は負の誘電泳動を受け、そしてｆｃより上の周波数で、粒子は正の誘電泳動を受ける。絶縁性の外側シェルの厚さの増加は、交差周波数の増加と相関がある。絶縁シェルの厚さと交差周波数との関係は、以下：
【０２３７】
【数３７】
2004503758.tif 000038
の関係式によって与えられる。
ここで、Ｃｍｅｍは、固有膜キャパシタンス（すなわち、シェル面積に対して正規化された）であり、σｓは、懸濁媒体の導電率であり、Ｒは、設計された微粒子の半径であり、ｆｃは、交差周波数であり、ε０は、自由空間の誘電率であり、εｍｅｍは、絶縁層の誘電率であり、そしてｄは、絶縁層の厚さである。これらの式を組み合わせると、以下の関係：
【０２３８】
【数３８】
2004503758.tif 000039
が得られる。
【０２３９】
上記の式によって、ｆｃ対σｓのプロットの勾配の逆数は、与えられた設計された微粒子の種類に関する、おおよその固有膜キャパシタンスを与える。さらに、このようなプロットの勾配は、膜の厚さの増加とともに増加する。
【０２４０】
誘電泳動の交差周波数の研究は、４種類の設計された誘電性微粒子（Ｃ９またはＣ１８のアルカンチオールの外側の自己会合性の絶縁性単分子層あるいは、Ｃ９もしくはＣ１８アルカンチオール＋Ｃ１４リン脂質の外側の自己会合性の絶縁性単分子層）が絶縁シェルの厚さと交差周波数との間の予想された相関を示すかどうかを決定するために、本発明者らによって行なわれた。誘電泳動性の研究に関して、設計された誘電性微粒子を、８．５％（ｗ／ｖ）の蔗糖、０．３％（ｗ／ｖ）のブドウ糖を含むＤＥＰ緩衝液中で懸濁した。緩衝液の導電率は、３００ｍＭのＥＤＴＡ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整）を用いて調節した。設計されたビーズ懸濁液のアリコートは、誘電泳動操作のための不均一な電場を生成するために、１ｋＨｚ〜１００ｋＨｚの間の周波数ピーク間で１〜１０ボルトでエネルギー付与された、金／ガラス（ｇｏｌｄ−ｏｎ−ｇｌａｓｓ）構造の平行な電極（５０μｍトレース−５０μｍギャップ）上の開口の容器内に置かれた。誘電泳動操作は、場の周波数を切り替えることによって達成され、そして誘電泳動の交差周波数を決定した。
【０２４１】
図２２によって示されるように、設計された微粒子は、適切な炭素鎖長のアルカンチオールおよびリン脂質の選択によって媒介される場合に、絶縁性の外側シェルの厚さへの明確な依存を示す。さらに、ｙ切片は、ゼロの非常に近くに生じ、これにより、絶縁層の導電率は低く、そして自己会合性単分子層は、頑丈な、均一な絶縁層を提供することが示唆される。
【０２４２】
細孔形成タンパク質メリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）のような親油性分子は、絶縁層へと組込まれ得る。さらに、チオレート化した核酸およびタンパク質のようなプローブを、設計された微粒子コアの金表面に吸着し得、そしてオリゴヌクレオチドおよびタンパク質捕捉プローブは、アルカンチオレート分子およびリン脂質分子に連結し得る。
【０２４３】
本明細書中で記載され、特許請求された全ての組成物および／または方法は、本開示の観点において、必要以上の実験なしに作製し得、そして実行し得る。本発明の組成物および方法は、具体的な実施形態によって記載されているが、本発明の概念、精神、および範囲を逸脱することなしに、変形は、本明細書に記載の組成物および／または方法に適用され得、そして本方法の工程において、あるいは工程の順序において適用され得ることは当業者に明らかである。さらに具体的には、同じ結果または同様の結果を達成しながら、化学的および生理学的の両方に関連する特定の薬剤は、本明細書中に記載される薬剤と置換し得ることが明らかである。当業者にとって明らかであるような同様の置換および改変の全ては、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると判断される。
【０２４４】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中に示すことを補足する、例示的な手順または他の詳説を提供する程度まで、特に参考として本明細書中で援用される。
【０２４５】
【表１】
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【０２４６】
【表２】
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【０２４７】
【表３】
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【０２４８】
【表４】
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【０２４９】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに示すために挙げられる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１以上を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】
図１は、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子を示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、誘電泳動力の線図である。この図は、電極に対して適用される１Ｖｒｍｓの位相直交電圧信号によって作り出された回転磁界中において、半径５μｍの球状粒子によって経験された、誘電泳動力ベクトルを示す。図２Ａにおいて、Ｒｅ（ｆＣＭ）＝０．５およびＩｍ（ｆＣＭ）＝０である。図２Ａにおいて、力は、粒子を図の端に沿って位置する電極に向ける。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、誘電泳動力の線図である。この図は、電極に対して適用される１Ｖｒｍｓの位相直交電圧信号によって作り出された回転磁界中において、半径５μｍの球状粒子によって経験された、誘電泳動力ベクトルを示す。図２Ｂにおいて、Ｒｅ（ｆＣＭ）＝０およびＩｍ（ｆＣＭ）＝０．５である。図２Ｂにおける力は、電極の構造の中心の周りを円形に、粒子が移動するように向ける。
【図３】
図３は、電気回転（ｅｌｅｃｔｒｏｒｏｔａｔｉｏｎ）スペクトルのグラフを示す。特に、導電率が５６ｍＳ／ｍの等張性スクロース中の赤血球（白三角）、Ｔリンパ球（白丸）およびＭＤＡ２３１乳癌細胞（白四角）についての典型的なＲＯＴスペクトルが示される。曲線は、上述の単一シェル誘電モデルの最適フィッティングを示す。
【図４】
図４は、異なる微粒子型のＡＣ界面導電挙動のグラフを示す。５種類の異なる微粒子型に対するｃＤＥＰ（従来の誘電泳動）応答およびｔｗＤＥＰ（進行波ＤＥＰ）応答が示される。各微粒子型は、それらの最も外側のシェルの厚さ（約１〜１０ｎｍで変動する）以外は同じである。微粒子の各々の異なる型は、異なるプローブに連結し得、そしてサンプル混合物中の異なる分析物を標識して次いで操作または同定するために使用され得る。
【図５】
図５は、分析物の分離を示す概略図である。ＡＣ界面導電特性を有する本開示の１つの実施形態による設計された微粒子の３つの異なる型（ａ、ｂおよびｃと表示される）は、例えば図４のように示され、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ１８細胞表面抗原に対する抗体を用いて感作され、異なる細胞部分母集団に対して標識を形成する。これらの標識は、模倣ＤＥＰ−ＦＦＦフラクトグラムに示されるような、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１８＋細胞のＤＥＰ−ＦＦＦ（ＤＥＰ／フィールドフロー分別法）による分離を容易にする。
【図６】
図６は、分析物の結合の検出を示す、概略図である。設計された微粒子の誘電特性は、分析物の結合によって乱され得る。ＤＥＰ−ＦＦＦのようなＡＣ動電的分析法は、溶出ピークのブロード化または溶出ピークのシフトの形態におけるこの変化を検出するのに使用され得る。
【図７】
図７は、誘電特性に対する粒子速度の依存性を示すグラフである。
【図８】
図８は、粒子および媒体の分極を示す概略図である。
【図９Ａ】
図９Ａは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子、それらの特性を示す。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子の挙動を示す。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子、それらの特性を示す。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子の挙動を示す。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子、それらの特性を示す。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子の挙動を示す。
【図１２Ａ】
図１２Ａは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子、それらの特性を示す。
【図１２Ｂ】
図１２Ｂは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子の挙動を示す。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子、それらの特性を示す。
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子の挙動を示す。
【図１４Ａ】
図１４Ａは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子、それらの特性を示す。
【図１４Ｂ】
図１４Ｂは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子の挙動を示す。
【図１５Ａ】
図１５Ａは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子、それらの特性を示す。
【図１５Ｂ】
図１５Ｂは、本開示の１つの実施形態による、誘電的に設計された微粒子の挙動を示す。
【図１６】
図１６は、本開示による研究における、タンパク質およびｍＲＮＡを検出するために使用し得るサンドイッチ（二重標識）アッセイを示す概略図である。
【図１７】
図１７は、ポリスチレンコア、金製シェル、およびアルカンチオール自己会合性単分子層を含む、本開示の１つの実施形態による誘電的に設計された微粒子を示す。
【図１８】
図１８は、ポリスチレンコア、金製シェル、アルカンチオール自己会合性単分子層、およびリン脂質自己会合性単分子層を含む、本開示の１つの実施形態による誘電的に設計された微粒子を示す。
【図１９】
図１９は、ポリスチレンコア、金製シェル、アルカンチオール自己会合性単分子層、および架橋したリン脂質自己会合性単分子層を含む、本開示の１つの実施形態による誘電的に設計された微粒子を示す。
【図２０】
図２０は、ポリスチレンコア、金製シェル、アルカンチオールの自己会合性単分子層、リン脂質自己会合性単分子層、および核酸プローブを含む、本開示の１つの実施形態による誘電的に設計された微粒子を示す。
【図２１】
図２１は、ポリスチレンコア、金製シェル、アルカンチオール自己会合性単分子層、リン脂質自己会合性単分子層、およびタンパク質プローブを含む、本開示の１つの実施形態による誘電的に設計された微粒子を示す。
【図２２】
図２２は、遷移周波数対電導率を示すグラフである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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