(57)【要約】開示は以下に示す構造をもつモジューラ蛍光センサであって、【化１】2004519677.tif 000014Ｆｌは蛍光分子、Ｎは窒素原子であり、Ｂｄ１とＢｄ２は独立的に選択された結合基、Ｓｐは脂肪族スペーサ、Ａｎはセンサを固体基体に付着させるための固着基を表し、ｎは１または２、ｍは１または２、ｘは整数であり、ｙ＝１または２である。結合基は被検体分子を結合して安定な１：１複合体を生成することができる。好ましい実施態様では、Ｂｄ１はＲ１−Ｂ（ＯＨ）２、Ｂｄ２はＲ２−Ｂ（ＯＨ）２であり、Ｒ１及びＲ２は互いに独立的に選択された脂肪族または芳香族の官能基であり、Ｂはホウ素原子である。本発明はまたモジューラ蛍光センサの合成方法と固定基体の標識に於ける使用方法を提供する。
2004519677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次に示す一般構造、
【化１】
2004519677.tif 000010
を有するモジューラ蛍光センサであって、
Ｆｌが蛍光分子であり、
Ｎが窒素原子であり、
Ｂｄ１とＢｄ２が独立的に選択された結合基で、被検体分子と結合して安定な１：１複合体を生成することができる結合基であり、
Ｓｐが脂肪族のスペーサであり、
Ａｎがセンサを固体基体に付着させるための固着基であり、
ｎ＝１または２、ｍ＝１または２、ｘが整数であること
を特徴とするモジューラ蛍光センサ。
【請求項２】
請求項１に記載のセンサであって、Ｆｌがナフチル、アンスリル、ピレニル、フェナンスリル及びペリレニルからなる群から選択されることを特徴とするセンサ。
【請求項３】
請求項１に記載のセンサであって、Ｂｄ１がＲ１−Ｂ（ＯＨ）２、Ｂｄ２がＲ２−Ｂ（ＯＨ）２であり、Ｒ１及びＲ２が互いに独立的に選択された脂肪族または芳香族の官能基であり、Ｂがホウ素原子であることを特徴とするセンサ。
【請求項４】
請求項３に記載のセンサであって、Ｒ１及びＲ２がメチル、エチル、プロピル、ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、ブトキシ及びフェノキシ基からなる群から選択されることを特徴とするセンサ。
【請求項５】
請求項１に記載のセンサであって、Ｓｐが直鎖アルカンであることを特徴とするセンサ。
【請求項６】
請求項５に記載のセンサであって、前記直鎖アルカンが１乃至９個の炭素原子を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項７】
請求項６に記載のセンサであって、前記直鎖アルカンが６個の炭素原子を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項８】
請求項１に記載のセンサであって、Ａｎが有機官能性を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項９】
請求項８に記載のセンサであって、Ａｎがメチルを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項１０】
請求項８に記載のセンサであって、Ａｎがフェニルを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項１１】
請求項１に記載のセンサであって、Ａｎとｘがセンサのミクロメータスケール粒子への安定な付着を与えるように選択されることを特徴とするセンサ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のセンサであって、粒子がフローサイトメトリーでの使用に適切であることを特徴とするセンサ。
【請求項１３】
請求項１に記載のセンサであって、Ｂｄ１，Ｂｄ２，Ｓｐ，ｍ及びｙがセンサのグルコースへの選択的結合を与えるように選択されていることを特徴とするセンサ。
【請求項１４】
次に示す一般構造、
【化２】
2004519677.tif 000011
を有するモジューラ蛍光センサであって、
Ｆｌが蛍光分子であり、
Ｎが窒素原子、Ｂがホウ素原子であり、
Ｒ１とＲ２が被検体をヒドロキシル基と共有結合させて安定な１：１複合体を生成させる脂肪族または芳香族の官能基であり、Ｒ１とＲ２が互いに独立的に選択されており、
Ａｎがセンサを固体基体に付着させるための固着基であり、
ｘが整数であること
を特徴とするモジューラ蛍光センサ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のセンサであって、Ｆｌがナフチル、アンスリル、ピレニル、フェナンスリル及びペリレニルからなる群から選択されることを特徴とするセンサ。
【請求項１６】
請求項１４に記載のセンサであって、Ｒ１及びＲ２がメチル、エチル、プロピル、ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、ブトキシ及びフェノキシ基からなる群から選択されることを特徴とするセンサ。
【請求項１７】
請求項１４に記載のセンサであって、Ａｎが有機官能性を含むことを特徴とするセンサ。
【請求項１８】
請求項１７に記載のセンサであって、Ａｎがメチルを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項１９】
請求項１７に記載のセンサであって、Ａｎがフェニルを含むことを特徴とするセンサ。
【請求項２０】
請求項１４に記載のセンサであって、Ａｎとｘがセンサのミクロメータスケール粒子への安定な付着を与えるように選択されていることを特徴とするセンサ。
【請求項２１】
次の構造式のモジューラ蛍光センサ。
【化３】
2004519677.tif 000012
【請求項２２】
モジューラ蛍光センサの合成方法であって、該合成方法が（ａ）次に示す一般構造の非対称合物を生成させるステップと、
【化４】
2004519677.tif 000013
（但し上記構造中、Ｆｌは蛍光分子、Ｎは窒素原子、Ｈは水素原子であり、Ｓｐは脂肪族スペーサ、Ａｎはセンサを固体基体に付着させる結合基であり、ｎ＝１または２、ｘは任意に整数である）
（ｂ）水素原子をＢｄ１及びＢｄ２基で置換するステップ（但しＢｄ１及びＢｄ２は被検体分子を結合して安定な１：１複合体を生成できる独立的に選択された結合基である）と、
を含むことを特徴とするモジューラ蛍光センサの合成方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、Ｆｌがナフチル、アンスリル、ピレニル、フェナンスリル及びペリレニルからなる群から選択されることを特徴とする合成方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、Ｂｄ１がＲ１−Ｂ（ＯＨ）２、Ｂｄ２がＲ２−Ｂ（ＯＨ）２であり、Ｒ１及びＲ２が互いに独立的に選択された脂肪族または芳香族の官能基であり、Ｂがホウ素原子であることを特徴とする合成方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、Ｒ１及びＲ２がメチル、エチル、プロピル、ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、ブトキシ及びフェノキシ基からなる群から選択されることを特徴とする合成方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、水素原子の置換ステップがオルソブロモメチルフェニルホウ素酸の添加を含むことを特徴とする合成方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法であって、Ｓｐが直鎖アルカンであることを特徴とする合成方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記直鎖アルカンが９個の炭素原子を含むことを特徴とする合成方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記直鎖アルカンが６個の炭素原子を含むことを特徴とする合成方法。
【請求項３０】
請求項２２に記載の方法であって、Ａｎが有機官能性を含むことを特徴とする合成方法。
【請求項３１】
請求項２２に記載の方法であって、Ａｎがメチルを含むことを特徴とする合成方法。
【請求項３２】
請求項２２に記載の方法であって、Ａｎがフェニルを含むことを特徴とする合成方法。
【請求項３３】
固体基体を標識する方法であって、該方法が
（ａ）固体基体を供給することと、
（ｂ）請求項１に記載のモジューラ蛍光センサを供給することと（但しＡｎは固体基体に付着されていることができる）、
（ｃ）センサが基体に付着する十分な条件下でセンサを固体基体と反応させることと、
を含むこと特徴とする固体基体を標識する方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、固体基体がマイクロ粒子であることを特徴とする標識する方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、粒子の径が０．１乃至２０μｍであることを特徴とする固体基体を標識する方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、粒子が多孔質粒子であり、センサが粒子の細孔内に結合していることを特徴とする固体基体を標識する方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、粒子が疎水性の不溶性粒子であり、センサが該粒子の表面に結合していることを特徴とする固体基体を標識する方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法であって、粒子がポリスチレンラテックス、可塑化ポリ塩化ビニル、ガラス、半浸透性膜及び生物再吸収性ポリマーからなる群から選択される材料から作られることを特徴とする固体基体を標識する方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、生物再吸収性ポリマーがポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、澱粉、ゲラチンからなる群から選択されることを特徴とする固体基体を標識する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般的に蛍光センサ分子に関し、特に蛍光センサ分子の新規なグループに関する。
【０００２】
（背景技術）
生化学試料に含まれる被検体の検出や定量には種々の検定方法が開発されている。現在使用されている検定方法の実質的な部分は被検体と反応成分との間の特異的な結合反応に依存する。被検体は、数例をあげると、タンパク質、ウィルス、ウィルス抗原、細菌細胞、細胞表面受容体、酵素、ホルモン、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質などの巨大複合分子のこともあり、或いはペプチド、ある種のホルモン、治療薬、乱用薬物などの小型ハプテン分子のこともある。
【０００３】
結合検定はそのフォーマットにより二つの主要なグループである均一及び不均一検定に別けられる。均一検定は被検体と検定試薬との間の単一相反応に基づく。不均一検定には、標準的に、液体試料中に含まれた被検体と固形支持体に付着した検定試薬との結合が含まれる。支持表面として種々の材料が使用されていて、ガラス棒、ガラス玉、シリカ含浸細片、ガラス繊維、マイクロ粒子などが包含される。
【０００４】
一般的な染料、特に蛍光染料が均一及び不均一結合検定の双方に使用されて検出可能なシグナルを表示する。しかしながら、標識に結合した被検体が発した蛍光シグナルの正確な検出は生物試料自体の蛍光に由来する高い種々の基底値によって妨害されることが多い。
【０００５】
液体フローサイトメトリーはこの問題を克服するのに役立つ。フローサイトメトリーでは、被検体を結合した標識分子はレーザビームを通過する。粒子が放射した蛍光シグナルを測定して被検体の存在と量に関係付ける。この方法の主な利点は他の試料非結合成分の存在下に於いて結合被検体関連の蛍光シグナルを正確に検出、測定できる能力である。
【０００６】
サッカリドは生化学被検体の重要なグループである。その試料中濃度の現在の決定方法は標準的に酵素検定法に依存する。酵素検定はその信頼性が証明された方法であるが、比較的不安定な酵素を使用する必要があり、酵素はそれらの基体の存在下で枯渇状態となる。加えて、通常の酵素検定法は簡便なフローサイトメトリーのフォーマットで使用できない。フローサイトメトリーで使用される粒子系検定では、粒子に閉じ込められたシグナル変化が要求される。標準の酵素分析法はこの用件に抵触する自由拡散性の中間体を用いる。
【０００７】
サッカリド（糖類）の確定は特に臨床設定に重要である。糖尿病及び高血糖症の治療は組織グルコース濃度の頻繁な測定を必要とする。それは通常少量の血液試料を一日当り数回採取することで行われる（指の刺通などによる）。患者は標準的に血液滴採取ランセットを用い、血液滴を小メータ内で読み取る試薬片に適用する。このプロセスは苦痛を伴うものであり、浸襲性で時間がかかる。
【０００８】
最近になって、グルコースのインビボでの測定に関する最小浸襲性の方法が本発明の譲受人に共同譲渡され、参照して本明細書の一部を成す米国特許出願番号第０９／３９３，７３８（１９９９年９月１０日提出）に開示された。その方法は体内の被検体濃度に反応して検出可能な被検体シグナルを発生することができる埋め込みセンサ粒子の使用に基づく。提案された方法は通常の指刺通方法よりも浸襲性の少ない血液Ｄ−グルコース測定方法である。その方法は皮膚内センサ粒子の周期的な取替えが必要なだけである。
【０００９】
センサ粒子は標準的に粒子本体の表面に付着した、或いは本体内に埋め込まれた蛍光センサを含む。センサは標的被検体に特異的である。センサの被検体への結合が被検体の濃度に応答する検出可能なシグナルを発する。被検体がグルコースである場合、蛍光体抱合二ホウ素酸が使用される。
【００１０】
グルコースに特異的な類似な蛍光センサはジェームス（Ｊａｍｅｓ）らのＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９５、Ｖｏｌ．１１７、ｐｐ．８９８２−８９８７、ジェームスらの米国特許第５，５０３，７７０号、タケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ）らのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ｖｏｌ．５２、Ｎｏ．４、ｐｐ．１１９５−１２０４に記述がある。手短に述べると、ジェームス及びタケウチの蛍光センサは次の一般構造を有する。
【００１１】
【化５】
2004519677.tif 000003
上記構造中、Ｆは蛍光分子を表し、Ｒは低級脂肪族または芳香族基であり、ｎ＋ｍは２または３である。センサの蛍光強度はグルコースヒドロキシルのホウ素酸対への結合によって変調される蛍光分子とアミン基との間の光誘導電子移行（ＰＥＴ）に反応して変化する。グルコース結合が存在しなければ、蛍光基による蛍光は窒素原子の被共有電子対によって消光される。グルコースが結合すると、非共有電子対は結合形成に用いられて蛍光消光に参画しない。その結果、センサの固有蛍光を発現する。
【００１２】
（発明の開示）
上述した蛍光センサの生化学検定及び臨床試験での応用は初期の酵素系インビトロ方法に対し或る利点をもたらすが、それにも拘らず重大な欠点をもつ。蛍光分子がサッカリド結合基を分離し、所望の被検体選択性を与えるためにスペーサとして用いられるために、蛍光分子の種類、その大きさ及び立体配座が厳しく制約される。同じ理由で、開示された蛍光化合物に特異的に結合して検出可能なシグナルを産出できる被検体の種類、大きさ及び立体配座に関する顕著な制限がある。さらに、参照技術は不均一検定フォーマットにＰＥＴタイプの蛍光化合物の使用を提唱するが、化合物を固形支持体に付着させるための手段を提供していない。この種の付着は蛍光分子の配座と構造に関する厳しい制約から見て特に難しいと思われる。
【００１３】
したがって、本発明の目的は蛍光センサ、特に蛍光基と結合基の独立した選択を可能にするモジューラ構造をもつＰＥＴタイプのセンサを提供することにある。広範囲な被検体への特異的な結合に容易に適合することができる蛍光センサを提供することも本発明の目的である。均一及び不均一結合検定の両方のフォーマットに用いることができ、固形表面に容易に付着できる蛍光センサの提供も本発明のさらなる目的である。最後に、蛍光センサの製作及び使用に関する便宜な方法を提供することが本発明の目的である。
【００１４】
これら及びその他の目的と利点は次の一般構造を有する本発明のモジュール蛍光センサで達成される。
【００１５】
【化６】
2004519677.tif 000004
上記構造に於いて、Ｆｌは蛍光分子、Ｎは窒素原子、Ｂｄ１とＢｄ２は独立的に選択された結合基、Ｓｐは脂肪族スペーサ、Ａｎはセンサを固形基体に付着させるための固着基であり、ｎは１または２、ｍは１または２であり、ｘは整数である。結合基は被検体分子と結合し、安定な１：１複合体を生成することができる。結合基の例には、次のものに限定されないが、一ホウ素酸及び１，４，７，１０，１３−ペンタオキザ−１６−アザ−シクロオクタデカン（アザ１８−クラウン−６）、１，４，７，１３−テトラオキザ−１０−アザ−シクロヘキサデカン（アザ１５−クラウン−５）などの一クラウンエーテルが含まれる。好適な実施態様では、Ｂｄ１はＲ１−Ｂ（ＯＨ）２であり、Ｂｄ２はＲ２−Ｂ（ＯＨ）２である。Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に選択された脂肪族または芳香族の官能基であり、Ｂはホウ素原子である。
【００１６】
別の態様では、本発明はモジューラ蛍光センサの合成方法を提供する。その方法は（ａ）次の一般構造の非対称化合物を合成するステップ、（ｂ）水素原子をＢｄ１とＢｄ２基で置換するステップとを含む。
【００１７】
【化７】
2004519677.tif 000005
上記構造中、Ｆｌは蛍光分子、Ｎは窒素原子、Ｈは水素原子、Ｓｐは脂肪族スペーサ、Ａｎはセンサを固形基体に付着させるための固着基である。Ｂｄ１とＢｄ２は被検体分子を結合して安定な１：１複合体を生成することができる独立的に選択された基であり、ｎは１または２、ｘは整数である。
【００１８】
本発明はまた固形基体の標識方法を提供する。その方法は（ａ）固形基体を供給するステップ、（ｂ）構造（２）の本発明のモジューラ蛍光センサを供給するステップ（但し、Ａｎは固形基体に付着していることができる）、（ｃ）センサが基体に充分に付着する条件下でセンサを固形基体と反応させるステップを含む。
【００１９】
固形基体はマイクロ粒子であってもよい。センサは粒子の外表面に付着していてもよく、或いは粒子の内部に付着していてもよい。
【００２０】
本発明のモジューラ蛍光センサは幾つかの利点を示すことが分かった。センサのモジューラ構造がその官能部分を都合よく置換して、被検体が構造、結合親和力及び溶解性の広い範囲で適合するのを可能にする。本センサの固着位置と非対称構造が不均一検定フォーマットに要求されるセンサの多様な固形基体への利便的付着を許容する。また、本発明の蛍光センサがシグナル発生を被検体結合と連結させることによって、被検体の測定が局所化される。その結果、センサは粒子系検定及びフローサイトメトリーに応用するのに好都合である。最後に本発明では、特殊なスペーサ基を使用して、被検体−結合基間に所望する分子間距離を与え、それが被検体の選択性を支配する。他方、従来のＰＥＴタイプのセンサは蛍光分子をスペーサとして用い、それが使用可能な蛍光分子の種類に厳しい制約を課している。対照的に本発明では、蛍光分子はその大きさまたは配座の制約なしに選択され得る。
【００２１】
その多用性の見地から、本発明の新規な蛍光センサは広範囲な分析的、臨床的用途に有用である。センサはサッカリドの検出と定量分析に特に好都合である。
【００２２】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の上述した特徴及びその他の特徴、それを得る方法は添付した図面と共に以下の記述を参照することによって、さらに明らかとなり、最良の理解が得られるであろう。図面は本発明の代表的な実施態様を示すものであり、本発明の範囲を制限するものでない。
【００２３】
本発明は次の一般構造をもつモジューラ蛍光センサを提供する。
【００２４】
【化８】
2004519677.tif 000006
上記構造中、Ｆｌは蛍光分子、Ｎは窒素原子であり、Ｂｄ１及びＢｄ２は独立的に選択された結合基、Ｓｐは脂肪族スペーサ、Ａｎはセンサを固形基体に付着させるための固着基である。構造式（２）に於いて、ｎ，ｍ，ｘ及びｙは整数であり、ｎ＝１または２、ｍ＝１または２、ｙ＝１または２でｘは整数である。一実施態様では、ｘ＝０〜１０である。結合基は被検体分子を結合して安定な１：１複合体を生成することができる。
【００２５】
本発明では、蛍光分子Ｆｌは結合基間でスペーサとして作用しない。その結果、蛍光分子は種々の大きさと配座を持つ広い範囲の官能基から選択され得る。適用可能な蛍光分子の例には、ナフチル、アンスリル（ａｎｔｈｒｙｌ）、ピレニル、フェナンスリル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｙｌ）、ペリレニルなどのπ−電子系を含む官能基が含まれるが、これに限定されるものではない。蛍光分子は非置換体、或いは置換体であってもよい。例えば、強塩基性分子、或いはカルボン酸またはスルホン酸などの酸性基に導入することによって、ある種の分子が水溶性となることはよく知られている。したがって、蛍光分子をスルホン酸基で置換して均一検定フォーマットに適合させることもできる。
【００２６】
本発明のセンサはその分子構造中に蛍光分子を含むが、被検体が存在しないときには蛍光を発しない。発明の開示に於いて説明したように、ＰＥＴ分子では、蛍光分子の蛍光は窒素原子の非共有電子対によって消光される。センサが試料中に含まれた被検体を結合すると、窒素原子の非共有電子対はセンサと被検体との分子間複合体生成に参画する。その結果、センサ固有の蛍光が発現してくる。
【００２７】
本発明では、結合基は、それが被検体をセンサに望み道理に特異的に結合させて１：１の複合体を生成させる限りに於いて、如何なる官能基であってもよい。結合基は電子不足基であるのが好ましい。被検体を特異的に結合したときに電子の不足が窒素原子から結合基への非共有電子の移行を支配する。適用可能な結合基の例には、一ホウ素酸及び１，４，７，１０，１３−ペンタオキザ−１６−アザ−シクロオクタデカン（アザ１８−クラウン−６）、１，４，７，１３−テトラオキザ−１０−アザ−シクロヘキサデカン（アザ１５−クラウン−５）などの一クラウンエーテルが含まれるが、これに限定されるものではない。本発明のセンサを用いることによって同定される被検体の例には、サッカリド、アミノサッカリド、カルボニルサッカリドが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
好適な実施態様では、Ｂｄ１はＲ１−Ｂ（ＯＨ）２、Ｂｄ２はＲ２−Ｂ（ＯＨ）２であり、Ｒ１及びＲ２は互いに独立的に選択された脂肪族または芳香族の官能基であり、Ｂはホウ素原子である。適用可能なＲ１とＲ２基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、フェニル、メトキシ、エトキシ、ブトキシ及びフェノキシキ基が非限定的に含まれる。
【００２９】
結合基は脂肪族スペーサＳｐによって別けられている。スペーサの炭素骨格の長さは被検体の大きさに適合するように選択される。一実施態様では、被検体がグルコースの場合、炭素骨格の長さは結合基間の間隔がグルコースの大きさと同程度の長さである。
【００３０】
スペーサは直鎖、分枝または環状構造であってもよいが、好適な実施態様では、スペーサは直鎖アルカンである。標準的に、スペーサは１〜９個の炭素原子を含むが、さらに長いスペーサも被検体の大きさに適合させるために使用されることもある。例として、被検体がグルコースの場合、スペーサは６個の炭素原子を含む。
【００３１】
センサの固着基Ａｎは固形支持体上、例えば不均一結合検定に使用される支持体上、にセンサを固定させる手段を提供する。Ａｎ基はセンサの窒素原子の一つに直接的または炭素ブリッジ−（ＣＨ２）ｘ−の手段によって付着している。Ａｎ基の種類及び炭素ブリッジ中の炭素数（ｘ）はセンサの固形支持体への付着を確実にするように選択される。例えば、一実施態様では、センサはマイクロメータスケールの粒子に付着している。本発明のセンサが付着したマイクロメータスケールの粒子はフローサイトメトリーを含む種々の用途に使用される。標準的に、Ａｎは有機官能性を含む。一実施態様では、Ａｎはフェニルを含む。
【００３２】
固着基Ａｎは任意的である。例えば、均一検定ではセンサの付着は必要でない。したがって、センサは固着基なしで、或いはメチル、ベンジルなどの官能基を伴って合成されることもある。
【００３３】
本発明は官能性要素間の相互作用が最小であるモジューラセンサの骨格を提供する。本発明になるセンサの個々の官能性要素は容易に置換されて広い範囲の被検体を受容する。例えば、一実施態様では、センサの全ての官能基及び炭素ブリッジの長さはセンサのグルコースへの選択的結合を与えるように選択される。
【００３４】
本発明のモジューラ蛍光センサは次の一般構造を有することが好適である。
【００３５】
【化９】
2004519677.tif 000007
上記構造（４）に於いて、Ｆｌは蛍光分子、Ｎは窒素であり、Ｂはホウ素原子である。Ｒ１とＲ２は脂肪族または芳香族の官能基であり、それが被検体をホウ素酸官能性のヒドロキシルと共有結合させて安定な１：１複合体を生成させる。Ｒ１及びＲ２は互いに独立的に選択される。Ａｎはセンサを固形基体に付着させる固着基であり、ｘは任意の整数である。一実施態様では、ｘ＝０〜１０である。
【００３６】
本発明の構造式（２）及び（４）に属する標準的な化合物は次の構造をもつ。
【００３７】
【化１０】
2004519677.tif 000008
化合物（５）は、思いがけなく、グルコースに対し特異的な選択性を有し、試料中に含まれたグルコースに結合したときに強い蛍光を発する。この種のグルコースに対する選択性は化合物（５）の構造によって説明される。二個のホウ素酸基が６個の炭素鎖を包含するスペーサによって互いに別けられていて、それによってホウ素酸基がグルコースのシス‐１，２及び４，６‐ヒドロキシル基と結合してグルコースと強い１：１複合体を生成している。
【００３８】
別の態様では、本発明はモジューラ蛍光センサの合成方法を提供する。その合成方法は、（ａ）次の構造で表される非対称化合物を生成するステップと、（ｂ）水素原子をＢｄ１及びＢｄ２基で置換するステップとを含む。
【００３９】
【化１１】
2004519677.tif 000009
上記構造中、Ｆｌは蛍光分子、Ｎは窒素原子、Ｈは水素原子であり、Ｓｐは脂肪族スペーサ、Ａｎはセンサを固体基体に付着させる固着基である。Ｂｄ１とＢｄ２は被検体と結合して安定な１：１複合体を生成させることができる独立的に選択された結合基であり、ｎは１又は２、ｘは任意の整数である。一実施態様では、ｘ＝０〜１０である。一実施態様では、水素原子を置換するステップはオルソブロモメチルフェニルホウ素酸の添加を含む。一例として、図１に示し、かつ以下の実施例Ｉに詳細に考察する反応スキームを用いることができる。
【００４０】
本発明は固体基体を標識する方法をも提供する。その方法は、（ａ）固体基体を供給するステップ、（ｂ）構造（２）の本発明になるモジューラ蛍光センサを供給するステップ（ここで、Ａｎは固体基体に付着されていることができる）、（ｃ）センサを基体に十分固着させる条件下で、センサを固形基体と反応させるステップを包含する。
【００４１】
本発明の目的に関し、センサの基体への付着が妨害されなければ、条件は十分である。当業者にとって、固形基体の種類および固着基の性状に基づき、どんな条件が十分であるかは周知であろう。例えば、固着基がアミノ基、好ましくは第一級アミンの場合、固形基体はカルボン酸グループを含む必要があり、十分な条件はカップリング剤の添加によって満足される。適用可能なカップリング剤には、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボイミドまたは水溶性カルボイミド、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）が含まれるが、これに限定されるものではない。さらに、良好な反応効率を得るために、Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸イミドを反応混合物に加えてもよい。本発明の一実施態様に拠れば、固着基が第一級アミンの場合、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を溶媒Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と混合し、混合物を室温下で２〜２４時間攪拌することによってセンサを基体に付着する。
【００４２】
固体基体はマイクロ粒子であってもよい。本発明の一実施態様では、粒子の大きさは約０．１乃至約２０μｍの範囲である。
【００４３】
粒子は乳化重合で生成したポリスチレンラッテクス粒子などの普通に入手可能な丸く、均一であるのが好ましい。粒子はその他の材料及び従来技術で周知な他のプロセスによって生成されてもよい。材料及び方法の例には、溶解ポリマーの液滴注入成型によって産出された可塑化ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）粒子、或いはゾルゲルから産出されたガラス様粒子が含まれるが、これに限定されるものではない。さらに、センサ粒子は生物再吸収性ポリマーから作られることもある。生物再吸収性ポリマーの例には、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、澱粉、ゲラチンなどが非限定的に含まれる。
【００４４】
本発明のセンサ粒子は、細孔調節ガラス（ＣＰＧ）玉またはポリマーゲルなどの親水性粒子であってもよいが、これに限定されるものではない。また、センサ粒子は小被検体による自由浸透を許容するために適当な可塑剤を伴った、或いはガラス転移温度が十分に低い疎水性粒子であってもよい。別の選択肢として、センサ粒子は非限定的にリポソームなどの半浸透性膜でもよい。センサの劣化を避けるために、センサはＣＰＧ玉の細孔またはポリマーゲルなどの親水性粒子の内部に結合されることもある。受容体もまた小被検体による自由浸透を許容するために適切な可塑剤を伴った疎水性粒子の内部に捕捉されることもある。受容体はさらに半浸透性膜の内部に収納されることもある。本発明の目的に関し、可塑剤は小被検体を疎水性粒子の中へ自由浸透させるものであれば適切である。その種の可塑剤には、ジオクチルアジピン酸エステル、ジイソデシルアジピン酸エステル、などが含まれるが、これに限定されるものではない。別の実施態様に拠れば、本発明のセンサは疎水性またはそのほかの不溶性粒子の表面に結合されることもある。
【００４５】
以上の説明は本発明の範囲を例示するものであり、制限するものではない。通常の当業者にとって、本明細書の教示に基づき、過度の実験を行うことなくさらなる実施態様を考え、生み出すことは実際に容易である。
【００４６】
（実施例Ｉ）
図１に示した合成経路に拠り、構造（５）の蛍光センサを以下に詳述するように合成した。
【００４７】
（Ｎ−ベンジル−ヘキサン−１，６−ジアミンの合成）
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３００ｍｌ）及びエタノール（７５ｍｌ）中にヘキサメチレン−１，６−ジアミン（１７．１５ｇ、１４８ｍｍｏｌ）とベンズアルデヒド（３．０ｍｌ、２９．５ｍｍｏｌ）を含む溶液を窒素雰囲気下で２４時間、室温にて攪拌した。溶媒を除去し油分を真空下で乾燥した。乾燥残渣をＴＨＦ（１００ｍｌ）中に溶解し、水素化硼素ナトリウム（５．５８ｇ、１４８ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。溶液を窒素雰囲気下で７時間、室温にて攪拌した。メタノールと水を溶液に加え、溶媒を真空下で除去した。得られた油分をクロロホルムに溶解し、水で洗った。溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を真空除去して無色の油分（４．４９ｇ、７４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ１．１〜１．５（８Ｈ，ｍ，（ＣＨ２）４）、２．５５（２Ｈ，ｔ，ＮＨＣＨ２）、２．６５（２Ｈ，ｔ，ＡｒＣＮＣＨ２）、３．７５（２Ｈ，ｓ，ＡｒＣＨ２）、７．１〜７．２５（５Ｈ，ｍ，ＡｒＨ）。
【００４８】
（Ｎ−ベンジル−Ｎ’‐ピレン−１−イルメチレン−ヘキサン−１，６−ジアミンの合成）
ＴＨＦ及びメタノール（各１２．５ｍｌ）中にＮ‐ベンジル‐ヘキサン‐１，６‐ジアミン（５００ｍｇ、２．４２ｍｍｏｌ）と１−ピレネカルボキシアルデヒド（６７０ｍｇ、２．９０ｍｍｏｌ）を含む溶液を窒素雰囲気下で２０時間、室温にて攪拌した。溶媒を真空除去し、残渣をメタノールで洗った。沈殿を濾過除去し、濾液を取り出して真空乾燥して黄色油分（９４０ｍｇ、９３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ１．４５〜１．６２（６Ｈ，ｍ，（ＣＨ２）３）、１．８５（２Ｈ，ｍ，＝ＨＣＣＨ２）、２．６５（２Ｈ，ｔ，ＮＨＣＨ２）、３．７８（２Ｈ，ｓ，ＰｈＣＨ２）、３．８５（２Ｈ，ｔ，＝ＮＣＨ２）、７．１５〜７．２５（５Ｈ，ｍ，Ｐｈ‐Ｈ）、７．９５〜８．２３，８．５３，８．８８（各７Ｈ，１Ｈ，１Ｈそれぞれ、ｍ，ｄ，ｄ，Ｐｙ‐Ｈ）、９．２７（１Ｈ，ｓ，Ｎ＝ＣＨ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ２７．３１，２７．４９，３０．１２，３１．１６，４９．５０，５４．１３，６２．７７，１２２．６４，１２５．００，１２５．５９，１２５．８４，１２６．１２，１２６．２４，１２６．９１，１２７．５０，１２８．１６，１２８．４２，１２８．５９，１３０．６４，１３１．３０，１４０．５０，１５９．５４；ｍ／ｚ（ＴＯＦ）４１９（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。
【００４９】
（Ｎ−ベンジル−Ｎ’−ピレン−１−イルメチル−ヘキサン−１，６−ジアミンの合成）
メタノール（１０．０ｍｌ）中にＮ−ベンジル−Ｎ’‐ピレン−１−イルメチレン−ヘキサン−１，６−ジアミン（４２０ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）と水素化硼素ナトリウム（１９０ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）を含む溶液を窒素雰囲気下で３時間、室温にて攪拌した。溶媒を真空除去し、残渣をクロロホルムに溶かして水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を除去して、残渣を真空乾燥して黄色油分（３８６ｍｇ、９２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ１．３２（４Ｈ，ｍ，（ＣＨ２）２）、１．４５（２Ｈ，ｍ，ＢｎＮＣＣＨ２）、１．５５（２Ｈ，ｍ，ＰｙＣＮＣＣＨ２）、２．５５（２Ｈ，ｔ，ＢｎＮＣＨ２）、２．７５（２Ｈ，ｔ，ＰｙＣＮＣＨ２）、３．７５（２Ｈ，ｓ，ＰｈＣＨ２）、４．５０（２Ｈ，ｓ，ＰｙＣＨ２）、７．１５〜７．２５（５Ｈ，ｍ，Ｐｈ−Ｈ）、７．９５〜８．１０，８．１５〜８．２２，８．３７（各４Ｈ，４Ｈ，１Ｈ，それぞれ、ｍ、ｍ、ｄ、Ｐｙ−Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ２７．３５，３０．１６，４９．４６，５０．０２，５１．９４，５４．１３，５４．１３，１２３．１９，１２４．７２，１２５．００，１２５．０９，１２５．８９，１２６．８９，１２７．０３，１２７．５０，１２７．６４，１２８．１４，１２８．４０，１２９．０６，１３１．３４，１３４．１５；ｍ／ｚ（ＥＩ）４２０（［Ｍ］＋７％）。
【００５０】
（Ｎ−ベンジル−Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−ボロノベンジル）−Ｎ’−ピレン−１−イルメチル−ヘキサン−１，６−ジアミン（図１、化合物１または構造（５））の合成
乾燥アセトニトリル（１０ｍｌ）中にＮ−ピレン−１−イルメチル−ヘキサン−１，６−ジアミン（２９１ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、２−（２−ブロモメチル−フェニル）−［１，３，２］ジオキザボリナン（４２２ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（３８０ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）を含む溶液を窒素雰囲気下で２０時間還流加熱した。溶媒を真空除去し、残渣をクロロホルムに溶かし水で洗った。溶媒を硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空除去した。残渣をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶かした。水（１０ｍｌ）をＴＨＦ溶液に加え、溶液を室温で３時間攪拌した。有機相をクロロホルムで抽出し、水洗いし硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空除去した。残渣をｎ−ヘキサンでクロロホルムから再結晶させて黄白色粉末（１７２ｍｇ、３５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ１．２５〜１．４８（８Ｈ，ｍ，（ＣＨ２）４）、２．２５（２Ｈ，ｔ，ＢｎＮＣＨ２）、２．４８（２Ｈ，ｔ，ＰｙＣＮＣＨ２）、３．４５（２Ｈ，ｓ，ＰｈＢ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＢｎ）、３．５８（２Ｈ，ｓ，ＰｈＢ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＣＰｙ）、３．８５（２Ｈ，ｓ，ＰｈＣＨ２）、４．２１（２Ｈ，ｓ，ＰｙＣＨ２）、７．０２〜７．４１及び７．８８〜８．１９（２２Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ）、８．８６（４Ｈ，ｂｓ，ＢＯＨ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ／ｐｐｍ５１．６９，５２．９９，５４．４２，５６．４２，５７．１１，６１．０３，６１．８６，６７．８５，１２２．９０，１２４．５５，１２４．９９，１２５．７９，１２７．３１，１２８．２８，１２８．５７，１２９．４３，１３０．００，１３０．５５，１３６．３２，１４１．５６；測定Ｃ：７６．５５、Ｈ：６．６９，Ｎ：３．８０、Ｃ４４Ｈ４６Ｂ２Ｎ２Ｏ４に要するＣ：７６．７６，Ｈ：６．７３，Ｎ：４．０７％；ｍ／ｚ（ＦＡＢ）１２３０（［Ｍ＋Ｈ＋４（３−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＮＯ２）−４（Ｈ２Ｏ）］＋，１００％）；融点：１６５〜１６８℃。
【００５１】
（実施例ＩＩ）
実施例Ｉで合成した構造式（５）のセンサの相対蛍光強度を５２．１重量％のメタノールと種々のＤ−グルコース濃度の燐酸緩衝液（ｐＨ８．２１）中で測定した（図２）。燐酸緩衝液はペリン（Ｄ．Ｄ．Ｐｅｒｒｉｎ）及びデンプセイ（Ｂ．Ｄｅｍｐｓｅｙ）の記述（「ｐＨ緩衝液及び金属イオン制御（Ｂｕｆｆｅｒｓ ｆｏｒ ｐＨ ａｎｄ Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ）」 Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９７４）のように調製した。溶液中に増加する量のＤ−グルコースを加えながら蛍光スペクトルを記録した。混合液の励起を３４２ｎｍで測定した。蛍光強度は溶液中の全グルコース濃度と相関することが判明した。
【００５２】
図３は蛍光強度に対しＤ−グルコース濃度の対数をプロットした図である。このプロットは蛍光がＤ−グルコース濃度の増加とともに増加すること、ＰＥＴ受容体の蛍光がＤ−グルコース濃度の検定に使用できることを示す。
【００５３】
本発明はその本質的な特性から逸脱することなく他の特異的な形態に具体化されると思われる。上述した実施態様はすべてに関し例示的なものであり、制約するものでないと理解されるべきである。したがって、本発明の範囲は上述の記述でなく添付のクレームによって表示されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛍光センサの合成スキームを示す図である。
【図２】Ｄ−グルコースの濃度変化に対する蛍光スペクトルの応答を示す図である。
【図３】蛍光強度に対するＤ−グルコース濃度の対数をプロットした図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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