(57)【要約】オステオポンチンに対する抗体を含む、転移についての予後インジケーター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオポンチンに対する抗体を含む、転移についての予後インジケーター。
【請求項２】
オステオポンチン遺伝子産物に対する抗体を含む、請求項１に記載の予後インジケーター。
【請求項３】
抗体がオステオポンチンに由来するペプチドに対するものである請求項２に記載の予後インジケーター。
【請求項４】
該ペプチドがオステオポンチンのアミノ酸末端に由来する請求項３に記載の予後インジケーター。
【請求項５】
該ペプチドが配列番号１の少なくとも１０個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む請求項３に記載の予後インジケーター。
【請求項６】
該ペプチドが配列番号１の１４〜２０の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む請求項５に記載の予後インジケーター。
【請求項７】
該ペプチドが配列番号２に少なくとも７０％相同的であるアミノ酸配列を含む請求項５または６のいずれか１つに記載の予後インジケーター。
【請求項８】
該ペプチドが配列番号２に少なくとも９０％相同的であるアミノ酸配列を含む請求項７に記載の予後インジケーター。
【請求項９】
オステオポンチンに由来する抗原ペプチドを含む転移性ガンに対するワクチン。
【請求項１０】
該ワクチンが転移性乳ガンに対するものである請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
該抗原ペプチドがオステオポンチンのアミノ末端に由来する請求項９または１０のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１２】
該抗原ペプチドが配列番号１の少なくとも１０個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む請求項１０または１１のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１３】
該抗原ペプチドが配列番号１の１４〜２０の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
該抗原ペプチドが配列番号２に少なくとも８０％相同的であるアミノ酸配列を含む請求項１２または１３のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１５】
該抗原ペプチドが配列番号２に少なくとも９０％相同的であるアミノ酸配列を含む請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
該抗原ペプチドがキャリアタンパク質へカップリングされる請求項９〜１５のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１７】
アジュバントを含む、請求項９〜１６のいずれか１つに記載の、ワクチン。
【請求項１８】
該アジュバントがミョウバンまたはＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全である請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
オステオポンチンの発現を調節する化合物を投与することを包含する、転移を処置するための、方法。
【請求項２０】
該オステオポンチンの発現がブロックされる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該化合物がオステオポンチンに対する抗体である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
該化合物がオステオポンチンｍＲＮＡの翻訳をブロックするアンチセンス分子を提供する請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
該化合物がオステオポンチン遺伝子の５’領域に相補的であり且つ転写をブロックする核酸分子を提供する請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
該化合物が小さい分子である請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
該化合物が２ＫＤａ以下である分子量を有する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜８のいずれか１つに記載の予後インジケーターおよび１つ以上の視覚インジケーター（ｖｉｓｕａｌ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を含む、転移を診断するための、キット。
【請求項２７】
被験体が転移を発症する危険性を有するか否かを決定するための請求項１〜８のいずれか１つに記載の予後インジケーターの使用であって、被験体サンプルを該予後インジケーターと接触させることおよび該予後インジケーターと被験体サンプルとの間の複合体の形成を検出することを包含する、使用。
【請求項２８】
被験体が転移を発症する危険性を有するか否かを決定するための方法であって、被験体サンプルを請求項１〜８のいずれか１つに記載の予後インジケーターと接触させることおよび該予後インジケーターと被験体サンプルとの間の複合体の形成を検出することを包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、転移についての予後インジケーター、転移性ガンに対するワクチン、転移を処置するための方法および生命を脅かす転移を診断するためのキットに関する。
【０００２】
ほとんどのガンは、それらの遺伝子産物を何らかの点でより効果的にする突然変異によってか、または効果の促進をもたらす正常遺伝子の過剰発現によって引き起こされる特定の遺伝子における改変に帰因すると考えられる。これらのガン遺伝子は主として、ヒトガン由来のＤＮＡの遺伝子−長フラグメントをマウス繊維芽細胞系（培養中）へ導入し、そして液体または半−固体培地中において制御不能な様態で増殖するこれらの細胞系を選択することによって、同定されてきた。このガン遺伝子自体は、標準的な組換え技術により、マウスＤＮＡから離れたヒトＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって、単離されてきている。あるいは、突然変異は、ガン遺伝子（例えば、ｐ５３、またはＲｂのような）の活性を抑制するまたはそれらの産物（例えば、ＮＭ−２３のような）のレベルを抑制する遺伝子において生じ得る。これらは、腫瘍抑制遺伝子と呼ばれる。一般的に発生するガンにおいて、ガン遺伝子または腫瘍抑制遺伝子中の５〜７のこのような変化が、成熟した（ｆｕｌｌ−ｂｌｏｗｎ）ガンを産生するために必要であると信じられている。
【０００３】
現在の療法は原発性腫瘍に対して効果的であり得るけれども、それらは主として播種するまたは転移する細胞（これは、最終的に患者を殺す）に対して効果的でないので、ガンの主要な形態（乳ガン、肺ガンおよび結腸ガンを含む）は効果的に治療され得ない。ガン研究における多大な労力にも関わらず、最も重要な生命を脅かす（ｌｉｋｅ−ｔｈｒｅａｔｅｎｉｎｇ）プロセス（転移のもの）について分子レベルで非常にわずかしか知られていない。発見されたガン遺伝子および抑制遺伝子のほとんどは、マウス繊維芽細胞系の制御不能な増殖を促進するそれらの能力から見出されてきた。この分野における主な問題は、細胞増殖を測定することが転移のプロセスの基準を与えないことである。実際、制御不能な増殖はガンの発生における最初の事象の重要な局面であるけれども、遠隔転移の増殖の速度は著しく遅くなり得る。それゆえ転移のプロセスは、主として、細胞増殖を含むプロセス（その最終的な段階のものは除く）に非依存的である。それゆえ、ガン遺伝子および腫瘍抑制遺伝子は、転移のプロセスにおける多大な関与を有し、そして転移性疾患の制御および排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）のための有用な診断的または治療的標的ではありそうもない。
【０００４】
ガンにおける転移の形成に関係してきたタンパク質は、オステオポンチンである（Ｏａｔｅｓ，Ａ．Ｊ．ら、１９９７　Ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　１７，１−１５）。オステオポンチン（ＯＰＮ）は、分泌される、インテグリン結合する、カルシウム結合する、負に帯電する、正常および病理プロセスの両方に関係してきた約４４〜６０ＫＤａ分子量の、グリコシル化ホスホプロテインである。ＯＰＮは、全ての体液および鉱化組織の細胞外マトリックスにおいて見出され、そして骨における非−コラーゲン性タンパク質（ｎｏｎ−ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のより豊富なメンバーの１つである。代表的に、これは、骨、腎臓、血管、内耳、胆嚢の上皮細胞、胃腸管、気管支、乳腺、泌尿器および生殖管および唾液および汗腺管、活性Ｔリンパ球に加えて継続的な再生を受ける組織において見出される。ＯＰＮは悪性細胞および転移性疾患を有する患者の血液において高レベルで発現されることが示されており、そして結果的に悪性疾患におけるＯＰＮについての役割が仮定されている（Ｓｉｎｇｅｒ　Ｄ．Ｒ．ら、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４８：　５７７０〜５７７４，１９８８）。数多くの研究が存在し、乳ガンにおける血中ＯＰＮレベルが転移によって著しく上昇され、より高いＯＰＮレベルが生存率の減少に対応することが示される（Ｓｉｎｇｈａｌ，　Ｈ　Ｃｌｉｎｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　３：　６０５−６１１，　１９９７；　Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，　Ａ　ａｎｄ　Ｃａｓｔｒａｎｏｖｏ　Ｖ　Ａｍ．　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　１４６：９５−１００，　１９９５）。
【０００５】
ヒトＯＰＮ前駆体の配列が明らかにされており、その翻訳は以下の通りである（配列番号１）：
【０００６】
【化１】
2004509357.tif 000002
【０００７】
（Ｃｒｏｓｂｙ，　Ａ．Ｈ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ　ｇｅｎｅ；　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｏｃｕｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｃａｕｓａｔｉｖｅ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｄｅｎｔｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ　ｔｙｐｅ　ＩＩ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２７（１），　１５５−１６０，　１９９５）
オステオポンチンはまた、以前に胃ガン（Ｕｅ，Ｔら、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　７９；　１２７−１３２，　１９９８）および乳ガン（Ｔｕｃｋ，　ＡＢら、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　７９；　５０２−５０８，　１９９８）の両方のための予後インジケーターとして示されてきたが、予後における差異は少しも絶対的ではなかった。
【０００８】
ガン細胞におけるＯＰＮの存在に関するこのような多大な研究にも関わらず、一般的にガン、または特に転移におけるＯＰＮについての役割を解明することは不可能であった。本発明の目的は、ガン細胞におけるＯＰＮの既知の存在と関連して、患者にとって実際に役立つものを決定することである。
【０００９】
本発明の最初の局面に従って、オステオポンチンに対する抗体を含む転移についての予後インジケーターが提供される。
【００１０】
本出願人は驚くべきことに、オステオポンチンが発現されない乳ガンを有する個体において、生命を脅かす転移の広がりが存在しないことを見出した。
【００１１】
従ってＯＰＮ発現は、転移のプロセスにおける原因かもしれない。それゆえ、ＯＰＮの発現を妨げることによって生命を脅かすガンを軽減または治療するための手段は、本発明の方法によって可能であり得る。
【００１２】
本発明において有用な抗体は、オステオポンチン遺伝子産物またはその保存改変体またはペプチドフラグメントのｉｎ　ｓｉｔｕ検出のために、組織学的に使用され得る。ｉｎ　ｓｉｔｕ検出は、患者から組織学的標本を取り、次いでそれにオステオポンチンに対する本発明の抗体（これは、引き続き二次標識抗体を用いて視覚化され得る）を適用することによって達成され得る。このような手順の使用を通じて、オステオポンチン遺伝子産物、または保存改変体またはペプチドフラグメントの存在だけでなく、検査組織におけるその分布を測定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、ｉｎ　ｓｉｔｕ検出を達成するために、あらゆる他の広く多様な組織学的方法（染色方法のような）が改変され得ることを容易に考えつくであろう。好ましくは、癌腫の上皮細胞のみが試験される；マクロファージ、宿主ストロマなどに帰因する染色が無視される。
【００１３】
例えば、抗体、または抗体のフラグメント（本明細書中上記されるもののような）が、オステオポンチンまたはその保存改変体またはペプチドフラグメントの存在を検出するために使用され得るか、または標識ｃＤＮＡアンチセンスプローブが、ｍＲＮＡ検出するために使用され得る。これは、例えば、蛍光的に標識される抗体を使用する免疫蛍光技術によって、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出を用いて、達成され得る。
【００１４】
オステオポンチン遺伝子産物またはその保存改変体またはペプチドフラグメントについてのアッセイは代表的に、オステオポンチン遺伝子産物またはその保存改変体またはペプチドフラグメントを同定し得る検出可能な標識抗体の存在下において、サンプル（組織抽出物、新鮮に回収される細胞または細胞培養においてインキュベートされた細胞の溶解物のような）をインキュベートすること、および当該分野において周知の多数の技術のいずれかによってこの結合抗体を検出することを包含する。
【００１５】
生物学的サンプルは、固体支持体またはキャリア（ニトロセルロースのような）、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化し得る他の固体支持体と接触させられ、そしてそこに固定化され得る。次いでその支持体は、洗浄され、その後検出可能に標識されるオステオポンチン特異的抗体または抗体のフラグメントで処理され得る。次いでこの固体支持体は、未結合抗体を取り除くために、緩衝液で２度目に洗浄され得る。次いで固体支持体上の結合標識の量が慣用的な手段によって検出され得る。
【００１６】
本発明の第２の局面に従って、オステオポンチンに対する抗体を生じる抗原ペプチドを含むワクチンが提供される。
【００１７】
このペプチドは、オステオポンチンの少なくとも１０個の連続アミノ酸に由来し得る。好ましくはこのペプチドは、オステオポンチンの１４〜２０個の連続アミノ酸に由来する。さらに好ましくは、このペプチドは、そのアミノ末端が細胞外に露出されるゆえに、オステオポンチンのアミノ末端からのアミノ酸に由来する。さらに好ましくはなお、このペプチドは、本明細書中上記のヒトＯＰＮ前駆体配列の領域２８〜４８（配列番号２）：ＥＥＫＱＬＹＮＫＹ　ＰＤＡＶＡＴＷＬＮＰ　ＤＰからのアミノ酸に由来する。
【００１８】
よりさらに好ましくはなお、このペプチドは、本明細書中上記のヒトＯＰＮ前駆体配列の領域３２〜４５（配列番号３）：ＱＬＹＮＫＹＰＤＡＶＡＴＷＬからのアミノ酸に由来する。
【００１９】
このペプチドは、配列番号２に少なくとも７０％相同的であるアミノ酸配列を含み得、好ましくはこのペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の相同性を含み、そしてさらに好ましくはこのペプチドは、配列番号２と少なくとも９０％の相同性を含む。なおさらに好ましくはこのペプチドは、配列番号３と少なくとも７０％の配列相同性を含み、よりさらに好ましくはなおこのペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％の配列少なくとも相同性を含み、そして最も好ましくはこのペプチドは、配列番号３と少なくとも９０％の配列相同性を含む。
【００２０】
好ましくはこのワクチンはさらに、アジュバントを含む：現在ミョウバン（水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム）がヒトワクチンにおける一般的使用に認可される唯一のアジュバントである。他のアジュバント（特にＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全）は動物において使用されてきており、またより効果的であるが、今までのところ有毒な副作用がヒトにおけるそれらの使用を妨げてきた。アルミニウム塩アジュバントは代表的に、タンパク質アジュバントと共に２つの方法（（ａ）ミョウバン−沈殿ワクチンとしておよび（ｂ）ミョウバン−吸着ワクチンとして）において使用される（Ｈａｒｌｏｗ，　Ｅ　＆　Ｄ．　Ｌａｎｅ，　１９８８，　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；　Ｎｉｃｋｌａｓ，　Ｗ．，　１９９２，　Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ　ｓａｌｔｓ．　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４３：４８９−４９３。ミョウバンは代表的に、Ａｌ（ＯＨ）３として商業的に入手可能である（Ａｌ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ−ｓｕｐｅｒｆｏｓ　ｏｆ　Ｄｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｃ　Ｃｏ，　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。
【００２１】
本発明の第２の局面の１つの実施形態において、抗原性ペプチドがキャリアタンパク質へカップリングされ得る。
【００２２】
本発明の第３の局面に従って、オステオポンチンの発現を調節する化合物を投与することを包含する転移を処置するための方法が提供される。
【００２３】
１つの実施形態において、オステオポンチンの発現がブロックされ得る。
【００２４】
この化合物はオステオポンチンに対して向けられた抗体であり得、これはオステオポンチンｍＲＮＡの翻訳をブロックするアンチセンス分子を提供し得るか、またはオステオポンチンの５’領域に相補的であり且つ転写をブロックする核酸分子を提供し得る。
【００２５】
この化合物はまた、発現を調節する任意の小さい分子であり得る。この化合物は、オステオポンチンの転写または翻訳をブロックすることによってか、またはＴ細胞ファクター（ＴＣＦ）４と相互作用することによりその誘導を妨げることによって、オステオポンチンの発現の誘導をブロックし得るか、あるいはこの小さい分子が、ＴＣＦ４のそのキレート形成を妨げるためにＤＮＡ上のＣＡＡＡＧ配列と相互作用し、それゆえにオステオポンチンの誘導を妨げ得る（Ｅｌ　Ｔａｎａｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　２０，　１７９３−９７　（２００１）；　Ｅｌ　Ｔａｎａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６１，　５６１９−５６２９　（２００１））。この化合物はまた、インテグリンアルファ　ニュー　ベータ１、インテグリンアルファ　ニュー　ベータ３、アルファ　ニュー　ベータ５またはアルファ４ベータ１とのオステオポンチンの相互作用を妨げ得る（Ｌｉａｗ　Ｌら、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　９５，　７１３−７２４　（１９９１）；　Ｍｉｙａｉｃｈｉら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６６，　２０３６９−２０３７４　（１９９１）；　Ｂａｙｌｅｓｓら、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１１１，　１１６５−１１７４　（１９９８））。好ましくは、この小さい分子が２ｋＤａより小さい分子量を有する。
【００２６】
本発明の第４の局面に従って、本明細書中上記のような予後インジケーターおよび１つ以上の視覚インジケーター（ｖｉｓｕａｌ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を含む転移を診断するためのキットが提供される。
【００２７】
本発明の第５の局面に従って、前記被験体サンプルを予後インジケーターと接触させることおよび予後インジケーターと被験体サンプルとの間の複合体の形成を検出することを包含する、被験体が転移を発生する危険性を有するか否かを決定するための請求項１〜８のいずれか１つに記載の予後インジケーターの使用が提供される。
【００２８】
本発明のさらなる局面に従って、被験体サンプルを請求項１〜８のいずれか１つに記載の予後インジケーターと接触させることおよび予後インジケーターと被験体サンプルとの間の複合体の形成を検出することを包含する、被験体が転移を発生する危険性を有するか否かを決定するための方法が提供される。
【００２９】
オステオポンチンの存在を検出するための方法は、例示のみの目的で、以下の実施例および図面への参照を用いてここで記載されるであろう：
図１および図２は、外科手術によって摘出された乳ガン組織が３３９人の原発性ガン患者（この疾患の手術可能なステージＩおよびステージＩＩ型を示し、Ｍｅｙｓｅｙｓｉｄｅ領域内に由来し、Ｒｏｙａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏｓｐｉｔａｌにて１９７６年〜１９８２年の間に診断された）の群から採取されたＫａｐｌａｎ　Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図示する（Ｗｉｎｓｔａｎｌｅｙら、１９９１　Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　６３：　４４７−４５０；　１９９３　Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　６７：　７６２−７７２）。年齢幅は、発表では２９−９２（平均５７）であった。標本組織は、日常的な手順で、中性緩衝ホルマリン中で固定され、そしてパラフィンブロック中に保存された。引き続いての情報が得られ、そして患者生存について、１９９５年８月３１日まで更新された。抗−オステオポンチン（アルファＭＢＩＩＩ　Ｂｉｏ（１）は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｂａｎｋ，　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｏｗａからであり、またＩｇＧ１アイソタイプのモノクローナルマウス抗体であり、そして０．０５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１／３０の希釈率にて使用された。二次抗体は、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１／２００の希釈率にて使用されるビオチン化ヒツジ抗−マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，　Ｂｕｃｋｓ）であった。この抗体は、ＡＢＣ複合体（Ｄａｋｏ，　Ｂｕｃｋｓ）およびジアミノベンジジンを用いて視覚化された。染色は、２人の独立した観察者によって評価され、各標本の２つの切片からのオステオポンチンについての細胞質染色を用いて、癌腫細胞のパーセンテージを記録した（１切片当たり１０場、２００×倍率にて）（未染色の細胞は、Ｍａｙｅｒ’ｓ　Ｈａｅｍａｌｕｍを用いて対比染色された）。Ｉｎ　ｓｉｔｕ癌腫の染色レベルは、マクロファージ、リンパ球、宿主ストロマ、紡錘細胞および血管の染色と同様に、無視された。群は、＜１細胞染色＝ｖｅ、＜５％＝＋／−、５−２５％＝＋、２５−５０％＝＋＋、５０−７５％＝＋＋＋、７５−１００％＝＋＋＋＋を有するように定義された。この群は、それぞれ、５１、６６、６０、９５、および６７癌腫を含んだ。図１および２を参照して、群間の相違は、−ｖｓ＋／および＋＋＋ｖｓ＋＋＋＋を除く全ての群について、５％レベルで有意である。
【００３０】
本出願人はさらに、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳ガン転移性細胞系）が、この細胞が培養物中において生存している場合、本明細書中上記の抗−オステオポンチン抗体によって認識されることを示してきた（ｉｎ　ｖｉｖｏでワクチンが働くことの明白な示唆）。
【００３１】
図３は、ウシオステオポンチン（３μｇ）が１２％ＳＤＳゲル中で電気泳動され、そしてニトロセルロース膜上でエレクトロブロットされるウェスタンブロットを図示する。この膜は３つの切片に切り取られ、そして各々が、０．００５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０を含むＴｒｉｓ−緩衝生理食塩水ｐＨ７（ＴＢＳ−Ｔ）中で、１：１０００希釈液の抗血清と共に、４℃にて一晩中インキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔの数回の交換において洗浄した後、この膜は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）に複合体化されるブタ（ｓｗｉｎｅ）抗−ウサギイムノグロブリンの１：１０００希釈液と共に、２時間、室温にてインキュベートされた。結合抗体は、ＥＣＬ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｋｉｔ　（ＢｉｏＲａｄ）および写真フィルムを用いて、視覚化された。現像されるフィルムをその膜の上へ二重に焼き付けること（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｎｇ）によって、その膜の上に存在する既知分子量のプレ染色タンパク質の位置がフィルム上に示され得た。抗−ペプチド１抗血清は、ウサギオステオポンチン配列の１５アミノ酸ペプチドに対して惹起された。ＧＯ６１およびＧＯ６２は、２つの別々の動物からの抗血清（両方ともこのペプチドと共にインキュベートされる）をいう。ＬＦ１２３は、組換えヒトオステオポンチンに対して惹起される全ウサギ血清であった。
【００３２】
ペプチドＣＱＬＹＨＫＨＰＤＡＬＡＴＷＬ　（Ｃｙｓ＋オステオポンチン前駆体のアミノ酸３２−４５）は商業的に合成され（Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　２　Ｒｕｅ　ｄｅ　Ｇｒａｖｉｌｌｉｅｒｅｓ，　７５００３，　Ｐａｒｉｓ，　Ｆｒａｎｃｅ）、そしてシステインを介してキーホールヒンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）へカップリングされた（Ｌｅｒｎｅｒら、１９８１，　ＰＮＡＳ　７８，３４０４−３４０７）。２羽のウサギが、アジュバントと共にこの構築物を用いて注射され（３週間の間隔で４回の注射）（初回注射についてはＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全、および他についてはＦｒｅｕｎｄ’ｓ不完全）、そして最後の注射の後２週間で採血された。
【００３３】
この抗血清（１％ウシ血清アルブミンおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水での１：１０，０００の希釈率）は、ＥＬＩＳＡにおいてペプチドを検出し、そして１：１，０００希釈液にて、ウェスタンブロットによってウシＯＰＮを検出した。１羽のウサギがまた、ウェスタンブロット上の〜３５ｋＤａにてより小さいポリペプチドを認識した。
【００３４】
このことは、（ｉ）このペプチドが抗原性であり、そして（ｉｉ）短期間で宿主へ害をもたらさないことを実証する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１　原発性腫瘍が異なる量のＯＰＮを発現する乳ガン患者についてのＫａｐｌａｎ　Ｍｅｉｅｒ生存曲線であり、陽性染色群はアマルガム化される。
【図２】
図２　オステオポンチンの発現の用量−応答効果を個別に示唆する群が示される図１において同定される乳ガン患者についてのＫａｐｌａｎ　Ｍｅｉｅｒ生存曲線。
【図３】
図３　Ｃｙｓ＋ウサギオステオポンチン前駆体のアミノ酸３２−４５（配列番号４　ＣＱＬＹＨＫＨＰＤＡＬＡＴＷＬ）に対して惹起される抗血清によるペプチドの検出を図示するウェスタンブロット。
【図１】
2004509357.tif 000003
【図２】
2004509357.tif 000004
【図３】
2004509357.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004509357.tif 000006
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月23日(2002.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性ガンの非存在を決定するための方法であって、以下の工程：
ｉ）原発性腫瘍からの上皮細胞および／または上皮細胞の溶解物を含む被験体サンプルを、オステオポンチンに対する抗体またはそのフラグメントを含む予後インジケーターと、接触させること；および
ｉｉ）該被験体サンプルと予後インジケーターとの間のあらゆる複合体の形成を検出すること、
を包含する、方法。
【請求項２】
転移に対する該予後インジケーターがオステオポンチン遺伝子産物に対する抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該抗体がオステオポンチンに由来するペプチドに対するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ペプチドがオステオポンチンのアミノ酸末端に由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該ペプチドが配列番号１の少なくとも１０個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該ペプチドが配列番号１の１４〜２０個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該ペプチドが配列番号２に少なくとも７０％相同的であるアミノ酸配列を含む、請求項５または６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
該ペプチドが配列番号２に少なくとも９０％相同的であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該診断の方法が転移性乳ガンについてである、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
オステオポンチン由来の抗原ペプチドを含む、転移ガンに対する、ワクチン。
【請求項１１】
該ワクチンが転移性乳ガンに対するものである請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
該抗原ペプチドがオステオポンチンのアミノ末端に由来する、請求項１０または１１のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１３】
該抗原ペプチドが配列番号１の少なくとも１０個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１４】
該抗原ペプチドが配列番号１の１４〜２０個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
該抗原ペプチドが配列番号２に少なくとも８０％相同的であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１６】
該抗原ペプチドが配列番号２に少なくとも９０％相同的であるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
該抗原ペプチドがキャリアタンパク質へカップリングされる、請求項１０〜１６のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１８】
アジュバントを含む、請求項１０〜１７のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１９】
該アジュバントがミョウバンまたはＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全である、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
転移性ガンを処置するための方法であって、以下の工程：
ｉ）請求項１−８のいずれか１つに記載のように転移を診断すること；および
ｉｉ）オステオポンチンの発現および／または機能をブロックする化合物を投与すること、
を包含する、方法。
【請求項２１】
該化合物がオステオポンチンに対する抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該化合物がオステオポンチンｍＲＮＡの翻訳をブロックするアンチセンス分子を提供する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該化合物がオステオポンチン遺伝子の５’領域に相補的であり且つ転写をブロックする核酸分子を提供する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
該化合物が小さい分子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
該化合物が２ＫＤａ以下である分子量を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
予後インジケーターおよび１つ以上の視覚インジケーター（ｖｉｓｕａｌ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載のように転移を診断するためのキット。
【請求項２７】
転移性ガンについての診断方法であって、以下の工程：
ｉ）原発性腫瘍からの上皮細胞および／または上皮細胞の溶解物を含む被験体サンプルを、オステオポンチンに対する抗体またはそのフラグメントを含む予後インジケーターと、接触させること；および
ｉｉ）該被験体サンプルと予後インジケーターとの間のあらゆる複合体の形成を検出すること、
を包含する、方法。
【国際調査報告】
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