(57)【要約】ＩＧＦＢＰ−２をコードする遺伝子の一部に対して相補的なアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を投与することで、ヒトを含む哺乳動物での前立腺及びその他の内分泌腺の治療のための組成物と方法が提供される。ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ腫瘍モデルをイン・ビトロ及びイン・ビボで用いて、そうしたＯＤＮの投与は腫瘍細胞の増殖を低下させること、さらに、アンドロゲン非依存状態への進行を遅らせることが示された。従って、ヒトを含む哺乳動物での前立腺及びその他の内分泌腺の治療と、前立腺腫瘍のアンドロゲン非依存状態への進行を遅らせることは、その哺乳動物に対して治療上有効な量の、ＩＧＦＢＰ−２をコードする遺伝子の一部に対して相補的で、処理された細胞内のＩＧＦＢＰ−２の量を減少させるアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を投与することで達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモン制御性腫瘍細胞によりＩＧＦＢＰ−２の発現を抑制するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含むホルモン制御性癌治療のための組成物。
【請求項２】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが翻訳開始又は停止部位にかかるＩＧＦＢＰ−２ｍＲＮＡの領域に対して相補的である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが配列番号１〜５６までのいずれかに示される一続きの連続塩基を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが１５−３０ヌクレオチドの長さを有している請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが配列番号１に示される１つながりの連続塩基によって構成される請求項１記載の組成物。
【請求項６】
ホルモン制御性腫瘍細胞のホルモン非依存状態への進行を、腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−２の発現を抑止するアンチセンス・オリゴヌクレオチドでホルモン感受性腫瘍細胞を処理することによって遅らせるための医薬組成物の製剤化における請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項７】
腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である請求項６記載の使用。
【請求項８】
腫瘍細胞が乳癌細胞である請求項６記載の使用。
【請求項９】
医薬組成物が個体におけるホルモン応答性癌細胞のアポトーシス性細胞死を誘発させるためにホルモン禁断の開始後に個体に投与され、それによって個体内のホルモン応答性癌細胞のホルモン非依存状態への進行を遅らせる、ホルモン応答性癌に罹患した個体におけるホルモン応答性癌を治療するための医薬組成物の製剤化における請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
ホルモン応答性癌が前立腺癌である請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ホルモン応答性癌によるＩＧＦＢＰ−２の発現を抑止するのに有効な量の組成物をヒトを含む哺乳動物に投与し、それによって腫瘍の転移性骨進行を抑止又は遅らせる、哺乳動物におけるＩＧＦ−Ｉ感受性腫瘍の転移性骨進行を抑止又は遅らせるための医薬組成物の製剤化における請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
ＩＧＦ−Ｉ感受性腫瘍が前立腺癌である請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
ホルモン制御性腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−２の発現を抑止するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む組成物を個体に投与する段階を含む、ホルモン応答性癌に罹患した個体内のホルモン応答性癌を治療するための方法。
【請求項１４】
組成物が個体内のホルモン応答性癌細胞のアポトーシス性細胞死を誘発させるためにホルモン禁断の開始後に個体に投与され、それによって個体内のホルモン応答性癌細胞のホルモン非依存状態への進行を遅らせる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ホルモン感受性腫瘍細胞を、腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−２の発現を抑止するアンチセンス・オリゴヌクレオチドによって処理する段階を含むホルモン制御性腫瘍細胞のホルモン非依存状態への進行を遅らせる方法。
【請求項１６】
ＩＧＦ−Ｉ感受性癌細胞によるＩＧＦＢＰ−２発現を抑止するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む組成物を、ＩＧＦ−Ｉ感受性癌細胞によるＩＧＦＢＰ−２発現を抑止するのに有効な量で投与することによって、腫瘍の転移性骨進行を抑止又は遅らせる段階を含む、ＩＧＦ−Ｉ感受性腫瘍に罹患した個体内のＩＧＦ−Ｉ感受性腫瘍の転移性骨進行を抑止又は遅らせる方法。
【請求項１７】
個体がヒトである請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
個体がヒトである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞が乳癌細胞である請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
個体がヒトである請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的には癌に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド療法に関するものである。より具体的には、前立腺癌及び乳癌を対象としている。
【０００２】
（発明の背景）
本願は、インシュリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）−２をコードする配列に対して相補的な配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを利用した前立腺腫瘍の治療に関する。
【０００３】
前立腺癌は男性に発生する最も一般的な癌であり、西側世界では男性における癌死では上から二番目の原因となっている。前立腺癌はアンドロゲン感受性腫瘍であるので、進行した前立腺癌を有する患者に対する一部の治療法式では、例えば性腺摘除によるアンドロゲン禁断（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）が用いられている。アンドロゲンを禁断すると前立腺腫瘍において広範なアポトーシスが起き、従って、その病気が退縮する。しかしながら、性腺摘除によって誘発されるアポトーシスは完全ではなく、最終的には生き残った腫瘍細胞のアンドロゲン非依存状態への進行が起きる。この進行は生残率及び生活の質の向上に対する主要な障害となっており、従って、アンドロゲン非依存性細胞を対象とする努力が行われている。これらの努力はアンドロゲン非依存性腫瘍細胞に対する非ホルモン療法に重点が置かれているが、これまでのところ、どんな非ホルモン療法も生残率を向上させていない（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｕｒｏｌ １６０：１２２０−１２２９ （１９９８））。従って別の方式が指示されている。我々の研究室における最近の研究では、アンドロゲン消失後のＩＧＦＢＰ−５（Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１：２２５７−２２６５， （２０００））及びＩＧＦＢＰ−２のレベル上昇がＩＧＦ−Ｉ有糸分裂と細胞生残率を増大させ、それによってアンドロゲン消失に対する進行が加速されることが示唆されている。
【０００４】
インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは多くの正常及び悪性細胞にとって強力な有糸分裂促進剤（ｍｉｔｏｇｅｎ）である。蓄積する証拠が、ＩＧＦが前立腺疾患および乳癌の病原において重要な役割を演じていることを示唆している（Ｂｏｕｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｍｅｔａｂ． ８１：６１２−６１７ （１９９６）； Ａｎｇｅｌｌｏｚ−Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６： ５４８５−５４９２ （１９９５）；Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９：８０７−８１０ （１９９８）， Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５９：１３７９−１３８３ （１９９８））。
【０００５】
ＩＧＦ類に対する生物学的応答は、ＩＧＦＢＰを含む種々の因子によって制御されている。今日までのところ、その機能が高親和性の相互作用を通じてＩＧＦ類の生物学的作用の調節に関与していると考えられる６つのＩＧＦＢＰが確認されている（Ｒａｊａｒａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｒｅｖ． １８： ８０１−８１３ （１９９７））。しかしながら、一部の証拠はＩＧＦとは無関係なＩＧＦＢＰに対する生物学的活性を示唆しており（Ａｎｄｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２２４６７−２２４７２ （１９９２）； Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： １４９６４−１４９７１ （１９９３））、細胞増殖に対するＩＧＦＢＰの促進性効果と抑止的効果の両方が種々の実験条件下で報告されている （Ａｎｄｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｅｌｇｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ８４： ３２５４−３２５８ （１９８７）； Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １０１６−１０２１ （１９９６）； Ｄａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９： ３４５６−３４６４ （１９９８））。従って、ＩＧＦＢＰの正確な機能については依然として検討の余地がある。こうしたことから、報告された結果は前立腺癌におけるＩＧＦについて示唆しているが、それらはこうした慣用に基づく治療方式を明確に示唆するものではない。
【０００６】
本発明は前立腺及びその他の内分泌腺癌の治療法としてＩＧＦＢＰ−２を標的とするアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を用いる。アンチセンスＯＤＮは、標的遺伝子ｍＲＮＡ領域に対して相補的であり、それによってＲＮＡ／ＤＮＡ錯体を形成することによって遺伝子発現を効果的に抑止する一本鎖ＤＮＡのつながり（ｓｔｒｅｔｃｈ）である（Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｕｒｏｌ．， １５９：１３７９−１３８３ （１９９８））。ＤＮＡの非架橋ホスホリル酸素の１つを硫黄で置換することでヌクレアーゼ消化に抵抗するようにホスホロチオエート型ＯＤＮを安定化させる。最近、特に腫瘍性病変進行に関与する遺伝子を標的とするいくつかのアンチセンスＯＤＮの評価がイン・ビトロとイン・ビボの両方で行われ、強力な治療剤としてのアンチセンス療法の有効性を実証している（Ｍｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２： ６６８−６７５ （１９９６）； Ｃｕｃｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： ４３３２−４３３７ （１９９６）； Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８９： １０２７−１０３６ （１９９７）； Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４： ２３２−２３４ （１９９８））。
【０００７】
（発明の要約）
本発明によれば、ＩＧＦＢＰ−２をコードする遺伝子の一部に対して相補的なアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を投与することで、ヒトを含む哺乳動物における前立腺及びその他の内分泌腺腫瘍を治療するための組成物と方法が提供される。アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰとアンドロゲン依存性マウス・シオノギ（ｓｈｉｏｎｏｇｉ）腫瘍モデルをイン・ビトロ及びイン・ビボで用いて、そうしたＯＤＮの投与が腫瘍細胞の増殖を減少させ、同時にアンドロゲン非依存状態への進行を遅らせることが示された。従って、ヒトを含む哺乳動物における前立腺癌及びその他のホルモン制御性（ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）癌の治療と、前立腺腫瘍のアンドロゲン非依存状態への進行の遅延は、ＩＧＦＢＰ−２をコードする核酸配列の一部に対して相補的で、標的癌細胞内のＩＧＦＢＰ−２レベルの低下をもたらす治療的に有効な量のアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドを哺乳動物に投与することによって達成される。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は前立腺腫瘍細胞のアンドロゲン非依存状態への進行を遅延させるための方法、前立腺癌あるいは乳癌などのホルモン制御性癌に罹っているヒトを含む個体を治療するための治療方法、そしてそうした方法を用いるのに有効な治療剤を提供する。さらに、本発明による組成物はそうした癌の成長と転移性進行を抑止し、遅らせるために用いることができる。本発明による治療方法は進んだ前立腺癌を有する個体の治療で最も一般的に用いられるであろうが、乳癌などのその他の内分泌腺悪性腫瘍のホルモン治療と組み合わせでも用いられるであろう。
【０００９】
本発明の第１の実施の形態によれば、アンドロゲン感受性前立腺癌細胞のアンドロゲン非依存状態への進行は、それら細胞内でのＩＧＦＢＰ−２の量を減らすことで遅らせることができる。実験はアンドロゲン感受性ヒト前立腺癌ＬＡＣａＰ及びアンドロゲン依存性マウス・シオノギ腫瘍モデルでイン・ビトロとイン・ビボの両方で行われた。シオノギ腫瘍モデルは雄の同系宿主の皮下で成長するアンドロゲン依存性マウス乳房悪性腫瘍の異種移植片である。シオノギ腫瘍細胞は高い腫瘍原性を有し、局所的な浸潤性が強い。これらの細胞はアンドロゲン禁断に対して前立腺腫瘍細胞で観察されている挙動と同様の挙動を示す方法で応答することが示されており、ヒトにおける前立腺癌に関する有効なモデルとして受け入れられている（Ｂｒｕｃｈｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０： ２２７５−２２８２（１９９０）； Ｒｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８： ６３０９−６３１２ （１９８８）； Ｂｒｕｃｈｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １３： ２７２−２８０ （１９７８）； Ｇｌｅａｖｅ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ３６７−３７８， Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ （１９９７）； Ｇｌｅａｖｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５７： １７２７−１７３０ （１９９７）； Ｂｒｕｃｈｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６： １３−２１ （１９９６））。従って、アンドロゲン禁断は非常に再現性の高い状態でアポトーシスと腫瘍退縮を促進する。さらに、性腺摘除後及びアンドロゲン非依存状態への進行中のヒト前立腺癌における発現及びＴＲＰＭ−２及びＢｃｌ−２などのペプチドなどの変化はシオノギ腫瘍細胞内で観察されるものと類似している。これらの類似性から、シオノギ腫瘍モデルはヒト前立腺癌と同様の挙動を示し、アンドロゲン非依存状態の開始を遅らせる化合物の能力の評価にとって非常に有益なモデルを提供している。性腺摘除後に完全な腫瘍退縮が起きるにもかかわらず、１ヶ月後には急速に成長するアンドロゲン非依存性シオノギ腫瘍が必ず再発し、アンドロゲン非依存状態への進行を遅らせることができる薬剤を評価する上での信頼性の高い指標を提供してくれる。
【００１０】
本発明につながった研究において、我々は最初に性腺摘除後及びＡＩ進行中のシオノギ腫瘍モデルにおけるＩＧＦＢＰ発現の変化の特徴づけを行った。性腺摘除前のＡＤの影響を受けていない（ＡＤ  ｉｎｔａｃｔ）腫瘍、性腺摘除後の４日目及び７日目の退縮中の腫瘍、そして性腺摘除から２８日後のＡＩ再発腫瘍におけるＩＧＦＢＰ  ｍＲＮＡ発現における変化の特徴づけを行うためにノーザン・ブロット分析を行った。ＩＧＦＢＰ−２、−３、−４及び−５ｍＲＮＡ発現における種々の変化パターンが観察された。ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ−６  ｍＲＮＡはシオノギ腫瘍モデルにおいては検出不能である。
【００１１】
性腺摘除前及び性腺摘除後の種々の時点でのＡＤの影響を受けていないＬＮＣａＰ腫瘍におけるＩＧＦＢＰ−２  ｍＲＮＡ発現における変化の特徴づけを行うためにノーザン・ブロッティングを用いた。図１に示すように、性腺摘除後１４日後からＩＧＦＢＰ−２の発現が徐々に始まり、そして、性腺摘除から２８日後には性腺摘除前と比較して２倍以上のレベルとなった（両側（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ）ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。性腺摘除後のＩＧＦＢＰ−２レベルの上昇はＬＮＣａＰ及びヒト前立腺癌腫瘍組織マイクロアレイでも確認された。平均ＩＧＦＢＰ−２染色強度はＡＤ腫瘍（ｎ＝２０スポット）で性腺摘除前の＋１からＡＩ腫瘍（ｎ＝４０スポット、性腺摘除後２８日及び３５日後）の＋２．３に増大した。他の群の平均強度は性腺摘除後３日間で＋１、５、７及び１０日間で＋１．２、１４日間で＋１．４、そして２１日間で＋１．６であった。免疫組織化学染色はノーザン・ブロッティングと一般的には対応していた。
【００１２】
本発明によれば、ＩＧＦＢＰ−２をコードする配列に相補的なアンチセンスＯＤＮを投与する。投与対象はヒトであり、投与された配列はヒトＩＧＦＢＰ−２に基づいていた。表２に具体的なアンチセンスＯＤＮをリストし、配列番号１〜５６で示してある。翻訳開始サイトを含んでいる配列番号１はこれらのテストに対して最も活発な反応を示し、本明細書で報告されている実験の大部分で用いられた。用いられるＯＤＮはイン・ビボでのＯＤＮの安定性を増大するように修飾してもよい。例えば、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を増大させたホスホチアネート誘導体（非架橋ホルホリル酸素原子を硫黄原子で置換したもの）などのＯＤＮを用いてもよい。ＯＤＮ安定性の増大は２メトキシエチル置換バックボーンを有する分子を用いても達成することができる。
【００１３】
アンチセンスＯＤＮの投与はそのままの投与、あるいは薬学的に許容される基質に入れた形態での投与など、先行技術で周知の種々のメカニズムを用いて実行することができる。例えば、アンチセンス伝達のための脂質基質については米国特許第５，８５５，９１１号及び第５，４１７，９７８号に述べられており、これらの特許は引用によって本明細書に組み入れられる。一般的に、上記アンチセンスは静脈、腹膜内、皮下、そして経口ルートなどによって投与される。
【００１４】
投与されるアンチセンスＯＤＮの量は前立腺癌あるいはその他のホルモン制御性腫瘍細胞内でのＩＧＦＢＰ−２のレベルを低下させるのに有効な量である。本発明の枠組みにおいては、出願人は、この低下が起きるいずれの具体的なメカニズムにも限定するつもりはないが、アンチセンス分子がｍＲＮＡの翻訳、あるいはＲＮａｓｅ媒介メカニズムによって干渉を及ぼすのであれば、ＩＧＦＢＰ−２の発現低下の結果としてその低下が起きても差し支えない。さらに、適切な用量は用いられる具体的なアンチセンスＯＤＮ、あるいは用いられる基質の性質によって変わる場合がある。適切な用量レベルを評価するために考案された標準的な一連のテストを通じてのいずれの任意の組成物の適切な用量に関する判定も、当業者に周知の範囲内である。
【００１５】
本発明による前立腺癌のテスト方法はさらに異なった標的に向けられた化学療法剤及び／又は別のアンチセンスＯＤＮの投与を含んでいてもよい。例えば、タキソール（パクリタキセルあるいはドセタクセル）及びミトキサントロンなどの通常の化学療法剤を用いてもよい。同様に、アンチセンスＩＧＦＢＰ−２とアンチセンスＢｃｎ−２  ＯＤＮ、ＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ、あるいはＩＧＦＢＰ−５  ＯＤＮなどの他のアンチセンス配列との組み合わせを用いてもよい。
【００１６】
実施例
本発明を以下の、非限定的実施例を参照してさらに説明する。
【００１７】
実施例１
配列番号１〜３に示されている配列を用いて３つのオリゴヌクレオチドを調製した。配列番号１は塩基番号６４から始まるＩＧＦＢＰ−２  ｍＲＮＡの翻訳開始サイトにかかっている。配列番号２と３は、塩基１３１−１５１及び６３０−６５０とそれぞれ対応する。２つの塩基ＩＧＦＢＰ−２不一致オリゴヌクレオチド（配列番号５７〜５９）も比較対照として調製した。
【００１８】
これら３つのオリゴヌクレオチドの最初のスクリーニングはＬＮＣａＰ細胞を用いて行われた。陽イオン性脂質であるリポフェクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｈｃｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて上記細胞へのオリゴヌクレオチドの取り込みを増大させた。ＬＮＣａＰ細胞を上記３つのオリゴヌクレオチド（配列番号１〜３）のうちの１つ、１０００ｎＭ、あるいは対応する不一致比較対照（配列番号５７〜５９）で処理した。総ＲＮＡを抽出して、ＲＮＡをコードするＩＧＦＢＰ−２のレベルに関してノーザン・ブロットで分析した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）を比較対照として用いた。用いられたプローブは配列番号６０〜６３で示される配列を有していた。ＲＮＡブロットをランダム・プライマー・ラベリングで［３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルしたヒトＩＧＦＢＰ−２プローブとハイブリダイズさせた。洗浄及び濃度分析を行った。ＲＮＡをコードするＩＧＦＢＰ−２の検出後、その一体性を検証するためにヒトＧ３ＰＤＨを用いて膜を再プローブした。
【００１９】
配列番号１は最も効果的で、ＩＧＦＢＰ−２ｍＲＮＡレベルが８０〜９０％低下した。配列番号２と３も有効であったが、やや有効性は低く、約５０％の低下をもたらした。
【００２０】
実施例２
ＬＮＣａＰモデルは種々の条件の下で胸腺欠損マウス内で腫瘍を形成するように誘発させることができるアンドロゲン感受性、ＰＳＡ分泌、ヒト前立腺癌細胞株である。ヒト前立腺癌の場合と同様、このモデル内の血清ＰＳＡレベルはアンドロゲンによって制御され、腫瘍体積と直接比例している。性腺摘除後、血清及び腫瘍細胞ＰＳＡは８０％まで低下し、３〜４週間抑制されたままであった。しかしながら、性腺摘除後４週間目から、ＰＳＡ生産が精巣アンドロゲンの不在下で性腺摘除前のレベルを徐々に上回り始め、アンドロゲン非依存状態への進行が開始された。ＬＮＣａＰモデルでの性腺摘除後の遺伝子発現の変化のパターンはシオノギ系の場合と同様であり、ＬＮＣａＰ腫瘍を持っているマウスの性腺摘除後、Ｂｃｌ−２、ＴＲＰＭ−２、及びＩＧＦＢＰ−２の発現が増大した。ＬＮＣａＰ及びシオノギ・モデルにおける遺伝子発現における変化の多くはヒトの前立腺癌でも起こり（例えば、Ｂｃｌ−２、クラステリン、ＩＧＦＢＰ、ＰＳＡ、Ｂｃｌ−ｘＬ）、このことはそれらを機能性ゲノムと主な実験の臨床前の証拠に関するヒト疾患のモデルとしての利用することの有効性を裏付けている。本発明につながった研究においては、我々は最初に性腺摘除後とＡＩ進行中のＬＮＣａＰ腫瘍モデルにおけるＩＧＦＢＰ発現の変化の特徴づけを行った。ノーザン・ブロット分析は、ＩＧＦＢＰ−２レベルが性腺摘除前のアンドロゲン依存性腫瘍と比較してアンドロゲン非依存性腫瘍においては２〜３倍も増大することを示し、これはＩＧＦＢＰ−２の増大がアンドロゲン非依存性の表現型の発展と関係している可能性を示唆している（図１）。
【００２１】
実施例３
シオノギ腫瘍モデルはヒト前立腺癌と同様の挙動を示し、アンドロゲン非依存状態開始を遅らせる化合物の能力の評価のために非常に有益なモデルを提供する。性腺摘除後に完全に腫瘍が退縮するにもかかわらず、１ヵ月後には急速に成長するアンドロゲン非依存性シオノギ腫瘍が必ず再発し、このことはアンドロゲン非依存状態への進行を遅らせることができる薬剤を評価する上での信頼できる指標を提供してくれる。本発明に導く研究においては、我々は最初に性腺摘除後とＡＩ進行中のシオノギ腫瘍モデルでのＩＧＦＢＰ発現の変化の特徴づけを行った。性腺摘除前のＡＤの影響を受けていない腫瘍、性腺摘除後４日目及び７日目の退縮中の腫瘍、そして性腺摘除後２８日目のＡＩ再発腫瘍におけるＩＧＦＢＰ  ｍＲＮＡ発現の変化の特徴づけを行うためにノーザン・ブロット分析を用いた。ノーザン・ブロット分析は、ＩＧＦＢＰ−２レベルが性腺摘除前のアンドロゲン依存性腫瘍と比較してアンドロゲン非依存性腫瘍においては２〜３倍も増大することを示し、これはＩＧＦＢＰ−２の増大がアンドロゲン非依存性の表現型の発展と関係している可能性を示唆している。
【００２２】
実施例４
ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ（配列番号１）によるヒトＬＮＣａＰ細胞の処理はＩＧＦＢＰ−２  ｍＲＮＡと蛋白質レベルの用量に依存し、配列固有のダウンレギュレーションをもたらした。ＩＧＦＢＰ−２レベルは５００ｎＭのＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ（配列番号１）による処理後９０％も低下した。細胞の生存可能性も用量に依存した形態で減少した（図２）。
【００２３】
実施例５
ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ（配列番号１）によるヒトＬＮＣａＰ腫瘍細胞の処理によって標的ｍＲＮＡ及び蛋白質レベルが９０％以上減少し、時間、及び用量に依存した形態で５０％以上の成長抑止をもたらした（図２）。
【００２４】
実施例６
ヒトＬＮＣａＰ前立腺腫瘍をもつマウスでＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ（配列番号１）を全身投与したところ、性腺摘除後にＡＩ再発腫瘍の成長と致死させるべき時期がかなり遅くなった。ＬＮＣａＰ腫瘍の成長と血清ＰＳＡ内での発生の両方とも、ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯで処理したマウスにおいては、不一致ＡＳＯで処理したマウスと比較してかなり遅くなった（図３ａ及び３ｂ）。これらの知見は、ＩＧＦＢＰ−２のアップレギュレーションがＩＧＦ−Ｉの有糸分裂活性を促進することを示す最初の証拠を提供するものであり、前立腺癌のＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ療法の大きな可能性を示すものである。
【００２５】
実施例７
ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯによるヒトＬＮＣａＰ腫瘍細胞（配列番号１）の処理は標的ｍＲＮＡ及び蛋白質レベルを９０％以上低下させ、時間及び用量に依存した形態で５０％以上の抑止効果をもたらしたが、同じ効果は、外来性ＩＧＦ−Ｉでは再現できなかった（図４）。ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ（配列番号１）＋ＩＦＧ−Ｉ抗体による処理は、イン・ビボでのＬＮＣａＰ腫瘍細胞の成長に対してさらに抑止効果を示した。
【００２６】
実施例８
ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ処理によるＩＧＦＢＰ−２レベルの低下という細胞サイクル制御に対する影響を調べるために、サイクリンＤ１レベルでの変化を、ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ（配列番号１）で処理した後のＬＮＣａＰ細胞で評価した。ウェスタン分析を行ったところ、ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ（配列番号１）処理後にサイクリンＤ１で５０％以上の低下が示され、このことは、ＡＳＯ処理によるＩＧＦＢＰ−２の低下がＩＧＦ信号発生を抑止し、細胞サイクルの停止をもたらすことを示している。ＩＧＦＢＰ  ＡＳＯ処理後のアポトーシス誘発も、ＩＧＦＢＰ−２ ＡＳＯによる処理後にフロー・サイトメトリーによるＬＮＣａＰ細胞サイクル分析で示された。ＬＮＣａＰ細胞を１ｎＭ  ＤＨＴ（ジヒドロテストテロン）を使用する場合と、使用しない場合の両方の条件で、ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯか不一致比較対照オリゴヌクレオチドを用いて２日間、毎日処理した。表１は種々の処理での各フェーズ（Ｓｕｂ  Ｇ１−Ｇ０、Ｇ１−Ｇ０、Ｓ、及びＧ２＋Ｍ）での細胞集団を％で示したものである。各データはそれぞれ３回の実験での平均値を示している。ＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯ処理後に、Ｓｕｂ  Ｇ１−Ｇ０での細胞の割合は３倍増えた（ｐ＜０．０５）が、Ｇ２＋Ｍでの細胞の割合は５０％減少した。
【００２７】
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【００２８】
実施例９
転移性前立腺癌及び乳癌は骨組織を冒すことがよくある。そうした転移の治療は非常に困難であり、それらの癌の骨への進入は通常、長期間生き延びる予後の可能性が低いことを示唆する。従って、こうした進行を抑止したり、遅らせたりする方法を持つことが望ましい。ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−２の両方が特に前立腺癌と乳癌を含むＩＧＦ−Ｉ感受性癌に対して重要な因子であるので、骨内の高レベルのＩＧＦＢＰ−２の存在が転移性病変の成長と進行促進に対して重要な役割を果たしていると考えられる。従って、一次ヒト骨組織培養体のサンプルに対してウェスタン分析を行った。この実験は、骨内での高レベルのＩＧＦＢＰ−２の存在を確認した。本発明によるアンチセンスＩＧＦＢＰ−２  ＯＤＮを用いたこれらのレベルの抑制は転移性病変の骨への進行を抑止、あるいは遅らせるための有効な治療法を提供する。
【００２９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
性腺摘除後、及びアンドロゲン非依存進行中のＬＮＣａＰ細胞内のＩＧＦＢＰ−２ｍＲＮＡレベルの増大を示すノーザン分析に関する濃度計微量（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ  ｔｒａｃｅ）分析結果を示す。
【図２】
アンチセンスＩＧＦＢＰ−２治療後の細胞数の用量依存的な減少を示す、生存ヒト前立腺ＬＮＣａＰ細胞のイン・ビトロレベルを示す。
【図３】
Ａ及びＢは性腺摘除後のＬＮＣａＰ腫瘍罹病マウスのＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯによる治療が腫瘍成長速度と血清ＰＳＡ内での発生を低下させ、アンドロゲン非依存状態への進行を遅延させることを示す。
【図４】
ヒトＬＮＣａＰ腫瘍細胞のＩＧＦＢＰ−２  ＡＳＯによる治療が、時間及び用量に依存した形態で５０％以上の成長抑止をもたらすことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年4月12日(2002.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモン制御性腫瘍細胞によりＩＧＦＢＰ−２の発現を抑制するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含むホルモン制御性癌治療のための組成物。
【請求項２】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが翻訳開始又は停止部位にかかるＩＧＦＢＰ−２ｍＲＮＡの領域に対して相補的である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが配列番号１〜５６までのいずれかに示される一続きの連続塩基を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが１５−３０ヌクレオチドの長さを有している請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドが配列番号１に示される１つながりの連続塩基によって構成される請求項１記載の組成物。
【請求項６】
ホルモン制御性腫瘍細胞のホルモン非依存状態への進行を、腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−２の発現を抑止するアンチセンス・オリゴヌクレオチドでホルモン感受性腫瘍細胞を処理することによって遅らせるための医薬組成物の製剤化における請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項７】
腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である請求項６記載の使用。
【請求項８】
腫瘍細胞が乳癌細胞である請求項６記載の使用。
【請求項９】
医薬組成物が個体におけるホルモン応答性癌細胞のアポトーシス性細胞死を誘発させるためにホルモン禁断の開始後に個体に投与され、それによって個体内のホルモン応答性癌細胞のホルモン非依存状態への進行を遅らせる、ホルモン応答性癌に罹患した個体におけるホルモン応答性癌を治療するための医薬組成物の製剤化における請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
ホルモン応答性癌が前立腺癌である請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ホルモン応答性癌によるＩＧＦＢＰ−２の発現を抑止するのに有効な量の組成物をヒトを含む哺乳動物に投与し、それによって腫瘍の転移性骨進行を抑止又は遅らせる、哺乳動物におけるＩＧＦ−Ｉ感受性腫瘍の転移性骨進行を抑止又は遅らせるための医薬組成物の製剤化における請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
ＩＧＦ−Ｉ感受性腫瘍が前立腺癌である請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
ホルモン制御性腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−２の発現を抑止するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む組成物を個体に投与する段階を含む、ホルモン応答性癌に罹患した個体内のホルモン応答性癌を治療するための方法。
【請求項１４】
組成物が個体内のホルモン応答性癌細胞のアポトーシス性細胞死を誘発させるためにホルモン禁断の開始後に個体に投与され、それによって個体内のホルモン応答性癌細胞のホルモン非依存状態への進行を遅らせる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ホルモン感受性腫瘍細胞を、腫瘍細胞によるＩＧＦＢＰ−２の発現を抑止するアンチセンス・オリゴヌクレオチドによって処理する段階を含むホルモン制御性腫瘍細胞のホルモン非依存状態への進行を遅らせる方法。
【請求項１６】
ＩＧＦ−Ｉ感受性癌細胞によるＩＧＦＢＰ−２発現を抑止するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む組成物を、ＩＧＦ−Ｉ感受性癌細胞によるＩＧＦＢＰ−２発現を抑止するのに有効な量で投与することによって、腫瘍の転移性骨進行を抑止又は遅らせる段階を含む、ＩＧＦ−Ｉ感受性腫瘍に罹患した個体内のＩＧＦ−Ｉ感受性腫瘍の転移性骨進行を抑止又は遅らせる方法。
【請求項１７】
個体がヒトである請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍細胞が前立腺腫瘍細胞である請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
個体がヒトである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞が乳癌細胞である請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
個体がヒトである請求項２０記載の方法。
【国際調査報告】
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