(57)【要約】血管新生は、血管新生の増加が望ましい状態の治療に望ましい位置で血管新生を誘導するのに有効な量の選択的アデノシンＡ１アロステリックエンハンサーを投与することによって処理され、当該状態としては、例えば卒中、心疾患、および末梢血管疾患がある。選択的アデノシンＡ１アロステリックエンハンサーは、血管新生の減少が望ましい状態の治療に望ましい位置で血管新生を阻害するのに有効な量で投与され、当該状態としては、例えば腫瘍、糖尿病性網膜症、リウマチ様関接炎や乾癬のような炎症性疾患がある。
2004505048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を阻害するのに有効な量の選択的アデノシンＡ１受容体アンタゴニストを、血管新生の阻害が必要な被験者に投与することを含む、血管新生を阻害する方法。
【請求項２】
前記選択的アデノシンＡ１受容体アンタゴニストがＷＲＣ−０５７１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管新生を阻害するのに有効な量の選択的アデノシンＡ１受容体アンタゴニストを、血管新生が関与する状態の処理が必要な被験者に投与することを含む、血管新生が関与する状態を処理する方法。
【請求項４】
前記状態が、腫瘍成長、糖尿病性網膜症または炎症性疾患である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
血管新生を阻害するのに有効な量の選択的アデノシンＡ１受容体アンタゴニスト、および、製薬上許容できる担体を含む、血管新生を阻害するための組成物。
【請求項６】
前記選択的アデノシンＡ１受容体アンタゴニストがＷＲＣ−０５７１である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
血管新生を誘導するのに有効な量の選択的アデノシンＡ１受容体アロステリックエンハンサーを、血管新生の誘導が必要な被験者に投与することを含む、血管新生を誘導する方法。
【請求項８】
前記選択的アデノシンＡ１受容体アロステリックエンハンサーがＰＤ８１，７２３である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アデノシンＡ１受容体アゴニストの投与をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アデノシンＡ１受容体アゴニストがシクロペンチル（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙ）アデノシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血管新生を誘導するのに有効な量の選択的アデノシンＡ１受容体アロステリックエンハンサーを、虚血性疾患の治療が必要な被験者に投与することを含む、虚血性疾患を治療する方法。
【請求項１２】
前記選択的アデノシンＡ１受容体アロステリックエンハンサーがＰＤ８１，７２３である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アデノシンＡ１受容体アゴニストの投与をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アデノシンＡ１受容体アゴニストがシクロペンチル（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙ）アデノシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患が、心疾患、卒中または末梢血管疾患である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
血管新生を誘導するのに有効な量の選択的アデノシンＡ１受容体アロステリックエンハンサー、および、製薬上許容できる担体を含む、血管新生を誘導するための組成物。
【請求項１７】
前記選択的アデノシンＡ１受容体アロステリックエンハンサーがＰＤ８１，７２３である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
アデノシンＡ１受容体アゴニストをさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記アデノシンＡ１受容体アゴニストがシクロペンチル（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙ）アデノシンである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記疾患が、心疾患、卒中または末梢血管疾患である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２１】
製薬上許容できる担体中、選択的アデノシンＡ１受容体アロステリックエンハンサーおよびアデノシンＡ１受容体アゴニストの相乗的な組み合わせの血管新生を誘導するのに有効な量を含む、血管新生を誘導するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、２０００年８月１日付で出願された米国特許仮出願第６０／２２２，３５５号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、血管新生を処理する方法に関し、より特定には、被検動物において血管新生を処理するための、選択的アデノシンＡ１受容体アゴニスト、アンタゴニストおよびアロステリックエンハンサーである化合物の使用に関する。これらの化合物およびそれらを含む組成物は、血管新生が関与する状態を治療するのに有用である。
【０００３】
発明の開示
血管新生は、以前に形成された血管から新しい血管が形成されるプロセスであって、多数の細胞型の間での協調した相互作用を含む複雑なプロセスである。重要な細胞は、初期の管および枝を形成するのに必要な全ての遺伝情報を含む内皮細胞である。他の細胞、例えば平滑筋細胞、肥満細胞、およびマクロファージは、血管新生の重要な調節因子を放出する。低酸素、血流量の減少、および、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）のような放出された血管新生物質により、血管新生を引き起こすことができる。血管新生は、細胞外マトリックスにおける損傷により誘導され、続いて、内皮細胞は増殖し、組織へ移動する。内皮細胞は、最初に、索（ｃｏｒｄｓ）を形成するが、その後、細胞中に大きな空胞が形成され、管が形成されるに至る。内皮細胞の管は内腔を有するが、周皮細胞を補充することにより新しい血管が強化されるまで、異常に透過性であり、漏れやすい。数種の成長因子、最も特定にはＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびアンジオポエチン−１は、血管新生を促進することが示されている。ＶＥＧＦは、内皮細胞に特異的なマイトジェンであり、新しい血管成長を刺激することができる。しかしながら、発生中の鳥類の胚でのＶＥＧＦの過剰発現は、漏れやすい大きい直径の血管のみを生じ、組織の浮腫がもたらされる。正常な新しい血管系の発生を刺激するためには、数種の成長因子の協調した作用が必要である。それゆえに、組織特異的な方法で上流の調節因子を用いる方法を見出すことにより、個々の血管新生の成長因子の用途に対する治療上の利点を提供する。
【０００４】
これまでの研究によれば、アデノシンは低酸素組織または虚血組織から放出され、アデノシンは血管新生を刺激することが示される。可能性のあるメカニズムは、流量の増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｌｏｗ）、血管細胞の増殖および移動の刺激、または、血管新生の成長因子の分泌の刺激を含む。インビボおよびインビトロでのアデノシン作用に関するこれまでの研究で得られた結果のいくつかによれば、アデノシンＡ２受容体（Ａ２ＡまたはＡ２Ｂ）の活性化により、アデノシンが血管新生を刺激する能力が生じることが示されている。培養内皮細胞におけるＡ２Ｂ受容体の活性化によりＶＥＧＦ放出が刺激されることがわかっている。たいていのこれまでの研究によれば、血管新生の刺激について、Ａ２ＡまたはＡ２Ｂ受容体に関する役割は示されるが、Ａ１アデノシン受容体活性化に関する役割は、ほとんどまたは全く示されていない。本発明は、Ａ１受容体がこれまで考えられてきたよりも重要である、ということを示すデータに基づく。本発明は、内在性アデノシンまたはアデノシンアゴニストの機能的作用をＡ１受容体において選択的に増加させるアロステリックエンハンサー化合物が利用できるため、および、血管新生をブロックする選択的Ａ１アンタゴニストが利用できるため、臨床的に重要である。Ａ１アデノシン受容体のアロステリックエンハンサーは、虚血組織においては血管新生を選択的に刺激し、十分な血流量がある組織においては刺激しない、ということが予測される。この部位特異性は、虚血組織に非選択的な他の血管新生剤を超える主な利点を代表する。
【０００５】
心臓血管医学、眼科学および腫瘍学における血管新生プロセスの処理に関して、広範な臨床的用途がある。虚血組織、特に、心臓および四肢において新しい血管系を刺激することは、アテローム性体肢動脈硬化症の罹患率と死亡率とに多大な影響力を持つことができており、目下、活発な臨床的な努力である。ヒトにおける試みによれば、虚血の下肢への側副循環形成（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）の刺激に関してＶＥＧＦが有用であることがわかっており、潰瘍治癒の促進、四肢の損失の低減がもたらされる。また、進行中の臨床的な試みとして、難治性の、手術不能のアンギナに罹った患者へのＶＥＧＦ注入の使用がある。
【０００６】
ＶＥＧＦは、直接的または１次的な血管新生因子であって、すなわち、インビトロまたはインビボで、内皮細胞で独立して血管新生を誘導することができることを意味する。細胞に１次的な因子を放出させることによって、２次的または間接的な血管新生因子が働く。科学者および臨床医の間で、１次的な因子を臨床的に用いることに関して、他の組織で異常な血管新生が起こるのではないかという懸念がある。即ち、アデノシンまたは他の血管新生プロモーターの使用の限界は、病気の組織と同様に、健康な組織でも血管新生を発生させることである。腫瘍成長を縮少させるための血管新生阻害は、心臓血管医学における刺激と同様に、腫瘍学において重要であり、従って、異常な血管の刺激の予測は、実際の関心事である。加えて、ＶＥＧＦが新しい血管の形成を刺激するのに十分である間は、正常で健康な血管が、数種の異なる成長因子間の協調した作用を必要とするといってもさしつかえない証拠がある。それゆえに、上流の２次的な血管新生の刺激を活性化することにより、より調節され、かつ正常な血管応答が得られる可能性がある。加えて、血管新生の刺激を特定の組織に向ける能力は、望ましくない全身の血管新生の危険を減らすはずである。
【０００７】
アデノシンは、動物モデルで血管新生を引き起こし、培養細胞中で内皮細胞の増殖を引き起こすことがわかっている。血管新生の調節因子としてのアデノシンを、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）モデルを用いて研究することができる。加えて、低酸素によって培養内皮細胞の増殖が起こり、非選択的アデノシン受容体アンタゴニストによりブロックされ得る応答が起こる。低酸素は、新しい血管形成のための駆動力であると長い間考えらてきた。ヒトでは、長期にわたり刺激された骨格筋および迅速に成長する腫瘍において、増加した血管密度が高度に観察される。ＣＡＭモデルでは、低められた酸素濃度により、血管新生が刺激される。アデノシンは、血管新生の低酸素刺激に関する矛盾のない調節因子である。アデノシンは、全ての虚血組織または低酸素組織から放出される、ＡＴＰ破壊の代謝産物であり、その場合、アデノシンは、「報復的な（ｒｅｔａｌｉａｔｏｒｙ）代謝産物」として作用し、初めに存在する血管を拡張することによって正常な酸素運搬の回復を助ける。アデノシン受容体のキサンチンブロッカーは、低酸素が内皮細胞増殖を刺激する作用をブロックすることがわかっている。矛盾するが、アデノシンは、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）モデルで血管新生を起こすことがわかっている。受容体サブタイプに選択的なリガンドは、これまでＣＡＭでは試験されてこなかった。サブタイプに選択的なリガンドは、アデノシン誘導性の内皮細胞増殖および移動のメカニズムを引き出すために用いられてきたが、結果は矛盾していた。
【０００８】
アデノシンは、細胞表面Ｇタンパク質共役受容体である４種の既知のサブタイプ、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３を介して作用する。Ａ１およびＡ３受容体はアミノ酸配列および薬理学上最も類似する。Ａ１およびＡ３受容体は、百日咳毒素感受性でありアデニリルシクラーゼを阻害するＧｉ／ＧｏファミリーからのＧタンパク質に共役する。また、Ａ１およびＡ３受容体の刺激は、おそらくはＧタンパク質βγサブユニットを介して、ホスホリパーゼＣを活性化することもできる。Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体はＧｓに共役し、アデニリルシクラーゼを刺激するが、Ａ２Ｂ受容体はまた、百日咳毒素非感受性のＧｑとも共役し得る。心臓において、Ａ１受容体は、陰性変時、変伝導および変力作用を有する。また、Ａ１受容体、およびおそらくはＡ３は、虚血心筋を保護する条件付けの現象（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）にも関与する。Ａ２Ａ受容体は冠動脈で発現され、活性化されることにより、冠動脈血管拡張をもたらす。Ａ２Ａ受容体は白血球でも発見され、この場合、それらは炎症性反応を減少させるように作用し、それにより、再潅流障害を減少させることができる。従って、アデノシンは、虚血組織を保護するいくつもの方法で作用する；アデノシンは、代謝を減少させ、血流量を増加させ、そして炎症性障害を減少させる。アデノシンは、培養内皮細胞でＡ２Ｂ受容体を活性化し、ＶＥＧＦ放出と内皮細胞の有糸分裂誘発を起こす。またアデノシンは、血管新生を刺激するようであるが、これまでＣＡＭモデルに関与するアデノシン受容体サブタイプを定義する試みはなされていない。加えて、本発明の前には、成体の哺乳動物モデルにおいてアデノシンが血管新生を刺激することは示されていない。より選択的なアデノシン受容体リガンドの新規の開発、および、ニワトリＡ１、Ａ２Ａ、およびＡ３受容体のクローニングにより、我々は、アデノシンに対するＣＡＭの血管新生反応に関与するアデノシン受容体サブタイプを同定することができた。
【０００９】
アデノシン受容体は、アデノシンの改変類似体によって活性化され、カフェインのようなキサンチン、および、他のアルキルキサンチンにより阻害される。近年、非キサンチンアンタゴニストが同様に説明されている。所定のアデノシン受容体サブタイプの薬理学は、種間ではなはだしく変化し得る。これは、Ａ１およびＡ３受容体に関して特に当てはまる。Ａ１およびＡ３受容体は、キサンチンアンタゴニストの結合に関して、種間で最も異なっている。Ａ２Ａ受容体は、結合に関する種間の変化がより少ない。Ａ２Ｂ受容体は、近年まで、選択的リガンドがなかった低い親和性の受容体である。広範囲にわたって特徴付けられないものの、組換えニワトリＡ１受容体は、 ラットおよびヒトのＡ１受容体のアデノシンアゴニストリガンドに対する順位序列的な効力（ｒａｎｋ ｏｒｄｅｒ ｐｏｔｅｎｃｙ）と類似した順位序列的な効力を示す。
【００１０】
シクロペンチルアデノシン（ＣＰＡ）は、長い間、高選択的Ａ１アゴニストとして知られてきたが、近頃説明された非キサンチンＡ１アンタゴニストＷＲＣ−０５７１は、特にＡ１およびＡ３受容体に対するＡ１選択性の増加を提供する。ＣＧＳ２１６８０は、これまで研究された全ての種における有用かつ高選択的なＡ２Ａアゴニストである；しかしながら、安定な、高選択的Ａ２Ａアンタゴニストはこれまで見出されていない。目下、数種の新規の高選択的Ａ２Ａアンタゴニスト化合物が利用可能であり、当該化合物としては、ＺＭ−２４１３８５があり、これはＡ１受容体よりかなり有効にＡ２Ａ受容体をブロックする。近年、最初のＡ３受容体選択的リガンドが説明されており、当該リガンドとして、アゴニストＮ６−ヨードベンジル−５’−Ｎ−メチル−カルボキサミドアデノシンＩＢ−ＭＥＣＡ、および、アンタゴニストＭＲＳ１１９１がある。ＭＲＳ１１９１は、ヒトＡ３に対して、Ａ１受容体に対して＞１３００倍の選択性を提供する。表１に、ＣＡＭでみられる血管新生反応を特徴付けるために我々が用いたリガンドを示す。
【００１１】
【表１】
2004505048.tif 000003
【００１２】
上述したように、内皮細胞は、アデノシン受容体の４種全てのサブタイプ、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３を有する。培養物中の微小血管内皮細胞は、アデノシンに応答して増殖し、移動するが、受容体サブタイプが、特に血管増殖性の応答の原因になるのかという議論がある。これまでの数々の調査で用いられたアゴニスト濃度は、サブタイプ選択的となるには高すぎた。ｃＡＭＰに関する増加が血管増殖性の内皮細胞の応答を阻害するのか、または、刺激するのかに関して、報告は異なる。数人の研究者の報告によれば、血管増殖性の応答は、Ａ２受容体の刺激の結果であるが、しかしながら百日咳感受性であることから、血管増殖性の応答がＡ１またはＡ３刺激により生じる可能性が示唆される。酸化窒素は、内皮細胞の増殖と移動を刺激し、アデノシンはＡ２メカニズムを介して内皮細胞の酸化窒素シンターゼを上流調節する。またアデノシンは、数種の細胞型においてＶＥＧＦのｍＲＮＡとタンパク質発現を上流調節し、そのいくつかはＡ２受容体、おそらくＡ２Ａを介して、および、そのいくつかはＡ１を介して上流調節する。最後に、アデノシンアゴニストは、ｃＡＭＰの減少と関連して平滑筋細胞の増殖を刺激し、これはＡ１またはＡ３が仲介することを示す。
【００１３】
数種の異なるアデノシン受容体サブタイプが血管新生の協調に関与しているようであるが、目下の調査の進展でＣＡＭ分析から得られた我々のデータによれば、アデノシンＡ１受容体の主な役割が思いがけなく指摘された。我々は、ＣＡＭモデルにおいて、Ａ１受容体に選択的な選択的Ａ１アゴニストまたはアロステリックエンハンサーのいずれかでアデノシンＡ１受容体を刺激することによって、血管新生反応が惹起されることを見出した。
【００１４】
受容体のアロステリックエンハンサーは、アゴニストへの応答を強化し、内在性リガンドの結合部位とは別のアロステリック部位に結合する化合物と定義される。ベンゾジアゼピンは、ＧＡＢＡＡ受容体のアロステリックエンハンサーである。アロステリックエンハンサーまたは阻害剤に対する他の受容体が数多く説明されており、例えば、ムスカリン様受容体や心房性ナトリウム排泄増加性の受容体がある。アデノシンＡ１受容体のアロステリックエンハンサーは、それ自体の作用は低いが、虚血組織において内在性アデノシンのＡ１作用を増強する化合物である。
【００１５】
ＰＤ８１，７２３（ＰＤ）は、最初に説明されたアデノシンＡ１受容体のアロステリックエンハンサーであるアミノチオフェン化合物ファミリーの一つである。これらの化合物は、［３Ｈ］Ｎ６−シクロヘキシルアデノシン（ＣＨＡ）のアデノシンＡ１受容体への結合を増大させ、様々な組織におけるアデノシンＡ１受容体活性化の作用を機能的に増強させた。ＰＤは、アデノシンＡ１受容体に選択的であり、他のクラスの受容体、または、他のアデノシン受容体サブタイプには作用しない。ＰＤは、これまで試験された全ての種のＡ１受容体において増強を示す。アデノシンまたはＡ１選択的アゴニストの非存在下では、エンハンサー分子単独では、アデノシン受容体に対する非常に弱いアンタゴニストとして作用する。アロステリックエンハンサー、例えばＰＤ８１，７２３の、２種の動物モデル系、すなわちニワトリ漿尿膜モデルおよびラット腸間膜モデルにおける血管新生を促進する能力が試験されてきた。本発明のデータによれば、アロステリックエンハンサーＰＤ８１，７２３は、ＣＡＭ分析において、関連化合物Ｃ１７と同様に血管新生を刺激することが示される。これらのデータと、Ａ１選択的アゴニストのデータとによれば、Ａ１受容体が、これまで知られていなかった血管新生における重要な役割を有することが示される。このことが臨床的に重要である理由は、アロステリックエンハンサーが、高い内在量のアデノシンと共に、低酸素組織で理論的に最もよく働き、それが必要でない他の組織の血管新生作用を抑えることができるためである。
【００１６】
血管新生の促進は、卒中、心疾患、および末梢血管疾患などの状態における虚血組織の血管再生に有用である。即ち、卒中、心疾患、および末梢血管疾患の治療方法において、血管新生を促進する化合物を効果的に投与することができる。２種の動物モデル系、すなわちニワトリ漿尿膜モデルおよびラット腸間膜モデルにおける、ＰＤ８１，７２３のようなアロステリックエンハンサーの血管新生を促進する能力は、アデノシンＡ１受容体のアロステリックエンハンサーが、アデノシンの血管新生を促進する能力を増強することを示す。
【００１７】
その上、血管新生が病的な状態に寄与する環境において血管新生を阻害するのに、選択的アデノシンＡ１受容体ブロッカーを用いることができるということが、容易に理解できる。異常な血管新生は、腫瘍、糖尿病性網膜症のような状態において、および、リウマチ様関接炎や乾癬のような炎症性疾患において、顕著な役割を有する。ＷＲＣ−０５７１のような選択的アデノシンＡ１受容体ブロッカーは、アデノシンアゴニストおよびエンハンサーに対する血管新生反応をブロックし、血管新生反応をコントロールレベル未満に阻害することができ、すなわち、当該ブロッカーが血管新生の阻害剤として使用可能であることを示す。
【００１８】
ＰＤ８１，７２３のようなアデノシンＡ１受容体のアロステリックエンハンサーを、虚血性疾患に罹った患者に治療的に用いることによって、病気の組織において血管新生を選択的に刺激することができる。虚血性疾患としては、これらに限定されないが、アンギナ、心筋梗塞、卒中、末梢血管疾患、および不妊症がある。
【００１９】
ＷＲＣ−０５７１のような選択的アデノシンＡ１受容体ブロッカーを用いて、血管新生を阻害することができる。当該ブロッカーが有用であるような状態としては、これらに限定されないが、腫瘍、糖尿病性網膜症、リウマチ様関接炎や乾癬のような炎症性疾患、および受胎調節（ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ）がある。
【００２０】
従って、本発明は、選択的アデノシンＡ１受容体アゴニスト、アンタゴニストまたはアロステリックエンハンサーとして作用する化合物を投与することによって、ヒトなどの被検哺乳動物における血管新生を処理する方法を提供する。選択的アデノシンＡ１受容体アゴニストおよび／またはアロステリックエンハンサーの投与の作用により、血管新生を増加させることができ、その一方で、選択的アデノシンＡ１受容体アンタゴニストの投与により、血管新生を阻害することができる。
【００２１】
本発明は、ヒトなどの被検哺乳動物における血管新生に関与する状態または症状を治療するための医薬品の製造における、上述のような選択的アデノシンＡ１受容体アゴニスト、アンタゴニストまたはアロステリックエンハンサーの使用も含む。
【００２２】
本発明は、ヒトなどの被検哺乳動物における血管新生の相乗的な刺激のための、アデノシンＡ１アロステリックエンハンサーとアデノシンＡ１アゴニストとの組み合わせの使用も含む。
【００２３】
加えて、本発明は、ヒトなどの被検哺乳動物における病的な状態または症状を予防または治療するための治療方法を提供し、当該方法において、血管新生は増加することが望ましく、当該方法は、このような治療が必要な哺乳動物に、有効量の選択的アデノシンＡ１アゴニスト、アロステリックエンハンサー、または上記２種の組み合わせを投与することを含む。
【００２４】
本発明は、ヒトなどの被検哺乳動物における病的な状態または症状を予防または治療するための治療方法も提供し、当該方法において、血管新生は減少することが望ましく、当該方法は、このような治療が必要な哺乳動物に、有効量の選択的アデノシンＡ１アンタゴニストを投与することを含む。
【００２５】
図面の簡単な説明
本発明の様々な他の目的、特徴および付随する利点を添付の図面とともに考察してより良く理解することによって、上記目的、特徴および付随する利点を十分に認識できる。
【００２６】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の化合物は、医薬配合物で用いる場合、遊離塩基の形態で、塩の形態で、および、水和物として有用である。全ての形態は、本発明の範囲内である。酸付加塩を形成することができ、事実上、使用するのにより都合のよい形態である；実際には、塩形態の使用は、本質的に塩基形態の使用に等しい。酸付加塩を調製するのに用いることのできる酸としては、好ましくは、遊離塩基と組み合わせて用いる場合、製薬上許容できる塩を生産する酸であり、当該塩とはすなわち、塩の製薬上の用量において、塩の陰イオンが動物に対して非毒性であり、遊離塩基に固有の有益な特性が当該陰イオンに起因する副作用によって損なわれない。前記塩基化合物の製薬上許容できる塩が好ましいが、特定の塩それ自体が中間生成物としてのみ求められる場合でも、例えば、塩が精製および同定の目的のためだけに形成される場合、または、イオン交換法で製薬上許容できる塩を調製する際に中間体として用いられる場合、全ての酸付加塩が遊離塩基形態の源として有用である。
【００２７】
本発明の範囲内の製薬上許容できる塩としては、以下の酸から誘導された塩、すなわち、鉱酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸およびスルファミド酸；および、有機酸、例えば酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミド酸、キナ酸などから誘導された塩がある。
【００２８】
対応する酸付加塩としては、それぞれ、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、スルファミド酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミド酸塩およびキニン酸塩（ｑｕｉｎａｔｅ）がある。
【００２９】
本発明の化合物の酸付加塩は、適切な酸を含む水もしくはアルコール水溶液または他の適切な溶媒に遊離塩基を溶解させ、溶液を蒸発させることによって塩を単離して調製するか、または、有機溶媒中で遊離塩基および酸を反応させて調製するかのいずれかであり、後者の場合、塩は直接分離するか、または、溶液を濃縮して得られる。
【００３０】
本発明の化合物は、選択された投与経路、すなわち、経口または非経口に適合させた様々な形態で被検哺乳動物に投与することができる。非経口投与が好ましく、この場合において、以下の経路、すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、滑液包内、経皮的（経皮、眼、舌下および口内を含む）；局所、例えば眼（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、皮膚、眼球（ｏｃｕｌａｒ）、直腸、および、吸入およびエアロゾルによる鼻吸入、ならびに、直腸からの全身投与による投与が含まれる。
【００３１】
上記活性化合物は、例えば、不活性な希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口的に投与してよく、または、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入してよく、または、錠剤に圧縮することができ、または、食事用の食品に直接含ませてよい。口への治療的投与のために、上記活性化合物は、賦形剤に配合してよく、さらに、経口摂取可能な（ｉｎｇｅｓｔｉｂｌｅ）錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハース等の形態に用いてよい。このような組成物および製剤は、一般的に、少なくとも０．１％の活性化合物を含む。
【００３２】
また、錠剤、トローチ、丸剤、カプセル等は、結合剤、例えばトラガカント、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン；添加剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム含んでよく、および、甘味剤、例えばスクロース、ラクトースまたはサッカリンを含んでよく、または、着香剤、例えばペパーミント、ウインターグリーン油、またはサクランボ着香剤を含んでよい。投与単位形態がカプセルの場合、上記タイプの物質に加えて、液状担体を含んでよい。コーティングとして、またあるいは、投与単位の物理的形態を変性させるために、様々な他の物質が存在してよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルを、セラック、糖またはその両方でコーティングすることができる。シロップまたはエリキシルは、上記活性化合物、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラオキシ安息香酸エステル類、色素、および、サクランボまたはオレンジフレーバーのような着香剤を含み得る。もちろん、いずれの投与単位形態を調製するのに用いられるいずれの物質も、製薬上純粋で、用いられる量において実質的に非毒性であるべきである。加えて、上記活性化合物は、持続放出性製剤および配合物に配合してよい。
【００３３】
好ましくは、上記活性化合物は、非経口的または腹腔内に投与される。上記活性化合物の遊離塩基または製薬上許容できる塩としての溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合した滅菌水中で調製することができる。また、分散物を、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で調製することもでき、油中で調製することもできる。通常の保存および使用の状態下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。
【００３４】
注射用途に適した製薬形態としては、滅菌水溶液または分散物、および、滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末がある。全ての場合において、上記形態（ｔｈｅ ｆｏｒ）は滅菌され、簡便な注射操作が可能（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）な程度に流動性を有していなければならない。上記形態は、製造および保存状態下で安定であればよく、細菌および菌類のような微生物の汚染作用を防いで保存しなければならない。担体としては、溶媒または分散媒が可能であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および、液状ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油が含まれる。適切な流動度は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散物の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、および、界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物作用は、様々な抗菌剤および抗かび剤により防止することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等がある。多くの場合において、例えば、糖類または塩化ナトリウムのような等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって可能である。
【００３５】
滅菌注射用溶液は、必要量の上記活性化合物と、上記で列挙された様々な他の成分とを適切な溶媒に配合し、必要であれば、さらにろ過滅菌することによって調製される。一般的に、分散物は、様々な滅菌した活性成分を滅菌した基剤に配合することによって調製され、当該滅菌した基剤は、基本的な分散媒および上記で列挙された必要な他の成分を含む。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それにより、活性成分および追加の所望の成分いずれかの粉末を、予めろ過滅菌したそれらの溶液から生じさせる。
【００３６】
本発明の治療用化合物は、被検哺乳動物に、単独で、または、上述のような製薬上許容できる担体と組み合わせて投与してよく、その比率は、上記化合物の溶解性および化学的性質、選択された投与経路および標準的な製薬の実施によって決定される。
【００３７】
予防または治療に最も適した本発明の治療剤の投与量は、投与形態、特定の選択された化合物、および、治療される特定の患者の生理学的な特徴に応じて変化することになる。一般的に、最初は少量の投与量が用いられ、必要に応じて、その環境下で最適な作用に達するまで少しずつ増量することによって投与量を増加させる。
【００３８】
ＣＡＭ分析において、アデノシンは血管新生を刺激する。これまでの研究者によってＣＡＭでなされた研究によれば、血管新生の刺激物質としてのアデノシンに関して、対立する結果しか得られていない。我々の第一段階は、窓を開けた（ｗｉｎｄｏｗｅｄ）ＣＡＭモデルでアデノシンが血管新生を刺激するかどうかを観察することであった。
【００３９】
実施例１
妊性のホワイトレグホン種ニワトリの卵を、Ｔｒｕｓｌｏｗ Ｆａｒｍｓ（Ｃｈｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、ＭＯ）から得た。卵を３７℃で７日間インキュベートし、次に、各卵のＣＡＭ上に１．５ｃｍの窓を開けた。ペレットをＣＡＭに適用し、窓をセロハンテープで閉じた。卵を１４日目までインキュベートし、ＣＡＭを固定した。Ｄｕｓｓｅａｕ（Ｄｕｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｈｉｃｋ Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， ５９，１６３−１７０，１９８６）で説明されたように、アデノシンをＥｌｖｄｘペレットを介してＣＡＭに適用した。各ペレットは、１０μｌ量であり、３ｍｇのアデノシン粉末を含んでいた。コントロールペレットは、アデノシン粉末は含まず、Ｅｌｖａｘポリマーのみを含んでいた。そのペレットを数本の血管が存在するＣＡＭ上に置き、７日間静置した。次に、そのＣＡＭを１０％緩衝ホルマリンで固定し、ニコン社製の立体顕微鏡を用いて２０倍の倍率で血管を計数した。血管数の定量は、血管密度指数ＶＤＩとして示され、当該指数は、Ｈａｒｒｉｓ−Ｈｏｏｋｅｒにより説明された方法の改造による（Ｈａｒｒｉｓ−Ｈｏｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ａｏｒｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ｊ． Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．， １１４， ３０２−３１０，１９８３）。同軸円の直径の４、５、６、および８ｍｍが刻まれたプラスチックカバースリップを、ホルマリン固定ＣＡＭ上のアデノシンペレットを覆うように中心に置いた。円を横切る血管の数を計測することによって血管密度を判断した。この技術によれば、直径が１０〜１２μの血管まで計測することができた。ＣＡＭ上のペレットの位置取りは、ランダムにした。これらの実験から、ＣＡＭモデルにおいてアデノシンが血管新生を刺激することがわかる（図５参照）。Ｅｌｖａｘペレットそれ自身は、血管新生反応を惹起しなかった。アデノシンは、他の手段で同様に運搬された（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ）。図５は、１グループにつき１２〜１５個の卵から得られたデータを示し、ＣＡＭ分析においてアデノシンが血管新生を刺激することを示す。
【００４０】
アデノシン受容体サブタイプ選択的アゴニストは、ＣＡＭにおいて、様々なレベルに血管新生を刺激する。図６は、様々なアデノシンリガンドをＣＡＭへ適用した後に得られた結果を示す。これらの研究において、滅菌したろ紙ディスクを用いて、インキュベーション７日後に窓を開けた卵のＣＡＭに薬物または基剤を適用した。円形のディスクの直径は７ｍｍであった。アゴニストおよびアンタゴニスト薬物の１００μｌ量を、上記ディスク上に置くことによって、７日間毎日与えた。１４日目に、そのＣＡＭをホルマリンで固定した。ディスクの端を横切る血管を計数することによって、その血管密度を決定した。各バーは、１３〜１９個の卵から得られたデータを示すが、例外として、キサンチンアミン同族体（ＸＡＣ）のバーは、４個の卵のみからのデータを示す。その結果によれば、Ａ１アゴニストＣＰＡ、非選択的アゴニストＮＥＣＡ、および、Ａ３選択的リガンドｍ−ＭＥＣＡに対して陽性の血管新生反応を示した。試験されたＡ２ＡアゴニストＣＧＳ２１６８０または他のＡ２Ａ選択的アゴニストに関しては、血管新生反応はみられなかった（データは示さず）。非選択的アンタゴニストＸＡＣは、基準の（ｂａｓｅｌｉｎｅ）血管新生を阻害せず、実際にはわずかに刺激があるかもしれない。いくつかのアデノシン受容体が血管新生を刺激することが可能であり、その一方で、他の受容体、特にＡ２Ａ受容体が血管新生を阻害し得る。それゆえに、ＸＡＣは多少の阻害を起こす（ｒｅｌｅａｓｅ）可能性がある。用いられた１００ｎＭの用量は、リガンドに対するサブタイプ選択性のいくらかの保存を可能にするべきであった。
【００４１】
実施例２
妊性のホワイトレグホン種ニワトリの卵をＴｒｕｓｌｏｗ Ｌａｂｓ（Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得て、受精後７日まで３７℃でインキュベートした。その卵をインキュベーターで自動的に回転させた。７日目に、その卵を光に照らし（ｃａｎｄｌｅｄ）、生存率を確認した。その卵殻表面をベタジンおよび７０％イソプロパノールで消毒した。各卵のＣＡＭ上に１．５×１．５ｃｍの窓を開けた。その窓を透明なセロハンテープで覆い、その卵を３７℃で一晩インキュベートした。その次の日、滅菌したろ紙ディスクをＣＡＭに適用して１００μｌ量の薬物または基剤を毎日与えた。１４日目にＣＡＭを固定し、上述のＨａｒｒｉｓ−Ｈｏｏｋｅｒ等の方法を用いて血管を計数した。
【００４２】
実施例３
図５に説明されたＡＴＬ−ＭＣ１２０１をデザインした化合物は、選択的アデノシンＡ１受容体アロステリックエンハンサーの新規のクラスの一つである。実施例２で説明したように、ＣＡＭにおいて血管系を増加させるＡＴＬ−ＭＣ１２０１の有効性に関して、基剤のみで処理されたサンプルの有効性と比較して分析した。基剤は、０．５％ＤＭＳＯからなった。処理は、１０μＭのＡＴＬ−ＭＣ１２０１でなされた。基剤（０．５％ＤＭＳＯ）または試験化合物（１０μＭのＡＴＬ−ＭＣ１２０１）の５０μｌのアリコートを７〜１３日間毎日ろ紙ディスクに適用した。１４日目にその膜を回収し、ディスクから４５本を超過するレベルで生じた血管を計数し、コントロールと処理した卵との間で比較した。コントロール群は５個の卵、処理群は３個の卵であった。コントロール卵では平均７５本の血管が存在し、処理した卵では平均９４本の血管が存在した。
【００４３】
実施例４
注入ポンプを用いて薬物をラット腸間膜に適用した。アルゼット浸透圧ポンプを、２００μｌ量の薬物または基剤で充填した。麻酔した１５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腹腔を切開し、ポンプを腹膜内の空洞に埋め込んだ。そのポンプにより、薬物を１．０μｌ／時間で与えた。１週間後、腸間膜サンプルを、血管係蹄（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｒｃａｄｅ）の間で小腸管の長さに沿って分取した。試験片を固定し、ＢＳ：レクチン染色を用いて染色した。
【００４４】
図７に示すように、Ａ１アゴニスト、ＣＰＡで刺激された血管新生をＡ１選択的ブロッカーＷＲＣ−０５７１でブロックした。
ＣＰＡを１００ｎＭで、１μＭのＷＲＣ−０５７１を存在させるかまたはさせずに、発生中のＣＡＭ上のろ紙ディスクに上述したように適用した。当該薬物の血管新生作用は、アンタゴニストの添加により完全にブロックされた。
【００４５】
アデノシンＡ１受容体のアロステリックエンハンサーは、血管新生を刺激した。図８は、与えられたＰＤのＣＡＭに対する作用を示す。ここで、ＰＤは、ＣＡＭにおいて、内在性アデノシンのニワトリＡ１受容体への作用を増強する。１００μＭ濃度のＰＤまたは基剤は、アデノシンアゴニストで用いられたのと同一のプロトコールを用いてろ紙ディスク上のＣＡＭに達した。そのデータは、ＰＤが１０％で血管新生を刺激したことを示す。適用されたリガンドまたは虚血／低酸素（これらは内在性アデノシンレベルを増加させ得る）がない場合のような低い作用が予測される。ＣＡＭは急速に成長する組織であるため、おそらく、ＣＡＭは活動していない組織に比べてより高いアデノシンレベルを有し、測定可能な作用が生じる。ＰＤの作用は、ＷＲＣ−０５７１により完全にブロックされ、ＷＲＣ−０５７１はまた内在性アデノシンの作用も同様にブロックするから、その血管新生の阻害剤としての有用性を示す。図９は、エンハンサー作用は、ＰＤ８１，７２３が属する化合物ファミリーの特性であり、ＰＤ８１，７２３それ自身に特有の特性ではないことを示す。当該グラフは、Ｃ１７、他のアロステリックエンハンサーも血管新生を刺激し、ＷＲＣ−０５７１によってブロックされることを示す。
【００４６】
図１０に示したように、アゴニストとＰＤ８１，７２３との間で相乗効果がある。ＣＡＭにおいて、２０ｎＭ濃度のＣＰＡは血管新生を刺激しなかった。低い用量のＣＰＡとＰＤ８１，７２３とを組み合わせて使用することにより、ＰＤ８１，７２３単独でみられる刺激の３倍大きい血管新生の刺激をもたらした。この実験は、ＰＤ８１，７２３を用いてアデノシンの高い組織レベルの作用を強化する見込みを示す。
【００４７】
ＰＤ８１，７２３による血管新生の刺激は、成熟した哺乳動物モデルでもみられる。図１１は、ラット腹膜の空洞にアルゼットポンプを用いてＰＤ８１，７２３を長期的に注入することの作用を示す。コントロール腸間膜は左側に、ＰＤ８１，７２３処理は右側に示す。当該モデルは虚血性モデルではないので、ＰＤ８１，７２３の安定した長期投与によって、より低い濃度の内在性アデノシン作用の強化を補助することができるので、長期的な注入が有利であった。
【００４８】
心臓、脳、および四肢を含む虚血組織に対する新しい血管成長の刺激は、アテローム性体肢動脈硬化症の罹患率および死亡率に劇的な影響を与えることができた。データは、アデノシンＡ１受容体が、血管新生反応における役割と、それらの他の組織に対する保護特性とを有し、虚血を治療するための新しい治療方法をもたらす可能性を示す。アロステリックエンハンサーに関する特定の要請（ａｐｐｅａｌ）は、それらは単独では作用しないが、内在性アデノシンレベルの増加に関しては、低酸素組織において最も効果的なことである。これは、他の治療でみられるような可能性のある全身性の副作用のいくつかを回避することができる。すでに上述したが、１次的な血管新生因子ではなく２次的な血管新生因子を選択する際のいくつかの利点も存在する。Ａ１受容体のブロッカーは、病理の原因となったり促進したりする血管新生を阻害するための使用においても有望であるか、または、避妊薬として、卵子着床の可能性を減少させることにおいても有望である。
【００４９】
１つの実施形態において、卒中、心疾患、および末梢血管疾患の治療方法が提供される。当該方法は、所望の位置で血管新生を誘導するのに有効な量のＡ１アロステリックエンハンサーを患者に投与する工程を含む。別の実施形態において、腫瘍、糖尿病性網膜症、リウマチ様関接炎および乾癬のような炎症性疾患の治療方法が提供される。この方法において、Ａ１アンタゴニストは、所望の位置で血管新生を阻害するのに有効な量で患者に投与される。投与された組成物は、当業者既知の標準的な技術のいずれかによって所望の組織に局在させることができる。これらは、局所的適用、または、標的組織へ直接注射もしくはその近辺への注射のいずれかによって標的領域へ直接的に適用すること、または、全身投与した後に標的組織に対して標的化するか、または、標的組織に選択的に蓄積させることによって標的領域へ直接的に適用させることを含む。本発明の組成物は、標的組織に選択的な親和性を有する化合物に活性薬剤を結合させることによって標的化させることができる。例えば、Ａ１アンタゴニストまたはＡ１アゴニストは、標的組織にしか存在しない抗原に特異的なモノクローナル抗体に結合させることができる。
【００５０】
本明細書で引用された全ての出版物、特許および特許文書を参照により合体させ、個別に参照により合体させたことと同様である。本発明は、様々な特定の好ましい実施形態および技術に関して説明されている。しかしながら、本発明の本質と範囲内である限り、多くの変化および変更が当業者によってなされ得ることは明白である。また、各々の上述の要素は（または２以上を共にあわせて）、上述したタイプとは異なる他のタイプの用途において、有用な用途を見出し得ることが理解される。これは、本明細書で説明された医学的用途と同様に、例えば、獣医学的用途を含む。
【００５１】
さらなる分析を行わずとも、前述の内容は本発明の要点を十分に明らかにしているので、他者は、本発明の必須の特徴を構成する、先行技術の観点に比べて明らかな特徴を省略することなく、現代の知識を適用することによって容易に様々な用途に適合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＤ８１，７２３の構造を示す。
【図２】図２は、ＷＲＣ−０５７１の構造を示す。
【図３】図３は、Ｃ１７の構造を示す。
【図４】図４は、ＡＴＬ−ＭＣ１２０１の構造を示す。
【図５】図５は、ＣＡＭ分析において、アデノシンが血管新生を刺激することを示す棒グラフである。
【図６】図６は、ＣＡＭ分析において、アデノシン受容体サブタイプ選択的アンタゴニストが様々な度合いで血管新生を刺激することを示す棒グラフである。
【図７】図７は、漿尿膜（ＣＡＭ）における、選択的アデノシンＡ１受容体アゴニストであるシクロペンチルアデノシン（ＣＰＡ）の血管新生を刺激する作用、および、選択的Ａ１アンタゴニストＷＲＣ−０５７１がその刺激をブロックする能力を示す棒グラフである。
【図８】図８は、ＣＡＭにおける、ＰＤ８１，７２３による血管新生の刺激を示す棒グラフである。また当図は、ＷＲＣ−０５７１は、ＰＤ８１，７２３の作用だけでなく、内在性アデノシンの作用も同様にブロックすることも示し、すなわち有用な血管新生阻害剤であることを示唆する。
【図９】図９は、アデノシンＡ１受容体、Ｃ１７の他のアロステリックエンハンサーの血管新生作用を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、ＰＤ８１，７２３とＣＰＡとの相乗効果を示す棒グラフである。これらの実験において、ＣＰＡを、個々の作用を起こすには低い濃度でＣＡＭ’Ｓに適用した。ＰＤ８１，７２３は、控えめな作用を起こしたが、２種を組み合わせた場合、血管新生作用は、ＰＤ８１，７２３単独を用いた場合にみられた作用の３倍以上に増加した。
【図１１】図１１は、ラット腸間膜におけるＰＤ８１，７２３の血管新生作用の最良の実施例の一つを示す。コントロール切片は左側に、ＰＤ８１，７２３処理切片は右側に示す。
【図５】
2004505048.tif 000004
【図６】
2004505048.tif 000005
【図７】
2004505048.tif 000006
【図８】
2004505048.tif 000007
【図９】
2004505048.tif 000008
【図１０】
2004505048.tif 000009
【図１１】
2004505048.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004505048.tif 000011
2004505048.tif 000012
2004505048.tif 000013
2004505048.tif 000014
2004505048.tif 000015
2004505048.tif 000016
2004505048.tif 000017
2004505048.tif 000018
2004505048.tif 000019
2004505048.tif 000020
2004505048.tif 000021
2004505048.tif 000022
2004505048.tif 000023
2004505048.tif 000024
2004505048.tif 000025
2004505048.tif 000026
2004505048.tif 000027
2004505048.tif 000028
2004505048.tif 000029
2004505048.tif 000030
2004505048.tif 000031
2004505048.tif 000032
2004505048.tif 000033
2004505048.tif 000034
2004505048.tif 000035
2004505048.tif 000036
2004505048.tif 000037
2004505048.tif 000038
2004505048.tif 000039
2004505048.tif 000040
2004505048.tif 000041
2004505048.tif 000042
【国際調査報告】
2004505048.tif 000043