(57)【要約】本発明は、Ｉ型糖尿病を検出、特徴付け、予防、および治療するための組成物、キット、および方法に関する。種々のマーカーが提供され、１またはそれ以上のマーカーの発現レベルの変化がＩ型糖尿病の存在と関連付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっているかどうかを評価する方法であって、下記ａ）とｂ）：
ａ）対象からの試料中のマーカーの発現レベル、ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものである；
ｂ）対照試料中のマーカーの正常発現レベル
を比較することを特徴とし、
対象からの試料中のマーカーの発現レベルと正常レベルとの間の有意な相違により、対象がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっていることが示される方法。
【請求項２】
マーカーが転写されたポリヌクレオチドまたはその一部分に対応するものであり、ポリヌクレオチドがマーカーを含むものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料が対象から得られた細胞を含むものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞が膵臓組織から集められたものである請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞が血液組織から集められたものである請求項３記載の方法。
【請求項６】
試料中のマーカーの発現レベルが、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっていない対象中のマーカーの正常発現レベルと少なくとも約２倍異なっているものである請求項１の方法。
【請求項７】
試料中のマーカーの発現レベルが、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっていない対象中のマーカーの正常発現レベルと少なくとも約５倍異なっているものである請求項１の方法。
【請求項８】
マーカーに対応する蛋白の試料中における存在を検出することにより試料中のマーカーの発現レベルが評価される請求項１記載の方法。
【請求項９】
蛋白に特異的に結合する試薬を用いて蛋白の存在が検出される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
試薬が抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントからなる群より選択されるものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
試料中のマーカーの発現レベルが、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の試料中における存在を検出することにより評価され、転写されたポリヌクレオチドがマーカーを含むものである請求項１記載の方法。
【請求項１２】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
検出工程が、転写されたポリヌクレオチドを増幅することをさらに特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ストリンジェントな条件下においてマーカーにアニールするかあるいはポリヌクレオチドの一部分にアニールする転写されたポリヌクレオチドの試料中における存在を検出することにより試料中のマーカーの発現レベルが評価され、ポリヌクレオチドがマーカーを含むものである請求項１記載の方法。
【請求項１６】
下記ａ）とｂ）：
ａ）表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーから独立して選択される複数の各マーカーの試料中での発現レベル；
ｂ）Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっていない対照の対象から得られた試料中の同じタイプの複数の各マーカーの正常発現レベル
を比較することを特徴とし、
１またはそれ以上のマーカーの発現レベルがマーカーの対応正常発現レベルと比較して有意に変化しており、それにより対象がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっていることが示される請求項１記載の方法。
【請求項１７】
複数が２種またはそれ以上のマーカーを含むものである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
複数が少なくとも５種のマーカーを含むものである請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の進行をモニターする方法であって、下記工程：
ａ）第１の時点で対象試料中のマーカーの発現を検出し；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであり；
ｂ）後続の時点で工程ａ）を繰り返し；次いで
ｃ）工程ａ）および工程ｂ）において検出された発現レベルを比較し、それにより対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の進行をモニターする
を特徴とする方法。
【請求項２０】
マーカーが表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるものである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
マーカーが転写されたポリヌクレオチドまたはその一部分に対応するものであり、ポリヌクレオチドがマーカーを含むものである請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
試料が対象から得られた細胞を含むものである請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
細胞が膵臓組織から集められたものである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
細胞が血液組織から集められたものである請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する試験化合物の有効性を評価する方法であって、下記ａ）とｂ）：
ａ）対象から得られた第１の試料であって、試験化合物に曝露されあるいは試験化合物の存在下に維持された試料中のマーカーの発現；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであり；
ｂ）対象から得られた第２の試料であって、試験化合物に曝露されていない試料中のマーカーの発現
を比較することを特徴とし、
第２の試料と比較して第１の試料中の有意に減少したマーカーの発現レベルにより、試験化合物が対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制することに有効であることが示される方法。
【請求項２６】
第１および第２の試料が対象から得られた単一試料の一部である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
第１および第２の試料が対象から得られたプールされた試料の一部である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する治療の有効性を評価する方法であって、下記ａ）とｂ）：
ａ）治療の少なくとも一部を対象に施す前に対象から得られた第１の試料中のマーカーの発現；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであり；
ｂ）治療の一部を施した後の対象から得られた第２の試料中のマーカーの発現を比較することを特徴とし、
第１の試料と比較して第２の試料中の有意に減少したマーカーの発現レベルにより、治療が対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制することに有効であることが示される方法。
【請求項２９】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する治療の有効性を評価する方法であって、下記ａ）とｂ）：
ａ）治療の少なくとも一部を対象に施す前に対象から得られた第１の試料中のマーカーの発現；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであり；
ｂ）治療の一部を施した後の対象から得られた第２の試料中のマーカーの発現を比較することを特徴とし、
第１の試料と比較して第２の試料中の有意に増加したマーカーの発現レベルにより、治療が対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制することに有効であることが示される方法。
【請求項３０】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する組成物を選択する方法であって、下記工程：
ａ）対象から細胞を含む試料を得て；
ｂ）複数の試験組成物の存在下に試料の部分試料を別個に維持し；
ｃ）各部分試料中のマーカーの発現を比較し；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであり；次いで
ｄ）他の試験組成物と比較した場合に部分試料中のマーカーの発現レベルの減少を誘導する１の試験組成物を選択する
を特徴とする方法。
【請求項３１】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する組成物を選択する方法であって、下記工程：
ａ）対象から細胞を含む試料を得て；
ｂ）複数の試験組成物の存在下に試料の部分試料を別個に維持し；
ｃ）各部分試料中のマーカーの発現を比較し；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであり；次いで
ｄ）他の試験組成物と比較した場合に部分試料中のマーカーの発現レベルの増加を誘導する１の試験組成物を選択する
を特徴とする方法。
【請求項３２】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する方法であって、下記工程：
ａ）対象から細胞を含む試料を得て；
ｂ）複数の試験組成物の存在下に試料の部分試料を別個に維持し；
ｃ）各部分試料中のマーカーの発現を比較し；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであり；次いで
ｄ）他の試験組成物と比較した場合に部分試料中のマーカーの発現レベルの減少を誘導する少なくとも１の試験組成物を対象に投与する
を特徴とする方法。
【請求項３３】
対象がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっているかどうかを評価するためのキットであって、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーの発現を評価するための試薬を含むキット。
【請求項３４】
Ｉ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与している細胞の存在を評価するためのキットであって、核酸プローブを含み、該プローブが表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーに対応する転写されたポリヌクレオチドと特異的に結合するものであるキット。
【請求項３５】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する組成物を選択する方法であって、下記工程：
ａ）対象からＩ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与している細胞を含む試料を得て；
ｂ）複数の試験組成物の存在下に試料の部分試料を別個に維持し；
ｃ）各部分試料中のマーカーの発現を比較し；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであり；次いで
ｄ）他の試験組成物と比較した場合に部分試料中のマーカーの発現レベルの増加を誘導する少なくとも１の試験組成物を対象に投与する
を特徴とする方法。
【請求項３６】
対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する複数の各化合物の適性を評価するためのキットであって、
ａ）複数の化合物；および
ｂ）表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーの発現を評価するための試薬
を含むキット。
【請求項３７】
Ｉ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与している細胞の存在を評価するためのキットであって、抗体を含み、該抗体が表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーに対応する蛋白と特異的に結合するものであるキット。
【請求項３８】
Ｉ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与している細胞の存在を評価するためのキットであって、核酸プローブを含み、該プローブが表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーに対応する転写されたポリヌクレオチドと特異的に結合するものであるキット。
【請求項３９】
細胞においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く試験化合物の潜在能力を評価するための方法であって、下記工程：
ａ）試験化合物の存在下および不存在下に細胞の別個の部分試料を維持し；次いで
ｂ）各部分試料中のマーカーの発現を比較する；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものである
を特徴とし、
試験化合物の不存在下に維持された部分試料と比較して、試験化合物の存在下に維持された部分試料中のマーカーの有意に増加した発現レベルにより、試験化合物が細胞においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く潜在能力を有していることが示される方法。
【請求項４０】
細胞においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く試験化合物の潜在能力を評価するための方法であって、下記工程：
ａ）試験化合物の存在下および不存在下に細胞の別個の部分試料を維持し；次いで
ｂ）各部分試料中のマーカーの発現を比較する；ここにマーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものである
を特徴とし、
試験化合物の不存在下に維持された部分試料と比較して、試験化合物の存在下に維持された部分試料中のマーカーの有意に減少した発現レベルにより、試験化合物が細胞においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く潜在能力を有していることが示される方法。
【請求項４１】
細胞においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く試験化合物の潜在能力を評価するためのキットであって、細胞およびマーカーの発現を評価するための試薬を含み、マーカーが表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるものであるキット。
【請求項４２】
Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象の処置方法であって、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象の細胞に表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーに対応する蛋白を提供することを特徴とする方法。
【請求項４３】
蛋白をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に提供することにより蛋白が細胞に提供される請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象の処置方法であって、対象の細胞に表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーに対応するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを特徴とする方法。
【請求項４５】
Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を発症する危険性のある対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する方法であって、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーに対応する遺伝子の発現を抑制することを特徴とする方法。
【請求項４６】
Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を発症する危険性のある対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する方法であって、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に掲載されたマーカーからなる群より選択されるマーカーに対応する遺伝子の発現を促進することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、参照により本明細書に一体化させる２０００年６月５日出願の米国仮出願第６０／２０９７０３号に対して優先権を主張するものである。
発明の背景
糖尿病は、相互関連した代謝系、血管系、およびニューロパチー成分を伴う症候群である。一般的には、代謝系の成分は高血糖により特徴付けられ、インスリン分泌の不存在または著しい低下および／または有効でないインスリン作用により引き起こされる炭水化物、脂質および蛋白代謝の変化を含む。血管系の成分は血管における異常を包含し、それらは心臓血管系、網膜および腎臓の合併症を導く。末梢および自律神経系の異常は糖尿病症候群の第３の成分を含む。
【０００２】
２つのタイプの糖尿病がある：Ｉ型およびＩＩ型である。Ｉ型糖尿病は、この疾患にかかっている対象が自分のインスリンを合成できないという事実により「インスリン依存性」糖尿病とも呼ばれ、それゆえ定期的にインスリンを対象の系に注射しなければならない。一方、ＩＩ型糖尿病にかかっている対象はインスリンを合成できるが、このインスリンは対象が必要とするには不十分であるか、あるいは対象により有効に利用されない。典型的には、ＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）は経口投薬により制御される。
【０００３】
多くの自己免疫疾患と同様に、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）は非常に複雑な病因を有する疾患であり、その病因は、多因子的な遺伝学的感受性と相互作用する環境的な「引き金」を含むと考えられている。ＩＤＤＭ感受性を付与する遺伝子座に関する最初期の同定はほぼ３０年前に始まり、主要組織適合性遺伝子座（ＭＨＣ）のある種の対立遺伝子と糖尿病との関連性が発見された（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ （１９８６） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ２１４（２１）： １３６０−１３６８； Ｗｉｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３： １７９−２００； およびＴｏｄｄ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２９： ５９９−６０４）。その後の伝染病学的研究により、糖尿病発病の危険性はある種のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の遺伝と強い関連性があることが結論的に示された。ＭＨＣ遺伝子座は糖尿病に関する最も重要な遺伝学的危険因子であるが、それはこの遺伝学的危険性の５０％未満に関与しているだけであり、ゲノム中に散在している非−ＭＨＣ遺伝子座もまた疾病感受性および重篤性に大きく貢献していることが明らかに示される（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３７１： １３０−１３６）。
【０００４】
分かり易いゲノム−ワイドスキャン（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃａｎｓ）はこれまでに１８個の異なるＩＤＤＭ感受性遺伝子座を有している（Ｂｅｃｋｅｒ （１９９９） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８（７）： １３５３−１３５８）。これらの推定感受性遺伝子座の多くは共通の標準よりも低い統計学的有意値を有しており（差異の対数［ＬＯＤ］≧３）、それらの一部のみが複製されるので、それは注意深く評価されなくてはならない。興味深いことに、１８個の候補遺伝子座のうち１５個が、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎および腹腔の疾病のごとき多の自己免疫疾患に関するすでに確認されている感受性遺伝子座と重複している（Ｂｅｃｋｅｒ （１９９９） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８（７）： １３５３−１３５８）。確定的ではないが、この結果は、候補感受性遺伝子座は正常な免疫機能および調節において中心的な役割を果たす遺伝子を含みうることを示唆しうる。しかしながら、この免疫調節を担う推定感受性遺伝子座における正確な遺伝子の同定は、その遺伝子座自体の同定よりもはるかに困難であることがわかった。これらの遺伝子座のそれぞれは非常に大きな遺伝学的距離にまたがっていて１０〜３０ｃＭまでのサイズであり、数千までではないが数百の遺伝子を含んでおり（Ｂｅｃｋｅｒ （１９９９） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８（７）： １３５３−１３５８）、それらの多くは機能が定義されておらず、組み合わさって作用するものである可能性がある。
【０００５】
存在しているＩ型糖尿病の分子的基礎をゲノムワイドスキャンに対して同定する相補的アプローチにおいて、疾病における異なった免疫細胞の関与も調べられた。インバリアントＣＤ１６１＋Ｖ２１４Ｊα２８１Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞）はＴヘルパー細胞（Ｔｈ）Ｔｈ１／Ｔｈ２バイアスの調節において重要であることが知られており（Ｂｅｎｄｅｌａｃ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５： ５３５−５６２）、いくつかの自己免疫に関するネズミモデルにおいて疾病の発症前にＮＫＴ細胞数が減少し、頻繁にさらに減少することが示されている（Ｔａｋｅｄａ ａｎｄ Ｄｅｎｎｅｒｔ （１９９３） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７７： １５５−１６４； Ｍｉｅｚａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６： ４０３５−４０４０； およびＢａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６： ５７２−５８２）。この細胞集団が非肥満糖尿病または非肥満糖尿病Ｖα１４Ｊα２８１−トランスジェニックドナーから前糖尿病動物へと移された場合、レシピエントは糖尿病から防御された（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６： ５７２−５８２； Ｌｅｈｕｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８： １８３１−１８３９）。この防御の移行は、抗−ＩＬ−４抗体の同時投与により有意に阻害された（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７： １０４７−１０５６）。
【０００６】
ヒトは相同的なインバリアント（すなわち、Ｎ領域付加がない）ＣＤ１６１＋Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞集団を有し、その制限エレメント（ネズミＣＤ１６１＋Ｖα１４Ｊα２８１ Ｔ細胞に対するものと類似）は非多型性クラスＩｂ分子ＣＤ１ｄである（Ｅｘｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６（１）： １０９−２０）。Ｉ型糖尿病に関して不一致である一卵性の双子および三つ子の５つのセットにおいて、非糖尿病同胞においてインバリアントＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞が有意に高い頻度で存在していた（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１（６６６３）： １７７−８１）。そのうえ、非糖尿病同胞からのＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンはＩＬ−４およびＩＦＮ−γの両方を分泌したが、糖尿病同胞からの細胞はＩＬ−４分泌能を著しく欠いていた。
【０００７】
発明の概要
１の具体例において、本発明は、対象からの試料中のマーカーの発現を対照試料中のマーカーの正常発現レベルと比較することにより、対象がＩ型糖尿病またはＮＫＴ Ｔ細胞関連症状にかかっているかどうかを評価する方法を提供し、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーの群から選択されるものであり、対象からの試料中のマーカーの発現レベルと正常レベルとの間の有意な相違は、対象がＩ型糖尿病またはＮＫＴ Ｔ細胞関連症状にかかっていることを示す。好ましい具体例において、マーカーは転写されたポリヌクレオチドまたはその部分に対応し、そのポリヌクレオチドは該マーカーを含む。特に好ましい具体例において、試料中のマーカーの発現レベルは、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ Ｔ細胞関連症状にかかっていない対象におけるマーカーの正常発現レベルとは少なくとも２倍異なり、さらに好ましい具体例において、発現レベルは少なくとも５倍異なる。もう１つの好ましい具体例において、マーカーは無関係な組織において有意に発現されないものである。
【０００８】
もう１つの好ましい具体例において、試料は対象から得られた細胞を含む。もう１つの好ましい具体例において、マーカーに対応する蛋白の試料中における存在を検出することにより試料中のマーカーの発現レベルが評価される。特に好ましい具体例において、蛋白に特異的に結合する試薬を用いて蛋白の存在が検出される。さらに好ましい具体例において、試薬は抗体、抗体誘導体、および抗体フラグメントを包含する試薬の群から選択される。もう１つの好ましい具体例において、転写されたポリヌクレオチドまたはその部分の試料中における存在を検出することにより試料中のマーカーの発現レベルが評価され、転写されたポリヌクレオチドはマーカーを含む。特に好ましい具体例において、転写されたポリヌクレオチドはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。もう１つの特に好ましい具体例において、検出工程は、転写されたポリヌクレオチドを増幅することをさらに含む。
【０００９】
もう１つの好ましい具体例において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、マーカーとアニールする、あるいはポリヌクレオチドの部分とアニールする転写されたポリヌクレオチドの試料中における存在を検出することにより試料中のマーカーの発現レベルが評価され、ポリヌクレオチドはマーカーを含む。もう１つの好ましい具体例において、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示されたマーカーから独立して選択される各試料中の複数のマーカーの発現レベルが、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっていない対照の対象から得られた試料中の同じタイプの複数の各マーカーの発現レベルと比較され、１つよりも多いマーカーの発現レベルがそのマーカーの対応正常発現レベルよりも有意に変化しており、それにより対象がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっていることが示される。特に好ましい具体例において、複数とは２種またはそれ以上のマーカーを包含する。さらにより好ましい具体例において、複数とは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーのうち少なくとも５種を包含する。
【００１０】
もう１つの具体例において、本発明は、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の進行をモニターする方法を提供し、該方法は、第１の時点での対象試料中のマーカーの発現を検出し、後続の時点においてこの検出工程を繰り返し、次いで、２つの検出工程で検出された発現レベルを比較し、次いで、この情報を用いて対照におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の進行をモニターすることを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択される。好ましい具体例において、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーならびにそれらの組み合わせを包含する群より選択される。もう１つの好ましい具体例において、マーカーは転写されたポリヌクレオチドまたはその部分に対応し、ポリヌクレオチドは該マーカーを含む。もう１つの好ましい具体例において、試料は対象から得られた細胞を含む。特に好ましい具体例において、細胞は膵臓または血液組織から収集される。
【００１１】
もう１つの具体例において、本発明は、対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する試験化合物の有効性を評価する方法を提供し、該方法は、試験化合物に曝露され、あるいは試験化合物の存在下に維持されている対象から得られた第１の試料中のマーカーの発現を、対象から得られた第２の試料中のマーカーの発現と比較することを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択され、第２の試料は試験化合物に曝露されていないものであり、第２の試料中のマーカーの発現レベルと比較して有意に減少した第１の試料中のマーカーの発現レベルが、試験化合物が対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制するに有効であることを示すものである。好ましい具体例において、第１および第２の試料は対象から得られた単一試料の部分である。もう１つの好ましい具体例において、第１および第２の試料は対象から得られたプールされた試料の部分である。
【００１２】
もう１つの具体例において、本発明は、対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する治療の有効性を評価する方法を提供し、該方法は、対象に治療の少なくとも一部を提供する前に対象から得た第１の試料中のマーカーの発現を、治療の部分を提供した後の対象から得た第２の試料中のマーカーの発現と比較することを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択され、第１の試料中のマーカーの発現レベルと比較して有意に減少した第２の試料中のマーカーの発現レベルが、治療が対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制するに有効であることを示すものである。
【００１３】
もう１つの具体例において、本発明は、対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する治療の有効性を評価する方法を提供し、該方法は、対象に治療の少なくとも一部を提供する前に対象から得た第１の試料中のマーカーの発現を、治療の部分を提供した後の対象から得た第２の試料中のマーカーの発現と比較することを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択され、第１の試料中のマーカーの発現レベルと比較して有意に増加した第２の試料中のマーカーの発現レベルが、治療が対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制するに有効であることを示すものである。
【００１４】
もう１つの具体例において、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する組成物を選択する方法を提供し、該方法は、対象からの細胞を含む試料を得て、複数の試験組成物の存在下で該試料の部分試料を別個に維持し、各部分試料中のマーカーの発現を比較し、次いで、他の試験組成物を含む部分試料中のマーカーの発現よりも減少したレベルの発現を誘導する１の試験組成物を選択することを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択される。
【００１５】
もう１つの具体例において、本発明は、対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する方法を提供し、該方法は、対象からの細胞を含む試料を得て、複数の試験組成物の存在下で該試料の部分試料を別個に維持し、各部分試料中のマーカーの発現を比較し、次いで、他の試験組成物と比較して減少したレベルの発現を誘導する少なくとも１の試験組成物を対象に投与することを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択される。
【００１６】
もう１つの具体例において、本発明は、対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する方法を提供し、該方法は、対象からの細胞を含む試料を得て、複数の試験組成物の存在下で該試料の部分試料を別個に維持し、各部分試料中のマーカーの発現を比較し、次いで、他の試験組成物と比較して増加したレベルの発現を誘導する少なくとも１の試験組成物を対象に投与することを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択される。
【００１７】
もう１つの具体例において、本発明は、対象がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっているかどうかを評価するためのキットを提供し、該キットは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択されるマーカーの発現を評価するための試薬を含む。
【００１８】
もう１つの具体例において、本発明は、Ｉ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与する細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは核酸プローブを含み、該核酸プローブは、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択されるマーカーに対応する転写されたポリヌクレオチド特異的に結合するものである。
【００１９】
もう１つの具体例において、本発明は、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する複数の化合物のそれぞれの適性を評価するキットを提供し、該キットは複数の化合物および表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択されるマーカーの発現を評価するための試薬を含む。
【００２０】
もう１つの具体例において、本発明は、Ｉ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与する細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは抗体を含み、該抗体は、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択されるマーカーに対応する蛋白に特異的に結合するものである。
【００２１】
もう１つの具体例において、本発明は、Ｉ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与する細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは核酸プローブを含み、該核酸プローブは、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択されるマーカーに対応する転写されたポリヌクレオチド特異的に結合するものである。
【００２２】
もう１つの具体例において、本発明は、細胞において試験化合物がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く能力を評価するための方法を提供し、該方法は、試験化合物の存在下および不存在下に細胞の別個の部分試料を維持し、次いで、各部分試料中のマーカーの発現を比較することを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択され、試験化合物の不存在下で維持された部分試料と比較して試験化合物の存在下で維持された部分試料中の有意に増加したマーカーの発現レベルが、細胞において試験化合物がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く能力を有することを示すものである。
【００２３】
もう１つの具体例において、本発明は、細胞において試験化合物がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く能力を評価するための方法を提供し、該方法は、試験化合物の存在下および不存在下に細胞の別個の部分試料を維持し、次いで、各部分試料中のマーカーの発現を比較することを特徴とし、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択され、試験化合物の不存在下で維持された部分試料と比較して試験化合物の存在下で維持された部分試料中の有意に減少したマーカーの発現レベルが、細胞において試験化合物がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く能力を有することを示すものである。
【００２４】
もう１つの具体例において、本発明は、細胞において試験化合物がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の引き金を引く能力を評価するためのキットを提供し、該キットは、細胞およびマーカーの発現を評価するための試薬を含み、マーカーは表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーを包含する群から選択されるものである。
【００２５】
もう１つの具体例において、本発明は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象の治療方法を提供し、該方法は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象の細胞に、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーから選択されるマーカーに対応する蛋白を提供することを特徴とする。好ましい具体例において、蛋白は、該蛋白をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に提供することにより提供される。
【００２６】
もう１つの具体例において、本発明は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象の治療方法を提供し、該方法は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象の細胞に、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーから選択されるマーカーに対応するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを特徴とする。
【００２７】
もう１つの具体例において、本発明は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を発症する危険性のある対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する方法を提供し、該方法は、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーから選択されるマーカーに対応する遺伝子の発現を抑制することを特徴とする。
【００２８】
もう１つの具体例において、本発明は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を発症する危険性のある対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を抑制する方法を提供し、該方法は、表１、２、４、５、６、８、９、１２および１３に示すマーカーから選択されるマーカーに対応する遺伝子の発現を促進することを特徴とする。
【００２９】
以下の詳細な説明および請求の範囲から、本発明の他の特徴および利点は明らかであろう。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的には、ＮＫＴ細胞における選択マーカーの発現と対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在との間の新たに見出された関連性に関する。これらのマーカーの発現の相対レベルは、マーカー単独および組み合わせの両方において、対象のＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状へのかかりやすさを示すものであり、そして／あるいは対象におけるＩ型糖尿病の存在または潜在的存在の診断となることがわかった。本発明は、マーカーのパネル、試料または対象中のＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在または不存在の検出方法、ならびに試料または対象中のＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の発症を予測する方法を提供する。また本発明は、本発明のマーカーを用いてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を治療することのできる方法も提供する。
【００３１】
本発明は、少なくとも一部には、非糖尿病対象と比較して糖尿病対象からの活性化ＮＫＴ細胞において異なって発現される表１〜７に示すいくつかの遺伝学的マーカーを同定することに基づく。また本発明は、少なくとも一部には、非糖尿病対象と比較して糖尿病対象からの休止ＮＫＴ細胞において異なって発現される表８に示すいくつかの遺伝学的マーカーを同定することに基づく。Ｉ型糖尿病に関して不一致である同一の双子から得た活性化糖尿病ＮＫＴ細胞対活性化糖尿病ＮＫＴ細胞における発現に関して、６８００種の既知遺伝子のパネルをスクリーニングした（実施例２参照）。罹病活性化細胞と正常活性化細胞との間で少なくとも２倍の相違を有する遺伝子を表１〜７に挙げる。罹病休止細胞と正常休止細胞との間で少なくとも２倍の相違を有する遺伝子を表８に挙げる。さらに本発明は、少なくとも一部には、ＮＫＴ細胞において発現増加した遺伝学的マーカー（表９に示す）、ＣＤ４細胞において発現増加した遺伝学的マーカー（表１０に示す）、そしてＣＤ８細胞において発現増加した遺伝学的マーカー（表１１に示す）の同定に基づく。さらに本発明は、少なくとも一部には、休止ＮＫＴ細胞よりも休止ＣＤ４細胞において発現が増加または減少した遺伝学的マーカー（表１２に示す）、および休止ＮＫＴ細胞よりも休止ＣＤ８細胞において発現が増加または減少した遺伝学的マーカー（表１３に示す）の同定に基づく。
【００３２】
活性化糖尿病ＮＫＴ細胞対活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞において６つの異なる発現パターンを観察した。表１（図３に示す各クラスター中の第１列、第１欄を示す）は、適切な休止対照細胞と比較して、活性化糖尿病ＮＫＴ細胞において発現の増加が観察された各遺伝子ならびに活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞において発現が変化しなかったかあるいはあまり増加しなかった各遺伝子を掲載する。表２（図３に示す各クラスターの第１列、第２欄を示す）は、対照休止細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞において発現が変化しなかったが、対照休止細胞と比較して活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞において発現の増加が観察された各遺伝子を掲載する。表３（図３に示す各クラスターの第１列、第３欄を示す）は、適切な休止対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞および非糖尿病ＮＫＴ細胞の両方において発現の増加が観察された各遺伝子を掲載する。表４（図３に示す各クラスターの第２列、第１欄を示す）は、休止対照細胞と比較して活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞において発現の減少が観察されたが、休止対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞において発現が変化しなかったかあるいはあまり減少しなかった各遺伝子を掲載する。表５（図３に示す各クラスターの第２列、第２欄を示す）は、休止対照細胞と比較して活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞において発現の増加が観察されたが、休止対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞において発現が減少した各遺伝子を掲載する。表６（図３に示す各クラスターの第２列、第３欄を示す）は、休止対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞において発現の減少が観察されたが、休止対照細胞と比較して非糖尿病ＮＫＴ細胞において発現が変化しなかったかあるいはあまり減少しなかった各遺伝子を掲載する。
【００３３】
ＮＫＴ、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を得て、抗−ＣＤ３で２、４、８、２４または４８時間刺激した。ＮＫＴ細胞試料において少なくとも１つの時点においてｍＲＮＡレベルの少なくとも３倍の増加を要する基準にて確認された遺伝子を表９に示す。ＣＤ４細胞試料においてすべての３系の実験に関して少なくとも１つの時点においてｍＲＮＡレベルの少なくとも３倍の増加を要する基準にて確認された遺伝子を表１０に示す。ＣＤ８細胞試料においてすべての３系の実験に関して少なくとも１つの時点においてｍＲＮＡレベルの少なくとも３倍の増加を要する基準にて確認された遺伝子を表１１に示す。
【００３４】
ＮＫＴ、ＣＤ４およびＣＤ８細胞クローンを得た。休止ＮＫＴ細胞試料と比較して休止ＣＤ４細胞試料におけるすべての３系の実験に関してｍＲＮＡレベルの少なくとも３倍の変化を要する基準にて確認された遺伝子を表１２に示す。休止ＮＫＴ細胞試料と比較して休止ＣＤ８細胞試料におけるすべての３系の実験に関してｍＲＮＡレベルの少なくとも３倍の変化を要する基準にて確認された遺伝子を表１３に示す。
【００３５】
非糖尿病ＮＫＴ細胞と比較して休止（例えば、未活性化）糖尿病細胞において異なって調節されたいくつかの遺伝子を同定した。これらの遺伝子は表８に示されており、本発明のマーカーとしても役立つ。
【００３６】
Ｉ型糖尿病に関与していることが当該分野において知られているいくつかの遺伝子があり、それらを表７に示す。これらの遺伝子は、本発明の方法、組成物およびキットに単独で使用できるのみならず、表１〜６および８〜１３に示す本発明のマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００３７】
したがって、本発明は、表１〜１３に示す遺伝子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、対応ｍＲＮＡ転写物、およびコードされるポリペプチドの、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在または発症の危険性に関するマーカーとしての使用に関する。さらにこれらのマーカーは疾病の程度および／または重篤度を関連づけることにも有用である。便利には、マーカーのパネルを配列させてキットにおける使用あるいは固体支持体上での使用に供することもできる。マーカーは、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の治療、あるいはＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の治療の有効性の評価においても有用でありうる。
【００３８】
１の態様において、本発明は、その量または活性がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在と関連性があるマーカーを提供する。本発明のマーカーは核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）であってもよく、あるいはポリペプチドであってもよい。これらのマーカーは、非糖尿病ＮＫＴ細胞と比較して、糖尿病ＮＫＴ細胞において量または活性が増加または減少する。例えば、ＩＦＮ−γ遺伝子（受託番号Ｊ００２１９）は活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞において発現レベルが増加するが、活性化糖尿病細胞においては増加せず（表２）、一方、リンホトキシン−ベータ遺伝子（「ＬＴ−β」と命名）（受託番号Ｕ８９９２２）は活性化糖尿病ＮＫＴ細胞において発現が増加したが、活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞においては増加しない（表１）。これらの遺伝子（および表１〜１３に示す他の遺伝子）に関する増加または減少したｍＲＮＡの存在、ならびにこれらの遺伝子（および表１〜１３に示す他の遺伝子）の蛋白産物の増加または減少したレベルもまた、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状のマーカーとして役立つ。好ましくは、本発明のマーカーの増加および減少したレベルは、適切な対照試料（例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっていない試料）と比較した場合に統計学的に有意な強度の増加および減少である。特に好ましい具体例において、対照試料と比較して、マーカーは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍またはそれ以上増加または減少する。同様に、当業者は、好ましい検出方法とは、得られた検出値がその方法の最低検出限界以上である方法であるという事実を認識するであろう。
【００３９】
本発明のＲＮＡまたは蛋白マーカーの相対量の測定は当該分野で知られているいずれの方法によるものであってもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； および Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ： １９９２参照）。ＲＮＡ検出のための典型的な方法は、細胞または組織試料からのＲＮＡ抽出、次いで、標的ＲＮＡに特異的な標識プローブ（例えば、相補的核酸分子）の抽出ＲＮＡへのハイブリダイゼーション、次いで、プローブの検出（例えば、ノーザンブロッティング）を包含する。蛋白検出のための典型的な方法は、細胞または組織試料からの蛋白の抽出、次いで、標的蛋白に特異的な標識プローブ（例えば、抗体）の蛋白試料へのハイブリダイゼーション、次いで、プローブの検出を包含する。標識基はラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターであってもよい。特的の蛋白および核酸の検出を、当業者によく知られた方法により、とりわけ、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、直接配列決定、または定量的ＰＣＲ（核酸分子の場合）により評価してもよい。
【００４０】
特定の具体例において、遺伝子自体（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状のマーカーとして役立ちうる。例えば、全部または一部の欠損によるある遺伝子（例えば、表１の遺伝子）に対応する核酸の不存在を疾病と関連づけてもよい。同様に、例えば、複製によるある遺伝子（例えば、表２の遺伝子）に対応する核酸の増加を疾病と関連づけてもよい。
【００４１】
本発明のマーカー遺伝子の全部または一部の存在またはコピー数の検出を、当該分野において知られたいずれの方法を用いて行なってもよい。典型的には、サザン分析によりＤＮＡまたはＲＮＡの存在および／または量を評価するこが便利であり、細胞または組織試料から全ＤＮＡを抽出し、標識プローブ（例えば、相補的ＤＮＡ分子）とハイブリダイゼーションさせ、次いで、プローブを検出する。標識基はラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターであってもよい。ＤＮＡ検出および／または定量の他の有用な方法は、当業者に知られているように、直接配列決定、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、および定量的ＰＣＲを包含する。
【００４２】
また本発明は、上記分子とは構造的に異なる（例えば、わずかに変化した核酸またはアミノ酸配列を有する）が、上記分子と同じ特性を有する核酸および蛋白分子（例えば、コードされるアミノ酸配列、または意味のないアミノ酸残基においてのみ変化した分子）を包含する。かかる分子は対立遺伝子変種を包含し、サブセクションＩにおいてさらに詳細に説明する。
【００４３】
もう１つの態様において、本発明は、その量または活性がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の重さに関係があるマーカーを提供する（例えば、実施例３参照）。これらのマーカーは、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の重さの程度と正または負の相関がある様式で糖尿病ＮＫＴ細胞において量または活性が増加または減少するものである。さらにもう１つの態様において、本発明は、その量または活性が対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の発症危険性に関係があるマーカーを提供する。これらのマーカーは、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の発症可能性と直接相関して量または活性が増加または減少するものである。
【００４４】
各マーカーは個々に考慮されるが、本発明の方法および組成物における使用のために２またはそれ以上のマーカーを組み合わせて分析の信頼性を向上させることは本発明の範囲内である。もう１つの態様において、本発明は、本発明のマーカーのパネルを提供する。好ましい具体例において、いずれか１つのパネル中のマーカーが特定の特徴を共有するようにこれらのパネルが選択される。例えば、第１のパネルの各マーカーが、非糖尿病組織と比較して糖尿病組織において量または活性の増加を示すものであってもよく、第２のパネルのマーカーが、非糖尿病組織と比較して糖尿病組織において量または活性の減少を示すものであってもよい。本発明のマーカーのパネルを表１〜１３に示す。表１〜１３に示すパネルのいずれか１つ、あるいはそれらの部分または組み合わせを用いて本発明の方法を実施しうることは当業者に明らかであろう。
【００４５】
便利には、本発明のマーカーのパネルが固体支持体上に提供されうることも当業者により理解されるであろう。例えば、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡのごときポリヌクレオチドをアレイ（例えば、ハイブリダイゼーション分析用のＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ）、樹脂（例えば、カラムクロマトグラフィー用にカラムに充填された樹脂）、またはマトリックス（例えば、ノーザンブロット分析用のニトロセルロースマトリックス）とカップリングさせてもよい。マーカーに相補的な分子の共有結合または非共有結合による固定化は、試料中の各マーカーの存在または活性の分別分析を可能にする。例えば、アレイにおいて、マーカーのパネルの各メンバーに相補的なポリヌクレオチドを個々に、アレイ上の異なる既知の位置に結合させてもよい。例えば、アレイを、対象からの血液試料から抽出されたポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせてもよい。アレイ上のいずれかの位置と試料からのポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出することができ、かくして試料中のマーカーの存在または量を確認することができる。好ましい具体例において、「ＧｅｎｅＣｈｉｐ」アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いる。同様に、対象からの蛋白試料にハイブリダイゼーションした異なるポリペプチドマーカーに特異的な固定化抗体に対してウェスタン分析を行なってもよい。
【００４６】
マーカー蛋白または核酸分子の全体を支持体に結合させる必要はなく、検出目的（例えば、ハイブリダイゼーション）に十分な長さのマーカーの一部分、例えば、長さ７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０，１００またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸であるマーカーの一部分でも検出目的に十分でありうることも当業者に明らかであろう。
【００４７】
対象のいずれの組織または細胞から本発明の核酸および蛋白を単離してもよい。好ましい具体例において、細胞はＮＫＴ細胞である。しかしながら、他の組織試料、とりわけ、体液（例えば、尿、胆汁、血清、リンパ液、唾液、粘膜および膿）を包含する試料も、本発明のマーカーを単離でき、あるいは本発明のマーカーの存在、活性および／または量を評価できるソースとして役立ちうることを当業者は理解するであろう。１またはそれ以上のマーカーを含有する組織試料自体本発明の方法において有用であり得、当業者は、かかる試料を都合良く取得、貯蔵、そして／あるいは保存する方法を認識するであろう。
【００４８】
本発明以前において、糖尿病に関連しているいくつかのマーカーが知られていた。これらのマーカーを表７に示す。これらのマーカーは本発明のマーカー本発明のマーカーに含まれない。しかしながら、都合良くは、これらのマーカーを本発明のマーカーと組み合わせて本発明の方法、パネルおよびキットに使用してもよい。
【００４９】
もう１つの態様において、本発明は、患者がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっているかどうかを評価するのに有用な抗体を産生する単離ハイブリドーマの製造方法を提供する。この方法において、既知方法を用いて本発明のマーカーに対応する蛋白を単離する（例えば、それが発現される細胞からの精製により、あるいはその蛋白をコードしている核酸のインビボまたはインビトロでの転写および翻訳により）。脊椎動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギまたはヒツジのごとき哺乳動物を、単離蛋白または蛋白フラグメントを用いて免疫する。所望により（そして好ましくは）、単離蛋白または蛋白フラグメントを用いて少なくともさらに１回脊椎動物を免疫して、その脊椎動物が該蛋白または蛋白フラグメントに対して旺盛な免疫応答を示すようにしてもよい。当該分野において知られた種々の方法を用いて、免疫された脊椎動物から脾臓細胞を単離し、不死化細胞系と融合させてハイブリドーマを得る。次いで、このようにして得られたハイブリドーマを標準的方法を用いてスクリーニングして、該蛋白または蛋白フラグメントに特異的に結合する抗体を産生する１またはそれ以上のハイブリドーマを同定する。また本発明は、この方法により得られたハイブリドーマおよびかかるハイブリドーマを用いて得られた抗体を包含する。
【００５０】
本発明は、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の診断方法、あるいはＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の発症危険性の診断方法を提供する。これらの方法は、対象から試料（例えば、膵臓細胞または血液細胞を含む試料）を単離し、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を有しないことが知られている対象からの第２の試料、あるいはＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在によっては変化しないことが知られている同じ対象中の組織からの第２の試料と比較して、試料中の本発明の１またはそれ以上のマーカーの存在、量および／または活性を検出することを含む。２つの試料中のマーカーのレベルを比較し、試験試料中の１またはそれ以上のマーカーの有意な増加または減少が対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在または危険性を示すものとなる。
【００５１】
また本発明は、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の重さを評価する方法も提供する。これらの方法は、対象から試料（例えば、膵臓細胞または血液細胞を含む試料）を単離し、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を有しないことが知られている対象からの第２の試料、あるいはＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在によっては変化しないことが知られている同じ対象中の組織からの第２の試料と比較して、試料中の本発明の１またはそれ以上のマーカーの存在、量および／または活性を検出することを含む。２つの試料中のマーカーのレベルを比較し、試験試料中の１またはそれ以上のマーカーの有意な増加または減少が対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の重さの程度と関連付けられる。
【００５２】
また本発明は、対象においてＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を治療（例えば、抑制）する方法を提供する。これらの方法は、対象から試料（例えば、膵臓細胞または血液細胞を含む試料）を単離し、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を有しないことが知られている対象からの第２の試料、あるいはＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在によっては変化しないことが知られている同じ対象中の組織からの第２の試料と比較して、試料中の本発明の１またはそれ以上のマーカーの存在、量および／または活性を検出することを含む。２つの試料中のマーカーのレベルを比較し、対照試料と比較した場合に試験試料中の１またはそれ以上のマーカーの有意な増加または減少を観察する。発現または活性が有意に減少するマーカーに関しては、対象にその発現されたマーカー蛋白を投与し、マーカー蛋白の転写レベルを増加あるいはマーカー蛋白の活性を増加させる薬剤（例えば、小型分子または他の化合物）を投与し、あるいは減少したマーカーに対応するｍＲＮＡまたはＤＮＡの導入により治療して（例えば、遺伝子治療により）、そのことにより対象におけるマーカー蛋白の活性レベルを増加させてもよい。発現または活性が有意に増加するマーカーに関しては、対象にその増加したマーカーに対するｍＲＮＡまたはＤＮＡアンチセンスを投与し（例えば、遺伝子治療により）、マーカー蛋白の転写レベルを減少あるいはマーカー蛋白の活性を減少させる薬剤（例えば、小型分子または他の化合物）を投与し、あるいは、そのマーカー蛋白に特異的な抗体を投与して、そのことにより対象におけるマーカー蛋白の活性レベルを減少させてもよい。このようにして、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状に関して対象を治療してもよい。
【００５３】
また本発明は、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の発症を防止する方法も提供する。これらの方法は、例えば、発現または活性が有意に減少するマーカー、そのマーカー蛋白の投与、あるいはその減少したマーカーに対応するｍＲＮＡまたはＤＮＡの導入を用いることにより、対象におけるマーカー蛋白のレベルを増加させるものである。発現または活性が有意に増加するマーカーに関しては、対象にその増加したマーカーに対するｍＲＮＡまたはＤＮＡアンチセンスを投与し（遺伝子治療により）、あるいは該マーカー蛋白に特異的な抗体を投与して、そのことにより対象における該マーカー蛋白のレベルを減少させる。このようにして、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状が防止される。
【００５４】
また本発明は、対象におけるＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状に対する治療または療法を評価する方法を提供する。これらの方法は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっており、治療または療法を受けている対象から試料（例えば、膵臓細胞または血液細胞を含有する試料）を単離し、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象であって当該症状に対する治療または療法を受けていない対象からの第２の試料と比較し、さらに、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状により影響を受けていない対象からの第３の試料あるいはＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在により影響されていないことが知られている同じ対象中の組織からの第３の試料と比較することを包含する。３つの試料中のマーカーのレベルを比較し、他の試料と比較して第１の試料中の１またはそれ以上のマーカーの有意な増加または減少を観察し、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の存在、存在の危険性、または重さと関連づける。Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状が対象にいおて減少または改善されたかどうかを評価することにより、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を治療する治療または療法の能力も決定される。
【００５５】
また本発明は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を治療するための医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明のマーカー蛋白および／または核酸（例えば、非糖尿病ＮＫＴ細胞に対して糖尿病ＮＫＴ細胞において量または活性が減少するマーカー）を含んでいてもよく、本明細書記載のように処方することができる。別法として、これらの組成物は、本発明のマーカー蛋白に特異的に結合する抗体および／または本発明のマーカー核酸（例えば、非糖尿病ＮＫＴ細胞に対して糖尿病ＮＫＴ細胞において量または活性が増加するマーカー）に相補的なアンチセンス核酸分子を含んでいてもよく、本明細書記載のように処方することができる。別法として、これらの組成物は、本発明の抗体でも、マーカー蛋白でもマーカー核酸でもないが、本発明のマーカー核酸またはマーカー蛋白の転写、翻訳または活性をモジュレーションする薬剤、例えば、小型分子または他の化合物を含んでいてもよく、本明細書記載のように処方することができる。
【００５６】
また本発明は、試料（例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の危険性のある対象からの試料）中の糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与する細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは抗体を含み、該抗体は表１〜１３に示すマーカーからなる群から選択されるマーカーに対応する蛋白に特異的に結合する。
【００５７】
さらに本発明は、対象（例えば、Ｉ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関する危険性のある対象）からの試料中のＩ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状に関与する細胞の存在を評価するためのキットを提供し、該キットは核酸プローブを含み、該核酸プローブは表１〜１３に示すマーカーからなる群より選択されるマーカーに対応する転写されたポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００５８】
さらに本発明は、対象においてＩ型糖尿病細胞またはＮＫＴ関連症状を抑制することに関する複数の化合物のそれぞれの適性を評価するためのキットを提供する。かかるキットは、試験されるべき複数の化合物、および表１〜１３に示すマーカーからなる群より選択されるマーカーの発現を評価するための試薬を含む。
【００５９】
上記の本発明の組成物および方法に対する標準的方法による修飾は当業者に用意に明らかであり、本発明に包含される。
【００６０】
本発明の理解を容易ならしめるために、多くの用語および語句を以下に定義する：
本明細書の用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は混用され、いずれかの長さのポリマー形態のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）またはそれらのアナログを包含する。ポリヌクレオチドはいずれの３次元構造を有していてもよく、既知または未知のいずれの機能を発揮してもよい。以下にポリヌクレオチド非限定的な例を挙げる：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離ＤＮＡ、いずれかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、ならびにプライマー。ポリヌクレオチドはメチル化ヌクレオチドのごとき修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含んでいてもよい。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾がポリマーのアッセンブリーの前または後に付加されてもよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により分断されていてもよい。さらにポリヌクレオチドはポリマー化後に、例えば標識成分との結合により修飾されてもよい。該用語はまた、２本鎖および１本鎖分枝の両方を包含する。特記しない限りあるいは必要でない限り、ポリヌクレオチドである本発明のいずれの具体例も２本鎖形態ならびに２本鎖形態を形成することが知られあるいは予想される２本の各相補的１本鎖の両方を包含する。
【００６１】
ポリヌクレオチドは下記の４種のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；ならびにポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にはグアニンのかわりにウラシル（Ｕ）の特定の配列から構成される。用語「ポリヌクレオチド配列」はポリヌクレオチド分子をアルファベット表示したものである。このアルファベット表示を集中プロセッシングユニットを有するコンピューター中のデータベースにインプットし、機能的ゲノム学および相同性検索のごときバイオインフォマティクスへの適用に使用することができる。
【００６２】
「遺伝子」は、転写され翻訳された後に特定のポリペプチドまたは蛋白をコードしうる少なくとも１個の読み取り枠を含むポリヌクレオチドを包含する。本明細書に記載されたいずれのポリヌクレオチド配列を用いて、それらが関連している遺伝子のより大きなフラグメントまたは完全長コーディング配列を同定してもよい。より大きなフラグメントの単離方法は当業者に知られており、そえらのいくつかは本明細書に記載されている。
【００６３】
「遺伝子産物」は、遺伝子が転写され翻訳される場合には、生じるアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を包含する。
【００６４】
本明細書の用語「（別の（第１の）ポリヌクレオチド）に対応するポリヌクレオチド」は、下記の関連性のいずれかにより第１のポリヌクレオチドに関連している場合の第２のポリヌクレオチドをいう：
１）第２のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドが遺伝子産物をコードしている。
２）ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはこれらのポリヌクレオチドのいずれかのフラグメントにおいて第２のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドの５’または３’側にある。例えば、第２のポリヌクレオチドは第１および第２のポリヌクレオチドを含む遺伝子のフラグメントであってもよい。第１および第２のポリヌクレオチドは、それらが蛋白または抗体のごとき遺伝子産物をコードする遺伝子の成分であるという点で関連している。しかしながら、本明細書の用語「対応」の定義に含まれるために、第２のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドを含み、あるいは重複する必要はない。例えば、第１のポリヌクレオチドは第２のポリペプチドの３’非翻訳領域のフラグメントであってもよい。第１および第２のポリヌクレオチドは遺伝子産物をコードする遺伝子のフラグメントであってもよい。第２のポリヌクレオチドは遺伝子のエクソンであってもよく、第１のポリヌクレオチドは遺伝子のイントロンであってもよい。
３）第２のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドの相補体である。
【００６５】
ポリペプチドを扱う場合に用いられる用語「プローブ」は、標的とハイブリダイゼーションすることにより興味ある試料中に存在する標的を検出するための試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを包含する。通常には、プローブは標識あるいはハイブリダイゼーション反応の前または後に標識を結合させることのできる手段を含むであろう。適当な標識は、ラジオアイソトープ、蛍光発色団、化学発光化合物、色素、および酵素などの蛋白を包含するが、これらに限らない。
【００６６】
「プライマー」は短いポリヌクレオチドを包含し、一般的には、興味ある試料中に存在する標的または「鋳型」にハイブリダイゼーションにより結合し、その後標的に相補的なポリヌクレオチドのポリマー化を促進する遊離の３’−ＯＨ基を有する。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、「上流」および「下流」プライマーからなる「プライマーのペアー」または「プライマーのセット」、ならびにＤＮＡポリメラーゼおよび典型的には耐熱性ポリメラーゼ酵素のごときポリマー化触媒を用いて複製コピーが標的ポリヌクレオチドから作成される。ＰＣＲ法は当該分野においてよく知られており、例えば、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）において教示されている。ＰＣＲまたは遺伝子クローニングのごときポリヌクレオチドの複製コピーを作成するためのすべてのプロセスを、本明細書においてはまとめて「複製」という。サザンまたはノーザンブロット分析のごときハイブリダイゼーション反応においてプライマーをプローブとして使用することもできる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９参照）。
【００６７】
用語「ｃＤＮＡｓ」は相補的ＤＮＡを包含し、すなわち逆転写酵素のごとき酵素にてｃＤＮＡに形成される、細胞または生物中に存在するｍＲＮＡを包含する。「ｃＤＮＡライブラリー」は、細胞または生物中に存在するｍＲＮＡのコレクションを包含し、それは逆転写酵素にてｃＤＮＡに変換され、次いで、「ベクター」（外来ＤＮＡ付加後に複製し続けることのできる他のＤＮＡ分子）中に挿入される。ライブラリー用の典型的なベクターは、バクテリオファージ、すなわち細菌に感染するウイルス（例えば、ラムダファージ）を包含する。次いで、興味ある特定のｃＤＮＡ（したがってｍＲＮＡ）に関してライブラリーをプローブすることができる。
【００６８】
「遺伝子デリバリービヒクル」は、１またはそれ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入しうる分子を包含する。遺伝子デリバリービヒクルの例は、リポソーム、天然ポリマーおよび合成ポリマーを包含する生体適合性ポリマー、リポ蛋白、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、ならびに細菌、ウイルスならびにバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスのごときウイルスベクター、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに種々の真核宿主および原核宿主における複製および／または発現に関して記載されている当該分野で典型的に使用されている他の組換えビヒクルである。挿入されたポリヌクレオチドの複製、遺伝子治療ならびに単なるポリペプチドおよび蛋白の発現に遺伝子デリバリービヒクルを用いてもよい。
【００６９】
「ベクター」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞中または宿主細胞間に移す自己複製核酸分子を包含する。該用語は、主に核酸分子を細胞に挿入機能を果たすべく、主に核酸の複製に機能を果たす複製ベクターならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳に機能を果たす発現ベクターを包含する。１つよりも多い上記機能を提供するベクターも包含される。
【００７０】
「宿主細胞」は、ベクターのレシピエントあるいは外来核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／または蛋白の取りこみのためのレシピエントであり得る、あるいはあり続けている個々の細胞または細胞培養物を包含する。自然発生的な、突然の、あるいは誘発された変異により、子孫は必ずしもオリジナルな親細胞と完全に同一である必要はない（形態において、あるいはゲノムまたは全ＤＮＡ相補体において）。細胞は真核細胞または原核細胞であってよく、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞、例えばネズミ、ラット、サルまたはヒト細胞を包含するが、これらに限らない。
【００７１】
用語「遺伝学的に修飾」は、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来遺伝子または核酸配列を含み、そして／あるいは発現する細胞を包含する。この用語は、細胞の内在性ヌクレオチドに対するいずれかの付加、欠失または破壊を包含する。
【００７２】
本明細書の用語「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白に翻訳されるプロセスを包含する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来のものである場合において、適切な真核宿主が選択された場合に発現はｍＲＮＡのスプライシングを包含しうる。発現に必要な調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列およびリボソーム結合用の転写開始配列を包含する。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターおよび転写開始のためのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列および開始コドンＡＵＧを含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）。同様に、真核発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ用の異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム離脱のための終止コドンを含む。かかるベクターは市販されているか、あるいは当該分野でよく知られた方法、例えば、一般的にベクター構築に関して後ほど説明する方法にて、記載された配列を集めることにより得ることができる。
【００７３】
遺伝子に用いる場合、「異なって発現され」なる用語は、ある遺伝子から転写されるｍＲＮＡの異なった生成、あるいはその遺伝子によりコードされる蛋白産物を包含する。異なって発現される遺伝子は、正常細胞または対照細胞の発現レベルと比較して、過剰発現または発現不足であってもよい。１の態様において、該用語は、対照試料において検出される発現レベルの２．５倍、好ましくは５倍または好ましくは１０倍高いまたは低い発現の相違を包含する。用語「異なって発現され」は、対照細胞においてサイレントである場合に発現され、あるいは対照細胞において発現される場合にに発現されない、細胞または組織中のヌクレオチド配列も包含する。
【００７４】
用語「ポリペプチド」は、２個またはそれ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣物からなる化合物を包含する。サブユニットはペプチド結合により連結されていてもよい。もう１つの具体例においてサブユニットは他の結合、例えば、エステル結合、エーテル結合等により連結されていてもよい。本明細書の用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤもしくはＬ光学異性体を包含する天然および／または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を包含する。３個またはそれ以上のアミノ酸のペプチドは、通常、オリゴペプチドと呼ばれる。３個またはそれ以上のアミノ酸のペプチド鎖をポリペプチドまたは蛋白という。
【００７５】
「ハイブリダイゼーション」は、１またはそれ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化されている複合体を形成する反応を包含する。水素結合はＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合により、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合により、あるいは他のいずれかの配列特異的様式で生じてもよい。複合体は２本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖を形成する３つまたはそれ以上の鎖、１つの自己ハイブリダイゼーション鎖、あるいはこれらのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、あるいはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的開裂のごときより広範なプロセスで工程を構成してもよい。
【００７６】
異なった「ストリンジェンシー」の条件下でハイブリダイゼーション反応を行なうことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、いずれか２つの核酸分子が互いにハイブリダイゼーションすることに関する困難性に関連している。ストリンジェントな条件下において、互いに少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％同一である核酸分子がハイブリダイゼーションしたままであるが、低いパーセントの同一性を有する分子はハイブリダイゼーションできないままである。非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい、非限定的な例は、約４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次いで、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらに好ましくは６５℃で０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回または２回の洗浄である。
【００７７】
２つの１本鎖ポリヌクレオチド間において逆平行配置でハイブリダイゼーションが起こる場合、反応は「アニーリング」と呼ばれ、これらのポリヌクレオチドは「相補的」であると説明される。ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖の一方と第２のポリヌクレオチドの鎖の一方の間で起こる場合には、２本鎖ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに対して「相補的」または「相同的」でありうる。「相補的」または「相同的」（１のポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に受け入れられている塩基対合則に従って互いに水素結合すると予想される対向する鎖における塩基の割合に関して定量可能である。
【００７８】
「抗体」は、抗原上に存在するエピトープに結合しうる免疫グロブリン分子を包含する。本明細書において、該用語は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のごとき免疫グロブリン分子と相互作用するもののみならず、抗−イディオタイプ抗体、変異対、フラグメント、融合蛋白、二特異性抗体、ヒト化蛋白、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の修飾体も包含する。
【００７９】
本明細書の用語「Ｉ型糖尿病」は、対象がインスリンを生成できない非伝染性疾患を包含する。Ｉ型糖尿病の徴候は体重減少、興奮性、頻尿、過度の口渇、過度の空腹感、虚弱または疲労、ならびに悪心または嘔吐を包含する。
【００８０】
本明細書の用語「ＮＫＴ細胞」は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞マーカーおよびインバリアントＴ細胞受容体の両方の発現により同定される細胞を包含する。かかる細胞はＣＤ１６１＋であり、Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞としても知られる。
【００８１】
本明細書の用語「ＮＫＴ関連症状」は、Ｉ型糖尿病と同様に、疾病の起源または進行においてＮＫＴ Ｔ細胞が役割を果たしていると考えられる疾病および症状を包含する。ＮＫＴ活性の損失に関連した疾病および症状の例は、リューマチ性関節炎および多発性硬化症を包含する。ＮＫＴ細胞の活性の過剰発現またはアップレギュレーションに関連した疾病／症状の例は重症筋無力症である。
【００８２】
本明細書の用語「糖尿病組織」または「糖尿病細胞」または「Ｉ型糖尿病組織」または「Ｉ型糖尿病細胞」は、Ｉ型糖尿病にかかっている対象からの組織または細胞を包含し、組織自体はＩ型糖尿病の総体的徴候に関連するものである。Ｉ型糖尿病組織の例は膵臓ベータ細胞（インスリン産生細胞）または血液である。「非糖尿病組織」または「非糖尿病細胞」は、Ｉ型糖尿病にかかっていない対象からの組織または細胞、あるいはＩ型糖尿病にかかっているが、組織または細胞自体は疾病の総体的徴候に関連していない、そして／あるいは疾病の存在により影響されない組織または細胞を包含する。それゆえ、「糖尿病ＮＫＴ細胞」は糖尿病対象から取られたＮＫＴ細胞である。「非糖尿病ＮＫＴ細胞」は非糖尿病対象から取られたＮＫＴ細胞である。
【００８３】
本明細書の用語「マーカー」は、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象、またはＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状に関連している細胞において、存在または存在せず、あるいは量または活性が増加または減少するポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を包含する。マーカーの量または活性の相対的な変化はＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の発症または発症危険性と相関関係がある。
【００８４】
本明細書の用語「マーカーのパネル」は一群のマーカーを包含し、その各メンバーの量または活性がＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の発症または発症危険性と相関関係を有するものである。ある具体例において、マーカーのパネルは、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状にかかっている対象またはＩ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状に関連している細胞において量または活性が増加または減少するマーカーのみを含んでいてもよい。他の具体例において、マーカーのパネルは、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の発症または発症危険性と相関関係がある特定組織タイプ中に存在するマーカーのみを含んでいてもよい。
以下のサブセクションにおいて本発明の種々の態様をさらに詳細に説明する。
【００８５】
Ｉ．単離核酸分子
本発明の１の態様は、それら自体が本発明の遺伝学的マーカーであるか（例えば、ｍＲＮＡ）、あるいは本発明のポリペプチドマーカーをコードする単離核酸分子、またはそのフラグメントに関する。本発明のもう１つの態様は、試料中の本発明のマーカーをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分である単離核酸フラグメント、ならびに本発明のマーカーをコードする核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用されるヌクレオチドフラグメントに関する。本明細書の用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを用いて得られるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログをいう。核酸分子は１本鎖または２本鎖でありうるが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００８６】
用語「単離核酸分子」は、核酸の天然ソース中に存在する他の核酸から分離されている核酸分子を包含する。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、用語「単離」は、ゲノムＤＮＡは本来的に結合している染色体から分離されている核酸分子を包含する。好ましくは、「単離」核酸分子は、当該核酸が由来した生物のゲノムＤＮＡ中の本来的に隣接している配列（すなわち、当該核酸分子の５’および３’末端に存在する配列）を含まない。例えば、種々の具体例において、単離マーカー核酸分子は、その核酸分子が由来した細胞のゲノムＤＮＡ中のその核酸分子に隣接した約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。そのうえ、組換え法により製造される場合にはｃＤＮＡ分子のごとき「単離」核酸分子は細胞性物質または培地を実質的に含まないものであってもよく、化学合成される場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【００８７】
標準的な分子生物学の方法および本明細書に示される配列の情報を用いて、本発明の核酸分子、例えば、表１〜１３に示す遺伝子の１つの核酸配列を有する核酸分子を単離することができる。表１〜１３に示す遺伝子の１つの核酸配列の全体または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング方法を用いて、本発明のマーカー遺伝子または本発明のポリペプチドマーカーをコードする核酸分子を単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されたようにして）。
【００８８】
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを鋳型として用いて、別法としてゲノムＤＮＡを鋳型として用い、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ増幅法により本発明の核酸を増幅することができる。そのようにして増幅された核酸を適当なベクター中にクローン化して、ＤＮＡ配列分析により特徴づけることができる。さらにそのうえ、標準的な合成方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて、マーカーヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド、または本発明のマーカーをコードするヌクレオチド配列を調製することができる。
【００８９】
もう１つの好ましい具体例において、本発明の単離核酸分子は、本発明のマーカーのヌクレオチド配列（例えば、表１〜１３に示す遺伝子）の相補配列である核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部分を含む。かかるヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子は、それらのヌクレオチド配列に対して十分に相補的である核酸分子であり、その結果、それらのヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションでき、そのことにより安定な２本鎖を形成する。
【００９０】
そのうえ、本発明の核酸分子は、本発明のマーカー核酸または本発明のマーカーポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用できるフラグメントのみを含んでいてもよい。典型的には、プローブ／プライマーは実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。典型的には、オリゴヌクレオチドは、本発明のマーカー核酸または本発明のマーカーポリペプチドをコードする核酸の少なくとも約７または１５個の、好ましくは約２０または２５個の、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、４００個の連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００９１】
本発明のマーカー遺伝子またはマーカーポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、本発明のマーカー遺伝子および／またはマーカーポリペプチドに対応する転写物またはゲノム配列を検出することができる。好ましい具体例において、プローブは、それに結合した標識基をさらに含み、例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターであってもよい。かかるプローブを診断試験キットの一部として用いて、本発明のマーカーポリペプチドを誤発現（例えば、過剰発現または発現不足）する細胞または組織、あるいは本発明のマーカー遺伝子のより多いまたはより少ないコピーを有する細胞または組織を同定することができる。例えば、対象からの細胞試料中のマーカーをコードする核酸のレベルを測定してもよく、マーカーポリペプチドをコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量を決定してもよく、あるいは本発明のマーカー遺伝子の変異または欠失の存在を評価してもよい。
【００９２】
さらに本発明は、遺伝暗号の縮重により、表１〜１３に示す遺伝子の核酸配列とは異なっているが、表１〜１３に示す遺伝子によりコードされるのと同じ蛋白をコードする核酸分子を包含する。
【００９３】
表１〜１３に示す遺伝子のヌクレオチド配列のほかに、表１〜１３に示す遺伝子によりコードされる蛋白のアミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型が集団（例えば、ヒト集団）中に存在してもよいことが当業者に理解されよう。表１〜１３に示す遺伝子におけるかかる遺伝学的多型が、天然の対立遺伝子変化により集団中の個体間に存在してもよい。対立遺伝子は一定の遺伝子座において別途生じる遺伝子群の１つである。さらに、ＲＮＡ発現レベルに影響するＤＮＡ多型も存在しうるものであり、それは当該遺伝子の正味の発現レベルに影響しうるものである（例えば、調節または分解に影響することにより）ことが理解されよう。本明細書の語句「対立遺伝子変種」は、一定の遺伝子座において生じるヌクレオチド配列あるいはそのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを包含する。本明細書の用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、本発明のマーカーポリペプチドをコードする読み取り枠を含む核酸分子をいう。
【００９４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において標準的なハイブリダイゼーション法により、本明細書開示のｃＤＮＡあるいはその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、表１〜１３に示す遺伝子に対する相同性に基づいて、本発明のマーカー遺伝子または本発明のマーカー蛋白をコードする遺伝子の天然の対立遺伝子変種およびホモログに対応する核酸分子を単離することができる。さらに、本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白をコードする遺伝子と同じ染色体または遺伝子座にマッピングすることにより、本発明のマーカー遺伝子の天然の対立遺伝子変種およびホモログに対応する核酸分子を単離することができる。
【００９５】
したがって、もう１つの具体例において、本発明の単離核酸分子は少なくとも１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０，２００，２５０，３００，３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり、ストリンジェントな条件下で、本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の対応する核酸分子にハイブリダイゼーションする。本明細書の用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする」は、有意に同一または相同的であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイゼーションしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件をいう。好ましくは、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％または９０％同一である配列が互いにハイブリダイゼーションしたままである条件である。かかるストリンジェントな条件は当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９５）， セクション ２， ４ および ６中に見られる。さらなるストリンジェントな条件はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）， 第 ７， ９ および １１ 章中に見られる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、６ＸＳＳＣ、４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで、０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらに好ましくは６５℃での１回またはそれ以上の回数の洗浄を包含する。好ましくは、ストリンジェントな条件下で表１〜１３に示す遺伝子の１つの配列にハイブリダイゼーションする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書の用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば、天然蛋白をコードするもの）をいう。
【００９６】
集団中に存在してもよい本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白をコードする遺伝子の天然に存在する対立遺伝子変種のほかに、当業者は、本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白をコードする遺伝子のヌクレオチド配列中に突然変異により変化を導入し、そのことによりこれらの蛋白の機能活性を変化させることなく、コードされる蛋白のアミノ酸配列における変化を導くことが可能であることをさらに認識するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を作成することができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなく蛋白の野生型配列から変化させることのできる残基であり、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要とされる。例えば、１の遺伝子の対立遺伝子またはホモログ間（例えば、異なる種の遺伝子のホモログ間）で保存されているアミノ酸残基は特に変化に適さないと推定される。
【００９７】
したがって、本発明のもう１つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含む本発明のマーカー蛋白をコードする核酸分子に関する。かかる蛋白は表１〜１３に示す遺伝子によりコードされるマーカー蛋白とはアミノ酸配列が異なっているが、やはり生物学的活性を保持している。１の具体例において、蛋白は、本発明のマーカー蛋白に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９８】
本発明のマーカー蛋白に対して相同的な蛋白をコードする単離核酸分子を、マーカー蛋白をコードする遺伝子のヌクレオチド配列中に１またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作成して、１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされる蛋白中に導入されるようにすることができる。部位特異的突然変異法およびＰＣＲによる突然変異法のごとき標準的方法により本発明の遺伝子（例えば、表１〜１３に示す遺伝子）中に変異を導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つまたはそれ以上の非必須アミノ酸残基で起こる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換する方法の１つである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義され、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。別法として、例えば飽和突然変異法により本発明の遺伝子のコーディング配列の全体または一部にランダムに変異を導入することができ、得られた変異体をスクリーニングして、活性を保持している変異体を同定することができる。突然変異後、コードされる蛋白を組換え法により発現させ、蛋白の活性を調べることができる。
【００９９】
本発明のもう１つの態様は、本発明のマーカー遺伝子およびマーカー蛋白をコードする遺伝子に対してアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は蛋白をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列、またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合しうる。アンチセンス核酸は、本発明の遺伝子のコーディング鎖全体、あるいはその蛋白にのみ相補的であり得る。１の具体例において、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスである。用語「コーディング領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。他の具体例において、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」に対してアンチセンスである。用語「非コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する５’および３’配列をいう（５’および３’非翻訳領域ともいう）。
【０１００】
本発明のアンチセンス核酸をＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対合の法則により設計することができる。アンチセンス核酸分子は、本発明の遺伝子に対応するｍＲＮＡの全コーディング領域に相補的であってよいが、より好ましくは、コーディング領域または非コーディング領域だけにアンチセンスなオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さであってよい。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および当該分野で公知の工程を使用する酵素により連結反応を使用して構築できる。例えば、天然に存するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させ、アンチセンスとセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用してアンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスヌクレオチド）を化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸の生成に使用しうる修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨウドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデシン、１−メチルグアニン、１−メチルリノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。別法として、核酸をアンチセンス方向（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、対象とする標的核酸に対してアンチセンス方向であろう。これは以下のサブセクションにさらに記載する。）にサブクローニングする発現ベクターを使用してアンチセンス核酸を生物学的に生産できる。
【０１０１】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与され、またはｉｎ ｓｉｔｕにおいて産生され、これらはハイブリッド形成し、または本発明のマーカー蛋白をコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡに結合し、そのことにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより、蛋白の発現を阻害する。ハイブリッド形成は、保存ヌクレオチド相補性により、あるいは例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重螺旋の主要な溝での特別な相互作用により、安定な二本鎖を形成することができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接注入を含む。別法として、アンチセンス核酸分子を修飾して選択された細胞を標的化し、ついで、全身投与することができる。例えば、全身投与するために、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合することにより、アンチセンス分子が選択された細胞表面で発現した受容体または抗原に結合するように特異的に修飾することができる。また、アンチセンス核酸分子を、本明細書記載のベクターを使用して細胞にデリバリーすることができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を実現させるため、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構造が好ましい。
【０１０２】
さらなる具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは通常のβ−ユニットとは対照的に鎖は互いに平行に伸長する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。また、アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチドを含んでいてもよく（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６４３１−６１４８）あるいはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログを含んでいてもよい（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５：３２７−３３０）。
【０１０３】
さらなる他の具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子はリボザイムである。リボザイムは、それに相補的な領域を有するｍＲＮＡのごとき１本鎖核酸分子を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ）（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１に記載）を用いて本発明の遺伝子（例えば、表１〜１３に示す遺伝子）のｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断することができ、そのことによりこのｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。マーカー蛋白をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムを、本明細書に開示した本発明の遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を、活性部位のヌクレオチド配列がマーカー蛋白をコードするｍＲＮＡ中で切断されるヌクレオチド配列に相補的であるように構築できる。例えば、Ｃｅｃｈ らの米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号参照。別法として、本発明の遺伝子から転写されたｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ， Ｄ． ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｊ． Ｗ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８参照。
【０１０４】
別法として、本発明の遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞中の遺伝子の転写を防ぐ三重螺旋構造を形成することにより、本発明の遺伝子（例えば、表１〜１３に示す遺伝子）の発現を阻害することができる。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ． （１９９１） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６（６）： ５６９−８４； Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ． ｅｔ ａｌ （１９９２） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６０：２７−３６； ａｎｄ Ｍａｈｅｒ， Ｌ． Ｊ． （１９９２） Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５参照。
【０１０５】
さらなる他の具体例において、本発明の核酸分子を、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾して、例えば、安定性、ハイブリッド形成、または分子の溶解性を改善することができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾してペプチド核酸を得ることができる（Ｈｙｒｕｐ， Ｂ． ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ． Ｅ． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４（１）：５−２３参照）。本明細書の用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を、擬似ペプチド骨格により置換し、４つの天然ヌクレオベースだけが維持された核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物を意味する。ＰＮＡの天然の骨格は、低イオン強度の環境下でＤＮＡおよびＲＮＡに特異的なハイブリッド形成を可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的な、Ｈｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ｓｕｐｒａ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１４６７０−６７５に記載のように固相ペプチド合成プロトコルを使用して実行できる。
【０１０６】
ＰＮＡを治療および診断用に使用できる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳の停止を誘発し、または複製を阻害することにより、アンチセンスまたは抗原作用剤として、遺伝子発現の配列特異的なモジュレーションに使用可能である。また、本発明の核酸分子（例えば、表１〜１３に示す遺伝子）のＰＮＡは、遺伝子中の単塩基対突然変異体の分析に（例えば、ＰＮＡ−指向性ＰＣＲクランピング）、他の酵素と組み合わせて使用される場合には「人工制限酵素」として（例えば、上記Ｓ１ヌクレアーゼ（上で引用したＨｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ （１９９６）））、あるいはＤＮＡ配列またはハイブリッド形成用のプローブまたはプライマーとして（上で引用したＨｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ （１９９６）； Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ｓｕｐｒａ）使用可能である。
【０１０７】
他の具体例において、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに付着させることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソームまたは当業者に公知の薬剤デリバリーの他の方法により、ＰＮＡを修飾することができる（例えば、安定性または細胞摂取を高めるために）。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができる本発明の核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを得ることができる。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）に、ＤＮＡ部分との相互作用を可能ならしめ、その一方で、ＰＮＡ部分は、高い結合アフィニティーおよび特異性を提供するであろう。塩基スタッキング、ヌクレオベース間の結合の数、および方向に関して選択される適当な長さのリンカーを使用してＰＮＡ−ＤＮＡキメラを連結することができる（Ｈｙｒｕｐ Ｂ． ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ｓｕｐｒａ）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Ｈｙｒｕｐ Ｂ． ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９６） ｓｕｐｒａ および Ｆｉｎｎ Ｐ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４（１７）：３３５７−６３に記載のように行なうことができる。例えば、標準的なホスホラミダイトカップリング化学物質を使用して、固体支持体上でＤＮＡ鎖を合成することができる。修飾ヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイト）を、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間のリンカーとして使用できる（Ｍａｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １７：５９７３−８８）。ついで、キメラ分子を生成する段階的な方法で、ＰＮＡモノマーを５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントとカップリングさせる（上記Ｆｉｎｎ Ｐ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９６））。別法として、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いてキメラ分子を合成することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ， Ｋ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ５：１１１９−１１１２４）。
【０１０８】
他の具体例において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのごとき他の付加基（例えば、インビボでの宿主細胞受容体の標的化のために）、あるいは細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６； Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：６４８−６５２； ＰＣＴ出願ＷＯ８８／０９８１０参照）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０１３４）を越えた輸送を容易ならしめる作用剤を包含する。さらに、オリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成により誘発される開裂剤（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６参照）または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ （１９８８） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９参照）を用いて修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリッド形成により誘発される架橋剤、輸送剤またはハイブリッド形成により誘発される開裂剤）に結合させることができる。最後に、オリゴヌクレオチドを検出可能に標識して、別の試薬（例えば、酵素標識の基質）の添加により標識を検出してもよく、あるいはヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより即座に標識（例えば、放射セ正標識または蛍光標識（例えば、米国特許第５８７６９３０号に記載された分子ビーコン））を検出可能としてもよい。
【０１０９】
ＩＩ．単離蛋白および抗体
本発明の１の態様は、単離されたマーカー蛋白、およびその生物学的に活性のある部分、ならびに抗−マーカー蛋白抗体を生じさせる免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントに関する。１の具体例において、ネイティブなマーカー蛋白は、標準的な蛋白精製技術を用いた適当な精製計画により細胞または組織供給源から単離され得る。別の具体例において、マーカー蛋白は、組換えＤＮＡ技術により製造される。組換え発現に代わるものとして、標準的なペプチド合成法を用いてマーカー蛋白またはポリペプチドを化学合成することができる。
【０１１０】
「単離」または「精製」された蛋白またはその生物学的に活性のある蛋白は、マーカー蛋白が由来した細胞または組織源由来の細胞性物質または他の混入蛋白を実質的に含まず、あるいは化学合成の場合には化学前駆体または他の化学試薬を含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、マーカー蛋白が単離されあるいは組み換え法により製造される細胞の細胞性成分から分離されているマーカー蛋白の調合物を意味する。１の具体例において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量で）未満の非マーカー蛋白（本明細書において「混入蛋白」ともいう）、より好ましくは約２０％の非マーカー蛋白、さらに好ましくは約１０％未満の非マーカー蛋白、最も好ましくは約５％未満の非マーカー蛋白を有するマーカー蛋白の調合物を包含する。また、マーカー蛋白またはその生物学的に活性のある部分が組み換え法により製造される場合、好ましくは、それは培地を含まないものであり、すなわち、培地が蛋白調合物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【０１１１】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、蛋白合成に使用される化学前駆体または化学物質から蛋白が分離されているマーカー蛋白の調合物を包含する。１の具体例において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は約３０％（乾燥重量で）未満の化学前駆体または非マーカー蛋白化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学前駆体または非マーカー蛋白化学物質、さらに好ましくは約１０％未満の化学前駆体または非マーカー蛋白化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非マーカー蛋白化学物質を有するマーカー蛋白調合物を包含する。
【０１１２】
本明細書の用語、マーカー蛋白の「生物学的に活性のある部分」は、マーカー蛋白のアミノ酸配列に対して十分に相同的、あるいはそれに由来するアミノ酸配列を含むマーカー蛋白のフラグメントであって、完全長のマーカー蛋白よりも少ないアミノ酸を含むフラグメントを包含する。典型的には、生物学的に活性のある部分は、マーカー蛋白の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。マーカー蛋白の生物学的に活性のある部分は、例えば、１０、２５、５０、１００、２００個またはそれ以上のアミノ酸の長さである。マーカー蛋白の生物学的に活性のある部分を、マーカー蛋白により媒介される活性をモジュレーションする作用剤の開発のための標的として使用することができる。
【０１１３】
好ましい具体例において、マーカー蛋白は表１〜１３に示す遺伝子によりコードされる。他の具体例において、マーカー蛋白は表１〜１３に示す遺伝子によりコードされるマーカー蛋白に対して実質的に相同的であり、マーカー蛋白の機能活性を保持しているが、上のサブセクションＩで詳述したように、自然発生的な対立遺伝子変化または突然変異によりアミノ酸配列が異なるものである。したがって、もう１つの具体例において、マーカー蛋白は、表１〜１３に示す遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０１１４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを測定するため、最適な比較を目的として配列を並置する（例、ギャップは、最適な並置のために第１および第２アミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、非相同性配列は比較目的に関しては無視され得る）。好ましい態様において、比較目的用に並置させたレファレンス配列の長さは、レファレンス配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である。次いで、対応する位置にある残基を比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応位置において同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、分子はその位置において同一である（本明細書で使用されているアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と均等内容である）。２つの配列の最適並置比較を行なうために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮すると、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列が共有する同一位置の数の関数である。
【０１１５】
数学的アルゴリズムを用いて２つの配列間の配列の比較および同一性％の決定を行なうことができる。好ましい具体例において、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐからオンラインで利用可能）中のＧＡＰプログラム中に含まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３ （１９７０））を用い、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重量１、２、３、４、５、または６として、２つのアミノ酸配列間の同一性％が決定される。さらにもう１つの好ましい具体例において、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐからオンラインで利用可能）中のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ギャップ重量４０、５０、６０、７０、または８０および長さ重量１、２、３、４、５、または６として、２つのヌクレオチド配列間の同一性％が決定される。もう１つの具体例において、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）中に含まれるＭｅｙｅｒｓ， Ｅ． ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ， Ｗ．のアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７ （１９８８））を用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長さペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性％が決定される。
【０１１６】
さらに本発明の核酸および蛋白配列を「クエリー（ｑｕｅｒｙ）配列」として使用することにより、パブリックデータベースに対する検索が遂行され、例えば他のファミリー構成員または関連配列が同定され得る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて遂行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で遂行することにより、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴ蛋白検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で遂行することにより、本発明のマーカー蛋白分子と相同的なアミノ酸配列が得られる。比較目的用のギャップトアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２記載の要領でギャップトＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップトＢＬＡＳＴプログラムを用いるとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。
【０１１７】
本発明はまた、キメラまたは融合マーカー蛋白を提供する。本明細書の用語マーカー「キメラ蛋白」または「融合蛋白」は、非マーカー蛋白に作動可能に結合されたマーカー蛋白を含む。「マーカーポリペプチド」は、表１〜１３に示す遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含し、「非マーカーポリペプチド」は、マーカー蛋白と実質的に相同的ではない蛋白、例えばマーカー蛋白とは異なり、同一または異なる生物に由来する蛋白に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。マーカー融合蛋白内では、ポリペプチドはマーカー蛋白の全部または一部に対応し得る。好ましい態様において、マーカー融合蛋白は、マーカー蛋白の少なくとも１つの生物学的活性を有する部分を含む。融合蛋白内で「作動可能に結合された」の語は、マーカーポリペプチドおよび非マーカーポリペプチドが互いにインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合されていることを示すものとする。非マーカーポリペプチドをマーカーポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合させることができる。
【０１１８】
例えば、１の具体例において、融合蛋白は、マーカー配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合したＧＳＴ−マーカー融合蛋白である。かかる融合蛋白は、組換えマーカー蛋白の精製を容易ならしめることができる。
【０１１９】
もう１つの具体例において、融合蛋白は、異種シグナル配列をＮ末端に含むマーカー蛋白である。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、異種シグナル配列を使用することによりマーカー蛋白の発現および／または分泌を増加させることができる。
【０１２０】
本明細書にて説明するように、本発明のマーカー融合蛋白を医薬組成物中に含有させ、インビボで対象に投与することができる。マーカー融合蛋白を用いてマーカー蛋白基質の生体利用性に影響を及ぼしてもよい。マーカー融合蛋白の使用は、例えば、（ｉ）マーカー蛋白をコードする遺伝子の異常な修飾または変異；（ｉｉ）マーカー蛋白をコードする遺伝子の誤調節；および（ｉｉｉ）マーカー蛋白の異常な翻訳後修飾により引き起こされる疾病（例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状）の処置に治療的に有用でありうる。
【０１２１】
そのうえ、本発明のマーカー融合蛋白を免疫原として用いて対象中に抗−マーカー蛋白抗体を産生させ、マーカー蛋白リガンドを精製し、スクリーニングアッセイにおいてマーカー蛋白とマーカー蛋白基質との相互作用を阻害する分子を同定することができる。
【０１２２】
好ましくは、本発明のマーカーキメラまたは融合蛋白は標準的な組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントが、慣用的技術によりインフレームにて一緒に連結され、例えば平滑末端またはスタガー末端を用いて連結され、制限酵素消化により適当な末端が提供され、適当な場合には付着末端がフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）され、アルカリ性ホスファターゼ処理により望ましくない連結が回避され、酵素により連結される。別の態様において、融合遺伝子を自動ＤＮＡ合成装置を含む慣用的技術により合成することができる。別法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、アンカープライマーを用いて実施してもよく、これにより２つの連続遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせ、次いで、アニーリング、再増幅を行なってキメラ遺伝子配列を得ることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ：１９９２参照）。さらに、既に融合部分（例、ＧＳＴポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。マーカー蛋白をコードする核酸を、融合部分がインフレームでマーカー蛋白に融合されるように、かかる発現ベクター中へクローン化することができる。
【０１２３】
シグナル配列を用いて、目的とする分泌蛋白または他の蛋白の分泌および単離を容易ならしめることができる。典型的には、シグナル配列は、一般的に１またはそれ以上の開裂イベントにおいて分泌途中の成熟蛋白から開裂される疎水性アミノ酸のコアにより特徴づけられる。かかるシグナルペプチドは、分泌経路を通過する場合に成熟蛋白からのシグナル配列の開裂を可能にするプロセッシング部位を含む。よって、本発明は、シグナル配列を有する記載されたポリペプチド、ならびにシグナル配列が蛋白分解的に開裂されたポリペプチド（すなわち、開裂生成物）に関する。１の具体例において、シグナル配列をコードする核酸配列を発現ベクター中で目的蛋白、例えば通常は分泌されないかあるいは単離が困難な蛋白に作動可能に連結してすることができる。シグナル配列は、例えば発現ベクターが導入された真核宿主からの蛋白の分泌を指令し、その後あるいは同時にシグナル配列が開裂される。その後、当該分野で認識されている方法により蛋白を細胞外培地から容易に精製することができる。別法として、ＧＳＴドメインのごとき精製容易化配列を用いてシグナル配列を目的蛋白に連結することができる。
【０１２４】
また本発明は、マーカー蛋白のアゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストのいずれかとして機能するマーカー蛋白の変種に関する。突然変異法、例えば、マーカー蛋白の別個の点突然変異または末端切断によりマーカー蛋白の変種を得ることができる。マーカー蛋白のアゴニストは、天然に存在する形態のマーカー蛋白と実質的に同じ生物学的活性またはその一部の活性を保持しうる。マーカー蛋白のアンタゴニストは、例えば、マーカー蛋白の活性を競争的にモジュレーションすることにより、天然に存在する形態のマーカー蛋白の１またはそれ以上の活性を阻害しうる。かくして、機能が限定された変種で処理することにより、特定の生物学的効果が誘発されうる。１の具体例において、天然に存在する形態のポリペプチドの生物学的活性の一部を有する変種での対象の治療は、天然に存在する形態のマーカー蛋白での治療に比べて対象における副作用が少ない。
【０１２５】
マーカー蛋白アゴニスト（模倣物）としてまたはマーカー蛋白アンタゴニストとして機能するマーカー蛋白の変種を、マーカー蛋白アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてマーカー蛋白の突然変異体、例えば末端切断突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。１の具体例において、マーカー蛋白変種の雑多な（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリーは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異導入により生成され、雑多な遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的に連結させることにより、マーカー蛋白変種の雑多なライブラリーを製造することができ、その場合、潜在的なマーカー蛋白配列の縮重セットは、個々のポリペプチドとして発現可能であり、あるいは別法として、マーカー蛋白配列のセットを含むより大きな融合蛋白のセットとして（例えば、ファージディスプレイ用に）発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なマーカー蛋白変種のライブラリーを製造するのに使用できる様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置で行なうことができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターに結合することができる。遺伝子の縮重セットの使用により、１の混合物中に、潜在的なマーカー蛋白配列の所望セットをコードする配列がすべて提供され得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６、Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７参照）。
【０１２６】
さらに、本発明のマーカー蛋白に対応する蛋白コーディング配列のフラグメントのライブラリーを用いて、マーカー蛋白フラグメントの雑多な集団を得ることにより、マーカー蛋白の変種をスクリーニングし、次いで、選択することができる。１の具体例において、ニッキングが１分子につき約１回だけ起こる条件下においてマーカー蛋白をコードする配列の２本鎖ＰＣＲフラグメントを処理し、２本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生させて、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含みうる２本鎖ＤＮＡを得て、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により再形成された２本鎖から１本鎖部分を除去し、次いで、得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより、コーディング配列フラグメントのライブラリーを得ることができる。この方法により、様々なサイズのマーカー蛋白のＮ−末端、Ｃ−末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【０１２７】
点突然変異または末端切断により製造されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ならびに選択された特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該分野において知られている。高処理量分析が可能な、大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広範に使用されている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターへクローニングし、生成したベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換し、そして目的とする活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。再帰アンサンブル突然変異導入法（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ＲＥＭ）という、ライブラリーにおける機能性突然変異体の頻度を高める新規技術を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用することにより、マーカー変異体を同定することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５、Ｄｅｌａｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６（３）：３２７−３３１）。
【０１２８】
単離されたマーカー蛋白、またはその一部もしくはフラグメント（またはかかるポリペプチドをコードする核酸分子）を免疫原として使用して、標準的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造技術を用いることによりマーカー蛋白に結合する抗体を得ることができる。完全長マーカー蛋白を使用することもでき、あるいはまた、本発明は、免疫原として使用されるこれらの蛋白の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。マーカー蛋白の抗原性ペプチドは、表１〜１３に示す遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、マーカー蛋白のエピトープを含むことから、ペプチドに対して産生した抗体はマーカー蛋白との特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。
【０１２９】
抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、蛋白表面に位置するマーカー蛋白の領域、例えば親水性領域、ならびに高抗原性を有する領域である。
【０１３０】
典型的には、マーカー蛋白免疫原を用いて、適当な対象（例、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）を免疫原で免疫することにより抗体が産生される。適当な免疫原性調合物は、例えば、組み換え発現マーカー蛋白または化学合成マーカーポリペプチドを含み得る。さらにこの調合物は、アジュバント、例えばフロイント完全または不完全アジュバント、または同様の免疫刺激剤を含み得る。免疫原性マーカー蛋白調合物で適当な対象を免疫化すると、ポリクローナル抗−マーカー蛋白抗体応答が誘導される。
【０１３１】
したがって、本発明のもう１つの態様は抗−マーカー蛋白抗体に関する。本明細書の用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、マーカー蛋白のごとき抗原と特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部を含む分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分の例は、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントであり、それらはペプシンのごとき酵素で抗体を処理することにより得ることができる。本発明は、マーカー蛋白に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書の用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、特定のエピトープと免疫反応しうるたった１種の抗原結合部位を含む抗体分子の集団をいう。よって、典型的には、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する特定のマーカー蛋白に対する単一の結合アフィニティーを示す。
【０１３２】
ポリクローナル抗−マーカー蛋白抗体を、適当な対象をマーカー蛋白免疫原で免疫化することにより上記要領で製造することができる。免疫化対象における抗−マーカー蛋白抗体力価を、標準的技術、例えば固定化マーカー蛋白を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により時間経過とともにモニターすることができる。所望ならば、マーカー蛋白に対して指向した抗体分子を、哺乳類から（例えば、血液から）単離し、さらに公知技術、例えばプロテインＡクロマトグラフィーにより精製すると、ＩｇＧフラクションが得られる。免疫後適当な時点で、例えば抗−マーカー蛋白抗体力価が最高であるときに、抗体産生細胞を対象から得ることができ、標準的技術、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７により最初に報告されたハイブリドーマ技術（また、Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６、Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５５：４９８０−８３、Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７６：２９２７−３１、および Ｙｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９−７５も参照）、さらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、アラン Ｒ．リス、インコーポレイテッド、７７−９６頁）またはトリオーマ技術によるモノクローナル抗体の製造に使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマ製造技術は公知である（一般的には、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、プレナム・パブリッシング・コーポレーション、ニューヨーク、ニューヨーク（１９８０）、Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２、Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６参照）。簡単に説明すると、不死細胞系（典型的にはミエローマ）を、上記要領でマーカー蛋白免疫原で免疫した哺乳類由来のリンパ球（典型的には脾臓細胞）に融合させ、生成したハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、本発明のマーカー蛋白に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０１３３】
リンパ球および不死化細胞系の融合に用いられる多くの公知プロトコルのいずれかを、抗−マーカー蛋白モノクローナル抗体産生目的に適用することができる（例えば、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２、Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）前出、Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）前出、Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）前出参照）。さらに、当業者にとって、同様に有用である上記方法の多くの変法があることは明らかである。典型的には、不死細胞系（例、骨髄種細胞系）は、リンパ球と同じ種の哺乳類に由来する。例えば、ネズミハイブリドーマは、本発明の免疫原性調合物により免疫化したマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞系と融合させることにより製造され得る。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性を示すマウスミエローマ細胞系である。若干の骨髄種細胞系を標準的技術による融合相手として使用することができ、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄種系がある。これらの骨髄種系は、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄種細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾臓細胞に融合させる。次いで、融合から生成したハイブリドーマ細胞はＨＡＴ培地を用いて選択し、この場合、非融合および非生産的融合骨髄種細胞は死滅する（非融合脾臓細胞は、形質転換されていないため数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、マーカー蛋白と結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
【０１３４】
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ製造のための別法として、マーカー蛋白を伴う組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例、抗体ファージディスプレーライブラリー）のスクリーニングによって、マーカー蛋白と結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより、モノクローナル抗−マーカー蛋白抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレーライブラリーを作成し、スクリーニングするキットは市販されている（例えば、ファルマシア・レコンビナント・ファージ・アンチボディー・システム、カタログ番号２７−９４００−０１、およびストラタジーンＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージ・ディスプレー・キット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作成およびスクリーニングにおいて特に使用しやすい方法および試薬の例は、例えばＬａｄｎｅｒら、米国特許第５２２３４０９号、Ｋａｎｇら、国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９、Ｄｏｗｅｒら、国際公開番号ＷＯ９１／１７２７１、Ｗｉｎｔｅｒら、国際公開ＷＯ９２／２０７９１、Ｍａｒｋｌａｎｄら、国際公開番号ＷＯ９２／１５６７９、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、国際公開ＷＯ９３／０１２８８、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７、Ｇａｒｒａｒｄら、国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０、Ｌａｄｎｅｒら、国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９、Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３６９−１３７２、Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６、Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８、Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３５７６−３５８０、Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３７３−１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７、Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７９７８−７９８２、および ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４において見出され得る。
【０１３５】
さらに、組換え抗−マーカー蛋白抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含み、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて製造され得るものであり、本発明の範囲内に包含される。上記キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第１７１４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４８１６５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５０２３号、Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３、Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３、Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６、Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８４：２１４−２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５、Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９、およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、Ｗｉｎｔｅｒ 米国特許５２２５５３９、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載された方法を用いることにより、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により製造され得る。
【０１３６】
完全には、ヒト抗体はヒト対象の治療的処置に特に好ましい。内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いてかかる抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスを通常の方法で選択抗原、例えば、本発明のマーカーに対応するポリペプチドの全体または一部分にて免疫する。慣用的なハイブリドーマ法を用いて抗原に対して指向されたモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスにより担持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化中に再配列し、その後クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。かくして、かかる方法を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を得ることができる。ヒト抗体産生に関するこの方法を概観するには、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕａｚａｒ （１９９５） Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体の産生ならびにかかる抗体の製造プロトコルに関するこの方法についての詳しい議論は、米国特許第５６２５１２６号；米国特許第５６３３４２５号；米国特許第５５６９８２５号；米国特許第５６６１０１６号；および米国特許第５５４５８０６号参照。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ． （Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， ＣＡ）のごとき会社は、上記方法と類似の方法を用いて選択抗原に対して指向されたヒト抗体を提供することを引きうけることができる。
【０１３７】
完全には、「ガイデッドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる方法を用いて選択エピトープを認識するヒト抗体を得ることができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、ネズミ抗体を用いて、完全には同じエピトープを認識するヒト抗体の選択を導く（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【０１３８】
抗−マーカー蛋白抗体（例、モノクローナル抗体）を用いて、標準的技術、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によりマーカー蛋白を単離することができる。抗−マーカー蛋白抗体により、細胞からの天然マーカー蛋白、および宿主細胞において発現される遺伝的組換えにより製造されるマーカー蛋白の精製は容易になり得る。そのうえ、抗−マーカー蛋白抗体を用いて、マーカー蛋白を検出（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）することができる。抗−マーカー蛋白抗体を臨床試験手順の一部として診断的に用いて、組織中の蛋白レベルをモニターすることができ、例えば、特定の治療の有効性を調べることができる。検出可能な物質に抗体をカップリング（すなわち、物理的結合）させることにより検出は容易になり得る。従って、１の具体例において、本発明の抗−マーカー蛋白抗体は、検出可能な物質により標識される。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質がある。適当な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼがあり、適当な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがあり、適当な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンがあり、ルミネセンス物質の例にはルミノールがあり、そして適当な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈがある。
【０１３９】
ＩＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう１つの態様は、本発明のマーカー蛋白（またはその一部分）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。ここで使用されている「ベクター」の語は、それに結合されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を包含する。ベクターの１のタイプは「プラスミド」であり、付加的ＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを包含する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、その場合、付加的ＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製し得る（例えば、細菌性複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ組込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に結合されている遺伝子の発現を指令し得る。上記ベクターは、ここでは「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが多い。本明細書の場合、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから、「プラスミド」および「ベクター」は混用され得る。しかしながら、本発明は、かかる他の形態の発現ベクターであって同様の機能を果たすもの、例えばウイルスベクター（例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を包含する。
【０１４０】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基いて選択された１つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味するもので、調節配列は、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結されている」は、興味の対象であるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、またはベクターが宿主細胞へ導入されたとき宿主細胞における）発現を可能にする状態で調節配列（複数も可）に連結されていることを意味する。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含する。上記調節配列は、例えば Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指令するものおよびある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例、組織特異的調節配列）がある。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、目的蛋白の発現レベルなどの因子により異なり得ることを認識するはずである。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載されたように（例えば、マーカー蛋白、変異形態のマーｋ−蛋白、融合蛋白など）、核酸によりコードされる融合蛋白またはペプチドを包含する蛋白またはペプチドを得ることができる。
【０１４１】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞におけるマーカー蛋白の発現を目的として設計され得る。例えば、マーカー蛋白は、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳類細胞において発現され得る。適当な宿主細胞については、前出のＧｏｅｄｄｅｌ（１９９０）でさらに検討されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳され得る。
【０１４２】
原核生物における蛋白の発現を、融合または非融合蛋白の発現を指令する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターによりエシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において行なうことが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされた蛋白に若干のアミノ酸を、通常には組換え蛋白のアミノ末端に付加する。上記融合ベクターは、典型的には、１）組換え蛋白の発現を高める、２）組換え蛋白の溶解性を高める、および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換え蛋白の精製で有用である、といった３つの目的に適うものである。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、蛋白分解性開裂部位が融合部分および組換え蛋白の接合点に導入されることにより、融合蛋白の精製後に組換え蛋白を融合部分から分離することが可能となる。上記酵素およびそれらの同族認識配列には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼがある。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（ファルマシア・バイオテク・インコーポレイテッド、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．および Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニューイングランド・バイオラブズ、ベヴァリー、マサチューセッツ）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュージャージー）があり、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白またはプロテインＡを標的組換え蛋白に融合させる。
【０１４３】
精製融合蛋白は、マーカー活性アッセイ（例、下記で詳述されている直接アッセイまたは競争的アッセイ）に、あるいは例えばマーカー蛋白に特異的な抗体の生成に使用されうる。
【０１４４】
適当な誘導性非融合エシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９）がある。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）が介在するＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下Ｔ７ｇｎ１遺伝子をもつ内在プロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１４５】
エシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え蛋白発現を最大化させる１の戦略は、蛋白分解的に組換え蛋白を開裂する能力が損なわれた宿主細菌において蛋白を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：１１９−１２８）。別の戦略は、発現ベクターへ挿入される核酸の核酸配列を改変することにより、各アミノ酸に関する個々のコドンが優先的にエシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で利用されるものとなるようにする方法である（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列の上記改変を、標準的なＤＮＡ合成技術により行なうことができる。
【０１４６】
もう１つの具体例において、マーカー蛋白発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現するベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア）およびｐｉｃＺ（インビトロゲン・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア）がある。
【０１４７】
別法として、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において本発明のマーカー蛋白を発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）における蛋白発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．および Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）がある。
【０１４８】
さらに別の具体例において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）がある。哺乳類細胞で使用する場合には、発現ベクターの制御機能がウイルス調節エレメントにより提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から誘導される。原核生物および真核生物の両細胞に関する他の適当な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）の１６および１７章参照。
【０１４９】
もう１つの具体例において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を指令し得る（例、組織特異的調節エレメントは核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当業界では公知である。適当な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅおよび Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体プロモーター（Ｗｉｎｏｔｏおよび Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９−７４０、Ｑｕｅｅｎおよび Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例、ニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅおよび Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例、乳漿プロモーター、米国特許第４８７３３１６号およびヨーロッパ出願公開第２６４１６６号）がある。また、発達的調節（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）プロモーター、例えばネズミホックス（ｈｏｘ）プロモーター（Ｋｅｓｓｅｌおよび Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓおよび Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。
【０１５０】
さらに本発明は、アンチセンス方向で発現ベクター中にクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、本発明の遺伝子（例えば、表１〜１３に示す遺伝子）に対応するｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする形で調節配列に作動可能に結合されている。アンチセンス方向でクローン化された核酸に作動可能に結合された調節配列であって、様々な細胞タイプにおけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指令するもの、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、あるいはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を指令する調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で製造される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルス形態であってもよく、その活性はベクターが導入されている細胞タイプにより決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節を検討したものについては、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら（１９８６）“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）を参照。
【０１５１】
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸分子、例えば、組換え発現ベクター中の表１〜１３に示される遺伝子、あるいは宿主細胞のゲノムの特異部位中に相同組換えが起こるようにする配列を含む本発明の核酸分子が導入されている宿主細胞に関するものである。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書で混用される。上記の語は特定対象細胞だけでなくかかる細胞の子孫または潜在的子孫も包含するものと理解すべきである。突然変異または環境的影響のためにある種の修飾が後続の世代で行われ得るため、上記子孫は事実上親細胞と同一ではないかもしれないが、依然としてここで使用されている用語の範囲内に包含される。
【０１５２】
宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。例えば、本発明のマーカー蛋白は、細菌細胞、例えばエシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適当な宿主細胞も当業者に公知である。
【０１５３】
ベクターＤＮＡは、慣用的形質転換またはトランスフェクション技術により原核生物または真核生物細胞中に導入され得る。ここで使用されている「形質転換」および「トランスフェクション」の語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション（脂質小胞を介する遺伝子導入）またはエレクトロポレーションを含め、外来核酸（例、ＤＮＡ）を宿主細胞へ導入するための当該分野で認識されている様々な技術を包含する。宿主細胞の適当な形質転換またはトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９）、および他の研究室マニュアルに見出され得る。
【０１５４】
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションを行うために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小フラクションのみが外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込まれうることが知られている。これらの成分を同定および選択するために、選択マーカー（例、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、一般的に興味の対象である遺伝子と一緒に宿主細胞へ導入する。好ましい選択マーカーには、薬剤、例えばＧ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートに対する耐性を付与するものがある。選択マーカーをコードする核酸を、マーカー蛋白をコードするものと同じベクターで宿主細胞へ導入することができ、あるいは別々のベクターで導入することができる。導入された核酸により安定してトランスフェクションされた細胞を薬剤選別により同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子が組込まれた細胞は生き残り、他の細胞は死滅する）。
【０１５５】
本発明の宿主細胞、例えば培養された原核生物または真核生物宿主細胞を、マーカー蛋白の製造（すなわち発現）に使用することができる。従って、さらに本発明は、本発明の宿主細胞を用いたマーカー蛋白の製造方法を提供する。１の具体例において、本発明のマーカー蛋白が製造されるように、本発明の宿主細胞（マーカー蛋白をコードする組換え発現ベクターが導入された）を適当な培養培地で培養することを含む。別の具体例において、前記方法はさらに、培地または宿主細胞からのマーカー蛋白の単離を含む。
【０１５６】
本発明の宿主細胞を用いて非ヒトトランスジェニック動物を製造することもできる。例えば、１の具体例において、宿主細胞は、マーカー蛋白コーディング配列が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、上記宿主細胞を用いることにより、本発明のマーカー蛋白をコードする外来配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物あるいは本発明のマーカー蛋白をコードする内在配列が改変された相同組換え動物が製造され得る。上記動物は、マーカー蛋白の機能および／または活性を研究ならびにマーカー蛋白活性のモジュレーターを同定および／または評価するのに有用である。ここで使用されている「トランスジェニック動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはげっ歯動物、例えばラットまたはマウスであり、この場合動物の細胞の１個またはそれ以上が導入遺伝子（トランスジーン）を含んでいる。トランスジェニック動物の他の例には、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニワトリ、両生類などがある。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組込まれており、成熟動物のゲノムに残存している外来ＤＮＡであり、それによってトランスジェニック動物の１種またはそれ以上の細胞タイプまたは組織におけるコードされた遺伝子産物の発現が指令される。ここで使用されている「相同組換え動物」は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスであり、この場合、本発明の内在遺伝子（表１〜１３に示す遺伝子）は、動物の発生前に、動物の細胞、例えば動物の胚性細胞へ導入された外来ＤＮＡ分子と内在遺伝子との間の相同組換えにより改変されている。
【０１５７】
トランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により、マーカーをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核へ導入し、偽妊娠した雌フォスター（ｆｏｓｔｅｒ）動物において卵母細胞を発達させることによりトランスジェニック動物を製造することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを導入遺伝子に含ませることにより、導入遺伝子の発現効率を高ることができる。組織特異的調節配列（複数も可）は、マーカー蛋白導入遺伝子に作動可能に連結されることにより、特定細胞に対してマーカー蛋白の発現を指令し得る。胚マニピュレーションおよびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物、特に例えばマウスといった動物の製造方法は、当業界では既に慣用的なものになっており、例えば、両方ともＬｅｄｅｒらによる米国特許第４７３６８６６号および同４８７０００９号、Ｗａｇｎｅｒらによる米国特許第４８７３１９１号および Ｈｏｇａｎ，Ｂ． Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８６）で報告されている。他のトランスジェニック動物の製造には類似方法も使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおける本発明の導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞における本発明の遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現に基いて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物を用いることにより、導入遺伝子を有する動物が追加的に産み出され得る。そのうえ、マーカー蛋白をコードする導入遺伝子を担持するトランスジェニック動物により、他の導入遺伝子を担持する他のトランスジェニック動物を育種することができる。
【０１５８】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加または置換が導入されていて、そのことにより当該遺伝子が変化し、例えば、機能的に破壊されている本発明の遺伝子の少なくとも一部分を含むベクターを調製する。遺伝子はヒト遺伝子であり得るが、さらに好ましくは本発明のヒト遺伝子（例えば表１〜１３に示す遺伝子）の非ヒトホモログである。例えば、マウス遺伝子を用いて、マウスゲノムにおいて本発明の内在遺伝子を改変するのに適した相同組換え核酸分子、例えばベクターを構築することができる。好ましい具体例において、相同組換えが起こると内在遺伝子が機能崩壊されるように相同組換え核酸分子が設計される（すなわち、もはや機能性蛋白をコードしない、「ノックアウト」ベクターとも称される）。別法として、相同組換えが起こると内在遺伝子は突然変異誘発または他の形で改変されるが、依然として機能性蛋白をコードするように相同組換え核酸分子を設計することができる（例えば、上流調節領域を改変することにより、内在性マーカー蛋白の発現が改変され得る）。相同組換え核酸分子において、相同組換え核酸分子により担持される外来遺伝子と細胞（例えば、胚性幹細胞）中の内在遺伝子との間で相同組換えを起こさせる本発明の遺伝子の付加的な核酸配列により、本発明の遺伝子の改変部分をその５’および３’末端に連結される。付加的な隣接核酸配列は、内在性遺伝子との有効な相同組換えにとって充分な長さを有する。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’および３’の両末端）がベクターに含まれている（例えば、相同組換えベクターの記載については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．および Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ５１：５０３参照）。ベクターは胚性幹細胞系中に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入され、導入された遺伝子が内在遺伝子と相同組換えされている細胞が選択される（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ら（１９８２）Ｃｅｌｌ６９：９１５参照）。次いで、選択された細胞は動物（例、マウス）の未分化胚芽細胞中に注入され、凝集キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編（ＩＲＬ、オクスフォード、１９８７）１１３−１５２頁参照）。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌養育（フォスター）動物へ移植し、胚を分娩させ得る。生殖細胞中に相同組換えＤＮＡをもつ子孫を用いることにより、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同組換えＤＮＡを含む動物が産み出され得る。相同組換えベクターおよび相同組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９および Ｌｅ ＭｏｕｅｌｌｅｃらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／１１３５４号、Ｓｍｉｔｈｉｅｓらによる同第ＷＯ９１／０１１４０号、Ｚｉｊｌｓｔｒａらによる同第ＷＯ９２／０９６８号、および Ｂｅｒｎｓらによる同第ＷＯ９３／０４１６９号に詳述されている。
【０１５９】
もう１つの具体例において、導入遺伝子の発現調節を可能にすべく選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が製造され得る。かかる系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記述については、例えば Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６２３２−６２３６参照。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｂｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択された蛋白の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が要求される。上記動物は、例えば、一方は選択された蛋白をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２種のトランスジェニック動物を交配させることにより、「二重」トランスジェニック動物の構築により提供され得る。
【０１６０】
また、本明細書に記載されているヒト以外のトランスジェニック動物のクローンを、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９７／０７６６８号および同第ＷＯ９７／０７６６９号記載の方法により製造することができる。簡単に述べると、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、増殖周期を脱してＧ０期へ入るように誘導することができる。次いで、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞を、静止細胞が単離されたのと同種の動物に由来する除核卵母細胞と融合させることができる。次いで、再構築された卵母細胞を培養して桑実胚または芽細胞にまで発達するようにし、次いで、偽妊娠した雌フォスター動物に移す。この雌フォスター動物から生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンとなる。
【０１６１】
ＩＶ．医薬組成物
本発明の核酸分子（表１〜１３に示す遺伝子）、本発明のマーカー蛋白のフラグメント、および抗−マーカー蛋白抗体（本明細書において「活性化合物ともいう」）を、投与に適した医薬組成物に含有させることができる。上記組成物は、典型的には核酸分子、蛋白または抗体および医薬的に許容される担体を含む。ここで使用されている「医薬的に許容される担体」の語は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などをすべて包含するものとする。医薬活性物質に関する上記媒質および薬剤の使用については当該分野では公知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物中におけるその使用が考えられる。補足的な活性化合物を組成物中に含有させることもできる。
【０１６２】
本発明は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性をモジュレーションするための医薬組成物の製造方法を包含する。かかる方法は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性をモジュレーションする作用剤と医薬上許容される担体とを処方することを特徴とする。かかる組成物はさらに付加的な活性作用剤を含んでいてもよい。よって、さらに本発明は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドまたは核酸の発現または活性をモジュレーションする作用剤および１またはそれ以上の付加的な活性化合物と医薬上許容される担体とを処方することによる医薬組成物の製造方法を包含する。
【０１６３】
また本発明は、モジュレーター、すなわち、（ａ）マーカーに結合する、（ｂ）マーカーの活性に対してモジュレーション（例えば、刺激または阻害）活性を有する、より詳細には、（ｃ）マーカーと１またはそれ以上のその本来の基質（例えば、ペプチド、蛋白、ホルモン、コファクター、または核酸）との相互作用に対してモジュレーション的影響を及ぼす、あるいは（ｄ）マーカーの発現に対してモジュレーション的影響を及ぼす候補または試験化合物または作用剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、小型分子または他の薬剤）を同定するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」ともいう）を提供する。典型的には、かかるアッセイは、マーカーと１またはそれ以上のアッセイ成分との間の反応を特徴とする。他の成分は、試験化合物自体であってもよく、あるいは試験化合物とマーカーの本来の結合パートナーとの組み合わせであってもよい。
【０１６４】
本発明の試験化合物を利用可能ないずれのソースから得てもよく、ソースは天然および／または合成化合物の系統的なライブラリーを包含する。当該分野で知られたコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかにより試験化合物を得てもよく、コンビナトリアルライブラリーは生物学的ライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの官能基を有する分子のライブラリーであるが、分子は酵素分解に耐性のある新規な非ペプチド骨格を有するがそれにもかかわらず生物学的活性を維持している；例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８−８５）、空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリーを包含し、さらにデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を要する合成ライブラリー法、「ワンビーズ・ワンコンパウンド（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法、ならびにアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法における多くのアプローチのいずれかにより試験化合物を得てもよい。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小型分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５）。
【０１６５】
本発明の医薬組成物は、意図されたその投与経路と適合するように処方される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与がある。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、次の成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェートおよび等張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムによりｐＨを調節することができる。非経口製剤を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器またはマルチプルドーズバイアル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ ｖｉａｌ）に封入することができる。
【０１６６】
注射可能用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液をその場で製造するための滅菌粉末が含まれ得る。静脈内投与の場合、適当な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォーＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）がある。どの場合も、組成物は無菌状態でなくてはならず、容易に注射できる程度には流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散液媒質およびその適当な混合物であり得る。例えば、レシチンのごときコーティングの使用により、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。微生物作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることにより達成され得る。
【０１６７】
必要に応じて、上記成分の１つまたは組み合わせとともに所望量の適当な溶媒に活性化合物（例えば、マーカー蛋白のフラグメントまたは抗−マーカー蛋白抗体）を含ませて、次いで、濾過滅菌することにより、滅菌注射可能溶液を調製することができる。一般的には、塩基性分散媒質および上記で列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌賦形剤中に活性化合物を含ませることにより分散液を製造する。滅菌注射可能溶液製造用滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過しておいたその溶液から有効成分に加えて所望の付加的成分からなる粉末を得ることができる。
【０１６８】
一般的には、経口組成物は不活性希釈剤または可食性担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入、あるいは錠剤に圧縮成型することができる。経口治療投与を目的とする場合、活性化合物は賦形剤と混合され、錠剤、トローチまたはカプセル形態で使用され得る。口内洗浄剤として使用される流動担体を用いて経口組成物を製造することもでき、流動担体中の化合物は経口適用され、スイッシュ（ｓｗｉｓｈ）され、吐き出されるかまたは嚥下される。医薬的に適合し得る結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、下記成分のいずれか、または類似した性質の化合物：結合剤、例えば微晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン、賦形剤、例えば澱粉または乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）、滑剤、例えばコロイド状二酸化珪素、甘味剤、例えばしょ糖またはサッカリン、または香味料、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料を含み得る。
【０１６９】
吸入投与の場合、化合物は、適当な推進剤、例えば気体、例えば二酸化炭素を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾールスプレー、またはネブライザーの形態でデリバリーされる。
【０１７０】
全身投与を経粘膜または経皮手段で行なってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤を製剤中に使用する。上記浸透剤は一般的に当業界では公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を包含する。鼻用スプレーまたは坐薬の使用により経粘膜投与を行なうことができる。経皮投与の場合、当該分野で一般的に知られているように、活性化合物を軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームとして製剤化する。
【０１７１】
化合物を直腸デリバリー用の坐薬（例、慣用的坐薬基剤、例えばカカオバターおよび他のグリセリド類による）または停留浣腸形態として調合することもできる。
【０１７２】
１の具体例において、活性化合物は、体内からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調合され、例えばインプラントおよびマイクロカプセル封入デリバリー系を包含する除放性製剤がある。生物分解性、生物適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。上記製剤の製造方法は、当業者に明らかであろう。これらの材料を、アルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッドから購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含む）を医薬的に許容され得る担体として使用することもできる。例えば米国特許第４５２２８１１号に記載されたような当業者に公知の方法に従ってこれらを調合することができる。
【０１７３】
投与し易く用量を均一にするために単位用量形態で経口または非経口組成物を製剤するのは特に有利である。本明細書で使用されている単位用量形態とは、処置される対象にとって単位用量として適する物理的に独立した単位を包含しており、各単位は必要とされる医薬用担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性化合物を含むものをいう。本発明の単位用量形態に関する詳細は、活性化合物特有の特徴および達成すべき特定治療効果、および個体の処置を目的としたかかる活性化合物調合の当該分野における制限に直接的に左右される。
【０１７４】
上記化合物の毒性および治療効率を細胞培養物または実験動物における標準製薬方法により測定して、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物を使用してもよい場合、かかる化合物を罹病組織の部位に標的化させるデリバリーシステムを設計して、未感染細胞に対する潜在的ダメージを最小化し、そのことにより副作用を減らすように注意を払うべきである。
【０１７５】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトで使用するための範囲の用量を処方するために用いることができる。好ましくは、かかる化合物の用量は、毒性を全くまたはほとんど伴わないＥＤ５０値を包含する循環濃度の範囲内である。使用される用量形態および使用される投与経路に応じて用量をこの範囲内で変化させてもよい。本発明方法で使用される化合物の場合、先ず、細胞培養アッセイから治療有効量を評価することができる。用量を動物モデルで製剤化することにより、細胞培養で測定されたＩＣ５０（すなわち、徴候の半−最大阻害を達成する試験化合物の濃度）をを包含する循環血漿濃度範囲が得られる。上記情報を使用することにより、ヒトにおける有用な用量をより正確に測定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１７６】
本発明核酸分子をベクター中に挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。例えば静脈内注射、局所投与（米国特許５３２８４７０参照）または定位注射（例えば Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７参照）により遺伝子治療ベクターを対象にデリバリーすることができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される希釈液中に遺伝子治療ベクターを含んでいてもよく、あるいは遺伝子デリバリービークルが埋封された遅速放出マトリックスを含んでいてもよい。別法として、完全な遺伝子デリバリーベクターを組換え細胞から無傷で製造できる場合（例えば、レトロウイルスベクター）、医薬製剤は遺伝子デリバリー系を生産する１個またはそれ以上の細胞を含んでいてもよい。
医薬組成物を投与に関する説明書とともに容器、パック、またはディスペンサーに入れることができる。
【０１７７】
Ｖ．コンピューター読み取り可能手段およびアレイ
本発明のマーカーを含むコンピューター読み取り可能媒体も提供される。本明細書の用語「コンピューター読み取り可能媒体」は、コンピューターにより直接読まれ、アクセスされうる媒体を包含する。かかる媒体は、フレキシブルディスク、ハードディスク貯蔵媒体および磁気テープのごとき磁気貯蔵媒体、ＣＤ−ＲＯＭのごとき光学的貯蔵媒体、ＲＡＭおよびＲＯＭのごとき電気的貯蔵媒体、ならびに磁気／工学的貯蔵媒体のごときこれらのカテゴリーのハイブリッドを包含するが、これらに限らない。当業者は、現在知られているコンピューター読み取り可能媒体をどのようにして用いて本発明のマーカーを記録したコンピューター読み取り可能媒体を含む製造物を作成するのがを容易に認識するであろう。
【０１７８】
本明細書の用語「記録」は、コンピューター読み取り可能媒体上に情報を貯蔵するプロセスを包含する。当業者は、コンピューター読み取り可能媒体上に情報を貯蔵するための現在知られている方法を適用して、本発明のマーカーを記録したコンピューター読み取り可能媒体を含む製造物を容易に作成することができる。
【０１７９】
種々のデータープロセッサープログラムおよびフォーマットを用いて本発明のマーカー情報をコンピューター読み取り可能媒体上に貯蔵することができる。例えば、マーカーに対応する核酸配列を、ワードプロセッシングテキストファイル中に表し、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏＳｏｆｔ Ｗｏｒｄのごとき市販ソフトウェア中にフォーマットし、あるいはＡＳＣＩＩファイルの形態で表し、ＤＢ２、Ｏｒａｃｌｅ等のごときデータベースアプリケーション中に貯蔵することができる。いずれの数のデータプロセッサー構築フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を適用して本発明のマーカーを記録したコンピューター読み取り可能媒体を得てもよい。
【０１８０】
本発明のマーカーをコンピューター読み取り可能形態として提供することにより、種々の目的のためにマーカー配列情報に常套的にアクセスすることができる。例えば、当業者は、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列をコンピューター読み取り可能形態として用いて、標的配列または標的構造モチーフをデータ貯蔵手段中に貯蔵された配列情報と比較することができる。特定の標的配列または標的モチーフに合致する本発明の配列のフラグメントまたは領域を、検索手段を用いて同定する。
【０１８１】
また本発明は、本発明のマーカーを含むアレイを提供する。アレイを用いて、アレイ中の１またはそれ以上の遺伝子の発現をアッセイすることができる。１の具体例において、アレイを用いて組織中の遺伝子発現をアッセイし、アレイ中の遺伝子の組織特異性を確認することができる。この様式で、約８６００個の遺伝子の発現を同時にアッセイすることができる。このことは、１またはそれ以上の組織中で特異的に発現される遺伝子の砲列を示すプロファイルを開発することを可能にする。
【０１８２】
かかる定性的決定のほかに、本発明は遺伝子発現の定量を可能にする。よって、組織特異性のみならず、組織中の遺伝子の砲列の発現レベルも確認することができる。したがって、本来の組織での発現レベルおよび当該組織での発現レベルに基づいて遺伝子をグループ分けすることができる。このことは、例えば、組織間または組織中の遺伝子発現の関連性を確認することに有用である。かくして、１の組織を混乱させて第２の組織における遺伝子発現に対する影響を調べることができる。この文脈において、生物学的刺激に応答する際の１の細胞タイプの別の細胞タイプに対する影響を調べることができる。かかる調査は、例えば、遺伝子発現のレベルにおける細胞−細胞相互作用の影響を知るために有用である。作用剤を治療的に投与して１の細胞タイプを処理するが、別の細胞タイプに対して望ましくない影響を及ぼす場合には、本発明は、望ましくない影響の分子的基礎を決定して逆作用剤を同時投与する機会あるいはさもなくば望ましくない影響を処置する機会を提供する。同様に、単一細胞タイプにおいてさえ、望ましくない生物学的影響を分子レベルで調べることができる。かくして、標的遺伝子以外の遺伝子の発現に対する作用剤の影響を確認し、逆作用を及ぼすことができる。
【０１８３】
もう１つの具体例において、アレイを用いて、アレイ中の１またはそれ以上の遺伝子の発現の経時変化をモニターすることができる。本明細書に開示するように、これを種々の生物学的な事象、例えば、発生および分化、疾病進行、細胞形質転換や老化のごときインビトロプロセス、痛みや食欲のごとき自律神経および神経学的プロセス、ならびに学習または記憶のごとき認識機能において行なうことができる。
【０１８４】
アレイは、同じ細胞または異なる細胞における遺伝子発現に対する他の遺伝子発現の影響を確認することにも有用である。このことは、例えば、最終または下流標的が調節できない場合の治療行為のための別の分子標的の選択肢を提供する。
アレイは、正常および疾病細胞における１またはそれ以上の遺伝子の異なった発現パターンを確認することにも有用である。このことは、診断または治療行為のための分子標的として役立ちうる遺伝子の砲列を提供する。
【０１８５】
ＶＩ．予測医学
本発明は、予後（予測）目的のために診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験をモニターすることを用い、それにより個体を予防的に処置する予測医学の分野にも適する。従って、本発明の一態様は、生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）中でのマーカー蛋白および／または核酸の発現ならびにマーカー蛋白の活性を測定し、それにより、個体が増加または減少したマーカー蛋白の発現または活性に関連する病気または疾患に罹患しているかどうか、または疾患が進行する危険にあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。本発明により、個体がマーカー蛋白、核酸の発現または活性に関連する疾患を進行させる危険にあるかどうかを決定するための予後（または予測）アッセイも提供される。例えば、マーカー遺伝子のコピー数を生物学的試料中でアッセイすることができる。かかるアッセイを予後または予測目的に使用して、そのことにより、マーカー蛋白、核酸の発現または活性により特徴づけられる、あるいはそれらに関連した疾病（例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状）の発症前に個体を治療的に処置することができる。
本発明の他の態様は、臨床試験においてマーカーの発現または活性に対する試薬（例えば、薬剤、化合物）の影響をモニターすることに関する。
これらおよび他の試薬を、以下のセクションにさらに詳細に記載する。
【０１８６】
１．診断アッセイ
生物学的試料中の本発明のマーカー蛋白または核酸の存在または不在を検出するための典型的な方法は、生物学的試料を試験対象から得て、次いでマーカー蛋白またはそれをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することができる化合物または試薬と生物学的試料とを接触させて、生物学的試料中のマーカー蛋白または核酸の存在を検出することを特徴とする。本発明のマーカー遺伝子または蛋白に対応するｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい試薬は、本発明のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。本発明の診断アッセイにおける使用に適した他のプローブを、本明細書中に記載する。
【０１８７】
マーカー蛋白を検出するのに好ましい試薬は、マーカー蛋白に結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであってよい。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して「標識された」なる用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を結合させる（即ち、物理的に結合させる）ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに、プローブまたは抗体を直接標識される他の試薬と反応させることにより間接的に標識することが含まれるものとする。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、およびＤＮＡプローブをビオチンで末端標識して、それを蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することが含まれる。「生物学的試料」なる用語には、対象から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに対象中に存在する組織、細胞および体液が含まれるものとする。即ち、本発明の検出方法を用いて生物学的試料中のマーカーｍＲＮＡ、蛋白またはゲノムＤＮＡを、インビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、マーカーｍＲＮＡのインビトロでの検出法には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションが含まれる。マーカー蛋白のインビトロでの検出法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、ウェスタン・ブロット、免疫沈降および免疫蛍光法が含まれる。マーカーゲノムＤＮＡのインビトロでの検出法にはサザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、マーカー蛋白のインビボでの検出法には、標識された抗−マーカー抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置を標準的な画像処理法で検出することができる放射活性マーカーで標識することができる。
【０１８８】
１の具体例において、生物学的試料は試験対象からの蛋白分子を含む。別法として、生物学的試料には試験対象からのｍＲＮＡ分子または試験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含むことができる。好ましい生物学的試料は、対象から慣用的方法により単離される血清試料である。
【０１８９】
もう１つの具体例では、該方法はさらに、対照生物学的試料を対照の対象から得ること、対照試料をマーカー蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または試薬と接触させて、生物学的試料中のマーカー蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を検出すること、ついで、対照試料中のマーカー蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中のマーカー蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを特徴とする。
【０１９０】
本発明は、生物学的試料中のマーカーの存在を検出するためのキットも包含する。例えば、該キットには、生物学的試料中のマーカー蛋白またはｍＲＮＡを検出することができる標識化合物または試薬、試料中のマーカーの量を測定する装置、および試料中のマーカーの量をスタンダードと比較する装置を含めることができる。該化合物または試薬は適当な容器に封入することができる。キットには、さらに、キットをマーカー蛋白または核酸を検出するのに用いるための使用説明書を含めることができる。
【０１９１】
２．予後アッセイ
さらにそのうえ、本明細書記載の診断方法を用いて、異常マーカーの発現または活性に関連した疾病または疾患を有する、あるいは発症する危険性のある対象を同定することができる。本明細書の用語「異常な」は、野生型マーカーの発現または活性から逸脱したマーカーの発現または活性を包含する。異常な発現または活性は、増加または減少した発現または活性、ならびに野生型の発達パターンの発現またはサブ細胞（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）パターンの発現に従わない発現または活性を包含する。例えば、異常なマーカーの発現または活性は、マーカー遺伝子中の変異がマーカー遺伝子の発現不足または過剰発現および刺激を引き起こす場合、ならびに変異が、無機能マーカー蛋白または野生型の様式で機能しない蛋白、例えば、マーカーリガンドと相互作用しない蛋白、または非マーカー蛋白リガンドと相互作用する蛋白を生じさせる状況を包含する。
【０１９２】
上記診断アッセイまたは下記アッセイのごとき本明細書中に記載のアッセイを用いて、マーカー蛋白活性または核酸発現の誤調節に関連した疾病、例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を有する、あるいは発症する危険性のある対象を同定することができる。別法として、予後アッセイを用いて、マーカー蛋白活性または核酸発現の誤調節に関連した疾病、例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状を有する、あるいは発症する危険性のある対象を同定することができる。かくして、本発明は、異常なマーカーの発現または活性に関連する病気または疾患を同定するための方法であって、試験試料を対象から得て、マーカー蛋白または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ）を検出する方法を提供し、マーカー蛋白または核酸の存在は、異常なマーカーの発現または活性に関連する病気または疾患を有する、あるいはそれらを進行させる危険にある患者の診断的特徴である。本明細書中で使用する「試験試料」は、関心の持たれる対象から得られる生物試料をいう。例えば、試験試料は、生物学的液体（例えば、血液）、細胞試料、または組織（例えば、膵臓組織）から得ることができる。
【０１９３】
さらにそのうえ、本明細書に記載する予後アッセイを用いて、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、蛋白、ペプチド、核酸、小型分子または他の薬物候補）を対象に投与して、増加または減少したマーカーの発現または活性に関連する病気または疾患を処置することができるかどうかを決定することができる。例えば、かかる方法を用いて、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状のごとき疾病に対する薬剤で対象を効果的に治療しうるかどうかを決定することができる。よって、本発明は、増加または減少したマーカーの発現または活性に関連する疾患のための薬剤を用いて対象を効果的に処置することができるかどうかを決定するための方法を提供するものであり、該方法は、試験試料を得、マーカー蛋白または核酸の発現または活性を検出する方法（例えば、マーカー蛋白または核酸の発現または活性が豊富なことは、増加または減少したマーカーの発現または活性に関連する疾患を治療するための薬剤を投与することができる対象の診断的特徴である）である。
【０１９４】
本発明の方法を用いて、マーカー遺伝子の遺伝学的変化を検出し、それにより、変化した遺伝子を有する対象がマーカー蛋白の活性または核酸発現の誤調節により特徴づけられる疾患、例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状の危険性があるかどうかを決定することもできる。好ましい具体例において、該方法は、対象からの細胞の試料において、マーカー蛋白をコードしている遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも一つの変化により特徴付けられる遺伝学的変化の存在または不在、またはマーカー遺伝子の誤発現を検出することを特徴とする。例えば、そのような遺伝学的変化は、１）マーカー遺伝子からの１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）マーカー遺伝子への１またはそれ以上のヌクレオチドの付加；３）マーカー遺伝子の１またはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）マーカー遺伝子の染色体転位；５）マーカー遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写のレベルでの変化；６）マーカー遺伝子、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な変化；７）マーカー遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在；８）マーカー蛋白の非野生型レベル；９）マーカー遺伝子の対立遺伝子欠失、および１０）マーカー蛋白の翻訳後の不適当な修飾、の少なくとも一つの存在を確認することにより検出することができる。本明細書に記載するように、マーカー遺伝子の変化を検出するのに用いることができる、当該分野で公知の多数のアッセイ法が存在する。好ましい生物試料は、対象から慣用的手段により単離された組織（例えば、膵臓組織）または血液試料である。
【０１９５】
ある具体例において、変化の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２を参照されたい）、例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ・ＰＣＲにおける、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： １０７７−１０８０； ａｎｄ Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ３６０−３６４参照）におけるプローブ／プライマーの使用が含まれ、後者はマーカー遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３： ６７５−６８２を参照されたい）。この方法は、対象から細胞の試料を収集すること、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離すること、マーカー遺伝子（存在する場合には）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じる条件下で、マーカー遺伝子に特異的にハイブリダイズする１またはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触させること、次いで増幅産物の存在または不存在を検出すること、あるいは増幅産物のサイズを検出し、および対照試料と長さを比較することを特徴とする。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載する変異を検出するのに用いられる方法のいずれかと組み合わせて予備的増幅ステップとして用いることが望ましいと考えてもよい。
【０１９６】
別の増幅法には、自己維持配列複製（ｓｅｌｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： １８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ， Ｄ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： １１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ， Ｐ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １１９７）またはいずれかの他の核酸増幅法が含まれ、この後、当業者に周知の方法を用いる増幅分子の検出を行う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数で存在している場合に核酸分子を検出するのに特に有用である。
【０１９７】
別の具体例において、試料細胞からのマーカー遺伝子における変異は、制限酵素開裂パターンの変化により同定することができる。例えば、試料および対照ＤＮＡを単離し、増幅し（所望により）、１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメントの長さのサイズをゲル電気泳動により決定し、そして比較する。フラグメントの長さのサイズに関する試料および対照ＤＮＡ間の違いが、試料ＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイムを使用して（例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５，４９８，５３１号を参照されたい）、リボザイム開裂部位の発生または消失により特異的変異の存在を評価することができる。
【０１９８】
他の具体例において、本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白をコードする遺伝子の遺伝学的変異は、試料および対照の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイゼーションさせることにより同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ， Ｍ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７： ２４４−２５５； Ｋｏｚａｌ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２： ７５３−７５９）。例えば、マーカーにおける遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎ， Ｍ． Ｔ． ｅｔ ａｌ（既出）に開示されているような光により生成する（ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）ＤＮＡプローブを含む二次元アレイ中にて同定することができ、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料および対照中のＤＮＡの長い鎖を探査し、配列がオーバーラップしているプローブの線状アレイ（ａｒｒａｙ）を作成することにより配列間の塩基変化を同定することができる。この工程により点突然変異の同定が可能となる。この工程を行った後に、検出されたすべての変種または変異に相補的な、小さな、特異化されたプローブアレイを用いることにより特異的変異の特定を可能とする二次ハイブリダイゼーションアレイを用いる。各変異アレイはパラレルなプローブのセットから構成され、一方は野生型遺伝子に相補的であり、もう一方は、変異遺伝子に相補的である。
【０１９９】
さらにもう一つの具体例において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを用いてマーカー遺伝子を直接配列決定し、試料マーカーの配列を対応する野生型（対照）の配列と比較することにより変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（（１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（（１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４： ５４６３）により開発された方法に基づくものが含まれる。診断アッセイ（（１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９： ４４８）を行う場合、質量スペクトル分析（例えば、ＰＣＴ国際公開ＮＯ．ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｄｖ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３６： １２７−１６２； およびＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８： １４７−１５９を参照されたい）を含む種々の自動配列決定法のいずれかを用いることができることも考えられる。
【０２００】
本発明のマーカー遺伝子またはマーカー蛋白をコードする遺伝子の変異を検出するための他の方法には、開裂試薬からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基対を検出する方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： １２４２）。一般に、「ミスマッチ開裂」の当該分野における方法は、野生型マーカー配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料から得られる潜在的に変異したＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロ二本鎖を用意することで始まる。二本鎖の分子を、対照および試料鎖間の塩基対ミスマッチのために存在しているであろう二本鎖分子の一本鎖領域を開裂する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はＲＮａｓｅで処理することができ、およびＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を酵素消化することができる。他の具体例では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化後、生じた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分けし、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ４３９７； Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｕｍｏｌ． ２１７： ２８６−２９５を参照されたい。好ましい具体例において、対照ＤＮＡまたはＲＮＡを、検出のために標識することができる。
【０２０１】
さらにもう１つの具体例において、ミスマッチ開裂反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１またはそれ以上の蛋白（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞の試料から得られたマーカーｃＤＮＡにおける点突然変異を検出およびマッピングするために規定されたシステムにおいて利用する。例えば、イー・コリのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチでＡを開裂し、ヒーラ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを開裂する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５： １６５７−１６６２）。典型的な具体例に従い、マーカー配列、例えば野生型マーカー配列に基づくプローブを、試験細胞からのｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。二本鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、そして開裂産物を、それが存在する場合には、電気泳動プロトコルなどから検出することができる。例えば、米国特許第５４５９０３９号参照。
【０２０２】
他の具体例において、電気泳動の移動度の変化を用いてマーカー遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖構造遺伝子多型（ＳＳＣＰ）を用いて変異型および野生型核酸間の電気泳動の移動度の違いを検出してもよい（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ： ８６： ２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ （１９９３） Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ２８５： １２５−１４４； およびＨａｙａｓｈｉ （１９９２） Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． ９： ７３−７９）。試料および対照のマーカー核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させ、次いで復元させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列によって異なり、電気泳動の移動度に関して結果的に生じる変化から、わずか一つの塩基変化も検出することができる。ＤＮＡフラグメントは標識プローブを用いて標識または検出することができる。アッセイの感度は、（ＤＮＡよりも）二次構造が配列の変化に対してより感受性の高いＲＮＡを用いることにより高めることができる。好ましい具体例において、主題の方法は、ヘテロ二本鎖の分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二本鎖分子を分離するものである（Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。
【０２０３】
さらにもう１つの具体例において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異型または野生型フラグメントの移動を、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いてアッセイする（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ４９５）。ＤＧＧＥを分析法として用いる場合、例えば約４０ｂｐの高融点のＧＣに富むＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲにより追加することによりＤＮＡを修飾して、ＤＮＡが完全に変性しないことを保証する。さらなる具体例では、温度勾配を変性勾配の代わりに用いて、対照と試料ＤＮＡの移動度の違いを同定する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒｅｉｓｓｎｅｒ （１９８７） Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ２６５： １２７５３）。
【０２０４】
点突然変異を検出するための他の方法の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が包含されるが、これらに限らない。例えば、知られた変異が中心に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが認められる場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせることができる（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２４： １６４）； Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ６２３０）。オリゴヌクレオチドがハイブリダイジング膜に結合し、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異体にハイブリダイズする。
【０２０５】
別法として、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅法を、本発明と組み合わせて用いてよい。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、興味ある変異を分子の中心に有していてもよく（その結果、増幅は引き算ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ２４３７−２４４８）、あるいは、適当な条件下でミスマッチによりポリメラーゼの伸張が妨げられ、または減じられ得る場合には、ある種のプライマーの３’末端に興味ある変異を有していてもよい（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｔｉｂｔｅｃｈ １１： ２３８）。さらに、新規な制限酵素部位を変異の領域に導入して、切断に基づいて検出を行うことが望ましい可能性もある（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ｎｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。ある具体例において、増幅用Ｔａｑリガーゼを用いて増幅を行ってもよいことが予想される（Ｂａｒａｎｙ （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８： １８９）。そのような場合、ライゲーションは、５’配列の３’末端に完全なマッチ（ｍａｔｃｈ）が存在する場合にのみ起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定部位での知られた変異の存在を検出することができる。
【０２０６】
例えば、本明細書に記載する少なくとも一つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予め包装された診断用キットであって、例えばマーカー遺伝子に関連する疾患または病気の兆項または家族歴を示している患者を診断するために臨床環境で簡便に用いることができる診断用キットを利用することにより、本明細書に記載した方法を行うことができる。
さらに、マーカーを発現するあらゆる細胞タイプまたは組織を本明細書に記載する予後アッセイに用いてよい。
【０２０７】
３．臨床試験の間の効果のモニタリング
マーカー蛋白の発現または活性に対する作用剤（例えば、薬剤）の影響（例えば、細胞増殖および／または移動のモジュレーション）のモニタリングを、基本的な薬剤スクリーニングのみならず臨床試験に適用することができる。例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより決定された作用剤の、マーカー遺伝子発現、ポリペプチドレベルを増大させ、あるいはマーカー活性をアップレギュレーションする有効性を、マーカー遺伝子発現、蛋白レベルの低下、あるいはマーカー活性のダウンレギュレーションを示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。別法として、スクリーニングアッセイにより決定された作用剤の、マーカー遺伝子発現、ポリペプチドレベルを減少させ、あるいはマーカー活性をダウンレギュレーションする有効性を、マーカー遺伝子発現、蛋白レベル、またはマーカー活性の上昇を示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。かかる臨床試験において、マーカー遺伝子、および好ましくは例えばマーカー関連疾患（例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状）に関連する他の遺伝子の発現または活性を、特定細胞の表現型の「リードアウト（ｒｅａｄ ｏｕｔ）」またはマーカーとして用いることができる。
【０２０８】
例えば、そして限定するものではないが、マーカー活性をモジュレーションする作用剤（例えば、化合物、薬剤または小型分子）（例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される）での処理により、細胞においてモジュレーションされる本発明のマーカー遺伝子およびマーカー蛋白をコードする遺伝子などの遺伝子を同定することができる。かくして、例えば臨床試験において、マーカー関連疾患（例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状）に対する作用剤の影響を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、マーカーの発現レベルおよびマーカー関連疾患に関与する他の遺伝子の発現レベルをそれぞれ分析することができる。本明細書記載のノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、あるいは別法として産生蛋白量を測定することにより、本明細書に記載の方法の１つにより、あるいはマーカーまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより、遺伝子発現のレベル（例えば、遺伝子発現パターン）を定量することができる。このようにして、遺伝子発現パターンは、作用剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして役立ちうる。したがって、個体を作用剤で治療する前および治療中の種々に時点においてこの応答状態を調べてもよい。
【０２０９】
好ましい具体例において、本発明は、作用剤（例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小型分子、または他の薬剤候補）での対象の治療の有効性をモニタリングする方法を提供し、該方法は、（ｉ）作用剤の投与の前に対象から投与前試料を得る；（ｉｉ）投与前試料中のマーカー蛋白、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを調べる；（ｉｉｉ）対象から１またはそれ以上の投与後試料を得る；（ｉｖ）マーカー蛋白、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを調べる；（ｖ）投与前試料中のマーカー蛋白、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと、投与後試料中のマーカー蛋白、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを比較する；次いで（ｖｉ）適宜、対象に対する作用剤の投与を変更する工程を含む。例えば、作用剤の投与増加は、マーカーの発現または活性を検出レベルよりも高いレベルにまで上昇させるために、すなわち、作用剤の有効性を高めるために望ましい。あるいはまた、作用剤の投与減少は、マーカーの発現または活性を検出レベルよりも低いレベルにまで低下させるために、すなわち、作用剤の有効性を低くするために望ましい。かかる具体例によれば、観察可能な表現型応答の不存在下においてさえも、マーカーの発現または活性を作用剤の有効性のインジケーターとして用いることができる。
【０２１０】
Ｃ．治療方法
本発明は、異常なマーカーの発現または活性に関連した疾病の危険性のある、あるいは有する対象を処置するための予防的および治療的両方の方法に関する。処置するための予防的および治療的両方の方法について、薬剤ゲノム学の分野から得られる知識に基づいてかかる処置を特別に構築あるいは修飾してもよい。本明細書の用語「薬剤ゲノム学」は、遺伝子配列決定、統計学的遺伝学、および遺伝子発現分析のごときゲノム学的手法を臨床開発および市場における薬剤に適用することを包含する。より詳細には、該用語は、いかにして対象の遺伝子が対象の薬剤への応答を決定するのか（例えば、対象の「薬剤応答表現型」または「薬剤応答遺伝子型」）を研究することをいう。かくして、本発明のもう１つの態様は、個体の薬剤応答遺伝子型に従って本発明のマーカー分子またはマーカーモジュレーターを用いて個体の予防的または治療的処置を構築する方法を提供する。薬剤ゲノム学は、臨床医または医師が、処置から最も多く利益を受けるであろう対象に予防的または治療的処置を施すこと、ならびに毒性薬剤に関連した副作用を受けるであろう対象の処置を回避することを可能にする。
【０２１１】
１．予防方法
１の態様において、本発明は、マーカー蛋白発現または少なくとも１つのマーカー蛋白活性をモジュレーションする薬剤を対象に投与することによる、対象において増加または減少したマーカー発現または活性に関連する疾病または症状（例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状）を防ぐ方法を提供する。増加または減少したマーカー発現または活性により誘発されるかまたはそれに起因する疾患の危険がある対象は、例えばここに記載されている診断または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせにより確認され得る。予防薬の投与は、疾病または疾患を阻止するかあるいはその進行を遅らせるように、異なったマーカー蛋白発現を特徴とする徴候が現れる前に行うことができる。マーカーの異常のタイプ（例えば、発現レベルの増加または減少）、例えば、マーカー蛋白、マーカー蛋白アゴニストまたはマーカー蛋白アンタゴニスト薬剤を対象処置のために使用することができる。適当な薬剤は本明細書に記載されているスクリーニングアッセイを用いて決定することができる。
【０２１２】
２．治療方法
本発明のもう１つの態様は、治療目的でマーカー蛋白の発現または活性をモジュレーションする方法に関する。したがって、典型的な具体例において、本発明のモジュレーション方法は、細胞を、マーカー蛋白または細胞に関連したマーカー蛋白の１またはそれ以上の活性をモジュレーションする薬剤と接触させることを特徴とする。マーカー蛋白活性をモジュレーションする薬剤は、核酸または蛋白、マーカー蛋白の天然に存在する標的分子（例えば、マーカー蛋白基質）、マーカー蛋白抗体、マーカー蛋白アゴニストもしくはアンタゴニスト、マーカー蛋白アゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド模倣物、または他の小型分子のごとき本明細書記載の薬剤であってもよい。１の具体例において、薬剤は１またはそれ以上のマーカー蛋白活性を刺激する。かかる刺激剤の例は、活性マーカー蛋白および細胞に導入されたマーカー蛋白をコードする核酸分子を包含する。もう１つの具体例において、作用剤は１またはそれ以上のマーカー蛋白活性を阻害する。かかる阻害剤の例は、アンチセンスマーカー蛋白核酸分子、抗−マーカー蛋白抗体、およびマーカー蛋白阻害剤を包含する。これらのモジュレーション方法をインビトロで行なうことができ（例えば、細胞を作用剤と接触させることにより）、あるいはまた、インビボで作用剤と細胞を接触させることにより行なうこともできる（例えば、作用剤を対象に投与することにより）。そのようなものとして、本発明は、マーカー蛋白または核酸分子の異常な発現または活性により特徴付けられる疾病または疾患にかかっている個体を処置する方法を提供する。１の具体例において、該方法は、マーカー蛋白の発現または活性をモジュレーション（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）する作用剤（例えば、本明細書記載のスクリーニングアッセイにより同定される作用剤）または作用剤の組み合わせを投与することを特徴とする。もう１つの具体例において、該方法は、マーカー蛋白または核酸分子を治療薬として投与して、低下したあるいは異常なマーカー蛋白の発現または活性を補償することを含む。
【０２１３】
マーカー蛋白活性の刺激は、マーカー蛋白が異常にダウンレギュレーションされる状況、および／または増大したマーカー蛋白活性が有益な効果をもたらす可能性のある状況において望ましい。例えば、マーカー蛋白活性の刺激は、マーカーがダウンレギュレーションされる状況、および／または増大したマーカー蛋白活性が有益な効果をもたらす可能性のある状況において望ましい。同様に、マーカー蛋白活性の阻害は、マーカー蛋白が異常にアップレギュレーションされる状況、および／または減少したマーカー蛋白活性が有益な効果をもたらす可能性のある状況において望ましい。
【０２１４】
３．薬剤ゲノム学
本発明のマーカー蛋白および核酸分子、ならびに本明細書記載のスクリーニングアッセイにより同定されるマーカー蛋白活性（例えば、マーカー遺伝子発現）に対して刺激または抑制効果を有する作用剤またはモジュレーターを個体に投与して、異常なマーカー蛋白活性に関連したマーカー関連疾患（例えば、Ｉ型糖尿病またはＮＫＴ関連症状）を処置することができる。かかる処置と組み合わせて、薬剤ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬剤に対するその個体の応答との間の関連性についての研究）を考慮してもよい。治療薬の代謝の相違は、薬理学的に活性のある薬剤の用量と血中濃度との間の関連性を変化させることにより、重大な毒性または治療失敗を引き起こす可能性がある。よって、医師または臨床医は、マーカー分子またはマーカーモジュレーターを投与するかどうか、ならびにマーカー分子またやマーカーモジュレーターでの治療の用量および／または治療規則を変更するかどうかを決定する際に、関連する薬剤ゲノム学の研究において得られた知識を考慮してもよい。
【０２１５】
薬剤ゲノム学は、罹病した人における変化した薬剤傾向（ｄｒｕｇ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）および異常な作用による薬剤に対する応答の臨床的に重要な遺伝的変化を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３（１０−１１）：９８３−９８５およびＬｉｎｄｎｅｒ， Ｍ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３（２）：２５４−２６６参照。一般的には、２つのタイプの薬剤ゲノム学的状態に分けられる。薬剤を変化させる単一因子として伝達される遺伝学的状態は身体に作用し（薬剤作用の変化）、あるいは身体を変化させる単一因子として伝達される遺伝学的状態は薬剤に作用する（薬剤代謝の変化）。これらの薬剤ゲノム学的状態は、稀な遺伝学的欠損としてあるいは自然発生的多型のいずれかとして生じうる。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損（Ｇ６ＰＤ）は、主な臨床的併発症がオキシダント薬剤（抗−マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取およびソラマメを食べた後の溶血である通常の遺伝性酵素疾患である。
【０２１６】
１の薬剤ゲノム学的アプローチは、「ゲノム−ワイドアソシエーション（ａ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」として知られる薬剤応答を予測するものであり、主に、すでに知られている遺伝子関連マーカーからなるヒトゲノムの高分解能マップ（例えば、ヒトゲノム上の６００００ないし１０００００の多型または可変部位からなるバイ−アレリック（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）遺伝子マーカーマップ、各マーカーが２種の変種を有する）に依存するものである。かかる高分解能遺伝学的マップを、フェーズＩＩ／ＩＩＩの薬剤試験に関連する統計学的に有意な数の各対象のゲノムのマップと比較して、特定の観察された薬剤応答または副作用に関連するマーカーを同定することができる。別法として、ヒトゲノム中の数千万の既知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）の組み合わせからかかる高分解能マップを得ることもできる。本明細書の用語「ＳＮＰ」は、ＤＮＡ鎖中の単一ヌクレオチド塩基において生じる通常の変化である。例えば、特定のＳＮＰはＤＮＡの１０００塩基ごとに１回生じうる。ＳＮＰは疾病のプロセスに関与しているが、大多数のものは疾病に関連していない。かかるＳＮＰｓの発生に基づいて遺伝学的マップが得られたならば、個々のゲノム中のＳＮＰｓの特定パターンに応じて個体を遺伝学的カテゴリーに分類することができる。かかるやり方で、かかる遺伝学的に類似の個体間の共通した特徴を考慮して、遺伝学的に類似した個体に対して治療規則を合わせることができる。
【０２１７】
別法として、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を用いて、薬剤応答を予測する遺伝子の同定をすることができる。この方法によれば、薬剤標的（例えば、本発明のマーカー蛋白）をコードする遺伝子が知られている場合、集団中の当該遺伝子のすべての共通の変種をかなり容易に同定することができ、当該遺伝子のもう１つのバージョンを有することが特定の薬剤応答に関連しているかどうかを決定することができる。
【０２１８】
典型的な具体例として、薬剤代謝酵素の活性は薬剤作用の強度および持続時間の両方に関する主要な決定因子である。薬剤代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）ならびにチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝学的多型の発見は、なぜいくつかの対象が期待される薬剤効果を得ないのか、あるいはなぜ標準的で安全な薬剤用量を用と去れた後に過大な薬剤応答および重大な毒性を示すのかについての説明を提供している。これらの多型は集団中において２つの表現型、よく代謝する者（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ （ＥＭ））およびあまり代謝しない者（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ （ＰＭ））として発現される。ＰＭの多さは異なる集団間で相違する。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は非常に多型性であり、数種の変異がＰＭにおいて同定されており、それらすべてが機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不存在を引き起こす。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９のあまり代謝しない者は、標準的な用量を投与された場合に非常に頻繁に過大な薬剤応答および副作用を示す。ＣＹＰ２Ｄ６により生成された代謝産物モルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果に関して示されるように、代謝産物が活性のある治療部分である場合であっても、ＰＭは治療応答を示さない。他のよく代謝する者はいわゆる超迅速に代謝する者であり、標準的な用量に応答しない者である。最近、超迅速に代謝する者の分子的基礎がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものであると同定された。
【０２１９】
別法として、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を用いて薬剤応答を予測する遺伝子を同定することができる。例えば、薬剤（例えば、本発明のマーカー分子またはマーカーモジュレ−ター）を投与された動物の遺伝発現は、毒性に関連した遺伝子経路がスイッチオンされたかどうかを示すものとなりうる。
【０２２０】
上記薬剤ゲノム学的アプローチの１つを用いて、個体における予防的または治療的処置のための適切な投与および処置規則を決定することができる。この知識を投与または薬剤選択に適用する場合、不利な反応または治療失敗を回避することができ、かくしてマーカー分子または本明細書記載の典型的なスクリーニングアッセイの１つにより同定されたモジュレーターのごときマーカーモジュレーターで対象を処置する際に治療または予防効率が向上する。
【０２２１】
限定的と解してはならない下記実施例により本発明をさらに説明する。本願において引用されたすべての文献、特許および公開された特許出願、ならびに図面および表を参照により本明細書に一体化させる。
【０２２２】
実施例
実施例１：阻害剤の研究
糖尿病のＮＫＴ細胞と非糖尿病のＮＫＴ細胞との間の知られた相違は、いずれの細胞も活性化によりＩＦＮ−γを分泌するが、糖尿病ＮＫＴ細胞は活性化によりＩＬ−４を分泌せず、非糖尿病細胞は分泌するということである。Ｔ抗原受容体の結合により開始されるいずれの既知シグナリングカスケードがＩＬ−４分泌において役割を果たすのかを確認するために、一連の阻害剤の研究を行なった。参照によりこの実施例に示す研究はそのまま本明細書に組み込まれる（Ｗｉｌｓｏｎ）。
【０２２３】
単一の、Ｖα２４−陽性でＣＤ４／８陰性のシングルセルソートを、放射線照射された同種フィーダー上で、１ウェルあたり５００００個の割合で増殖させた。１ウェルあたり５０００個の十分に放射線照射（５０００ラド）された７２１．２２１リンパ芽球様細胞ならびに１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐ、各１０ユニット／ｍｌのＩＬ−２およびＩＬ−７（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｅｍ）を入れ、記載されたようにして（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１： １７７−１８１）増殖させた。フローサイトメトリーによりＶα２４およびＮＫＲ−Ｐ１Ａに関して陽性のクローンならびにＶα２４ＪαＱ ＣＤＲ３ Ｔ細胞抗原受容体配列を、Ｃ１Ｒ／ＣＤ１Ｓ限定実験においてサイトカイン分泌に関してアッセイした。サイトカイン分泌および阻害剤の研究のために、１ウェルあたり５ｘ１０４個のＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンＧＷ４（非糖尿病）およびＭＥ１０（糖尿病）を１μｇ／ｍｌのプレート結合抗−ＣＤ３またはＩｇ対照で活性化させた。記載されたようにして（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１７７−１８１）活性化から４時間後に分泌されたＩＬ−４およびＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによりアッセイした。前もって阻害剤用量−応答実験により阻害剤の最適濃度を決定した。使用した阻害剤の濃度は１０ｎＭウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）；１０μＭ ＹＬ２９４００２、５０μＭ ＰＤ９８０５９（マイトジェン活性化蛋白キナーゼ阻害剤）、および５０μＭＳＢ２０３５８０（ｐ３８キナーゼ阻害剤）であった。使用したホルボールエステルおよびカルシウムイオノフォアの濃度は１ｎｇ／ｍｌ ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）および１μｇ／ｍｌ イオノマイシンであった。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）はＴ細胞活性化を防止する能力があるので、これを陰性対照として５ｎｇ／ｍｌで使用した。製造者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の指示に従って細胞にインド−１をロードし、次いで、１０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３で活性化することによりカルシウムフラックスを決定した。イオノマイシンを添加することにより最大カルシウムフラックスを決定した。
【０２２４】
ホスホイノシチド−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）阻害剤ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２は抗−ＣＤ３により誘導されるＩＬ−４＋クローンからのＩＬ−４分泌をブロックしたが、ＩＬ−４＋またはＩＬ−４−ヌルクローンからのＩＦＮ−γ分泌には影響しなかった（図２）。対照的に、ＰＤ９８０５９によるＭＥＫキナーゼの阻害またはＳＢ２０３５８０でのＪＮＫおよびｐ３８カスケードの阻害（Ｒｉｎｃｏｎ ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ７（１１）：Ｒ７２９−３２； Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０（６）：２５７９−８９）は影響を有しなかった。ＰＩ３−キナーゼの阻害後、ホルボールエステルＰＭＡまたはカルシウムイオノフォアイオノマイシンの取りこみによりＩＬ−４分泌がＩＬ−４＋クローンにおいてレスキューされ得た。これらの基質は単独でもあるいは組み合わせても、糖尿病由来クローンＭＥ１０からのＩＬ−４分泌の欠損を修復しなかった。さらに、糖尿病個体由来のＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンは、抗−ＣＤ３刺激後において細胞内カルシウム蓄積能を減じていた（図２）。これらのデータは、Ｔ細胞抗原受容体結合後に観察された不一致ＩＬ−４表現型がＰＩ３−キナーゼの上流に単一に存在するのではなく、カルシウムフラックスを調節する蛋白における相違を包含する複数の遺伝学的／調節上の相違が含まれていることを示唆する。
【０２２５】
実施例２：マーカーｃＤＮＡの同定および特徴付け
Ａ．フローサイトメトリー
末梢血白血球を蛍光抱合モノクローナル抗体で染色した。染色された細胞をＦＡＣＳｃａｎサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析し、記載されたようにして（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１７７−１８１）ＭｐＦｌｏサイトメーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ， ＮＪ）を用いてシングルセルソーティングおよびカルシウムフラックス測定を行なった。
【０２２６】
Ｂ．細胞培養
単一のＶα２４−陽性、ＣＤ４／８陰性のシングルセルソートを、放射線照射された同種フィーダー上で、１ウェルあたり５００００個の割合で増殖させた。１ウェルあたり十分に放射線照射（５０００ラド）された７２１．２２１リンパ芽球様細胞ならびに１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐ、各１０ユニット／ｍｌのＩＬ−２およびＩＬ−７（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｅｍ）を入れ、記載されたようにして（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１： １７７−１８１）増殖させた。
【０２２７】
Ｃ．メッセンジャーＲＮＡ発現
Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンＧＷ４およびＭＥ１０（１ｘ１０７個）を１０μｇ／ｍｌの可溶性抗−ＣＤ３または対照ＩｇＧで４時間活性化させた。４時間の時点は、Ｉ型糖尿病について不一致である一卵性双生児由来のクローンのサイトカイン分泌に関する以前の分析（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１（６６６３）：１７７−８１）に用いられていたことから採用された。以前は、抗−ＣＤ３の最適濃度はサイトカイン分泌を測定する用量応答実験により決定されていた。Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙ ｋｉｔｓを用いて全ＲＮＡを単離した。次いで、５’末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含むオリゴ（ｄＴ）プライマーでのプライミングにより全ＲＮＡを２本鎖ｃＤＮＡに変換した。ビオチン化ヌクレオチドの存在下でのインビトロ転写反応においてｃＤＮＡを直接使用して、標識ｃＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）を得て、これをＧｅｎｅｃｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）と一晩ハイブリダイゼーションさせた。フィコエリスリン−ストレプトアビジンでの染色後、標準的なプロトコルを用いてＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｒｅａｄｅｒ（修飾された共焦点顕微鏡， Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用することにより結合ＲＮＡの蛍光を定量した。
【０２２８】
Ｄ．データ分析
刺激前または後に検出可能な発現をしている遺伝子の数はＩＬ−４ヌルおよびＩＬ−４分泌クローン（それぞれ１５２３個および１５５８個）とほとんど同じであった。大部分の転写物の発現頻度は活性化により変化しなかった。抗−ＣＤ３刺激後の発現が未刺激遺伝子の少なくとも２倍増加または減少することがわかった遺伝子の数は、ＩＬ−４ヌルおよびＩＬ−４＋クローンにおいて、それぞれ８６個（６％）および２２６個（１５％）であった。
【０２２９】
ＩＬ−４ヌルおよびＩＬ−４分泌クローン間の遺伝子発現の相違をより徹底的に分析するために、Ｓｅｌｆ−Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｍａｐアルゴリズム（Ｔａｍａｙｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：２９０７−２９１２）を用いることにより遺伝子を６つの別個の発現バターンに分類した。ＩＬ−４分泌またはＩＬ−４ヌルクローンにおいて抗−ＣＤ３刺激により少なくとも２倍修飾されたすべての遺伝子を、２つのクローンにおける各遺伝子の相対的挙動によりクラスター分けした。図３の最初のパネルは２倍の判断基準に合致したすべての遺伝子に関する結果を示し、他の１１個のパネルは特定の機能クラスに関する結果を示す。出現した優勢なパターンを第１列、第２欄に示し、それはＩＬ−４分泌クローンにおいて活性化によりアップレギュレーションされたが、ＩＬ−４ヌルクローンにおける刺激には無応答であった遺伝子を含む。この知見は試験したすべての機能クラスにおいて当てはまり、ＩＬ−４ヌルクローンにおける多数の遺伝子について意味深い転写誘導欠損が示される。しかしながら、他の５つのクラスターの試験において、このクローンにおいて誘導されたがＩＬ−４分泌クローンにおいては誘導されなかった遺伝子の群（第１列、第１欄（表１））ならびにＩＬ−４ヌルクローンにおいてダウンレギュレーションされたがＩＬ−４分泌クローンにおいてはアップレギュレーションされた遺伝子を含む群（第２列、第２欄（表５））により明らかなように、ＩＬ−４ヌルクローンにおける転写調節不良は単なる全般的な無応答よりも複雑であることが明らかとなった。それゆえ、ＩＬ−４ヌルクローンはＴ細胞受容体を介する刺激に応答しうる。
【０２３０】
６つの異なる発現パターンが観察された。表１（図３に示す各クラスター中の第１列、第１欄を代表するもの）には、適切な休止対照細胞と比較して、活性化糖尿病ＮＫＴ細胞における発現が増加し、活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞における発現が不変または少し減少したことが観察された各遺伝子が示されている。表２（図３に示す各クラスター中の第１列、第２欄を代表するもの）には、適切な休止対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞における発現が不変であり、適切な休止対照細胞と比較して活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞における発現が増加したことが観察された各遺伝子が示されている。表３（図３に示す各クラスター中の第１列、第３欄を代表するもの）には、適切な対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞および活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞の両方において発現が増加したことが観察された各遺伝子が示されている。表４（図３に示す各クラスター中の第２列、第１欄を代表するもの）には、対照細胞と比較して活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞において発現が減少し、対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞において発現が不変であることが観察された遺伝子が示されている。表５（図３に示す各クラスター中の第２列、第２欄を代表するもの）には、休止対照細胞と比較して活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞における発現が増加し、休止対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞における発現が減少したことが観察された遺伝子が示されている。表６（図３に示す各クラスター中の第２列、第３欄を代表するもの）には、休止対照細胞と比較して活性化糖尿病ＮＫＴ細胞における発現が減少し、休止対照細胞と比較して活性化非糖尿病ＮＫＴ細胞における発現が不変または少し減少したことが観察された遺伝子が示されている。
【０２３１】
ＩＬ−４＋およびＩＬ−４ヌルクローン間のサイトカイン／ケモカインファミリーのメンバーの転写の有意な変化が観察され、ＥＬＩＳＡアッセイにより蛋白レベルで確認された。有意な発現の相違は、細胞生存、サイトカイン分泌、および一部にはＢＣＬｘＬ、ＩＡＰ、ＰＬＣγ１およびｔｅｃファミリーキナーゼ、Ｉｔｋ、のごときＰＩ３−キナーゼを介して活性化されるカルシウムフラックスにとり重要な他の遺伝子においても検出され、それらの転写物はＩＬ−４＋クローンにおいてより豊富であることがわかった。ＧＡＴＡ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、およびＮＦＡＴ４のごときサイトカイン分泌およびＴｈ表現型に関して重要な転写因子およびシグナリングモジュレーターをコードするｍＲＮＡの発現においても相違が観察された。これらの遺伝子の特定のもの（ＧＡＴＡ３、ＪｕｎＢおよびＪｕｎＤ）はＩＬ−４＋クローンにおいて発現が増加したが、残りのものはＩＬ−４ヌルクローンにおいて発現が増加した。
【０２３２】
実施例３：ＮＫＴ、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞クローンにおける遺伝子発現
Ａ．アプローチ
上記方法を用いて単一ドナーからＮＫＴ、ＣＤ４、およびＣＤ８ Ｔ細胞クローンを得た。各タイプの単一クローンを選択し、抗−ＣＤ３で２、４、８、２４または４８時間刺激して、反応動力学的活性化シリーズを作成した。ＣＤ４およびＣＤ８に関して３系の同じ実験を行なったが、ＮＫＴについては１系の実験のみ行なった。ＮＫＴ実験系の問題は３倍のフィルター交換を要することであった。ＣＤ４およびＣＤ８についてはフィルター交換の必要はなく、むしろ、交換されたフィルターは、３系すべての実験系に関して０時間に対して遺伝子を増加または減少させる。１２０００種の既知ヒト遺伝子をモニターするチップ上でＲＮＡを単離し、分析した。３回の繰り返し実験で得られた一貫した発現パターンを有し、異なるＴ細胞サブセット間で３倍の変化を有する遺伝子と発現データとを関連付けた。
【０２３３】
Ｂ．結果
ＮＫＴ細胞試料において少なくとも１の時点においてｍＲＮＡレベルが少なくとも３倍増加することにより同定され、ＣＤ４およびＣＤ８細胞試料とは異なる発現パターンおよび強度を有していた遺伝子を表９に示す。ＣＤ４細胞試料における３系すべての実験に関して少なくとも１の時点においてｍＲＮＡレベルが増加することにより同定され、ＮＫＴおよびＣＤ８細胞試料とは異なる発現パターンおよび強度を有していた遺伝子を表１０に示す。表９に示した遺伝子は表１０から排除された。ＣＤ８細胞試料における３系すべての実験に関して少なくとも１の時点でｍＲＮＡレベルが増加することにより同定され、ＮＫＴまたはＣＤ４細胞試料とは異なる発現パターンまたは強度を有していた遺伝子を表１１に示す。表９および１０に示した遺伝子は表１１から排除された。
【０２３４】
実施例４：未刺激ＮＫＴ、ＣＤ４、およびＣＤ８ Ｔ細胞クローンにおける遺伝子発現
Ａ．アプローチ
上記方法を用いてＮＫＴ、ＣＤ４、およびＣＤ８ Ｔ細胞クローンを単一ドナーから得た。各タイプの単一クローンを選択し、休止細胞における遺伝子発現の相違を観察した。ＣＤ４およびＣＤ８に関して３系の同じ実験を行ない、ＮＫＴに関して２系の同じ実験を行った。ＲＮＡを単離し、１２０００種の既知ヒト遺伝子をモニターするチップ上で分析した。３回の繰り返し実験で得られた一貫した発現パターンを有し、異なるＴ細胞サブセット間で３倍の変化を有する遺伝子と発現データとを関連付けた。
【０２３５】
Ｂ．結果
休止ＣＤ４細胞試料における３系すべての実験に関してｍＲＮＡレベルが変化することにより同定され、休止ＮＫＴ細胞試料とは異なる発現パターンまたは強度を有していた遺伝子を表１２に示す。休止ＣＤ８細胞試料において３系すべての実験に関してｍＲＮＡレベルが変化することにより同定され、休止ＮＫＴ細胞試料とは異なる発現パターンまたは強度を有していた遺伝子を表１３に示す。
【０２３６】
【表１】
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【０２３７】
【表２】
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【０２３８】
【表３】
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【０２３９】
【表４】
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【０２４０】
【表５】
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【０２４１】
【表６】
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【０２４２】
【表７】
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【０２４３】
【表８】
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【０２４４】
【表９】
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【０２４５】
【表１０】
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【０２４６】
【表１１】
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【表１２】
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【０２４７】
【表１３】
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【０２４８】
【表１４】
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【表１５】
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【０２４９】
均等物
当業者は、本明細書記載の発明の特別な具体例に対する多くの均等物を認識し、あるいは常套的な実験を用いて確認することができるであろう。かかる均等物は特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、糖尿病および非糖尿病細胞中のマーカー遺伝子の相対的発現を調べるために本発明において使用された方法を図式的に示したものである。
【図２】図２は、ＩＬ−４＋およびＩＬ−４ヌル Ｖα２４ＪαＱ Ｔ細胞（ＮＫＴ）クローンにおけるＰＩ３−キナーゼにより調節されるイベントの不一致発現を示す。図２Ａは、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定された、種々のシグナルトランスダクション経路の阻害剤または促進剤の存在下または不存在下における、プレート結合抗−ＣＤ３またはＩｇ対照で活性化されたＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンＧＷ４（非糖尿病細胞）およびＭＥ１０（糖尿病細胞）から分泌されたＩＦＮおよびＩＬ−４発現レベルを示す棒グラフである。使用した阻害剤はウォルトマンニン（「ｗｏｒｔ」１０ｍＭ）、ＬＹ２９４００２（「ＬＹ」１０μＭ）、ＰＤ９８０５９（「ＰＤ」５０μＭ）、Ｓ８２０３５８０（「Ｓ８」５０μＭ）であった。使用した刺激剤はホルボールエステルＰＭＡ（１ｎｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（「ｉｏｎｏ」１ｎｇ／ｍｌ）およびサイクロスポリンＡ（「ＣｓＡ」５ｎｇ／ｍｌ）であった。３つの平行した系にてデータポイントを集め、示されたデータは４つの独立した実験の典型的なものである。図２Ｂは、ｉｎｄｏ−１標識（１０μＭ）され、抗−ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ）刺激されたＶα２４ＪαＱ Ｔ細胞クローンＣＷ４（ＩＬ−４＋）およびＭＥ１０（ＩＬ−４−ヌル）のフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＭｏＦｌｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用）による経時的蛍光検出のグラフを示す。実験の終わりに、イオノマイシンを添加して最終濃度１μｇ／ｍｌとして最大フラックスを決定した。クローンの典型的なペアーにおける刺激後の４１０／４９０ｎｍ（４１０：Ｃａ２＋結合；４９０：Ｃａ２＋遊離）におけるＩｎｄｏ−１蛍光比を図示する。
【図３】図３は、糖尿病／非糖尿病の双子のペアーに由来するＮＫＴ細胞クローンにおいて異なって発現される遺伝子を図式的に示したものである。クローンＭＥ１０（糖尿病細胞）およびＧＷ４（非糖尿病細胞）を対照ＩｇＧ（Ｒと命名＝休止）または抗−ＣＤ３（Ａと命名＝活性化）で４時間処理し、その後ＲＮＡを単離し、Ｕｎｉｇｅｎｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの６８００種のヒト遺伝子の発現を遺伝子チップでモニタリングして分析した。いずれかのクローンにおいて発現が少なくとも２倍モジュレーションされた遺伝子を選択して、Ｓｅｌｆ−Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｍａｐアルゴリズム（Ｔａｍａｙｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９））を用いるクラスター化分析に供した。この方法を用いて、発現強度とは無関係のＭＥ１０およびＧＷ４間の引き算発現パターンに基づいて遺伝子を６つの別個の群にクラスター化した。２倍の変化という判断基準に合致したすべての遺伝子を用いた場合、第１の群は示された６つのパターンを示す。他のグループ分けにより、選択された遺伝子機能クラスの異なる発現パターンが明らかとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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