(57)【要約】本発明は、使用される幹細胞集団から、比較的均一な細胞集団が望ましい場合にはいかなる場合でも分化細胞を産生させる系を提供する。このような細胞は、集団中の比較的未分化な細胞中で遺伝子を発現させる転写制御エレメント（TERTプロモーターなど）の制御下に配置されたエフェクター遺伝子を含む。エフェクター遺伝子を発現させることで未分化細胞が枯渇するか、または後に未分化細胞を除去する際に使用可能なマーカーが発現される。適切なエフェクター配列は、毒素、アポトーシス誘導性タンパク質、細胞表面抗原、またはプロドラッグを細胞に致死的な作用をもつ物質に変換する酵素（チミジンキナーゼなど）をコードする。本開示にしたがって作製された分化細胞集団は、組織の再生、および非治療的応用（薬剤スクリーニングなど）における使用に適している。2004523217.tif 000007
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化細胞を本質的に含まない、エクスビボで培養した霊長類の多能性幹（pPS）細胞から分化した細胞の集団。
【請求項２】
細胞が構造P-Xを含む核酸分子を含む、請求項1記載の細胞集団であって、
Xが、発現されると細胞に致死的な作用を及ぼす産物または発現されると外来薬剤による致死的作用に対して細胞を感受性とする産物をコードする核酸配列であり、且つ
Pが、Xを未分化細胞内で選択的に発現させる転写制御エレメントである、細胞集団。
【請求項３】
構造P-Xを含む核酸分子を含む霊長類の多能性幹（pPS）細胞であって、
Xが、発現されると細胞に致死的作用を及ぼす核酸配列または発現されると外来薬剤による致死的作用に対して細胞を感受性とする核酸配列であり、且つ
Pが、Xを未分化細胞内で選択的に発現させる転写制御エレメントである、霊長類の多能性幹細胞。
【請求項４】
Xが毒素またはアポトーシスを誘導もしくはアポトーシスに関与するタンパク質をコードする、請求項2または3記載の細胞または細胞集団。
【請求項５】
Xが、プロドラッグをXが発現された細胞に致死的な作用を及ぼす化合物に変換する酵素をコードする、請求項2または3記載の細胞または細胞集団。
【請求項６】
Xがチミジンキナーゼをコードする、請求項5記載の細胞または細胞集団。
【請求項７】
P-Xが導入される異種分子である、請求項2〜6のいずれか一項記載の細胞または細胞集団。
【請求項８】
Pが内因性転写制御エレメントである、請求項2〜6のいずれか一項記載の細胞または細胞集団。
【請求項９】
PがOCT-4プロモーターまたはテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）のプロモーターである、請求項2〜6のいずれか一項記載の細胞または細胞集団。
【請求項１０】
幹細胞がヒト胚性幹（hES）細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞または細胞集団。
【請求項１１】
以下の段階を含む、分化細胞集団を産生させる方法：
a）構造P-Xを含む核酸分子を含む未分化幹細胞を含む細胞集団を提供する段階であって、Xが、発現された細胞に致死的な作用を及ぼす産物または発現されると外来薬剤による致死的作用に対して細胞を感受性とする産物をコードする核酸配列であり、且つPが、Xを未分化細胞内で選択的に発現させる転写制御エレメントである段階；および
b）集団中の少なくとも複数の未分化細胞を分化させる段階。
【請求項１２】
細胞集団と外来薬剤を混合する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
集団中の未分化幹細胞を遺伝的に変化させて、構造P-Xを含む核酸分子を含むようにする段階を含む、未分化幹細胞の細胞集団を枯渇させる方法であって、Xが、発現されると細胞に致死的な作用を及ぼす産物をコードする核酸配列であり、且つPが、Xを未分化細胞内で選択的に発現させる転写制御エレメントである方法。
【請求項１４】
Xが毒素またはアポトーシスを誘導もしくはアポトーシスに関与するタンパク質をコードする、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
以下の段階を含む、未分化幹細胞の細胞集団を枯渇させる方法：
a）集団中の未分化幹細胞を遺伝的に変化させて、構造P-Xを含む核酸分子を含むようにする段階であって、Xが、発現されると外来薬剤による致死的作用に対して細胞を感受性とし、且つPが、Xを未分化細胞内で選択的に発現させる転写制御エレメントである段階；および
b）細胞と外来薬剤を混合することで未分化細胞を集団から枯渇させる段階。
【請求項１６】
XがプロドラッグをXが発現された細胞に致死的な作用を及ぼす化合物に変換する酵素をコードする、請求項11、12、または15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
Xがチミジンキナーゼをコードする、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
外来薬剤がガンシクロビルである、請求項16または17記載の方法。
【請求項１９】
P-Xが導入される異種分子である、請求項11〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
Pが内因性転写制御エレメントである、請求項11〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
細胞集団が、集団中の未分化細胞内でXが一過的に発現されるように遺伝的に変化される、請求項11〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
P-Xが集団中の細胞の子孫に受け継がれて、未分化の子孫で発現されるようになる、請求項11〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
PがOCT-4プロモーターまたはテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）のプロモーターである、請求項11〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
核酸分子が構造P-X-Yを含み、Yが薬剤耐性遺伝子である、請求項11〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
幹細胞がヒト胚性幹（hES）細胞である、請求項11〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
請求項11〜25のいずれか一項記載の方法で得られる分化細胞の集団。
【請求項２７】
ニューロン細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、心筋細胞、骨芽細胞、またはこれらの系列が決定された前駆細胞の集団である、請求項1〜10または請求項26のいずれか一項記載の細胞または細胞集団。
【請求項２８】
請求項1〜10または26〜27のいずれか一項記載の細胞または細胞集団を含む、ヒトまたは動物の手術または治療のための薬学的調製物。
【請求項２９】
ヒトまたは動物の体内の未分化幹細胞を枯渇させるための薬物調製物に含まれるプロドラッグの使用であって、
未分化幹細胞が構造P-Xを含み、
Xが、プロドラッグを未分化幹細胞に致死的な作用を及ぼす化合物に変換する産物をコードする核酸配列であり、且つ
Pが、Xを未分化細胞内で選択的に発現させる転写制御エレメントである使用。
【請求項３０】
プロドラッグがガンシクロビルである、請求項29記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は一般に胚細胞の細胞生物学、およびウイルスベクターを制御するプロモーターの分子生物学の分野に関する。具体的には本発明では、多能性幹細胞に由来する集団から、選択的に発現する溶解性ベクターを用いて未分化細胞を除去する技術について説明する。
【０００２】
関連出願の相互対照
本出願は、2000年11月27日に出願された米国特許出願第60/253,443号および第60/253,357号（係属中）；および2001年2月13日に出願された第09/783,203号（係属中）の優先権を主張する。本出願を米国内で実施する目的において、優先権に関する文書は、全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
前駆細胞は医学研究の中心的存在である。身体の多くの組織は、老化した細胞や、外傷や疾患によって損傷を受けた細胞を置き換えることが可能な前駆細胞を予備的に貯蔵している。再生医療に使用される多種多様な組織の前駆体を単離する研究は最近活発に行われている。
【０００４】
米国特許第5,750,397号（Tsukamotoら、Systemix）では、Thy-1+、CD34+で、リンパ球系列、赤血球系列、および骨髄単球系列への分化能を有するヒト造血幹細胞の単離および成長について報告されている。米国特許第5,736,396号（Bruderら）では、適切な生物活性因子を用いた、単離ヒト間葉系幹細胞の系列誘導性分化の方法について報告されている。採取した細胞は後に、間葉組織を再生または修復するために宿主に導入することができる。
【０００５】
米国特許第5,716,411号（Orgillら）では、上皮を自家移植することで、やけどや創傷を負った部位において皮膚を再生する方法が提案されている。米国特許第5,766,948号（F.Gage）では、動物の脳組織から神経芽細胞を産生させる方法について報告されている。米国特許第5,672,499号（Andersonら）では、胚組織から神経冠幹細胞を得る方法について報告されている。米国特許第5,851,832号（Weissら、Neurospheres）では、8〜12週齢のヒト胎児から神経幹細胞と推定される細胞を単離する方法について報告されている。米国特許第5,968,829号（M.Carpenter）では、主要な中枢神経系組織に由来するヒト神経幹細胞について報告されている。
【０００６】
米国特許第5,082,670号（F.Gage）では、中枢神経系の欠損、疾患、または損傷を治療するために、遺伝的に修飾した細胞を移植する方法について報告されている。Auerbachら（Eur.J.Neurosci. 12：1696、2000）は、動物の脳に移植された多能性CNS細胞が、電気的に活発で機能的に連結されたニューロンを形成することについて報告している。Brustleら（Science 285：754、1999）は、胚性幹細胞から採取された前駆細胞が宿主ニューロンと相互作用して、脳内および脊髄内の軸索を効率的に有髄化することについて報告している。
【０００７】
多種多様な細胞へ分化する能力を有すると考えられている胚性幹細胞の開発には大きな関心が寄せられている。胚性幹細胞に関する初期の研究はマウスを対象に行われた。マウスの幹細胞は、初期胚細胞と胚組織の両方から単離することができる。多能性幹細胞の望ましい特徴は、未分化状態でインビトロにおいて増殖可能なこと、正常な核型を維持すること、また全3種類の胚葉派生物（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）へ分化する能力を保持することである。
【０００８】
ヒト多能性幹細胞調製物の開発は、マウス細胞を対象とした研究と比べてほとんど進んでいない。Thomsonらは、下等霊長類から（米国特許第5,843,780号；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844、1995）、また後にはヒトから（Science 282：114、1998）多能性幹細胞を増殖させた。Gearhartらは、胎児の性腺組織からヒト胚（hEG）細胞系列を採取している（Shamblottら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726、1998；および米国特許第6,090,622号）。
【０００９】
hES細胞もhEG細胞も、多能性幹細胞の長年探し求められていた以下の特徴を有する：すなわち、分化せずにインビトロで成長可能であること、核型が正常であること、また多種多様な細胞を産生する能力を残していること。クローン由来のヒト胚性幹細胞系列は、培養中で多能性および増殖能を長期間維持する（Amitら、Dev.Biol. 227：271、2000）。このような細胞は、ヒトを対象とした治療における使用に有望であり、遺伝子異常、外傷、または疾患状態によって損なわれた、ほぼすべての任意の組織の再生用の貯蔵部位となる。
【００１０】
国際公開公報第99/20741号（Geron社）は、霊長類に由来する始原幹細胞を成長させる方法および使用される材料に関する。一つの態様では、細胞培地は、霊長類由来の始原幹細胞を実質的に未分化状態で、低浸透圧かつ低エンドトキシンレベルで成長させるために提供される。基礎培地には、霊長類由来の始原幹細胞の成長を支持するのに有効な栄養分としての血清、およびフィーダー細胞の基質、またはフィーダー細胞に由来する細胞外マトリックス成分が混合される。この培地には、非必須アミノ酸、抗酸化剤、および成長因子（ヌクレオシド類またはピルビン酸塩）をさらに含める場合がある。
【００１１】
治療目的に幹細胞を使用する上での大きな課題は、各患者の治療に必要とされる特定の種類の組織への成長および分化を制御することである。
【００１２】
米国特許第4,959,313号（M.Taketo、Jackson Labs）では、隣接する外因性遺伝子、または組換え遺伝子の発現を、通常は未分化細胞では発現を誘導しない遺伝子に伴うプロモーターから誘導する特定のエンハンサー配列が提供されている。米国特許第5,639,618号（D.A.Gay、Plurion社）では、系列特異的な幹細胞をインビトロで単離する方法が提案されている。この方法には、系列特異的な遺伝子エレメントがレポーター遺伝子に機能的に連結されているコンストラクトを多能性胚性幹細胞にトランスフェクトする段階、同細胞が分化する条件で細胞を培養する段階、およびレポーターを発現する細胞を他の細胞と分離する段階が含まれる。
【００１３】
米国特許第6,087,168号（Levesqueら、Cedars Sinai Med. Ctr.）は、上皮細胞を、細胞療法および遺伝子治療の両方に有用な生存能をもつニューロンに分化転換する方法に関する。皮膚細胞に、神経発生に関与する転写因子をトランスフェクトし、ニューロン分化の負の調節因子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培地中で培養する。
【００１４】
国際公開公報第97/32025号（Mclvorら、U.ミネソタ）では、薬剤耐性造血幹細胞を移植する方法が提案されている。移植片中の細胞は、幹細胞で機能するプロモーターの制御下にある薬剤耐性遺伝子（メトトレキセート耐性を示すジヒドロ葉酸還元酵素など）によって増殖する。このような細胞を哺乳動物に投与し、次に薬剤で処理することで非トランスジェニック細胞に対してトランスジェニック細胞の移植効率を高める。
【００１５】
国際公開公報第98/39427号（Steinら、U.マサチューセッツ）は、骨格組織などの分化細胞内で外因性遺伝子を発現させる方法に関する。幹細胞（例えば骨髄由来の幹細胞）に、分化細胞内における発現を制御するエレメントに遺伝子が連結されている核酸を接触させる。例示的なエレメントには、ラットのオステオカルシンプロモーターがある。国際公開公報第99/10535号（Liuら、Yale U.）では、幹細胞内における遺伝子発現の変化を調べる過程が提案されている。幹細胞集団の遺伝子発現プロファイルを作成した後に分化細胞の遺伝子発現プロファイルと比較する。
【００１６】
国際公開公報第99/19469号（Braetscherら、Biotransplant）は、ブタの多能性胚性幹細胞を成長させる方法に関する。選択可能なマーカー遺伝子を細胞内に挿入することで、ES細胞内において制御配列またはプロモーター配列（例えばブタのOCT-4プロモーター）によって制御されるようになる。
【００１７】
国際公開公報第00/15764号（Smithら、U.エディンバラ）は、胚性幹細胞の増殖および採取に関する。胚性幹細胞は、分化細胞の増殖に不可欠なシグナル伝達経路を抑制することによってES細胞以外の細胞の増殖または生存を選択的に阻害する化合物の存在下で培養する。例としてSHP-2、MEK、またはras/MAPKのカスケードを阻害する化合物などがある。
【００１８】
Klugら（J.Clin.Invest. 98：216、1996）は、分化途上のマウス胚性幹細胞から心筋細胞を遺伝的に選択する方法を提案している。α-心臓ミオシン重鎖プロモーターおよびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードするcDNAを含む融合遺伝子がES細胞に安定にトランスフェクトされている。結果として得られた系列がインビトロで分化されてG418で選択された。選択された心筋細胞培養物は、高度に分化した状態であることが報告されている。これを再びマウスに移植すると、ES由来の心筋細胞移植片は、移植後の最長7週間にわたって検出可能であった。
【００１９】
Schuldinerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：11307、2000）は、8種類の成長因子がヒト胚性幹細胞に由来する細胞の分化に及ぼす作用について報告している。胚様体形成を介した分化の開始後、細胞がbFGF、TGF-β1、アクチビン-A、BMP-4、HGF、EGF、βNGF、またはレチノイン酸の存在下で培養された。各成長因子は分化経路に固有の作用を及ぼしたが、いずれの成長因子も、一種の細胞の選択的な分化を誘導しなかった。
【００２０】
ヒトへの投与に適した分化細胞集団を得るためには新しいアプローチが求められている。
【発明の開示】
【００２１】
発明の概要
本発明は、比較的未分化な細胞を、幹細胞の分化によって得られるような異種細胞集団から枯渇させる系を提供する。このような細胞集団を、致死的作用を及ぼすエフェクター遺伝子、または潜在的に致死的作用を及ぼすエフェクター遺伝子を、未分化の下位集団中において高レベルの遺伝子発現を可能とする遺伝子エレメントの制御下に配置するベクターで処理する。この処理の結果、成熟細胞が比較的濃縮され、再生医療における使用に適した集団が得られる。
【００２２】
本発明の一つの態様は、エクスビボで培養された幹細胞から分化した細胞の集団であり、未分化細胞を本質的に含まない。例えば、ヒト胚性幹細胞などの霊長類起源の多能性幹細胞がこれに該当する。
【００２３】
集団中の細胞は、構造P-X（Xは、発現されると細胞に致死的作用を及ぼす核酸配列、または発現されると細胞を外来薬剤による致死的作用に対して感受性とする核酸配列；またPは、Xを未分化細胞内で選択的に発現させる転写制御エレメント）を含むポリヌクレオチドを含む場合があるか、またはこれを用いて採取される場合がある。PとXをつなぐハイフンは、遺伝子エレメントが、核酸分子中で隣接しているか否かにかかわらず機能的に連結されていることを意味する。
【００２４】
Xは本開示では、エフェクター配列の次に位置することを意味する。Xは毒素、アポトーシスを誘導したりアポトーシスに介在したりするタンパク質、またはプロドラッグ（ガンシクロビルなど）を、Xが発現されると細胞に致死的な作用を及ぼす化合物に変換する酵素（チミジンキナーゼなど）をコードする場合がある。他の例については本開示の後半で提供する。
【００２５】
ある態様では、P-Xは導入される異種分子であり、細胞またはその祖先が、P-Xを含むベクターによって遺伝的に改変されていることを意味する。他の態様では、このような細胞およびその祖先は、ベクターによって、Xが内因性転写制御エレメントの制御下に配置されるように遺伝的に改変された状態にある。トランスフェクション後、Xを集団中の未分化細胞内で一過的に発現させたり、P-Xを未分化の子孫に遺伝可能として発現させたりすることができる。Pの非制限的な例には、OCT-4プロモーター、およびテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）のプロモーターなどがある。細胞はまた、Pの制御下に薬剤耐性遺伝子Yを含む場合もある（本開示ではP-X-Yとして記載され、これはPがXとYの両方の転写を調節し、エレメントが、このように機能を結びつける配列中に任意の方向で存在することを意味する）。
【００２６】
本発明の別の態様は、上述した構造P-Xをもつ核酸を含むように遺伝的に改変された幹細胞である。本発明はまた、このように幹細胞を遺伝的に変化させるように適合させたポリヌクレオチドベクターも提供する。
【００２７】
本発明の別の態様は、分化細胞集団を作製する方法である。構造P-Xを含む核酸分子を含む未分化幹細胞を含む細胞集団は、少なくともいくつかの未分化細胞の分化を集団中で誘導するように処理される。
【００２８】
本発明の別の態様は、細胞集団から未分化幹細胞を枯渇させる方法である。集団中の幹細胞は、遺伝的に変化を受けて、上述の構造P-Xを含む核酸分子を含むようになる。このようにして、発現されると細胞に致死的な作用を示す遺伝子、または細胞に外来薬剤による致死的作用に対する感受性をもたせる遺伝子が、未分化細胞内における遺伝子の選択的な発現を誘導する転写制御エレメントの制御下に配置される。このような細胞集団は、未だ大部分が未分化な状態（分化が誘導される前の状態）の場合に、または既に分化細胞を主に含む場合に遺伝的に変化している場合がある。
【００２９】
Xが細胞に致死的な作用を及ぼす場合、未分化幹細胞は、Xが発現される条件で細胞集団を培養することで単純に枯渇させることができる。Xが細胞を外来薬剤（薬剤またはプロドラッグなど）の致死的作用に感受性とする場合、細胞を外来薬剤と混合することで未分化幹細胞が枯渇する。これは、細胞をインビトロにおいて組織培養物中で薬剤と接触させることで、または細胞を外来薬剤と同時に（最初に薬剤が存在しない場合）、または連続的に被験者に投与することで行われる場合がある。
【００３０】
本発明の試薬および手法は、任意の種類の幹細胞を含む細胞集団が対象とされる場合がある。これは特に、霊長類の多能性幹細胞（ヒト胚性幹細胞など）に対する応用に適している。
【００３１】
本発明の他の態様は以下の記述から明らかになる。
【００３２】
発明の詳細な説明
さまざまな種類の幹細胞は、再生医療分野における極めて魅力ある様式である。幹細胞は、培養物中で増殖させて、インビトロまたはインサイチューで治療に必要な細胞種に分化させることができる。最近になって、ヒト胚性幹細胞が高レベルのテロメラーゼを連続的に発現し、テロメアの長さを維持して、培養中でほぼ無制限に成長可能なことが報告されている。
【００３３】
これまで、幹細胞を分化させる研究は主に、再生医療分野に望ましい組織型の表現型の特徴をもつ細胞集団の成長を促進する培養条件を決めることに向けられてきた。Schuldinerら（前掲）は、成長因子がヒト胚性幹細胞の分化に及ぼす影響について報告している。米国特許第5,639,613号では、レポーター遺伝子に機能的に連結されて、後に同レポーター発現細胞の選択に使用される系列特異的遺伝子が幹細胞にトランスフェクトされている。国際公開公報第97/32025号では、薬剤耐性遺伝子により造血幹細胞が増殖され、被験者に移植されている。この細胞を哺乳動物に投与した後に対象薬剤で処理することで、トランスジェニック細胞の移植効率が高まる。Klugら（前掲）は、α-心臓ミオシン重鎖プロモーターがアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼの発現を制御するコンストラクトを使用している。トランスフェクトされた分化細胞をG418で選択することで心筋細胞様細胞の系列が得られた。これは、所望の種類の組織の遺伝子発現パターンを利用するポジティブ選択法の一つであり、分化組織の選択的な生存が可能となる。
【００３４】
本発明における仮説は、適応培養およびポジティブ選択法で作られる分化細胞の一部の集団はヒトを対象とした治療における使用に最適ではないというものである。環境によっては、集団中の未分化細胞は、インビボにおける細胞の移植または機能を損なう場合がある。未分化細胞は、治療目的の移植部位において、または移植された細胞が移動することによって、悪性度が高くなったり、他の腫瘍を形成する確率が高い場合もある。
【００３５】
本発明は、このような分化細胞集団に残存する未分化細胞が枯渇可能である方法に関する。この方法は、遺伝的に改変した細胞を用いて実施されるので、発現されることで細胞に致死的な作用を及ぼす、または細胞を外来薬剤による致死的作用に感受性とする遺伝子が、集団中の任意の未分化細胞内における選択的な発現を誘導する遺伝子エレメントの転写制御下に配置される。この方法は、未分化細胞の割合を極めて小さくするように設計された負の選択法である。この手法を、さまざまな種類のポジティブ選択法と結びつけることで、未分化細胞を本質的に含まない、所望の組織型の比較的純粋な集団が得られる。
【００３６】
本発明の非制限的な検証法として、ヒト胚性幹（hES）細胞に、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子がヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）のプロモーター配列の制御下に配置されたアデノウイルスベクター（TPAC）が導入されている。hES細胞はhTERTを構成的に発現するが、この能力は分化した状態では失われる。実施例10（図6〜8）は、TPACベクターをhES細胞に導入することで、未分化細胞がチミジンキナーゼの基質であるプロドラッグのガンシクロビルによる致死的作用に約20 μMの濃度で感受性をもつようになることを示している。実施例11（図9）は、hES細胞にTPACベクターを導入してDMSOで分化させると、OCT-4の検出可能な発現（未分化細胞の表現型）のみられる生存細胞が消失することを示している。
【００３７】
本発明の方法は部分的には、ヒトを対象とした治療に良好な特徴を有する細胞集団を提供するように設計されている。未分化細胞を枯渇させた後には、分化した集団は、優れた機能性および移植特性をもち、また処置を行った被験者で望ましくない組織構造および悪性状態を生じるリスクが低くなることが期待される。また、未分化細胞が枯渇した細胞集団はより均一である。これは抗体産生、cDNAライブラリー、および候補薬剤のスクリーニングなどの非治療的応用上、際だつ利点である。
【００３８】
定義
プロトタイプの「霊長類多能性幹細胞」（pPS細胞）は、8〜12週齢のSCIDマウスにおける奇形腫形成能力の確認といった、当技術分野で受け入れられている標準的な試験法にしたがって、授精後の任意の時点で、適切な条件において前胚性組織、胚組織、または胎児組織から採取され、3種類の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）のすべてに由来する多種多様な細胞の子孫を産生するという特徴を有する多能性細胞である。
【００３９】
pPS細胞の定義には多種多様な胚細胞が含まれ、代表的な細胞には、Thomsonら（Science 282：1145、1998）に記載されたヒト胚性幹（hES）細胞；他の霊長類の胚性幹細胞（アカゲザルの幹細胞（Thomsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844、1995）、マーモセットの幹細胞（Thomsonら、Biol.Reprod. 55：254、1996）、およびヒトの胚性生殖（hEG）細胞（Shamblottら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726、1998））などがある。他の種類の多能性細胞もこの定義に含まれる。全3種類の胚葉の誘導体である子孫を産生可能な霊長類起源起源の任意の細胞は、胚組織、胎児組織、または他の供給源に、その由来にかかわらず含まれる。本発明は、悪性供給源に由来しないpPS細胞に関する。細胞の核型は正常であることが望ましいが、必ずしも正常である必要はない。
【００４０】
pPS細胞培養物は、集団中における幹細胞およびその派生物の実質的な割合が未分化細胞の形態学的特徴を示して、胚起源または成体起源の分化細胞と明瞭に区別される場合に「未分化」であると表現される。未分化pPS細胞は当業者によって容易に認識され、典型的には核/細胞質比が高く、核小体が顕著な細胞のコロニー中で2次元の顕微鏡像として観察される。集団中の未分化細胞のコロニーは、近傍の分化細胞に囲まれることが多いと理解されている。これにもかかわらず、集団が適切な条件で培養されたり継代されたりする場合に未分化のコロニーは維持され、また個々の未分化細胞は、多くの割合の細胞集団から構成される。実質的に未分化な培養物は、少なくとも20%の未分化なpPS細胞を含み、また選択性を高めるために少なくとも40%、60%、または80%を含む場合がある。培養物または細胞集団が本開示において「分化せずに」増殖すると表現される場合は、増殖後に組成物が上記の記述にしたがって実質的に未分化な状態であることを常に意味する。
【００４１】
「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、別の種類の細胞と同時に培養されて、第二の種類の細胞の成長を可能とする環境を提供する、ある種の細胞を表すために用いられる表現である。フィーダー細胞は任意選択であり、それを支持する細胞としてさまざまな種に由来する。例えばある種のpPS細胞は、本開示で後述するように、一次マウス胚性線維芽細胞、不死化されたマウス胚性線維芽細胞、またはhES細胞から分化したヒト線維芽細胞様細胞によって支持される場合がある。pPS細胞集団は、細胞が、新鮮なフィーダー細胞がpPSの成長を支持するために添加されずに分割された後に少なくとも1回成長した場合に、フィーダー細胞を「本質的に含まない」と表現される。フィーダー細胞を本質的に含まない培養物は約5%未満のフィーダー細胞しか含まない。培養物または細胞集団が本開示で「フィーダーフリー」と表現される場合は、組成物が、上記の定義によるフィーダー細胞を本質的に含まないことを常に意味し、明確に必要とされる別の制約条件のみを受ける。
【００４２】
「胚様体」という表現は、当技術分野で「凝集体」と同義の表現である。この表現は、pPS細胞を単層培養物中で成長させたときに現れる、または懸濁培養物中に維持される分化細胞および未分化細胞の凝集体を意味する。胚様体は、さまざまな種類の細胞、典型的には形態学的基準で区別可能な複数の胚葉に由来する混合物である。
【００４３】
「系列が決定された前駆細胞」、「系列が限定された前駆細胞」、および「発生系列が限定された細胞」という表現はいずれも、増殖および多種多様な細胞への分化が可能な細胞を意味し、その範囲は典型的には、全3種類の胚葉の子孫となりうる胚起源の多能性幹細胞と比べて限定される。系列が決定された前駆細胞の非制限的な例には、さまざまな血液細胞に分化可能な造血細胞；胆管上皮細胞および肝細胞に分化可能な肝細胞前駆体；ならびに間葉系幹細胞などがある。別の例には、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトに進むグリア細胞前駆体、ならびにニューロンに進むニューロン前駆体を産生可能な神経限定細胞などがある。
【００４４】
この記述の意味では「幹細胞」という表現は、多能性幹細胞、または系列が決定された前駆細胞（いずれも上述）のいずれかを意味する場合がある。幹細胞は最低でも、複数の異なる表現型の細胞を増殖して形成する能力を有し、同じ培養物の一部として、または異なる条件で培養した場合のいずれかにおいて自己再生能力ももつ。胚性幹細胞は酵素テロメラーゼについて陽性であると判断される。
【００４５】
本開示に使用される「分化した」および「未分化の」という表現は、使用される文脈に依存する相対する表現である。具体的には、特定の種類の自己再生性幹細胞に関し「未分化」という表現は同じ自己再生性の幹細胞を意味するが、「分化した」という表現は形態学的基準、抗原マーカー、および遺伝子転写物で区別されるように、幹細胞が発現する場合のある比較的成熟した表現型を意味する。未分化のpPS細胞は、3種類すべての胚葉に分化する能力を有する。胚葉から分化した細胞は分化せず、また当業者によって形態学的基準により容易に認識される。
【００４６】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という表現は、任意の長さのヌクレオチドの重合体を意味する。この表現には、遺伝子および遺伝子断片、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離されたDNAおよびRNA、核酸プローブ、ならびにプライマーが含まれる。本開示に使用されるように、ポリヌクレオチドという表現は、2本鎖分子および1本鎖分子を相互転換可能に意味する。特に断らない限り、または必要がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の態様は、2本鎖状態、および二つの相補的な1本鎖状態のそれぞれが2本鎖状態を作ることが既知あるいは推定される2本の相補的な1本鎖状態を含む。ホスホラミデートやチオホスホラミデートなどの核酸類似体は、この表現に含まれる。
【００４７】
細胞は、ポリヌクレオチドが、人工的操作の任意の適切な手段で細胞内に移された場合に、または細胞が、ポリヌクレオチドを遺伝した細胞が当初変化した細胞の子孫である場合に「遺伝的に改変された」、「トランスフェクトされた」、または「遺伝的に形質転換された」と表現される。ポリヌクレオチドは、細胞に高レベルのタンパク質を発現させることを可能とする対象タンパク質をコードする転写可能な配列を含む場合がある。遺伝的変化は、変化した細胞の子孫が同じ変化を有している場合に「遺伝可能である」と表現される。
【００４８】
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解といった、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子間相互作用に関与するヌクレオチド配列である。転写制御エレメントには、プロモーター、エンハンサー、およびリプレッサーなどが含まれる。
【００４９】
「TERTプロモーター」または「OCT-4プロモーター」のようなプロモーターと呼ばれる特定の遺伝子配列は、機能的に連結された遺伝子発現産物の転写を促進する遺伝子と呼ばれる遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列である。上流およびイントロンのような非翻訳遺伝子配列のさまざまな部分が状況によってはプロモーター活性に寄与すること、およびこのような部分の全体または一部が遺伝子工学的に作製されたコンストラクト中に存在する可能性があることが認識されている。プロモーターは、明確な制限を受けない限り、遺伝子を有する任意の種の遺伝子配列を基礎とする場合があり、また標的組織内で転写を促進する能力がある限りは、望ましい付加、置換、または欠失を組み入れる場合がある。ヒトを対象とした治療目的で設計された遺伝子コンストラクトは、ヒト遺伝子のプロモーター配列と少なくとも90%が同一なセグメントを通常含む。特定の配列は、活性および特異性について、例えばレポーター遺伝子に機能的に連結させることで検討することができる（実施例9）。
【００５０】
遺伝子エレメントは、予期される機能にしたがって作動可能なように構造的に関連している場合に「機能的に連結された」と表現される。例えばプロモーターがコード配列の転写の開始を促す場合、コード配列は、プロモーターに機能的に連結された、またはプロモーターの制御下にあると表現することができる。機能的な関係が維持される限りは、プロモーターとコード配列との間に介在配列が存在する場合がある。
【００５１】
コード配列、プロモーター、および他の遺伝子エレメントに関して「異種」という表現は、対象エレメントが、比較対象の残りの部分とは遺伝子型的に異なる部分に由来することを意味する。例えば遺伝子工学的手法でさまざまな種類の動物に導入されるプロモーターまたは遺伝子は、異種ポリヌクレオチドと表現される。「内因性」の遺伝子エレメントは、自然界に存在する場合と染色体上の同じ位置にあるエレメントであるが、他のエレメントが近位に人工的に導入される場合がある。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という表現は、任意の長さのアミノ酸の重合体を意味するように本開示では互換的に使用される。このような重合体は修飾されたアミノ酸を含む場合があるが、これは直鎖状の場合もあれば分枝状の場合もあり、また非アミノ酸が割り込む場合もある。
【００５３】
一般的手法
実施者は、本発明の実施に有用な一般的手法をさらに詳しく理解するために、細胞生物学、組織培養法、および発生学の標準的な教科書および総説を参照するとよい。これには「奇形腫および胚性幹細胞：実用的アプローチ（Teratocarcinomas and and embryonic stem cells：A practical approach）」（E.J.Robertson編、IRL Press社、1987）；「マウス発生技術のガイド（Guide to Techniques in Mouse Development）」（P.M.Wassermanら編、Academic Press、1993）；「インビトロにおける胚性幹細胞の分化（Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro）」（M.V.Wiles、Meth.Enzymol. 225：900、1993）；「胚性幹細胞の特性および使用：ヒト生物学および遺伝子治療への適用の可能性（Properties and uses of Embryonic Stem Cells：Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy）」（P.D.Rathjenら、Reprod.Fertil.Dev. 10：31、1998）などが含まれる。幹細胞の分化については、Robertson、Meth.Cell Biol. 75：173、1997；およびPedersen、Reprod.Fertil.Dev. 10：31、1998で概説されている。
【００５４】
分子遺伝学および遺伝子工学的な方法は一般に、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」（Sambrookら）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（MJ.Gait編）；「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」（R.I.Freshney、編）；「哺乳動物細胞のための遺伝子輸送ベクター（Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells）」（MillerおよびCalos編）；「分子生物学の最新プロトコルおよび分子生物学の短縮プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology）」、第3版（P.M.Ausubelら編）；および「組換えＤＮＡ方法論（Recombinant DNA Methodology）」（R.Wu編、Academic Press）の最新版に記載されている。本開示で言及された遺伝的操作に使用する試薬、クローニングベクター、およびキットは業者（BioRad、Stratagene、Invitrogen、およびClonTechなど）から購入できる。
【００５５】
細胞培養および培地回収の一般的な手法は、「哺乳動物細胞の大規模培養（Large Scale Mammalian Cell Culture）」（Huら、Curr.Opin.Biotechnol. 8：148、1997）；「無血清培地（Serum-free Media）」（K.Kitano、Biotechnology 17：73、1991）；「哺乳動物細胞の大規模培養（Large Scale Mammalian Cell Culture）」（Curr.Opin.Biotechnol. 2：375、1991）；および「哺乳動物細胞の懸濁培養液（Suspension Culture of Mammalian Cells）」（Birch ら、Bioprocess Technol. 19：251、1990）で概説されている。培地、および培地が培養環境に及ぼす影響に関する他の知見は、Marshall McLuhanおよびFred Allenによって報告されている。
【００５６】
幹細胞の供給源
本発明は、以下の非制限的な例を含む場合がある、さまざまな種類の幹細胞を用いて実施することができる。
【００５７】
米国特許第5,851,832号では、脳組織から得られる多能性神経幹細胞について報告されている。米国特許第5,766,948号では、新生児の大脳半球に神経芽細胞を産生させる方法について報告されている。米国特許第5,654,183号および第5,849,553号では、哺乳類の神経冠幹細胞の使用について報告されている。米国特許第6,040,180号では、哺乳類の多能性CNS幹細胞の培養物に由来する分化したニューロンのインビトロにおける産生について報告されている。国際公開公報第98/50526号および国際公開公報第99/01159号では、神経上皮幹細胞、オリゴデンドロサイト-アストロサイト前駆体、および系列限定ニューロン前駆体の作製および単離について報告されている。米国特許第5,968,829号では、胚の前脳から得られ、グルコース、トランスフェリン、インスリン、セレン、プロゲステロン、および他の複数の成長因子を含む培地で培養された神経幹細胞について報告されている。
【００５８】
一次肝細胞培養物は、ヒトの生検で得られるほか、外科的に切除された組織から、コラゲナーゼとヒアルロニダーゼの適切な組み合わせで潅流することで得られる。あるいは欧州特許第0953633A1号では、細かく刻んだヒト肝組織を調製して肝細胞を単離し、濃縮した組織細胞を成長培地中に再懸濁し、培養物中で細胞を増殖させる方法について報告されている。この成長培地には、肝細胞を悪性形質転換することなく増殖させる、グルコース、インスリン、トランスフェリン、T3、FCS、およびさまざまな組織抽出物が含まれる。肝臓の細胞は、肝実質細胞、クッパー細胞、類洞内皮細胞、および胆管上皮細胞、さらには成熟肝細胞、または胆道上皮細胞の両方への分化能力を有する前駆細胞（「肝芽細胞」または「円形細胞」と呼ばれる）も含む特殊な細胞を含むと考えられている（L.E.Rogler、Am.J.Pathol. 150：591、1997；M.Alison、Current Opin.Cell Biol. 10：710、1998；ら、Cancer Res. 58：514、1998）。
【００５９】
米国特許第5,192,553号では、ヒトの新生児または胎児の造血幹細胞または前駆細胞を単離する方法について報告されている。米国特許第5,716,827号では、Thy-1陽性の子孫であるヒト造血細胞、およびこれらをインビトロで再生させる適切な成長培地について報告されている。米国特許第5,635,387号では、ヒト造血細胞および前駆体を培養する方法および装置について報告されている。米国特許第6,015,554号では、ヒトリンパ細胞および樹状細胞を再構成する方向が説明されている。
【００６０】
米国特許第5,486,359号では、ヒト間葉系幹細胞の均一集団が、複数の結合組織の種類（骨、軟骨、腱、靱帯、および表皮など）の細胞に分化可能なことが報告されている。これらは骨髄または骨膜から得られる。間葉系幹細胞の増殖に使用される培養条件についても報告されている。国際公開公報第99/01145号では、G-CSFやGM-CSFなどの成長因子の処置を受けた被験者の末梢血液から単離されたヒト間葉系幹細胞について報告されている。国際公開公報第00/53795号では、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない脂肪由来幹細胞および格子について報告されている。これらの細胞は、増殖および培養して、ホルモンおよび、馴化培地を産生可能なことが報告されている。
【００６１】
本発明は、任意の脊椎動物種の幹細胞を用いて実施することができる。これにはヒトに由来する幹細胞が含まれるほか、非ヒト霊長類、家畜、および他の非ヒト哺乳動物に由来する幹細胞も含まれる。
【００６２】
本発明における使用に適した幹細胞のなかには、妊娠後に形成される組織（胚盤胞など）、または妊娠期間中に採取される胎児もしくは胚の組織に由来する、霊長類の多能性幹（pPS）細胞が含まれる。非制限的な例には、一次培養物または樹立胚性幹細胞系列がある。
【００６３】
培地およびフィーダー細胞
pPS細胞を単離して増殖させるための培地は、得られる細胞が所望の特徴をもち、さらに増殖可能な限りにおいて、任意の多種多様な組成とすることができる。適切な供給源は以下の通りである：ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、Gibco #11965-092；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（KO DMEM）、Gibco #10829-018；200 mM L-グルタミン、Gibco #15039-027；非必須アミノ酸溶液、Gibco 11140-050；β-メルカプトエタノール、Sigma #M7522；ヒト組換え体塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、Gibco #13256-029。例示的な血清含有ES培地は、80% DMEM（通常KO DMEM）、20% 規定ウシ胎児血清（FBS；加熱不活性化されていないもの）、0.1 mM 非必須アミノ酸、1 mM L-グルタミン、および0.1 mM β-メルカプトエタノールから作製される。この培地は濾過して4℃で最長2週間保存される。無血清ES培地は、80% KO DMEM、20%血清代替添加物、0.1 mM 非必須アミノ酸、1 mM L-グルタミン、および0.1 mM β-メルカプトエタノールから作製される。有効な血清代替添加物はGibco #10828-028である。この培地は濾過して4℃で最長2週間保存される。使用直前にヒトbFGFを添加して最終濃度を4 ng/mLとする（Bodnarら、Geron社、国際公開公報第99/20741号）。
【００６４】
フィーダー細胞（使用時）は、90% DMEM （Gibco #11965-092）、10% FBS （Hyclone #30071-03）、および2 mM グルタミンを含むmEF培地中で増殖させる。mEFはT150フラスコ（Corning #430825）中で増殖させ、1日おきにトリプシン処理して細胞を1：2に分け、細胞をサブコンフルエントな状態に維持する。フィーダー細胞層の調製時には、増殖を抑制するが、hES細胞を支持する重要な因子の合成を可能とする線量の放射線を細胞に照射する（約4000ラドのガンマ線）。6ウェル培養プレート（Falcon #304など）を、1ウェルあたり1 mLの0.5%ゼラチンを加えて37℃で一晩インキュベートしてコーティングを行い、1ウェルあたり375,000個の照射mEFをプレーティングする。フィーダー細胞層は通常、プレーティングしてから5時間〜4日以内に使用する。培地は、pPS細胞を播種する直前に新鮮なhES培地と交換する。
【００６５】
他の幹細胞を培養する条件も知られており、細胞の種類に準じて適切に最適化することができる。上述した、特定の種類の細胞の培地および培養法は引用文献に記載されている。
【００６６】
胚性幹細胞
胚性幹細胞は霊長類種の胚盤胞から単離可能である（Thomsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844、1995）。ヒト胚性幹（hES）細胞は、Thomsonら（米国特許第5,843,780号；Science 282：1145、1998；Curr.Top.Dev.Biol. 38：133 ff.、1998）、およびReubinoffら、Nature Biotech. 18：399、2000に記載された手法でヒト胚盤胞細胞から調製することができる。
【００６７】
簡単に説明すると、ヒト胚盤胞は、ヒトのインビボ着床前胚から得られる。あるいは体外受精（IVF）胚を使用できるほか、一つの細胞のヒト胚を胚盤胞期まで増殖させることができる（Bongsoら、Hum Reprod 4：706、1989）。ヒト胚はG1.2培地およびG2.2培地中で胚盤胞期まで培養する（Gardnerら、Fertil.Steril. 69：84、1998）。発生する胚盤胞を対象に、ES細胞が単離されるものを選択する。透明帯は、プロナーゼ（Sigma）で短時間処理して胚盤胞から除去する。内部細胞塊は免疫手術で単離し、ウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清の1：50希釈液に胚盤胞を30分間曝露させた後に、DMEMで3回各5分間洗浄し、モルモットの補体（Gibco）の1：5希釈液に3分間曝露させる（Solterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：5099、1975を参照）。さらに2回DMEMで洗浄した後に、溶解した栄養外胚葉細胞を、完全な内部細胞塊（ICM）から穏やかにピペッティングして除去し、ICMをmEFフィーダー層上にプレーティングする。
【００６８】
9〜15日後、内部細胞塊由来の成長塊を、カルシウムおよびマグネシウムを含まない、1 mM EDTAを加えたリン酸緩衝食塩水（PBS）に曝露するか、もしくはディスパーゼもしくはトリプシンに曝露するか、またはマイクロピペットで機械的に解離するいずれかの方法で凝集塊に解離した後に、新鮮な培地中のmEF上に再びプレーティングする。解離した細胞を再び新鮮なES培地中のmEFフィーダー層にプレーティングし、コロニーの形成を観察する。未分化の形態を示すコロニーをマイクロピペットで個別に選択し、機械的に凝集塊に解離して再びプレーティングする。ES様の形態の特徴は、見かけ上高い核-細胞質比を有し、核小体が顕著なコンパクトなコロニーである。結果として得られるES細胞を次に、常用の方法で1〜2週間毎に短時間トリプシン処理して分け、ダルベッコPBS（2 mM EDTAを含み、カルシウムまたはマグネシウムを含まない）に曝露させ、IV型コラゲナーゼ（約200 U/mL；Gibco）に曝露させるか、または個々のコロニーをマイクロピペットで選択する。約50〜100細胞からなる凝集塊が最適である。
【００６９】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（hEG）細胞は、最終月経の約8〜11週後に採取されるヒト胎児材料中に存在する一次生殖細胞から調製することができる。適切な調製法はShamblottら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726、1998、および米国特許第6,090,622号に記載されている。
【００７０】
簡単に説明すると、生殖隆起を等張性緩衝液で洗浄後に、0.1 mLの0.05% トリプシン/0.53 mM EDTAナトリウム溶液（BRL）中に移し、1 mm3未満の小片に切り分ける。この組織を次に100 μLのチップを介してピペットで吸い取り、さらに細胞をバラバラにする。約37℃で5分間インキュベートした後に、約3.5 mLのEG成長培地を添加する。EG成長培地はDMEM、4500 mg/L D-グルコース、2200 mg/L mM炭酸水素ナトリウム；15% ES認可ウシ胎児血清（BRL；安全性確認済み）；2 mM グルタミン（BRL）；1 mM ピルビン酸ナトリウム（BRL）；1000〜2000 U/mL ヒト組換え白血病抑制因子（LIF、Genzyme）；1〜2 ng/ml ヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、Genzyme）；および10 μM フォルスコリン（溶媒は10% DMSO）である。別のアプローチでは、EG細胞をヒアルロニダーゼ/コラゲナーゼ/DNAseを用いて単離する。生殖巣原基（gonadal anlagen）または腸間膜を伴う生殖隆起を胎児材料から切除し、生殖隆起をPBSで洗浄後に、0.1 mlのHCD消化液（0.01% V型ヒアルロニダーゼ、0.002% DNAseI、0.1% IV型コラゲナーゼ、いずれもEG成長培地中で調製したもの；Sigma製）に移す。組織を細かく刻み、1時間または一晩37℃でインキュベートし、1〜3 mLのEG成長培地中に再懸濁し、フィーダー層上にプレーティングする。
【００７１】
96ウェル組織培養プレートは、5000ラドのガンマ線を照射して不活性化した、LIF、bFGF、またはフォルスコリンを含まない改変EG成長培地中で3日間培養したサブコンフルエントな層のフィーダー細胞を用いて調製する。適切なフィーダーはSTO細胞（ATCCアクセッション番号CRL 1503）である。約0.2 mLの一次生殖細胞（PGC）懸濁物を各ウェルに添加する。最初の継代は7〜10日後にEG成長培地中で行い、各ウェルを、照射処理したSTOマウス線維芽細胞を事前に調製しておいた24ウェル培養ディッシュの一つのウェルに移す。この細胞を毎日培地を交換して、EG細胞と一致する細胞の形態が観察されるまで、通常7〜30日後まで、または1〜4回の継代培養する。
【００７２】
未分化状態でのpPS細胞の増殖
pPS細胞は、分化を促進することなく増殖を促す培養条件を組み合わせることで連続的に培養物中で増殖させることができる。
【００７３】
従来の方法でpPS細胞を、フィーダー細胞、典型的には線維芽細胞（場合によっては胚または胎児組織に由来する細胞）の層上で培養する。この細胞系列を、ほぼコンフルエントになるまでプレーティングし、通常は放射線を照射して増殖を妨げた後に、pPS細胞培養物の支持に使用する。
【００７４】
一例では、pPS細胞を最初に採取し、一次胚性線維芽細胞を支持させる。マウス胚性線維芽細胞（mEF）は、非近交系CF1マウス（SASCO）、または他の適切な系統から得られる。妊娠13日目のマウスの腹部を70%エタノールでぬぐい、脱落膜をリン酸緩衝食塩水（PBS）中に移す。胚を回収し、胎盤、膜、および軟組織を除去し、脱落膜をPBSで2回洗浄する。次に2 mLのトリプシン/EDTAを含む新鮮な10 cmの細菌用ディッシュに移し、細かく切り刻む。37℃で5分間インキュベートした後に、10%ウシ血清（FBS）を含む5 mLのDMEMでトリプシンを不活性化し、混合物を15 mLの円錐管に移して遊離させる。細片を2分間かけて沈降させ、上清を最終容量10 mLにして、10 cm組織培養プレートまたはT75フラスコにプレーティングする。フラスコを静かに24時間インキュベートした後に培地を交換する。フラスコがコンフルエントになったら（約2〜3日）、新しいフラスコに1：2に分ける。
【００７５】
Geron社の研究者たちは、hPS細胞が、フィーダー細胞を添加しなくとも未分化の状態で維持可能であることを見出した。フィーダーフリーの培養物の環境は、基底膜に由来することがあり、または接着性分子受容体-リガンドカップリングの一部を形成する場合のある適切な培養基質、特に細胞外マトリックスを含む。適切な調製物はBecton DickensonからMatrigel（登録商標）の名称で入手することができる。他の細胞外マトリックス成分および成分混合物は代替物として適している。増殖させる細胞の種類に依存して、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、硫酸ヘパランなどを単独で、またはさまざまな組み合わせで含む場合がある。ラミニンは、α6β1やα6β4（ラミニン特異的）などのインテグリンヘテロ二量体、および他のヘテロ二量体（他のマトリックスと交差反応するもの）と相互作用する、脊椎動物のあらゆる基底層の主成分である。
【００７６】
多能性幹細胞を、適切な分布で、また細胞の生存、増殖、および望ましい特徴の保持を促す培地の存在下で基質上にプレーティングする。少なくとも細胞約15,000個/cm2（典型的には90,000〜170,000/cm2）のプレーティング密度が生存を促進し分化を制限することがわかっている。フィーダーの非存在下におけるpPS細胞の継代は、pPS細胞を小さなクラスターで調製できるという利点がある。典型的には、酵素による切断は細胞が完全に分散する前に停止させる（例えばコラゲナーゼIVで約5分）。約10〜2000個の細胞の凝集塊を次に、さらに分散させることなく基質上に直接プレーティングする。あるいは霊長類のPS細胞は、適切な酵素および培地が提供される場合には、精細な細胞懸濁物としてフィーダーフリー培養物間で継代可能であり、プレーティング密度は十分高い。説明目的において、フィーダーの非存在下で培養されたコンフルエントなヒト胚性幹細胞は、0.05%（wt/vol）のトリプシン（Gibco）および0.053 mM EDTAの溶液と37℃で5〜15分間インキュベートすることでプレートから除去する。ピペットを用いることで、プレートに残った細胞を除いて、細胞が、1個の細胞および複数の小さなクラスターを含む懸濁物中に分散するまで細胞をピペットで摩砕する。次に細胞を50,000〜200,000個/cm2の密度でプレーティングすることで生存を促進して分化を制限する。この手法で継代されるES細胞の表現型は、コラーゲンによる消化によって細胞をクラスターとして回収したときに観察される表現型と似ている。別の選択肢として、プレートがコンフルエントになる前に、酵素を使用せずに細胞を回収することができる。細胞を、PBS中に0.5 mM EDTAのみを含む溶液中で約5分間インキュベートし、培養器から洗い出した後に、さらに分散させることなく新しい培養物中にプレーティングする。
【００７７】
新鮮なフィーダー細胞の非存在下でプレーティングしたpPS細胞には、栄養培地中で培養されるという利点がある。培地は一般に、等張性緩衝液、必須ミネラル、および血清または数種の血清代替添加物のいずれかを含む細胞の生存を促す通常の成分を含む。馴化培地は、放射線を照射した一次マウス胚性線維芽細胞（または別の適切な細胞調製物）を、20%血清代替添加物および4 ng/mL 塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を添加したKO DMEMなどの無血清培地中で約5〜6×104/cm2の密度で培養して調製することができる。培養上清は37℃で約1日後に回収する。
【００７８】
一次マウス線維芽細胞培養物の代替物として、馴化培地を、培地を適切に調節する能力を検討するための胚性線維芽細胞系列から調製することができる。このような系列には任意選択でテロメラーゼ逆転写酵素をトランスフェクトして、複製能力を高めることができる。別の可能な供給源には、線維芽細胞の形態学的特徴を有する分化したpPS細胞がある。pPS細胞は、非接着性細胞培養プレート（細胞約2×106個/9.6 cm2）を用いて分化用培地中に凝集物として培養された懸濁物である。2日後に凝集物をゼラチンコーティングプレートに移し、約11日後に線維芽細胞様細胞が混合集団中の100〜1000個の細胞のクラスター中に現れる。短時間コラゲナーゼで処理した後に、線維芽細胞様細胞を顕微鏡下で採取し、mEF培地に継代し、またES培地の条件を整える能力を検討することができる。
【００７９】
1〜2日間で条件が整えられた培地は通常、pPS細胞培養物を1〜2日支持するために使用した後に交換する。望ましい場合、馴化培地には、pPS細胞培養物に有益な別の成長因子を使用前に添加することができる。hESの場合、bFGFまたはFGF-4のような成長因子を使用することができる。hEGの場合は、培地には成長因子（bFGFなど）、gp130の誘導因子（LIFまたはOncostatin-Mなど）、また場合によっては環状AMP濃度を高める因子（フォルスコリンなど）を添加することができる。
【００８０】
未分化pPS細胞の特徴
2次元の標準的な顕微鏡像では、hES細胞は、画像の平面上で高い核/細胞質比を示し、顕著な核小体がみられ、また細胞結合の区別が難しいコンパクトなコロニー形成を有する。細胞系列は、標準的なG-バンド法（Cytogenetics Lab （Oakland CA）などの常用の核型決定サービスを提供する多くの臨床検査室で入手可能）で核型を決定して、公表済みのヒト核型と比較することができる。
【００８１】
hES細胞およびhEG細胞はまた、発現された細胞マーカーで特性を決定することができる。一般に本開示で説明される組織特異的マーカーは、膜結合型マーカーに対するフローサイトメトリー、細胞内マーカーに対する免疫組織化学的方法、および培地中に放出されるマーカーに対する酵素結合免疫アッセイ法などの適切な免疫学的手法で検出することができる。タンパク質マーカーの発現は、マーカー特異的なプライマーを用いた逆転写酵素PCR法でmRNAレベルで検出することもできる。これについては米国特許第5,843,780号で詳述されている。
【００８２】
段階特異的な胚抗原（SSEA）は、ある種の胚性細胞種の特徴である。SSEAマーカーに対する抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bank（Bethesda MD）から入手することができる。他の有用なマーカーは、Tra-1-60およびTra-1-81などの抗体（Andrewsら、「ヒト胚細胞由来の細胞系列（Cell Lines from Human Germ Cell Tumors）」、E.J.Robertson、1987、前掲）を用いて検出される。hES細胞は典型的にはSSEA-1陰性でSSEA-4陽性である。hEG細胞は典型的にはSSEA-1陽性である。pPS細胞をインビトロで分化させることで、SSEA-4、Tra-1-60、およびTra-1-81の発現が消失し、SSEA-1の発現が上昇する。pPS細胞はまた製造業者（Vector Laboratories、Burlingame CA）により説明されているように、細胞を4%パラホルムアルデヒドに固定化した後に、基質としてVector Redを反応させることで検出可能なアルカリホスファターゼ活性の存在によって特性を解析することができる。
【００８３】
胚性幹細胞は通常、テロメラーゼ陽性でOCT-4陽性でもある。テロメラーゼ活性は、TRAP活性アッセイ法（Kimら、Science 266：2011、1997）で市販のキット（TRAPeze（登録商標） XK Telomerase Detection Kit、カタログ番号s7707；Intergen社、Purchase NY；またはTeloTAGGG（商標） Telomerase PCR ELISAplus、カタログ番号2,013,89；Roche Diagnostics、Indianapolis）を用いて決定することができる。hTERTの発現は、RT-PCR法でmRNAレベルで評価することもできる。LightCycler TeloTAGGG（商標） hTERT定量キット（カタログ番号3,012,344；Roche Diagnostics）は研究目的で市販品を入手することができる。
【００８４】
分化するpPS細胞
pPSの分化は、最初に胚様体を形成させることで開始することができる。胚様体を培養する基本原理は、O'Shea、Anat.Rec.（New Anat. 257：323、1999）で報告されている。pPS細胞を、凝集体が形成可能な方法で培養するが、方法には以下の多くの選択肢がある：例えばドナーのpPS細胞培養物を成長させる方法、またはpPS細胞を、EB形成を可能とする低接着性基質を含む培養容器中で培養する方法）。胚様体は懸濁培養物中で作製することもできる。pPS細胞は、短時間コラゲナーゼで消化し、クラスターに解離し、また非接着性の細胞培養プレートにプレーティングすることで回収する。凝集物には数日毎に栄養分を供給し、適切な期間（通常4〜8日）後に回収する。次に細胞を培地中で、および/または特定系列の細胞の濃縮を促す基質上で培養することができる。基質は、マトリックス産生細胞系列（線維芽細胞や内皮細胞系列など）を最初に培養した後に、マトリックスが容器表面に結合した状態を維持するように溶解させて洗浄することで、Matrigel（登録商標）（Becton Dickenson）、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、またはマトリックス-産生細胞系列（線維芽細胞や内皮細胞系列）などのマトリックス成分を含む場合がある。胚様体は、可能であれば内胚葉を外側に、また中胚葉および外胚葉を内側にもつような異種細胞集団を含む。
【００８５】
Geron社の研究者たちは、pPS細胞が、系列が決定された前駆細胞、または最終分化細胞に、中間段階として胚様体すなわち凝集物を形成することなく分化可能であることを見出した。簡単に説明すると、未分化pPS細胞の懸濁物を調製後に、分化を促進する固体表面上にプレーティングする。適切な基質には、接着性のガラス製またはプラスチック製の表面などがある。例えばガラス製のカバーガラスを、ポリリシン、ポリオルニチンのようなポリアミン、もしくは他の均一もしくは混合状態のポリペプチドなどのポリカチオン物質、または顕著な正電荷を有する他の重合体でコーティングすることができる。次に細胞を、所望の細胞系列へ分化を促すように適合させた適切な栄養培地中で培養する。
【００８６】
環境によっては、培地から血清または血清代替添加物を除くことで、分化がさらに促進される。これは、例えば再プレーティング時に、血清または血清代替添加物を含まない培地と交換することで達成できる。本発明のある態様では、未分化細胞の成長を促進する、または分化阻害物質として作用する一種または複数の培地成分を除去することで分化が促進される。このような成分の例には、ある種の成長因子、分裂促進因子、白血病抑制因子（LIF）、および塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）などがある。分化は、分化を所望の細胞系列へ促す培地成分、または望ましくない特徴を有する細胞の成長を阻害する培地成分を添加することで促進される場合もある。例えばニューロン系列またはグリア系列に系列が決定される細胞を作る際には、培地に以下の任意の因子、または培地成分を有効な組み合わせで含めるとよい：脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、NT-4、上皮成長因子（EGF）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、神経成長因子（NGF）、レチノイン酸（RA）、ソニックヘッジホッグ、FGF-8、アスコルビン酸、フォルスコリン、ウシ胎児血清（FBS）、および骨形成タンパク質（BMP）。
【００８７】
多能性幹細胞から組織細胞を得るための一般原理は、Pedersen（Reprod.Fertil.Dev. 6：543、1994）、および米国特許第6,090,622号で概説されている。対象となる他の出版物には以下のようなものがある：ニューロン前駆体、神経限定細胞、およびグリア細胞前駆体については、Bainら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 200：1252、1994；Trojanowskiら、Exp.Neurol. 144：92、1997；Wojcikら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1305〜130；および米国特許第5,851,832号、第5,928,947号、第5,766,948号、および第5,849,553号を参照されたい。心筋および心筋細胞については、Chenら、Dev.Dynamics 197：217、1993、およびWobusら、Differentiation 48：173、1991を参照されたい。造血前駆細胞については、Burkertら、New Biol. 3：698、1991、およびBieseckerら、Exp.Hematol. 21：774、1993を参照されたい。米国特許第5,773,255号は、グルコース-反応性のインスリン分泌膵β細胞系列に関する。米国特許第5,789,246号は、肝細胞の前駆細胞に関する。対象となる他の前駆体には、軟骨細胞、骨芽細胞、網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、角質細胞などの皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、腎尿細管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、精巣前駆体、および血管内皮細胞などがあるがこれらに限定されない。
【００８８】
Geron社の研究者たちは、成長因子受容体に結合するリガンドの存在下でpPS細胞または胚様体細胞を培養すると、神経前駆細胞の濃縮が促進されることを見出した。成長環境は、神経細胞を支持する細胞外マトリックス（フィブロネクチンなど）を含む場合がある。適切な成長因子には、EGF、bFGF、PDGF、IGF-1、およびこれらのリガンドに対する受容体に対する抗体などがあるがこれらに限定されない。次に培養細胞を、A2B5などのマーカーを発現するか否かに着目して任意選択で分離することができる。適切な環境下では、A2B5マーカーの発現を指標に濃縮された細胞集団は、ニューロン細胞（成熟ニューロンを含む）、ならびにグリア細胞（アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含む）の両方の産生能力を有する場合がある。任意選択で、このような細胞集団を、例えばcAMPの活性化因子を含む培地中で培養することでさらに分化させる。
【００８９】
Geron社の研究者たちは、肝細胞を分化させる試薬の存在下でpPS細胞または胚様体細胞を培養することが、肝細胞様細胞の濃縮を促すことを見出した。このような成長環境には、肝細胞を支持する細胞外マトリックス（コラーゲンやMatrigel（登録商標）など）が含まれる場合がある。適切な分化用薬剤には、酪酸塩およびn-酪酸塩に代表される類似体のさまざまな異性体が含まれる。培養細胞は任意選択で肝細胞成熟因子（ジメチルスルホキシド（DMSO）のような有機溶媒；成熟補因子（レチノイン酸など）；またはグルココルチコイド、上皮成長因子（EGF）、インスリン、TGF-α、TGF-β、線維芽細胞成長因子（FGF）、ヘパリン、肝細胞成長因子（HGF）、IL-1、IL-6、IGF-I、IGF-II、およびHBGF-1などのサイトカインもしくはホルモンなどと同時に、または連続的に培養される。
【００９０】
Geron社の研究者たちは、心筋細胞または心筋細胞前駆体を含む高度に濃縮された集団へhPS細胞を分化させることが可能なことも見出した。心筋細胞系列の細胞は例えばhES細胞を、DNAのメチル化に影響する心臓栄養因子（例えば5-アザシチジン）を含む成長環境中で分化させることで得られる。自然に収縮する細胞は次に、例えば密度遠心法により、集団中の他の細胞と分離することができる。別の過程には、クレアチン、カルニチン、またはタウリンを含む培地中で細胞を培養する段階が含まれる場合がある。あるいは、オステオカルシンおよびコラーゲン-1を発現する骨芽前駆細胞または骨芽細胞を含む高度に濃縮された集団にhPS細胞を分化させることが可能である。このような細胞は、pPS由来の間葉細胞を採取して、骨形成タンパク質（特にBMP-4）、ヒトTGF-β受容体のリガンド、またはヒトビタミンD受容体のリガンドを含む培地中で分化させることで得られる場合がある。
【００９１】
分化細胞の特徴
細胞は、表現型に関するいくつかの基準を元に特徴を決定することができる。基準には、形態学的特徴の決定、発現された細胞マーカーおよび酵素活性の検出または定量、およびインビボにおける細胞の機能特性の決定などが含まれるがこれらに限定されない。
【００９２】
神経細胞の対象マーカーには、ニューロンの特徴であるβ-チューブリンIIIまたは神経フィラメント；アストロサイトに存在するグリア繊維酸性タンパク質（GFAP）；オリゴデンドロサイトの特徴であるガラクトセレブロシド（GalC）もしくはミエリン塩基性タンパク質（MBP）；未分化hES細胞の特徴であるOCT-4；ニューロン前駆体および他の細胞の特徴であるネスチンなどがある。A2B5およびNCAMはそれぞれグリア前駆体およびニューロン前駆体の特徴である。細胞は、特徴的な生物活性物質の分泌について検討することもできる。例えばGABA分泌性ニューロンは、グルタミン酸デカルボキシラーゼまたはGABAの産生を元に同定することができる。ドーパミン作動性ニューロンは、ドーパデカルボキシラーゼ、ドーパミン、またはチロシンヒドロキシラーゼの産生を元に同定することができる。
【００９３】
肝細胞の対象マーカーには、α-フェトプロテイン（肝前駆体）；アルブミン、α1-アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、シトクロムp450活性、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質受容体、およびグリコーゲン貯蔵（肝細胞）；CK7、CK19、およびγ-グルタミルトランスフェラーゼ（胆管上皮）などがある。肝細胞の分化には転写因子HNF-4αが必要であることが報告されている（Liら、Genes Dev. 14：464、2000）。HNF-4α発現に依存しないマーカーには、α1-アンチトリプシン、α-フェトプロテイン、apoE、グルコキナーゼ、インスリン成長因子1および2、IGF-1受容体、インスリン受容体、ならびにレプチンなどがある。HNF-4αの発現に依存するマーカーには、アルブミン、apoAI、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、アルドラーゼB、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、L型脂肪酸結合タンパク質、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、およびエリトロポイエチン（EPO）などがある。
【００９４】
pPS細胞に由来する混合細胞集団中の細胞の種類は、特徴的な形態および発現されるマーカーによって認識される場合がある。骨格筋の場合、これはmyoD、ミオゲニン、およびmyf-5である。内皮細胞の場合、これはPECAM（血小板内皮細胞接着分子）、Flk-1、tie-1、tie-2、血管内皮（VE）カドヘリン、MECA-32、およびMEC-14.7である。平滑筋細胞の場合、これは特異的ミオシン重鎖である。心筋細胞の場合、これはGATA-4、Nkx2.5、心臓トロポニンI、α-ミオシン重鎖、およびANFである。膵細胞の場合、これはpdxおよびインスリンの分泌である。造血細胞およびその前駆体の場合、これはGATA-1、CD34、AC133、β-主要グロブリン、およびβ-主要グロブリン様遺伝子βH1である。
【００９５】
本開示に記載された、または当技術分野で周知の組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーに対するフローイムノサイトケミストリー（flow immunocytochemistry）、細胞内または細胞表面のマーカーに対する免疫組織化学的方法（例えば固定細胞または組織切片に対する方法）、細胞抽出物のウエスタンブロット解析、および細胞抽出物または培地中へ分泌される産物に対する酵素結合イムノアッセイ法などの免疫学的手法で検出することができる。組織特異的遺伝子産物の発現は、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション解析によって、または標準増幅法における配列特異的プライマーを用いる逆転写酵素で開始するポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によってmRNAレベルで検出することもできる。本開示に記載された特定マーカーの配列データは、GenBank（URL www.ncbi.nlm.nih.gov：80/entrez）などの公的データベースから得られる。
【００９６】
未分化細胞を本質的に含まない細胞集団の調製
本発明では、分化細胞集団は、未分化細胞で遺伝子を選択的に発現させる転写制御エレメントの制御下にある細胞に致死的な作用を及ぼす遺伝子、または外来薬剤による致死的作用に感受性をもたせる遺伝子を発現させることで、相対的に未分化な細胞を枯渇させる。
【００９７】
これを達成するためには、未分化細胞の負の選択に適したエフェクター遺伝子を、所望の特性をもつ転写制御エレメントの制御下に配置することで、治療目的の所望の系列に細胞を分化させるための過程の前または後に細胞を遺伝的に改変する。
【００９８】
負の選択に用いる転写制御エレメント
制御エレメントは、集団に含まれる未分化細胞および分化細胞のタンパク質の発現パターンを考慮して選択される。
【００９９】
所望の発現パターンを有する遺伝子は、二つの異なる細胞集団（分化細胞が比較的濃縮されている集団と、未分化細胞が比較的濃縮されている集団）における発現を、転写レベル、翻訳レベル、または機能レベルで比較することで同定可能である。適切な比較法には、cDNAライブラリーのサブトラクティブハイブリダイゼーション、およびmRNAレベルのマイクロアレイ解析などがある。適切な発現パターンを示す転写物が同定されたら、対応する遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーを用いて、負の選択用ベクターを構築することができる。
【０１００】
適切なマイクロアレイ解析は、Genetic Microsystemsのアレイ作製装置、およびAxon GenePix（商標） Scannerを用いて行われる。マイクロアレイは、96ウェルまたは384ウェルのフォーマットでcDNA断片を増幅させることで調製し、ガラススライド上に直接スポッティングする。二つの細胞集団に由来するmRNA調製物を比較する際には、一つの調製物をCy3標識cDNAに変換し、もう一つの調製物をCy5標識cDNAに変換する。2種のcDNA調製物について、マイクロアレイスライドに対して同時にハイブリダイズさせた後に、洗浄して非特異的な結合を除去する。アレイ上の任意のスポットは、個々のcDNA産物と、二つの元のmRNA調製物に含まれる転写物の量的な割合で結合する。次に、スライドを各標識に適した波長でスキャンしてmRNAの相対量を決定する。好ましくは、エフェクター遺伝子の発現レベルは、分化細胞と比較して未分化細胞では少なくとも5倍、またはさらには25倍高い。
【０１０１】
多能性胚細胞を枯渇させるために使用される例示的な制御エレメントは、テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）のプロモーターである。ヒトTERT遺伝子（上流のプロモーター配列を含む）の配列については後述する。また英国特許第GB2321642B号（Cechら、Geron社、およびU.Colorado）、国際公開公報第00/46355号（Morinら、Geron社）、国際公開公報第99/33998号（Hagenら、Bayer Aktiengesellschaft）、およびHorikawa、I.ら（Cancer Res.、59：826、1999）も参考となる。マウスTERT遺伝子の配列は、国際公開公報第99/27113号（Morinら、Geron社）に記載されている。hTERTコード配列の上流の約13,500塩基を含むλGφ5と命名されたラムダファージクローンはATCCから入手できる（アクセッション番号98505）。ベクター発現系におけるTERTプロモーター配列（配列番号：1）の検討法および使用については実施例9で説明する。
【０１０２】
別の例示的な制御エレメントは、POUファミリー転写因子のオクタマー結合転写因子4（OCT-4）のプロモーター配列である。OCT-4の転写は、発生途上の胚の4〜80細胞期で活性化され、拡大中の胚盤胞で、また後には卵筒の多能性細胞で高く発現される。転写は、原始外胚葉が中胚葉に分化すると抑制され、交尾の8.5日後までに一次生殖細胞の遊走は制限される。高レベルのOCT-4遺伝子発現は、多能性の胚性癌腫および胚性幹細胞系列でもみられ、これらの細胞の分化が誘導されると抑制される。ブタ、マウス、およびヒトのOCT-4プロモーター配列は国際公開公報第9919469号（Biotransplant社）に記載されている。
【０１０３】
他の適切な制御エレメントは、集団中の未分化細胞に特徴的であるが、分化細胞には特徴的でないマーカーの発現を誘導する遺伝子から得られる。例えばSSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、およびTra-1-81は、さまざまな種類の未分化の多能性胚性幹細胞の特徴である。SSEA-4の合成に関与する酵素は、所望の発現特異性をもつ転写制御エレメントを有する場合がある。さらに最近の例の一つが、着床前の胚で発現される、レチノイン酸によって調節されるジンクフィンガータンパク質であるRex1タンパク質のプロモーターである。マウスRex1プロモーターは、未分化の胚性幹細胞の有効な転写マーカーとして作用することがわかっている（Eigesら、Current Biol. 11：514、2001）。
【０１０４】
特定のエレメントが適切であるか否かは、遺伝子転写物発現の解析（例えばマイクロアレイ解析）によって推定できる。次にレポーターコンストラクトが、分化細胞および未分化細胞内で適切な特異性があるか否かを、緑色蛍光タンパク質、分泌型アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子の転写を制御する、同定された細胞-特異的遺伝子に由来するプロモーター配列またはエンハンサー配列を使用して検討することができる。プロモーターの特異性を検討する際にレポーターコンストラクトを使用する手順については実施例9で説明する。
【０１０５】
負の選択に用いるエフェクター遺伝子
適切な特異性を有する転写調節エレメントは、直接的に、または細胞を通常は無害の外来薬剤に感受性とすることで細胞の除去を導く産物のコード領域に機能的に連結される。
【０１０６】
適切なエフェクター遺伝子には、リシン（ricin）、アブリン（abrin）、ジフテリア、ジェロニン（gelonin）、シュードモナス外毒素A、ガラガラヘビ（Crotalus durissus terrificus、Crotalus adamenteus）毒、コブラ（Naja naja、Naja mocambique）毒などのペプチド毒素をコードする遺伝子などがある（Hughesら、Hum.Exp.Toxicol. 15：443、1996；Rosenblumら、Cancer Immunol.Immunother. 42：115、1996；Rodriguezら、Prostate 34：259、1998；Mauceriら、Cancer Res. 56：4311：1996）。
【０１０７】
ICEファミリーのシステインプロテアーゼ、Bcl-2ファミリーのタンパク質、Bax、bclX、およびカスパーゼ（Favrotら、Gene Ther. 5：728、1998；McGillら、Front.Biosci. 2：D353、1997；McDonnellら、Semin.Cancer Biol. 6：53、1995）などの、アポトーシスを誘導またはアポトーシスに関与する遺伝子群も適している。抗腫瘍剤と考えられる他の薬剤には、小分子薬剤を用いた化学療法が失敗する場合においてもアポトーシスを誘導するタンパク質であるアポプチン（apoptin）がある（Pietersenら、Adv.Exp.Med.Biol. 465：153、2000）。コガ（Koga）ら（Hu.Gene Ther. 11：1397、2000）は、アポトーシス遺伝子カスパーゼ-8（FLICE）を結合させたhTERT遺伝子プロモーターを用いるテロメラーゼ特異的な遺伝子治療を提案している。Guら（Cancer Res. 60：5359、2000）は、hTERTプロモーターを介してBax発現を誘導する二成分アデノウイルス系について報告している。Guらは、同ウイルス系が、腫瘍特異的なアポトーシスをインビトロで誘発し、ヌードマウスで腫瘍成長を抑制することを見出した。
【０１０８】
細胞傷害性Tリンパ球またはLAK細胞が標的に輸送される溶解パッケージ（lytic package）中に存在する酵素も対象となる。孔形成タンパク質であるパーフォリン、およびFasリガンドは、これらの細胞に存在する主要な細胞溶解分子である（Brandauら、Clin.Cancer Res. 6：3729、2000；Cruzら、Br.J.Cancer 81：881、1999）。CTLは、四つの主要な基質特異性を有する、グランザイムと呼ばれる少なくとも11種のセリンプロテアーゼのファミリーも発現する（Kamら、Biochim.Biophys.Acta 1477：307、2000）。低濃度のストレプトリシンOおよびニューモリシンは、グランザイムB依存性アポトーシス促進する（Browneら、Mol.Cell Biol. 19：8604、1999）。
【０１０９】
他の適切なエフェクターは、それ自体は細胞に毒性がないが、通常は毒性のない化合物に対して、代謝的に細胞を変化させることによって、または非毒性プロドラッグを致死的な薬剤に変えることによって細胞に感受性をもたせる活性を有するポリペプチドをコードする。未分化の表現型を有する子孫に対する致死的作用はプロドラッグが存在する場合にのみ現れる。したがって、インビトロで分化し、増殖し、または維持されている細胞にプロドラッグを混合することで、未分化表現型を示す細胞の割合を極めて小さくすることができる。読者はプロドラッグを治療対象の患者に細胞を治療と同時に、または後の時点で投与して、未分化表現型を示す子孫の出現をインビボで最小限に抑えることが可能なことも容易に理解すると思われる。
【０１１０】
このような子孫の例示的なエフェクター遺伝子は、単純ヘルペスウイルスおよび触媒的に等価な変異体に由来するチミジンキナーゼ（tk）をコードする。HSVのtkは、抗ヘルペス薬剤であるガンシクロビル（GCV）を、増殖中の細胞においてDNA複製に干渉する毒性産物に変換する。
【０１１１】
米国特許第5,631,236号（Baylor大学医学部）では、癌細胞でtkを発現させるプロモーターに機能的に連結されたHSV tk遺伝子を含むアデノウイルスベクターについて概説されている。米国特許第5,997,859号および欧州特許第702084B1号（Chiron）は、通常は不活性な化合物を細胞障害性をもつ状態に変換する、HSV tk遺伝子の発現を誘導するベクターコンストラクトを有する複製欠損型の組換えレトロウイルスに関する。欧州特許第415731A1号、第657540A1号、および欧州特許第657541A1号（Wellcome Foundation）では、プロドラッグを癌細胞に毒性のある薬剤に変換するための、VZV tk、カルボキシペプチダーゼG2、アルカリホスファターゼ、ペニシリン-Vアミダーゼ、およびシトシンデアミナーゼなどの酵素をコードするレトロウイルスベクターが提案されている。国際公開公報第98/14593号、および国際公開公報第00/46355号（Geron社）では、hTERTプロモーター配列の制御下にHSV tkを含むコンストラクトについて記載されている。
【０１１２】
ヒトのHSV tk遺伝子配列については後述する（配列番号：2および3）。また併せて、TERTを発現する細胞の標的化における使用についても説明する。標的細胞における同遺伝子の発現と同時に、または発現後に、ガンシクロビルなどの転換可能なプロドラッグが環境に添加されると標的が枯渇する。
【０１１３】
細胞を、通常は毒性のない薬剤に感受性にする別のタイプのエフェクターは、外来抗原を細胞膜上に呈示させる遺伝子である。呈示される物質は、同種抗原、異種抗原、または特異的な抗原の入手が容易な非哺乳類種に由来する抗原の場合がある。このような遺伝子を発現させることで、抗原が未分化細胞上に呈示され、後に免疫アフィニティ法（例えばパニング）、蛍光標示式細胞ソーティング、または補体による溶解法などの適切な免疫学的分離法による枯渇過程に用いることができる。
【０１１４】
形質導入剤がウイルスベクターの場合、エフェクターは、ウイルスの複製に必要なウイルス遺伝子とすることができる。アデノウイルスの複製に不可欠な遺伝子群はE4、E1a、E1b、およびE2の各領域である。HSV-1の複製に不可欠な遺伝子群はICP6およびICP4である。これらの遺伝子は特異的なプロモーターの制御下に配置され、分化細胞集団に含まれる細胞の形質導入に用いられる。その後、ウイルスは、存在する未分化細胞内で特異的に複製して細胞を破裂させる。TERTを発現する細胞内で複製する溶解ベクターについては、国際公開公報第00/46355号（Morinら、Geron社）を参照されたい。
【０１１５】
別の種類のエフェクター配列は、特異的な抗原によって認識されるエピトープを含む膜タンパク質をコードする。このような膜タンパク質は、同種の他の種類の細胞で発現されるタンパク質の場合があるが、より典型的には別の種から得られるか、または人工的な配列である。この場合、抗原は、幹細胞を採取する種にとって異物であり、同じ種で産生される抗体は細胞上の他の抗原と交差反応しない。
【０１１６】
あるいは、標的抗原は、細胞表面の糖質または脂質成分の場合がある。この場合、エフェクター配列は、抗原合成に関与する酵素をコードする。特に対象となるのは、糖質の分化抗原、同種抗原、異種抗原、または抗体によって検出可能な新規の決定基を合成する哺乳類起源または非哺乳類起源のグリコシルトランスフェラーゼである。例には、エフェクター配列が、対応するフコシルトランスフェラーゼをコードするマーカーSSEA-1；α（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼ（α1,3GT）によって形成される、ヒトおよび旧世界ザルを除く多くの哺乳類の内皮組織上に存在するGalα（1,3）Gal結合；およびコード配列が、対応するABOトランスフェラーゼである、多くのヒト細胞上に存在するABO組織血液型抗原などがある。以上の例については、GenBankアクセッション番号S71333、J05175、およびAF134414を参照されたい。Galα（1,3）GalおよびABO決定基はいずれも、自己抗原としての決定基をもたない被験者に天然の状態で存在する抗体が関与する溶解に感受性がある。
【０１１７】
別の可能なエフェクター配列は、RNA干渉（RNAi）法に基づく。細胞内の成熟mRNA（遺伝子転写物など）の一部分に対応する2本鎖またはヘアピンRNAはmRNAを標的分解する（Sharpら、Genes Dev. 13：139、1999；Wiannyら、Nat.Cell Biol. 2：70、2000）。例えばヘアピンRNA（細胞遺伝子のコード領域に由来し、短いリンカー配列によって隔てられていることで、2本鎖領域を含む合成RNAを生じる逆方向反復を含む転写物）の発現を誘導するプロモーターを含むプラスミドは、安定かつ遺伝性のRNAi作用を線虫（C.elegans）で発揮させるために用いられている（Tavernarakisら；Nat.Genet. 24：180、2000）。
【０１１８】
本発明のある態様では、未分化細胞（またはTERTを発現する細胞）で転写を誘導する制御エレメントは、特定の遺伝子転写物を標的とするヘアピンRNAiのコード配列に機能的に連結される。標的遺伝子は細胞生存に不可欠なように選択され：例えば塩基性の転写因子もしくは翻訳因子、tRNA遺伝子、リボソームRNAサブユニット、またはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼなどが該当する。一例では、hTERTプロモーターは、プリンのサルベージ経路の遺伝子を不活性化するRNAiを誘導する。アミノプテリンなどの薬剤の存在下では、プリンのデノボ合成が抑制される。これは、酵素ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）およびチミジンキナーゼ（TK）の活性が阻害されるためである。HGPRTおよびTKを有する細胞は、ヒポキサンチンおよびチミジンが培地に添加されている限りはアミノプテリンの存在下で生存する（HAT培地）。残存する未分化細胞は、HAT培地中でインキュベートすることで集団から除去される。HGPRTやTKなどの不可欠な遺伝子群の転写物も、他のタイプのエフェクター配列（例えばアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または機能性触媒ドメインをもたない優性的に負の類似体のコード配列）を用いて標的化することができる。
【０１１９】
本発明のベクターに使用されるエフェクター領域は、分子スイッチによって機能的に調節されるように構築可能である。リガンドと受容体の結合ドメインが融合することで、天然タンパク質の正常な機能が、リガンド結合ドメインによって認識されるホルモンの非存在下で抑制される分子となる。融合タンパク質は、リガンド（小分子ハプテンなど）と結合ドメインの結合がエフェクタードメインを露出させたり活性化させるように、エフェクタードメインに結合させたスイッチ分子の結合ドメインを含むように構築される。適切なリガンド結合ドメインは、エストロゲン受容体などの受容体または抗体から得られる。エフェクタードメインは、細胞に致死的な作用を及ぼすことが既にわかっているペプチド毒素、エンドヌクレアーゼ（I-Sce-1などのメガヌクレアーゼ、もしくはヒト化された標準制限エンドヌクレアーゼ）、またはアポトーシスのメディエーターなどの任意のタンパク質の場合がある。エフェクター遺伝子のもつ致死的機能は、リガンドが存在する場合を除いて静止状態にある。これはエフェクター遺伝子が、未分化細胞の枯渇を培養中に、またはインビボで制御するために任意に投与可能な外来薬剤（この場合はリガンド）の毒性作用に対して細胞を感受性とする別の系となる。
【０１２０】
本発明に使用されるベクターコンストラクトは、特異的なプロモーターの制御下にある場合もある抗生物質耐性遺伝子などの陽性選択マーカーを含む場合もある。例えば「hTERTプロモーター−tk遺伝子−IRES−neo」という構造を有するベクターがこれに該当する。これは細胞死エフェクターと薬剤耐性遺伝子の両方がTERTプロモーターの制御下で発現されるように設計されている。内部リボソーム導入部位（IRES）配列を用いると、tk遺伝子とneo遺伝子の両方をhTERTプロモーターの転写制御下に配置することが可能となる。2A配列（Felipeら、Gene Ther. 6：198、1999）などの翻訳後切断部位を用いることでも同様の作用が得られる場合がある。このコンストラクトが安定に組み込まれたhES系列の作製および選択は、未分化細胞内における薬剤耐性遺伝子の活性によって促進される。これは、さまざまなプロモーターの制御下に配置した薬剤耐性遺伝子を用いる同時トランスフェクション法より優れている。というのは、薬剤耐性遺伝子は分化細胞内では発現されないからである。このため、移植細胞に含まれる遺伝子産物に対する宿主による望ましくない免疫応答は回避されるはずである。
【０１２１】
未分化細胞を除去するための選択法
未分化細胞から分化細胞集団を枯渇させるためには、未分化細胞でエフェクター遺伝子を選択的に発現させる。
【０１２２】
これは複数の方法で達成できる。一つの態様では、適切な特異性をもつ転写制御エレメントをエフェクター遺伝子に機能的に連結されているベクターを用いて細胞集団を遺伝的に改変する。このような遺伝的な改変は一過的な場合がある（例えばアデノウイルスベクターを使用する場合）。すなわち発現のレベルが細胞が分裂する度に低下する。これは、治療時に異種遺伝子を含まない分化細胞集団を作製する際に適している。また遺伝的改変は永久的な場合もある（例えばレトロウイルスベクターを使用する場合）。すなわち改変が、当初改変した細胞の子孫に受け継がれる。これはインビトロもしくはインビボにおける増殖に伴って矯正機能が進行して、集団中に現れる未分化細胞または脱分化細胞が除去される分化細胞集団を作製する際に適している。
【０１２３】
任意の適切な発現ベクターを使用することができる。本発明によって改変された幹細胞を作製するための適切なウイルスベクター系は、市販のウイルス成分を用いて調製することができる。エフェクター遺伝子群を含むウイルスベクターについては、最終セクションで列挙する出版物に一般に記載されている。あるいはベクタープラスミドは、米国特許第5,578,475号；第5,627,175号；第5,705,308号；第5,744,335号；第5,976,567号；第6,020,202号；および第6,051,429号に記載されているようにエレクトロポレーション法、または脂質/DNA複合体を用いて細胞に導入することができる。例えばGibco/Life Technologiesから入手可能なLipofectamine 2000（商標）などがこれに該当する。別の例示的な試薬には、脂質を非リポソーム状態に混合したFuGENE（商標） 6 Transfection Reagent、および80%エタノール中に含まれる他の化合物（Roche Diagnostics 社から入手可）がある。
【０１２４】
別の態様では、エフェクター遺伝子は内因性転写制御エレメント（hTERTまたはOCT-4のプロモーターなど）の制御下に配置される。これは例えば一方を転写制御エレメントおよび上流のゲノム配列に隣接し、他方を標的遺伝子に対する下流のゲノム配列に隣接するエフェクターのコード配列を含むベクターを用いた相同組換えにより作動させることができる。米国特許第5,464,764号および第5,631,153号では、遺伝子標的に相同な二つの配列が正の選択マーカーに隣接し、また負の選択マーカーが第二の隣接領域の3'端に結合される二重選択法について説明されている。米国特許第5,789,215号では、マウス胚性幹細胞の細胞ゲノムを調節する際の相同組換えターゲティングベクターの使用について報告されている。相同組換えによるターゲティングに関する対象となる他の情報は米国特許第5,589,369号、第5,776,774号、および第5,789,215号に記載されている。
【０１２５】
エフェクター遺伝子が、細胞溶解またはアポトーシスを直接誘導するのであれば、集団は、細胞を制御エレメントが遺伝子の転写を引き起すことが期待される条件で培養することによって未分化細胞を失う。しかし仮に、エフェクター遺伝子が致死的作用を直接発揮するのではなく、外来薬剤による致死的作用に対する感受性を細胞にもたせるのであれば、枯渇は外来薬剤が提供されるまで遅らせることができる。例えば遺伝子がプロドラッグ変換酵素をコードする場合、枯渇は、プロドラッグを含む環境に細胞を配置することでもたらされる。遺伝子が抗体の標的の場合、枯渇は、特異的な抗原に加えて補体を含む環境に細胞を配置することでもたらされる。環境は培養容器の場合があり、このような場合は、必要な濃度の薬剤が培地に単に添加される。あるいは、またはこれに加えて枯渇は、細胞集団を患者に投与することによって、また同時に、または連続して薬剤を投与することによって（薬剤が事前に存在しない場合）インビボで生じる場合がある。
【０１２６】
細胞の大部分が分化している細胞集団は、このような手順で遺伝的に修飾することで未分化細胞を枯渇させることができる。あるいは比較的未分化な細胞の前駆体集団は、上記の手順で遺伝的に修飾した後に分化させることができる。このような状況では、発現直後に細胞を死滅させるのではなく、外来薬剤による致死的作用に対する感受性を細胞にもたせるエフェクター遺伝子を用いることが一般的である。一例では、培養物中で成長させた未分化pPS細胞に、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子をhTERTプロモーターの制御下に配置したレトロウイルスベクターを導入する。細胞は、選択可能なマーカーをコンストラクト中に含めることによって、または導入遺伝子の発現を測定して培養物中で増殖させることによって、形質導入陽性であることが任意選択で選択される。分化細胞が望ましい場合は、集団を分化手順（例えば上述したように肝細胞またはニューロン前駆体を作る）で得る。これらを次に、ガンシクロビルの存在下でtk遺伝子の発現を可能とする条件で培養する。
【０１２７】
RNAiがエフェクター配列である例では、hES細胞に二つのカセットを含むコンストラクトを安定に（例えばリポフェクション法で）トランスフェクトする。カセットの一つでは、PGKプロモーターがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を駆動し（ジェネティシンなどの毒性ネオマイシン類似体に耐性となる）；もう一つでは、HGPRTまたはTKに由来する2本鎖領域を含むRNAiのコード領域をhTERTプロモーターが駆動する。安定に修飾されたクローンは、ジェネティシンおよびアザグアニンもしくは6-メルカプトプリンの両方を含む培地（HGPRT陰性細胞選択用）、またはジェネティシンおよび5-ブロモデオキシウリジンの両方を含む培地（TK陰性細胞選択用）で単離される。あるいはトランスフェクションは、培地からジェネティシンが除かれたRNAiキットを使用するだけで実施することができる場合もある。生存クローンを単離した後に、これらの系列について所望の細胞種への分化を誘導し、HAT培地に曝露することで残存する幹細胞を死滅させる。
【０１２８】
細胞集団は、存在する未分化細胞の割合のかなりの低下を意味する、未分化細胞を「枯渇させる」ための以上の手法で得られる場合がある。この手順を実施後には、未分化細胞の割合は50%またはさらには90%低下する可能性がある。選択する制御エレメントおよびエフェクターにより、未分化細胞を「本質的に含まない」分化細胞集団が得られる場合がある。これは集団が全体として、未分化表現型を示す細胞を1%未満しか含まないことを意味する。0.2%、0.05%、0.01%、20 ppmまたは5 ppm未満の未分化細胞を含む集団は、この順でより望ましくなる。pPS細胞の場合、未分化細胞の存在は、SSEA-4発現細胞をFACS解析で数えることで、またはTERTもしくはOCT-4を発現する細胞を蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法で数えることで判定することができる。
【０１２９】
分化細胞の使用
本発明で調製される細胞は、さまざまな商業的に重要な研究、診断、および治療を目的として使用できる。
【０１３０】
本発明の細胞集団は、未分化細胞を枯渇しているので、分化した表現型に特異的な抗体およびcDNAのライブラリーの調製に使用することができる。抗体を作製し、精製し、また修飾する際の一般的な方法、ならびに免疫アッセイ法および免疫単離法における抗体の使用については、「実験的免疫学のハンドブック（Handbook of Experimental Immunology）」（Weir & Blackwell編）；「免疫学の最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）」（Coliganら編）；ならびに「免疫学的分析の手法（Methods of Immunological Analysis）」（Masseyeffら編、Weinheim：VCH Verlags GmbH）に記載されている。mRNAおよびcDNAのライブラリーを調製する一般的な手法は、「RNA方法論：同定および特徴付けのための実験室ガイド（RNA Methodologies：A Laboratory Guide for Isolation and Characterization）」（R.E.Farrell、Academic Press、1998）；「cDNAライブラリープロトコル（cDNA Library Protocols）」（CowellおよびAustin編、Humana Press）；ならびに「機能ゲノミクス（Functional Genomics）」（HuntおよびLivesey編、2000）に記載されている。
【０１３１】
比較的均一な細胞集団は、薬剤スクリーニングおよび治療的応用における使用に特に適している。
【０１３２】
薬剤スクリーニング
分化した本発明のpPS細胞を用いて、諸因子（溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）、または分化細胞の特徴に影響する環境条件（培養条件もしくは操作など）のスクリーニングを行うことができる。
【０１３３】
一部の応用では分化細胞を用いて、長期培養における、このような細胞の成熟を促進する因子、または増殖および維持を促進する因子のスクリーニングが行われる。例えば候補となる成熟因子や成長因子は、これらを異なるウェル中のpPS細胞に添加した後に、結果として生じる表現型の変化を、さらに培養を続けるか、また細胞を使用するかの望ましい基準にしたがって決定することで検討される。
【０１３４】
本発明の特定のスクリーニングの応用は、薬剤研究における薬学的組成物の検討に関する。読者は一般に、標準的な教科書である「薬学的研究におけるインビトロの手法（In vitro Methods in Pharmaceutical Research）」（Academic Press、1997）、および米国特許第5,030,015号を参照するとよい。候補となる薬学的化合物の活性の評価には一般に、本発明の分化した細胞を候補化合物と混合する段階、化合物に起因する細胞の形態、マーカーの表現型、または代謝活性における何らかの変化を（未処理の細胞、または不活性化合物で処理した細胞と比較して）決定する段階、次いで化合物の作用を観察された変化と関連づける段階が含まれる。
【０１３５】
スクリーニングは例えば、化合物がある種の細胞に対する薬学的作用をもつように設計されているために、または別の作用をもつように設計された化合物が意図されない副作用を有する可能性があるために実施される場合がある。2種またはそれ以上の薬剤を（細胞と同時もしくは連続的に混合することで）組み合わせて検討することで、ありうる薬剤間相互作用を検出することができる。一部の応用では、毒性があるか否かについて最初にスクリーニングが行われる（Castellら、「薬学的研究におけるインビトロの手法（In Vitro Methods in Pharmaceutical Research）」、375〜410、Academic Press、1997）。細胞毒性は第一に、細胞の生存、生存率、形態、およびある種のマーカー、受容体、もしくは酵素の発現もしくは放出に及ぼす作用によって決定することができる。薬剤が染色体DNAに及ぼす作用は、DNAの合成または修復を測定することで決定できる。特に細胞周期の予想外の時点における、または細胞の複製に必要なレベル以上の［3H］チミジンまたはBrdUの取り込みは、薬剤の作用と一致する。望ましくない作用には、分裂中期の展開によって決定される姉妹染色分体交換の異常な割合なども含まれる。読者は、ビッカーズ（A.Vickers）（「薬学的研究におけるインビトロの手法（In vitro Methods in Pharmaceutical Research）」、375〜410、Academic Press、1997）を参照することで詳細な情報を得ることができる。
【０１３６】
治療的使用
本発明の分化細胞は、組織の再構成または再生を必要とするヒト患者における組織の再構成または再生にも使用することもできる。細胞は、意図された組織部位への移植、および機能的に損なわれた領域の再構成もしくは再生を可能とするために投与される。
【０１３７】
一例では、神経幹細胞が、中枢神経系の実質部位または髄腔内部位に、治療対象の疾患を考慮して直接移植される。移植は単純な細胞懸濁物、または細胞25,000〜500,000個/μLの密度の小規模凝集物を用いて行われる（米国特許第5,968,829号）。神経細胞移植の効率は、McDonaldら（Nat.Med. 5：1410、1999）に記載されているような、脊髄が急性的に損傷を受けたラットモデルで評価できる。移植が成功すると、2〜5週間後に病変中に存在する移植片由来細胞がアストロサイト、オリゴデンドロサイト、および/またはニューロンに分化し、病変末端から脊髄に沿って移動すること、ならびにゲート、協調、および荷重が改善することがわかる。
【０１３８】
本発明のある種の神経前駆体は、急性または慢性の神経系損傷の治療用として設計される。例えば興奮毒性は、てんかん、脳卒中、虚血、ハンチントン病、パーキンソン病、およびルツハイマー病などのさまざまな症状に関連づけられている。本発明のある分化細胞は、ペリツェーウス・メルツバッヒャー病、多発性硬化症、白質ジストロフィー、神経炎、およびニューロパシーなどの脱髄疾患の治療に適している場合がある。これらの目的に適しているのは、再ミエリン化を促進するオリゴデンドロサイト、またはオリゴデンドロサイト前駆体中に濃縮された細胞培養物である。
【０１３９】
本発明で調製された肝細胞および肝細胞前駆体は、肝障害の修復可能を調べる動物モデルで評価することができる。この一例が、D-ガラクトサミンの腹腔内注射で生じる損傷である（Dabevaら、Am.J.Pathol. 143：1606、1993）。治療の効果は、肝細胞マーカーの免疫組織化学的染色、成長途上組織で小管構造が形成されるか否かの顕微鏡判定、および肝特異的タンパク質の合成を回復する治療能力によって決定できる。肝細胞は、直接投与による治療に、または被験者の肝組織が劇症肝炎後に自然に再生する間に一時的な肝機能を提供するバイオアシスト装置の一部として使用することができる。
【０１４０】
本発明で調製された心筋細胞の有効性は、治療を実施しないと左室壁組織の55%が瘢痕組織となる心臓の低温損傷（cryoinjury）の動物モデルで評価することができる（Liら、Ann.Thorac.Surg. 62：654、1996；Sakaiら、Ann.Thorac.Surg. 8：2074、1999、Sakaiら、J.Thorac.Cardiovasc.Surg. 118：715、1999）。治療が成功すると瘢痕面積が縮小し、瘢痕拡大が抑制され、また収縮期圧、拡張期圧、および展開圧（developed pressure）によって判定される心機能が改善する。心外傷は、左冠動脈前下行枝の遠位部に塞栓コイルを用いてモデル化することも可能であり（Watanabeら、Cell Transplant. 7：239、1998）、また治療の有効性は、組織像および心機能で評価することができる。本発明の心筋細胞調製物を治療に用いることで、心筋を再生して不十分な心機能を治療することができる（米国特許第5,919,449号および国際公開公報第99/03973号）。
【０１４１】
以下に挙げる実施例はさらに説明する目的で提供するものであって、請求される発明の実施を制限することを意図しない。
【０１４２】
実施例
実施例1：hES細胞のフィーダーフリーの継代
この実験では、一次マウス胚フィーダー細胞上で維持した未分化のhES細胞を回収後に、フィーダーの非存在下で維持した。培養ウェルはMatrigel（登録商標）でコーティングし、放射線を照射した一次線維芽細胞の培養物から得た馴化栄養培地の存在下で細胞を培養した。
【０１４３】
一次マウス胚性線維芽細胞（mEF）に由来する馴化培地（CM）の調製：
線維芽細胞を、Ca++/Mg++を含まないPBSで1回洗浄してT150フラスコから回収し、1.5〜2 mLのトリプシン/EDTA （Gibco）中で5分間インキュベートした。線維芽細胞がフラスコから剥がれた後に、mEF培地（DMEM＋10% FBS）に回収した。細胞に4000ラド（140 kV、508秒、シェルフ（shelf）設定6：Torrex（商標）ジェネレーター）の放射線を照射し、計数後に細胞約55,000個/cm2となるようにmEF培地に播種した（6ウェルプレートに525,000細胞/ウェル）。少なくとも4時間後に、培地を6ウェルプレートの9.6 cmウェルあたり3〜4 mLを用いてSR含有ES培地（bFGFを含む）と交換した。馴化培地は、hES培養物を補給するために毎日回収した。または培地を、培養フラスコ中にプレーティングしたmEFを用いて調製し、培地を0.3〜0.4 mL/cm2となるように毎日交換した。hES培養物への添加前に、馴化培地に4 ng/mLのヒトbFGF（Gibco）を添加した。この系で線維芽細胞培養物を約1週間用いた後に、新規調製した細胞と交換した。
【０１４４】
Matrigel（登録商標）のコーティング：
Growth Factor Reduced Matrigel（登録商標）、または通常のMatrigel（登録商標）（Becton-Dickinson、Bedford MA）を4℃で解凍した。Matrigel（登録商標）を、冷KO DMEM中に1：10〜1：500（通常1：30）に希釈した。0.75〜1.0 mLの溶液を、9.6 cm2の各ウェルに添加して室温で1時間インキュベートした。コーティングしたウェルを冷KO DMEMで1回洗浄後に細胞を添加した。プレートはコーティングから2時間以内に使用するか、またはDMEM中で4℃で保存し、約1週間以内に使用した。
【０１４５】
ヒトES培養物：
未分化のhESコロニーをフィーダー上のhES培養物から以下の手順で回収した。培養物を約200 U/mLのコラゲナーゼIV中で37℃で約5分間インキュベートした。コロニーを、個々のコロニーを顕微鏡下で20 μLのピペットチップでつまみ取るか、またはかきとって、馴化培地（CM）中の小規模培養物中で解離することで回収した。これらの細胞を次に、馴化培地中のMatrigel（登録商標）上に、9.6 cm2のウェルあたり15個のコロニーとなるように播種した（1個のコロニーが約10,000個の細胞の場合のプレーティング密度は細胞約15,000個/cm2となる）。
【０１４６】
Matrigel（登録商標）上に播種した翌日に、hES細胞が小さなコロニー（約100〜2,000個の細胞）として視認でき、分化中または死滅中のように見えるコロニー間に一種の細胞が存在した。hES細胞が増殖すると、コロニーは、きわめて大きくなり非常にコンパクトとなる。これは、培養ディッシュ表面のほぼ全体にみられる。コロニーに含まれるhES細胞は、細胞質に対する核の比が高く、顕著な核小体が認められ、フィーダー細胞上で維持されるhES細胞に似ていた。コンフルエント時には、コロニー間に存在する分化細胞は、培養中の細胞の10%未満となる。
【０１４７】
播種してから6日後に、培養物はほぼコンフルエントとなった。この培養物を、KO DMEM中で1 mLの約200 U/mL コラゲナーゼIV溶液と37℃で約5分間インキュベートして分けた。コラゲナーゼ溶液を吸引し、各ウェルに2 mLのhES培地を添加し、またhES細胞をピペットを用いてディッシュからかきとった。細胞懸濁物を15 mLの円錐管に移し、6 mLにメスアップし、穏やかに摩砕して、細胞を10〜2000個の小さなクラスターに解離した。この細胞を、CM中のMatrigel（登録商標）コーティングプレートに上述のように再び播種した。細胞は1：3または1：6の比（細胞約90,000〜170,000個/cm2）で播種し、各ウェルの容量を3 mLとした。培地は毎日交換し、最初の播種から13日後と19日後に再び細胞を分けて継代した。
【０１４８】
最初の播種から19日目に細胞を回収し、細胞表面マーカーに特異的な標識抗体を用いた免疫蛍光細胞サイトメトリーで表面マーカーの発現の評価を行った。フィーダーの非存在下で維持したhES細胞の場合、高いパーセンテージでSSEA-4、Tra-1-60、またはTra-1-81が発現される。これら3種類のマーカーは、フィーダー上で維持された未分化のヒトES細胞で発現されている（Thomsonら、1998）。また、未分化のES細胞上で発現されていない（または低レベルで発現されている）糖脂質であるSSEA-1の発現はほとんど認められない。SSEA-4、Tra-1-60、およびTra-1-81の免疫組織化学的な評価から、これらのマーカーの発現がESコロニーに局在化していて、コロニー間の分化細胞にはみられないことがわかる。
【０１４９】
hES細胞上の培養物は、フィーダー細胞の非存在下で、最初の播種から180日間にわたって成長しており、増殖能または表現型に明らかな変化は認められなかった。mEF馴化培地中のMatrigel（登録商標）上で維持されたヒトES細胞は、複製時間が約31〜33時間であり、mEFフィーダー細胞上で成長させたhES細胞の増殖速度と同等であった。64日後のフィーダーフリー培養のH1細胞の核型は正常であった。
【０１５０】
実施例2：フィーダーフリー培養物中のhES細胞の表現型マーカー
未分化hES細胞は、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、OCT-4、およびhTERTを発現する。これらのマーカーの発現は分化が進むと低下する。フィーダーフリー条件で維持された細胞が、上記マーカーを保持しているか否かを評価するために、免疫染色法、逆転写PCR増幅法、およびテロメラーゼ活性アッセイ法で細胞の評価を行った。
【０１５１】
蛍光標示式細胞ソーティング（FACS）による解析では、hES細胞を0.5 mM EDTA（溶媒PBS）中で解離させ、0.1% BSA（溶媒PBS）を含む50 μLの希釈液中に細胞約5×105個となるように再懸濁した。表面マーカーの発現の解析では、細胞をIgGアイソタイプ対照（0.5 μg/試験）、IgMアイソタイプ対照（1：10）、SSEA-1 （1：10）、SSEA-4 （1：20）、Tra-1-60 （1：40）、およびTra-1-81 （1：80）を含む一次抗体と4℃で30分間かけてインキュベートし、希釈液中に希釈した。希釈液で洗浄後、PE（Becton Dickinson、San Jose、CA）を結合させたラット抗マウスκ鎖抗体と細胞を4℃で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、FACScalibur（商標） Flow Cytometer （Becton Dickinson、San Jose、CA）でCellQuest（商標）ソフトウェアを用いて解析を行った。
【０１５２】
フィーダー上のhES細胞と同様に、Matrigel（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンIV上の細胞は、SSEA-4、Tra-1-60、およびTra-1-81を発現していた。未分化hES細胞では発現されていない糖脂質SSEA-1の発現はほとんど認められなかった。
【０１５３】
免疫細胞化学的解析では、細胞を、ノックアウトDMEM中に希釈したSSEA-1 （1：10）、SSEA-4 （1：20）、Tra-1-60 （1：40）、およびTra-1-81 （1：80）を含む一次抗体と37℃で30分間インキュベートした。次に、加温したノックアウトDMEMで細胞を洗浄し、2%パラホルムアルデヒド中で15分間かけて固定した。PBSで洗浄後、細胞を、5%ヤギ血清（溶媒PBS）で室温で30分間インキュベートした後に、FITC結合ヤギ抗マウス抗体（1：125）（Sigma）と室温で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、DAPIで染色してマウントした。染色は通常、継代の約2日後に行った。細胞は、未分化ES細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼの発現についても調べた。これは、細胞をチャンバースライド上で培養し、4%パラホルムアルデヒドで15分間かけて固定化した後に、PBSで洗浄して行った。次に細胞を、アルカリホスファターゼの基質（Vector Laboratories社、Burlingame、CA）と室温で暗条件で1時間かけてインキュベートした。スライドを100%エタノールで2〜5分間洗浄した後にマウントした。
【０１５４】
結果から、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、およびアルカリホスファターゼは、フィーダー上の細胞についてみられるようにMatrigel（登録商標）またはラミニン上のhESコロニーで発現されるが、コロニー間に存在する分化細胞では発現されないことがわかった。
【０１５５】
図1は、フィーダー上におけるH1細胞のOCT-4およびhTERTの発現、およびフィーダーを用いない場合の発現を示す（逆転写酵素PCRを用いた増幅法で検出）。各遺伝子産物の放射活性の相対定量については、QuantumRNA（商標）オルタネイト18S内在標準プライマー（Alternate 18S Internal Standard primers）（Ambion、Austin TX、USA）を製造業者の指示書にしたがって用いた。簡単に説明すると、特定のプライマー対による増幅の線形範囲を決定した後に、オルタネイト18Sプライマー：コンペティマー（alternate 18S primers:competimers）の適切な混合物と同時に増幅して、一致する線形範囲を有するPCR産物を得た。AmpliTaq（商標）（Roche）をPCR反応に添加する前に、同酵素はTaqStart（商標）抗体（ProMega）と、製造業者の指示書通りにプレインキュベートした。放射性PCR反応は5%非変性ポリアクリルアミドゲルで解析し、乾燥させ、ホスホイメージスクリーン（Molecular Dynamics）を1時間感光させた。スクリーンをMolecular Dynamics Storm 860でスキャンし、バンド強度をImageQuant（商標）ソフトウェアで定量した。結果は、hTERTまたはOCT-4のバンドに取り込まれた放射能の比で表し、18sバンドに取り込まれた放射能に対して標準化する。
【０１５６】
特定のマーカーのプライマーおよび増幅条件を以下に示す。
2004523217.tif 000002
【０１５７】
hTERTおよびOCT-4の発現は、Matrigel（登録商標）および通常培地を除くすべての培養条件で認められた。また細胞分化を促進する因子であるレチノイン酸（RA）またはジメチルスルホキシド（DMSO）に細胞を曝露させた後には、hTERTの発現は著しく低下した。
【０１５８】
図2は、TRAP活性アッセイ法（Kimら、Science 266：2011、1997；Weinrichら、Nature Genetics 17：498、1997）で測定したテロメラーゼ活性を示す。いずれの培養条件も、mEF馴化培地中のMatrigel（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンIV上で40日後に陽性のテロメラーゼ活性を示した。
【０１５９】
実施例3：hES細胞の分化
この実験では、凝集体生成の標準的な方法による分化を直接分化法と比較した。
【０１６０】
凝集体分化法の場合、アカゲザルおよびヒトのES系列の単層培養物をコラゲナーゼIV中で5〜20分インキュベートし、細胞をプレートから剥離させて回収した。次に細胞を解離させ、非接着性細胞培養プレートのFBS含有培地にプレーティングした。このプレートを37℃のインキュベーター内に置き、場合によっては振盪器を使用して懸濁物中における凝集物の維持を促した。4〜8日後に懸濁物中に凝集体が形成され、これを基質上にプレーティングしてさらに分化させた。
【０１６１】
直接分化法の場合は、アカゲザルおよびヒトのES細胞懸濁物を同様に調製した。次に細胞を摩砕して細胞約50〜100個のクラスターに解離させ、ポリオルニチン処理したカバーガラスにプレーティングした。細胞を血清含有培地中で、またはディファインド培地中で7〜10日間維持した後に解析を行った。
【０１６２】
両調製物に由来する細胞を固定化し、ニューロンの特徴であるβ-チューブリンIIIおよびMAP-2、ならびにアストロサイトの特徴であるグリア繊維酸性タンパク質（GFAP）に対する免疫反応性によって検討した。結果を表1に示す。
【０１６３】
（表１）hPS分化法の比較
2004523217.tif 000003
【０１６４】
アカゲザルおよびヒトのES系列を、凝集体法または直接分化法のいずれかにより、ニューロンおよびアストロサイトのマーカーを有する細胞に分化させた。アカゲザル培養物の場合、ニューロンを含む凝集物のパーセンテージは49〜93%であった。ヒト系列の場合、ニューロンを含む凝集物のパーセンテージは60〜80%であった。GABAおよびβ-チューブリンに対する二重ラベリングの結果、ニューロンの下位集団が抑制性神経伝達物質GABAを発現していることがわかった。またアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトは、それぞれGFAP免疫応答性を有すること、またGalC免疫応答性を有することがわかった。したがって、ヒトおよびアカゲザルのES細胞は、全3種類の主要な細胞表現型を中枢神経系で形成する能力をもつ。
【０１６５】
ニューロトロフィン成長因子ファミリーの複数の因子の作用を調べた。hES細胞は、コラゲナーゼで回収し、解離させ、ポリオルニチンでコーティングしたカバーガラス上に再播種することで分化させた。この細胞をDMEM/F12＋N2＋10% FBSに一晩プレーティングした。翌日、培地から血清を除去し、10 ng/mLのヒトbFGFおよび検討対象の成長因子と交換した。24時間後、培地からbFGFを除去した。以上の培養物には1日おきに栄養分を補給した。分化させてから7日後に固定化し、免疫染色を行って解析した。ニューロンの数は、β-チューブリン陽性細胞を数えることで評価した。10 ng/mLの脳由来神経栄養因子（BDNF）の存在下で維持した培養物は、対照培養物より約3倍多いニューロンを形成した。ニューロトロフィン-3（1 ng/mL）中で維持した培養物は、対照培養物より約2倍多いニューロンを形成した。
【０１６６】
続く実験で、ヒトES細胞懸濁物を、親系列H9および二つのサブクローン系列から調製した。細胞をコラゲナーゼIVを用いて回収後に、ポリオルニチンでコーティングしたガラススライド上の培地（20% FBSを含む）に再プレーティングした。次に培養物に1日おきに7〜10日にわたって栄養分を補給した後に、固定化して免疫染色を行った。各系列から、いくつかの分化細胞が筋特異的アクチン（Dako製抗体）に関して陽性に染色されたが、心臓トロポニンIでは染色されなかった。複数のパッチの細胞は、α-フェトプロテインで陽性に染色され、内胚葉細胞が存在することがわかる。
【０１６７】
実施例4：直接分化と胚様体を介した分化の比較
直接分化を誘導するために、未分化のhES細胞を回収して、分化する条件に直接再プレーティングした。プレーティング時に多数の細胞死が明瞭に認められたが、多くの細胞は接着しており、増殖および/または分化を始めた。血清を含む条件で分化させた培養物では、培養物は増殖を続け、5〜10日内にコンフルエントとなった。この時点では、培養物は、多種多様な形態を示す異種集団を含んでいた。免疫組織化学的方法で、それぞれβ-チューブリンIII、筋特異的アクチン、およびα-フェトプロテインに対する抗体を用いて外胚葉、中胚葉、および内胚葉の系列の存在が明らかとなった。これら3種類すべての細胞種の陽性染色は、ときにきわめて高密度なパッチにみられたので、各細胞種のパーセンテージを正確に定量することは困難であった。
【０１６８】
ニューロンのパーセンテージを高めるために、ポリオルニチンでコーティングしたカバーガラス上のデファインド培地中にhES細胞をプレーティングした。得られたデータは、全3種類の胚葉に由来する細胞が、EBを作ることなく採取可能であることを示しているが、心筋細胞は認められなかった。
【０１６９】
比較するために、胚様体（EB）を作らせることでhES細胞の分化を誘導した。このような実験では、ES細胞を回収し、懸濁培養物中に再プレーティングした。当初は著しい量の細胞死が認められたが、2〜3日後には残りの細胞は凝集物を形成した。EBは培養物中で16日間も維持され、後のプレーティング後でも生存しており、多くの構造を形成した。後期には、ヒトEBは嚢胞状を示すことが多く、ときには拍動性のEBを生じた。
【０１７０】
心筋細胞の形成を評価するために、懸濁培養の4日後に、ゼラチンでコーティングしたプレートまたはチャンバースライドにEBを移した。播種後に表面に接着した状態のEBは、増殖して異なる種類の細胞に分化した。自発的に収縮する細胞が、分化8日目に培養物のさまざまな領域に認められ、拍動領域の数は約10日目まで上昇した。場合によっては75%を上回るEBが収縮領域を有していた。拍動性細胞は、マウスのES細胞に由来する拍動性心筋細胞に形態が似ていた。また心臓特異的マーカーである心臓トロポニンIの発現を分化15日目に免疫細胞化学的な方法で調べた。分化した培養物中における個々の収縮性フォーカスの写真を撮影し、収縮面積を記録してから培養物を固定した。次に培養物を心臓cTnlの発現について評価し、最初の写真とマッチさせて、cTnl染色に陽性を示した収縮面積のパーセンテージを決定した。対照として、収縮性フォーカスに隣接する細胞もcTnl染色を調べた。これらの培養物では、収縮面積の100%が免疫反応に陽性を示したが、非拍動性細胞の免疫反応は極めて小さかった。
【０１７１】
分化したEBの培養物を対象に、cTnlに対するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。このアッセイ法では、精製された天然ヒト心臓Tnlの大きさに対応する31 kDaのタンパク質の強いシグナルが現れた。cTnlは、収縮性細胞を含む分化したヒトES細胞で検出されたが、収縮性細胞の徴候のない未分化のES細胞または分化した培養物では検出されなかった。これは、心筋細胞が特異的に検出されることを示唆している。対照として、このブロットをβ-アクチン特異的抗体をプローブとして再び反応させ、同等量のタンパク質がすべての試料中に存在することを確認した。
【０１７２】
他の実験ではEBを8日間または16日間培養し、接着状態の培養物としてさらに10日間維持した。分化したヒトES細胞からRNAを調製し、半定量的RT-PCRを行って、内胚葉特異的産物であるα1-アンチトリプシン、AFP、およびアルブミンの相対的な発現を検出した。未分化培養物中には低レベルのα1-アンチトリプシンおよびAFPが検出され；同じ培養物中にアルブミンはほとんど、または全く検出されなかった。全3種類のマーカーは、分化後に有意に高いレベルで検出された。3種類の内胚葉マーカーの発現は、16日目の胚様体に由来する培養物と比べて8日目の胚様体に由来する培養物の方が高かった。
【０１７３】
実施例5：一次mEFフィーダー細胞層上に維持したhES細胞のトランスフェクションおよび形質導入
hES培養物は、1% 非必須アミノ酸、1 mM グルタミン、0.1 mM β-メルカプトエタノール、および4 ng/mL hbFGF （Gibco）を添加した80% KO DMEM （Gibco）および20% Serum Replacement （Gibco）を含む成長培地中で維持した。プレートを0.5% ゼラチン（Sigma）溶液で37℃で一晩コーティングしてから、細胞を添加した。一次mEFを標準mEF培地中で培養し、2日毎に最多5回まで1：2に分けた。mEFのサブコンフルエントの培養物をトリプシン処理して剥がし、10 mLの培地中に再懸濁し、Torrex（商標） 150D X線発生装置で総線量3500〜4000ラドを照射した。照射細胞を400×gで5分間遠心して沈殿させ、細胞1.25×105個/mLになるように標準mEF培地中に再懸濁した。6ウェルプレートの各ウェルに、1ウェルあたり3.75×105個の照射mEFを播種し、24ウェルプレートの各ウェルに、1ウェルあたり75,000個の照射mEFを播種した。
【０１７４】
トランスフェクションは以下の手順で行った。6ウェルプレートにプレーティングしたhES細胞は、コラゲナーゼ（約200ユニット/mL）で37℃で7〜10分間処理してフィーダー細胞層から除去した。コロニーが剥がれ始めたら、各ウェルからコラゲナーゼを吸引し、代わりに1ウェルあたり2 mLの標準hES成長培地を添加した。hES細胞を1個のウェルの表面を5 mLのピペットでかきとって除去し、50 mLの円錐管に移した。さらにhES成長培地を最終容量が10 mLになるように添加した。この細胞懸濁物を10 mLのピペットで10〜12回摩砕し、8 mLの標準hES成長培地をさらに添加した。3 mLの細胞懸濁物を、上述のようにゼラチンおよびmEFフィーダー層で事前にコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに添加した（すなわち6ウェルプレートの1ウェルは、新しいプレートの6ウェルに播種するのに十分であった）。
【０１７５】
再プレーティングしたhES細胞を多種多様なトランスフェクション系で検討し、hES細胞の遺伝的変化が分化を生じることなく生じるか否かを判定した。検討した系は以下の系である：Mammalian Transfection Kit（CaPO4およびDEAE試薬）、Stratagene、カタログ番号200285；TransIT-LT1 Mirus（商標）（Panvera）、カタログ番号MIR 2310；Polybrene （Sigma）；Poly-L-Lysine（Sigma）；Superfect（商標）（Qiagen）；Effectene（商標）（Qiagen）；Lipofectin（商標）（Life Technologies）；Lipofectamine（Lipofectamine 2000（商標）とは別製品）（Life Technologies）；Cellfectin（商標）（Life Technologies）；DMRIE-C （Life Technologies）；Lipofectamine 2000 （Life Technologies）；およびBioRad （商標） Gene pulserを使用したエレクトロポレーション法。
【０１７６】
用いた条件では、Lipofectamine 2000（商標）（Gibco Life Technologies；カタログ番号11668019、特許出願係属中）、およびFuGENE（商標）（Fugent L.L.C.の商標；脂質および他の成分のメーカー独自の混合物、Roche Diagnostic社から購入；カタログ番号1 814 443）ではいずれも良好なトランスフェクション効率が得られた。トランスフェクション効率は一般に、再プレーティングしたhES細胞に試薬を、再プレーティングの約48時間後に接触させた場合に最高であった。
【０１７７】
Lipofectamine 2000（商標）を用いたトランスフェクションは以下の手順で実施した。プラスミドDNA （3〜5 μgのpEGFP-C1、ClonTechカタログ番号6084-1）を最終容量が100 μlとなるように水で希釈した。パイロット実験では、5〜30 μLのLipofectamine 2000（商標）（Gibco、カタログ番号11668-019）を、最終容量が100 μLとなるようにOptiMEM（商標）（Gibco、カタログ番号11-58-021）で希釈した。このDNA溶液を次にLipofectamine 2000（商標）溶液に緩やかに添加し、穏やかに混合した。混合物を室温で20〜30分間インキュベートした後に、800 μlのOptiMEM（商標）を添加した。細胞を3 mLの事前に保温しておいたOptiMEM（商標）で洗浄し、ウェルあたり（9.6 cm2）0.5〜1 mLのDNA/脂質混合物溶液中で37℃で4時間かけてインキュベートした。一部の実験では、4時間後に複合体を除去してから4 mLのmEF馴化培地を添加した。他の実験では、十分なmEF馴化培地をウェルに添加して、最終容量を3.5 mLとして同混合物を細胞上に一晩おいた。他の実験では、十分なmEF馴化培地を含むウェルに最終容量が3.5 mlとなるようにDNA/脂質混合物を添加し、この混合物中で細胞を一晩インキュベートした。
【０１７８】
FuGENE（商標）を用いたトランスフェクションは以下の手順で行った。FuGENE（商標）6（Roche Diagnostics社）を用いて、FuGENE（商標）試薬：DNAが3：2の比になるように、製造業者の指示書通りに10 μgのDNAを各ウェルにトランスフェクトした。トランスフェクションにはOptiMEM（商標）無血清培地を使用した。「従来のプロトコル」では、FuGENE（商標）-DNA複合体を添加してから4時間後に、トランスフェクトした各ウェルに2.5 mLの標準hES成長培地を添加した。改訂されたプロトコル（「3：2 L」）では、トランスフェクトしたウェルには、標準hES成長培地を再添加しなかった。トランスフェクションの24時間後にGFPの発現をフローサイトメトリーで評価した。
【０１７９】
トランスフェクションの48時間前に、ゼラチンおよびmEFフィーダー層で上述の通りにコーティングしておいた6ウェルプレート上にhES細胞を播種した。hES細胞のトランスフェクションには、FuGENE（商標）6（Roche）、またはLipofectamine 2000（商標）（Gibco）を製造業者の指示書にしたがって使用した。トランスフェクションの24時間後に、GFP発現について、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで細胞の評価を行った。図1に示す実験では、以下の三つの方法を比較した：標準的なLipofectamine 2000（商標）プロトコル、標準的なFuGENE（商標）プロトコル、および改変FuGENE（商標）プロトコル（DNA/脂質混合物を細胞上に一晩放置）。Lipofectamine 2000（商標）ではGFP発現細胞の一貫して高いパーセンテージが得られたが、改変FuGENE（商標）プロトコルでは、平均蛍光強度より高いGFP発現細胞が認められた。
【０１８０】
アデノウイルスベクターを用いた一過的な形質導入は以下の手順で行った。ベクターAd5CMV5-GFP（本発明ではAd5GFPと呼ぶ）は、CMVプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質のコード領域を含むベクターで、Quantum Biotechnologiesから購入した（カタログ番号ADV0030）。形質導入の72時間前に、hES細胞を、上述のようにゼラチンおよびmEFフィーダー層でコーティングした24ウェルプレートに播種した。形質導入に先立ち、hES細胞の3ウェルの内容物を、0.05%トリプシン/5 mM EDTA （Sigma）溶液で37℃で剥がし、500 μLの標準mEF 成長培地中に再懸濁し、血球計数器で数えて（75,000個のmEFフィーダー細胞を各ウェルから差引いた）、トランスフェクション前の細胞数を決定した。アデノウイルスのストックは使用直前に氷上で解凍した。
【０１８１】
Ad5GFPを感染させる場合は、hES細胞を含むウェルから成長培地を吸引し、代わりに1 mLのhES成長培地＋9 μLのAd5 GFPストックを添加した（MOI＝40）。2時間後、ウイルス含有培地を、1ウェルあたり1 mLのhES成長培地と交換した。形質導入を行った各ウェルには、1 mLの新鮮なhES成長培地を24時間毎に再添加した。GFPの発現はフローサイトメトリーで評価した。典型的な実験で得られた結果から、発現は形質導入の24時間後に最も高くなるが、少なくとも8日間低レベルで維持されることがわかった（さらに時間が経過すると、hES細胞の過剰な成長のために広範囲に及ぶ分化がみられた）。
【０１８２】
実施例6：不死化フィーダー細胞系列NH190の調製
この例では、霊長類の多能性幹（pPS）細胞培養用の馴化培地に適した永久的なマウス細胞系列を樹立した。NHG190系列は、3剤耐性で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する、テロメラーゼを有する不死化されたマウスの胚性線維芽細胞系列である。
【０１８３】
抗生物質ネオマイシンおよびハイグロマイシンに対する耐性に関する導入遺伝子を有する二つのマウス系列を、Jackson Laboratory （Bar Harbor、Maine）から入手した。同所から入手したC57BL/6J TgN（pPGKneobpA）3EmsマウスとC57BL/6J-TgN（pPWL512hyg）1Emsマウスを交配した。ネオマイシンとハイグロマイシンの両方に耐性の胚を受胎後13.5日に、フィーダー層用のマウス胚性線維芽細胞（mEF）を調製するための標準プロトコル（E.J.Robertson、71〜112、「奇形腫および胚性幹細胞系列（Teratocarcinoma and Embryonic Stem Cell Lines）」、Lines編、E.J.Robertson、Oxford：IRL Press、1987）の通りに切り出した。採取したmEF細胞は凍結保存した。
【０１８４】
mEFは、20%ウシ胎児血清（HyClone）、2 mM L-グルタミン （Gibco/BRL）、80% DMEM （Gibco/BRL）を含む成長培地中で解凍した。この細胞を、1：2の分割比で4代にわたって増殖させた。約75%のコンフルエンシーとなった2本のフラスコに、エレクトロポレーションの4時間前に新鮮な培地を添加した。細胞を0.5% トリプシン/500 mM EDTA （Gibco/BRL）を用いてフラスコから剥がし、400×gで5分間室温で遠心して沈殿させ、成長培地中に細胞4×106個/mLの濃度となるように再懸濁した。
【０１８５】
細胞懸濁物を二つの500 μLのアリコートに分け、2本のエレクトロポレーション用キュベット（ギャップ幅0.4 cm；BioRad）に移した。1本のキュベットには5 μgの対照プラスミド（pBS212；SV40初期エンハンサー/プロモーターで駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含む）を添加し、もう1本のキュベットには5 μgのpGRN190（MPSVプロモーターで駆動されるマウステロメラーゼ逆転写酵素（mTERT）のコード領域＋SV40初期エンハンサー/プロモーターで駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含む）を添加した。細胞とDNAを手で混合し、BioRad製の容量拡張装置（300V、960 μFに設定）を接続したBioRad gene Pulserを用いてエレクトロポレーションを行った。
【０１８６】
細胞の各アリコートを、25 mLの成長培地を含む各150 cmのプレートに移した。プレート上の培地を翌日交換し、その次の日に成長培地を、成長培地＋0.5 μg/mL ピューロマイシンと交換した。プレート上の培地は、新鮮なピューロマイシン含有培地と48時間毎に、エレクトロポレーションの29日後まで交換を続けた。この時点で、ピューロマイシン耐性細胞の大きな個々のコロニーが、エレクトロポレーションでpBS212を導入したプレート、およびpGRN190を導入したプレートの両方で明瞭に認められた。対照プレートから10個のコロニー、およびエレクトロポレーションでpGRN190を導入したプレートから12個のコロニーをクローニングシリンダーで単離し、各コロニーを48ウェルプレートの一つのウェルに移した（1ウェルに1コロニー）。
【０１８７】
1週間後、48ウェルプレート（対照コロニー3個、エレクトロポレーションでpGRN190を導入したコロニー1個）にコンフルエンスに増殖した全生存コロニーを24ウェルプレートのウェルに個別に移した。6日後、増殖を続けていたコロニーのみを、エレクトロポレーションでpGRN190を導入したプレートから採取し、NH190と命名した。この細胞は、0.5 μg/mLのピューロマイシンを添加した成長培地中で維持した。TRAPアッセイ法（Kimら、Nucleic Acids Res. 25：2595、1997）によるテロメラーゼ活性の解析の結果、NH190細胞が機能性のテロメラーゼ活性を示すことがわかった。
【０１８８】
混合培養集団中の細胞、およびインビボにおける細胞のモニタリングを容易にするために、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現をもたらすレトロウイルスコンストラクトをNH190細胞にさらに感染させた。プラスミドpEGFP-1に由来する強化型GFP配列は、ClonTechから入手可能なLiving Colors（商標）蛍光タンパク質ベクターの一種である。これは制限ヌクレアーゼ切断部位が変化し、コードされたタンパク質の励起波長および発光波長が変化した強化型GFPのコード配列を含む。EGFP-1の配列は、ベクターpMSCV.neo（ClonTechカタログ番号K1062-1）にクローニングした。作製したベクターをNH190細胞に導入し、GFP陽性細胞をFACSソーティング法で分離した。GFP発現細胞系列はNHG190と命名した。細胞は、培養物中で3か月間以上維持された。
【０１８９】
実施例7：NHG190フィーダー細胞上で維持したhES細胞の遺伝的修飾
NHG190細胞を、20%ウシ胎児血清（HyClone）および5 mM グルタミンを添加したDMEM （Gibco）中で培養した。細胞は3日毎に1：10に分けた。サブコンフルエントとなった培養物をトリプシン処理して剥がし、10 mLの培地中に懸濁し、Torrex（商標） 150D X線発生装置で総線量3500ラドを照射した。照射細胞を400×gで5分間遠心して沈殿させ、細胞1.25×105個/mLになるように、NHG190培地中または標準hES培地中に再懸濁した。
【０１９０】
馴化培地は、NHG190細胞を4.08×104/cmの濃度で、ゼラチンコーティングプレート上にプレーティングして調製した。プレーティングの18〜24時間後に、培地を、4 ng/mLのbFGFを添加した標準hES培地と交換した。この培地を18〜24時間かけて細胞によって馴化してから回収し、さらに4 ng/mLのbFGFを添加した。この培地は、回収同日にhES細胞培養物を支持するために使用した。照射NHG190細胞は、馴化培地の調製に7〜10間使用することが可能と考えられている。
【０１９１】
hES細胞のトランスフェクションは以下の手順で行った。コラゲナーゼ（約200 U/mL）処理を37℃で7〜10分間行ってフィーダー層から細胞を除去し、50 mLの円錐管に移した。hES成長培地を最終容量が10 mLとなるように添加し、懸濁物を10 mLのピペットを用いて10〜12回摩砕し、さらに8 mLのhES培地を添加した。3 mLの細胞懸濁物を、Matrigel（登録商標）およびNHG190フィーダー細胞で事前にコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに添加した。
【０１９２】
播種から48時間後に、FuGENE（商標）6（Roche）を用いて製造業者のプロトコルにしたがって、hESに1ウェルあたり10 μgのDNAをOptiMEM（商標）無血清培地中でトランスフェクトした。DNAは、PGKプロモーターによって駆動されるneorを含むプラスミドとした。4時間後、3 mLのNHG190-馴化培地をトランスフェクションを行った各ウェルに添加した。細胞には3 mlの馴化培地を毎日再添加した。トランスフェクションの48時間後に、200 μg/mLのジェネティシン（Sigma）を添加したNHG190馴化培地上に細胞を重層し、その後は毎日交換した。選択から3日後に、さらに照射NHG190フィーダー細胞を添加した（hES培地中に細胞1.25×105個/ウェル）。24時間後、培地を再び200 μg/mLのジェネティシンを含むNHG190馴化培地と交換し、その後は毎日交換した。
【０１９３】
個々のコロニーを単離し、さらに選択ラウンドを行って増殖させた。さらに5日後に、各クローンを顕微鏡で同定し、ディッシュの外側に印を付けた。培地を除去し、代わりにコラゲナーゼ（約200 U/mL）を添加した。個々のコロニーをp20ピペットチップで拾い上げ、2 mLのNHG190馴化培地（ジェネティシン非添加）を含む各チューブに移した。この懸濁物を5回摩砕してコロニーをバラバラにし、また各チューブの内容物を、ゼラチンおよび照射NHG190細胞（細胞1.875×105個/ウェル）でコーティングした12ウェルプレートのウェルに移した。24時間後に、2 mLの新鮮な馴化培地を細胞に添加した。播種の2日後に、200 μg/mLのジェネティシンを含む2 mLの馴化培地に細胞を重層し、培地は5日間、毎日交換した。各ウェルのコンフルエンシーが50〜75%となった時点で、コラゲナーゼで細胞を剥がし、6 mLの馴化培地に移し、10〜12回摩砕した。3 mLの細胞懸濁物を、ゼラチンおよび照射NHG190細胞（細胞3.75×105個/ウェル）でコーティングした6ウェルプレートの二つのウェルにそれぞれ添加し、24時間後の時点で3 mLの馴化培地を細胞に添加した。次に細胞を、ジェネティシンを含む3 mLの馴化培地を用いて5日間かけて選択し、前述したように1：6に分けた。
【０１９４】
レトロウイルスを用いた安定な形質導入は以下の手順で行った。PMSCVneoベクターから作られたGRN354と命名したレトロウイルスベクター（Geron社製）はClonTechから購入した（カタログ番号K1062-1）。eGFPコード領域をMSCV LTRの下流に挿入した。LTRはGFPの発現を誘導する。また同ベクターは、マウスPGKプロモーターによって駆動されるneor遺伝子も含む。プレートは、0.5% ゼラチンおよびNHG190フィーダー細胞でコーティングした（24ウェルプレートでは1 mLのNHG190培地につき7.5×104個；6ウェルプレートでは3 mL中に3.75×105個）。hES系列H7を、hES培地中で調製したプレートの24ウェルに播種した（1 mL/ウェル）。48時間後、hES細胞の3ウェルを、0.05% トリプシン/5 mM EDTA （Sigma）を用いて37℃で剥がし、500 μLのNHG190培地に再懸濁して計数した。レトロウイルスコンストラクトpGRN354のストックは使用直前に氷上で解凍した。成長培地をウェルから吸引し、400 μLのhES培地＋8 μLのレトロウイルス（MOI＝10）、および4 μLの8 mg/mL ポリブレン溶液（Sigma）と交換した。2時間後に、800 μLのhES成長培地を各ウェルに添加した。形質導入を行った各ウェルには、1 mLの新鮮なhES培地を24時間毎に添加した。
【０１９５】
形質導入の4日後、培地を、200 μg/mLのジェネティシンを含む1 mLのhES成長培地と交換した。ジェネティシンによる選択の3日後に細胞をコラゲナーゼで剥がして摩砕し、3 mLのhES培地中に再懸濁し、ゼラチンおよびNHG190フィーダーでコーティングした6ウェルプレートの一つのウェルに再播種し、24時間後にhES培地を再添加した。次に同培地を、ジェネティシンを含むhES培地と再び交換し、24時間毎に再び添加した。未分化コロニーは選択に対して生存し、3か月間にわたって維持された。FACS解析の結果、選択された細胞の50〜65%がGFPを低レベルながら発現することがわかった。細胞の核型は正常であった。
【０１９６】
図3は、レトロウイルスを導入後に分化させたhES細胞でGFPが発現されていることを示している。hES細胞系列H7を薬剤耐性（NHG190）フィーダー層にプレーティングし、GRN354を感染させ、薬剤G418耐性細胞を選択した。導入細胞を増殖させ、G418選択下で数代にわたって維持した。この細胞を懸濁培養物中に移して胚様体を形成させ、4日間かけて分化させた後に、20% FBS培地に1週間プレーティングした。広範囲に及ぶ分化がみられた後に、培養物を4%パラホルムアルデヒド中に固定化し、GFP発現を確認するために蛍光顕微鏡写真を撮影した。分化した細胞の多くは、未分化のトランスフェクトされたhES系列と比べて高レベルのGFPを発現し、これは異なる細胞の種類ではMESV-LTRの活性化に差があることと一致する。
【０１９７】
実施例8：フィーダーフリーのhES細胞のトランスフェクション
この例では、馴化培地中のラミニン上でフィーダーフリー培養物中で維持したhES細胞を、CMVプロモーターで駆動される緑色蛍光タンパク質（GFP）を有するプラスミドでトランスフェクトすることで遺伝的に修飾した。
【０１９８】
mEF馴化培地は上述の手順で調製した。mEFに放射線を照射し、細胞約5.7×104個/cm2となるように播種した。少なくとも16時間後に、培地を、4 ng/mLのhbFGFを添加したhES培地と交換した。馴化培地は、hES培養物を補給するために毎日回収した。hES培養物に添加する前に、同培地に4 ng/mLのhbFGFをさらに添加した。安定な形質移入体の選択が必要な場合は、mEF馴化培地に200 μg/mLのジェネティシン（Sigma；カタログ番号G5013）を添加した。
【０１９９】
mEFフィーダー層上で維持したH9 hES細胞を、約200ユニット/mLのコラゲナーゼIVと37℃で10分間インキュベートすることで培養物から回収した。細胞を解離させ、通常のhES培地、またはmEF馴化培地に再懸濁した。次に通常培地中の細胞をmEFフィーダー層上に再播種し、mEF馴化培地中の細胞をMatrigel（登録商標）またはラミニン上にプレーティングした。すべての培養物の播種密度は細胞約4×104個/cm2とした。フィーダー層上の細胞は通常の培地上で維持したが、マトリックス上の細胞はmEF馴化培地中で1日または2日間維持したのちにトランスフェクションに用いた。馴化培地は24時間毎に交換した。
【０２００】
hES細胞培養物には上述のLipofectamine 2000（商標）をトランスフェクトした。GFP発現のFACS解析は以下の手順で行った。hES細胞を0.5 mM EDTA（溶媒PBS）を用いて回収し、細胞約1x106個/試験の濃度で再懸濁した。細胞をPBS＋2% FBS、0.1%アジ化ナトリウム、および2 mM EDTAを含む溶液で洗浄した。SSEA-4染色は、Developmental Studies Hybridoma Bank （University of Iowa、Iowa City）から入手した抗体を1：15の希釈率で用いて同じ緩衝液中で行った。対照にマッチさせたアイソタイプはSigma （St. Louis MO、USA）から入手した。細胞を、最終容量100 μl中で4℃で30分間かけて抗体とインキュベートして洗浄後、PE（Becton Dickinson、San Jose、GA）を結合させたラット抗マウスκ鎖抗体と4℃で30分間かけてインキュベートした。試料を上述の通りに洗浄し、GFPおよびSSEA-4の発現を、FACScalibur（商標）フローサイトメーター（Becton Dickinson、San Jose、CA）で解析した（ソフトウェアはCellQuest（商標）を使用）。
【０２０１】
mEF馴化培地中のラミニン上で維持したH9系列のhES細胞に、CMVプロモーターによって駆動されるGFPを有するプラスミドをプレーティングの24時間後または48時間後にトランスフェクトした。最初の実験では、5 μgのプラスミドおよび12 μLのLipofectamine 2000（商標）の混合物を用いた。細胞に1 mLのDNA/脂質複合体を添加し、37℃で4時間インキュベートしてから、3 mLのmEF馴化培地を添加し、トランスフェクションの24時間後にGFP発現のモニタリングを行った。
【０２０２】
図4は、この実験の結果を示す。パネルAは、ラミニン上で維持したH9細胞の形態を示す。パネルBは、Aに示した同じコロニーで観察されたGFP陽性細胞を示す。パネルCは、SSEA-4高集団（未分化細胞）中におけるGFP陽性細胞率を示すFACS解析を示す。細胞は、播種の24時間後（バー1および2）、または48時間後（バー3および4）にトランスフェクトし、トランスフェクションの24時間後（バー1および3）または48時間後（バー2および4）に解析を行った。明るい緑色の細胞が、ラミニン上の未分化ESコロニーの狭い領域に、トランスフェクションの24時間後に観察された（パネルAおよびB）。最初の播種の48時間後におけるトランスフェクションで最高の効率が得られ、細胞の38%がGFP陽性であることが、トランスフェクションの24時間後におけるFACS解析で確認された（パネルC）。
【０２０３】
次の実験では、mEF馴化培地中のMatrigel（登録商標）上、またはラミニンコーティングプレート上で維持したH9細胞のトランスフェクション効率を、mEFフィーダー上で維持した細胞のトランスフェクション効率と比較した。通常培地中で維持したフィーダー層上の細胞を対照として用いた。フィーダー上の細胞と、フィーダー上にない細胞間にみられる形態の差は、播種の1日後または2日後に認められた。フィーダー上のコロニーは、フィーダー層上で維持しなかった細胞と比べてコンパクトであり、フィーダーフリー培養物中の個々のhES細胞はそれほどコンパクトでなく平板であった。ラミニン上の細胞とMatrigel上の細胞間には、細胞またはコロニーの形態に有意差は認められなかった。これらの細胞に、CMVプロモーターによって駆動されるGFPを発現するプラスミドを播種の2日後にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞のGFP発現を蛍光顕微鏡で調べた。
【０２０４】
細胞は、通常培地中のmEFフィーダー（mEF/RM）上、mEFで馴化した培地中のラミニン（ラミニン/CM）上、または、馴化培地中のMatrigel（登録商標）（Matrigel/CM）上で維持した。明るい緑色の細胞が、フィーダーフリー培養物の未分化hESコロニー中に観察された。これとは対照的に、フィーダー上のコロニーでは緑色の細胞はほとんど認められなかった。FACS解析の結果、Matrigel（登録商標）上の細胞の16%、およびラミニン上の細胞の14%は、SSEA-4高集団中でGFP陽性であったが、フィーダー上で陽性の細胞はわずか5%であった。以上の結果は、トランスフェクション効率が、フィーダーフリー条件では有意に高くなることを意味する。
【０２０５】
次の実験では、（1）DNA/脂質の比の影響、（2）「mEF馴化培地添加の4時間前におけるDNA/脂質複合体の細胞への添加」対「mEF馴化培地の存在下における同複合体の細胞への添加」の影響、および（3）「Lipofectamine 2000（商標）の使用」対「FuGENE（商標）の使用」の影響を評価した。
【０２０６】
Lipofectamine 2000（商標）を用いたトランスフェクションについては上述した。FuGENE（商標）を用いたトランスフェクションは以下の手順で実施した。プラスミドDNA（5〜10 μgのpEGFP-C1、ClonTechカタログ番号6084-1）を水で希釈して最終容量を100 μlとした。パイロット実験では、5〜30 μLのFuGENE（商標）を十分なOptiMEM（商標）に添加して最終容量を100 μLとした。このDNA溶液を次にFuGENE（商標）溶液に緩やかに添加して穏やかに混合した。混合物を室温で30分間インキュベートした後に、800 μlのOptiMEM（商標）を添加した。細胞を3 mLの事前に保温したOptiMEM（商標）で洗浄し、1 mLのDNA/脂質混合物溶液中で37℃で4時間インキュベートした。一部の実験では、4時間後にさらに2 mLのmEF馴化培地をウェルに添加した。また別の実験では、DNA/脂質混合物を、2 mLのmEF馴化培地を含むウェルに添加し、細胞を同混合物中で一晩インキュベートした。
【０２０７】
最高効率は以下の条件で得られた：バー1＝5 μgのプラスミド＋12 μlのLipofectamine 2000（商標）の混合物（1 mLのDNA/脂質混合物を2.5 mLのmEF馴化培地を含むウェルに添加して細胞を同混合物中で一晩インキュベートした）。バー2および3＝10 μgのプラスミド＋15 μlのFuGENE（商標）の混合物（細胞を1 mLのDNA/脂質混合物中で4時間インキュベートした後に、2.5 mLのmEF馴化培地を添加した）。L＝Lipofectamine 2000（商標）；F＝FuGENE（商標）。
【０２０８】
フィーダーフリーのhES細胞が安定な遺伝的修飾を受けるか否かを調べるために、Matrigel（登録商標）上に維持したH1 hES細胞を、EF1aプロモーターで駆動されるβ-ガラクトシダーゼをコードする7.5 μgのプラスミドと、PGKプロモーターで駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードする2.5 μgのプラスミドの混合物を同時にトランスフェクトした。細胞は、mEF馴化培地中のMatrigel（登録商標）上にプレーティングした48時間後にトランスフェクションを行った。10 μgのプラスミド＋15 μlのFuGENE（商標）を1 mL中で細胞と4時間かけてインキュベート後に、2.5 mLのmEF馴化培地を添加した。48時間後に培地を、200 μg/mLのジェネティシンを添加したmEF馴化培地と交換した。培養物をジェネティシン含有培地中で維持し、21日間にわたって毎日培地を交換した。すべての擬似トランスフェクション培養物（プラスミドの代わりに水と混合したFuGENE（商標）で処理したもの）は48〜72時間以内に死滅した。薬剤耐性コロニーは、FuGENE（商標）とプラスミドの両方をトランスフェクトしたウェル中に現れ、出現頻度は、当初トランスフェクトした細胞105個あたり約1個であった。これらのコロニーは、ジェネティシンを含むmEF馴化培地中で維持して増殖させた。
【０２０９】
実施例9：チミジンキナーゼ遺伝子がhTERTプロモーター配列の制御下にあるベクターの調製
hTERTプロモーターを含むλGφ5と命名したラムダクローンは、American Type Culture Collection （ATCC；10801 University Blvd.、Manassas、VI 20110 U.S.A.）に登録されている（アクセッション番号98505）。λGφ5は、hTERTのコード配列の約13,500塩基上流に15.3 kbpの挿入部分を含む。
【０２１０】
hTERTプロモーター配列を含むNot1断片を、pUC系プラスミドのNot1部位にサブクローニングし、pGRN142と命名した。9 kbのNcoI断片（hTERT遺伝子配列および約4〜5 kbのラムダベクター配列を含む）を含むサブクローン（プラスミド「pGRN140」）の配列を部分的に決定して挿入方向を確認した。pGRN140をSalIで切断してラムダベクター配列を除去し、結果として得られたプラスミド（ラムダ配列が除去された状態）をpGRN144と命名した。次にpGRN144の挿入部分の配列を決定した。
【０２１１】
配列番号：1は、得られた遺伝子データのリストである。ヌクレオチド1〜43および15376〜15418はプラスミド配列である。したがってゲノム挿入部分は、44位の残基から始まり15375位の残基で終わる。クローニングされたcDNA断片の開始点は13490位の残基に対応する。Alu配列エレメントが約1700塩基対上流に位置する。pGRN142のhTERT挿入部分の配列は現在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）から入手できる（アクセッション番号PGRN142.INS AF121948）。以下の記述中におけるプラスミドにおけるTERT残基のナンバリングは、当技術分野の標準的な慣行にしたがって翻訳開始コドンから始まる。hTERTのATGコドン（翻訳開始部位）は、配列番号：1の13545位の残基から始まる。したがって最初の上流残基である位置-1は、配列番号：1の13544番目のヌクレオチドに対応する。
【０２１２】
さまざまなhTERTの上流配列およびイントロン配列を含むレポーターコンストラクトを用いて発現試験を行った。pGRN144（上述）のBglII〜Eco47III断片を切断してpSEAP2Basic （ClonTech、San Diego、CA）のBglII〜NruI部位にクローニングしてpGRN148と命名したプラスミドを得た。第二のレポーター-プロモーターであるプラスミドpGRN150は、pGRN144のBglII-FspI断片をpSEAP2のBglII〜NruI部位に挿入して作製した。プラスミドpGRN173は、pGRN144のEcoRV〜StuI断片（+445〜-2482）を用いて構築した。このようにして、hTERTの読み枠の開始点から約2.5 kb上流から、コード領域内の第1イントロンの直後までのhTERTのプロモーター領域を含むプロモーターレポータープラスミドが得られる（hTERT読み枠の開始MetコドンはLeuに変更）。プラスミドpGRN175は、APA1（Klenowブラント）-SRF1による切断と、pGRN150の再連結により、hTERTの上流のゲノム配列の大部分を欠失させて作製した。このようにして、hTERTの上流配列（-36〜-117）である204ヌクレオチドを使用するプロモーター/レポータープラスミドが得られた。プラスミドpGRN176は、pGRN150のPML1-SRF1の再連結によって、hTERT上流配列の大部分を欠失させることで作製した。このようにして、hTERTの上流配列（-36〜-239）の204ヌクレオチドを用いたプロモーター/レポータープラスミドを得た。
【０２１３】
分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（SEAP）活性のレベルは、化学発光基質CSPDTM （CtonTech）を用いて検出した。培地中に検出されたSEAP活性は、SEAP mRNAの細胞内濃度の変化に正比例することがわかった。pGRN148プラスミドおよびpGRN150プラスミド（hTERTプロモーター-レポーター）、ならびにpSEAP2 プラスミド（SV40初期プロモーターおよびエンハンサーを含む正の対照）を試験細胞系列にトランスフェクトした。pGRN148コンストラクトおよびpGRN150コンストラクトは、不死化（腫瘍由来）細胞系列中におけるpSEAP2と同程度の効率でSEAP発現を誘導した。pSEAP2対照のみが不死化されていない細胞内で検出可能な活性を示した。
【０２１４】
hTERTプロモーターのもつ、腫瘍細胞内においてチミジンキナーゼ（tk）遺伝子の発現を特異的に誘導する能力を、さまざまなコンストラクトを用いて検討した。一つのコンストラクト（pGRN266と命名）は、EcoRI〜FseIのPCR断片を含み、tk遺伝子がpGRN263のEcoRI〜FseI部位にクローニングされている。約2.5 kbのhTERTプロモーター配列を含むpGRN263はpGRN150に似ているが、選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含む。pGRN267はEcoRI〜FseI PCR断片を含み、tk遺伝子がpGRN264のEcoRI〜FseI部位にクローニングされている。約210 bpのhTERTプロモーター配列を含むpGRN264はpGRN176に似ているが、選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含む。pGRN268はEcoRI〜XbaI PCR断片を含み、tk遺伝子がpGRN265のEcoRI〜XbaI（非メチル化）部位にクローニングされている。約90 bpのhTERTプロモーター配列を含むpGRN265はpGRN175に似ているが、選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含む。
【０２１５】
上記のhTERTプロモーター/tkコンストラクトであるpGRN266、pGRN267、およびpGRN268を哺乳動物細胞に再導入し、tk/+の安定なクローン（および/または塊集団）を選択した。tk/+細胞をインビトロでガンシクロビルで処理したところ、143B、293、HT1080、Bxpc-3'、DAOY、およびNIH3T3を含む検討した全腫瘍系列が選択的に破壊された。ガンシクロビル処理は、正常BJ細胞には影響はなかった。
【０２１６】
図5は、TPACアデノベクターpGRN376のマップである。このベクターは、pGRN267のNot1〜BAMHI断片をpAdBN （Quantum Biotech）のNot1〜BGL2部位にクローニングして作製した。この7185 bpのベクターは、中程度の長さのhTERTプロモーター配列の制御下に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（TK）遺伝子を含む。
【０２１７】
実施例10：hES細胞へのチミジンキナーゼコンストラクトの導入
この実験では、上記実施例に記載したpGRN376ベクターがhES細胞に及ぼす作用を検討した。このベクターは、テロメラーゼ逆転写酵素のプロモーターの制御下にヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を含む。細胞内でチミジンキナーゼ遺伝子を発現させると、プロドラッグのガンシクロビルによる毒性に感受性となるはずである。
【０２１８】
未分化のH1細胞を24ウェルプレートにプレーティングした（6ウェルプレートのコンフルエントな1個のウェルを24ウェルプレートの24個のウェルに分けた）。48時間後に、複数のウェルにTPACベクターをMOIが30または100になるように感染させた。ウイルスベクターを添加した4時間後に、培地を新しいマウス胚性線維芽細胞馴化培地（mEF-CM）に交換し、複数のウェルに30 μMのガンシクロビル（GCV）を加えた培地を添加した。GCVに曝露させた細胞に、30 μMのGCVを含むmEF-CMを毎日4日間添加した。GCV処理開始から2日後、3日後、および4日後に、ウェルから内容物を回収してフローサイトメトリーによる解析を行い、（1）総細胞数、および（2）細胞生存率（PI排除法で測定）の変化を評価した。
【０２１９】
図6は、この実験の結果を示す。MOI＝30ではGCVの非存在下で総細胞数に変化は認められなかったが、MOI＝100ではGCVの非存在下で開始から48時間の時点でやや減少していた。またGCV単独で毒性があることの証拠が得られた。GCVのみを添加したウェルは、2日目に対照ウェルの約55%の細胞を含んでおり、4日目までに40%に減少した。GRN376をMOI＝30または100で添加してGCVの存在下で培養したウェルでも同様の結果が得られ、2日目までにウェル内には、対照ウェル中の細胞の18%が含まれており、3日目および4日目には、ウェルには対照ウェル中の細胞の6%および8%の細胞が含まれていた。
【０２２０】
GCVの非存在下では、4日目にMOIが100において、わずかな毒性が認められた（ESゲートの細胞が50%に対して対照細胞は83%）。GCV単独によるある程度の毒性は、2日目にESゲートの75%の細胞で（対照は85%）、3日目に68%で（対照は82%）、4日目に50%で（対照は65%）認められた。GRN376をMOI＝30または100で添加してGCVの存在下で培養したウェルでも同様の結果が得られ、2日目までにウェル内には、ESゲート中の細胞の24〜28%が含まれており、3日目には、ESゲート中の細胞の19〜22%が含まれており、また4日目には、ウェルにはESゲート中の細胞の12%が含まれていた。したがってGRN376＋GCVは、MOIが30と低くても未分化hES細胞を死滅させるのに有効である。
【０２２１】
力価測定実験
未分化H1細胞を24ウェルプレートにプレーティングした（6ウェルプレートのコンフルエントな1個のウェルを24ウェルプレートの24個のウェルに分けた）。48時間後、複数のウェルにpGRN376をMOI＝30で感染させた。ウイルスベクターを添加してから4時間後に培地を新しいmEF-CMと交換した。複数のウェルに、5 μM、10 μM、20 μM、30 μM、または40 μMのガンシクロビル（GCV）を加えた培地を添加した。GCVに曝露させた細胞に、GCVを含むmEF-CMを毎日2日間にわたって再添加した。GCV処理を開始してから2日目にウェルの内容物を回収してフローサイトメトリーで解析を行い、総細胞数の変化および細胞生存率の変化（PI排除法で測定）を評価した。
【０２２２】
図7は、この実験の結果を示す。約20 μMのGCVが検討条件のなかで最適であった。
【０２２３】
分化hES系列の比較
H1細胞およびH7細胞と命名された未分化hES系列を24ウェルプレートにプレーティングした（6ウェルプレートのコンフルエントな1個のウェルを24ウェルプレートの24個のウェルに分けた）。48時間後、複数のウェルにpGRN376をMOI＝30で感染させた。ウイルスベクターを添加してから4時間後に培地を新しいmEF-CMと交換し、20 μMのGCVを加えた培地を複数のウェルに添加した。GCVに曝露させた細胞に、GCVを含むmEF-CMを毎日3日間にわたって再添加した。GCV処理を開始してから4日目にウェルの内容物を回収してフローサイトメトリーで解析を行い、総細胞数の変化を評価した。
【０２２４】
図8に結果を示す。総細胞数の推移から、TPACベクター処理後に両系列で細胞数が減少することがわかった。H7はGCVのみに誘導される毒性がH1より低いことがわかった。したがって異なるhES細胞系列がTPACベクターに反応する。続く試験で、H9細胞系列が、TPACベクター処理後にGCVに対して高度の感受性をもつこともわかった。
【０２２５】
実施例11：分化細胞の選択
この実験では、hES細胞をレチノイン酸（RA）、またはジメチルスルホキシド（DMSO）で処理し、次にTPAC処理後のhTERTおよびOCT-4の発現を解析した。
【０２２６】
未分化のH1細胞を24ウェルプレートにプレーティングした（6ウェルプレートのコンフルエントな1個のウェルを24ウェルプレートの24個のウェルに分けた）。24時間後、複数のウェルに、500 nMのRAまたは0.5% DMSOのいずれかを含むmEF-CMを再添加し、残りの実験用にウェルにRAまたはDMSOを加えた培地を再添加した。RAまたはDMSOによる処理から7日後に、細胞にGRN376を感染させた（MOI＝30）。
【０２２７】
ウイルスベクターを添加してから4時間後に、培地を新しいmEF-CM（適宜RAまたはDMSOを添加）と交換し、複数のウェルには、20 μMのガンシクロビル（GCV）を加えた培地も添加した。GCVに曝露させた細胞には、GCVを含むmEF-CMを毎日3日間にわたって再添加した。GCV処理を開始してから3日目に、ウェル内容物を回収し、フローサイトメトリーによる解析を行って総細胞数の変化を評価した。別のウェルは、残りの未分化幹細胞を培養して除く実験に使用し、これらのウェルの培地をmEF-CM（RA、DMSO、またはGCVを含まない）と交換した。mEF-CMを毎日7日間にわたって細胞に再添加した後に、回収してRNAを単離した。これらの試料を定量RT-PCR法で解析して、hTERTおよびOCT-4の発現を調べた。
【０２２８】
図9は、TPAC処理後に細胞数が減少したことを示す。薬剤前処理に続くTPAC＋GCV処理の7日後に、すべてのウェルに含まれる細胞数は同程度であった。生存幹細胞を培養して除く実験では、ウェルは高度に分化したように見える細胞でコンフルエントとなり、未分化hES細胞は認められなかった。RAで前処理した細胞を含むウェルは、純粋なmEF-CMで前処理された細胞、またはmEF-CM＋DMSOで処理された細胞とは外見が異なっていた。RT-PCR解析（下のパネル、非定量的、35サイクル）から、mEF-CMまたはDMSOで処理したウェルに由来する生存細胞では、OCT-4の発現が検出されなかったが、四つのRA前処理試料中の2つでは、極めて弱いOCT-4 PCR産物が現れた。
【０２２９】
したがって、検出可能な未分化細胞は、TPAC処理とこれに続くmEF-CMまたはmEF-CM＋DMSO中で成長させたウェル中の培養物で生存しない。RAで前処理すると生存細胞内で低レベルのOCT-4が検出される。これが、未分化幹細胞が持続していること、またはOCT-4を発現する別の細胞種が誘導されたことを反映したものか否かは明らかでない。
【０２３０】
実施例12：TPACコンストラクトを含む安定な幹細胞系列：
hTERTプロモーター/チミジンキナーゼコンストラクトによって遺伝的に変化した安定な細胞系列を容易に作製するために、プラスミドpGRN376（実施例9）を修飾して、アデノウイルス配列の大部分を欠失させた。このプラスミドをStuIおよびNotIで切断した後に平滑末端化して再連結した。残りのベクターは、ゲノム中の組み込み部位の上流にあるプロモーター配列によるtk遺伝子発現の促進を妨げる転写ブロッキング配列の後方にhTERTプロモーター/チミジンキナーゼコンストラクトを含む。修飾したベクターはpGRN376modと命名した。
2004523217.tif 000004
【０２３１】
H9 hES細胞系列の培養物を、上述したように0.5 mM EDTAを含むPBSを用いて1：4に分け、6ウェルプレート中のフィーダーフリー培養物中にプレーティングした。プレーティングの24時間後に、上述したFuGENE（商標）-6を用いて、2 μgのGRN376mod＋ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする0.5 μgのプラスミドを細胞に同時にトランスフェクトした。200 μg/mLのジェネティシンを含む培地をトランスフェクションの48時間後に添加して、トランスフェクトされた細胞を選択した。7〜10日後のジェネティシン含有培地中から103個のコロニーをウェルから選択し、24ウェルプレートに個別にプレーティングした後に、約7日間培養して増殖させた。90個のクローンを対象に、プロドラッグであるガンシクロビル（30 μM）に対する感受性についてスクリーニングを行った。10個のクローンが同定され、本質的にすべての未分化細胞が、ガンシクロビルとの培養の1〜3日以内に死滅し、主要コロニーの外側で分化していたわずかな細胞のみが残存していた。
【０２３２】
別の実験では、hES細胞のH1系列（59回の継代）を、標準hES細胞用培地を満たしたMatrigel（登録商標）でコーティングした24ウェルプレート中に1：6に分けた（0日目；1 ml/ウェル、mEF馴化培地＋4 ng/mL bFGF）。培地は翌日に新しい標準培地と交換した。3日目に培地を除去し、200 μL/ウェルの標準培地（擬似トランスフェクション）、またはpGRN376ウイルス（MOI＝100；標準hES培地に200 μL/ウェルで希釈）を再プレーティングした。4時間後、この培地を全ウェルから除去し、1 mg/mLの標準hES培地に30 μMのガンシクロビルを適宜添加したものと交換した。ウェルは、続く3日間にそれぞれ新鮮な培地（30 μMのガンシクロビルを含むものと含まないもの）と交換した。
【０２３３】
図10は、6日目における細胞の顕微鏡写真である。対照ベクターを導入したウェル（パネルA）では、hESコロニーが、正常な特徴をもつコロニーを形成していた。pGRN376ウイルスを導入した後にガンシクロビルで処理したウェル（パネルB）では、大部分またはすべてのES細胞コロニーが消失して分化細胞のみが残っていた。TPACで処理したウェルには、対照ウェルより8倍少ない細胞しか含まれていなかった。
【０２３４】
実施例13：安定なTPAC胚性幹細胞系列の追加特性解析
TPAC安定クローンは、pGRN376modおよびpGK-neoプラスミドを、成長因子を減じたMatrigel（登録商標）コーティングプレート上に塩基性FGFを添加したmEF馴化培地中で成長させたhES細胞系列H9に同時トランスフェクションすることで得た。
【０２３５】
一つの実験では、H9系列（p80）を、0.5 mM EDTAを用いて6回継代培養してからトランスフェクションを行った。2 μgのpGRN376mプラスミドと0.5 μgのpGK-neoプラスミドを用いて、Fugene（商標）（脂質ベースのトランスフェクション促進因子）：DNAが3：2の比で、ES細胞の6ウェルプレートの各ウェルのトランスフェクションを行った。播種の24時間後に細胞をトランスフェクトし、G418による選択をトランスフェクションの24時間後に開始した。101個のG418耐性コロニーをコラゲナーゼを用いて選択した。pGK-neoのみをトランスフェクトした細胞に由来するクローンを単離して、同時トランスフェクションの対照とした。
【０２３６】
各コロニーを0.5 mM EDTAを用いて増殖させ、一次および二次のGCVスクリーニングに用いた。30 μMのGCVによる一次スクリーニング（第1週および第2週）では、10個のGCV感受性クローンと20個の部分的GCV感受性クローンが同定された。30 μMのGCVによる二次スクリーニング（第3週および第4週）では9個のGCV感受性クローン（H9-376m-18、H9-376m-77、およびH9-376m-62と命名されたクローンを含む）が確認された。二次GCVスクリーニングに続き、0.5 mM EDTAを用いて、より大規模な培養物中で細胞を増殖させ、コラゲナーゼを用いて継代した。
【０２３７】
第二の実験では、H9系列（p24）を再び最初に0.5 mM EDTAに通した後に上述の手順でトランスフェクトした。62個のG418耐性の同時トランスフェクションコロニーをコラゲナーゼを用いて0日目に選択した。30 μMのGCVによる一次スクリーニング（第20日、第22日、および第26日）では、1個のGCV感受性クローンと4個の部分的GCV感受性クローンが同定された。一次GCVスクリーニング後に、0.5 mM EDTAを用いて細胞をより大規模な培養物中で増殖させ、標準コラゲナーゼによる継代に徐々に戻した。30 μMのGCVによる二次スクリーニング（第57日）では、1個のGCV感受性クローンが確認された（H9-376m-6と命名）。
【０２３８】
以上の各実験に由来するGCV感受性クローンを対象に、培養物中でG418による選択をさらに行って安定性を判定した。H9-376m-18およびH9-376m-77と命名した各クローンは、安定ではないG418耐性を示した。H9-376m-62、H9-376m-6、およびH9-pGK-neo-1と命名した各クローンはG418耐性であった。
【０２３９】
図11（上）は、安定なTPAC系列がガンシクロビル（GCV）感受性であることを示す。GCV量を減少させながら各細胞系列に曝露させ、毒性を最小限に抑えながら未分化ES細胞の完全な死滅を導くために必要なGCVの最低濃度を決定した。わずか0.5 μMの濃度が、30 μMと同様未分化ES細胞を死滅させたが、毒性は有意に低かった。
【０２４０】
図11（下）は、TPAC系列が、別のプロドラッグ（E）-5-（2-ブロモビニル）-2'-デオキシウリジン（BVDU）に感受性があることを示す。検討したBVDU濃度では、細胞数は有意に少なかったが、ES細胞の死滅は事実上認められなかった。BVDUが高濃度でも存在する細胞数は、ブランク対照のレベルにまでは低下していない。
【０２４１】
安定なTPAC ES細胞系列でHSV-TKが発現していることを検証するために、H9-376m-6、H9-376m-62、およびH9-pGK-neo-1の各培養物に由来する未分化細胞を対象にHSV-TKまたはOCT-4に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行った。TKの発現は、H9-376m-6およびH9-376m-62の試料では検出され、高濃度のRNAにおけるH9-pGK-neoの試料では検出されなかったが、OCT-4の発現は全試料で検出された。
【０２４２】
実施例14：未分化細胞に対するプロモーターの特異性
安定なTPACクローンにおけるhTERTプロモーターの特異性を決定するために、各TPACクローンおよびpGK-neo対照クローンの分化後にGCV感受性を判定した。
【０２４３】
未分化細胞を成長因子を減少させたMatrigel（登録商標）コーティングプレートに、KO DMEM＋20% Hyclone PBS（bFGF非添加）とともに播種した（分化条件）。培養物は分化条件で7日間維持し、継代し、分化条件でさらに4日間プレーティングした。この処理後には、培養物には、未分化細胞はほとんど含まれていなかった（形態により評価）。この時点で、分化した培養物に30 μMのGCVを4日間にわたって添加した。
【０２４４】
TPAC細胞系列のH9-376m-6、H9-376m-62、H9-376m-18、もしくはH9-376m-77から得られた、またはトランスフェクション対照系列H9-pGKneoから得られた分化した培養物ではGCV感受性は認められなかった。したがって、組み込まれたコンストラクト中のhTERTプロモーターは、未分化細胞だけでTKエフェクター遺伝子を機能させる適切な特異性を有する。
【０２４５】
実施例15：未分化TPAC細胞系列におけるESマーカーの発現
安定なTPAC ES細胞系列におけるESマーカーの発現はフローサイトメトリーで決定した。コンフルエントな培養物から、0.5 mM EDTAを用いて細胞を回収し、ヒトSSEA-4、SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81、CD9、AC133に対するモノクローナル抗体、および蛍光色素を結合させた適切な二次抗体とインキュベートした。発現レベルはFACSCalibur（商標）で決定した。負の対照にマッチさせた適切なアイソタイプ対照、および生存能の評価から、非特異的結合の程度を決定した。
【０２４６】
（表２）親hES細胞および安定なTPAC系列上のマーカー
2004523217.tif 000005
*%＝マーカーを発現する生細胞の割合。
【０２４７】
H9-376m-6、H9-376m-62、およびH9-pGK-neo-1細胞系列では、非トランスフェクションH9細胞系列に匹敵するレベルで、検討したすべてのESマーカーの発現がみられた。
【０２４８】
実施例16：TPAC細胞系列が適切に分化する能力
H9-376m-6、H9-376m-62、H9-376m-77、H9-376m-18、およびH9-pGK-neo-1を対象に、三つの胚生殖系列から細胞を生じる能力の有無を検討した。胚様体（EB）を各細胞系列から樹立し、KO DMEMおよび20% Hyclone FBSとともに懸濁物中で培養した。4日間の培養後、ゼラチンコーティングチャンバースライドにEBをプレーティングし、さらに8〜10日間成長させた。培養物を対象に、拍動性細胞の存在をスコアリングし、β-チューブリン、AFP、筋特異的アクチン、および心臓トロポニンI陽性細胞の存在に関して染色を行った。
【０２４９】
図12は、免疫細胞化学試験の代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。結果は以下の通りであった。
・H9-376m-18 p80+20は大きな胚様体を生じた（1回の実験）。拍動性領域（心筋細胞系列細胞と一致する）が認められた。筋特異的アクチン+++；α-フェトプロテイン+++；β-チューブリン+++；心臓トロポニンI+。
・H9-376m-77 p80+16は小さな胚様体しか生じなかった（1回の実験）。拍動性領域は認められなかった。筋特異的アクチン+；α-フェトプロテイン＋：β-チューブリン-（検出されず）；心臓トロポニンI-。
・H9-376m-62 p80+16、p80+20、p80+21、p80+24（4回の実験）は小さな胚葉体のみを生じることが可能であった。拍動性領域は認められなかった。筋特異的アクチン++；α-フェトプロテイン+；β-チューブリン+；心臓トロポニンI-。
・H9-376m-6 p24+12、p24+13、p24+21（3回の実験）は大きな胚葉体を生じることが可能であった。多くの拍動性領域が全実験で認められた。筋特異的アクチン++；α-フェトプロテイン++；β-チューブリン++++；心臓トロポニンI+。
・H9-pGK-neo-1 p24+9、p24+10、p24+13（3回の実験）は、大きな胚葉体を生じることが可能であった。拍動性領域は3回の実験のうち2回で認められた。β-チューブリン+++；心臓トロポニンI+；筋特異的アクチン++++；α-フェトプロテイン++。
【０２５０】
実施例13〜16の結果から、テロメラーゼプロモーターによって駆動されるチミジンキナーゼ遺伝子を含む少なくとも3種類の幹細胞系列が、3種類の胚葉のそれぞれの細胞に分化可能なことがわかる。これらの系列から分化した細胞は、残存性または再出現性の未分化細胞に対する重要なストップ-ギャップを含む。わずか2.5 μMの濃度のガンシクロビルは、このような修飾された実質的にすべての未分化ES細胞を約4日以内に死滅させる。
【０２５１】
配列データ
（表３）本開示に記載された配列
2004523217.tif 000006
【０２５２】
本開示で提供された組成物および手順は、当業者により、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の精神から解離することなく事実上修正される場合があると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】フィーダー細胞（mEF）、または細胞外マトリックス（Matrigel（登録商標）またはラミニン）＋通常培地（RM）/馴化培地（CM）で培養したhES細胞内におけるOCT-4およびhTERTの発現の解析。上のパネルは、RT-PCRで調べたmRNAレベルにおけるOCT-4およびhTERTの発現を示すゲルのコピーである。下のパネルは、さまざまな基質上で成長させ、18s標準に対するOCT-4またはhTERTの比で表した、細胞の発現レベルを比較した棒グラフである。馴化培地中でラミニンおよびMatrigel（登録商標）上で成長させたhES細胞は、フィーダー細胞層上で成長させた細胞と同様の発現パターンがみられた。
【図２】培養hES細胞を対象にTRAP活性アッセイ法で測定されたテロメラーゼ活性を示すゲルのハーフトーンの複写。すべての培養条件で、フィーダーフリー培養物中におけるテロメラーゼ活性は40日後の時点で陽性であった。
【図３】レトロウイルスを導入した後に分化させたhES細胞におけるGFPレポーター遺伝子の発現を示すハーフトーンの複写。hES細胞を懸濁培養物に移して、胚様体を形成させ、さらに4日間培養し、ゼラチンコーティングスライド上に再びプレーティングし、1週間培養した後に固定して、GFP発現を検出するために蛍光下で写真を撮影した。左のパネルは明視野で撮影した写真であり、右のパネルはGFPの発現による蛍光を示す。
【図４】フィーダーフリー培養物中でリポフェクション法で一過的に遺伝的に変化させたhES細胞を調べた結果。パネルAは光学顕微鏡のハーフトーンの複写であり、トランスフェクション後におけるラミニン上のhES細胞の形態を示す。パネルBは蛍光顕微鏡写真のハーフトーンの複写であり、同じコロニーでGFPが発現していることを示す。パネルCは、さまざまな条件においてGFPを発現する細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図５】pGRN376と命名されたTPACベクターのマップ。このベクターは、ヒトのテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）遺伝子の上流配列に由来するプロモーターの制御下に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（tk）遺伝子を含む全長7185 bpのアデノウイルスベクターである。tkの発現は、hTERTを発現する細胞（未分化の胚性幹細胞など）中で促進される。
【図６】TPACチミジンキナーゼベクターが未分化のhES細胞に及ぼす作用を示す二つの折れ線グラフ。再プレーティングの48時間後に、細胞にTPACベクターをMOIが30または100となるように、またはベクターを添加せず擬似的に導入した。4時間後、プロドラッグのガンシクロビル（GCV）を含む新鮮な培地に交換した。3日目までに、TPACベクター＋GCVで処理したウェルには、対照ウェルに対して8%の細胞が含まれていた。
【図７】TPACベクターで処理したhES細胞内におけるGCVの力価を示す棒グラフ。ベクターを導入した4時間後に、記載濃度のGCVを含む新鮮な培地を添加した。約20 μMのGCVが検討した条件のなかで最適な濃度であった。
【図８】二つの異なる系列に由来する、TPACベクターを導入したhES細胞、および擬似的に導入操作を行った同細胞に対するGCVの力価を示す二つの棒グラフ。いずれの系列とも、TPACベクター処理後にGCVに感受性を示した。
【図９】hES細胞を分化させて得られた混合細胞集団にTPAC＋GCV処理が及ぼす作用。細胞は、馴化培地を毎日添加して未分化状態を維持するか、または500 nMのレチノイン酸または0.5%のDMSOのいずれかを添加して、混合型の表現型を有する、系列が決定した細胞へ分化を誘導した。7日後、細胞に20 μMのGCVに加えてTPACベクターをMOIが30になるように感染させた。  上のパネルは、培養物中で生存している細胞数を示す棒グラフである。TPAC＋GCVで処理することで各条件で培養された細胞は除去された。いずれの場合も、生存細胞の培養物には高度に分化した状態で現れ、また実質的に未分化細胞の形態を示さない集団がみられた。下のパネルは、生存細胞のRT-PCR解析を示すゲルのハーフトーンの複写を示す。馴化培地（mEF-CM）またはDMSOで培養された細胞ではOCT-4の発現は検出されなかったが、レチノイン酸（RA）で処理した四つの試料のうち二つの試料では、極めて低レベルのOCT-4発現に一致する増幅産物の存在が認められた。
【図１０】対照アデノウイルスベクター（パネルA）、またはTERTプロモーターの制御下にtk遺伝子を含むpGRN376（パネルB）を混合して導入したhES細胞系列の顕微鏡写真の複写。形質転換細胞の両ウェルをガンシクロビル含有培地中で3日間培養した。正常なhES細胞培養物に典型的な未分化コロニーが対照ウェルに認められた。pGRN376で処理したウェル中には、大部分またはすべての未分化ESコロニーが消失しており、分化細胞のみが残存していた。
【図１１】テロメラーゼプロモーターによって駆動されるチミジンキナーゼ遺伝子（TPAC）を含む未分化細胞の薬剤感受性を示す二つの折れ線グラフ。上下のパネルはそれぞれ、プロドラッグであるガンシクロビル（GCV）、および（E）-5-（2-ブロモビニル）-2'-デオキシウリジン（BVDU）に対する感受性を示す。わずか2.5 μMの低濃度のガンシクロビルで、ほぼすべての未分化TPAC ES細胞が4日以内に死滅している。
【図１２（Ａ）−（Ｂ）】分化したES細胞の白黒の蛍光顕微鏡写真の複写。細胞系列H9-376m-18、H9-376m-62、およびH9-376m-6はTPAC遺伝子を含み；H9-pGK-neo-1は、薬剤選択プラスミドのみをトランスフェクトした対照細胞系列である。安定にトランスフェクトされた細胞を胚様体に分化させ、プレーティングして免疫細胞化学的解析を行った。少なくとも3種類のTPAC含有幹細胞系列で、全3種類の胚葉を示す筋特異的アクチン、α-フェトプロテイン、β-チューブリン、および心臓トロポニンIの染色領域が認められる。
【図１】
2004523217.tif 000008
【図２】
2004523217.tif 000009
【図３】
2004523217.tif 000010
【図４】
2004523217.tif 000011
【図５】
2004523217.tif 000012
【図６】
2004523217.tif 000013
【図７】
2004523217.tif 000014
【図８】
2004523217.tif 000015
【図９】
2004523217.tif 000016
【図１０】
2004523217.tif 000017
【図１１】
2004523217.tif 000018
【図１２Ａ】
2004523217.tif 000019
【図１２Ｂ】
2004523217.tif 000020
【国際公開パンフレット】
2004523217.tif 000021
2004523217.tif 000022
2004523217.tif 000023
2004523217.tif 000024
2004523217.tif 000025
2004523217.tif 000026
2004523217.tif 000027
2004523217.tif 000028
2004523217.tif 000029
2004523217.tif 000030
2004523217.tif 000031
2004523217.tif 000032
2004523217.tif 000033
2004523217.tif 000034
2004523217.tif 000035
2004523217.tif 000036
2004523217.tif 000037
2004523217.tif 000038
2004523217.tif 000039
2004523217.tif 000040
2004523217.tif 000041
2004523217.tif 000042
2004523217.tif 000043
2004523217.tif 000044
2004523217.tif 000045
2004523217.tif 000046
2004523217.tif 000047
2004523217.tif 000048
2004523217.tif 000049
2004523217.tif 000050
2004523217.tif 000051
2004523217.tif 000052
2004523217.tif 000053
2004523217.tif 000054
2004523217.tif 000055
2004523217.tif 000056
2004523217.tif 000057
2004523217.tif 000058
2004523217.tif 000059
2004523217.tif 000060
2004523217.tif 000061
2004523217.tif 000062
2004523217.tif 000063
2004523217.tif 000064
2004523217.tif 000065
2004523217.tif 000066
2004523217.tif 000067
2004523217.tif 000068
2004523217.tif 000069
2004523217.tif 000070
2004523217.tif 000071
2004523217.tif 000072
2004523217.tif 000073
2004523217.tif 000074
2004523217.tif 000075
2004523217.tif 000076
2004523217.tif 000077
2004523217.tif 000078
2004523217.tif 000079
2004523217.tif 000080
2004523217.tif 000081
2004523217.tif 000082
2004523217.tif 000083
2004523217.tif 000084
2004523217.tif 000085
2004523217.tif 000086
2004523217.tif 000087
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004523217.tif 000088
【国際調査報告】
2004523217.tif 000089
2004523217.tif 000090
2004523217.tif 000091