(57)【要約】ハイブリッドカウロバクターＳ層タンパクの部分としての非相同的ペプチドの発現への使用に最適化されたカウロバクター、及びそのようなカウロバクターの生産方法を提供する。本発明のカウロバクターは、ハイブリッドＳ層タンパクを切断する天然型カウロバクタープロテアーゼが欠損している。本発明は、更に、カウロバクターライブラリー、及びＦＡＣＳのような細胞選別方法を用いたそのようなライブラリーの選別方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリッドカウロバクターＳ層タンパクモノマーを切断するカウロバクターの天然型プロテアーゼが欠損する単離カウロバクター。
【請求項２】
前記単離カウロバクターに欠損する前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ活性部位を含むプロテアーゼであること
を特徴とする請求項１に記載の単離カウロバクター。
【請求項３】
前記単離カウロバクターに欠損する前記プロテアーゼは、１又は２以上のＲＴＸ配列を含むプロテアーゼであること
を特徴とする請求項１又は２に記載の単離カウロバクター。
【請求項４】
前記単離カウロバクターに欠損する前記プロテアーゼは、凡そ１５０〜凡そ２５０のアミノ酸を含む第１配列を有するＣ末端部分を含み、該第１配列は、凡そ１５０〜凡そ２５０のアミノ酸を含む第２配列と３０％以上の配列同一性を有し、該第２配列は、カウロバクターＳ層タンパクモノマーのＮ末端部分であること
を特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の単離カウロバクター。
【請求項５】
前記第１及び第２配列は、それぞれ、凡そ１９０〜凡そ２３０のアミノ酸を有すること
を特徴とする請求項４に記載の単離カウロバクター。
【請求項６】
前記第２配列は、配列番号１のアミノ酸２３〜２４２であること
を特徴とする請求項４又は５に記載の単離カウロバクター。
【請求項７】
前記第１配列は、凡そ２００のアミノ酸長であること
を特徴とする請求項６に記載の単離カウロバクター。
【請求項８】
前記単離カウロバクターに欠損する前記プロテアーゼは、配列番号３と凡そ７５％以上配列同一性を有するアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載の単離カウロバクター。
【請求項９】
配列番号３との前記配列同一性は、凡そ８０％以上であること
を特徴とする請求項８に記載の単離カウロバクター。
【請求項１０】
配列番号３との前記配列同一性は、凡そ８５％以上であること
を特徴とする請求項８に記載の単離カウロバクター。
【請求項１１】
配列番号３との前記配列同一性は、凡そ９０％以上であること
を特徴とする請求項８に記載の単離カウロバクター。
【請求項１２】
配列番号３との前記配列同一性は、凡そ９５％以上であること
を特徴とする請求項８に記載の単離カウロバクター。
【請求項１３】
前記単離カウロバクターに欠損する前記プロテアーゼは、配列番号３と実質的に同一のアミノ酸配列、又は配列番号３の１又は２以上のアミノ酸が保存的に置換されている配列を含むこと
を特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の単離カウロバクター。
【請求項１４】
前記単離カウロバクターに欠損する前記プロテアーゼは、配列番号３を含むこと
を特徴とする請求項１に記載の単離カウロバクター。
【請求項１５】
前記単離カウロバクターは、前記プロテアーゼをコードする遺伝子におけるヌクレオチドの欠失、置換又は付加の結果として該プロテアーゼが欠損すること
を特徴とする請求項１〜１４の何れか一項に記載の単離カウロバクター。
【請求項１６】
前記単離カウロバクターは、前記カウロバクターの天然型遺伝子によってコードされているＳ層タンパクモノマーを分泌できないこと
を特徴とする請求項１〜１５の何れか一項に記載の単離カウロバクター。
【請求項１７】
前記単離カウロバクターは、Ｓ層タンパクモノマー発現能を有する組換えＤＮＡを含むこと
を特徴とする請求項１〜１６の何れか一項に記載の単離カウロバクター。
【請求項１８】
前記組換えＤＮＡによって発現されるＳ層タンパクモノマーは、ハイブリッドＳ層タンパクモノマーであること
を特徴とする請求項１７に記載の単離カウロバクター。
【請求項１９】
前記ハイブリッドＳ層タンパクモノマーは、前記単離カウロバクターによって分泌され、前記カウロバクターの細胞表面に付着可能であり、かつカウロバクターＳ層タンパクモノマーと非相同的な１又は２以上のペプチドを含むこと
を特徴とする請求項１８に記載の単離カウロバクター。
【請求項２０】
カウロバクターのライブラリであって、該ライブラリのメンバーが、請求項１９に記載の互いに異なる単離カウロバクターであると共に、該メンバーが、前記１又は２以上の非相同的ペプチドのアミノ酸配列だけ互いに異なるものから構成されるライブラリ。
【請求項２１】
非相同的ペプチドの標的結合能に応じて請求項２０に記載のライブラリを選別する方法であって、該ライブラリが該標的と接触させられ、該標的と結合する該ライブラリのメンバーが、該標的と結合しないメンバーから分離されることから構成される選別方法。
【請求項２２】
前記標的が標識され、一のメンバーと結合する標識の存在が、該標的と当該一のメンバーとの結合を指示すること
を特徴とする請求項２１に記載の選別方法。
【請求項２３】
前記標識は蛍光性であり、前記分離はフローサイトメータによって行われること
を特徴とする請求項２２に記載の選別方法。
【請求項２４】
ハイブリッドカウロバクターＳ層タンパクモノマーを発現するための宿主細胞としての使用に最適化されたカウロバクターの生産方法であって、
i）   プロテアーゼ活性を示すカウロバクターを供給し、該カウロバクターによって発現されるハイブリッドＳ層タンパクモノマーを切断すること;
ii）  前記カウロバクターを突然変異させること；及び
iii） 前記プロテアーゼ活性を示さない突然変異カウロバクターを選択・培養すること
を含む生産方法。
【請求項２５】
前記カウロバクターは、配列番号２の全部又は一部と相同的組換えが可能な核酸の、該カウロバクターへの組込みによって突然変異されること
を特徴とする請求項２４に記載の生産方法。
【請求項２６】
前記カウロバクターは、トランスポゾン挿入によって突然変異されること
を特徴とする請求項２４に記載の生産方法。
【請求項２７】
前記カウロバクターは、１又は２以上の放射線及び１つの化学的変異原によって突然変異されること
を特徴とする請求項２４に記載の生産方法。
【請求項２８】
プロテアーゼ活性を示す前記カウロバクターは、配列番号３と凡そ７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を発現すること、及び前記カウロバクターは、該アミノ酸配列中のアミノ酸が挿入、欠失又は置換されるよう突然変異されること
を特徴とする請求項２４に記載の生産方法。
【請求項２９】
請求項２４〜２８の何れか一項に記載の生産方法によって生産される、突然変異カウロバクターないしその系統。
【請求項３０】
請求項２９に記載の突然変異カウロバクターないしその系統のライブラリであって、互いに異なるハイブリッドカウロバクターＳ層タンパクモノマーを発現・分泌するメンバーから構成されるライブラリ。
【請求項３１】
互いに異なるハイブリッドＳ層タンパクモノマーの標的結合能に応じて請求項３０に記載のライブラリを選別する方法であって、該ライブラリが該標的と接触させられ、該標的と結合する該ライブラリのメンバーが該標的と結合しないメンバーから分離されることから構成される選別方法。
【請求項３２】
前記標的が標識され、一のメンバーと結合する標識の存在が、該標的と当該一のメンバーとの結合を指示すること
を特徴とする請求項３１に記載の選別方法。
【請求項３３】
前記標識は蛍光性であり、前記分離はフローサイトメータによって行われること
を特徴とする請求項３２に記載の選別方法。
【請求項３４】
互いに異なるハイブリッドＳ層タンパクモノマーを発現・分泌するカウロバクターライブラリのメンバーをカウロバクターのＳ層の標的結合能に応じて選別する方法であって、
i）   前記ライブラリを蛍光標識化標的と接触させること；及び
ii）  前記蛍光標識化標的が一のメンバーと結合するか否かに応じ、フローサイトメータによって前記ライブラリのメンバーの分離を行うこと
を含む選別方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
グラム陰性菌カウロバクター（Caulobacter）は、その外膜の表面を覆う準結晶タンパク表面層（Ｓ層）を生成する（Smit, et al., 1981;1992）。Ｓ層タンパクモノマーは、分泌プロセス中当該タンパクのその他の部分に付着した状態に維持されるＣ末端分泌シグナルに依拠するＩ型分泌機構によって分泌される（Gilchrist, et al., 1992; 非特許文献１、 Awram & Smit 1998）。タンパクモノマーが分泌されると、Ｓ層は、自己組織化プロセスにより、凡そ４０,０００の相互連結したタンパクモノマーから構成される六方晶系アレイ（hexagonal array）として生成する（Nomellini, et al., 1997）。細胞表面へのＳ層タンパクの結合は、滑面リポ多糖（ＬＰＳ）分子とＣａ＋２イオンとに依存し（Walker, et al., 1994）、Ｓ層モノマーのＮ末端部分を必要とする（例えば、非特許文献１及び２参照）。Ｓ層タンパクの存在量、細胞表面位置及び幾何学的パッキング構造並びにカウロバクターの固有の性質（遺伝子操作の容易さ、単純な培養条件、非病原性的性質、及び生物膜形成能力）の特徴から、バイオテクノロジーの発展に資すべくカウロバクター／Ｓ層システムが開発された（Smit, et al., 2000）。
【０００２】
異種ペプチドをコードする配列を連結したＳ層モノマーのＣ末端分泌シグナルをコードする遺伝子融合体を使用することにより、カウロバクター／Ｓ層システムは、当該異種ペプチドを多量に分泌することができる（例えば、特許文献１及び２、並びにBingle, et al., 2000参照）。そのようなカウロバクター発現システムは、商標名ＰｕｒｅＰｒｏＴＭ（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア）として商業的に入手することができる。ＰｕｒｅＰｒｏＴＭシステムは、異種ペプチドがＳ層モノマーＣ末端分泌シグナルに結合されかつ宿主にＳ層を形成しない「Ｃ末端ハイブリッドタンパク」を発現するように設計されている。
【０００３】
カウロバクター／Ｓ層システムは、全長（ないしほぼ全長）Ｓ層モノマーの内部の部位に挿入された異種ペプチドを発現し、以って本書（特許請求の範囲、図面及び図面の中の説明も含む。以下同様。）において「全長ハイブリッドタンパク」と指称するものを産生するためにも使用される。そのような場合、Ｓ層モノマーのＮ末端領域には、ハイブリッドタンパクの細胞表面への結合を可能にするための十分な部分が存在する。Ｃ末端分泌シグナルの存在により、ハイブリッドタンパクの分泌は可能となる。異種ペプチドをＳ層タンパクに挿入するのに好ましい種々の部位が報告されている（特許文献１及び非特許文献２参照）。そのようにして産生されたハイブリッドＳ層タンパクは、細胞表面における自己組織化能を有し、以って細胞表面のＳ層として生成するハイブリッドＳ層タンパクモノマーアレイを構築する。このようにして、異種ペプチドは、発現され、細胞表面に存在することができる。この技術は、抗原の発現及び提示のために特に使用される。
【０００４】
カウロバクター／Ｓ層システムの形成中に観察された現象は、種々のハイブリッドタンパクの明らかなタンパク分解性の切断であった。これは、最初は、Ｃ末端ハイブリッドタンパク及び全長ハイブリッドタンパクの両者に対して観察された。Ｓ層タンパクモノマーの異なる位置に挿入された種々の長さの異なる異種ペプチドを含む多数の改変Ｓ層タンパクの分解を観察したにもかかわらず、部位特異性は、全くこの現象とは関連していなかった（例えば、非特許文献１及び２参照）。更に、Ｃ末端ハイブリッドタンパク製品を汚染すると考えられるより小さいタンパクは、タンパク分解活性の結果ではなく、寧ろハイブリッドタンパクの異種ないし「パッセンジャー」部分の内部のＭｅｔ残基に続く内部翻訳の開始の結果であるという報告もある（Simon, B. et al. 2001）。それにもかかわらず、切断現象のため、とりわけ「パッセンジャー」ペプチドが未知ないし特徴未同定の場合、この現象がハイブリッド産物に影響を与えたか否かを知ることは困難であると思われるので、全長ハイブリッドタンパクの発現システムとしてのカウロバクターの使用には依然限界がある。
【０００５】
選択された標的に対するペプチドの結合能を評価するための異なるペプチドからなるパネルないしライブラリを発現及び提示するための生物システムの使用は、細胞成分間の相互作用を研究するための強力な手段となった（米国特許番号5,223,409及び5,571,698参照）。この方法では、それぞれ異なるペプチドと、該ペプチドを生物システムの外表面に提示するためのシグナルとをそれぞれコードする複数の核酸が、該生物システムに導入される。これらペプチドは発現され、該ペプチドの結合ドメインが該生物システムの外表面に提示される。この生物システムは、標的分子に接触させられ、標的分子と結合するシステムのメンバーが単離され、対応する核酸が増幅される。そして、成功した結合ドメインが特徴付けられる。種々のペプチドを接触させ、互いに異なる推定結合領域をそれぞれ提示するこの一般的方法を、本書においては、「パニング」と指称する。現在までのところ、ファージは、パニング法で使用するための好ましい生物システムをなしている。その理由は、部分的には、異種ペプチドの発現及び提示のために細菌システムを使用するのは困難だからである。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開ＷＯ第９７／３４０００号パンフレット
【特許文献２】
国際公開ＷＯ第００／４９１５３号パンフレット
【非特許文献１】
Bingle, W.H., et al. (1997)  J. Bacteriol. 179: 601-611.
【非特許文献２】
Bingle W.H., et al. (1997)  Mol. Microbiol. 26: 277-288.
【発明の開示】
【０００７】
全長ハイブリッドタンパクに関する研究により、異常な構造上の特徴を有するプロテアーゼ、即ちＳ層タンパクモノマーと類似する配列を共有するドメインを有する酵素がカウロバクターによって合成されることが最近発見された。この天然型プロテアーゼは、全長Ｓ層タンパクに挿入された異種ペプチドを発現するカウロバクターについて見られる切断現象の原因をなす。
【０００８】
この発見は、異種ペプチドの発現及び細胞表面提示のためのシステムとしてのカウロバクターの使用を最適化する手段、及び未知ないし特徴未同定のペプチドを良好な忠実度で発現するためそのようなシステムを使用するための手段を提供する。このため、提示及びパニング目的でペプチド又は遺伝子断片のランダムなライブラリを作成するための発現システムとしてカウロバクターを使用することが可能となる。Ｓ層モノマー内の異種ペプチドを発現し、カウロバクター細胞表面にハイブリッドＳ層タンパクの構築・付着を行うための当分野で既知の方法は、いまや、細菌媒介性ライブラリ提示システムで使用することができる。これは、とりわけカウロバクターが、蛍光標示式細胞選別法（ＦＡＣＳ）のような従来の細胞選別技術の使用によって選別されるために十分な寸法を有するので、従来のファージ提示（システム）を越える大きな利点を有する。というのは、そのような技術は、ファージを選別するためには使用することはできないからである。
【０００９】
本発明は、ハイブリッドカウロバクターＳ層タンパクモノマーを切断するカウロバクターの天然型プロテアーゼが欠損する単離カウロバクターを提供する。また、本発明は、そのようなカウロバクターのライブラリを提供する。このライブラリのメンバーは、該メンバーによって発現されるハイブリッドＳ層タンパクモノマーの異種ペプチドのアミノ酸配列だけ互いに異なる。
【００１０】
本発明は、ハイブリッドカウロバクターＳ層タンパクモノマーを発現するための宿主細胞としての使用に最適化されたカウロバクターを生産する方法であって、i）プロテアーゼ活性を示すカウロバクターを供給し、該カウロバクターによって発現されるハイブリッドＳ層タンパクモノマーを切断すること、ii）前記カウロバクターを突然変異させること、及びiii）前記プロテアーゼ活性を示さない突然変異カウロバクターを選択・培養することを含む方法も提供する。突然変異は、挿入、欠失、又は置換によって行うことも可能であり、また放射線及び／又は化学的突然変異誘発物質、トランスポゾン挿入、相同的組換え又はその他の方法の使用によって行うことも可能である。更に、本発明は、この方法によって生産される突然変異カウロバクターないしその系統（子孫）及びそのようなカウロバクターのライブラリを提供する。
【００１１】
天然型カウロバクタープロテアーゼは、野生型Ｓ層タンパクモノマーよりも優先的に、本書において定義されるようなハイブリッドＳ層タンパクモノマーを切断する。プロテアーゼは、Ｓ層タンパクモノマーに対し特異的であるように思われる。この意味において、プロテアーゼは、ハイブリッドＳ層タンパクモノマーの切断に関する一般的な特異性を有するように思えるが、Ａｒｇ及びＰｈｅ残基のＣ末端を切断する傾向がある。プロテアーゼは、既知のカルシウム結合コンセンサス配列に特徴的な１又は２以上のＲＴＸ配列及びメタロプロテアーゼ活性化部位コンセンサス配列に特徴的な配列を含むメタロプロテアーゼ活性部位を含むことができる。本書においては、天然型カウロバクタープロテアーゼを、“S-layer associated protease”の略語として“Ｓａｐ”と指称する。また、本書においては、このプロテアーゼをコードする遺伝子を“sap”と指称する。
【００１２】
Ｓａｐプロテアーゼは、ＢｌａｓｔＴＭサーチアルゴリズムの初期設定（Altschul, S.F., et al. 1997参照）での使用により決定されるようなカウロバクターＳ層タンパクモノマーのアミノ酸配列の部分と凡そ３０％以上の配列同一性を有する、凡そ１５０〜凡そ２５０、好ましくは凡そ１９０〜凡そ２３０、より好ましくは凡そ２００のアミノ酸を含むＣ末端部分を含むことができる。プロテアーゼは、始原株に応じて、凡そ６００〜凡そ７００のアミノ酸、好ましくは凡そ６３０〜凡そ６７０のアミノ酸、より好ましくは凡そ６５０〜凡そ６６０のアミノ酸を含むことができる。本書において開示されるＳａｐプロテアーゼ配列は、凡そ６５８のアミノ酸を有する。プロテアーゼが配列同一性を示すカウロバクターＳ層タンパクモノマーの部分は、該プロテアーゼのＣ末端部分とほぼ同じ大きさであり、かつ該Ｓ層タンパクモノマーのＮ末端に向かう方向性を以って配置されているであろう。Ｓ層タンパクモノマーの上述のような配列同一性を示す部分は、ＲｓａＡのアミノ酸２３〜２４２を含む。ＲｓａＡとそのような配列同一性を示すプロテアーゼの領域は、本書に開示する特定のＳａｐアミノ酸配列のアミノ酸４５１〜６５０に対応する領域でありうる。プロテアーゼは、後述のような緑膿菌（P．aeruginosa）アルカリプロテアーゼ領域と凡そ５０％以上の配列同一性を示すＮ末端領域を更に含むことができる。プロテアーゼは、本書において開示する特定のＳａｐアミノ酸配列と凡そ７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００１３】
本発明は、上述のような天然型プロテアーゼが発現されないか又は失活しているカウロバクター（「プロテアーゼ陰性」株）を提供する。このようなカウロバクターは、天然型プロテアーゼの遺伝子ないしコード領域の突然変異を含むことも可能である。本発明のプロテアーゼ陰性株は、カウロバクターにより認識されるプロモータと機能可能に結合する組換えＤＮＡであって、カウロバクターＳ層タンパクモノマーの少なくとも１つのＣ末端分泌シグナルをコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡを含むことも可能である。この組換えＤＮＡは、カウロバクターＳ層タンパクモノマーＮ末端領域の部分であって、カウロバクターの細胞表面への該組換えＤＮＡの翻訳産物の付着に十分な部分をコードする核酸配列を更に含むことができる。組換えＤＮＡは、カウロバクターＳ層タンパク遺伝子をほぼ全部含むことも可能である。（組換え）ＤＮＡは、カウロバクターＳ層タンパクに非相同な１又は２以上のペプチド（ポリペプチド及びタンパクを含む）をコードするＤＮＡの該組換えＤＮＡへの挿入を可能にする制限（酵素）部位を更に含むことも可能である。このため、当該組換えＤＮＡは、Ｓ層タンパクモノマーの全部又は一部と、上記１又は２以上の非相同的ペプチドとを含むハイブリッドＳ層タンパクモノマーをコードすることとなる。組換えＤＮＡは、カウロバクターＳ層タンパクモノマーに非相同なペプチド、ポリペプチド又はタンパクをコードするＤＮＡを更に含むことも可能である。組換えＤＮＡは、プラスミドの形態でカウロバクター内に存在すること、又はカウロバクターゲノムに組み込まれることも可能である。
【００１４】
本発明は、カウロバクターのパネル又はライブラリを提供する。当該パネル又はライブラリの各メンバーは、上述のような、ハイブリッドＳ層タンパクモノマーの一部として、互いに異なる非相同的ペプチド、ポリペプチド又はタンパクを発現する。パネル又はライブラリのカウロバクターは、１又は２以上の本発明のプロテアーゼ陰性株であることが好ましい。更に、本発明は、ライブラリが接触させられる標的が該ライブラリのメンバーのハイブリッドＳ層タンパクモノマーと結合するか否かに応じてそのようなライブラリの選別を行うための方法を提供する。
【００１５】
更に、本発明は、上述のようなパネル又はライブラリのメンバーをなすカウロバクターの表面への標的化合物の結合を検出する方法も提供する。標的化合物は、とりわけ蛍光性標識によって標識されることが好ましい。標的化合物と結合するパネル又はライブラリのメンバーの検出は、ＦＡＣＳによって行うこと、及びフローサイトメータによって実行することも可能である。これらの方法は、更に、標的と結合するカウロバクターの選択、非相同的ペプチド、ポリペプチド又はタンパクをコードするＤＮＡの増幅、及び当該ＤＮＡの配列決定を含むことも可能である。
【００１６】
本発明は、更に、カウロバクターのＳ層の標的結合能に応じて、互いに異なるハイブリッドＳ層タンパクモノマーを発現・分泌するカウロバクターライブラリのメンバーの選別を行う方法であって、i）前記ライブラリを蛍光標識化標的と接触させること；及びii）前記蛍光標識化標的が（任意の）一のメンバーと結合するか否かに応じ、フローサイトメータによって前記ライブラリのメンバーの分離を行うことを含む選別方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本書において、用語「Ｓ層タンパクモノマー」及び「Ｓ層タンパク」は、野生型カウロバクター（Caulobacter）によって典型的に発現され、かつ該カウロバクターの細胞表面にＳ層を形成するタンパクを指称するものとする。このＳ層タンパクモノマーの代表例としては、カウロバクター・クレセンタス（C.crescentus）のＳ層タンパクモノマーであるＲｓａＡがある。ＲｓａＡのアミノ酸配列は、既知であり、表１にこれを示した（配列番号１）。後者の配列は、異なる系統及び種のカウロバクターのＳ層タンパクモノマーの同定のための基準として、又は配列の比較により本書で開示するカウロバクタープロテアーゼを同定するための基準として利用することができる。本書において言及されるＲｓａＡのアミノ酸残基の番号は、表１に示した残基の番号に対応する。ＲｓａＡをコードする天然型遺伝子の配列は、既知であり、これを以下“ｒｓａＡ”と指称する。
【００１８】
表１
ＲｓａＡアミノ酸配列（配列番号１；Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号ＡＡＣ３８６６５）。RsaA遺伝子配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号ＡＦ０６２３４５にある。
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【００１９】
本書において、カウロバクターに関する「プロテアーゼ」という用語は、本書において開示される、ハイブリッドＳ層タンパクモノマーを切断する天然型プロテアーゼを意味するものとする。このプロテアーゼは、カウロバクターＳ層タンパクモノマーとの配列類似性を有し、従って、このプロテアーゼの存在は、或るカウロバクターにより産生された改変Ｓ層モノマーが本書において開示される「タンパク分解性表現型」を呈するか否かを求めることにより検出することができる。他方、このプロテアーゼの不存在（ないし該プロテアーゼ活性の不存在）は、同様に、タンパク分解性表現型の不存在ないし消失によって求めることができる。
【００２０】
本書において、微生物に関する「単離（isolated）」ないし「単離する（isolate）」という用語は、他の遺伝子型又は表現型の微生物が実質的に排除された自然発生的又は組換え微生物を意味するものとする。そのようなものとして、この用語は、ナチュラルソースから精製された微生物を含むが、これに限定されない。
【００２１】
本書において、用語「ペプチド」は、２以上のアミノ酸から構成されるペプチドを意味するものとする。従って、この用語は、用語「ポリペプチド」及び「タンパク」と可換性がある。本書全般において言及される、Ｓ層タンパクモノマー又は遺伝子に関する「非相同的ペプチド」及び「パッセンジャーペプチド」という用語は、Ｓ層タンパクモノマーには見出されないアミノ酸配列又はそのようなアミノ酸配列をコードする核酸を意味するものとする。
【００２２】
本書において、用語「制限酵素部位（restriction site）」は、当該制限酵素部位が存する核酸を切断するヌクレアーゼによって認識される核酸配列を意味するものとする。
【００２３】
本書において、用語「ライブラリ」及び「パネル」は、類似する微生物、核酸又はペプチドの集合又は複数の当該微生物等であって、これらパネル又はライブラリの個々のメンバー（ないし個々のメンバー群）が、当該個々のメンバーないし個々のメンバー群に特有の（１つの）特徴を有するものを意味するものとする。一例として、当該集合に属する核酸の各々が検出可能なペプチドシグナルをコードする（１つの）部分を含む核酸の集合であって、該集合の個々のメンバー又は個々のメンバー群が特有のペプチドをコードする核酸配列を有するものを挙げることができる。また、他の一例として、当該集合に属する組換えカウロバクターの各々が組換えＳ層タンパクモノマーを発現することができる組換えカウロバクターの集合であって、該集合の個々のメンバー又は個々のメンバー群によって発現される組換えＳ層タンパクモノマーがＳ層タンパクモノマーに非相同な互いに異なるペプチドを含むものを挙げることができる。
【００２４】
本書において、カウロバクターＳ層モノマーに関する「改変（modified）」という用語は、非野生型Ｓ層タンパクモノマーを意味するものとする。そのような改変モノマーは、野生型モノマーと比べて欠失、付加又は置換を含むことが可能である。改変モノマーは、野生型モノマーをコードする遺伝子に制限酵素部位を導入した結果として僅かに１アミノ酸だけ当該野生型モノマーと配列が異なるものも含む。カウロバクターＳ層タンパクモノマーに適用される「ハイブリッド」という用語は、カウロバクターＳ層モノマーに非相同な１又は２以上のペプチドを含む改変Ｓ層モノマーを意味するものとする。改変Ｓ層モノマーに関する「全長ハイブリッド」という用語は、背景技術に関して上述したような意味を有するものとする。
【００２５】
本書において、用語「天然型（native）」は、自然発生的な状態にある微生物を意味するものとし、また、微生物の産物に関する場合は、微生物において自然発生的に産生される産物をいうものとする。
【００２６】
本書において、アミノ酸置換に関する「保存的」という用語は、ペプチドの所定の位置において或る１つのアミノ酸が他の１つアミノ酸で置換されるが、当該位置では機能の検出可能な如何なる喪失又は獲得も伴わず置換が実行可能であり、生物学的に等価なポリペプチドが得られることを意味するものとする。そのような変化を行うに際し、類似するアミノ酸残基の置換は、例えば大きさ、（荷電）電荷数、疎水性、親水性等の側鎖置換基の相互類似性に基づいて行うことが可能であり、そのような置換は、通常の検査方法により、ペプチドの機能の効果に対してアッセイすることができる。保存的アミノ酸置換は、或る（１つの）アミノ酸残基を類似の親水性価（例えば、±２．０の範囲内の価数）を有する他のアミノ酸に対して置換する部位で行うことも可能であるが、以下に列挙する親水性値が、アミノ酸残基に付与されている（米国特許4,554,101に詳細に記載されているが、その内容に関しては引用を持って繰り込み本書に記載されているものとみなす）：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；及びＴｒｐ（−３．４）。また、保存的アミノ酸置換は、或る（１つの）アミノ酸残基を類似の疎水性指数（例えば、±２．０の範囲内の価）を有する他のアミノ酸に対して置換する部位で行うことも可能である。そのような実施形態では、アミノ酸残基には、以下に列挙するように、疎水性及び（荷電）電荷特性に基づいて疎水性指数をそれぞれ付与することも可能である：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；Ａｒｇ（−４．５）。また、保存的アミノ酸置換は、或る（１つの）アミノ酸残基を同じクラスの他のアミノ酸に対して置換する部位で行うことも可能である。この場合、アミノ酸は、以下のように、非極性、酸性、塩基性及び中性の各クラスに分けられる：非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ。
【００２７】
本発明のカウロバクターのプロテアーゼ陰性株は、本書において開示する方法を含む既知の方法によりカウロバクターを突然変異させ、プロテアーゼを発現しないかプロテアーゼが不活性な（失活している）突然変異カウロバクターを選択することによって得ることも可能である。プロテアーゼの活性は、本書において開示する方法を用いて容易に求めることができる。また、プロテアーゼを産生できないカウロバクターの自然発生株を同定・単離することも可能である。この同定・単離は、例えば、カウロバクターの互いに異なる株を、メタロプロテアーゼ活性の有無に対し、又は当該プロテアーゼをコードするカウロバクター天然型ポリヌクレオチドに相同なポリヌクレオチドの有無に関してスクリーニングを行うことによって行うことが可能である。
【００２８】
本発明のプロテアーゼ陰性カウロバクターは、本書に示したsapの塩基配列（表２；配列番号２）又はＳａｐのアミノ酸配列（表３；配列番号３）に関する情報を用いることによりカウロバクターの突然変異によって得ることも可能である。この配列情報は、天然型遺伝子（sap）を破壊するため選択されたカウロバクターにおける天然型sapとの相同的組換えのためのミュータントsapを含むプラスミドを構築するために利用することも可能である。本書で開示される自殺ベクターは、そのようなベクターの構築の際に使用することができる。更に、部位特異的突然変異生成、又はsapアンチセンス配列をコードする遺伝子の導入に関する既知の方法をプロテアーゼ陰性カウロバクターの生産に使用することも可能である。
【００２９】
表２
sap（配列番号２；Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号ＡＹ０６４２１１）を含むカウロバクターゲノム配列。この遺伝子（sap）は、ｎｔ１８６〜２３２６にあり、ｎｔ１８６〜１９１に−３５シグナル、ｎｔ２４７〜２５２にシャイン・ダルガルノリボソーム結合部位、及びｎｔ２５８〜２２３４にコード配列を有する。
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表２の続き
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【００３０】
表３
Ｓａｐアミノ酸配列（配列番号３；Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号ＡＡＬ４７１９０）。配列中の下線部は、コンセンサス配列ＨＥＸＸＨＸＵＧＵＸＨ（配列番号４）（Ｘは任意のアミノ酸、Ｕは嵩高な疎水性残基を表す）を有するメタロタンパク活性部位を示す（Baumann, et al. 1993）。配列中の二重下線部は、コンセンサス配列ＧＧＸＧＸＤ（配列番号５）（Ｘは任意の残基）を有するＣａ２＋結合部位を示す（Baumann, et al. 1993）。
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【００３１】
本発明のプロテアーゼ陰性カウロバクター株は、Ｓ層タンパクモノマー内の非相同的ペプチド、又はＳ層タンパクのＣ末端分泌シグナルに非相同的ペプチドが付着するＣ末端ハイブリッドタンパクとしての非相同的ペプチドを発現するために既知の方法に応じて使用することも可能である。このようにして、改変又はハイブリッドＳ層遺伝子産物の望ましくない切断は最少化される。
【００３２】
本発明の発現システムとして使用するためのプロテアーゼ陰性カウロバクターは、カウロバクターにおいて発現可能なプロモータと機能可能に結合する少なくとも１つのカウロバクターＳ層タンパクＣ末端分泌シグナルを含みうる。このＤＮＡ構築体は、Ｓ層タンパクが細胞（菌体）から分泌されると該Ｓ層タンパクを該細胞の表面に付着させるためカウロバクターＳ層タンパクの十分なＮ末端部分又はモノマーをコードするＤＮＡを含むことも可能である。ＤＮＡ構成体は、コード配列が非相同的ＤＮＡの挿入によって破壊されているカウロバクターＳ層タンパクないしタンパクモノマーのほぼ全体をコードするＤＮＡを含むことも可能である。何れの場合においても、ＤＮＡ構成体中の非相同的ＤＮＡは更なる非相同的ＤＮＡの挿入を可能とする１又は２以上の制限酵素部位でありえ及び／又は非相同的ＤＮＡはカウロバクターＳ層タンパクに非相同なペプチド、ポリペプチド又はタンパクをコードするＤＮＡを含みうる。
【００３３】
細胞表面に現れる全長ハイブリッドタンパクの発現を目的とするカウロバクター／Ｓ層発現システムの構築に利用可能な情報は多く存在し（Bingle, et al. [1997(b)];及び Umelo-Njaka, E., et al. [2000]）、これには、好適なカウロバクター宿主の選択、及び宿主カウロバクターからのＳ層タンパクモノマーの発現に使用可能な大腸菌及びカウロバクターの両系での複製に好適なプラスミドの構築が含まれる。好ましいカウロバクター宿主は、機能可能な天然型Ｓ層タンパクモノマー遺伝子を有さず、その代わり、プラスミド由来の又は細菌ゲノムに組み込まれた組換えＤＮＡによって生成されるＳ層タンパクモノマーのみを発現する。
【００３４】
全長ハイブリッドタンパクを産生するため、Ｓ層をコードするＤＮＡへの非相同的ＤＮＡ配列の挿入に好適な部位は既に公表されているが、当技術分野において既知の方法に応じて求めることも可能である。翻訳産物はメタロプロテアーゼによる分解を受け難いので、プロテアーゼ陰性株の使用により、追加の（挿入）部位が利用可能になるであろう。
【００３５】
カウロバクターは、Ｓ層タンパクの部分として発現可能なペプチドの種類の豊富さ及び細菌表面に提示される単位面積当りの外来ペプチドのコピー数の多さの観点から外来ペプチドの提示にとりわけ好適である。成功した挿入では、細胞当たり凡そ２０，０００〜４０，０００コピーもの多さの数の提示が可能である。このため、非常に大きな感度、及びスクリーニング、及びアフィニティ結合相互作用を探す能力が実現可能となる。これに対し、従来のファージ提示（システム）では、とりわけ凡そ１０〜１５のアミノ酸長のペプチドを扱う場合、ファージ粒子当たり１コピー数に制限されることがよくある。更に、カウロバクターは、ペプチド／タンパクライブラリスクリーニングの分野におけるある種の応用に関し、単層生物膜の自発的形成が可能なので、菌体細胞を表面に高密度で容易に付着する能力は有用であろう。このため、改変細胞のライブラリの取り扱い、及び試験化合物と該改変細胞との接触の制御が容易となる。
【００３６】
カウロバクターを用いたプレゼンテーションライブラリーの作成
この方法では、Ｓ層モノマーの分泌・付着を実現するためにＳ層タンパクモノマー遺伝子の全部又は十分な部分を含むプラスミドを使用する。好ましくは、プラスミドは、Ｓ層コード領域を実質的にすべて含み、かつＤＮＡフラグメントのＳ層遺伝子へのクローニングを直接指向するために使用される少なくとも一対の制限酵素部位を含む。好ましくは、これらの制限酵素部位は、非相同材料の挿入が許容可能な部位であることが示されたＳ層コード領域の好ましい位置に配される。これは、当技術分野で開示された好ましい部位に応じて、又は他のペプチドをその部位に配し、そのペプチドが抗体の結合に利用可能か否かを及びＳ層アレイの分泌、構築及び付着を阻害するか否かを決定することによって、求めることができる。例えば、国際特許出願国際公開WO97/34000に記載されているようなリンカー突然変異生成によって、ユニークなＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入することができる。これらの部位では、例えば選択者の順にＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ部位のような他の制限酵素部位を含むよう当該部位を改変するショートセットのオリゴヌクレオチドを導入することも可能である。プラスミドベクターは、標的化合物へ提示される際肯定的な結果を示すようにカウロバクターにおいても大腸菌のような他の系においても複製するようなものが好ましい。好適なプラスミドは、上述のような、カウロバクターによって認識可能なプロモータを含みかつＳ層遺伝子を導入可能なものでありうる。例えば、そのようなベクターとしては、Bingle, et al., (1997a)によって開示されたようなｐＷＢ９が挙げられる。好ましくは、ライブラリのプレゼンテーションに使用されるカウロバクターは、本書において開示されるプロテアーゼ陰性株である。
【００３７】
ライブラリを作成するために、オリゴヌクレオチドは、可変配列に隣接する既知の配列を含むよう合成することも可能である。該既知の配列は、制限酵素部位における適切な消化又はライゲーションに、及びポリメラーゼ伸長反応のためのプライマーへのハイブリダイゼーションに必要なものとすることも可能である。該オリゴヌクレオチドの中間領域は、ＤＮＡ合成機を用いて各位置の４つの塩基をすべて変化させることによって調製することも可能である。合成後、相補的なオリゴヌクレオチドを一方の端部に付加し、ポリメラーゼ反応を用いて、二本鎖を形成する。二本鎖ＤＮＡは、適切な制限酵素（例えばＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ）で切断し、プラスミドのＳ層遺伝子の対応するレセプター部位へのクローン化を可能な状態にすることも可能である。これは、ライゲーション反応及び上述の方法を用いたカウロバクター細胞へのプラスミドのエレクトロポレーションによる一括導入によって行うことも可能である。生成したコロニーはすべてプールし、スクリーニングのために必要となるまで凍結保存することも可能である。
【００３８】
プロテアーゼ陰性宿主カウロバクターを使用することによる利点の一つは、Ｓ層への挿入物の大きなライブラリの調製及びスクリーニングにある。これらは、コンビナトリアルペプチドライブラリ（これは通常８〜１２アミノ酸の固定長のペプチドを特定するオリゴヌクレオチドのランダムないし半ランダム合成（及び次いで行われるＳ層へのクローニング）によって達成される）の構築、又は細菌ゲノムのランダムフラグメント又はｃＤＮＡフラグメントのクローニングから得ることが可能であろう。そのような場合、挿入物の切断のため喪失ないし不十分にしか現れないクローンの数を最小化することは、有用なクローンがライブラリに含まれる可能性を最大にすることを確実にするために重要である。
【００３９】
一般的に、そのようなライブラリを使用する場合、非常に稀な現象、即ち目的のリガンドに結合するものがサーチされる。ゲノムフラグメントライブラリからワクチン候補物をサーチする場合、リガンドは、ある感染症から回復した患者からの血清に存在する抗体とすることが可能であろう。コンビナトリアルペプチドライブラリの典型的な応用例は、生起する特殊な相互作用を理解するためのシグナル伝達カスケード系の成分に結合するペプチドを見出すことであろう。他の例としては、治療上の価値を有する分子に結合すると思われるペプチド配列をサーチすることを挙げることができる。従って、そのペプチドは、当該治療用分子を精製するために使用されうるアフィニティマトリックスの主要成分として使用可能であろう。
【００４０】
Ｓ層提示の他の利点は、提示を行う細菌は、蛍光標示式細胞選別法（ＦＡＣＳ）を含む自動細胞選別法によって容易に検出されるための十分な大きさを有するということである。ＦＡＣＳを実行するための装置は、「フローサイトメータ」と指称される。実用上、目的の標的分子（即ち、結合するペプチドがライブラリの中から見出されることが予期されるような分子）は、蛍光性タグ（例えばフルオレセイン）によって誘導体化される。そして、ＦＡＣＳ装置を用いて、蛍光性タグと結合する極めて僅かなライブラリのメンバーを見出し分離する。
【００４１】
このような操作を行うための方法の１つでは、５０μｍノズルを備えサンプルのジェット流を形成するために２６ｐｓｉの圧力を生成するベクトン・ディッキンソン社のＦＡＣＳ装置（型式 ＢＤ ファックス・バンテージＴＭＴＳＯ ＳＥ）を用いる。ジェット流は、４０，０００Ｈｚの振動発生器によって粉砕されて液滴化される。試料はＦ１−１（５３０／４０ｎｍフィルタ）に掛けて蛍光標識されていない細菌を排除する。この装置は、フルオレセインの特定の蛍光を検出し、十分な量の当該標識を提示する細胞を偏向して収集装置へと移動させ、当該細胞を分離する。この収集装置は、単一のチューブとして構成し、「的中（細胞）」をすべてプールすることも可能である。更に、この装置は、個々の細胞（「的中」）を標準的な９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに配することも可能である。これらのウェルは、培地を含み、長期間の保存及び後の試験のために、選別された個々の細胞の増殖を可能にすることもできる。
【００４２】
カウロバクターのクローンを同定するためのＦＡＣＳ法は、バクテリオファージのペプチドのライブラリディスプレイ法のような現在流行している他のどの方法よりも遥かに迅速に実行できる。実際上、この方法によるカウロバクターライブラリの試験時間は、１〜２時間以内で済ますことが可能である。ＦＡＣＳを実行した後、培地を加えることにより、「的中」として偏向された多数の細胞が増殖される。培養細胞の試料を幾つか溶解し、そのプラスミドＤＮＡをＤＮＡシークエンサーに掛けることも可能である。可変配列の隣接領域にハイブリダイズする既知のオリゴヌクレオチドを、配列決定を可能にするため目的の領域を増幅するためのサーモサイクラー装置においてポリメラーゼと共に使用することも可能である。個々のクローンの配列を解読し評価を行う。所望のクローンを複製試料から回収することも可能である。
【実施例】
【００４３】
菌種及びプラスミド
菌種及びプラスミドを表５及び表６に列挙した。大腸菌株は、ルリア・ベルタニ（ＬＢ）培地で３７℃で増殖した。必要に応じて、ＬＢ培地には抗体を以下の濃度で添加した：ストレプトマイシン（Ｓｍ）５０μｇ／ｍｌ、カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、及びクロラムフェニコール（Ｃｍ）２μｇ／ｍｌ。
【００４４】
カウロバクター・クレセンタスは、３０℃のペプトン・イーストエキストラクト（ＰＹＥ）培地（０．２％ペプトン、０．１％イーストエキストラクト、０．０１％ＣａＣｌ２、０．０２％ＭｇＳＯ４、１．２％アガー）。必要に応じて、ＰＹＥ培地には抗体を以下の濃度で添加した：ストレプトマイシン（Ｓｍ）５０μｇ／ｍｌ、カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、及びクロラムフェニコール（Ｃｍ）２μｇ／ｍｌ。
【００４５】
終濃度１．２％ｗ／ｖになるまでアガーを加え、固体ＬＢ・ＰＹＥ培地を調製した。
【００４６】
表４
菌種
2004528039.tif 000007
【００４７】
表５
プラスミド
2004528039.tif 000008
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【００４８】
組換えＤＮＡ法
染色体ＤＮＡは、標準的な方法（Sambrook, et al., 1989）を用いてカウロバクターから単離した。他方、プラスミドＤＮＡは、煮沸法（RSF1010系プラスミド; Holmes and Quigley, 1981）又はアルカリ法（他のすべてのプラスミド；Birnboim and Doly, 1979）を用いて大腸菌及び／又はカウロバクターから単離した。プラスミドＤＮＡは、Gilchrist and Smit (1991)によって開示されたようなエレクトロポレーションによって大腸菌及びカウロバクターへ導入した。
【００４９】
ＤＮＡ修飾酵素は、ライフ・テクノロジーズ（バーリントン、オンタリオ、カナダ）又はニュー・イングランド・バイオラブズ（ミシソーガ、オンタリオ、カナダ）から購入し、製造会社の使用説明書に従って使用した。
【００５０】
アガロースゲル電気泳動法（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファ）は、標準的な方法（Sambrook, et al., 1989）で実行した；前処理において、ＤＮＡフラグメントは、ＱＩＡＥＸII（キアゲン社、チャッツワース、カリフォルニア）を用いて精製した。
【００５１】
サザンハイブリダイゼーションは、標準的な方法（Sambrook, et al., 1989; 及び Taso, et al., 1983）によって行った。ＤＮＡ試料は、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、Rediprime IIＴＭランダム・プライム・ラベリングシステム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ＵＫ）を用いて｛α−３２Ｐ｝ｄＣＴＰ（アマシャム）で標識したオリゴヌクレオチドでプローブした。
【００５２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法は、製造会社の使用説明書に従ってＴａｑＩ又はＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（ライフ・テクノロジーズ、バーリントン、オンタリオ、カナダ）とTechne ProgeneＴＭサーマルサイクラー（マンデル・サイエンティフィック社、グエルフ、オンタリオ、カナダ）とを用いて実行した。
【００５３】
ヌクレオチド配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭＴＭ３７７自動シークエンサーで行った。オリゴヌクレオチドは、パーキン・エルマーＡＢＩシンセサイザーを用いて合成した。
【００５４】
ＲｓａＡの単離
野生型Ｓ層タンパク（ＲｓａＡ）及び全長ＲｓａＡハイブリッドタンパクは、低ＰＨ抽出法（Walker, et al. 1992;及び Nomellini, et al. 1997）によってカウロバクター細胞から単離した。対数期の中間部の細胞（ＯＤ６００は０．５〜１．０）は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファｐＨ＝７．２中で遠心分離（１０，０００×ｇ、５分）によって一回洗浄したあと、初期培養液の体積の５％に等しい体積の１００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファｐＨ２．０にボルテックスで振盪しながら再懸濁した。室温中で５分経過後、遠心分離によって細胞をペレット状に沈殿させ、ＲｓａＡを含む上清を回収した。
【００５５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタン分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Laemmli(1970)の不連続ゲル法によって行った。試料は、電気泳動を行う前にＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ中で沸騰させずに３７℃で処理した（Smit and Agabian, 1984）。Walker, et al. (1994)によって開示されたように、プローブとして抗ＲｓａＡポリクローナル抗体を用いてウエスタン免疫ブロット分析を行った。抗体の結合は、西洋わさびペルオキシダーゼ及び発色試薬と結合したヤギ抗ウサギ又はマウス血清を用いて可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより低ｐＨ法で抽出したＲｓａＡを分析する前に、抽出タンパク２０μＬ当たり１Ｎ ＮａＯＨを２μＬ加えた。
【００５６】
ウエスタン・コロニー免疫ブロッティング法（Bingle, et al. 1997b）は、標準的なペトリ皿当たり凡そ１００〜２００ｃｆｕの密度になるようＰＹＥアガー上に細胞をスプレッドプレーティングすることによって行った。３０℃で３〜４日インキュベートした後、ニトロセルロース膜をペトリ皿の表面に２分間押し付けた。そして、コロニー状物質が付着したニトロセルロース膜を剥がし取り、５〜１０分間空気乾燥させ、５％スキンミルクで遮断し、最後に上述のように処理した。
【００５７】
アミノ末端配列決定
Ｎ末端配列決定のためのタンパク試料は、電気泳動により、バイオラッドの転写装置を用い製造会社の使用説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから０．２μｍ ＰＶＤＦ膜（バイオラッド）へと転写した。この膜を短時間クマシーブルーＲ−２５０（シグマ）で染色し、５０％メタノールで脱色した後、空気乾燥した。目的のタンパクのバンドは、メスを用いて膜から切除し、自動エドマン分解法によってＮ末端アミノ酸配列を得た。
【００５８】
ＪＳ４０２０株の構築
プラスミドpTZ18USm:rsaΔP(485/IHNVG20)のサンプルは、エレクトロポレーションによってＳｍ感受性ＲｓａＡ−株：ＪＳ４０００に導入した。プラスミド由来rsaAコピーとＪＳ４０００株の染色体rsaAコピーとの間で起こる一回の乗り換えによって生じる染色体に組み込まれたプラスミドを含む細胞を選択するために、生成した細胞懸濁液をＳｍ５０μｇ／ｍＬを含む固体ＰＹＥ培地に播種した。そして、ＩＨＮＶ−Ｇインサート内でのタンパク分解性切断及びＲｓａＡ Ｎ末端内でのタンパク分解性切断に特徴的な細胞表面結合性Ｓ層タンパクフラグメントの有無を目的として、幾つかのコロニーからＳｍ耐性（ＳＭＲ）細胞を低ｐＨ抽出法によってスクリーニングした（「タンパク分解性表現型」；図１参照）。Ｓｍ耐性も予期されるタンパク分解パターンも示す１つの単離体を確保し、ＪＳ４０２０株と命名した。
【００５９】
ＪＳ４０２０のＴｎ５突然変異生成
接合を利用して、自殺ベクターｐＡＧ４０８を用いてＴｎ５誘導体をＪＳ４０２０に導入した。大腸菌Ｓ−１７λpir (ｐＡＧ４０８)のオーバーナイト培養液１００μＬをＪＳ４０２０の対数期の初期の培養液１ｍＬと共に１０ｍＭ ＭｇＳＯ４５ｍＬ中で混合した。細胞混合物を２２ｍｍ径のニトロセルロース滅菌濾紙で捕集し、この濾紙をペトリ皿のＰＹＥアガーの表面に置いた。３０℃、オーバーナイトでインキュベートした後、細胞を濾紙から１０ｍＭ ＭｇＳＯ４５ｍＬに移し、１００μｌＬのアリコートをＫｍとＳｍをそれぞれ５０μｇ／ｍＬずつ含むＰＹＥアガーに播種した。
【００６０】
ＪＳ４０００のＵＶ／ＮＴＧ突然変異生成
予め紫外線（ＵＶ）によって生成したＪＳ４０００株の突然変異株プール（Ong, C., et al. 1990）をMiller（1972）の方法に従いニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて更に変異させた。
【００６１】
カウロバクタープロテアーゼの特徴付け
Bingle, et al. (1997b)において報告されているように、緑膿菌ピリンに由来する１２アミノ酸のペプチドを、１０２６アミノ酸の全長ＲｓａＡの一次配列の中央部に位置付けられた領域に挿入すると、ピリンペプチドインサートの内部及び／又はＲｓａＡのＮ末端内の挿入サイトの遠位部位においてハイブリッドタンパクの切断がしばしば起こる。ピリンペプチドインサート内部での切断により、細胞表面との結合が維持される２つのフラグメントが生じ、他方、ＲｓａＡ Ｎ末端内での切断により、細胞表面との結合が維持される２６ｋＤａＮ末端切断産物と、増殖培地に放出されるＣ末端フラグメントが生じる（図１）。本書の目的のために、図１に示したタンパク分解現象を示す細胞は、「タンパク分解性表現型」を有するということにする。
【００６２】
従来の技術を用い、カウロバクターがエネルギー非依存性（ＡＴＰはプロテアーゼ活性を刺激しない）のプロテアーゼ活性を示すこと；プロテアーゼ活性は、細胞内で自由に起こり、このグラム陰性菌の細胞膜又はペリプラズムとの関連を有しないこと；ＥＤＴＡは多少阻害性を有する（メタロプロテアーゼの特徴）こと；この酵素の誘導は、切断されるべきことが示される組換えＳ層タンパクの存在によって刺激されないこと；及びこのプロテアーゼが組換えＳ層タンパクを分解するとき、他の細胞タンパクはこのプロテアーゼから影響を受けないことを確認した。組換え産物の一貫して行われる切断に繋がる挿入は、Ｓ層コード領域の中央の２／３の部分と、プロテアーゼ作用を免れる傾向のあるＮ末端又はＣ末端領域の近傍の部位にある傾向がある。この情報と、後述する配列情報を組合わせることにより、このプロテアーゼは上記モノマーに付着しかつ作用するタンパクの長さに沿った限定的な範囲を有するということが分かる。Ｃ末端領域は、Ｓ層タンパクのための分泌シグナルとして必要とされ、Ｎ末端領域は、Ｓ層タンパクアセンブリーの細胞表面への付着のために必要とされる。
【００６３】
カウロバクター・クレセンタス（ＣＢ２Ａ株）は、上述のように紫外線又は化学的突然変異原によって、凡そ１％の細胞が生き残ることができるような強度で処理した。突然変異に処理を受けて生き残った個々の細胞は、タンパク分解性表現型に従って効率的に切断されるよう示された非相同的挿入（断片）を含むＳ層遺伝子のプラスミドバージョンを持っていた。次に、コロニーをニトロセルロース板と重ね合わせてから該ニトロセルロース板を引き剥がし、ウエスタンブロット法で使用されるものと実質的に同じ方法でＳ層タンパクに特異的な抗体によって処理を行う免疫ブロット法を用いてコロニーをスクリーニングした。典型的な結果は、モノマーを切断し該モノマーが表面付着性結晶Ｓ層に組み込まれることを阻止されることにより生じる、コロニーを取り囲む抗体反応の「ハロー（暈）」である。ハローを生成しないコロニーは稀にしか存在せず、これらコロニーが野生型細胞により見出される態様による組換えＳ層分子切断能を欠如していることを次に確認するために当該コロニーを選択した。
【００６４】
ＩＨＮＶ−Ｇインサートのタンパク分解の特徴付け
タンパク分解性表現型がピリンペプチドインサートと関連しないことを確認するために、伝染性造血器壊死ウイルス糖タンパク（ＩＨＮＶ−Ｇ）のアミノ酸３０６〜３２５に由来する２０アミノ酸ワクチンエピトープ（ＡＳＥＳＲＥＥＬＬＥＡＨＡＥＩＩＳＴＮＳ；配列番号６）を、ＲｓａＡのアミノ酸４８５及び４５０に対応する２つの許容部位に挿入した。ＩＨＮＶ−Ｇ ＤＮＡは、ＰＣＲによって合成し、rsaAΔPへ挿入し、ＲｓａＡ−株：ＪＳ４０００に導入した。これは、Bingle, et al (1997a)においてピリンペプチドＤＮＡに関して開示された方法と同一の方法によりカウロバクター発現プラスミドｐＷＢ９ＫＳＣＡＣを用いて行った。
【００６５】
インサートの性質に相違があるにもかかわらず、ＩＨＮＶ−Ｇペプチド挿入断片（１００ｋＤａ）を有するＲｓａＡハイブリッドタンパクは、ピリンペプチドインサートを有するＲｓａＡ分子を合成する細胞と同じタンパク分解性表現型（図１）を示した。アミノ酸４８５又は４５０において２０アミノ酸のＩＨＮＶ−Ｇペプチドを挿入すると、ペプチドインサート内でハイブリッドタンパクが切断されて２つの５０ｋＤａフラグメントが生じたが、この結果はＩＨＮＶ−Ｇインサート内での切断（図４Ａ）並びに表面結合性２６ｋＤａフラグメントと矛盾しない。天然型ＲｓａＡ（９８ｋＤａ）に対しては切断を行わなかった（図４Ａ）。
【００６６】
Ｎ末端ミクロシークエンシングにより、ＩＨＮＶ−Ｇインサートの切断はＡｒｇ残基とＳｅｒ残基の間で起こるということがわかった。この切断部位は、ＩＨＮＶ−Ｇペプチド自体の内部には存在せず、ピリンペプチド挿入の場合と同様にＩＨＮＶ−Ｇ ＤＮＡとrsaA ＤＮＡとの間の３’融合接合領域によってコードされる部分に存在した。
【００６７】
ＪＳ４０２０のＴｎ５突然変異生成
ＲｓａＡハイブリッドタンパクのタンパク分解性切断が非相同的挿入部位の遠位にあるＮ末端部位で起こると、Ｃ末端切断産物フラグメントは、細胞表面から離脱する。ＲｓａＡ抗体でプローブされるコロニー免疫ブロットでは、この離脱ＲｓａＡフラグメントは、コロニーの周りに免疫反応性のハローを生成する。タンパク分解性表現型を喪失するＴｎ５突然変異生成は、コロニー免疫ブロット法を用いてコロニーの周りのこのようなハローの喪失に関してスクリーニングを行うことによって検出することも可能である。
【００６８】
ＪＳ４０２０株は、Ｔｎ５突然変異生成の結果としてのタンパク分解性表現型の喪失を検出するためのバックグラウンドとして使用した。この菌株は、ＲｓａＡアミノ酸４８５に対応する部位に２０アミノ酸ＩＨＮＶ−ＧペプチドをコードするＤＮＡインサートを有する染色体rsaAコピーを有する。
【００６９】
ＪＳ４０２０株のＴｎ５突然変異生成は上述のようにして行い、生成した突然変異株に対しコロニー免疫ブロットアッセイを行った。タンパク分解性表現型の喪失を確認しかつrsaAのＴｎ５挿入又はその分泌器官の成分をふるい落とすために、ハローの喪失を示すコロニーの細胞に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと組合わせた低ｐＨ抽出法により分解しなかったＲｓａＡ／ＩＨＮＶＧハイブリッドタンパクの有無に関して更にスクリーニングを行った。
【００７０】
Ｔｎ５分断染色体ＤＮＡの挿入
タンパク分解性表現型の喪失を明確に示したＪＳ４０２０の３つの突然変異株を単離した。これら３つのすべての突然変異株から染色体ＤＮＡを調製し、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、プローブとして使用するｐＡＧ４０８由来の１．５ｋｂ ＫｐｎＩ（Ｔｎ５）フラグメントを用いてサザン分析に掛けた。ｐＡＧ４０８中のＴｎ５誘導体は、Ｔｎ５の両端部に生じる単一のＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ部位を有するので、単一のＤＮＡフラグメントは、ＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩの何れか一方を単独で作用させることによりＴｎ５分断染色体ＤＮＡを消化することにより生じるが、両方一緒に作用させると２つのフラグメントは、Ｔｎ５に加えて分断領域の５’及び３’部分を含むであろう。
【００７１】
（３つの突然変異株すべての染色体ＤＮＡの消化から得られた）関連するＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ Ｔｎ５標識フラグメントを、ｐＢＳＫ（−）のＢａｍＨＩ部位の増殖のためにアガロースゲルから回収した。該突然変異株のうちの１つに対し、プラスミドｐＥＵ１及びｐＥＵ２をそれぞれ生じる６ｋｂＢａｍＨＩフラグメント及び７ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントをクローン化することができた。ｐＡＧ４０８の転移領域は、２．２ｋｂ長である。従って、Ｔｎ５に（両側で）隣接するＤＮＡの凡そ４ｋｂと５ｋｂの部分が、ヌクレオチド配列分析に利用することができた。ガイドとしてのｐＡＧ４０８からの適切な既知の制限酵素部位を制限酵素切断地図と組合わせて使用することにより、Ｔｎ５の（両側の）直近に隣接するＤＮＡをｐＥＵ１及びｐＥＵ２から切除し、ｐＴＺ１９Ｕへ挿入し、プラスミドｐＴＺ１９ＵＰ１及びｐＴＺ１９ＵＰ７（図２）を得て、配列決定した。
【００７２】
Ｔｎ５挿入部位に隣接するＤＮＡのヌクレオチド配列決定
Ｔｎ５挿入部位の直近に隣接するＤＮＡに関するｐＴＺ１９ＵＰ１及びｐＴＺ１９ＵＰ７からのヌクレオチド配列情報を使用して、ゲノム研究機関（ＴＩＧＲ）データベース（Nierman, et al. 2001）のカウロバクター・クレセンタス株ＣＢ１５のゲノムのヌクレオチド配列をサーチした。その結果、ＧＴＧで開始する１９７７ｂｐの翻訳領域（オープンリーディングフレーム）（遺伝子ＣＣ０７４６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ００５７５０）が同定された。これは、翻訳されると、幾つかのメタロプロテアーゼとの有意な配列類似性を示すＮ末端領域を供する：この中で最も注目すべきメタロプロテアーゼは、緑膿菌のアルカリプロテアーゼである（Okuda, K., et al. [1990]）。
【００７３】
ＴＩＧＲデータベースに含まれるヌクレオチド配列はカウロバクター・クレセンタスゲノムの分析に由来したものであり、本発明のこの実施例はＣＢ２株に由来するＪＳ４０００と関係するものであるが、この２つの菌株の間で最初に比較される翻訳領域は、２つの推定上のプロテアーゼ遺伝子（本書においてはこれらをまとめて“sap”という）は、ヌクレオチド配列のレベルでは殆ど同一であること、及びＴＩＧＲ配列は、Ｔｎ５挿入部位に隣接するＤＮＡの配列決定のためのガイドとして使用することができることを示している。更に、この配列比較により、Ｔｎ５挿入の可能な方向と、挿入部位の両側にほぼ１０００ｂｐを有する遺伝子の中央にほぼ正確に挿入部位が位置するということの何れもが明らかとなった（図３）。
【００７４】
この情報と、好適な制限酵素部位の位置へのガイドとしてのＴＩＧＲ配列とを用いて、ｐＴＺ１９Ｕ由来の更にもう１つのプラスミドｐＴＺ１９ＵＰ４を構築した（図２及び図３）。ｐＴＺ１９ＵＰ１、４及び７をそれぞれ用いて、タンパク分解性表現型の喪失と関係するＴｎ５挿入突然変異の両側の１０００ｂｐを含むヌクレオチド配列を構築した。このようにして得たsapＤＮＡ配列及びＳａｐアミノ酸配列を上記表２及び表３にそれぞれ示した。
【００７５】
Ｓａｐ配列の分析
ＪＳ４０００sap遺伝子のヌクレオチド配列（表２）は、ＣＢ１５株に関しNierman, et al. (2001)により報告されたヌクレオチド配列とは２塩基対しか異なっていなかった。この両者から、６５８アミノ酸残基からなる一次翻訳産物が想定されるが、ＪＳ４０００遺伝子の配列からは位置２１７はバリンであることが示されている（表３）のに対し、報告されたＣＢ１５ sap遺伝子のヌクレオチド配列からは当該位置は保存的置換体（アラニン）であることが予想される。従って、これら菌株のsap遺伝子及びＳａｐタンパクは、相互転換可能（可換）であるといえる。ＪＳ４０００株及びＣＢ１５株のsapヌクレオチド配列の間の一致は、上流域ではＯｍｐ様タンパクをコードする推定的遺伝子へと、下流域ではステム・ループ構造をコードする可能性のあるＧＣリッチな領域へと伸びていた。ＤＮＡのこれらの領域は、この２つの菌株の間でヌクレオチド配列の１００％の同一性を示した。カウロバクター・クレセンタスのハウスキーピング遺伝子に特徴的な−３５転写開始シグナル（５'-ＴＴＧＴＣＧ-３'）及び翻訳開始シグナル（５'-ＧＧＡＧ-３”）（Malakooti, J., et al. [1995]）もまた、この２つの菌株のこれらの領域において同定された。
【００７６】
Ｓａｐのアミノ酸配列は２つの領域に分けることができるが、そのうちの一方の領域は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを初期パラメータと組合わせて使用することにより同定されるような、国立バイオテクノロジー（情報）センター（ＮＣＢＩ）タンパクデータベースの他のタンパクと大幅な類似性を示している。
【００７７】
ＳａｐのＮ末端領域は、緑膿菌のアルカリメタロプロテアーゼ（ＡｐｒＡ）（及びプロテアーゼのこのファミリーの他のメンバー）との大幅な類似性を示している。とりわけ、Ｓａｐのアミノ酸８９〜４１７（表３）は、ＡｐｒＡのアミノ酸９２〜４０８との凡そ５５％の配列同一性を有する。Ｓａｐタンパクのこの領域は、メタロプロテアーゼ活性部位コンセンサス配列（ＨＥＸＸＨＸＵＧＵＸＨ；配列番号４）並びに（「ＲＴＸ配列」としても知られている）ＡｐｒＡに見出される７つのＣａ２＋結合コンセンサス配列（ＧＧＸＧＸＤ）うちの４つを含む。
【００７８】
ＳａｐのＣ末端領域は、カウロバクター・クレセンタスＪＳ４０００のＣ末端切断型３５８アミノ酸突然変異体Ｓ層タンパクのＮ末端領域並びにカウロバクター・クレセンタスＣＢ１５株及びＮＡ１０００株のＳ層タンパクのような野生型Ｓ層タンパクのＮ末端領域との大幅な類似性を示している。とりわけ、Ｓａｐのアミノ酸４５１〜６５０（表３）は、ＲｓａＡのアミノ酸２３〜２４２（表６参照）との凡そ３３％の配列同一性を有する。ＮＣＢＩタンパクデータベースの他のどのアミノ酸配列も、ＳａｐのＣ末端領域とは如何なる程度であれ大幅な配列類似性は示さなかった。Ｓａｐアミノ酸配列の２つの領域は、ＮＣＢＩタンパクデータベースの配列と殆どないし全く類似性を示さない：この２つの領域とは、最外Ｎ末端（アミノ酸１〜８８）及びアミノ酸４１８〜５４０をカバーする領域のことである。ＳａｐがＡｐｒＡと機能的に等価であるとするならば、このタンパクの当該領域はＣ末端Ｉ型分泌シグナル（しかしながら実際にはＳａｐには存在しない）を含むであろう。Ｓａｐの最外Ｎ末端領域は、如何なるシグナルリーダーペプチドも明らかに欠いており、Ｓａｐタンパクは膜貫通ドメインを含まないように思われる。これらの特徴から、Ｓａｐは細胞質に局在していることが分かる。
【００７９】
表６
Ｓａｐのアミノ酸４５１〜６５０（配列番号３）とＲｓａＡのアミノ酸２３〜２４２（配列番号１）の配列の比較。２つの配列の間には同一の残基と類似の残基（+）を示した。
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【００８０】
ＪＳ４０００のＵＶ／ＮＴＧ突然変異株ライブラリ中のプロテアーゼ欠損突然変異株の単離
Ｔｎ５挿入を欠如するＳａｐ−突然変異体を生成するために、ＵＶ／ＮＴＧ突然変異誘発ＪＳ４００ＸのプールをｐＷＢＫＳＡＣ:rsaA（４８５／ＩＨＮＶＧ２０）で形質転換し、タンパク分解性表現型の喪失に対してスクリーニングを行った（図４Ｂ）。凡そ２０,０００コロニーのスクリーニングの結果、タンパク分解性表現型を喪失している３つの突然変異株が同定された。そのうちの１つを選択し、これをＪＳ４０１５と命名した。
【００８１】
ＵＶ／ＮＴＧ誘導突然変異がsap遺伝子のなかに存在することを確認するために相補（補完）性分析を行った。ＪＳ４０１５を、ＪＳ４０００からのsap遺伝子のＰＣＲ増幅コピーを有するｐＢＢＲｌＭＣＳ:Ｋｍsap（ｐＷＢＫＳＡＣと可換な広宿主域プラスミド）で形質転換した。適当なＰＣＲプライマーを選択し、sap遺伝子の天然型プロモータを捕獲するためsapコード領域の上流域及び下流域の配列１４０ｂｐを増幅した。ｐＢＢＲｌＭＣＳ:ＫｍsapがＪＳ４０１５に導入された場合、タンパク分解性表現型は回復した（図４Ｃ）。ＪＳ４０２０株のＴｎ５突然変異体もまたｐＢＢＲｌＭＣＳ:sapを用い同じ方法で補完した。
【００８２】
ＪＳ４０１５sap遺伝子からのＰＣＲ増幅されたＤＮＡの配列の分析から、ＮＴＧ及びＵＶ組合せ突然変異により引き起こされる幾つかの点在する塩基変化があることが分かる。とりわけ興味深いのは、プロテアーゼ活性部位の極近くにあるＳａｐのＶａｌ１８８のリジン残基による置換を引き起こす隣接する２つの塩基の変化である。
【００８３】
Ｓａｐ−ＪＳ４０１５の表現型とＩＨＮＶ−Ｇ挿入とには単純な関係はないことを確証するために、分解によって影響を受けることが知られている他の全長ＲｓａＡハイブリッドタンパク構造体を幾つか試験した。２つの構造体に対する結果を図５に示した。すべての試験例において、野生型宿主（ＪＳ４０００）ではハイブリッド全長rsaAタンパクの著しい分解が起こったが、Ｓａｐ−ＪＳ４０１５株では当該分解は検出されなかった。
【００８４】
上述の通り、理解の容易化のために、図表及び実施例を用いて本発明を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に記載した本発明の技術的思想の範囲を逸脱しない範囲においてなしうる変更・修正等は、本発明の教示の範囲に含まれることは当業者には明白であろう。本書において引用した特許、特許出願及び参考文献はすべて引照を持って繰り込みその内容は本書に記載されたものとみなす。
【００８５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】全長ＲｓａＡハイブリッドタンパクの発現と関連する「タンパク分解性表現型」の模式図。
【図２】カウロバクタープロテアーゼをコードするＤＮＡ（Ｓａｐ）のＴｎ５分断を含むプラスミドの模式図。
【図３】カウロバクター・クレセンタス（C.crescentus）ＪＳ４０２０のプロテアーゼ遺伝子（sap）Ｔｎ５挿入の位置及び方向並びにＴｎ５分断遺伝子のヌクレオチド配列決定を示す模式図。矢印は、プラスミドｐＴＺ１９Ｕｐ１、４及び７における配列決定にかけられたカウロバクターＤＮＡの領域を表す。制限酵素部位の略称は以下の通り：ＢｍはＢａｍＨＩ、ＢｇはＢｇｌＩＩ、ＰはＰｓｔＩ、ＸはＸｂａＩ。
【図４】カウロバクター・クレセンタスのＳａｐ＋株及びＳａｐ−株によって合成されたＲｓａＡ（４８５／ＩＨＮＶＧ２０）の分析結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのコピー。タンパクは、「低ｐＨ（low-pH）」法によって細胞表面から抽出した。２６ｋＤａのフラグメントを含むゲルの領域は示していない。Ａは、Ｓａｐ＋ＪＳ４０００のＲｓａＡ（４８５／ＩＨＮＶＧ２０）及びＲｓａＡのタンパク分解性切断を示す。レーン１は、ＪＳ４０００の低ｐＨ抽出物。レーン２は、（ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ［４８５／ＩＨＮＶＧ２０］）の低ｐＨ抽出物。レーン３は、ＪＳ４０００（ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ）の低ｐＨ抽出物。Ｂは、Ｓａｐ＋ＪＳ４０２０及びＳａｐ−Ｔｎ５変異株ＪＳ４０２１のＲｓａＡ（４８５／ＩＨＮＶＧ２０）のタンパク分解性切断を示す。レーン１は、ＪＳ４０２０。レーン２は、ＪＳ４０２１。レーン３は、ＪＳ４０２１（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ：Ｋｍsap）。Ｃは、ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰかｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ［４８５／ＩＨＮＶＧ２０］かの何れかを含むＳａｐ−ＪＳ４０１５のＵＶ／ＮＴＧ変異株の相補性を示す。レーン１は、Ｓａｐ−ＪＳ４０１５のＲｓａＡ（４８５／ＩＨＮＶＧ２０）の切断。レーン２は、Ｓａｐ−ＪＳ４０１５のＲｓａＡの切断。レーン３は、Ｓａｐ＋ＪＳ４０１５（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ：Ｋｍsap）のＲｓａＡ（４８５／ＩＨＮＶＧ２０）の切断。レーン４は、Ｓａｐ＋ＪＳ４０１５（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ：sap）のＲｓａＡの切断。
【図５】ＲｓａＡ、及びＳａｐ＋株ＪＳ４０００及びＳａｐ−株ＪＳ４０１５によって合成された大きな非相同性インサートを含むＲｓａＡの分析結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのコピー。タンパクは、「低ｐＨ」法によって細胞表面から抽出した。Ａは、緑膿菌（P.aeruginosa）ピリンエピトープの３倍直列型反復配列の挿入配列を有するＲｓａＡを示す。Umelo-Njaka, et al. (2000)に記載されているような方法を用いて、緑膿菌のＩＶ型線毛からのピリンチップアドヘシンエピトープの３倍直列型反復配列を調製し、ＲｓａＡのアミノ酸７２３に対応するrsaAの位置に挿入した。この挿入配列の全体の長さは、１３４アミノ酸であった。レーン１は、ＪＳ４０００（ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ）（挿入配列を含まないコントロール）。レーン２は、ＪＳ４０００（ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ）（７２３／３×ピリン１２）。レーン３は、ＪＳ４０１５（ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ）（７２３／３×ピリン１２）。Ｂは、サケウイルスの糖タンパクセグメントの挿入配列を有するＲｓａＡを示す。伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）株ＳＰ（１６）のＶＰ２表面糖タンパクの１１２アミノ酸セグメントは、当該ウイルスに由来するゲノムＲＮＡを用いて、逆転写ＰＣＲによって調製した。このセグメントは、ＲｓａＡにＩＨＮＶ−Ｇアミノ酸配列を挿入するためのBingle, et al. (1997a) 及びSimon, et al. (2001) に記載された方法と同様の方法を用い、ＲｓａＡのアミノ酸７２３に対応する位置に挿入された。レーン１は、ＪＳ４０００（ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ）。レーン２は、ＪＳ４０００（ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ）（７２３／ＶＰ２Ｃ）。レーン３は、ＪＳ４０１５（ｐＷＢ９ＫＳＡＣ：rsaAΔＰ）（７２３／ＶＰ２Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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