(57)【要約】本発明は、特定の酵素のアンチセンス阻害により、ｐ４５０酵素によって代謝される薬物の性能を改善する方法に関する。典型的に、ｐ４５０酵素は、外因性物質またはその薬物自身によって誘導される。被験体における薬物の薬物動態を、薬物代謝酵素（特にｐ４５０酵素）をコードするＲＮＡに対するアンチセンスであるオリゴマー（好ましくはＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド）を同時投与することによって改善する方法を記載する。このオリゴマーは、薬物代謝酵素の産生を減少させ、このことは、薬物の半減期および薬物の有効性を延長し、そして／または薬物の毒性を減少させる。
2004523465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における薬物の薬物動態を改善する方法であって、該方法は、薬物の有効性を減少させる薬物代謝性のシトクロムＰ４５０酵素の合成を、該酵素をコードする標的ＲＮＡ分子にハイブリダイズすることによって減少させるのに有効なモルホリノアンチセンスオリゴマーを該薬物と同時に投与する工程を包含し、ここで、該アンチセンスオリゴマーは、該被験体に経口投与または経皮的に投与される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記モルホリノオリゴマーが、図６ＡＡ〜６ＥＥにおいて示される構造からなる群から選択されるサブユニット間の結合を有する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで前記結合が図６Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート結合であり、ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏ、あるいはＸ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ’、およびＺ＝Ｏ、であり、そしてＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、ここでＲおよびＲ’は、アルキル、ポリアルキレンオキシ、およびこれらの組み合せから独立して選択される部分であり、これらは、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステルおよび無機エステルから選択される１つ以上の基で置換されていてもよい、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで各前記ＲおよびＲ’部分は、置換に関係なく、１〜６原子の長さである、方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、ここでＮＲＲ’は、窒素、炭素、酸素、および硫黄から選択される５〜７個の環原子を有しかつ非炭素環原子と少なくとも同じ数の炭素環原子を有する窒素複素環を示す、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記アンチセンスオリゴマーが少なくとも１５ヌクレオチドの長さである、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記アンチセンスオリゴマーが、前記標的ＲＮＡの一領域に、３７℃を超えるＴｍでハイブリダイズする、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記アンチセンスオリゴマーが、前記標的ＲＮＡ分子のＡＵＧ翻訳開始部位含有領域に、ハイブリダイズする、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記標的ＲＮＡ分子が、プレｍＲＮＡであり、前記アンチセンスオリゴマーが、該プレｍＲＮＡの、イントロン−エキソンの境界、またはエキソン−イントロンの境界を含む領域にハイブリダイズする、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記薬物が、前記薬物代謝性シトクロムｐ４５０酵素を誘導するか、またはこのような酵素を誘導する生体異物因子に曝露された被験体に投与されるかのいずれかである、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ここで前記薬物がシトクロムｐ４５０酵素を誘導する、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記シトクロムｐ４５０が、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ２、
ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ６Ａ１からなる群から選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記被験体がヒト被験体であり、前記シトクロムｐ４５０が、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、およびＣＹＰ３Ａ４からなる群から選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで前記シトクロムｐ４５０が、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｅ１、およびＣＹＰ３Ａ４からなる群から選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記シトクロムｐ４５０が、ＣＹＰ２Ｅ１であり、前記薬物がアセトアミノフェンである、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記シトクロムｐ４５０が、ＣＹＰ２ＢまたはＣＹＰ３Ａサブファミリー由来であり、前記薬物が、フェノバルビタールまたはヘキソバルビタールである、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで前記シトクロムｐ４５０がＣＹＰ２Ｂ１である、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記シトクロムｐ４５０がＣＹＰ３Ａ４であり、前記薬物が、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、リファンピシン、リファンピン、リファブチン、およびラパマイシンからなる群から選択される抗生物質である、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記シトクロムｐ４５０がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ１Ａ２であり、前記薬物がエストロゲンまたはエストラジオールを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１１に記載の方法であって、ここで前記シトクロムｐ４５０がＣＹＰ３Ａ４であり、前記薬物がプロテアーゼインヒビターまたは非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターであり、前記生体異物因子が、ＣＹＰ３Ａ４誘導性非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターである、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記薬物がパクリタキセルであり、前記シトクロムｐ４５０がヒトＣＹＰ３Ａ４である、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号３５、４６および４７からなる群から選択される、方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号１６〜３５および配列番号４６〜４７からなる群から選択される、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで前記オリゴマーが、配列番号２６〜３５および配列番号４６〜４７からなる群から選択される、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで前記オリゴマーが、配列番号２７、３０、３４、３５、および４６〜４７からなる群から選択される、方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記薬物がタモキシフェンであり、前記シトクロムｐ４５０がヒトＣＹＰ３Ａ４である、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、特定の酵素のアンチセンス阻害により、ｐ４５０酵素によって代謝される薬物の性能を改善する方法に関する。典型的に、ｐ４５０酵素は、外因性物質またはその薬物自身によって誘導される。
【０００２】
（発明の背景）
薬物が生物学的系に導入される場合、複数の薬学動態学的プロセスは、この薬物の最終的な有効性に影響を及ぼし始め、このことは、どの程度迅速に、どのような濃度で、およびどのくらいの期間この薬物が標的器官に対して有効であり得るかを決定する。一般的に、親油性生体異物は、より極性、そしてそれ故より容易に排出し得る生成物に代謝される。脂質溶解性薬物の不活性化における代謝の役割は、非常に劇的であり得る。例えば、チオペンタルおよびフェノバルビタールのような親油性バルビツール酸塩は、これらがより水溶性化合物へ代謝的に変換されなかったとしても、非常に長い半減期を持つ。多くの潜在的抗癌薬物は、これらの半減期が有用な治療効果を達成するにはあまりにも短いので、非有益と判断される。
【０００３】
摂取した化合物（薬物または食物などが挙げられる）の、体から容易に除去される形への代謝的変換は、生体内変化または解毒と呼ばれる。生物体によって摂取された化合物は、一般的に２つの相において生体内変化される。相１（官能基付与と言う）において、例えば、アミン、チオール、またはヒドロキシル基のような反応部位が、一般的に酸化反応を経由して導入される。相２（共役と言う）において、水溶性基が反応部位に付加される。相２としては典型的に、化合物に対するグルクロン酸、硫酸、酢酸、またはアミノ酸の付加が挙げられる。
【０００４】
相１の反応はシトクロムｐ４５０スーパーファミリーの酵素によって、しばしば触媒される。典型的な相１の反応において、シトクロムｐ４５０酵素は、ヒドロキシラジカルなどの反応基を薬物に付加するために、酸素およびＮＡＤＨを用いる。生産された反応性中間体は、親分子より毒性が強まり得、そして細胞内のタンパク質、ＲＮＡ、およびＤＮＡに損傷を引き起こし得る（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｎ．Ｐ．Ｅ．，「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ，」  ｉｎ：Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ，Ｃ．，ｅｄ．，ＣＹＴＯＣＨＲＯＭＥ  Ｐ４５０：ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＡＮＤ  ＴＯＸＩＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＳＰＥＣＴＳ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ；１９９６，ｐｐ２９−５３）。
【０００５】
一般的に相１の活性化反応に続く、相２の共役反応は、相１の反応によって形成された反応性中間体の毒性を、しばしば減少させる。相２の共役は、薬物を排泄しうる（例えば、尿または胆汁を介して）水溶性化合物に変換する。体内において、いくつかの型の共役反応（グルクロン酸抱合、硫酸化、ならびにグルタチオンおよびアミノ酸共役が挙げられる）が生じる。いくつかの場合において、親薬物はすでに、直接的に共役を形成する官能基を有し得る。例えば、イソニアジドのヒドラジド部分が、相２の反応においてアセチル共役を形成することは公知である。この共役はその後、相１型反応、すなわち、イソニコチン酸への加水分解のための基質である。従って、相２の反応はいくつかの場合において、実際に相１の反応に先行し得る。
【０００６】
相１および／または相２の代謝活性の変化と、癌および肝疾患などの疾患のリスクの増加との間の相関、および有害な薬物反応における相関が注目されている。例えば、いくつかの薬物（アセトアミノフェンのような）は、多様な器官に対して毒性の反応性中間体に代謝的に変換される。これらの毒性反応は、続くステップまたは代替的経路が、圧倒もされず（ｏｖｅｒｗｈｅｌｍｅｄ）、損なわれもせず、そして内因性共基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（グルタチオン、グルクロン酸、硫酸）の有効性が制限されない場合には、低投薬量で認められないかもしれない。しかしながら、これらの再資源が排出される場合は、毒性経路が優勢であり得、結果として明白な器官毒性または癌形成を生じる。
【０００７】
多くの薬物および他の生体異物因子は、薬物代謝性酵素をコードする遺伝子を誘導し、これらの酵素のレベルを強め、そして結果的にこれらの酵素によって触媒される代謝反応を促進し得る。このような促進された代謝は、基質薬物の半減期および薬学的有効性の縮小を引きこし得る。薬物代謝（ｄｒｕｇ−ｍｅｔａｂｌｉｚｉｎｇ）化合物をコードする誘導遺伝子は、反応性中間体または毒性中間体の定常状態レベルを増加させることによって、薬物媒介性の組織の毒性を悪化させる。
【０００８】
患者における多様な薬物の薬物動態を調節するための技術が必要である。本発明は、薬物自身または患者が曝露されている他の生体異物因子のいずれかによって誘導される、１つ以上の特異的薬物代謝酵素の産生を減少することによって、これを達成する。減少した薬物代謝は、結果として薬物半減期の増大を生じる。このような調節を欠く場合には、より低用量とより高用量のバイオアベイラビリティーが等価であり、そして高い投薬量に関連する毒性が回避され得るので、薬物の投薬量は減少し得る。従って、代謝的毒性経路の有効性を減少させることは薬物の安全性を増強する。
【０００９】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は被験体に投与された薬物の薬物動態を改善する方法を提供し、ここでこの薬物は、この薬物の有効性を減少させるシトクロムｐ４５０酵素によってインビボで代謝されることが公知である。この方法に従うと、薬物は、薬物代謝性シトクロムｐ４５０酵素合成を（この酵素をコードする標的ＲＮＡ分子にハイブリダイズすることによって）減少させるのに有効な、モルホリノアンチセンスオリゴマーと共投与される。本発明の有利な特徴において、アンチセンスオリゴマーは経口投与または経皮投与され得る。経口投与のためには、典型的用量は少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００１０】
１つの実施形態において、薬物はパクリタキセルであり、そして標的とされる酵素はＣＹＰ３Ａ４である。好ましい方法の実施形態において、この薬物自身は薬物代謝性ｐ４５０酵素を誘導し、または被験体は、このような酵素を誘導する生体異物因子に曝露されている。選択された実施形態において、酵素はＣＹＰ２Ｅ１であり、そして薬物はアセトアミノフェノンであり；あるいは酵素はＣＹＰ２ＢまたはＣＹＰ３Ａサブファミリー、好ましくはＣＹＰ２Ｂ１に由来し、そして薬物はフェノバルビタールまたはヘキソバルビタールである。さらに好ましい実施形態において、酵素はＣＹＰ３Ａ４であり、そして薬物はクラリスロマイシン、エリスロマイシン、リファンピシン、リファンピン、リファブチン、およびラパマイシンからなる群から選択される抗生物質であり；あるいは酵素はＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ１Ａ２であり、そして薬物はエストロゲンまたはエストラジオールを含む。なおさらなる実施形態において、酵素はＣＹＰ３Ａ４であり、薬物はプロテアーゼインヒビターまたは非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターであり、そして誘導生体異物はＣＹＰ３Ａ４誘導非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターである。
【００１１】
アンチセンスオリゴマーは好ましくは３７℃より高温のＴｍでＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする。１つの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはＡＵＧ翻訳開始部位を含む標的ＲＮＡ分子領域にハイブリダイズする。他の実施形態において、標的ＲＮＡ分子はプレｍＲＮＡであり、そしてアンチセンスオリゴマーは、イントロン−エキソン境界またはエキソン−イントロン境界を含むプレｍＲＮＡ領域にハイブリダイズする。
【００１２】
好ましくは、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１５ヌクレオチド長である。好ましいオリゴマーはモルホリノオリゴマーであり、これは図６ＡＡ−６ＥＥに提示される構造からなる群から選択される、サブユニット間結合を構成する荷電されていない骨格を有する。好ましくは、この結合はホスホルアミデートであり、またはより好ましくは、図６Ｂ−Ｂに提示されるホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ）結合であり、ここでＸ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲＲ’であり、Ｙ＝Ｏであり、そしてＺ＝Ｏであり、あるいはここでＸ＝ＯＲであり、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ’であり、そしてＺ＝Ｏであり、そしてＲおよびＲ’は標的結合に干渉しない基である。好ましくはＲおよびＲ’は、アルキル、ポリアルキレンオキシ、およびその組み合わせから独立して選択される部分であり、これらはヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル、および無機エステルから選択される１つ以上の基に置換され得る。選択された実施例において、各上記ＲおよびＲ’部分は、置換から独立して、１〜６個の鎖原子（炭素および／または酸素）長である。ＮＲＲ’はまた、窒素、炭素、酸素、および硫黄から選択される５〜７個の環原子を有し、そして少なくとも非炭素環原子と同じくらい多くの炭素環原子を有する窒素複素環を提示する。
【００１３】
オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号：１６〜３５および４６〜４７からなる群より選択されるもので有り得、好ましくは配列番号：２６〜３５および４６〜４７（ヒトＲＮＡ配列に標的化される）、ならびにより好ましくは配列番号：２７、３０、３４、３５、および４６〜４７から選択されるものであり得る。
【００１４】
標的にされるシトクロムｐ４５０酵素は、好ましくはＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ６Ａ１の酵素からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ここで被験体はヒトの被験体であり、シトクロムｐ４５０は、好ましくはＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、およびＣＹＰ３Ａ４の酵素からなる群から選択され、より好ましくはＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｅ１、およびＣＹＰ３Ａ４酵素からなる群から選択される。
【００１５】
これらおよび他の目的ならびに本発明の特徴は、後に続く発明の詳細な説明を付属の図面と合わせて読むと、より十分に明らかになる。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用される以下の用語は、他に指定がない限り、以下の意味を有する：
「生体異物」は、生物学的系に対して外来の化学物質である。生体異物としては以下：当該生物学的系に対して外来の、すなわち非自生性（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）である天然に存在する化合物、薬物、環境性因子、発癌物質、および殺虫剤が挙げられる。
【００１７】
「薬物」は、治療目的のために動物に対して投与される化学物質を言う。このような薬剤は、例えば、イオン、小さな有機分子、ペプチド、タンパク質またはポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびオリゴサッカライドの形態をし得る。因子は典型的に、細胞によって取り込まれた際に細胞の構造、機能、または組成において、観測可能なかつ望ましい変化を引き起こすために投与される。このような変化としては、例えば、１つ以上のｍＲＮＡの発現の増加または減少、１つ以上のタンパク質の発現の増加または減少、タンパク質または他の細胞成分のリン酸化、酵素の阻害または活性化、結合対（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｉｒ）メンバー間の結合の阻害または活性化、代謝産物の合成率の増加または減少、あるいは細胞増殖の増加または減少が挙げられる。
【００１８】
遺伝子の「誘導」は、インデューサー分子（例えば、ホルモンまたは外因性物質）のような刺激、あるいは熱のような他の刺激による、遺伝子スイッチングまたは遺伝子発現の増強を言う。本発明の状況において、外因性物質（生体異物）による誘導が典型的に意図されている。酵素の誘導は典型的に、酵素をコードする遺伝子の誘導から生じる。
【００１９】
「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴマー）は、その骨格がヌクレアーゼによる切断に対する感受性がないオリゴマーである。例示的なヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエートおよびリン酸−アミンＤＮＡ（ｐｎＤＮＡ）のようなオリゴヌクレオチドアナログ（これらの両方ともが、荷電した骨格を有する）、ならびにメチルホスホネート、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）アナログ（これらの全ては荷電していない骨格を有する）である。
【００２０】
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「アンチセンスオリゴマー」は、交換可能に使用され、そしてヌクレオチド塩基の配列およびサブユニットからサブユニットへの骨格を有するオリゴマーを言う。これはアンチセンスオリゴマーが、標的配列内の：ＲＮＡオリゴマーヘテロ二重鎖を形成するように、ワトソン−クリック塩基対合によって、ＲＮＡの標的配列にハイブリダイズすることを可能にする。オリゴマーは、標的配列に対して正確な配列相補性を有し得るか、またはほぼ相補性である。これらのアンチセンスオリゴマーは、標的配列を含むｍＲＮＡの翻訳をブロックまたは阻害し得るか、および／またはｍＲＮＡのスプライシング改変体を産生するｍＲＮＡのプロセシングを改変し得る。二本鎖ＤＮＡ結合因子であるアンチセンスオリゴマーは遺伝子の転写を阻害し得る。
【００２１】
オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、このオリゴマーが生理学的条件下（３７℃よりも高く、好ましくは少なくとも５０℃、より好ましくは少なくとも６０℃、８０℃またはそれより高温のＴｍ）で標的に対してハイブリダイズする場合に、標的ポリヌクレオチドに対して「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約１０℃低く、および好ましくは約５℃低いように選択される）に相当する。所定のイオン強度およびｐＨでは、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。
【００２２】
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが、２つの一本鎖ポリヌクレオチド間のアンチパラレルな立体配置で生じる場合に、互いに「相補的」であると記載される。二本鎖ポリヌクレオチドが、他のポリヌクレオチドに対して「相補的」であり得るのは、第一のポリヌクレオチドのうち１つの鎖と第二のポリヌクレオチド鎖の間で、ハイブリダイゼーションが起こり得る場合である。相補性（１つのポリヌクレオチドが他方と相補的である程度）は、一般的に受け入れられている塩基対合の規則に従って互いに水素結合を形成すると予想される反対の鎖における塩基の割合の点からの定量化が可能である。
【００２３】
アンチセンスオリゴマーは標的配列に対して１００％の相補性である必要はないにもかかわらず、これは、標的配列の発現が調節されるように標的配列に対して安定的かつ特異的に結合するために有効である。良好な特異性を併せ持った安定な効率的結合を可能にするオリゴマーの適切な長さは、約８〜４０ヌクレオチド塩基対であり、そして好ましくは約１２〜２５塩基対である。ミスマッチが存在する場合は、中心よりもハイブリッド二本鎖の末端領域に向かって不安定が低くなる。標的塩基との塩基対合を変性させ得るオリゴマー塩基はまた、標的との塩基対特異性が維持されると仮定して、考慮される。
【００２４】
第一の配列を有するポリヌクレオチドが、第二の配列を有するポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする場合、第一の配列が第二の配列に対して「アンチセンス配列」である。
【００２５】
「標的ＲＮＡに関する塩基特異的な細胞内結合事象」は、多くの他の多様な分子が存在するとしても、細胞内での標的ＲＮＡ配列とオリゴマーとが特異的に結合することを言う。このような結合の塩基特異性は配列特異的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列上相補的である一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。
【００２６】
本明細書中で使用される「モルホリノオリゴマー」または「モルホリノオリゴヌクレオチド」は、典型的なポリヌクレオチドに水素結合を形成し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー分子を言い、ここでこのポリマーは、ヌクレオチドおよびヌクレオシドに典型的なホスホジエステル結合により連結されるリボース骨格を欠き、その代わりに、環に窒素を有するサブユニットを含み、この環の窒素を通してのカップリングを伴う。好ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図５Ａ〜Ｅに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成されている。ここでは、（ｉ）この構造は、リン含有結合（１〜３個の原子の長さ）によってともに結合され１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外の炭素原子に連結する、、そして（ｉｉ）ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的な水素結合によってポリヌクレオチド内の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジンの塩基対合部分である。本発明で使用されるアンチセンスヌクレオチド構造の例としては、図６Ａ−Ａ〜６Ｅ−Ｅに示される結合をともなう、図５Ａ〜Ｅに示されるモルホリノサブユニット型が挙げられる。モルホリノオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）に特徴的な合成、構造、および結合は、共有に係る米国特許第５，１８５，４４４号、同第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号において詳細に記載されおり、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００２７】
好ましい実施形態において、モルホリノオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）であり、図６Ｂ−Ｂに説明されるようなホスホロジアミデート結合（ここでＸ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲＲ’であり、Ｙ＝Ｏであり、およびＺ＝Ｏである）、ならびに図６Ｂ−Ｂに説明されるような別のホスホロジアミド化結合（ここでＸ＝ＯＲであり、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲであり、およびＺ＝Ｏである）から選択される結合を有する。このような構造は、例えば、Ｈｕｄｚｉａｋら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．６、２６７〜２７２（１９９６）ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７、１８７〜１９５（１９９７）に記載されている。ＲおよびＲ’は、標的結合に干渉しない基である。好ましくは、ＲおよびＲ’は、アルキル、ポリアルキレンオキシ（例えば、ＰＥＧ；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、またはその組み合わせから独立して選択される。（このような組合わせの例は−（ＣＨ２）３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−）である）。アルキル／ポリアルキレンオキシ鎖は、好ましくは末端で、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、チオール、低級アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル、および無機エステル（例えば、リン酸エステルまたはスルホン酸エステル）から選択される基によって置換され得る。好ましくは、この鎖（置換基とは独立している）は１〜１２個の原子（炭素および／または酸素）長であり、そしてより好ましくは、１〜６個の原子長である。選択された実施例において、ＲおよびＲ’は独立してメチルまたはエチルである。１つの実施例において、Ｘ＝Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｙ＝Ｏであり、およびＺ＝Ｏである。
【００２８】
ＮＲＲ’はまた、窒素、炭素、酸素、および硫黄から選択される５〜７個の環原子を有し、そして少なくとも非炭素の環原子と同じらい多くの炭素環原子を有する窒素の複素環式環を意味する。例としては、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、トリアゾール、ピラゾール、ピロール、イソピロール、イミダゾール、オキサゾール、イミダゾール、イソサゾールなどが挙げられる。
【００２９】
「アリキル」は、炭素および水素を含む完全に飽和した非環式一価のラジカルを言い、これは分枝鎖または直鎖であり得る。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、およびイソプロピルである。「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子（例としては、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチル、およびイソペンチル）、好ましくは１〜４個の炭素原子がアルキルラジカルであるアルキルを言う。
【００３０】
「Ｃ−５−メチル改変された」オリゴヌクレオチドは、シチジン塩基のＣ−５水素がメチル基に置換されたものである。「Ｃ−５−プロピン改変された」または「Ｃ−５−プロピンピリミジン改変された」オリゴヌクレオチドは、チミジン塩基のＣ−５メチル基および／またはシチジン塩基のＣ−５水素がプロピニル基（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）に置換されたものである。
【００３１】
用語オリゴヌクレオチドに対して「発現を調節する」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡの発現または翻訳に干渉することにより、所定のタンパク質の発現の増大または減少のいずれかを行う能力を言う。タンパク質の発現が増大する場合、アンチセンスオリゴマーは、例えば腫瘍サプレッサー遺伝子といったサプレッサー遺伝子の発現をブロックし得る。タンパク質の発現が減少する場合、アンチセンスオリゴマーは所定の遺伝子の発現を直接ブロックし得るか、またはその遺伝子から転写されたＲＮＡの破壊の促進に寄与し得る。
【００３２】
「有効な量」は、アンチセンスオリゴマーに関して、哺乳動物の被験体に対して投与されるアンチセンスオリゴマーの量であって、選択された標的配列の全てまたは一部に対して特異的にハイブリダイズし、それにより標的配列によりコードされるタンパク質の発現を減少させるために有効な、単回の用量または一連の用量の一部のいずれかとしての量を言う。
【００３３】
個体または細胞の「処置（処理）」とは、個体または細胞の天然の経過を変化させようとする任意のタイプの介入である。処置としては、薬学的組成物の投与が挙げられるがこれに限定されず、そして予防的に、または病理的事象の開始もしくは病因学的因子との接触の後のいずれかに、行われ得る。
【００３４】
用語「相対量」は、試験測定値とコントロール測定値の間で比較が行われる場合に用いられる。反応において複合体を形成する試薬の相対量は、コントロール標本に反応する量と比較した試験標本に反応する量である。このコントロール標本は、同様のアッセイにおいて別々に行われるか、またはそれは同様のサンプル（例えば、組織切片において悪性領域を取り囲んでいる正常組織が挙げられる）の一部であり得る。
【００３５】
アンチセンスオリゴマーと薬物の「同時投与」は、アンチセンスオリゴマーが代謝を調節し、そして薬物の有効性を増強するのに有効な限りは、薬物の投与と同時、投与後、または、好ましくは薬物の投与に先立って行われ得る。薬物およびオリゴマーは異なる経路によって投与され得る；すなわち、この薬物は必ずしも経口または経皮投与される必要がない。
【００３６】
略語：ＯＮ＝オリゴヌクレオチド；ＯＤＮ＝オリゴデオキシリボヌクレオチド；ＰＳまたはＰＳ−ＯＤＮ＝ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド；ＰＭＯ＝ホスホルアミデートまたは（好ましくは）ホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ）モルホリノオリゴヌクレオチド。
【００３７】
（ＩＩ．アンチセンスオリゴマー）
アンチセンスオリゴマーは、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡへの比較的短いオリゴヌクレオチドの相補的ハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現（転写）およびタンパク質産生（翻訳）に変化をもたらし、その結果、これらの細胞内核酸の正常な本質的な機能は混乱される（米国特許第５，８４３，６８４号参照）。
【００３８】
標的核酸分子上のアンチセンスオリゴマーの作用の２つのメカニズムが提唱されている。１つのメカニズムにおいて、アンチセンスオリゴマーは、細胞内ＲＮａｓｅ  Ｈによる標的とされたＲＮＡの酵素的切断によって、核酸の機能を混乱させると考えられている。このオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログ（デオキシリボ型でなければならない）は、標的とされたＲＮＡにハイブリダイズし、そしてこの二重鎖は、ＲＮａｓｅ  ＨがＲＮＡ鎖を切断するのを活性化し、従ってＲＮＡの正常機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、このメカニズムによって操作されるアンチセンスオリゴマーの顕著な例である。
【００３９】
他のメカニズムにおいて、用語「ハイブリダイゼーション阻止」は、アンチセンスオリゴマーが標的核酸に結合し、従って立体障害によって必須のタンパク質（最も多くの場合リボソームである）の核酸への結合を阻止する終結事象を含む。このメカニズムにより作用する例示的なアンチセンスオリゴマーとしては、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドおよびαアノマーオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、Ｃｏｈｅｎ，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ：ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌａ．，１９８９を参照のこと）。
【００４０】
アンチセンスオリゴマーが薬物または他の生体異物因子の薬物動態をこれらの因子を代謝することによって誘導される特異的代謝酵素の産生を減少することによって調節する有用性は、このオリゴマーが、多くの量の合成、細胞による取り込みおよび／または細胞膜を横切る輸送、標的とされたＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡである）への適切なハイブリダイズ、そしてその後のＲＮＡからの翻訳の終了または混乱に扱いやすいことを必要とする。
【００４１】
非イオン性のオリゴヌクレオチドアナログ、すなわち、荷電していない骨格を伴うオリゴマーは、一般的にこれらの荷電された対応物よりも容易に細胞膜を横切る。非イオン性のオリゴヌクレオチドアナログとしては、ホスホトリエステル結合ＤＮＡおよびメチルホスホネート結合ＤＮＡ（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５１３４（１９７９）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：６９５９（１９８０））、カルバメート結合ヌクレオシド（Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２（１９８７））、ホスホロアミデート結合ＤＮＡ（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：４８３１（１９９８））、およびペプチド核酸（ＰＮＡｓ）が挙げられる。
【００４２】
本発明の方法において使用される好ましい非イオン性アンチセンスオリゴマーは、上記載に規定されるように荷電していない骨格のモルホリノオリゴマーである。モルホリノオリゴマー（例えば、図５および図６に説明される）は、モルホリノサブユニット構造で構成され、この構造は、荷電していないリン酸含有結合（１〜３原子長）によりともに結合され、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結する。各サブユニットに結合されるのは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効な、プリンまたはピリミジン塩基対合部分である。ピリミジン塩基対合部分としてはまた、チミジンおよび／またはシチジン部分のＣ−５−プロピン改変、および／またはシチジン塩基のＣ−５−メチル改変が挙げられる。
【００４３】
図６ＡＡ−ＥＥは、好ましい骨格構造（マルチサブユニットオリゴマーの２つのモルホリノサブユニットを示す）を説明している。各環構造としては、プリンまたはピリミジンあるいは関連する水素結合部分（ＰｉおよびＰｊと表現され、β−配向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）の結合を通して骨格のモルホリノ部分に結合する）が挙げられる。オリゴマーのプリンまたはピリミジン塩基対合部分は、典型的にはアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはチミンである。好ましい構造は、図６Ｂ−Ｂおよび上の記載のように、ホスホルアミデート結合モルホリノオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
アンチセンス化合物の溶解性、およびこの化合物が溶液中の蓄積による沈殿を阻害する化合物の能力は、親水性オリゴマーのような可溶化部分、あるいは荷電アミノ酸または有機酸のような荷電部分でのオリゴマーの誘導体化によってさらに増強され得る。この部分は、任意の生体適応性の親水性部分または荷電部分であり得、これらは、アンチセンス化合物と結合され得、そして標的配列に結合する化合物に干渉しない。この部分は、アンチセンス化合物（例えば、その５’末端）に、周知の誘導体化方法によって化学的に結合され得る。１つの好ましい部分は、規定の長さのトリエチレングリコールのようなオリゴエチレングリコール部分であり、アンチセンス化合物の５’末端に、トリエチレングリコールとカルバメート結合を形成するピペラジン連結基によって、炭酸結合を通して共有結合され、ここで、第二のピペラジン窒素はアンチセンスの５’末端ホスホルアミデート結合に結合される。あるいは、またはさらに、この化合物は、ホスホジエステル結合のような少数の荷電した骨格結合を、好ましくは、化合物の末端に近い１つに含むように設計され得る。付加された部分は、好ましくは、水溶性媒体における化合物の溶解性を少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌに促進するのに効果的である。本発明のアンチセンスオリゴマーはまた、改変を含み、この改変としては以下が挙げられるが、これらに制限されない：コレステロールのような共役部分；アミノ基間に種々の数の炭素残基を伴うジアミン化合物；ならびに、末端リボース、デオキシリボースおよびリン酸の改変。これらは、ハイブリダイズした標的核酸、あるいは標的核酸に結合する酵素または他のタンパク質を切断またはこれらを架橋する改変である。
【００４５】
モルホリノオリゴマーは、特にＲＮＡ標的に対して高い標的結合親和性を提供し、そしてヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。モルホリノオリゴマーの標的への結合は、上に記載のより強い結合親和性に起因して、そしてオリゴマー／標的二重鎖は細胞内の二重鎖巻き戻しメカニズムに影響されにくいので強い不活性化を提供することが示されている。さらに、化合物の細胞性の取り込みに関連した治療的適用において、荷電していないモルホリノポリマーは荷電した骨格のオリゴマーよりも細胞内へより効率的に輸送される。
【００４６】
メッセンジャーＲＮＡ配列またはスプライシングされていないプレｍＲＮＡ配列の標的化は好ましいけれども、２本鎖ＤＮＡ（すなわち、ゲノムＤＮＡ）は、二重鎖ＤＮＡの主溝部位に配列特異的に結合するように設計された非イオン性プローブを用いることによって標的とされ得る。標的二重鎖ＤＮＡと塩基特異的３重鎖構造を形成するために適切なオリゴマーは、例えば、共有に係る米国特許第５，４０５，９３８号に記載されている。
【００４７】
モルホリノオリゴマーのインビボでの有効性。モルホリノオリゴマーは、標的とされる配列の翻訳阻害において、当該分野で広く使用されているホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、有意に改善された選択性を提供することが示されている。このモルホリノオリゴマーはまた、対応するホスホロチオエートよりもはるかに低い濃度で翻訳を阻害し、そしてホスホロチオエートによって提示された実質的な非アンチセンス活性の証拠は、ほとんどないかまたはないことが示されている。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７（２）ｐ６３〜７０（１９９７）を参照。
【００４８】
モルホリノオリゴマーは非常に高いヌクレアーゼ耐性および良好な水溶性を有し、このことは、モルホリノオリゴマーをインビボでの使用にとって良好な候補にしている。モルホリノオリゴマーは、荷電していないので、細胞膜の透過により有効である。これらは、静脈内または腹腔内投与、あるいは経口または経皮投与のようなより便宜的な方法によって投与される場合に有効である（下の実施例５および６を参照）。
【００４９】
インビボのモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、例として、共有に係る同時係属の米国仮出願番号６０／１１７，８４６号（１９９９年１月２９日出願）に記載の手順において証明されている。その中に記載の手順において、被験体に投与されるホスホルアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）は、標的ＲＮＡとヘテロ二重鎖を形成し、この二重鎖状態においてヌクレアーゼ分解から保護される。この二重鎖は細胞から放出され、そして標的ＲＮＡは後に被験体からの体液サンプル（例えば、尿サンプル）において検出され得る。これらの結果は、モルホリノオリゴマーが（ｉ）体内で移動し、そして細胞に入り、そして（ｉｉ）標的核酸領域に対してワトソン−クリック塩基対合によって高い親和性で結合し、（ｉｉｉ）細胞から血流中にヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の形態で放出され、そして（ｉｖ）体液で検出されるのに十分な量で血流に残存する。
【００５０】
（ＩＩＩ．標的遺伝子の選択）
本発明は被験体に投与された薬物の薬物動態を改善する方法に関し、これは薬物自身または被験体が曝露されている生体異物因子のいずれかによってアップレギュレートされる薬物代謝酵素の産生を減少させることによる。この薬物代謝酵素は薬物を毒性代謝産物に変換し得るか、被験体における薬物の半減期を縮小し得るか、あるいはその両方であり得る。酵素遺伝子（すなわち、「標的遺伝子」）由来の標的ＲＮＡの転写は、薬物、または異なる生体異物因子によって誘導される。本発明によると、ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマー、好ましくはモルホリノオリゴマーは、薬物代謝酵素（薬物の半減期を縮小するか、薬物を毒性代謝産物に変換するか、あるいはその両方である）をコードする遺伝子に標的にされる。アンチセンスオリゴマー、好ましくは薬物と共に投与されるアンチセンスオリゴマーは、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることによって被験体における酵素の産生を減少させるのに有効である。
【００５１】
外因性生体異物誘導性の遺伝子によってコードされている任意の薬物代謝酵素の産生は、本発明の方法によって減少し得る。例えば、重要な相２の薬物代謝酵素としては、エポキシド加水分解酵素（その基質としてはカルバマゼピン−１０，１１−エポキシドが挙げられる）；グルクロニル（ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ）転移酵素（その基質としてはオキサゼパムが挙げられ、そしてこの酵素はフェニトインおよびカルバマゼピンなどの抗痙攣薬によって誘導される）；およびグルタチオン転移酵素が挙げられる。酵素の選択は当該薬物の代謝性スキームによって決定され得る。
【００５２】
（Ａ．シトクロムｐ４５０ファミリー）
好ましい実施形態に従って、本発明はシトクロムｐ４５０（ＣＹｐ４５０）遺伝子に対するアンチセンスであるアンチセンスオリゴマーを提供する。シトクロムｐ４５０は、内因性化合物および外因性化合物の両方の酸化的代謝に関連する酵素の集まりである。シトクロムｐ４５０をコードする、３０を超えるの遺伝子ファミリーに分けられた２００を超えるの遺伝子が同定されている。このｐ４５０遺伝子ファミリーはサブファミリーに組織化され、遺伝子発現のレギュレーションおよびアミノ酸配列ホモロジーの点で、コードされた酵素の基質特異性、触媒活性、ならびに生理学的役割が異なる。次の代表的なｐ４５０遺伝子、これらの遺伝子のインデューサー、およびコードされた酵素の基質の議論は、説明目的のために提供されるが、本発明を制限することを意図していない。
【００５３】
多種の多数のｐ４５０遺伝子配列は、公知であり、かつＧｅｎＢａｎｋなどの公的なデータベースおよび総論を通して当業者に利用され得る。総論としてはＦ．Ｊ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ、「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｐ４５０’ｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４０（４），２４３−２８８（１９８９）；Ｓ．Ｄ．Ｂｌａｃｋら、「Ｐ−４５０  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６０，３５−８７（１９８７）；Ｄ．Ｒ．Ｎｅｌｓｏｎら、「Ｔｈｅ  ｐ４５０  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  Ｎｅｗ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒｓ，Ｅａｒｌｙ  Ｔｒｉｖｉａｌ  Ｎａｍｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，  ａｎｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２（１）、１−５１（１９９３年１月〜２月）、およびこれらに引用されている論文が挙げられる。
【００５４】
（Ｂ，ｐ４５０酵素および遺伝子の配列ホモロジー）
異なる哺乳動物種におけるｐ４５０酵素およびそれらの遺伝子間に高レベルの配列ホモロジーが見出されている。例えば、ラット、ヒトおよびウサギの２Ｅ１  ｃＤＮＡが単離および配列決定され、そしてこれらのアミノ酸配列は約８０％の類似性を提示する。ヒト２ＢサブファミリーｃＤＮＡは、ラット２Ｂ  ｃＤＮＡプローブを用いた肝臓ライブラリースクリーニングによって単離され、そして単離されたｃＤＮＡは＞７５％のアミノ酸類似性を証明した。ラットＣＹＰ３Ａ酵素（ＣＹＰ３Ａ１およびＣＹＰ３Ａ２）は、ヒトＣＹＰ３Ａ３およびＣＹＰ３Ａ４それぞれに対して、約９０％同一および機能的に同等である（ＤｅｓｊａｒｄｉｎｓおよびＩｖｅｒｓｅｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７５（３）：１６０８−１３、１９９５）。次の表は、これらおよび他の種のＣＹＰ３Ａ遺伝子由来のｍＲＮＡのＡＴＧ領域間の配列類似性を示す。
【００５５】
【表１】
2004523465.tif 000003
ｐ４５０３Ａタンパク質の３つの保存ドメインにおいて、次のホモロジー度が見出された：
１．ヘム結合システイン含有ペプチド（Ｈｅｍｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｙｓｔａｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）；ヘム鉄に対する第五配位子（ヒトタンパク質における４３５位から開始する２３アミノ酸セグメント）
【００５６】
【表２】
2004523465.tif 000004
２．膜移行結合ドメイン
（ヒトタンパク質における３９位から開始する８アミノ酸セグメント）
【００５７】
【表３】
2004523465.tif 000005
３．膜挿入のためのシグナル配列および半移行（ｈａｌｆ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）配列
（ヒトタンパク質における１６７位から開始する２０アミノ酸セグメント）
【００５８】
【表４】
2004523465.tif 000006
これら３つの公知の機能ドメイン（総数５００のうちの５１アミノ酸）に関するホモロジーの平均度は、サルに対してヒト９２．９％、ラットに対してヒト９２．５％、イヌに対してヒト９２．１％であった。
【００５９】
（Ｃ．ｐ４５０酵素の基質およびインデューサー）
ＣＹＰ２Ｂサブファミリーの遺伝子は、フェノバルビタールによって強く誘導されることは公知である。２Ｂ１および２Ｂ２タンパク質は９７％のアミノ酸配列類似性を示す。これらの酵素は類似した基質特異性を有し；しかしながら、精製された２Ｂ１（ラット）は、特定基質（ベンズフェタミンおよびテストステロンが挙げられる）に対して２Ｂ２よりも約５倍高い触媒活性を有し、そして基質ベンゾ（ａ）ピレンおよび７，１２−ジメチルゼンズアトラセンに対して２倍〜３倍高い活性を有する。
【００６０】
ｐ４５０、ＣＹＰ２Ｅ１の明確なエタノール含有形態は、最初にウサギにおいて同定され、そして後にラットおよびヒトにおいて同定された。このサブファミリーの酵素は以下に示した多くの基質を代謝し、これら基質としては、例えば、エタノール、アセトン、アセトアセテート、アセトール、ジエチルエーテル、ｐ−ニトロフェノール、ハロタン、ベンゼン、ピリジン、およびＮ−ニトロソジメチルアミンが挙げられる。
【００６１】
ＣＹＰ３Ａサブファミリーは、テストステロンの６β−ヒドロキシル化および多数の臨床的に重要な薬物の代謝に関連し、これらはの薬物は、例えば、以下に記載されるものである。
【００６２】
下の記載は、公知のインデューサーおよび多様なｐ４５０サブファミリーメンバーの基質のさらなる例である（Ｋｌａｓｓｅｎ，ｅｄ．，Ｃａｓａｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄｏｕｌｌ’ｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｉｓｏｎｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，１９９６．ｐｐ．１５０ｆｆの議論もまた参照）。シトクロムｐ４５０基質、インデューサー、および代謝産物についてのさらなる情報は、Ｇｏｎｚａｌｅｓおよび上に引用した他の総論において見出され得る。インターネットによって得られる現在の情報源としては、例として、Ｄａｖｉｄ  Ｎｅｌｓｏｎによって維持されている「Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｐ４５０  Ｈｏｍｅｐａｇｅ」，ｈｔｔｐ：／／ｄｒｎｅｌｓｏｎ．ｕｔｍｅｍ．ｅｄｕ／Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｐ４５０．ｈｔｍｌ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎによって提供されている「Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｐ４５０  Ｄａｔａｂａｓｅ」，ｈｔｔｐ：／／ｃｐｄ．ｉｂｍｈ．ｍｓｋ．ｓｕ／、およびＫｉｒｉｌｌ  Ｎ．ＤｅｇｔｙａｒｅｎｋｏおよびＰｅｔｅｒ  Ｆａｂｉａｎによって提供されている「Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  ｐ４５０−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｇｅｂ．ｔｒｉｅｓｔｅ．ｉｔ／ｐ４５０／が挙げられる。
【００６３】
本明細書中に議論されるｐ４５０遺伝子の例示は、目的説明のためにのみ与えられ、そして本発明を制限することを意図していない。
【００６４】
（ｐ４５０ファミリー１（ＣＹＰ１））
（ＣＹＰ１Ａ１：）
・以下を含む誘導因子：ダイオキシン、タバコの煙または炭火焼の牛肉中のＰＡＨ（多環式芳香族炭化水素）、食物中のβ−ナフトフラボン
・以下を含む基質：ジエチルスチルベストロール、２−ヒドロキシエストラジオールおよび４−ヒドロキシエストラジオール
（ＣＹＰ１Ａ２：）
・以下を含む誘導因子：ダイオキシン、ＰＡＨ、β−ナフトフラボン、アブラナ科の野菜、オメプラゾール
・以下を含む基質：アセトアミノフェン、フェナセチン、アセトアニリド（鎮痛剤）、カフェイン、クロザピン（鎮静剤）、シクロベンザプリン（筋弛緩剤）、エストラジオール、イミプラミン（抗うつ剤）、メキシリテン（ｍｅｘｉｌｌｉｔｅｎｅ）（抗不整脈剤）、ナプロキセン（鎮痛剤）、リルゾール（ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、タクリン、テオフィリン（心臓刺激剤、気管支拡張剤、平滑筋弛緩剤）、ワルファリン
・プローブ反応：カフェイン  ３−脱メチル化
（ｐ４５０ファミリー２（ＣＹＰ２））
（ＣＹＰ２Ａ６：）
・以下を含む誘導剤：バルビツレート
・以下を含む基質：クマリン、ブタジエン、ニコチン
（ＣＹＰ２Ｂ１：）
・以下を含む誘導剤：フェノバルビタール
・以下を含む基質：フェノバルビタール、ヘキソバルビタール
（ＣＹＰ２Ｃ９：）
・以下を含む誘導剤：リファンピン、セコバルビタール
・以下を含む基質：ＮＳＡＩＤ（例えば、ジクロフェナク、イブプロフェンおよびピロキシカム）；経口低血糖剤（例えば、トルブタミドおよびグリピジド）；アンギオテンシン−２ブロッカー（例えば、イルベサルタン（ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ）、ロサルタン（ｌｏｓａｒｔａｎ）およびバルサルタン（ｖａｌｓａｒｔａｎ））；ナプロキセン（鎮痛剤）；フェニトイン（抗痙攣剤、抗癲癇剤）；スルファメトキサゾール、タモキシフェン（抗新生物剤）；トルセミド（ｔｏｒｓｅｍｉｄｅ）；ワルファリン
（ＣＹＰ２Ｃ１９：）
・以下を含む誘導剤：リファンピン、セコバルビタール
・以下を含む基質：ヘキソバルビタール、メフォバルビタール、イミプラミン、クロミプラミン、シタロプラム、シクログアニル、抗痙攣剤フェニトインおよびジアゼパム、Ｓ−メフェニトイン、ジフェニルヒダントイン、ランソプラゾール、パントプラゾール（ｐａｎｔｐｒａｚｏｌｅ）、オメプラゾール、ペンタミジン、プロプラノロール、シクロホスファミド、プロゲステロン
（ＣＹＰ２Ｄ６：）
・以下を含む誘導剤：デキサメタゾン、リファンピン
・以下を含む基質：抗うつ剤（イミプラミン、クロミプラミン、デシンプラミン（ｄｅｓｉｍｐｒａｍｉｎｅ）、抗精神病剤（ハロペリドール、パーフェナジン、リスペリドン（ｒｉｓｐｅｒｄｏｎｅ）、チオリダジン）、βブロッカー（カルベディロール、Ｓ−メトプロロール、プロパフェノン、チモロール）、アンフェタミン、コデイン、デキストロメトルファン、フルオキセチン、Ｓ−メキシレチン（ｍｅｘｉｌｌｅｔｉｎｅ）、フェナセチン、プロプラノロール
（ＣＹＰ２Ｅ１：）
・以下を含む誘導剤：エタノール、アセトン、イソニアジド、ジメチルスルホキシド、ピラゾール
・以下を含む基質：アセトアミノフェン、クロルゾキサゾン（筋弛緩剤）、エタノール；カフェイン、テオフィリン；ダプソン、一般的麻酔剤（例えば、エンフルラン、ハロタンおよびメトキシフルラン）；ニトロサミン
（ｐ４５０ファミリー３（ＣＹＰ３））
（ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２：）
ラットのＣＹＰ３Ａサブファミリー；それぞれ、ヒトＣＹＰ３Ａ３およびＣＹＰ３Ａ４に対して、約９０％同一であり、そして機能的に等価である（以下）
（ＣＹＰ３Ａ４：）
・以下を含む誘導剤：カルバマゼピン、フェノバルビタール、フェニトイン、デキサメタゾンおよび他のグルココルチコイド；バルビツレート、種々のステロイド、抗生物質（例えば、リファンピン、リファブチン、エリスロマイシン）；フェニルブタゾン、スルファジミジン、スルフィンピラゾン、トロレアンドマイシン
・以下を含む基質：ＨＩＶプロテアーゼインヒビター（例えば、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、およびサキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ））；ベンゾジアゼピン（例えば、アルプラゾラム、ジアゼパム、ミダゾラムおよびトリアゾラム）；免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｏ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（例えば、シクロスポリン）；抗ヒスタミン剤（例えば、アステミゾールおよびクロルフェニラミン）；ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素インヒビター（例えば、アトロバスタチン（ａｔｏｒｂａｓｔａｔｉｎ）、セルビバスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、ロバスタチンおよびシンバスタチン）；チャネルブロッカー（例えば、ジルチアゼム、フェロジピン、ニフェジピン、ニソルジピン、ニトレンジピンおよびベラパミル）；抗生物質（例えば、クラリスロマイシン、エリスロマイシンおよびラパマイシン）；種々のステロイド（コルチゾール、テストステロン、プロゲステロン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、ヒドロコルチゾン、プレドニゾンおよびプレドニゾロンを含む）；アセトアミノフェン、アルドリン、アルフェンタニル、アミオダロン、アステミゾール、ベンズフェタミン、ブデソニド、カルバマゼピン、シクロホスファミド、イホスファミド、ダプソン、ジギトキシン、キニジン（抗不整脈剤）、エトポシド、フルタミド、イミプラミン、ランソプラゾール、リドカイン、ロサルタン、オメプラゾール、レチノイン酸、ＦＫ５０６（タクロリムス）、タモキシフェン、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、テルフェナジン、ブスピロン、ハロペリドール（抗精神病剤）、メタドン、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、トラゾドン、テオフィリン、トレミフィン（ｔｒｅｍｉｆｉｎｅ）、トロレアンドマイシン、ワルファリン、ザトセトロン（ｚａｔｏｓｅｔｒｏｎ）、ゾニサミド。
【００６５】
ＣＹＰ３Ａファミリーの酵素は、ヒト肝臓において最も豊富なＣＹＰ酵素である。ＣＹＰ３Ａ４は、分子量５７ｋＤａを有する５０２アミノ酸のタンパク質であり、そしてまた、ニフェジピンオキシダーゼ、ＮＦ−２５、Ｐ４５０−ＰＣＮ１またはポリペプチド４といわれる。これは、全ての薬物の全ての公知のもののうち、半分より多くの酵素の中で、少なくとも一部は代謝に寄与することから、中でも最も重要な酵素である。ＣＹＰ３Ａ４をこのような多能な酵素にしている、ＣＹＰ３Ａ４によって触媒される反応としては、Ｏ−脱メチル化、酸化的脱アミノ化、Ｎ−ヒドキシル化、脂肪族酸化およびＮ−脱アルキル化が挙げられる。
【００６６】
（ｐ４５０ファミリー６（ＣＹＰ６））
（ＣＹＰ６Ａ１：）
・以下を含む誘導剤：クロフィブレート（ｃｈｌｏｆｉｂｒａｔｅ）
・以下を含む基質：脂肪酸。
【００６７】
（Ｄ．ｐ４５０酵素によって代謝される例示的薬物）
（アセトアミノフェン：）エタノールは、ＣＹＰ２Ｅ１をアップレギュレートし、この酵素は、アセトアミノフェンを活性なキノンに代謝する（図２）。この反応性キノン中間体は、十分な量で生成される場合、肝臓損傷および壊死を引き起こす。ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子に対するオリゴマーアンチセンスは、酵素の合成を減少させ、そして毒性の中間体の生成を減少させる。毒性経路を介した流れを減少させることは、代替の、より所望の代謝経路が補償することを可能にする。
【００６８】
（鎮静剤：）鎮静剤フェノバルビタール（ＰＢ）は、いくつかのｐ４５０遺伝子（ＣＹＰ２ＢおよびＣＹＰ３Ａのサブファミリーの遺伝子を含む）をアップレギュレートする。これらの酵素のアップレギュレーションは、代謝を増大し、そしてＰＢおよび関連の鎮静剤ヘキソバルビタールの鎮静効果を減少させる。実施例１は、ＣＹＰ２Ｂ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、酵素の合成を減少させ、そしてＨＢの代謝を増大し、同等の鎮静効果のために投与されるＨＢの量がより低くなることを可能にすることを実証する。このようなオリゴマーはまた、誘導剤フェノバルビタールの存在下でＨＢの有効性を増大した。実施例３は、ＣＹＰ３Ａに対するアンチセンスの、ミダゾラム（ＭＺ）の効力に対する類似の影響を実証する。
【００６９】
（抗生物質：）抗生物質リファンピシン、リファンピン、リファブチン、エリスロマイシン、および関連の化合物は、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の誘導剤であり、酵素産物の基質である。ＣＹＰ３Ａ遺伝子に対するオリゴマーアンチセンスは、血清の半減期を増大し、従って、抗生物質の効果を増大する。
【００７０】
（経口避妊剤／エストロゲン置換療法：）エストロゲンおよびエストラジオールは、経口避妊剤中の、および閉経後の女性のためのホルモン置換療法における活性成分である。リファンピシンもしくはエリスロマイシンのような抗生物質、またはデキサメタゾンのようなグルココルチコイドを摂取し、そして喫煙する女性はまた、アップレギュレートされたＣＹＰ３Ａ４および／またはＣＹＰ１Ａ２酵素によって、これらの化合物の代謝が増大したことに起因して、エストロゲン／エストラジオール処置の効果を減少させる危険性がある。このような状況におけるＣＹＰ３Ａ４および／またはＣＹＰ１Ａ２遺伝子に対するオリゴマーアンチセンスの投与は、これらの酵素のアップレギュレーションをブロックし、そして経口避妊剤を摂取する女性の妊娠の危険性、またはエストロゲン置換療法を受ける女性における骨粗鬆症の危険性を減少させる。
【００７１】
（プロテアーゼインヒビター：）最近、ＨＩＶの処置における使用のために示される全てのプロテアーゼインヒビターおよび非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターは、ｐ４５０酵素の基質である；詳細には、これらは、ＣＹＰ２Ｄ６酵素の潜在的な関与を伴って（Ｋｕｍａｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２２７（１）：４２３−３１、１９９６）、ＣＹＰ３Ａ４酵素によって代謝される（例えば、Ｓａｈａｉ、ＡＩＤＳ  １０  補遺１：Ｓ２１−５、１９９６を参照のこと）。プロテアーゼインヒビターは、ＣＹＰ３Ａ４のインヒビターであることが報告されているが、いくつかの非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（例えば、ネビラピンおよびエファビレンツ）は、ＣＹＰ３Ａ４の誘導剤である（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｒｕｇｓ  ５／９：１１８３−９９、１９９６を参照のこと）。ＨＩＶ感染の処置のための多剤治療の使用が増加していることを考慮すると、干渉の可能性が高い。ＣＹＰ３Ａ４および／またはＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に対するオリゴマーアンチセンスの補足的投与は、これらの酵素のアップレギュレーションをブロックし得、従って、プロテアーゼインヒビターの代謝を減少させ、低用量および時々の重篤な副作用の減少を可能にする。
【００７２】
ＴａｘｏｌＴＭ（パクリタキセル）は、広範な種々のヒトおよびげっ歯類の両方の腫瘍細胞株（白血病、非小細胞肺癌種、小細胞肺癌腫、結腸癌腫、ＣＮＳ癌腫、黒色腫、腎癌腫、卵巣癌腫および乳房癌腫を含む）に対して、インビトロで細胞傷害性活性を示す。これは、卵巣または乳房の転移性癌腫のための、いくつかの公知の有効な処置のうちの１つである。タキサンおよびタキソイドは、微小管の重合を促進することによって（そして脱重合を阻害することによって）、細胞機能に有害な程度に、その抗癌性効果を発現すると考えられ、細胞複製を阻害し、そして最終的に細胞死を導く。パクリタキセルは、ヒトにおいて、ＣＹＰ３Ａ４によって代謝される。以下の実施例７に示すように、この酵素を標的化するアンチセンスＰＭＯの共投与は、薬物の細胞傷害性効果を増大した。
【００７３】
（Ｅ．個体間の変動）
個体間の大きな変動は、肝臓および小腸における、酵素含量および酵素活性の両方において報告されている。例えば、肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４の特異的含量（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）は、２０倍変化することが報告されているが、酵素活性は、エリスロマイシン呼吸試験によって決定されるように、１０倍変化することが報告されている（Ｓｈｉｍａｄａら、１９９４）。小腸のＣＹＰ３Ａ４含量は、１０〜４９倍変化することが報告されている（Ｌｏｗｎら、１９９４；Ｐａｉｎｅら、１９９７；Ｚｈａｎｇら、１９９９）。続いて、ＣＹＰ３Ａ４活性におけるこれらの変動は、種々の薬物の治療的効力および性質における個体間の変動を担うようである。ＣＹＰ３Ａ４活性に影響する因子としては、遺伝的多型、生理的状態、環境（外因性）因子および病理学的状態が挙げられる。これらの因子は、ＣＹＰ３Ａ４活性（これは、広範な種々の薬物の治療的効果に影響し得る）における大きな個体間の変動を引き起こす。
【００７４】
最近の医療行為は、標準的な用量の薬物で患者を処置することを優先的に含み、代謝における個体間の差異について調節されないままである。これらの差異は、最適以下の薬物応答、完全な処置の失敗または有害な薬物反応を生じ得る。確立された薬物と組み合わせた、Ｐ４５０酵素、特にＣＹＰ３Ａ４の阻害に対するアンチセンスアプローチは、狭い範囲の個体間の変動、従って、治療に対するより断言できる応答を生成するために使用され得る。
【００７５】
（ＩＶ．アンチセンスオリゴマーの設計および調製）
（Ａ．標的配列の選択）
前記の節に概説された考慮に従って選択された遺伝子由来の標的配列（ゲノム配列、プレ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ配列を含む）は、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースからか、または当業者に容易に利用可能な他の公開供給源から入手され得る。上記のように、多くのラットおよびヒトのｐ４５０遺伝子についての配列は公知であり、そしてＧｅｎＢａｎｋのような供給源ならびにＧｏｎｚａｌｅｓ  １９８９、Ｂｌａｃｋら  １９８７、およびＮｅｌｓｏｎら  １９９３（上記で引用）のような総説論文を介して当業者に利用可能である。例えば、Ｎｅｌｓｏｎらは、１９９２年１２月の時点でＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔおよびＮＢＲＦ−ＰＩＲデータベースにおいて利用可能であったｐ４５０遺伝子の全てのデータベース登録番号を列挙している。ヒトｐ４５０配列についての登録番号としては、以下のファミリー由来のものが挙げられる：ＣＹＰ−１Ａ１、１Ａ２、２Ａ６、２Ａ７、２Ｂ６、２Ｂ７Ｐ、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１０、２Ｃ１７、２Ｃ１８、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｄ７Ｐ、２Ｄ８Ｐ、２Ｅ１、２Ｆ１、３Ａ３、３Ａ４、３Ａ５、３Ａ７、４Ａ９、４Ａ１１、４Ｂ１、４Ｆ２、４Ｆ３、５、７、１１Ａ１、１１Ｂ１、１７、１９、２１Ａ１Ｐ、２１Ａ２および２７。１９９３年の論文の公開以降、他のヒト配列（例えば、ＣＹＰ−１Ｂ１およびＣＹＰ−２Ｂ１の配列）がまた、ＧｅｎＢａｎｋにおいて利用可能になっている。
【００７６】
（Ｂ．アンチセンスオリゴマーの長さおよび相補性）
良好な特異性を伴う、安定で効果的な結合を可能にするアンチセンスオリゴマーの適切な長さは、一般に約１０〜４０ヌクレオチド塩基単位であり、そして好ましくは約１５〜２５塩基単位である。アンチセンスオリゴマーは、標的配列の所望の領域に対して１００％相補的であり得るか、またはアンチセンスオリゴマーは、例えば、オリゴマーと標的ＲＮＡとの間で形成される二重鎖が、細胞において翻訳をブロックまたは阻害するために十分に安定である限り、コード配列改変体（例えば、多型）を受け入れるようにミスマッチを含み得る。ミスマッチは、存在する場合には、中央部分よりもハイブリッド二重鎖の末端領域に向かって不安定性が低くなる。許容されるミスマッチの数は、二重鎖の安定性の十分に理解されている原理に従って、オリゴマーの長さ、この二重鎖の中のＧ：Ｃ塩基対の割合、およびこの二重鎖の中のミスマッチ（単数または複数）の位置に依存する。好ましくは、このオリゴマー／標的配列のＴｍは、少なくとも３７℃、より好ましくは少なくとも５０℃、そして最も好ましくは少なくとも６０℃、８０℃またはそれより高い。標的塩基との塩基対形成を変性させるオリゴマー塩基はまた、標的との塩基対特異性が維持されると仮定して、意図される。
【００７７】
（Ｃ．ｐ４５０を標的化する、例示的アンチセンスオリゴマー）
例示的なオリゴマー配列を、以下のガイドラインに従って設計し得る：
１．（ａ）このオリゴマーの中央付近もしくは３’末端付近に位置する開始コドンのＣＡＵ相補体を有する、示された遺伝子（５’から３’の方向で発現される）のＡＵＧ開始コドンにわたるか、または（ｂ）スプライシングされていないプレ−ｍＲＮＡ配列のイントロン−エキソン（スプライスドナー）境界、もしくはより好ましくはエキソン−イントロン（スプライスアクセプター）境界にわたるかのいずれかである各オリゴマー；
２．約１７〜２５塩基の長さを有する；そして
３．好ましくは、５’末端で、二重鎖に安定性を与えるＧ（グアニン）塩基で、終結する。
【００７８】
表２に示される塩基配列を有する例示的なアンチセンスオリゴマーは、翻訳および／またはスプライシングのｐ４５０  ＲＮＡ特異的な阻害のために設計される。ＧｅｎＢａｎｋの配列番号付けに従って番号付けられた、オリゴマーにハイブリダイズする標的配列中の塩基の位置は、表の右側に示される。慣習によって、このアンチセンス配列の方向は、５’から３’の方向で示される。標的遺伝子配列におけるハイブリッド二重鎖は、５’から３’の方向で示され（慣習によって）、ハイブリッドしたアンチセンスオリゴマー配列の方向は、逆；すなわち、３’から５’の方向で示される。この表はまた、各例示的オリゴマー配列の配列同定番号（配列番号）を特定する。本発明の方法の実行における使用のための好ましいアンチセンスオリゴマーは、配列番号１６〜１７、１９、２５、２７、３０、３４〜３５および４６〜４７によって特定されるものであり、これはそれぞれ、ラットのＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ２、ならびにヒトのＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来の標的ＲＮＡの翻訳および／またはスプライシングを阻害するためのものである。
【００７９】
【表５】
2004523465.tif 000007
（Ｅ．アンチセンスオリゴマーの有効性の試験）
標的遺伝子の発現を阻害することにおける所定のアンチセンスオリゴマー分子の有効性は、当該分野で公知のスクリーニング方法により決定され得る。
【００８０】
（Ｅ１．インビトロスクリーニング方法：）候補アンチセンスオリゴマーを、例えば、肝細胞培養物中において、インビトロで試験して、薬物または他の誘導剤の存在下または非存在下で標的ＲＮＡによって生成されるタンパク質に対するこのオリゴマーの効果を定量し得る。例えば、以下の実施例２および４を参照のこと。ＲＮＡ定量方法は、当該分野で公知であり、そしてノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む。タンパク質産物は、標的酵素に特異的な抗体を用いるウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって、評価され得る。あるいは、またはさらに、タンパク質発現は、標的酵素に特異的なプローブ基質を使用して酵素的に評価され得る。例えば、基質は、種々のｐ４５０アイソザイムと差示的に反応することが公知である（Ｍ．Ｂｕｒｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４（１８）：３３３７−４５（１９８５）；Ｇｏｎｚａｌｅｚ、１９８９（上記で引用））。
【００８１】
候補オリゴマーはまた、周知の方法に従って、急性および慢性の細胞毒性（例えば、タンパク質全体およびＤＮＡ合成に対する効果）について、それぞれ、３Ｈ−ロイシンおよび３Ｈ−チミジンの取り込みを介して測定されるように評価される。
【００８２】
非標的配列に対するオリゴマー分子の非特異的結合が限定されることが、所望される。非特異的結合の効果を試験するために、センスまたは非センス配列のような制御配列、あるいはミスマッチした塩基を含む配列は、スクリーニング試験に含まれ得る。過剰な標的タンパク質またはｍＲＮＡをまた、細胞培養物に添加して、アンチセンスオリゴマーの効果が逆であるか否かを決定し得る。
【００８３】
（Ｅ２．インビボのスクリーニング方法：）アンチセンス組成物は、例えば、以下の実施例１、３および５に記載のような動物モデルにおいてインビボで試験され得る。薬物の効果はまた、ヘキソバルビタールによって誘導される睡眠時間において直接観察され得、そして／または酵素レベルは、当業者に公知のアッセイによって決定され得る。
【００８４】
上記のように、そして同時係属中かつ共有に係る米国出願番号６０／１１７，８４６において、標的ＲＮＡ配列とのＰＭＯアンチセンスオリゴマーの二重鎖は、ＰＭＯオリゴマーのインビボ投与後に体液サンプルにおいて検出されている。このような方法は、所定のオリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡ結合のインビボスクリーニングのために使用され得る。
【００８５】
（Ｖ．薬物動態および投与）
ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの薬物動態は、種々の内在性遺伝子のインビボの治療的処置のために好ましいことが示されている。今日、ラット、マウスおよびサルにおける研究は、血漿における２０時間より長い排泄半減期を明らかにしている。ほとんどの薬物代謝が生じる肝臓は、オリゴヌクレオチドの蓄積の臓器であることがまた示されている。例えば、動物被験体およびヒト患者に投与されるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの薬物動態の考察については、Ｐ．Ｉｖｅｒｓｅｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ＆Ｄｅｖ  ４：４３−５２（１９９４）およびＥ．Ｂａｙｅｖｅｒら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  ３：３８３−３９０（１９９３）を参照のこと。Ｂａｙｅｖｅｒらは、安全かつ好ましい薬物動態が、ヒトにおける潜在的な遺伝子特異的治療剤としてのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの調査をさらに支持することを結論付ける。
【００８６】
モルホリノオリゴヌクレオチドは、広く使用されるホスホロチオエートと比較して、標的配列の翻訳を阻害する際の、有意に改善された選択性を提供することが示されている。このモルホリノオリゴマーはまた、対応するホスホロチオエートよりもかなり低い濃度で翻訳を阻害し、そしてホスホロチオエートによってしばしば示される非アンチセンス活性の証拠をほとんど有さないかまたは有さないことが示されている。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７（２）：６３−７０（Ａｐｒ  １９９７）を参照のこと。モルホリノオリゴマーは非荷電性であることから、これらは、細胞膜を透過する点で、非常に有効である。このモルホリノオリゴマーはまた、高いヌクレアーゼ耐性および良好な水溶性を有し、このことが、これらをインビボの使用のための良好な候補にしている。
【００８７】
表３は、以下の表８に示すように、単回の０．１ｍｇ用量のＩＰ注射後のホスホロチオエート（ＰＳ）およびＰＭＯオリゴヌクレオチドの薬物動態および腎排泄特性を比較する。
【００８８】
（表３．単回用量（０．１ｍｇ）の血漿薬物動態）
【００８９】
【表６】
2004523465.tif 000008
アンチセンスオリゴマーの投与経路としては、種々の全身的経路（経口および非経口経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内および動脈内注射、ならびに吸入および経皮的送達を含む）が挙げられるががこれらに限定されない。いくつかの場合、特定の組織または部位への直接投与による、標的化された送達が好ましい。本発明は特に、経口および経皮的送達を意図する。
【００９０】
標準的な薬学的に受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、油／水乳濁物のような乳濁物、トリグリセリド乳濁物、湿潤剤、錠剤、およびカプセル剤が挙げられる。適切な生理学的に受容可能なキャリアの選択は、選択される投与の形態に依存して変化することが理解される。
【００９１】
アンチセンスモルホリノオリゴマーの送達のために有用な分子結合体は、米国特許第６，０３０，９４１号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、２０００）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載される。本発明のオリゴマーはまた、リポソームにカプセル化されて投与され得る。（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０（１２）：１９８０〜１９８９、１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２３：１１９、１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０巻、Ｎｏ．４、５４４〜５８４頁、１９９０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、第１４章、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」、Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２８７〜３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９を参照のこと）。活性成分は、その溶解性に依存して、水相および脂質層の両方に存在し得るか、または一般にリポソーム懸濁物と呼ばれるものの中に存在し得る。この脂質層は一般に、リン脂質（例えば、レシチンまたはスフィンゴミエリン）、ステロイド（例えば、コレステロール）、イオン性界面活性剤（例えば、ジアセチルホスフェート（ｄｉａｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ステアリルアミン（ｓｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ）もしくはホスファチジン酸）、および／または他の疎水性材料を含む。リポソームの直径は、一般的に、約１５ｎｍ〜約５ミクロンの範囲である。
【００９２】
本発明の方法の実施において、アンチセンスオリゴマーは、所望の用量および投与スケジュールで薬物と共に同時投与される。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、薬物の最初の投与の数時間から数日前に、最初に投与され、標的酵素レベルの減少を可能にする。経口投与のための好ましい用量は、オリゴヌクレオチド分子量を約７０００と仮定して、患者の体重１ｋｇ当たり、約１〜２ｍｇの間のオリゴマーである。従って、体重７０ｋｇの患者に対して、代表的な治療用量は、１日に一回、約７０ｍｇの投与であるが、必要な場合、より高い用量が投与され得る。
【００９３】
この用量は、（例えば、予防目的のために）毎日数回、毎日一回、またはそれ未満で投与され得る。治療の効力は、その代謝が改変されている薬物に従って確立された試験の前であり得る。代表的には、このオリゴヌクレオチドは、薬物の投与と同時期の期間にわたって、少なくとも一回毎日投与され、そして、例えば、薬物治療が中断される場合に、中断され得る。
【００９４】
（Ａ．経口投与）
アンチセンスＰＭＯの経口バイオアベイラビリティーを、以下の実施例５に記載のように、ラットＣＹＰ３Ａ２に対するＰＭＯアンチセンス（配列番号２５）を使用して、ラットにおいて実証した。このアンチセンスＰＭＯ（体重１ｋｇ当たり、２ｍｇ）を、経口強制飼育によってラットに投与し、そして臓器を２４時間後に回収した。肝臓ミクロソームサンプルのウェスタンブロット（図７、レーン４および５）は、この用量の２５％を使用して腹腔内で投与した得られたものよりも大きいＣＹＰ３Ａ２タンパク質の減少を示した。
【００９５】
（Ｂ．経皮的投与）
アンチセンスオリゴマーの経皮的送達は、局所的投与のために調節された薬学的に受容可能なキャリア、または経皮的パッチの使用によって達成され得る。このようなキャリアとしては、代表的に、水性溶媒またはアルコール溶媒、および１以上の経皮的浸透増強剤（これらの多くは、当業者に公知である）が挙げられる。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｋｉｎ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ、Ｋ．Ａ．ＷａｌｔｅｒｓおよびＪ．Ｈａｄｇｒａｆｔ編（Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３）；Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄ．Ｓ．Ｈｓｅｉｈ編（Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４）を参照のこと。例としては、ジオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびそれらのソルビタンエステル、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪酸アミド、脂肪酸エステル（例えば、モノオレイン酸グリセロール、モノリノレン酸グリセロール、イソステアリン酸イソプロピル、リノレン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ラウリル酸ソルビタンおよびオレイン酸ソルビタン）、トリメチレングリコール、脂肪アルコールエステル、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０、６０、８０および８５、シクロデキストリン、ニコチンエステル、アミノ酸、レシチン、テルペン（例えば、リモネンまたはメントール）、イオン性化合物（例えば、アスコルベート、脂肪アルキルアンモニウムハライド、リン酸モノアルキル、ヒアルロン酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸ナトリウム、およびデオキシコール酸ナトリウム、ジメチルスルフォキシドおよび関連の化合物、Ｎ−メチルピロリドンおよび関連の化合物、ならびにアゾン（ａｚｏｎｅ）および関連の化合物（例えば、Ｍｉｎａｓｋａｎｉａｎら、米国特許第４，８７９，２７５号を参照のこと）が挙げられる。
【００９６】
本発明に従うアンチセンスＰＭＯの経皮的投与は、ラットＣＹＰ３Ａ２の−３／＋１９領域を標的化するＰＭＯ（配列番号２５）を使用する以下の実施例６に記載される。使用されるビヒクルは、９５：５のプロピレングリコール／リノレン酸であった。肝臓Ｓ−９画分を、ＰＭＯレベルおよびＣＹＰ３Ａ酵素活性について分析し、後者は、７−ベンジルオキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリン（ＢＦＣ）から、７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリン（ＨＦＣ）への転換によって分析した。結果は、オリゴマーの経皮的送達、およびＣＹＰ３Ａに対するアンチセンスで処置された動物における酵素活性の実質的な減少を確認した（以下の表１１を参照のこと）。
【００９７】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を例示することを意図しており、限定することを意図しない。
【００９８】
アッセイ試薬は、ＧｅｎＴｅｓｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）（シトクロムｐ４５０試薬および抗体を供給している）から購入した。
【００９９】
（実施例１：ヘキソバルビタールを伴ってのラットＣＹＰ２Ｂ１に対するアンチセンスの同時投与）
（１Ａ．アンチセンスオリゴマー、ヘキソバルビタールおよび／または誘導試薬フェノバルビタールの同時投与）
ラットにおいてヘキソバルビタールの代謝を改善する目的で、アンチセンスオリゴヌクレオチドをシトクロムｐ４５０  ２Ｂ１（ラットＣＹＰ２Ｂ１）遺伝子配列に含まれる標的配列に対して相補的であるよう設計した。５つのホスホロチオエートオリゴマーを公知のラットＣＹＰ２Ｂ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００７１９）に従って合成した。
【０１００】
アンチセンスオリゴマーを表４に示す。オリゴ２Ｂ１−ＡＴＧ（配列番号１６）は、２２マーであり、ラットＣＹＰ２Ｂ１  ｍＲＮＡ上のＡＵＧ開始コドンを含む領域（配列番号３９、以下の表に示す）に１００％の相補性を有する。オリゴ２Ｂ１−ＮＲＭ（配列番号１７）は、塩基８５５で始まるＣＹＰ２Ｂ１  ｍＲＮＡに１００％の相補性を有する。オリゴ２Ｂ１−ＢＰＢ（配列番号３６）は、２つの塩基（２Ｂ１−ＮＲＭ配列中に太字で示す）を欠損した２Ｂ１−ＮＲＭの配列を有する。オリゴ２Ｂ１−３ＭＭ（配列番号３７）および２Ｂ１−ＣＭＭ（配列番号３８）の各々は、ＢＰＢ配列と比較して逆向きになった２塩基（太字で示す）を有する。これらの最後の３オリゴは、ＧｅｎＢａｎｋ中の全ての配列と比較され、このデータベース中に挙げられるいずれの配列にも相同性を示さなかった。この表は、各配列の融解温度（Ｔｍ）、分子量およびＣＹＰ２Ｂ１  ｍＲＮＡに対する相同性（％）を示す。
【０１０１】
【表７】
2004523465.tif 000009
全ての研究について、体重２１０〜２９０ｇの間の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｓａｓｃｏ，Ｏｍａｈａ）を用いた。これらを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＡＡＡＬＡＣに認可された動物供給施設における動物舎（ａｎｉｍａｌ  ｑｕａｒｔｅｒ）において飼育した。動物を１２時間の明暗のサイクルに曝し、Ｐｕｒｉｎａラット固形飼料および水道水を適宜与えた。
【０１０２】
ラットに、所定のＯＤＮ（表３を参照）を１日１回で２日間、１回の注射あたり１ｍｇ／ｋｇ体重の量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。コントロールラットには、生理食塩水のみ注射した。「ＰＢ］群中のラットに、フェノバルビタール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を１回の注射につき８０ｍｇ／ｋｇ体重で、１日１回で２日間、腹腔内注射した。ＯＤＮと共にＰＢを同時投与した群において、注射は同時に与えた。全ての群において注射の総容量は、０．１ｍｌ／ｍｇ体重であった。「２Ｂ１−ＮＲＭ＋ＰＢ＋前処理」群中の動物にもまた、２Ｂ１−ＮＲＭ＋ＰＢの最初の投与の２４時間前に、２Ｂ１−ＮＲＭオリゴマー（配列番号１７）の１ｍｇ／ｋｇの用量を与えた。
【０１０３】
最初（前処理なし）のＯＤＮおよび／またはＰＢの注射の４８時間後で、毎日新しく調製した１００ｍｇ／ｋｇ体重のヘキソバルビタール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を総容量１ｍｌ／ｋｇ体重で、ラットに腹腔内注射した。睡眠時間（ラットが仰向けになっているときから正向反射が回復するときまでの時間で規定される）を測定した。睡眠時間を群中の各動物の平均±標準偏差として表５に提供する。
【０１０４】
種々の群の処理を、以下のように要約する：
１．生理食塩水のみを注射
２．１日あたり８０ｍｇ／ｋｇのＰＢを２日間注射
３．１日あたり１ｍｇの２Ｂ１−ＮＲＭを２日間注射
４．１日あたり１ｍｇのＯＤＮ  ２Ｂ１−ＮＲＭおよび８０ｍｇ／ｋｇのＰＢを同時に２日間注射
５．２Ｂ１−ＮＲＭ＋ＰＢ注射の開始前に、１ｍｇの２Ｂ１−ＮＲＭを１日間注射したこと以外は、４と同じ
６．１日あたり１ｍｇのＯＤＮ  ２Ｂ１−ＡＴＧを２日間注射
７．１日あたり１ｍｇのＯＤＮ  ２Ｂ１−ＡＴＧおよび８０ｍｇ／ｋｇのＰＢを同時に２日間注射
８．１日あたり１ｍｇのＯＤＮ  ２Ｂ１−ＢＰＤを２日間注射
９．１日あたり１ｍｇのＯＤＮ  ２Ｂ１−３ＭＭを２日間注射
１０．１日あたり１ｍｇのＯＤＮ  ２Ｂ１−ＣＭＭを２日間注射
（表５：ヘキソバルビタール睡眠時間）
【０１０５】
【表８】
2004523465.tif 000010
ａ  コントロールと有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
ｂ  フェノバルビタールを処理した群と有意に異なる（ｐ＜０．０３）。
ｃ  コントロール（ｐ＜０．００１）、２Ｂ１−３ＭＭ（ｐ＜０．００１）および２Ｂ１−ＣＭＭ（ｐ＜０．００１）と有意に異なる。
【０１０６】
コントロールラット（２日間の処理レジメンの間生理食塩水のみを注射した）は、約２３分間の睡眠時間を有した。ＰＢ処理したラットは、約１１．４分間の睡眠時間を示した（予想どおりのコントロールラットに対して睡眠時間の有意な減少）。ＰＢが、ＣＹＰ２Ｂ１遺伝子発現を刺激するので、ヘキソバルビタール（ＣＹＰ２Ｂ１によってヒドロキシル化された）は、ＰＢ処理したラットにおいてさらに迅速に代謝され、そしてヘキソバルビタールの鎮静効果は、減少した。
【０１０７】
単独で投与した場合、オリゴマー２Ｂ１−ＮＲＭ（配列番号１７（群３））は、コントロールと比べて睡眠時間に影響を与えなかった。これは、ラットのおけるＣＹＰ２Ｂ１の発現の低い構成的な（すなわち、誘導されない）レベルに起因し得た。
【０１０８】
一緒に投与されたオリゴマー２Ｂ１−ＮＲＭおよびＰＢ（群４）は、目に付くアンチセンス効果を有しなかった。遺伝子発現のＰＢ誘導が、迅速であり（３０〜６０分間）（ＷａｘｍａｎおよびＡｚａｒｏｆｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８１（３）：５７７〜９２，１９９２）そして肝臓におけるＯＤＮ蓄積は、ゆっくりであった（約１２時間（本発明者らによる関連する研究によって示される））ので、一群のラットを、ＰＢ＋２Ｂ１−ＮＲＭの同時注射の前に１日間２Ｂ１−ＮＲＭで前処理した（群５）。しかし、得られた睡眠時間は、前処理なしと本質的に同じであった。
【０１０９】
オリゴマー２Ｂ１−ＡＴＧ（配列番号１６）単独（群６）は、これもまたおそらくＣＹＰ２Ｂ１の低い構成的な発現して、コントロールに対して睡眠時間を有意に変化しなかった。しかし、２Ｂ１−ＡＴＧおよびＰＢを同時に投与した場合（群７）、睡眠時間は、ＰＢ群に対して有意に増大した。従って、オリゴマー２Ｂ１−ＡＴＧは、ＰＢ誘導されたＣＹＰ２Ｂ１発現に対して強力なインビボアンチセンス効果を示した。
【０１１０】
オリゴマー２Ｂ１−３ＭＭ単独（配列番号３７）は、コントロールに対して睡眠時間をわずかに延長した。オリゴマー２Ｂ１−ＢＰＤ（配列番号３６）は、コントローから睡眠時間をわずかに減少した。これは、ＨＢ代謝の異常な増大を示唆する。オリゴマー２Ｂ１−ＣＭＭ（配列番号３８）は、コントロールに対してＨＢ睡眠時間を有意に変えなかった。
【０１１１】
（１Ｂ．ミクロソームの調製）
酵素レベルおよび活性の決定のために、ミクロソームを、ＦｒａｎｋｌｉｎおよびＥｓｔａｂｒｏｏｋ（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４３：３１８〜２９，１９７１）に記載されるように調製した。ラットを、エチルエーテルを使用して屠殺し、そして肝臓を、門脈を介して１２ｍｌの４％生理食塩水で灌流し、そして動物から摘出した。この肝臓を、細かく刻み、０．２５Ｍのスクロース（Ｓｉｇｍａ）中でホモジナイズし、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２Ｂ遠心機（Ｄｕｐｏｎｔ）で４℃、８０００×Ｇで２０分間遠心分離した。上清を取り、０．２５Ｍのスクロースで再懸濁し、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＯＴＤ５５Ｂ超遠心機（Ｄｕｐｏｎｔ）で４℃、１００，０００×Ｇで４５分間遠心分離した。ペレットを、１．１５％のＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）で再懸濁し、そして４℃、１００，０００×Ｇで１時間遠心分離した。最後のペレットを、等量の緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のグリセロール；Ｓｉｇｍａ）で再懸濁し、そして−８０℃で凍結した。
【０１１２】
（１Ｃ．タンパク質濃度の決定）
タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２：２８４〜５４，１９７６）によって決定した。上記のように調製された、ホモジネートの８０μｌアリコートを、９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）に添加した。次いで、２０μｌのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を、添加し、そしてプレートを、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｎｅｗｐｏｒｔ  ＭＮ）で５９５ｎｍにおいて読み取った。データを、既知の濃度のウシ血清アルムミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて作製した検量線と比較した。
【０１１３】
（１Ｄ．酵素活性の決定：ＰＲＯＤアッセイ）
ＣＹＰ２Ｂ１酵素活性を、ペントキシレソルフィン（ｐｅｎｔｏｘｙｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）Ｏ−脱アルキル化（ＰＲＯＤ）活性（Ｂｕｒｋｅら，１９８５）によって決定した。各ミクロソームサンプルに関して、１ｍｇのタンパク質を含む１ｍｌの０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液、１ｍｌの２μＭ  ５−ペントキシレソルフィン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）および１７μｌの６０ｍＭのＮＡＤＰＨを混合し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、混合物を、２ｍｌのキュベットに添加し、そして５３０ｎｍの励起波長および５８５ｎｍの放射波長を使用して、ＲＦ５０００Ｕ  分光蛍光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）によって読み取った。濃度を、レソルフィン標準物（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の検量線から計算した。結果は、ｎｍｏｌ  レソルフィン／ｍｇ  タンパク質／分と記録した。
【０１１４】
コントロールラット由来のミクロソームの活性は、１３．８±１０．１ｎｍｏｌ  レソルフィン／ｍｇ  タンパク質／分であった。ＰＢ群から単離されたミクロソームの全ては、約５０〜１１５ｎｍｏｌ  レソルフィン／ｍｇ  タンパク質／分の範囲で、ＰＲＯＤ活性を有意に増大した。２Ｂ１−ＮＲＭ、２Ｂ１−ＡＴＧ、２Ｂ１−３ＭＭおよび２Ｂ１−ＣＭＭ（それぞれ、配列番号１７、１６、３７および３８）処理したラット由来のミクロソームは、コントロールに対して変化を示さなかった。コントロールと有意に異ならないが、２Ｂ１−ＢＰＤ（配列番号３６）は、活性において少しの増大を示した。（これらの結果を解釈した場合、ペントキシレソルフィンＯ−脱アルキル化（ＰＲＯＤ）アッセイは、ＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２の両方を測定することに留意するべきである）。
【０１１５】
（１Ｅ．ＥＬＩＳＡアッセイ）
ＣＹＰ２Ｂ１タンパク質の直接測定を、ＣＹＰ２Ｂ１タンパク質に対する抗体を使用する、ＥＬＩＳＡアッセイによって実施した（ＳｃｈｕｕｒｓおよびＶａｎ  Ｗｅｅｍａｎ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ８１（１）：１〜４０，１９７７）。１ウェルあたり５０μｇのミクロソームタンパク質を、９６ウェルのｎｕｎｃ−ｉｍｍｎｕｏプレート（ＩｎｔｅｒＭｅｄ，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）における１００μｌの０．３５％の炭酸水素ナトリウム緩衝液中に一晩プレートした。このミクロソームを、１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で３回洗浄し、そして２００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡを、除去し、そして５０μｌのＣＹＰ２Ｂ１抗体（Ｏｘｙｇｅｎｅ，Ｄａｌｌａｓ）を、添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。このミクロソームを、生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ）で５回洗浄し、そして５０μｌの西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合化二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。このミクロソームを、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ）で５回洗浄し、そして８５％の生理食塩水で２回洗浄した。ＨＲＰ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（１００μｌ）を添加し、そして４０５ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において連続的に１時間読み取った。結果を、ｍＯＤ／分におけるＨＲＰ活性として記録した。
【０１１６】
結果を、図３において図解して示す。種々の群に関する平均ＨＲＰ活性およびｎ値を、表６に示す。
【０１１７】
（表６）
【０１１８】
【表９】
2004523465.tif 000011
予想どおり、ＰＢ単独で処理されたミクロソームのＨＲＰ活性は、ＰＢによるＣＹＰ２Ｂ１遺伝子の発現の誘導に起因して、コントロールラット由来のミクロソームの活性よりも有意に大きかった。オリゴマー２Ｂ１−ＮＲＭ、２Ｂ１−ＡＴＧ、２Ｂ１−３ＭＭおよび２Ｂ１−ＣＭＭ（それぞれ、配列番号１７、１６、３７および３８）処理したラット由来のミクロソームは、コントロールミクロソームのＨＲＰ活性に対して変化を示さなかった。
【０１１９】
２Ｂ１−ＮＲＭ＋ＰＢ群および２Ｂ１−ＮＲＭ＋ＰＢ＋前処理群におけるラット由来のミクロソームは、ＰＢ−単独処理群のＨＰＲ活性に対してＨＲＰ活性の減少を示した。これは、ミクロソーム分画に存在するＰＢ誘導されたＣＹＰ２Ｂ１の量に対する２Ｂ１−ＮＲＭオリゴマーの阻害効果を示す。
【０１２０】
２Ｂ１−ＡＴＧ＋ＰＢ処理群におけるラット由来のミクロソームは、ＰＢ単独群に対してＨＲＰ活性の有意な減少を示した。これは、２Ｂ１−ＡＴＧオリゴマーが、このラット処理群において観察された有意な睡眠時間の増大に一致して、ＣＹＰ２Ｂ１のＰＢ誘導性生成に対して有意な阻害効果を有することを示す。２Ｂ１−ＢＰＤ処理ラット由来のミクロソームは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてコントロールに対してＣＹＰ２Ｂ１の増大を示す。これは、２Ｂ１−ＢＰＤ処理したラットにおいて観察された異常な睡眠時間の減少に一致する。
【０１２１】
（１Ｆ．ＣＹＰ２Ｅ１誘導の決定）
ＰＢが、多くの異なるＣＹＰ（ＣＹＰ２Ｅ１を含む）を誘導することが公知なので、ミクロソームＰＮＰ（ｐ−ニトロフェノールヒドロキシナラーゼ）活性を、ＣＹＰ２Ｅ１の誘導の尺度として使用した。ＣＹＰ２Ｅ１活性を、ＲｅｉｎｋｅおよびＭｏｙｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．１３：５４８〜５２，１９８５；Ｋｏｏｐ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：３９９〜４０４，１９８６に記載されるようにＰＮＰ活性によって決定した。活性を、１分間あたりの１ミリグラムタンパク質あたりの光学密度（ＯＤ）として記録した。
【０１２２】
コントロールラット由来のミクロソームは、０．４９±０．０５  ＯＤ／ｍｇ
タンパク質／分のＰＮＰ活性を有した。ＰＢ（ＰＢ；２Ｂ１−ＮＲＭ＋ＰＢ；２Ｂ１−ＮＲＭ＋ＰＢ＋前処理；２Ｂ１−ＡＴＧ＆ＰＢ）で処理したラット群から単離したミクロソームの全ては、コントロールのＰＮＰ活性よりも有意な増大を示した。これは、ＰＢによるＣＹＰ２Ｅ１の誘導を実証する。各ＰＢ群が、およそ等価なＰＮＰ活性を示したので、ＯＤＮは、ＣＹＰ２Ｅ１のＰＢ誘導機構に干渉しないようであった。オリゴマー２Ｂ１−ＮＲＭ、２Ｂ１−ＡＴＧ、２Ｂ１−ＢＰＤ、２Ｂ１−３ＭＭおよび２Ｂ１−ＣＭＭ（それぞれ、配列番号１７、１６、３６、３７および３８）単独（ＰＢなし）で処理したラットから単離したミクロソームは、コントロール値とＰＮＰ活性において優位な差異を示さなかった。
【０１２３】
全データは、平均±標準偏差として報告した。この平均および標準偏差を、コンピュータープログラムＩｎＳｔａｔ２（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）によって決定した。ｐ値をまた、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  Ｔｅｓｔを使用してＩｎＳｔａｔ２によって計算した。
【０１２４】
（実施例２：ラットＣＹＰ２Ｅ１のアンチセンス阻害）
シトクロムｐ４５０アイソザイムに対する基質は、アイソザイム遺伝子発現を調節することによってそれら自体の代謝の速度を頻繁に制御する（Ｅｌｉａｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２２）；１５７６５〜９，１９９２）。シトクロムｐ４５０  ＩＩＥ１（ＣＹＰ２Ｅ１）上方制御は、増大した転写、ｍＲＮＡ安定化およびタンパク質の増大した安定性に起因する。ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子発現は、低分子量化合物（例えば、エタノール、アセトンおよびピラゾール）によって誘導される。
【０１２５】
表２に示された例示的なラットＣＹＰ２Ｅ１アンチセンス配列を、使用して、プレｍＲＮＡスプライシングおよびｍＲＮＡ翻訳のプロセスに重要な特異的な配列のアンチセンス標的化の有効性を評価した。
【０１２６】
オリゴヌクレオチド：ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、標準的な方法論（例えば、Ｇ．ＺｏｎおよびＷ．Ｊ．Ｓｔｅｃ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（編），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ），８７−１０８頁（１９９１）に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ａ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）の使用によって１μｍｏｌｅのスケールで合成した。オリゴヌクレオチドは、ラットシトクロムＣＹＰ２Ｅ１  ｍＲＮＡ配列およびプレｍＲＮＡ配列に対してアンチセンス配列を有した（Ｕｍｅｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７（２５）：９００６−１３，１９８８）；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ  ＲＡＴＣＹＰ４５Ｉ，登録番号Ｍ２０１３１）。
【０１２７】
抗２Ｅ１  ３０マー、５’−（ＧＧＴ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＣＡＴ）−３’（配列番号１８）は、１４０６位で始まるラットＣＹＰ２Ｅ１配列における領域に対するアンチセンスであり、そしてＡＴＧ転写開始部位の上流配列を含む。抗２Ｅ１  ２０マーの配列は以下の通りである：５’−（ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＣＣ）−３’（配列番号１９）、１５６０位で始まる領域に対するアンチセンスであり、そして、ＡＴＧ転写開始部位を標的化する；５’−  （ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＧＧ）−３’（配列番号２０）、１７２５位で始まる領域に対するアンチセンスを標的化し、そして、エキソン１のスプライスドナー；５’−（ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧ）−３’（配列番号２１）２６４５位で始まる領域に対するアンチセンスであり、そして、エキソン２のスプライスドナー；５’−（ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡ）−３’（配列番号２２）６６８１位で始まる領域に対するアンチセンスを標的化し、そして、エキソン４のスプライスドナー；５’−（ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＣＧＣ  ＴＴ  ＴＣＣ）−３’（配列番号２３）１１５９１位で始まる領域に対するアンチセンスを標的化し、そしてエキソン４のスプライスアクセプターを標的化する。コントロールの目的のために調製した２つの非センスオリゴヌクレオチドは、ラットゲノムにおける相同な配列を有さない、２７マー  ５’−（ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＣＣ）−３’（配列番号４１）、ＨＩＶ−のｒｅｖに対するアンチセンス（Ｍａｔｓｕｋｕｒａら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６（１１）：４２４４−８，１９８９）および２０マー  ５’−（ＴＣＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＡＧ）−３’（配列番号４２）を含む。
【０１２８】
細胞トランスフェクション：ラット肝癌細胞株（Ｈ４２Ｅ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から購入した。この細胞を、１０％の熱非働化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、ペニシリンＧ（１０，０００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１０％  ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を補充した、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）中で維持した。この細胞を、５ｍｌの培地を含む２５ｃｍ２フラスコあたり２×１０５細胞の密度で、３〜４日間の間隔で継代培養し、そして９５％空気、５％ＣＯ２の加湿された雰囲気下で３７℃でインキュベートした。
【０１２９】
Ｈ４２Ｅ細胞を、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを含む１００ｍｍの組織培養皿（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）にプレートし（１〜５日間の時点で２×１０６〜１．２５×１０５）、そして一晩接着させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（３．０μＭ）およびピラゾール（１６μＭ、Ｓｉｇａｍ）を、添加し、そして皿を、３７℃で１〜５日間インキュベートした。細胞を、２ｍｌの０．１ＭのＫ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）に回収し、そしてミクロソームにホモジナイズした。
【０１３０】
上記のような８個のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、使用して、ＣＹＰ２ＥＰ１酵素のピラゾール誘導合成を阻害する、種々のｍＲＮＡ標的領域の能力を試験した。上記のような、６個のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１８〜２３）は、ＣＹＰ２Ｅ１  ｍＲＮＡに沿って異なる領域に特異的であった。最後の２つの配列（ＭＭ３およびＢＵＤ（それぞれ、配列番号４１および４２））は、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子内に標的を有さない非センスオリゴヌクレオチドであった。
【０１３１】
調製されたミクロソーム中のＣＹＰ２Ｅ１酵素の相対的な濃度を、ＥＬＩＳＡの使用によって測定した。５０〜６．２５μｇ／ｍｌの各サンプルのミクロソーム希釈物を、９６ウェルイムノアッセイＮＵＮＣプレート（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）中のカップリング緩衝液（０．０６％の炭酸ナトリウム、０．２９％の炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６））にプレートした。プレートを、４℃で一晩インキュベートして、ウェルにタンパク質を接着させた。ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｍ２０ＴＭ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）／ＰＢＳで、１０回洗浄し、最後は、ＰＢＳのみで洗浄し、次いで、３％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳで２時間ブロッキングした。ウェルを、前のように洗浄した。１％のＢＳＡ／ＰＢＳで１：２００に希釈した、一次抗体（抗シトクロム  ｐ４５０  ２Ｅ１（Ｏｘｙｇｅｎｅ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ））を、添加し、そしてプレートを、１．５時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、そして１：２０００希釈の二次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ））を添加した。プレートを、２時間インキュベートし、そして洗浄した。１：１希釈のＡＢＴＳペルオキダーゼ基質およびペルオキダーゼ溶液Ｂ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、ウェルに添加した。プレートを、０．５００のＯＤｍａｘで３０秒ごと１時間４０５ｎｍで動力学的に読み取った（Ｐｒｕｓｌｉｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３７（１）：２７−３５，１９９１）。結果を、表７に示す。
【０１３２】
（表７：アンチセンスＣＹＰ２Ｅ１オリゴマーの特徴およびＣＹＰ２Ｅ１酵素レベルに対する効果）
【０１３３】
【表１０】
2004523465.tif 000012
オリゴヌクレオチドの幾つかは、ＣＹＰ２Ｅ１酵素のレベルの有意な減少を生じた。アンチセンスオリゴマー２Ｅ１−１５６０、２Ｅ１−１１５９１、２Ｅ１−１７２５および２Ｅ１−１４０６（それぞれ、配列番号１９、２３、２０および１８）は、それぞれ、コントロールの５２％、６３％、６６％および７６％まで酵素レベルを減少した。他のＣＹＰ２Ｅ１特異的なオリゴヌクレオチドおよび非センスオリゴヌクレオチドでの処理は、コントロールレベルと有意に異ならないＣＹＰ２Ｅ１レベルを生じた。
【０１３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド２Ｅ１−１５６０（配列番号１９）の用量の変化を、Ｈ４２Ｅ培養物中のＣＹＰ２Ｅ１酵素の阻害に関して調べた。この培養物は、０．３μＭから３μＭまでのオリゴヌクレオチド濃度の増加に対する阻害の増大を示した。ここで、酵素レベルは、コントロールの約４１％であった。このレベルを超えると、ＣＹＰ２Ｅ１タンパク質阻害は、横ばいになり、１０μＭのオリゴヌクレオチドにおいてさらなる阻害はほとんど示さなかった（図４）。
【０１３５】
（実施例３：ＰＳ（ホスホロチオネート）およびＰＭＯオリゴヌクレオチドによるラットＣＹＰ３Ａ２のアンチセンス阻害およびミダゾラム効力に対する効果）
シトクロムｐ４５０  ３Ａ２（ラットＣＹＰ３Ａ２）遺伝子配列内の標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ラットにおけるミダゾラム（ＭＺ）の効力を増大する目的で調製した。２つのホスホロチオエート（ＰＳ）および２つのＰＭＯオリゴマーを、公知のラットＣＹＰ３Ａ２配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０９７４２；表２を参照のこと）に従って、合成した。
【０１３６】
（表８．アンチセンスラットＣＹＰ３Ａ２オリゴヌクレオチド配列およびコントロール）
【０１３７】
【表１１】
2004523465.tif 000013
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、表８に示す。ＡＵＧ３Ａ２／ＰＭＯおよびＡＴＧ３Ａ２／ＰＳと命名されたオリゴは、配列番号２４と命名された配列を有し、これは、ＡＴＧ開始コドンを標的とする。（−３）ＡＴＧ３Ａ２／ＰＭＯ−Ｃ５Ｍ（配列番号２５、配列番号２４から３塩基シフト）において、幾つかのシチジン塩基は、表に示されるように、５’メチル化される。逆配列オリゴ（配列番号４３）およびｃ−ｍｙｃ配列（配列番号４４）を、コントロールとして使用した。
【０１３８】
２１０〜２９０グラムの間の重量の、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｓａｓｃｏ，Ｏｍａｈａ）を、全ての研究のために使用した。この動物を、１２時間明／暗サイクルに曝露し、そしてＰｕｒｉｎａラット飼料を与え、そし自由に水を飲ませた。
【０１３９】
ＭＺに関する用量応答曲線を、２０、５０または７０ｍｇ／ｋｇのＭＺをラット腹腔内に注射することによって決定し、そして睡眠時間を記録した（データは示さない）。睡眠時間は、ラットを、あおむけに位置してから、正向反射が回復するまでの時間として定義した。
【０１４０】
睡眠時間を、０時間（１日目）、２４時間（２日目）および４８時間（４日目）における５０ｍｇ／ｍｌのＭＺ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，  Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）の腹腔内注射後に測定した。注射の容積は、２．０〜２．４ｍｌ／ラットであった。全ての動物は、ＭＺの腹腔注射後２分以内の正向反射能力の消失を実証した。ラットが、０時間および２４時間において決定された正向反射が回復した後、この動物を、０．２５、０．５０または１．００ｍｇのアンチセンスＯＤＮ（腹腔内）で即座に処理した。コントロールラットは、生理食塩水のみを受けた。総注射容積は、生理食塩水中で０．１ｍｌであった。
【０１４１】
（ミクロソームの調製）
酵素レベルおよび活性の決定のために、ミクロソームを、ＦｒａｎｋｌｉｎおよびＥｓｔａｂｒｏｏｋ（上に引用される）に記載されるように調製した。ラットを、エチルエーテルを使用して屠殺し、そして肝臓を、門脈を介して１２ｍｌの４％生理食塩水で灌流し、そして動物から摘出した。この肝臓を、細かく刻み、０．２５Ｍのスクロース（Ｓｉｇｍａ）中でホモジナイズし、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２Ｂ遠心機（Ｄｕｐｏｎｔ）で４℃、８０００×Ｇで２０分間遠心分離した。上清を取り、０．２５Ｍのスクロースで再懸濁し、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＯＴＤ５５Ｂ遠心機（Ｄｕｐｏｎｔ）で４℃、１００，０００×Ｇで４５分間遠心分離した。ペレットを、１．１５％のＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）で再懸濁し、そして４℃、１００，０００×Ｇで１時間遠心分離した。最終のペレットを、等量の緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のグリセロール；Ｓｉｇｍａ）で再懸濁し、そして−８０℃で凍結した。
【０１４２】
（タンパク質濃度の決定）
タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２：２８４〜５４，１９７６）によって決定した。上記のように調製された、ホモジネートの８０μｌアリコートを、９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）に添加した。次いで、２０μｌのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を、添加し、そしてプレートを、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｎｅｗｐｏｒｔ  ＭＮ）で５９５ｎｍにおいて読み取った。データを、既知の濃度のウシ血清アルムミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて作製した検量線と比較した。
【０１４３】
（ＣＹＰ３Ａ２に関する肝臓ミクロソームアッセイ）
エリスロマイシン脱メチル化（ＥＤ）を、ＣＹＰ３Ａ２酵素活性の尺度として使用した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．４０：２４３−８７，１９８９）。活性を、１分間あたり１ミリグラムタンパク質あたりのマイクロモルのホルムアルデヒドとして記録した。
【０１４４】
（ＣＹＰ３Ａ２のウエスタンブロット）
ＣＹＰ３Ａ２のウエスタンブロット分析を、Ｔｒａｃｅｗｅｌｌら，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３５（２）：１７９−８４，１９９５によって記載される方法を使用して実行した。バンドの強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を備えるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって決定した。
【０１４５】
（統計分析）
全てのミクロソームのデータを、コンピュータープログラムＩｎＳｔａｔ２（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）によって決定されるような平均の平均標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として報告した。ｐ値をまた、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ複数比較検定を使用してＩｎＳｔａｔ２によって計算した。標準曲線およびグラフを、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して作製した。
【０１４６】
（結果：）
睡眠時間：表９は、種々の処理を受けた動物に関する睡眠時間（ＭＺ  ＳＴ）およびＥＤ活性（ＣＹＰ３Ａ２のためのマーカー）における変化を示す。開始コドン（配列番号２４および２５）を標的化する、ＰＭＯおよびＰＳオリゴの両方は、睡眠時間の増大を示し、これは、ＣＹＰ３Ａ２の阻害および結果としてのＭＺの代謝の阻害から生じた。しかし、ＰＭＯオリゴは、ＰＳオリゴの１０分の１の濃度で効果的であった。コントロールオリゴ（配列番号４３および４４）は、生理食塩水のみのコントロールに対してわずかか、または全く変化を示さなかった。
【０１４７】
ＥＤ活性：抗３Ａ２オリゴ（配列番号２４および２５）の全ては、ＥＤ活性をある程度減少し、５’−Ｃ−メチル改変したＰＭＯ（配列番号２５）改変していないオリゴよりも大きな活性を示す。コントロールオリゴを投与された動物における活性は、生理食塩水コントロールと有意に異ならなかった。
【０１４８】
（表９．ラットにおけるＭＺ睡眠時間およびＥＤ活性に対する抗ＣＹＰ３Ａ２オリゴヌクレオチドの効果）
【０１４９】
【表１２】
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全ての値は、平均±平均の標準誤差を示す。ＭＺ  ＳＴ−ミダゾラム睡眠時間、分；ＥＤ−エリスロマイシン脱メチル化活性（ＣＹＰ３Ａ２のためのインビトロマーカー）、μｍｏｌ  ＨＣＯＨ／ｍｇ／分。（ａ）生理食塩水、ｍｙｃおよびｒｅｖ群とは有意に異なる，ｐ＜０．０１。（ｂ）ｍｙｃおよび生理食塩水群とは有意に異なる、ｐ＜０．０５。
【０１５０】
（実施例４：トランスフェクトされた細胞におけるヒトＣＹＰ３Ａ４のアンチセンス阻害）
Ｖ７９細胞を、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子を用いて安定にトランスフェクトした。ヒトＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡ（配列番号４６、４６および３５；表２を参照のこと）のＡＴＧコドンを標的化する、以下に示す配列を有する１０ｕＭのＰＭＯをすくい取って細胞に充填した（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｅｄ）。ＡＴＧラットＣＹＰ３Ａ２を標的化する配列（配列番号２５；Ｃ−メチル置換を有する）をまた、使用した。活性を、蛍光生成物７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリンへの７−ベンジルオキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリン変換を介してＳ−９分画中でアッセイした（ＣＹＰ３Ａ４特異的な反応）。結果を、表１０に示した
【０１５１】
【表１３】
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（表１０  ヒトＣＹＰ３Ａ４のアンチセンス阻害）
【０１５２】
【表１４】
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表に示すように、ヒトアンチセンス配列は、酵素活性を顕著に減少させた。抗ラットオリゴ（この場合、標的にされるヒト配列と約５５％のみの相同性を有する）は、酵素活性における減少を示さなかった。
【０１５３】
（実施例５：ＰＭＯアンチセンスオリゴマーの経口投与）
図７は、ラットＣＹＰ３Ａ２遺伝子に対してアンチセンスのホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）（配列番号２５、Ｃ−メチル修飾なし）を投与（腹腔内投与または経口投与）したラットから得られた肝ミクロソームサンプルのウエスタンブロットを示す。このブロットは、抗ラットＣＹＰ３Ａ２抗体で最初にプローブされた。抗体をはがした後、このブロットを、種々のレーンにおける総タンパク質ローディングについてのコントロールとしてのＮＡＤＰＨレダクターゼに対する抗体で再プローブした。
【０１５４】
各ラットは、約２００グラムの体重であり、器官を回収する２４時間前に以下で処置された：生理食塩水（腹腔内注射した）（レーン１）；１５ｎｍｏｌのＰＭＯ  １−０−３２８（腹腔内注射した）（レーン２および３）；６０ｎｍｏｌのＰＭＯ  １−０−３２８（経口投与した）（レーン４および５）。各レーンは、異なる試験動物に対応する。
【０１５５】
１５ｎｍｏｌ（およそ０．５ｍｇ／ｋｇ体重）のＰＭＯの腹腔内注射の２４時間後、生理食塩水を注射されたコントロールに比較してＣＹＰ３Ａ２タンパク質の顕著な減少は観察されなかった（レーン２〜３）；しかし他の実験において、これらの条件下で、ＣＹＰ３Ａ２酵素活性における軽度の減少が観察された。さらに、１５ｎｍｏｌのＰＭＯの第２の注射が第１の注射後２４時間で投与され、それから２４時間後に器官が回収された場合に、ＣＹＰ３Ａ２タンパク質レベルにおける顕著な減少が、ウエスタンブロットによって観察された（データは示していない）。
【０１５６】
アンチセンスＰＭＯの経口バイオアベイラビリティーの試験において、６０ｎｍｏｌのアンチセンスＰＭＯ（２ｍｇ／ｋｇ体重を４回、上記で使用された腹腔内用量）をラットに経口栄養補給法により投与し、器官を２４時間後に回収した。レーン４および５は、レーン２および３に比べて、ＣＹＰ３Ａ２タンパク質の顕著な減少を示し、アンチセンスＰＭＯの相対的な経口バイオアベイラビリティーが、腹腔内投与されるＰＭＯの２５％より実質的に大きいことを示す。
【０１５７】
（実施例６：ＰＭＯアンチセンスオリゴマーの経皮的投与）
配列番号２５を有するラットＣＹＰ３Ａ２の−３／＋１９領域に標的化されたＰＭＯ（５’−ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  Ｃ−３’）を用いた。各４動物の３群をそれぞれ以下のように処置した：
アンチセンス群：３ｍｇ／ラット  ＡＶＩ−４４７２（配列番号２５）
コントロール群：３ｍｇ／ラット  ＡＶＩ−４１２６（ｃ−ｍｙｃに対するアンチセンス；配列番号４４）
ビヒクル群：ビヒクルのみ
アンチセンス群およびコントロール群について、９５：５のプロピレングリコール／リノール酸（ビヒクル）１００μＬ中の３ｍｇ  ＰＭＯの処方物を２８０〜３００グラムのラットの右後ろ側腹部に適用した。ＰＭＯ投与直前にこの領域を剃毛し、目に見える切り傷も挫傷もないことを確認した。ＰＭＯ処方物を２００ｍｍ２の領域にわたって、ガイドとしてプラスチック製の輪を用いて、適用した。３〜５分以内に皮膚から処方物が外観上消失したことが観察された。
【０１５８】
全てのラットを経皮的投与の２４時間後に安楽死させた。７−ベンジルオキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリン（ＢＦＣ）の７−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリン（ＨＦＣ）への変換によって、肝臓Ｓ−９画分をＣＹＰ３Ａ酵素活性について分析した。この反応は、ＣＹＰ３Ａに特異的であり、蛍光産物処方物を励起波長４０９ｎｍおよび発光波長５３０ｎｍでモニターし得る。
【０１５９】
コントロールＰＭＯ基由来の肝サンプルをＰＭＯのレベルについて分析し、経皮投与後２４時間で９．９±０．７μｇ  ＰＭＯ／ラット肝臓であることを明らかにした。このことは、このオリゴマーの経皮送達を確立した。表１１におけるデータが示すように、酵素活性における実質的な減少が、ＣＹＰ３Ａに対するアンチセンスで処置された動物において観察されたが、コントロールアンチセンスについての結果は、ビヒクルのみのコントロールに本質的に類似した。
【０１６０】
（表１１  経皮的に送達されたアンチセンスＰＭＯによるＣＹＰ３Ａ２活性の減少）
【０１６１】
【表１５】
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（実施例７：ＣＹＰ３Ａ４に対するアンチセンスと共に同時投与されたパクリタキセルの増強された細胞毒性）
初代ヒト肝細胞およびｃａｃｏ−２／ｈ３Ａ４細胞（染色体外ベクターｐ２２０ＣＭＶ３Ａ４上のＣＹＰ３Ａ４  ｃＤＮＡをトランスフェクトされたヒト結腸癌細胞株ｃａｃｏ−２；Ｇｅｎｔｅｓｔ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）の細胞の生存率を、３つの細胞傷害性薬物（パクリタキセル、シクロホスファミド、およびシスプラチン）との組み合せにおいて、配列番号４７またはコントロールＰＭＯで同時処理した後に、評価した。これらの中で、１番目のものは、ＣＹＰ３Ａ４によってより細胞傷害性の少ない代謝産物へと代謝され、２番目のものは、細胞傷害になるのにＣＹＰ３Ａ４による代謝活性化を必要とする、プロドラッグであり、３番目のものは、ＣＹＰ３Ａ４によって代謝されない。細胞傷害性薬物の添加２４時間前に細胞をＰＭＯで処理した。５μＭパクリタキセル、６００μＭシクロホスファミド、または７μＭシスプラチンとともにさらに２４時間インキュベートした後に、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって決定した。
【０１６２】
細胞が未代謝のパクリタキセルに対してより多く曝されることから予測されるように、配列番号４７の配列を有するアンチセンスＰＭＯをパクリタキセルと組み合せて添加することにより、両方のモデル系において細胞生存率が減少した。アンチセンスＰＭＯおよびシクロホスファミドを用いた細胞の同時処理は、シクロホスファミドのみを用いた処理に比較して、細胞生存率を両方の系において顕著に増大させた。シスプラチンおよびアンチセンスＰＭＯを用いた細胞の同時処理は、この中程度に細胞傷害性の毒性用量のシスプラチンから、細胞生存率を顕著には変化させなかった。
【０１６３】
さらなる研究を実施して、ｃａｃｏ−２／ｈ３Ａ４細胞においての、アンチセンスＰＭＯによる、パクリタキセル毒性の変化の機構を調査した。５μＭパクリタキセルの添加の２４時間前に、細胞をコントロールまたはアンチセンスＰＭＯ（配列番号４７）で処理した。さらに２４時間パクリタキセルをインキュベーションした後、フローサイトメトリーを用いて、ｃａｃｏ−２／ｈ３Ａ４細胞の細胞周期分布を決定した。
【０１６４】
細胞へのパクリタキセルのみの添加は、Ｇ１／Ｇ０期（ＤＮＡ損傷を示す細胞周期チェックポイント）にある生存可能な細胞の割合を増大させた。ＤＮＡ損傷は、ＣＹＰ３Ａ４によって生成された３’−（ｐ−ヒドロキシフェニル）タキソール代謝産物によって主に生成されたようである。逆に、アンチセンスＰＭＯ（配列番号４７）およびパクリタキセルで処理された生存可能なｃａｃｏ−２／ｈ３Ａ４細胞は、細胞周期のＳ期に主に蓄積した。このことは、Ｇ１−Ｓ  ＤＮＡ損傷チェックポイントの解除および微小管レベルでのパクリタキセルの作用機構への復帰を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、シトクロムｐ４５０による薬物の酸化の工程を示す。
【図２】
図２は、アセトアミノフェン代謝の、毒性産物または非毒性メルカプツレート（ｍｅｒｃａｐｔｕｒａｔｅ）共役を導く代替的経路を示し、ここでＧＳＨ＝グルタチオンであり、そしてＡＣ＊＝反応性中間体である。
【図３】
図３は、肝臓のミクロソーム由来のシトクロムｐ４５０  ２Ｂ１（ＣＹＰ２Ｂ１）を、ＣＹＰ２Ｂ１を誘導する薬剤フェノバルビタール（ＰＢ）の存在下または非存在下において、多様なアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１を参照）で処置したＥＬＩＳＡ法の結果を示す。
【図４】
図４は、漸増量のアンチセンスオリゴヌクレオチド２Ｅ１−１５６０（配列番号：１９）で処理された培養物由来のＣＹＰ２Ｅ１アイソザイムのレベルを示し、これはＣＹＰ２Ｅ１アイソザイムの存在量を比較するためにＥＬＩＳＡ法によってアッセイされた（実施例２を参照）。
【図５】
図５は、ポリマーを形成するために適切な、５個の原子（Ａ）、６個の原子（Ｂ）、および７個の原子（Ｃ〜Ｅ）連結基を有するいくつかの好ましいサブユニットを示す。
【図６】
図６Ａ−Ａ〜Ｅ−Ｅは、図５の各Ａ〜Ｅのサブユニットを用いて構成される、所望のＡ−Ａ〜Ｅ−Ｅの例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドのサブユニットセグメントの繰り返しを示す。
【図７】
図７は、組織を採集する２４時間前に、生理食塩水の腹腔内投与（レーン１）、１５ｎＭのＣＹＰ３Ａ２アンチセンスＰＭＯ（配列番号：２５）をともなう腹腔内投与（レーン２および３）、または６０ｎＭのＣＹＰ３Ａ２アンチセンスＰＭＯを経口投与（レーン４および５）したラットのＣＹＰ３Ａ２アイソザイム相対的レベルを比較するための肝臓ミクロソームサンプルのウエスタンブロットを示す。ここで、「ＮＡＤＰＨレダクターゼ」と示したレーンはブロット上の総タンパク質のコントロールである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004523465.tif 000081
2004523465.tif 000082
【国際調査報告】
2004523465.tif 000083
2004523465.tif 000084
2004523465.tif 000085
2004523465.tif 000086
2004523465.tif 000087