(57)【要約】本発明は、分析対象物質に対して生物学的、化学的または生化学的プロトコルを実行するための連続フロー手順に関する。このプロトコルはいくつかの段階:-分析対象物質および試薬の受取り手段(12)を備えた移動式分析支持体(11)を前進させ、-移動式分析支持体(11)が移動している間に、分析対象物質に対してプロトコルの諸段階を実施するを含む。
2004526138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物質に対して生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フローで実行するためのシステムにおいて、
-分析対象物質および試薬の受取り手段を備え、前記受取り手段が、行および列からなるマトリックスを形成するように配置された移動式分析支持体(11、30、50)と、
-プロトコルの実施中に、支持体の受取り手段がその前を通過するように配置されたプロトコル実施手段と
を備えたシステムであって、
-移動式分析支持体が、分析対象物質および試薬の蒸発を防ぐ手段を備え、
-分析対象物質および試薬の蒸発を防ぐ手段が、
・分析対象物質、試薬、および分析対象物質と試薬との間の反応で生じる生成物と非混和性の液体媒質、
・分析対象物質および試薬と非混和性であり、受取り手段を覆い、分析対象物質および試薬が通過することのできる液体フィルム
の中から選択され、
-プロトコル実施手段が、異なるエネルギーを投入する連続する複数の手段を備える
ことを特徴とするシステム。
【請求項２】
移動式分析支持体の受取り手段に、分析対象物質および試薬を順番に送達する手段(36)をさらに備えていることを特徴とする、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
プロトコルが実行された物質に適用し、これらの物質の分析を行うための検出手段をさらに備えていることを特徴とする、請求項1または2に記載のシステム。
【請求項４】
エネルギー投入手段が、受取り手段を規定温度まで加熱する加熱手段(14、15、34、35、54、55、56)であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
前記加熱手段が、前記規定温度まで加熱された少なくとも1つのサーマルロッド(54、55、56)を備えていることを特徴とする、請求項4に記載のシステム。
【請求項６】
熱輸送流体の循環によって、かつ/またはジュール効果によって、かつ/またはペルチエ効果によって、かつ/または光放射によって、前記サーマルロッドが前記の規定温度まで加熱されることを特徴とする、請求項5に記載のシステム。
【請求項７】
移動式分析支持体をサーマルロッドに近づける手段(59)をさらに備えていることを特徴とする、請求項5または6に記載のシステム。
【請求項８】
分析対象物質および試薬を運ぶ手段およびプロトコル実施手段が、以下の事項：
-第1の化合物を受取り手段のための反応容量とすること、
-移動式分析支持体を第1の注入エレメントに向かって移動させること、
-第1の注入エレメントによって第2の化合物を反応容量中とすること、
-および任意選択で、移動式分析支持体を第2の注入エレメントに向かって移動させて、前記反応容量中に第3の化合物を加えることを順番に達成するように配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のシステム。
【請求項９】
検出手段が、移動式分析支持体上で物質を直接に分析する手段であることを特徴とする、請求項3に記載のシステム。
【請求項１０】
検出手段が、物質を移動式分析支持体から移動させた後で、物質を分析する手段であることを特徴とする、請求項3に記載のシステム。
【請求項１１】
移動式分析支持体がプレートからなり、受取り手段が、プレートの表面に配置され、かつ分析対象物質を付着させるために使用されるパッドを含むことを特徴とする、請求項1に記載のシステム。
【請求項１２】
移動式分析支持体がフィルム(30)であることを特徴とする、請求項1に記載のシステム。
【請求項１３】
受取り手段が、フィルムの表面と分析対象物質との間の毛管力に帰因することを特徴とする、請求項12に記載のシステム。
【請求項１４】
フィルム(30)が、巻出しリール(37)と巻取りリール(38)との間を自由に移動できることを特徴とする、請求項12に記載のシステム。
【請求項１５】
フィルム(30)が均一なフィルムであり、フィルム表面が親水性表面であることを特徴とする、請求項12に記載のシステム。
【請求項１６】
フィルムが構造化されたフィルムであり、前記フィルムが受取り手段の位置の決定に使用できることを特徴とする、請求項12に記載のシステム。
【請求項１７】
フィルムの前記表面が疎水性であり、前記受取り手段を形成する親水性パッドを支持していることを特徴とする、請求項16に記載のシステム。
【請求項１８】
フィルムが異方性の熱伝導性を有し、フィルムの厚さ方向の熱伝導性がフィルムの平面中の熱伝導性よりも大きいことを特徴とする、請求項12に記載のシステム。
【請求項１９】
分析対象物質に対して生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フローで実行するための方法であって、
-分析対象物質および試薬を受け取る受取り手段を備え、受取り手段が、行および列のマトリックスを形成するように配置された移動式分析支持体(11、30、50)を移動させること
を含み、
移動式分析支持体が、
・分析対象物質、試薬、および分析対象物質と試薬との間の反応生成物と非混和性の液体媒質、
・分析対象物質および試薬と非混和性であり、受取り手段を覆い、分析対象物質および試薬が通過することのできる液体フィルム
の中から選択された、分析対象物質および試薬の蒸発を防ぐ手段を備え、
さらに、
-移動式分析支持体が移動している間に、異なるエネルギーを加える連続する複数の手段を使用することによって、分析対象物質に対してプロトコルを実施すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
支持体が移動するにつれて、分析対象物質および試薬が、支持体の異なる受取り手段に順番に届けられることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
検出手段が、プロトコルが実行された物質をさらに分析することを特徴とする、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２２】
エネルギー投入段階が熱エネルギーを加えることからなることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
以下の事項:
-第1の化合物を受取り手段のための反応容量とすること、
-分析支持体を第1の注入エレメントへ移動させること、
-第1の注入エレメントによって第2の化合物を反応容量中とすること、
-および任意選択で、移動式分析支持体を第2の注入エレメントに向かって移動させて、第3の化合物を反応容量中とすること
が順番に達成されるように実施されることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
プロトコルが実行された前記物質を、移動式分析支持体上で直接に分析することができることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
プロトコルが実行された前記物質を、移動式分析支持体から移動させた後で分析することを特徴とする、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フロー(continuous flow)で実行するための方法及びシステムに関する。本発明は、多数の試料に対して分析プロトコルを完全に実行する手段である。
【背景技術】
【０００２】
生物学研究では、明確に定義されたプロトコルに従って化学的、生化学的または生物学的反応を実行する必要がある。これらの反応は多くの場合、混合段階、熱処理段階、インキュベーション段階及び検出段階を含む。
【０００３】
例えば、このシステムを、ファインケミカルの合成、言い換えると少量生産されかつ/または非常に高い品質を有する化学製品の合成、あるいは試薬の処理および/または試薬の注入を含む一連の段階に使用することができる。このシステムはさらに、薬物の追跡、例えば薬物が標的タンパク質に結合しているときの薬物の追跡、あるいはタンパク質-タンパク相互作用の検出、複合生体試料中のタンパク質含有成分の検出などの生物学分析に使用することができる。
【０００４】
PCR(Polymerisation Chain Reaction:重合連鎖反応)法は化学反応または生物学反応の例として遺伝学で非常に幅広く使用されている。重合連鎖反応(PCR)段階では、DNA試料を、増幅に必要な試薬と混合する必要がある。次いでこの反応容量を50℃から94℃の間の温度サイクルにかけなければならない。
【０００５】
実験設備の対費用効果(cost effectiveness)を高めるためには、以下のポイントを最適化する能力を有した機械を設計しなければならない。
-試料及び試薬の量を最小化して、反応を実施するコストを最小限に抑える。
-同じシステム内にいくつかの反応を連続的に配置する。理想的な解決策は、同一機械上において生物学的プロトコル全体が実行されることである。
-多数の分析を並行して実施する。これによって(1日あたり、機械1台あたりの分析数に関して)実験室の能力が高まる。
【０００６】
現時点で、多数の試料に対して化学的または生物学的分析プロトコルを完全に実行する機械には主な2つのグループがある。第1のグループは、ウェルの中に液体を入れるシステムを含む。第2のグループは、マイクロチャネルの中で流体を移動させるマイクロシステムを含む。「全分析システム(Total Analysis System)」を表す用語μTAS及び「フローインジェクション分析(Flow Injection Analysis)」を表す用語μFIAも使用されている。
【０００７】
第1のグループの機械では、プレートに形成されたウェルの形状の液だめに生物学的試料を入れ、これを、生物学的反応に必要な熱処理のため、必要な温度まで順番に加熱する。M. J. Research社またはPerkin Elmer社製機器のような市販の機器は通常、ペルチエ効果に基づくサーモスタット制御のシステムを使用する。この方法は実施が容易であり、16行×24列のマトリックスに従って分布した384個のウェルを有する滴定プレートの場合には構成部品が標準化されている。
【０００８】
生物学的プロトコルの各操作(充てん、PCR、試薬の追加)は通常、異なる機械上で実施される。実施する分析の数によっては、試料、試薬及びプレートの管理が非常に複雑になる場合がある。このタイプの機械は通常、一度に1枚のプレートしか処理できないので、このタイプの機械を用いた連続反応フローは不可能である。
【０００９】
第1のグループよりも新しい第2のグループの機械では、マイクロチャネルを使用して反応に必要な液体を輸送する。この第2のグループには、例えば以下のような多くの利点がある。
-試薬及び試料の少量化。
-同じ構成部品上にいくつかの反応を統合できる。これによって生物学的プロトコル全体を同じバイオチップ上で実行することができ、それによって操作が最小限に抑えられ、または操作の自動化が容易になる。
-いくつかのチャネルでプロトコルを同時に実行できる。
【００１０】
チャネルは、シリコン、ガラスまたは高分子材料から作られた基板にエッチングすることによって得ることができる。反応に関与する液体は温度制御されたゾーンを循環する。この件についての追加情報は、M. U. KOPP他の論文「Continuous Flow PCR on a Chip」、the μTAS'98 Workshop(1998年10月13〜16日、カナダBanff)の会議録、 Kluwer  Academic  Publishers編、7から10ページに出ている。
【００１１】
同じチャネル上でいくつかの試料が同時に循環するシステムもある。これは連続反応フロー(continuous reactions flow)と呼ばれている。この件についての追加情報は、E. LITBORN他の論文「Synthesis and Analysis of Chemical Components in Nanoscale」、the μTAS'2000 symposiumの会議録、447から454ページ、および国際出願WO-A-00/21666に出ている。
【００１２】
主としてチャネル内での液体輸送を制御する問題のため、これらの構成部品を完全なものにすることは残念ながら難しい。液体を強制的に移動させるには、電気浸透、または高圧もしくは強制(imposed)の流れ場システムなどのポンピング方法を組み込む必要がある。しかしこれらは完全なものにすることが難しく、しばしば製造コストが非常に高くなる。プロトコル反応が実行されるチャネル内で液体を輸送するポンピング機能は、全ての「ラボ・オン・チップ(lab on a chip)」構成部品の重要な不可避の態様である。
【００１３】
米国特許第5736106号には、物質に対して熱処理プロトコルを実行するための装置が開示されている。この装置は、分析対象物質を含み反応室の働きをする空洞を有する熱伝導プレートを備えている。反応室は、透明シートによって閉じられる。空洞の内容物の温度を規定温度まで上昇させるため、コンベヤベルト機構が、空洞を有するプレートを、連続する複数の固定位置まで運ぶ。
【特許文献１】
WO-A-00/21666
【特許文献２】
米国特許第5736106号
【特許文献３】
WO-A-95/34374
【非特許文献１】
M. U. KOPP他、「Continuous Flow PCR on a Chip」、the μTAS'98 Workshop(1998年10月13〜16日、カナダBanff)の会議録、Kluwer Academic Publishers編、7から10ページ
【非特許文献２】
E. LITBORN他、「Synthesis and Analysis of Chemical Components in Nanoscale」、the μTAS'2000 symposiumの会議録、447から454ページ
【非特許文献３】
C. D. BEVAN他、Anal. Chem.、2000年4月15日、72(8)、1781から1787ページ
【非特許文献４】
F. X. BARRE他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000年3月28日、97(7)、3084から3088ページ
【非特許文献５】
S. LEJNINE、Nucleic Acids Res.、1999年9月15日、27(18)、3676から3684ページ
【非特許文献６】
M. GHALI他、J. Neurovirol、1998年10月、4(5)、521から530ページ
【非特許文献７】
G. FRY他、Biotechniques、1992年7月、13(1)、124から131ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、現状技術の諸技法の利点を結合し、一方でその欠点を最小化する。本発明は、実験室の費用効果を高めるために、同じ機械上での連続分析フローを可能にする。本発明は、試薬または試料の注入、試薬の混合、分析物の検出、光学または熱処理、または温度サイクル、試薬混合、ことによると検出などの機能の実施を統合して、1台の機械で生物学的プロトコルの全段階を実施する手段である。本発明は、マイクロチャネル中の複雑な液体ポンピングシステムの開発を必要としない。
【００１５】
本発明は、連続的にまたは小さなステップで移動する分析支持体を使用する。先に述べた米国特許第5736106号とは違い、多数の試料に対してプロトコルの諸段階を同時に実施することができ、そのため、生物学的プロトコルを連続的に実行することができる。
【００１６】
本発明の第1の目的は、分析対象物質に対して生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フローで実行するためのシステムからなる。このシステムは、
-分析対象物質および試薬の受取り手段を備え、受取り手段が、行および列からなるマトリックスを形成するように配置された移動式分析支持体と、
-プロトコルの実施中に支持体の受取り手段がその前を通過するように配置されたプロトコル実施手段と
を備えたシステムであって、
-移動式分析支持体が、分析対象物質および試薬の蒸発を防ぐ手段を備え、
-分析対象物質および試薬の蒸発を防ぐ手段が、
・分析対象物質、試薬、および分析対象物質と試薬の間の反応で生み出される生成物と非混和性である液体媒質、
・分析対象物質および試薬と非混和性であり、受取り手段を覆い、分析対象物質および試薬が通過することができる液体フィルム
の中から選択され、
-プロトコル実施手段が、異なるエネルギーを投入する連続する複数の手段を含む
ことを特徴とする。
【００１７】
このシステムはさらに、移動式分析支持体の受取り手段に分析対象物質および試薬を順番に送達する手段を備えることができる。このシステムはさらに、プロトコルを実行した物質に適用して、これらの物質の分析を行う、検出手段を備えることができる。
【００１８】
プロトコルのこれらの段階を実施する手段はさらに、試薬または試料を注入する手段、試薬または試料の光学処理(例えば紫外線処理)手段、磁場を適用する手段、反応容量の一部または全部を除去する吸引手段、例えば試料成分のパラメータまたは他の検出可能な任意のマーカーを検出する検出手段、および試料の化学処理手段を備えることができる。
【００１９】
エネルギー投入手段は、受取り手段を規定温度まで加熱する加熱手段とすることができる。これらの加熱手段は、前記規定温度の少なくとも1つのサーマルロッドを備えることができる。サーマルロッドは、熱輸送流体の循環によって、かつ/またはジュール効果によって、かつ/またはペルチエ効果によって、かつ/または光放射によって、前記規定温度まで加熱することができる。このシステムはさらに、移動式分析支持体をサーマルロッドに近づける手段を備えることができる。
【００２０】
例示的な一実施形態によれば、分析対象物質および試薬を運ぶ手段およびプロトコル実施手段が、以下の事項を順番に達成するように配置される:
-受取り手段の反応容量中に第1の化合物をもたらすこと、
-移動式分析支持体を第1の注入エレメントに向かって移動させること、
-第1の注入エレメントを通して前記反応容量中に第2の化合物をもたらすこと、
-および任意選択で、移動式分析支持体を第2の注入エレメントに向かって移動させて、前記反応容量中に第3の化合物を加えること。
【００２１】
検出手段は、移動式分析支持体上で物質を直接に分析する手段、または物質を移動式分析支持体から移動させた後で物質を分析する手段とすることができる。
【００２２】
一変形実施形態によれば、移動式分析支持体がプレートからなり、受取り手段が、プレートの表面に配置され、分析対象物質を付着させる目的に使用されるパッドからなる。
【００２３】
他の変形実施形態によれば、移動式分析支持体がフィルムである。受取り手段は、フィルムの表面と分析対象物質の間の毛管力に依存する。フィルムは、巻出しリールと巻取りリールとの間を自由に移動できる。フィルムが均一なフィルムである場合には、フィルム表面を親水性表面とすることができる。
【００２４】
フィルムを、フィルムの構造が受取り手段の位置を決める構造化されたフィルムとすることができる。例えば、フィルムの表面を疎水性表面とし、これが、前記受取り手段を形成する親水性パッドを支持することができる。フィルムは、フィルムの厚さ方向の熱伝導性がフィルムの平面方向の熱伝導性よりも大きい異方的熱伝導性を有するフィルムとすることができる。
【００２５】
本発明の第2の目的は、分析対象物質に対して生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フローで実行するための方法である。この方法は、
-分析対象物質および試薬を受け取る受取り手段を備え、受取り手段が、行および列からなるマトリックスを形成するように配置された移動式分析支持体を移動させること
を含み、
移動式分析支持体が、
・分析対象物質、試薬、および分析対象物質と試薬の間の反応生成物と混ざらない液体媒質、
・分析対象物質および試薬と混ざらず、受取り手段を覆い、分析対象物質および試薬が通過することができる液体フィルム
の中から選択された、分析対象物質および試薬の蒸発を防ぐ手段を備え、
さらに、
-移動式分析支持体が移動している間に、異なるエネルギーを加える連続する複数の手段を使用することによって、分析対象物質に対してプロトコルを実施すること
を含むことを特徴とする。
【００２６】
有利には、支持体が移動するにつれて、分析対象物質および試薬が、支持体の異なる受取り手段に順番に受け取られる。
【００２７】
この方法はさらに、プロトコルを実行した物質を、検出手段で分析することを含むことができる。
【００２８】
エネルギー投入段階は、熱エネルギーを加えることからなることができる。
【００２９】
特定の一実施形態によれば、この方法が、以下の事項が順番に達成されるように実施される:
-受取り手段の反応容量中に第1の化合物をもたらすこと、
-分析支持体を第1の注入エレメントへ移動させること、
-第1の注入エレメントによって前記反応容量中に第2の化合物をもたらすこと、
-および任意選択で、移動式分析支持体を第2の注入エレメントに向かって移動させて、前記反応容量中に第3の化合物を提供すること。
【００３０】
プロトコルが実行された物質は、移動式分析支持体上で直接に分析することができ、または物質を移動式分析支持体から移動させた後で分析することができる。
【００３１】
非限定的な例として記載した以下の説明を添付の図面を参照して読めば、本発明の理解はいっそう深まり、他の利点および具体的な特徴は明白となろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
先に説明したようにこのシステムはさらに、一連の段階を含むプロトコルを含む任意の応用に有利に使用することができる。プロトコル実施手段は例えば、試薬または試料を注入する手段、試薬または試料の光学処理(例えば紫外線処理)手段、例えば試料成分のパラメータまたは検出可能な任意のマーカーを検出する検出手段、および試料に熱処理を加える手段を含むことができる。
【００３３】
具体的には、試薬の順次注入を必要とする任意の合成を、本発明に基づく方法に従い、本発明に基づくシステムを使用して有利に実施することができる。例えば、本発明の応用には、化学製品の合成、特にファインケミカル、言い換えれば少量だけ生産されかつ/または非常に高い品質を有する化学製品の合成が含まれる。さらに、2つ以上のプロトコルを使用する本発明に基づく微小流動(microfluidic)基板または装置を、例えばファインケミカルの合成とインライン追跡(例えば薬物の追跡)の組合せのために設計することができる。
【００３４】
本発明の一応用では、必要に応じて1種または数種の試薬が支持体の表面に液滴の形態で配置される。装置に沿って置かれた注入エレメントによって別の試薬を加えることができる。これらの注入エレメントは必要な量の試薬を注入する。分析支持体の材料および他の材料を含む装置の特性は、予想される反応の特性、例えば合成で使用される反応温度および溶剤(例えば水、有機溶剤)と適合するように選択される。他の実施形態では、本発明に基づくシステムを使用して薬物を追跡することができる。この追跡では、タンパク質または細胞組成物を支持体に液滴の形態で供給し、システムに沿って配置された注入エレメントによって試験化合物を注入し、任意選択で、その試料に対する検出または分析段階を、好ましくはシステム上に位置する検出手段によって実施する。他の実施形態では、このシステムを検出プロトコルに使用することができる。この場合には、試料を分析支持体に液滴の形態で供給し、検出段階を実施するエレメントがシステムに配置される。例えば、水中での薬物の溶解度を決定する高フロー追跡のために、レーザ比濁分析を使用して抗原-抗体複合体を検出することができる。この件についての追加情報は、Anal. Chem.、2000年4月15日、72(8)、1781から1787ページに発表されたC. D. BEVAN他の論文に出ている。他の応用では、紫外線処理を実行する手段を使用してプロトコルを実施する。例えば、紫外光が、相補DNA鎖間およびDNAとタンパク質の間の架橋を引き起こすことは知られている。試料を分析支持体に液滴の形態で提供し、システムに含まれる紫外線処理エレメントを使用して、3重らせん上の標的遺伝子の修飾(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000年3月28日、97(7)、3084から3088ページに発表されたF. X. BARRE他の論文を参照されたい)、ヒト細胞核でのタンパク質とDNAの架橋(Nucleic Acids Res.、1999年9月15日、27(18)、3676から3684ページに発表されたS. LEJNINEの論文を参照されたい)、および病原性エレメントの不活化(J. Neurovirol、1998年10月、4(5)、521から530ページに発表されたM. GHALI他の論文を参照されたい)に関して試料を処理する。本発明の他の応用では、磁性ビーズとの結合による試料成分の分離(例えば常磁性粒子を使用した配列決定応用の較正による精製、G. FRY他、Biotechniques、1992年7月、13(1)、124から131ページ)に関して、プロトコル実施手段が、磁場が適用された領域を含む。本発明の他の応用ではプロトコル実施手段が、規定量の試料または試料の一部分を抽出するのに使用できる抽出手段を含む。他の応用では、例えば後に説明するPCR反応を実行するために、プロトコル実施手段が、試料の温度を規定値まで上昇させる熱エレメントを含む。
【００３５】
図1に、本発明に基づくシステムの中に置かれた第1の移動式分析支持体11を示す。支持体11は、試薬が加えられたときにその中で化学反応が起こる異なる反応媒質を形成する複数の液滴12からなるマトリックスを支持するフィルムである。分析支持体は、矢印の方向の運動を生み出す機構に結合されており、プロトコルの実行に必要なさまざまなエレメントに対してそれぞれの液滴列を前進させることができる。
【００３６】
PCRなどのいくつかのプロトコルは温度サイクル、一般に一定温度を2、30秒持続させる94℃(変性)-55℃(ハイブリッド形成)-72℃(延長)の約20回の温度サイクルを必要とする。これらの温度変化は、例えばペルチエ効果または熱輸送流体の循環によって動作する、温度ロッドとも呼ばれる図1の14および15のような温度制御エレメントによって与えられる。
【００３７】
サーマルロッドの中を通る円形のチャネル、または熱輸送流体とロッドの間の熱交換を最適化するリブシステムを通して、熱輸送流体を循環させることができる。各サーマルロッドは、熱輸送流体を循環させるポンピングシステムを備えたサーモスタット制御の浴に接続されている。
【００３８】
サーモスタット制御の浴の温度をサーボ制御するため、ロッドに温度測定エレメントを組み込むことができる。サーモスタット制御されたロッドにはさらに、相補的な加熱エレメントを組み込むことができる。例えば、加熱エレメントを、熱源の働きをする電気抵抗と冷却源として作用する熱輸送流体とすることができる。光放射によって加熱することもできる。
【００３９】
熱交換を高めるために、分析支持体を加熱ロッドに押しつけるシステムを追加すると有用なことがある。これは例えば、加熱ロッドのところで吸引装置を使用して、またはフランジと加熱ロッドの間に分析支持体をはさみこむフランジシステムによって、達成することができる。
【００４０】
分析対象物質および試薬の蒸発を防ぐため、使用前に、加えられる生成物と混ざらない液体で満たされた容器中にベルトまたはフィルムを封じ込めると特に有利であることがある。これらのさまざまな生成物は、分析支持体が移動している間に注入する生成物が連続的に加えられるように配置された小さい毛細管を通して運ぶことができる。毛細管は例えば、微小流動装置で頻繁に使用されている溶融シリカ繊維とすることができる。例えば、繊維から出るところの液滴の形成は、圧力発生装置またはシリンジプッシャによって制御することができる。
【００４１】
図2に示す実施形態では、移動式分析支持体がフィルム30またはコンベヤベルトである。分析対象物質および反応生成物は、移動しているフィルム30上に置かれた液滴に対応する。図2には、注入毛細管36、およびボード31の中に収容された温度制御エレメント34、35が示されている。
【００４２】
液滴は、液滴とフィルム30の間の毛管力によって付着している。プロトコル(液滴の配置、加熱、検出)を実行できるように、フィルム並進システムが異なるエレメントに沿って液滴を移動させる。図2に示した例では、VCRカセットに似た巻上げシステムによってフィルム30が移動している。フィルムは巻出しリール37から、または巻取りリール38へ移動する。
【００４３】
分析対象物質および試薬が蒸発しないように、巻き出されたフィルム30は、油フィルム32によって、または分析対象物質および試薬と混ざらない液体によって覆われる。分析対象物質および試薬と混ざらないこの液体は、油(鉱油、シリコーン油)またはオクタンなどの水と混ざらない有機溶媒とすることができる。
【００４４】
明らかに、図2に示した例示的な実施形態は、必要なサイクル、例えばPCRサイクルを実行するための数列の加熱領域を含むことができる。
【００４５】
フィルムは均一なフィルムまたは構造化されたフィルムとすることができる。均一フィルムの場合には、その上に置かれた液滴が転がらず、液滴がフィルムに確実に付着するように、フィルムがわずかに親水性であると有利である。有機材料(プラスチックまたはKapton(登録商標)などのポリアミド」)から作られたフィルム、または(例えばアルミニウムおよび金から作られた)金属糸を使用することができる。
【００４６】
構造化されたフィルムの利点は、液滴の自己位置決め(self-positioning)に寄与する点である。これは例えば、親水性パッドを有する疎水性フィルムによって達成することができる。次いで親水性パッド上に液滴を毛管作用によって配置する。くぼみを有するフィルムを構築することによっても同じ結果を得ることができる。
【００４７】
熱交換を最適化し、温度制御エレメント間の熱の流れを最小限に抑えるために、異方的熱伝導性を有するフィルム、言い換えるとフィルムの平面方向には断熱性でフィルムの厚さ方向には熱伝導性のフィルムを使用することもできる。
【００４８】
次いで、システムのこの消耗部分は、ウェルまたはチャネル構造よりも簡単かつ安価に製造できるという利点を有するフィルムにする。
【００４９】
さらに、液滴の視認性は、それぞれの注入後の反応容量のリアルタイムチェックおよび測定を可能にし、これは、リアルタイム生成モニタリングの展開に役立つ可能性がある。
【００５０】
図3に温度制御エレメントを示す。フレーム51がボード52を支持し、その上を移動式分析支持体50が移動する。液滴の形態の反応容量53は、分析支持体50上に均一に配置されている。図3には3つの温度制御エレメント54、55および56が示されている。これらのエレメントは、絶縁材料57の中に収容されたサーマルロッドである。サーマルロッドの上面は絶縁材料と同じ高さになっている。例えばジュール効果、ペルチエ効果または光放射効果に基づく他の加熱手段を使用することもできる。サーマルロッド54、55および56は、熱輸送流体を通すための穴、例えば穴58を備えている。分析支持体50をサーマルロッドに押しつけるため、サーマルロッドの上面には、吸気装置に接続された、サーマルロッド54の上面の空洞59などの吸引空洞がある。サーマルロッド55は、このロッドの温度を上昇させる電気抵抗61を有する。サーマルロッド56は、このロッドの上面の温度を測定するためのエレメント62を備える。
【００５１】
図4に、20サイクルプロトコルのPCRにかけられた移動式分析支持体70を概略的に示す。それぞれのサイクルは、20群のサーマルロッド74、75および76によって供給される94℃、55℃および72℃の別々の3つの温度に物質を順番に提示することを含む。
【００５２】
従来技術に基づく技法と比較した本発明の利点は、以下の段階を含む一連の試料を分析するためのプロトコルを使用して証明することができる。
-第1の試薬と試料の混合
-持続時間t1の熱サイクル
-第2の試薬の追加
-持続時間t2の熱サイクル
-第3の試薬の追加
-異なる色または物理化学的な量(magnitude)を用いた物質の検出
【００５３】
本発明では、多数(例えば384)の試料および多数(例えば100)の異なる試薬に対してこのプロトコルを実施することができる。本発明を使用して、「ラボ・オン・チップ」システムよりも単純な実施形態を維持しながら、従来のウェルを有するプレートを使用する機械で可能な時間よりも短い時間で、これらの100×384の分析を達成することができる。384個のウェルを有するプレートを使用する標準的な機械では、プロトコル実施時間は100×(t1+t2)である。この時間は短縮できず、通常は長すぎる。100枚のウェルプレートを操作するロボット、ならびに100×384個の試料の管理/分配および3×100×384個の試薬の分配のためのシステムを設計することも必要である。
【００５４】
連続反応フローで動作するマイクロチャネルチップを使用する機械では、
連続フローシステムを使用した100×384の反応に必要な時間が最小になるようにシステムのサイズを決めることができる。例えば、384本のチャネルを有するチップを製作し、384本のそれぞれのチャネルのプロトコルの諸段階が実施される異なる領域で100の反応を順番に循環させればよい。それぞれの反応は、混ざり合う、または混ざらない分離プラグによって他の反応から切り離される(文書WO-00/21666参照)。100×384の反応に必要な時間は、2つの連続する反応間の通過時間によって与えられる。したがって、非常に高速な液体速度は、全ての反応を最小時間で循環させることができることを意味する。
【００５５】
液体の移動速度Vは、関係式V=L/tによって制御される。Lは、生物学的プロトコルが実施されるゾーンの長さ、tは、生物学的プロトコルの時間である。したがってこの長さを長くすることによって、反応移動速度を増大させ、したがって100×384の反応を達成するのに必要な時間を最小化することができる。しかし、この観察は問題を引き起こす。なぜなら、チャネルの長さを長くする必要と、微小流動チップの小型化とは相容れず、この構成部品を製作するマイクロ技術の使用を危うくするからである。さらに、100の異なる反応と並行する384本チャネル上での移動の制御は、大きな設計上の問題を引き起こし、特に、小チャネルにおける流体力学の問題は、完全に制御されなければならない。
【００５６】
本発明では、100×384の反応の実行速度に関する連続反応フローの利点を、マイクロチャネル内の液体の移動に関する制御の欠点を伴わずに維持することができる。本発明では、反応容量を固定した移動式支持体を移動させることによって、生物学反応を連続フローで実施することができる。したがって、マイクロチャネルのポンピングシステムよりもはるかに簡単な移動式支持体の移動によって、反応容量の移動が直接に制御される。さらに、マイクロチャネル装置と比較した場合の他の利点は、分析支持体の移動速度、したがって分析される試料の移動速度が、試料の量または注入される量とは独立していることである。
【００５７】
次に、本発明の原理を使用してPCRプロトコルを実行する1つの例を示す。
【００５８】
移動式分析支持体は、Dupont社から販売されている200HN Kaptonフィルムであり、厚さは50μmである。使用する非混和性液体は、Sigma社から入手できる軽質の鉱油である。
【００５９】
PCR溶液100μlは例えば以下の成分を含む。これらは可能な試料の例を示したものである。
-10X緩衝液(Gibco)  10μl
-50mMマグネシウムMg2+(Gibco)  4μl
-2mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)  10μl
-プライマー  4μl×2
-20mg/ml BSA  10μl
-液滴
をはっきりと見せるための着色した水  58μl
-マトリックス(DNA)  1μl
-taqポリメラーゼ(Gibco)  2μl
【００６０】
この溶液の滴を、油を使用してベルトまたはフィルムの上に載せる。
【００６１】
次いで、体積0.5μl、1μlおよび2μlの液滴を、本発明に従って連続する94、55および72℃の温度の約30回の熱サイクルにかける。液滴の回収の後、アガローシスゲル上での電気泳動によって結果を分析する。得られた結果を、同じ調製物からの容積2μlのPCRによる、標準ウェルプレート型装置での増幅から得られた対照を使用した結果と比較する。
【００６２】
上記プロトコルの一変形は、DNAを含む第1の液滴0.5μlを配置し、次いでプライマーを含む第2の液滴0.5μlを配置することから成る。これらの操作は、異なるタイプのDNAを含むN滴の列を作ることによって並行して実施することもできる。したがって、0.5μl液滴、N行が形成され、次いで、プライマーを含む試薬の液滴0.5μlが順番に置かれる。プライマーは列ごとに異なる。したがって、PCRによる増幅を、多数の異なるプライマーについて、N個の異なるタイプのDNAに実施されることができる。
【００６３】
本発明に対して実施したさまざまな試験から以下の結論に達した。
【００６４】
液滴の形状は再現可能である。それぞれの液滴は、毛管力によってフィルムに付着すると、そのままフィルムに固定され、生物学的プロトコルを実行するプロセス全体を通じて非常に良好な安定性を維持する。
【００６５】
2つの0.5μl体積間の混合は非常に迅速であり、文献WO-A-95/34374の開示とは違って、強制的に混合させる追加の機能を加える必要はない。小体積(1μl程度)では混合が数秒で達成されることが観察されている。
【００６６】
熱サイクルは、PCRプロトコルとしては十分な精度で液滴に適用される。油およびフィルムの存在は、試薬とさまざまなサーマルロッドの間の熱交換を妨害しない。
【００６７】
記載の構成のKapton(登録商標)フィルムおよび鉱油からなるシステムは、PCRに関して生体適合性である。
【００６８】
数回の熱サイクルの後に気泡が発生することがある。しかしこれは結果を損ねるものではない。したがって、PCRサイクルを実行する前に各種液体の脱気操作を実行する必要はない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フローで実行する本発明に基づくシステムの上面図である。
【図２】システム運転中の本発明に基づく移動式分析支持体の透視図である。
【図３】本発明に基づくシステムの部分図を示す縦断面図である。生物学的、化学的または生化学的プロトコルの諸段階の実施に使用される3つのサーマルロッドが示されている。
【図４】本発明に基づく移動式分析支持体上で実行されるPCRサイクルを示す図である。
【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月11日(2003.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物質に対して生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フローで実行するためのシステムにおいて、
-分析対象物質および試薬の受取り手段を備え、前記受取り手段が、行および列からなるマトリックスを形成するように配置された移動式分析支持体(11、30、50)を備え、
-前記受け取り手段中の各列が、プロトコルの実施に必要な様々なエレメントの前を通過することができるように、前記支持体が、連続的動作でまたは小さな段階で動作する機構に接続され、
-前記受取り手段が、分析対象物質および試薬の蒸発を防ぐために、分析対象物質および試薬と非混和性の液体フィルムで覆われている、
システムであって、
-プロトコルが実施されて、前記受け取り手段がを様々な規定温度とされる一方で、前記受け取り手段がその前を通過するように配置された、加熱手段(14、15、34、35、54、55、56)を含む
ことを特徴とするシステム。
【請求項２】
移動式分析支持体の受取り手段に、分析対象物質および試薬を順番に送達する手段(36)をさらに備えていることを特徴とする、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
プロトコルが実行された物質に適用し、これらの物質の分析を行うための検出手段をさらに備えていることを特徴とする、請求項1または2に記載のシステム。
【請求項４】
前記加熱手段が、前記規定温度まで加熱された少なくとも1つのサーマルロッド(54、55、56)を備えていることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
熱輸送流体の循環によって、かつ/またはジュール効果によって、かつ/またはペルチエ効果によって、かつ/または光放射によって、前記サーマルロッドが前記の規定温度まで加熱されることを特徴とする、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
移動式分析支持体をサーマルロッドに近づける手段(59)をさらに備えていることを特徴とする、請求項４または５に記載のシステム。
【請求項７】
プロトコルを実施するために必要な様々なエレメントが、以下の事項:
-第1の化合物を受取り手段のための反応容量とすること、
-移動式分析支持体を第1の注入エレメントに向かって移動させること、
-第1の注入エレメントによって第2の化合物を反応容量中とすること、
-および任意選択で、移動式分析支持体を第2の注入エレメントに向かって移動させて、前記反応容量中に第3の化合物を加えること
を順番に達成するように配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のシステム。
【請求項８】
検出手段が、移動式分析支持体上で物質を直接に分析する手段であることを特徴とする、請求項3に記載のシステム。
【請求項９】
検出手段が、物質を移動式分析支持体から移動させた後で、物質を分析する手段であることを特徴とする、請求項3に記載のシステム。
【請求項１０】
移動式分析支持体がプレートからなり、受取り手段が、プレートの表面に配置され、かつ分析対象物質を付着させるために使用されるパッドを含むことを特徴とする、請求項1に記載のシステム。
【請求項１１】
移動式分析支持体がフィルム(30)であることを特徴とする、請求項1に記載のシステム。
【請求項１２】
受取り手段が、フィルムの表面と分析対象物質との間の毛管力に帰因することを特徴とする、請求項11に記載のシステム。
【請求項１３】
フィルム(30)が、巻出しリール(37)と巻取りリール(38)との間を自由に移動できることを特徴とする、請求項11に記載のシステム。
【請求項１４】
フィルム(30)が均一なフィルムであり、フィルム表面が親水性表面であることを特徴とする、請求項11に記載のシステム。
【請求項１５】
フィルムが構造化されたフィルムであり、前記フィルムが受取り手段の位置の決定に使用できることを特徴とする、請求項11に記載のシステム。
【請求項１６】
フィルムの前記表面が疎水性であり、前記受取り手段を形成する親水性パッドを支持していることを特徴とする、請求項15に記載のシステム。
【請求項１７】
フィルムが異方性の熱伝導性を有し、フィルムの厚さ方向の熱伝導性がフィルムの平面中の熱伝導性よりも大きいことを特徴とする、請求項11に記載のシステム。
【請求項１８】
分析対象物質に対して生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フローで実行するための方法であって、
-移動式分析支持体(11、30、50)を移動させること
-移動式分析支持体が移動している間に、加熱手段によって供給される熱エネルギーの投入によって、分析対象物質に対してプロトコルを実施すること
を含む、請求項１乃至１７のいずれか一項に記載のシステムを使用する方法。
【請求項１９】
支持体が移動するにつれて、分析対象物質および試薬が、支持体の異なる受取り手段に順番に届けられることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
検出手段が、プロトコルが実行された物質をさらに分析することを特徴とする、請求項18または19に記載の方法。
【請求項２１】
以下の事項:
-第1の化合物を受取り手段のための反応容量とすること、
-分析支持体を第1の注入エレメントへ移動させること、
-第1の注入エレメントによって第2の化合物を反応容量中とすること、
-および任意選択で、移動式分析支持体を第2の注入エレメントに向かって移動させて、第3の化合物を反応容量中とすること
が順番に達成されるように実施されることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
プロトコルが実行された前記物質を、移動式分析支持体上で直接に分析することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
プロトコルが実行された前記物質を、移動式分析支持体から移動させた後で分析することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【国際調査報告】
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