(57)【要約】完全長でＮ末端が切断されている形の、インフルエンザ菌の分類不能型菌株のＨｉａタンパク質の組み換え生成物が記載されている。分類不能型およびｃ型インフルエンザ菌のさまざまな菌株のＨｉａ遺伝子の核酸および演繹アミノ酸配列も記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ菌（ヘモフィルス・インフルエンジー（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））の菌株のインフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしている単離され精製された核酸分子であって、
（ａ）図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７）からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または
（ｂ）図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン（ｒＨｉａ）タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を有する単離され精製された核酸分子。
【請求項２】
インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしており、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号４９と配列番号５１
からなる群から選択されるヌクレオチドの１対によって増幅可能な、単離され精製された核酸分子。
【請求項３】
封入体として発現可能なインフルエンザ菌の菌株の切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしている、単離され精製された核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の前記核酸分子を含む宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項５】
請求項２または３に記載の前記核酸分子を含む宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項６】
プラスミドベクターである、請求項４または５に記載のベクター。
【請求項７】
前記プラスミドベクターが、
図１Ａ中に示されるＤＳ−２００８−２−３
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１８６−１−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２２０１−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１８６−２−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１６８−２−６
図３２中に示されるＩＡ−１９１−３−１
からなる群から選択されるプラスミドの同定特性を有する、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
完全長またはＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質および前記完全長または切断型Ｈｉａタンパク質を発現するためのプロモーターを含む、宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項９】
大腸菌の遺伝子をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
プラスミドベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
前記プラスミドベクターが、
図６Ａ中に示されるＢＫ−９６−２−１１
図７Ａ中に示されるＤＳ−２２４２−１
図７Ａ中に示されるＤＳ−２２４２−２
図８Ａ中に示されるＤＳ−２３４０−２−３
図９Ａ中に示されるＤＳ−２４４７−２
図９Ｂ中に示されるＤＳ−２４４８−１７
図３２中に示されるＪＢ−２９３０−３
からなる群から選択されるプラスミドベクターの同定特性を有する請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項４、５または８に記載のベクターによって形質転換され、ヘモフィルスの分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項１３】
大腸菌の菌株である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換された大腸菌またはその免疫原性断片またはアドヘシン官能性類縁体によって産生可能な、インフルエンザ菌の菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質。
【請求項１５】
（Ａ）インフルエンザ菌の菌株のインフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしている単離され精製された核酸分子であって、
（ａ）図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７）からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または
（ｂ）図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン（ｒＨｉａ）タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を有する単離され精製された核酸分子、
（Ｂ）インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしており、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号４９と配列番号５１
からなる群から選択されるヌクレオチドの１対によって増幅可能な、単離され精製された核酸分子、
（Ｃ）封入体として発現可能なインフルエンザ菌の菌株の切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしている、単離され精製された核酸分子、
（Ｄ）請求項４、５または８に記載の発現ベクターによって形質転換された大腸菌によって産生可能な、インフルエンザ菌の菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的に活性のある成分、および薬学的に許容可能なこれらの担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
ヘモフィルスに起因する疾患に対して防御するために宿主へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与用ワクチンとして製剤化される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
免疫系の特定の細胞または粘膜表面への送達用の標的分子と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
ミクロ粒子、カプセル、またはリポソーム調製物として製剤化される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
感受性のある宿主に請求項１５に記載の免疫原性組成物を有効量投与すること含む、ヘモフィルスに起因する疾患に対する防御を誘導するための方法。
【請求項２１】
前記感受性のある宿主がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
インフルエンザ菌の分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質の産生のための方法であって、
請求項５と同様にベクターによって宿主を形質転換すること、
宿主を成長させてエンコードされている切断型Ｈｉａを発現させること、
前記発現されたＨｉａタンパク質を単離および精製することを含む方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エンコードされている切断型Ｈｉａが封入体内で発現される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記発現されたＨｉａの前記単離および精製が、
成長し形質転換された細胞を破壊して上澄みおよび前記封入体を生成すること、
前記封入体を可溶化して組換えＨｉａの溶液を生成すること、
クロマトグラフィによって細胞の残骸のない組換えＨｉａの前記溶液を精製すること、および
前記精製された組換えＨｉａタンパク質を単離することによって実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘモフィルスの分類不能型菌株が菌株１１、３３、３２、２９、Ｍ４０７１、Ｋ９、Ｋ２２および１２からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ベクターがＴ７プロモーターを含み、前記大腸菌が誘導量のラクトースの存在下で培養される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、同時係続の米国特許出願第０９／２６８，３４７号の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は分子遺伝学の分野に関し、詳細には組換えインフルエンザ菌（ヘモフィルス・インフルエンジー（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質の産生に関する。
【０００３】
（発明の背景）
インフルエンザ菌は、髄膜炎、喉頭蓋炎、敗血症および中耳炎などのいくつかの重大なヒト疾患の原因である。インフルエンザ菌には、ａからｆで表され、それらの莢膜多糖によって識別される６種類の血清型がある。ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）は、１９８０年代にいくつかのＨｉｂ結合ワクチンが導入されるまでは細菌性髄膜炎の主な原因であった（ｒｅｆ．１．本出願全体にわたって、さまざまな参考文献を括弧内に引用し、本発明が関係する分野の現状をより完全に説明する。それぞれの引用に関する完全な文献情報は、明細書の最後、特許請求の範囲の直前に見出される。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む）。ジフテリアトキソイド（ｒｅｆ．２）、破傷風トキソイド（ｒｅｆ．３および米国特許第４，４９６，５３８号）または髄膜炎菌外膜タンパク質（ｒｅｆ．４）に結合したｂ型インフルエンザ菌莢膜多糖をベースとするワクチンは、ｂ型インフルエンザ菌誘発髄膜炎を減らすのに有効とされてきた。他の血清型インフルエンザ菌が侵襲性疾患に関連する頻度は低いが、Ｈｉｂ疾患の発生率が減少するにつれて、これらの菌株に起因する疾患の発生率が増加するようである（ｒｅｆ．５、６）。非被包性すなわち分類不能型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）もまた中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎および気管気管支炎を含む広範囲のヒト疾患の原因となる。ＮＴＨｉ誘発疾患の発生率は、Ｈｉｂワクチンの導入によって影響を受けなかった（ｒｅｆ．７）。
【０００４】
中耳炎は幼児期に最もよく見られる病気であり、２歳未満の子供全体の６０から７０％が１回から３回の耳感染症を経験する（ｒｅｆ．８）。子供の慢性中耳炎は聴力、発話および認知障害の原因となる。インフルエンザ菌感染症は、急性中耳炎の症例の約３０％、慢性中耳炎の約６０％を占める。米国だけでも中耳炎の治療には、抗生物質ならびに扁桃摘出術、咽頭扁桃切除術および中耳腔換気用チューブの挿入などの外科的処置に年間１０億ドルから２０億ドルが費やされている。言語療法および特殊教育授業などの付加的治療に対し、年間さらに３００億ドルが費やされていると推定される。さらに、中耳炎の原因となる生物の多くは、抗生物質治療に対して耐性になりつつある。したがって、中耳炎に対する有効な予防ワクチンが望まれている。ＮＴＨｉによる自然感染では、抗体の応答を刺激する露出した外膜タンパク質が殺菌および／または防御的な抗体として潜在的に重要な標的であり、したがって潜在的なワクチンの候補である。ＮＴＨｉの上皮細胞への付着の際に重要である高分子量タンパク質（ＨＭＷ１およびＨＭＷ２）のファミリーが、約７０から７５％のＮＴＨｉ菌株において同定されている（ｒｅｆ．９、ｒｅｆ．１０）。これらの高分子量アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ）は、中耳炎のチンチラモデルにおいていくらかの防御を可能にすることが分かっている（ｒｅｆ．１１）。高分子量アドヘシンタンパク質の第２のファミリーが、約２５％のＮＴＨｉおよび被包性インフルエンザ菌株において同定されている（ｒｅｆ．１２、ｒｅｆ．１３、ｒｅｆ．１４）。この第２のファミリーのＮＴＨｉメンバーは、インフルエンザ菌アドヘシンすなわちＨｉａと呼ばれ、被包性菌株において発見される相同タンパク質はインフルエンザ菌表面原繊維タンパク質すなわちＨｓｆと呼ばれる。ｈｉａ遺伝子は、中耳炎患者の回復期血清を使用して発現ライブラリーから最初にクローニングされ、このことはｈｉａ遺伝子が疾患における重要な免疫原であることを示す。プロトタイプのＨｉａおよびＨｓｆタンパク質は約８２％の配列類似性を示すが、Ｈｓｆタンパク質はかなり高い。これらのタンパク質には保存されたアミノ酸およびカルボキシ末端およびいくつかの繰り返しモチーフが含まれ、ＨｓｆはＨｉａと比較してより多くの繰り返し配列を含む。高分子量タンパク質（２００ｋＤａ）も、ＨｓｆおよびＨｉａタンパク質といくらかの配列相同性があるＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓから同定されている（米国特許第５，８０８，０２４号）。
【０００５】
ＨｉａおよびＨｓｆはインフルエンザ菌の被包性菌株および約２０〜２５％の非被包性菌株中で保存され、アドヘシンであることが示されているので、ＨｉａまたはＨｉａと特異的に反応する抗体を産生する能力のあるタンパク質を産生する、インフルエンザ菌または他の細菌性病原体によって引き起こされる疾患に対する診断および予防接種において、このタンパク質は有用性がある。
【０００６】
診断において有用であり予防接種における免疫原としてのアンチＨｉａ抗体を産生するために、診断において抗原としてＨｉａを使用することの欠点は、インフルエンザ菌種からの天然タンパク質の回収があまりできないことである。
【０００７】
他の免疫原用のワクチン、担体を含めた免疫調製、および診断試薬の生成において、抗原として使用するための組換えＨｉａタンパク質を提供することが有利であろう。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は組換えインフルエンザ菌アドヘシン（ｒＨｉａ）の提供を対象とする。
【０００９】
このような組換えタンパク質の提供に関して、本発明は単離され精製されたある種の核酸分子を提供する。したがってその一態様において、本発明は単離され精製された核酸分子を提供し、この核酸分子はインフルエンザ菌株のインフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしており、以下のものを含む。（ａ）図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７）からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または（ｂ）図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン（ｒＨｉａ）タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列。
【００１０】
このような核酸は、プラスミドベクターである可能性のあるベクター中に含まれていてよい。詳細には、分類不能型ヘモフィルスの菌株１１または３３からのＨｉａタンパク質を、核酸分子はエンコードしていてよい。
【００１１】
本発明の他の態様では、インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしており、１対のヌクレオチドによって増幅可能な単離され精製された核酸分子が提供される。ヌクレオチドは配列番号７と配列番号１５、配列番号９と配列番号１５、配列番号１１と配列番号１５、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４９、および配列番号５１からなる群から選択される。
【００１２】
このような核酸は、プラスミドベクターである可能性のあるベクター中に含まれていてよい。詳細には、分類不能型ヘモフィルスの菌株１１または３３からのコドンＶ３８またはＳ４４で始まるＮ末端切断型Ｈｉａタンパク質を、核酸分子はエンコードしていてよい。
【００１３】
本発明のこれらの態様に従って提供される単離され精製された核酸を組み込んでいるプラスミドベクターは、
図１Ａ中に示されるＤＳ−２００８−２−３
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１８６−１−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２２０１−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１８６−２−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１６８−２−６
図３２中に示される１Ａ−１９１−３−１
からなる群から選択されるプラスミドの同定特性を有する可能性がある。
【００１４】
本明細書で提供されるベクターは、大腸菌からのｃｅｒ遺伝子を含んでよい。したがって、本発明の他の態様では、完全長またはＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしている核酸分子、前記完全長または切断型Ｈｉａタンパク質を発現するためのプロモーター、任意選択で大腸菌のｃｅｒ遺伝子含む、宿主を形質転換するためのベクターが提供される。ベクターはプラスミドベクターまたは他の非複製ベクターであってよく、
図６Ａ中に示されるＢＫ−９６−２−１１
図７Ａ中に示されるＤＳ−２２４２−１
図７Ａ中に示されるＤＳ−２２４２−２
図８Ａ中に示されるＤＳ−２３４０−２−３
図９Ａ中に示されるＤＳ−２２４７−２
図９Ｂ中に示されるＤＳ−２４４８−１７
図３２中に示されるＪＢ−２９３０−３
からなる群から選択されるプラスミドベクターの同定特性を有する可能性がある。
【００１５】
本明細書で提供されるベクターは、サルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアまたはポリオウイルスからのベクターを含めた複製ベクターを含んでよい。
【００１６】
本明細書で提供される任意のベクターを使用して、完全長または切断型である可能性のある、ヘモフィルスの分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質を発現するのに適切な宿主細胞を形質転換することができる。このような宿主は、好都合には大腸菌であってよい。このような発現はＴ７プロモーターの制御下で行うことができ、形質転換された宿主からの組換えＨｉａの発現はラクトースまたは他の好都合な誘導剤の誘導用濃縮液中で培養することによって実施することができる。
【００１７】
本発明は他の態様において、形質転換された宿主、特に本明細書で提供される大腸菌によって産生される、分類不能型ヘモフィルス菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をさらに含む。このようなＨｉａタンパク質を組換えタンパク質の免疫原性断片またはアドヘシン官能性類縁体の形で提供することができる。
【００１８】
完全長またはＮ末端切断型である本明細書で提供される組換えＨｉａタンパク質は、免疫原性組成物中の抗原、他の免疫原用の担体、診断用薬としておよび診断用薬の生成において有用である。完全長またはＮ末端切断型であるＨｉａタンパク質をエンコードしている核酸分子も、診断のための使用用、および免疫原性組成物中においてもプローブとして有用である。
【００１９】
追加的な態様において本発明は、本明細書で提供されるのと同様な単離され精製された核酸分子、本明細書で提供されるのと同様なヘモフィルスの菌株の完全長またはＮ末端切断型である組換え防御性Ｈｉａタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的に活性のある成分、および薬学的に許容可能なこれらの担体を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００２０】
本明細書で提供される免疫原性組成物を、宿主へのｉｎ ｖｉｔｒｏ投与用ワクチンとして製剤化して、インフルエンザ菌に起因する疾患に対する防御を提供することができる。このような目的のために、組成物をミクロ粒子、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム調製物として製剤化することができる。免疫原性組成物を免疫系の特定の細胞または粘膜表面への送達用の標的分子と組み合わせて提供することができる。
【００２１】
本発明の免疫原性組成物（ワクチンを含めて）は少なくとも１種の他の免疫原性または免疫刺激性材料をさらに含んでよく、この免疫刺激性材料少なくとも１種のアジュバントまたは少なくとも１種のサイトカインであってよい。本発明で使用するのに適切なアジュバントには（これらに限らないが）リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ、その誘導体および成分、ＩＳＣＯＭマトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡおよびリポタンパク質ならびに他のアジュバントがある。
【００２２】
アジュバントの有利な組み合わせは、本出願人と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照（１９９５年１１月２１日発行のＷＯ ９５／３４３０８）により本明細書に組み込む１９９４年６月１６日出願の同時係続の米国特許第０８／２６１，１９４号、および１９９５年６月７日出願の第０８／４８３，８５６号に記載されている。
【００２３】
本発明の他の態様に従って、感受性のある宿主に有効量の前述の免疫原性組成物を投与するステップを含む、宿主中で免疫応答を生み出すための方法が提供される。免疫応答は体液の免疫応答であるか、または細胞を介する免疫応答であってよい。その内部で疾患に対する防御を与えることができる宿主には、ヒトを含めた霊長類がある。
【００２４】
本発明の他の態様に従って、薬剤として使用されるとき本明細書で提供される免疫原性組成物、および疫原性組成物の製造における免疫原性組成物のこれらの成分の使用法が提供される。
【００２５】
他の追加的な態様において本発明は、インフルエンザ菌の分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質の産生のための方法を提供し、この方法は
本明細書で提供されるのと同様な菌株のＮ末端切断型のインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸分子を含むベクターによって、大腸菌などの宿主を形質転換すること、
宿主を成長させてエンコードされている切断型Ｈｉａを発現させること、
発現したＨｉａタンパク質を単離および精製することを含む。
【００２６】
エンコードされている切断型Ｈｉａを封入体中で発現させることができる。成長し形質転換された細胞を破壊して上澄みおよびＨｉａを含む封入体を生成し、上澄みからの分離の後に封入体を可溶化して組換えＨｉａの溶液を生成し、クロマトグラフィによって細胞の残骸のない組換えＨｉａの溶液を精製し、精製された組換えＨｉａタンパク質を単離することによって、単離および精製ステップを実施することができる。
【００２７】
大腸菌などの宿主細胞を形質転換するベクターはＴ７プロモーターを含んでよく、大腸菌または他の宿主細胞を誘導量のラクトースまたは他の好都合な誘導剤の存在下で培養することができる。
【００２８】
本明細書のインフルエンザ菌の菌株は、菌株１１、３３、３２、２９、Ｍ４０７１、Ｋ９、Ｋ２２および１２からなる分類不能型菌株の群から選択することができる。このような菌株からの代表的なＨｉａタンパク質をエンコードしている遺伝子に特異的な核酸配列が、本明細書で提供され以下に記載される。
【００２９】
本明細書で提供される核酸配列は、診断に関する適用例において有用である。したがって本発明の他の態様では、サンプル中でインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸の存在を判定するするための方法が提供され、この方法は、
ａ）サンプルを本明細書で提供されるのと同様な核酸分子と接触させて、本明細書で提供される核酸配列、およびサンプル中に存在し特異的にハイブリダイズすることができるヘモフィルスの菌株のＨｉａタンパク質をエンコードしている核酸を含むデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）を生成するステップと、
ｂ）デュプレックスの生成を判定するステップを含む。
【００３０】
さらに本発明は、サンプル中でインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸の存在を判定するための診断キットを提供し、このキットは、
ａ）本明細書で提供されるのと同様な核酸分子と、
ｂ）核酸分子とサンプルを接触させて、この核酸分子および任意のこのような核酸分子を含むデュプレックスを生成するための手段と、
ｃ）デュプレックスの生成を判定するための手段をを含む。
【００３１】
本明細書で提供される組換えによって産生された切断型Ｈｉａタンパク質も、診断に関する適用例において有用である。したがって本発明の他の態様では、サンプル中のＨｉａタンパク質と特異的に反応する抗体の存在を判定するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）サンプルと本明細書で提供される組換えＨｉａタンパク質を接触させて、この組換えＨｉａタンパク質とサンプル中に存在しタンパク質と特異的に反応する任意のこのような抗体の複合体を提供するステップと、
（ｂ）複合体の生成を判定するステップを含む。
【００３２】
本発明の利点には以下のものがある。
【００３３】
インフルエンザ菌アドヘシンタンパク質またはこのＨｉａタンパク質の断片または類縁体をエンコードしている単離され精製された核酸分子、
他のいかなるヘモフィルスのタンパク質も含まない組換えによって産生されたＨｉａタンパク質、
ヘモフィルスの特異的な同定用の診断キットおよび免疫試薬。
【００３４】
本発明は、図面を参照しながら以下の記述からさらに理解されるはずである。
【００３５】
（発明の全般的な説明）
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株は、少量のＨｉａおよびＨｓｆタンパク質を発現するので、ＮＴＨｉ株由来のｈｉａ遺伝子を、Ｅ．Ｃｏｌｉ中で組み換えタンパク質を過剰発現させるための発現ベクター中にクローン化した。全長組み換えＨｉａ（ｒＨｉａ）タンパク質が発現する際、それは比較的少量であった。組み換えタンパク質が発現されているのを確認するために、本出願と同じ譲受人に譲受され、その開示を参照により本明細書に組み込む米国特許第５，８０８，０２４号で２００ｋＤａであると同定されたＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ高分子量アドヘシンタンパク質に対する抗体を用いてイムノブロットを実施した。ゲル精製した未変性２００ｋＤａタンパク質に対する抗体は、ｒＨｉａタンパク質サンプル中に特異的に誘導されたバンドを認識した。ｒＨｉａの収量はＴ７ｈｉａ遺伝子カセットの遺伝子コピー数を増加させることによっても顕著には増加しない。
【００３６】
Ｅ．Ｃｏｌｉのｃｅｒ遺伝子は、大きな挿入部を含むプラスミドを安定化するが（参考文献１５）、Ｅ．Ｃｏｌｉのｃｅｒ遺伝子を発現ベクターに添加しても、ｒＨｉａの収量は顕著には増加しない。しかし、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞は培養中に凝集し、このことは、Ｈｉａアドヘシンタンパク質の表面発現が起きていることを示唆している。ｒＨｉａタンパク質が封入体として生成されればｒＨｉａタンパク質の強い毒性は克服されるので、推定シグナル配列を欠失させるために遺伝子の５’−末端を切断した。この変性の結果、Ｖ３８位置から出発している切断型ｒＨｉａの生産および回収が良好となった。
【００３７】
全長およびＶ−３８切断型ｒＨｉａタンパク質は免疫原性であり、得られる抗−ｒＨｉａ抗体は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｒｎｚａｅのタイプａまたはタイプｂ株による菌血症の受動的幼ラットモデルを防護する。さらに、切断型Ｖ３８ｒＨｉａタンパク質は、チンチラの能動的抗原投与モデルにおける鼻咽頭コロニー形成に対して特に防護に働くことが見出された。ＮＴＨｉ株からのｒＨｉａによってもたらされる防護が、ＮＴＨｉおよび被包性タイプａまたはタイプｂ株が原因となって起こる疾患に対するものであることは、一般的な防護エピトープが存在することを意味している。付加的なｈｉａ遺伝子のクローニングおよび配列分析は、保存領域の同定の助けとなる。全長またはＮ−末端切断型ｒＨｉａタンパク質を、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ疾患に対する防護のためのワクチン成分として使用できる。
【００３８】
ｈｉａ遺伝子を有する任意のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、少なくとも本発明の態様で特徴付けるＨｉａタンパク質をコードする部分を含有する核酸分子（おそらくＤＮＡ分子の形）の精製および単離に利用できる。このような株は一般的な臨床所およびバクテリア培養収集所、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手される。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの適切な株：
分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株１１；
分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株３３；
分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株３２；
分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株２９；
分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株  Ｍ４０７１；
分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株  Ｋ９；
分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株  Ｋ２２；
分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株  １２；
タイプＣ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  株  ＡＰＩ。
【００３９】
本明細書において、“Ｈｉａ”タンパク質という用語は、Ｈｉａタンパク質のファミリーを定義するために使用され、Ｈｉａタンパク質には種々のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株中で見出されるアミノ酸配列を有する天然の変異体が含まれる。
【００４０】
図１Ａは、Ｔ７プロモーターの影響下での、分類不能型  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株１１由来全長ｈｉａ遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２００８−２−３の制限地図を示す図である。株１１由来のｈｉａ遺伝子の核酸（配列番号：４３）および推測アミノ酸配列（配列番号：４４）は、前記米国特許第５，６４６，２５９に記載されている（該明細書中では“ＨＡ１”と定義される）。ｈｉａ遺伝子を株１１の遺伝子のＡＴＧ開始コドンからＰＣＲ増幅するために使用したオリゴヌクレオチドを、図１Ｂに示す。
【００４１】
図２は、抗−未変性Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ高分子量アドヘシン抗体によりｒＨｉａ（１１）タンパク質を確認するためのイムノブロットを示す図である。前記米国特許第５，８０８，０２４に記載される、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ高分子量アドヘシンタンパク質または２００ｋＤａタンパク質は、ＨｉａおよびＨｓｆタンパク質と、特にカルボキシ末端部に、何らかの配列相同性を有する（図２８）。
【００４２】
図３は、ＮＴＨｉ株１１由来の全長ｈｉａ遺伝子から成るＴ７ｈｉａ遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ−２０９２−１およびＤＳ−２０９２−４０の構築スキームを示す図である。増加した遺伝子コピー数を示すこのようなプラスミドは、しばしば組み換えタンパク質の生産レベルを上昇させる。しかし、以下に示すように、組み換えＨｉａの低い収率は、遺伝子コピー数の増加によって顕著には増加しない。
【００４３】
図４は、ＮＴＨｉ株１１タンパク質のＮ−末端配列および経時的にＮ−末端切断されたｒＨｉａタンパク質の位置を示す図である。Ｅ２１部分までのＮ−末端切断型は、Ｈｉａのシグナル配列の構成部分であると考えられる長い疎水性領域が欠失している。Ｔ３３部分までの欠失は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡｌａ−Ｘ−Ａｌａシグナル切断部位を有する。Ｖ３８部分までの欠失は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡｌａ−Ｘ−Ａｌａシグナル切断部位を有する。Ｓ４４部分から始まる組み換えＨｉａタンパク質は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡｌａ−Ｘ−Ａｌａシグナル切断部位を有する。Ｎ５２部分から始まる組み換えＨｉａタンパク質は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の高分子量（２００ｋＤａ）アドヘシンの近接した開始点を模倣しており、アドヘシンは米国特許第５，８０８，０２４に記載され、該組み換えタンパク質は、Ｖ５６から開始するようにＮ−末端切断型されている場合に過剰発現する。
【００４４】
図５Ａは、４種のＮ―末端切断型ｒＨｉａを製造するための、プラスミドＤＳ−２１８６−１−１、ＤＳ−２２０１−１、ＤＳ−２１８６−２−１、およびＤＳ−２１６８−２−６を作製するための構築スキームを示す図である。５’−末端フラグメントをＰＣＲ増幅するために使用されるこのオリゴヌクレオチドを図５Ｂに示す。図３０は、Ｓ４４欠失を製造する、プラスミドＪＢ２９３０−３を作製するための構築スキームを示す図である。５’−フラグメントをＰＣＲ増幅するために使用するオリゴヌクレオチドを図２９に示す。
【００４５】
図６Ａは、ＮＴＨｉ株１１由来のＶ３８ｈｉａ遺伝子ならびにプラスミドを安定化するＥ．Ｃｏｌｉ ｃｅｒ遺伝子を含むプラスミドＢＫ−９６−２−１１を作製するための構築スキームを示す図である。毒性のタンパク質を産生するプラスミドへのｃｅｒ遺伝子の導入により、タンパク質産生の強化が予測された。ｃｅｒ遺伝子の存在下で全長ｒＨｉａ産生Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞の形態に変化が生じ、すなわち細胞が凝集した。このことは、凝集を起こす細胞表面のアドヘシンの発現が強化されたことを示唆する。発現プラスミドＢＫ−９６−２−１１はさらに、遺伝子安定性を高めると考えられているＴ７Ｖ３８ｈｉａ遺伝子カセットの上流および下流に転写ターミネーターを含んでいる。マルチクローニング部位および転写ターミネーターを作製するために使用されるオリゴヌクレオチドを図６Ｂに示す。
【００４６】
図７Ａは、Ｔ７プロモーターの影響下に、分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株３３由来の全長ｈｉａ遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２２４２−１およびＤＳ−２２４２−２のための構築スキームを示す図である。発現プラスミドは、Ｔ７ｈｉａ（３３）遺伝子カセットの上流および下流にＥ．Ｃｏｌｉ ｃｅｒ遺伝子および形質転換ターミネーターをも含有する。ＤＳ−２２４２−１は、Ｔ７ｈｉａ（３３）遺伝子と同一の鎖上にコードされたターミネーターを有する。しかし、２つのプラスミドに由来するｒＨｉａの発現には違いが見られなかった。ＮＴＨｉ株３３の真性５’末端の構築に使用されるオリゴヌクレオチドを図７Ｂに示す。
【００４７】
図８Ａは、ＮＴＨｉ株３３由来のＶ３８Ｈｉａ遺伝子ならびにＥ．Ｃｏｌｉ ｃｅｒ遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２３４０−２−３のための構築スキームを示す図である。Ｔ７Ｖ３８ｈｉａ遺伝子カセットの上流および下流の同一の鎖上に転写ターミネーターも存在する。ＮＴＨｉ株３３ｈｉａ遺伝子をＶ３８コドンからＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを図８Ｂに示す。
【００４８】
図９は、Ｔ７Ｖ３８ｈｉａ（１１）またはＴ７Ｖ３８ｈｉａ（３３）遺伝子カセットのタンデムコピーをそれぞれ含有するプラスミドＤＳ−２４４７−２およびＤＳ−２４４８−１７の構築を示す図である。
【００４９】
図１０、パネルＡは、ＮＴＨｉ株１１由来の全長または切断型ｈｉａ遺伝子をコードするプラスミドからのｒＨｉａタンパク質の産生を示す図である。全長ｒＨｉａ（１１）タンパク質の産生は非常に低かった。Ｅ２１およびＴ３３切断型ｒＨｉａタンパク質の場合も発現は低かった。しかし、Ｖ３８およびＮ５２切断型ｒＨｉａタンパク質は顕著に改善された発現レベルを示す。図１０、パネルＢから明らかなように、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）の産生は、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｃｅｒ遺伝子を発現プラスミドへ添加した場合に明らかに増加している。
【００５０】
図１１は、封入体として製造されるｒＨｉａタンパク質の精製スキームを示す図である。細胞を、超音波破砕により溶解し、封入体を連続した抽出により精製した。封入体を、グアニジニウムクロライド中に溶解し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加して不純物を沈殿させた。（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加によりｒＨｉａが沈殿し、粗ｒＨｉａをさらにゲル濾過により精製した。
【００５１】
図１２は、株１１および３３由来の精製されたＶ３８ｒＨｉａタンパク質を示す図である。封入体はレーン３に示され、最終精製タンパク質はレーン４に示される。精製されたタンパク質の推定純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデンシトメトリーにより測定して、約９０％を上回る。
【００５２】
図１３は、ここに記載されるようにして製造されたｒＨｉａタンパク質の、グリセロールを添加した場合としない場合でかつ４℃で、およびグリセロールを添加して−２０℃で８週間貯蔵する際の安定性に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。タンパク質はいずれの条件でも安定である。
【００５３】
図１４は、ＣＤ−１マウス中の株１１および３３由来Ｖ３８ｒＨｉａタンパク質の免疫原性を示す図である。０．３〜１０μｇの用量では、いずれのタンパク質でも、１ないし２回投与した後に強い免疫応答を示す。これらのレベルでは顕著な用量応答は認められない。同様の結果が、ＢＡＬＢ／ｃマウス（図１５Ａ）およびモルモット（図１５Ｂ）でも見られ、このことはｒＨｉａが投与量あたり０．３μｇであっても強い免疫原性を有することを示唆している。
【００５４】
図１６は、Ｖ３８ｒＨｉａ（３３）によってもたらされる、ＮＴＨｉ株３３が引き起こすコロニー形成に対する防護を示す図である。Ｙａｎｇ 等（参考文献２０）が記載しているように、チンチラ鼻咽頭コロニー形成モデルは、この疾患の初期の段階での防護を評価するために開発された。このモデルは、最初に、ｈｍｗ遺伝子を発現するＮＴＨｉ株のために確立され、ｈｉａ遺伝子を発現するＮＴＨｉ株に適応させなければならなかった。プロトタイプｈｍｗ−発現株（ＮＴＨｉ１２）における感染の確立には１０２〜１０８ｃｆｕを使用するが、ＮＴＨｉ３３株の場合には５×１０８ｃｆｕが必要であり、このような高レベルであってもプロトタイプｈｉａ−発現株１１では感染が確立されない。１００μｇ量で免疫化コホートは明らかに部分的に防護されるが、５０μｇ量では防護されない。疾患の初期の段階でのこのような防護は、ワクチン抗原としてのｒＨｉａアドヘシンの利用性を示している。
【００５５】
図１７は、別のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｈｉａ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。配列は、ＨｉａおよびＨｓｆタンパク質の保存アミノ酸およびカルボキシ末端配列に基づいている。
【００５６】
図１８は、ＮＴＨｉ株３３ｈｉａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図１９は、ＮＴＨｉ３２ｈｉａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２０は、ＮＴＨｉ株２９ｈｉａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２１は、ＮＴＨｉ株  Ｍ４０７１ｈｉａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２２は、ＮＴＨｉ株  Ｋ９ｈｉａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２３は、ＮＴＨｉ株  Ｋ２２ｈｉａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２４は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  タイプｃ株ＡＰＩｈｉａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２５は、ＮＴＨｉ株１２由来のｈｉａ座の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。ＰＣＲ増幅されたフラグメントは、ｈｉａ遺伝子の３’−末端へ連結したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｄ株ＲｄゲノムのＨＩ１７３３遺伝子に関連する遺伝子の３’−末端を含有する。ＨＩ１７３３タンパク質の上流ＯＲＦのアラインメントを図２７に示す。
【００５７】
図２６は、前記米国特許５，６４６，２５９に記載されるような、ＮＴＨｉ株１１由来のＨｉａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【００５８】
図２８は、Ｈｓｆ、Ｈｉａから推定されるタンパク質の配列のアラインメント、およびＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ２００ｋＤａタンパク質の部分配列を示す図である。
【００５９】
本発明の種々の実施態様を、ワクチン摂取、診療、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ感染の治療、免疫剤の製造の分野の応用に利用できることは、当業者に明らかである。このような使用について以下に述べるが、これに限定するものではない。
【００６０】
ワクチンの製造および使用
ワクチンとして使用するのに好適な免疫原性組成物は、ここに記載されるような、分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株の免疫原性組み換えＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅアドヘシン（ｒＨｉａ）タンパク質、その免疫原性類似体およびフラグメントおよび／または免疫原性ペプチドから製造できる。ワクチンは免疫応答を誘起し、これにより抗−ｒＨｉａ抗体およびオプソニン化または死菌化された抗体を含む抗体が産生される。
【００６１】
ワクチンを含む免疫原性組成物は、液体溶液またはエマルジョンのような注入可能な形で製造できる。ｒＨｉａタンパク質、その免疫原性類似体およびフラグメントおよび／または免疫原性ペプチドを、製薬学的に認容性の添加剤と混合してよく、該添加剤はｒＨｉａタンパク質、免疫原性フラグメント類似体または免疫原性ペプチドと混和性である。このような添加物には、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれる。
【００６２】
免疫原性組成物およびワクチンはさらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンの効果を増強するためのアジュバントを含有してよい。
【００６３】
免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射または筋肉内注射のような非経口投与が可能である。また、本発明で製造される免疫原性組成物を処方し、粘膜表面で免疫応答を喚起する方法で輸送する。従って、免疫原性組成物は例えば鼻または口（胃）のような経路で粘膜表面に適用してよい。
【００６４】
免疫原性組成物は免疫系の特異的な細胞または粘膜表面へ輸送するために、標的分子と組み合わせてよい。標的分子には、ＷＯ９２／１７１６７に記載されるような（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ． Ｌｔｄ．）、ビタミンＢ１２およびバクテリア毒素、および米国特許第５，１９４，２５４（Ｂａｒｂｅｒ等）に記載されるようなモノクローナル抗体が含まれる。
【００６５】
また、座剤および経口処方を含む別の投与形態が望ましい。座剤には、結合剤および担体が含まれていてよく、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドである。経口処方には、一般的に使用される添加剤、例えば製薬学的な量のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムが含まれてよい。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続性製剤または粉剤の形で投与され、ｒＨｉａタンパク質、フラグメント類似体および／またはペプチドを約１〜９５％含有する。
【００６６】
ワクチンは、投与処方に適合する方法で、治療効果、防護および免疫原性として機能する量で投与される。投与量は治療対象、例えば個人の免疫系の抗体合成能力および必要であれば細胞−仲介免疫応答の発現能力により変化する。投与に必要とされる活性成分の適切な量は、専門医の評価に依存する。しかし、好適な投与範囲は当業者により容易に決定可能であり、ｒＨｉａ、その類似体およびフラグメントおよび／またはペプチドはマイクログラム程度でよい。初期投与およびブースター投与のための好適な治療法も効果的であるが、初期投与には連続投与も含まれる。ワクチンの投与量は、投与経路に依存し、宿主の大きさによっても変化する。
【００６７】
分類不能型ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓのｒＨｉａタンパク質をコードする核酸分子を免疫化に直接使用してよく、その際、ＤＮＡを直接投与、例えば遺伝子的免疫化として注入するかまたは生ベクター、例えば核酸分子を含むサルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアまたはポリオウイルスを構築する。異種抗体を免疫系へ運ぶために使用される数種の生ベクターについては、例えばＯ，Ｈａｇａｎ（１９９２）（参考文献１６）に議論されている。遺伝子的免疫化のための、ＤＮＡの被検対象への直接的な注入方法は、例えばＵｌｍｅｒ等、１９９３（参考文献１７）に記載されている。
【００６８】
抗原と一般的にリン酸バッファー生理食塩水中の０．０５〜１．０％溶液として使用されるアジュバントとを同時に投与することにより、免疫原性は著しく向上する。アジュバントは抗原の免疫原性を強化するが、それ自体は免疫原性を必ずしも有さない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くに局所的に維持することにより、抗原の免疫系の細胞へのゆっくりとした継続的な放出を助ける、蓄積効果を生み出す。アジュバントはまた、免疫系細胞を蓄積した抗原へと誘引し、そのような細胞を刺激して免疫応答を促す。
【００６９】
免疫促進剤またはアジュバントは、宿主の免疫応答を向上させるために長年使用されてきており、例えばワクチンが挙げられる。内因性アジュバント、例えばリポポリサッカライドは、一般的にワクチンとして使用される死菌または弱毒化バクテリアの成分である。外因性アジュバントは、典型的に、抗原と非−共役結合した免疫調節物質であり、宿主の免疫応答を強化するために処方される。従って、アジュバントは非経口的に導入された抗体への免疫応答を強化するものである。これらのアジュバントのいくつかは毒性であり、不所望の副作用を起こすので、ヒトおよび多くの動物に使用するのは不適当である。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（まとめて一般的にアルムと称される）のみが、ヒトおよび家畜用のワクチン中にアジュバントとして慣用される。アルムによるジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答の増強は、よく確立されている。
【００７０】
外因性アジュバントの多くは抗原に対する潜在的な免疫応答を呼び起こす。これらには、前記した特異的アジュバントならびに膜タンパク質抗原と複合するサポニン（免疫刺激複合体）、鉱油を含む複合ポリマー、死んだ微生物および鉱油、フロイドの完全アジュバント、微生物の生成物、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）ならびにリピドＡおよびリポソームが含まれる。
【００７１】
効果的に体液性免疫応答（ＨＩＲ）および細胞−仲介免疫（ＣＭＩ）を誘導するには、免疫原をアジュバント中に乳化させる。多くのアジュバントは毒性であり、肉芽腫、急性および慢性の炎症（フロイドの完全アジュバント、ＦＣＡ）、細胞溶解（サポニンおよび複合ポリマー）および発熱、関節炎および前ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）を引き起こす。ＦＣＡは優れたアジュバントであり研究に汎用されるが、その毒性のために、ヒトまたは家畜用ワクチン中に使用することを許可されていない。
【００７２】
理想的なアジュバントの所望の特徴は：
（１）毒性の欠如；
（２）長期にわたる免疫応答刺激能力；
（３）製造の容易性および長期貯蔵における安定性；
（４）種々の経路で投与された抗原に対して、ＣＭＩおよびＨＩＲの両方を誘起する能力；所望であれば、
（５）他のアジュバントとの相乗作用；
（６）抗原提示細胞（ＡＰＣ）群と選択的に相互作用する能力；
（７）適切なＴＨ１またはＴＨ２細胞−特異的免疫応答を特異的に誘起する能力；および
（８）抗原に対する適切な抗体イソタイプレベル（例えば、ＩｇＡ）を選択的に増加させる能力
である。
【００７３】
参照することでここに組み込んだものとする、Ｌｏｃｋｈｏｆｆ等の１９８９年８月８日付けの米国特許第４，８５５，２８３には、免疫調節剤またはアジュバントとして、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシルウレアおよびＮ−グリコシルカルバメートを含む糖脂質類似体が記載され、それぞれ糖残基をアミノ酸で置換されていてよい。また、Ｌｏｃｋｈｏｆｆ等、１９９１（参考文献１８）は、天然の糖脂質と構造的類似性を有するＮ−糖脂質類似体、例えばグリコスフィンゴリピドおよびグリコグリセロリピドが、ヘルペス単純ウイルスワクチンおよび偽性狂犬病ウイルスワクチンの両方で強い免疫応答を誘起することを報告している。ある種の糖脂質は長鎖−アルキルアミンと脂肪酸とから合成され、芳香族炭素を介して糖と直接結合し、天然の脂質残基の機能を模倣する。
【００７４】
本出願と同じ譲受人に譲渡され、参照により本明細書に組み込む、Ｍｏｌｏｎｙ等による米国特許第４，２５８，０２９には、破傷風トキソイドおよびホルマリン不活化タイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩポリオウイルスワクチンと複合させた場合に、オクタデシルチロシンヒドロクロライド（ＯＴＨ）がアジュバントとして機能することが記載されている。またＮｉｘｏｎ−Ｇｅｏｒｇｅ等、１９９０（参考文献１９）は、組み換えＢ型肝炎表面抗原と組み合わせた、芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ型肝炎ウイルスに対する宿主の免疫応答を強化することを報告している。
【００７５】
イムノアッセイ
本発明により製造されるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓの分類不能型株のｒＨｉａタンパク質、その類似体およびフラグメントは、免疫原性として、酵素結合性免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非−酵素結合性抗体結合アッセイまたは抗菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、および／またはＨｉａ抗体を検出するための従来公知の方法を含むイムノアッセイ中の抗原として、有用である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、Ｈｉａタンパク質、類似体およびフラグメントを、選択された表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートの壁面のようなタンパク質またはペプチドが結合可能な表面上へ固定する。不完全に吸着されているＨｉａタンパク質、類似体および／またはフラグメントを除くために洗浄し、その後、非特異的タンパク質、例えば試験サンプルに対する抗原性が中性であることを知られているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼイン溶液を選択表面へ結合させてよい。これにより、固定表面上の非特異的吸着部位が遮断され、結果的に、表面上への抗血清の非特異的結合によって起こるバックグラウンドが減少する。
【００７６】
次いで固定表面を、臨床または生化学的材料のようなサンプルと接触させ、免疫複合体（抗原／抗体）の形成が起こる方法で試験する。この際、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎのような希釈剤でサンプルを希釈してよい。サンプルを次に約２５℃〜３７℃程度の温度で約２〜約４時間インキュベートする。インキュベートに続き、サンプル−接触表面を洗浄して、非−免疫複合材料を除去する。洗浄方法には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、またはホウ酸バッファーのような溶液による洗浄が含まれてよい。
【００７７】
試験サンプルと結合Ｈｉａタンパク質、類似体および／またはフラグメントとの間に特異的な免疫複合体が形成された後、次いで洗浄し、複合体形成の出現およびその量を、一次抗体に特異的な二次抗体を免疫複合体へ添加することにより測定する。試験サンプルがヒト起源である場合、二次抗体はヒトイムノグロブリンに特異的な抗体であり、一般的にＩｇＧである。検出可能にするために、二次抗体は、例えば適当な発色性物質とインキュベートすることにより呈色が見られるような酵素活性等の関連活性を有する。定量化は、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて呈色の度合いを測定することにより実施される。
【００７８】
ハイブリダイゼーションプローブとしての配列の使用
本発明のヌクレオチド配列は、新規に単離および特徴付けされたｈｉａ遺伝子配列を含有し、他のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ分類不能型株から、ｈｉａ遺伝子を同定およびクローニングすることができる。
【００７９】
本発明のｈｉａ遺伝子配列を含有するヌクレオチド配列は、その能力のために、他のｈｉａ遺伝子の補足的部分と倍体分子を選択的に形成するのが有用である。適用に応じて、種々のハイブリダイゼーション条件を利用し、他の分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株中の別のｈｉａ遺伝子のための、プローブの選択性の度合いを変化させる。高い選択性のためには、比較的厳しい条件を利用して倍体を形成し、例えば低塩および／または高温条件、例えばＮａＣｌ  ０．０２Ｍ〜０．１５Ｍでありかつ約５０〜７０℃の温度という条件が挙げられる。ある種の適用では、それほど厳しいハイブリダイゼーション条件は必要とされず、例えば０．１５〜０．９Ｍの塩で２０〜５５℃の温度範囲でよい。ハイブリダイゼーション条件は、ホルムアミドの添加量が増加すると、ハイブリッドした倍体が不安定になるので、より厳しい条件が必要とされる。従って、特定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作でき、所望の結果に応じて方法を選択するのが一般的である。一般的に、便利なハイブリダイゼーション温度は、５０％ホルムアミドの存在下かつＮａＣｌ  ０．１５Ｍで：ｈｉａ遺伝子が標的核酸フラグメントと９５〜１００％の相同性を有する場合に４２℃、９０〜９５％の相同性で３７℃および８５〜９０％の相同性で３２℃である。
【００８０】
臨床診断の態様において、本発明のｈｉａ遺伝子の核酸配列は、適当な手段、例えばハイブリダイゼーションを測定するための標識、と組み合わせて利用してよい。種々の適当な指示手段が知られており、放射活性、酵素または他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンが含まれ、検出可能なシグナルの提供を可能にする。ある診断の態様において、放射活性タグの代わりに、酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリンホスファターゼまたはペルオキシダーゼを使用してもよい。酵素タグの場合、肉眼または分光光度計で視覚的に捉えられ、Ｈｉａ遺伝子配列を含むサンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを同定できる手段として使用されるものとして、発色指示物質が公知である。
【００８１】
本発明のＨｉａ遺伝子核酸配列は、溶液ハイブリダイゼーション中のハイブリダイゼーションプローブとして、および液相法で使用される態様として有用である。固相法に関する態様において、滲出液、体液（例えば血清、羊水、中耳滲出液、唾液、気管支肺胞洗浄液）または組織のような臨床サンプルを含むサンプルの試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を、選択したマトリクスまたは表面へ吸着あるいは固定させる。固定された一本鎖核酸を、次いで、所望の条件下に、本発明のｈｉａ遺伝子またはそのフラグメントの核酸配列を含む選択プローブと特異的にハイブリダイゼーションさせる。選択する条件は、例えばＧ＋Ｃ含量、標的核酸のタイプ、核酸源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさ等に応じて必要とされる特定の基準に基づく特定の状況に応じて変化する。続いてハイブリダイゼーション表面を洗浄して非特異的に結合したプローブ分子を除去し、標識の手段により、特異的ハイブリダイゼーションを検出または定量化する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種で保存されている核酸配列部分を選択するのが好ましい。選択されたプローブは、少なくとも長さ１８ｂｐであり、多くの場合３０〜９０ｂｐ長さである。
【００８２】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅアドヘシン遺伝子の発現
宿主細胞に適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を、発現系中のｈｉａ遺伝子の発現に利用してよい。ベクターは、通常、複製部位ならびに形質転換細胞中の表現型の選択を行うマーカー配列を有する。例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２を使用して形質転換でき、従って、形質転換細胞を同定するための簡易な方法を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージは、宿主細胞が自身のタンパク質を発現させるために使用できるプロモーターも含有するか、または含有するように変性する。
【００８３】
さらに、宿主細胞に適合性のレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主と一緒に形質転換ベクターとして使用できる。例えば、ラムダＧＥＭＴＭ−１１中のファージを、Ｅ．ＣｏｌｉＬＥ３９２のような宿主細胞を形質転換させるために使用できる組み換えファージベクターを製造するために使用してよい。
【００８４】
組み換えＤＮＡ構築体中で一般的に使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステムおよび他の微生物プロモーター、例えばここで好ましい態様として使用されるＴ７プロモーターシステム（米国特許第４，９５２，４９６）が含まれる。プロモーターのヌクレオチド配列の詳細は公知であり、当業者にはそれらを遺伝子を用いて機能的に結合することが可能である。使用される特定のプロモーターは、一般的に、所望の結果に応じて選択されたプロモーターである。Ｈｉａタンパク質および免疫学的フラグメントまたはその類似体の発現に適当な宿主には、Ｅ．Ｃｏｌｉが含まれ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｕ種、菌体、酵母またはバクロウイルスシステムを使用してもよい。Ｅ．Ｃｏｌｉがここで使用される好ましい宿主である。
【００８５】
本発明において、特にＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種を培養して精製した天然Ｈｉａタンパク質が微量の毒性物質または他の汚染物質を含む場合に、Ｈｉａタンパク質の製造は、組み換え法によるのが好ましい。この問題点は、組み換えにより製造されたＨｉａタンパク質を異種システム中で使用することにより解決され、この際、Ｈｉａタンパク質は、特に記載された構築体を使用して、精製物質中の汚染物質を最小化する方法で宿主から単離される。
【００８６】
微生物寄託
ここに記載し参照した分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ株の高分子量タンパク質をコードする核酸を含むベクターを、本明細書の出願に先立って、ブタペスト条約に従い、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｆｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９、米国に所在するＡｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託した。寄託されたベクターのサンプルは、公共に利用可能であり、課される全ての制限または寄託物を利用する権利は、この米国特許出願に基づく特許の許可を受けることとする。さらに、受託者が生存可能なサンプルを分配できない場合には、寄託物を受託者に戻すこととする。寄託された実施形態は本発明を例示するためだけのものであるので、本明細書に記載および請求された発明が、寄託された生物材料によって範囲を限定されることはない。本出願の記載と等価または同等な抗原をコードする核酸を含むいずれの等価または類似のベクターも本発明の範疇に入るものとする。
寄託概要
2004529601.tif 000002
実施例
上記の開示は概して本発明を説明している。以下の特定した実施例を参照するとさらに完全な理解が得られる。これらの実施例はただ例示の目的で説明されるものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。状況によって形状の変化および同等品への置き換えを図ることで好都合なことを示唆できるかまたは提供できる。ここでは特殊な用語を使用したが、そのような用語は説明的感覚で使用するつもりであって限定を目的とするものではない。
【００８７】
本開示およびこれらの実施例には明記していないが、使用した分子遺伝学、蛋白質生化学、免疫学および発酵技術による方法は科学文献で広く報告されており、当業者の能力に充分に保有されたものである。
【００８８】
実施例１
この実施例はＮＴＨｉ菌株１１由来の全長のそろったｒＨｉａ蛋白質を発現するプラスミドＤＳ−２００８−２−３の構造を説明するものである。
【００８９】
ＮＴＨｉ菌株１１から染色体ＤＮＡを精製し、図１Ｂに記載したオリゴヌクレオチド（５０３８．ＳＬおよび５０３９．ＳＬ）を使用して全長のそろったｈｉａ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ｐＴ７−７発現ベクター（ｒｅｆ．２１）にクローン化するためにＮｄｅ  Ｉ部位をこの遺伝子の５’末端で設計し、ＢａｍＨ  Ｉ部位を３’末端で設計した。増幅した断片をＮｄｅ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉで切断し、同じ酵素で切断したｐＴ７−７にクローン化した。プラスミドＤＳ−２００８−２−３はＴ７プロモーターの下流に３．４ｋｂの１１株ｈｉａ遺伝子を含む（図１Ａ）。このプラスミドは組換えＨｉａを発現するために使用した（下記の実施例９）。
【００９０】
実施例２
この実施例は抗Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ野生株高分子量アドヘシン抗体によるｒＨｉａの識別を例示するものである。
【００９１】
インフルエンザ菌のＨｉａ蛋白質と前述した米国特許第５，８０８，０２４号の中でＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ２００ｋＤａ蛋白質として分類されるＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ高分子量アドヘシン（図２８）との間にはいくらかの配列不変性が認められる。米国特許第５，８０８，０２４号の記載では、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ野生株２００ｋＤａ蛋白質がゲル精製され、テンジクネズミの抗野生株２００ｋＤａ抗体が生成された。Ｔ７  ｈｉａ遺伝子はプラスミドＤＳ−２００８−２−３から発現され、ｒＨｉａ蛋白質を含む細胞培養物がニトロセルロース膜に電気泳動的に転写された。抗野生株２００ｋＤａ抗体を使用した免疫ブロット分析から、この抗体が図２に見られるように、ｒＨｉａ蛋白質を認識することが示された。
【００９２】
実施例３
この実施例はＴ７  ｈｉａ（１１）遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ−２０９２−１およびＤＳ−２０９２−４０の構造を説明するものである。
【００９３】
全長のそろった組換えＨｉａ蛋白質の生成を向上させるために、菌株１１のｈｉａ遺伝子（実施例１）を含むＴ７  ｈｉａ遺伝子カセットのタンデムコピーを単一のベクターに挿入した。プラスミドＤＳ−２００８−２−３をＢｇｌ  ＩＩで直線化させ、脱リン酸化した。プラスミドＤＳ−２００８−２−３はまた、Ｔ７  ｈｉａ遺伝子カセットを切り取るためにＢｇｌ  ＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉによっても切断された。このＴ７  ｈｉａ断片を直線化したベクターに連結し、反時計回り方向に配向して２つのＴ７  ｈｉａ遺伝子コピーを含むプラスミドＤＳ−２０９２−１（ａ，ａ）および反対方向に配向してタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ−２０９２−４０（ａ，ｃ）（図３）を生成した。どちらの作製試料からもｒＨｉａ発現における顕著な向上は認められなかった（下記の実施例９参照）。
【００９４】
実施例４
この実施例は末端欠失した菌株１１のｈｉａ遺伝子を発現するプラスミドの作製を説明するものである。
【００９５】
Ｔ７  ｈｉａ遺伝子カセットの単一またはタンデムのコピーからのｒＨｉａ蛋白質生成量は非常に低く、この蛋白質は（下記の実施例９で説明するように）Ｅ．ｃｏｌｉに対する毒性を有するようであった。インフルエンザ菌のＨｉａは表面露出したアドヘシン分子であるので、分泌をするためにはシグナル配列または補助蛋白質のいずれかを使用しなければならないが、しかし関連の補助遺伝子は判明していない。もしもＥ．ｃｏｌｉ中での組換え蛋白質発現のためにシグナル配列が除去された場合、ｒＨｉａは封入体として発現され、毒性効果が低減される可能性がある。推定されるシグナル配列および切断部位を分類し、Ｎ末端で末端欠失したｒＨｉａ蛋白質を発現する４種類の作製試料を設計した（図４）。菌株１１のｈｉａ遺伝子では開始コドンから約５００ｂｐに独特のＳｔｙ  Ｉ切断部位が存在する。プラスミドＤＳ−２００８−２−３をＮｄｅ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉで切断し、５．７ｋｂのベクター断片を精製した（図５Ａ）。末端欠失部位からＳｔｙ  Ｉ切断部位までを増幅するためにＰＣＲプライマーを設計し、末端欠失したクローンを選別するためにアンチセンスプライマーに独特のＮｈｅ  Ｉ切断部位を導入した（図５Ｂ）。増幅した断片は、より操作を容易にするためにｐＣＲＩＩ中でサブクローン化し、プラスミドＤＳ−２１５３Ｒ−１−２（Ｅ２１）、ＤＳ−２１６５−４−８（Ｔ３３）、ＤＳ−２１５３−３−５（Ｖ３８）、およびＤＳ−２１５３−４−４（Ｎ５２）を生成した。このｐＣＲＩＩ  ｈｉａプラスミドをＮｄｅ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉで切断し、断片をＤＳ−２００８−２−３から得たベクター片と連結した。プラスミドＤＳ−２１８６−１−１（Ｅ２１）、ＤＳ−２２０１−１（Ｔ３３）、ＤＳ−２１８６−２−１（Ｖ３８）、およびＤＳ−２１６８−２−６（Ｎ５２）を、カッコ内に示したＴ７プロモーターおよび末端欠失したｈｉａ遺伝子を含ませて生成した。これらのプラスミドは組換えＨｉａを発現させるために使用した（下記の実施例９参照）。
【００９６】
実施例５
この実施例はＴ７  Ｖ３８  ｈｉａ（１１）カセット、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＢＫ−９６−２−１１の作製を説明するものである。
【００９７】
プラスミドＤＳ−１８４３−２は多数のクローン化部位および２つの転写終結部がＥｃｏＲ  ＩおよびＰｓｔ  Ｉ部位の間でオリゴヌクレオチド上に導入され、これによってクロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子の両方が破壊されたｐＢＲ３２８を基にしたプラスミドである（図６Ｂ）。ｐＵＣ−４Ｋから得たカナマイシン耐性遺伝子をＳａｌ  Ｉ部位に挿入し、カナマイシン耐性でかつテトラサイクリン感受性のプラスミドＤＳ−２１４７−１を生成した。プラスミドＤＳ−２２２４−１−４はオリゴヌクレオチドから作製してＢａｍＨ  Ｉ切断部位に接する合成のＥ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子（ｒｅｆ．１５）を含むｐＵＣプラスミドである。このｃｅｒ遺伝子の２９０ｂｐのＢａｍＨ  Ｉ断片をＤＳ−２１４７−１のＢａｍＨ  Ｉ部位に挿入してプラスミドＢＫ−２−１−２を作製した。その結果、このｐＢＲを基にしたプラスミドは多数のクローン化部位、カナマイシン耐性遺伝子およびｃｅｒ遺伝子を含む。プラスミドＢＫ−２−１−２はＢｇｌ  ＩＩで直線化し、脱リン酸化した。プラスミドＤＳ−２１８６−２−１をＢｇｌ  ＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切断し、３．６ｋｂのＴ７  Ｖ３８  ｈｉａ断片をＢＫ−２−１−２に挿入してプラスミドＢＫ−９６−２−１１を作製した（図６Ａ）。
【００９８】
実施例６
この実施例はＥ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子の存在下で全長のそろったＮＴＨｉ菌株３３のｈｉａ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ−２２４２−１およびＤＳ−２２４２−２の作製を説明するものである。
【００９９】
ＮＴＨｉ菌株３３から染色体ＤＮＡを精製し、オリゴヌクレオチド５０３９．ＳＬおよび５０４０．ＳＬ（図１７）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。センスプライマー（５０４０．ＳＬ）は菌株１１のｈｉａの５’隣接配列を基にして設計したものであって、ＮＴＨｉ  ＨｉａおよびＨｉｂ  Ｈｓｆ蛋白質のアミノ末端配列を保存していた。アンチセンスプライマー（５０３９．ＳＬ）は実施例１で述べたものと同じであって、ＨｉａおよびＨｓｆ蛋白質のカルボキシ末端配列の保存を基本とした。菌株３３の３ｋｂのｈｉａ  ＰＣＲ断片をｐＣＲ  ＩＩ中でクローン化し、プラスミドＤＳ−１９１７−３−８を作成した。
【０１００】
全長のそろった菌株３３  ｈｉａ遺伝子を発現させるために、この遺伝子の５’末端の、開始コドンからＡｌｗＮ  Ｉ切断部位まで（図７Ｂ）の、およそ１０６ｂｐをオリゴヌクレオチドから合成した。プラスミドＤＳ−１９１７−３−８をＡｌｗＮ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切断し、ｈｉａ遺伝子を含む約２．９ｋｂの断片を精製した。プラスミドｐＴ７−７をＮｄｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切断し、Ｎｄｅ  Ｉ−ＡｌｗＮ  ＩオリゴヌクレオチドおよびＡｌｗＮ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉ  ｈｉａ断片をこのｐＴ７−７ベクターに連結してプラスミドＤＳ−２１０３−４を作製した。
【０１０１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子を含ませ、カナマイシンによる選択を使用するために、Ｔ７  ｈｉａ（３３）遺伝子カセットを含むＢｇｌ  ＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉ断片をＤＳ−２１０３−４から切り取り、Ｂｇｌ  ＩＩで切断されて脱リン酸化されたＢＫ−２−１−１中でクローン化した。プラスミドＤＳ−２２４２−１およびＤＳ−２２４２−２は反対方向に配向したＴ７  ｈｉａ（３３）遺伝子カセットの単一コピー、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含む（図７Ａ）。
【０１０２】
実施例７
この実施例は末端欠失したＶ３８菌株３３のｈｉａ遺伝子をもつＴ７  ｈｉａ遺伝子カセット、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２３４０−２−３の作製を説明するものである。
【０１０３】
ＮＴＨｉ菌株３３  ｈｉａ遺伝子の、Ｖ３８開始コドンから内側のＳｎａＢ  Ｉ切断部位に至るまでの、５’末端の２５０ｂｐ断片を増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。クローン化を目的として５’末端にＮｄｅ  Ｉ切断部位を追加し、鋳型としてプラスミドＤＳ−２２４２−１を使用してこの断片を増幅した。この構成図式は図８Ａに示されており、ＰＣＲプライマーは図８Ｂに示されている。この断片をｐＣＲ  ＩＩにクローン化し、プラスミドＤＳ−２３２８−１−１を作製した。ＤＳ−２２４２−１をＮｄｅ  ＩおよびＳｎａＢ  Ｉで切断し、８．５ｋｂのベクター断片を精製した。ＤＳ−２３２８−１−１をＮｄｅ  ＩおよびＳｎａＢ  Ｉで切断し、その０．２５ｋｂの５’ｈｉａ断片をＤＳ−２２４２−１から得た８．５ｋｂのベクター断片と連結してプラスミドＤＳ−２３４０−２−３を作製した。
【０１０４】
実施例８
この実施例はＴ７  Ｖ３８  ｈｉａ（１１）またはＴ７  Ｖ３８  ｈｉａ（３３）遺伝子カセットのタンデムコピーをそれぞれと、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２４４７−２およびＤＳ−２４４８−１７の作製を説明するものである。
【０１０５】
Ｔ７  Ｖ３８  ｈｉａ（１１）遺伝子カセットを含むプラスミドＢＫ−９６−２−１１をＢｇｌ  ＩＩで直線化し、脱リン酸化した。ＤＳ−２１８６−２−１から得たＢｇｌ  ＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉ  Ｔ７  Ｖ３８  ｈｉａ（１１）遺伝子カセットをＢＫ−９６−２−１１に連結し、同じ配向でＴ７  Ｖ３８  ｈｉａ（１１）遺伝子のタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ−２４４７−２を作製した（図９Ａ）。
【０１０６】
プラスミドＤＳ−２３４０−２−３をＥｃｏＲ  Ｉで切断し、そのＴ７  Ｖ３８  ｈｉａ（３３）遺伝子カセットを、ＥｃｏＲ  Ｉで切断して脱リン酸化したｐＵＣ−ＢｇＸｂにサブクローン化した。その結果得られたプラスミドＤＳ−２４４０−２をＢｇｌ  ＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切断してＴ７  Ｖ３８  ｈｉａ（３３）カセットを放出させ、Ｂｇｌ  ＩＩで直線化して脱リン酸化したＤＳ−２３４０−２−３とそれを連結した。プラスミドＤＳ−２４４８−１７は同じ配向でタンデムのＴ７  Ｖ３８  ｈｉａ（３３）遺伝子を含む（図９Ｂ）。
【０１０７】
実施例９
この実施例は全長のそろったおよび末端欠失した組換えｈｉａ遺伝子の発現を説明するものである。
【０１０８】
先行の実施例で説明したようにして調製した発現プラスミドのＤＮＡを、ＢｉｏＲａｄ社のエレクトロポレータを使用して電子的に受容可能となったＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入した。細胞は適切な抗生物質選別を使用して、ラクトースを１．０％になるまで加える前に、Ａ５７８が０．３となるまでＮＺＣＹＭ培地中で３７℃にて４時間成育させた。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分解液＋負荷バッファで０．２ＯＤ／μｌとなるよう調整し、それぞれの蛋白質サンプルを同じ量でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ｒｅｆ．２２）に流した。図１０は種々の作製試料からのｒＨｉａ（１１）蛋白質相対生成量を図解したものである。パネルＡに見られるように、ｒＨｉａのサイズが低下するにつれて生成量の増加が認められる。Ｖ３８−（レーン５）およびＮ５２−末端欠失ｒＨｉａ（レーン６）はそれらのさらに長い相当物質（レーン２、３、４）よりも有意差をもって高い発現レベルを有する。加えて、パネルＢはＶ３８  ｒＨｉａの生成がｃｅｒ遺伝子の存在下で明らかに増加することを示している。
【０１０９】
実施例１０
この実施例はｒＨｉａ蛋白質の精製について説明するものである。
【０１１０】
すべての組換えＨｉａ蛋白質はＥ．ｃｏｌｉ中で封入体として発現され、同じ手法によって精製された（図１１）。５００ｍｌの培養物から得たＥ．ｃｏｌｉ細胞ペレットを０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸５０ｍｌ中に再懸濁し、超音波破砕した。この抽出物を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、その結果生じた上清を廃棄した。このペレット（ＰＰＴ１）をさらに０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０で抽出処理し、それから２０，０００×ｇで３０分間遠心分離して上清を廃棄した。このペレット（ＰＰＴ２）をさらに１％のオクチルグルコシドを含む５０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０で抽出し、それから２０，０００×ｇで３０分間遠心分離して上清を廃棄した。
【０１１１】
以上の抽出処理後に結果として得られたペレット（ＰＰＴ３）は封入体を含んでいる。このペレットを６Ｍのグアニジンおよび５ｍＭのＤＴＴを含む６ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０に溶解した。この溶液に１２ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０を加え、混合液を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。この上清（ＳＵＰ４）を終濃度７％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００で沈降させた。その結果生じたペレット（ＰＰＴ５）を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離して除去し、上清を５０％飽和の硫酸アンモニウムで沈降させた。硫酸アンモニウムによる沈降物は２０，０００×ｇで３０分間遠心分離して採取した。結果として得られたペレット（ＰＰＴ６）を６Ｍのグアニジン塩酸および５ｍＭのＤＴＴを含む２ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０に溶解し、この透明な液体を、２Ｍのグアニジン塩酸を含む５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラムで精製した。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、精製されたｒＨｉａを含む画分をプールし、４℃でＰＢＳに対して一晩透析し、その後、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。これらの条件では蛋白質は可溶性を維持しており、−２０℃で保存するためにこのｒＨｉａ調製液にグリセロールを終濃度２０％で加えた。精製されたＶ３８  ｒＨｉａ（１１）およびＶ３８  ｒＨｉａ（３３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は図１２に図解されている。精製Ｖ３８  ｒＨｉａ蛋白質の平均収率は約１０ｍｇ／Ｌ培地である。
【０１１２】
ｒＨｉａの安定性を調べるために、精製したＶ３８  ｒＨｉａ（１１）蛋白質は４℃でグリセロールなしかまたは入れて保存するか、あるいはグリセロールを入れて−２０℃で保存した。この蛋白質は３つの条件すべてにおいて安定であることが分かり、凍結と解凍を繰り返して少なくとも８週間は完全さを維持した（図１３）。
【０１１３】
実施例１１
この実施例はＶ３８  ｒＨｉａ（１１）およびＶ３８  ｒＨｉａ（３３）蛋白質の免疫原性を説明するものである。
【０１１４】
日程１において完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ）で乳化した５μｇの抗原を筋肉内（ｉ．ｍ．）注入して二匹のテンジクネズミ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を免疫感作させることによってｒＨｉａ蛋白質に対する高度免疫抗血清を生成させた。日程１４および２８において不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に加えた蛋白質５μｇを投与して動物を追加免疫応答させ、日程４２において血清を集めた。免疫原として熱で不活化したバクテリア調製物（１回の投与量１×１０８ｃｆｕ）を使用した以外は同じプロトコルを使用して、抗Ｈｉｂ菌株ＭｉｎｎＡおよび抗ヘモフィルス属菌株ＡＴＣＣ９００６抗血清を作製した。
【０１１５】
Ｖ３８  ｒＨｉａ蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｑｕｅｂｅｃ）の複数グループを日程１および２８において、リン酸アルミニウム（ａｌｕｍ）の存在下（１回の投与量１．５ｍｇ）で０．３、１、３、および１０μｇの抗原によりｓ．ｃ．免疫感作させた。血液サンプルを日程１、２８および４２において集めた。顕著に抗Ｖ３８  ｒＨｉａ抗体を生成したマウスは抗体０．３μｇを１回注入されても応答を示し（図１４、パネルＡ）、両方の蛋白質ともに封入体抽出および可溶化処理の後でも免疫原性を維持することを示唆している。菌株１１または３３に由来するＶ３８  ｒＨｉａ蛋白質によって誘導される抗体力価において統計学的に顕著な差異は認められなかった。
【０１１６】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＶ３８  ｒＨｉａ（１１）蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹の動物（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｑｕｅｂｅｃ）の複数グループを日程１、２８および４２において、リン酸アルミニウムの存在下（１回の投与量１．５ｍｇ）で抗原０．３、１、３、および１０μｇによりｓ．ｃ．免疫感作させた。血液サンプルは日程１、１４、２８、４２および５６において集めた。すべてのグループにおいて高い抗体力価が認められ、この蛋白質が１回の投与量０．３μｇにおいてさえ強度の免疫原性であることを示した（図１５、パネルＡ）。
【０１１７】
テンジクネズミにおいてＶ３８  ｒＨｉａ（１１）蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹の動物（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｑｕｅｂｅｃ）の複数グループを日程１、２８および４２において、リン酸アルミニウムの存在下（１回の投与量１．５ｍｇ）で抗原０．３、１、３、および１０μｇによりｓ．ｃ．免疫感作させた。血液サンプルは日程１、１４、２８、４２および５６において集めた。すべてのグループにおいて高い抗体力価が認められ、この蛋白質がテンジクネズミにおいてもまた強度の免疫原性であることを示した（図１５、パネルＢ）。
【０１１８】
実施例１２
この実施例は菌血症の無抵抗な幼齢ラットのモデルにおいて抗ｒＨｉａ抗体によって生じる防御の分析を説明するものである。
【０１１９】
妊娠中のＷｉｓｔａｒラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。インフルエンザ菌ｂ型の菌血症モデルでは、６〜１０匹の５日齢の幼齢ラットのグループを、テンジクネズミの抗ｒＨｉａまたは抗菌株ＭｉｎｎＡ抗血清０．１ｍｌ、背面  でｓ．ｃ．注入した。比較対照の動物には免疫感作前の血清のみを注入した。２０時間後、元気に生育したＨｉｂ菌株ＭｉｎｎＡを２００〜２４０コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）で（０．１ｍｌ）腹腔内（ｉ．ｐ．）抗原投与した。血液サンプルを抗原投与後２０時間に、イソフルラン麻酔して心臓に針を刺して集め、チョコレート寒天培地にまいた。１日後、コロニーをカウントしてその結果をフィッシャー検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）によって統計学的に分析した。
【０１２０】
インフルエンザ菌ａ型菌血症モデル（ｒｅｆ．２３）では、９〜１０匹の５日齢の幼齢ラットのグループを、テンジクネズミの抗ｒＨｉａまたは抗菌株ＡＴＣＣ９００６抗血清０．１ｍｌ、背面でｓ．ｃ．注入した。比較対照グループの動物にはテンジクネズミの免疫感作前の血清を注入した。２０時間後、元気に生育したインフルエンザ菌ａ型菌株ＡＴＣＣ９００６を（０．１ｍｌ）１００，０００ｃｆｕで動物にｉ．ｐ．抗原投与した。血液サンプルを抗原投与の２０時間後に集めて上述のように分析した。
【０１２１】
後述の表１および２に示したように、テンジクネズミの抗ｒＨｉａ（１１）または抗Ｖ３８  ｒＨｉａ（１１）抗血清のいずれかで受動免疫感作された幼齢ラットは、菌血症を引き起こしたインフルエンザ菌ａ型またはｂ型に対してすべてが顕著に防御された。これらの結果は、インフルエンザ菌ａ型またはｂ型によって引き起こされる菌血症に対して動物を防御することにおいて、わずかに末端欠失したＨｉａ蛋白質（Ｖ３８  ｒＨｉａ）に対応して生成した抗体が全長のそろった蛋白質に対応して生成したものと同程度に効果的であることを示している。ＮＴＨｉ由来の組換え蛋白質によって生じる、被包性のバクテリアによって引き起こされる侵襲性の疾病に対するそのような防御はｒＨｉａ蛋白質のワクチン抗原としての有用性を説明するものである。
【０１２２】
実施例１３
この実施例は鼻咽頭部でのコロニー形成のチンチラのモデルにおいて、Ｖ３８  ｒＨｉａ蛋白質の免疫感作によって生じる防御を説明するものである。
【０１２３】
鼻咽頭部のコロニー形成モデルはＹａｎｇらによって報告された（ｒｅｆ．２０）。このモデルは、ＨＭＷアドヘシンを産生するＮＴＨｉ菌株については適切であるが、しかしＨｉａを産生する菌株では同じ条件で再現性のあるコロニー形成は達成できなかった。原型のＨｉａ産生ＮＴＨｉ菌株１１で繰り返したコロニー形成の試みは不成功であった。原型のＨＭＷ産生ＮＴＨｉ菌株１２ではわずか１０８ｃｆｕしか必要としなかったのに比べて、ＮＴＨｉ菌株３３では１回の植菌当たり５×１０８ｃｆｕでコロニー形成が達成された。これらの条件下では、１００μｇのＶ３８  ｒＨｉａ（３３）で免疫感作され、同様のＮＴＨｉ菌株３３で抗原投与された動物において部分的な防御が認められた。
【０１２４】
実施例１４
この実施例はインフルエンザ菌株に由来する追加のｈｉａ遺伝子のクローン化および配列分析を説明するものである。
【０１２５】
保存されたプロモーター、ｈｉａおよびｈｓｆ遺伝子および蛋白質のＮ末端およびＣ末端配列に基づいて、ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド（５０４０．ＳＬおよび５０３９．ＳＬ）を設計した（図１７）。ＰＣＲ増幅のための選択菌株は抗ｒＨｉａ（１１）抗血清との反応性に基づいて選んだ。
【０１２６】
ＮＴＨｉ菌株１２、２９、３２、Ｍ４０７１、Ｋ９および、Ｋ２２およびヘモフィルスｃ型菌株ＡＰＩから染色体ＤＮＡを調製した。ＰＣＲ増幅は以下のようにして実施した。それぞれの反応混合液には５〜１００ｎｇのＤＮＡ、それぞれ１μｇのプライマー、５ユニットのｔａｑ＋またはｔｓｇ＋（Ｓａｎｇｏｎ）またはｔａｑプラスロング（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、２ｍＭの硫酸マグネシウム、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＢＳＡを含ませた。サイクル条件は、９５℃で１分間、その後、９５℃で３０秒、４５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを２５サイクル行い、その後、７２℃で１０分間とした。
【０１２７】
菌株３３のｈｉａ遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図１８に示されている。予測された菌株３３由来のＨｉａ蛋白質は１０３．６ｋＤａの分子量を有し、ｐＩが９．４７であった。菌株３２のｈｉａ遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列は図１９に示されている。予測された菌株３２由来のＨｉａ蛋白質は７０．４ｋＤａの分子量を有し、ｐＩが５．６７であった。残基４９３と４９６との間にはＫＤＥＬ配列が存在する。そのような配列は小胞体への固定蛋白質に付随するものであった。由来する菌株３２のＨｉａ蛋白質は顕著により小さくかつ顕著に異なるｐＩを有するが、しかしながら他のＨｉａ蛋白質に存在する特色の多くを含んでいる。
【０１２８】
菌株２９のｈｉａ遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２０に示されている。予測された菌株２９のＨｉａ蛋白質は１１４．４ｋＤａの分子量および７．５８のｐＩを有する。菌株Ｋ２２のｈｉａ遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２３に示されている。予測された菌株Ｋ２２のＨｉａ蛋白質は１１４．４ｋＤａの分子量および７．５８のｐＩを有する。ＮＴＨｉ菌株２９およびＫ２２に由来するＨｉａ配列は同一であることが判明した。菌株２９はオハイオ州クリーブランドの中耳炎の生後７カ月の乳児から単離され、それに対して菌株Ｋ２２はオーストラリアのキンバリー近郊のアボリジニから単離された。
【０１２９】
菌株４０７１のｈｉａ遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２１に示されている。予測されたＭ４０７１のＨｉａ蛋白質は１０３．４ｋＤａの分子量および９．４９のｐＩを有する。残基５３４と５３７との間にはＫＤＥＬ配列が存在する。
【０１３０】
菌株Ｋ９のｈｉａ遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２２に示されている。予測された菌株Ｋ９のＨｉａ蛋白質は１１３．８ｋＤａの分子量および６．４５のｐＩを有する。
【０１３１】
ヘモフィルスｃ型菌株ＡＰＩのｈｉａ遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２４に示されている。予測されたＡＰＩのＨｉａ蛋白質は２４９．４ｋＤａの分子量および５．３４のｐＩを有する。ｃ型菌株ＡＰＩの由来するＨｉａ／Ｈｓｆ配列は６０残基の挿入部があることを除いて公表されているｂ型のＨｓｆ配列と殆ど同一である。ここに提示したＮＴＨｉに基づくＨｉａ蛋白質はａ型およびｂ型感染の受動モデルにおいて防御をするので、ｂ型とｃ型蛋白質との間の配列類似性に起因するｃ型の疾病に対してもまた防御をすることはありそうである。
【０１３２】
菌株１２のｈｉａ遺伝子座のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２５に示されている。ＮＴＨｉ菌株１２はＨｉａを生成しない。しかしながら、ｈｉａ遺伝子部分はＰＣＲ増幅可能であり、ＳＢ１２細胞溶解物と抗ｒＨｉａ抗体とのつじつまの合わない陽性の反応性が存在し、サザンブロットでは菌株１１のｈｉａ遺伝子の３’末端に由来するＤＮＡプローブとの反応性がある。ＰＣＲ増幅したＤＮＡの分析から、上流ＨＩ１７３２関連遺伝子の３’末端の１ｋｂおよびｈｉａ遺伝子の３’末端の０．８ｋｂを含む１．８ｋｂの断片が明らかになった。
【０１３３】
菌株１２中のこれら２つの遺伝子の推定される接合部を交差して増幅するであろうプライマーを使用してＰＣＲ増幅したところ、この遺伝子座の遺伝子組成が確認された。したがって、菌株１２はｈｉａ遺伝子の５’末端の欠失を生じたためにＨｉａを生成しないようであった。図２７は菌株１２の上流ＯＲＦとＲｄゲノム由来ＨＩ１７３３蛋白質との配列比較を示すものである。相同の領域によって、これら２つの蛋白質は９５％が同一である。
【０１３４】
ＮＴＨｉ菌株３３、３２、２９、Ｋ２２、Ｍ４０７１、１１、９およびｃ型菌株ＡＰＩからの由来Ｈｉａ配列のアラインメントが、インフルエンザ菌ｂ型Ｈｓｆ、ＲｄゲノムのａｉｄＡ類似（Ｈｓｆ／Ｈｉａ）ＨＩ１７３２遺伝子、と菌株４２２３およびＬＥＳ−１のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ  ２００ｋＤａ蛋白質と比較して図２８に示されている。ＨＩ１７３２蛋白質の早期末端欠失の結果生じる、Ｒｄゲノム配列内のフレーム移動が認められる。ｈｉａに関連する付加的な下流配列はここに含まれる。配列の下にある星印は保存された残基を示している。Ｎ末端（約５０残基）およびＣ末端配列（約１５０残基）はヘモフィルス菌株の中で高度に保存されており、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの相応部分とのある程度の類似性は明白である。配列分析から、Ｈｉａ蛋白質について２つの可能性のある遺伝子集団が存在し、１つは原型の菌株１１に関係し、他方はさらに密接に菌株３３に関係することは明らかである。菌株１１およびＫ９の蛋白質は、より一層ヘモフィルス菌株のｂ型、ｃ型またはｄ型由来のＨｓｆ蛋白質に類似しているようであるが、一方で、菌株３３、３２、２９、Ｋ２２およびＭ４０７１の蛋白質は第２の集団を構成するようである。
【０１３５】
実施例１５
この実施例は末端欠失したＳ４４  菌株１１  ｈｉａ遺伝子をもつＴ７  ｈｉａ遺伝子カセット、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子、およびカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドＪＢ−２９３０−３の作製、およびＳ４４  Ｈｉａ蛋白質の発現を説明するものである。
【０１３６】
Ｓ４４アミノ酸から内側のＳｔｙ  Ｉ切断部位までのＮＴＨｉ菌株１１  ｈｉａ遺伝子のＳ４４  Ｈｉａ  Ｎ末端（図２９）を増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。クローン化を目的として５’末端にＮｄｅ  Ｉ切断部位を追加し、鋳型としてプラスミドＤＳ−２２４２−１を使用してこの断片を増幅した。この断片をｐＣＲ  ＩＩにクローン化してプラスミドＪＢ−２９１０−１−１を作製した。この構成図式を図３０に示す。プラスミドＪＢ−２９１０−１−１をＮｄｅ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉで切断し、５’ＰＣＲ  ｈｉａ断片を単離した。Ｖ３８  ｈｉａ遺伝子を含むプラスミドＩＡ−４６−５をＮｄｅ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉで切断し、大きい方の約８．５ｋｂの断片を精製した。これら２つの精製断片を連結してプラスミドＪＢ−２９１７−１を作製した。その後、このプラスミドをＮｄｅ  Ｉで切断し、ウシ腸のホスファターゼ（ＣＡＰ）で処理し、プラスミドＩＡ−４６−５から得たＴ７プロモーターをその中でクローン化した。このプロモーターはＩＡ−４６−５のＮｄｅ  Ｉ切断により切り取った。結果として得られたプラスミドＪＢ−２９２５−３をＢｇｌ  ＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉで切断してｈｉａ遺伝子を単離した。Ｂｇｌ  ＩＩ／ＣＡＰ処理したプラスミドＢＫ−２−１−２にこの断片を連結し、プラスミドＪＢ−２９３０−３を作製した。このプラスミドはＴ７プロモーターＳ４４  ｈｉａ遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ  ｃｅｒ遺伝子を含み、カナマイシン耐性である。
【０１３７】
発現を調べるため、組換えＳ４４  ｈｉａベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に転換した。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための手法は実施例９に記載したりである。図３１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、２つの異なるベクター、（上述の）ＪＢ−２９３０−３およびｐＥＴベクターのＩＡ−１９１−３−１からの組換えＳ４４  ｈｉａの発現を示している。プラスミドＩＡ−１９１−３−１は、それがｌａｃＩｑリプレッサーを含むｐＥＴベクターであり、したがって生成するＳ４４  Ｈｉａの量がＪＢ−２９３０−３からのＴ７  Ｓ４４よりも少ないということを除くとＪＢ−２９３０−３と同じである。このプラスミドは、プラスミドＪＢ−２９３０−３とともに、図３２に示されている。図３１は二重のバンド（レーン３）としておよそ１１６ｋＤａのＳ４４  Ｈｉａを示している。ＪＢ−２９３０−３から精製したＳ４４  ｈｉａを使用した追加の分析によると、この二重バンドの下側のバンドはＣ末端の９４アミノ酸の末端欠失を有するがＮ末端と考えられるものはそのまま存在することが判明した。末端欠失したＨｉａの単離に使用した精製方法は実施例１０に記載した通りであった。
【０１３８】
（開示の概要）
本開示の概要では、本発明は新たに単離精製した、ヘモフィルスから得たインフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）蛋白質の全長を有するものおよびＮ末端欠失したものをコードし、防御力のあるＨｉａ蛋白質を遺伝子組換えにより生成することを可能にする核酸分子を提供する。本発明の範囲内での変更態様は可能である。
【０１３９】
【表１】
2004529601.tif 000003
【０１４０】
【表２】
2004529601.tif 000004
【０１４１】
参考文献
【０１４２】
【表３】
2004529601.tif 000005
【０１４３】
【表４】
2004529601.tif 000006
【０１４４】
【表５】
2004529601.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
Ｔ７プロモーターおよび完全長ＮＴＨｉ菌株１１のｈｉａ遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２００８−２−３の制限地図を示す図である。
【図１Ｂ】
菌株１１のｈｉａ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス鎖（５０３８．ＳＬ）：配列番号１、エンコードされているアミノ酸配列番号２；アンチセンス鎖（５０３９．ＳＬ）：配列番号３、相補配列番号４、エンコードされているアミノ酸配列番号５。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｓｔｙ、Ｓｔｙ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性である。
【図２】
抗ネイティブＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの高分子量アドヘシン抗体による、完全長ｒＨｉａタンパク質の認識のイムノブロットを示す図である。レーン１、非誘導型ＤＳ−２０４３−１；レーン２、４時間かけて誘導されたＤＳ−２０４３−１；レーン３、非誘導型ＤＳ−２０４３−２；レーン４、４時間かけて誘導されたＤＳ−２０４３−２；レーン５、分子量マーカー。ＤＳ−２０４３−１およびＤＳ−２０４３−２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）内のｐＴ７ｈｉａ（１１）の独立したクローンである。
【図３】
菌株１１のｈｉａ遺伝子用のＴ７ｈｉａ遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ−２０９２−１およびＤＳ−２０９２−４０の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉである。他の略語はＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；Ｔ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性である。
【図４】
菌株１１のＨｉａタンパク質の切断部位（配列番号６）を示す図である。
【図５Ａ】
菌株１１からの切断型ｈｉａ遺伝子を発現するプラスミドの構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｎｈｅ、Ｎｈｅ  Ｉ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓｔｙ、Ｓｔｙ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性である。
【図５Ｂ】
切断型遺伝子用に５’断片をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。Ｅ２１切断部：センス（５５２４．ＳＬ）：配列番号７、エンコードされているアミノ酸配列番号８；Ｔ３３切断部：センス（５５２５．ＳＬ）：配列番号９、エンコードされているアミノ酸配列番号１０；Ｖ３８切断部：センス（５５２６．ＳＬ）：配列番号１１、エンコードされているアミノ酸配列番号１２；Ｎ５２切断部：センス（５５２７．ＳＬ）：配列番号１３、エンコードされているアミノ酸配列番号１４；アンチセンス（５５２８．ＳＬ）：配列番号１５、相補配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７。
【図６Ａ】
ＮＴＨｉ菌株１１および大腸菌のｃｅｒ遺伝子からのＶ３８ｈｉａ遺伝子を含むプラスミドＢＫ−９６−２−１１の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｋ、Ｋｐｎ  Ｉ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｓｍ、Ｓｍａ  Ｉ；Ｓｔｙ、Ｓｔｙ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉ；Ｘｈｏ、Ｘｈｏ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図６Ｂ】
複数のクローン部位および転写ターミネーターを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。「Ｒ」および「Ｐｓ」はＥｃｏＲ  ＩまたはＰｓｔ  Ｉの端部とオーバーラップする末端を示すが、これらの部位を再び生成するわけではない。上側鎖（配列番号５０）、下側（配列番号５１）。
【図７Ａ】
Ｔ７プロモーターおよび完全長のＮＴＨｉ菌株３３のｈｉａ遺伝子、大腸菌のｃｅｒ遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２２４１−１およびＤＳ−２２４２−２の構築を示す図である。制限酵素部位はＡ、ＡｌｗＮ  Ｉ；Ｂ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｋ、Ｋｐｎ  Ｉ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｓｍ、Ｓｍａ  Ｉ；；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉ；Ｘｈｏ、Ｘｈｏ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図７Ｂ】
鎖（配列番号５２）、相補鎖（配列番号５３）、およびエンコードされているアミノ酸配列（配列番号５４）をコードしている菌株３３のｈｉａ遺伝子の５’末端を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図８Ａ】
Ｔ７プロモーターおよび菌株３３からのＶ３８遺伝子、大腸菌のｃｅｒ遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２３４０−２−３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｓｎ、ＳｎａＢ  Ｉ；；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図８Ｂ】
切断型遺伝子用の５’端をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス（６２８６．ＳＬ）：配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７；アンチセンス（６２８７．ＳＬ）：配列番号１８、相補配列番号１９、エンコードされているアミノ酸配列番号２０。
【図９Ａおよび９Ｂ】
Ｔ７のＶ３８ｈｉａ（１１）およびＴ７のＶ３８ｈｉａ（３３）遺伝子のタンデムコピーをそれぞれ含むプラスミドＤＳ−２４４７−２およびＤＳ−２４４８−１７の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図１０】
ｒＨｉａの発現を示す図である。パネルＡ：レーン１、誘導されていない完全長ｒＨｉａ（１１）；レーン２、完全長ｒＨｉａ（１１）；レーン３、Ｅ２１ｒＨｉａ（１１）；レーン４、Ｔ３３ｒＨｉａ（１１）；レーン５、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）；レーン６、Ｎ５２ｒＨｉａ（１１）。パネルＢ：レーン１、誘導されていないＶ３８ｒＨｉａ（１１）；レーン２、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）；レーン３、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）／ｃｅｒ。
【図１１】
ｒＨｉａの精製スキームを示す図である。略語はＳＰ、上澄み；ＰＰＴ、沈殿；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＯＧ、オクチルグルコシドであり、（ｘ）は捨てられたことを意味する。
【図１２】
パネルＡおよびＢを有し、精製されたｒＨｉａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。パネルＡは菌株１１からの精製されたＶ３８ｒＨｉａタンパク質を示し、パネルＢは菌株３３からのＶ３８ｒＨｉａタンパク質を示す。レーン１、分子量マーカー；レーン２、全細胞の溶解物；レーン３、未精製抽出物；レーン４、精製されたｒＨｉａタンパク質。
【図１３】
パネルＡ、ＢおよびＣを有し、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）の安定性を示す図である。パネルＡは、グリセロールなしで４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＢは、２０％グリセロールの存在下で４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＣは、２０％グリセロールの存在下で−２０℃で保存されたサンプルを示す。レーン０はｔ０を示し、レーン１〜８は１〜８週間保存されたサンプルを示す。
【図１４】
パネルＡおよびＢを有し、ＣＤ−１マウスのＶ３８ｒＨｉａ（１１）またはＶ３８ｒＨｉａ（３３）の免疫原性を示す図である。パネルＡは単一の免疫化後の応答を示し、パネルＢは最初の／追加の免疫化の応答を示す。
【図１５Ａおよび１５Ｂ】
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびモルモットのＶ３８ｒＨｉａ（１１）の免疫原性を示す図である。図１５Ａはマウスにおける抗体の応答を示し、図１５Ｂはモルモットにおける応答を示す。
【図１６】
チンチラモデルにおける鼻咽頭コロニー形成に対するＶ３８ｒＨｉａ（３３）の防御能力を示す図である。
【図１７】
追加のｈｉａ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス（５０４０．ＳＬ）：配列番号２１、エンコードされているアミノ酸配列番号２２；アンチセンス（５０３９．ＳＬ）：配列番号３、相補配列番号４、エンコードされているアミノ酸配列番号５。
【図１８】
ＮＴＨｉ菌株３３からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２３）および演繹アミノ酸配列（配列番号２４）を示す図である。
【図１９】
ＮＴＨｉ菌株３２からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２５）および演繹アミノ酸配列（配列番号２６）を示す図である。
【図２０】
ＮＴＨｉ菌株２９からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２７）および演繹アミノ酸配列（配列番号２８）を示す図である。
【図２１】
ＮＴＨｉ菌株Ｍ４０７１からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２９）および演繹アミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。
【図２２】
ＮＴＨｉ菌株Ｋ９からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３１）および演繹アミノ酸配列（配列番号３２）を示す図である。
【図２３】
ＮＴＨｉ菌株Ｋ２２からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３３）および演繹アミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である。
【図２４】
ｃ型菌株ＡＰＩからのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３５）および演繹アミノ酸配列（配列番号３６）を示す図である。
【図２５】
ＮＴＨｉ菌株１２からのｈｉａ遺伝子座のヌクレオチド配列（配列番号３７）および演繹アミノ酸配列（配列番号３８）を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのｏｒｆの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス（６４３１．ＳＬ）：配列番号３９、（６４３２．ＳＬ）配列番号４０；アンチセンス（６２９５．ＳＬ）配列番号４１、（６２７１．ＳＬ）配列番号４２。
【図２６】
米国特許第５，６４６，２５９号において公開されている、ＮＴＨｉ菌株１１からのｈｉａ遺伝子座のヌクレオチド配列（配列番号４３）および演繹アミノ酸配列（配列番号４４）を示す図である。
【図２７】
菌株１２のｈｉａ遺伝子座からの上流ＯＲＦ（配列番号４５）の配列およびｂ型インフルエンザ菌株ＲｄからのＨＩ１７３２タンパク質（配列番号４６）の一部の整列を示す図である。
【図２８】
Ｈｉａ（配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２）、Ｈｓｆ（配列番号４７）、および菌株４２２３およびＬＥＳ−１（配列番号４８、４９）からのＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの高分子量タンパク質（２００ｋＤａ）からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２９】
ｈｉａ遺伝子の５’端をＳ４４切断位置でＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス（６８１７．ＳＬ）配列番号４９、エンコードされているアミノ酸配列番号５０；アンチセンス（６８１８．ＳＬ）配列番号５１、相補配列番号５２、エンコードされているアミノ酸配列番号５３。
【図３０】
ＮＴＨｉ菌株１１からのＳ４４ｈｉａ遺伝子および大腸菌のｃｅｒ遺伝子およびＴ７プロモーターを含む、プラスミドＪＢ−２９３０−３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｋ、Ｋｐｎ  Ｉ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｓｍ、Ｓｍａ  Ｉ；Ｓｔｙ、Ｓｔｙ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉ；Ｘｈｏ、Ｘｈｏ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図３１】
Ｓ４４からのｒＨｉａの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１、時間０での（誘導なしで）ｐＥＴＳ４４ベクターからの発現体；レーン２、４時間の誘導後のｐＥＴＳ４４ベクターからの発現体；レーン３、４時間の誘導後のＪＢ−２９３０−３からの発現体。
【図３２】
発現試験用に使用された２つのベクター、Ｓ４４切断型ｒＨｉａのＪＢ−２９３０−３およびＩＡ−１９１−３−１の概略を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１９Ａ】
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【図２０Ａ】
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【図２１Ａ】
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【図２２Ａ】
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【図２３Ａ】
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【図２４Ａ】
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【図２５Ａ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529601.tif 000325
【手続補正書】
【提出日】平成13年6月22日(2001.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ菌（ヘモフィルス・インフルエンジー（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））の菌株のインフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしている単離され精製された核酸分子であって、
（ａ）図１８、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２３、２７、２９、３１、３３、３５、３７）からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または
（ｂ）図１８、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２４、２８、３０、３２、３４、３６、３８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン（ｒＨｉａ）タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を有する単離され精製された核酸分子。
【請求項２】
インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしており、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号５５と配列番号５７
からなる群から選択されるヌクレオチドの１対によって増幅可能な、単離され精製された核酸分子。
【請求項３】
封入体として発現可能なインフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしており、前記Ｎ末端切断型タンパク質がヒトの上皮細胞に結合するための能力を有する、単離され精製された核酸。
【請求項４】
インフルエンザ菌の菌株１１のＥ２１、Ｔ３３、Ｖ３８およびＮ５２切断部およびインフルエンザ菌の菌株３３のＶ３８切断部からなる群から選択される切断型Ｈｉａタンパク質をエンコードしている、請求項３に記載の核酸分子
【請求項５】
請求項１に記載の前記核酸分子を含む宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項６】
請求項２から４に記載の前記核酸分子を含む宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項７】
プラスミドベクターである、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
前記プラスミドベクターが、
図１Ａ中に示されるＤＳ−２００８−２−３
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１８６−１−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２２０１−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１８６−２−１
図５Ａ中に示されるＤＳ−２１６８−２−６
図３２中に示されるＩＡ−１９１−３−１
からなる群から選択されるプラスミドの同定特性を有する、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１に記載の完全長のインフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質または請求項２から４のいずれか一項に記載のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質および前記完全長または切断型Ｈｉａタンパク質を発現するために前記核酸分子に作用的に結合しているプロモーターを含む、宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項１０】
大腸菌の遺伝子をさらに含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
プラスミドベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１２】
前記プラスミドベクターが、
図６Ａ中に示されるＢＫ−９６−２−１１
図７Ａ中に示されるＤＳ−２２４２−１
図７Ａ中に示されるＤＳ−２２４２−２
図８Ａ中に示されるＤＳ−２３４０−２−３
図９Ａ中に示されるＤＳ−２４４７−２
図９Ｂ中に示されるＤＳ−２４４８−１７
図３２中に示されるＪＢ−２９３０−３
からなる群から選択されるプラスミドベクターの同定特性を有する請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項５、６または９に記載のベクターによって形質転換され、ヘモフィルスの分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項１４】
大腸菌の菌株である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換された大腸菌またはその免疫原性断片によって産生可能な、インフルエンザ菌の菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質。
【請求項１６】
（Ａ）インフルエンザ菌の菌株のインフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしている単離され精製された核酸分子であって、
（ａ）図１８、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２３、２７、２９、３１、３３、３５、３７）からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または
（ｂ）図１８、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列（配列番号２４、２８、３０、３２、３４、３６、３８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン（ｒＨｉａ）タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を有する単離され精製された核酸分子、
（Ｂ）インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしており、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号５５と配列番号５７
からなる群から選択されるヌクレオチドの１対によって増幅可能な、単離され精製された核酸分子、
（Ｃ）封入体として発現可能なインフルエンザ菌の菌株の切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしており、前記Ｎ末端切断型タンパク質がヒトの上皮細胞に結合するための能力を有する、単離され精製された核酸分子、
（Ｄ）請求項５、８または９に記載の発現ベクターによって形質転換された大腸菌によって産生可能な、インフルエンザ菌の菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的に活性のある成分、および薬学的に許容可能なこれらの担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１７】
ヘモフィルスに起因する疾患に対して防御するために宿主へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与用ワクチンとして製剤化される、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
免疫系の特定の細胞または粘膜表面への送達用の標的分子と組み合わせた、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
ミクロ粒子、カプセル、またはリポソーム調製物として製剤化される、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
アジュバントをさらに含む、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
感受性のある宿主に請求項１６に記載の免疫原性組成物を有効量投与すること含む、ヘモフィルスに起因する疾患に対する防御を誘導するための方法。
【請求項２２】
前記感受性のある宿主がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
インフルエンザ菌の分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質の産生のための方法であって、
請求項６と同様にベクターによって宿主を形質転換すること、
宿主を成長させてエンコードされている切断型Ｈｉａを発現させること、
前記発現したＨｉａタンパク質を単離および精製することを含む方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記エンコードされている切断型Ｈｉａが封入体内で発現される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記発現したＨｉａの前記単離および精製が、
成長し形質転換された細胞を破壊して上澄みおよび前記封入体を生成すること、
前記封入体を可溶化して組換えＨｉａの溶液を生成すること、
クロマトグラフィによって細胞の残骸のない組換えＨｉａの前記溶液を精製すること、および
前記精製された組換えＨｉａタンパク質を単離することによって実施される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヘモフィルスの分類不能型菌株が菌株１１、３３、３２、２９、Ｍ４０７１、Ｋ９、Ｋ２２および１２からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記ベクターがＴ７プロモーターを含み、前記大腸菌が誘導量のラクトースの存在下で培養される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン（Ｈｉａ）タンパク質をエンコードしている核酸分子を増幅および生成する能力がある１対のヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチドの対が、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号５５と配列番号５７
からなる群から選択される１対のヌクレオチド配列。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
Ｔ７プロモーターおよび完全長ＮＴＨｉ菌株１１のｈｉａ遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２００８−２−３の制限地図を示す図である。
【図１Ｂ】
菌株１１のｈｉａ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス鎖（５０３８．ＳＬ）：配列番号１、エンコードされているアミノ酸配列番号２；アンチセンス鎖（５０３９．ＳＬ）：配列番号３、相補配列番号４、エンコードされているアミノ酸配列番号５。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｓｔｙ、Ｓｔｙ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性である。
【図２】
抗ネイティブＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの高分子量アドヘシン抗体による、完全長ｒＨｉａタンパク質の認識のイムノブロットを示す図である。レーン１、非誘導型ＤＳ−２０４３−１；レーン２、４時間かけて誘導されたＤＳ−２０４３−１；レーン３、非誘導型ＤＳ−２０４３−２；レーン４、４時間かけて誘導されたＤＳ−２０４３−２；レーン５、分子量マーカー。ＤＳ−２０４３−１およびＤＳ−２０４３−２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）内のｐＴ７ｈｉａ（１１）の独立したクローンである。
【図３】
菌株１１のｈｉａ遺伝子用のＴ７ｈｉａ遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ−２０９２−１およびＤＳ−２０９２−４０の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉである。他の略語はＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；Ｔ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性である。
【図４】
菌株１１のＨｉａタンパク質の切断部位（配列番号６）を示す図である。
【図５Ａ】
菌株１１からの切断型ｈｉａ遺伝子を発現するプラスミドの構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｎｈｅ、Ｎｈｅ  Ｉ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓｔｙ、Ｓｔｙ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性である。
【図５Ｂ】
切断型遺伝子用に５’断片をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。Ｅ２１切断部：センス（５５２４．ＳＬ）：配列番号７、エンコードされているアミノ酸配列番号８；Ｔ３３切断部：センス（５５２５．ＳＬ）：配列番号９、エンコードされているアミノ酸配列番号１０；Ｖ３８切断部：センス（５５２６．ＳＬ）：配列番号１１、エンコードされているアミノ酸配列番号１２；Ｎ５２切断部：センス（５５２７．ＳＬ）：配列番号１３、エンコードされているアミノ酸配列番号１４；アンチセンス（５５２８．ＳＬ）：配列番号１５、相補配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７。
【図６Ａ】
ＮＴＨｉ菌株１１および大腸菌のｃｅｒ遺伝子からのＶ３８ｈｉａ遺伝子を含むプラスミドＢＫ−９６−２−１１の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｋ、Ｋｐｎ  Ｉ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｓｍ、Ｓｍａ  Ｉ；Ｓｔｙ、Ｓｔｙ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉ；Ｘｈｏ、Ｘｈｏ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図６Ｂ】
複数のクローン部位および転写ターミネーターを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。「Ｒ」および「Ｐｓ」はＥｃｏＲ  ＩまたはＰｓｔ  Ｉの端部とオーバーラップする末端を示すが、これらの部位を再び生成するわけではない。上側鎖（配列番号５０）、下側（配列番号５１）。
【図７Ａ】
Ｔ７プロモーターおよび完全長のＮＴＨｉ菌株３３のｈｉａ遺伝子、大腸菌のｃｅｒ遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２２４１−１およびＤＳ−２２４２−２の構築を示す図である。制限酵素部位はＡ、ＡｌｗＮ  Ｉ；Ｂ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｋ、Ｋｐｎ  Ｉ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｓｍ、Ｓｍａ  Ｉ；；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉ；Ｘｈｏ、Ｘｈｏ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図７Ｂ】
鎖（配列番号５２）、相補鎖（配列番号５３）、およびエンコードされているアミノ酸配列（配列番号５４）をコードしている菌株３３のｈｉａ遺伝子の５’末端を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図８Ａ】
Ｔ７プロモーターおよび菌株３３からのＶ３８遺伝子、大腸菌のｃｅｒ遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ−２３４０−２−３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｓｎ、ＳｎａＢ  Ｉ；；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図８Ｂ】
切断型遺伝子用の５’端をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス（６２８６．ＳＬ）：配列番号６０、エンコードされているアミノ酸配列番号６１；アンチセンス（６２８７．ＳＬ）：配列番号１８、相補配列番号１９、エンコードされているアミノ酸配列番号２０。
【図９Ａおよび９Ｂ】
Ｔ７のＶ３８ｈｉａ（１１）およびＴ７のＶ３８ｈｉａ（３３）遺伝子のタンデムコピーをそれぞれ含むプラスミドＤＳ−２４４７−２およびＤＳ−２４４８−１７の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｈ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ；Ｐｓ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図１０】
ｒＨｉａの発現を示す図である。パネルＡ：レーン１、誘導されていない完全長ｒＨｉａ（１１）；レーン２、完全長ｒＨｉａ（１１）；レーン３、Ｅ２１ｒＨｉａ（１１）；レーン４、Ｔ３３ｒＨｉａ（１１）；レーン５、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）；レーン６、Ｎ５２ｒＨｉａ（１１）。パネルＢ：レーン１、誘導されていないＶ３８ｒＨｉａ（１１）；レーン２、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）；レーン３、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）／ｃｅｒ。
【図１１】
ｒＨｉａの精製スキームを示す図である。略語はＳＰ、上澄み；ＰＰＴ、沈殿；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＯＧ、オクチルグルコシドであり、（ｘ）は捨てられたことを意味する。
【図１２】
パネルＡおよびＢを有し、精製されたｒＨｉａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。パネルＡは菌株１１からの精製されたＶ３８ｒＨｉａタンパク質を示し、パネルＢは菌株３３からのＶ３８ｒＨｉａタンパク質を示す。レーン１、分子量マーカー；レーン２、全細胞の溶解物；レーン３、未精製抽出物；レーン４、精製されたｒＨｉａタンパク質。
【図１３】
パネルＡ、ＢおよびＣを有し、Ｖ３８ｒＨｉａ（１１）の安定性を示す図である。パネルＡは、グリセロールなしで４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＢは、２０％グリセロールの存在下で４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＣは、２０％グリセロールの存在下で−２０℃で保存されたサンプルを示す。レーン０はｔ０を示し、レーン１〜８は１〜８週間保存されたサンプルを示す。
【図１４】
パネルＡおよびＢを有し、ＣＤ−１マウスのＶ３８ｒＨｉａ（１１）またはＶ３８ｒＨｉａ（３３）の免疫原性を示す図である。パネルＡは単一の免疫化後の応答を示し、パネルＢは最初の／追加の免疫化の応答を示す。
【図１５Ａおよび１５Ｂ】
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびモルモットのＶ３８ｒＨｉａ（１１）の免疫原性を示す図である。図１５Ａはマウスにおける抗体の応答を示し、図１５Ｂはモルモットにおける応答を示す。
【図１６】
チンチラモデルにおける鼻咽頭コロニー形成に対するＶ３８ｒＨｉａ（３３）の防御能力を示す図である。
【図１７】
追加のｈｉａ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス（５０４０．ＳＬ）：配列番号２１、エンコードされているアミノ酸配列番号２２；アンチセンス（５０３９．ＳＬ）：配列番号３、相補配列番号４、エンコードされているアミノ酸配列番号５。
【図１８】
ＮＴＨｉ菌株３３からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２３）および演繹アミノ酸配列（配列番号２４）を示す図である。
【図１９】
ＮＴＨｉ菌株３２からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２５）および演繹アミノ酸配列（配列番号２６）を示す図である。
【図２０】
ＮＴＨｉ菌株２９からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２７）および演繹アミノ酸配列（配列番号２８）を示す図である。
【図２１】
ＮＴＨｉ菌株Ｍ４０７１からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２９）および演繹アミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。
【図２２】
ＮＴＨｉ菌株Ｋ９からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３１）および演繹アミノ酸配列（配列番号３２）を示す図である。
【図２３】
ＮＴＨｉ菌株Ｋ２２からのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３３）および演繹アミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である。
【図２４】
ｃ型菌株ＡＰＩからのｈｉａ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３５）および演繹アミノ酸配列（配列番号３６）を示す図である。
【図２５】
ＮＴＨｉ菌株１２からのｈｉａ遺伝子座のヌクレオチド配列（配列番号３７）および演繹アミノ酸配列（配列番号３８）を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのｏｒｆの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス（６４３１．ＳＬ）：配列番号３９、（６４３２．ＳＬ）配列番号４０；アンチセンス（６２９５．ＳＬ）配列番号４１、（６２７１．ＳＬ）配列番号４２。
【図２６】
米国特許第５，６４６，２５９号において公開されている、ＮＴＨｉ菌株１１からのｈｉａ遺伝子座のヌクレオチド配列（配列番号４３）および演繹アミノ酸配列（配列番号４４）を示す図である。
【図２７】
菌株１２のｈｉａ遺伝子座からの上流ＯＲＦ（配列番号４５）の配列およびｂ型インフルエンザ菌株ＲｄからのＨＩ１７３２タンパク質（配列番号４６）の一部の整列を示す図である。
【図２８】
Ｈｉａ（配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２）、Ｈｓｆ（配列番号４７）、および菌株４２２３およびＬＥＳ−１（配列番号４８、４９）からのＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの高分子量タンパク質（２００ｋＤａ）からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２９】
ｈｉａ遺伝子の５’端をＳ４４切断位置でＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス（６８１７．ＳＬ）配列番号５５、エンコードされているアミノ酸配列番号５６；アンチセンス（６８１８．ＳＬ）配列番号５７、相補配列番号５８、エンコードされているアミノ酸配列番号５９。
【図３０】
ＮＴＨｉ菌株１１からのＳ４４ｈｉａ遺伝子および大腸菌のｃｅｒ遺伝子およびＴ７プロモーターを含む、プラスミドＪＢ−２９３０−３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢａｍＨ  Ｉ；Ｂｇ、Ｂｇｌ  ＩＩ；Ｋ、Ｋｐｎ  Ｉ；Ｎ、Ｎｄｅ  Ｉ；Ｐ、Ｐｓｔ  Ｉ；Ｒ、ＥｃｏＲ  Ｉ；Ｓ、Ｓａｌ  Ｉ；Ｓｍ、Ｓｍａ  Ｉ；Ｓｔｙ、Ｓｔｙ  Ｉ；Ｘｂ、Ｘｂａ  Ｉ；Ｘｈｏ、Ｘｈｏ  Ｉである。他の略語はＴ７ｐ、Ｔ７プロモーター；ＡｐＲ、アンピシリン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；ｔｔ１、ｔｒｐＡからの転写ターミネーター１；ｔｔ２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図３１】
Ｓ４４からのｒＨｉａの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１、時間０での（誘導なしで）ｐＥＴＳ４４ベクターからの発現体；レーン２、４時間の誘導後のｐＥＴＳ４４ベクターからの発現体；レーン３、４時間の誘導後のＪＢ−２９３０−３からの発現体。
【図３２】
発現試験用に使用された２つのベクター、Ｓ４４切断型ｒＨｉａのＪＢ−２９３０−３およびＩＡ−１９１−３−１の概略を示す図である。




【国際調査報告】
2004529601.tif 000326
2004529601.tif 000327
2004529601.tif 000328
2004529601.tif 000329
2004529601.tif 000330
2004529601.tif 000331