(57)【要約】本発明は、ＲＮＡを細胞内に挿入する方法に関する。本発明において、高いトランスフェクション効率を達成するために、エレクトロポレーションを用いてＲＮＡで細胞をトランスフェクトする。この方法は、中でも細胞主体療法において用いられる細胞を提供する際（例えば、抗癌ワクチンとして有用な細胞を調製する際）に有用である。好ましくはＲＮＡは、５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）尾部を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の電気パルスを用いて、細胞内にＲＮＡを導入することを含む方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡはポリ（Ａ）尾部を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリ（Ａ）尾部は少なくとも７０ヌクレオチド長である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡは５’キャップを有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡはｍＲＮＡである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡは腫瘍細胞ＲＮＡである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡはテロメラーゼの全てまたは一部をコードする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡはエレクトロポレーションにより細胞内に導入される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記エレクトロポレーションは方形波エレクトロポレーションである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
０．０００１〜１００，０００ミリ秒、例えば、０．０１〜１０００ミリ秒継続する１以上のパルスを用いる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
０．００１〜１０００ｋＶ／ｃｍ、例えば、０．１〜１０ｋＶ／ｃｍの電圧を用いる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は初代細胞、リンパ球、幹細胞または樹状細胞である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は抗原提示細胞である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１００個の細胞（例えば１００個の樹状細胞）集団の少なくとも１０％のトランスフェクションを達成するために用いることができる請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞主体療法での使用のための細胞の調製における請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１６】
免疫療法での使用のための細胞の調製における請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１７】
ワクチンの調製における請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１８】
癌治療での使用のための細胞の調製における請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１９】
添付の図面および実施例を参照して、実質的に本明細書に記載されるような発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に遺伝物質を挿入する方法に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
細胞内への遺伝物質の導入は、現代の生物学および医学における発展にとって根本的重要性があり、遺伝子の機能および調節に関するわれわれの知識の多くを提供してきた。ほとんど全ての場合において、トランスフェクションのためにＤＮＡが用いられてきたのは、固有の安定性、およびホストゲノムに組み込んで安定なトランスフェクタントを生成するその能力のためである。遺伝物質を細胞内へ導入するのに、幅広い様々な方法が利用できる。これらには、ＤＮＡをリン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリリジン、あるいはキャリアタンパク質と混合するような単純な操作が含まれる。他の方法には、いくつか挙げれば、マイクロインジェクション、原形質融合、リポソーム、遺伝子銃送達、およびウィルスベクターが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明によれば、１以上の電気パルスを用いて細胞内にＲＮＡを導入することを含む方法が提供される。
【０００４】
エレクトロポレーション技法は知られているが、これはＤＮＡを用いることに集中してきた。
【０００５】
ＲＮＡ主体トランスフェクションは、他の技法において注目されてきた。例えば、ｍＲＮＡ媒介トランスフェクションに関する戦略は、ＲＮＡ／リポソーム複合体を用いて（Malone, R. W. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 6077-6081; Glenn, J. S. et al., 1993, Methods Enzymol. 221: 327-339; Lu, D. et al., 1994, Cancer Gene Ther. 1: 245-252)、あるいは単純に細胞およびｍＲＮＡを共にインキュベートすることによって（Boczkowski, D. et al., 1996, J. Exp. Med. 184: 465-472; Boczkowski, D. et al., 2000, Cancer Res. 60: 1028-1034）開発されてきた。
【０００６】
本発明の方法を利用することによって、驚くべきことに、高いトランスフェクション効率を達成することができる。本発明の方法を用いて達成できるトランスフェクション効率は、ある他のＲＮＡ主体技法を用いて達成した効率と比べて、時には数百倍であることが可能である。また、本発明の方法は、ｍＲＮＡトランスフェクション後の異所的発現の直接的な測定が以前に明らかにされていない樹状細胞（ＤＣ）のような初代細胞のトランスフェクションに用いることができる（Mitchell D. A. および Nair S. K., 2000, J Clin Invest 106: 1065-1069参照）。したがって、本発明はトランスフェクション分野における大きなブレークスルーを表している。
【０００７】
好ましくは、本発明の方法は、ポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡを用いる。望ましくは、ポリ（Ａ）尾部は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、あるいは少なくとも７０ヌクレオチド長である。
【０００８】
いくつかの場合では、このポリ（Ａ）尾部は、１００超、２００超、５００超、あるいは１０００超のヌクレオチド長でさえあることがある。長いポリ（Ａ−Ｔ）鎖は、本発明の好ましい態様であり、熱安定性ポリメラーゼ酵素を用いた高温ＰＣＲを用いることによって達成することができる（実施例および図９参照）。例えば、長いポリ（Ａ−Ｔ）鎖は、オリゴｄ（Ａ）およびオリゴｄ（Ｔ）オリゴヌクレオチドと、Ｐｆｕ（ストラタジーン）のような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰデオキシヌクレオチドと、この酵素に必要な追加的バッファー成分（通常この酵素と共に供給される）とを含むＰＣＲ反応で作り出すことができる。このＰＣＲは、例えばＰＴＣ−２００（ＭＪリサーチ、ウォルサム、マサチューセッツ州）の熱サイクラーにおいて、１〜１００サイクル、より好ましくは２０〜３０サイクルで繰り返される適切な温度プロファイルを用いて実行される。２０℃で１秒間、次いで７０℃で１０秒間からなるプロファイルを用いてもよいが、他のプロファイルも良い結果をもたらすことがある（図９）。かかる方法を用いることにより、本発明者らは、１００００ヌクレオチド長までの非常に長いポリ（Ａ−Ｔ）鎖を得ることができた。また、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなクレノウ断片のような非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼもこの方法で用いることができ、主に１００〜２５０ヌクレオチドの範囲のより短いポリ（Ａ−Ｔ）鎖を生成することができる（実施例および図９参照）。また化学合成あるいはリガーゼ酵素を用いた、より短い断片の結合のようなポリ（Ａ−Ｔ）鎖の他の生成方法も用いてもよい。また、ポリ（Ａ−Ｔ）鎖を、適切なｃＤＮＡ源から得てもよい。
【０００９】
望ましくは、上記ＲＮＡは５’キャップを有する。この５’キャップは、例えば、ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧまたはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ類似体でもよく、これらは、例えば、ＮＥＢ社、ベバリー、マサチューセッツ州から市販されている。安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する他の化学構造も使用してもよい。
【００１０】
本発明の最も好ましい実施形態において、上記ＲＮＡは５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）尾部の両方を有する。
【００１１】
上記ＲＮＡはｍＲＮＡであってもよく、これは不可欠ではない。標準的な技法により、５’キャップおよび／またはポリ（Ａ）尾部を有する他の分子が提供され得る。例えば、ハイブリダイズする能力および他のＲＮＡの機能をなくす能力を有するアンチセンスＲＮＡを、５’キャップおよび／またはポリ（Ａ）尾部と共に合成してもよく、本発明において用いてもよい。
【００１２】
また、必要に応じて上記ＲＮＡは、１以上の追加的特性を有してもよい。例えば、グロビンＲＮＡ由来の非翻訳領域のような安定化エレメント（stabilising element）が存在してもよい。また、ｍＲＮＡが３’ＵＴＲを欠いているため、オープンリーディングフレームの末端における停止コドンがポリ（Ａ）尾部に直接融合されるということも、有利であることがある。
【００１３】
本発明は、エレクトロポレーション技法を利用して電気パルスを提供することができる。実施例において提供された結果は、方形波エレクトロポレーターを用いて得られた（「材料および方法」参照）。他の技法を用いることができるが、方形波エレクトロポレーションが本発明にとって好ましい。
【００１４】
本発明の方法は、試験された全ての細胞型の高レベルのトランスフェクションを提供した点で注目に値するものであり、この細胞型は、ＤＣ、リンパ球およびＣＤ３４＋幹細胞のような（生体の組織から直接調製された）初代細胞、ならびにエプスタインバー（Epstein Barr）ウィルスによって形質転換されたＢ細胞（ＥＢ）およびいくつかの癌細胞株も含む。
【００１５】
ＲＮＡのエレクトロポレーションを用いて、かかる高レベルのトランスフェクションを達成することができることを示す文献は存在しない。上に示したように、核酸のエレクトロポレーションはＤＮＡに集中している。実験目的でｇｌａｃＺｇnＲＮＡをＨｅＬａ−Ｋb細胞内にエレクトロポレーションした他に類のない論文が存在する（Hoerr et al, Eur. J. Immunol. 30: 1-7 [2000]）。この論文に開示されたような、ｇｌａｃＺｇnＲＮＡのＨｅＬａ−Ｋb細胞内へのエレクトロポレーションは、本発明の範囲から明らかに放棄されている。この論文において、エレクトロポレーションを用いて得ることができるトランスフェクションレベルについての議論はなされていない。実は、この論文は、プロタミン縮合ＲＮＡ（カプセル化あるいは非カプセル化形態）のまたは裸のＲＮＡの直接注入を含む予防接種プロトコルに注目している。プロタミン縮合ＲＮＡは、（ＤＮＡと比較して）非常に低レベルで用いてＣＴＬ応答を刺激することができるという点で有利であるということが示されている。上記の予防接種プロトコルは、どれもエレクトロポレーションを含まない。本発明の方法を用いて、印加される電圧、パルス長およびパルス数における変化を含む幅広い範囲の種々の機器設定に対して、細胞を効率良くトランスフェクトすることができる。例えば、ＤＣ(樹状細胞)の最適なトランスフェクションは、０．１５〜０．２５ミリ秒（ｍｓ）間１．５〜３ｋＶ／ｃｍ（キロボルト／ｃｍ）の範囲の（機器によって報告されたような）電圧を印加することによって達成することができるが、著しいトランスフェクションは、より短いパルスと組み合わされたより高い電圧、およびより長いパルスと組み合わされたより低い電圧の両方においても得ることができる。ＣＤ３４＋幹細胞に関しては、最適な範囲はより短いパルス長と組み合わされたより高い電圧（２．２〜４ｋＶ／ｃｍで０．０３〜０．１ｍｓ）を含むのに対し、ＥＢ細胞および癌細胞株に関しては、より低電圧かつより長いパルス継続時間（０．５〜１．５ｋＶ／ｃｍで０．４３〜４０ｍｓ）を利用することが有利である。
【００１６】
初代細胞（ＤＣ、リンパ球およびＣＤ３４＋幹細胞）のトランスフェクションに対し、低電圧と組み合わせた長継続パルス（数ミリ秒以上）は、より効果的でなく、および／または細胞にとって有害である。したがって、これらの細胞型のエレクトロポレーションに関する最適条件は、細胞株および多くの他の細胞型に対して確立されたものであって、一般に低電圧と長継続パルスとの組み合わせを含むものとは非常に異なる（最新のプロトコルの編集物は、ＢＴＸ（http://www.btxonline.com/btx/index.html.）から得ることができる）。
【００１７】
いずれの件においても、当業者は日常的な実験により、如何なる所与の細胞およびＲＮＡ分子に対する適切なエレクトロポレーション条件を決定することができるだろう。したがって、上記の条件は限定されるべきであるということは意図されない。このため、パルス長は大きく異なっていてもよい（例えば、０．０００１〜１０００００ミリ秒、より好ましくは０．０１〜１０００ミリ秒）。また、電圧も大きく異なっていてもよい（例えば、０．００１〜１０００ｋＶ／ｃｍ、より好ましくは０．１〜１０ｋＶ／ｃｍ）。エレクトロポレーションの間、細胞を様々な型のバッファー／培地中に浸漬することができる。いくつか挙げれば、ＲＰＭＩ、ＩＭＤＭ、Ｘ−ＶＩＶＯおよびＰＢＳのような市販の成長培地は、本発明で用いた場合、良好な結果をもたらしている。多くの細胞型に対して、特別に配合されたバッファーを用いることによって、トランスフェクション効率および／または生存率を向上させることができる。例えば、バッファーはより低濃度の塩を含んでもよく、および／またはナトリウム塩の代わりにカリウム塩を用いてもよい。如何なる所与の細胞型に対して、最適なエレクトロポレーションバッファーを日常的な実験によって決定することができる。エレクトロポレーションに用いる細胞／バッファーの温度は、好ましくは４３℃未満、より好ましくは０〜４℃である。
【００１８】
本発明の方法には、莫大な範囲の用途がある。これらのいくつかを以下で議論する。
【００１９】
ここ２０年において、病原（pathogenic sources）および腫瘍組織から遺伝子をクローニングして特徴付けるための鋭意努力がなされてきた。この知見に基づき、医学的治療および予防接種レジメンのための新規かつ重要なアプローチにより、かかる遺伝子および変異体（mutation）を抗原として用いて保護免疫応答を誘導することが明らかにされた。遺伝子ワクチンは比較的安価で製造しやすく、かつ皮膚へ注入することによって直接投与することができるので、その免疫原性および効力は多くの系において解析されてきた。研究は、小さな実験動物から霊長類に急速に移行し、マラリア、ＨＩＶ感染および癌のような疾病に対する臨床試験が現在行われている。しかしながら、多くの系における遺伝子ワクチンの効力は、特に体の質量の大きい生体において満足なものであることが証明されていない（Manickan E. et al., 1997, Crit. Rev. Immunol. 17: 139-154において論評されている）。
【００２０】
Ｔ細胞媒介免疫応答を誘導するための最も潜在的な抗原提示細胞として樹状細胞（ＤＣ）を認識することにより、ワクチン開発に力点が移ってきた（Banchereau J. and Steinman R. M., 1998, Nature 392: 245-252において論評されている）。その理論的解釈は、適切な抗原を取り込んだ（loaded）ＤＣが局所のリンパ節へ移動して抗原特異的Ｔ細胞を活性化するであろうということである。多くのＤＣは、付着性の単核細胞をサイトカインの存在下で培養することによって、血液から容易に生成され得（Romani, N. et al., 1995, J. Exp. Med. 180: 83-93）、多くの研究は、抗原を取り込んだかかるＤＣを用いる予防接種後のマウスにおけるＴ細胞応答のプライミングを文書で示している。最近、抗原のパルスを付与された樹状細胞を用いる癌患者の予防接種により、癌患者の様々な群において臨床的利益と相関する強い免疫応答がもたらされた（Nestle, F. O. et al., 1998, Nat Med. 4: 328-332; Schadendorf, D. and Nestle, F. O., 2001, Recent Results Cancer Res. 158: 236-248. Review.; Yu, J. S. et al., 2001, Cancer Res. 61: 842-847）。
【００２１】
本発明は、免疫応答が標的とされるタンパク質のみの発現をもたらすように、ＤＣの（または他の細胞の）トランスフェクションが達成されることを可能にする。関連抗原以外のタンパク質の発現が、免疫優性（Pion, S. et al., 1999, Blood. 93: 952-962）および以前から存在する免疫性に起因して、意図される応答の発生を妨げることがある。これは特にウィルスベクターと関連しており、このウィルスベクターは、その高いトランスフェクション効率のために、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける初代細胞のトランスフェクションに最も広く用いられてきた。
【００２２】
本発明はまた、ＲＮＡを直接提供することにより転写調節を含む潜在的な問題を回避するという点でも有利であり、これは、細胞内への侵入時の細胞質翻訳機構への容易なアクセスを有している。さらにＲＮＡは、ホスト（宿主）において永続的な遺伝的変異を引き起こすには限定された能力に起因して、しばしばＤＮＡよりも安全な代替物である。
【００２３】
腫瘍生検のような細胞サンプルからＲＮＡを直接単離することができ、あるいは、例えば化学的または遺伝子クローニング方法によってＲＮＡを合成してもよい。
【００２４】
また、ＲＮＡ主体エレクトロポレーションは、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）の刺激のためにＤＣ（または他の細胞）へ腫瘍由来ｍＲＮＡを直接トランスフェクションする便利な方法も提供し、他の人が行ったような（Boczkowski, D. et al., 2000, Cancer Res. 60: 1028-1034）事前の増幅ステップの必要性を排除し得る。
【００２５】
ＲＮＡ主体トランスフェクションは、細胞の相互作用を誘導するのに用いることができる。例えば、ｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＤＣを、ｈＴＥＲＴ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するのに用いることができる（実施例を参照）。この戦略に基づく免疫療法は、原則として、タンパク質をコードする如何なるＲＮＡと共に用いることができる。この方法の重要な利点は、ウィルス媒介トランスフェクションと対比するものとして、一度に単一のタンパク質を細胞に取り込ませる能力である。
【００２６】
細胞性処理の調節を研究するために、本発明を用いて細胞をトランスフェクトすることができる。例えば遺伝子の調節および機能ならびに調節カスケードの理解を高めるために、例えばＭＹＣまたはＦＯＳのような転写因子をコードするｍＲＮＡを細胞内へエレクトロトランスフェクション（electrotransfected）してもよく、他のタンパク質の表現型および／または発現における改変における効果を、標準的な技法を用いてモニタリングしてもよい。同様に、Ｖ−ＭＹＣ、Ｖ−ＦＯＳまたはＲＡＳ−１２Ｃｙｓのような変異形の細胞性タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞内にエレクトロトランスフェクトして、細胞性処理および癌の進行のかかる変異体の効果を研究してもよい。
【００２７】
本発明を、添付の図面を参照して、例示としてのみ以下に記載する。
【実施例】
【００２８】
序論
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｍＲＮＡの生成に関して、我々は一連の（a panel of）プラスミドベクターを開発してきた。このベクターには、ＰＣＲ産物からのＤＮＡ転写ユニットの構築に有用であるｐＢＮｃｏシャトルベクター（図１）、および固有の転写ユニットの一部として異なる長さのポリ（Ａ）領域を含むいくつかのｐＣＩｐＡ  ｍＲＮＡ発現ベクター（図２）が含まれる。これらのベクターを組み合わせて、あるいは単独で用いて、数百までのヌクレオチドを含む均一に長いポリ（Ａ）尾部を有するキャップｍＲＮＡ（capped mRNA）を生成することができる。エレクトロポレーションとこのｍＲＮＡを組み合わせるトランスフェクションレジメンにおいて、効果的なレポーター遺伝子発現を、１００％までの細胞において誘導することができる。細胞集団において得られた平均のレポーター遺伝子発現および生存率は、エレクトロポレーションに用いられる特定の設定に依り、様々な要件を満たすようにこれらの条件を調整することができる。５’キャップおよび長いポリ（Ａ）尾部は、これらの構築物に用いられたが（図６）、グロビンＲＮＡ由来の非翻訳領域のような他の安定化エレメントも用いることができる。
【００２９】
我々は、ｒＧＴＰおよびキャップ類似体の濃度を調整することによって、リボマックス（Ribomax）キットを用いて得られるｍＲＮＡ収量を少なくとも５倍増加させることができるということを発見した（「材料および方法」参照）。プラスミドＤＮＡを用いる既存の方法と比較する場合でさえ、驚くべきことに、この高濃度のｍＲＮＡを用いることによって、このプロトコルは効果的になった。１０２ヌクレオチドの長いポリ（Ａ）尾部（ｐＣＩｐＡ102）を有するｍＲＮＡを用いるｍＲＮＡ媒介トランスフェクションからもたらされるレポーター遺伝子産物レベルは、一般にトランスフェクションの２日後に最大に達する（図４Ｂ／Ｃ）。ＥＧＦＰをレポーターｍＲＮＡとして用いる（ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡ）と、ＤＣで得られる平均のＥＧＦＰシグナルは、バックグラウンドレベル（ＢＧ）の７７倍であり、最も強い発現細胞ではＢＧの４００倍である。ＥＧＦＰ／ｐＣＩプラスミドＤＮＡを用いて得られるＤＣの最も高いトランスフェクションは、５０μｇ／ｍｌのＤＮＡを用いた２．５ｋＶ／ｃｍで０．２５ｍｓの方形波エレクトロポレーションを用いて達成され、陽性の発現を有する亜集団（sub-population）内で、ＢＧの８６倍の平均のＥＧＦＰシグナルをもたらし、最も強い発現細胞ではＢＧの１０００倍である。しかしながら、ＤＮＡを用いて達成されたトランスフェクション率はより低いので、全集団の平均のＥＧＦＰシグナルもＢＧの２９倍とより低い。したがって、ＤＣ集団において得られた全ＥＧＦＰ発現に関して、ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡは、エレクトロポレーションのためのＥＧＦＰ／ｐＣＩプラスミドＤＮＡより少なくとも２．６倍効果的である。
【００３０】
我々は、文献中に提示された代替的ｍＲＮＡ主体トランスフェクション技法とエレクトロポレーションを比較した（図７）。この技法には、感作（ｍＲＮＡとの単純なインキュベーション）およびＤＯＴＡＰを用いたリポソーム媒介トランスフェクションが含まれる。これらの代替的方法は、ＤＣのｍＲＮＡ媒介トランスフェクションにとってあまり効果的ではなく、エレクトロポレーションによって２００倍以上高いトランスフェクション効率を達成することができる（図４／７）。
【００３１】
多くの、おそらくほとんどの細胞型と共にならびに一過的（transient）発現が要求されるかまたは十分であるいずれもの目的または実験のために、ｍＲＮＡ主体エレクトロトランスフェクションを用いることができる。例えば、我々はＤＣにテロメラーゼ活性を誘導する方法を採用してきた。ＤＣを、エレクトロポレーションにより全長のｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いてトランスフェクトし、テロメラーゼ活性の誘導をＴＲＡＰアッセイを用いてモニタリングした(図８)。この細胞は、時間をベースにした方式で（in a time-based manner）でテロメラーゼ活性を獲得し、この酵素活性はＨＬ６０細胞を増殖させる際のおよそ４０％であった。この処理を定期的に適用することより、原則的に永久に遺伝子的に修飾される必要なく、分割細胞を不死化状態に保持することができる。
【００３２】
材料および方法
ｐＢＮｃｏシャトルベクター
霊長類共通翻訳開始配列という状況では（すぐ下流）（context (immediately downstream)）において平滑末端遺伝子断片のクローニングを行うことと同時に、クローニング実験における青／白色選別の利点を提供してｐＢＮｃｏシャトルベクター（図１）を構築した。粘着ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ末端をそれぞれ、ならびに内部のＮｈｅＩ、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩ制限切断部位を含むＤＮＡ断片を、２つのオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＡＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＣ 、５’−ＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡ）をハイブリダイズすることによって作製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州; GenBank acc.: 52324）のＳｐｅＩとＮｏｔＩ部位との間に挿入した。挿入断片は、ＮｈｅＩおよびＮｃｏＩ切断部位をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）マルチクローニング部位（ＭＣＳ）に付加し、また正常なｌａｃＺ機能を付与することなくｌａｃＺのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と連続している。クローニング操作で使用する前に、ｐＢＮｃｏをＮｃｏＩで消化し、熱失活させて、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きなクレノウ断片（ＤＮＡｐｏｌ  Ｉ  クレノウ；ＮＥＢ社、ベバリー、マサチューセッツ州）を用いてへこんだ３’末端のフィルイン（fill-in）反応を行い、インフレーム（in frame）融合のためのＧＣＣＡＣＣＡＴＧ−３’平滑末端を作った。このポリメラーゼの失活後、このＤＮＡをＸｂａＩまたはＮｏｔＩで消化して、下流のクローニング部位を作った。その後、このＤＮＡをエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ；ロシュ、バーゼル、スイス）を用いて脱リン酸化し、ウィザードＰＣＲプレプス（Wizard PCR Preps）キット（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）で精製し、ｐＢＮｃｏクローニング用（ready-for-cloning）断片（ｐＢＮｃｏ−Ｒ）を生成させた。
【００３３】
ｐＣＩｐＡ102発現ベクター
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのラン−オフ（run-off）転写によるポリアデニル化ｍＲＮＡの生成のために、ｐＣＩ発現ベクター（プロメガ）を、その転写ユニットの一部としてポリ（Ａ）領域を含むように改変した。ポリ（Ａ−Ｔ）断片は、ｄ（Ａ20）およびｄ（Ｔ15）オリゴヌクレオチドから、ＰＴＣ−２００熱サイクラー（ＭＪリサーチ、ウォルサム、マサチューセッツ州）における反復合成（２４サイクル：４０℃で５秒間、２０℃で５秒間、３７℃で５秒間）によって、ＤＮＡｐｏｌ  Ｉ  クレノウを用いて、適切な反応条件下（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；５ｍＭのＭｇＣｌ2；７．５ｍＭのＤＴＴ；１μＭのｄ（Ａ20）およびｄ（Ｔ15）；０．５ｍＭのｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ；０．２５Ｕ／μｌのＤＮＡｐｏｌ  Ｉ  クレノウ）で生成され、ｐＣＩ中のＳＶ４０  ３’ＵＴＲにおけるＨｐａＩ切断部位（非翻訳領域；プロメガにより後期（late）ポリアデニル化シグナルと称される）中に挿入された。このＨｐａＩ部位は、ＭｕｎＩ／ＭｆｅＩ切断部位に続いており、この部位は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写の前にプラスミドを直線化するのに用いることができる。１００ヌクレオチド長のポリ（Ａ−Ｔ）挿入を含有するプラスミド（ｐＣＩｐＡ102と称される（図２））を、さらなる作業のために選択した。
【００３４】
ＥＧＦＰ／ｐＣＩおよびＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102構築物
強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いた消化によってｐＥＧＦＰ−Ｎ３（クローンテック、パロ・アルト、カリフォルニア州）から単離し、ｐＣＩおよびｐＣＩｐＡ102発現ベクターにおける同じ切断部位の間に挿入し、ＥＧＦＰ／ｐＣＩおよびＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102をそれぞれ生成させた。ＭｆｅＩを用いたこれらの構築物の消化およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写により、５８ヌクレオチド長の５’ＵＴＲ（主としてｐＥＧＦＰ−Ｎ３ポリリンカー）、ＥＧＦＰのＯＲＦ、ＳＶ４０  ３’ＵＴＲ、１０２ヌクレオチド長のポリ（Ａ）尾部（ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102のみ）および１４ヌクレオチドのベクター配列を含む（５’から３’）転写物（transcript）を生成する。
【００３５】
ｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102構築物
ｐＣＩ−Ｎｅｏ（プロメガ）においてクローニングされたｈＴＥＲＴ  ｃＤＮＡ（以前はｈＥＳＴ２／ｈＴＲＴ）の全コード配列（ＣＤＳ）を含むプラスミド構築物は、ロバートＡ．ワインバーグ教授（マサチューセッツ工科大学、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の好意で我々に提供された。このクローンのＣＤＳは、ＡＴＧ開始コドンを除き、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（ストラタジーン）と、２つの適切なプライマー：リン酸化プラス鎖プライマー（Ｐ−５’−ＣＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣＴＧＣ）および、ｐＣＩ−Ｎｅｏ中のＳＶ４０  ３’ＵＴＲ内でハイブリダイズする下流側プライマー（５’−ＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡ）とを用いてＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物は、ＮｏｔＩで消化されてｐＣＩ−Ｎｅｏベクター配列が除去され、ｐＢＮｃｏ−Ｒベクター断片と連結された。このクローンからｈＴＥＲＴ  ＣＤＳを含むＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ断片を単離し、ｐＣＩｐＡ102中のそれぞれの切断部位の間に挿入し、ｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102を生成させた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたこの構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、１１ヌクレオチド長の５’ＵＴＲ（５’−ＧＧＣＵＡＧＣＣＡＣＣ）、ｈＴＥＲＴ  ＣＤＳ、ＳＶ４０  ３’ＵＴＲ、１０２ヌクレオチド長のポリ（Ａ）尾部および１４ヌクレオチドのベクター配列を含む（５’から３’）転写物を生成した。
【００３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡの生成
プラスミド構築物をＭｆｅＩで直線化し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１；ｐＨ７．８）抽出、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）抽出およびエタノール沈殿を用いることによって精製した。その後その構築物を、ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体（ＮＥＢ）の付加することと共にリボマックスＴ７  ＲＮＡ生成系（プロメガ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した。反応混合物は、以下のものを含む：８０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２４ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのスペルミジン、４０ｍＭのＤＴＴ、７．５ｍＭのｒＡＴＰ／ｒＣＴＰ／ｒＵＴＰ、２．４ｍＭのｒＧＴＰ、１２ｍＭのｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡテンプレートおよび１０％（ｖ／ｖ）酵素混合物（Ｔ７）。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１；ｐＨ４．３）およびクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いた抽出後、ｍＲＮＡを沈殿させ、エタノールで洗浄し、ＲＮアーゼ非含有水中に溶解した。合成されたｍＲＮＡの質は、変性アガローズ／ホルムアルデヒドゲル電気泳動により、および磁性オリゴ（ｄＴ）ダイナビーズ（ダイナルＡＳ、オスロ、ノルウェー）に結合させることにより調べた。
【００３７】
テロメラーゼアッセイ
テロメラーゼ活性を測定するために用いたプロトコルは、テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ；Kim, N. W. et al., 1994, Science 266: 2011-2015）から改変された。ＣＨＡＰＳ抽出物は、１０5個の細胞から調製された。この細胞をまずＰＢＳ中で洗浄し、次いでＨＥＰＥＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）；１．５ｍＭのＭｇＣｌ2；１０ｍＭのＫＣｌ；１ｍＭのＤＴＴ）中で洗浄し、４℃でペレット化した。このペレットを０．２ｍｌの氷冷ＣＨＡＰＳバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）；１ｍＭのＭｇＣｌ2；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）；０．１ｍＭのベンズアミジン；５ｍＭのβ−メルカプトエタノール；０．５％のＣＨＡＰＳ；１０％のグリセロール）中に溶解することによって、細胞を溶解し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、この溶解物を１２０００ｇで４℃３０分間遠心分離し、このＣＨＡＰＳ抽出物（上清）を回収し、使用しない場合は−８０℃にて保存した。テロメラーゼ活性は、２μｌのＣＨＡＰＳ抽出物（１０００細胞当量）を４８μｌのマスターミックス（２００ｎＭのＴＳプライマー、４０ｎＭの蛍光色素標識ＣＸＡプライマー（ＨＥＸ−５’−ＧＴＡＧＣＣＧＣＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡＣＣ）、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、６３ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、５０μＭのｄＡＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰおよび０．０５Ｕ／μｌのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ）と組み合わせることによって測定した。この反応混合物を３０℃で１０分間インキュベートした後、２８サイクルのＰＣＲ（９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間）を行った。その後、一部をホルムアミド／サイズ標準中１：１２希釈し、ＡＢＩプリズム３１０キャピラリー電気泳動ユニット（ＰＥ社、ノーウォーク、コネチカット州）を用いて解析した。
【００３８】
ヒト血液細胞の調製
正常なＨＬＡ−Ａ２+ドナーからのバフィーコートを、リンフォプレップ（Lymphoprep）（ニコメッド、オスロ、ノルウェー）での密度勾配遠心分離によって分離し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離して、刺激物質および応答物質細胞として後に使用するために、分取して低温保存した。解凍したＰＢＭＣを、２％熱不活化ヒトプール血清補填Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（バイオウィタッカー社、ウォーカーズビル、メリーランド州）中で、１０7細胞／ウェルにて６ウェルプレートにプレーティングすることにより、ＤＣを生成させた。この細胞を５％ＣＯ2中で３７℃にて１．５時間にわたり付着させ、非付着細胞を除去した。付着細胞を３回洗浄し、２％熱不活化ヒトプール血清補填Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αおよび１００Ｕ／ｍｌのＩＮＦ−α（以下、成熟培地として言及される））中に懸濁させ、４〜７日間（５％ＣＯ2、３７℃にて）インキュベートし、ＤＣを分化させた。分化した細胞の表現型を、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１ａおよびＣＤ１４細胞表面マーカーに対する蛍光色素標識抗体で染色することによって評価し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン・イムノサイトメトリーシステムズ（Becton Dickinson Immunocytometry Systems）、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いたフローサイトメトリーで解析した。ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６のアップレギュレーション、ならびにＣＤ１ａおよびＣＤ１４のダウンレギュレーションにより測定されたような成熟ＤＣの分化は、５日目に完了した（結果は示されていない）。
【００３９】
ＤＣのトランスフェクション
ＤＣを１回洗浄し、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０に懸濁し、氷上に置いた。ＤＮＡトランスフェクションの場合、０．１ｍｌ（１０4〜１０5個）の細胞を２μｇのＤＮＡ（１μｇ／μｌ）と混合した。ｍＲＮＡを用いたトランスフェクションの場合は、０．２ｍｌ（１０5〜１０6個）の細胞を１０〜５０μｇのｍＲＮＡ（１〜５μｇ／μｌ）と混合した。細胞を２ｍｍギャップのキュベットに移し、ＢＴＸ  ＥＣＭ８３０方形波エレクトロポレーター（ジェネトロニクス社、サンディエゴ、カリフォルニア州）により、本明細書中で特定したようなパラメーター設定を用いてパルスを付与した。１分間氷上でインキュベートした後、細胞を成熟培地に播種し、３７℃でインキュベートした。ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ／ｐＣＩプラスミド、ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡ）を発現させるためにトランスフェクトされた細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで解析した。ｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いたトランスフェクション後のｈＴＥＲＴの発現を、上記のテロメラーゼアッセイを用いて解析した。
【００４０】
一次ＣＴＬ応答の誘導および細胞傷害性アッセイ
ｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いてＤＣをトランスフェクトし、成熟培地中で２４時間インキュベートした。その後、このＤＣを洗浄し、１０％熱不活化ヒトプール血清および５Ｕ／ｍｌの組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）補填Ｘ−ＶＩＶＯ  １０中、１：１０の刺激物質と応答物質との比にて、解凍された自己ＰＢＭＣと混合した。大量の培養物を毎週再刺激し、１週間に２回培地の部分的交換を行った。細胞傷害性アッセイを、最後の再刺激の１０日後に行った。ｈＴＥＲＴを用いたプライミング後のＣＴＬ応答の誘導は、従来の51Ｃｒ標識放出（release）アッセイにおいてモニタリングされた。ｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡ用いてトランスフェクトしたＤＣ、ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いてトランスフェクトしたＤＣまたは単にエレクトロポレーションしたＤＣ（後者の２つはコントロール用）を、標的細胞として用いた。これらの細胞を７．５ＭＢｑの51Ｃｒと共に全量で０．５ｍｌとして、３７℃にて１時間インキュベートし、その後３回洗浄し、９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート（コースター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に、２×１０3細胞／ウェルにて播種した。２×１０4個のエフェクター細胞を各ウェルに添加し、これらのプレートを３７℃にて４時間インキュベートした。その後、上清を回収し、放射能をトップカウントマイクロプレートシンチレーションカウンター（パッカードインスツルメント社、メリデン、コネチカット州）で測定した。最大および自然の51Ｃｒ放出を、５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または培地と共にそれぞれインキュベートした後に測定した。特有の放出を以下の式で算出した：（実験での放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）。
【００４１】
方形波エレクトロポレーションによるＤＣのトランスフェクションのための最適条件
方形波エレクトロポレーションによるＤＣのトランスフェクションのための機能的要件を決定するために、様々な組み合わせの電圧およびパルス長を用いて、ＥＧＦＰ／ｐＣＩプラスミドＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトした。細胞質に侵入した直後にタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを用いるトランスフェクションとは対照的に、プラスミドＤＮＡはまた、発現されるためには核エンベロープを通り抜けなければならない。これは非効率的なプロセスであり、細胞に侵入するプラスミドＤＮＡの少数の一部（１０-3〜１０-4の範囲）のみが、核での発現のために利用できるようになる。それにも関わらず、核に侵入するＤＮＡの量は、その細胞質ゾル濃度に直接依存するので、これらのトランスフェクション方法のための最適要件が類似していると仮定することは妥当である。本実施例において、ＥＧＦＰ／ｐＣＩプラスミドを用いて、トランスフェクション効率ならびにＥＣＭ８３０方形波エレクトロポレーターを用いた特定の電圧および時間設定の間の関係を解析した。ＤＣを回収して洗浄し、氷冷培地中に懸濁した。各トランスフェクションについて、０．１ｍｌ（１０4個）の細胞を２μｇのＤＮＡ（１μｇ／μｌ）と混合し、様々な組み合わせの電圧およびパルス長を用いて２ｍｍギャップのキュベット中でパルスを付与した。完全培地中で２日間インキュベートした後、この細胞をフローサイトメトリーで解析した。図３に示すように、幅広い範囲の様々な機器設定を用いる方形波エレクトロポレーションにより、ＤＣを効果的にトランスフェクトした。ＤＣの最適なトランスフェクションは、１．５〜３ｋＶ／ｃｍ（キロボルト／ｃｍ）で０．１５〜０．２５ｍｓ（ミリ秒）間の範囲で電圧（前記機器で報告される）を印加する場合に達成され、０．２５ｍｓ間２．５ｋＶ／ｃｍの最大ピークで、１５％のトランスフェクトされた細胞を生成した。著しいトランスフェクションは、より高い電圧／より短いパルスおよびより低い電圧／より長いパルスの両方においても得られた。一方、低電圧と組み合わせた長継続パルス（数ミリ秒以上）は、非効果的および／または細胞にとって有害であった。このため、ＤＣのエレクトロポレーションに関する要件は、低電圧と長継続パルスとの組み合わせを一般に含む細胞株および多くの他の細胞型により要求される要件とはかなり異なる（最新のプロトコルの編集物は、ＢＴＸのホームページ（http://www.btxonline.com/btx/index.html）から得ることができる）。効果的なトランスフェクションをもたらす様々な機器設定の幅広い窓口（window）は、トランスフェクション効率と細胞生存との間のバランスをとることによって、様々な実験的要件を適応させることができる。また、エレクトロポレーションバッファーに対するいくつかの改変が試験され、上昇した濃度のＤＮＡ、減少した濃度の全量の塩、およびカリウム塩でのＮａＣｌの交換を含む適度な量で適用すると、図３に示されたトランスフェクション率へとトランスフェクション率を向上させることが見出された。後者の改変は、生存率にもプラスの効果があった（結果は示されていない）。
【００４２】
方形波エレクトロポレーションを他の細胞型に適用することもできるかどうか試験するため、我々は骨髄由来ＣＤ３４＋幹細胞を用いて、同様のパラメータースクリーニングを行った。これらの細胞は延長されたパルス長に対しては、より耐性ではないことを示したが、２．２〜４ｋＶ／ｃｍで０．０３〜０．１ｍｓ間パルスを付与した場合、著しいトランスフェクションおよび良好な生存率（５０〜９０％）を達成した。最も高いトランスフェクション効率は、３．５ｋＶ／ｃｍで０．０５ｍｓ間で得られ、７．９％のトランスフェクトされた細胞を得た。また、我々はリンパ球の良好なトランスフェクションを観察し、これはプラスチックへの付着によって単離された単球由来ＤＣをしばしば伴う。存在する場合、これらはこのＤＣと共に効果的にトランスフェクトされる。したがって、方形波エレクトロポレーションは、多くの細胞型のトランスフェクションのための代替方法としての機能を果たすことがある。
【００４３】
エレクトロポレーションによる初代細胞のｍＲＮＡ主体トランスフェクション
トランスフェクトしたｍＲＮＡの細胞質翻訳機構への容易なアクセス、および永続的な遺伝的変異を引き起こすには限定されたその能力は、細胞の一過的トランスフェクションに対する魅力的なアプローチとなる。しかしながら、ｍＲＮＡ媒介トランスフェクションに対する以前の戦略は、代替のトランスフェクション方法と比較して非常に非効果的であり、ほとんどの適用に対して、この戦略により代替方法は示されなかった。これらの問題を克服するため、我々は、ｍＲＮＡの細胞内へのトランスフェクションのための方形波エレクトロポレーションを用いるトランスフェクション方法を確立した。ｍＲＮＡは、腫瘍生検のような細胞サンプルから直接単離することができ、あるいはラン−オフ転写によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。後者の目的のために、我々は２つのプラスミドベクター、すなわちｐＢＮｃｏシャトルベクター（図１）およびｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡ発現ベクター（図２）を開発し、これらにより構築物の効果的なクローニングおよび均一な１０２ヌクレオチド長のポリ（Ａ）尾部を有するｍＲＮＡの生成が可能となる。リボマックスＴ７キットマニュアルに記載の手順にしたがってキャップｍＲＮＡを連続的に生成させるためのｐＣＩｐＡ102中の強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をクローニングすることによって、この方法の予備的評価を行った。様々な電圧設定を用いて約５０μｇ／ｍｌのｍＲＮＡと共にＤＣをエレクトロポレーションし、トランスフェクションに伴う発現プロファイルをモニタリングした。図４Ａ−Ｂに示されるように、このｍＲＮＡ媒介エレクトロポレーションは、穏やかなエレクトロポレーション条件および強力なエレクトロポレーション条件の両方においても全ＤＣ集団（９５〜１００％）を効果的にトランスフェクトすることができ、この集団中の平均のＥＧＦＰシグナルは、印加された電圧と正の相関があった（図４Ａ）。トランスフェクションに伴い、平均のシグナルは着実に上昇し、ＥＧＦＰの発現および分解のバランスが崩れた時点である約４８時間までにＢＧ（バックグラウンドレベル）の１２倍のピーク値に達した（図４Ｂ）。次の３日間、この平均のＥＧＦＰシグナルは３５％減少した。しかしながら、このフェーズにおける発現プロファイルは、発現された特定のタンパク質の半減期に強く影響され、他のタンパク質とは異なって進行することがある。
【００４４】
リボマックスキットを用いて得られたｍＲＮＡの収量を、ｒＧＴＰおよびキャップ類似体の濃度を調整することによって少なくとも５倍上昇させることができることを我々は発見した（「材料および方法」参照）。この改変が全トランスフェクション効率に関して有益であるかを試験するため、ＤＣを図４Ｂで用いたものに関して等容量のこのｍＲＮＡの反応生成物でエレクトロポレーションしたところ、約２５０μｇ／ｍｌの最終的なｍＲＮＡ濃度という結果になった。発現プロファイルをモニタリングし、図４Ｃに示すように、改変された手順により、ＥＧＦＰｍＲＮＡの上昇した濃度に大体比例する平均のＥＧＦＰ蛍光の上昇がもたらされ、これはｍＲＮＡの質（キャップ効率）が保たれたことを示す。この高濃度のｍＲＮＡを用いることにより、このプロトコルは非常に効果的にもなる。行われた測定のピーク値を示す３８時間のインキュベート後、ＢＧの４００倍であった最も強い発現細胞と共に、平均のＥＧＦＰシグナルはＢＧの７７倍に達した。トランスフェクションの５日後、顕微鏡下で明るく輝く星のようにこの細胞がまだ見えていた（図５）。この段階において、この細胞の一部が培地からヨウ化プロピジウムを吸収するのが観察され、これは漏れやすさ（leakiness）および低下した生存率を示す。これはおそらく、少なくとも一部で、これらの細胞が核内で強いＥＧＦＰ染色（黄色を伴って現れる）を示すような高い細胞内ＥＧＦＰ濃度による毒性効果に起因している。
【００４５】
また、ｍＲＮＡ媒介エレクトロポレーションは、プラスミドＤＮＡを用いる方法と比較すると、非常に効果的である。ＥＧＦＰ／ｐＣＩプラスミドＤＮＡを用いた我々の系において得られるＤＣの最も高いトランスフェクションは、５０μｇ／ｍｌのＤＮＡを用いて、２．５ｋＶ／ｃｍで０．２５ｍｓ間の方形波エレクトロポレーションで達成される。インキュベートの４８時間後、ＥＧＦＰを発現する亜集団はＢＧの８６倍の平均ＥＧＦＰシグナルを有し、最も強い発現細胞ではＢＧの１０００倍であった。しかしながら、ＤＮＡを用いて達成されたより低いトランスフェクション率に起因して、生存細胞の全集団の平均ＥＧＦＰシグナルはＢＧの２９倍とより低い。したがって、ＤＣ集団において得られた全ＥＧＦＰ発現に関して、ｍＲＮＡは、エレクトロポレーション用プラスミドＤＮＡよりも２．６倍より効果的であった。
【００４６】
ｍＲＮＡの５’キャップおよびポリ（Ａ）尾部は、翻訳開始および安定性に関する重要な因子として認識されている（Tarun, S. Z. et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 9046-9051）。我々の系におけるこれらの因子の重要性を試験するために、ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いた標準的なエレクトロポレーションを、キャップ類似体を用いずに合成したＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡおよびポリ（Ａ）尾部を欠くＥＧＦＰ／ｐＣＩｍＲＮＡを用いたエレクトロポレーションと比較した。図６に示すように、これらのエレメントのいずれかを省くと有意な発現は起こらなかった。したがって、５’キャップおよびポリ（Ａ）尾部は、これらのｍＲＮＡ構築物の発現にとって不可欠である。また我々は、文献中にある代替のｍＲＮＡ主体トランスフェクション技法とエレクトロポレーションとを比較した。この技法には、感作（単なるｍＲＮＡとのインキュベーション）およびＤＯＴＡＰを用いたリポソーム媒介トランスフェクションが含まれる（図７）。感作は、完全培地の添加前に、ＲＮアーゼ非含有培地中でＤＣをＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡと２時間インキュベートすることによって行われたが、適用されたｍＲＮＡ濃度が最も高い場合（１００μｇ／ｍｌ）でさえ、この処理により蛍光レベルの有意な上昇はもたらされなかった。また我々は、ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102／ＤＯＴＡＰ複合体を用いた一連の実験も行ったが、毒性のためにＤＣによるこの処理の使用の重大な限界を発見した。最も良好なトランスフェクションは、ＤＯＴＡＰおよび凝集した５μｇ／ｍｌのＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡ（重量比＝５：１）を用いて、ＲＮアーゼ非含有培地中で２時間細胞をトランスフェクトすることによって達成された。この処理により８５％のＤＣを殺し、残存細胞の平均の蛍光は、非トランスフェクト細胞と比較して３６％（ＢＧの１．３６倍）上昇した。まとめると、これらの代替の方法は、ＤＣのｍＲＮＡ媒介トランスフェクションに対してあまり効果的でなく、少なくとも２００倍（ＢＧの７７倍−１／ＢＧの１．３６倍−１）高いトランスフェクション効率を、エレクトロポレーションにより達成することができた。
【００４７】
ｍＲＮＡ主体方形波エレクトロポレーションを用いて達成された高いトランスフェクション効率は、細胞の免疫応答刺激のためのＤＣへの腫瘍由来ｍＲＮＡの直接のトランスフェクションの簡便な方法を提供し、事前の増幅ステップの必要性を排除し得る。
【００４８】
ｈＴＥＲＴ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導
テロメラーゼ触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）は、テロメラーゼ複合体の構成成分であり、直線状の染色体の末端にテロメアを付加することによってゲノム安定性の維持に重要な役割を果たす。通常、テロメラーゼ活性は、胚組織および早期胚において発現されるものであり、いくつかの増殖成体組織においても検出された。これらの組織は、骨髄幹細胞（Yui, J. et al., 1998, Blood 9: 3255-3262; Uchida, N. T. et al., 1999, Leuk Res 23: 1127-1132）、結腸陰窩の上皮細胞（Tahara, H. et al., 1999, Oncogene 18: 1561-1567）および活性化リンパ球（Liu, K. et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 5147-5152; Son, N. H. et al., 2000, J. Immunol. 165: 1191-1196）を含む。ほとんどの成体組織はテロメラーゼ活性を含まず（Dhaene, K. et al., 2000, Virchows Arch 437: 1-16 において論評されている）、テロメラーゼ複合体は様々な様式の調節に付されるので、テロメラーゼ活性がないことは、異なる解釈を有してもよい。ｈＴＥＲＴ遺伝子は転写不活性であり得、機能的複合体は存在してもよいが他の因子により阻害されるか、あるいはｈＴＥＲＴプレｍＲＮＡがスプライシングされて非機能的変異体を得ることがある。しかしながら、テロメラーゼ活性の再活性化は、不死化および悪性形質転換のために必要であると思われ、ほとんどのヒトの癌において検出された。これは、ｈＴＥＲＴタンパク質が癌免疫療法にとっての標的として機能するかどうかに関する論争を引き起こし、この考えを支持するいくつかの報告が現れた（Minev, B. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4796-4801; Nair, S. K. et al., 2000, Nature Medicine 6: 1011-1017）。
【００４９】
高発現のｈＴＥＲＴおよび自然に加工されたエピトープを用いた系（癌細胞を増殖させる状況）においてこの命題の妥当性を試験するために、自系Ｔ細胞の刺激のためのエレクトロポレーションによって、全長のｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いてＤＣをトランスフェクトした。ＴＲＡＰアッセイを用いてテロメラーゼ活性の誘導をモニタリングすることによって、トランスフェクション効率の証明を行った。図８に示すように、時間をベースにした方式で細胞がテロメラーゼ活性を獲得し、２４時間後、この活性はＨＬ６０細胞を増殖させる場合の約４０％であった。異なるＨＬＡ−Ａ２+ドナーからの１０のバフィーコートの全量を、「材料および方法」に概略されるように処理し、ｈＴＥＲＴ陽性ＤＣを用いてＰＢＭＣを毎週刺激した。４回目の刺激後、従来の51Ｃｒ標識放出アッセイにおいてランダムに選択された３つのサンプルを用いて毒性試験を行った。標的細胞として自系ｈＴＥＲＴ陽性ＤＣを用いた特有の放出は、それぞれ６、１７および３３％であった。一方、標的としてＥＧＦＰ陽性ＤＣを用いた陰性コントロールは、全て陰性であった。また我々は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共にインキュベートし、１０日目にトランスフェクトし、その後Ｔ細胞の刺激前に成熟培地中で２日間インキュベートすることによって、単球を未成熟ＤＣへと分化させた代替のプロトコルを用いることによって、４つのバフィーコートを加工した。
【００５０】
成熟ＤＣ表現型の分化は、免疫染色によって証明され（「材料および方法」参照）、トランスフェクトされていない細胞と比較すると、エレクトロポレーションに影響されなかった。このレジメンにおいて、Ｔ細胞応答はより速く展開し、３回目の刺激後、ｈＴＥＲＴ取り込みＤＣの特異的溶解は、全ての培養物について（５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いた溶解と比較して）１００％を超えた。
【００５１】
この実験により、ｍＲＮＡ主体エレクトロポレーションは、ＤＣの取り込みおよびＴ細胞応答誘導のために用いることができ、それを行う際は非常に効果的である、ということが示される。
【００５２】
ポリ（Ａ−Ｔ）鎖のＰＣＲ系合成
本発明は、ポリアデニル化ｍＲＮＡの生成のために、長いポリ（Ａ−Ｔ）鎖（一方の鎖はポリ（Ａ）であり、その相補的な鎖がポリ（Ｔ）である）を含む発現ベクターを利用する。長いポリ（Ａ−Ｔ）鎖を生成させる方法は、オリゴｄ（Ａ）およびオリゴｄ（Ｔ）オリゴヌクレオチドによるＰＣＲを用いて開発された。オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応においてプライマーおよびテンプレートの両方として機能し、合成されたポリ（Ａ−Ｔ）鎖は、形成されたＤＮＡ二重鎖の融点が変性（または変性／合成の組み合わせ）工程に用いられた温度よりも高い各ＰＣＲサイクルで、最大の長さに達するまでより長く成長する。したがって、得られたポリ（Ａ−Ｔ）長は、融解温度およびサイクル数のような一般的なＰＣＲパラメーターに依存し、特に、ＰＣＲが従来の高温ＰＣＲであるか非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いてより低温で行われるかに依存する。
【００５３】
高温ＰＣＲによるポリ（Ａ−Ｔ）合成は、以下のものを含む反応中で行われた：１μＭのオリゴｄ（Ａ20）、１μＭのオリゴｄ（Ｔ15）、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、０．５ｍＭのｄＴＴＰ、１×Ｐｆｕバッファーおよび０．０６Ｕ／μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）。低温ＰＣＲに関しては、反応は、１μＭのオリゴｄ（Ａ20）、１μＭのオリゴｄ（Ｔ15）、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、０．５ｍＭのｄＴＴＰ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、７．５ｍＭのＤＴＴおよび０．２５Ｕ／μｌのＤＮＡｐｏｌ  Ｉクレノウ（ＮＥＢ）を含有した。これらのＰＣＲは、ＰＴＣ−２００熱サイクラー（ＭＪリサーチ）で行い、図９において、いくつかの実例となる温度プロファイルおよび結果の詳細な記載が与えられる。高温ＰＣＲによって生成されたポリ（Ａ−Ｔ）鎖は、長さ１００〜１００００ｂｐの範囲であり、ＰＣＲパラメーターを改変することによって平均の長さを調整することができた。低温ＰＣＲによって、より均一な長さのより短いポリ（Ａ−Ｔ）鎖（主に１００〜２００ｂｐの範囲）、さらに約２５００ｂｐまでの範囲のより長い鎖の小さなフラクションが生成された。１００〜３００ｂｐの範囲の１０本の鎖を、ｐＣＩベクターへの挿入後に配列決定し、すべてが、配列決定された鎖上の相同なポリ（Ａ）またはポリ（Ｔ）のいずれかであるポリ（Ａ−Ｔ）構成と確認した。したがって、プライマー／テンプレートとしてｄ（Ａ）およびｄ（Ｔ）オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ技法は、長いポリ（Ａ−Ｔ）鎖を生成させる効果的な方法である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ｐＢＮｃｏシャトルベクターの概略図である。ｌａｃＺオープンリーディングフレームの一部を形成するマルチクローニング部位（ＭＣＳ）のヌクレオチド配列を、この配列の上に注釈された特有の制限切断部位と共に右側に示す。ｐＢＮｃｏはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＭＣＳにＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ切断部位を加えることによって構築された。これらの切断部位を有するこの挿入配列は、ＭＣＳ配列パネルにおいて下線が施されている。図中に用いられている他の注釈は、ｌａｃＩ：ｌａｃプロモーター、ＣｏｌＥｌ  ｏｒｉ：大腸菌の複製開始点、ｆｌ  ｏｒｉ：ｆｌファージの複製開始点、ＡｍｐR：ラクタマーゼ遺伝子である。
【図２】図２は、ｐＣＩｐＡ102発現ベクターの概略図である。ｐＣＩｐＡ102は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によりポリアデニル化ｍＲＮＡの生成を容易にするｐＣＩ発現ベクターの改変により作製された。１００ｂｐのポリ（Ａ−Ｔ）断片は、ｐＣＩにおけるＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル中に位置するＨｐａＩ切断部位中へ挿入されており、黒い箱形で表されている。ポリ（Ａ）領域のすぐ下流に位置するＭｆｅＩ切断部位は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の前にプラスミドを直線化するのに用いられる。用いられた注釈は、ＣＭＶ  ＩＥ  ｅｎｈ／ｐｒｏｍ：ＣＭＶ即時型（immediate-early）エンハンサー／プロモーター、ｉｎｔｒｏｎ：キメライントロン、Ｔ７ｐｒｏｍ：Ｔ７プロモーター、ＭＨＣ：マルチクローニング部位、ＳＶ４０  ３’ＵＴＲ：５’− ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルのほとんどの領域（１３１ｂｐ）、ｐｏｌｙ（Ａ）102：１０２ｂｐのポリ（Ａ）領域、ｆｌ  ｏｒｉ：ｆｌファージの複製開始点、ｏｒｉ：大腸菌の複製開始点、ＡｍｐR：ラクタマーゼ遺伝子である。
【図３】図３は、様々な機器の設定におけるＤＮＡを用いたＤＣの方形波エレクトロポレーションを例示するグラフである。トランスフェクションの最適条件を特定するために、様々な組み合わせの電圧およびパルス長で、ＥＧＦＰ／ｐＣＩ  ＤＮＡ構築物を用いてＤＣをエレクトロポレーションした。用いた様々なパルス長は最上部に示し、ｘ軸上の規定電圧は、０．２ｃｍ（エレクトロポレーションに用いたキュベット中の電極間の距離である）ずつ区画された機器により報告された実際の電圧として定義されている。トランスフェクション効率（パネル下部）および生存率（パネル上部）は、各サンプル中の全細胞数の百分率として示される。
【図４】図４は、方形波エレクトロポレーションによりＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＤＣのヒストグラム表示である。細胞を０．２５ミリ秒間エレクトロポレーションした。Ａ：リボマックスＴ７キットマニュアルに記載されたように生成されたｍＲＮＡを用いた様々な電圧設定、Ｂ−Ｃ：約２．４ｋＶ／ｃｍで、トランスフェクションと、リボマックスＴ７キットマニュアルに記載されたように生成されたｍＲＮＡ（パネルＢ）を用いるか、または「材料および方法」に記載されたような上昇した濃度のｒＧＴＰおよびキャップ類似体を用いた改変プロトコル(パネルＣ)を用いた解析との間の、様々なインキュベート期間。実験は２回行われ、実際的に同一の結果が得られた。Ｕ：前記機器により報告された電圧、Ｔ：トランスフェクション後のインキュベート期間、Ｍ：生存細胞の平均蛍光。
【図５】図５は、ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いたトランスフェクションの５日後のＤＣの顕微鏡写真を示す。上のパネルは、位相のコントラストを用いて通常の光条件において得られたものである。一方、下のパネルは、それぞれ、ＥＧＦＰおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の励起後の同一細胞の緑および赤色フィルター写真のオーバーレイである（ＰＩは、死んだ細胞を着色するために、解析前に氷上で細胞に添加された）。ＥＧＦＰおよびＰＩの両方を有する細胞は、黄色として現れる。
【図６】図６は、ＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡ、キャップ類似体なしで合成されたＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡ、またはポリ（Ａ）尾部を欠いているＥＧＦＰ／ｐＣＩｍＲＮＡのいずれかを用いたＤＣのエレクトロポレーションを例示するグラフである。５０μｇ／ｍｌのＲＮＡを用いて約２．４ｋＶ／ｃｍで０．２５ミリ秒間細胞をエレクトロポレーションし、フローサイトメトリーでＥＧＦＰの積算に関してモニタリングした。各組は、ほとんど同一の結果をもたらした２つの平行実験の平均値を示す。
【図７】図７は、様々な濃度のＥＧＦＰ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いての、ＤＣのエレクトロポレーション、感作（単純なインキュベーション）およびリポソーム媒介トランスフェクションの間の比較を示すグラフである。エレクトロポレーションは、約２．４ｋＶ／ｃｍで０．２５ｍｓ間行われた。感作およびリポソーム媒介トランスフェクションは、ＲＮアーゼ非含有培地中でｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体（重量比１：５）と細胞をそれぞれ混合し、完全培地中に播種する前に３７℃で２時間インキュベートすることによって行われた。その後、細胞を一晩インキュベートし、フローサイトメトリーで解析した。
【図８】図８は、テロメラーゼ触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）をコードするｍＲＮＡを用いたトランスフェクション後のＤＣにおけるテロメラーゼ活性の誘導を例示するグラフである。５０μｇ／ｍｌの濃度でｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いて細胞をエレクトロポレーションし、ＴＲＡＰアッセイを用いてテロメラーゼ活性の誘導に関してモニタリングした。各パネルは１０００細胞当量を表す。各パネルは、Ａ：マスターミックス、Ｂ：４個のテロメア反復ユニットで伸張したＴＳプライマーからなる１アトモルの合成テロメアを用いた陽性対照アッセイ、Ｃ：ＨＬ６０細胞株を用いた陽性対照アッセイ、Ｄ〜Ｇ：ｈＴＥＲＴ／ｐＣＩｐＡ102ｍＲＮＡを用いてトランスフェクトされ、トランスフェクション後０（Ｄ）、６（Ｅ）、２４（Ｆ）または４８（Ｇ）時間に解析されたＤＣを示す。
【図９】図９は、ＰＣＲ技法により生成され、ポリアクリルアミドゲル上で分離されたポリ（Ａ−Ｔ）鎖を示す。このポリ（Ａ−Ｔ）鎖は、熱安定性ポリメラーゼＰｆｕを用いた高温ＰＣＲ(レーン１〜３)または大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの非熱安定性巨大クレノウ断片（レーン４〜５）を用いた低温ＰＣＲのいずれかを使用することによって合成された。各レーンにおいて用いた温度プロファイルは、１）２５×（７５℃１秒間；２０℃１秒間；７２℃５秒間）、２）２５×（７５℃１秒間；２０℃１秒間；７２℃５秒間）、３）２５×（２０℃１秒間；７０℃１０秒間）、４）２５×（２０℃１秒間；３７℃５秒間）、５）２５×（４０℃５秒間；２０℃１秒間；３７℃５秒間）である。「Ｍ」は、分子量マーカーを用いたレーンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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