(57)【要約】本発明は特に、腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシス、および／またはウイルス耐性の分子経路に関与する新規配列に関する。本発明はまた、癌、ウイルス性疾患、神経変性疾患の治療および診断の分野、ならびに化合物をアッセイするスクリーニング法を実施するための、該配列の使用にも関する。本発明はさらに、生物試料における本発明の配列またはそれらの発現産物の検出および／またはアッセイ法のための方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたヌクレオチド配列：
a）配列番号：72、
b）a）に定義された配列の、少なくとも15個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列、
c）最適なアライメントの後に、a）またはb）に定義された配列と、少なくとも80％の同一性を示すヌクレオチド配列、
d）高ストリンジェントな条件下で、a）またはb）に定義された配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、および
e）a）、b）、c）、またはd）に定義された配列に対応する、相補的ヌクレオチド配列またはRNA配列。
【請求項２】
発現が腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシス、および／またはウイルス耐性に関与することを特徴とする、請求項1記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
請求項1記載のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
以下のものから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項3記載のポリペプチド：
a）請求項3記載のポリペプチド、
b）a）に定義されたポリペプチドと少なくとも80％の同一性を示すポリペプチド、
c）a）またはb）に定義されたポリペプチドの、少なくとも5個の連続したアミノ酸の断片、
d）a）、b）、またはc）に定義されたポリペプチドの生物活性断片、および
e）a）、b）、c）またはd）に定義されたポリペプチドの改変ポリペプチド。
【請求項５】
請求項1記載のヌクレオチド配列を含む、または請求項3もしくは4記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする、細胞発現ベクターおよび／またはクローニングベクター。
【請求項６】
アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスから選択されるウイルスベクターであることを特徴とする、請求項5記載のベクター。
【請求項７】
裸の核酸を含むベクターであることを特徴とする、請求項5記載のベクター。
【請求項８】
組織特異的なターゲティングおよび／または発現を可能にする配列を含むことを特徴とする、請求項5〜7のいずれか一項記載のベクター。
【請求項９】
請求項5〜8のいずれか一項記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項9記載の細胞を含むことを特徴とする、動物、好ましくはヒトを除く哺乳動物。
【請求項１１】
請求項3および4のいずれかに記載されるポリペプチドを特異的に認識しうることを特徴とする、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの抗体の断片、またはキメラ抗体。
【請求項１２】
核酸配列の検出、同定、アッセイ法、および／または増幅のための、プローブまたはプライマーとしての、請求項1記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項１３】
インビトロにおける、センスヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチドとしての、請求項1記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項１４】
組換えポリペプチドの産生のための、請求項1記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項１５】
組換えポリペプチド産生のための方法であって、請求項9記載の細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で使用すること、および該組換えポリペプチドを回収することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項1記載の少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とするDNAチップ。
【請求項１７】
請求項3もしくは4記載のポリペプチドまたは請求項11記載の抗体を含むことを特徴とするタンパク質チップ。
【請求項１８】
医薬品の調製のための、
a）請求項1記載のヌクレオチド配列、
b）請求項3または4記載のポリペプチド、
c）請求項5〜8のいずれか一項記載のベクター、
d）請求項9記載の細胞、
e）請求項11記載の抗体、
から選択される化合物の使用。
【請求項１９】
医薬品がウイルス性疾患、または腫瘍細胞の発生もしくは細胞変性を特徴とする疾患の、予防および／または治療を目的とすることを特徴とする、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
疾患が癌であることを特徴とする、請求項19記載の使用。
【請求項２１】
ウイルス性疾患または腫瘍の発生もしくは細胞変性を特徴とする疾患の診断および／または予後評価のための方法であって、検査しようとする患者の生物試料由来の、配列番号：72に対応する少なくとも1つの配列の発現の分析を含む方法。
【請求項２２】
以下の段階を含む、請求項21記載の診断および／または予後評価の方法：
検査しようとする患者から入手した生物試料由来のメッセンジャーRNAを単離する段階、
該メッセンジャーRNA由来の相補的DNAを調製する段階、
選択的に、配列番号：72に対応する少なくとも1つの配列に対応する相補的DNAの一部を増幅する段階、および
選択的に増幅された相補的DNAを検出する段階。
【請求項２３】
配列の発現の分析を請求項16記載のDNAチップを用いて行う、請求項22記載の診断および／または予後評価の方法。
【請求項２４】
請求項1記載のヌクレオチド配列と相互作用しうる化合物のスクリーニングのための方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする方法：
請求項1記載のヌクレオチド配列または請求項9記載の細胞を候補化合物と接触させる段階、および
該候補化合物と該ヌクレオチド配列または該細胞との複合体の形成を検出する段階。
【請求項２５】
請求項3または4記載のポリペプチドと結合しうる化合物のスクリーニングのための方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする方法：
請求項3もしくは4記載のポリペプチドまたは請求項9記載の細胞を候補化合物と接触させる段階、および
該候補化合物と該ポリペプチドまたは該細胞との複合体の形成を検出する段階。
【請求項２６】
生物試料における、請求項1記載のヌクレオチド配列の検出および／またはアッセイの方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする方法：
請求項1記載の標識ヌクレオチド配列と、検査しようとする生物試料とを、ハイブリッドの形成のために必要な条件下で接触させる段階、および
該ヌクレオチド配列と該生物試料中に存在する核酸との間に形成されたハイブリッドを検出および／またはアッセイする段階。
【請求項２７】
請求項1に定義されたヌクレオチド配列から選択されたプライマーを利用して生物試料の核酸を増幅する段階を含むことを特徴とする、請求項26記載の検出および／またはアッセイの方法。
【請求項２８】
請求項16に定義されたDNAチップを用いて行うことを特徴とする、請求項26または27記載の検出および／またはアッセイの方法。
【請求項２９】
生物試料における請求項3または4に定義されたポリペプチドの検出および／またはアッセイの方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする方法：
生物試料を請求項11に定義された標識抗体と接触させる段階、
該抗体と該試料中に存在する該ポリペプチドとの間に形成された複合体を検出および／またはアッセイする段階。
【請求項３０】
請求項17に定義されたタンパク質チップを用いて行うことを特徴とする、請求項29記載のポリペプチドの検出および／またはアッセイの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抑制、腫瘍復帰変異（tumour reversion）、アポトーシス、および／またはウイルス耐性の分子経路に関与する遺伝子の同定に関する。
【０００２】
本発明は、腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、および／またはアポトーシス過程の際に発現または抑制されるメッセンジャーRNAに対応するcDNAの単離によって可能となった。
【０００３】
腫瘍復帰変異の際に活性化または抑制される遺伝子を単離するために、悪性細胞株（U937）および派生細胞株（US4）における遺伝子発現に関する全体的スクリーニングを悪性表現型の抑制下で行った。発現された遺伝子（両方のタイプの細胞で発現されたメッセンジャーRNA）の比較により、差異を伴って発現される遺伝子、すなわち、一方の細胞では発現されるが他方の細胞では発現されない遺伝子（遺伝子は活性化されても抑制されてもよい）を同定することが可能になった。
【０００４】
これにより、これらの遺伝子が、ある場合にはそれが存在しないことにより、また別の場合にはそれが存在することにより、癌化プロセスに少なくとも関与していることが容易に推定される。
【０００５】
この示差的研究のために用いた方法は、Brennerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(4), 1665-70）により2000年に記載された方法である。
【０００６】
本発明者らはモデルを作成するために以下の仮説を立てた：パルボウイルスH-1の細胞変性作用に対する感受性のある腫瘍から耐性のある細胞を選択することが可能であれば、この耐性はそれらの悪性表現型の変化に起因すると考えられる。このことをU937癌細胞から選択したUS4細胞に関して示すことができた。U937親系統とは異なり、US4クローン（本発明では取り扱わないUS3クローンでも同じであった）は、パルボウイルスH-1の細胞変性作用に対して耐性であった。
【０００７】
分子レベルでは、悪性表現型のこの抑制がp21ｗａｆ１遺伝子の活性化に付随しており、p53遺伝子の発現とは関係ないことを観察することが可能であった。
【０００８】
この問題に対する本発明によるアプローチにより、いくつかの厳密な機能に直接関係する配列を単離することができた。したがって、ESTのランダムシークエンシングとは異なり、この種の配列は、悪性表現型の抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシス、および／またはウイルス耐性の過程に関与することが判明している配列である。
【０００９】
腫瘍復帰変異は、腫瘍抑制遺伝子のものよりも幅広い領域をカバーするという事実により、腫瘍抑制と区別することができる。換言すれば、腫瘍復帰変異は、腫瘍抑制遺伝子が関与する、代謝経路および分子経路に限定されない代謝経路および／または分子経路を用いて実現される。
【００１０】
このため、本発明は特に、新規配列、ならびにこれらの配列の診断分野における使用および被験化合物のスクリーニングを目的とする方法を実行するための使用に関する。本発明はまた、生物試料における本発明の配列もしくはそれらの産物の発現の検出および／またはアッセイのための方法にも関する。
【発明の開示】
【００１１】
本発明はまず第一に、以下のものからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたヌクレオチド配列に関する：
a）配列番号：1〜配列番号：1020、好ましくは配列番号：72、
b）a）に定義された配列の、少なくとも15個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列、
c）最適なアライメントの後に、a）またはb）に定義された配列と少なくとも80％の同一性を示すヌクレオチド配列、
d）高ストリンジェントな条件下で、a）またはb）に定義された配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、および
e）RNA配列がa）、b）、c）、またはd）に定義された配列に対応する、相補的ヌクレオチド配列。
【００１２】
c）に定義した本発明のヌクレオチド配列は、最適なアライメントの後に、上記のa）またはb）に定義した配列と、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を示す。
【００１３】
本発明の文脈において、配列番号：72は好ましいヌクレオチド配列であり、TCTPとも呼ばれるTPT1遺伝子に対応する。この遺伝子は特に腫瘍復帰変異に関与しており、以下に示すように、本発明者らによるさらに詳細な実験の対象となっている。
【００１４】
本明細書の記載において区別せずに用いられる用語である、ヌクレオチド配列、核酸、核酸配列（nucleic or nucleic acid sequence）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチド配列という表現は、天然でないヌクレオチドを含むかまたは含まない核酸の断片または領域を規定することを可能とし、同時に二本鎖DNA、一本鎖DNA、およびDNAの転写産物に対応しうる、改変型または非改変型のヌクレオチドの厳密な連続物を意味するものと解釈される。このため、本発明の核酸配列の範囲には、PNA（ペプチド核酸）なども含まれる。
【００１５】
本発明のヌクレオチド配列の断片は、少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。それらは少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含むことが好ましく、さらにより好ましくはそれらは少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含む。
【００１６】
本発明は、天然の染色体環境にある、すなわち天然の状態にあるヌクレオチド配列に関するものではないことが理解される必要がある。これは、単離および／または精製された配列、すなわち、例えば複製によって、直接的または間接的に収集され、それらの環境が少なくとも部分的には変更された配列にかかわる。化学合成によって得られた核酸もそれによって指定されるものと解釈される。
【００１７】
本発明の目的に関して、2つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の「同一性」という表現は、最適なアライメントの後に得られる、比較しようとする2つの配列の間で同一なヌクオチドまたはアミノ酸残基の比率を意味するものと解釈され、この比率は純粋に統計学的なものであり、2つの配列間の差異はランダムに分布しており、その全長に及ぶ。「最良のアライメント」または「最適なアライメント」という表現は、以下のようにして決定される同一性が最も高いアライメントのことと解釈される。2つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の配列比較は、従来より、これらの配列を最適な様式に整列化した後に比較することによって行われ、この比較は、配列類似性を有する局所領域の同定および比較を行う目的で区域（segment）または「比較域（comparison window）」毎に行われる。配列の比較のための最適なアライメントは、手作業による以外に、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム（1981）、NeddlemanおよびWunschの局所相同性アルゴリズム（1970）、PearsonおよびLipmanの類似性検索法（1988）、これらのアルゴリズムを用いたコンピュータソフトウエアパッケージ（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI中のGAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA、およびTFASTA）により、実施することができる。最適なアライメントを得るためには、BLASTプログラムをBLOSUM 62マトリックスとともに用いることが好ましい。PAMまたはPAM 250マトリックスを用いることもできる。
【００１８】
2つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一性は、最適な様式に整列化されたこれらの2つの配列を比較することによって決定され、比較しようとする核酸配列またはアミノ酸配列については、これらの2つの配列間の最適なアライメントのために参照配列に対する付加または欠失を含めることが可能である。同一性は、2つの配列間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較する位置の総数によって除算した上で、これらの2つの配列の間の同一性を得るために、得られた結果に100を掛けることによって算出する。
【００１９】
最適なアライメントの後の、参照配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を示す核酸配列という表現は、核酸配列が参照核酸配列と比べてある種の変更、特に欠失、切断、アライメント、キメラ融合、および／または置換、特に点置換を示し、その核酸配列が最適なアライメントの後に参照核酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を示すことを意味するものと解釈される。好ましくは、特異的なまたは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、最適なアライメントの後に、2つの配列の一方と、他方のものに対して相補的な配列との間の同一性が確実に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％となるようなものであると考えられる。
【００２０】
高ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度の条件が、2つの相補的核酸断片の間のハイブリダイゼーションを維持することを可能にするように選択されることを意味する。例えば、上記のヌクレオチド配列を定義するために、ハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェントな条件は、以下のものが有益と考えられる。
【００２１】
DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションは2つの段階で行われる：（1）5×SSC（1×SSCは0.15M NaCl＋0.015Mクエン酸ナトリウムを含む溶液に相当する）、50％ホルムアミド、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、10×デンハルト溶液、5％デキストラン硫酸および1％サケ精子DNAを含むリン酸緩衝液（20mM、pH 7.5）中での42℃で3時間のプレハイブリダイゼーション；（2）プローブのサイズに依存する温度（すなわち：42℃、サイズが100ヌクレオチドを上回るプローブの場合）での20時間の正式なハイブリダイゼーション、その後に、2×SSC＋2％SDS中で20℃での20分間の洗浄を2回、0.1×SSC＋0.1％SDS中で20℃での20分間の洗浄を1回。最後の洗浄は0.1×SSC＋0.1％SDS中で30分間、サイズが100ヌクレオチドを上回るプローブに対しては60℃で行う。規定サイズのポリヌクレオチドに対する上記の高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者により、Sambrookら、1989の教示内容に従って、サイズのより大きいまたはより小さいオリゴヌクレオチド用に調整されうる。
【００２２】
最適なアライメントの後の、本発明の配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を示すヌクレオチド配列としては、本発明の配列またはその断片の変種型核酸配列、すなわち、対立遺伝子変種（すなわち、本発明の配列の個々の変形物）に対応するすべての核酸配列も好ましい配列である。
【００２３】
「変種型ヌクレオチド配列」という表現は、本発明のヌクレオチド配列に対応するゲノムDNAのスプライス部位の変異および／または変化に起因する、任意のRNAまたはcDNAを意味するものと解釈される。
【００２４】
本発明のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドも、本発明の主題である。
【００２５】
「ポリペプチド」という表現は、本発明の目的に関して、タンパク質またはペプチドのいずれをも意味するものと解釈される。
【００２６】
1つの特定の態様によれば、本発明のポリペプチドは、以下のものから選択されるポリペプチドを含む：
a）本発明のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、
b）a）に定義されたポリペプチドと少なくとも80％の同一性を示すポリペプチド、
c）a）またはb）に定義されたポリペプチドの少なくとも5アミノ酸の断片、
d）a）、b）、またはc）に定義されたポリペプチドの生物活性断片、および
e）a）、b）、c）、またはd）に定義されたポリペプチドの改変ポリペプチド。
【００２７】
同一性は、関係する配列の最適なアライメントの後に評価されるものと解釈される。アミノ酸配列が、最適なアライメントの後に参照配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を示すポリペプチドという表現は、ポリペプチドが、参照ポリペプチドと比べてある種の変更、特に1つもしくは複数の欠失、切断、伸長、キメラ融合、および／または1つもしくは複数の置換を示すことを意味するものと解釈される。
【００２８】
アミノ酸配列が、最適なアライメントの後に本発明のポリペプチドまたはその断片などの参照配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも98％の同一性を示すポリペプチドとしては、以前に定義した変種型ヌクレオチド配列によってコードされる変種型ポリペプチド、特にアミノ酸配列が本発明のポリペプチド配列またはそれらの断片の1つと比べて、特に、少なくとも1つの残基の切断、置換、および／または付加に対応する、少なくとも1つの変異を示すポリペプチドが好ましい。
【００２９】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含む、または本発明のポリペプチドをコードすることを特徴とする、細胞クローニングおよび／または発現ベクターにも関する。このようなベクターは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現のための、およびおそらくは分泌のために必要な因子も含んでよい。このような宿主細胞も本発明の主題である。
【００３０】
プロモーターおよび／または調節配列を含むベクターも本発明の一部を構成する。ベクターは、プロモーター、翻訳開始および翻訳終結のためのシグナル、ならびに転写調節のための適切な領域を含むことが好ましい。それらは細胞内で安定に維持されうるべきであるほか、翻訳されたタンパク質の分泌を可能にする特定のシグナルを有してもよい。
【００３１】
これらの種々の制御シグナルは用いる細胞宿主に応じて選択する。これを作用させるためには、本発明の核酸配列を、選択した宿主内で自律的に複製するベクター中に挿入する、または選択した宿主のベクター中に組み込むとよい。
【００３２】
自律複製系としては、宿主細胞に応じて、プラスミドまたはウイルス型の系を用いることが好ましく、ウイルスベクターとしては特に、アデノウイルス（5）、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス（5a）が可能である。当業者は、これらの系のそれぞれに対して用いうる技術を認識している。
【００３３】
配列を宿主細胞の染色体に組み込むことが望ましい場合には、例えば、プラスミドまたはウイルス型の系を用いることが可能である。このようなウイルスには、例えば、レトロウイルス（6）またはAAV（7）がある。
【００３４】
本発明のベクターは、組織特異的なターゲティングおよび／または発現を可能にする配列を有効に含む。
【００３５】
非ウイルスベクターとしては、VICAL社によって開発された技術による裸のDNAまたは裸のRNAなどの裸のポリヌクレオチド、細菌人工染色体（BAC）、酵母における発現のための酵母人工染色体（YAC）、マウス細胞における発現のためのマウス人工染色体（MAC）のほか、好ましくはヒト細胞における発現用のヒト人工染色体（HAC）が好ましい。
【００３６】
このようなベクターは当業者によって一般に用いられている方法に従って調製され、それによって得られたクローンは、例えば、リポフェクション、電気穿孔、熱ショック、膜の化学的透過化後の形質転換、細胞融合などの標準的な方法によって、適切な宿主に導入しうる。
【００３７】
本発明はさらに、本発明のベクターによって形質転換された宿主細胞、特に真核細胞および原核細胞、ならびに、本発明の上記形質転換細胞のいずれかを含むトランスジェニック動物、好ましくはヒトを除く哺乳動物も含む。これらの動物は、モデルとして、炎症性疾患および／または免疫疾患、特に消化管の炎症性疾患の病因を研究するために、または癌を研究するために用いることができる。
【００３８】
本発明の目的に用いることができる細胞としては、細菌細胞（8）のほかに、酵母細胞（9）、さらには動物細胞、特に哺乳動物細胞の培養物（10）、特にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞もある。また、昆虫細胞も考えられ、これには例えばバキュロウイルスを用いる方法を用いることができる（11）。本発明のタンパク質の発現のために好ましい細胞宿主にはCOS細胞が含まれる。
【００３９】
本発明の哺乳動物としては、本発明のポリペプチドを発現する齧歯動物、特にマウス、ラット、またはウサギが好ましい。
【００４０】
これらのトランスジェニック動物は、例えば、胚性幹細胞での相同組換え、これらの幹細胞の胚への導入、生殖系統のレベルで影響を受けたキメラの選択、およびキメラの育成によって得られる。
【００４１】
本発明のトランスジェニック動物は、このため、本発明のタンパク質をコードする遺伝子もしくはそれらの相同遺伝子を過剰発現することができ、または変異が導入された遺伝子を発現してもよい。これらのトランスジェニック動物、特にマウスは、例えば、遍在性である、もしくはある種の組織に対して選択的である強力なプロモーターの制御下にある遺伝子のコピーのトランスフェクション、またはウイルス転写によって得られる。
【００４２】
本発明の細胞および哺乳動物は、以下に述べるように、本発明のポリペプチドを作製するための方法に用いることができ、同様に分析用のモデルとして用いることもできる。
【００４３】
上記の形質転換細胞または哺乳動物を、関与しているさまざまな機序および相互作用を研究する目的で、本発明のポリペプチドと、本発明のポリペプチドの活性に直接的または間接的に関与する化合物またはタンパク質化合物との相互作用を研究するためのモデルとして用いることもできる。
【００４４】
それらは特に、本発明のポリペプチドまたはそれらの［空白］と、補因子もしくは阻害物質として、特に競合的に相互作用する産物、または本発明のポリペプチドの活性に対するアゴニスト活性もしくはアンタゴニスト活性を有する産物の選択のために用いることができる。
【００４５】
上記形質転換細胞またはトランスジェニック動物は、遺伝子の異常発現と関係のある病態のコントロールを可能にする産物を選択するためのモデルとして用いられることが好ましい。
【００４６】
本発明に基づいてポリペプチドを特異的に認識しうる、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、この抗体の断片またはキメラ抗体も、本発明の主題である。
【００４７】
特異的なモノクローナル抗体は、当業者に周知の従来のハイブリドーマ培養法に従って入手しうる。
【００４８】
本発明の抗体は、例えば、ヒト化抗体、Fab断片、またはF(ab')2断片である。それらを、検出可能な、および／または定量化可能なシグナルを得るための標識がなされた免疫複合体または抗体の形態で提供してもよい。
【００４９】
このため、本発明の抗体、さらには免疫複合体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができる。
【００５０】
特異的なポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチド、特に従来の手順による遺伝子組換えまたはペプチド合成によって作製されたものに対して免疫化された動物の血清から入手しうる。
【００５１】
本発明のポリペプチド、それらの変種、またはそれらの免疫原性断片を特異的に認識する抗体の重要性には、特に留意する必要がある。
【００５２】
本発明のヌクレオチド配列を、核酸配列の検出、同定、アッセイ法、および／または増幅のためのプローブまたはプライマーとして用いることも、本発明の主題である。
【００５３】
本発明によれば、核酸配列の検出、同定、アッセイ法、および／または増幅のための方法において、プローブまたはプライマーとして用いうるヌクレオチド配列は最小サイズが15塩基であり、好ましくは20塩基、またはさらに好ましくは25〜30塩基である。
【００５４】
本発明のプローブおよびプライマーを、検出可能な、および／または定量化可能なシグナルを得る目的で、当業者に周知の方法により、放射性または非放射性化合物で直接的または間接的に標識してもよい。
【００５５】
本発明の標識されていない核酸配列を、プローブまたはプライマーとして直接用いてもよい。
【００５６】
配列は一般に、さまざまな用途に用いうる配列を入手する目的で標識される。本発明のプライマーまたはプローブの標識は、放射性元素または非放射性分子によって行われる。
【００５７】
用いられる放射性同位元素としては、32P、33P、35S、3H、または125Iが考えられる。非放射性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジオキシゲニンなどのリガンド、ハプテン、発色剤、放射線発光物質、化学発光物質、生物発光物質、蛍光物質、およびリン光物質などの発光性物質から選択される。
【００５８】
本発明のヌクレオチド配列は、このため、諸方法、特にPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いる方法において、プライマーおよび／またはプローブとして用いうる（11a）。この技法では、増幅させようとする断片に隣接したオリゴヌクレオチドプライマーの対を選択する必要がある。例えば、米国特許第4,683,202号に記載された技法を参照のこと。増幅された断片は、例えば、アガロースゲルもしくはポリアクリルアミドゲルによる電気泳動、またはゲル濾過クロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法によって同定することができ、続いてシークエンシングを行うことができる。増幅の特異性は、本発明のヌクレオチド配列をプライマーとして用い、これらの配列を含むプラスミドまたはそれに由来する増幅産物をテンプレートとして用いて確かめることができる。増幅されたヌクレオチド断片を、生物試料において、増幅されたヌクレオチド断片に対して相補的な配列を有する標的核酸の存在を示すためのハイブリダイゼーション反応における試薬として用いることもできる。
【００５９】
本発明はまた、本発明のプライマーを用いる増幅によって入手しうる核酸にも関する。
【００６０】
標的核酸を増幅するための他の技法を、本発明のヌクレオチド配列の対を用いるPCRに代わる選択肢（PCR様のもの）として有効に用いてもよい。PCR様のもの（PCR-like）という表現は、核酸配列の直接的もしくは間接的な複製を用いるか、または標識系が増幅される任意の方法を意味するものと解釈され、これらの技法は当然ながら知られている。一般に、これらはポリメラーゼによるDNAの増幅を伴い、当初の試料がRNAである場合には、前もって逆転写を行う必要がある。この増幅が可能な方法は現在では非常に数多くあり、これには例えば、SDA（鎖置換増幅）法（12）、（13）により記載されたTAS（転写に基づく増幅システム）法、（14）により記載された3SR（自律的配列複製）法、（15）により記載されたNASBA（核酸配列に基づく増幅）法、TMA（転写を介した増幅）法、（16）により記載されたLCR（リガーゼ連鎖反応）法、（17）により記載されたRCR（修復連鎖反応）法、（18）により記載されたCPR（サイクル式プローブ反応）法、（19）により記載されたQ-β-レプリカーゼ増幅法などがある。これらの技法のいくつかは、その後に改良されている。
【００６１】
検出しようとする標的ポリヌクレオチドがmRNAである場合には、本発明のプライマーを利用する増幅反応を用いる前、または本発明のプローブを利用する検出方法を用いる前に、生物試料に含まれるmRNAからcDNAを入手する目的で、逆転写酵素型の酵素を用いることが好都合である。このようにして得られたcDNAは、本発明の増幅または検出の方法に用いられるプライマーまたはプローブの標的としての役割を果たすと考えられる。
【００６２】
プローブハイブリダイゼーション法はさまざまな形式で行うことができる（20）。最も一般的に用いられる方法は、種々の組織の細胞または培養下にある細胞から抽出した核酸を支持体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン）上に固定化すること、および固定化された標的核酸をプローブとともに、明確に規定された条件下でインキュベートすることを本質とする。ハイブリダイゼーションの後に、余分なプローブを除去し、形成されたハイブリッド分子を適切な方法（プローブと結合した放射能、蛍光、または酵素活性の測定）によって検出する。
【００６３】
本発明の核酸プローブのもう1つの態様によれば、それらを捕捉用プローブとして用いることもできる。この場合には、「捕捉用プローブ」と呼ばれるプローブを支持体上に固定化し、これを利用して、調査しようとする生物試料から得られた標的核酸を特異的ハイブリダイゼーションによって捕捉し、続いて、容易に検出しうる成分によって標識された「検出プローブ」と呼ばれる第2のプローブによって検出する。
【００６４】
本発明のヌクレオチド配列は、それらをアンチセンスヌクレオチドとして用いる場合、すなわちその構造が標的配列とのハイブリダイゼーションにより、対応する産物の発現の阻害をもたらす場合もまた対象とされる。それらを、対応する産物の発現の調節に関与するタンパク質との相互作用によってこの発現の阻害または活性化を誘導すると考えられる、センスヌクレオチドとして用いてもよい。
【００６５】
本発明のヌクレオチド配列を、組換えポリペプチドの産生または合成のために用いることも、本発明の主題である。
【００６６】
組換え型の本発明のポリペプチド（それ自体が本発明に含まれる）を産生する方法は、形質転換細胞、特に本発明の哺乳動物の細胞を、本発明のヌクレオチド配列によってコードされる組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養すること、および組換えポリペプチドを回収することを特徴とする。
【００６７】
前記産生方法によって入手できることを特徴とする組換えポリペプチドも、本発明の一部を構成する。
【００６８】
以上に示したようにして得られた組換えポリペプチドは、グリコシル化型または非グリコシル化型のいずれとして提供してもよく、天然の三次構造を有しても有しなくてもよい。
【００６９】
組換えポリペプチドの配列を、それらの溶解性、特に水性溶媒におけるものを改善するために改変してもよい。
【００７０】
このような改変は当業者に知られており、これには例えば、疎水性ドメインの除去、または疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸による置換などがある。
【００７１】
これらのポリペプチドは、以上に定義した核酸配列から、当業者に知られた組換えポリペプチドの産生のための技法に従って産生されうる。この場合には、用いる核酸配列を、細胞宿主におけるその発現を可能にするシグナルの制御下に配置する。
【００７２】
組換えポリペプチドの産生のために有効なシステムは、本発明のベクターおよび宿主細胞を有することを必要とする。
【００７３】
これらの細胞を、ヌクレオチド配列が以上に定義したベクターに挿入されたものを宿主細胞に導入した後に、細胞を、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能にする条件下で培養することによって入手することもできる。
【００７４】
組換えポリペプチドを精製するための方法は当業者に知られている。組換えポリペプチドは、細胞の可溶化物または抽出物から、培養液の上清から、分画、クロマトグラフィー法、特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いるイムノアフィニティー法などを、個別的にまたは組み合わせて用いる方法によって精製しうる。
【００７５】
本発明のポリペプチドを、さまざまな既知のペプチド合成法のいずれか、例えば、固相を用いる技法（21）もしくは部分的固相を用いる技法、断片の濃縮、または溶液中での従来の合成法などを用いる化学合成によって得ることもできる。
【００７６】
化学合成によって得られ、対応する非天然アミノ酸を含みうるポリペプチドも本発明に含まれる。
【００７７】
本発明の少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とするDNAチップも、本発明の主題である。
【００７８】
実際に、核酸配列の検出、同定、アッセイ法および／または増幅のためのプローブもしくはプライマーとして用いることを想定している、本発明のヌクレオチド配列を、DNAチップまたは高密度フィルターである支持体上に共有的または非共有的に固定化してもよい。
【００７９】
「DNAチップ」または「高密度フィルター」という表現は、DNA配列のそれぞれをその地理的な局在性に従って位置させることが可能な、DNA配列を付着させる支持体を意味するものと解釈される。これらのチップまたはフィルターは主としてそのサイズ、支持体の材料の点で異なり、おそらくはそれに付着する配列の数も異なると考えられる。
【００８０】
特に、光化学ターゲティングまたはインクジェットターゲティングにより、インサイチューでの合成を行うことが可能である。他の技法は、エクスサイチューで合成を行うこと、またはインクジェット式、電子式、もしくは機械的なアドレス指定によってDNAチップの支持体に付着させることを本質とする。これらのさまざまな方法は当業者に周知である。
【００８１】
本発明のポリペプチドまたは抗体を含むタンパク質チップも、本発明の主題である。
【００８２】
このようなタンパク質チップは、本発明のポリペプチドと他のタンパク質または化合物との相互作用の研究を可能とし、このため、本発明のポリペプチドと相互作用する化合物のスクリーニングのために有用と考えられる。
【００８３】
また、本発明のタンパク質チップを、検査しようとする患者の血清における本発明のポリペプチドに対する抗体の存在を検出するために用いることも可能と思われる。また、本発明の抗体を含むタンパク質チップを、逆に、抗体によって認識されうる患者の血清中のポリペプチドの存在を検出するために用いることも可能と思われる。
【００８４】
本発明のヌクレオチド配列、ポリペプチド、ベクター、細胞、または抗体から選択された化合物を、医薬品の調製のために用いることも、本発明の主題である。
【００８５】
標的となるより具体的な病態は、ウイルス性疾患、および腫瘍細胞の発生または細胞変性を特徴とするアルツハイマー病または統合失調症などの疾患である。すなわち、上記の医薬品は、これらの疾患の予防および／または治療を目的とする。特に標的となる疾患は癌である。
【００８６】
本発明の恩典の1つは、これにより、多数のヌクレオチド配列の、腫瘍抑制、腫瘍復帰変異、アポトーシス、および／またはウイルス耐性の現象への関与が示されたことである。その結果として、これらの配列は、これらの上記の過程のいずれかが誘発されると差異を伴って発現される。したがって、これらの過程のいずれかの発生が疑われる患者、またはこの種の発生がないことを確かめることが望ましい患者が存在する場合に、患者の生物試料から、本発明の1つまたは複数の配列の発現を判定すること、またはさらに定量化することは有用である。選択的には、配列の1つまたは複数の発現の分析に付随して、健康個体のものに対応する基準発現レベルとの比較を行ってもよい。
【００８７】
したがって、本発明は、ウイルス性疾患または腫瘍の発生もしくは細胞変性を特徴とする疾患の診断および／または予後評価のための方法であって、検査しようとする患者の生物試料からの、本発明の少なくとも1つの配列の発現の分析を含む方法も含む。
【００８８】
1つの好ましい態様によれば、前記方法は以下の段階を含む：
検査しようとする患者から入手した生物試料からのメッセンジャーRNAの単離、
前記メッセンジャーRNAからの相補的cDNAの調製、
選択的な、本発明の少なくとも1つの配列に対応する相補的DNAの一部の増幅、および
選択的に増幅された相補的DNAの検出。
【００８９】
特に、配列の発現の分析は、上記のDNAチップを用いて行うこともできる。
【００９０】
本発明の配列のいくつかは細胞表面に発現される受容体であるとの特徴を示しており、上記の過程の状況下でのその機序を解明するためには、この受容体と相互作用しうる、すなわち本発明のポリペプチドと相互作用しうる化合物を探索することが有用であり、分泌タンパク質を予測することも必要である。これは、分泌タンパク質（細胞の表面または外側）、ホルモン様タンパク質などに対応する本発明のポリペプチドにも当てはまる。したがって、本発明のペプチドと結合しうる化合物のスクリーニングのための方法であって、
本発明のポリペプチドまたは細胞の候補化合物との接触、および
前記候補化合物と前記ポリペプチドまたは前記細胞との複合体の形成の検出、
を含む方法も、本発明の主題である。
【００９１】
化合物のスクリーニングのための方法は、本発明のヌクレオチド配列と、またはさらにはこれらの配列の発現もしくは調節のために必要な配列と相互作用しうる化合物に関しても有用と思われる。実際、このような化合物は配列と相互作用し、その効果として当該配列の発現を低下、阻害、または逆に増強することができる。このような方法は以下の段階を含む：
本発明のヌクレオチド配列または細胞を候補化合物と接触させること、および
前記候補化合物と前記ヌクレオチド配列または前記細胞との複合体形成の検出。
【００９２】
上記の理由のために、検査しようとする患者からの生物標本または試料における、本発明のヌクレオチド配列の存在を探索および／またはアッセイすることは有用と思われる。このような検出および／またはアッセイの方法は以下の段階を含む：
本発明の標識ヌクレオチド配列を、検査しようとする生物試料と、ハイブリッドの形成のために必要な条件下で接触させる段階、および
前記ヌクレオチド配列と前記生物試料中に存在する核酸との間に形成されたハイブリッドの検出および／またはアッセイ。
【００９３】
本方法はさらに、本発明のヌクレオチド配列から選択されたプライマーを利用して、生物試料の核酸を増幅するための段階を含んでもよい。
【００９４】
特に、本方法を、上記のDNAチップを用いて行うこともできる。
【００９５】
当業者はこのような方法を行うやり方を認識しており、これには特に、以下のものを含む試薬キットを用いてもよい：
a）プローブとして用いる、本発明のヌクレオチド配列、
b）前記プローブと生物試料の核酸とのハイブリダイゼーション反応を行うために必要な試薬、
c）前記プローブと生物試料の核酸との間に形成されたハイブリッドの検出および／またはアッセイ法のために必要な試薬。
【００９６】
この種のキットが、得られた結果の質を確保するための陽性対照または陰性対照を含んでもよい。
【００９７】
同様に、本発明のポリペプチドの検出および／またはアッセイ法も本発明に関連して想定することができ、この方法はこのため、以下の段階を含む：
生物試料を本発明の標識抗体と接触させる段階、および
前記抗体と前記試料中に存在するポリペプチドとの間に形成された複合体の検出および／またはアッセイ。
【００９８】
本方法は、上記のタンパク質チップを用いて行うことが好ましい。この場合も同様に、当業者はこのような方法を行うやり方を認識しており、これには特に、以下のものを含む試薬キットを用いてもよい：
a）本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；
b）選択的に、抗原／抗体反応に都合の良い媒体を調製するための試薬；
c）抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬。
【００９９】
さらに、請求項1記載の少なくとも1つのヌクレオチド配列、および／または請求項3もしくは4に定義された少なくとも1つのポリペプチド配列がその上に記録された、コンピュータ可読式支持体またはコンピュータ用支持体も、本発明の主題である。特に、この支持体は、以下のものからなる群より選択される：
a）フロッピーディスク、
b）ハードディスク、
c）ランダムアクセスメモリ（RAM）、
d）読み出し専用メモリ（ROM）、
e）CD ROM。
【０１００】
本発明は、本明細書の記載には限定されず、すべての変形物を含んでおり、これは以下の実験データに鑑みて、より明瞭に理解されると考えられる。
【０１０１】
1. U937細胞およびUS4細胞に関するデータ
これまで見てきた通り、本発明には、親細胞U937およびその「派生」細胞であるUS4を用いている。実際には、US4細胞およびUS3細胞（これは本発明の文脈には含まれていない）には共通の特徴がいくつかある。それらの産生様式および特性を以下に提示する。
【０１０２】
US3細胞およびUS4細胞の選択および特徴付け
U937細胞に対して2回の限界希釈を行い、単一クローンの集団を得た。これらの細胞をH-1パルボウイルスに感染させた。このウイルスの細胞変性作用のために大規模な細胞死が起こり、残った2つの耐性クローンを3カ月間連続培養したものがUS3およびUS4である。細胞の生存性は、H-1ウイルスを感染させた培養物における生細胞の相対的な数を、非処理培養物と比較して再感染から4日後に測定したものと定義される。腫瘍形成能を計測するために、10７個のU937細胞、US3細胞、およびUS4細胞をscid／scidマウス（4または5週齡）に皮下注射した。腫瘍形成能は注射から2カ月以内にマウスに生じた腫瘍の数によって表される。
【０１０３】
その手法は以下の通りとした：悪性細胞のクローン集団を用いて、腫瘍形成性の表現型が抑制されたサブクローンを導き出した。H-1パルボウイルスを用いて行われるこの選択は、選択的に死滅する腫瘍細胞を除去して正常細胞を残すことによって行われる。H-1パルボウイルスの細胞変性作用に対して耐性のある細胞を感受性のある腫瘍から選択することにより、悪性表現型の弱い細胞を得ることができる。
【０１０４】
これに基づいてU937細胞のクローン集団を単離したが、これらの細胞はH-1パルボウイルスの細胞変性作用に対して感受性があり、一方、US3およびUS4クローンはこのウイルスに対して耐性がある。US3およびUS4クローンでは腫瘍形成性の表現型が強く抑制されており、これに対して、親U937細胞はパルボウイルスに感染したscid／scidマウスの80％のケースで腫瘍を生じさせ、US3細胞は単一の腫瘍しか形成させず、US4細胞は10７個の細胞の20回の接種につき1つの腫瘍を生じさせた。この結果を以下の表にまとめた。
U397細胞、US3細胞およびUS4細胞のH-1パルボウイルスに対する耐性および腫瘍形成能
2004532007.tif 000002
【０１０５】
2．材料および方法
この目的は、トランスフェクトされたU937およびUS4ヒト白血病細胞株の皮下注射によって誘導されるSCIDマウスにおける皮下腫瘍の成長を比較することである。
【０１０６】
A．白血病細胞株および培養条件
注射したU937（ATCC）およびUS4細胞株の細胞はすべて、2mM L-グルタミン、10％ウシ胎仔血清、およびゲンタマイシンを添加したRPMI-1640培地を加えた瓶に入った細胞懸濁液の形で提供された。
【０１０７】
U937細胞株は、びまん性組織球性リンパ腫の患者に由来するCD4+ヒト単球性細胞株である（1）。
【０１０８】
細胞を血球計算器で計数し、その生存度を0.25％トリパンブルー色素の排除によって調べた。生存度はU937細胞およびUS4細胞でそれぞれ95.5％および90.5％であった。U937細胞およびUS4細胞を遠心した上でRPMI培地中に再懸濁し、その後にSCIDマウスに注射した。
【０１０９】
B．動物
体重20〜25gの範囲の健康な31週齡の雌性SCIDマウス10匹（CB17／IcrHsd）を、Harlan France（Gannat, France）から入手した。このマウスを7日間、特定病原体不在動物を処置前に扱うための設備である、出願人の所有する専用の飼育室で観察した。動物を扱うためのこの設備（INRA, Dijon, France）は、フランス農業省および研究省の承認を受けている（認可番号A21100）。動物実験は、動物福祉に関する欧州倫理ディレクティブに準拠し、実験的新生物の状況に即して行われる（3）。
【０１１０】
B.1．環境
マウスは、温度（24±1℃）、湿度（55±1％）、光周期（照明下12時間／暗下12時間）および換気が調節された条件下の室内にて飼育した。マウスはSPF条件下で飼育し、室内の温度および湿度は連続監視した。換気システムは、1時間に14回、空気を再循環せずに交換するプログラムした。外部の新鮮な空気が内側の一連のフィルターを通過した後に、各飼育室に均一に拡散する。マウス集団内での病原体の汚染または流布を防ぐために実験室内は高圧（2mm）に保った。SPF条件下で作業するスタッフは全員、繁殖エリアにいる時には衛生および衣類に関する特別な指示に従った。
【０１１１】
B.2．飼育
マウスはポリカーボネート製ケージ（UAR, Epinay sur Orge, France）の中で飼育し、飼料および水を与えた。用いたケージの標準的なサイズは、施設内の標準的作業手順に従い、マウス10匹に対して637cm2である。滅菌おがくずからなるマウス用の寝藁（UAR）を週2回交換した。
【０１１２】
B.3．飼料および飲用水
マウスの飼料はExtralabo社（Provins, France）から購入した。飼料は自由に摂取させ、ケージの上部の金属製蓋の箇所に設置した。水もゴムタップを装着した給水瓶から自由摂取させた。給水瓶は洗浄、滅菌して週1回交換した。水は0.2μmアブソリュートフィルターの濾過によって滅菌した。
【０１１３】
B.4．動物およびケージの識別
無作為に配分した後に、両耳に異なる2つの数字を刻印することによってマウスを識別した。各ケージは特別なコードで標識した。
【０１１４】
C. 実験データおよび処置
C.1．SCIDマウスへの腫瘍の導入
細胞の注射の前に、SCIDマウスを無作為に2群に分け、1群当たり5匹とした。0.2mlのRPMI培地中にある10７個のUS4またはU937腫瘍細胞を、SCIDマウスの各部位への注射により、ゼロ時点で皮下接種した。各マウスには種々の領域、すなわち両側の側腹部および両側の上背部に1箇所ずつ、腫瘍細胞の計4回の注射を行った。
【０１１５】
C.2．腫瘍の採取
腫瘍体積が1500mm３に達した時点で、マウスを屠殺し、腫瘍を採取して秤量し、液体窒素中で凍結させて-80℃で保存した上で、個別的に標識した。
【０１１６】
C.3．マウスの観測
細胞の注射の前にイソフルランフォレン（Minerve, Bondouble, France）を用いてマウスに麻酔を施した。腫瘍細胞を注射した後、マウスを5時間観察した。マウスの生存、行動、体重、および皮下腫瘍の成長について週2回記録した。
【０１１７】
実験期間中に以下の徴候のいずれかが現れた時点で、マウスをイソフルラン麻酔下での頸部切断によって屠殺した：
苦痛の徴候（悪液質、衰弱、移動または摂食が困難）、
体重の10％に至る腫瘍成長、
腫瘍が潰瘍化し、脱毛した状態が持続する、
腫瘍の位置が運動および／または摂食の妨げになる、
3日連続して20％の体重減少
【０１１８】
各マウスに対して、転移または形態的異常の有無を検出するための剖検を行った。
【０１１９】
D. データの提示
D.1．観測パラメーター
生存期間の中央値および平均の算出は以下の通りに表される：
平均生存期間＝S1／（S2−NT）
式中：S1＝第0日から実験終了時までの日々の生存個体の合計（「評価の対象とならない」* 生存個体を除く）
S2＝動物の最初の数
NT＝「評価の対象とならない」* 動物の数
*「評価の対象とならない」：これは、腫瘍の移植による障害に起因すると判断される規定の限界値よりも小さい腫瘍を有する動物のことである。
【０１２０】
D.2．腫瘍の抑制に関するシステム
腫瘍サイズ（およびmm３単位での腫瘍体積）をコンパスを用いて週2回測定し、以下の式によって推定する：（長さ×幅２／2（4）。実験はマウスの腫瘍サイズが1500mm３に達した時点で終了した。
屠殺後に腫瘍を摘出し、秤量した。
US4群およびU937群の腫瘍成長曲線を、腫瘍体積の平均を用いて作成した。
US4群およびU937群の腫瘍倍増時間は、成長期間中に平均腫瘍体積の200％に達するまでの時間と定義した。
注射からの1回または2回の倍増時間（DT）にわたる比成長期間（specific growth period）は以下の通りに定義する：
比成長期間＝（DT US4−DT U937）／DT U937。
成長期間は、US4群およびU937群が同じ腫瘍サイズに達するための平均成長期間の差として算出される。
【０１２１】
D.3．統計学的検定
統計分析はすべて、StatView（登録商標）ソフトウエア（Abacus Concept, Berkeley, USA）を用いて行った。平均体重、腫瘍倍増時間および「V」到達時間の変化に関する統計分析は、ボンフェロニ／ダン検定を用いて行った。p値＜0.05を有意とみなした。すべての群を互いに比較した。
【０１２２】
E. 結果
平均腫瘍体積および体重に関する曲線をそれぞれ図1および2に示している。
【０１２３】
2群のSCIDマウスにおいて第8日と第19日との間に有意な体重減少は認められなかった。
【０１２４】
「V」到達時間に関しては2群間のSCIDマウスに有意差が認められたが、平均体重の変化（第19日−第8日）および倍増時間に関しては有意差は認められなかった。
【０１２５】
剖検を行ったところ、転移の存在も、結節性の疑いがあるものの発生も認められなかった。麻酔後に頸部切断によって屠殺したマウスから腫瘍を採取した。腫瘍は直ちにチューブに入れ、液体窒素中で凍結した上で-80℃で保存した。摘出した腫瘍は卵形で、硬さは中程度であり、色調は薄紅色であった。腫瘍とその環境（皮膚および筋肉組織）との相互作用は限定的で、表面に留まった。
【０１２６】
F. 結論
US4細胞株のSCIDマウスにおける取り込みレベルは、U937細胞株よりも有意に低かった。
【０１２７】
US4腫瘍とU937腫瘍との間の成長遅延期間は23.5日であり、倍増時間は同程度であった。
【０１２８】
3．TPT1／TCPTの腫瘍復帰変異における関与
TPT1／TCPT（ヒスタミン遊離因子をコードする翻訳が制御された腫瘍タンパク質）の腫瘍復帰変異における関与について検討するために、腫瘍復帰変異の種々の細胞モデル：U937／US4.2、MCF7／MCF7＋SIAH1、およびM1／LTR6における遺伝子の発現（図3a）およびタンパク質の発現（図3b）を分析した。復帰細胞におけるTPT1／TCTPの発現レベルは腫瘍細胞に比べて著しく低かった。
【０１２９】
この低下の生理的側面について検討するために、U937腫瘍細胞にアンチセンスTPT1／TCTPをトランスフェクトした。TPT1／TCTPの発現低下を確認した後に（図3c、左図）、本発明者らは、その結果としてアポトーシスが生じたことを3種の異なる方法：PARPの切断の検出、アネキシンVによる標識、およびTUNEL法（それぞれ図3c、右図；図3d；図3e）によって検出した。
【０１３０】
培養下にある腫瘍細胞におけるTPT1／TCTPの発現の減少は、アポトーシスを増加させる。
【０１３１】
本発明者らは続いて、このTPT1／TCTP機能の喪失による生理的転帰をインビボで評価した。アンチセンスTPT1／TCTPをトランスフェクトしたU937細胞をマウスに注射したところ、TPT1／TCTPの発現が低下するとともに、形成される腫瘍数の劇的な減少が認められた（図3f）。
【０１３２】
これらの結果と同時に、細胞外マトリックス上で培養しているMCF7細胞およびT47D細胞への、TPT1／TCTP（siRNA）に対して特異的な二本鎖RNAのトランスフェクションによって得られたTPT1／TCTPの低下により、正常構造に匹敵する腺房の細胞再組織化がもたらされた（図4）。
【０１３３】
参照
2004532007.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】SCIDマウスのU937群およびUS4群に関する腫瘍成長曲線を表している。
【図２】U937腫瘍またはUS4腫瘍を有するマウスの体重曲線を表している。
【図３Ａ】ノーザンブロット法による、U937／US4.2株およびMCF7／MCF7＋SIAH1株におけるTPT1／TCTP遺伝子の発現の分析。全転写物の量をGAPDHのモニタリングによって確かめている；
【図３Ｂ】U937／US4.2モデル、MCF7／MCF7＋siahモデルにおけるTCTPタンパク質の発現のウエスタンブロット分析、および32℃で20時間インキュベートした後のM1／LTR6系におけるTCTPのマウス相同体TCTP_MOUSEの発現の分析；
【図３Ｃ】アンチセンスTPT1／TCTPをトランスフェクトしたU937細胞におけるTCTPの発現の分析。クローンIおよびIIIを対照と比較し、U937細胞をベクター単独と比較している。
右側の図は、アンチセンスTPT1／TCTPをトランスフェクトしたU937細胞、クローンI、およびIIIにおける、アポトーシスのマーカーであるPARPの切断の検出。アポトーシス誘導物質である抗Fas（抗CD95）抗体で処理したジャーカット細胞を対照として用いている；
【図３Ｄ】FITC-アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム（PI）の二重標識によるアポトーシス細胞の特徴付け。  U937細胞＋対照ベクターおよびU937細胞＋アンチセンスTPT1／TCTPは、FITCを結合させたアネキシンV（初期のアポトーシス細胞のホスファチジルセリンと結合する）およびPI（原形質膜が損なわれた壊死細胞のみを標識する）によって同時に標識される。サイトフローメトリー分析により、アポトーシス細胞（アネキシン+、PI-）、壊死細胞（アネキシン+、PI+、またはアネキシン-、PI+）および無傷細胞（アネキシン-、PI-）の比率を決定することが可能となる；
【図３Ｅ】アンチセンスTPT1／TCTPをトランスフェクトした細胞における、核DNAの遊離3'末端のインサイチュー標識：TUNEL（「ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼを介したdUTPニックエンド標識」）法によるアポトーシスの評価。この標識により、アポトーシスの際のエンドヌクレアーゼの活性化に起因する核DNAの断片化をインサイチューで示すことが可能となる。アポトーシス細胞は緑色に見える。
【図３Ｆ】ベクター単独（最も上の曲線−91個の腫瘍／100個中）、アンチセンスプレセニリン1（上から2番目の曲線−12個の腫瘍／20個中）、SIAH1（中央の曲線−12個の腫瘍／20個中）、およびアンチセンスTPT1／TCTP、クローンI、およびIII（下の2つの曲線―8個の腫瘍／20個中および4個の腫瘍／20個中）をトランスフェクトしたU937細胞のインビボ腫瘍形成能の検討。1000万個の細胞を各々の側腹部および上背部に注射した。
【図４】細胞外腫瘍マトリックス（Matrigel）上で培養した細胞を表している。ベンゾ(a)ピレンにより形質転換させた乳腺上皮細胞である184B5株を腺房形成に関する対照として用いる。腫瘍細胞T47DおよびMCF7は不規則なコロニーを形成する。SIAH1をトランスフェクトしたMCF7細胞では、秩序立った構造が部分的に回復している。アンチセンスTPT1／TCTPをトランスフェクトしたMCF7細胞およびT47D細胞は、正常な腺房形成に匹敵する細胞の再組織化を生じる。緑色に見える細胞（図中の明るい点）はFITCを結合させた抗E_カドヘリン抗体で標識されており、PIで標識された核は赤色に見える（やや暗い点）。  アンチセンスTPT1／TCTPをトランスフェクトしたMCF7細胞およびT47D細胞におけるTCTPの発現に関するウエスタンブロット分析。
【図１】
2004532007.tif 000004
【図２】
2004532007.tif 000005
【図３Ａ】
2004532007.tif 000006
【図３Ｂ】
2004532007.tif 000007
【図３Ｃ】
2004532007.tif 000008
【図３Ｄ】
2004532007.tif 000009
【図３Ｅ】
2004532007.tif 000010
【図３Ｆ】
2004532007.tif 000011
【図４】
2004532007.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004532007.tif 000013
2004532007.tif 000014
2004532007.tif 000015
2004532007.tif 000016
2004532007.tif 000017
2004532007.tif 000018
2004532007.tif 000019
2004532007.tif 000020
2004532007.tif 000021
2004532007.tif 000022
2004532007.tif 000023
2004532007.tif 000024
2004532007.tif 000025
2004532007.tif 000026
2004532007.tif 000027
2004532007.tif 000028
2004532007.tif 000029
2004532007.tif 000030
2004532007.tif 000031
2004532007.tif 000032
2004532007.tif 000033
2004532007.tif 000034
2004532007.tif 000035
2004532007.tif 000036
2004532007.tif 000037
2004532007.tif 000038
2004532007.tif 000039
2004532007.tif 000040
2004532007.tif 000041
2004532007.tif 000042
2004532007.tif 000043
2004532007.tif 000044
2004532007.tif 000045
2004532007.tif 000046
2004532007.tif 000047
2004532007.tif 000048
2004532007.tif 000049
2004532007.tif 000050
2004532007.tif 000051
2004532007.tif 000052
2004532007.tif 000053
2004532007.tif 000054
2004532007.tif 000055
2004532007.tif 000056
2004532007.tif 000057
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532007.tif 000058
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532007.tif 000059
【国際調査報告】
2004532007.tif 000060
2004532007.tif 000061
2004532007.tif 000062
2004532007.tif 000063
2004532007.tif 000064
2004532007.tif 000065
2004532007.tif 000066
2004532007.tif 000067