(57)【要約】本発明は、デメチルカンタリジンをプラチナ含有抗がん剤と組み合わせて含む、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を阻害するための医薬組成物、およびその用途を提供する。また、本発明は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の阻害における、デメチルカンタリジンまたは医薬として許容可能なそれらの誘導体とプラチナ含有抗がん剤との組合せの相乗作用についても開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害するデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物の用途。
【請求項２】
がん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である、請求項１に記載の用途。
【請求項３】
シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を、ある量のデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物と接触させることからなる、前記細胞の生育を阻害する方法。
【請求項４】
がん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
対象者においてシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害する方法であって、前記細胞の生育を阻害するために有効な量のデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物を前記対象者に投与することからなる方法。
【請求項６】
がん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物を、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育阻害において相乗作用を有するプラチナ含有抗がん剤、ならびに医薬として許容可能な担体とともに含んでなる医薬組成物。
【請求項８】
がん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
デメチルカンタリジンまたはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤とのモル比が５５：１〜１：１００である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
該モル比が１０：１〜１：１０である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
該モル比が１：１である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記プラチナ含有抗がん剤は
【化１】
2004532260.tif 000021
の構造を有する複合体のうち少なくとも１つから選択される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＲはＨ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ３、およびＣ２Ｈ５から選択され、‐Ａ‐Ａ‐は
【化２】
2004532260.tif 000022
である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プラチナ含有抗がん剤はシスプラチンである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記プラチナ含有抗がん剤はカルボプラチンである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記プラチナ含有抗がん剤はオキサリプラチンである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害するための医薬組成物の製造におけるデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）の用途。
【請求項１８】
がん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である、請求項１７に記載の用途。
【請求項１９】
シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を、デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤との組合せに接触させることからなる、前記細胞の生育を阻害する方法。
【請求項２０】
がん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤とのモ
ル比が５５：１〜１：１００である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
該モル比が１０：１〜１：１０である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該モル比が１：１である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プラチナ含有抗がん剤は
【化３】
2004532260.tif 000023
の構造を有する複合体のうち少なくとも１つから選択される、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＲはＨ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ３、およびＣ２Ｈ５から選択され、‐Ａ‐Ａ‐は
【化４】
2004532260.tif 000024
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プラチナ含有抗がん剤はシスプラチンである、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記プラチナ含有抗がん剤はカルボプラチンである、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記プラチナ含有抗がん剤はオキサリプラチンである、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
対象者においてシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害する方法であって、デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤との組合せを前記対象者に投与することからなる方法。
【請求項３０】
がん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デメチルカンタリジンを含んで成る、がん細胞を阻害するための医薬組成物に関し、特に、デメチルカンタリジンをプラチナ含有抗がん剤と組み合わせて含む、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を阻害するための医薬組成物、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
デメチルカンタリジン（ｄｅｍｅｔｈｙｌｃａｎｔｈａｒｉｄｉｎ，ＤＭＣ）は、「ツチハンミョウ（ｂｌｉｓｔｅｒ  ｂｅｅｔｌｅｓ）」が有する活性成分であるカンタリジンの修飾構造体である。ツチハンミョウは、漢方薬（ＴＣＭ）として肝臓、肺および消化管のがんを治療するために用いられてきた。
【０００３】
シスプラチンおよびカルボプラチンはいずれもプラチナ（Ｐｔ）を含む薬剤であり、世界中でがんの治療に臨床的に使用されている。これらの薬剤に共通の問題点には、毒性の副作用および薬剤耐性がある。しかしながら、近年の発明（本明細書に援用されるアウ‐ヨン（Ａｕ‐Ｙｅｕｎｇ）らの米国特許第６，１１０，９０７号）により、構造ＩまたはＩＩ（アウ‐ヨン（Ａｕ‐Ｙｅｕｎｇ）らの米国特許第６，１１０，９０７号を参照）を有するデメチルカンタリジンのプラチナ複合体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ（生体外）で抗がん活性を示すことが明らかとなっている。発明者らの最近の研究では、該特許のプラチナ含有複合体はｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）での良好な活性、シスプラチン耐性の回避、ならびに乳がんおよび肝臓がんへの選択性を有することが示されている。後者の２つの特性（耐性の回避および選択性）は、ＤＭＣの含有によるものと考えられる。
【０００４】
【化１】
2004532260.tif 000002
驚くべきことに、発明者らは、ＤＭＣまたはその加水分解物がそれ自体で高感受性ならびにシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害する良好な活性を有するだけでなく、Ｐｔ含有抗がん剤と組み合わせてシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害する相乗作用をも有することを見出した。その結果本発明が提供される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、デメチルカンタリジンを含んで成る、がん細胞を阻害するための医薬組成物を提供することであり、特に、デメチルカンタリジンをプラチナ含有抗がん剤と組み合わせて含む、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を阻害するための医薬組成物、およびその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害するデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物の用途を提供する。
【０００７】
本発明は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を、ある量のデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物と接触させることからなる、前記細胞の生育を阻害する方法を提供する。
【０００８】
本発明は、対象者においてシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害する方法であって、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害するために有効な量のデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物を前記対象者に投与することからなる方法を提供する。
【０００９】
本発明は、デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物を、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育阻害において相乗作用を有するプラチナ含有抗がん剤とともに含んでなる医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害するための医薬組成物の製造におけるデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）の用途を提供する。
【００１１】
本発明は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を、デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤との組合せに接触させることからなる、前記細胞の生育を阻害する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、対象者においてシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害する方法であって、デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤との組合せを前記対象者に投与することからなる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害するデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物の用途を提供する。
【００１４】
本発明は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を、有効な量のデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物と接触させることからなる、前記細胞の生育を阻害する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、対象者においてシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害する方法であって、前記細胞の生育を阻害するために有効な量のデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物を前記対象者に投与することからなる方法も提供する。
【００１６】
本明細書において「加水分解物」とは、ＤＭＣまたはその誘導体の加水分解によって得られる医薬として許容可能な任意の形態を意味し、二価酸、一価酸、エステル、塩などがあるがこれらに限定されない。一実施形態では、加水分解物はＤＭＣの二価酸である。
【００１７】
上述のがん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である。
「有効な量」とは、通常は動物又はヒトを含む対象者においてがん細胞の生育を阻害するために有効な任意の量である。有効な量の決定方法は当業者には良く知られており、関係する対象者のタイプ、血液サンプルが接触する場合は大きさ、および使用される検出可能なマーカーなどの（これらに限定はされない）因子によって変わる。
【００１８】
本発明において「投与（すること）」とは、当業者に周知の任意の標準的な投与方法を意味する。例としては、静脈内、腹腔内または筋肉内への投与があるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明は、デメチルカンタリジンまたはその加水分解物と、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育阻害において相乗作用を有するプラチナ含有抗がん剤との組合せ、ならびに医薬として許容可能な担体を含んでなる医薬組成物を提供する。該組成物において、デメチルカンタリジンまたはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤との比は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育阻害において相乗作用を生じる全ての比を対象とする。一般に、ＤＭＣまたはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤との間のモル比は５５：１〜１：１００であり、好ましくは１０：１〜１：１０であり、最も好ましくは１：１である（以降、比は特に指示のない限りモル比を意味する）。当然であるが、本発明の医薬組成物は１つまたはそれ以上のプラチナ含有抗がん剤を含みうる。
【００２０】
２つ以上の治療薬を組み合わせる目的は、より低い薬剤用量を達成し、毒性を低減し、標的細胞による耐性の発現を最小限にとどめるかまたは遅らせることであり、相乗作用の可能性を提供することである。本明細書は、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞株における抗がん活性を示す、デメチルカンタリジンとプラチナ含有抗がん剤との相乗作用を有する組合せについての最初の報告である。種々のプラチナ含有抗がん剤とＤＭＣとの様々な比率の組合せは、化学療法の探索における新たな候補となりうるものである。
【００２１】
本発明において使用されるプラチナ含有抗がん剤には、がんの治療においてこれまで使用されてきた、または使用されるべき任意のプラチナ含有抗がん剤が含まれる。本発明において、プラチナ含有抗がん剤はシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、および米国特許第６，１１０，９０７号においてクレームに記載されたすべての複合体から選択されることが好ましい。米国特許第６，１１０，９０７号の複合体の中では、複合体１〜５が好ましいが、それらは以下の構造を有する。
【００２２】
【化２】
2004532260.tif 000003
本発明は、デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物をプラチナ含有抗がん剤ならびに医薬として許容可能な担体と組み合わせることからなる、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害するための医薬組成物の製造におけるＤＭＣまたはその加水分解物の用途を提供する。ＤＭＣまたはその加水分解物をプラチナ含有抗がん剤および医薬として許容可能な担体と組み合わせる方法は当業者にはよく知られている。医薬として許容可能な担体も当業者によく知られており、水溶液または非水性の溶液、懸濁液、乳濁液、および個体の形状でよい。担体の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油脂、水、生理食塩水、デキストロース、ＣａＣＯ３、および穀物などの粉末がある。がん細胞は、肺がん、肝臓がん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、白血病、リンパ腫、または鼻咽頭がん由来である。
【００２３】
シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞を、デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤との組合せと接触させることからなる、前記細胞の生育を阻害する方法を提供する。
【００２４】
本発明は、対象者においてシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチンに感受性および耐性のがん細胞の生育を阻害する方法であって、デメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤との組合せを前記対象者に投与することからなる方法も提供する。該組合せにおけるデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物とプラチナ含有抗がん剤とのモル比は、５５：１〜１：１００であり、好ましくは１０：１〜１：１０であり、最も好ましくは１：１である。
【００２５】
単剤として、ＤＭＣまたはその加水分解物、および米国特許第６，１１０，９０７号に開示された構造ＩおよびＩＩのプラチナ含有複合体は、表１および表２に示すように種々の細胞株においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで良好な抗がん活性を示す。
【００２６】
【表１】
2004532260.tif 000004
【００２７】
【表２】
2004532260.tif 000005
（プラチナ含有抗がん剤とデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物との組合せの相乗作用）
【実施例１】
【００２８】
（シスプラチンとＤＭＣとの組合せ）
プラチナ含有抗がん剤とデメチルカンタリジンまたはその加水分解物（二価酸）との、様々な比率の組合せは、シスプラチン感受性およびシスプラチン耐性のがん細胞のいずれにおいても相乗作用を示す。例えば、相乗作用の結果として、感受性を有するＬ１２１０細胞株において、抗がん作用（シスプラチン単独と同等）を達成するために必要なシスプラチンの用量は、デメチルカンタリジンと組み合わせた場合（モル比は１：１０を越えない）には１／２に低減可能である（表３）。同程度のシスプラチンとＤＭＣとの比率について、この用量の低減は、シスプラチン耐性のＬ１２１０細胞株（シスプラチンに対して４０倍の耐性を有する）においてはさらにより劇的である。すなわち、同等の抗がん作用を達成するために必要なシスプラチンの用量は１／６（シスプラチン：ＤＭＣがモル比で１：１）〜１／２７（シスプラチン：ＤＭＣがモル比で１：６）に低減される（表４）。
【００２９】
表３および４から、シスプラチン耐性のＬ１２１０におけるシスプラチンの用量低減指数（ｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ；ＤＲＩ）は、一般にシスプラチン感受性のＬ１２１０細胞株におけるＤＲＩよりも高かった。このことは、ＤＭＣをシスプラチンと組み合わせることにより、シスプラチンとＤＭＣとの相乗作用（図１および２）によりシスプラチン耐性を克服する可能性がある理由の説明となりうる。
【００３０】
シスプラチンおよびデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）ならびにそれらの組合せの、７２時間曝露におけるシスプラチン感受性およびシスプラチン耐性のＬ１２１０マウス白血病細胞株の生育阻害における用量‐効果の関係を示す。
【００３１】
【表３】
2004532260.tif 000006
【００３２】
【表４】
2004532260.tif 000007
表中、パラメータｍ、Ｄｍ、およびｒはメジアン‐効果プロットの傾き、ｘ切片の真数、および直線の相関係数であり、それぞれ用量‐効果曲線の形、有効性（ＩＣ５０）、および質量‐作用の法則に対するデータの整合性を意味する；用量‐効果の関係の実験を３セット実施し、各実験は６〜８連とした。
【００３３】
♯ＤＲＩ（用量低減指数）は、各薬剤単独の用量と比較して、ある一定程度の効果を導くために、組合せにおいて可能な用量の低減の規模の程度（倍数）を表す。全てのＤＲＩ値は、古典的なアイソボログラムの式および仮説に基づいて算出する。
【実施例２】
【００３４】
（カルボプラチンとＤＭＣとの組合せ）
プラチナ含有抗がん剤とデメチルカンタリジンまたはその加水分解物（二価酸）との、様々な比率の組合せは、シスプラチン感受性および耐性のがん細胞のいずれにおいても相乗作用を示す。例えば、相乗作用の結果として、感受性を有するＬ１２１０細胞株において、抗がん作用（カルボプラチン単独と同等）を達成するために必要なカルボプラチンの用量は、デメチルカンタリジンと組み合わせた場合には１／２〜１／８に低減可能である（表５）。同程度のカルボプラチンとＤＭＣとの比率について、この用量の低減は、シスプラチン耐性のＬ１２１０細胞株（シスプラチンに対して４０倍の耐性を有する）においてはさらにより劇的である。すなわち、同等の抗がん作用を達成するために必要なカルボプラチンの用量は１／１７（カルボプラチン：ＤＭＣがモル比で１：１）〜１／６５（カルボプラチン：ＤＭＣがモル比で１：７）に低減される（表６）。
【００３５】
表５および６から、シスプラチン耐性のＬ１２１０におけるカルボプラチンの用量低減指数（ＤＲＩ）は、一般にシスプラチン感受性のＬ１２１０細胞株におけるＤＲＩよりも高かった。このことは、ＤＭＣをカルボプラチンと組み合わせることにより、カルボプラチンとＤＭＣとの相乗作用（図３および４）によりシスプラチン耐性を克服する可能性がある理由の説明となりうる。
【００３６】
カルボプラチンおよびデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）ならびにそれらの組合せの、７２時間曝露における、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチン感受性および耐性のＬ１２１０マウス白血病細胞株の生育阻害における用量‐効果の関係を示す。
【００３７】
【表５】
2004532260.tif 000008
【００３８】
【表６】
2004532260.tif 000009
表中、パラメータｍ、Ｄｍ、およびｒはメジアン‐効果プロットの傾き、ｘ切片の真数、および直線の相関係数であり、それぞれ用量‐効果曲線の形、有効性（ＩＣ５０）、および質量‐作用の法則に対するデータの整合性を意味する；用量‐効果の関係の実験を３セット実施し、各実験は６〜８連とした。
【００３９】
♯ＤＲＩ（用量低減指数）は、各薬剤単独の用量と比較して、ある一定程度の効果を導くために、組合せにおいて可能な用量の低減の規模の程度（倍数）を表す。全てのＤＲＩ値は、古典的なアイソボログラムの式および仮説に基づいて算出する。
【実施例３】
【００４０】
（オキサリプラチンとＤＭＣとの組合せ）
オキサリプラチンとデメチルカンタリジンまたはその加水分解物（二価酸）との、様々な比率の組合せは、シスプラチン感受性および耐性のがん細胞のいずれにおいても相乗作用を示す。例えば、相乗作用の結果として、感受性を有するＬ１２１０細胞株において、抗がん作用（オキサリプラチン単独と同等）を達成するために必要なオキサリプラチンの用量は、デメチルカンタリジンと組み合わせた場合には約１／２に低減可能である（表７）。この用量の低減は、シスプラチン耐性のＬ１２１０細胞株（シスプラチンに対して４０倍の耐性を有する）においてより大きい。すなわち、同等の抗がん作用を達成するために必要なオキサリプラチンの用量は１／４に低減可能である（表８）。
【００４１】
オキサリプラチンおよびデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）ならびにそれらの組合せの、７２時間曝露における、シスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチン感受性および耐性のＬ１２１０マウス白血病細胞株の生育阻害における用量‐効果の関係を示す。
【００４２】
【表７】
2004532260.tif 000010
【００４３】
【表８】
2004532260.tif 000011
表中、パラメータｍ、Ｄｍ、およびｒはメジアン‐効果プロットの傾き、ｘ切片の真数、および直線の相関係数であり、それぞれ用量‐効果曲線の形、有効性（ＩＣ５０）、および質量‐作用の法則に対するデータの整合性を意味する；用量‐効果の関係の実験を３セット実施し、各実験は６〜８連とした。
【００４４】
♯ＤＲＩ（用量低減指数）は、各薬剤単独の用量と比較して、ある一定程度の効果を導くために、組合せにおいて可能な用量の低減の規模の程度（倍数）を表す。全てのＤＲＩ値は、古典的なアイソボログラムの式および仮説に基づいて算出する。
【実施例４】
【００４５】
（ＤＭＣ‐Ｐｔ複合体１とＤＭＣとの組合せ）
複合体１とデメチルカンタリジンまたはその加水分解物（二価酸）との、様々な比率の組合せは、シスプラチン感受性および耐性のがん細胞のいずれにおいても相乗作用を示す。例えば、相乗作用の結果として、感受性を有するＬ１２１０細胞株において、抗がん作用（複合体１単独と同等）を達成するために必要な複合体１の用量は、デメチルカンタリジンと組み合わせた場合には１／３〜１／５に低減可能である（表９）。同程度の複合体１とＤＭＣとの比率について、この用量の低減は、シスプラチン耐性のＬ１２１０細胞株（シスプラチンに対して４０倍の耐性を有する）においてはさらにより劇的である。すなわち、同等の抗がん作用を達成するために必要な複合体１の用量は１／４（複合体１：ＤＭＣがモル比で１：１）〜１／１７（複合体１：ＤＭＣがモル比で１：５）に低減される（表１０）。
【００４６】
表９および１０から、シスプラチン耐性のＬ１２１０における複合体１の用量低減指数（ＤＲＩ）は、一般にシスプラチン感受性のＬ１２１０細胞株におけるＤＲＩよりも高かった。このことは、ＤＭＣを複合体１と組み合わせることにより、複合体１とＤＭＣとの相乗作用（図７および８）によりシスプラチン耐性を克服する可能性がある理由の説明となりうる。
【００４７】
複合体１およびデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）ならびにそれらの組合せの、７２時間曝露における、シスプラチン感受性および耐性のＬ１２１０マウス白血病細胞株の生育阻害における用量‐効果の関係を示す。
【００４８】
【表９】
2004532260.tif 000012
【００４９】
【表１０】
2004532260.tif 000013
表中、パラメータｍ、Ｄｍ、およびｒはメジアン‐効果プロットの傾き、ｘ切片の真数、および直線の相関係数であり、それぞれ用量‐効果曲線の形、有効性（ＩＣ５０）、および質量‐作用の法則に対するデータの整合性を意味する；ｎは、実施した用量‐効果の関係の実験セットの数である。
【００５０】
♯ＤＲＩ（用量低減指数）は、各薬剤単独の用量と比較して、ある一定程度の効果を導くために、組合せにおいて可能な用量の低減の規模の程度（倍数）を表す。全てのＤＲＩ値は、古典的なアイソボログラムの式および仮説に基づいて算出する。
【実施例５】
【００５１】
（ＤＭＣ‐Ｐｔ複合体５とＤＭＣとの組合せ）
複合体５とデメチルカンタリジンまたはその加水分解物（二価酸）との、様々な比率の組合せは、シスプラチン感受性および耐性のがん細胞のいずれにおいてもわずかに弱い相乗作用を示す（図９および１０）。
【００５２】
表１１および１２から、シスプラチン耐性のＬ１２１０における複合体１の用量低減指数（ＤＲＩ）は、シスプラチン感受性のＬ１２１０細胞株におけるＤＲＩとほぼ同じであった。ＤＭＣの割合が高い場合でさえ、複合体５のＤＲＩは低いままであり、シスプラチン（実施例１）およびカルボプラチン（実施例２）について得られた結果とは異なることが観察されている。このことは、複合体５単独でがん細胞のシスプラチン誘導による耐性を克服可能であり、複合体５単独で有効性の高い抗がん剤であることを意味している。
【００５３】
複合体５およびデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）ならびにそれらの組合せの、７２時間曝露における、シスプラチン感受性および耐性のＬ１２１０マウス白血病細胞株の生育阻害における用量‐効果の関係を示す。
【００５４】
【表１１】
2004532260.tif 000014
【００５５】
【表１２】
2004532260.tif 000015
表中、パラメータｍ、Ｄｍ、およびｒはメジアン‐効果プロットの傾き、ｘ切片の真数、および直線の相関係数であり、それぞれ用量‐効果曲線の形、有効性（ＩＣ５０）、および質量‐作用の法則に対するデータの整合性を意味する；ｎは、実施した用量‐効果の関係の実験セットの数である。
【００５６】
♯ＤＲＩ（用量低減指数）は、各薬剤単独の用量と比較して、ある一定程度の効果を導くために、組合せにおいて可能な用量の低減の規模の程度（倍数）を表す。全てのＤＲＩ値は、古典的なアイソボログラムの式および仮説に基づいて算出する。
（Ｐｔ含有抗がん剤のシスプラチンに対する交差耐性のまとめ）
【００５７】
【表１３】
2004532260.tif 000016
表中、パラメータｍ、Ｄｍ、およびｒはメジアン‐効果プロットの傾き、ｘ切片の真数、および直線の相関係数であり、それぞれ用量‐効果曲線の形、有効性（ＩＣ５０）、および質量‐作用の法則に対するデータの整合性を意味する；用量‐効果の関係の実験を３セット実施し、各実験は６〜８連とした。
【００５８】
表中のパラメータは、メジアン‐効果プロットを用いてｆａ＝５０％において評価した。
後天的に耐性を得た細胞株はシスプラチンに対して約４０倍の耐性を有し、カルボプラチンに対して約１５倍の交差耐性を有する。オキサリプラチンおよび複合体１も異なる程度の交差耐性を示す。しかしながら、複合体５およびデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）の示す交差耐性はごくわずかである。
（Ｐｔ含有抗がん剤の用量低減指数（ＤＲＩ）のまとめ）
【００５９】
【表１４】
2004532260.tif 000017
表中、パラメータｍ、Ｄｍ、およびｒはメジアン‐効果プロットの傾き、ｘ切片の真数、および直線の相関係数であり、それぞれ用量‐効果曲線の形、有効性（ＩＣ５０）、および質量‐作用の法則に対するデータの整合性を意味する；用量‐効果の関係の実験を３セット実施し、各実験は６〜８連とした。
【００６０】
表中のパラメータは、メジアン‐効果プロットを用いてｆａ＝５０％において評価した。
シスプラチンに対して交差耐性を示す化合物（シスプラチン（４０倍）、カルボプラチン（１５倍）、複合体１（８倍））については、シスプラチン耐性の細胞株におけるＣＩは一般に親細胞株におけるＣＩよりも低く、シスプラチン耐性の細胞株におけるＤＲＩは一般に親細胞株におけるＤＲＩよりも高い。これらのデータから、ＤＭＣが耐性のメカニズムを選択的に標的としていることが示唆される。
（実験の詳細）
（ＤＭＣ加水分解物の調製）
ＤＭＣ１相当を２相当の１Ｍ水酸化ナトリウムに溶解させた。得られた溶液を真空中（ｉｎ  ｖａｃｕｏ）で乾燥させた。生成した白色の固体についてＦＴ‐ＩＲおよびＮＭＲにより特性を解析した。
（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗がん剤スクリーニング）
試験用複合体１‐５、ＤＭＣ、ＤＭＣ加水分解物、カンタリジンについて、対照のシスプラチンおよびカルボプラチンとともに、テトラゾリウム微小培養アッセイを用いて一連のヒトがん細胞株およびマウス白血病Ｌ１２１０に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗がん活性についてスクリーニングした。
【００６１】
（薬剤）
被験薬剤を、使用する最高濃度の２倍の濃度で完全培地に溶解した後、フィルター（０．２２μｍ）で滅菌した。完全培地を用いて、各薬剤溶液の対数希釈系列を作製した。全ての薬剤溶液を、細胞に添加する前１０分以内に調製した。
【００６２】
（細胞）
ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１（ヒト乳がん）、ＳＫ‐ＯＶ‐３（ヒト卵巣がん）、ＳＫ‐Ｈｅｐ‐１（ヒト肝臓がん）、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ（ヒト大腸がん）、Ｌ１２１０（マウス白血病）、ＮＣＩ：Ｈ４６０（ヒト肺がん）およびＮＴＥＲＡ‐Ｓｃｌ‐Ｄ１（ヒト精巣がん）を米国細胞バンク（ＡＴＣＣ）より入手した。
【００６３】
（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける薬剤への曝露）
トリプシン処理した細胞を完全培地中で２×１０５個／ｍｌの濃度に調整し、各被験薬剤につき、該細胞懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレートの２４ウェルに０．１ｍｌずつ添加した。次いで、細胞をウェルの底に付着させて対数増殖状態に回復させるために、プレートを標準的条件で２４時間インキュベートした。対照の培養用および薬剤／濃度の組合せ用の各ウェルに、それぞれ０．１ｍｌの完全培地および薬剤溶液を添加した。各々の薬剤／濃度の組合せは４連とし、対照培養物は１２連とした。０．２ｍｌの完全培地を含む１２連のブランクを、バックグラウンドとするために用意した。培養物をさらに７２時間インキュベートした。全ての実験を、別々の時に少なくとも３回繰り返した。
【００６４】
（ＭＴＴアッセイ）
ＭＴＴ（テトラゾリウム）アッセイを用いて種々の薬剤の生育阻害効果を測定した。ＭＴＴ（３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）の５ｍｇ／ｍｌ溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に調製し、フィルター（０．２２μｍ）で滅菌して−２０℃で保存した。各ウェルに０．０２ｍｌのＭＴＴ溶液を添加し、プレートを標準的な条件で４時間インキュベートした。次いで各ウェルから培地を取り除き、０．１ｍｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を各ウェルに添加してＭＴＴの代謝による還元から生成した色素を可溶化した。還元されたＭＴＴの量を、分光光学的手段（５７０ｎｍ）により測定した。
【００６５】
（データ解析）
対照の１２ウェルの平均ＯＤ値を測定した。各薬剤の各々の濃度について、４ウェルの平均ＯＤ値を測定した。バックグラウンドを考慮し、全ての平均ＯＤ値からブランクを差し引いた。「対照に対する比率（％）」の値を決定しプロットした。５０％生育阻害をもたらす濃度（ＩＣ５０）を、ソフトウェアＰｒｉｓｍ３．０を用いてグラフをＳ字状の用量‐反応曲線にフィッティングすることにより測定した。
（Ｌ１２１０マウス白血病細胞におけるシスプラチン耐性の誘導）
シスプラチン耐性のＬ１２１０白血病細胞株は、Ｌ１２１０／０細胞を１年にわたり薬物濃度を段階的に増大させて曝露することにより作製した（表１４）。
（プラチナ含有抗がん剤とデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）またはその加水分解物、二価酸との組合せにおける相乗作用）
プラチナ化合物を、単独およびデメチルカンタリジン（ＤＭＣ）と組み合わせて細胞毒性効果について評価した。化合物の細胞毒性は、上述のようにＭＴＴアッセイにより測定した。チョウ（Ｃｈｏｕ）およびタラレー（Ｔａｌａｌａｙ）のメジアン‐効果の原理（ｍｅｄｉａｎ‐ｅｆｆｅｃｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）および組合せ指数（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ‐ｉｎｄｅｘ）のアイソボログラムの方法を用いて、シスプラチン、ＤＭＣ、またはそれらの様々な組合せ比率の混合物について用量‐効果のパラメータを測定した。細胞毒性アッセイにおける用量‐効果の関係を導くため、各薬物または混合物を３倍希釈系列とした。
【００６６】
相乗作用の評価の詳細は以下のとおりである：
シスプラチンおよびＤＭＣの組合せについて、チョウ（Ｃｈｏｕ）およびタラレー（Ｔａｌａｌａｙ）の参照文献１‐４のメジアン‐効果プロットおよび組合せ指数のアイソボログラムの方法を用いて、相乗作用、相加作用、または拮抗作用について評価した。
【００６７】
この方法は、メジアン‐効果の式（３，６）を用いて、多段階希釈した各薬剤およびそれらの組合せについて用量‐効果曲線をプロットすることを含む。
ｆａ／ｆｕ＝（Ｄ／Ｄｍ）ｍ
（式中、ｆａは作用を受けた細胞の割合（すなわち死滅した細胞の割合）、ｆｕは作用を受けなかった細胞の割合（すなわち生き残った細胞の割合；ｆａ＝１−ｆｕ）、Ｄは薬剤の用量、およびＤｍはメジアン効果を引き起こす用量である）。
【００６８】
パラメータｍ、Ｄｍ、およびｒは、メジアン‐効果プロットの傾き、ｘ切片の真数、および直線の相関係数であり、それぞれ用量‐効果曲線の形、有効性（ＩＣ５０）、および質量‐作用の法則に対するデータの整合性を意味する（参照文献３、５および６）。Ｄｍ値およびｍ値を用いて組合せ指数（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ；ＣＩ）の値を算出する。
【００６９】
ＣＩ＜１、ＣＩ＝１、およびＣＩ＞１はそれぞれ相乗作用、相加作用、および拮抗作用を表す。古典的なアイソボログラムの式に基づき、ＣＩを方程式により算出することができる。すなわち、
CI=[(D)1/(DX)1]+[(D)2/(DX)2]+[α(D)1(D)2]/[(DX)1/(DX)2]
（式中、(D)1は薬剤１の用量、
(D)2は薬剤２の用量、および
(DX)はメジアン効果を生じるのに必要な用量(=Dm[fa/(1-fa)]1/m) であり、
α＝０の場合は薬剤が相互に独立な、α＝１の場合は薬剤が相互に独立でない作用メカニズムを有する。）
チョウ（Ｃｈｏｕ）およびタラレー（Ｔａｌａｌａｙ）により定義された（参照文献７）、相互に独立でない、および独立な薬剤相互作用のいずれも評価される。２つの仮定条件についてのデータ間に実質的な違いはなかったので、提示のデータは相互に独立とする仮定条件のみについて得られたものである。
【００７０】
擬陽性の結果を排除するため、古典的なアイソボログラム曲線のトレースにより妥当な部分的細胞毒性（ｆａ＝５０％）における相乗作用を確認した。
【００７１】
【表１５】
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（用量低減指数）
「用量低減指数（ｄｏｓｅ‐ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）」すなわちＤＲＩという用語は１９８８年に初めて発表され（チョウ  ジェイ．およびチョウ  ティ．‐シー．（Chou J.and Chou T.-C. ）、相乗作用を有する薬剤の組合せにおける用量低減指数（ＤＲＩ）のコンピュータ・シミュレーション（Computerized simulation of dose reduction index (DRI) in synergistic drug combinations. ）、Pharmacologist、１９８８年、第３０巻、要旨Ａ２３１）、１９８９年にコンピュータによる自動解析に用いられた（バーマン  イー．，デュゴウ‐オスタンドルフ  アール．，クラウン  エス．イー．，ファヌッキ  エム．ピー．，チョウ  ジェイ．，ヒルシュ  エム．エス．，クラークソン  ビー．ディー．，チョウ  ティ．‐シー．（Berman E., Duigou-Osterndorf R., Krown S.E., Fanucchi M.P., Chou J., Hirsch M.S., Clarkson B.D., Chou T.-C. ）アジドチミジンおよび組換えインターフェロンαの正常ヒト骨髄前駆細胞に対する相乗的細胞毒性作用（Synergistic cytotoxic effect of azidothymidine and recombinant interferon alpha on normal human bone marrow progenitor cells）、Blood 、１９８９年、第７４巻、１２８１〜６ページ）。ＤＲＩは、ある一定の効果（すなわち阻害率（％））およびある一定の組合せ比率の、相乗作用を有する組合せにおいて、用量が何倍低減されうるかを表す。
CI=(D)1/(DX)1+(D)2/(DX)2=1/(DRI)1+1/(DRI)2
（式中、(D)1は組合せにおける薬剤１の用量、
(D)2は組合せにおける薬剤２の用量、および
(DX)はメジアン効果を生じるのに必要な（単独の薬剤の）用量(=Dm[fa/(1-fa)]1/m) である。）
従って、例えば感受性を有するＬ１２１０においてシスプラチン：ＤＭＣが１：１．４９のときは、
【００７２】
【数１】
2004532260.tif 000019
であり、シスプラチン耐性のＬ１２１０においてシスプラチン：ＤＭＣが１：１．６７のときは、
【００７３】
【数２】
2004532260.tif 000020
である。
シスプラチンについてのＤＲＩは耐性の細胞株において感受性の親細胞株よりも約５．５倍高い。このことは、ＤＭＣとシスプラチンとの組合せがシスプラチン耐性を克服する可能性がある理由を説明するものかもしれない。
【００７４】
（Ｆａ‐ＣＩプロット）
段階的に希釈された（すなわち阻害曲線全体にわたる）混合物中の様々な効果レベルにおける２つの薬剤の相乗作用又は拮抗作用を示すために、ｆａ‐ＣＩプロット（図１１）を構築することも可能である。数種の混合物を作製すれば、プロットから最大の相乗作用をもたらす最適な組合せ比率を推定することが可能である。異なる効果レベルでは一般に相乗作用または拮抗作用の程度が異なる。ＣＩ＜１、＝１、＞１は、それぞれ相乗作用、相加作用、および拮抗作用を表す。がんに対する化学療法については、高い効果レベルにおける相乗作用は、低い効果レベルにおける相乗作用よりも臨床的により意味のあることである。
【００７５】
本発明を上記に説明してきたが、前述の発明を実施するための最良の形態の記載を基にした本発明の変更形態および修正形態は当業者には自明のことである。これらの変更形態、修正形態およびそれらの同等物のすべては特許請求の範囲の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】感受性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、シスプラチン＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図２】シスプラチン耐性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、シスプラチン＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図３】感受性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、カルボプラチン＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図４】シスプラチン耐性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、カルボプラチン＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図５】感受性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、オキサリプラチン＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図６】シスプラチン耐性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、オキサリプラチン＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図７】感受性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、複合体１＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図８】シスプラチン耐性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、複合体１＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図９】感受性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、複合体５＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図１０】シスプラチン耐性Ｌ１２１０マウス白血病細胞における、複合体５＋ＤＭＣのアイソボログラムを示す図。
【図１１】シスプラチン耐性Ｌ１２１０におけるシスプラチンとＤＭＣとの組合せ（１：４．５）についてのＦａ‐ＣＩプロットを示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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