(57)【要約】Ｇ蛋白共役受容体（ＧＰＣＲ）活性の検出法、ＧＰＣＲ活性のアッセイ法、ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング法、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）活性、ＧＰＣＲ制御過程の成分と相互作用する化合物について説明している。リガンドの探索、アゴニストあるいはアンタゴニストのスクリーニングへの応用とともに、ＧＰＣＲ活性をアッセイするＩＣＡＳＴ技術を拡張する方法も含まれる。こうした方法には、活性型ＧＰＣＲに対するアレスチンの親和性を高める、あるいは活性型ＧＰＣＲとアレスチンの結合時間を長くするため、既知あるいはオーファンＧＰＣＲのオープン・リーディング・フレームへのセロトニン／トレオニンリン酸化部位を設計すること、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼは制限的であり得るが、このキナーゼがない状態で活性型ＧＰＣＲに結合した変異型アレスチンタンパク質を設計すること、リン酸化されているかに関わらず、活性型ＧＰＣＲの親和性を高めた変異型スーパーアレスチンタンパク質を設計することが含まれる。こうした方法の目的は、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼが存在しないか制限されている状態、あるいはＧＰＣＲが効果的にダウンレギュレートされていないか、再感作されている（従って、アレスチンと不安定な相互作用をしている）状態で、ＧＰＣＲ／ＩＣＡＳＴ技術の信頼性を高めることである。薬物リード化合物の発見、オーファンＧＰＣＲのリガンドおよび機能の発見への応用とともに、相補的なＩＣＡＳＴ酵素フラグメントを利用し、ＧＰＣＲホモ、ヘテロダイマー形成をモニターするための特異的な方法も含まれる。
2004504805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）経路活性における検査条件の効果の査定方法であって、
ａ） レポーター酵素の１つの変異体への融合タンパク質としてＧＰＣＲを、また、別の酵素変異体への融合として相互作用するタンパク質パートナーを発現する細胞を提供し、
ここで前記細胞は、前記ＧＰＣＲへのアレスチンの結合を強化させるべく改変されたアレスチンを発現しており、前記アレスチンと前記ＧＰＣＲ間の結合強化が、前記検査条件の前記効果の検知感度を増加させる、
ｂ） 前記検査条件の下で前記ＧＰＣＲのリガンドに対し細胞を提示し、および
ｃ） 前記レポーター酵素の相補により、前記ＧＰＣＲの活性を監視することを含み、
前記検査条件が不在の場合と比較して細胞内のレポーター酵素活性が増加することは、相互作用するタンパク質パートナーとのＧＰＣＲの相互作用が、前記検査条件不在の場合と比較して増加することを示し、また、前記検査条件が不在の場合の発生と比べ細胞内のレポーター酵素活性が減少することが、相互作用するタンパク質パートナーとのＧＰＣＲの相互作用が前記検査条件が不在の場合と比べて減少することを示すものである方法。
【請求項２】
Ｇタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）経路活性における検査条件の効果の査定方法であって、
ａ） レポーター酵素の１つの変異体への融合タンパク質としてＧＰＣＲを、また、別の酵素変異体への融合として相互作用するタンパク質パートナーを発現する細胞を提供し、
ここで前記ＧＰＣＲ融合タンパク質が１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターを含むべく改変され、前記１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターが前記ＧＰＣＲのアレスチンへの結合を強化させ、前記ＧＰＣＲと前記アレスチン間で強化された前記結合が前記検査条件の前記効果の検知感度を増加させる、ｂ） 前記検査条件の下で前記ＧＰＣＲのリガンドに対し細胞を暴露し、および
ｃ） 前記レポーター酵素の相補により、前記ＧＰＣＲの活性を監視することを含み、
前記検査条件が不在の場合と比較して細胞内のレポーター酵素活性が増加することは、相互作用するタンパク質パートナーとのＧＰＣＲの相互作用が、前記検査条件不在の場合と比較して増加することを示し、また、前記検査条件が不在の場合の発生と比べ細胞内のレポーター酵素活性が減少することが、相互作用するタンパク質パートナーとのＧＰＣＲの相互作用が前記検査条件が不在の場合と比べて減少することを示すものである方法。
【請求項３】
生物的に活性のハイブリッドＧＰＣＲをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、前記ハイブリッドＧＰＣＲがレポーター酵素の１つの変異体への融合タンパク質としてのＧＰＣＲを構成し、前記ハイブリッドＧＰＣＲが前記１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターを含むよう改変されており、前記１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターが前記ハイブリッドＧＰＣＲのアレスチンへの結合を強化させる、ＤＮＡ分子。
【請求項４】
細胞内へ生物的活性ハイブリッドＧＰＣＲの発現を導き得、以下の操作的にリンクした要素：
プロモーター、および
生物的に活性なハイブリッドＧＰＣＲをコードする配列を含むＤＮＡ分子、を含み、前記ハイブリッドＧＰＣＲがレポーター酵素の１つの変異体への融合タンパク質としてのＧＰＣＲを構成し、前記ハイブリッドＧＰＣＲが前記１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターを含むよう改変されており、前記１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターが前記ハイブリッドＧＰＣＲのアレスチンへの結合を強化させるものであるＤＮＡ構築物。
【請求項５】
細胞内へ生物的活性ハイブリッドＧＰＣＲの発現を導き得るＤＮＡ構築物であって、以下の操作的にリンクした要素：
プロモーター、および、
生物的に活性なハイブリッドＧＰＣＲをコードする配列を含むＤＮＡ分子、を含み、前記ハイブリッドＧＰＣＲがレポーター酵素の１つの変異体への融合タンパク質としてのＧＰＣＲを構成し、前記ハイブリッドＧＰＣＲが前記１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターを含むよう改変されており、前記１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターが前記ハイブリッドＧＰＣＲのアレスチンへの結合を強化させるものであるＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞。
【請求項６】
生物的に活性なハイブリッドアレスチンをコードする配列を含み、前記ハイブリッドアレスチンがレポーター酵素の１の変異体への融合タンパク質としてのアレスチンを構成し、前記ハイブリッドアレスチンがＧＰＣＲへの前記アレスチンの結合を強化するよう改変されているＤＮＡ分子。
【請求項７】
細胞内に生物的に活性なハイブリッドアレスチンの発現を導くことができ、以下の操作的にリンクした要素：
プロモーター、および
生物的に活性なハイブリッドアレスチンをコードする配列を含むＤＮＡ分子、を含み、前記ハイブリッドアレスチンがレポーター酵素の１の変異体への融合タンパク質としてのアレスチンを構成し、前記ハイブリッドアレスチンがＧＰＣＲへの前記アレスチンの結合を強化させるよう改変されている、ＤＮＡ構築物。
【請求項８】
細胞内へ生物的に活性なハイブリッドアレスチンの発現を導くことができ、以下の操作的にリンクした要素：
プロモーター、および
生物的に活性なハイブリッドアレスチンをコードする配列を含むＤＮＡ分子、を含み、前記ハイブリッドアレスチンがレポーター酵素の１つの変異体への融合タンパク質としてのアレスチンを構成し、前記ハイブリッドアレスチンがＧＰＣＲへの前記アレスチンの結合を強化させるよう改変されているＤＮＡ構築物により形質転換された細胞。
【請求項９】
Ｇタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）経路活性における検査条件の効果の査定方法であって、
ａ） レポーター酵素の１の変異体への融合タンパク質としてＧＰＣＲを、また、別の酵素変異体への融合として相互作用するタンパク質パートナーを発現させる細胞を提供し、
ここで前記細胞はアレスチンをもまた発現し、前記アレスチンがリン酸化認識領域内のポイントミューテーションを誘導することによって、ＧＰＣＲがアレスチンへ結合する際にＧＰＣＲのリン酸化必要であるという条件を取り除き、ＧＰＣＲがリン酸化されているか否かに関わらず細胞内のＧＰＣＲへのアレスチンの結合を可能にしている、
ｂ） 前記検査条件の下で前記ＧＰＣＲのリガンドに対し細胞を暴露し、および
ｃ） 前記レポーター酵素の相補により、前記ＧＰＣＲの活性を監視することを含み、
前記検査条件が不在の場合と比較して細胞内のレポーター酵素活性が増加することは、相互作用するタンパク質パートナーとのＧＰＣＲの相互作用が、前記検査条件不在の場合と比較して増加することを示し、また、前記検査条件が不在の場合の発生と比べ細胞内のレポーター酵素活性が減少することが、相互作用するタンパク質パートナーとのＧＰＣＲの相互作用が前記検査条件が不在の場合と比べて減少することを示すものである方法。
【請求項１０】
前記アレスチンが、活性化された非リン酸化ＧＰＣＲの結合親和性および結合活性からなる群より選択される特性を増強するものである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記アレスチンがβアレスチン２であり、βアレスチン２がＡｒｇ１６９を逆の電荷を有する残基に変換されるよう変異されている、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
逆の電荷を有する残基が、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、スレオニンにより成る群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記アレスチンが活性化かつリン酸化されたＧＰＣＲの結合親和性および結合活性からなる群から選択される特性を増強する、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
Ｇタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）経路活性における検査条件の効果の査定方法であって、
ａ） レポーター酵素の１つの変異体への融合タンパク質としてＧＰＣＲを、また、別の酵素変異体への融合として相互作用するタンパク質パートナーを発現させる細胞を提供し、
ここで、前記ＧＰＣＲ融合タンパク質が１つあるいは複数のセリン／スレオニンクラスターを含むべく改変され、セリン／スレオニン残基として定義される前記１つあるいは複数のセリン／スレオニンクラスターが前記ＧＰＣＲのカルボキシル末端内の３つの連続する、あるいは、４つのうち３つの部位を占め、前記１または複数セットのセリン／スレオニンクラスターが前記ＧＰＣＲのアレスチンへの結合を強化させ、前記ＧＰＣＲと前記アレスチン間で強化された前記結合が前記検査条件の前記効果の検知感度を増加させるものである、
ｂ） 前記検査条件の下で前記ＧＰＣＲのリガンドに対し細胞を提示し、および
ｃ） 前記レポーター酵素の相補により、前記ＧＰＣＲの活性を監視することを含み、
前記検査条件が不在の場合と比較して細胞内のレポーター酵素活性が増加することは、相互作用するタンパク質パートナーとのＧＰＣＲの相互作用が、前記検査条件不在の場合と比較して増加することを示し、また、前記検査条件が不在の場合の発生と比べ細胞内のレポーター酵素活性が減少することが、相互作用するタンパク質パートナーとのＧＰＣＲの相互作用が前記検査条件が不在の場合と比べて減少することを示すものである方法。
【請求項１５】
改変された前記アレスチンが活性化／リン酸化されたＧＰＣＲへの結合強化を誘導するものである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
改変された前記アレスチンが、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、スレオニンにより成るグループから選択されるアミノ酸へのＡｒｇ１６９の変換を含む、請求項１４記載の方法
【請求項１７】
改変された前記アレスチンがＶＡＬ１７０のアラニンへの変換を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記アレスチンがβアレスチン１およびβアレスチン２から成る群から選択され、前記βアレスチン１または前記βアレスチン２がカルボキシル末端の全てまたは一部において前記βアレスチン１または前記βアレスチン２の半分に切形されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記βアレスチン１または前記βアレスチン２が前記βアレスチン１または前記βアレスチン２のアミノ酸１９０から前記βアレスチン１または前記βアレスチン２のカルボキシル末端まで切形されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記アレスチンがβアレスチン１、βアレスチン２および／または視覚系（ｖｉｓｕａｌ）アレスチンのキメラである、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
前記アレスチンがβアレスチン１、βアレスチン２および／または視覚系アレスチンのキメラである、請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
前記アレスチンがβアレスチン１、βアレスチン２および／または視覚系アレスチンのキメラである、請求項１１記載の方法。
【請求項２３】
前記アレスチンがβアレスチン１、βアレスチン２および／または視覚系アレスチンのキメラである、請求項１２記載の方法。
【請求項２４】
前記アレスチンがβアレスチン１であり、前記βアレスチン２がＡｒｇ１７０を逆の電荷を有する残基と変換するよう変異されている、請求項１０記載の方法。
【請求項２５】
改変された前記アレスチンが、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、スレオニンにより成るグループから選択されるアミノ酸へのＡｒｇ１７０の変換を含む、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年２月７日に出願された米国仮出願番号第６０／１８０，６６９号から利益を請求する、２０００年９月１日に出願された米国出願番号第０９／６５４，４９９号の一部継続である。前述の特許出願の全開示は引用により本明細書に編入する。
【０００２】
発明の分野
本発明はＧタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性を検知する手段に関連し、ＧＰＣＲ活性のアッセイ法、ＧＰＣＲリガンド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストのスクリーニング法、オーファンＧＰＣＲの自然なリガンドおよび代理リガンドのスクリーニング法、ＧＰＣＲ制御過程の化合物と相互に作用する化合物のスクリーニング法を提供する。
【０００３】
発明の背景
細胞外の多くのシグナル活動はＧタンパク質−共役受容体（ＧＰＣＲ）とグアニンヌクレオチド−結合制御タンパク質（Ｇタンパク質）の相互作用により仲介される。Ｇタンパク質−仲介信号系は哺乳類や酵母など、多くの多細胞生物において確認されている。ＧＰＣＲは分岐アミノ酸鎖を有するタンパク質の大きなスーパーファミリーであるが、共通の構造的特徴、特に７つの膜貫通領域（蛇皮状）の存在を共有する。ＧＰＣＲは細胞外シグナル（神経伝達物質、ホルモン、臭気、光、その他）に応答する。個々のＧＰＣＲタイプは特定のシグナル伝達経路を活性化、少なくとも１０個の異なる信号伝達経路がＧＰＣＲにより活性化されることが知られている。例えばβ２アドレナリン受容体（β２ＡＲ）は、原型哺乳ＧＰＣＲである。β２ＡＲ受容体はアゴニスト結合に応答して、Ｇタンパク質（Ｇｓ）を活性化し、それが呼応してアデニレートシクラーゼ活性を刺激し、細胞内に環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）を増加生成せしめる。
【０００４】
ＧＰＣＲの刺激によって生じたシグナル経路と最終的な細胞応答は、特定の受容体の結合対象であるＧタンパク質の特定クラスによる。（「Ｇタンパク質シグナルの多くの顔（Ｔｈｅ Ｍａｎｙ Ｆａｃｅｓ ｏｆ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）」、ハム著、ジェイ・バイオル・ケム（Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）誌１９９８年２７３：６６９−６７２を参照のこと）
【０００５】
例えば、Ｇタンパク質のＧｓクラスとの結合は、ｃＡＭＰの産生と、タンパク質キナーゼＡおよびＣ経路の活性化を誘発し、そこにおけるＧタンパク質のＧｉクラスとの結合がｃＡＭＰを抑制する。カルシウム、ホスホリパーゼＣ、ホスファチジルイノシトール３などのほかのセカンドメッセンジャーの利用も可能である。ゆえに、ＧＰＣＲシグナルイベントは、これらのセカンドメッセンジャープロダクトの定量化により大部分測定されることとなる。
【０００６】
持続的刺激に対する応答の減少は、よく知られている生物学的現象である。多様なＧＰＣＲによるシグナルは同一の２段階のメカニズムにより中断されると信じられている。活性化された受容体は先ず、ＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）によりリン酸化される。アレスチンタンパク質は活性化およびリン酸化された受容体に結合し、その結果Ｇタンパク質の相互作用を遮断する。この過程は一般的に「脱感作（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれ、機能的に多様なＧＰＣＲを表すひとつの一般的メカニズムである。アレスチンはまた、異なるＧＰＣＲの間でヘテロジニアスの過程である、ＧＰＣＲ内在化および脱感作の抑制における役割を果たす。（ジェイ・バイオル・ケム（Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）誌１９９９年２７４：３２２４８−３２２５７、オークリー（Ｏａｋｌｅｙ）他著を参照のこと。）内在化および再感作の過程におけるアレスチンとＧＰＣＲの間の相互作用は、特定のＧＰＣＲのカルボキシル末端内の特定の配列モティーフにより決定される。カルボキシル末端に３つのセリンまたはスレオニン残基クラスタを持つＧＰＣＲのサブセットのみが、リガンド刺激の後に飲食小胞内にアレスチンとともに共輸送することがわかっている。ＧＰＣＲの脱感作に関わる受容体キナーゼとアレスチンの数はかなり限られている。
【０００７】
ＧＰＣＲ生理学の一般的特徴は、受容体リン酸化、飲食、脱リン酸化の過程を通しての受容体の脱感作とリサイクルである。（「Ｇタンパク質−共役受容体の調節：Ｇタンパク質−共役受容体キナーゼとアレスチンの役割（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ａｒｒｅｓｔｉｎｓ）」ファーグソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）ｅｔ．ａｌ．編集、Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ誌１９９６年７４：１０９５−１１１０を参照のこと。）リガンドで占められるＧＰＣＲは、セリン／スレオニンキナーゼの２つのファミリー、Ｇタンパク質−共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）、タンパク質イドナーゼＡやタンパク質キナーゼＣなどの、セカンドメッセンジャー依存のタンパク質キナーゼによりリン酸化できる。キナーゼのいずれかのクラスによるリン酸化は、対応するＧタンパク質からの解離により受容体を抑制する作用をする。ＧＲＫ−リン酸化はまた、受容体の細胞質領域を結合し、受容体の飲食小胞へのクラスタ化を促すアレスチンと呼ばれるタンパク質の一クラスを漸増することにより受容体を抑制する役割も果たす。受容体が一度飲食されると、リソソームに分解されるか、あるいは、リン酸化され、完全機能の受容体として形質膜に再循環される。
【０００８】
アレスチンタンパク質の活性化受容体への結合は、ロドプシンからβ２ＡＲ、さらに、ニューロテンシン受容体までの様々なＧＰＣＲの一般的現象として発表されている。（「Ｇタンパク質−共役受容体活性検知のためのβアレスチン／緑色蛍光融合タンパク質（ＧＦＰ）バイオセンサー（Ａ β ａｒｒｅｓｔｉｎ／Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」バラク（Ｂａｒａｋ）ｅｔ．ａｌ．編集、ジェイ・バイオル・ケム（Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）誌１９９７年２７２：２７４９７−５００を参照のこと。）その結果、特定ＧＰＣＲとアレスチンの相互作用の監視は、ＧＰＣＲ活性測定の一般的ツールとして利用できる。同様に、単一Ｇタンパク質とＧＲＫも様々な受容体と組み合わせることができ（ハム（Ｈａｍｍ）他著（１９９８年）および「Ｇタンパク質−共役受容体キナーゼ（Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋｉｎａｓｅｓ）」、ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ）他著、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ誌１９９８年６７：６５３−９２を参照のこと）、これらタンパク質／タンパク質相互作用も受容体の活性状態を決定するために監視が可能である。
【０００９】
ＧＰＣＲは、血管拡張、心拍数、気管支拡張、内分泌、腸蠕動を含む生命生理学的応答を調節することから、今日使われている多くの治療薬がＧＰＣＲをターゲットとしている。（例としてレフコヴィッツ（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ）他著、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．誌 ５２：１５９（１９８３年）を参照のこと。）これら治療薬にはこの受容体のリガンドを模倣したものもある。その他の薬剤は、受容体の自発的活性から発生した疾患の場合、受容体を拮抗する作用を持つ。
ヒトゲノムプロジェクトなどの努力は、生理学的役割やリガンドが未知の、新たなＧＰＣＲ（オーファン受容体）を発見することである。ヒトゲノムには数千のＧＰＣＲが存在すると推定されている。
【００１０】
刺激薬に対する細胞内活動の監視には、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フロレッスンスイメージングプレートリーダー検定法（ＦＬＩＰＲｔｍ、モラキュラー・デバイシーズ社、カリフォルニア州サニーベル）、ＥＶＯｓｃｒｅｅｎ ｔｍ，ＥＶＯＴＥＣ ｔｍ，Ｅｖｏｔｅｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｇｍｂｈ（ドイツ、ハンブルグ）、また、ペンシルバニア州ピッツバーグセロミクス社のＣＥＬＬＯＭＩＣＳ ｔｍ 開発技術など、様々な試みがこれまで採用されている。
【００１１】
ジャーミノ（Ｇｅｒｍｉｎｏ）ｅｔ．ａｌ．編集「インビボタンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニング（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．誌 ９０（３）：９３３−９３７ （１９９３年）は、着目するタンパク質との相互作用を行うタンパク質の単離にインビボ法を開示している。
フィジッキー（Ｐｈｉｚｉｃｋｙ）他「タンパク質−タンパク質相互作用法：検知および解析方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ： ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．誌５９（ｌ）：９４−１２３ （１９９５年）は、タンパク質−タンパク質相互作用の研究に使われる生物化学、分子生物学、遺伝法の論評を開示している。
オファーマン他著「Ｇα１５およびＧα１６が多種の受容体をホスホリパーゼＣに結合する（Ｇα１５ ａｎｄ Ｇα１６ Ｃｏｕｐｌｅ ａ Ｗｉｄｅ Ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ）」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．誌 ２７０（２５）：１５１７５−１５１８０ （１９９５年）は、Ｇα１５ およびＧα１６が多様なＧタンパク質−共役受容体により活性化されることを開示している。活性化受容体のＧタンパク質個別模様への選択的結合は、正確なシグナルトランスダクションＩｄ の達成のための重要な必要条件と考えられている。
バラク（Ｂａｒａｋ）他著「Ｇタンパク質−共役受容体検知のためのβアレスチン／緑色蛍光融合タンパク質（ＧＦＰ）（Ａ β−ａｒｒｅｓｔｉｎ／Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．）」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．誌２７２（４４）：２７４９７−２７５００ （１９９７年）と、米国特許番号第５，８９１，６４６号および第６，１１０，６９３号は、光学機器を使ってのＧＰＣＲの刺激によるタンパク質転座の造影へのβアレスチン／緑色蛍光融合タンパク質（ＧＦＰ）の利用を開示している。
【００１２】
上記に参照された研究にはそれぞれ以下の例にような欠点がある。
・従来技術の方法では、タンパク質の過剰発現が必要であり、人為結果を招いたり、細胞調節器の均衡が崩れるなどの恐れがある。
・従来の可視化または造影アッセイ法ではスループットが低く、完全な定量化に欠く。従って、スループットの高い薬理／運動学的アッセイ法には不適である。
さらに、従来技術のアッセイ法では、ＧＰＣＲの隔離を必要とし、細胞内でのＧＰＣＲの観察ができない。そのため、ＧＰＣＲ機能の監視のためには方法を改善する必要があった。
【００１３】
発明の要約
本発明は米国出願連続番号第０９／６５４，４９９号における開示に変更を提供するものである。特に本発明は、アッセイ法の感度をさらに強化する下記の発明の側面を変更する方向付けを持つ。変更は、ＧＰＣＲがリン酸化か非リン酸化に関わらず活性化されたＧＰＣＲへの結合を強化する、遺伝的変異されたアレスチンの利用、および、独自の構造的モチーフを有しないオーファン受容体のスクリーニングアッセイを簡易化するセリン／スレオニンクラスター戦略の利用、および、さらに強化された検知を達成するための上記変更をの併用を含む。
【００１４】
本発明の最初の側面はＧＰＣＲ機能を受容体活性化の箇所で近位的に監視し、従って、より少数の競合メカニズムにより、薬剤発見目的に多くの情報を提供せしめる方法である。ＧＰＣＲの活性化は、受容体と、アレスチン、Ｇタンパク質、ＧＲＫ、または、その他のキナーゼなどの、受容体への結合が受容体のアゴニスト居住に依存する、調整化合物の相互作用の出力により測定される。本発明は、変異レポーター酵素の相補によるタンパク質−タンパク質相互作用の検知に関するものである。
活性化ＧＰＣＲへのアレスチンの結合は、これまで研究されているほとんどのＧＰＣＲで実証されている脱感作の第一段階における共通の過程である。変異酵素相補検定（ＩＣＡＳＴなど）を通してのＧＰＣＲのアレスチンとの相互作用の測定は、多様なＧＰＣＲとオーファン受容体に適用されるより一般的なアッセイ技術を提供するものである。
【００１５】
本発明のさらなる側面は、変異レポーター酵素への融合タンパク質として、例えばムスカリン、アドレナリン、ドーパミン、アンギオテンシン、エンドセリン様のＧＰＣＲを発現せしめる検査細胞を提供し、例えばＧタンパク質、アレスチン、ＧＲＫなど、相補変異レポーター酵素との融合タンパク質として、ＧＰＣＲ経路内でタンパク質を相互作用させることより、検査状況下でＧＰＣＲ経路活性化を査定する方法である。検査状況下で、検査細胞がターゲットＧＰＣＲの既知のアゴニストに提示されると、ＧＰＣＲの活性化がレポーター酵素の相補により監視される。増加したレポーター酵素活性は、相互作用するそのタンパク質パートナーとの、ＧＰＣＲの相互作用を反映する。
【００１６】
本発明のさらなる側面は、検査アレスチン、例えばβアレスチンなどの存在下でＧＰＣＲ経路の活性化を査定する方法である。
本発明のさらなる側面は、検査Ｇタンパク質の存在下でＧＰＣＲ経路の活性化を査定する方法である。
本発明のさらなる側面は、検査細胞を検査リガンドに提示した状態でのＧＰＣＲ経路の活性化を査定する方法である。
本発明のさらなる側面は、セカンドレセプターの検査細胞内の共発現におけるＧＰＣＲ経路の活性化を査定する方法である。セカンドレセプターは同一ＧＰＣＲまたはオーファン受容体（ホモダイマー）、異なるＧＰＣＲまたはオーファン受容体（ヘテロダイマー）か、あるいは、別のタイプのレセプターがあり得る。
本発明のさらなる側面は、オーファンＧＰＣＲのリガンドまたはアゴニストのスクリーニング方法である。リガンドまたはアゴニストは自然または合成ライブラリまたは混合に含まれるか、あるいは、物理的刺激があり得る。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質として、オーファンＧＰＣＲを発現させ、さらに、例えば、別のβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素との融合タンパク質としてアレスチンまたはアレスチンの変異体を発現するものが提供されている。受容体活性時におけるアレスチンのオーファンＧＰＣＲとの相互作用は、相補されたレポーター酵素の酵素的活性により測られる。検査細胞は検査化合物に曝され、レポーター酵素活性の増加がリガンドまたはアゴニストの存在を示す。
【００１７】
本発明のさらなる側面は、リン酸化または活性化されたＧＰＣＲへの結合能力を知るために、着目するタンパク質、例えばアレスチンタンパク質（または、アレスチンタンパク質の変異体）をスクリーニングする法である。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質としてＧＰＣＲを発現させ、さらに、例えば、別のβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素との融合タンパク質としてアレスチン（またはアレスチンの変異体）を含むものが提供されている。受容体活性時におけるアレスチンのＧＰＣＲとの相互作用は、相補されたレポーター酵素の酵素的活性により測られる。検査細胞は周知のＧＰＣＲアゴニストに曝され、その後レポーター酵素活性が検知される。レポーター酵素活性の増加が、βアレスチン分子がリン酸化または活性化された検査細胞内のＧＰＣＲと結合され得ることを示す。
【００１８】
本発明のさらなる側面は、特定のＧＰＣＲのアゴニストのスクリーニング方法である。アゴニストは自然または合成ライブラリまたは混合に含まれるか、あるいは、物理的刺激があり得る。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質としてＧＰＣＲを、さらに、例えば、別のβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素との融合タンパク質としてアレスチンを発現するものが提供されている。受容体活性時におけるアレスチンのＧＰＣＲとの相互作用は、相補されたレポーター酵素の酵素的活性により測られる。検査細胞は検査化合物に曝され、レポーター酵素活性の増加がアゴニストの存在を示す。検査細胞は既知のＧＰＣＲ、または、既知の多種ＧＰＣＲを発現するか、または、未知の多種ＧＰＣＲをＧＰＣＲ発現することもある。このＧＰＣＲは例えば臭気ＧＰＣＲまたはβＡＲ ＧＰＣＲともなり得る。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、ＧＰＣＲアンタゴニスト活性の検査化合物のスクリーニング方法である。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質としてＧＰＣＲを、さらに、例えば、もうひとつのβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素との融合タンパク質としてアレスチンを発現するものが提供されている。受容体活性時におけるアレスチンのＧＰＣＲとの相互作用は、相補されたレポーター酵素の酵素的活性により測られる。検査細胞は検査化合物に曝され、レポーター酵素活性の増加がアゴニストの存在を示す。細胞はの検査細胞およびＧＰＣＲアゴニストに曝され、その後レポーター酵素活性が検知される。検査化合物への提示と同時、または、それに続いてアゴニストへの提示が提起されると、検査化合物への提示後のレポーター酵素活性の増加が、検査化合物がＧＰＣＲに対するアンタゴニスト活性を有していることを示す。
【００２０】
本発明のさらなる側面は、ＧＰＣＲへのアゴニスト、アンタゴニスト、リガンドの存在をみるための、試料液のスクリーニング方法である。検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素との融合タンパク質としてＧＰＣＲを発現し、さらに、例えば、もうひとつのβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーターとの融合タンパク質としてβアレスチンを含んでいる。検査細胞は試料液に提示され、レポーター酵素活性が検知される。試料液への提示の後に変化したレポーター酵素活性は、試料液が細胞内に発現したＧＰＣＲに対しアゴニスト、アンタゴニスト、または、リガンドを含んでいることを示す。
【００２１】
本発明のさらなる側面は、ＧＰＣＲの存在をみるための細胞スクリーニング方法である。この側面に従うと、変異レポーター酵素を含むアレスチン融合タンパク質、および、変異レポーター酵素を含むＧＰＣＲの下流信号融合タンパク質がＧＰＣＲ活性の見地のために採用されている。細胞本側面の変更を、ＧＰＣＲを含むこれらの細胞の細胞数多性をスクリーニングする方法として用いることもできる。本側面に従うと、レポーター酵素とともに融合タンパク質としてのβアレスチンで構成される共役を含む細胞数多性が提供され、数多細胞をＧＰＣＲアゴニストに提示し、レポーター酵素の活性化が検知される。ＧＰＣＲアゴニストへの提示後のレポーター酵素活性の増加がβアレスチンタンパク質がＧＰＣＲに結合していることを示し、その結果、細胞がＧＰＣＲアゴニストに応答するＧＰＣＲを含んでいることが示される。
【００２２】
本発明のさらなる側面は、ＧＰＣＲ仲介のシグナル経路のマッピング方法である。例えば本システムを、ｃ−ＳＲＣのβアレスチン１との、ＧＰＣＲ活性化時の相互作用を監視するために利用することも可能である。さらに本システムを、ＧＰＣＲシグナリング経路と、レセプターチロシンキナーゼやＲａｓ／Ｒａｆなどのその他経路間のクロストークに関わるタンパク質／タンパク質相互作用を監視するために利用することも可能である。本側面に従うと、検査細胞は、例えばβガラクトシダーゼ変異体など変異レポーター酵素を含むＧＰＣＲや関連タンパク質を発現し、さらに、例えば、もうひとつのβガラクトシダーゼ変異体など相補変異レポーター酵素を含む融合タンパク質としての、別の経路からのタンパク質を含むものが提供されている。レポーター酵素の増加がタンパク質／タンパク質相互作用を示す。
【００２３】
本発明の更なる側面は、アゴニストまたはアンタゴニスト刺激時の、ＧＰＣＲのホモダイマーまたはヘテロダイマーの監視方法である。ＧＰＣＲダイマーが生体活動に重要であることは多くの文献証拠で示されている。（アブダーラ（ＡｂｄＡｌｌａ）． ｅｔ ａｌ編集、「ＡＴ１受容体ヘテロダイマーが示すＧタンパク質活性強化および変容受容体金属イオン封鎖（ＡＴＩ −ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｓｈｏｗ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ．）Ｎａｔｕｒｅ誌 ４０７：９４−９８ （２０００年）； ボッカート（Ｂｏｃｋａｅｒｔ） ｅｔ ａｌ．編集「Ｇタンパク質−共役受容体の分子操作：進化成功度（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｉｎｋｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｓｕｃｃｅｓｓ．） ＥＭＢＯ Ｊ．誌 １８：１７２３−２９ （１９９９年）；ジョーダン（Ｊｏｒｄａｎ） ｅｔ ａｌ．編集「Ｇタンパク質−共役受容体ヘテロダイマーによる受容体機能の調節（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．）」 Ｎａｔｕｒｅ誌， ３９９：６９７−７００ （１９９９年） は、２つの非機能性オピオイドレセプター、ｋａｐｐａおよびｄｅｌｔａがヘテロダイマー化し、機能性レセプターを形成することを示している。ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ） ｅｔ ａｌ．編集「（Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｄ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．）」Ｂｉｏｃｈ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．誌 ２２７：２００−２０４ （１９９６年）は、ドーパミンレセプターＤ２におけるモノメリックおよびダイメリックフォームに関連する異なる薬理学的特性を示している。Ｄ２レセプターは、スピペロンの選択的ターゲットであるモノマーとして、または、ネモナプリドのターゲットであるダイマーフォームとして存在する。ハーバート（Ｈｅｒｂｅｒｔ） ｅｔ ａｌ．編集「β２アドレナリンレセプター膜貫通領域から発生するペプチドによる受容体のダイマー化および活性化の阻害（Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ β２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｏｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．）」Ｊ．Ｂ．Ｃ．誌 ２７１：１６３８４−９２ （１９９６年）は、アゴニスト刺激により、受容体の二量体状態が安定化し、そこにおいて逆拮抗薬がモノメリックフォームに有利に働くことが発見されていることを示している。実際に、同じ研究が、β２アドレナリンレセプターの第六膜貫通領域に対応するペプチドが、受容体のダイマー化と活性化を阻害したことを示している。さらに、アンガース（Ａｎｇｅｒｓ） ｅｔ ａｌ．編集「生物発光エネルギー伝達を利用した生細胞内β２アドレナリンレセプターダイマー化の検知（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ β−２ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．誌ＵＳＡ， ９７（７）−．３６８４−３６８９は、β２アドレナリンレセプターダイマー化研究のためのβ２アドレナリンレセプター融合タンパク質（ルシフェラーゼに融合したβ２アドレナリンレセプターおよび赤色よりの強化ＧＦＰに融合したβ２アドレナリンレセプター）の使用を開示している。
【００２４】
細胞性理学および薬理学的意味合いにおけるＧＰＣＲダイマー化は、本発明に従って監視が可能である。例えばβガラクトシダーゼ相補は、例えばＧＰＣＲ１ΔαやＧＰＣＲ２Δω などのβガラクトシダーゼ変異酵素のＧＰＣＲ融合タンパク質を共発現する検査細胞内で測定可能である（図２７を参照されたい）。本側面に従うと、ＧＰＣＲまたはオーファン受容体の単量体と二量体間の相互変換が変異レポーター酵素相補により測定可能である。図２７は、βガラクトシダーゼのΔα体を有する融合タンパク質（例えばＧＰＣＲ１Δα）としてＧＰＣＲまたはオーファン受容体を、また、同じＧＰＣＲまたはオーファン受容体をβガラクトシダーゼのΔω体を有する融合タンパク質（例えばＧＰＣＲ１Δω）として共発現している検査細胞を示している。ＧＰＣＲホモダイマーの形成は活性酵素の形成により反転され、これはＧａｌ−Ｓｃｒｅｅｎ（ｔｍ）アッセイ法などの酵素活性アッセイで測ることができる。同様に、２つの個別ＧＰＣＲ間か、２つのオーファン受容体間、または、１つの既知ＧＰＣＲと１つのオーファン受容体間のヘテロダイマー化を例えばＧＰＣＲ１ΔαやＧＰＣＲ２Δωなどの融合タンパク質を共発現する検査細胞内で測ることもできる。βガラクトシダーゼ活性の増加が２つの受容体がヘテロダイマーを形成できることを示している。
【００２５】
本発明の更なる側面は、アゴニストまたはアンタゴニスト治療影響下で、ＧＰＣＲの単量体および二量体相互変換を監視する方法である。検査受容体は、同じＧＰＣＲまたはオーファン受容体（ホモダイマー）間、または、２つの個別ＧＰＣＲあるいはオーファン受容体（ヘテロダイマー）間に置くことができる。化合物を使った治療後のβガラクトシダーゼ活性の増加は、その化合物が受容体の二量体に結合および／またはそれを安定化することを意味している。化合物を使った治療後のβガラクトシダーゼ活性の減少は、その化合物が受容体の単量体に結合および／またはそれを安定化することを意味している。
本発明のさらなる側面は、ＧＰＣＲアゴニストに対するＧＰＣＲの応答をみるための細胞スクリーニング方法である。細胞はＧＰＣＲ経路内の下流方向に相互作用するタンパク質パートナーを含むものが提供される。タンパク質パートナーは、酵素を相補しながら変異体との融合タンパク質として発現され、ＧＰＣＲ活性監視に使われる。検査細胞はＧＰＣＲアゴニストに提示され、その後レポーター酵素の酵素的活性が検知される。レポーター酵素活性の増加は、細胞がアゴニストに応答するＧＰＣＲを含んでいることを示す。
【００２６】
本発明は、ＧＰＣＲシグナリング内のタンパク質／タンパク質相互作用を監視するための独自開発技術（ＩＣＡＳＴ（ｔｍ）、Ｉｎｔｅｒｃｉｓｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇａｌ−Ｓｃｒｅｅｎ（ｔｍ）等）の併用に関連する。米国出願番号第０９／６５４，４９９号で開示されているごとく、本発明の方法は、結果的に２つの非活性化βガラクトシダーゼ変異体（それぞれがＧＰＣＲやアレスチンなどの２つの相互作用ターゲットタンパク質ペアの１つに融合）の利用に関与するＩＣＡＳＴ（ｔｍ）の使用と一部関連している。活性化βガラクトシダーゼ群の形成は、ターゲットタンパク質の相互作用により促される。本システムでは、βガラクトシダーゼ活性化は例えば、直接細胞溶解とβガラクトシダーゼレポーター酵素の高速超高感度化学発光法検知とを組み合わせるＧａｌＳｃｒｅｅｎ（ｔｍ）アッセイシステム等を使って検知できる。このシステムは、ＧＰＣＲ活性の出力として照度計内の測定に例えばＧａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（ｒ） ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ を使っている。
【００２７】
図２３は、本発明の方法に相補技術を利用した例を表す概略図である。図２３は、アレスチン分子と活性化ＧＰＣＲまたはオーファン受容体の融合パートナー間で、特定の相互作用により強制的に結合された際に活性化する、２つの非活性βガラクトシダーゼ変異体を示している。このアッセイ技術は、オーファン受容体を釣り餌としてリガンドを同定する（「脱オーファン」と呼ばれるプロセス）ハイスループットスクリーニングアッセイに有効である。図２８で示されている通り、オーファン受容体のβガラクトシダーゼ融合タンパク質（例としてＧＰＣＲｏｒｐｈａｎΔα）はβアレスチンの融合タンパク質（例としてβ−ＡｒｒΔｗ）を伴う検査細胞内に共発現される。検査細胞の被験が天然または合成化合物に対して行われる場合は、βガラクトシダーゼ活性の増加は、化合物がこのＧＰＣＲの自然の、または、代理のリガンドであることを意味する。同じアッセイシステムは新規ＧＰＣＲの薬剤リード発見に使うことも可能である。治療後の検査細胞内におけるβガラクトシダーゼ活性の増加は、化合物のアゴニスト作用を示している。治療後の検査細胞内におけるβガラクトシダーゼ活性の減少は、化合物のアンタゴニスト作用または逆アゴニスト作用を示している。さらに、本発明の方法は、Ｇタンパク質、ＧＲＫ、プロトオンコジーンｃ−Ｓｒｃなどのその他下流シグナリング化合物を介したＧＰＣＲ仲介シグナリング経路の監視にも使うことが可能である。
【００２８】
本発明は、シグナリング経路のマッピングにＩＣＡＳＴ（ｔｍ） タンパク質／タンパク質相互作用スクリーニングを使用して、一部達成されている。本技術は多様な機能を備える、多様な既知／未知のＧＰＣＲに適用可能である。それらは下記を含むがこれに限定されないＧＰＣＲのサブファミリーを含む。
（ａ） アミン様リガンド−アセチルコリンムスカリン様レセプター（Ｍ１−Ｍ５）、αおよびβアドレノセプター、ドーパミンレセプター（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）、ヒスタミンレセプター（Ｈ１およびＨ２）、オクトパミンレセプター、セロトニンレセプター（５ＨＴ１、５ＨＴ２、５ＨＴ４、５ＨＴ５、５ＨＴ６、５ＨＴ７）に結合するレセプター；
（ｂ）ペプチドリガンド−アンギオテンシンレセプター、ボンベシンレセプター、ブラジキニンレセプター、Ｃ−Ｃケモキネレセプター（ＣＣＲ１ − ＣＣＲ８およびＣＣＲ１０）、Ｃ−Ｘ−Ｘタイプケモキネレセプター（ＣＸＣ−Ｒ５）、コレシストキニンタイプＡレセプター、ＣＣＫタイプレセプター、エンドセリンレセプター、ニューロテンシンレセプター、ＦＭＬＰ−関連レセプター、ソマトスタチンレセプター（タイプ１−５）、オピオイドレセプター（タイプＤ、Ｋ、Ｍ、Ｘ）に結合するレセプター；
（ｃ） ホルモンタンパク質−卵胞刺激ホルモンレセプター、甲状腺刺激レセプター、ルトロピン−絨毛性性腺刺激ホルモンレセプターに結合するレセプター；
（ｄ）神経伝達物質−サブスタンスＰレセプター、サブスタンスＫレセプター、神経ペプチドＹレセプターに結合するレセプター；
（ｅ） 嗅受レセプター−嗅受タイプ１−１１、味覚レセプター、臭覚レセプター；
（ｆ） プロスタノイドレセプター、プロスタグランジンＥ２（ＥＰ１−ＥＰ４サブタイプ）　、プロスタサイクリン、トロンボキサン；
（ｇ） メタボトロピックサブスタンス−メタボトロピックグルタミングループＩ−ＩＩＩレセプターと結合するレセプター
（ｈ） 光などの物理的刺激に応答するレセプターおよび味覚、嗅覚などの化学的刺激に応答するレセプター；
（ｉ） オーファンＧＰＣＲ−レセプターの自然なリガンドは未定義。
【００２９】
本発明と組み合わせたＩＣＡＳＴ（ｔｍ）技術の使用は、ＧＰＣＲスクリーニングプロセスに多くの利点を提供するものである。それらには、細胞以下のすべての部分−膜、サイトソル、核とのタンパク質相互作用を監視する能力；タンパク質の過剰発現の必要なく、生理学的により関連の深いモデルを達成する能力；レセプター結合のための機能的アッセイを達成し、高い情報内容を提供する能力、が含まれる。
【００３０】
好適な態様の詳細な説明
本発明はＧＰＣＲ機能と経路を探索する方法を提供する。Ｇタンパク質−共役スーパーファミリーは、新規受容体としての急速な拡大を続け、ｃＤＮＡライブラリまたはゲノムＤＮＡの自動配列をとおして発見される。ヒトゲノムには数千のＧＰＣＲが存在すると推定されている。クローン化されているのはその一部のみで、リガンドと結び付けられている数はさらに少ない。これら、または新規発見されるオーファン受容体をそれぞれの同族リガンドや生理学的機能と結び付ける方法は、生物学的／生物医学的研究の大きな課題である。オーファン受容体の同定は一般的に個別化されたアッセイと機能に関する推測を必要とする。本発明は、検査ＧＰＣＲまたはオーファン受容体とβアレスチン間の活性依存タンパク質／タンパク質相互作用を利用した、受容体の活性化の監視によるＧＰＣＲ機能の探索に関連する。この特定のタンパク質／タンパク質相互作用は、本明細書に開示されている変異体酵素相補技術により測られる。このアッセイシステムは、その他シグナリングイベントの既存の知識の有無に関わらず、実行できるため、必要な推定を限定するものである。これは感度が高く、高速に、簡易に実行できるものであり、これら受容体の大部分が共通のメカニズムにより脱感受されているため、ほとんどすべてのＧＰＣＲに適用できる。
【００３１】
本発明は、ＧＰＣＲ経路内のタンパク質／タンパク質相互作用監視のための完全なアッセイシステムを提供するものである。本発明は相補技術、ＩＣＡＳＴ （ｔｍ）（Ｉｎｔｅｒｃｉｓｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８年４月１日に申請された米国特許係属中申請番号第０５３，６１４号で、その全開示は引用により本明細書に編入する）を採用しているＩＣＡＳＴ（ｔｍ） テクノロジーは、着目するタンパク質に融合されたレポーター酵素の２つの変異体の使用に関連する。着目するタンパク質が相互に作用しない場合、レポーター酵素は不活性のままである。着目するタンパク質が相互に作用しない場合、レポーター酵素は不活性状態のままである。本発明の態様によると、βガラクトシダーゼの活性は、化学発光法サブストレートであるＧａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（ｒ）に関連する、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｔｍ）による開発のＧａｌＳｃｒｅｅｎ（ｔｍ）アッセイシステムで検知が可能である。ＧａｌＳｃｒｅｅｎ（ｔｍ）アッセイシステムおよびＧａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（ｒ）化学発光法サブストレートは米国特許番号第５，８５１，７７１号、第５，５３８，８４７号、第５，３２６，８８２号、第５，１４５，７７２、第４，９７８，６１４号、第４，９３１，５６９号で開示されており、その全開示は引用により本明細書に編入する。本発明は高速、非放射性アッセイフォーマットである、ＧＰＣＲ結合アッセイを含む一連のアッセイを提供するものである。本発明の方法は、緑色蛍光融合タンパク質（ＧＦＰ）を含む融合としてのＧＰＣＲコンポーネントの顕微鏡的画像化や分光法に依存する、米国特許番号第５，８９１，６４６号および第６，１１０，６９３号、また、前記アンガース（Ａｎｇｅｒｓ）ｅｔ ａｌ．編集で開示の発明をさらに発展させたものである。米国特許番号第５，８９１，６４６号および第６，１１０，６９３号とＡｎｇｅｒｓ ｅｔ ａｌでの分光法ベースの技術は、ロースループットおよび完全定量化の不足により制限を受ける。
【００３２】
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｔｍ） テクノロジーと本発明のアッセイシステムを組み合わせることにより、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が可能なＧＰＣＲ経路探索用高感度細胞ベースアッセイ法が実現される。本発明と併用が可能なＡｄｖａｎｃｅｄ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ（ｔｍ）開発のテクノロジーには、Ｇａｌ−Ｓｃｒｅｅｎ（ｔｍ）（上記記述を参照されたい）アッセイシステムおよびｃＡＮＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（ｔｍ）イミュノアッセイシステム等がある。ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（ｔｍ）イミュノアッセイシステムは、細胞溶解液中のｃＡＭＰ濃度を超高感度で測定する。 ｃＡＭＰ Ｓｃｒｅｅｎ（ｔｍ）アッセイは、超高感度化学発光アルカリフォスタファーゼ（ＡＰ）サブストレートＣＳＰＤ（ｒ） （ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３−（４− ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ ｛ｌ，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ） ｔｒｉｃｙｃｌｏ ３．３． １．１．３，７｝ｄｅｃａｎ−４−ｙｌ ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびＳａｐｐｈｉｒｅ−ＩＩ（ｔｍ） 発光エンハンサーを利用している。
【００３３】
高スループットアッセイのタンパク質／タンパク質相互作用監視に使われるｙｅａｓｔ−ｂａｓｅｄ−ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ アッセイとは違い、本発明では（１）哺乳動物細胞、植物細胞、大腸菌などの原生細胞、また、酵母、粘菌変形菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）昆虫などの無脊椎源の細胞、など種々の細胞を利用でき、（２）例えばヌクレアスなどの限定された細胞限局化ではなく、受容体ターゲット部位の膜における、あるいは、下流ターゲットタンパク質の部位におけるシトソル内の相互作用を検知できる他、（３）転写活性化などの間接的出力に依存しない。従って、本発明はより高い生理学的関連性と、偽陽性の減化を提供するものである。
【００３４】
本発明は、発明ＧＰＣＲアッセイ法の感度を強化するために、前記記載の米国特許出願番号第０５３，６１４号開示の態様に改変を加えて開発されている。態様に従うと、本発明はＧＰＣＲ−アレスチンの相互作用を強化／延長化して検知の信頼性をより高めるため、セリン／スレオニンクラスターの利用を伴うものである。これらクラスターは、これらのシークエンスモチーフを持たないオーファン受容体または既知ＧＰＣＲに利用できる。このシークエンスを受容体のｃ−末端に付加し、例えばβガラクトシダーゼ変異体を伴うターゲットタンパク質の融合タンパク質からのβガラクトシダーゼ相補など、ＧＰＣＲへのアレスチン結合を出力することにより、受容体の活性化が簡易に検知できる。
【００３５】
別の態様に従うと、本発明は、特定ＧＲＫの活性化によるリン酸化の必要を回避する目的で、活性時にＧＰＣＲのｃ−末端上または細胞間ループ上のアレスチンポイントミューテーションを利用する。態様はｉ） 特定のＧＰＣＲまたはオーファン受容体と同族のＧＲＫが未知であり、また、 ｉｉ） 着目する（または検査下の）受容体の特定ＧＲＫが、受容体活性化アッセイに使われるホスト細胞内に不存在または低活性である可能性を含む。
【００３６】
別の態様に従うと、本発明は、活性化されたＧＰＣＲへのアレスチンの結合効果を強化し、ＧＰＣＲ脱感作中、ＧＰＣＲ／アレスチン群を安定化する目的でのスーパーアレスチンの利用を伴う。本態様はＧＰＣＲが通常、脱感作後急速に再感作する、ＩＣＡＳＴ／ＧＰＣＲ態様の信頼性を増すために利用できる。
【００３７】
これら方法を各、以下に述べる。
本発明を、限定されない以下の実施例で説明する。
実施例：
本発明のひとつの態様によると、ＧＰＣＲ活性化はリガンド−活性化ＧＰＣＲへのアレスチンの結合監視を通して測定できる。本アッセイシステムでは、例えばβアドレナリン受容体（β２ＡＲ）などのＧＰＣＲおよび例えばβアレスチンなどのアレスチンは、例えばβガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）などのレポーター酵素の変異体を伴う融合タンパク質と同じ細胞内に共発現される。図２３で示されている通り、β２ＡＲはβ−ｇａｌ変異体のΔαを伴う融合タンパク質（β２ＡＲΔα）として、βアレスチンはβ−ｇａｌ変異体のΔωを伴う融合タンパク質（β−ＡｒｒΔω）として発現する。当初、例えばＧＰＣＲの膜とアレスチンのシトソルなど、２つの異なる区画内の静止（または非刺激性）細胞内に存在する、これら２つの融合タンパク質は、活性のβガラクトシダーゼ酵素を形成することはできない。かかる細胞がアゴニストまたはリガンドにより治療されると、リガンド居住の活性化受容体は、アレスチンにとっての高親和結合部位となる。活性化ＧＰＣＲ、β２ＡＲΔα、アレスチンβ−ＡｒｒΔω間の相互作用がβ−ｇａｌ変異体相補を誘導する。酵素活性化は、分割に際して比色、蛍光、化学発光（例えばＧａｌ−Ｓｃｒｅｅｎ（ｔｍ）アッセイシステム等）法により測定可能な生成物を解離する、酵素基質を使って測定できる。
【００３８】
実験プロトコル
１． まず始めに、選択可能なレトロウイルスベクターｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ（図１８で説明）およびｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ（図１５で説明）に、β２ＡＲΔαおよびβＡｒｒ２Δωの発現ベクターを組み込んだ。
２． 第二に、２つの発現体を、Ｃ２Ｃｌ２心筋細胞、あるいはＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ａ４３１、ＨＥＫ ２９３、ＣＨＷなどの他の哺乳類細胞株に形質導入した。抗生物質を選択した後、２種類の融合タンパク質両方を適切なレベルで発現している、安定なクローンを選択した。
３． 最後に、β２ＡＲΔαおよびβＡｒｒ２Δωの両方を発現している細胞の反応性を、アゴニスト／リガンドで刺激されるβ−ガラクトシダーゼ活性により測定した。３種類の細胞サンプルを、９６ウェル培養プレートのウェルに、１００マイクロリットル、１０，０００細胞にて播種した。細胞は２４時間培養し、アッセイを行った。アゴニストのアッセイ（図３および４）については、（−）イソプロテレノール、プロカテロール、ドブタミン、Ｌ−Ｌ−フェニレフリンなど、アゴニストの濃度を変えて、６０分、３７℃にて細胞を処理した。誘導したβ−ガラクトシダーゼの活性は、Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌ−ＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイ系の基質（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて測定し、発光はＴｒｏｐｉｘ ＴＲ７１７ＴＭ照度計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。アンタゴニストのアッセイ（図５）については、まず調整したばかりの培地に、血清なし、ＩＣＩ−１１８，５５１あるいはプロプラノロール存在下で１０分間細胞をインキュベートし、次に１０マイクロモル濃度の（−）イソプロテレノールを加えた。
【００３９】
セリン／スレオニンクラスターストラテジー
背景
βアレスチンの構造−機能研究によると、βアレスチンのアミノ末端内の大領域（活性化認識領域と呼ばれる）がＧＰＣＲのアゴニスト活性化状況を認識する。βアレスチンにおけるこの領域は、正電荷を帯びたリン酸化認識領域（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ） と呼ばれる小領域（ネット電荷＋７で約２０個のアミノ酸）も含み、これはＧＲＫ−リン酸化されたＧＰＣＲのカルボキシル末端と相互作用しているように見られる。
【００４０】
ＧＰＣＲはβアレスチンへの親和性により２つのクラスに分けられる。オークリー（Ｏａｋｌｅｙ） ｅｔ ａｌ．， 編集「クラスリン仲介飲食作用中のβアレスチンのＧタンパク質−共役受容体との結合による受容体再感作のプロフィールの検知（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ β−Ａｒｒｅｓｔｉｎ ｗｉｔｈ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｃｌａｔｈｒｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｄｉｃｔａｔｅｓ ｔｈｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．）」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．誌、２７４（４５）：３２２４８−３２２５７ （１９９９年）。この分類の根底にある分子決定因子が、受容体のカルボキシル端子に位置する特定セリンまたはスレオニン残基内に存在しているようである。カルボキシル末端に、離散したセリンおよびスレオニン残基のみしか備えていない受容体クラスは、低い親和性でβアレスチンと結合し、内在化時にβアレスチンから解離するのに対し、カルボキシル端子内のセリン／スレオニンクラスター（連続する３つ、または、４つのうち３つの配列を持つセリンまたはスレオニン残基として定義される）を含む受容体クラスは、活性化およびリン酸化時、高い親和性でβアレスチンと結合し、受容体の内在化後もβアレスチンと結合を維持する。バソプレシンＶ２レセプター（Ｏａｋｌｅｙ， ｅｔ ａｌ）、ニューロテンシンレセプター１、アンジオテンシンＩＩレセプタータイプ１Ａ（ツァン（Ｚｈａｎｇ） ｅｔ ａｌ編集「Ｇタンパク質−共役受容体／βアレスチンエンドサイトーシス群の細胞輸送（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ− Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／β−Ａｒｒｅｓｔｉｎ Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．）」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．誌、２７４（１６）：１０９９９−１１００６ （１９９９年））など、カルボキシル末端内にこのようなセリン／スレオニンクラスターを１つあるいは複数持ついくつかの既知のＧＰＣＲは、βアレスチンを高い親和性で結合することが示されている。
【００４１】
実施例
本発明の態様によると、セリン／スレオニンクラスターストラテジーは、独自にこういった構造的モチーフを持たないオーファン受容体のスクリーニングアッセイ法の簡易化に利用できる。オーファン受容体は連鎖配列により簡単に分類化ができる。セリン／スレオニンクラスターを備えないオーファン受容体を、それぞれ、受容体のカルボキシル末端に１つあるいは複数のセリン／スレオニンクラスターを誘導すべく改変された発現ベクターにクローニングする。（図２４）セリン／スレオニンクラスターが、強力なイオン相互作用を通して、活性化およびリン酸化された受容体（負電荷）とβアレスチン（リン酸化認識領域中に正電荷）との間の受容体活性化依存相互作用を強化させる。オーファン受容体末端の修飾により、このように、受容体活性化の検知信頼性が強化される。
【００４２】
実験プロトコル
１． まず始めに、セロトニン／トレオニンクラスターのない、オーファン受容体のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を、図１０Ａで説明したｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣなどの修飾した発現ベクターにクローニングする。この修飾したｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣには、１つ以上のセロトニン／トレオニンクラスター（例えばＳＳＳあるいはＳＳＴ）のコード配列が、オーファン受容体のＯＲＦ挿入部位下流に位置している（図２４）。
２． 第二に、キメラオーファン受容体であるＯＲＦｏｒｐｈａｎ−（ＳＳＳ）ｎ−Δαを、図１５で説明したβＡｒｒ２Δωなどのβ−アレスチンキメラを持つ哺乳類細胞に共発現させる。
３． 第三に、この細胞にアゴニストまたはリガンドを処理し、リン酸化セリンクラスターを持つ活性型受容体を、β−ｇａｌ相補性の値が強いシグナルを示す高親和性β−アレスチンに結合させる。
【００４３】
このアッセイは、オーファン受容体の機能活性化を測定できる高感度の方法であり、オーファン受容体の天然リガンドあるいは代理リガンドのスクリーニングに用いることができる。このプロセスは、新しいＧＰＣＲのデオーファニング（ｄｅ−ｏｒｐｈａｎｉｎｇ）あるいはターゲット発見と呼ばれる（図２８）。さらに、このアッセイは、ＧＰＣＲのリード発見に用いる潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングにも有用である。
【００４４】
ＧＰＣＲリン酸化の存在時、非存在時における強化アレスチン結合
背景
これまでＧタンパク質−共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）の６つの異なるクラスが特定され、さらにこれら各クラスが複数のｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖａｒｉａｎｔとして発現することが報告されている。クループニック（Ｋｒｕｐｎｉｃｋ） ｅｔ ａｌ．編集「Ｇタンパク質−共役受容体調節におけるレセプタキナーゼおよびアレスチンの役割（Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ａｒｒｅｓｔｉｎｓ ｉｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．）」Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．誌、３８：２８９−３１９ （１９９８）。細胞株は多くが種々のＧＲＫを発現するが、あるＧＰＣＲのリン酸化に必要な特定のＧＲＫが、組換ＧＰＣＲおよびアレスチン発現に使われる細胞株に、常に存在するとは限らない。これは、同族ＧＲＫが未知である可能性が高い、オーファン受容体を使う態様で特に問題となる。その他の場合では、組換え発現作業に使われる細胞株が必要なＧＲＫを備えていたとしても、ＧＲＫの発現率が低い可能性がある。このような危険性を回避するために、活性化ＧＰＣＲに特異的に結合されているがＧＲＫリン酸化の必要のない、遺伝子的に改変されたアレスチンが採用されている。
【００４５】
アレスチン上の変異誘発に関する研究は、リン酸化認識領域におけるポイントミューテーション、特にＡｒｇ１７５（視覚系アレスチンの）を逆の電荷を帯びたグルタミンなどの残基へと変換する変異（Ｒ１７５Ｅ変異）は、ＧＰＣＲに特異的に結合するアレスチンを生むが、リン酸化の必要なくそれを行うことを示している。
【００４６】
多くの研究により、アレスチンがＧＰＣＲへの親和性の低い非活性状態中に存在するとの仮説を導いている。ＧＰＣＲの活性化とリン酸化の両方がひとたび起こると、ＧＰＣＲ Ｃ末端のリン酸化領域がアレスチンのリン酸化認識領域と相互作用し、アレスチンの構造変化、引いては、活性化認識領域の提示と活性化／リン酸化された受容体への結合が導かれる。ヴィシュニヴェツキー（Ｖｉｓｈｎｉｖｅｔｓｋｉｙ） ｅｔ ａｌ．編集「ロドプシンのリン酸化過程に対するアレスチンの応答（Ｈｏｗ ｄｏｅｓ ａｒｒｅｓｔｉｎ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ？）」 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．誌 ２７４（１７）：１１４５１−１１４５４ （１９９９年）；グレヴィッチ（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ） ｅｔ ａｌ．編集「Ｇタンパク質−共役受容体とのアレスチンの相互作用：野生／変異型アレスチンとロドプシンβ２アドレナリン／ｍ２ムスカリン様アセチルコリン受容体の直接結合研究（Ａｒｒｅｓｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ａｒｒｅｓｔｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ， ｂｅｔａ ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ ｍ２ ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．誌２７０（２）：７２０−７３１， （１９９５年）；グレヴィッチ（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ） ｅｔ ａｌ．編集「視覚系アレスチンによるリン酸化認識と高親和性結合部位へのアレスチンの転位メカニズム（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｖｉｓｕａｌ ａｒｒｅｓｔｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｒｅｓｔｉｎ ｉｎｔｏ ａ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．）」Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．誌５１（ｌ）：１６１−１６９ （１９９７年）；コーヴァー（Ｋｏｖｏｏｒ） ｅｔ ａｌ．編集「細胞内に構成活性性を有するリン酸化非依存性βアレスチン変異体のターゲット構成（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｅｔａ−ａｒｒｅｓｔｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｅｌｌｓ．）」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．誌２７４（１１）：６８３１−６８３４ （１９９９年）。結論的には、非活性化、非活性化／リン酸化、活性化／非リン酸化、リン酸化された視覚系／非視覚系ＧＰＣＲとの単一変異株、二重変異株、欠失、キメラアレスチンの結合研究のすべてが本モデルを論証してるのである。
【００４７】
実施例
変異レポータータンパク質に融合されたアレスチンのリン酸化非感作変異体を、リン酸化非依存の様態で活性化されたＧＰＣＲと結合すべく産生することが可能である。この考え方の証明として、本発明に従い、βアレスチン２、Ｒ１７０Ｅ βアレスチン２のポイントミューテーションが産生され、β２ＡＲ との相互作用が分析された。
【００４８】
実験プロトコル：
１）　まず始めに、Ａｒｇ １７０をＧｌｕに変換するなど、β−アレスチン２を変異させた。この変異は、視覚系アレスチンのＲ１７５Ｅ変異と同等である。変異型β−アレスチン２のオープン・リーディング・フレームを、ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ発現ベクターのΔω−β−ガラクトシダーゼフレームにクローニングし、修飾発現ベクターＲ１７０Ｅ β−アレスチン２を作成した（図２５）。
２）　第二に、Ｒ１７０Ｅ β−アレスチン２発現体をＣ２Ｃ１２心筋細胞株に形質導入した。Ｃ２Ｃ１２心筋細胞株は、図１８、米国出願シリアル番号０９／６５４，４９９に説明した通り、Δα−β−ガラクトシダーゼに融合させてβ２ＡＲを発現させるために設計したものである。抗生物質を選択した後、２種類の融合タンパク質両方を発現しているクローンを採取した。
３）最後に、Ｒ１７０Ｅ β−アレスチン２Δωおよびβ２ＡＲΔαの両方を発現しているこの細胞集団の反応性を、図２６に示されている通り、アゴニスト／リガンドで刺激されるβ−ガラクトシダーゼ活性により測定した。β２ＡＲΔαおよび野生型β−アレスチン２Δωを共発現しているＣ２Ｃｌ２クローン４３−８（図２６）を、対照として用いた。３種類の細胞サンプルを、９６ウェル培養プレートのウェルに、１００マイクロリットル、１０，０００細胞にて播種した。細胞は２４時間培養し、アッセイを行った。図２６のアゴニストアッセイについては、細胞を０．３ｍＭアスコルビン酸で安定化させた１０μｍ （−）イソプロテレノールにより、３７℃、０、５、１０、１５、３０、４５あるいは６０分間、処理した。誘導したβ−ガラクトシダーゼの活性は、Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌ−ＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイ系の基質（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて測定し、発光はＴｒｏｐｉｘ ＴＲ７１７ＴＭ照度計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。図２６に示した通り、変異型アレスチンは、アゴニスト依存的にβ２ＡＲと相互作用し、野生型アレスチンと同等であった。
４）　リン酸化非感受性のアレスチンを用いた応用に拡張するため、Ｃ２Ｃ１２、ＣＨＯ、ＨＥＫ ２９３などの細胞株をＲ１７０Ｅ β−アレスチン２Δω構造を発現させる開発を行う。アゴニストおよびアンタゴニストスクリーニング用の細胞株を開発するため、これらの細胞株を用いて、Δα−β−ガラクトシダーゼに融合させて、オーファンあるいは既知のＧＰＣＲを形質導入することができる。
【００４９】
スーパーアレスチンの開発
背景
アレスチン経路によるＧＰＣＲシグナリングのアティニュエーションは、細胞または微生物が刺激に対し過剰に反応を防ぐ作用をする。同時に、アレスチン経路はＧＰＣＲを、一時的に非活性化し、すばやく再感作して新規刺激に対する感作を可能にするために再循環する作用も持つ。ダウンレギュレーション過程では、アレスチンとエンドサイトーシスとを結合しながら、受容体のリン酸化が行われる。脱感作された受容体のエンドサイトーシスに続き、受容体はライソソームにディグレードするか、または、再感作され、膜に戻される。再感作により、アレスチンが受容体から解離、リン酸化が行われ、膜へと戻る。活性化に伴いＧＰＣＲがたどる実際の経路は、生物学的機能と生体のニーズに拠る。ダウンレギュレーション経路の必要の可能性を含むこれら経路の多様性により、活性化したＧＰＣＲへのアレスチン親和性は受容体により異なる。そのため、自然が提供するものよりも高い、活性化されたＧＰＣＲへの親和性と結合活性を備えたスーパーアレスチンの精製は極めて有益である。
【００５０】
アレスチンの変異、欠失、キメラ研究は、これまで、ＧＰＣＲリン酸化状態に応答する分子の調節スイッチの解明に集中してきたが、アレスチンの改変組換えが活性化リン酸化されたＧＰＣＲへの分子内の結合強化をもたらしている。Ａｒｇ１７５の、ヒスチジン、タイロシン、フェニルアラニン、スレオニンへの変換は、野生型アレスチンまたはＲ１７５Ｅアレスチンよりも、リン酸化、活性化されたロドプシンへの相当量に高い結合量を導いているが、これら変異体は活性化、非リン酸化された受容体には低い結合となっている。（ビレヴィッチ（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ） ｅｔ ａｌ．編集（１９９７年））。さらに、バリン１７０のアラニンへの変換は、Ｒ１７５Ｅ変異の構成効果を増加させているが、野生型アレスチンの活性化／リン酸化ロドプシンとの相互作用量もほとんど倍化させている。（グレヴィッチ（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ） ｅｔ ａｌ．編集（１９９７年））。
【００５１】
βアレスチン１のアミノ酸３８２での切形は、Ｒ１６９Ｅ（アレスチンＲ１７５Ｅと同等）と野生型βアレスチンのいずれもの、活性化または活性化／リン酸化受容体への結合をそれぞれ強化していることが報告されている。（コーヴァー（Ｋｏｖｏｏｒ） ｅｔ ａｌ．編集）。視覚系アレスチンの機能領域がβアレスチン１のそれとスワップされている、キメラアレスチンの場合、活性化／リン酸化されたＧＰＣＲへの結合親和性が変化することが報告されている。（グレヴィッチ（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ） ｅｔ ａｌ．編集（１９９５年））。これらキメラのうち、視覚系アレスチン極性Ｎ末端を伴うβアレスチン１などのいくつかのキメラが、野生型βアレスチン１よりも、リン酸化／活性化されたＧＰＣＲに特異的に結合を増加させていることを示している。（ブレクイヴィッチ（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ） ｅｔ ａｌ編集 （１９９５年））。前記に説明の、活性化ＧＰＣＲへのアレスチン親和性を強化する改変は、アレスチン／ＧＰＣＲ群が安定化および／または長命化することから、リン酸化か非リン酸化かに関わらず、βガラクトシダーゼ活性のノイズへのシグナルも強化させる可能性がある。活性化されたＧＰＣＲとより高い親和性を持つ変異体アレスチンを利用することにより、ＧＰＣＲターゲットの発明技術の改善が、受容体／リガンドの生物学を妥協させることなく、実現される。
【００５２】
さらに、この「スーパーアレスチン」アプローチとアレスチンポイントミューテーションの利用とを組み合わせて、ＧＲＫの必要の有無に関わらずノイズへのシグナルを強化させることもできる。
【００５３】
実施例
変異レポーターと融合されたアレスチン変異体を、活性化ＧＰＣＲへのアレスチンの結合強化目的のため産生、結果、検知の感度を強化する。
【００５４】
実験プロトコル
１）　まず始めに、変異型β−アレスチン２構造に、Ｒ１７０Ｅ／Ｔ／Ｙ／あるいはＨ、Ｖ１６５Ａを組み込み、視覚系アレスチンのａａ． １−４３とａ．ａ． １−４７を置換、あるいはＣ末端を欠失させるか、これらの変質を組み合わせて行う。図２５に示したＲ１７０Ｅ β−アレスチン２変異のクローニングと同様に、変異型β−アレスチン２のオープン・リーディング・フレームを、ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ発現ベクターのΔω−β−ガラクトシダーゼ骨格にクローニングする。
２）　第二に、変異型発現体を、Δα−β−ガラクトシダーゼに融合させるとβ２ＡＲを発現するように設計したＣ２Ｃｌ２心筋細胞株に形質導入する。抗生物質を選択した後、２種類の融合タンパク質両方を発現しているクローン個体を採取する。野生型およびＲ１７０Ｅ β−アレスチン２の構造を形質導入し、対照の基準クローンを作成する。
３）　第三に、β−アレスチン２Δω（変異型あるいは野生型）およびβ２ＡＲΔαの両方を発現した細胞集団の反応性を、アゴニスト／リガンドで刺激されるβ−ガラクトシダーゼ活性により測定する。
４）　次に、野生型β−アレスチン２Δωと比較し、アゴニストアッセイでノイズ比よりも有意に高いシグナルを示した変異型（スーパー）β−アレスチン２Δω構造を選択する。この構造を用い、既知あるいはオーファンＧＰＣＲに形質導入することができ、「スーパー」β−アレスチン２Δωを発現している安定な細胞株を開発する。スーパーβ−アレスチン２Δωを用い、ＩＣＡＳＴ／ＧＰＣＲの応用に関し、ノイズに対するシグナルを増加させることができ、リードおよびリガンド発見のためのスクリーニング効果を改善することができる。
【００５５】
スーパーアレスチンを用い、ＧＰＣＲの脱感作中、活性型ＧＰＣＲおよび安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体へのアレスチンの結合効率を向上させる。この応用技術を用いることで、通常はＧＰＣＲが脱感作後、急速に再感作されるケースで、ＩＣＡＳＴ／ＧＰＣＲ技術の信頼性を高めることができる。
【００５６】
本発明のアッセイ、応用と調整法は、包括的にも、特定の例を用いても説明してある。例は、限定的なものとして用いているわけではない。他の代替アイデンティティ、性質、アッセイは、発明力を駆使しなくとも、この分野における普通の技術の中で見出されることであろう。後述する特許請求の範囲に関する詳述で除外されていない限り、そのような修正は本発明の範囲内に収まるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】β２アドレナリン受容体（β２ＡＲ）およびβ−アレスチン−２（βＡｒｒ２）のＣ２クローン中細胞発現レベルβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）融合タンパク質の定量は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより、抗β−ｇａｌ抗体と精製したβ−ｇａｌタンパク質の滴定曲線を用いて行った。図１Ａでは、（発現ベクターｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ中の）β２ＡＲ−βｇａｌΔαクローン発現レベルを示している。図１Ｂには、クローン９−３、−７、−９、−１０、−１９、−２４の発現ベクターｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ４あるいはクローン１２−４、−９、−１６、−１８、−２２、−２４の発現ベクターｐＩＣＡＳＴ ＯＭＮ４中のβＡｒｒ２−βｇａｌΔωの発現レベルを示している。
【図２】β２ＡＲ受容体の活性は、アゴニストで刺激されるｃＡＭＰ産生により測定した。ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ β２ＡＲ（クローン５）を発現したＣ２細胞あるいは親細胞には、濃度を増加させながら（−）イソプロテレノールと０．１ｍＭ ＩＢＭＸ処理を行った。ｃＡＭＰレベルの量はｐｍｏｌ／ｗｅｌｌとして示した。
【図３】活性化β２ＡＲ受容体とアレスチンの相互作用は、β−ガラクトシダーゼの相補性により測定することができる。図３Ａには、（発現ベクターｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣおよびｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ、同一のコロニーから単離されたクローン（４３−１、４３−２、４３−７、４３−８）中の）β２ＡＲ−βｇａｌΔαを発現したＣ２（発現ベクターｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ中のβ２ＡＲのみ、あるいはβ２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβＡｒｒ２−βｇａｌΔωを共発現し、二重に形質導入されたＣ２プール）について、アゴニストである（−）イソプロテレノール刺激に反応して活性化されたβ−ガラクトシダーゼの時間経過を示している。図３Ｂには、（発現ベクターｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ中の）β２ＡＲ−βｇａｌΔαのみを発現したＣ２細胞、および（発現ベクターｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣおよびｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ中の）β２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβＡｒｒ１−βｇａｌΔωを共発現したＣ２クローンについて、アゴニストである（−）イソプロテレノール刺激に反応して活性化されたβ−ガラクトシダーゼの時間経過を示している。
【図４】β２ＡＲとアレスチンの相互作用に対するアゴニスト用量反応は、β−ガラクトシダーゼの相補性により測定することができる。図４Ａには、β２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβＡｒｒ２−βｇａｌΔω融合体を共発現したＣ２細胞中の、アゴニスト（−）イソプロテレノールおよびプロカテロールに対する用量反応を示している。図４Ｂには、β２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβＡｒｒ１−βｇａｌΔω融合体を共発現したＣ２細胞中の、アゴニスト（−）イソプロテレノールおよびプロカテロールに対する用量反応を示している。
【図５】受容体活性のアンタゴニストによる抑制は、β２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβＡｒｒ−βｇａｌΔωを共発現した細胞中のβ−ガラクトシダーゼの相補性により測定することができる。図５Ａには、アゴニスト（−）イソプロテレノールをインキュベート後、β２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβＡｒｒ２−βｇａｌΔω融合体を共発現したＣ２クローン中の、アドレナリン拮抗薬ＩＣＩ−１１８，５５１およびプロプラノロールによるβ−ガラクトシダーゼの特異的抑制を示している。図５Ｂには、アゴニスト（−）イソプロテレノール存在下、β２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβＡｒｒ１−βｇａｌΔω融合体を共発現したＣ２クローン中の、アドレナリン拮抗薬ＩＣＩ−１１８，５５１およびプロプラノロールによるβ−ガラクトシダーゼの特異的抑制を示している。
【図６】アデノシン受容体Ａ２ａを発現したＣ２細胞は、アゴニスト（ＣＧＳ−２１６８０）の処理に反応してｃＡＭＰを誘導することが示されている。Ａ２ａＲ−βｇａｌΔαおよびβＡｒｒ１−βｇａｌΔωを共発現したＣ２親細胞とＣ２細胞は、プールあるいは特定のクローン（４７−２， ４７−１３）として用い、アゴニストで誘導されるｃＡＭＰ反応（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）を測定した。
【図７】ドパミン受容体Ｄ１（Ｄ１−βｇａｌΔα）およびβ−アレスチン−２（βＡｒｒ２−βｇａｌΔω）を共発現したＣ２細胞のアゴニストで刺激されたｃＡＭＰ反応。このアッセイでは、βＡｒｒ２−βｇａｌΔω（Ａｒｒ２のみ）を発現したクローンをネガティブコントロールとして用いた。βＡｒｒ２−βｇａｌΔωおよびＤｌ−βｇａｌΔαを発現した細胞は、アゴニスト処理（３−ヒドロキシトラミン塩酸塩、３μＭ）に反応した。Ｄ１（ＰＩＣ２）あるいはＤ１（ＰＩＣ３）はそれぞれ、発現ベクターｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ２あるいはｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ４でＤ１を発現した。
【図８】種々の哺乳類細胞株を用いて、ＧＰＣＲとアレスチンの相互作用をモニターするための、安定した細胞を作成することができる。図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃには、例として、β−ガラクトシダーゼ変異株のアドレナリン受容体β２ＡＲおよびアレスチン融合タンパク質を共発現した、ＨＥＫ ２９３、ＣＨＯ、およびＣＨＷ細胞株を示している。β−ガラクトシダーゼ活性を利用し、アゴニストにより誘導されたβ２ＡＲとアレスチンタンパク質の相互作用をモニターした。
【図９】βｇａｌの相補性を用いて、β２アドレナリン受容体のホモダイマー形成をモニターすることができる。図９Ａには、β２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβ２ＡＲ−βｇａｌΔωを共発現したＨＥＫ ２９３中のβ−ガラクトシダーゼ活性を示している。図９Ｂには、β２ＡＲ−βｇａｌΔαおよびβ２ＡＲ−βｇａｌΔωを共発現したＨＥＫ ２９３クローン中のアゴニスト（−）イソプロテレノールに対するｃＡＭＰの反応を示している。このアッセイでは、ＨＥＫ２９３親細胞をネガティブコントロールとして含めている。
【図１０Ａ】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ：標的タンパク質のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔαを発現させるためのベクター。このベクターは、ＭＣＳ、β−ｇａｌΔα骨格の中で標的タンパク質をクローニングするための複数のクローニング部位、ＧＳリンカー、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ＮｅｏＲ、ネオマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、リボソーム内部進入部位、ＣｏｌＥｌｏｒｉ、Ｅ．ｃｏｌｉの成長複製点、５’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲおよび３’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ウイルスプロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ白血病ウイルス由来のポリアデニル化シグナルなどの機能を持つ。
【図１０Ｂ】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣのヌクレオチド配列。
【図１１Ａ】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＮ：標的タンパク質のＮ末端に融合させてβ−ｇａｌΔαを発現させるためのベクター。このベクターは、ＭＣＳ、β−ｇａｌΔα骨格の中で標的タンパク質をクローニングするための複数のクローニング部位、ＧＳリンカー、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ＮｅｏＲ、ネオマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、リボソーム内部進入部位、ＣｏｌＥ１ｏｒｉ、Ｅ．ｃｏｌｉの成長複製点、５’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲおよび３’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ウイルスプロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ白血病ウイルス由来のポリアデニル化シグナルなどの機能を持つ。
【図１１Ｂ】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＮのヌクレオチド配列。
【図１２Ａ】ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ：標的タンパク質のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔωを発現させるためのベクター。このベクターは、ＭＣＳ、β−ｇａｌΔω骨格の中で標的タンパク質をクローニングするための複数のクローニング部位、ＧＳリンカー、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、Ｈｙｇｒｏ、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、リボソーム内部進入部位、ＣｏｌＥｌｏｒｉ、Ｅ．ｃｏｌｉの成長複製点、５’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲおよび３’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ウイルスプロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ白血病ウイルス由来のポリアデニル化シグナルなどの機能を持つ。
【図１２Ｂ】ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣのヌクレオチド配列。
【図１３Ａ】ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＮ：標的タンパク質のＮ末端に融合させてβ−ｇａｌΔωを発現させるためのベクター。このベクターは、ＭＣＳ、β−ｇａｌΔω骨格の中で標的タンパク質をクローニングするための複数のクローニング部位、ＧＳリンカー、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、Ｈｙｇｒｏ、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、リボソーム内部進入部位、ＣｏｌＥｌｏｒｉ、Ｅ．ｃｏｌｉの成長複製点、５’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲおよび３’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ウイルスプロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ白血病ウイルス由来のポリアデニル化シグナルなどの機能を持つ。
【図１３Ｂ】ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＮのヌクレオチド配列。
【図１４】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ βＡｒｒ２：β―アレスチン―２のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔαを発現させるためのベクター。ヒトβ―アレスチン―２（遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿００４３１３）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣベクターのβ−ｇａｌΔα骨格にクローニングした。
【図１５】ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ βＡｒｒ２：β―アレスチン―２のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔωを発現させるためのベクター。ヒトβ―アレスチン―２（遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿００４３１３）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣベクターのβ−ｇａｌΔω骨格にクローニングした。
【図１６】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ βＡｒｒ１：β―アレスチン―１のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔαを発現させるためのベクター。ヒトβ―アレスチン―１（遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿００４０４１）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣベクターのβ−ｇａｌΔα骨格にクローニングした。
【図１７】ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ βＡｒｒ１：β―アレスチン―１のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔωを発現させるためのベクター。ヒトβ―アレスチン―１（遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿００４０４１）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣベクターのβ−ｇａｌΔω骨格にクローニングした。
【図１８】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ β２ＡＲ：β２アドレナリン受容体のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔαを発現させるためのベクター。ヒトβ２アドレナリン受容体（遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿００００２４）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣベクターのβ−ｇａｌΔα骨格にクローニングした。
【図１９】ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ β２ＡＲ：β２アドレナリン受容体のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔωを発現させるためのベクター。ヒトβ２アドレナリン受容体（遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿００００２４）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣベクターのβ−ｇａｌΔω骨格にクローニングした。
【図２０】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ Ａ２ａＲ：アデノシン２ａ受容体のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔαを発現させるためのベクター。ヒトアデノシン２ａ受容体（遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿０００６７５）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣベクターのβ−ｇａｌΔα骨格にクローニングした。
【図２１】ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣ Ａ２ａＲ：アデノシン２ａ受容体のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔωを発現させるためのベクター。ヒトアデノシン２ａ受容体（遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿０００６７５）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣベクターのβ−ｇａｌΔω骨格にクローニングした。
【図２２】ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣ Ｄ１：ドパミンＤ１受容体のＣ末端に融合させてβ−ｇａｌΔαを発現させるためのベクター。ヒトドパミンＤ１受容体（遺伝子バンク受入番号：Ｘ５８９８７）のコード配列は、ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣベクターのβ−ｇａｌΔα骨格にクローニングした。
【図２３】本発明の方法で用いられている相補技術の図解。図２３では、対応する融合パートナー、ＧＰＣＲおよびβ−アレスチンが相互作用すると活性化する、２つの不活性な変異した受容体酵素を示している。
【図２４】β−ｇａｌΔαと融合させ、セロトニン／トレオニンのアミノ酸配列を挿入してＧＰＣＲを発現させるためのベクター。既知あるいはオーファンＧＰＣＲのオープン・リーディング・フレームを設計し、ＳＳＳ（セロトニン、セロトニン、セロトニン）などのセロトニン／トレオニン配列をＣ末端に追加している。設計したＧＰＣＲは、ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣベクターのβ−ｇａｌΔα骨格にクローニングしている。ｐＩＣＡＳＴ ＡＬＣベクターは、ＭＣＳ、β−ｇａｌΔα骨格の中で標的タンパク質をクローニングするための複数のクローニング部位、ＧＳリンカー、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ＮｅｏＲ、ネオマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、リボソーム内部進入部位、ＣｏｌＥｌｏｒｉ、Ｅ．ｃｏｌｉの成長複製点、５’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲおよび３’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ウイルスプロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ白血病ウイルス由来のポリアデニル化シグナルなどの機能を持つ。
【図２５】β−ｇａｌΔωと融合させ、変異型（Ｒ１７０Ｅ）β−アレスチン２を発現させるためのベクター。アルギニン１７０をグルタミン酸に変換するポイントミューテーションを行うため、β−アレスチン２のオープン・リーディング・フレームを設計している。変異型β−アレスチン２は、ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣベクターのβ−ｇａｌΔω骨格中にクローニングしている。ｐＩＣＡＳＴ ＯＭＣベクターは、ＭＣＳ、β−ｇａｌΔα骨格の中で標的タンパク質をクローニングするための複数のクローニング部位、ＧＳリンカー、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、Ｈｙｇｒｏ、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、リボソーム内部進入部位、ＣｏｌＥｌｏｒｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ中の成長複製点、５’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲおよび３’ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ウイルスプロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ白血病ウイルス由来のポリアデニル化シグナルなどの機能を持つ。
【図２６】リン酸化非感受性変異株Ｒ１７０Ｅ β−アレスチン２Δωが、アゴニストの活性化に反応してβ２ＡＲΔαに結合。β２ＡＲΔα Ｃ２親細胞株は、変異型Ｒ１７０Ｅ β−アレスチン２Δωと形質導入した。２構造を共発現したクローン個体は、９６ウェルプレートに１０，０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて播種し、指示された期間、１０μＭ （−）イソプロテレノール、０．３ｍＭアスコルビン酸を処理した。β−ガラクトシダーゼ活性は、Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌ−ＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイ系の基質（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を加えて測定し、発光はＴｒｏｐｉｘ ＩＲ７１７ＴＭ照度計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。処理は３回行った。比較のため、β２ＡＲΔαおよび野生型β−アレスチン２Δωを共発現したクローン細胞株（４３−８）を１０，０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて播種し、同様のアゴニスト処理を行った。（−）イソプロテレノール処理後の時間（分）はＸ軸に示され、β−ガラクトシダーゼ活性は相対的な光ユニット（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ： ＲＬＵ）としてＹ軸に示されている。
【図２７】ＧＰＣＲのダイマー形成は、β−ガラクトシダーゼの相補性により測定した。ＧＰＣＲのホモ、ヘテロダイマー形成をモニターする上での、本発明の利用を図解している。１つ目のＧＰＣＲは１つの酵素補部フラグメントに融合させ、２つ目のＧＰＣＲは２つ目の酵素補部フラグメントに融合させている。２つのＧＰＣＲの相互作用は、活性酵素複合体を生成する酵素フラグメントの相補性によりモニターしている（β−ガラクトシダーゼ活性など）。ＧＰＣＲのホモ、ヘテロダイマー形成は、リガンド、アゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニストの有無に関わらず、モニターすることができる。
【図２８】ＩＣＡＳＴＴＭ系における、変異型β−ガラクトシダーゼの相補性によるオーファン受容体のリガンドスクリーニング（ｌｉｇａｎｄ ｆｉｓｈｉｎｇ）。オーファンＧＰＣＲ用のｌｉｇａｎｄ ｆｉｓｈｉｎｇおよびアゴニスト／アンタゴニストスクリーニングに対する、本発明利用の図解。例として、２種類のβ−ｇａｌ融合タンパク質、ＧＰＣＲｏｒｐｈａｎ−ΔαおよびアレスチンΔωを発現したテスト細胞に、天然あるいは合成の化合物ライブラリ、組織抽出物、培養細胞のならし培地から採取したサンプルを処理している。処理後にβ−ｇａｌ活性が上昇したことから、テストサンプル中のリガンドにより、オーファン受容体が活性化されたことが示されている。β−ｇａｌ活性の上昇値は、β−アレスチンと活性化したＧＰＣＲオーファン受容体との相互作用を反映している。従って、テスト受容体の同系リガンドあるいは代理リガンドが示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１１Ａ】
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【図１２Ａ】
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【図１３Ａ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際公開パンフレット】
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