(57)【要約】本発明は、特定のエキソン配列サブセットによりコードされる単数又は複数の全く異なるタンパク質ドメインから成る一次翻訳産物のフラグメントである機能タンパク質ドメインを産生する方法を提供する。該方法は、単一の相同性組換え事象により、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン配列に直接隣接するイントロンゲノミック領域のレベルで一次翻訳産物についてコードする真核性遺伝子の中に調節単位を組込むことに基づいている。
2004504840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端又はＮ末端のいずれかである機能タンパク質ドメインであるタンパク質の産生方法において、該タンパク質が前記一次翻訳産物の生物活性と全く異なる生物活性をもち、
（ｉ）（ａ）該タンパク質をコードするＤＮＡの転写及び翻訳を開始するか又は終結させる能力をもつ調節ＤＮＡ；及び
（ｂ）該タンパク質についてコードする配列に対しそれぞれ５′又は３′のいずれかのところに標的遺伝子の１領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティングセグメント；
を含むＤＮＡ構成体によるトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、該構成体は、該タンパク質の発現が調節ＤＮＡの制御下にあるような形でＤＮＡターゲティングセグメントにより決定された位置で、宿主細胞のゲノミックＤＮＡ内に組込まれる、段階、そして任意には、
（ｉｉ）相同的に組換え型の細胞を培養する段階；そして任意には、
（ｉｉｉ）機能性タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端又はＮ末端のいずれかである機能タンパク質ドメインである１つのタンパク質についてコードする１又は複数のエキソンを選択的に発現するための方法において、前記１又は複数のエキソンによりコードされるタンパク質が一次翻訳産物の生物活性と全く異なる生物活性をもち、
（ａ）機能タンパク質ドメインに対応するタンパク質をコードする１又は複数のエキソンの転写及び翻訳を開始するか又は終結させる能力をもつ調節ＤＮＡ配列；
（ｂ）該タンパク質についてコードするエキソン（単複）に対しそれぞれ５′又は３′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティングセグメント；
を含むＤＮＡ構成体によるトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、該構成体は、１又は複数のエキソンの発現が調節ＤＮＡの制御下にあるような形でＤＮＡターゲティングセグメントにより決定された位置で、宿主細胞のゲノミックＤＮＡ内に組込まれる、段階、
を含んで成る方法。
【請求項３】
標的遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端に対応し、少なくともイントロン含有標的遺伝子の最３′エキソンによってコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生する方法において：
（ｉ）相同な組換えによる宿主細胞ゲノム内の組込みを経て前記エキソンに操作可能な形で連結されるＤＮＡ構成体をもつ宿主細胞を増殖させる段階であって、前記構成体が、
（ａ）該タンパク質をコードする１又は複数のエキソンに対し５′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域：
（ｂ）機能タンパク質ドメインをコードするＤＮＡの転写を活性化する能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）機能タンパク質ドメインの翻訳を開始する能力をもつＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール； そして任意には、
（ｄ）機能タンパク質ドメインのＮ末端をコードする内因性エキソンの不対合３′スプライス受容部位を補完することにより、一次写しのスプライシングを可能にして、機能タンパク質ドメインをコードする配列に対する翻訳モジュールの「枠内」並置を結果としてもたらす、不対合５′スプライス供与部位を含むスプライシングモジュール；
を含んで成る段階、そして任意には、
（ｉｉ）相同に組換え型である細胞を培養する段階；そして任意には、
（ｉｉｉ）機能タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法。
【請求項４】
翻訳モジュールが５′の未翻訳領域を含み、翻訳開始コドンが、機能タンパク質ドメインのＮ末端をコードするエキソンの中か又は機能タンパク質ドメインのＮ末端をコードするエキソンに対し５′にあるイントロンの中のいずれかに含まれている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
翻訳モジュールが、スプライシングモジュールにより機能タンパク質ドメインをコードする配列と「同一枠内」に置かれ機能タンパク質ドメインのＮ末端残基となる翻訳開始コドン及び５′の未翻訳領域を含む１又は複数の天然又は合成エキソンを含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記天然又は合成エキソン（単複）がシグナルペプチド又はそのＮ末端をコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
標的遺伝子の一次翻訳産物のＮ末端に対応し、少なくともイントロン含有標的遺伝子の１又は複数の最５′エキソンによってコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生する方法において：
（ｉ）相同な組換えによる宿主細胞ゲノム内の組込みを経て前記エキソンに操作可能な形で連結されるＤＮＡ構成体によるトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、前記構成体が、
（ａ）該タンパク質をコードする１又は複数のエキソンに対し３′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域：
（ｂ）ゲノミックＤＮＡの転写を終結させる能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）機能タンパク質ドメインの翻訳を終結させるＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール； そして任意には、
（ｄ）機能タンパク質ドメインのＣ末端をコードする内因性エキソンの５′不対合スプライス供与部位を補完することにより、一次写しの正しいスプライシングを可能にして、機能タンパク質ドメインをコードする配列に対する翻訳モジュールの「枠内」並置を結果としてもたらす、不対合３′スプライス受容部位を含むスプライシングモジュール；
を含んで成る段階、そして任意には、
（ｉｉ）相同に組換え型である細胞を培養する段階；そして任意には、
（ｉｉｉ）機能タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法。
【請求項８】
翻訳モジュールが３′の未翻訳領域を含み、翻訳終止コドンが、機能タンパク質ドメインのＣ末端をコードするエキソンに対し５´にあるイントロンの中に含まれている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
翻訳モジュールが、スプライシングモジュールにより機能タンパク質ドメインをコードする配列と「同一枠内」に置かれ機能タンパク質ドメインの翻訳終止コドンとなる翻訳終止コドン及び３′の未翻訳領域を含む１又は複数の天然又は合成エキソンを含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記１又は複数の天然又は合成エキソンが、機能タンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンと同一枠内に置かれた時点で、標的遺伝子によってコードされる一次翻訳産物内に含まれたタンパク質配列と非相同なタンパク質配列をコードする、請求項５、６又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１又は複数の天然又は合成エキソンが、機能タンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンと同一枠内に置かれた時点で、標的遺伝子によりコードされる一次翻訳産物内に含まれたタンパク質配列と相同なタンパク質配列をコードする、請求項５、６又は９に記載の方法。
【請求項１２】
前記１又は複数の天然又は合成エキソンがさらに、タンパク質分解酵素の認識部位をコードする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質分解酵素が宿主細胞により発現される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質分解酵素が市販のプロテアーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ターゲティングセグメントが２つのターゲティングセグメントで構成されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
構成体がさらに１又は複数の選択可能な及び／又は増幅可能なマーカー遺伝子を含んで成る、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
機能タンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンを含有する標的遺伝子の一次翻訳産物がホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、膜結合タンパク質、トランスメンブランタンパク質、細胞外基底膜、細胞内タンパク質、核タンパク質、細胞成長及び代謝調節因子、酵素、レセプタ、血液製剤又はモノクローナル抗体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
機能タンパク質ドメインが可溶性ＴＲＡＮＣＥ、エンドスタチン、Ｔｒｘ８０、チロシン−ｔＲＮＡシンセターゼ由来サイトカイン、又は免疫グロブリンの抗原結合部位に対応する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
片端には内因性転写及び翻訳制御要素、中央には機能タンパク質ドメインに結合された１又は複数の内因性エキソン及び１又は複数のイントロン、並びにもう１方の端部には外因性転写及び翻訳制御要素を含有する真核細胞のゲノム内に組込まれた組換え型遺伝子。
【請求項２０】
標的遺伝子の一次翻訳産物のＮ末端に対応し少なくともイントロン含有標的遺伝子の１又は複数の最５′エキソンによりコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生するためのＤＮＡ構成体において：
（ａ）　該タンパク質をコードする１又は複数のエキソンに対するゲノミック領域３′と相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域；
（ｂ）　機能タンパク質ドメインをコードするＤＮＡの転写を終結させる能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）　機能タンパク質ドメインの翻訳を終結させる能力をもつＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール；そして任意には；
（ｄ）　不対合３′スプライス受容部位を含むスプライシングモジュール、
を含んで成るＤＮＡ構成体。
【請求項２１】
標的遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端に対応し少なくともイントロン含有標的遺伝子の１又は複数の最３′エキソンによりコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生するためのＤＮＡ構成体において：
（ａ）　該タンパク質をコードする１又は複数のエキソンに対するゲノミック領域５′と相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域；
（ｂ）　機能タンパク質ドメインをコードするＤＮＡの転写を活性化させる能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）　機能タンパク質ドメインの翻訳を開始させる能力をもつＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール；そして任意には；
（ｄ）　不対合５′スプライス供与部位を含むスプライシングモジュール、
を含んで成るＤＮＡ構成体。
【請求項２２】
翻訳モジュールが単数又は複数の合成又は天然の１又は複数のエキソンを含んで成る、請求項２０又は２１に記載の構成体。
【請求項２３】
ターゲティング領域の２つのターゲティングセグメントから成る、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の構成体。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって得られた相同的に組換え型の細胞。
【請求項２５】
ヒト細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質特に機能タンパク質ドメインの産生方法に関する。
発明の背景
タンパク質の機能性は、異なるレベル、すなわち一次構造（遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対応するもの）、二次構造（配列的に連続する残基の好ましい相対的バックボーン場所）、三次構造（ポリペプチド鎖の全原子の相対的位置）及び四次構造（各々全く異なるポリペプチド鎖に対応する異なるタンパク質サブユニットの、１つの複合体の形への配置）に組織されているその構造的特性に密に関係している。
【０００２】
これらの組織レベルに加えて、問題のポリペプチドは、２つの要素で定義できるタンパク質ドメインに対応し得る。構造的な視点から見ると、ドメインというのは、単数又は複数の二次及び／又は三次構造を含む、ち密に折りたたまれたポリペプチドの１領域である。小さいタンパク質（アミノ酸１００個未満）は往々にして、単一の構造タンパク質ドメインから成り、一方さらに大きいタンパク質は、通常多数の構造タンパク質ドメインから成る。１つのタンパク質の３次元構造においては、構造タンパク質ドメインは、タンパク質のその他の部分とは全く異なる独立して折りたたまれたポリペプチドの一単位として考えられる。この構造的定義に結びつけられる、１タンパク質ドメインの第２の見方は、それが、単数又は複数のタンパク質、核酸、糖、脂質又はその他のあらゆる有機又は無機化合物とのその相互作用の結果として得られる１つの機能を保持するタンパク質の１つの最小片である、というものである。１つの機能ドメインは、一般に５０〜３５０個のアミノ酸から成り、従って、単数又は複数の構造ドメインで構成され得る。
【０００３】
天然には、タンパク質は、互いに配列的にリンクされ三次元配置されている単数又は複数の機能タンパク質ドメインを含有することができる。１クラスの構造ドメインに対する特定のアミノ酸配列の割当ては、ＮＭＲ又はＸ線結晶学によって可能であるが、一方、１つのタンパク質配列が１つの機能に結びつけられるということの実証は、ほとんどの場合、既知の機能タンパク質ドメインに対する配列相同性を固定しかつ／又は いわゆる構造−活性又は構造−機能研究において関連する生化学又は生物学的検定の中でテストすべきもとのタンパク質の改変された形態を生成することによって得られる。
【０００４】
多くのタンパク質は、おそらくは「エキソンシャッフリング」と呼ばれるプロセスの結果として、非常に相同性の高い機能及び／又は構造タンパク質ドメインを共有している。この進化理論に従って、タンパク質「モジュール」についてコードする既存のエキソンの一連の重複、イントロン組換え、コンビナトリアルな組立て、及び突然変異を通して、一定数の遺伝子が作り出されてきた（Ｐａｔｔｈｙ Ｌ， Ｇｅｎｅ（１９９９），２３８（１）；１０３−１１４）。
【０００５】
真核生物ではタンパク質の進化が同様に親ゲノムの性的イントロン相同性組換えによっても媒介され、特異的タンパク質ドメインに会合したエキソンの組合せから新しい遺伝子を作り出すという考えは、タンパク質ドメイン間の構造的境界に対するイントロンの位置と位相の関係を一連の研究が実証していることにも起因して、現在広く受入れられている（ｄｅ Ｓｏｕｚａ ＳＪ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ， Ａｃａｄ Ｓｕ ＵＳＡ（１９９６）， ９３（２５）：１４６３２−６）。有意な数の状況において、ゼロ期（イントロンがコドンを中断しない）にある又はつねに同じ期にあるイントロンにより制限された１又は複数のエキソンに関係していることは明白である。このようにして、かかる「移動」ドメインについてコードするエキソンは、枠の問題が全くない状態で、かかるタンパク質モジュールのモザイクで構成された新しいタンパク質の中にさらに容易に組合され得る（ｄｅ Ｓｏｕｚａ ＳＪ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９９８），９５（９）：５０９４−９；Ｋｏｌｋｍａｎ ＪＡ． ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２００１），１９（５）：４２３−８）。
【０００６】
しかしながら、機能タンパク質ドメインが、一次翻訳産物の残りの部分から物理的に分離されているとき完全タンパク質すなわち１つの遺伝子から転写されたｍＲＮＡを直接翻訳することによって得られるタンパク質の状況下で及ぼされるものとは明らかに全く異なる生物活性を及ぼしうるということも又示されてきた。かかる機能タンパク質ドメインは、例えば一次翻訳産物が細胞膜上に分泌されるか又は露呈された時点で、一次翻訳産物自体をコードする細胞又はその他の細胞によって産生されるエンドペプチターゼによって実施されうるタンパク質分解分割の後に、ｉｎ ｖｉｖｏで得られる。かかる事象は、まずまず頻繁に特徴づけされるようになってきており、こうして産生された機能タンパク質ドメインが重要な生理学的活性をもち得ることは明白である（Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ ＬＬ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ ＥＪ， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．（１９９８），５（３）：Ｒ４９−Ｒ６２；Ｈａｌｉｍ ＮＳ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（２０００），１（１６）：２０；Ｂｌｏｂｅｌ ＣＰ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０００）、１２（５）：６０６−６１２）。
【０００７】
商業的な価値を有する多くの真核性タンパク質が、一定数のケースにおいて全遺伝子を作り上げているコーディングエキソンのサブセットによってコードされるこれらの機能タンパク質ドメインに対応している。
【０００８】
一例としては、細胞外基質のコラーゲンタンパク質であるコラーゲンＸＶＩＩＩ １アルファのＣ末端タンパク質分解フラグメントに対応する脈管形成及び腫瘍成長外因性阻害物質であるエンドスタチンがある。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩ １アルファ（ＣＯＬ１８Ａ１）遺伝子の３′末端にある３エキソンによって基本的にコードされるが、それは、一次翻訳産物であるコラーゲンＸＶＩＩＩ．アルファ−１からタンパク質分解によって放出された後に初めて完全に機能的となる（Ｏ′Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ（１９９７），８８（２）：２７７−２８５）。
【０００９】
もう１つの例としては、破骨細胞の発達を引き起こす遺伝子の急速な誘発を活性化するシグナリング経路に関与するＩＩ型膜内外タンパク質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−関連の活性化により誘発されたサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ、ＲＡＮＫＬ、ＯＰＧＬ又はＯＤＦとも呼ばれる）がある。ＴＲＡＮＣＥは、メタロプロテアーゼ−ディスインテグリンＴＮＦ−アルファコンベルターゼ（ＴＡＣＥ）により分割され、強力な樹状細胞生存及び破骨細胞原性活性をもつ完全に機能的なタンパク質である可溶性ＴＲＡＮＣＥを生成する。細胞膜結合型一次翻訳産物として作られる。この可溶性タンパク質は、ＴＲＡＮＣＥ遺伝子の最後の３つのエキソンによってコードされるものに対応する（Ｌｕｍ Ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９９），２７４（１９）：１３６１３−８）。
【００１０】
機能タンパク質ドメインの商業的規模の産生のためには、各々がその欠点を有する２つの主たる代替案が存在する。
【００１１】
その１つでは、自然をまねて第１の例では一次翻訳産物を産生し、その後これをタンパク質分解により処理して所望のタンパク質を得ることを試みることができるであろう。
【００１２】
組換え型ＤＮＡ技術によりこのプロセス全体を行なうことは、技術的に厳しいものである。一次翻訳産物を発現させなければならないばかりでなく、所望の機能タンパク質ドメインに特異的なタンパク質分解酵素も同定し、発現させ、さらなる処理の前に適切な分割を確保するべく細胞モデル内又はｉｎ ｖｉｔｒｏシステム内のいずれかで一次翻訳産物と相互作用できるようにしなければならない。
【００１３】
第２のアプローチとしては、もとのｍＲＮＡ又は遺伝子から単離された機能タンパク質ドメインのためのＤＮＡコーディング配列のみを含む発現構成体を調製することができる。この一般的に用いられている技術でさえも、組換え型産物の発生をかなり遅延させ得る一連の作業を必要とする（Ｍａｋｒｉｄｅｓ ＳＣ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．（１９９９），１７（２）：１８３−２０２；Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１），１６（２）：１５１−６０）。宿主細胞内での適正な発現のために必要な全ての転写及び翻訳制御要素を含有する発現ベクターへとさらにサブクローニングされ得るような形で修飾されなくてはならない問題のコーディング配列を全ｃＤＮＡ配列から単離することが必要である。このとき、構成体は、宿主細胞を形質転換するために用いられ、適正にかつ高いレベルで外因性タンパク質を発現するクローンを単離するため、形質転換体に対してスクリーニング手順が適用される。
【００１４】
関連するクローンの単離は、先に列挙した必要条件に加えて通常の発現ベクターを宿主細胞のゲノミック配列と組換する必要があるために、時間のかかる作業となりうる。染色体外に維持された発現構成体は、不安定でかつ、通常商業的規模での産生を可能にするのに不充分であるタンパク質の過渡的な発現しか可能にしない。
【００１５】
従って、当初形質転換された細胞のその後のＤＮＡ複製及び有糸分裂サイクルによって生成された全ての細胞に対し発現構成体を伝達するためには、コーディング及び非コーディング外因性ＤＮＡ及び宿主細胞ゲノミックＤＮＡが関与する組換え事象が必要である。発現ベクターのいかなる特異的特長も外因性配列の宿主細胞ゲノム内への完全な取込みを駆動できないことから、このプロセスは同様に全く無作為で誤りに陥りやすいものである。かくして、相同性組換えよりも数ケタ頻度の高いものであることがわかっている非相同組換え事象のために、細胞は、任意の内因性配列とのきわめて低いものでさえある相同性をもつそのいずれかの部分を使用する可能性があり、往々にして、必要な外因性配列の不完全な取込みが結果としてもたらされることになる。
【００１６】
これらの問題から、発現構成体が不完全な形で取込まれた形質転換体を除去することを目的とする遺伝的富化及び選択手順の開発が導かれる。外因性配列のいくつかの必須部分は組換えプロセス中に失なわれるか又は改変された可能性があることから、問題のコーディング配列は、突然変異を受けるか、又は切形にされるか又は全く発現されないかもしれない。いずれの場合でも、ＤＮＡを導入し細胞を選択するためにいかなる技術が使用されるにせよ、大部分の形質転換体は、予想されたタンパク質を産生することができない。
【００１７】
最後に、文献中では、真核細胞内の組換え型タンパク質の適正な発現が、特定の宿主細胞に関係する数多くの要因によって左右されるということが充分に立証されている。組換え型タンパク質の毒性度、ｍＲＮＡ処理及び安定性及びその他の翻訳後事象といったような特長は、産物自体、発現ベクター中のコーディング及び非コーディング配列の両方、そして宿主細胞のゲノム背景と外因性配列の相互作用に厳密に関係している。実際、ＤＮＡを何キロベースも含有しうる完全組換え型遺伝子の無作為挿入は、宿主細胞のゲノムをひどく混乱させ、その安定性及び生存可能性を危うくする可能性がある。従って、たとえ外因性配列が完全に組込まれたとしても、かかる配列が細胞代謝及び／又は複製のために重要なゲノミック配列を分断する場合にはつねに、タンパク質を産生するために一部のクローンを使用することができない。かかるクローンは、細胞培養中の選択的圧力に起因して失なわれる可能性があり、又そうでない場合には、あまりにもゆっくりと複製するために、満足のいく効率で所望のタンパク質を安定した形で発現する充分な細胞を得ることが困難である。
【００１８】
基本的に無制御の外因性遺伝子取込みの欠点を最小限におさえるために、代替的戦略が開発された。これらは大部分が、哺乳動物細胞の予め定められたゲノミック配列内への特異的外因性配列の挿入を可能にする独特の技術である相同的組換えに基づいている。この技術は大部分が、近年再考されてきたように（Ｍｕｌｌｅｒ Ｕ， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ．（１９９９），８２（１−２）：３−２１；Ｓｅｄｉｖｙ ＪＭ ａｎｄ Ｄｕｔｒｉａｕｘ Ａ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．（１９９９），１５（３）：８８−９０），動物及び細胞モデル内の遺伝子又は調節配列を修飾して、分断された非機能的又はキメラ遺伝子を生成することによってこれらの遺伝子又は調節配列の特徴づけのために使用されてきた。ホルモン調節、生殖能、免疫応答、器官の発達といったようなさまざまな表現型特長に対する遺伝的改変の効果を研究するために、マウス胚芽基幹（ＥＳ）細胞のゲノム内にさまざまなベクター及び選択可能なマーカー遺伝子が導入されてきた。
【００１９】
組換え型タンパク質の産生のための相同的組換えをベースとする技術の実現可能性は、完全内因性遺伝子を外因性転写調節配列の制御下に置くことにより得られた全一次翻訳産物のレベルで実証されてきた（ＷＯ９１／０９９５５、ＷＯ９５／３１５６０）。代替的には、ひとたび細胞内にトランスフェクションされた時点で、全コーディング配列を通って進むべくリボソームを遮断する内因性ｍＲＮＡに対合し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、切形タンパク質を得ることができる（ＷＯ９７／２３２４４）。しかしながら、文献中の文書のいずれも、外因性調節配列を組込むことによって一次翻訳産物内に含まれた機能タンパク質ドメインをコードする内因性標的遺伝子の単数又は複数のエキソンを選択的に発現するための相同的組換えの使用を示唆していない。
【００２０】
発明の要約
現在、例えば少なくともイントロン含有遺伝子の最５′又は３′エキソン（単複）によってコードされる一次翻訳産物のＮ又はＣ末端に対応する場合、機能タンパク質ドメインを産生できるさらなる方法が存在するということが発見された。
【００２１】
かくして、本発明の第１の態様に従うと、
１つの遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端又はＮ末端のいずれかに対応する機能タンパク質ドメインであるタンパク質の産生方法において、該タンパク質が前記一次翻訳産物の生物活性と全く異なる生物活性をもち、
（ｉ）（ａ）該タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写及び翻訳を開始するか又は終結させる能力をもつ調節ＤＮＡ；及び
（ｂ）該タンパク質についてコードする配列に対しそれぞれ５′又は３′のいずれかのところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティングセグメント；
を含むＤＮＡ構成体によるトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、該構成体は、該タンパク質の発現が調節ＤＮＡの制御下にあるような形でＤＮＡターゲティングセグメントにより決定された位置で、宿主細胞のゲノミックＤＮＡ内に組込まれる段階；
（ｉｉ）相同的に組換え型の細胞を培養する段階；
（ｉｉｉ）機能性タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法が提供されている。
【００２２】
本発明は、単数又は複数のコーディングエキソンに片端において、一次翻訳産物のセグメントとしてではなく全く異なる分子としてそれらの発現及び直接的翻訳に必要な調節ＤＮＡ配列が欠如している、細胞内の機能タンパク質ドメインを形成するタンパク質の産生のために有用である。タンパク質という語の中に含まれるのは、短かいペプチド及びオリゴペプチド（例えば最高３０個のアミノ酸残基を含有するもの）ならびにさらに長いポリペプチド（３０個を超えるアミノ酸残基を含有するもの）である。本発明を用いて産生可能なペプチド及びポリペプチドには、一次翻訳産物のタンパク質分解成熟により産生されるものが含まれる。
【００２３】
本発明は同様に、
遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端又はＮ末端配列のいずれかに対応する配列をもつ機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンを選択的に発現するための方法において、前記１又は複数のエキソンによりコードされるタンパク質が一次翻訳産物の生物活性と全く異なる生物活性をもち、
（ａ）機能タンパク質ドメインに対応するタンパク質をコードする１又は複数のエキソンの転写及び翻訳を開始するか又は終結させる能力をもつ調節ＤＮＡ配列；
（ｂ）該タンパク質についてコードする１又は複数のエキソンに対しそれぞれ５′又は３′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域；
を含むＤＮＡ構成体によるトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、該構成体は、１又は複数のエキソンの発現が調節ＤＮＡの制御下にあるような形でＤＮＡターゲティングセグメントにより決定された位置で、宿主細胞のゲノミックＤＮＡ内に組込まれている段階、
を含んで成る方法をも開示している。
【００２４】
本発明の方法で修飾された宿主細胞は、いかなる特異的細胞又は組織型タンパク質分解修飾もなく、機能タンパク質ドメイン内に直接翻訳される新規のｍＲＮＡ分子として機能タンパク質ドメインについてコードするゲノム内に存在するエキソン配列を選択的に発現する。
【００２５】
好ましい実施形態においては、機能タンパク質ドメインを形成するペプチド又はポリペプチドは、イントロン含有遺伝子の少なくとも最５′又は３′エキソンによってコードされる。かくして、第１の好ましい実施形態においては、
標的遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端に対応し、少なくともイントロン含有標的遺伝子の最３′エキソンによってコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生する方法において：
（ｉ）相同な組換えによる宿主細胞ゲノム内の組込みの後前記エキソンに操作可能な形でリンクされるＤＮＡ構成体でトランスフェクションされた宿主細胞を増殖させる段階であって、前記構成体が、
（ａ）該タンパク質についてコードする１又は複数のエキソンに対し５′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域：
（ｂ）機能タンパク質ドメインをコードするＤＮＡの転写を活性化する能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）機能タンパク質ドメインの翻訳を開始する能力をもつＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール； そして任意には、
（ｄ）機能タンパク質ドメインのＮ末端をコードする内因性エキソンの不対合３′スプライス受容部位を補完することにより、一次写しのスプライシングを可能にして、機能タンパク質ドメインについてコードする配列に対する翻訳モジュールの「枠内」並置を結果としてもたらす、不対合５′スプライス供与部位を含むスプライシングモジュール；
を含んで成る段階；
（ｉｉ）相同に組換え型である細胞を培養する段階；
（ｉｉｉ）機能タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法が提供されている。
【００２６】
適切には、本発明のこの実施形態においては、構成体は、機能タンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンについての適正な転写及び翻訳開始を可能にする調節単位を形成する外因性配列を提供するはずである。ＤＮＡターゲティング領域は、機能タンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンに属する配列を伴って又は伴わずに、（その５′末端にある標的遺伝子の隣接するイントロンといったような）機能タンパク質ドメインタンパク質についてコードする配列に対し５′にあるゲノミック領域に属する配列によって形成されることになる。相同性領域の長さを増大させる必要がある場合には、標的遺伝子（又は場合によってはコンティグ遺伝子）のコンティグコーディング及び／又は非コーディング配列に属するＤＮＡ配列を内含させることもできる。
【００２７】
翻訳を開始するのに必要なメチオニン（ＡＴＧ）コドンは、優れたコザック配列状況下になくてはならず、これは、機能タンパク質ドメインのＮ末端を含有するエキソンによって、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン（単複）に対し５′のところにあるイントロンによって提供され得、そうでなければ、機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンと転写を開始するべく調節単位内に含まれた外因性配列の間に挿入された単数又は複数の天然又は合成エキソンの付加によって内因性コーディング配列に操作可能な形で連結され得る。翻訳開始コドンが内因性である場合、転写モジュールは、適切な５′未翻訳領域を含むことになる。
【００２８】
不対合スプライシング供与部位を含むスプライシングモジュールは、機能タンパク質ドメインのＮ末端についてコードするエキソンに隣接する天然又は合成のエキソンに会合させられる。スプライシングモジュールは、スプライシングプロセスの後機能タンパク質ドメインの同じ枠内に置かれた時点でメチオニンコドンが機能タンパク質ドメインのＮ末端残基になることができるようにするはずである。この実施形態においては、一次翻訳産物についてコードする標的遺伝子は、充分なレベルですでに発現されていてもいなくてもよいが、外因性調節配列は、機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンに対し５′のところに新しい転写及び翻訳開始部位が得られるようにするはずである。
【００２９】
図１Ａ−Ｆには、本発明のこの実施形態を実施するいくつかの例が示されている。
【００３０】
本発明の第２の好ましい実施形態においては、
標的遺伝子の一次翻訳産物のＮ末端に対応し、少なくともイントロン含有標的遺伝子の１又は複数の最５′エキソンによってコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生する方法において：
（ｉ）相同な組換えによる宿主細胞ゲノム内の組込みの後前記エキソンに操作可能な形で連結されるＤＮＡ構成体でのトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、前記構成体が、
（ａ）該タンパク質についてコードする１又は複数のエキソンに対し５′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域：
（ｂ）ゲノミックＤＮＡの転写を終結させる能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）機能タンパク質ドメインの翻訳を終結させるＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール； そして任意には、
（ｄ）機能タンパク質ドメインのＣ末端をコードする内因性エキソンの不対合５′スプライス供与部位を補完することにより、一次写しの正しいスプライシングを可能にして、機能タンパク質ドメインについてコードする配列に対する翻訳モジュールの「枠内」並置を結果としてもたらす、不対合３′スプライス受容部位を含むスプライシングモジュール；
を含んで成る段階；
（ｉｉ）相同に組換え型である細胞を培養する段階；
（ｉｉｉ）機能タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法が提供されている。
【００３１】
適切には、本発明のこの実施形態において、構成体は、機能タンパク質ドメインを形成するタンパク質をコードする１又は複数のエキソンについての適正な転写及び翻訳終結を可能にする外因性配列を提供するはずである。ＤＮＡターゲティング領域は、タンパク質のＣ末端をコードするエキソン又はその３′末端にあるイントロンのいずれか又は両方に属する配列を伴って又は伴わずに、（その３′末端にある標的遺伝子の隣接するイントロンといったような）機能タンパク質ドメインタンパク質についてコードする配列に対し３′にあるゲノミック領域に属する配列によって形成されることになる。相同性領域の長さを増大させる必要がある場合には、標的遺伝子（又は場合によってはコンティグ遺伝子）のコンティグコーディング及び／又は非コーディング配列に属するＤＮＡ配列を内含させることもできる。
【００３２】
翻訳を終結するのに必要なコドンは、機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンに対し３′のところにあるイントロンによって提供されるか又は、機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンと転写を終結するべく相同的組換えにより導入された外因性配列の間に挿入された天然又は１又は複数の合成エキソンの付加によって内因性コーディング配列に操作可能な形で連結されるかのいずれでもありうる。翻訳終止コドンが内因性である場合、転写モジュールは、適切な３′未翻訳領域を含むことになる。
【００３３】
不対合スプライシング受容部位を含むスプライシングモジュールは、機能タンパク質ドメインのＣ末端についてコードするエキソンの近位の天然又は合成のエキソンに会合させられる。スプライシングモジュールは、スプライシングプロセスの後機能タンパク質ドメインの同じ枠内に置かれた時点で、停止コドンが機能タンパク質ドメインの終止用コドンになることができるようにするはずである。この実施形態においては、一次翻訳産物についてコードする標的遺伝子は、充分なレベルですでに発現されていなければならず、外因性配列は、異なる位置で転写及び翻訳を停止させるためだけに必要である。
【００３４】
図１−Ｇ−Ｌには、この実施形態を実施するいくつかの例が示されている。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、ひとたび相同的組換えによりゲノム内に適正に組込まれた時点で、一次翻訳産物をコードする標的遺伝子の中に含まれた全てのエキソンの中で機能タンパク質ドメインをコードするものだけを内含する新規のｍＲＮＡを宿主細胞が発現できるようにする構成体を提供している。
【００３６】
相同的組換えのための戦略の選択は、調節単位が隣接するイントロンの中に挿入された状態になることも又このイントロンの一部分及び同じ遺伝子に属するものの機能タンパク質ドメインについてコードしないゲノミック領域の全て又は一部分に置換することもできることから、標的遺伝子の最終的構造に影響を及ぼす。
【００３７】
機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンを含む遺伝子内に相同的組換えになって組込まれた調節単位は、転写モジュール、翻訳モジュールそして任意にはスプライシングモジュールを内含する外因性配列を含有する。かかる外因性配列は、機能タンパク質ドメインを含有する外因性配列と組合わされるべく必要な配列を提供するように意図されている。かくして、宿主細胞のゲノム内には、片端には内因性転写及び翻訳制御要素、中央には機能タンパク質ドメインに会合された１又は複数の内因性エキソン及び１又は複数のイントロン及びもう１方の端部とは外因性転写及び翻訳制御要素を含有する新しい組換え型遺伝子が存在するはずである。
【００３８】
本発明は、エキソン配列の特異的サブセットによってコードされる単数又は複数の全く異なるタンパク質ドメインから成る一次翻訳産物のフラグメントである機能タンパク質ドメインを産生する方法を提供している。該方法は機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン配列に直接隣接するイントロンゲノミック領域のレベルでの一次翻訳産物についてコードする真核性遺伝子内への調節単位の単一の相同的組換え事象による組込みに基づいている。標的遺伝子内の関連するエキソン配列の位置に応じて、かかるイントロンは、機能タンパク質ドメインがそれぞれ一次翻訳産物のＣ末端又はＮ末端にある場合に、エキソン配列に対する５′又は３′に直接存在するものである。
【００３９】
本発明は、技術的現状に比べいくつかの重要な利点を提供する。機能タンパク質ドメインの産生は、機能タンパク質ドメインのコーディング配列を単離しそれをその端部に位置づけされた調節配列の制御下で発現するか又は一次翻訳産物及び機能タンパク質ドメインを生成する特異的プロテアーゼのコーディング配列を単離し両方を発現することによって、当該技術分野において既知の方法により達成される。
【００４０】
本発明は、機能タンパク質ドメインが一次翻訳産物のＣ又はＮ末端フラグメントのいずれかでありかつ対応するゲノミックＤＮＡのエキソン／イントロン構造がわかっている場合につねにかかる機能タンパク質ドメインを産生するための方法を提供する。この方法には、ゲノミックＤＮＡ内でこれらのタンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンに対し（機能タンパク質ドメインがＣ末端フラグメントである場合）５′で、又は（機能タンパク質ドメインがＮ末端フラグメントである場合）３′で外因性調節配列を組込むことが関与している。本発明の方法は、一次翻訳産物をコードする遺伝子とは対照的に、機能タンパク質ドメイン内に細胞により直接転写され翻訳され得る組換え型遺伝子を生成することを可能にする。
【００４１】
相同的組換えの特性に基づく本発明の方法は、機能タンパク質ドメインを産生するべく宿主細胞ゲノムの制御された精確な修飾を可能にする。宿主細胞ゲノム内に組込まれるべき外因性配列の量は、コーディング配列として宿主細胞ゲノム自体の中に存在するもとのコーディング配列が使用されることから、非常に制限されたものである。その上、必要なだけの転写及び／又は翻訳制御要素といったような付加的な要素のみが実際に組込まれる。
【００４２】
機能タンパク質ドメインをコードする宿主細胞配列の使用は、同様に、かかるコーディング配列の組換え由来の改変をことごとく無くすること及び実際に機能タンパク質ドメインの成熟のためにｉｎ ｖｉｖｏで適用されているものと同じ転写後プロセス（例えばスプライシング）及び／又は翻訳後プロセス（例えばグリコシル化、リン酸化）を使用することという両方の利点を提供する。単一調節単位の使用は、機能タンパク質ドメインをコードするセグメントを単離しそれを発現ベクターに適合させるべく一次翻訳産物についてコードする相補的ＤＮＡを操作する必要性を無くする。
【００４３】
最後に、ゲノミック発現構成体（すなわち単数又は複数の合成及び／又は天然イントロンを含有するもの）が、おそらくはスプライシングプロセスに起因して、イントロンが欠如した同一の構成体（すなわち文献中で開示された技術を用いて一般に得られるもの）よりもさらに効率良く発現されるということが実証されてきた。本発明の方法は、機能タンパク質ドメインについてコードする配列を天然に中断するイントロンを使用することによって、外因性イントロン配列を導入することを回避している。
【００４４】
発明の詳細な説明
以下の段落では、本発明の基本的要素について、相同的組換え技術（Ｍｕｌｌｅｒ Ｕ， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ．（１９９９），８２（１−２）：３−２１；Ｈａｓｔｙ Ｐ ｅｔ ａｌ．，「遺伝子ターゲティング：その実践的アプローチ」内、ｅｄ． Ｊｏｙｎｅｒ ＡＬ， ｐｕｂ． Ｏｘｆｏｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ， １９９９，１−３５）及びタンパク質発現技術（Ｍａｋｒｉｄｅｓ ＳＣ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．（１９９９），１７（２）：１８３−２０２；Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ， Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１），１６（２）：１５１−６０）に関する文献を参照しながら適切に記述する。
【００４５】
機能タンパク質ドメイン
「機能タンパク質ドメイン」（ＦＤＤ）という表現は、１つのタンパク質のフラグメントが生物学的機能を発揮する１つの遺伝子の一次翻訳産物であることを意味している。（互いに同一の又は異なるものである）単数又は複数の構造タンパク質ドメインから成り得る機能タンパク質ドメインは、独立した折畳み単位として適切に折畳みを行ない、予想された生物活性を発揮するのに必要な全ての生物理学的特長を含むはずである。
【００４６】
１つの細胞のゲノミックＤＮＡという状況下では、機能タンパク質ドメインが遺伝子の全コーディング領域の一部分によりコードされ、その間、一次翻訳産物は、１つの遺伝子のコーディング配列全体によりコードされる。機能タンパク質ドメインをコードするゲノミック配列には、一方の端部又は両方の端部のいずれかで、一次転写及び翻訳一次産物を生成するべく細胞の発現機構によって認識される適切に位置づけされた調節配列が欠如している。その結果として機能タンパク質ドメインは、細胞により転写されたｍＲＮＡ内に含まれた翻訳済み領域の一部分に対応し、両端で活性な調節配列が必要となる代替的スプラインシング事象の結果もたらされる可能性はない。
【００４７】
かくして、機能タンパク質ドメインに対応するタンパク質内に直接転写及び翻訳され得るゲノミックＤＮＡが１つも無いことから、両端で転写及び翻訳調節配列により制限された完全かつ機能的読取り枠をもつ遺伝子又は機能タンパク質ドメインについてコードするｍＲＮＡが、存在しない。１つの細胞は、その独自のゲノム内に含まれかかるタンパク質のためのコーディング配列が中に埋込まれている遺伝子から出発して、後に特異的タンパク質分解事象によって修飾される一次翻訳産物への遺伝子の転写及び翻訳の後に初めて機能タンパク質ドメインを産生することができる。
【００４８】
本発明の意味合いでは、機能タンパク質ドメインの原点であるタンパク質分解事象は、シグナルペプチドが細胞外又は膜内外タンパク質内で認識され削除される場合のように、１つのタンパク質の局在化を単純に決定する事象ではない。機能タンパク質ドメインの原点であるタンパク質分解事象はむしろ、一次翻訳産物から機能タンパク質ドメインを分離することによって一次翻訳産物によって提供されるものとは全く異なる生理学的効果を提供する単数又は複数の生物活性を該機能タンパク質ドメインが実施できるようにする事象であるものとして意図されている。シグナルペプチドを削除する酵素の場合のように、あらゆる細胞によって類似のタンパク質分解活性が、構成的に発現されるわけではなく、或る種の細胞型によってのみ又は或る種の代謝条件下でのみ特異的に発現される。
【００４９】
タンパク質配列の機能は、その他のタンパク質、核酸、脂質、糖又はその他のあらゆる有機又は無機リガンドとのその相互作用の結果もたらされることから、本発明の意味合いでの機能タンパク質ドメインは、３つの基本グループを識別するべく、相互作用特性と示差的特性を関連づけることによって定義づけされる。
【００５０】
機能タンパク質ドメインの第１のグループでは、単離された又は一次翻訳産物の状況下での機能タンパク質ドメインがリガンド特異性及び親和性の点で同じ相互作用特性を維持しているものの、一次翻訳産物の残りの部分から分離された時点で細胞又は生体がかかるリガンドの存在を同定することを可能にしないという事実に起因して示差的効果が存在するようなグループである。例としては、外因性プロテアーゼによってレセプタの膜内外及び細胞内部分からタンパク質分解により分離された時点で、膜レセプタに対するリガンドを取去り、細胞内シグナリング経路の必然的活性化を遮断する膜レセプタの細胞外結合ドメインが挙げられる。
【００５１】
放出された細胞外ドメインは、それらが一次翻訳産物の残りの部分にリンクされた場合のように、リガンドの存在を細胞にシグナリングする代りにリガンドを捕捉しシグナリング経路をサイレンシングし特異的細胞応答を防ぐという効果をもつことから、本発明の意味合いでの機能タンパク質ドメインである。往々にしておとりレセプタと呼ばれるかかる機能タンパク質ドメインは、生体に対し例えばケモカイン及びサイトカインを循環させる効果を最終的に調節する可能性を与えることから、重要な生理学的役割を果たす（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１），２２（６）：３２８−３６）。
【００５２】
機能タンパク質ドメインの第２のグループは、機能タンパク質ドメインが、一次翻訳産物の状況から隔離された時点で一次翻訳産物による結合を受けていない又はほとんど受けていないリガンドを高い親和力で認識し、予想外の生理的効果を見極めるという事実に起因して示差的効果が存在するようなグループである。強い脈管形成防止特性をもつ構造的細胞外基質タンパク質のタンパク質分解フラグメンといったような、重要な生理的効果をもつかかる機能タンパク質ドメインの例（Ｃａｏ Ｙ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１），３３（４）：３５７−６９）は、文献中に増々頻繁に記述されており、特異的生理的メカニズムの枠内でタンパク質分解事象によってタンパク質が単離された機能的形態となることができるようになるまで、一次翻訳産物の中に隠れている機能タンパク質ドメインのタンクとしてタンパク質が機能しうるということを示している。
【００５３】
機能タンパク質ドメインの第３グループは、不活性前駆体タンパク質からタンパク質分解によって放出されたタンパク質により代表される。数多くのシグナリング及び分泌タンパク質が、前炎症性サイトカインのようにＰＴＲから分離された後にのみその生理的機能を発揮する（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ， Ｃｈｅｓｔ（２０００），１１８（２）；５０３−５０８）。
【００５４】
機能タンパク質ドメインは、異なる手順を用いて同定可能である。従来、機能タンパク質ドメインは、異なる特異性をもつ一連のプロテアーゼに１つのタンパク質を露呈し、結果として得られたフラグメンの活性をテストすることにより同定される（Ｃａｒｒｅｙ Ｅ．，「タンパク質構造：その実践的アプローチ」、ｅｄ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ（１９８９），１１７−１４４）。この手順は、迅速性、単純性及び感度という利点を提供するが、これは、消化すべき完全未変性タンパク質の量、プロテアーゼの特異性及び、機能タンパク質ドメインとしてタンパク質分解フラグメンを実証するのに用いられる検定の感度によって制限を受ける。
【００５５】
その上、タンパク質の単離及び配列決定の分野でもたらされる進歩（例えば質量分光学、二次元ゲル）ならびに生物情報科学の分野における進歩により、代表度の低い分子種でさえその同一性及び数量について情報を提供する数多くのタンパク質標本の並行分析が可能となっている（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ Ｆ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ．Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．（１９９９）；３８（１７）：２４７６−２４９２）。例えば、現在では予め分画しないでも、生体標本中の全タンパク質含有量の特異的タンパク質分解酵素での制御された消化の後に得られたか又はフラグメン化されていないタンパク質混合物中に存在するタンパク質を、全てとは言わないまでも大部分同定し単離することが可能である（Ｓｐａｈｒ ＣＳ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００１），１（１）：９３−１０７）。タンパク質の消化、検出、単離、配列比較及び分析のこれらの技術を適切な細胞生物学又は生化学ベースの高流量検定（Ｋｕｈｌｍａｎｎ Ｊ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍ． 及びＴｈｅｒ．（１９９７），３５（１２）：５４１−５５２）と組合わせることにより、新規の機能タンパク質ドメインを同定することが可能である。
【００５６】
重要な生理的活性が、タンパク質の単なる分解をはるかに超えて、基質メタロプロティナーゼ（Ｒａｚａ ＳＬ 及びＣｏｒｎｅｌｉｕｓ ＬＡ， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｓｙｍｐ． Ｐｒｏｃ．（２０００），５（１）：４７−５４）及びキャスパーゼ（Ｌｏｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１），２２（１）：３１−４）といったようなプロテアーゼにより及ぼされるタンパク質分解活性による微調節を受けることがわかってきた。その上、プロテアーゼは、人間における全遺伝子含有量の１．５〜２％を占めるはずであること（Ｓｏｕｔｈａｎ Ｃ， Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．（２０００），６（９）：４５３−８）そして特異的タンパク質に会合されたプロテアーゼ分割部位モチーフを増々容易に同定することができること（Ｔｕｒｋ ＢＥ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００１），１９（７）：６６１−７）から、テスト対象となりうるタンパク質及びプロテアーゼの多様性は増大することになり、その結果、治療及び商業上有利な機能タンパク質ドメインを同定することが可能となる。
【００５７】
一次翻訳産物のＮ末端又はＣ末端であるものとして機能タンパク質をひとたび同定し、タンパク質ドメインの組織と対応する遺伝子のエキソン／イントロン組織の相関関係を発見した時点で、適切なターゲティング領域及び調節単位を含有する構成体を、本発明の方法に従ってかかるタンパク質種を発現する細胞を生成するために使用することができる。
【００５８】
機能タンパク質ドメインとして発現されるべき１又は複数のエキソンの選択は、フラグメン化された又はフラグメン化されたタンパク質の標本を分析することによって提供された証拠のみならず、計算上のタンパク質三次元構造、その他の既知の機能タンパク質ドメインとの相同性、突然変異誘発及び構造−機能研究についての情報又はその他のモデリング及びコンピュータシミュレーションを組合せることによって得られた結果によっても影響され得る。
【００５９】
たとえ、機能タンパク質ドメインが当初、離散的数のエキソンに正確に対応するものとしてｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴づけされなかったとしても、タンパク質配列の相同性及び／又は構造は、機能タンパク質ドメインの不可欠要素が１又は複数の特異的Ｎ又はＣ末端エキソンによりコードされているものとして同定できるようなものであり得る。本発明の方法によって産生された機能タンパク質ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで当初同定されたものと同一のＮ又はＣ末端残基をもつ必要はなく、比較可能な活性を発揮することが必要である。
【００６０】
タンパク質分解フラグメンが機能タンパク質ドメインであることのさらなる有効化及び特徴づけは、無作為ＰＣＲ／欠失突然変異誘発、タンパク質分解分割部位のマッピング、ファージ表示、２ハイブリッドシステムが関与する（ＷＯ９６／３１６２５；ＷＯ９０／０４７８８；Ｐａｒｒｙ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．（２００１），２８３（３）：７１５−２０；Ｋａｗａｓａｋｉ Ｍ， ａｎｄ Ｉｎａｇａｋｉ Ｆ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．（２００１），２８０（３）：８４２−４）又は非相同性ベースの方法が関与する（Ｍａｒｃｏｔｔｅ ＥＭ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．（２０００），１０（３）：３５９−６５；ＷＯ００／１１２０６）その他の機能的スクリーニング方法によって得ることができる。大規模に機能ドメインを産生するために本発明の方法を応用する前に、一次翻訳産物に属する異なる長さのフラグメントを、一般的な発現技術により小規模で産生させ、検定でテストして、機能タンパク質ドメインに対応する最小限の又は充分なタンパク質配列を限定することが可能である。
【００６１】
最後に、増々数多くのインターネット利用可能なアルゴリズム及びソフトウェア（Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．（２００１），１１（３）：３５４−６３；Ｓｋｏｌｎｉｃｋ Ｊ． ａｎｄ Ｆｅｔｒｏｗ ＪＳ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，（２０００）：１８（１）３４）を別々に又は組合わせた形で使用して、既知の構造及び／又は生物活性をもつタンパク質又はＤＮＡ配列のデータベースと、機能がわかっていないタンパク質又はＤＮＡ配列（例えば、ゲノミック配列決定プログラムの出力又はＥＳＴを翻訳することによって得られるようなもの）を比較することができる。このｉｎ ｓｉｌｉｃｏ手順は、まだクローニングされていない遺伝子内への又は未知の機能のタンパク質内に包含されたタンパク質ドメインの位置及び機能の優れた近似を可能にする。従って、かかる生物情報科学手段を、本発明の方法によって発現され得る機能タンパク質ドメインを同定する上で一助とすることができる。
【００６２】
商業的に価値ある機能タンパク質ドメインの中でも、代表的な好ましい１グループは治療上有利なものである。治療上有用なタンパク質の大部分は、調節因子（ホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、レセプタ及びその他の細胞成長及び代謝調節因子を含む）、血液製剤（血漿由来血液因子及び酵素フィブリノーゲン活性化剤）及びモノクローナル抗体、という３つのクラスにまとめることができる。外因性エキソンを用いて機能タンパク質ドメインを産生するために本発明の方法が標的遺伝子として使用しうるこれらの３つのクラスに属する遺伝子によって、機能タンパク質ドメインを含有する一次翻訳産物をコードすることが可能である。
【００６３】
しかしながら、本発明の背景参考及び例をその中から選択することのできる科学的文献は、当初これらのグループに属するものとして特徴づけされず（例えば膜結合タンパク質、トランスメンブランタンパク質、酵素、細胞外基底膜のタンパク質、細胞内シグナリング及び構造タンパク質、核タンパク質）治療的に有利な機能タンパク質ドメインをも同様に内含するものと特徴づけされた一次翻訳産物へと治療的に有利なＦＤＤを同定できる、ということを示している。従って、これらの一次翻訳産物に対応する遺伝子も同様に、内因性エキソンを用いて機能タンパク質ドメインを生成するために本発明の方法により標的遺伝子として使用可能である。
【００６４】
宿主細胞
イントロンの存在は基本的に真核性遺伝子に制限されていることから、本発明は一般に、真核生物由来のタンパク質配列に適用可能である。このような理由から、宿主細胞は標準的に、哺乳動物細胞といったような真核細胞となるが、植物、昆虫、酵母及び真菌に由来するその他の真核細胞も使用可能である。問題の機能タンパク質ドメインの大部分がヒトタンパク質に属することを条件として、ヒトの宿主細胞が好まれる。
【００６５】
問題の機能タンパク質ドメインを含有する一次翻訳産物についてコードするイントロン含有遺伝子のコピーを少なくとも含有するあらゆる真核細胞を使用することができるが、好ましい真核細胞は、特に、ヒト、サル、及びゲッ歯類由来の分化した及び／又は不死化した哺乳動物細胞、例えばＳＶ４０−形質転換済みアフリカ産グリーンモンキー腎ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞としてより良く知られている）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ）−２９３、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、及び、問題の機能タンパク質についてコードするエキソン（単複）が存在するその他のあらゆる基幹、分化又は未分化真核細胞系統である。
【００６６】
本発明の方法に付す前に、かかる細胞をすでに、標的遺伝子又はその他の遺伝子の発現及び／又は構造を改変しうる相同性又は非相同性組換えによって組込まれたその他のウイルス性又は非ウイルス性構成体を用いてゲノミックレベルで修飾させることもできる。標的遺伝子のコピーが２つ以上存在しうる形質転換された又は不死化細胞系統の場合には、相同的組換えの連続的ラウンドにより、考えられる場所のうちの単数又は複数の場所で調節単位を挿入することができる。
【００６７】
宿主細胞は又、関連するＥＶＳの５′末端又は３′末端で組込まれた外因性調節単位を考慮に入れ、かくしてかかる配列が構成的又は誘発可能な形でその活性を充分に発揮できるようにすることによっても選択されなくてはならない。例えば、本発明の方法は、特異的機能タンパク質ドメインの発現、特に免疫グロブリン由来の機能ペプチド又はポリペプチドのため、又は本発明の方法を用いてその転写が免疫グロブリン特異的プロモータ及び／又はエンハンサ要素の制御下に置かれたその他のあらゆる機能タンパク質ドメインのためにきわめて有用でありうる、不死化された細胞の体細胞ハイブリッドに適用することができる。
【００６８】
一次細胞は、不死化された細胞系統に比較可能な頻度で培養中の相同的組換えによって修飾され得ることから（Ｈａｔａｄａ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０００），９７（２５）：１３８０７−１１）、本発明の方法は、同様に、例えば遺伝子療法を目的として、類似の細胞環境内で機能タンパク質ドメインの産生を達成しなければならない場合つねに、一次細胞に対しても応用可能である。明らかに、ヒト由来の機能タンパク質ドメインの産生のためには、宿主細胞はヒト細胞となる。
【００６９】
本発明の方法において使用するための宿主細胞型を選択するために応用できる付加的な基準は、相同的組換えを可能にする宿主細胞型の固有の能力及び標的遺伝子の実際の転写状態の両方である。該方法が所望の機能タンパク質ドメインを産生するクローンのより高速かつより直接的な単離を可能にしうる細胞型を選択する上で、候補細胞型の中でのこれらの特長の予備評価が一助となる可能性がある。
【００７０】
霊長類及びマウスの繊維芽細胞系統の中で、相同的組換えの頻度が測定、比較され、重大な差異を示した（Ｔａｇｈｉａｎ ＤＧ ａｎｄ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ＪＡ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９７），１７（１１）：６３８６−９３）。核抽出物及び／又は標準相同的組換えベクターでの形質転換に基づく類似の検定が、特異的細胞型の組換え活性を定量化する上で一助となりうる。
【００７１】
培養されたヒト細胞内での遺伝子ターゲティングに対する標的遺伝子転写の効果は、標的部位の転写を刺激する作用物質の存在下又は不在下での異なる遺伝子座における遺伝子ターゲティングの効果を比較することによって評価された（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９５），２３（１４）：２７８４−９０）。遺伝子ターゲティングは一般に標的部位を通した転写によって有意な形で増強されるように思われる。
【００７２】
最後に、宿主細胞は、標的遺伝子の一次翻訳産物から機能タンパク質ドメインを生成するのに必要なもの以外の、機能タンパク質ドメインを翻訳後に修飾する酵素を発現するはずである。例えば、該機能タンパク質ドメインが分泌された一次翻訳産物のＮ末端に対応する場合、宿主細胞はシグナルペプチドの処理を可能にするはずである。その他の特異的状況下では、宿主細胞は、機能タンパク質ドメインの適正なグリコシル化又はリン酸化を可能にするはずである。細胞型が細胞培養条件下で標的遺伝子を発現するものの、機能タンパク質ドメインを生成するのに必要なタンパク質分解活性を発現しない場合及び／又は商業的に開発利用するのに充分なレベルでこの遺伝子を発現しない場合、本発明の方法によって、機能タンパク質ドメインをより効率良く産生するクローンの生成が可能になる。
【００７３】
転写モジュール
外因性調節単位内に含まれた第１のＤＮＡ配列である転写モジュールは、標的遺伝子に属するエキソン全体のうち機能タンパク質ドメインについてコードするもののみを含む一次写しを得るべく、ターゲティングされた１又は複数のエキソンの片端で欠如している転写制御要素を提供する。転写モジュールは、（一次翻訳産物のＣ末端に対応する機能タンパク質ドメインの場合：図１Ａ−Ｆ）５′乃至より５′のエキソン内に、又（一次翻訳産物のＮ末端に対応する機能タンパク質ドメインの場合：図１Ｇ−Ｌ）機能タンパク質ドメインについてコードする３′乃至より３′のエキソン内に組込まれるはずである。
【００７４】
機能タンパク質ドメインの位置及び配列に応じて、同一方向に向けられた状態で、標的遺伝子内に組込まれるべき転写モジュール内に、異なる種類のＤＮＡ配列、すなわち、プロモータ、エンハンサ、転写因子の認識部位、ポリアデニル化部位及び、場合によって構成体内に付加されたイントロンの中に含まれる配列を含めた、ｍＲＮＡ分子へのＤＮＡの転写を調節することのできる他のあらゆる種類のＤＮＡ配列を内含させることができる。
【００７５】
プロモータというのは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩタンパク質複合体が遺伝子の転写を開始する部位として、機能的に定義づけされる。補助タンパク質と相互作用させ活性転写複合体の凝集を容易にすることにより、エンハンサ及び転写因子のためのその他の認識部位が、プロモータ活性を増強させることができる。機能タンパク質ドメインが一次翻訳産物のＣ末端にある場合、エンハンサを伴う又は伴わないプロモータが、挿入されたＤＮＡ構成体である。
【００７６】
優先的に使用されるプロモータ及びエンハンサの組合せは、相同的組換えが実施される宿主細胞系統内での遺伝子の発現を構成的に又は誘発後に促進するものとして知られている組合せである。例えば、宿主細胞系統が、成長ホルモン及びプロラクチンといったようなタンパク質を天然に発現する下垂体細胞で構成される場合、これらの遺伝子のいずれかのためのプロモータを使用することができる。同様に適しているのは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シンドビス（ＳＧ）内で同定される調節要素といったような、大部分の細胞系統内で機能する混交又は構成性ＤＮＡ調節セグメントである。さらなるプロモータ例としては、インタフェロンアルファ（ＩＦＮ−ａｌｐｈａ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、延長因子１−アルファ（ＥＦ−１、アルファ）、メタロチオネイン−Ｉ／ＩＩ（ＭＴ−Ｉ／−ＩＩ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）、ロイコシアリン（ＬＳ）といったようなヒト遺伝子の転写を調節するプロモータがある。これらの後者のプロモータは、（ＬＳプロモータが活性である）Ｔ細胞のように、宿主細胞が高度に分化されている場合に特に有用である。
【００７７】
何らかの理由で宿主細胞に対する毒性かつ／又は成長阻害性をもつ可能性のある機能タンパク質ドメインの産生のためには、誘発可能なプロモータが望ましい。誘発可能なプロモータの例としては、（重金属の存在下で活性な多数の金属応答要素を含有する）ＭＴ−Ｉ／−ＩＩ及び（哺乳動物細胞に適合されたＩＰＴＧによって誘発される細菌性オペレータ／リプレッサ系である）Ｌａｃがある。
【００７８】
機能タンパク質ドメインが一次翻訳産物のＮ末端にある場合、転写モジュールは、一次写しの分割及び連結型ポリアデニル化反応が関与する複雑なプロセスである、その３′末端におけるｍＲＮＡの適正な終結及び修飾を可能にする配列を含有しているはずである。大部分の哺乳動物のｍＲＮＡにはポリ（Ａ）路が存在しており、それはｍＲＮＡの安定性及び翻訳効率にとって不可欠である。ポリアデニル化のためのシグナルは、ポリアデニル化部位の上流側２０〜３０ヌクレオチドのところにあるＡＡＴＡ アミノ酸配列、及びポリアデニル化部位のすぐ下流側のＧＴ富有セグメントで構成されている。発現ベクター内ですでに使用され、真核生物（ウシ成長ホルモン、マウスベータグロビン）又はウイルス遺伝子（ＳＶ４０早期転写単位、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）のいずれかの中で単離された調節単位の中で使用可能ないくつかの効率の良いポリ（Ａ）シグナルが存在する。
【００７９】
遺伝子の発現レベルは主としてプロモータ及び遺伝子の５′内のその他の転写調節領域によって決定されることから、転写及び翻訳終結部位を含有する構成体で修飾された標的遺伝子は、充分とみなされるレベルで宿主細胞によりすでに発現されていなければならない、ということは明白である。これらの状況下で、宿主細胞の選択は、一次翻訳産物についてコードする遺伝子をすでに強く発現している細胞に向けられなくてはならない。
【００８０】
ポリ（Ａ）シグナルに会合した状態で、転写モジュール内には、転写が機能タンパク質ドメインに関連しない３′隣接ゲノミック配列内まで進行しないことを確実にするため、転写ターミネータと呼ばれる付加的な配列が存在する可能性がある。この事象は、所望の機能タンパク質ドメインの翻訳を削減又は改変しうる一次写し内の不要な配列の導入及び、宿主細胞の複製又は代謝にとって重要な遺伝子を制御しうる下流側プロモータの活性の阻害という、考えられる２つの結果を導く可能性がある。いくつかのｍＲＮＡの分析によって明確なコンセンサスが規定されなかったにせよ、これらの配列のうちのいくつかは、文献中で充分に特徴づけされてきた（Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃ Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５），４０（３）；１６９−７８）。
【００８１】
ＤＮＡ構成体はさらに、転写に影響を及ぼすその他のＤＮＡ配列を含むことができる。例えば、クロマチン開放ドメイン（ＵＣＯＥ）と呼ばれるＤＮＡ配列が、１つの遺伝子の近くに挿入された場合、それは、発現度の低い又はサイレント遺伝子を標的遺伝子に近い推定上の負の調節配列からそれを遮へいするか又は近くにあるクロマチンドメインを強制的に開放することによってかかる遺伝子のより良い発現を可能にすることができる。かかる要素のうちのいくつかは、遺伝子導入マウス又は培養された細胞系統の両方において組織依存的又は組織独立的に非相同プロモータから遺伝子発現を増大させるものであることが報告されている（ＷＯ ００／０５３９３）。
【００８２】
翻訳モジュール
外因性調節単位内に含まれている第２のＤＮＡ配列である翻訳モジュールは、機能タンパク質ドメイン内への一次写しの適正かつ効率の良い翻訳を得るべく、適正な枠内でターゲティングされた１又は複数のエキソンの片端において欠如している翻訳制御要素を提供する。翻訳モジュールは、転写モジュールと（一次翻訳産物のＣ末端に対応する機能タンパク質ドメインの場合には）より５′のエキソン又は（一次翻訳産物のＮ末端に対応する機能タンパク質ドメインの場合には）機能タンパク質ドメインについてコードするより３′のエキソンの間に取込まれ、同じ方向に方向づけされているはずである。
【００８３】
機能タンパク質ドメインの位置及び配列に応じて、（周囲のヌクレオチド状況と合わせて、コザック 配列を形成する）翻訳開始コドン、翻訳停止コドン、５′／３′未翻訳領域そしてタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を調節することのできるその他のあらゆる種類のＤＮＡ配列といった異なる種類のＤＮＡ配列を、翻訳モジュールに内含させることができる。
【００８４】
機能タンパク質ドメインが一次翻訳産物のＣ末端にあり、内因性配列（イントロン又はエキソンのいずれか）が機能タンパク質ドメインの適正な翻訳のために活用すべき適切な位置にＡＴＧを含有していない場合にはつねに、通常はＡＴＧ（メチオニンについてコードする）である翻訳開始コドンが翻訳モジュール内に導入されなくてはならない。このような状況においては、翻訳モジュールは、最適な翻訳開始効率をもつものとしてコザックにより定義づけられたコンセンサス配列のグループ内に含まれている１つの配列内に埋込まれた外因性ＡＴＧコドンを含有するはずである。このようなコンセンサス（ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＴＧＧ）が、何百ものｍＲＮＡの翻訳開始配列の分析から出現したか、全てのヌクレオチドが同等に重要であるわけではない：単数又は複数のシトシンがもう１つのヌクレオチドで置換され得るが、プリン（Ａ／Ｇ）は保存されなくてはならない（Ｋｏｚａｋ Ｍ， Ｇｅｎｅ（１９９９），２３４（２）：１８７−２０８）。
【００８５】
５′未翻訳領域（５′ＵＴＲ）は、翻訳開始コドンに対し５′のところの一次写しに属する配列であることから、翻訳開始コドンに関係づけされる。物理的には、それは、転写開始部位（通常は、プロモータから下流側にあり、「キャッピング」酵素により修飾されるべきＧヌクレオチドで構成されている２０〜３０個のヌクレオチド）と翻訳開始コドンの間の配列である。相同的組換えによりターゲティングされたイントロンの配列及び機能タンパク質ドメインについてコードする隣接するエキソンの配列に応じて、この配列は、（ＡＴＧが同様に相同的組換えによって導入される場合には）完全に構成され得、そうでなければ、外因性配列により部分的にのみ構成され得る。文献中には、５′未翻訳領域についての特定的長さ又はコンセンサス配列は全く定義されていないが、機能タンパク質ドメインの適正かつ効率の高い翻訳に対する妨害を最小限にするため、それは、１００〜２００ヌクレオチドを超えてはならない。さらに、それは、対合して翻訳中のリボソームの進展を遅延又は停止させることのできる二次構造を作り出し得る付加的なＡＴＧ又はその他の配列（例えばＧＣ富有領域）を含有すべきではない。或る種の状況、例えば、５′ＵＴＲが特に長い場合などには、複数の哺乳動物細胞型において異なるｍＲＮＡについて示されてきたように、リボソームタンパク質と一次写しの相互作用を容易にし翻訳効率を増大させるべく５′ＵＴＲ内に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は翻訳エンハンサ要素を取込むことができる（Ｌｉｕ Ｘ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（２０００），２８０（Ｉ）：２０−８）。
【００８６】
機能タンパク質ドメインが一次翻訳産物のＮ末端にある場合、翻訳モジュールは、終止コドン及び３′未翻訳領域（３′ＵＴＲ）といったような、翻訳の適正な終結を可能にする配列を含有しているべきである。上述のように、相同的組換えによりターゲティングされたイントロンの配列及び機能タンパク質ドメインについてコードする隣接エキソンの配列に応じて、これらの配列は、外因性配列により全体的又は部分的に構成され得るが、大部分のケースで、翻訳モジュールは両方の要素を提供することになる。充分に確立された停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）以外に、このトリプレットをとり囲む配列は、翻訳の終結の効率に対し幾分かの影響をもち得る。例えば、停止コドンのすぐ後に続くヌクレオチドがＡ又はＧである場合、終結はさらに効率の良いものである。
【００８７】
５′未翻訳領域について述べた通り、翻訳停止コドンとポリアデニル化部位の間の一次写しセグメントから成る３′未翻訳領域についても、文献中にはいかなる特定的長さ又はコンセンサス配列も記述されていない。しかしながら、転写効率を最大にするためには、それは、ＡＴ富有配列のような不安定化領域を含有すべきである。
【００８８】
翻訳開始又は終止コドンは、機能タンパク質ドメインコード化配列と同じ読取り枠内になくてはならない。機能タンパク質ドメインをコードするエキソン（単複）に近位のイントロンが正しい枠内でかつ機能タンパク質ドメインの活性と相容性ある一定数のアミノ酸の付加が関与する距離で停止又は開始コドンに対応するトリヌクレオチドを含有する場合、翻訳モジュールが単に適切な未翻訳領域を含有している状態での適切な転写モジュールの取込みは、機能タンパク質ドメインの適正な発現を直接可能にすることができる。このようにして、これらのトリヌクレオチド及びそれらと隣接するエキソンのより近位の端部との間に含まれたイントロン配列は、それらがこのエキソンの一部となることから、完全に機能的であり得る。
【００８９】
機能タンパク質のＮ末端又はＣ末端で融合された、結果としてもたらされることになるペプチド配列は、これらのタンパク質配列の機能性を妨害してはならず、又存在する場合には、精製プロセス中に容易に除去又は不活性化されるべきである。一次翻訳産物のＣ末端に対応する機能タンパク質ドメインの場合には、より５′のエキソンが、そのＮ末端を制限する機能タンパク質ドメインと同じ枠内で通常内部メチオニンについてコードするＡＴＧを含有するならば、同じアプローチを使用することもできる。かかるＡＴＧに対する５′に転写を活性化する転写モジュールを組込むことで、機能タンパク質ドメインの適正な転写及び翻訳が可能になるはずである。
【００９０】
しかしながら、（イントロン内に含まれている場合）スプライシング中に除去されるか又は（エキソン内に含まれている場合）その他の翻訳開始部位により先行されているため通常は翻訳開始又は終結部位として不活性であるかかるトリヌクレオチドの存在は、少数の遺伝子に制限される。従って、翻訳モジュールの一部となる合成又は天然のいずれかのエキソン内に、翻訳開始又は停止コドンが含まれるべきである。このモジュールは、標的遺伝子によりコードされる一次翻訳産物内に含まれたタンパク質配列に対し相同又は非相同のいずれかであるタンパク質配列について付加的にコードすることのできる単数又は複数の外因性エキソン（天然又は合成のイントロン配列により分離されている）を含むことができる。
【００９１】
しかしながら、前出の状況の場合と同様に、機能タンパク質に融合されるこのタンパク質配列は、機能タンパク質ドメインの活性を妨害してはならず、存在する場合、最終的には宿主細胞自体により生成される酵素活性によって容易に除去又は不活性化されるべきである。例えば、機能タンパク質ドメインが、一次翻訳産物のＣ末端フラグメンである場合、１又は複数のエキソンは、ひとたび翻訳開始部位と内因性エキソン配列の間の適正な枠内に置かれた時点で培地中での機能タンパク質ドメインの分泌を可能にするシグナルペプチド（又はシグナルペプチドのＮ末端）をコードすることができる。
【００９２】
代替的には、この付加的なタンパク質配列は単純に、場合によって、機能タンパク質ドメインの精製及び／又は収集を助けるスペーサ又はリンカーペプチドであり得る。付加的なタンパク質配列は同様に、支持体上に固定化された基質に対する付加的な配列の親和力を活用して機能タンパク質ドメインを精製できる場合に、市販のプロテアーゼを用いて後にこれを削除できるような形で、タンパク質分解酵素のための認識部位についてもコードすることができる。
【００９３】
スプライシングモジュール
上述のように、標的遺伝子に属する内因性配列が、活用されるべき適切な位置（すなわち機能タンパク質ドメインについてコードし機能タンパク質ドメインと同じ枠をもつ１又は複数のエキソンに隣接するか又はその内部にある）に翻訳終結又は開始コドンを含有しない場合、相同的組換えのための構成体は、天然又は合成のいずれかの外因性エキソン内にそれらのうちの１つを収納することになる。
【００９４】
しかしながら、翻訳モジュールに属する１又は複数の外因性エキソンは、１又は複数の内因性エキソンと同じ枠内に位置づけされなくてはならない。この配置は、より近位のエキソンのスプライシング部位を補完するスプライシング部位を使用すること（図Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）によってか又は、エキソンがより近位のエキソンに精確に融合されるような形でターゲティング配列を選択すること（図Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）によって達成可能である。
【００９５】
従って、外因性エキソンが翻訳開始コドンを含有する場合、スプライシングモジュールは翻訳モジュールの３′末端にある５′供与体スプライス部位となり（図１Ａ、Ｄ）機能タンパク質ドメインについてコードする近位内因性エキソンに会合させられた３′スプライス受容体を補完する。代替的には、合成エキソンが翻訳停止コドンを含有する場合、スプライシングモジュールは、翻訳モジュールの５′末端にある３′受容体スプライス部位となり（図１ Ｇ、Ｊ）、機能タンパク質ドメインについてコードする近位内因性エキソンに会合させられた５′スプライス供与部位を補完する。
【００９６】
従って、調節単位は、その組込みの後残留イントロン配列が、機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンから翻訳モジュールを分離する場合にはつねに、機能タンパク質ドメインについてコードする写しの生成を可能にするスプライシングモジュールを含むことができる。外因性調節単位の制御下に置かれたものに対する機能タンパク質ドメインについてコードするもの以外の１又は複数のエキソンの融合を通常駆動する内因性スプライシング配列は、宿主細胞の中での標的遺伝子のスプライシング事象を再構築することができないはずである。これは、調節単位がそれらに置換しかつ／又は、過度に遠くその活性を効率よく発揮することができないような形で位置づけされ、不対合状態にとどまっているという事実に起因するものである。
【００９７】
５′／３′スプライス部位は、イントロン中断された遺伝子から生成された一次写しの適切なスプライシングを可能にすることから、遺伝子の発現のための基礎的な要素である。これらの配列は、数多くの脊椎動物遺伝子の中で特にイントロンの５′及び３′で充分に保存されている。高等真核生物内の５′スプライス供与部位の大部分は、ＡＧがエキソンの３′末端における保存されたジヌクレオチドモチーフであるコンセンサス配列ＡＧ］［ＧＴＲＡＧＴに適合する。なおここで ］［ はスプライス部位を、ＧＴはイントロンの５′末端にある保存度の高いジヌクレオチドモチーフであり、Ｒはプリンである。３′スプライス受容部位は、基本的に、コンセンサス配列、ＹＡＧ］［Ｇにより構成されており、ここで、ＡＧは（標準的にピリミジン（Ｙ）の伸長が先行している）イントロンの３′末端にある保存度の高いジヌクレオチドモチーフであり、］［はスプライス部位を表わし、Ｇは、エキソンの５′末端にある保存されたヌクレオチドである。
【００９８】
適切なコンセンサススプライシング配列以外に、スプライシングモジュールの後には、隣接するターゲティング領域から来たイントロン、スプライシング部位とターゲティング領域の間で構成体の中に付加された天然又は合成のイントロン配列が続いている。かかるイントロン配列は、例えば、通常３′スプライス部位の上流側１８〜４０ヌクレオチドの距離のところにある分岐部位として知られているもう１つの配列要素を含有しうる。この部位は、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＡがｍＲＮＡスプライシングの触媒段階中にイントロンの５′末端でＧ又クレオチドのリン酸塩基と相互作用する能力をもつ−ＯＨ基をもつヌクレオチドであるものとして、配列ＣＴＲＡＣＴを表示する。エキソンスプライシングエンハンサと同様、哺乳動物の前ｍＲＮＡスプライシングに関与するコンセンサス配列、メカニズム、因子及びその他の調節配列は、再考されてきた（Ｌｏｎｇ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ，（１９９８），９５（１）：２１９−２２３；Ｂｌｅｎｃｏｗｅ ＢＪ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．（２０００），２５（３）：１０６）。
【００９９】
スプライシングメカニズムの知識における進歩は、一般的コンセンサス配列のより精密な定義を可能にするものではないにせよ、相同的組換えによって修飾されるべき細胞型との関係における特異的スプライシングモジュールの選択を導く可能性がある。例えば、一連の配列特長及びモチーフが、脳特異的にスプライシングされた遺伝子に共通であることが発見され、このことは、かかる配列を選択することによって細胞型特異的スプライシングの調節が可能となりうるということを表わしている（Ｂｒｕｄｎｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２００１），２９（１１）；２３３８−４８）。
【０１００】
スプライシングモジュールは、完全に内因性であるか、完全に外因性であるか又は内因性配列と外因性配列のハイブリッドであり得るイントロン含有配列により、標的遺伝子内の機能タンパク質ドメインについてコードする隣接エキソンの近位端部に存在する内因性スプライシング制御要素から分離されている。この配列は究極的にスプライシングされ尽すことになるため、所望の機能タンパク質ドメインの適切な発現と不利に干渉しないかぎり、精確な配列は問題とはなり得ない。
【０１０１】
ＤＮＡターゲティング配列
ＤＮＡターゲティング配列は、細胞のゲノム内の外因性配列（調節単位、正のマーカー遺伝子）の適正な組込み及び位置づけを担当することから、構成体の必須要素である。通常ゲノミックＤＮＡからクローニングされるか又はＰＣＲ増幅されるかかる配列は、特異的ゲノミック領域内で相同的組換え（ストランド対合及び変位）をひき起こす分子プロセスを駆動するのに充分なレベルの内因性ＤＮＡとの相同性をもつものとして機能的に定義されている。
【０１０２】
ＤＮＡターゲティング配列は、単一のＤＮＡセグメントによって構成されてもよいし又は調節単位に対応する外因性配列そして場合によっては正のマーカー遺伝子によって構成体内で分離されている２つのＤＮＡセグメントに分割されていてもよい。組込みの効率及び精度を増大させるためには２つのターゲティングセグメントが好まれるが、本発明は同様に単一のターゲティングセグメントの使用も包含している。その最も単純な形態では、ターゲティングセグメントと共に調節単位をも含有するＤＮＡの円形片が利用される。このようにして、相同性ターゲティングセグメントはそのゲノム対応物とハイブリッド形成し、調節単位は、交差事象の後に標的遺伝子内に挿入される。
【０１０３】
ターゲティングセグメント（すなわち相同性領域）の各々のサイズは、さほど重要ではないが、領域が短かければ短かいほどそれらが適切な相同性領域を見い出し所望のスポットで組換えする確率は低くなる。かくして、相同性領域が短かければ短かいほど、相同的組換えの効率は低く、すなわち、うまく組換えられたクローンの百分率は低くなる。配列相同性についての最小の必要条件は２５塩基対であることが示唆されてきた（Ａｙａｒｅｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９８６），８３（１４）：５１９９−２０３）。最適な結果は、両方のターゲティング領域を含めた合計相同性領域が大きい、例えば１〜５キロベース以上である場合に達成される。ゲノム内の適当な点で調節単位を導入できるかぎり、ベクター安定性に影響を及ぼさないならば、ターゲティングセグメントのサイズには限界はない。
【０１０４】
ＤＮＡターゲティングセグメントは、数多くの状況下で、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン（単複）の５′（機能タンパク質ドメインが一次翻訳産物のＣ末端にある場合）又は３′（機能タンパク質ドメインが一次翻訳産物のＮ末端にある場合）のイントロンの全て又は１セグメントを含有することになる（図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ）。ターゲティング領域は、この特異的イントロンに加えて、機能タンパク質ドメインをコードするエキソン（単複）を含め、標的遺伝子のその他の部分を内含する可能性がある（図１Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）。その他の一部のケースでは、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン（単複）に近位のイントロン（単複）及びエキソン（単複）は、場合によって隣接する遺伝子内にある配列を使用することで多少の差こそあれ完全に除去され外因性調節単位により置換され得る（図１Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）。ＤＮＡターゲティング配列が単一のＤＮＡセグメントにより構成される場合、それは、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン（単複）を内含する標的遺伝子の一部分の中にのみ含まれる標的遺伝子の１セグメント、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン（単複）に近位のイントロンを内含する標的遺伝子の一部分の中にのみ含まれる標的遺伝子のセグメント、又は、両方のこれらの領域に属する配列を内含する標的遺伝子のセグメントに対する相同性をもつはずである。いずれの場合でも、ＤＮＡターゲティング配列によって決定された位置における相同的組換えによる宿主細胞ゲノミックＤＮＡ内の構成体の組込みは、調節単位の制御下で機能タンパク質ドメインの発現を可能にするはずである。
【０１０５】
かかるターゲティング戦略は、構成体の組込みが、機能タンパク質ドメインについてコードするゲノミック要素の順序及び／又は配列又は細胞の生存度又は代謝に必要なその他のゲノミック配列の何らかの変更を導かないかぎり、実現可能である。標的遺伝子自体の一次翻訳産物が細胞の生存度又は代謝に不可欠である場合、相同的組換えによって修飾されていないかかる遺伝子のコピーは、通常、細胞を代謝的に活性の状態に保つのに充分な発現レベルを有するはずである。
【０１０６】
プロモータからポリアデニル化に至るまでの完全な遺伝子の配列及び構造についての知識は、より適切なターゲティング戦略を選択する上で一助となるが、ただ単に機能タンパク質ドメインに会合させられたエキソン及びイントロンの配列及び構造から出発して構成体を生成することも可能であり得る。このことは、特にすでに配列決定され特徴づけされた対応するマウス遺伝子に比べた場合、５′又は３′末端について優れた候補配列を含有するゲノミッククローンだけが利用可能であるヒトの遺伝子について特に起こり得る。同じ又はその他の生体内のその他の遺伝子との相同性及びコンピュータ予測に基づいて（Ｒｏｇｉｃ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２００１），１１（５）：８１７−３２）、関連するエキソン／イントロン接合部を、機能タンパク質ドメインを片端で制限している周囲の配列と共に、ゲノミッククローン上に規定することができる。従って、ゲノミッククローンのフラグメントが、適正なゲノム場所に調節単位を誘導するために必要なターゲティング配列を生成するのに充分な長さをもつという理由で選択され得る。
【０１０７】
ＤＮＡターゲティング配列は、ターゲティングされたゲノムの中で隣接するか又は隣接しない、標的遺伝子と相同性をもつ配列を含有する可能性がある。第１の場合には、機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンに近位のイントロンの片端か又は内部のいずれかで、外因性配列の単純な挿入が存在することになる（図１Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ）。第２の場合では、（１又は複数のイントロン及び／又は１又は複数のエキソンである）機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンに近位の非隣接配列を分離する標的遺伝子の部分は、相同的組換えの結果として欠失しかつ／又は外因性配列により置換されることになる（図１Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）。両方のタイプのベクターにおいて、相同的組換えは、機能タンパク質ドメインをコードする標的遺伝子内の相同性配列と直接整列され得る進入する外因性ＤＮＡのＤＮＡ配列によって駆動される。外因性ＤＮＡ内の相同性配列の特定の線形配置は、機能タンパク質ドメインについてコードする１又は複数のエキソンに近位のイントロン領域のレベルでの調節単位の位置及び方向性を決定することになる。
【０１０８】
ターゲティングセグメントは、それらがＰＣＲによって得られかつ／又は宿主細胞と同質遺伝子的でない細胞に由来する場合にはつねに、機能タンパク質ドメインの予想される配列及び発現を著しく改変する可能性のあるあらゆる配列差（ターゲティング領域の由来に起因するもの）を同定するべく構成体を調整する時点で配列決定されるべきである。
【０１０９】
選択されたターゲティング構成体のタイプは、機能タンパク質ドメインをコードする組換え型遺伝子を結果としてもたらす標的遺伝子のゲノミック修飾の性質を決定することになるが、ターゲティングされた細胞系統を得るために一定の与えられた構成体を使用できる実際の効率は、まず第１に、ターゲティング構成体によって左右される。
【０１１０】
特に、該構成体で達成され得る絶対ターゲティング頻度は、ターゲティング構成体内の相同性配列の長さ、ターゲティング構成体内の配列と標的遺伝子の間の相同性度及びターゲティングされつつある特定のゲノミック領域を含めた一定数の要因により左右されることが示されてきた。ターゲティング頻度は、挿入及び置換ベクターの間の一貫性ある頻度差が無い状態で、ターゲティング頻度の安定状態が１０〜１４ｋｂの間で達成されるまで、ターゲティングベクターと遺伝子座の間の配列相同性の長さが増大するにつれて増大することが示されてきた（Ｄｅｎｇ Ｃ及びＣａｐｅｃｃｈｉ ＭＲ，Ｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９２），１２（８）：３３６５−７１．）この安定状態は、ターゲティング頻度に対する相同性の長さの効果における限界ではなくむしろ細胞内へ導入できる無傷のＤＮＡフラグメントのサイズについての限界を反映しうるものである。
【０１１１】
相同的組換えにより構成体の適正な組込みを駆動するのに必要とされる相同性レベルに関して、ＤＮＡターゲティング配列は、例えば、２×ＳＣＣ、０．１％ＳＤＳ、各３０分間室温で２回；次に２×ＳＣＣ、０．１％ＳＤＳ、３０分間５０℃で一回；次に２×ＳＣＣ、各１０分間室温で２回という洗浄条件を用いて、文献中で記述された緊縮ハイブリダイゼーション条件で（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「分子クローニング；実験室マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）内因性配列とハイブリッド形成しなくてはならない。
【０１１２】
多くとも約２５〜３０％の塩基対ミスマッチしか含まない相同性配列を同定することができる。最も好ましくは、相同性核酸ストランドは、１５〜２５％の塩基対ミスマッチ、より一層好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチしか含有しない。これらの相同性度は当該技術分野において周知のように、遺伝子ライブラリ（又はその他の遺伝材料供給源）からのクローンの同定のためのさらに緊縮性の高い洗浄条件を用いることによって選択可能である。
【０１１３】
選択可能なマーカー遺伝子
構成体は、又、正の選択遺伝子、増幅可能な遺伝子及び負の選択遺伝子のうちの単数又複数のものを含む可能性がある。相同的組換えのために使用される構成体は、調節単位を構成するもの以外の外因性配列を含む可能性がある。特に、ゲノム内に適正に組込まれた調節単位をもつ形質転換されたクローンの同定を容易にするべく、正の選択遺伝子、増幅可能な遺伝子又は負の選択遺伝子のうちの単数又複数のものを、構成体に付加することができる。このような理由から、増幅可能な及び／又はマーカー遺伝子（単複）は、ターゲティング領域の間、通常は転写モジュールとターゲティング領域の１つの間で、構成体内に位置づけされる（図１Ｄ−Ｆ、Ｊ−Ｌ）。選択可能なマーカー遺伝子が使用される場合にはつねに、それは、機能タンパク質ドメインのものと全く異なる転写及び翻訳単位を構成するはずであり、前記機能タンパク質ドメインのものとの干渉をことごとく回避するため、前述した転写ターミネータといったようなあらゆる「読み過し」事象を回避する配列により調節単位からそれを分離することができる。場合によっては、正のマーカー遺伝子には片端において転写及び／又は翻訳シグナル配列が欠如している可能性があり、これは適正に組込まれた時点で初めて標的遺伝子により提供され、融合遺伝子を生成することになる。
【０１１４】
正の選択可能なマーカー遺伝子は、通常は毒性をもつ環境に対する耐性をトランスフェクションを受けた宿主細胞に付与する能力をもつ、かかる遺伝子の列としては、アデノシンデアミラーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＥＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）がある。
【０１１５】
正の選択可能なマーカー遺伝子に加えて、又はその代替として、構成体の中には、増幅可能な遺伝子も任意に内含させることができる。増幅可能な遺伝子は、選択的圧力下にあるとき、コピー数の増加を導く遺伝子である。機能タンパク質ドメインをコードする新規遺伝子を含めた、増幅可能な遺伝子に隣接する遺伝子のコピー数も又増大することになる。使用可能な増幅可能な遺伝子としては、ＤＨＦＲ、ＭＤＲ、ＯＤＣ、ＡＤＡ及びＣＡＤがある。正の選択可能マーカー遺伝子グループの成員及び増幅可能遺伝子グループの成員は重なり合い、そのため理論的には正の選択のために１つそして増幅のために１つの計２つの遺伝子を使用する代りに、両方の目的のために１つの遺伝子を使用することができる。しかしながら、大部分の細胞系統がこれらの増幅可能な遺伝子の内因性コピーを含有することから、細胞はすでに選択条件に対する幾分かの耐性をもっており、トランスフェクションを受けたＤＮＡをもつ細胞のトランスフェクションを受けたＤＮＡを受理していない細胞と区別することは困難であり得る。かくして、増幅可能な遺伝子が望まれるケースにおいては、ＨＰＨ、ｇｐｔ， ｎｅｏ及びｔｋ（ｔｋ細胞中）といったような優性な正の選択遺伝子も同様に構成体内に内含されるべきである。いくつかの利用分野においては、機能タンパク質ドメインについてコードする新規遺伝子のコピー数の増大が最終的にこのタンパク質をより大量に提供するかもしれないにせよ、増幅可能マーカーを削除することが可能である又は好ましいかもしれない。増幅は、例えば、調節単位が機能タンパク質ドメインの転写及び翻訳を非常に効率良く駆動する場合には、必要でない可能性がある。同様に、正の選択遺伝子を削除し、所望のタンパク質又はｍＲＮＡの産生についてスクリーニングすることだけにより、細胞を選択することも可能である。しかしながら、大部分のケースにおいて、少なくとも正の選択遺伝子を内含することが好ましい。
【０１１６】
構成体内には、ターゲティング配列の外部で、負の選択可能マーカー遺伝子も存在し得る。かかる遺伝子は、相同的組換えにより適切にＤＮＡ構成体が挿入されている細胞内では、削除されているために発現されないが、無作為組込みなどによりＤＮＡ構成体が不適切に挿入されている細胞内では発現される。ベクターが相同的組換えにより適切に挿入する場合、それは、相同性領域へと組換わり、これらの領域の外での配列の喪失をひき起こすことになる。かかる遺伝子の１つは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ）である。ＨＳＶｔｋは、ヌクレオチドに対するより低い緊縮性をもち、通常の哺乳動物細胞がリン酸化できないヌクレオチド類似体をリン酸化することができる。ＨＳＶｔｋが細胞内に存在する場合、アシクロビル及びガンシクロビルといったようなヌクレオチド類似体はリン酸化され宿主細胞のＤＮＡ内に取込まれ、かくして細胞を殺す。
【０１１７】
いかなるマーカー遺伝子が使用されるにせよ、文献中では、かかる遺伝子を、細胞ゲノム内にすでに存在する部位特異的リコンビナーゼ（Ｆｌｐ又はＣｒｅのようなもの）を用いてその後除去し、相同的組換えのため構成体と同時トランスフェクションに付すか、又は後に形質転換又はあらゆる組換え型技術により導入させることができる、ということが充分に認知されている、マーカー遺伝子が近くの遺伝子の転写に影響を及ぼす場合に必要でありうるかかる手順は、すでに記述されてきており、場合によってはこれを調節単位の要素を活性化又は不活性化するために使用することが可能である。（Ｇｏｒｍａｎ Ｃ ａｎｄ Ｂｕｌｌｏｃｋ Ｃ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２０００），１１（５）：４５５−６０；Ｋｕｈｎ Ｒ ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｎｋ Ｆ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），９（２）：１８３−８）
構成体
前述のような、ＤＮＡ配列を含む構成体、つまりターゲティングベクターは、線形化された形又は円形の形状で宿主細胞内に導入され、従って、ＤＮＡターゲティング領域は相同性ゲノミック配列とハイブリッド形成し、宿主細胞のゲノム内に安定した形で組込まれている内因性配列と外因性配列の間の相同的組換え可能にすることができるようになっている。
【０１１８】
構成体の集合には、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン（単複）の方向性が考慮に入れられるべきである。かくして、ターゲティング配列は、調節単位内に含まれている要素が相同的組換えにより同じ方向性で組込まれ、機能タンパク質ドメインをコードするエキソン（単複）を含む内因性ゲノミック領域と外因性調節単位の間の操作可能な形の連結を決定することができるようにするため、構成体内でクローニングされるべきである。反対に、１又は複数の選択的マーカー遺伝子は、あらゆる方向性をもつことができるが、前述のように、これらは、外因性調節単位の活性を妨害してはならず、従って、通常は、転写モジュールとより近位のターゲティング配列との間に位置づけされる。
【０１１９】
最終的に（例えば細菌細胞内の複製又は選択に関連する）相同的組換えにより組込まれ得る、調節単位及び選択的マーカー遺伝子（単複）以外の、構成体に属するＤＮＡ配列は、同様に、機能タンパク質ドメインの転写又は翻訳に影響を及ぼしてはならない。
【０１２０】
機能タンパク質ドメインの産生
機能タンパク質ドメインのアミノ酸配列及び遺伝子構造がひとたびわかった時点で、本発明の方法を用い、以下の手順を使ってその産生を得ることができる。
【０１２１】
−　調節単位の組込み（挿入又は置換のいずれかによる）が機能タンパク質ドメインの精確で効率の高い発現を可能にすることになる標的遺伝子領域の同定；
−　ターゲティング配列、調節単位及び任意には増幅可能及び／又は選択可能マーカー遺伝子（単複）を含有するターゲティングベクターの構築；
−　機能タンパク質ドメインについてコードするエキソン（単複）及びターゲティング配列を含有する適切な宿主細胞の選択；
−　既知の技術（リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降）を用いた、構成体での宿主細胞の形質転換；
−　正及び／又は負の選択、増幅、制限部位分析、ゲノミックノ逆転写ＰＣＲ、サザンブロット又はＤＮＡ配列決定といったような技術を用いた、相同的組換え後に予想される通りの組換え型遺伝子を含有する形質転換体の同定；
−　一般的な分離技術（細胞分解／破砕、抽出、沈降、クロマトグラフィ）を用いて培養細胞及び／又は培地から収集し処理した標本に対し、ｍＲＮＡ分析（プライマ拡張、ノーザンブロット法）及びタンパク質分析（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、タンパク質配列決定、エピトープマッピング、２次元ポリアクリルアミドゲル、親和力精製、酵素検定、ＣＤ／ＮＭＲスペクトル分析、ＨＰＬＣゲルろ過、質量分光法）の技術を適用することによる、選択された形質転換体の拡張及び機能タンパク質ドメインを適正に発現するクローンの選択。
【０１２２】
−　定量分析により、商業的生産に有用な相同的に組換え型のクローンを選択できるようにし、拡張された細胞培養から選択された機能タンパク質ドメインを発現し精製するための効率の良いプロトコルを開発するための、培養中の選択されたクローンのさらなる拡張。
【０１２３】
ここで本発明について、以下の例を参考にしながら記述していくが、これらの例は、いかなる形であれ発明を制限するものとみなされるべきものではない。
【０１２４】
実施例
可溶性ＴＲＡＮＣＥ
マウスＴＲＡＮＣＥ遺伝子は、５つのエキソンを含有し、第１のエキソンが基本的にタンパク質の細胞内及び膜内外ドメインについてコードする一方で、細胞外ドメインの大部分は残りの４エキソンによりコードされる。特に、ｉｎ ｖｉｖｏ 機能タンパク質ドメイン（可溶性ＴＲＡＮＣＥ又はｓＴＲＡＮＣＥ）について特異的にコードするセグメントは、第３，第４，及び第５のエキソンによって完全にコードされる（Ｌｕｍ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ ｃｈｅｍ．（１９９９），２７４（１９）：１３６１３−８：Ｋｏｄａｉｒａ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ（１９９９），２３０（１），１２１−１２７）。対応するヒト遺伝子の構造は、まだわかっていないが、ヒト染色体１３（ＧｅｎＢａｎｋ記録ＮＴ−００９９３５）に会合したヒトゲノミックセグメントは、配列及び長さに関してマウスＴＲＡＮＣＥ遺伝子のエキソンに対する高い類似性をもつセグメントへと分割されたヒトＴＲＡＮＣＥタンパク質のコーディング配列を含有している。イントロン配列の長さは同様に、２つの遺伝子の中で類似しているように思われる（図２）。
【０１２５】
近年、わずかに異なるＮ末端配列をもつｓＴＲＡＮＣＥ形態が特徴づけされ（Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒ ｆｆ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００１），２７６（１８）；１４６６５−７４），機能タンパク質ドメインをエキソン４−５のコーディング配列に縮小できるということを示唆している。又、ｓＴＲＡＮＣＥの考えられるＮ末端配列をとり囲む部域内でマウスとヒトのＴＲＡＮＣＥ間の相同性が低いことを指摘しておくのも有利である。
【０１２６】
可溶性ＴＲＡＮＣＥに対応する機能タンパク質ドメインの産生が望まれる場合、例えば、エキソン３−５を発現する相同的組換えのためのターゲティング配列としてイントロン２の２つの隣接する又は隣接しないセグメント（長さ２０Ｋｂ）を用いることによって、マウス又はヒト宿主細胞を修飾することができる。調節単位は、ヒト細胞の中で活性なプロモータ及びエンハンサ配列を含有する転写モジュール及び適切な５′ＵＴＲＭｅｔコドン及び５′スプライシング供与部位を伴う合成エキソンを含有する翻訳モジュールを含むことになる。
【０１２７】
代替的には、ヒト及びマウスのＴＲＡＮＣＥｃＤＮＡ及びタンパク質配列の間の相同性及びｓＴＲＡＮＣＥの近年同定された形態を考慮すると、イントロン３に対応する配列を、エキソン４及び５のみを発現するマウス又はヒト細胞内でターゲティングすることも可能である。構成体は、エキソン３−５を発現するために用いられるものに類似した調節単位を有することができるが、ヒト及びマウスの両方のＴＲＡＮＣＥゲノミック配列内でエキソン４のちょうど開始点に保存されたメチオニンが存在することから、スプライシングモジュール無しで、適切な翻訳モジュール及び翻訳モジュールとしての５′の未翻訳領域のみを内含する単純化された構成体も又、使用可能である。
【０１２８】
本発明の方法は、類似の遺伝子構造をもつＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＦａｓＬといったようなＴＮＦ系統群に属するその他のタンパク質の細胞外ドメインを産生するために有用である（Ｋｏｄａｉｒａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ（１９９９），２３０（１），１２１−１２７；Ｌｏｃｋｓｌｅｙ ＲＭ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ．（２００１），１０４（４）：４８７−５０１）。
【０１２９】
コラーゲンＸＶＩＩＩ １．アルファ由来の血管形成防止因子（エンドスタチン）
ａ）　ターゲティング戦略
エンドスタチンは、血管形成関連活性を全くもたない分泌された一次翻訳産物のタンパク質分解フラグメントとしてｉｎ ｖｉｖｏで生成される増々数の増大する血管形成関連機能タンパク質ドメインに属している。近年再考されてきたように、（Ｃａｏ Ｙ， Ｉｎｔ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（２００１），３３（４）：３５７−６９），Ｐエキソン，エンドスタチン又はレスチンといったような既知の血管形成阻害物質は、それぞれ、ＭＭＰ−２，コラーゲンＸＶＩＩＩ １アルファ及びコラーゲンＸＶのＣ末端フラグメントであるが、一方Ｆｎ−ｆ及びバソスタチンは、それぞれフィブロネクチン及びカルレチクリンのＮ末端フラグメントである。
【０１３０】
特に、コラーゲンタンパク質系統群に属し細胞外基質の構造要素として作用する数多くのタンパク質は、血管安定性因子を得るべくタンパク質分解により修飾され、そのうち最も研究の進んでいるのがエンドスタチンとして知られているものである。この機能タンパク質ドメインは、コラーゲンＸＶＩＩＩ １アルファ（ＣＯＬ １８Ａ１）遺伝子によりコードされ、コラーゲンＸＶ（ＣＯＬ１５）遺伝子によりコードされるレスチンと呼ばれる類似性の高いフラグメントとして、一次翻訳産物の非膠原性ドメイン（ＮＣ１）のＣ末端を表わす（Ｊｏｈｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９），３８（３２）：１０２１７−２４；Ｓａｓａｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０００），３０１（５）：１１７９−９０）。
【０１３１】
ヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子が４１のエキソンを含有する一方、マウスＣＯＬ１８Ａ１ 遺伝子は４３のエキソンを含有するが、ＮＣ１は、両方の生体においてドメイン最後の６つのエキソンによりコードされる。多量体化ドメイン（エキソン３６−３７），ヒンジ領域（エキソン３８）及びエンドスタチンコアドメイン（エキソン３９−４１）に会合されたものの間で、ＮＣ１ドメインをコードするヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子のエキソンの中でのさらなる区別を行なうこともできる。
【０１３２】
エンドスタチンは最初、エキソン４０によりコードされた最後の９個のアミノ酸とそれに加えてエキソン４１−４３によりコードされたアミノ酸に対応する１８３個のアミノ酸を含有するフラグメントとして、マウス内で特徴づけされた（ＯＲｅｉｌｌｙ ＭＳ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ（１９９７）８８（２）：２７７−２８５）。しかしながら、エキソン３８によりコードされた最後の９個のアミノ酸とエキソン３９−４１によってコードされたアミノ酸を含有する対応するフラグメントは、ヒトの標本中では発見されなかった。いくつかの研究により、ヒンジ領域がさまざまなプロテアーゼに対し特に感応性をもつことが示され（Ｆｅｌｂｏｒ Ｕ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．（２０００），１９（６）：１１８７−９４；Ｆｅｒｒｅｒａｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（２０００），４８６（３）：２４７−５１；Ｊｏｈｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９），３８（３２）：１０２１７−２４；Ｗｅｎ Ｗ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９），５９（２４）：６０５２−６０５６）、エキソン３８によりコードされた異なるＮ末端配列をもつ一連のフラグメントが導かれた（図３）。文献では、又、エキソン３９によりコードされた第１のアミノ酸が構造化されていること（Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ Ｅ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９８），１７（６）：１６５６−６４）及びエキソン３９−４１によってコードされたタンパク質のＮ末端に比べて長い又は短かい少なくとも４個のアミノ酸のＮ末端に有するタンパク質が、それぞれ活性及び不活性であると思われる（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９９），１８（１６）：４４１４−４４２３；Ｓｔａｎｄｋｅｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（１９９７），４２０（２−３）：１２９−１３３）。最後に、エキソン３９−４１によってコードされた異なる配列から誘導された、単離した又はキメラフラグメントは、細胞移動及び増殖に関して可変的特性を有する（ＷＯ００／６３２４９，ＷＯ００／６７７７１）。
【０１３３】
結論としては、ヒトＣＯＬ１８Ａｌ　エキソン３９−４１が、天然エンドスタチンの血管安定特性を提供する真正のコア機能タンパク質ドメインに対応するヒトコラーゲンＸＶＩＩＩ １アルファタンパク質の自律的折畳み単位についてコードする、と言うことができる。その上、文献では同様に、エキソン３６−３８に属する配列番号さらには、制限された長さをもつ場合にかかる機能タンパク質ドメインのＮ末端に場合により付加される非相同性配列でさえも（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９９），１８（１６）：４４１４−４４２３；Ｂｌｅｚｉｎｇｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９），１７（４）：３４３−３４８），かかるエンドスタチン様の機能タンパク質ドメインに結びつけられた血管安定性特性と干渉しないものと予想されることも示されている。
【０１３４】
染色体２１上に位置特定されるヒトＣＯＬ１８Ａ１ 遺伝子ゲノミックＤＮＡ配列（Ｈａｔｔｏｒｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（２０００），４０５（６７８４）：３１１−９）は、Ｇｅｎｂａｎｋを通してアクセス可能な３４０キロベースのゲノミッククローン内に含まれており（受入れ番号ＡＬ１６３３０２），このクローン内に内含されたセグメントの特異的増幅を可能にするプライマを容易に設計することができる。従って、相同的組換えによりヒトＣＯＬ１８Ａ１ 遺伝子のイントロン３７又はイントロン３８のレベルで調節単位の組込みを可能にするターゲティング配列及び調節単位を含有するベクターを用いて、本発明に従って、ヒト細胞を修飾することにより、ヒトエンドスタチンの血管安定性特性をもつ機能タンパク質ドメインを産生することができる。
【０１３５】
ヒトＣＯＬ１８Ａ１ 遺伝子に属する異なるターゲティング配列及び同じ調節単位を用いて、２つの異なる構成体（ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１及びｐＥｎｄ−ＨＲ＃２）を組立てた（図４Ａ）。構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１は、相同的組換えによるイントロン３６の３′末端、完全エキソン３７，イントロン３７の５′末端の、エキソン３８−４１の発現を促進する調節単位での置換を可能にする。構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２は、相同的組換えによるイントロン３７の３′末端及び全エキソン３８の、エキソン３９−４１の発現を促進する調節単位での置換を可能にする。
【０１３６】
ＤＮＡセグメントのクローニング、プラスミドの構築及びトランスフェクションならびに細胞の選択及び分析は、文献中に記述されている標準的技術を用いて実施された（Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，「分子生物学における現行プロトコル」ｐｕｂ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９９；「分子クローニング：実験室マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９；Ｈａｓｔｙ Ｐ ｅｔ ａｌ．，「遺伝子ターゲティング：実践的アプローチ」ｅｄ． Ｊｏｙｎｅｒ ＡＬ， ｐｕｂ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ（１９９９），１−３５）。全てのプラスミドを、一般的な Ｅ． ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａｌｐｈａ又はＸＬ１　ブルーを用いてヒト細胞内にトランスフェクションに先立ち維持し伝播させた。
【０１３７】
ｂ）ターゲティングベクターの構築
ターゲティングベクターを生成するために必要なＣＯＬ１８Ａ１ゲノミックフラグメントのクローニングは、ＰＣＲを用い、特にエキソン３２とエキソン４１の３′未翻訳領域の間に含まれた９．７キロベースのセグメントの内側で、ＧｅｎＢａｎｋクローンＡＬ１６３３０２からの適切な相同性領域を増幅することによって実施された。
（図４Ａ）
３７塩基の長さのプライマｏ−１１２４（配列番号５）は、５′末端においてＳａｌ Ｉ制限部位を内含する１０塩基の長さの配列を含有し、一方３′末端にある２７の塩基は、クローンＡＬ１６３３０２からのヌクレオチド２０２７９０−２０２８１６に対応している。この後者の配列は、ヒトＣＯＬ１８Ａｌ遺伝子のエキソン３２内のｏ−１１２４のハイブリダイゼーションを可能にし、それは、両方の構成体の５′ターゲティング領域を増幅するための順方向プライマとして使用された。
【０１３８】
３６塩基の長さのプライマｏ−１１２５（配列番号６）は、５′末端においてＢａｍＨ Ｉ制限部位を内含する９塩基の長さの配列を含有し、一方３′末端にある２７の塩基は、クローンＡＬ１６３３０２からのヌクレオチド２０６３０１−２０６３２７と相補的である。この後者の配列は、ヒトＣＯＬ１８Ａｌ遺伝子のイントロン３６内のｏ−１１２５のハイブリダイゼーションを可能にし、それは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の５′ターゲティング領域を増幅するための逆方向プライマとして使用された。
【０１３９】
３５塩基の長さのプライマｏ−１１２１（配列番号７）は、５′末端においてＢａｍＨ Ｉ制限部位を内含する９塩基の長さの配列を含有し、一方３′末端にある２６の塩基は、クローンＡＬ１６３３０２からのヌクレオチド２０８０９９−２０８１２５と相補的である。この後者の配列は、ヒトＣＯＬ１８Ａｌ遺伝子イントロン３７内のｏ−１１２１のハイブリダイゼーションを可能にし、それは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２の５′ターゲティング領域を増幅するための逆方向プライマとして使用された。
【０１４０】
３５塩基の長さのプライマｏ−１１１６（配列番号８）は、５′末端においてＸｂａ Ｉ制限部位を内含する１０塩基の長さの配列を含有し、一方３′末端にある２５の塩基は、クローンＡＬ１６３３０２からのヌクレオチド２０６３８２−２０６４０６に対応している。この後者の配列は、ヒトＣＯＬ１８Ａｌ遺伝子のイントロン３７内のｏ−１１１６のハイブリダイゼーションを可能にし、それは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の３′ターゲティング領域を増幅するための順方向プライマとして使用された。
【０１４１】
４０塩基の長さのプライマｏ−１１１７（配列番号９）は、５′末端においてＮｏｔ Ｉ制限部位を内含する１６塩基の長さの配列を含有し、一方３′末端にある２４の塩基は、クローンＡＬ１６３３０２からのヌクレオチド２０２７９０−２０２８２１と相補的である。この後者の配列は、ヒトＣＯＬ１８Ａｌ遺伝子イントロン３７内のｏ−１１１７のハイブリダイゼーションを可能にし、それは構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の３′ターゲティング領域を増幅するための逆方向プライマとして使用された。
【０１４２】
３４塩基の長さのプライマｏ−１１２６（配列番号１０）は、５′末端においてＸｂａ Ｉ制限部位を内含する９塩基の長さの配列を含有し、一方３′末端にある２５の塩基は、クローンＡＬ１６３３０２からのヌクレオチド２０８３８１−２０８４０５に対応している。この後者の配列は、ヒトＣＯＬ１８Ａｌ遺伝子のイントロン３８内のｏ−１１２６のハイブリダイゼーションを可能にし、それは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２の３′ターゲティング領域を増幅するための順方向プライマとして使用された。
【０１４３】
４３塩基の長さのプライマｏ−１１２３（配列番号１１）は、５′末端においてＮｏｔ Ｉ制限部位を内含する１７塩基の長さの配列を含有し、一方３′末端にある２６の塩基は、クローンＡＬ１６３３０２からのヌクレオチド２０９８２８−２０９８５３と相補的である。この後者の配列は、ヒトＣＯＬ１８Ａｌ遺伝子のイントロン３９内のｏ−１１２３のハイブリダイゼーションを可能にし、それは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２の５′ターゲティング領域を増幅するための逆方向プライマとして使用された。
【０１４４】
鋳型としてゲノミッククローンＡＬ１６３３０２を、又プライマとしてｏ―１１２４及びｏ−１１２５を使用して、ＰＣＲは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の５´ターゲティングＤＮＡフラグメントの生成を導く。この３．５Ｋｂのフラグメントは、エキソン３２の３´末端、完全なイントロン３２−３５及びエキソン３３−３６、イントロン３６の５´末端及び、それぞれ５´及び３´末端にあるユニークＳａｌ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ制限部位を内含する。
【０１４５】
鋳型としてゲノミッククローンＡＬ１６３３０２を、又プライマとしてｏ―１１２４及びｏ−１１２１を使用して、ＰＣＲは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２の５´ターゲティングフラグメントの生成を導く。この５３５４塩基対のフラグメントは、エキソン３２の３´末端、完全なイントロン３２−３６及びエキソン３３−３７、イントロン３７の５´末端及び、それぞれ５´及び３´末端にあるユニークＳａｌ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ制限部位を内含する。
【０１４６】
鋳型としてゲノミッククローンＡＬ１６３３０２を、又プライマとしてｏ―１１１６及びｏ−１１１７を使用して、ＰＣＲは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の３´ターゲティングＤＮＡフラグメントの生成を導く。この１．７Ｋｂのフラグメントは、イントロン３７の中央領域、及びそれぞれ５´及び３´末端にあるユニークＸｂａ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ制限部位を内含する。
【０１４７】
鋳型としてゲノミッククローンＡＬ１６３３０２を、又プライマとしてｏ―１１２６及びｏ−１１２３を使用して、ＰＣＲは、構成体ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２の３´ターゲティングＤＮＡフラグメントの生成を導く。この１．５Ｋｂのフラグメントは、完全なイントロン３８及びエキソン３９、及びイントロン３９の５´末端及び、それぞれ５´及び３´末端にあるＸｂａ Ｉ及びＮｏｔ Ｉのユニーク制限部位を内含する。
【０１４８】
ＰＣＲ産物は特に長いことから、ターゲティングベクターを生成するのに必要なフラグメントを増幅するためには、当該技術分野において既知の特異的酵素及び手順が好まれる。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような高信頼性の長範囲ＰＣＲ用キットが市販されている。
【０１４９】
各々の増幅された５′及び３′相同性領域を、それぞれ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳＩＩ（ｐＢＳ−ＫＳＩＩ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨ ＩとＳａｌ Ｉ部位及びＸｂａ ＩとＮｏｔ Ｉ部位の間でクローニングした。次に、制限マッピング及び部分ＤＮＡ配列決定により、増幅しクローニングしたゲノミックフラグメントを分析してそれらの同一性を確認した。
【０１５０】
文献中で知られているＤＮＡ配列を組立てることにより、調節単位の構築を実施した（図４Ｂ）。高レベルでヒト培養細胞内で構成的に活性であるヒト又は非ヒトプロモータの中から、転写モジュールを選択した。一例としては、広い宿主細胞範囲内で非常に有効であることが実証された（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｓ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ Ｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０），１８（１７）：５３２２）クローニングされたヒト伸長因子−１（ＥＦ−１）アルファ遺伝子のプロモータがある（Ｕｅｔｓｕｋｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９８９），２６４（１０）：５７９１−８）。いくつかの市販のプラスミド（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に存在するこの１．２Ｋｂの長さのプロモータは、複数のＳｐ１及びＡｐ１配列を含有するため転写の増強効果をもつ、０．９Ｋｂのイントロン及び長さ２２塩基の未翻訳エキソンの転写を開始させる転写開始部位が後続するＴＡＴＡｂｏｘを含有している。
【０１５１】
翻訳開始部位を含有する翻訳モジュールは、スプライス供与部位のためのコンセンサス配列を伴うスプライシングモジュールと組合わせられた。さらに、遺伝子の３′末端にある機能タンパク質ドメインの単離を容易にするために、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソンと同一枠内にあるシグナルペプチドについてコードする配列が、翻訳開始部位とスプライシングコンセンサス配列の間に内含された。シグナルペプチドとしては、マウスＩｇ シグナルペプチド（ｍＩｇＳＰ）配列（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受入れ番号Ｍ１３３２９）が選択され、一方、ヒト細胞内で機能的であることが近年示されたものの中からスプライシング適切コンセンサスが選択された。（Ｌｏｎｇ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（１９９８），９５（１）：２１９−２２３；Ｂｌｅｎｃｏｗｅ ＢＪ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．（２０００），２５（３）：１０６−１１０）。
【０１５２】
ヒトＥＦ−１アルファプロモータのフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ記録Ｊ０４６１７内のヌクレオチド３７３−１５６１に対応が、ｐＢＳ−ＫＳＩＩのＣｌａ ＩとＮｈｅＩの間でクローニングされ、ベクターｐＢＳ−ＥＦ１アルファを生成した。ｍＩｇＳＰについてコードするエキソン及びスプライス供与体は、１つの合成０．２Ｋｂ ＤＮＡセグメントに組合された。このコーディング配列は、５′末端にＸｂａ Ｉ制限部位を、３′末端にＮｈｅＩ及びＮｏｔ Ｉ制限部位を含有している。このフラグメントは、例えばヒトＥＦ１アルファプロモータに対する３′に位置づけされるように、Ｘｂａ ＩとＮｏｔ Ｉ部位の間でｐＢＳ−ＥＦ１アルファ内にクローニングされ、プラスミドｐＢＳ−ＥＦアルファ−ｍＩｇＳＰ−ＳＤを生成した（図５）。
【０１５３】
相同的組換えベクターバックボーンは、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から出発して構築され、これに対し、正及び負の選択マーカー、ターゲティング領域及び転写、翻訳及びスプライシングモジュールが次のように付加された。
【０１５４】
相同的組換えのための負の選択用の遺伝子を、遍在的に活性なマウスホスホグリセレートキナーゼ（ｍＰＧＫ）プロモータ及びポリアデニル化シグナル（それぞれ、Ｘ７６６８３としてＧｅｎＢａｎｋに寄託されたプラスミドに由来する５０８及び４８０塩基の長さのフラグメント）の制御下にあるＨＳＶ−１ チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ：ＮＣ−００１８０６としてＧｅｎ Ｂａｎｋに寄託されたヒトヘルペスウイルス１完全ゲノムに由来する１．８Ｋｂの長さのフラグメント）であった。
【０１５５】
ＨＳＶ−ＴＫに対し３′のところにある多重クローニング部位を修飾して、その他全ての要素のクローニングを可能にした。２つのアニールされたオリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、２つの新しいユニーク制限部位Ｎｏｔ Ｉ及びＣｌａ Ｉを導入する一方で、逐次的消化及び複製によりｍＰＧＫプロモータ及びポリアデニル化部位の近くの２つのＸｂａ Ｉ部位を削除して、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ−ｍＰＧＫ−ＴＫ−ＨＲ（図６）を生成した。この後者のプラスミドは、各構成体について、まず第１に５′ターゲティング領域を、次に正の選択マーカーを、そして最後に３′ターゲティング領域と転写／翻訳モジュールをクローニングするのに使用した。
【０１５６】
各構成体の５′ターゲティング領域を、ＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉ制限部位を用いてｐＢＳ−ＫＳＩＩベクターから切断し、次にＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉ部位の間のｐＧＥＭ−３Ｚ−ＰＧＫ−ＴＫ−ＨＲ内にサブクローニングし、結果としてｐＧＥＭ−３Ｚ−ＰＧＫ−ＴＫ−５′ＨＲ＃１及びｐＧＥＭ−３Ｚ−ｍＰＧＫ−ＴＫ−５′ＨＲ＃２をもたらした。正の選択遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子を選択し、プラスミドｐＨｙｇＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からこれを得たが、ここでは耐性遺伝子は、緑色螢光タンパク質（ＧＦＰ）としてウイルスプロモータ（ＣＭＶ）の制御下で発現されている。Ｎｏｔ Ｉで切断しクレノウ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をこれに埋めることによって２つの隣接するＮｏｔ Ｉ部位を除去するべく商用プラスミドを修飾した。その後、Ｃｌａ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ制限部位を用いて、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ−ＰＧＫ−ＴＫ−５′ＨＲ＃１及びｐＧＥＭ−３Ｚ−ｍＰＧＫ−ＴＫ−５′ＨＲ＃２内にＣｌａ Ｉ−ＢｇｌＩＩフラグメントとしてＣＭＶ−ＨｙｇＥＧＦＰ−ポリＡカセットをクローニングし、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ−ＰＧＫ−ＴＫ−ＨＹＧ−５′ＨＲ＃１及びｐＧＥＭ−３Ｚ−ｍＰＧＫ−ＴＫ−ＨＹＧ−５′ＨＲ＃２を生成した。
【０１５７】
ｍＩｇＳＰシグナルペプチドについてコードするエキソンに対し下流側にあるＮｈｅ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ部位とそれに続くコンセンサススプライス供与部位を用いて、各構成体の３′ターゲティング領域をｐＢＳ−ＫＳＩＩベクターからＸｂａ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉフラグメントとして切断し、プラスミドｐＢＳ−ＥＦ１アルファ−ｍＩｇＳＰ−ＳＤ内にクローニングした。結果として得られたプラスミドｐＢＳ−ＥＦ１アルファ−ｍＩｇＳＰ−ＳＤ−３′ＨＲ＃１及びｐＢＳ−ＥＦ１アルファ−ｍＩｇＳＰ−ＳＤ−３′ＨＲ＃２は、Ｃｌａ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ部位間で３′ターゲティング領域に融合されたＥＦ１−ｍＩｇＳＰコーディング配列を含有している。かかるＣｌａ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉフラグメントは最後に、正の選択カセットに対し下流側にあるｐＧＥＭ−３Ｚ−ＰＧＫ−ＴＫ−ＨＹＧ−５′ＨＲ＃１及びｐＧＥＭ−３Ｚ−ＰＧＫ−ＴＫ−ＨＹＧ−５′ＨＲ＃２のＣｌａ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ部位の間に導入され、最終的ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１（図７）及びｐＥｎｄ及びＨＲ＃２ベクターを提供した。これらのプラスミドは、ヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子内へと特異的場所へ外因性配列をターゲティングするため細胞内にトランスフェクションされる前に３′ターゲティング領域の３′末端にあるユニークＮｏｔ Ｉ部位で線形化され得る。ひとたび組込まれた時点で、調節単位は、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１のためのＣＯＬ１８Ａ１エキソン（配列番号１２；配列番号１３；図８）又はｐＥｎｄ−ＨＲ＃２のためのＣＯＬ１８Ａ１エキソン（配列番号１４，配列番号１５；図９）のいずれかに対し同一枠内で融合されたｍＩｇＳＰについてコードするｍＲＮＡの転写を駆動するものと予想される。
【０１５８】
ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１及びｐＥｎｄ−ＨＲ＃２の中に内含された外因性調節単位の活性は、エンドスタチンコーディング配列を含有するｐＥＡＫプラスミドを過渡的にトランスフェクションを行なうことによって予備的にテストされた（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）。調節領域は、ヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子内の相同的組換えの後に転写されスプライシングされることになるイントロン配列、少量であってもタンパク質の同定を補助する非相同性エピトープと同一枠内で融合されたヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子の下流側エキソン内のコーディング配列、停止コドン及びベクター内に存在するポリアデニル化部位を含有するＤＮＡフラグメントに対して５′のところでクローニングされた（図１０Ａ）。２つの構成体（ｐＥＡＫ−ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１及びｐＥＡＫ−ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２）は、ＣＯＬ１８Ａ１遺伝子を発現していない（後に相同的組換えのために使用される）ヒト２９３−ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクションされた（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９９），１８（１６）：４４１４−４４２３）。
【０１５９】
トランスフェクションを受けた細胞のｍＲＮＡならびに分泌された及び細胞内のタンパク質をテストして、適正な転写、スプライシング及び翻訳を確認した。
【０１６０】
分析はまず最初にトランスフェクションを受けた細胞から得たｃＤＮＡを増幅するＲＴ−ＰＣＲによってそして次にエンドスタチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）及びＦＬＡＧエピトープ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のために市販されている抗体を用いたウェスタンブロットによって実施された。特にタンパク質分析は、ＥＦ−１アルファプロモータが２９３−ＥＢＮＡへと活性であり、転写及びスプライシングの後、最終的ｍＲＮＡが、予想されたサイズの機能タンパク質ドメインへと翻訳されることを示している（図１０Ｂ）。このタンパク質は次に、ＣＯＬ１８Ａ１エキソン配列のみを含有する構成体を用いて文献で示された通り（Ｂｌｅｚｉｎｇｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９），１７（４）：３４３−３４８），外因性シグナルペプチド（図１０Ｃ）によって培地内に分泌される。
ｃ）　ターゲティングベクターのトランスフェクションとクローン選択
内因性ＣＯＬ１８Ａ１遺伝子がすでに発現されているか否かとは無関係に外因性調節配列が、活性であるか又は誘発可能であるヒト細胞型のトランスフェクションを行なうために、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１及びｐＥｎｄ−ＨＲ＃２ベクターを使用することができる。この遺伝子は、肝臓、心臓及び腎臓の血管組織ならびに肝細胞内で高度に発現される（Ｓａａｒｅｌａ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８），１５３（２）：６１１−６２６）。従って、本発明の方法を適用するために、これらの細胞型から誘導された細胞系統を使用することができるが、この遺伝子座におけるクロマチン構造が場合によって転写を抑制しうる場合でさえ、充分に強く遍在的に活性又は誘発可能な調節配列がこのような制限条件を克服できることから、ＣＯＬ１８Ａ１を発現しないその他の細胞型も同様に使用可能である。従って、細胞型の選択を、ＨＴ１０８０，ＷＩ３８，ＨｅｐＧ２又は２９３細胞のような、容易にトランスフェクション及び拡張され得る不死化されたヒト細胞系統まで拡張することが可能である。
【０１６１】
先に示した通り、血管形成防止機能タンパク質ドメインについてコードするヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子内のエキソンの選択的発現を得るべく本発明の方法で有効に修飾できるヒト不死化細胞系統の一例として、ヒト胚性腎由来細胞２９３−ＥＢＮＡが取上げられる。市販されている（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）これらの細胞は、エプスタイン−バールウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ−１）を発現し、電気穿孔を用いて効率良くトランスフェクションされ得、１０％のウシ胎児血清、４．５グラム／リットルのグルコース及び抗生物質（１００マイクログラム／ミリリットルのペニシリン及びストレプトマイシン：Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含有する標準ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で成長する。
【０１６２】
推奨された条件（６０マイクロシーメンス及び５００ボルト）で４ミリメートルのギャップ電極を備えたＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ装置（ＥｐｐＥｎｄｏｒｆ）を用い、かつメーカーから提供された哺乳動物細胞に最適化された低オスモル濃度の緩衝液を用いて、電気穿孔によるトランスフェクションを実施した。８００マイクロリットルの緩衝液中で、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１又はｐＥｎｄ−ＨＲ＃２のいずれかのＮｏｔ Ｉ線形化プラスミド１２マイクログラムを用いて電気穿孔した。パルスの後、同じ線形化されたベクターのトランスフェクションを受けた。合計２×１０７個の細胞を、予めＤ−ポリリジン（ＳＩＧＭＡ）でコーティングした１５０ミリメートルの直径をもつ４枚の組織培養平板内（ＮＵＮＣ）に平板固定した。７２時間後、２日おきに培地を交換しながら、２５０ミリグラム／ミリリットルのハイグロマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて選択を開始した。選択下でさらに４日置いた後、ハイグロマイシンに加えて１０マイクロモルのＧａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ （Ｃｙｍｅｖｅｎｅ： Ｒｏｃｈｅ ）を含有する組織培地を用いて細胞をインキュベートすることにより、相同的組換えについての負の選択を適用した。
【０１６３】
トランスフェクションから約２５日後に、単一クローンとして顕微鏡下でピペット先端部を用いて、選択された細胞を単離した。各平板について１つのクローンプールを生成し（約３００クローン／プール）、より小さいクローンプールを選択することに着手する前に拡張されさらなる分析のために充分な材料を得るべく４つのプールを最高４〜５週間正の選択下に保った。
ｄ）エンドスタンチンを発現するクローンの同定及び分析
ヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子内の外因性調節単位の相同的組換えにより、組込みの結果として血管形成防止機能タンパク質ドメインが発見される細胞を同定する目的で、正−負選択の後結果としてもたらされたクローンに対して、数多くのアプローチを適用することができる。以下の実験は、調節単位の適正な組込み及び、血管形成防止機能タンパク質ドメインをコードするエキソンの特異的発現を確認するために実施された。
【０１６４】
選択されたクローン内のヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子及び写しの構造の分析は、当業者にとって既知の文献の中で記述された技術を用いて陽性の細胞プールから抽出したゲノミックＤＮＡ及びｍＲＮＡについて実施された。適正なターゲティング及びスプライシングの後、ゲノミックＤＮＡ及びｍＲＮＡ内に含まれることになる配列を同定するためには、より高速で必要な生体材料が比較的少ないことから、第１のアプローチとして、ＤＮＡプライマを用いたＤＮＡセグメントの選択的増幅（ＰＣＲ）が好まれた（図１１Ａ−Ｂ）。増幅されたコーディング配列の一部分は同じくクローニングされ、配列同一性のさらなる確認のためＤＮＡ配列決定に付された。
【０１６５】
ＰＣＲは、ＨｏｔＳｔａｒＴＡＱ　ＰＣＲ（初期材料がゲノミックＤＮＡ又はｃＤＮＡである場合）又はＯｎｅＳｔｅｐ ＨｏｔＳｔａ ＲＴ−ＰＣＲ市販キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）のいずれかを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ９７００サーモサイクラ上で、基本的にメーカーにより記述された通りに実施された。反応の最終体積は２５又は５０マイクロリットルのいずれかであった。ＰＣＲ反応の完了後、反応混合物１０又２０マイクロリットルをアガロースゲルで走らせ、ＣＯＬ１８Ａ１遺伝子のターゲティングされた位置における外因性配列の適切な組込み又は血管形成防止機能タンパク質ドメインについてコードする予想上のスプライシング済みｍＲＮＡの存在のいずれかを示すことになる予想上のＰＣＲフラグメントの存在についてスクリーニングした。
【０１６６】
ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１又はｐＥｎｄ−ＨＲ＃２でのトランスフェクションを受けたクローンのプールをまず最初に、新しい写しの存在についてスクリーニングした。クローンから抽出したｍＲＮＡを、逆転写しその後ＰＣＲで増幅する（２段階アプローチ）か又は、直接逆転写し同じ試験管内で増幅した（１段階アプローチ）。プライマは、ｍＩｇＳＰエキソン内にハイブリッド形成する同じ順方向プライマを保ちかつ、ヒト内因性ＣＯＬ１８Ａ１エキソンとハイブリッド形成する異なる逆プライマを用いて、異なる外因性配列内で鋳型とハイブリッド形成するように設計された（図１１Ａ）。
【０１６７】
２段階アプローチについては、メーカーが記述した通りのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＩＩｃＤＮＡキット（Ｌｉｆｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），及び５単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、１マイクログラムの全ＲＮＡをオリゴ−ｄＴ１８プライマで逆転写した。３７℃で４５分間インキュベートした後、オリゴヌクレオチドから拡張されたＤＮＡに対合されたＲＮＡを削除するため、ＲＮａｓｅＨを添加し（１単位）、さらに１５分間３７℃でのインキュベーションを延長した。結果として得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、最終的に、ＲＮａｓｅを含まない水を用いて、１０ナノグラム／マイクロメートルの濃度まで希釈した。その後、２０ナノグラムのオリゴ−ｄＴプライミングされたｃＤＮＡと０．５マイクロモルの各プライマを用いて、かつ以下のプログラムを適用して、ＰＣＲを実施した：
−　１５分間、９５℃×１；
−　４５秒間、９５℃，６０℃〜５６℃（各サイクルで１℃ずつ減少）、７２℃で１分間×５；
−　４５秒間、９５℃，３０秒間５４℃及び１分間７２℃×３５；
−　１０分間、７２℃×１；
１段階アプローチについては、５００ナノグラムの全ＲＮＡと０．５マイクロモルの各プライマを用いることにより、ＯｎｅＳｔｅｐ ＨｏｔＳｔａｒ ＲＴ−ＰＣＲを実施した。メーカーが示した条件に従って３０分間５０℃で逆転反応を実施し、その後以下のプログラムを適用した：
−　１５分間　９５℃×１；
−　３０秒間、９５℃，３０秒間５７℃，１分間７２℃×３５；
−　１０分間７２℃×１；
最初、ヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子内の２つの構成体のいずれかの組込みの後に発現されるべきである、外因性ＣＯＬ１８Ａ１エキソン４０（ｏ−１１７５：配列番号１７）内でハイブリッド形成するプライマと合わせて、外因性ｍＩｇＳＰエキソン（ｏ−１１６５；配列番号１６１内のコーディング領域内でハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを使用した。ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１又はｐＥｎｄ−ＨＲ＃２のいずれかでのトランスフェクションを受けた選択されたクローンのプールから抽出されたｍＲＮＡを用いて生成されたｃＤＮＡを増幅して、適切なターゲティング，転写及びスプライシングの後に予想された一定数のヌクレオチド（ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１について５７７塩基、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２について３３１塩基）によって分離された内因性及び外因性の両方のエキソン配列をもつｍＲＮＡ分子を発現する各ターゲティング構成体のためのクローンのプール（ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１については含有するプール４及びｐＥｎｄ−ＨＲ＃２についてはプール３）を同定することが可能であった。ＰＣＲは、トランスフェクションを受けていない細胞については陰性であった（図１２）。
【０１６８】
ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１陽性クローンのプールにおいては、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２について予想されたサイズに見かけ上対応するマイナーバンドを同定することが可能であった。従って、より外部のプライマｏ−１１６５（配列番号１６）及びｏ−１１３１（配列番号１８）を用いて２つの分子種の各々について詳細なＰＣＲ分析が行なわれ、より内部の逆プライマｏ−１１７５を用いて観察された同じ長さ差をもつ２つのより大きいバンド（ＦｒａｇＡ及びＦｒａｇＢ）であるｐＥｎｄ−ＨＲ＃１陽性クローンが増幅された。かかるフラグメントは、ゲルから単離され、クローニングされ、ｏ−１１６５を順方向プライマとしその他のオリゴヌクレオチドを逆プライマシフトされたプライマとして、その他のオリゴヌクレオチドすなわちｏ−１１６４（配列番号１９），ｏ−１１７５（配列番号１７），ｏ−１１７９（配列番号２０）を用いて、鋳型として別々に使用された。
【０１６９】
マイナーバンドが代替スプライシングから結果としてもたらされる場合には、鋳型としてＦｒａｇＡ及びＦｒａｇＢを用いて得られた増幅されたフラグメントは、欠如するエキソンの長さに対応するコーディング配列だけ異なるはずである。ＦｒａｇＡとＦｒａｇＢの間で約２５０塩基対だけ異なるフラグメントを全てのプライマ対が増幅することから、もともとプール４内で同定されたマイナーバンドが実際には、全てのフラグメント内に含まれたエキソン３８（２４６塩基）が代替スプライシング事象に起因してスプライシングし尽された１つの写しに対応していた、という結論を下すことができる（図１３）。しかしながら、その後、クローニングされたフラグメントを配列決定することにより確認されたこの不規則なスプライシングは、エキソン３８及び３９が同じ枠をもつことから、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃２を細胞にトランスフェクションして得られたものと同一の写しを導く（図８）。
【０１７０】
最後に、エキソン４１の５′未翻訳領域に特異的なプライマｏ−１１９３（配列番号２１）及びｍＩｇＳＰ特異的プライマｏ−１１６５を用いて、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１でのトランスフェクションを受けた細胞のプール４からのｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲにより、０．９Ｋｂのフラグメントが得られた。このフラグメントをクローニングし配列決定した。配列は予想上のものに対応しており（図８）、エンドスタチンに特異的なターゲティングされたＣＯＬ１８Ａ１エキソンの転写を駆動するためにＤＮＡ構成体が適正に組込まれたということがさらに確認された。
【０１７１】
ｏ−１１６５（配列番号１６）及びｏ−１１６６（配列番号２２）の場合のようにエキソン配列か又はｏ−１１６８（配列番号２３）及びｏ−１１２１（配列番号７）の場合のようにイントロン配列のいずれかとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドでのＰＣＲを用いてゲノミックレベルで、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１でのトランスフェクションを受け適正な写しを発現するクローンのプールについてのさらなる分析を行なった（図１１Ｂ）。
【０１７２】
（ＲＴ−ＰＣＲにより同定されたクローンのｐＥｎｄ−ＨＲ＃１陽性プールから、又は２９３−ＥＢＮＡ未形質転換細胞から単離された）ゲノミックＤＮＡ２００ナノグラム及び各プライマを０．５マイクロモル用いて、以下のプログラムを適用してＰＣＲを実施した：
−　１５分間９５℃×１；
−　３０秒間９５℃，３０秒間で６２℃〜５８℃（各サイクル毎に１℃ずつ減少）、２分１５秒間７２℃×５；
−　３０秒間９５℃，３０秒間５７℃，２分１５秒間７２℃×２５；
−　１０分間７２℃×１。
【０１７３】
エキソン領域内でハイブリッド形成するプライマ（１方は相同的組換えにより挿入されたもの、もう１方は内因性のもの）は、もとの陽性プールから生成された全てのクローンプール内で予想された長さ（１８２０塩基）のフラグメントを増幅することができたが、トランスフェクションを受けていない細胞内ではできず（図１４Ａ）、これによりｍＩｇＳＰエキソンの組込みが確認された。イントロン領域内でハイブリッド形成するプライマは、トランスフェクションを受けたクローン及び受けないクローンの両方において予想の長さ（１７８４塩基）のフラグメントを増幅することができ、これにより、遺伝子構造の無欠性が確認された（図１４Ｂ）。
【０１７４】
遺伝子構造が、ターゲティングベクターｐＥｎｄ−ＨＲ＃１内に含有された調節単位の組込みの後予想された構造であるというさらなる証拠は、一連の制限酵素で、エキソン及びイントロン特異的プライマを用いて得られたフラグメントを消化させて、結果として得られたサブフラグメントが予想の長さをもつことを確認することによって得られた。テスト対象の酵素の全てが、予想された制限パターンを提供した（図１５Ａ，Ｂ）。
【０１７５】
本発明の方法によって修飾された細胞から抽出されたゲノミックＤＮＡ及びｍＲＮＡについて行なわれたＰＣＲ分析は、ヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子内の調節単位の組込みによって、エンドスタチンの血管安定性特性を見極める機能タンパク質ドメインについてコードするエキソンの特異的発現がひき起こされるクローンの同定を可能にした。従って、分析はさらに、所望の機能タンパク質ドメインを最も良く発現するクローンの単離及び特徴づけへと進むことができる。この付加的な分析は、充分に拡張された後でこれらのクローンから得られる全ＲＮＡ（ノーザンブロット）又はゲノミックＤＮＡ（サザンブロット）でエンドスタチン特異的プローブをハイブリッド形成するといったレベルで実施可能である。例えば、サザンブロット法により、それぞれｐＥｎｄ−ＨＲ＃１又はｐＥｎｄ−ＨＲ＃２でのトランスフェクションを受けたクローンから単離したＲＮＡの２．２Ｋｂ又は１．９Ｋｂのバンドの同定が可能となるはずである。ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩで消化された陽性細胞及びトランスフェクションを受けていない細胞のゲノミックＤＮＡがアガロースゲル上で分離され、フィルタ上に移され、エキソン３２−３６及びイントロン３２−３６に内含するヒトＣＯＬ１８Ａ１ゲノミック領域に対応する放射性フラグメントでプローブ探査された場合、トランスフェクションを受けていない細胞内で目に見えるイントロン３１から最後までのヒトＣＯＬ１８Ａ１を含む１２Ｋｂのフラグメントが正の選択のための遺伝子内の付加的なＮｈｅＩ及びＳｐｅＩ部位に起因して陽性細胞内のより短かいフラグメント（ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１のトランスフェクションを受けていない細胞）により置換されることになるため、ハイブリダイゼーションパターンは異なるものとなる。
【０１７６】
タンパク質レベルでは、血管安定性機能タンパク質ドメインのさらなる拡張、収集及び精製の前に、より高い産生レベルをもつクローンを同定するために、抗体ベースの技術（ＥＬＩＳＡ，ウェスタンブロット、免疫沈降法）を用いてスクリーニングを進めることができる。
【０１７７】
さらに精製された機能タンパク質ドメインの血管形成防止活性は、内皮細胞に基づいて文献中に記述された幾つかの方法のうちの１つにより決定可能である。陽性クローンから得た陽性抽出物、精製済み調製物又は培地は、標準として組換え型又は精製されたヒトエンドスタチンを用いて、内皮細胞移動検定においてテストすることができる。より一般的な検定のうちの１つは、市販され（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ），高い信頼性の移動試験を構築するために培養可能な人間の臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を利用している（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９９），１８（１６）；４４１４−４４２３）。
【０１７８】
Ｔｒｘ８０
ヒトチオレドキシン（Ｔｒｘ）は、細胞内ジスルフィド還元の触媒として作用する酵素である。８０〜８４のＮ末端残基を含有しかついかなる酵素活性も欠如しているチオレドキシンの切形形態（Ｔｒｘ８０）が、単球細胞系統により分割され分泌され、単独で、増殖していないヒト末梢血単核細胞の成長を刺激する強力な分裂促進サイトカインである。（Ｐｅｋｋａｒｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（２０００），２７５（４８）：３７４７４−８０）。その上、精製されたヒトＣＤ１４（＋）単球培地は、ＣＤ１４，ＣＤ４０，ＣＤ５４，ＣＤ８６の発現の増大によって測定されるように、Ｔｒｘ８０により分化まで特異的に活性化された。Ｔｒｘ８０は、同様に、ヒト末梢血単核細胞培養内でＣＤ４０（＋）単球からのＩＬ−１２の分泌をも誘発し、これは、ＰＢＭＣ培養内のインタフェロン−ガンマの分泌を誘発するＩＬ−２により増強される効果である（Ｐｅｋｋａｒｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００１ Ｍａｙ１５；９７（１０）：３１８４−９０）。Ｔｒｘがリーダー無しの分泌の後インタロイキンとの同時サイトカイン活性を幾分か有するかもしれないにせよ（Ｂｅｒｔｉｎｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（１９９９），１８９（１１）：１７８３−９），Ｔｒｘ８０で得られた効果は、完全タンパク質を用いて再現することができない。
【０１７９】
ヒトＴｒｘ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ記録Ｘ５４５３９及びＸ５４５４０）は、１０５の残基を含有するタンパク質についてコードするエキソンを５つ含有する（Ｋａｇｈａｄ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ（１９９４）１４０（２），２７３−８）。最初の４つのエキソンは、全てゼロ枠をもち、合計８５の残基についてコードし、基本的にＴｒｘ８０に対応する。イントロン４のレベルで、スプライシング受容部位と共に転写及び翻訳を終結させるための調節単位の組込みを可能にするターゲティングベクターを構築するために、イントロン４，エキソン４〜５及びイントロン３の一部を含有する１．３Ｋｂの配列を使用することができる（ＧｅｎＢａｎｋ記録Ｘ７０２８８）。
【０１８０】
ヒトチロシン−ｔＲＮＡシンセターゼ由来サイトカイン
アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のアミノアシル化の触媒として作用する。未変性ヒトチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、細胞シグナリング分子として不活性であるが、おそらくは、細胞外プロテアーゼである白血球エラスターゼによるアポトーシス条件下で、これを分泌させ、２つの全く異なるサイトカインに分割することが可能である（Ｗａｋａｓｕｇｉ Ｋ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ Ｐ， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９），２８４（５４１１）；１４７−５１）。触媒部位を収容するＮ末端フラグメントは、インタロイキン８様サイトカインとして作用する。Ｃ末端ドメインは、強力な白血球及び単球走化活性をもち、ミエロペルオキシダーゼ及び腫瘍壊死因子アルファの産生を刺激する内皮細胞−単球活性化ポリペプチドＩＩ（ＥＭＡＰ−ＩＩ）様サイトカインである。
【０１８１】
５２８個の残基を含有するタンパク質の推定上の分割部位は、残基３６０に位置設定されているが、残基３４４で分割を行なうことで得られたフラグメントも同様に活性をもつ。ヒトゲノムを探索するためにチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼの既知のコーディング配列を用いることにより（ＧｅｎＢａｎｋ記録ＢＣ００１９３３），ヒトチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼコーディング配列に対応する中断された配列を含有するゲノミッククローンを見い出すことができる（ＧｅｎＢａｎｋ記録ＡＬ３５６７８０）。特にアミノ酸３０３−３４８及び３４９−３８０についてコードする配列はそれぞれ、相対する番号づけ方向性をもつヒトクローンの配列９８１１０−９７９７０及び９６７１２〜９６６１５に対応する。
【０１８２】
この状況で、９８１１０と９６６１５の間に含まれているクローンのコーディング配列ならびにクローン内で利用可能なその他の周囲配列を用いて、Ｎ末端（アミノ酸ｌ−３４８）又はＣ末端（アミノ酸３４９−５２８）サイトカインのいずれの発現が望まれているかに応じて、９７９７０と９６７１２の間の転写及び翻訳を開始又は終結させる調節単位をターゲティングすることが可能である。
【０１８３】
免疫グロブリン重鎖の抗原結合部位
一部の実施形態においては、調節単位は、機能タンパク質ドメインの５′末端に対応する位置で転写及び翻訳を終結させる能力をもつ配列を含有することができる。かかるアプローチは、問題の機能タンパク質ドメインが標的遺伝子の第１の１又は複数のエキソン内に位置づけされ、標的遺伝子が構成的に又は誘発の後に該方法が適用される細胞の中で高度に発現される場合につねに適用可能である。
【０１８４】
一例としては、免疫グロブリン分子のＮ末端にある抗体の結合部位が挙げられる。従来の抗体の抗原結合部位は、主として重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインから超可変ループによって形成される。しかしながら、機能的抗原結合部位は、抗体が２つの重鎖可変ドメインしか含まず軽鎖が欠如している、ラクダ及びラクダ化物の場合のように、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）単独で形成される可能性もある。従来のヒト抗体からのＶＨドメインとこれらのラクダ重鎖単独抗体のＶＨの間のアミノ酸配列の差異を分析することは、改変されたヒトＶＨドメインを設計する上で一助となった。このラクダ化されたＶＨは、ラクダＶＨと同様、単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインによって形成された小さく頑丈な効率の良い認識単位であることが実証された。（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９９ Ｄｅｃ １０；２３１（１−２）：２５−３８； Ｄａｖｉｅｓ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）。１９９５ Ｍａｙ；１３（５）；４７５−９）．
Ｂ細胞の発達中に発生する再配置及び突然変異の結果として、ＩｇＧのＶＨドメインをコードするエキソンがもたらされる。抗原に対して高い親和性をもつ抗原についてコードするＢ細胞にひとたび骨髄腫細胞が融合された時点で、結果として得られるハイブリドーマ細胞は、完全ＩｇＧ遺伝子を活発に転写し翻訳するが、これらの細胞は同様に、高い効率で相同的組換えにより外因性配列を組込むこともできる（Ｓｈｕｌｍａｎ ＭＪ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９０）１０（９）；４４６６−４４７２）。機能タンパク質ドメインとしてＶＨドメインのみを得たい場合には、相同的組換えにより、関連するエキソンに後続するイントロン内に転写及び翻訳終始モジュールを含有する調節単位を組込む本発明の方法を用いて、ＩｇＧ遺伝子を修飾することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソンを発現する新規の遺伝子を得るべく、本発明のＤＮＡ構成体が標的遺伝子と相同的に組換わることのできるいくつかの可能な方法を示している。
ＨＳ１及びＨＳ２は、ＤＮＡターゲティング配列として使用される機能タンパク質ドメインについてコードするエキソンを含有する標的遺伝子と相同性をもつ構成体セグメントである。この概略的図示においては、標的遺伝子は４つのエキソン（ＥＸ１、ＥＸ２、ＥＸ３、ＥＸ４）と３つのイントロン（ＩＮ１、ＩＮ２、ＩＮ３）を含有する。機能タンパク質ドメインについてコードするエキソンは、黒色バーで示され、標的遺伝子の３′末端（Ａ−Ｆ内）及び５′末端（Ｇ−Ｌ内）のいずれかに位置設定されたものである。Ｄ−Ｆ及びＪ−Ｌでは、構成体は同様にマーカー遺伝子（ＭＫ）をも含有している。
調節単位は、転写モジュール（ＴＳ）及び翻訳モジュール（ＴＬ）、そして翻訳モジュールと機能タンパク質ドメインをコードするより近位のエキソンの間のイントロン配列をスプライスし尽すことが必要である場合にはつねに、スプライシング供与部位（Ａ及びＤ中のＳＤ）又はスプライシング受容部位（Ｇ及びＪ中のＳＡ）のいずれかを含有する外因性スプライシングモジュールで構成されている。
ＤＮＡ構成体は、調節単位そして任意にはマーカー遺伝子の、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソンに隣接するイントロン領域内への挿入を駆動でき、かくして、機能タンパク質ドメインの転写及び翻訳が開始されるか（Ａ−Ｆ中で
【化１】2004504840.tif 000003
により表わされているように）又は停止される（Ｇ−Ｌ中で
【化２】2004504840.tif 000004
という記号で表わされているように）ようになっている。内因性及びマーカー遺伝子転写／翻訳開始及び停止調節要素は、それぞれ→及び
【化３】2004504840.tif 000005
という記号で表わされている。
スプライシングモジュールは、翻訳モジュールの３′末端（Ａ及びＤ）又は５′末端（Ｇ及びＪ）に位置設定され得る。例えば、外因性調節単位の挿入がイントロン（ＩＮ２）を２つの部分（ＩＮ２′及びＩＮ２’’）に分割した場合、介入するイントロン配列（Ａ及びＤ内のＩＮ２’’；Ｇ及びＪ内のＩＮ２’）は、スプライシングモジュールを使用することによってスプライシングし尽され、かくしてＥＸ３／ＥＸ４（Ａ及びＤ中）又はＥＸ１／ＥＸ２（Ｇ及びＪ中）は、機能タンパク質ドメインを得るべく選択的に転写及び翻訳されることになる。代替的には、ＤＮＡ構成体は、調節単位そして任意にはマーカー遺伝子のイントロンと問題のエキソン（Ｂ及びＥ中のＩＮ２とＥＸ３；Ｈ及びＫ中のＩＮ２とＥＸ２）の間への挿入を、イントロンの分割無く駆動することができ、かくしてＥＸ３／ＥＸ４（Ｂ及びＥ中）又はＥＸ１／ＥＸ２（Ｈ及びＫ中）は、機能タンパク質ドメインを得るべく選択的に転写及び翻訳されることになる。
さらに代替的には、ＤＮＡ構成体は、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソンに隣接する内因性遺伝子セグメントの、外因性調節単位での置換、そして任意にはマーカー遺伝子の置換を駆動することができる。前出の状況の場合と同様、１つのターゲティング配列は必然的に、機能タンパク質ドメインについてコードするエキソンに属し（Ｂ、Ｃ、Ｅ、及びＦ中のＥＸ３；Ｈ、Ｉ、Ｋ、及びＬ中のＥＸ２）、一方、もう１つのターゲティング配列は、機能タンパク質ドメインについてのゲノミック領域内に含まれていない内因性配列に対応する。その結果は、新しいＩＮＴ配列が生成されている一方で（Ｃ及びＦ中のＩＮ／１／ＥＸ２；Ｉ及びＬ中のＥＸ３／ＩＮ３）の、外因性調節配列と２つの相同性領域（Ｃ及びＦ中のＩＮ２及びＥＸ２の一部分；Ｉ及びＬ中のＩＮ２及びＥＸ３の一部分）の間のセグメントとの置換である。
【図２】
図２は、ｓＴＲＡＮＣＥを生成するようにタンパク質分解処理された領域内のマウスとヒトのＴＲＡＮＣＥタンパク質（ＳＮ１及びＳＮ２）の整列を示す（＝は同一性を、＋は相同性を意味する）。マウスｓＴＲＡＮＣＥの可能なＮ末端として知られている残基（Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．（２００１）、２７６（１８）：１４６６５−７４）は、§で示されている。ｓＴＲＡＮＣＥのＮ末端、マウスＴＲＡＮＣＥタンパク質（ＩＣ、ＴＭ及びＥＣＤはそれぞれ細胞内、膜内外及び細胞外ドメインを表わす）マウスＴＲＡＮＣＥ遺伝子（ＥＸはエキソンを表わし、ＩＮはイントロンを表わし、相対数が後に続く）、及びヒト染色体１３（ヌクレオチドの番号づけはＧｅｎ ＢａｎｋバージョンＮＴ−００９９３５．３に関するものである）の間の対応は、破線で表わされている。ヒト及びマウスのタンパク質配列の番号付けは、元の刊行物に対応している。（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＭ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９７），３９０（６６５６）：１７５−９；Ｗｏｎｇ ＢＲ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９７），２７２（４０）：２５１９０−４）。
【図３】
図３は、対応するコード化するエキソンを伴うヒトコラーゲンＸＶＩＩＩ １アルファＮＣ１ドメインのタンパク質配列を示す（ＳＮ３）。番号付けは、公示された通りの完全な長い変異体配列に対応している（Ｏｈ ＳＰ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９４ Ｆｅｂ；１９（３）：４９４−９）。
マウス又はヒトエンドスタチンの機能タンパク質ドメインの可能なＮ末端として文献中で特徴づけされた残基は、§で表わされている。
【図４】
図４（Ａ）は、ヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子上でｐＥｎｄ−ＨＲ＃１及びｐＥｎｄ−ＨＲ＃２を構築するために使用される５′及び３′ターゲティング配列の位置を示す。元のＡＬ１６３３０２ Ｇｅｎ Ｂａｎｋクローンを用いてターゲティングベクターを構築するために必要なＣＯＬ１８Ａ１ゲノミック配列を増幅するために設計されたプライマ、エキソン及び増幅された配列の長さも同様に示されている。
（Ｂ）は、調節単位、ターゲティング配列（破線）及び正及び負のマーカー遺伝子の相対的位置を示すｐＥｎｄ−ＨＲ＃１及びｐＥｎｄ−ＨＲ＃２の単純化された表現を示す。囲みは、マウスＩｇシグナルペプチド（ｍＩｇＳＰ：Ｍ１３３２９ Ｇｅｎ Ｂａｎｋ記録のヌクレオチド１〜５６）についてコードする配列とそれに続いて、スプライシングをシミュレートするモチーフの中から選ばれた、イントロンの最初の６つのヌクレオチドとこのコーディング配列の最後のヌクレオチドを含むスプライシング供与部位（ＳＤ：下線付き配列）を示している。スプライシング部位は、 ］［ という記号で示されている。元のマウスＩｇシグナルペプチド最終コドンＴＣＡは、その適正なＳＰ４のためのｍＩｇＳＰエキソンのより優れた３′末端を提供するべくＴＣＧへと修飾されたが、この突然変異は、対応するアミノ酸（セリン）を変えていない。
【図５】
図５は、関連する制限部位を伴うプラスミドｐＢＳ−ＥＦ１アルファ−ｍＩｇＳＰ−ＳＤの簡略化した地図を示している。
【図６】
図６は、関連する制限部位を伴うプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ−ｍＰＧＫ−ＴＫ−相同的組換えの簡略化された地図を示す。
【図７】
図７は、プラスミドｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の簡略化された地図である。これは同様に、５′及び３′ターゲティング領域（５′ＨＲ及び３′ＨＲ）正の選択（ＳＥＬ＋）及び負の選択（ＳＥＬ−）のための遺伝子及びＥＦ１−アルファプロモータ、マウスＩｇシグナルペプチド及びスプライス供与部位を含有する調節単位（ＲＵ）の相対的位置をも示している。トランスフェクションに先立ちプラスミドを線形化するために使用されるＮｏｔ Ｉユニーク制限部位は、３′ＨＲの端部に位置設定される。プラスミドｐＥｎｄ−ＨＲ＃２は、ターゲティング配列のゲノミックＤＮＡ上の長さ及び位置のレベルでｐＥｎｄ−ＨＲ＃１だけ異なり（図４Ａ）、わずかに大きい（１６．９Ｋｂ）。
【図８】
図８は、プラスミドｐＥｎｄ−ＨＲ＃１がヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子特にｍＩｇＳＰエキソン及び内因性コーディング配列内に適正に組込まれている細胞内で発現された新規のｍＲＮＡの配列を示している。開始及び停止コドンは、太字で示されている。完全ｍＲＮＡは、２２１０個のヌクレオチドを含有し（エキソン４１のコーディング部分のみが示されている）、一方機能タンパク質ドメインは、２７５のアミノ酸を含有するタンパク質としてコードされている。（そのうち１９個は、ｍＩｇＳＰエキソンに属し、２５６個はヒトＣＯＬ１８Ａ１エキソン３８−４１コーディング配列に属する）。
【図９】
図９は、プラスミドｐＥｎｄ−ＨＲ＃２がヒトＣＯＬ１８Ａ１遺伝子、特にｍＩｇＳＰエキソン及び内因性コーディング配列内に適正に組込まれている細胞内で発現された新規のｍＲＮＡの配列を示している。開始及び停止コドンは、太字で示されている。完全ｍＲＮＡは、１９６４個のヌクレオチドを含有し（エキソン４１のコーディング部分のみが示されている）、一方機能タンパク質ドメインは、１９３のアミノ酸を含有するタンパク質としてコードされている（そのうち１９個は、ｍＩｇＳＰに属し、１７４個は、ヒトＣＯＬ１８Ａ１エキソン３９−４１コーディング配列に属する）。
【図１０】
図１０：（Ａ）は、ｐＥＡＫ−ＨＲ＃２フラグメントの簡略化された地図を示す。エキソン３９−４１のＣＯＬ１８Ａ１イントロン３７及びコーディング配列は、ＦＬＡＧエピトープ及びポリアデニル化部位に融合された。ｐＥＡＫ−ＨＲ＃１は、イントロン３８の代りにイントロン３７を、そしてイントロン３７とエキソン３９−４１の間にエキソン３８を含有していた。（Ｂ）は、１／１００に希釈したヒトエンドスタチンに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１８７８）でテストした全細胞抽出物を用いて実施されたウェスタンブロットを示す。（Ｃ）は、１／１０００に希釈したマウスモノクローナル抗−ＦＬＡＧ−Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ Ｆ３１６５）での免疫沈降によりテストされた同じトランスフェクションを受けた細胞からの１．５ミリリットルの調整培地及び２０マイクロリットルのＭ２−ＦＬＡＧ−アガロース（Ｓｉｇｍａ Ａ１２０５）を用いて実施したウェスタンブロットを示す。ヤギ抗ウサギ又は抗マウスのいずれかに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ標識づけされた抗体に結合された二次抗体を１／１０００に希釈し（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｉｃｏ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１及びｐＥｎｄ−ＨＲ＃２のための機能タンパク質ドメインについて予想される分子量は、それぞれ（Ｂにあるようにシグナルペプチド除去に先立ち）３１Ｋｄ及び２２Ｋｄ又は（Ｃにあるようにシグナルペプチドの除去及び培地内分泌後）２９Ｋｄ及び１９Ｋｄである。分子量におけるシフトは、エキソン３８によりコード化された配列のレベルにおけるグリコシル化に起因している。
【図１１】
図１１。（Ａ）は、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の組込みの後にヒト２９３−ＥＢＮＡ細胞によって発現された　内に含有された１．０Ｋｂの長いコーディング領域の簡略化された地図を示す。写しを同定するために使用されるプライマの位置が示されている。（Ｂ）は、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の組込みの後のヒト２９３−ＥＢＮＡ細胞内の２．４Ｋｂの長さのＣＯＬ１８Ａ１ゲノミック領域の簡略化された地図を示している。クローンを特定づけするために用いられるプライマ及び制限部位の位置が示されている。
【図１２】
図１２は、プライマとしてｏ−１１６５及びｏ−１１７５を用いて選択された細胞のｃＤＮＡを増幅させることにより得られた増幅産物が分離されているアガロースゲルを示す。各プールは、単一の平板から得られた細胞に対応する。
【図１３】
図１３は、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１の陽性クローンＦｒａｇＡ及びＦｒａｇＢのプール４から得られた２つの増幅されたセグメントの制限分析を示す。ＦｒａｇＡから得られる増幅されたフラグメントの予想上の長さは、５０１（Ａ），５７７（Ｂ），６１８（Ｃ），及び８５１（Ｄ）塩基である。ＦｒａｇＢから得られる増幅されたフラグメントの予想上の長さは、２５５（Ａ）、３１１（Ｂ）、３７２（Ｃ）、及び６０５（Ｄ）塩基である。
【図１４】
図１４：（Ａ）は、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１でのトランスフェクションを受けた２９３−ＥＢＮＡ細胞の元のプール４から（１），このプールかさらに単離されたクローンのプールから（２−４）、又はトランスフェクションを受けていない２９３−ＥＢＮＡ細胞から（５）抽出されたいずれかのゲノミックＤＮＡを用いたｏ−１１６５及びｏ−１１６６エキソン特異的プライマを使用して増幅されたＤＮＡフラグメントを示す。（Ｂ）は、ｐＥｎｄ−ＨＲ＃１でのトランスフェクションを受けた２９３−ＥＢＮＡ細胞の元のプール４から，単離されたクローンの異なるプールから（２−４）又はトランスフェクションを受けていない２９３−ＥＢＮＡ細胞から（５）抽出されたいずれかのゲノミックＤＮＡを用いたｏ−１１２１及びｏ−１１６８イントロン特異的プライマを使用して増幅されたＤＮＡフラグメントを示す。レーン２−４内のクローンのプールはなおも、予想された写しを発現している。
【図１５】
図１５：（Ａ）　イントロン３７内に存在する配列について特異的なプライマと２９３−ＥＢＮＡ細胞からのゲノミックＤＮＡ（１）か又はｍＩｇＳＰエキソン及びエキソン３８内でハイブリッド形成するプライマ及びＲＴ−ＰＣＲにより以前に同定されたクローンのｐＥｎｄ−ＨＲ＃１陽性プールからのゲノミックＤＮＡ（２）のいずれかを、一連の制限酵素を用いて２つのフラグメントの各々から得られたパターンと共に用いて増幅されたＤＮＡフラグメントを示す。（Ｂ）　ＤＮＡ フラグメントの予想上の長さをまとめた表である。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504840.tif 000125
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【手続補正書】
【提出日】平成14年8月13日(2002.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端又はＮ末端のいずれかである機能タンパク質ドメインであるタンパク質の産生方法において、該タンパク質が前記一次翻訳産物の生物活性と全く異なる生物活性をもち、
（ｉ）（ａ）該タンパク質をコードするＤＮＡの転写及び翻訳を開始するか又は終結させる能力をもつ調節ＤＮＡ；及び
（ｂ）該タンパク質についてコードする配列に対しそれぞれ５′又は３′のいずれかのところに標的遺伝子の１領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティングセグメント；
を含むＤＮＡ構成体によるトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、該構成体は、該タンパク質の発現が調節ＤＮＡの制御下にあるような形でＤＮＡターゲティングセグメントにより決定された位置で、宿主細胞のゲノミックＤＮＡ内に組込まれる、段階、そして任意には、
（ｉｉ）相同的に組換え型の細胞を培養する段階；そして任意には、
（ｉｉｉ）機能性タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端又はＮ末端のいずれかである機能タンパク質ドメインである１つのタンパク質についてコードする１又は複数のエキソンを選択的に発現するための方法において、前記１又は複数のエキソンによりコードされるタンパク質が一次翻訳産物の生物活性と全く異なる生物活性をもち、
（ａ）機能タンパク質ドメインに対応するタンパク質をコードする１又は複数のエキソンの転写及び翻訳を開始するか又は終結させる能力をもつ調節ＤＮＡ配列；
（ｂ）該タンパク質についてコードするエキソン（単複）に対しそれぞれ５′又は３′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティングセグメント；
を含むＤＮＡ構成体によるトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、該構成体は、１又は複数のエキソンの発現が調節ＤＮＡの制御下にあるような形でＤＮＡターゲティングセグメントにより決定された位置で、宿主細胞のゲノミックＤＮＡ内に組込まれる、段階、
を含んで成る方法。
【請求項３】
標的遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端に対応し、少なくともイントロン含有標的遺伝子の最３′エキソンによってコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生する方法において：
（ｉ）相同な組換えによる宿主細胞ゲノム内の組込みを経て前記エキソンに操作可能な形で連結されるＤＮＡ構成体をもつ宿主細胞を増殖させる段階であって、前記構成体が、
（ａ）該タンパク質をコードする１又は複数のエキソンに対し５′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域：
（ｂ）機能タンパク質ドメインをコードするＤＮＡの転写を活性化する能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）機能タンパク質ドメインの翻訳を開始する能力をもつＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール； そして任意には、
（ｄ）機能タンパク質ドメインのＮ末端をコードする内因性エキソンの不対合３′スプライス受容部位を補完することにより、一次写しのスプライシングを可能にして、機能タンパク質ドメインをコードする配列に対する翻訳モジュールの「枠内」並置を結果としてもたらす、不対合５′スプライス供与部位を含むスプライシングモジュール；
を含んで成る段階、そして任意には、
（ｉｉ）相同に組換え型である細胞を培養する段階；そして任意には、
（ｉｉｉ）機能タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法。
【請求項４】
翻訳モジュールが５′の未翻訳領域を含み、翻訳開始コドンが、機能タンパク質ドメインのＮ末端をコードするエキソンの中か又は機能タンパク質ドメインのＮ末端をコードするエキソンに対し５′にあるイントロンの中のいずれかに含まれている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
翻訳モジュールが、スプライシングモジュールにより機能タンパク質ドメインをコードする配列と「同一枠内」に置かれ機能タンパク質ドメインのＮ末端残基となる翻訳開始コドン及び５′の未翻訳領域を含む１又は複数の天然又は合成エキソンを含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記天然又は合成エキソン（単複）がシグナルペプチド又はそのＮ末端をコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
標的遺伝子の一次翻訳産物のＮ末端に対応し、少なくともイントロン含有標的遺伝子の１又は複数の最５′エキソンによってコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生する方法において：
（ｉ）相同な組換えによる宿主細胞ゲノム内の組込みを経て前記エキソンに操作可能な形で連結されるＤＮＡ構成体によるトランスフェクションを受けた宿主細胞を増殖させる段階であって、前記構成体が、
（ａ）該タンパク質をコードする１又は複数のエキソンに対し３′のところにゲノミック領域に相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域：
（ｂ）ゲノミックＤＮＡの転写を終結させる能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）機能タンパク質ドメインの翻訳を終結させるＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール； そして任意には、
（ｄ）機能タンパク質ドメインのＣ末端をコードする内因性エキソンの５′不対合スプライス供与部位を補完することにより、一次写しの正しいスプライシングを可能にして、機能タンパク質ドメインをコードする配列に対する翻訳モジュールの「枠内」並置を結果としてもたらす、不対合３′スプライス受容部位を含むスプライシングモジュール；
を含んで成る段階、そして任意には、
（ｉｉ）相同に組換え型である細胞を培養する段階；そして任意には、
（ｉｉｉ）機能タンパク質ドメインを収集する段階、
を含んで成る方法。
【請求項８】
翻訳モジュールが３′の未翻訳領域を含み、翻訳終止コドンが、機能タンパク質ドメインのＣ末端をコードするエキソンに対し５´にあるイントロンの中に含まれている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
翻訳モジュールが、スプライシングモジュールにより機能タンパク質ドメインをコードする配列と「同一枠内」に置かれ機能タンパク質ドメインの翻訳終止コドンとなる翻訳終止コドン及び３′の未翻訳領域を含む１又は複数の天然又は合成エキソンを含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記１又は複数の天然又は合成エキソンが、機能タンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンと同一枠内に置かれた時点で、標的遺伝子によってコードされる一次翻訳産物内に含まれたタンパク質配列と非相同なタンパク質配列をコードする、請求項５、６又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１又は複数の天然又は合成エキソンが、機能タンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンと同一枠内に置かれた時点で、標的遺伝子によりコードされる一次翻訳産物内に含まれたタンパク質配列と相同なタンパク質配列をコードする、請求項５、６又は９に記載の方法。
【請求項１２】
前記１又は複数の天然又は合成エキソンがさらに、タンパク質分解酵素の認識部位をコードする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質分解酵素が宿主細胞により発現される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質分解酵素が市販のプロテアーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ターゲティングセグメントが２つのターゲティングセグメントで構成されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
構成体がさらに１又は複数の選択可能な及び／又は増幅可能なマーカー遺伝子を含んで成る、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
機能タンパク質ドメインをコードする１又は複数のエキソンを含有する標的遺伝子の一次翻訳産物がホルモン、サイトカイン、リンフォカイン、ケモカイン、膜結合タンパク質、トランスメンブランタンパク質、細胞外基底膜、細胞内タンパク質、核タンパク質、細胞成長及び代謝調節因子、酵素、レセプタ、血液製剤又はモノクローナル抗体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
機能タンパク質ドメインが可溶性ＴＲＡＮＣＥ、エンドスタチン、Ｔｒｘ８０、チロシン−ｔＲＮＡシンセターゼ由来サイトカイン、又は免疫グロブリンの抗原結合部位に対応する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
片端には内因性転写及び翻訳制御要素、中央には機能タンパク質ドメインに結合された１又は複数の内因性エキソン及び１又は複数のイントロン、並びにもう１方の端部には外因性転写及び翻訳制御要素を含有する真核細胞のゲノム内に組込まれた組換え型遺伝子であって、当該遺伝子が当該細胞により機能タンパク質へと直接転写及び翻訳されることができることを特徴とする、遺伝子。
【請求項２０】
標的遺伝子の一次翻訳産物のＮ末端に対応し少なくともイントロン含有標的遺伝子の１又は複数の最５′エキソンによりコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生するためのＤＮＡ構成体において：
（ａ）　該タンパク質をコードする１又は複数のエキソンに対するゲノミック領域３′と相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域；
（ｂ）　機能タンパク質ドメインをコードするＤＮＡの転写を終結させる能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）　機能タンパク質ドメインの翻訳を終結させる能力をもつＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール；そして任意には；
（ｄ）　不対合３′スプライス受容部位を含むスプライシングモジュール、
を含んで成るＤＮＡ構成体。
【請求項２１】
標的遺伝子の一次翻訳産物のＣ末端に対応し少なくともイントロン含有標的遺伝子の１又は複数の最３′エキソンによりコードされる機能タンパク質ドメインであるタンパク質を産生するためのＤＮＡ構成体において：
（ａ）　該タンパク質をコードする１又は複数のエキソンに対するゲノミック領域５′と相同な配列を含むＤＮＡターゲティング領域；
（ｂ）　機能タンパク質ドメインをコードするＤＮＡの転写を活性化させる能力をもつＤＮＡ配列から成る転写モジュール；
（ｃ）　機能タンパク質ドメインの翻訳を開始させる能力をもつＤＮＡ配列から成る翻訳モジュール；そして任意には；
（ｄ）　不対合５′スプライス供与部位を含むスプライシングモジュール、
を含んで成るＤＮＡ構成体。
【請求項２２】
翻訳モジュールが単数又は複数の合成又は天然の１又は複数のエキソンを含んで成る、請求項２０又は２１に記載の構成体。
【請求項２３】
ターゲティング領域の２つのターゲティングセグメントから成る、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の構成体。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって得られた相同的に組換え型の細胞。
【請求項２５】
ヒト細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【国際調査報告】
2004504840.tif 000127
2004504840.tif 000128
2004504840.tif 000129
2004504840.tif 000130
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