(57)【要約】種々のＲａｓ細胞膜アンカータンパク質の同定が開示される。また、Ｒａｓのアイソフォームに結合する他のアンカータンパク質を同定する方法と、異常なＲａｓ活性を阻害する薬剤候補を同定する方法と、薬剤の治療量を決定する方法とが開示される。さらに、インビボにおいて異常なＲａｓ活性を阻害する方法が開示される。
2004510967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｓタンパク質に結合する細胞膜アンカータンパク質を同定する方法であって、
Ｒａｓタンパク質、細胞膜またはそれらの断片およびＲａｓアンタゴニストを含む第１の反応混合物と、Ｒａｓタンパク質および細胞膜またはそれらの断片を含むが、Ｒａｓアンタゴニストを含まない第２の反応混合物とを調製するステップと、
第１および第２の反応混合物に架橋剤を添加し、それによってＲａｓタンパク質と他のタンパク質の架橋複合体を作製するステップと、
架橋複合体の各々を個別に分離するステップと、
前記第１の反応混合物中に存在するＲａｓアンタゴニストによって阻害される、前記第２の反応混合物に形成される複合体を同定するステップと、
他の複合体からこのように同定された複合体を分離するステップと、
分離された複合体中の他のタンパク質からＲａｓタンパク質を分離するステップと
を含む方法。
【請求項２】
アンタゴニストが、プレニル化Ｒａｓタンパク質の阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アンタゴニストが、ファルネシル化Ｒａｓタンパク質の阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アンタゴニストが、Ｓ−ｔｒａｎｓ、ｔｒａｎｓ−ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）またはその類似物である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
類似物が、５−フルオロ−ＦＴＳ、５−クロロ−ＦＴＳ、４−クロロ−ＦＴＳ、２−クロロ−５−ファルネシルアミノ安息香酸、ファルネシルｔｈｉｏｎｉｃｏａｔｉｎｉｃ　ａｃｉｄ、Ｓ−ファルネシル−メチルチオサリチル酸または３−ファルネシルチオ−ｃｉｓ−アクリル酸である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アンタゴニストが、プレニル化されていないＲａｓタンパク質の阻害剤である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞膜が、発癌性Ｋ−Ｒａｓ４Ｂ（１２Ｖ）、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）またはＮ−Ｒａｓ（１３Ｖ）により形質転換されたＮＩＨ繊維芽細胞、５１８Ａ２／Ｎ−Ｒａｓ黒色腫細胞、６０７Ｂ黒色腫細胞、発癌性Ｋ−Ｒａｓを含有するＰａｎｃ−１細胞、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）を含有するＥＪ細胞またはＭＣ−ＭＡ−１１細胞から入手される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
架橋剤がＤＳＳである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
架橋剤がＤＳＰである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
異常なＲａｓ活性を阻害する薬剤候補を同定する方法であって、
Ｒａｓタンパク質、Ｒａｓタンパク質に結合するアンカータンパク質および薬剤候補を含有する反応混合物を調製するステップと、
Ｒａｓタンパク質とアンカータンパク質との相互作用に対する薬剤候補の影響を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記決定するステップが、Ｒａｓタンパク質の二量体化の程度の変化を測定するステップを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記決定するステップが、Ｒａｆタンパク質の活性の変化を測定するステップを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記決定するステップが、Ｒａｆタンパク質のＲａｓタンパク質への結合程度の変化を測定するステップを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記決定するステップが、Ｒａｓタンパク質とアンカータンパク質との結合程度の変化を測定するステップを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
反応混合物が、架橋剤をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒａｓタンパク質が基質に固定されている請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
アンカータンパク質が基質に固定されている請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
アンカータンパク質およびＲａｓタンパク質が溶液状態である請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
アンカータンパク質および／またはＲａｓタンパク質が検出可能であるように標識されている請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
アンカータンパク質および／またはＲａｓタンパク質が、蛍光タンパク質で検出可能であるように標識されている請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アンカータンパク質がガレクチン−１を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
アンカータンパク質がガレクチン−３である請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
アンカータンパク質がガレクチン−７である請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
アンカータンパク質がガレクチン−８である請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒａｓタンパク質およびアンカータンパク質が生きている細胞の形態で提供される請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
前記決定するステップが、アンカータンパク質からのＲａｓタンパク質の損失を測定するステップを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記決定するステップが、Ｒａｓタンパク質またはアンカータンパク質の細胞内での移動を観察するステップを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
異常なＲａｓ活性を示す患者に、Ｒａｓアンカータンパク質のｍＲＮＡに結合してＲａｓアンカータンパク質の発現を阻害するオリゴヌクレオチド分子を含む化合物を注入するステップを含む、インビボにおいて異常なＲａｓ活性を阻害する方法。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドがガレクチン−１のｍＲＮＡに結合する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドがガレクチン−３のｍＲＮＡに結合する請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドがガレクチン−７のｍＲＮＡに結合する請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドがガレクチン−８のｍＲＮＡに結合する請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチドが、ホスホラチオエート修飾ヌクレオチドを少なくとも１つ含有する請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドが、リポソームを介して患者に投与される請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒａｓ−アンカータンパク質結合を阻害するＲａｓアンタゴニストの有効量を決定する方法であって、
インビボまたはインビトロにおいて細胞にアンタゴニストを接触させるステップと、
前記接触させる段階の後に細胞を回収するステップと、
回収した細胞から細胞膜を単離するステップと、
細胞膜タンパク質１単位あたりのアンカータンパク質濃度の低下を測定するステップと、
低下をＲａｓアンタゴニストの用量に相関させるステップと
を含む方法。
【請求項３７】
ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−７またはガレクチン−８をコードする核酸に特異的に結合し、核酸を分解させるアンチセンス化合物。
【請求項３８】
請求項３７に記載の化合物と担体を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、Ｒａｓタンパク質に関し、さらに具体的には、Ｒａｓと他の細胞タンパク質との相互作用に関する。
【０００２】
［背景技術］
Ｒａｓタンパク質は、細胞増殖、分化、生存および形質転換をコントロールするシグナルトランスダクション経路の細胞調節因子として機能するために、細胞膜の内側面に固定されていなければならない［Ｋｌｏｏｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９］。Ｒａｓタンパク質の膜固定は、Ｃ末端Ｓ−ファルネシルシステイン、Ｋ−Ｒａｓ　４ＢのリジンのストレッチまたはＨ−ＲａｓおよびＮ−ＲａｓのＳ−ファルネシルシステインおよびＳ−パルミトイル部分によって促進され、Ｒａｓ膜標的化および結合の２シグナル機序の概念を示唆している［Ｃａｓｅｙ　ｅｔａｌ．，１９８９、Ｈａｎｃｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９、Ｃｏｘ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２］。また、パルミトイル化部位周囲のインタクトな配列も適切な標的化に必要であり、３シグナル機序を示している［Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６］。
【０００３】
Ｒａｓタンパク質のアンカリング部分が細胞質膜［Ｃｏｘ　ａｎｄ　Ｄｅｒ，１９９７］およびおそらく、特定の微小ドメイン［Ｓｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６、Ｍｉｎｅｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６、Ｅｎｇｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７、Ｍｉｎｅｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７］に標的化させると思われる。ファルネシル依存的Ｒａｓ膜アンカリングの機序は不明である。しかし、全てのＲａｓタンパク質に共通のファルネシル部分が、親油性脂質アンカーとして働き、またＲａｓに機能的な特異性を与えることをいくつかの実験が示唆している。例えば、不適当なイソプレノイド（例えば、Ｃ２０ゲラニルゲラニル基）によって修飾されたＨ−Ｒａｓは、形質転換活性を有するが、通常のＲａｓ機能がない［Ｂｕｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，］。ファルネシル化されていない不活性な通常のＲａｓが脂肪酸ミリスチン酸塩により修飾されると、形質転換活性が活性化されることを他の実験が示しており、ミリストイル化Ｒａｓ（ｍｙｒ−Ｒａｓ）は通常のＲａｓ機能をコントロールできないことを示唆している ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｂｕｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８９］。さらに、種々の脂質によって修飾されたＲａｓモデルペプチドの脂質小胞との結合定数の測定は、ファルネシル化ペプチドは比較的低い親和性でしか結合しないことを示した［Ｓｈａｈｉｎｉａｎ　ａｎｄ　Ｓｉｌｖｉｕｓ，１９９５；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７］。これらの検討は、ファルネシルの分岐側鎖構造は、ミリスチン酸塩またはパルミチン酸塩などの他の脂質と比較すると、質が劣る脂質結合剤（ｇｌｕｅ）であることを示唆している ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｇｅｌｂ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。Ｒａｓは細胞膜に非特異的に結合するのではなく、特異的な膜微小ドメインに選択的に結合し、おそらく特異的な受容体またはアンカーに結合する ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｓｉｄｄｉｑｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］、およびＲａｓとこのようなドメインとの相互作用は天然では動的であるという考えにいくつかの証拠が一致している［Ｎｉｖ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］。
【０００４】
上記で考察した実験により、全てのＲａｓタンパク質に共通のファルネシル基は細胞膜の特異的なアンカレッジ（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）脂質またはタンパク質の認識単位部分として作用するという可能性が生じている ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｃｏｘ　ａｎｄ　Ｄｅｒ，　１９９７］。Ｒａｓ機能は、膜−アンカレッジドメインと推定されるものの成熟タンパク質が競争的に置換されることによって阻害されるという仮定のもとに、Ｒａｓタンパク質のファルネシルシステインに類似する一連の有機化合物が設計されている［Ｍａｒｃｉａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５、 ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ Ｍａｒｃｉａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７、Ａｈａｒｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。これらの化合物のうち、Ｓ−ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ファルネシルチオサリチル酸（ＦＴＳ）は、Ｈ−Ｒａｓにより形質転換されたラット−１（ＥＪ）繊維芽細胞の強力な増殖阻害剤であることが見出されている。この化合物およびその活性類似物のいくつかは、濃度範囲５〜５０μＭにおいて有効であり、これらの細胞において膜に結合したＨ−Ｒａｓタンパク質に特異的に影響した ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｍａｒｃｉａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５、Ｍａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５、Ａｈａｒｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８、Ｈａｋｌａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。Ｓ−プレニル類似物における抗Ｒａｓ活性の観察される厳密な構造要件は特異的なタンパク質結合を示唆している ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ａｈａｒｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。驚くべきことに、ＦＴＳおよびそのＣ２０ゲラニルゲラニル類似物（ＧＧＴＳ）はＲａｓによる形質転換細胞の増殖を阻害したが、Ｃ１０−ゲラニル類似物（ＧＴＳ）またはそのカルボキシメチルエステル類似物は阻害しなかった ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ａｈａｒｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。Ｒａｓの上流に作用するＥｒｂＢ２によって形質転換された繊維芽細胞の増殖をＦＴＳが阻害するが、Ｒａｆ−１とは異なって、Ｒａｓとは独立に作用するｖ−Ｒａｆによって形質転換された細胞の増殖を阻害しないという証明は、Ｒａｓに対するＦＴＳの特異性を示唆した ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｍａｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５］。作用機序の検討は、ＦＴＳはＨ−Ｒａｓのファルネシル化を阻害しないことを示した ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｍａｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５］。それは、アンカレッジドメインからタンパク質を放出することによってインビトロにおいてインタクトな細胞のＨ−Ｒａｓ膜相互作用に影響を与え、分解を促進するので、細胞Ｒａｓタンパク質の総量を低下させた ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｈａｋｌａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。ＦＴＳおよび他のＳ−プレニル類似物はインビトロにおいてＲａｓメチル化を阻害するが ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｍａｒｃｉａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５、　Ａｈａｒｏｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］、インタクトな細胞におけるその増殖阻害作用は、メチル化の阻害に必要な濃度より低濃度で生じる ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｍａｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５］。ファルネシル化されているが、メチル化されていないＫ���Ｒａｓ　４Ｂ（１２Ｖ）ＣＶＹＬアイソフォームで形質転換された細胞の増殖をＦＴＳが阻害することを追加の検討は示しており、これは、Ｒａｓのメチル化は形質転換に必要ないことを確認している［Ｅｌａｄ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］。ＦＴＳはまた、正常に処理されたＫ−Ｒａｓ　４Ｂ（１２Ｖ）、Ｎ−Ｒａｓ（１３Ｖ）およびＮ−Ｒａｓ（６１Ｌ）アイソフォームをげっ歯類繊維芽細胞膜から放出させる［Ｅｌａｄ，　ｅｔ　ａｌ．　１９９９、 ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ Ｊａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］ことおよびヒト腫瘍細胞系統の膜から放出させること ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｊａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９、Ｗｅｉｓｚ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９、Ｅｇｏｚｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］をさらに別の検討は証明した。ＦＴＳの影響は、Ｒａｓタンパク質に特異的であるように思われた。例えば、ＦＴＳは、ヘテロトリマーＧタンパク質のプレニル化Ｇβγ−サブユニットをＲａｔ−１細胞膜から放出せず、ｍｙｒ−Ｒａｓによる形質転換細胞のｍｙｒ−Ｒａｓに全く影響を与えなかった ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｈａｋｌａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。ＦＴＳはヒト黒色腫細胞のプレニル化Ｒａｃ−１およびＲｈｏ　Ａ量を低下しないことも最近の検討が示した ＡＤＤＩＮ ＥＮＲｆｕ ［Ｊａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］。
【０００５】
［発明の開示］
出願人らは、ＩＤＲＡ（イソプレノイド−依存Ｒａｓアンカレッジタンパク質：ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒａｓ ａｎｃｈｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と呼ばれるＲａｓ−相互作用タンパク質を単離した。Ｒａｓ−ＩＤＲＡタンパク質複合体は、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）により形質転換したＲａｔ−１（ＥＪ）細胞の膜抽出物から同定された。ＩＤＲＡは、このような複合体から単離され、ＭＳ並びに細胞増殖および形質転換に関連する哺乳類タンパク質であるガレクチン−１としての特異抗体によって同定された［Ｐｅｒｉｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。インビボおよびインビトロ検討に基づいて、出願人らは、これがＲａｓ、特にＨ−Ｒａｓアイソフォームのアンカータンパク質であることを確立した。同様の実験において、ガレクチン−３は、Ｋ−Ｒａｓアイソフォームのアンカータンパク質として同定され、ガレクチン−７およびガレクチン−８は多数のＲａｓアイソフォームのアンカータンパク質として同定された。
【０００６】
本発明の一態様は、Ｒａｓのアイソフォームに結合する細胞膜アンカータンパク質を同定するための方法に関する。本発明の方法は、Ｒａｓタンパク質源とそのアンカータンパク質、例えば、インタクトの細胞、細胞溶菌液、細胞膜またはそれらの分画を含有する２つの反応混合物を調製するステップを必要とする。１つの反応混合物はまたＲａｓアンタゴニストも含有する。架橋剤を両方の反応混合物に添加し、Ｒａｓと細胞膜タンパク質との架橋複合体を作製する。両方の反応混合物中に形成された架橋複合体を個別に分離する。（他方の反応混合物中に存在する）Ｒａｓアンタゴニストによって阻害される（アンタゴニストを含有しない反応混合物中に形成された）Ｒａｓタンパク質複合体を同定する。その複合体を他方の複合体から単離し、次いでＲａｓタンパク質をその複合体中の他方のタンパク質から分離する。好ましいＲａｓアンタゴニストはＦＴＳおよびその類似物である。他の好ましい実施態様において、架橋された複合体を個別に分離し、アンタゴニストによって阻害された複合体の同定は、２つの反応混合物をゲル上で隣り合わせで分画することによって実施する。本発明の方法は、一般に「典型的な」Ｒａｓアイソフォームと認識されている、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ４Ａ、Ｋ−Ｒａｓ４ＢおよびＮ−Ｒａｓなどのプレニル化アイソフォーム並びにＲａｃおよびＲｈｏなどのプレニル化Ｒａｓ調節タンパク質、並びにＲｉｔおよびＲｉｎなどのプレニル化されていないＲａｓ調節タンパク質のアンカータンパク質を同定するために使用することができる。本発明の目的のために、このようなＲａｓタンパク質を全て、ＲａｓアイソフォームまたはＲａｓタンパク質と呼び、交換可能である。
【０００７】
本発明の別の態様は、異常なＲａｓ活性を阻害する薬剤候補を同定する方法に関する。本発明の方法は、生きている細胞または、Ｒａｓタンパク質、Ｒａｓタンパク質に結合する１つ以上のアンカータンパク質および薬剤候補を含有する反応混合物を調節するステップと、Ｒａｓとアンカータンパク質との相互作用に対する薬剤候補の影響を測定するステップとを必要とする。Ｒａｓ−アンカー相互作用に対する薬剤の影響は種々の方法で測定することができる。一実施態様において、Ｒａｓアイソフォームの二量体化の程度の変化を測定する。別の実施態様において、Ｒａｆタンパク質の結合または活性化の程度の変化を測定する。さらに別の実施態様において、Ｒａｓアイソフォームとアンカータンパク質との結合程度の変化を反応混合物またはインタクトな細胞において測定する。好ましい実施態様において、Ｒａｓアイソフォームまたはアンカータンパク質を基質に固定する。他の好ましい実施態様において、アンカータンパク質はガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−７またはガレクチン−８である。
【０００８】
本発明のさらに別の態様は、インビボにおいて異常なＲａｓ活性を阻害する方法と、それに使用する組成物とに関する。本発明の方法は、異常なＲａｓ活性を示す患者に、Ｒａｓのアンカータンパク質のｍＲＮＡに結合して不活性化する特異的なオリゴヌクレオチドを投与するステップを必要とする。特異的なオリゴヌクレオチドはアンカータンパク質のｍＲＮＡに結合し、その発現を低下し、Ｒａｓ活性を低下する。好ましい実施態様において、特異的なオリゴヌクレオチドはガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−７またはガレクチン−８ｍＲＮＡに結合する。これらのタンパク質の異なるものに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせも考慮されている。本発明の組成物は、核酸に結合（例えば、ハイブリダイゼーション）して、核酸を分解させる、Ｒａｓアンカータンパク質をコードする核酸を特異的に標的化するオリゴヌクレオチドを含有する。好ましいアンチセンスオリゴは、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−７またはガレクチン−８をコードする核酸に結合する。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は、Ｒａｓ−アンカータンパク質結合を阻害するＲａｓアンタゴニストの有効量を設定する方法であって、
（ｉ）インビボまたはインビトロにおいて細胞にアンタゴニストを接触させるステップと、
（ｉｉ）前記接触させる段階の後に細胞を回収するステップと、
（ｉｉｉ）回収した細胞から細胞膜を単離するステップと、
（ｉｖ）細胞膜タンパク質１単位あたりのアンカータンパク質濃度の低下を測定するステップと、
（ｅ）低下をＲａｓアンタゴニストの用量に相関させるステップと
を含む方法に関する。
【００１０】
［発明を実施する最良の形態］
本発明の一態様は、突然変異体は発癌性であることが知られている、Ｒａｓの４つのファルネシル化アイソフォーム、すなわち、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ　４Ａ、Ｋ−Ｒａｓ　４ＢおよびＮ−Ｒａｓのアンカータンパク質を同定する方法に関する。ＲａｓアンタゴニストＦＴＳおよびその活性な類似物は、細胞膜の結合部位から活性化Ｒａｓおよび発癌性Ｒａｓを特異的に除去するプレニル基ファルネシルを含有する薬剤である。Ｒａｓ膜結合が、一部には、Ｒａｓタンパク質のＣ末端アミノ酸によって決定されたとしても、これらのプレニル化薬剤はＲａｓを除去し、不活性化するのに十分である。本発明は、ファルネシル化Ｒａｓの特異的な結合部位またはアンカータンパク質を同定し、単離するためにこの特性を使用している。
【００１１】
Ｒａｓなどのタンパク質およびそのアンカーは細胞膜に密接に結合し、ジスクシンイミジルサバレート（ｓｕｂａｒａｔｅ）（ＤＳＳ；ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂａｒａｔｅ）およびジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）（ＤＳＰ； ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ））などの架橋剤によって化学的に一体として接続されうる。架橋されたＲａｓ／アンカータンパク質複合体はより大型で、Ｒａｓと比較してＳＤＳゲル上をゆっくり移動する。単離するための候補分子は、抗Ｒａｓ抗体で染色し、Ｒａｓより大型で、Ｒａｓアンタゴニストで前処理された膜に極めて低濃度で存在する複合体である。架橋された複合体が精製されたら、化学的架橋を元に戻す（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）ことによってファルネシル化Ｒａｓの候補アンカータンパク質をＲａｓから放出させ、ＳＤＳゲル上での分画によるなどによって単離する。アンカーと推定されるものからのＲａｓタンパク質の分離は、液体クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動などの標準的な技法により実施される。次いで、放出されたアンカータンパク質をゲルから抽出して、配列決定することができる。この方法はまた、他の全てのアイソフォームのＲａｓのアンカーを同定するためにも使用することができる。
【００１２】
他の実施態様において、ファルネシル以外の基でプレニル化されているＲａｓのアイソフォームおよびプレニル化されていないもののアンカータンパク質を同定する。ＦＴＳおよびその活性なプレニル化類似物も、ゲラニルゲラニルなどのファルネシル以外のプレニル基によって細胞膜にアンカリングされている調節タンパク質を競合的に置換する。ＦＴＳの好適な類似物には、５−フルオロ−ＦＴＳ、５−クロロ−ＦＴＳ、４−クロロ−ＦＴＳ、２−クロロ−５−ファルネシルアミノ安息香酸、３−ファルネシルチオ−ｃｉｓ−アクリル酸、ファルネシルｔｈｉｏｎｉｃｏａｔｉｎｉｃ　ａｃｉｄまたはＳ−ファルネシル−メチルチオサリチル酸が挙げられる。これらのプレニル化薬剤は、架橋剤と共に、ＲａｃおよびＲｈｏなどのプレニル化タンパク質のアンカータンパク質の単離および同定を可能にする。Ｒｉｔ、ＲｉｎおよびＲａｓの多数のプレニル化されていないアイソフォームなどの他のＲａｓ結合調節タンパク質は、プレニル基の助けがなくても細胞膜に結合される。これらの後者の調節タンパク質と細胞膜の相互作用は、それらのアミノ酸配列の小さい部分に依存する。にもかかわらず、これらのアミノ酸配列と相互作用する小さい有機分子は、膜アンカー部位からこれらのタンパク質を完全に除去することができる。従って、除去作用のある薬剤および架橋試薬の組み合わせを使用して、アンカー部位を同定する。好適な有機分子を大型の化学ライブラリーから同定することができる。
【００１３】
これらの方法および本明細書に開示されている他の方法は、細胞全体、細胞溶菌液もしくはホモジネートまたは単離された細胞膜もしくはそれらの断片を使用して実施することができる。好ましい細胞全体には、発癌性Ｋ−Ｒａｓ４Ｂ（１２Ｖ）、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）またはＮ−Ｒａｓ（１３Ｖ）により形質転換されたＮＩＨ繊維芽細胞、５１８Ａ２／Ｎ−Ｒａｓ黒色腫細胞、６０７Ｂ黒色腫細胞、Ｋ−Ｒａｓを含有するＰａｎｃ−１細胞、形質転換されたＲａｔ−１　ＥＪ細胞またはＭＣ−ＭＡ−１１細胞が挙げられる。
【００１４】
本発明の別の態様は、Ｒａｓアイソフォームまたはタンパク質とそれらの同種のアンカータンパク質との相互作用を遮断する薬剤を同定する化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明の方法は、任意の細胞アンカレッジ部位からＲａｓなどの調節タンパク質を除去する分子を同定する。このようなアンカレッジタンパク質の機能は、Ｒａｓなどの調節タンパク質が二量体化して、細胞質因子と組み合わされて活性を増大または増加することができるように、それらを細胞膜と相互作用させることである。従って、アンカータンパク質は任意の細胞コンパートメントから得ることができる。一般に、本発明の方法は、２つのタンパク質（例えば、Ｒａｓアイソフォームおよびアンカータンパク質）の相互作用の薬剤候補による競合的阻害に関係する。結果として、３または４つの成分の相互作用に関係する任意の競合的結合アッセイを使用することができる。これらのアッセイの多数は、体液中のホルモン、ホルモン受容体相互作用、および抗体／抗原相互作用並びに調節タンパク質と活性化因子および抑制因子の相互作用を測定するために開発されている。このような結合反応は、通常、器機により平衡状態またはリアルタイムで作成される。各場合において、アッセイのエンドポイントは薬剤と一方または両方のタンパク質の相互作用を直接または間接的に測定するか、またはこの相互作用の生物学的な結果を定量する。使用する特定の方法に応じて、アンカータンパク質および／またはＲａｓタンパク質を基質に固定するか、または溶液状態とする。また、細胞内の１つの位置から別の位置へのタンパク質の移動を測定する場合などには、タンパク質のどちらかまたは両方を、例えば、緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色の蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質で検出できるように標識することができる。
【００１５】
一実施態様において、Ｒａｓタンパク質とアンカータンパク質との相互作用に対する薬剤候補の影響は、Ｒａｓタンパク質の二量体形成が低下される程度を測定することによって求められる。Ｒａｓおよびアイソフォームが活性であるためには、それらは、アンカーと結合してニ量体を形成する細胞膜に取り入れられなければならない。次いで、Ｒａｓニ量体はＲａｆタンパク質および他の細胞質因子と相互作用し、活性化する。次いで、この複合体は調節カスケードを開始する。ニ量体形成またはＲａｆなどの他の分子の取り入れの薬剤による阻害を定量する。Ｒａｓニ量体形成を定量する方法および例えば、Ｒａｓに対するＲａｆの結合を測定することによるＲａｆの活性はＩｎｏｕｙｅら（２０００）に記載されている。別の実施態様において、Ｒａｓタンパク質とアンカータンパク質との相互作用に対する薬剤候補の影響は、Ｒａｓタンパク質とアンカータンパク質との架橋が低下される程度を測定することによって求められる。Ｒａｓ／アンカー複合体試料を、一方では薬剤候補と反応させ、もう一方では薬剤候補と反応させず、次に架橋剤で処理する。薬剤を用いた場合と用いない場合の複合体形成の量を測定する。
【００１６】
さらに別の実施態様では、相互作用に対する影響は、アンカータンパク質と結合するＲａｓの程度を測定することによって求められる。この方法は、生きている細胞におけるタンパク質の移動を観察することによって実施することができる。さらに、この方法は、両方のタンパク質が溶液である場合またはタンパク質の一方をカラムなどの基質に固定することができる場合に実施することができる。タンパク質は、抗体、蛍光標識またはタンパク質−タンパク質相互作用などの標準的な技法により同定される。タンパク質相互作用の例には、（ｉ）一方のタンパク質が基質に固定され、薬剤が第２のタンパク質の結合を阻止する親和性カラムまたは膜、（ｉｉ）例えば、溶液状態の一方のタンパク質がＢｉｏｃｏｒの細胞に固定された他方のタンパク質と相互作用し、タンパク質／タンパク質相互作用およびこのような相互作用を阻害する薬剤の能力を実時間で測定する「ＢＩＡｃｏｒｅ」バイオセンサー器機を用いて測定する表面プラスモン共鳴（この技術の利点は、親和性定数を測定することができることである）、（ｉｉｉ）標識した溶液状態の２つのタンパク質の相互作用によって発生する色の変化で、これが薬剤によりどのように影響されるかも実時間で測定される、（ｉｖ）蛍光標識したタンパク質と、ヒツジ赤血球細胞などの物体の表面にコーティングした未標識のタンパク質の相互作用により、ＦＡＣＳｃａｎ機械を用いた薬物誘導性の相互作用の測定が可能になる、および（ｖ）マイクロタイタープレートリーダーを使用して、平衡状態にあるタンパク質／タンパク質相互作用の薬剤調節を可能にするマイクロタイタープレート中での標識したタンパク質の相互作用が挙げられる。
【００１７】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−７またはガレクチン−８を使用して実施される。ガレクチン−１は、β−ガラクトシドに結合することが周知のタンパク質である。ラットタンパク質のアミノ酸配列は以下のようである：
ＭＡＣＧＬＶＡＳＮＬＮＬＫＰＧＥＣＬＫＶＲＧＥＬＡＰＤＡＫＳＦＶＬＮＬＧＫＤＳＮＮＬＣＬＨＦＮＰＲＦＮＡＨＧＤＡＮＴＩＶＣＮＳＫＤＤＧＴＷＧＴＥＱＲＥＴＡＦＰＦＱＰＧＳＩＴＥＶＣＩＴＦＤＱＡＤＬＴＩＫＬＰＤＧＨＥＦＫＦＰＮＲＬＮＭＥＡＩＮＹＭＡＡＤＧＤＦＫＩＫＣＶＡＦＥ（配列番号：１）。
Ｃｌｅｒｃｈら（１９８８）参照。対応するヌクレオチド配列は、
５’ＡＴＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧ　ＣＣＣＣＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＣＡＣＧＧＡＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＴＧＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＣＡＡＣＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＧＧＧＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡ３’（配列番号：２）である。マウスおよびヒト細胞から得られたガレクチン−１も報告されている。Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）およびＧｉｔｔら（１９９１）参照。ヒトガレクチン−１のアミノ酸および対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号：３および配列番号：４として記載されている。
ＭＡＣＧＬＶＡＳＮＬＮＬＫＰＧＥＣＬＲＶＲＧＥＶＡＰＤＡＫＳＦＶＬＮＬＧＫＤＳＮＮＬＣＬＨＦＮＰＲＦＮＡＨＧＤＡＮＴＩＶＣＮＳＫＤＧＧＡＷＧＴＥＱＲＥＡＶＦＰＦＱＰＧＳＶＡＥＶＣＩＴＦＤＱＡＮＬＴＶＫＬＰＤＧＹＥＦＫＦＰＮＲＬＮＬＥＡＩＮＹＭＡＡＤＧＤＦＫＩＫＣＶＡＦＤ （配列番号：３）コード配列：
５’ＡＴＧＧＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＧＧＣＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＡＣＧＣＴＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＴＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＴＴＧＣＡＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＡＡＧＣ ＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡ ＴＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＡ ３’（配列番号：４）
マウスおよびラットのガレクチン−１ＤＮＡｓは同一ではないが、９４％の配列の類似性をもっている。対応するアミノ酸配列は９５％の配列の類似性を持っている。マウスガレクチン−１のアミノ酸配列は以下のようである：
ＭＡＣＧＬＶＡＳＮＬＮＬＫＰＧＥＣＬＫＶＲＧＥＶＡＳＤＡＫＳＦＶＬＮＬＧＫＤＳＮＮＬＣＬＨＦＮＰＲＦＮＡＨＧＤＡＮＴＩＶＣＮＴＫＥＤＧＴＷＧＴＥＨＲＥＰＡＦＰＦＱＰＧＳＩＴＥＶＣＩＴＦＤＱＡＤＬＴＩＫＬＰＤＧＨＥＦＫＦＰＮＲＬＮＭＥＡＩＮＹＭＡＡＤＧＤＦＫＩＫＣＶＡＦＥ 配列番号：５）
【００１８】
ガレクチン−３の分子量は種内および種間で異なり、２９〜３４ｋＤの範囲である。Ｌｉｕら（１９８７）（ラット）、Ｐｉｌｌａｉ（１９９０）（ヒト）およびＣｈｅｒａｙｉｌら（１９８９）（マウス）参照。２つのヒトガレクチン−３タンパク質のアミノ酸および対応する核酸配列を以下に記載する。
ＭＡＤＮＦＳＬＨＤＡ　ＬＳＧＳＧＮＰＮＰＱ　ＧＷＰＧＡＷＧＮＱＰ　ＡＧＡＧＧＹＰＧＡＳ　ＹＰＧＡＹＰＧＱＡＰ　ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰ　ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹ　ＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ　ＧＰＰＳＧＰＧＡＹＰ　ＳＳＧＱＰＳＡＴＧＡ　ＹＰＡＴＧＰＹＧＡＰ　ＡＧＰＬＩＶＰＹＮＬ　ＰＬＰＧＧＶＶＰＲＭ　ＬＩＴＩＬＧＴＶＫＰ　ＮＡＮＲＩＡＬＤＦＱ　ＲＧＮＤＶＡＦＨＦＮ　ＰＲＦＮＥＮＮＲＲＶ　ＩＶＣＮＴＫＬＤＮＮ　ＷＧＲＥＥＲＱＳＶＦ　ＰＦＥＳＧＫＰＦＫＩ　ＱＶＬＶＥＰＤＨＦＫ　ＶＡＶＮＤＡＨＬＬＱ　ＹＮＨＲＶＫＫＬＮＥ　ＩＳＫＬＧＩＳＧＤＩ　ＤＬＴＳＡＳＹＴＭＩ（配列番号：６）
コード配列：
５’ＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＣ ＧＣＴＣＣＡＴＧＡＴ ＧＣＧＴＴＡＴＣＴＧ ＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡ ＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＡＴＧＧ ＧＧＧＧＡＡＣＣＡＧ ＣＣＴＧＣＴＧＧＧ ＣＡＧＧＧＧＧＣＴＡ ＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴ ＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＡＣＣＣ ＣＧＧＧＣＡＧＧＣＡ ＣＣＣＣＣＡＧＧＧＧ ＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧ ＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴ ＣＣＡＧＧＣＧＣＣＴＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣ ＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴ ＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧ ＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣ ＴＧＧＡＧＴＣＴＡＣ ＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣ ＴＧＧＧＧＣＣＴＡＣ ＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧ ＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧ ＴＧＣＣＡＣＣＧＧＡ ＧＣＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣ ＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣ ＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣ ＣＡＣＴＧＡＴＴＧＴ ＧＣＣＴＴＡＴＡＡＣ ＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＴ ＧＧＴＧＣＣＴＣＧＣ ＡＴＧＣＴＧＡＴＡＡ ＣＡＡＴＴＣＴＧＧＧ ＣＡＣＧＧＴＧＡＡＧ ＣＣＣＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＧＣ ＴＴＴＡＧＡＴＴＴＣ ＣＡＡＡＧＡＧＧＧＡ ＡＴＧＡＴＧＴＴＧＣ ＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴ ＡＡＣＣＣＡＣＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＧＡＡ ＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡ ＧＴＣＡＴＴＧＴＴＴ ＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡ ＧＣＴＧＧＡＴＡＡＴ ＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧ ＡＣＡＧＴＣＧＧＴＴ ＴＴＣＣＣＡＴＴＴＧ ＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡ ＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡ ＡＴＡＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＧＡＡＣＣ ＴＧＡＣＣＡＣＴＴＣ ＡＡＧＧＴＴＧＣＡＧ ＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣ ＴＣＡＣＴＴＧＴＴＧ ＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＡＴＣＧＧＧＴＴＡＡ ＡＡＡＡＣＴＣＡＡＴ ＧＡＡＡＴＣＡＧＣＡ ＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴ ＴＴＣＴＧＧＴＧＡＣ ＡＴＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣ ＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧ ＡＴＡＴＡＡ ３’（配列番号：７）
ＢＣ００１１２０．　ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ，　ｌｅｃ．．．）［ｇｉ：１２６５４５７０］
ＭＡＤＮＦＳＬＨＤＡ　ＬＳＧＳＧＮＰＮＰＱ　ＧＷＰＧＡＷＧＮＱＰ　ＡＧＡＧＧＹＰＧＡＳ　ＹＰＧＡＹＰＧＱＡＰ　ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰ　ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹ　ＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ　ＧＰＰＳＧＰＧＡＹＰ　ＳＳＧＱＰＳＡＴＧＡ　ＹＰＡＴＧＰＹＧＡＰ　ＡＧＰＬＩＶＰＹＮＬ　ＰＬＰＧＧＶＶＰＲＭ　ＬＩＴＩＬＧＴＶＫＰ　ＮＡＮＲＩＡＬＤＦＱ　ＲＧＮＤＶＡＦＨＦＮ　ＰＲＦＮＥＮＮＲＲＶ　ＩＶＣＮＴＫＬＤＮＮ　ＷＧＲＥＥＲＱＳＶＦ　ＰＦＥＳＧＫＰＦＫＩ　ＱＶＬＶＥＰＤＨＦＫ　ＶＡＶＮＤＡＨＬＬＱ　ＹＮＨＲＶＫＫＬＮＥ　ＩＳＫＬＧＩＳＧＤＩ　ＤＬＴＳＡＳＹＴＭＩ （配列番号：８）
コード配列：
５’ＡＴＧＧＣＡＧ ＡＣＡＡＴＴＴＴＴＣ ＧＣＴＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＣＴＧ ＧＧＴＣＴＧＧＡＡＡ ＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣ ＣＴＧＧＣＧＣＡＴＧ ＧＧＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧ ＣＡＧＧＧＧＧＣＴＡ ＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴ ＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧ ＧＧＧＣＣＴＡＣＣＣ ＣＧＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＧＧ ＣＴＴＡＴＣＣＴＧＧ ＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴ ＣＣＡＧＧＣＧＣＣＴ ＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣ ＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧ ＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣ ＴＧＧＡＧＴＣＴＡＣ ＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣ ＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣ ＴＧＧＧＧＣＣＴＡＣＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧ ＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧ ＴＧＣＣＡＣＣＧＧＡ ＧＣＣＴＡＣＣＣＴＧ ＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣ ＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣ ＣＡＣＴＧＡＴＴＧＴ ＧＣＣＴＴＡＴＡＡＣ ＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣ ＣＴＧＧＧＧＧＡＧＴ ＧＧＴＧＣＣＴＣＧＣＡＴＧＣＴＧＡＴＡＡ ＣＡＡＴＴＣＴＧＧＧ ＣＡＣＧＧＴＧＡＡＧ ＣＣＣＡＡＴＧＣＡＡ ＡＣＡＧＡＡＴＴＧＣ ＴＴＴＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＡＧＡＧＧＧＡ ＡＴＧＡＴＧＴＴＧＣ ＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴ ＡＡＣＣＣＡＣＧＣＴ ＴＣＡＡＴＧＡＧＡＡ ＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＧＴＣＡＴＴＧＴＴＴ ＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡ ＧＣＴＧＧＡＴＡＡＴ ＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡ ＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧ ＡＣＡＧＴＣＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＧ ＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡ ＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡ ＡＴＡＣＡＡＧＴＡＣ ＴＧＧＴＴＧＡＡＣＣ ＴＧＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＴＧＣＡＧ ＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣ ＴＣＡＣＴＴＧＴＴＧ ＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣ ＡＴＣＧＧＧＴＴＡＡ ＡＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣＡ ＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴ ＴＴＣＴＧＧＴＧＡＣ ＡＴＡＧＡＣＣＴＣＡ ＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣ ＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＡＡ ３’（配列番号：９）
追加の３つのヒトガレクチン−３の配列並びにラットおよびマウスガレクチン−３の配列を以下に記載する。
Ｍ３５３６８　（ヒト）
ＭＡＤＮＦＳＬＨＤＡ　ＬＳＧＳＧＮＰＮＰＱ　ＧＷＰＧＡＷＧＮＱＰ　ＡＧＡＧＧＹＰＧＡＳ　ＹＰＧＡＹＰＧＱＡＰ　ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰ　ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹ　ＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ　ＧＰＰＳＧＰＧＡＹＰ　ＳＳＧＱＰＳＡＰＧＡ　ＹＰＡＴＧＰＹＧＡＰ　ＡＧＰＬＩＶＰＹＮＬ　ＰＬＰＧＧＶＶＰＲＭ　ＬＩＴＩＬＧＴＶＫＰ　ＮＡＮＲＩＡＬＤＦＱ　ＲＧＮＤＶＡＦＨＦＮ　ＰＲＦＮＥＮＮＲＲＶ　ＩＶＣＮＴＫＬＤＮＮ　ＷＧＲＥＥＲＱＳＶＦ　ＰＦＥＳＧＫＰＦＫＩ　ＱＶＬＶＥＰＤＨＦＫ　ＶＡＶＮＤＡＨＬＬＱ　ＹＮＨＲＶＫＫＬＮＥ　ＩＳＫＬＧＩＳＧＤＩ　ＤＬＴＳＡＳＹＴＭＩ （配列番号：１０）
ＮＭ＿００２３０６　（ヒト）
ＭＡＤＮＦＳＬＨＤＡ　ＬＳＧＳＧＮＰＮＰＱ　ＧＷＰＧＡＷＧＮＱＰ　ＡＧＡＧＧＹＰＧＡＳ　ＹＰＧＡＹＰＧＱＡＰ　ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰ　ＧＡＹＨＧＡＰＧＡＹ　ＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ　ＧＰＰＳＧＰＧＡＹＰ　ＳＳＧＱＰＳＡＰＧＡ　ＹＰＡＴＧＰＹＧＡＰ　ＡＧＰＬＩＶＰＹＮＬ　ＰＬＰＧＧＶＶＰＲＭ　ＬＩＴＩＬＧＴＶＫＰ　ＮＡＮＲＩＡＬＤＦＱ　ＲＧＮＤＶＡＦＨＦＮ　ＰＲＦＮＥＮＮＲＲＶ　ＩＶＣＮＴＫＬＤＮＮ　ＷＧＲＥＥＲＱＳＶＦ　ＰＦＥＳＧＫＰＦＫＩ　ＱＶＬＶＥＰＤＨＦＫ　ＶＡＶＮＤＡＨＬＬＱ　ＹＮＨＲＶＫＫＬＮＥ　ＩＳＫＬＧＩＳＧＤＩ　ＤＬＴＳＡＳＹＴＭＩ （配列番号：１１）
Ｓ５９０１２　（ヒト）
ＭＡＤＮＦＳＬＨＤＡ　ＬＳＧＳＧＮＰＮＰＱ　ＧＷＰＧＡＷＧＮＱＰ　ＡＧＡＧＧＹＰＧＡＳ　ＹＰＧＡＹＰＧＱＡＰ　ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰ　ＧＡＹＰＧＡＰＧＡＹ　ＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ　ＧＰＰＳＧＰＧＡＹＰ　ＳＳＧＱＰＳＡＴＧＡ　ＹＰＡＴＧＰＹＧＡＰ　ＡＧＰＬＩＶＰＹＮＬ　ＰＬＰＧＧＶＶＰＲＭ　ＬＩＴＩＬＧＴＶＫＰ　ＮＡＮＲＩＡＬＤＦＱ　ＲＧＮＤＶＡＦＨＦＮ　ＰＲＦＮＥＮＮＲＲＶ　ＩＶＣＮＴＫＬＤＮＮ　ＷＧＲＥＥＲＱＳＶＦ　ＰＦＥＳＧＫＰＦＫＩ　ＱＶＬＶＥＰＤＨＦＫ　ＶＡＶＮＤＡＨＬＬＱ　ＹＮＨＲＶＫＫＬＮＥ　ＩＳＫＬＧＩＳＧＤＩ　ＤＬＴＳＡＳＹＴＭＩ（配列番号：１２）
Ｐ０８６９９　（ラット）
ＭＡＤＧＦＳＬＮＤＡ　ＬＡＧＳＧＮＰＮＰＱ　ＧＷＰＧＡＷＧＮＱＰ　ＧＡＧＧＹＰＧＡＳＹ　ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰ　ＧＧＹＰＧＱＡＰＰＳ　ＡＹＰＧＰＴＧＰＳＡ　ＹＰＧＰＴＡＰＧＡＹ　ＰＧＰＴＡＰＧＡＦＰ　ＧＱＰＧＧＰＧＡＹＰ　ＳＡＰＧＡＹＰＳＡＰ　ＧＡＹＰＡＴＧＰＦＧ　ＡＰＴＧＰＬＴＶＰＹ　ＤＭＰＬＰＧＧＶＭＰ　ＲＭＬＩＴＩＩＧＴＶ　ＫＰＮＡＮＳＩＴＬＮ　ＦＫＫＧＮＤＩＡＦＨ　ＦＮＰＲＦＮＥＮＮＲ　ＲＶＩＶＣＮＴＫＱＤ　ＮＮＷＧＲＥＥＲＱＳ　ＡＦＰＦＥＳＧＫＰＦ　ＫＩＱＶＬＶＥＡＤＨ　ＦＫＶＡＶＮＤＶＨＬ　ＬＱＹＮＨＲＭＫＮＬ　ＲＥＩＳＱＬＧＩＩＧ　ＤＩＴＬＴＳＡＳＨＡ　ＭＩ（配列番号：１３）
Ｐ１６１１０　　（マウス）
ＭＡＤＳＦＳＬＮＤＡ　ＬＡＧＳＧＮＰＮＰＱ　ＧＹＰＧＡＷＧＮＱＰ　ＧＡＧＧＹＰＧＡＡＹ　ＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰ　ＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧ　ＡＹＰＧＱＡＰＰＳＡ　ＹＰＧＰＴＡＰＧＡＹ　ＰＧＰＴＡＰＧＡＹＰ　ＧＱＰＡＰＧＡＦＰＧ　ＱＰＧＡＰＧＡＹＰＱ　ＣＳＧＧＹＰＡＡＧＰ　ＧＶＰＡＧＰＬＴＶ　ＰＹＤＬＰＬＰＧＧＶ　ＭＰＲＭＬＩＴＩＭＧ　ＴＶＫＰＮＡＮＲＩＶ　ＬＤＦＲＲＧＮＤＶＡ　ＦＨＦＮＰＲＦＮＥＮ　ＮＲＲＶＩＶＣＮＴＫ　ＱＤＮＮＷＧＫＥＥＲ　ＱＳＡＦＰＦＥＳＧＫ　ＰＦＫＩＱＶＬＶＥＡ　ＤＨＦＫＶＡＶＮＤＡ　ＨＬＬＱＹＮＨＲＭＫ　ＮＬＲＥＩＳＱＬＧＩ　ＳＧＤＩＴＬＴＳＡＮ　ＨＡＭＩ　　（配列番号：１４）
【００１９】
他の実施態様において、本発明の方法は、出願人らがＲａｓアイソフォームの細胞膜アンカーとして機能することも見出した、ガレクチン−７および／またはガレクチン−８を使用して実施される。ヒトガレクチン−７および−８のアミノ酸および対応する核酸配列を以下に記載する。
ガレクチン−７
Ｌ０７７６９．　ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）ガレクチン−７［ｇｉ：１８２１３１］
ＭＳＮＶＰＨＫＳＳＬＰＥＧＩＲＰＧＴＶＬＲＩＲＧＬＶＰＰＮＡＳＲＦＨＶＮＬＬＣＧＥＥＱＧＳＤＡＡＬＨＦＮＰＲＬＤＴＳＥＶＶＦＮＳＫＥＱＧＳＷＧＲＥＥＲＧＰＧＶＰＦＱＲＧＱＰＦＥＶＬＩＩＡＳＤＤＧＦＫＡＶＶＧＤＡＱＹＨＨＦＲＨＲＬＰＬＡＲＶＲＬＶＥＶＧＧＤＶＱＬＤＳＶＲＩＦ（配列番号：１５）
コード配列：
５’ＡＴＧＴＣＣＡＡＣＧＴＣ　ＣＣＣＣＡＣＡＡＧＴ　ＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣ　ＣＧＡＧＧＧＣＡＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡ　ＣＧＧＴＧＣＴＧＡＧ　ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣ　ＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣ　ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧ　ＣＡＧＧＴＴＣＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＧＣ　ＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡ　ＧＧＡＧＣＡＧＧＧＣ　ＴＣＣＧＡＴＧＣＣＧ　ＣＣＣＴＧＣＡＴＴＴ　ＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＧＴ　ＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴ　ＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣ　ＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧ　ＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧ　ＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＣＣＧＧ　ＧＣＧＴＴＣＣＴＴＴ　ＣＣＡＧＣＧＣＧＧＧ　ＣＡＧＣＣＣＴＴＣＧ　ＡＧＧＴＧＣＴＣＡＴ　ＣＡＴＣＧＣＧＴＣＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＴ　ＴＣＡＡＧＧＣＣＧＴ　ＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣ　ＧＣＣＣＡＧＴＡＣＣ　ＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧ　ＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣ　ＧＣＧＴＧＣＧＣＣＴ　ＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧ　ＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧ　ＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡ　ＣＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＧＡ　３’　　（配列番号：１６）
ガレクチン−８
ＡＹ０３７３０４．　ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｂｅｔａ．．．）［ｇｉ：１４６２６４７３］
ＭＭＬＳＬＮＮＬＱＮＩＩＹＳＰＶＩＰＹＶＧＴＩＰＤＱＬＤＰＧＴＬＩＶＩＣＧＨＶＰＳＤＡＤＲＦＱＶＤＬＱＮＧＳＳＶＫＰＲＡＤＶＡＦＨＦＮＰＲＦＫＲＡＧＣＩＶＣＮＴＬＩＮＥＫＷＧＲＥＥＩＴＹＤＴＰＦＫＲＥＫＳＦＥＩＶＩＭＶＬＫＤＫＦＱＶＰＫＳＧＴＰＱＬＰＳＮＲＧＧＤＩＳＫＩＡＰＲＴＶＹＴＫＳＫＤ　Ｓ　ＴＶ　ＮＨＴＬＴＣＴＫＩＰＰＴＮＹＶＳＫＩＬＰＦＡＡＲＬＮＴＰＭＧＰＧＧＴＶＶＶＫＧＥＶＮＡＮＡＫ　ＳＦＮＶＤＬＬＡＧＫＳＫＨＩＡＬＨＬＮＰＲＬＮＩＫＡＦＶＲＮＳＦＬＱＥＳＷＧＥＥＥＲＮＩＴＳ　ＦＰＦＳＰＧＭＹＦＥＭＩＩＹＣＤＶＲＥＦＫＶＡＶＮＧＶＨＳＬＥＹＫＨＲ　ＦＫＥＬＳＳＩＤＴＬＥＩＮＧＤＩＨＬＬＥＶＲＳＷ（配列番号：１７）
コード配列：
５’ＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴ　ＣＣＴＴＡＡＡＣＡＡ　ＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴ　ＡＴＣＡＴＣＴＡＴＡ　ＧＣＣＣＧＧＴＡＡＴ　ＣＣＣＧＴＡＴＧＴＴ　ＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣ　ＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴ　ＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡ　ＡＣＴＴＴＧＡＴＴＧ　ＴＧＡＴＡＴＧＴＧＧ　ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＴ　ＡＧＴＧＡＣＧＣＡＧ　ＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡ　ＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧ　ＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡ　ＧＣＡＧＴＧＴＧＡＡ　ＡＣＣＴＣＧＡＧＣＣ　ＧＡＴＧＴＧＧＣＣＴ　ＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡ　ＴＣＣＴＣＧＴＴＴＣ　ＡＡＡＡＧＧＧＣＣＧ　ＧＣＴＧＣＡＴＴＧＴ　ＴＴＧＣＡＡＴＡＣＴ　ＴＴＧＡＴＡＡＡＴＧ　ＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧ　ＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧ　ＡＴＣＡＣＣＴＡＴＧ　ＡＣＡＣＧＣＣＴＴＴ　ＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡ　ＡＡＧＴＣＴＴＴＴＧ　ＡＧＡＴＣＧＴＧＡＴ　ＴＡＴＧＧＴＧＣＴＡ　ＡＡＧＧＡＣＡＡＡＴ　ＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣ　ＡＡＡＧＴＣＴＧＧＣ　ＡＣＧＣＣＣＣＡＧＣ　ＴＴＣＣＴＡＧＴＡＡ　ＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡ　ＧＡＣＡＴＴＴＣＴＡ　ＡＡＡＴＣＧＣＡＣＣ　ＣＡＧＡＡＣＴＧＴＣ　ＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡ　ＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣ　ＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴ　ＣＡＣＡＣＴＴＴＧＡ　ＣＴＴＧＣＡＣＣＡＡ　ＡＡＴＡＣＣＡＣＣＴ　ＡＣＧＡＡＣＴＡＴＧ　ＴＧＴＣＧＡＡＧＡＴ　ＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣ　ＧＣＴＧＣＡＡＧＧＴ　ＴＧＡＡＣＡＣＣＣＣ　ＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴ　ＧＧＣＧＧＣＡＣＴＧ　ＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡ　ＡＧＧＡＧＡＡＧＴＧ　ＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧ　ＣＣＡＡＡＡＧＣＴＴ　ＴＡＡＴＧＴＴＧＡＣ　ＣＴＡＣＴＡＧＣＡＧ　ＧＡＡＡＡＴＣＡＡＡ　ＧＣＡＴＡＴＴＧＣＴ　ＣＴＡＣＡＣＴＴＧＡ　ＡＣＣＣＡＣＧＣＣＴ　ＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡ　ＧＣＡＴＴＴＧＴＡＡ　ＧＡＡＡＴＴＣＴＴＴ　ＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧ　ＴＣＣＴＧＧＧＧＡＧ　ＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧ　ＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣ　ＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴ　ＴＴＡＧＴＣＣＴＧＧ　ＧＡＴＧＴＡＣＴＴＴ　ＧＡＧＡＴＧＡＴＡＡ　ＴＴＴＡＴＴＧＴＧＡ　ＴＧＴＴＡＧＡＧＡＡ　ＴＴＣＡＡＧＧＴＴＧ　ＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧ　ＣＧＴＡＣＡＣＡＧＣ　ＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡ　ＡＡＣＡＣＡＧＡＴＴ　ＴＡＡＡＧＡＧＣＴＣ　ＡＧＣＡＧＴＡＴＴＧ　ＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡ　ＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡ　ＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴ　ＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴ　ＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧ　ＴＡＧ　３’　　（配列番号：１８）。本発明の方法において、Ｒａｓタンパク質に結合するアンカータンパク質の断片も使用することができる。従って、本明細書において使用する「アンカータンパク質」という用語は、このような断片および全長のタンパク質を含む。
【００２０】
本発明の別の態様は、インビボにおいて異常なＲａｓ活性を低下または阻害する方法に関する。一般に、異常なＲａｓ活性は、未制御の有糸分裂によって発現される。この現象によって特徴付けられる疾患には、癌並びに自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病、狼瘡および多発性硬化症）、肝硬変、移植片拒絶、アテローム性動脈硬化症、多発性嚢胞腎および血管形成後再狭窄などの種々の非悪性疾患が挙げられる。好ましい適応症は、Ｔ細胞の増殖を含む、罹患器官の細胞増殖によって特徴付けられる疾患である。本発明の方法は、ガレクチン−１、ガレクチン−３および／またはガレクチン−７またはガレクチン−８などの別のＲａｓアンカータンパク質に対してアンチセンス配向であるオリゴヌクレオチドを患者に投与するステップを必要とする。それらは、タンパク質の翻訳に最も強力な影響を示し、アンチセンスではない影響を最小にする配列に基づいて設計される。
【００２１】
アンチセンスＤＮＡの設計に考慮される因子には、オリゴヌクレオチドの鎖長、その結合親和性および標的ＲＮＡの接近性、内因性ヌクレアーゼによる分解への抵抗性、標的細胞膜の透過性が挙げられる。最も強力な阻害剤を選択するために、培養中の標的細胞について数十のオリゴヌクレオチドをスクリーニングすることができる（Ｗａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）。腫瘍細胞は、特に好ましい標的細胞である。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＮＡのほとんどの領域（例えば、５’非翻訳領域−および３’非翻訳領域、ＡＵＧ開始部位、スプライス接合部およびイントロン）を標的とすることができる。高い結合親和性およびヌクレアーゼ安定性はアンチセンスの活性に重要である。オリゴヌクレオチドの最適な鎖長は異なるが、一般に約１５ヌクレオチドである。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイゼーションすることができる標的核酸の配列と１００％相補的ではない。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの通常の機能を妨害して、利用性を損失させる場合並びに特異的な結合が望ましい条件下、すなわち、アッセイを実施する条件下において、インビボアッセイまたは治療的治療の場合およびインビトロアッセイの場合の生理的条件下において非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度相補的である場合には、アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイゼーションすることができる。ウリジンおよびシチジンのＣ−５プロピン類似物を含有するホスホラチオエート修飾オリゴヌクレオチドを加えることにより、アンチセンスオリゴの結合および安定性が改善される（Ｗａｇｎｅｒ，１９９３）。活性の中程度の増加はリポソームによりアンチセンスオリゴを送達することによっても達成することができる。例えば、インビトロにおけるオリゴヌクレオチドの生物活性の１０倍以下の増加は、血清抵抗性陽イオンリポソーム、ＧＳ２８８８と複合体形成することによって達成される。リポソームに高分子量核酸を封入する方法を開示している国際公開公報第９６／４００６２号、タンパク質結合リポソームを開示しており、このようなリポソームの内容物がアンチセンスＲＮＡを含むことができることを主張している米国特許番号第５，２６４，２２１号、リポソームにオリゴヌクレオチドを封入するある種の方法を記載している米国特許番号第５，６６５，７１０号、ｒａｆ遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示している国際公開公報第９７／０４７８７号も参照。
【００２２】
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ＩＶ投与用生理食塩液に溶解することによってヒトへの使用用に製剤化される。用量反応作用は、１〜２週間の持続治療では、０．０６〜７ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で期待される（Ｗａｇｎｅｒ、１９９５）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸、例えば、アンカータンパク質のｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡを分解させ、次にＲａｓの濃度を低下させる。オリゴヌクレオチドを含有するアンチセンス化合物は、米国特許番号第６，２９４，３８２号に言及されている手法などの周知の手法により調製される。
【００２３】
例えば、ガレクチン−１　ｍＲＮＡに結合するアンチセンスｍＲＮＡは、アンチセンスｍＲＮＡの鎖から選択される配列を試験し、それらをインビボにおいて使用する前に、効力についてインビトロにおいて試験することによって設計することができる。ヒトガレクチン−１の全長のアンチセンスを以下に記載する。
ＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＧＴＴＧＧＧＧＡＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＣＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＧＴＴＧＡＡＧＣＧＡＧＧＧＴＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＴＣＴＴＡＧＣＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＣＴＣＧＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＡＴ　（配列番号：１９）。好ましいガレクチン−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは以下のようである：
ＡＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＧＴ　（配列番号：２０）、
ＧＡＴＧＣＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＡＡＣＡＣＴＴＣ　（配列番号：２１）、
ＴＣＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＴＣＴＴＡＧＣＧＴＣＡＧ　（配列番号：２２）、
ＧＣＡＣＴＣＧＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧ　（配列番号：２３）および
ＧＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡ　（配列番号：２４）。
ヒトガレクチン−３の全長のアンチセンスを以下に記載する。
ＴＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＴＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＡＴＴＡＴＣＣＡＧＣＴＴＴＧＴＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＴＴＧＡＡＧＣＧＴＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＣＡＡＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＡＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＧＣＡＣＡＡＴＣＡＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＡＴＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＣＡＣＴＴＧＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＧＴＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＴＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＡＧＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＧＧＧＧＴＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＴＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＴ　（配列番号：２５）。好ましいガレクチン−３アンチセンスオリゴヌクレオチドは以下のようである：
ＴＡＴＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＴＧＡＧＧＴＣ　（配列番号：２６）、
ＧＡＡＧＣＧＴＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣ　（配列番号：２７）、
ＴＴＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＣ　（配列番号：２８）、
ＣＡＣＴＴＧＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧ　（配列番号：２９）、
ＧＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＡＧ　（配列番号：３０）および
ＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴ　（配列番号：３１）。
ガレクチン−７およびガレクチン−８　ｍＲＮＡに結合する好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは以下のようである：ガレクチン−７アンチセンスオリゴ：
５’　ＴＧＴＧＧＧＧＧＡＣＧＴＴＧＧＡＣＡＴ　３’（配列番号：３２）
ガレクチン−８アンチセンスオリゴ：
５’　ＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴ　３’（配列番号：３３）。
【００２４】
本発明のよりさらに別の態様は、Ｒａｓ−アンカータンパク質結合を阻害するＲａｓアンタゴニストの有効用量を設定する方法に関する。一般に、本発明の方法は、インビボまたはインビトロにおいて細胞にアンタゴニストを接触させるステップと、接触後に細胞を回収するステップと、回収した細胞から細胞膜を単離するステップと、細胞膜タンパク質１単位あたりのアンカータンパク質濃度の低下を測定するステップと、低下をＲａｓアンタゴニストの用量に相関させるステップとを必要とする。好ましい実施態様において、ＦＴＳおよびその類似物の生物学的作用をインビボおよびインビトロにおいて測定する方法は、Ｈ−Ｒａｓによる形質転換腫瘍におけるイムノアッセイ可能なガレクチン−１の抑制に基づいている。このアッセイの基本は、細胞膜からガレクチン−１がＦＴＳにより用量依存的に損失されることに依存している。ＦＴＳによる腫瘍細胞の最大刺激下では、ガレクチン−１の９０％が膜から損失される。これは優れた用量反応を可能にする。このアッセイの一形態は、第１相臨床試験においてＦＴＳで治療されている患者から単離した正常ヒトリンパ球におけるアンカータンパク質の薬剤誘導性の抑制を使用している。ガレクチン−１（またはアンタゴニストのそれぞれのアンカータンパク質）を最大に抑制するＦＴＳまたは任意の他のＲａｓアンタゴニストの用量は、インビボにおいて他の生物学的エンドポイントに影響を生ずる用量であるべきである。このようなアッセイがマウスおよびヒトにおける場合には、Ｒａｓアンタゴニストのヒトのための治療的に有効な用量を設定することができる。
【００２５】
本発明の種々の態様は、以下の実施例によってさらに例示される。これらの実施例の提供は、いかなる意味でも出願人らの発明を限定する意図のものではない。特に明記しない限り、割合は全て重量による。
【００２６】
［実施例　１］
本発明者らは、Ｒａｓとの相互作用をＦＴＳによって遮断できると思われるタンパク質を単離するために化学的架橋剤を使用した。本発明者らは、形質転換したＲａｔ−１（ＥＪ）細胞においてＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）とのＦＴＳ感受性複合体を形成するようなタンパク質を同定した。このタンパク質をこのような複合体から単離し、質量分析（ＭＳ）並びに細胞増殖および形質転換に関連することが周知の哺乳類ガラクトース結合タンパク質、ガレクチン−１などの特異的な抗体によって同定した。無傷のＥＪ細胞および細胞膜において検出されるガレクチン−１に対するＨ−Ｒａｓの架橋はガレクチン−１糖結合活性とは無関係であった。ＦＴＳは、Ｒａｓの低下と平行して、ＥＪ細胞における内因性ガレクチン−１のレベルを低下した（が、その不活性な類似物、ＧＴＳは低下しなかった）。ガレクチン−１はファルネシル化Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）と主に相互作用すると思われる。Ｋ−Ｒａｓ　４Ｂ（１２Ｖ）は、Ｈ−Ｒａｓと比較して低い効率でしかガレクチン−１と相互作用しなかった。ガレクチン−３はＫ−およびＨ−Ｒａｓと相互作用した。活性化されたＮ−Ｒａｓ（１３Ｖ）はガレクチン−１またはガレクチン−３と複合体形成しなかった。ウエスタンブロットで検出したとき、２つの細胞系統においてガレクチン−１アンチセンスＲＮＡおよびＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）が同時発現されることより、Ｒａｓタンパク質が低下した。ガレクチン−１アンチセンスの共焦点顕微鏡発現を使用すると、生細胞膜から緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識したＨ−Ｒａｓが放出された。従って、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）およびガレクチン−１は細胞膜内で相互作用し、細胞形質転換に協力すると思われる。これらの結果は、Ｒａｓ形質転換と、活性化されたＲａｓの能力と同様に、多種類のヒト悪性腫瘍に関連する、ガレクチン−１の周知の糖非依存的有糸分裂促進および形質転換能力との関係を提供している。
【００２７】
１．　Ｒａｓ阻害剤ＦＴＳに感受性のＲａｓ−相互作用タンパク質の同定
細胞膜におけるＲａｓの幾分限定されるが、迅速な横方向への移動は、Ｒａｓと他のタンパク質との相互作用が動的で、一過的であると思われることを示唆している［Ｎｉｖ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９］。本発明者らは、ＲａｓとＲａｓ相互作用タンパク質の解離が迅速な複合体を同定する試みに化学的架橋剤を使用した。Ｒａｓ阻害剤ＦＴＳに感受性である複合体を同定するために、Ｒａｓの横方向への移動の拘束を開放することが示されている［Ｎｉｖ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９］、Ｒａｓ阻害剤ＦＴＳを、分析ツールとして使用した。従って、分析段階は、対照およびＦＴＳ処理ＥＪ細胞を、架橋剤ＤＳＳおよび還元可能であるＤＳＰと組み合わせて用いて実施した。可溶化され、ＳＤＳ含有ゲルで分画したこれらの架橋剤に対照およびＦＴＳ処理細胞膜を暴露すると、３４〜４３ｋＤａ、５０ｋＤａおよび７０ｋＤａにＲａｓ免疫反応バンドが明らかに検出された（図１）。架橋剤が存在しない場合には、これらの複合体は検出されなかった。ＦＴＳによる処理後の細胞（データは示していない）または細胞膜（図１参照）には３４〜４３ｋＤａのブロードバンドは存在しなかった。ＦＴＳおよびその活性な類似物はこの結合を阻害するので、このバンドのタンパク質は特異的なアンカー（ＩＤＲＡ）に結合するＲａｓタンパク質の基準に適合する。ＲａｓとＩＤＲＡｓとの相互作用は、腫瘍細胞に対して抗−Ｒａｓ活性を持たないＦＴＳ類似物では阻害されなかった（データは示していない）。この実験は、Ｒａｓおよび抗−Ｒａｓ剤と相互作用するタンパク質の同定方法を示した。
【００２８】
２．　Ｒａｓ−相互作用（アンカー）タンパク質のＥＪ細胞からの精製
ＤＳＰと架橋することによって形成されるＲａｓ複合体を含有する膜のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００抽出物をその後の精製段階に使用した。精製をＲａｓ抗体で追跡できるように、最初の段階は還元試薬を用いないで実施した。ＩＤＲＡタンパク質と推定されるものからのＲａｓの放出は最後の分画段階においてのみ実施した。精製の詳細は、以下のフローダイアグラムにより要約される。
【００２９】
【数１】
2004510967.tif 000003
【００３０】
ＦＰＬＣ　ＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィーにより、Ｒａｓ−タンパク質複合体の濃縮調製物が得られた。上記の３４〜４３ｋＤａのバンドは最も顕著なものと思われた。さらに高分子量の複合体も同様に濃縮した。ＲａｓおよびプールしたＭｏｎｏＱ分画中に検出されるＲａｓ−免疫反応複合体の全ての種は、ビオチン−ｐａｎ　Ｒａｓ抗体によって特異的に免疫沈降させることができた。より大きい複合体が３４〜４３ｋＤａの複合体の多数に相当すると考えて、最も小さい分子量のＲａｓ−免疫反応バンドをさらに精製した。連続して２回のゲル精製段階を使用した。非還元条件下において調製した第１のゲルの後に、３４〜４３ｋＤａのタンパク質に相当するゲルスライスをゲルから切り出し、次いで、還元剤（ＤＴＴ）が存在しない場合または還元剤（ＤＴＴ）が存在する場合に、タンパク質をＳＤＳ試料緩衝液で抽出した。予測されるように、非還元条件下では、３４〜４３ｋＤａのＲａｓ−免疫反応バンドだけがＲａｓ抗体を用いたウエスタンイムノブロット法によって検出され、２１ｋＤａのＲａｓは、ＤＴＴによる還元によって複合体から放出された。また、２つの主要なタンパク質が、ＤＴＴによって、３４〜４３ｋＤａのＲａｓ−免疫反応複合体から放出された。１つは１４〜１５ｋＤａのタンパク質で、他方は１９〜２０ｋＤａのタンパク質である。２１ｋＤａのＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）タンパク質およびこれらのタンパク質の各々の見かけの分子量の合計は３４〜４３ｋＤａの複合体に相当するので、両方のタンパク質は、Ｒａｓ−相互作用アンカーの類似した妥当な候補であると思われた。これらのタンパク質が、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）と特異的に相互作用する分子の良好な候補であることをさらに証明するために、平行して等しい数のＥＪ細胞、それらの親Ｒａｔ−１細胞およびｍｙｒ　Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）−形質転換Ｒａｔ−１細胞を使用して、上記の精製手法を実施した。１４〜１５ｋＤａおよび１９〜２０ｋＤａタンパク質の量は、ＥＪ細胞と比較して、Ｒａｔ−１細胞では有意に低かった。１４〜１５ｋＤａのタンパク質はｍｙｒ　Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）細胞ではまれに検出されただけであった。１４〜１５ｋＤａのタンパク質はファルネシル化Ｈ−Ｒａｓと相互作用し、このＲａｓアイソフォームによって誘導される細胞の形質転換に関与することをこれらの結果は示唆している。さらなる実験はこの１４〜１５ｋＤａのタンパク質に向けられた。
【００３１】
３．　１４〜１５ｋＤａのバンドをラットガレクチン−１として同定した
１４〜１５ｋＤａの定量および高い程度の精製には、フローダイアグラムに記載されているいくつかのゲル精製段階を必要とした。還元により放出されたタンパク質を十分に精製したものにトリプシン切断を実施し、次にトリプシン処理した断片をＭｉｃｒｏｂｏｒｅ　ＨＰＬＣ分離および単離したペプチドのＭＳ分析を実施した。２つのペプチドの断片化パターンは１４ｋＤａのラットガレクチン−１に正確に対応した。ガレクチンは１４ｋＤａのタンパク質（単離されたタンパク質のサイズ）であるという事実は、ＦＴＳ−感受性Ｒａｓ−相互作用タンパク質は、以前に同定された糖−結合タンパク質［Ｐｅｒｉｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８］、ガレクチン−１であることをさらに確認した。ガレクチン−１のＮ−末端ペプチドに対して形成された抗体はこの結論を確認した。Ｒａｓ阻害剤ＦＴＳは架橋された３４〜４３ｋＤａのＲａｓ−免疫反応バンドの形成を阻害したという先の観察と矛盾することなく（図１）、フローダイアグラムに示す手法を使用してＦＴＳ−処理したＥＪ細胞から精製したガレクチン−１の量は非常に低かった（図２）。また、３４〜４３ｋＤａのＲａｓタンパク質複合体のビオチン−Ｒａｓ抗体による免疫沈降、およびガレクチン−１抗体によるイムノブロット法は、ガレクチン−１は実際に複合体の一部であることおよびそれはＤＴＴによって放出されることを明らかにした。
【００３２】
上記の結果が単離された膜における架橋剤使用の作用でないことを確実にするために、対照およびＦＴＳ−処理細胞を架橋剤ＤＳＰに暴露する。膜を単離し、上記の２−ステップゲル精製手法によって複合体を精製した。３４〜４３ｋＤａ、４３〜６７ｋＤａおよび６７〜９５ｋＤａのタンパク質に相当する第１の非還元ゲルのスライスをゲルから切り出し、ＤＴＴの存在下において第２のゲルを実施した。次いで、各試料にＲａｓおよびガレクチン−１抗体を用いてイムノブロット法を実施した。結果は、全てのサイズの複合体から両方のタンパク質が放出されることを示している。これらの結果は、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）およびガレクチン−１は無傷細胞において相互作用すること、およびそれらは別のタンパク質と複合体を形成するおよび／または多量体複合体を形成することを示している。これに関しては、Ｒａｓ［Ｉｎｏｕｙｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０００］およびガレクチン−１はホモダイマーを形成する［Ｐｅｒｉｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８］。
【００３３】
別のセットの実験において、インタクトなＥＪ細胞をＦＴＳまたは不活性な類似物ＧＴＳで処理し（架橋剤を使用しない）、膜Ｒａｓおよび膜ガレクチン−１の量に対する化合物の影響を求めた。以前の結果［Ｋｌｏｏｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］に一致して、ＦＴＳは細胞の膜Ｒａｓの量を５０〜６０％低下したが、ＧＴＳは低下しなかった（データは示していない）。同様に、ＦＴＳは膜ガレクチン−１の量の９０％の低下を誘導した（しかし、ＧＴＳは誘導しなかった）（図３）。従って、ＦＴＳ−誘導性のガレクチン−１の低下の大きさはＲａｓよりはるかに大きかった。この結果は、細胞培養物およびヒトを含む無傷の動物におけるＦＴＳおよびその活性な類似物のバイオアッセイにおけるガレクチン−１の利用性を証明している。
【００３４】
４．　ガレクチン−１は、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）に対する有意な特異性を示す
全てのＲａｓアイソフォームがガレクチン−１と相互作用するかどうかを判定するための実験を実施した。３つの細胞種：Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）により形質転換したＲａｔ−１（ＥＪ）細胞、Ｎ−Ｒａｓ（１３Ｖ）により形質転換したＲａｔ−１細胞およびＫ−Ｒａｓ　４Ｂ（１２Ｖ）により形質転換したＮＩＨ　３Ｔ３細胞におけるガレクチン−１の量についての比較分析を実施した。これらの細胞系統の全てにおいて、ＦＴＳは細胞膜からＲａｓを遊離することが周知である［Ｋｌｏｏｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］。これらの細胞は全てガレクチン−１を発現したが、ＥＪおよびＫ−Ｒａｓ　４Ｂ細胞は、Ｎ−Ｒａｓ（１３Ｖ）細胞と比較して、多量のガレクチン−１を発現することを結果は示した。Ｒａｓおよびガレクチン−１が３４〜４３ｋＤａのタンパク質の複合体から放出されるかどうかを判定するために、細胞系統の各々を用いて架橋実験を実施した。全ての細胞系統の複合体から等しい量のＲａｓが放出された。一方、複合体から放出されたガレクチン−１の量は異なった。ガレクチン−１は、Ｈ−Ｒａｓにより形質転換したＥＪ細胞の複合体では非常に高く、Ｋ−Ｒａｓ　４Ｂ（１２Ｖ）細胞では有意に低く、Ｎ−Ｒａｓ（１３Ｖ）細胞ではほとんど検出されなかった。試験した細胞系統は全てガレクチン−１を発現し、全てが対応するＲａｓアイソフォームを過剰発現するので、ガレクチン−１はＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）に対する有意な特異性を示すことをこれらの結果は示唆している。
【００３５】
Ｒａｓのアイソフォームのなかには他のＩＤＲＡｓを選択するものがあることを上記の観察は示唆した。この可能性を検討するために、３つのＲａｓアイソフォームを含有する細胞系統を用いた上記の架橋実験を実施し、架橋された膜から単離した３４〜４３ｋＤａバンドからのガレクチン−１およびガレクチン−３の放出を測定した。図４に示す結果は、Ｒａｓが全ての膜から放出されることを示している。これらの複合体において、Ｋ−Ｒａｓ（１２Ｖ）はガレクチン−３に結合し、Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）はガレクチン−１および−３に結合する。一方、細胞膜へのＮ−Ｒａｓ（１３Ｖ）のアンカレッジは、ガレクチン−１または−３によっても説明されないと思われる。予測されるように、ミリストイル化Ｒａｓは、異なる機序によって膜に接続されるので、アンカータンパク質に結合しない。形質転換されていない細胞（Ｒａｔ１）のＲａｓは、ガレクチン−１およびガレクチン−３を使用する。１０種の周知のガレクチンのうち少なくとも２つが、細胞膜にＲａｓをアンカリングする際に関与していることをこれらの観察は示唆している。
【００３６】
５．　Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）とガレクチン−１との間の機能的な関係
Ｃｌｅｒｃｈら（１９８８）に記載されているように、ＥＪ細胞ＲＮＡを鋳型として使用したＲＴ−ＰＣＲによって、Ｒａｔガレクチン−１をコードするｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡをセンス（ｐｃＤＮＡ−ｇａｌ−１）方向またはアンチ−センス方向にｐｃＤＮＡに挿入した。ＣＯＳ−７および２９３Ｔ細胞へのセンスｐｃＤＮＡ−ｇａｌ−１の一過的なトランスフェクションにより、ｍＲＮＡの増加により、予測されるように、ガレクチン−１が顕著に増加した。Ｒａｓとガレクチン−１との関係を分析するために、ガレクチン−１アンチセンスｃＤＮＡを使用して実験を実施した。アンチセンスｐｃＤＮＡ−ｇａｌ−１の同時トランスフェクションは、ＣＯＳ−７または２９３Ｔ細胞におけるガレクチン−１タンパク質の発現を遮断し、それによって、ｇａｌ−１アンチセンスの効率を立証している。次いで、ＣＯＳ−７および２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡに挿入したＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）ｃＤＮＡまたはＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）ｃＤＮＡプラスｇａｌ−１アンチセンスで同時トランスフェクトした。図５に示すように、ｇａｌ−１アンチセンスはＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）濃度を顕著に低下させた。ｍｙｒＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）およびＮ−Ｒａｓ（１３Ｖ）を用いて同様の実験を実施した。ｇａｌ−１アンチセンスは、ガレクチン−１に関与しない機序によって固定されているこれらのＲａｓアイソフォームの濃度に影響を与えないことを結果は示した。従って、ガレクチン−１はＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）の発現または安定性にむしろ特異的に寄与する。これらの所見は、ガレクチン−１アンチセンスは、ＦＴＳと同じ作用をＨ−Ｒａｓに与えたことも示している。この観察は、ガレクチン−１の低下は、ＦＴＳと同様に、発癌性Ｈ−Ｒａｓによって誘導される腫瘍に抗癌作用を与えると思われることを示唆している。
【００３７】
第２のセットの実験では、ＣＯＳ−７および２９３Ｔ細胞において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−標識Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）を単独またはアンチセンスｇａｌ−１と組み合わせて発現させた。ＧＦＰ−Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）を局在化するために、共焦点顕微鏡を使用した。ＧＦＰ−Ｋ−Ｒａｓ（１２Ｖ）を用いた以前の検討のように、ＧＦＰ−Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）は細胞膜に局在化した［Ｎｉｖ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］。同時トランスフェクション実験は、ｇａｌ−１アンチセンスは、細胞膜に結合したＧＦＰ−Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）の顕著な低下を誘導することを明らかに示した（図６）。融合されていない相対物とは異なり、ＧＦＰ−Ｒａｓタンパク質は容易に分解されないことは以前の検討から周知である。実際、この実験において、ｇａｌ−１アンチセンスは、細胞膜から細胞質コンパートメントにＧＦＰ−Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）の分布を移行させ（図６）、細胞が発現するＧＦＰ−Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）の量を低下しないことを本発明者らは見出した。これらの結果は、ガレクチン−１は、細胞膜における適切な局在化を可能にするようにＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）を安定化させるのに重要なタンパク質であることを証明している。
【００３８】
［実施例２：　Ｒａｓアンカー−固相方法］
Ｒａｓアンカーと相互作用する新規化合物をスクリーニングする固相アッセイ
アンカータンパク質へのＲａｓの結合の阻害剤としての新規化合物の効力を評価するために、２つの独立した固相方法を使用した。方法Ｉにおいて、Ｒａｓタンパク質をマイクロタイタープレートウェルの表面に固定し、次いで、種々の濃度の競合剤が存在しない場合（１００％結合）または存在する場合において、可溶性ビオチン−標識Ｒａｓアンカータンパク質（例えば、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチン−７またはガレクチン−８）を固定されているＲａｓに結合した。固定されているＲａｓへのガレクチン結合の見かけの量は、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合物および基質としてのｏ−フェニレンジアミンによって測定する。方法ＩＩにおいて、Ｒａｓアンカータンパク質をマイクロタイタープレートウェルの表面に固定し、種々の濃度の競合剤が存在しない場合（１００％結合）または存在する場合において、可溶性Ｒａｓを添加する。Ｒａｓ結合の見かけの量を測定するために、ＰａｎマウスＲａｓ抗体、二次抗体であるビオチンヤギ抗マウスＩｇＧ、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび基質ｏ−フェニレンジアミンを添加する。競合化合物が存在しない場合（１００％結合）に記録したＯＤ４９０と比較したときの、競合化合物が存在する場合のＯＤ４９０値の低下は結合阻害の程度を示す。
【００３９】
方法Ｉ：固定したＲａｓを用いたアッセイ
以前に詳細に記載されているように、十分に処理したＨＡ−標識Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）およびＨＡ−標識Ｋ−Ｒａｓ（１２Ｖ）を昆虫細胞中で作製し、精製する（Ｐａｇｅ，　Ｍ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　１９８９，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６４，　１９１４７−１９１５４、Ｌｏｗｅ，　Ｐ．Ｎ．　１９９１，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６６，　１６７２−１６７８）。以前に詳細に記載されているように、ビオチン−ガレクチン−１およびビオチン−ガレクチン−３を作製する（Ｇａｂｉｕｓ，　Ｈ．−Ｊ．およびＧａｂｉｕｓ，　Ｓ．　編、レクチンおよび糖生物学（Ｌｅｃｔｉｎｓ　ａｎｄ　ｇｌｉｏｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｐｕｂ．　Ｃｏ．　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ｐｐ．　８１〜８５におけるＺｅｎｇ，　Ｆ．−Ｊ．およびＧａｂｉｕｓ，　Ｈ−．−Ｊ．　１９９３　、Ａｎｄｅｒ’，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　１９９７，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　８，　８４５−８５５）。
【００４０】
マウス抗ＨＡ抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））を炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５／１５０ｍＭ　ＮａＣｌに加えたものを各ウェルに添加して３０分置き、次いでウェルを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４、０．１％オクチルグルコシド、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２（緩衝液Ａ）で洗浄した。次いで、Ｒａｓタンパク質（ウェルあたり０．５μｇ）を緩衝液Ａに加えたものをウェルに添加し、２５℃において１時間インキュベーションする。このＲａｓ固定ステップおよび緩衝液Ａによる３回の洗浄後、ビオチン−ガレクチン−１（Ｈ−Ｒａｓアッセイ用）またはビオチン−ガレクチン−３（Ｋ−Ｒａｓアッセイ用）を、競合化合物が存在しない場合または存在する場合において５μｇ／ｍｌの濃度で緩衝液Ａに添加する。２５℃における２時間のインキュベーション後、ウェルを２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩液ｐＨ７．２／１００ｍＭラクトース（緩衝液Ｂ）で洗浄する。次いで、ウェルを２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩液ｐＨ７．２（緩衝液Ｃ）で３回洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（０．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を緩衝液Ｃに添加して、２５℃において１時間インキュベーションする。緩衝液Ｃによる３回の洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン（１ｍｇ／ｍｌ）およびＨ２Ｏ２　μ１／ｍｌを緩衝液Ｃに加えたものを添加する。３０分〜１時間のインキュベーション後、自動ＥＬＩＳＡリーダーを用いてＯＤ４９０値を測定する。
【００４１】
方法ＩＩ：固定したガレクチンを用いたアッセイ
以前に詳細に記載されているように調製したアシアロフェツインを用いて、ガレクチン−１またはガレクチン−３をマイクロタイタープレートに固定する（Ａｎｄｅｒ’，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　１９９７，　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　８，　８４５−８５５）。基本的には、ウェルあたり１μｇのアシアロフェツインおよび１０μｇ／ｍｌのガレクチン−１または５μｇ／ｍｌのガレクチン−３を緩衝液Ｃに加えたものを使用する。次いで、ウェルを緩衝液Ａで洗浄する。競合化合物が存在しない場合および存在する場合に、Ｒａｓタンパク質（ウェルあたり１μｇを緩衝液Ａに加えたもの）を添加する。２５℃における２時間のインキュベーション後、ウェルを緩衝液Ａで３回洗浄し、マウスｐａｎ　Ｒａｓ抗体（１μｇ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を同じ緩衝液に添加し、２５℃において１時間インキュベーションする。次いで、ビオチン接合ヤギ抗マウス抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、次にストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを添加する。次いで、方法Ｉに詳細に記載するように、手法を継続する。
【００４２】
［産業上の利用可能性］
本発明は、種々の疾患状態における基礎的な生化学的反応を中断させ、阻害する方法と組成物とを提供する。また、疾患を治療すると思われる薬剤について化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【００４３】
本明細書に引用されている特許および特許以外の文献は全て、本発明が関係する分野の当業者の技術レベルを示す。これらの文献および特許出願は全て、個々の文献が各々具体的および個別に参照することにより本明細書に組み入れられていることが示されているのと同じ程度で、参照することにより本明細書に組み入れられている。
【００４４】
［刊行物］
【表１−１】
2004510967.tif 000004
【００４５】
【表１−２】
2004510967.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｒａｓ阻害剤、ＦＴＳに感受性を示すＲａｓ　ＩＤＲＡ複合体を同定するためのＲａｓ抗体および化学的架橋剤の使用を例示する電気泳動ゲル写真である。Ｒａｓ抗体（Ａｂ）は、ＥＪ細胞膜中のＲａｓおよびＲａｓ−ＩＤＲＡ複合体を同定する。１０６個の対照またはＦＴＳ（５０μＭ）処理ＥＪ細胞に相当する膜を、プロテアーゼ阻害剤および２％ＤＭＳＯ（架橋剤を含有しない対照）または示した濃度の架橋剤ＤＳＳもしくはＤＳＰを含有する５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中でインキュベーションする。非還元条件下において膜のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００抽出液試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、次にＲａｓ　Ａｂを用いたウエスタン免疫ブロット法を実施した。白抜き矢印は、このような条件下のブロットにおいて検出されるＲａｓ（２１ｋＤａ）に相当し、黒塗り矢印は主要なＲａｓ推定ＩＤＲＡバンド（３４〜４３ｋＤａ）に相当する。このバンドは、架橋されていない試料のブロットまたはＦＴＳ−処理細胞の架橋試料のブロットでは検出されない。
【図２】
ＦＴＳ処理を行った細胞（＋）およびＦＴＳ処理を行わなかった細胞（−）から単離したガレクチン−１のウエスタンブロット写真である。ＦＴＳはＲａｓとそのアンカーとの相互作用を遮断し、処理した細胞中のアンカーの量を低下する。
【図３】
対照、ＦＴＳおよびＧＴＳの存在下において細胞から単離されたガレクチン−１のウエスタンブロット写真である。ＦＴＳは、膜結合ガレクチン−１の量を９０％低下したが、ＦＴＳの不活性な類似物（ＧＴＳ）は影響を与えなかった。
【図４】
電気泳動ゲルの写真を含む。左のパネル：各々異なるＲａｓアイソフォームを有する５つの細胞種の膜を架橋し、抽出し、図１のようにゲルで分画した（ＥＪおよびＲａｔ１細胞は、それぞれ、発癌性および野生型Ｈ−Ｒａｓを含有し、ｍｙｒ−Ｒａｓは任意のアンカータンパク質に結合する）。３４〜４３ｋＤａのバンドをＲａｓ抗体で同定し、抽出し、第２のゲルで分析した。右のパネル：種々の発癌性Ｒａｓアイソフォームで形質転換した細胞から単離した膜の３４〜４３ｋＤａ架橋タンパク質から還元条件下で放出されたＲａｓタンパク質、ガレクチン−１（Ｇａｌ−１）およびガレクチン−３（Ｇａｌ−３）。
【図５】
アンチセンスＧａｌ−１がＨ−Ｒａｓ（１２Ｖ）の発現を低下することを例示するウエスタンブロット写真である。ベクターｐｃＤＮＡ３に組み込んだ発癌性Ｈ−Ｒａｓで形質転換したＣＯ７−７または２９３Ｔ細胞は、Ｈ−Ｒａｓタンパク質を発現した（レーン３）。Ｈ−Ｒａｓをガレクチン−１のアンチセンスで形質転換すると、Ｒａｓタンパク質が低下し（レーン４）、これはガレクチン−１タンパク質の低下に関連する。ベクターおよびアンチセンス対照はＲａｓタンパク質を産生しなかった（レーン１および２）。
【図６】
緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識したＨ−Ｒａｓを産生する細胞の写真を含む。これにより、蛍光顕微鏡を使用して、生きている細胞中でＲａｓを局在化することができる。上：以前の検討から予測されるように［Ｎｉｖ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９］、形質転換した細胞の膜だけがＧＦＰ標識Ｈ−Ｒａｓで標識された。下：ＧＦＰ−Ｈ−Ｒａｓ（１２Ｖ）をガレクチン−１アンチセンスでトランスフェクトすると、ガレクチン−１アンカータンパク質が低下するにつれて、大量のＧＦＰ−標識Ｒａｓ分画が細胞膜から細胞質に移動させられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004510967.tif 000075
【国際調査報告】
2004510967.tif 000076
2004510967.tif 000077
2004510967.tif 000078
2004510967.tif 000079