(57)【要約】支持細胞と共培養することなく、４日を超えて生存可能なヒト肺肥満細胞の培養方法を提供する。また、これらのヒト肺肥満細胞培養物をこれらの細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的および薬学的活性を評価し、ヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能および表現型の発現のモジュレーターを同定するために用いるための方法も提供する。これらの細胞を介して同定されたモジュレーターは、ヒト肺肥満細胞機能に関連する疾患の予防および処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肺肥満細胞培養物を製造する方法であって、ヒト肺組織からのヒト肺肥満細胞を部分的に純化すること、および該部分的に純化したヒト肺肥満細胞を増殖因子の存在下で培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
部分的に純化されたヒト肺肥満細胞が、幹細胞因子の存在下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
部分的に純化されたヒト肺肥満細胞が、幹細胞因子およびインターロイキン４の存在下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒト肺肥満細胞がエルトリエーションにより部分的に純化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法に従って製造された、ヒト肺肥満細胞培養物。
【請求項６】
請求項５に記載のヒト肥満細胞培養物の薬理学的および生化学的活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト肺肥満細胞の薬学的および生化学的活性を決定するための方法。
【請求項７】
ヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能または表現型の発現のモジュレーターを同定するための方法であって、
（ａ）潜在的なモジュレーターの存在下で、請求項５に記載の培養物中のヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能または表現型の発現を決定すること、および
（ｂ）決定された生存、増殖、機能または表現型の発現を、前記潜在的なモジュレータの非存在下における請求項５に記載の培養物中のヒト肺肥満細胞と比較すること、
を含み、前記モジュレーターは、その存在下におけるヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能または表現型の発現の増加または減少によって同定される、前記方法。
【請求項８】
同定されたモジュレーターが、無機小分子、タンパク質またはその断片、薬学的な剤、または生物学的な化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
同定されたモジュレーターが、ヒト肺肥満細胞の機能に関連する疾患の予防または処置に有用である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法に従って同定された、ヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能または表現型発現のモジュレーター。
【請求項１１】
ヒト肺肥満細胞を請求項１０に記載のモジュレーターに接触させることを含む、ヒト肺肥満細胞の機能を調節する方法。
【請求項１２】
ヒト肺肥満細胞の機能に関連する疾患に苦しむ患者に、請求項１０に記載のモジュレーターを投与することを含む、ヒト肺肥満細胞の機能に関連する疾患を予防または処置する方法。
【請求項１３】
予防または処置される疾患が、アレルギー性過敏症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、局所炎症過程または線維化性肺障害である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
日常の環境中で普通に遭遇する物質に対するアレルギー応答、または過敏症反応は、何らかの形態の過敏症に苦しむ多くのアメリカ人にとってありふれたものである。かかるアレルギー反応は、またしばしば、米国の人口の４〜５％が罹患していると推測される一般的な呼吸器疾患である、喘息の存在を伴っている。アレルギーまたは喘息のための既知の治療法はなく、現在使用可能な処置は、ほとんどの場合症状を緩和するだけである。
【０００２】
ヒト肺肥満細胞は、アレルギーおよび喘息の両方に特徴的な呼吸器過敏症応答の重要なエフェクターである。肺肥満細胞からの炎症性メディエーターの放出は、ヒトアレルギー性疾患の病態生理学において中心的な役割を果たす。しかしながら、ヒト肺肥満細胞の生化学および薬理学を研究する試みは、この細胞の純化における技術的困難性、低い収率、ＩｇＥ媒介性の刺激への一貫性のない反応性、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの短い生存期間によって妨げられてきた。
【０００３】
ヒト肺肥満細胞の純化方法は行うことが極めて困難であり、世界中でわずかな研究所しか、この細胞の純化された調製物を提供することに成功していない。
Ｓｃｈｕｌｍａｎらは、ヒト肺組織を細かくミンチした後、一連の酵素を用いて単細胞懸濁液に分散させる、ヒト肺肥満細胞の純化方法を記載している（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８２ １２９：２６６２−２６６７）。しかしながら、この方法で純化された細胞は、短時間（２４〜９６時間）しか培養下で生存できない。
【０００４】
生存している期間を延長するために、ヒト肺肥満細胞を、線維芽細胞およびヒト腫瘍細胞系と共培養することが試みられた。ヒト線維芽細胞でコートされた培養ディッシュで培養したヒト肺肥満細胞は、約１５〜３０日間生存し、この期間該肥満細胞は純化されず、そして増殖しなかったが（Ｌｅｖｉ−Ｓｃｈａｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８７ １３９（２）：４９４−５００； ａｎｄ Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １９９１ １３９（６）：１３０９−１８）、ヒト腫瘍細胞系でコートされたディッシュで培養されたヒト肺肥満細胞は、約３０日間生存した（Ｈａｒｔｚｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ＡＲＲＤ １３９（４）：Ａ１１９， １９８９）。
【０００５】
支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）が肥満細胞の生存を延長する正確な機構および化学的エフェクターは、これらの研究のいずれにおいても決定されなかった。また、これらの共培養において、ヒト肺肥満細胞が完全に分化したままであり、ｉｎ ｖｉｖｏで発揮されるそれらのユニークな特徴を維持しているかどうかは知られていない。具体的には、メディエーターの合成、貯蔵および放出に関わる重要な細胞の過程がこれらの培養条件下で変化せずに保たれており、したがって、ヒト肺肥満細胞としての特定の表現型が保たれているかどうかは知られていない。これらのヒト肺肥満細胞は、これらの条件下では増殖しないことが知られている。
【０００６】
また、ＣＤ３４陽性前駆幹細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から肥満細胞を得る試みもなされた。最も一般的には、これらの細胞のソースは、ヒト臍帯血であるが、末梢血および胎児肝臓も用いられた。１９９０年代初めの幹細胞因子のクローニングの後に、肥満細胞を育てることが可能となった。成功の鍵は、幹細胞因子を特定のサイトカイン増殖因子（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、通常はインターロイキン６および／またはインターロイキン３と組み合わせることであった。
【０００７】
驚くべきことに、アレルギー性の免疫を最も決定づけるサイトカインであるインターロイキン４のこの肥満細胞培養系への添加は、プログラム細胞死（アポトーシス）を誘発した（Ｏｓｋｅｒｉｔｚｉａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ １６２：５１０５−５１１５）。したがって、前駆細胞由来肥満細胞を培養するために必須な成長因子の組み合わせは重要である。この方法で得られた肥満細胞は、肥満細胞の生化学および情報伝達などの分野の研究には有用と思われるが、ヒト肺肥満細胞に対するそれらの比較可能性は最終的には証明されていない。
【０００８】
いくつかの報告は、これらの細胞の核の５０％までが、異常な発達の指標となり得る異型性を示しているとして、かかる細胞の完全な成熟性に疑問を投げかけている（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９ ９６：８０８０−８０８５； Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． １９９３ ５４：４６５−４８５； Ｔｏｒｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ ＆ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８ １０２：４９１−５０２）。さらにまた、これらの細胞と成熟ヒト肺肥満細胞は、数種の生理学的および薬学的アゴニストに対し異なる応答を示した。
【０００９】
たとえば、ヒト臍帯血由来肥満細胞は、抗ＩｇＥ抗体と幹細胞因子による共刺激下でのみＩＬ−１３を産生することができるが、ヒト肺肥満細胞は、ＩＬ−１３の産生には、抗ＩｇＥ抗体しか要しない。これらの細胞はまた、アデノシンに対して全く異なった応答を示す。アデノシンは臍帯血前駆細胞由来肥満細胞において、ＩｇＥ媒介性ヒスタミン放出を阻害するが、反対に、新鮮に単離したヒト肺肥満細胞においては抗ＩｇＥ抗体誘発性の放出の増強が観察された（Ｋａｎｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ １１９（２）：１３８−１４２； Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９８ ２４２：６９７−７０２； Ｐｅａｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １９８８ １３８（５）：１１４３−１１５１）。
【００１０】
Ｂｉｓｃｈｏｆｆらは、ヒト腸の外科試料からの腸肥満細胞純化のための酵素的な分散法を記載した（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９ ９６：８０８０−８０８５）。しかしながら、人体の異なる組織および器官に由来する肥満細胞の生物学の根本的な差異については、十分立証されている。たとえば、皮膚肥満細胞と肺肥満細胞との間のトリガー、表面レセプターおよび放出されるメディエーターの基本的な差異は顕著である。
【００１１】
これらの重大な差異は、１つの器官、たとえば腸から由来した生存肥満細胞を培養する方法を、他の器官、たとえば肺などからの肥満細胞の培養に直接適用することを不可能にする（Ｓｃｈｕｌｍａｎ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｄ．Ｇ． Ｒａｉｂｌｅ． １９９８． Ｉｎ： Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， ｖｏｌ． １， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ．Ｐ． Ｆｉｓｈｍａｎ （ｅｄ．）， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２８９−３０１； Ｓｃｈｕｌｍａｎ， Ｅ．Ｓ． Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９３ １３：３５−７０）。
【００１２】
発明の概要
本発明の１つの目的は、ヒト肺組織からヒト肺肥満細胞を部分的に純化すること、および増殖因子、好ましくは、幹細胞因子などのサイトカイン増殖因子を含む培養培地中で、かつ支持細胞との共培養なしで、該部分的に純化したヒト肺肥満細胞を培養することを含む、ヒト肺肥満細胞培養物を製造する方法を提供することである。
【００１３】
好ましい態様において、ヒト肺肥満細胞はまた、インターロイキン４の存在下で培養される。生存ヒト肺肥満細胞を、これらの培養物から４日を超えて維持することができる。さらに、この方法は、ヒト肺肥満細胞の純粋で、均質な集団を得るために用いることができる。
【００１４】
本発明の他の目的は、ヒト肺肥満細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの薬学的および生化学的活性を決定するために、これらのヒト肺肥満細胞培養物をｉｎ ｖｉｔｒｏで用いるための方法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、ヒト肺肥満細胞のモジュレーター（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）をスクリーニングするための方法であって、純化されたヒト肺肥満細胞培養物を試験化合物と接触させ、該試験化合物がヒト肺肥満細胞の生物学を調節する能力を評価することを含む前記方法を提供することである。これらの方法は、ヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能および／または表現型の発現のモジュレーターを同定するために用いることができる。
【００１６】
これらの方法に従って同定されたモジュレーターは、肺肥満細胞の機能に関わる疾患の予防および／または処置に有用であり得る。かかる疾患としては、アレルギー性過敏症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、心筋梗塞後の状態などの局所炎症過程（ｌｏｃａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、および線維化性肺障害があげられるが、これらに限定されない。
【００１７】
発明の詳細な説明
支持細胞との共培養なしで、ヒト肺肥満細胞を長期間培養することができる方法が、ここに開発された。さらに、本発明の方法は、ヒト肺肥満細胞の純粋で、均質な集団を得るために用いることができる。本発明の方法に従って産生された細胞は、数ヶ月間生存条件に維持できるだけでなく、分裂し、増殖する能力をも維持している。さらに、これらの培養肥満細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト肺肥満細胞の表現型発現を維持しており、したがって、種々の刺激物質および膜受容体媒介性の剤への反応性を保っており、また、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト肺肥満細胞に特徴的な生化学的および薬学的活性の両方を示す。
【００１８】
本発明において、細胞の「長期」培養物とは、支持細胞と共培養されていないヒト肺肥満細胞の培養物であって、４日を超えて生存状態のままであるものを意味する。好ましい態様においては、本発明の長期培養物は、少なくとも数週間から数ヶ月生存状態のままである。
本発明において、「純化された」または「純粋な」細胞とは、少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％のヒト肺肥満細胞を含む細胞集団を意味する。
【００１９】
本発明の方法において、ヒト肺肥満細胞は、正常ヒト肺組織から少なくとも１５％に部分的に純化される。部分的に純化されたヒト肺肥満細胞は、次に増殖因子を添加した培地で培養される。好ましい態様において、培地には、幹細胞因子などのサイトカイン増殖因子が添加されている。より好ましくは、培地には幹細胞因子およびインターロイキン４の両方が添加されている。これらの培養物の培地に含めることができる追加の増殖因子は、本明細書に提供されている教示にしたがい、当業者が日常的に決定することができる。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、部分的に純化されたヒト肺肥満細胞は、以下のようにして得る。肉眼的に正常なヒト肺組織を細かくミンチし、無菌水から調製した１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび０．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンを含有し、二価陽イオンを含まないタイロード緩衝液で、２２ＥＣで十分に洗浄する。組織および細胞は、すべての工程において抗生剤中に保つ。リリース緩衝液（ｒｅｌｅａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ）はＥ−ｔｏｘａｔｅアッセイ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）によりテストし、有意なエンドトキシンを含まないことを確認した。
【００２１】
ミンチした断片を次に、酵素プロナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）およびキモパパイン（０．５ｍｇ／ｍｌ）での２回のインキュベーションと、それに引き続くコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＩ型エラスターゼ（１０Ｕ／ｍｌ）での２回の同様のインキュベーションにより、酵素的に単細胞懸濁液に分散する。分離した細胞を次に十分に洗浄し、抗生剤入りのＲＰＭＩ−１６４０中で１晩培養し、肥満細胞を対向流エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）で部分的に純化した。
【００２２】
しかしながら、この開示を読むことにより当業者に理解されるとおり、本発明の培養方法で用いるための、ヒト肺肥満細胞を部分的に純化するための他の方法もまた用いることができる。たとえば、Ｏｋａｙａｍａらは、ｃ−ｋｉｔに対するＹＢ５．Ｂ８モノクローナル抗体でのアフィニティ磁気選別（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によりヒト肺肥満細胞を純化する方法を記載している（純度＞９０％）（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９５ １５５， １７９６−１８０８）。
【００２３】
部分的に純化したヒト肺肥満細胞を、次に、増殖因子を添加した培地で培養する。好ましい態様では、細胞は、幹細胞因子などのサイトカイン増殖因子を添加した培地中で、９６穴プレートにて培養する。幹細胞因子の好ましい濃度は２５ｎｇ／ｍｌである。より好ましいのは、幹細胞因子およびインターロイキン４の培地への添加である。
【００２４】
この態様における幹細胞因子の好ましい濃度はまた２５ｎｇ／ｍｌであるが、インターロイキン４の好ましい濃度は１０ｎｇ／ｍｌである。最も好ましいのは、約５％の二酸化炭素を含む湿潤な雰囲気にて、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、２５ ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および０．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含み、さらに幹細胞因子を添加したＲＰＭＩ−１６４０などの培養培地中で、細胞を初期の密度で培養することである。
【００２５】
１晩経つと、細胞はウェルの底に定着する。本発明の培養肺肥満細胞は、好ましくは毎週３回、培養培地の上半分を、ウェルに元々添加されていたのと同じ濃度のサイトカインを含む新しい培地と交換することにより、栄養を補給する。培養中は、非肥満細胞を死滅するに任せ、ヒト肺肥満細胞の純度は上昇し続ける。
【００２６】
たとえば、培養の開始時に、７の個別の肺からの、純度が１３％〜８５％の範囲のヒト肺肥満細胞を、初期密度０．４ｘ１０６／ｍｌで、幹細胞因子（２５ｎｇ／ｍｌ）およびインターロイキン４（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培養培地中、５％のＣＯ２を含む湿潤な雰囲気の中、３７℃に置いた。培養物中に置かれたすべての肥満細胞分画について、エルトリエーションを行った。
【００２７】
培養の最初の１週間のうちに、約５０％のヒト肺肥満細胞が死滅した。しかしながら、４週間以内に、ヒト肺肥満細胞数は、培養開始時の肥満細胞数と同等になるかまたはそれを上回った。さらに、混入した非肥満細胞（ｎｏｎ−ｍａｓｔｏｃｙｔｅ）は死滅し、純度は上昇し続けた。４〜６週間以内に、トルイジンブルーでの染色および肥満細胞特異染色であるトリプターゼでの染色により決定される限りでは、培養物は均質と思われた。キマーゼ酵素陽性率は細胞の１０±４．７％（０〜１９．９％の範囲、ｎ＝４）であり、新鮮に単離されたヒト肺肥満細胞においてみられるのと同様であった。
【００２８】
トルイジンブルー、トリプターゼおよびキマーゼでの染色の強度も、新鮮に単離されたヒト肺肥満細胞でみられるものに匹敵した。開始純度が８０％またはそれよりもよい調製物は、２〜４週間以内に明らかな均質性を達成した。しかしながら、エルトリエーションおよびパーコール密度分離後の純度が１３〜２５％の肥満細胞調製物でさえ、６〜８週間以内に明らかな均質性（〜１００％の純度）を達成した。
【００２９】
これに対し、エルトリエーションを行わずに、肥満細胞を酵素的に分散した肺細胞からパーコールのみを用いて部分的に（５〜２０％に）純化した８の調製物においては、肥満細胞は生存したが、細胞性の混入細胞も生存した。したがって、８つの調製物のいずれも均質にならず、肥満細胞の純度は１０〜４８％の範囲だった。したがって、幹細胞因子などの増殖因子中での培養に先立つ、ヒト肺肥満細胞のエルトリエーションによる部分的な純化は、本発明の純化ヒト肺肥満細胞培養物を得るために好ましい。
【００３０】
本発明のヒト肺肥満細胞培養物の増殖、表現型および機能の特性を評価した。
ヒト肺肥満細胞の増殖を証明する実験では、各ウェルにおいて５〜８週目に細胞数を最初に決定した。次に、各ウェルから約１／２の細胞を取り出した。１週間後に細胞の計数を繰り返したところ、ヒト肺肥満細胞数が６０±３％（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝８）増加したことが見出された。
【００３１】
さらに、この増殖が元々の組織肥満細胞自身からのものであり、希少なＣＤ３４（＋）前駆細胞からのものはないことが、実験的に確認された。何らかの形態で循環に入り、組織に到達し、そこで局所の微少環境に影響されて分化するＣＤ３４＋骨髄前駆細胞から、肥満細胞が生じることが示唆されている（Ｏｓｋｅｒｉｔｚｉａｎ， Ｃ．Ａ． ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｌ．Ｂ． Ｈｕｍａｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ： ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ： Ｉｎ Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｒｈｉｎｉｔｉｓ． Ｂｕｓｓｅ ＷＷ ａｎｄ Ｈｏｌｇａｔｅ Ｓｔ， ｅｄｓ． ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． ｐｐ． ２７５−２９５， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， ２０００）。
【００３２】
最近、ＣＤ３４（＋）細胞が、アトピー性喘息の対象およびアトピーだが喘息ではない対象の気道について報告され、炎症性細胞が肺で分化し得ることが示唆された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １９９９ ２０：９−１３）。このため、培養開始後１〜２週間以内に、フローサイトメトリー法を用いてＣＤ３４（＋）の細胞のパーセンテージを評価した。３つの別々の調製物において、ＣＤ３４＋細胞は、全細胞の１〜２％を構成するに過ぎず、したがって、前駆細胞ではなくヒト肺肥満細胞が増殖したことが確認された。
【００３３】
本発明のヒト肺肥満細胞培養物の、異なるサイトカイン増殖因子の存在下における生存および増殖の指標として、３Ｈチミジンの取り込みもモニターした。これらの実験において、３Ｈ−チミジンを、培養５〜７週の３個体からのヒト肺肥満細胞のアリコットに加えた。幹細胞因子なしでインターロイキン４を添加した培地中で培養したヒト肺肥満細胞は、培養培地のみでみられたものを超える増殖をもたらさなかった。幹細胞因子なしでは、細胞は３〜５日以内で死滅した。
【００３４】
幹細胞因子のみを加えた培地は、取り込みを６０％増加させた。幹細胞因子およびインターロイキン４を添加した培地は、幹細胞因子のみのものに対し、増殖を４倍以上増加させた。インターロイキン９などの他のサイトカイン増殖因子は、幹細胞因子およびインターロイキン４を含有する培養培地に添加すると、増殖をさらに大幅に増強した。これに対し、幹細胞因子およびインターロイキン４を含有する培養培地に添加したインターフェロンγは、これらの細胞の増殖を顕著に減少させた。
【００３５】
細胞分裂を評価するためにＢｒｄＵの取り込みもモニターした。０日目に、幹細胞因子（２５ｎｇ／ｍｌ）およびインターロイキン４（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培養培地中で培養されているヒト肺肥満細胞にＢｒｄＵ（１０μＭ）を添加した。毎週、分析のためにアリコットを取り出した。培養開始から３〜４週までに、高いパーセンテージの陽性染色細胞が認められ（７３．０±５．９％、ｎ＝３）、希少なサブセットではなく、ヒト肺肥満細胞の多くが細胞分裂を行っていることが示された。
【００３６】
ヒスタミンは、肥満細胞の最も重要な事前に産生されたメディエーターであるとされている。このため、本発明の培養ヒト肺肥満細胞を、培養５〜７週の間に、ヒスタミン含量について検討した。肥満細胞ごとのヒスタミン含量は、３．１８±０．４３ｐｇ／細胞（範囲は０．６９〜６．６８ｐｇ／細胞、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝１９）であった。これは、新鮮に単離されたヒト肺肥満細胞について報告された３．６±０．５ｐｇのヒスタミン含量に、有利に匹敵する（Ｓｃｈｕｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８２ １２９：２６６２−６７）。
【００３７】
種々の刺激に対するヒスタミンの放出もまた検討した。すべての調製物における自発的な（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）ヒスタミンの放出は＜１％（ｎ＝２２）であった。しかしながら、２２Ｅ７抗体に暴露された本発明の培養物において、用量依存性のヒスタミン放出が観察された。さらにまた、該放出は培養開始時に新鮮に単離されたヒト肺肥満細胞において見出されたもの（０〜１５％の放出）を上回っていた。具体的には、すべての調製物（ｎ＝２２）が、抗体の最大刺激濃度（１：１０，０００希釈）で強力なヒスタミン放出応答を示した。最大放出は、１７％〜８０％の範囲であった。
【００３８】
げっ歯類（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １９７６ ８５（２）：４３７−６４； ａｎｄ Ｉｒｍａｎ−Ｆｌｏｒｊａｎｃ， Ｔ． ａｎｄ Ｅｒｊａｖｅｃ， Ｆ． Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ １９８３ １３（２−３）：１３８−４１）および皮膚、滑膜および心臓からのヒト肥満細胞における有効な分泌促進剤（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ）であるが、肺からのヒト肥満細胞においてはそうではない（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８７ １３９（９）：３０６２−９； ｄｅ Ｐａｕｌｉｓ ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，． １９９６３９（７）：１２２２−３３； Ｐａｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９５ １０６（４）：３８６−９３； Ｅｎｎｉｓ， Ｍ． Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ １９８２ １２（１−２）：６０−３）、サブスタンスＰおよびコンパウンド４８／８０は、本発明の培養ヒト肺肥満細胞からのヒスタミン放出を惹起することができず、これは新鮮に単離されたヒト肺肥満細胞と同等な機能的表現型を示している。
【００３９】
本発明のヒト肺肥満細胞培養物において、ＩｇＥ媒介性刺激の増強に対する細胞外ＡＴＰの効果についても検討した。これらの細胞培養物での４回の実験で、２２Ｅ７モノクローナル抗体による亜最大（ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ）ＩｇＥ架橋により惹起された放出に対するＡＴＰ（１０−４Ｍ）の効果が検討された。
【００４０】
２２Ｅ７のみでは、１７．９±８．２％のヒスタミン放出が生じた。ＡＴＰ存在下では、２２Ｅ７誘発性放出は、３９．５±１２．２％に増強された。同様の増強が、ウリジン５’三リン酸（ＵＴＰ）について示されたが、これは、細胞表面Ｐ２Ｙレセプターがこれらの応答を媒介していることを示している。新鮮に単離されたヒト肺肥満細胞について以前に見出されているのと同様に、ＡＴＰ単独またはＵＴＰ単独では、目立ったヒスタミン放出は引き起こされなかった。
【００４１】
本発明のヒト肺肥満細胞培養物のβ受容体反応性も、典型的なアゴニストであるイソプロテレノール、および長時間作用型βアゴニストであるサルメテロールを用いて検討した。両方の剤とも、ナノモル以下の範囲でヒスタミンの放出を深く抑制した（イソプロテレノールおよびサルメテロールについて、それぞれＩＣ５０＝９ｘ１０−１１Ｍおよび１０−１０Ｍ）。
本発明のヒト肺肥満細胞培養物はまた、非免疫刺激であるカルシウムイオノフォアＡ２３１８７に対し、新鮮に単離されたヒト肺肥満細胞と同様に反応した。
【００４２】
これらのデータは、本発明のヒト肺肥満細胞培養物が、純粋であり、培養中、数日のみではなく、むしろ数週間または数ヶ月の期間生存可能であることを示している。さらに、本発明の培養物中の細胞の多くは、数ヶ月生存するだけでなく、増殖もしている。２〜６週以内に、本発明の方法によって培養された細胞は、ほぼ均質になる（純度は１００％に近づく）。さらにまた、培養物中のこれらの細胞は、免疫反応にヒスタミンの放出により応答し、そしてカルシウムイオノフォアＡ２３１８７などの非免疫刺激に対し、新鮮に単離されたヒト肺肥満細胞と同様に応答する能力を示す。
【００４３】
したがって、本発明は、数ヶ月までの期間生存可能で機能的なヒト肺肥満細胞を大量に産生する方法を提供する。本方法は、手を加えられていない（ｉｎｔａｃｔ）組織かまたは分散された細胞液から部分的に純化したヒト肺肥満細胞を、増殖因子、好ましくは幹細胞因子などのサイトカイン増殖因子、より好ましくは、幹細胞因子およびインターロイキン４とともに培養することを伴う。培養物中のこれらの細胞は、長期間生存し、増殖し、ヒト肺肥満細胞として機能的であり続ける。
【００４４】
本発明はまた、ヒト肺肥満細胞の機能をよりよく理解するための生物学的および／または薬学的アッセイにおけるこれらのヒト肺肥満細胞培養物を用いるための方法にも関する。これらの細胞培養物で研究することができる肥満細胞の機能の例としては、ヒスタミン含量、ヒスタミン放出、アレルギー性および非アレルギー性チャレンジ、およびメディエーターの放出、そして、アラキドン酸代謝産物および細胞タンパク質を包含する薬剤のそれらへの効果が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の細胞培養物はまた、ヒト肺肥満細胞の生存および増殖に影響する因子をモニターするアッセイにも用いることができる。
【００４５】
これらのアッセイはまた、ヒト肺肥満細胞の機能のモジュレーターの同定に用いることもできる。ヒト肺肥満細胞のモジュレーターをスクリーニングする方法は、純化された本発明のヒト肺肥満細胞培養物をモジュレーターと接触させ、該モジュレーターがヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能および／または表現型の発現を変化させる能力を評価することを含む。
【００４６】
「モジュレーター」とは、無機小分子またはタンパク質またはその断片、薬学的な剤または生物学的な化合物などの試験化合物、ならびに、酸素レベル、湿度レベルなどの変化などの環境条件であって、ヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能および／または表現型の発現を増加させるかまたは低下させるものを包含するとされる。
【００４７】
ヒト肺肥満細胞の生存、増殖、機能および／または表現型の発現を評価するためのアッセイは、本明細書中で提供された教示にしたがって行うことができる。これらの方法にしたがって同定されたモジュレーターは、肺肥満細胞の機能に関連する疾患の予防および／または治療に有用であり得る。かかる疾患は、アレルギー性過敏症、喘息、慢性閉塞性肺疾患または線維化性肺障害を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
以下の非限定的な例は、本発明をさらに説明するために提供されたものである。
【００４９】
例
例１：材料
次のものを入手した：ＤＮａｓｅ、プロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ， Ｆｒｅｅｈｏｌｄ， ＮＪ）、およびゼラチン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）。ブタＩ型エラスターゼ、キモパパイン、サブスタンスＰ、アデノシン、ＡＴＰおよびＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。抗ＦｃεＲＩモノクローナル抗体２２Ｅ７は、Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ （Ｎｕｔｌｅｙ， ＮＪ）から得た。
【００５０】
例２：緩衝液
肺断片は、ＮａＣｌ、８．０、ＫＣｌ、０．２、ＮａＨ２ＰＯ４、０．０５およびグルコース、１．０（ｇ／ｌ）を含有するタイロード緩衝液で洗浄した。緩衝液は、ＮａＨＣＯ３の添加によりｐＨ７．２に滴定した。肥満細胞の単離とエルトリエーションは、ＴＧＭＤ（ゼラチン（１．０）、マグネシウム（０．２５、１ｍＭ）、およびＤＮａｓｅ（０．０１）（ｇ／ｌ）を添加したタイロード緩衝液）中で行った。ＰＡＧＣＭは、グルコース（１．０）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１４（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２（１ｍＭ）（ｇ／ｌ）を含有したＰｉｐｅｓ−アルブミン（０．００３％）緩衝液であった。すべての緩衝液は０．２２ミクロンのフィルターで濾過してから、無菌条件下で保管、維持した。水および緩衝液は、検出可能なエンドトキシンがないことを確認するために日常的に試験した（Ｅ−ｔｏｘａｔｅ， Ｓｉｇｍａ）。
【００５１】
例３：ヒト肺肥満細胞の純化
開胸術によるサンプルから新鮮に由来した肉眼的に正常なヒト肺組織を細かくミンチし、次に二価陽イオンを含まないタイロード緩衝液を用いて血液および肺胞細胞がなくなるまで十分に洗浄した。断片をプロナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）およびキモパパイン（０．５ｍｇ／ｍｌ）の混合液中で２回インキュベートした。遊離細胞をＮＹＴＥＸナイロン布（ポアサイズ１５０ミクロン）で採取した。残った断片をコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）およびエラスターゼ（１０単位／ｍｌ）の混合液にさらに２回さらした。
【００５２】
すべてのインキュベーションおよび洗浄は３７℃で行った。回収した細胞は、直ちに大量のＴＧＭＤで３回洗浄した。得られた肺細胞懸濁液は、アルシアンブルー染色（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ １９７５ ４６（２）：２７９−８６）により決定されたところでは１〜８％の範囲の純度の肥満細胞を含有した。ヒト肺肥満細胞は、対向流エルトリエーションにより、細胞性混入物からさらに分離した（Ｓｃｈｕｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８３ １３１：１９３６−４１）。いくつかの実験においては、エルトリエーションに引き続き、培養の前に、非連続パーコールグラジエントによりヒト肺肥満細胞で濃縮された分画への浮遊を行った（Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８３ １３０：２３５７−６２）。
【００５３】
例４：ヒト肺肥満細胞の培養
例３に記載した単離および濃縮手順の後、約１０７個のヒト肺肥満細胞を、５％のＣＯ２を含有する湿潤な雰囲気の中、３７℃にて、０．４ｘ１０６個／ｍｌの初期密度で、培養培地（幹細胞因子（２５ｎｇ／ｍｌ）±インターロイキン４（１０ｎｇ／ｍｌ））をさらに添加した、ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン、および０．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ）中、マルチウェルプレートを用いて培養した。
【００５４】
１晩経つと、細胞はウェルの底に定着した。細胞は、培養培地の上半分を、当初の濃度の増殖因子を含有する新たな培地と交換することにより、毎週１〜３回栄養補給をした。計数は、アルシアンブルー技法を用いて毎週２回行い、ヒト肺肥満細胞の回復と純度を決定した。写真資料用に、スライド上のサイトスピンプレパラートをトルイジンブルーおよび他の細胞化学染色で染色した。
【００５５】
例５：ヒスタミン放出アッセイ
ＰＡＧＣＭ中の肥満細胞（１０〜５０ｘ１０３個／チューブ）を３７℃でプレインキュベートしてから、緩衝液または２重希釈の（ｉｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）抗ＦｃεＲＩ抗体でチャレンジした。ベータアゴニストおよびプリン作動性アゴニストの効果を検討する実験においては、剤をＦｃεＲＩ媒介性チャレンジの前に、１５分間、３７℃で細胞に添加した。チャレンジの２０分後に、細胞を素早くペレット化し、上清をヒスタミン分析のために取り出した。
【００５６】
ヒスタミン放出は、総ヒスタミン含量で除した正味のヒスタミン放出ｘ１００％として表した。総細胞ヒスタミン含量は、２％過塩素酸による細胞溶解の後に決定した。自発性のヒスタミン放出は常に細胞ヒスタミンの＜２％であり、一般的に＜１％であった。ヒスタミンの測定は、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ （Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， ＮＹ）の自動分光蛍光法（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて行った。反復実験間の変動は一貫して＜５％であった。すべてのアッセイは、反復して行った。
【００５７】
例６：ＲＮＡ抽出およびＰＣＲ
総細胞ＲＮＡ（ｔｃＲＮＡ）を、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ （Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８７ １６２：１５６−１５９）から適応させたフェノール−クロロホルム抽出技法の変法を用いて、培養ヒト肺肥満細胞から単離した。同様に、陽性対照用に、全血をフィコール−ハイパック密度勾配遠心法で処理し、末梢血単核細胞を得、該細胞をｔｃＲＮＡ用に同様に処理した（Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９５ １３：６６５−７５）。
【００５８】
純化された肥満細胞のｔｃＲＮＡは、１０単位のヘパリナーゼ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）によって、室温で２時間処理し、肥満細胞のヘパリンのＲＴ−ＰＣＲ反応への抑制効果を中和した。ｃＤＮＡを、１ｍｇのｔｃＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびマウスのモロニー白血病ウイルス逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を用い、３７℃で１時間、２０単位のＲＮａｓｉｎの存在下、それぞれ１０ｎＭのデオキシヌクレオチド三リン酸（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）で合成した。
【００５９】
ＧＡＰＤＨ、ＩＬ−５およびＩＬ−１３プライマーのためのＰＣＲ工程で用いた産物特異的（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プライマーは、事前に公開されている（Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９５ １３：６６５−７５； Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９６ １５：４７３−８１）。
ＰＣＲは、１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を用いて３０サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒）行い、引き続き、プログラム可能なサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて、追加の産物伸長工程（ｐｒｏｄｕｃｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｓｔｅｐ）（７２℃で５分）を行った。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法を用いて分離し、デジタル画像分析システム（Ｇｅｌ Ｄｏｃ １０００， Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用いてエチジウムブロマイド染色により視覚化した。
【００６０】
例７：トリプターゼおよびキマーゼの免疫細胞化学
カルノア固定液で３０分固定し、ｄＨ２Ｏ中で洗浄し、平衡塩溶液中で３０分洗浄し、液を切り、そしてブロッキング溶液中に室温で６０分おいたサイトスピン標本で、培養した細胞を評価した。免疫細胞化学は、１：１００希釈のヒトトリプターゼに対する１次抗体（アルカリホスファターゼ標識ＩｇＧ１）および１：３００希釈のヒトキマーゼに対する抗体（ビオチン標識、ＩｇＧ１）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行った。適切なマウスＩｇＧ１対照を用いた。細胞を平衡塩溶液（ＢＳＳ）中で３回洗浄後、キマーゼ染色用に、１：１０，０００希釈のエクストラアビジンアルカリホスファターゼを、モイストチャンバー内で１晩添加した。ＢＳＳ中で２０分間、３回リンスした後、基質（Ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｄ）を添加し、暗中で４５分間発色させた。１スライドあたり少なくとも５００個の細胞を計数した。
【００６１】
例８：３Ｈ−チミジンを用いた増殖アッセイ
３５〜４９日目に、培養物が＞９５〜９９％の肥満細胞を含んでいるとき、５０μｌの培養培地中の２ｘ１０４個の肥満細胞を、９６穴平底プレートにトリプリケーションで設置し、３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／５０μｌ／ウェル）を添加した。４日後、細胞をグラスファイバーフィルター上に採取し、３回洗浄し、放射性の取り込みをベータカウンターで評価した。培養物はほぼ均質な集団を含むので、計数は細胞性の混入物ではなく、肥満細胞の増殖を反映している。結果は、培地のみで培養した肥満細胞に対する放射活性の増加パーセントとして表した。
【００６２】
例９：ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いた増殖アッセイ
このマーカーに陽性な細胞のパーセンテージは、細胞分裂を行った肥満細胞の実際のパーセンテージを反映している。ＢｒｄＵ（１０μＭ）を培養初期に加え、結果に示した間隔でアリコットを取り出した。サイトスピン後、スライドを固定し、０．０７ＮのＮａＯＨで２分間浸透化してから、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ （Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）からのＦＩＴＣ結合抗ＢｒｄＵ抗体（αＢｒｄＵ）中で３０分間インキュベートした。次に、スライドを０．０４μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色し、全細胞を描き出した。ＦＩＴＣ結合α−ＢｒｄＵｍＡｂにより、蛍光顕微鏡下でＢｒｄＵ陽性細胞計数を行った。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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