(57)【要約】連結担体及び１以上の標的指向物質を含む標的化高分子、並びにそれらの製造方法及び使用が提供される。また、連結担体、連結担体と結合した治療用物質及び少なくとも１つの標的指向物質を含む標的化治療剤、並びにそれらの製造方法及び使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連結担体及び１以上の標的指向物質を含む標的化高分子。
【請求項２】
連結担体が、２以上の標的指向物質、１０以上の標的指向物質、１００以上の標的指向物質及び１０００以上の標的指向物質から成る群より選択される量の標的指向物質を含む、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項３】
標的指向物質が０．１〜３０モル％の濃度で存在する、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項４】
連結担体がホスファチジルコリン誘導体を含む、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項５】
標的指向物質が、細胞内標的、細胞表面標的及び細胞外マトリックス標的から成る群より選択される標的に標的化高分子を指向させる、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項６】
標的指向物質が共有結合手段により連結担体と結合している、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項７】
標的指向物質が非共有結合手段により連結担体と結合している、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項８】
標的指向物質が血管標的を有する、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項９】
標的指向物質が腫瘍細胞標的を有する、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項１０】
連結担体がリポソームである、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項１１】
更に重合性脂質を含む、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項１２】
連結担体が重合小胞である、請求項１１に記載の標的化高分子。
【請求項１３】
標的指向物質がインテグリン特異的分子である、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項１４】
インテグリン特異的分子がＲＧＤペプチドを含む、請求項１３に記載の標的化高分子。
【請求項１５】
インテグリン特異的分子が、３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸を含む、請求項１３に記載の標的化高分子。
【請求項１６】
式：
【化１】
2004535407.tif 000015
式中、該化合物は連結担体と非共有結合手段又は共有結合手段により結合している、
の化合物を含む、請求項１３に記載の標的化高分子。
【請求項１７】
標的指向物質がキナーゼ特異的分子又はその誘導体である、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項１８】
キナーゼ特異的分子がＡＧ１４３３若しくはＳＵ１４９８又はそれらの誘導体である、請求項１７に記載の標的化治療剤。
【請求項１９】
標的指向物質がプロテアーゼ特異的分子である、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項２０】
プロテアーゼ特異的分子が、ペプチド若しくはＣ末端アルデヒドを有する疑似ペプチド又はそれらの誘導体である、請求項１９に記載の標的化高分子。
【請求項２１】
標的指向物質が、カテプシン、ケモカインレセプターＣＣＲ４及びＣＣＲ５、ＶＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、表面結合ＭＭＰを含むマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＰＤＧＦＲ、Ｐ−及びＥ−セレクチン、プレイオトロピン、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１、Ｔｅｋ、Ｔｉｅ、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリン、Ａｘｌ、αｖβ３、αｖβ５、α５β１、α４β１、α１β１、α２β２を含むインテグリン、並びに前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）から成る群より選択される標的を有する、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項２２】
標的指向物質が酵素モジュレーターである、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項２３】
更に治療用物質を含む、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項２４】
治療用物質がキレーター脂質を介して連結担体と結合している、請求項２３に記載の標的化高分子。
【請求項２５】
脂質キレーターが、Ｎ，Ｎ−ビス［［［［（１３’，１５’−ペンタコサジイナミド−３，６−ドキサオクチル）カルバモイル］メチル］（カルボキシメチル）アミノ］エチル］グリシンである、請求項２４に記載の標的化高分子。
【請求項２６】
治療用物質が、Ｙ−９０、Ｂｉ−２１３、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｐｒ−１４２、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｕ−１５２、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６及びＲｅ−１８８から成る群より選択される、請求項２４に記載の標的化高分子。
【請求項２７】
治療用物質がＹ−９０である、請求項２６に記載の標的化高分子。
【請求項２８】
治療用物質が９０Ｙであり、そして標的指向物質が３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸である、請求項２６に記載の標的化高分子。
【請求項２９】
治療用物質が、マトリックスメタロプロテアーゼインヒビター、鎮痛剤、アグリカナーゼインヒビター、破骨細胞インヒビター、アルキル化剤、シスプラチナム及びその誘導体、ピリミジンアナログ及びプリンアナログ、トポイソメラーゼインヒビター、微小管−標的指向薬剤、エストロゲン誘導体、アンドロロゲン誘導体、インターフェロン、挿入剤、キナーゼインヒビター、並びにＭＤＲインヒビターから成る群より選択される、請求項２３に記載の標的化高分子。
【請求項３０】
更に安定化用物質を含む、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項３１】
安定化用物質が、天然ポリマー、半合成ポリマー及び合成ポリマーから成る群より選択される、請求項３０に記載の標的化高分子。
【請求項３２】
安定化用物質が、デキストラン、修飾デキストラン及びポリ（エチレンイミン）から成る群より選択される、請求項３１に記載の標的化高分子。
【請求項３３】
安定化用物質が多価性を呈する、請求項３０に記載の標的化高分子。
【請求項３４】
それを必要とする患者に十分量の治療剤を投与することを含み、該治療剤は標的化高分子を含み、該標的化高分子はリポソーム又は重合小胞、１以上の標的指向物質及び治療用物質を含む、患者を治療する方法。
【請求項３５】
所望の治療領域に接する体液に請求項１に記載の標的化高分子を導入する工程を含む、治療的処置方法。
【請求項３６】
更に検出用物質を含む、請求項１に記載の標的化高分子。
【請求項３７】
検出用物質が金属イオンである、請求項３６に記載の標的化高分子。
【請求項３８】
金属イオンが放射性金属イオンである、請求項３７に記載の標的化高分子。
【請求項３９】
金属イオンが、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８及びＴｌ−２０１から成る群より選択される、請求項３８に記載の標的化高分子。
【請求項４０】
ａ）それを必要とする患者に撮像剤を投与すること、該撮像剤は標的化高分子を含み、該標的化高分子は１以上の標的指向薬剤及び検出用物質を含む；そして
ｂ）患者を撮影すること、
を含む、患者を撮影する方法。
【請求項４１】
撮影が磁気共鳴撮影又は核シンチグラフィーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
患者の撮影が腫瘍の撮影を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
式：
【化２】
2004535407.tif 000016
の化合物。
【請求項４４】
１以上の３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］−ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニルアミノプロピオン酸部分を含む、高分子。
【請求項４５】
連結担体、連結担体と結合した治療用物質、及び少なくとも１つの標的指向物質を含む、標的化治療剤。
【請求項４６】
連結担体が、２以上の標的指向物質、１０以上の標的指向物質、１００以上の標的指向物質及び１０００以上の標的指向物質から成る群より選択される量の標的指向物質を含む、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項４７】
標的指向物質が０．１〜３０モル％の濃度で存在する、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項４８】
連結担体が、リポソーム及び重合小胞から成る群より選択される、請求項１に記載の標的化治療剤。
【請求項４９】
連結担体がホスファチジルコリン誘導体を含む、請求項４８に記載の標的化治療剤。
【請求項５０】
標的指向物質が、細胞表面標的、細胞内標的及び細胞外マトリックス成分から成る群より選択される標的に脂質構築物を指向させる、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項５１】
標的指向物質が共有結合手段により脂質構築物と結合している、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項５２】
標的指向物質が非共有結合手段により脂質構築物と結合している、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項５３】
標的指向物質が血管標的を有する、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項５４】
標的指向物質が、ケモカインレセプターＣＣＲ４及びＣＣＲ５、ＶＣＡＭ、ＦＧＦＲ、表面結合ＭＭＰを含むマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＰＤＧＦＲ、Ｐ−及びＥ−セレクチン、プレイオトロピン、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１、Ｔｅｋ、Ｔｉｅ、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリン、Ａｘｌ、αｖβ３、αｖβ５、α５β１、α４β１、α１β１、α２β２を含むインテグリン、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）から成る群より選択される血管標的を有する、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項５５】
標的指向物質が腫瘍細胞標的を有する、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項５６】
標的指向物質が、ケモカインレセプターＣＣＲ４及びＣＣＲ５、ＶＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、表面結合ＭＭＰを含むマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＰＤＧＦＲ、Ｐ−及びＥ−セレクチン、プレイオトロピン、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１、Ｔｅｋ、Ｔｉｅ、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリン、Ａｘｌ、αｖβ３、αｖβ５、α５β１、α４β１、α１β１、α２β２を含むインテグリン、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）から成る群より選択される腫瘍細胞標的を有する、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項５７】
標的指向物質がインテグリン特異的分子である、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項５８】
インテグリン特異的分子がＲＧＤペプチドを含む、請求項５７に記載の標的化治療剤。
【請求項５９】
インテグリン特異的分子が、３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸を含む、請求項５７に記載の標的化治療剤。
【請求項６０】
式：
【化３】
2004535407.tif 000017
式中、該化合物は脂質構築物と非共有結合手段又は共有結合手段により結合している、
の化合物を含む、請求項５７に記載の標的化治療剤。
【請求項６１】
標的指向物質がキナーゼモジュレーターである、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項６２】
キナーゼモジュレーターがＡＧ１４３３又はＳＵ１４９８である、請求項６１に記載の治療剤。
【請求項６３】
標的指向物質がプロテアーゼ特異的分子である、請求項４５に記載の標的化高分子。
【請求項６４】
プロテアーゼ特異的分子が、ペプチド若しくはＣ末端アルデヒドを有する疑似ペプチド又はそれらの誘導体である、請求項６３に記載の治療剤。
【請求項６５】
更に安定化用物質を含む、請求項１に記載の標的化治療剤。
【請求項６６】
安定化用物質が、天然ポリマー、半合成ポリマー及び合成ポリマーから成る群より選択される、請求項６５に記載の標的化治療剤。
【請求項６７】
安定化用物質が、デキストラン、修飾デキストラン及びポリ(エチレンイミン)から成る群より選択される、請求項６６に記載の標的化治療剤。
【請求項６８】
安定化用物質が多価性を呈する、請求項６５に記載の標的化治療剤。
【請求項６９】
治療用物質が約１％〜約４０％の濃度で存在する、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項７０】
治療用物質が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビン及びイダルビシンから成る群より選択される、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項７１】
治療用物質がドキソルビシンである、請求項７０に記載の標的化治療剤。
【請求項７２】
治療用物質がタキサン化合物である、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項７３】
タキサン化合物がパクリタキセル又はドセタキセルである、請求項７２に記載の標的化治療剤。
【請求項７４】
治療用物質がカンプトテシン又はトポテカンである、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項７５】
治療用物質が、マトリックスメタロプロテアーゼインヒビター、鎮痛剤、アグリカナーゼインヒビター、破骨細胞インヒビター、アルキル化剤、シスプラチナム及び誘導体、ピリミジンアナログ及びプリンアナログ、トポイソメラーゼインヒビター、微小管−標的指向薬剤、エストロゲン誘導体、アンドロロゲン誘導体、インターフェロン、挿入剤、キナーゼインヒビター、並びにＭＤＲインヒビターからなる群より選択される、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項７６】
治療用物質がドキソルビシンであり、標的指向物質が３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノエチルオキシ］−ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸である、請求項４５に記載の標的化治療剤。
【請求項７７】
標的化脂質構築物を提供すること、該標的化脂質構築物は１以上の標的指向物質を含む、そして該脂質構築物内に治療用物質を結合させること、を含む、標的化治療剤の製造方法。
【請求項７８】
標的化脂質構築物が、リポソーム、ミセル、小胞及び重合リポソームからなる群より選択される脂質構築物を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
治療用物質が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビン及びイダルビシンから成る群より選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
治療用物質がタキサン化合物である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
タキサン化合物がパクリタキセル又はドセタキセルである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
治療用物質がカンプトテシン又はトポテカンである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
連結担体を含む有効量の医薬組成物を投与し、該連結担体は少なくとも１つの標的指向物質、及びそれを必要とする患者に対する結合した治療用物質を含む、それを必要とする患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療、撮影及び診断を含む、多くのｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ応用に適した標的化剤に関する。より詳細には、本発明は、１以上の標的指向物質及び／又は治療用物質を有する高分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、依然として工業化社会における主要な死因の１つである。米国では、がんは心臓病に次ぎ２番目の最も一般的な死因であり、１９９７年には死因の約１／４を占めていた。明らかに、新規の有効ながん治療が有意な健康の恩恵を提供するであろう。がんについて提案されている広範な治療の中で、標的化治療剤が注目すべき有望さを保っている。原則として、細胞毒性剤をがん組織特異的に標的化している場合、健常組織は影響を受けないか又は病理組織よりも非常に小さな範囲の影響ですむため、患者は非常に高用量の細胞毒性剤の作用に耐えるであろう。
【０００３】
治療剤
がんの治療に関し、膨大な数の治療剤が利用可能である。ほんのわずかな関心事がここで議論される。アントラサイクリン系抗生物質ドキソルビシン（ドキソルビシン）及びその誘導体、並びに他の陽イオン性アントラサイクリンが、現在、白血病及び固形腫瘍を含むがんの治療において非常に大きな臨床上の関心事となっている。ドキソルビシンは多くのヒト新生物に対し広範な活性を有しており、単一薬剤としても組合せ処方としても広く用いられている。ドキソルビシンは遊離型で用いることもできるが、この遊離型ドキソルビシンの使用は急性及び慢性の心筋症といった形で毒性につながっている。現在、米国食品薬品局が認可した２つのドキソルビシンのリポソーム製剤が利用でき、いくつかの更なるリポソーム製剤が実験室又は臨床試験で研究されている。これらリポソーム製剤は、これらの系が肝臓、脾臓及び腫瘍により多く蓄積し、心臓のような臓器から薬物を隔離する傾向があるため、ドキソルビシンの毒性を減ずる。全般に、リポソームドキソルビシンの使用は、より多くの生涯のドキソルビシン蓄積量を投与可能にする。
【０００４】
タキサンは、パクリタキセル(タキソール（登録商標）)及びドセタキセル(タキソテア（登録商標）)を含む薬物群であり、がんの治療に使用される。タキサンは、微小管集合体の促進及び安定化により細胞分裂をブロックする。この誘導された安定性は、有糸分裂、細胞形態の維持、形状変化、軸策形成、歩行運動及び分泌のような機能に必要な、微小管依存性細胞質構造の動態及び平衡を混乱させ、これにより細胞に障害を与える。１９９２年１２月に米国食品薬品局（ＦＤＡ）は、治療に耐性のある（治療抵抗性）卵巣癌に対し、パクリタキセルの使用を認可した。パクリタキセルは後に卵巣癌の初期治療としてシスプラチンとの組合せで認可された。現在、上皮卵巣癌を有する女性は一般的に外科治療され、続いてタキサン及びプラチナム（別のタイプの抗がん剤）で処置される。ＦＤＡは、アジュバント化学療法（一次治療後、一次治療の有効性を高めるために施される化学療法）後、６ヶ月以内に再発した乳癌、又はリンパ節近傍若しくは身体の他の部分に広がった（転移した）乳癌の治療に対し、パクリタキセルも認可している。パクリタキセルは、ＡＩＤＳ−関連カポジ肉腫及び肺癌を含む他のがんにも使用される。
【０００５】
パクリタキセルと構造的に類似する化合物であるドセタキセルは、進行した乳癌、肺癌及び卵巣癌を治療するため、ＦＤＡにより認可されている。パクリタキセルとドセタキセルにはともに不快な副作用があり、現在いずれもリポソーム製剤に利用されていない。
【０００６】
カンプトテシン及びトポテカンはｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を発揮する他の治療剤であり、血管新生の阻害を通して介在すると考えられている。Clements et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1999) 44: 411-16。この出版物、並びに本明細書で参照する他の全ての特許、特許出願及び出版物は、本明細書にその全体が援用される。
【０００７】
インテグリン
インテグリンは、ＲＧＤペプチド配列を介して細胞がマトリックスに接着することに関与するタンパク質のクラスである。Ruoslahti & Pierschbacher, Science (1987) 238: 491-497。これらの発現は、骨粗鬆症、関節リウマチ、黄斑変性及びがんのような新生血管の形成（血管新生）に関わる多くの主要な疾患過程に密接に関連している。Folkman, Nature Medicine (1995) 1(1): 27-31。インテグリンの阻害は、これらタンパク質の機能（抗血管新生）及び／又は薬剤送達のアンカーとしてのインテグリンの使用（血管標的指向）を直接干渉することによりこうした疾患を治療するための新規戦略である。Schmitzer, New Eng. J. Med. (1998) 339 (7):472-474；Eliceiri & Cheresh, J. Clin. Invest. (1999) 103 (9): 1227-1230。多価性は、細胞表面レセプターに対する分子の親和性を増大させるための潜在的に強力な戦略である。Mammen et al., Angew. Chem. Int. Ed. (1998) 37: 2754-2794。ポリマーはＲＧＤペプチドの多価配置を含有するように合成され、これらの材料はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでインテグリンへの親和性が増大している。Saiki et al., Cancer Res. (1989) 49 (14): 3815-3822；Komazawa et al., J Bioact. Compat. Polym. (1993) 8: 258-274；Oku et al., Life Sci. (1996) 58 (24): 2263-2270；Kurohane et al., Life Sci. (2000) 63 (3): 273-81；Maynard et al., J. Am. Chem. Soc. (2001) 123: 1275-1279。これらの材料は、動物腫瘍モデルにおいて、ｉｎｖｉｖｏで肺及び肝転移を阻害するためにも用いられている。現在まで、インテグリンを阻害するためにＲＧＤを模倣するリガンドを有する多価材料は設計されていなかった。
【０００８】
現在、少なくとも１１の異なるαサブユニットが同定され、少なくとも６の異なるβサブユニットが同定されている。それぞれ異なるαサブユニットがそれぞれ異なるβサブユニットと組み合わされて異なるインテグリンを形成することができる。αｖβ３として同定されているインテグリン（ビトロネクチンレセプターとしても知られる）が、腫瘍転移、固形腫瘍増殖（新形成）、骨粗鬆症、パジェット病、悪性の体液性高カルシウム血症、腫瘍血管新生を含む血管新生、抗血管新生、網膜症、黄斑変性、関節リウマチを含む関節炎、歯周病、乾癬及び平滑筋細胞遊走（例えば再狭窄）を含むが、これらに限定されない種々の状態又は疾患状態において役割を果たすインテグリンとして同定されている。更に、そのようなインテグリンの阻害剤が抗ウイルス剤、抗真菌剤及び抗菌剤として有用であろうことがわかっている。したがって、αｖβ３を選択的に阻害するか又はこれと拮抗する治療剤は、そのような状態の治療に有益であろう。αｖβ３インテグリンは、フィブリノーゲン（Bennett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80 (1983) 2417）、フィブロネクチン（Ginsberg et al., J. Clin. Invest., Vol. 71 (1983) 619-624）及びフォンビルブラント因子（Ruggeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 79 (1982) 6038）のような多くのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）含有マトリックス分子と結合することが示されている。ＲＧＤ配列を含有する化合物は細胞外マトリックスリガンドを模倣し、細胞表面レセプターに結合する。しかしながら、ＲＧＤペプチドは一般的にＲＧＤ依存性インテグリンに対し非選択的であることも知られている。例えば、αｖβ３に結合する多くのＲＧＤペプチドは、αｖβ５、αｖβ１及びαＩＩｂβＩＩＩａにも結合する。血小板αＩＩｂβＩＩＩａ（フィブリノーゲンレセプターとしても知られる）の拮抗はヒトにおいて血小板の凝集をブロックすることが知られている。
【０００９】
多くの抗インテグリン抗体が知られている。Doerr et al., J. Biol. Chem. 1996 271: 2443は、αｖβ５インテグリンに対するブロッキング抗体が、ＩＧＦ−１からの刺激に応じてｉｎｖｉｔｒｏでＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の遊走を阻害することを報告している。Gui et al., British J. Surgery 199582: 1192は、αｖβ１及びαｖβ５に対する抗体が、ヒト乳癌カルシノーマ細胞株Ｈｓ５７８Ｔ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１による化学浸潤をｉｎｖｉｔｒｏで阻害することを報告している。Lehman et al., Cancer Research 1994 54: 2102は、モノクローナル抗体（６９−６−５）が、αｖβ３を含むいくつかのαｖインテグリンと反応し、ビトロネクチンを含む多くの基質への結腸癌細胞の接着を阻害すること示す。Brooks et al., Science 1994 264: 569は、抗αｖβ３モノクローナル抗体を用いたインテグリン活性の遮断が、ヒトＭ２１メラノーマフラグメントによるニワトリ漿尿膜の腫瘍−誘発血管新生を阻害することを示す。Chuntharapai et al., Exp. Cell. Res. 1993 205: 345は、αｖβ３複合体を認識するモノクローナル抗体９Ｇ２．１．３及びＩＯＣ４．１．３を開示する。後者のモノクローナル抗体は、破骨細胞以外のαｖβ３発現組織に弱く結合するか又は全く結合しないと言われており、骨疾患のｉｎｖｉｖｏ治療に有用であることが示唆された。前者のモノクローナル抗体は、ある種のがんにおいて治療剤としての可能性を有することが示唆されている。
【００１０】
Ginsberg et al.の米国特許第５，３０６，６２０号は、インテグリンと反応し、インテグリンのリガンドに対する結合アフィニティーを増加させる抗体を開示する。このようなモノクローナル抗体は、メラノーマ腫瘍を固定することにより転移を予防するのに有用であるといわれている。Brownの米国特許第５，０５７，６０４号は、ＲＧＤ配列含有タンパク質を認識するレセプターに結合することにより、ＲＧＤが介在する貪食作用の増大を阻害する、αｖβ３インテグリンに対するモノクローナル抗体の使用を開示する。Plow et al.の米国特許第５，１４９，７８０号は、インテグリンβサブユニットのＲＧＤエピトープと相同性のあるタンパク質、及びβサブユニットに結合することによりインテグリン−リガンド結合を阻害するモノクローナル抗体を開示する。その作用は、接着により開始される凝集のようなヒトの反応及びある種の炎症反応に対する療法に有用であるといわれている。
【００１１】
Carronの米国特許第６，１７１，５８８号は、細胞接着、破骨細胞介在骨再吸収、再狭窄、眼血管新生及び血管腫の増殖、並びに新生物形成性細胞又は腫瘍増殖及び播種のようなαｖβ３が介在するイベントをブロックするための方法に用いることができるモノクローナル抗体を記載する。記載される他の使用は、αｖβ３を有する新生物及び腫瘍関連血管床を破壊し、殺すための抗体介在標的指向及び治療剤の送達である。加えて、創意に富んだモノクローナル抗体は、αｖβ３を有する新生物又は腫瘍関連血管床をＮＭＲ又はイムノシンチグラフィーにより可視化又は撮影するために用いることができる。
【００１２】
ＶＥＧＦ
今日までに多くの血管新生増殖因子が記載されている。その中で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、生理学的及び病理学的血管新生の正のレギュレーターとして重要な役割を果たしているようにみえる（Brown et al. (1997)、血管新生の調節（Goldberg及びRosen編集）、Birkhauser, Basel, 233-269；Thomas (1996) J. Biol. Chem. 271: 603-606；Neufeld et al. (1999) FASEB J. 13: 9-22に概説されている）。ＶＥＧＦは、分泌される、ジスルフィド連結ホモダイマーであり、内皮細胞が増殖し、遊走し、マトリックス分解酵素を産生するように選択的に刺激する（Conn et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 1323-1327；Ferrara and Henzel (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851-858；Gospodarowicz et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 7311-7315；Pepper et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181: 902-906；Unemori et al. (1992) J. Cell. Physiol. 153: 557-562）。これらはすべて新脈管の形成に必要とされる工程である。唯一知られている内皮細胞特異的分裂促進因子であることに加えて、ＶＥＧＦは、高分子の血管透過性に一過性の増加を誘導する能力において血管新生増殖因子の中でユニークな存在である（それ故、そのオリジナルの別名は血管透過性因子という）（Dvorak et al. (1979) J. Immunol. 122:166-174；Senger et al. (1983) Science 219: 983-985；Senger et.al. (1986) Cancer Res. 46: 5629-5632）。血管透過性の増加及びその結果の血管外空間における血漿タンパク質の沈着は、内皮細胞遊走のための仮のマトリックスを提供することにより新血管形成を補助する（Dvorak et al. (1995) Am. J. Pathol. 146: 1029-1039）。透過性亢進は実際、腫瘍に関連するものを含む新脈管の固有の特徴である（Dvorak et al. (1995) Am. J. Pathol. 146: 1029-1039）。更に、組織低酸素状態により誘導される代償性血管新生は、ＶＥＧＦにより介在されることが現在知られている（Levy et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 2746-2753；Shweiki et al. (1992) Nature 359: 843-845）。
【００１３】
ＶＥＧＦは、ほとんど全ての腫瘍細胞によりさまざまな量で産生され、分泌される（Brown et al. (1997)、血管新生の制御（Goldberg及びRosen編集）、Birkhauser, Basel: 233-269）。ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖が、ＶＥＧＦに対する中和抗体（Kim et al. (1993) Nature 362: 841-844）、ドミナントネガティブＶＥＧＦＲ２の発現（Millauer et al. (1996) Cancer Res. 56: 1615-1620；Millauer et al. (1994) Nature 367: 576-579）、ＶＥＧＦレセプターインヒビターの低分子量インヒビター（Strawn et al. (1966) Cancer Res. 56: 3540-3545）、又はＶＥＧＦｍＲＮＡに対するアンチセンス配列の発現（Saleh et al. (1996) Cancer Res. 56: 393-401）により阻害されることを証明することで、最近、ＶＥＧＦ及びそのレセプターが腫瘍増殖に寄与しているという直接的な証拠が得られた。重要なのは、腫瘍転移発生率がＶＥＧＦアンタゴニストにより劇的に減少したことも発見されたことである（Asano et al. (1995) Cancer Res. 55: 5296-5301；Warren et al. (1995) J. Clin. Invest. 95:1789-1797；Claffey et al. (1996) Cancer Res. 56: 172-181；Melnyk et al. (1996) Cancer Res. 56: 921-924）。したがって、ＶＥＧＦのシグナル伝達インヒビターは、抗がん剤として臨床上広範に有用であるかもしれない。上記のように、がんに加えて、乾癬、加齢関連黄斑変性、糖尿病性網膜症及び関節リウマチなどの過剰血管新生を特徴とする他の増殖性疾患は、ＶＥＧＦシグナル伝達のアンタゴニストで治療するとができるであろう。
【００１４】
ＶＥＧＦは、８エクソンから成るＶＥＧＦ遺伝子の選択的スプライシングの結果として、数種の形態で生ずる（ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１４５、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６）（Houck et al. (1991) Mol. Endocrin. 5: 1806-1814；Tischer et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 11947-11954；Poltorak et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 7151-7158）。低分子の３形態は拡散性であり、高分子の２形態はヘパリンに対する高アフィニティーの結果として、細胞膜に顕著に局在している。ＶＥＧＦ−１６５及びＶＥＧＦ−１４５は、（エクソン６及び７を含有する）ＶＥＧＦ−１８９と比較して幾分アフィニティーが低いが、（それぞれエクソン７及びエクソン６にコードされる塩基性ドメインを含有する結果として）ヘパリンにも結合する。ＶＥＧＦ−１６５は、多くの組織で最も豊富な形態であるようにみえる（Houck et al. (1991) Mol. Endocrinol. 5:1806-1814；Carmeliet et al. (1999) Nature Med. 5: 495-502）。選択的スプライシングされたヘパリンに結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、レセプターに対しアフィニティーが幾分低く（Gitay-Goren et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5519-5523）、分裂促進能も低いようにみえる（Keyt et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7788-7795）。
【００１５】
ＶＥＧＦの生物学的効果は、その発現が内皮由来細胞に高度に限定される、相同性を有する２つのチロシンキナーゼレセプターであるＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）により介在される（de Vries et al. (1992) Science 255: 989-991；Millauer et al. (1993) Cell 72: 835-846；Terman et al. (1991) Oncogene 6: 519-524）。両レセプターは、７つのＩｇＧ様ドメインから成る細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインを有する。ＶＥＧＦに対するＶＥＧＦＲ１のアフィニティー（Ｋｄ＝１〜２０ｐＭ）は、ＶＥＧＦＲ２（Ｋｄ＝５０〜７７０ｐＭ）と比較して高い（Brown et al. (1997)、血管新生の調節、前掲；de Vries et al. (1992) Science 255: 989-991；Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579-1586）。２次元培養におけるヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）では、ＶＥＧＦＲ２は非常に豊富なレセプターである（Brown et al. (1997)、血管新生の調節、前掲）。しかしながら、ｉｎｖｉｖｏの静止期の内皮細胞では、両レセプターは低レベルで発現する（Kremer et al. (1997) Cancer Res. 57: 3852-3859；Barleon et al. (1997) Cancer Res. 57: 5421-5425）。
【００１６】
内皮細胞が種々の刺激により活性化されるとき、両レセプターは実質的に上方制御される。例えば、低酸素状態は、内皮細胞において、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の発現増加を誘導する（Tuder et al. (1995) J. Clin. Invest. 95: 1798-1807；Gerber et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 23659-23667；Brogi et al. (1996) J. Clin. Invest. 97: 469-476；Kremer et al. (1997) Cancer Res. 57: 3852-3859）。ＶＥＧＦＲ１については、低酸素状態は、低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）コンセンサス結合部位を含有するｆｌｔ−１プロモーターを介して直接活性化し（Gerber et al. (1997) J. Biol. Chem., 前掲）、低酸素状態で誘導されたＶＥＧＦを介して間接的に活性化する（Barleon et al. (1997) Cancer Res., 前掲）。ＶＥＧＦＲ１のＶＥＧＦ−誘導上方制御は、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２により介在される（Barleon et al. (1997) Cancer Res., 前掲）。ＶＥＧＦＲ２はＶＥＧＦにより上方制御され（ＶＥＧＦＲ２を介するがＶＥＧＦＲ１は介さない）（Kremer et al. (1997) Cancer Res., 前掲；Wilting et al. (1996) Dev. Biol. 176: 76-85）、そしておそらく筋原細胞から得られる低酸素状態調製培地中のまだ同定されていない因子により上方制御される（Brogi et al. (1996) J. Clin. Invest., 前掲）。内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ２の発現は、ｂＦＧＦによっても制御され、これはＶＥＧＦ及びｂＦＧＦによる内皮細胞の相乗的活性化を部分的に説明する（Pepper et al. (1998) Exp. Cell Res. 241: 414-425）。加えて、ｋｄｒ及びｆｌｔ−１のプロモーターは、シス作用性流体剪断力応答性配列を含有するため、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の発現は血流の変化に感受性であるかもしれない（Tuder et al. (1995) J. Clin. Invest., 前掲）。
【００１７】
ｆｌｔ−１又はｋｄｒレセプター遺伝子をトランスフェクトされたブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞を用いた実験は、ＶＥＧＦＲ２が内皮細胞の細胞形態及びマイトジェン活性の変化に関係するＶＥＧＦ介在シグナルの主なトランスデューサーであることを示唆している（Waltenberger et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:26988-26995）。同研究において、ｆｌｔ−１をトランスフェクトされた、ＶＥＧＦを有するＰＡＥ細胞の刺激は検出可能な変化を生じないようにみえた。しかしながら、最も最近では、ＶＥＧＦＲ１を介したＶＥＧＦシグナル伝達は、単球の遊走、並びに内皮細胞及び単球における組織因子の発現の上方制御を誘導することが証明された（Clauss et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 17629-17634；Barleon et al. (1996) Blood 87: 3336-3343）。ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインは、ＶＥＧＦＲ１の存在下でのみ陽イオン交換樹脂上に保持され、ＶＥＧＦＲ２の保持はＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦが存在するときに促進されるという観察に基づき、Kendall et al.は、２つのレセプターが互いにアフィニティーを有し、この相互作用がＶＥＧＦにより安定化されると結論づけた（Kendall et al. (1996) Biochem Biophys. Res. Commun. 226: 324-328）。両レセプターが細胞表面上で発現するとき、ＶＥＧＦＲ１／Ｒ２ヘテロダイマーは少なくとも結合成分ＶＥＧＦレセプターの画分を構成するようにみえる。
【００１８】
ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２は内皮細胞で顕著に発現するが、いくつかの非内皮細胞でも検出されている。ＶＥＧＦＲ１は、栄養芽細胞（Charnockjones et al. (1994) Biol. Reprod. 51: 524-530）、単球（Barleon et al. (1996) Blood, 前掲）、血液幹細胞及び巨核球/血小板（Katoh et al. Cancer Res. 55: 5687-5692）、腎メサンギウム細胞（Takahashi et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209: 218-226）及び周皮細胞（Yamagishi et al. (1999) Lab. Invest. 79: 501-509）で発現する。単球では、ＶＥＧＦＲ１はＶＥＧＦが介在する遊走及び組織因子の発現の誘導の原因である（Clauss et al. (1996) J. Biol. Chem., 前掲；Barleon et al. (1996) Blood, 前掲；Hiratsuka et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., 前掲）。周皮細胞では、ＶＥＧＦＲ１は、最近記載された分裂促進因子及び走化性因子として作用するＶＥＧＦの能力を介在することができる（Yamagishi et al. (1999) Lab. Invest., 前掲）。栄養芽細胞及びメサンギウム細胞におけるＶＥＧＦＲ１の役割は明らかにされていない。ＶＥＧＦＲ２の発現は、血液幹細胞、巨核球／血小板及び網膜前駆細胞で検出されている（Katoh et al. (1995) Cancer Res. 55: 5687-5692；Yang et al. (1996) J. Neurosci. 16: 6089-6099）。ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の発現は、白血病細胞（Katoh et al. (1995) Cancer Res., 前掲）及びメラノーマ細胞（Gitay-Goren et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 702-709）を含む悪性細胞でも報告されている。
【００１９】
標的化治療
標的化治療アプローチの例は、種々の特許文献及び科学文献に記載されている。国際特許出願ＷＯ９３／１７７１５号は、腫瘍血管系関連抗原を認識することにより固形腫瘍塊の血管系に標的指向する、診断剤又は治療剤を運ぶ抗体について記載している。国際特許出願ＷＯ９６／０１６５３号及び米国特許第５，８７７，２８９号は、抗体を用いて凝血剤を部位特異的送達することによる腫瘍血管系のｉｎ ｖｉｖｏ凝血方法及び組成物について記載している。一方、国際特許出願ＷＯ ９８／３１３９４号は、凝血及び腫瘍治療のための組織因子組成物の使用について記載している。国際特許出願ＷＯ９３／１８７９３号並びに米国特許第５，７６２，９１８号及び第５，４７４，７６５号は、血管内皮細胞に結合するポリ陰イオン性ポリマーに連結したステロイドについて記載している。国際特許出願ＷＯ９１／０７９４１号及び米国特許第５，１６５，９２３号は、腫瘍細胞に対する抗体に結合したリシンＡなどの毒素について記載している。米国特許第５，６６０，８２７号、第５，７７６，４２７号、第５，８５５，８６６号及び第５，８６３，５３８号は、腫瘍血管系の治療方法についても記載している。国際特許出願ＷＯ９８／１０７９５号及びＷＯ９９／１３３２９号は、薬物を腫瘍に標的指向させるために用いることができる腫瘍回帰分子について記載している。
【００２０】
Tabata et al., Int. J. Cancer 1999, 82: 737-42では、抗体を用いてラジオアイソトープを増殖している血管に送達している。Ruoslahti & Rajotte, Annu. Rev. Immunol. 2000, 18: 813-27；Ruoslahti, Adv. Cancer Res. 1999, 76: 1-20は、治療剤を新生血管系に標的指向させるための戦略について概説している。一方、Arap et al., Science 1998, 279: 377-80は、腫瘍血管を標的指向するペプチドの選択について記載している。
【００２１】
このようなシステムに用いる典型的な配置は、標的指向物質を単結合又は比較的短い化学リンカーにより治療用物質に連結させることであることに注目すべきである。このようなリンカーの例には、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）又は米国特許第４，８８０，９３５号に開示されるリンカー、及びオリゴペプチドスペーサーが含まれる。カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド試薬は、治療用物質及び標的指向物質を適切な反応性化学基と直接結合させるのに用いられている。
【００２２】
遺伝子治療法において、異種遺伝子を送達するために陽イオン性有機分子を使用することは、文献に報告されている。全ての陽イオン性化合物がＤＮＡと複合体を形成し、遺伝子移入を促進させるわけではない。最近の主な戦略は、陽イオン性分子の慣例スクリーニングである。過去に用いられてきた化合物のタイプには、ポリエチレンアミン、エチレンジアミンカスケードポリマー及びポリブレンのような陽イオン性ポリマーが含まれる。実効陽電荷を有するポリリジンのようなタンパク質も用いられてきた。最も大きな化合物群である陽イオン性脂質にはＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−ｃｈｏｌ及びＤＯＳＰＡが含まれる。これらの薬剤は全て有効であることが証明されているが、毒性及び薬剤の製造費用のような潜在的問題を抱えている。陽イオン性リポソームは、遺伝子トランスフェクションの研究に関し、近年最も普及した系である。陽イオン性リポソームは、ＤＮＡを分解から保護し、細胞に入るＤＮＡ量を増加させるという２つの機能を果たす。陽イオン性リポソームがどのように機能するかを示すメカニズムは十分に説明されていないが、このようなリポソームはｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの研究で有用であることが証明されている。しかしながら、これらのリポソームにはいくつかの重要な制約がある。このような制約には、トランスフェクション効率の低さ、脂質製造費用、ＤＮＡと複合体を形成したときのコロイド状安定性の低さ、及び毒性が含まれる。
【００２３】
標的指向物質と治療用物質との比較的短いリンカーを介した結合体は多くの注目を集めているが、大きな粒子をリンカーとして用いることはほとんど注目されてこなかった。典型的には、リンカーは治療用物質及び標的指向物質を結合させるために単純に機能し、リンカーの特性についての考察は、一般に連結した物質との干渉を避けること、例えば免疫グロブリンの抗原結合部位の連結点を避けることに集中している。
【００２４】
リポソームのような生体適合性材料の大きな微粒子の集合体は、薬物及び常磁性造影剤を投与するための担体として用いられてきた。米国特許第５，０７７，０５７号及び第５，２７７，９１４号は、水溶性の低い薬物を送達するための、所定サイズの粒子、特に非プロトン性溶媒に溶解性の脂質を有するリポソーム又は脂質粒子懸濁液の製造について教示している。米国特許第４，５４４，５４５号は、リポソームを予め決められた臓器により特異的にするための、修飾されたコレステロール誘導体を含む外殻を有するリン脂質リポソームについて教示する。米国特許第５，２１３，８０４号は、小胞形成脂質と、１〜２０モル％の親水性生体適合性ポリマーで誘導体化された小胞形成脂質とで構成され、その生体内分布及び再循環半減期を制御するための大きさにした薬物のような、トラップされた薬剤を含有するリポソーム組成物を教示する。米国特許第５，２４６，７０７号は、トラップされたタンパク質及びポリペプチドのような水溶性生体分子の放出速度を制御するためのリン脂質で被覆された生物活性材料の微晶性粒子を教示する。米国特許第５，１５８，７６０号は、リポソームで被包された放射性標識されたヘモグロビンなどのタンパク質を教示する。
【００２５】
米国特許第５，５１２，２９４号及び第６，０９０，４０８号及び第６，１３２，７６４号（その内容は本明細書に援用される）は、種々の生物学的適用のための重合リポソームの使用について開示する。１つの記載された態様は、局所治療のために特定の生体部位に治療剤を指向送達するための、治療用化合物（例えばタンパク質、ホルモン又は薬物）に連結させるか又はそれを被包することができる標的化重合リポソームに関するものである。リポソーム組成物について記載する他の出版物には、米国特許第５，６６３，３８７号、第５，４９４，８０３号及び第５，４６６，４６７号が含まれる。タンパク質及び酵素を非共有結合的に固定するための重合脂質含有リポソームは、Storrs et al.の「常磁性重合リポソーム：合成、性質決定及び磁気共鳴撮影への適用」、J. Am. Chem. Soc. (1995) 117 (28): 7301-7306；及びStorrs et al.の「新規再循環ＭＲ造影剤としての常磁性重合リポソーム」、JMRI (1995) 5 (6): 719-724に記載されている。Wu et al.の「放射性免疫療法及び撮影に使用するための金属−キレート−デンドリマー抗体構築物」、Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (1994) 4 (3): 449-454は、デンドリマーをベースとした化合物に関する出版物である。
【００２６】
安定化
肝臓での急速なクリアランスを避けるため又は他の安定化効果のための、リポソームとポリマー化合物との結合が記載されている。例えば、Dadeyの米国特許第５，９３５，５９９号は、リポソーム、及び塩の形態で複数の陰イオン性部を有するポリマーを含有するポリマー結合リポソームについて記載する。ポリマーは合成でも天然でもよい。ポリマー結合リポソームは、長時間血管系に保持される。
【００２７】
多糖はポリマー安定化剤の１つのクラスである。Calvo Salve et al.の米国特許第５，８４３，５０９号は、脂質多糖複合体を形成すること、及び水溶性で陽電荷の多糖と陰電荷のリン脂質の２成分の組合せを含むコロイド系の製造方法を開発することによるコロイド系の安定化について記載している。安定化は、界面でイオン性複合体であるアミノ多糖−リン脂質が形成されることにより起こる。Calvo Salve et al.に使用される多糖には、キチン及びキトサンが含まれる。
【００２８】
デキストランは、その安定化特性が研究されている他の多糖である。Cansell et al., J. Biomed. Mater. Res. 1999, 44: 140-48は、デキストラン又は官能化デキストランをコレステロールで疎水性化し、リポソーム形成のあいだリポソームの脂質２重層に固定し、デキストランで被覆されたリポソームとしたことを報告している。これらのリポソームは、培養ヒト内皮細胞と特異的に相互作用する。Letourneur et al., J. Controlled Release 2000, 65: 83-91では、抗増殖性官能化デキストラン−被覆リポソームを血管平滑筋細胞の標的指向薬剤として用いている。Ullman et al., Proc. Nat. Acad. Sci 91: 5426-30 (1994)及びUllman et al., Clin. Chem. 42: 1518-26 (1996)は、ポリスチレンビーズをデキストランで被覆すること、並びにリガンド、核酸及びタンパク質をデキストラン−ポリスチレン複合体に付着させることを記載している。
【００２９】
デキストランは金属ナノ粒子の被覆にも用いられており、このようなナノ粒子は主に撮像剤として用いられている。例えば、Moore et al., Radiology 2000, 214: 568-74は、齧歯類モデルにおいて、長時間循環デキストラン−被覆酸化鉄ナノ粒子は、腫瘍細胞に優先して取り込まれるが、腫瘍結合マクロファージにも取り込まれ、非常に少ない量であるが血管新生領域の内皮細胞にも取り込まれたことを報告している。Groman et al.の米国特許第４，７７０，１８３号は、撮像剤として使用するための１０〜５０００Aの超常磁性酸化金属粒子について記載している。粒子は、粒子の取り込み及び標的臓器中での滞留時間を最適にするため、デキストラン又は他の好適なポリマーで被覆されることができる。デキストラン−被覆酸化鉄粒子は、患者の血流、例えば肝臓に限局した血流に注射される。Groman et al.は、デキストラン−被覆粒子が、がん細胞に取り込まれることなく優先して健常細胞に吸収されることができることも報告している。
【００３０】
撮影
磁気共鳴撮影（ＭＲＩ）は、Ｘ線とは異なり、電離放射線を含まない撮影技術である。ＭＲＩは、例えば軸面、冠状面、矢状面又は直交面のような種々のスキャンニング面での身体の断面像の作製に用いることができる。ＭＲＩは、身体を撮影するために、磁場、高周波エネルギー及び磁場勾配を採用する。コントラスト又はシグナル強度は、Ｔｌ（縦軸）及びＴ２（横軸）緩和値並びに組織中のプロトン密度を主に反映する組織間で異なっている。造影剤の使用により患者のある領域のシグナル強度を変化させるために、いくつかのアプローチが利用できる。例えば、造影剤は、Ｔ１、Ｔ２又はプロトン密度を変化させるために設計することができる。
【００３１】
一般的に言えば、ＭＲＩは造影剤を使用することが必要である。造影剤を使用しないでＭＲＩを行えば、得られる像の中で目的組織を周辺組織と区別することが困難となる。過去には、ＭＲＩ用常磁性造影剤が主に注目されていた。常磁性造影剤は、不対電子含有材料を含む。不対電子は主要磁場内で小さな磁石として作用し、縦軸（Ｔ１）及び横軸（Ｔ２）の緩和速度を増加させる。常磁性造影剤は、典型的には、不対電子源を提供する金属イオン、例えば遷移金属イオンを含む。しかしながら、これらの金属イオンも一般に非常に毒性がある。例えば、フェライトは、経口投与後の吐き気の症状や、膨満及び血清鉄の一時的上昇を引き起こすことが多い。Ｇｄ−ＤＴＰＡ中で複合体形成しているガドリニウム鉄は、遊離型では非常に毒性がある。胃での酸性度の上昇（低ｐＨ）及び腸でのアルカリ度の上昇（高ｐＨ）を含む消化管の種々の環境は、複合体から遊離イオンを脱カップリングさせ、分離させる機会を増加させるかもしれない。毒性を軽減させるための努力において、金属イオンは典型的にはリガンドとキレートしている。
【００３２】
超音波は、例えば組織微小血管系のような血管系を含む身体の種々の領域を研究するための、もう１つの価値ある診断撮影技術である。超音波は他の診断技術に比べてある利点を提供する。例えば、核医学及びＸ線を含む診断技術は、一般に患者を電離放射線に曝露させる。このような放射線は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びタンパク質を含む細胞下材料に障害を引き起こし得る。超音波は、このような潜在的に障害を引き起こす放射線を含まない。加えて、超音波は、精巧で高価な装置を必要とするＣＴ及びＭＲＩを含む他の診断技術に比べて高価ではない。
【００３３】
超音波は患者を音波に曝す。一般に、音波は、体組織の吸収により消失するか、組織を通過するか、又は組織に反射する。一般に後方散乱又は反射能を意味する音波の組織による反射は、超音波像を顕出するための基礎を形成する。これに関連して、音波は、異なる体組織からそれぞれに反射する。このそれぞれの反射は、特定の観察組織の構成成分及び密度を含む種々の因子によるものである。超音波は、一般に、１〜１０メガヘルツ（ＭＨｚ）の振動数を有する音波を検出できる変換器を用いて、それぞれに反射した音波を検出することを含む。検出された音波は数値化された像に統合され、数値化された音波は研究組織の像に変換されることができる。
【００３４】
上で議論した診断技術のように、超音波は一般に造影剤の使用も含む。典型的な造影剤の例には、例えば、固体粒子懸濁液、乳濁化液滴及びガス充填泡が含まれる（例えばHilmann et al.の米国特許第４，４６６，４４２号、並びに公開された国際特許出願ＷＯ９２／１７２１２号及びＷＯ ９２／２１３８２号を参照されたい）。Widder et al.の公開出願ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ９３８号は、熱変性性生体適合性タンパク質、例えばアルブミン、ヘモグロビン及びコラーゲンから製造した安定化した微小泡タイプ超音波撮像剤について開示する。
【００３５】
液体−気体界面からの音の反射は、非常に効率的である。したがって、ガス充填泡を含むリポソーム又は小胞は造影剤として有用である。以下でより詳細に議論するように、リポソームの造影剤としての有効性は種々の因子、例えば泡のサイズ及び／又は弾性による。
【００３６】
先行技術に開示される多くのリポソームは、望ましくないことに安定性が低い。したがって、先行技術のリポソームはｉｎｖｉｖｏでより破裂しやすく、例えばその中に含まれる治療剤及び／又は診断剤を早期に放出する。リポソームの安定性を向上させるための試みに関し、種々の研究が行われている。このような研究は、例えばその膜又は壁が、アルブミンのようなタンパク質又は架橋を介して強化されているように見える材料を含むリポソームの製造を含んでいる。例えば、生分解性架橋剤と架橋したタンパク質を含むリポソームが開示されている、Klaveness et al.のＷＯ ９２／１７２１２号を参照されたい。医学磁気共鳴学会のカリフォルニアミーティング（１９９１年、Napa）においてMoseley et al.により発表がなされ、これが「微小泡：新規ＭＲ感受性造影剤」と題して要約にまとめられている。Moseley et al.により記載された微小泡は、ヒトアルブミンの殻で被包された空気を含む。あるいは、膜は、タンパク質ではないが生体適合性化合物と架橋している化合物を含むことができる。例えばKlaveness et al.のＷＯ ９２／１７４３６号、ＷＯ９３／１７７１８号及びＷＯ ９２／２１３８２号を参照されたい。
【００３７】
外膜へのタンパク質の使用を含むリポソームを安定化させるための先行技術には種々の欠点がある。アルブミンのようなタンパク質の膜への使用は、泡壁に硬直性を付与できる。これにより泡の弾性が引き出され、したがって、変形して毛細血管通過する能力が減少する。こうしてタンパク質を含む先行技術の造影剤には脈管閉塞の見込みが非常に高くなる。
【発明の開示】
【００３８】
発明の概要
本発明は、連結担体及び１以上の標的指向物質を含む標的化高分子を提供する。ある態様において、標的化高分子は３以上の標的指向物質、１０以上の標的指向物質、１００以上の標的指向物質及び１０００以上の標的指向物質を含み、また標的化高分子は０．１〜１０モル％の濃度で存在する。連結担体は、リポソームでよく、重合性脂質を含んでいてよく、又は重合小胞でよい。
【００３９】
標的指向物質は、連結担体と共有結合手段又は非共有結合手段により結合することができる。標的指向物質は、標的化高分子を細胞表面に指向させ、又は血管標的、腫瘍細胞標的を有することができる。
【００４０】
ある態様において、標的指向物質は、ＲＧＤペプチドのようなインテグリン特異的分子であり、又は／及び３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］−ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸のようなＲＧＤ疑似ペプチドである。
【００４１】
特に、本発明は、１以上の３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］−ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸部分を含む高分子を提供する。標的化高分子は、式：
【００４２】
【化１】
2004535407.tif 000002
【００４３】
式中、該化合物は連結担体と非共有結合手段又は共有結合手段により結合している、
の化合物を含んでいてよい。この化合物も本発明により提供される。
ある態様において、標的指向物質は、化合物ＡＧ１４３３又はＳＵ１４９８のようなチロシンキナーゼ特異的分子である。
【００４４】
他の態様において、標的指向物質は、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、プレイオトロピン、Ｇタンパク質共役レセプター、エンドシアリン、エンドグリン、ＶＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９を含むマトリックスメタロプロテアーゼ、並びに前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）から成る群より選択される標的を有する。
【００４５】
他の態様において、標的指向物質は酵素モジュレーターである。
更に他の態様において、標的化高分子は更に治療用物質を含む。治療用物質はＮ，Ｎ−ビス［［［［（１３’，１５’−ペンタコサジイナミド−３，６−ドキサオクチル）カルバモイル］メチル］（カルボキシメチル）アミノ）エチル］グリシンのようなキレーター脂質を介して連結担体と結合することができる。
【００４６】
ある態様において、治療用物質は、Ｙ−９０、Ｂｉ−２１３、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｐｒ−１４２、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｕ−１５２、Ｅｒ１７１、Ｒｅ−１８６又はＲｅ−１８８である。
【００４７】
好ましい態様において、治療用物質は９０Ｙであり、標的指向物質は３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］−ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼンスルホニル−アミノプロピオン酸である。
【００４８】
ある態様において、標的化高分子は更に、天然ポリマー、半合成ポリマー、及びデキストラン、修飾デキストラン及びポリ(エチレンイミン)のような合成ポリマーなどの安定化用物質を含む。ある態様において、安定化用物質は多価性を呈する。
【００４９】
他の態様において、本発明は、それを必要とする患者に十分量の治療剤を投与することを含む患者の治療方法を提供する。該治療剤は標的化高分子を含み、該標的化高分子はリポソーム又は重合小胞、１以上の標的指向物質及び治療用物質を含む。
【００５０】
更なる態様において、本発明は、所望の治療領域に接する体液中に標的化高分子を導入する工程を含む治療的処置方法を提供する。
更に他の態様において、標的化高分子は更に、金属イオン、又はＴｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８若しくはＴｌ２０１を含む放射性金属イオンのような検出用物質を含む。
【００５１】
本発明は更に、それを必要とする患者に撮像剤を投与すること、該撮像剤は標的化高分子を含み、該標的化高分子は１以上の標的指向物質及び検出用物質を含む；そして患者を撮影すること、を含む患者の撮影方法を提供する。撮影には磁気共鳴撮影又は核シンチグラフィーを含むことができる。患者の撮影は腫瘍の撮影を含むことができる。
【００５２】
本発明は、連結担体、連結担体と結合した治療用物質、及び少なくとも１つの標的指向物質を含む標的化治療剤を提供する。ある態様において、薬剤は、３以上の標的指向物質、１０以上の標的指向物質、１００以上の標的指向物質及び１０００以上の標的指向物質を有し、又は標的指向薬剤は０．１〜１０モル％の濃度で存在する。連結担体は、とりわけ、リポソーム、重合小胞、デンドリマー及びブロックコポリマーを含む高分子でよい。ある態様において、連結担体はホスファチジルコリン誘導体を含む。
【００５３】
標的指向物質は脂質構築物を共有結合手段又は非共有結合手段により結合させることができる。標的指向物質は、脂質構築物を細胞表面に指向させることができ、又は血管標的、腫瘍細胞標的を有することができる。
【００５４】
ある態様において、標的指向物質は、ＲＧＤペプチド又は３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］−ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸を含むＲＧＤ疑似ペプチドのようなインテグリン特異的分子である。
【００５５】
特に、本発明は、１以上の３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］−ベンゾイルアミノ｝２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸部分を含む標的化治療剤を提供する。標的化治療剤は、式：
【００５６】
【化２】
2004535407.tif 000003
【００５７】
式中、該化合物は脂質構築物と非共有結合手段又は共有結合手段により結合している、
の化合物を含むことができる。この化合物も本発明により提供される。
ある態様において、標的指向物質は、化合物ＡＧ１４３３又はＳＵ１４９８のようなチロシンキナーゼ特異的分子である。
【００５８】
他の態様において、標的指向物質は、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、プレイオトロピン、Ｇ−タンパク質共役レセプター、エンドシアリン、エンドグリン、ＶＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＭＭＰ２及びＭＭＰ９を含むマトリックスメタロプロテアーゼ、並びに前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）から成る群より選択される標的を有する。
【００５９】
他の態様において、標的指向物質は酵素モジュレーターである。
更なる態様において、標的化治療剤は更に、天然ポリマー、半合成ポリマー、及びデキストラン、修飾デキストラン及びポリ(エチレンイミン)のような合成ポリマーなどの安定化用物質を含む。ある態様において、安定化用物質は多価性を呈する。
【００６０】
標的化治療剤は、約１％〜約２０％の濃度で存在する治療用物質を含むことができる。治療用物質は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビン、又はイダルビシン、又はパクリタキセル若しくはドセタキセルのようなタキサン化合物、又はカンプトテシン若しくはトポテカンのような他の薬剤でよい。
【００６１】
ある態様において、本発明は、ドキソルビシン及び３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシベンゾイルアミノ］−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸を含む標的化治療剤を提供する。
【００６２】
更に他の態様において、本発明は、標的化脂質構築物を提供すること、該標的化脂質構築物は１以上の標的指向物質を含む、そして脂質構築物内に治療用物質を結合させることを含む標的化治療剤の製造方法を提供する。脂質構築物は、リポソーム、ミセル、小胞及び重合リポソームから成る群より選択される。標的指向物質は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビン、イダルビシン、パクリタキセル若しくはドセタキセルのようなタキサン化合物、又はカンプトテシン若しくはトポテカンのような他の治療用物質でよい。
【００６３】
更なる態様において、本発明は、連結担体を含む有効量の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含み、該連結担体は少なくとも１つの標的指向物質及び結合した治療用物質を含む、それを必要とする患者の治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
発明の詳細な説明
本発明は、生体標的に対し特異的かつ高親和性で結合する新規標的指向分子、及びその製造方法に関する。本発明は、安定化された治療剤及び撮像剤に関し、その例は図１Ａ〜図１Ｉに概略的に示すが、１つの連結担体５０、１つの安定化剤５２、１つの標的指向物質５４及び／又は１つの治療用若しくは処置用物質５６で構成される。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、標的指向物質及び／又は治療用物質は、脂質構築物又は安定化用物質と結合することができる。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、１つの治療剤又は標的指向薬剤を含む例を示すが、本発明の薬剤は１つの治療用物質、１つの標的指向物質、またはその両方を含むことができる。更に、治療用物質は、脂質構築物内に被包されてもよく、又は脂質構築物若しくは安定化剤の表面に結合していてもよい。「１つの」物質という用語は、１つ以上の物質を意味することに注意されたい；例えば、１つの治療用物質とは１つ以上の治療用物質又は少なくとも１つの治療用物質を意味する。このようにして、「１つの」、「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書中で互換性をもって用いることができる。「包含する」「含む」、「有する」という用語も互換性をもって用いることにができることに注意されたい。
【００６５】
これら多価薬剤は、標的に対し高親和性を発揮し、モノマー性リガンドと比較して、細胞接着をブロックする能力が２００倍まで増加することが立証され、マウスメラノーマモデルにおいてｉｎｖｉｖｏで腫瘍に蓄積する。本発明の標的化剤は１以上の標的指向物質を含む。ある態様において、標的化剤は３以上の標的指向物質を含む。他の態様において、標的化剤は１０以上の標的指向物質を含む。他の態様において、標的化剤は１００以上の標的指向物質を含む。他の態様において、標的化剤は１０００以上の標的指向物質を含む。本明細書中に、０．１〜３０モル％の標的指向物質を包含する薬剤を含むこのような多価標的指向薬剤の製造を記載する実施例を提供する。
【００６６】
より詳細には、本発明は、脂質構築物、１以上の標的指向物質、及び治療用物質又は撮像用物質を含む、治療剤及び撮像剤に関する。
【００６７】
連結担体
「連結担体」という用語は、Ａ）治療用物質と標的指向物質を連結させるのに役立ち、そしてＢ）治療用物質及び標的指向物質を単に非常に近接した状態にしておくよりも更なる有益な特性を血管標的化治療剤に与える、あらゆる物質を意味する。これら更なる利点の例としては、限定されるものではないが：１）多価性、これは以下のいずれかとして定義される、ｉ）標的化部位に送達される治療用物質の有効な「ペイロード」を増加させる、多数の治療用物質が血管−標的化治療剤に付着する能力（即ち、数ユニットの同一治療用物質若しくは１ユニット以上の異なる治療用物質）；ｉｉ）多数の標的指向物質が血管-標的化治療剤に付着する能力（即ち、１ユニット以上の異なる治療用物質若しくは好ましくは数ユニットの同一標的指向物質）；又はｉｉｉ）この文の項目ｉ）及びｉｉ）の両方；及び２）向上した循環寿命、これは粒子サイズを調製して細網内皮系による比クリアランス速度を達成することを含むことができる、が挙げられる。治療用物質の有効なペイロードとは、標的への薬剤の１結合当たり標的部位に送達される治療用物質数をいう。ペイロードは、個々の治療用物質及び標的に依存するであろう。ペイロードは、薬剤の１結合当たりの送達がわずか約１分子である場合もある。金属イオンの場合、ペイロードは、１結合当たりの送達が約１〜１０３分子であることができる。ペイロードは１結合当たりの送達が１０４分子もあり得ることが意図される。ペイロードは、１結合当たり約１〜約１０４分子で変化することができる。
【００６８】
好ましい連結担体は、生体適合性ポリマー（デキストランなど）、又は脂質構築物、デンドリマー、ブロックコポリマーなどのような生体適合性成分の高分子集合体である。高分子集合体の製造に用いることができる成分は本明細書に記載されている。連結担体の例としては、限定されるものではないが、リポソーム、ミセル、ジ−及びトリ−ブロックコポリマー、重合リポソーム、他の脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、キャップ化ポリリジン、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、デキストラン、並びに被覆ポリマーが挙げられる。好ましい連結担体は重合リポソームである。重合リポソームは、米国特許第５，５１２，２９４号及び第６，１３２，７６４号に記載されている。他の好ましい連結担体はデンドリマーである。本明細書中に用いる「脂質構築物」は、脂質、リン脂質、又はその脂質を水性懸濁液に採用することが知られているさまざまな異なる構造配置を含むそれらの誘導体を含有する構造である。これらの構造は、限定されるものではないが、脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、エマルジョン、脂質リボン又はシートを含み、種々の薬物及び医薬的に許容可能であることが知られている成分と複合体を形成することができる。好ましい態様において、脂質構築物はリポソーム又は重合小胞である。
【００６９】
リポソーム
本明細書において、脂質とは、水中で組織化された構造を自発的に採用させる両親媒性特性を発揮する薬剤を意味する。その際、分子の疎水性部分は水相から隔離されている。本発明の意味における脂質は、脂肪又は脂肪材料と同様の特性を有するあるゆる物質である。原則として、このタイプの分子は、伸びた無極性領域を有し、そして多くの場合、水溶性で極性の親水性基、いわゆる頭部基も有する。リン脂質は主に細胞膜の構成成分である脂質である。典型的なリン脂質親水性基はホスファチジルコリン（図３９）及びホスファチジルエタノールアミン部分を含み、一方、典型的な疎水性基はジアセチレンを含む種々の飽和及び不飽和脂肪酸部分を含む。水中のリン脂質の混合物は、用いる条件により、リン脂質分子を種々の特徴的な相へ自発的に組織化させる。これらには２重層構造が含まれる。ここで、リン脂質の親水性基は２重層の外部で水と相互作用し、一方、疎水性基は２重層の内部で隣接分子上の同様の基と相互作用する。このような２重層構造は、細胞膜に非常に好適であり、細胞膜の主要な基礎を形成する。
【００７０】
２重層構造は、小胞又はリポソームと呼ばれる密閉型球状貝殻様構造に形成することもできる。本発明に用いるリポソームは、種々の従来のリポソーム製造技術を用いて製造することができる。当業者に容易に理解されるように、このような従来技術には超音波処理、キレート透析、均質化、押し出しと結びついた溶媒注入、凍結融解押し出し、マイクロエマルジョン化、及び他の技術が含まれる。これらの技術及び他の技術は、例えば米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許出願第ＧＢ２１９３０９５Ａ、米国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１、Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 858, pp. 161-168 (1986)；Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 812, pp. 55-65 (1985)；米国特許第４，５３３，２５４号；Mahew et al., Methods In Enzymology, Vol. 149, pp. 64-77 (1987)；Mahew et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 75, pp. 169-174 (1984)；及びCheng et al., Investigative Radiology, Vol. 22, pp. 47-55 (1987)；並びに１９８９年１０月２７日に出願された米国出願第４２８，３３９号で議論されている。上記特許、出版物及び特許出願の各開示は本明細書にその全体が援用される。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１又は１９８９年１０月２７日に出願された米国出願第４２８，３３９号に記載されているのと同様の無溶媒系は、リポソーム構築物の製造に用いることができる。以下の工程に従うことにより、その中にガス状前駆体又は固体若しくは液体コントラスト増強剤を被包させたリポソームを製造することができる。
【００７１】
本発明のリポソームの製造に用いることができる材料には、当業者にリポソームの構築に好適であることが知られているいずれかの材料又はそれらの組合せが含まれる。用いる脂質は天然由来でも合成由来でもよい。このような材料には、限定されるものではないが、コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、リゾ脂質、脂肪酸、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、糖脂質、サルファチド、アミド、エーテル及びエーテル結合脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、並びにそれらの組合せのような脂質が含まれる。当業者が認識するように、リポソームは、従来の工程を用いて、導入される糖脂質, 複合体炭水化物、タンパク質又は合成ポリマーの非存在下又は存在下で合成することができる。リポソームの表面は、当業者に容易に明らかな工程を用いて、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などで修飾することもできる。脂質は、金属に付着させるための表面官能基を含有することができ、これにより治療用物質として作用するラジオアイソトープ又は他の材料のキレート化を提供する。脂質又は脂質と脂質マトリックス内に導入される関連材料との組合せが、生理学的に適切な条件下で２重層を形成することを唯一の条件として、いかなる種の脂質も用いることができる。当業者が認識するように、リポソームの組成物を変化させて、得られるリポソームの生体内分布及びクリアランス特性をモジュレートすることができる。
【００７２】
一般的なアジュバントには、とりわけコレステロール及びα−トコフェロールが含まれる。脂質構築物は単独で用いてもよく、また当業者が特定の適用に所望される特徴を提供すると理解できる組み合わせで用いてもよい。加えて、脂質構築物、小胞及びリポソームの形成の技術的側面は当該技術分野に周知であり、当分野で通常実施されるいかなる方法も本発明に用いることができる。治療用物質又は処置用物質は、薬剤と共有結合手段又は非共有結合手段により結合することができる。本明細書において、結合手段は共有結合性又は非共有結合性の相互作用により付着する。
【００７３】
こうした構造の２重層膜は、典型的には水性容量を被包し、被包された容量と外液とのあいだに透過性バリアを形成する。水溶液中に分散された脂質は、内向きの炭化水素尾部及び水と相互作用するため外向きの極性頭部基と共に自然に２重層を形成する。
【００７４】
混合物を簡単に攪拌することにより、通常多重膜小胞（ＭＬＶ）を生成する。タマネギ様の形態で多くの２重層を有する構造は、直径１〜１０μｍ（１０００〜１０，０００ｎｍ）である。こうした構造を超音波処理又は当該技術分野に公知の方法で処理すると、平均直径約３０〜３００ｎｍの単層小胞（ＵＶ）が形成される。しかしながら、例えばｉｎｖｉｖｏ最大循環時間の観点から、５０〜２００ｎｍの範囲が最適であると考えられる。実際の平衡直径は、用いるリン脂質の性質及びコレステロールのような他の脂質の導入範囲により大部分は決定される。リポソームを形成するための標準方法は、当該技術分野に公知である。例えば、リポソームの商業的生産方法は、Ronald C. Gambleの米国特許第４，７５３，７８８号及びKevin R. Brackenの米国特許第４，９３５，１７１号に記載されている。
【００７５】
ＭＬＶであってもＵＶであっても、リポソームは、動物及びヒトにおいて薬物送達するためのビヒクルとして価値のあることが証明されている。親水性分子及びポリペプチドを含む活性薬物を、リポソームの水性コア中にトラップさせることができ、一方、疎水性物質はリポソーム膜中に溶解させることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡのような他の分子は、遺伝子療法又は遺伝子送達に適用するために、リポソームの外側に付着させることができる。リポソーム構造は容易に注射することができ、徐放性及び特定細胞タイプ又は身体の部分への薬物送達の基礎を形成することができる。ＭＬＶは第１に比較的大きいため、通常急速に細網内皮系（肝臓及び脾臓）により取り込まれる。本発明は典型的には、循環器系において何時間ものあいだ残存し、標的細胞による内部移行後、速やかに分解する小胞を利用する。これらの要件のために、製剤は好ましくは、直径２００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下のＵＶを利用する。
【００７６】
重合リポソーム
重合リポソームは、本明細書中「重合小胞」及び「ナノ粒子」ともいうが、粒子サイズ及び表面化学に非常に多様性を示す、脂質分子の自己集合した凝集体である。重合リポソームは本明細書にその全体が援用される米国特許第５，５１２，２９４号及び第６，１３２，７６４号に記載されている。重合性脂質の疎水性尾部基は、紫外線又は他のラジカルの、陰イオン性又は陽イオン性の開始種に曝されたときに不可逆的に架橋又は重合するジアセチレン基のような重合性基で誘導体化され、一方、リポソームの表面官能基の分布は維持されている。得られた重合リポソーム粒子は、細胞膜又は他のリポソームとの融合に対して安定化し、そして酵素分解に対して安定化する。重合リポソームのサイズは、当業者に公知の押し出し又は他の方法により調製できる。重合リポソームは、重合性脂質で構成されていてよいが、飽和脂質及び非アルキレン不飽和脂質も含む。重合リポソームは、親水性の曝露された表面上に異なる官能基を提供する脂質混合物であることができる。例えばある親水性頭部基は、官能表面基、例えばビオチン、アミン、シアノ、カルボン酸、イソチオシアネート、チオール、ジスルフィド、α−ハロカルボニル化合物、α，β−不飽和カルボニル化合物及びアルキルヒドラジンを有することができる。これらの基は、所望の細胞表面分子への特定の標的指向及び付着のため、並びに薬物、治療効果を有する遺伝子をコードする核酸又はラジオアイソトープのような治療用物質の付着のため、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸又はそれらの組合せのような標的指向物質の付着に用いることができる。他の頭部基は、重合リポソーム粒子が付着する特定の生体分子又はその近傍の生物学的部位と相互作用するために、例えば抗体、ホルモン及び薬物のような、付着され又は被包された治療用物質を有することができる。他の親水性頭部基は、ラジオアイソトープ又は治療用物質として働く他の材料をキレートする金属への付着のために、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、エチレンジニトリルテトラ酢酸、テトラアゾシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、ポルフォリンキレート及びシクロヘキサン−１，２，−ジアミノ−Ｎ，Ｎ’−ジアセテート、並びにそれら化合物の誘導体の官能表面基を有することができる。キレート頭部基を有する脂質の例は、本明細書にその全体が援用される米国特許第５，５１２，２９４号に提供されている。
【００７７】
重合リポソーム粒子は、非特異的接着及び網膜内皮系の取り込みを制御する基を含有することもできる。例えば、リポソームのＰＥＧ化は循環寿命を延長することが示されている；国際特許出願ＷＯ９０／０４３８４号公報参照。
【００７８】
重合リポソームの脂質成分は、標準の公知技術を用いてそれぞれ精製及び性質決定することができ、次に制御された様式で組み合わせ、最終的な粒子を生成することができる。重合リポソームは、天然細胞膜を模するように又はエチレングリコール誘導体のように官能性が存在するように構築することができ、潜在的免疫原性を減ずることができる。更に、重合リポソームは透過型電子顕微鏡及び原子力顕微鏡のような公知の物理的技術により特徴付けることができる明確に定義された２重層構造を有している。
【００７９】
デンドリマー
他の好ましい連結担体はデンドリマーである。デンドリマーは、中心コアから明確に定義された分岐を有するポリマーである（例えば「星型ポリマー」）。従来のポリマーとは対照に、デンドリマーは高度に分岐した単分散性高分子である傾向があり、即ち、従来の線状又は分岐状のポリマーが有する範囲にかわって、分子量が非常に明確に定義される傾向にある。デンドリマーは、米国特許第４，５０７，４６６号、第４，５５８，１２０号、第４，５６８，７３７号、第４，５８７，３２９号、第４，６３１，３３７号、第４，６９４，０６４号、第４，７３７，５５０号及び第４，８５７，５９９号、並びに多くの他の特許及び特許公報に記載されている。デンドリマーの構造、合成及び特徴は以下の文献に論評されている：Kim and Zimmerman、「生体有機化学におけるデンドリマーの適用」、Current Opinion In Chemical Biology (1998) 2 (6): 733-42；Tam and Spetzler、「成形ブロックとして非保護ペプチドを用いたペプチドデンドリマー及び分岐鎖人工タンパク質の製造のための化学選択的アプローチ」、Biomedical Peptides、Proteins & Nucleic Acids (1995) 1 (3): 123-32；Frechet、「官能性ポリマー及びデンドリマー：反応性、分子構築及び界面エネルギー」、Science (1994) 263 (5154): 1710-5；Liu and Frechet、「薬物送達のためのデンドリマーの設計」、Pharmaceutical Science and Technology Today (1999) 2 (10): 393401；Verprek and Jezek 「ペプチド及び糖ペプチドデンドリマー．Part I」、Journal of Peptide Science (1999) 5(1): 5-23；Veprek and Jezek、「ペプチド及び糖ペプチドデンドリマー．Part II」、Journal of Peptide Science (1999) 5 (5) 203-20; Tomalia et al.、「星型デンドリマー：サイズ、形状、表面化学、トポロジー、及び原子から肉眼要素までの柔軟性の分子レベル制御」Angewandte Chemie-International Edition in English (1990) 29 (2): 138-175；Bosman et al.、「デンドリマーについて：構造、物理的性質及び応用」、Chemical Reviews (1999) 99 (7):1665-1688；Fischer and Vogtle、「デンドリマー：設計から応用まで−経過報告」、Angewandte Chemie-International Edition (1999) 38 (7): 885905；Roovers and Comanita、「デンドリマー及びデンドリマー−ポリマーハイブリッド」、Advances In Polymer Science (1999) 142: 179-228；Smith and Diederich、「機能的デンドリマー：ユニークな生物学的擬態」、Chemistry-A European Journal (1998) 4(8): 1353-1361；及びMatthews et al.、「デンドリマー−−好奇心から新技術への分岐」Progress In Polymer Science (1998) 23(1): 1-56。デンドリマーの合成は、典型的には反復合成サイクルを用い、デンドリマーのサイズ、形状、表面化学、柔軟性及び内部トポロジーを制御可能にする。連結用物質として用いるのに好適なデンドリマーの例は、Wu et al.、「放射性免疫療法及び撮像に用いるための金属−キレート−デンドリマー−抗体構築物」Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (1994) 4 (3): 449-454に記載されている。
【００８０】
デンドリマーは、標的指向物質と治療用物質を付着させるために種々の化学接合技術を採用することにより、連結担体として容易に用いることができる。例えばジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合をコアに有するデンドリマーを開示する米国特許第６，０２０，４５７号では、デンドリマーは特許に記載された方法により構築することができる。デンドリマーの最終的な外部層は、アミン又はカルボキシル基のような反応性基でキャップすることができる。次にこれら反応性基は、標的指向物質又は治療用物質（又は両者の混合物の場合もある）のいずれかで誘導体化することができる。次にコアのジスルフィド結合を、チオール及びチオール官能基を介して付着した補足的物質に還元することができる。即ち、治療用物質がデンドリマーの連結担体の外部層に付着していた場合、還元及びチオール官能基の形成により、標的指向物質が遊離ＳＨ基を介して付着できる。そのような標的指向物質の１例は、Ｎ末端−ヨードアセチル化ペプチド（ペプチドはホルモン又はより大きなタンパク質の生物活性フラグメントでよい）であり、標準固相ペプチド技術により容易に合成される。ヨードアセチル基は遊離チオール官能基と反応し、治療用物質−誘導体化連結担体と標的指向物質（ペプチド）とが接合する。
【００８１】
ブロックコポリマー
本明細書で用いるブロックコポリマーは、構造上又は立体配置上異なる特徴を有する２以上の鎖の組合せである。ブロックコポリマーは、種々の化学結合技術を採用して標的指向物質及び治療用物質を付着することにより、連結担体として用いることができる。ブロックコポリマーには、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー又はマルチブロックコポリマーが含まれる。
【００８２】
両親媒性ブロックコポリマーのミセルの使用は、疎水性薬物を水性環境に溶解させることができる潜在的に有効な薬物担体として近年非常に多くの関心を集めている。例えば、界面活性剤様の特性を有する両親媒性ブロックコポリマーのミセルについて多くの研究が報告されており、特に注目すべきは、疎水性薬物を、コポリマーの特定の性質及び特性により安定化されたブロックコポリマーのミセルに導入する試みである。例えば、ＥＰ０３９７ ３０７ Ａ２は、ＡＢタイプ両親媒性ジブロックコポリマーのポリマー性ミセルを開示し、これはポリ（エチレンオキシド）を親水性成分として、及びポリ（アミノ酸）を疎水性成分として含有する。ここで、治療的に活性な薬剤はポリマーの疎水性成分と化学的に結合している。ＥＰ０５８３ ９５５ Ａ２は、疎水性薬物を、ＥＰ０３９７ ３０７ Ａ２に記載された両親媒性ジブロックコポリマーのミセルに物理的に導入するための方法を開示する。ＥＰ０５５２ ８０２ Ａ２は、ポリ（エチレンオキシド）を親水性成分として、及びポリ（乳酸）を水相中で架橋できる疎水性成分として有する化学的に固定されたミセルの形成を開示する。米国特許第４，７４５，１６０号は、ポリエチレングリコールを親水性成分として、及びポリ（Ｄ−、Ｌ−及びＤＬ−乳酸）を疎水性成分として有する、医薬的に又は獣医学的に許容可能な両親媒性で非架橋性の線状、分岐又はグラフトブロックコポリマーを開示する。米国特許第５，５４３，１５８号は、実質的にポリ（アルキレングリコール）及び生分解性ポリマー、ポリ（乳酸）から成るブロックコポリマーで形成されるナノ粒子又はマイクロ粒子を開示する。ナノ粒子又はマイクロ粒子において、コポリマーの生分解性部分はナノ粒子又はマイクロ粒子のコア中にあり、ポリ（アルキレングリコール）部分は、細網内皮系によるナノ粒子又はマイクロ粒子の取り込みを減少させるのに有効な量でナノ粒子又はマイクロ粒子の表面上にある。米国特許第６，００７，８４５号は、多官能性化合物を１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーと共有結合的に連結させ、生物学的に活性な材料を含有させることにより製造されるマルチブロックコポリマーベースの組成物を記載する。米国特許第５，５４３，１５８号は、細網内皮系のマクロファージにより血流から急速に除去されず、可変性放出速度を達成するか又は所望の特定細胞若しくは臓器を標的指向するのに必要なように修飾されることができるブロックコポリマーベースの粒子を提供する。粒子は、表面に生物活性材料及びポリ（アルキレングリコール）部分を含有する生分解性固相コアを有する。ポリ（アルキレングリコール）の末端ヒドロキシル基を用いて、特定細胞若しくは臓器、又は粒子の電荷、親油性若しくは親水性に影響を与える分子、に標的化された表面抗体上に共有結合的に付着させることができる。
【００８３】
本発明に連結担体ブロックコポリマーとして用いるのに好適な生体適合性ポリマーの例は、ポリ（エチレン−コビニルアセテート）、並びにポリ（ジメチルシロキサンスルホキシド）に架橋したシリコーンゴム及びその誘導体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリカプロラクトン及びそれらの結合したコポリマー、例えばあらゆるラクチドとグリコリドの比のポリ（ラクチド−コグリコリド）、及びＬ−ラクチド又はＤ，Ｌ−ラクチドである。更なる親水性ポリマーには、ポリピロリドン、ヒトアルブミン、フィブリン、ゼラチン及びそれらのフラグメントのような短鎖の非毒性及び非免疫原性タンパク質及びペプチドを含むポリ（アミノ酸）、デキストラン、並びにポリ（ビニルアルコール）が含まれる。他の材料には、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのコポリマーであるプルロニック（商標）Ｆ６８（BASF Corporation）が含まれ、これは米国食品薬品局（ＦＤＡ）により認可されている。他の疎水性ポリマーは、ポリ無水物、ポリジオキサノン、ポリホスファゼン、α−ヒドロキシカルボン酸のポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリリン酸塩であることができ、又はこれらのポリマーのモノマーから製造されたコポリマーを用いて、本明細書に記載されるマルチブロックコポリマーを形成することができる。粒子を形成しているブロックコポリマーを製造するために用いることのできる種々の材料は、生体内で達成され得る放出速度の多様性及び放出プロファイルを有意に増加させる。
【００８４】
好ましい態様において、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）のポリエステルは、多官能性化合物に結合した疎水性侵食性ポリマーとして用いられる。これらのポリマーは、ＦＤＡにより非経口投与について認可されている。
【００８５】
本発明のブロックコポリマーは、好ましくは、標的指向物質、治療用物質又は他のポリマーを含む、他の物質と物理的に架橋するための相互作用領域を有するポリマー性骨格で構成される。好ましくは、ポリマー骨格は多数の相互作用領域を含む。官能基は、以下に詳細に記載されるように、他の生物活性分子が粒子表面へ共有結合的に結合するための、例えばアミン、ヒドロキシル、カルボニル、チオール、及びカルボン酸のような結合性基を包含する。生物活性分子の結合性基への結合に続いて形成される連結には、アミド、エステル及びチオエーテルが含まれる。結合性官能基を有するコポリマーの例としては、（ポリ）リジン、アセチル化ポリ（リジン）；ポリ（グルタミン酸及びポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）コポリマーが挙げられる。
【００８６】
治療用物質
「治療用物質」という用語は、治療対象に対して治療効果を有する分子、分子集合体又は高分子を意味する。ここで、治療対象は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「治療効果」という用語は、疾患状態を回復させ、疾患状態を停止し、疾患状態の進行を遅らせ、疾患状態を改善し、疾患状態の症状を緩和する効果を意味し、又は治療対象に対し他の有益な結果を有する効果を意味する。治療用物質には、限定されるものではないが、抗生物質を含む薬物、ドキソルビシン、パクリタキセルのような薬物、並びにカンプトテシン及びトポテカンを含む他の化学療法剤；低分子治療薬、リシンのような毒素；ラジオアイソトープ；細胞毒性を発揮するタンパク質をコードする遺伝子、並びにプロドラッグ（不活性型で体内に導入され、ｉｎｓｉｔｕで活性化する薬物）が含まれる。
【００８７】
治療用物質として有用なラジオアイソトープは、Kairemo et al., Acta Oncol. 35: 343-55 (1996)に記載されており、Ｙ−９０、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｂｉ−２１３、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｐｒ−１４２、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｕ−１５２、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６及びＲｅ−１８８が含まれる。
【００８８】
更なる治療剤には、限定されるものではないが、増殖因子を標的とする細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤、細胞周期モジュレーター、Ｂｃｌ−２、ＴＮＦ−αレセプター、サイクリン依存性キナーゼ、Ｒａｓ経路、ＥＧＦＲ経路及び他の関連細胞内経路、ｐ−糖タンパク質を含む多剤耐性に関与するタンパク質、チューブリン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、及びキナーゼ、及びＤＮＡメチル化に関与する酵素が含まれる。これらの治療剤は、例えばアルキル化剤、シスプラチナム及び誘導体、ピリミジン及びプリンのアナログ、トポイソメラーゼインヒビター、微小管−標的指向薬剤、エストロゲン誘導体、アンドロゲン誘導体、インターフェロン、挿入剤、並びにＭＤＲインヒビターであってよい。特定の薬剤には、チューブリン結合分子であるビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビンが含まれる。
【００８９】
他の好ましい態様において、治療用物質は、ＡＧ１４３３又はＳＵ１４９８のような細胞内キナーゼインヒビターであり（それぞれ、図３５Ａ及び３５Ｂ）、標的はＦｌｋ−１／ＫＤＲである。ＡＧ１４３３又はＳＵ１４９８のような治療用物質は標的指向物質として分類されることもでき；同様に、ある標的指向物質は治療用物質としても作用できるということに注目されたい。
【００９０】
本発明の好ましい態様において、治療用物質はリポソーム若しくは重合小胞内に被包され、又は連結担体若しくは高分子集合体と共有結合手段若しくは非共有結合手段により結合している。好ましくは、これらの薬剤は、標的化治療剤の用量が疾患の治療に有効であるような量で被包されている。
【００９１】
他の好ましい態様において、治療用物質はリポソーム又は重合小胞の表面と結合している。
【００９２】
安定化用物質
本発明の薬剤は好ましくは安定化用物質を含有する。本明細書で用いるように、「安定化」とは、治療剤又は撮像剤に更なる利点、例えば物理的安定性、即ちより長い半減期、コロイド安定性及び／又は多価能；即ち標的指向薬剤を付着させるための多くの部位による増加したペイロード能のような利点を付与する能力を意味する。本明細書で用いるように、「安定化用物質」とは高分子又はポリマーを意味し、場合により、安定化用物質の小胞表面への付着及び／又は続いて起こる治療用物質若しくは標的指向薬剤の付着のための化学官能基を含んでいてよい。ポリマーは水溶液と生体適合性であるほうがよい。本発明のリポソームを安定化させるのに有用なポリマーは、天然由来、半合成由来（修飾された天然由来）又は合成由来でよい。本発明に用いることができる多くの安定化用物質は入手可能であり、ザンサンガム、アカシア、アガー、アガロース、アルギン酸、アルギン酸塩、アルギン酸ナトリウム、カラゲナン、ゼラチン、グアルガム、トラガカント、ローカストビーン、バソリン、カラヤ、アラビアゴム、ペクチン、カゼイン、ベントナイト、未精製ベントナイト、精製ベントナイト、ベントナイトマグマ及びコロイド状ベントナイトを含む。
【００９３】
他の天然ポリマーには、天然多糖、例えばアラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えばイヌリンのような）、レバン、フコイダン、カラゲナン、ガラトカロロース、ペクチン酸、アミロースを含むペクチン、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストロース、デキストリン、グルコース、ポリグルコース、ポリデキストロース、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンガム、デンプンのようなもの、及び以下の１種以上のアルドース、ケトース、酸又はアミンを含むような種々の他の天然のホモポリマー又はヘテロポリマー：エリスロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、デキストロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスバラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン及びノイラミン酸並びにそれらの天然誘導体が含まれる。他の好適なポリマーには、アルブミン、ポリアルギネートのようなタンパク質、並びにポリラクチド−グリコリドコポリマー、セルロース、セルロース（微晶性）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びカルシウムカルボキシメチルセルロースが含まれる。
【００９４】
典型的な半合成ポリマーには、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース及びメトキシセルロースが含まれる。本発明に用いるのに好適な他の半合成ポリマーには、カルボキシデキストラン、アミノデキストラン、デキストランアルデヒド、キトサン及びカルボキシメチルキトサンが含まれる。
【００９５】
典型的な合成ポリマーには、ポリ（エチレンイミン）及び誘導体、ポリホスファゼン、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイトポリマー、ポリエチレン（例えばポリエチレングリコール、プルロニクス（登録商標）としてBASF（Parsippany, N. J.）から市販されている化合物のクラス、ポリオキシエチレン及びポリエチレンテレフタレートのようなもの）、ポリプロピレン（例えばポリプロピレングリコールのようなもの）、ポリウレタン（例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルクロリド及びポリビニルピロリドンのようなもの）、ナイロンを含むポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ素化炭化水素ポリマー、フッ化炭素ポリマー（例えばポリテトラフルオロエチレンのような）、アクリレート、メタクリレート及びポリメチルメタクリレート、並びにそれらの誘導体、ポリソルベート、カルボマー９３４Ｐ、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、モノステアリン酸アルミニウム、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールが含まれる。小胞組成物を安定化させるためにポリマーを採用する小胞を製造するための方法は、本明細書の開示を、本明細書にその全体が援用されるUngerの米国特許第５，２０５，２９０号に記載され、参照されるような当該技術分野に公知の情報と組み合わせることにより、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００９６】
好ましい態様において、安定化用物質はデキストランである。他の好ましい態様において、安定化用物質は、アミノデキストランのような修飾デキストランである。更に好ましい態様において、安定化用物質はポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）である。理論にとらわれることなく、デキストランはリポソームの循環時間をＰＥＧと同様にして増加させることができると思われる。更に、各ポリマー鎖（即ちアミノデキストラン又はスクシニル化アミノデキストラン）は、標的指向薬剤の接着のための多数の部位を含有し、これにより、脂質構築物全体のペイロードを増加させる能力を付与する。ペイロードを増加させるこの能力により、本発明の安定化剤をＰＥＧと区別させる。ＰＥＧには付着部位はただ１つであり、したがって、ＰＥＧの標的指向薬剤負荷能（鎖当たり１つの付着部位）は、複数の付着部位を有するポリマー系と比較して制限される。
【００９７】
他の好ましい態様において、以下のポリマー及びそれらの誘導体が用いられる。ポリ（ガラクツロン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸−Ｌ−チロシン）、ポリ［Ｒ］−３−ヒドロキシ酪酸］、ポリ（イノシン酸カリウム塩）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エタノールスルホン酸ナトリウム塩）、ポリ（メチルヒドロシロキサン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルポリピロリドン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）及びヒアルロン酸。他の好ましい態様において、少なくとも１つの反応性部位を有するモノマーを含むコポリマー、及び好ましくはコポリマーの小胞又は他の分子への付着のための多反応性部位。
【００９８】
ある態様において、ポリマーは、標的指向薬剤、治療用物質、タンパク質、又はＤＴＰＡ及びその誘導体のようなキレーターを付着させるためのヘテロ又はホモ２官能性連結剤として作用することができる。
【００９９】
１つの態様において、安定化用物質は小胞を共有結合手段により結合させる。他の態様において、安定化用物質は小胞を非共有結合手段により結合させる。標的指向物質とリポソームとの結合のための共有結合手段は当該技術分野に公知であり、実施例のセクションに記載されている。
【０１００】
標的指向物質とリポソームとの結合のための非共有結合手段には、限定されるものではないが、水分子又は他の溶媒に介在されるものを含むイオン性の水素結合相互作用、疎水性相互作用又はこれらの組合せを介した付着が含まれる。
【０１０１】
好ましい態様において、安定化剤はリポソーム上にコーティングを形成する。
【０１０２】
標的指向物質
「標的指向物質」という用語は、生体標的に特異的に結合する分子、高分子又は分子集合体を意味する。標的指向物質の例としては、限定されるものではないが、抗体（抗体フラグメント、並びに特異的結合を保持する、抗体由来のＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖのような他の抗体由来分子を含む）；レセプターに特異的に結合するホルモン又は他の分子のようなレセプター結合リガンド；細胞機能に影響し、免疫応答、炎症反応又は造血反応に関わる細胞間の相互作用をモジュレートするポリペプチドであるサイトカイン；酵素インヒビターのような酵素に結合する分子；核酸リガンド又はアプタマー、並びにビオチン又はイミノビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンのような特異的に結合する相互作用の１種以上のメンバーが挙げられる。好ましい標的指向物質は、血管細胞上に見られるレセプター又は抗原に特異的に結合する分子である。より好ましくは、血管由来新生血管系の細胞に見られるレセプター、抗原若しくはマーカーに特異的に結合するか、又は腫瘍血管系に関わるレセプター、抗原若しくはマーカーに結合する分子である。腫瘍血管系に関わるレセプター、抗原又はマーカーは、腫瘍内に侵入若しくは局在し、又は腫瘍の内部若しくは外部周辺に限局する脈管の細胞で発現することができる。１つの態様において、本発明は、以前から存在するか又は誘発された腫瘍血管床からの漏出を利用する；この態様において腫瘍細胞抗原は、血液循環から腫瘍間質容積へと通過する薬剤に直接標的とされることもできる。
【０１０３】
他の標的指向物質は、内皮レセプター、組織、又は体液若しくはレセプターを介して接近可能な他の標的、又は組織若しくは体液に隣接するか体液中にある細胞中で上方制御される他の標的に標的指向する。例えば、眼に薬物を送達するように設計された担体に付着した標的指向物質は、硝子体、脈絡膜又は強膜に注射することができ;あるいは関節に薬物を送達するように設計された担体に付着した標的指向薬剤は、滑液に注射することができる。
【０１０４】
標的指向物質は、標的への特異的結合に加えて、治療効果を含む他の効果を有することもできる。例えば、標的指向物質は、酵素標的の機能をモジュレートすることができる。「機能をモジュレートする」とは、標的指向物質を加えない場合と比較して変化することを意味する。多くの場合、機能のモジュレーションの好ましい形態は阻害である。他の機能又は効果を有することができる標的指向薬剤の例は、本明細書中に記載される。このカテゴリーに含まれる他の標的指向物質には、血管標的指向薬剤として用いることができ、抗血管新生剤としても作用するコンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）（Oxigene/BMS）、及び殺菌剤及び抗炎症剤として用いられる環状リポペプチドであるシデシン（Cubist Pharm/Emisphere）が含まれる。
【０１０５】
本発明の重合リポソーム又は連結担体に付着する標的指向物質には、限定されるものではないが、炭水化物のような低分子リガンド、及び米国特許第５，７９２，７８３号（低分子リガンドは、本明細書中、分子量約５０００ダルトン以下の有機分子として定義される）に開示されているような化合物；抗体及び成長因子のようなタンパク質；ＲＧＤ含有ペプチド（例えば米国特許第５，８６６，５４０号に開示されているようなもの）、ボンベシン又はガストリン放出ペプチド、米国特許第５，４０３，４８４号に記載されるようなファージディシプレイ技術により選択されるペプチド、及び腫瘍で発現されるレセプターに相補的であるように新規に設計されたペプチドのようなペプチド；抗原決定基；又は他のレセプター標的指向基が含まれる。
【０１０６】
これら標的指向物質を用いて、脂質構築物の生体内分布、非特異的接着及び血液プール半減期を制御することができる。例えば、β−Ｄ−ラクトースは、循環血液プールと接触する肝細胞中に見いだされるアシアログリコプロテイン（ＡＳＧ）に標的指向する。糖脂質は、標的指向物質として使用するために、市販の脂質（ＤＡＧＰＥ）又はＰＥＧ−ＰＤＡアミンを糖脂質に変換することにより、誘導体化することができる。
【０１０７】
ある態様において、標的指向物質は、リポソームを細胞表面に標的指向させる。治療剤又は撮像剤の送達は、リポソームのエンドサイトーシスを介して生ずることができる。このような送達は当該技術分野に公知である。例えば、Mastrobattista et al.、抗腫瘍薬物を標的化送達するための免疫リポソーム、Adv. Drug Del. Rev. (1999) 40: 103-27を参照されたい。
【０１０８】
１つの態様において、付着は共有結合手段により行われる。他の態様において、付着は非共有結合手段により行われる。例えば、抗体標的指向物質は、種々の市販のビオチン化抗体を被覆重合リポソーム上で使用可能にするビオチン−アビジンビオチン化抗体サンドイッチにより付着させることができる。
【０１０９】
好ましい態様において、標的指向物質は、ケモカインレセプター ＣＣＲ４及びＣＣＲ５、ＶＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、表面結合ＭＭＰを含むマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＰＤＧＦＲ、Ｐ−及びＥ−セレクチン、プレイオトロピン、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１、Ｔｅｋ、Ｔｉｅ、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリン、Ａｘｌ、αｖβ３、αｖβ５、α５β１、α４β１、α１β１、α２β２、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する低分子リガンド疑似ペプチドである。更なる標的はE. Ruoslahti in Nature Reviews: Cancer, 2, 83-90 (2002)に記載されている。更なる標的には、ＣＤ１〜ＣＤ１７８を含む細胞表面抗原のＣＤファミリー、及び患者に投与することにより標的指向薬剤に接近できる、疾患組織に曝されているが正常組織には曝されていない細胞外マトリックス成分を含むあらゆる標的が含まれる。
【０１１０】
本発明の標的化薬剤に用いることができる標的指向物質の例としては、限定されるものではないが、コニバプタン（Yamanouchi Pharm.）、Ｖ１及びＶ２バソプレシンレセプターアンタゴニスト；ＧＢＣ−５９０（Abbott/GlycoGenesys）、転移の予防に有用なレクチンインヒビター；Veletri（Actelion）、エンドセリンアンタゴニスト（tesosentan）；ＶＬＡ−４アンタゴニスト（Aventis）、関節リウマチ、多発性硬化症、心血管疾患及び他の状態を治療する可能性がある薬剤；カンパス（Berlex/Millenium）、ＣＤ５２＋悪性リンパ球に特異的なモノクローナル抗体；Tracleer（Actelion）、肺動脈低血圧の治療に対して認可されたエンドセリンアンタゴニスト（bosentan）；及びナトレコール（Scios）、血管平滑筋細胞及び内皮細胞に結合するナトリウム排出増加ペプチドが挙げられる。
【０１１１】
好ましい態様において、標的指向物質はインテグリン−特異的分子である。インテグリン特異的分子は、ＲＤＧペプチドまたはその誘導体でよい。他のインテグリン特異的分子は、例えば、米国特許第５，５６１，１４８号；米国特許第６，２０４，２８０号、国際公開公報ＷＯ０１／１４３３８号、及び国際公開公報ＷＯ ０１／１４３３７号に記載されている。特に好ましい態様において、標的指向物質は、化合物１０、３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］−ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼンスルホニル−アミノプロピオン酸であり、標的はαｖβ３である。他の態様において、インテグリン特異的分子はCilengitideである。他の特に好ましい態様において、標的指向物質は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−アルデヒド（Bachem N-1380）又はＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−アルデヒド セミカルバゾン（Bachem C-3085）のようなプロテアーゼインヒビターであり、標的はパパイン又はカテプシンＢである。
【０１１２】
抗腫瘍剤は、シスプラチン；抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（例えばヘルセプチン）などの腫瘍マーカーに対する抗体；又は血管−標的化治療剤について本明細書中で記載するようなものであるが、血管系よりは腫瘍細胞を標的とする３連剤などの従来の抗腫瘍療法であることができる。種々の腫瘍マーカーに対するモノクローナル抗体の概要は、本明細書中にその全体が援用される米国特許第６，０９３，３９９号の表Ｉに与えられている。一般に、血管標的化療法剤が腫瘍領域の血管の完全性を危うくする場合、腫瘍細胞に直接作用するいかなる薬物の有効性も高めることができる。
【０１１３】
本発明の１つの態様において、血管−標的化治療剤は、腫瘍細胞に直接標的指向する薬剤と結びついている。本態様は、腫瘍周囲の新生血管系は高度に透過性又は「漏出性」であることが多く、材料が血流から腫瘍周囲の間質空間へ直接通過できるという事実を利用している。あるいは、標的化治療剤自体が腫瘍血管系に透過性を誘導することができる。例えば、薬剤が放射性治療用物質を収容する場合、血管組織に結合してその組織に放射することにより、血管上皮の細胞死が次に起こり、血管系の完全性を危うくするであろう。
【０１１４】
したがって、１つの態様において、血管−標的化治療剤は２つの標的指向物質：血管マーカーを指向する１つの標的指向物質、及び腫瘍細胞マーカーを指向する１つの標的指向物質を有する。他の態様において、抗腫瘍剤は血管標的化治療剤とともに投与される。抗腫瘍剤は、血管標的化治療剤と同時に、又は血管標的化治療剤の投与に続いて投与することができる。特に、血管標的化治療剤が、腫瘍領域で血管の完全性を危うくすることに依拠する場合、抗腫瘍剤の投与は好ましくは腫瘍血管系への最大障害時に行われる。
【０１１５】
小胞サイズは、例えば診断及び／又は治療における使用を含む、特定の意図する目的での使用のために調製することができる。連結担体のサイズは容易に操作することができるため、血管−標的化治療剤の全体的なサイズを、薬剤が所望の特性（例えば循環寿命、多価性）を維持するために十分なサイズを保持する限り、粒子が病理部位で透過性（「漏出性」）血管系を介して最適に透過するために調製することができる。したがって、粒子のサイズは、所望のように、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００又は３５０ｎｍであることができる。加えて、最初に透過性血管系を透過できないサイズの粒子を投与し、次に１つ以上の透過性血管系を透過できるサイズの粒子を更に投与することを容認するように、粒子のサイズを選択することができる。小胞サイズは、好ましくは直径約３０ナノメートル（ｎｍ）〜約４００ｎｍの範囲であり、その中の範囲の全ての組合せ及びサブコンビネーションであることができる。より好ましくは、小胞は直径約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、更により好ましくは直径約４０ｎｍ〜約１２０ｎｍである。特定の使用、例えば血管系の磁気共鳴撮影を含む血管内の使用に関し、小胞は直径約５００ｎｍ以下が好ましく、より小さな小胞、例えば直径約１００ｎｍ以下の小胞が好ましい。これらのより小さな小胞が微小血管系のような細い血管を灌流でき、同時に赤血球細胞が小胞を通り過ぎていくのを容認するのに十分な余地又は空間を血管内に提供するることが意図される。
【０１１６】
更に、本発明に用いることを意図する治療剤には、限定されるものではないが、再狭窄を治療するためのＡＧＩ−１０６７（Atherogenics）、抗真菌剤のニスタチン及び，白血球細胞中のＢｃｒ−Ａｂｌ細胞内タンパク質をブロックするグリーベックが含まれる。
【０１１７】
本発明の１つの主要な焦点は、がんを治療するための腫瘍血管系に対する血管標的化治療剤の使用であるが、本発明の薬剤は血管新生又は他の異所性血管増殖が病理に付随するか又は貢献するいかなる疾患にも使用することができる。新血管増殖に関わる疾患には、限定されるものではないが、固形腫瘍；白血病のような血液が媒介する腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫；関節リウマチ；乾癬；慢性炎症；眼の血管腫瘍、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、新生血管緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；動静脈奇形；虚血肢血管新生；オスラー−ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク血管新生；毛細管拡張；血友病関節；血管線維腫；及び創傷顆粒形成が含まれる。内皮細胞の過剰な又は異常な刺激の疾患には、限定されるものではないが、腸管癒着症、粥状動脈硬化症、再狭窄、強皮症及び肥厚性瘢痕、即ちケロイドが含まれる。
【０１１８】
投与ビヒクルとは異なり、薬剤の最適な投与について用量及び投与経路を決定することができる；例えば、腫瘍部位近傍への注射は固形腫瘍の治療に好ましいかもしれない。こうした疾患状態の治療も、血管−標的化治療剤を病理部位の間質腔に特異的に送達するために、先に議論したように、病理部位の新生血管の透過性を利用することができる。
【０１１９】
標的化多価薬剤
連結担体は、関連する特定の化学により、種々の方法で標的指向物質及び治療用物質にカップリングすることができる。カップリングは共有結合でも非共有結合でもよい。標的指向物質及び治療用物質を連結担体にカップリングさせるのに好適な種々の方法は、Hermanson、「生接合技術」、Academic Press: New York, 1996；及び「タンパク質の接合及び架橋の化学」、S. S. Wong, CRC Press, 1993に見い出すことができる。特異的カップリング方法には、限定されるものではないが、２官能性リンカーの使用、カルボジイミド縮合、ジスルフィド結合形成、及び特異的結合ペアの使用が含まれ、ここでペアの一方のメンバーは連結担体上にあり、ペアの他のメンバーは治療用物質又は標的指向物質上にある。例えばビオチンアビジン相互作用が挙げられる。
【０１２０】
共有結合的にＬに付着しているスペーサーＹに、Ｚが共有結合的に付着した化学的反応性部分であるリガンドＺ−Ｙ−Ｌのカップリングの概要を図２に示す。この結合は活性化剤を必要とするかもしれない。
【０１２１】
一般に、標的指向物質と脂質、連結担体及び／又は場合によりスペーサー基とのあいだに連結を形成する前に、少なくとも１つの化学官能基が活性化されるであろう。当業者であれば、ヒドロキシ基、アミノ基及びカルボキシ基を含む種々の化学官能基は、種々の標準方法及び条件を用いて活性化することができることを理解するであろう。例えば、リガンド又は脂質のヒドロキシル基は、対応するクロロホルメートを形成するためにホスゲンを用いて処置することにより活性化することができる。加えて、ヒドロキシル官能性が糖残基の１部である場合は、ヒドロキシル基を、スズ複合体を形成するためにジ−（ｎ−ブチル）スズオキシドを用いて反応させることにより活性化することができる。
【０１２２】
カルボキシ基は、対応するハロゲン化アシルに転換することにより活性化することができる。この反応は、Jerry March、応用有機化学：反応、機構及び構造、第４版、388-89に記載されているような種々の条件下で行うことができる。１つの態様において、ハロゲン化アシルは、カルボキシ含有基をオキサリルクロリドと反応させることにより製造される。
【０１２３】
典型的には、脂質又は連結担体は、それぞれの化学官能基による標準化学技術を用いて標的指向物質に共有結合的に連結している。場合により、標的指向物質は脂質又は、１つ以上のスペーサー基を介して連結担体にカップリングすることができる。スペーサー基は、組み合わせて用いる場合、等価物であっても異なっていてもよい。
【０１２４】
脂質−標的指向薬剤複合体は、脂質を標的指向物質に（又は場合により、標的指向基に付着しているか又は付着するであろうスペーサー基に）、それぞれの化学官能基を介して連結させることにより製造される。好ましくは、脂質（例えば化学官能基１）は、標的指向物質に、場合によりスペーサー基（例えば化学官能基２）を介して、表３に示す連結により結合する。当業者は、先ずスペーサーを標的指向薬剤又は脂質に付着させることができることを認識するであろう。表３に示す化学官能基は、採用する合成スキームにより、標的指向物質、スペーサー又は脂質上に存在することができる。
【０１２５】
【表１】
2004535407.tif 000004
【０１２６】
2004535407.tif 000005
【０１２７】
当業者は、これら連結の多くは種々の方法で、種々の条件を用いて製造することができることを容易に認識するであろう。エステルの製造には例えばMarch、前掲、1157を参照されたい；チオエステルにはMarch、前掲、362-363、491、720-722、829、941及び1172を参照されたい；カルボネートにはMarch、前掲、346-347を参照されたい；カルバメートにはMarch、前掲、1156-57を参照されたい；アミドにはMarch、前掲、1152を参照されたい；ウレア及びチオウレアにはMarch、前掲、1174を参照されたい；アセタール及びケタールにはGreene et al.、前掲、178-210及びMarch、前掲、1146を参照されたい；アシルオキシアルキル誘導体にはプロドラッグ：Topical and Ocular Drug Delivery、K. B. Sloan編集、Marcel Dekker, Inc.、New York、1992を参照されたい；エノールエステルにはMarch、前掲、1160を参照されたい；Ｎ−スルホニルイミデートにはBundgaard et al.、(1988) J. Med. Chem.、31: 2066を参照されたい；アンヒドリドにはMarch、前掲、355-56、636-37、990-91及び1154を参照されたい；Ｎ−アシルアミドにはMarch、前掲、379を参照されたい；Ｎ−マンニッヒ塩基にはMarch、前掲、800-02及び828を参照されたい；ヒドロキシメチルケトンエステルにはPetracek et al. (1987) Annals NY Acad. Sci.、507: 353-54を参照されたい；そしてジスルフィドにはMarch、前掲、1160を参照されたい。
【０１２８】
種々のケタールタイプ連結を生成することができる。本発明の薬剤−化学修飾剤複合体中に生成され得るケタールタイプ連結には、限定されるものではないが、イミダゾリジン−４−オン（プロドラッグ、前掲参照）；オキサゾリン−５−オン（Greene et al.、前掲、358参照）；ジオキソラン−４−オン（Schwenker et al. (1991) Arch. Pharm. (Weinheim) 324: 439参照）；スピロチアゾリジン（Bodor et al. (1982) Int. J. Pharm.、10: 307並びにGreene et al.、前掲、219及び292参照）；及びオキサゾリジン（March、前掲、87並びにGreene et al.、前掲、217-218及び266-267参照）が挙げられる。
【０１２９】
好ましい態様において、標的指向物質は、脂質上のカルボキシル頭部基に付着している。他の好ましい態様において、標的指向物質は、マレイミド、又はアセトアミドのα−メチル基に付着している。
【０１３０】
脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質を、図３〜図１５に示す。例えば核酸を付着させるための、更なる連結及び官能基は、Hale et al.の米国特許第５，６０７，６９１号に記載されている。
【０１３１】
１つ以上のスペーサー基を場合により脂質と標的指向物質とのあいだに導入してもよい。スペーサー基は典型的には２つの化学官能基を含有し、そして典型的には電荷をもたない。典型的には、スペーサー基の１つの化学官能基が脂質の化学官能基に結合し、一方、スペーサー基の他の化学官能基が標的指向物質の化学官能基との結合に用いられる。スペーサー基の化学官能基の例としては、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシ基、アミノ基、ケトン基及びメルカプト基が挙げられる。スペーサー基は組み合わせて用いることもできる。スペーサー基の組合せを用いる場合、スペーサー基は異なっていても等価のものでもよい。
【０１３２】
好ましいスペーサー基には、６−アミノヘキサノール、６−メルカプトヘキサノール、１０ヒドロキシデカン酸、グリシン及び他のアミノ酸、１，６−ヘキサンジオール、β−アラニン、２−アミノエタノール、システアミン（２−アミノエタンチオール）、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、３−マレイミド安息香酸、フタリド、α−置換フタリド、カルボニル基、動物エステルなどが含まれる。特に好ましいスペーサー基は図３〜図１５に概要を示すが、ポリエチレングリコール、及び末端アミノ基を有するエチレングリコール誘導体が含まれる。
【０１３３】
スペーサーは、連結担体−標的指向物質複合体に更なる分子質量及び化学官能基を導入するのに役立つことができる。一般的に、更なる質量及び官能基は、薬剤−化学修飾剤複合体の血清半減期及び他の特性に影響するであろう。したがって、スペーサー基の慎重な選択を通して、ある範囲の血清半減期を有する連結担体-標的指向物質複合体を製造することができる。
【０１３４】
更に、スペーサー基を化学修飾剤又は薬剤にカップリングさせるために用いる連結の性質は血清半減期に影響するかもしれない。
したがって、議論が更に単一タイプの標的指向物質と連結担体とのカップリングに集中しているが、ある態様において、他の物質を連結担体又は連結担体−標的指向物質複合体にカップリングさせることができる。共有結合的に連結担体−標的指向物質複合体に結合する（場合によりスペーサー基を介して）他の物質は、検出手段、複合体の排泄半減期を増加させる手段、凝集軽減手段、膜を通る薬剤の送達に付随する炎症及び／又は刺激軽減手段並びにレセプター架橋促進手段の提供を含む複合体の化学的、物理的又は生物学的特性に影響するか改変するのに役立つであろう。
【０１３５】
検出用手段を提供するのに役立つ更なる物質の例は、腫瘍撮像又は放射線療法のため及び異なる組織における用法−用量を評価するための放射性標識キレートを含む放射性標識部位である。放射性標識のための脂質含有部位を用いる複合体の例は、本明細書及び、ともに係属中の米国仮特許出願第６０／３０８，３４７号に記載されている。
【０１３６】
他の物質は薬剤の排泄半減期を拡張することが可能である。典型的には、これらの物質はペプチド及びタンパク質薬物又は排泄半減期の短い他の薬剤との使用を見いだすであろう。一般に、この調節剤は、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質に結合可能な部分を含むであろう。典型的にはそれらの部分は、当該技術分野に公知の手順で測定して、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上血漿に結合するであろう。このようなエフェクター基の例としては、ナプロキセン、フルオキセチン、オキサゼパム、ニトラゼパム、フェニルブタゾン、ノルトリプチリン、メタドン塩酸塩、ロラゼパム、イミプラミン、ハロペリドール、フルラゼパム、ドキシサイクリン、ditonin、ジフルニサル、ジアゾキシド、ジアゼパム、ノルダゼパム、デシプラミン、ダプソン、クロフィブレート、アマンタジン、クロルタリドン、クロナゼパム、クロルプロパミド、クロルプロマジン、クロルフェニラミン、クロロキン、カルバマゼピン、オーラノフィン、アミトリプチリン、アンフォテリシンＢ、ピロキシカム、ワルファリン、ピモジド、ドキソルビシン、ピリメタミン、amidoarone、プロトリプチリン、デシプラミン、ノルトリプチリン、オキサゼパム、ニトラゼパム及びテトラヒドロカナビノールが挙げられる。
【０１３７】
官能性調節剤に架橋しているレセプターは、本質的に標的指向調節剤である。細胞表面レセプターの架橋は、架橋はレセプター内部移行の前に必要とされることが多いステップであるという点で薬剤にとって有用な能力である。したがって、架橋調節剤は薬剤を細胞に導入するための手段として用いることができる。加えて、２つのレセプター結合部位の存在は（即ち標的指向調節剤）、薬剤の親和性を増加させる。
【０１３８】
親和性調節剤を用いて同様の効果を得ることもできる。この場合、各薬剤は標的指向調節剤及び親和性調節剤を有するであろう（即ち２量体ペプチド）。２つのペプチドの２量体化は、２つの標的指向調節剤を有する１分子を有効に形成する。したがって、レセプター架橋が可能である。架橋に対するこの２分子アプローチにより、濃度依存がより大きくなり、高レセプター密度をもつ組織に対する増大した標的指向及び架橋特異性を得ることができる。
【０１３９】
あるいは、官能性調節剤は、凝集予防に役立つことができる。特に、多くのペプチド及びタンパク質薬剤は、その透過性を制限するかさもなければ剤形又はバイオアベイラビリティに関連する特性に影響する２量体又はより大きな凝集体を形成する。例えば、６量体型インスリンは、適当な官能性調節剤の使用を介して阻害されることができ、したがって、単量体型インスリンのより大きな拡散可能性をもたらす。
【０１４０】
非常に多くの治療用物質を、標的表面にｉｎ ｖｉｖｏ接着させるために、数個〜約１，０００個の標的指向物質を担うこともできる１つの連結担体に付着させることができる。多数の標的指向物質によりもたらされる向上した結合は、例えば内皮レセプターに対するｉｎｖｉｖｏ細胞接着をブロックするのに治療的に利用されることもできる。これらのレセプターをブロックすることは、炎症のような病理の進行を制御すること、及び転移がんを制御することに有用であることができる。例えば、多価シアリルルイスＸ誘導体化リポソームは、好中球の結合をブロックするのに用いることができ、重合リポソーム上のＶＣＡＭ−１に対する抗体は、リンパ球、例えばＴ−細胞の結合をブロックするのに用いることができる。
【０１４１】
一般に、重合リポソームに用いるのに好適な脂質は、１つ以上の治療用物質又は標的指向物質を付着させるための活性頭部基、活性頭部基の接触性のためのスペーサー部；リポソーム中への自己集合のための疎水性尾部；そしてリポソームを安定化するための重合性基を有する。
【０１４２】
血管系を再循環する標的化重合リポソームは、多くの標的化重合リポソームを所望の部位に保持するための細胞接着分子又は他の細胞表面レセプターと相互作用する内皮抗原を含むことができる。重合リポソーム中の高濃度の治療用物質は、高濃度の薬物又は他の治療用物質の部位特異的送達を可能にし、他の組織への負担を最小にする。本明細書に記載される重合リポソームは、ｉｎｖｉｖｏで完全性を維持するため特によく適合し、血液プールを再循環し、柔軟性がなく、容易に細胞膜と融合せず、抗体／標的指向物質及び治療用物質の付着のための足場として役立つ。重合リポソームのサイズ分布、粒子の硬直性及び表面特性は、細網内皮系による急速なクリアランスを避けるためにあつらえることができ、その表面は血管内再循環時間を更に増加させるためにエチレングリコールで修飾することができる。１つの態様において、重合リポソームは、血液プール半減期がラットでは約２０時間であることが判明した。
【０１４３】
１つの態様において、特定のレセプター標的指向のためにモノクローナル抗体を付着させた部位特異的重合リポソームは、治療用物質を、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）を発現する細胞に送達させるために用いることができる。このマーカーは、多発性硬化症動物モデルであるネズミの実験的自己免疫脳炎において上方制御される。
【０１４４】
治療用組成物
本発明はまた、本発明の治療剤を含む治療用組成物に関するものである。本発明の組成物は、医薬的に許容可能な賦形剤、アジュバント及び／又は担体のような他の成分を含むこともできる。例えば、本発明の組成物は、治療すべき動物が許容できる賦形剤中に製剤化することができる。そのような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、マンニトール、ハンクス溶液、及び他の水性の生理学的平衡塩溶液が挙げられる。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチル又はトリグリセリドのような非水性ビヒクルも用いることができる。他の有用な製剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール又はデキストランのような増粘剤含有懸濁液が含まれる。賦形剤は、等張性及び化学的安定性を増大させる物質のような微量の添加剤を含有することもできる。バッファーの例としては、リン酸塩バッファー、重炭酸塩バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ヒスチジン、クエン酸塩、及びグリシン、又はそれらの混合物が挙げられる。一方、保存剤の例としては、チメロサール、ｍ−又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールが挙げられる。標準製剤は、注射液、又は好適な液体中に懸濁液若しくは注射液として取り込まれることができる固体のいずれでもよい。したがって、非液性製剤において、賦形剤は、滅菌水又は生理食塩水を投与前にくわえることができるデキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤などを含むことができる。
【０１４５】
本発明の１つの態様において、組成物はアジュバント又は担体のような免疫強化物質を含むこともできる。アジュバントは典型的には、動物の特定抗原に対する免疫応答を一般に高める物質である。好適なアジュバントには、限定されるものではないが、フロイントアジュバント；他の細菌細胞壁成分；アルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質；ウイルスコートタンパク質；他の細菌由来調製物；γ−インターフェロン；ハンターのTitermaxアジュバント（Vaxcel. TM., Inc. Norcross, Ga.）のようなブロックコポリマーアジュバント；Ｒｉｂｉアジュバント（Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.から入手可能）；並びにＱｕｉｌ Ａ（Superfos Biosector A/S, Denmarkから入手可能）のようなサポニン及びその誘導体が含まれる。担体は典型的には、治療される動物において治療用組成物の半減を増加させる化合物である。好適な担体には、限定されるものではないが、ポリマー性放出制御製剤、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、オイル、エステル及びグリコールが含まれる。
【０１４６】
本発明の１つの態様は、本発明の組成物を動物にゆっくり放出することが可能な放出制御製剤である。本明細書で用いるように、放出制御製剤は本発明の組成物を放出制御ビヒクル中に含む。好適な放出制御ビヒクルには、限定されるものではないが、生体適合性ポリマー、他の重合マトリックス、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェア及び経皮送達システムが含まれる。本発明他の放出制御製剤には、動物に投与することにより、ｉｎｓｉｔｕで固体又はゲルを形成する液体が含まれる。好ましい放出制御製剤は生分解性（即ち生体分解性）である。
【０１４７】
一般に、本発明に用いる治療剤は、動物に有効量で投与される。一般に、有効量とは、（１）治療しようとする疾患の症状を軽減させるか、又は（２）治療しようとする疾患の治療に関連して薬理学的変化を誘導するのに有効な量である。がんの場合、有効量には、腫瘍サイズを小さくする；腫瘍増殖を遅くする；転移を予防若しくは阻害する；又は罹患動物の余命を増加させる、のに有効な量が含まれる。
【０１４８】
治療的有効量の治療剤は、所望の効果を引き起こすのに十分な量又は用量であることができ、部分的に、がんの状態、タイプ及び部位、患者のサイズ及び状態、並びに当業者に容易に知られる他の因子に依存することができる。用量は、単回用量として、又は例えば数週間のコースに対して分けられた数回用量として与えられる。
【０１４９】
本発明はまた、本発明の治療用組成物を用いる治療方法に関するものである。この方法は治療剤をその投与を必要とする患者にに投与することを含む。
本発明の治療剤は、注射又はエアロゾルによる皮内投与のように、例えば非経口投与、局所投与、経口投与又は局部投与を含むいずれかの好適な手段で投与することができる。本発明の好ましい態様において、薬剤は注射により投与される。このような注射は罹患領域に局部的に投与することができる。治療用組成物は、投与方法により種々の単一剤形で投与することができる。例えば動物への経口投与に好適な単一剤形は、粉末、錠剤、丸剤及びカプセルを含む。本発明の治療用組成物の好ましい送達方法は、例えば注射又は局所投与による静脈内投与及び局部投与を含む。送達の特別の様式に関し、本発明の治療用組成物は本発明の賦形剤中に製剤化できる。本発明治療薬はいかなる動物にも投与することができ、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与する。
【０１５０】
投与の特定モデルは治療される状態に依存するであろう。本発明の薬剤の投与は、体液、又は体液を介して接触可能な標的若しくは組織を介することが意図される。
本発明の細胞表面標的化治療剤の好ましい投与経路は、静脈又はリンパ管系への投与を含む静脈内注射、腹膜注射又は皮下注射によるものである。本発明の主要な焦点は原則として血管標的化薬剤にあるが、標的化薬剤は、他の体液、生体組織及び体腔上に、例えば滑液、眼液又は髄液に存在するマーカーに集中するように設計することもできる。したがって、例えば、薬剤は、抗体が髄液から接近可能な病理部位を標的とする場合、髄液に投与することができる。例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）−血液関門の脈絡叢内皮中にある標的の場合、クモ膜下送達、即ち脊髄や脳がつかっている脳脊髄液への投与が適切であるかもしれない。
【０１５１】
１つの治療例として、体液を介した投与経路には、治療すべき疾患が関節リウマチであるものがある。本発明のこの態様において、本発明は、関節リウマチに悩む人々の炎症性滑液を治療するための治療剤を提供する。このタイプの治療剤は、放射線滑膜切除剤である。関節リウマチを罹患する個人は、実質的な痛みと身体障害を引き起こす可動関節又は滑膜関節の破壊を体験する。これらの患者の多くにとって、疾患は、手（中手指節関節）、肘、手首、足首及び肩に関わるであろう。そして半数以上は膝関節に影響するであろう。治療しないと、関節裏打ちにますます炎症が起こり、痛み、動作が失われ、関節軟骨の破壊をもたらす。炎症性滑液を攻撃し、破壊し又は除去するため、化学薬品、外科手術、及び放射線が用いられてきたが、すべて欠点があった。
【０１５２】
放射線滑膜切除剤の濃度は特定の使用により変化するが、申し分のない放射線滑膜切除を提供するために十分な量が存在する。例えば、股関節部の放射線滑膜切除において、薬剤の濃度は、手首関節の放射線滑膜切除に用いる場合より一般に高くなるであろう。放射線滑膜切除用組成物は、好ましくはアイソトープが２０半減期のあいだ関節内に実質的に保持されるように投与される。しかし、より短い滞在時間であっても、放射性核種の漏出が少なく、漏出した放射性核種が急速に体から排出される限り許容できる。
【０１５３】
放射線滑膜切除用組成物は、このような処置に対して通常の方法で用いることができる。例えば、膝関節の治療の場合、適切な放射線滑膜切除を提供するのに十分な量の放射線滑膜切除用組成物が膝関節に注射される。用いることができる多くの異なる技術があり、適切な技術は治療される関節により異なる。膝関節の例は、例えばNuclear Medicine Therapy, J. C. Harbert, J. S. Robertson and K. D. Reid, 1987, Thieme Medical Publishers, pages 172-3に見いだすことができる。
【０１５４】
滑液を介した投与経路は、変形性関節症の治療にも有用である。変形性関節症とは、軟骨の悪化が激しい痛みをもたらし、影響された関節を使用できなくなる疾患である。年齢が唯一の最も強力な危険因子であるが、主な外傷及び関節の反復使用は更なる危険因子である。この疾患の主な特徴には、関節の菲薄化、軟骨の軟化、軟骨潰瘍及び骨消耗が含まれる。標的化担体の注射により薬剤を滑液に送達して炎症を軽減させること、分解性酵素の阻害、及び痛みの軽減が本発明のこの態様において予見される。
【０１５５】
他の投与経路は、眼液を介するものである。眼の網膜は、眼底の内壁に整列する光感受性組織の薄い層である。光が眼に入ると、角膜及び網膜上のレンズにより焦点が合わされる。次に網膜は光像を電気刺激に変換し、視神経により脳に送られる
斑紋は、中心視に色視関連する網膜の非常に狭い領域である。斑紋は、我々が読むこと、運転すること及び細かい作業をすることを可能にする。斑紋を取り囲むのは側視及び夜間視力に関連する周辺網膜である。黄斑変性は、斑紋、その下にある組織又は隣接組織の障害又は分解である。黄斑変性は、視力の低下並びに読力及び「精密」視力の障害の主な原因である。年齢関連黄斑変性(ARMD)は、老人の法的盲の最も一般的な原因である。
【０１５６】
黄斑変性の最も一般的な形態は、「乾燥」又は退行黄斑変性と呼ばれ、血管の菲薄化及び黄斑領域の網膜の下にある他の構造的又は栄養的組織を原因とする。より重篤な形態は、「湿潤」又は滲出性黄斑変性と呼ばれる。この形態では、脈絡膜層の血管（網膜下層にあり、網膜に栄養物を提供する層）が２つの組織間の薄い保護層から漏出する。これらの血管は、急速で制御できない様式で網膜の真下に異常増殖し、毛細血管出血、出血、又は最終的に斑紋に瘢痕組織形成を引き起こし、中心視の重症な欠失をもたらす。この過程は脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と呼ばれる。
【０１５７】
ＣＮＶは予後の悪い状態である。熱レーザー光凝固術を用いた有効な治療は、病変の検出及びその結果の境界のマッピングに依拠する。血管造影を用いて傷ついた脈管からの漏出を検出するが、脈管は大きく、不明確なベッドを有し、網膜の下に突き出ており、色素上皮と結合できるため、CNVは従来の血管造影像により示されるものよりも大きいことが多い。
【０１５８】
血管新生は、血管新生緑内障、眼のヒストプラズマ症候群、近視、糖尿病、翼状片、並びに感染症及び炎症性疾患を含む他の眼病で視界の欠失をもたらす。ヒストプラズマ症候群では、眼の後方に整列する内部の脈絡膜層において一連の事象が起こり、脈絡膜の局所炎症並びにその結果として起こる関連網膜の機能損失及び盲点の産生（絶対暗点）を伴う瘢痕化をもたらす。脈絡膜層は、正常血管よりも非常にもろい新生血管の産生を惹起される場合がある。これらは、更なる瘢痕化、及び重なっている網膜の機能損失を伴って出血する傾向がある。糖尿病性網膜症は、出血、不規則血管及び白っぽい浸出液をもたらす脈絡膜血管よりも網膜血管に関与する。網膜の血管新生は最も重症な形態を引き起こすかもしれない。眼の血管系を標的とする場合、標的が血管系のいずれの側に存在してもよいことが評価されるべきである。
【０１５９】
本発明の薬剤の眼組織への送達は、静脈内、眼及び局所を含む多くの形態をとることができる。眼の局所投与については、本発明の薬剤は、懸濁化点眼水溶液、粘性点眼液、ゲル、水溶液、エマルジョン、軟膏などのような点眼水溶液の形態で製造することができる。このような製剤の製造に好適な添加剤は、当業者に公知である。眼への徐放性送達系の場合、徐放性送達系は、眼瞼の下に置くか、又は結膜、強膜、網膜、視神経鞘、又は眼内若しくは眼窩内部位に注射することができる。眼に薬剤を硝子体内送達することも意図される。このような硝子体内送達方法は当業者に公知である。この送達は、Averyの米国特許第６，２５１，０９０号に記載されているような装置を介した送達を含むことができる。
【０１６０】
更なる態様において、本発明の治療剤は、遺伝子療法又は遺伝子送達に有用である。本明細書において、「遺伝子療法」又は「遺伝子送達」という語は、遺伝病若しくは後天性疾患又は状態を治療又は予防するために目的の遺伝子材料（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主へ移入することを意味する。目的の遺伝材料は、ｉｎｖｉｖｏでその生産が所望される産物（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は機能性ＲＮＡ）をコードする。例えば目的の遺伝材料は、治療的に価値のあるホルモン、レセプター、酵素又はポリペプチドをコードすることができる。特定の態様において、本発明は、非ウイルス遺伝子療法に使用するために、本明細書にその全体が援用される、Hughes, et al.の米国特許第６，１６９，０７８号に記載されているように核酸と複合体を形成できるあるクラスの脂質分子を利用する。ここで、ジスルフィドリンカーが、脂質の極性頭部基と親油性尾部基とのあいだに提供される。
【０１６１】
本発明のこれらの治療用化合物は、ＤＮＡと有効に複合体を形成し、異種ＤＮＡで形質転換される細胞の細胞内空間へ、細胞膜を介してＤＮＡを容易に移入させる。更に、これらの脂質分子は、細胞質内での異種ＤＮＡの放出を促進し、それによりヒト又は動物の遺伝子療法において遺伝子トランスフェクションを増加させる。
【０１６２】
陽イオン性脂質−ポリ陰イオン性高分子凝集体は、当該技術分野で公知の種々の方法により形成することができる。代表的な方法は、Felgner et al., 前掲；Eppstein et al., 前掲；Behr et al., 前掲；Bangham, A. et al., M. Mol. Biol. 23: 238, 1965；Olson, F. et al., Biochim. Biophys. Acta 557: 9, 1979；Szoka, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978；Mayhew, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 775: 169, 1984；Kim, S. et al., Biochim. Biophys. Acta 728: 339, 1983；及びFukunaga, M. et al., Endocrinol. 115: 757, 1984に開示されている。一般に凝集体は、（１）陽イオン性脂質又は（２）コ脂質と混合した陽イオン性脂質から成る脂質粒子を調製し、約室温（約１８〜２６℃）でポリ陰イオン性高分子を脂質粒子に加えることにより形成することができる。一般に、保護基が脱保護されないように条件は選択される。１つの態様において、次に混合物は約１０分〜約２０時間かけて凝集体を形成する。約１５〜６０分が最も好都合である。その他の時間も特定の脂質タイプには適している。複合体は、より長い時間をかけて形成することができるが、通常、より長時間の複合体形成により、さらにトランスフェクション効率が増大することはないであろう。
【０１６３】
本発明の化合物及び方法を用いて、例えばポリヌクレオチドのような所望の分子を標的細胞に細胞内送達することができる。所望のポリヌクレオチドは、DNA若しくはRNAまたはそれらの類似体で構成されることができる。本発明を用いて送達される所望のポリヌクレオチドは、レギュレーター機能を有するヌクレオチド、例えばプロモーター配列のようなさまざまな機能若しくは活性を提供するヌクレオチド配列、又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で構成されることができる。所望のポリヌクレオチドは、細胞内で他のヌクレオチド配列のアンチセンスであるヌクレオチド配列も提供する。例えば、細胞内で翻訳される場合、所望のポリヌクレオチドは、細胞内で他のヌクレオチド配列のアンチセンスである配列を有するポリヌクレオチドを提供することができる。アンチセンス配列は、細胞内でセンス鎖配列とハイブリダイズすることができる。アンチセンス配列を提供するポリヌクレオチドは、当業者により容易に製造することができる。細胞内に送達される所望のポリヌクレオチドは、細胞で２重鎖ＤＮＡと３重鎖複合体を形成可能なヌクレオチド配列含むこともできる。細胞に送達される所望のポリヌクレオチドは、細胞の生物学的経路を妨害し、それにより細胞死をもたらすことができる。
【０１６４】
撮影
本発明は、医学的診断における重要な特性を表示するための撮像剤に関するものである。より詳細には、本発明は、ガドリニウムのような磁気共鳴コントラスト撮像剤、超音波撮像剤、又はＴｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｉ−１２３、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８及びＴｌ−２０１のような核撮像剤に関するものである。
【０１６５】
本発明は、異常病理に関わる分子に標的指向した複数の標的指向画像増強重合粒子を異常病理に接する体液に導入し、標的指向画像増強重合粒子は異常病理に関わる分子に付着し、そして異常病理に関わる分子に接着した標的指向画像増強重合粒子をｉｎｖｉｖｏで撮影することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏにおける異常病理の診断方法も提供する。このような方法は実施例のセクション及びともに継続中の米国仮特許出願第６０／３０８，３４７号に開示されている。
【０１６６】
典型的な脂質構築物及び使用
インテグリン−標的化ＰＶは、生体適合性のためのホスホコリン（ＰＣ）脂質、コロイド状安定性を付与し、ｉｎｖｉｔｒｏ結合アッセイを可能にするジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の脂質誘導体、及びαｖβ３インテグリン結合リガンド３−｛４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）−エチルオキシ］ベンゾイルアミノ｝−２（Ｓ）−ベンゼン−スルホニル−アミノプロピオン酸（図１６の化合物１０）に由来する頭部基を有する標的指向脂質、から成る。図１６に、本発明標的指向薬剤の製造に用いる新規な３価の脂質−インテグリンアンタゴニスト１２の製造を略述する。
【０１６７】
図１７は、Storrs, et al.、前掲、に記載されるように、適当な脂質の自己集合及び重合によるナノ粒子（ＰＶ）の形成を略述する。３価の脂質−インテグリンアンタゴニスト１２を、クロロホルム溶液中で市販のジアセチレンリン脂質１３及びユーロピウム−キレーター脂質複合体１４を組み合わせた。蛍光分光計を用いて粒子を可視化するために、化合物１４を１％で全ての製剤に加えた。Orellana, et al., Biochim. Biophys. Acta (1996) 1284: 29-34。表面電荷を変え、キレート放射性核種に表面を提供するために、この溶液に陰イオン性キレーター脂質１５又は陽イオン性脂質１６を加えた。Storrs, et al., 1995b。ＰＶ上のインテグリンアンタゴニストの表面密度を、化合物１２の濃度を変えることにより制御した。小胞を形成するために、組み合わせた脂質溶液を蒸発乾固させ、高真空下で乾燥させて残留溶媒を除去した。乾燥させた脂質フィルムを、脱イオン水を用いて、公知の脂質密度（３０ｍＭ）に水和させた。次に得られた懸濁液を、プローブチップソニケーターを用いて、ゲル−液晶相転移（Ｔｍ約６４℃）よりも高温で超音波処理し、ｐＨは７．０〜７．５に維持した。Spevak, W. R. Doctoral Thesis, University of California at Berkeley, 1993；Leaver, et al., Biochim. Biophys. Acta (1983) 732: 210-218。約１時間の超音波処理後、溶液は透明になった。次に小胞を、溶液を湿潤氷床上で０℃まで冷却し、溶液を小型ＵＶランプで２時間２５４ｎｍで照射することにより重合させた。得られたＰＶ（ＰＶ１〜ＰＶ６）は黄色〜オレンジ色であり、４９０ｎｍ及び５３５ｎｍに接合したエン−インジアセチレン ポリマーから生じた２本の可視吸収バンドがあった。Storrs, et al., 1995a。ＰＶの平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したところ４０ｎｍ〜５０ｎｍであり、ゼータ電位は、それぞれＰＶ１〜ＰＶ４が−４２〜−５３ｍＶ、ＰＶ５及びＰＶ６が＋３５及び＋４３ｍＶであった（Brookhaven Instruments, Holtsville, NY）。ｉｎｖｉｖｏ適用のために１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭヒスチジン及び５％デキストロース溶液を用いて製剤化したとき、ＰＶは何ヶ月ものあいだ物理学的及び生物学的特性に有意な変化を起こすことなく安定であった。典型的なＰＶの特性を表Ｚに示す。
【０１６８】
【表２】
2004535407.tif 000006
【０１６９】
αｖβ３インテグリンアゴニスト−脂質化合物１２を１〜３０モル％で含有し、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ビスＴＰＣ、１３）を９９〜７０モル％で含有するＰＶも製造した。アゴニスト−脂質化合物１２を含有するリポソーム及びＰＶは、本明細書中、「インテグリン標的化リポソーム」又はＩＴＬという。
【０１７０】
ＰＶの結合をｉｎｖｉｔｒｏで評価するために、実施例５に記載するように、小胞をユーロピウムで標識し、αｖβ３インテグリンでコーティングした９６穴プレート中で、時間分解蛍光（ＴＲＦ）により結合をモニターした。ＴＲＦシグナルは、非標的指向リポソームに対するシグナルよりも、ＰＶに対して６倍高い。特異的標的指向は、ＩＴＬ−Ｅｕ複合体からのシグナルが脂質側鎖のないインテグリンリガンドにより減少した競合アッセイでも証明された。
【０１７１】
実施例５に記載されるように、インテグリンを標的指向する上でのＰＶの有用性を評価するために、表Ｚに概略を示すように０．１、１及び１０モル％のインテグリンアンタゴニスト脂質複合体化合物１２及び化合物１３〜１６を用いて重合小胞を構築した。１０モル％の化合物１２（ＰＶ１及びＰＶ５）を含有する材料は、インテグリンαｖβ３に対して最も高い親和性を示した。競合インテグリン結合アッセイにおいて、ＰＶ（ＰＶ１〜ＰＶ５）を、種々の濃度の１０と混合し、次に予めαｖβ３インテグリンでコーティングした９６穴プレートに加えた。未結合ＰＶ及びインテグリンアンタゴニスト１０を洗浄除去し、結合ＰＶをＰＶ中に存在するユーロピウムを用いて測定した（Wallac, Gaitherburg, MD）（図１８Ａ〜１８Ｂ）。図１９に示すように、その表面上に０．５μＭのインテグリンアンタゴニスト１０とほんの等量有するＰＶ１を５０％阻害するのに、１００倍の遊離リガンド１０（６５μＭ）を要した。
【０１７２】
実施例６に記載するαｖβ３陽性Ｍ２１（ビトロネクチンでコーティングしたプレートに結合するメラノーマ細胞）を用いた細胞接着のｉｎｖｉｔｒｏ阻害アッセイにおいて、遊離リガンド１０に対するＩＣ５０は、６４μＭであった。これとは全く異なり、陰イオン性粒子ＰＶ１に対するＩＣ５０は、表面上の化合物１０の０．２７μＭ等量であった。これは、遊離リガンドと比較してＮＰが１０上にある場合、細胞表面に対して２００倍以上も親和性が高い。陽イオン性粒子ＰＶ５に対するＩＣ５０も、遊離リガンドと比較して約１８０倍親和性が高い化合物１０の０．３５μＭ等量であった（表３）。
【０１７３】
【表３】
2004535407.tif 000007
【０１７４】
したがって、表面電荷にもかかわらず、PVのインテグリンに対する親和性は、単量体リガンドと比較して約200倍も増加する。これは、PV表面と細胞表面とのあいだに強健な相互作用が起こることを証明している。この相互作用はＰＶ上の表面電荷に依存せず、特異的なレセプターとリガンドの相互作用に直接関連する。したがって、遊離リガンドと比較して約２桁増加した親和性は、ＰＶ表面上のインテグリンアンタゴニストに存在する多価性により達成することができる。ＰＶ製剤中の化合物１２の量を１０倍及び１００倍減少させて１モル％及び０．１モル％とし、それぞれＰＶ２及びＰＶ３を得た場合、細胞接着をブロックする能力は約１桁及び２桁減少した（表３）。
【０１７５】
コラーゲンでコーティングしたプレートを用いて細胞接着アッセイも行った。コラーゲンはコラーゲンレセプター（α２β１インテグリン）に結合するが、αｖβ３インテグリンには結合しない。この場合、ＰＶ−インテグリンアゴニストは細胞接着を阻害するが、ＰＶ単独もアゴニスト単独も細胞接着を阻害しないことが観察される。いずれの成分も単独で阻害しないため、個々の成分はコラーゲンレセプターに結合しないことは明らかである。理論にとらわれることなく、観察されたＰＶ−インテグリンアゴニストによる細胞接着の阻害は、ＰＶのサイズが大きいため、コラーゲンとそのレセプターとの立体障害によるＰＶ妨害相互作用によるものであると考えられる。したがって、特異的レセプターに標的指向したＰＶが細胞表面のレセプターに結合するだけでなく、その立体的なかさにより隣接レセプターへの接近をブロックする。
【０１７６】
ＩＴＬの結合をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価するため、小胞をユーロピウムで標識し、αｖβ３インテグリンでコーティングした９６穴プレート中で、時間分解蛍光（ＴＲＦ）により結合をモニターした。ＴＲＦシグナルは、非標的指向リポソームよりもＩＴＬについて６倍高い。ＩＴＬ−Ｅｕ複合体からのシグナルが脂質側鎖のないインテグリンリガンドにより減少した競合アッセイで、特異的標的指向も証明された。
【０１７７】
常磁性ＰＶは、実施例７で説明するように、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を撮影するのに有用である。したがって、これらの材料は、インテグリンに対しｉｎ ｖｉｖｏで高親和性を示す、空間的及び時間的撮像剤として役立つことができる。細胞接着アッセイ中のＰＶの親和性が、遊離リガンドと比較して２００倍増加したことに加えて、この効果は、図２０Ａ〜図２０Ｅに示すように、メラノーマ腫瘍モデルにおいて表面上にインテグリンアンタゴニストを含有するＰＶの顕著な取り込みが起こり、２４時間後であっても腫瘍部位に存在することを示すことにより、ｉｎｖｉｖｏでも観察される。
【０１７８】
０．１５及び１．５ｍｇ／ｍＬでのドキソルビシンの定量的被包が、実施例１１〜実施例１４に示すように、２５０ｍＭ硫酸アンモニウムを含有する小胞（１５ｍｇ／ｍＬ）を用いた１０％スクロース溶液中で達成された。ＩＴＬによるドキソルビシンの標的化送達が、記載されているｉｎｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイのネズミ内皮細胞（ＭＥＣ）を用いて証明された。しかし、ネズミ腫瘍細胞は同様のアッセイ条件下の処置に対して耐性であった。ＭＥＣについては、ＩＴＬｄｏｘ存在下のインキュベーションは、未標的Ｌｄｏｘよりも、細胞密度が４倍も減少した。ドキソルビシン非存在下のＩＴＬは、細胞増殖に効果を示さなかった。同濃度のドキソルビシンは細胞増殖を顕著に減少させたが、サイズ排除クロマトグラフィーで小胞を解析したところ、細胞増殖の減少は、ＩＴＬｄｏｘからのドキソルビシンの放出によるものではない。
【０１７９】
Ｋ１７３５−Ｍ２同系ネズミメラノーマモデルにおいて、ＩＴＬｄｏｘに対し腫瘍増殖速度の統計的有意差が観察された（ＡＮＯＶＡＰ＜０．００１）。１対１の比較により、１０％スクロース、Ｌｄｏｘ及びＩＴＬを含む対照処置と比較して、１及び１０μｇ／ｇのドキソルビシン用量でＩＴＬｄｏｘ処置と関連して有意な腫瘍増殖の減少を示した。（ＴｕｋｅｙのＷ法Ｐ＝０．０４８〜Ｐ＜０．００１）。脂質用量は１００μｇ／ｇであった。データを図２３に示す。
【０１８０】
実施例部分にも、他の治療用物質の被包、他の標的指向物質の結合、異なる脂質組成物を有する物質、治療用ラジオアイソトープの結合などを含む多くの他の手順を記載する。
本発明のわずかな態様が記載されているのみであるが、本発明は、本発明の範囲の精神を逸脱することなく多くの他の特定型に具体化することができると理解されるべきである。
【実施例１】
【０１８１】
一般的方法
使用した全ての溶媒及び試薬は試薬グレードのものである。溶媒蒸発は、室内真空又はWelch direct drive真空ポンプより供される減圧下で、４０℃にて行った。各ケースで記載しているように、１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬＦＸ９０Ｑを用いて、ＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ、Ｄ２Ｏ又はそれらの混合液中で９０ＭＨｚで記録した。注：脂質は、ＣＤＣｌ３には可溶性であるが、ＣＤ３ＯＤを添加すると逆転ミセルの形成を阻害し、よりシャープなスペクトルを呈する。スペクトルは、１Ｈの実験では残留ＣＨＣｌ３（７．２５ｐｐｍ）を基準とし、１３Ｃの実験ではＣＤＣｌ３のセンターライン（７７．００ｐｐｍ）を基準とした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、PerSeptive DE機器を用いて行った（質量分析法、The Scripps Resea ch Institute, La Jolla, CA）。ＴＬＣは、glass backed Merck 60 F254（０．２ｍｍ；EM Separations, Wakefield, RI）を用いて行い、展開板を通常通りに１０％硫酸水溶液中の硫酸セリウム（１％）及びモリブデン酸アンモニウム（２．５％）でスプレーし、約１５０℃で加熱した。他の展開剤にはヨウ素（一般的使用）、酢酸中の０．５％ニンヒドリン（アミン用）及び紫外線（発色団用）が含まれる。
【実施例２】
【０１８２】
４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）エチルオキシ］ベンゾイル−２−（Ｓ）アミノエチルスルホニルアミノ−β−アラニンの製造
Ａ．  Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−タウリンナトリウム塩（２）の製造。  タウリン，１（４０ｇ、３２０ｍｍｏｌ）を４Ｎ水酸化ナトリウム溶液（８０ｍＬ）及び水（１，２００ｍＬ）に溶解した。この溶液に、４時間の間、塩化ベンジルオキシカルボニル（４８ｍＬ、３３０ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら１滴ずつ加えた。ｐＨを、１０％炭酸水素ナトリウム溶液（３００ｍＬ）及び４Ｎ水酸化ナトリウム溶液（４５ｍＬ）を添加することによりアルカリに維持した。次に反応混合物をエーテル（１０００ｍＬ）で洗浄し、水相をスピン蒸発乾固し、５酸化リンを用いて高真空下で一晩乾燥し、化合物２を１２．７０ｇ（１４．１％）得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．５０（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ），５．２１（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ２），３．６２（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２），３．１４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２）。
【０１８３】
Ｂ．  ２−ベンジルオキシカルボニルアミノエタンスルホニルクロリド（３）の製造。  Ｎ−ＣＢＺ−タウリンナトリウム２（１２．７ｇ、３２ｍｍｏｌ）を陽圧のアルゴン下で無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）中に懸濁し、５部の５塩化リンで１５分以上処理した（７ｇ、３３．６ｍｍｏｌ）。反応液を周囲温度で４時間攪拌させた。溶媒をスピン蒸発により除去した。氷水（１０ｍＬ）を加え、フラスコ及び内容物を氷浴中で冷却後、残渣を粉末にした。更に氷水（５０ｍＬ）を加え、産物を凝固させた。固体をろ過により回収し、氷水（２０ｍＬ）で洗浄し、５酸化リンで一晩乾燥させ、６．９５ｇ（７８．０％）の化合物３を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３５（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ），５．１２（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ２），３．８９（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２）（３．８５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２）とオーバーラップしていた）。
【０１８４】
Ｃ．  メチル３−ブチルオキシカルボニルアミノ−２−（Ｓ）ベンジルオキシカルボニル−アミノエチルスルホニルアミノプロピオネート（５）の製造。  得られたスルホニルクロリド３（２１．６ｇ、７８．０ｍｍｏｌ）、及び無水テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中のメチル−３−Ｎ−ブトキシカルボニルアミン−２−アミノプロピオネート（４）（９．９６ｇ、３９．２ｍｍｏｌ）の混合物を氷浴中で陽圧のアルゴン下で冷却した。この溶液に、無水ＴＨＦ（２７５ｍＬ）中のＮ−メチルモルホリン（１６ｍＬ、１４５ｍｍｏｌ）を、予め乾燥させた滴下漏斗を用いて陽圧のアルゴン下で３０分間１滴ずつ加えた。氷浴中で１時間攪拌後、ＴＬＣにより、全てのスルホニルクロリド（Ｒｆ＝０．６５）（溶離液：酢酸エチル／ヘキサン１：１）が消失していることが観察された；しかしながら、未反応のジアミノプロピオン酸（Ｒｆ＝０．１、ニンヒドリンスプレー）が依然として存在していた。３時間の間、更にスルホニルクロリド（５．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）を加えた。次に反応液をろ過し、スピン蒸発させて溶媒を除去し、酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させ、冷希塩酸（２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒をスピン蒸発で除去し、真空下で一晩乾燥させた。残渣を、まず酢酸エチルに溶解し、次に等量のヘキサンを添加することにより、再結晶させ、化合物５を無色固体１３．４ｇ（７４．３％）として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３６（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ），５．８３（１Ｈ，ｄ，ＮＨ），５．５５（１Ｈ，ｔ，ＮＨ），５．１２（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ２），５．０６（１Ｈ，ｔ，ＮＨ），４．２６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ），３．７９（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．７０（２Ｈ，ｄｄ，ＣＨ２），３．２６（２Ｈ，ｄｄ，ＣＨ２），１．４３（９Ｈ，ｓ，（ＣＨ３）３）。
【０１８５】
Ｄ．  ３−ブチルオキシカルボニルアミノ−２−（Ｓ）−ベンジルオキシカルボニルアミノエチル−スルホニルアミノプロピオン酸（６）の製造。  テトラヒドロフラン（１６０ｍＬ）中のメチルエステル５（１３．３ｇ、２８．９ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴中で冷却し、この溶液に氷水（１６０ｍＬ）中の水酸化リチウム（５．４２ｇ、１２８ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。氷浴からはずして反応混合物をゆっくりと周囲温度まで暖め、混合物周囲温度で１時間攪拌した。次に有機溶媒スピン蒸発により除去した。残留水性部をジエチルエーテル（２０ｍＬ）で洗浄し、次に希塩酸でｐＨ４まで酸性化した。この溶液を氷浴中で冷却し、次に酢酸エチル（１００ｍＬ）と混合させ、そして更に氷冷希塩酸でｐＨ１まで酸性化し、直ちに酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。次に溶媒をスピン蒸発により除去し、高真空下で一晩乾燥させ、１３．３ｇの泡沫状固体を得た。これをヘキサン／酢酸エチル（１：１）で再結晶させ、１１．６ｇ（８９．７％）の化合物６を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３３（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ），６．１２（１Ｈ，ｄ，ＮＨ），５．６８（１Ｈ，ｔ，ＮＨ），５．２６（１Ｈ，ｔ，ＮＨ），５．１（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ２），４．２４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．６７（１Ｈ，ｔ，ＣＨ２），３．２７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２），１．４５（９Ｈ，ｓ，Ｃ（ＣＨ３）３）。
【０１８６】
Ｅ．  ３−アミノ−２−（Ｓ）−ベンジルオキシカルボニルアミノエチルスルホニルアミノプロピオン酸（７）の製造。  Ｎ−ＢＯＣ−β−アミノ酸６（１１．５ｇ、２５．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３５０ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（６８ｍＬ）で１．５時間処理し、次にスピン蒸発乾固させた。残渣を水（２００ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥させ、化合物７を１０．９ｇ（９８．８％）のβ−アミノ酸の固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３０（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ），６．０７（１Ｈ，ｄ，ＮＨ），５．６１（１Ｈ，ｔ，ＮＨ），５．２０（１Ｈ，ｔ，ＮＨ），５．１７（２Ｈ，ｓ，Ａｒ−ＣＨ２），４．１１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．５３（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２），３．３２（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２）。Ｃ１３Ｈ１９Ｎ３Ｏ６ＳについてのＤＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ（イオン）３４６（Ｍ＋Ｈ）（Ｃ１３Ｈ１９Ｎ３Ｏ６Ｓ＋Ｈ，ｍ／ｚ３４６について計算）。
【０１８７】
Ｆ．  ４−［２−（ピリミジン−２−イルアミノ）エチルオキシ］ベンゾイル−２−（Ｓ）−ベンジルオキシカルボニルアミノエチルスルホニルアミノ−β−アラニン（９）の製造。  安息香酸誘導体８（６．４ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｇ、３１ｍｍｏｌ）を陽圧のアルゴン下で無水ジメチルスルホキシド（１１０ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却した。この溶液に、１−（３（ジメチルアミノ）プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４．９ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を氷冷温度で１時間攪拌し、次に周囲温度まで暖め、室温で２４時間攪拌を続けた。この混合物にβ−アミノ酸７（１２．２ｇ、２５．８ｍｍｏｌ）の溶液を加え、続いてＮ−メチルモルホリンを加え、アルゴン下で３日間攪拌した。次に混合物を水（１Ｌ）に注ぎ、希塩酸でｐＨ１．５まで酸性化し、酢酸エチル（５×５００ｍＬ）で抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、次に無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒をスピン蒸発により除去し、残渣を酢酸エチル中で粉末にし、ろ過し、高真空下で乾燥して、１０．５ｇ（７２．５％）の化合物９を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．３０（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），７．９９（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），７．３４（５Ｈ，ｓ，Ａｒ−Ｈ），７．００（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），６．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ−Ｈ），５．０１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２），４．１５（１Ｈ，ｔ，ＣＨ），３．６７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２），３．５６（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２），３．１７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２）。
【０１８８】
Ｇ．  ４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）エチルオキシ］−ベンゾイル−２−（Ｓ）アミノエチルスルホニルアミノ−β−アラニン（１０＝Ｒ’ＮＨ２）の製造。  ピリミジン誘導体１０（３．７ｇ、６．４ｍｍｏｌ）の溶液を酢酸（１９０ｍＬ）及び濃塩酸（１７ｍＬ）に溶解した。この溶液を、炭素（１．６２ｇ）について１０％パラジウムで処理し、４５ｐｓｉの水素ガスで５時間水素添加した。次に混合物そセライトでろ過し、水で洗浄した。溶媒をスピン蒸発で除去し、高真空下で乾燥させた。残渣を水（約ｌ００ｍＬ）に溶解し、ｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で７．０に調製し、そしてスピン蒸発乾固した。残渣をメタノール（２０ｍＬ）に溶解してろ過した。ろ液をスピン蒸発し、水（２７５ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥させた。次に凍結乾燥させた産物を水から再結晶させ、２．９６ｇ（７８．９％）の純粋な産物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．８０（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），７．１４（２Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），４．４９（１Ｈ，ｓ，ＣＨａＨｂ），４．２８（１Ｈ，ｔ，ＣＨ２），３．９４（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨａＨｂ），３．６１（６Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．３２（４Ｈ，ｔ，ＣＨ２），１．９０（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２）。Ｃ１８Ｈ２８Ｎ６Ｏ６ＳについてのＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ（イオン）４５７（Ｍ＋Ｈ）（Ｃｌ８Ｈ２８Ｎ６Ｏ６Ｓ＋Ｈ，ｍ／ｚ４５７について計算）。
【０１８９】
Ｈ．  ４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）エチルオキシ］ベンゾイル−２−（Ｓ）−アミノエチルスルホニルアミノ−β−アラニンのキラル純度の測定。  化合物１０の溶液（６３６μＬの水及び６３６μＬのアセトン中に１．４ｍｇ）１ｍＬに、マーフィーの試薬溶液（１．４ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加えた。混濁液に５００μＬのアセトン、１．５ｍＬの水及び４００μＬの１ＭＮａＨＣＯ３溶液を加え、４０℃で２４時間インキュベートした。次にこの溶液を２００μＬの２Ｍ塩酸溶液で中和し、ＨＰＬＣで解析した。化合物１０なしで作製した対照溶液も同様に処理し、ＨＰＬＣで解析した。化合物１０のサンプルを、溶解するまで加熱することによりエピ化した。このエピ化化合物を化合物１０と同様に処理した。化合物１０のサンプルはＳＳジアステレオマーのみを示し、ＳＲジアステレオ異性体は完全に欠失していた。これは％ｅｅが＞９９％であることを示している。（ＳＳジアステレオ異性体はｔＲ＝１２．２分、ＳＲジアステレオ異性体は１０．８分）
【０１９０】
Ｉ．  化合物１２の合成  化合物１１（６９ｍｇ、５０μモル）を、先に炎で乾燥しアルゴンを充填した３クビ丸底フラスコ中の無水ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）、無水ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）及びＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）に溶解した。この溶液にＢＯＰ試薬（１３４ｍｇ、１５０μモル）を加え、反応物を５分間十分に攪拌した。化合物１０の溶液（６９ｍｇ、１５０μモル）を、無水ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）と無水ＤＭＦ（２ｍＬ）との混合物の状態でアルゴンを充填した乾燥バイアル中に調製した。化合物１０の混濁溶液を、乾燥シリンジを用いて攪拌を継続しながら脂質溶液に加えた。反応物を遮光して１０時間攪拌した。ＴＬＣ（溶媒：ＣＨＣｌ３、ＣＨ３ＯＨ、Ｈ２Ｏ及びＣＨ３ＣＯＯＨ（７３：２７：４：１））は、開始物質が完全に消滅したことを示した（Ｒｆ＝０．５３）。１つの主産物（Ｒｆ＝０．２）及び５つの副産物（Ｒｆ＜０．１６）があった。溶媒を蒸発により除去し、高真空下で２４時間乾燥させた。粗産物を、順相ＨＰＬＣで、粗調製用シリカカラムを用いて精製した。流速５ｍＬ／分、isocratic移動相ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＯＯＨ（７３／２７／４／１）。主産物を含む画分（ｔＲ＝３５〜３７分）を併せ、蒸発させて溶媒を除去し、高真空下で２４時間乾燥させ、３５．５ｍｇ（２６．５％）の所望の産物（１２）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ（１／１））：δ７．７４（６Ｈ，ｂｍ，Ａｒ−Ｈ），６．９６（６Ｈ，ｂｍ，Ａｒ−Ｈ），４．５９，４．２０，３．８０，３．６１，３．３２，２．６８，２．２０，２．０５，１．９４，１．４２（オーバーラップしたピーク，１６７Ｈ，ｂｍ，全てのＣＨ及びＣＨ２），０．８４（６Ｈ，ｔ，ＣＨ３）。高分解ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ：ｍ／ｚ２６８１．４７１１（Ｃ１３０Ｈ２０９Ｎ２５Ｏ２９Ｓ３＋Ｈ，ｍ／ｚ２６８１．４８８２について計算）。
【実施例３】
【０１９１】
［（ＰＤＡ−ＰＥＧ３）２−ＤＴＰＡ−（ＣＯＮＨＰＭ）３］（１２）、インテグリンアゴニストに接合した脂質キレーターの製造
ＤＴＰＡ−（ＣＯＯＨ）３（１１）（６９ｍｇ，５０μモル）を、先に炎で乾燥しアルゴンを充填した３クビ丸底フラスコ中の無水ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）、無水ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）及びＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）に溶解した。この溶液にＢＯＰ試薬（１３４ｍｇ、１５０μモル）を加え、５分間十分に攪拌した。化合物１０の溶液（６９ｍｇ、１５０μモル）を、アルゴンを充填した乾燥バイアル中で、無水ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）と無水ＤＭＦ（２ｍＬ）との混合物の状態で調製した。化合物１０の溶液を、乾燥シリンジを用いて攪拌を継続しながら脂質溶液に加えた。反応物を遮光して１０時間攪拌した。ＴＬＣ（溶媒：ＣＨＣｌ３、ＣＨ３ＯＨ、Ｈ２Ｏ及びＣＨ３ＣＯＯＨ）は、開始物質が完全に消滅したことを示した（Ｒｆ＝０．５３）。１つの主産物（Ｒｆ＝０．２）と５つの副産物（Ｒｆ＜０．１８）があった。溶媒をスピン蒸発により除去し、高真空下で２４時間乾燥させた。粗産物を、順相ＨＰＬＣで、粗調整用シリカカラムを用いて、流速５ｍＬ／分で精製した。濃度勾配系：開始１００％ＣＨＣｌ３で５分、次に７５％ＣＨＣｌ３／２５％ＣＨ３ＯＨで１０分、次に５０％ＣＨＣｌ３／５０％ＣＨ３ＯＨで１０分、次に２５％ＣＨＣｌ３／７５％ＣＨ３ＯＨで１０分、そして最後に１００％ＣＨ３ＯＨで２０分。主産物を含む画分（ｔＲ＝３５〜３７分）を併せ、スピン蒸発して溶媒を除去し、高真空下で２４時間乾燥させ、３５．５ｍｇ（２６．５％）の所望の産物を得た。高分解ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ：ｍ／ｚ２６８１．４７１１（Ｃ１３０Ｈ２０９Ｎ２５Ｏ２９Ｓ３＋Ｈ，ｍ／ｚ２６８１．４８８２について計算）。
【実施例４】
【０１９２】
常磁性重合ナノ粒子（ＰＶ１からＰＶ６）の製造
有機溶媒（１：１のＣＨＣｌ３及びＣＨ３ＯＨ）に溶解させた適量の精製脂質成分（１２，１３，１４及び１５）を併せた。溶媒を蒸発させ、残渣を真空で遮光して２４時間乾燥させた。蒸留脱イオン水を加え、脂質濃度で３０ｍＭの不均質溶液を得た。次に脂質／水混合物をプローブチップソニケータで少なくとも１時間超音波処理して溶液を透明にした。超音波処理のあいだ、溶液のｐＨを１ＮＮａＯＨ溶液で７．０〜７．５に維持した。温度は、超音波処理で発生した熱でゲル−液晶相転移点（Ｔｍ）より上に維持した。リポソームを重合させるために、リポソーム溶液を湿潤氷床上に静置したペトリ皿に移し、０℃まで冷却し、ペトリ皿の上１ｃｍの位置に置いた小型ＵＶランプを用いて２５４ｎｍで少なくとも１時間照射し、ＰＶを生成した。次にＰＶを０．２μｍフィルターでろ過して回収した。ＰＶの組成及び物理的性質を表Ｚに示す。
【実施例５】
【０１９３】
インテグリンに結合した重合ナノ粒子
インテグリンを標的指向する際のＰＶの有用性を評価するために、表ＺにまとめたようにＰＶを構築し、ユーロピウムで標識した。精製αｖβ３を９６穴プレート上にコーティングし、ＰＶを加えて室温でインキュベートすることにより、インテグリン結合性を測定した。未結合ＰＶをバッファーで洗浄することにより除去し、ＰＶ中のユーロピウムの時間分解蛍光を用いて結合ＰＶを測定した（Wallac, Gaitherburg, MD 20877 USA）。１０モル％の化合物１２を含有する材料（ＰＶ１及びＰＶ５）が、インテグリンαｖβ３に対して最も高い親和性示した。
【０１９４】
インテグリン結合競合アッセイでは、αｖβ３に対するＰＶの結合を５０％阻害するために、ＰＶ（ＰＶ１〜ＰＶ５）を種々の濃度の化合物１０と混合させた。報告した値は４回の試験の平均値であり、最大標準誤差は±３である。このアッセイの概要を図１８Ａ−１８Ｂに示す。
【実施例６】
【０１９５】
細胞接着阻害のｉｎｖｉｔｒｏアッセイ
細胞接着阻害研究を、ビトロネクチンでコーティングしたプレート上で、ヒトメラノーマ細胞株M21を用いて行った（Wu, et al., Methods in Molecular Biology: Integrin Protocols; Howlett, Ed.; Humana Press: Totowa, NJ, 1999; vol. 129, pp 211-217）。多価粒子複合体ＰＶＩ〜ＰＶ６及びモノマーリガンド１０を、別々にＭ２１細胞とインキュベートし、ビトロネクチンでコーティングした４８穴プレートに加えた。１時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、接着した細胞をクリスタルバイオレット溶液で染色し、５９０ｎｍでＯＤを測定した。測定したＯＤはビトロネクチンプレートに結合した細胞数に比例しており、各種製剤中のＰＶ表面の化合物１０の濃度に対してプロットし、ＩＣ５０を計算した。報告した値は４回の試験の平均値であり、最大標準誤差は０．０５である。
【０１９６】
遊離リガンド１０に対するＩＣ５０をＰＶ上のリガンド１０の濃度のＩＣ５０で割ることにより、多価性の効果を計算した。
【実施例７】
【０１９７】
腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ撮影における常磁性重合ナノ粒子の使用
１０〜１２週齢のＣ３Ｈ／Ｋｍマウスを麻酔し（ネンブタール（５８ｍｇ／ｋｇ））、右側腹部の体毛を剃り、ハンクス液（０．５ｍＬ）中の平均２×１０５の腫瘍細胞（マウスＭＫ５０４メラノーマ細胞）を、各マウスの右側腹部領域に２７Ｇ針で皮内注入した。マウスの腫瘍増殖をモニターした。腫瘍が１ｃｍのサイズに成長するのに約2週間を要した。腫瘍を有する２匹のマウスを２群に分けた。両群のＰＶを、先に記載されているように（Storrs, et al.,1995a; Haubner, et al., Cancer Res. (2001) 61: 1782-1785）放射性インジウム（１１１Ｉｎ）で標識し、次にマウスに尾静脈注入を介して投与した（０．１ｍｇの脂質／動物の体重（ｇ）；７．１μｇ／ｇのＰＶ表面上の化合物１０；１２．５μＣｉ／ｇ）。γシンチグラフィーによると、腫瘍中のＰＶ１の蓄積は、動物中に観察された全量の約５％±１％であった。第１群は静脈内ナノ粒子−インテグリンアンタゴニスト複合体ＰＶ１で処理し、第２群は静脈内ナノ粒子複合体ＰＶ４で処理した。結果を図２０Ａ−２０Ｅに示す。ＰＶ４で処理したマウスは、腫瘍内に顕著な増強が見られなかった（全量の＜０．５％）（図２０Ｄ−Ｅ）。ＰＶ１処理群のＰＶは、２４時間後であっても腫瘍に増強が見られた（図２１Ｂ−Ｃ）。これは、多価性が、ｉｎｖｉｖｏで腫瘍部位に安定なＰＶ１の複合体生じさせたことを示している（補助材料を参照されたい）。これらの結果は、多価ＰＶをｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を標的指向するのに用いることができ、材料は２４時間後であっても腫瘍内に保持されることを証明している。したがって、これらの材料は、ｉｎｖｉｖｏでインテグリンに対し高親和性を示す、空間的及び時間的撮像剤として役立つことができる。
【実施例８】
【０１９８】
インテグリン−標的指向脂質及び硫酸アンモニウムを含有するインテグリン−標的指向リポソームの製造
ビスＴ−ＰＣ１３（５００ｍｇ、５４６．９μモル、９５モル％）を、清潔な１００ｍｌの丸底フラスコ中に秤り取った。キレーター脂質１５（３．１５ｍｌ、３１．５ｍｇ、２３μモル、４モル％）及びＲＧＤ疑似ペプチド脂質１２（１．５４ｍｌ、１５．４ｍｇ、５．７４μモル、１モル％）をガラスシリンジでフラスコに加えた。クロロホルムをロータリーエバポレーションで除去した。脂質フィルムを、６５℃の水浴中のフラスコを回転させながら、２０ｍｌの２５０ｍＭ硫酸アンモニウム及び１９０μＬの０．５ＮＮａＯＨで水和させた。押し出しの直前に脂質懸濁液を１００ｍＬフラスコ内で短時間超音波処理して凝集物のサイズを小さくし、次に押し出し機に移した。脂質懸濁液を、連続的に孔径の小さくなる一連のポリカーボネート（ＰＣ）膜を通して押し出した。９０℃に維持した１０ｍｌの熱障壁押し出し機を２枚の重ねた膜と適合させ、脂質懸濁液を３００〜６００ｐ．ｓ．ｉ．のアルゴンを用いて１００ｎｍの膜、次に５０ｎｍの膜、最後に３０ｎｍの膜を通して押し出した。小胞を透析カセットに移し、１０％スクロースに対して透析した（２×１８００ｍｌ、４時間）。動的光散乱により測定したいサイズは約６０ｎｍであった。
【実施例９】
【０１９９】
インテグリン−標的指向脂質及びクエン酸ナトリウムを含有するインテグリン−標的指向リポソームの製造
ビスＴ−ＰＣ１３（９１．４ｍｇ、９９．９６μモル、９５モル％）、キレーター脂質１５（５．８ｍｇ、４．２４μモル、４モル％）及びＲＧＤ疑似ペプチド脂質１２（２．８ｍｇ、１．０４μモル、１モル％）を、１００ｍＬフラスコに加え、１０ｍｌのクロロホルムに溶解した。クロロホルムをロータリーエバポレーションを用いて、６５℃で６０分間蒸発させ、１０ｍｌの０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４を濃縮した脂質に加えた。不均質溶液をアセトン／ドライアイスで凍結させ、６５℃の水浴中で融解させた。この工程を４回繰り返し、溶液を、熱障壁押し出し機により、２枚の０．１μｍフィルターを通して６５℃で３回押し出し、続いて２枚の０．０５μｍフィルターを通して６回押し出した。動的光散乱で測定したサイズは８０ｎｍであった。
【実施例１０】
【０２００】
硫酸アンモニウムを含有する非標的指向リポソームの製造
非標的指向リポソームを、インテグリン−標的指向脂質を使用しない以外は実施例８に記載されているのと同様にして製造した。キレーター脂質１５のモル％は５％であった。あるいは、１モル％のトリアルギニン脂質１８を含有する非標的指向小胞（図３４）を、ＲＧＤ疑似ペプチド脂質１２を抜いた以外は実施例８に記載されているのと同様にして製造した。
【実施例１１】
【０２０１】
１０％ドキソルビシンを含有するインテグリン−標的化小胞の製造
実施例８の硫酸アンモニウムを含有するインテグリン−標的化リポソーム（２ｍＬ、６０ｍｇ）を１２×１００ｍｍのガラス培養チューブ中に入れ、１０％スクロース中のドキソルビシン６００μｌ（６ｍｇ）を加えた。混合物を６５℃で５分間インキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ドキソルビシンの添加が定量的であったことを示した。ＳＥＣ解析は、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを用いて、ドキソルビシン添加混合物からのサンプル１００μｌをセファロースＣＬ４Ｂカラム（１．５×６ｃｍ）に加えることにより行った。混合物を１０％スクロースで希釈し、最終小胞濃度１５ｍｇ／ｍｌを得た。これらの小胞は１０重量％のドキソルビシンを含有する。動的光散乱で測定したサイズは６０〜６５ｎｍであった。
【実施例１２】
【０２０２】
１％ドキソルビシンを含有するインテグリン−標的化小胞の製造
実施例８の硫酸アンモニウムを含有するインテグリン−標的化リポソーム（２ｍＬ、６０ｍｇ）を、１２×１００ｍｍのガラス培養チューブに入れ、６０μｌ（０．６ｍｇ）のドキソルビシン溶液を加えた。チューブを水浴中に浸し、６５℃で５分間維持した。混合物を１０％スクロースで希釈し、最終小胞濃度１５ｍｇ／ｍｌを得た。ＳＥＣ解析は、実施例１１に記載されているようにして行い、添加した全てのドキソルビシンがリポソームに被包されたことを示した。．これらの小胞は１重量％のドキソルビシンを含有する。動的光散乱で測定したサイズは６０〜６５ｎｍであった。
【実施例１３】
【０２０３】
２０％ドキソルビシンを含有するインテグリン−標的化小胞の製造
実施例９のクエン酸塩を含有するインテグリン−標的化小胞の溶液を、１ＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４及び水酸化ナトリウムでｐＨ８に調製した。この溶液に、ｐＨ８で１ｍｌ（１０ｍｇ）の小胞あたり、２００μｌのドキソルビシンを加え（１０％スクロース中に１０ｍｇ／ｍｌ）、溶液を６５℃で７分間水浴中でインキュベートした。ＳＥＣ解析は実施例１２に記載されるようにして行い、添加した全てのドキソルビシンがリポソームに被包されたことを示した。動的光散乱で測定したサイズは９３ｎｍであった。
【実施例１４】
【０２０４】
１０％ドキソルビシンを含有する非標的指向リポソームの製造
実施例１０の小胞（６０ｍｇ、２ｍｌ）を、１２×１００ｍｍのガラス培養チューブに入れ、６００μｌのドキソルビシン溶液（１０％スクロース中に１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。チューブを水浴中に浸し、６５℃で５分間維持した。混合物を１０％スクロースで希釈し、最終小胞濃度１５ｍｇ／ｍｌを得た。ＳＥＣ解析は実施例１２に記載されるようにして行い、添加した全てのドキソルビシンがリポソームに被包されたことを示した。これらの小胞は１０重量％のドキソルビシンを含有する。
【実施例１５】
【０２０５】
Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥ及び硫酸アンモニウムを含有する小胞の製造
ビスＴ−ＰＣ（１ｇ、１０９３．７μモル、９５モル％）及びＮ−スクシニル−ＤＰＰＥ（４７ｍｇ、５７．６μモル、５モル％）を、清潔な１００ｍｌの丸底フラスコに秤り取り、２０ｍｌのクロロホルムに溶解させた。クロロホルムをロータリーエバポレ−ションで除去した。脂質フィルムを、６５℃の水浴中でフラスコを回転させながら、４０ｍｌの２５０ｍＭ硫酸アンモニウム及び５００μｌの０．５ＮＮａＯＨに水和させた。水和後のｐＨは７．５であった。小胞は、熱障壁押し出し機を用いて、孔径１００ｎｍ（４００ｐｓｉ アルゴン）、次に５０ｎｍ（４００ｐｓｉ アルゴン）、最後に３０ｎｍ（７００ｐｓｉアルゴン）の２枚の重ねた膜に溶液を通すことにより、６５℃で製造した。小胞を透析カセットに移し、１０％スクロースに対して透析した。動的光散乱により測定したサイズは約６８ｎｍであった。この工程を用いて、水酸化ナトリウムを添加することなく、１０モル％のＮ−スクシニル−ＤＰＰＥ脂質を含有する小胞、５０モル％のジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）又はジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を含有する小胞、及び４０モル％のコレステロールを含有する小胞を製造することもできる。
【実施例１６】
【０２０６】
Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥを含有する小胞の製造
実施例１５と同一の小胞を硫酸アンモニウムなしで調製した。
【実施例１７】
【０２０７】
アミノデキストラン−小胞結合体の製造
９５モル％の１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ビスＴ−ＰＣ１３、Avanti Polar Lipids）及び５モル％のＤＴＰＡ脂質誘導体１３を用いて製造した小胞を、以下のようにしてアミノデキストランで被包した：小胞（１０ｍｌ、２５０ｍｇ）を、５ｍｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ８中で攪拌されたアミノデキストラン（アミンで修飾した分子量１０，０００のデキストラン、Molecular Probes、product D-1860、５００ｍｇ、デキストランポリマー当たり３アミノ基）に滴下した。２００μｌの水中のＥＤＡＣ（Aldrich 16146-2、エチルジメチルアミノジプロピルカルボジイミドＨＣｌ塩、６ｍｇ）を、コーティング混合物に攪拌しながら滴下した。混合物を室温で一晩攪拌した。透明な反応混合物を、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳで平衡化したセファロースＣＬ４Ｂカラム（２．５×３０ｃｍ、Amersham Pharmacia Biotech AB product 17-0150-01）カラムでサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。被包小胞が溶出し始めたとき、４ｍｌ画分を回収した。ピーク画分（２〜６）をプールし、０．４５μｍフィルター（Nalgene ２５ｍｍシリンジフィルター、product 190-2545）でろ過し、続いて０．２μｍフィルター（Nalgene ２５ｍｍシリンジフィルター、product 190-2520）でろ過した。被包小胞の濃度を、９０℃に維持したオーブンでサンプルを一定重量まで乾燥することにより測定した。
【実施例１８】
【０２０８】
アミノデキストラン−小胞結合体のスクシニル化
１０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４中の実施例１７のアミノデキストラン−被包小胞（１５ｍｌ、４６５ｍｇ）を等量の２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーで希釈し、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで８に調製した。無水コハク酸（Aldrich product 23、969-0、278mg）を１ｍｌ ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（Aldrich product 27685-5））に溶解し、100μｌのアリコートを被包−小胞懸濁液に急速に攪拌しながら加えた。ｐＨをモニターし、１Ｎ ＮａＯＨを加えて、ｐＨを７．５〜８に維持するために必要な調製をした。無水コハク酸の最終添加の後、混合物を室温で１時間攪拌し、次に透析カセットに移し、１０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４に対して透析した。
【実施例１９】
【０２０９】
ＲＧＤ疑似ペプチドのスクシニル化デキストラン−小胞結合体へのカップリング
実施例１８のスクシニル化アミノデキストランで被包された小胞（６．９ｍｌの水中に２００ｍｇ）及びαｖβ３インテグリン−標的指向薬剤１２（１ｍｌの水中に４０ｍｇ）を、水（６．１ｍｌ）、１ＭＮａＣｌ（３ｍｌ）及び５００ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ６（２ｍｌ）と混合した。ＥＤＡＣ（１９．２ｍｇ、１ｍｌ）を加えた。溶液を混合し、室温で１８時間インキュベートした。反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーで解析したところ、カップリング生成は約３０〜５０％であった。結合体を５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．４を含有する３．５Ｌの５０ｍＭ ヒスチジンバッファー中の１０ＫＭＷＣＯカセットで８時間及び１８時間の２回透析した。
【実施例２０】
【０２１０】
脂質ベースの、パクリタキセル含有インテグリン−標的化粒子の製造
インテグリン−標的指向脂質１２を含有するインテグリン−標的化パクリタキセル粒子を硫酸アンモニウムを使用せずに実施例８に記載されているようにして作製する。例えば、ビスＴ−ＰＣ１３、キレーター脂質１５、インテグリン標的指向脂質１２及び４．５％ｗ／ｗパクリタキセルを含有する１００ｍｇの小胞の製造を、９０．７ｍｇビスＴ−ＰＣ、６．５ｍｇ ＰＤＡ−ＤＴＰＡ、２．８ｍｇ インテグリン−標的指向脂質及び４．５ｍｇ パクリタキセルを用いて達成した。ＨＰＬＣ解析も、この工程がパクリタキセル分解の結果ではないことを示しており、サイズは６３ｎｍであった。
【実施例２１】
【０２１１】
パクリタキセル及びＤＭＰＣを含有するＲＧＤ疑似ペプチド小胞の製造
以下の手順を用いて、１〜１０重量％パクリタキセルを含有する小胞を製造することができる。クロロホルム中のＤＭＰＣ（４２．５ｍｇ、６２．７μモル；Avanti）、１：１ クロロホルム／メタノール中のＮ−スクシニル−ＤＰＰＥ（５ｍｇ、６．１μモル；Avanti）、及びクロロホルム中のパクリタキセル（２．５ｍｇ、２．９μモル；Sigma）を丸底フラスコに入れた。全量を５ｍＬとした。溶媒をロータリーエバポレーションにより４８℃で除去した。真空で乾燥した脂質を、５ｍｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４で、４８℃の水浴中で混合しながら水和させた。混合物を、５０ｎｍポリカーボネートtrack-etchedフィルター（Osmonics）を用いて、７００ｐｓｉの圧力のアルゴンを負荷することにより、Lipex １０ｍｌ熱障壁押し出し機を通して４８℃で押し出した。この工程を５回繰り返し、続いて５０ｎｍフィルターで５回押し出した。動的光散乱で測定したサイズは７３ｎｍであった。ＲＧＤ疑似ペプチド１０を、小胞中のＮ−スクシニル−ＤＰＰＥ脂質のカルボキシル基を疑似ペプチドの存在下でＥＤＣで活性化することにより、タキソール含有小胞に付着させた。あるいは、小胞をＥＤＣで活性化し、疑似ペプチドを添加してもよく、又は小胞をＥＤＣで活性化し、残留ＥＤＣをサイズ排除クロマトグラフィーで除去し、疑似ペプチドを活性化小胞に添加してもよい。典型的な手順においては、小胞（１５ｍｇ、１ｍＭカルボキシル基）、疑似ペプチド１０（２ｍＭ）及びＥＤＣ（５ｍＭ）を、１．５ｍＬポリプロピレンチューブ中、室温で、１．５ｍＬの容量でインキュベートする。結合体を５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４（１０Ｋ ＭＷＣＯ透析カセット）に対して透析し、未反応疑似ペプチドを除去する。付着をＳＥＣ解析によりモニターしたところ、図２２に示すようにパクリタキセルを含有するＲＧＤ疑似ペプチド−小胞結合体はビオチン化フィブリノーゲンの結合を阻害していた。
【実施例２２】
【０２１２】
パクリタキセル、ＤＭＰＣ及びコレステロールを含有するＲＧＤ疑似ペプチド小胞の製造
成分がＤＭＰＣ（３０．８ｍｇ、４５．４μモル）、Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥ（５ｍｇ、６．１μモル；Avanti）、コレステロール（１１．７ｍｇ、３０．３μモル）及びパクリタキセル（２．５ｍｇ、２．９μモル；Sigma）である以外は実施例２１と同一の小胞を製造した。動的光散乱で測定したサイズは８５．３ｎｍであった。
【実施例２３】
【０２１３】
パクリタキセル及びＤＰＰＣを含有するＲＧＤ疑似ペプチド小胞の製造
成分がＤＰＰＣ（４２．５ｍｇ、５７．９μモル）、Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥ（５ｍｇ、６．１μモル；Avanti）及びパクリタキセル（２．５ｍｇ、２．９μモル；Sigma）である以外は実施例２１と同一の小胞を製造した。動的光散乱で測定したサイズは８０．０ｎｍであった。
【実施例２４】
【０２１４】
タキソール、ＤＰＰＣ及びコレステロールを含有するＲＧＤ疑似ペプチド小胞の製造
成分がＤＰＰＣ（３１．４ｍｇ、４２．８μモル）、Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥ（５ｍｇ、６．１μモル；Avanti）、コレステロール（１１．ｌｍｇ、２８．６μモル）及びパクリタキセル（２．５ｍｇ、２．９μモル；Sigma）である以外は実施例２１と同一の小胞を製造した。動的光散乱で測定したサイズは９１．１ｎｍであった。
【実施例２５】
【０２１５】
工程１によるドキソルビシンを含有するＲＧＤ疑似ペプチド−デキストラン−小胞結合体の製造
ビスＴ−ＰＣ（１ｇ、１０９３．７μモル、９５モル％）及びＮ−スクシニル−ＤＰＰＥ（４７ｍｇ、５７．６μモル、５モル％）を含有する乾燥した脂質フィルムを、クロロホルム溶液のロータリーエバポレーションにより製造した。乾燥したフィルムを２５０ｍＭ硫酸アンモニウムの添加し、６５℃の水浴中で３０分間暖めることにより水和した。次に水和した脂質懸濁液を、連続して孔径の小さくなる一連のポリカーボネートtrack etchedフィルターメンブレンを通して、６５℃に維持した熱障壁押し出し機を用いて押し出した。押し出しは１００ｎｍ孔サイズフィルターで開始し、３０ｎｍ孔サイズフィルターで終わらせた。過剰の硫酸アンモニウムを１０％スクロース溶液で透析することにより除去した。小胞をアミノデキストランで被包し、スクシニル化し、実施例１７〜１９に記載される手順によりインテグリンアンタゴニスト１０とカップリングさせた。ドキソルビシンを、ドキソルビシンのスクロース溶液とともに混合し、混合物を６５℃で５分間暖めることにより小胞に負荷した。典型的な製造において、１０％スクロース溶液中のドキソルビシン１０ｍｇ／ｍＬを、硫酸アンモニウムを含有する１ｍＬの小胞に加えた。添加したドキソルビシンの完全な取り込みは、ＳＥＣによりセファロースＣＬ４Ｂカラム上で解析した。平衡化及び溶出は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で行った。
【実施例２６】
【０２１６】
工程２によるドキソルビシンを含有するＲＧＤ疑似ペプチド−デキストラン−小胞結合体の製造
ビスＴ−ＰＣ（１ｇ、１０９３．７μモル、９５モル％）及びＮ−スクシニル−ＤＰＰＥを含有するスクシニル化デキストラン−被包小胞を、硫酸アンモニウムを使用しない以外は実施例２０に記載されているようにして製造した。ＲＧＤ疑似体１０を、実施例１９に記載されるようにしてこれらの小胞とカップリングさせた。得られたＲＧＤ疑似体−デキストラン小胞結合体を、２５０ｍＭ硫酸アンモニウム溶液に懸濁し、６５℃で３０分間加熱した。過剰の硫酸アンモニウムを１０％スクロース溶液で透析することにより除去した。ドキソルビシンを、ドキソルビシンのスクロース溶液と混合し、混合物を６５℃で５分間暖めることにより小胞に負荷した。典型的な製造において、１０％スクロース溶液中のドキソルビシン１０ｍｇ／ｍｌを硫酸アンモニウムを含有する１ｍｌの小胞に加えた。添加したドキソルビシンの完全な取り込みを、セファロースＣＬ４Ｂカラム上でＳＥＣにより確認した。平衡化及び溶出は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で行った。
【実施例２７】
【０２１７】
ドキソルビシンを含有するインテグリン−標的化リポソームの製造
αＶβ３インテグリン−結合ＲＧＤ疑似ペプチド１０を、実施例１９に記載されている方法を用いて、硫酸アンモニウムを含有するリポソーム（実施例１５）に付着させた。例えば、疑似ペプチドを、最終濃度５ｍＭまでＥＤＡＣを添加し、続いて２当量の疑似ペプチド１０を添加することにより、５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７中で、Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥ、ＤＭＰＣ及びコレステロールをモル比１０／５０／４０で含有する、硫酸アンモニウムを負荷した小胞に付着させ、脂質１ｍｇ当たり約１４μｇの疑似ペプチドを含有する小胞を生成した。
【実施例２８】
【０２１８】
９０Ｙの疑似ペプチド−小胞複合体への付着
キレーター脂質１５を含有する疑似ペプチド−小胞複合体を、５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭヒスチジンバッファー中で、以下の手順により９０Ｙで標識する。５０ｍＭＨＣｌ（NEN Life Science Products）中の塩化イットリウム−９０を約２０ｍＣｉ／ｍＬを含有する希釈標準溶液に希釈した。１００μＬのインテグリン−標的化小胞（０．１〜５０ｍｇ／ｍＬ）に、約１００〜２５０μＣｉの塩化イットリウム−９０（NEN Life Science Products）を加え、ボルテックスミキサーで混合し、室温で３０分間インキュベートした。２重で、治療用小胞への％９０Ｙ結合を、１００μＬの９０Ｙ−小胞複合体を１００ｋＭＷＣＯ Ｎａｎｏｓｅｐ（商標）（Pall Filtron）フィルターに加えることにより測定した。フィルター集合体をマイクロ遠心器で、４０００ｒｐｍ、１時間、又は全ての溶液がフィルターを通過するまで遠心した。集合体中の「全９０Ｙ」をＣａｐｉｎｔｅｃＣＲＣ−１５Ｒ線量計を用いて測定した。集合体のフィルター部分を取り外し、廃棄した。線量計を用いて、フィルターを通過した「未結合９０Ｙ」を含有する集合体の残留部分をカウントした。「結合９０Ｙ」は、「全９０Ｙ」から「未結合９０Ｙ」を引くことにより決定した。％９０Ｙ結合は「結合９０Ｙ」を「全９０Ｙ」で割り、１００を掛けることにより決定した。
【実施例２９】
【０２１９】
マウスメラノーマモデルにおける９０Ｙ−疑似ペプチド−小胞複合体の抗腫瘍有効性の研究
Ｋ１７３５−Ｍ２マウスメラノーマモデルを、先に記載されているようにして（X. Li, et al. Irzvasion 転移 1998,18,1-14）、腫瘍細胞の皮下注射により作製した。動物にプラセボ又は治療剤の単回静注をし、腫瘍が４倍のサイズになるまで腫瘍容積を測定した。腫瘍を以下のようにしてマウスに誘発した：腫瘍を、約１×１０６のＫ１７３５Ｍ２メラノーマ細胞を皮下注射することにより移植した（X. Li, B. Chen, S. D. Blystone, K. P. McHugh, F. P. Ross, D. M. Ramos, Differential 発現 of alpha v integrins in K1735 melanoma cells. Invasion 転移 18(1) (1998) 1-14）。Ｋ１７３５ Ｍ２腫瘍細胞は、組織培養フラスコ内の１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ培地中で増殖させた。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン含有）を用いて回収し、ＰＢＳに１０，０００，０００／ｍｌで再懸濁し、氷上に維持した。１００〜２００ｍｍ３の腫瘍をもつ動物を表Ｉに記載される治療のために選択した。
【０２２０】
【表４】
2004535407.tif 000008
【０２２１】
図２３は、この研究で得られた、正規化した腫瘍容積データを示す。治療後７日がこの研究で全ての動物が生存していた最後の日であった。以下の図２４は、治療後７日に治療群により分類された各動物についての正規化した腫瘍容積を示す。
【０２２２】
治療後７日の正規化した腫瘍容積を分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びKruskal-Wallis統計的検定で比較した。これらの検定により、治療群間で観察された差が偶然によるものか否かを決定する。ＡＮＯＶＡは治療手段の均一性を検定する。ＡＮＯＶＡは、データ中に有意な外れ値がない場合に最も信頼できる。一方、Kruskal-Wallis検定は、他の治療と比較される所定の群の腫瘍の順序又は階級を考慮し、したがって外れ値の影響を最小化する。Kruskal-Wallis検定は治療母集団の中央値に有意差を探し出し、データが有意な外れ値を含む場合により信頼できる。
【０２２３】
治療後７日の正規化した腫瘍容積について、ＡＮＯＶＡ検定のＰ値は０．０５２であった。Kruskal-Wallis検定のＰ値は０．１６７であった。これら検定のいずれも95%の信頼レベルで有意である。図23及び図24が示すように、この研究は、有効性に差がない多くの対照群を含む。多くの治療群が統計的検定の結果を希釈しているか否かを決定するために、いくつかのあまり差のない対照群を排除後に、検定を繰り返した。バッファーのみ、ＩＡ−ＮＰ、ＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０（２．５）及びＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０（５）治療を比較すると、Ｐ値が実質的に向上している（ＡＮＯＶＡ検定で０．００９、及びKruskal-Wallis検定で０．０３４）。これは、この換算比較において、少なくとも１つの有意に異なる治療があることを示している。
【０２２４】
異なる統計的手順により、異なる治療群の１組ずつ又は１対１の比較を行った。結果は、バッファーによる治療と比較した場合、ＩＡ−ＮＰ及びＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０（２．５）治療が、データをどのように解析するかにより、有意に低い正規化した腫瘍容積を有するであろうことを示している。一方、バッファーによる治療と比較した場合、採用した統計的検定にかかわらず、ＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０（５）による治療は有意に低い正規化した腫瘍容積を生ずる。
【０２２５】
腫瘍増殖遅延もこの研究の有効性をモニターするのに用いられる。腫瘍増殖遅延は、所定の腫瘍が、治療の日に測定した腫瘍容積と比較して４倍の容積に増加するのに要する時間として定義される（腫瘍体積４倍時間又はＴＶＱＴ）。４倍に増殖するための正確な時間は、２つの近接した時間点のあいだに線を引くことにより推定される。図２３にこの研究の増殖遅延データをまとめる。
【０２２６】
再度ＡＮＯＶＡ及びKruskal-Wallis検定を用いて、ＴＶＱＴ値を異なる治療群と比較する。両検定に関連するＰ値は非常に有意であった（Kruskal-Wallis検定で０．００１、及びＡＮＯＶＡで＜０．０００５）。異なる治療群で１組ずつ比較すると、より高い放射用量（５μＣｉ／ｇ）でのＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０による治療が、バッファー、ＩＡ並びに低及び高ＩＡ−ＮＰ治療と有意に異なることを示している。以下の表ＩＩＩに、Tukey's Wの１組ずつの比較手順の結果を示す。これらの結果は、非パラメトリック統計的検定でも確認された。
【０２２７】
【表５】
2004535407.tif 000009
【０２２８】
治療後８日に、組織染色のため、各治療群から１つの腫瘍をランダムに選択した。腫瘍を再切開し、液体窒素温度のイソペンタン中で凍結させた。
Marin Biologic Laboratories, Inc. in Tiburon CA は、resceted腫瘍について、ＴＵＮＥＬアッセイ、フォンビルブラント因子及びＨ＆Ｅ染色を行った。ＴＵＮＥＬアッセイの結果は、Ｈｉｓｔ／Ｃｉｔバッファー、ＩＡ、及びＮＰ−Ｙ９０  ２．５μＣｉ／ｇ処置はほとんど健康な細胞となったことを示し、一方、ＩＡ−ＮＰ、ＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０  ２．５μＣｉ／ｇ、及びＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０  ５μＣｉ／ｇはアポトーシス及び細胞死を増加させたことを示している。
【０２２９】
５μＣｉ／ｇのＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０を用いた治療は、この腫瘍モデルにおいて有意に腫瘍増殖を減少させる（有意性は９５％の信頼レベルで確立された）。平均して、５μＣｉ／ｇのＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０で処置した腫瘍に対する正規化した腫瘍容積は、バッファーで処置した腫瘍と比較して半分より小さい。加えて、５μＣｉ／ｇのＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０で処置した腫瘍に対する平均ＴＶＱＴは、バッファーで処置した腫瘍の６．４日に対し、１５．０日である。腫瘍サンプルの組織学的研究はこの結果を裏付けるものである。
【０２３０】
興味深いことに、メラノーマ細胞は比較的放射線療法に耐性であることが知られている。このタイプの標的化療法は、最終分化して一般的に安定な内皮細胞上の新生血管細胞表面マーカーの存在のみに依拠している。
【実施例３０】
【０２３１】
マウスメラノーマモデルにおける疑似ペプチド−デキストラン−小胞９０Ｙ複合体の抗腫瘍有効性の研究
デキストランで被包した小胞を、実施例２９に記載されているようにしてマウスメラノーマモデルにおいても試験した。結果を図２６に示す。これらの研究のためにビスＴ−ＰＣ及びキレーター脂質１５を含有するデキストラン−被包小胞を用い、それらは実施例１７〜１９に記載されているようにして調製し、実施例２８に記載されているようにしてイットリウム−９０で標識した。
【実施例３１】
【０２３２】
マウス大腸癌モデルにおける疑似ペプチド−小胞−９０Ｙ複合体の抗腫瘍有効性の研究
この研究において、先に報告されているように皮下注射により雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植されたＣＴ−２６大腸癌細胞株（H. N., Moehler, T., Siang, R., Jonczyk, A., Gillies, S. D., Cheresh, D. A., Reisfeld, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 1591-1596, 1999）を用いて、Targesomeの放射性薬剤の抗腫瘍活性を評価した。この研究の目的は、IA-NP-Y90 複合体の単回静脈内投与の潜在的抗腫瘍効果を調査することである。
【０２３３】
腫瘍は、約１×１０６ＣＴ−２６細胞の皮下注射により移植した。ＣＴ−２６腫瘍細胞は、組織培養フラスコで、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコ培地中で増殖させた。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン含有）を用いて細胞を回収し、ＰＢＳに１０，０００，０００／ｍｌで再懸濁し、氷上に維持する。
【０２３４】
【表６】
2004535407.tif 000010
【０２３５】
図２７に正規化した腫瘍容積データをまとめる。８日目が研究に用いた全動物が生存していた最終日である。治療群間の差を分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びKruskal-Wallis統計的検定を用いて比較した。８日目の正規化した腫瘍容積の場合、ＡＮＯＶＡ及びKruskal-Wallis検定のＰ値は０．０００５以下である。この研究における治療間で有意に差があるというのが妥当な結論である。いずれの治療群にもＡＮＯＶＡ解析の結果をゆがめるかもしれない大きな外れ値はなかった。このため、ＴｕｋｅｙのＷ法を用いて、どの治療が治療後８日に有意に異なる正規化した腫瘍容積を示すかを決定した。
【０２３６】
【表７】
2004535407.tif 000011
【０２３７】
表ＩＩＩが示すように、以下の治療間で治療後８日の正規化した腫瘍容積に有意差が存在する：
バッファーと、ＩＡ−ＮＰ、ＮＰ−Ｙ９０又はＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０との比較
ＩＡとＩＡ−ＮＰ又はＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０との比較
この研究の有効性をモニターするため、腫瘍増殖遅延も用いた。腫瘍増殖遅延とは、所定の腫瘍が治療日に測定した腫瘍容積と比較して４倍の大きさに増殖するのに必要とする時間として定義される。４倍に増殖するための正確な時間は、２つの近接する時間点間に線を引くことにより推定される。図２８にこの研究の増殖遅延データをまとめる。
【０２３８】
ＡＮＯＶＡ及びKruskal-Wallis検定に関連するＰ値はともに０．０００５以下であり、図２８に示す治療群間の差は偶然のみによるものではないことを示している。腫瘍増殖遅延データに外れ値はないため、チューキーの多重比較法を用いてどの治療が他と有意に異なるかを決定した。以下の表ＩＶはＴｕｋｅｙ法で得たＰ値を示す。
【０２３９】
【表８】
2004535407.tif 000012
【０２４０】
表ＩＶが示すように、以下の治療間の腫瘍増殖に有意差がある：
バッファーとＩＡ−ＮＰ、ＮＰ−Ｙ９０及びＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０との比較
ＩＡとＩＡ−ＮＰ、ＮＰ−Ｙ９０及びＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０との比較
ＩＡ−ＮＰをＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０と比較した（注、この比較に関連する差の値は他の差の比較よりも非常に小さい）。興味深いことに、この腫瘍タイプは放射線療法に耐性であることが知られている。Ｉｎｖｉｔｒｏ αｖβ３インテグリン結合アッセイ
キレーター脂質１５を含有するＲＧＤ疑似ペプチド−リポソーム結合体のインテグリン結合をｉｎｖｉｔｒｏで放射結合アッセイを用いて証明した。簡単に言えば、αｖβ３インテグリンでコーティングした９６穴プレートをＢＳＡでブロッキングした。０〜１００μｇ／ｍＬのアゴニスト−リポソーム−９０Ｙ複合体を含有するウサギ血清又はバッファーサンプルを添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴバッファーで３回洗浄し、Wallac Microbetaシンチレーションカウンターを用いて９０Ｙを測定した。
【実施例３２】
【０２４１】
パクリタキセル含有脂質ベース粒子の製造
以下の手順を用いて１〜１０重量％パクリタキセルを含有する小胞を製造することができる。９３．４ｍｇのビスＴ−ＰＣ１３、６．６ｍｇのキレーター脂質１５及び１ｍｇのパクリタキセル（Sigma）を秤取る。丸底フラスコに入れ、５ｍｌのクロロホルムを加える。脂質及びパクリタキセルをかき混ぜて溶かす。ドライアイス／アセトン冷却トラップを取り付けたロータリーエバポレーターに丸底フラスコを付け、フラスコを４８℃の水浴中に下げる。真空に引き、一方フラスコを回転させてクロロホルムを除去し、１時間真空を保つ。フラスコをロータリーエバポレーターから取り外し、１０ｍｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を加える。直ちにロータリーエバポレーターに戻し、水浴中で回転させて脂質を再懸濁する。４８℃の水浴に取り付けたサーモバーレルを含むＬｉｐｅｘの１０ｍｌ押し出し機をセットする。フィルターディスク（Poretics）を押し出し機内に置き、次に１００ｎｍポリカーボネートtrack-etchedフィルター（Osmonics）を置き、次にフィルターディスクそして更に１００ｎｍフィルターを置く。脂質混合物をピペットで取り押し出し機のバーレルに入れて５分待ち、押し出し機の温度と釣り合わせる。圧縮空気で７００ｐｓｉの圧力をかけて混合物を押し出す。この工程を３回繰り返し、次にトップフィルターを３０ｎｍフィルター（Osmonics）に取り替え、計４回押し出す。リポソーム溶液を、０．２μｍの界面活性剤のないセルロースアセテートシリンジフィルターを通してろ過し、１００μｌをポリスチレンキュベット中の３ｍｌの１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４で希釈し、Brookhaven ZetaPALSで動的光散乱によりサイズを測定することによりリポソームサイズを得る。パクリタキセルの定量化は逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、０．５ｍｌ／分７０％メタノール／３０％水、２２７ｎｍで検出）で行った。ＨＰＬＣ解析も、この工程がパクリタキセルの分解によるものではないことを示した。
【実施例３３】
【０２４２】
チロシンキナーゼインヒビターを含有する脂質ベース粒子の製造
以下の手順を用いて、１００ｍｇの組成物  ９５％モル／モル ビスＴ−ＰＣ１３、５％モル／モル キレーター脂質１５、及び１０％ｗ／ｗ ＡＧ１４３３（２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−６，７−ジメチルキノキサリン、Kroll and Waltenberger, 1997, J. Biol. Chem. 272, 32521; Strawn et al., 1996 Cancer Res. 56, 3540）又はＳＵ１４９８（（Ｅ）−３−（３，５−ジイソプロピル−ヒドロキシフェニル）−２−［（３−フェニル−Ｎ−プロピル）アミノ−カルボニル］アクリロニトリル、Strawn et al., 1996 Cancer Res. 56, 3540）を製造した。９３．４ｍｇのビスＴ−ＰＣ（Avanti)、６．６ｍｇのキレーター脂質１５及び１０ｍｇのＡＧ１４３３又はＳＵ１４９８（Calbiochem）を秤取る。丸底フラスコに入れ、１ｍｌのクロロホルム及び０．５ｍｌのメタノールを加える。脂質及び低分子をかき混ぜて溶かす。丸底フラスコを、ドライアイス／アセトン冷却トラップを取り付けたロータリーエバポレーターに付け、フラスコを６５℃の水浴中に下げる。真空に引き、一方フラスコを回転させてクロロホルムを除去し、真空を１時間保つ。フラスコをロータリーエバポレーターから取り外し、４ｍｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を加え、脂質を再懸濁する。９０℃の水浴に取り付けたサーモバーレルを含むＬｉｐｅｘの１０ｍｌ押し出し機，をセットする。フィルターディスク（Poretics）を押し出し機内に置き、次に５０ｎｍポリカーボネートtrack-etchedフィルター（Osmonics）を置き、次にフィルターディスクそして更に５０ｎｍフィルターを置く。脂質混合物をピペットで取り押し出し機のバーレルに入れ、圧縮空気で７００ｐｓｉの圧力をかけて混合物を押し出す。リポソーム溶液を、０．２μｍの界面活性剤のないセルロースアセテートシリンジフィルターを通してろ過し、１００μｌを、ポリスチレンキュベット中の３ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４で希釈し、Brookhaven ZetaPALSで測定することによりリポソームサイズを得る。インヒビターの定量化は逆相ＨＰＬＣ（ＣＩＳカラム、０．５ｍｌ／分７０％メタノール／３０％水、２２７ｎｍで検出）で行った。
【実施例３４】
【０２４３】
脂質ベースの、チロシンキナーゼインヒビターインテグリン−標的化粒子の製造
ＡＧ１４３３及びインテグリン−標的指向脂質１２を含有するインテグリン−標的化粒子は実施例３３に記載されているようにして製造する。例えば、ビスＴ−ＰＣ１３、キレーター脂質１５、インテグリン−標的指向脂質１２及び１２．７重量％ＡＧ１４３３を含有する１００ｍｇの小胞の製造は、９０．７ｍｇビスＴ−ＰＣ、６．５ｍｇキレーター脂質４、２．８ｍｇインテグリン標的指向脂質１２及び１２．７ｍｇＡＧ１４３３を用いて達成された。
【実施例３５】
【０２４４】
Ｋ１７３５−Ｍ２マウスメラノーマモデルの治療
Ｋ１７３５−Ｍ２マウスメラノーマモデルを、先に記載されているようにして（X. Li, et al. Invasion Metastasis 1998, 18, 1-14）、腫瘍細胞を皮下注射することにより作製した。動物にプラセボ又は治療剤の単回静注をし、腫瘍が４倍のサイズになるまで腫瘍容積を測定した。腫瘍は、以下のようにしてマウス内で誘発させた：腫瘍を約１×１０６Ｋ１７３５Ｍ２メラノーマ細胞を皮下注射することにより移植した（X. Li, B. Chen, S. D. Blystone, K. P. McHugh, F. P. Ross, D. M. Ramos、Ｋ１７３５メラノーマ細胞におけるαｖインテグリンのディファレンシャル発現。 Invasion Metastasis 18(1) (1998) 1-14）。K１７３５ Ｍ２腫瘍細胞は、組織培養フラスコ内の１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ培地中で増殖させた。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン含有）を用いて回収し、ＰＢＳ中に１０，０００，０００／ｍｌで再懸濁し、氷上に維持した。１００〜２００ｍｍ３の腫瘍を有する動物を選択して治療した。
【０２４５】
【表９】
2004535407.tif 000013
【実施例３６】
【０２４６】
細胞増殖アッセイで測定したｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性
標的化薬物送達を、小胞をＭＳ１マウス膵島内皮細胞及びＫ１７３５−Ｍ２ネズミメラノーマ腫瘍細胞とインキュベートすることによりｉｎｖｉｔｒｏで評価した。遊離ドキソルビシン又はリポソーム被包されたドキソルビシンの細胞に対する効果を、わずかに改変したクリスタルバイオレット染色方法により比色計でアッセイした。マウス内皮細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−２２７９）及びマウスメラノーマ細胞（Ｍ２）を９６穴平底マイクロタイタープレートに播いた。小胞の細胞増殖に対する効果を、コンフルエントに近い（約８０％）細胞を用いて測定した。各ウェル中の培地を、２５０μｇ／ｍｌのドキソルビシン含有小胞を含む１００μｌの培地に交換した。マウス内皮細胞及びメラノーマ細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーション１時間後、薬物を除去し、薬物のない競合培地を加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。実験は２回行った。インキュベーション時間の最後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、培養物を７０％エタノールで一晩固定した。次に、細胞を１０％エタノール中の０．１％クリスタルバイオレット１００μｌで１０分間室温で染色し、細胞を水で穏やかに５回洗浄した。次に１００μｌの１％ＳＤＳを各ウェルに加え、プレートをオービタルシェーカーに１５分間置いた。細胞膜のクリスタルバイオレットをＳＤＳで除去後、プレートを５９０ｎｍで測定した。最後に、細胞生存率を、光学密度の平均値として求めた。結果を図２１に示す。
【実施例３７】
【０２４７】
パクリタキセル、ＤＰＰＣ及びコレステロールを含有するＲＧＤ疑似ペプチド小胞の製造
成分がＤＰＰＣ（３１．４ｍｇ、４２．８μモル）、Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥ（５ｍｇ、６．１μモル；Avanti）、コレステロール（１１．１ｍｇ、２８．６μモル）及びパクリタキセル（２．５ｍｇ、２．９ｕμモル；Sigma）である以外は実施例２１と同一の小胞を調製した。動的光散乱で測定したサイズは９１．１ｎｍであった。
【実施例３８】
【０２４８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるフィブロネクチンのαｖβ３インテグリンへの結合の阻害
９６穴プレートを、１ウェル当たり０．１μｇのαｖβ３インテグリンで、４℃で一晩コーティングした。溶液を除去し、プレートを２％ＢＳＡを含有する１００μｌのバッファーＡ（２５ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で２時間ブロッキングし、このバッファーで３回洗浄した。ＲＧＤ疑似ペプチド−小胞結合体及び治療剤を含有するＲＧＤ疑似ペプチド−小胞結合体を、０．１％ＢＳＡ及び１ｍＭＭｎＣｌ２を含有するバッファーＡに加え、次にフィブロネクチン−ＨＲＰ結合体（ＨＲＰ＝西洋ワサビペルオキシダーゼ）を加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄し、１００μｌの化学発光ＨＲＰ基質を加えた。化学発光をWallac Victor readerを用いてモニターした。結果を図２２に示す。
【実施例３９】
【０２４９】
１０，１２−トリコサジイン酸，ＮＨＳエステル（化合物４０）
５００ｍｌ丸底フラスコ中に、１０，１２−トリコサジイン酸（ＴＡ、Lancaster、２５ｇ、７２．２ｍモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Aldrich、１３．５ｇ、１１７．２ｍモル）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Aldrich、１６．２ｇ、８４．４ｍモル）を入れた。ジクロロメタン（５８０ｍｌ）を加え、混合物を室温で攪拌し、２０時間遮光した。次に得られた赤みを帯びた溶液を、水／ジクロロメタン（それぞれ１２５ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム（１２５ｍＬ）、ブライン（１２５ｍＬ）、及び水（１２５ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮してわずかに青みを帯びた固体（３０ｇ）を得た。プロトン及び炭素ＮＭＲの結果は所望の化合物を一致した。
【実施例４０】
【０２５０】
Ｎ−（８’−アミノ−３’，６’−ジオキサオクチル）−１０，１２−トリコサジインアミド（ＴＡ−ＰＥＧ３アミン）（図３６、化合物４１）
磁気スターラーの入った５００ｍｌの３クビフラスコ中で、ジクロロメタン中の実施例３９の１０，１２−トリコサジイン酸，ＮＨＳエステル（３０ｇ）を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中の１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＰＥＧ３、Jeffamine, Texaco Chemical Co、２８ｇ、１８７ｍモル）の攪拌した溶液に、滴下漏斗からゆっくり加えた。混合物を室温で攪拌し、４０時間遮光した。得られたエマルジョンを、シリカゲルカラム（９ｃｍ×１８ｃｍ）上で、ジクロロメタン／メタノール（２５／１から８／１へ）の勾配を用いてクロマトグラフィーにかけた。均一画分をプールし、濃縮して４．８ｇの青みを帯びた固体を得た。プロトン及び炭素ＮＭＲ、並びに質量スペクトル分析の結果は、所望の化合物と一致した。
【実施例４１】
【０２５１】
Ｎ−スクシンアミド−ＰＥＧ３−ＴＡ（ＳＰ−ＴＡ）（図３６、化合物４２）
実施例４０のＴＡ−ＰＥＧ３アミン（４．７９ｇ、９．９ｍモル）を、ピリジン（５０ｍＬ）に溶解させた。いくつかの不溶性材料をろ過により除去した。溶液を２５ｍｌに濃縮し、無水コハク酸（０．９９ｇ、９．９ｍモル、Aldrich）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌し、遮光した。溶液をろ過し、減圧下で濃縮し、メタノール（５０ｍＬ）で２回蒸発乾固した。残渣をアセトン（２００ｍｌ）に溶解し、混合物を４℃で一晩保存することにより沈殿させた。赤みを帯びた粉末をろ過により単離し（３．２ｇ）、生成物をメタノール（１００ｍｌ）で再結晶し、２．９ｇの固体を得た。プロトン及び炭素ＮＭＲの結果は、所望の構造と一致した。
【実施例４２】
【０２５２】
Ｎ−スクシンアミド−ＰＥＧ３−ＴＡ，ＮＨＳエステル（ＮＨＳ−ＳＰ−ＴＡ）（図３６、化合物４３）
磁気スターラーバーの入った１００ｍｌの褐色ビンに、実施例４１のＮスクシンアミド−ＰＥＧ３−ＴＡ（１．６ｇ、２．７７ｍモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Aldrich、０．５３ｇ、４．７ｍモル）、及びＥＤＣ（０．７ｇ、３．４ｍモル）を入れた。ジクロロメタン（５０ｍｌ）中の混合物を室温で攪拌し、１５時間遮光した。得られた透明な溶液を水（４０ｍｌ）で洗浄した。有機相を１％ＨＣｌ（５０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム（５０ｍｌ）、及びブライン（５０ｍｌ）で洗浄した。ジクロロメタン抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、１．６ｇの無色固体を得た。プロトン及び炭素ＮＭＲの結果は所望の構造と一致した。
【実施例４３】
【０２５３】
ＰＥＧ３−スクシンアミド−ＰＥＧ３−ＴＡ（図３６、化合物４４）
磁気スターラーバーの入った１００ｍｌの丸底フラスコで、ジクロロメタン（２５ｍｌ）中の実施例４２のＮ−スクシンアミドＰＥＧ３−ＴＡ，ＮＨＳエステル（１．６ｇ、２．３ｍモル）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＰＥＧ３、Jeffamine, Texaco Chemical Company、１．１ｇ、７．３ｍモル）の攪拌した溶液に滴下した。混合物を室温で攪拌し、４０時間遮光した。混合物をロータリーエバポレーションで濃縮し、残渣を少量のジクロロメタンに溶解し、４×２５ｃｍシリカゲルカラム上でジクロロメタン／メタノール勾配（２５／１から８／１へ）を用いてクロマトグラフィーにかけた。適切な画分をプールし、濃縮して、１５３ｍｇの無色固体を得た。プロトン及び炭素ＮＭＲの結果は所望の化合物と一致した。
【実施例４４】
【０２５４】
タンパク質活性をモジュレート可能なリガンド−小胞結合体の製造
Ａ．  プロテアーゼインヒビターのポリマーで被包された小胞へのカップリング：  スクシニル化アミノデキストランで被包された小胞（０．４１４ｍｌの水中に１２０ｍｇ）、水（０．５４６ｍｌ）、ＭＯＰＳバッファー（５００ｍＭを１２０μｌ）及びＡｃ−ＬＶＫ−アルデヒド（２５ｍＭを１２０μｌ；Bachem）を、２ｍｌのキャップ付きポリプロピレンチューブに加え、溶液を混合した。１ｍｌの溶液に、ＥＤＡＣ（０．９６ｍｇ、１０μｌ）を加えた。溶液を混合し、室温で１８時間インキュベートした。結合体を、５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．４を含有する３．５Ｌの５０ｍＭヒスチジンバッファー内の１０ＫＭＷＣＯカセット中で２回透析した。サイズ排除クロマトグラフィーにより結合体混合物を解析したところ、カップリング生成は約８２％であった。
【０２５５】
Ｂ．  プロテアーゼインヒビターの重合小胞へのカップリング：  脂質１５（０．６ｍｌの水中に１２０ｍｇ）、水（０．３６ｍｌ）、ＭＯＰＳバッファー（５００ｍＭを１２０μｌ；Sigma）及びＡｃ−ＬＶＫ−アルデヒド（２５ｍＭを１２０μｌ；Bachem）を含有する重合小胞を、２ｍｌのキャップ付きポリプロピレンチューブに加え、溶液を混合した。１ｍｌの溶液に、ＥＤＡＣ（０．９６ｍｇ、１０μｌ）を加えた。溶液を混合し、室温で１８時間インキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィーにより結合体混合物を解析したところ、カップリング生成は約４５％であった。結合体を、５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．４を含有する３．５Ｌの５０ｍＭヒスチジンバッファー内の１０ＫＭＷＣＯカセット中で２回透析した。
【０２５６】
Ｃ．  プロテアーゼインヒビターの重合小胞へのカップリング：  ＧＦＧ−アルデヒドセミカルバゾンを、Ａｃ−ＬＶＫ−アルデヒドと同様にして小胞に付着させた。
【実施例４５】
【０２５７】
プロテアーゼ活性の阻害
Ａ．  パパイン活性アッセイ  基質（２０μｌの３ｍＭ ＡＦＫ−７ＡＭＣ又は２ｍＭ Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣ；Bachem）を、４．５ｍｌのメチルアクリレートキュベット（ＶＷＲ）中の３ｍｌのバッファー（５０ｍＭリン酸カリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ＤＭＳＯ、ｐＨ６．８）に加える。ペプチド（１０μｌの２５ｍＭ ＧＦＧｓｃ又は０．２５ｍＭＬＶＫ−ａｌｄ）又はインヒビター−小胞結合体（２０μｌを水で０〜３２０μｇ／ｍｌに希釈）をキュベットに加える。パパイン（５０ｍＭリン酸カリウム／ｌｍＭＥＤＴＡ、５％ＤＭＳＯ、ｐＨ６．８、５ｍＭ ＤＴＴ含有中の２０μｌの２μＭパパイン）を加える。パラフィルム（ＶＷＲ）でキュベットをカバーし、転倒により混合する。キュベットを直ちに蛍光光度計（ｅｘｃ．３８０ｎｍ、ｅｍ．４６０ｎｍ；１〜６０秒で測定、Photon Technology）で測定する。結果を図２９、図３０、図３１及び図３２に示す。
【０２５８】
B. カテプシン活性アッセイ  カテプシン（５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ５．５及び５ｍＭ ＤＴＴ中に１μＭを１５μｌ）を、１．５ｍｌポリプロピレンチューブ中の１５μｌのペプチドインヒビター（２μＭ Ａｃ−ＬＶＫ−ｃｈｏ）又はペプチド小胞結合体（水で０〜８０μｇ／ｍｌに希釈）に加え、室温で１５分間インキュベートする。基質（１０μｌの４ｍＭＺ−ＲＲ−ａｍｃ；Bachem）を、インヒビター溶液を添加する直前に、４．５ｍｌキュベット中の３ｍｌバッファー（５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ５．５）に加える。実施例４５のカテプシンインヒビター溶液又は未修飾インヒビター（２０μｌ）をキュベットに加える。キュベットをパラフィルム（ＶＷＲ）でカバーし、転倒により混合する。キュベットを蛍光光度計で直ちに測定する（ｅｘｃ．３８０ｎｍ、ｅｍ．４６０ｎｍ；１〜６０で秒測定、Photon Technology）。結果を図３３に示す。
【実施例４６】
【０２５９】
１０，１２−ペンタコサジイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＤＡ−ＣＯＮＨＳ３２）（図３７）の製造
１０，１２−ペンタコサジイン酸（ＰＤＡ３０）（Lancaster、ＦＷ：３７４．６１、３７４ｍｇ、１ミリモル）を塩化メチレン（Aldrich、１０ｍＬ）に溶解した（アルゴン下）。この溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（Aldrich、ＦＷ：１１５．０９、１７３ｍｇ、１．５ミリモル）及びトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（Aldrich、ＦＷ：１０１．１９、ｄ：０．７２６、０．４ｍＬ、３ミリモル）を加えた。溶液を攪拌して溶解させた。ＥＤＣを加え（Aldrich、ＦＷ：１９１．７１、２８８ｍｇ、１．５ミリモル）、室温で一晩攪拌した。反応混合物のＴＬＣによると、開始材料が完全に消滅し、１つの生成物が見られた。反応混合物を塩化メチレン（１００ｍＬ）で希釈し、０．１ＮＨＣｌ（２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）、そして最後にブライン（２５ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次に溶媒をスピン蒸発で除去した。得られた粗生成物（４０１ｍｇ、収率８５％）を、更に生成することなく用いた。
【実施例４７】
【０２６０】
１０，１２−ペンタコサジイノイックポリエチレングリコールアミド（ＰＤＡ−ＣＯＮＨ−ＰＥＧ３３３６）（図３７）の製造例
実施例４６のＰＤＡ−ＣＯＮＨＳ（４０１ｍｇ、０．８５ミリモル）を、アルゴン下で塩化メチレン（Aldrich、１０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、シリンジポンプを用いて５時間のあいだ、ＰＥＧ３３（Huntsman、ＦＷ：２０００、２．５５ｇ、１．２８ミリモル）を加えた。ＴＬＣによると開始材料は完全に消滅していた。次に反応物を塩化メチレン（２００ｍＬ）で希釈し、０．１ＮＨＣｌ（３×５０ｍＬ）で洗浄した。次に有機相を水（５０ｍＬ）で洗浄し、最後にブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。残渣を水（２５０ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）とに分配し、残留ＰＥＧ３３を除去した。
【０２６１】
ＣＨ２Ｃｌ２相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して硫酸ナトリウムを除去し、そして溶媒をスピン蒸発で除去した。生成物３６は高真空下で乾燥した。
【実施例４８】
【０２６２】
４−［２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イルアミノ）エチルオキシ］ベンゾイル−２−（Ｓ）−（１０’，１１’−ペンタコサジイノイックアミドエチルスルホニルアミノ（３−アラニン（ＰＤＡ−ＰＭ３４）の製造（図３７）
実施例４６のＰＤＡ−ＣＯＮＨＳ（１４１．３ｍｇ、３００μモル）及び化合物１０（図１６）（ＳＲＩ、ＦＷ：４５６、１６２．５ｍｇ、３３０μモル）を、先にフレームを乾燥させアルゴンを充填したフラスコ内で無水ピリジン（Aldrich、１０ｍＬ）に溶解した。溶液を二晩攪拌した。次に反応物を還流下で攪拌した。６時間後、開始材料は依然として存在していた。反応物に、別の１６３ｍｇのＰＭ（３３０μモル）を加えた。反応物を還流下で一晩攪拌した。反応混合物を高真空下でスピン蒸発させ、溶媒を除去した。生成した混合物を高真空下で一晩乾燥させた。粗生成物が１２５．７ｍｇ（５１．６％、１−００％＝２４４ｍｇ）生じた。生成物３４を更に生成することなく用いた。
【実施例４９】
【０２６３】
１０％ＰＤＡ−ＰＭ、１０％ＰＤＡ−ＤＴＰＡ、１％ＰＤＡ−ＤＴＰＡ−Ｅｕ及び７９％ＰＣを含有する小胞の製造（図３７）
【０２６４】
【表１０】
2004535407.tif 000014
【０２６５】
上記脂質（１１４．８２ｍｇ、４ｍＬ）を試験管内で混合し、０．５ｍＬのＣＨＣｌ３に溶解し、スピン蒸発乾固させ、高真空下で一晩乾燥させた。有効濃度のＰＭ（化合物１０）は３ｍＭ（１．３７／ｍｇ／ｍＬ）であった。
【０２６６】
乾燥した残渣を４ｍＬの水に懸濁させ、ｐＨを頻繁にチェックしながら約１時間超音波処理した。
形成された小胞を、先ず氷浴中のペトリ皿で溶液を冷却し、次にＵＶランプ下に１２０分間置くことにより重合させた。次に溶液を５０ｍＭヒスチジン、５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で一晩透析した。
【０２６７】
重合小胞（ＰＶ）の物理的パラメータは以下の通りである：４７．７ｎｍ有効直径、５３．３ｎｍ平均直径、ゼータ電位−９４．５５ｍｖ、λｍａｘ＝４８６ｎｍ及び５１８ｎｍ、ｐＨ＝７．４。
【０２６８】
溶液を、３０ｍＬのむき出しのシリンジを用いて透析カセットから除去した。針をシリンジから取りはずして０．２μフィルターに固定し、粒子をバイアルにろ過した。２５μＬのＰＶを２ｍＬの水で希釈することにより、サイズ及びゼータ電位を測定した。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１Ａ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。標的指向薬剤５４及び被包された治療剤５６をもつポリマー−被覆担体を示す。ポリマー被覆５２は小胞５０に対して外部にある。
【図１Ｂ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。標的指向薬剤５４及び小胞成分に結合する治療剤５６をもつポリマー−被覆担体を示す。ポリマー被覆５２小胞５０に対して外部にある。
【図１Ｃ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。標的指向薬剤５４及び被包された治療剤５６をもつ担体５０を示す。
【図１Ｄ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。標的指向薬剤５４及び小胞成分と結合する治療剤５６をもつ担体５０を示す。
【図１Ｅ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。標的指向薬剤５４及び小胞表面に結合する治療剤５６をもつポリマー−被覆担体を示す。ポリマー被覆５２は小胞５０に対して外部にある。
【図１Ｆ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。標的指向薬剤５４及び小胞表面に共有結合手段又は非共有結合手段により付着する治療剤５６をもつ担体５０を示す。
【図１Ｇ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。小胞表面に共有結合手段又は非共有結合手段により結合する治療剤５６をもつポリマー−被覆担体を示す。ポリマー被覆５２は小胞５０に対して外部にある。
【図１Ｈ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。担体５０の表面に共有結合手段又は非共有結合手段により付着する治療剤５６を示す。
【図１Ｉ】本発明の典型的な治療用構築物の概要を示す。ミセル又は小胞を形成する脂質構築物は好ましい担体である。標的指向薬剤５４及びポリマー被覆に共有結合手段又は非共有結合手段により結合する治療剤５６をもつポリマー−被覆担体を示す。ポリマー被覆５２は小胞５０に対して外部にある。
【図２】リガンドＺ−Ｙ−Ｌのカップリングを示す。ここで、Ｚは、リガンドＬに共有結合的にに付着したスペーサーＹに、共有結合的に付着した化学的反応性部分である。この結合はカルボジイミド誘導体又は還元剤のような活性化剤を必要とするかもしれない。
【図３】Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥ，ナトリウム塩の構造を示す。
【図４】Ｎ−カプロイルアミン−ＤＰＰＥ塩酸塩の構造を示す。
【図５】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図６】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図７】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図８】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図９】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図１０】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図１１】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図１２】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図１３】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図１４】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図１５】脂質を標的指向物質又は治療用物質に連結させるための種々の官能基を有する典型的な脂質、及び種々のスペーサー基を示す。
【図１６】重合小胞に多価性を発揮させる脂質に付着させるためのリンカーを含有するインテグリンアンタゴニストの合成を示す。エチルアミンリンカーを導入し、インテグリンに結合するために必要なアミノスルフォネートを保持するように化合物を設計した。条件：（ａ）４ＮＮａＯＨ、１０％ ＮａＨＣＯ３；（ｂ）ＰＣｌ５；（ｃ）ＮＭＭ、ＴＨＦ；（ｄ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、Ｈ２Ｏ；（ｅ）ＴＦＡ、ＣＨ２Ｃｌ２；（ｆ）ＨＳ、ＥＤＣ、ＨＯＢＴ、ＮＭＭ；（ｇ）Ｈ２、１０％Ｐｄ／Ｃ、ＨＯＡｃ、ＨＣｌ；（ｈ）ＢＯＰ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２。
【図１７Ａ】重合ＰＶであるＰＶ１〜ＰＶ６を集合させるのに使用するための主要な単量体脂質１２〜１６を示す。脂質は、添付の表に示す比で組み合わせた。次にこれらの化合物を超音波処理し、冷却し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）を２時間照射することにより重合させ、そして滅菌フィルター（０．２μＭ）でろ過した。図１７〜３０は、標的指向薬剤を付着させるための脂質を示す。これらの脂質を用いて、標的指向剤若しくは治療剤又は両方を付着させるための小胞を製造することができる。これらの脂質のうちのいくつかは小胞に取り込まれ、そして更に水溶液中で、標的指向薬剤が付着することができる化学反応性物質で誘導化させることができる。実施例２３〜３０に関し、Ｒは脂質、脂肪酸、又はジ−若しくはトリ−ブロックコポリマーとして定義される。
【図１７Ｂ】重合ＰＶであるＰＶ１〜ＰＶ６を集合させるのに使用するための主要な単量体脂質１２〜１６を示す。脂質は、添付の表に示す比で組み合わせた。次にこれらの化合物を超音波処理し、冷却し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）を２時間照射することにより重合させ、そして滅菌フィルター（０．２μＭ）でろ過した。図１７〜３０は、標的指向薬剤を付着させるための脂質を示す。これらの脂質を用いて、標的指向剤若しくは治療剤又は両方を付着させるための小胞を製造することができる。これらの脂質のうちのいくつかは小胞に取り込まれ、そして更に水溶液中で、標的指向薬剤が付着することができる化学反応性物質で誘導化させることができる。実施例２３〜３０に関し、Ｒは脂質、脂肪酸、又はジ−若しくはトリ−ブロックコポリマーとして定義される。
【図１７Ｃ】重合ＰＶであるＰＶ１〜ＰＶ６を集合させるのに使用するための主要な単量体脂質１２〜１６を示す。脂質は、添付の表に示す比で組み合わせた。次にこれらの化合物を超音波処理し、冷却し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）を２時間照射することにより重合させ、そして滅菌フィルター（０．２μＭ）でろ過した。図１７〜３０は、標的指向薬剤を付着させるための脂質を示す。これらの脂質を用いて、標的指向剤若しくは治療剤又は両方を付着させるための小胞を製造することができる。これらの脂質のうちのいくつかは小胞に取り込まれ、そして更に水溶液中で、標的指向薬剤が付着することができる化学反応性物質で誘導化させることができる。実施例２３〜３０に関し、Ｒは脂質、脂肪酸、又はジ−若しくはトリ−ブロックコポリマーとして定義される。
【図１７Ｄ】重合ＰＶであるＰＶ１〜ＰＶ６を集合させるのに使用するための主要な単量体脂質１２〜１６を示す。脂質は、添付の表に示す比で組み合わせた。次にこれらの化合物を超音波処理し、冷却し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）を２時間照射することにより重合させ、そして滅菌フィルター（０．２μＭ）でろ過した。図１７〜３０は、標的指向薬剤を付着させるための脂質を示す。これらの脂質を用いて、標的指向剤若しくは治療剤又は両方を付着させるための小胞を製造することができる。これらの脂質のうちのいくつかは小胞に取り込まれ、そして更に水溶液中で、標的指向薬剤が付着することができる化学反応性物質で誘導化させることができる。実施例２３〜３０に関し、Ｒは脂質、脂肪酸、又はジ−若しくはトリ−ブロックコポリマーとして定義される。
【図１７Ｅ】重合ＰＶであるＰＶ１〜ＰＶ６を集合させるのに使用するための主要な単量体脂質１２〜１６を示す。脂質は、添付の表に示す比で組み合わせた。次にこれらの化合物を超音波処理し、冷却し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）を２時間照射することにより重合させ、そして滅菌フィルター（０．２μＭ）でろ過した。図１７〜３０は、標的指向薬剤を付着させるための脂質を示す。これらの脂質を用いて、標的指向剤若しくは治療剤又は両方を付着させるための小胞を製造することができる。これらの脂質のうちのいくつかは小胞に取り込まれ、そして更に水溶液中で、標的指向薬剤が付着することができる化学反応性物質で誘導化させることができる。実施例２３〜３０に関し、Ｒは脂質、脂肪酸、又はジ−若しくはトリ−ブロックコポリマーとして定義される。
【図１７Ｆ】重合ＰＶであるＰＶ１〜ＰＶ６を集合させるのに使用するための主要な単量体脂質１２〜１６を示す。脂質は、添付の表に示す比で組み合わせた。次にこれらの化合物を超音波処理し、冷却し、ＵＶ光（２５４ｎｍ）を２時間照射することにより重合させ、そして滅菌フィルター（０．２μＭ）でろ過した。図１７〜３０は、標的指向薬剤を付着させるための脂質を示す。これらの脂質を用いて、標的指向剤若しくは治療剤又は両方を付着させるための小胞を製造することができる。これらの脂質のうちのいくつかは小胞に取り込まれ、そして更に水溶液中で、標的指向薬剤が付着することができる化学反応性物質で誘導化させることができる。実施例２３〜３０に関し、Ｒは脂質、脂肪酸、又はジ−若しくはトリ−ブロックコポリマーとして定義される。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｂは、キレーター脂質 15を含有する小胞のαｖβ３インテグリンでコーティングした９６穴プレートへの結合を示す。このアッセイのために、小胞はユーロピウムで標識され、実施例５に記載されるように時間分解蛍光を測定した。
【図１９】図１９は、表ＺのＲＧＤ疑似重合小胞構築物を５０％阻害するのに必要なＲＧＤ疑似ペプチド１０の濃度を示す。これらの結果は、実施例５に記載されるインテグリン−結合アッセイを用いて得られた。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｅは、ＰＶのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍撮影での使用について示す。図２０Ａは、撮影された動物及び腫瘍の概要を示す。図２０Ｂ及び２０ＣはそれぞれＰＶ１（標的化ＰＶ）の注射後３時間及び２４時間の像である。図２０Ｄ及び２０ＥはそれぞれＰＶ４（対照ＰＶ）の注射後３時間及び２４時間の像である。
【図２１】図２１は、内皮細胞及び腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、１重量％ドキソルビシン（Ｖ−１％Ｄｏｘ）及び遊離のドキソルビシンを小胞（１％Ｄｏｘ）に用いたものと同一の濃度で含有する、１重量％ドキソルビシン（ＰＭ−１％Ｄｏｘ）小胞を含有する疑似ペプチド−小胞結合体で処置して得られた結果を示す。細胞を実施例３６に記載されるように処置した。
【図２２】図２２は、Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥ（ＳＤＰＰＥ）、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、コレステロール（ＣＨ）、ビスＴ−ＰＣ、ＲＧＤ疑似ペプチド脂質（ＰＭＬ）１及びパクリタキセル（ＰＴＸ）を含有するＲＧＤ疑似ペプチド（ＰＭ）小胞による、ＨＲＰ標識フィブロネクチンのαｖβ３インテグリンへの結合の阻害を示す。実施例３８に記載されるこの阻害アッセイにおいて、表面結合ＲＧＤ疑似ペプチドを有する小胞濃度の上昇に伴い、シグナルは減少している。
【図２３】図２３は、実施例２９に記載されるように、イットリウム９０（ＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０）で標識したインテグリン−標的化小胞のマウスメラノーマモデルにおける有効性を示す。治療群には、ＩＡ（ＲＧＤ疑似ペプチド１０）、ＩＡ−ＮＰ（ＲＧＤ疑似ペプチド−重合小胞結合体）、ＮＰ−Ｙ９０（イットリウム−９０で標識された重合小胞）及びＩＡ−ＮＰ−Ｙ９０（イットリウム−９０で標識されたＲＧＤ−疑似ペプチド−重合小胞結合体）が含まれる。
【図２４】図２４は、実施例２９に記載される研究のために、治療群により分類された治療後７日の正規化した腫瘍容積を示す。
【図２５】図２５は、実施例２９に記載されるマウスメラノーマ研究における、腫瘍容積４倍時間（ＴＶＱＴ）として測定した腫瘍増殖遅延データを示す。
【図２６】実施例３０に記載されるように、マウスメラノーマモデルにおける、イットリウム−９０で標識されたインテグリン標的化デキストラン−被覆重合小胞結合体での固形腫瘍の治療を示す。
【図２７】図２７は、実施例３１に記載されるように、マウス大腸癌モデルにおける有効性を示す。誤差バーは１つの標準誤差を示す。治療群には、バッファー、ＰＭ（ＲＧＤ疑似ペプチド１０）、ＰＭ−ＰＶ（ＲＧＤ疑似ペプチド−小胞結合体）、ＰＶ−Ｙ９０（イットリウム−９０で標識された重合小胞）及びＰＭ−ＰＶ−Ｙ９０（イットリウム−９０で標識されたＲＧＤ疑似ペプチド小胞結合体）が含まれる。
【図２８】実施例３１の研究のための群で分類された８日後の正規化した腫瘍容積のプロットを示す。
【図２９】図２９は、実施例４４に記載されるように、基質Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−７−アミノメチルクマリン（Biochim. Biophys Acta 1190, 430, (1994)）のパパイン−触媒加水分解の、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−アルデヒド（ＬＶＫ−ＣＨＯ、J. Med. Chem 36, 1084, (1993)）及びＮ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−アルデヒド−小胞結合体（小胞−ＬＶＫ−ＣＨＯ）による阻害を示す。
【図３０】図３０は、実施例４４に記載されるように、基質Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−７−アミノメチルクマリン（Biochem J.187, 909, (1980)）のパパイン−触媒加水分解の、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓアルデヒド（ＬＶＫ−ＣＨＯ）及びＮ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−アルデヒド−小胞結合体（小胞ＬＶＫ−ＣＨＯ）による阻害を示す。
【図３１】図３１は、実施例４４に記載されるように、基質Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−７−アミノメチルクマリンのパパイン−触媒加水分解の、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−セミカルバゾン（ＧＦＧｓｃ、J. Parasitol.83, 112, (1997)）及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−セミカルバゾン−小胞結合体（小胞−ｄｅｘ−ＧＦＧｓｃ及び小胞−ＧＦＧｓｃ）による阻害を示す。
【図３２】図３２は、実施例４４に記載されるように、基質Ｚ−ＰｈＡｒｇ−７−アミノメチルクマリンのパパイン−触媒加水分解の、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−セミカルバゾン（ＧＦＧｓｃ）及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−セミカルバゾン−小胞結合体（小胞−ｄｅｘ−ＧＦＧｓｃ及び小胞−ＧＦＧｓｃ）による阻害を示す。
【図３３】図３３は、基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−７−アミノメチルクマリン（Z-RRamc, Meth. Enzymol. 80, 535(1981)）のカテプシン−触媒加水分解の、インヒビターＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−アルデヒド（ＬＶＫ−ＣＨＯ）及び小胞結合体（小胞−ＬＶＫ−ＣＨＯ）による阻害を示す。
【図３４】図３４は化合物１８：アルギニン−脂質を示す。
【図３５】図３５Ａ及び３５Ｂは、それぞれＡＧ１４３３及びＳＵ１４９８の構造を示す。
【図３６】実施例３９〜４３の化合物を製造するための合成スキームを示す。
【図３７】実施例４６〜４９の化合物を製造するための合成スキームを示す。
【図３８】図３８は、実施例３６に記載されるように、同系ネズミ腫瘍モデルにおいて皮下腫瘍をスクロース（◆）、Ｌｄｏｘ（□、リポソームドキソルビシン、１０μｇ／ｇドキソルビシン）、ＩＴＬ（○、インテグリン−標的化リポソーム）、ＩＴＬｄｏｘ１（●、ドキソルビシン含有インテグリン−標的化リポソーム、１μｇ／ｇドキソルビシン）及びＩＴＬｄｏｘ１０（■、ドキソルビシン含有インテグリン−標的化リポソーム、１０μｇ／ｇドキソルビシン）で治療後、正規化した腫瘍容積を示す。
【図３９】典型的なホスファチジルコリン脂質の構造を示す。
【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３６】
2004535407.tif 000035
【図３８】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535407.tif 000167
【国際調査報告】
2004535407.tif 000168
2004535407.tif 000169