(57)【要約】本発明の課題は、分子生物学の方法を利用して個体の年齢の分析を可能にする方法を提供することである。そのためにＤＮＡメチル化パターンが使用されるものである。この場合、特に前記特異的メチル化パターンが人種帰属性または、たとえば年齢同定を他の場合で歪曲する環境の影響に左右されてはならない問題を解決する。【解決手段】個体のＤＮＡプローブ中のＤＮＡメチル化パターンが分析される個体の年齢同定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体のＤＮＡプローブ中のＤＮＡメチル化パターンが分析される個体の年齢同定方法。
【請求項２】
ＤＮＡプローブが精液プローブである、請求項１記載の個体の年齢同定方法。
【請求項３】
ａ）ゲノムＤＮＡ中の特定のＣｐＧジヌクレオチドがそのメチル化率について、それも種々の年齢の種々の発端者ごとに分離して分析され；
ｂ）前記ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化率が発端者の年齢と相関され、この情報がデータベースの中に蓄積され；
ｃ）個体の年齢が個体のＤＮＡプローブのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化分析を基にデータベース情報と分析結果の比較によって同定される、請求項１または２のいずれか１項記載の個体の年齢同定方法。
【請求項４】
ａ）プローブ中に含有されるＤＮＡが、化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが異なって反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように、処理される方法ステップと；
ｂ）ＤＮＡ断片の核塩基配列の部分が同定される方法ステップと；
ｃ）得られた核塩基配列が、どの配列が個体の年齢と相関するかをデータベースによって検定される方法ステップと、が実施される、上記請求項１から３のいずれか１項記載の個体の年齢同定方法。
【請求項５】
ａ）プローブ中に含有されるＤＮＡが、化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが異なって反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように、処理される方法ステップと；
ｂ）前記のように処理されたＤＮＡのフラグメントが増幅され；
ｃ）前記フラグメントがオリゴマーの１組にハイブリダイズされ；
ｄ）ハイブリダイズされないフラグメントが除去され；
ｅ）ハイブリダイズされたフラグメントが分析され、この結果が、ハイブリダイゼーションパターンを個体の年齢と相関させるデータベースによって検定される、上記請求項１から４のいずれか１項記載のＤＮＡプローブを利用した個体の年齢同定方法。
【請求項６】
ａ）プローブ中に含有されるＤＮＡが、化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが異なって反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように、処理され；
ｂ）前記のように処理されたＤＮＡのフラグメントが増幅され；
ｃ）フラグメントがプライマーオリゴヌクレオチドの１組にハイブリダイズされ；
ｄ）プライマーが配列特異的反応で伸長され；
ｅ）伸長生成物が分析され、この結果が、分析結果が個体の年齢と相関させるデータベースによって検定される、請求項１から４のいずれか１項記載のＤＮＡプローブを利用した個体の年齢同定方法。
【請求項７】
分析がオリゴヌクレオチド−アレイを用いて実施される、上記請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
分析が質量分析法を利用して実施される、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、個体の年齢同定方法に関する。
【０００２】
分子生物学における近年の方法論的開発によって良好に研究されている観察水準は、遺伝子自体、ＲＮＡへの前記遺伝子の翻訳およびそこから生成するタンパク質である。個体の発達の経過中にいつどの遺伝子にスイッチが入り、特定の細胞および組織中の特定の遺伝子の活性および阻止がどのように制御されるかは、遺伝子もしくはゲノムのメチル化の規模および性格と相関させることができる。その限りにおいて個体の年齢は、個々の遺伝子またはゲノムの変化したメチル化パターンの中に現れる。
【０００３】
ますます頻繁に犯行現場での犯罪の痕跡または犠牲者において検出された微量物質としての生物物質が押収され、ＤＮＡ分析を利用して調査され、他のＤＮＡ物質と比較されている。
【０００４】
ゲノム解析の分野における世界的な研究に鑑みて、この間に内容的な情報値を有する遺伝子素因について具体的な証言を下すことができる。ＤＮＡ分析によって得た調査結果の鑑識目的のためのデータベースへの蓄積および利用は、特に重要性がある。
【０００５】
生物物質の類型化は、１９８５年以来、裁判医学における個体同定および刑事犯罪学上の調査において最も重要な方法に属している（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ　Ａ　Ｊ、Ｗｉｌｓｏｎ　Ｖ、Ｔｈｅｉｎ　Ｓ　Ｌ．　Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　“ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ”ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ＤＮＡ．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９８５　Ｍａｒ　７−１３；３１４（６００６）：６７−７３；　Ｂｅｎｅｃｋｅ　Ｍ．　ＤＮＡ　ｔｙｐｉｎｇ　ｉｎ　ｆｏｒｅｎｓｉｃ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｃｒｉｍｉｎａｌ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ：　ａ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｓｕｒｖｅｙ．　Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ　１９９７　Ｍａｙ；８４（５）：１８１−８）。個人同定のためのＤＮＡフィンガープリントのほかに、男性の個体の年齢を精液のメチル化パターンを利用して検出する可能性もある。
【０００６】
哺乳動物ＤＮＡの性別−および配列特異的なメチル化パターンは、配偶子形成中に確立する。この配偶子形成は決定的にゲノム刷り込みおよび発達に限定された遺伝子調節に参加していると想定されている。ＤＮＡメチル化に参加した酵素の発現と取り組む調査は、このような酵素が精子形成中にｍＲＮＡ、タンパク質および酵素活性の段階で一義的に発達生物学的に調節されることを示している（Ｂｅｎｏｉｔ　Ｇ、Ｔｒａｓｌｅｒ　ＪＭ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ，　ｐｒｏｔｅｉｎ，　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｔｅｓｔｉｓ．　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ．　１９９４　Ｊｕｎ；５０（６）：１３１２−９）。ＤＮＡの５−メチルデオキシシチジンパターン中の変化が、発達、分化、発癌および老化に関する特定の乳児遺伝子の遺伝子発現に影響を及ぼす。プロモータ部位中のＤＮＡメチル化の検出、つまり常態で転写活性を抑制する過程は、年齢に限定された疾患の分子発現の変化に関連する重要な調査基準である（Ｎａｇａｎｅ　Ｙ、Ｕｔｓｕｇｉｓａｗａ　Ｋ、Ｔｏｈｇｉ　Ｈ．　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＧＣ−ｒｉｃｈ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ａｕｔｏｐｓｙ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｐｒｏｔｏｃ．　２０００　Ａｐｒ；５（２）：１６７−７１）。
【０００７】
ＣｐＧに富む部位（ＣｐＧ島）を含有する遺伝子のメチル化状態がヒト精子、胎児および成人の組織で調査された（Ｇｈａｚｉ　Ｈ、Ｇｏｎｚａｌｅｓ　ＦＡ、Ｊｏｎｅｓ　ＰＡ．　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣｐＧ−ｉｓｌａｎｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｐｅｒｍ，　ｆｅｔａｌ　ａｎｄ　ａｄｕｌｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ．　Ｇｅｎｅ．　１９９２　Ｍａｙ　１５；１１４（２）：　２０３−１０）。様々なヒト遺伝子における発達の種々の段階中のメチル化の変化が調査された。インシュリンのためにコードされる前記遺伝子の１つで、包括的に精子中にメチル化され、胎児組織中の発現から独立して殆どメチル化されず、増強したメチル化が成人組織中に存在することが検出された。精子から単離した第ＶＩＩＩ因子のＤＮＡの特異的メチル化パターンと取り組む最近の調査で、突然変異頻度における相違がＣｐＧ位置の間のみならず、２つの人種集団の間にも存在することを示すことができた。この結果は、さらにそのメチル化パターン中の種々のＣｐＧ位置が同じ個体内部で変化しないのみならず、種々の個体間でも変化しないことを示している（Ｍｉｌｌａｒ　ＤＳ、Ｋｒａｗｃｚａｋ　Ｍ、Ｃｏｏｐｅｒ　ＤＮ．　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩＩ　（Ｆ８Ｃ）　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ．　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ．　１９９８　Ａｕｇ；１０３（２）：２２８−３３）。
【０００８】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡ中で最も頻繁に共有結合修飾する塩基である。この塩基は、たとえば転写調節、遺伝子刷り込みおよび腫瘍形成においてある役割を果たしている。従って遺伝情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定は大きな関心がある。しかし５−メチルシトシン位置は、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対挙動を有するため、塩基配列決定によって同定することができない。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅において５−メチルシトシンを担う後成情報が完全に失われてしまう。
【０００９】
比較的新規の、この間に５−メチルシトシンのＤＮＡ調査のために最も頻繁に適用されている方法は、その塩基対挙動においてチミジンに相当する、それに続くアルカリ加水分解によってウラシルに転換されるシトシンと重亜硫酸塩の特異的反応に基づく。それに対し５−メチルシトシンは前記条件下で修飾されない。それによって原初のＤＮＡは、原初にそのハイブリダイゼーション挙動によってシトシンから区別できないメチルシトシンが、ここで「常法の」分子生物学技術によって唯一残留するシトシンとして、たとえば増幅およびハイブリダイゼーションまたは塩基配列決定によって検出できるように転換される。これらの技術は全て現在全面的に利用されている塩基対に基づく。感受性に関する先行技術は、アガロースマトリクス中の被検ＤＮＡを封入する方法によって定義され、それによってＤＮＡ（重亜硫酸塩が一本鎖ＤＮＡにのみ反応する）の拡散および復元を阻止し、全ての沈降および洗浄ステップが迅速な透析に置換される（Ｏｌｅｋ、Ａ．ら、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．　１９９６、２４、５０６４−５０６６）。この方法によって、個々の細胞を調査することができ、これが前記方法のポテンシャルを具体的に示している。しかし、これまで長さ約３０００塩基対までの個々の部位のみが調査されているにすぎず、可能なメチル化解析の何千にも及ぶ細胞の全般的な調査は不可能である。しかし、この方法も非常に小さいフラグメントを少ないプローブ量から確実に分析することはできない。前記フラグメントはマトリクスによる拡散保護にもかかわらず失われてしまう。
【００１０】
５−メチルシトシンを検出する別の公知の可能性に関する概要は、次の概要論文から読み取ることができる：Ｒｅｉｎ、Ｔ．、ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、Ｍ．　Ｌ．、Ｚｏｒｂａｓ、Ｈ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９９８、２６、２２５５。
【００１１】
重亜硫酸塩技術は、これまで幾つかの例外（たとえばＺｅｃｈｎｉｇｋ、Ｍ．ら、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎ．　１９９７、５、９４−９８）に至るまで研究においてのみ適用されている。しかし、常に公知の遺伝子の短い特異的断片が重亜硫酸塩処理によって増幅され、完全な塩基配列決定（Ｏｌｅｋ、Ａ．およびＷａｌｔｅｒ、Ｊ．、Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９９７、１７、２７５−２７６）または個々のシトシン位置が「プライマー拡張反応」（Ｇｏｎｚａｌｇｏ、Ｍ．　Ｌ．およびＪｏｎｅｓ、Ｐ．　Ａ．、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９９７、２５、２５２９−２５３１、ＷＯ−Ａ９５００６６９）または酵素切片（Ｘｉｏｎｇ、Ｚ．およびＬａｉｒｄ、Ｐ．　Ｗ．、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．　１９９７、２５、２５３２−２５３４）のいずれかによって検出される。特にハイブリダイゼーションによる検出も記載されている（Ｏｌｅｋら、ＷＯ−Ａ　９９２８４９８）。
【００１２】
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための重亜硫酸塩技術の適用と取り組むその他の出版物は次のものがある：Ｘｉｏｎｇ、Ｚ．およびＬａｉｒｄ、Ｐ．　Ｗ．　（１９９７）、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５、２５３２；Ｇｏｎｚａｌｇｏ、Ｍ．　Ｌ．およびＪｏｎｅｓ、Ｐ．　Ａ．　（１９９７）、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５、２５２９；Ｇｒｉｇｇ、Ｓ．およびＣｌａｒｋ、Ｓ．　（１９９４）、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１６、４３１；Ｚｅｓｃｈｎｉｋ、Ｍ．ら（１９９７）、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　６、３８７；Ｔｅｉｌ、Ｒ．ら（１９９４）、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２２、６９５；Ｍａｒｔｉｎ、Ｖ．ら（１９９５）、Ｇｅｎｅ　１５７、２６１；ＷＯ−Ａ　９７４６７０５およびＷＯ−Ａ　９５１５３７３。
【００１３】
オリゴマーアレイ製造における先行技術に関する概要は、１９９９年１月に出版された自然遺伝学特別号（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｖｏｌｕｍｅ　２１、Ｊａｎｕａｒｙ　１９９９）、そこで引用された文献および低減した非特異的バックグラウンドシグナルにおけるオリゴヌクレオチドのような標的分子のための個体担体の製造方法に関する米国特許第５９９４０６５号から読み取ることができる。
【００１４】
本発明の課題は、分子生物学の方法を利用して個体の年齢の分析を可能にする方法を提供することである。そのためにＤＮＡメチル化パターンが使用されるものである。この場合、特に前記特異的メチル化パターンが人種帰属性または、たとえば年齢同定を他の場合で歪曲する環境の影響に左右されてはならない問題を解決することである。
【００１５】
従って本発明は、個体の年齢を同定することを目的とした、ゲノムＤＮＡプローブのメチル化状態の検出方法である。
【００１６】
この課題は個体の年齢同定方法において、個体のＤＮＡプローブ中のＤＮＡメチル化パターンが分析される前記方法によって解決される。
【００１７】
この場合、ＤＮＡプローブが精子プローブであることが申し分なく特に有利である。
【００１８】
本発明によれば、ａ）ゲノムＤＮＡ中の特定のＣｐＧジヌクレオチドがそのメチル化率について、しかも種々の年齢の種々の発端者ごとに分離して分析され；
ｂ）前記ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化率が発端者の年齢と相関され、前記情報がデータベースの中に蓄積され；
ｃ）個体の年齢が個体のＤＮＡプローブのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化分析を基にデータベース情報による分析結果の検定によって同定される方法が有利である。
【００１９】
本発明によれば、ａ）プローブ中に含有されるＤＮＡが、化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが異なって反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように、処理される方法ステップと；
ｂ）ＤＮＡ断片の核塩基配列の部分が同定される方法ステップと；
ｃ）得られた核塩基配列が、どの配列が個体の年齢と相関するかをデータベースによって検定される方法ステップとが実施される、個体の年齢同定方法も有利である。
【００２０】
さらに本発明によれば、ａ）プローブ中に含有されるＤＮＡが、化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが異なって反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように、処理され；
ｂ）前記のように処理されたＤＮＡのフラグメントが増幅され；
ｃ）前記フラグメントがオリゴマーの１組にハイブリダイズされ；
ｄ）ハイブリダイズされないフラグメントが除去され；
ｅ）ハイブリダイズされたフラグメントが分析され、その結果が、ハイブリダイゼーションパターンを個体の年齢と相関させるデータベースによって検定される方法が有利である。
【００２１】
さらに本発明によれば、ａ）プローブ中に含有されるＤＮＡが、化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが異なって反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように、処理され；
ｂ）前記のように処理されたＤＮＡのフラグメントが増幅され；
ｃ）前記フラグメントがプライマーオリゴヌクレオチドの１組にハイブリダイズされ；
ｄ）プライマーが配列特異的反応で伸長され；
ｅ）伸長生成物が分析され、この結果が分析結果を個体の年齢と相関させるデータベースによって検定される方法が有利である。
【００２２】
本発明による方法において、分析がオリゴヌクレオチド−アレイを用いて実施されることが申し分なく特に有利である。
【００２３】
つまり、好ましくは精子プローブを利用した本発明による個体の年齢同定方法が記載される。
【００２４】
個体の年齢の同定情報は、ＤＮＡプローブ中のＤＮＡメチル化パターンの分析方法によって得られる。
【００２５】
個体の年齢同定方法の特に有利な実施形態において、精子プローブが調査され、年齢情報が精子プローブ中に含有されるプローブＤＮＡのＤＮＡメチル化パターンの分析によって得られる。
【００２６】
この個体の年齢の同定のために、好ましくは次の実施形態がある：
有利な実施形態において、ゲノムＤＮＡ中の限定されたＣｐＧジヌクレオチドがそのメチル化率について、しかも種々の年齢の種々の発端者ごとに分離して調査される。ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化率が発端者の年齢と相関され、この情報がデータベースの中に蓄積される。個体の年齢は、個体のＤＮＡプローブのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化分析を基にデータベース情報による分析結果の検定によって同定される。
【００２７】
もう１つの有利な実施形態において、プローブ中に含有されたＤＮＡが、化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが異なって反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように、処理される。有利には重亜硫酸塩が使用され、それによって非メチル化シトシン塩基に付加される。それに続きアルカリ加水分解が、更に非メチル化シトシン核塩基からウラシルへ転換へと導く。それに続きＤＮＡ断片の核塩基配列の部分が同定され、得られた核塩基配列が個体の年齢と塩基配列決定を相関させるデータベースによって検定される。
【００２８】
もう１つの有利な実施形態において、プローブ中に含有されたＤＮＡが化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが様々に反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように処理される。次に、前処理したＤＮＡのフラグメントが耐熱性ポリメラーゼおよび少なくとも１つのプライマーの使用下に、有利にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。種々の限定された増幅が反応器内で実施される。これは好ましくは、種々のプライマーがそれぞれ限定されたフラグメントを生成する、いわゆる多重ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ）である。もう１つの方法の変形において、プライマーが目的を指定して、再現可能にそれぞれ複数のフラグメントを増幅する。特に有利な方法の変形において、増幅が固相に結合したプライマーの伸長によって行われる。多重ＰＣＲは広義の意味で、様々なプライマーが種々の限定された固相の場所に結合したことによって実施することができる。この固相は一般に一様であり、様々なオリゴヌクレオチド配列が四角形または六角形の格子の形状で配列されている。これは結果的に、様々な増幅体も固相上に四角形または六角形の格子の形状で配列されることになる。上述のように、この場合は複数の増幅体が直接固相上に生成される。固相表面は、好ましくは、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。増幅したゲノムＤＮＡのフラグメントは、オリゴマー（プライマー）の１組に二重鎖形成下にハイブリダイズされる。それに続きハイブリダイズされないフラグメントが除去される。最後にハイブリダイズされたフラグメントが分析され、この結果がハイブリダイゼーションパターンを個体年齢と相関させるデータベースによって検定される。
【００２９】
もう１つの特に有利な実施形態において、プローブ中に含有されたＤＮＡが化学的に、５−メチルシトシンおよびシトシンが様々に反応し、選択的にシトシンがシトシンから区別される塩基対挙動を有する塩基に転換されるように処理される。次に、前処理されたＤＮＡのフラグメントが耐熱性ポリメラーゼおよび少なくとも１つのプライマーの使用下に、有利にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。種々の限定された増幅が反応器内で実施される。これは好ましくは、種々のプライマーがそれぞれ限定されたフラグメントを生成する、いわゆる多重ＰＣＲである。もう１つの方法の変形において、プライマーが目的を指定して、再現可能にそれぞれ複数のフラグメントを増幅する。特に有利な方法の変形において、増幅が固相に結合したプライマーの伸長によって行われる。多重ＰＣＲは広義の意味で、様々なプライマーが種々の限定された固相の場所に結合したことによって実施することができる。この固相は一般に一様であり、様々なオリゴヌクレオチド配列が四角形または六角形の格子の形状で配列されている。これは結果的に、様々な増幅体も固相上に四角形または六角形の格子の形状で配列されることになる。上述のように、この場合は複数の増幅体が直接固相上に生成される。固相表面は、好ましくは、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなる。このフラグメントは、それに続きプライマーオリゴヌクレオチドの１組にハイブリダイズされ、プライマーが耐熱性ポリメラーゼによる配列特異的反応で伸長される。その場合、有利には少なくとも１つのヌクレオチドが検出可能の標識を担う。この場合の伸長の形式は、ゲノムＤＮＡプローブ中の各シトシンのメチル化状態に依存する。最後に、伸長生成物が分析され、この結果がハイブリダイゼーションパターンを個体年齢と相関させるデータベースによって検定される。
【００３０】
前記実施形態のＤＮＡメチル化パターンの分析は、特に有利に質量蛍光分析法を利用して実施される。
【００３１】
以下の例が本発明を説明する：
例１：
ＰＣＲの説明
単一遺伝子ＰＣＲ反応はサーモサイクラー（エッペルドルフ　ゲーエムベーハー）を利用して重亜硫酸塩処理ＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー１２．５ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰ１ｍＭ、ＭｇＣｌ２１．５ｍＭおよびＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ（キアゲン　アーゲー）１Ｕの使用下に実施した。その他の条件はＴａｑポリメラーゼ製造者が推奨する条件に相当する。ＰＣＲを利用して、第１変性ステップが、４５サイクル（９５℃で６０秒、５５℃で４５秒、７２℃で７５秒）につづき、９５℃で２０分間、およびそれに続き最後の伸長が７２℃で１０分間実施されることによって単一遺伝子を増幅した。
【００３２】
例２：次の例は、メチル化上の特異的ＣＧ位置を分析した遺伝子ＦＶＩＩＩのエクソン４０のフラグメントに関係する。
【００３３】
第１ステップにおいて、ゲノム配列が重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）の使用下に別の塩基が塩基対挙動を基準として置換されるような方式で、塩基第５位にメチル化されない全てのシトシンが修飾され、他方第５位にメチル化したシトシンが変化しないように処理されている。
【００３４】
反応のために重亜硫酸塩溶液が使用される場合、非メチル化シトシン塩基に付加される。さらに変性試薬または溶剤ならびに遊離基捕捉剤が存在しなければならない。それに続くアルカリ加水分解が、次にウラシルへの非メチル化シトシン核塩基の転換を生ぜしめる。化学的に転換されたＤＮＡが、次にメチル化シトシンの検出に使用される。第２の方法ステップにおいて、処理されたＤＮＡプローブが水または水溶液で希釈される。有利にはＤＮＡが次のように脱スルホン化される。
【００３５】
第３の方法ステップにおいて、例１に記載したように、より有利な方法で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用下に、ＤＮＡプローブがポリメラーゼ連鎖反応で増幅される。本事例において、遺伝子ＦＶＩＩＩのエクソンＩＩのシトシンが分析される。そのために、５６１ｂｐの長さをもつ限定されたフラグメントが特異的プライマーオリゴヌクレオチドＡＧＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧＡＡＴＡＧＡＧＧＧＡおよびＴＡＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡで増幅される。
【００３６】
この増幅体は、事前に固相に結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして利用され、二重鎖構造、たとえばＴＴＣＣＡＣＴＴＡＡＴＣＧＣＴＣＣＣ（このオリゴヌクレオチドのＣＧを図１、Ｉに示す）またはＡＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＡＧＴＴＴＴＴ（このオリゴヌクレオチドのＣＧは図１、ＩＩに示す）を形成し、被検シトシンが増幅体の第３０位もしくは第５００位にある。ハイブリダイゼーション生成物の検出は、増幅のために使用したＣｙ５を蛍光標識したプライマーオリゴヌクレオチドに基づく。オリゴヌクレオチドと増幅ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応は、図１に示すように、メチル化シトシンが重亜硫酸塩処理したＤＮＡ内の前記部位に前置している場合にのみ行われる。それによって特異的な被分析シトシンのメチル化状態がハイブリダイゼーション生成物から導き出される。
【００３７】
非メチル化状態を分析するために、オリゴヌクレオチドＴＴＣＣＡＣＴＴＡＡＴＣＡＣＴＣＣＣ（このヌクレオチドのＣＡは図１、Ｉに示す）またはＡＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＴ（このオリゴヌクレオチドのＴＧは図１、ＩＩに示す）が使用される。被分析位置に前記オリゴヌクレオチドがシトシンの代わりにチミン塩基を包含する。したがってハイブリダイゼーション反応は、図１に示すように、非メチル化シトシンが被分析位置に前置した場合にのみ行われる。２種類のオリゴヌクレオチドについて、被分析ＣｐＧ位置が年齢２３歳の発端者（図１、Ｂ）と比較した年齢４１歳の発端者（図１、Ａ）の様々なメチル化率を示すことが示される。ＣＧを含有する年齢４１歳の発端者（図１、Ａ）のオリゴヌクレオチドで表した、メチル化状態のための両方のオリゴヌクレオチドのシグナル強度は、非メチル化状態を表すＣＡを含有する前記患者のオリゴヌクレオチドの強度よりも高くなる。それと逆に、メチル化状態を表すオリゴヌクレオチドのシグナル強度と、年齢２３歳の発端者のメチル化状態を表すオリゴヌクレオチドのシグナル強度は、ほぼ同じである（図１、Ｂ）。
【００３８】
図１の説明
図１は、種々のオリゴヌクレオチドの表面に結合したオリゴヌクレオチドへの蛍光標識増幅のハイブリダイゼーションである（図１のように各オリゴヌクレオチドごとに２回繰り返して示す）。この場合、オリゴヌクレオチド−プローブＡは年齢４１歳の発端者から、プローブＢは年齢２３歳の発端者から由来する。矢印で示したスポットの蛍光は、オリゴヌクレオチドでの増幅体のハイブリダイゼーションを示唆する。ＣＧを含有するオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、分析したシトシン位置へのメチル化を表し、ＣＡもしくはＴＧを含有するオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、被分析シトシン位置へのメチル化を表さない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１のＡ及びＢは、種々のオリゴヌクレオチドの表面に結合したオリゴヌクレオチドへの蛍光標識増幅のハイブリダイゼーションである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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