(57)【要約】本発明はＰＣＲを手段とし、かつ次のハイブリダイゼーションステップ：ａ）核酸塩基配列が３’および５’末端でそれぞれ１つのアダプタプライマーによってハイブリダイズされ、ｂ）ステップａ）からの産物が３’および５’末端で伸長配列を含有するそれぞれ１つの伸長プライマーによってハイブリダイズされ、核酸塩基配列から核酸塩基配列の３’および５’末端に伸長配列だけ伸長かつ増幅された核酸配列が形成される長い核酸の調製方法、ならびにこのような方法の種々の使用を教示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のハイブリダイゼーションステップ、すなわち
ａ）核酸塩基配列が３’および５’末端でそれぞれ１つのアダプタープライマーによってハイブリダイズされるステップと、
ｂ）ステップａ）からの産物が３’および５’末端で伸長配列を含有するそれぞれ１つの伸長プライマーによってハイブリダイズされるステップと、を有するＰＣＲを手段とする長い核酸の調製方法において、
核酸塩基配列から核酸塩基配列の３’および５’末端に伸長配列だけ伸長かつ増幅された核酸配列が形成される方法。
【請求項２】
ステップｂ）の産物がステップｃ）で３’末端および５’末端でそれぞれ１つの増幅プライマーでハイブリダイズされ、増幅した核酸塩基配列が形成される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アダプタープライマーがヌクレオチド＜７０を含有し、伸長プライマーがヌクレオチド≧７０を含有し、および／または増幅プライマーがヌクレオチド＜７０を含有する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）、ｂ）および選択的にステップｃ）が核酸塩基配列、アダプタプライマー、伸長プライマーおよび選択的に増幅プライマーを含有するＰＣＲ溶液中で実施される、請求項１ないし３のいずれか１項記載の核酸。
【請求項５】
方法ステップＡ）のステップａ）およびｂ）が所定の第１サイクル数のための核酸塩基配列、アダプタープライマーおよび伸長プライマーを含有するプレＰＣＲ溶液中で実施され、方法ステップＢ）のステップｃ）が所定の第２サイクル数のためのステップＡ）からのＰＣＲ産物と増幅プライマーとを含有する主ＰＣＲ溶液中で実施される、請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲが１０〜１００μｌ、好ましくは２０〜４０μlの反応容積中で、核酸塩基配列０．０１〜１００ｐｇ、好ましくは１〜５０ｐｇ、アダプタープライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭおよび伸長プライマー０．００５〜０．５μＭ、好ましくは０．００１〜０．１μＭで実施され、所定の初期サイクル数後に増幅プライマー０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭが添加され、それに続く所定数のサイクルによって増幅した核酸塩基配列が製造される、請求項１ないし４のいずれか１項記載方法。
【請求項７】
次の反応条件：
ステップＡ）：反応容積＜１０μｌ、核酸塩基配列０．００１〜５ｐｇ、好ましくは０．０１〜１ｐｇ、アダプタープライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭおよび伸長プライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭ、第１サイクル数１０〜３０、好ましくは１５〜２５、
ステップＢ）：反応容積１０〜１００μｌ、好ましくは１５〜５０μｌ、ＰＣＲ開始溶液によりステップＡ）の溶液の補給によって得た、増幅プライマー０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭ、第２サイクル数１５〜５０、好ましくは２０〜４０、を有する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
細胞を含有しないインビトロ蛋白質生合成のための、特に原核系におけるまたはインビトロ転写系のための核酸の製造のための請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項９】
Ｅｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  Ｄ１０からの翻訳系での請求項８記載の使用。
【請求項１０】
核酸ライブラリからの所定の核酸塩基配列の選択的増幅のための請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項１１】
遺伝子配列が核酸塩基配列として使用され、得た蛋白質は構造および／または機能に関して解析される遺伝子配列の特性化のための請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項１２】
１つの蛋白質のためにコードする塩基配列および１つのリボソーム結合配列ならびに「プロモーター配列、転写ターミネータ配列、発現エンハンサー配列、安定化配列、およびアフィニティタグ配列」からなるグループから選択的に１つまたは複数の配列を含有する細胞を含有しない蛋白質生合成系のための核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲを手段とする長い核酸の調製方法ならびにこのような方法のための種々の使用可能性に関する。細胞を含有しない蛋白質生合成系および／またはインビトロ転写系における直接的使用に好適である得られた核酸量を調製規模と呼ぶ。蛋白質のためにコードする核酸塩基配列（任意の長さ）のほかに別の配列、特にそれぞれヌクレオチド５０以上、さらに７０以上を含有する調節配列のような核酸を長い核酸と呼ぶ。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、しかしまたＰＮＡとしてよい。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質はバイオテクノロジーおよび医療上の適用のために高純度で、特にまた大量に、すなわちミリグラム（ｍｇ）規模およびグラム（ｇ）規模で必要になる。巨大蛋白質の場合は、慣用的な合成が全く不可能であり、いずれにしても不経済である。
【０００３】
大規模な蛋白質の製造の可能なのは遺伝子技術による製造である。そのために所望の蛋白質のためにコードするクローン化ＤＮＡが外来ＤＮＡとして細胞内、特に原核細胞内にベクターもしくはプラスミドの形で導入される。次いでこれらの細胞が培養され、外来ＤＮＡによってコードした蛋白質が発現かつ獲得される。確かにこの方法ですでに相当量の蛋白質を、その公知の措置の限りで、特にクローニングで獲得することはできるが、コストがかかる。とりわけ細胞はたいてい過渡的にのみトランスフェクトされ、とりわけ例外的な場合にのみ安定して固定化される。それ故、蛋白質の連続的な生産は、さらに前記コストのかかる措置によって製造しなければならない新鮮細胞の常時補給を必要とする。
【０００４】
もう１つの試みは、いわゆる細胞を含有しないインビトロ蛋白質生合成である。この場合は天然に存在する細胞からなる核酸から広範囲に解放され、アミノ酸、エネルギー供給物質および少なくとも１つの核酸によって置換される生物学的に活性の細胞抽出物が使用される。その際に付加した核酸が被製造蛋白質のためにコードする。核酸としてＤＮＡを使用するときは、ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼの存在が必要である。もちろん直接ＲＮＡ、ｍＲＮＡを使用してもよい。この方法により、このような蛋白質を短時間かつ比較的適度の、遺伝子技術的にも製造可能である費用で製造できるのみならず、むしろたとえば細胞毒性があり、そのため通常の遺伝子技術的細胞系で全く特に発現可能ではない蛋白質を製造することができる。もちろん付加した核酸自体を製造する必要があり、これは遺伝子技術的方法によりさらにコストがかかる。それに対して、しばしば天然による方法では蛋白質配列と結合した調節配列ならびにスペーサーのようなその他の配列を蛋白質合成の効率を改善するために使用することが望ましいことがある。
【０００５】
完全な、細胞を含有しない蛋白質生合成に使用可能の核酸の遺伝子技術的製造のための別法が、いわゆる発現ＰＣＲである。この関連性において被製造核酸内への調節配列（ならびに別の翻訳効率を促進する配列）の効率的な導入が増幅の枠組の中で特別な役割を果たしている。標的核酸内へのこのような別の配列の導入のために非常に長いＰＣＲプライマーが必要である。長いプライマーは、一方で製造にさらにコストがかかり、他方では不均一ＰＣＲ産物の発生の確率を高める。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
文献箇所米国特許第５，５７１，６９０号明細書から、ＰＣＲを手段とする調製規模での核酸において、被増幅核酸がすでに全ての必要な調節配列を含有する前記核酸を製造することが公知である。従ってその点で公知の措置において、他の良好に調節された配列の導入もしくはこのような他の良好な配列による既存の調節配列の置換は不可能である。とりわけ増幅から得た核酸は直接蛋白質合成に導入することができない。最終的に特異的核酸によってコードする蛋白質生合成用の標的遺伝子の同時転換において、目的を定めて核酸混合物から特異的核酸を増幅することはできない。
【０００７】
文献箇所国際出願ＷＯ−Ａ−９２０７９４９から、蛋白質のためにコードする配列を有する核酸ならびに複数のステップで調節配列を製造かつ増幅することが公知である。第１ステップで蛋白質のためにコードする配列が標準ＰＣＲで増幅される。この場合、いわゆる「オーバーラップ伸長ＰＣＲ」のためのアダプター配列の導入用の上流ハイブリダイズプライマーを利用する。平行の第２段階でオーバーラップ伸長ＰＣＲのためのハイブリダイゼーションパートナーが製造される。そのために２つの部分相補性プライマーがハイブリダイズかつ充填される。得た産物は、この場合３’末端に第１ステップからの増幅体の５’末端とアダプター配列の相同配列ならびに細胞を含有しない蛋白質生合成のためのプロモーター配列および調節要素をもつ。第３ステップは、最後にオーバーラップと伸長反応である。両方の第１ステップからの産物がハイブリダイズされ、二本鎖に充填され、最後に別のプライマーによって増幅される。この終了する増幅において、プライマーを介して改善された転写を生ぜしめるべきプロモーターの前に付加的な配列が組み込まれる。２つの別のステップで転写ならびに翻訳が細胞を含有しない系で行われる。この場合、所望のｍＲＮＡを得るまで合計４ステップが必要になることが欠点である。さらに、原核系内の蛋白質生合成に重要である３’配列が欠失する。また、それを手段として得た蛋白質の洗浄が容易になるアフィニティタグ配列等が導入されない。方法の複雑性ならびに原核系のための３’配列の欠失に基づき、その点で公知の方法は、原核系にも核酸混合物（ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリ）への適用にも役立てることはできない。
【０００８】
文献箇所  Ｍａｒｔｅｍｙａｎｏｖ、Ｋ．Ａ．、ら；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４：２６８−２７０（１９９７）に、文献箇所ＷＯ−Ａ−９２０７９４９に類似する方法が記載されている。相違点は配列相同性が上流プライマーの５’末端と下流プライマーの３’末端との間に存在することにある。それによって多量化が行われ、最終的に再び単量体に分裂されるポリ蛋白質が生成される。さらにこの変形体における欠点は、ポリ蛋白質が非常に少ない蛋白質から化学的に分裂可能であることである。とりわけ収集量が非常に少ない。
【０００９】
文献箇所  Ｎａｋａｎｏ、Ｈ．、ら；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６４：１９４−１９９（１９９９）から、Ｅｓｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ溶解物中のＰＣＲ産物の発現のための特異的蛋白質生反応器が公知である。この場合、標準ＰＣＲ産物がその生成のための特殊方法論なしに使用されている。ＰＣＲ産物がこの場合プラスミド中よりも明らかに速く発現される。
【００１０】
上記全ての文献箇所は真核系に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、低費用で作業し、多量の産物核酸が得られ、余剰費用なしに原核系に好適であり、それを手段として核酸ライブラリから定義された核酸の増幅が可能である、特に蛋白質配列ならびに選択した調節配列を有する長い核酸の製造方法を提示する技術的問題を基礎においている。
【００１２】
この技術的問題の解決のために、本発明はＰＣＲを手段とし、かつ次のハイブリダイゼーションステップ：ａ）核酸塩基配列が３’および５’末端でそれぞれ１つのアダプタプライマーによってハイブリダイズされ、ｂ）ステップａ）の産物が３’および５’末端で伸長配列を含有するそれぞれ１つの伸長プライマーによってハイブリダイズされ、核酸塩基配列から核酸塩基配列の３’および５’末端に伸長配列だけ伸長かつ増幅された核酸配列が形成される長い核酸の調製方法を教示する。
【００１３】
蛋白質のためにコードする配列が核酸塩基配列と呼ばれる。これは特に遺伝子であってよく、さらにまたイントロンを含まないゲノムからの配列としてよい。伸長配列は、特に調節配列を包含する配列および／またはリボソーム結合配列を含有する配列であってよい。アダプタープライマーは比較的短い。アダプター配列の一部は核酸塩基配列に特異的であり、別の部分は一定であり、それぞれ１つの伸長配列にハイブリダイズする。
【００１４】
そこから様々な核酸塩基配列のためにそれぞれ「合致する」長さの伸長配列を使用する必要のないことが生じる。むしろ単に比較的短いアダプタープライマーを所定の核酸塩基配列に合わせなければならず、他方、伸長配列は、いわば汎用にすることができる。すなわち種々の核酸塩基配列に対して常に等しくもしくは若干少なく選択した伸長配列を使用可能である。比較的費用のかかる被製造伸長配列は幅広い利用に供することができ、特異的な核酸塩基配列のために単にアダプター配列を製造するだけである。しかしながらアダプター配列は比較的短くすることができるので、これはあまり費用がかからない。
【００１５】
これは、たとえば調節配列もリボソーム結合配列もそれぞれ伸長プライマーの１つを介して、しかも１つのＰＣＲステップで核酸塩基配列に接合することを可能にする。つまり特に高い転写および／または翻訳効率を、細胞を含有しない蛋白質生合成の原核系内で生じる、核酸を得ることができる。
【００１６】
本発明による方法の特別の長所は、一般的に適用可能の選択的にコードする配列のための方法である。
【００１７】
プライマー３’および５’末端を有するハイブリダイゼーションは、特に二本鎖核酸に関係し、プライマーのハイブリダイゼーションはそれぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端で行われる。一本鎖に関しては、前述および後述のプライマーによるハイブリダイゼーションがそれぞれ５’末端で行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の継続形成が自明的な重要性をもち、ステップｂ）の産物がステップｃ）で３’末端と５’末端に各々１つの増幅プライマーでハイブリダイズすることができ、増幅した核酸塩基配列が形成される。また増幅プライマーは、一方で比較的短くかつ汎用に使用可能であり、従って容易に提供可能である。増幅プライマーを利用して、特に翻訳効率をさらに高める別の（より短い）配列を末端に接合することができる。また短い増幅プライマーを利用して核酸の末端で別の変形体および調節も僅かな費用で導入可能である。これは、それによって変形体および調節のために再び妨害する規模の費用がかかりうる様々な伸長プライマーを製造する必要がないので、特に長所となる。
【００１９】
変形体もしくは修正体の一例は、ビオチン残基の組込みであり、増幅プライマーの５’−末端に結合している。それによって、たとえばビオチン結合ストレプトアビジンによる核酸塩基配列のインキュベーション後にエキソヌクレアーゼ分解に対して安定化した核酸塩基配列が得られ、この核酸塩基配列はインビトロ蛋白質生合成系で安定化しない核酸塩基配列中で数倍、典型的には５倍以上、たとえば約１５分から約２時間の半減期の増加を有する。環状プラスミドの各々と比較可能であり、このプラスミドをその限りで等価に置換できる安定化が達成される。別法は抗ジゴキシゲニン抗体を結合するジゴキシゲニンを手段とした安定化である。安定化基は特に核酸塩基配列の両末端に配置することができる。別の一例は、アフィニティタグもしくはそのためにコードする配列を有する修正またはアンカー基もしくはそのためにコードする配列である。アンカー基はマッチした結合サイトを有する固体表面へのアンカー基の結合による固定化を可能にする。アンカー基は、核酸自体に取り込むことができ、しかしまたそのためにコードする配列を設けてもよい。
【００２０】
アダプタープライマーは典型的にヌクレオチド＜７０、特に２０〜６０を含有する。伸長プライマーは典型的にヌクレオチド≧７０、また９０およびそれ以上を含有する。さらに増幅プライマーは、典型的にヌクレオチド＜７０、大抵は＜３０、典型的にヌクレオチド＞９を含有する。単にアダプタプライマーを所定の核酸塩基配列に特異的に適合させなければならず、これが比較的短い配列のために僅かな費用へと結びついている。
【００２１】
好ましくはステップａ）、ｂ）および選択的にステップｃ）が核酸塩基配列、アダプタプライマー、伸長プライマーおよび選択的に増幅プライマーを含有するＰＣＲ溶液中で実施される。これは合計６プライマー、２アダプター配列、２伸長配列および２増幅配列を有する１段階ＰＣＲである。この場合、アダプタープライマーおよび伸長プライマーを低濃度で使用し、その限りで少量の中間産物のみを作るだけで充分である。中間産物は特に均質に存在する必要がなく、それによって費用のかかる最適化を廃止することができる。増幅プライマーの短縮によって増幅時に大量の核酸塩基配列への最適化が不要である。
【００２２】
上記実施形態の別法として、２段階のＰＣＲで作業する変形体は自明的な重要性をもつ。この場合、方法ステップＡ）のステップａ）およびｂ）は所定の第１サイクル数のための核酸塩基配列、アダプタプライマーおよび伸長プライマーを含有するプレＰＣＲ溶液中で実施され、方法ステップＢ）のステップｃ）が所定の第２サイクル数のためのステップＡ）からのＰＣＲ産物と増幅プライマーとを含有する主ＰＣＲ溶液中で実施される。この場合、ステップＡ）は、ステップＢ）の反応容積の１／２〜１／１０になる反応容積で実施してよい。次にステップＡ）で、少量の容積に限定されて、中間産物により高い濃度が生じ、もしくは明らかに少ない核酸塩基配列を使用してよい。ステップＡ）からステップＢ）へ移行する際にＰＣＲ開始容積による希釈によって再びアダプタプライマーならびに伸長プライマーが強く希釈され、その結果、増幅プライマーを介した核酸塩基配列の中への変形体および／または修飾体の組込みの確率は増大する。
【００２３】
個別的に前記第１の別法において、ＰＣＲは１０〜１００μｌ、好ましくは２０〜４０μlの反応容積中で、核酸塩基配列０．０１〜１００ｐｇ、好ましくは１〜５０ｐｇ、アダプタプライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭおよび伸長プライマー０．００５〜０．５μＭ、好ましくは０．００１〜０．１μＭで実施され、所定の初期サイクル数後に増幅プライマー０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭが添加され、それに続く所定数のサイクルによって増幅した核酸塩基配列が製造されるように処理することができる。前記第２の別法において次の反応条件が望ましい：ステップＡ）：反応容積＜１０μｌ、核酸塩基配列０．００１〜５ｐｇ、好ましくは０．０１〜１ｐｇ、アダプタプライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭおよび伸長プライマー０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭ、第１サイクル数１０〜３０、好ましくは１５〜２５、ステップＢ）：反応容積１０〜１００μｌ、好ましくは１５〜５０μｌ、ＰＣＲ開始溶液によりステップＡ）の溶液の補給によって得た、増幅プライマー０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜５μＭ、第２サイクル数１５〜５０、好ましくは２０〜４０。
【００２４】
本発明はさらに、細胞を含有しないインビトロ蛋白質生合成のために、特に原核系、好ましくはＥｓｈｅｒｉａ  Ｃｏｌｉ  Ｄ１０からの翻訳系での本発明による核酸の製造方法の使用を教示する。
【００２５】
本発明による方法は、好ましくは核酸ライブラリから所定の核酸塩基配列の選択的増幅に使用可能である。これは遺伝子配列の特性化を可能にし、この遺伝子配列が核酸塩基配列として使用され、得た蛋白質は構造および／または機能に関して解析される。この本発明の観点の背景は、多数の遺伝子のための配列が知られているが、それによってコードした蛋白質の構造と機能が知られていないことである。従って単に配列が自体として知られている遺伝子ライブラリの各エレメントをその機能について有機体で調査することができる。得た蛋白質の構造および機能の調査は、この場合通常の生化学の作業方法に従う。
【００２６】
本発明による方法を利用して、１つの蛋白質のためにコードする核酸塩基配列および１つのリボソーム結合配列ならびに「プロモーター配列、転写ターミネータ配列、発現エンハンサー配列、安定化配列、およびアフィニティタグ配列」からなるグループから選択的に１つまたは複数の配列を含有する核酸を得ることができる。アフィニティタグ配列は精製のために分離系の中で（大抵が固定化した）結合部位に対して高いアフィニティを有する構造のためにコードする。それによってアフィニティタグを含有しない蛋白質の容易にかつ高類似性の分離が可能である。その一例がＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩであり、これはストレプタクチンとのアフィニティを有する８アミノ酸基からなるペプチド構造である。安定化配列は、自体でまたは構造に特異的な結合分子との結合後に、特にヌクレアーゼによって減成に対する安定化を生ぜしめる構造のためにコードする。核酸（エンド）配列の安定化は、一端に、好ましくは両端にストレプトアビジンで置換してよいビオチン基を組み込むことによって行うことができる。この組込みは、ビオチンをもつプライマー、特に増幅プライマーの使用によって行うことができる。発現エンハンサー配列は、発現エンハンサー配列なしで核酸に対する翻訳効率を高める。この場合は、たとえば（非翻訳）スペーサーとしてよい。転写ターミネータ配列はＲＮＡ合成を終結する。その一例はＴ７ファージ遺伝子１０転写ターミネータである。転写ターミネータ配列は、３’エキソヌクレアーゼによる減成に対して安定化することができる。前記配列要素相互の好ましい相対的な配置は、以下の実施例から一般化することができる。
【００２７】
以下、本発明は単に有利な実施形態を示した例を利用してより詳しく説明する。
【００２８】
ＰＣＲ：
ＰＣＲは、トリス−ＨＣｌ１０ｍＭ（２０℃でｐＨ８．８５）、ＫＣｌ２５ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｍＭ、ＭｇＳＯ４２ｍＭ、各ｄＮＴＰ０．２５ｍＭ、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ３Ｕ（ロシュ）ならびに本例で指示した量の核酸塩基配列を含む本例で定量化した反応容積で実施した。サイクルは９４℃で０．５分、５５℃で１分および７２℃で１分で実施した。
【００２９】
インビトロ発現：
インビトロ発現、文献箇所  Ｚｕｂａｙ、Ｇ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇａｎｅｔ．７：２６７−２８７（１９７３）に基づき以下のような変更によって実施した。Ｅｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ−３０溶解物をＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ７５０Ｕ／ｍｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および３００μＭ［１４Ｃ］Ｌｅｕ（１５ｄｐｍ／ｐｍｏｌ、アマースハム）で補充した。ＰＣＲ産物および制御プラスミドは、１ｎＭ〜１５ｎＭの濃度で使用した。反応は３７℃で実施し、その経過は後の時点で部分標本５μｌを反応混合物から抽出し、ＴＣＡ沈降によって［１４Ｃ］Ｌｅｕの組込みを評価した。別の部分標本１０μｌは、合成した蛋白質の分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用してオートラジオグラフィーに続いてホスホイメージャ−システム（モレキュラーダイナミクス）で抽出した。
【００３０】
プラスミド構造：
ウシ心臓脂肪酸結合蛋白質  （ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｕｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のためにコードして構成されたプラスミドｐＥＴ ＢＨ−ＦＡＢＰ（Ｓｐｅｃｈｔ，Ｂ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２５９−２６９（１９９４））の高複製誘導体（ｈｉｇｈ  ｃｏｐｙ  Ｄｅｒｉｖａｔ）がｐＨＭＦＡと呼ばれる。ｐＥＴ ＢＨ−ＦＡＢＰのフラグメントはエンドヌクレアーゼＳｐｈＩとＥｃｏＲＩによる消化によって生成し、ベクターｐＵＣ１８の中に挿入した。Ｈ−ＦＡＢＰの合成にとり重要である配列に関して、プラスミドｐＨＭＦＡはオリジナルプラスミドと同一である。ここで線状化プラスミドは環状プラスミドよりも良好に挙動しないことを注記しておく。
【００３１】
プロモーターの上流に種々の配列領域を有する核酸の構造：
プラスミドｐＨＭＦＡは、プロモーターの下流に種々の配列領域を有する核酸の構造のためのマトリックスとして利用する。プロモーターの上流に塩基対０．５および２４９を有する構造体（例参照）ＦＡ１、ＦＡ２およびＦＡ４は、プライマーＰ１、Ｃ１およびＰ２ならびに下流のプライマーＰ３によって発生した。プロモーターの上流に１５塩基対の配列領域を有する構造体ＦＡ３は、エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩによるＦＡ４の消化によって得た。３０４０塩基対の配列領域を有する制御プラスミドｐＨＭＦＡ（ＥｃｏＲＶ）は、ＥｃｏＲＶによるプラスミドの消化によって得た。全産物は、「高純度ＰＣＲ産物精製キット」（“Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”）によるゲル抽出に続き、アガロースゲル電気泳動によって洗浄した。
【００３２】
アフィニティ洗浄：
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを含有する脂肪酸結合蛋白質（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の洗浄（Ｖｏｓｓ，Ｓ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．10：９７５−９８２（１９９７））は、アフィニティカラム（２００μｌ）の容積を低減したほかは、製造者規則（ＩＢＡゲッティンゲン、ドイツ）に基づくアフィニティクロマトグラフィーを利用して実施した。結合した転写／翻訳の反応混合物は短く遠心分離し、次にカラムに取り込んだ。単離した画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上記参照）によるＴＣＡ沈降とオートラジオグラフィーによって分析した。
【００３３】
Ｈ−ＦＡＢＰ活性アッセイ：
インビトロ合成Ｈ−ＦＡＢＰを含む完全な反応混合物は、オレイン酸の結合の活性について調査した。様々な容積（０〜３０μｌ）はＨ−ＦＡＢＰを含有しない反応混合物を３０μｌまで充填し、翻訳緩衝溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、７０ｍＭ ＫＯＡｃ、３０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００２％ＮａＮ３）で最終容積１２０μｌに希釈した。比活性１０００ｄｐｍ／ｐｍｏｌを有するオレイン酸（アマースハム）２μｌ５ｍＭ［９．１０（ｎ）−３Ｈ］の添加後、サンプルを１時間３７℃でインキュベートした。サンプル５０μｌをゲル濾過（マイクロバイオスピンクロマトグラフィカラム；バイオ−ラート）を利用して非結合オレイン酸の除去のために使用した。溶離した画分の３Ｈ放射能は、シンチレーションカウンターで測定した。
【００３４】
核酸の安定化の分析：
放射性標識核酸を前記条件に従って、ただしｄＣＴＰ０．１６７μＣｉ／μｌ［α−３５Ｓ］の存在下に合成した。標識した核酸は、結合した転写／翻訳、反応容積４００μｌに使用した。部分標本３０μｌは、連続する時点で抽出した。リボヌクレアーゼＡ１５μｇ（ＤＮＡｓｅなし、ロシュ）の添加後、これを１５分間３７℃でインキュベートした。さらに３７℃で３０分間のインキュベートは、ＳＤＳ０．５％、ＥＤＴＡ２０ｍＭおよびプロテイナーゼＫ５００μｇ／ｍｌ（ジブコＢＲＬ）を全反応容積６０μｌで実施した。残留するＰＣＲ産物は、さらにエタノール沈降によって洗浄し、その後に減成電気泳動（ポリアクリルアミド５．３％、尿素７Ｍ、ＳＤＳ０．１％、ＴＢＥ）にかけた。乾燥したゲルは放射能の定量化のためにホスイメージャシステム（モレキュラーダイナミクス）を通過させた。
【００３５】
配列：
使用したプライマー配列は図１に示した。
【実施例１】
【００３６】
４プライマーによるＰＣＲ
図２に、４プライマーによる本発明による１段階ＰＣＲの模式図を示した。中央にまずエンドヌクレアーゼＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩによる消化によりｐＨＭＦＡから５４８ｂｐ制限断片として得たＨ−ＦＡＢＰ（「ウシ心臓由来の均質および機能活性脂肪酸結合蛋白質」“ｈｏｍｏｅｇｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅａｒｔ”）のための完全なコーディング配列を含む蛋白質のためにコードする核酸塩基配列が識別される（ならびに翻訳されず、アダプタプライマーまたは伸長プライマーとも相補的ではない３’−末端の１５０ｂｐ配列）。それに核酸塩基配列の末端と均質の末端を包む両アダプタプライマーＡおよびＢがハイブリダイズされる。アダプタプライマーＡは、さらにリボソーム結合配列を含む。アダプタプライマーＡおよびＢの外部末端に伸長プライマーＣおよびＤがハイブリダイズされる。伸長プライマーＣはＴ７転写プロモーターを含むＴ７遺伝子１０リーダー配列と、選択により下流に、たとえば５ヌクレオチドの配列とを包む。伸長プライマーＤはＴ７遺伝子１０ターミネータ配列を含む。
【実施例２】
【００３７】
プロモーターの上流の配列領域に依存するＨ−ＦＡＢＰ合成の効率
プロモーターの上流に種々の配列領域（０、５、１５、２５０塩基対）を有する４ＰＣＲ産物（ＦＡ１〜ＦＡ４）およびプロモーターの上流に３０４０ｂｐを有する線状化制御プラスミドｐＨＭＦＡ（ＥｃｏＲＶ）は、様々な濃度（１、５、１０および１５ｍＭ）でインビトロ転写／翻訳について調査した。図３は、０（下側曲線）を除き、全配列領域が蛋白質生合成の増加を生ぜしめることを示す。すでに５塩基対で充分である。
【実施例３】
【００３８】
ファージＴ７遺伝子１０転写ターミネータ／５’リーダー配列ファージＴ７遺伝子１０によるＨ−ＦＡＢＰ合成の改善。
図４に、ファージＴ７遺伝子１０転写ターミネータによって少なくとも係数２．８分だけ合成を改善できることが識別される。三角形はＦＡΔｔを表し、四角形はＦＡｔを表す（図２も参照）。
【００３９】
さらに図４に、３４ｂｐの欠失が転写開始とε配列（Ｏｌｉｎｓ，Ｐ．Ｏ．ら；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｎａ．ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．264：１６９７３−１６９７６（１９８９））との間で産物形成の橋渡しをすることが識別される。この範囲は前記変形体ＦＡΔ３４を表す(図２も参照)。
【実施例４】
【００４０】
転写ターミネータ配列の状態の影響
ターミネータ配列の状態の影響の調査のために、産物ＦＡｓｔおよびＦＡａｓｔ（図２参照）を生成した。両者とも、２２ｂｐスペーサー配列がストップコドンとターミネータとの間で異なるプライマーを用いて挿入したこと以外は、ＦＡｔおよびＦＡａｔと同一である。図５に、スペーサー配列が約２倍の発現の増加を生ぜしめることが識別される。
【００４１】
しかし図５に、さらにＦＡｔおよびＦＡａｔの比較から、アフィニティタグが発現に全く影響を及ぼさないことも識別される。
【実施例５】
【００４２】
複合ＤＮＡ混合物からのＰＣＲ
本発明による方法の効果性および特異性を大量の適格ＤＮＡの存在下に調査した。ＦＡｓｔのＰＣＲは、以下を例外として、前記説明に準じて実施した。すなわち核酸塩基配列は０．１６〜２０ｐｇ／５０μl反応器容積の濃度で実施し、反応をエッシェリキア・コリからクロモソマールＤＮＡ０．８３μｇを用いて、５分間超音波処理して補充した。５００万倍過剰の適格ＤＮＡの存在によってＰＣＲ産物の質も量も影響されないことが見出された。
【実施例６】
【００４３】
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩによるアフィニティ洗浄
放射性標識ＦＡａｓｔ１０μｇを含む反応混合物をアフィニティ洗浄にかけた。装填物質約８１％をカラムから得て、純産物として６７％を溶離画分中で得ることができた（アフィニティカラムの画分のＴＣＡ沈降から計算）。
【実施例７】
【００４４】
ＰＣＲ産物のアフィニティ。
Ｈ−ＦＡＢＰのサンプルを、プラスミドまたはＰＣＲ産物ＦＡａｓｔのいずれかを利用して合成し、相互にオレイン酸の結合活性について調査した。転写／翻訳後、非標識Ｈ−ＦＡＢＰ０〜３３０ｐｍｏｌを有する種々の容積を結合アッセイ中で前記方法説明に従って調査した。活性は、製造方法に関係なく同一であることが見出された。
【実施例８】
【００４５】
ＰＣＲ産物の安定性
ＰＣＲ産物の安定性はできる限り発現の効果性を制限しうるかの調査のために、ＰＣＲ産物ＦＡａｓｔの減少を測定した。そのために放射性標識産物を使用した。所定の時間間隔で反応混合物の部分標本から抽出し、減成ポリアクリルアミドゲル電気泳動を利用して調査した。残留するＰＣＲ産物の量は、ゲルの放射能のスキャニングによって定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる反応混合物の分離後にゲル中のＨ−ＦＡＢＰの放射能のスキャニングによって測定して、蛋白質生合成の時間的推移と比較した。この結果は図６に示した。ＰＣＲ産物の半減期は約１００分になり、これがプラトー部でＨ−ＦＡＢＰ合成の流入に相当することが識別される。
【実施例９】
【００４６】
４プライマーによるＰＣＲの最適化条件
表１に、反応容積２５μｌ中の４プライマーによるＰＣＲ用の最適化条件をまとめた。
【００４７】
表１
ａ）反応成分
2004524854.tif 000002
ｂ）温度プログラム
2004524854.tif 000003
【実施例１０】
【００４８】
６プライマーによるＰＣＲ
実施例９からの物質を用いて、ただし付加的に２増幅プライマーｅ（２６ヌクレオチド）とｆ（３３ヌクレオチド）ならびに増加したアダプタプライマー濃度０．２μＭを用いて、変化させた伸長プライマー濃度を調節した。増幅プライマーに関しては、図１のＢＩＯＲおよびＢＩＯＦを参照されたい。ＢＩＯＦはビオチン標識フォワードプライマーであり、ＢＩＯＲはビオチン標識リザーブプライマーである。この構造は図７に示している。
【００４９】
高価な伸長プライマーの最小限の所要量は、初めに増幅プライマーなしで２５サイクル、それに続きさらに増幅プライマーつきで２５サイクル行ったときに生じた。伸長プライマーの濃度は、０．０２５μＭまでの増幅プライマーの使用によって低減することができた。これは係数約１／２０であり、それにもかかわらずＰＣＲ産物の均質性と収率が改善された。
【００５０】
これらの長所は、中間産物の生成のために必要であるプライマーが低濃度で使用されるので、６プライマーの使用による高濃度での中間産物の形成の確率が、大幅に低減されることに基づく。従って中間産物は増幅プライマーによって指数関数的に富化させることができない。
【実施例１１】
【００５１】
２ステップでの６プライマーによるＰＣＲ
基本的に前記のような物質を用いて処理する。初めに反応容積５μｌ中のプレＰＣＲを核酸塩基配列０．１ｐｇ、しかもアダプタプライマー０．３μＭおよび伸長プライマー０．５μＭで２０サイクル以上実施する。次にこのように得た反応溶液をＰＣＲ開始容積で２５μｌに希釈する。次に増幅プライマーを最終濃度０．５μＭまで添加する。最後に、さらに３０サイクル増幅する。
【実施例１２】
【００５２】
ビオチンを含む核酸の安定化
プライマーＢＩＯＦおよびＢＩＯＲの使用下に６プライマーによるＰＣＲの方法で、前記のように核酸を製造し、その分解を時間の関数ならびに蛋白質合成の改善を調査する。これは図７および図８に示している。ビオチンにより、特にストレプトアビジンによる転換後、著しく改善された安定性が生じることが識別される。これはより高い２０％までの蛋白質合成をもたらす。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
上記実施例に関係なく、本発明による方法によって非常に容易な配列の変化も突然変異によって、たとえばタグポリメラーゼの使用および／または変化した反応条件によって可能であることを注記しておく。これが所望ではないときは、好ましくはより正確に機能し、プルーフリーディング活性を有するＰｗｏまたはＰｆｕを用いて処理してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＰＣＲに用いたプライマーの配列である。
【図２】図１に示す４プライマーを用いたＰＣＲの模式図である。
【図３】横軸に鋳型[ｎＭ]を示し、縦軸にＨ−ＦＡＢＰ合成[％]を示したグラフである。
【図４】横軸に鋳型[ｎＭ]を示し、縦軸にＴＣＡ沈降可能ロイシン[ｎＭ]を示したグラフである。
【図５】横軸に鋳型[ｎＭ]を示し、縦軸にＴＣＡ沈降可能ロイシン[ｎＭ]を示したグラフである。
【図６】横軸に時間[ｍｉｎ]を、縦軸にＨ−ＦＡＢＰ合成[％]と残留ＰＣＲ産物[％]を示したグラフである。
【図７】５´−ビオチンの構造式と、ビオチン、ストレプトアビジンによる核酸の安定化を示した模式図である。横軸に時間[ｍｉｎ]、縦軸にＴＣＡ沈降可能ＰＣＲ産物[％]を示したグラフである。
【図８】蛋白質合成に及ぼすストレプトアビジンの影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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