(57)【要約】本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞に関する。本発明における使用に適した組み込みベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、トランスポゾンベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。組み込みベクターを高い感染多重度で用いることによって宿主細胞を調製する方法を提供する。宿主細胞は、医薬タンパク質、スクリーニングアッセイに用いるためのタンパク質の変種の産生、および高速スクリーニングにおける直接的な使用に関して有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが少なくとも２つの組み込まれた組み込みベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）を含み、該組み込みベクターがプロモーターと機能的に結合した少なくとも１つの外因性遺伝子を含む、該ゲノムを含む宿主細胞。
【請求項２】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合したＲＮＡ安定化因子をさらに含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項４】
組み込みベクターが少なくとも２つの外因性遺伝子を含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項５】
少なくとも２つの外因性遺伝子が多シストロン性配列として配置される、請求項４記載の宿主細胞。
【請求項６】
少なくとも２つの外因性遺伝子が少なくとも１つのリボソーム内部進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）によって隔てられている、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
２つの外因性遺伝子が多シストロン性配列として配置される、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項８】
２つの外因性遺伝子が免疫グロブリン分子の重鎖および免疫グロブリン分子の軽鎖をコードする、請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】
少なくとも２つの外因性遺伝子の１つが選択マーカーである、請求項４記載の宿主細胞。
【請求項１０】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項１１】
レトロウイルスベクターが偽型のレ（ｐｓｕｅｄｏｔｙｐｅｄ）トロウイルスベクターである、請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
偽型のレトロウイルスベクターがＧ糖タンパク質を含む、請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１３】
Ｇ糖タンパク質が、水疱性口内炎ウイルス、ピリウイルス、チャンディプラウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、およびモコラ（Ｍｏｋｏｌａ）ウイルスのＧ糖タンパク質からなる群より選択される、請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１４】
レトロウイルスベクターが、ＭｏＭＬＶ、ＭｏＭｕＳＶおよびＭＭＴＶの末端反復配列からなる群より選択される末端反復配列を含む、請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１５】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１６】
レンチウイルスベクターが、ＨＩＶおよびウマ伝染性貧血ウイルスの末端反復配列からなる群より選択される末端反復配列を含む、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
インビトロ培養およびインビボ培養からなる群より選択される培養系に存在する、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項１８】
チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項１９】
クローン由来である、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項２０】
非クローン由来である、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項２１】
ゲノムが１０回を上回る継代に対して安定である、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項２２】
ゲノムが５０回を上回る継代に対して安定である、請求項２１記載の宿主細胞。
【請求項２３】
ゲノムが１００回を上回る継代に対して安定である、請求項２１記載の宿主細胞。
【請求項２４】
組み込まれた外因性遺伝子が、選択がなされない状態で安定である、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項２５】
プロモーターが、α−ラクトアルブミンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、およびモロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列からなる群より選択される、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項２６】
少なくとも１つの外因性遺伝子が、抗原結合タンパク質、医薬用タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、核酸結合タンパク質、膜受容体タンパク質、シグナル伝達タンパク質、イオンチャネルタンパク質および腫瘍性タンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項２７】
ゲノムが少なくとも３つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項２８】
ゲノムが少なくとも４つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項２９】
ゲノムが少なくとも５つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３０】
ゲノムが少なくとも７つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３１】
ゲノムが少なくとも１０個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３２】
ゲノムが少なくとも２０個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３３】
ゲノムが少なくとも１０００個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３４】
第１の外因性遺伝子を含む第１の組み込みベクターの少なくとも２つの組み込まれたコピー、および第２の外因性遺伝子を含む第２の組み込みベクターの少なくとも１つの組み込まれたコピーをさらに含む、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞が１日当たり約１０ピコグラムを上回る外因性タンパク質を発現する、請求項１記載の宿主細胞。
【請求項３６】
宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、
１）ａ）ゲノムを含む宿主細胞、および
ｂ）複数の組み込みベクター
を提供する段階；ならびに
２）少なくとも２つの組み込みベクターが該宿主細胞の該ゲノムに組み込まれる条件下で、該宿主細胞を該複数の組み込みベクターと接触させる段階
を含む方法。
【請求項３７】
条件が、１０を上回る感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
条件が、約１０〜１０００の感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも３つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも４つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも５つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも７つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項３６記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１０個の組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項３６記載の方法。
【請求項４４】
組み込みベクターが、プロモーターと機能的に結合した少なくとも１つの外因性遺伝子を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４５】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナルをさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４６】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合したＲＮＡ安定化因子をさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４７】
組み込みベクターが少なくとも２つの外因性遺伝子を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも２つの外因性遺伝子が多シストロン性配列中に配置される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項３６記載の方法。
【請求項５０】
レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
レンチウイルスベクターが、Ｇ糖タンパク質を含む偽型のレンチウイルスベクターである、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項３６記載の方法。
【請求項５４】
トランスフェクトされた宿主細胞をクローン的に（ｃｌｏｎａｌｌｙ）選択する段階をさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項５５】
２つの組み込みベクターのそれぞれが異なる外因性遺伝子を含む、少なくとも２つの組み込みベクターを該宿主細胞にトランスフェクトする段階をさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項５６】
関心対象のタンパク質を産生する方法であって、
１）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む、少なくとも１つの組み込みベクターの少なくとも２つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、該外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、該ゲノムを含む宿主細胞を提供する段階、および
２）該関心対象のタンパク質が産生される条件下で、該宿主細胞を培養する段階
を含む方法。
【請求項５７】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
段階３）関心対象のタンパク質を単離する段階
をさらに含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
条件が、回転瓶培養、灌流培養、流加培養（ｂａｔｃｈ ｆｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）およびペトリ皿培養からなる群より選択される、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの３つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの４つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの５つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６３】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの７つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６４】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの１０個を上回る組み込まれたコピーを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６５】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの約２個〜２０個の組み込まれたコピーを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６６】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの約３個〜１０個の組み込まれたコピーを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６７】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項５６記載の方法。
【請求項６８】
レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項５６記載の方法。
【請求項７１】
宿主細胞が、細胞１個当たり１日につき約１ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項５６記載の方法。
【請求項７２】
宿主細胞が、細胞１個当たり１日につき約１０ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項５６記載の方法。
【請求項７３】
宿主細胞が、細胞１個当たり１日につき約５０ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項５６記載の方法。
【請求項７４】
細胞をクローン的に選択する、請求項５６記載の方法。
【請求項７５】
化合物のスクリーニングのための方法であって、
１）ａ）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む、少なくとも１つの組み込みベクターの少なくとも２つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、該外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、該ゲノムを含む宿主細胞；および
ｂ）１つまたは複数の被験化合物
を提供する段階；
２）該関心対象のタンパク質が発現される条件下で、該宿主細胞を培養する段階；
３）宿主細胞を該１つまたは複数の被験化合物で処理する段階；ならびに
４）該宿主細胞における該被験化合物に対する反応の存在に関してアッセイする段階
を含む方法。
【請求項７６】
外因性遺伝子が、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、および癌遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
宿主細胞がレポーター遺伝子をさらに含む、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
レポーター遺伝子が、緑色蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびβ−ラクタマーゼからなる群より選択される、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
アッセイの段階が、レポーター遺伝子からのシグナルを検出する段階をさらに含む、請求項７５記載の方法。
【請求項８０】
宿主のゲノムが少なくとも２つの組み込みベクターを含み、該少なくとも２つの組み込みベクターのそれぞれが、異なる外因性遺伝子を含む、請求項７５記載の方法。
【請求項８１】
組み込みベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項７５記載の方法。
【請求項８２】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項７５記載の方法。
【請求項８３】
タンパク質の機能を比較するための方法であって、
１）ａ）第１の外因性遺伝子が第１の関心対象のタンパク質をコードし、該第１の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む、第１の組み込みベクターを含む第１の宿主細胞、および
ｂ）第２の外因性遺伝子が、第１の関心対象のタンパク質の変種（ｖａｒｉａｎｔ）である第２のタンパク質をコードし、該第２の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む第２の組み込みベクターを含む、少なくとも第２の宿主細胞
を提供する段階；
２）該第１および第２の関心対象のタンパク質が産生される条件下で、該宿主細胞を培養する段階；ならびに
３）該第１および第２の関心対象のタンパク質の活性を比較する段階
を含む方法。
【請求項８４】
外因性遺伝子が、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、細胞周期タンパク質、および癌遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
第１および第２の関心対象のタンパク質が、単一のヌクレオチド多型により異なる、請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
第１および第２の関心対象のタンパク質の同一性が９５％を上回る、請求項８３記載の方法。
【請求項８７】
第１および第２の関心対象のタンパク質の同一性が９０％を上回る、請求項８３記載の方法。
【請求項８８】
第１および第２の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの３つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項８３記載の方法。
【請求項８９】
第１および第２の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの４つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項８３記載の方法。
【請求項９０】
第１および第２の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの５つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項８３記載の方法。
【請求項９１】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項８３記載の方法。
【請求項９２】
レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
１）ａ）少なくとも１つの組み込まれた外因性遺伝子を含むゲノムを含む、宿主細胞；および
ｂ）複数の組み込みベクター
を提供する段階；ならびに
２）該組み込みベクターの少なくとも２つが該宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、該宿主細胞を該複数の組み込みベクターと接触させる段階
を含む方法。
【請求項９５】
組み込まれた外因性遺伝子が組み込みベクターを含む、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
宿主細胞をクローン的に選択する、請求項９４記載の方法。
【請求項９７】
宿主細胞を非クローン的に選択する、請求項９４記載の方法。
【請求項９８】
条件が、１０を上回る感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項９４記載の方法。
【請求項９９】
条件が、約１０から１０００の感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項９４記載の方法。
【請求項１００】
少なくとも３つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項９４記載の方法。
【請求項１０１】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項９４記載の方法。
【請求項１０２】
レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項１０１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、組み込みベクターの組み込まれた複数のコピーを含む宿主細胞に関する。
【０００２】
発明の背景
医薬・バイオテクノロジー産業は、哺乳類細胞における組換えタンパク質の産生を拠り所としている。これらのタンパク質は、多くの疾患および状態の治療的処置のために不可欠である。多くの場合、これらのタンパク質の市場は年間１０億ドルを上回る。哺乳類細胞における組換え産生が行われているタンパク質の例には、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびインスリンが含まれる。これらのタンパク質の多くに関しては、正しい翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはｓｉｌａｔｉｏｎ；例えば、米国特許第５，７２１，１２１号を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）が必要なことから、哺乳類細胞における発現の方が原核細胞における発現よりも好ましい。
【０００３】
組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製するための方法はいくつか知られている。最も基本的な方法では、異種タンパク質をコードする遺伝子および適切な調節領域を含む核酸構築物を宿主細胞に導入して組み込ませる。導入方法には、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、リポフェクションおよびエレクトロポレーションが含まれる。他の方法では、選択方式を用いて、導入した核酸構築物を増幅する。これらの方法では、増幅可能な選択マーカーをコードする遺伝子および異種タンパク質をコードする遺伝子により、細胞の共トランスフェクションを行う（例えば、ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＦｒｉｅｄｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ５３（６）：５４７〜５９［１９９７］を参照）。最初の形質転換体の選択の後に、培地中の選択用物質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を段階的に増やすことにより、トランスフェクトした遺伝子を増幅する。場合によっては、これらの手順によって外因性遺伝子を数百倍に増幅しうる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の他の発現方法では、エピソーム性ベクター（例えば、プラスミド）によるトランスフェクションを用いる。
【０００４】
組換えタンパク質の発現用の哺乳類細胞系を作製するための現行の方法にはいくつか欠点がある（例えば、Ｍｉｅｌｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５：２２３９〜５２［１９９６］を参照）。エピソーム系は、組換えタンパク質の高レベルの発現を可能にするが、短期的にしか安定でないことが多い（例えば、ＫｌｅｈｒおよびＢｏｄｅ、Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ａｄｖ．）７：４７〜５２［１９８８］を参照）。外因性遺伝子が組み込まれた哺乳類細胞系はそれよりも幾分安定しているが、安定性は外因性遺伝子の少数のコピー、場合によっては単一のコピーのみの存在に依存しているという知見が増しつつある。
【０００５】
標準的なトランスフェクション法は、導入遺伝子の複数のコピーを宿主細胞のゲノムに導入するのに好都合である。多くの場合、導入遺伝子の複数の組み込みは本質的に不安定であることが判明している。この本質的な不安定性は、相同組換えによるコード配列の消失を促す特徴的な頭−尾様式の組み込みに起因すると思われ（例えば、Ｗｅｉｄｌｅら、Ｇｅｎｅ ６６：１９３〜２０３［１９８８］を参照）、これは特に導入遺伝子が転写される際に想定される（例えば、ＭｃＢｕｒｎｅｙら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． ２０：５２９〜４０［１９９４］を参照）。宿主細胞にも、複数のコピーの組み込みイベントに対する後成的な防御機構がある。植物では、この機構は「共抑制」と呼ばれている（例えば、Ａｌｌｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５：６０３〜１３［１９９３］を参照）。実際に、発現レベルがコピー数と逆相関することは珍しくない。これらの観察結果は、外因性遺伝子の複数のコピーが、メチル化（例えば、Ｍｅｈｔａｌｉら、Ｇｅｎｅ ９１：１７９〜８４［１９９０］を参照）およびそれに続く変異誘発（例えば、Ｋｒｉｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８９：１０７５〜７９［１９９２］を参照）による不活性化、またはヘテロクロマチン形成によるサイレンシング（例えば、ＤｏｒｅｒおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｃｅｌｌ ７７：９９３〜１００２［１９９４］を参照）を受けるようになるという所見と一致する。
【０００６】
したがって、当技術分野では、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製するための改良された方法が必要とされている。宿主細胞は、長期間にわたって安定であって、導入遺伝子によってコードされるタンパク質を高レベルで発現するものが好ましい。
【０００７】
発明の概要
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生、より詳細には、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞に関する。本発明は、特定の数の組み込みベクターがトランスフェクトされた宿主細胞には限定されない。実際には、広範囲にわたる組み込みベクターを含む宿主細胞を考えている。いくつかの態様において、本発明は、好ましくは少なくとも約２つの組み込まれた組み込みベクターを含むゲノムを含む宿主細胞を提供する。またさらなる態様において、ゲノムは好ましくは少なくとも３つの組み込まれた組み込みベクターを含み、最も好ましくは少なくとも４つの組み込まれた組み込みベクター、５つの組み込まれた組み込みベクター、６つの組み込まれた組み込みベクター、７つの組み込まれた組み込みベクター、１０個の組み込まれた組み込みベクター、１５個の組み込まれた組み込みベクター、２０個の組み込まれた組み込みベクター、または５０個の組み込まれた組み込みベクターを含む。
【０００８】
本発明は、単一の関心対象のタンパク質（すなわち、外因性タンパク質）をコードするベクターを含む宿主細胞には限定されない。実際には、細胞には、複数の関心対象のタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトすることを考えている。いくつかの態様において、組み込みベクターは少なくとも２つの外因性遺伝子を含む。いくつかの好ましい態様において、少なくとも２つの外因性遺伝子は多シストロン性配列として配置される。いくつかの特に好ましい態様において、少なくとも２つの外因性遺伝子はリボソーム内部進入部位によって隔てられる。他の好ましい態様において、少なくとも２つの外因性遺伝子は多シストロン性配列として配置される。またさらなる態様において、２つの外因性遺伝子は免疫グロブリン分子の重鎖および免疫グロブリン分子の軽鎖を含む。他の態様において、少なくとも２つの外因性遺伝子の一方は選択マーカーである。さらに他の態様において、宿主細胞は、第１の外因性遺伝子を含む第１の組み込みベクターの少なくとも２つの組み込まれたコピー、および、第２の外因性遺伝子を含む第２の組み込みベクターまたは他のベクターの少なくとも１つの組み込まれたコピーを含む。またさらなる態様において、宿主細胞は、第１の外因性遺伝子を含む第１の組み込みベクターの少なくとも１０個の組み込まれたコピー、および第２の外因性遺伝子を含む第２の組み込みベクターまたは他のベクターの少なくとも１つの組み込まれたコピーを含む。
【０００９】
いくつかの好ましい態様において、組み込みベクターは、プロモーターと機能的に結合した少なくとも１つの外因性遺伝子を含む。本発明は、特定のプロモーターを含むベクターには限定されない。実際には、さまざまなプロモーターを考えている。本発明のいくつかの態様において、プロモーターは、α−ラクトアルブミンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびモロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列からなる群より選択される。他の好ましい態様において、組み込みベクターは、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナルをさらに含む。さらに他の態様において、組み込みベクターは、外因性遺伝子と機能的に結合したＲＮＡ移行因子（ＲＮＡ ｅｘｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）をさらに含む。
【００１０】
本発明は、特定の組み込みベクターには限定されない。実際には、さまざまな組み込みベクターを考えている。本発明のいくつかの態様において、組み込みベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターからなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、レトロウイルスベクターは偽型のレトロウイルスベクターである。他の好ましい態様、偽型のレトロウイルスベクターはＧ糖タンパク質を含む。本発明のレトロウイルスベクターは特定のＧ糖タンパク質には限定されない。実際には、さまざまなＧ糖タンパク質を考えている。いくつかの特に好ましい態様において、Ｇ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス、ピリウイルス、チャンディプラウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、およびモコラ（Ｍｏｋｏｌａ）ウイルスのＧ糖タンパク質からなる群より選択される。またさらなる態様において、レトロウイルスベクターは末端反復配列を含む。本発明のレトロウイルスベクターは特定のＬＴＲには限定されない。実際には、ＭｏＭＬＶ、ＭｏＭｕＳＶ、ＭＭＴＶの末端反復配列を含むが、これらに限定されない、さまざまなＬＴＲを考えている。
【００１１】
他の態様において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの好ましい態様において、レンチウイルスベクターは偽型化されたものである。いくつかの特に好ましい態様において、レンチウイルスベクターはＧ糖タンパク質を含む。またさらなる態様において、Ｇ糖タンパク質は、Ｇ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス、ピリウイルス、チャンディプラウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、およびモコラウイルスのＧ糖タンパク質からなる群より選択される。さらに他の態様において、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶおよびウマ伝染性貧血ウイルスの末端反復配列からなる群より選択される末端反復配列を含む。
【００１２】
本発明のまたさらなる態様において、組み込みベクターはトランスポゾンベクターである。いくつかの好ましい態様において、トランスポゾンベクターはＴｎ５、Ｔｎ７およびＴｎ１０トランスポゾンベクターから選択される。
【００１３】
本発明は特定の宿主細胞には限定されない。実際には、さまざまな宿主細胞を考えている。本発明のいくつかの態様では、宿主細胞をインビトロで培養する。本発明のまたさらなる態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞およびウシ乳腺上皮細胞から選択される。いくつかの好ましい態様において、宿主細胞はクローン由来である。他の態様において、宿主細胞は非クローン由来である。いくつかの態様において、宿主細胞のゲノムは１０回を上回る継代に対して安定である。他の態様において、ゲノムは５０回を上回る継代に対して安定であり、さらに他の態様において、ゲノムは１００回を上回る継代に対して安定である。さらに他の態様において、宿主細胞は胚性幹細胞、卵母細胞または胚でありうる。いくつかの態様において、組み込まれたベクターは選択がなされない状態で安定である。
【００１４】
本発明は、特定の関心対象のタンパク質をコードするベクターには限定されない。実際には、外因性遺伝子によってコードされるさまざまな関心対象のタンパク質をコードするベクターを考えている。いくつかの態様において、関心対象のタンパク質は、Ｂ型肝炎表面抗原、ＭＮ１４抗体、ＬＬ２抗体、ボツリヌス毒素抗体およびｃｃ４９ＩＬ２から選択される。いくつかの態様において、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子にはイントロンがなく、また別の態様において、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子は少なくとも１つのイントロンを含む。
【００１５】
本発明は、宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入のための方法であって、１）ａ）ゲノムを含む宿主細胞、およびｂ）複数の組み込みベクターを提供すること；ならびに２）少なくとも２つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させること、を含む方法も提供する。いくつかの態様において、本条件は、１０を上回る感染多重度で宿主細胞を接触させることを含む。他の態様において、本条件は、約１０〜１，０００，０００の感染多重度で宿主細胞を接触させることを含む。またさらなる態様において、本条件は、約１００〜１０，０００の感染多重度で宿主細胞を接触させることを含む。またさらなる態様において、本条件は、約１００〜１，０００の感染多重度で宿主細胞を接触させることを含む。本発明のさらに他の態様において、本方法はさらに、２つの組み込みベクターのそれぞれが異なる外因性遺伝子を含む、少なくとも２つの組み込みベクターを前記宿主細胞にトランスフェクトすることを含む。さらに他の態様において、本条件は、宿主細胞に対して、関心対象のタンパク質をコードするベクターによる少なくとも第１のトランスフェクションまたは形質導入でトランスフェクションまたは形質導入を行い、続いて、別のトランスフェクションまたは形質導入の段階で再度のトランスフェクションまたは形質導入を行う、宿主細胞の連続的なトランスフェクションまたは形質導入を含む。
【００１６】
本発明はさらに、関心対象のタンパク質を産生する方法であって、１）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む少なくとも１つの組み込みベクターの少なくとも２つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、ゲノムを含む宿主細胞を提供すること、および２）関心対象のタンパク質が産生される条件下で、宿主細胞を培養すること、を含む方法を提供する。いくつかの好ましい態様において、組み込みベクターは、前記外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む。他の態様において、本方法は、段階３）関心対象のタンパク質を単離することをさらに含む。本発明は何らかの特定の培養システムには限定されない。実際には、回転瓶培養、灌流培養、流加培養およびペトリ皿培養を含むが、これらに限定されない、さまざまな培養システムを考えている。いくつかの態様において、細胞系はクローン的に選択され、また別の態様において、細胞は非クローン的に選択される。
【００１７】
本発明の方法は、何らかの特定の数の組み込まれた組み込みベクターを含む宿主細胞には限定されない。実際には、いくつかの態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの３つを上回る組み込まれたコピーを含む；他の態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの４つを上回る組み込まれたコピーを含む；さらに他の態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの５つを上回る組み込まれたコピーを含む；さらなる態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの７つを上回る組み込まれたコピーを含む；またさらなる態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの１０個を上回る組み込まれたコピーを含む。他の態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの約２〜２０個の組み込まれたコピーを含む。いくつかの態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの約３〜１０個の組み込まれたコピーを含む。
【００１８】
本発明の方法は何らかの特定の組み込みベクターには限定されない。実際には、さまざまな組み込みベクターの使用を考えている。いくつかの態様において、組み込みベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの好ましい好ましい態様において、レトロウイルスベクターは偽型のレトロウイルスベクターである。他の態様において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００１９】
本発明の方法は、何らかの特定の宿主細胞の使用には限定されない。実際には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、ウシ乳腺上皮細胞、卵母細胞、胚、幹細胞および胚性幹細胞を含むが、これらに限定されない、さまざまな宿主細胞の使用を考えている。
【００２０】
本発明の方法は、宿主細胞からの、何らかの特定の量の外因性タンパク質（すなわち、関心対象のタンパク質）の産生には限定されない。実際には、本発明の方法による種々の発現レベルが許容されると考えている。いくつかの態様において、宿主細胞は、細胞１個当たり１日につき約１ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する。他の態様において、宿主細胞は、細胞１個当たり１日につき約１０ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する。またさらなる態様において、宿主細胞は、細胞１個当たり１日につき約５０ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、化合物のスクリーニングのための方法であって、１）ａ）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む少なくとも１つの組み込みベクターの少なくとも２つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、ゲノムを含む宿主細胞；およびｂ）１つまたは複数の被験化合物を提供すること；２）関心対象のタンパク質が発現される条件下で、宿主細胞を培養すること；３）宿主細胞を１つまたは複数の被験化合物で処理すること；ならびに４）宿主細胞における被験化合物に対する反応の有無をアッセイすること、を含む方法を提供する。本発明のいくつかの態様において、外因性遺伝子は、レポータータンパク質、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、癌遺伝子によってコードされるおよびタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする。
【００２２】
またさらなる態様において、宿主細胞はレポーター遺伝子をさらに含む。いくつかの特に好ましい態様において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−ラクタマーゼからなる群より選択される。いくつかの態様において、アッセイの段階は、レポーター遺伝子からのシグナルを検出することをさらに含む。他の態様において、宿主細胞のゲノムは、それぞれが異なる外因性遺伝子を含む、少なくとも２つの組み込みベクターを含む。
【００２３】
さらに他の態様において、本発明は、タンパク質活性を比較するための方法であって、１）ａ）第１の外因性遺伝子が第１の関心対象のタンパク質をコードする、第１の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む第１の組み込みベクターを含む第１の宿主細胞、およびｂ）第２の外因性遺伝子が第１の関心対象のタンパク質の変種である第２の外因性遺伝子をコードする、第２の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む第２の組み込みベクターを含む少なくとも第２の宿主細胞を提供すること；２）第１および第２の関心対象のタンパク質が産生される条件下で、宿主細胞を培養すること；ならびに３）第１および第２の関心対象のタンパク質の活性を比較すること、を含む方法を提供する。
【００２４】
いくつかの態様において、外因性遺伝子は、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、細胞周期タンパク質、および癌遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする。他の態様において、第１および第２の関心対象のタンパク質は単一のアミノ酸のみの点で異なる。またさらなる態様において、第１および第２の関心対象のタンパク質の同一性は９５％を上回り、好ましくは９０％を上回り、最も好ましくは８０％を上回る。
【００２５】
他の態様において、本発明は、１）ａ）少なくとも１つの組み込まれた外因性遺伝子を含むゲノムを含む宿主細胞；およびｂ）複数の組み込みベクターを提供すること；ならびに２）組み込みベクターの少なくとも２つが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させること、を含む方法を提供する。いくつかの態様において、組み込まれた外因性遺伝子には組み込みベクターが含まれる。他の態様において、宿主細胞はクローン的に選択される。代替的な態様において、宿主細胞は非クローン的に選択される。
【００２６】
またさらなる態様において、本発明は、関心対象のタンパク質の発現を間接的に検出する方法であって、ＩＲＥＳによって機能的に結合したシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質を含む多シストロン性配列をコードするベクターによるトランスフェクションを行った宿主細胞を提供すること、ならびにシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質が産生される条件下で、宿主細胞を培養することを含み、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されるような方法を提供する。本発明の方法は何らかの特定の関心対象のタンパク質の発現には限定されない。実際には、Ｇタンパク質共役受容体を含むが、これらに限定されない、さまざまな関心対象のタンパク質の発現を考えている。本発明は何らかの特定のシグナルタンパク質の使用には限定されない。実際には、免疫グロブリン重鎖および軽鎖、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、緑色蛍光性タンパク質ならびにルシフェラーゼを含むが、これらに限定されない、さまざまなシグナルタンパク質の使用を考えている。特に好ましい態様において、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質の発現は同一のプロモーターによって駆動され、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質は単一の転写単位として転写される。
【００２７】
定義
本発明の理解を容易にするために、数多くの用語を以下に定義する。
【００２８】
本明細書で用いる「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれにあるかを問わず、任意の真核生物細胞（例えば、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）のことを指す。
【００２９】
本明細書で用いる「細胞培養」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養物のことを指す。この用語には、連続継代細胞系（例えば、不死化した表現型を有するもの）、初代細胞培養物、有限継代性細胞系（例えば、非形質転換細胞）ならびに、卵母細胞および胚を含む、インビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
【００３０】
本明細書で用いる「ベクター」という用語は、適切な制御因子を伴った場合に複製可能であり、細胞間の遺伝子配列の移行を可能とする、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝因子のことを指す。このため、この用語には、クローニング用および発現用の媒体、さらにウイルスベクターも含まれる。
【００３１】
本明細書で用いる「組み込みベクター」という用語は、核酸（例えば、染色体）へのその組み込みまたは挿入がインテグラーゼを介して行われるベクターのことを指す。「組み込みベクター」の例には、レトロウイルスベクター、トランスポゾンおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で用いる「組み込まれた」という用語は、ゲノム中（すなわち、宿主細胞の染色体中）に安定的に挿入されたベクターのことを指す。
【００３３】
本明細書で用いる「感染多重度」または「ＭＯＩ」という用語は、宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入の際に用いられる組み込みベクター：宿主細胞の比のことを指す。例えば、１００，０００個の宿主細胞の形質導入に１，０００，０００個のベクターを用いる場合には、感染多重度は１０である。この用語の使用は形質導入を伴うイベントには限定されず、リポフェクション、マイクロジェクション、リン酸カルシウム沈殿および電気穿孔などの方法による宿主細胞へのベクターの導入も含まれる。
【００３４】
本明細書で用いる「ゲノム」という用語は、生物体の遺伝物質（例えば、染色体）のことを指す。
【００３５】
「関心対象のヌクレオチド配列」という用語は、その操作が何らかの理由（例えば、疾患の治療、質の改善、宿主細胞における関心対象のタンパク質の発現、リボザイムの発現など）で望ましいと当業者が考える、任意のヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）のことを指す。このようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子のコード配列（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子など）、および、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物をコードしない非コード性調節配列（例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、エンハンサー配列など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で用いる「関心対象のタンパク質」とは、関心対象の核酸によってコードされるタンパク質のことを指す。
【００３７】
本明細書で用いる「シグナルタンパク質」という用語は、関心対象のタンパク質とともに発現され、適切なアッセイによって検出された場合に関心対象のタンパク質の発現の間接的な証拠となるタンパク質のことを指す。本発明において有用なシグナルタンパク質の例には、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で用いる「外因性遺伝子」という用語は、宿主生物もしくは細胞に自然条件下では存在しない、または宿主生物もしくは細胞に人工的に導入された遺伝子のことを指す。
【００３９】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆物質（例えば、プロインスリン）の産生のために必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列のことを指す。ポリペプチドは完全長コード配列によってコードされてもよく、または、完全長もしくは断片の必要な活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保たれている限り、コード配列の任意の部分によってコードされてもよい。この用語には構造遺伝子のコード領域も含まれ、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するような、コード領域の５’および３’端に隣接して位置する約１ｋｂまたはそれ以上の範囲にわたる配列も含まれる。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡにも存在する配列は５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡにも存在する配列は３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム型の両方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、コード領域が「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって分断されたものを含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）へと転写される遺伝子の区域である；イントロンはエンハンサーなどの調節因子を含むことがある。イントロンは核内転写産物または一次転写産物から除去または「スプライスアウト（ｓｐｌｉｃｅ ｏｕｔ）」される；このため、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは翻訳時に新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定する働きをする。
【００４０】
本明細書で用いる「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」により（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用による）、遺伝子にコードされた遺伝情報がＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡ）に変換されるプロセス、タンパク質をコードする遺伝子の場合には、ｍＲＮＡの「翻訳」によってタンパク質に変換される過程のことを指す。遺伝子発現はその過程における多くの段階で調節可能である。「上方制御（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」または「活性化」とは、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させる調節のことを指し、「下方制御（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」または「抑制」とは、産生を減少させる調節のことを指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）はしばしば、それぞれ「活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）」および「抑制因子（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）」と呼ばれる。
【００４１】
天然のタンパク質分子のアミノ酸配列に言及して本明細書に「アミノ酸配列」を詳述する場合、「アミノ酸配列」および類似の用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸配列を、詳述するタンパク質分子にみられる完全な天然型アミノ酸配列には限定しないものとする。
【００４２】
本明細書で用いる「コードする核酸分子」「コードするＤＮＡ配列」「コードするＤＮＡ」「コードするＲＮＡ配列」および「コードするＲＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のストランドに沿って並んだデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列のことを指す。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序が、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿って並ぶアミノ酸の順序を決定する。したがって、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００４３】
本明細書で用いる「変種」という用語は、タンパク質に言及して用いる場合、部分的に相同な核酸によってコードされるタンパク質のことを指し、このため、タンパク質のアミノ酸配列は異なる。本明細書で用いる「変種」という用語は、タンパク質の機能の変化を引き起こさない保存的および非保存的なアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質のほかに、タンパク質の機能の低下（例えば、ヌル変異）またはタンパク質の機能の上昇を引き起こすアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質も含む。
【００４４】
本明細書で用いる「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合則により関連づけられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に言及して用いられる。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って合致するというように「部分的」でもよい。または、核酸の間に「完全」または「全体的」な相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは核酸同士の結合に依存する増幅反応ならびに検出方法において特に重要である。
【００４５】
「相同性」および「一致率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、核酸に関して用いる場合、相補性の程度のことを指す。これは部分的な相同性（すなわち、部分的同一性）でもよく、完全な相同性（すなわち、完全な同一性）でもよい。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸配列とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するもののことであり、これは「実質的に相同な」という機能的用語を用いて呼ばれる。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーションなど）を低ストリンジェンシー条件下で用いて検討しうる。実質的に相同な配列またはプローブ（すなわち、関心対象の別のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド）は、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同な配列と標的配列との結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合する、またはそれを阻害すると考えられる。低ストリンジェンシー条件は非特異的な結合が許容されるような条件という訳ではない；低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の相互の結合が特異的な（すなわち、選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合がないことは、部分的な程度の相補性すらない（例えば、同一性が約３０％未満）第２の標的を用いることによって検証しうる；非特異的結合がないとプローブは第２の非相補的な標的とハイブリダイズしないと考えられる。
【００４６】
当技術分野では、さまざまな同等な条件を用いて低ストリンジェンシー条件を構成しうることが周知である；プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物、溶液中に存在する、または固定化されているなど）ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）などの要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更して、上に挙げた条件とは異なるものの同等な低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を得ることができる。さらに、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを促す条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄段階の温度を高める、ハイブリダイゼーション溶液中にホルムアミドを用いるなど）も当技術分野で周知である。
【００４７】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方のストランドとハイブリダイズしうる任意のプローブのことを指す。
【００４８】
一本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズしうる（すなわち、その相補物である）任意のプローブのことを指す。
【００４９】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合を指して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、用いる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内部のＧ：Ｃ比などの要因による影響を受ける。単一の分子が構造の内部に相補的核酸の対合を含む場合には「自己ハイブリダイズした（ｓｅｌｆ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）」という。
【００５０】
本明細書で用いる「Ｔｍ」という用語は、核酸の「融解温度」を指して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度のことである。核酸のＴｍを算出するための式は当技術分野で周知である。標準的な参考文献に示されているように、核酸が１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中にある場合、Ｔ値の単純な推定値は以下の式によって算出しうる：
Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）
（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、定量的フィルターハイブリダイゼーション（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［１９８５］中を参照）。その他の参考文献には、Ｔｍの算出に配列特性のほかに構造特性も考慮に入れた、より精巧な計算が含まれる。
【００５１】
本明細書で用いる「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う温度、イオン強度および有機溶媒などの他の化合物の存在といった条件を指して用いられる。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的塩基配列の頻度が高い核酸断片の間のみで核酸塩基対合が起こると考えられる。このため、遺伝的に異なる生物に由来する核酸同士に対しては、相補的配列の頻度が通常低いことから、「弱」または「低」ストリンジェンシーの条件がしばしば必要となる。
【００５２】
「高ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００５３】
「中程度のストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００５４】
「低ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬［５０×デンハルト試薬は５００ｍｌ当たり以下のものを含む：５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ（４００型、Ｐｈａｒａｍｃｉａ）、５ｇ ＢＳＡ（第Ｖ画分；Ｓｉｇｍａ）］および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
【００５５】
１つの遺伝子から、ＲＮＡ一次転写産物の異なるスプライシングによって生成される多数のＲＮＡ種が生じてもよい。同一遺伝子のスプライス変種であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全な相同性を有する領域（両方のｃＤＮＡに同じエクソンまたは同じエクソンの部分が存在することを表す）および完全に同一でない領域（例えば、ｃＤＮＡ １にエクソン「Ａ」が存在し、ｃＤＮＡ ２はその代わりにエクソン「Ｂ」を含むことを表す）を含む。２つのｃＤＮＡは配列同一性のある領域を含むため、それらはいずれも、両方のｃＤＮＡに認められる配列を含む遺伝子全体または遺伝子の部分に由来するプローブとハイブリダイズすると考えられる；このため、２つのスプライス変種はこのようなプローブおよびお互いと実質的に相同である。
【００５６】
「機能的な組み合わせにある（ｉｎ ｏｐｅｒａｂｌｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」「機能的な順序にある（ｉｎ ｏｐｅｒａｂｌｅ ｏｒｄｅｒ）」および「機能的に結合した」という用語は、本明細書で用いる場合、所定の遺伝子の転写および／または望ましいタンパク質分子の合成を指令しうる核酸分子が生じる様式で複数の核酸配列が結び付いていることを指す。この用語は、機能的なタンパク質が生じる様式で複数のアミノ酸配列が結び付いていることも指す。
【００５７】
本明細書で用いる「選択マーカー」という用語は、通常であれば必須栄養素と考えられるものを含まない培地中での増殖能力を付与する酵素活性をコードする遺伝子（例えば、酵母細胞におけるＨＩＳ３遺伝子）のことを指す；さらに、選択マーカーは、選択マーカーが発現された細胞に抗生物質または薬剤に対する耐性を付与するものでもよい。選択マーカーは「優性」であってもよい；優性選択マーカーは、あらゆる真核生物細胞系で検出可能な酵素活性をコードする。優性選択マーカーの例には、薬剤Ｇ４１８に対する耐性を哺乳類細胞に付与する細菌アミノグリコシド３’リン酸転移酵素遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンＧリン酸転移酵素（ｈｙｇ）遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下における増殖能を付与する細菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）が含まれる。他の選択マーカーには、関連する酵素活性を欠く細胞系とともに用いる必要があるという点で優性でないものがある。非優性選択マーカーの例には、ｔｋ−細胞系とともに用いられるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＣＡＤ欠損細胞とともに用いられるＣＡＤ遺伝子、およびｈｐｒｔ−細胞系とともに用いられる哺乳類ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子が含まれる。哺乳類における選択マーカーの使用に関する総説は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）ｐｐ．１６．９〜１６．１５にある。
【００５８】
本明細書で用いる「調節因子」という用語は、核酸配列の発現の何らかの面を制御する遺伝因子のことを指す。例えば、プロモーターは、機能的に結合したコード領域の転写開始を促す調節因子である。他の調節因子には、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結シグナル、ＲＮＡ移行因子、リボソーム内部進入部位などがある（以下に定義する）。
【００５９】
真核生物における転写制御シグナルには、「プロモーター」因子および「エンハンサー」因子が含まれる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡの短い配列からなる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７［１９８７］）。プロモーター因子およびエンハンサー因子は、酵母、昆虫および哺乳類細胞の遺伝子を含む種々の真核生物供給源、ならびにウイルスから単離されている（類似の制御因子、すなわちプロモーターは原核生物にも認められる）。個々のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどの細胞種を用いるかに依存する。真核生物プロモーターおよびエンハンサーの中には、宿主範囲が幅広いものもあり、限定的な細胞種のサブセットのみで機能するものもある（総説については、Ｖｏｓｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、１１：２８７［１９８６］；およびＭａｎｉａｔｉｓら、前記を参照）。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳類種に由来するさまざまな細胞種で高い活性を示し、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現に広く用いられている（Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ． ４：７６１［１９８５］）。広範囲の哺乳類種において活性のあるプロモーター／エンハンサー因子の他の２つの例は、ヒト伸長因子１α遺伝子（Ｕｅｔｓｕｋｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６４：５７９１［１９８９］；Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ ９１：２１７［１９９０］；ならびにＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．、１８：５３２２［１９９０］）、ならびにラウス肉腫ウイルス（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：６７７７［１９８２］）およびヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１［１９８５］）の末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）からのものである。
【００６０】
本明細書で用いる「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能（すなわち、プロモーター因子およびエンハンサー因子によって与えられる機能、これらの機能に関する考察については上記参照）を提供しうる配列を含むＤＮＡの区域のことを指す。例えば、レトロウイルスの末端反復配列はプロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を含む。エンハンサー／プロモーターは「内因性」でもよく、「外因性」または「異種」でもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中で所定の遺伝子と自然条件下で結合しているものである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子の転写が結合したエンハンサー／プロモーターによって指令されるように、遺伝子操作（すなわち、クローニングおよび組換えなどの分子生物学の技法）によって遺伝子と並置されたものである。
【００６１】
調節因子は組織特異的または細胞特異的なものでもよい。「組織特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、特定の種類の組織（例えば、肝臓）に対するヌクレオチド配列の選択的発現を指令し、異なる種類の組織（例えば、肺）における同じ関心対象のヌクレオチド配列の発現は相対的に引き起こさない調節因子のことを指す。
【００６２】
調節因子の組織特異性を、例えば、レポーター遺伝子をプロモーター配列（組織特異的でないもの）および調節因子と機能的に結合させてレポーター構築物を作製し、レポーター構築物を動物のゲノムに導入して、その結果得られるトランスジェニック動物の全組織にレポーター構築物を組み込んだ上で、トランスジェニック動物の種々の組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出すること（例えば、レポーター遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、タンパク質またはタンパク質の活性を検出すること）によって評価してもよい。１つまたは複数の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルが他の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルよりも高いことを検出することにより、調節因子が、相対的に高い発現レベルが検出された組織に対して「特異的」であることが示される。したがって、本明細書で用いる「組織特異的「（例えば、肝特異的）」という用語は、発現の絶対的特異性を必要としない相対的な用語である。言い換えると、「組織特異的」という用語は、１つの組織の発現レベルが極めて高く、別の組織には全く発現がないことを要しない。１つの組織の発現が別のものよりも高いことで十分である。これに対して、「厳密な」または「絶対的な」組織特異的発現とは、単一の種類の組織（例えば、肝臓）における発現がみられ、他の組織における発現が検出不能であることを示すものとする。
【００６３】
「細胞種特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、特定の種類の細胞に対するヌクレオチド配列の選択的発現を指令し、同じ組織中の異なる種類の細胞における同じ関心対象のヌクレオチド配列の発現は相対的に引き起こさない調節因子のことを指す。「細胞種特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、単一組織中のある領域における関心対象のヌクレオチド配列の選択的発現を促しうる調節因子のことも意味する。
【００６４】
調節因子の細胞種特異性は、当技術分野で周知の方法（例えば、免疫組織化学的染色および／またはノーザンブロット分析）を用いて評価しうる。簡潔に述べると、免疫組織化学的染色のためには、組織切片をパラフィン中に包埋し、このパラフィン切片を、調節因子によって発現が調節される関心対象のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物に対して特異的な一次抗体と反応させる。一次抗体に対して特異的な標識化した（例えば、ペルオキシダーゼを結合させた）二次抗体を切片化した組織と結合させ、特異的結合を顕微鏡によって検出する（例えば、アビジン／ビオチンを用いる）。簡潔に述べうると、ノーザンブロット分析のためには、ＲＮＡを細胞から単離し、アガロースゲル上で電気泳動を行ってＲＮＡをサイズ別に分画した後に、ＲＮＡをゲルから固体支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）に移す。続いて、固定化したＲＮＡを標識化したオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブまたはＤＮＡプローブにより検索し、用いたプローブに対して相補的なＲＮＡ種を検出する。ノーザンブロットは分子生物学者にとって標準的なツールである。
【００６５】
「プロモーター」「プロモーター因子」または「プロモーター配列」という用語は、本明細書で用いる場合、関心対象のヌクレオチド配列と連結した場合に関心対象のヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御しうるＤＮＡ配列のことを指す。プロモーターは、ｍＲＮＡへの転写を制御する関心対象のヌクレオチド配列の５’側（すなわち、上流）に位置し、転写開始のためにＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合が起こる部位を備えることが、必然的ではないものの一般的である。
【００６６】
プロモーターは構成性でも調節性でもよい。「構成性」という用語は、プロモーターに言及する場合、プロモーターが、刺激（例えば、熱ショック、化学物質など）がなくとも、機能的に結合した核酸配列の転写を指令しうることを意味する。これに対して、「調節性」プロモーターとは、刺激（例えば、熱ショック、化学物質など）の存在下で、機能的に結合した核酸配列の、刺激の非存在下における機能的に結合した核酸配列の転写レベルとは異なるレベルの転写を指令しうるもののことである。
【００６７】
発現ベクターに「スプライシングシグナル」が存在すると、組換え転写産物の発現レベルの上昇がしばしば起こる。スプライシングシグナルはＲＮＡ一次転写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナー部位およびアクセプター部位からなる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９８９］、ｐｐ．１６．７〜１６．８）。よく用いられるスプライスドナー部位およびアクセプター部位は、ＳＶ４０の１６Ｓ ＲＮＡに由来するスプライス部位である。
【００６８】
真核生物細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的発現には、効率的な転写終結およびその結果生じた転写産物のポリアデニル化を指令するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは一般にポリアデニル化シグナルの下流に認められ、長さは数百ヌクレオチドである。本明細書で用いる「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、転写終結および新生ＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を指令するＤＮＡ配列のことを表す。ポリＡ尾部を持たない転写産物は不安定で急速に分解されるため、組換え転写産物が効率的にポリアデニル化されることが望ましい。発現ベクター中に用いるポリＡシグナルは「異種」でも「内因性」でもよい。内因性ポリＡシグナルとは、ゲノム中で所定の遺伝子のコード領域の３’端に天然に認められるもののことである。異種ポリＡシグナルとは、１つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’側に配置されたもののことである。よく用いられる異種ポリＡシグナルはＳＶ４０ポリＡシグナルである。ＳＶ４０ポリＡシグナルは２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ制限断片に含まれており、転写終結およびポリアデニル化の両方を指令する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記、１６．６〜１６．７）。
【００６９】
真核生物発現ベクターが「ウイルスレプリコン」または「ウイルス複製起点」を含んでいてもよい。ウイルスレプリコンは、適切な複製因子を発現する宿主細胞におけるベクターの染色体外複製を可能とするウイルスＤＮＡ配列である。ＳＶ４０またはポリオーマウイルスの複製起点を含むベクターは、適切なウイルスＴ抗原を発現する細胞内で高「コピー数」（最大１０４コピー／細胞）へと複製される。ウシパピローマウイルスまたはエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンを含むベクターは染色体外で「低コピー数」（ほぼ１００コピー／細胞）の複製が起こる。しかし、発現ベクターは何らかの特定のウイルス複製起点には限定されないものとする。
【００７０】
本明細書で用いる「末端反復配列」または「ＬＴＲ」とは、レトロウイルスゲノムの５’および３’側のＵ３領域に位置するか、またはそこから単離された転写制御因子のことを指す。当技術分野で知られている通り、末端反復配列をレトロウイルスベクター中の制御因子として用いてもよく、または、レトロウイルスゲノムから単離して他の種類のベクターからの発現を制御するために用いてもよい。
【００７１】
本明細書で用いる「分泌シグナル」という用語は、シグナルペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列と機能的に結合させた場合に組換えポリペプチドの分泌を引き起こすことができる任意のＤＮＡ配列のことを指す。一般に、シグナルペプチドは一連の約１５〜３０個の疎水性アミノ酸残基を含む（例えば、Ｚｗｉｚｉｎｓｋｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５（１６）：７９７３〜７７［１９８０］、Ｇｒａｙら、Ｇｅｎｅ ３９（２）：２４７〜５４［１９８５］およびＭａｒｔｉａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５：６０２〜６０７［１９７９］を参照）。このような分泌シグナル配列は、組織特異的発現の標的となる細胞種から分泌されるポリペプチド（例えば、乳腺分泌細胞における発現およびそれからの分泌の目的には乳タンパク質）をコードする遺伝子に由来することが好ましい。しかし、分泌性ＤＮＡ配列はこのような配列には限定されない。多くの細胞種および生物体から分泌されるタンパク質に由来する分泌性ＤＮＡ配列を用いてもよい（例えば、ｔ−ＰＡ、血清アルブミン、ラクトフェリンおよび成長ホルモンに対する分泌シグナル、ならびに酵母、糸状菌および細菌などの分泌性ポリペプチドをコードする微生物遺伝子に由来する分泌シグナル）。
【００７２】
本明細書で用いる「ＲＮＡ移行因子」または「ｍＲＮＡ前駆体プロセシングエンハンサー（ＰＰＥ）」とは、核からのＲＮＡの輸送を増強する３’および５’シス作用性転写後調節因子のことを指す。「ＰＰＥ」因子には、メルツ（Ｍｅｒｔｚ）配列（米国特許第５，９１４，２６７号および第５，６８６，１２０号に記載、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）およびウッドチャックｍＲＮＡプロセシングエンハンサー（ＷＰＲＥ；国際公開公報第９９／１４３１０号および米国特許第６，１３６，５９７号、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書で用いる「多シストロン性」と言う用語は、複数のポリペプチド鎖をコードするｍＲＮＡのことを指す（例えば、国際公開公報第９３／０３１４３号、国際公開公報第８８／０５４８６号および欧州特許第１１７０５８号を参照、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。同様に「多シストロン性配列中に配置された」という用語は、単一のｍＲＮＡ中に２つの異なるポリペプチド鎖をコードする遺伝子の配置のことを指す。
【００７４】
本明細書で用いる「リボソーム内部進入部位」または「ＩＲＥＳ」という用語は、二シストロン性ｍＲＮＡの翻訳の内部開始によって第２の遺伝子から生じる発現産物の産生を可能とする、多シストロン性遺伝子の間に位置する配列のことを指す。リボソーム内部進入部位には、口蹄疫ウイルス（ＦＤＶ）、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルスおよびＲＤＶに由来するものが含まれるが、これらに限定されない（Ｓｃｈｅｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７６：８０１〜８０９［１９９４］；Ｍｅｙｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：２８１９〜２８２４［１９９５］；Ｊａｎｇら、１９８８、Ｓ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：２６３６〜２６４３［１９９８］；Ｈａｌｌｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：５０７５〜５０８６［１９９５］）。ＩＲＥＳが組み入れられたベクターは当技術分野で知られた通りに構成しうる。例えば、多シストロン性配列を含むレトロウイルスベクターは、機能的に結び付いた以下の因子を含みうる：ヌクレオチドポリリンカー、関心対象の遺伝子、リボソーム内部進入部位および哺乳類選択マーカーまたは関心対象の別の遺伝子。多シストロン性カセットは、５’ ＬＴＲプロモーターからの転写によって多シストロン性メッセージカセットが転写されるような、レトロウイルスベクター内部の５’ ＬＴＲと３’ ＬＴＲとの間の位置に置かれる。多シストロン性メッセージカセットの転写を、用途に即して好ましいと思われる内部プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター）または誘導性プロモーターによって駆動させてもよい。多シストロン性メッセージカセットはさらに、機能的に結び付いたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）配列をポリリンカー内部に含みうる。任意の哺乳類選択マーカーを、多シストロン性メッセージカセットの哺乳類選択マーカーとして用いることができる。このような哺乳類選択マーカーは当業者に周知であり、これにはカナマイシン／Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢまたはミコフェノール酸耐性マーカーが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書で用いる「レトロウイルス」という用語は、細胞内に侵入し、レトロウイルスゲノム（二本鎖プロウイルスとして）を宿主細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルス粒子のことを指す（すなわち、この粒子は、宿主細胞表面と結合して宿主細胞の細胞質へのウイルス粒子の侵入を促進しうる、外被タンパク質またはウイルスＧ糖タンパク質などの膜関連タンパク質を含む）。「レトロウイルス」という用語には、オンコウイルス亜科（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＯＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）およびマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ））、スプマウイルス亜科およびレンチウイルス亜科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルスが含まれる；例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および第６，０１３，５１６号を参照。これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。
【００７６】
本明細書で用いる「レトロウイルスベクター」という用語は、関心対象の遺伝子を発現するように改変されたレトロウイルスのことを指す。レトロウイルスベクターは、ウイルスの感染プロセスを利用することにより、宿主細胞に遺伝子を効率的に導入するために用いることができる。レトロウイルスゲノム中にクローニングされた（すなわち、分子生物学の技法を用いて挿入された）外来遺伝子または異種遺伝子を、レトロウイルス感染に対する感受性のある宿主細胞に効率的に送達することができる。よく知られた遺伝子操作により、レトロウイルスゲノムの複製能を消失させることが可能である。この結果得られる複製能欠損ベクターは新たな遺伝物質を細胞に導入するために用いうるが、自らは複製を行えない。ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系を、ベクター粒子の集合および細胞からの流出を可能にするために用いることができる。このようなレトロウイルスベクターは、少なくとも１つの関心対象の遺伝子をコードする核酸配列（多シストロン性核酸配列は複数の関心対象の遺伝子をコードしうる）、５’レトロウイルス末端反復配列（５’ ＬＴＲ）；および３’レトロウイルス末端反復配列（３’ ＬＴＲ）を含む複製能欠損レトロウイルスのゲノムを含む。
【００７７】
「偽型のレトロウイルスベクター」という用語は、異種膜タンパク質を含むレトロウイルスベクターのことを指す。「膜関連タンパク質」という用語は、ウイルス粒子を取り囲む膜に付随するタンパク質のことを指す（例えば、ＶＳＶ、ピリー（Ｐｉｒｙ）、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）およびモコラ（Ｍｏｋｏｌａ）などのラブドウイルス科のウイルスのウイルス外被糖タンパク質またはＧタンパク質）；これらの膜関連タンパク質はウイルス粒子の宿主細胞への侵入を媒介する。レトロウイルス外被タンパク質の場合のように膜関連タンパク質が特異的な細胞表面タンパク質受容体と結合する場合もあり、またはラブドウイルス科のメンバーに由来するＧタンパク質の場合のように膜関連タンパク質が宿主細胞の原形質膜のリン脂質成分と相互作用する場合もある。
【００７８】
「異種膜関連タンパク質」という用語は、ベクター粒子のヌクレオキャプシドタンパク質の由来である同じウイルス綱または科のメンバーではないウイルスに由来する膜関連タンパク質のことを指す。「ウイルス綱または科」とは、国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ）により指定された網または科という分類学上の等級を指す。
【００７９】
「ラブドウイルス科」という用語は、ヒトを含む動物および植物を感染させる、外被を有するＲＮＡウイルスの科のことを指す。ラブドウイルス科は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、コカル（Ｃｏｃａｌ）ウイルス、ピリー（Ｐｉｒｙ）ウイルス、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）ウイルスおよびコイ春ウイルス病ウイルスを含むベシクロウイルス属を含む（コイ春ウイルス病ウイルスをコードする配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ１８１０１で入手可能）。ベシクロウイルス属のウイルスのＧタンパク質はウイルスにコードされた内在性膜タンパク質であり、受容体結合および膜融合に必要な、外側に突出したホモ三量体棘状糖タンパク質複合体を形成する。ベシクロウイルス属のウイルスのＧタンパク質には、共有結合したパルミチン酸（Ｃ１６）部分がある。ベシクロウイルス由来のＧタンパク質のアミノ酸配列はかなりよく保存されている。例えば、ピリーウイルスのＧタンパク質とＶＳＶのＧタンパク質の同一性は約３８％であり、類似性は約５５％である（ＶＳＶにはＩｎｄｉａｎａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、Ｏｒｓａｙ株、Ｓａｎ Ｊｕａｎ株などの複数の株が知られており、それらのＧタンパク質の相同性は高い）。チャンディプラウイルスのＧタンパク質とＶＳＶ Ｇタンパク質の同一性は約３７％であり、類似性は５２％である。ベシクロウイルスのＧタンパク質の保存性（アミノ酸配列）が高度であり、機能特性（例えば、合胞体形成を含む、ウイルスの宿主細胞との結合および膜融合）が類似していることを考えると、ウイルス粒子の偽型化のために、ＶＳＶ以外のベシクロウイルス由来のＧタンパク質をＶＳＶ Ｇタンパク質の代わりに用いうると考えられる。リサウイルス（ラブドウイルス科に属する別の属）のＧタンパク質も、ＶＳＶ Ｇタンパク質との間に高度の保存性があり、同様の様式で作用するため（例えば、膜融合を媒介する）、ウイルス粒子の偽型化のためにＶＳＶ Ｇタンパク質の代わりに用いうる。リサウイルスには、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）ウイルスおよび狂犬病ウイルスが含まれる（狂犬病ウイルスには複数の株が知られており、それらのＧタンパク質はクローニングおよび配列決定がなされている）。モコラウイルスのＧタンパク質にはＶＳＶ Ｇタンパク質と相同な領域があり（特に細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン）、ＶＳＶ Ｇタンパク質との同一性は約３１％、類似性は４８％である。好ましいＧタンパク質は、ＶＳＶ Ｇタンパク質と少なくとも２５％の同一性、好ましくは少なくとも３０％の同一性、最も好ましくは少なくとも３５％の同一性を有するものである。ニュージャージー株からのＶＳＶ Ｇタンパク質（このＧタンパク質の配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２７１６５およびＭ２１５５７に示されている）を、基準ＶＳＶ Ｇタンパク質として用いる。
【００８０】
本明細書で用いる「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルス亜科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルス）に由来する、非分裂細胞への組み込みが可能なレトロウイルスベクターのことを指す（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および第６，０１３，５１６号を参照。これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。
【００８１】
「偽型のレンチウイルスベクター」という用語は、異種膜タンパク質（例えば、ＶＳＶ、ピリー、チャンディプラおよびモコラなどのラブドウイルス科のウイルスのウイルス外被糖タンパク質またはＧタンパク質）を含むレンチウイルスベクターのことを指す。
【００８２】
本明細書で用いる「トランスポゾン」という用語は、ゲノム中の１つの位置から別の位置への移動または転位が可能な転位因子（例えば、Ｔｎ５、Ｔｎ７およびＴｎ１０）のことを指す。一般に、転位はトランスポザーゼによって制御される。本明細書で用いる「トランスポゾンベクター」という用語は、関心対象の核酸がトランスポゾンの末端と隣接したものをコードするベクターのことを指す。トランスポゾンベクターの例には、米国特許第６，０２７，７２２号；第５，９５８，７７５号；第５，９６８，７８５号；第５，９６５，４４３号および第５，７１９，０５５号（これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書で用いる「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」という用語は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含むが、これらに限定されない血清型のアデノ随伴ウイルスに由来するベクターのことを指す。ＡＡＶベクターは、全体または一部、好ましくはｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子が欠失しているものの機能的なフランキングＩＴＲ配列は保持している、１つまたは複数のＡＡＶ野生型遺伝子を有しうる。
【００８４】
ＡＡＶベクターは、当技術分野で知られた組換え技術を用いて、機能的なＡＡＶ ＩＴＲが両端（５’および３’）に隣接した１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含むように構築することができる。本発明の実施に際して、ＡＡＶベクターは少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ、異種ヌクレオチド配列の上流に位置する適したプロモーター配列、および異種配列の下流に位置する少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含みうる。「組換えＡＡＶベクタープラスミド」とは、ベクターがプラスミドを含む、ある種の組換えＡＡＶベクターのことを指す。一般的なＡＡＶベクターの場合と同じく、５’および３’ ＩＴＲが選択した異種ヌクレオチド配列に隣接する。
【００８５】
ＡＡＶベクターは、ポリアデニル化部位などの転写配列のほか、選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列、および転写の誘導を可能とする他の制御因子を含むこともできる。このような制御因子については上に述べた。
【００８６】
本明細書で用いる「ＡＡＶビリオン」という用語は、完全なウイルス粒子のことを指す。ＡＡＶビリオンは野生型ＡＡＶウイルス粒子（線状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含み、ＡＡＶキャプシド、すなわちタンパク質外被を伴う）でもよく、組換えＡＡＶウイルス粒子（以下に述べる）でもよい。この点に関して、一本鎖ＡＡＶ核酸分子（センス／コード鎖またはアンチセンス／アンチコード鎖のいずれか。これらの用語は一般的な定義による）はＡＡＶビリオンへのパッケージングが可能である；センス鎖およびアンチセンス鎖には同じ感染性がある。
【００８７】
本明細書で用いる「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶ」という用語は、５’および３’側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接した異種ヌクレオチド配列がＡＡＶタンパク質外殻でキャプシド化された（すなわち、タンパク質外被で囲まれた）ものから構成される、感染性のある複製能欠損ウイルスのことを指す。組換えＡＡＶビリオンを構築するための技法は当技術分野で数多く知られている（例えば、米国特許第５，１７３，４１４号；国際公開公報第９２／０１０７０号；国際公開公報第９３／０３７６９号；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８〜３９９６［１９８８］；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０［１９９０］（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｎｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３〜５３９［１９９２］；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７〜１２９［１９９２］；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１［１９９４］；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５〜１６９［１９９４］；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１８６７〜１８７５［１９９４］を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。
【００８８】
ＡＡＶベクター（実際には、本明細書に記載のすべてのベクター）中に用いるのに適したヌクレオチド配列には、機能的に適切な任意のヌクレオチド配列が含まれる。このため、本発明のＡＡＶベクターは、標的細胞ゲノムでは欠陥があるもしくは欠失しているタンパク質をコードする、または望ましい生物的もしくは治療的効果（例えば、抗ウイルス作用）を有する非天然タンパク質をコードする任意の望ましい遺伝子を含むことができ、または、配列がアンチセンスもしくはリボザイムの機能を有する分子に対応してもよい。適した遺伝子には、以下の疾患の治療のために用いられるものが含まれる：ＡＩＤＳ、癌、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症などの疾患を含む炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性疾患および感染症；種々の貧血、サラセミアおよび血友病を含む種々の血液疾患；嚢胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、肺気腫などの遺伝的欠損。癌およびウイルス性疾患に対するアンチセンス療法において有用な、さまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）の周りの配列に対して相補的な短いオリゴヌクレオチド）が当技術分野では記載されている（例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４３１３〜４３１７［１９９１］；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０：５４３〜５８４［１９９０］；Ｈｅｌｅｎｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １０４９：９９〜１２５［１９９０］；Ａｇａｒｗａｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：７０７９〜７０８３［１９８９］；およびＨｅｉｋｋｉｌａら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４４５〜４４９［１９８７］を参照）。適したリボザイムに関する考察については、例えば、チェック（Ｃｅｃｈ）ら（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１７４７９〜１７４８２および米国特許第５，２２５，３４７号（これらは参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００８９】
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＤＮＡ複製起点およびウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシス的に協同作用する、ＡＡＶゲノムの両端に存在する当技術分野で認知されているパリンドローム領域を意味する。本発明に用いるためには、選択した１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列の５’および３’側にフランキングＡＡＶ ＩＴＲを配置し、これをｒｅｐコード領域またはＲｅｐ発現産物と併用することにより、選択した配列の標的細胞ゲノム中への組み込みが得られる。
【００９０】
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は知られている（例えば、ＡＡＶ−２配列に関しては、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１［１９９４］；Ｂｅｒｎｓ， Ｋ．Ｉ． 「パルボウイルスおよびその複製（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、「基礎ウイルス学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、第２版（Ｂ．Ｎ． ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅ編）を参照）。本明細書で用いる「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、除去または置換によって改変してもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含むが、これらに限定されない複数のＡＡＶ血清型のいずれに由来してもよい。選択した異種ヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ ＩＴＲは、意図した通りに機能する限り、すなわちｒｅｐ遺伝子が（同じまたは異なるベクター上に）存在する場合またはＲｅｐ発現産物が標的細胞内に存在する場合に、付随する異種配列の標的細胞ゲノム中への組み込みを行える限り、必ずしも同一である必要はなく、同じＡＡＶ血清型または分離株に由来する必要もない。
【００９１】
本明細書で用いる「インビトロ」という用語は、人工的環境、および人工的環境で起こるプロセスまたは反応のことを指す。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物から非制限的に構成される。「インビボ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で起こるプロセスまたは反応のことを指す。
【００９２】
本明細書で用いる「クローン由来である（ｃｌｏｎａｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ）」とは、単一細胞に由来する細胞系のことを指す。
【００９３】
本明細書で用いる「非クローン由来である」とは、複数の細胞に由来する細胞系のことを指す。
【００９４】
本明細書で用いる「継代」という用語は、特定の密度または集密度（例えば、７０％または８０％の集密度）まで増殖した細胞の培養物を希釈し、希釈した細胞を再び望ましい特定の密度または集密度へと増殖させるプロセスのことを指す（例えば、細胞の再プレーティング、または細胞を用いて新たな回転びん培養物を樹立することによる）。
【００９５】
本明細書で用いる「安定な」という用語は、ゲノムに言及して用いる場合、ゲノムの情報内容が１つの世代から次の世代に、または細胞系という特定の場合には、１つの継代物から次の継代物へと安定的に維持されることを指す。したがって、ゲノムに大きな変化（例えば、遺伝子の欠失または染色体転座）が起こっていなければゲノムは安定であるとみなす。「安定な」という用語は、ゲノムに点変異などのわずかな変化が起こっている可能性を否定するものではない。
【００９６】
本明細書で用いる「反応（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」という用語は、アッセイに言及して用いる場合、検出可能なシグナル（例えば、レポータータンパク質の蓄積、イオン濃度の上昇、検出可能な化学生成物の蓄積）の発生のことを指す。
【００９７】
本明細書で用いる「膜受容体タンパク質」という用語は、リガンド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）が結合する膜貫通タンパク質のことを指す。当技術分野で知られているように、タンパク質のリン酸化は、調節シグナルを細胞外から核へと運ぶタンパク質を選択的に修飾するために細胞が用いる一般的な調節機構である。これらの生化学的修飾を遂行するタンパク質は、プロテインキナーゼとして知られる一群の酵素である。それらはさらに、リン酸化の標的とする基質残基によっても定義しうる。プロテインキナーゼの１つの群に、標的タンパク質のチロシン残基を選択的にリン酸化するチロシンキナーゼ（ＴＫ）がある。チロシンキナーゼの一部は膜結合型受容体（ＲＴＫ）であり、これらはリガンドによって活性化されると基質の修飾に加えて自己リン酸化も行いうる。リガンド刺激による連続的リン酸化の開始は、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などの、この種のエフェクターの作用の基盤を成すパラダイムである。これらのリガンドに対する受容体はチロシンキナーゼであり、これらはリガンド（ホルモン、増殖因子）の標的細胞との結合、および１つまたは複数の生化学的経路の活性化によるシグナルの細胞内への伝達のインターフェースとなる。受容体チロシンキナーゼに対するリガンドの結合により、その固有の酵素活性が活性化される（例えば、ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ ６１：２０３〜２１２［１９９０］を参照）。チロシンキナーゼは細胞質の非受容体型酵素のこともあり、これはシグナル伝達経路の下流成分として作用する。
【００９８】
本明細書で用いる「シグナル伝達タンパク質」という用語は、膜受容体タンパク質に対するリガンド結合または何らかの他の刺激により、活性化または別の様式の影響を受けるタンパク質のことを指す。シグナル伝達タンパク質の例には、アデニルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣおよびＧタンパク質が含まれる。多くの膜受容体タンパク質はＧタンパク質と共役している（すなわち、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）；総説については、Ｎｅｅｒ、１９９５、Ｃｅｌｌ ８０：２４９〜２５７［１９９５］を参照）。一般に、ＧＰＣＲは７つの膜貫通ドメインを含む。既知のＧＰＣＲとの配列相同性に基づいて、ＧＰＣＲと推定されるものを同定することが可能である。
【００９９】
ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲの細胞外部分に対するリガンドの結合によって生じる、細胞膜を介したシグナル伝達を媒介する。ＧＰＣＲの細胞内部分はＧタンパク質と相互作用し、細胞の外側から内側へのシグナル伝達の調節を行う。このため、ＧＰＣＲはＧタンパク質と「共役している」という。Ｇタンパク質は、ＧＴＰと結合してそれを加水分解するαサブユニットおよび二量体のβγサブユニットという３つのポリペプチドサブユニットから構成される。活性化されていない基底状態では、Ｇタンパク質はαおよびβγサブユニットのヘテロ三量体として存在する。Ｇタンパク質が活性化されると、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）がＧタンパク質のαサブユニットと会合する。ＧＰＣＲがリガンドと結合して活性化されると、ＧＰＣＲはＧタンパク質ヘテロ三量体と結合し、ＧαサブユニットのＧＤＰに対する親和性を低下させる。活性化状態では、ＧサブユニットはＧＤＰをグアニン三リン酸（ＧＴＰ）と交換し、活性型Ｇａサブユニットが受容体および二量体βγサブユニットの両方から解離する。解離した活性型Ｇαサブユニットは、細胞内のＧタンパク質シグナル伝達経路の「下流」にあるエフェクターにシグナルを伝達する。最終的に、Ｇタンパク質の内因性ＧＴＰアーゼ活性により、活性型ＧサブユニットはＧＤＰおよび二量体βγサブユニットと会合した不活性状態に復帰する。
【０１００】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質ファミリーのメンバーは数多くクローニングされており、これには種々のＧαサブユニットをコードする２０種を上回る遺伝子が含まれる。これらの種々のＧサブユニットは、アミノ酸配列および機能的相同性に基づいて４つのファミリーに分類されている。これらの４つのファミリーはＧαｓ、Ｇαｉ、ＧαｑおよびＧα１２と命名されている。機能的には、これらの４つのファミリーは、活性化する細胞内シグナル伝達経路および共役するＧＰＣＲの点で異なる。
【０１０１】
例えば、ある種のＧＰＣＲは通常Ｇαｓと共役しており、これらのＧＰＣＲはＧαｓを介してアデニリルシクラーゼ活性を刺激する。他のＧＰＣＲは通常ＧＧαｑと共役しており、これらのＧＰＣＲはＧＧαｑを介して、ホスホリパーゼＣのβアイソフォーム（すなわちＰＬＣβ、ＳｔｅｒｍｗｅｉｓおよびＳｍｒｃｋａ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７：５０２〜５０６［１９９２］）などのホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化することができる。
【０１０２】
本明細書で用いる「核酸結合タンパク質」という用語は、核酸と結合するタンパク質のことを指し、特に、遺伝子からの転写を増加させる（すなわち、活性化物質または転写因子）または減少させる（すなわち、阻害物質）タンパク質のことを指す。
【０１０３】
本明細書で用いる「イオンチャネルタンパク質」という用語は、細胞膜を介したイオンの流入または流出を制御するタンパク質のことを指す。イオンチャネルタンパク質の例には、Ｎａ＋−Ｋ＋ＡＴＰアーゼポンプ、Ｃａ２＋ポンプおよびＫ＋漏洩チャネルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本明細書で用いる「プロテインキナーゼ」という用語は、ヌクレオシド三リン酸に由来するリン酸基のタンパク質のアミノ酸側鎖への付加を触媒するタンパク質のことを指す。キナーゼは既知の酵素スーパーファミリーのうち最大のものであり、その標的タンパク質は極めて広範囲にわたる。キナーゼは、チロシン残基をリン酸化するタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）、ならびにセリンおよび／またはトレオニン残基をリン酸化するタンパク質セリン／トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）に分類しうる。一部のキナーゼは、セリン／トレオニンおよびチロシン残基に対する二重特異性を有する。ほとんどすべてのキナーゼは、保存的な２５０〜３００アミノ酸の触媒ドメインを含む。このドメインはさらに１１種のサブドメインに分けることができる。Ｎ末端サブドメインＩ〜ＩＶはフォールディングにより、ＡＴＰドナー分子と結合してそれを正しい方向に配置させる二葉状構造を生じ、サブドメインＶはこの二葉部分にまたがる。Ｃ末端サブドメインＶＩ〜ＸＩはタンパク質の基質と結合し、γリン酸をセリン、トレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシル基に転移させる。１１種のサブドメインはそれぞれ、そのサブドメインに特徴的な特定の触媒残基またはアミノ酸モチーフを含む。例えば、サブドメインＩは８アミノ酸のグリシンに富むＡＴＰ結合コンセンサスモチーフを含み、サブドメインＩＩは最大限の触媒活性のために必要な決定的に重要なリジン残基を含み、サブドメインＶＩ〜ＩＸは高度に保存された触媒コアを含む。ＳＴＫおよびＰＴＫは、サブドメインＶＩおよびＶＩＩＩにヒドロキシアミノ酸特異性を付与すると思われる独特な配列モチーフも含んでいる。一部のＳＴＫおよびＰＴＫは双方のファミリーの構造的特徴を共有している。さらに、キナーゼを、キナーゼドメインに隣接して、またはその内部に存在する、一般に５〜１００残基の付加的なアミノ酸配列によって分類することもできる。
【０１０５】
非膜貫通型ＰＴＫは、原形質膜受容体の細胞質ドメインとシグナル伝達複合体を形成する。非膜貫通型ＰＴＫを通じてシグナルを伝達する受容体には、サイトカイン受容体、ホルモン受容体および抗原特異的リンパ球受容体が含まれる。多くのＰＴＫは最初、ＰＴＫ活性化が正常な細胞制御を受けていない癌細胞における癌遺伝子の産物として同定された。実際に、既知の癌遺伝子の３分の１はＰＴＫをコードしている。さらに、細胞形質転換（発癌）はしばしばチロシンリン酸化活性の上昇を伴う（例えば、Ｃａｒｂｏｎｎｅａｕ、Ｈ．およびＴｏｎｋｓ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：４６３〜９３［１９９２］を参照）。このため、ＰＴＫ活性の調節は、ある種の癌を抑制する上で重要な戦略であると考えられる。
【０１０６】
プロテインキナーゼの例には、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＣおよびサイクリン依存性プロテインキナーゼが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第６，０３４，２２８号；第６，０３０，８２２号；第６，０３０，７８８号；第６，０２０，３０６号；第６，０１３，４５５号；第６，０１３，４６４号；および第６，０１５，８０７号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１０７】
本明細書で用いる「プロテインホスファターゼ」という用語は、タンパク質からリン酸基を除去するタンパク質のことを指す。プロテインホスファターゼは一般に、受容体型および非受容体型のタンパク質という２つの群に分けられる。ほとんどの受容体型プロテインチロシンホスファターゼは、それぞれ２４０アミノ酸残基の区域を含む、２つの保存的な触媒ドメインを含む（例えば、Ｓａｉｔｏら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆ． ２：５９〜６５［１９９１］を参照）。受容体型プロテインチロシンホスファターゼは、細胞外ドメインのアミノ酸配列の多様性に基づいてさらに細分することができる（例えば、Ｋｒｕｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７４１７〜７４２１［１９９２］を参照）。プロテインホスファターゼの例には、ｃｄｃ２５ ａ、ｂおよびｃ、ＰＴＰ２０、ＰＴＰ１ＤおよびＰＴＰλが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，９７６，８５３号；第５，９９４，０７４号；第６，００４，７９１号；第５，９８１，２５１号；第５，９７６，８５２号；第５，９５８，７１９号；第５，９５５，５９２号；および第５，９５２，２１２号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１０８】
本明細書で用いる「癌遺伝子によってコードされるタンパク質」という用語は、直接的または間接的に、宿主細胞の悪性形質転換を引き起こすタンパク質のことを指す。癌遺伝子の例には以下の遺伝子が含まれるが、これらに限定されない：ｓｒｃ、ｆｐｓ、ｆｅｓ、ｆｇｒ、ｒｏｓ、Ｈ−ｒａｓ、ａｂｌ、ｓｋｉ、ｅｒｂＡ、ｅｒｂＢ、ｆｍｓ、ｆｏｓ、ｍｏｓ、ｓｉｓ、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｋｉｔ、ｒａｆ、Ｋ−ｒａｓおよびｅｔｓ。
【０１０９】
本明細書で用いる「免疫グロブリン」という用語は、特異的抗原と結合するタンパク質のことを指す。免疫グロブリンには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片が含まれるが、これらに限定されず、以下のクラスの免疫グロブリンが含まれる：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｂＥおよび分泌型免疫グロブリン（ｓＩｇ）。免疫グロブリンは一般に、２つの同一な重鎖（γ、α、μ、δまたはε）および２つの軽鎖（κまたはλ）を含む。
【０１１０】
本明細書で用いる「抗原結合タンパク質」という用語は、特異的抗原と結合するタンパク質のことを指す。「抗原結合タンパク質」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む免疫グロブリン；Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ発現ライブラリー；ならびに一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で知られたさまざまな手順がポリクローナル抗体の作製のために用いられる。抗体の産生のためには、望ましいエピトープに対応するペプチドの注射による免疫処置を、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むが、これらに限定されない種々の宿主動物に行うとよい。１つの好ましい態様では、ペプチドを免疫原性担体（例えば、ジフテリアトキソイド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））と結合させる。免疫応答を高めるために、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの有用と考えられるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない種々のアジュバントを宿主種に応じて用いる。
【０１１１】
モノクローナル抗体の調製のためには、培養下にある連続継代細胞系による抗体分子の産生を用いうる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照）。これらには、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって最初に開発されたハイブリドーマ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７［１９７５］）のほか、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２［１９８３］参照）、ならびにヒトモノクローナル抗体の産生を目的とするＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、モノクローナル抗体および癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７〜９６［１９８５］）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明によれば、一本鎖抗体の作製を目的として記載された技法（米国特許第４，９４６，７７８号；参照として本明細書に組み入れられる）を、必要な特異的一本鎖抗体を作製するために適合化することができる。本発明のもう１つの態様では、望ましい特異性を備えたモノクローン性Ｆａｂ断片の迅速かつ容易な同定が可能となるように、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築を目的とする当技術分野で知られた技法を用いる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１［１９８９］）。
【０１１３】
抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片は、既知の技法によって作製することができる。例えば、このような断片には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン消化によって作製しうるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合の還元によって作製しうるＦａｂ’断片、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製しうるＦａｂ断片。
【０１１４】
抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で知られた方法によって単離することができる。抗体の作製に際しては、当技術分野で知られた技法により、望ましい抗体に関するスクリーニングを実施しうる（例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチューイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素標識または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット法、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなど）。
【０１１５】
本明細書で用いる「レポーター遺伝子」という用語は、アッセイしうるタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。レポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ｄｅＷｅｔら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：７２５［１９８７］ならびに米国特許第６，０７４，８５９号；第５，９７６，７９６号；第５，６７４，７１３号；および第５，６１８，６８２号；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４３２８４；さまざまなＧＦＰ変種がクロンテックラボラトリーズ社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から販売されている）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本明細書で用いる「精製された」という用語は、自然環境から採取、単離または分離された、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかである分子のことを指す。このため、「単離された核酸配列」は精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、自然条件下で付随する他の成分を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
【０１１７】
「被験化合物」という用語は、疾患、疾病、病もしくは身体機能の障害の治療および／もしくは予防に有用と考えられる、または試料の生理的状態もしくは細胞状態を別の様式で変化させると考えられる、任意の化学的実体、医薬品、薬剤などを指す。被験化合物には、既知の治療的化合物およびその可能性のあるものの両方が含まれる。本発明のスクリーニング法を用いるスクリーニングにより、被験化合物が治療的であることを判定することができる。「既知の治療的化合物」とは、このような治療または予防に有効なことが示されている（例えば、動物試験、またはヒトに対する過去の投与の経験により）、治療的化合物のことを指す。
【０１１８】
発明の詳細な説明
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞に関する。本発明は、関心対象の遺伝子をコードする核酸を高コピー数含む細胞系を作製するために、組み込みベクター（すなわち、インテグラーゼまたはトランスポザーゼによって組み込みを行うベクター）を利用する。高コピー数細胞（ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｃｅｌｌ）のトランスフェクトされたゲノムは、反復継代（例えば、少なくとも１０回の継代、好ましくは少なくとも５０回の継代、最も好ましくは少なくとも１００回の継代）に対して安定である。さらに、本発明の宿主細胞は、高レベルのタンパク質を産生することができる（例えば、１ｐｇ／細胞／日を上回る、好ましくは１０ｐｇ／細胞／日を上回る、より好ましくは５０ｐｇ／細胞／日を上回る、最も好ましくは１００ｐｇ／細胞／日を上回る）。
【０１１９】
本発明の宿主細胞のゲノム安定性および高い発現レベルは、以前に記載された細胞培養の方法を上回る明確な利点をもたらす。例えば、遺伝子の複数のコピーを含む哺乳類細胞系は本質的に不安定であることが当技術分野では知られている。実際に、この不安定性は、高速スクリーニングアッセイを含むさまざまな目的に哺乳類細胞系を用いたいと考えている研究者が直面する、認知された問題である（例えば、Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １（３）：３８４〜９１［１９９７］を参照）。
【０１２０】
本発明は特定の作用機序には限定されないものとする。実際には、機序の理解は本発明の構成および使用に必要ではない。しかし、本発明の宿主細胞のゲノム安定性およびタンパク質発現レベルの高さは、組み込みベクター（例えば、レトロウイルスベクター）に特有の特性に起因すると考えられる。例えば、レトロウイルスは多くの生物の生殖系列における遺伝性因子であることが知られている。実際に、哺乳類ゲノムの５〜１０％もの割合は逆転写に起因する因子からなると考えられており、このことは高度の安定性を意味する。同様に、これらの種類のベクターの多くは、ゲノム中の活性のある（例えば、ＤＮＡ分解酵素Ｉ高感受性部位）転写部位を標的とする。
【０１２１】
多くの研究が、レトロウイルスおよびトランスポゾンによる組み込みの有害な影響を対象としている。ゲノムの活性領域を標的とする性質があるため、レトロウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターはプロモータートラップ法および飽和変異誘発法に用いられている（例えば、米国特許第５，６２７，０５８号および第５，９２２，６０１号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。プロモータートラップ法では、細胞を、プロモーターを含まないレポーターベクターに感染させる。プロモーターを含まないベクターがプロモーターの下流（すなわち、遺伝子内）に組み込みを行うと、ベクターによってコードされるレポーター遺伝子が活性化される。続いて、プロモーターのクローニングを行い、さらに特徴分析を行うことができる。
【０１２２】
理解されるであろうが、これらの方法は内因性遺伝子の破壊に依拠している。このため、通常であれば遺伝子の破壊を招くと考えられる、組み込みベクターを高い感染多重度で用いる本発明の方法により、関心対象のタンパク質を大量に発現する安定な細胞系が開発されたことは驚くべきことである。これらの細胞系の開発について以下にさらに詳細に述べる。説明は以下のセクションに分かれる：Ｉ）宿主細胞；ＩＩ）ベクターおよびトランスフェクションの方法；ならびにＩＩＩ）トランスフェクトされた宿主細胞の使用。
【０１２３】
Ｉ．宿主細胞
本発明は、組み込みベクターによる種々の宿主細胞のトランスフェクションを考えている。当技術分野では数多くの哺乳類宿主細胞系が知られている。一般に、これらの宿主細胞は、以下により詳細に述べる適切な栄養素および増殖因子を含む培地中での単層培養または懸濁培養下においた場合に生育および生存が可能である。典型的な場合、細胞は関心対象の特定のタンパク質を大量に発現し、培地中に分泌する。適した哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ ＣＣ１−６１）；ウシ乳腺上皮細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０２７４；ウシ乳腺上皮細胞）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎細胞系（２９３細胞または懸濁培養下での生育用にサブクローニングされた２９３細胞；例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９［１９７７］参照）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３〜２５１［１９８０］）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８［１９８２］）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；ラット線維芽細胞（２０８Ｆ細胞）；ＭＤＢＫ細胞（ウシ腎細胞）；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
哺乳類細胞系に加えて、本発明は、組み込みベクターによる低いまたは高い感染多重度での植物プロトプラストのトランスフェクションも考えている。例えば、本発明は、少なくとも１つの組み込みベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、最も好ましくは偽型のレトロウイルスベクターが組み込まれた植物細胞または全植物体を考えている。プロトプラストからの再生による産生が可能な植物はすべて、本発明によるプロセスを用いてトランスフェクトすることができる（例えば、ナス属、タバコ属、アブラナ属、トウジシャ属、エンドウ属、インゲンマメ属、ダイズ属、ヒマワリ属、ネギ属、カラスムギ属、オオムギ属、イネ属、エノコログサ属、ライムギ属、モロコシ属、コムギ属、トウモロコシ属、バショウ属、ヤシ属、マルメロ属、ナシ属、リンゴ属、ナツメヤシ属、アブラヤシ属、クサイチゴ属、ヘビイチゴ属、サクラ属、ラッカセイ属、キビ属、サトウキビ属、コーヒー属、ツバキ属、アナナス属、ブドウ属またはカンキツ属の栽培植物）。一般に、プロトプラストは従来の方法に従って作製する（例えば、米国特許第４，７４３，５４８号；第４，６７７，０６６号、第５，１４９，６４５号；および第５，５０８，１８４号；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。植物組織を適切な浸透ポテンシャル（例えば、３〜８重量％の糖ポリオール）および１つまたは複数の多糖ヒドロラーゼ（例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼなど）を有する適切な培地中に分散させ、プロトプラストが得られるのに十分な時間をかけて細胞壁を分解させてもよい。濾過後にプロトプラストを遠心処理によって分離し、続いて以降の処理または使用のために再懸濁してもよい。培養下に保ったプロトプラストの全植物体への再生は、当技術分野で知られた方法によって行われる（例えば、Ｅｖａｎｓら、「植物細胞培養ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、１：１２４〜１７６、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９８３］；Ｂｉｎｄｉｎｇ、植物プロトプラスト（Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）、ｐ．２１〜３７、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ［１９８５］）ならびにＰｏｔｒｙｋｕｓおよびＳｈｉｌｌｉｔｏ、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１１８巻、「植物分子生物学（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａ．およびＨ． Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ［１９８６］を参照）。
【０１２５】
本発明は、両生類宿主細胞系および昆虫宿主細胞系の使用も考えている。適した昆虫宿主細胞系の例には、蚊細胞系（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６０）が含まれるが、これらに限定されない。適した両生類宿主細胞系の例には、ヒキガエル細胞系（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
ＩＩ．トランスフェクションのためのベクターおよび方法
本発明によれば、上記のものなどの宿主細胞に対して、組み込みベクターによる形質導入またはトランスフェクションを行う。組み込みベクターの例には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターが含まれるが、これらに限定されない。本発明におけるこれらのベクターの設計、作製および使用については以下に述べる。
【０１２７】
Ａ．レトロウイルスベクター
レトロウイルス（レトロウイルス科）は一般に、以下の３つの群に分けられる：スプマウイルス（例えば、ヒト泡沫状ウイルス）；レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒツジビスナウイルス）およびオンコウイルス（例えば、ＭＬＶ、ラウス肉腫ウイルス）。
【０１２８】
レトロウイルスは、動物細胞を感染させる、外被を有する（すなわち、宿主細胞由来の脂質二重層膜に囲まれた）一本鎖ＲＮＡウイルスである。レトロウイルスに細胞が感染すると、そのＲＮＡゲノムは線状二本鎖ＤＮＡ形態に変換される（すなわち、逆転写される）。次に、ＤＮＡ形態のウイルスはプロウイルスとして宿主細胞ゲノムに組み込まれる。プロウイルスはさらにウイルスゲノムおよびウイルスｍＲＮＡを産生するためのテンプレートの役割を果たす。ゲノムＲＮＡの２つのコピーを含む成熟ウイルス粒子が感染細胞の表面から出芽する。ウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡ、逆転写酵素および他のｐｏｌ遺伝子産物をウイルスキャプシド（ウイルスｇａｇ遺伝子産物を含む）の内部に含み、これがさらにウイルス外被糖タンパク質（膜関連タンパク質とも呼ばれる）を含む宿主細胞由来の脂質二重層膜によって囲まれている。
【０１２９】
さまざまなレトロウイルスのゲノム構成が当技術分野では知られており、これにより、レトロウイルスベクターの作製を目的とするレトロウイルスゲノムの適合化が可能となった。関心対象の遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターの作製は一般に、２つの段階で行われる。
【０１３０】
第１に、関心対象の遺伝子を、関心対象の遺伝子の効率的な発現のために必要な配列（プロモーターおよび／またはエンハンサー因子を含む。これはウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）、または内部プロモーター／エンハンサーおよび適切なスプライシングシグナルによって提供してもよい）、ウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへの効率的なパッケージングに必要な配列（例えば、パッケージングシグナル（Ｐｓｉ）、ｔＲＮＡプライマー結合部位（−ＰＢＳ）、逆転写のために必要な３’調節配列（＋ＰＢＳ））およびウイルスＬＴＲを含むレトロウイルスベクター中に挿入する。ＬＴＲは、ウイルスゲノムＲＮＡの会合、逆転写酵素およびインテグラーゼの機能に必要な配列、ならびにウイルス粒子へのパッケージングを行おうとするゲノムＲＮＡの発現の指令に関与する配列を含む。安全面の理由から、多くの組換えレトロウイルスベクターはウイルス複製に必須な遺伝子の機能的コピーを持たない（これらの必須遺伝子は除去または無効化されている）；このため、この結果得られるウイルスは複製能欠損性と呼ばれる。
【０１３１】
第２に、組換えベクターを構築した後に、ベクターＤＮＡをパッケージング細胞系に導入する。パッケージング細胞系は、望ましい宿主範囲を有するウイルス粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングのためにトランス的に必要なウイルスタンパク質を提供する（すなわち、ウイルスにコードされたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質）。宿主範囲は一部には、ウイルス粒子の表面に発現される外被遺伝子産物の種類によって調節される。パッケージング細胞系が同種指向性、両種指向性または異種指向性の外被遺伝子産物を発現してもよい。または、パッケージング細胞にウイルス外被（ｅｎｖ）タンパク質をコードする配列がなくてもよい。この場合には、パッケージング細胞系は膜関連タンパク質（例えば、ｅｎｖタンパク質）を含まない粒子中へのウイルスゲノムのパッケージングを行うと考えられる。ウイルスの細胞内への侵入を可能にすると考えられる膜関連タンパク質を含むウイルス粒子を作製するためには、レトロウイルス配列を含むパッケージング細胞系に、膜関連タンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質）をコードする配列をトランスフェクトすることが一般的である。トランスフェクトされたパッケージング細胞は、トランスフェクトされたパッケージング細胞系によって発現された膜関連タンパク質を含むウイルス粒子を産生すると考えられる；別のウイルスの外被タンパク質によるキャプシド形成がなされたウイルスに由来するウイルスゲノムＲＮＡを含むこのようなウイルス粒子を偽型のウイルス粒子という。
【０１３２】
本発明のレトロウイルスベクターを、追加的な調節配列を含むようにさらに改変することができる。上記の通り、本発明のレトロウイルスベクターは機能的に結び付いた以下の因子を含む：ａ）５’ ＬＴＲ；ｂ）パッケージングシグナル；ｃ）３’ ＬＴＲ；ならびにｄ）５’および３’ ＬＴＲの間に位置する、関心対象のタンパク質をコードする核酸。本発明のいくつかの態様において、内部プロモーターからの転写が望ましい場合には、関心対象の核酸を５’ ＬＴＲに対して反対の向きに配置してもよい。適した内部プロモーターには、α−ラクトアルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター（ヒトまたはサルのもの）およびチミジンキナーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明の他の態様において、関心対象のタンパク質の分泌が望ましい場合には、関心対象のタンパク質と機能的に結び付いたシグナルペプチド配列を含めることにより、ベクターを改変する。組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長ホルモン、ラクトフェリン、α−カゼインおよびα−ラクトアルブミンに由来するものを含むが、これらに限定されない、いくつかの適したシグナルペプチドの配列が当技術分野で知られている。
【０１３４】
本発明の他の態様では、ＲＮＡ移行因子を、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列の３’側または５’側に組み入れることによってベクターを改変する（例えば、米国特許第５，９１４，２６７号；第６，１３６，５９７号；および第５，６８６，１２０号；ならびに国際公開公報第９９／１４３１０号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。ＲＮＡ移行因子の使用により、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列にスプライスシグナルまたはイントロンを組み入れなくても、関心対象のタンパク質の高レベルの発現を得ることが可能になると考えられる。
【０１３５】
さらに他の態様において、ベクターは、少なくとも１つのリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）配列をさらに含む。口蹄疫ウイルス（ＦＤＶ）、脳心筋炎ウイルスおよびポリオウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない、いくつかの適したＩＲＥＳの配列が入手可能である。ＩＲＥＳ配列を２つの転写単位（例えば、異なる関心対象のタンパク質、または抗体などの多サブユニットタンパク質の複数のサブユニットをコードする核酸）の間に介在させることにより、２つの転写単位が同一のプロモーターから転写される多シストロン性配列を形成することができる。
【０１３６】
本発明のレトロウイルスベクターに、形質転換細胞の選択を容易にする選択マーカーをさらに含めてもよい。薬剤Ｇ４１８に対する耐性を哺乳類細胞に付与する細菌アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下における増殖能を付与する細菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られたさまざまな選択マーカーを本発明に用いうる。いくつかの態様において、選択マーカー遺伝子は、関心対象のタンパク質をもコードする多シストロン性配列の一部として提供される。
【０１３７】
本発明のさらに他の態様において、レトロウイルスベクターは組換え系によって認識される組換え因子を含んでもよい（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘＰまたはｆｌｐリコンビナーゼ系を参照：例えば、Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：２２８７−２３００［１９８６］、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−５５［１９９１］、ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７３７６−８０［１９９５］および米国特許第６，０２５，１９２号を参照。これらは参照として本明細書に組み入れられる）。宿主細胞のゲノム中へのベクターの組み込みの後に、組み込まれたベクター中に関心対象の核酸配列が挿入されるように、リコンビナーゼ酵素（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）、またはリコンビナーゼ酵素をコードする核酸配列、および組換え酵素によって認識される配列が隣接した関心対象のタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸配列を、宿主細胞に一時的にトランスフェクトすることができる（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクションによる）。
【０１３８】
組換えレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、エレクトロポレーションまたは核酸のマイクロインジェクションなどの他の技法に比べて、遺伝子を細胞内に導入するより効率的な手段となる。ウイルス導入の効率は一部には、核酸の移行が受容体を介するプロセスである（すなわち、ウイルスは標的細胞の表面にある特異的な受容体タンパク質と結合する）という事実によると考えられている。さらに、ひとたび細胞内に入った後も、ウイルスにより導入された核酸は制御の下で組み込まれるが、これは非ウイルス的に導入されたものとは対照的である；リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈などの他の手段によって導入された核酸は再配列および分解を被る。
【０１３９】
最もよく用いられる組換えレトロウイルスベクターは、両種指向性であるモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）である（例えば、ＭｉｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：２８９５［１９８６］を参照）。ＭｏＭＬＶ系にはいくつか利点がある：１）この特定のレトロウイルスは多くの異なる細胞種を感染させることができる、２）樹立されたパッケージング細胞系を組換えＭｏＭＬＶウイルス粒子の産生に用いうる、および３）導入した遺伝子が宿主細胞の染色体に永続的に組み込まれる。確立されているＭｏＭＬＶベクター系は、レトロウイルス配列の一部（例えば、ウイルス末端反復配列または「ＬＴＲ」、およびパッケージングシグナルまたは「ｐｓｉ」シグナル）を含むＤＮＡベクター、およびパッケージング細胞系を含む。導入しようとする遺伝子をＤＮＡベクター中に挿入する。ＤＮＡベクターに存在するウイルス配列は、ベクターＲＮＡのウイルス粒子中への挿入またはパッケージング、および挿入された遺伝子の発現のために必要なシグナルを提供する。パッケージング細胞系は、粒子の集合に必要なタンパク質を提供する（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１１２０［１９８８］）。
【０１４０】
これらの利点にもかかわらず、ＭｏＭＬＶをベースとする既存のレトロウイルスベクターは、いくつかの本質的な問題によって制限されている：１）非分裂細胞を感染させない（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：４２３９［１９９０］）、ただし、おそらく卵母細胞は例外と思われる；２）産生される組換えウイルスの力価が低い（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０［１９８０］およびＭｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５［１９９０］）；および３）ある種の細胞種（例えば、ヒトリンパ球）に対する感染効率が低い（Ａｄａｍｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：８９８１［１９９２］）。ＭｏＭＬＶをベースとするベクターの力価が低いことは、少なくとも一部には、ウイルスによってコードされる外被タンパク質の不安定性に起因するとされている。レトロウイルスのストックを物理的手段に（例えば、超遠心および限外濾過）によって濃縮すると、感染性ウイルスの重大な喪失を招く。
【０１４１】
ＭｏＭＬＶをベースとするベクターの力価の低さおよびある種の細胞種に対する感染効率の低さは、ＶＳＶのＧタンパク質を膜関連タンパク質として含む偽型のレトロウイルスベクターを用いることによって克服されてきた。特異的な表面タンパク質受容体と結合して細胞内に侵入するレトロウイルス外被タンパク質とは異なり、ＶＳＶ Ｇタンパク質は原形質膜のリン脂質成分と相互作用する（Ｍａｓｔｒｏｍａｒｉｎｏら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：２３５９［１９７７］）。ＶＳＶの細胞内への侵入は特異的なタンパク質受容体の存在に依存しないため、ＶＳＶの宿主範囲は極めて広範囲にわたる。ＶＳＶ Ｇタンパク質を有する偽型のレトロウイルスベクターは、ＶＳＶに特徴的な変化した宿主範囲を有する（すなわち、それらは脊椎動物、無脊椎動物および昆虫細胞のほぼすべての種を感染させうる）。重要なこととして、ＶＳＶ Ｇ−偽型のレトロウイルスベクターは、感染性を明らかに低下させずに超遠心による２０００倍またはそれ以上に濃縮することができる（Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８０３３［１９９３］）。
【０１４２】
本発明は、ウイルスＧタンパク質をウイルス粒子内部の異種膜関連タンパク質として用いる場合に、ＶＳＶ Ｇタンパク質の使用には限定されない（例えば、米国特許第５，５１２，４２１号を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）。ピリウイルスおよびチャンディプラウイルスなどのＶＳＶ以外のベシクロウイルス属のウイルスのＧタンパク質はＶＳＶ Ｇタンパク質と非常に相同性が高く、共有結合したパルミチン酸を含む（Ｂｒｕｎら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ． ３８：２７４［１９９５］およびＭａｓｔｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌ． １７１：２８５（１９９０］）。このため、ウイルス粒子の偽型化のために、ＶＳＶ Ｇタンパク質の代わりにピリウイルスおよびチャンディプラウイルスのＧタンパク質を用いることができる。さらに、狂犬病ウイルスおよびモコラウイルスなどのリサウイルス属に属するウイルスのＶＳＶ Ｇタンパク質にもＶＳＶ Ｇタンパク質との高度の保存性（アミノ酸配列ならびに機能面での保存）が認められる。例えば、モコラウイルスのＧタンパク質はＶＳＶ Ｇタンパク質と同様の様式で作用することが示されており（すなわち、膜融合を媒介する）、このためウイルス粒子の偽型化のためにＶＳＶ Ｇタンパク質の代わりに用いうると考えられる（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：１４４４［１９９５］）。実施例２に述べるように、ピリ、チャンディプラまたはモコラウイルスのＧタンパク質を用いてウイルス粒子を偽型化しうるが、その際には例外として、適したプロモーター因子（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター；ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの、ＣＭＶ ＩＥプロモーターを含むさまざまな発現ベクターが入手可能である）の転写制御下にあるピリ、チャンディプラまたはモコラウイルスのＧタンパク質をコードする配列を含むプラスミドを、ｐＨＣＭＶ−Ｇの代わりに用いる。ラブドウイルス科の他のメンバーに由来する他のＧタンパク質をコードする配列を用いてもよい；種々のラブドウイルスＧタンパク質をコードする配列がゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースから入手可能である。
【０１４３】
レトロウイルスの大半は、レシピエント細胞が感染時に細胞周期を進行させている（すなわち、分裂している）場合にのみ、二本鎖線状ウイルス（プロウイルス）をレシピエント細胞のゲノムに導入または組み込むことができる。分裂細胞のみを感染させる、またはそれらをより効率的に感染させることが示されているレトロウイルスには、ＭＬＶ、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ；ＨＩＶは分裂細胞をより効率的に感染させるが、ＨＩＶは非分裂細胞も感染させうる）。
【０１４４】
ＭＬＶウイルスＤＮＡの組み込みは宿主細胞の有糸分裂の進行に依存することが示されており、この有糸分裂に対する依存性は、ウイルス組み込み複合体が核内に侵入するためには核膜の破壊が必要なことを反映している（Ｒｏｅら、ＥＭＢＯ Ｊ． １２：２０９９［１９９３］）。しかし、分裂中期で停止した細胞では組み込みは起こらないため、核膜の破壊だけではウイルス組み込みが起こるには不十分であると思われる；ゲノムＤＮＡの凝縮状態などの別の必要条件があると考えられる（Ｒｏｅら、前記）。
【０１４５】
Ｂ．レンチウイルスベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたレンチウイルスベクターの使用も考えている。レンチウイルス（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス）はレトロウイルスの亜科であり、非分裂細胞への組み込みを行うことができる。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、すべてのレトロウイルスに認められる３つの遺伝子、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含み、これらは２つのＬＴＲ配列によって隣接している。ｇａｇ遺伝子は内部構造タンパク質（例えば、マトリックス、キャプシドおよびヌクレオキャプシドタンパク質）をコードする；ｐｏｌ遺伝子は逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼタンパク質をコードする；ならびにｐｏｌ遺伝子はウイルス外被糖タンパク質をコードする。５’および３’ ＬＴＲはウイルスＲＮＡの転写およびポリアデニル化を制御する。レンチウイルスゲノム中のこのほかの遺伝子には、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘ遺伝子が含まれる。
【０１４６】
種々のレンチウイルスベクターおよびパッケージング細胞系が当技術分野で知られており、本発明に用いることができる（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および第６，０１３，５１６号を参照。これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、ＶＳＶ Ｇタンパク質も、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするレトロウイルスベクターの偽型化のために用いられている（Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３［１９９６］）。このため、ＶＳＶ Ｇタンパク質はさまざまな偽型のレトロウイルスベクターの作製に用いることができ、ＭｏＭＬＶをベースとするベクターには限定されない。レンチウイルスベクターを、種々の調節配列（例えば、シグナルペプチド配列、ＲＮＡ移行因子およびＩＲＥＳのもの）を含むように上記の通りに改変してもよい。レンチウイルスベクターを作製した後には、それらを、レトロウイルスベクターに関して上に述べたように宿主細胞のトランスフェクションに用いてもよい。
【０１４７】
Ｃ．アデノ随伴ウイルスベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も考えている。ＡＡＶは、デペンドウイルス属に属するヒトＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶゲノムは、約４６８０塩基を含む線状の一本鎖ＤＮＡ分子から構成される。本ゲノムは、ＤＮＡ複製起点およびウイルスのパッケージングシグナルとしてシス性に作用する逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を両端に含む。ゲノムの内部非反復部分は、それぞれＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ領域として知られる２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。ＡＡＶ ｒｅｐ領域からは、見かけの分子量に従って命名されたＲｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ ５２およびＲｅｐ ４０という、少なくとも４つのウイルスタンパク質からなるファミリーが合成されている。ＡＡＶ ｃａｐ領域は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３という少なくとも３つのタンパク質をコードする（ＡＡＶゲノムの詳細な説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７〜１２９［１９９２］；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１［１９９４］を参照のこと）。
【０１４８】
ＡＡＶがウイルス産生性感染を引き起こすためには、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスなどの近縁関係にないヘルパーウイルスとの重複感染を必要とする。このような重複感染がなければ、ＡＡＶはゲノムを宿主細胞染色体に挿入することによって潜伏状態を引き起こす。その後のヘルパーウイルス感染により、組み込まれたコピーが復旧し、複製して感染性ウイルスの子孫を産生できるようになる。非偽型のレトロウイルスとは異なり、ＡＡＶは宿主範囲が広く、任意の種に由来する細胞において、その種で同じく増殖すると思われるヘルパーウイルスとの重複感染が存在する限り、複製可能である。したがって、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスに重複感染したイヌ細胞で複製すると考えられる。さらに、レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶにはヒトまたは動物疾患とのつながりがなく、組み込み後に宿主細胞の生物特性を変化させないと思われるほか、非分裂細胞にも組み込みが可能である。また、ＡＡＶが宿主細胞ゲノムへの部位特異的組み込みを行えることも最近明らかになっている。
【０１４９】
上記の特性を考慮して、数多くの組換えＡＡＶベクターが遺伝子送達を目的として開発されている（例えば、米国特許第５，１７３，４１４号；第５，１３９，９４１号；国際公開公報第９２／０１０７０号および国際公開公報第９３／０３７６９号。これらはどちらも参照として本明細書に組み入れられる；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８〜３９９６［１９８８］；Ｃａｒｔｅｒ， Ｂ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３〜５３９［１９９２］；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７〜１２９［１９９２］；Ｋｏｔｉｎ， Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５〜１６９［１９９４］；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１８６７〜１８７５［１９９４］を参照）。
【０１５０】
組換えＡＡＶビリオンは、ＡＡＶヘルパープラスミドおよびＡＡＶベクターの両方をトランスフェクトした適した宿主細胞において産生が可能である。ＡＡＶヘルパープラスミドは一般にＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域を含むが、ＡＡＶ ＩＴＲは含まない。したがって、ヘルパープラスミドは複製を行えず、自らのパッケージングも行えない。ＡＡＶベクターは一般に、選択した関心対象の遺伝子が、ウイルス複製およびパッケージング機能を提供するＡＡＶ ＩＴＲと結合したものを含む。ヘルパープラスミドおよび選択した遺伝子を有するＡＡＶベクターの両方を、一時的トランスフェクションによって適した宿主細胞に導入する。続いて、トランスフェクト細胞を、ヘルパープラスミドに存在してＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ領域の転写および翻訳を指令するＡＡＶプロモーターをトランス活性化する、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。選択した遺伝子を有する組換えＡＡＶビリオンが形成され、これを調製物から精製することができる。ＡＡＶベクターをひとたび作製すれば、高コピー数宿主細胞を作製する目的で、それらを宿主細胞に対して望ましい感染多重度でトランフェクトすることができる（例えば、米国特許第５，８４３，７４２号を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）。当業者には理解されるであろうが、ＡＡＶベクターを、種々の調節配列（例えば、シグナルペプチド配列、ＲＮＡ移行因子およびＩＲＥＳのものなど）を含むように上記の通りに改変してもよい。
【０１５１】
Ｄ．トランスポゾンベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたトランスポゾンベクターの使用も考えている。トランスポゾンは、ゲノム中の１つの位置から別の位置への移動または転位が可能な移動性遺伝因子である。ゲノム内部での転位は、トランスポゾンによってコードされる酵素トランスポザーゼによって制御される。トランスポゾンの例は当技術分野で数多く知られており、これには、Ｔｎ５（例えば、ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚら、Ｊ． Ｂａｃｔ． １７５：６９３２〜３８［１９９３］を参照）、Ｔｎ７（例えば、Ｃｒａｉｇ、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０４：２７〜４８［１９９６］を参照）およびＴｎ１０（例えば、ＭｏｒｉｓａｔｏおよびＫｌｅｃｋｎｅｒ、Ｃｅｌｌ ５１：１０１〜１１１［１９８７］を参照）が含まれるが、これらに限定されない。トランスポゾンがゲノム中に組み込みを行う能力は、トランスポゾンベクターの作製に利用されている（例えば、米国特許第５，７１９，０５５号；第５，９６８，７８５号；第５，９５８，７７５号；および第６，０２７，７２２号を参照；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。トランスポゾンは感染性でないため、トランスポゾンベクターは当技術分野で知られた方法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクション）によって宿主細胞に導入される。このため、トランスポゾンベクターと宿主細胞との比を調整することにより、本発明の高コピー数宿主細胞を作製するのに望ましい感染多重度が得られる。
【０１５２】
本発明における使用に適したトランスポゾンベクターは一般に、関心対象のタンパク質をコードする核酸が、２つのトランスポゾン挿入配列の間に介在するものを含む。いくつかのベクターは、トランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列も含む。これらのベクターでは、挿入配列の１つを、組換えの際に宿主細胞のゲノム中に組み入れられないように、トランスポザーゼ酵素と関心対象のタンパク質をコードする核酸との間に配置する。または、トランスポザーゼ酵素を適した方法によって提供してもよい（例えば、リポフェクションまたはマイクロインジェクション）。当業者には理解されるであろうが、トランスポゾンベクターを、種々の調節配列（例えば、シグナルペプチド配列、ＲＮＡ移行因子およびＩＲＥＳのもの）を含むように、上記の通りに改変してもよい。
【０１５３】
Ｅ．高い感染多重度でのトランスフェクション
関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクター（例えば、レトロウイルスベクター）をひとたび作製すれば、それらを宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入に用いることができる（その例は上のセクションＩに述べた）。好ましくは、宿主細胞に対して、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたはそれ以上のレトロウイルスベクターの組み込みが生じるのに十分な感染多重度で、組み込みベクターによるトランスフェクションまたは形質導入を行う。いくつかの態様では、感染した宿主細胞のゲノムが組み込まれたベクターの２〜１００個のコピー、好ましくは組み込まれたベクターの５〜５０個のコピーを含むように、１０〜１，０００，０００の感染多重度を用いうる。他の態様では、１０〜１０，０００の感染多重度を用いる。非偽型のレトロウイルスベクターを感染用に用いる場合には、宿主細胞を、望ましい力価（すなわち、コロニー形成単位、ＣＦＵ）の感染性ベクターを含むレトロウイルス産生細胞から得た培地とともにインキュベートする。偽型のレトロウイルスベクターを用いる場合には、ベクターを超遠心によって適切な力価に濃縮した後に宿主細胞培養物に添加する。または、濃縮したベクターを細胞種に適した培地中に希釈してもよい。さらに、宿主細胞による複数の関心対象のタンパク質の発現が望ましい場合には、宿主細胞に対して、異なる関心対象のタンパク質をコードする核酸をそれぞれが含む複数のベクターをトランスフェクトすることができる。
【０１５４】
いずれの場合も、宿主細胞は、感染およびそれに続くベクターの組み込みが起こるのに十分な期間にわたり、感染性レトロウイルスベクターを含む培地に曝露される。一般に、細胞を重ねるために用いる培地の量は、細胞１個当たりの組み込みイベントが最大量となるように、できるだけわずかな容積に保つ必要がある。一般的な指針としては、１ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数は、望ましい組み込みイベントの数に応じて、約１０５〜１０７ｃｆｕ／ｍｌである必要がある。
【０１５５】
本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、作用機序の理解は本発明の実施のために必要ではない。しかし、ベクターの拡散速度は極めて低いことが知られている（例えば、米国特許第５，８６６，４００号、これは拡散速度の考察に関して参照として本明細書に組み入れられる）。このため、実際の組み込み率は感染多重度よりも低くなる（場合によってははるかに低くなる）と考えられる。米国特許第５，８６６，４００号の式を適用すると、１０６ｃｆｕ／ｍｌの力価の場合の平均ベクター−ベクター間隔は１ミクロンである。ＭＭＬＶベクターが１００ミクロン動くのに要する拡散時間は約２０分である。したがって、ベクターは１時間に約３００ミクロン移動しうる。１０００個の細胞をＴ２５フラスコ内にプレーティングした場合、細胞間隔は平均２．５ｍｍとなる。これらの値を用いると、１時間以内に任意の細胞と接触すると予想されるウイルス粒子は５６個に過ぎない。以下の表は、特定のベクター力価に対して、Ｔ２５フラスコ内の所定数の細胞に関して予想される接触率を示している。しかし、以下の実施例の項に示すように、実際に得られた組み込みの数はこれらの式によって予想されるよりもはるかに少ない。
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【０１５６】
したがって、実際の組み込み率は、感染多重度だけでなく、接触時間（すなわち、宿主細胞を感染性ベクターに曝露させる時間）、トランスフェクトしようとする宿主細胞の集密度または形状、およびベクターが含まれる培地の容積にも依存することが考えられる。これらの条件は、本明細書の教示のように、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞系が作製されるように変更しうると考えられる。実施例８および９に示すように、ＭＯＩは、細胞数を一定に保ってＣＦＵを変化させることにより（実施例９）、またはＣＦＵを一定に保って細胞数を変化させることにより（実施例８）、変更可能である。
【０１５７】
いくつかの態様では、トランスフェクションまたは形質導入の後に細胞を増殖させ、続いてトリプシン処理を行って再プレーティングを行う。続いて、クローン的に選択された細胞系を得るために個々のコロニーを選択する。またさらなる態様では、望ましい数の組み込みイベントが起こったことを確認するために、クローン的に選択した細胞系をサザンブロット法またはインベーダー（ＩＮＶＡＤＥＲ）アッセイによってスクリーニングする。また、クローン選択により、より優れたタンパク質産生細胞系の同定も可能になると考えられる。他の態様では、トランスフェクション後に細胞のクローン選択を行わない。
【０１５８】
いくつかの態様では、宿主細胞に対して、異なる関心対象のタンパク質をコードする複数のベクターをトランスフェクトする。異なる関心対象のタンパク質をコードするベクターを用いて細胞に同時にトランスフェクトすることもでき（例えば、宿主細胞を、異なる関心対象のタンパク質をコードする複数のベクターを含む溶液に曝露させる）、またはトランスフェクションが連続的であってもよい（例えば、宿主細胞に第１の関心対象のタンパク質をコードするベクターをまずトランスフェクトし、一定時間をおいた後に、宿主細胞に第２の関心対象のタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトする）。いくつかの好ましい態様では、宿主細胞を第１の関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクターに感染させて、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む高発現性細胞系を選択した上で（例えば、クローン的に選択する）、選択した細胞系に、第２の関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクターをトランスフェクトする。複数の関心対象のタンパク質を導入するためにはこの工程を反復するとよい。いくつかの態様では、関心対象のタンパク質の発現を増加または減少させるために、感染多重度を操作（例えば、高めるまたは低くする）してもよい。同様に、関心対象のタンパク質の発現を変化させるために異なるプロモーターを用いてもよい。これらのトランスフェクション方法は、外因性代謝経路全体を含む宿主細胞系を構築するため、またはタンパク質のプロセシングの能力が高まった宿主細胞（例えば、翻訳後修飾に必要な酵素を宿主細胞に付与することができる）を得るために用いうると考えられる。
【０１５９】
またさらなる態様では、細胞系に対して、同一の遺伝子をコードする複数のベクターを連続的にトランスフェクトする。いくつかの好ましい態様では、宿主細胞に（例えば、約１０〜１００，０００、好ましくは１００〜１０，０００のＭＯＩで）関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクターをトランスフェクトし、組み込みベクターの単一もしくは複数の組み込まれたコピーを含む細胞系、または望ましいタンパク質を高レベルで発現する細胞系を選択した上で（例えば、クローン的に選択する）、選択した細胞系にベクターを再びトランスフェクトする（例えば、約１０〜１００，０００、好ましくは１００〜１０，０００のＭＯＩで）。いくつかの態様では、ベクターの少なくとも２つの組み込まれたコピーを含む細胞系を同定および選択する。この工程を、望ましいタンパク質発現レベルが得られるまで複数回繰り返してもよく、複数の関心対象のタンパク質をコードするベクターを導入するために繰り返してもよい。予想外のことに、同一の遺伝子による連続トランスフェクションにより、その結果得られた細胞からは、単に相加的ではないタンパク質産生の増加がもたらされる。
【０１６０】
ＩＩＩ．トランスフェクトされた宿主細胞の用途
高い感染多重度でトランスフェクトされた宿主細胞は、さまざまな目的に用いることができる。第１に、本宿主細胞は、医薬品、産業、診断および他の目的のためのタンパク質の産生に有用である。第２に、特定の１つまたは複数のタンパク質を発現する宿主細胞はスクリーニングアッセイに有用である（例えば、高速スクリーニング）。第３に、本宿主細胞は、タンパク質の複数の変種を産生し、続いてタンパク質変種の活性を分析するのにも有用である。これらの用途のそれぞれについて、以下により詳細に説明する。
【０１６１】
Ａ．タンパク質の産生
本発明の宿主細胞は、医薬品、産業、診断および他の用途を目的とするタンパク質の産生に有用と考えられる。本発明は何らかの特定のタンパク質の産生には限定されない。実際には、以下のものを含むが、これらに限定されない、非常にさまざまなタンパク質の産生を考えている：エリスロポエチン、α−インターフェロン、α−１プロテイナーゼインヒビター、アンジオゲニン、アンチトロンビンＩＩＩ、β酸デカルボキシラーゼ、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒト血清アルブミン、β−インターフェロン、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、インスリン、ラクトフェリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ミエリン塩基性タンパク質、インスリン、プロインスリン、プロラクチン、Ｂ型肝炎抗原、免疫グロブリン、モノクローナル抗体ＣＴＬＡ４ Ｉｇ、Ｔａｇ ７２モノクローナル抗体、Ｔａｇ ７２一本鎖抗原結合タンパク質、プロテインＣ、サイトカインおよびその受容体、例えば腫瘍壊死因子αおよびβ、それらの受容体ならびにそれらの誘導体など；レニン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；フォンビルブラント因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ；ボンベシン；トロンビン；造血系増殖因子；エンケファリナーゼ；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばミューラー管抑制物質など；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼ；ＤＮＡ分解酵素；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＢＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３；ＮＴ−４；ＮＴ−５またはＮＴ−６）、またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦなど；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−β；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９など；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α−βおよび−γなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなど；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０など；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばＡＩＤＳ外被の一部など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；調節��ンパク質；抗体；キメラタンパク質、例えばイムノアドヘシンなど、ならびに以上に挙げた任意のものの断片。これらのタンパク質の核酸配列およびタンパク質配列は公開データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能である。
【０１６２】
いくつかの態様では、本発明のベクターを、複数の外因性タンパク質を発現させるために用いる。例えば、宿主細胞が、第１の関心対象のタンパク質をコードする第１のベクターの少なくとも１つの組み込まれたコピー、および第２の関心対象のタンパク質をコードする第２の組み込みベクターの少なくとも１つの組み込まれたコピーを含むように、宿主細胞に複数の異なる関心対象のタンパク質をコードするベクターによるトランスフェクション（例えば、第１の関心対象のタンパク質をコードする１つのベクターおよび第２の関心対象のタンパク質をコードする第２のベクターによる感染多重度１０００での共トランスフェクションもしくは感染、または連続的トランスフェクションもしくは感染）を行ってもよい。他の態様では、多シストロン性配列（例えば、二シストロン性または三シストロン性配列）として複数の異なる関心対象のタンパク質をコードする核酸を配置することにより、複数のタンパク質を発現させる。この配置は、異なる関心対象のタンパク質の発現が約１：１のモル比であることが望ましい場合に特に有用である（例えば、免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖の発現）。
【０１６３】
またさらなる態様では、宿主細胞においてリボザイムを発現させる。リボザイムは、種々の表現型を備えた宿主細胞を得ることを目的として、特定の遺伝子の発現を下方制御するために、またはＴＥＴ、エクジソン、グルココルチコイドエンハンサーなどの遺伝子スイッチとともに、用いることができると考えられる。
【０１６４】
トランスフェクトされた宿主細胞は当技術分野で知られた方法に従って培養する。哺乳類細胞に適した培養条件は当技術分野で周知である（例えば、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８３）５６：２２１〜２３４、「動物細胞培養：実践的アプローチ（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、第２版、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ， Ｄ．およびＨａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９９２］を参照）。
【０１６５】
本発明の宿主細胞培養物は、培養する特定の細胞に適した培地中で調製する。栄養液の例には、ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地がある。適した培地は、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第５，１２２，４６９号および第４，５６０，６５５号；ならびに国際公開公報第９０／０３４３０号および国際公開公報第８７／００１９５号にも記載されている；これらは参照として本明細書に組み入れられる。これらのいずれかの培地に対して、必要に応じて、血清、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシンなど）、微量元素（最終濃度がμＭの範囲で通常存在する無機化合物と定義される）、脂質（リノール酸または他の脂肪酸など）およびそれらの適した担体、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補充してもよい。任意の他の必要な補充成分を当業者に知られた適切な濃度で含めてもよい。哺乳類細胞培養の場合、培地の重量オスモル濃度は一般に約２９０〜３３０ｍＯｓｍである。
【０１６６】
本発明は、トランスフェクトされた宿主細胞用のさまざまな培養システム（例えば、ペトリ皿、９６穴プレート、回転瓶およびバイオリアクター）の使用も考えている。例えば、宿主細胞を灌流システム中で培養することができる。灌流培養とは、高い細胞密度で維持している培養物に培地の連続流を与えることを指す。細胞は浮遊状態とし、生育のための固体支持体は必要でない。一般に、新たな栄養素を連続的に供給し、同時に有害代謝産物の除去、さらに理想的には死細胞の選択的除去を行う必要がある。濾過、捕捉（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）およびマイクロカプセル化の方法はいずれも培養環境を十分な速度で回復するのに適している。
【０１６７】
もう１つの例として、いくつかの態様では、流加培養法を用いうる。好ましい流加培養法では、哺乳類宿主、細胞および培地を最初に培養容器に供給し、追加用の培養栄養成分を培養中の培養物に連続的または不連続的に加え、培養終了までそのままおくか、または細胞および／もしくは細胞の定期的な収穫を行う。流加培養には、例えば、培養物全体（細胞および培地を含む）を生育容器から取り出し、新たな培地と交換する半連続的流加培養が含まれうる。流加培養は、培養プロセスの開始時に細胞培養のためのすべての成分（細胞およびすべての培養栄養成分を含む）を培養容器に供給するという点で、単純なバッチ培養とは区別される。流加培養はさらに、プロセスの最中に上清を培養容器から取り出さない限りにおいては、灌流培養とも区別しうる（灌流培養では、細胞を培養下に拘束し（例えば、濾過、カプセル封入、微粒子担体への付着など）、培地を連続的または間欠的に導入して、培養容器から取り出す）。いくつかの特に好ましい態様において、バッチ培養は回転瓶の中で行う。
【０１６８】
さらに、培養物の細胞を、個々の宿主細胞および個々の産生計画に適した任意の方式または定型的手順に従って増殖させてもよい。したがって、本発明は一段階ならびに多段階の培養手順を考えている。一段階培養では、宿主細胞を培養環境に接種し、細胞培養物の単一の産生期の間に本発明のプロセスを用いる。または、他段階培養も考えている。多段階培養では、細胞を複数の工程または期で培養する。例えば、細胞をおそらくは貯蔵物から取り出し、生育および高い生存性を促すのに適した培地中に接種するという第１の工程または生育期の培養で細胞を生育させてもよい。宿主細胞培養物に対する新たな培地の添加により、細胞を適切な期間にわたって生育期に維持してもよい。
【０１６９】
流加培養または連続細胞培養の条件は、細胞培養物の生育期にある哺乳類細胞の生育が増強されるように考慮する。生育期では、生育のために最適化された条件および期間の下で細胞を生育させる。温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などの培養条件は個々の宿主に用いられるものであり、当業者には明らかである。一般に、ｐＨは酸（例えば、ＣＯ２）または塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３またはＮａＯＨ）を用いて約６．５〜７．５のレベルに調整する。ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞の培養に適した温度の範囲は約３０℃〜３８℃であり、適したｄＯ２は空気中飽和量の５〜９０％である。
【０１７０】
ポリペプチド産生期に続いて、関心対象のポリペプチドを、当技術分野で十分に確立された技法を用いて培地から回収する。関心対象のタンパク質は分泌型ポリペプチドとして培地から回収することが好ましい（例えば、関心対象のタンパク質の分泌はシグナルペプチド配列によって導かれる）が、宿主細胞の可溶化物から回収してもよい。第１の段階として、粒状細胞片を除去するために培地または可溶化物を遠心処理にかける。続いて、ポリペプチドを混入性の可溶性タンパク質およびポリペプチドから任意の適した方法を用いて精製するが、適した精製手順の例は以下の通りである：免疫親和性またはイオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ、またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；ゲル濾過、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるもの；およびＩｇＧなどの混入物を除去するためのプロテインＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼインヒビターも精製時のタンパク質分解を抑制するには有用と思われる。さらに、関心対象のタンパク質を、関心対象のタンパク質の精製を可能にするマーカー配列とインフレーム形式で融合させることもできる。マーカー配列の非制限的な例には、ベクター、好ましくはｐＱＥ−９ベクターによって供給しうるヘキサヒスチジンタグ、およびヘマグルチニン（ＨＡ）タグが含まれる。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７［１９８４］参照）。当業者は、関心対象のポリペプチドに適した精製法に、組換え細胞培養物における発現時のポリペプチドの特性の変化に対応するために修正を要する場合があることを理解している。
【０１７１】
本発明の宿主細胞は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）および他の膜貫通タンパク質を発現させるためにも有用である。これらのタンパク質を発現させると、それらは膜の内部に本来のコンフォメーションで正しく挿入されると考えている。このため、当技術分野で知られた方法により、ＧＰＣＲおよび他の膜貫通タンパク質を膜画分の部分として精製しうる、または膜から精製しうると思われる。
【０１７２】
さらに、本発明のベクターは、アッセイが存在しない、またはアッセイが困難な、関心対象のタンパク質を共発現させる目的にも有用である。このシステムでは、関心対象のタンパク質およびシグナルタンパク質を多シストロン性配列として配置する。ＩＲＥＳ配列がシグナルタンパク質と関心対象のタンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）を隔て、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質をコードする遺伝子が単一の転写単位として発現されることが好ましい。本発明は何らかの特定のシグナルタンパク質には限定されない。実際いは、容易なアッセイが存在するさまざまなシグナルタンパク質の使用を考えている。これらのシグナルタンパク質には、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび抗体重鎖または軽鎖が含まれるが、これらに限定されない。シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質を多シストロン性配列から発現させる場合には、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されると考えられる。したがって、いくつかの態様において、本発明は、関心対象のタンパク質の発現を間接的に検出するための方法であって、ＩＲＥＳによって機能的に結合したシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質を含む多シストロン性配列をコードするベクターによるトランスフェクションを行った宿主細胞を提供すること、ならびにシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質が産生される条件下で、宿主細胞を培養することを含み、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されるような方法を提供する。
【０１７３】
Ｂ．化合物の活性に関するスクリーニング
本発明は、活性に関する化合物のスクリーニングのため、特にコンビナトリアルライブラリー（例えば、１０４種を上回る化合物を含むライブラリー）からの化合物の高速スクリーニングのための、高コピー数細胞系の使用を考えている。本発明の高コピー数細胞系はさまざまなスクリーニング法に用いることができる。いくつかの態様において、本細胞は、細胞表面受容体の活性化後のシグナル伝達を観測するための二次メッセンジャーアッセイに用いうる。他の態様において、本細胞は、細胞反応を転写／翻訳レベルで観測するレポーター遺伝子アッセイに用いることができる。またさらなる態様では、本細胞を、外部刺激に対する細胞の全体的増殖／増殖反応のないことを観測するための細胞増殖アッセイに用いうる。
【０１７４】
二次メッセンジャーアッセイでは、宿主細胞に対して、上記の通りに、細胞表面受容体、イオンチャネル、細胞質受容体、またはシグナル伝達に関与する他のタンパク質（例えば、Ｇタンパク質、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ）をコードするベクターをトランスフェクトすることが好ましい（例えば、米国特許第５，６７０，１１３号；第５，８０７，６８９号；第５，８７６，９４６号；および第６，０２７，８７５号を参照；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。続いて、宿主細胞を１つまたは複数の化合物（例えば、コンビナトリアルライブラリーからのもの）で処理し、反応の有無についてアッセイする。コンビナトリアルライブラリー中の化合物の少なくとも一部は、ベクターによってコードされる１つまたは複数のタンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、活性化物質または阻害物質として作用しうると考えられる。また、コンビナトリアルライブラリー中の化合物の少なくとも一部は、シグナル伝達経路内でベクターによってコードされる蛋白質の上流または下流で作用するタンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、活性化物質または阻害物質として作用しうると考えられる。
【０１７５】
非制限的な例として、膜貫通型受容体と結合するアゴニストは、特徴が詳細に解明されているいくつかのプロモーター／エンハンサー因子（例えば、ＡＰ１、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）、血清応答配列（ＳＲＥ）および活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦ−ＡＴ））の調節と機能的に関係することが知られている。ＧαＳ共役受容体が活性化されると、アデニリルシクラーゼが刺激され、細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇、プロテインキナーゼＡの刺激、ＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化、およびＣＲＥ配列を有するプロモーターの誘導が生じる。Ｇαｉ共役受容体は、同じシグナル伝達の成分を阻害することによってＣＲＥ活性を抑制する。Ｇαｑおよび一部のβγ対は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ならびにイノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の生成を刺激する。一過性の細胞内カルシウム流入は、カルシニューリンおよびＮＡ−ＦＴ、さらにはカルモジュリン（ＣａＭ）依存性キナーゼおよびＣＲＥＢの誘導を促す。ＤＡＧ濃度の上昇はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびエンドソーム／リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭアーゼ）を刺激する；ａＳＭアーゼ経路が優位になると、ＮＴκＢ阻害因子ＩκＢの分解ならびにＮＦκＢ活性化の両方を誘導する。代替的な経路では、増殖因子受容体などの受容体が活性化され、Ｓｏｓを原形質膜に動員してＲａｓの刺激を引き起こし、次にこれがセリン／トレオニンキナーゼＲａｆを原形質膜に動員する。Ｒａｆは活性化されるとＭＥＫキナーゼをリン酸化し、次にこれがＭＡＰＫおよび転写因子ＥＬＫのリン酸化および活性化を行う。ＥＬＫはＳＲＥ配列を有するプロモーターからの転写を駆動して転写因子ＦｏｓおよびＪｕｎの合成をもたらし、これによってＡＰ１部位を活性化しうる転写因子複合体を形成させる。ここに述べた経路を形成するタンパク質、さらには他の受容体、キナーゼ、ホスファターゼおよび核結合タンパク質はコンビナトリアルライブラリー中の化合物の標的であり、本発明の宿主細胞において発現させる候補でもあると考えられる。
【０１７６】
いくつかの態様では、二次メッセンジャーアッセイにより、膜受容体およびイオンチャネル（例えば、リガンド依存性イオンチャネル；Ｄｅｎｙｅｒら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ ３：３２３〜３２［１９９８］；およびＧｏｎｚａｌｅｓら、Ｄｒｕｇ． Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ ４：４３１〜３９［１９９９］を参照）の刺激に起因する細胞内変化（例えば、Ｃａ２＋濃度、膜電位、ｐＨ、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、アラキドン酸遊離）に反応する、レポーター分子からの蛍光シグナルを測定する。レポーター分子の例には、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）系（例えば、Ｃｕｏ−脂質およびオキソノール、ＥＤＡＮ／ＤＡＢＣＹＬ）、カルシウム感受性指示薬（例えば、Ｆｌｕｏ−３、ＦＵＲＡ ２、ＩＮＤＯ １およびＦＬＵＯ３／ＡＭ、ＢＡＰＴＡ ＡＭ）、塩素イオン感受性指示薬（例えば、ＳＰＱ、ＳＰＡ）、カリウム感受性指示薬（例えば、ＰＢＦＩ）、ナトリウム感受性指示薬（例えば、ＳＢＦＩ）およびｐＨ感受性指示薬（例えば、ＢＣＥＣＦ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
一般には、宿主細胞に対して化合物への曝露の前に指示薬を添加する。化合物による処理に対する宿主細胞の反応は、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡（例えば、ＦＣＳシステム）、フローサイトメトリー、ミクロ流動装置、ＦＬＩＰＲシステム（例えば、ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＮｅａｇｌｅ、Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １：７５〜８０［１９９６］を参照）およびプレート読取りシステムを含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られた方法によって検出することができる。いくつかの好ましい態様では、活性がわかっていない化合物によって引き起こされた反応（例えば、蛍光強度の上昇）を既知のアゴニストによって生じた反応と比較し、既知のアゴニストによる最大反応に対する百分率として表現する。既知のアゴニストによって引き起こされる最大反応は１００％の反応と定義される。同様に、既知のアンタゴニストまたは被験アンタゴニストを含む試料に対するアゴニストの添加後に記録された最大反応は、１００％反応よりも検出可能な程度に小さい。
【０１７８】
本細胞はレポーター遺伝子アッセイにも有用である。レポーター遺伝子アッセイには、レポーター遺伝子のコード配列が結合した、標的遺伝子（すなわち、疾患標的の生物的な発現および機能を制御する遺伝子）の転写制御因子を含む核酸をコードするベクターをトランスフェクトした宿主細胞の使用が含まれる。このため、標的遺伝子の活性化によってレポーター遺伝子産物の活性化が生じる。本発明において有用なレポーター遺伝子の例には、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ホタルおよび細菌のルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼならびに緑色蛍光性タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。これらのタンパク質の産生は、緑色蛍光性タンパク質を除き、特異的基質（例えば、Ｘ−ｇａｌおよびルシフェリン）の化学発光性、比色定量性または生物発光性産物を用いることによって検出される。活性が知られた化合物と活性がわかっていない化合物との比較を上記の通りに行ってもよい。
【０１７９】
Ｃ．変種タンパク質の活性の比較
本発明は、変種の活性を比較できるようにタンパク質の変種を作製することを目的とした、高コピー数宿主細胞の使用も考えている。いくつかの態様において、変種は、単一のアミノ酸の違いを引き起こす一塩基多型（ＳＮＰ）の点で異なる。他の態様において、変種は複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、インビボまたは細胞抽出物における変種タンパク質の活性をアッセイする。他の態様では、タンパク質を精製し、インビトロでアッセイする。いくつかの態様において、変種タンパク質を、容易な精製を可能にする配列（例えば、ｈｉｓ−タグ配列）またはレポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光性タンパク質）と融合させることも考えている。タンパク質の活性は、当技術分野で知られた適した方法（例えば、基質の生成物への変換）によってアッセイしうる。いくつかの好ましい態様では、野生型タンパク質の活性を測定し、変種型の野生型タンパク質の活性を野生型タンパク質の活性に対する百分率として表現する。さらに、それぞれが野生型タンパク質の異なる変種を発現する複数の宿主細胞系を作製することにより、変種タンパク質の細胞内活性を比較してもよい。続いて、変種タンパク質（例えば、シグナル伝達経路に関与するタンパク質の変種）の活性を、上記の二次メッセンジャーアッセイのためのレポーターシステムを用いて比較してもよい。したがって、いくつかの態様では、刺激またはアゴニストもしくはアンタゴニストの結合に対する変種タンパク質の直接的または間接的な反応（例えば、シグナル伝達経路の上流または下流の活性化によるもの）を比較する。いくつかの好ましい態様では、野生型タンパク質の反応を測定し、変種型の野生型タンパク質の反応を野生型タンパク質の反応に対する百分率として表現する。
【０１８０】
実施例
以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい態様および面を例示するためのものであり、その範囲を制限するものとみなされるべきではない。
【０１８１】
以下の実験の開示においては、以下の略号を用いる：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；ＡＭＰ（アデノシン５’−一リン酸）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ｃＤＮＡ（コピーＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ）；ＣＳ（子ウシ血清）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＬＨ（黄体形成ホルモン）；ＮＩＨ（米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｅｓｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；ｇ（重力）；ＯＤ（光学密度）；ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）；ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−塩酸）；クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノー）フラグメント）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ｂｌａ（β−ラクタマーゼまたはアンピシリン耐性遺伝子）；ＯＲＩ（プラスミド複製起点）；ｌａｄ（ｌａｃ抑制因子）；Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−Ｄ−ガラクトシド）；ＡＴＣＣ（米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ギブコ社（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）；パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）；およびシグマ社（Ｓｉｇｍａ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１８２】
実施例１
ベクターの構築
下記の実施例には、以下の実験に用いるベクターの構築について述べる。
【０１８３】
Ａ．ＣＭＶ ＭＮ１４
ＣＭＶ ＭＮ１４ベクター（配列番号：４；ＭＮ１４抗体は米国特許第５，８７４，５４０号に記載されている。これは参照として本明細書に組み入れられる）は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：ＣＭＶプロモーター；ＭＮ１４重鎖シグナルペプチド、ＭＮ１４抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ；ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチド；ＭＮ１４抗体軽鎖；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。ＣＭＶ ＭＮ１４ベクターは、配列番号：４に記載された配列に加えて、５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナルおよびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：７に示されている；本明細書に記載の構築物のそれぞれにおいて５’ ＬＴＲはモロニーマウス肉腫ウイルスに由来するが、これは組み込まれるとＭｏＭｕＬＶ ５’ ＬＴＲに変換される）。
【０１８４】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ＭＮ１４抗体の発現はＣＭＶプロモーターによって制御される。ＭＮ１４重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ配列によって結合している。ＣＭＶプロモーターは、ＩＲＥＳによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生される。ＬＴＲならびにＣＭＶプロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。構築物は以下のセクションＢに述べるものと同様の方法によってクローニングした。
【０１８５】
ＩＲＥＳ配列（配列番号：３）は、プラスミドｐＬＸＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＩＲＥＳとウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドとの融合物を含む。ＩＲＥＳからの翻訳開始が最も効率化されるように、シグナルペプチドの最初のＡＴＧをＩＲＥＳと結合した。シグナルペプチドの３’末端は、関心対象の任意のタンパク質が容易に結合して、シグナルペプチドとの融合タンパク質が作製されるようにマルチクローニングサイトを備えている。このＩＲＥＳ配列は翻訳エンハンサーとして作用することに加えて、単一のｍＲＮＡから２つのタンパク質が産生されるようにする第２の翻訳開始部位を形成する。
【０１８６】
ＩＲＥＳ−ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドは以下の通りに構築した。ＥＣＭＶ ＩＲＥＳを含むプラスミドｐＬＸＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）の部分を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
2004524805.tif 000003
【０１８７】
プライマー２は、ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドコード領域の開始部に対応する尾部をＩＲＥＳ配列と結合させる。さらに、ＩＲＥＳ配列からの翻訳を効率化するために、ラクトアルブミンシグナルペプチドの第２のトリプレットコドンをＡＴＧからＧＣＣに変異させた。この変異により、タンパク質配列にメチオニンからアラニンへの変化が生じた。この変異を導入した理由は、ＩＲＥＳがタンパク質鎖の第２のアミノ酸としてアラニンを好むためである。この結果得られたＩＲＥＳ ＰＣＲ産物は断片の５’末端（上記のプライマー１のすぐ下流）にＥｃｏＲＩ部位を含む。
【０１８８】
次に、α−ラクトアルブミンシグナルペプチドを含む配列を、以下のプライマーを用いてα−ＬＡシグナルペプチドベクター構築物からＰＣＲ増幅した。
2004524805.tif 000004
【０１８９】
プライマー３は、ＩＲＥＳ配列の３’末端に対応する尾部をα−ラクトアルブミンシグナルペプチドコード領域と結合させる。上記の通り、ＩＲＥＳ配列からの翻訳が効率化されるように、ウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドの第２のトリプレットコドンを変異させた。この結果得られたシグナルペプチドのＰＣＲ断片は、３’末端にＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ部位を含む。
【０１９０】
ＩＲＥＳおよびシグナルペプチドを上記のプライマーを用いて個別に増幅した後に、２つの反応産物を混合し、プライマー１およびプライマー４を用いてＰＣＲを行った。この反応の結果として得られた産物は、ＩＲＥＳが完全長α−ラクトアルブミンシグナルペプチドと結合したものを含むスプライス断片である。シグナルペプチドの開始部をコードするＡＴＧを、ベクターｐＬＸＩＮ中に存在するネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をコードするＡＴＧと同じ位置に置かれている。この断片は、５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏｌ部位も含む。
【０１９１】
このスプライシングを受けたＩＲＥＳ／α−ラクトアルブミンシグナルペプチドＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した。α−ＬＡシグナルペプチドベクター構築物も同じくＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した。これらの２つの断片を連結してｐＩＲＥＳ構築物を得た。
【０１９２】
ｐＩＲＥＳベクターのＩＲＥＳ／α−ラクトアルブミンシグナルペプチド部分の配列決定を行ったところ、ＩＲＥＳの５’末端を変異を含んでいないことが明らかになった。これらの変異はＣの長い連鎖として存在し、単離したすべてのクローンに認められた。
【０１９３】
この問題点を修復するために、ｐＬＸＩＮ ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＦＩで消化した。ＩＲＥＳ配列の一部に対応する５００ｂｐのバンドが単離された。変異型ＩＲＥＳ／α−ラクトアルブミンシグナルペプチド構築物もＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＦＩで消化し、変異型ＩＲＥＳ断片を取り出した。続いて、変異型ＩＲＥＳ／α−ラクトアルブミンシグナルペプチド構築物のＩＲＥＳ断片をｐＬＸＩＮからのＩＲＥＳ断片によって置換した。この結果得られたプラスミドのＩＲＥＳ／α−ＬＡシグナルペプチド部分をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１９４】
この結果得られた構築物の配列には、クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から入手した予想されるｐＬＸＩＮ配列とは多くの違いがあることが判明した。本発明者らは、クロンテック社から購入したｐＬＸＩＮのＩＲＥＳ部分の配列決定も配列を確認するために行った。予想された配列との違いは、本発明者らがクロンテック社から入手したｐＬＸＩＮプラスミドにも存在すると思われた。配列には以下の４つの違いが同定された：
ｂｐ ３４７ Ｔは、ｐＬＸＩＮ配列ではＧであった。
ｂｐ ７８６〜７８８ ＡＣＧは、ＬＸＩＮ配列ではＧＣであった。
【０１９５】
Ｂ．ＣＭＶ ＬＬ２
ＣＭＶ ＬＬ２（配列番号：５；ＬＬ２抗体は米国特許第６，１８７，２８７号に記載されている。これは参照として本明細書に組み入れられる）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ ＣＭＶプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＬＬ２重鎖シグナルペプチド、ＬＬ２抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ；ウシα−ＬＡシグナルペプチド；ＬＬ２抗体軽鎖；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。ＣＭＶ ＬＬ２ベクターは、配列番号：５に記載された配列に加えて、５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナルおよびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：７に示されている）。
【０１９６】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ＬＬ２抗体の発現はＣＭＶプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって制御される。ＬＬ２重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ配列によって結合している。ＣＭＶプロモーターは、ＩＲＥＳによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生される。ＬＴＲならびにＣＭＶプロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０１９７】
ＩＲＥＳ配列（配列番号：３）は、プラスミドｐＬＸＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＩＲＥＳとウシα−ラクトアルブミンシグナルペプチドとの融合物を含む。ＩＲＥＳからの翻訳開始が最も効率化されるように、シグナルペプチドの最初のＡＴＧをＩＲＥＳと結合した。シグナルペプチドの３’末端は、関心対象の任意のタンパク質が容易に結合して、シグナルペプチドとの融合タンパク質が作製されるようにマルチクローニングサイトを備えている。このＩＲＥＳ配列は翻訳エンハンサーとして作用することに加えて、単一のｍＲＮＡから２つのタンパク質が産生されるようにする第２の翻訳開始部位を形成する。
【０１９８】
ＬＬ２軽鎖遺伝子を以下の通りにＩＲＥＳα−ラクトアルブミンシグナルペプチドと結合させた。ＬＬ２軽鎖を以下のプライマーを用いてベクターｐＣＲＬＬ２からＰＣＲ増幅した。
2004524805.tif 000005
【０１９９】
これらのプライマーは、成熟ＬＬ２軽鎖のコード領域の開始部にＨｉｎｃＩＩ部位を付加する。ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩで消化すると、成熟ＬＬ２をコードする最初のＧＡＣから始まる平滑末端断片が５’末端に得られる。プライマー２は、遺伝子の３’末端の停止コドンの直後にＢｇｌＩＩ部位を付加する。この結果得られた ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＮａｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化したＩＲＥＳ−シグナルペプチドプラスミド中に直接クローニングした。
【０２００】
続いて、ＬＬ２重鎖遺伝子のコザック配列を改変した。ベクターｐＣＲＭＮ１４ＨＣをＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、約４００ｂｐの断片を取り出した。続いてＰＣＲを用いて、ＸｈｏＩ−ＡｖｒＩＩ消化によって取り出したＬＬ２重鎖構築物の同じ部分を増幅した。この増幅によって遺伝子の５’末端の変異も生じ、より優れたコザック配列がクローンに付加された。典型的なＩｇＧコザック配列に類似させるためにコザック配列を改変した。ＰＣＲプライマーを以下に示す。
2004524805.tif 000006
【０２０１】
このＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、以前に消化しておいたプラスミド骨格中に挿入し直した。
【０２０２】
続いて、この「優れた」コザック配列を軽鎖遺伝子に付加した。「優れた」コザックＬＬ２重鎖遺伝子構築物をＥｃｏＲＩで消化し、重鎖遺伝子を含む断片を単離した。ＩＲＥＳ−αラクトアルブミンシグナルペプチドＬＬ２軽鎖遺伝子構築物も同じくＥｃｏＲＩで消化した。続いて重鎖遺伝子をＩＲＥＳ軽鎖構築物のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。これにより、重鎖遺伝子がＩＲＥＳ配列の５’端に配置された。
【０２０３】
次に、ＬＮＣＸレトロウイルス骨格のプラスミド中にマルチクローニングサイトを付加した。ＬＮＣＸプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化した。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製して互いにアニーリングさせ、二本鎖ＤＮＡマルチクローニングサイトを作製した。以下のプライマーを互いにアニーリングさせた。
2004524805.tif 000007
【０２０４】
アニーリングの後に、マルチクローニングサイトをＬＮＣＸ中に連結し、ＬＮＣ−ＭＣＳを作製した。
【０２０５】
次に、二重鎖遺伝子断片をレトロウイルス骨格の遺伝子構築物中に連結した。上記の通りに作製した二重鎖遺伝子構築物をＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、二重鎖を含む断片を単離した。レトロウイルス発現プラスミドＬＮＣ−ＭＣＳをＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。続いて二重鎖断片をＬＮＣ−ＭＣＳレトロウイルス発現骨格中にクローニングした。
【０２０６】
次に構築物におけるＲＮＡスプライシングの問題を修正した。構築物をＮｓｉＩで消化した。この結果得られた断片をＥｃｏＲＩで部分消化した。この部分消化によって得られた約９３００塩基対のサイズの断片をゲル精製した。ＬＬ２重鎖遺伝子の３’端のスプライスドナー部位を変異させるためにリンカーを作製した。さらに、２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって二本鎖ＤＮＡリンカーを形成させることによってリンカーを再び作製した。リンカーの作製に用いた２つのプライマーを以下に示す。
2004524805.tif 000008
【０２０７】
アニーリングの後に、部分消化の際に除去された当初のＮｓｉＩ／ＥｃｏＲＩ断片の部分をこのリンカーで置換した。
【０２０８】
Ｃ．ＭＭＴＶ ＭＮ１４
ＭＭＴＶ ＭＮ１４（配列番号：６）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ ＭＭＴＶプロモーター；二重変異型ＰＰＥ配列；ＭＮ１４抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ；ウシαＬＡシグナルペプチド；ＭＮ１４抗体軽鎖；ＷＰＲＥ配列；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。ＭＭＴＶ ＭＮ１４ベクターは、配列番号：６に記載された配列に加えて、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナル；ＭＭＴＶプロモーターの５’側に位置するネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：７に示されている）。
【０２０９】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ＭＮ１４抗体の発現はＭＭＴＶプロモーターによって制御される。ＭＮ１４重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド配列（配列番号：３）によって結合している。ＭＭＴＶプロモーターは、ＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド配列によって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生されるようになる。さらに、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を補助し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を補助する２つの遺伝因子がｍＲＮＡには含まれる。ＰＰＥ配列はＲＮＡ ＣＡＰ部位とＭＮ１４タンパク質コード領域の開始部との間に含まれ、ＷＰＲＥはＭＮ１４タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。ＬＴＲならびにＣＭＶプロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０２１０】
望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、ＰＰＥ因子（配列番号：２）内部のＡＴＧ配列を変異させた。この変異配列の２つのコピーを頭−尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド−コード領域の上流に配置した。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくｍＲＮＡの移行を補助するとともに、ｍＲＮＡに安定性をもたらす。この配列がＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれると、このＲＮＡからのタンパク質発現レベルは最大１０倍に上昇する。
【０２１１】
Ｄ．α−ＬＡ ＭＮ１４
α−ＬＡ ＭＮ１４（配列番号：７）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナル、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子、ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター、二重変異型ＰＰＥ因子、ＭＮ１４重鎖シグナルペプチド、ＭＮ１４抗体重鎖、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ／ウシαＬＡシグナルペプチド、ＭＮ１４抗体軽鎖、ＷＰＲＥ配列；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。
【０２１２】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ＭＮ１４抗体の発現はハイブリッド型α−ＬＡプロモーター（配列番号：１）によって制御される。ＭＮ１４重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ配列／ハイブリッド型α−ＬＡプロモーター（配列番号：３）によって結合している。α−ＬＡプロモーターは、ＩＲＥＳによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生される。
【０２１３】
さらに、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を補助し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を補助する２つの遺伝因子がｍＲＮＡには含まれる。この変異型ＰＰＥ配列（配列番号：２）はＲＮＡ ＣＡＰ部位とＭＮ１４タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、ＰＰＥ因子（配列番号：２）内部のＡＴＧ配列を変異させた。この変異配列の２つのコピーを頭−尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド−コード領域の上流に配置した。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくｍＲＮＡの移行を補助するとともに、ｍＲＮＡに安定性をもたらす。この配列がＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれると、このＲＮＡからのタンパク質発現レベルは最大１０倍に上昇する。ＷＰＲＥはＭＮ１４タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。ＬＴＲならびにウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０２１４】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：１）は、ヒトおよびウシのα−ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター／エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（ｔｓｐ）を基準として＋１５からｔｓｐを基準として−６００までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはｔｓｐを基準として−５５０〜−２０００に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスＲＮＡの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。
【０２１５】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンプロモーターの構築のために、ヒトゲノムＤＮＡを単離して精製した。ヒトα−ラクトアルブミンプロモーターの部分を以下の２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
2004524805.tif 000009
【０２１６】
この２つのプライマーにより、ＰＣＲ断片の５’末端にＮｄｅＩ部位が作製され、ＰＣＲ断片の３’末端にＥｃｏＲＩ部位が作製された。
【０２１７】
上記のプライマーを用いて作製したヒトＰＣＲ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化した。プラスミドｐＫＢａＰ−１も同じくＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで二重消化した。プラスミドｐＫＢａＩＰ−１は、ウシα−ラクトアルブミン５’隣接領域にマルチクローニングサイトが結合したものを含む。このプラスミドにより、種々の遺伝子をウシα−ラクトアルブミンプロモーターと結合させることが可能になる。
【０２１８】
次に、二重消化の際にｐＫＢａＰ−１プラスミドから除去されたプロモーターのウシ断片の部分をヒト断片で置換した。この結果得られたプラスミドはウシおよびヒトのα−ラクトアルブミンプロモーター／調節領域のハイブリッドであることがＤＮＡ配列決定によって確認された。
【０２１９】
ＭＮ１４軽鎖遺伝子のＩＲＥＳα−ラクトアルブミンシグナルペプチドとの結合は以下の通りに行った。ＭＮ１４軽鎖を、以下のプライマーを用いてベクターｐＣＲＭＮ１４ＬＣからＰＣＲ増幅した。
2004524805.tif 000010
【０２２０】
これらのプライマーは、成熟ＭＮ１４軽鎖のコード領域の開始部にＨｉｎｃＩＩ部位を付加する。ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩで消化すると、成熟ＭＮ１４をコードする最初のＧＡＣから始まる平滑末端断片が５’末端に得られる。プライマー２は遺伝子の３’末端の停止コドンの直後にＢｇｌＩＩ部位を付加する。この結果得られた ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＮａｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化したＩＲＥＳ−シグナルペプチドプラスミド中に直接クローニングした。
【０２２１】
次に、ベクターｐＣＲＭＮ１４ＨＣをＸｈｏＩおよびＮｒｕＩで消化し、約５００ｂｐの断片を取り出した。続いてＰＣＲを用いて、ＸｈｏＩ−ＮｒｕＩ消化によって取り出したＭＮ１４重鎖構築物の同じ部分を増幅した。この増幅によって遺伝子の５’末端の変異も生じ、より優れたコザック配列がクローンに付加された。典型的なＩｇＧコザック配列に類似させるためにこのコザック配列を改変した。ＰＣＲプライマーを以下に示す。
2004524805.tif 000011
【０２２２】
このＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＮｒｕＩで消化し、以前に消化しておいたプラスミド骨格中に挿入しなおした。
【０２２３】
次に、この「優れた」コザックＭＮ１４重鎖遺伝子構築物をＥｃｏＲＩで消化し、重鎖遺伝子を含む断片を単離した。ＩＲＥＳ−αラクトアルブミンシグナルペプチドＭＮ１４軽鎖遺伝子構築物も同じくＥｃｏＲＩで消化した。続いて重鎖遺伝子をＩＲＥＳ軽鎖構築物のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。これにより、重鎖遺伝子がＩＲＥＳ配列の５’端に配置された。
【０２２４】
続いて、ＬＮＣＸレトロウイルス骨格のプラスミド中にマルチクローニングサイトを付加した。ＬＮＣＸプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化した。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製して互いにアニーリングさせ、二本鎖ＤＮＡマルチクローニングサイトを作製した。以下のプライマーを互いにアニーリングさせた。
2004524805.tif 000012
アニーリングの後に、マルチクローニングサイトをＬＮＣＸ中に連結し、ＬＮＣ−ＭＣＳを作製した。
【０２２５】
続いて、二重鎖遺伝子断片をレトロウイルス骨格の遺伝子構築物中に連結した。段階３において作製した二重鎖遺伝子構築物をＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、二重鎖を含む断片を単離した。レトロウイルス発現プラスミドＬＮＣ−ＭＣＳをＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。続いて二重鎖断片をＬＮＣ−ＭＣＳレトロウイルス発現骨格中にクローニングした。
【０２２６】
次に、構築物におけるＲＮＡスプライシングの問題を修正した。構築物をＮｓｉＩで消化した。この結果得られた断片を次にＥｃｏＲＩで部分消化した。この部分消化によって得られた約９３００塩基対のサイズの断片をゲル精製した。ＭＮ１４重鎖遺伝子の３’端のスプライスドナー部位を変異させるためにリンカーを作製した。さらに、２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって二本鎖ＤＮＡリンカーを形成させることによってリンカーを再び作製した。リンカーの作製に用いた２つのプライマーを以下に示す。
2004524805.tif 000013
【０２２７】
アニーリングの後に、部分消化の際に除去された当初のＮｓｉＩ／ＥｃｏＲＩ断片の部分をこのリンカーで置換した。
【０２２８】
次に、変異型二重鎖断片をα−ラクトアルブミン発現性レトロウイルス骨格のＬＮα−ＬＡ−Ｍｅｒｔｚ−ＭＣＳ中に挿入した。上記の通りに作製した遺伝子構築物ＢａｒｎＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、変異型二重鎖遺伝子を含む断片を単離した。このＬＮ α−ＬＡ−Ｍｅｒｔｚ−ＭＣＳレトロウイルス骨格プラスミドをＢｇｌＩＩで消化した。続いてＢａｒｎＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片をレトロウイルス骨格プラスミド中に挿入した。
【０２２９】
続いてＷＰＲＥ因子を遺伝子構築物中に挿入した。ＷＰＲＥ因子を取り出すためにプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ ＷＰＲＥ−Ｂ１１をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化し、この因子を単離した。上記の通りに作製したベクターをＢｇｌＩＩおよびＨｐａＩで消化した。ＷＰＲＥ断片をＢｇｌＩＩおよびＨｐａＴ部位と連結し、最終的な遺伝子構築物を作製した。
【０２３０】
Ｅ．α−ＬＡ Ｂｏｔ
α−ＬＡ Ｂｏｔ（配列番号：８、ボツリヌス毒素抗体）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター、変異型ＰＰＥ因子、ｃｃ４９シグナルペプチド、ボツリヌス毒素抗体軽鎖、脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド、ボツリヌス毒素抗体重鎖、ＷＰＲＥ配列および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。加えて、αＬＡボツリヌス毒素抗体ベクターは５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ伸長型ウイルスパッケージングシグナル、およびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子を含む（これらの追加的な因子は配列番号：７に示されている）。
【０２３１】
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ボツリヌス毒素抗体の発現はハイブリッド型α−ＬＡプロモーターによって制御される。ボツリヌス毒素重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド配列（配列番号：３）によって結合している。ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターは、ＩＲＥＳによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むｍＲＮＡの産生を駆動する。リボソームはｍＲＮＡのＣＡＰ部位およびＩＲＥＳ配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のｍＲＮＡから産生されるようになる。
【０２３２】
さらに、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を補助し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を補助する２つの遺伝因子がｍＲＮＡに含まれる。変異型ＰＰＥ配列（配列番号：２）はＲＮＡ ＣＡＰ部位とＭＮ１４タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、ＰＰＥ因子（配列番号：２）内部のＡＴＧ配列を変異させた。この変異配列の２つのコピーを頭−尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド−コード領域の上流に配置した。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくｍＲＮＡの移行を補助するとともに、ｍＲＮＡに安定性をもたらす。この配列がＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれると、このＲＮＡからのタンパク質発現レベルは最大１０倍に上昇する。ＷＰＲＥはＭＮ１４タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。ＬＴＲならびにウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０２３３】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：１）は、ヒトおよびウシのα−ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター／エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（ｔｓｐ）を基準として＋１５からｔｓｐを基準として−６００までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはｔｓｐを基準として−５５０〜−２０００に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスＲＮＡの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。
【０２３４】
Ｆ．ＬＳＲＮＬ
ＬＳＲＮＬ（配列番号：９）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶウイルスパッケージングシグナル；Ｂ型肝炎表面抗原；ＲＳＶプロモーター；ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。
【０２３５】
この構築物は、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子の産生を制御するために５’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲを用いる。ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の発現はＲＳＶプロモーターによって制御される。ＬＴＲならびにＲＳＶプロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０２３６】
Ｇ．α−ＬＡ ｃｃ４９ＩＬ２
α−ＬＡ ｃｃ４９ＩＬ２（配列番号：１０；ｃｃ４９抗体は米国特許第５，５１２，４４３号；第５，９９３，８１３号；および第５，８９２，０１９号に記載されている；これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター；ｃｃ４９−ＩＬ２コード領域；および３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。この遺伝子構築物は、一本鎖抗体ｃｃ４９がインターロイキン−２と結合した融合タンパク質を発現する。融合タンパク質の発現はウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターによって制御される。
【０２３７】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：１）は、ヒトおよびウシのα−ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター／エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（ｔｓｐ）を基準として＋１５からｔｓｐを基準として−６００までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはｔｓｐを基準として−５５０〜−２０００に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスＲＮＡの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。３’ウイルスＬＴＲはｍＲＮＡのポリアデニル化配列を提供する。
【０２３８】
Ｈ．α−ＬＡ ＹＰ
α−ＬＡ ＹＦ（配列番号：１１）構築物は、５’側から３’側の順に以下の因子を含む：５’ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター；二重変異型ＰＰＥ配列；ウシαＬＡシグナルペプチド；ペスト菌（Ｙｅｒｓｅｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）抗体重鎖Ｆａｂコード領域；ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ／ウシα−ＬＡシグナルペプチド；ペスト菌抗体軽鎖Ｆａｂコード領域；ＷＰＲＥ配列；３’ ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ。
【０２３９】
この遺伝子構築物は、ペスト菌マウスＦａｂ抗体の発現を引き起こすと考えられる。遺伝子構築物の発現はウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターによって制御される。ＰＰＥ配列およびＷＰＲＥ配列はｍＲＮＡの核から細胞質への移動を補助する。ＩＲＥＳ配列により、重鎖および軽鎖遺伝子の両方が同一のｍＲＮＡから翻訳されるようになる。３’ウイルスＬＴＲはｍＲＮＡのポリアデニル化配列を提供する。
【０２４０】
さらに、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を補助し、ｍＲＮＡのポリアデニル化を補助する２つの遺伝因子がｍＲＮＡに含まれる。変異型ＰＰＥ配列（配列番号：２）はＲＮＡ ＣＡＰ部位とＭＮ１４タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、ＰＰＥ因子（配列番号：２）内部のＡＴＧ配列を変異させた（配列番号：２の塩基４位、１１２位、１３１位および２３８位をＧからＴに変更した）。この変異配列の２つのコピーを頭−尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド−コード領域の上流に配置した。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくｍＲＮＡの移行を補助するとともに、ｍＲＮＡに安定性をもたらす。この配列がＲＮＡの３’非翻訳領域に含まれると、このＲＮＡからのタンパク質発現レベルは最大１０倍に上昇する。ＷＰＲＥはＭＮ１４タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。ＬＴＲならびにウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのｍＲＮＡ発現は３’ ＬＴＲで終結し、そこでポリアデニル化される。
【０２４１】
ウシ／ヒトα−ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：１）は、ヒトおよびウシのα−ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター／エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（ｔｓｐ）を基準として＋１５からｔｓｐを基準として−６００までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはｔｓｐを基準として−５５０〜−２０００に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスＲＮＡの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。
【０２４２】
実施例２
ＭｏＭＬＶ ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を安定的に発現する細胞系の作製
実施例２〜５では、偽型のレトロウイルスベクターの作製について述べる。これらの方法は、上記のベクターの作製に一般的に適用可能である。融合誘導性ＶＳＶ Ｇタンパク質が細胞表面に発現されると合胞体形成および細胞死が起こる。このため、ＶＳＶ Ｇタンパク質を膜関連タンパク質として含むレトロウイルス粒子を作製するために二段階アプローチを採用した。第１に、ＭｏＭＬＶ由来のｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を高レベルで発現する安定的な細胞系を作製した（例えば、２９３ＧＰＳＤ細胞）。ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を発現する安定的な細胞系は、膜関連タンパク質（例えば、外被タンパク質）を含まない非感染性ウイルス粒子を産生する。続いて、安定的な細胞系に対して、リン酸カルシウム沈殿を用いてＶＳＶ−Ｇおよび関心対象の遺伝子プラスミドＤＮＡによる共トランスフェクションを行った。作製した偽型ベクター遺伝子を用いて２９３ＧＰＳＤ細胞を感染させ、安定的な形質転換細胞系を作製した。安定的な細胞系には、ＶＳＶ Ｇタンパク質の高レベルの発現を指令しうるプラスミドを一時的にトランスフェクトしうる（以下参照）。この一時的トランスフェクト細胞はＶＳＶ Ｇ−偽型レトロウイルスベクターを産生し、合胞体形成の結果として産生細胞が死滅するまでの３〜４日の期間にわたり、これを細胞から収集することが可能である。
【０２４３】
ＶＳＶ Ｇ−偽型レトロウイルスベクターの作製における第１の段階である、ＭｏＭＬＶ ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を発現する安定的な細胞系の作製について以下に述べる。ヒトアデノウイルスＡｄ−５によって形質転換された胚腎細胞系２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）に対して、ｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌ、およびフレオマイシンをコードする遺伝子による共トランスフェクションを行った。ｐＣＭＶ ｇａｇ−ｐｏｌは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＭｏＭＬＶ ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む（ｐＣＭＶ ｇａｇ−ｐｏｌはＡＴＣＣから入手しうる）。
【０２４４】
リン酸カルシウム共沈法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌ． ５２：４５６［１９７３］）を用いて、プラスミドＤＮＡを２９３細胞に導入した。ＤＮＡ共沈物を添加する前日に、約５×１０５個の２９３細胞を１００ｍｍ組織培養プレートにプレーティングした。１０％ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍｌフレオマイシンを含むＤＭＥＭ−高グルコース培地（選択培地）中で生育させることにより、安定的な形質転換体を選択した。選択培地中で生育したコロニーを細胞外逆転写酵素活性（Ｇｏｆｆら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ３８：２３９［１９８１］）および細胞内ｐ３０ｇａｇ発現に関してスクリーニングした。ｐ３０ｇａｇ発現の存在は、ヤギ抗ｐ３０抗体（ＮＣＩ抗血清 ７７Ｓ００００８７）を用いるウエスタンブロット法によって判定した。レトロウイルス遺伝子の安定的な発現を呈したクローンを選択した。このクローン２９３ＧＰＳＤ（２９３ｇａｇ−ｐｏｌ−Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）と命名した。ヒトＡｄ−５で形質転換された胚腎細胞系２９３の派生物であるこの２９３ＧＰＳＤ細胞系を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ−高グルコース培地中で生育させた。
【０２４５】
実施例３
ＶＳＶのＧ糖タンパク質を保有する偽型レトロウイルスベクターの調製
ＶＳＶ Ｇタンパク質偽型レトロウイルスを作製するために以下の手順を用いた。２９３ＧＰＳＤ細胞系に対して、ＶＳＶ−Ｇプラスミドおよび関心対象のＤＮＡプラスミドによる共トランスフェクションを行った。この共トランスフェクションにより、２９３ＧＰＳＤ細胞を感染させてパッケージング細胞系を作製するために用いる感染性粒子が作製される。本実施例では、偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスの作製について述べる。この一般的な方法を、実施例１に記載したベクターの任意のものを作製するために用いてもよい。
【０２４６】
ａ）細胞系およびプラスミド
パッケージング細胞系２９３ＧＰＳＤを、１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭ−高グルコース培地中で生育させた。偽型ウイルスの力価は２０８Ｆ細胞（Ｑｕａｄｅ、Ｖｉｒｏｌ． ９８：４６１［１９７９］）またはＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）を用いて判定しうる；２０８ＦおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞は１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ−高グルコース培地中で生育させる。
【０２４７】
プラスミドＬＮＢＯＴＤＣは、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下にあるＢＯＴＤをコードする遺伝子を含み、ＬＴＲプロモーターの転写制御下にあるネオマイシンリン酸転移酵素（Ｎｅｏ）をコードする遺伝子がこの後に続く。プラスミドｐＨＣＭＶ−Ｇは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下にあるＶＳＶ Ｇ遺伝子を含む（Ｙｅｅら、Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３：９９［１９９４］）。
【０２４８】
ｂ）安定的なパッケージング細胞系、偽型ベクターの作製、および偽型ＬＮＢＯＴＤＣベクターの力価判定
ＬＮＢＯＴＤＣ ＤＮＡ（配列番号：１３）をｐＨＣＭＶ−Ｇ ＤＮＡとともにパッケージング細胞系２９３ＧＰＳＤに共トランスフェクトして、ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを作製した。次に、この結果得られたＬＮＢＯＴＤＣウイルスを用いて２９３ＧＰＳＤ細胞を感染させ、細胞の形質転換を行った。偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスの作製のための手順は記載の通りに行った（Ｙｅｅら、Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３：９９［１９９４］。
【０２４９】
これは、感染性のある複製能欠損レトロウイルスベクターの生成に伴い、関心対象の細胞内への上記の配列の挿入が引き起こされると考えられるレトロウイルス遺伝子構築物である。挿入が起こると、ＣＭＶ調節配列がボツリヌス毒素抗体重鎖および軽鎖遺伝子の発現を制御する。ＩＲＥＳ配列により、重鎖および軽鎖遺伝子の両方が同一のｍＲＮＡから翻訳されるようになる。３’ウイルスＬＴＲはｍＲＮＡのポリアデニル化配列を提供する。
【０２５０】
ボツリヌス毒素抗体の重鎖および軽鎖タンパク質の両方がこのシグナルｍＲＮＡから産生される。この２つのタンパク質が会合すると活性のあるボツリヌス毒素抗体が形成される。また、重鎖および軽鎖タンパク質は互いに等しいモル比で形成されるように思われる。
【０２５１】
簡潔に述べると、第１日に約５×１０４個の２９３ＧＰＳＤ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコに播いた。その翌日（第２日）に、標準的なリン酸カルシウム共沈法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌ． ５２：４５６［１９７３］）を用いて、２９３ＧＰＳＤ細胞に２５μｇのｐＬＮＢＯＴＤＣプラスミドＤＮＡおよび２５μｇのＶＳＶ−ＧプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。１０〜４０μｇの範囲のプラスミドＤＮＡを用いうる。２９３ＧＰＳＤ細胞が組織培養プレートに固着するには２４時間以上を要する場合があるため、２９３ＧＰＳＤ細胞をトランスフェクションの４８時間前に７５ｃｍ２フラスコに入れておくとよい。トランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ細胞は、偽型のＬＮＢＯＴＤＣウイルスを生じる。
【０２５２】
第３日に、トランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ細胞から偽型ウイルスを収集する２４時間前に、約１×１０５個の２９３ＧＰＳＤ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコに入れた。第４日に、ｐＬＮＢＯＴＤＣおよびＶＳＶ−Ｇ ＤＮＡの適用から４８時間後にトランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ細胞から、培地を採取した。培地を０．４５μｍフィルターで濾過し、ポリブレンを添加して最終濃度を８μｇ／ｍｌとした。ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを含む培地を用いた２９３ＧＰＳＤ細胞の感染は以下の通りに行った。培地を２９３ＧＰＳＤ細胞から除去し、ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを含む培地に交換した。細胞に対する添加後にポリブレンを培地に加えた。ウイルスを含む培地中に２９３ＧＰＳＤ細胞を２４時間保った。感染時期から１６時間後（第５日）に培地を２９３ＧＰＳＤから除去し、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含む新たな培地に交換した。培地をほぼ３日毎に交換したところ、約２週間後にＧ４１８耐性コロニーが出現した。
【０２５３】
このＧ４１８耐性２９３コロニーを単細胞として９６個のウェルにプレーティングした。高生産性クローンを同定するために、６０〜１００個のＧ４１８耐性コロニーをＢＯＴＤＣ抗体の発現に関してスクリーニングした。９６穴プレート中の上位１０種のクローンを６穴プレートに移し、集密に達するまで生育させた。
【０２５４】
この上位１０種のクローンを高力価産生に関してスクリーニングした。タンパク質発現および力価産生に基づいて５つのクローン細胞系を選択した。１つの細胞系をマスター細胞バンクに指定し、他の４つを予備細胞系とした。偽型ベクターは以下の通りに作製した。約１×１０６個の２９３ＧＰＳＤ／ＬＮＢＯＴＤＣ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコに播いた。２４時間後にリン酸カルシウム共沈法を用いて細胞に２５μｇのｐＨＣＭＶ−ＧプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。６〜８時間後にカルシウム−ＤＮＡ沈殿物を細胞に適用し、ＤＮＡ溶液を新たな培地（Ｇ４１８を含まないもの）に交換した。トランスフェクション時間の長い方（一晩）では、２９３ＧＰＳＤ／ＬＮＢＯＴＤＣ細胞の大半がプレートから剥離したことが判明したため、これは用いていない。トランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ／ＬＮＢＯＴＤＣ細胞は偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを産生した。
【０２５５】
トランスフェクトされた２９３ＧＰＳＤ／ＬＮＢＯＴＤＣ細胞から生じた偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスは、トランスフェクションから２４〜９６時間の間は少なくとも１日１回収集することができる。最も高いウイルス力価は最初のｐＨＣＭＶ−Ｇトランスフェクションから約４８〜７２時間後に得られた。トランスフェクションから約４８時間後に合胞体形成がトランスフェクト細胞の大半に認められるようになったが、細胞は組織培養プレートに付着し続ける限り、少なくともさらに４８時間にわたって偽型ウイルスの産生を続けた。ＶＳＶ Ｇ−偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを含む収集した培地をプールし、０．４５μｍフィルターで濾過した上で、−８０℃で保存するか、または直ちに濃縮した後に−８０℃で保存した。
【０２５６】
続いて、ＶＳＶ Ｇ−偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスの力価を以下の通りに判定した。約５×１０４個のラット２０８Ｆ線維芽細胞を６穴プレートにプレーティングした。プレーティングから２４時間後に、８μｇ／ｍｌ ポリブレンの存在下で、ＬＮＢＯＴＤＣウイルス含有培地を連続希釈したものによって細胞を感染させた。ウイルスによる感染から２４時間後に、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む新たな培地に交換し、Ｇ４１８耐性コロニーが認められるようになるまで１４日間にわたって選別を続けた。ウイルス力価は一般に約０．５〜５．０×１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌであった。以下に述べる通り、ウイルスストックの力価が１０９ｃｆｕ／ｍｌを上回るまで濃縮することが可能であった。
【０２５７】
実施例４  偽型レトロウイルスベクターの濃縮
超遠心分離を１サイクル行うことにより、ＶＳＶ Ｇ−偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを濃縮して高力価とした。しかし、さらに濃縮するために２サイクルを行うことが可能である。実施例２に記載した通りに収集した、偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスを含む凍結培地を３７℃水浴中で解凍し、あらかじめオートクレーブによって滅菌しておいたオークリッジ型遠心管（密封蓋付きの５０ｍｌオークリッジ型遠心管、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に移した。ＪＡ２０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）により４８，０００×ｇ（２０，０００ｒｐｍ）、４℃で１２０分間遠心してウイルスを沈殿させた。次に、バイオセーフティーフード内で培地をチューブから採取し、チューブ内に残った培地を吸引して上清を採取した。ウイルスペレットを最初の容量の０．５〜１％のＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。再懸濁したウイルスペレットを４℃で一晩、攪拌せずにインキュベートした。一晩インキュベートした後には、感染性ウイルスを大きく失うことなく、ウイルスペレットを丁寧なピペッティングで分散させることができた。ウイルスストックの力価は通常、超遠心を１回行った後には１００〜３００倍に上昇した。感染性ウイルスの回収効率は３０〜１００％の範囲でさまざまであった。
【０２５８】
続いて、視認しうる細胞片、または以上の条件下で再懸濁されなかった凝集ビリオンを除去するために、ウイルスストックを微量遠心管に入れ、低速遠心を４℃で５分間行った。ウイルスストックを卵母細胞または胚への注入に用いる予定がなければ、この遠心段階を省いてもよい。
【０２５９】
ウイルスストックをさらに濃縮するためにこのウイルスストックに超遠心をさらにもう１回行うことができる。１回目の遠心後に再懸濁したウイルスをプールし、２回目の超遠心を上記と同じく行うことによってペレット化する。２回目の超遠心後にはウイルス力価は約２０００倍に上昇する（偽型ＬＮＢＯＴＤＣウイルスの力価は、第２回目の超遠心後には一般に１×１０９ｃｆｕ／ｍｌとなる）。
【０２６０】
遠心前および遠心後の液体の力価を２０８Ｆ細胞の感染によって判定した後（ＮＩＨ ３Ｔ３またはウシ乳腺上皮細胞も用いうる）、上記の実施例２の通りにＧ４１８耐性コロニーを選択した。
【０２６１】
実施例５
宿主細胞の感染用の偽型レトロウイルスの調製
濃縮した偽型のレトロウイルスを０．１×ＨＢＳ（２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．１２、１４ｍＭ ＮａＣｌ、７５μＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ）中に再懸濁し、１８μｌのアリコートを０．５ｍｌバイアル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れた上で、使用時まで−８０℃で保存した。１μｌの濃縮ウイルスを０．１×ＨＢＳで１０−７または１０−８倍に希釈することにより、濃縮ベクターの力価を判定した。続いて、希釈したウイルス溶液を用いて２０８Ｆおよびウシ乳腺上皮細胞を感染させ、ウイルス力価を実施例２に記載した通りに判定した。
【０２６２】
実施例６
宿主細胞によるＭＮ１４の発現
本実施例では、多数の組み込みベクターをトランスフェクトした細胞からの抗体ＭＮ１４の産生について述べる。以下のベクターに関して、偽型ベクターをパッケージング細胞系から作製した：ＣＭＶ ＭＮ１４、α−ＬＡ ＭＮ１４およびＭＭＴＶ ＭＮ１４。ラット線維芽細胞（２０８Ｆ細胞）、ＭＤＢＫ細胞（ウシ腎細胞）およびウシ乳腺上皮細胞に感染多重度１０００でトランスフェクションを行った。１０００個の細胞をＴ２５フラスコに播き、培地３ｍｌ中にて１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のベクターを細胞とともにインキュベートした。感染時間は２４時間とし、その後に培地を交換した。トランスフェクション後は細胞を増殖させ、集密化させた。
【０２６３】
細胞系をＴ２５フラスコ内で集密化するまで増殖させ、培地５ｍｌを毎日交換した。ＭＮ１４の存在に関して培地を毎日アッセイした。産生されたＭＮ１４はすべて活性があり（ヒトＩｇＧの検出を目的としたＥＬＩＳＡで、ＣＥＡ結合ＥＬＩＳＡと全く同じ値が得られた）、ウエスタンブロット法により、重鎖および軽鎖が１：１と思われる比で産生されることが示された。さらに非変性ウエスタンブロットにより、抗体複合体の１００％と思われる割合が正しく形成されたことが示された（図１参照：レーン１、８５ｎｇ対照Ｍｎ１４；レーン２、ウシ乳腺細胞系、α−ＬＡプロモーター；レーン３、ウシ乳腺細胞系、ＣＭＶプロモーター；レーン４、ウシ腎細胞系、α−ＬＡプロモーター；レーン５、ウシ腎細胞系、ＣＭＶプロモーター；レーン６、２０８細胞系、α−ＬＡプロモーター；レーン７、２０８細胞系、ＣＭＶプロモーター）。
【０２６４】
図２は、４種の細胞系に関してＭＮ１４産生の時間的推移を示したグラフである。Ｙ軸は培地１ｍｌ当たりのＭＮ１４産生量をｎｇ単位で示している。Ｘ軸は実験用の培地収集日を示している。グラフ上には４組のデータが示されている。比較はＣＭＶとα−ＬＡプロモーターとの間および２０８細胞とウシ乳腺細胞との間で行っている。ウシ乳腺細胞系は発現が最も高度であり、次いで２０８Ｆ細胞およびＭＤＢＫ細胞であった。構築物に関しては、ＣＭＶ駆動性の構築物が最も高い発現レベルを示し、次いでα−ＬＡ駆動性遺伝子構築物およびＭＭＴＶ構築物であった。第２週の時点で、ＣＭＶ構築物の１日産生レベルは４．５μｇ／培地ｍｌであった（Ｔ２５フラスコ内で２２．５ｍｇ／日）。発現レベルはその後、以降の週で細胞が極めて高密度に集密化するに伴って徐々に上昇し、４０μｇ／日となった。α−ｌａｃ−ＭＮ１４パッケージング細胞系から収集した２．７Ｌの培地を親和性クロマトグラフィーにより処理し、ＭＮ１４の精製ストックを得た。
【０２６５】
図３は、ＭＮ１４抗体の重鎖および軽鎖を分離するために変性条件下で泳動を行った１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットである。レーン１はウシ乳腺細胞系、ハイブリッド型α−ＬＡプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン２はウシ乳腺細胞系、ＣＭＶプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン３はウシ腎細胞系、ハイブリッド型αＬＡプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン４はウシ腎細胞系、ＣＭＶプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン５はラット線維芽細胞系、ハイブリッド型α−ＬＡプロモーターによるＭＮ１４を示している；レーン６はラット線維芽細胞、ＣＭＶプロモーターによるＭＮ１４を示している。上の図１と一致して、これらの結果は重鎖および軽鎖が約１：１の比で産生されることを示している。
【０２６６】
実施例７
細胞１個当たりの産生タンパク質の定量
本実施例では、本発明に従って作製した細胞培養物における細胞１個当たりの産生タンパク質量の定量について述べる。種々の細胞（２０８Ｆ細胞、ＭＤＢＫ細胞およびウシ乳腺細胞）を２５ｃｍ２培養皿に１０００個／培養皿の密度でプレーティングした。この３つの細胞種を感染させるために３種の異なるベクター（ＣＭＶ−ＭＮ１４、ＭＭＴＶ−ＭＮ１４およびα−ＬＡ−ＭＮ１４）をＭＯＩ １０００で用いた（力価：それぞれ２．８×１０６、４．９×１０６および４．３×１０６）。すべての培養物から培地をほぼ２４時間毎に収集した。培地収集を１カ月間行った後に、２０８Ｆ細胞およびＭＤＢＫ細胞は状態が悪くＭＮ１４発現も弱かったため廃棄した。細胞をＴ２５フラスコに継代し、ウシ乳腺細胞からの培地の収集を約２カ月行ったが、Ｍ１４の発現は継続していた。Ｔ２５フラスコ内で２カ月培養した後、ＣＭＶプロモーターを用いた細胞は２２．５ｐｇ／細胞／日、α−ＬＡプロモーターを用いた細胞は２．５ｐｇ／細胞／日のＭＮ１４を産生した。
【０２６７】
Ｔ２５フラスコ内で２カ月培養した後に、生産規模を拡大するため、および多回継代後もＭＮ１４発現が安定しているかどうかを判定するために、回転瓶（８５０ｃｍ２）への播種を行った。２本の回転瓶にＣＭＶプロモーターからＭＮ１４を発現しているウシ乳腺細胞を播種し、２つの回転瓶にα−ＬＡプロモーターからＭＮ１４を発現しているウシ乳腺細胞を播種した。培養物は約２週後に集密状態に達し、ＭＮ１４を発現し続けた。回転瓶での発現を以下の表１に示す。
【０２６８】
【表１】
2004524805.tif 000014
【０２６９】
実施例８
さまざまな感染多重度でのトランスフェクション
本実施例では、タンパク質発現に対する、さまざまな感染多重度でのトランスフェクションの影響に関して述べる。２０８Ｆラット線維芽細胞およびウシ乳腺上皮細胞（ＢＭＥＣ）を、２５ｃｍ２プレートに種々の細胞数／２５ｃｍ２でプレーティングした。ＣＦＵ数を一定に保って感染させる細胞数を変化させることにより、細胞にＣＭＶ ＭＮ１４ベクターまたはαＬＡ ＭＮ１４ベクターを１、１０、１０００および１０，０００のＭＯＩで感染させた。
【０２７０】
感染後には培地を毎日交換し、約２カ月にわたって約２４時間毎にすべての細胞から培地を収集した。ウシ乳腺上皮細胞における両方のベクターの結果を以下の表２に示している。データのない細胞は、実験が完了する前に感染した培養物であることを示す。「細胞数」の欄は、実験終了時の細胞数を表す。この結果は、ＭＯＩが高いほど、１日当たりに産生されるタンパク質の量および総蓄積量のいずれの点からもＭＮ１４産生の増加がもたらされることを示している。
【０２７１】
【表２】
2004524805.tif 000015
【０２７２】
実施例９
さまざまな感染多重度でのトランスフェクション
本実施例では、種々のＭＯＩ値でのＣＭＶ ＭＮ１４ベクターからのタンパク質産生に関して述べる。ウシ乳腺細胞、ＣＨＯ細胞およびヒト胚腎細胞（２９３細胞）を２４穴プレート（２ｃｍ２）に１００個／２ｃｍ２ウェルの密度でプレーティングした。細胞をさまざまな希釈度のＣＭＶ ＭＮ１４に感染させ、１、１０、１００、１０００および１００００のＭＯＩ値を得た。ＣＨＯ細胞はすべてのＭＯＩで感染から１１日以内に集密状態に達した。 しかし、ＭＯＩ １０，０００で感染させた細胞の増殖は比較的緩徐であった。ウシ乳腺細胞および２９３細胞の増殖はより緩徐であり、これは特に最も高い１０，０００のＭＯＩでそうであった。続いて、細胞を分散させるために細胞をＴ２５フラスコに継代した。分散の後に、細胞は１週間以内に集密状態に達した。培地を１週間後に収集し、ＭＩＮ１４産生に関して分析した。ＣＨＯ細胞およびヒト２９３細胞は長期培養下で良好な増殖を示さなかった。このため、これらの細胞からはデータを収集しなかった。ウシ乳腺上皮細胞に関するデータを以下の表３に示している。この結果は、ＭＮ１４の産生はＭＯＩが高いほど増加することを示している。
【０２７３】
【表３】
2004524805.tif 000016
【０２７４】
実施例１０
ウシ乳腺細胞によるＬＬ２抗体の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞による抗体ＬＬ２の発現に関して述べる。ウシ乳腺細胞にベクターＣＭＶ ＬＬ２（７．８５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を１０００および１０，０００のＭＯＩで感染させ、２５ｃｍ２培養皿にプレーティングした。ＭＯＩ １０，０００でトランスフェクトした細胞は全く生存しなかった。集密度２０％の時点で、２５０ｎｇ／ｍｌのＬＬ２が培地中に存在した。
【０２７５】
実施例１１
ウシ乳腺細胞によるボツリヌス毒素抗体の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞におけるボツリヌス毒素抗体の発現に関して述べる。ウシ乳腺細胞にベクターα−ＬＡ Ｂｏｔ（２．２×１０２ＣＦＵ／ｍｌ）を感染させ、２５ｃｍ２培養皿にプレーティングした。集密度１００％の時点で、６ｎｇ／ｍｌのボツリヌス毒素抗体が培地中に存在した。
【０２７６】
実施例１２
ウシ乳腺細胞によるＢ型肝炎表面抗原の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞におけるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）の発現に関して述べる。ウシ乳腺細胞にベクターＬＳＲＮＬ（３５０ＣＦＵ／ｍｌ）を感染させ、２５ｃｍ２培養皿にプレーティングした。集密度１００％の時点で、２０ｎｇ／ｍｌのＨＢＳＡｇが培地中に存在した。
【０２７７】
実施例１３
ウシ乳腺細胞によるｃｃ４９ＩＬ２抗原結合タンパク質の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞におけるｃｃ４９ＩＬ２の発現に関して述べる。ウシ乳腺細胞にベクターｃｃ４９ＩＬ２（３．１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）をＭＯＩ １０００で感染させ、２５ｃｍ２培養皿にプレーティングした。集密度１００％の時点で、１０μｇ／ｍｌのｃｃ４９ＩＬ２が培地中に存在した。
【０２７８】
実施例１４
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の発現に関して述べる。ＭＮ１４を産生する乳腺細胞（ＣＭＶ−ＭＮ１４ベクターに感染したもの）にｃｃ４９ＩＬ２ベクター（３．１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）をＭＯＩ １０００で感染させ、細胞１０００個を２５ｃｍ２培養プレートにプレーティングした。集密度１００％の時点で、細胞はＭＮ１４を２．５μｇ／ｍｌ、ｃｃ４９ＩＬ２を５μｇ／ｍｌ発現した。
【０２７９】
実施例１５
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の発現に関して述べる。ＭＮ１４を産生する乳腺細胞（ＣＭＶ−ＭＮ１４ベクターに感染したもの）にＬＳＮＲＬベクター（１００ＣＦＵ／ｍｌ）をＭＯＩ １０００で感染させ、細胞１０００個を２５ｃｍ２培養プレートにプレーティングした。集密度１００％の時点で細胞はＭＮ１４を２．５μｇ／ｍｌ、肝炎表面抗原を１５０ｎｇ／ｍｌ発現した。
【０２８０】
実施例１６
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の発現に関して述べる。Ｂ型肝炎表面抗原を産生する乳腺細胞（ＬＳＲＮＬベクターに感染したもの）にｃｃ４９ＩＬ２ベクターをＭＯＩ １０００で感染させ、細胞１０００個を２５ｃｍ２培養プレートにプレーティングした。集密度１００％の時点で、細胞はＭＮ１４を２．４μｇ／ｍｌ、Ｂ型肝炎表面抗原を１３ｎｇ／ｍｌ発現した。上記の他の細胞系においても、複数のタンパク質が発現されうることが理解されると考えられる。
【０２８１】
実施例１７
ウシ乳腺細胞におけるＢ型肝炎表面抗原およびボツリヌス毒素抗体の発現
本実施例では、回転瓶培養におけるトランスフェクト細胞の培養に関して述べる。２０８Ｆ細胞およびウシ乳腺細胞を２５ｃｍ２培養皿に１０００個／２５ｃｍ２の密度でプレーティングした。ＬＳＲＮＬまたはα−ＬＡ Ｂｏｔベクターを用いて各細胞系をＭＯＩ １０００で感染させた。培養および培地収集を１カ月間行った後に、２０８Ｆ細胞は生育および培養状態が悪かったため廃棄した。同様に、α−ＬＡ Ｂｏｔに感染させたウシ乳腺細胞もタンパク質発現が弱かったため廃棄した。ＬＳＲＮＬに感染させたウシ乳腺細胞を継代して回転瓶（８５０ｃｍ２）に播種した。約２０ｎｇ／ｍｌのＢ型肝炎表面抗原が回転瓶培養物中に産生された。
【０２８２】
実施例１８
クローン的に選択した細胞系における発現
本実施例では、クローン的に選択した細胞系からのＭＮ１４の発現に関して述べる。細胞系をＴ２５フラスコ内で集密状態に達するまで増殖させ、培地５ｍｌを毎日収集した。培地をＭＮ１４の存在に関して毎日アッセイした。産生されたＭＮ１４すべて活性があり、ウエスタンブロット法により、重鎖および軽鎖がほぼ厳密に１：１と思われる比で産生されることが示された。さらに、非変性ウエスタンブロットにより、抗体複合体のほぼ１００％が正しく形成されたことが示された。培養下に約２カ月間おいた後、細胞を回転瓶内で増殖させるか、または単細胞クローンとして９６穴プレートにプレーティングした。
【０２８３】
培地交換の追加によって週１回の培地交換の場合よりも産生が増加するか否かを明らかにするために、回転瓶における２４時間でのＭＮ１４の産生を分析した。８５０ｃｍ２回転瓶内のＣＭＶプロモーター細胞は第１日に９０９ｎｇ／ｍｌ、第２日に１１６０ｎｇ／ｍｌ、第３日の１１１２ｎｇ／ｍｌを産生した。α−ＬＡプロモーター細胞は第１日に４０１ｎｇ／ｍｌ、第２日に４７７ｎｇ／ｍｌ、第３日に４６３ｎｇ／ｍｌを産生した。これらの値は、ＣＭＶ細胞で得られた８〜１０ｍｇ／ｍｌ／週、およびα−ＬＡ細胞で得られた２〜３ｍｇ／ｍｌという値とよく対応する。培地の交換頻度を高めても回転瓶におけるＭＮ１４産生は増加しないように思われる。
【０２８４】
単細胞系を９６穴プレート内に樹立した後に、同じウェルに継代して細胞を集密状態になるまで増殖させた。細胞が集密状態に達したところで、それらを２４時間でのＭＮ１４産生に関してアッセイした。ＣＭＶ細胞系からのＭＮ１４のクローン性産生量は１９ｎｇ／ｍｌ／日〜５５００ｎｇ／ｍｌ／日の範囲であった。全細胞クローンの平均産生量は１９８４ｎｇ／ｍｌ／日であった。α−ＬＡ細胞クローンについても同様の結果が得られた。α−ＬＡ細胞系からのＭＮ１４のクローン性産生量は１ｎｇ／ｍｌ／日〜２８００ｎｇ／ｍｌ／日の範囲であった。これらの細胞クローンの平均産生量は６２２ｎｇ／ｍｌ／日であった。結果を以下の表４に示す。
【０２８５】
【表４】
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【０２８６】
実施例１９
挿入コピー数の推定
本実施例では、感染多重度、遺伝子コピー数およびタンパク質発現の関係について述べる。インベーダーアッセイシステム（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｌｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて３種類のＤＮＡアッセイを開発した。アッセイの１つでは、ウシα−ラクトアルブミン５’隣接領域の一部を検出する。このアッセイはウシに対して特異的であり、ブタまたはヒトのα−ラクトアルブミン遺伝子は検出しない。このアッセイでは、すべての対照ウシＤＮＡ試料においてα−ラクトアルブミン遺伝子の２つのコピーが検出され、同じくウシ乳腺上皮細胞でも検出されると考えられる。第２のアッセイは、ＭＬＶウイルスの伸長型パッケージング領域の一部を検出する。このアッセイはこの領域に対して特異的であり、２９３ヒト細胞系、ウシ乳腺上皮細胞系またはウシＤＮＡ試料におけるシグナルは検出しない。理論的に、ＭＬＶに感染していないすべての細胞系または他の試料はシグナルを生じないはずである。しかし、２９３ＧＰ細胞系はＤＮＡの伸長型パッケージング領域を用いて作製されているため、この細胞系はアッセイを行うとシグナルを生じる。初期の分析からは、２９３ＧＰ細胞系は本アッセイによって検出される伸長型パッケージング領域配列の２つのコピーを含むように思われる。最後のアッセイは対照アッセイである。このアッセイは、ウシ、ブタ、ヒトおよび他の数多くの種で同一である、インスリン様増殖因子Ｉ遺伝子の一部を検出する。これは、２コピー遺伝子の場合にその試料から生じるシグナルの量を決定するために、検査するすべての試料に対して対照として用いる。検査するすべての試料は、対照遺伝子の２つのコピーを含む必要がある。
【０２８７】
ＤＮＡ試料はさまざまな方法を用いて単離しうる。続いて、２つのアッセイを各試料に対して行う。対照アッセイはウシα−ラクトアルブミンアッセイまたは伸長型パッケージング領域アッセイのいずれかとともに行う。必要な試料および情報の種類により、どの行うべきかが決まると考えられる。対照アッセイおよび導入遺伝子検出アッセイはいずれも、厳密に同じ量のＤＮＡを用いて、同一のＤＮＡ試料に対して行う。
【０２８８】
本アッセイによって得られるデータは以下の通りである（計数値は任意の蛍光単位を表す）：
伸長型パッケージング領域またはα−ラクトアルブミンのバックグラウンド計数値
伸長型パッケージング領域またはα−ラクトアルブミンによる計数値
内部対照のバックグラウンド計数値
内部対照による計数値
【０２８９】
アッセイによる正味の計数値を決定するために、バックグラウンド計数値を実際の計数値から差し引く。これは対照アッセイおよび導入遺伝子検出アッセイの両方に対して行う。正味の計数値が得られれば、導入遺伝子検出アッセイによる正味の計数値と対照アッセイの正味の計数値との比を得ることができる。この値は、導入遺伝子のコピー数を内部対照遺伝子（この場合にはＩＧＦ−Ｉ）のコピー数と比較した指標である。導入遺伝子検出アッセイおよび対照アッセイは２つの全く異なるアッセイであるため、それらは厳密に同じく振る舞うわけではない。このことは、特定の試料中に導入遺伝子の２つのコピーおよび対照遺伝子の２つのコピーが存在しても、厳密に１：１の比は得られないことを意味する。しかし、値は概ね１：１の比に近い。また、導入遺伝子の挿入部位が異なることも、導入遺伝子アッセイが挿入位置によって異なる振る舞いを示す原因になりうる。
【０２９０】
したがって、この比はコピー数の厳密な尺度ではないものの、試料間の相対的なコピー数の良い指標となる。この比の値が大きいほど導入遺伝子のコピー数も多い。このため、試料を最も低いものから最も高いものまでランク付けすると、コピー数に関する試料の極めて正確な比較が得られると考えられる。表５にはＥＰＲアッセイの実際の結果を示している：
【０２９１】
【表５】
2004524805.tif 000021
【０２９２】
このデータから、２９３細胞系は伸長型パッケージング領域／導入遺伝子のコピーを全く持っていないと判断することができる。しかし、２９３ＧＰ細胞は伸長型パッケージング領域の２つのコピーを有するように思われる。残る３つの細胞系は伸長型パッケージング領域の３つまたはそれ以上のコピーを有する（２９３ＧＰ細胞と比べて１つまたはそれ以上のコピーが余分にある）ように思われる。
【０２９３】
インベーダーアッセイによる遺伝子比および細胞系のタンパク質産生
ウシ乳腺上皮細胞に対して、ＣＭＶ駆動性のＭＮ１４構築物またはα−ラクトアルブミン駆動性のＭＮ１４構築物を感染させた。細胞の感染はベクター１０００に対して細胞１の比で行った。感染した細胞を増殖させた。この最初にプールした細胞集団から、α−ＬＡおよびＣＭＶ含有細胞の両方に関してクローン細胞系を樹立した。約５０種の細胞系を各遺伝子構築物に関して作製した。個々の細胞を９６穴プレートにプレーティングした後、同じウェルに継代して細胞を集密状態になるまで増殖させた。細胞系が集密状態に達したところで、それらを２４時間でのＭＮ１４産生に関してアッセイした。ＣＭＶ細胞系からのＭＮ１４のクローン性産生量は０ｎｇ／ｍｌ／日〜５５００ｎｇ／ｍｌ／日の範囲であった。全細胞クローンの平均産生量は１９８４ｎｇ／ｍｌ／日であった。α−ＬＡ細胞クローンについても同様の結果が得られた。α−ＬＡ細胞系からのＭＮ１４のクローン性産生量は０ｎｇ／ｍｌ／日〜２８００ｎｇ／ｍｌ／日の範囲であった。これらの細胞クローンの平均産生量は６２２ｎｇ／ｍｌ／日であった。
【０２９４】
これらのクローン系をさらに分析するために、１５種のＣＭＶクローンおよび１５種のα−ＬＡクローンを選択した。うち５種は最も発現が高度な系から、５種は最も発現が低い系から、５種は発現が中程度である系から選択した。これらの３０種の細胞系を増殖させて貯蔵した。この３０種の細胞系のほとんどすべてからＤＮＡを単離した。細胞系を６穴プレートで継代し、集密化するまで増殖させた。集密状態に達した時点で、培地を２４時間毎に交換し、各細胞系からの２つの別々の収集物をＭＮ１４産生に関してアッセイした。これらの２つのアッセイの結果を平均し、これらの数値を用いて以下の表６および７を作成した。細胞系から得たＤＮＡはインベーダー伸長型パッケージング領域アッセイを用いてアッセイしており、その結果を以下に示した。これらの表には、細胞系の番号、対応する遺伝子比および抗体産生量を示している。
【０２９５】
【表６】
2004524805.tif 000022
【０２９６】
【表７】
2004524805.tif 000023
【０２９７】
本グラフ（図１７および１８）は、タンパク質発現とインベーダーアッセイによる遺伝子比との比較を示している。この結果は、インベーダーアッセイによる遺伝子比とタンパク質産生との間に直接の相関があることを示している。また、タンパク質産生は最大に達しておらず、インベーダーアッセイによる遺伝子比がさらに高い細胞を作製すれば、より多くのタンパク質産生が起こるものと思われた。
【０２９８】
インベーダーアッセイによる遺伝子比および複数の細胞系の感染
複製能欠損レトロウイルスベクターの作製に用いた前記の方法を用いて、２つのパッケージング細胞系（２９３ＧＰ）を作製した。細胞系のうち一方は、ＣＭＶプロモーターからボツリヌス毒素抗体遺伝子を発現するレトロウイルス遺伝子構築物（ＬＴＲ−伸長型ウイルスパッケージング領域−Ｎｅｏ遺伝子−ＣＭＶプロモーター−Ｂｏｔ軽鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−Ｂｏｔ重鎖遺伝子−ＬＴＲ）を含み、もう一方の細胞系は、ＣＭＶプロモーターからＹＰ抗体遺伝子を発現するレトロウイルス遺伝子構築物（ＬＴＲ−伸長型ウイルスパッケージング領域−Ｎｅｏ遺伝子−ＣＭＶプロモーター−ＹＰ重鎖遺伝子−ＩＲＥＳ−ＹＰ軽鎖遺伝子−ＷＰＲＥ−ＬＴＲ）を含む。これらの細胞系はそれぞれ、複製能欠損レトロウイルスベクターを産生する能力を持つことに加えて、ボツリヌス毒素抗体またはＹＰ抗体も産生する。
【０２９９】
続いて、これらの細胞系から産生されたベクターを用いて、親細胞系の再感染を行った。この手順は、遺伝子挿入数を増やすため、およびこれらの細胞系からの抗体産生を向上させるために行った。ボツリヌス毒素親細胞系には３日間連続してベクターの新たなアリコートを感染させた。感染を行うために用いたベクターの力価は１×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。最後の２４時間の感染が完了した時点で細胞のクローン選択を行い、ボツリヌス毒素抗体産生に関して最も多くタンパク質を産生する細胞系を樹立した。ＹＰ親細胞系に対しても同様の手順を行った。この細胞系にも３日間連続してベクターの新たなアリコートを感染させた。ＹＰベクターのアリコートの力価は１×１０４であった。最後の２４時間の感染が完了した時点で細胞のクローン選択を行い、ＹＰ産生に関して最も多くタンパク質を産生する細胞系を樹立した。
【０３００】
親細胞系および娘細胞である産生細胞系のそれぞれを、伸長型パッケージング領域アッセイを用いてインベーダー遺伝子比に関してアッセイするとともに、タンパク質産生に関してもアッセイした。最も力価が高いベクターを用いて作製したＢｏｔ産生細胞系は、遺伝子比が最も高かった。これはタンパク質産生量も最も多く、遺伝子コピー数がタンパク質産生と比例することが改めて示唆された。ＹＰ産生細胞系も親細胞系より遺伝子比が高く、より多くのタンパク質を産生し、このことからも遺伝子コピーの増加がタンパク質産生の増加と直接相関することが示唆された。データを表８に示す。
【０３０１】
【表８】
2004524805.tif 000024
【０３０２】
実施例２０
レンチウイルスベクターによるトランスフェクション
本実施例では、レンチウイルスベクターの作製、および高い感染多重度で宿主細胞を感染させるためのその使用に関して述べる。２９３Ｔヒト腎細胞における、米国特許第６，０１３，５１６号に記載されたプラスミドの一時的な共トランスフェクションにより、複製能欠損ウイルス粒子を作製する。標準的な分子生物学の手順に従って、すべてのプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換導入して増殖させる。真核生物細胞のトランスフェクションのためには、ＣｓＣｌ−臭化エチジウム勾配を用いた平衡遠心法によってプラスミドＤＮＡを２倍に精製する。合計４０μｇのＤＮＡを以下の比率で１０ｃｍ培養皿内の培養物のトランスフェクションに用いる：１０μｇ ｐＣＭＶΔＲ８、２０μｇ ｐＨＲ’、および１０μｇ ｅｎｖプラスミド（ＭＬＶ／Ａｍｐｈｏ、ＭＬＶ／ＥｃｏまたはＶＳＶ−Ｇのいずれか）。１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を加えたＤＭＥＭ中にある２９３Ｔ細胞を１０％ＣＯ２インキュベーター内で増殖させる。細胞をトランスフェクションの前日に１．３×１０６個／１０ｃｍ培養皿の密度でプレーティングする。トランスフェクションの前には培地を４〜６時間毎に交換する。チェン（Ｃｈｅｎ）およびオカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）の方法（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、７：２７４５、１９８７）に従ってリン酸カルシウム−ＤＮＡ複合体を調製し、５％ＣＯ２雰囲気下で細胞を一晩インキュベートする。翌朝に培地を交換し、培養物を再び１０％ＣＯ２下におく。トランスフェクションから４８〜６０時間後に馴化培地を回収し、低速遠心（３００×ｇ、１０分間）によって細胞片を除去した上で、孔径０．４５μｍのタンパク質低結合性フィルターを通過させる。
【０３０３】
ベクター粒子を濃縮するためには、上記の通りに回収したプール馴化培地を２０％スクロース溶液（ＰＢＳ中）の上に重層し、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ２８ローターにより５０，０００×ｇで９０分間遠心する。３０〜６０分間のインキュベーションおよび丁寧なピペッティングによってペレットを１〜４ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、再びベックマンＳＷ５５ローターにより５０，０００×ｇで９０分間遠心する。ペレットを最小容積（２０〜５０μｌ）のＰＢＳ中に再懸濁し、そのまま感染用に用いるか、または凍結アリコートとして−８０℃で保存する。
【０３０４】
濃縮したレンチウイルスベクターの力価を判定し、感染多重度１，０００で適切な細胞系のトランスフェクションに用いる（例えば、２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ラット２０８Ｆ線維芽細胞）。外因性タンパク質を発現するクローン的に選択した細胞系の分析により、選択した細胞系がベクターの２つを上回る組み込まれたコピーを含むことが判明すると考えられる。これらの細胞系は、組み込まれたベクターの１つのコピーのみを含む細胞系よりも多くの外因性タンパク質を発現すると考えられる。
【０３０５】
実施例２１
Ｇタンパク質共役受容体の発現およびアッセイ
本実施例では、レトロウイルスベクターからのＧタンパク質共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）の発現について述べる。本実施例では、ＧＰＣＲなどのようにアッセイが難しいタンパク質またはアッセイが存在しないタンパク質の発現のマーカーとしての、ＩＲＥＳからのシグナルタンパク質の発現についても述べる。遺伝子構築物（配列番号：３４；図１９）は、Ｇタンパク質共役受容体にＩＲＥＳ−シグナルペプチド−抗体軽鎖が続く形で、ｐＬＢＣＸレトロウイルス骨格のＭＣＳ中にクローニングされたものを含む。簡潔に述べると、ＧＰＣＲ−ＩＲＥＳ−抗体軽鎖を含むＰｖｕＩＩ／ＰｖｕＩＩ断片（３０５７ｂｐ）をｐＬＢＣＸのＳｔｕＩ部位にクローニングした。ｐＬＢＣＸは、ＥＭ７（Ｔ７）プロモーター、ブラスチシジン遺伝子およびＳＶ４０ポリＡを、ｐＬＮＣＸからのネオマイシン耐性遺伝子に代わって含む。
【０３０６】
この遺伝子構築物を用いて複製能欠損レトロウイルスパッケージング細胞系を作製し、この細胞系を用いて複製能欠損レトロウイルスベクターを作製した。続いて、この細胞系から産生されたベクターを用いて２９３ＧＰ細胞（ヒト胚腎細胞）を感染させた。感染後に細胞をブラスチシジン選択条件下に置き、単細胞性ブラスチシジン耐性クローンを単離した。これらのクローンを抗体軽鎖の発現に関してスクリーニングした。上位１２種の軽鎖発現性クローンを選択した。続いて、これらの１２種の軽鎖発現性クローンを、リガンド結合アッセイを用いてＧＰＣＲの発現に関してスクリーニングした。１２種の試料はすべて受容体タンパク質も発現した。クローン細胞系およびそれらの発現を表９に示す。
【０３０７】
【表９】
2004524805.tif 000025
【０３０８】
実施例２２
複製能欠損レトロウイルスベクターによる２９３細胞の多重感染
本実施例では、レトロウイルスベクターによる細胞の複数回の連続的トランスフェクションについて述べる。複製能欠損レトロウイルスパッケージング細胞系の作製には以下の遺伝子構築物を用いた。
【０３０９】
５’ ＬＴＲ＝モロニーマウス肉腫ウイルス５’末端反復配列
ＥＰＲ＝モロニーマウス白血病ウイルス伸長型パッケージング領域
Ｂｌａｓｔ＝ブラスチシジン耐性遺伝子
ＣＭＶ＝ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター
Ｇｅｎｅ＝被験タンパク質をコードする遺伝子
ＷＰＲＥ＝ＲＮＡ移行因子
３’ ＬＴＲ＝モロニーマウス白血病ウイルス３’ ＬＴＲ
【０３１０】
続いて、このパッケージング細胞系を用いて、以下の通りに複製能欠損レトロウイルスベクターを作製した。Ｔ１５０フラスコ内で増殖させた細胞からベクターを産生させて凍結した。凍結ベクターを各感染時に解凍した。感染＃３に関しては、ベクターの濃縮溶液を感染に用いた。他のすべての感染は濃縮していないベクターを用いて行った。感染は、集密度３０％の２９３細胞を含むＴ２５フラスコに５ｍｌのベクター／培地溶液を加えることにより、約５カ月間にわたって行った。感染期間中には８ｍｇ／ｍｌのポリブレンもベクター溶液に含めた。このベクター溶液を細胞の上に加えて２４時間おいた後に除去した。続いて、培地（１０％ウシ胎仔血清を加えたＤＭＥＭ）を細胞に添加した。細胞を完全に集密化するまで増殖させ、新たなＴ２５フラスコに継代した。続いて細胞を集密度３０％まで増殖させ、感染手順を再び行った。この工程を１２回繰り返したが、その概要を以下の表１０に示す。感染１、３、６、９および１２の後の、継代後に残った細胞をＤＮＡ試料の採取に用いた。感染手順をさまざまな回数行った後に、細胞内のベクター挿入物の数に関する推定値を得るために、ＤＮＡをインベーダーアッセイを用いて分析した。その結果、ベクター挿入物の数は時間の経過とともに増加し、１２回目の感染後が最も高レベルであったことが示された。０．５の値は、細胞１個当たりのベクター挿入物が１つの場合の平均値とほぼ同じであるため、１２回の感染後にも平均ベクター挿入コピー数はまだ２に達していない。これらのデータは、細胞１個当たりの平均ベクターコピー数が１．５コピー／細胞未満であることを示している。また、感染＃６から感染＃９までは遺伝子コピー数に全く実際の変化はみられなかった。さらに、これらのデータは、標準的な低い感染多重度で行うトランスフェクションでは、レトロウイルスベクターの複数のコピーを細胞に導入できないことも示している。
【０３１１】
【表１０】
2004524805.tif 000026
【０３１２】
実施例２３
ＹＰ抗体の産生
本実施例には、ウシ乳腺上皮細胞およびヒト腎臓線維芽細胞（２９３細胞）によるペスト菌抗体の産生を示す。細胞系にα−ＬＡ ＹＰベクターを感染させた。いずれの細胞系もＹＰ抗体を産生した。抗体のすべてに活性があり、重鎖および軽鎖はほぼ１：１の比で産生される。
【０３１３】
実施例２４
植物プロトプラストの形質導入
本実施例には、植物プロトプラストの形質導入のための方法を述べる。標準的な工程に従って、タバコ懸濁培養物からプチ・ハバナのタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎｎａ）のタバコプロトプラストを作製する（ＰｏｔｒｙｋｕｓおよびＳｈｉｌｌｉｔｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ． １１８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ．およびＨ． Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、１９８６）。６週齢の苗条培養物から完全に開いた葉を無菌条件下で採取し、以下の組成からなる酵素溶液で十分に湿潤させる：酵素溶液：Ｈ２Ｏ、７０ｍｌ；スクロース、１３ｇ；マセロザイムＲ １０、１ｇ；セルラーゼ、２ｇ；「オノズカ（Ｏｎｏｚｕｋａ）」Ｒ １０（ヤクルト（Ｙａｋｕｌｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）、日本）ドリセラーゼ（Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｆａｂｒｉｋ Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｈａｌｌｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、０．１３ｇ；および２（ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．５ｍｌ、ｐＨ ６．０。
【０３１４】
続いて、葉を１〜２ｃｍ角の正方形に切り、これを上記の酵素溶液の上に浮かべる。それらを２６℃で一晩暗所にてインキュベートする。続いてこの混合物をゆっくりと振盪しながら、消化が完了するまでさらに３０分間インキュベートする。
【０３１５】
この懸濁液をメッシュ幅１００μｍのスチール製篩いに通し、０．６Ｍスクロース（ＭＥＳ、ｐＨ ５．６）で十分にすすぎ洗いした後に、４０００〜５０００ｒｐｍで１０分間遠心する。培地の表面に集まったプロトプラストを、例えば滅菌注射用シリンジを用いて、プロトプラストの下のものから分けて採取する。
【０３１６】
このプロトプラストを、０．４Ｍスクロースを含むＫ３培地［スクロース（１０２．９６ｇ／ｌ；キシロース（０．２５ｇ／ｌ）；２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（０．１０ｍｇ／ｌ）；１−ナフチル酢酸（１．００ｍｇ／ｌ）；６−ベンジルアミノプリン（０．２０ｍｇ／ｌ）；ｐＨ ５．８］（ＰｏｔｒｙｋｕｓおよびＳｈｉｌｌｉｔｏ、前記）中に再懸濁する。
【０３１７】
形質転換実験を行うためには、プロトプラストをまずすべて洗浄し、計数した上で、単離したプロトプラストの高い生存率が確実に得られるＷ５培地［１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２ ｘ ２Ｈ２Ｏ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、ｐＨ ５．６）中に、１〜２．５×１０６個／ｍｌの細胞密度で再懸濁する。６〜８℃で３０分間インキュベートした後に、プロトプラストを形質導入実験に用いる。
【０３１８】
プロトプラストを、植物特異的プロモーターによって駆動される関心対象のタンパク質をコードする偽型のレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）に対して曝露させる。ベクターは上記の通りに調製し、ＭＯＩ １，０００で用いる。続いて、プロトプラストを新たなＫ３培地中に再懸濁する（１０ｍｌの新たなＫ３培地中に０．３ｍｌのプロトプラスト溶液）。さらに、１０ｍｌの部分を直径１０ｃｍのペトリ皿に入れて２４℃で暗所下にてインキュベーションを行い、プロトプラストの集団密度を４〜８×１０４個／ｍｌとする。３日後に、培地を培養皿当たり０．３倍容量のＫ３培地で希釈し、インキュベーションを２４℃でさらに４日間、３０００ルクスの人工光の照射下で続ける。合計７日後に、プロトプラストから発生したクローンを、１％アガロースで固形化した５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む栄養培地中に包埋し、「ビーズ型」培養法に従って２４℃で暗所下にて培養する（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２、２４４〜２４７（１９８３））。栄養培地は５日毎に新たな同じ栄養液と交換する。クローンの分析により、関心対象の遺伝子を発現するものが示される。
【０３１９】
実施例２５
細胞系におけるベクター挿入物の経時的な安定性
ＬＮ−ＣＭＶ−Ｂｏｔベクターの遺伝子挿入物を含む２つの細胞系を、複数の継代を経た後にもベクター挿入物を維持する能力に関して、ネオマイシン選択を行った場合と行わなかった場合に分けて分析した。第１の細胞系は、少数の挿入コピーを含むウシ乳腺上皮細胞系である。第２の細胞系は、ベクター挿入物の複数のコピーを含む２９３ＧＰ系である。実験開始時に細胞培養物を分割した。これはウシ乳腺上皮細胞の場合は１０回目の継代の時点であり、２９３ＧＰ細胞の場合は８回目の継代の時点であった。１件の試料はネオマイシン類似体Ｇ４１８を含む培地中で連続的に継代したが、他の培養物は抗生物質を含まない培地中で継代した。３〜６回の継代のたびに細胞を収集し、インベーダーアッセイを用いて遺伝子比を決定するためにＤＮＡを単離した。細胞はＴ２５フラスコ内で連続的に増殖させて継代した。アッセイの結果を以下に示す：
【０３２０】
【表１１】
2004524805.tif 000027
【０３２１】
【表１２】
2004524805.tif 000028
【０３２２】
これらのデータは、Ｇ４１８で処理した細胞と抗生物質で処理しなかった細胞との間に、遺伝子比に関して一貫した差は認められないことを示している。このことは、ベクター遺伝子挿入物の安定性を維持するためにＧ４１８選択は必要でないことを示唆している。また、これらのベクター挿入物は時間経過に対して極めて安定であるように思われる。
【０３２３】
上記の明細書中に引用したすべての刊行物および特許は参照として本明細書に組み入れられる。当業者には、発明の範囲および精神を逸脱することなく、本発明に記載の方法およびシステムに対するさまざまな修正および変更が明らかであると考えられる。本発明をその特定の態様とともに説明してきたが、請求する本発明がこのような特定の態様に過度に制限されるべきではないことが理解される必要がある。実際には、本発明の実施に関して説明した態様のさまざまな修正が、分子生物学、タンパク質発酵、生化学または関連分野の当業者には明らかであり、それらも発明の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】変性条件下で泳動させ、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）および抗ヒトＩｇＧ（κ）によりプローブ検索を行った１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットである。
【図２】経時的なＭＮ１４発現に関するグラフである。
【図３】非変性条件下で泳動させ、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｅ）および抗ヒトＩｇＧ（κ）によりプローブ検索を行った１５％ＰＡＧＥのウエスタンブロットである。
【図４】ハイブリッド型ヒト−ウシα−ラクトアルブミンプロモーターの配列を提示したものである（配列番号：１）。
【図５】変異型ＰＰＥ配列の配列を提示したものである（配列番号：２）。
【図６】ＩＲＥＳ−シグナルペプチド配列の配列を提供する（配列番号：３）。
【図７Ａおよび７Ｂ】ＣＭＶ ＭＮ１４ベクターの配列を提供する（配列番号：４）。
【図８Ａおよび８Ｂ】ＣＭＶ ＬＬ２ベクターの配列を提供する（配列番号：５）。
【図９Ａ−Ｃ】ＭＭＴＶ ＭＮ１４ベクターの配列を提供する（配列番号：６）。
【図１０Ａ−Ｄ】α−ラクトアルブミンＭＮ１４ベクターの配列を提供する（配列番号：７）。
【図１１Ａ−Ｃ】α−ラクトアルブミンＢｏｔベクターの配列を提供する（配列番号：８）。
【図１２Ａ−Ｂ】ＬＳＲＮＬベクターの配列を提供する（配列番号：９）。
【図１３Ａ−Ｂ】α−ラクトアルブミンｃｃ４９ＩＬ２ベクターの配列を提供する（配列番号：１０）。
【図１４Ａ−Ｃ】α−ラクトアルブミンＹＰベクターの配列を提供する（配列番号：１１）。
【図１５】ＩＲＥＳ−カゼインシグナルペプチド配列の配列を提供する（配列番号：１２）。
【図１６Ａ−Ｃ】ＬＮＢＯＴＤＣベクターの配列を提供する（配列番号：１３）。
【図１７】ＣＭＶプロモーター細胞系における、インベーダーアッセイによる遺伝子比を示すグラフを提供する。
【図１８】α−ラクトアルブミンプロモーター細胞系における、インベーダーアッセイによる遺伝子比を示すグラフを提供する。
【図１９Ａ−Ｄ】Ｇタンパク質共役受容体および抗体軽鎖を発現するレトロウイルスベクターの配列を提供する。
【図１】
2004524805.tif 000029
【図２】
2004524805.tif 000030
【図３】
2004524805.tif 000031
【図４】
2004524805.tif 000032
【図５】
2004524805.tif 000033
【図６】
2004524805.tif 000034
【図７Ａ】
2004524805.tif 000035
【図７Ｂ】
2004524805.tif 000036
【図８Ａ】
2004524805.tif 000037
【図８Ｂ】
2004524805.tif 000038
【図９Ａ】
2004524805.tif 000039
【図９Ｂ】
2004524805.tif 000040
【図９Ｃ】
2004524805.tif 000041
【図１０Ａ】
2004524805.tif 000042
【図１０Ｂ】
2004524805.tif 000043
【図１０Ｃ】
2004524805.tif 000044
【図１０Ｄ】
2004524805.tif 000045
【図１１Ａ】
2004524805.tif 000046
【図１１Ｂ】
2004524805.tif 000047
【図１１Ｃ】
2004524805.tif 000048
【図１２Ａ】
2004524805.tif 000049
【図１２Ｂ】
2004524805.tif 000050
【図１３Ａ】
2004524805.tif 000051
【図１３Ｂ】
2004524805.tif 000052
【図１４Ａ】
2004524805.tif 000053
【図１４Ｂ】
2004524805.tif 000054
【図１４Ｃ】
2004524805.tif 000055
【図１５】
2004524805.tif 000056
【図１６Ａ】
2004524805.tif 000057
【図１６Ｂ】
2004524805.tif 000058
【図１６Ｃ】
2004524805.tif 000059
【図１７】
2004524805.tif 000060
【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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