(57)【要約】本発明は、一般に、核酸配列分析の分野に関する。特定の実施形態では、この分析は、遺伝子型決定である。特定の実施形態では、分析は、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出することを含む。本発明はまた、核酸分析のための方法、キットおよびコンピュータソフトウェアに関する。特定の実施形態では、核酸分析の方法が提供される。特定のこのような実施形態は、核酸標的配列の複数のフラグメントを、この標的配列を少なくとも１つの制限酵素で消化することによって作製する工程、および第１のプライマーセットを用いてこの複数のフラグメントを増幅して、複数の増幅フラグメントを作製する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列内の少なくとも１つの標的ヌクレオチドを同定するための方法であって、以下：
少なくとも１つの制限酵素で該標的配列を消化することによって該標的配列の複数のフラグメントを作製する工程；
該複数のフラグメントを、第１のプライマーセットを用いて増幅して、複数の増幅フラグメントを作製する工程であって、ここで、該第１のプライマーセットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む、工程；
第１の伸長されたプライマーセットを用いて、該複数の増幅フラグメントの少なくとも１つのサブセットを増幅して、該複数の増幅フラグメントの少なくとも１つの増幅されたサブセットを作製する工程であって、ここで、該第１の伸長されたプライマーセットは、該第１のプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第１の伸長されたプライマー、ならびに該第２のプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第２の伸長されたプライマーを含む、工程；ならびに
該複数の増幅フラグメントの少なくとも１つの該増幅されたサブセット内の該少なくとも１つの標的ヌクレオチドを同定することによって、標的配列内の該少なくとも１つの標的ヌクレオチドを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
第２の伸長されたプライマーセットを用いて、前記複数の増幅フラグメントの前記少なくとも１つのサブセットを増幅して、増幅フラグメントの少なくとも１つの第２のサブセットを作製する工程をさらに包含し、ここで、該第２の伸長されたプライマーセットは、前記第１の伸長されたプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第三の伸長されたプライマー、ならびに前記第２の伸長されたプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第四の伸長されたプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
伸長されたプライマーの第三のセットを用いて、前記複数の増幅フラグメントの前記少なくとも１つの第２のサブセットを増幅して、増幅フラグメントの少なくとも１つの第三のサブセットを作製する工程をさらに包含し、ここで、該伸長されたプライマーの第三のセットが、該第三の伸長されたプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第五の伸長されたプライマー、ならびに該第四の伸長されたプライマーおよび３’末端の配列のさらに１ヌクレオチドを含む第六の伸長されたプライマーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的配列の前記複数のフラグメントを作製する工程の後で、かつ、該複数のフラグメントを増幅する工程の前に、該標的配列の該複数のフラグメントの各末端にアダプターを連結する工程をさらに包含し、そしてここで、前記第１のプライマーが、該アダプターまたは該標的配列の該複数のフラグメントの一方の末端に相補的な配列を含み、そして前記第２のプライマーが、該標的配列の該複数のフラグメントの他方の末端の該アダプターに相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的配列内の前記少なくとも１つの標的ヌクレオチドを同定する前に、前記複数の増幅フラグメントの前記少なくとも１つの増幅されたサブセットを非対称的に増幅して、一本化テンプレートを作製する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非対称的に増幅する工程が、前記第１のプライマーセットの前記プライマーの１つの配列を含むプライマー、および同定されるべきヌクレオチドに直接隣接する領域に対応する配列を含む少なくとも１つのプライマーを用いて増幅して、既知の長さの長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製することを包含し；ここで、同定されるべきヌクレオチドに直接隣接する領域に対応する配列を含む該少なくとも１つのプライマーと比較して過剰な、該第１のプライマーセットの該プライマーの１つの配列を含むプライマーが存在し、ここで、該長いプライマーの３’末端が、該同定されるべきヌクレオチドに直接隣接する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記長いオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記配列ターミネーターの特異的ヌクレオチドに特異的なインジケーターを有する配列ターミネーターを用いて１塩基伸長反応を実施して、一塩基伸長産物を作製する工程；ならびに同定されるべきヌクレオチドを同定する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記一塩基伸長産物を、前記長いオリゴヌクレオチドプライマーの長さに従って分離する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
移動度モディファイヤーを、前記一塩基伸長産物に結合させる工程および該一塩基伸長産物をその移動度によって分離する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記１塩基伸長反応が、等温で実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
増幅フラグメント長多型の増幅のためのキットであって、以下：
増幅フラグメント長多型を作製するために使用される、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む第１のプライマーセット；ならびに
第１の伸長されたプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第三の伸長されたプライマー、ならびに第２の伸長されたプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第四の伸長されたプライマーを含む、第１の伸長されたプライマーセット
を備える、キット。
【請求項１２】
ＳＮＰ部位でヌクレオチドを同定するための方法であって、以下：
ゲノムＤＮＡを、２つの制限酵素で消化して、複数のフラグメントを作製する工程；
アダプターを、標的配列の複数のフラグメントの各末端に連結する工程；
第１のプライマーセットを用いて該複数のフラグメントを増幅して、複数の増幅フラグメント作製する工程であって、ここで、該第１のプライマーセットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーは、該アダプターに相補的な配列を、該標的配列の該複数のフラグメントの一方の末端に含み、そして該第２のプライマーは、該アダプターに相補的な配列を、該標的配列の該複数のフラグメントの他方の末端に含む、工程；
第１の伸長されたプライマーセットを添加する工程であって、ここで、該第１の伸長されたプライマーセットは、該第１のプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第１の伸長されたプライマー、ならびに該第２のプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第２の伸長されたプライマーを含む、工程；
該第１の伸長されたプライマーセットを用いて該複数の増幅フラグメントのサブセットを増幅して、該複数の増幅フラグメントの第１の増幅されたサブセットを作製する工程；
伸長されたプライマーの第２のセットを添加する工程であって、ここで、該伸長されたプライマーの第２のセットは、該第１の伸長されたプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第三の伸長されたプライマー、ならびに該第２の伸長されたプライマーおよび３’末端のさらに１ヌクレオチドの配列を含む第四の伸長されたプライマーを含む、工程；
伸長されたプライマーの該第２のセットを用いて該複数の増幅フラグメントの第２のサブセットを増幅して、該複数の増幅フラグメントの第２の増幅されたサブセットを作製する工程；
該複数の増幅フラグメントの該第２の増幅されたサブセットの非対称増幅を実施して、複数の一本鎖フラグメントを作製する工程；
該複数の一本鎖フラグメント、１塩基伸長プライマー、および該配列ターミネーターの特定のヌクレオチドに特異的なインジケーターを有する配列ターミネーターの少なくとも１つを用いて１塩基伸長反応を実施して、一塩基伸長産物を得る工程であって、ここで、該１塩基伸長プライマーは、（ｉ）その３’末端で、該ＳＮＰ部位に直接隣接するヌクレオチドに相補的な配列、および（ｉｉ）独特配列アイデンティファイヤーを含む、工程；ならびに
該特異的インジケーターから該ＳＮＰ部位でのヌクレオチドを同定する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、核酸配列分析の分野に関する。特定の実施形態では、分析は、遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）である。特定の実施形態では、分析は、分析は、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出することを含む。本発明はまた、核酸分析のための方法、キットおよびコンピュータソフトウェアに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
核酸分析についての種々の方法が存在する。１つの方法は、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）の使用を含む。別の方法は、増幅フラグメント長多型（ＡＦＬＰ）を用いる。
【０００３】
個体間の対立遺伝子の相違の分析は、核酸分析の１領域である。特定の適用では、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出する。約２．９×１０６のＳＮＰが、ヒトゲノムにおいてマッピングされており、そして配列決定されている。これは、約３×１０９塩基対を包含する。効率的かつ迅速な規模での個体ゲノムの有効な分析は、非常に有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願は、米国仮出願第６０／２８４，４０９号（２００１年４月１６日出願）の優先権を主張する。米国仮出願第６０／２８４，４０９号は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００５】
（発明の要旨）
特定の実施形態では、核酸分析の方法が提供される。特定のこのような実施形態は、核酸標的配列の複数のフラグメントを、この標的配列を少なくとも１つの制限酵素で消化することによって作製する工程、および第１のプライマーセットを用いてこの複数のフラグメントを増幅して、複数の増幅フラグメントを作製する工程を包含する。
【０００６】
特定の実施形態によれば、この方法は、複数の増幅フラグメントの増幅されたサブセットの少なくとも１つについてのヌクレオチドを検出する工程をさらに包含する。特定の実施形態によれば、この増幅する工程は、第２のプライマーセットを用いて、複数の増幅フラグメントのサブセットを増幅して、複数の増幅フラグメントの増幅されたサブセットを作製することを含み、この第２のプライマーセットは、第１のプライマーセットの３’末端に少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを含む。
【０００７】
特定の実施形態では、この増幅する工程は、１以上の引き続くプライマーセットを使用して、増幅フラグメントの１以上のサブセットを連続して作製することを含み、このプライマーセットは、第１のプライマーセットの３’末端に少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを含む。
【０００８】
特定の実施形態では、複数の増幅フラグメントの増幅されたサブセットは、複数の増幅フラグメントの増幅されたサブセットの少なくとも１つについてのヌクレオチドを検出する前に非対称に増幅されて、一本化ＤＮＡが作製される。
【０００９】
特定の実施形態によれば、１塩基伸長反応を実施する方法は、等温で提供される。
【００１０】
特定の実施形態によれば、一本鎖テンプレートは、１塩基伸長反応における使用のために調製される。特定の実施形態では、一本鎖テンプレートは、非対称ＰＣＲ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ）によって調製される。
【００１１】
特定の実施形態によれば、さらなる増幅は、第１のプライマー対由来の１つのプライマー、および検出されるべきヌクレオチドに直接隣接する領域に対応する配列を含む少なくとも１つのプライマーを用いて実施される。特定の実施形態によれば、第１のプライマー対に由来する過剰なプライマーを添加して、既知の長さの長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ここで、長いプライマーの３’末端は、検出されるべきヌクレオチドに近位である。これらの実施形態のうちの特定のものにおいて、標識した配列ターミネーターを反応容器に添加し、そして１塩基伸長（すなわち、微小配列決定）反応を実施する。特定の実施形態では、微小配列決定反応の産物は、長いオリゴヌクレオチドの長さに従って分離される。特定の実施形態では、微小配列決定反応は、等温で実施される。
【００１２】
本発明の特定の実施形態によれば、キットが提供される。特定の実施形態では、このようなキットは、ＡＦＬＰの増幅のための第１のプライマー対を含む。第１のプライマー対は、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む。このようなキットは、第２のプライマーセットをさらに含み、ここで、第２のセットのプライマーは、ＡＦＬＰを作製するために用いられるプライマーと同一の配列を含み、そしてさらに、第１のプライマーセットのプライマーの３’末端に付加された１ヌクレオチドを含む。
【００１３】
特定の実施形態によれば、ソフトウェアが提供される。特定の実施形態では、このソフトウェアは、電子データベースから既知のＳＮＰを同定し、既知のＳＮＰに直接隣接する領域の配列を含むプライマーを設計し、このプライマーの融解温度を計算し、そしてプライマーを、計算された融解温度に基づいて選択する。
【００１４】
（発明の特定の実施形態の詳細な説明）
本明細書中で用いた節の見出しは、組織化の目的のためのみであり、記載される主題を限定するとは解釈されるべきでない。特許、特許出願、論文、書籍および学術論文を含むがこれらに限定されない、本願に引用した全ての文書は、明らかに、その全体があらゆる目的のために参考として援用される。
【００１５】
（定義）
用語「アダプター」とは、連結反応を通して別のポリヌクレオチドの末端へと連結されるオリゴヌクレオチドをいう。アダプターは、一本鎖または二本鎖であり得る。代表的には、アダプターは、ポリヌクレオチドの末端に対して有用な特徴を与え得る。このような特徴としては、制限酵素部位または独特の配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。特定の実施形態では、独特の配列は、そのアダプターに特異的な増幅プライマーのための部位として用いられ得る。
【００１６】
「等温条件」は、プライマーオリゴヌクレオチドの改変または重合が本発明に従って行われる、実質的に均一または一定な温度である。温度は、プライマーオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを用いて形成される二重鎖が、ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイズしていないポリヌクレオチドとほぼ平衡であるように選択される。ほぼ平衡な状態は、ポリヌクレオチドと二重鎖を形成するオリゴヌクレオチドが、温度サイクルなしに、解離し得、そして再度一本化し得る状態である。特定の実施形態では、少なくとも１％、特定の実施形態では、２０〜８０％、そして特定の実施形態では９５％未満のポリヌクレオチドが、等温条件下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。従って、等温条件下では、プライマーオリゴヌクレオチドまたはその一部分とハイブリダイズし、そして動的平衡においては、そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない分子とハイブリダイズするポリヌクレオチドが存在する。等温条件は、温度の何らかの変動を含み得る。特定の実施形態によれば、温度の変動は、±２℃であり得る。
【００１７】
従って、用語「等温条件」は、変動する温度（例えば、特にランダムまたは未制御の温度変動）の使用を包含する。それゆえ、この用語は、熱サイクリング（これは、いくつかの公知の増幅手順（例えば、ＰＣＲ）において用いられる）と呼ばれるタイプの温度変動を排除する。
【００１８】
等温条件としては、４０℃と８０℃との間の温度で、プライマーを標的ポリヌクレオチド配列に対して可逆的にハイブリダイズすることが挙げられる。特定の実施形態では、等温温度は、本方法を異なる温度で実施し、そして最適温度を決定して、この方法の必要条件に最も適した増幅を得ることによって経験的に到達される。コンピュータモデルをまた用いて、適切な温度を選択し得る。重合反応における等温条件の使用は、例えば、米国特許第５，８８２，８６７号に記載されている。
【００１９】
用語「微小配列決定」反応とは、配列ターミネーターを用いた、ある種の１塩基伸長配列決定反応をいう。特定の実施形態では、微小配列決定反応は、遊離の１ヌクレオチドの実質的に非存在下で実施して、配列ターミネーターによって配列決定される１ヌクレオチドを超えて核酸の重合を最少化または防止する。特定の実施形態では、配列ターミネーターは、蛍光色素で標識され、その結果、各ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣ）が、蛍光標識の色によって同定可能である。例示的な配列ターミネーターおよびこれらを用いる反応は、例えば、米国特許第５，４９８，５２３号；および同第４，９９４，３７２号に記載される。
【００２０】
用語「移動度モディファイヤー（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）」とは、核酸の移動度および移動特性を変更する、因子および化学物質（核酸を含むがこれらに限定されない）をいう。移動度モディファイヤーの例は、例えば、米国特許第５，７０３，２２２号；同第５，４７０，７０５号；同第５，７７７，０９６号；同第５，５１４，５４３号；および同第５，７０３，０９６号に記載されている。
【００２１】
用語「多重」とは、同じ反応容器中で生じる複数の反応をいう。特定の実施形態では、反応は、複数の核酸標的についてまたは複数の核酸標的を用いて実施される。
【００２２】
用語「１ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」とは、対立遺伝子が１ヌクレオチド異なる遺伝子座での多型または対立遺伝子バリエーションをいう。
【００２３】
用語「独特の配列アイデンティファイヤー（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）」とは、サンプル中の他のオリゴヌクレオチド配列とは実質的に異なるオリゴヌクレオチド配列をいう。特定の実施形態では、独特の配列アイデンティファイヤーは、好ましくは、サンプル核酸または他の独特の配列アイデインティファイヤーとほとんどまたは全く交差反応性がないことを実証する。特定の実施形態では、独特の配列アイデンティファイヤーは、標的ポリヌクレオチドを相補することが公知のオリゴヌクレオチドへと結合され得る。特定の実施形態では、独特の配列アイデンティファイヤーおよび任意の結合した核酸は、独特の配列アイデンティファイヤーに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて単離され得る。
【００２４】
特定の実施形態では、次いで、独特の配列アイデンティファイヤーを用いて、標的ポリヌクレオチドを選択的に結合し得るかまたはサンプルから除去し得る。これは、得られる核酸二重鎖が、独特の配列アイデンティファイヤーに相補的な別の選択的オリゴヌクレオチドへと選択的に結合され得る場合、達成される。特定の実施形態では、他の選択的オリゴヌクレオチドは、基材へと結合されて、標的ポリヌクレオチドの精製が容易にされ得る。このような独特の配列アイデンティファイヤーは、例えば、米国特許第５，９８１，１７６号；およびＰＣＴ公報ＷＯ  ９７／３１２５６に記載されている。
【００２５】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形態などを含め、ヌクレオチドモノマーのポリマー（このようなポリマーのアナログを含む）を意味する。オリゴヌクレオチドをどのようにして合成するかの説明は、他の箇所の中でも、米国特許第４，３７３，０７１号；同第４，４０１，７９６号；同第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；同第４，５００，７０７号；同第４，６６８，７７７号；同第４，９７３，６７９号；同第５，０４７，５２４号；同第５，１３２，４１８号；同第５，１５３，３１９号；および同第５，２６２，５３０号に見出され得る。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり得る。
【００２６】
「プライマー」は、プライマーおよび少なくとも１つのさらなるヌクレオチドの重合を容易にするための反応において用いられる配列を含むオリゴヌクレオチドである。重合は、増幅、プライマー伸長、および／または配列決定の目的のために実施され得る。本発明によるプライマーとは、標的ポリヌクレオチドまたは増幅産物の一部と配列特異的様式でハイブリダイズするように設計されて、プライマー伸長、増幅および／または配列決定反応のためのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドをいう。
【００２７】
配列特異的プライマーを設計するための基準は、当業者に周知である。配列特異的アニーリングを提供するプライマー設計の詳細な説明は、他の箇所の中でも、ＤｉｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５、ならびにＫｗｏｋら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８：９９９−１００５，１９９０）に見出され得る。プライマーの配列特異的部分は、適切に、連結産物および増幅産物中の相補的配列への特異的アニーリングを可能にするに充分な長さのものである。
【００２８】
多くの型の増幅は、本発明の種々の実施形態のために用いられ得る。例示的な増幅方法としては、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ−βレプリカーゼベースのシステム、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびローリングサークル複製が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ＰＣＲが、用いられる増幅方法である。
【００２９】
増幅反応を最適化する方法は、当業者に周知である。例えば、アニーリング、重合および変性のための時間および温度を変更すること、ならびに反応組成物中の緩衝液、塩および他の試薬を変更することによって、ＰＣＲが最適化され得ることが周知である。最適化はまた、用いられる増幅プライマーの設計によってもたらされ得る。例えば、プライマーの長さ、ならびにＧ−Ｃ：Ａ−Ｔ比は、プライマーアニーリングの効率を変化させ得、従って、増幅反応を変化させ得る。Ｊａｍｅｓ  Ｇ．Ｗｅｔｍｕｒ，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６０５−８頁（Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ編，１９９５）を参照のこと。
【００３０】
図２は、ＡＦＬＰフラグメントが、制限酵素消化および徐々に伸長したプライマーを選択的にビンに入れることによって作製される方法を例示する。例示の目的のために、図３は、プライマーの３’末端で３ヌクレオチド伸長されたプライマーによって増幅された、選択されたビンの中のマッピングされたＳＮＰおよびＡＦＬＰフラグメントの見積もり数を示す。
【００３１】
（ＡＦＬＰ）
本発明の特定の実施形態によれば、増幅フラグメント長多型、すなわち、ＡＦＬＰが作製される。ＡＦＬＰの使用は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ９６／２２３８８および米国特許第５，８７４，２１５号；および同第６，０４５，９９４号に以前に記載されている。特定の実施形態では、ＡＦＬＰは、少なくとも１つの制限酵素による消化にゲノムＤＮＡ全体を最初に供することによって、ゲノムＤＮＡ全体から作製される。特定の実施形態では、２つの制限酵素を用いて、ゲノムＤＮＡを消化する。これらの実施形態の特定のものでは、制限酵素消化から作製されるフラグメントは、アダプターに連結される。特定の実施形態では、制限酵素消化後に残存する独特の一本鎖突出ＤＮＡを使用して、アダプターをフラグメントへと連結する。特定の実施形態では、独特の配列は、アダプターに特異的な増幅プライマーのための部位として用いられ得る。図１を参照のこと。
【００３２】
特定の実施形態では、プライマーは、フラグメントを増幅するためにフラグメントに添加される。特定の実施形態では、プライマーは、特定の実施形態において用いられる、連結したアダプターを相補するように設計され得る。特定の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡを消化するために用いられる制限酵素の部位の全てまたは一部に対して相補的であり得る。特定の実施形態では、これらのプライマーは、第１のプライマー対を含み、この対はさらに、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む。特定の実施形態では、この第１のプライマー対の第１のプライマーおよび第１のプライマー対の第２のプライマーは、異なる配列を含む。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、フラグメントの増幅は、複数の反応において生じ、複数の反応容器中で同じＡＦＬＰを作製する。
【００３４】
（ＡＦＬＰフラグメントをビンに入れること）
本発明の特定の実施形態によれば、伸長されたプライマーは、異なるフラグメントをビンに入れること、または異なるフラグメントの間を識別するために用いられる。特定の実施形態によれば、伸長されたプライマーは、ＡＦＬＰを作製するために用いられる第１のプライマーおよび第２のプライマーに同一である配列を含み、そしてプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に付加された１ヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態では、反応容器は、どの伸長されたプライマーがその反応に添加されたかに従って分割される。
【００３５】
例えば、反応容器の一部、すなわち、「ビン」は、添加され伸長されたプライマーを有し得、このプライマーは、プライマーの３’末端に付加されたアデニン（「Ａ」）ヌクレオチドを有する、第１のプライマー対の第１のプライマーの配列を含む。反応容器の別のビンは、第１のプライマー対の第１のプライマーの配列を含むプライマーを有し得るが、グアニン（「Ｇ」）ヌクレオチドが、プライマーの３’末端に付加されている。
【００３６】
従って、増幅後、第１のビンにおいて増幅された増幅フラグメントのサブセットは、全てが、第１のプライマーのヌクレオチド（ならびに相補的配列）の３’末端に直接隣接してヌクレオチド「Ａ」を有するはずである。また、増幅後、第２のビンにおいて増幅された増幅フラグメントのサブセットは、全て、第１のプライマーのヌクレオチド（ならびに相補的配列）の３’末端に直接隣接してヌクレオチド「Ｇ」を有するはずである。
【００３７】
同様に、第１のプライマー対の第２のプライマーの３’末端で伸長されたヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣ）によってビンに入れられる、第１のプライマーセットの１、２、３または４つの異なる伸長された第２のプライマーを用い得る。従って、特定の実施形態によれば、第１の伸長されたプライマーおよび第２の伸長されたプライマーの１６の異なる組合せを有する１６の異なるビンを用い得る。このような実施形態では、このようなビンにおける増幅は、フラグメントのいずれかの側の制限部位のヌクレオチドに直接隣接する１ヌクレオチドの１６の異なる可能な組合せを有するフラグメントを分離すべきである。
【００３８】
ビンへのフラグメントの連続する回の細分は、さらなる伸長されたプライマーを用いて実施され得る。例えば、第２の細分のために、第１の伸長されたプライマーの第１の伸長されたヌクレオチドに直接隣接する３’末端に４つの可能な伸長されたヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）を含む第２の伸長されたプライマーを用いる。従って、１６の異なる第１の伸長されたプライマー対および１６の異なる第２のプライマー対が存在する場合、フラグメントのいずれかの末端の制限部位に隣接する２つのヌクレオチドの２５６の異なる組合せを有する２５６の異なるビンが存在する。連続した回のビンに入れられることによって、各ビン中の異なるフラグメントの数を減らす。
【００３９】
特定の実施形態では、伸長されたプライマーは、３回伸長され、そして最後のＡＦＬＰ増幅は、第１のプライマーの配列および第２のプライマーの配列を含み、かつプライマーの３’末端に結合した３ヌクレオチドをさらに含むプライマーを用いて行われる。図２を参照のこと。特定の実施形態では、反応容器は、１，０００ビンを超えるまで細分される。
【００４０】
（一本鎖テンプレート調製）
特定の実施形態では、数コピーの一本鎖ＡＦＬＰが、非対称ＰＣＲによって作製される。特定の実施形態では、これは、他の増幅プライマーよりも不均衡に多い量の１つの増幅プライマーを添加することによって生じる。より多い量の増幅によるＤＮＡプライマー鎖は、相補鎖がプライマーから外れてもはや複製しない後でも、増幅し続ける。作製される鎖は、どの増幅プライマーがより多い量で添加されるかによって決定される。
【００４１】
特定の実施形態では、非対称ＰＣＲは、ＡＦＬＰ増幅の最後の回の間に生じる。
【００４２】
特定の実施形態では、一本鎖テンプレートは、二本鎖核酸の一方の鎖の酵素消化によって作製され得る。このような実施形態は代表的に、酵素のエキソヌクレアーゼ活性によって実施される。このような実施形態において、二本鎖核酸の一方の鎖は、ヌクレアーゼ活性に対して無防備にされるか、または他方の鎖がヌクレアーゼ活性から保護される。
【００４３】
特定の実施形態では、一本化テンプレートは、二本鎖ポリヌクレオチドから一方の鎖を捕獲することによって作製される。特定の実施形態では、捕獲は、ビオチン標識ヌクレオチドを用いて実施される。特定の実施形態では、捕獲は、一方の鎖に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施される。特定の実施形態では、捕獲は、二本鎖ポリヌクレオチドについて実施され、次いでこの二本鎖ポリヌクレオチドは、変性され、そして洗浄される。特定の実施形態では、一方の鎖は、捕獲されたままであり、そして他方の鎖は、洗浄によって除去される。
【００４４】
（検出）
特定の実施形態では、各反応容器中のＡＦＬＰの数を、ＳＮＰを含むＡＦＬＰの算出数まで減少させた後、ＳＮＰが検出される。特定の実施形態では、１塩基伸長を用いて、ＡＦＬＰ後にヌクレオチドを検出する。特定の実施形態では、１塩基伸長を用いて、一本鎖テンプレート上のヌクレオチドを検出する。
【００４５】
特定の実施形態では、ＳＮＰでの特定のヌクレオチドは、蛍光インジケーターを用いて検出され得る。特定の実施形態では、この蛍光インジケーターは、特定のオリゴヌクレオチドによってクエンチング分子へと連結された、蛍光を発する色素であり得る。これらとしては、５’−ヌクレアーゼ蛍光インジケーターおよび分子ビーコンが挙げられるがこれらに限定されない。このようなシステムの例は、例えば、米国特許第５，５３８，８４８号および同第５，７２３，５９１号に記載される。特定の実施形態では、互いに区別され得る４つのインジケーターを使用し、この４つのインジケーターの各々は、特定のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣ）に対応する。
【００４６】
特定の実施形態では、微小配列決定反応を用いて、ＳＮＰを検出する。特定の実施形態では、微小配列決定反応は、等温条件下で実施される。
【００４７】
（長いオリゴヌクレオチドプライマー）
特定の実施形態によれば、ＡＦＬＰは、以前に記載されたとおりに作製される。特定の実施形態では、さらなる増幅は、ビンの材料の一部、第１のプライマー対由来のプライマー、およびＳＮＰに直接隣接する領域の配列を含む少なくとも１つのＳＮＰ特異的プライマーを用いて実施される。特定の実施形態では、ＳＮＰに直接隣接する領域の配列を含む少なくとも１つのＳＮＰ特異的プライマーは、ＳＮＰに近位の５’末端を有する。図４を参照のこと。過剰の、第１のプライマー対由来の以前に用いられたプライマーを添加して、既知の長さの長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ここで、長いオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、ＳＮＰに近位である。図４を参照のこと。特定の実施形態では、所定のフラグメントまたはビン内のフラグメント内の異なるＳＮＰに対応する、複数の異なる長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製し得る。各異なるＳＮＰに直接隣接する領域の配列を含む異なるＳＮＰ特異的プライマーを用い得る。これらの実施形態では、異なるＳＮＰ特異的プライマーを用いた増幅は、異なるＳＮＰに特異的な異なる長いオリゴヌクレオチドプライマーをもたらす。このような長いオリゴヌクレオチドプライマーは、ＳＮＰと第１のプライマー（伸長されていないプライマー）の末端との距離に依存した、異なる長さのものである。
【００４８】
特定の実施形態では、微小配列決定反応において長いオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特定のＳＮＰを同定する。特定の実施形態によれば、異なる長いオリゴヌクレオチドプライマー、ＡＦＬＰフラグメントの最初のビンの一部（長いオリゴヌクレオチドプライマー調製前）、および配列ターミネーターを用いて反応を実施する。特定の実施形態では、ターミネーターの４つのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）の各々について異なるインジケーターを各々含む、４つの異なる配列ターミネーターが用いられる。特定の実施形態によれば、反応物中の１ヌクレオチドがポリメラーゼ反応において重合しないように、これらの１ヌクレオチドを実質的に除去または改変しようとする。配列ターミネーターを用いて１塩基伸長反応を実施して、長いオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチドおよび付加された標識ヌクレオチド（ＳＮＰ部位に対応する）を含むＳＮＰ含有配列を作製する。次いで、そのサイズに基づいてＳＮＰ含有配列を分離して、異なるＳＮＰ部位間を区別し得る。ＳＮＰ含有配列上の区別可能なインジケーターを考慮して、各ＳＮＰ部位で特異的ヌクレオチドをまた決定し得る。特定の実施形態では、微小配列決定反応は、等温で実施される。
【００４９】
移動度によってフラグメントまたは長いオリゴヌクレオチドプライマーを区別することは、種々の方法によって達成され得る。特定の実施形態では、１塩基伸長プライマーは、電気泳動によって分離される。
【００５０】
（独特な配列アイデンティファイアーおよび移動度モディファイアー）
特定の実施形態では、一本鎖ＤＮＡを生成するために、ＡＦＬＰの増幅および非対称ＰＣＲを、記載のようにして実施する。特定の実施形態によれば、反応物中の単一ヌクレオチドを実質的に除去または変更することが試みられ、その結果、そのヌクレオチドは、ポリメラーゼ反応において重合化しない。特定の実施形態では、ＳＮＰにすぐ隣接した領域の配列を含むプライマーを、反応に添加する。これらのプライマーは、そのプライマーの３’末端がＳＮＰに近接するように設計される。特定の実施形態では、標識化された配列ターミネーターを反応容器に加え、そしてＳＮＰにすぐ隣接した領域の配列を含むプライマーで微小配列決定反応を実施して、そのプライマーと、付加された標識化ヌクレオチドとを含む配列を含有するＳＮＰを得る。特定の実施形態では、異なる標識（指示薬）を、各々異なるヌクレオチドターミネーター（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）について使用する。図５を参照のこと。特定の実施形態では、微小配列決定（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）反応を、等温で実施する。
【００５１】
移動度によるフラグメントまたはプライマーの識別は、種々の方法によって達成され得る。特定の実施形態では、一塩基伸長プライマーが、電気泳動によって分離される。
【００５２】
特定の実施形態では、ＳＮＰにすぐ隣接するがＳＮＰを含まない領域の配列を含むプライマーはさらに、ＳＮＰにすぐ隣接するがＳＮＰを含まない領域の配列の５’末端に、独特のアイデンティファイアー配列を含む。図５を参照のこと。特定の実施形態では、異なるＳＮＰ部位に対応して、複数の異なる独特のアイデンティファイアー配列が使用される。特定の実施形態では、この独特のアイデンティファイアー配列は、アレイ上の異なる位置の異なる配列に対して相補的である。次いで、異なるＳＮＰ部位間を区別するために、アレイ上の異なる位置への結合に基づいて、ＳＮＰ含有配列が分離され得る。また、ＳＮＰ含有配列における識別可能な指示薬に鑑みて、各ＳＮＰ部位における特定のヌクレオチドが決定され得る。
【００５３】
特定の実施形態では、ＳＮＰにすぐ隣接する領域の配列を含むプライマーはさらに、移動度モディファイアーを含む。特定の実施形態では、分析される各々異なるＳＮＰ部位について、複数の異なる移動度モディファイアーが使用される。移動度モディファイアーを有するプライマーのヌクレオチドと、付加された標識化ヌクレオチド（これがＳＮＰ部位に対応する）とを含むＳＮＰ含有配列を生成するために、標識化された配列ターミネーターを使用して、一塩基伸長反応が実施される。次いで、異なるＳＮＰ部位についての異なる移動度に基づいて、ＳＮＰ含有配列が分離され得る。また、ＳＮＰ含有配列における識別可能な指示薬に鑑みて、各ＳＮＰ部位における特定のヌクレオチドが決定され得る。
【００５４】
特定の実施形態では、各々の独特な配列アイデンティファイアーは、増幅生成物の独特な配列アイデンティファイアー部分に対して相補的なタグと、移動度に依存する分析技術（例えば、電気泳動）において特定の移動度をもたらすためのテイル（ｔａｉｌ）とを含む、特定の移動度モディファイアーに対して相補的である。例えば、１９９９年３月１５日付けで出願された米国特許出願番号０９／５２２，６４０号を参照のこと。
【００５５】
（オリゴヌクレオチド連結アッセイ）
特定の実施形態では、ＳＮＰは、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（ＯＬＡ））によって検出される。ＯＬＡは、例えば、米国特許第５，１８５，２４３号に記載されている。特定の実施形態では、ＡＦＬＰを増幅し、そして非対称ＰＣＲを実施して、一本鎖ＤＮＡを生成する。特定の実施形態では、ＳＮＰにすぐ隣接した領域の配列を含むプライマーを反応容器に加える。（ｉ）ＳＮＰの他方の側にすぐ隣接した領域、および（ｉｉ）ＳＮＰに対して相補的な、異なるあり得るヌクレオチドを含む、異なるプライマーを、反応容器に加える。特定の実施形態では、ＳＮＰの他方の側にすぐ隣接する領域を含む、およびＳＮＰに対して相補的な、異なるあり得るヌクレオチドを含む、異なるプライマーは、移動度モディファイアーによってか、プライマーの異なる長さによってか、または異なる標識によって識別される。連結反応を実施し、そしてＳＮＰに対して相補的なヌクレオチドを含むプライマーを、連結生成物の存在によって検出する。
【００５６】
特定の実施形態では、プライマーのいずれかまたは両方を、フラグメント内における異なるＳＮＰ部位の区別化を可能にするように設計し得る。例えば、プライマーの一方または両方が、各ＳＮＰ部位について異なる配列アイデンティファイアーおよび／または移動度モディファイアーを含み得、この配列アイデンティファイアーおよび／または移動度モディファイアーが、異なるＳＮＰ部位間の区別を可能にする。ＳＮＰ部位の特定のヌクレオチドに対して相補的なあり得るヌクレオチドを含むプライマーはまた、特定のＳＮＰ相補的ヌクレオチドに特異的な指示薬を含み得る。このようにしてまた、各々区別化されるＳＮＰ部位の特定のヌクレオチドが決定され得る。
【００５７】
本発明の特定の実施形態によれば、キットが提供される。特定の実施形態では、このようなキットは、ＡＦＬＰの増幅のための第一のプライマー対を備える。この第一のプライマー対は、第一プライマーおよび第二プライマーを含む。このようなキットはさらに、伸長されたプライマーを備え、ここでこの伸長されたプライマーは、ＡＦＬＰを生成するために使用されるプライマーと同一の配列を含み、そしてさらに、そのプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に付加された単一ヌクレオチドを含む。
【００５８】
特定の実施形態では、このキットはさらに、いくつかのプライマー対を備え、ここで各プライマー対は、ＡＦＬＰを生成するために使用される第一プライマーおよび第二プライマーと同一の配列を含み、そしてさらに、そのプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端に付加された１つ以上のヌクレオチドを含み、その結果、連続的により長いプライマーで増幅されたＡＦＬＰは、複数の双対（ｂｉｎ）に再分配され得る。
【００５９】
特定の実施形態では、このキットはさらに、ＳＮＰにすぐ隣接した領域の配列を含む少なくとも１つのプライマーを備える。特定のさらなる実施形態では、ＳＮＰにすぐ隣接した領域の配列を含むこの少なくとも１つのプライマーはさらに、独特の配列アイデンティファイアーを含む。特定のさらなる実施形態では、ＳＮＰにすぐ隣接した領域の配列を含むこの少なくとも１つのプライマーはさらに、移動度モディファイアーを含む。特定の実施形態では、このキットはさらに、標識化配列ターミネーターを備える。
【００６０】
特定の実施形態によれば、ソフトウェアが提供される。特定の実施形態では、このソフトウェアは、電子データベースから既知のＳＮＰを同定し、既知のＳＮＰにすぐ隣接した領域の配列を含むプライマーを設計し、そのプライマーの融解温度を算出し、そして算出された融解温度に基づいてプライマーを選択する。
【００６１】
特定の実施形態では、このソフトウェアは、特定の第一プライマー配列で開始し、そして特定の第二プライマー配列で終結する、ゲノム内の配列を同定する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、予期される緩衝液において使用される特定の塩濃度の、融解温度に対する効果を算出する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、分析から、反復配列由来の１０塩基対のＳＮＰまたは１０塩基対よりも短いＳＮＰを排除する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、プライマー選択のための判断基準として、アニーリング温度での二本鎖配列のパーセントを使用する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、ゲノム中においてＳＮＰについての単一の位置が存在するか否かを決定する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、選択されたプライマーを長さによって分類し、そしてそのプライマーの末端にオリゴヌクレオチドを付加する。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（Ａ．ＡＦＬＰテンプレート混合物の調製）
異なる長さの１２個の異なるＡＦＬＰフラグメントを、Ｃｅｌｅｒａ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。このフラグメントは、ラットのゲノムＤＮＡを、ＢｓｔＹＩおよびＭｓｅＩで消化することによって生成された。この消化生成物を、オリゴヌクレオチドアダプターに連結した。次いで、この生成物を、Ｍｓ０００およびＢｓ０００プライマー（表２に示す）を使用して増幅した。次いで、これらの増幅の生成物を、表４に示すプライマーの組み合わせにより増幅した。最後に、このフラグメントを、表１に同定されたこれらのプライマーにより増幅した。その配列を、表２に示す。フラグメントの長さは、５０塩基対から４３５塩基対まで異なった。この１２個の個々のフラグメントは、Ｃｅｌｅｒａ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって単離および精製された。
【００６３】
次いで、これらの１２個の精製されたフラグメントを、一緒に混合した。これらのフラグメントの混合物を、モデルＡＦＬＰテンプレート混合物として使用した。表１は、混合物中における各フラグメントのコピー数およびフラグメント長を示す。
【００６４】
上記ＡＦＬＰ（各々１０７〜１０８コピー）のモデルＡＦＬＰ混合物の１μｌを、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）を使用して、１００μｌのＰＣＲ反応において増幅した。この反応において使用されたプライマー（Ｂｓ０００およびＭｓ０００）は、アダプターを有するＭｓｅＩ−ＢｓｔＹＩフラグメントを一般に増幅するように設計され、そして表２に規定されている：
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ緩衝液    １０μｌ
２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                        ８μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                          ８μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ                  １μｌ
Ｂｓ０００（プライマー）                      ５μｌ
Ｍｓ０００（プライマー）                      ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物                    １μｌ
水                                          ６２μｌ。
【００６５】
この増幅反応を、以下のパラメーターに従って、１５サイクルで熱サイクルした：
９５℃      １５秒間
６４℃    １２０秒間
７５℃    １２０秒間。
【００６６】
増幅後、４μｌの反応生成物を、エビのアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩで処理した。このホスファターゼは、遊離の単一ヌクレオチドからリン酸を取り除き、それらが配列決定反応の間に重合化しないようにする。この工程は、決定することが意図される単一ヌクレオチドを超えて、配列決定反応が伸長しないようにするのに役立つ。エキソヌクレアーゼは、終了まで伸長しなかった未重合オリゴヌクレオチドを破壊する。ＳＡＰおよびエキソヌクレアーゼＩは両方とも、ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．（それぞれ、部品番号７００９２Ｚおよび７００７３Ｚ）から入手可能である。この反応を、以下のように実施した：
ＳＡＰ（１単位／μｌ）                        ２μｌ
エキソヌクレアーゼＩ（１０単位／μｌ）    ０．２μｌ
水                                            ６μｌ
増幅生成物                                    ４μｌ。
【００６７】
【表１】
2004526453.tif 000002
2004526453.tif 000003
この混合物を、３７℃で１時間反応させ、次いで、７５℃で１５分間反応させて、ＡＦＬＰテンプレート混合物から増幅生成物を得た。エキソヌクレアーゼＩの１単位の定義は、標準的な条件下で３７℃にて３０分間において、変性ＤＮＡから１０ｎｍｏｌｅの酸可溶性ヌクレオチドを放出するのを触媒する酵素の量である。ＳＡＰの１単位の定義は、グリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）中において３７℃にて、１分間あたり１μｍｏｌｅのｐ−ニトロフェニルホスフェートの加水分解を触媒する酵素の量である。
【００６８】
（Ｂ．検出プライマーの調製）
各フラグメントの中央部付近の無作為な領域を選択した。これらの領域に相補的なプライマーを設計した。これらのプライマーを合成した。各プライマーは、特定のフラグメントに対して相補的な２３ヌクレオチドを有し、そして３つのプライマーは、以下のように、プライマーの５’末端に付加された多数のＴを有した：
１３０ｂｐ  ＡＦＬＰフラグメント      ０個のＴ
１７９ｂｐ  ＡＦＬＰフラグメント      ４個のＴ
１８４ｂｐ  ＡＦＬＰフラグメント      ８個のＴ
２２４ｂｐ  ＡＦＬＰフラグメント    １２個のＴ。
【００６９】
これらのプライマーの正体を、表３に示す。
【００７０】
（Ｃ．一塩基対伸長による微小配列決定）
微小配列決定反応を、以下のように４つのすべてのプライマーを使用して、「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」実験のために実施した：
Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ                                                ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物（実施例１Ａ）からの
ＳＡＰ処理増幅生成物                                            １μｌ
１３０ｂｐ、１７９ｂｐ、１８４ｂｐおよび２２４ｂｐの
フラグメント（０個のＴ、４個のＴ、８個のＴおよび１２個のＴ）
についてのプライマーを各々１μｌ（５μＭ）                  合計４μｌ
水                                                                ０μｌ。
【００７１】
Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘは、酵素、配列決定ターミネーターおよび緩衝液を含み、そしてＳＮａＰｓｈｏｔキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，部品番号４３２３１５４および４３１２１６３）の一部として、入手可能である。配列ターミネーターは蛍光標識されており、その結果、各ヌクレオチドは異なる色の標識を有し、電気泳動分離の間または後における蛍光検出の間にそれらを識別させる。
【００７２】
４つの別々の「単一化（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）」微小配列決定反応を、以下のように別々の反応において、上記のプライマーの各々を用いて実施した：
Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ                                                  ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物（実施例１Ａ）からの
ＳＡＰ処理増幅生成物                                              １μｌ
プライマー（０個のＴ、４個のＴ、８個のＴまたは１２個のＴ）（５μＭ）１μｌ
水                                                                  ３μｌ。
【００７３】
すべての反応を、以下のようなパラメーターを使用して、２５サイクルで熱サイクルした：
９６℃      １０秒間
５０℃        ５秒間
６０℃      ３０秒間。
【００７４】
次いで、各サンプルを、３７℃で１時間にわたって０．５単位のＳＡＰで処理し、次いで、７２℃で１５分間処理した。すべての反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１０において分析した。
【００７５】
すべての反応が、予期されたシグナルを示した。このことは、多重化の一塩基伸長微小配列決定反応が可能であることを示す。この多重化反応の結果を、図６に示す。
【００７６】
（実施例２）
（Ａ．非対称テンプレートの調製）
実施例１からの１２個のＡＦＬＰ（各々１０７〜１０８コピー）のモデルＡＦＬＰ混合物の１μｌを、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）を使用して、１００μｌのＰＣＲ反応において増幅した。この反応において使用されたプライマー（Ｂｓ０００およびＭｓ０００）は、アダプターを有するＭｓｅＩ−ＢｓｔＹＩフラグメントを一般に増幅するように設計され、そして表２に規定されている。以下のような反応において３つの異なる濃度のＢｓ０００プライマーを使用して３つの別々の反応を実施し、一本鎖テンプレートを生成した：
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ緩衝液    １０μｌ
２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                        ８μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                          ８μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ                  １μｌ
Ｂｓ０００（プライマー）
（５μＭ、１μＭおよび０．１μＭ濃度中）    ５μｌ
Ｍｓ０００（プライマー）（５μＭ）            ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物                    １μｌ
水                                          ６２μｌ。
【００７７】
これらの反応を、以下のパラメーターに従って、１５サイクルで熱サイクルした：
９５℃      １５秒間
６４℃    １２０秒間
７５℃    １２０秒間。
【００７８】
増幅後、４μｌの反応生成物を、以下の反応においてＳＡＰで処理した：
ＳＡＰ（１単位／μｌ）                        ２μｌ
水                                            ６μｌ
増幅生成物                                    ４μｌ。
【００７９】
（Ｂ．等温での一塩基対伸長による微小配列決定）
微小配列決定を、実施例１の４つのフラグメント（１３０ｂｐ（０個のＴ）、１７９ｂｐ（４個のＴ）、１８４ｂｐ（８個のＴ）および２２４ｂｐ（１２個のＴ））のプライマーを使用することによって実施した。微小配列決定反応を、以下のように４つすべてのプライマーを使用して、「多重化」実験のために実施した：
Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ                                                  ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物（実施例２Ａ）からの
ＳＡＰ処理増幅生成物                                              １μｌ
プライマー（５μＭ）（１３０（０個のＴ）、１７９（４個のＴ）、
１８４（８個のＴ）および２２４（１２個のＴ））を各々１μｌ    合計４μｌ
水                                                                  ０μｌ。
【００８０】
４つの「単一化」微小配列決定反応を、以下のように別々の反応において、上記のプライマーの各々を用いて実施した：
Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ                                                  ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物（実施例２Ａ）からの
ＳＡＰ処理増幅生成物                                              １μｌ
プライマー（５μＭ）（１３０（０個のＴ）、１７９（４個のＴ）、
１８４（８個のＴ）または２２４（１２個のＴ））を各々１μｌ        １μｌ
水                                                                  ３μｌ。
【００８１】
すべての反応を、サイクルさせずに、１時間６５℃でインキュベートした。次いで、各サンプルを、３７℃で１時間にわたって０．５単位のＳＡＰで処理し、次いで、７２℃で１５分間処理した。すべての反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１０において分析した。
【００８２】
この結果により、１：５の比率のＢｓ０００／Ｍｓ０００プライマー比が、最も強いシグナルを与え、一方、より小さな比率（１：１０および１：１００）は、より弱いシグナルを与えることが示された。対称ＰＣＲ（１：１の比率のプライマーを使用する）は、ほとんど全くシグナルを与えなかった。データは示さない。多重化反応の１つを、図６に示す。弱い「緑色」のシグナルは、その反応において使用された特定のプライマー配列の結果である可能性がある。
【００８３】
（実施例３）
（Ａ．ＡＦＬＰテンプレート混合物の調製）
実施例１からの１２個のＡＦＬＰ（各々１０７〜１０８コピー）のモデルＡＦＬＰ混合物の１μｌを、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）を使用して、１００μｌのＰＣＲ反応において増幅した。この反応において使用されたプライマー（Ｂｓ０００およびＭｓ０００）は、アダプターを有するＭｓｅ  Ｉ−Ｂｓｔ  ＹＩフラグメントを一般に増幅するように設計され、そして表２に規定されている。増幅を、以下の成分を用いて実施した：
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ緩衝液    １０μｌ
２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                        ８μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                          ８μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ                  １μｌ
Ｂｓ０００（プライマー）                      ５μｌ
Ｍｓ０００（プライマー）                      ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物                    １μｌ
水                                          ６２μｌ。
【００８４】
この反応を、以下のパラメーターに従って、４０サイクルで熱サイクルした：
９５℃      １５秒間
６４℃    １２０秒間
７５℃    １２０秒間。
【００８５】
増幅後、４μｌの反応生成物を、ＳＡＰおよびエキソヌクレアーゼＩで処理した。この反応は、以下の通りであった：
ＳＡＰ（１単位／μｌ）                        ２μｌ
エキソヌクレアーゼＩ（１０単位／μｌ）    ０．２μｌ
水                                            ６μｌ
増幅生成物                                    ４μｌ。
【００８６】
この混合物を、３７℃で１時間反応させ、次いで、７５℃で１５分間反応させた。
【００８７】
（Ｂ．非対称ＰＣＲによる、長いオリゴヌクレオチドプライマーの調製）
１２個のフラグメントのうちの１０個における１０個の選択されたヌクレオチドの各々に隣接する領域を選択し、そしてプライマーを、これらの領域に対して相補的に設計した。これらのプライマーを合成した。プライマーの各々の配列を、表３に示す。長さが５０塩基対および４３５塩基対のフラグメントに対応するフラグメントは、合成されなかった。図７は、「モデルＳＮＰ」部位（×）に隣接する対応のフラグメントにおける、表３の６つのプライマーの相対的配置を示す。１０個のプライマーを、各々のプライマーについての最終濃度が０．５μＭで、一緒に混合した。１μｌのこの混合物（各々のプライマーの０．５ｐｍｏｌｅに対応する）を、以下の反応において、非対称ＰＣＲのために使用した：
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ緩衝液          ２μｌ
２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                         １．６μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                            １．６μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ                    ０．２μｌ
プライマー混合物                                    １μｌ
Ｍｓ０００（５μＭ濃度中）                          ３μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物                      ０．２μｌ
水                                            １０．４μｌ。
【００８８】
この反応を、以下のパラメーターで、４０サイクルで熱サイクルした：
９５℃      １５秒間
６４℃    １２０秒間
７５℃    １２０秒間。
【００８９】
１２μｌの得られた増幅生成物を、以下の反応に使用した：
ＳＡＰ（１単位／μｌ）                      １２μｌ
水                                      １２．６μｌ
増幅生成物                                  １２μｌ。
【００９０】
この混合物を、３７℃で１時間反応させ、次いで、７５℃で１５分間反応させた。
【００９１】
（Ｃ．一塩基伸長による微小配列決定）
微小配列決定反応を、以下のように実施した：
Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ                                                ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物（実施例３Ａ）からの
ＳＡＰ処理増幅生成物                                          ２．５μｌ
長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物（実施例３Ｂ）          ２．５μｌ。
【００９２】
この反応を、以下のパラメーターを使用して、２５サイクルで熱サイクルに供した：
９６℃      １０秒間
５０℃        ５秒間
６０℃      ３０秒間。
【００９３】
ＳＡＰ（０．７５単位）を、サイクルが完了した後で反応物に加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。次いで、反応物を７５℃に１５分間供し、そして、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において分析した。この結果を、図８に示す。
【００９４】
（実施例４）
（Ａ．長いオリゴヌクレオチドプライマーの調製）
融解温度において異なった２つのプライマーを設計および合成した。一方は６０Ｆと名付け、６０℃でアニールし、一方で６５Ｆは６５℃でアニールする。６５Ｆプライマーが６０Ｆプライマーと比較して５’末端に２個のさらなるヌクレオチドを含むことを除いて、両方のプライマーは同じ配列を含む。６０Ｆおよび６５Ｆの配列を、表２に示す。２つの異なる別々の反応において、２０μｌの増幅反応中で、１ｐｍｏｌｅの６０Ｆまたは６５Ｆのいずれかを、１５ｐｍｏｌｅのＭｓ０００と組み合わせた。この反応物を、以下のように構成した：
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ緩衝液          ２μｌ
２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                         １．６μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                            １．６μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ                    ０．２μｌ
６０Ｆプライマーまたは６５Ｆプライマー（１μＭ）    １μｌ
Ｍｓ０００（５μＭ濃度中）                          ３μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物                      ０．２μｌ
水                                            １０．４μｌ。
【００９５】
この反応を、以下のパラメーターに従って、４０サイクルで熱サイクルした：
９５℃      １５秒間
６４℃    １２０秒間
７５℃    １２０秒間。
【００９６】
得られた増幅生成物を、以下のようにしてＳＡＰ処理に供した：
ＳＡＰ（１単位／μｌ）                      ２μｌ
水                                      ６．２μｌ
増幅生成物                                  ４μｌ。
【００９７】
この反応を、３７℃で１時間行い、次いで、７５℃で１５分間行った。
【００９８】
（Ｂ．非対称ＰＣＲ）
実施例４Ａからの生成物を、以下のような非対称ＰＣＲにおいて、長いオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した：
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ緩衝液          ２μｌ
２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                         １．６μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                            １．６μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ                    ０．２μｌ
長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物            １μｌ
Ｂｓ０００（５μＭ濃度中）                          ３μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物                      ０．２μｌ
水                                            １０．４μｌ。
【００９９】
この反応を、以下のパラメーターに従って、４０サイクルで熱サイクルした：
９５℃      １５秒間
６４℃    １２０秒間
７５℃    １２０秒間。
【０１００】
得られた増幅生成物を、以下のようにしてＳＡＰ処理に供した：
ＳＡＰ（１単位／μｌ）                      ２μｌ
水                                      ６．２μｌ
非対称増幅生成物                            ４μｌ。
【０１０１】
この混合物を、３７℃で１時間反応させ、次いで、７５℃で１５分間反応させた。次いで、この非対称増幅生成物を、一本鎖テンプレートとして使用した。
【０１０２】
（Ｃ．一塩基伸長による微小配列決定）
微小配列決定反応を、以下のように実施した：
Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ                                                ５μｌ
長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物（実施例４Ａ）        ２．５μｌ
ＳＡＰ処理された非対称増幅生成物（実施例４Ｂ）                ２．５μｌ。
【０１０３】
熱サイクルを、以下のようにして、７５サイクル行った：
９６℃      １０秒間
７０℃      ３０秒間。
【０１０４】
６０Ｆプライマーおよび６５Ｆプライマーは両方とも、検出された既知のヌクレオチドについて正確なシグナルを生じた。このシグナルは、正確な長さで現れた。図９を参照のこと。この結果は、６０℃および６５℃の両方のアニーリング温度で設計されたプライマーが、これらの条件下で、長いオリゴヌクレオチドプライマーの調製物に対して機能することを実証する。
【０１０５】
（実施例５）
（Ａ．ＡＦＬＰテンプレート混合物の調製）
Ｂｓ２４４およびＭｓ１１１と命名されたプライマー（表２に示される）を用いて増幅された、ＡＦＬＰ混合物のサブセットを、Ｃｅｌｅｒａ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。これらのプライマーは、３’末端に付加されたＣＴＴを有するＢｓ０００プライマー配列、および３’末端に付加されたＡＡＡを有するＭｓ０００プライマー配列を含んだ。これらのプライマーを、以下のような反応において使用した：
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ緩衝液    １０μｌ
２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                        ８μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                          ８μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ                  １μｌ
プライマー  Ｂｓ２４４                        ５μｌ
プライマー  Ｍｓ１１１                        ５μｌ
ＡＦＬＰ混合物のサブセット                  ２０μｌ
水                                          ４３μｌ。
【０１０６】
熱サイクルを、以下のようなパラメーターを使用して、４０サイクルで行った：
９５℃      １５秒間
７５℃    ２４０秒間。
【０１０７】
得られた生成物の半分を、水で希釈することなく、１１μｌのＳＡＰ（１単位／μｌ）に添加した。この混合物を、３７℃で１時間反応させ、次いで、７５℃で１５分間反応させた。
【０１０８】
（Ｂ．長いオリゴヌクレオチドプライマーの調製）
長いオリゴヌクレオチドプライマーを、表５に示されるような１０個のフラグメント特異的プライマーを使用する別々の反応において生成した。この別々の反応混合物を、以下のようにして調製した。
【０１０９】
１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ緩衝液        １０μｌ
２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ                            ８μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                              ８μｌ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ                      １μｌ
１０個の特異的プライマーのうちの１つ（５μＭ）    １μｌ
Ｍｓ０００（５μＭ）                              ５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物                        １μｌ
水                                              ６６μｌ。
【０１１０】
熱サイクルを、以下のようなパラメーターを使用して、４０サイクルで行った：
９５℃      １５秒間
６４℃    ２４０秒間
７５℃    ２４０秒間。
【０１１１】
各増幅反応の生成物全体を、水で希釈することなく、２２μｌのＳＡＰ（１単位／μｌ）を有する別々の容器に添加した。この混合物を、３７℃で１時間反応させ、次いで、７５℃で１５分間反応させた。
【０１１２】
（Ｃ．一塩基伸長による微小配列決定）
微小配列決定反応を、前述された長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物の各々について、以下のように実施した：
Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ                                                ５μｌ
長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物（実施例５Ｂ）        ２．５μｌ
ＡＦＬＰテンプレート混合物（実施例５Ａ）からの
ＳＡＰ処理増幅生成物                                        ２．５μｌ。
【０１１３】
この反応を、以下のパラメーターを使用して、７５サイクルで熱サイクルした：
９６℃      １５秒間
７０℃    １２０秒間。
【０１１４】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析された場合に、１０個の反応物の各々についてシグナルが生成された。図１０は、１０個の「単一化」反応のうちの５つの結果を示す。この結果は、すべてのプライマーが、一塩基伸長配列決定し得ることを示す。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１９】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成した少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を伴った本特許または特許出願の公報のコピーは、請求をして必要な料金を支払ったら、特許庁によって提供される。
【図１】図１は、制限酵素消化およびその後のアダプターの連結によるフラグメント作成を図示する。
【図２】図２は、本発明の特定の実施形態に記載されるＡＦＬＰの方法の代表を示す。フラグメントは、フラグメントを増幅するために用いられるプライマーの複雑さを増すことによって、徐々に小さくなるサブセットへと選択的にビンに入れられる。
【図３】図３は、増幅プライマーの３’の３つのさらなるヌクレオチドを用いて、見込みのあるビンにおいて、Ｍｓｅ  ＩおよびＢｓｔ  ＹＩを用いた制限消化によって作製されるＡＦＬＰフラグメントの評価数を示す。各ビン中の既知のＳＮＰの数もまた示す。
【図４】図４は、１塩基伸長（ＳＢＥ）配列決定反応において使用するための長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製するための非対称ＰＣＲにおいて用いられるプライマーの位置を図示する。
【図５】図５は、独特配列アイデンティファイヤーまたは移動度モディファイヤーを用いる１塩基伸長配列決定反応のためのフラグメント特異的配列決定プライマーの使用を図示する。
【図６】図６は、実施例１および２において使用される多重配列反応の結果を示す。
【図７】図７は、全フラグメントに対して実施例３および実施例５で用いられる特異的プライマーの位置を図示する。
【図８】図８は、実施例３の結果を示す。７つの１ヌクレオチド配列は、多重反応において正確に検出される。
【図９】図９は、実施例４の結果を示す。１ヌクレオチド配列の正確な同定を、６０℃のＴｍを有するプライマーおよび６５℃のＴｍを有するプライマーについて示す。
【図１０】図１０は、実施例５の結果を示す。特異的プライマーのうちの５つは、適切な部位でのヌクレオチド配列を実証した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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