(57)【要約】本発明は、免疫治療用途において、免疫刺激剤としてのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの治療的な使用に関する。本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物による免疫応答を増強するのための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって、式５’−ピリミジン−プリン−３’、式中、ピリミジンは非天然ピリミジンヌクレオシドであり、およびプリンは天然または非天然プリンヌクレオシドである、で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含む、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって、式Ｃ＊ｐＧ、式中、Ｃ＊はシチジンアナログであり、Ｇはグアノシン、２’−デオキシグアノシンまたはグアノシンアナログであり、およびｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合である、で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含む、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３】
非天然ピリミジンヌクレオシドが、式（Ｉ）：
【化１】
2004509970.tif 000007
式中、Ｄは水素結合供与体であり、Ｄ’は水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子吸引基および電子供与基からなる群から選択され、Ａは水素結合受容体または親水基であり、Ｘは炭素または窒素であり、およびＳはペントースまたはヘキソース糖環である、を有し、但し、式（Ｉ）で表されるピリミジンヌクレオシドはシチジンまたはデオキシシチジンではない、請求項１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項４】
非天然ピリミジンヌクレオシドが、非天然に生ずるピリミジン塩基を含む、請求項３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項５】
非天然に生ずるピリミジン塩基が、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシンおよび４−チオウラシルからなる群から選択される、請求項４に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項６】
非天然に生ずるピリミジン塩基が、５−ヒドロキシシトシンおよびＮ４−エチルシトシンからなる群から選択される、請求項４に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７】
式（Ｉ）で表される非天然ピリミジンヌクレオシドが、非天然に生ずる糖部分を含む、請求項４に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８】
非天然に生ずる糖部分がアラビノースである、請求項７に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項９】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって、式（ＩＩ）：
５’――――Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４――――３’　　（ＩＩ）
式中、
Ｙは、シチジン、２’−デオキシシチジンまたは非天然ピリミジンヌクレオシドであり；
Ｚは、グアノシン、２’−デオキシグアノシンまたは非天然プリンヌクレオシドであり；
Ｘ１は、天然に生ずるヌクレオシドまたはＣ３−アルキルリンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカーおよびβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｘ２は、天然に生ずるヌクレオシドまたはアミノリンカーである免疫刺激部分であり；
Ｘ３は、天然に生ずるヌクレオシドまたはヌクレオシドメチルホスホネートである免疫刺激部分であり；
Ｘ４は、天然に生ずるヌクレオシドまたはヌクレオシドメチルホスホネートおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
但し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つが免疫刺激部分である、
で表される免疫刺激ドメインを含む、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０】
Ｙが、非天然ピリミジンヌクレオシドである、請求項９に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１１】
Ｙが、式（Ｉ）：
【化２】
2004509970.tif 000008
式中、Ｄは水素結合供与体であり、Ｄ’は水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子吸引基および電子供与基からなる群から選択され、Ａは水素結合受容体または親水基であり、Ｘは炭素または窒素であり、およびＳはペントースまたはヘキソース糖環である、を有し、但し、Ｙはシチジンまたはデオキシシチジンではない、請求項１０に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１２】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって、式（ＩＩＩ）：
５’−Ｕｍ．．．．．．．Ｕ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４−Ｄ１．．．．．．．．Ｄｍ−３’　　　（ＩＩＩ）
式中：
Ｙは、非天然ピリミジンヌクレオシドであり；
Ｚは、グアノシン、２’−デオキシグアノシンまたは非天然プリンヌクレオシドであり；
各Ｘは、独立して、天然に生ずるヌクレオシドまたは免疫刺激部分であり；
式中、Ｕｍ−Ｕ１は、上流増強ドメインを示し、ここで、各Ｕは、独立して、天然に生ずるヌクレオシドまたは免疫刺激部分であり；
式中、Ｄ１−Ｄｍは、下流増強ドメインを示し、ここで、各Ｄは、独立して、天然に生ずるヌクレオシドまたは免疫刺激部分であり；および
ｍは、各場合において、０〜３０の数を示す、
で表される配列を含む、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１３】
少なくとも１つのＸ、ＵまたはＤが、免疫刺激部分である、請求項１２に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１４】
Ｘ１が、天然に生ずるヌクレオシドまたはＣ３−アルキルリンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカーおよびβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｘ２が、天然に生ずるヌクレオシドまたはアミノリンカーである免疫刺激部分であり；
Ｘ３が、天然に生ずるヌクレオシドまたはヌクレオシドメチルホスホネートである免疫刺激部分であり；
Ｘ４が、天然に生ずるヌクレオシドまたはヌクレオシドメチルホスホネートおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｕ１が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボース、Ｃ３−リンカーおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｕ２が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボース、Ｃ３−リンカー、スペーサー１８、３’−デオキシヌクレオシド、ヌクレオシドメチルホスホネート、β−Ｌ−デオキシヌクレオシドおよび２’−Ｏ−プロパルギルリボヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｕ３が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボース、Ｃ３−リンカー、スペーサー９、スペーサー１８、ヌクレオシドメチルホスホネートおよび２’−５’結合からなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｄ１が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボースおよびヌクレオシドメチルホスホネートからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｄ２が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボース、Ｃ３−リンカー、スペーサー９、スペーサー１８、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、ヌクレオシドメチルホスホネートおよびβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；および
Ｄ３が、天然に生ずるヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオシド、２’−Ｏ−プロパルギルリボヌクレオシドおよび２’−５’結合からなる群から選択される免疫刺激部分である；
請求項１３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１５】
Ｕ２およびＵ３が、両方ともに、１’，２’−ジデオキシリボース、Ｃ３−リンカーおよびβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドからなる群から選択される同一の免疫刺激部分である、請求項１３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１６】
Ｕ３およびＵ４が、両方ともに、ヌクレオシドメチルホスホネートおよび２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドからなる群から選択される同一の免疫刺激部分である、請求項１３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１７】
Ｕ５およびＵ６が、両方ともに、１’，２’−ジデオキシリボースおよびＣ３−リンカーからなる群から選択される同一の免疫刺激部分である、請求項１３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１８】
Ｘ１およびＵ３が、両方ともに、１’，２’−ジデオキシリボースである、請求項１３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１９】
Ｄ２およびＤ３が、両方ともに、１’，２’−ジデオキシリボースおよびβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドからなる群から選択される同一の免疫刺激部分である、請求項１３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２０】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって：
式５’−ピリミジン−プリン−３’、式中、ピリミジンは天然または非天然ピリミジンヌクレオシドであり、およびプリンは天然または非天然プリンヌクレオシドである、で表される免疫刺激ジヌクレオチド；
３’−３’結合；および
１つまたは２つのアクセス可能な５’−末端；
を含み、但し、オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１のｇａｇまたはｔａｔ遺伝子に相補的ではない、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、２つのアクセス可能な５’−末端を含む、請求項２０に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２２】
免疫刺激ジヌクレオチドが、非天然ピリミジンヌクレオシドを含む、請求項２０に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２３】
非天然に生ずるピリミジン塩基を含むジヌクレオチドアナログを免疫刺激ドメインに導入することを含む、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の免疫刺激効果を調節するための方法。
【請求項２４】
免疫刺激部分を免疫刺激ドメインおよび／または増強ドメインに導入することを含む、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の免疫刺激効果を調節するための方法。
【請求項２５】
３’−３’結合をオリゴヌクレオチドに導入することを含む、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の免疫刺激効果を調節するための方法。
【請求項２６】
患者に免疫応答を引き起こすための方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物が、抗生物質、抗原、アレルゲン、ワクチン、抗体、細胞毒性剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバントまたはこれらの組み合わせと組み合わせて投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物が、抗原またはワクチンと結合している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
結合がオリゴヌクレオチド化合物の３’−末端へのものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
病原体による疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３１】
病原体がウイルスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
病原体が寄生虫である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
病原体がバクテリアである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
癌患者を処置するための方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３５】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物が、化学療法化合物と組み合わせて投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
自己免疫疾患を処置するための方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３７】
自己免疫疾患が自己免疫性の喘息である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
気道炎症またはアレルギーを処置するための方法であって、請求項１〜２２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、免疫治療用途における、免疫刺激剤としてのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの治療的な使用に関する。
【０００２】
関連技術の概要
オリゴヌクレオチドは、現代の分子生物学において、不可欠のツールとなっており、ＰＣＲの診断プローブ法から遺伝子発現のアンチセンス阻害および免疫治療用途に至るまで、多種多様の技術に使用されている。
オリゴヌクレオチドのこの広範囲に及ぶ使用は、オリゴヌクレオチドを合成するための迅速、安価かつ効率的な方法に対する増大する需要をもたらした。
【０００３】
アンチセンスおよび診断用途のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在では、日常的に達成できる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２０： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ ｐｐ． １６５−１８９ （Ｓ． Ａｇｒａｗａｌ， Ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９３）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ． ８７−１０８ （Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｅｄ．， １９９１）； ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ， ｓｕｐｒａ． Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ｉｙｅｒ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ６： １２ （１９９５）； およびＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３）を参照。初期の合成方法は、ホスホジエステルおよびホスホトリエステル化学を含んでいた。
【０００４】
Ｋｈｏｒａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ７２： ２０９ （１９７２）には、オリゴヌクレオチド合成のためのホスホジエステル化学が開示されている。Ｒｅｅｓｅ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３４： ３１４３−３１７９ （１９７８）には、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成のためのホスホトリエステル化学が開示されている。これらの初期の方法は、大幅に、合成において一層効率的なホスホラミダイトおよびＨ−ホスホネート方法に移行した。Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２２： １８５９−１８６２ （１９８１）には、ポリヌクレオチド合成におけるデオキシヌクレオシドホスホラミダイトの使用が開示されている。Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ｚａｍｅｃｎｉｋ， 米国特許第５，１４９，７９８号（１９９２）には、Ｈ−ホスホネート方法による最適化されたオリゴヌクレオチド合成が開示されている。
【０００５】
これらの現代的な方法の両方は、種々の修飾されたヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドの合成に使用されている。Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２８： ３５３９−３５４２ （１９８７）には、ホスホラミダイト化学を用いるオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成が教示されている。Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３： ３４４３ （１９８４）には、ホスホラミダイト化学を用いるオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成が開示されている。Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７： ７２３７ （１９８８）には、ホスホラミダイト化学を用いるオリゴヌクレオチドホスホラミデートの合成が開示されている。Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ７０７９−７０８３ （１９８８）には、Ｈ−ホスホネート化学を用いるオリゴヌクレオチドホスホラミデートおよびホスホロチオエートの合成が開示されている。
【０００６】
さらに最近、数人の研究者が、免疫治療用途における免疫刺激剤としてのオリゴヌクレオチドの使用の有効性を例証した。ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫刺激を誘導することができるという観察は、治療のツールとして、この副作用を開発する興味を引き起こした。これらの取り組みは、ジヌクレオチドＣｐＧを含有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを対象とした。
【０００７】
Ｋｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８３： １１２８−１１３１ （１９９２）には、ＣｐＧジヌクレオチドを含むパリンドロームを含有するホスホジエステルが、インターフェロン−αおよびγ合成を誘導し、並びにナチュラルキラー活性を増強することができることが教示されている。Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７１： ５４６−５４９ （１９９５）には、ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、免疫刺激性であることが開示されている。Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８： １１１９−１１２９ （１９９６）には、このようなオリゴヌクレオチドが、ヒトＢ細胞を活性化させることが開示されている。
【０００８】
Ｐｉｓｅｔｓｋｙ， Ｄ． Ｓ．； Ｒｉｃｈ Ｃ． Ｆ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５４： １０１ （１９９４）には、ＣｐＧ−オリゴの免疫刺激活性が、さらに、これらのオリゴ上のホスホロチオエート（ＰＳ）バックボーンの存在により増強されることが教示されている。Ｔｏｋｕｎａｇａ， Ｔ．； Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｔ．； Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｓ． Ｊａｐ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ５２： １ （１９９９）には、ＣｐＧ−オリゴの免疫刺激活性が、ＣｐＧ−モチーフの位置およびＣｐＧ−モチーフの近傍に位置する配列に依存することが教示されている。ＣｐＧ−オリゴによる免疫刺激の活性化機構は十分に理解されていなかった。しかし、Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｔ．； Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｓ．； Ｋａｔａｏｋａ， Ｔ．； Ｔｏｋｕｎａｇａ， Ｔ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３８： ８３１ （１９９４）には、ＣｐＧ−オリゴが、まだ特徴づけされていない細胞内レセプター／タンパク質に結合することにより、免疫カスケードを誘導することが示唆されている。
【０００９】
数人の研究者は、これが、最終的に、ストレスキナーゼ経路、ＮＦ−κＢの活性化およびＩＬ−６、ＩＬ−１２、γ−ＩＦＮおよびＴＮＦ−αなど種々のサイトカインの誘導を引き起こすことを見出した（例えば、Ｋｌｉｎｍａｎ， Ｄ． Ｍ．； Ｙｉ， Ａ． Ｋ．； Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ． Ｌ．； Ｃｏｎｏｖｅｒ， Ｊ．； Ｋｒｉｅｇ， Ａ． Ｍ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９３： ２８７９ （１９９６）； Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ， Ｔ．； Ｍｉｅｔｈｋｅ， Ｔ．； Ｌｉｐｆｏｒｄ， Ｇ． Ｂ．； Ｅｒｄｍａｎｎ， Ａ．； Ｈａｅｃｋｅｒ， Ｈ．； Ｈｅｅｇ， Ｋ．； Ｗａｇｎｅｒ， Ｈ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７： １６７１ （１９９７）； Ｌｉｐｆｏｒｄ， Ｇ． Ｂ．； Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ， Ｔ．； Ｂａｕｅｒ， Ｍ．； Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｓ．； Ｋｏｃｈ， Ｅ． Ｓ．； Ｈｅｅｇ， Ｋ．； Ｗａｇｎｅｒ， Ｈ． Ｅｕｒ． Ｊ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７： ３４２０ （１９９７）； Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ， Ｔ．； Ｋｏｃｈ， Ｅ． Ｓ．； Ｖａｂｕｌａｓ， Ｒ． Ｍ．； Ｌｉｐｆｏｒｄ， Ｇ． Ｂ．； Ｈｅｅｇ， Ｋ．； Ｅｌｌａｒｔ， Ｊ． Ｗ．； Ｗａｇｎｅｒ， Ｈ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８： ２０４５ （１９９８）； およびＺｈａｏ， Ｑ．； Ｔｅｍｓａｍａｎｉ， Ｊ．； Ｚｈｏｕ， Ｒ． Ｚ．； Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ７： ４９５ （１９９７）を参照）。
【００１０】
抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤および抗炎症剤、ならびに免疫治療におけるアジュバントとしてのＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの使用が、報告されている （例えば、Ｄｕｎｆｏｒｄ， Ｐ． Ｊ．； Ｍｕｌｑｕｅｅｎ， Ｍ． Ｊ．； Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ９７： Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ， （Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ａｂｓｔｒａｃｔ， １９９７， ｐｐ ４０； Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．； Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ Ｅ． Ｒ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ６： ７２ （２０００）； Ｃｈｕ． Ｒ． Ｓ．； Ｔａｒｇｏｎｉ， Ｏ． Ｓ．； Ｋｒｉｅｇ， Ａ． Ｍ．； Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｐ． Ｖ．； Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｃ． Ｖ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６： １６２３ （１９９７）； Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｓ．； Ｅｇｅｔｅｒ， Ｏ．； Ｈａｕｓｍａｎｎ， Ｓ．； Ｌｉｐｆｏｒｄ， Ｇ． Ｂ．； Ｒｏｃｋｅｎ， Ｍ．； Ｗａｇｎｅｒ， Ｈ．； Ｈｅｅｇ， Ｋ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： ３６２７ （１９９８）を参照）。
【００１１】
Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ １６： １２１６−１２４ （１９９８）には、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を増強するということが教示されている。ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１： ４４６３−４４６６ （１９９８）には、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｂ型肝炎表面抗原に対する免疫応答を増強する強力なアジュバントとして作用することが教示されている。
【００１２】
Ｚｈａｏ， Ｑ．； Ｔｅｍｓａｍａｎｉ， Ｊ．； Ｉｄａｒｏｌａ， Ｐ．； Ｊｉａｎｇ， Ｚ．； Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５１： １７３ （１９９６）には、ＣｐＧ−モチーフにおけるデオキシヌクレオシドを２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドに置換することは、免疫刺激活性を抑制することが教示されており、２’−Ｏ−メチル修飾より誘導された強固なＣ３’−エンド（ｅｎｄｏ）型コンホメーションにより、免疫刺激経路に関与するタンパク質とＣｐＧ−モチーフの適切な認識および／または相互作用がなされないことが示唆されている。さらに、この文献には、ＣｐＧ−モチーフのＣとＧ間におけるリン酸基の非架橋性酸素に対するメチル基の置換が、免疫刺激活性を抑制することが教示されており、リン酸基の負電荷がタンパク質認識および相互作用のために不可欠であるということが示唆されている。
【００１３】
Ｚｈａｏ， Ｑ．； Ｙｕ， Ｄ．； Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ９： ３４５３ （１９９９）には、５’−側で、ＣｐＧ−モチーフに隣接する１つまたは２つの２’−デオキシヌクレオシドを２’−または３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドに置換することは、免疫刺激活性の減衰を引き起こすが、同じ置換がＣｐＧ−モチーフの３’−側でなされる場合は、それは微々たる影響しか有さないことが教示されている。しかし、Ｚｈａｏ， Ｑ．； Ｙｕ， Ｄ．； Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １０： １０５１ （２０００）には、５’−側のＣｐＧ−モチーフから２または３ヌクレオシド離れているデオキシヌクレオシドを１つまたは２つの２’−Ｏ−メトキシエチルまたは２’−若しくは３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドに置換することが、免疫刺激活性の著しい増強をもたらすことが教示されている。
【００１４】
免疫刺激の原因となる、タンパク質／レセプター因子の認識に必要なＣｐＧ−モチーフの正確な構造条件および特有の官能基は、未だ詳細には研究されていない。したがって、効果的な免疫刺激活性を与える新規な免疫刺激モチーフが必要である。
【００１５】
発明の概要
本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物による免疫応答を増強するための方法を提供する。本発明による方法は、免疫治療用途における免疫刺激効果を増大させること可能にする。したがって、本発明は、さらに、このようなオリゴヌクレオチド化合物を製造し、使用するための方法を提供する。
本発明者らは、驚くべきことに、免疫刺激オリゴヌクレオチドの位置的修飾が、これらの免疫刺激能力に劇的に影響することを見出した。特に、免疫刺激ドメインおよび／または増強ドメインにおける修飾は、免疫刺激効果を、再現可能かつ予測可能な方法で増強する。
【００１６】
第１の側面において、本発明は、免疫刺激ドメインおよび随意的に、１つまたは２つ以上の増強ドメインを含む免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を提供する。いくつかの態様において、免疫刺激ドメインは、非天然に生ずるピリミジン塩基を含んでいるジヌクレオチドアナログを含む。いくつかの態様において、免疫刺激ドメインおよび／または増強ドメインは、以下に記載されるように、特定の位置に免疫刺激部分を含む。いくつかの態様において、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、３’−３’結合を含む。一態様において、そのような３’−３’結合のオリゴヌクレオチドは、２つのアクセス可能な（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）５’−末端を有する。
【００１７】
第２の側面において、本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の免疫刺激効果を調節するための方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、免疫刺激ドメインに非天然に生ずるピリミジン塩基を含むジヌクレオチドアナログを導入することを含む。いくつかの態様において、本方法は、以下に記載されるように特定の位置で、免疫刺激部分を免疫刺激ドメインおよび／または増強ドメインに導入することを含む。いくつかの態様において、本方法は、３’−３’結合をオリゴヌクレオチドに導入することを含む。
【００１８】
第３の側面において、本発明は、患者に免疫応答を引き起こすための方法であって、本発明による免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
第４の側面において、本発明は、病原体による疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、本発明による免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
第５の側面において、本発明は、癌患者を処置するための方法であって、本発明による免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
第６の側面において、本発明は、自己免疫性の喘息などの自己免疫疾患を処置するための方法であって、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。投与は、本発明の第３の側面で記載したように実施する。
【００２２】
第７の側面において、本発明は、気道炎症またはアレルギーを処置するための方法であって、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。投与は、本発明の第３の側面で記載したように実施する。
【００２３】
詳細な説明
本発明は、免疫治療用途における免疫刺激剤としてのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの治療的な使用に関する。本明細書中で引用した特許および刊行物は、当該分野における知識のレベルを反映し、これらの全体が、参照により本出願中に組み込まれる。本明細書中に引用した任意の参考文献の任意の教示と本明細書との間に矛盾がある場合には、本発明に関しては、後者が優勢でなければならない。
【００２４】
本発明は、免疫治療用途における免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物による免疫応答を増強するための方法を提供する。したがって、本発明は、さらに、免疫治療のための最適レベルの免疫刺激効果を有する化合物、並びにそのようなオリゴヌクレオチド化合物を製造し、使用するための方法を提供する。
【００２５】
本発明者らは、驚くべきことに、免疫刺激オリゴヌクレオチドに導入された位置的化学修飾が、これらの免疫刺激能力に劇的に影響することを見出した。特に、免疫刺激ドメインおよび／または増強ドメインにおける修飾は、免疫刺激効果を、所望の用途に対して再現可能な様式で増強することができる。
【００２６】
第１の側面において、本発明は、免疫刺激ドメインおよび随意的に、１つまたは２つ以上の増強ドメインを含む免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を提供する。ある好ましい態様において、免疫刺激ドメインは、非天然ピリミジンヌクレオシドを含んでいるジヌクレオチドアナログを含む。
【００２７】
本発明の全ての側面に関して、用語「オリゴヌクレオチド」は、２または３以上のデオキシリボヌクレオシドのポリマー、または２’−若しくは３’−置換ヌクレオシド、２’−若しくは３’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、デアザヌクレオシドまたはこれらの任意の組み合わせを含む、任意の修飾されたヌクレオシドのポリマーを含む。このようなモノマーは、互いに、既知の種々のヌクレオシド間結合のいずれかにより結合させることができる。ある好ましい態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホラミデート結合であってもよく、前記の任意の３’−５’、２’−５’、３’−３’および５’−５’結合またはこれらの組み合わせを含む。
【００２８】
用語オリゴヌクレオチドはまた、化学的に修飾された塩基または糖を有し、および／または、限定せずに親油性基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含む、追加の置換基を有するようなポリマーを包含する。用語オリゴヌクレオチドはまた、以下でさらに記載されるように、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロック（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸並びに非ペントース糖（例えばヘキソース）またはアベーシック（ａｂａｓｉｃ）糖のバックボーン若しくはバックボーン部分を含むオリゴヌクレオチドおよびノンシュガーリンカー若しくはスペーサー基を有するバックボーン部分を含むオリゴヌクレオチドを包含する。
【００２９】
本発明に関して、用語「２’−置換」および「３’−置換」は、（それぞれ）ペントース部分の２’（または３’）位置のハロゲン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、または１〜６個の飽和若しくは不飽和炭素原子を含有する−Ｏ−低級アルキル基での、あるいは２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基での置換を意味し、ここで、このようなアルキル、アリールまたはアリル基は、非置換であってもよく、または、例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボニル、カルバルコキシまたはアミノ基で置換されてもよく；または、このような２’置換は、水酸基（リボヌクレオシドを生成するため）またはアミノ基によるものでもよいが、２’（または３’）Ｈ基によるものではない。
【００３０】
本発明に関して、用語「免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物」は、それがなければ該化合物が免疫刺激効果を有さないであろう、免疫刺激ジヌクレオチドを含む化合物を意味する。「免疫刺激ジヌクレオチド」は、式５’−ピリミジン−プリン−３’、式中、「ピリミジン」は、天然または非天然ピリミジンヌクレオシドであり、および「プリン」は、天然または非天然プリンヌクレオシドである、を有するジヌクレオチドである。このような免疫刺激ジヌクレオチドの１種は、ＣｐＧである。
【００３１】
用語「ＣｐＧ」または「ＣｐＧジヌクレオチド」は、ジヌクレオチド５’−デオキシシチジン−デオキシグアノシン−３’を意味し、ここで、ｐは、ヌクレオチド間結合であり、好ましくは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートから選択される。
【００３２】
本発明に関して、用語「ジヌクレオチドアナログ」は、上記の免疫刺激ジヌクレオチドであり、ここで、ピリミジンおよびプリンヌクレオシドの一方または両方は、非天然ヌクレオシドである。「非天然」ヌクレオシドは、非天然に生ずる塩基および／または非天然に生ずる糖部分を含有するものである。
【００３３】
本発明に関して、塩基は、それがチミン、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルからなる群から選択されない場合、非天然とみなされる。用語「Ｃ＊ｐＧ」および「ＣｐＧ＊」は、各々、シチジンアナログ（非天然ピリミジンヌクレオシド）またはグアノシンアナログ（非天然プリンヌクレオシド）を含む免疫刺激ジヌクレオチドアナログを示す。
【００３４】
図２７は、ＣｐＧ−モチーフの化学構造を示しており、シトシンの水素結合受容基および水素結合供与基として作用する官能基を示している。シトシンは、２つの水素結合受容基を位置２（ケト−酸素）および位置３（窒素）に、および水素結合供与基を位置４（アミノ基）に有する。これらの基は、免疫刺激を担うレセプターとの、潜在的な認識および相互作用基として働くことができる。
【００３５】
図２８は、天然シトシンと同型構造であり、５−メチル−デオキシシトシン（２）、５−メチル−デオキシイソシトシン（３）、５−ヒドロキシ−デオキシシトシン（４）、デオキシウリジン（５）、Ｎ４−エチル−デオキシシトシン（６）およびデオキシ−Ｐ−塩基（７）を含むシトシンアナログを示す。
【００３６】
したがって、一態様において、免疫刺激ジヌクレオチドは、構造（Ｉ）：
【化３】
2004509970.tif 000002
【００３７】
（Ｉ）において、Ｄは、水素結合供与体であり、Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子吸引基および電子供与基からなる群から選択され、Ａは、水素結合受容体であり、Ｘは、炭素または窒素であり、およびＳは、ピリミジン塩基に連結されたペントースまたはヘキソース糖環である、で表されるピリミジンヌクレオシドを含むいくつかの態様において、ピリミジンヌクレオシドは、非天然ピリミジンヌクレオシドであり、すなわち、構造（Ｉ）で表される化合物は、シチジンまたはデオキシシチジンではない。
【００３８】
いくつかの態様において、（Ｉ）の塩基部分は、非天然に生ずるピリミジン塩基である。好ましい非天然に生ずるピリミジン塩基の例は、限定されることなく、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくは、Ｎ４−エチルシトシンおよび４−チオウラシルを含む。
【００３９】
いくつかの態様において、（Ｉ）の糖部分Ｓは、非天然に生ずる糖部分である。本発明に関して、「天然に生ずる糖部分」は、リボースまたは２’−デオキシリボースであり、そして「非天然に生ずる糖部分」は、ヌクレオチドにおけるバックボーンに用いることができる、リボースまたは２’−デオキシリボース以外のいずれかの糖である。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、好ましい非天然に生ずる糖部分の例である。
【００４０】
本発明による免疫刺激ドメインは、免疫刺激天然ジヌクレオチドまたは非天然ジヌクレオチドアナログの片側あるいは両側の免疫刺激部分を含んでもよい。例えば、免疫刺激ドメインは、以下のように描写されてもよく、
５’――――――Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４――――――３’
ここで、Ｙは、シチジンまたは非天然ピリミジンヌクレオシドアナログを示し、Ｚは、グアノシンまたは非天然プリンヌクレオシドアナログを示し、および各Ｘは、独立して、本発明によるヌクレオシドまたは免疫刺激部分を示す。
【００４１】
「免疫刺激部分」は、免疫刺激部分を欠くものより高免疫刺激性の免疫刺激オリゴヌクレオチドをもたらす、免疫刺激ドメインまたは増強ドメイン中の特定の位置における化学構造である。
【００４２】
好ましい免疫刺激部分は、限定されることなく、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、ボラノホスホネート、ホスホラミデート、特に、一級アミノホスホラミデート、Ｎ３−ホスホラミデートおよびＮ５−ホスホラミデート、並びに立体特異的な結合（例えば、（Ｒ）−または（Ｓ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル結合）を含む、リン酸バックボーンにおける修飾を含む。
【００４３】
本発明による好ましい免疫刺激部分は、さらに、限定されることなく、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボースおよび２’−デオキシ−２’−フルオロリボースを含む２’−置換ペントース糖；限定されることなく、３’−Ｏ−メチルリボースを含む３’−置換ペントース糖；１’，２’−ジデオキシリボース；限定されることなく、アラビノース、１’−メチルアラビノース、３’−ヒドロキシメチルアラビノース、４’−ヒドロキシメチルアラビノースおよび２’−置換アラビノースを含むヘキソース糖；並びにα−アノマーを、限定されることなく含む糖修飾を有するヌクレオシドを含む。
【００４４】
本発明による好ましい免疫刺激部分は、他の炭水化物バックボーン修飾および置換を有し、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸を含むオリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを有するバックボーン部分を有するオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００４５】
アルキルリンカーは、分枝状または非分枝状であってもよく、置換されていてもまたは非置換であってもよく、および光学的に純粋であってもまたはラセミ混合物でもよい。最も好ましくは、約２〜約１８個の炭素原子を有するこのようなアルキルリンカーである。
【００４６】
いくつかの好ましい態様において、このようなアルキルリンカーは、約３〜約９個の炭素原子を有する。このようなアルキルリンカーは、ポリエチレングリコールリンカー［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ（ｎ＝２〜９）を含む。いくつかの好ましい態様において、このようなアルキルリンカーは、ペプチドまたはアミノ酸を含んでもよい。
【００４７】
本発明による好ましい免疫刺激部分は、さらに、限定されることなく、β−Ｌ−デオキシヌクレオシドおよびα−デオキシヌクレオシドを含むＤＮＡアイソフォームを含む。本発明による好ましい免疫刺激部分は、さらに、限定されることなく、２’−５’、２’−２’、３’−３’および５’−５’結合を含む、非天然なヌクレオシド間結合位置を有するヌクレオシドを含む。
【００４８】
本発明による好ましい免疫刺激部分は、さらに、限定されることなく、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン、好ましくは、Ｎ４−エチルデオキシシチジン、４−チオウリジン、６−チオデオキシグアノシン、７−デアザグアノシンおよびニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、および限定されることなく、２，６−ジアミノプリンを含むジアミノプリンを含む、修飾された複素環式の塩基を有するヌクレオシドを含む。
【００４９】
具体的な説明のために、そして限定することを目的とせずに、例えば、前記の免疫刺激ドメインにおいて、
５’――――――Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４――――――３’
位置Ｘ３またはＸ４のヌクレオシドメチルホスホネートは免疫刺激部分であり、位置Ｘ１の置換または非置換アルキルリンカーは、免疫刺激部分であり、そして位置Ｘ１のβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドは、免疫刺激部分である。免疫刺激ドメイン中の免疫刺激部分の代表的な位置および構造については、以下の表１を参照。
【００５０】
【表１】
2004509970.tif 000003
【００５１】
いくつかの態様において、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、さらに、増強ドメインを含む。
「増強ドメイン」は、増強ドメインを含有する場合に、増強ドメインを欠くオリゴヌクレオチドより高免疫刺激性のオリゴヌクレオチドをもたらす、免疫刺激ドメイン以外の免疫刺激オリゴヌクレオチドアナログの領域である。
【００５２】
増強ドメインは、免疫刺激ドメインに対して上流または下流であることができる。用語「上流」は、免疫刺激ジヌクレオチドまたはジヌクレオチドアナログ（Ｙ−Ｚ）の５’側の位置を示すために用いられる。用語「下流」は、Ｙ−Ｚの３’側の位置を示すために用いられる。
【００５３】
例えば、免疫刺激オリゴヌクレオチドアナログは、構造
５’−Ｕ９−Ｕ８−Ｕ７−Ｕ６−Ｕ５−Ｕ４−Ｕ３−Ｕ２−Ｕ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４−Ｎ−Ｎ−Ｎ−３’
を有してもよく、ここで、Ｕ９〜Ｕ１は、上流増強ドメインを示し、ここで、各Ｕは、独立して、同一または異なるヌクレオシド免疫刺激部分を示し、Ｎは、任意のヌクレオシドを示し、およびＸ１〜Ｘ４、ＹおよびＺは、前記と同様である。
【００５４】
代替的に、免疫刺激オリゴヌクレオチドアナログは、構造
５’−Ｎ−Ｎ−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｄ５−Ｄ６−Ｄ７−Ｄ８−３’
を有してもよく、ここで、Ｄ１〜Ｄ８は、下流増強ドメインを示し、ここで、各Ｄは、独立して、同一または異なるヌクレオシドまたは免疫刺激部分を示し、および他の記号の全ては、上記と同様である。
【００５５】
これらの構成において、Ｕ６の免疫刺激部分は、免疫刺激ジヌクレオチドまたはジヌクレオチドアナログから６位置上流であり、およびＤ４の免疫刺激部分は、免疫刺激ジヌクレオチドまたはジヌクレオチドアナログから４位置下流であろう。
【００５６】
任意のＵまたはＤ位置は、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログであるか、またはそうでなくてもよい免疫刺激部分を示すことができるため、ヌクレオシドよりむしろ用語「位置」が用いられる。当然ながら、上流および下流増強ドメインの両方を有するオリゴヌクレオチドアナログは構築可能である。
【００５７】
表２は、上流増強ドメインを有する免疫刺激オリゴヌクレオチド中の免疫刺激部分の代表的な位置と構造を示す。表２および３に記載のスペーサー９およびスペーサー１８の定義については、図７を参照。
【表２】
2004509970.tif 000004
【００５８】
表３は、下流増強ドメインを有する免疫刺激オリゴヌクレオチド中の免疫刺激部分の代表的な位置と構造を示す。
【表３】
2004509970.tif 000005
【００５９】
本発明の別の態様において、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有する。本発明者らは、免疫刺激ジヌクレオチドに対し５’領域での免疫刺激部分は、免疫刺激ジヌクレオチドに対し３’領域での同様の置換よりも免疫刺激活性に対する影響が増大であることを見出した。
【００６０】
この観察は、ＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの５’−フランキング領域は、免疫刺激活性において、重要な役割を果たすことを示唆する。さらに、本発明者らは、３’−５’または３’−３’結合を介して連結した２つのオリゴヌクレオチドユニットを有する化合物は、５’−５’結合を介して連結した２つのオリゴヌクレオチドユニットの化合物より高い免疫刺激活性を有することを見出した。
【００６１】
したがって、いくつかの好ましい態様において、本発明による免疫刺激オリゴヌクレオチドは、３’−３’結合を含む。いくつかのそのような態様において、オリゴヌクレオチドは、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有する。
【００６２】
第２の側面において、本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を調節するための方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、本発明の第一の側面で記載したように、免疫刺激ドメインに非天然に生ずるピリミジン塩基を含むジヌクレオチドアナログを導入することを含む。
【００６３】
いくつかの態様において、本方法は、上記のように、特定の位置で免疫刺激部分を免疫刺激ドメインおよび／または増強ドメインに導入することを含む。いくつかの態様において、本方法は、３’−３’結合をオリゴヌクレオチドに導入することを含む。
【００６４】
本発明に関して、特定の位置で、「免疫刺激部分を導入すること」は、単に、特定された位置で免疫刺激部分を有するオリゴヌクレオチドを合成することを意味する。例えば、「位置Ｕ６に免疫刺激部分を導入すること」は、単に、例えば以下の構造
５’−Ｕ９−Ｕ８−Ｕ７−Ｕ６−Ｕ５−Ｕ４−Ｕ３−Ｕ２−Ｕ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３−３’
を参照し、そのような位置で免疫刺激部分を有するオリゴヌクレオチドを合成することを意味する。
【００６５】
好ましくは、本発明のこの側面による方法は、表１〜３に記載した好ましい置換パターンによる免疫刺激ドメインまたは上流若しくは下流増強ドメインの位置で、免疫刺激部分を導入することを含む。
【００６６】
本発明のこの側面による方法は、単に、所望の位置を得るための適切なサイクル中における合成方法において、適切な免疫刺激部分のモノマーシントンを用いることにより、よく知られた合成手法のいずれかを用いて、好都合に実施することができる。
【００６７】
好ましいモノマーは、ホスホラミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネートを含む。ＰＳ−オリゴは、簡易に、例えば、適切なホスホラミダイトを用いるＣＰＧ−固体担体で、β−シアノエチルホスホラミダイト化学を用いて合成し、必要に応じて、脱保護し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣにより精製し、蒸留水に対して透析し、および凍結乾燥する。各ＰＳ−オリゴの純度は、簡易に、ＣＧＥにより測定され、そして分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析により確認できる。
【００６８】
第３の側面において、本発明は、患者の免疫応答を引き起こすための方法であって、本発明によるオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００６９】
本発明のこの側面による方法において、好ましくは、化合物の投与は、非経口、経口、舌下、経皮的、局所的、鼻腔内、気管内、膣内または直腸内である。治療組成物の投与は、既知の手順を用いて、疾患の症状または代用のマーカーを減少させるのに有効な投与量および期間で実施することができる。全身的に投与する場合、治療組成物を、好ましくは、約０．００１マイクロモル〜約１０マイクロモルのオリゴヌクレオチドの血中レベルを達成するのに十分な投与量で投与する。
【００７０】
局所的投与において、これよりもはるかに低い濃度が有効であり得、およびはるかに高い濃度が耐容され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドの合計投与量は、患者あたり１日約０．１ｍｇのオリゴヌクレオチド〜体重１ｋｇあたり１日約４０ｍｇのオリゴヌクレオチドの範囲内であろう。治療に有効な量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは逐次的に、個体に、単一の処置エピソードとして投与することが望ましいだろう。
【００７１】
いくつかの例において、上記定義より低い投与量でも効果を与え得る。好ましい態様において、対象となる組成物を投与した後に、補体の活性化、有糸分裂の誘導およびトロンビン血餅形成の阻害からなる群から選択された生物学的効果の１または２以上の測定を行う。
【００７２】
ある好ましい態様において、本発明による化合物を、抗生物質、抗原、アレルゲン、ワクチン、抗体、細胞毒性剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、ＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバントと組み合わせて投与して、免疫応答の特異性または規模を増大する。化合物若しくはワクチンのいずれか、または両方を、随意に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質または任意の他の免疫原性担体タンパク質に結合させることができる。限定されることなく、完全フロイントアジュバント、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＱＳ−２１を含むサポニン、ミョウバンおよびこれらの組み合わせを含む、多くの任意のアジュバントを用いてもよい。
【００７３】
本発明による方法の、ある好ましい態様は、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の投与により、サイトカインを誘導する。ある好ましい態様において、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を、抗原、ハプテンまたはワクチンに結合させる。上記のように、本発明者らは、アクセス可能な５’−末端が、ある免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の活性に非常に重要であることを見出した。したがって、最適の免疫刺激活性のために、オリゴヌクレオチドを、好ましくは、オリゴヌクレオチド化合物の３’−末端によって、抗原またはワクチンに結合させる。
【００７４】
この側面に関して、「組み合わせて」は、同一の患者において、同一の疾患を処置する経過において、を意味し、オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントを、同時投与および数日間隔までの時間的に離間した順序を含む任意の順序で投与することを含む。
【００７５】
このような組み合わせ処置はまた、オリゴヌクレオチドおよび／または独立してワクチンおよび／または独立してアジュバントの一回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一または異なる経路からであってもよい。
本発明のこの側面による方法は、免疫系のモデル研究のために有用であり、さらにヒトまたは動物疾患の治療的処置に有用である。
【００７６】
第４の側面において、本発明は、病原体による疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、患者に本発明によるオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を投与することを含む方法を提供する。投与は、本発明の第３の側面における記載のように実施する。
【００７７】
第５の側面において、本発明は、癌患者を処置するための方法であって、患者に本発明によるオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を投与することを含む方法を提供する。投与は、本発明の第３の側面における記載のように実施する。
【００７８】
第６の側面において、本発明は、自己免疫性の喘息などの自己免疫疾患を処置するための方法であって、患者に本発明によるオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を投与することを含む方法を提供する。投与は、本発明の第３の側面における記載のように実施する。
【００７９】
第７の側面において、本発明は、気道炎症またはアレルギーを処置するための方法であって、患者に本発明によるオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を投与することを含む方法を提供する。投与は、本発明の第３の側面における記載のように実施する。
【００８０】
以下の例は、本発明のある好ましい態様をさらに説明することを意図するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００８１】
例
例１：免疫調節部分を含むオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９， ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて、１マイクロモル規模で合成した。標準的なデオキシヌクレオシドホスホラミダイトは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た。１’，２’−ジデオキシリボースホスホラミダイト、プロピル−１−ホスホラミダイト、２’−デオキシ−５−ニトロインドール−リボフラノシルホスホラミダイト、２’−デオキシ−ウリジン−ホスホラミダイト、２’−デオキシ−Ｐホスホラミダイト、２’−デオキシ−２−アミノプリンホスホラミダイト、２’−デオキシ−ネブラリンホスホラミダイト、
【００８２】
２’−デオキシ−７−デアザグアノシンホスホラミダイト、２’−デオキシ−４−チオウリジンホスホラミダイト、２’−デオキシ−イソグアノシンホスホラミダイト、２’−デオキシ−５−メチルイソシトシンホスホラミダイト、２’−デオキシ−４−チオチミジンホスホラミダイト、２’−デオキシ−Ｋホスホラミダイト、２’−デオキシ−２−アミノアデノシンホスホラミダイト、２’−デオキシ−Ｎ４−エチル−シトシンホスホラミダイト、２’−デオキシ−６−チオグアノシンホスホラミダイト、２’−デオキシ−７−デアザ−キサントシンホスホラミダイト、
【００８３】
２’−デオキシ−８−ブロモグアノシンホスホラミダイト、２’−デオキシ−８−オキソグアノシンホスホラミダイト、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシトシンホスホラミダイト、アラビノ−シトシンホスホラミダイトおよび２’−デオキシ−５−プロピンシトシンホスホラミダイトは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ）から得た。２’−デオキシ−イノシンホスホラミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ （Ａｓｈｌａｎｄ， ＭＡ）から得た。
【００８４】
通常のカップリングサイクルまたはホスホラミダイト製造業者により推奨されるカップリングサイクルを、全てのホスホラミダイトに用いた。ホスホロチオエート修飾を得るために、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬をオキシダントとして用いた。合成後、オリゴヌクレオチドを、ＣＰＧ−結合オリゴヌクレオチドを濃縮水酸化アンモニウムとともに、室温で１．５〜２時間インキュベートし、次いで、水酸化アンモニウム上清を５５℃で１２時間インキュベートし、またはホスホラミダイト製造業者により推奨されるようにして、脱保護した。
【００８５】
水酸化アンモニウム溶液を、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃにおいて蒸発乾固し、５’−ＤＭＴｒ−オリゴヌクレオチドをＣ１８逆相マトリックスにおけるＨＰＬＣにより、０．１Ｍ酢酸アンモニウムおよび１：５比率のアセトニトリル中の０．１Ｍ酢酸アンモニウムの溶媒系を用いて精製した。次いで、オリゴヌクレオチドを、８０％酢酸で処理して、ＤＭＴｒ基を除去し、ナトリウム形態に転化し、２回蒸留水に対して透析することにより脱塩した。オリゴヌクレオチドを、０．４μ フィルターに通してろ過し、凍結乾燥し、および２回蒸留水に再溶解した。特性評価は、変性ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により達成した。
【００８６】
例２：シトシンアナログを含有するＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの合成
例１で概説された手順に従って、以下のオリゴヌクレオチドが合成された。
【表４】
2004509970.tif 000006
ａＣｐＧ−モチーフは、下線で示されている。Ｃ＊は、５−ヒドロキシシトシン（オリゴ２および３）またはＮ４−エチルシトシン（オリゴ４および５）を示す。
【００８７】
オリゴヌクレオチドは、ＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｂｒｕｃｋｅｒ Ｐｒｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分析計の３３７ｎｍ Ｎ２レーザー）により特性評価した。各オリゴヌクレオチドにおける観察分子量および計算分子量（括弧で示される）は、以下のとおりである：オリゴ１、５７０４（５７０４．８）；オリゴ２、５７２０（５７２０．８）；オリゴ３、５６８１（５６８０．７）；オリゴ４、５７３３、（５７３３）；オリゴ５、５６９４（５６９３）。
【００８８】
例３：処置マウスにおける脾臓重量の分析
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜５週齢、１９〜２１ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）を、本研究に用いた。その動物に商用の食餌および水を制限せずに与えた。その動物に、滅菌ＰＢＳに溶解した免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の５または１０ｍｇ／ｋｇ用量を注入した。マウスの一群に、コントロール（ＰＢＳ）として、ＰＢＳのみを与えた。各免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物に対し、４匹の動物を用いた。マウスを７２時間後に屠殺し、脾臓を摘出し、重量を測定した。
【００８９】
例４：マウスリンパ球増殖アッセイにおける免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の分析
ＣＤ−１、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４〜８週齢）からの脾臓を、リンパ球源として用いた。ガラススライドのフロストされた末端で、穏やかに細分し、単細胞浮遊液を調製した。次いで、細胞を、ＲＰＭＩ完全培地［１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（５６℃で３０分間、熱不活化）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン加ＲＰＭＩ培地］で培養した。次いで、細胞を、最終容積１００μＬの１０６細胞／ｍＬの密度で、９６ウェルディッシュに播いた。
【００９０】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物またはＬＰＳ（リポ多糖類）を１０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、細胞培養物に加えた。次いで、細胞を３７℃で培養に付した。４４時間後、１μＣｉ３Ｈ−ウリジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）を、２０μＬのＲＰＭＩ培地の培養に加え、細胞を、さらに４時間、パルスラベルした。細胞を自動細胞採取装置（Ｓｋａｔｒｏｎ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ）により採取し、フィルターをシンチレーションカウンターで計測した。実験は、３回実施した。
【００９１】
例５：シトシンアナログを含有するＣｐＧ−ＰＳ−オリゴのリンパ球増殖活性
ＣｐＧ−ＰＳ−オリゴ１〜５（例４）の免疫刺激活性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスリンパ球増殖アッセイを用いて研究した。すなわち、マウス脾臓細胞を培養し、０．１、０．３、１．０および３．０μｇ／ｍＬの濃度のＣｐＧ−ＰＳ−オリゴとともに４８時間インキュベートし、そして細胞増殖を３Ｈ−ウリジンの取り込みにより測定した。
【００９２】
図２３は、マウスリンパ球培養におけるオリゴ１〜５の用量依存的細胞増殖活性を示す。用量３．０μｇ／ｍＬで、天然シチジンを有するオリゴ１は、増殖率２９．５±２．１を示した。ＣｐＧ−モチーフのデオキシシチジンのシトシン塩基が５−ヒドロキシシトシンで置換されているオリゴ２もまた、用量依存的リンパ球増殖を示した。オリゴ２においては、用量３．０μｇ／ｍＬで、増殖率２３．７±２．９が観察された。
【００９３】
ＣｐＧ−モチーフにおいて、シトシン塩基の代わりにＮ４−エチル−シトシンを含有するＰＳ−オリゴ４もまた、用量依存的細胞増殖活性を示した。オリゴ４において、用量３．０μｇ／ｍＬで観察された増殖率１８．７±１．６は、ＣｐＧ−モチーフにおけるシトシンの４−アミノ基に対するかさ高い疎水性置換の存在が、免疫刺激活性を若干妨げることを示唆する。
【００９４】
ＣｐＧ−モチーフのデオキシシチジン位置の代わりにデオキシグアノシン位置で５−ヒドロキシ−デオキシシチジンが置換されているオリゴ３は、培地コントロールにおいて観察されたのと同様の増殖率を示した（図２３）。同様に、ＣｐＧ−モチーフのデオキシグアノシンがＮ４−エチルデオキシシチジンで置換されているコントロールオリゴ５は、培地コントロールと同様の細胞増殖を示した。
【００９５】
ＣｐＧ−モチーフのシトシン塩基が、５−メチル−デオキシシトシン（２；図２８参照）、５−メチル−デオキシイソシトシン（３）、デオキシウリジン（５）またはデオキシ−Ｐ−塩基（７）で置換されている他のオリゴは、同様のアッセイシステムにおいて、細胞増殖活性がないか、またはわずかな細胞増殖活性しか示さなかった。
【００９６】
これらの結果は、（ｉ）ＣｐＧ−モチーフのシトシン塩基が５−ヒドロキシシトシンまたはＮ４−エチルシトシンで置換されている場合（それぞれオリゴ２および４）には、細胞増殖活性は維持されるが、（ｉｉ）グアニン塩基をこれらのシトシンアナログに置換することは、細胞増殖活性の損失をもたらすことを示唆するものである。
【００９７】
例６：シトシンアナログを含有するＣｐＧ−ＰＳ−オリゴにより誘導されたマウスの脾種
ＣｐＧ−ＰＳ−オリゴのインビトロでの効果を確認するために、オリゴ１、２および４（例４から）を、用量１０ｍｇ／ｋｇで、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内（ｉｐ）注入し、各ＰＳ−オリゴの免疫刺激活性のレベルの指標として脾臓重量の変化を測定した。ＣｐＧ−ＰＳ−オリゴで処置した結果としての脾臓重量の変化を、図２４に示す。
【００９８】
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢、１９〜２１ｇ）を、各グループ４匹のマウスの異なるグループに分割した。オリゴヌクレオチドを滅菌ＰＢＳに溶解し、用量１０ｍｇ／ｋｇで、マウスに腹腔内投与した。７２時間後、マウスを屠殺して、脾臓を取り出し、重量を測定した。各円は、個々のマウスの脾臓重量を表し、＋は、各グループにおける平均脾臓重量を表す。
【００９９】
ＣｐＧ−モチーフに天然デオキシシチジンを有するオリゴ１は、ＰＢＳを受けたマウスのコントロールグループと比較し、用量１０ｍｇ／ｋｇで、脾臓重量の約４５％の増加を示した。ＣｐＧ−モチーフのシトシン塩基の代わりに５−ヒドロキシシトシンを有するオリゴ２は、同じ用量で、脾臓重量の約３５％の増加を示した。
【０１００】
ＣｐＧ−モチーフのシトシン塩基の代わりにＮ４−エチルシトシンを有するオリゴ４は、コントロールグループと比較して、同じ用量で、脾臓重量の約３４％の増加を示した。これらのデータは、ＣｐＧ−モチーフにおいて、デオキシシチジンの代わりに、修飾されたシチジンアナログを含有するこれらのオリゴに対するリンパ球増殖アッセイで観察された結果を確認するものである。
【０１０１】
例７：Ｃ＊ｐＧ−ＰＳ−オリゴの構造活性相関
ＣｐＧ−モチーフにおいて、シトシンの５−位置でのメチル基の存在（５−メチル−デオキシシトシン、２（図２８））は、ＣｐＧ−ＰＳ−オリゴのＣｐＧに関する免疫刺激効果を完全になくす。インビトロおよびインビボ実験において観察された結果に基づき、我々は、シトシンアナログを含有するＰＳ−オリゴにおける構造活性相関を構築した。
【０１０２】
ＣｐＧ−モチーフにおいて、シトシン塩基（１）の５−メチルイソシトシン（３）での置換は、５−メチルシトシン（２）でのものと同様に免疫刺激活性の完全な喪失をもたらすが、これは、それぞれ２および４−位置のケトおよびアミノ基の入れ替えおよび／またはシトシンの５−位置への、疎水性メチル基の設置の結果であり得る。
【０１０３】
ＣｐＧ−モチーフにおいて、シトシンの５−位置での親水性水酸基置換を含有するオリゴ２は、天然シトシン塩基を含有するオリゴ１と同様の免疫刺激活性を示した。この観察は、ＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの免疫刺激活性に関して、かさ高い親水基は、シトシンの５−位置の疎水基より一層耐容されることを示唆する。おそらく、レセプター上のＣｐＧ−オリゴに対する結合ポケットは事実上親水性であり、シトシンの５−位置の疎水基に適合できない。
【０１０４】
ＣｐＧ−モチーフにおいて、シトシン塩基を、ケト基が２および４−位置の両方に存在するウラシルと置換する場合（５（図２８参照））、免疫刺激活性は観察されず、これは、シトシンの４−位置の水素結合供与性アミノ基が、免疫刺激活性に重要であることを示唆している。
【０１０５】
ＣｐＧ−モチーフにおいて、シトシンの４−アミノ基に大型疎水性エチル基を置換する場合、マウスのリンパ球増殖の減少および脾臓重量増加の若干の減少が観察され、これは、この位置でのかさ高いエチル基は、免疫刺激活性を引き起こすレセプター因子へのＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの結合を妨害しないことを示唆するものである。
【０１０６】
エチル置換にもかかわらず、Ｎ４−エチルシトシン（６）の４−アミノ基は、受容体との水素結合形成に関与できる。４−位置に位置する窒素基が５−位置との環状構造形成に関与し、水素結合供与性アミノ基を４−位置に有さない、修飾ピリジン塩基ｄＰは、培養中で、マウスリンパ球増殖活性を有さなかったが、これは、ＣｐＧ−モチーフにおいて、シトシンの４−アミノ基が免疫刺激活性に重要であることを示唆するものである。
【０１０７】
結論として、ここで示した結果は、シトシンの２、３および４位置の官能基が、ＣｐＧ−関連免疫刺激活性に重要であることを示している。シトシンの５−位置での疎水性置換は、完全にＣｐＧ−オリゴの免疫刺激活性を抑制するが、この位置の親水基は、十分に耐容される。
【０１０８】
さらに、ＣｐＧ−モチーフにおいて、シトシンの代わりに、５−ヒドロキシシトシンまたはＮ４−エチルシトシンを含有するＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの免疫刺激活性は、５’−フランキング配列における適切な化学修飾の組込みにより有意に調節でき、これは、ＣｐＧ−モチーフにおいて、これらのシトシンアナログは免疫刺激モチーフの一部として認識されることを示唆している。
【０１０９】
例８：末端−ブロックＣｐＧ−ＰＳ−オリゴヌクレオチドの合成
図１７で示されるＣｐＧ−ＰＳ−オリゴは、自動化合成装置およびホスホラミダイト方法を用いて合成した。オリゴ１（１６マー（１６−ｍｅｒ））は、ヌクレオシド−５’−β−シアノエチルホスホラミダイトを用いて合成した。オリゴ２（３２マー）を、ヌクレオシド−３’−β−シアノエチルホスホラミダイトおよびオリゴ１の１６マー配列が二度繰り返された３’−結合ヌクレオシドを有するコントロールドポアガラス担体（ＣＰＧ−固体担体）を用いて合成した；したがって、オリゴ２は、通常の３’−５’結合により連結した２つの１６マー（オリゴ１）を有した。
【０１１０】
オリゴ３（３２マー）は、５’−５’結合により連結した２つの１６マー（オリゴ１）により合成したため、オリゴ３は、２つの３’−末端を有し、５’−末端は有さない。オリゴ３の合成は、２段階で実施した：第一の１６マーを、ヌクレオシド−３’−β−シアノエチルホスホラミダイトおよび３’−結合ヌクレオシドを有する固体担体を用いて合成し、次いで、第二の１６マーセグメントの合成を、ヌクレオシド−５’−β−シアノエチルホスホラミダイト用いて継続した。
【０１１１】
オリゴ４（３２マー）は、３’−３’結合により連結した２つの１６マー（オリゴ１）を含むため、オリゴ４は、２つの５’−末端を有し、３’−末端は有さない。オリゴ４の合成は、２段階で実施した：第一の１６マーを、ヌクレオシド−５’−β−シアノエチルホスホラミダイトおよび５’−結合ヌクレオシドを有する固体担体を用いて合成し、第二の１６マーセグメントの合成を、ヌクレオシド−３’−β−シアノエチルホスホラミダイトを用いて継続した。
【０１１２】
オリゴ５〜８の合成は、それぞれ、オリゴ１〜４に関するのと、同一のヌクレオシド−β−シアノエチルホスホラミダイトを用いることにより実施した。合成の最後で、オリゴ１〜８を、濃縮アンモニア溶液で脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、脱トリチル化し、脱塩しおよび透析した。各ＰＳ−オリゴの純度を、ＣＧＥによりチェックし、および分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により確認した（表１）。
【０１１３】
オリゴ１〜８において、５’−ＣｐＧモチーフの配列完全性および方向性を、これらのそれぞれのＤＮＡ相補鎖（オリゴ１〜４については５’−ＡＡＧＧＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ−３’、オリゴ５〜８については５’−ＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＣＴＧＧＧＡＧＡ−３’）との二重鎖の融解温度（Ｔｍｓ）を記録することにより確認した。これらの二重鎖の融解温度は、５３．９±０．９℃（オリゴ１〜４）、６１．８℃（オリゴ５）および５８．８±０．６℃（オリゴ６〜８）であった（注：オリゴ５は１８マーであり、およびオリゴ６〜８は、３２マーであり、３６マーではない）。
【０１１４】
例９：末端ブロックＣｐＧ−ＰＳ−オリゴヌクレオチドのマウス脾臓リンパ球増殖活性
リンパ球増殖アッセイにおいて、例８の末端−ブロックＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの免疫刺激活性を、最初に研究した。典型的には、マウス（Ｂａｌｂ−Ｃ）脾臓リンパ球を、ＣｐＧ−ＰＳ−オリゴとともに濃度０．１、１．０および１０．０μｇ／ｍｌで４８時間培養し、細胞増殖を、例３で記載したように、３Ｈ−ウリジンの取り込みにより決定した。結果は図１７に示す。
【０１１５】
オリゴ１は、細胞増殖の用量依存的効果を誘導した；濃度１０μｇ／ｍｌ（〜２．０μＭ）で、増殖率は５．０±０．３２であった。３’−５’結合により連結されたオリゴ１の２つのユニットからなるオリゴ２は、同用量（〜１．０μＭ）で、５．８±０．２８の増殖率を有した。
【０１１６】
５’−５’結合により連結されたオリゴ１の２つのユニットからなるオリゴ３は、２．０±０．２６の増殖率を有し、これは、オリゴ１および２での観察よりも極めて低い免疫刺激活性であるということを示す。３’−３’結合により連結されたオリゴ１の２つのユニットからなるオリゴ４は、７．２±０．５の増殖率を有し、これは、オリゴ１および２での観察よりも高い免疫刺激活性であるということを示す。
【０１１７】
オリゴ５〜８でも同様の結果が得られた。オリゴ５は、３．９±０．１２の増殖率を有した。２ユニットのオリゴ５が、３’−５’結合（オリゴ６）、５’−５’結合（オリゴ７）および３’−３’結合（オリゴ８）により連結したオリゴ６〜８は、それぞれ、４．９±０．２、１．７４±０．２１および７．７±０．８２の増殖率を有した。
【０１１８】
オリゴ６〜８で得られた結果の比較は、２つのオリゴ５配列が３’−５’結合または３’−３’結合により連結したオリゴ６および８は、オリゴ５よりも高い免疫刺激活性を有するが、２つのオリゴ５が５’−５’結合により連結したオリゴ７は、オリゴ５よりも極めて低い免疫刺激活性を有することを示す。
オリゴ１〜８のリンパ球増殖の結果から、オリゴが５’−末端を介して連結する場合、免疫刺激活性の大きな損失となるが、それらが３’−末端を介して連結する場合、免疫刺激活性の増大になることは明白である。
【０１１９】
３’−３’結合のオリゴは、同様に増大した免疫刺激活性をもたらすフリーな３’−末端を含有するオリゴよりも、実質的に、エキソヌクレアーゼによる分解に対し十分な安定性を示したことに注目することは重要である。オリゴの５’−末端がブロックされたオリゴ３および７の低い免疫刺激活性は、オリゴの５’−末端へのアクセス性がＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの免疫刺激活性に不可欠であることを示唆している。
【０１２０】
例１０：末端−ブロックＣｐＧ−ＰＳ−オリゴヌクレオチドにより誘導されたマウスの脾腫
オリゴ１〜８（例８）のインビボでの免疫刺激活性を確認するために、用量５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注入した。投与７２時間後にマウスを屠殺し、脾臓を取り除き、乾燥のためにブロットし、重量を測定した。処置されたマウスと処置されてないマウスの脾臓重量変化を免疫刺激活性のパラメータとして使用した。
【０１２１】
５ｍｇ／ｋｇの用量のオリゴ１の投与は、ＰＢＳを与えられたコントロールマウスと比較して、脾臓重量の約４０％の増加を引き起こした。オリゴ２および４の投与もまた、脾臓重量の約５０％の増加を引き起こした。オリゴ３の投与は、コントロールマウスと比較し、脾臓重量の変化を引き起こさなかった。
【０１２２】
これらの結果は、さらに、５’−末端がブロックされたオリゴ３は、アクセス可能な５’−末端を有するオリゴと比較し、非常に低い免疫刺激活性を有するという観察を裏付けるものである。これらの結果はまた、オリゴ５〜８の投与によっても確認された。オリゴ５、６および８の投与は、脾臓重量の約４０〜５０％の増加を引き起こしたが、オリゴ７の投与の後には脾臓重量の変化は観察されなかった。
【０１２３】
上記の結果は、オリゴの５’−末端がアクセス可能でない場合に、ＣｐＧモチーフを含有するＰＳ−オリゴの免疫刺激活性が、著しく最小化されることを示唆している。オリゴ３および７の免疫刺激活性のこの損失は、ヌクレアーゼ安定性に基づいて説明できない。なぜなら、両方のオリゴが、２つの３’−末端を有し、１つの３’−末端を有するオリゴ１、２、５および６よりも３’−エキソヌクレアーゼ分解に敏感でないためである。
【０１２４】
ブロックされた３’−末端を有し、エキソヌクレアーゼによる分解に非常に安定であるＰＳ−オリゴ４および８は、同様の免疫刺激活性を示した。オリゴ４および８は、投与後わずか７２時間でマウスを屠殺したため、本研究においては確かではないが、インビボで増大した安定性のため、持続的免疫刺激活性を示し得る。投与後７２時間より長い時間でマウスを屠殺する場合の研究が進行中である。
【０１２５】
ここで記載した結果は、興味深く、そしてＣｐＧ−ＰＳ−オリゴの５’−末端が、免疫刺激活性に重要であることを示唆している。ここで論じたように、我々は、５’−フランキング領域において、修飾２’−または３’−置換リボヌクレオシドによるデオキシヌクレオシドの置換は、免疫刺激活性の増大を引き起こすことを示した。
【０１２６】
さらに、ＣｐＧモチーフに対し直上流（５’−末端）のデオキシヌクレオシドの置換は、著しい抑制を引き起こし、およびＣｐＧモチーフに対し直下流（３’−末端）のデオキシヌクレオシドの置換は、免疫刺激活性には影響しなかった。総合すれば、これらの結果は、免疫刺激に関与する酵素／レセプターが、５’−末端からオリゴのＣｐＧモチーフを認識し、５’−末端へのアクセス性を要求することを示唆している。
【０１２７】
上記発明を、明瞭性および理解のために、幾分詳細に記載したが、本発明の範囲および付加請求の正確な範囲からはずれることなく、当業者は、この開示を読解することにより、形態および細部における種々の変更が可能であることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
種々の位置において、１’，２’−ジデオキシリボース置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１Ｂ】
種々の位置において、１’，２’−ジデオキシリボース置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図２Ａ】
種々の位置において、１’，２’−ジデオキシリボース置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２Ｂ】
種々の位置において、１’，２’−ジデオキシリボース置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図３Ａ】
種々の位置において、１’，２’−ジデオキシリボース置換を有する異なったオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図３Ｂ】
種々の位置において、１’，２’−ジデオキシリボース置換を有する異なったオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図４Ａ】
種々の位置において、１’，２’−ジデオキシリボース置換を有する異なったオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図４Ｂ】
種々の位置において、１’，２’−ジデオキシリボース置換を有する異なったオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図５Ａ】
種々の位置において、Ｃ３−リンカー置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図５Ｂ】
種々の位置において、Ｃ３−リンカー置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図６Ａ】
種々の位置において、Ｃ３−リンカー置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図６Ｂ】
種々の位置において、Ｃ３−リンカー置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図７Ａ】
種々の位置において、スペーサー９またはスペーサー１８置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図７Ｂ】
種々の位置において、スペーサー９またはスペーサー１８置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図８Ａ】
種々の位置において、スペーサー９またはスペーサー１８置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図８Ｂ】
種々の位置において、スペーサー９またはスペーサー１８置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図９Ａ】
種々の位置において、アミノ−リンカー置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図９Ｂ】
種々の位置において、アミノ−リンカー置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１０Ａ】
種々の位置において、アミノ−リンカー置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１０Ｂ】
種々の位置において、アミノ−リンカー置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１１Ａ】
種々の位置において、３’−デオキシヌクレオシド置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１１Ｂ】
種々の位置において、３’−デオキシヌクレオシド置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１２Ａ】
種々の位置において、３’−デオキシヌクレオシド置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１２Ｂ】
種々の位置において、３’−デオキシヌクレオシド置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１３Ａ】
種々の位置において、メチルホスホネート置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１３Ｂ】
種々の位置において、メチルホスホネート置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１４Ａ】
種々の位置において、メチルホスホネート置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１４Ｂ】
種々の位置において、メチルホスホネート置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１５Ａ】
種々の位置において、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエチル置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１５Ｂ】
種々の位置において、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエチル置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１６Ａ】
種々の位置において、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエチル置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１６Ｂ】
種々の位置において、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエチル置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１７Ａ】
種々の位置において、５’−３’、５’−５’または３’−３’結合置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１７Ｂ】
種々の位置において、５’−３’、５’−５’または３’−３’結合置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１７Ｃ】
種々の位置において、５’−３’、５’−５’または３’−３’結合置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図１８Ａ】
種々の位置において、β−Ｌ−デオキシヌクレオシド置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１８Ｂ】
種々の位置において、β−Ｌ−デオキシヌクレオシド置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１９Ａ】
種々の位置において、２’−Ｏ−プロパルギル置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図１９Ｂ】
種々の位置において、２’−Ｏ−プロパルギル置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２０Ａ】
種々の位置において、種々の置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２０Ｂ】
種々の位置において、種々の置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２１Ａ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、７−デアザグアニン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２１Ｂ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、７−デアザグアニン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２１Ｃ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、７−デアザグアニン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２２Ａ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、６−チオグアニン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図２２Ｂ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、６−チオグアニン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図２３Ａ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、５−ヒドロキシシトシンまたはＮ４−エチルシトシン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２３Ｂ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、５−ヒドロキシシトシンまたはＮ４−エチルシトシン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２４Ａ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、５−ヒドロキシシトシンまたはＮ４−エチルシトシン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２４Ｂ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、５−ヒドロキシシトシンまたはＮ４−エチルシトシン置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２５Ａ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、アラビノフラノシルシトシン（アラシチジン；Ａｒａ−Ｃ）置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図２５Ｂ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、アラビノフラノシルシトシン（アラシチジン；Ａｒａ−Ｃ）置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた増殖アッセイの結果を示した図である。
【図２６Ａ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、４−チオウラシル置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２６Ｂ】
免疫刺激ジヌクレオチドに、４−チオウラシル置換を有するオリゴヌクレオチドを用いた脾臓重量アッセイの結果を示した図である。
【図２７】
水素結合受容基および水素結合供与基として機能するシトシンの官能基を示している、ＣｐＧ−モチーフの化学構造を示した図である。
【図２８】
シトシン（１）およびシトシンアナログ（２〜７）の化学構造を示した図である。ヌクレオシドシチジン、デオキシシチジンおよび関連するアナログにおいて、置換基Ｒは、リボースまたは２’−デオキシリボースである。
【図１Ａ】
2004509970.tif 000009
【図１Ｂ】
2004509970.tif 000010
【図２Ａ】
2004509970.tif 000011
【図２Ｂ】
2004509970.tif 000012
【図３Ａ】
2004509970.tif 000013
【図３Ｂ】
2004509970.tif 000014
【図４Ａ】
2004509970.tif 000015
【図４Ｂ】
2004509970.tif 000016
【図５Ａ】
2004509970.tif 000017
【図５Ｂ】
2004509970.tif 000018
【図６Ａ】
2004509970.tif 000019
【図６Ｂ】
2004509970.tif 000020
【図７Ａ】
2004509970.tif 000021
【図７Ｂ】
2004509970.tif 000022
【図８Ａ】
2004509970.tif 000023
【図８Ｂ】
2004509970.tif 000024
【図９Ａ】
2004509970.tif 000025
【図９Ｂ】
2004509970.tif 000026
【図１０Ａ】
2004509970.tif 000027
【図１０Ｂ】
2004509970.tif 000028
【図１１Ａ】
2004509970.tif 000029
【図１１Ｂ】
2004509970.tif 000030
【図１２Ａ】
2004509970.tif 000031
【図１２Ｂ】
2004509970.tif 000032
【図１３Ａ】
2004509970.tif 000033
【図１３Ｂ】
2004509970.tif 000034
【図１４Ａ】
2004509970.tif 000035
【図１４Ｂ】
2004509970.tif 000036
【図１５Ａ】
2004509970.tif 000037
【図１５Ｂ】
2004509970.tif 000038
【図１６Ａ】
2004509970.tif 000039
【図１６Ｂ】
2004509970.tif 000040
【図１７Ａ】
2004509970.tif 000041
【図１７Ｂ】
2004509970.tif 000042
【図１７Ｃ】
2004509970.tif 000043
【図１８Ａ】
2004509970.tif 000044
【図１８Ｂ】
2004509970.tif 000045
【図１９Ａ】
2004509970.tif 000046
【図１９Ｂ】
2004509970.tif 000047
【図２０Ａ】
2004509970.tif 000048
【図２０Ｂ】
2004509970.tif 000049
【図２１Ａ】
2004509970.tif 000050
【図２１Ｂ】
2004509970.tif 000051
【図２１Ｃ】
2004509970.tif 000052
【図２２Ａ】
2004509970.tif 000053
【図２２Ｂ】
2004509970.tif 000054
【図２３Ａ】
2004509970.tif 000055
【図２３Ｂ】
2004509970.tif 000056
【図２４Ａ】
2004509970.tif 000057
【図２４Ｂ】
2004509970.tif 000058
【図２５Ａ】
2004509970.tif 000059
【図２５Ｂ】
2004509970.tif 000060
【図２６Ａ】
2004509970.tif 000061
【図２６Ｂ】
2004509970.tif 000062
【図２７】
2004509970.tif 000063
【図２８】
2004509970.tif 000064
【国際公開パンフレット】
2004509970.tif 000065
2004509970.tif 000066
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2004509970.tif 000154
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2004509970.tif 000156
2004509970.tif 000157
2004509970.tif 000158
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509970.tif 000159
【手続補正書】
【提出日】平成14年12月5日(2002.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって、式５’−ピリミジン−プリン−３’、式中、ピリミジンは非天然ピリミジンヌクレオシドであり、およびプリンは天然または非天然プリンヌクレオシドである、で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含む、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって、式Ｃ＊ｐＧ、式中、Ｃ＊はシチジンアナログであり、Ｇはグアノシン、２’−デオキシグアノシンまたはグアノシンアナログであり、およびｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオチド間結合である、で表される免疫刺激ジヌクレオチドを含む、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項３】
非天然ピリミジンヌクレオシドが、式（Ｉ）：
【化１】
2004509970.tif 000160
式中、Ｄは水素結合供与体であり、Ｄ’は水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子吸引基および電子供与基からなる群から選択され、Ａは水素結合受容体または親水基であり、Ｘは炭素または窒素であり、およびＳはペントースまたはヘキソース糖環である、を有し、但し、式（Ｉ）で表されるピリミジンヌクレオシドはシチジンまたはデオキシシチジンではない、請求項１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項４】
非天然ピリミジンヌクレオシドが、非天然に生ずるピリミジン塩基を含む、請求項３に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項５】
非天然に生ずるピリミジン塩基が、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシンおよび４−チオウラシルからなる群から選択される、請求項４に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項６】
非天然に生ずるピリミジン塩基が、５−ヒドロキシシトシンおよびＮ４−エチルシトシンからなる群から選択される、請求項４に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７】
式（Ｉ）で表される非天然ピリミジンヌクレオシドが、非天然に生ずる糖部分を含む、請求項４に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８】
非天然に生ずる糖部分がアラビノースである、請求項７に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項９】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって、式（ＩＩ）：
５’――――Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４――――３’
（ＩＩ）
式中、
Ｙは、非天然ピリミジンヌクレオシドであり；
Ｚは、グアノシン、２’−デオキシグアノシンまたは非天然プリンヌクレオシドであり；
Ｘ１は、天然に生ずるヌクレオシドまたはＣ３−アルキルリンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカーおよびβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｘ２は、天然に生ずるヌクレオシドまたはアミノリンカーである免疫刺激部分であり；
Ｘ３は、天然に生ずるヌクレオシドまたはヌクレオシドメチルホスホネートであり；
Ｘ４は、天然に生ずるヌクレオシドまたはヌクレオシドメチルホスホネートであり；
但し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つが免疫刺激部分である、
で表される免疫刺激ドメインを含む、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０】
Ｙが、式（Ｉ）：
【化２】
2004509970.tif 000161
式中、Ｄは水素結合供与体であり、Ｄ’は水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子吸引基および電子供与基からなる群から選択され、Ａは水素結合受容体または親水基であり、Ｘは炭素または窒素であり、およびＳはペントースまたはヘキソース糖環である、を有し、但し、Ｙはシチジンまたはデオキシシチジンではない、請求項９に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１１】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって、式（ＩＩＩ）：
５’−Ｕｍ．．．．．．．Ｕ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ−Ｚ−Ｘ３−Ｘ４−Ｄ１．．．．．．．．Ｄｍ−３’　　　（ＩＩＩ）
式中：
Ｙは、非天然ピリミジンヌクレオシドであり；
Ｚは、グアノシン、２’−デオキシグアノシンまたは非天然プリンヌクレオシドであり；
各Ｘは、独立して、天然に生ずるヌクレオシドまたは免疫刺激部分であり；
式中、Ｕｍ−Ｕ１は、上流増強ドメインを示し、ここで、各Ｕは、独立して、天然に生ずるヌクレオシドまたは免疫刺激部分であり；
式中、Ｄ１−Ｄｍは、下流増強ドメインを示し、ここで、各Ｄは、独立して、天然に生ずるヌクレオシドまたは免疫刺激部分であり；および
ｍは、各場合において、０〜３０の数を示す、
で表される配列を含む、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１２】
少なくとも１つのＸ、ＵまたはＤが、免疫刺激部分である、請求項１１に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１３】
Ｘ１が、天然に生ずるヌクレオシドまたはＣ３−アルキルリンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカーおよびβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｘ２が、天然に生ずるヌクレオシドまたはアミノリンカーである免疫刺激部分であり；
Ｘ３が、天然に生ずるヌクレオシドまたはヌクレオシドメチルホスホネートであり；
Ｘ４が、天然に生ずるヌクレオシドまたはヌクレオシドメチルホスホネートであり；
Ｕ１が、天然に生ずるヌクレオシド、１’，２’−ジデオキシリボースまたはＣ３−リンカーであり；
Ｕ２が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボース、Ｃ３−リンカー、スペーサー１８、３’−デオキシヌクレオシド、ヌクレオシドメチルホスホネート、β−Ｌ−デオキシヌクレオシドおよび２−Ｏ−プロパルギルリボヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｕ３が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボース、Ｃ３−リンカー、スペーサー９、スペーサー１８、ヌクレオシドメチルホスホネートおよび２’−５’結合からなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｄ１が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボースおよびヌクレオシドメチルホスホネートからなる群から選択される免疫刺激部分であり；
Ｄ２が、天然に生ずるヌクレオシドまたは１’，２’−ジデオキシリボース、Ｃ３−リンカー、スペーサー９、スペーサー１８、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、ヌクレオシドメチルホスホネートおよびβ−Ｌ−デオキシヌクレオシドからなる群から選択される免疫刺激部分であり；および
Ｄ３が、天然に生ずるヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオシド、２’−Ｏ−プロパルギルリボヌクレオシドおよび２’−５’結合からなる群から選択される免疫刺激部分である；
請求項１２に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１４】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物であって：
式５’−ピリミジン−プリン−３’、式中、ピリミジンは非天然ピリミジンヌクレオシドであり、およびプリンは天然または非天然プリンヌクレオシドである、で表される免疫刺激ジヌクレオチド；
３’−３’結合；および
１つまたは２つのアクセス可能な５’−末端；
を含み、但し、オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１のｇａｇまたはｔａｔ遺伝子に相補的ではない、前記免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが、２つのアクセス可能な５’−末端を含む、請求項１４に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１６】
非天然に生ずるピリミジン塩基を含むジヌクレオチドアナログを免疫刺激ドメインに導入することを含む、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の免疫刺激効果を調節するための方法。
【請求項１７】
免疫刺激部分を免疫刺激ドメインおよび／または増強ドメインに導入することを含む、免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の免疫刺激効果を調節するための方法。
【請求項１８】
３’−３’結合をオリゴヌクレオチドに導入することを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物の免疫刺激効果を調節するための方法。
【請求項１９】
患者に免疫応答を引き起こすための方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物が、抗生物質、抗原、アレルゲン、ワクチン、抗体、細胞毒性剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子療法ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバントまたはこれらの組み合わせと組み合わせて投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物が、抗原またはワクチンと結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
結合がオリゴヌクレオチド化合物の３’−末端へのものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
病原体による疾患を有する患者を治療的に処置するための方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
病原体がウイルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
病原体が寄生虫である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
病原体がバクテリアである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
癌患者を処置するための方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
免疫刺激オリゴヌクレオチド化合物が、化学療法の化合物と組み合わせて投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
自己免疫疾患を処置するための方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３０】
自己免疫疾患が自己免疫性の喘息である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
気道炎症またはアレルギーを処置するための方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログ免疫刺激化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
これらの構成において、Ｕ６の免疫刺激部分は、免疫刺激ジヌクレオチドまたはジヌクレオチドアナログから８位置上流であり、およびＤ４の免疫刺激部分は、免疫刺激ジヌクレオチドまたはジヌクレオチドアナログから６位置下流であろう。




【国際調査報告】
2004509970.tif 000162
2004509970.tif 000163
2004509970.tif 000164
2004509970.tif 000165