(57)【要約】本発明はタンパク質の人工ｉｎ  ｖｉｖｏ進化方法に関し、前記方法は類縁タンパク質Ｙの相補によりタンパク質Ｘを進化させることができ、ＸとＹはいずれもＥＣ酵素命名法の同一分類又は近縁分類に属する。各々デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）にチミジンキナーゼ活性を獲得させるように突然変異させたＤＣＫの突然変異体Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑが得られた。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質Ｘの特性を改変するように進化させる方法であって、
ａ）タンパク質Ｘをコードする遺伝子を含む核酸で［タンパク質Ｙ＊］細胞を形質転換させることにより遺伝子型［タンパク質Ｙ＊：：タンパク質Ｘ＋］を含む細胞を得る段階（但し、Ｙ＊はＹをコードする遺伝子が不活化されていることを意味し、Ｙは類似活性をもつＸの近縁分類に属するタンパク質であり、ＸとＹの分類は４桁番号による国際命名法の少なくとも上３桁が共通のＥＣ分類に属することを特徴とし、前記細胞はその生存のためにＹとその基質の反応生成物が培地に供給されることを必要とする栄養要求性表現型を示す）と、
ｂ）段階ａ）で得られた細胞を突然変異誘発物質に暴露する段階と、
ｃ）Ｙの基質を含む培地で前記細胞を培養する段階（但し、Ｙとその基質の反応生成物は前記細胞の生存に必要なものである）と、
ｄ）段階ｃ）後に生存しており、前記前変異原ヌクレオシド類似体の作用により改変したタンパク質Ｘがタンパク質Ｙの欠損を相補している細胞を選択する段階を含む前記方法。
【請求項２】
タンパク質ＸがＥＣ分類２．７．１．に属するキナーゼ、ＥＣ分類２．７．７．に属するヌクレオチジルトランスフェラーゼ、特にポリメラーゼ及びＥＣ分類２．４．２．に属するホスホリラーゼから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質Ｘがそれ自体の遺伝子に突然変異を導入する前変異原ヌクレオシド類似体を活性化できることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
キナーゼＸの特性を改変するように進化させる方法であって、
ａ）キナーゼＸをコードする遺伝子を含む核酸で［キナーゼＹ＊］細胞を形質転換させることにより遺伝子型［キナーゼＹ＊：：キナーゼＸ＋］を含む細胞を得る段階（但し、Ｙ＊はＹをコードする遺伝子が不活化されていることを意味し、Ｙは類似活性を示すＸの近縁分類に属するキナーゼであり、ＸとＹの分類は４桁番号による国際命名法の少なくとも上３桁が共通のＥＣ分類２．７．１．に属することを特徴とし、前記細胞はその生存のためにＹとその基質の反応生成物が培地に供給されることを必要とする栄養要求性表現型を示す）と、
ｂ）段階ａ）で得られた細胞をキナーゼＸによりリン酸化することが可能な前変異原ヌクレオシド類似体に所与時間暴露する段階と、
ｃ）Ｙの基質を含む培地で前記細胞を培養する段階（但し、Ｙとその基質の反応生成物は前記細胞の生存に必要なものである）と、
ｄ）段階ｃ）後に生存しており、前記変異原物質の作用により改変したキナーゼＸがキナーゼＹの欠損を相補している細胞を選択する段階を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が原核又は真核細胞、好ましくは大腸菌であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質がヌクレオシドとその類似体から選択されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
キナーゼＸがＥＣ分類２．７．１．７４に属するデオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）であることを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
キナーゼＹがＥＣ分類２．７．１．２１に属するチミジンキナーゼ（ＴＤＫ）であることを特徴とする請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）段階ａ）で得られた細胞を、
−前変異原ヌクレオシド類似体とチミジル酸シンターゼによるチミジル酸合成を阻止するトリメトプリムから選択される突然変異誘発物質と、
−前記細胞の生存に必要なチミジン
を含む培地で培養して大腸菌Δｄｅｏ  ｔｄｋ  ｐ：：ｄｃｋＨ＋を得る段階と、
ｂ）段階ｂ）後に生存しており、前記前変異原類似体の作用により改変したＤＣＫＨがＴＤＫの欠損を相補している細胞を選択する段階を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
キナーゼＸがデオキシシチジンキナーゼ、好ましくはＧＥＮＢＡＮＫに登録番号Ｍ６０５２７で登録されている配列をもつヒトＤＣＫ１であり、突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑから選択される少なくとも１種の突然変異を加えることを特徴とする請求項４から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法により獲得可能な突然変異タンパク質Ｘであって、元のタンパク質Ｘよりも拡張した活性をもつことを特徴とする前記突然変異タンパク質Ｘ。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法により獲得可能な突然変異キナーゼＸであって、元のキナーゼＸよりも拡張した活性をもつことを特徴とする前記突然変異キナーゼＸ。
【請求項１３】
ＧＥＮＢＡＮＫに登録番号Ｍ６０５２７で登録されている配列をもつヒトＤＣＫ１に突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑから選択される少なくとも１種の突然変異を加えたことを特徴とする請求項１２に記載のキナーゼ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキナーゼのコーディング配列を含む核酸。
【請求項１５】
請求項１３に記載のキナーゼのコーディング配列を含む発現ベクター。
【請求項１６】
前記配列が真核及び／又は原核細胞で有効なプロモーターに融合していることを特徴とする請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
大腸菌で形質転換し、維持することが可能なプラスミドであることを特徴とする請求項１５又は１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記前変異原類似体を活性化するための請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における請求項１２又は１３に記載のキナーゼの使用。
【請求項２０】
超突然変異誘発方法における請求項１２又は１３に記載のキナーゼの使用。
【請求項２１】
酵素リン酸化に自然耐性のヌクレオシドを夫々の５’リン酸誘導体に変換するための請求項１２又は１３に記載のキナーゼの使用。
【請求項２２】
前変異原による突然変異誘発範囲をｉｎ  ｖｉｖｏ拡張するための請求項１２又は１３に記載のキナーゼと他の酵素（例えばＡＭＫ及び／又はトランスデオキシリボシラーゼ（ＮＴＤ））の併用。
【請求項２３】
ＤＮＡにヌクレオシド類似体を取込ませるための遺伝子治療用医薬の製造における請求項１５から１７のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２４】
細胞内の所定ＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発方法であって、
−少なくとも１種の酵素系を発現する細胞を使用して少なくとも１種の前変異原ヌクレオシドを前記ＤＮＡ配列に挿入することにより突然変異を行う段階と、
−突然変異配列の存在を検出する段階を含み、酵素系が請求項１２又は１３に記載のキナーゼを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２５】
細胞から発現される特定タンパク質を進化させるための方法であって、細胞の生存に必要な前記特定タンパク質の類縁タンパク質をコードする遺伝子を不活化させ、前記特定タンパク質をコードする遺伝子の突然変異後に相補を検出することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記特定タンパク質と前記類縁タンパク質が４桁番号によるＥＣ国際命名法の少なくとも上３桁が共通の近縁分類に属する酵素であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質がそれ自体の遺伝子を進化させることができる特性をもつことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＮＣＭに登録番号Ｉ−２６３１で寄託されたＤ１３３Ｅ突然変異ＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７１５１。
【請求項２９】
ＣＮＣＭに登録番号Ｉ−２６３０で寄託されたヒトＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７１３４。
【請求項３０】
ＣＮＣＭに登録番号Ｉ−２６５０で寄託されたＤ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑ二重突然変異ＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７３３８。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の人工ｉｎ  ｖｉｖｏ進化方法に関し、前記方法は類縁タンパク質Ｙの相補によりタンパク質Ｘを進化させることができ、ＸとＹはいずれもＥＣ酵素命名法の同一分類又は近縁分類に属する。各々デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）にチミジンキナーゼ活性を獲得させるように突然変異させたＤＣＫの突然変異体Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑが得られた。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシド三リン酸はＤＮＡポリメラーゼにより縮合可能な活性化モノマーであるが、益々多様なものが配列決定及びＰＣＲ増幅技術に必要になっている。このような人工モノマーは複素環塩基［Ｓａｌａら，１９９６］や五炭糖や三リン酸基が化学的に修飾されている点が４種の天然モノマーと異なる。三リン酸誘導体の製造は一般に遊離５’アルコールをリン酸化した後に５’リン酸を縮合してピロリン酸とし、三リン酸を得ることにより行われている。ＡＴＰを消費するヌクレオシドキナーゼによるリン酸化段階の触媒は工業的規模で有効な方法である。このような合成法は拡張活性をもつ酵素即ち任意ヌクレオシドを同等効率でリン酸化することが可能なヌクレオシドキナーゼを使用しなければ考えられない。より一般には、拡張活性を示す酵素が得られるならば、あらゆる種類のバイオテクノロジー用途に強力なツールを利用できることになろう。
【０００３】
ＤＮＡ分子に部位特異的突然変異を行う方法は種々のものが技術文献に記載されている。これらの技術は例えばＰＣＲを使用することによりＤＮＡ分子内の所定部位に突然変異、欠失又は挿入をｉｎ  ｖｉｔｒｏを導入するものである。これらの各種技術はＨａｌｌら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４：６０１（１９９１）；Ｈｅｍｓｌｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：６５４５−６５５１（１９８９）；Ｈｏら，Ｇｅｎｅ  ７７：５１−５９（１９８９）；Ｈｕｌｔｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：５１０７−５１１２（１９９０）；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：７９３−７９４（１９９０）；Ｊｏｎｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：５２８−５３３（１９９２）；Ｌａｎｄｔら，Ｇｅｎｅ  ９６：１２５−１２８（１９９０）；Ｎａｓｓａｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：３０７７−３０７８（１９９０）；Ｎｅｌｓｏｎら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８０：１４７−１５１（１９８９）；Ｖａｌｌｅｔｔｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：７２３−７３３（１９８９）；Ｗａｔｋｉｎｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：７００−７０４（１９９３）；Ｗｅｉｎｅｒら，Ｇｅｎｅ  １２６：３５−４１（１９９３）；Ｙａｏら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：２０５−２０７（１９９２）及びＷｅｉｎｅｒら，Ｇｅｎｅ  １５１：１／９−１２３（１９９４）に記載されている。
【０００４】
技術的問題に加え、このような技術では所与突然変異がタンパク質の活性に及ぼす影響を予め知ることができない。
【０００５】
突然変異誘発物質（２−アミノプリン、ヒドロキシルアミン又はＡＣＲＩＤＩＮＥ）を使用してゲノムに突然変異をランダムに導入し、所望表現型を示す細胞又は生物を選択する方法もある。しかし、これらの方法は致死性の場合もある多数の突然変異を導入しなければならず、所与タンパク質を厳密な目的に合うように進化させるには適していない。
【０００６】
例えばＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ−又は突然変異を導入することが可能な他のタンパク質を使用すればｉｎ  ｖｉｖｏ系を利用できることも従来技術に示されている（米国特許第６，０１５，７０５号）が、これらの技術のいずれも本発明が提案する方法とは異なる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記必要性及び問題に対処するために、本発明はタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ人工進化方法を提案する。この方法は類縁タンパク質Ｙの相補によりタンパク質Ｘをｉｎ  ｖｉｖｏ進化させることができ、ＸとＹはいずれもＥＣ酵素命名法の同一分類又は近縁分類に属する。実際に、ある分類の酵素の活性を突然変異により改変することができ、同一分類内だけでなく近縁分類（ＥＣ命名法の上３桁が共通）の特徴を表す活性を獲得させることもできることが判明した。換言するならば、本発明は別のタンパク質Ｙの活性を獲得するようにタンパク質Ｘを進化させる方法を提供し、Ｘはその元の特性又は活性の少なくとも１種を維持し、従って、結果的に拡張活性をもつ。
【０００８】
本方法はそれ自体の遺伝子に突然変異を導入できるという性質を利用できることからヌクレオチジルキナーゼ、ホスホリラーゼ及びヌクレオチジルトランスフェラーゼ型の酵素に特に適している。
【０００９】
従って、本発明はデオキシシチジン（ｄＣ）と化学的近縁性を示す広範なヌクレオシドを反応式：
ｄＣ＋ＡＴＰ→ｄＣＭＰ＋ＡＤＰ
に従ってリン酸化することが可能な酵素であるヒトデオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）を利用した。
この酵素はデオキシシチジン以外にプリンデオキシヌクレオシドｄＡ及びｄＧや、５−アザシチジン（５ａｚａｄＣ）及びアラビノシチジン等の塩基又は糖構造類似体も基質として認識する。他方、チミジンはこの酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ基質ではない［Ｄａｔｔａら，１９８９］。ヒトデオキシシチジンキナーゼのｃＤＮＡはクローニング及び配列決定されており［Ｃｈｏｔｔｉｎｅｒら，１９９１，ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｍ６０５２７］、ＤＣＫとヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの類似性が明らかになっている［Ｈａｒｒｉｓｏｎら，１９９１］。また、ヘルペスのチミジンキナーゼの三次元構造もＸ線結晶解析により解明されている［Ｂｒｏｗｎら，１９９５］。米国特許第６，０６３，３７６号はＤＣＫ１と６０％の一致度をもつ第２のヒトデオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ２と言う）を記載している。
【００１０】
本発明の方法では、それ自体のｄｃｋ遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発させるために前変異原ヌクレオシド類似体の存在下のＤＣＫの条件付き突然変異誘発特性を利用した。
【００１１】
即ち、遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋ  ｐ：：ｄｃｋＨ＋の細菌を２−アミノ−２’−デオキシリボシルプリン（ｄｉｓｏＡ）又は２−アミノデオキシリボシル−２−ヒドロキシプリン（ｄｉｓｏＧ）に暴露した後、トリメトプリムとチミジンの存在下に富栄養固形培地で培養した。２種の化合物を１０−８のオーダーの頻度で投与後にコロニーが出現した。前変異原ヌクレオシドの不在下ではコロニーは全く生存しなかった。
【００１２】
独立して得られた７個の突然変異プラスミド（ｄｉｓｏＧで突然変異誘発した４個とｄｉｓｏＡで突然変異誘発した３個）の遺伝子を配列決定した処、各々ＤＣＫのチミジンキナーゼ活性獲得を付与するＤ１３３ＥとＲ１０４Ｑの２種の点突然変異が判明した。更に、同一対立遺伝子にこれら２種の突然変異を併有するプラスミドを構築し、遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの株β７１１７に導入した。こうして突然変異又は欠失により不活化されたｔｄｋを相補し、同様にチミジンキナーゼ活性を発現させた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、一般に本発明はタンパク質の人工ｉｎ  ｖｉｖｏ進化方法に関し、前記方法は類縁タンパク質Ｙの相補によりタンパク質Ｘをｉｎ  ｖｉｖｏ進化させることができ、ＸとＹはＥＣ酵素命名法の同一分類又は近縁分類に属する。
【００１４】
このような方法はタンパク質Ｘの特性を改変するように進化させることができ、
ａ）タンパク質Ｘをコードする遺伝子を含む核酸で［タンパク質Ｙ＊］細胞を形質転換させることにより遺伝子型［タンパク質Ｙ＊：：タンパク質Ｘ＋］を含む細胞を得る段階（但し、Ｙ＊はＹをコードする遺伝子が不活化されていることを意味し、Ｙは類似活性をもつＸの近縁分類に属するタンパク質であり、ＸとＹの分類は４桁番号による国際命名法の少なくとも上３桁が共通のＥＣ分類に属することを特徴とし、前記細胞はその生存のためにＹとその基質の反応生成物が培地に供給されることを必要とする栄養要求性表現型を示す）と、
ｂ）段階ａ）で得られた細胞を突然変異誘発物質に暴露する段階と、
ｃ）Ｙの基質を含む培地で前記細胞を培養する段階（但し、Ｙとその基質の反応生成物は前記細胞の生存に必要なものである）と、
ｄ）段階ｃ）後に生存しており、前記突然変異誘発物質の作用により改変したタンパク質Ｘがタンパク質Ｙの欠損を相補している細胞を選択する段階を含む。
【００１５】
段階ｂ）では、例えばキナーゼ、ホスホリラーゼ又はＤＮＡ  ｐｏｌ  ｅｘｏ−の発現により突然変異原又は前変異原に対する細胞の感受性を増すことを目的とした任意技術を使用することができる。上記突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑを含むＤＣＫ１の発現ベクターを使用することが好ましい。
【００１６】
本発明の範囲では、「Ｙ＊」なる用語はＹをコードする遺伝子が不活化されており、即ち全部もしくは一部が欠失しているか又は配列挿入もしくは突然変異導入により不活化されていることを意味する。本発明はＹ遺伝子をＴｓ（温度感受性）型の表現型に改変する場合にも実施できることに留意すべきである。この場合には、細胞を選択段階（段階ｃ）及びｄ））中に非許容温度で培養する。
【００１７】
進化させることが所望されるタンパク質としては、特に以下のものを挙げることができる。
−キナーゼファミリーに属するタンパク質、例えば、
ＥＣ番号              国際命名法による名称
２．７．１．２０      アデノシンキナーゼ
２．７．１．２１      チミジンキナーゼ
２．７．１．３８      ホスホリラーゼキナーゼ
２．７．１．４９      ヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ
２．７．１．７４      デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）
２．７．４．６        ヌクレオシド二リン酸キナーゼ
２．７．４．７        ホスホメチルピリミジンキナーゼ
２．７．４．８        グアニル酸キナーゼ
２．７．４．９        チミジル酸キナーゼ
２．７．４．１０      ヌクレオシド三リン酸−アデニル酸キナーゼ
２．７．４．１１      （デオキシ）アデニル酸キナーゼ
２．７．４．１２      Ｔ２誘導デオキシヌクレオチドキナーゼ
２．７．４．１３      （デオキシ）ヌクレオシドリン酸キナーゼ。
−ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、例えば
ＥＣ番号              国際命名法による名称
２．７．７．６        ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
２．７．７．７        ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
２．７．７．８        ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ
２．７．７．１９      ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
２．７．７．２５      ｔＲＮＡアデニリルトランスフェラーゼ
２．７．７．４８      ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
２．７．７．４９      ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
２．７．７．５０      ｍＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ。
−ホスホリラーゼ、例えば
ＥＣ番号              国際命名法による名称
２．４．２．１        プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ
２．４．２．２        ピリミジン−ヌクレオシドホスホリラーゼ
２．４．２．３        ウリジンホスホリラーゼ
２．４．２．４        チミジンホスホリラーゼ
２．４．２．７        アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
２．４．２．８        ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ
２．４．２．９        ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ
２．４．２．１５      グアノシンホスホリラーゼ
２．４．２．２３      デオキシウリジンホスホリラーゼ
２．４．２．２８      ５’−メチルチオアデノシンホスホリラーゼ。
【００１８】
当然のことながら、他の酵素、特に代謝又は異化酵素も本発明の方法による進化の対象とすることができる。これらの酵素と夫々のＥＣ番号は国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の委員会により以下のアドレスｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｏｒｇ．ａｕ／ｅｎｚｙｍｅ／に記載されている。
【００１９】
１好適実施態様では、本発明はタンパク質ＸがＤＮＡに突然変異を導入する特性をもつ上記方法に関する。前変異原ヌクレオシド類似体の介在下のタンパク質Ｘの条件付き突然変異誘発特性により、それ自体の遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発させることができる。
【００２０】
この観点では、本発明の方法はキナーゼＸの特性を改変するように進化させることができ、前記方法は、
ａ）キナーゼＸをコードする遺伝子を含む核酸で［キナーゼＹ＊］細胞を形質転換させることにより遺伝子型［キナーゼＹ＊：：キナーゼＸ＋］を含む細胞を得る段階（但し、Ｙ＊はＹをコードする遺伝子が不活化されていることを意味し、Ｙは類似活性を示すＸの近縁分類に属するキナーゼであり、ＸとＹの分類は４桁番号による国際命名法の少なくとも上３桁が共通のＥＣ分類２．７．１．に属することを特徴とし、前記細胞はその生存のためにＹとその基質の反応生成物が培地に供給されることを必要とする栄養要求性表現型を示す）と、
ｂ）段階ａ）で得られた細胞をキナーゼＸによりリン酸化することが可能な前変異原ヌクレオシド類似体に所与時間暴露する段階と、
ｃ）Ｙの基質を含む培地で前記細胞を培養する段階（但し、Ｙとその基質の反応生成物は前記細胞の生存に必要なものである）と、
ｄ）段階ｃ）後に生存しており、前記前変異原ヌクレオシド類似体の作用により改変したキナーゼＸがキナーゼＹの欠損を相補している細胞を選択する段階を含む。
【００２１】
「相補」とは、遺伝子Ｙの不活化による栄養要求性表現型の抑制を意味する。
【００２２】
前記細胞は原核又は真核細胞、好ましくは大腸菌である。タンパク質Ｘがキナーゼである場合には、基質はヌクレオシドとその類似体から選択される。
【００２３】
キナーゼＸはＥＣ分類２．７．１．７４に属するデオキシシチジンキナーゼが有利である。キナーゼＹはＥＣ分類２．７．１．７４に属さないキナーゼ、特にＥＣ分類２．７．１．２１に属するチミジンキナーゼ（ＴＤＫ）が好ましい。Ｘがホスホリラーゼ又はポリメラーゼである場合には、ＹはＸとは異なるホスホリラーゼ又はポリメラーゼである。
【００２４】
従って、上記方法は、
ａ）段階ａ）で得られた細胞を、
−前変異原ヌクレオシド類似体とチミジル酸シンターゼによるチミジル酸合成を阻止するトリメトプリムから選択される突然変異誘発物質と、
−前記細胞の生存に必要なチミジン
を含む培地で培養して大腸菌Δｄｅｏ  ｔｄｋ  ｐ：：ｄｃｋＨ＋を得る段階と、
ｂ）段階ｂ）後に生存しており、前記前変異原類似体の作用により改変したＤＣＫＨがＴＤＫの欠損を相補している細胞を選択する段階を含むことができる。
【００２５】
キナーゼＸはデオキシシチジンキナーゼ、特にＧＥＮＢＡＮＫに登録番号Ｍ６０５２７で登録されている配列のヒトＤＣＫ１が有利であり、突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑから選択される少なくとも１種の突然変異を加える。ＤＣＫ１の二重突然変異配列（配列番号１）を以下に示す。
【００２６】
【化１】
2004528844.tif 000003
【００２７】
更に、キナーゼＸはそれ自体の遺伝子に突然変異を導入する前変異原ヌクレオシド類似体を活性化できることが好ましい。
【００２８】
方法の完了後に、突然変異キナーゼＸはキナーゼＹに代替（相補）することができるので、その元の活性よりも拡張した活性を示す。
【００２９】
従って、第２の側面では、本発明は上記方法により獲得可能な突然変異タンパク質Ｘ、特に突然変異キナーゼＸに関し、元のタンパク質Ｘ（又は元のキナーゼＸ）よりも拡張した活性を示すことを特徴とする。例えば、突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑから選択される少なくとも１種の突然変異を加えた上記ヒトキナーゼＤＣＫ１を挙げることができる。本発明は上記ヒトキナーゼＤＣＫ１をコードする配列を含む核酸と、このコーディング配列を含むベクターにも関し、前記配列は真核及び／又は原核細胞で有効なプロモーターに融合することができる。
【００３０】
ベクターは形質転換により細菌（例えば大腸菌）に導入可能なプラスミドが好ましく、ベクターは細菌で安定的又は一過的に維持される。
【００３１】
本発明は上記ベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００３２】
本発明の別の側面は前変異原ヌクレオシド類似体を活性化するための上記方法における上記キナーゼの使用に関する。より一般には、本発明は酵素リン酸化に自然耐性のヌクレオシドを夫々の５’リン酸誘導体に変換するための任意超変異誘発方法における上記キナーゼの使用に関する。
【００３３】
本発明は前変異原による突然変異誘発範囲をｉｎ  ｖｉｖｏ拡張するための請求項１２又は１３に記載のキナーゼと他の酵素（例えばＡＭＫ及び／又はトランスデオキシリボシラーゼ（ＮＴＤ））の併用にも関する。
【００３４】
更に、ＤＮＡにヌクレオシド類似体を取込ませるための遺伝子治療用医薬の製造にも上記ベクターを使用できることに留意すべきである。
【００３５】
本発明は細胞内の所定ＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発方法として、
−少なくとも１種の酵素系を発現する細胞を使用して少なくとも１種の前変異原ヌクレオシドを前記ＤＮＡ配列に挿入することにより突然変異を行う段階と、
−突然変異配列の存在を検出する段階を含み、酵素系が上記キナーゼを含むことを特徴とする方法にも関する。
【００３６】
本方法は細胞の特定タンパク質を進化させることができる。この観点では、細胞の生存に必要な前記特定タンパク質の類縁タンパク質をコードする遺伝子を不活化させ、前記特定タンパク質をコードする遺伝子の突然変異後に相補を検出する。前記特定タンパク質と前記類縁タンパク質は４桁番号によるＥＣ国際命名法の少なくとも上３桁が共通の近縁分類に属する酵素であることが好ましい。
【００３７】
これらのタンパク質は適当な選別手段を使用することによりＥＣ分類２．７．１．に属するキナーゼ、ＥＣ分類２．７．７．に属するヌクレオチジルトランスフェラーゼ、特にポリメラーゼ及びＥＣ分類２．４．２．に属するホスホリラーゼから選択される。前記タンパク質はそれ自体の遺伝子を進化させることができる特性をもつものが有利である。
【００３８】
本発明は２００１年２月２１日付けでＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  ｃｅｄｅｘ  １５，フランス）に登録番号Ｉ−２６３１で寄託されたＤ１３３Ｅ突然変異ＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７１５１にも関する。
【００３９】
本発明は２００１年２月２１日付けでＣＮＣＭに登録番号Ｉ−２６３０で寄託されたヒトＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７１３４にも関する。
【００４０】
本発明は２００１年３月２７日付けでＣＮＣＭに登録番号Ｉ−２６５０で寄託されたＤ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑ二重突然変異ＤＣＫを発現するベクターを含む遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの大腸菌株β７３３８にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
材料と方法
化合物：化合物３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’−デオキシイノシン（ｄＩ）、Ｎ４−アミノ−２’−デオキシシチジン（２−ヒドロキシ−４−ヒドラジノピリミジンのデオキシリボヌクレオシド、略称４ａｍ’ｄＣ）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５ａｚａｄＣ）、５−ヨード−２’−デオキシシチジン（５ＩｄＣ）、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン（５ＢｒｄＣ）及び５−メチル−２’−デオキシシチジン（５ＭｅｄＣ）はＳｉｇｍａ社から購入した。２−デオキシイソアデノシン（ｄｉｓｏＡ）（２−アミノ−９−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン）はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉのＮ−デオキシリボシルトランスフェラーゼの粗抽出物を使用して酵素糖転移反応により製造した。２’−デオキシイソグアノシン（２−ヒドロキシ−６−アミノ−９−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン）は５−アミノ−１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミドの閉環により製造した。１−（２’−デオキシリボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド（ｄＹ）の製造はＰｏｃｈｅｔら，１９９５に記載されている。
【００４２】
細菌株の培養：細菌はＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）富栄養培地又はグルコース２ｇ／ｌを加えた最少培地（ＭＳ）で培養した。同一増殖培地に寒天（Ｄｉｆｃｏ）１５ｇ／ｌを加えて凝固させ、ペトリ皿を調製した。培養液と固形分を３７℃で培養した。場合により、抗生物質としてカルベニシリン１００ｍｇ／ｌ、カナマイシン２５ｍｇ／ｌ、テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを加えた。０．３ｍＭチミジンを加えたＬＢ培地中１００ｍｇ／ｌの濃度でトリメトプリムを使用した。遺伝子の発現を誘導するために、０．５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えた。
【００４３】
株とプラスミド構築：使用した大腸菌株Ｋ１２と本発明の範囲で構築したプラスミドの一覧を下表１に示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
３０μＭ  ＡＺＴを加えたＬＢプレートで培養したＭＧ１６５５のＡＺＴ自然耐性突然変異体として株β７０６９を選択した。トリメトプリムとチミジンを加えたミューラーヒントン（ＭＨ）富栄養培地での増殖不在によりｔｄｋ表現型を試験した。ＬＢ２０世代後にトリメトプリムとチミジンを加えたＭＨ培地に細胞を移すことにより、突然変異β７０６９ｔｄｋが自然復帰しないことを確かめた。連続２回のＰ１形質導入後にΔｄｅｏ  ｔｄｋ株β７１１７を得た。ΔｓｅｒＢ欠失と近位マーカーＴｎ１０を導入する目的でＫＵ８に由来するＰ１溶解液をまずβ７０６９細菌に感染させた。テトラサイクリン耐性クローンを選択し、そのセリン栄養要求性を試験した。次に、これらのクローンの１個にＳφ９２８に由来するＰ１溶解液を感染させ、最少培地でセリン原栄養株を選択した。選択した全Ｓｅｒ＋形質導入株は単独炭素源としてチミジンを加えた最少培地で増殖できないのでオペロンｄｅｏを欠失している。ｐＤＣＫ３の４６６塩基長ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＤＣＫ２の同一フラグメントで置換することによりプラスミドｐＤＣＫ４を構築した。ｐＤＣＫ４に突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑが存在することを配列決定により確認した。
【００４６】
ＤＣＫ突然変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ選択：カルベニシリン５０ｍｇ／ｌを加えたＭＳ培地でβ７１３４細胞を１２時間培養し、同一培地で１００倍に希釈し、濁度０．１００（６００ｎｍ）に達する時点まで通気培養した。次に、ＩＰＴＧを加えるか又は加えずに同一培地で培養液を２５倍に希釈し、可変濃度（５〜３０μＭ）の前変異原ヌクレオシド類似体ｄｉｓｏＧ及びｄｉｓｏＡを加えた後、１８時間通気培養した。細胞をリンスした後にトリメトプリム、チミジン及びＩＰＴＧを加えたＭＧプレートに播種した。３７℃で３６時間培養後にコロニーが出現した。ヌクレオシド類似体の不在下ではコロニーは得られなかった。
【００４７】
最少阻止濃度（ＭＩＣ）の測定試験：常法を次のように改変してヌクレオシド類似体のＭＩＣを測定した。即ち、適当な抗生物質を加えたＭＳ培地で１２時間培養した細菌培養液を同一培地で１００倍に希釈し、濁度約０．１ＯＤ（６００ｎｍ）が得られるまで３７℃で通気培養した。次に、ＩＰＴＧを加えた同一培地で培養液を１００倍に希釈し、ヌクレオシド類似体の２倍希釈系列を加えた９６穴マイクロプレートに最終容量が１００μｌとなるように分配した。各類似体を２回ずつ試験した。３７℃で１８時間撹拌下に培養後に、濁度を検出できない最低類似体濃度に対応する濃度としてＭＩＣを測定した。
【００４８】
復帰試験：ｌａｃ株ＣＣ１０１〜ＣＣ１０６の細胞をプラスミドｐＳＵＤＣＫ２単独又はプラスミドｐＳＵＤＣＫ２とｐＡＫ１で形質転換させた。プラスミドを維持するのに適した抗生物質とグルコース０．２％を加えた最少培地で形質転換細胞を１２時間培養した。次に、培養液を同一培地で１００倍に希釈し、０．１ＯＤ（６００ｎｍ）が出現するまで培養した。次に、０．５ｍＭＩＰＴＧを加えた同一培地で培養液を１００倍に希釈した後、被験ヌクレオシド類似体の１０倍濃縮液で１０倍に希釈した。細胞を３７℃で１８時間培養後にバッチ培養した。ＬＢ固形培地で生存細胞の計数を行った。炭素源として０．２％ラクトースを加えた最少培地でＬａｃ＋復帰突然変異体を選択した。突然変異頻度は生存細胞数に対する突然変異細胞数の比として定義した。Ｍｉｌｌｅｒ細胞由来株の各種類似体に対する感受性はＭＧ１６５５由来株と同一ではないので、ＭＩＣ／２、ＭＩＣ／４、ＭＩＣ／１０及びＭＩＣ／２０に対応する各種最終濃度のヌクレオシド類似体を試験した。１８時間後に明白な増殖を可能にする最高濃度のヌクレオシド類似体で得られる培養液を使用して突然変異頻度を測定した。
【実施例１】
【００４９】
選択スクリーニング
ｔｄｋ遺伝子によりコードされ、チミジンとデオキシウリジンに非常に特異的であるチミジンキナーゼを除き、大腸菌はデオキシヌクレオシドキナーゼ活性をもたない。大腸菌にデオキシシチジンキナーゼ活性を導入した場合にこの生物に存在しない代謝経路がどのように構築され、天然デオキシヌクレオシド及び構造類似体がＤＮＡのモノマープールを利用できるかについては先に報告した［ＢｏｕｚｏｎとＭａｒｌｉｅｒｅ，１９９７］。ｔｄｋ遺伝子の欠損対立遺伝子をもつ株はチミジンをチミジル酸（ｄＴＭＰ）源として利用することができず、その増殖はチミジル酸のｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路の完全性に依存する（図１）。ｄＵＭＰからｄＴＭＰの合成はチミジル酸シンターゼ（ｔｈｙＡ遺伝子）により触媒される。この合成はトリメトプリムにより阻止することができ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性の阻害により、反応にメチル基を供与する５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸の細胞内プールを枯渇させる。本発明者らはｔｄｋ遺伝子を不活化させた株がトリメトプリムとチミジンを加えた富栄養培地で増殖しないことをまず実証した。チミジンキナーゼ活性の維持を条件とするこの選択スクリーニングを利用し、大腸菌でヒトデオキシシチジンキナーゼ活性を進化させた。これを図１に示す。
【実施例２】
【００５０】
拡張活性を示す突然変異体ｄｃｋＨの選択
前変異原ヌクレオシド類似体の介在下のＤＣＫの条件付き突然変異誘発特性を利用し、それ自体のｄｃｋ遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発させた。即ち、遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋ  ｐ：：ｄｃｋＨ＋の細菌を２’−デオキシイソアデノシン（ｄｉｓｏＡ）又は２’−デオキシイソグアノシン（ｄｉｓｏＧ）に暴露した後、トリメトプリムとチミジンの存在下に富栄養固形培地で培養した。前記２種の化合物を１０−８のオーダーの頻度で投与後にコロニーが出現した。前変異原ヌクレオシドの不在下ではコロニーは全く生存しなかった。
【００５１】
独立して得られた７個の突然変異プラスミド（ｄｉｓｏＧで突然変異誘発した４個とｄｉｓｏＡで突然変異誘発した３個）の遺伝子を配列決定した処、各々ＤＣＫのチミジンキナーゼ活性獲得を付与するＤ１３３ＥとＲ１０４Ｑの２種の点突然変異が判明した。これらの対立遺伝子をｄｃｋＨ＊と言う。同一対立遺伝子にこれら２種の突然変異を併有するプラスミドｄｃｋＨ＊＊を構築し、遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋの株β７１１７に導入した。こうしてｔｄｋ突然変異を相補し、同様にチミジンキナーゼ活性を発現させた。選択した各種対立遺伝子を下表２に示す。
【００５２】
【表２】
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選択と遺伝子解析の詳細については材料と方法の項に記載した。
【実施例３】
【００５３】
突然変異体ｄｃｋＨの機能特性
野生型対立遺伝子、Ｄ１３３Ｅ、Ｒ１０４Ｑ及び二重突然変異体の各種ｄｃｋＨ対立遺伝子をプラスミドで発現する遺伝子型Δｄｅｏ  ｔｄｋ  ｃｄｄの株で糖又は塩基の異なるヌクレオシド類似体の毒性を検討した。
【００５４】
Δｄｅｏマーカーはデオキシヌクレオシドの異化オペロンの不活化に対応し、ｃｄｄマーカーはデオキシシチジンデアミナーゼの不活化に対応し、これらのマーカーは培地に加えたヌクレオシド類似体がＤＣＫの作用による所望リン酸化誘導体以外の誘導体を生成しないようにし、類似体の使用量を少なくすることができる。結果を下表３に示す。
【００５５】
【表３】
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最少阻止濃度（μＭで表す）を材料と方法の項に記載したように測定した。
【００５６】
３回ずつアッセイしたが、最高類似体濃度である１．２８ｍＭでは毒性を全く検出することができなかった。
【００５７】
各対立遺伝子の宿主株の詳細な遺伝子型は表１に示す。
【００５８】
いずれも基質としてチミジンを受容させた処、点突然変異Ｄ１３３Ｅ及びＲ１０４Ｑは試験した各種類似体のリン酸化に対照的な効果があった。
【００５９】
大腸菌野生型株は低濃度ＡＺＴに感受性であるが、チミジンキナーゼ活性を失ったｔｄｋ株は耐性である［Ｅｌｗｅｌｌら，１９８７］。表３に報告する試験によると、ＡＺＴは野生型ＤＣＫの基質ではないが、突然変異体Ｄ１３３Ｅはこの類似体を活性化し、類似体濃度が高いと毒性が検出される（ＭＩＣ＝１２８０μＭ）。この毒性はｄＴＭＰキナーゼとヌクレオシドジホスホキナーゼがＡＺＴ一リン酸に連続作用した後にＡＺＴ三リン酸がＤＮＡポリメラーゼにより取込まれ、このチェーンターミネーターにより伸長が阻止されることに起因すると思われる。
【００６０】
更に表３の結果を分析すると、突然変異Ｄ１３３ＥはｄｉｓｏＡの強い毒性を生じる（ＭＩＣ＝１０μＭ）。突然変異Ｒ１０４Ｑはこの化合物に影響がない。同様に、突然変異Ｄ１３３ＥはデオキシイノシンｄＩの非常に強い毒性を生じる（ＭＩＣ＝１μＭ）。２−ヒドロキシ−４−ヒドラジノピリミジンのデオキシリボヌクレオシド（４ａｍ’ｄＣ）は突然変異体Ｄ１３３Ｅよりも突然変異体Ｒ１０４Ｑの良好な基質であると思われ、どちらの突然変異もこの類似体の毒性を著しく増す。５−アザデオキシシチジン（５ａｚａｄＣ）はＤＣＫ対立遺伝子の種類に関係なく非常に低濃度（ＭＩＣ＜１．２５μＭ）で毒性である。
【００６１】
総合すると、対立遺伝子ｄｃｋＨ−Ｄ１３３Ｅが最も有利であり、最多数の類似体に対して感受性が増すことが判明した。Ｄ１３３ＥとＲ１０４Ｑの２種の突然変異を併用すると、個々の突然変異体の中間と思われる活性スペクトルが得られる。
【実施例４】
【００６２】
異種遺伝子の同時発現による代謝多様化
全毒性作用はＤＮＡ鎖に間違ったモノマーが取込まれる結果であると仮定するならば、ヌクレオシド類似体がｄｃｋＨ遺伝子又はその突然変異対立遺伝子の１種を発現する大腸菌株に対して毒性作用をもたない場合にはいくつかの理由が考えられ、（ｉ）類似体が酵素ＤＣＫの基質でないか又は不良な基質である、（ｉｉ）類似体がＤＣＫによりリン酸化されて一リン酸となるが、二リン酸や三リン酸への後期リン酸化段階に至らない、（ｉｉｉ）三リン酸類似体がＤＮＡポリメラーゼの基質でないなどの理由が考えられる。
【００６３】
三リン酸から二リン酸を生成するヌクレオシド一リン酸キナーゼはリボースとデオキシリボースを受容するが、非常に塩基特異的であることが知られている。従って、拡張種の一リン酸（突然変異ＤＣＫ対立遺伝子）を形成する酵素と拡張種の二リン酸を形成する酵素が同一大腸菌細胞で同時に生産されると、異なる塩基をもつヌクレオシド基質を野生型ＤＣＫ又は突然変異ＤＣＫによりリン酸化して一リン酸とすることはできるが、大腸菌酵素の触媒により二リン酸に変換することはできないと予想されていた。
【００６４】
真核生物のアデノシン一リン酸キナーゼ（ＡＭＫ）は細菌のＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼと構造類似を示す［Ｏｋａｊｉｍａら，１９９３］。その生理機能はＡＭＰとＡＴＰの間のリン酸交換：
ＡＭＰ＋ＡＴＰ  ＜――＞  ＡＤＰ＋ＡＤＰ
を触媒することであると考えられ、この酵素はデオキシリボースをもつ基質にも作用する。
ｄＡＭＰ＋ＡＴＰ  ＜――＞  ｄＡＤＰ＋ＡＤＰ。
【００６５】
日本のグループ［Ｏｋａｊｉｍａら，１９９３］は配列比較に基づく部位特異的突然変異誘発によりニワトリ酵素の遺伝子の突然変異体Ｔ３９Ａ（ａｍｋＧ＊）を構築している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏではＣＭＰに対するＡＭＫの活性はＡＭＰに対するその活性の１％未満である。突然変異Ｔ３９Ａは酵素の活性スペクトルを変え、ＣＭＰとＵＭＰの変換を著しく増加する［Ｏｋａｊｉｍａら，１９９３］。
【００６６】
４種のｄｃｋＨ対立遺伝子の各々と野生型及びＴ３９Ａの２種のａｍｋＧ対立遺伝子の各々をΔｄｅｏ  ｔｄｋ  ｃｄｄ遺伝子コンテキストで同時に発現させ、先に試験した各種ヌクレオシド類似体の毒性を試験した（下表４）。
【００６７】
【表４】
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最少阻止濃度（μＭで表す）を材料と方法の項に記載したように測定した。
【００６８】
各実験を３回ずつ実施したが、最高類似体濃度である１２８０μＭでは毒性を全く検出することができなかった。
【００６９】
各対立遺伝子の宿主株の詳細な遺伝子型は表１に示す。
【００７０】
２種の真核遺伝子を同時発現させると、デオキシシチジンｄＣの５−ハロゲン化誘導体（５ＢｒｄＣ，５ＩｄＣ）と５−メチル化誘導体（５ＭｅｄＣ）は組換え細菌を阻害する誘導体に代謝変換されるが、２種の遺伝子の一方のみを発現させると、細菌は同一類似体に耐性のままであることが判明した。ＤＣＫとＡＭＫを同時発現させると類似体の毒性が非常に強いことからＤＣＫはこれらの基質をリン酸化するが、一リン酸キナーゼによる後期リン酸化段階は制限的であると考えられる。
【００７１】
表４から明らかなように、対立遺伝子ＤＣＫ−Ｄ１３３Ｅと対立遺伝子ＡＭＫ−Ｔ３９Ａを併用すると、これらの遺伝子をもつ大腸菌株はデオキシリボシルイミダゾールカルボキサミド（略称ヌクレオシドｄＹ）に対して毒性になる［Ｐｏｃｈｅｔら，１９９５］。塩基Ｙの突然変異誘発効果はＰＣＲ増幅反応中にｅｘ  ｖｉｖｏで立証され、特にＡ：Ｔ−＞Ｇ：ＣトランジションとＡ：Ｔ−＞Ｔ：Ａトランスバージョンを生じることが分かっている［Ｓａｌａら，１９９６］。ここで報告する株に対する１ｍＭ  ｄＹの毒性は同一ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異スペクトルの増加を伴う。
【００７２】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】大腸菌でチミジンキナーゼ活性を選択するためのスクリーニング。
【図２】大腸菌チミジンキナーゼとヒトデオキシシチジンキナーゼの特異性の比較。
【図３】ヌクレオシド類似体の例。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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