(57)【要約】本発明は、アドレスにより定義された表面上の核酸の比較定量のための方法および関連する組成物に関する。本発明の方法は、核酸と一般的なオリゴヌクレオチドを結合させる工程、および一般的なオリゴヌクレオチドと直接的または間接的に標識された相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程を包含する。この方法は、例えば、ＳＮＰ遺伝子型決定および遺伝子発現解析に適用可能である。この方法はまた、多くの異なる生物体および組成物に適用可能である。例えば、この方法および組成物は、とりわけ、ヒトおよび他の霊長類、畜牛および他のウシのような有蹄動物、ブタ、ならびに細菌で使用され得る。
2004535769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の存在または量を決定するための方法であって、以下：
少なくとも１つの第１オリゴヌクレオチドと少なくとも１つの捕獲オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、該捕獲オリゴヌクレオチドが該第１オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、そして、該捕獲オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、該第１ヌクレオチドが特異的標的オリゴヌクレオチドである場合には該第１オリゴヌクレオチド中の対応するヌクレオチドに相補的であり、そして、該第１オリゴヌクレオチドが該特異的標的ヌクレオチドでない場合には相補的でない、工程；
該第１オリゴヌクレオチドとレポーターオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、少なくとも４ヌクレオチド長の該レポーターオリゴヌクレオチドの５’部分が該特異的標的オリゴヌクレオチドと完全に相補的であり、そして、該レポーターオリゴヌクレオチドの少なくとも４ヌクレオチド長の３’部分が該特異的標的オリゴヌクレオチドに相補的でなく、ここで、該レポーターオリゴヌクレオチドが該捕獲オリゴヌクレオチドに直接隣接する該特異的標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、工程；
該第１オリゴヌクレオチド、該捕獲オリゴヌクレオチドおよび該レポーターオリゴヌクレオチドをライゲーション条件に供する工程であって、ここで、該３’末端ヌクレオチドが該第１オリゴヌクレオチド対応するヌクレオチドに相補的である場合にのみ、該捕獲オリゴヌクレオチドが該レポーターオリゴヌクレオチドに連結される、工程；
該レポーターオリゴヌクレオチドと、該レポーターオリゴヌクレオチドの該３’部分に特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件下で接触させる、工程；
異なる識別可能なアドレスに、レポーターオリゴヌクレオチドと連結された異なる捕獲オリゴヌクレオチドを結合させる、工程；
および、該標識オリゴヌクレオチドが、該特異的標的オリゴヌクレオチドの存在または量の指標として、該識別可能なアドレスに存在するかどうかを決定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドが使用され、各レポーターオリゴヌクレオチドが前記３’部分中に同一のヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで、１つのヌクレオチド配列のみが、前記３’部分に相補的な前記標識オリゴヌクレオチドに対して使用される、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記決定する工程が複数の異なる標的オリゴヌクレオチドに対して実施される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記決定する工程が、複数の異なる識別可能なアドレスに結合した前記異なる標的オリゴヌクレオチドの各数を決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記複数の異なる識別可能なアドレスに結合する前記異なる標的オリゴヌクレオチドの各数が、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位中に存在する各異なるヌクレオチドの相対数を示す、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記オリゴヌクレオチドがアレイ上に結合している、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記オリゴヌクレオチドがコードビーズに結合している、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標識オリゴヌクレオチド上の標識が蛍光標識である、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標識オリゴヌクレオチド上の標識が放射標識である、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、該標識オリゴヌクレオチド上の標識が光散乱標識である、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、該標識オリゴヌクレオチド上の標識が間接的に標識されている、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記捕獲オリゴヌクレオチドが、前記アドレスに結合するオリゴヌクレオチドへの核酸ハイブリダイゼーションを使用して、前記アドレス可能な位置に結合する、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ライゲーション条件が、熱サイクルを使用して複数回繰り返される、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記ライゲーション条件が、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼの使用を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、潜在的な特異的標的オリゴヌクレオチドの数が増幅によって増大する、方法。
【請求項１７】
サンプル中の標的核酸の量または存在を決定するための方法であって、以下；
レポーターオリゴヌクレオチドと該サンプル由来の該標的核酸を特異的に結合させる工程であって、ここで、該レポーターオリゴヌクレオチドが該標的核酸に相補的でない一般的オリゴヌクレオチド配列を含有する、工程；
該一般的オリゴヌクレオチド配列と標識相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程；および
該標的オリゴヌクレオチドを識別可能なアドレスに結合させる工程、
を包含する方法であって、
ここで、該識別可能なアドレスでの該標識相補的オリゴヌクレオチドの存在が、該サンプル中の該標的ヌクレオチドの存在または量を示す、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記標識オリゴヌクレオチド上の標識が蛍光標識である、方法
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、該標識オリゴヌクレオチド上の標識が光散乱標識である、方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、該標識オリゴヌクレオチド上の標識が間接的な標識を含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記間接標識がストレプトアビジン／ビオチンの結合を利用する、方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの生物体由来の標的核酸配列における少なくとも１つのＳＮＰ部位の遺伝子型を決定する方法であって、以下：
捕獲オリゴヌクレオチドとＳＮＰ部位を含む該標的核酸配列を特異的にハイブリダイズさせる工程であって、ここで、該捕獲オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが該ＳＮＰ部位での代替ヌクレオチドの１つと相補的である、工程；
レポーターオリゴヌクレオチドと該捕獲オリゴヌクレオチドのすぐ３’の該標的核酸をハイブリダイズさせる工程であって、ここで、該レポーターオリゴヌクレオチドがまた、該標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしない少なくとも４ヌクレオチド長の３’部分を含む、工程；
該標的核酸、該捕獲オリゴヌクレオチド、および該レポーターオリゴヌクレオチドをライゲーション条件に供する工程であって、ここで、該捕獲オリゴヌクレオチドが、該ＳＮＰ部位でのヌクレオチドが該捕獲オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドと相補的である場合にのみ、該レポーターオリゴヌクレオチドに連結される、工程；
該レポーターオリゴヌクレオチドと、該レポーターオリゴヌクレオチドの該３’部分とハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドを接触させる、工程；
レポーターオリゴヌクレオチドに連結された捕獲オリゴヌクレオチドを該識別可能なアドレスに結合させる、工程；および
該標識オリゴヌクレオチドが、該ＳＮＰ部位で該標的核酸配列の遺伝子型の指標として該識別可能なアドレスに存在するかどうかを決定する、工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記ライゲーション条件が、熱サイクルを使用して複数回繰り返される、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記ライゲーション条件が、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼの使用を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記数なくとも１つのＳＮＰ部位が複数のＳＮＰ部位である、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記複数のＳＮＰ部位が少なくとも５つのＳＮＰ部位である、方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記遺伝子型を決定する工程が、少なくとも１つのＳＮＰ部位中の代替ヌクレオチドの存在の決定を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記生物体が哺乳動物である、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物がヒトである、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物がウシである、方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物がブタである、方法。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物がヒツジである、方法。
【請求項３３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記生物体が細菌である、方法。
【請求項３４】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記生物体が植物である、方法。
【請求項３５】
結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの複合体であって、該複合体の各々は以下：
標的オリゴヌクレオチドであって、該標的オリゴヌクレオチドに捕獲オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしており、ここで、該捕獲オリゴヌクレオチドおよび該レポーターオリゴヌクレオチドが該標的オリゴヌクレオチド上の直接隣接する位置にハイブリダイズし、そして、該レポーターオリゴヌクレオチドの３’末端が該標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしない、複合体；および
該レポーターオリゴヌクレオチドの該３’末端にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
を含有する、複合体。
【請求項３６】
請求項３５に記載の複合体であって、ここで、前記捕獲オリゴヌクレオチドおよび前記レポーターオリゴヌクレオチドがひとつに連結されている、複合体。
【請求項３７】
請求項３５に記載の複合体であって、ここで、前記複合体がアッセイ溶液中に存在する、複合体。
【請求項３８】
請求項３５に記載の複合体であって、ここで、前記複合体が識別可能なアドレスにて固相表面に結合されている、複合体。
【請求項３９】
請求項３５に記載の複合体であり、ここで、前記少なくとも１つの複合体が、単一の溶液中の複数の複合体であって、以下：
複数の異なる標的オリゴヌクレオチド；
複数の異なる捕獲オリゴヌクレオチド、および
複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドであって、ここで、該異なるレポーターオリゴヌクレオチドが前記標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする同一のヌクレオチド配列を有する、レポーターオリゴヌクレオチド
を含有する、複合体。
【請求項４０】
結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの複合体であって、該複合体の各々が以下：
標的オリゴヌクレオチド；
該標的オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするレポーターオリゴヌクレオチドであって、ここで、該レポーターオリゴヌクレオチドの少なくとも４ヌクレオチド長の末端部分が、該標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしない、レポーターオリゴヌクレオチド；および
該レポーターオリゴヌクレオチドの該末端部分にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
を含有する、複合体。
【請求項４１】
請求項４０に記載の複合体であって、前記少なくとも１つの複合体が単一溶液中の複数の複合体であり、以下：
複数の異なる標的オリゴヌクレオチド；および
複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドであって、ここで、該異なるレポーターオリゴヌクレオチドが前記末端部分中に同一のヌクレオチド配列を有する、レポーターオリゴヌクレオチド、
を含有する、複合体。
【請求項４２】
請求項４０に記載の複合体であって、ここで、該複合体が識別可能なアドレスで固相表面に結合している、複合体。
【請求項４３】
生物体由来の核酸における少なくとも１つのＳＮＰ部位の遺伝子型を決定するためのキットであって、以下：
識別可能なアドレスを有する少なくとも１つの固相であって、結合条件下で捕獲オリゴヌクレオチドに結合する化学物質を含有する、固相；
潜在的な標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように選択されたヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの該捕獲オリゴヌクレオチド；
該捕獲オリゴヌクレオチドのすぐ３’部分の該潜在的な標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように選択されたヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つのレポーターオリゴヌクレオチド；および
ハイブリダイゼーション条件下で該レポーターオリゴヌクレオチドの３’部分にハイブリダイズする、標識オリゴヌクレオチド、
を含有する、キット。
【請求項４４】
請求項４３に記載のキットであって、前記捕獲オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが鋳型核酸の対応するヌクレオチドに相補的でない場合に、選択的な連結条件下で、該鋳型核酸にハイブリダイズする隣接した該捕獲オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドに連結しないリガーゼをさらに含有する、キット。
【請求項４５】
請求項４３に記載のキットであって、前記捕獲オリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な配列を含む結合オリゴヌクレオチドをさらに含有し、ここで、該結合オリゴヌクレオチドが前記固相表面に結合する、キット。
【請求項４６】
サンプル中の少なくとも１つの標的核酸の存在を決定するためのキットであって、以下：
標識オリゴヌクレオチド；および
該標的オリゴヌクレオチドを使用して、レポーターオリゴヌクレオチドと標的核酸を特異的に結合させることによりサンプル中の標的核酸の存在または量を決定し、；該標識オリゴヌクレオチドと該レポーターオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ；該レポーターオリゴヌクレオチドを識別可能なアドレスに結合し；そして該識別可能なアドレスからのシグナルを該サンプル中の該標的核酸の存在または量の指標として決定する方法、を記載した説明書、
を含有する、キット。
【請求項４７】
請求項４６に記載のキットであって、複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドをさらに含有し、各々の異なるレポーターオリゴヌクレオチドが前記標識オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含む、キット。
【請求項４８】
請求項４７に記載のキットであって、複数の異なる捕獲オリゴヌクレオチドをさらに含有し、ここで、各々の異なる捕獲オリゴヌクレオチドが、前記レポーターオリゴヌクレオチドに直接隣接する標的核酸に結合するように選択された配列を含む、キット。
【請求項４９】
ＤＮＡリガーゼをさらに含有する、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
サンプル中の標的核酸の存在を決定するためのキットであって、以下：
複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドであって、該異なるレポーターオリゴヌクレオチドの各々が標的核酸および一般的なオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように選択された配列を含む、複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチド；および
該一般的なオリゴヌクレオチドの配列の含む、標識オリゴヌクレオチド、
を含有する、キット。
【請求項５１】
請求項５０に記載のキットであって、前記標識オリゴヌクレオチドおよび前記レポーターオリゴヌクレオチドを使用してレポーターオリゴヌクレオチドと標的核酸を特異的に結合させることによりサンプル中の標的核酸の存在または量を決定し；該標識オリゴヌクレオチドと該レポーターオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ；識別可能なアドレスに該レポーターオリゴヌクレオチドを結合し；そして該識別可能なアドレスからのシグナルを、該サンプル中の該標的核酸の存在または量の指標として決定する方法、記載した説明書をさらに含有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、結合核酸、特にＳＮＰ遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の比較定量、ならびに結合核酸の比較定量に関する他の適用に関連する。
【０００２】
多くの研究が、遺伝的変異と表現型の発現との間の関連性を示してきた。遺伝的変異を決定するために、多くの異なる遺伝子型決定方法が開発された。
【０００３】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、異なる個体間の特定の遺伝子座での単一のヌクレオチドの改変または差異である。ＳＮＰは、最も頻繁かつ安定な遺伝的変異の１つを表す。ゆえに、ＳＮＰ遺伝子型決定は、非常に詳細なレベルの染色体の遺伝的および物理的マッピングを提供するために使用され得る。
【０００４】
ヒトゲノムプロジェクトの完了およびハイスループットなＤＮＡ配列決定技術の開発とともに、ＳＮＰ検出は大きく前進した。多くの技術的プラットフォームがＳＮＰ多型を検出するために、商業的に開発されている。例として、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＣｌｅａｖａｓｅに基づくＩｎｖａｄｅｒアッセイ、Ｓｅｑｕｅｎｏｍによる単一塩基伸長（ＳＢＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒによるＴａｑｍａｎ反応に基づくアッセイ、Ｏｒｃｈｉｄによる単一塩基伸長に基づくＧＢＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）アッセイ、Ｌｕｍｉｎｅｘによるカラーコード微粒子およびＬａｂＭａｐコンピューター分析に基づくアッセイ、ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇに基づくアッセイ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、ならびにＬＪＬ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓによるＳＢＥおよび蛍光偏光に基づくアッセイが、挙げられる。
【０００５】
多様な選択の中で、ＬｕｍｉｎｅｘカラーコードビーズおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップのみが複数の遺伝子型決定のために設計されており、ここで、複数のＳＮＰ部位は、一回の反応で同時に遺伝子型が決定される。例示的な複数の遺伝子型決定において、カラーコードビーズまたはチップ上の物理的に定義された部位は、ＳＮＰ特異的オリゴヌクレオチドに結合され、次いで、ＤＮＡサンプル（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）のＳＮＰ遺伝子型を調べるために、使用される。この調査技術は、例えば、ＳＮＰ特異的ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｎ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｌｅｙらに対する米国特許第４，８８３，７５０号、Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７（１９８８）、Ｄ．Ｙ．Ｗｕら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９）、Ｆ．Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１８９〜１９３（１９９１）を参照のこと、これらの全ては、その全体が本明細書中に参考として援用される）、またはＳＮＰの２つの対立遺伝子を区別し得る任意の他のアッセイであり得る。
【０００６】
ＯＬＡは、ハイブリダイゼーションおよびＴａｑリガーゼの酵素的反応の両方の特異性を併せ持つので、有用である。ＯＬＡアッセイにおいて、ＳＮＰ対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（捕獲オリゴヌクレオチド）（標的ＳＮＰの５’上流側および代替ＳＮＰヌクレオチドの１つにハイブリダイズする配列を有する）は、共通のオリゴヌクレオチド（レポーターオリゴヌクレオチド）（Ｔａｑリガーゼによって触媒される反応において、標的ＳＮＰのすぐ３’下流部位にハイブリダイズする配列を有する）に共有結合される。この反応は、捕獲オリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡがＳＮＰ部位で完全にマッチすることを、必要とする。ミスマッチは、ＯＬＡ反応を中断する（本明細書では、用語オリゴヌクレオチドおよびオリゴは、交換可能に使用される）。
【０００７】
この方法において、ＳＮＰの２つの対立遺伝子が区別される。この反応は、ＳＮＰ部位周辺におけるオリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡとの完全なマッチを必要とする一方、ＳＮＰ部位の１５ヌクレオチドもしくはそれより上流、または下流のオリゴヌクレオチド配列に関して、このような拘束はない。
【０００８】
現在、ＯＬＡ反応は典型的に、捕獲オリゴヌクレオチドの位置する特定のアドレス（または、特定の識別可能なビーズ）にてレポーターオリゴヌクレオチドに結合された蛍光標識により生成される蛍光シグナルによって測定される。レポーターオリゴヌクレオチドは、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）を用いて直接的に標識され得るか、または例えば、ビオチンをオリゴヌクレオチドに結合させ、次いでストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を用いて染色することによって、間接的に標識され得る。蛍光色素の選択は、使用される遺伝子型決定装置によって生成される励起光の波長により、部分的に決定される。例えば、最新のＬｕｍｉｎｅｘおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ機器は、フィコエリトリンが最も明るく、そして、最も共通に使用される色素である波長にて、励起光を提供するために、ＹａｇまたはＡｒｇｏｎレーザーを使用する。
【０００９】
ＯＬＡは特異性についての有効性を提供したが、残念ながら、蛍光標識オリゴヌクレオチドは非常に高価である。また、市販の供給源を通じてこのような標識オリゴヌクレオチドを注文することは、個々のレポーターオリゴヌクレオチドの各々が、個別に標識されていなければならないので、非常に時間を浪費する。染色体スキャニングまたは遺伝系統研究のために（ならびに他の適用において）、数百または数千のＳＮＰが遺伝子型決定されなければいけない。従って、個々に標識するレポーターオリゴヌクレオチドの費用は、多くの研究者の資力を上回るものである。
【００１０】
近年、Ｉａｎｎｏｎｅら（２０００）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３９：１３１〜１４０は、完全にマッチする１８塩基のオリゴヌクレオチドを置換するために、短くかつ縮重した８塩基（定義された６＋縮重した２）レポーターを使用するＯＬＡを記載した。Ｉｎａｎｎｏｎｅらは、そうでなければ、レポーターの可能な配列全てを網羅する必要のある莫大な数を置換するために、オリゴの限定されたセットを使用することを意図する。しかし、この系が種々の異なる標的に対するハイスループットなアッセイのために使用される場合、このスキームは依然として、４６＝４０９６の特異的標識レポーターオリゴの合成を必要とする。さらに、１６個のこれらの縮重オリゴ中の１つのみが標的に完全にマッチする（従ってライゲーションに適している）ので、１５個のマッチしないオリゴは、溶液中に残存する。Ｉａｎｎｏｎｅら（前述）において、取り込まれなかったレポーターは、問題を引き起こさなかったようである。なぜなら、蛍光色素（フルオレセイン）は、低分子であり、そして、レポーターオリゴに共有結合されるからである。
【００１１】
対照的に、フィコエリトリンは巨大なタンパク質（２４０ｋＤａ）である。その巨大な大きさに起因して、フィコエリトリンは極めて低モル濃度にてのみ適用され得る。限定された数のフィコエリトリン分子は、取り込まれていない豊富なレポーターによって容易に飽和され、これは、レポーターが連結されるビーズ上の蛍光シグナルを大幅に減少する。従って、Ｉａｎｎｏｎｅら（前述）のスキームは、最新のＬｕｍｉｎｅｘおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ機器に適用可能でない。取り込まれなかったレポーターは洗浄することによって機械的に除去できるが、この余分な工程はハイスループットな遺伝子型決定のために望ましくない。なぜならば、この工程は反復的でかつ正確なピペッティングを必要とし、特に反応容積が小さい場合には、これはむしろ誤差を起こしやすいからである。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の方法は、異なる標識オリゴヌクレオチド（遺伝子型決定アッセイまたはサンプルもしくはアッセイにおける特定の核酸配列の存在または量についての他の決定を実施することが必要とされる）の数を劇的に減らすことによって、コストならびに現在の遺伝子型決定方法および材料における便宜的制限を回避する。この方法は、全てのレポーターオリゴヌクレオチドと一般的オリゴヌクレオチド配列とを適合させ、そして、一般的オリゴヌクレオチドと標識された相補的な一般的オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることによって、結合したレポーターオリゴヌクレオチドに対応する、標識シグナル（例えば、蛍光シグナル）を検出する工程および／または定量する工程を包含する。この方法は、多数の異なる構成に容易に組み込まれ得、特定の型の決定法（例えば、ＳＮＰ遺伝子型決定）に適合され得る。
【００１３】
本発明の方法および組成物は、複数の定量および／または多数のアッセイの実施について特に好都合であるが、これらの適用に限定されない。
【００１４】
従って、第１の局面において、本発明は、ハイブリダイゼーション条件下において、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチドと少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドとの接触により、特定の核酸配列（例えば、アッセイまたはサンプル中の）を定量するための方法を提供する。第１のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＰＣＲ増幅したゲノムＤＮＡである（例えば、Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）およびＭｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと）。このような捕捉ヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、そして捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、第１のヌクレオチドが特定の標的オリゴヌクレオチドである場合、第１のオリゴヌクレオチドの対応するヌクレオチドと相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドが特定の標的オリゴヌクレオチドでない場合、そして第１のオリゴヌクレオチドの対応するヌクレオチドと相補的でない。この方法はまた、ハイブリダイゼーション条件下において、第１のオリゴヌクレオチドと対応するレポーターオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を包含する。レポーターオリゴヌクレオチドの少なくとも４ヌクレオチド長（ハイブリダイゼーション条件下において相補的配列に対するハイブリダイゼーションを提供し、そして連結反応を支持するのに十分な長さ）の５’部分は、特定の標的オリゴヌクレオチドに対し相補的である。レポーターヌクレオチドの少なくとも４ヌクレオチド長の３’部分は、特定の標的オリゴヌクレオチドに対し相補的でない。レポーターオリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドに直接隣接する特定の標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。第１のオリゴヌクレオチド、捕捉オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドは、連結条件に供され、ここで、３’末端ヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドの対応するヌクレオチドと相補的である場合に限り、捕捉オリゴヌクレオチドは、レポーターオリゴヌクレオチドと連結される。レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下でレポーターオリゴヌクレオチドの３’部分と特異的にハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチドと接触させられる。レポーターオリゴヌクレオチドと連結した異なる捕捉オリゴヌクレオチドは、異なる識別可能なアドレスに結合され、そして１つまたは複数の識別可能なアドレスにおける標識されたオリゴヌクレオチドの存在および／または量が、存在する特異的な標的オリゴヌクレオチドの存在または量の指標として決定される。
【００１５】
好ましい実施形態において、複数の異なるレポーターオリグヌクレオチドが使用され、それぞれその３’部分に同一のヌクレオチド配列を含む。このことは、共通または一般的な標識されたオリゴヌクレオチドの使用を可能にする。
【００１６】
従って、好ましい実施形態において、１つのヌクレオチド配列のみが、複数の異なるレポーターオリゴの３’部分に相補的な標識されたオリゴヌクレオチドについて使用される。
【００１７】
好ましい実施形態において、決定は、単一のアッセイにおいて（本明細書中に記載される他の遺伝子型決定および存在または量の決定方法においてもまた）複数の異なる標的オリゴヌクレオチドについて実施され、そして従って、多重決定を包含する。あるいは、好ましい実施形態において、異なる標的オリゴの決定は、同一の生物体、同一セットの生物体のセットに由来する核酸に対して実施されるか、このような定量を実施するための二つ以上のパーティーの間での同一の協議または他の協定の下で実施されるか、あるいは１日、１週間、または１ヶ月のような限定された期間内（決定はこのような期間より延長し得るが、このような実施形態において、複数の決定は、このような特定の期間で実施される）に実施される。このような複数の決定、または複数の異なる標的核酸配列は、例えば、少なくとも、２、３、４、５、６、８、１０、２０、３０、４０、５０、７０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、またはより多くのこのような決定または標的を含み得る。
【００１８】
複数の異なる標的オリゴヌクレオチド（例えば、異なるＳＮＰ部位を含む配列、１つ以上のＳＮＰ部位における代替的なヌクレオチドを含む配列、供給源配列における異なる遺伝子座由来の配列、および／または異なる供給源由来の配列が挙げられる）を含む実施形態において、決定はまた、複数の異なる識別可能なアドレスに結合した異なる標的オリゴヌクレオチドのそれぞれの数を決定する工程も包含する。このようにして、異なる標的核酸の存在および／または量を、決定し得る。異なる標的核酸はまた、選択された関係を有する標的核酸を、同一の識別可能なアドレスに結合するように、分類され得る。
【００１９】
従って、好ましい実施形態において、複数の異なる識別可能なアドレスに結合した異なる標的オリゴヌクレオチドのそれぞれの数は、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位に存在するそれぞれの異なるヌクレオチドの数または相対数を示す。
【００２０】
関連する局面において、本発明は、レセプターオリゴヌクレオチドと上記のサンプル由来の標的核酸とを特異的に会合させることにより、サンプル中の１つ以上の標的核酸の量または存在を決定するための方法に関する。各レポーターオリグヌクレオチドは、標的核酸に相補的でない、一般的な（すなわち、共通の）オリゴヌクレオチド配列を含む。この方法はまた、一般的オリゴヌクレオチド配列と標識された相補的オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程、および標的オリゴヌクレオチドを識別可能なアドレスで結合させる工程を包含する。識別可能なアドレスにおける標識された相補的オリゴヌクレオチド（一般的には標識それ自体）の存在は、サンプル中の標的ヌクレオチドの存在または量を示す。
【００２１】
好ましい実施形態において、一般的オリゴヌクレオチド配列は、レポーターオリゴの３’末端である。好ましくは、一般的な配列は、少なくとも４、６、８、１０、１２、１５、１７、２０、または３０ヌクレオチド長であり、好ましくは、下限として列挙された長さのいずれかを取り、上限として任意のより長い長さを取ることにより特定される範囲内にある。制限はまた、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチドであり得る。より長い長さもまた使用され得る。
【００２２】
別の関連する局面において、本発明は、少なくとも１つの生物体由来標的核酸配列中の少なくとも１つのＳＮＰ部位における遺伝子型決定のための方法を提供する。この方法は、ＳＮＰ部位を含む標的核酸配列に捕捉オリゴヌクレオチドを特異的にハイブリダイズさせる工程を包む、（ここで捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドは、ＳＮＰ部位でどちらか１つのヌクレオチドと相補的である）工程、およびレポーターオリゴヌクレオチドを捕捉オリゴヌクレオチドの直ぐ３’側の標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程を包含する。レポーターオリゴヌクレオチドはまた、標的オリゴヌクレオチドとはハイブリダイズしない、少なくとも４ヌクレオチド長、好ましくは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１５ヌクレオチド長の３’部分を含む。好ましくは、この３’部分は、３０、２０、１５、１２、または１０ヌクレオチド長より長くはない。種々の実施形態において、３’部分の長さは、範囲の終点を含むとして言及された長さのいずれか２つを取ることにより規定される範囲内にある。第１のオリゴヌクレオチドまたは標的オリゴヌクレオチド、捕捉オリゴヌクレオチド、およびレポーターオリゴヌクレオチドは、連結条件に供され、ここで捕捉オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ部位のヌクレオチドが、捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに対して相補的である場合に限り、隣接するレポーターオリゴヌクレオチドと連結される。レポーターオリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーション条件下においてレポータオリゴヌクレオチドの３’部分と特異的にハイブリダイズする、標識されたオリゴヌクレオチドと接触させられる。レポーターオリゴヌクレオチドと連結した捕捉オリゴヌクレオチドは、異なる捕捉オリゴ／レセプターオリゴが異なるアドレスに結合されるように、識別可能なアドレスに結合する。標識されたオリゴヌクレオチドが、特定の識別化可能なアドレスに存在するか否かを決定することは、ＳＮＰ部位における標的核酸配列の遺伝子型を示す。特定のＳＮＰ部位における特定のＳＮＰ改変体に対応する連結した捕捉／レポーターのみが、アドレスにおいて標識に結合するので、この相関が存在する。
【００２３】
好ましくは少なくとも１つのＳＮＰ部位は、複数のＳＮＰ部位、例えば、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０またはそれより多くのＳＮＰ部位である。
【００２４】
好ましくは、遺伝子型決定は、少なくとも１つのＳＮＰ部位、好ましくは複数このＳＮＰ部位（例えば、本明細書中に記載されるような多数の部位）での代替ヌクレオチドの存在の決定を包含する。
【００２５】
上記の局面を踏まえて、本発明はまた、オリゴヌクレオチドの複合体に関する。従って、別の局面において、本発明は、会合したオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの複合体を含み、ここでこのような複合体の各々は、この複合体とハイブリダイズした、捕捉オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドを伴う、標的オリゴヌクレオチドを含む。捕捉オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチド上の直接隣接する部分にハイブリダイズし、そして、レポーターオリゴヌクレオチドの３’末端は、上記の標的ヌクレオチドとハイブリダイズしない。その代わり、標識されたオリゴヌクレオチドは、レポーターオリゴヌクレオチドの３’末端とハイブリダイズする。
【００２６】
好ましくは、捕捉オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドは、一緒に連結される。従って、連結した捕捉オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドは、より長いオリゴヌクレオチドを形成する。
【００２７】
好ましい実施形態において、この複合体は、例えば、上記の方法によって形成されるか、または本明細書中に記載された以外の方法によって形成される場合にアッセイ溶液中に存在する。さらに好ましい実施形態においてもまた、この複合体は、固相表面の識別可能なアドレスで結合する。この固相表面を有する組成物は、例えば、アッセイ溶液中の懸濁物で存在し得るか、またはチップもしくはプレートであり得る。
【００２８】
好ましい実施形態において、単一溶液中または単一固相表面上に、複数の複合体が存在する。複数の複合体は、複数の異なる標的オリゴヌクレオチド、複数の異なる捕捉オリゴヌクレオチド、および複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドを含み、ここで異なるレポーターオリゴヌクレオチドは、標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした同一のヌクレオチド配列を有する。
【００２９】
関連する局面において、本発明はまた、会合したオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの複合体を提供する。このような複合体の各々は、標的オリゴヌクレオチド、および、標的オリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズしたレポータオリゴヌクレオチドを含み、ここでレポーターオリゴヌクレオチドの少なくとも４ヌクレオチド長の末端部分は、標的オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされない。この複合体はまた、レポーターオリゴヌクレオチドの末端部分とハイブリダイズした、標識されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００３０】
好ましい実施形態において、単一溶液中または単一固相表面上に、複数の複合体が存在する。複数の複合体は、複数の異なる標的オリゴヌクレオチドおよび、複数の異なるレポータヌクレオチドを含む。異なるレポーターオリゴヌクレオチドの各々は、末端部分において同一のヌクレオチド配列を有する。
【００３１】
好ましくは、このような複合体は、固相表面上に識別可能なアドレスで結合する。
【００３２】
同様に、別の局面において、本発明は、生物体由来の核酸中の少なくとも１つのＳＮＰ部位での遺伝子型決定のためのキットを提供する。このキットは、識別可能なアドレスを有する少なくとも１つの固相表面を含み、この固相表面は、結合条件下において、捕捉オリゴヌクレオチドを結合する化学実体を有する。このような化学実体は、例えば、ヌクレオチド配列または特異的結合対のメンバー（例えば、抗体または対応する抗原、あるいはアビジンまたはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）の１種）であり得る。このキットはまた、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを含み、この捕捉オリゴヌクレオチドは、潜在的な標的ヌクレオチド配列（例えば、標的オリゴヌクレオチドの中の）とハイブリダイズように選択されたヌクレオチド配列を含む。このキットはまた、少なくとも１つのレポーターオリゴヌクレオチドを含み、このレポーターオリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドのすぐ３’側の潜在的な標的ヌクレオチド配列（捕捉オリゴヌクレオチドと同一の標的配列）とハイブリダイズするように選択されたヌクレオチド配列を含む。このレポーターオリゴヌクレオチドはまた、標的とハイブリダイズしない３’ヌクレオチド配列も含む。複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドを含むキットのために、複数の（好ましくは全ての）異なるレポーターオリゴヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズしない同一の３’配列を含む。さらに、このキットは、ハイブリダイズ条件下において、レポーターオリゴヌクレオチドの３’部分とハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００３３】
好ましい実施形態において、このキットはまた、リガーゼを含み、捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドが、テンプレート核酸の対応するヌクレオチドと相補的でない場合、このリガーゼは、選択的な連結条件下において、テンプレート核酸にハイブリダイズされた隣接する捕捉オリゴヌクレオチドとレポータオリゴヌクレオチドリガーゼとを連結しない。
【００３４】
好ましい実施形態において、このキットは、捕捉オリゴヌクレオチドの５’部分に相補的な配列を含む、結合オリゴヌクレオチドを含み、ここでこの結合オリゴヌクレオチドは、固相表面上の識別可能なアドレスに結合される。
【００３５】
さらに別の局面において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸の存在および／または量を検出するためのキットを提供する。このキットは、標識されたオリゴヌクレオチド、ならびに標的核酸と特異的に会合するレポーターオリゴヌクレオチドによってサンプル中の標的核酸の存在または量を決定するための、標識されたオリゴヌクレオチドの使用のための方法；標識されたオリゴヌクレオチドをレポーターオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるための方法；レポーターオリゴヌクレオチドを識別可能なアドレスに結合する方法；およびサンプル中の標的核酸の存在または量の指標として識別可能なアドレスからの標識シグナルを決定する方法を記載する指示書を含む。
【００３６】
好ましい実施形態において、このキットは、複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドを含み、異なるレポータオリゴヌクレオチドの各々は、標識されたオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、このキットは複数の異なる捕捉オリゴヌクレオチドを含み、ここで異なる各捕捉オリゴヌクレオチドは、特定のレポーターオリゴヌクレオチドに直接隣接する標的核酸と結合するように選択された配列を含む。好ましくは、このキットは、複数の異なる捕捉オリゴおよび複数の異なるレポータオリゴの両方を含む。ＳＮＰ遺伝子型決定のために適合するキットにおいて、好ましくは、特定のＳＮＰ部位のための代替的捕捉オリゴのセットについて、１つのレポーターオリゴヌクレオチドを有する。好ましくは、このセットは、ＳＮＰ部位に存在することが知られている各代替的ヌクレオチドに対する捕捉オリゴを含み、これはまた、他のヌクレオチド（例えば、コントロールとして使用するための）に対するオリゴも含み得る。（キットにおいて標的化されるオリゴヌクレオチドのための他のＳＮＰ部位と同様に）。
【００３８】
好ましい実施形態において、このキットは、ＤＮＡリガーゼを含み、好ましくは、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼのような熱安定性ＤＮＡリガーゼを含む。
【００３９】
さらに別の局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在および／または量を決定するためのキットに関する。このキットは、複数の異なるレポーターオリゴヌクレオチドを含み、ここでこのような異なるレポーターオリゴヌクレオチドの各々は、標的核酸とハイブリダイズするように選ばれた配列、および共通のオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含む。このキットはまた、共通のオリゴヌクレオチドの配列を含む、標識されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００４０】
好ましくは、このキットはまた、レポーターオリゴヌクレオチドと標的核酸とを特異的に会合させることにより、サンプル中の標的核酸の存在または量を決定するための標識されたオリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドの使用のための方法；標識されたオリゴヌクレオチドをレポータオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるための方法；レポーターオリゴヌクレオチドを識別可能なアドレスに結合する方法；およびサンプル中の標的核酸の存在または量の指標として識別可能なアドレスからのシグナルを決定する方法を記載する指示書を含む。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、共有結合したヌクレオチドの鎖（これはまた、結合される他の部分または構造を、有してもまた有さなくてもよい）をいい、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
用語「オリゴヌクレオチド」、または同等に「オリゴ」、とは、３〜５０００の共有結合したヌクレオチドの配列を含む、核酸分子をいうために使用される。好ましい実施形態において、特定のオリグヌクレオチドは、当業者によって理解されるような特定の適用におけるその役割に適するように選択される長さを有する。例えば、オリゴヌクレオチドは、３〜３０００、４〜２０００、４〜１０００、６〜１０００、８〜１０００、４〜５００、６〜５００、８〜５００、１０〜５００、１５〜３００、１５〜２００または１５〜１００の共有結合したヌクレオチドを含み得る。
【００４３】
本発明の方法に関連して使用される場合、用語「一般的オリゴヌクレオチド」は、定量されている核酸（すなわち、標的核酸またはテンプレート）に関連する特定の配列を有することを必要としないオリゴヌクレオチドをいう。しかし、一般的オリゴヌクレオチドの配列は、有用な特徴を提供するために選択され得る。例えば、一般的オリゴヌクレオチド配列は、特定の温度範囲（例えば、５０〜６０℃）に、完全に相補的な配列由来の融点をもつように、および／または定量される核酸の部分への結合を回避するように、および／または反応混合物における他の核酸への結合を回避するように、選択され得る。
【００４４】
本発明に関して、用語「結合した核酸」は、アドレス特異的（例えば、位置特異的）な様式で固相表面（例えば、粒子、ビーズ、プレート、チップ、または他の固体表面）に結合され得る核酸をいう。例えば、この核酸は、アレイ中（例えば、ガラスもしくはポリスチレンのスライドまたはチップ上）の特異的な識別可能部位に結合し得るか、またはコードされたビーズもしくは他の粒子（例えば、カラーコード（ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ）されたビーズ）に結合され得る。このようなビーズまたは粒子の実施形態において、ビーズまたは粒子のコード化は、アレイ中の特定の場所によって提供されるのと同一の様式で、特異的な同定を提供する。結合は、直接的でも間接的でもよく、そして共有結合、核酸ハイブリダイゼーション、またはアドレス特異的な会合を提供するために十分な他のいずれかの型の結合会合に関与し得る。
【００４５】
本発明の種々の局面および実施形態において、生物体、または決定される核酸、第１のオリゴヌクレオチド、標的核酸もしくはオリゴヌクレオチドの供給源、またはアッセイされる類似の核酸は、任意の供給源から得られる。例えば、生物体またはＤＮＡの供給源は、生物体から、または生物体に由来する細胞から、このような供給源から得られる核酸もしくは合成の核酸から直接的に得られ得る。例えば、限定しないが、生物体または供給源は、ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、脊椎動物、無脊椎動物、甲殻類、魚類、鳥類、または哺乳動物であり得る。哺乳動物は、例えば、ヒト、有蹄類（例えば、ウシ）、ブタ、ヒツジ、反芻動物、イヌ、ネコ、ラット、またはマウスであり得る。
【００４６】
さらに、識別可能なアドレスに関する本発明の種々の局面および実施形態において、識別可能なアドレスは、種々の型であり得る。例えば、このアドレスは、アレイ上の物理的な位置であり得る。従って、このアドレス付けは、このようなアレイ上（例えば、マイクロアレイ）の規定された位置でのオリゴの結合を含み得る。同様に、識別可能なアドレスは、コードされたビーズ（例えば、ポリスチレンまたはラテックスミクロスフェア）または粒子によって提供され得る。従って、アドレス付けは、このようなコードされたビーズに対するオリゴヌクレオチドの結合を含み得る。コード化は、種々の方法（例えば、ビーズまたは粒子に結合されたかまたはこれらに取り込まれた２つ以上の異なる着色蛍光色素の相対量に基づく蛍光色によるか、または他の標識の識別可能な組み合わせによって）によって提供され得る。
【００４７】
好ましい実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチド上の標識は、蛍光標識であり、これは、直接的または間接的に結合され得る。しかし、他の標識は、代替としてかまたは組み合わせてさえ、使用され得る（例えば、光散乱標識および放射性同位体標識）。間接的な標識化は、標識されたオリゴ上の結合部分を使用し、この結合部分が検出可能な標識を結合する。例えば、結合部分は、核酸ハイブリダイゼーション、抗体／抗原結合、アビジンもしくはストレプトアビジン／ビオチン結合、または他の結合対相互作用により結合を提供するヌクレオチド配列を利用し得る。
【００４８】
好ましい実施形態において、アドレスに結合されるオリゴヌクレオチド（または異なるオリゴヌクレオチド）への核酸ハイブリダイゼーションを使用して、捕捉オリゴヌクレオチドは、識別可能なアドレス（例えば、アドレス可能な位置）に結合される。
【００４９】
より強いシグナルを提供するために、オリゴヌクレオチドの連結工程を含む、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態において、アッセイ中の標的核酸配列の数に関して、結合したオリゴの数を増加させることが有利であり得る。従って、好ましい実施形態において、連結条件は、複数回繰り返され、好ましくは連結したオリゴがテンプレート（すなわち、標的核酸）から分離されることを可能にし、そして新しい捕捉オリゴおよびレポーターオリゴがハイブリダイズし、そして結合されることを可能にする熱サイクルを使用する。このプロセスは、数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回）、またはより多く（例えば、１５回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、または１００回、あるいはさらに多くの回まで）繰り返され得る。従って、熱安定性ＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ）の使用が、好都合である。
【００５０】
アッセイを容易にするために、本明細書中に記載される方法の好ましい実施形態において、潜在的な特異的標的オリゴヌクレオチドの数は、増幅によって増加される。従って、所望の核酸配列は、（例えば、ＰＣＲを用いて）アッセイの連結部分の前に、間に、または後で増幅される。
【００５１】
さらなる実施形態は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００５２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（導入）
背景の項において指摘されたように、ＯＬＡはＳＮＰ遺伝子型決定のために有用であり、そして特定のオリゴヌクレオチドの存在を同定するための他の適用のために有用であるが、多数の標識されたオリゴヌクレオチドが、金銭および時間における高いコストが、現在のハイスループット分析のために必要とされる。いくつかの改良を考慮しても、Ｉａｎｎｏｎｅら（上述）に記載された方法はなお、多数の標識されたオリゴを必要とし、そして現在の設備では容易に適用できない。
【００５３】
従って、本方法は、一般的な標識されたオリゴヌクレオチドの利用によるこのような多数の蛍光レポーターオリゴヌクレオチドの生産に伴う、高いコストおよび冗長な時間を回避するために有利であり、その結果、同じ１つのまたは同じいくつかの標識されたオリゴヌクレオチドは、全ての標的オリゴヌクレオチド分析のために使用され得る。従って、本方法は、ハイスループット遺伝子型決定のために特に望ましいが、このような使用に限定されない。
【００５４】
本発明は、多数の異なる構成をセットし得る。この種々の実施形態は、一般的オリゴヌクレオチド（または、少セットの一般的オリゴ、例えば、２、３、４または他の少数の異なるオリゴ）の使用および一般的オリゴに対する相補的な標識されたオリゴのハイブリダイゼーションを一般に持つ。
【００５５】
例えば、捕捉オリゴは、識別可能なアドレスに、直接的または間接的に結合され得る。これに関連して、直接の結合としては、オリゴ（これは共有結合したリンカーを含み得る）とビーズ、チップ、または他の固体表面との間の結合相互作用、および／またはオリゴと固体表面上の間の部分または官能基（例えば、リンカー基）との間の共有結合が挙げられる。間接的な結合は、別の（第２の）結合分子を介した固体表面へのオリゴの結合を含み、ここでオリゴと第２の結合分子との間の会合は、少なくともはじめは、共有結合ではない。例えば、間接的な結合は、核酸ハイブリダイゼーション、抗体／抗原相互作用、他の結合対相互作用などを利用し得る。
【００５６】
識別可能なアドレスへの結合は、（標的に対応する）特定の様式で、なされ得る。例えば、捕捉オリゴが利用される場合、捕捉オリゴは、アドレス可能な表面に結合した核酸配列と相補的な部分を含み得る。この結合した核酸配列は、識別されることが望まれる標的配列の各々について異なる。従って、識別可能な表面上のオリゴは、対応する捕捉オリゴ、従って、対応する標的分子を特異的に引き抜く。あるいは、捕捉オリゴは、非特異的な様式で、アドレス可能な表面に結合され得る。例えば、非特異的（すなわち、一般的な）オリゴは、この表面に結合され得る。次いで、標的特異的捕捉オリゴは、特定の捕捉プローブ、従って、特定の標的が、特定のアドレスに対応するように、アドレス特異的な様式でハイブリダイズされる。この様式において、１つまたはいくつかの結合オリゴが、多くの異なる標的に対して利用され得る。他の型の分子相互作用（例えば、抗原／抗体）もまた、アドレス可能な表面への結合のために同様の特異的または非特異的な様式で使用され得る。
【００５７】
本発明は、特に、ＯＬＡへ適用される場合に有利である。上記に示したように、ＯＬＡは、標的核酸分子（一般的には、オリゴヌクレオチド）に隣接する位置でハイブリダイズされる、捕捉オリゴヌクレオチドとレポーターオリゴヌクレオチドとの連結（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを用いる）を含む。最終的なシグナルの検出性を増加するために連結反応が実行される前に、一般的に、標的核酸分子の数が、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する）増幅により増加される。連結反応において、捕捉オリゴおよびレポーターオリゴの両方が隣接位置でハイブリダイズされる場合、捕捉オリゴおよびレポーターオリゴは、単に連結され、そして両方の隣接末端ヌクレオチドは、標的の対応するヌクレオチドに相補的である。例えば、捕捉オリゴの末端位置のＳＮＰの非相補的ヌクレオチドの存在によって、ミスマッチが作り出され得る。
【００５８】
捕捉オリゴとレポーターオリゴとの連結は、より大きいオリゴを提供するので、標的のアドレス特異的な同定に加えて、ＯＬＡはまた、大きさに基づく同定法を用いて使用され得る。オリゴの大きさは、ゲル電気泳動のような方法を使用して、サイズ分離され得る。レポーターオリゴへの標識されたオリゴのハイブリダイゼーションは、連結されたオリゴに対応するシグナルを提供し、これによって標的を同定する（そして所望の場合は、定量する）。
【００５９】
ＳＮＰ遺伝子型決定のための本発明の例示的な使用の略図、および標識されたれたレポーターオリゴに依存するＯＬＡとの差異を、図１に示す。この図において、カラーコードされたビーズへの結合は、アドレスの指定のために使用される。「シグナルコード（ＳｉｇｎａｌＣｏｄｅ）」は、（蛍光標識された）一般的な標識されたオリゴヌクレオチドである。
【００６０】
本発明は、ＯＬＡの使用に限定されない。他の実施形態において、標的核酸分子への特異性は、配列特異的ハイブリダイゼーションによって提供される。このような実施形態において、標的核酸は、ＤＮＡリガーゼによって触媒される直接的な連結によってか、一般的オリゴヌクレオチド改変ＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲもしくは任意の他の方法のいずれかによって、一般的オリゴヌクレオチドに適合される。一般的オリゴ適合される標識された逆相補的オリゴのハイブリダイゼーションは、標的核酸に対応するシグナルを提供し、これによって標識を同定する（そして所望の場合、定量する）。
【００６１】
種々の実施形態において、好ましくは、増幅は、標的分子の数を増加するのに使用される（例えば、ＰＣＲを使用して）。しかしながら、十分に感応性の標識／検出システムが使用される場合、増幅無しに標的を検出することが可能であり得る。
【００６２】
本方法は、多くの異なる生物体および組成物に適用可能である。例えば、この方法および組成物は、とりわけ、ヒトおよび他の霊長類、畜牛および他のウシのような有蹄動物、ブタ、ならびに細菌で使用され得る。
【００６３】
（オリゴヌクレオチオド合成）
全ての記載されるオリゴヌクレオチドは、従来の合成方法、好ましくは自動化ＤＮＡ合成機（例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成サービスによって）を使用して合成され得る。この自動ＤＮＡ合成の基礎となる化学は、糖保護基の継続的な除去および付加である。第１のヌクレオチドを、固体支持体に結合する合成は、５’ヒドロキシ保護基であるジメトキシトリチルエーテルが、ジクロロメタン中でジクロロ酢酸によって除去されるように開始される。その逆ブロック化後、そのヒドロキシルは、固体支持体に共有結合された反応求核原子にのみなる。次に、高い反応性のホスホルアミダイト改変されたヌクレオチドを、弱酸テトラゾールと同時に注射した。ホスホルアミダイトの窒素は、プロトン化され、そしてホスホルアミダイトは、容易に攻撃されて、求核性５’ヒドロキシル基によって置換される。その反応は、第１のヌクレオチドに第２のヌクレオチドを付加する。このサイクルを繰り返すことで、段階的で、連続的なヌクレオチドの付加を導き、オリゴヌクレオチド鎖を成長させる。
【００６４】
Ｃ１２スペーサーのようなスペーサ−を伴うアミノ基は、多くの市販のオリゴヌクレオチド合成サービスによって、オリゴヌクレオチドの５’末端（例えば、ジップコードオリゴ（Ｚｉｐｃｏｄｅ  ｏｌｉｇｏ））に一致され得る。ホスホルアミダイト改変されたアミノＣ１２は、オリゴヌクレオチド合成の間、直接的に結合される。これは高い有効性に結合体化し、標準の脱塩を超えた精製を典型的に必要としない。ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって製造されるアミノＣ６またはＵｎｉ−ｌｉｎｋＴＭのような他のアミノ修飾因子がまた使用され得る。
【００６５】
以下に示すように、例示的な実施形態のために、合成される種々のオリゴヌクレオチドそれぞれに対する融解温度（Ｔｍ）は、約５５℃で選択されるが、他の温度もまた、選択され得る。このオリゴヌクレオチドのＴｍは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイに精通する者に周知のアルゴリズムを使用して容易に計算され得る。例えば、オリゴヌクレオチド配列に対するＴｍは、ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ．のサイトのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上で無料で入手可能なＯｌｉｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒのような種々のコンピュータプログラムのいずれかによって計算され得、オリゴヌクレオチドの長さを調節して適切なＴｍを提供し得る。
【００６６】
（ハイブリダイゼーション結合の実施形態）
ＳＮＰ遺伝子型決定に特に適用可能である本発明の好ましい実施形態において、この方法は、ＯＬＡを使用し、そして捕捉オリゴヌクレオチド（従って標的オリゴヌクレオチド、レポーターオリゴヌクレオチド、および標識オリゴヌクレオチドもまた）をカラーコードビーズ（ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ−ｂｅａｄ）に核酸ハイブリダイゼーションを使用して結合する。これらの実施形態において、４つの異なる型のオリゴヌクレオチドが使用される。（図１に概略的に示される例示的な実施形態のように。）これらは：
１．アドレス特異的ジップコードオリゴヌクレオチド。このジップコード配列は、好ましくは選択されたヌクレオチドから構築され、約５５℃（例えば、５０〜６０℃の範囲）のＴｍを提供する（しかし、標的ヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションは提供しない）。この５’末端のジップコードは、好ましくはアミノ基（好ましくはＣ１２リンカー（例えば、アルキルリンカー）を伴う）によって置換されるが、種々の他のリンカーもまた、使用され得る。このアミノ基は、粒子または表面（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ由来のカラーコード粒子）にジップコードを連結する反応基を提供する。このジップコードオリゴヌクレオチドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）によって触媒されるカップリング反応を介してカラーコード粒子に結合される。このＬｕｍｉｎｅｘカラーコードビーズは、これらの表面上のカルボキシル基で特異的に改変される。カルボジイミドは、Ｏ−尿素誘導体を形成するためにカルボキシルを活性化することによってカルボン酸とアミンとの間のアミド結合の形成を触媒する。この誘導は、アミンのような求核基によって容易に反応し、ビーズの表面のジップコードオリゴヌクレオチドに一致する。ジップコードオリゴヌクレオチドまたは類似のオリゴの使用は、Ｂａｒａｎｙら、１９９１、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３、および米国特許第６，０２７，８８９号、同第６，０５４，５６４号、同第５，８３０，７１１号および同第５，４９４，８１０号に記載され、ならびにＩａｎｎｏｎｅら（前出）において使用される。これら全ての参考文献は、本明細書中に参考としてその全体が援用される。
２．捕捉オリゴヌクレオチド（標的ＳＮＰの５’側および１つのＳＮＰ対立遺伝子上の配列と相補的）。この捕捉オリゴはまた、好ましくは約５５℃のＴｍを有するように設計され、これは、オリゴヌクレオチドの長さを調節することによって容易に達成され得る。この捕捉オリゴヌクレオチドは、これらの５’末端の「抗ジップコード」と一致する。この抗ジップコードは、ジップコードにハイブリダイズすることによって特定のアドレスに結合されるように設計されたオリゴヌクレオチドのセットである。この特定のアドレスは、例えば、カラーコードビーズまたは固相表面の物理的に規定された位置であり得る。
３．レポーターオリゴヌクレオチド（標的ＳＮＰの３’側における配列と相補的）。このレポーターオリゴは、これらの３’末端において「シグナルコード」と呼ばれる１つの一般的なオリゴヌクレオチドと一致する。このシグナルコードは、好ましくは約５５℃のＴｍを有し、標的オリゴヌクレオチド、ジップコードオリゴヌクレオチド、抗ジップコードオリゴヌクレオチド、捕捉オリゴヌクレオチド、またはレポーターオリゴヌクレオチドに相補的ではないように選択された配列を伴うオリゴヌクレオチドである。この５’末端は、好ましくはリン酸基で置換され、Ｔａｑリガーゼによって触媒される連結反応を促進する。
４．抗シグナルコードオリゴヌクレオチド。この抗シグナルコードオリゴは、シグナルコード配列に相補的である。この３’側または５’側の末端は、直接的にかまたは間接的な標識で（例えば、ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合で染色され得るビオチン）、標識される。
【００６７】
このオリゴヌクレオチドの記載が示すように、すべてのオリゴは、好ましくは約５５℃（例えば、５０〜６０℃の範囲）のＴｍを有するように設計される。特定のハイブリダイゼーションおよび／またはＯＬＡ反応を促進する他のオリゴもまた、使用され得る。
【００６８】
好ましくは、このジップコードオリゴヌクレオチドは、カラーコードビーズ（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）によって提供されるようなビーズ）に結合される。例えば、Ｆｕｌｔｏｎら、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：１７４９−１７５６；Ｋｅｔｔｍａｎら、１９９８、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３３：２３４−２４３を参照のこと。これらの型のビーズは、これらの蛍光特徴（例えば、赤およびオレンジの蛍光の特定の組合せ）によって区別され得る（次いで、蛍光団ｇａ
、アッセイシグナルとして使用され得る（例えば、緑色の蛍光団））。このようなカラーコードビーズは、１−エチル’，−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（ＥＤＣ）によって触媒されるカップリング反応を使用してジップコードオリゴにカップリングされ得る。このＯＬＡは、捕捉オリゴ、レセプターオリゴ、ＰＣＲ  ＤＮＡテンプレート（標的テンプレート）、およびＴａｑリガーゼを含有する反応中で実施される。この結果的な対立遺伝子特異性連結オリゴヌクレオチドは、ジップコードビーズによって同時に分類され、そして同時に単一のハイブリダイゼーションにおいて蛍光標識またはビオチン標識された抗シグナルコードオリゴによって染色され得る。染色されたビーズの蛍光は、カラーコードビーズの同定と共にフローサイトメーターで測定され得る。この蛍光シグナルとビーズの同定の相関は、標的オリゴヌクレオチドが、アッセイ混合物中に存在することを示す。
【００６９】
以下に記載されるような実験は、ＳＮＰ遺伝子型決定のためのこの実施形態の好首尾な適用を繰り返し示している。このような遺伝子型決定はまた、直接的なＤＮＡ配列決定または他の遺伝子型決定方法によっても確認され得る。示されるように、本方法は、種々の標識されたレポーターオリゴを調製する費用を大きく削減する。各レポーターに対する一般的なオリゴヌクレオチドシグナルコードの一致によって、１つの蛍光標識またはビオチン標識された抗シグナルコードオリゴが、全てのＳＮＰ遺伝子型決定に十分である。
【００７０】
従って、本発明は、先行のＯＬＡ方法の実質的な改善を提供する。本発明は、蛍光標識されたオリゴの数を１つまで減少させるだけではなく、最も一般に使用される蛍光、フィコエリトリンをまた適用する。単一の抗シグナルコードオリゴを用いて、ストレプアビジン−フィコエリトリンは、Ｉａｎｎｏｎｅら（前出）の方法を用いる場合のように、大量の非反応性の変性されたビオチン化オリゴの存在によって、飽和されない。このシグナルコードを一致させる費用は、特異的に標識されるレポーターオリゴを製造する費用と比べて、比較的少ない。なぜなら、このオリゴ合成工程は、高度に自動化されているが、標識オリゴを生成する標識反応が、多くの手動の作業を必要とする。
【００７１】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて発展された広範な知識を利用する。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、理想的な二次動力学に従うので、１つのオリゴ濃度が一定である場合（例えば、標識された一般的なオリゴ）、ハイブリダイゼーションは、その相補鎖の濃度に直接的に比例する（例えば、レセプターオリゴ、ゆえに標的核酸もまた）。本発明の定量的な性質は、本発明が、ＳＮＰ遺伝子型決定および遺伝子発現分析のみならず、結合された核酸の相対的な定量を必要とする任意のプロセスに対しても適用され得ることを示す。
【００７２】
（実施例）
（実施例１：ビーズへのジップコードのカップリング）
このジップコードオリゴヌクレオチドを、以下の手順に従ってビーズにカップリングした。１００μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）中にビーズを分散させた。アミノ置換したオリゴヌクレオチドを２μＭの最終濃度まで加えた。５μＬの新しく作製されたＥＤＣ溶液（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロライド、１００μｇ／μＬ）を加えた。暗闇で、室温で２０分間インキュベートした。ＥＤＣの添加およびインキュベーションを繰り返した。ビーズを０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、次いで、０．１％のＳＤＳで洗浄した。ＴＥ緩衝液にビーズを再懸濁した。
【００７３】
（実施例２：オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ））
ＯＬＡを１×Ｔａｑリガーゼ緩衝液、０．５ｐｍｏｌの捕捉オリゴ、５．０ｐｍｏｌのレポーターオリゴ、２０ｎｇのＰＣＲ  ＳＮＰテンプレート、および１０単位のＴａｑリガーゼを含有する２０μＬの反応混合物中で実施した。このＰＣＲ  ＳＮＰテンプレートをゲノムＤＮＡから産生した。好ましくは、このテンプレートは、１００〜１０００の長さであり、より好ましくは、１５０〜１０００の長さである。これは、小さいＰＣＲ標的を増幅するのに一般的により効率的である。しかしながら、アンプリコンのサイズが、１００ｂｐ未満である場合、アガロースゲル上に電気泳動することによってＰＣＲアンプリコンサイズを測定することは、困難でかもしれない。より短い長さが適切である異なるサイズの決定技術が利用される場合、より小さいアンプリコンサイズ（例えば、２０〜１００、３０〜１００、３０〜８０、または４０〜８０ｂｐ）が好ましくあり得る。この反応混合物を９６℃で２分間で変性させ、続けて９４℃で１５秒間、３７℃で６０秒間を５５サイクルで実施した。
【００７４】
（実施例３：ＳＮＰ検出）
ジップコードビーズによるオリゴヌクレオチドの分類およびビオチン化抗シグナルコードオリゴによるレポーター染色を単一のハイブリダイゼーション反応中で同時に実施した。５０μＬのハイブリダイゼーション混合物は、１×ＴＭＡＣ緩衝液、各ＳＮＰに対する５０００ジップコードビーズ、２．５ｐｍｏｌのビオチン化抗シグナルコードオリゴ、および２０μＬのＯＬＡ反応混合物を含む。この１×ＴＭＡＣ緩衝液は、２．５ＭのＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロライド）、０．１５％のＳＤＳ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）である。この反応混合物を９５℃で５分間、次いで、５０℃で１５分間インキュベートした。
【００７５】
このビオチン化抗シグナルコードオリゴを、１×ＴＥ緩衝液および蛍光ストレプアビジン−フィコエリトリン結合体を含む反応中（１０μｇ／ｍＬ）で、その蛍光ストレプアビジン−フィコエリトリン結合体で染色した。この反応を室温で５分間実施した。次いで、このビーズをＬｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメーターでそれらの蛍光シグナルについて測定した。
【００７６】
（実施例４：ＳＮＰ部位１の検出）
この実施例において、ウシＳＮＰ部位を、以下の配列：
【００７７】
【化１】
2004535769.tif 000003
を有する一対のＰＣＲプライマーによって増幅した。
【００７８】
このＰＣＲ反応混合物は、１×ＰＣＲ反応緩衝液、３００μＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭのＰＣＲプライマー、１．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および１００ｎｇのゲノムＤＮＡを５０μＬの容積中に含有した。ＰＣＲ増幅を以下のサイクルパラメーターで実施した：９６℃で２分間、次いで９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で１分間を３５サイクル。このＰＣＲ産物を、ＯＬＡ反応に直接的に使用し得る。３つのジップコードオリゴヌクレオチドは以下：
【００７９】
【化２】
2004535769.tif 000004
である。
【００８０】
このジップコードオリゴヌクレオチドを、以下の手順に従ってビーズにカップリングした。１００μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）にビーズを拡散した。アミノ置換されたオリゴヌクレオチドを２μＭの最終濃度まで加えた。５μＬの新しく作製されたＥＤＣ溶液（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロライド、１００μｇ／μＬ）を加えた。暗闇で、室温で２０分間インキュベートした。ＥＤＣの添加およびインキュベーションを繰り返した。ビーズを０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、次いで、０．１％のＳＤＳで洗浄した。ＴＥ緩衝液にビーズを再懸濁した。
【００８１】
３つの捕捉オリゴヌクレオチドは、以下：
【００８２】
【化３】
2004535769.tif 000005
である。
【００８３】
この捕捉オリゴヌクレオチドにおいて、小文字の配列は抗ジップコード配列であり、大文字配列は、ＳＮＰの５’側上流の標的配列に相補的な配列である。３’側末端におけるこの２つのヌクレオチドＣおよびＧは、２つの代替ＳＮＰヌクレオチドに対応する。例示的なシグナルコードレポーターオリゴヌクレオチド配列は、以下：
【００８４】
【化４】
2004535769.tif 000006
である。
【００８５】
この小文字の配列は、シグナルコードであり、大文字の配列は、標的ＳＮＰの３’側下流の標的配列に相補的な配列である。コントロールとして、従来のレポーターオリゴヌクレオチド  ５’−ホスホ−ＡＣＡＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＡＡＴＡＣＴＧＣ−ビオチンー３’  をまた、ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイのために合成した。
【００８６】
このＯＬＡを以下を含有する２０μＬの反応中で実施した：１×Ｔａｑリガーゼ緩衝液、０．５ｐｍｏｌの捕捉オリゴ、５．０ｐｍｏｌのレポーターオリゴ（シグナルコードレポーターか従来のレポーターのいずれか）、２０ｎｇのＰＣＲ  ＳＮＰテンプレート、および１０単位のＴａｑリガーゼ。このＰＣＲ  ＳＮＰテンプレートをゲノムＤＮＡから生成した。この受容可能なサイズは、１５０ｂｐ〜１０００ｂｐである。この反応混合物を９６℃で２分間で変性し、続いて、９４℃で１５秒間、３７℃で６０秒間を５５サイクル実施した。
【００８７】
抗シグナルコードは、以下：
５’−ｃｔｇａａｃｇｇｔａｇｃａｔｃｔｔｇａｃ−ビオチン−３’
であり、これは、シグナルコードレポーターオリゴヌクレオチドのシグナルコードに逆相補的である。ジップコードビーズによるオリゴヌクレオチドの分類およびビオチン化抗シグナルコードオリゴとのハイブリダイゼーションを単一のハイブリダイゼーション中で同時に実施した。５０μＬのハイブリダイゼーション混合物は、１×ＴＭＡＣ緩衝液、各ＳＮＰに対する５０００ジップコードビーズ、２．５ｐｍｏｌのビオチン化抗シグナルコードオリゴ、および２０μＬのＯＬＡ反応混合物を含有する。１×ＴＭＡＣ緩衝液は、２．５ＭのＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロライド）、０．１５％のＳＤＳ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む。この反応混合物を９５℃で５分間、次いで、５０℃で１５分間インキュベートした。このコントロール実験において、抗シグナルコードは、従来のレポーターを省略した。
【００８８】
このビオチン化抗シグナルコードオリゴを、１×ＴＥ緩衝液および蛍光ストレプアビジン−フィコエリトリン結合体（１０μｇ／ｍＬ）を含む反応中で、その蛍光ストレプアビジン−フィコエリトリン結合体で染色した。この反応を室温で５分間実施した。次いで、このビーズをＬｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメーターでその蛍光シグナルに対して測定した。以下は、シグナルコードレポーターおよび従来のレポーターの両方での遺伝子型決定の結果である。この遺伝子型決定の結果は、同じであり、直接的なＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００８９】
【表１】
2004535769.tif 000007
【００９０】
【表２】
2004535769.tif 000008
（実施例５：ＳＮＰ部位２の検出）
この実施例において、別のウシＳＮＰ部位を、一対のＰＣＲプライマー：
【００９１】
【化５】
2004535769.tif 000009
で増幅した。
【００９２】
このＰＣＲを実施例４に記載されるように実施した。
【００９３】
３つのジップコード配列は、以下：
【００９４】
【化６】
2004535769.tif 000010
である。
【００９５】
このジップコードオリゴヌクレオチドを、実施例４に記載される方法に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘカラーコードビーズにカップリングした。
【００９６】
３つの捕捉オリゴヌクレオチドは、以下：
【００９７】
【化７】
2004535769.tif 000011
である。
【００９８】
このシグナルコードレポーターオリゴヌクレオチドは、以下：
【００９９】
【化８】
2004535769.tif 000012
である。
【０１００】
従来のレセプターオリゴヌクレオチドは、以下：
【０１０１】
【化９】
2004535769.tif 000013
である。
【０１０２】
このＯＬＡ反応を実施例４に記載したように実施した。
【０１０３】
この抗シグナルコード５’−ｃｔｇａａｃｇｇｔａｇｃａｔｃｔｔｇａｃ−ビオチン−３は、実施例４における抗シグナルコードと同一である。ジップコードビーズによるオリゴヌクレオチドの分類、ビオチン化抗シグナルコードオリゴとのレセプターのハイブリダイゼーション、そしてフィコエリトリンでの染色を実施例４に記載されるように実施した。以下の遺伝子型決定結果が得られた：
【０１０４】
【表３】
2004535769.tif 000014
【０１０５】
【表４】
2004535769.tif 000015
さらなる遺伝子型決定の結果は、両方の方法で正確に同一である。
【０１０６】
（参考文献）
【０１０７】
【表５】
2004535769.tif 000016
【０１０８】
【表６】
2004535769.tif 000017
明細書中に言及される全ての特許および刊行物は、本発明に関する当業者の能力のレベルを示している。この開示に引用される全ての参考文献は、各参考文献がそれぞれその全体において参考文献によって援用されるのと同じ程度まで、参考として援用される。
【０１０９】
当業者は、本発明が、特定の核酸セグメントの遺伝子型決定および／またはサンプル中の標的核酸の存在の同定における使用に十分に適用されることを容易に理解する。この特定の方法および組成物は、現在の代表的な好ましい実施形態が、例示され、本発明の範囲に対する制限としては意図されないように、本明細書中に援用される。本発明における変化および他の使用が、当業者に対して生じ、これらは、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神内に含まれる。
【０１１０】
種々の置換および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本明細書に開示される本発明に対してなされ得ることは、当業者にとって容易に明らかである。例えば、当業者は、本発明が種々の異なるオリゴヌクレオチド、緩衝液、標識、および固相表面のいずれかを使用して適切に実施され得ることを認識する。
【０１１１】
本明細書中に例示的に記載される発明は、必須として本明細書中に特に開示さない任意の要素、制限の非存在下で適切に実施され得る。従って、例えば、本明細書中の各実例において、本発明の実施形態において、用語「含む」「本質的に〜からなる」および「からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置換され得る。この用語および使用される言いまわしは、記述の用語として使用されるものであり、制限するものではなく、そのような用語および言い回しの使用において、示される特徴および記載される特徴のいずれかの等価物またはそれらの部分を除外することを意図しないが、様々な改変が、本発明の特許請求の範囲の範囲内において可能であることが認識される。従って、本発明が、好ましい実施形態および最適な特徴、によって詳細に開示されるが、開示される本発明の概念の改変および変化は、当業者に頼られ得、そしてそのような改変および変化は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように本発明の範囲内であると考えられることが、理解されるべきである。
【０１１２】
さらに、本発明の特徴または局面は、代替のマーカッシュ群または他の群の用語で記載され、当業者は、従って、本発明がまた、マーカッシュ群もしくは他の群の、個々のメンバーもしくはメンバーのサブグループのいずれかに関して記載されることを認識する。例えば、代替物Ａ、Ｂ、およびＣが存在する場合、全ての以下の可能性が含まれる：別々のＡ、別々のＢ、別々のＣ、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、そしてＡおよびＢおよびＣ。従って、この実施形態は、これらの代替物のサブセットまたはサブグループのいずれかを明確に含有する。このようなサブセットまたはサブグループの各々が、別々に列挙され得るが、簡潔のために、このような列挙は、本記載によって置きかえられる。
【０１１３】
特定の実施形態および実施例が本発明を記載するのに使用されるが、多くの変化が可能であり、これらは本発明の精神および範囲の範囲内である。
【０１１４】
このような変化は、本明細書および本明細書中の特許請求の範囲を鑑みて当業者に明らかである。
【０１１５】
他の実施形態も、上記特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＳＮＰ遺伝子型決定のためのオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）の２つの概略図を含む。上の図は、標識されたレポーターオリゴヌクレオチドを用いる従来のＯＬＡを図示する。下の図は、本発明の実施形態を図示し、ここではレポーターオリゴヌクレオチドの５’末端部分とハイブリダイズする一般的オリゴヌクレオチドが、使用される。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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