(57)【要約】本発明は、知覚、集中、学習および／または記憶を改善するための医薬品の製造における選択的ホスホジエステラーゼ２（ＰＤＥ２）阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
知覚、集中、学習および／または記憶を改善するための医薬品の製造における、選択的ＰＤＥ２阻害剤の使用。
【請求項２】
知覚、集中、学習および／または記憶の障害を予防および／または処置するための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
障害が痴呆から生じたものである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
障害が脳卒中または頭蓋脳外傷から生じたものである、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
障害がアルツハイマー疾患から生じたものである、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
障害がパーキンソン疾患から生じたものである、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
障害が鬱病から生じたものである、請求項２に記載の使用。
【請求項８】
障害が前頭葉退化を伴う痴呆から生じたものである、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
選択的ＰＤＥ２阻害剤が以下の式（Ｉ）で示される化合物またはその塩である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用：
【化１】
2004505054.tif 000004
［式中、
Ａ＝Ｄは、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨまたはＣＲ５＝Ｎを表し、ここにＲ５は水素、メチル、エチルまたはメトキシを表し、
Ｒ１およびＲ２は、隣接する炭素原子といっしょになって、ヒドロキシメチレンまたはカルボニルを表し、ならびに、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、メチル、エチル、メトキシ、エトキシまたは式：ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７の基を表し、
ここに、
Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルを表すか、あるいは、
Ｒ６およびＲ７は隣接する窒素原子といっしょになって、アゼチジン−１−イル、ピロル−１−イル、ピペリジ−１−イル、アゼピン−１−イル、４−メチルピペラジン−１−イルまたはモルホリン−１−イル基を形成する］。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、知覚、集中、学習および／または記憶を改善するための、選択的ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ２）阻害剤の使用に関する。
【０００２】
アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸シクラーゼの細胞での活性化は、それぞれ、ＡＴＰおよびＧＴＰをそれぞれ５’−３’環式アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および５’−３’環式グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）に環化する。これらの環式ヌクレオチド（ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ）は重要な第二メッセンジャーであり、したがって、細胞のシグナル伝達カスケードにおいて中心的役割を担う。これらはそれぞれ、排他的にではないが、とりわけタンパク質キナーゼを反応性にする。ｃＡＭＰによって活性化されるタンパク質キナーゼはタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）と称され、ｃＧＭＰによって活性化されるタンパク質キナーゼはタンパク質キナーゼＧ（ＰＫＧ）と称される（再考に関して：Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５ を参照のこと）。活性化されたＰＫＡおよびＰＫＧは、次いで、多数の細胞性エフェクタータンパク質（例えばイオンチャネル、Ｇ−タンパク質共役レセプター、構造タンパク質）をリン酸化することができる。このように、第二メッセンジャーである、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、幅広く種々の器官における幅広く種々の生理学的プロセスを調節することが可能である。しかし、環式ヌクレオチドはまた、エフェクター分子に直接作用することができる。したがって、例えばｃＧＭＰはイオンチャネルに直接作用して細胞のイオン濃度に影響を与えることができることが既知である（再考に関して：Ｋａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”， １９９１， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｃｈａｐｔｅｒ ２８， ｐｐ． ４０３−４０８ を参照のこと）。ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）はｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの活性を調節し、これによりこれらの生理学的プロセスを調節する調節機構である。ＰＤＥｓは環式一リン酸化合物を加水分解して、不活性な一リン酸、ＡＭＰおよびＧＭＰにする。現在、少なくとも２１ＰＤＥ遺伝子が記載されている（Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｄｒｕｇｓ ２０００， ９， １３５４−３７８４）。これらの２１ＰＤＥ遺伝子は、その配列相同性に基づいて、１１ＰＤＥファミリーに分けられる（提案されている命名法に関して：ｗｗｗ．ｈｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ． を参照のこと）。一ファミリーに含まれる個々のＰＤＥ遺伝子は、文字によって区別される（例えばＰＤＥ１ＡおよびＰＤＥ１Ｂ）。一遺伝子内の異なるスプライスの変異体が存在する場合、これは文字の後ろのさらなる番号付けによって示される（例えばＰＤＥ１Ａ１）。本来「ｃＧＭＰ刺激性ＰＤＥ」と称され、後にＰＤＥ２とされた酵素が、１９８２年に初めてウシ心臓およびウシ副腎から生物学的に単離精製された（Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８２， ２５７， １９７３−１９７９）。このホスホジエステラーゼの特有の特徴は、これが、基質であるｃＧＭＰに関して、正の協同的な動力学を有することである。少量のｃＧＭＰはいわゆるｃＧＭＰ結合ドメインに結合して、この酵素を活性化することが仮定された。これはまた、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰに関する��媒ドメインのアフィニティーを増大させる（Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８２， ２５７， １９７３−１９７９）。この理由のため、ＰＤＥ２は、加水分解により、少量のｃＧＭＰを介して、第二メッセンジャー系のすべてを調節することができる。
【０００３】
ｃＧＭＰによって刺激されるＰＤＥｓはまた、種々の他の組織においても記載されている。これらには、非限定的に、肝臓（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８３， ２５８， １２５２６−１２５３３）および血小板（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ． １９９０， ５９， １０５−１１９）が含まれる。膜結合型のｃＧＭＰ刺激性ＰＤＥはウサギ脳から単離された（Ｗｈａｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １９８８， ９７２， ７９−９４）。ＰＤＥ２のｃＤＮＡはウシおよびラット組織から初めてクローニングされた（Ｓｏｎｎｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， １７６５５−１７６６１．； Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ． １９９１， １３， ８７−９８．）。Ｓｏｎｎｅｎｂｕｒｇ らはまた、脳皮質、基底核および海馬におけるＰＤＥ２ｍＲＮＡの強い発現を示した。ヒトイソ型ＰＤＥ２Ａ３配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ． Ｕ６７７３３）は Ｒｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ． １９９７， １９１， ８９−９５ によって報告された。ここで調べられている組織のうち、ＰＤＥ２Ａの発現は、脳および心臓で強く検出され、肝臓、骨格筋、腎臓およびすい臓において弱く検出された。
【０００４】
今日までに記載されている唯一のＰＤＥ２特異的阻害剤は、エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン（ＥＨＮＡ：ＩＣ５０＝１μＭ）である。しかし、ＥＨＮＡはまた、非常に強力なアデノシンデアミナーゼ阻害剤（ＩＣ５０＝３ｎＭ）であり、これは、ＥＨＮＡによって生じる細胞生物学的およびインビボ薬理学的作用ははっきり解釈できないことを意味する。
【０００５】
ＥＰ−Ａ−０ ７７１ ７９９、ＷＯ ９８／４０３８４およびＷＯ ００／１２５０４はプリノン、アロプリノールおよびトリアゾロピリミジノン誘導体、ＰＤＥ阻害作用および特定の血管障害の処置に関するこれらの妥当性を記載している。
【０００６】
驚くべきことに、選択的ＰＤＥ２阻害剤は、知覚、集中、学習または記憶を改善するための医薬品を生産するのに適当であることが現在発見された。
【０００７】
本発明の方法の範囲内であるＰＤＥ２阻害剤とは、以下に記載の条件下で、１０μＭより小さい、好ましくは１μＭより小さい、特に好ましくは０．１μＭより小さいＩＣ５０でヒトＰＤＥ２を阻害する化合物である。
【０００８】
本発明の方法の範囲内である選択的ＰＤＥ２阻害剤とは、以下に記載の条件下で、ヒトｃＡＭＰ ＰＤＥｓ ３Ｂ、４Ｂおよび７Ｂより強くヒトＰＤＥ２を阻害する化合物である。これは、ＩＣ５０（ＰＤＥ２）／ＩＣ５０（ＰＤＥ３Ｂ、４Ｂまたは７Ｂ）に関して、０．１以下であることが好ましい。
【０００９】
選択的ＰＤＥ２阻害剤とは、特定の症状／疾患／症候群、例えば軽症の認識障害、年齢関連性の学習および記憶障害、年齢関連性の記憶喪失、血管性痴呆、頭蓋脳外傷、脳卒中後に生じる痴呆（脳卒中後痴呆）、外傷後頭蓋脳外傷、全般的集中障害、学習および記憶に問題を有する子供の集中障害、アルツハイマー疾患、レビ小体を伴う痴呆、ピック症候群を含む前頭葉退化を伴う痴呆、パーキンソン疾患、進行性核麻痺、皮質基底退化を伴う痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン疾患、多発性硬化症、視床退化、クロイツフェルトヤコブ痴呆、ＨＩＶ痴呆、痴呆を伴う統合失調症またはコルサコフ精神病において生じる認識障害後の、知覚、集中、学習または記憶の改善に特に適当である。
【００１０】
本発明は、好ましくは、以下の一般式（Ｉ）で示される化合物またはその塩であるＰＤＥ２阻害剤の本発明に記載の使用に関する：
【化２】
2004505054.tif 000002
［式中、
Ａ＝Ｄは、Ｎ＝Ｎ、Ｎ＝ＣＨまたはＣＲ５＝Ｎを表し、ここにＲ５は水素、メチル、エチルまたはメトキシを表し、
Ｒ１およびＲ２は、隣接する炭素原子といっしょになって、ヒドロキシメチレンまたはカルボニルを表し、ならびに、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、メチル、エチル、メトキシ、エトキシまたは式：ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７の基を表し、
ここに、
Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ３−Ｃ７シクロアルキルを表すか、あるいは、
Ｒ６およびＲ７は隣接する窒素原子といっしょになって、アゼチジン−１−イル、ピロル−１−イル、ピペリジ−１−イル、アゼピン−１−イル、４−メチルピペラジン−１−イルまたはモルホリン−１−イル基を形成する］。
【００１１】
Ｃ１−Ｃ６−アルキルとは、本発明の目的に関して、１〜６炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基を表す。１〜６炭素原子を有する直鎖または分岐アルキル基が好ましい。例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルを記載することができる。
【００１２】
Ｃ３−Ｃ７−シクロアルキルとは、本発明の目的に関して、３〜７炭素原子を有するシクロアルキル基を表す。好ましいものとして、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルを記載することができる。
【００１３】
一般式（Ｉ）で示される本発明の物質はまた、塩形態であってよい。生理学的に許容される塩が本発明の目的に関して好ましい。
【００１４】
生理学的に許容される塩は、本発明の化合物の、無機または有機の酸との塩であってよい。無機の酸、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸または硫酸との塩、または、例えば、酢酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸、またはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸のような有機カルボン酸またはスルホン酸との塩が好ましい。
【００１５】
生理学的に許容される塩は、同様に、本発明の化合物の金属またはアンモニウム塩であり得る。アルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウムまたはカルシウム塩）、および、アンモニアまたは有機アミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミンまたはトリエチルアミン、ジエタノールアミンまたはトリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、アルギニン、リシン、エチレンジアミンまたは２−フェニルエチルアミンから誘導されるアンモニウム塩は特に好ましい。
【００１６】
一般式（Ｉ）で示される化合物は、ＥＰ−Ａ−０ ７７１ ７９９、ＷＯ ９８／４０３８４およびＷＯ ００／１２５０４に開示されているか、あるいはそこに記載されている方法によって製造できる。ＥＰ−Ａ−０ ７７１ ７９９、ＷＯ ９８／４０３８４およびＷＯ ００／１２５０４の開示内容は引用により本明細書中に包含される。
【００１７】
活性物質は全身的および／または局所的に作用し得る。この目的のため、例えば経口、非経口、鼻腔、舌下、舌、頬側、直腸、経皮、結膜または耳経路によるか、あるいは移植のような適当な方法で投与可能である。
【００１８】
これらの投与経路に関して、適当な投与剤型で活性物質を投与することができる。
【００１９】
経口投与に適当な投与剤型として、短時間の、および／または修飾された活性物質のデリバリーが可能な投与剤型、例えば錠剤（コーティングなし、およびコーティング錠、例えば腸溶コーティング）、カプセル剤、糖衣錠、顆粒剤、ペレット剤、粉末剤、エマルジョン、懸濁剤および溶液剤が既知である。
【００２０】
非経口投与は、吸収工程を回避して（静脈内、動脈内、心内、髄腔内または腰内経路）、あるいは吸収を算入して（筋肉内、皮下、皮内、経皮または腹腔内経路）行うことが可能である。非経口投与に適当な投与剤型は、とりわけ、溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥物および滅菌粉末の剤型での注射および注入用の調製物である。
【００２１】
他の投与経路に適当なものは、例えば吸入用製薬的剤型（とりわけ粉末吸入器または噴霧器用）、鼻腔ドロップ／溶液、スプレー；舌、舌下または頬側投与用の錠剤またはカプセル剤、坐剤、耳および眼用の調製物、膣カプセル、水性懸濁剤（ローション、シェイク混合物（ｓｈａｋｉｎｇ ｍｉｘｔｕｒｅｓ））、脂肪親和性懸濁液、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、粉塵粉末剤（ｄｕｓｔｉｎｇ ｐｏｗｄｅｒｓ）または移植片である。
【００２２】
活性物質は、既知の様式で、本質的に、記載される投与剤型に変換可能である。これは、不活性で、無毒の製薬的に適当な賦形剤を使用して行われる。これらには、とりわけ、担体（例えば微結晶セルロース）、溶媒（例えば液状ポリエチレングリコール）、乳化剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、分散剤（例えばポリビニルピロリドン）、合成および天然のバイオポリマー（例えばアルブミン）、安定化剤（例えばアスコルビン酸のような抗酸化剤）、着色物質（例えば酸化鉄のような無機の顔料）または味および／またはにおいの遮断剤が含まれる。
【００２３】
一般に、非経口投与に関する有効な結果を得るために、約０．００１〜３０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ量を投与するのが有益であることが示されている。経口投与に関する量は、約０．０１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．１〜３０ｍｇ／体重ｋｇである。
【００２４】
しかし、適当な範囲内で、特に体重、投与経路、活性物質に対する個体の応答、調製物のタイプおよび投与を行う時間またはその間隔に依存して、記載される量から逸脱することが必要かもしれない。
【００２５】
ＰＤＥ阻害
ｃＧＭＰによって刺激可能なＰＤＥ２はウシ心筋から単離する。Ｃａ２＋カルモジュリンによって刺激可能なＰＤＥ１はブタ大動脈、ブタ脳または好ましくはウシ大動脈から単離する。ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ５は、ブタ小腸、ブタ大動脈、ヒト血液血小板および、好ましくはウシ大動脈から得られる。精製は、本質的に Ｈｏｅｙ， Ｍ； Ｈｏｕｓｌａｙ， Ｍ．Ｄ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９０， ４０， １９３−２０２ および Ｌｕｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９８６， ３５， １７４３−１７５１ の方法にしたがって、ＭｏｎｏＱＲ Ｐｈａｒｍａｃｉａ におけるアニオン交換クロマトグラフィーによって行う。
【００２６】
酵素活性は、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミンおよび８００Ｂｑの ［３Ｈ］−ｃＡＭＰまたは ［３Ｈ］−ｃＧＭＰのいずれかを含有する２０ｍＭ トリス／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）中の１００μＬのアッセイ混合物中で測定する。各ヌクレオチドの最終濃度は１０−６ｍｏｌ／Ｌである。酵素を加えることによって反応を開始し、酵素の量は、インキュベーション時間３０分の間に基質の約５０％が変換されるようにする。ｃＧＭＰによって刺激可能なＰＤＥ２のアッセイに関して用いられる基質は ［３Ｈ］−ｃＡＭＰであり、１０−６ｍｏｌ／ＬのラベルされていないｃＧＭＰを混合物に加える。Ｃａ−カルモジュリン−依存性ＰＤＥ１をアッセイするために、ＣａＣｌ２ １μＭおよびカルモジュリン０．１μＭ をこの反応混合物に加える。１ｍＭ ｃＡＭＰおよび１ｍＭ ＡＭＰを含有するアセトニトリル１００μＬを加えることによって反応をピークにする。反応混合物１００μＬをＨＰＬＣによって分離し、フローシンチレーションカウンターを用いて分解産物をオンラインで定量的に測定する。反応速度が５０％減少する物質濃度を測定する。使用するアッセイは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ によって供給される「ホスホジエステラーゼ［３Ｈ］ｃＡＭＰ−ＳＰＡ酵素アッセイ」および「ホスホジエステラーゼ［３Ｈ］ｃＧＭＰ−ＳＰＡ酵素アッセイ」である。製造元の指示する実験プロトコルにしたがってこのアッセイを行った。
【００２７】
ヒト組換えＰＤＥ２（Ｒｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １９９７ １９１， ８９−９５）、ＰＤＥ３Ｂ（Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９６ ３６， ４７６−４８５）、ＰＤＥ４Ｂ（Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９９３ １３， ６５５８−６５７１）およびＰＤＥ７Ｂ（Ｈｅｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２０００ ９７， ４７２−４７６）は、Ｓｆ９細胞において、ｐＦＡＳＴＢＡＣバキュロウイルス発現系（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて発現させる。
【００２８】
ヒト組換えＰＤＥ２、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ７Ｂに対する試験物質の活性は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｅｎｇｌａｎｄ） から得た［３Ｈ］ｃＡＭＰシンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ）（ＳＰＡ）キットを用いて測定し、ＰＤＥ１およびＰＤＥ５に対しては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｅｎｇｌａｎｄ） から得た［３Ｈ］ｃＧＭＰシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）キット（ＴＲＫＱ７１００）を用いて測定する。
【００２９】
試験物質を１００％ＤＭＳＯ（１０ｍＭ）に溶解し、この溶液をさらにＨ２Ｏで希釈する（このアッセイにおける最大最終濃度：１０μＭ）。ｃＧＭＰ（このアッセイにおける最終濃度：１０−６Ｍ）を加えることによってＰＤＥ２をプレ刺激する。酵素をＰＤＥバッファー（２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬアルブミン、ｐＨ７．５）中で希釈する。以下の容量を９６ウェルプレート（Ｗａｌｌａｃ， １４５０−４０１）の各ウェルにピペッティングし、反応を開始させる：物質溶液１０μＬ（１００％値用のＨ２Ｏ１０μＬ）、ｃＧＭＰ（１０−５Ｍ）１０μＬ、［３Ｈ］−ｃＡＭＰアッセイ混合物７０μＬ（キット参照）、酵素１０μＬ（酵素なしでは、代わりに０値用のＨ２Ｏ１０μＬを加える）。３０℃で１５分間インキュベーションした後、ＳＰＡビーズ溶液（キット参照）５０μＬを用いて反応を停止させ、このプレートをフィルムで密封し、３０秒間シェイクする。ビーズが沈降した後（約１５分）、プレートをベータカウンターで測定する。
【００３０】
ＰＤＥ１測定のために、カルモジュリン１０−７ＭおよびＣａＣｌ２１μＭを反応混合物に加える。ＰＤＥ５は［３Ｈ］ｃＧＭＰ ＳＰＡアッセイを用いて測定する。ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ７Ｂは［３Ｈ］ｃＡＭＰシンチレーション近接アッセイを用いて測定する。
【００３１】
実施態様１で用いられた、６−（３，４−ジメトキシベンジル）−１−［１−（１−ヒドロキシエチル）−４−フェニルブチル］−３−メチル−１，５−ジヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン（実施例１化合物）は、ＷＯ ９８／４０３８４の実施例３６に相当し、そこに記載される方法によって製造された。
【００３２】
実施例１化合物によるＰＤＥイソ酵素の阻害
2004505054.tif 000003
【００３３】
細胞培養における細胞内ニューロン性ｃＧＭＰ濃度の増加
初期マウス脳細胞培養内の１０−４Ｍ ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）を用いるグアニル酸シクラーゼのプレ刺激後に、ＰＤＥ２阻害剤は細胞内ニューロン性ｃＧＭＰ濃度を増大させる。
【００３４】
マウス胚を断頭し、その頭部を解剖皿に移した。頭皮および頭蓋の頂部を除去し、曝露された脳を別のペトリ皿に移した。双眼顕微鏡および２ピンセットを用いて、大脳（皮質）を単離し、氷で４℃に冷却した。次いで、パパイン乖離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｌａｋｅｗｏｏｄ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８７０１， ＵＳＡ）を用いる標準的プロトコル（Ｈｕｅｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９８６， ６， ３０４４−３０６０）にしたがって、この皮質ニューロンの解剖および単離を行った。機械的に単離されたニューロンを、標準的条件（３７℃、５％ＣＯ２）下で７日間、９６ウェルプレート（ポリ−Ｄ−リシン１００μｇ／ｍＬ ｆｉｒ ２０分）において、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ 溶媒２００μＬ／ウェル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ； Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ； ２ｍＭ Ｌ−グルタミン；ペニシリン／ストレプトマイシン存在下）中、１５０ ０００細胞／ウェルで培養した。７日後、培地を除去し、細胞をＨＢＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で洗浄した。次いで、ＳＮＰ溶液１００μＬおよびＨＢＳ中の実施例１化合物（あらかじめ１００％ＤＭＳＯに１０ｍＭで溶解されている）１００μＬを細胞に加え、ＳＮＰの最終濃度が１００ｍＭ、実施例１化合物の濃度を図１に示されるようにし、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を２００μＬ溶解バッファー（ｃＧＭＰキットコード ＲＰＮ ２２６；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で溶解し、製造元が記載するように、ｃＧＭＰ濃度を測定した。すべての測定は３回行った。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ ＵＳＡ） を用いて行った。
【００３５】
ニューロンとＳＮＰ（グアニル酸シクラーゼ刺激物）および実施例１化合物との並行インキュベーションでは、濃度１００ｎＭにおいてさえ、細胞内ｃＧＭＰレベルのはっきりした増加が示された（図１）。
【００３６】
細胞は１００ｍＭ ＳＮＰ（０）または１００ｍＭ ＳＮＰおよび実施例１化合物（１×１０−８Ｍ；５×１０−８Ｍ；１×１０−７Ｍ；５×１０−７Ｍ；１×１０−６Ｍ）で２０分間処置した。次いで細胞内ｃＧＭＰレベルを測定した。
【００３７】
物体認識試験
物体認識試験は記憶試験である。これはラット（およびマウス）がよく知っている物体およびよく知らない物体を区別する能力を測定するものである。
【００３８】
試験は記載されているように行った（Ｂｌｏｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ １９９８， ９， ４２０５−４２０８； Ｅｎｎａｃｅｕｒ， Ａ．， Ｄｅｌａｃｏｕｒ， Ｊ．， Ｂｅｈａｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １９８８， ３１， ４７−５９； Ｅｎｎａｃｅｕｒ， Ａ．， Ｍｅｌｉａｎｉ， Ｋ．，． Ｐｓｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９９２， １０９， ３２１−３３０； Ｐｒｉｃｋａｅｒｔｓ， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９７， ３３７， １２５−１３６）。
【００３９】
最初の実行では、ラットを２つの同一の物体と対面させ、それ以外は空の比較的広いサイズの観察領域に置く。両物体の匂いを嗅ぎ回り、それに触れることに関して、このラットを詳細に調査する。第二の実行では、２４時間の間隔後、ラットを観察領域に再び置く。ここでよく知っている物体の一方は、新たな、よく知らない物体と置き換えられる。ラットがよく知っている物体を認識する場合、よく知らない物体の調査に集中するだろう。しかし、２４時間後、ラットは通常、どちらの物体が最初の実行で調査されたかを忘れ、したがって、両物体は同程度に調べられる。学習および記憶の改善作用を有する物質の投与により、ラットが２４時間前の最初の実行時に見た物体をよく知っていると認識するようになる。マウスは新たな、よく知らない物体をよく知っている物体より詳細に調査する。この記憶能力は識別率で記載する。識別率０は、ラットが、古いものおよび新たなものの両物体を等しい時間調査することを意味し；これは古い物体を認識しておらず、両物体に対し、それらをよく知らず、新たな物体であるかのように反応する。０より大きい識別率は、ラットが新たな物質を古い物体より長く調査することを意味し；これはラットが古い物体を認識していることを意味する。
【００４０】
最初の実行の２４時間後の、ラットによる物体認識に対する実施例１化合物の作用を調査した。動物は、２つの同一の物体に対する最初の実行の直後に、Ｔｙｌｏｓｅ のみ、または、Ｔｙｌｏｓｅ に懸濁された用量０．３、１．０または３．０ｍｇ／体重ｋｇの実施例１化合物を経口投与された。この２４時間後に、各場合について第二の実行を行った。２または３日の洗い出し期間の後、実施例１化合物の新規投与を同一のラットにおいて試験し、全投与量に関してすべてのラットの記憶能力を２回測定した。したがってすべての動物はそれ自身のコントロールとなる。この実験の結果を図２に示す。驚くべきことに、記憶能力は、コントロール条件（Ｔｙｌｏｓｅ のみでの処置）と比較した場合、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇの実施例１化合物での処置後の第二の実行において改善された。識別率は０より大きく、コントロール条件の識別率とは異なっていた。
【００４１】
この試験の結果を図２に記載する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＮＰおよび実施例１化合物（横座標）で処置した後の初期マウス（Ｅ１８）皮質培養における細胞内ｃＧＭＰ濃度（縦座標）を示す。
【図２】図２は、物体認識試験における識別率（ｄ２）に対する実施例１化合物の作用を示す（平均＋ＳＥＭ）。ビヒクル処置は１％ Ｔｙｌｏｓｅ を用いる。物質で試験される動物は０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇで処置された。統計分析：＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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