(57)【要約】本発明は、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａの以前未知種の、バナナの真菌病原体の検出のためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおけるプライマーの使用に関する。特異的プライマーを、ＰＣＲに基づく技術を使用する真菌単離株の同定のため有用であるように同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＰＣＲに基づく検出での使用のためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、当該プライマーが配列番号５ないし１３からなる群より選択される、プライマー。
【請求項２】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＰＣＲに基づく検出での使用のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、当該プライマーの少なくとも１つが、請求項１のオリゴヌクレオチドプライマーである、プライマー対。
【請求項３】
請求項２のオリゴヌクレオチドプライマー対であって、当該対が、
【表１】
2004503250.tif 000011
【表２】
2004503250.tif 000012
からなる群より選択される、上記対。
【請求項４】
当該対が配列番号７および配列番号１２からなる、請求項２のオリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項５】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種の検出方法であって、
（ａ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種に感染した植物組織からＤＮＡを単離するステップ、
（ｂ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）配列の一部を、当該ＤＮＡをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応においてプライマー対と使用して増幅し、ここで当該プライマーのいずれかが請求項１のプライマーである、ステップ、および
（ｃ）当該Ｍｙｃｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を、該ＩＴＳ配列の増幅された部分を可視化することによって検出するステップ、
を含む方法。
【請求項６】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種の検出方法であって、
（ａ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種に感染した植物組織からＤＮＡを単離するステップ、
（ｂ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）配列の一部を、当該ＤＮＡをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応において請求項２のプライマー対と使用して増幅するステップ、および
（ｃ）当該Ｍｙｃｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を、該ＩＴＳ配列の増幅された部分を可視化することによって検出するステップ、
を含む方法。
【請求項７】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種の検出方法であって、
（ａ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種に感染した植物組織からＤＮＡを単離するステップ、
（ｂ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）配列の一部を、当該ＤＮＡをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応において請求項３のプライマー対と使用して増幅するステップ、および
（ｃ）当該Ｍｙｃｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を、該ＩＴＳ配列の増幅された部分を可視化することによって検出するステップ、
を含む方法。
【請求項８】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種の検出方法であって、
（ａ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種に感染した植物組織からＤＮＡを単離するステップ、
（ｂ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）配列の一部を、当該ＤＮＡをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応において請求項４のプライマー対と使用して増幅するステップ、および
（ｃ）当該Ｍｙｃｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を、該ＩＴＳ配列の増幅された部分を可視化することによって検出するステップ、
を含む方法。
【請求項９】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を検出する場合に使用する診断キットであって、請求項１のプライマーを含むキット。
【請求項１０】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｒｅｌｌａ種を検出する場合に使用する診断キットであって、請求項２のプライマーを含むキット。
【請求項１１】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｒｅｌｌａ種を検出する場合に使用する診断キットであって、請求項３のプライマーを含むキット。
【請求項１２】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を検出する場合に使用する診断キットであって、請求項４のプライマーを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、バナナ病原体Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ菌の以前未知の種の検出のためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおけるプライマーの使用に関する。これらのプライマーの使用は、真菌病原体の特異的単離株の検出および植物集団中の病気の発生の監視を可能とする。
【０００２】
植物の病気は、年々のかなりの作物ロスを引き起こし、農家からの経済的剥奪および、世界の多くの地域において、局地的集団への栄養提供の不足という結果となる。殺菌剤の広範な使用は、植物病原体攻撃に対してかなりの安全を提供した。しかし、１０億ドルもの殺菌剤への支出にもかかわらず、全世界中の作物ロスは、１９８１年の作物価値の近似的に１０％に相当する（Ｊａｍｅｓ， １９８１； Ｓｅｅｄ ｓｃｉ． ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ９：６７９−６８５）。
【０００３】
病気の破壊プロセスの重度は、病原体の侵略力および宿主の応答に依存する。ほとんどの植物育種計画の１つの目的は、宿主植物の病気に対する抵抗性を増加させることである。典型的には、病原体の異なるレースは、同じ作物種の異なる変種（ｖａｒｉｅｔｙ）と異なって相互作用し、そして多くの、宿主抵抗性の源は、特異的の病原体レースに対してのみ防御する。さらに、何らかの病原体レースは、病気病徴の早期のサインを示すが、作物ヘのほとんど損傷を引き起こさない。ＪｏｎｅｓおよびＣｌｉｆｆｏｒｄ（１９８３； Ｃｅｒｅａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）は、病原体の感染性フォームが宿主品種への抵抗性の導入に応答して、病原体集団中に出現すると予測されること、および、したがって病原体集団を監視することが必要であること、を報告している。
【０００４】
加えて、特定殺菌剤へ抵抗性である真菌の菌株（ｓｔｒａｉｎ）の発達のいくつかの実証された場合がある。１９８１年に早くも、ＦｌｅｔｃｈｅｒおよびＷｏｌｆｅ（１９８１； Ｐｒｏｃ． １９８１ Ｂｒｉｔ． Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔ． Ｃｏｎｆ）は、春オオムギからのウドンコ病集団の２４％および冬オオムギからの５３％が、殺菌剤トリアジメノールに応答してかなりの変異を示すこと、および、これらの集団の分布が変種間で異なり、ほとんどの感受性変種はまたより感受性でないタイプの最高の発生を生じることを、議論している。真菌の殺菌剤ヘの感受性の類似する変異は、コムギｍｉｌｄｅｗ（またトリアジメノールへの）、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ（ベノミルへの）、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ（有機水銀剤への）、Ｐｓｅｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ（ＭＢＣ−型殺菌剤への）およびトリアゾールへのＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓについて実証され、ごくわずかしか説明されない（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｆｆｏｒｄ； Ｃｅｒｅａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， １９８３）。
【０００５】
２種の、バナナに影響するシンガトカ斑点（ｓｉｇａｔｏｋａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔｓ）の周知のフォーム（ｆｏｒｍ）がある−Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌａ ｍｕｓｉｃｏｌａによって引き起こされるイエローシンガトカ（ｙｅｌｌｏｗ ｓｉｇａｔｏｋａ）およびＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓによって引き起こされるブラックシンガトカ（ｂｌａｃｋ ｓｉｇａｔｏｋａ）。ブラックシンガトカは、より経済的に圧倒的であり、葉面積の有意な減少、５０％またはそれ以上の収量ロス、および不時成熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｒｉｐｅｎｉｎｇ）、輸出された果実の重度の傷を生じる（００年４月１７日に、ｗｗｗ．ｓｃｉｓｏｃ．ｏｒｇ／ｆｅａｔｕｒｅ／ｂａｎａｎａ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌに見出されるように）。それは、関連するイエローシンガトカ病より損害があり、制御するのが困難であり、そしてイエローシンガトカによって通常は影響を受けないプランテーンおよびデザートバナナおよびＡＢＢ料理バナナを含むより広い宿主範囲を有する。
【０００６】
輸出プランテーションでは、ブラックシンガトカは頻繁な殺菌剤の適用で制御される。これは、飛行機またはヘリコプター、永久的着陸帯および殺菌剤の混合及び負荷の設備の使用、および噴霧材料それ自体の高い反復支出を含むから、非常に高価な実施である。全部で、これらのコストは輸入国のこれらの果実の最終小売価格の２５％を最終的に占める（００年４月１７日に見出されるように、ｗｗｗ．ｓｃｉｓｏｃ．ｏｒｇ／ｆｅａｔｕｒｅ／ｂａｎａｎａ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）。種々のステロール脱メチル化阻害剤（ＤＭＩｓ）は現在、シンガトカの制御のために最も共通して使用される化合物であるが、該病原体のＤＭＩ殺菌剤に対する増加された耐性は、バナナ育成領域の幾つかの国での適用を、年に２５−４０回の頻度に増加させることが必要とする（００年４月１７日に見出されるように、ｗｗｗ．ｓｃｉｓｏｃ．ｏｒｇ／ｆｅａｔｕｒｅ／ｂａｎａｎａ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）。
【０００７】
ブラックシンガトカはしばしば視覚で認識されるが、一義的な診断はバナナ葉上に見出される他の病原体の存在によって複雑であり得る。子のう胞子の脱負荷によってほとんど首尾良く達成される、該病原体の単離は、しばしば成熟被子器の不存在によって混乱を生じ、そして培養で取得されるときでさえも、Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭ． ｍｕｓｉｃｏｌａは容易に視覚的に区別される（Ｊｏｈａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｅｇｅｒ Ｍｙｃｏｌ． Ｒｅｓ． ９７（６）：６７０−６７４（１９９３））。
【０００８】
生物医学研究者は、ここしばらくＰＣＲに基づく技術を使用し、感染性動物組織の病原体を検出することにある程度の成功を収めた。最近になって、しかし、この技術は植物病原体を検出するために適用された。感染性コムギのＧａｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓの存在は、病原体ミトコンドリアゲノムに特異的な配列のＰＣＲを使用して検出され（Ｓｃｈｌｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５７：５５３−５５６）、そしてランダム増幅多型性ＤＮＡ（すなわちＲＡＰＤ）マーカーは、針葉樹のｓｃｌｅｒｏｄｅｒｒｉｓ ｃａｎｋｅｒの原因物質である、Ｇｒｅｍｍｅｎｉｅｌｌａ ａｂｉｅｔｉｎａの多くのレースを区別することができた。米国特許番号５５８５２３８（引用によりその全体をここに含める）は、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ（ＲおよびＷ型）、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ、およびＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｕｓｉｃｏｌａの菌株のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列から由来するプライマーおよびＰＣＲに基づく技術を使用するこれらの真菌単離株の同定でのこれらの使用を記載している。
【０００９】
加えて、米国特許５９５５２７４号（引用によりその全体をここに含ませる）は、フザリウムの菌株のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列に由来するプライマーおよびＰＣＲに基づく技術を使用するこれらの真菌単離株の同定におけるこれらの使用を記載する。さらに米国特許５８００９９７号（引用によりその全体をここに含める）は、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ、およびＰｕｃｃｉｎｉａの菌株のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列に由来するプライマーおよびＰＣＲに基づく技術を使用するこれらの真菌単離株の同定におけるこれらの使用を記載する。
【００１０】
前記の観点から、感染進行の早期に病原体真菌の追加的な特異的レースの同定を可能とする技術の開発の真の必要がある。立毛（ｃｒｏｐ ｓｔａｎｄ）中に病気病徴が明白となる前に病原体の特異的レースを同定することによって、農学者は、病原体が同定された作物変種における病原体のさらなる発生のありうる影響を評価することができ、そしてそのような適用が必要と考えられるならば、適用可能な殺菌剤を選択することができる。
【００１１】
本発明はこうして：
・Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＰＣＲに基づく検出での使用のためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで当該プライマーが、配列番号５−１３からなる群から選択される、上記オリゴヌクレオチドプライマー；
・Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＰＣＲに基づく検出での使用のためのオリゴヌクレオチドプライマーの対であって、ここで当該プライマーの少なくとも１つが、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーである、上記対；
【００１２】
Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＰＣＲに基づく検出での使用のためのオリゴヌクレオチドの対であって、ここで当該プライマーが、
【表３】
2004503250.tif 000002
【表４】
2004503250.tif 000003
からなる群より選択され、特に、ここで当該対が配列番号７および配列番号１２からなる、上記対；
を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種の検出方法であって、
（ａ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種に感染した植物組織からＤＮＡを単離するステップ、
（ｂ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）配列の一部を、当該ＤＮＡをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応においてプライマー対と使用して増幅し、ここで当該プライマーのいずれかまたは両方が本発明のプライマーである、ステップ、および
（ｃ）当該Ｍｙｃｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を、該ＩＴＳ配列の増幅された部分を可視化することによって検出するステップ、
を含む方法を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を検出する場合で使用する診断キットであって、本発明のプライマーまたはプライマー対を含む、キットを提供する。
本発明は、植物病原性真菌の異なる病原型の同定の方法に関係する。本発明は、異なる真菌病原型の間で変異を示すＩＴＳ　ＤＮＡ配列を提供する。そのようなＤＮＡ配列は、本発明の方法で有用であり、これらを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく診断アッセイでの使用のためのプライマーをもたらす。これらのプライマーは、ＰＣＲ反応での独特なフラグメントを生成し、ここで該ＤＮＡテンプレートは、特異的真菌病原型によって提供され、そしてこうして、これらを使用し、病気病徴の開始の前に宿主植物体での特異的病原型の存在または不存在を同定する。
【００１５】
特に、本発明は以前未知種のＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａからのＩＴＳ　ＤＮＡ配列、並びにＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａのこの種の検出およびそれを他のＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種、例えばＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｕｓｉｃｏｌａから区別ためのＩＴＳに由来する診断プライマーを提供する。
【００１６】
ある実施態様では、本発明は、真菌病原体のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域から単離されたＤＮＡ分子を提供し、ここで、当該ＤＮＡ分子は、以前未知種のＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａのＩＴＳ　ＤＮＡ配列である。好ましい実施態様では、以前未知種のＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａからのＩＴＳ配列は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１９からなる群より選択される。
【００１７】
別の実施態様にしたがって、本発明は、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＰＣＲに基づく検出での使用のためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、ここで、当該プライマーは、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａの以前未知種からのＩＴＳ配列の少なくとも１０連続ヌクレオチドと配列同一性を有する。好ましくは、該オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号５−１３からなる群より選択される。
【００１８】
なお別の実施態様にしたがって、本発明は、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＰＣＲに基づく検出での使用のためのオリゴヌクレオチドプライマー対を提供し、ここで当該プライマーの少なくとも１つは前記パラグラフに記載のオリゴヌクレオチドプライマーである。好ましくは該オリゴヌクレオチドプライマーの対は、配列番号５および配列番号１０；配列番号５及び配列番号１１；配列番号５及び配列番号１２；配列番号５及び配列番号１３；配列番号５および配列番号４；配列番号６および配列番号１０；配列番号６および配列番号１１；配列番号６および配列番号１２；配列番号６および配列番号１３；配列番号６および配列番号４；配列番号７および配列番号１０；配列番号７および配列番号１１；配列番号７および配列番号１２；配列番号７および配列番号１３；配列番号７および配列番号４；配列番号８および配列番号１０；配列番号８および配列番号１１；配列番号８および配列番号１２；配列番号８および配列番号１３；配列番号８および配列番号４；配列番号９及び配列番号１０；配列番号９および配列番号１１；配列番号９および配列番号１２；配列番号９および配列番号１３；配列番号９および配列番号４；配列番号１及び配列番号１０；配列番号１および配列番号１１；配列番号１および配列番号１２；および配列番号１および配列番号１３からなる群より選択される。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーの対は配列番号７および配列番号１２である。
【００１９】
なお別の実施態様にしたがって、本発明は、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種の検出方法であって、（ａ）Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種で感染した植物組織からＤＮＡを単離するステップ、（ｂ）当該Ｍｙｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種のＩＴＳ配列の一部を、当該配列をテンプレートとして、前記プライマーの対とポリメラーゼ連鎖反応で使用して増幅するステップ、および（ｃ）当該Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種を該ＩＴＳ配列の増幅部分を可視化することによって検出するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、特異的作物変種−病原体菌株関連性における可能性のある損傷を評価する、および、利用可能である殺菌剤の広範な資材を賢明に利用する可能性を提供する。さらに、本発明を使用し、広範な地理的領域にわたる、特異的病原体レースの発生及び蔓延に関する詳細な情報を提供することができる。本発明は長い潜在相のある病気について特に好適である検出方法を提供する。
本発明の実施化に有用なキットをまた提供する。該キットは、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ真菌病原体の同定での特定の使用を見出す。
【００２１】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号１　オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ１
配列番号２　オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ２
配列番号３　オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ３
配列番号４　オリゴヌクレオチドプライマーＩＴＳ４
配列番号５　オリゴヌクレオチドプライマーＪ−ＢＰ１
配列番号６　オリゴヌクレオチドプライマーＪ−ＢＰ２
配列番号７　オリゴヌクレオチドプライマーＪ−ＢＰ３
配列番号８　オリゴヌクレオチドプライマーＪ−ＢＰ４
配列番号９　オリゴヌクレオチドプライマーＪ−ＢＰ５
配列番号１０　オリゴヌクレオチドプライマーＪ−ＢＰ６
配列番号１１　オリゴヌクレオチドプライマーＪ−ＢＰ７
配列番号１２　オリゴヌクレオチドプライマーＪ−ＢＰ８
配列番号１３　オリゴヌクレオチドプライマーＪＢ−４７３
【００２２】
配列番号１４　バナナサンプル「Ｃａｐｅｓｔｅｒｒｅ−ｂａｂｉｎ ２」から増幅される真菌のＩＴＳについてのトランケートＤＮＡ配列（ｐＣＲＢＰＣａｐｂａｂＢ２−１）
配列番号１５　バナナサンプル「Ｍａｔｏｕｂａ ｂａｓ ３」から増幅される真菌のＩＴＳについてのトランケートＤＮＡ配列（ｐＣＲＢＰＭａｔｂａｓＢ３−２）。
配列番号１６　バナナサンプル「Ｔｅｍｏｉｎ Ｉｎｆｅｓｔ Ｆｏｒｔｅ」から増幅される真菌のＩＴＳについてのトランケートＤＮＡ配列（ｐＣＲＢＰＭｆ９）。
配列番号１７　Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓＡＴＣＣ単離株＃２２１１６のＩＴＳについてのＤＮＡ配列（米国特許５５８５２３８）。
配列番号１８　Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｕｓｉｃｏｌａＡＴＴＣ単離株＃２２１１５のＩＴＳについてのＤＮＡ配列（米国特許５５８５２３８）。
配列番号１９　３種の感染バナナサンプルから増幅される真菌のＩＴＳ　ＤＮＡのコンセンサス配列（配列番号１４−１６のコンセンサス）。
【００２３】
本発明は、植物病原性真菌の異なる病原型を同定する場合に有用である独特なＤＮＡ配列を提供する。特に、該ＤＮＡ配列を真菌病原型の同定のためのＰＣＲに基づく分析でのプライマーとして使用できる。本発明のＤＮＡ配列は、特定のＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ真菌病原体のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列並びにこのＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ病原型を同定することのできるこの領域に由来するプライマーを含む。病原体種または属内での異なる病原型に由来するＩＴＳ　ＤＮＡ配列であって、種または属の異なるメンバーの間で異なるものを使用し、これらの特異的メンバーを同定することができる。
【００２４】
リボゾーム遺伝子は、分子プローブ標的としての使用のために好適であり、なぜならそれらの高コピー数のためである。成熟ｒＲＮＡ配列の間の高度な保存にもかかわらず、該非転写および転写スペーサー配列は通常、あまり保存されておらず、こうして、最近の進化分岐の検出のための標的配列として好適である。真菌ｒＲＮＡ遺伝子をユニットとして構成し、そのそれぞれは、１８Ｓ（小サブユニット）、５．８Ｓ、および２８Ｓ（大サブユニット）の３種の成熟サブユニットをコードする。これらのサブユニットは、約３００ｂｐである２種のＩＴＳ配列であるＩＴＳ１およびＩＴＳ２によって分離されている（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｅｄｓ．： Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．； ｐａｇｅｓ ３１５−３２２中）。加えて、該転写ユニットは、非転写スペーサー配列（ＮＴＳ）によって分離されている。ＩＴＳおよびＮＴＳ配列は、異なる真菌病原体の特異的の病原型の検出のために特に好適である。
【００２５】
本発明のＤＮＡ配列は、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ植物病原体の以前未知種のリボゾームＲＮＡ遺伝子領域のＩＴＳ配列からのものである。病原体種または属ないでの異なる病原型からのＩＴＳ　ＤＮＡ配列は、該種または属の異なるメンバー間で異なる。ひとたび病原体のＩＴＳ配列を決定したら、これらの配列を他のＩＴＳ配列、例えばＭ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭ． ｍｕｓｉｃｏｌａからのものとアラインメントすることができる。この態様では、プライマーは該ＩＴＳから由来することができる。すなわち、プライマーを、該真菌病原型内での配列中の最大の差異を含むＩＴＳ配列ないの領域に基づいて設計することができる。これらの配列及びこれらの配列に基づくプライマーを使用し、特異的病原体を同定することができる。
【００２６】
本発明のＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ　ＩＴＳ配列に由来する代表的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、配列番号５−１３に開示する。該配列は、所望の病原体のＰＣＲに基づく同定での使用を見出す。
ＰＣＲ分析での本発明のプライマー配列の使用のための方法は、当業界で周知である。例えば、米国特許４６８３１９５号及び４６８３２０２号、並びにＳｃｈｌｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９１）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５７：５５３−５５６参照。また、Ｎａｚａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１； Ｐｈｙｓｉｏｌ． ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ． ３９：１−１１）であって、ＰＣＲ増幅を使用し、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍおよびＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅのＩＴＳ領域の差異を探索し、その結果２種間を区別したもの、および類似の技術を記載し、バナナ病原体Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭｙｃｏｓｐｈａｒｅｌｌａ ｍｕｓｉｃｏｌａを区別する、米国特許５５８５２３８号参照。
【００２７】
該ＩＴＳ配列をそれぞれの病原体群内で比較し、ＰＣＲで試験するために有用であり得る分岐を位置決定し、異なる種及び／または菌株を区別し得る。分岐の同定から、多くのプライマーを合成し、そしてＰＣＲ増幅で試験する。ＰＣＲ増幅試験のための使用されるテンプレートは、最初に精製病原体ＤＮＡであり、そして次に、感染している宿主植物組織から単離されたＤＮＡである。こうして、診断的である、すなわち、同じ病原体の、ある特定の病原体種または菌株を同定（識別）するが、他の種または菌株を同定（識別）しないプライマー対を同定することが可能である。プライマーをまた、種間で高度に保存されている領域に対して設計し、属−特異的プライマー並びに特定の病気を引き起こすいくつかの真菌病原体のいずれかを同定するプライマーを開発する。例えば、ここで記載のように、プライマーを設計し、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａの以前未知の種を、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａの他の種、例えばＭ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭ． ｍｕｓｉｃｏｌａから区別する。
【００２８】
好ましいプライマー組み合わせは、感染した宿主組織、すなわち以前特異的な病原体種または菌株に感染した感染宿主組織中の異なる種または菌株の間を区別することができる。本発明は、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａの以前未知の種を、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａの他の種、例えばＭ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭ． ｍｕｓｉｃｏｌａから区別する多くのプライマー組み合わせを提供する。本発明のプライマーを、真菌ＩＴＳ領域間での配列差異に基づいて設計する。配列間の最小１塩基対の差異は、識別性プライマーの設計を可能とする。特異的な真菌ＤＮＡのＩＴＳ領域に対して設計したプライマーを、リボゾームＤＮＡのコード領域間で保存された配列領域に対して作成し、種特異的ＰＣＲフラグメントを増幅することができる。一般に、プライマーは約６０ないし約７０℃の間の理論融解温度を有し、良好な感度を達成し、そして顕著な二次構造およびプライマー組み合わせ間の３’オーバーラップをなくすべきである。プライマーは一般にＩＴＳ１およびＩＴＳ２の少なくとも約５−１０連続ヌクレオチド塩基と配列同一性を有する。好ましい実施態様では、プライマーは近似的に５ないし３０ヌクレオチド塩基長からどこでもよい。
【００２９】
本発明は、該プロセスを実行するために必要な要素を含む「キット」の製造にすぐに役に立つ。そのようなキットは、１または２以上の容器、例えば管またはバイアルを厳重に密閉して受けるために区画化されたキャリアーを含み得る。該容器のいずれかは、未標識または検出可能に標識されたＤＮＡプライマーを含み得る。標識したＤＮＡプライマーは、必要に応じて、凍結乾燥形態または適当なバッファー中で存在し得る。１または２以上の容器は、ＰＣＲ反応で利用されるべき１または２以上の酵素または試薬を含み得る。これらの酵素は、それ自体または混合物として、凍結乾燥形態または適当なバッファー中で存在し得る。
【００３０】
最終的に、該キットは、本発明の技術を実施するため必要な追加的要素のすべて、例えばバッファー、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシドトリフォスフェート、濾紙、ゲル材料、移動材料、オートラジオグラフィーサプライ等を含み得る。
【００３１】
以下の例は、好適なプライマー配列の選択、選択的及び診断的効験のためのプライマーの試験、およびそのようなプライマーの、病気および真菌単離株検出のための使用で使用できる典型的な実験プロトコールを示す。そのような例は、例示のために提供し、そしていかなる意味でも限定しない。
【００３２】
実施例
ここで使用の標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当業界で周知であり、そしてＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）ａｎｄ ｂｙ Ｔ．Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ． Ｂｅｒｍａｎ， ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８４） ａｎｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｕｂ．ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）によって記載されている。
【００３３】
実施例１：真菌単離株およびゲノム真菌ＤＮＡ抽出
使用した真菌単離株およびそれらの源の列挙のための表１参照。真菌を、ＰＤＡ（ポテトデキストロースアガー）培養物からの菌糸片を接種した１５０ｍｌのポテトデキストロースブロス中で成長させる。培養物を、オービタルシェーカー上で２８℃で７−１１日間インキュベートする。あるいは、菌糸を、ＰＤＡプレートから直接的に単離する。菌糸を遠心分離によってペレット化し、それから液体窒素中で磨砕し、そして総ゲノムＤＮＡを、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ（１９９０；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｅｄｓ．： Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，； ｐａｇｅｓ ２８２−２８７中）のプロトコルを使用して抽出する。
【００３４】
【表５】
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【表６】
2004503250.tif 000005
１Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ
２Ｄｒ． Ａｎｄｒｅａ Ｊｏｈａｎｓｏｎ， Ｎａｔｕｒａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ＵＫ
【００３５】
実施例２：バナナ組織からのＤＮＡ抽出
ＤＮＡを、バナナ葉から、ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇａｒｄｅｎ Ｇｒｏｖｅ， ＣＡ）のＩｓｏＱｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｃａｔ＃ＭＸＴ−０２０−１００）からのＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌの修飾バージョンを使用して抽出する。これは以下の通りである：
（１）近似的に０．２ｇの組織を、エタノール洗浄したハサミでバナナ葉から切り取り、滅菌エッペンドルフ管中に置く。
（２）５０μＬのＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ａおよび５０μＬの（Ｒｅａｇｅｎｔ ＃１ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、管に添加し、該管に数粒の砂を添加し、組織を細かく砕くのを助ける。
（３）該組織を、Ｋｏｎｔｅｓ乳棒を使用して繊維状と成るまで磨砕する。
（４）該砂及び残骸を、サンプルを１００００ｘＧで５分間遠心分離することによって遊離ＤＮＡを含む上清から分離する。上清を新しいエッペンドルフ管に移す。
（５）５０μＬのＲｅａｇｅｎｔ２（抽出マトリックス）を該上清に添加する。
（６）２００μＬのＲｅａｇｅｎｔ３（抽出バッファー）を該混合物に添加しそして該サンプルを強く撹拌する。
（７）サンプルを１２０００ｘＧで５分間遠心分離する。近似的に２００μＬの水相を新しい管に移す。
（８）０．１ｘ体積の水相のＲｅａｇｅｎｔ＃４（酢酸ナトリウム）を該水相に添加する。
（９）等体積のイソプロパノールを添加し、そして該混合物を強く撹拌する。
（１０）該ＤＮＡを１２０００ｘＧで１０分間ペレット状に遠心分離する。
（１１）該イソプロパノールを注ぎ出し、そして０．５μＬの氷温７０％エタノールを添加する。
（１２）該洗浄物を１２０００ｘＧで５分間遠心分離する。
（１３）該ＤＮＡを１００μｇ／ｍＬ　ＲＮアーゼと５０μＬのＴＥ中に再懸濁する。
【００３６】
シンガトカの証拠のあるバナナ葉のサンプルを、マルティニクおよびグアドループから取得する（表２）。目視病気評価を、バナナ葉表面上の病斑を探すことによってなす。ＤＮＡ調製物を、この実施例に概説したプロトコルを使用してそれらから作成する。
【００３７】
表２：バナナ葉組織の源
【表７】
2004503250.tif 000006
【００３８】
実施例３：ポリメラーゼ連鎖反応増幅
ポリメラーゼ連鎖反応を、２００μＭのそれぞれのｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰを含む５０ｍＭ　ＫＣｌ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｐｍｏｌのそれぞれンプライマー、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ並びに１０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒからのＧｅｎｅ Ａｍｐ Ｋｉｔ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ；ｐａｒｔ ｎｏ．．Ｎ８０８−０００９） で実施する。反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ９６００または９７００サーマルサイクラー中で、３０−４０サイクルの、１５秒９４℃、１５秒５０−７０℃、および４５秒７２℃で稼動する。産物を、１．０％　アガロースゲル上にそれぞれのＰＣＲ産物の１０μｌを負荷しそして電気泳動することによって分析する。
【００３９】
実施例４：オリゴヌクレオチドの合成および精製
オリゴヌクレオチド（プライマー）を例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）またはＭｉｄｌａｎｄ Ｃｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ， Ｔｅｘａｓ）のいずれかによって合成する。
【００４０】
実施例５：以前未知のＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ種の感染バナナの同定
実施例３に記載のようなポリメラーゼ連鎖反応でプライマーＪＢ４７３（配列番号１３）およびプライマーＩＴＳ４（配列番号４）を使用して感染バナナ葉から増幅した配列を、Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭ． ｍｕｓｉｃｏｌａ　ＩＴＳ領域配列（それぞれ、配列番号１７および１８）との比較のために配列決定する。配列（配列番号１４、１５および１６）を、３種の異なる源からの感染バナナ葉から増幅した産物について取得する。該３種の配列は、９９．５−１００％の相同性を共有するから、すべての３種を表すコンセンサス配列を作成する（配列番号１９）。ＩＴＳ２を含むこのコンセンサス配列の一部を、ＧｅｎＢａｎｋ公的データベースと比較し、類似配列を見出す（ＢｌａｓｔＮ ２．０．７， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９７）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）。配列番号１９のＩＴＳ２領域は、Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｐｉｎｉ、Ｍ． ａｆｒｉｃａｎａ、およびＭ． ｋｅｎｉｅｎｓｉｓを含むＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａの種に最も近くブラストｓする（ｂｌａｓｔｓ）（表３）。
【００４１】
【表８】
2004503250.tif 000007
【００４２】
実施例６：種−特異的プライマーの選択
多重配列アラインメントを、米国特許５５８５２３８号から取得した、Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭ． ｍｕｓｉｃｏｌａのＩＴＳ領域配列（それぞれ配列番号１７および１８）および感染バナナ葉からのコンセンサス配列（配列番号１９）で作成した。
【００４３】
該コンセンサス配列は、Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓおよびＭ． ｍｕｓｉｃｏｌａからのものと、わずかに８４−８７％の相同性を共有するのみであることが発見される。この証拠に基づいて、我々は、感染バナナ配列から、プライマーＪＢ４７３およびＩＴＳ４を使用して増幅した配列が、Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓからでもＭ． ｍｕｓｉｃｏｌａからでもなく、むしろ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａの以前未知の種からのものであると結論付ける。この新規配列を特異的に標的するオリゴヌクレオチドプライマー、例えば、以下の表４に示すものを、アラインメントされる配列の分析に基づいて実施例４にしたがって合成する。プライマーを、真菌種間で、配列の最大の差異を含む領域に対して設計する。
【００４４】
加えて、公開されたリボゾーム遺伝子−特異的プライマーであるＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＩＴＳ３およびＩＴＳ４（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｅｄｓ．：Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ｐａｇｅｓ ３１５−３２２中）を、ＩＴＳ領域について特異的なプライマーと組み合わせて試験するために合成する。
【００４５】
【表９】
2004503250.tif 000008
【００４６】
実施例６：精製された真菌ゲノムＤＮＡに対するプライマー特異性の決定
ＰＣＲを、単一の特異的なフラグメントを増幅する試みにおいて、種々のプライマーの組み合わせ（表５）を使用して実施例３にしたがって実施する。特異的ＰＣＲ増幅産物を、所望のそれぞれの真菌菌株の、小および大リボゾームＤＮＡサブユニットの間のＩＴＳ領域から設計したプライマーから生産する。
【００４７】
【表１０】
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【００４８】
【表１１】
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【００４９】
実施例７：真菌に感染した植物組織へのプライマー特異性および他の真菌病原体との交差反応性の決定
総ゲノムＤＮＡを、バナナ葉の目視的に感染している部分から実施例２に記載のとおり単離する。ＰＣＲを実施例３の記載のように実施し、該バナナ組織からのＤＮＡに対して表５に列挙したもののようなプライマー組み合わせを試験する。精製された真菌ゲノムＤＮＡを、実施例１に記載のとおり取得し、そして診断プライマーを使用して実施例３に記載の通りアッセイする。他の真菌ＤＮＡ種および単離株を、診断プライマーの、それとの交差反応の能力について試験する。代表的な実験の結果は以下の通りである：
【００５０】
ＩＴＳ１（配列番号１）およびＩＴＳ４（配列番号４）を含む組み合わせを除く他、すべてのプライマー組み合わせは、感染バナナ葉抽出物から単離した〜３００ｂｐ産物を増幅する。プライマーＪ−ＢＰ３（配列番号７）およびＪ−ＢＰ８（配列番号１２）は、最も明瞭な産物を生じるようである。この対をさらに、表１のバナナ病原体のパネルに対して試験する。これらの他の真菌ＤＮＡに対して、何らの交差増幅も観察されない。健康なバナナ組織（表２のＴｅｍｏｉｎ ０）に対して稼動させるとき、プライマー対Ｊ−ＢＰ３／Ｊ−ＢＰ−８は、交差増幅を生じない。
【００５１】
本発明を、特異的実施態様を引用して記載したが、多くの変形、修飾およびさらなる実施態様が可能であり、したがってすべてのそのような変形、修飾および実施態様は本発明の範囲内であるとしてみなされるべきであることが理解される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004503250.tif 000042
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