(57)【要約】細胞電気融合を生じさせるための、新規でかつ有用な装置が提供される。この装置は、以下の部分を含む：ａ．そこに基材を配置したチャンバ；ｂ．融合する細胞をこの基材の一面に向かって移動させるための手段；およびｃ．この細胞の一部の融合を誘発するための装置。融合を誘発する装置は、基材に印加される電場のようなエネルギー源、または別のエネルギー源（例えば、音波／圧力波、光、マイクロ波、電磁エネルギーまたはこれらのエネルギー源の組合せであるが、これらに限定されない）であり得る。この融合プロセスを引き起こすために、単独でまたはエネルギー源と組み合わせて、化学融合剤を含有させることもまた、本発明の範囲内である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞間融合を引き起こす方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）チャンバに基材および液状媒体を備え付ける工程であって、該液状媒体は、細胞を含有する；（ｂ）該細胞の少なくとも一部を、該基材の一面に向かって移動させる工程；および（ｃ）該基材の該一面に近接して、該移動した細胞の一部を細胞間接触で融合する工程。
【請求項２】
前記融合工程が、さらに、任意のエネルギー手段、化学手段およびエネルギー手段と化学手段との組合せから本質的になる群から選択される手段により融合を引き起こすこととして規定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合工程が、さらに、エネルギー手段により融合を引き起こすこととして規定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記エネルギー手段が、音波／圧力波、光、マイクロ波または電磁エネルギーおよび磁気誘導した電場からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記融合工程が、さらに、化学手段により融合を達成することとして規定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記化学手段が、ポリエチレングリコール、化学接着剤、界面活性剤、自然硬化および硬化剤からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記融合工程が、さらに、前記細胞を前記チャンバに導入する前に起こることとして規定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記融合工程が、さらに、複数の融合工程を同時に適用することとして規定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記融合工程が、さらに、複数の融合工程を順次に適用することとして規定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
細胞融合を引き起こす装置であって、該装置は、以下の部分を含む：
（ａ）基材を有するチャンバ；
（ｂ）融合する細胞を該チャンバに含有させるための液体媒体；
（ｃ）該基材の一面に向かう該チャンバ内の細胞の移動を誘発するための手段；および
（ｄ）該細胞の少なくとも一部の融合を誘発するための手段。
【請求項１１】
前記融合手段が、エネルギー手段、化学手段およびエネルギー手段と化学手段との組合せから本質的になる群から選択される、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記エネルギー手段が、音波／圧力波、光、マイクロ波または電磁エネルギーおよび磁気誘導した電場からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記化学手段が、ポリエチレングリコール、化学接着剤、界面活性剤、自然硬化および硬化剤からなる群から選択される、請求項１１に記載の装置。
【請求項１４】
前記融合手段が、細胞を前記チャンバに導入する前に融合が起こるように、該チャンバの外側に収容されている、請求項１０または１１に記載の装置。
【請求項１５】
前記融合手段が、同時に適用される複数の融合手段を含む、請求項１０または１１に記載の装置。
【請求項１６】
前記融合手段が、順次に適用される複数の融合手段を含む、請求項１０または１１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、１９９９年６月８日に出願された米国特許出願第０９／３２８，８３３号の部分継続出願であり、この出願は、１９９８年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／０８８，７５８号の転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）であり、両者の内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、電気融合チャンバに関し、特に、使い捨て電気融合チャンバに関し、これは、電気融合を実行する簡単で安価かつ効率的な方法を提供するのに使用される。
【０００３】
（背景）
電気融合とは、電気を使用して生細胞の融合を誘発する操作の一般的な名称である。細胞間電気融合（ＣＣＥ）とは、生細胞の電気融合を記述するのに使用される一般用語である。ＣＣＥは、１種類の細胞の異なる種類の細胞に対する融合を意味し得、または同じ種類の細胞の融合を意味し得る。本願では、細胞の融合との言及は、異なる種類の細胞の融合および同じ種類の細胞の融合の両方を包含するように解釈される。さらに、それは、２個またはそれ以上の細胞を互いに融合することを包含すると解釈される。
【０００４】
ＣＣＥプロセスは、一般に、３つの主要な工程を包含する。まず第一に、融合パートナー（すなわち、互いに融合する２個またはそれ以上の細胞）は、２個の電極間または電気融合を誘発する何らかの他の手段の間で、互いに強制的に接触されなければならない。これらの細胞は、導電性媒体中になければならない。第二に、これらの電極間で接触している細胞には、１つまたはそれ以上の電気パルスが印加される。電気パルスは、融合を誘発し、これらの電極を横切る電位差（電圧）を作りだし維持することにより、加えられる。ＣＣＥは、通常、直流（ＤＣ）パルスを使用して、達成される。第三の最終ＣＣＥ工程は、自然に起こる；融合した細胞は、それらの普通の流動性のために、１個の細胞にアニールする。ＣＣＥプロセスは、通常、１００％の融合を生じない。典型的には、接触した細胞の断片は、融合するように誘発されるのに対して、残りの断片は、融合しない。また、頻繁に使用されている方法の多くは、細胞を殺す割合が高い工程を包含する。
【０００５】
出願人に公知の殆どの既存の市販ＣＣＥ装置および用途は、細胞間接触を引き起こす誘電泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）と呼ばれるプロセスを使用する。誘電泳動とは、融合パートナーを電極間で鎖状に整列するように交流（ＡＣ）を印加することである。それゆえ、細胞間接触は、鎖状に隣接した細胞が触れる地点で、達成される。誘電泳動は、上記の３工程融合プロセスの第一工程に組み込まれる。鎖が形成された後、１つまたはそれ以上のＤＣパルスが送達されて、融合を誘発し、それらの細胞は、アニールされる。
【０００６】
Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６７，１９９４年１０月、１５７４〜１５８１）は、細胞間電気融合を機械的に促進して実行できる装置および方法を開示している。この装置および方法は、融合前に、細胞を接触させて機械的に配置する。新規な融合チャンバが開示されており、これは、機能が同じ２個の電極から構成され、これらの電極は、多層構造体に収容されている。これらの層は、これらの電極用の支持体として機能する。それらはまた、対向電極面間の距離の調節を可能にする。これらの電極は、真空により、各面上に細胞を堆積させるように構成された。その電極面は、堆積した細胞間で細胞間接触を機械的に強制するために、互いから所定距離で位置付けられた。並置した細胞に直流パルスを送達することにより、融合が誘発された。
【０００７】
Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１６，２７１〜２７５（１９９４））は、細胞間電気融合から得られたハイブリッド細胞を検出し定量する細胞数測定方法を開示している。この方法を示すために、フローサイトメーターと共に、２本の異なる細胞株に由来の細胞と２種のバイタル蛍光染料を使用した。
【０００８】
Ｓｔｒｅｌｌｒｅｃｈｔらのドイツ特許出願ＤＥ　３５０５１４７　Ａ１は、第一および第二キャリア上に細胞を固定する電気融合プロセスを開示している。これらの２個のキャリアは、各キャリアに固定される細胞が、互いに向かい合っているように、配列されている。これらの細胞は、互いに向かって移動して細胞の対（各キャリアから１個ずつ）を形成する。これらの対は、それぞれ、融合される。
【０００９】
上記のものよりも効率的かつ効果的な細胞間接触および融合を誘発する手段を提供できれば、有利である。本発明は、このような細胞間接触を誘発する改良された手段を提供し、堆積した細胞に対して従来技術とは異なる方向から印加した電気パルスを使用する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、新規で有用な電気融合装置を提供し、これは、便利で安価で使い易い装置であるように設計され、この装置は、強制的に細胞間を接触して、細胞間接触で細胞の少なくとも一部の融合を誘発するのに使用できる。この装置は、単一用途および／または多用途の装置として製造でき、容易に滅菌され、使い捨て装置として作製でき、ＡＣを使用する必要がない。
【００１１】
ＡＣなしでの融合は、極めて有利である。例えば、ＤＣ発生装置だけが必要である電気融合装置は、誘電泳動設備に一般に必要な投資よりも初期設備投資が少ない。さらに、ＡＣおよびＤＣを生じる発生装置の価格が高いために、一部の研究者は、電気融合を使用する意欲を失い得る。本発明は、ＤＣ電圧だけを要するので、その問題を解決し、それにより、従来の誘電泳動装置に付随したＡＣ発生装置の費用負担なしで、電気融合の実行が可能となる。
【００１２】
さらに、本発明の装置は、種々の電気的な細胞マニピュレータ装置のＤＣ電源から操作できるという意味で、融通がきく。例えば、多くの研究室は、細胞を操作するために、融合に関連した物理的な現象を使用する。この現象は、エレクトロポレーションと呼ばれている。具体的には、普通、研究者は、電気融合およびエレクトロポレーションの両方を実行する。しかしながら、エレクトロポレーション用の電気パルス発生装置は、ＤＣパルスのみを生じる。それゆえ、ＡＣを必要としない安価な電気融合チャンバがあれば、既にＤＣパルス発生装置を備えた設備で、電気融合を行うことが可能となる。
【００１３】
前述の例の両方でＡＣの必要性がなくなったという事実は、生物学的に適切である。具体的には、出願人が知っている他の装置は、細胞間接触を達成するために、比較的に持続時間（例えば、数秒および／または数分）が長い誘電泳動（これは、ＡＣで誘発さる）と呼ばれる現象を利用する。持続時間が長いＡＣは、細胞の損傷を直接引き起こし得るので、それをなくせば、生物学的に有利となる。また、誘電泳動中に発生する熱は、これらの細胞を損傷し得る。
【００１４】
本発明によれば、２種類の細胞の電気融合を生じる装置は、以下の部分を備える：
ａ．基材を備えたチャンバであって、チャンバは、細胞間接触を達成する面として使用される、チャンバ；
ｂ．融合する細胞の相当量が引き出されて、基材の一面に保持される様式で、液状媒体内に含有された細胞を基材の一面に向ける機構であって、細胞の一部は、基材の一面に沿って、互いに細胞間接触される、機構；および
ｃ．基材の一面の所定部分にわたって、互いに細胞間接触して、細胞の一部の融合を誘発する化学または化学手段／エネルギー手段を有する装置。
【００１５】
融合を誘発する装置は、基材に印加される電場のようなエネルギー源、または別のエネルギー源（例えば、音波／圧力波、光、マイクロ波、電磁エネルギーまたはこれらのエネルギー源の組合せであるが、これらに限定されない）であり得る。この融合プロセスを引き起こすために、単独でまたはエネルギー源と組み合わせて、化学融合剤を含有させることもまた、本発明の範囲内である。
【００１６】
細胞を基材の一面に向かって引き出す手段は、２つの好ましい方法（両者は、同じ結果を達成する）で得ることができる。第一のものは、多孔質基材および真空源を使用する。真空源は、基材の一面で細胞を細胞間接触して保持しつつ基材を通って液状媒体の相当部分を引き出すのに十分なレベルの真空を、液状媒体に適用するように構成されている。真空源は、細胞のこの移動を誘発しかつ融合する細胞の生存度を維持するのに十分な媒体（これは、細胞と混合される）を保持するように、構成される。第二の構成は、選択した極性を備えた荷電基材を使用し、これは、基材の一面とは反対の極性の細胞を引き付ける。
【００１７】
チャンバは、好ましくは、ＡＣ電流源およびＤＣ電圧源の両方を有する従来の誘電泳動装置のＤＣ電源で操作できるように、設計されている。この装置はまた、代表的にエレクトロポレーション装置に関連した形式のＤＣ電源で操作できるか、または他の設備で存在する種々の他の形式のＤＣ電源で操作できる。
【００１８】
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、以下の詳細な説明および添付の請求の範囲から、さらに明らかとなる。
【００１９】
（詳細な説明）
上記のように、電気融合とは、電気を使用して生細胞の融合を誘発する操作の一般的な名称である。細胞間電気融合（ＣＣＥ）とは、生細胞の電気融合を記述するのに使用される一般用語である。ＣＣＥは、１種類の細胞の異なる種類の細胞に対する融合を意味し得、または同じ種類の細胞の融合を意味し得る。本願では、２種類の細胞の融合との言及は、異なる種類の細胞の融合および同じ種類の細胞の融合の両方を包含するように解釈される。さらに、以下の記述は、２個の細胞の融合に関連しているものの、本発明の原理は、２個またはそれ以上の細胞を融合するのに使用できると考えられる。
【００２０】
一般に、電気融合は、密に並置した細胞に１つまたはそれ以上の直流パルスを印加することにより、実行される。単極パルスおよび双極パルスが使用されている。パルスは、一連の同じパルスまたは異なるパルスとして加えられ得る。ＣＣＥの現在一般に認められた科学的な説明は、絶縁破壊の原理に基づいている。生細胞が電場を受けるとき、膜間電位が誘発される。この誘発された電位は、その細胞が維持する自然に生じる膜間電位に重ね合わされる。この自然電位は、通例、静止電位と呼ばれている。物理学の用語では、これらの電位は、その膜のいずれかの面に蓄積したイオンである。ある極性のイオンは、一般の面で蓄積し、また、反対の極性のイオンは、他の面にある。もし、この膜を横切る電位が十分に高いなら、その膜は、極性が反対の分離したイオン間での引力の結果として、絶縁破壊する。この種の絶縁破壊により、その脂質二重層構造において、一時的な構造欠陥が生じ、この膜が脱分極する。これらの欠陥は、細孔および細孔様構造として描写されており、その理由は、サイトゾル区画に通常入らない分子が、細胞を電気的に処理した後、その細胞の内部へのアクセスを獲得できることが観察されているからである。この構造上の欠陥は、通常の膜流動性によって細胞が膜欠陥を再シールして無傷の膜に戻るので、一時的なものである。２個またはそれ以上の細胞の融合は、接触領域において両方の細胞で起こる膜欠陥が両方の細胞膜を１つのものとして再シールできるように、細胞を電気処理したときの密接な細胞間接触を維持することにより、促進される。
【００２１】
ＣＣＥプロセスは、一般に、３つの主要工程を包含する。図１Ａを参照すると、融合パートナー（すなわち、互いに融合する２種類の細胞）は、２個の電極１０、１２間で、互いと強制的に接触されなければならない。これらの細胞は、導電性媒体中になければならない。第二に、これらの電極間で接触している細胞には、１つまたはそれ以上の電気パルスが印加される（図１Ｂを参照）。電気パルスは、融合を誘発し、これらの電極を横切る電位差（電圧）を作りだし維持することにより、加えられる。ＣＣＥは、通常、直流（ＤＣ）パルスを使用して、達成される。第三の最終ＣＣＥ工程は、自然に起こる；融合した細胞は、それらの普通の流動性のために、１個の細胞にアニールする（図１Ｃを参照）。ＣＣＥプロセスは、通常、１００％の融合を生じない。典型的には、接触した細胞の断片は、融合するように誘発されるのに対して、残りの断片は、融合しない。
【００２２】
図２で図示しているように、典型的なジ電気融合機械を用いて、交流（ＡＣ）を印加によって、融合パートナーを電極１０、１２間で鎖状に整列させる。それゆえ、細胞間接触は、鎖内の隣接した細胞が触れる地点で、達成される。鎖が形成された後、１つまたはそれ以上のＤＣパルスが送達されて、融合を誘発し、それらの細胞は、アニールされる。
【００２３】
図３Ａ、３Ｂ、４、５および７〜９は、本発明の原理に従って電気融合を実行するチャンバ２０の異なる図を示す。チャンバ２０は、成形チャンバ本体２２およびキャップ２８を含む。容器２２は、円筒形であり、開放上部２４および下部２６を備え、内部部品用のハウジングとして働く。キャップ２８は、本体２２の上部を覆って、チャンバ２０を完成する。チャンバ２０の内部部品は、２個の電極３０、３２、多孔質基材３４、基材支持体３６およびポート３８（真空源との接続用）を含む。チャンバ２０はまた、チャンバ２０内でシールを完成するためのＯリング５８を含むことができる。
【００２４】
細胞間電気融合は、チャンバ２０内で、まず、細胞懸濁液を２個の電極３０、３２間に配置することにより、行われる。次いで、真空が適用される。この真空は、この懸濁液から基材３４の一面４０に向かってその基材の細孔を通って液体を引き出すのに十分であるが、この液状媒体の全てを脱気するほどには完全ではなく、その結果、この懸濁液中の細胞は、事実上、生存した状態のままとなる。これは、堆積物を引き出し、この基材の一面４０上で、細胞の層を維持する。この結果、２個の電極３０、３２間の空間で互いに接触した細胞が得られる。堆積後、電極３０、３２には、１つまたはそれ以上のＤＣパルスが加えられて、細胞の融合を誘発し、これらの細胞は、これらの電極間で細胞間接触した状態である。これらのＤＣパルスで生じた電場は、基材３４と実質的に平行である。
【００２５】
本発明のさらに他の特徴は、再使用可能なスタンド４２であり、これは、使用中にて、このチャンバを保持するように設計されている。このスタンドは、図５で描写されている。このスタンドは、これらの小チャンバをその真空ポートに簡単にアクセスできる様式に保持する手段であり、また、このチャンバに電気発生装置を連結する簡単な手段である。これらの規準を満たすスタンドはまた、これらの使い捨てチャンバの複雑性および費用を少なくする。その理由は、この使い捨てチャンバにパルス発生装置接続および小チャンバを保持する手段を組み込む必要がないためである。
【００２６】
上記チャンバは、非常に融通がきく機能的な設計であり、これは、多くの異なる状況に適用できる。例えば、図３、４および５で図示しているように、容器２２は、円筒形であり、多孔質基材３４は、円形であり、そして電極３０、３２は、この容器の一部を横切って伸長している。しかしながら、この容器は、他の立体形状をとることができ（例えば、矩形の断面であり得）、また、この基材は、この容器の形状に一致する形状を有することができると考えられる。さらに、
１．このチャンバの物理的サイズは、少数の細胞または多数の細胞の融合に適合するように調節できる；
２．この基材中の１単位面積あたりの細孔のサイズおよび数は、研究中の細胞型に依存して、調節できる；
３．電極のサイズおよび間隔は、種々の電気融合パラメータに適合するように調節できる。例えば、チャンバは、２個の哺乳動物の細胞だけがそれらの間で嵌るのに十分な幅（約２０マイクロメーター）の電極間隙で、設計できる。このようにして融合を実行すると、２個の細胞からなる融合産物の収量が非常に高くなる。
【００２７】
電気融合を実行するために電気融合チャンバを構築して操作できる様式の一例は、以下で記述する：
１．非導電性材料（例えば、プラスチック）から、このチャンバの本体を成形し、押し出すか機械切削することであって、これらは、必要なとき、当該技術分野で公知の方法を使用して、滅菌できる。
【００２８】
２．細胞を堆積するための多孔質面を設けること。メッシュ、多孔質膜、または他の多孔質材料が利用できる。出願人は、ポリカーボネートトラックエッチ（ｔｒａｃｋ　ｅｔｃｈ）膜（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。
【００２９】
３．この多孔質面に堆積した細胞に電気パルスを送達する２以上の電極を設けること。それらは、任意の形状またはサイズであり得る。本発明者は、平行ステンレス鋼電極を示唆しており、これらは、円形または矩形の断面であり得る。これらの電極は、細胞堆積前に、この多孔質面に設置するか、堆積後、これらの細胞にすぐ隣接して設置するか、多孔質表面に包埋するか、および／または基材支持体に包埋すべきである。
【００３０】
４．標準的な真空ポンプ、吸引バルブまたは注射器から作製した真空源を設けること。この真空源を真空連結用ポートに装着する手段もまた、設けるべきである。（この真空源は、特に、特定していない）。あるいは、これらの細胞を膜の一面に向かって強制的に移動するために、これらの細胞を含有するチャンバの面には、圧力を加えることができる。
【００３１】
５．これらの電極にＤＣパルス発生装置を連結する手段を設けること。
【００３２】
６．これらの電極に電流を送達できるＤＣ発生装置を設けること。ＤＣパルスを送達する市販のエレクトロポレーションおよび電気融合発生装置が使用できる；しかしながら、これらの発生装置に使用が限定されている訳ではない。
【００３３】
この装置を操作する１方法は、以下のとおりである：
１．ユーザーが融合したい１以上の異なる型の細胞を含有する生細胞懸濁液を調製すること。
【００３４】
２．装置からキャップを取り除き、その融合チャンバに所望量の細胞を移動すること。
【００３５】
３．真空を適用して、これらの細胞を、多孔質膜上で、互いに接触させること。本発明者は、２５〜１５０ｍｍＨｇの範囲の真空が有用であることを発見した；しかしながら、他の真空度が使用できる。
【００３６】
４．ＤＣ電気を印加して、並置した細胞間で融合を誘発すること。融合を誘発する正確な電気パラメータは、ユーザーが融合したい細胞の型に依存している。機能することが明らかな一部のパラメータには、１〜１０個の長方形パルスがあり、これらは、数マイクロ秒〜数ミリ秒の範囲のパルス持続時間を備えている。これらの場合に発生される電場の規模は、１センチあたり数百ボルト〜１センチあたり数千ボルトの範囲である。
【００３７】
５．パルスを送達した後、融合した細胞は、キャリア溶液（例えば、生理食塩水であるが、これに限定されない）を使用して、このチャンバから洗い出される。
【００３８】
上記のように構成され使用される試作品を、ラットＮ１−Ｓ１肝細胞の癌細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＲＬ−１６０４）を融合するのに使用した。これらの細胞をチャンバに導入する前に、その細胞の半分を、５−クロロメチルフルオレセイン（ＣＭＦＤＡ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（これは、緑色蛍光発生化合物である）で染色した。これらの細胞の残りの半分を、５−（および６−）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン（ＣＭＴＭＲ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）（これは、赤色蛍光発生化合物である）で染色した。これらの緑色および赤色蛍光発生細胞の等部分を共に混合し、次いで、その融合チャンバに導入した。フローサイトメトリーを使用して、赤色蛍光および緑色蛍光の両方を示すハイブリッドとして、融合産物を確認した（Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｒ．Ａ．　ａｎｄ　Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．（１９９４）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１６：２７１〜２７５）。得られたデータの表を、以下で示す。
【００３９】
【表１】
2004504022.tif 000002
上記記述は、多孔質基材および真空源を使って細胞を基材の一面に移動させ細胞間接触を達成する電気融合チャンバを使用することに当てはまる。上で言及したように、荷電基材３４’は、図６（図示した異なる実施形態間にて、ダッシュを付けた同じ番号は、同じ部材を示すのに使用される）で示すように、移動に引き続き細胞間接触を達成するのに使用できる。殆どの生物細胞は、表面電荷（負電荷）を有する。基材２６’に反対の極性の表面電荷（正電荷）を備え付けると、液状媒体から基材３６’の表面への移動が起こる。表面電荷は、電気回路および／または機械回路によって、基材に与えることができる。表面電荷はまた、自然に生じるか、製造工程の一部として与えられる。荷電した基材を使用する融合チャンバの使用および機能は、真空を適用しないこと以外は、上記記述と類似している。
【００４０】
図６を特に参照すると、基材３４’は、誘電体４８で分離された導電性プレート４４、４６から構成される。最上層の導電性プレート４６の上には、非導電性材料のプレート３４’があり、これは、この基材として働く。細胞５２は、２個の電極３０’、３２’間で、互いに接触して堆積され、これらの電極は、融合誘導（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）パルスを送達する。ＤＣパルス発生装置５４は、電極３０’、３２’に操作可能に接続されているのに対して、電圧を供給する手段５６は、導電性プレート４４、４６に操作可能に接続されている、それゆえ、本発明のこの実施形態は、細胞間接触を達成する表面として、荷電基材を提供する。
【００４１】
さらに、上記電気融合チャンバには、本発明の概念から逸脱することなく、改良を加えることができる。例えば、その基材の一面に細胞を引き出すために、真空基材および荷電基材が記述されているものの、それらの細胞に融合誘導ＤＣ電圧を加えつつ、細胞を含有する媒体をその基材の一面に向かって引き出してこれらの細胞を基材の一面に対して細胞間接触させて保持するのに、他の装置（例えば、磁気ビーズ分離原理を使用する装置）が使用できると考えられる。それに加えて、その細胞含有媒体を基材に引き出すのではなく、全てを含有する媒体を基材に押し付けるように、それを加圧できる。本発明は、その融合プロセスを引き起こす電場の点から記述されているものの、また、当業者に一般に公知の他の形態の融合技術６０を使用することも、本発明の範囲内である。図７〜９を参照すると、これらの技術６０には、音波、圧力波、光、マイクロ波、電磁エネルギーおよび磁気誘導した電場またはそれらのエネルギー源の任意の組合せを挙げることができるが、これらに限定されない。化学剤（例えば、ポリエチレングリコール、生物接着剤および種々の界面活性剤であるが、これらに限定されない）もまた、本発明の範囲内であると考えられる。それに加えて、化学的な技術およびエネルギーベースの技術６０の任意の組合せは、本発明の範囲内である。
【００４２】
例えば、これらの音波／圧力波は、市販の音響変換器６０（図７〜９）または当該技術分野で公知の他の形式の音響発生装置を使用して、適用できる。これらの装置６０は、典型的には、電気信号発生装置（例えば、正弦電圧信号）により、駆動される。これらの発生装置は、１ヘルツ〜１０ギガヘルツの周波数範囲内の音を発する。その音響エネルギーは、この装置内および／またはそれに近接して位置している１以上のエミッタにより得る。音響エネルギーは、１×１０−５ワット／平方メートル（Ｗ／ｍ２）と５０ワット／平方メートル（Ｗ／ｍ２）の範囲内であり得、これは、典型的には、音響発生装置の出力で、定量される。この型のエネルギーは、連続的に送達できか、または拍動様式で送達できる。拍動とは、一定時間にわたってエネルギーが加えられ、次いで、中断されること、すなわち、エネルギー適用時間に続いてエネルギーを加えない時間を設けることを意味する。連続様式でエネルギーを加える全時間は、数マイクロ秒〜数分の範囲であり得る。拍動様式で音響エネルギーを加える総時間は、数マイクロ秒〜数十分の範囲であり得る。
【００４３】
他の例では、この融合チャンバ内またはそれに近接して位置している１以上の市販の光エミッタを使用して、光エネルギーが適用できる。適当な光発生装置の一例には、レーザー発生源があるが、これに限定されない。化学剤と組み合わせて使用するとき、ＵＶ感受性化学物質の結合を引き起こすために、ＵＶ源のような他の適当な光源が使用できる。光源は、市販されており、任意の望ましいスペクトル領域（これには、赤外スペクトル、紫外スペクトルおよび可視スペクトルが挙げられるが、これらに限定されない）で光を発することができる。拍動レーザーエネルギーまたは連続レーザーエネルギーは、数マイクロ秒〜数分の範囲で、一定時間にわたって、適用できる。
【００４４】
さらなる実施形態では、市販の技術（例えば、導波管があるが、これに限定されない）を使用して、マイクロ波放射が適用できる。これらの装置の１つは、そのエネルギーを融合チャンバ内の細胞へと伝達するために、そのチャンバ内および／またはそれに近接して位置できる。マイクロ波エネルギーは、数マイクロ秒〜数分間の範囲の時間にわたって、連続様式または拍動様式で適用できる。このマイクロ波エネルギーの周波数範囲は、１００メガヘルツ〜１００ギガヘルツの範囲内であり得、これらの細胞に適用されるエネルギーは、１×１０−１２ワット／平方メートルの範囲である。このエネルギーはまた、数マイクロ秒〜数分間程度の時間で、拍動様式または連続様式で加えることができる。
【００４５】
この融合プロセスを引き起こすのに化学源もまた使用できることが、本発明によりさらに提供されている。これらはまた、当業者に公知の一般に知られている化学融合剤から選択され、これらには、ポリエチレングリコール、化学接着剤、界面活性剤、および当該技術分野で一般に公知の他の自然硬化剤または硬化剤（これらは、細胞または類似物質を共に結合する）が挙げられるが、これらに限定されない。この化学融合はまた、単独でまたは任意の適切な組合せで、上記エネルギー源のいずれかと組み合わせることができる。
【００４６】
さらに、これらの細胞は、このチャンバに導入する前に、このエネルギー源または化学源に晒すことができる。融合は、移動後に起こるが、このチャンバそれ自体に挿入する前に、細胞膜の破裂により、さらに促進される。
【００４７】
このエネルギー源および／または化学融合源は、順次または同時および任意の組合せで、適用または加えることができる。それゆえ、例えば、１つのエネルギー源は、細胞膜を破裂するように使用でき、また、第二のものは、その融合プロセスを完結するのに使用できる。あるいは、化学源はまた、他の化学源と共に、またはエネルギー源と組み合わせて使用でき、そしてエネルギー源の使用と同時に、またはエネルギー源の使用前または使用後に、導入できる。従って、任意の組合せの融合源は、本発明の範囲内である。
【００４８】
上記のことに基づいて、本発明は、従来技術と区別できる。従来技術に基づけば、細胞は、（上記背景技術の項で引用した特許で述べられているように）、２つの多孔質面に堆積され、これらの面は、共に移動され、堆積に使用される基材の平面とは垂直の方向で、電場（ＤＣパルス）が適用される。本発明によれば、細胞は、１基材面に堆積され、その基材の表面と平行な方向で、パルスが適用される。これにより、本発明を使用するのが容易になるという点で、このプロセスを実施する簡単な設計が得られる。従来技術では、２表面間において、それらの上の細胞と共に、非常に正確な移動機構および間隙の測定が必要であったので、それを作製するのがずっと簡単になる。本発明は、可動部品を含まず、また、従来技術で必要であったミクロンレベルまでの臨界的な寸法を含まない。
【００４９】
さらに、本発明における融合点は、その基材と同じ平面にある隣接細胞の細胞間接触領域を利用する。従来技術では、複数の細胞層を２枚の基材間に挟む必要があった。最後に、本発明は、従来技術のアセンブリと比較して、可動部品および臨界寸法（ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）がないことから、ずっと低価格で作製できる。本発明は、使い捨てで作製できるのに対して、従来技術は、使い捨てにするには価格が非常に高い。このことは、滅菌が必要な環境（これは、単用使い捨て装置が最も適している）で本発明を実施する際に、重要である。
【００５０】
従って、簡単かつ効率的と考えられる電気融合チャンバであって、その好ましい実施形態によれば、ＡＣ発生装置を必要としないものが上で記述されている。しかしながら、もし、上記の生物学的な問題を引き起こさないように、ＡＣ発生装置が非常に短時間（例えば、数秒未満）使用されるなら、本発明のチャンバおよび他の原理を使用して、細胞間融合を達成するために、このＡＣ発生装置を使用するのが可能であると考えられている。前述の開示を考慮に入れると、本発明の原理を具体化している他の形態の電気融合チャンバが当業者に明らかとなると考えられている。
【００５１】
本発明は、例証的な様式で記述されており、使用されている専門用語は、用語の性質上、限定ではなく説明であると解釈される。
【００５２】
明らかに、上記教示に照らして、本発明の多くの改良および変更が可能である。従って、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、具体的に記述された様式以外で実施され得ることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、電気融合の基礎を成すある種の原理を概略的に詳述している。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、電気融合の基礎を成すある種の原理を概略的に詳述している。
【図１Ｃ】
図１Ｃは、電気融合の基礎を成すある種の原理を概略的に詳述している。
【図２】
図２は、誘導泳動を実行するための機械の原理を概略的に説明している。
【図３Ａ】
図３Ａは、本発明の原理に従って、互いに９０度で、電気融合を実行するための装置の概略断面図である。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、本発明の原理に従って、互いに９０度で、電気融合を実行するための装置の概略断面図である。
【図４】
図４は、４−４方向で取り出した図３の装置の上部概略図である。
【図５】
図５は、本発明によるチャンバ（これは、再使用可能なスタンドで支持されている）の概略断面図であり、さらに、いかにして電気接続が行われるかを図示している。
【図６】
図６は、本発明に従って作製したチャンバのさらなる実施態様の概略透視図である。
【図７】
図７は、本発明のチャンバの拡大三次元描写であり、これはさらに、本発明の代替実施態様を示している。
【図８】
図８は、本発明のさらなる実施態様を示す別の概略透視図である。
【図９】
図９は、本発明に従って作製したチャンバのさらなる実施態様を示す本発明の合成図である。
【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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