(57)【要約】本発明は、ビタミンＫ−依存性タンパク質の新規調製方法に関する。さらに、本発明は、新規の同時トランスフェクトされた宿主細胞、及びビタミンＫ−依存性タンパク質を調製するためのこの改良された方法に使用される組換えベクターに関する。
2004510436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドを発現し、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを発現する真核宿主細胞。
【請求項２】
第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされ、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた真核宿主細胞。
【請求項３】
前記第１ポリヌクレオチドが、第１プロペプチド及びヒトＦＶＩＩをコードする請求項１又は２記載の真核宿主細胞。
【請求項４】
第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドを発現し、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを発現する真核宿主細胞。
【請求項５】
第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされ、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた真核宿主細胞。
【請求項６】
前記第１ポリヌクレオチドが、プロトロンビン、第ＩＸ因子、ＦＶＩＩ、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、プロリンに富んでいるＧｌａタンパク質１、又はマトリックスＧｌａタンパク質から独立して選択されたビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする請求項４又は５記載の真核宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が、発現単位におけるγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする追加のポリヌクレオチドによりトランスフェクトされる請求項１〜８のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項８】
前記第１プロペプチドが、下記式：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７
［式中、Ｘ１， Ｘ４， Ｘ５， Ｘ６， Ｘ７， Ｘ９， Ｘ１０及びＸ１３は独立して、Ｇ， Ｐ， Ａ， Ｖ， Ｌ， Ｉ， Ｍ， Ｃ， Ｆ， Ｙ， Ｗ， Ｈ， Ｋ， Ｒ， Ｑ， Ｎ， Ｅ， Ｄ， Ｓ及びＴから選択され、そして
Ｘ２， Ｘ３， Ｘ１１及びＸ１２は独立して、Ｖ， Ｌ， Ｐ， Ｎ， Ａ， Ｉ， Ｓ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｑ， Ｔ及びＹから選択され、そして
Ｘ８は独立して、Ｇ及びＡから選択され、そして
Ｘ１４， Ｘ１５， Ｘ１６及びＸ１７は独立して、Ｒ， Ｈ， Ａ， Ｔ， Ｗ， Ｌ， Ｉ， Ｖ， Ｑ， Ｋ， Ｙ， Ｐ又は不在である］により表されるアミノ酸配列を含んで成る請求項１〜７のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項９】
前記第１プロペプチドが、１ｍＭ以下のＫｉ、及び配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項１〜７のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項１０】
前記第１プロペプチドが、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択されたアミノ酸配列を含んで成る請求項１〜９のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項１１】
前記第２遊離プロペプチドが、下記式：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７
［式中、Ｘ１， Ｘ４， Ｘ５， Ｘ６， Ｘ７， Ｘ９， Ｘ１０及びＸ１３は独立して、Ｇ， Ｐ， Ａ， Ｖ， Ｌ， Ｉ， Ｍ， Ｃ， Ｆ， Ｙ， Ｗ， Ｈ， Ｋ， Ｒ， Ｑ， Ｎ， Ｅ， Ｄ， Ｓ及びＴから選択され、そして
Ｘ２， Ｘ３， Ｘ１１及びＸ１２は独立して、Ｖ， Ｌ， Ｐ， Ｎ， Ａ， Ｉ， Ｓ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｑ， Ｔ及びＹから選択され、そして
Ｘ８は独立して、Ｇ及びＡから選択され、そして
Ｘ１４， Ｘ１５， Ｘ１６及びＸ１７は独立して、Ｒ， Ｈ， Ａ， Ｔ， Ｗ， Ｌ， Ｉ， Ｖ， Ｑ， Ｋ， Ｙ， Ｐ又は不在である］により表されるアミノ酸配列を含んで成る請求項１〜１０のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項１２】
前記第２遊離プロペプチドが、１ｍＭ以下のＫｉ、及び配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項１〜１０のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項１３】
前記第２遊離プロペプチドが、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択されたアミノ酸配列を含んで成る請求項１〜１２のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である請求項１〜１３のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項１５】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である請求項１４記載の真核宿主細胞。
【請求項１６】
前記哺乳類細胞が、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞から独立して選択される請求項１４記載の真核宿主細胞。
【請求項１７】
前記第１及び第２ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１〜１６のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項１８】
前記第１及び第２ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１〜１６のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
【請求項１９】
ＦＶＩＩ又はその変異体の生成方法であって、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離を含んで成る方法。
【請求項２０】
ＦＶＩＩ又はその変異体の生成方法であって、ａ）第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での適切な培養培地における請求項１〜３、７〜１８のいずれか１項記載の真核宿主細胞の培養；及びｂ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離を含んで成る方法。
【請求項２１】
ＦＶＩＩａ又はその変異体の生成方法であって、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離及び活性化を含んで成る方法。
【請求項２２】
ＦＶＩＩａ又はその変異体の生成方法であって、ａ）第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での適切な培養培地における請求項１〜３、７〜１８のいずれか１項記載の真核宿主細胞の培養；及びｂ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離及び活性化を含んで成る方法。
【請求項２３】
前記第１ポリヌクレオチドが、第１プロペプチド及びヒトＦＶＩＩをコードする請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
ビタミンＫ−依存性タンパク質の生成方法であって、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのビタミンＫ−依存性タンパク質の単離を含んで成る方法。
【請求項２５】
ビタミンＫ−依存性タンパク質の生成方法であって、ａ）第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での適切な培養培地における請求項４〜１８のいずれか１項記載の真核宿主細胞の培養；及びｂ）前記培地からのビタミンＫ−依存性タンパク質の単離を含んで成る方法。
【請求項２６】
前記第１ポリヌクレオチドが、第１プロペプチド、及びプロトロンビン、第ＩＸ因子、ＦＶＩＩ、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、プロリンに富んでいるＧｌａタンパク質１、又はマトリックスＧｌａタンパク質から独立して選択されたビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする請求項２４又は２５記載の方法。
【請求項２７】
前記第１発現単位が第１ベクター上に存在し、そして前記第２発現単位が第２の別のベクター上に存在する請求項１９〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
前記第１発現単位及び第２発現単位が、同じベクター上に存在する請求項１９〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記第１プロペプチドが、下記式：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７
［式中、Ｘ１， Ｘ４， Ｘ５， Ｘ６， Ｘ７， Ｘ９， Ｘ１０及びＸ１３は独立して、Ｇ， Ｐ， Ａ， Ｖ， Ｌ， Ｉ， Ｍ， Ｃ， Ｆ， Ｙ， Ｗ， Ｈ， Ｋ， Ｒ， Ｑ， Ｎ， Ｅ， Ｄ， Ｓ及びＴから選択され、そして
Ｘ２， Ｘ３， Ｘ１１及びＸ１２は独立して、Ｖ， Ｌ， Ｐ， Ｎ， Ａ， Ｉ， Ｓ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｑ， Ｔ及びＹから選択され、そして
Ｘ８は独立して、Ｇ及びＡから選択され、そして
Ｘ１４， Ｘ１５， Ｘ１６及びＸ１７は独立して、Ｒ， Ｈ， Ａ， Ｔ， Ｗ， Ｌ， Ｉ， Ｖ， Ｑ， Ｋ， Ｙ， Ｐ又は不在である］により表されるアミノ酸配列を含んで成る請求項１９〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
前記第１プロペプチドが、１ｍＭ以下のＫｉ、及び配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項１９〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
前記第１プロペプチドが、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択されたアミノ酸配列を含んで成る請求項１９〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
前記第２遊離プロペプチドが、下記式：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７
［式中、Ｘ１， Ｘ４， Ｘ５， Ｘ６， Ｘ７， Ｘ９， Ｘ１０及びＸ１３は独立して、Ｇ， Ｐ， Ａ， Ｖ， Ｌ， Ｉ， Ｍ， Ｃ， Ｆ， Ｙ， Ｗ， Ｈ， Ｋ， Ｒ， Ｑ， Ｎ， Ｅ， Ｄ， Ｓ及びＴから選択され、そして
Ｘ２， Ｘ３， Ｘ１１及びＸ１２は独立して、Ｖ， Ｌ， Ｐ， Ｎ， Ａ， Ｉ， Ｓ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｑ， Ｔ及びＹから選択され、そして
Ｘ８は独立して、Ｇ及びＡから選択され、そして
Ｘ１４， Ｘ１５， Ｘ１６及びＸ１７は独立して、Ｒ， Ｈ， Ａ， Ｔ， Ｗ， Ｌ， Ｉ， Ｖ， Ｑ， Ｋ， Ｙ， Ｐ又は不在である］により表されるアミノ酸配列を含んで成る請求項１９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記第２遊離プロペプチドが、１ｍＭ以下のＫｉ、及び配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項１９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記第２遊離プロペプチドが、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択されたアミノ酸配列を含んで成る請求項１９〜３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
前記培養培地が血清フリー培地である請求項１９〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である請求項１９〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳類細胞が、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞から独立して選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記第１及び第２ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１９〜３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
前記第１及び第２ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１９〜３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
発現単位における遊離プロペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター。
【請求項４２】
第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチド、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター。
【請求項４３】
前記第１ポリヌクレオチドが、プロペプチド及びヒトＦＶＩＩをコード請求項４２記載の組換えベクター。
【請求項４４】
第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチド、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター。
【請求項４５】
前記第１ポリヌクレオチドが、第１プロペプチド、及びプロトロンビン、第ＩＸ因子、ＦＶＩＩ、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、プロリンに富んでいるＧｌａタンパク質１、又はマトリックスＧｌａタンパク質から独立して選択されたビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする請求項４４記載の組換えベクター。
【請求項４６】
前記第１プロペプチドが、下記式：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７
［式中、Ｘ１， Ｘ４， Ｘ５， Ｘ６， Ｘ７， Ｘ９， Ｘ１０及びＸ１３は独立して、Ｇ， Ｐ， Ａ， Ｖ， Ｌ， Ｉ， Ｍ， Ｃ， Ｆ， Ｙ， Ｗ， Ｈ， Ｋ， Ｒ， Ｑ， Ｎ， Ｅ， Ｄ， Ｓ及びＴから選択され、そして
Ｘ２， Ｘ３， Ｘ１１及びＸ１２は独立して、Ｖ， Ｌ， Ｐ， Ｎ， Ａ， Ｉ， Ｓ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｑ， Ｔ及びＹから選択され、そして
Ｘ８は独立して、Ｇ及びＡから選択され、そして
Ｘ１４， Ｘ１５， Ｘ１６及びＸ１７は独立して、Ｒ， Ｈ， Ａ， Ｔ， Ｗ， Ｌ， Ｉ， Ｖ， Ｑ， Ｋ， Ｙ， Ｐ又は不在である］により表されるアミノ酸配列を含んで成る請求項４１〜４５のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項４７】
前記第１プロペプチドが、１ｍＭ以下のＫｉ、及び配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項４１〜４５のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項４８】
前記第１プロペプチドが、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択されたアミノ酸配列を含んで成る請求項４１〜４７のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項４９】
前記第２遊離プロペプチドが、下記式：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７
［式中、Ｘ１， Ｘ４， Ｘ５， Ｘ６， Ｘ７， Ｘ９， Ｘ１０及びＸ１３は独立して、Ｇ， Ｐ， Ａ， Ｖ， Ｌ， Ｉ， Ｍ， Ｃ， Ｆ， Ｙ， Ｗ， Ｈ， Ｋ， Ｒ， Ｑ， Ｎ， Ｅ， Ｄ， Ｓ及びＴから選択され、そして
Ｘ２， Ｘ３， Ｘ１１及びＸ１２は独立して、Ｖ， Ｌ， Ｐ， Ｎ， Ａ， Ｉ， Ｓ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｑ， Ｔ及びＹから選択され、そして
Ｘ８は独立して、Ｇ及びＡから選択され、そして
Ｘ１４， Ｘ１５， Ｘ１６及びＸ１７は独立して、Ｒ， Ｈ， Ａ， Ｔ， Ｗ， Ｌ， Ｉ， Ｖ， Ｑ， Ｋ， Ｙ， Ｐ又は不在である］により表されるアミノ酸配列を含んで成る請求項４１〜４８のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項５０】
前記第２遊離プロペプチドが、１ｍＭ以下のＫｉ、及び配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項４１〜４８のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項５１】
前記第２遊離プロペプチドが、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択されたアミノ酸配列を含んで成る請求項４１〜５０のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項５２】
前記第１及び第２ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項４１〜５１のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項５３】
前記第１及び第２ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項４１〜５１のいずれか１項記載の組換えベクター。
【請求項５４】
ＦＶＩＩ又はその類似体の生成方法であって、ａ）第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及びｂ）第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクションを含んで成る方法。
【請求項５５】
前記宿主細胞がさらに、γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドよりトランスフェクトされる請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリヌクレオチドが、請求項４〜４３、４６〜５３のいずれか１項記載のベクターである請求項５４又は５５記載の方法。
【請求項５７】
ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離を含んで成る方法により得られる組換えＦＶＩＩ又はその変異体。
【請求項５８】
ａ）第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での適切な培養培地における請求項１〜３、７〜１８のいずれか１項記載の真核宿主細胞の培養；及びｂ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離を含んで成る方法により得られる組換えＦＶＩＩ又はその変異体。
【請求項５９】
ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離及び活性化を含んで成る方法により得られる組換えＦＶＩＩａ又はその変異体。
【請求項６０】
ａ）第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での適切な培養培地における請求項１〜３、７〜１８のいずれか１項記載の真核宿主細胞の培養；及びｂ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離及び活性化を含んで成る方法により得られる組換えＦＶＩＩａ又はその変異体。
【請求項６１】
前記ポリヌクレオチドが、第１プロペプチド及びヒトＦＶＩＩをコードする請求項５７〜６０のいずれか１項記載の組換えＦＶＩＩ又はその変異体。
【請求項６２】
ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのビタミンＫ−依存性タンパク質の単離を含んで成る方法により得られる組換えビタミンＫ−依存性タンパク質。
【請求項６３】
ａ）第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での適切な培養培地における請求項４〜１８のいずれか１項記載の真核宿主細胞の培養；及びｂ）前記培地からのビタミンＫ−依存性タンパク質の単離を含んで成る方法により得られる組換えビタミンＫ−依存性タンパク質。
【請求項６４】
前記第１ポリヌクレオチドが、第１プロペプチド、及びプロトロンビン、第ＩＸ因子、ＦＶＩＩ、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、プロリンに富んでいるＧｌａタンパク質１、又はマトリックスＧｌａタンパク質から独立して選択されたビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする請求項６２又は６３記載の組換えビタミンＫ−依存性タンパク質。
【請求項６５】
前記方法が請求項１９〜２１、２３、２７〜４０のいずれか１項記載の方法に従う請求項５７〜５８、６１のいずれか１項記載の組換えＦＶＩＩ又はその変異体。
【請求項６６】
前記方法が請求項２４〜４０のいずれか１項記載の方法に従う請求項６２〜６４のいずれか１項記載の組換えビタミンＫ−依存性タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ビタミンＫ−依存性タンパク質及び特に凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の新規調製方法に関する。さらに、本発明は、ビタミンＫ−依存性タンパク質のこの改良された方法に使用される、新規の同時トランスフェクトされた真核細胞及び組換えベクターに関する。
【０００２】
発明の背景：
ビタミンＫ−依存性タンパク質の生合成は、成熟の機能的タンパク質が得られる前、いくつかの後翻訳プロセッシング段階を包含する。
ビタミンＫは、それらのビタミンＫ−依存性タンパク質、例えば前凝固因子トロンビン、第ＶＩＩ、ＩＸ及びＸ因子；抗凝固剤プロテインＣ及びプロテインＳ；及び他のタンパク質、例えばオステオカルシン（骨Ｇｌａタンパク質）、マトリックスＧｌａタンパク質及びプロリンに富んでいるＧｌａタンパク質１におけるグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化のための必要な補因子である。このカルボキシル化は、それがリン脂肪へのカルシウム結合及び前凝固剤及び抗凝固剤の結合を可能にするので、正常な止血のために必要とされる。
【０００３】
γ−グルタミルカルボキシラーゼは、粗面小胞体に位置する膜内在性ミクロソーム酵素である。それは、ビタミンＫ−依存性タンパク質のＧｌａドメインに位置するグルタミン酸基をカルボキシル化する。ヒトγ−グルタミルカルボキシラーゼｃＤＮＡが最近、単離され、そして配列決定されている（Ｗｕ Ｓ．Ｍ． など． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４： １６３４， １９９１）。ＢＨＫ及びＣＨＯ細胞におけるビタミンＫ−依存性タンパク質の生合成の研究は、カルボキシラーゼが小胞体（ＥＲ）及びゴルジ体の両者に存在し、そしてカルボキシラーゼ認識部位を含むプロペプチドが、γ−カルボキシル化の完結の後、切断されることを示す。
【０００４】
プロペプチドがカルボキシラーゼ活性を刺激することができことが推測される（Ｓｉｇｌｕｒａ， Ｉ． など． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９， ９０６９−９０７４； Ｋｎｏｂｌｏｃｈ ａｎｄ Ｓｕｔｔｌｅ （１９８７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， １９３３４−１５３３７； Ｆｕｉｅ など． （１９９９） Ｂｌｏｏｄ， ９３． １７９４−１８０８）。
【０００５】
血液凝固は、最終的にフィブリン凝塊を生ぜしめる、種々の血液成分又は因子の複雑な相互作用から成る工程である。一般的に、凝固“カスケード”として言及されて来た工程に関係する血液成分は、プロ酵素又はチモーゲン、すなわちそれ自体、活性化された凝固因子である活性化因子の作用によりタンパク質加水分解酵素に転換される酵素的に不活性のタンパク質である。そのような転換を受け、そして一般的に、“活性因子”として言及される凝固因子は、“ａ”接尾語の付加により例示される（例えば、活性化された第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）。
【０００６】
活性化された第Ｘ因子（ＦＸａ）は、プロトロンビンをトロンビンに転換するために必要とされ、次にこれは、フィブリン凝塊を形成する最終段階としてフィブリノーゲンをフィブリンに転換する。ＦＸの活性化を促進する２種のシステム又は経路が存在する。“固有の経路”とは、血漿にのみ存在する因子の利用を通してトロンビン形成を導くそれらの反応を言及する。一連のプロテアーゼ介在性活性化は究極的には、第ＶＩＩＩａ因子と共に、ＦＸをＦＸａに分解する第Ｉｘａ因子を生成する。
【０００７】
類似するタンパク質加水分解は、血漿凝固の“外因性経路”において、ＦＶＩＩａ及びその補因子、すなわち組織因子によりもたらされる。組織因子は、膜結合されたタンパク質であり、そして通常、血漿においては循環しない。しかしながら、血管の破壊に基づいて、それは、Ｃａ２＋及びリン脂質の存在下で、ＦＸ活性化又は第ＩＸ因子活性化を触媒するために、ＦＶＩＩａと複合体化することができる。止血における２種の凝固経路の相対的重要性は不明であるが、最近、ＦＶＩＩ及び組織因子が、血液凝固の調節において中枢的役割を演じることが見出された。
【０００８】
ＦＶＩＩは、一本鎖チモーゲンとして血液において循環する微量血漿糖タンパク質である。チモーゲンはクロット不活性である。一本鎖ＦＶＩＩは、インビトロで、ＦＸａ， 第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子又はトロンビンにより二本鎖ＦＶＩＩａに転換される。ＦＸａは、ＦＶＩＩの主要生理学的活性化因子であると思われる。止血に包含されるいくつかの他の血漿タンパク質のように、ＦＶＩＩは、タンパク質のアミノ末端における１０個のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化のために必要とされる、その生合成のためのビタミンＫに依存する。ＦＶＩＩの細胞内後−翻訳プロセッシングは、小胞体（ＥＲ）及びゴルジ体において起こる。ビタミンＫ−依存性γ−カルボキシル化の他に、ＦＶＩＩは、Ｎ−末端プロペプチドを除くために制限されたタンパク質加水分解、及びアスパラギン−１４５及び−３２２、及びセリン−５２及び−６０のグリコシル化にゆだねられる（図１）。
【０００９】
γ−カルボキシル化されたグルタミン酸（Ｇｌａ）残基は、リン脂肪とのＦＶＩＩの金属−結合された相互作用のために必要とされる。
組織因子、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下で、二本鎖ＦＶＩＩａは、制限されたタンパク質加水分解により急速にＦＸ又は第ＩＸ因子を活性化する。
プロテインＣは、セリンプロテアーゼ、及び凝固カスケードにおいて第Ｖａ因子及びＶＩＩａを不活性化することにより止血の調節において役割を演じる天然に存在する抗凝固剤である。ヒトプロテインＣは、４６１個のタンパク質の一本鎖ポリペプチドとして主に肝臓においてインビボで製造される。この一本鎖前駆体分子は、９個のグルタミン酸残基のカルボキシル化を包含する複数の後−翻訳修飾を受ける。
【００１０】
プロテインＳまた、インビトロクロットアッセイにおいて抗凝固活性を示す。プロテインＳは、活性化されたプロテインＣについての抗凝固相補因子活性を示す。プロテインＳはまた、それが活性化されるプロテインＣを有さないアッセイにおいてプロトロンピナーゼ活性を示すことができ、そして第Ｖａ因子又はＸａ因子に結合し、そして活性化されたプロテインＣを伴なわないで抗凝固剤として機能するので、活性化されたプロテインＣの不在下で抗凝固体であることが示されている。プロテインＳは、その遺伝性又は獲得された欠損が静脈及び動脈血栓症に関連するので、生理学的に非常に重要な抗血栓因子である。正常レベルの合計プロテインＳに関する遊離プロテインＳの欠失が、血栓疾病を有する何人かの患者において記載されている。
【００１１】
患者における凝固カスケードを選択的に阻止することがしばしば必要である。抗凝固剤、例えばプロテインＣ又はプロテインＳは、例えば、腎臓透析の間、又は深静脈血栓、散在性血管内凝固（ＤＩＣ）、急性血栓症のために危険な患者、プロテインＳ欠失、敗血症、炎症、癌、手術を受ける患者及び他の医学的障害の宿主を処理するために使用され得る。
【００１２】
オステオカルシンは、３個のＧｌａ残基を包含する、４９個のアミノ酸残基から構成される。このタンパク質の機能は、過剰のミネラリゼーションを抑制すると思われる。オステオカルシンは、骨芽細胞により分泌される骨−特異的タンパク質である。新しく合成されるオステオカルシンの画分は、血流に開放され、ここでその濃度は骨芽細胞活性率及び骨形成速度と相互関係する。ヒトにおいては、循環するオステオカルシンレベルの変化は、代謝性骨疾患、例えばオステオポローシス及び上皮小体亢進症に関連している。
【００１３】
マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）は、５個のＧｌａ残基を包含する、７９個のアミノ酸から構成される。このタンパク質は通常、鉱物質除去されたマトリックスにおいて見出され、そして骨形成の開始において一定の機能を有すると思われる。
組換えビタミンＫ−依存性タンパク質及び特定の組換え凝固因子の生成のための改良されたシステムの必要性がまだ当業界において存在する。本発明は、組換えビタミンＫ−依存性タンパク質、特にＦＶＩＩのより効果的でより早い生成及び／又はその高い収率を付与する方法を提供することによって、この必要性を満たす。
【００１４】
発明の記載：
本発明は、ビタミンＫ−依存性タンパク質及び特に凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）の新規調製方法に関する。
ビタミンＫ−依存性タンパク質のグルタミン酸残基のＮ−末端プロセッシング段階及び特にγ−カルボキシル化は、本発明者によりＦＶＩＩに関して例示されるように、それらのタンパク質の生合成における制限段階であることが示されている。γ−カルボキシル化を高めるための方法は、組換えビタミンＫ−依存性タンパク質の発現を高めることが示されている。
【００１５】
ビタミンＫ−依存性タンパク質のプロペプチドは、カルボキシレートに結合するために必須であり、そしてそれは、後に成熟タンパク質のＮ−末端になるであろう、カルボキシル化されるＧｌｕ残基のために、ビタミンＫ−依存性タンパク質に共有結合されるべきである。本発明者は、遊離プロペプチドが、その遊離プロペプチドの濃度が高まる場合、γ−カルボキシル化工程の活性をまた高めるような態様で、アロステリズム調節分子として機能することを仮定する。
【００１６】
遊離プロペプチドの濃度の直接的な上昇は、遊離プロペプチド自体の同時発現により得られる。これは、突然変異誘発及び切断を伴なって又はそれらを伴なわないで、１又は複数のコピーで、遊離プロペプチドをコードするポリヌクレオチドによるトランスフェクションにより行われ得、そしてビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドと共にこれを同時発現することができる。後者は、ビタミンＫ−依存性タンパク質により通常結合される配列以外のもう１つのプロペプチド配列を含む。
【００１７】
ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現は、興味ある遺伝子を細胞中にトランスフェクトすることにより、又は細胞において通常、発現されないか、又は得られるような細胞において、生理学的に有意なレベルで発現されない、脊椎動物起源の一次、二次、又は不滅化された細胞にすでに存在するビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする内因性遺伝子を活性化することにより得られる。
【００１８】
興味ある遺伝子の活性化に関しては、相同組換えが、その対応するトランスフェクトされていない細胞において明らかなレベルよりも高いレベルでの遺伝子の発現を引き起こすか、又はその対応するトランスフェクトされていない細胞において明らかなパターンとは異なる調節又は誘発のパターンの表示を引き起こす調節配列による得られるような細胞における遺伝子と通常関連する調節領域を置換するか又はその領域を無能にするために使用され得る。
【００１９】
第１の観点においては、本発明は、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドを発現し、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを発現する真核宿主細胞に関する。前記第１ポリヌクレオチドは第１発現単位に位置し、そして第２ポリヌクレオチドは第２発現単位に位置し、ここで前記第１及び第２単位は異なることが理解されるべきである。
【００２０】
第２の観点においては、本発明は、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされ、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた真核宿主細胞に関する。前記第１ポリヌクレオチドは第１発現単位に位置し、そして第２ポリヌクレオチドが第２発現単位に位置し、ここで前記第１及び第２発現単位は異なることが理解されるべきである。トランスフェクションの実際の順序はもちろん、通常通りであり、そして従って、宿主細胞は、第１、次に第２ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされ得るか又は逆もまた真である。用語“第１プロペプチド”及び“第２プロペプチド”の使用は、単なる便利さからであり、従って第１及び第２プロペプチドは同じであっても又は異なっても良い。
【００２１】
用語“真核宿主細胞”とは、本明細書において使用される場合、異種ＤＮＡが発現され得るハイブリッド細胞を包含するいずれかの細胞を表す。典型的な宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、例えばヒト細胞、例えばＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨＥＫ及びＣＯＳ細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。本発明の実施においては、培養される宿主細胞は好ましくは、哺乳類細胞、より好ましくは確立された哺乳類細胞系、例えばＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＣＯＳ−１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、子供ハムスター腎臓（ＢＨＫ）及びＨＥＫ２９３（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５０３； Ｇｒａｈａｍなど．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６： ５９−７２， １９７７）細胞系であるが、但しそれらだけには限定されない。
【００２２】
好ましいＢＨＫ細胞系は、ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞系（Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ， ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： １１０６−１１１０， １９８２）であり、この後、ＢＨＫ５７０細胞として言及される。ＢＨＫ５７０細胞系は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０３１４号として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ ２０８５２から入手できる。ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞系はまた、受託番号ＣＲＬ１６３２としてＡＴＣＣから入手できる。
【００２３】
他の適切な細胞系は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：Ｒａｔ ＨｅｐＩ（ラット肝癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ ＨｅｐＩＩ（ラット肺癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）及びＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｉａｕｂ ａｎｄ Ｃｈｕｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ７７： ４２１６−４２２０， １９８０）。３Ｔ３細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、メラノーマ、及び他の細胞とのメラノーマの融合体がまた有用である。
【００２４】
用語“ポリヌクレオチド”とは、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドの長さは、ヌクレオチド（略語“ｎｔ”）、又は塩基対（略語“ｂｐ”）として表される。
【００２５】
用語“ヌクレオチド”は、一本鎖又は二本鎖分子について使用される。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのような不対末端は一般的に２０ｎｔの長さを越えない。
【００２６】
用語“プロペプチド”とは、本明細書において使用される場合、γ−グルタミルカルボキシラーゼを結合できるいずれかのアミノ酸配列を表す。ビタミンＫ−依存性タンパク質のγ−カルボキシル化を指図する典型的なプロペプチドは、ビタミンＫ−依存性タンパク質のＮ−末端で見出され、そしてビタミンＫ−依存性タンパク質のＧｌａドメインに通常位置するグルタミン酸残基をカルボキシル化する、γ−グルタミルカルボキシラーゼとの相互作用のための結合部位又は認識配列として作用する。
【００２７】
１つのプロペプチドにおいて、γ−グルタミンカルボキシラーゼのための１つよりも多くの部位、すなわちγ−グルタミルカルボキシラーゼ認識配列が存在する。従って、この定義内のプロペプチドの１つの例は、ＦＶＩＩの天然のプロペプチド配列である。この定義内のもう１つの例は、同じアミノ酸配列内の第ＩＸ因子の天然のプロペプチド配列に結合されるＦＶＩＩの天然のプロペプチド配列である。
【００２８】
用語“遊離プロペプチド”とは、本明細書において使用される場合、γ−カルボキシル化されるべきビタミンＫ−依存性タンパク質に結合されていないプロペプチドを意味する。従って、遊離プロペプチドの例は、ＦＶＩＩのアミノ酸配列に結合されていないＦＶＩＩのプロペプチドである。
【００２９】
用語“第ＶＩＩ因子”又は“ＦＩＩ”とは、本明細書において使用される場合、活性化されていない形から成る生成物（第ＶＩＩ因子）を意味する。用語“第ＶＩＩａ因子”又は“ＦＶＩＩａ”とは、本明細書において使用される場合、活性化された形から成る生成物（第ＶＩＩａ因子）を意味する。これは、天然のヒト第ＶＩＩ又は第ＶＩＩａ因子のアミノ酸配列１〜４０６を有するタンパク質を包含する。それはまた、わずかに修飾されたアミノ酸配列、例えばそれらのタンパク質がＦＶＩＩａの活性を実質的に保持する限り、Ｎ−末端アミノ酸欠失又は付加を包含する修飾されたＮ−末端を有するタンパク質を包含する。上記定義内の“ＦＶＩＩ”又は“ＦＶＩＩａ”はまた、１つの個体からもう１つの個体で存在し、そして生じることができる天然の対立遺伝子変異を包含する。また、グルコシル化又は他の後翻訳修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞環境の性質に依存して変化できる。
【００３０】
用語“変異体”とは、本明細書において使用される場合、ＦＶＩＩの企画を意図し、ここで親タンパク質の１又は複数のアミノ酸残基がもう１つのアミノ酸残基により置換されており、そして／又は親タンパク質の１又は複数のアミノ酸残基が欠失されており、そして／又は１又は複数のアミノ酸残が親タンパク質に付加されている。そのような付加は、親タンパク質のＮ−末端又はＣ−末端、又は両者で起こることができる。
【００３１】
用語“発現単位”とは、本明細書において使用される場合、次の操作可能的に連結された要素を含んで成るポリヌクレオチドを意味する：（ａ）転写プロモーター；（ｂ）アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列；及び（ｃ）転写ターミネーター。従って、発現単位の例は、次の連結された要素を含んで成るＤＮＡベクターである：（ａ）転写プロモーター；（ｂ）遊離プロペプチドをコードするｃＤＮＡ配列；及び（ｃ）転写ターミネーター。
【００３２】
用語“ベクター”とは、本明細書において使用される場合、宿主細胞において増幅できるいずれかの核酸実在物を意味する。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体外実在物として存在し、その複製が染色体複製とは関係ないベクター、例えばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターである。ベクターの選択はしばしば、それが導入されるべき宿主細胞に依存するであろう。ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィルス又はコスミドベクターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。ベクターは通常、複製の起点、及び少なくとも１つの選択遺伝子、すなわち容易に検出できるか、又はその存在が細胞増殖のために必須である生成物をコードする遺伝子を含む。
【００３３】
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合、及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうでない。
第３の観点においては、本発明は、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドを発現し、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを発現する真核宿主細胞に関する。
【００３４】
さらなる観点においては、本発明は、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされ、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた真核宿主細胞を提供する。
【００３５】
用語“ビタミンＫ−依存性タンパク質”とは、本明細書において使用される場合、グルタミン酸残基上でγ−カルボキシル化されるいずれかのタンパク質を意味する。典型的なビタミンＫ−依存性タンパク質は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：プロ凝固因子トロンビン、第ＶＩＩ、ＩＸ及びＸ因子；抗凝固剤プロテインＣ及びプロテインＳ；及び他のタンパク質、例えばオステオカルシン（骨Ｇｌａタンパク質）、マトリックスＧｌａタンパク質、及びプロリンに富んでいるＧｌａタンパク質１。
【００３６】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドの真核宿主細胞における発現、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドの真核宿主細胞における発現；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養を含んで成る、ＦＶＩＩ又はその変異体の生成方法に関する。
【００３７】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドの真核宿主細胞における発現、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドの真核宿主細胞における発現；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離を含んで成る、ＦＶＩＩ又はその変異体の生成方法に関する。
【００３８】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養を含んで成る、ＦＶＩＩ又はその変異体の生成方法に関する。
【００３９】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離を含んで成る、ＦＶＩＩ又はその変異体の生成方法に関する。
【００４０】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離及び活性化を含んで成る、ＦＶＩＩａ又はその変異体の生成方法に関する。
【００４１】
さらなる観点においては、本発明は、発現単位における遊離プロペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターに関する。第２ポリヌクレオチド、第２遊離プロペプチド、及び第２発現単位に関しての下記態様は、ポリヌクレオチド、遊離プロペプチド、及び組換えベクター内に包含される発現単位の態様を、個々に又は組合して表す。
【００４２】
さらなる観点においては、本発明は、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチド、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターに関する。
さらなる観点においては、本発明は、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチド、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターに関する。
【００４３】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）第１発現単位におけるＦＶＩＩのアミノア酸配列−１８〜４０６及びそのプロペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドを、真核宿主細胞において活性化する遺伝子、及びｂ）第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクションを含んで成る、ＦＶＩＩを生成する真核宿主細胞の調製方法に関する。この観点においては、アミノ酸配列−１８〜−１は、配列番号７として同定されるＦＶＩＩのプロペプチドと同一である。
【００４４】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及びｂ）第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクションを含んで成る、ＦＶＩＩ又はその類似体の生成方法に関する。
【００４５】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドの真核宿主細胞における発現、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養を含んで成る、ビタミンＫ−依存性タンパク質の生成方法に関する。
【００４６】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドの真核宿主細胞における発現、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのビタミンＫ−依存性タンパク質の単離を含んで成る、ビタミンＫ−依存性タンパク質の生成方法に関する。
【００４７】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養を含んで成る、ビタミンＫ−依存性タンパク質の生成方法に関する。
【００４８】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのビタミンＫ−依存性タンパク質の単離を含んで成る、ビタミンＫ−依存性タンパク質の生成方法に関する。
【００４９】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養を含んで成る方法により得られる組換えＦＶＩＩ又はその変異体に関する。
【００５０】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離を含んで成る方法により得られる組換えＦＶＩＩ又はその変異体に関する。
【００５１】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩ又はその変異体をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのＦＶＩＩ又はその変異体の単離及び活性化を含んで成る方法により得られる組換えＦＶＩＩａ又はその変異体に関する。
【００５２】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養を含んで成る方法により得られる組換えビタミンＫ−依存性タンパク質に関する。
【００５３】
さらなる観点においては、本発明は、ａ）同時トランスフェクトされた真核宿主細胞を生成するために、第１発現単位における第１プロペプチド及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション、及び第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによる真核宿主細胞のトランスフェクション；ｂ）前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下での前記同時トランスフェクトされた真核宿主細胞の適切な培養培地における培養；及びｃ）前記培地からのビタミンＫ−依存性タンパク質の単離を含んで成る方法により得られる組換えビタミンＫ−依存性タンパク質に関する。
【００５４】
前記第１プロペプチドは、ビタミンＫ−依存性タンパク質に通常関連するプロペプチドであり得るか、又はそれは、いずれか他のプロペプチド、例えば異なったビタミンＫ−依存性タンパク質に通常関連するプロペプチドであり得る。
１つの観点においては、前記第１プロペプチドは、γ−グルタミルカルボキシラーゼのための１つの結合配列を含んで成る。もう１つの態様においては、前記第１プロペプチドは、γ−グルタミルカルボキシラーゼのための複数の結合配列を含んで成る。従って、前記第１プロペプチドの例は、ＦＶＩＩと通常関連するプロペプチド、及び同じ発現単位において共有結合されるプロトロンビンである。
【００５５】
さらなる態様においては、第２遊離プロペプチドは、γ−グルタミンカルボキシラーゼのための１つの結合配列を含んでなる。さらなる態様においては、第２遊離プロペプチドは、γ−グルタミルカルボキシラーゼのための複数の結合配列を含んで成る。従って、第２遊離プロペプチドの例は、ＦＶＩＩに通常関連するプロペプチド、及び同じ発現単位において共有結合されるプロトロンビンである。
本発明のさらなる態様においては、真核宿主細胞は、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩをコードする第１ポリヌクレオチドを発現し、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドを発現する。特定の態様においては、ＦＶＩＩはヒトＦＶＩＩである。
【００５６】
本発明のさらなる態様においては、真核宿主細胞は、第１発現単位における第１プロペプチド及びＦＶＩＩをコードする第１ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされ、そして第２発現単位における第２遊離プロペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドによりトランスフェクトされる。特定の態様においては、ＦＶＩＩはヒトＦＶＩＩである。
【００５７】
本発明のさらなる態様においては、ビタミンＫ−依存性タンパク質は、プロトロンビン、第ＩＸ因子、ＦＶＩＩ、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、プロリンに富んでいるＧｌａタンパク質１、又はマトリックスＧｌａタンパク質から独立して選択される。それらのタンパク質のいずれか１つが、本発明の他の態様を構成することが理解されるべきである。
【００５８】
本発明のさらなる態様においては、真核宿主細胞はさらに、発現単位におけるγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドによりトランスフェクトされる。この発現単位は、第１又は第２発現単位とは異なる発現であり得、又はγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは第１又は第２発現単位に位置することができる。γ−グルタミルカルボキシラーゼの例は、組換えヒト、ラット、ショウジョウバエ、ハツカネズミ筋又はハムスターγ−グルタミルカルボキシラーゼから選択される。
【００５９】
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、下記式：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７
［式中、Ｘ１， Ｘ４， Ｘ５， Ｘ６， Ｘ７， Ｘ９， Ｘ１０及びＸ１３は独立して、Ｇ， Ｐ， Ａ， Ｖ， Ｌ， Ｉ， Ｍ， Ｃ， Ｆ， Ｙ， Ｗ， Ｈ， Ｋ， Ｒ， Ｑ， Ｎ， Ｅ， Ｄ， Ｓ及びＴから選択され、そして
Ｘ２， Ｘ３， Ｘ１１及びＸ１２は独立して、Ｖ， Ｌ， Ｐ， Ｎ， Ａ， Ｉ， Ｓ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｑ， Ｔ及びＹから選択され、そして
Ｘ８は独立して、Ｇ及びＡから選択され、そして
Ｘ１４， Ｘ１５， Ｘ１６及びＸ１７は独立して、Ｒ， Ｈ， Ａ， Ｔ， Ｗ， Ｌ， Ｉ， Ｖ， Ｑ， Ｋ， Ｙ， Ｐ又は不在である］により表されるアミノ酸配列を含んで成る。
【００６０】
第１プロペプチドの１つの態様においては、Ｘ１はＡ， Ｓ， Ｎ， Ｒ， Ｔ及びＨから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ２はＶ， Ｌ， Ｐ， Ｎ及びＡから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ３はＬ， Ｉ， Ｖ及びＳから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ４はＳ， Ｒ， Ｎ， Ｔ， Ｄ及びＡから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ５はＲ， Ｑ， Ｋ， Ｇ， Ｈ， Ｓ及びＰから選択される。
【００６１】
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ６はＥ， Ｒ及びＱから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ７はＱ， Ｎ， Ｅ， Ｋ及びＲから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ８はＡ及びＧから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ９はＮ， Ｈ， Ｓ及びＲから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１０はＱ， Ｎ， Ｔ， Ｇ， Ｓ， Ｋ及びＥから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１１はＶ， Ｉ， Ｆ及びＬから選択される。
【００６２】
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１２はＬ， Ｉ及びＶから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１３はＱ， Ａ， Ｓ， Ｈ， Ｖ， Ｋ， Ｎ及びＲから選択される。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１４はＲ， Ｈ， Ｋ， Ｉ及びＰから選択されるか、又は不在である。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１５はＲ， Ｈ， Ｋ， Ｑ， Ｖ， Ｙ， Ｐ， Ａ， Ｔ， Ｗ及びＬから選択されるか、又は不在である。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１６はＲ， Ｈ， Ｔ， Ｑ， Ｋ， Ｙ及びＰから選択されか、又は不在である。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１７はＲ， Ｈ及びＫから選択されるか、又は不在である。
第１プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１７はＲである。
【００６３】
本明細書においては、アミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ （ＣＢＮ） により許可される、表１に示されるような略語を用いて表される。アミノ酸、及び異性体を有する同様のものに関しては、次の略語により表されるそれらは、天然のＬ−形で存在する。さらに、ペプチドのアミノ酸配列の左及び右端は、特にことわらない限り、それぞれＮ−及びＣ−末端である。
【００６４】
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、１ｍＭ以下の阻害定数（Ｋｉ）を有するアミノ酸配列を含んで成る。さらなる態様においては、アミノ酸配列は０．５ｍＭ以下のＫｉを有する。さらなる態様においては、アミノ酸配列は、０．１ｎＭ〜０．５ｍＭのＫｉを有する。
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
【００６５】
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
【００６６】
本発明のさらなる態様においては、前記第１プロペプチドが、１ｍＭ以下のＫｉ、及び配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
本発明のさらなる態様においては、前記第１プロペプチドが、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された特定のアミノ酸配列を含んで成る。
【００６７】
本発明のさらなる態様においては、第２遊離プロペプチドは、下記式：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７
［式中、Ｘ１， Ｘ４， Ｘ５， Ｘ６， Ｘ７， Ｘ９， Ｘ１０及びＸ１３は独立して、Ｇ， Ｐ， Ａ， Ｖ， Ｌ， Ｉ， Ｍ， Ｃ， Ｆ， Ｙ， Ｗ， Ｈ， Ｋ， Ｒ， Ｑ， Ｎ， Ｅ， Ｄ， Ｓ及びＴから選択され、そして
Ｘ２， Ｘ３， Ｘ１１及びＸ１２は独立して、Ｖ， Ｌ， Ｐ， Ｎ， Ａ， Ｉ， Ｓ， Ｆ， Ｍ， Ｗ， Ｑ， Ｔ及びＹから選択され、そして
Ｘ８は独立して、Ｇ及びＡから選択され、そして
Ｘ１４， Ｘ１５， Ｘ１６及びＸ１７は独立して、Ｒ， Ｈ， Ａ， Ｔ， Ｗ， Ｌ， Ｉ， Ｖ， Ｑ， Ｋ， Ｙ， Ｐ又は不在である］により表されるアミノ酸配列を含んで成る。
【００６８】
第２プロペプチドの１つの態様においては、Ｘ１はＡ， Ｓ， Ｎ， Ｒ， Ｔ及びＨから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ２はＶ， Ｌ， Ｐ， Ｎ及びＡから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ３はＬ， Ｉ， Ｖ及びＳから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ４はＳ， Ｒ， Ｎ， Ｔ， Ｄ及びＡから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ５はＲ， Ｑ， Ｋ， Ｇ， Ｈ， Ｓ及びＰから選択される。
【００６９】
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ６はＥ， Ｒ及びＱから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ７はＱ， Ｎ， Ｅ， Ｋ及びＲから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ８はＡ及びＧから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ９はＮ， Ｈ， Ｓ及びＲから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１０はＱ， Ｎ， Ｔ， Ｇ， Ｓ， Ｋ及びＥから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１１はＶ， Ｉ， Ｆ及びＬから選択される。
【００７０】
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１２はＬ， Ｉ及びＶから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１３はＱ， Ａ， Ｓ， Ｈ， Ｖ， Ｋ， Ｎ及びＲから選択される。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１４はＲ， Ｈ， Ｋ， Ｉ及びＰから選択されるか、又は不在である。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１５はＲ， Ｈ， Ｋ， Ｑ， Ｖ， Ｙ， Ｐ， Ａ， Ｔ， Ｗ及びＬから選択されるか、又は不在である。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１６はＲ， Ｈ， Ｔ， Ｑ， Ｋ， Ｙ及びＰから選択されか、又は不在である。
第２プロペプチドのさらなる態様においては、Ｘ１７はＲ， Ｈ， Ｔ， Ｑ， Ｋ， Ｙ及びＰから選択されるか、又は不在である。
【００７１】
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、１ｍＭ以下の阻害定数（Ｋｉ）を有するアミノ酸配列を含んで成る。さらなる態様においては、アミノ酸配列は０．５ｍＭ以下のＫｉを有する。さらなる態様においては、アミノ酸配列は、０．１ｎＭ〜０．５ｍＭのＫｉを有する。
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
【００７２】
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
本発明のさらなる態様においては、第１プロペプチドは、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
【００７３】
本発明のさらなる態様においては、前記第１プロペプチドが、１ｍＭ以下のＫｉ、及び配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された配列に対して少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んで成る。
本発明のさらなる態様においては、前記第１プロペプチドが、配列番号１， ２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７及び１８から成る群から独立して選択された特定のアミノ酸配列を含んで成る。
【００７４】
本発明のさらなる態様においては、真核宿主細胞は、酵母細胞である。
本発明のさらなる態様においては、真核宿主細胞は、昆虫細胞である。
本発明のさらなる態様においては、真核宿主細胞は、哺乳類細胞である。
本発明のさらなる態様においては、真核宿主細胞は、ヒト細胞である。
本発明のさらなる態様においては、真核宿主細胞は、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞から独立して選択される。
【００７５】
本発明のさらなる態様においては、第１ポリヌクレオチド配列はＤＮＡである。
本発明のさらなる態様においては、第２ポリヌクレオチド配列はＤＮＡである。
本発明のさらなる態様においては、第１ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。
本発明のさらなる態様においては、第２ポリヌクレオチド配列はＲＮＡである。
本発明のさらなる態様においては、第１発現単位は第１ベクター上に存在し、そして第２発現単位は第２別のベクター上に存在する。
本発明のさらなる態様においては、第１及び第２発現単位は、同じベクター上に存在する。
【００７６】
本発明のさらなる態様においては、第１ベクターは、プラスミドベクターである。
本発明のさらなる態様においては、第２ベクターは、プラスミドベクターである。
本発明のさらなる態様においては、第１ベクターは、ファージベクターである。
本発明のさらなる態様においては、第２ベクターは、ファージベクターである。
本発明のさらなる態様においては、培養培地は、血清フリー培地である。
【００７７】
本発明のさらなる態様においては、第１ポリヌクレオチドは、プラスミドＤＮＡである。
本発明のさらなる態様においては、第２ポリヌクレオチドは、プラスミドＤＮＡである。
用語“γ−グルタミルカルボキシラーゼのための結合配列”とは、本明細書において使用される場合、γ−グルタミルカルボキシラーゼによる結合又はそれとの相互作用のための配列（すなわち、認識配列内）の必要なアミノ酸残基を意味する。
【００７８】
本発明のさらなる態様のおいては、第１プロペプチドは、第２遊離のプロペプチドよりも、カルボキシラーゼに対して高い親和性（阻害定数（Ｋｉ）により測定される場合）を有する。カルボキシラーゼ、基質結合及び活性調節に対するビタミンＫ−依存性タンパク質のプロペプチドの２種の分離できる機能が存在する場合、共有結合されるプロペプチド及び遊離プロペプチドの異なった親和性及び濃度は、組換えビタミンＫ−タンパク質をカルボキシレート化する生成体細胞の全体的能力に影響を及ぼす。
【００７９】
遊離プロペプチド及び共有結合されるプロペプチドの同時発現及びそれらの組合せは、機能的組換えＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩ）の生成を高める。新しく合成されたＧｌｕ−含有ビタミンＫ−依存性タンパク質のカルボキシル化を阻害しないためには、好ましくは、第２遊離プロペプチドは、γ−カルボキシル化されるビタミンＫ−依存性タンパク質に対して共有結合されるプロペプチドよりも低い親和性を有する。
【００８０】
遊離プロペプチドについてのＫｉは、Ｓｔａｎｌｅｙなど． （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８， １５６８１−１５６８７ （１９９９） 及びＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， １６９４０−１６９４４） に従って決定される。
さらなる態様においては、ビタミンＫ−依存性タンパク質と共に同時発現される遊離プロペプチドは好ましくは、表２及び３に要約されるような列挙から選択される。
【００８１】
【表１】
2004510436.tif 000003
【００８２】
【表２】
2004510436.tif 000004
【００８３】
【表３】
2004510436.tif 000005
【００８４】
本発明はまた、上記で言及されるようなビタミンＫ−依存性タンパク質の生成方法に関する。ビタミンＫ−依存性タンパク質は好ましくは、組換えＤＮＡ技法により生成される。このためには、ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして標準技法に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブリダイゼーションによりタンパク質のすべて又は一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることにより単離され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照のこと）。このためには、タンパク質をコードするＤＮＡ配列は好ましくは、ヒト起源のものであり、すなわちヒトゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリー由来のものである。
【００８５】
本発明はまた、通常、細胞において発現されないか、又は得られるような細胞において生理学的に有意なレベルで発現されない、脊椎動物起源の一次、二次又は不滅化された細胞に存在するビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする遺伝子を活性化する（すなわち、変更する）方法に関する。相同組換えは、その対応するトランスフェクトされていない細胞において明らかなよりも高いレベルでの遺伝子の発現、又はその対応するトランスフェクトされていない細胞において明らかなパターンとは異なる調節又は誘発のパターンの遺伝子による表示を引き起こす調節配列により、得られるような細胞における遺伝子に通常関連する調節領域を置換するか、又はそれを無能にするために使用され得る。
【００８６】
従って、本発明はまた、トランスフェクトされた一次、二次又は不滅化された細胞におけるビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする内因性遺伝子を変更するか又は活性化することによって、ビタミンＫ−依存性タンパク質を調製するための方法にも関する。内因性遺伝子の活性化は、アメリカ特許第５，９６８，５０２号に記載のようにして行われ得る。
【００８７】
ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡはまた、確立された標準方法、例えばＢｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２ （１９８１）， １９５９−１８６９により記載されるホスホアミジット方法、又はＭａｔｔｒｅｓなど．， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３ （１９８４）， ８０１−８０５により記載される方法により、合成的に調製され得る。ホスホラミジット方法に従って、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機により合成され、精製され、アニーリングされ、結合され、そして適切なベクターにクローン化される。
ＤＮＡ配列はまた、例えばアメリカ特許第４，６８３，２０２号、Ｓａｉｋｉなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９ （１９８８）， ４８７−４９１， 又はＳａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記に記載のように、特定のプライマーを用いてのポリメラーゼ鎖反応により調製され得る。
【００８８】
ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列は通常、便利には組換えＤＮＡ工程にゆだねられ得る、いずれかのベクターであり得る組換えベクター中に挿入され、そしてベクターの選択は、それが挿入される宿主細胞に、しばしば依存する。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に関係しない染色体外実在物として存在するベクター、例えばプラスミドである。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターである。
【００８９】
ベクターは好ましくは、ビタミンＫ−依存性タンパク質がＤＮＡの転写のために必要とされる追加のセグメントに操作可能に連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターはプラスミド又はウィルスＤＮＡ由来であるか、又は両者の要素を含むことができる。用語“操作可能的に連結される”とは、セグメントが、それらの意図された目的のために機能し、例えば転写がプロモーターにより開始し、そしてポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を通して進行するよう配置されることを示す。
【００９０】
プロモーターは、選択の宿主細胞における転写活性を示すいずれかのＤＮＡ配列であり得るか、又は宿主細胞に対して相同であるか又は異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る。
【００９１】
哺乳類細胞におけるビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡの転写を指図するための適切なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １ （１９８１）， ８５４−８６４）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２ （１９８３）， ８０９−８１４）、ＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔなど．， Ｃｅｌｌ４１： ５２１−５３０， １９８５）、又はアデノウィルス２主要後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２： １３０４−１３１９， １９８２）である。
【００９２】
昆虫細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、ポリヘドリンプロモーター（アメリカ特許第４，７４５，０５１号；ｖａｓｕｖｅｄａｎなど．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３１１ （１９９２） ７−１１）、オートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウィルス塩基性タンパク質プロモーター（ＥＰ３９７，４８５号）、バキュロウィルス初期遺伝子１プロモーター（アメリカ特許第５，１５５，０３７号；第５，１６２，２２２号）、又はバキュロウィルス３９Ｋ遅延された−初期遺伝子プロモーター（アメリカ特許第５，１５５，０３７号；第５，１６２，２２２号）である。
【００９３】
酵母宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、酵母解糖遺伝子からのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５ （１９８０）， １２０７３−１２０８０； Ａｌｂｅｒ ａｎｄ Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １ （１９８２）， ４１９−４３４）、又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇなど．， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒなど， ｅｄｓ．）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｌｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２）、又はＴＰ１１（アメリカ特許第４，５９，３１１号）又はＡＤＨ２−４ｃ（Ｒｕｓｓｅｌｌなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３０４， （１９８３）， ６５２−６５４）プロモーターである。
【００９４】
糸状菌宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、例えばＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔなど．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ． ４ （１９８５）， ２０９３−２０９９）、又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー又はＡ．アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、Ａ．オリザエアルカリプロテアーゼ、Ａ．オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のそれらである。ＴＡＫＡ−アミラーゼ及びｇｌｕＡプロモーターが好ましい。適切なプロモーターは、例えばＥＰ２３８，０２３号及びＥＰ３８３，７７９号に言及されている。
【００９５】
ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列はまた、必要なら、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２， １９８３， ｐｐ． ８０９−８１４）、又はＴＰ１１（Ａｌｂｅｒ ａｎｄ Ｋａｗａｓａｋｉ Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １， １９８２， ｐｐ． ４１９−４３４）又はＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔなど．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ． ４， １９８５， ｐｐ． ２０９３−２０９９）ターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターはまた、プロモーターの下流に、及びＦＶＩＩ配列自体のための挿入部位から上流に位置する１組のＲＮＡスプライス部位を含むことができる。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウィルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得られる。
【００９６】
挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルはまた、発現ベクターに含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０からの初期又は後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ． 前記）、アデノウィルス５Ｅｌｂ領域からのポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏなど．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９： ３７１９−３７３０， １９８１）、又はヒトＦＶＩＩ遺伝子又はウシＦＶＩＩ遺伝子からのポリアデニル化シグナルを包含する。発現ベクターはまた、非コードウィルスリーダー配列、例えばプロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置するアデノウィルス２　三分節リーダー；及びエンハンサー配列、例えばＳＶ４０エンハンサーを含むことができる。
【００９７】
組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複数の可能にするＤＮＡ配列を含んで成る。そのような配列の例（宿主細胞が哺乳類細胞である場合）は、複数のＳＶ４０起点である。
宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適切な配列は、酵母２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３及び複数の起点である。
【００９８】
ベクターはまた、選択マーカー、例えば宿主細胞における欠失を補充する生成物の遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（Ｐ．Ｒ． Ｒｎｓｓｅｌｌ， Ｇｅｎｅ４０， １９８５， ｐｐ． １２５−１３０により記載される）、又は薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子を含んで成ることができる。糸状菌に関しては、選択マーカーは、ａｎｄ Ｓ， ｐｙｒＧ， ａｒｇＢ， ｎｉａＤ， ｎｉａＤ又はｓＣを包含する。
【００９９】
宿主細胞の分泌路中に本発明のビタミンＫ−依存性タンパク質を指図するためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列として知られている）が、組換えベクターに供給され得る。分泌シグナル配列は、正しい読み取り枠で、ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結される。分泌シグナル配列は、ペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に通常位置する。分泌シグナル配列は、通常、タンパク質に関連する配列であるか、又はもう１つの分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からであり得る。
【０１００】
酵母細胞からの分泌に関しては、分泌シグナル配列は、細胞の分泌路中への発現されたビタミンＫ−依存性タンパク質の効果的な指図を確保するいずれかのシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド、又はその機能的部位であり得るか、又は合成ペプチドであり得る。適切なシグナルペプチドは、α−因子シグナルペプチド（アメリカ特許第４，８７０，００８号を参照のこと）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ． Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅなど．， Ｎａｔｕｒｅ ２８９， １９８１， ｐｐ． ６４３−６４６）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ． Ｖａｌｉｓなど．， Ｃｅｌｌ４８， １９８７， ｐｐ． ８８７−８９７）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０号）、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ． Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉなど．， Ｙｅａｓｔ ６， １９９０， ｐｐ． １２７−１３７）であることが見出されている。
【０１０１】
酵母における効果的な分泌に関しては、リーダーペプチドをコードする配列はまた、シグナル配列の下流に及びビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入され得る。リーダーペプチドの機能は、ゴルジ体への、及びさらに、培養培地中への分泌のための分泌小胞への小胞体からの発現されたペプチドの方向付け（すなわち、酵母細胞の細胞周辺腔中への細胞を通しての又は少なくとも細胞膜を通してのビタミンＫ−依存性タンパク質の輸送）を可能にすることである。
【０１０２】
リーダーペプチドは、酵母α−因子リーダーであり得る（その使用は、例えばアメリカ特許第４，５４６，０８２号、アメリカ特許第４，８７０，００８号、ＥＰ１６２０１号、ＥＰ１２３２９４号、ＥＰ１２３５４４号及びＥＰ１６３５２９号に記載される）。他方では、リーダーペプチドは、天然において見出されないリーダーペプチドである合成リーダーペプチドであり得る。例えば、合成リーダーペプチドは、ＷＯ８９／０２４６３号又はＷＯ９２／１１３７８号に記載されている。
【０１０３】
糸状菌への使用に関しては、シグナルペプチドは便利には、アスペルギラスｓｐ． アミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ又はプロテアーゼをコードする遺伝子、又はヒューミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼをコードする遺伝子から誘導され得る。シグナルペプチドは好ましくは、Ａ．オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性アミラーゼ、又はＡ．ニガーグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導される。適切なシグナルペプチドは、例えばＥＰ２３８０２３号及びＥＰ２１５５９４号に開示される。
【０１０４】
昆虫細胞への使用に関しては、シグナルペプチドは便利には、昆虫遺伝子（ＷＯ９０／０５７８３号）、例えば鱗翅目のマンジュカ・セキスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）脂肪動員物質）ホルモン前駆体ペプチド（アメリカ特許第５，０２３，３２８号）から誘導され得る。
それぞれ、ビタミンＫ−依存性タンパク質、プロモーター及び任意には、ターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を連結し、そして複製のために必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）。
【０１０５】
哺乳類細胞をトランスフェクトし、そして細胞に導入されるＤＮＡ配列を発現するための方法は、例えば次の文献に記載されている：Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９ （１９８２）， ６０１−６２１： Ｓｏｕｔｈｅｍ ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １ （１９８２）， ３２７−３４１； Ｌｏｙｔｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９ （１９８２）， ４２２−４２６； Ｗｉｇｌｅｒ など．， Ｃｅｌｌ １４ （１９７８）， ７２５； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７ （１９８１）， ６０３； Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２ （１９７３）， ４５６； 及びＮｅｕｍａｎｎなど．， ＥＭＢＯ Ｊ． １ （１９８２）， ８４１−８４５。
【０１０６】
適切なマーカーは、興味ある遺伝子と同時に、別々のプラスミドに基づいて細胞中に導入されるか、又は同じプラスミド上に導入され得る。同じプラスミド上に存在する場合、選択マーカー及び興味ある遺伝子は、異なったプロモーター又は同じプロモーターの制御下にあり、後者の配列は二シストロン性メッセージを生成する。このタイプの構成体は、当業界において知られている（例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｓｅｎ， アメリカ特許第４，７１３，３３９号）。細胞中に導入される混合物に、“キャリヤーＤＮＡ”として知られている追加のＤＮＡを付加することはまた、好都合デあり得る。
【０１０７】
細胞がＤＮＡを取り込んだ後、それらは、興味ある遺伝子の発現を開始するために、適切な増殖培地において、典型的には１〜２日間、増殖される。本明細書において使用される場合、“適切な増殖培地”とは、細胞の増殖、及び興味あるビタミンＫ−依存性タンパク質の発現のために必要とされる他の成分及び栄養物を含む培地を意味する。培地は一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質及び成長因子を含む。
【０１０８】
γ−カルボキシル化されたタンパク質の生成に関して、培地は、ビタミンＫを、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの濃度で含むであろう。次に、薬剤選択が、選択マーカーを安定性態様で発現する細胞の増殖について選択するために適用される。増幅できる選択マーカーによりトランスフェクトされた細胞に関しては、薬物濃度は、高められたコピー数のクローン化された配列について選択するために高められ、それにより、発現レベルが高められる。次に、安定してトランスフェクトされた細胞のクローンは、興味あるビタミンＫ−依存性タンパク質の発現についてスクリーンされる。
【０１０９】
ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列が導入される宿主細胞は、後翻訳の修飾されたビタミンＫ−依存性タンパク質を生成することができるいずれかの細胞であり得、そして酵母、菌類及び高等真核細胞を包含する。
本発明への使用のための哺乳類細胞系の例は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、子供ハムスター肝臓（ＢＨＫ）及び２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６： ５９−７２， １９７７）細胞系である。好ましいＢＨＫ細胞系は、ｔｋ．ｓｕｐ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞系（Ｗａｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｓｅｒｇａ， ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： １１０６−１１１０， １９８２）であり、この後、ＢＨＫ５７０細胞として言及される。
【０１１０】
ＢＨＫ５７０細胞系は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０３１４号として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ ２０８５２から入手できる。ｔｋｓｕｐ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞系はまた、受託番号ＣＲＬ１６３２としてＡＴＣＣから入手できる。さらに、多くの他の適切な細胞系は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：Ｒａｔ ＨｅｐＩ（ラット肝癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ ＨｅｐＩＩ（ラット肺癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）及びＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｉａｕｂ ａｎｄ Ｃｈｕｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ７７： ４２１６−４２２０， １９８０）。
【０１１１】
適切な酵母細胞の例は、サッカロミセスｓｐ．又はシゾサッカロミセスｓｐｐ．， 特にサッカロミセス・セレビシアエ又はサッカロミセス・クルイベリの株の細胞を包含する。異種ＤＮＡにより酵母細胞を形質転換し、そしてそれらから異種ポリペプチドを生成するための方法は、例えばアメリカ特許第４，５９９，３１１、第４，９３１，３７３号、第４，６７０，００８号、第５，０３７，７４３号及び第４，８４５，０７５号（それらのすべては、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、薬物耐性、又は特定の栄養物、例えばロイシン不在下で増殖する能力により決定される表情型により選択される。
【０１１２】
酵母への使用のための好ましいベクターは、アメリカ特許第４，９３１，３７３号に開示されるＰＯＴ１ベクターである。ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列に続いて、シグナル配列及び任意には、リーダー配列が存在する。適切な酵母細胞のさらなる例は、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばＫ． ラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ（Ｈｕｎｓｅｎｕｌａ）、例えばＨ． ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又はピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ． パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株である（Ｇｌｅｅｓｏｎなど．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂ２， １９８６， ｐｐ． ３４５９−３４６５； アメリカ特許第４，８８２，２７９号）。
【０１１３】
他の菌類細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギラスｓｐｐ．， ニューロスポラｓｐｐ．， フサリウムｓｐｐ． 又はトリコダーマｓｐｐ． の株、特にＡ．オリザエ、Ａ．ニジュランス又はＡ．ニガーの株である。タンパク質の発現のためへのアスペルギラスｓｐｐ．の使用は、例えばＥＰ２７２２７７号、ＥＰ２３８０２３号、ＥＰ１８４４３８号に記載される。Ｆ．オキシスポラムの形質転換は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒなど．， １９８９， Ｇｅｎｅ ７８： １４７−１５６により記載される。トリコダーマｓｐｐの形質転換は、例えばＥＰ２４４２３４号に記載のようにして行われ得る。
【０１１４】
糸状菌が宿主細胞として使用される場合、それは、便利には、組換え宿主細胞を得るために、宿主染色体にＤＮＡ構成体を組み込むことによって、本発明のＤＮＡ構成体により形質転換され得る。この組み込みは一般的に、ＤＮＡ配列が細胞に安定して維持される場合、有益であると思われる。宿主染色体中へのＤＮＡ構造体の組み込みは、従来の方法、例えば相同又は異種組換えにより行われ得る。
【０１１５】
昆虫細胞の形質転換及びそこにおける異種ポリペプチドの生成は、アメリカ特許第４，７４５，０５１号；第４，８７９，２３６号；第５，１５５，０３７号；第５，１６２，２２２号；ＥＰ３９７，４８５号（それらはすべて引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして行われ得る。宿主として使用される昆虫細胞系は適切には、レピドプテラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）細胞系、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はトリコプルシエ・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞である（アメリカ特許第５，０７７，２１４号）。培養条件は、適切には、ＷＯ８９／０１０２９号又はＷＯ８９／０１０２８号、又は前述の引例のいずれかに記載される。
【０１１６】
次に、上記形質転換されるか又はトランスフェクトされた宿主細胞は、ビタミンＫ−依存性タンパク質の発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地において培養され、この後、得られるペプチドのすべて又は一部が培養物から回収され得る。細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖するために適切ないずれかの従来の培地、例えば適切な補充物を含む最少又は複合培地であり得る。適切な培地は市販されており、又は公開されたレセピー（例えば、ＡＴＣＣのカタログ）に従って調製され得る。
【０１１７】
次に、細胞により生成されるビタミンＫ−依存性タンパク質が、従来の方法、例えば遠心分離又は濾過による培地からの宿主細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清液又は濾液のタンパク質成分の沈殿、問題のポリペプチドの型に依存して、種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル化クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものによる精製により、培養培地から回収され得る。
【０１１８】
組換えヒトＦＶＩＩ又はその変異体の調製に関しては、クローン化された野生型ＦＶＩＩ ＤＮＡ配列が使用される。この配列は、所望するＦＶＩＩタンパク質又はその変異体をコードするよう修飾され得る。次に、配列が、発現ベクター中に挿入され、このベクターにより、宿主細胞が形質転換されるか又はトランスフェクトされる。高等真核細胞、特に培養された哺乳類細胞が、宿主細胞として好ましい。ヒトＦＶＩＩのための完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列は知られている。引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許第４，７８４，９５０号を参照のこと（ここで、組換えヒトＦＶＩＩのクローニング及び発現が記載されている）。ウシＦＶＩＩ配列は、Ｔａｋｅｙａなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １４８６８−１４８７２ （１９８８）（これは引用により本発明に組み込まれる）に記載されている。
【０１１９】
アミノ酸配列変更は、種々の技法により達成され得る。ＤＮＡ配列の修飾は、部位特異的突然変異誘発による。部位特異的変異誘発は当業界において知られており、そして例えばＺｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （ＤＮＡ ３： ４７９−４８８， １９８４）により記載される。従って、ＦＶＩＩのヌクレオチド及びアミノ酸配列を用いて、選択の変更を導入することができる。
【０１２０】
本発明内への使用のためのＤＮＡ配列は典型的には、正しい後−翻訳プロセッシング（例えば；グルタミン酸残基のγ−カルボキシ化）及び宿主細胞からの分泌を得るために、ＦＶＩＩタンパク質のアミノ末端でプレ−プロペプチドをコードするであろう。前記プレープロペプチドは、ＦＶＩＩ又はもう１つのビタミンＫ−依存性血漿タンパク質、例えば第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、プロテインＣ又はプロテインＳのそのプロペプチドであり得る。当業者により理解されるように、追加の修飾がＦＶＩＩのアミノ酸配列において行われ得、ここでそれらの修飾は凝固因子として作用するタンパク質の能力を有意に害しない。例えば、触媒試験におけるＦＶＩＩはまた、引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許第５，２８８，６２９号に一般的に記載のように、チモーゲンＦＶＩＩのその活性化された二本鎖形への転換を阻害するために、活性化切断部位において修飾され得る。
【０１２１】
本発明においては、トランスジェニック動物技法が、ビタミンＫ−依存性タンパク質を生成するために使用され得る。宿主雌哺乳類の乳腺内でタンパク質を生成することが好ましい。興味あるタンパク質の乳腺における発現及びその乳汁への続く分泌は、他の源からタンパク質を単離することにおいて遭遇する多くの困難性を克服する。乳汁は容易に集められ、多量に入手でき、そして生化学的に十分に特徴づけられている。さらに、主要乳汁タンパク質は、高濃度（典型的には、約１〜１５ｇ／ｌ）で乳汁に存在する。商業的な観点から、高い乳生成の種を宿主として使用することが明らかに好ましい。
【０１２２】
より小さな動物、例えばマウス及びラットが使用され（そして、主要段階の証明で好ましい）るが、本発明においては、家畜哺乳類、例えばブタ、羊及びウシを使用することが好ましいが、但しそれらだけには限定されない。羊は、この種におけるトランスジェネシスのこれまでの歴史、乳汁収率、費用及び羊乳汁を集めるための装置の容易な入手性のような因子のために、特に好ましい。宿主種の選択に影響を及ぼす因子の比較についてはＷＩＰＯ公開ＷＯ８８／００２３９号を参照のこと。酪農使用のために交配された宿主動物の品種、例えばＥａｓｔ Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ羊を選択するか、又は後日、トランスジェニック系の交配により酪農家畜を得ることが一般的に所望される。とにかく、既知の良好な健康の状態の動物が使用されるべきである。
【０１２３】
乳腺における発現を得るためには、乳タンパク質遺伝子からの転写プロモーターが使用される。乳タンパク質遺伝子は、ガゼイン（引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許第５，３０４，４８９号を参照のこと）、β−ラクトグロブリン、ａ−ラクトアルブミン及び乳清酸性タンパク質をコードするそれらの遺伝子を包含する。β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）プロモーターが好ましい。羊β−ラクトグロブリン遺伝子の場合、遺伝子５’フランギングの配列の少なくとも近位４０６ｂｐの領域が一般的に使用され得るが、但し約５ｋｂｐまでの５’フランギング配列の大きな部分、例えば５’フランギングプロモーター及びβ−ラクトグロブリン遺伝子の非コード部分を包含する約４．２５ｋｂｐのＤＮＡセグメントも好ましい。Ｗｈｉｔｅｌａｗなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２８６： ３１−３９ （１９９２） を参照のこと。他の種からのプロモーターＤＮＡの類似するフラグメントもまた適切である。
【０１２４】
β−ラクトグロブリン遺伝子の他の領域はまた、発現されるべき遺伝子のゲノム領域である場合、構成体に組み込まれ得る。イントロンを欠いている構成体は、そのようなＤＮＡ配列を含むそれらの構成体に比較して、不良に発現することは一般的に当業界において許容されている（Ｂｒｉｎｓｔｅｒなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８３６−８４０ （１９８８）； Ｐａｌｍｉｔｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８８： ４７８−４８２ （１９９１）； Ｗｈｉｔｅｌａｗなど．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． １： ３−１３ （１９９１）； ＷＯ８９／０１３４３号；及びＷＯ８１／０２３１８号を参照のこと；それらの個々は引用により本明細書に組み込まれる）。
【０１２５】
これに関しては、興味あるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の生来のイントロンのすべて又はいくつかを含むゲノム配列を使用することが一般的に好ましく、従って、β−ラクトグロブリン遺伝子からの少なくともいくつかのイントロンのさらなる包含が好ましい。１つのそのような領域は、羊β−ラクトグロブリン遺伝子の３’非コード領域からのイントロンスプライシング及びＲＮＡポリアデニル化を提供するＤＮＡセグメントである。遺伝子の天然の３’非コード配列により置換される場合、この羊ベーターラクトグロブリンセグメントが興味あるタンパク質又はポリペプチドの発現レベルを増強し、そして安定化することができる。
【０１２６】
他の態様においては、ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする配列の開始ＡＴＧを取り囲む領域が、乳汁特異的タンパク質遺伝子からの対応する配列により置換される。そのような置換は、発現を増強するための推定上の組織−特異的開始環境を提供する。ビタミンＫ−依存性タンパク質の完全なプレ−プロ配列及び５’非コード配列を、例えばＢＬＧ遺伝子のそれらの配列により置換することが便利であるが、但しより小さな領域でも置換され得る。
【０１２７】
トランスジェニック動物におけるビタミンＫ−依存性タンパク質の発現に関しては、ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするＤＮＡセグメントが、発現単位を生成するために、その発現のために必要とされる追加のＤＮＡセグメントに操作可能的に連結される。そのような追加のセグメントは、上記プロモーター、及び転写の終結及びｍＲＮＡのポリアデニル化を提供する配列を包含する。
【０１２８】
発現単位はさらに、ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードするセグメントに操作可能的に連結される分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメントを包含するであろう。分泌シグナル配列は、ビタミンＫ−依存性タンパク質の生来の分泌シグナル配列であり、又はもう１つのタンパク質、例えば乳タンパク質のその配列であり得る。例えば、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ４６８３−４６９０ （１９８６）；及びＭｅａｄｅなど．， アメリカ特許第４，８７３，３１６号（それらは、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１２９】
トランスジェニック動物への使用のための発現単位の構成は便利には、発現単位は実質的にいずれかの配列の連結により構成され得るが、追加のＤＮＡセグメントを含むプラスミド又はファージベクター中に、ビタミンＫ−依存性タンパク質をコードする配列を挿入することによって行われる。乳タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターを供給し、そして乳タンパク質のためのコードを、ビタミンＫ−依存性タンパク質のその配列により置換し、それにより、乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合体を創造することが特に便利である。いずれにせよ、プラスミド又は他のベクターにおける発現単位のクローニングは、ビタミンＫ−依存性タンパク質の増幅を促進する。増幅は便利には、細菌（例えば、Ｅ．コリ）宿主細胞において行われ、従って、ベクターは典型的には、複製の起点、及び細菌細胞において機能的な選択マーカーを含むであろう。
【０１３０】
次に、発現単位は、選択された宿主種の受精卵（初期段階胚を包含する）中に導入される。異種ＤＮＡの導入は、マイクロインジェクション（例えば、アメリカ特許第４，８７３，１９１号）、レトロウィルス感染（Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １４６８−１４７４ （１９８８））又は胚幹（ＥＳ）細胞を用いての特定部位組み込み（Ｂｒａｄｌｅｙなど．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ５３４−５３９ （１９９２））を包含するいくつかの経路の１つにより達成され得る。次に、卵が、擬似妊娠雌の卵管又は子宮に移植され、そして一定の期間、成長せしめられる。それらの胚系において前記導入されたＤＮＡを担持する子孫は正常なメンデルの法則でそれらの子供にＤＮＡを伝達することができ、トランスジェニック集団の開発を可能にする。
【０１３１】
トランスジェニック動物を生成するための一般的な方法は、当業界において知られている。例えば、下記文献及び特許を参照のこと：Ｈｏｇａｎ など．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． １９８６； Ｓｉｍｏｎｓ など．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １７９−１８３ （１９８８）； Ｗａｔｌ など．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ３２： ６４５−６５１ （１９８５）； Ｂｕｈｉｅｒ など．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： １４０−１４３ （１９９０）； Ｅｂｅｒｔ など．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ８３６−８３８ （１９９１）； Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔなど．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ８４４−８４７ （１９９１）； Ｗａｌｌ など．， Ｊ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４９： １１３−１２０ （１９９２）；アメリカ特許第４，８７３，１９１号及び第４，８７３，３１６号；ＷＩＰＯ公開ＷＯ８８／００２３９号、ＷＯ９０／０５１８８号、ＷＯ９２／１１７５７号；及びＧＢ８７／００４５８号（それらの引用により本明細書に組み込まれる）。
【０１３２】
哺乳類及びそれらの胚細胞中に外来性ＤＮＡ配列を導入するための技法は、本来、マウスにおいて開発された。例えば、Ｇｏｒｄｏｎなど．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ７３８０−７３８４ （１９８０）； Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４： １２４４−１２４６ （１９８１）； Ｐａｌｍｉｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ， Ｃｅｌｌ４１： ３４３−３４５ （１９８５）； Ｂｒｉｎｓｔｅｒなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ４４３８−４４４２ （１９８５）； 及びＨｏｇａｎなど． （前記）を参照のこと。従って、それらの技法は、より大きな動物、例えば家畜種による使用のために適合された（例えば、ＷＩＰＯ公開ＷＯ８８／００２３９号、ＷＯ９０／０５１８８号、及びＷＯ９１／１１７５７号；及びＳｉｍｏｎｓなど．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １７９−１８３ （１９８８） を参照のこと）。
【０１３３】
要約すると、トランスジェニックマウス又は家畜の生成に今日まで使用されて来た最も効果的な経路においては、興味あるＤＮＡの数百の線状分子が、確立された技法に従って、受精された卵の前核の１つの中に注入される。接合体の細胞中へのＤＮＡの注入がまた使用され得る。トランスジェニック植物における生成もまた使用され得る。発現は一般化されるか、又は特定の器官、例えば塊茎に向けられ得る。Ｈｉａｔｔ， ｎａｔｕｒｅ ３４４： ４６９−４７９ （１９９０）；Ｅｄｅｌｂａｕｍなど．， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． １２： ４４９−４５３ （１９９２）； Ｓｉｊｍｏｎｓ など．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ２１７−２２１ （１８９０）； 及びヨーロッパ特許局ＥＰ２５５，３７８号を参照のこと。
【０１３４】
本発明に従って生成されたＦＶＩＩは、抗−ＦＶＩＩ抗体カラム上での親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。好ましくは、免疫吸着カラムは、高い特異性のモノクローナル抗体を含んで成る。Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１： １１０９７−１１１０８， （１９８６） 及びＴｈｉｍなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７： ７７８５−７７９３， （１９８８） （引用により本明細書に組み込まれる）により記載されるように、カルシウム−依存性モノクローナル抗体の使用が特に好ましい。追加の精製が、従来の化学的精製手段、例えば高性能液体クロマトグラフィーにより達成され得る。
【０１３５】
クエン酸バリウム沈殿を包含する他の精製方法は、当業界において知られており、そして本明細書に記載されるＦＶＩＩの精製に適用され得る（一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｒ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｉａｇ， Ｎ．Ｙ．， １９８２を参照のこと）。少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なＦＶＩＩが好ましく、そして９８〜９９％又はそれ以上の均質性が医薬使用のためには、最も好ましい。所望により、部分的に又は均質性に精製されると、ＦＶＩＩは治療的に使用され得る。
【０１３６】
一本鎖ＦＶＩＩの活性二本鎖ＦＶＩＩａへの転換は、Ｈｅｄｎｅｒ ａｎｄ Ｋｉｓｉｅｌ （１９８３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６−１８４１）により記載のようにして、第ＸＩＩａ因子を用いて、又はトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ（Ｋｉｓｉｅｌ ａｎｄ Ｆｕｊｉｋａｗａ， Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ７３： ２９−４２， １９８３）により達成され得る。他方では、ＦＶＩＩは、それを、イオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばモノＱ．ＲＴＭ． （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ） 又は同様のもの（Ｂｊｏｅｍなど．， １９８６， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｉｏｓｕｒｅｓ ２６９： ５６４−５６５）に通すことによって活性化され得る。本発明のＦＶＩＩ分子及びその医薬組成物は、血管内凝固を包含する種々の状態を処理するためにヒトへの投与のために特に有用である。
【０１３７】
本発明のビタミンＫ−依存性タンパク質は、一定の型の血友病を処理するために使用され得る。血友病Ａは、活性第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子の不在、又は第ＶＩＩＩ因子対するインヒビターの存在により特徴づけられる。血友病Ｂは、活性第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子の不在、ＦＶＩＩ欠失により特徴づけられるが、但しまれであるが、第ＶＩＩ因子投与に十分に応答する（Ｂａｕｅｒ， Ｋ． Ａ．， １９９６， Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ， ２６： １５５， ｓｕｐｐｌ． １）。第ＶＩＩＩ因子置換療法は、ある患者において高い力価の阻害第ＶＩＩＩ因子抗体の開発のために制限される。
【０１３８】
他方では、ＦＶＩＩａは、血友病Ａ及びＢの処理に使用され得る。第ＩＸａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子は第Ｘ因子を活性化する。第ＶＩＩａ因子は、第Ｘ因子を直接的に活性化することによって、第ＩＸ及びＶＩＩＩ因子のための必要性を排除し、そして少数の免疫的学的因果関係を有する第ＩＸ及びＶＩＩＩ因子欠失の問題を克服することができる。
本発明は次の例によりさらに例示されるが、但しそれらの例は、本発明の範囲を制限するものではない。前述の記載及び次の例に開示される特徴は、種々の型で本発明を実現するための材料であり得る。
【０１３９】
実施例
例１．ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＦＶＩＩ及びＦＶＩＩプロペプチドの同時発現
ヒトＦＶＩＩの発現のためのプラスミドベクターｐＬＮ１７４は記載されている（Ｐｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ， １９９６， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５： ２４１−２４３）。手短に言及すれば、それは、挿入されたｃＤＮＡの転写のためのマウスメタロチオネインプロモーターの制御の下でのプロペプチドを包含するヒトＦＶＩＩをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列、及び選択マーカーとしての使用のためのＳＶ４０初期プロモーターの制御下でのマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡを担持する。
【０１４０】
γ−カルボキシル化認識配列をコードするプラスミドベクターの構成に関しては、そのプロペプチドを包含するＦＶＩＩをコードするｃＤＮＡを包含するクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を使用した（ｐＬＮ１７１）（Ｐｅｒｓｓｏｎなど．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １９９１９−１９９２４）。停止コドンをコードするヌクレオチド配列を、クローニングベクターに基づく逆ＰＣＲ−介在性変異誘発により、ＦＶＩＩのプロペプチドの後に、ＦＶＩＩをコードするｃＤＮＡ中に挿入した。鋳型プラスミドを、ＮａＯＨによる処理、続いて、次のプライマーを用いて、Ｐｗｏ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） 及びＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ポリメラーゼによるＰＣＲにより変性した：
ａ）５’−ＡＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ−３’（配列番号１９）；
ｂ）５’−ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＣＣ−３’（配列番号２０）。
【０１４１】
得られる混合物を、残留鋳型ＤＮＡを消化するために、ＤｐｎＩにより消化し、そしてＥ．コリを、ＰＣＲ生成物により形質転換した。クローンを、配列決定することによって、突然変異の存在についてスクリーンした。正しいクローンからのｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスファーした。得られるプラスミドを、ｐＬＮ３２９と命名した。
【０１４２】
ＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）を、Ｆｕｇｅｎｅ６方法（Ｂｏｅｈｒｉｎｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、等量のｐＬＮ１７４及びｐＬＮ３２９によりトランスフェクトした。トランスフェクタントを、メトトレキセートを１μＭまで、及びＧ−４１８を０．４５ｍｇ／ｍｌまで添加することにより選択した。トランスフェクタントのプールを、制限稀釈によりクローン化し、そしてそしてそのクローンからのＦＶＩＩ発現を決定した。
【０１４３】
高い生成性クローンをさらに、サブクローン化し、そして１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地のおいて２．４ｐｇ／細胞／日の特異的ＦＶＩＩ発現をクローンＥ１１を選択した。クローンを、市販のＣＨＯ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）における血清フリー懸濁培養に適合した。
適合された細胞を、回転培養において連続的に増殖し、そして細胞数の上昇につれて、体積を、新規培養物の添加により高めた。
２５日後、６Ｌの回転培養物を、５０Ｌのバイオリアクター中に接種した。細胞をそのバイオリアクターにおいて増殖し、そして細胞数の上昇につれて、体積を、新規培地の添加により徐々に高めた。
【０１４４】
最終的に、５０Ｌの種培養物を、マクロ多孔性Ｃｙｔｏｐｏｒｅ１キャリヤー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む５００Ｌの生成バイオリアクター中に接種し、この後、それはその懸濁細胞はキャリヤーに固定されるようになる。培養物を、７．０〜７．１のｐＨ及び５０％飽和の溶解された酸素均衡（ＤＯＴ）で、３６℃で維持した。バイオリアクターにおける体積を、細胞数の上昇につれて、新しい培地の添加により徐々に高めた。
【０１４５】
細胞密度が約１０〜２×１０５個の細胞／ｍｌに達する場合、生成相を開始し、そして培地交換を２４時間ごとに行い；撹拌を停止し、細胞包含キャリヤーの沈殿を可能し、そして次に、培養上清液の８０％を収穫し、そして新しい培地により交換した。収穫された培養上清液を濾過し、獲得されなかった細胞（すなわち、キャリヤーに固定されなかった細胞）及び細胞残骸を濾過し、そして次に、さらなるプロセッシングのためにトランスファーした。
生成相の間、細胞は２〜３×１０７個の細胞／ｍｌ及び８ｍｇの第ＶＩＩ因子／Ｌの力価に達した。
【０１４６】
例２．ＦＶＩＩ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、及びＦＶＩＩ及び遊離ＦＶＩＩプロペプチドを同時発現する細胞の比較
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、例１に記載のようにして、ｐＬＮ１７４及び１）空のｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター、又はｐｃＤＮＡ３．１＋中、ＦＶＩＩプロペプチドによりトランスフェクトした。トランスフェクタントのプールを、ＦＶＩＩ発現及び細胞数について分析した。ＦＶＩＩ収率／細胞／２４時間が図３に概略されている。その結果は、ＦＶＩＩプロペプチドの同時発現が、約１ｐｇ／細胞／日から４ｐｇ／細胞／日まで、ＦＶＩＩ収率／細胞を高めることを示す。結果は図３に示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、正しくプロセッシングされたヒト凝固ＦＶＩＩの構造、アミノ酸１〜４０６、並びにγ−カルボキシル化されたＧｌｕ−残基（γ）及びグリコシル化（＊）を示す。アミノ酸残基１５２での矢印は、一本鎖ＦＶＩＩが切断され、活性された二本鎖ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）に転換される部位を示す。
【図２】
図２は、遊離プロペプチドの発現及び連結されたプロペプチドと共に組換えヒトＦＶＩＩの発現のためのプラスミドの構成を示す。プラスミドｐＬＮ１７１及びｐＬＮ１７４は、天然においてＦＶＩＩに関連する、連結されたプロペプチドと共にヒトＦＶＩＩを発現する。プラスミドｐＬＮ３２９は、遊離プロペプチドのみを発現するために天然においてＦＶＩＩに関連するプロペプチドの後に、ＦＶＩＩをコードするｃＤＮＡ中に挿入された停止コドンを有する。
【図３】
図３は、ＦＶＩＩを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（対照）、及びＦＶＩＩ及び遊離プロペプチド（ＦＶＩＩプロペプチド）を同時発現する細胞の比較を示す。結果は、ｐｇＦＶＩＩ発現／細胞／日で示される。
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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