(57)【要約】再構成可能なマルチモードポストカラム分析システムは、パーキング又はＭＳ／ＭＳ検出モードを提供することによって、液体クロマトグラフィ検出の分解能を改善する。ここで、カラム溶出剤流は、実質的に減少され、単一の溶出検出ピーク内におけるより長い分析時間を提供する。マイクロスイッチングバルブは、カラム溶出剤をＭＳユニットに直接通過する通常（ＭＳ）モードと、通常モードカラム流が中断され、勾配が停止し、興味の検出ピークがＭＳユニットを通してより緩やかに流れるピークパーキング（またはＭＳ／ＭＳ）モードとの間を再構成できる。マイクロシリンジポンプは、実質的により低いＭＳ／ＭＳ流速に寄与する。ＭＳコントロールユニットは、マイクロスイッチングバルブをコントロールして、ＭＳとＭＳ／ＭＳモードの間で再構成する。検出ピークの後、ＭＳモードが回復し、システム１次ポンプが通常モード流速及び勾配条件に戻る。モード変化は、各クロマトグラム検出ピークに対して行われ得る。【選択図】図２Ｃ
2004510979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフカラムを含み、そこを通して少なくとも１つの成分を有する移動相がポストカラム検出器による分析用の溶出剤として通過する、液体クロマトグラフィ装備において使用する、前記検出器に関連するクロマトグラフピークの溶出時間を増加するためのシステムであって、該システムが、
（ａ）前記溶出剤と流体係合する入口ポートを有するマイクロスイッチングバルブユニットであって、前記溶出剤が第１流速で前記ポストカラム検出器に流れる第１ポジションと、前記カラムを通して流れる溶出剤が停止し、前記マイクロスイッチングバルブユニットの領域内で前記溶出剤の一部が第２流速で前記ポストカラム検出器に流れる第２ポジションとの間をスイッチ可能であり、前記第２流速が、前記第１流速よりも実質的に遅い、前記マイクロスイッチングバルブユニット；
（ｂ）前記マイクロスイッチングバルブユニットの一部に結合可能であり、前記マイクロスイッチングバルブユニットが前記第２ポジションにある場合に前記第２流速に寄与するように作動可能である２次ポンプシステム；
を含み、前記マイクロスイッチングバルブユニットが前記第２ポジションにある場合、前記２次ポンプシステムが、前記マイクロスイッチングバルブユニットの一部に保持される前記溶出剤の一部を、前記ポストカラム検出器にポンプし、個々の検出ピークを前記ポストカラム検出器によりゆっくりと入力することを特徴とする、システム。
【請求項２】
さらに、前記ポストカラム検出器に結合したコントロールユニットであって、検出ピークが前記ポストカラム検出器によって検知された場合に前記マイクロスイッチングバルブユニットに前記第１ポジションから前記第２ポジションにスイッチさせ、及び前記検出ピークが終わった場合に前記マイクロスイッチングバルブユニットに前記第１ポジションから前記第２ポジションに戻すシグナルを出力する前記コントロールユニット；
を含み、前記コントロールユニットが、さらに前記２次ポンプに結合して、前記マイクロスイッチングバルブユニットが前記第１ポジションにあるか前記第２ポジションにあるかのいずれかの関数としてその流速をコントロールする、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記装備が１次プレカラムポンプを含み；及び
前記コントロールユニットが、前記マイクロスイッチングバルブユニットが前記第２ポジションの場合、前記１次プレカラムポンプにより遅い流速を生じさせる、
請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記２次ポンプシステムがシリンジポンプを含み；及び
前記第２流速が前記第１流速の約１０％〜約５０％である、
請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記液体クロマトグラフィ装備が、（ａ）キャピラリー液体クロマトグラフィ装備、及び（ｂ）ナノ液体クロマトグラフィ装備、からなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記マイクロバルブユニットが前記第２ポジションにある場合、前記マイクロバルブユニット及び前記２次ポンプシステムが前記カラム中における実質的に一定の圧力に寄与する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記マイクロバルブユニットが約５μｌより低い内部容積を有し、前記システムに対する死容積を減少する、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記第１流速が、約５０ｎｌ／分〜約４００ｎｌ／分の範囲の値を有し；及び前記第２流速が約５ｎｌ／分〜約５０ｎｌ／分の範囲の値を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記ポストカラム検出器が、少なくとも１つの（ａ）質量分析計、及び（ｂ）各共鳴検出器を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記装備が、前記カラムにわたるマイクロフローの送達を可能とし、及び前記カラムにわたるナノフローの送達を可能にするプレカラムフロースプリットを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記マイクロバルブユニットが前記第２ポジションにある場合、勾配組成を実質的に一定に維持し、及び前記マイクロバルブユニットが第１ポジションにある場合、前記勾配組成を維持する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第２ポジションにおいて、前記マイクロバルブユニットが前記カラムからのアウトフローをブロックすることによってクロマトグラフプロセスを停止し；及び、前記カラムに対する入口流速がプレカラムスプリットを使用して約５０％〜約８０％まで減少する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
移動相がポストカラム検出器による分析用の溶出剤として通過するクロマトグラフカラムを有する液体クロマトグラフィ装備を使用するための、前記検出器に関連するクロマトグラフピークの溶出時間を増加するためのシステムであって、該システムが、
溶出剤流を、通常、前記カラムから前記ポストカラム検出器に選択的に通すが、溶出剤の一部を前記ポストカラム検出器に流体結合する間、ピークパーキングモードにおける前記カラムから溶出剤流を停止する手段；
前記ピークパーキングモードの間の流速を前記通常モードの間の流速と比較して実質的に減少する手段；及び
前記システムが、前記通常モード又は前記ピークパーキングモードのいずれにおいて作動するべきかを選択する前記ポストカラム検出器に結合した手段、
を含むシステム。
【請求項１４】
前記選択停止手段が、複数の双方向バルブ及び該双方向バルブの隣接するものの間における複数のポートを有するマイクロスイッチングバルブユニットを含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
実質的に減少した流速を生む前記手段が、ピークパーキングモードにおいて、前記通常モードの間に存在する流速の約１０％〜約５０％の流速を生じるマイクロシリンジポンプを含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記選択停止手段及び前記生む手段の少なくとも１つが、前記カラムにわたって、前記ピークパーキングモードの間、実質的に一定の圧力に寄与する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１７】
前記選択停止手段及び前記生む手段の少なくとも１つが、前記ピークパーキングモードの間、実質的に一定の勾配組成に寄与する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１８】
クロマトグラフカラムを有し、そこを通して移動相がポストカラム検出器による分析用の溶出剤として通過して、前記検出器に関連するクロマトグラフピークの溶出時間を増加する、液体クロマトグラフィ装備の使用方法であって、以下の工程：
（ａ） 通常モードにおいて、前記カラムからの溶出流を前記ポストカラム検出器に選択的に通し、ピークパーキングモードにおいて、前記カラムからの溶出流を停止する工程；
（ｂ） 前記ピークパーキングモードにおいて、前記溶出の一部を前記ポストカラム検出器に流体結合する工程；
（ｃ）前記ピークパーキングモードの間、前記溶出の前記ポストカラム検出器への送達の実質的に減少した流速を生じる工程；及び
（ｄ）ピークが前記ポストカラム検出器によって検出された場合、ピークパーキングモードで前記システムを作動し、そうでなければ通常モードで前記システムを作動する工程、
を含む方法。
【請求項１９】
前記（ｃ）工程が、前記通常モードの間に存在する流速の約１０％〜約５０％がピークパーキングモードの間の流速になる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記ピークパーキングモードの間、前記カラムにわたって実質的に一定の圧力を維持する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（先行出願との関係）
本出願は、２０００年１０月３日に出願された米国仮出願シリアル番号６０／２３７，５８８号、タイトル「キャピラリー及びナノ液体クロマトグラフィにおける調節された流速変化及び溶出剤プロファイルの広がりのための装置（Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ− ａｎｄ Ｎａｎｏ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（本発明の属する分野）
本発明は、一般的に、液体クロマトグラフィ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）分析に関し、特に、感度を向上し、及び／又は多くのＭＳ／ＭＳデータをナノ−ＬＣ／ＭＳシステムから収集するためのいわゆるピークパーキング手段に関する。
【０００３】
（本発明の背景）
液体クロマトグラフィ（ＬＣ）は、カラム又は管を、典型的に精細に分離された固体またはゲルである固定相材料で充填する分析技術である。図１Ａは、ＬＣシステム１０を示し、ここで、移動相液体源２０は、典型的にシステム１０で試験される種を含む。この種を含む液体は、管等３０を経由して１次ポンプ４０に移り、精細に分離された固体またはゲルを含むカラム５０に入る。パッキングによって占有されていないカラム５０内の領域は、典型的にカラムを通して連続的にポンプされる移動相液体で満たされるようになる。図１Ａにおけるカラムの下端の多孔性プラグ又はフィルター（図示せず）は、パッキングを支持する。当業者は、いくらかの適用において、プレカラム流スプリット構成を使用することを認識するだろう。これは、要素５５として幻影で示した。
カラムから多孔性プラグを通して出る溶出剤流は、管６０（等）を通過し、検出器７０に入るか、さもなければかけられる。これは、カラムを通してポンプされた液体中に存在する種を検出しようとする。図１Ｂに示すように、溶出剤流内の異なる種の濃度（例えば、種Ａ、種Ｂ）は、典型的に異なる時間にピークとなる。ある種が他の種よりカラム及びプラグを早く通過し得るからである。従って図１Ｂにおいて、検出器７０は、種Ａに対する濃度のピークを時間ｔ１に示し、種Ｂに対する濃度のピーク（ここで、小さな振幅のピーク）を時間ｔ２に示す。図１Ｂにおける種Ａに対するより早いピークは、種Ａの比較的早い移動、より小さな分子サイズ等を含む、多くのファクターに起因する。典型的に、検出器７０によって分析された液体及び種Ａは、コンテナ８０に集められ、廃棄される。
【０００４】
システム１０のような多くのＬＣシステムにおける一つの欠点は、液体２０内の多様な種がシステムを通過する場合に適切に検知することが、検出器７０では困難であることである。図１Ｂが２つのどちらかといえば最終的な濃度ピークを示す一方、実際には、種々のピークは、識別するのが困難かもしれない。種々のピークは、非常に近接した濃度ピークを示し、及び／又は時間が非常に近接して生じるかもしれない。
【０００５】
多くのＬＣ分析システムにおいて、液体２０は、入手困難で、かついわゆるナノサイズのキャピラリーカラムで分析される生物学的試料であるかもしれない。言うまでもなく、この大切な液体試料は、その中の種についてのすべての可能性ある情報が得られるまで放棄されないことが望ましい。しかしながら、図１Ａに示されたような従来のＬＣシステムは、従来の検出器で行われ得る分析においていくらか制限される。分析下の流体が、細胞の抽出物及び／又は生物学的流体を含むとき、多量のタンパク質が存在する。プロテオミクスのような適用において、３つのタンパク質を同定することが望ましく、例えば、複雑な医学及び生物学の問題を解決するのを助けることが望ましい。異常細胞における欠乏又は過発現したタンパク質の同定は、特に興味がある。
【０００６】
タンパク質の同定の一般的戦略は、酵素、例えばトリプシンでの消化を行い、その後、ペプチド質量をマトリックス補助レーザー脱離イオン化質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を使用して測定することである。この方法ではタンパク質同定ができない場合の適用において、ペプチドは、フラグメンテーション質量分析計を使用して配列決定しなければならない。測定されたペプチドのアミノ酸配列は、その後、タンパク質データベースからの理論的配列と比較される。
質量分析（ＭＳ）検出は、化合物がイオン化され、かつ気相であることが要求される。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、ペプチド及びタンパク質のような生体分子を取り扱うときに一般に適用される技術である。ＥＳＩでは、電位を電導ニードルの出口に適用して試料及びそれが入った溶媒をスプレーする。溶媒液滴は分解し、溶媒は蒸発する。いわゆるナノスプレーでは、試料を、約５μｍ未満の先端径を有するニードルから、５ｎｌ／分〜５０ｎｌ／分の間の試料流速を使用してスプレーする。ナノスプレーＭＳは、わずかな試料体積中、低フェントモル量のペプチドの分析に使用される。しかしながら、大部分の試料は、直接ナノスプレーＭＳ分析には複雑すぎであり、いくらかの物理的分離が必要である。
【０００７】
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、高分解能ペプチド分離に使用され得るので、ＥＳＩ−ＭＳ分析と共にオンラインで容易に使用し得る。加えて、ＭＳにオンライン接続したＨＰＬＣは、希釈試料のプレ濃縮、脱塩及び界面活性剤の除去に対する可能性を提供する。タンパク質研究における利用可能な試料の量はしばしば限定され、及び比較的高価である。従って、分析を最小限の量の生物学的分子を使用して行うことが非常に重要であり得る。
多くの適用において、特に、比較的少体積の試料を分析にかける場合、検出感度の改善は、特に重要になり得る。濃度感応性検出器、例えば、ＵＶ／Ｖｉｓ吸収度及びＥＳＩ質量分析計を使用する検出感度の改善は、小さな内径（Ｉ．Ｄ．）を有するＨＰＬＣカラムを使用することによって達成され得る。例えば、ペプチド分析の間に増加した感度は、それぞれ５０μｍ及び３００μｍのカラムＩ．Ｄ．を有するナノ及びキャピラリーＬＣを使用することに起因し得る。そのようなカラムを通した移動相の流速は、数ｎｌ／分〜数μｌ／分であり、移動相は、スプリットすることなく直接スプレーされ得る。
【０００８】
最大ＬＣ分離分解能に対し、ピーク幅は最小であるべきだが、狭いピークは、質量分析データに対する取得時間を制限する。好ましくは、分析システムは、ＨＰＬＣシステム内のすべての化合物の分離を可能とする一方（狭いピークと高いピークの容量）、各分離された化合物に対する質量分析データを獲得するための実質的に無制限の時間を与えることができるものである。例えば、キャピラリー又はナノＬＣカラムから溶出する化合物の半分の高さにおけるピーク幅は、一般的に、５秒〜３０秒の範囲内である。この間に、ペプチドは配列決定されなければならず、これには、多段階のＭＳ検出が要求される。ペプチドは同定され、単離され、及び分離されてフラグメントイオンを生成しなければならない。ペプチドの配列決定は、測定したフラグメントスペクトルと計算されたフラグメントスペクトルとを比較することによって行われる。これらスキャンサイクルは約数秒かかり、実験は、クロマトグラフピークの溶出の間の制限されたサイクルだけで実施することしか許されない。
【０００９】
ＨＰＬＣ実験の間の流速を減少すると、溶出時間ウインドウが増加し得る。好ましくは、移動相流速の減少は、質量分析計が化合物を検出するときに、同時に効果的であるべきであり、例えば、Ｌｅｅら「Ａ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｆｏｒ Ｏｎ−Ｌｉｎｅ， Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ」Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９５年， ６７， ４５４９−４５５６頁に示されている。Ｌｅｅは、予備形成された勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）をループ中に貯蔵すること、及び、プログラム可能なシリンジポンプを使用して移動相流速を遅くすることを開示する。低速度が達成される前に遅延時間を補正するために、ポンプの方向を逆転してカラムヘッド圧力を急速に下げようとした。この実験システムがＬｅｅらによって作動するように思われるが、最も広く使用されたＨＰＬＣポンプである往復ポンプで流速を逆転することは典型的に不可能である。さらに、カラム入口圧力を減少するＬｅｅタイプシステムにおける流れ逆転は、カラム床に重篤なダメージとなり、及びカラム寿命を減少し得る。さらに、そのような流れ逆転は、なお分離カラム中にある成分の重篤なバンド広幅化を引き起こし得る。
【００１０】
Ｓｅｔｔｌａｇｅらの米国特許第６，１３９，７３４号明細書は、レストリクターとして機能する２つの異なる長さの溶融シリカキャピラリーを使用する可変流速クロマトグラフィを実施するためのシステムを開示する。しかしながら、実際には、特に、レストリクターが部分的に詰まった場合、その一つがカラムを通して流速をうまくコントロール又は調節することができない。さらに、Ｓｅｔｔｌａｇｅのシステムは、注入された試料をスプリットし、試料を受け入れない手段は、プロテオミクス中における適用を限定する。Ｓｅｔｔｌａｇｅタイプシステムの追加の欠点は、流れ減少による分離効率のロスである。実際に、カラム圧力の軽減によるＳｅｔｔｌａｇｅのカラムを通した流速を事実上減少するために所定の時間が要求される。残念ながら、この時間の間、溶出ピークのかなりの部分は、すでにＭＳによって検出され得、これによって感度における流れ減少の利点は最小になる。
従って、改善されたＬＣ分析システムであって、試験下の液体試料内における種に関する良好な分解能又は検出情報の粒度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）を提供するものが要求される。さらに、そのようなシステムは、廃棄される前に、好ましくは、クロマトグラフの結果の損失なしに溶出ピークを広幅化する一方で溶出剤流速の良好なコントロールを可能にすることにより、できるだけ多くの情報を試料から抽出するための追加の分析ツールを提供するべきである。バイオテクノロジーの用途においては、このような向上したさらなるデータが提供されるだけでなく、そのようなデータが提供される一方で比較的少量の試料が使用される。
本発明は、このようなシステム及びこれを実施する方法を提供する。
【００１１】
（本発明の概要）
本発明は、液体クロマトグラフィ検出データの改善された分解能を可能にする再構成可能なマルチモードポストカラム分析システムを提供する。本発明は、素早くかつ回転可能に再構成できる電気的に作動可能な（ａｃｔｕａｂｌｅ）２ポジションマルチポートマイクロスイッチングバルブユニットを含む。通常（又はＭＳ）モードにおいて、マイクロスイッチングバルブユニットは、フローセルを通して質量分析計（ＭＳ）ユニットに直接入るカラム溶出剤と流体係合を与えるために構成される。しかしながら、ピークパーキングモードにおいて（ＭＳユニットが好ましくはＭＳ／ＭＳモードで作動している間）、マイクロスイッチングバルブユニットは、通常モードカラム流を妨げ、勾配を停止するために構成され、その間、興味の検出ピークを実質的に減少した流速でＭＳユニットを通して流す。本発明が実施され得る基礎となるカラムシステムは、通常モード流速を確立するが、その速度は、本発明がピークパーキングモードにあるときは減少する、プレカラム１次ポンプを含む。
本発明は、さらに、ピークパーキングモードにおいてＭＳユニットと流体係合を与えるマイクロスイッチングバルブポートの１つに結合されたマイクロシリンジポンプを含む。マイクロシリンジポンプは、通常ＭＳ流速よりも実質的に低い流速を発生し、マイクロスイッチングバルブを経由して、マイクロスイッチングバルブとＭＳとの間のカラム内容物をＭＳに移送する液体を送達する。それ自体、マイクロシリンジポンプは２次ポンプとして機能し、及び、ＭＳ／ＭＳ流速を、プレカラムポンプで確定した通常モード流速とは独立して調節するためのメカニズムを提供する。ＭＳに結合したコントロールユニットは、ＭＳモードからＭＳ／ＭＳ又はパーキングモードへ、ＭＳモードへ等の再構成を指揮するマイクロスイッチングバルブユニット中のポートの操作を指揮し、さらにＭＳ／ＭＳモードにおける流速を減少するためのプレカラムポンプを指揮し得る。マイクロシリンジポンプは、分離した化合物をＭＳ中に移送し、減少したＭＳ／ＭＳモード流速は、クロマトグラフカラムを通した通常モード流速と、マイクロシリンジポンプによって送達された実質的により遅い流速との比によって、ＭＳ検出のデータ取得時間を増加する。
【００１２】
検出ピークの最後では、コントロールユニットは、マイクロスイッチングバルブユニットを指揮してＭＳモード構成に戻し、１次ポンプを指揮して通常送達流速及び勾配状態に戻す。モード変化手順は、得られたクロマトグラムの各検出ピークに対して行われ得る。ＭＳ／ＭＳモードにおける流速は、通常ＭＳ流速と比べて２０％以下であってもよく、この減少は、興味の検出ピークにわたる分析時間を延長し得る。その結果、所望の前駆イオン選択のため、及びＭＳ／ＭＳ分析のための単一溶出ピークの状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）の範囲内における測定時間は、適宜延長されてもよい。
本発明の他の特徴及び利点は、添付図面と共に、好ましい態様が詳細に述べられた以下の記述から明らかになるだろう。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ここで、図２Ａ−２Ｃを参照して記載すると、本発明は、流速をキャピラリー及びナノ液体クロマトグラフィの間に停止でき、及びマイクロシリンジポンプを２次ポンプとして使用する通常流速より実質的に低いときに、検出した溶出ピークを同時に移送することができる。減少した流速は、ピーク溶出時間を増加し、及びデータ取得時間を結果的に増加する。本発明は、ナノＬＣ条件下でさえ、比較的小さな死容積を示し、クロマトグラフ分解能を維持することができる。
ここで図２Ａに移ると、本発明の態様に従うマルチモードシステム１００が示されている。システム１００は、カラム５０、例えば、図１Ａに関して使用されかつ開示されたようなＨＰＬＣカラムの下流で使用されて、クロマトグラフカラム、例えばカラム５０を使用して分離される化合物の溶出時間を調節してもよい。マイクロスイッチングバルブ１４０は、システム１００を通常又はＭＳモードとピークパーキング又はＭＳ／ＭＳモードとの間で再構成するために使用される。マイクロスイッチングバルブは、ツーウェイローターメカニズムを含み、好ましくは６ポート、及び６流体保有区域を含み、及び、典型的におそらく１００ｍｓ以内に回転可能かつ電気機械的に再構成できる。通常又はＭＳモードにおいて、溶出剤は、質量分析計（ＭＳ）ユニット２００に通常の流速、おそらく５０ｎｌ／分〜３００ｎｌ／分で流れ、典型的なピーク溶出時間は、約５秒〜３０秒である。対照的に、ピークパーキング又はＭＳ／ＭＳモードにおいて、ＭＳユニット２００への流速は、実質的に減少する。「実質的に減少」は、流速が通常からおそらく４〜１０、典型的には５ｎｌ〜約５０ｎｌ／分だけ減少することを意味する。一つの態様において、ピークパーキング（又はＭＳ／ＭＳ）流速は、たった約２５ｎｌ／分であり、ピーク溶出時間は、約１〜３分延長される。記載するように、ピークパーキング又はＭＳ／ＭＳモードは、カラム５０から溶出するクロマトグラフピークの向上した分解能を有利に促進する。
【００１４】
図２Ａにおいて、カラム５０からの溶出剤出口は、典型的に、管６０、高圧コネクタ１１０、好ましくはＵＶフローセル（ＵＶ ＦＣ）１３０を通して管１２０を経由して結合される。高圧コネクタ１１０は、カラム５０の出口とＵＶ ＦＣ１３０の入口とを結合し、及びＵＶ ＦＣ１３０の出口とマイクロスイッチングバルブユニット１４０の入口とを結合する。好適な高圧コネクタは、マイクロタイトＴＭコネクタで、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ， ＷＡ， ＵＳから入手できる。他の相互接続は、高圧に耐えることを要せず、標準テフロンＴＭタイプスリーブを、例えば１９０、２３０において使用してもよく、この相互接続は、約１０バール（１５０ｐｓｉ）までの圧力に耐え得る。ＵＶ ＦＣ１３０の典型的溶融シリカ出口ポートからの出口は、管１２０及び第２高圧コネクタ１１０を経由してマイクロスイッチングバルブ１６０の入口ポート１５０に結合される。好ましくは、管１２０は、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）材料のスリーブ、ナット及び金環を含むが、他の管材料を使用してもよい。これとは別に、フローセル１３０からの流体結合が直接、例えば、マイクロフィッティングを使用して達成されてもよい。
【００１５】
マイクロスイッチングバルブ１６０は、好ましくは、示すように、６つの流体保有区域又は領域１６０−１、１６０−２、１６０−３、１６０−４、１６０−５、１６０−６の間に結合された６ポートＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６を有する。質量分析計ユニット２００からコントロールシグナルを受けるために結合されたコントロールユニット１７０からの指揮下、ポートは、流体流をポートに結合された区域に向けさせることができ、又は流体流をその区域にブロックすることができる（実際に、コントロールユニット１７０は、ＭＳユニット２００内に含有する統合回路ボードであってもよい。）。例えば、ポートＶ１は、マイクロスイッチングバルブ入口１５０、区域１６０−１と、ポートＶ２との間で流体係合することができ、又はポートＶ１は、一方で、入口１５０、区域１６０−６と、ポートＶ６との間で流体係合を与えることができる。
さらに図２Ａで示しように、ポートＶ２は、管１８０及びすべての必要なインターフェース１９０を経由してＭＳユニット２００用イオン源に結合される。実際、管１８０は、１５μｍ〜２５μｍの内径を有する溶融シリカキャピラリー（１４０）の一部であってもよいが、他の寸法を有する他の材料も使用してよい。マイクロスイッチングバルブ入口１５０と関連して、第２ポートＶ６は、プラグ等２１５でブロックされた管２１０の一部に結合される。他のポートＶ３は、キャピラリー管２２０の一部及びすべての必要なインターフェース２３０を経由してシリンジポンプユニット２４０（ＳＰ）に結合される。他のポートＶ４は、管２４０の出口部分に結合されていて、その遠位末端は、管２５０内の溶出剤が容器９０中に流体８０として収集されるようになっている。
【００１６】
好ましくは、シリンジポンプユニット２４０は、２５μｌまたは５０μｌガスタイトシリンジを含み、ＳＰ２４０は、約５ｎｌ／分〜５０ｎｌ分の実質的に一定の流速に設定され得る。記載するように、ＭＳ／ＭＳモードにおける減少した流速を導入するＳＰ２４０の能力は、クロマトグラフピークの広幅化することができる。図２Ａの態様において、減少した流れは、ＳＰ２４０からマイクロスイッチングバルブ１４０に、好ましくは２５μｍ〜５０μｍの内径を有する溶融シリカ２２０の部分を経由して結合される。
図２Ｂ及び図２Ｃを比較すると、コントロールユニット１７０（又はコントロールメカニズム）は、ポートＶ１〜Ｖ６のセッティングを構成して流体流を所望の構成又は方向に、マイクロスイッチングバルブ１４０及びＭＳユニット２００を通して方向づけすることができるように理解されるだろう。好ましくは、マイクロスイッチングバルブユニット１４０及び上流１次ポンプ４０（図１Ａ参照）は、例えば、コントローラーユニット１７０からの、通常の電気接触クロージャーによってトリガーされる。ＭＳユニット２００及び／又はコントローラーユニット１７０であってデータ依存性接触クロージャーを提供し得るものは、容易に利用できる。典型的に、ソフトウエアは、ＭＳユニット２００及び／又はコントローラーユニット１７０をコントロールし、トリガー接触クロージャーを、ＭＳユニット２００が前もってセットされた閾値を越えるシグナルを検出したときのみ発生する。従って、ＭＳユニット２００及び／又はコントローラーユニット１７０は、システム１００をＭＳモードからピークパーキングＭＳ／ＭＳモードに自動的に、又はその逆で、ＭＳ２００によって検出されたシグナルの関数として動的に切り替える（ｔｏｇｇｌｅ）ことができる。ＭＳ／ＭＳモードにおいて注意すべきは、１次ポンプ４０は、好ましくはコントローラーユニット１７０によって遅くするように指令され、シリンジポンプ２４０は、より容易に非常に微細で比較的遅い流速を達成することができることである。
【００１７】
図２Ｂにおいて、コントロールユニット１７０は、ポートＶ１−Ｖ６の位置を指令し、システム１００を通常ＭＳモード分析、つまり、比較的早い流速によって一部特徴づけられる分析を行うように構成する。通常モードにおいて、１次プレカラムポンプ４０（図１Ａ参照）は、比較的高い流速、約２００ｎｌ／分を達成する。マイクロスイッチングバルブ１４０内において、クロスハッチをつけた区域、例えば、１６０−２、１６０−４、１６０−６は、３つの区域に隣接するポートの設定によって、流体流が起きない区域を示す。通常ＭＳモードにおいて、ポートＶ１は、流体係合することができ、カラム５０から、及びＵＶ ＦＣ１３０からの溶出剤流体が入口１５０から入り、マイクロスイッチングバルブ区域１６０−１ｂを経由し、管１８０を通してＭＳユニット２００に通過する。図２Ｂにおける想像線は、この興味の流体流路を示す。図２Ｂに示す通常モードにおいて、もはや興味のない液体は、区域１６０−３、ポートＶ４、管２５０を経由して通過し、廃棄８０として容器９０に現れることを注記する。
【００１８】
ここで、図２Ｃに示すピークパーク又はＭＳ／ＭＳモードを比較する。図２Ｃの構成において、コントロールユニット１７０は、ここで、ポートＶ１に区域１６０−６及びポートＶ６、及びその遠位末端がプラグ２１５でブロックされている区域２１０と流体係合させる。ポートＶ２は、ここで、区域１６０−２、管１８０及びＭＳ２００と流体係合し、かつポートＶ３、区域２２０及びＳＰ２３０と流体結合する。最終的に、ポートＶ５は、区域１６０−４と係合し、これはポートＶ４及び管２５０と流体係合する。マイクロスイッチングバルブ１４０をコントロールすることに加え、ＭＳユニット２００及び／又はコントロールユニット１７０は、システム１００がピークパーク又はＭＳ／ＭＳモードにある間、プレカラムポンプ４０も指揮してその流速を減少するだろう。
カラム流速は、興味の化合物がＭＳユニット２００のソースに溶出するとすぐに、ミクロスイッチングバルブユニット１４０によって停止される。より具体的に、ＭＳ２００またはコントロールユニット１７０からの電気信号又はクロージャーは、マイクロスイッチングバルブユニット１４０を新しいポジション、ここではピークパーキングポジションに回転させる。ここで、ＭＳユニット２００は、好ましくはＭＳ／ＭＳモードで作動する。同時に、勾配は停止し、及びマイクロシリンジポンプ２４０は、キャピラリー管２２０、ポートＶ３、区域１６０−２、及びポートＶ２、管１８０を通して作動し、ピークをＭＳ２００イオン化源に導く。マイクロシリンジ２４０は、２次ポンプとして機能し、ピークパーキングモード流速を、プレカラムポンプ４０によって確立された流速と実質的に独立して確立すると理解される。
典型的にマイクロシリンジ２４０は、導入期の流速を１０分の１にすることができるが、他の流速変化を使用してもよい。しかし、有利に、ナノスケールＬＣと関連する分析物濃度の改善及び増加したイオン化効率保持される。従って、本発明は、クロマトグラフピークの選択、及びＭＳ／ＭＳによる増加した検出に対するピークの広幅化を、クロマトグラフの実行における最小限の損失で可能にする。
【００１９】
システム１００を、ペプチド又は他の生物学的化合物のキャピラリー又はナノＬＣ ＭＳを行うために使用してもよい。マイクロスイッチングバルブ１４０の適切なコントロールスイッチングによって、カラム５０を通した移動相流は、直ちに停止する。同時に、ＨＰＬＣシステムの勾配形成が停止し、及び勾配又は１次ポンプ４０（図１Ａ参照）の流速は、例えば、コントロールユニット１７０のコントロール下、初期値の約５０％〜約８０％まで減少する。プレカラムスプリット、例えば図１Ａの５５と組み合わせた流速におけるこの減少は、実質的に一定のカラム圧力を維持するために十分である。分離された化合物は、２次ポンプとして働くシリンジポンプ２４０の流速で、ＭＳユニット２００に移送される。
ＭＳユニット２００及び／又はコントローラー１７０からの次の接触クロージャー又はパルスを受け取ると、電気的に起きる機械的な回転により、マイクロスイッチングバルブ１４０を含むポートが通常モードに戻って再構成し、カラムを通した通常流速が再確立し、勾配プログラムが継続する。通常モードにおいて、コントロールユニット１７０は、１次プレカラムポンプ４０（図１Ａ参照）を指揮して通常流速操作を再開する。マイクロスイッチングバルブユニット１４０が通常モード構成に回転すると、１次ポンプ４０がコントローラー１７０によってそのもとの送達体制及び勾配条件に戻す。そのような手順は、クロマトグラフの各ピークに対して自動化した方法で行ってもよいことを注記する。
【００２０】
図２Ａ〜２Ｃに言及すると、ナノカラム５０は、好ましくは高圧コネクター１１０を使用してＵＶ／Ｖｉｓフローセル１３０に結合される。フローセル１３０の出口側を、マイクロスイッチングバルブ１４０、０．１５ｍｍポート直径を有するバルコケミナート（Ｖａｌｃｏ Ｃｈｅｍｉｎｅｒｔ）マイクロスイッチングバルブにつけた。このユニットは、（カタログナンバー）Ｃ２−ＯＯＲ６ローターを有するカタログナンバーＣ２−０００６Ｄであり、電気的マイクロドライブにマウントされている。マイクロスイッチングバルブ１４０に対する択一的ソースは、アップチャーチ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ）Ｖ−４３５ ６ポートマイクロスイッチングバルブであり、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ， ＷＡ， ＵＳから入手可能である。マイクロシリンジポンプユニット２４０は、好ましくはハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ガスタイト２５μｌタイプ１７０２シリンジを含み、ハーバードアパラチャスモデル（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｍｏｄｅｌ）１１ＶＰＦシリンジポンプにマウントされている。マイクロシリンジポンプユニット２４０は、上述したように、２５ｎｌ／分のピークパーキング流速を送った。上記コンポーネントは、例示的であり、他のコンポーネントを使用してもよい。
【００２１】
スタンダードモードにおいて、マイクロスイッチングバルブ１４０を、移動相を、ポートＶ１、区域１６０−１、管１８０を通してＭＳユニット２００に向けさせる。ピークパーキングモードにおいて、コントロールユニット１７０は、マイクロスイッチングバルブ１４０内の種々のポートを切り替え、移動相を管２１０の末端においてプラグ２１５によって止める。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析を、ハイブリッド四重極／飛行時間型質量分析計のＱ−ＴＯＦを正イオンモードで行った。このＭＳユニットは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ， Ａｌｔｒｉｎｃｈａｍ， Ｃｈｅｓ．， ＵＫから入手したが、他のユニットを代わりに使用することもできる。ペプチドの配列決定は、例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を、システム１００を使用して自動化した方法で行った。
【００２２】
クロマトグラフ実行におけるピークパーキングの実証は、２つのＵＶ／Ｖｉｓ検出器を使用して行った。第１検出器、例えば、ＩＶ ＦＣ １３０は、移動相をナノＬＣカラムの後に直接モニターし、及び第２検出器、例えばＭＳ２００を、ＵＶ吸収度をピークパーキングの後に測定するために使用した。実際の適用において、第２ＵＶ／Ｖｉｓ検出器は、質量分析計と類似する。図３Ａは、通常流速条件下で（例えば、比較的早い流速で）、チトクロムＣのトリプシン消化のナノＬＣ分離について、ＵＶ ＦＣ１３０から得たＵＶクロマトグラムを示す。対照的に、図３Ｂは、システム１００がピークパーキングモードで作動する場合のＭＳユニット２００からの検出結果を示し、２つの化合物の検出を示し、ピーク１とピーク４として示されている。このピークに対し、流速は、ＳＰ２４０によって少なくとも部分的に減少する。図３Ｂについて言及すると、化合物がＭＳユニット２００のフローセル部に入ったとき、コントロールユニット１７０は、マイクロスイッチングバルブ１４０をＭＳ通常モードからピークパーキングＭＳ／ＭＳモードに切り替え、減少した流速が結果として得られる。ピーク１及び４の溶出は、マイクロシリンジポンプ２３０の作用に起因する、より低い流速（ここでは５０ｎｌ／分）によってかなり広幅化されることが図３Ｂから明らかである。化合物がＭＳ２００を通過するとき、コントロールユニット１７０からの第２コントロールパルスは、マイクロスイッチングバルブユニット１４０における種々のポートをもとの通常モードに戻し、流速は、０．２μｌ／分にリセットされた。その間、残留ピークは、「パーク」され、興味のピークが終わった後に検出され得る。
【００２３】
カラム５０とＭＳ検出器２００との間に配置されたマイクロスイッチングバルブユニット１４０の影響を広幅化するすべてのバンドが許容され得ることを注記する。実際は、図３Ａのクロマトグラフにおける通常溶出ピークと、図３Ｂのクロマトグラフにおける拡大溶出ピークを比較すると、ピーク幅がわずかに大きいだけで、これは、クロマトグラフの分解能が全体の装置内で維持されることを示す。
ピークパーキングを使用するＭＳ検出の増加した感度を実証するＬＣ−ＭＳ試験の結果をペプチドニューロテンシンに対する図４Ａ及び４Ｂに示す。図４Ａは、２００ｎｌ／分の流速を使用する通常モードＬＣ条件下でのニューロテンシンの選択されたイオントレースを示し、１６秒のハーフハイトでのピーク幅を示す。図４Ｂは、ＭＳ／ＭＳモードにおける同じトレースを示し、ここで、ハーフハイトピーク幅は、たった２５ｎｌ／分減少した流速で１０３秒である。可能性ある前駆時間およびＭＳ／ＭＳ取得時間において、６倍より大きい増加が得られたことは注目すべきである。
図４Ａおよび４Ｂのデータは、ナノＬＣ実験におけるシステム１００で収集した。分析は、ＮＡＮ７５キャリブレーター及び内径７５μｍ×長さ１５ｃｍ、ＰｅｐＭａｐＴＭＣ１８，３μｍ固定相で充填されたナノ−ＬＣカラムを備える、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＣシステムで行った。
【００２４】
システム及び言及したコンポーネントは、オランダアムステルダムのＬＣパッキング社から入手可能である。１次ポンプ装置は、プレカラムフロースプリットに基づき、アイソクラティック及び勾配条件に対して高度に再現性のマイクロ及びナノリットルフローデリバリーができる（例えば、共同発明者Ｊ．Ｐ． Ｃｈｅｒｖｅｔによる欧州特許番号０４９５２５５号参照）。移動相Ａは、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水であり、移動相Ｂの有機溶出剤は、０．０４％ＴＦＡを含む８０％アセトニトリル／水である。
ペプチドは、約３０分で５％〜４０％の勾配で溶出された。ＬＣカラムを通した流速は、２００ｎｌ／分だった。チトクロムＣの消化物（１．６ｐｍｏｌ）を注入した。チトクロムＣ及びニューロテンシンを米国ミズーリ州セントルイスＳｉｇｍａ， Ｉｎｃから入手した。チトクロムＣを、カルボン酸アンモニウム１ｍｌ（ｐＨ８）中、タンパク質：酵素比が５０：１、３７℃で、シークエンス級修飾トリプシンで一晩消化した。シークエンス級修飾トリプシンは、米国ウィスコンシン州マジソンのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から入手できる。
【００２５】
図５Ａ及び５Ｂは、上記手順のＭＳ感度の結果を示す。図５Ａは、ニューロテンシンのクロマトグラフピークに沿って合計されたＭＳスペクトルを示す。一方、図５Ｂは、合計されたＭＳニューロテンシンスペクトルを示し、減少した流速条件に起因する向上した分解能を示す。図５Ａにおける通常モード２００ｎｌ／分に対するイオンカウントは３３３０である一方、図５Ｂにおける減少した２５ｎｌ／分ＭＳ／ＭＳ流速に対するイオンカウントは、２５，２００であり、８倍増加する。
要約すると、ピークパーキングＭＳ／ＭＳモードにおいて、本発明は感度を向上し、及び／又は、さらに多くの時間単位のＭＳ／ＭＳデータをナノ−又はＬＣ／ＭＳシステムから収集する。マイクロスイッチングバルブ及びマイクロシリンジポンプでのピークパーキングは、カラム流を妨げ、勾配を停止する一方で、興味のピークを実質的に低い流速でＭＳ検出器を通して移動する。マイクロスイッチングバルブを電気的に再構成することは、システムモードを、通常モードからピークパーキングモードに、通常モードに、ピークパーキングモードに等、変化する。ピークパーキングモードにおいて、マイクロシリンジポンプは、通常モードで存在するプレカラム１次ポンプ流速とは実質的に独立して、減少した流速を生成し、及びマイクロスイッチングバルブポートは、カラムから溶出する物質（又は「ピーク」）を保持するのに役立つ。マイクロシリンジは、興味のピークを低いＭＳ／ＭＳモード流速で、ＭＳ検出ユニットに移送する。ＭＳ検出感度は、与えられた物質のより多くのスキャン、言うなれば、与えられた前駆イオンのより多くのスペクトルが得られ、及び／又は複数の共溶出物質に対するより多くのＭＳ／ＭＳデータが得られる。
修正及び変異を、以下の請求の範囲によって定義されるような本発明の主題及び精神から逸脱することなく、開示された態様に対して行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】先行技術に基づく、従来の液体クロマトグラフィ（ＬＣ）分析システムを示す。
【図１Ｂ】先行技術に基づく、図１Ａに示すようなシステムで検出された種々の種の濃度データを示す。
【図２Ａ】本発明に基づく、マイクロスイッチングバルブユニットをコントロールしてマイクロスイッチングバルブの領域を通して溶出剤流速を変化することができ、カラム分離した化合物の溶出時間を延長して検出を向上することができる、ピークパーキングシステムを示す。
【図２Ｂ】本発明に基づく、マイクロスイッチングバルブユニットが通常ＭＳ溶出モードを生じるように構成されている、図２Ａのシステムを示す。
【図２Ｃ】本発明に基づく、マイクロスイッチングバルブユニットがピークパーキング又はＭＳ／ＭＳ溶出モードであってその減少した流速が検出を向上するものを生じるように構成されている、図２Ａのシステムを示す。
【図３Ａ】先行技術に基づく、チトクロムＣのトリプシン消化の通常モードＵＶクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】本発明に基づく、ピーク１及び４に対して減少した流速を有する、チトクロムＣのトリプシン消化のピークパーキングモードＵＶクロマトグラムを示す。
【図４Ａ】先行技術に基づく、通常モードで得られた、ニューロテンシンに対するイオンクロマトグラムを示す。
【図４Ｂ】本発明に基づく、ＬＣ／ＬＣモードにおける減少した流速条件に起因する向上した分解能を示す、ニューロテンシンに対するイオンクロマトグラムを示す。
【図５Ａ】先行技術に基づく、ニューロテンシンに対する加算（ｓｕｍｍｅｄ）ＭＳスペクトルを示す。
【図５Ｂ】本発明に基づく、減少した流速条件に起因する向上した分解能を示す、ニューロテンシンに対する加算ＭＳスペクトルを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004510979.tif 000040
【国際調査報告】
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2004510979.tif 000042
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