(57)【要約】本発明は、一本及び二本鎖の抗体、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)分子、T細胞受容体(TCR)及びその類などを含む抗体、抗体ドメイン、あるいはそのフラグメントのような抗原結合部位をコードした核酸のセット又はライブラリーを作製する方法を開示する。本発明は、飽和変異誘発、合成ライゲーション再集合、それらの組み合わせなどによって鋳型核酸を変化させることによって、抗体や特異的な領域（specific domain) あるいは抗体のフラグメント（例えば、Fab 又はFc ドメイン)のような変種抗原結合部位を作製する方法を提供する。ある面で本発明は、全ヒトあるいはヒト化抗体を作製する方法、又は安定性、持続性、発現性、生成性、酵素活性性、アフィニティ、結合力、局在性、及びその他の免疫学的な特質に関する最適な特性を得るためにそれらの抗体を進化させる方法を提供する。これらの方法によって作製されるポリペプチドは、新規のキャピラリーアレイプラットフォームを用いて分析され、そのプラットフォームはこれまでにはない超ハイスループットスクリーニングを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の修飾した抗原結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する方法であって、その修飾した抗原結合部位が、初期抗原結合部位をコードする配列を含む初期核酸に由来するものであり、
a) ある初期抗原結合部位をコードする初期核酸を提供し、
b) 初期核酸内における多数の標的コドンで天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異されたオリゴヌクレオチドのセットを提供し、また、
c) アミノ酸変種の配列を変異された各アミノ酸コドンでコードする、抗原結合部位をコードする変異核酸のセットをつくりだすために変異されたオリゴヌクレオチドのセットを用いるものであり、
これにより多数の修飾した抗原結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｂ）が、各標的コドンで19種すべての天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異オリゴヌクレオチドのセットを提供するものであり、これにより19種すべて可能な天然に存在するアミノ酸の変化を変異された各アミノ酸コドンで作製するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
変異核酸によってコードされる抗原結合部位をコードするポリペプチドが発現されるように、抗原結合部位をコードする変異核酸を発現することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
変異オリゴヌクレオチドのセットが、変異される各コドンのために19倍に縮重された変異オリゴヌクレオチドを含み、19倍に縮重された各変異オリゴヌクレオチドは、相同的な第一配列、および１つの縮重トリプレットの第二配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
抗原結合部位が、一本鎖抗原結合ポリペプチド、Fabフラグメント, Fdフラグメント, Fcフラグメント, F(ab')2 フラグメント, Fvフラグメント, 及び相補性決定領域(CDR)を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
抗原結合部位ポリペプチドが、さらに抗体ポリペプチドを含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
抗原結合部位ポリペプチドが、さらにT細胞受容体(TCR)の抗原結合部位を含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
抗原結合部位ポリペプチドが、さらにT細胞受容体(TCR)を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
抗原結合部位ポリペプチドが、さらに主要組織適合抗原複合体 (MHC) 分子の抗原結合部位を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
抗原結合部位ポリペプチドが、さらに主要組織適合抗原複合体 (MHC) 分子を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
主要組織適合抗原複合体 (MHC) 分子が、クラスI分子を含む請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
主要組織適合抗原複合体 (MHC) 分子が、クラスII分子を含む請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ステップ (a) の核酸が、哺乳類のポリペプチドをコードする核酸に由来する請求項１記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類のポリペプチドが、ヒトのポリペプチドを含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
哺乳類のポリペプチドが、抗体、T細胞受容体、クラスI MHC分子、およびクラスII MHC分子からなるグループから選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ステップ (a) の核酸が、抗原結合部位をコードするヒトの核酸に由来する請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ステップ (a) の核酸が、抗原結合部位をコードするヒトの核酸配列を含むファージに由来し、これによりファージが抗原結合部位を発現する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ステップ (a) の核酸が、抗原結合部位をコードするヒト核酸の配列を含むヒト以外の哺乳類に由来し、これによりヒト以外の哺乳類が抗原結合部位を発現する請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ヒト以外の哺乳類が、ヒト以外の形質変換（トランスジェニック）哺乳動物である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物が、マウスである請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
抗原結合部位内のアミノ酸コドンのうち最低でも２個のコドンが変異される請求項１記載の方法。
【請求項２２】
抗原結合部位内のすべてのアミノ酸コドンが変異される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
抗体ポリペプチド内のすべてのアミノ酸コドンが変異される請求項６記載の方法。
【請求項２４】
T細胞受容体(TCR)内のすべてのアミノ酸コドンが変異される請求項８記載の方法。
【請求項２５】
主要組織適合抗原複合体 (MHC) 分子内のすべてのアミノ酸コドンが変異される請求項１０記載の方法。
【請求項２６】
縮重された変異オリゴヌクレオチドが、第一の相同配列、縮重トリプレットの第二の配列、および第三の相同配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項２７】
各縮重オリゴヌクレオチドが、第一の相同配列、多数の縮重トリプレットの第二の配列、および第三の相同配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項２８】
発現された抗原結合部位ポリペプチドを、抗原に特異的に結合する能力をみるためにスクリーニングすることをさらに含む請求項３記載の方法。
【請求項２９】
初期抗原結合部位ポリペプチドによって特異的に結合されることが可能な抗原に特異的に結合する能力をみるために発現させた抗原結合部位ポリペプチドをスクリーニングすることをさらに含む請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
初期抗原結合部位の抗原に対する親和性又は特異性と比べ、増加した抗原結合親和性又は抗原結合特異性で抗原結合部位変種を同定することを含む請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
初期抗原結合部位の抗原に対する抗原結合親和性又は結合特異性と比べ、減少した抗原結合親和性又は抗原結合特異性で抗原結合部位変種を同定することを含む請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
ステップ(a)の初期の核酸を至適化した指向変異システムから成る方法によって変異させることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３３】
ステップ(a)の初期の核酸を合成ライゲーション再集合法を含む方法によって変異させることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３４】
発現された抗原結合部位ポリペプチドを抗原に特異的に結合する能力をみるために、固体状態において発現された抗原結合部位ポリペプチドの発現を含む方法によってスクリーニングすることを含む請求項３記載の方法。
【請求項３５】
発現された抗原結合部位ポリペプチドを、キャピラリーアレイを含む方法により、抗原に特異的に結合する能力をみるためにスクリーニングすることを含む請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
発現された抗原結合部位ポリペプチドを、二穴コンテナを含む方法により、抗原に特異的に結合する能力をみるためにスクリーニングすることを含む請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
二穴コンテナが、キャピラリーアレイを含む請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
二穴コンテナキャピラリーアレイが、ギガマトリックスTM  (GIGAMATRIX 登録商標)である請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
発現された抗原結合部位ポリペプチドを、酵素免疫測定法(ELISA法)を含む方法により、抗原に特異的に結合する能力をみるためにスクリーニングすることを含む請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
発現された抗原結合部位ポリペプチドを、抗原結合部位ポリペプチドのファージディスプレイを含む方法により、抗原に特異的に結合する能力をみるためにスクリーニングすることを含む請求項３記載の方法。
【請求項４１】
発現された抗原結合部位ポリペプチドを、液相で発現された抗原結合部位ポリペプチドの発現を含む方法により、抗原に特異的に結合する能力をみるためにスクリーニングすることを含む請求項３記載の方法。
【請求項４２】
発現された抗原結合部位ポリペプチドを、抗原結合部位ポリペプチドのリボソームディスプレイを含む方法により、抗原に特異的に結合する能力をみるためにスクリーニングすることを含む請求項３記載の方法。
【請求項４３】
子孫抗原結合部位をコードする変異核酸のセットが、多数のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼに基く増幅によるステップ(a)の核酸を増幅することによって作製される請求項１記載の方法。
【請求項４４】
増幅が、ポリメラーゼチェーンリアクション (PCR) を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
初期抗原結合部位をコードする配列を含む初期核酸に由来する多数の修飾した抗原結合部位をコードする核酸のライブラリーであって、下記のステップを含む方法によって作製されるライブラリー。
(a)  初期抗原結合部位をコードする初期核酸を提供し；
(b)  天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異させたオリゴヌクレオチドのセットを提供し、その際その天然に存在するアミノ酸変種が初期核酸内にある多数の標的コドンでコードさせ、
(c)  抗原結合部位をコードする変種核酸のセットを作製するため変異させたオリゴヌクレオチドのセットを用い、その際変種核酸が変異された各アミノ酸コドン上でアミノ酸変種の配列をコードするものであり、
これにより、多数の修飾した抗原結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する。
【請求項４６】
鋳型抗体から変異抗体のライブラリーを作製する方法であって、下記のステップを含む方法。
(a)  鋳型抗体をコードする初期核酸を提供し；
(b)  天然に存在するアミノ酸変種を初期核酸内にある多数の標的コドンでコードする変異されたオリゴヌクレオチドのセットを提供し；そして、
(c)  変異された各アミノ酸コドンでコードされたアミノ酸変種の配列を変異した抗体をコードする変異核酸のセットを作製するために変異されたオリゴヌクレオチドのセットを用い、
これにより、多数の変異抗体をコードする核酸のライブラリーを作製する。
【請求項４７】
ステップ(b)が、各標的コドンのために19種すべての天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異されたオリゴヌクレオチドのセットを提供し、これにより19種すべて可能な天然に存在するアミノ酸の変化を変異された各アミノ酸コドンで作り出すものである請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
抗体が、Fabフラグメント, Fdフラグメント, Fcフラグメント, F(ab')2 フラグメント, Fvフラグメント, および相補性決定領域(CDR)を含むポリペプチドから成るグループから選定される請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
多数のオリゴヌクレオチドが、変異される各コドンのための縮重オリゴヌクレオチドを含み、その際その各縮重オリゴヌクレオチドは、第一の相同配列、および縮重トリプレットの第二配列を含む請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
抗体をコードする子孫ポリヌクレチドのセットが、多数のオリゴヌクレオチドを用い、ステップ(a)の核酸を増幅することによって作製される請求項４６記載の方法。
【請求項５１】
鋳型抗体に由来する変異抗体のライブラリーであって、下記のステップを含む方法により作製されるライブラリー。
(a)  鋳型抗体をコードする初期核酸を提供し；
(b)  天然に存在するアミノ酸変種を初期核酸内での標的コドンでコードする変異されたオリゴヌクレオチドのセットを提供し；
(c)  変異された各アミノ酸コドンにアミノ酸変種の配列をコードした抗体をコードする変異核酸のセットを作り出すために変異されたオリゴヌクレオチドのセットを用い、
これにより多数の変異抗体をコードする核酸のライブラリーを作製する。
【請求項５２】
鋳型T細胞受容体(TCR)から変異T細胞受容体(TCR)のライブラリーを作製する方法であて、下記のステップを含む方法。
(a)  鋳型T細胞受容体(TCR)をコードする初期核酸を提供し；
(b)  天然に存在するアミノ酸変種を初期核酸内での多数の標的コドンでコードする変異されたオリゴヌクレオチドのセットを提供し；そして、
(c)  変異された各アミノ酸コドンでアミノ酸変種の配列をコードしたT細胞受容体(TCR)をコードする変異核酸のセットを作り出すために変異されたオリゴヌクレオチドのセットを用い、
これにより、多数の変異T細胞受容体(TCR)をコードする核酸のライブラリーを作製する。
【請求項５３】
鋳型T細胞受容体(TCR)に由来する変異T細胞受容体(TCR)のライブラリーであって、下記のステップを含む方法によって作製されるライブラリー。
(a)  鋳型T細胞受容体をコードする初期核酸を提供し；
(b)  天然に存在するアミノ酸変種を初期核酸内での多数の標的コドンでコードする変異されたオリゴヌクレオチドのセットを提供し；
(c)  変異された各アミノ酸コドンでアミノ酸変種の配列をコードしたT細胞受容体(TCR)をコードする変異核酸のセットを作り出すために変異されたオリゴヌクレオチドのセットを用い、
これにより、多数の変異T細胞受容体(TCR)をコードする核酸のライブラリーを作製する。
【請求項５４】
鋳型主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子により変異主要組織適合抗原複合体(MHC) 分子のライブラリーを作製する方法であって、下記のステップを含む方法。
(a)  鋳型主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子をコードする初期核酸を提供し；
(b)  天然に存在するアミノ酸変種を初期核酸内での多数の標的コドンでコードする変異されたオリゴヌクレオチドのセットを提供し；
(c)  変異された各アミノ酸コドンでアミノ酸変種の配列をコードした主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子をコードする変異核酸のセットを作り出すために変異されたオリゴヌクレオチドのセットを用い、
これにより、多数の変異主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子をコードする核酸のライブラリーを作製する方法である。
【請求項５５】
鋳型主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子により変異主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子のライブラリーを作製する方法であって、下記のステップを含む方法。
(a)  鋳型主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子をコードする初期核酸を提供し；
(b)  天然に存在するアミノ酸変種を初期核酸内での多数の標的コドンでコードする変異されたオリゴヌクレオチドのセットを提供し；
(c)  変異された各アミノ酸コドンでアミノ酸変種の配列をコードした主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子をコードする変異核酸のセットを作り出すために変異されたオリゴヌクレオチドのセットを用い、
これにより、多数の変異主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子をコードする核酸のライブラリーを作製する。
【請求項５６】
抗原結合部位変種のセットをコードする核酸のセットを作製する方法であって、下記のステップを含む方法。
(a)  抗原結合ポリペプチドをコードする鋳型核酸を提供し；
(b)天然に存在する19種すべてのアミノ酸変種を抗原結合ポリペプチドの一個のアミノ酸残基でコードする多数のオリゴヌクレオチドを提供し；
(c)  各アミノ酸置換の非確率的な配列を変異された各アミノ酸コドンでコードする子孫抗原結合部位をコードする変異核酸のセットを作り出し、その際、19種すべて可能なアミノ酸の変化が変異された各アミノ酸コドンが作り出されるものであり、
これにより、抗原結合部位変種のセットをコードする核酸のセットを作製する。
【請求項５７】
子孫ポリヌクレチドによってコードされた抗原結合部位をコードするポリペプチドが発現されるように、抗原結合部位をコードする子孫ポリヌクレチドのセットの発現をさらに含む請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
多数のオリゴヌクレオチドが、縮重オリゴヌクレオチドのセットを含み、各縮重オリゴヌクレオチドは、第一の相同配列及び縮重トリプレットの第二配列を含む請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
抗原結合部位をコードするポリペプチドが、一本鎖抗原結合ポリペプチドを含む請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
抗原結合部位をコードするポリペプチドが、抗体ポリペプチドを含む請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
抗原結合部位をコードするポリペプチドが、T細胞受容体(TCR)の抗原結合部位を含む請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
抗原結合部位をコードするポリペプチドは、T細胞受容体(TCR)をさらに含む請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
抗原結合部位をコードするポリペプチドが、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子の抗原結合部位をさらに含む請求項５６記載の方法。
【請求項６４】
抗原結合部位をコードするポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子をさらに含む請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
ステップ(a)の核酸が、哺乳類の抗体ポリペプチドをコードする核酸に由来する請求項５６記載の方法。
【請求項６６】
ステップ(a)の核酸が、ヒトの核酸に由来する請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
抗原結合部位内の最低でも二個のアミノ酸コドンが変異されるものであり、19種すべての天然に存在するアミノ酸変種をコードする縮重オリゴヌクレオチドのセットが、変異された各アミノ酸コドンのために提供されるものである請求項５６記載の方法。
【請求項６８】
抗原結合部位内のすべてのアミノ酸コドンが変異されるものであり、19種すべての天然に存在するアミノ酸変種をコードする縮重オリゴヌクレオチドのセットが、変異された各アミノ酸コドンのために提供されるものである請求項５６記載の方法。
【請求項６９】
抗体ポリペプチド内のすべてのアミノ酸コドンが変異される請求項６０記載の方法。
【請求項７０】
T細胞受容体(TCR)の抗原結合部位内のすべてのアミノ酸コドンが変異される請求項６１記載の方法。
【請求項７１】
主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子の抗原結合部位内のすべてのアミノ酸コドンが変異される請求項６３記載の方法。
【請求項７２】
縮重オリゴヌクレオチドが、第一の相同配列、縮重トリプレットの第二の配列、および第三の相同配列を含む請求項５６記載の方法。
【請求項７３】
各縮重オリゴヌクレオチドが、第一の相同配列、縮重トリプレットの第二の配列、および第三の相同配列を含む請求項５６記載の方法。
【請求項７４】
発現された抗原結合部位をコードするポリペプチドを、抗原に特異的に結合する能力をみるために、スクリーニングすることを含む請求項５７記載の方法。
【請求項７５】
発現された抗原結合部位をコードするポリペプチドを、初期抗原結合部位によって特異的に結合される抗原に特異的に結合する能力をみるために、スクリーニングすることを含む請求項５７記載の方法。
【請求項７６】
ステップ(a)の核酸よってコードされる抗原結合部位の親和性や特異性と比べて増加した抗原結合親和性又は抗原に対する抗原結合の特異性によって抗原結合部位変種を同定することを含む請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
至適化指向変異システムを含む方法により鋳型核酸を変異させることをさらに含む請求項５６記載の方法。
【請求項７８】
合成ライゲーション再集合を含む方法により鋳型核酸を変異することをさらに含む請求項５６記載の方法。
【請求項７９】
発現された抗原結合部位をコードするポリペプチドを、抗原に特異的に結合する能力をみるために、キャピラリーアレイ法によってスクリーニングすることを含む請求項５６記載の方法。
【請求項８０】
発現された抗原結合部位をコードするポリペプチドを、抗原に特異的に結合する能力をみるために、ELISA法によってスクリーニングすることを含む請求項５６記載の方法。
【請求項８１】
変異核酸のセットが、ステップ(a)の核酸について、抗原結合ポリペプチドの単一アミノ酸残基において19種のアミノ酸置換変異コードする変異核酸のセットを作製するためのオリゴヌクレオチドのセットを用いた増幅反応によって作製される請求項５６記載の方法。
【請求項８２】
増幅が、ポリメラーゼに基く増幅を含む請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
ポリメラーゼに基く増幅が、ポリメラーゼチェーンリアクション (PCR) を含む請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
変異核酸のセットが、1010  のメンバーから成る請求項５６記載の方法。
【請求項８５】
変異核酸のセットが、105  のメンバーから成る請求項５６記載の方法。
【請求項８６】
変異核酸のセットが、103  のメンバーから成る請求項５６記載の方法。
【請求項８７】
抗体変種のセットを作製する方法であって、下記のステップを含む方法。
(a)  抗体をコードする核酸を提供し；
(b)  多数のオリゴヌクレオチドを提供し；
(c)  各アミノ酸コドンで非確率的な単一アミノ酸置換した配列を作り出し、それによって19種すべて可能な天然に存在するアミノ酸の変異が各変異アミノ酸コドンで作り出され、それのよって変異核酸のセットを作り出すものであり；
(d)  変異核酸によってコードされる抗体変種が発現されるように、変異核酸のセットを発現する。
【請求項８８】
抗体が、Fabフラグメント, Fdフラグメント, Fcフラグメント, F(ab')2フラグメント, Fvフラグメント, および相補性決定領域(CDR)を含むポリペプチドから成るグループから選択される請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
多数のオリゴヌクレオチドが、19種すべての天然に存在するアミノ酸変異体を抗体の一個のアミノ酸残基でコードする縮重オリゴヌクレオチドのセットを含み、各縮重オリゴヌクレオチドが、第一の相同配列及び縮重トリプレットの第二配列を含む請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
単一アミノ酸置換の非確率的な配列を作製することが、ステップ(a)の核酸について、19種のアミノ酸置換変異を抗体の単一のアミノ酸残基でコードする変異核酸のセットを作り出すためにオリゴヌクレオチドのセットを用いて増幅反応を行うことを含む請求項５６記載の方法。
【請求項９１】
変異抗原結合部位を同定する方法であって、下記のステップを含む方法。
(a)  抗原結合部位をコードする核酸を提供し；
(b)  19種すべての天然に存在するアミノ酸変種を、抗原結合部位の全残基においてコードするオリゴヌクレオチドのセットを提供し；
(c)  19種のアミノ酸置換変種を抗原結合部位の各残基でコードする変異核酸のセットを作り出すため、ステップ(b)のオリゴヌクレチドの配列をステップ(a)の核酸に組み入れ；
(d)  各変異核酸をポリペプチドとして発現し、抗原に対する親和性を測定し；
(e)  変異抗原結合部位を、ステップ(a)の核酸によってコードされる抗原結合部位の抗原結合親和性と比べ、増加又は減少した抗原結合特異性によって同定する。
【請求項９２】
変異核酸が、インビトロ転写/翻訳を用いて発現される請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
変異核酸が、ファージディスプレイを用いて発現される請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
変異核酸が、リボソームディスプレイを用いて発現される請求項９１記載の方法。
【請求項９５】
変異核酸が、二穴コンテナを用いて発現される請求項９１記載の方法。
【請求項９６】
変異核酸が、二穴コンテナキャピラリーアレイを用いて発現される請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
オリゴヌクレオチドのセットが、抗体の単一アミノ酸残基で19種すべての天然に存在するアミノ酸変種をコードする縮重オリゴヌクレオチドのセットを含み、各縮重オリゴヌクレオチドは、第一の相同配列及び縮重トリプレットの第二配列を含む請求項９１記載の方法。
【請求項９８】
抗原結合部位が、抗体を含む請求項９１記載の方法。
【請求項９９】
抗体が、Fabフラグメント, Fdフラグメント, Fcフラグメント, F(ab')2 フラグメント, Fvフラグメント, 及び相補性決定領域(CDR)を含むポリペプチドから成るグループから選択される請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
抗原結合部位が、T細胞受容体(TCR)の抗原結合部位を含む請求項９１記載の方法。
【請求項１０１】
抗原結合部位が、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子の抗原結合部位を含む請求項９１記載の方法。
【請求項１０２】
ステップ(b)のオリゴヌクレオチドの配列をステップ(a)の核酸に組み入れることが、オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた増幅作用によって達成される請求項９１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、以下の既出願による優先的利点を求める。
U.S. Provisional Application No. 60/300,381 35U.S.C.§119(e) (2001年5月17日提出)
U.S. Provisional Application No. 60/300,907 (2001年6月25日提出)
U.S. Patent Application (USSN) 09/535,754 (タイトル：Exonuclease  Mediated Gene Assembly in Directed Evolution) (2000年3月27日提出、一部継続出願：CIP)
さらにこれらは、以下の既出願の特に示さない限り一部継続出願 (CIP) である。
USSN 09/522,289  (2000年3月9日提出) (タイトル：End Selection in Directed Evolution)
USSN 09/498,557  (2000年2月4日提出) (タイトル：Non-Stochastic Generation of Genetic Vaccines and Enzymes)
USSN 09/495,052  (2000年1月31日提出) (タイトル： Non-Stochastic Generation of Genetic Vaccines)
USSN 09/276,860 (1999年3月26日提出) (タイトル：  Exonuclease Mediated Gene Assembly in Directed Evolution)
USSN09/267,118  (1999年3月9日提出)  (タイトル：  End  Selection  in  Directed Evolution)
USSN  09/246,178  (1999年2月4日提出)  (タイトル：Saturation  Mutagenesis in Directed Evolution, 現在の USPN 6,171,820)
USSN 09/185,373 (1998年11月3日提出) (タイトル：Directed Evolution of Thermophilic Enzymes) の継続
USSN 08/760,489 (1996年12月5日提出) (タイトル：Directed Evolution of Thermophilic Enzymes, 現在の USPN 5,830,696) の継続
【０００２】
これらは  U.S.  provisional  application  No.60/008,311  (1995年12月7日 提出)の利点を請求するものである。
USSN 09/246,178 (1999年2月4日提出) (タイトル：Saturation Mutagenesis in Directed Evolution) は、また、USSN 08/962,504 (1997年12月 31日提出)  (タイトル：Method of DNA Shuffling)の CIP であり、これは、 USSN 08/677,112 (1996年6月9日提出) (タイトル：Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis、現在の USPN 5,965,408)の CIP となっている。
USSN  09/246,178  (1999年2月4日提出)  (タイトル：Saturation  Mutagenesis  in  Directed  Evolution)  は、また、USSN 08/651,568  (1996年5月22日提出) (タイトル：Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagenesis, 現在の USPN 5,939,250)の CIP であり、U.S. provisional  出願  No.  60/008,316  (1995年12月7日提出)  (タイトル： Combinatorial  Enzyme  Development)の優先利点を持っている。
本出願は、また、PCT  application  No.  PCT/US 00/16838  (2000年6月 14日提出) (タイトル：Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution, 現在の PCT No. WO 00/77262)の CIP であり、 USSN 09/332,835 (1999年6月14日提出) (タイトル：Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution）の利点を請求する USSN 09/594,459  (2000年6月14日提出)  (タイ トル：Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution)の CIP と な っている。
本出願は、また、USSN 09/276,860 (1999年3月26日提出) (タイトル： Exonuclease  Mediated  Gene  Assembly  in  Directed  Evolution)の利点 を請求する PCT application No. PCT/US00/08245 (2000年3月27日提出) (タイトル：Exonuclease-Mediated Nucleic Acid Reassembly in Directed Evolution, 現在の PCT No. WO 00/58517)のCIPである。 PCT application No.  PCT/US 00/08245、現在の  PCT  No. WO 00/58517、は  USSN 09/267,118 (1999年3月9日提出) (タイトル：End Selection in Directed Evolution)の CIP であり、USSN  09/185,373  (1998年11月3日提出)  (タイトル：Directed Evolution of Thermophilic Enzymes)、USSN 08/760,489 (1996年12月5日提出) (タイトル： Directed Evolution of Thermophilic Enzymes, 現在の USPN 5,830,696)の継続であり、U.S. provisional application  No. 60/008,311  (1995年12月7日提出)の利点を請求する  USSN 09/246,178 (1999年2月4日提出) (タイトル：Saturation Mutagenesis in Directed Evolution, now USPN 6,171,820)の CIP となっている。
本出願は、また、USSN  09/332,835  (1999年6月14日提出)  (タイトル： Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution)の利点を請求した PCT application No. PCT/US00/06497 (1999年3月9日提出) (タイトル：End Selection  in  Directed  Evolution、現在の  PCT  No. WO 00/53744)の CIP である。PCT application No. PCT/US00/06497 (1999年3月9日提出) (タイトル ：End Selection in Directed Evolution, 現在の PCT No. WO 00/53744)は、 また、U.S. provisional application No. 60/008,311 (1995年12月7日提出)の 利点を請求した  USSN08/760,489  (1996年12月5日提出) (タイトル：Directed Evolution of Thermophilic Enzymes, 現在の USPN 5,830,696)の継続とした  USSN09/185,373 (1998年11月3日提出) (タイトル：Directed Evolution of Thermophilic Enzymes)の継続である USSN 09/246,178 (1999年2月4日提出) (タイトル：Saturation Mutagenesis in Directed Evolution, 現在の USPN 6,171,820)の CIP である。
PCT  application  No.  PCT/US00/06497  (1999年3月9日提出) (タイト ル：End Selection in Directed Evolution, 現在の PCT publication No. WO 00/53744)  は、また、USSN09/246,178 (1999年2月4日提出) (タイトル： Saturation Mutagenesis in Directed Evolution, now USPN 6,171,820)の CIP である USSN 09/276,860 (1999年3月9日提出) (タイトル ：Exonuclease  Mediated  Gene  Assembly  in  Directed  Evolution)の利点を請求する。 USSN  09/246,178  は U.S. provisional application No. 60/008,311 (1995年12月7日提出)の利権を請求した  USSN 08/760,489 (1996年12月5日提出) (タイトル : Directed Evolution of Thermophilic Enzymes, 現在の USPN 5,830,696)の継続である USSN 09/185,373 (1996年12月5日提出) (タイトル : Directed Evolution of Thermophilic Enzymes)を継続した USSN 09/246,178  (1999年2月4日提出) (タイトル : End Selection in Directed Evolution)の CIP となっている。
本出願は、また、 USSN 09/332,835  (1999年6月14日提出) (タイトル : Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution)のCIPである USSN 09/594,459  (2000年6月14日提出) (タイトル : Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution)の CIP である。
【０００３】
本出願は、また、 USSN 09/246,178  (1999年2月4日提出) (タイトル : Saturation Mutagenesis in Directed Evolution、現在の USPN 6,171,820)の利点 を請求した PCT application No. PCT/US 00/03086  (2000年2月 4日提出) (タイ トル :  Non-Stochastic Generation of Genetic Vaccines and Enzymes)のCIP である。 USSN 09/246,178（現在の  USPN6,171,820）は U.S.  provisional  application  NO. 60/008,311  (1995年12月7日提出)の利点を請求した USSN 08/760,489  (1996年12月5日提出)  (タイトル:  Directed  Evolution of Thermophilic Enzymes）の継続である USSN 09/185,373 本出願は、また、 Directed Evolution of Thermophilic Enzymes）の継続である。
本出願は、また、USSN 09/246,178  (1999年2月4日提出)  (タイトル：  Saturation  Mutagenesis  in  Directed  Evolution、現在の USPN 6,171,820） の継続である USSN 09/756,459  (2001年1月8日提出) (タイトル : Saturation  Mutagenesis  in  Directed  Evolution)のCIPである。USSN 09/246,178  (現在の USPN 6,171,820）は U.S. provisional application No. 60/008,311 (1995年12月 7日提出)の利点を請求する USSN 09/185,373 (1998年 11月3日提出) (タイトル : Directed Evolution of Thermophilic Enzymes)の継続である。
【０００４】
本出願は、また、USSN  [UNASSIGNED]  (2001年1月9日提出)  (タイトル: Optimized Directed Evolution System and Method)の CIP である。
本出願は、また、USSN08/677,112  (1996年7月9日提出) (タイトル :  Method  of  DNA  Reassembly  by  Interrupting  Synthesis、現在の USPN 5,965,408)の継続である USSN 09/376,727  (1999年8月17日提出) (タイトル :   Method of DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or Interrupting a Synthesis or Amplification Process)のCIPである。 本出願は、 また、USSN 08/677,112  (1996年7月9日提出)  (タイトル：Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis, 現在の USPN 5,965,408)の CIP である  USSN 09/962,504  (1997年10月31日提出)  (タイトル：Method of DNA Shuffling) の利点を請求する PCT application No. PCT/US 98/22596  (1998年10月23日提出) (タイトル：Method of DNA Shuffling)の CIP である。
本出願は、また、USSN09/214,645  (1999年9月27日提出) (タイトル： Method of DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or Interrupting  a  Synthesis  or  Amplification  Process)のCIPであり、これは  USSN08/677,112  (1996年7月9日提出) (タイトル：Method of DNA Reassembly  by  Interrupting  Synthesis、現在の USPN5,965,408)の利権を請求した  PCT  application  No.  PCT/US97/12239  (1997年7月9日提出) (タイトル：Method of DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or Interrupting a Synthesis or Amplification Process, 現在の PCT publication No. WO98/01581) の CIP である。
【０００５】
本出願は、また、USSN 09/687,219  (2000年10月12日提出)  (タイトル： Capillary  Array-Based  Sample  Screening)の一部である USSN 09/790,321 (2001年2月21日提出)  (タイトル：Capillary Array-Based Enzyme Screening)の CIP である。USSN09/687,219  は  USSN09/876,276  (1997年6月16日提出) (タイ トル：High  Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes)の CIP である USSN 09/098,206  (1998年6月16日提出)  (タイトル：High  Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes、現在の  USPN 6,174,673)の継続である USSN 09/636,778  (2000年8月11日提出) (タイトル：High Throughput Screening of Novel Enzymes) の CIP である。
本出願は、また、USSN 09/876,276  (1997年6月16日提出)  (タイトル： High  Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes)の CIP である USSN 09/098,206 (1998年6月16日提出)  (タイトル：High Throughput Screening of  Novel  Enzymes、現在の  USPN6,174,673)の一部となっている USSN 09/761,559  (2001年1月16日提出) (タイトル：High Throughput Screening of Novel Enzymes) の CIP である。
本出願は、また、USSN 09/098,206 (1998年6月16日提出) (タイトル： High  Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes、現在の USPN 6,174,673)の継続で ある  USSN09/636,778  (2000年8月11日提出)  (タイトル：High Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes)の一部である  USSN 09/848,185  (2001年5月3日 提出) (タイトル： High Throughput Screening for Novel Enzymes）のCIP であ る。 USSN 09/098,206 は、USSN 09/876,276  (1997年6月16日提出)  (タイトル：  High  Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes)の CIP である。
【０００６】
本出願は、また、USSN 09/444,112  (1999年11月22日提出)  (タイトル： Capillary  Array-Based  Enzyme  Screening)の CIP である USSN 09/685,432  (2000年10月10日提出)  (タイトル： High Throughput Screening for Sequences  of  Interest)の CIP、USSN09/738,871  (2000年12月14日提出)  (タイトル：High  Throughput Screening for a Bioactivity or Biomolecule)の CIP である。USSN 09/444,112は、USSN 09/876,276  (1997年6月16日提出)  (タイトル：High  Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes)の CIP である USSN 09/098,206  (1998年6月16日提出)  (タイトル： High Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes、現在の USPN 6,174,673)の CIP である。
本出願は、また、USSN  09/636,778  (2000年8月11日提出)  (タイトル：  High  Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes)の CIP である USSN  09/687,219  (2000年10月1２日提出)  (タイトル： Capillary Based-Based  Sample  Screening)の利点を請求した  PCT  application  No. PCT/US 00/32208  (2000年11月22日提出)  (タイトル： Capillary Array-Based Sample Screening)  のCIPである。 USSN 09/636,778  は USSN 09/876,276  (1997年6月16日提出)  (タイトル： High Throughput Screening of  Novel  Enzymes)の CIP である  USSN 09/098,206  (1998年6月16日提出)  (タイトル： High Throughput Screening of Novel Enzymes, 現在の USPN 6,174,673)の CIP である。
本出願は、また、USSN 09/876,276  (1997年6月16日提出)  (タイトル： High Throughput Screening of Novel Enzymes)の利点を請求した PCT application No. PCT/US 98/12674  (1998年6月16日提出)  (タイトル： High Throughput Screening for Novel Enzymes, 現在の PCT publication No. WO 98/58085) の CIP である。
PCT/US 00/32208  (2000年11月22日提出)  (タイトル： Capillary Array-Based  Sample  Screening)は、USSN 09/876,276  (1997年6月16日提出)  (タイトル：High  Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes)の CIP である USSN 09/098,206  (1998年6月16日提出)  (タイトル： High Throughput  Screening  of  Novel  Enzymes、現在の  USPN  6,174,673)の CIP である USSN 09/444,112  (1999年11月22日提出)  (タイトル： Capillary Array-Based Enzyme Screening)の利点を請求している。
これら先に述べた出願及び特許はそれらの実体ならびに全ての応用のための参考としてここに明確に組み込まれる。
【０００７】
技術分野
本発明は、総じて、医学、タンパク質エンジニアリング、免疫学、ならびに分子生物学の領域に適用されるものである。一例として、本発明は、抗原結合分子をコードする遺伝子の集合あるいはライブラリーを作製する方法を教示するものである。抗原結合分子とは、例えば、抗体及び抗原結合部位やドメイン関連分子ならびに他の抗原結合断片のような関連分子であり、一本鎖及び二本鎖抗体、T細胞受容体（TCR）及びクラスＩ、クラスII主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）などが含まれる。本発明は、また、新規あるいは亜型の抗原結合ポリペプチド、例えば、抗原結合部位、抗体、そして抗体の特異的ドメインまたは断片（Fab あるいは Fcドメイン）、TCR、及び MHC 分子等、を飽和変異、至適化された指向的進化システム、合成的結合再構成、あるいはそれらの組み合わせ等によりそれらの遺伝子鋳型を変えることによって作製する方法を提供する。
このような方法により作製されたポリペプチドは如何なる液相または固相のスクリーニング方法、例えば、ファージディスプレイ、リボゾームディスプレイ、キャピラリーアレイプラットフォーム及びその類の方法、により分析することが可能である。本発明の方法により作製されたポリペプチドは、インビトロでは抗原の単離あるいは同定、またインビボではいろいろな病気及び状況における処置あるいは治療、免疫応答の調節、刺激あるいは増強、等の目的で使うことが可能である。
本発明は、遺伝子ワクチンの領域に応用される。特に、本発明は、特別な予防接種を目標に至適化された構成成分を含む複合構成成分よりなる遺伝子ワクチンを与えるものである。他の例として、本発明は、特別な組織あるいは細胞のタイプに対する遺伝子ワクチンの標的を容易にする物質を与えることにより遺伝子ワクチンの効力を改善する方法を提供するものである。また、本発明は、例えば、T 細胞受容体ならびにクラスI、クラスII主要組織適合遺伝子複合体分子 (MHC) 等の抗原結合分子に工学的に修飾された親和性を持たせるものであり、それはワクチンへの免疫応答を操作することを可能にするものである。
【０００８】
本発明は、抗原に対して調節された親和性を持つ抗原結合部位を含む、例えば抗体のような、ポリペプチドを提供することにより、生物的治療学の分野に応用される。例えば、本発明の方法は、免疫学的治療あるいは診断等に使用するために親和性を改造あるいは増加させた抗体を提供するものである。本発明により作製された抗体は、例えば、癌細胞のような細胞の増殖を抑えたり、死滅させる目的、あるいは、組織新生や免疫応答を促進させるために細胞分割を刺激する目的、あるいは、いかなる生物学的機構または応答を変える治療学的目的で投与することが可能である。例えば、免疫エフェクターあるいは調節細胞、リンホカインやサイトカイン等に結合する抗体の投与より細胞性あるいは液性免疫応答を亢進、刺激、あるいは減少させることが可能である。
本発明は、遺伝子ワクチンに誘導されるような免疫応答の調節分野に応用されるものであり、また、多様な抗原に対して十分な免疫応答を誘導できるような免疫源の開発分野に応用できる。
【０００９】
本発明は、例えば、T 細胞受容体ならびにクラスI、クラスII主要組織適合遺伝子複合体分子(MHC)等を含んだ免疫応答の刺激あるいは調節に関与する分子を修飾することにより免疫応答を調節する分野に応用される。従って、本発明により作製された分子は、抗原に対して増加あるいは低下した親和性を持つことができる。例えば、ある抗原に対するあるT細胞受容体の親和性を低下させることにより(TCRはMHC分子と共に結合する。そのMHC分子はその抗原にそのTCRを提供する)、本発明による方法は、ある自己反応性のTCRの非自己反応性の亜型を作製できる。他の例として、例えば、病原性抗原のような抗原に対するMHC分子の親和性を増加させることにより、本発明の方法は、その病原体に対する免疫応答を促進することができ、同様に、もしその抗原が自己抗原である場合、本法は、抗原に対するそのMHC分子の親和性を低下させることにより、その自己抗原に対する免疫応答を増加させたり低下させることができる。
本発明は、タンパク質エンジニアリングの分野にも関連している。特に、本発明はポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを作製するための指向的進化法と関連している。より特別には、本発明は、新規ポリペプチドをコードした新規ポリヌクレオチドや新規ポリペプチドそれ自体が変異（改良）された生物分子であり他の改良された生物分子の作製のために貢献するか、または、そのいずれかを作製するための遺伝変異法を用いる方法に関連している。また、さらに特別に、本発明は、非確率的なポリヌクレオチドのキメラ化及び部位特異的点変異を行う両方法に関連している。
従って、一例として、本発明は、合成的あるいは非確率的な手段によりポリヌクレオチドキメラの子孫ライブラリーあるいは集団を作製する方法に関連している。子孫ポリヌクレオチドのデザインは親ポリヌクレオチド及び／又は親ポリヌクレオチドによって符合的にコードされたポリペプチドの分析に委ねられる。他の展望に於いて、本発明は、徹底的かつ系統的かつ非確率的な手段を用いることにより部位特異的点変異を行う方法に関連している。
【００１０】
さらに本発明は、作製された子孫分子の集団から特に好ましい種から成るサブセットを選択し、そしてそのサブセットを更にスクリーニングできるような手段と関連している。また、本発明は、ポリペプチドの産生及び／又は抗原に対する親和性を増大させた抗体のような有益な性質を持つ他の発現された生物学的分子の産生等のために一群のポリヌクレオチドをスクリーニングする手段と関連している。
本発明により教授された製造法による新規生物学的分子は、遺伝子、遺伝子経路、及びそれらによりその発現が影響される如何なる分子をも含み、直接コードされたポリペプチド及び／又はそのようなポリペプチドにより影響される如何なる分子をも含んでいる。前述の新規生物学的分子は、糖質、脂質、核酸、及び／又は、タンパク質成分を含む分子を包括するものであるが、これらの非制限的な例として抗性物質、抗体、TCR、MHC分子、酵素、ステロイド及び非ステロイドホルモンを含んでいる。
【００１１】
背景
抗体のような抗原結合ポリペプチドが多角的な治療応用に使われる機会は増大している。例えば、免疫療法において、抗体は、癌細胞のような標的細胞を直接死滅させる目的で使われる。抗原結合ポリペプチド細胞毒性剤あるいは造影剤を分配分布するための担体としても使われる。癌治療のため承認され得るいくつかの単クローン抗体（mAb）が、現在、Phase II また Phase III の臨床試験の段階にある。抗体の抗原結合部位と結合するある抗イデオタイプ抗体は、その内在性抗原の三次元構造及び機能を効果的に擬態することができ、また、現在使用されている特別な免疫療法のための代理抗原として使用できる。そのような両特異的抗体は、免疫細胞活性化と腫瘍細胞の認識に対する特異性を合わせ持っている。そのために腫瘍細胞あるいは腫瘍特異的抗原を発現している細胞（例えば、腫瘍血管系）は、予め限定されたエフェクター細胞により淘汰される。抗体はサイトカインやホルモンの濃度を直接の結合あるいは分泌細胞の抑制により増加あるいは低下させることを目的として投与できる。従って、抗体の癌特異的抗原のような好ましい抗原に対する親和性または反応性を増加させることは、その標的に対する抗体の特異性を高め、少量の薬剤結合抗体を施療するなど多様な治療利益を期待できる。
【００１２】
生物学的分子を望ましい特性へと実験的に変更する、指向進化と名づけられた方法は、1つ又は複数の親分子鋳型に突然変異導入する段階、および子孫分子の中から任意の所望の分子を同定する段階により達成されうる。指向進化において現在利用可能な技術には、確率論的（すなわちランダム）に変異導入を達成するための方法および非確率論的（非ランダム）に変異導入を達成するための方法が含まれる。しかし、両方の種類の方法における重大な不足点が、本開示において同定されている
前置きとして、ある客観的な視点から考慮されるならば、全ての変異導入は非確率論的であり、かつさらに、ある客観的な視点から、全宇宙は非確率論的な過程を経ていると、哲学的に主張する者がいるかもしれないことは注目すべきである。これが真実であるかどうかは本考察の範囲外である。したがって、ここで用いられているように、「ランダム性」、「不確実性」および「予測不可能性」という用語は主観的な意味を有しており、実験過程の設計者の知識、特に予測知識が、その過程が確率論的または非確率論的であるかの決定因子である。
説明のために、事前決定されていない変異を有する子孫分子セットを得るために祖先分子鋳型が変異される（変更されるまたは変化される（change））状況により、確率論的又はランダムな突然変異導入が例示される。従って、インビトロ確率論的変異導入反応においては、例えば、その産生が意図されているような特定の事前決定産物は存在せず、むしろ、達成される変異の正確な性質に関して、かつそれゆえ産生される産物に関しても、不確実性、それゆえにランダム性が存在する。対照的に、1つ又は複数の事前決定変異を有する子孫分子を得るために祖先分子鋳型が変異される（変更されるまたは変化される）状況により、非確率論的又は非ランダムな変異導入が例示されている。分子処理が起こる多くの反応においてある量のバックグラウンド産物の存在が現実であること、およびこれらのバックグラウンド産物の存在は事前決定産物を有する変異導入過程の非確率論的性質を減少させないことは理解される。
【００１３】
従って、ここで用いられているように、確率論的変異導入は、達成される変異がランダムであるか事前決定されていない、エラープローン(error-prone) PCRおよび確率論的シャッフリング等の過程において明らかにされる。対照的に、ここで用いられているように、非確率論的変異導入は、意図された産物の正確な化学構造が事前決定されている、遺伝子部位飽和性変異導入および合成ライゲーション再集合等の本発明で開示された過程によって明らかにされる。
要するに、既存の非確率論的変異導入法は、方法の適用ごとに一つから非常に少数の事前決定変異を産生するために役立ち、それゆえ事前決定された分子構造を有する一つからごくわずかな数の子孫分子を方法の適用ごとに産生する。さらにこれらの非確率論的方法の適用により現在利用可能な変異の種類もまた制限されており、それゆえ子孫変異分子の種類も制限されている。
対照的に、本質的に確率論的な既存の変異導入法は、ランダムな様式を介し、かつ多数のしかし望ましくないバックグラウンド化合物の不可避な分割（contigency）を通常伴うが、方法の適用ごとに若干多い数の変異を産生するために役立つ。それゆえ、これらの既存の確率論的方法は、方法の適用ごとに未決定の分子構造を有するが、より多数の子孫分子を産生することができる。これらの現在の確率論的方法の適用により達成可能な変異の種類もまた制限されており、従って、子孫変異分子の種類も制限されている。
以下のような、非確率論的変異導入法の開発が必要である：
1）事前決定された分子構造を有する多数の子孫分子を産生するために使用することが可能である；
2）より多くの種類の変異を容易に産生するために使用することが可能である；
3）より多様な子孫変異分子を産生することが可能である；
4）不要バックグラウンド産物の産生を減少させる；
5）全ての可能性に関して網羅的な方法で使用することが可能である；及び
6）体系的かつ非反復的な方法により子孫分子を産生することが可能である。
【００１４】
自然進化を補う指向進化 
自然進化は、指向進化又は実験的進化の出発点であり、模倣すべき方法および変異導入されるべき分子鋳型の両方の宝庫としてはたらく。（好ましい及び/又は許容される突然変異導入過程の種類において）その過程に関連する本質的な限界およびその速度にも関わらず、自然進化は数百万年間の過程および多様な環境全体を通して進行中であるという優位点を有していることは理解される。したがって自然進化（自然における、分子突然変異導入および選抜）は、ある商業応用において有用性が示されている豊富な生物学的化合物の産生をもたらしてきた。
しかし未達成である多くの商業上の必要性は、自然に見出される任意の進化上の圧力及び/又は方向とは一致しないことが即座に理解される。さらに、商業上有用な変異が天然の分子レベルにおいてその他の点で好ましくない場合、（好ましい変異が有害変異に付随するとき等の様に）例えば、全体として生物体に対して併発する害がある場合、自然進化はそのような変異の正選抜をしばしば優先する（override）ケースがよくある。その上、自然進化は遅いことが多く、多くの複製腫において正確性を好む。さらにその上、自然進化は、連続した有益な変異により主に開かれた経路を好むことが多く、一方、負の変異が組み合わされると恩典を証明しうるか、又は回り道を介して有益な最終的状態を導きうるとしても、複数の連続したそのような負の変異を避ける傾向がある。
【００１５】
さらに、自然進化は特定の段階（例えば、特異的突然変異導入および選抜過程）を介して、あまり好ましくない段階を避けながら進行する。例えば、多くの核酸は作用環境においてキメラ化もしくは取り込みまたは、ある種から別の種へのその他の種類の移転を受けるのにかろうじて十分な互いの近傍には到達しない。それゆえ、特定の二つの種間の性交が天然では避けられている場合、分子間遭遇およびDNA交換の非常に遅い経路の一例としてはたらく、二種に共通の寄生虫を用いたこれら二種由来の核酸のキメラ化は、同様に可能性が低い。他の例として、自己毒性もしくは自己致死または性的不能を引き起こす分子の産生は自然では避けられている。さらに別の例としては、生物体に特定の迅速な利益を有さない分子の増殖（propagation）は、生物体の次世代において消失されやすい。さらに、例えば、内在性環境においてそれが暴露されているもの以外の条件下において分子の性能を改良するための選択圧が存在しない、例えば、細胞質分子が細胞質内においてそれに必要とされるものを超えて進展した機能特性を獲得する可能性は低い。その上さらに、生物学的分子の増殖は、それ自身により引き起こされるかどうかにかかわらず、その生態系に対する任意の全体的な有害効果にも感受性である。これらおよびその他の特性は自然において増殖可能である変異の種類を大きく制限する。
【００１６】
一方、特にこの中で提供されるような、指向（または実験的）進化は、よりずっと迅速に実施されうり、自然がそれを提供しない及び/又は提供する可能性が低いところの商業的に望ましい事前決定された分子特性を進化させる点により効率的な様式で方向付けられうる。さらにこにおいて提供される指向進化の発明は、変異導入および選抜過程において使用することができる種類の段階においてより広範囲の可能性を提供することができる。したがって天然に得られた鋳型を用いて、本指向進化の発明は、産生されうる子孫分子の種類において及びそれらが産生されうる速度において、しばしば自然自身が同じ期間における期待より広範囲の可能性を提供する。
ある特定の例示においては、本発明において開示された指向進化法は、自然では増殖する（すなわち産生及び/又は選抜される）可能性が低いと考えられるが、自然進化では達成不可能である望ましい下流突然変異導入産物の産生をもたらしうる、子孫分子の結合（例えば連続したセットの子孫分子を含む）を産生するために反復して適用されうる。
【００１７】
従来の指向進化法は最適以下（suboptimal）である
突然変異導入は過去多くの機会において、しかし本発明の目的にとって不適切である方法によって、実施されてきた。例えば、過去に記載された非確率論的方法は（しばしば単に単独の子孫分子からなる）非常に小さな子孫分子セットのみの産生において役に立った。説明のために、各断片が別々の祖先（又は親）分子に由来するような、制限酵素により産生された互換的な粘着末端を用いて2つのポリヌクレオチド断片を連結することによりキメラ遺伝子が作製された。別の例は、ある単一の部位変異導入ポリヌクレオチドをコードする、単一の子孫ポリヌクレオチドを産生するために、親ポリヌクレオチドにおける単一コドン部位の突然変異導入（すなわち、コドン置換、付加または欠失を達成するための）であってもよい。
以前の非確率論的方法は、方法の適用ごとに一個から数個の変異の産生において役立つに過ぎなかった。それゆえ、以前に記載されたこれらの非確率論的方法は本発明の中心的目標の一つ、すなわち核酸の網羅的および非確率論的なキメラ化に応えることができない。したがって以前の非確率論的方法は、非常に望ましい子孫分子の産生につながりうる、潜在的な点変異、キメラ化、およびそれらの組み合わせの大部分を未開発のまま残している。
【００１８】
対照的に、確率論的方法は、非確率論的方法よりも多数の点変異及び/又はキメラ化を達成するために使用されてきた。この理由から、確率論的方法は、スクリーニングに供されうる子孫分子セットを産生するための、かつその中で所望の分子種がうまくいけば発見されうる、最も有力なアプローチを含んでいた。しかし、これらのアプローチの大きな欠点は、それらの確率論的性質のために、産生される子孫分子の各セットの正確な（exact）構成成分にランダム性が存在することである。従って、実験者は、通常ある特定の反応容器内において、どの正確な子孫分子種が示されているかについてその産生前にはほとんど又は全く分からない。それゆえ、（例えば、望ましい子孫分子の探索の続行中において）確率論的手法が反復される時、以前に破棄された望ましくない分子種の再産生および再スクリーニングは、進行に対する労働集約的な障害となり、環状ではないとしても、遠回りの経路がとられることになる。それらの分子構造を同定するために塩基配列決定等の労働負担的（labor-incurring）過程に、確率論的に産生された子孫分子セットを供することにより、しかしこれでさえ不完全な救済法ではあるが、そのような非常に最適以下の経路の欠点は処理されうる。
【００１９】
さらに現在の確率論的方法は、ある特定の変異分類内における全ての分子種を包括的にまたは網羅的に産生すること、ある鋳型分子（例えばある特定の一つのアミノ酸部位または、二つもしくはそれ以上のアミノ酸部位からなる配列）における特定の構造基に機能性を帰すること、および特定の変異分類を分別および比較することのためには非常に不適である。したがって、現在の確率論的方法は、不要な変異導入の結果を体系的に除去することが本質的にできず、かつ要するに本質的な欠点が多すぎて指向進化に最適化できないことが負担となっている。
有用なハイブリッドタンパク質及びこれらのハイブリッドタンパク質をコードする対応する生物学的分子、即ちDNA、RNAを作製するための、タンパク質内のアミノ酸の意図的及びランダムな組み合わせには、極めて多数の可能性が存在する。従って、そのような極めて多様なハイブリッドタンパク質、特に、多様性の大きいランダムタンパク質を作製し、所望の有用性に関してそれらをスクリーニングする必要が存在する。
【００２０】
生物学的高分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列の両方を含む分子）の活性配列の複雑度は、情報含有量（information content）（「IC」）と呼ばれている。ICとは、活性タンパク質のアミノ酸配列変動に対する抵抗性（同一機能を有する関連配列のファミリーを記載するために必要な不変アミノ酸の最小数（ビット）から計算される）と定義されている。ランダム突然変異誘発に対する感受性が比較的高いタンパク質は、高い情報含有量を有する。
分子ライブラリーのような分子生物学の発達は、極めて多数の可変塩基の同定を可能にし、さらに、ランダムライブラリーから機能的配列を選択するための方法をも提供した。そのようなライブラリーにおいて、大部分の残基が、状況における補正変化に依存して変動しうる（ただし、典型的には、全て同時ではない）。従って、100アミノ酸のタンパク質は、異なる突然変異を2,000個しか含有できないが、20100 個の配列組み合わせが可能である。
情報密度（information density）とは、配列の単位長さ当たりのICである。酵素の活性部位は、高い情報密度を有する傾向がある。対照的に、酵素内の情報のフレキシブルリンカーは、低い情報密度を有する傾向がある。
【００２１】
ライブラリー形式で別タンパク質を作製するために広範に使用されている現在の方法は、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応、及び最適化すべき特異的領域を合成的に変異誘発されたオリゴヌクレオチドと交換するカセット変異誘発である。いずれの場合においても、最初の配列内のいくつかの部位の周辺に、実質的な数の変異部位が生成する。
エラープローンPCRは、低レベルの点突然変異を長い配列へとランダムに導入するための忠実度の低い重合条件を使用する。未知の配列を有する断片の混合物においては、エラープローンPCRが、混合物を変異誘発するために使用されうる。発表されているエラープローンPCRプロトコルにおいては、ポリメラーゼの低い進行度（processivity）が問題となる。従って、そのプロトコルは、平均的なサイズの遺伝子のランダム変異誘発をもたらすことができない。そのため、エラープローンPCRの実際の適用は制限されている。点突然変異のみでは、あまりに逐次的であるため、継続的かつ劇的な配列進化に必要な大規模なブロック変化を可能にし得ない場合が多いことが、いくつかのコンピュータシミュレーションにより示唆されている。さらに、発表されているエラープローンPCRプロトコルでは、0.5 から1.0 kbより大きいDNA断片を増幅することができず、実際の適用は制限されている。さらに、エラープローンPCRのサイクルを繰り返すことにより、結合親和性ではなくタンパク質の免疫原性に影響を与えるような望ましくない結果を有する中性的な突然変異が蓄積しうる。
【００２２】
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発においては、短い配列が、合成的に変異誘発されたオリゴヌクレオチドと交換される。この手法は、離れた変異の組み合わせを生成させず、従ってコンビナトリアルではない。膨大な配列長と比較すると限定されているライブラリーサイズは、タンパク質を最適化するために多くの選択ラウンドが不可欠であることを意味する。合成オリゴヌクレオチドを用いた変異誘発には、各選択ラウンドの後、個々のクローンを配列決定し、続いてそれらをファミリーに分類し、単一のファミリーを任意に選択し、コンセンサスモチーフへと縮小することが必要である。そのようなモチーフが、再合成され、単一遺伝子へと再挿入され、続いてさらなる選択を行われる。この段階は、統計的な障害物を構成し、大きな労力を要し、多くの突然変異誘発ラウンドにとっては実用的でない。
従って、エラープローンPCR及びオリゴヌクレオチド特異的変異誘発は、配列微調整の単一サイクルにとっては有用であるが、複数のサイクルに適用する場合には急速に限定されたものとなる。
エラープローンPCRのもう一つの限界は、ダウンミューテーション(down-mutations) の速度が、配列の情報含有量と共に増大するという点である。情報含有量、ライブラリーサイズ、及び変異誘発速度が増大するにつれ、ダウンミューテーションとアップミューテーション (up-mutation) との均衡が、さらなる改良の選択を統計的に妨害するであろう（統計的上限）。
【００２３】
カセット変異誘発においては、単一鋳型の配列ブロックが典型的には（部分的に）ランダム化された配列と交換される。従って、入手されうる最大情報含有量が、ランダム配列の数（即ち、ライブラリーサイズ）によって統計的に制限される。これは、現在は最良でないが、長期的には大きな潜在能力を有するかもしれない、その他の配列ファミリーを除去する。
また、合成オリゴヌクレオチドを用いた変異誘発は、各選択ラウンド後の個々のクローンの配列決定を必要とする。従って、そのような手法は、面倒であり、多くの変異誘発ラウンドにとっては実用的でない。
従って、エラープローンPCR及びカセット変異誘発は、比較的低い情報含有量の区間を微調整するためには最も適しており、広範に使用されている。一つの明らかな例外は、エラープローンPCR及び選択による多くの増幅ラウンドを使用した、ランダムライブラリーからのRNAリガーゼリボザイムの選択である。
天然において、大部分の生物の進化は、天然の選択及び有性生殖により起こる。有性生殖は、選択された個体の子孫における遺伝子の混合及び組み合わせを確実にする。減数分裂においては、親からの相同染色体が、長さに沿って互いに整列し、一部を交差することによって、遺伝材料をランダムにスワッピングする。そのようなDNAのスワッピング又はシャッフリングは、生物がより迅速に進化することを可能にする。
組換えにおいては、挿入配列が相同な環境において有用性を有することが立証されたため、挿入配列は、新たな配列に挿入された後も、実質的な情報量を有している可能性が高い。
【００２４】
理論的には、100アミノ酸のタンパク質には2,000個の異なる単一変異体が存在する。しかしながら、100アミノ酸のタンパク質は 20100 個の可能な配列組み合わせを有し、この数は、従来の方法により徹底的に検索するには大きすぎる。これらの可能な組み合わせ突然変異の全てを生成させ、スクリーニングすることを可能にするであろう系を開発することは、有利であると考えられる。
当技術分野における数人の研究者は、ファージ系における発現のため、軽鎖抗体遺伝子と重鎖抗体遺伝子とを組み合わせたハイブリッドを生成させるため、インビボ部位特異的組み換え系を利用している。しかしながら、それらの系は、特定の組み換え部位に依存しており、従って限定されている。オーバーラッピング伸長及びPCRによる、一本鎖抗体（scFv）における抗体CDR領域の同時突然変異誘発が、報告されている。
ランダムインビボ組換えを使用して、複合ハイブリッドの大集団を生成させるための方法も記載されている。この方法は、それぞれが異なる選択可能マーカーを有する二つの異なるプラスミドライブラリーの組換えを必要とする。その方法は、存在する選択可能マーカーの数と等しい有限の組換え数に限定されており、選択された（一つ又は複数の）配列と連結したマーカー遺伝子の数を同時に直線的に増加させる。
二つの相同であるが短縮されているプラスミド上の昆虫毒素遺伝子間のインビボ組み換えが、ハイブリッド遺伝子を作製する方法として報告されている。ハイブリッド分子形成をもたらす、欠陥ミスマッチ修復酵素を有する宿主細胞における、実質的にミスマッチのDNA配列のインビボ組換えが、報告されている。
【００２５】
概 要
本発明は、複数の抗原結合部位をコードした核酸の一群あるいはライブラリーの作製方法を提供する。その中にある修飾された抗原結合部位とは初めの抗原結合部位をコードした配列を持った初めの核酸に由来するものである。その方法とは、
ａ）初期抗原結合部位をコードしている初期核酸を提供する。
ｂ）初期核酸にある複数の標的コドンに異なった天然に存在するアミノ酸による変異をコードするようにした一群の変異オリゴヌクレオチドを与える。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された変異アミノ酸の並びをコードしている 一群の抗原結合部位をコードした変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを用い、修飾された多数の抗原結合部位をコードしている核酸ライブラリーを作製する。
から成る。
本発明の一例として、ステップb）は、各標的コドンが19種ある全ての天然アミノ酸のコードするような一群の変異オリゴヌクレオチドを与え、それにより、変異される各アミノ酸コドンに19種ある天然に存在する全てのアミノ酸を変異として存在させることができる。
その方法は、さらに変異核酸にコードされた抗原結合部位をコードしたポリペプチドが発現するように変異抗原結合部位をコードしている核酸の一群を発現する方法を含んでいる。
【００２６】
一例として、一群の変異オリゴヌクレオチドは、変異される各コドンに対して19倍に縮重（degenerate）された変異オリゴヌクレオチドを含み、その中には、変異オリゴヌクレオチドの各々が単一の第一配列と一つの変異トリプレットを持つ第二配列を含んでいる。
抗原結合部位は、一本鎖抗原結合ポリペプチド、Fabフラグメント、Fcフラグメント、Fdフラグメント、F(ab)2フラグメント、Fvフラグメントまたは相補性決定領域（CDR）を包含し得る。
他の例として、抗原結合部位は、さらに、T細胞受容体（TCR）の抗原結合部位をも含めることができる。本発明の方法によって修飾されたTCR抗原結合部位のポリペプチド配列は、TCRアルファ鎖、TCRベーター鎖あるいはその両方を含むことができる。抗原結合部位のポリペプチドは、さらに、T細胞受容体（TCR）を含めることができる。
他の例として、抗原結合部位のポリペプチドは、さらに、主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）の抗原結合部位を含めることができる。抗原結合部位のポリペプチドはさらに主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）を含めることができる。他の例として、主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）は、クラスI MHC 分子またはクラスII MHC 分子を含めることができる。 本発明による方法によって修飾された MHC 抗原結合部位のポリペプチド配列は、MHC クラスII分子アルファ鎖、MHC クラスII分子ベーター鎖あるいはその両方を含むことができる。
【００２７】
違った一例として、ステップａ）の核酸は、哺乳動物のポリペプチド、例えば、ヒトのポリペプチド、をコードした核酸に由来している。哺乳動物のポリペプチドは、抗体、T細胞受容体（アルファ鎖及び／又はベーター鎖）クラスI MHC 分子、あるいはクラスII MHC 分子（アルファ鎖及び／又はベーター鎖）であり得る。
ステップａ）の核酸は、抗原結合部位をコードしたヒトの核酸に由来することができる。ステップａ）の核酸は、抗原結合部位をコードしたヒトの核酸を含んだファージに由来することができ、そのファージは、抗原結合部位を発現する。ステップａ）の核酸は、抗原結合部位をコードしたヒトの核酸を含んだヒト以外の哺乳動物に由来することができ、それらヒト以外の哺乳動物は、その抗原結合部位を発現する。ヒト以外の哺乳動物は、形質変換した哺乳動物、例えば、マウスをも含む。
その方法の一例として、本法は、抗原結合部位の少なくとも二つのアミノ酸コドンが変異される。別法として、抗原結合部位の全てのアミノ酸コドンを変異させたり、あるいは、抗体、T 細胞受容体、MHC ポリペプチドのようなタンパク質の全てのアミノ酸コドンを変異させる。
一例として、変異オリゴヌクレオチドは第一の単一配列、変異されたトリプレットを持つ第二の配列そして第三の単一配列から成る。他の例として、各変異オリゴヌクレオチドは第一の単一配列、多数の変異されたトリプレットを持つ第二の配列そして第三の単一配列から成る。
【００２８】
本法は、さらに、発現された抗原結合部位ポリペプチドをその抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。一例として、本法は、さらに、発現された抗原結合部位ポリペプチドを初期抗原結合部位ポリペプチドと特異的に結合する抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。一例として、本法は、抗原への初期抗原結合部位の親和性あるいは特異性と比較して増加された抗原結合親和性あるいは抗原結合特異性を利用して抗原結合部位亜種を同定することを含んでいる。一例として、本法は、抗原への初期抗原結合部位の親和性あるいは特異性と比較して低下された抗原結合親和性あるいは抗原結合特異性を利用して抗原結合部位亜種を同定することを含んでいる。
本法は、至適化された特異的進化システムを含む方法によってステップａ）の核酸を変異させることを含めることができる。本法は、合成的結合再構成を含む方法によってステップａ）の初期核酸を変異させることを含めることができる。
本法は、発現された抗原結合部位ポリペプチドをその発現された抗原結合部位ポリペプチドの固相での発現を含んだ方法によってその抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。本法は、キャピラリーアレーを含んだ方法により発現された抗原結合部位ポリペプチドをその抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。
【００２９】
本法は、例えば、GIGAMATRIX（登録商標）、のような二穴コンテナキャピラリーアレーを含んだ方法により発現された抗原結合部位ポリペプチドをその抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。本法は、ELISA の使用を含む 方法によって特異的な抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。本法は、抗原結合部位ポリペプチドのファージディスプレーを含んだ方法によって特異的な抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。本法は、発現された抗原結合部位ポリペプチドを発現させた抗原結合部位ポリペプチドの液相における発現を含んだ方法によって特異的な抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。本法は、抗原結合部位ポリペプチドのリボゾームディスプレーを含んだ方法によって特異的な抗原への特異的結合能を見るためにスクリーニングすることを含む。
【００３０】
一例として、本法は、変異核酸をコードした一群の抗原結合部位子孫を多数のオリゴヌクレオチドを使ったポリメラーゼを基にした増幅、例えばポリメラーゼチェインリアクション（PCR）、によってステップａ）の核酸を増幅することにより作製する。
本発明は、以下のような方法により作られた多数の修飾された抗原結合部位をコードした核酸のライブラリー、その中の修飾された抗原結合部位は初期抗原結合部位配列をコードした初期核酸に由来する、を提供する。その方法は、
ａ）初期抗原結合部位配列をコードした初期核酸を提供する。
ｂ）初期核酸における多数の標的コドンにおいて、天然に存在するアミノ酸による変異を持たせた一群の変異オリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された変異アミノ酸の並びをコードしている一群の抗原結合部位をコードした変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを使用して多数の修飾された抗原結合部位をコードした核酸のライブラリーを作製する。
のステップを含む。
本発明は、鋳型の抗体から変異抗体のライブラリーを作製する方法を提供する。その方法は、
ａ）鋳型抗体をコードしている初期核酸を提供する。
ｂ）初期核酸における多数の標的コドンで天然に存在するアミノ酸による変異をコードする一群の変異オリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された変異アミノ酸の並びをコードしている一群の抗体をコードした変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを使用して多数の変異抗体をコードした核酸のライブラリーを作製する。
から成っている。
【００３１】
一例として、ステップｂ）は、各標的コドンに19 種全ての天然に存在するアミノ酸で変異を持たせるような一群の変異オリゴヌクレオチドを提供するものであり、それによって、変異された各アミノ酸コドンにおいて19 種全ての天然に存在するアミノ酸での変換を作製する。抗体は、Fabフラグメント、Fcフラグメント、Fdフラグメント、F(ab)2フラグメント、Fvフラグメントまたは相補性決定領域（CDR）から成るポリペプチドであり得る。
方法の一例として、多数のオリゴヌクレオチドは、変異される各コドンに対して一つの変性されたオリゴヌクレオチドを含み、単一の初期配列及び変性トリプレットを持つ二次配列を含んでいる。抗体をコードした一群の子孫オリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドを用いたステップａ）の核酸を増幅することにより作製できる。
本発明は、以下の方法により作製される鋳型抗体に由来する変異抗体のライブラリーを提供する。その方法は、
ａ）鋳型抗体をコードした初期核酸を提供する。
ｂ）初期核酸中にある多数の標的コドンに天然に存在するアミノ酸よりなる変異を持つ一群の変異オリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された変異アミノ酸の並びをコードしている抗体をコードした一群の変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを使用して多数の変異抗体をコードした核酸のライブラリーを作製する。
を含む。
【００３２】
本発明は、鋳型T細胞受容体（TCR）より変異T細胞受容体（TCRs）を作製する方法を提供する。その方法は、
ａ）鋳型T細胞受容体をコードした初期核酸を提供する。
ｂ）初期核酸中にある多数の標的コドンに天然に存在するアミノ酸よりなる変異を持つ一群の変異オリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された変異アミノ酸の並びをコードしているT細胞受容体（TCR）をコードした一群の変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを使用して多数の変異T細胞受容体（TCRs）をコードした核酸のライブラリーを作製する
等を含むものである。
【００３３】
本発明は、以下の方法によって作製される鋳型T細胞受容体（TCR）に由来する変異T細胞受容体（TCRs）ライブラリーを提供する。その方法は、
ａ）鋳型T細胞受容体をコードした初期核酸を提供する。
ｂ）初期核酸中にある多数の標的コドンに天然に存在するアミノ酸よりなる変異を持つ一群の変異オリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された変異アミノ酸の並びをコードしているT細胞受容体（TCR）をコードした一群の変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを使用して多数の変異T細胞受容体（TCRs）をコードした核酸のライブラリーを作製する。
等を含むものである。
【００３４】
本発明は、鋳型主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）より変異T細胞受容体（TCRs）を作製する方法を提供する。その方法は、
ａ）鋳型主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）をコードした初期核酸を提供する。
ｂ）初期核酸中にある複数の標的コドンに天然に存在するアミノ酸よりなる変異を持つ一群の変異オリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された変異アミノ酸の並びをコードしている主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）をコードした一群の変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを使用して多数の主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）をコードした核酸ライブラリーを作製する。
等を含むものである。
本発明は、以下の方法によって作製される鋳型主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）に由来する変異主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）ライブラリーを提供する。その方法は、
ａ）鋳型主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）をコードした初期核酸を提供する。
ｂ）初期核酸中にある複数の標的コドンに天然に存在するアミノ酸よりなる変異を持つ一群の変異オリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された変異アミノ酸の並びをコードしている主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）をコードした一群の変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを使用して多数の変異主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）をコードした核酸のライブラリーを作製する。
等を含むものである。
【００３５】
本発明は、一群の変異抗原結合部位をコードした一群の核酸を作製する方法を提供する。その方法は、
ａ）抗原結合ポリペプチドをコードした鋳型核酸を提供する。
ｂ）抗原結合ポリペプチドのあるアミノ酸残基に天然に存在する全てのアミノ酸よりなる変異を持つ多数の変異オリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで変異された単一アミノ酸の非確率的並びをコードしている抗原結合部位変異核酸の子孫を作製する。変異される各アミノ酸コドンにおいて19種ある全てのアミノ酸置換が作製され、それにより、一群の抗原結合部位をコードした一群の核酸を作製する。
等を含むものである。
本発明の一例として、本法は、一群の子孫抗原結合部位をコードしたポリヌクレオチドを子孫抗原結合部位をコードしたポリペプチドが発現するように発現させることを含む。多数のオリゴヌクレオチドとは一群の変異オリゴヌクレオチド及び単一の初期配列及び変性トリプレットを持つ二次配列を含む変性オリゴヌクレオチドから成る。
一例として、抗原結合部位をコードしたポリペプチドは、一本鎖の抗原結合ポリペプチドから成る。抗原結合部位をコードしたポリペプチドは、T細胞受容体（TCR）の抗原結合部位あるいはT細胞受容体（TCR）を含み得る。違った展望に於いて、抗原結合部位をコードしたポリペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）の抗原結合部位あるいは主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）を含み得る。
【００３６】
一例として、ステップａ）の核酸は、哺乳動物の抗体ポリペプチドをコードした核酸に由来できる。ステップａ）の核酸は、ヒト核酸に由来できる。
一例として、抗原結合部位の少なくとも二つのアミノ酸コドンが変異され、変異される各アミノ酸コドンに19種ある全ての天然アミノ酸を変異としてコードさせるための一群の変異オリゴヌクレオチドが提供される。一例として、抗原結合部位の全てのアミノ酸コドンが変異され、変異される各アミノ酸コドンに19種ある全ての天然アミノ酸を変異として コードさせるための一 群の変異オリゴヌクレオチドが提供される。
一例として、抗体ポリペプチドの全てのアミノ酸コドンが変異されることができる。違った一例として、T細胞受容体（TCR）の抗原結合部位の全てのアミノ酸コドンが変異され、主要組織適合遺伝子複合体分子（MHC）の抗原結合部位の全てのアミノ酸コドンが変異され、また、その抗体の抗原結合部位の全てのアミノ酸コドンが変異される。
【００３７】
一例として、変異オリゴヌクレオチドは、第一の単一配列、変異トリプレットを持つ第二の配列及び単一な第三の配列から成る。一例として、各変異オリゴヌクレオチドは第一の単一配列、変異トリプレットを持つ第二の配列及び単一な第三の配列から成る。
違った一例として、本法は、さらに、鋳型核酸を至適化した特異的進化システムを含む方法及び合成的結合再構成を含む方法によって変異することを含んでいる。19種ある天然に存在する全てのアミノ酸を変異として存在させることができる。
一例として、本法は、発現された抗原結合部位をコードしたポリペプチドをその抗原への特異的結合能のためにスクリーニングすることを含んでいる。その方法は、また、抗原結合部位をコードしたポリペプチドを初期の抗原結合部位によって結合されうる抗原への特異的結合能のためにスクリーニングすることを含んでいる。本法はステップａ）の核酸によりコードされた抗原結合部位の親和性あるいは特異性と比較して増加あるいは低下あるいは変異された抗原結合親和性あるいは抗原結合特異性を利用して抗原結合部位亜種を同定することを含んでいる。
違った一例として、発現された抗原結合部位をコードしたポリペプチドを固相あるいは液相においてその特異的結合能のためにスクリーニングすることを含んでいる。一例として、本法は、二穴キャピラリーアレーのようなキャピラリーアレーを含んでいる。本法は、ELISA によって抗原への特異的結合 能を見るために抗原結合部位をコードしたポリペプチドをスクリーニングすることを含む。
違った一例として、一群の変異核酸は、ステップａ）の核酸について抗原結合ポリペプチドの少なくとも一つあるいは全てのアミノ酸残基において19種のアミノ酸で置換変種した変異核酸を作製するための一群の変異オリゴヌクレオチドを用いた増幅反応を行うことにより作製する。その増幅は、ポリメラーゼを基にしたポリメラーゼチェインリアクション（PCR）あるいは他の同等な増幅反応を含む。
違った一例として、一群の核酸は、1010 分子、109、109、108、107、 106、105、104、103、102分子から成る。
【００３８】
本発明は、一群の変異抗体（ライブラリー）を作製する方法を提供する。その方法は、
ａ）ある抗体をコードしたある核酸を提供する。
ｂ）複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）各アミノ酸コドンで単アミノ酸置換した非統計的な並びを作りだし、変異される各アミノ酸コドンには19種ある全ての天然アミノ酸による変異が作りだされ、それにより一群の変異核酸が作製される。
ｄ）変異核酸によりコードされた変異抗体が発現されるように一群の変異核酸を発現させる。
等のステップを含む。
抗体は、Fabフラグメント、Fcフラグメント、Fdフラグメント、F(ab)2フラグメント、Fvフラグメントまたは相補性決定領域（CDR）包含しているポリペプチド集団から選別できる。多数のオリゴヌクレオチドは抗体のある一つのアミノ酸に19種ある全ての天然アミノ酸による変異が作りだせるようにコードした一群の変異オリゴヌクレオチドを包括し、各変異オリゴヌクレオチドは単一の初期配列と一つの変異トリプレットを持つ二次配列を含む。単アミノ酸置換の非確率的な並びを作製する方法は、ステップａ）の核酸について抗体の各アミノ酸残基において19種ある全ての天然アミノ酸による変異が作りだせるような一群のオリゴヌクレオチドを用いた増幅反応を行うことを含み得る。
【００３９】
本発明は、抗原結合部位の変種を同定する方法を提供する。その方法は、
ａ）ある抗原結合部位をコードしたある核酸を提供する。
ｂ）抗原結合部位の全ての残基に19種ある全ての天然アミノ酸による変異が作りだせるようにコードした一群のオリゴヌクレオチドを提供する。
ｃ）ステップｂ）のオリゴヌクレオチドを抗原結合部位の各残基に19種ある全ての天然アミノ酸による変異が作りだせるようにコードした一群の変異核酸作製するステップａ）の核酸に導入する。
ｄ）変異核酸の各々をポリペプチドとして発現し、抗原に対する変異ポリペプチドの親和性を測定する。
ｅ）ステップａ）の核酸によってコードされた初期抗原結合部位の結合親和性に比べた結合親和性の増加あるいは低下により変異抗原結合部位の同定を行う。
等のステップを含む。
一例として、変異核酸は、インビトロトランスクリプション／トランスレーション法により発現させる。異なった一例として、変異核酸は、ファージディスプレー、リボゾームディスプレー、あるいはそれらと同等の方法によって発現させる。異なった展望として、発現された抗原結合部位を固相あるいは液相においてその特異的結合能のためにスクリーニングすることを含んでいる。一つの展望に於いて、スクリーニングは、二穴キャピラリーアレーのようなキャピラリーアレーにより達成される。
【００４０】
一例として、一群のオリゴヌクレオチドには抗体の少なくとも一つのアミノ酸残基に19種ある全ての天然アミノ酸による変異をコードした一群の 変異オリゴヌクレオチドが含まれ、各変異オリゴヌクレオチドは、単一の初期配列と一つの変異トリプレットを持つ二次配列を含む。一例として、一群のオリゴヌクレオチドは、抗体の全てのアミノ酸残基に19種ある全ての天然アミノ 酸による変異持たせるようにコードした一群の変異オリゴヌクレオチドを含んでいる。一つの展望に於いて、ステップｂ）のオリゴヌクレオチド配列をステップａ）の核酸に導入する方法は、そのオリゴヌクレオチドをプライマーとする増幅反応により達成される。
一例として、抗原結合部位は、Fabフラグメント、Fcフラグメント、Fdフラグメント、F(ab)2フラグメント、Fvフラグメントまたは相補性決定領域（CDR）を包む抗体を含む。異なった一例として、抗原結合部位は、T 細胞 受容体や主要組織適合遺伝子複合体分子の抗原結合部位を含む。異なった一例として、本発明の方法により作製される抗原結合部位をコードした核酸（例えば、修飾した抗原結合部位をコードした核酸のライブラリー）は、さらに変化あるいは進化される。それらの核酸配列は、ミュータジェネシス、塩基の挿入、あるいは塩基の削除を行うことにより変えられる。さらにこの中に詳しく説明されるように、遺伝子飽和部位変異法（Gene Site Saturation Mutagenesis : GSSM） 及び遺伝子再集合法（GeneReassembly）（Diversa Corp. San Diego, California）を含む進化のテクノロジーは、それらの配列をさらに工学的に修飾するために使われる。あるいは、それらの核酸配列は、例えば、error-prone PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチドを基にした変異法、assembly PCR、 sexual PCR 変異法、インビトロ変異法、カセット変異法、部位特異的変異法、遺伝子再集合、再帰的アンサンブル変異法、指数的アンサンブル変異法、遺伝子飽和部位変異法（GSSM）、合成結合再集合（SLR）及び／あるいはそれらの組み合わせ等の方法により変化あるいは進化あるいは遺伝工学的に修飾されることができる。
【００４１】
異なった一例として、その修飾、付加あるいは削除は、例えば、組換え、再帰的配列組換え、フォスフォチオエイトDNA変異法、ウラシル含有テンプレート変異法、ギャップデュプレックス変異法、ポイントミスマッチリペアー変異法、リペアー欠損宿主変異法、化学変異法、放射線変異法、デリション変異法、リストリクション／セレクション変異法、リストリクション／ピュリフィケーション変異法、人工遺伝子合成、アンサンブル変異法、キメラ遺伝子重合体の創製及び／又はそれらの組み合わせ等の方法によって導入される。一例として、それらの方法は、抗原結合部位（例えば、抗体）が進化される抗原結合部位に比べ変化あるいは異なった活性または安定性を持てるまで反復繰り返し行われる。一例として、抗原結合分子をコードした核酸のCDR3領域が変化あるいは進化される。
一つの非制限的な例として、本発明は、親鋳型における可能な全ての点変異を包括的かつ徹底的に作製する非確率的な手段を提供する。他の非制限的な一例として、本発明は、さらに、キメラ集団の中に可能な全てのキメラを徹底的に作製する手段を提供する。従って、（背景において）前述した諸問題は、本発明により解決される。
【００４２】
本発明で述べられる技術的な例において特別な欠陥は、例えば、以下のようなことを含む。
１）信頼度の低い PCR などの部位特異的変異技術は、ポリペプチド配列 の各位置における可能な変異（即ち、可能なアミノ酸置換の全て）の完全な（飽和した）系統的な達成に非効果的である。
２）ある分子配列や一つあるいはそれ以上の鋳型分子の特異的な変異によって得られるであろう相当数の、あるいは、子孫分子に含まれる膨大な量の情報を迅速に分析するための相対的に簡単な系統的手段がない。
３）分子の構造と機能に関連した理解力のある経験的情報を提供する相対的に簡単な系統的手段がない。
４）ある変異操作（例えば、キメラ化）の重要な段階でポジティブコントロールのような内部標準を含めるための簡単な系統的手段がない。
５）より小さい部分的な配列の中から子孫分子の特別な集団（例えば、完全長のキメラ）を選別するための簡単な系統的手段がない。
【００４３】
本発明の具体的実施態様に於いて、実験的に（インビトロ及び／又はインビボ）に作製されたポリヌクレオチドライブラリーは、コードされたペプチドあるいはポリペプチドが複製可能な遺伝子封入体の表層で発現されるタンパクとの融合体として作られるように実験的に（インビトロ及び／又はインビボ）に作製されたポリヌクレオチドを発現させること、その受容体を発現する複数の細胞に複製可能な遺伝子封入体を接触させること、及びその受容体により媒介される免疫応答の調節が見られる細胞を同定すること、等によりスクリーニングされる。
【００４４】
異なった一例として、本発明のポリペプチドとは、ここに述べられる及び／あるいは参考される（引用された参考文献を含む）、生物学的に活性なフラグメントあるいはそれらの類似のアミノ酸配列と実体的に相同である。また、提供されるものはこれらポリペプチドを含んだ医薬構成成分である。
異なった実施態様として、本発明は、上述のポリペプチドをコードした核酸を提供する。本発明の典型的な核酸とは、ここに述べられる及び／又は参考される（引用された参考文献を含む）、核酸配列の一部分あるいは全体、あるいはここに述べられる及び／又は参考される（引用された参考文献を含む）配列をコードした核酸と実体的に相同である。本発明は、また、これら核酸の配列及び同じものを発現できる細胞に含まれる発現ベクターを提供する。
付加的な実施態様に於いて、本発明は、PfEMP1 あるいはその生物学的に活性 な断片を認識あるいはそれらと結合する抗体を提供する。これらのペプチドは、P.falciparum の一変種以上による感染と関連したPfEMP1タンパクを認識し結合できる。更なる具体例に於いて、本発明は、PfEMP1／リガンド複合体の形成を阻害する方法を提供し、PfEMP1またはそのリガンドと本発明のポリペプチドとを接触させることを含んでいる。関連した具体例として、本発明は、マラリアに感染した患者において赤血球の破壊脱落を阻害し、本発明のポリペプチドを前述した患者に効果量投与することを含む。そのような投与は、感染の前後において施される。別の関連した具体例として、本発明は、検体中に PfEMP1 の存否を検 出する方法を提供する。その方法は、その検体を本発明の抗体に暴露すること、たとえ僅かでも検体の成分と本抗体間の結合を検出することを含む。付加的な実体に於いて、本発明は、被検成分が PfEMP1／リガンド複合体の形成のアンタゴニストであるものかを調べる方法を提供する。その方法は、PfEMP1 あるいはその生物学的に活性な断片及びそのリガンドを持った被検成分を複合体形成の起こり得る条件下で反応させることを含む。被検成分の存在下に形成される複合体の量を測定し、それを被検成分の非存在下に形成される複合体の量と比較する。被検成分の存在下に形成される複合体の量が減少することは、その成分が PfEMP1 ／リガンド複合体形成のアンタゴニストであることに示唆的である。
【００４５】
特異的進化への手引きの総括
本発明はまた、概して核酸工学およびそれに伴うコード組換え型タンパク質工学に関連する。より詳しくは、本発明は、対象となる活性のために、核酸の指向的進化、および進化した核酸を有するクローンのスクリーニングに関するもので、そのような特定のタンパク質、特に酵素を有する核酸活性が、対象となる活性である。
本発明による突然変異分子は、キメラ分子及び点突然変異を有する分子を有していてもよく、それには、炭水化物、脂質、核酸、及び／又はタンパク質化合物、および、ここに限定されない詳細な例として抗生物質、抗体、酵素、ステロイドおよび非ステロイドホルモンを有する生物分子を含む。
本発明は、概して以下の方法に関する：1）一つ以上の祖先または親テンプレートから、少なくとも一つの点突然変異、追加、削除、及び/又はキメラ化を達成する突然変異である、子孫分子の調整（ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチド配列からなる分子、及び部分的にポリヌクレオチド配列及び部分的にポリペプチド配列からなる分子を含む）；2）好ましくは高スループット法を使用した、少なくとも一つの関連する特質のための、子孫分子のスクリーニング（例えば酵素活性の改良または安定化増加、または新規の化学療法効果等）；3）任意に、親及び/又は子孫分子の、構造及び/又は機能情報の獲得及び/又はリスト作成；および4）任意に、手段1）〜3）の何れかの繰り返し。
【００４６】
好ましい実施例において、（例えば、親ポリヌクレオチドテンプレートから）「コドンサイト飽和変異誘発」と呼ばれるものが生成される−少なくとも最高3つの連続した点突然変異一式を有する（例えば、新規のコドンを含む異なった塩基）子孫ポリヌクレオチド、それは例えば、すべてのコドン（又は同じアミノ酸をコードする同義コドンのすべての系統群）は、それぞれのコドン位置によって表される。この子孫ポリヌクレオチドに対応し−またコードされて−、少なくとも一つの単独アミノ酸点変異を有する子孫ポリペプチドが生成される。好ましくは「アミノ酸サイト飽和変異誘発」において、ポリペプチドに伴うそれぞれすべてのアミノ酸位置において19の自然コードポリペプチド形成α−アミノ酸置換で、それぞれに変異ポリペプチドの一つが発生する。これにより、親ポリペプチドに伴うそれぞれすべてのアミノ酸位置に、起源アミノ酸を含む合計20の異なった子孫ポリペプチド、または、20の自然コードアミノ酸に変わって、または追加して新たなアミノ酸が使用された場合には、場合によって22以上の異なった子孫ポリペプチドを生み出す。
つまり、他方では、20の自然コードポリペプチド形成α−アミノ酸に加えて、及び／又は組み入れて、この方法は、その他の希少及び/又は非自然コードアミノ酸またはアミノ酸誘導体を有する突然変異体の生成に有益である。また、一方では、この方法は,また、適切なホストの自然または非改変コドン認識システムに加えて及び/又は組み入れて、改変、形質転換及び/又はデザイナーコドン認識システムを利用して突然変異を引き起こすことに有益である。（例えば1つ以上の改変tRNA分子を有するホスト細胞。）
【００４７】
また、本発明は、組換えに関するもので、より詳細には、生体内で部分的相同性のある範囲を含むポリヌクレオチド配列を再分類し、ポリヌクレオチドを分類して少なくとも1つのポリヌクレオチドを形成し、役立つ特質を有するポリペプチドの生成のためにポリヌクレオチドをスクリーニングすることによって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの調整方法である。
その他の好ましい実施例において、本発明は、分子特性（例えば、酵素活性）や現在の技術で得られる特性の組合せに関し、得られた変異の効果をすべて分析、カタログ化するのに役立つ（特に飽和変異誘発を含む）。つまり、親ポリペプチド内のそれぞれのアミノ酸を、少なくとも19の可能な置換物それぞれに変化させる効果を判定する総合的な方法を提供するものである。これにより、親ポリペプチド内のそれぞれのアミノ酸は、ポリペプチドの測定可能な潜在特性の範囲に応じて、特徴づけられまた、カタログ化されることになる。また、本発明の方法は、分子の組換え及び/又は複雑な配列や、相同範囲を有する反復または連続した配列の範囲を還元する媒介となるよう、細胞の自然特性を活用する。
【００４８】
本発明の目的の一つは、強化された活性を有する生物学的に活性であるハイブリッドポリペプチドをコードするハイブリッドポリヌクレオチドを生成する方法を提供することである。これらのまたその他の目的を達成するにあたり、本発明の特徴によれば、ポリヌクレオチドを適切なホスト細胞に導入しハイブリッドポリヌクレオチドを生成する条件下でホスト細胞を成長させる方法が提供される。
本発明の他の特徴では、本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドに暗号かされた生物学的に活性であるハイブリッドポリペプチドのスクリーニング方法を提供する。本方法により、強化された生物学的活性を有する生物学的に活性であるハイブリッドポリペプチドの特定ができる。
【００４９】
被検分子がポリペプチド（ペプチドを含む）の場合、それは、その初期配列（wild type）の修飾、付加、あるいは削除により修飾される。その修飾はア ミノ酸残基（例えば、疎水性残基を他の疎水性残基に変えるような保守的変換、あるいは、疎水性残基を親水性残基に変えるような非保守的変換）における変換であり得るし、または、アミノ酸残基の構造変換、例えば、翻訳後に起こる変換（リン酸化、脂質化等）またはアミノ酸残基の合成後の変換（サイクロデプシペプチド、ミコスポリン様アミノ酸、アミドか、酸化またその類）のよることも可能である。被検ポリペプチドの修飾は、例えば、error-prone PCR、シャッフリ ング、オリゴヌクレオチドを基にした変異法、assembly PCR、sexual PCR変異法、インビトロ変異法、カセット変異法、部位特異的変異法、遺伝子再集合、再帰的アンサンブル変異法、指数的アンサンブル変異法、遺伝子飽和部位変異法（GSSM）、合成結合再集合（SLR）及び／又はそれらの組み合わせなどの方法により導入することができる。異なった一例として、その修飾、添加あるいは削除は、例えば、組換え、再帰的配列組換え、フォスフォチオエイトDNA変異法、ウラシル含有テンプレート変異法、ギャップデュプレックス変異法、ポイントミスマッチリペアー変異法、リペアー欠損宿主変異法、化学変異法、放射線変異法、デリーション変異法、リストリクション／セレクション変異法、リストリクション／ピュリフィケーション変異法、人工遺伝子合成、アンサンブル変異法、キメラ遺伝子重合体の創製及び／又はそれらの組み合わせ等の方法によって導入される。
【００５０】
高親和性抗体を作製する方法
本発明は、高親和性抗体を作製する方法を提供する。その方法は、
ａ）単離したＢリンパ球細胞の標品を提供する。
ｂ）単離したＢリンパ球細胞に由来する抗体分子をコードした核酸を単離あるいはクローン化する。
ｃ）抗体をコードした核酸を翻訳し、その翻訳したポリペプチドを VH/ VL ペアーリングが抗原結合分子を形成することのできる条件下に置く。
ｄ）その抗原結合分子を抗原に対する選択的結合能及びその抗原親和性によりスクリーニングする。
ｅ）抗原結合分子をコードした核酸単離し、その核酸配列を変化させる。
ｆ）その抗原結合分子を抗原に対する選択的結合能により次の手順で再スクリーニングする。
i）抗原結合ポリペプチドを作製するためのステップｅ）において単離した抗体をコードした核酸を発現させる。
ii）その発現したポリペプチドをVH/VLペアーリングが抗原結合分子を形成することができる条件の下に置く。
iii）その抗原結合分子を抗原に対する選択的結合能によりスクリーニングし、それをステップ d）でスクリニングした抗原結合分子よりも親和性の高いものを得る。
のステップを含む。
【００５１】
異なった一例として、Ｂリンパ球細胞は、ヒトあるいはマウスのＢリンパ球細胞である。Ｂリンパ球細胞は、FACS による選別により単離することができる。
一例として、抗体をコードした核酸は、mRNA を含み、抗体をコードした核酸は RT-PCR により単離することができる。
一例として、Ｂリンパ球細胞は、抗体をコードした核酸が単離あるいはクローン化される前に別々のフラクションに集めることができる。Ｂリンパ球細胞はフラクション当たりおおよそ 1000、500、100、50、25 あるいは10細胞ずつに分画することができる。
異なった一例として、その核酸の配列は、変異法、塩基挿入、あるいは塩基削除により変えられる。進化テクノロジー、例えば、この中に詳しく説明されるように、遺伝子飽和部位変異法（Gene  Site  Saturation  Mutagenesis（登録商標）:  GSSM）及び遺伝子再集合法（GeneReassembly（登録商標））（Diversa Corp. San Diego,  California）は、さらにこれらの配列を工学的に修飾するために使われる。別法として、その核酸配列は、例えば、error-prone PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチドを基にした変異法、assembly PCR、sexual  PCR変異法、インビトロ変異法、カセット変異法、部位特異的変異法、遺伝子再集合、再帰的アンサンブル変異法、指数的アンサンブル変異法、遺伝子飽和部位変異法（GSSM）、合成結合再構成（SLR）及び／又はそれらの組み合わせなどの方法により変化、進化あるいは遺伝工学的に修飾されることができる。異なった一例として、その修飾、付加あるいは削除は、例えば、組換え、再帰的配列組換え、フォスフォチオエイトDNA変異法、ウラシル含有テンプレート変異法、ギャップデュプレックス変異法、ポイントミスマッチリペアー変異法、リペアー欠損宿主変異法、化学変異法、放射線変異法、デリーション変異法、リストリクション／セレクション変異法、リストリクション／ピューリフィケーション変異法、人工遺伝子合成、アンサンブル変異法、キメラ遺伝子重合体の創製及び／又はそれらの組み合わせ等の方法によって導入される。一例として、それらの方法は、抗体が進化される抗体に比べて変化あるいは異なった活性あるいは安定性を持てるまで反復繰り返し行われる。一例として、抗原結合分子をコードした核酸の CDR3 領域が変化あるいは進化される。
【００５２】
抗体アレーとそれらを作製、使用する方法
本発明は、多数のポリペプチドから成るアレー（例えば、バイオチップ）を提供し、各ポリペプチドはポリペプチドアレーを作るために基質表面に分離した既知のスポットとして固定化され、多数のポリペプチドは個別に単離また／あるいは発現された抗原結合部位の標品（サブセット）あるいは全てを含む。一例として、一つあるいはそれ以上の抗原結合部位は、ここに述べるように、一つあるいはそれ以上の本発明における方法により修飾あるいは進化された核酸によりコードされた抗原結合部位であり得る。一例として、一つあるいはそれ以上のこれら抗原結合部位は、本発明のライブラリー（例えば、核酸によりコードされた抗原結合部位）に由来した核酸にコードされた抗原結合部位であり得る。
一例として、アレーにおけるポリペプチドは、個々に発現された分泌抗体あるいは細胞−発現（例えば、細胞に結合した発現）抗体あるいはそれらの断片を含んだ抗体から単離されるものかあるいはその抗原結合部位と相補的なものである。一例として、抗原結合部位は、個々に発現された循環抗体について発現させた抗原結合部位から単離されるものかあるいはその抗原結合部位と相補的なものである。一つあるいはそれ以上のこれらの分泌、循環及び／又は細胞−発現抗原結合部位は、ここに述べるように、一つあるいはそれ以上の本発明における方法により修飾あるいは進化された核酸によりコードされたものであり得る。
一例として、細胞結合抗体とは、B細胞結合、血漿細胞結合あるいはマクロファージ結合抗体を含む。細胞結合性抗体は、IgG、IgM、IgD、IgA及び／あるいはIgE であり得る。一例として、その標品は、個々に発 現された細胞結合抗体あるいは循環抗体について発現させた抗原結合部位から単離されるものかあるいはその抗原結合部位と相補的なものである。一例として、その標品は個々に発現された抗体の完全なレパートリーから成る。
一例として、抗原結合部位は、一本鎖抗原結合ポリペプチドの Fabフラグメント、Fcフラグメント、Fdフラグメント、F(ab)2フラグメント、Fvフラグメントまたは相補性決定領域（CDR）から成る集団から選別されたポリペプチドから成る。抗原結合部位は各々二本の軽鎖と重鎖から成る抗体ポリペプチドを含み得る。
【００５３】
一例として、その標品は、個々のリンパ節で発現する抗原結合部位から単離されるものかあるいはその抗原結合部位と相補的なものである。リンパ節は、例えば、解剖あるいは生検により単離されることができる。その細胞は吸引あるいはセルソーターにより採ることができる。
一例として、その標品は個体に発現されるT細胞受容体（TCRs）から単離される抗原結合部位の補足成分かあるいはそのT細胞受容体（TCRs）と相補的な抗原結合部位の補足成分である。その標品は個体に発現されるT細胞受容体（TCRs）及び抗体から単離される抗原結合部位の補足成分かあるいはそのT細胞受容体（TCRs）と相補的な抗原結合部位の補足成分である。
その標品は、個体に発現されるT細胞受容体（TCRs）から単離される抗原結合部位かあるいはそのT細胞受容体（TCRs）と相補的な抗原結合部位である。その標品は、個体に発現されるT細胞受容体（TCRs）及び抗体から単離されるものかあるいはそのT細胞受容体（TCRs）と相補的なものである。その標品は個体に発現されたT細胞受容体（TCRs）の完全なレパートリーから成る。
個体とは、マウス、ラットあるいはヒトを含む如何なる哺乳動物であり得る。
【００５４】
多数のポリペプチドは、さらに、個体において発現される抗原結合部位の構造亜種である抗原結合部位から成る標品を含み得る。その構造亜種は次の方法により作製されることができる。
その方法は、
ａ）鋳型ポリヌクレオチドを提供する。その鋳型ポリヌクレオチドは抗原結合部位をコードした配列から成る。
ｂ）多数のオリゴヌクレオチド提供し、各オリゴヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドに相同した配列を持つ。それにより、鋳型ポリヌクレオチド及び抗原結合部位をコードする配列の亜種配列の特異的な配列を標的する。
ｃ）ステップ b）のオリゴヌクレオチドを用い、ステップａ）鋳型ポリヌクレオチドを複製することにより非確率的な亜種配列から成る子孫ポリヌクレオチドを作製し、それにより、抗原結合部位をコードした亜種配列から成るポリヌクレオチドを作製する。
ｄ）個体に発現される抗原結合部位の構造亜種である抗原結合部位から成るポリペプチドを作製するためのポリヌクレオチドを発現させる。
から成る。
鋳型ポリヌクレオチドに相同的な配列は、X 塩基の長さを持つ。X は、10−20あるいは 2−20の間の整数である。ステップb）のオリゴヌクレオ チドは、さらに、鋳型ポリヌクレオチドに相同的な配列及び鋳型ポリヌクレオチドに相同的な配列に隣接する亜型配列を含めることができる。抗原結合部位においてあるアミノ酸をコードしたコドンは、修飾するための標的と成り得、多数のオリゴヌクレオチドは標的コドンのために19種ある全ての天然アミノ酸を変異としてコードした変異配列を含む。それにより、標的アミノ酸において19ある全ての天然アミノ酸を変異として持たせた抗原結合部位ポリペプチドを作製する。
一例として、抗原結合部位の全てのアミノ酸をコードしたコドンは、修飾のための標的となる。多数のオリゴヌクレオチドは、標的コドンのために19種ある全ての天然アミノ酸を変異としてコードした変異配列を含み、それにより、各標的アミノ酸で19種ある全ての天然アミノ酸を変異として持った抗原結合部位ポリペプチドを作製する。ステップ b）のオリゴヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドに一つあるいはそれ以上の塩基を導入あるいは削除することができる核酸配列を含めることができる。
【００５５】
抗原結合部位の構造多様性は、次のステップから成る方法により作製することができる。その方法は、
ａ）鋳型ポリヌクレオチドを提供し、その鋳型ポリヌクレオチドは抗原結合部位をコードした配列を含んでいる。
ｂ）多数のビルディングブロックとなるポリヌクレオチドを提供する。そのビルディングブロックとなるポリヌクレオチドは、予め決定した配列にその鋳型ポリヌクレオチドを用いて交叉再構成するために修飾され、ビルディングブロックとなるポリヌクレオチドは、抗原結合部位をコードした配列の亜型である配列及び変異配列を隣接した鋳型ポリヌクレオチドに相同的な配列を含む。
ｃ）多様性を持たせた抗原結合部位をコードした配列を含むポリヌクレオチドを作製するための鋳型ポリヌクレオチドを用いてビルディングブロックポリヌクレオチドの交叉が再構成されるようにビルディングブロック片を混合する。
ｄ）個体に発現させた抗原結合部位の構造変種である抗原結合部位を含むポリペプチドを産生するためにそのポリヌクレオチドを発現させる。
のステップを含む。
一例として、ビルディングブロックポリヌクレオチドは、X 塩基の長さを持つ鋳型ポリヌクレオチドに相同的な配列を含み、X は、10−30の間の整数である。そのビルディングブロックポリヌクレオチドは X 塩基の長さを持つ鋳型ポリヌクレオチドの変種に相同的な配列を含み、X は、2−20 の間の 整数である。抗原結合部位のアミノ酸をコードしたコドンは修飾するための標的と成り得、そして、ビルディングブロックポリヌクレオチドは、標的コドンに19種ある全ての天然アミノ酸を変異としてコードさせるような変異配列を含む。それにより、標的アミノ酸で19種ある全ての天然アミノ酸を変異として持った抗 原結合部位ポリペプチドを作製する。抗原結合部位の全てのアミノ酸をコードしたコドンは修飾するための標的と成り得る。
【００５６】
一例として、多数のオリゴヌクレオチドは、標的コドンに19種ある全ての天然アミノ酸を変異としてコードさせるような変異配列を含み、それにより、各標的アミノ酸で19種ある全ての天然アミノ酸を変異として持った抗原結合部位ポリペプチドを作製する。ビルディングブロックポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドに一つあるいはそれ以上の塩基を導入あるいは削除することができる核酸配列をさらに含めることができる。一例として、変種抗原結合部位は、その鋳型抗原結合部位よりもより高い抗原親和性を持つ。
一例として、抗原結合部位の構造を修飾する方法は、さらに、ａ）−ｄ）の反復繰り返しの操作を含めることができ、それにより、抗原結合部位の変異構造をさらに作製する。一例として、その方法は、酵素学的な触媒反応ができる変異抗原結合部位を選別する操作を含める。
本発明の提供する多数の抗原結合部位ポリペプチドを含むアレーを作る方法は、
ａ）ある個体で発現された抗原結合部位から単離されるものかあるいはその抗原結合部位と相補的な抗原結合部位を含む多数のポリペプチド標品（例えば、サブセット）を提供する。
ｂ）同じ抗原結合部位を各々含む一つあるいはそれ以上のポリペプチドを基質表面に分離した既知のスポットとして固定化し、それにより、抗原結合部位ポリペプチドのアレーを作る。
のステップを含む。
【００５７】
一例として、その標品は、その個体で発現された分泌抗体について発現させた抗原結合部位から単離されるものかあるいはその抗原結合部位と相補的なものを含む。その標品に含まれる抗原結合部位は、その個体で発現された循環抗体について発現させた抗原結合部位から単離されるかあるいはその抗原結合部位と相補的なものを含み得る。その標品に含まれる抗原結合部位は、その個体で発現された細胞結合抗体について発現させた抗原結合部位から単離されるものかあるいはその抗原結合部位と相補的なものを含み得る。一例として、細胞結合抗体はB細胞結合抗体を含む。その標品に含まれる抗原結合部位は、その個体のリンパ節で発現した抗原結合部位から単離される抗原結合部位あるいはその抗原結合部位と相補的な抗原結合部位を含み得る。その標品に含まれる抗原結合部位は、その個体で発現された細胞結合抗体や循環抗体について発現させた抗原結合部位から単離されるかあるいはその抗原結合部位と相補的なものを含み得る。その標品は、個体に発現された抗体の抗原結合部位の完全なレパートリーから成る。
【００５８】
一例として、その標品に含まれる抗原結合部位は、その個体で発現されたT細胞受容体（TCRs）から単離されるものかあるいはそれと相補的なものを含み得る。その標品に含まれる抗原結合部位の補足成分は、その個体で発現されたT細胞受容体（TCRs）及び抗体から単離されるものかあるいはそれと相補的なものを含み得る。
一例として、その標品は、その個体で発現された抗原結合部位の完全なレパートリーから成る。その抗原結合部位は、μ、γ、 γ２、γ３、γ ４、δ、α１あるいは α２不変領域を含む抗体を含み得る。
一例として、抗原結合部位は、その個体に由来する核酸の増幅による核酸の発現によって作製される。その増幅は、例えば、ポリメラーゼチェインリアクション（PCR）を含み得る。その核酸は、cDNAライブラリーを含み得る。その cDNA ライブラリーは、B細胞あるいは血漿細胞に由来する核酸から単離 された核酸から作ることができる。その cDNA ライブラリーは、例えば、リンパ 節、脾臓、胸腺、B細胞あるいは血漿細胞に由来する核酸から単離された核酸から作ることができる。
本発明は、抗原に選択的に結合できる抗体の選別をする方法を提供する。その方法は、
ａ）多数のポリペプチドから成るアレーを提供する。その中には、各ポリペプチドは、ポリペプチドのアレーを作るために基質表面に分離した既知のスポットとして固定化される。その多数のポリペプチドは、ある個体で発現する抗原結合部位の標品（例えば、サブセット）を含む。
ｂ）抗原が特異的に抗体に結合する条件下で抗原をアレーに接触させる。
ｃ）非結合の抗原をアレーから洗い流す。
ｄ）抗原がどのスポットと特異的に結合したかを測定し、それにより、抗原に特異的に結合できる抗体を選別する。
のステップを含む。一例として、抗原をアレーにより厳重な種々の条件下に接触させ、抗原に対してより高い親和性を持った抗体を選別する。その親和性は、約 １ x 105 M-1、約 １ x 105 M-1、約 １ x 106 M-1、約 １ x 107 M-1、約 １ x 108 M-1、約  １ x 109 M-1、約 ２ x 109 M-1、約 ５ x 109 M-1、約 １ x 1010 M-1、約 １ x 1011  M-1 及び １ x 1011 M-1 以上の集団から選別できる。一つの展望に於いて、抗原は 蛍光分子などの検出可能な標識、例えば、ウンベリフェロン、フルオレスセイン、フルオレスセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレスセイン、ダンシルクロライドあるいはフィコエリスリンを含む。
異なった例として、その検出可能な標識は、放射性分子あるいは酵素、例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼあるいはアルカリ性フォスファターゼ、を含む。
本発明の一つあるいはそれ以上の例の詳細は、以下のことを描き述べることと附随して述べられる。本発明の持つ他の特徴、目的及び投機はその説明描写ならびにその請求から明らかにする。
ここに引用する全ての出版、GenBank アクセッション文献 （シークエンス）、ATCC デポジット、特許及び特許出願は、ここに全ての目的のために明確に取り込まれる。
【００５９】
詳細な記述
本発明は、変異抗原結合部位、抗体、及び抗体の特異的ドメインあるいは断片（例えば、Fab あるいは Fc ドメイン）を至適化された飽和変異法、指向的進化システム、合成的結合再集合法あるいはそれらの組み合わせによる核酸鋳型の変異により作製するための方法を提供する。これらの方法により作製されたポリペプチドは、例えば、その結合活性（例えば、抗原に対する）を本発明による新規キャピラリーアレープラットホームを用いて解析できる。本発明は、Fc ド メインの修飾（例えば、変異）法を提供する。異なった例として、この発明は、Fc 領域あるいは Fc 領域を含む分子または断片あるいはドメインまたはサ ブセクションの少なくとも整数ごとの値（少なくとも1％、少なくとも2％、少なくとも3％、-------、少なくとも99％、あるいは少なくとも100％）を含む変異パーセンテージを提供する。例えば、Fcドメイン（またはそれからのサブ配列）をコードした核酸を、それがある修飾された機能（例えば、結合性質）、性質（例えば、溶解性または抗原性）を増大、喪失、あるいは獲得するように、または修飾された結合性（より高いまたは低い）を持てるように、修飾することができる。例えば、Fc ドメインの特別な細胞表層受容体（例えば、Fc 受容 体：FcR、B 細胞、T 細胞、マクロファージ、単球細胞、マスト細胞、好塩球、 樹枝状細胞、ランゲルハンス細胞及びその類、あるいは補体タンパク質、あるいはその受容体）に結合する能力（例えば、親和性を含む）が標的されることができる。Fc ドメインは、異なる細胞受容体（例えば、野生型 Fc がマクロファー ジあるいは単球細胞の FcR に結合すると B 細胞 FcR に結合するように変化する）、付加的な受容体（付加された機能）あるいはより少ない受容体（機能の喪失））に結合するように変えられる。Fc ドメインは、それが異なる補体ポリペ プチドに結合したり（例えば、特異性を変えること）、特異性を加えたり、あるいは補体タンパク質に対する親和性を変化させたりするように変えることができる。
【００６０】
抗体、T細胞受容体及び Fc ドメインを含む抗原結合部位を持つ如何なるタンパク質にとって、それらの結晶構造は、どの残基が標的にとって好ましいかを予測するために使うことができる。例えば、溶質にむき出しにされる残基をコードした核酸、例えば、タンパク：タンパク結合に関与したもの、は、本発明による方法によって標的できる。さらに異なった例として、本発明の飽和変異法は、ある領域（例えば、Fc）の溶質にむき出しにされるアミノ酸に変異（例えば、飽和変異法、GSSM）を与える。例えば、飽和変異法（例えば、飽和変異法、GSSM）は、単一コドン変異法（例えば、アラニンスキャンニング）により好ましい性質を持っているものとして特徴付けされたものを含む溶質にむき出しにされるアミノ酸について行うことができる。US  Patent  No.5,834,597参照。
【００６１】
従って、本発明は、ヒト免疫グロブリン（Ig）Fc 領域（IgG、IgE、IgA、 IgM、IgDを含む）の変種のライブラリー（例えば、飽和変異法で作製された）を作製する方法（方法の産物だけではなく）を提供する。一つの例として、本発明は、ヒト IgG アミノ酸部位 329 あるいは、ヒト IgG Fc 領域のアミノ酸部 位 329、331 及び 322 の二つまたは全てのアミノ酸部位において少なくとも二つのアミノ酸置換（19 種ある全ての天然に存在するアミノ酸による置換を含む）含む変種を提供する；これらIgG Fc 領域の番号は EU インデックスにおけるものに同じ（US Patent No.6,242,195と6,194,551及びWO99/51642参照）であり、その変種は抗原に対する結合能を持っている。本発明の一例として、ヒトIgG Fc領域のアミノFc領域を含む抗体は、ヒトIgG1 Fc 領域を含む。例えば、本発明は、ヒト IgG Fc 領域を含む抗体を修飾する方法を提供し、その方法は、アミノ酸部位（あるいは残基）329あるいは、ヒトIgG Fc領域のアミノ酸部位 329、331 及び 322 の二つまたは全てのアミノ酸部位にアミノ酸置換を持つ変種 ライブラリーを作製（スクリーニングを含む）することを含んでいる；これら IgG Fc 領域の番号は EU インデックスにおけるものに同じであり、その変種は 抗原に対する結合能を持っている。本発明は、また、ここにで同定された変種に限らず変種ライブラリーのスクリーニングをも保護する。一例として、スクリーニングの基準は、補体を活性化しない変種の選択である。他の例として、スクリーニングの基準は、FcR に結合する変種の選択である。他の例として、スクリーニングの基準は、FcRI、FcRII、FcRIII あるいは FcRn のような FcR に結合する変種の選択である。一例として、スクリーニングの 基準 は、ヒト IgG Fc 領域を含む抗体変種の選択であり、それらは補体を活性化せず、ヒトIgG Fc 領域のアミノ酸残基 322 あるいは 329 あるいはそれら両方にアミノ酸置換を含んでいる；これら IgG Fc 領域の番号は、EU インデックスにおけるものに同じであり、その変種は、抗原に対する結合能を持っている。また、提供されるものは、本発明の組み立て及び生理学的に受け入れが可能な担体、例えば、ここに述べられる如何なる変種をも含む本発明の組成であり、生理学的に受け入れが可能な担体である。
【００６２】
定義及び限定
特に限定しない限り、ここで用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術に習熟した人に共通して理解される意味を持っている。ここに使われるように、以下の用語は、特に示さない限り、それらに帰する意味を持つ。
ここで用いられる用語”核酸”とは、一本鎖あるいは二本鎖のデオキシリボヌクレオチド（DNA）またはリボヌクレオチド（RNA）である。それは、既知の天然のヌクレオチド類似物を含む核酸おも包括する。それは、フォスフォジエステル結合を介して DNA の一部と結合している 2'-O-アルキル置換を持った RNA の一部分から成る混合オリゴヌクレオチドを含む（US  Patent No.5,013,830 参照）。その用語は、また、合成バックボーンを持つ核酸様構造体を含む。フォスフォジエステル、フォスフォロチオレイト、フォスフォロジチオレイト、メチルフォスフォネイト、フォスフォラミデイト、アルキルフォスフォジエステル、スルファメイト、3'-チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、3'-N-カルバメイト、モルフォノカルバメイト及びペプチド核酸（PNAs）を含む DNA バック ボーン類似物が本発明により提供される；Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach、 F.Eckstein 編集、オックスフォード大学 IRL 出版 （1991）参照；Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Science、600巻、Baserga  &  Denhardt 編集（NYAS  1992）；Milligan (1993) J.Med.Chem.36：1923-1937；Antisense Research and  Applications（1993、CRC 出版）。PNAs は、N-（2-アミノエチル）グリシン ユニットのような非イオン的バックボーンを含む。フォスフォロチオレイト結合は、例えば、U.S. Patent No.6,031,092；6,001,982；5,684,148；WO 97/03211；WO 96/39154；Mata（1997）Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197、 に述べられている。他の合成バックボーンは、メチルフォスフォネイト結合あるいはメチルフォスフォネイトとフォスフォジエステルの交互結合（例えば、U.S.  Patent No.5,962,674；Strauss-Soukup（1997）Biochemistry  36：8692-8698 参照）、及びベンジルフォスフォネイト結合（例えば、U.S. Patent No.  5,532,226；Samstag（1996）Antisense  Nucleic  Acid  Drug  Dev  6：153-156参照）を含む用語によって包括される。核酸という用語は、遺伝子、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ及び増幅産物などと共に相互変換可能的に使うことができる。
【００６３】
用語”ポリペプチド”、”タンパク”、及び”ペプチド”とは、変種が由来した元のポリペプチドに実体的に対応する構造と活性を持った”類似物”または”保存的変種”及び”疑似体”あるいは”ペプチド疑似体”をも含む本発明の組成に含まれる。
用語”飽和変異”とは、以下に詳しく述べられるように、ポリヌクレオチドに点変異を導入するためのオリゴヌクレオチドプライマーの変異に用いられる方法を含む。
用語”至適化指向的進化システム”あるいは”至適化指向的進化”とは、関連した核酸配列、例えば、関連した遺伝子、の断片を再集合するのための方法を含み、以下に詳しく述べられる。
本発明は、至適化指向的進化システムによる鋳型核酸の変異により変種抗原結合部位、抗体そして抗体のドメインあるいは断片（例えば、FabあるいはFcドメイン）を作製するための方法を提供する。
用語”合成結合再集合”あるいは”SLR”とは、オリゴヌクレオチド断片を非確率的に結合させる方法を提供するもので、以下に詳しく述べられる。
【００６４】
用語”抗体”とは、抗原やエピトープに特異的に結合できる免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリンあるいはそれらの断片によって設計されたものか実体的にコードされたものか由来するペプチドあるいはポリペプチドを含む；Fundamental  Immunology、Third  Edition  W.E.  Paul  編集、Raven 出版、N.Y. （1993）；Wilson（1994）J.Immunol.Methods  175：26773；Yarmush（1992） J.Biochem.Biophys.Methods 25：85-97参照。一つの特殊技術として、抗体をコ ードした核酸やポリペプチドが化学的あるいは組換え遺伝子の方法論により単離あるいは新規に合成されることは評価される。用語”抗体”とは、抗原結合部分、即ち、抗原に結合する能力を持った抗原結合部位（例えば、断片、サブシークエンス、相補性決定領域（CDRs））を含むものであり、それらは、
（i）VL、VH、CL 及び CH1 ドメインを含む一価断片である Fab 断片
（ii）VH 及び CH1 ドメインを含む二価断片である F(ab')2 断片
（iii）VH 及び CH1 ドメインより成るFd断片
（iv）抗体の一アーム部分のVL及び VH ドメインより成るFv断片
（v）VHドメインより成るdAb断片（Ward et al.、（1989）Nature 341：544-546）
（vi）単離された相補性決定領域（CDR）
を含む。さらに、Fv 断片の二ドメイン、VL 及び VH、は別々の遺伝子に よりコードされているが、それらは、組換え方法を用いて VL 及び VH 領域が一 価分子を形成している単一のタンパク鎖にできるるような合成リンカーにより結合させることができる；一本鎖 Fv としても知られる（scFv）（例えば、Bird （1988）Science  242：423-426；Huston（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85 ：5879-5883 参照）。一本鎖抗体は、また、”抗体”という用語の引用をも含 む。断片は、抗体の組換え技術あるいは酵素、化学的な解裂により調整できる。その用語は、また、多価抗原結合タンパクをも含む（例えば、US Patent No. 6,027,725 参照）。抗体という用語は、抗体分子全体の修飾あるいは組換え DNA 技術の方法論のいずれかにより新規に合成される“キメラ”抗体を含む。そのようなキメラ抗体は、エピトープ結合部位が免疫されたマウスのような哺乳動物により作られ、その骨組みはヒトであるヒト化抗体となり得る。例えば、“ヒト化”抗体のようなキメラを作製する方法は、文献において良く知られている；U.S.  Patent No.5,811,522；5,789,554；Huse（1989）Science 246：1275；Ward （1989）Nature 341：544；Hoogenboom（1997）Trends Biotechnol.15：62-70； Katz（1997）Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.  26：27-45 参照。その用語 は、また、ヒト抗体を産生できる形質変換したヒト以外の動物（例えば、マウス）により作製されるヒト抗体核酸やポリペプチドを含む（U.S. Patent No.  5,939,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318）。ファージディスプレーライブラリー−を用いて作製されるエピトープ結合ポリペプチドやここにいう変種をも含む（U.S. Patent  No.5,55,885；6,027,930）。以下の考察も参照。
【００６５】
用語”主要組織適合遺伝子複合体分子”あるいは”MHC”は、クラス II 分子のアルファー及びベーター鎖及びクラス I のベーター−２ミクログロブリンを含む全てのクラス I 及び II 分子を含む。ヒトMHC分子は、”ヒト白血球抗 原”あるいは”HLA”と言及できる。クラスII MHC 分子は、例えば、マクロファージ、単球細胞、活性化内皮細胞、ヒト B 細胞のような抗原修飾／提示細胞 （APCs）の細胞表層に発現されるヘテロダイマーである。本発明の方法は、これらポリペプチドの一部あるいは全てを、例えば、発現の修飾、抗原あるいは補刺激分子、T細胞受容体及びその類の他分子との相互作用を修飾するための修飾を含む。MHC分子の構造及びその単離、作製及び使用は文献において良く知られている。例えば、Fundamental Immunology、Third Edition、Paul  編集、Raven 出版、New York；及び  U.S. Patent No. 6,232,445；6,241,985；6,245,764； 6,248,564 参照。
【００６６】
ここで用いる用語”T 細胞受容体”あるいは”TCR”は、全ての特異的 T 細胞受容体分子を含む。TCR は、T リンパ球の細胞表層上に発現されるヘテロダイマー（アルファーとベーター鎖あるいはガンマとデルタ鎖）である。TCR は MHC 分子の結合ポケットに存在する抗原ペプチドと結合する。本発明の方法は、これらポリペプチドの一部及び全てを、例えば、抗原ペプチドあるいは補刺激分子、MHC分子及びその類の他分子との相互作用を修飾するための修飾を含む。MHC分子の構造及びその単離、作製及び使用は文献において良く知られている。例えば、Fundamental  Immunology、Third  Edition、Paul  編集、Raven出版、New  York、U.S. Patent No. 5,316,925；5,601,822；5,614,192；5,635,363； 5,667,967；5,840,304；6,054,292；6,180,104；6,245,764 参照。
【００６７】
本発明は、ある個体により単離及び／又は発現された抗原結合部位の標品（サブセット）、あるいは全て、あるいは、その個体により単離及び／又は発現された抗原結合部位に相補的な標品（サブセット）、あるいは全て、から成るアレーを提供する。本発明は、また、これら抗原結合部位をコードした核酸から成るアレーを提供する。本発明は、如何なる既知のアレーをもって実践され、”マイクロアレー”あるいは”DNAアレー”あるいは”核酸アレー”あるいは”ポリペプチドアレー”あるいは”バイオチップ”あるいはそれらの組み合わせを言及する。本発明を実践するにあたり、既知のアレー及びアレー作製や使用方法が全体あるいは一部あるいはその組み合わせとして含まれる。以下はその例である。U.S. Patent No.6,277,628；6,277,489；6,261,776；6,258,606； 6,054,270；6,048,695；6,045,996；6,022,963；6,013,440；5,965,452； 5,959,098；5,856,174；5,830,645；5,770,456；5,632,957；5,556,752； 5,143,854；5,807,522；5,800,992；5,744,305；5,700,637；5,556,752； 5,434,049；WO 99/51773；WO 99/09217；WO 97/46313；WO 96/17958； Johnston（1998）Curr.Biol. 8：R171-R174；Schummer（1997）Biotechniques  23：1087-1092；Kern（1997）Biotechniques 23：120-124；Solinas-Toldo （1997）Genes、Chromosomes & Cancer  20：399-407；Bowtell（1999）Nature  Genetics Supp. 21：25-32；U.S. Patent Applications No. 20,010,018,642； 20,010,019,827；20,010,016,322；20,010,014,449；20,010,014,448； 20,010,012,537；20,010,008,765参照。
【００６８】
ここに使用される”薬剤、試薬”とは、化学物質、その混合物、特定の場所に局在させた化合物のアレー（例えば、VLSIPS ペプチドアレー、ポリヌクレ オチドアレー及び／又は小分子混合アレー）、生物学的高分子、バクテリオファージペプチドディスプレーライブラリー、バクテリオファージ抗体（例えば、scFv）ディスプレーライブラリー、ポリゾームペプチドディスプレーライブラリー、あるいは、例えば、バクテリア、植物、カビあるいは動物（特に、哺乳動物）細胞や組織の抽出物等を意味している。薬剤、試薬は、以下に述べるように、潜在活性を抗新生物形成、抗炎症、あるいはアポトーシス調節因子としてスクリーニングアッセイに含めることによって評価される。薬剤、試薬は、以下に述べるように、潜在活性を特異的タンパク相互作用阻害剤（即ち、二つの予め決められたポリペプチド間の相互作用を選択的に阻害するが実体的に細胞の増殖を阻害しない薬剤）としてスクリーニングアッセイに含めることにより評価される。
【００６９】
制限部位における多義性の塩基要求性は、完全には特定しないヌクレオチド塩基の要求性を言及し、即ち、それは特異的塩基ではなく（非限定的なＡ、Ｃ、Ｇ及びＴから選択される特異的塩基の例示ような）、むしろ少なくとも二つあるいはそれ以上の如何なる塩基でもよい。ここあるいは文献等において塩基の多義性について共通して受け入れられている略称は以下を含む。R  =  G  または  A；Y  =  C  または  T；M  =  A  または  C；K  =  G  または  T；S  =  G  または  C；W  =  A  または  T；H  =  A  または  C  または  T；B  =  G  または  T  または  C；V  =  G  または  C  または  A；D  =  G  または  A  または  T；N  =  A  または  C  または  G  または  T。
【００７０】
分子配列に関する”アラインメント”とは、二つあるいはそれ以上の配列の相同性を調べる方法である。比較のための配列の至適なアラインメントは、例えば、Smith と Waterman の局所アラインメントアルゴリズムにより(Adv.Appl. Math.2：482（1981）)、NeedlemanとWunschの相同性検索法により（J.Mol.Biol.  48：443（1970））、PearsonとLipmanの相同法の検索により（Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444（1988）、これらアルゴリズムのコンピューター化による実行により（GAP、BESTFIT、FASTA ＆ TFASTA in the Wisconsin Genetics Software  Package Genetics Computer Group 575 Science  Dr.、Madison、WI）、または 視的な検閲により（Altschul et al. infra）行うことができる。配列の相同性 や配列の同等性の割合を調べるために適したアルゴリズムの一例は、BLAST アル ゴリズムであり、それは、Altschul et al.、J.Mol. Biol.215：403-410（1990） により述べられている。BLAST 解析を行うためのソフトウェアーは National  Center for Biotechnology Information を通して公に手に入れることができ る。このアルゴリズムは、まず、請求配列における長さW の短いワードを同定することにより高いスコアーの配列ペアー（HSPs）を同定することと関連し、それらは、データーベース中の配列と同じ長さのワードを持ってアラインメントした場合に正の限界値スコアーTに一致するかあるいは満足する。T は、その近傍のワードスコアー限界値を言及する（Altschul et al. Supra）。これらの初期近傍 ワードは、それらを含むより長い HSPs を見いだすための初期検索の根本として 働く。ヒットしたワードは、その累積アラインメントスコアーが増加できる限り各配列に沿って両方向に拡大される。累積スコアーとは、ヌクレオチドにとって、パラメーター M（マッチした残基ペアーに対する報酬スコアーで常に０以上） 及びN（ミスマッチした残基ペアーに対する減点スコアーで常に０以下）を用いて算出される。アミノ酸配列に対しては、あるスコアーマトリックスがその累積スコアーの算出に使われる。ヒットしたワードの各方向への延長は、累積アラインメントスコアーがその最大の達成価から価X減少するか一つまたはそれ以上の負のスコアーを持つ残基アラインメントの蓄積により累積アラインメントスコアーが０またはそれ以下になった時点、あるいはどちらかの配列の末端に到達した時点、で停止される。BLAST アルゴリズムのパラメーター W、T 及び X は、ア ラインメントの感度及びスピードを決定する。BLASTN プログラム（ヌクレオチ ド配列のための）は、ワード長（W）11、期待度（E）10、カットオフ100、M ＝５、N ＝４ 及び両ストランドの比較のデフォルトとして使用される。アミノ 酸配列のためには、BLASTP がワード長（W）3、期待度（E）10 及び BLOSUM62 スコアーマトリックスのデフォルトとして使用される（Henikoff & Henikoff （1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915 参照）。配列の相同性の割合を算 出する以外に、BLASTアルゴリズムは、両配列の相同性に関する統計的な解析を行う（Karlin & Altschul（1993）Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：5873-5787 参照 ）。BLAST アルゴリズムにより与えられる相同性の一つの測定は、最小総計確率 (P(N))であり、それは両ヌクレオチドあるいはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を表示する。例えば、もしある核酸と対象核酸の比較における最小総計確率が約 0.1 以下、約 0.01 以下、あるいは約 0.001 以下である��らば、その 核酸は対象配列と似ていると考えられる。二つの核酸配列が実体的に同等であるという他の表示は、二つの分子が厳格な条件下においてお互いにハイブリダイズすることである。”×に特異的にハイブリダイズしている”というフレーズは、厳格な条件下において、ある分子が、複合混合液中（例えば、総 DNA あるいは RNA）に存在する特別なヌクレオチド配列にのみ結合、重複あるいはハイブリダイズすることである。”実体的に結合する”とは、プローブ核酸と標的核酸間の相補的ハイブリダイゼイションを言及し、標的核酸の好ましい検出を達成するためのハイブリダイゼイションの厳格度を低下させることにより生じ得るマイナーなミスマッチを包括する。
【００７１】
ここに用いる用語”アミノ酸”とは、アミノ基（-NH2）及びカルボキシル基（-COOH）を含む如何なる有機化合物を意味する；一例として、遊離基あるいはペプチド結合の一部として縮合後のもの。”20 種の天然にコードされ るポリペプチド形成aアミノ酸”とは、文献的に理解され、次のものを意味している。  または、
アラニン（ala  または  A）、アルギニン（arg  または  R）、アスパラギン（asn  または  N）、アスパラギン酸（asp  または  D）、システイン（cys  または  C）、グルタミン酸（glu  または  E）、グルタミン（gln  または  Q）、グリシン（gly  または  G）、ヒスチジン（his  または  H）、イソロイシン（ile  または  I）、ロイシン（leu  または  L）、リジン（lys  または  K）、メチオニン（met  または  M）、フェニルアラニン（phe  または  F）、プロリン（pro  または  P）、セリン（ser  または  S）、スレオニン（thr  または  T）、トリプトファン（trp  または  W）、チロシン（tyr  または  Y）、及びバリン（val  または  V）。
用語”増幅”は、ポリペプチドのコピー数を増加させることを意味する。
ここに用いる用語”抗体”とは、抗原エピトープに結合できる免疫グロブリン分子及びFab、Fab'、(Fab')2、Fv 及び SCA のようなその断片を意味する。 これら抗体の断片は、それらが由来した抗体の抗原（例えば、ポリペプチド抗原）への選択的結合能を部分的に持ち備え、文献的に良く知られた方法（Harlow &  Lane、supra参照）または以下にさらに述べるようにして作製できる。
【００７２】
（１）Fab 断片は、抗体分子の一価抗原結合断片から成り、抗体分子のパパイン消化により完全な軽鎖及び重鎖の一部からなる断片として産生できる。
（２）抗体の Fab' 断片は、抗体分子のペプシン処理及びそれに引き続く還元により、完全な軽鎖及び重鎖の一部からなる断片として産生できる。このような処理により、一分子の抗体から二つの Fab' 断片が得られる。
（３）抗体の (Fab')2 とは、抗体分子のペプシン処理により、それに引き続く還元処理なしに、得られる。(Fab')2 断片は、二つの Fab' 断片のダイマーであり、二つのジスルフィッド結合によって折り畳まれている。
（４）Fv 断片とは、遺伝的にエンジニアーされた二本鎖として発現された軽鎖及び重鎖の可変領域断片を含む断片として定義される。
（５）一本鎖抗体（”SCA”）とは、遺伝的にエンジニアーされた二本鎖として発現された軽鎖及び重鎖の可変領域断片を含む断片で適当な可動性のポリペプチドリンカーと結合したものとして定義される。
【００７３】
用語”応用分子進化（Applied Molecular Evolution  ”AME”）”とは、 特異的、有用なゴールへの進化的デザインアルゴリズムの応用を意味する。AMEのための多くの異なるライブラリーフォーマットがポリヌクレオチド、ペプチド及びタンパク（ファージ、LacI 及びポリゾーム）について報告されているが、それらのうち、組み合わせライブラリーを慎重に作製するための無作為な交叉による組換えを与えるものはない。
”キメラ的性質”を持つ分子とは、次のような分子を意味する。
（１）初めの分子に一部相同であり、一部異なっているもの
（２）一方、同時に、二次分子に一部相同であり、一部異なっているもの
（３）同時に、一つあるいはそれ以上の対象分子に一部相同であり、一部異なっている可能性を排除しないもの
【００７４】
一つの非限定的な具体例に於いて、キメラ分子は、部分的な分子配列の再組み合わせの再構成により調整してもよい。一つの非限定的な具体例に於いて、キメラポリヌクレオチド分子は、多数の分子鋳型を用いたキメラポリヌクレオチドの合成により調整してもよい。
ここに用いられる用語”同族”とは、種間に進化的及び機能的に遺伝子配列を言及する。例えば、限定ではなく、ヒト CD4 遺伝子とマウス 3d4 遺伝子の 配列と構造は、相同性に高く、両遺伝子が MHC クラスII-限定の抗原認識を介し たT細胞の活性化シグナルに機能するタンパクをコードしていることから、ヒトゲノムにおけるヒト CD4 遺伝子はマウス 3d4 遺伝子と同族である。
ここに用いる”比較ウィンドウ”とは、少なくとも20の隣接ヌクレオチド部分の概念的区分を意味し、その中であるポリヌクレオチド配列が少なくとも20の隣接ヌクレオチドの対象配列と比較されてもよいし、また、比較ウィンドウにある部分的なポリヌクレオチド配列は至適なアラインメントのために対象配列（付加あるいは削除を含まない）に比べて20%あるいはそれ以下の付加あるいは削除（即ち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウィンドウを並べるための至適なアラインメントは、Smithの局所相同アルゴリズム（Smith and Waterman、Adv. Appl.Math.（1981）；Smith and Waterman、J.Teor.Biol.（1981）；Smith and Waterman  J.mol.Biol.（1981）；Smith et al.、J.Mol.Evol.（1981））、 Needleman の相同アラインメントアルゴリズム（Needleman and Wuncsch（1970））、 Personの相同法の検索（Pearson and Lipman、（1988））、これらアルゴリズムのコンピューター化した実行（GAP、BESTFIT、FASTA ＆ TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Genetics Computer Group 575 Science Dr.、Madison、WI）あるいは検閲によって行ってもよく、種々の方法により得られた最良のアラインメント（即ち、比較ウィンドウにおいて最も高い相同性の割合を与えている）が選別される。
【００７５】
ここに用いるように、用語”相補性決定領域”及び”CDR”とは超可変的領域あるいはループとしても知られる、Kabat-Chothiaの定義（Chothia and Lesk、（1987）；Clothia et al、（1989）；Kabat et al、（1987）；及び  Tramontano et al、（1990））、によって例示される専門的用語である。典型的 な可変領域ドメインは、天然に存在するイムノグロブリン鎖のN末端側およそ105−110 アミノ酸から成るが、それよりも短いあるいは長いものも一本鎖抗体を 作製するために適している。
”保存的アミノ酸置換”とは、類似した側鎖を持った残基の相互置換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を持つアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；アミドを含む側鎖を持つアミノ酸は、アスパラギン及びグルタミン；芳香側鎖を持つアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；塩基性側鎖を持つアミノ酸は、リジン、アルギニン及びヒスチジン；含硫黄側鎖を持つアミノ酸は、システイン及びメチオニン、である。典型的な保守的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００７６】
ある特別なポリヌクレオチド配列の”保守的修飾変異”とは、本質的に同等な配列に対して同等あるいは本質的に同等なアミノ酸配列をコードしたポリヌクレオチドまたはそこにあるアミノ酸配列をコードしていないポリヌクレオチドを指す。遺伝コードの変質のために、如何なる与えられたポリペプチドを非常に多くの機能的に同等な核酸コードすることになる。例えば、コドン CGU、CGC、 CGA、CGG、AGA 及び AGG は全てアルギニンをコードする。従って、あるコドン によってアルギニンが特定されている各位置において、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく述べた対応する如何なるコドンに換えられることができる。このような核酸変種を”サイレント変種”と呼び、それらは”保守的修飾変異”の一種である。ここに述べられるポリペプチドをコードした各ポリヌクレオチド配列とは、特に述べない限り各々可能なサイレント変種をも述べている。技術の一つは、ある核酸の各コドン（メチオニンに対する唯一のコドン、AUG を除く）を標準的な技術により機能的に同等な分子に修飾することができることを認知する。従って、あるポリペプチドをコードした核酸各”サイレント変種”は描写れているそれぞれの配列において暗黙的である。さらに、技術の一つは、とあるコードされた配列の単一あるいは数％（典型的には５％以下、より典型的には１％以下）のアミノ酸を変化、付加あるいは削除する個体の置換、削除あるいは付加は、変換が化学的に類似したアミノ酸の置換となる”保守的修飾変異”であることを認知する。機能的に類似しているアミノ酸を与える保守的置換表が文献的によく知られている。以下の五グループの各々は、お互いの保守的置換であるアミノ酸を含んでいる。脂肪族：グリシン（G）、アラニン（Ａ）、バリン（V）、ロイシン（L）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；含硫：メチオニン（M）、システイン（C）；塩基性：アルギニン（R）、アスパラギン（N）、グルタミン（Q）、リジン（K）、ヒスチジン（H）；酸性：アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（Ｅ）。更なるアミノ酸の分類については Creighton（1984）Proteins、 W.H.Freeman and Company 参照。さらに、あるコードされた配列中の単一あるい は数％のアミノ酸を変化、付加あるいは削除する個体の置換、削除あるいは付加もまた”保守的修飾変異”である。
【００７７】
ここに用いられる用語”〜に対応する”とは、ポリヌクレオチド配列が 対象ポリヌクレオチド配列の全てあるいは一部と相同であるか、あるいはポリペプチド配列が対象ポリペプチド配列と同等であることを意味している。その対比において、ここに用いる用語”〜に相補的な”とは、相補的配列は、対象ポリヌクレオチド配列の全てあるいは一部と相同であることを意味する。説明として、ヌクレオチド配列”TATAC”は対象配列”TATAC”に対応し、対象配列”GTATA”に相補的である。
用語”サイトカイン”とは、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、ヘマトポエティック成長因子、腫瘍壊死因子及びトランスフォーミング成長因子などを含む。一般に、これらは、免疫系の細胞の成熟、活性化、増殖及び分化を制御する低分子量のタンパクである。
用語”効果的（量に）分解する”とは、酵素と接触しない基質と比べて少なくとも 50 % の基質を処理するために必要な酵素量である。
ここに用いられるように、用語”特定される配列の骨組み”とは、一般に実験データーあるいは構造データーを基本にして、無作為に選別される一群の特定配列を意味している；例えば、特定される配列の骨組みは、他の変種間にβ−シートの形成が予想される一群のアミノ酸配列あるいはロイシンジッパー７回繰り返しモチーフ、Znフィンガードメインを含んでもよい。”特定された配列核”とは、多様性の限定的な範囲を包括する一群の配列である。しかし、
（１）通常の20アミノ酸の完全にランダムな10量体配列は(20)10 配列のどれにでも成り得る。
（２）通常の20アミノ酸の完全にランダムな 10量体配列は(20)10 配列のどれにでも成り得るが、かなりの部位及び／又は全体にわたり相当の残基に偏りが存在する。
（３）もし各残基の部位が許される20の慣習的なアミノ酸（及び／又は許される非慣習的なアミノ酸／イミノ酸）のいずれにでも成り得るなら、限定配列核は配列のサブセットである。
【００７８】
限定配列核は、通常、変種及び非変種の残基部位から成り、及び／又は変種のアミノ酸算基の限定サブセットから選別された残基を含み得る残基部位、そして、個体に選別されたライブラリーメンバーの配列全体長の一部分あるいは全体のいずれかを含む。限定配列核は、アミノ酸配列あるいはポリヌクレオチド配列のいずれかを言及する。配列 (NNK)10 及び (NNM)10 は、限定配列核である；N は、Ａ、Ｔ、ＧあるいはＣを表す；Kは、GあるいはTを表す；M は、Ａあるいは Ｃを表す。
DNA の”消化”とは、その DNA におけるある配列にのみ作用する制限酵 素を用いた DNA の触媒的な解離を意味する。ここに用いる種々の制限酵素は商品として購入可能であり、それらの反応条件、補欠因子及び他の要求物質は通常習熟した研究者に知られたものとして使用される。分析の目的として、普通、１μg のプラスミドあるいは DNA 断片は、約20μl の緩衝液中、約2ユニットの 酵素が使われる。プラスミド作製のためにDNA断片を単離する目的には、通常、5〜50μg のプラスミドあるいは DNA 断片がより多い緩衝液中、約20〜250 ユニットの酵素で消化される。特別な制限酵素のための適当な緩衝液や基質の量は生産者により特定される。37℃、１時間の反応が通常用いられるが、供給者の説明に従って変えてもよい。消化後、反応は直接、ゲル電気泳動にかけ、求める断片を単離する。
【００７９】
”指向性ライゲーション”とは、ポリヌクレオチドの 5' 端及び端がある典型的なライゲーションの方向を特定するために十分に異なっている状況におけるライゲーションを意味する。例えば、二つの平滑末端を持つ PCR 産物は、マル チクローニング部位に平滑末端を持つように消化されたクローニングベクターに結合される場合、通常、典型的なライゲーションの方向性を持っていない；従って、指向性ライゲーションはこれらの状況においては、通常、達成されない。反対に、指向性ライゲーションは、5'EcoRI-処理端及び 3'BamHI-処理端を持った 消化 PCR 産物が、EcoRI 及び BamHI で処理したマルチクローニング部位を持つクローニングベクターに結合される場合に、通常、発揮される。
ここに用いられる用語“DNAシャッフリング”とは、実体的には相同であるが同一ではない配列間の組換えを意味し、ある具体例として、DNAシャッフリングは、cer/lox及び／又はflp/frt システム及びその類の非相同組換え を介したクロスオーバー（交叉）を含んでもよい。
本発明において使われるように、用語“エピトープ”とは、抗原、ファイターゼポリペプチドのような、の抗原決定基を言及し、そこに抗体、ファイターゼ特異的抗体のような、の抗原結合部位が結合する。通常、抗原決定基は、アミノ酸、あるいは糖の側鎖のような分子の化学的に活性な表層郡別から成り、荷電特性だげでなく、特異的な三次元構造の特徴を持ち備えている。ここに用いるように“エピトープ”とは、抗体の可変領域結合部と結合相互作用を起こし得る抗原あるいはマクロ分子の一部分を意味する。典型的には、そのような結合相互反応は、CDRの一つあるいはそれ以上のアミノ酸残基との分子内コンタクトとして表わされる。
【００８０】
ここに用いる“外因性DNA断片”、“異型配列”あるいは“異型核酸”とは、特別な宿主細胞に外来の起源から由来するもの、あるいは、もし、同じ起源であるならば、初めの型を修飾したもの、を意味する。従って、宿主細胞は、特別な宿主細胞に外因性であるが修飾していない遺伝子を含む。ここに述べる応用における異型配列の修飾は、統計的（例えば、ポリヌクレオチドシャッフリング及び中断合成）あるいは非統計的なポリヌクレオチドの再構成の使用によって典型的に行われる。従って、その用語は、細胞にとって外来あるいは異型のDNA断片、あるいは細胞にとって同種であるが宿主細胞核酸に通常は見出せない配列を言及する。
“外因性”DNA 断片は、外因性ポリペプチドを産生するために発現され る。
広く使われる用語”遺伝子”とは、生物学的機能と関連する如何なる DNA 断片をも言及する。従って、遺伝子は、それらの発現に必要とされるコード及び／又は調節配列を含む。遺伝子は、また、例えば、他のタンパクに対する認識配列を形成するような非発現 DNA 断片を含む。遺伝子は、関与する素材からのクローニングあるいは既知または予想される配列情報からの合成を含む種々の素材から得られ、望ましいパラメーターを持つようにデザインした配列を含んでもよい。
【００８１】
“実験的に作製された（インビボ及び／又はインビトロ）ポリヌクレオチド”（この用語は、“組換えポリヌクレオチド”を含む）あるいは“実験的に作製された（インビボ及び／又はインビトロ）ポリペプチド”（この用語は、“実験的に作製されたポリペプチド”を含む）は、一種以上の素材に各々由来する核酸あるいはポリペプチドを含む非天然に存在するポリヌクレオチドあるいはポリペプチドであり、それら素材の核酸あるいはポリペプチドは天然に存在する核酸あるいはポリペプチドであり得るし、あるいは変異法あるいは他の修飾に付したものでもあり得る。異なる核酸あるいはアミノ酸配列による素材ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは、時として、同種（同じまたは類似した構造及び／又は機能を持つ、あるいはそのような性質をコードするポリペプチドをコードする）であり、例えば、それらは、生物の異なる分離体、血清型、株、種、あるいは異なる病態からよく得られる。
用語「断片」「誘導体」及び「類縁体」は、対照ポリペプチドと少なくとも一つの生物機能や活性を有する場合は、基本的に対照ポリペプチドと同一とみなす。更に「断片」「誘導体」及び「類縁体」とは、例えば、切断などにより高活性を持つ成熟酵素となるような低活性前駆物質のような前駆物質も含む。ここに、鋳型ポリペプチドからの一連の継代ポリペプチドの生産法を示す。この中で、「広範一アミノ酸置換」とは、各々のアミノ酸位置を示すものとする。ここで示されるように、「広範一アミノ酸置換」のアミノ酸とは、ペプチド鎖を形成する天然に存在する20種類のα−アミノ酸のことである。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生産に関与している DNA 断片を意味する：すなわちそれは、個体の翻訳領域（エクソン）間に存在する非翻訳配列（イントロン）と同様に、コード領域の上流や下流領域も含むものである。
「遺伝的不安定性」は、ここでは配列の単純化に関与する繰り返し配列の遺伝子欠失という自然な過程を意味する。欠失は、繰り返し配列の一コピー及びそのすべてを欠落する傾向がある。
用語「異種性」は、他の一本鎖 DNA もしくはその相補的一本鎖DNAとは、ハイブリダイズしない一本の一本鎖核酸という意味で使われる。従って、異種領域とは、他のポリヌクレオチドやポリヌクレオチド領域と結合できないポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド領域のこと指す。このような領域は、例えば、組換えの起こった領域である。
【００８２】
用語「同種性」もしくは「相同性」とは、相補的な一本鎖核酸配列と、結合し得る一本の一本鎖核酸を意味する。ハイブリダイセーションの程度は、配列の相同性や後に述べるような温度、塩濃度と言った結合条件等、様々な因子に左右される。一例として、相同性領域は、約5〜10塩基対以上である。
免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖における可変領域は、三つの高度可変領域（または CDR と呼ばれる）により隔てられる「フレームワーク」よりなる。フレームワークと CDR 領域の範囲は、正確に決められている：「免疫学的対象タンパクの配列」（Kabat et al, 1987)を、参照のこと。異なる軽鎖もしくは重鎖のフレームワーク領域の配列は種間で比較的保持されている。ここで使われる「ヒトフレームワーク領域」とは、天然型ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と抗体フレームワーク領域 (それは、CDR を形成する一定の軽鎖、及び重鎖の組み合わさった枠組)と実質的に同一 (約 85 ％以上、通常は 90 〜 95 %以上) であるものである。CDR は主に抗原のエピトープに対する結合の役割を担っている。
【００８３】
ここに報告する発明の利点は、非商業的商業利用（非営利団体での生物医学的研究）同様、商業的応用（もしくは商業的過程）、この用語は商業的応用施設(もしくは単に工場）における応用を含む。同様の応用法として、診断、医薬、農業、製造、アカデミア領域におけるそれらも含む。
用語「同一」、若しくは「同一性」とは、二つの核酸配列が同様もしくは相補的な配列を持つことを表す。従って、「同一領域」とは、もう一方の、もしくは、そのヌクレオチドの領域と同一もしくは相補的なポリヌクレオチド領域である。
用語「同一」もしくは、「％相同性」とは、二残基もしくはそれ以上より成る核酸もしくはポリヌクレオチド配列において、以下に示す配列解析アルゴリズムのうちの一つもしくは肉眼的観察により比較した際、二つもしくはそれ以上の配列が同一、もしくは特定のアミノ酸残基の同一性と百分率で表したものである。配列比較において、通常、一方の配列は試験配列と比較されるべき対象配列となる。配列比較アルゴリズムを使用時、調査される配列及び対象となる配列がコンピューターにインプットされ、必要ならば部分配列が設計され、そしてプログラムパラメーターを設定する。そして配列比較アルゴリズムが設定されたパラメーターに基づき、対象に対する調査配列の％同一性を計算する。
更に、二つの核酸あるいはポリペプチドは実質上同一と示された時、これは第一の核酸にコードされるポリペプチドが、第二の核酸にコードされるポリペプチドと、免疫学的交差反応性、若しくは特異的に結合することを示している。よって、このポリペプチドは、第二のポリペプチドと実質上同一である (例えば二つのペプチドが、保存的置換部位のみ異なる場合)。
【００８４】
用語「単離された」は、その材料が起源環境（それが天然由来の場合、その自然環境）より採集されたことを意味する。例えば、生物体に存在する天然由来ポリヌクレオチド酵素は単離されたのではなく、天然界に共に存在する材料より、同一のポリヌクレオチドやペプチドが分離された場合、「単離された」と言う。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部、そして（もしくは）このようなポリヌクレオチドや酵素は構成成分の一部であり、このようなベクターや構成成分がその自然環境の一部でない場合でも単離される。
用語「単離される」は、核酸やタンパクに対して使われた時、その核酸やタンパクは天然の存在状態より少なくとも一つの他の構成物より取り除かれたことを意味する。それは実質的に天然の存在状態より少なくとも一つの他の構成物より分離されたことを意味する。それらは乾燥状態もしくは溶液状態であるが、均質的状態である。純度もしくは均質性は、通常はポリアクリルアミドゲル電気泳動やHPLCなどの分析化学的技術を使い調べられる。検体中に高含量に存在するタンパク質が実質上は精製される。特に、単離される遺伝子は、その遺伝子のα側にあり、そして目的の遺伝子とは異なるタンパクをコードするORF（読み取り枠）から分離される。
【００８５】
「単離された核酸」とは、それは、それが由来する生物体中のゲノムに存在するときは、通常近傍に存在する 5′及び 3′フランキング配列とは直結していない DNA もしくは RNA などの核酸を意味する。従って、この用語は、例えばプラスミドやウイルスベクターなどのベクターに取り込まれた核酸、異種細胞のゲノム（もしくは同種細胞ではあるが、自然状態とは異なるゲノム部位に取り込まれた）に組み込まれた核酸、PCR 増幅、制限酵素消化により得られた DNA 断片やインビトロ転写により合成された RNA 分子などの分離された分子として存在する核酸を意味する。この用語はまた、例えば融合タンパクの生産に使われる付加的ポリペプチド配列をコードする複合遺伝子の部分を形成する組み換え核酸をも含む。
ここで使われている「リガンド」とは、特定の受容体に認識されるランダム（無作為）ペプチドや、可変断片配列などの分子を意味する。該当技術において、分子（もしくは多分子複合体）は受容体でありリガンドでもある、と考えられる。一般的に、低分子量の結合相手をリガンドと呼び、高分子量側の結合相手を受容体と呼ぶ。
「連結反応」とは、二つの二本鎖 DNA 断片間でのホスホジエステル結合の形成過程を意味する。他に示さない限り、ライゲーションは、ほぼ等量モルの連結される DNA 断片 0.5 μｇ当たり10ユニットの T4 DNA リガーゼ（リガーゼ）により、既知の緩衝液、及び条件により行われる。
【００８６】
「リンカー」「スペーサー」は、DAN 結合タンパクやランダムペプチドのような、2つの分子をつなぐ分子や文士群を指し、例えばランダムペプチドが DAN 結合タンパクとの最小の立体障害を持って受容体と結合するように、二つの分子を至適な立体配置に置く役目を持つ。
ここで使われるように、「進化される分子特性」とは、ポリヌクレオチド配列から成る分子、ポリペプチド配列から成る分子、ポリヌクレオチド配列の一部、及びポリペプチド配列の一部より成る分子を含む。特に、「進化される分子特性」に相当する（しかしこれに限定されない）例として、特定の条件（例えば、温度、塩濃度、気圧、 pHやグリセロール、DMSO、界面活性剤等やその他、反応環境に関連する様々な因子における酵素活性を含む。その他の進化される分子特性に相当（限定されない）の例としては、その分子安定性であり、例えば保存における特定環境下での特定の時間後の残存分子特性量である。
【００８７】
「多価抗原性ポリペプチド」もしくは「組み換え多価抗原ペプチド」とは、一種以上のポリペプチド由来のアミノ酸配列を含む非天然ポリペプチドであるが、この資源ポリペプチドは、通常、天然由来ポリペプチドである。異なるアミノ酸配列を持つ少なくともいくつかの領域は、資源ペプチドを注射した哺乳類に見られる抗体により認識されるエピト−プを構成している。異なるエピト−プに由来する資源ポリペプチドは、通常相同的である (例えば類似、若しくは同一の構造、又は機能)。
用語「変異」は、野生型もしくは親核酸の配列変化もしくはペプチド配列の変化を含む。そのような変異とは、トランジションやトランスバージョンなどの点突然変異でもよい。変異は、削除、挿入、倍化でもよい。変異は、また、一方の親分子由来の部分もしくは全配列及び少なくとも一つの他の親分子由来の部分、もしくは全配列を含むように生産された子孫分子に例示される「キメラ化」をも含む。この新案は、キメラポリヌクレオチドとキメラポリペプチドの両者を提供する。
ここで使われるように、縮重した「N,N,G/T」ヌクレオチド配列は 32 通りの可能なトリプレットを表し、「N」とは A, C, G もしくは T である。
用語「天然由来」は、自然界で見つけられる物質に対して使われる。例えば天然資源より分離され、研究室で人為的に修飾されていない有機生命体（ウイルス、細菌、原虫。昆虫、植物、若しくは哺乳類組織を含む）に存在するポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列は、天然由来である。一般的に、この用語「天然由来」は、例えばその種の定常固体のような、非病理（非疾病）状態の物体に使われる。
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸もしくはリボ核酸をさし、そのポリマーは一本鎖もしくは二本鎖を形成する。特に限定しない限り、その用語は、対象核酸と類似の結合特性を持ち、天然由来核酸と類似の機構で代謝される天然核酸の既知類縁体をも網羅する。他に示されぬ限り、特定の核酸配列は、明確に示された配列と同様に、保存的に修飾されたその変異体（すなわちデジェネレートコドン置換）、相補的配列をも含む。特に、デジェネレートコドン置換は、一つもしくはそれ以上（または全て）のコドンの第3位がいずれかの塩基又はデオキシイノシン残基で置換されることにより成される。（Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081;Ohtsuka et al. (1985) J Biol. Chem 260: 2605-2608; Cassol et al. (1992) Rossolini et al. (1994) Mol.  Cell.  Probes 8: 91-98).
用語核酸は、遺伝子、cDNA、そしてその遺伝子にコードされるmRNAとほとんど同じ意味で使われる。
【００８８】
「遺伝子由来核酸」は、遺伝子により合成されるか、それに続いて合成されるもので、つまるところ鋳型として作用している。従って、mRNA、mRNA より逆転写された cDNA、cDNA より転写された mRNA、cDNA より増幅された DNA、増幅 DNA より転写された RNA 等は全て遺伝子に由来し、それに由来する生産物の検出は、起源遺伝子もしくは検体中における遺伝子転写産物の存在もしくは不在を示している。
ここで使われる、「核酸分子」は、それは一本鎖か二本鎖かにより、少なくとも各々一塩基若しくは一塩基対より成る。更に核酸分子は、包括的もしくはキメラ的に、しかしこれには限定されないが、以下に示されるようなヌクレオチド含有分子のいずれかの群に属している；RNA, DNA, ゲノミック核酸、非ゲノミック核酸、核酸、天然由来もしくは非天然由来核酸、そして合成核酸。これは限定されない例であるが、ミトコンドリアなど何らかの細胞内小器官結合性核酸、リボゾーマルRNA、そして天然由来コンポーネントに起因する一つもしくはそれ以上のキメラ的非天然コンポーネントより成る核酸を含む。
【００８９】
加えて、「核酸分子」は、アミノ酸や糖等（これに限定されないが）の非核酸成分を、一つもしくはそれ以上含むものをその一部として含む。従って、例として（これに、限定されないが）核酸系もしくはタンパク質系リボザイムも「核酸分子」として考えられる。
加えて、例として（これに限定されないが）、放射性物質や他の非放射性物質を検出基としてもった核酸分子もまた「核酸分子」として考えられる。
用語「特定の酵素をコードする核酸配列」もしくは「特定の酵素の DNA コード配列」又は、「特定の酵素をコードするヌクレオチド配列」は、他の類似の用語も含めて、適切な調節配列下に置かれた際は、その酵素に転写もしくは翻訳されるDNA配列を示す。「プロモーター配列」は、細胞内で RNA ポリメラ-ゼと結合し、3′方向の下流にある、コード配列の転写を開始させることのできる DNA の調節配列である。プロモーターは DNA 配列の一部である。この配列は、その3′末端領域に開始コドンを持つ。プロモーター配列は、バックグラウンド以上の検出可能レベルの転写が開始されるために必要な最小の塩基を含んでいる。しかし、RNA ポリメラーゼがその配列に結合し、開始コドン（プロモーターの 3′領域）において転写が開始された後、転写は 3′方向下流へと進む。プロモーター配列中には、RNA ポリメラーゼの結合に必要なタンパク結合領域（共通配列）に加え、転写開始部位（ヌクレアーゼS１により都合よく位置づけられる）が見られる。
【００９０】
用語「酵素（タンパク質）をコードする核酸」もしくは「酵素（タンパク）をコードするDNA）又は、「酵素をコードするポリヌクレオチド」や、その他の関連表現は、酵素をコードするだけの配列を含むポリヌクレオチドに加えて、付加的な配列や非コード配列を含むポリヌクレオチドも含んでいる。
一つの実例として、「特定核酸分子種」とは、その初期配列として例示されるような（それに限定されないが）その化学構造と定義される。特定核酸分子種は、その核酸分子や核酸分子に由来する生産物の機能をも意味する。従って、限定されない一例として、「特定核酸分子種」は、その分子及びその分子による生産物の一つもしくはそれ以上の活性や機能と定義される。
「核酸検体の核酸ライブラリーへのアッセンブル」の簡易的定義は、ベクターへのライゲーションや宿主の形質転換などによる核酸検体のベクタ-系コレクションへの取り込み行程を含んでいる。当該ベクター、ホスト、その他の試薬やそれらの特定の非限定例の詳細は後述する。「核酸検体の核酸ライブラリーへの集合反応」の簡易的定義はまた、アダプターへのライゲーションによる核酸検体の非ベクター系コレクションへの取り込む行程も含む。一例として、アダプターは PCR による増幅を促進するため、PCR プライマーにアニールされる。
【００９１】
従って、非限定例として、「核酸ライブラリー」は、一つもしくはそれ以上の核酸分子のベクター系コレクションより成る。他の一例として、「核酸ライブラリー」は、核酸分子の非ベクター系コレクションを構成する。更にまた一例として、「核酸ライブラリー」は、ベククター系及び非ベクター系による核酸分子のコレクション混合構成物より成る。ある見地において、ライブラリーを構成している分子コレクションは、個体の核酸分子種により、検索可能でありかつ分離可能である。
本発明は、「核酸ビルディングブォック」または「ヌクレオチドビルディングブォック」もしくは「DNA ビルディングブォック」を提供するものである。用語「ビルディングブォック」は、ここでは、ベクターやべクターの一部などの一つもしくはそれ以上の付加的分子がポリヌクレオチド（phytase ポリヌクレオチド）などの他の分子と、化学的に結合したものを表すために使われる。特別な、しかし限定されない一例として、ヌクレオチドビルディングブォックは、宿主細胞の形質転換に適した DNA 発現ビルディングブォックが掲げられる。
「オリゴヌクレオチド」（又は単に「オリゴ」）は、化学的に合成された一本鎖もしくは相補的二本鎖ポリデオキシヌクレオチドのいずれかを表す。このような合成オリゴヌクレオチドは、5′リン酸を持つものと持たないものがある。5′リン酸を持たないものは、ATP 及びキナーゼの存在下でリン酸化されなければ、他のオリゴヌクレオチドと結合しないであろう。合成オリゴは脱リン酸化されていない断片と結合することが出来る。
【００９２】
ポリメラーゼ系増幅（PCR 等）を行うため、「連続した少なくとも最初の相同配列、デジェネレートN,N,G/T配列、そして第二の相同的配列より成る 32 倍に縮重したオリゴヌクレオチド」について記述する。ここで使われるように、「相同的」は、オリゴとポリメラーゼ系増幅を受ける親ポリヌクレオチドとの相同性を表す。
一つの核酸は、もう一方の核酸と機能的関係に置かれた際、“作動可能的に連結(operably linked)した”状態にある。例えば、プロモーターやエンハンサーは、それがコード配列の転写を増加する場合、操作可能コード配列と連結している。ここで使われる「操作可能的連結」とは、ある機能的関係におけるポリヌクレオチド配列の連結を表す。一つの核酸は、もう一方の核酸と機能的関係に置かれた際、“作動可能的に連結(operably linked)した”状態にある。例えば、プロモーターやエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、操作可能コード配列と連結している。「操作可能的連結」はまた、連結されるべき DNA 配列が、通常は隣接しているか、若しくは隣接及びフレーム内の領域をコードした二タンパク質を結合させる必要があることを意味している。しかし、エンハンサーは、一般的にプロモーターから数キロベース離れている場合に機能し、またイントロン配列は様々な長さを持っているので、ある種のポリヌクレオチド配列同士は隣接しておらず、「操作可能的連結」している。
【００９３】
RNA ポリメラーゼが2つのコード配列から１つの mRNA を転写する際、一方のコード配列は他方のコード配列と作動可能的に結合し、両者のコード配列に由来するアミノ酸配列を持つ、一本のポリペプチドが翻訳される。コード配列は、発現されるタンパク質が、最終的に目的タンパク質を生産するよう加工（処理）される限り、もう一方のコード配列と隣接している必要はない。
ここで使われる「親ポリヌクレオチド  セット」とは、一つもしくはそれ以上の別個のポリヌクレオチド種より成るセットを表す。通常この用語は、親セットの組み換えにより得られる子孫ポリヌクレオチドセットに関して使われ、このような場合、用語「親」「開始」そして「鋳型」が互換的に使われる。
ここで使われる用語「生理学的条件」とは、培養酵母細胞や哺乳類細胞が通常存在できるもしくは生存している温度、PH、イオン強度やその他の生物化学的パラメーターを表している。例えば、研究室で通常使われる培養条件下で成育した酵母の細胞内条件は、「生理学的条件」である。インビトロ転写反応液における至適な反応条件は、一般的には「生理学的条件」である。概して、インビトロ生理学的条件とは、50 〜 200 mM NaCl 又は KCl, pH6.5 〜 8.5, 20 〜 45℃ 及び 0.001 〜 10 mM 二価陽イオン (即ち、, Mg++, Ca++); 若しくは、 約 150 mM NaCl 又は KCl, pH7.2 〜 7.6, 5 mM 二価陽イオンであり、しばしば0.01 〜 1.0 % 非特異的タンパク質 (即ち、BSA)を含む。非イオン性界面活性剤 (Tween, NP-40, Triton X-100)が、0.001 〜 2% 、若しくは通常 0.05 〜 0.2% (v/v) がしばしば含まれる。常法に基づき、特別な水溶液条件が実験者により決められるべきである。一般的指針としては、以下の水溶液条件が適用される：10 〜 250 mM NaCl, 5 〜 50 mM Tris HCl, pH 5 〜 8, 任意として、二価陽イオン、金属キレート化剤、非イオン性界面活性剤、膜画分、及び / 又は消泡剤。
二本鎖ポリヌクレオチドの配列の記載として、標準的な慣習（5'→3'）が使われている。
【００９４】
用語「個体群」は、ここではポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの一部、あるいはタンパク質などの構成成分の集団を示す。「混合個体群」は同族の（関連した）核酸やタンパク質群に属するが、配列が異なり（同一でない）、従って、生物活性の異なる構成物の集団を表す。
「代用形」を持つ分子とは、前駆対照となる代用形分子と比べ、異なる特性（すなわち活性の増加）を持つ更に成熟した分子形と成る途中、一つもしくはそれ以上の共役および非共役的化学修飾（グリコシレーション、タンパク分解、二量体もしくは多量体化、温度誘導性、若しくはpH 誘導性の立体配置変化、補因子との結合等）を受ける分子を指す。成熟分子の生成途上で、二重もしくはそれ以上の化学修飾（２回のタンパク分解もしくは１回のタンパク分解と脱グリコシレーション）を区別する場合、当該前駆分子は「前々駆体」と呼ばれる。
用語「擬似ランダム」とは、例えば他の部位での残基変異性が限定されている一画の配列をさすが、制限されているが、いずれの擬似ランダム部位も、ある程度の残基変異は可能である。
用語「精製された」は、電気泳動ゲルにおいて本質的に一本のバンドを生じる核酸やタンパクを指す。詳しくは、核酸もしくはタンパクは、少なくとも50％ピュア、85％ピュア、99％ピュアのように表す。
【００９５】
「準繰り返し単位」はここでは、再集合されるべき本質的には同一ではない繰り返しを指す。実際にこの方法は、同一の開始配列の変異により、生産される実質的に同一なコード単位だけでなく、ある領域において、顕著に異なるであろう類似の、もしくは関連した配列の再集合のためにも設計されている。それにもかかわらず、その配列がこの方法により再集合されるため十分な相同性を含んでいる場合、それらは「準繰り返し」単位と記述される。
「ランダムペプチドライブラリー」とは、一連のランダムペプチドをコードする、一連のポリヌクレオチド配列、これらのポリヌクレオチド配列にコードされるランダムペプチド及びこれらのランダムペプチドを含む融合タンパク質を意味する。
「ランダムペプチド配列」とは、二つもしくはそれ以上のアミノ酸単量体より成るアミノ酸配列を指し、確率的もしくはランダムな行程で構築される。ランダムペプチドは不可変配列より成る枠組みもしくは足場モチーフを含むことが出来る。
「受容体」とは、与えられたリガンドに対し親和性のある分子を表す。受容体は天然由来もしくは合成分子である。受容体は不変の状態もしくは他の分子種との会合体として使用される。受容体は共有的もしくは非共有的に、直接もしくは特異的な結合基質を介して、結合相手と結合する。これに限定されないが、受容体の例には、単クローン抗体を含む抗体、（ウィルス細胞やその他の物質上の特異的）抗原性決定物質に反応性である抗血清、細胞膜レセプター、炭化水素や糖タンパク複合体、酵素、そしてホルモン受容体などがある。
【００９６】
用語「組み換え（体）」は、細胞に関して使われた場合は、異種性核酸を複製する細胞、もしくは異種性核酸にコードされるペプチドやタンパクを発現する細胞を指す。組換え細胞は、野生型（非組み換え）には見られない遺伝子を含んでいる。組換え細胞は、人工的に修飾され、細胞内に再導入された遺伝子を持つ野生型細胞に見られる遺伝子をも含む。この用語はまた、細胞から分離されずに細胞内で修飾された核酸を含む細胞をも含む。このような修飾は遺伝子置換、部位特異的変異や、その他関連技術による修飾である。
「組換え酵素」とは、組換えDNA技術により生産された酵素であり、例えば目的酵素をコードする外来DNAにより形質転換された細胞により生産されるものである。「合成」酵素は、化学合成により調整されたものである。
「組換え体発現カセット」もしくは単に「発現カセット」とは、組換えもしくは合成により作成された構造遺伝子の発現が宿主中で可能な核酸エレメントを持つ核酸である。発現カセットは少なくともプロモーターを含み、随意的に転写終結シグナルを持つ。通常、組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（すなわち目的ポリペプチドをコードする核酸）とプロモーターを含む。ここで述べられるように発現に必要なもしくは発現を助ける付加的な因子も使われる。例えば、発現カセットは宿主細胞から発現タンパクを分泌させるシグナル配列をコードする核酸も含む。遺伝子発現に影響する転写終結シグナル、エンハンサー、そして他の核酸配列等も発現カセットに含まれる。
用語「関連ポリヌクレオチド」は、互いに同一、若しくは相同的なポリヌクレオチド配列を持つ領域を意味する。
【００９７】
「復元的再集合」は、繰り返し配列により仲介される削除（または挿入）の結果として生ずる分子多様性の増加を意味する。
以下の用語は、二つもしくはそれ以上の、ポリヌクレオチドの配列間関連性を表すものとして使われる：「対象配列」「比較枠」「配列相同性」「配列相同性％」「実質的相同性」。
対照配列は、配列比較の基準として使われる、確定した配列である；対照配列は、大きな配列の中の一部であり、例えば全長 cDNA の一断片；列挙された配列中の遺伝子配列、もしくは完全長 cDNA や遺伝子配列から成っている。一般的には、対照配列は少なくとも 20 ヌクレオチドであり、しばしば少なくとも 25 ヌクレオチド、また、少なくとも 50 ヌクレオチドのこともある。二つのポリヌクレオチドは、各々（１）二本のポリヌクレオチド間で類似の配列（例えば完全はポリヌクレオチド配列の一部）を構成し、（２）更に二本のポリヌクレオチド間で相違すも 9 配列を構成しているので、配列相同性の局所的領域を同定及び比較するためには、「比較枠」を越えて、二つのポリヌクレオチドの配列を比較することにより、二種（もしくはそれ以上）のヌクレオチド間の配列比較が、通常行われる。
反復指数（RI）は、クローニングベクター中に含まれる「擬似繰り返し単位」の平均数である。
「制限部位」は、制限酵素の作用発現に必要な認識配列を表し、触媒的切断部位を含む。切断部位は、低いあいまいな配列 (ambiguity sequence 、例えば、制限部位での切断頻度を決定する重要な配列) の中に含まれる場合と、そうでない場合が認められる。よって、多くの場合、対応する制限部位は、切断部位を低いあいまいな配列の内部(EcoR I サイトの G/AATTC など)、若しくはその近隣(EcoR II サイトの/CCWGG など) に含む。他の例では、対応する制限部位 (Eco57 Iサイトの CTGAAG) は、切断部位 (制限部位に対してN16 に相当する部分) を、低いあいまいな配列 (Eco57 I サイトの CTGAAG ) の外側に含んでいる。酵素 (制限酵素) がポリヌクレオチドを「切断する」と言われたとき、それは、制限酵素がポリヌクレオチドの切断を触媒、若しくは促進した、という意味である。
用語「スクリーニング」は一般に、適切な抗原を同定するプロセスを意味する。抗原発現、折りたたみ、安定性、免疫原性や幾つかの関連抗原由来のエピトープの存在を含む幾つかの抗原特性が、セレクションやスクリーニングに使われる。セレクションはある遺伝的環境において他の細胞が成育しない一方で、そのマーカーを発現する細胞だけが生き残れるような（もしくはその逆）選択性マーカーの発現により同定と物理的分離を同時に行う、スクリーニングの一つの方法である。スクリーニングマーカーは、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレスセインタンパクを含む。選択マーカーは、薬物及び毒素耐性遺伝子やそのようなものを含む。
【００９８】
インビトロでの初期免疫応答研究における限界のため、インビボ研究は、特に、有用なスクリーニング方法である。これらの研究において、抗原は、まず、実験動物に投与され、続いて免疫された動物由来のリンパ球を用いて、免疫応答の分析もしくは誘導された免疫応答の、定性、及び定量分析による免疫反応が調べられる。自然な進化の過程で自然淘汰が起こるが、現在の方法において、セレクションは人間によって成される。
限定されない一例として、「選択可能なポリヌクレオチド」は、5'末端末端領域、中間領域、（例えば内部もしくは中央領域）そして3’末端領域より成る。
ここで示されるように、5’末端領域は、5’ポリヌクレオチド末端（側）に位置する；従って、それは5’側半分のポリヌクレオチドの一部分もしくは全体のいずれかにある。
同様に、3’末端領域は3’ポリヌクオチド末端（側）に位置する；従って、それは3’側半分のポリヌクレオチドの一部分もしくは全体のいずれかにある。限定されない一例として、二つの領域間、もしくは三つの全ての領域間と重なった配列が存在してもよい。
用語「配列相同性」は、二つのポリヌクレオチド配列が、比較の枠内で同一(ヌクレオチド対ヌクレオチドベースで）であることを意味する。
【００９９】
「配列相同性％」は、比較枠内で二つの配列を適切に並べ、両方の配列において同一の核酸塩基（即ちA,T,C,G,UもしくはI）を持つ位置の数を求め、その数を比較の枠内（例えば枠サイズ）の全体の塩基の数で除し、そして百分率で表すためにその数（商）に 100 をかけて求める。この「実体的同等性」は、少なくとも 25〜50 ヌクレオチドの比較枠の対照配列との比較において、対照配列とポリヌクレオチド配列との比較により％配列相同性が計算され、80 ％以上の、少なくとも 85 ％、しばしば 90〜95 ％の、もしくは少なくとも 99 ％の配列相同性を持つ配列により成るポリヌクレオチドというように、ポリヌクレオチドの配列の特性が表され、この場合、そのポリヌクレオチドは、比較枠内において、対照配列の 20 ％もしくはそれ以下の削除もしくは挿入を含んでいることを意味する。
二つの酵素の「類似性」は、第一の酵素の第二の酵素に対する置換を、アミノ酸配列と比較することにより決められる。「類似性」は、よく知られた例では、BLAST プログラムによって求められる。
【０１００】
用語「一本鎖抗体」は、一般的にスペーサーペプチド（即ち〔Gly-Gly-Gly-Gly-Ser〕x）を介して結合したVH領域とVL領域より成り、それらはアミノ末端及び（若しくは）カルボキシ末端に付加的なアミノ酸配列を含んでいる。例えば、一本鎖抗体は、ポリヌクレオチドを結合させるためのつなぎ断片を持っている。一例として、scFv は、一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、ほとんどの場合、げっ歯類、非人間−霊長類、鳥類、ブタ、ウシ、羊、ヤギ若しくはヒト重鎖又は軽鎖遺伝子にコードされる免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によりコードされる少なくとも 10 残基のアミノ酸より成るひとつ若しくはそれ以上のポリペプチド断片より成るタンパクである。機能的単鎖抗体は、一般的に受容体や抗原（エピトープ）等の特異的標的分子に対する結合能を維持するため、免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部分を含んでいる。
【０１０１】
フレーズ「特異的に（選択的に）抗体と結合する」あるいは「特異的に（選択的に）免疫応答する」とは、タンパクやペプチドについて記述される際は、様々なタンパク質や他の生物物質の集団の存在下において、タンパクやタンパク由来のエピト-プの存在を決定づける結合反応を意味する。従って、一定の免疫反応条件下において、特定の抗体は特定のタンパクと結合するが、検体中に多量に存在する他のタンパク質とは結合しない。多価の抗原性ポリペプチドに対して生じた抗体は、通常一つ若しくはそれ以上のエピトープの得られるタンパク質と結合する。このような条件下での抗体に対する特異的結合には、特定のタンパクに対する特異性により、選ばれた抗体が要求される。様々な免疫アッセイ系が特定のタンパクに対する特異性な免疫反応性抗体の選別に使われている。例えば、固相 ELISA 免疫アッセイ、ウエスタンブロッティング、若しくは、免疫組織化学法などが、タンパク質に対する特異的な単クローン抗体の選別に定法として使われている。特異的な免疫反応の決定に使われる免疫アッセイ系や条件については、Harlow and Lane〔（1988）  Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York "Harlow and Lane"〕を参照のこと。
通常、特異的あるいは選択的な反応は、少なくともバックグラウンドやノイズに対して２倍、多くの場合バックグラウンドに対し10〜100倍以上である。
【０１０２】
対を形成する成分（即ち、抗原、抗体対や核酸対）は、お互い方の非特異的分子に比べ、高い親和性で結合する場合、「特異的に結合する」と言われる。例えば、ある抗原に対し、他の非特異的タンパクに比べはるかに効率的に結合する抗体は、その抗原と特異的に結合する、と表現される。（同様に塩基対相互作用によって、ある核酸がもう一方の核酸と特異的に二本鎖を形成する場合、それは標的の核酸と特異的に結合すると言われる。（上記参照））
二分子間の「特異的結合親和性」、例えばリガンドと受容体とは、分子の混合液中での互いの分子の優位な結合を表す。分子同士の結合は、結合親和性が 1 X 104 M-1 から 1 X 106 M-1、もしくはそれ以上の場合、特異的と考えられる。
「特異的ハイブリデーション」は、第一のポリヌクレオチドと第二のポリヌクレオチド（即ち、別個であるが実質的に第一のポリヌクレオチドと同一の配列を持つ）との間でのハイブリッドの形成を指し、ここでは非関連性のポリヌクレオチド配列は、混合物中でハイブリッドを形成しない。
用語「特異的ポリヌクレオチド」は、一定の終点と一定の核酸配列を持つポリヌクレオチドを指す。二つのポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドの一部と同一の配列を持つが、末端が異なる第一のポリヌクレオチドと、二つの異なる特異的なポリヌクレオチドを形成する。Tm（融点）は、（特定のイオン強度及び pH において）プローブの 50 ％が、標的配列とハイブリダイズする時の温度である。一つのプローブに対し、非常に厳しい条件が Tm に対して選択される。サザンあるいはノーザンブロットのフィルター上で 100 以上の相補性残基を持つ核酸のハイブリダイゼーションの為のストリンジェント（stringent）な条件の一例は 42℃、オーバーナイトでのハイブリダイゼーションでは 50 ％ホルムアミド、1 mg ヘパリンである。
【０１０３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、配列間での相同性か、少なくとも 90 ％又は 95 ％もしくは 97 ％である時のみ、ハイブリダイゼーションが起こる条件であることを意味する。Sambrook et al, 1989を参照のこと。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、0.15 M NaCl 72℃で 15 分である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、0.2 X SSC洗浄を 65℃で 15 分である。（参照, Sambrook, infra., SSC buffer  に関する説明)  しばしばストリンジェントな洗浄は、低ストリンジェントな洗浄でのバックグラウンドプローブの除去後に行われる。
100 ヌクレオチド以上の二本鎖のための中程度ストリンジェントな洗浄の一例は、１X SSC を 45℃で 15 分である。100 ヌクレオチド以上の二本鎖のための低度stringency洗浄の一例は、4〜6 X SSC を40℃で 15 分である。短いプローブ (10-50ヌクレオチド) では、ストリンジェントな条件は、1 M Na+イオン以下で (通常は 0.01 〜 1.0 M) pH 7.0 から 8.3 であり、温度は少なくとも 30℃である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミド等の非安定化剤の添加によっても成される。一般的に、非関連プローブで見られるものに比べ、２倍 (若しくはそれ以上) のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションによるものと見なされる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションが起こらない核酸同士でも、それらがT細胞受容体ポリペプチドや、主要組織適合遺伝子複合体 (major histocompatibility) 分子をコードし、実質上同一である場合は 、これらの核酸は事実上同一である。これは、即ち、遺伝子コードにより認められる最大のコドン縮重 (degeneracy) を使い、核酸のコピーが作製された場合に起こる。
【０１０４】
ノーザンハイブリダイゼーションや、サザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」や「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる条件下では、これらは異ったものとなる。長い配列のハイブリダイゼーションには、より高い温度が必要とされる。核酸のハイブリダイゼーションにおける詳しい指針は、以下を参照のこと；Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-- Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York。一般に、一定のイオン強度とpHでの高ストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件には、特異的配列に対するTm より約 5℃低い温度が選ばれる。通常、「ストリンジェントな条件」 において、プローブは、その標的配列と結合するが、他の配列とは結合しない。
【０１０５】
また、本発明には、SEQ ID 1 の中のひとつのように、phytase ポリペプチドの配列と事実上同一である配列を持つポリペプチドも含まれる。「実質的に同一な」アミノ酸配列とは、対照配列と比べて保存的なアミノ酸置換でのみ異なるアミノ酸配列を表し、例えば、ひとつのアミノ酸が他の同じクラスのアミノ酸で置換されたもの (イソロイシン、バリン、ロイシンやメチオニンなどの疎水性アミノ酸の一つが、この中の他の一つと置換、若しくはアルギニンがリジンに、グルタミン酸がアスパラギン酸に、グルタミンがアスパラギンに、といった親水性アミノ酸同士の置換) である。
二つの核酸やポリペプチドに関する文脈中の語句、「実質的に同一な」 は、以下に述べる配列比較アルゴリズムの一つにより、若しくは視覚的にそれらを比較し、最大の一致性を与えるように並べた時、二つ、若しくはそれ以上の配列同士が、少なくとも 60 %、又は 80 %,若しくは 90〜95 % の配列相同性を示したことを意味する。一例として、実質的相同性は、少なくとも 50 残基、若しくは 100 残基の配列範囲で存在するか、又はそれらの配列が少なくとも 150 残基にわたり同一である際に使われる。幾つかの例においては、コード領域の全ての範囲で、配列が実質的に同一である。
【０１０６】
「亜配列(subsequence)」とは、長い核酸、若しくはアミノ酸 (ポリペプチド) の中の一部の核酸、若しくはアミノ酸 配列を意味する。
更に、「実質的に同一な」 アミノ酸配列とは、対照アミノ酸とは配列が異なるにもかかわらず、又は、一つ、若しくはそれ以上の同類置換、欠失、挿入が、その分子内の活性部位以外の部分で起こり、そのポリペプチドが実質的に対照アミノ酸と同一の特性を保持している場合に使われる。例えば、そのポリペプチド構造に変化が起こるが、何ら生物活性を変えることなく、phytase ポリペプチドから一つ、若しくはそれ以上のアミノ酸を取り除くかとができる。一例として、生物活性に必要でない phytase の N- 若しくは C- 末端アミノ酸は除去可能である。このような修飾は、更に短い活性型 phytaseポリペプチドの開発へとつながる。
ここで使用されている「実質的に純粋な」とは、その物質が優位に存在する、という意味であり (例えば、構成物中にその物質が、他の分子に比べ、モル換算で圧倒的に多く存在する場合)、実質的に純化された分画には、その中に存在する全ての高分子中で、目的の物質が 50% 以上 (モル換算) 存在している。通常、実質的に純粋な組成では、資料中に含まれる全ての高分子の中で、目的物質が 80-90% 以上 (モル換算) を占めている。一例として、目的物質は、本質的に均一 (常法による分析において、試料中に他の夾雑物が検出されない)となるように精製され、その試料中で、目的物質が実質的に唯一の高分子成分である。溶媒、低分子 (＜ 500 ダルトン)、及び元素イオンは高分子成分とは見なされない。
【０１０７】
ここで使用されている「可変断片」とは、始原ペプチドの一部であり、ランダム、擬似ランダム、若しくは特定の中心配列である。可変断片は、可変部と不変部の両者から成り、可変部残基における変異の程度は制限されているであろう。そして両者の選択は実験者の判断により決定される。可変断片は長く、また抗体フラグメント、核酸結合タンパク、受容体タンパク等の抗体部位や受容体タンパクを構成しているが、通常可変断片としては、5 〜 20 アミノ酸残基が使われる。
「野生型」は、そのポリヌクレオチドが何の変異も持たないことを意味する。「野生型タンパク」とは、そのタンパクが天然に見られるタンパクと同様の活性及びアミノ酸配列を持つことを意味する。
作業用検体中に見られる「作業用」とは、例えば単に実験に使われている検体を指す。同様に「作業用分子」は、例えばそこで使われている分子のことである。
【０１０８】
核酸の作製及び操作
本発明は、ここで示されるように、鋳型核酸の操作による変異した抗原結合部位、抗体、そして抗体の特異的領域や断片（即ち、Fab あるいは Fc 領域）の作製法についてを提示している。この発明は、学術雑誌や特許中に示されている既知の方法、プロトコールや装置とあわせて実行することが出来る。
【０１０９】
一般的技術
本発明を実行するために使われる RNA、cDNA、ゲノミック DNA、ベクター、ウィルスやそのハイブリッドなどの核酸は、様々な資源より単離をされたものや、遺伝子操作されたもの、増幅されたもの、若しくは組換え技術により発現、作製されたもの、（組換えポリペプチドはこの発明に従い、修飾若しくは固定化される）などが使われる。バクテリア、哺乳類、酵母、昆虫若しくは植物等、いずれの組換え体発現系を用いても実行可能である。
またはこれらの核酸は、以下に示された化学合成技術によってもインビトロで合成できる。（Carruthers(1982) Cold Spring Harbor Symp.  Quant. Biol.  47:411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997)  Nucleic Acids Res.  25:3440-3444;  Frenkel (1995) Free Radic. Biol.  Med.  19:373-380; Blommers (1994)  Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979)  Meth. Enzymol.  68:90; Brown(1979) Meth.  Enzymol.  68:109; Beaucage(1981)  Tetra.  Lett. 22:1859; U.S. Patent No. 4,458,066.)
二本鎖DNＡ断片は、相補的DNA鎖を合成し、二本のDNA鎖を適当な条件下でアニールするか、プライマートと共にDNA鎖をDNAポリメラーゼで処理することにより得られる。
サブクローニング、プローブのラベル化、（Klenow ポリメラーゼによるランダムプライマーのラベル化、ニックトランスレーション、増幅等）、配列決定、ハイブリダイズ等の核酸操作技術は、学術誌や特許に詳しく述べられている。Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols.  1-3 Cold Sprig Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed.  John Wiley & Sons, Inc., New York(1997);  LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part Ｉ.  Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
【０１１０】
本発明で使う核酸の入手及び操作として、他の有用な手段は、ゲノム試料より核酸を単離し、必要であればゲノミッククローン、cDNA クローン、若しくは他の完全なゲノム DNA より単離（あるいは増幅）された目的核酸断片を選別、再クローンすることである。この方法で使われるゲノミック核酸資源、そしてこの発明を構築しているものには、哺乳類人工染色体（Ascenzioni (1997) Cancer Lett. 118:135-142;  U.S.  Patent Nos. 5,721,118; 6,025,155）（ヒト人工染色体を含む；Warburton (1997) Nature 386:553-555; Roush (1997) Science 276:38-39; Rosenfeld (1997) Nature Genet. 15:333-335）、酵母人工染色体（YAC), BAC, P1人工染色体、（Woon (1998) Genomics  50:306-3s16; Boren (1996)  Genome Res.  6:1123-1130参照）、PACs（バクテリオファージP-1由来ダ78クター、Ioannou(1994) Naure Genet. 6:84-89;Reid(1997)  Genomics 43: 366-375; Nothwang(1997) Genomics 41:370-378; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124を参照のこと）、コスミド、プラスミド及び cDNA に含まれるか若しくは、その全てから成るゲノミックまたは cDNA ライブラリーが含まれる。
【０１１１】
核酸の増幅
本発明の飽和変異を使う方法を含む一例として、鋳型核酸は、ポリメラーゼ系増幅即ちポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの増幅反応により増幅される。増幅反応は変異を導入するため、各コドンに対し、64 倍の縮重されたオリゴヌクレオチドを用いて行われる。実験者は、適切なオリゴヌクレオチド増幅用プライマーを選別、設計できる。
増幅法は良く知られた方法であり、即ち、PCR (PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y.(1990) and PCR STRATEGIES (1995),ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., ligase chain reaction (LCR)(Wu (1989)Genomics 4:560; Lndegren (1998) Science 241;1077; Barringer (1990) Gene 89;1173))、転写増幅（Kwoh (1989)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173） 、配列複製 (Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:18740) 、Q-beta レプリカーゼ (Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491) 、Q-beta レプリカーゼ自動化増幅アッセイ(Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271)、そして他の RNA ポリメラーゼ- 依存性技術 (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); see also Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; U.S. Patent Nos. 4,683,195 and 4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564) を含む。
【０１１２】
抗体及び抗原結合部位
本発明は、飽和突然変異による鋳型核酸の変換、最適化された指向的進化系、合成的ライゲーション再集合、又はこれらの組み合わせによる抗原結合部位、抗体、及び抗体の特異的領域、若しくは断片、即ちFab、若しくは Fc領域(上述)への変異の導入法を提供している。これらの方法により作製された抗原結合部位、抗体、及びその断片は、本発明における新規のキャピラリーアレーにより選別され、その抗原結合活性 (親和性、結合特性) が分析される。全ての抗体配列は、これらの方法の一つ、もしくはそれ以上の組み合わせにより変えることができ、又はそれらの配列の一部や領域は、独立して変換することが可能で、更に何れの順序、方向にも再構築が可能である。例えば、ひとつのFc領域が、Fc-細胞表面受容体との結合能に対して変異、選別される。その後、そのFc断片を抗原結合領域と再結合、再集合させることができる。
本発明は、生物、細胞、又は合成的生産物より得られた抗体をコードする配列 (即ち、ゲノムDNAなど) 等の鋳型配列より変異核酸を作製する方法を提示している。これらの特異的抗原に対する産物をコードする核酸配列 (即ち本発明に使用される鋳型核酸) は、免疫付与により生成、選別され、更にその抗原に特異的に結合する抗体をコードする全て、若しくは一部の配列が単離される。ポリクロナール抗体、及びモノクロナール抗体の生産法は研究者によく知られており、以下の学術書や特許にも記述されている；Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York. 抗体はまた、従来の動物を使ったインビボによる方法に加え、インビトロでも産生される。これは、組換え抗体結合部位を発現するファージディスプレイライブラリーを用いる方法である (Huse (1989) Science 246:1275; Ward (1989) Nature 341:544; Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:6270; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27−45.)。ヒト抗体は、ヒト抗体のみを産生するように設計されたマウスにより生産させることができる (U.S. Patent Nos. 5,877,397; 5,874,299; 5,789,650; and 5,939,598)。これらマウスのB細胞は、ヒトモノクロナール抗体産生細胞を作製するために、常法 (ミエローマなどの不死化細胞系との融合や、細胞を不死化するためのその他の技術によるB細胞の処理) により不死化させることができる (U.S. Patent No. 5,916,771; 5,985,615)。
例えば、目的の抗原に対するヒト抗体をコードする核酸を産生するため、ヒトリンパ球が、SCIDマウスなどの免疫不全実験動物に投与される。その動物は、一回、若しくはそれ以上の抗原投与を受け、その抗原に対する特異的抗体を発現するリンパ球が単離/クローン化される。または、ヒト抗体のみを発現する遺伝子を持つマウスが使用される (上述)。
【０１１３】
目的抗体をコードする核酸配列 (即ち、ヒト抗体産生マウスより得られたcDNAライブラリー等) は、クローン化され、更に操作される (本発明中の実験における鋳型として使用される)。例えば、その抗体が非ヒト由来である場合、それは最終的な患者への投与目的として「ヒト化」されるべきである。キメラを作製する方法、つまり「ヒト化」抗体の作製法については広く知られている (U.S. Patent Nos. 5,811,522; 5,789,554; 5,861,155)。また、組換え抗体は、ヒト細胞、若しくは細胞系を含む哺乳類細胞に導入された、一過性、若しくは安定性発現ベクターにより発現される (Norderhaug (1997) J. Immunol. Methods 204:77−87; Boder (1997) Nat. Biotechnol. 15:553−557; see also U.S. Patent No. 5,976,833)。「ヒト化」された糖化型抗体を発現するCHO細胞系は、特に有用である (U.S. Patent No. 5,272,070)。
ここで考案された方法は、抗体や抗原結合部位の「親和性向上」の方法をも提示している。抗体不変領域 (即ち、Fc領域) もまた、Fc受容体や相補的ポリペプチドに対する特異的結合能の「親和性向上」が可能である。CDR, Fab, Fc 又は一本鎖抗体等を含む変異抗体の大きな集合体やライブラリーが作製され、リガンド (抗原、補体、受容体等) に対する結合能により選別される。一例として、変異ポリペプチドが単離され、更にここで記述された方法により処理される。つまり、選別されたポリペプチド、ペプチド、若しくはそれらの中から選別された一部のアミノ酸配列の組み合わせによる組換えを行うための切り混ぜなどである。よって、目的分子に対して要求される結合親和性を持った抗体、抗原結合部位、Fc領域などが産生される。これらのペプチドや抗体は、その後、目的 (医薬品、診断薬、又はインビトロ試薬) に応じた常法に従い、大量合成される。
【０１１４】
飽和突然変異
本発明は、飽和突然変異による鋳型核酸の改変により、変異した抗体、抗原結合部位、抗体の特定の領域や断片 (Fab や Fc領域) 、T細胞受容体ポリペプチドや主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子の生産法を提示している。一例として、ポリヌクレオチドに点突然変異を導入するため、デジェネレートされたN, N, G/T 配列を含むコドンプライマーが使用され、これらにより、全域のアミノ酸配列において各々のアミノ酸位置に置換が導入されている一連の子孫ポリペプチドが産出される。これらのオリゴヌクレオチドは、隣接した第一の相同的配列、デジェネレートされたN, N, G/T 配列、そして随意的に挿入される第二の相同的配列により構成されている。N, N, G/T 配列の縮重 (degeneracy) 、20種アミノ酸全てに対応するコドンを含むため、これらのオリゴヌクレオチドによる子孫翻訳産物は、ポリペプチド中の各々の位置で、全ての可能なアミノ酸の置換を持った変異体を含んでいる。
ある局面において、このような縮重オリゴ（一つの縮重 N,N,G/T カセットからなる）の一つは、親ポリヌクレオチド鋳型の中のそれぞれの本来のコドンを、全範囲のコドン置換に供するために使用される。別の局面において、親ポリヌクレオチドの鋳型における少なくとも二個の本来のコドンを、全領域のコドン置換に供するために、同一のオリゴ又はそれ以外のどちらかの、少なくとも二個の縮重 N,N,G/T カセットが使用される。従って、一つ以上の部位でアミノ酸変異を導入するために、一個以上の N,N,G/T 配列が、一個のオリゴの中に含まれうる。この複数の N,N,G/T 配列は、直接的に連続している又は、一つもしくは複数の付加的なヌクレオチド配列によって分けられうる。別の局面において、アミノ酸の付加、欠損、および/もしくは置換の任意の組み合わせ又は順列を導入するため、付加や欠損を導入するために使用可能なオリゴは、単独でも又はN,N,G/T配列を含むコドンと組み合わせて使用されうる。
【０１１５】
一例として、連続的な N,N,G/T トリプレット、すなわち縮重（N,N,G/T）n配列を含むオリゴを使用して、二つ又はそれ以上の連続したアミノ酸部位を同時に突然変異誘発させることが可能である。別の局面において、本発明はN,N,G/T 配列未満の縮重度をもつ縮重カセットの使用を提供する。例えば、Nがトリプレットの最初の、二番目の又は三番目の部位にあることができるような、たった一つのNから成る縮重トリプレットを使用（例えばオリゴにおいて）することが、場合によっては望ましいであろう。その任意の組み合わせ及び順列も含む、任意の他の塩基を、トリプレットの残りの二つの位置で用いることができる。または、場合によっては縮重 N,N,N トリプレット、又は N,N,G/C トリプレットを使用（例えば、オリゴにおいて）することが望ましいであろう。
一例として、縮重トリプレット（N,N,G/T、又はN,N,G/Cトリプレット配列のような）の使用は、ポリペプチドにおけるそれぞれおよび全てのアミノ酸部位に、可能なアミノ酸（20アミノ酸の合計に対して）の全てによる置換を、系統的に、かつ、かなり容易に作製を可能にする。例えば、100アミノ酸のポリペプチドにとって、本発明は、系統的に、かつ、かなり容易に2000の異なる種（すなわち、部位あたり20の可能なアミノ酸X100アミノ酸部位）を作製するための方法を提供する。縮重 N,N,G/T 又は N,N,G/C トリプレット配列を含むオリゴの使用を通じて、20の可能なアミノ酸をコードする32の個々の配列が提供されることは評価される。したがって、親ポリヌクレオチド配列が、このようなオリゴを使った飽和変異法に供されるような反応容器において、20の異なるポリペプチドをコードする32の異なる子孫ポリヌクレオチドが作製される。対照的に、部位特異的突然変異誘発における非縮重オリゴの使用は、反応容器あたり一つの子孫ポリペプチド産物のみをもたらす。
【０１１６】
本発明はまた、開示された縮重したプライマーとの組み合わせにおいて、随意的に使用うる非縮重オリゴの使用を提供する。いくつかの状況においては、作用ポリヌクレオチドに特定の点変異を作製するため、非縮重オリゴを使用することが有利であるとが評価される。これは、アミノ酸置換につながらない特異的なサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、及び停止コドンの作製やポリペプチド断片の対応する発現を引き起こす点変異を作製するための手段を提供する。
従って、本発明の好ましい態様において、全ての20アミノ酸が、親ポリヌクレオチドにおいて変異されたコドン部位に対応する一つの特定のアミノ酸部位で現われるように、それぞれの飽和変異誘発反応の容器は、少なくとも20の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む。それぞれの飽和変異誘発反応容器から作製された32重縮重子孫ポリペプチドは、クローン増幅（例えば発現ベクターを使って適切な大腸菌宿主にクローニングされる）に供され、発現スクリーニングに供されることが可能である。特性における好適な変化（親ポリペプチドと比較したとき）を提示するためのスクリーニングによって、個々の子孫ポリペプチドが同定される場合、その中に含まれる対応する好適なアミノ酸置換を同定するために配列決定されうる。
ここに開示されたように飽和変異誘発法を用いて、親ポリペプチドにおける、それぞれのおよび全てのアミノ酸部位を変異させる場合、好ましいアミノ酸の変化が、一つ以上のアミノ酸部位で同定されうることが評価される。これらの好ましいアミノ酸置換の全てまたはその一部の組み合わせを含む、一つ又は複数の新しい子孫分子を作製することが可能である。例えば、もし二個の特定の好ましいアミノ酸の変化が、ポリペプチドの三アミノ酸部位のそれぞれにおいて同定されるならば、順列はそれぞれの部位で三つの可能性（本来のアミノ酸が変化しない場合及び、二つの好ましい変化それぞれの場合）および三つの部位を含んでいる。したがって、既に検討された7つの可能性、つまり、6個の単一の点変異（すなわち三つの部位のそれぞれにおける二つ）及び、どの位置でも変化のない場合を含む、3 X 3 X 3、又は27の全可能性がある。
【０１１７】
また他の例として、シャッフリング、キメラ化、組換えやその他の変異導入行程と共に、部位飽和突然変異が、スクリーニングと平行して用いられる。この発明は、飽和突然変異を含む何れかの変異導入行程の反復利用である。例えば、何れかの変異導入行程の反復利用が、スクリーニングと組み合わせて行われる。よって、これに限定されない一例として、本発明は、組換えや減少再分類 (reductive reassortment) によりハイブリッドポリヌクレオチドの生成が行われるような適切な宿主細胞に、二つ、若しくはそれ以上の関連したポリヌクレオチドを導入する行程のような、付加的な変異導入行程との組み合わせによる飽和突然変異の使用法についてを提示するものである。
【０１１８】
最適化された指向的進化系
本発明は、最適化された指向的進化系による核酸操作により、変異した抗体、抗原結合部位、抗体の特定の領域や断片 (Fab や Fc領域) 、T細胞受容体ポリペプチドや主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) 分子の生産法を提示している。一例として、本発明は、更に鋳型核酸の変異法をも含んでおり、即ち、それは、飽和突然変異により変換された抗原結合部位、抗体、若しくはその断片をコードする核酸の指向的進化系による変異導入法である。最適化された指向的進化系は、組換えを通じて核酸分子を進化させるような減少再分類、組換え、及び選別の反復的利用により行われる。最適化された指向的進化系は、大多数の進化したキメラ配列を生成させ、それにより生成した集団は、予め定められた数の交差結合点を含み、著しく向上した配列を持つ。
【０１１９】
交差結合点は、キメラ配列において、親変異体からもう一方の親変異体への配列移動の起こる部位である。このような部位は、通常両方の親からのオリゴヌクレオチドが一本鎖配列を形成する際に、お互いが結合接点に存在する。この方法は、最終的な配列のキメラ集団が、選択された数の交差結合点を満たすためのオリゴヌクレオチドの正確な濃度計算を可能にさせる。また本法は、予め定められた数の交差結合点を持つキメラ変異体の選択を、更に調整可能とさせる。加えて、この方法は、他の系と比べ、非常に多くのタンパク質の変異スペース探索にも簡便な手段である。例えば、一分子が反応中に1013のキメラ分子を生成した場合、このような多数のキメラ変異体の特定の活性を試験することは非常に難しいであろう。更に、大多数の子孫分子集団は、非常に多くの交差結合点を持ったタンパク質となり、それらの全てが増加した特定の活性を持っているとは考えにくいであろう。これらの方法を利用することにより、キメラ分子の集団は、特定の数の交差結合点を持つキメラ変異体を豊富に含むようになるであろう。よって、反応中に、一分子から1013のキメラ分子が生成されるが、分析により選別された各々の分子は、例えば、ただ三箇所の交差結合点を持っているものと推定される。生成した子孫集団は、予め定められた数の交差結合点を含むように設計されているため、キメラ分子間での機能的多様性の範囲は限られている。これにより、どの起源親ポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドが、抗原結合のような特定の活性に影響を与える能力を有するかを調べる際、更に扱いやすい数の変異体が与えられる。
【０１２０】
一面として、キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を生成する1つの方法として、それぞれの親配列の断片または部分に対応するオリゴヌクレオチドの生成がある。それぞれのオリゴヌクレオチドは、特異的な重複区域を含むのが好ましく、それによりオリゴヌクレオチドの混合で、正しい順序でそれぞれのオリゴヌクレオチド断片を有する新しい変異体が生まれることになる。詳細は、USSN 09/332,835 に記載されている。
それぞれの親変異体に生成されたオリゴヌクレオチドの数は、最終的に生成されたキメラ分子内の乗り換えの起因となる合計数と関連がある。例えば、3つの親ヌクレオチド配列の変異体に、例えば、高温下で高活性であるキメラ変種を探す連結反応を起こす。一例として、それぞれの親変異体のそれぞれの部分に対応してオリゴヌクレオチド配列が 50 生成される。したがって、連結組換えプロセス中にはそれぞれのキメラ配列の中に最高で 50 回の乗り換えイベントがあることになる。生成されたそれぞれのキメラポリヌクレオチドが、交互に親変種からのオリゴヌクレオチドを含有している確率は、非常に少ない。それぞれのオリゴヌクレオチド断片が同一の分子量の連結反応で存在している場合には、ある位置で同じ親ポリヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドが互いに連結している可能性が高く、そのため、乗り換えイベントは起こらない。それぞれの親からのそれぞれのオリゴヌクレオチドの濃度が、本例のどの連結ステップ中にも一定であった場合には、同じ親変異体からのオリゴヌクレオチドが、キメラ配列内で連携し乗り換えを起こさない確立は（親は3体と仮定した場合）1／3である。
【０１２１】
したがって、それぞれの連結反応ステップ中に、決められた親変異体数、それぞれの変異体に対応するオリゴヌクレオチドの数、およびそれぞれの変異体の濃度における連結反応のそれぞれのステップにおいて、交叉イベントが起きる個体群を予想するために、特定確率濃度機能（PDF）を特定することができる。PDF特定の背景となる統計および数学を以下に説明する。これらの方法を利用して、そのような確率濃度機能を推定することができ、その結果、特定の連結反応から生じた予め決められた回数の交叉イベントのためにキメラ子孫個体群を強化することができる。また、対象となる乗り換えイベント回数を予め決定することができ、その後、システムは、連結反応時のそれぞれのステップ中のそれぞれの親オリゴヌクレオチドの開始時の数量を計算するようにプログラムされ、それによって、予め決められた回数の交叉イベントを中心とする確率濃度機能が生じる。
【０１２２】
クロスオーバーイベントの決定  
本発明の実施例には所望する乗り換え確率濃度機能（PDF）を受け取るシステムおよびソフトウェア、再組合せされる親遺伝子の数、および再組換え中に投入される断片の数が含まれる。このプログラムの出力は「断片PDF」であり、再組合せ遺伝子の処方およびそれらの遺伝子の推定される乗り換えPDFを決定するのに使用できる。ここで説明されるプロセスは、プログラミング言語であり、また技術的なコンピュータの利用における環境開発をするMATLAB（登録商標）（マスワークス、Natick、Massachusetts）で行われるのが好ましい。
【０１２３】
コンピューターシステム
このシステムの一例は、ここで記述されている方法を行うためのコンピューターシステムである。一つの特徴として、コンピューターシステムは、Intel マイクロプロセッサーに基づき、Windows（登録商標）オペレーションシステムで働くような従来のパーソナルコンピューターである。コンピューターシステムの出力は、断片化PDFで、それは生産される再集合子孫遺伝子やそれら遺伝子の予想された交差結合点を示したファイルとして使用される。ここで示されるプロセッシングは、 MATLAB（登録商標）プログラミング言語、及び展開環境を使用したパーソナルコンピューターにより行われる。本発明は、特定の構成のハードウエアーやソフトウエアーに限定されない。例えば、UNIX（登録商標）, Linux, MacOS やその他の有名なマイクロプロセッサーや操作システムによるコンピューターも使用される。
【０１２４】
反復再集合
様々な形態のうち、本法では、一連のキメラ核酸やタンパク質分子が生成され、これら分子の、目的の抗原に対する結合能など、特定の活性がスクリーニングされる。本発明は、一段階のスクリーニングのみに限定される訳ではない。例えば、全ての子孫キメラ抗体ポリヌクレオチドが、増加した親和性を示したり、特定の親ポリヌクレオチドが共通な特定の特異性を持つ場合、第二段階目のスクリーニングが行われる。この決定に基づき、これらの子孫オリゴヌクレオチドを進化させるため、第二段階目の再集合が行われる。これは、例えば、ライゲーション再集合反応に対応する他の親ポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチド配列を加えずに行われる。よって、各々の遺伝子にライゲーションされるべきオリゴヌクレオチドは、目的のオリゴヌクレオチドのみとなるであろう。
同様に、ある特定のオリゴヌクレオチドが望ましい特質（例えば、新規の表現型）に全く影響を与えないと確認されると、排除したい配列を含むより大きな親オリゴヌクレオチドを合成することにより、それを排除することができる。大型配列内に配列を組み入れると交叉イベントが妨げられるため、子孫ポリヌクレオチド内でこの配列の変異種が存在しないことになる。どのオリゴヌクレオチドが所望する特質により関連しているか、またどれが関連していないかを決定する反復操作によって、特定の特質または活性を提供するタンパク変異型のすべての候補をより効果的に調査できるようになる。
【０１２５】
反応の自動管理
本発明の方法による反応を起こすプロセスは、すべて自動機器およびロボット機器によって自動化することができる。例えば、一例として、Wedgewood Technology、Inc. の細胞成長モニターモデル652等の細胞成長モニター機器は、リアルタイム代謝フラックス分析に使用できる。他の機器の例は、Tecan Corporation（Hombrechtikon、Switzerland）による TECAN GENESIS（登録商標） プログラム可能ロボットで、コンピュータとのインタフェースを持ち、それぞれのオリゴヌクレオチド断片の量を決定し、その結果PDFを生産する。それぞれのオリゴヌクレオチドの適切な量を決定するコンピュータと、自動ロボットを連結することにより、完全な連結組換えシステムが提供されることになる。シリアルまたはその他のインタフェースによりリンクするデータにより、連結組換え計算から生じたデータファイルは、適切な形式で転送され、ロボットシステムが自動的にそれぞれ適切な量のオリゴヌクレオチド断片の反応試験管への分配を始める。
自動システムには、一連の核酸配列変異子に由来する複数のオリゴヌクレオチド断片を含んでもよい。前述の断片は、特有のオーバーハングで次々に配列に参加する。また、システムはそれぞれの変異子配列における交叉イベントの目標数を保管するようにデータ入力が構成されている。システム内で、予測モジュールが、それぞれの断片が混合する量を決定するように設定され、そのため、断片の混合により、目標数に対応する乗り換えイベントのために子孫個体群の分子が強化される。このシステムはまた、ロボットの腕を、通信インタフェースを介して予想モジュールに連結し、決められた量の断片が自動的に混合されるようになっている。
【０１２６】
変異オリゴヌクレオチド
最適化指向的進化の方法では、親ポリヌクレオチド配列に 100 ％ 適合するオリゴヌクレオチドを利用することができるが、そこまでのレベルの適合は、必要とされていない。例えば、三つの関連する親ポリヌクレオチドが選択され、例えば、新規の表現型を生成するために、連結組換えが行われた場合には、特異的な重複領域を持つオリゴヌクレオチドは、通常の方法によって合成されてもよい。しかし、変異オリゴヌクレオチドもまた合成されうる。これらの変異オリゴヌクレオチドは、サイレント、保存または非保存アミノ酸をコードするように設計されるのが望ましい。
サイレント変異開始の選択は、例えば、断片に相同である領域であるが、最終的に翻訳タンパクに影響を与えないヌクレオチドを加えることによって行う。非保存または保存置換は、そのような変化が生じたポリペプチドの機能をどのように改変したかを決定するものである。例えば、ある特定のオリゴヌクレオチド断片における変異が、ペプチドの活性を増加させる原因であると決定された場合に、これを行うことができる。変異オリゴヌクレオチド（例、親とは異なるヌクレオチド配列を有するもの）を合成することにより、制御された形で、ペプチドまたはタンパク質配列への改変がペプチドまたはポリペプチドの活性に影響を与えるかを調査することができる。
変異断片を利用した核酸配列の変異子のその他の方法は、殆どの該変異子に保管されているが、すべての該変異子には保管されていない、変異子内の境界画定サイトを決定するために、複数の核酸配列を最初に整列させる過程を含む。保管核酸配列の第1の配列断片は、その後生成されるが、ここで、断片は、境界画定サイトにおいて互いに結合する。その後、非保管核酸配列の2番目の断片が例えば、核酸合成器等により生成される。しかし、保管されていないため、配列は生成されると、境界画定サイトにおいて変異を起こし、二番目の断片は、境界画定サイトにおいて、該第一の断片と同一のヌクレオチド配列を有することになる。これにより、親配列への連結反応中でも、非保管配列が雑種形成を行えるようになる。一旦断片が生成されると、それぞれの変異子に対し所望の回数の交叉イベントを選択することができる。その後第1および第2の断片それぞれの量が計算され、第一および第二の断片の計算された量の間の連結／培養反応により、子孫が所望する回数の交叉イベントを有することになる。
【０１２７】
合成ライゲーション再集合 (Synthetic Ligation Reassembly, SLR)
本発明は、合成ライゲーション再集合 (Synthetic Ligation Reassembly, SLR) による鋳型核酸の変換により、変異した抗原結合部位、抗体、そして抗体の特異的領域や断片 (つまり、FabやFc領域) の作製法を示している。SLRは、非確率的にオリゴヌクレオチド断片同士を結合させる方法である。この方法は、核酸ビルディングブォックがシャッフリング、連結、若しくはランダムにキメラ化されていない確立的オリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なり、非確率的にオリゴヌクレオチドが集合される。本発明におけるSLRは、再編成されるべきポリゴヌクレオチド間の高度な相同性に依存しない。よって、本法は、10100以上の異なるキメラ分子より成る子孫分子のライブラリー (又はセット) を非確率的に作製するために利用される。SLRは、101000以上の異なる子孫キメラ分子より成るライブラリーを構築するためにも利用される。よって、本発明の一部として、設計により選ばれた全ての組み立て順序を含む、一連の完全なキメラ核酸分子 (即ち、抗体やその断片をコードする核酸) を非確率的に生産させる方法を含んでいる。この方法は、設計による有用な互換的に結合可能な末端を持つ多数の特異的核酸ビルディングブォックの生成、及び設計された全ての組み立て順序のオリゴヌクレオチドを合成するための核酸ビルディングブォックの編成過程が含まれている。編成されるべき核酸ビルディングブォックの互換的結合可能末端は、それらが核酸ビルディングブォックを予め定められた順序に結合されるような場合に有用であると考えられる。よって、結合させる核酸ビルディングブォックの全体的な編成順序は、結合可能末端の設計により指定される。一段階以上の編成を行う場合、核酸ビルディングブォックの全体的な編成順序は、編成ステップでの連結順序により決定される。例えば、アニーリングされた核酸ビルディングブォックは、それらを共有結合させるため、リガーゼ (T4 DNA リガーゼ等) などの酵素で処理される。
【０１２８】
一例として、オリゴヌクレオチドビルディングブォックの設計は、最終的に産生される一連の子孫キメラポリヌクレオチド分子 (つまり、変異抗体) を指針とした一連の親核酸鋳型 (抗体をコードする配列など) の分析により行われる。これらの親オリゴヌクレオチド鋳型は、よって、変異 (即ち、キメラ化、若しくはシャッフリング) されるべき核酸ビルディングブォックの設計を行う上での有用な配列情報源となる。
一つの特徴として、ある集合や群、若しくは関連遺伝子のキメラ、そしてそれらにコードされるポリペプチドの集合や群が提供される。これらにコードされる生産物は、抗原結合部位、抗体、抗体の特異的領域や断片 (つまり、FabやFc領域)、CDRなどである。
本法の例として、多数の核酸鋳型配列が、一つ、又はそれ以上の分界点 (demarcation point) を選別するために整列させられる。分界点は、相同性領域に存在し、一つ、又はそれ以上のヌクレオチドより成る。これらの分界点は、少なくとも二つの前駆鋳型に共有されている。分界点は、これによって、親ポリヌクレオチドの再編成のために作製されたオリゴヌクレオチドビルディングブォックの境界を区別する目的で使われる。前駆分子中で同定、及び選択された分界点は、最終的キメラ分子の編成における潜在的な変異導入位置となる。分界点は、少なくとも二つの親ポリヌクレオチドに共有される相同性領域 (少なくとも一つの相同性塩基より成る)の一部である。或いは、分界点は、少なくとも半分 (若しくは 2/3) のポリヌクレオチド配列に共有される相同性領域の一部である。一例として、有用な分界点は、ポリヌクレオチド配列の少なくとも3/4 (若しくはほぼ全体) が共有されている相同性領域の一部である。または、分界点は、親ポリヌクレオチド配列の全て が共有されている相同性領域の一部である。
【０１２９】
その他の特徴として、ライゲーション再編成行程は、子孫キメラポリヌクレオチドの包括的なライブラリーを作製するために、余すところなく行われる。言い換えれば、核酸ビルディングブォックの全ての可能な組み合わせが、最終的なキメラ核酸分子のセット中に含まれている。同時に、他の例として、各々の組み合わせにおける編成順序 (例えば、各々の最終的なキメラ核酸 5' から3' 方向への配列における各々のビルディングブォックの集合順序) は、上述されたような設計により(若しくは非確率的に) 行われる。本発明の非確率的特性により、不要な副産物の生成の確立ははるかに減ぜられる。
一つの例として、ライゲーション再集合法は、計画的に行われる。例えば、本法は、子孫分子の計画的に細分化されたライブラリーを作製し、計画的なスクリーニング(即ち、個々に) が行えるように分画化されている。言い換えると、本発明は、選択的、かつ賢明な特異的核酸ビルディングブォックによる、選択的、かつ賢明な連続的集合反応の利用により、幾つかの反応容器中の各々で、特異的な一連の子孫生産物が作製されるような設計法を提示している。これにより、計画的な実験とスクリーニングが可能となる。よって、これらの方法は、更に少ない集団中で、スクリーニングされるべき子孫分子の大量作製を可能にする。
【０１３０】
これらの方法は、非常に柔軟で、かつ包括的、計画的な様式でのキメラ化を可能にするため、特に親分子間での相同性が低い場合でも、多数の子孫分子より成るライブラリー (セット) を提供できる。この簡便なライゲーション再集合の非確率的特性により、作製された子孫分子は、設計により選ばれた全ての集合順列を持つ最終的なキメラ核酸分子を含むライブラリーとなるであろう。他の例として、産生された子孫分子 (核酸、又はポリペプチド) のライブラリー 、若しくはセットは、103以上の異なる分子種、105以上の異なる分子種、1010以上の異なる分子種、1015以上の異なる分子種、1020以上の異なる分子種、1030以上の異なる分子種、1040以上の異なる分子種、1050以上の異なる分子種、1060以上の異なる分子種、1070以上の異なる分子種、1080以上の異なる分子種、1090以上の異なる分子種、10100以上の異なる分子種、10110以上の異なる分子種、10120以上の異なる分子種、10130以上の異なる分子種、10140以上の異なる分子種、10150以上の異なる分子種、10175以上の異なる分子種、10200以上の異なる分子種、10300以上の異なる分子種、10400以上の異なる分子種、10500以上の異なる分子種、101000以上の異なる分子種を含んでいる。
【０１３１】
飽和突然変異法や最適化された指向的進化法もまた、これらと同量の異なる子孫分子種を作製する目的で利用される。
一例として、ここで示された方法により作製された一連の最終的なキメラ核酸分子は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドより成る。他の例に従い、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、それは人工遺伝子であろう。また、このポリペプチドは、抗体、若しくはその断片である。
本発明は、分界点の選択、核酸ビルディングブォックの長さや数、そして結合反応の回数や設計による選択と調節の自由を提供するものである。更に、分子間相同性の必要性が本発明の操作柔軟性を高めている。実際は、分界点は、分子間相同性の低い領域、若しくは無い領域であっても選択可能である。例えば、コドンの揺らぎ (例えばコドンの縮重) により、核酸置換は、本来対応する親鋳型にコードされるアミノ酸を変換すること無しに、核酸構築物へ導入することができる。また、一つのコドンは、本来のアミノ酸を置換するためのコードへと変換することができる。本発明は、分子間相同的分界点の出現を増加させるため、そして、更に構築物間での成されるべき結合の数を増やすため、言い換えると、産出されるべき子孫キメラの分子数を増やすために、上述のようなアミノ酸置換の核酸構築物への導入を可能とした。
【０１３２】
他の特徴としては、ビルディングブォックが産生される行程の合成特性が、後にインビトロ行程 (即ち変異導入)、若しくはインビボ行程 (即ち宿主生物の遺伝子スプライシング能の利用による) において、随意的に取り除かれるヌクレオチド (例えばコドン、イントロン、若しくは調節配列等の一つ、若しくはそれ以上の核酸) の設計と導入を可能にしている。多くの場合、有用な分界点創出に加え、その他多くの理由により、これらのヌクレオチドの導入は価値のあるものと考えられる。
他の特徴として、核酸構築物は、イントロンの導入に使用される。よって、機能的イントロンが、ここで記述されている方法に従い調製される人工遺伝子に導入されるであろう。更に、機能的イントロンは、本発明による人工抗体遺伝子にも導入されるであろう。したがって、これらの方法は、人工的に導入されたひとつの (若しくはそれ以上の) イントロンを含む人工遺伝子の作製法をも提示している。人工的に導入されたイントロンは、天然由来のイントロンが機能的に遺伝子スプライシングを受けるのと同様の方法で、一つ、若しくはそれ以上の宿主細胞中で、機能的に遺伝子スプライシングを受ける。宿主細胞中に導入され、組換え、若しくはスプライシングを受ける人工イントロン含有ポリヌクレオチドの作製行程もまた検討される。
【０１３３】
スクリーニング法
本発明の特徴として、一連の子孫核酸、即ち抗体、Fc, 若しくは抗原結合部位をコードするポリヌクレオチド、T細胞受容体ポリペプチド、及びMHC分子が挙げられる。これらのポリペプチドは、リガンド、即ち抗原 (例えば抗体の親和性成熟が必要な場合)、受容体、若しくは補体分子 (即ち、Fc 領域) に対する、それらの結合能をスクリーニングする目的で発現される。技術的に知られている何れの発現法やスクリーニング法をも使用できる。
提示されるペプチドやポリペプチド配列は、様々の長さを持つであろう、即ち、長さにして 3〜5,000 アミノ酸、若しくはそれ以上、5〜100 アミノ酸、又は8〜15 アミノ酸などである。一つのセットやライブラリーは、様々な長さの、提示されたペプチド配列を持つ成分、若しくは一定の長さの提示されたペプチド配列を持つ成分により構成されている。代表的なディスプレイ法には、ポリソーム上での scFv  や、scFv ファージディスプレイ等の単鎖抗体のインビボ、及びインビトロディスプレイ法が含まれ、これらにより、多様な可変領域配列と結合特性を持つ scFv ライブラリーの大規模なスクリーニングが可能となる。
【０１３４】
また、本発明は、ランダム、擬似ランダム、及び特定のフレームワーク配列を持つ核酸やポリペプチドのライブラリー、及び受容体分子、抗原、若しくは対象のエピトープと結合する有用な化合物 (即ち、単鎖抗体、 Fc などを含む抗体) を同定するための、これらのライブラリーの作成法やスクリーニング法をも提示している。ランダム、擬似ランダム、及び特定のフレームワーク配列を持つペプチドは、その提示されたペプチドを合成するポリヌクレオチド鋳型と、提示ペプチド、若しくは提示単鎖抗体を結合させたものより成るペプチドライブラリーにより産生される。結合様式は、選ばれた本発明中の特定の方法により異なり、またそれは、ファージ粒子への封入、若しくは細胞内への取り込みも含むであろう。
【０１３５】
キャピラリーアレーによるスクリーニング
本発明の一つの実地例として、変異核酸が発現され、生産されたポリペプチド (即ち、抗原結合部位、CDR、Fab、若しくはFc を含む抗体) のある分子 (即ち抗原、補体分子、Fc 受容体) に対する特異的結合能が、ギガマトリックス (GIGAMATRIX（登録商標）, Diversa Corporation, San Diego, CA) などのキャピラリーアレーを含む方法によりスクリーニングされる。
本発明のキャピラリーアレーは、試料の保持、及びスクリーニングに対するシステム、及び方法を提示する。キャピラリーアレーの一例として、試料スクリーニング装置は、多数のキャピラリーが列をなし隣接しており、そこで各々のキャピラリーは、試料を保持するための光束 (lumen) を隔たらせる少なくともひとつの壁を持っている。この装置は更に、隣接したキャピラリー間に間質材が配置されており、間質材の間にひとつ、若しくはそれ以上の参照印が置かれている。また、試料をスクリーニングするためのキャピラリーは、キャピラリーアレーで結合するように改良されており、試料を保持するための光束を隔てる第一の壁があり、更に、試料を励起させるために与えられる励起光を透過するためのフィルター材を持つ第二の壁がある。
【０１３６】
一例として、本発明は、対象生物分子 (即ち、抗体、その断片、若しくはスクリーニングされるものに対するエピトープや抗原などのリガンド) をインキュベートするための方法を与え、それは、キャピラリーアレー中における少なくとも一部のキャピラリーへの、第一の試料の導入法を含み、キャピラリーアレーの各々のキャピラリーは、第一の試料を保持するための光束を隔てる少なくとも一つの壁を持ち、キャピラリー中には、第一の成分の後に空気泡が導入される。本法は更に、キャピラリーへの第二の試料の導入法を含み、第二の試料は、空気泡により第一の試料から分離される。他の例として、対象試料は、検出可能な粒子でラベルされた第一液としてキャピラリーアレー中のひとつのキャピラリーに導入され、その中で各々のキャピラリーは、第一液と検出用粒子を保持するための光束で仕切られた少なくとも一つの壁を形成しており、そこでは、少なくとも一つの壁が検出用粒子を結合させるための結合基剤で覆われている。本法は更に、キャピラリーからの第一液の除去についても述べられ、そこでは、結合した検出用粒子がキャピラリー中に保持されており、そして、そのキャピラリーに第二液が導入される。
一例として、抗体やその断片などの変異ポリペプチドは、キャピラリーアレー上 (他のスクリーニング法を利用する場合はその装置) に固定される (例えば、抗体は「固相中」に)。また、 スクリーニングされるべき試料に対するエピトープや抗原などのリガンドは、キャピラリーアレー上に固定される (例えば、抗原などのリガンドは「固相中」に)。
また一例として、キャピラリーアレーは光束を隔てる少なくとも一つの外壁を持つ個々のキャピラリーにより形成されている。キャピラリーの外壁は、互いに結合したひとつ、若しくはそれ以上の壁を持つ。同様に、その壁は、それが液体や試料を保持する光束を形成する限りは、円筒形、四角、六角形やその他の幾何学的形態の光束を隔たらせる。キャピラリーアレー中のキャピラリーは、平面構造を形成するように近接して、互いに支えあっている。キャピラリーは融合 (この例では、キャピラリーはガラス製)、接着剤、粘結剤、若しくは固定具などにより互いに結着している。キャピラリーアレーは、何れの数のキャピラリーからでも形成できる (例えば、100 から 4,000,000 のキャピラリー)。キャピラリーアレーは、約 100,000、若しくはそれ以上の互いに結着したキャピラリーを持つマイクロタイタープレートを形成できる。
【０１３７】
キャピラリーは、縦横比 50 : 1 で作製される。一例として、各々のキャピラリーは、長さ 10 mm、光束の内径約 200μm である。しかし、ほかの縦横比も可能であり、それは 10 : 1 から 1,000 : 1 以上の範囲にわたる。従って、個々のキャピラリーは、内径として10 - 500μm を持つ。内径 200μm 、長さ 1cm のキャピラリーの容積は約 0.3μl である。各々のキャピラリーの長さと幅は、必要な容量や蒸発速度等の他の特性により決められる。キャピラリーアレーの密度は 1cm2 当り約 500 から 1,000 以上のキャピラリー、若しくは1mm2 当り約5本のキャピラリーである。キャピラリーアレーは、幅、又は直径約 0.5 - 20mm、高さ、若しくは厚さが 0.05 から約 10cm となるようにする。キャピラリーアレーは、厚さ0.1 から約 5cm である。
本発明における方法の一例として、スクリーニングのために、一つ、若しくはそれ以上の粒子 (抗原/ リガンド、若しくは抗体より成る。どちらを固相として用いるかによる) が各々のキャピラリーに導入される。適当な粒子としては、細胞、細胞クローン、その他の生物学的試料、化学ビーズ、若しくはその他の粒状物質が含まれる。対象粒子を含むキャピラリーは、興味対象の活性 (抗原への抗体の結合、補体とFc の結合など) のスクリーニングを行うため、様々なタイプの基質に曝されるであろう。新しい粒子を含む化学溶液は、一つ、若しくはそれ以上のキャピラリーにすでに導入されている他の化学ビーズと組み合わせるために、それらのキャピラリーへと導入される。その粒子と、結果として生ずる興味対象の活性が、キャピラリーアレーを用いてスクリーニング、分析される。一例として、その活性は、キャピラリー中で光学エネルギーを産出し、キャピラリーは、光エネルギーを分析器へと伝える導波管として働く。
【０１３８】
キャピラリーは、様々な製造技術により作製される。一例として、キャピラリーは、中空吸引 (hollow-drawn) 技術を使って製造される。円筒状、若しくは他の中空型のガラス部分は、既知の技術により連続した長い状態へと引き伸ばされる。そのガラス管は、目的の直径まで引き伸ばされ、本発明での使用に適したキャピラリーを形成するように、特定の長さに切断される。そして、多数の個々のキャピラリーが列となるように、互いに結着される。他の特徴として、ガラスエッチング工程が使われる。ガラスの固形チューブが、特的の直径まで引き伸ばされ、その後、特定の長さに切断される。そして、各々の固形チューブは、キャピラリーを形成するよう酸により中央部が食刻される。これらの管は、食刻行程の前、若しくは後で結着される。これらに限定されないが、ガラス、金属に加え、シリコン、液晶、セラミック等の半導体、更にポリエチレン、ポリスチレンやポリプロピレンなどのポリマーやプラスティックを含む多数の材料が、キャピラリーアレーを製造するために、本発明に則り、若しくはそこで使用される製造技術に依存して、適切に使用される。キャピラリーアレーの内壁、若しくはその一部は、それらの表面特性を修飾するため、コーティング、若しくはシラン処理が施されるであろう。例えば、キャピラリーのキャピラリー減少を促進、又は減少させるためにキャピラリーの親水性、若しくは疎水性特性が改良されるであろう。コーティング剤としては、例えばアビジン、ストレプトアビジン、抗体、抗原のようなリガンド、若しくは特異的結合親和性を持つ分子や、高温、若しくは滅菌耐性の分子などが使用される。
【０１３９】
キャピラリーアレーは、位置や列の基準とされる参照印を随意的に含む。参照印は、キャピラリーアレーの表面から伸びているガラスのパッドより形成されるか、若しくは間隙の素材中に固定されているであろう。一例として、参照印はキャピラリーアレーより成るマイクロタイタープレートのひとつ、若しくはそれ以上の角に与えられる。キャピラリープレート、若しくはセットの角は取り除かれ、参照印で置き換えられる。参照印はまた、キャピラリーセットの間の間隙を形成し、キャピラリーの亜集団の目安となる。
キャピラリーは、光束を隔たらせる第一の壁と、それを取り囲む第二の壁を含んでいる。一つの特徴として、第二の壁は第一の壁より低い屈折率を持っている。また、第一の壁は、高屈折率のスリーブガラスであり、励起蛍光が通過する導波管を形成している。第二の壁は、低屈折率の、黒い EMA ガラスより成り、光が屈折される第一壁の周辺は被覆加工されているため、全ての光が毛管内での内部反射となり、第一壁に沿って通過できる。従って、第二の壁は、隣接したキャピラリー間での「クロストーク」や、拡散を減少させるものであれば、どんな素材でもよい。また、第一の壁の内側表面は、光束内での正反射を行わせる鏡、若しくは鏡状構造を形成するような反射材で被覆されている。目的に応じた屈折率を得るため、多くの異なる素材が、第一の壁と第二の壁の形成に使用される。光束への、又は光束からのエネルギーをフィルターするため、光束の周辺にはフィルター材が使用されている。一例として、キャピラリーアレー中の各々の毛管の第一壁の内壁、若しくはその一部は、フィルター材で被覆されている。また、第二の壁にもフィルター材が使用される。第二の壁は、例えば、フィルターガラスのようなフィルター材で形成されるか、若しくは他の例として、第二の壁は、適切な量のフィルター材で被覆されている。フィルター材は、黒以外の色の素材で形成され、目的に応じた励起 / 放射特性が与えられるよう調整されている。フィルター材は、励起エネルギーの光束への伝導を可能にし、キャピラリーの片側の開口部由来のエネルギー以外の放射エネルギーの伝達を妨げている。励起エネルギーは直線により、放射エネルギーは破線により表されている。第二の壁が、フィルター材により形成されている場合、励起エネルギーをとしての一定の波長を持った光のみが光束を通過し、放射エネルギーとしての他の波長の光は、第一の壁に沿って、若しくはその内側を通って伝わるもの以外は、遮断される。全体のキャピラリーアレー、若しくはその一部は、励起、及び検出過程において、特定の波長 (群) を持った光以外のものを取り除くように調整されている。
【０１４０】
一例として、励起光は粒子 (上述) と接触し、放射光を発するレポーター蛍光剤を励起させる光束中を通過する。放射された光は、検出器に到達するまでキャピラリー中を移動する。第二の壁が黒い EMA ガラスの場合、放射された光は、キャピラリーアレー中の隣接したキャピラリーに移動するこどができない。加えて、黒い EMA ガラスは、放射された光を毛管の何れかの一端に導くため、増加したシグナルが光学検出器 (即ち、CCD カメラなど) により検出される。
本発明中のキャピラリーアレーを用いた検出過程において、光学検出系は一列に並べられ、一つ、若しくはそれ以上の輝点が精査されるが、それらは、「ポジティブ」と関連した蛍光、若しくは発光を示している。用語、「ポジティブ」は、興味対象の活性の存在を示している。その活性とは、化学的、若しくは生物学的事象に基づくものであろう。一例として、キャピラリーアレーは、粒子や興味対象分子を含むコンテナに浸されるか、若しくは混合される。その粒子とは、液体に懸濁させた細胞、細胞のクローン、又は分子や化合物 (即ち、抗体、その断片、抗原など) である。溶液は、毛細管現象により、キャピラリー中に移動する。毛管力の結果として起こる自然吸引により、ポンプ装置や液体分配器は、必要でなくなる。生物活性を測定するための基質は、粒子がキャピラリーアレー中のキャピラリーに導入される前、若しくは後に、それら粒子と接触する。基質は、例えば興味対象の細胞のクローンを含んでいる。キャピラリーの開口側を、粒子を含む溶液と基質の混液を含むコンテナ中に置くことにより、基質はキャピラリー中に同時に導入される。又は、粒子を含む溶液を先ずキャピラリーに導入し、そしてその後、基質がキャピラリーの残りの部分に導入されるであろう。
【０１４１】
キャピラリー中の混合液は、その後目的の活性 (即ち、抗体の抗原に対する結合、Fc の補体に対する結合等の結合反応) を生じさせるためにインキュベーションされる。インキュベーションは、適切な温度で、特定の時間行われるか、又は光学的に検出可能なシグナルを産生させる基質を、細胞膜に透過させるように行われ、若しくは適切な結合活性を得るために必要な温度で、特定の時間行われる。インキュベーションは、例えば湿式恒温器や、室温に保たれ、キャピラリー中の液体の蒸発を抑えるための水源を含んだ装置中にキャピラリーアレーを置くことにより行われる。蒸発速度は、湿度を高くすることにより減少するであろう(即ち、キャピラリーアレーを多湿槽に置く)。蒸発速度はまた、キャピラリーをオイル、ワックス、メンブラン等で密栓することにより抑えられる。更に、アルコール類のような高分子量液体や、単層、若しくは重層を形成するような分子、薄いフィルム (脂肪酸) や様々なオイル (ミネラルオイル) なども蒸発を抑える目的で使用される。
【０１４２】
一例として、第一液が、上記方法によりキャピラリーに導入される。基質液を含むそのキャピラリーはその後、第二液を含む液槽に導入される。第二液は、第一液と同じ、若しくは異なる溶液であろう。例えば第一液は、活性が測定される粒子を含んでいるであろう。その粒子は、光束中で液体に懸濁され、キャピラリーを伝って液体の流れに従い、上方に向かってゆっくりと移動する。キャピラリーの開口側における光束の幅は、混液の蒸発速度、及び量を調節するために、光束上部で特定の液体表面積を与えるような幅となっている。液槽周辺の環境の調節により、キャピラリー内の第一液は蒸発し、液槽からの第二液が補充されるであろう。蒸発量は、キャピラリー中の内容物の液体への可能な拡散により、更に振動や圧力変化による、液体とキャピラリー内容物機械的混合によっても平衡が保たれる。キャピラリーが長くなればなるほど、キャピラリー内容物は、液体と混ざりにくくなり、拡散しにくくなるであろう。光束の幅が広がるほど、機械的混合量が増えるであろう。よって、周辺環境の温度と湿度は、目的の蒸発速度を得るために調節されるべきであり、更に光束幅も、目的の蒸発速度を得ると同時に、機械的混合量を最低に抑えるように調節されるべきである。キャピラリーの非浸水側開口端は、キャピラリー内に内容物を保持させ、かつ液体中での内容物の機械的混合や拡散を最小化するための真空状態を密栓により維持するであろう。しかし、密栓された場合、キャピラリーは蒸発を受けないであろう。環境の比較的高い湿度は、蒸発速度を遅め、キャピラリー中により多くの液体が保持されるであろう。しかし、その環境とキャピラリーアレー間の温度差が一定のレベルを超えた場合、蒸発した液体などがキャピラリーアレー中の、きつく塞がれた各々のキャピラリー上部表面に、凝集されるに違いない。キャピラリー壁の外側表面は、平面である。また、キャピラリー壁は、ガラス製であり、キャピラリー壁の外側表面は、研磨されたガラス製である。
【０１４３】
凝集を最小限に抑えるため、疎水性被覆処理が、キャピラリー壁の外側表面に施されるべきである。その被覆は、水や他の液体のキャピラリー壁の外側表面付近への蓄積傾向を減少させるであろう。その一例は、TEFLON（登録商標） による疎水性被覆であり、その被覆は、キャピラリー壁の外側表面のみに施される。他の方法としては、キャピラリー壁の外側表面、及びその間隙部を被覆するものである。キャピラリー壁の外側表面の疎水性被覆処理のその他の利点は、最初の試料吸引行程におけるものであり、液滴中の流動物は、溶液が導入された表面部に結着する傾向がある。よって、これらの被覆処理により、キャピラリーアレー表面への外来液体の付着は最小限に抑えられ、かつ必要に応じて振とうやたたくことにより、外来液体はその表面から除かれる。
ある意味では、一つのゴールは、抗原や抗体などの目的粒子を一定濃度にすることである。一回、もしくは一連の希釈行程が、粒子を一定の濃度にするために使用されるであろう。希釈のための一例として、キャピラリーのごく一部が満たされるまで、第一液を毛細管現象によりキャピラリーに導入するものである。例えば、第一液が毛管の全てに進入しないように、キャピラリーの一端に圧力がかけられる。圧力を与えるために、キャピラリーの片側は完全に、若しくは部分的に塞がれるであろう。そして、第一の成分に隣接した毛管に、一定量の空気が導入される。その空気は、数段階により導入される。このような行程の一つとして、適当量の空気 (84) が、第一成分の後に導入されるまでのキャピラリー内での第一成分の一方向への移動が含まれる。陰圧、若しくは陽圧の負荷による第一成分の更なる移動は、第一成分による空気中へのピストン様効果を生じる。キャピラリー、若しくはキャピラリーアレーはその後、第二成分と接触する。第二成分は、第一成分とは空気によって分離されるキャピラリー中に、適切な量の第二成分量となるまで導入され、その導入は、第一成分の移動で生ずるピストン様効果によるキャピラリーへの第二成分の吸引により成される。第一成分、若しくは第二成分のいずれかは、一つ、若しくはそれ以上の興味対象粒子を含み、もう一方の成分は、興味対象活性を生じさせるため、粒子の展開液として働くであろう。キャピラリー、もしくはキャピラリーアレーはその後、第一と第二の成分が至適温度に到達するまで、若しくは例えば細胞の生育に必要な時間インキュベーションされる。二つの成分を分離させている空気泡は、これら二つの成分を混和し、目的の反応を開始させるために攪拌される。一例として、気泡を崩すため、どちらか一方の成分、若しくはキャピラリー全体に圧力がかけられる。
【０１４４】
一方の成分は、常磁性ビーズ、若しくは粒子を含んでいるであろう。常磁性ビーズは、気泡をかく乱し、キャピラリー、若しくはキャピラリーアレーの内容物を混和するために使用される。例えば、常磁性ビーズは、ある位置から他の位置へと磁気的に誘引される。常磁性ビーズは、キャピラリー、若しくはキャピラリーアレー近辺で形成された磁場に誘引される。各々のキャピラリーに対する磁場の位置を変えたり調節することにより、常磁性ビーズはキャピラリー中で液体を混和するように移動し、これにより粒子が攪拌されるであろう。溶液の混和は、細胞中への空気流入をを増加させることにより、細胞の生育を促進する。この特性はまた、キャピラリー間での液体試料の均一性、及び検出感度を改良する。
その他の特徴として、多成分アッセイの構成法は、第一成分中への一つ、若しくはそれ以上の第二成分のカプセルの利用が含まれる。第二成分カプセルは、予め定められた温度で融解、若しくは溶解する物質より成る外層を持ち、それにより第二成分を第一成分中へと放出し、各々の成分粒子を混合させる。このようなものの一例は、特定の温度により活性化される酵素である。また、予め定められた事象や条件下で第二成分を放出する「命令的放出」機構もまた使用されるであろう。
他の例では、レポーター構築物、若しくは基質を含んだ組換えクローンが、キャピラリーアレー中の毛管に運ばれる。この例において、レポーター構築物として基質を加える必要は無く、又はクローン中に含まれる基質は、既知の技術により容易に検出されるであろう。例えば、GFP (green fluorescent protein) のようなレポーター構築物を含むクローンは、そのクローン、若しくはクローン中の基質を、蛍光を誘導する波長の光に曝すことにより検出される。このようなレポーター構築物は、様々な条件や、物理的刺激 (光や熱を含む) に応答する能力を備えている。加えて、同様な技術を用い、試料中より様々な化合物が探索される。例えば、蛍光分子でラベル化された抗原、若しくは抗体は、キャピラリーアレー中のキャピラリーで容易に検出されるであろう。
他の例として、希釈の変わりに、キャピラリー中への運搬用の粒子や、クローンの分離や単離に蛍光細胞分離分析装置 (fluorescence-activated cell sorter, FACS) が利用される。よって、キャピラリー当り一つ、若しくはそれ以上のクローンが正確に導入されるべきである。
【０１４５】
ある実験系では、キャピラリー中の溶液の交換が必要とされるであろう。溶液交換行程において、粒子を含む第一液がキャピラリー中に運ばれる。第一液が除かれ、第二液に置換される間、粒子はキャピラリー中に懸濁されたまま残っている。キャピラリーへの第二液の添加、及び粒子との接触により、例えばアッセイのような活性化反応が開始される。溶液交換行程は、第一液が除かれる間、キャピラリー中の粒子が物理的にキャピラリー中に保持されるような機構を持っている。一例として、キャピラリーアレー中の内壁は、抗原が結合できる抗体 (即ち細胞) で被覆される。そして、第一液が除かれる一方で、抗原は抗体に結合したままキャピラリー中に保持され、そして第二液がキャピラリー中に運ばれる。第二液は、目的によっては、抗原の結合を引き離す溶液が使用される。その他の例として、キャピラリーの一つ、若しくはそれ以上の壁が磁性化される。粒子もまた磁性化され、壁へと誘引される。更に他の例では、磁性化された粒子は、磁場の置かれた側の壁に誘引され保持される。
キャピラリーアレーは、例えば産出された光や、光の伝達を検出できるような検出器により、光学的シグナル (即ち、蛍光) のような検出可能なシグナルを持つキャピラリーの同定のために分析される。検出は、キャピラリーアレー中の各々のキャピラリーに、蛍光励起をおこさせるような照明源や、更に蛍光励起による放射を検出する光学検出器を用いて行われる。適当な照明源としては、これらに限定されないが、レーザー、白熱電球、発光ダイオード (LED)、アーチ放電などがある。適当な光学検出器としては、これらに限定されないが、フォトダイオードアレイ、CCD (前述)、又は電荷注入装置 (charge-injection device, CID) などがある。一例として、検出系に、レーザー光線をを照射する光源が使用される。レーザー光線は、ビーム拡大器に向かって進み、そこで、キャピラリーアレーを励起するための幅広、若しくは幅狭の光線へと変換される。適当なレーザー源としては、アルゴンや、イオンレーザーが使われる。冷却された CCD もまた、利用される。
【０１４６】
光が、例えば蛍光基質の酵素的活性により産生された場合、それは、適当な光学検出器、若しくは本発明における装置に隣接して設置された検出器により検出される。光学検出器は、例えば、フィルム、光電子増倍管、発光ダイオード、アバランシェ  フォトダイオード、CCD やその他の光学検出器やカメラが利用されるであろう。光学検出器は、走査レーザーのような連続的放射を検出するための一台の検出器、若しくは放射光の単一、又は複数の波長における同時放射を検出、及び解析するための、独立した複数の検出器を含んでいるであろう。放射され、検出された光は、可視光、又は赤外線や紫外線のような非可視光であろう。温度検出器は、赤外吸収を検出するために使用される。検出器は、固定されるか、若しくは移動可能である。放射光やその他の光は、キャピラリーアレー上、若しくは隣接した一側面に設置された検出器に直接、又はレンズ、鏡、導光管、若しくはコンダクター (単一、複数、固定、可動式) などを通して運ばれる。
光学検出器は、CCD 、CID 、若しくはフォトダイオードアレイより形成される。光学的シグナルを持つひとつ、若しくはそれ以上のキャピラリー位置の検出が、各々のキャピラリーからの光学的観測により行われる。又は、それらのキャピラリーアレーは、共焦点、若しくは位相差蛍光顕微鏡等でスキャンされ、そこでは、キャピラリーアレーは、例えば、光学シグナルの検出されるキャピラリーアレー中の毛管位置を同定するため、X-Y 平面に移動可能な台座の上に載せられ、各キャピラリーに、連続的にビームが照射される。CCD カメラなどが、顕微鏡と共に使用される。検出系は、迅速なスクリーニングや解析のために、コンピューターにより自動化されている。テレセントリックレンズが、検出に使用される。テレセントリックレンズの倍率は、キャピラリーアレー視野の平面と、カメラが一致するように調節される。
【０１４７】
発色基質が使用される場合、分光光度計などを用いることにより、吸光度の変化が測定される。このような測定は、光路長が短いため、低容量溶液を使用した場合は、通常困難である。しかし、本発明におけるキャピラリーを利用する方法は、低容量溶液に長い光路 (即ち、キャピラリーの縦方向の長さ) を持たせることにより、従来の技術による吸光度変化の測定を可能としている。
他の例として、結合やその他の活性は、例えば光学的、磁気的、及び温度検出を含む様々な電磁的検出装置により検出される。また、既知の検出法により、キャピラリー中の放射能活性も測定できる。放射は、キャピラリーの何れの端からでも測定可能である。他の検出法として、これに限定されないが、発光、蛍光偏光、若しくは時間分解蛍光の検出などが利用される。発光検出には、試料分子や細胞の、化学的、若しくは生理学的過程において産出された発光の検出が含まれる。蛍光偏光検出には、偏光に伴う光束の励起が含まれる。このような環境下において、蛍光発色団は、特定の分子に対する偏光を発する。しかし、その発せられた分子は、移動し、方角を変え、更に偏光はランダムになる。
時間分解蛍光は、励起後、特定の時間での蛍光の測定を含んでいる。長寿命蛍光発色団の場合、その分子は励起エネルギーにより発光し、基質中の他の分子と同様、蛍光発色団から光を発する。他の分子からの光が、バックグラウンドとしての蛍光を発する。バックグラウンドの蛍光は、通常蛍光発色団由来の長寿命蛍光発色と比べて、寿命が短い。発光は、全てのバックグラウンド蛍光が短い寿命であるとき、励起終了後の長寿命蛍光発色団が蛍光を発し続けている一定の時間で測定される。時間分解蛍光法は、バックグラウンド蛍光活性を抑える技術である。
【０１４８】
キャピラリー中の流動体は、通常各々の端において、メニスカスを形成するであろう。キャピラリーに入るどんな光も、メニスカスの湾曲の中央部に入る軸傍の光線を除いて、壁に向かい偏向されるであろう。軸傍の光線は、キャピラリー中央部で、小さな輝点を形成し、それは、通過する少量の光の存在を示している。輝点の測定は、どれだけの光が、その通過過程で吸収されたのかを測定するものである。一例では、その検出系では、二つの異なる波長が使用される。第一と第二の波長比は、どれ位の光がキャピラリー中で吸収されたのかを示している。また、二枚のキャピラリー画像を撮影し、キャピラリー中の物質による吸収の差異を確認する。吸光度検出において、光束中心部の光のみがキャピラリーを通過する。しかし、少なくとも一つのメニスカスが平坦であるとき、光学的効率は改良される。メニスカスは、キャピラリー中での蒸発過程等、様々な環境下で平坦な状態となる。流動槽は、透明な、光透過性のコンテナであり、光源は、そのコンテナを通してキャピラリーに達する。
検出可能な光学シグナルを産生する活性物質 (抗体に対する抗原結合) の回収は、検出系からの回収装置 (ピペット、チップ、若しくはキャピラリーなど) の自動位置解析へのフィードバックにより行われる。本法では、ニードルが選択され、回収系へと接続されている。支持テーブルは、マイクロタイタープレートキャピラリーアレーと光源を支えている。光源は、カメラを使い回収系と接続されたニードルの Z 軸における位置を探すために使用される。支持テーブルは、「ヒット」を含むキャピラリーをニードル真下に置くように、X 軸、及び Y 軸方向へと移動し、回収系はそして、「ヒット」を含むキャピラリーとニードルが重なるまで、ニードルを Z 軸上で移動させる。キャピラリーの破損を防ぐため、ニードルはバネやその他の柔軟な素材と結合している。ニードルが、開口キャピラリーと接触すると、キャピラリー中の試料は、キャピラリーより吸引されるか、取り除かれる。
【０１４９】
典型的な回収技術において、ニードルチップ等の回収系の Z 軸上における位置を決定するために、一台のカメラが使用される。Z 軸平面位置の決定は、カメラに接続された自動焦点アルゴリズム、若しくは近接センサーにより行われる。Z 軸平面上での回収系の近接性が決められると、画像処理機能が作動し、回収系の X 軸、及び Y 軸上の正確な位置が決定される。一例として、回収系は、画像処理効率を上げるため、背面照明される。X 軸、及び Y 軸座標が決定されると、キャピラリーアレーは回収系の正確な位置へとX 軸、及び Y 軸上を移動され、標的キャピラリーと連結されるように、 Z 軸上を移動する。その他の回収技術の例として、回収系での位置決定のために、二台、若しくはそれ以上のカメラが使用される。例えば、第一のカメラが、ニードル等回収系の X 、Z 軸上の位置座標を決定する。第二のカメラが、回収系の Y 、Z 軸上の位置座標を決定する。これら二つの位置座標、そして完全な X 、Y 、Z座標を得るために多重化される。次に、回収系に対するキャピラリーアレーの移動が行われる。
試料は、例えば、不活性ガスのキャピラリーへの噴射により取り除かれ、キャピラリーの反対側に設置された回収装置に回収される。回収装置の直径は、キャピラリーの直径と同等、若しくはそれ以上であるべきである。回収された試料は、更に例えば、ポリヌクレオチドやタンパク質の抽出、若しくはクローンの培地中での培養などの行程に使用される。他の例として、試料は真空により吸引されるであろう。この例では、ニードルは、(ほとんど) キャピラリーに接触し、試料は、キャピラリーより回収装置へと吸引される。回収装置は、ニードルの近傍に置かれるマイクロチューブか、フィルターであろう。適当な回収装置としては、マイクロチューブ、キャピラリー、マイクロプレート、細胞培養プレートなどがある。試料の輸送は、培養液、空気、その他の液体を、フィルターを通して反対方向に流すことにより行われる。試料は、試料注入装置により、キャピラリーから除かれる。一例として、注入装置は噴射系であり、キャピラリー片側の試料液は、もう一方のキャピラリー側へと取り除かれるために、高温下に置かれる。試料液への加熱は、キャピラリー片側への加熱用プローブの、直接の設置により、機械的に行われる。加熱用プローブは、キャピラリー片側を塞ぎ、プローブとの接触により試料は加熱され、キャピラリーの反対側へと移動される。加熱や除去はまた、電気的にも行われる。例えば、噴射系の一例として、キャピラリーの少なくとも一つの壁が金属化されている。加熱用材を直接その壁に接触させる。加熱用材は完全にキャピラリーの片側を塞ぐか、若しくは部分的に塞ぐであろう。加熱用材が金属壁を加熱し、キャピラリー中の溶液が加熱される。加熱用材は、例えば電圧源、若しくは電流源のような電源であろう。また、他の噴射系の例としては、レーザーがキャピラリーの片側でキャピラリー内液に熱パルスを与えるであろう。本発明において、毛管からの液体の除去には、その他の系も使用されるであろう。ある電場が、電気泳動的反応をキャピラリー内液中、若しくはその周辺で生じさせ、その電場により生じた電気的移動により、液体成分が泳動されるであろう。電場はまた、加熱されたプローブや、荷電した物質の溶液中での目的位置への移動を補助するであろう。電磁場もまた使用されるであろう。一例として、キャピラリーには、キャピラリー中での物質の移動を補助するするために、液体に加えて、磁性化粒子も添加されるであろう。
【０１５０】
改良の最終目標
本発明中の方法により入手、若しくは改良された特性や特徴は広範であり、当然、基質の選択に依存している。抗体においては、「親和性成熟化」や、「抗原に対する高親和性を示す抗体の産生」を含むものである。 T 細胞受容体においては、MHC 分子に代表されるような、抗原に対する増加した、若しくは減少した親和性を含んでいる。遺伝子ワクチンとしては、その改良の最終目標として、高力価、安定した発現、改良された安定性、標的分子に対する高親和性、高い、若しくは低い組み込み頻度、減少したベクターや、その発現産物の免疫原性、増加した抗原への免疫原性、若しくは遺伝子産物の高発現性などを含んでいる。最適化が求められるその他の特徴としては、特定の適用における最も効果的な免疫応答の適合化を含む。遺伝子ワクチンの例は、本案件中に示され、記述され、又は参照として含まれている。二種、若しくはそれ以上の成分が、一つのベクター分子中に含まれ、若しくは各々の成分は、独立した分子として遺伝子ワクチン構成成分中に提示される。
【０１５１】
第二段階的再集合（又は本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）
生産物の更なる改良が要求される場合、少なくとも若しくは多くの場合、第一段階目のスクリーニングの選別により生き残った一連の組換え断片が、次段階の再集合（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）に使用される。これらの組換え断片は、お互いに、若しくは起源断片やその変異体等からなる外来断片と共に再集合（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）反応を受けるであろう。また、再集合（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）反応は、インビトロ又はインビボで行われる。前スクリーニング過程で、目的の組換え断片が細胞の成分として同定された場合、その成分の更なる再集合反応（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）をインビボもしくはインビトロで行われるか、又は、インビトロでの再集合反応（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）が行われる前にその断片が単離されるであろう。逆に、前スクリーニング過程で目的の組換え断片が、そのままの状態で若しくはウィルスや他のベクター中の成分として同定された場合、これらの断片は次の再集合反応（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）をインビボで行うために細胞へと導入されるであろう。第二段階の再集合反応（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）は、どのような形態で行われようとも、前段階反応により得られた断片と比較して、更に広がった多様性を持つ組換え断片を産出する。
【０１５２】
十分な進化型組換え断片を得るための付加的再集合（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）/スクリーニング
第一段階再集合反応で述べられた原理に基づき第二段階の再集合反応（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）に引き続いて、更なるスクリーニング/選別が行われる。スクリーニング/選別の厳密性は、各段階ごとに増加される。また、スクリーニングやスクリーニングされる物質の特性は、（一つ以上の特質の改良や、新しい特質の獲得が要求される場合、各段階で変えられるであろう。
付加的な再集合反応（若しくは本発明における一つ若しくはそれ以上の付加的指向的進化法）やスクリーニングは、その後、目的とする新たな若しくは改良された特性や機能を持つ組換え断片が得られるまで繰り返されるであろう。
本発明の実施には、組換え核酸の生成及び組み換え宿主細胞での、その遺伝子の発現が含まれている。これらの最終目標を達成する分子クローニング技術は、すでに知られている。適切な発現ベクター等の組換え核酸作製のための様々なクローニング法やインビトロ増幅法は、研究者によく知られている。本発明で使用される変異的組換えを含む分子生物学的手法の記述された一般書として、以下が挙げられる：
Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1998) ("Ausubel")).
【０１５３】
PCR、 リガーゼ連鎖反応（LCR）、Q-レプリカーゼ及び他のRNAポリメラーゼ媒介技術を含む研究者が、本法を行うに十分なインビトロ増幅技術例は、以下に記述されている：Mullis et al. (1987) U.S. Patent No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Antheirn & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173; Guatelli el al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87, 1874; Lowell et al. (1989) J Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al. (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4, 560; Barringer et al. (1990) Gene 89, 117, and Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564.
インビトロ増幅された核酸のクローニングにおける改良された方法が、U.S. Pat. No. 5,426,039 に示されている。PCR による改良された長い核酸の増幅法が、Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685 に要約されており、この中の参考文献には、40kb までの PCR 産物の生成法が述べられている。一つの技術として、リバーストランスクリプターゼやポリメラーゼを用い、いずれの RNA をも本質的に制限酵素消化、PCR 反応及びシークエンシングに適切な二本鎖 DNA へと変換させる方法が、Ausubel, Sambrook and Berger や上記全ての文献に報告されている。
【０１５４】
インビトロ増幅反応や再集合のための標的（即ち、合成遺伝子や遺伝子断片の）遺伝子プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは、通常 Needham- VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 に記述されている自動合成装置を用い、Beaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Letts., 22(20):1859-1862で示される固相ホスホラミデートトリエステル法に従い化学合成される。オリゴヌクレオチドはまた、研究者により知られた様々な商業的業者により注文合成される。
事実、本質的に全ての既知配列を持つ核酸が、The Great American Gene Company, ExpressGen Inc., Operon Technologies Inc. (Alameda, CA などの業者により受託合成されている。同様にペプチドや抗体も PeptidoGenic (pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc., BMA Biomedicals Ltd (U.K.), Bio-Synthesis, Inc. 等の様々な業者により受託合成されている。
【０１５５】
最小限の選択サイクルにより、最大数の変異体が得られ、かつ従来のような広範の分析やコンピューター解析を必要としない、異なった進行形式の利用による再集合反応（又は本法に示されるような付加的な指向的進化）
様々な進行形態による、スクリーニングのための組換え核酸ライブラリー産生法が利用される。ある例として、本発明は、個々の遺伝子、プラスミド、ウィルス、多遺伝子クラスターの全体若しくは全ゲノム'進化'させる再集合反応（Stemmer (1995) Bio/Technology 13:549-553 、又は、本法に示されるような付加的な指向的進化）、スクリーニング、若しくは選別を伴う再集合反応（又は本法に示されるような付加的な指向的進化）やスクリーニング/選別の再反復行程は、対象核酸を更に進化させるために行われるであろう。これらの技術には、従来のポリペプチド設計のような広範な分析やコンピューター解析が必要とされない。再集合反応においては、従来の対形成組換え反応 (即ち、有性的複製により行われるもの) とは異なり、最小限の選別サイクルにより、多数の組換え体の組み合わせを得ることが可能である。よって、本発明における指向的進化技術は、何れかの、若しくは全ての変異体間における再集合反応 (又は本法に示されるような付加的な指向的進化) を提供できるという利点があり、それにより、目的の活性を持つ様々な異なる組み合わせの組換え体の迅速な探索が可能である。ある例としては、配列の再集合反応(又は本法に示されるような付加的な指向的進化) を要求せず、構造  活性相関による技術の改良がを可能にする情報が提供される。
【０１５６】
参照される形式、再集合反応 (又は本法に示されるような付加的な指向的進化) の例、及びその他の方法
ここで示された反応形式例、及びポリヌクレオチド再集合、遺伝子飽和突然変異、interrupted 合成、その他の指向的進化法などは、本法の発明者、及びその他の共同研究者、若しくはUSPN 5,965,408 (issued 10-12-99), USPN 5,830,696 (issued 11-03-98), and USPN 5939,250 (issued 08-17-99) 等により既に報告されている。
実験的に産生されたポリヌクレオチドライブラリーの作製法、核酸基質の確立的 (即ち、ポリヌクレオチドシャッフリング、及び 中途（interrupted） 合成) 、若しくは非確率的ポリヌクレオチド再集合による多様性の取得法が、例えばW098/42727; Smith, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985); Botstein and Shortle, Science 229: 1193-1201 (1985); Carter, Biochem. J 237: 1-7 (1986); Kunkel, "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic acids & Molecular Biology, Eckstein and Lilley, eds., Springer Verlag, Berlin (1987)) に記されている。これらの方法の中には、オリゴヌクレオチド指向性変異 (Zoller and Smith, Nucl. Acids Res. 10: 6487-6500 (1982), Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983), and Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)) 、ホスフォチオエート  修飾 DNA 変異 (Taylor et al., Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye and Eckstein, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., Nucl. Acids Res. 16: 791-802 (1988); Sayers et al., Nucl. Acids Res. 16: 803- 814 (1988)) 、ウラシル含有鋳型による変異 (Kunkel, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82: 488- 492 (1985) and Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154: 367-382)) 、ギャップ含有二本鎖 DNA による変異 (Kramer et al., Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer and Fritz, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kramer et al., Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)); and Fritz et al., Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)) が含まれている。その他の適当な方法としては、点ミスマッチ修復 (Kramer et al., Cell 38: 879-887 (1984)) 、修復機能欠損宿主株による変異 (Carter et al., Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)) 、削除変異 (Eghtedarzadeh and Henikoff, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)) 、制限選別、及び制限精製 (Wells et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)) 、全遺伝子合成による変異化 (Nambiar et al., Science 223: 1299- 1301 (1984); Sakamar and Khorana, Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Gene 34: 315- 323 (1985); and Grundstr6m et al., Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985) が含まれる。突然変異導入用キットも、購入可能である (即ち、Bio-Rad, Amersharn International, Anglian Biotechnology)。
【０１５７】
開始配列に対する増加した多様性を産生するための再集合反応 (又は本法に示されるような付加的な指向的進化) には、開始配列が、お互いに少なくとも二塩基異なるものでなくてはならない。
再集合反応は、一般的に、互いの実質的な配列相同性が、例えば少なくとも 30 %、50 %、70 %、80 %、若しくは 90 % を示すが、特定の位置で、配列が異なる少なくとも２種類の基質により開始される。その配列差は、例えば置換、挿入、削除等、何れのタイプの変異でも良い。しばしば、互いの配列が、5〜20の位置で異なる断片が使用される。開始配列に対する増加した多様性を産生するための再集合反応 (又は本法に示されるような付加的な指向的進化) には、開始配列が、お互いに少なくとも２塩基異なるものでなくてはならない。それはつまり、ただ二種類の基質が存在する場合、少なくとも二箇所の相違位置が存在することになるであろう。三種類の基質の場合、第一の基質は、第二の基質と一点でのみ異なり、第二のの基質は、第三の基質と、それと異なる一点でのみ異なるであろう。開始 DNA 断片は、例えば対立遺伝子多型、若しくは種間遺伝子多型などの互いに異なる天然の変異体が使用されるであろう。その断片はまた、ある程度の構造的、そして通常、機能的関連性を示す非対立遺伝子多型に由来するものであろう (例えばエルシニア V  抗原ファミリーのように、スーパーファミリー間で異なる遺伝子)。開始 DNA 断片はまた、互いに誘導された変異体であるであろう。例えば、一つのDNA 断片は、他のDNA のエラープローン PCR により産生されたものであり、その核酸は、化学的、又は他の変異原、若しくは変異性カセットの置換などの処理を施されたものである。実際に変異体はまた、変異を受ける株における片側 (若しくは、両側) の断片の伝播、若しくはその細胞中でのエラープローン修復系の誘導により調製される。
【０１５８】
開始基質を形成する異なる断片は関連したものであり、同じ、若しくは異なる長さの断片であろう。
これらの状況において、厳密に言えば、第二の DNA 断片は単一の断片ではなく、関連した断片中の一つの大きなファミリーであると言える。開始基質を形成する異なる断片は、しばしば同じ長さであるか、若しくは実質上同じ長さの断片である。しかし、例えば、ひとつの断片がもう一方の配列の一部となるような場合は、同じ長さである必要はない。これらの断片は、ベクター等の大きな分子の一部として存在するか、若しくは単離された型であるに違いない。
【０１５９】
全長コーディング配列やその他の必要な調節配列を含むであろう一連の組換え DNA 断片ライブラリーを作製するための開始 DNA 再集合 (又は、本法に示されるような付加的な指向的進化) 
開始 DNA断片は、一連の様々な組換えDNA 断片ライブラリーを作製するために、本発明で記述された何れかの配列再集合 (又は、本法に示されるような付加的な指向的進化) により再集合反応を施される。このようなライブラリーは、数十から、105、109、1012 以上、若しくは更に多くの広範な数の成分を含んでいるであろう。ある例として、開始 DNA断片や、産生された組換え体ライブラリーは、全長コード配列、及びプロモーター、ポリアデニル化配列、及びその他発現に必要な配列など、全ての調節配列を含んでいるであろう。その他の例として、ライブラリー中の組換えDNA 断片は、スクリーニング選別を行う前に、発現に必要な配列を持った共通のベクターへと挿入されるであろう。
別々に進化された複数の断片の、遺伝子等の全長核酸鋳型への、PCR による再集合反応
核酸配列における組換え変異のための他の技術として、「再集合 PCR」が利用される。この方法は、別々に進化された複数の断片の、遺伝子等の全長核酸鋳型への集合反応に使用される。この技術は、有益な変異体が、既に以前の実験で得られているか、若しくはPCR 変異導入、カセット変異、ドープオリゴ変異、化学的変異、又は突然変異誘発株によるインビボ DNA 鋳型増殖などにより創生された変異体が、既にスクリーニングにより同定されている場合に行われる。目的核酸配列断片を特徴付ける境界は、遺伝子間領域、イントロン、若しくは目的の変異を持たないであろう遺伝子領域に位置するであろう。
【０１６０】
二つのオリゴ同士を、10 から 100 塩基の範囲で重複させる核酸配列断片を、PCR 増幅させるために必要なオリゴが合成される。
一例として、目的の核酸配列断片を PCR 増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー (オリゴ) が合成されるが、そのようなオリゴ配列は、二つの断片の接合部の一部と重なり合っている。その重複領域は、通常長さ10〜100 ヌクレオチドである。各々の断片が、このようなプライマーセットにより増幅される。その PCR 産物は、非確率的に産生された核酸構成成分や、ランダムに断片化された遺伝子を編集するために、ここで記されたような組み立て法に従って「再集合」される。要約すれば、組み立て法において、PCR 産物は先ず、例えばゲル電気泳動や、サイズ排除クロマトグラフィーにより、プライマーから分離される。精製されたPCR 産物は混合され、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド -3- リン酸 (dNTP's) とともに、プライマーの非存在下で、適当な緩衝液中で、約1〜10サイクルの変性、再アニーリング、伸長反応を受ける (セルフプライミング) 。十分に再集合した、実験的に進化した遺伝子 (即ち、ポリヌクレオチド再集合、及び / 又はポリヌクレオチド点飽和突然変異による) を得るために、その遺伝子の両側に位置するプライマーを用いて、次のPCR 反応が行われる。
【０１６１】
PCR プライマーは、目的遺伝子に変異を導入するために使用され、目的位置に変異を持った断片が、核酸配列のシークエンシングによりスクリーニング/選別される。
更に他の例として、目的核酸配列の断片を増幅するPCR プライマーは、目的遺伝子に変異を導入するため、以下のように使われる。核酸配列中における目的部位での変異は、スクリーニング、又は選別、若しくは核酸配列のシークエンシングなどにより同定される。
【０１６２】
他のスクリーニングや選別行程が、高価で扱いにくく、又は非実用的な場合の、前記置換情報を持つ全長遺伝子のライブラリー作製における野生型、若しくは変異体のための PCR プライマーの使用法
野生型、若しくは変異を目的位置に導入する情報を持ったオリゴヌクレオチド PCR プライマーが合成される。これらのプライマーはそして、野生型配列の指定された部位に置換や変異を持つ、全長遺伝子のライブラリーを作製するための PCR 突然変異反応に使用される。この技術は、通常、スクリーニングや選別行程が、目的変異体遺伝子の配列決定や変異導入用オリゴヌクレオチドの合成にかかる費用が高価で、しかも扱いにくく非実用的である場合に有益である。
本発明のHTSにおいて、数千にも及ぶ実験的に進化された (即ち、ポリヌクレオチド再集合や、ポリヌクレオチド部位飽和突然変異による) 変異体を、一日でスクリーニングすることが可能である。例えば、マイクロタイタープレートの各々のウェルが独立したアッセイに使われるか、又は濃度や反応時間による効果が観察される場合は、5 〜 10 ウェル毎に一つの変異体が試験される。よって、一枚の標準マイクロタイタープレートが約 100 (即ち、96) の試験に使われる。1,536 ウェルプレートを使用する場合、一枚のプレートで、約 100 〜 1,500 の異なる反応が行える。数枚の異なるプレートを一日でアッセイできる、即ち、本発明の完全な系を用いることにより、6,000 〜 20,000 までの異なる反応 (例えば、異なる核酸、タンパク質、若しくは濃度) が可能である。最近、反応液系の改良された微量流動液装置が開発された (Caliper Technologies, Palo Alto, CA)。
【０１６３】
一例として、ライブラリー成分、即ち細胞、ウイルスプラーク等が、個々のコロニー (若しくはプラーク) を生成するように、固体培地上で分離される。自動コロニー選別機 (即ち、 Q-bot, Genetix, U.K.) の使用により、コロニー 、若しくはプラークが同定、選別され、凝集を防ぐため各ウェルに随意にガラス球を含んだ 96 ウェルマイクロタイタープレートに、10,000 までの異なる変異体が接種される。Q-bot は、全コロニーを摘み取らず、コロニー中心部にピンを挿入し、少量の細胞 (又は、 プラーク中のウイルス) を取り出す。Q-bot の統合された行程は、人為的エラーを減らし、コロニーの処理速度を増加させる (おおよそ10,000/ 4 時間)。これらの培養液はその後、温度、及び湿度が調節された恒温槽中で振とうされる。マイクロタイタープレート中のガラス球は、ファーメンター中の羽根と同様に、細胞への安定した通気や細胞の分散等を促進するように働く。目的培養液由来のクローンは、限界希釈により得られる。ライブラリーを構成するプラークや細胞もまた直接、ハイブリダイゼーション、タンパク質活性、抗体に対するタンパクの結合能等の検出や測定によるスクリーニングに使用される。
アッセイに有用な溶液相化学ロボット系が多数開発されている。これらの系には、タケダ薬品工業 (大阪) により開発された自動合成装置のような自動化ワークステーションや、科学者による手動合成操作を模倣するロボットアームによるロボット系 (Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.) 等が含まれている。上記装置の幾つかは、本発明での使用にも適しており、即ち、それは、コドン改変核酸にコードされる分子の HTSである。熟練した使用者が、これらの系を、本法で記されたように操作する際、必要であれば、これら装置の改良の内容や実行は、これらの使用者には明確に理解できるであろう。
【０１６４】
HTS 系は、商業的に入手可能である (Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, etc)。  これらの系では、全ての試料や試薬のピペッティング、液体分配、培養時間調節、アッセイに適切な検出器におけるマイクロプレートの最終的記録を含む全工程は、通常自動化されている。これらの配列化された系により、高度な柔軟性、及びカスタム化と同様、高処理性、かつ迅速な始動が可能となる。
このような装置の製造業者により、様々な HTS における詳細なプロトコールが提供される。よって例えば、Zymark Corporation は、遺伝子転写調節やリガンド結合等の検出によるスクリーニング系について記載された技術情報誌を提供している。また、Caliper Technologies により、反応液系の改良された微量流動液装置が開発された。
カメラや、その他の記録用装置 (即ち、発光ダイオードやデータ保存装置 ) により検分された (そして、随意的に記録された) 視覚的画像は、必要であればコンピューターによる画像のデジタル化、保存、分析を含む、ここで示された何れかの方法により、更に処理される。上述のように、幾つかの適用法において、アッセイにおけるシグナルが蛍光の場合、視覚的検出が、このアッセイに適当なものとなる。以下に示すものを含む多数の商業的入手可能な周辺機器やソフトウエアーが、データや画像のデジタル化、デジタル化されたビデオや視覚画像の保存や分析に利用される；PC (Intel x86 or Pentium（登録商標） chip- compatible DOS, OS2 WINDOWS（登録商標）, WINDOWS（登録商標） NT or VIMOWS95 based machines), MACINTOSH, or LTNIX based (e.g., SLJN work station) computers.
【０１６５】
関連技術において、共通に使用されるものの一つに、アッセイ装置から出る光を、CCD (cooled charge-coupled device) カメラに伝えるシステムがある。 CCD カメラは画素列 (pixel) を含んでいる。試料からの光がCCD カメラに写される。試料中のある領域 (生物ポリマー中の各々のハイブリダイゼーション部位) と一致する特定の画素が、各位置での光の強度記録を得るために回収される。多数の画素が高速で同時に処理される。本発明に含まれる装置と方法は、何れの試料の蛍光や、暗視野顕微鏡技術をも容易にさせる。
本発明における分析の、全体の系には、通常、高処理液体調節ソフトウエアーを伴うデジタルコンピューター、画像分析ソフトウエアー、データ解析ソフトウエアー、デジタルコンピューターと連結した試料液運搬用のロボット液体分配器、ロボット液体分配器による高処理液体分配を調節するための命令をデジタルコンピューターに入力する入力装置 (コンピューターキーボード)、そしてラベル化されたアッセイ試料からのデジタル化されたラベルシグナルの画像取り込み装置 (任意) が含まれる。画像取り込み装置は、視覚的強度の測定値を、画像分析装置へと送るために連結されている。通常、強度測定値は、最適化された抗原ポリペプチド産物が生産されているかを調べるため、データ解析ソフトウエアーにより解析される。
【０１６６】
構成的プロモーター
未進化基準遺伝子の発現レベルに比べて、高いレベルでの目的遺伝子の発現を行うための調節配列（プロモーター、エンハンサーetc）の進化
本発明は、調節配列と連結した目的遺伝子の構成的発現を行わせるための核酸配列の進化法を提供している。通常、プロモーター、エンハンサーなどを含む調節配列は、非進化型基準配列を連結した遺伝子に比べて、高いレベルで目的遺伝子を発現させるために進化される。  進化されるべき基準配列をスクリーニングする為に、基準配列の組換えライブラリーが一定の数の細胞に導入され、調節配列と連結した検出マーカーの発現レベルが調べられる。一例として、至適化されたプロモーターは、基準プロモーター構成成分に比べて、30 ％高い遺伝子の発現が可能である。若しくは、至適化プロモーターは、少なくとも 50 ％又は約 75 ％、基準プロモーターに比べて強力である。
【０１６７】
動物系及び臨床利用の両者において、外来遺伝子を発現させるための改良されたCMVプロモーター/エンハンサーエレメント（SV 40とSra）の利用
本発明において、基質として使われるプロモーターには、目的の宿主細胞において機能する構成的プロモーターのいずれかが含まれる。プロモーターやエンハンサー配列（プロモーター/エンハンサー領域）を含むサイトメガロウィルス（CMV）の主要な前初期 (immediate-early, IE) 領域、転写調節エレメントは、様々な細胞のタイプで高発現されるため、遺伝子治療におけるベクターの転写調節に広範に使われている。抗原発現のレベルを増加させる至適化されたCMV転写調節エレメントは、本発明における反復再集合（又は、本法に示されるような付加的な指向的進化）により産生され、遺伝子治療において改良された効率を示す。CMV プロモーター及びエンハンサーは、人及び動物細胞の両者で活性を示すので、動物系及び臨床利用の両者において、外来遺伝子を発現させるための改良されたCMVプロモーター/エンハンサーエレメントが利用される。
本法の使用により分析されるべき、他の構成的プロモーターには、例えば、SV40, SRα及びその他の研究者に知られているプロモーターが含まれる。
【０１６８】
CMV 株IE領域のPCRにより、プロモーター、エンハンサー、そして第一イントロン配列を得るための、5種の関連CMV株中の2種若しくはそれ以上の株由来野生型配列を用いた確率的（ポリヌクレオチドシャッフリング及び中途(interrupted)合成）及び非確率的ポリヌクレオチド再集合によるキメラ転写調節エレメントライブラリーの作製
一例として、キメラ転写調節配列が、5種の関連CMV株中の2種若しくはそれ以上の株由来野生型配列を用いた確率的（ポリヌクレオチドシャッフリング及びinterrupted 合成）及び非確率的ポリヌクレオチド再集合により作製される。IE領域のプロモーター、エンハンサー及び第一イントロン配列が、以下の CMV 株の PCR により得られる: human VR-53 8 strain AD169 (Rowe (195 6) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 92:418; human V-977 strain Towne (Plotkin (1975) Infect. Immunol. 12:521-527); rhesus VR-677 strain 68-1 (Asher (1969) BacterioL Proc. 269:91); vervet VR-706 strain CSG (Black (1963) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 112:60 1); and, squirrel monkey VR-1398 strain SqSHV (Rangan (1980) Lab. Animal Sci. 30:532)。
【０１６９】
ヒト由来 CMV 株間のプロモーター/エンハンサー配列は、95 ％相同性を持ち、サル由来CMV株と70％相同性を示すので、広範な多様性を持つライブラリーを作製するためのポリヌクレオチド再集合（随意的にここで示された他の指向的進化法と組み合わせて）に使用される。再集合反応（随意的にここで示された他の指向的進化法と組み合わせて）に続いて、そのライブラリーはプラスミドに組み込まれ、哺乳類細胞中でのマーカー遺伝子の転写実験に使用される。天然型プロモーターによる制御を受ける内部標準プラスミドが、通常同時に導入され、同量のベクターを持つ細胞数が分析及びソーティングされる。
グリーンフルオレスセインタンパク（GFP）や、CD86 (B7.2 としても知られる、Freeman (1993) J Exp. Med 178:2185, Chen (1994) J Immunol. 152:4929) のような発現マーカーもまた使用されるであろう。加えて、SV40 複製オリジンを含むベクターを増幅するために、SV40 T 抗原-形質転換細胞が、使用されるであろう。トランスフェクトされた細胞は、マーカー遺伝子が高発現している細胞を同定するため、FACS によりスクリーニングされ、細胞当りのベクターコピー数の差異を計算するために、内部標準マーカーに対して標準化される。必要であれば、繰り返し再集合 (及び/又は、一回、若しくはそれ以上の指向的進化) された、最良のプロモーター配列を持つベクターが回収され、更なる再集合 (及び/又は、一回、若しくはそれ以上の指向的進化) と、選別が施される。
【０１７０】
テーブル 1〜85 の概要
これらのテーブルは、好ましくはあるが、非制限的な、非確率的な縮重された三塩基長変異カセットの例を示す。
【０１７１】
【表１】
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【０１７２】
【表２】
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【０１７３】
【表３】
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【０１７４】
【表４】
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【０１７５】
【表５】
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【０１７６】
【表６】
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【０１７７】
【表７】
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【０１７８】
【表８】
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【０１７９】
【表９】
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【０１８０】
【表１０】
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【０１８１】
【表１１】
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【０１８２】
【表１２】
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【０１８３】
【表１３】
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【０１８４】
【表１４】
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【０１８５】
【表１５】
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【０１８６】
【表１６】
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【０１８７】
【表１７】
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【０１８８】
【表１８】
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【０１８９】
【表１９】
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【０１９０】
【表２０】
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【０１９１】
【表２１】
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【０１９２】
【表２２】
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【０１９３】
【表２３】
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【０１９４】
【表２４】
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【０１９５】
【表２５】
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【０１９６】
【表２６】
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【０１９７】
【表２７】
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【０１９８】
【表２８】
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【０１９９】
【表２９】
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【０２００】
【表３０】
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【０２０１】
【表３１】
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【０２０２】
【表３２】
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【０２０３】
【表３３】
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【０２０４】
【表３４】
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【０２０５】
【表３５】
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【０２０６】
【表３６】
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【０２０７】
【表３７】
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【０２０８】
【表３８】
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【０２０９】
【表３９】
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【０２１０】
【表４０】
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【０２１１】
【表４１】
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【０２１２】
【表４２】
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【０２１３】
【表４３】
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【０２１４】
【表４４】
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【０２１５】
【表４５】
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【０２１６】
【表４６】
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【０２１７】
【表４７】
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【０２１８】
【表４８】
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【０２１９】
【表４９】
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【０２２０】
【表５０】
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【０２２１】
【表５１】
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【０２２２】
【表５２】
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【０２２３】
【表５３】
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【０２２４】
【表５４】
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【０２２５】
【表５５】
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【０２２６】
【表５６】
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【０２２７】
【表５７】
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【０２２８】
【表５８】
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【０２２９】
【表５９】
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【０２３０】
【表６０】
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【０２３１】
【表６１】
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【０２３２】
【表６２】
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【０２３３】
【表６３】
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【０２３４】
【表６４】
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【０２３５】
【表６５】
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【０２３６】
【表６６】
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【０２３７】
【表６７】
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【０２３８】
【表６８】
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【０２３９】
【表６９】
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【０２４０】
【表７０】
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【０２４１】
【表７１】
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【０２４２】
【表７２】
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【０２４３】
【表７３】
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【０２４４】
【表７４】
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【０２４５】
【表７５】
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【０２４６】
【表７６】
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【０２４７】
【表７７】
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【０２４８】
【表７８】
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【０２４９】
【表７９】
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【０２５０】
【表８０】
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【０２５１】
【表８１】
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【０２５２】
【表８２】
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【０２５３】
【表８３】
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【０２５４】
【表８４】
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【０２５５】
【表８５】
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【０２５６】
【表８６】
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【０２５７】
【表８７】
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【０２５８】
【表８８】
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【０２５９】
【表８９】
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【０２６０】
【表９０】
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【０２６１】
【表９１】
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【０２６２】
【表９２】
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【０２６３】
【表９３】
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【０２６４】
【表９４】
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【０２６５】
【表９５】
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【０２６６】
【表９６】
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【０２６７】
【表９７】
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【０２６８】
【表９８】
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【０２６９】
【表９９】
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【０２７０】
【表１００】
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【０２７１】
【表１０１】
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【０２７２】
【表１０２】
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【０２７３】
【表１０３】
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【０２７４】
【表１０４】
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【０２７５】
【表１０５】
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【０２７６】
【表１０６】
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【０２７７】
【表１０７】
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【０２７８】
【表１０８】
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【０２７９】
本発明に同様に含まれるものは、上記に説明してあるポリペプチドのアミノ酸変種である。これら変種には、挿入、削除、及び他のアミノ酸との置換が含てもよい。例えば、ある場合には、アミノ酸は、正味の荷電、疎水性あるいはその類など、同様の構造特性を持たせるために類似の構造的性質を持つ他のアミノ酸と置換出来る。例えば、フェニルアラニンは、似ている疎水性残基があるチロシンと置換出来る。グリコシレイション修飾（異なる修飾残基や残基総数の増減など）も他の配列修飾と同様に想定される。
【０２８０】
上述の天然に存在するアミノ酸だけから成るポリペプチドに加えて、本発明のポリペプチドのペプチドミメテック（疑似体）もまた与えられる。製薬企業では、一般的に、ペプチド類似体を鋳型ペプチドと性質が似ている非ペプチド製剤として使っている。この様な非ペプチド化合物は「ペプチドミメテック」（peptide mimetics かpeptidomimetics）と呼び（Fauchere,J.(1986)Adv.Drug Res15:29；VeberとFreidinger(1985)TINSp.392;及びEvansら（1987）J.Med.Chem30:1229）、コンピューターでの分子モデリングにより開発されている。医療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチドミメテックは、それらと同等の医薬的、又は予防的効果を発現させる目的で用いられてもよい。天然に存在する受容体結合ポリペプチドなどのように、一般的ペプチドミメテックは、模範ポリペプチドと構造が似ているが（例えば、生物学的、薬理学的活性があるポリペプチドなど）、一つもしくはそれ以上のペプチド結合が以下の置換基のいずれかに随意で置換されている。その置換基は、-CH2NH-、 -CH2S-,、-CH2-CH2-、- CH=CH- (シスとトランス)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、と -CH2SO-などで、その置換法は、既知の技術であるか、または次の参考書に述べられている。Spatola, A.F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (一般概論); Morley, J.S., Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468 (一般概論); Hudson, D. ら, Int J Pept Prot Res (1979) 14:177-185 (- CH2NH-, CH2CH2-) ; Spatola, A.F. ら, Life Sci (1986) 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, M.M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, シスとトランス); Almquist, R.G. et al., J Med Chem (1980) 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C. ら, Tetrahedron Lett (1982) 23:2533 (-COCH2-); Szelke, M. ら, European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay, M.W. ら, Tetrahedxon Lett (1983) 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); 及び Hruby, V.J., Life Sci (1982) 31:189-199 (-CH2-S-)。ペプチドミメテックは、実用されているペプチドに比べて著しい有用性を持っている。例えば、優れた経済的な生産性、増加した化学的安定性、高められた薬理学的性質（半減期、吸収、活性、効能など）、効良された特異性（例えば、広範な生物活性）、減少された抗原性などである。
【０２８１】
ペプチドミメテックのラベル化は、通常、一つ又は複数のラベルの共有結合により成され、このラベルは、定量的構造−活性データ及び／又は分子モデリングにより予想されるペプチドミメテックの非妨害位置に直接あるいはスペーサー（例えば、アミド基）を通して導入される。このような非妨害位置は、一般的には、ペプチドミメテックがその薬理効果を発現させる為に、対象分子（即ち、CD36）と直接結合する部位とは異なる部位に位置する。ペプチドミメテックの優導体化（例えば、ラベリング）は実質上、ペプチドミメテックに期待される生物学的、若しくは薬理学的効果を妨害させないように行うべきである。一般的に、本案で発明されたペプチドのペプチドミメテックは、高い親和性でそのリガンド（即ち、CD36）と結合し、更に検出可能な生物学的活性（例えば、一つ若しくはそれ以上のリガンドにより媒介される表現型の変化に対するアゴニスト、又はアンタゴニスト活性）を示す。
共通配列中の一つか複数のアミノ酸の同一アミノ酸のD-体による系統的置換（例えば、L-リジンの代わりにD-リジン）が、更に安定したペプチドを得るために利用される。加えて、合共通配列、若しくは実質的に同一な共通配列の変異による制約されたペプチドは、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成できるシスティン残基の導入などの良く知られている方法で生成されてもよい（Rizo と Gierasch (1992) Ann. Rev. Blochem. 61: 387）。
本発明のポリペプチドは、単一のポリペプチドとして使われたり、融合タンパク質として存在してもよい。融合タンパク質は、通常、一つに融合されていない二つ若しくはそれ以上の独立した異種タンパク質より成るタンパク質の事を言う。
【０２８２】
抗  体
本発明の核酸とポリペプチド、又はその断片は、また、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体を生産する上で有用である。これらの抗体は、本発明におけるポリペプチド、若しくはその断片によるラット、マウス、ウサギ、ヤギ等の適当な背椎動物への免疫付与により、若しくは本発明における核酸それ自身、又はその他の付加物を含む核酸を持ったプラスミドDNAにより生産される。通常、二回若しくはそれ以上の免疫付与が行われ、最後の注入の数日後、宿主の血液か脾臓が収穫される。
ポリクローナル抗体の作製の場合、適切な標的が選ばれ、通常それは、ハツカネズミかウサギであるが、ヤギ、ヒツジ、ウシ、モルモット、サル、ラットも含まれている。実質的に精製した抗原かプラスミドが、その動物における免疫機構に相応しい方法で付与される。これらとまた他のパラメーターは、免疫学者に良く知られている。普通、足蹄の筋内、皮内、又は腹腔内に注射される。宿主が生産した免疫グロブリンは、アフィニティー精製を含む通常通りの方法で沈殿、分離、そして精製される。
【０２８３】
モノクローナル抗体の場合、適当な免疫機構が選ばれ、望ましい免疫付与が行われる。適切な期間の後、上記の動物の脾臓が切除され、個別の脾臓細胞が不死化している骨髄腫細胞と適度な選択条件下で、融合される。その後、細胞はクローンとして分離され、各々のクローンより得られた上清中の、目的の抗原領域に対する特異的な抗体の生産性が試験される。抗体生産の技術は良く知られている。例えば、Goding ら、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Acad. Press, N.Y., と Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)を参照のこと。他に適した技術の中では、抗原ポリペプチド、あるいはファージや他のベクター中の抗体ライブラリーとリンパ球とのインビトロでの接触がある。Huse ら、 Generation of Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246:1275-1281 (1989)。これらの方法によって、10-8 mole/liter又はより高い、好ましくは10-8〜10-8、親和性を持ったモノクローナル抗体を得ることができる。
【０２８４】
生成された抗体は、さまざまな目的に使われる。即ち、免疫測定（PfEMP1のリガンドに対する結合を祖害し、従って、赤血球破壊を抑制か減少する）、診断学、治療学、又はマラリア感染の様々な機構、特にP.falciparumによる感染、をさらに解明するための研究に使われるだろう。本発明の抗体は、修飾若しくは修飾されずに使われる。本発明の抗体は、しばしば、検出可能なシグナルを提示する物質と、共役的若しくは非共役的な結合により標識されるであろう。前述のポリペプチドの標識のような方法を含むこの様な標識化は、技術的に良く知られている。また、本発明の抗体は、抗原性を低減させるために、ターゲットとの親和性を減少させずにキメラ化した、即ち、ヒト化されたものであってもよい。キメラ化した、即ち、ヒト化された、抗体は、この技術の中で説明される。一般的に、この様な抗体は、可変領域、例えば、哺乳類の動物（例えば、ネズミ）や人間のフレームワーク領域由来の相補性決定領域（CDR）（ヒト化抗体のための）などを含む。できるだけ少ない外来性配列を合成抗体に導入することによって、抗原性は低減される。これらの合成抗体の調製は良く知られている方法で行ってもよい。
【０２８５】
好ましい抗体は、本発明のポリペプチド及びその免疫学的に活性な断片と特異的に免疫反応を起こす抗体である。本発明の抗体と特定のタンパク質との相互作用は、「特異的免疫反応」と表現され、この抗体は特異的に特定のタンパク質を認識し、比較的高い親和性でそのタンパク質と結合する。この結合で、混合タンパク質や他の生物資源中における特定のタンパク質の存在が確認される。従って、指定された免疫測定法の条件内では、特定の抗体は、特定のタンパク質と結合し、サンプル内に著しい量存在する他のタンパク質とは結合しない。特定のタンパク質と免疫反応する特異的な抗体を選ぶため、いろいろな免疫測定法が使われる。例えば、タンパク質と特異的免疫反応を起こすモノクローナル抗体を選別するために固相酵素免疫吸着測定法(ELISA)が頻繁に使われている。Harlow と Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkに特異的の免疫反応を決定する免疫測定法の形式と条件が説明されている。
生成された抗体は、さまざまな目的に使われる。例えば、免疫測定ではプローブとして使われ、PfEMP1タンパク質とそのリガンド（例えば、CD-３６、TSP、ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1か、コンドロイチン硫酸）の相互作用を抑制し、従ってPfEMP1とリガンドの相互作用を抑制又は阻害する。また、診断学、治療学、研究にもマラリア病理学、例えば、赤血球破壊、の機構をさらに解明するため使われている。本発明のポリペプチドと関連するリガンド又はPE間の結合を妨害するような状況において、抗体は「妨害抗体」と言及される。好ましい抗体とは、本発明のポリペプチドを特異的に認識でき、かつ結合できるモノクローナルあるいはポリクローナル抗体である。従って、この様な好ましい抗体は、本件に記されるか若しくは参照されているアミノ酸配、又はその免疫学的に活性な断片と実質的に相同的なアミノ酸配列を持つポリペプチドを特異的に認識し、結合する。最も好ましい抗体は、PfEMP1配列中の比較的保存されているポリペプチド断片と抗体-リガンド複合を形成することで、PfEMP1リガンドと、様々なP.falciparum株由来のPfEMP1との相互作用を抑制するものである。
【０２８６】
使用方法
本発明のポリペプチド、抗体、核酸は、いろいろな重要な使い方がある。この使い方には、これらに限定されないが、診断、スクリーニング、ワクチン接種などの予防法や治療薬としてのアプリケーションがある。
診断のアプリケーション
特に優先されている側面では、本発明の方法と試薬は、サンプル内のPfEMP1の存在を探知する事で役に立つ。この様な探知法は、特に、患者のマラリア感染を診断する事に役立つ。例えば、特に優先されている側面では、本発明の抗体は、サンプルにPfEMP1が存在するか、否かの検定に使われるであろう。特定の抗原を検知できる免疫測定法は、技術的に良く知られている。一般的な免疫学的行程と免疫測定法の概論はBasic and Clinical Immunology 7th Edition (D. Stites と A. Terr ed.) 1991に書かれている。
さらに本発明の免疫測定は、Enzyme Immunoassay, E.T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980)と"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," P. Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam (1985); とHarlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, supra等で広範に記されている幾つかの実験系のいずれにおいても実施可能である。一般的に、これらの方法は抗体の検査されるサンプルとの接触、及び抗体とサンプル中のタンパク質との特異的結合の検知より成る。通常、このためにブロット形式、即ち、ウエスタン・ブロット法か、ELISA法が使われる。この様な検定形式の方法は、技術的に良く知られている。例えば、Basic and Clinical Immunology, 7th ed. (D. Stites と A Terr, eds., 1991)。
【０２８７】
通常、これらの診断方法は、この中に説明されているとおり、サンプル中の抗体とPfEMP1の接触、及びその抗体がサンプル内のどの部分に結合するかの判断より成る。人間診断法の場合、サンプルは全血液か、その赤血球などの分画であろう。この様な診断法は、技術的に良く知られており、上記の参照にも説明されてある。抗体とサンプルの免疫反応性は、PfEMP1がサンプル内に存在することを示し、患者からのサンプルの場合、マラリア感染の可能性を示す。
また、本発明の標識ポリペプチドは、診断薬として、患者のPfEMP1に対する抗体の有無を検知することにも使われるであろう。抗体の存在は、その患者が抗原応答を示すに十分量のマラリア原虫に曝されている事を暗示する。
スクリーニングのアプリケーション
一例として、本発明は、化合物がマラリア感染に対する拮抗物質であるか否かのスクリーニング法として使用される。特に、本発明のスクリーニング方法では、検査される化合物が、P.falciparumマラリアと関連する赤血球破壊の拮抗物質であるか否かの決定にも使われるだろう。更に具体的には、このスクリーニング方法により、化合物がPfEMP1とリガンドとの相互作用の拮抗物質であるか否かが検定される。PfEMP1のリガンドには、通常、CD36, TSP, ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1かコンドロイチン硫酸が含まれる。
一般的に本発明のスクリーニング方法では、「検査化合物」とPfEMP1タンパク質かその断片、及び／又はリガンドタンパク質が含まれている。PfEMP1とリガンドとの複合体の水準が感知され、対照（即ち、検査される化合物を含まないもの）と比べられる。PfEMP1とリガンドとの相互作用の水準が低くなっている場合は、検査化合物がこの相互作用との拮抗物質であることを示唆している。
【０２８８】
検査化合物は、化学物質、化学物質の混合物、生体高分子、又は細菌、ファージ、酵母、植物、菌類、動物細胞かその組織の抽出物であるだろう。検査化合物の、PfEMP1とリガンドとの相互作用におけるアンタゴニスト活性が、この中に説明されている、スクリーニング検定により評価される。「拮抗物質」とは、対照と比べ、PfEMP1とリガンドとの相互作用の水準を減少させる化合物の事を言う。
PfEMP1かリガンドタンパク質のいずれか一方を固定支持体の上で固定化する事が、本発明のスクリーニング検定において、しばしば必要とされるであろう。適した固型支持体としては、例えば、アがロース、セルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチック  フィルム、ガラス玉、ポリアミンメチルビニルエーテルとマレイン酸の共重合体、アミノ酸の共重合体、エチレン‐マレイン酸の共重合体、ナイロン、シルクなどがある。この支持体は、例えば、試験管、マイクロタイター皿、ビーズ、テスト・ストリップ、ブロット法用の平面、のような形で使われるであろう。PfEMP1ポリペプチドあるいはそのリガンドと特定の支持体との反応は、良く知られている方法で実施されている。例えば、固定化した坑PfEMP1抗体との結合か、誘導体化されていない支持体との結合である。
【０２８９】
上記に加えて、PfEMP1あるいはそのリガンドを適した検出可能基と結合させた方が、タンパク質との結合の探知が容易になるので、望ましい。使いやすい検出基又は標識は、一般的に技術的に知られている。例えば、検出基は、125I、 32P、35Sのような放射性標識、蛍光性若しくは化学発光基であろう。
または、検出基は測定できる基質、共同因子、阻害剤、アフィニティーリガンド、抗体と結合するエピトープ、若しくは酵素であろう。望ましい酵素は、例えば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼか、他の手軽に測定できる酵素である。このような酵素は、PfEMP1ポリペプチドと結合するか、そのリガンドと化学的に結合するか、既に説明されたように、融合タンパク質として発現されるであろう。
一般的に、上の一つのタンパク質、例えば、PfEMP1リガンドが支持体の上で固定化した場合、もう一方のタンパク質、例えば、PfEMP1かその断片は、適した検出基でラベルされる。化合物が二つのタンパク質の相互作用に対する拮抗物質かどうか測定するには、測定化合物の存在下、二つのタンパク質を特異的に結合させる条件において、ラベルされたPfEMP1ポリペプチドかその断片と固定化されたリガンドを接触させる。支持体に結合されるラベルの量は、テスト化合物が入ってないコントロールと比べられる。テスト化合物が支持体と結合するラベル量を減少させる場合、その化合物はPfEMP1とリガンドとの相互作用の拮抗物質である。
【０２９０】
治療法と予防法へのアプリケーション
上に説明されている方法の他に、本発明のポリペプチドは、人間若しくは人間以外の哺乳類に対する治療にも適用されるであろう。本発明のポリペプチドの医薬品としての利用法には、既存疾患の症状の治療や予防が含まれている。「予防法」という言葉は、特定の疾患か、その症状を防ぐ事を示す。従って、予防的処置は、通常、特定の疾患（例えば、マラリア感染かその症状）の予防を、積極的に行う医薬品を含んでいる。
一般的に、治療法と予防法の両方のアプリケーションとしては、マラリア原虫の感染症状を防ぐため、若しくはその治療か予防の為、本発明の適量の配合が患者に投与されるであろう。この中の「適量」とは、望まれる目標、例えば、症状の緩和、症状か感染の予防、病気の治療、に到達する配合量の事を示す。
破壊の阻害は、宿主のPEの破壊につながるこの種のマラリアの症状である微少血管の閉塞を縮小か排除するであろう。本発明の抗体も同じように使われる。特に本発明のポリペプチドと結合できる抗体は、患者に直接投与されるであろう。PfEMP1と結合する事によって、本発明の抗体は、赤血球破壊のようなPfEMP1を介した相互作用を効果的に、阻害、縮小させる事が出来る。キメラ化したヒト化抗体を人間の患者に投与する事は、特に、有用である。更に、この様な抗体は、以前から使われている抗非A型肝炎ワクチンの様に短期予防注射のような免疫付与法として使われるであろう。
【０２９１】
他の例として、本発明のポリペプチド、抗体、核酸は、すでにマラリア感染に苦しんでいる患者にも使用されるであろう。特に、本発明の配合は、マラリア感染の症状に苦しんでいる患者に投与されるであろう。更に具体的には、この配合は、マラリア（特にP.falciparum）感染による赤血球破壊や微少血管の阻害を防ぐためか、軽減させるため患者に投与されるであろう。
本発明のポリペプチド、核酸、抗体は、治療法と予防法のアプリケーションの為、単独で投与されるが、これらの要素は、一般的には、調合薬の配合の一部、例えば、調合薬に適した担体との組み合わせとして投与されるであろう。通常、一つの配合が治療法と予防法の両方のアプリケーションに使われる。本発明に適した調合法は、一般的にRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 17th ed. (1985)に記載されている。
【０２９２】
本発明の調合薬は、非経口的投与、局所性投与、経口投与を目的とされる。もし調合薬が非経口投与される場合、上記のような、調合薬形成に適した抗体（水溶性抗体が好ましい）に溶解若しくは懸濁された製剤として使用される。例えば、水、緩衝液、グリシン含有生理食塩水など様々な担体が使われるであろう。この様な配合は、例えば、減菌ろ過等の常法により殺菌されるであろう。これらの水溶液は、そのまま使われるために包装されるか、投与される前に滅菌溶液と配合する為に凍結乾燥される。生理学的条件に近づける為、配合薬には調合に適した補助剤が含まれるであろう。その補助剤は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどの様な、ｐH調節剤、緩衝剤、等張化剤、湿潤剤が含まれるであろう。
固定配合の場合、マンニトール、でんぷん乳糖、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレードの調合剤が、慣習的に非中毒性の固体担体として、使われる。経口投与の場合、前述された担体など普通使われている賦形剤及び一般的には10から95パーセントの活性成分と、出来れば25から75パーセントの活性成分を抱合し、調合薬に適した非中毒性製剤を作る。さらにペプチドを基準とした化合物を、経口投与する場合、消化による活性成分のタンパク質分解を防ぐ為に、調合薬の中の活性成分は基質の部分に入っている。例として、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 17th Ed. (1985)に書いている様に、リポソーム配合による調合薬の包合が、良く知られている方法である。
【０２９３】
エアロゾル投与の場合、界面活性剤か噴射剤と一緒に微粒化したポリペプチドが通例施こされる。好ましくは界面活性剤は、噴射剤の中で溶解されるであろう。このような医薬品の代表例は、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸、オレイン酸など6から22の炭素原子を含む脂肪酸と脂肪族多価アルコールや環状無水物とのエステルか、エステルの部分を持つ化合物である。混合か、天然のグリセリドのような混合エステルも利用される。経鼻投与には、レシチンの様な担体が使用される事もある。上記に説明されている配合は、単独投与か、連続投与に適している。追加ワクチンとして、ワクチンが連続投与される場合、最初の投与に続くワクチン接種は、免疫反応を促進する為に与えられ、通常、追加接種と呼ばれる。
患者に投与される上記の配合量は、何が患者に与えられるか、その患者の状態、投与様式、治療法か予防法かのアプリケーションにより異なる。治療目的の場合、既にマラリア感染で苦しんでいる患者に対しては、赤血球からの寄生虫の拡散を阻害できる量の配合を投与することにより病気の症状とそれによる合併症を治療するか、せめてその一部を抑える事ができる。
【０２９４】
この効果を保たせる量は、「治療的有効量」と言われる。効果的な量は、病気の重症度、患者の体重及び状態によるが、通常70キロの患者の場合、1日1ミリグラムから5グラム、出来れば1日50ミリグラムから500ミリグラム、更に好ましくは、50ミリグラムから100ミリグラムであろう。
予防法のアプリケーションの場合、免疫学的有効量は、配合、投与様式、患者の体重や状態、及び処方する医師の判断にもよる。通常、ペプチド、ペプチド類緑体及び抗体による薬剤の配合の場合、最初の免疫付与（予防法か治療法のアプリケーションの為の）は、70キロの患者の場合、100マイクログラムから１グラムであり、患者の反応と状態次第で（例えば、患者の血液の中の寄生虫か抗体の量を調べる）数週間から数ヶ月に渡り、1マイクログラムから1グラムのポリペプチドの追加接種が与えられる。核酸の場合、通常、約30から100マイクログラムの核酸が70キロの患者に注射され、多くの場合、適切な後追加接種が50から150ミクログラムの核酸により行われる。
【０２９５】
ここに記した発明は、組換えを通じて、DNA、RNA又はタンパク質のような高度に複雑な線状配列の方向付けられた分子進化を可能にするような、縮小的再組合せ(reductive reassortment)、組換え及び選択への反復サイクルの使用に関する。
分子のインビボシャッフリングは、組換え多量体に対する細胞の天然の特性を用いて行うことができる。インビボにおける組換えは、分子多様性への主要な自然経路を提供するが、遺伝的組換えは、以下の点に関連して、依然比較的複雑な方法である：1)相同性の認識；2)組換えキアズマ形成に繋がる、鎖の切断、鎖の侵入(invasion)、および代謝の過程；並びに最後に、3)個別の組換え分子へのキアズマの解離(resolution)。キアズマの形成は、相同配列の認識を必要とする。
好ましい態様において、本発明は、少なくとも第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを作出する方法に関する。本発明は、適当な宿主細胞へ、部分的配列相同性の少なくとも一領域を共有する少なくとも第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドを導入することによる、ハイブリッドポリヌクレオチドの作出に使用することができる。この部分的配列相同領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを作出する配列の再組織化を生じるような方法を促進する。本明細書において使用される用語「ハイブリッドポリヌクレオチド」とは、本発明の方法により生じかつ少なくとも二種の本来のポリヌクレオチド配列由来の配列を含むようなヌクレオチド配列のいずれかを意味する。このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列組込みを促進する分子間組換え事象により生じ得る。加えてこのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子内のヌクレオチド配列を変更するために反復配列を利用する、分子内縮小的再組合せ法により作成することができる。
【０２９６】
本発明は、生物学的活性のあるハイブリッドポリペプチドをコードし得るハイブリッドポリヌクレオチドを作出する手段を提供する。ある局面において、本来のポリヌクレオチドは、生物学的活性のあるポリペプチドをコードしている。本発明の方法は、得られるハイブリッドポリヌクレオチドが本来の生物学的活性のあるポリペプチドに由来した活性を示すポリペプチドをコードしているように、本来のポリヌクレオチドの配列を組込むような細胞処理を用いて、新規ハイブリッドポリペプチドを作出する。例えば、本来のポリヌクレオチドは、様々な微生物由来の特定の酵素をコードすることができる。ある生物由来の第一のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、例えば、高塩分のような特定の環境条件下で効果的に機能することができる。異なる生物の第二のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、極端な高温のような様々な環境条件下で効果的に機能することができる。第一および第二の本来のポリヌクレオチド由来の配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、本来のポリヌクレオチドでコードされた両方の酵素の特徴を発揮する酵素をコードすることができる。従って、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、第一および第二のポリヌクレオチドでコードされた各々の酵素により共有された環境条件下、例えば、高塩分及び極端な温度で、効果的に機能することができる。
【０２９７】
本発明の本来のポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、及びリガーゼを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の方法から得られるハイブリッドポリペプチドは、本来の酵素においてはディスプレイされない特定化された酵素活性を示すことができる。例えば、加水分解酵素活性をコードしているポリヌクレオチドの組換え及び/又は縮小的再組合せの後、得られるハイブリッドポリヌクレオチドでコードされたハイブリッドポリペプチドは、各々の本来の酵素から得られた特定化された加水分解酵素活性、即ち、加水分解酵素が作用する結合の種類および加水分解酵素が機能する温度についてスクリーニングすることができる。従って、例えば、加水分解酵素は、本来の加水分解酵素(hydrolyases)からハイブリッド加水分解酵素を識別するそれらの化学的機能性について確かめるためにスクリーニングすることができ、これは下記のようなものである：(a)アミド(ペプチド結合)、即ち、プロテアーゼ；(b)エステル結合、即ち、エステラーゼおよびリパーゼ；(c)アセタール、即ち、グリコシダーゼ、また、例えば、ハイブリッドポリペプチドが機能する温度、pH又は塩濃度についてである。
本来のポリヌクレオチドの供給源は、個別の生物(「単離体」)、制限培地中で増殖された生物の収集(「富化培養」)、または最も好ましくは未培養の生物から(「環境試料」)単離されうる。環境試料由来の新規生体活性をコードしているポリヌクレオチドを誘導する培養とは無関係の方法の使用が、生体多様性の利用されない給源に接近することができるので最も好ましい。
【０２９８】
「環境ライブラリー」とは、環境試料から作成され、かつ適当な原核生物宿主において増殖することができるクローニングベクターにおいて実現される天然の生物の集合的ゲノムを表している。クローニングしたDNAは最初に環境試料から直接抽出されるので、これらのライブラリーは、純粋な培養物において増殖することができる原核細胞の小さい画分に限定されない。加えてこれらの試料中に存在する環境DNAの標準化は、本来の試料中に存在する全ての種からのDNAのより同等の提示を可能にする。これは、ドミナント種と比較して大きさが数桁下回って提示されることがある試料の少量の成分から関心対象の遺伝子を発見する効率を劇的に増加することができる。
例えば、一種以上の培養していない微生物から作成された遺伝子ライブラリーは、関心対象の活性についてスクリーニングされる。関心対象の生体活性分子をコードしている可能性のある経路は、最初に遺伝子発現ライブラリーの形で原核細胞において捕捉される。関心対象の活性をコードしているポリヌクレオチドは、このようなライブラリーから単離されかつ宿主細胞に導入される。この宿主細胞は、新規または増強された活性を伴う可能性のある活性を有する生体分子を作出する組換え及び/又は縮小的再組合せを促進する条件下で増殖される。
【０２９９】
ポリヌクレオチドが調製される微生物は、真正細菌および古細菌のような原核微生物、ならびに真菌、一部の藻類および原生動物のような比較的低等な真核微生物を含む。ポリヌクレオチドは、核酸が微生物の培養をせずに回収されるかまたは一種以上の培養された生物から回収される場合のように、環境試料から単離することができる。ある局面において、このような微生物は、極端を好む菌(extremophules)、例えば超高熱菌、好冷菌、低温菌(psychrotrophs)、好高塩菌、好高圧菌、および好酸菌である。極端を好む微生物から単離された酵素をコードしているポリヌクレオチドが特に好ましい。このような酵素は、陸上の温泉および深海熱水口の 100℃以上の温度、極地水の 0℃以下の温度、死海の飽和塩環境、石炭堆積層および地熱イオウ分が豊富な温泉のような 0 近傍のpH値、または下水スラッジの11を超えるpH値で機能することができる。例えば、極端を好む生物からクローングされかつ発現されたエステラーゼおよびリパーゼのいくつかは、広範な温度およびpHを通じて高い活性を発揮する。
前述のように選択および単離されたポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞に導入される。適当な宿主細胞は、組換え及び/又は縮小的再組合せを促進することが可能な細胞のいずれかである。選択されたポリヌクレオチドは、好ましくは既に適当な調節配列を含むベクター内にある。この宿主細胞は、例えば、哺乳類細胞のような高等真核細胞、又は酵母細胞のような比較的低等な真核細胞であることができ、もしくは好ましくは宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であることができる。構築体の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAEデキストラン媒介型トランスフェクション法、または電気穿孔法により行うことができる(Davisら、1986)。
【０３００】
適当な宿主細胞の代表例としては、大腸菌、Streptomyces、Salmonella typhimuriumのような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Drosophila S2およびSpodoptera Sf9のような昆虫細胞；CHO、COSまたはBowesメラノーマのような動物細胞；アデノウイルス；ならびに植物細胞を挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書の内容から当業者の範囲内であると思われる。
特に、組換えタンパク質を発現するために使用することができる様々な哺乳類細胞培養システムに関する哺乳類発現システムの例は、「SV40形質転換されたシミアン細胞は、初期SV40変異体の複製を支持する」(Gluzman, 1981)に記された、サル腎繊維芽細胞のCOS-7系、および共存性のあるベクターの発現が可能な他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa及びBHK細胞株である。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサー、ならびにいずれか必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転写終結配列、ならびに5'隣接する非転写配列を含むであろう。SV40スプライシング及びポリアデニル化部位由来のDNA配列は、必要な転写されない遺伝子エレメントを提供するように使用することができる。
関心対象のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子増幅に適するように変更された常用の栄養培地で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞でこれまでに使用されたものであり、かつ当業者には明らかであろう。特定の酵素活性を有することが確定されたクローンは、その後増強された活性を有する酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を確定するために、配列決定される。
【０３０１】
別の局面において本発明の方法は、一種以上のオペロン由来の生化学的経路をコードしている新規ポリヌクレオチド、又はそれらの遺伝子クラスターもしくは一部を作成するために使用することができるように構想されている。例えば、細菌および多くの真核生物は、その産物が関連したプロセスに関与しているような遺伝子を調節するための調和された機構を有する。これらの遺伝子は、クラスター化され、構造から単独の染色体上の「遺伝子クラスター」と称されており、かつクラスター全体の転写を開始する単独のプロモーターを含む単独の調節配列の制御下で一緒に転写される。従って、遺伝子クラスターとは、通常はそれらの機能に関して同じ又は関連のある隣接遺伝子の群である。遺伝子クラスターによりコードされた生化学経路のとしてポリケチドがある。ポリケチドとは、生体活性の極端に豊富な給源分子であり、抗生物質(テトラサイクリン及びエリロマイシンなど)、抗癌剤(ダウノマイシン)、免疫抑制剤(FK506及びラパマイシン)、ならびに獣医学的産物(モネンシン)を含んでいる。多くのポリケチド(ポリケチドシンターゼにより形成される)は治療物質として価値がある。ポリケチドシンターゼは、長さならびに官能性および環化のパターンが異なる多種多様な炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は、遺伝子クラスターに分類され、及びポリケチドシンターゼの少なくとも一種(タイプIと称される)は、大きいサイズの遺伝子及び酵素を有し、このことがこれらの遺伝子/タンパク質の遺伝的操作及びインビトロ試験を複雑化する。
ポリケチド又はそれらの断片のライブラリーから所望の成分を選択しかつ組合わせる能力、ならびに試験のための新規ポリケチド作成のためのポストポリケチド生合成遺伝子が明らかになっている。本発明の方法は、分子間組換えを通じての新規ポリケチドシンターゼ作出を促進することを可能にしている。
【０３０２】
好ましくは、遺伝子クラスターDNAは、様々な生物から単離することができ、かつベクターにライゲーションする、特にライゲーションした遺伝子クラスターからの検出可能なタンパク質の作製又はタンパク質関連アレイ活性を制御および調節することができる発現調節配列を含むベクターにライゲーションすることができる。内在性DNA導入のための例外的に大きい容量を有するベクターの使用は、このような遺伝子クラスターでの使用に特に適しており、かつ大腸菌のf因子(稔性因子)を含むことが例として本明細書に記されている。この大腸菌のf因子は、接合時にそれ自身の高頻度の移行に作用するプラスミドであり、かつ混合微生物試料からの遺伝子クラスターのような、巨大なDNA断片を実現しかつ安定に増殖するのに理想的である。一旦適当なベクターにライゲーションされると、様々なポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターを含む二種以上のベクターを、適当な宿主細胞に導入することができる。これらの遺伝子クラスターと相同性を共有している部分配列の領域は、ハイブリッド遺伝子クラスターを生じる配列再構成を生じるプロセスを促進するであろう。その後この新規ハイブリッド遺伝子クラスターは、本来の遺伝子クラスターにおいては認められない増強された活性についてスクリーニングすることができる。
【０３０３】
従って、好ましい態様において本発明は、下記段階による、生物学的に活性のあるハイブリッドポリペプチドを作出し、かつこのようなポリペプチドを増強された活性についてスクリーニングする方法に関連している：
1)  適当な宿主細胞へ、動作可能的にライゲーションされた少なくとも第一のポリヌクレオチド及び動作可能的に連結された第二のポリヌクレオチドを導入する段階であり、これらの少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが部分配列相同性を少なくとも1領域共有しているような段階；
2)  配列再構成を促進する条件下で宿主細胞を増殖し、動作可能的に連結されたハイブリッドポリヌクレオチドを生じる段階；
3)  ハイブリッドポリヌクレオチドでコードされたハイブリッドポリペプチドを発現する段階；
4)  増強された生物学的活性の同定を促進する条件下でハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする段階；及び
5)  ハイブリッドポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを単離する段階。
様々な酵素活性をスクリーニングする方法が、当業者に公知であり、かつ本明細書において論じられている。このような方法は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離する際に利用することができる。
【０３０４】
ここで使用することができる発現ベクターの代表例は、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌の人工染色体、ウイルスDNA(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、及びSV40誘導体)、P1に基づいた人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び関心対象の具体的な宿主に特異的ないずれか他のベクター(バシラス、アスペルギルス及び酵母など)を挙げることができる。従って、例えば、DNAは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれかひとつに含むことができる。このようなベクターは、染色体性、非染色体性および合成DNA配列を含む。適当なベクターの多数が、当業者に公知であり、かつ市販されている。下記のベクターを例として挙げることができる；細菌性：pQEベクター(Qiagen社)、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、λ-ZAPベクター(Stratagene社)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia社)；真核性：pXT1、pSG5(Stratagene社)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia社)がある。しかし、いずれか他のプラスミド又は他のベクターを、宿主において複製及び生存可能な限り使用することができる。低いコピー数または高いコピー数のベクターを、本発明において使用することができる。
【０３０５】
本発明において使用するのに好ましい種類のベクターは、f因子複製起点を含む。大腸菌 におけるf因子(又は稔性因子)は、接合時にそれ自身の高頻度の移行および細菌性染色体それ自身のより少ない頻度の移行に作用するプラスミドである。特に好ましい態様において、「フォスミド」又は細菌性人工染色体(BAC)ベクターと称されるクローニングベクターを使用する。これらは、ゲノムDNAの大きいセグメントの安定した組込みが可能であるような大腸菌 f因子に由来している。混合未培養の環境試料由来のDNAを組込む場合、これは安定した「環境DNAライブラリー」の形の巨大なゲノム断片を実現することを可能にする。
本発明において使用するのに好ましい別の種類のベクターは、コスミドベクターである。コスミドベクターは、最初にゲノムDNAの巨大なセグメントをクローニングしかつ増殖するように設計された。コスミドベクターへのクローニングは、「Molecular Cloning: A laboratory Manual」(Sambrook ら、1989)において詳細に説明されている。
発現ベクター内のDNA配列は、RNA合成を指示するのに適当な発現制御配列(複数)(プロモーター)に動作可能的に連結されている。特に言及された細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびtrpを含む。真核プロモーターは、極初期CMV、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルス由来のLTR及びマウスのメタロチオネイン-Iを含む。適当なベクター及びプロモーターの選択は、当業者には周知である。発現ベクターは、同じく、翻訳開始および転写終結のためのリボソーム結合部位を含む。このベクターも、発現を増幅するための適当な配列から選択することができる。プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクター又は選択マーカーを伴う他のベクターを用い、いずれか所望の遺伝子から選択することができる。
【０３０６】
加えて、この発現ベクターは、真核細胞培養物についてのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する一種以上の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
一般に組換え発現ベクターは、複製起点、例えば、大腸菌およびS. cerevisiae TRPl遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子のような宿主細胞の形質転換をもたらす選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高度に発現された遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。このようなプロモーターは、3-ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)のような解糖酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、又は熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来することができる。異種構造配列は、翻訳開始及び終結配列、及び好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔又は細胞外媒質への分泌を指示することが可能であるリーダー配列の適当な相において集成される。
クローニング戦略は、ベクター起動及び内在性プロモーターの両方による発現を可能にし；ベクターの促進は、内在性プロモーターが大腸菌において機能しないような遺伝子発現において重要であろう。
【０３０７】
微生物から単離されるか又はそれに由来したDNAは、選択されたDNAについてプロービングする前に、ベクター又はプラスミドに挿入することが好ましい。このようなベクター又はプラスミドは、プロモーター、エンハンサーなどを含む、発現調節配列を含むものが好ましい。このようなポリヌクレオチドは、ベクター及び/又は組成物の一部であることができ、また、このようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないように依然単離されている。特に、好ましいファージまたはプラスミド及びそれらへの導入およびパッケージングのための方法は、ここにおいて言及されたプロトコールにおいて詳述されている。
クローニングベクターの選択は採用された方法によって決まり、例えば、ベクターは、配列の反復コピーを増すか、又は宿主細胞において、うまく形質転換及び選択することができる配列を倍加するのに適当な容量を伴ういずれかのクローニングベクターであることができる。このようなベクターの一例は、「Polycosベクター：λファージパッケージング抽出物を用いる繊維状ファージおよびファージミドベクターのパケージングシステム」(Alting-MecsおよびShort, 1993) に記されている。増殖/維持は、クローニングベクターにより保持された抗生物質耐性によるものであることができる。増殖期以降に、天然に短縮化された分子は、ゲル又はカラム上のサイズ分画により回収されかつ同定されるか、もしくは直接増幅される。利用されたクローニングベクターは、長い構築体の挿入により破壊される選択可能な遺伝子を含むことができる。縮小的再組合せの進行に伴い、反復ユニット数が縮小され、かつ妨害された遺伝子は再度発現され、これによりプロセッシングされた構築体の選択が行われる。このベクターは、所望の生物学的特性を有する発現された産物の選択を可能にする発現/選択ベクターであることができる。挿入は、機能的プロモーターの下流に位置し、および所望の特性を適当な手段でスクリーニングすることができる。
【０３０８】
インビボ再集合は、細菌内で、一般に「RecA依存」現象として見られるような、集合的に「組換え」と称される「分子間」のプロセスに焦点が当てられている。本発明は、配列を組換え及び再集合するための宿主細胞の組換え法、又は欠失により細胞の準反復配列の複雑度を低下する縮小的方法を媒介する細胞の能力に頼ることができる。この「縮小的再集合」の方法は、「分子内」RecA依存法により生じる。
従って、本発明の別の局面において、新規ポリヌクレオチドを縮小的再組合せ法により作成することができる。この方法は、連続配列(本来のコード配列)を含む構築体を作成、それらの適当なベクターへの挿入、及びその後の適当な宿主細胞への導入に関する。個々の分子同定物の再組合せは、相同領域を有する構築体中の連続配列間、または準反復ユニット間において、コンビナトリアル法により行われる。再組合せ法は、反復配列の複雑度および程度を再度組合せ及び/又は縮小し、かつ新規分子種の作成をもたらす。様々な処理を、再組合せ率を増すために適用することができる。これらは、紫外線処理、又はDNAを損傷する化学物質及び/又は「遺伝子不安定性」の増強されたレベルをディスプレイする宿主細胞系の使用を含むことができる。従って、この再組合せ法は、相同的組換え又はそれら自身の進化を示す準反復配列の天然の特性に関する。
【０３０９】
反復配列又は「準反復」配列は、遺伝的不安定性において役割を果たす。本発明において、「準反復物」とは、それらの本来のユニット構造に対して制限されない反復物である。準反復ユニットは、構築体の配列アレイ；類似の配列の連続ユニットとして示すことができる。一旦ライゲーションされたならば、連続配列間の接合は、本質的に不可視となり、かつ得られる構築体の準反復性の性質は、ここでは分子レベルで連続している。この細胞の欠失法は、準反復配列間で得られる構築体の操作の複雑度の低下をもたらす。準反復ユニットは、ずれ事象が生じ得るような鋳型の実践上の制限のないレパートリーを提供する。従って、準反復物を含む構築体は、準反復ユニット内で欠失(おそらく挿入)事象が実際に生じ得る十分な分子弾性を効果的に提供する。
準反復配列が同じ方向、例えば、頭から緒又はその逆でにライゲーションされる場合には、この細胞は個々のユニットを識別することはできない。結果的に、この縮小的プロセスは、この配列全体に発生し得る。対照的に、例えば、これらのユニットが、頭から尾よりもむしろ頭から頭へ示される場合には、この逆転は、隣接ユニットの終点(endpoint)を線引きすることができ、その結果、欠失の形成は、個別のユニットの喪失に有利となる。従って、本発明の方法にとって、これらの配列が同方向であることが好ましい。準反復配列の無作為な方向は、再組合せ効率の低下を招く一方で、これらの配列の一貫した方向は高効率を提供する。しかし、同方向の連続配列が減ることは効率を低下する一方で、新規分子の効果的回収に十分な弾性が提供されもする。構築体は、より高い効率をもたらすよう同方向の準反復配列で作成することができる。
【０３１０】
配列は、下記を含む様々な方法のいずれかを用いて、頭から尾へ構築することができる：
a)一本鎖で作成された場合に方向を提供するような、ポリA頭及びポリT尾を含むプライマーを利用することができる。これは、RNAから作成され、その後容易にRNAseHで除去される、プライマーの最初の数塩基を有することによって実現される；
b)独自の制限酵素部位を含むプライマーを利用することができる。複数の部位、一連の独自の配列、ならびに反復合成及びライゲーション段階が必要であると考えられる；
c)プライマーの内側の2、3の塩基はチオール化され、かつエキソヌクレアーゼを使用して、適当に尾側の分子を作成する。
再集合された配列の回収は、縮小されたRIを伴うクローニングベクターの同定に頼っている。その後再組合せされたコード配列は、増幅により回収することができる。これらの産物は、再クローニングされ、かつ発現される。縮小されたRIを伴うクローニングベクターの回収は、下記により実現することができる：
1)  該構築体の複雑度が低下した場合にのみ安定して維持される、ベクターの使用；
2)  物理的方法による短縮化されたベクターの物理的回収
この場合、クローニングベクターは、標準のプラスミド単離法及び標準の手法を利用するアガロースゲル又は低分子量カットオフのカラムのいずれかを用いるサイズ分画を用いて、回収される；
3)  挿入サイズが減少する場合に選択することができる切断された遺伝子を含むベクターの回収；
4)  発現ベクター及び適当な選択による直接の選択技術の使用。
関連生物に由来するコード配列(例えば、遺伝子)は、高度の相同性を示し、
かつ極めて多様なタンパク質産物をコードしている。これらの配列の種類は、本発明において準反復物として特に有用である。しかし、下記に説明された例は、ほぼ同じ本来のコード配列(準反復物)の再集合を明らかにする一方で、この方法は、このようなほぼ同じ反復物に限定されるものではない。
【０３１１】
以下の実施例は、本発明の方法を明らかにしている。三種の独自の種に由来したコード核酸配列(準反復物)について言及している。各配列は、個別の特性セットを伴うタンパク質をコードしている。各配列は、「A」、「B」及び「C」と称される配列内の独自の位置において一個又は数個の塩基対が異なる。この準反復配列は、個別に又は集合的に増幅されかつランダム集成体へとライゲーションされ、その結果全ての可能性のある順列及び組合わせがライゲーションされた分子集団において利用可能になる。準反復ユニットの数は、集成条件により制御することができる。構築体内の準反復ユニットの平均数は、反復指数(RI)と定義される。
一旦構築物が形成されると、該構築体は公表されたプロトコールに従うアガロースゲル上のサイズ分画、クローニングベクターへの挿入及び適当な宿主細胞へのトランスフェクションを行うことも行わないこともできる。その後これらの細胞は増殖され、かつ「縮小的再組合せ」が実施される。望ましいならば、縮小的再組合せ法の率は、DNA損傷の導入により刺激することができる。RIの縮小が、「分子内」機構による反復配列間の欠失の形成により媒介されるか、もしくは「分子間」機構による組換え様事象により媒介されるかのいずれであるかは、重要ではない。最終結果は、全ての可能性のある組み合わせへの分子の再組合せである。
【０３１２】
任意に、本方法は、例えば、タンパク質受容体、ペプチドオリゴ糖、ビリオンのようなあらかじめ定められた巨大分子、又は他のあらかじめ定められた化合物又は構造と結合さもなければ相互作用する能力を有する個々のシャッフリングされたライブラリーメンバー(例えば、触媒抗体など)を同定するために、シャッフリングされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングする追加段階を含む。
このようなライブラリーから同定された、ディスプレイされたポリペプチド、抗体、偽ペプチド抗体、及び変異領域の配列を、治療、診断、研究及び関連目的(例えば、触媒、水溶液の浸透圧を増大する溶質など)に使用することができ、及び/又は一種以上のシャッフリング及び/又は親和性選択の追加サイクルを施すことができる。この方法は、表現型の特性についての選択段階があらかじめ定められた分子への結合親和性以外(例えば、触媒活性、安定性、酸化抵抗性、薬物耐性、又は宿主細胞に付与された検出可能な表現型など)であるように変更することができる。
【０３１３】
本発明は、親和性相互作用スクリーニングに適したディスプレイされた抗体のライブラリーを作成する方法を提供することができる。この方法は、(1)ディスプレイされた抗体及び該ディスプレイされた抗体をコードしている会合したポリヌクレオチドを含む第一の複数の選択されたライブラリーメンバーを得、かつ該ディスプレイされた抗体をコードしている会合したポリヌクレオチドを得、かつ得た会合したポリヌクレオチド又はそのコピーを得る段階であり、ここで該会合したポリヌクレオチドと実質的に同じ変異領域フレームワーク配列領域を含んでいる段階、ならびに(2)該ポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、かつ組換え及び縮小的再組合せを促進する条件下で細胞を増殖し、その結果シャッフリングされたポリヌクレオチドを生じる段階。シャッフリングされたプールにより構成されたCDR組合せは、第一の複数の選択されたライブラリーメンバー中に存在せず、該シャッフリングされたプールはCDR順列を含みかつ親和性相互作用スクリーニングに適したディスプレイされた抗体のライブラリーを構成する。任意にシャッフリングされたプールは、予め決定されたエピトープ(抗原)に結合するシャッフリングされたライブラリーメンバーの選択のために親和性スクリーニング及びそれによる複数の選択されたシャッフリングされたメンバーの選択が施される。さらに、複数の選択的にシャッフリングされたライブラリーメンバーがシャッフリングされ、かつ1〜約1000サイクル又は望ましいならば所望の結合親和性を持つライブラリーメンバーが得られるまで、反復スクリーニングされる。
【０３１４】
別の本発明の局面において、組換え又は再組合せの前又はその期間に、本発明の方法により作成されたポリヌクレオチドは、本来のポリヌクレオチドへの変異の導入を促進する物質又は方法にさらすことが構想されている。このような変異の導入は、得られるハイブリッドポリヌクレオチドおよびそれらによりコードされたポリペプチドの多様性を増大するであろう。変異を促進する物質又は方法は、以下を含むことができるが、これらに限定されるものではない：(+)-CC-1065、または(+)-CC-1065-(N3-アデニン)のような合成アナログ(Sun及びHurley, 1992参照)；DNA合成を阻害することが可能な N-アセチル化又は脱アセチル化された4'-フルオロ-4-アミノビフェニル付加物(例えば、van de Pollら、1992参照)；又はDNA合成を阻害することが可能なN-アセチル化又は脱アセチル化された4-アミノビフェニル付加物(同じくvan de Pollら、1992, pp.751-758参照)；DNA複製を阻害することが可能な三価クロム、三価クロム塩、多環式芳香族炭化水素(「PAH」)DNA付加物、例えば、7-ブロモメチル-ベンズ[α]アントラセン(「BMA」)、リン酸トリス(2,3-ジブロモプロピル)(「Tris-BP」)、1,2-ジブロモ-3-クロロプロパン(「DBCP」)、2-ブロモアクロレイン(2BA)、ベンゾ[α]ピレン-7,8-ジヒドロジオール-9-10-エポキシド(「BPDE」)、ハロゲン化プラチナ(II)塩、N-ヒドロキシ-2-アミノ-3-メチルイミダゾ-[4,5-f]-キノリン(「N-ヒドロキシ-IQ」)、及びN-ヒドロキシ-2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5f]-ピリジン(「N-ヒドロキシ-PhIP」)。特に好ましいPCR増幅を遅延又は停止する手段は、UV光(+)-CC-1065及び(+)-CC-1065-(N3-アデニン)からなる。特に包含された手段は、DNA付加物またはポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドプールに由来したDNA付加物を含有するポリヌクレオチドであり、これはさらにプロセッシングする前にポリヌクレオチドを含有する溶液を加熱することを含む方法により放出又は除去することができる。
【０３１５】
別の局面において、本発明は、ハイブリッド又は再集合されたポリヌクレオチドの作成を提供する本発明の条件下で、野生型タンパク質をコードしている二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含有する試料を処理することによって生物学的活性を有する組換えタンパク質を作製する方法を教授する。
本発明は、また、ウイルス遺伝子(例えば、キャプシドタンパク質、スパイク糖タンパク質、ポリメラーゼ、およびプロテアーゼ)又はウイルスゲノム(例えば、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レオウイルス及びリノウイルス)の集団をシャッフリングするための、ポリヌクレオチドシャッフリングの適用を提供する。ある態様において、本発明は、エピトープに加え、組換えにより作出された新規エピトープの新規組合せを作成するための、免疫原性ウイルスタンパク質の全体又は一部をコードしている配列をシャッフリングする方法を提供し；このようなシャッフリングされたウイルスタンパク質は、エピトープ又はエピトープに加え、組換えにより作製された新規エピトープの組合せを含むことができ；このようなシャッフリングされたウイルスタンパク質は、ウイルス進化の結果として天然の環境においておそらく生じるであろうエピトープ又はエピトープの組合せを含むことができる；(例えば、インフルエンザウイルス株の組換えなど)。
【０３１６】
本発明は、また、ヒトの遺伝子治療に使用することができるような、遺伝子治療ベクター及び複製欠損した遺伝子治療構築体を作製するためのポリヌクレオチド配列のシャッフリングに適した方法を提供し、これはDNAに基づいた予防接種用のワクチンベクターに加え、抗腫瘍遺伝子治療および他の一般的治療様式を含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書において使用されるポリペプチドの表記は、標準の使用及び慣習に従い、左手方向がアミノ末端方向であり、かつ右手方向がカルボキシ末端方向である。同様に特に記さない限りは、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は、5'末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、5'方向と称される。新生RNA転写物の5'から3'の付加の方向は転写方向と称され；RNAと同じ配列を有し、かつ、RNA転写物の5'末端に対し5'側であるDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され；RNAと同じ配列を有しかつコードRNA転写物の3'末端に対し3'側であるDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【０３１７】
飽和変異誘発
ある局面において本発明は、各アミノ酸部位において単一のアミノ酸置換の全範囲が表されるような、新しく作製した一連の子孫ポリペプチドを作製するために、特許権のあるコドンプライマー（縮重N,N,G/T配列を含む）の使用を提供し、点変異をポリヌクレオチドに導入する。使用されるオリゴは、第一の相同的な配列、縮重N,N,G/T配列、及び好ましくは、しかし、必ずしも必要ではない、第二の相同的な配列を、連続的に含む。N,N,G/T配列の縮重は全ての20アミノ酸のコドンを含むため、そのようなオリゴの使用による下流側の子孫翻訳産物は、ポリペプチドに沿ったそれぞれのアミノ酸の部位でのすべての可能なアミノ酸変化を含む。
ある局面において、このような縮重オリゴ（一つの縮重 N,N,G/T カセットからなる）の一つは、親ポリヌクレオチド鋳型の中のそれぞれの本来のコドンを、全範囲のコドン置換に供するために使用される。別の局面において、親ポリヌクレオチドの鋳型における少なくとも二個の本来のコドンを、全領域のコドン置換に供するために、同一のオリゴ又はそれ以外のどちらかの、少なくとも二個の縮重 N,N,G/T カセットが使用される。従って、一つ以上の部位でアミノ酸変異を導入するために、一個以上の N,N,G/T 配列が、一個のオリゴの中に含まれうる。この複数の N,N,G/T 配列は、直接的に連続している又は、一つもしくは複数の付加的なヌクレオチド配列によって分けられうる。別の局面において、アミノ酸の付加、欠損、及び/又は置換の任意の組み合わせ又は順列を導入するため、付加や欠損を導入するために使用可能なオリゴは、単独でも又はN,N,G/T 配列を含むコドンと組み合わせて使用されうる。
【０３１８】
特別な例証において、連続的な N,N,G/T トリプレット、即ち、縮重（N,N,G/T）n 配列を含むオリゴを使用して、二つ又はそれ以上の連続したアミノ酸部位を同時に変異誘発させることが可能である。
別の局面において、本発明は N,N,G/T 配列未満の縮重度をもつ縮重カセットの使用を提供する。例えば、N がトリプレットの最初の、二番目の又は三番目の部位にあることができるような、ただ一つの N から成る縮重トリプレットを使用（例えばオリゴにおいて）することが、場合によっては望ましいであろう。その任意の組み合わせ及び順列も含む、任意の他の塩基を、トリプレットの残りの二つの位置で用いることができる。又は、場合によっては縮重 N,N,N トリプレット、又は N,N,G/C トリプレットを使用（例えば、オリゴにおいて）することが望ましいであろう。
しかしながら、本発明において開示された、縮重トリプレット（N,N,G/T、又は N,N,G/C トリプレット配列のような）の使用は、いくつかの理由で有利であると評価される。ある局面においては、本発明は、ポリペプチドにおけるそれぞれおよび全てのアミノ酸部位に、可能なアミノ酸（20アミノ酸の合計に対して）の全ての範囲の置換を、系統的に、かつ、かなり容易に作製するための手段を提供する。従って、100アミノ酸のポリペプチドにとって、本発明は、系統的に、かつ、かなり容易に2000の異なる種（即ち、部位あたり20の可能なアミノ酸×100アミノ酸部位）を作製するための方法を提供する。縮重N,N,G/T 又は N,N,G/C トリプレット配列を含むオリゴの使用を通じて、20の可能なアミノ酸をコードする32の個々の配列が提供されることは評価される。したがって、親ポリヌクレオチド配列が、このようなオリゴを使った飽和変異法に供されるような反応容器において、20の異なるポリペプチドをコードする32の異なる子孫ポリヌクレオチドが作製される。対照的に、部位特異的突然変異誘発における非縮重オリゴの使用は、反応容器あたり一つの子孫ポリペプチド産物のみをもたらす。
【０３１９】
本発明はまた、開示された縮重したプライマーとの組み合わせにおいて、随意的に使用うる非縮重オリゴの使用を提供する。いくつかの状況においては、作用ポリヌクレオチドに特定の点変異を作製するため、非縮重オリゴを使用することが有利であるとが評価される。これは、アミノ酸置換につながらない特異的なサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、及び停止コドンの作製やポリペプチド断片の対応する発現を引き起こす点変異を作製するための手段を提供する。
従って、本発明の好ましい態様において、全ての20アミノ酸が、親ポリヌクレオチドにおいて変異されたコドン部位に対応する一つの特定のアミノ酸部位で現われるように、それぞれの飽和変異誘発反応の容器は、少なくとも20の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む。それぞれの飽和変異誘発反応容器から作製された32重縮重子孫ポリペプチドは、クローン増幅（例えば、発現ベクターを使って適切な大腸菌宿主にクローニングされる）に供され、発現スクリーニングに供されることが可能である。特性における好適な変化（親ポリペプチドと比較したとき）を提示するためのスクリーニングによって、個々の子孫ポリペプチドが同定される場合、その中に含まれる対応する好適なアミノ酸置換を同定するために配列決定されうる。
【０３２０】
ここに開示されたように飽和変異誘発法を用いて、親ポリペプチドにおける、それぞれの及び全てのアミノ酸部位を変異させる場合、好ましいアミノ酸の変化が、一つ以上のアミノ酸部位で同定されうることが評価される。これらの好ましいアミノ酸置換の全て又はその一部の組み合わせを含む、一つ又は複数の新しい子孫分子を作製することが可能である。例えば、もし二個の特定の好ましいアミノ酸の変化が、ポリペプチドの三アミノ酸部位のそれぞれにおいて同定されるならば、順列はそれぞれの部位で三つの可能性（本来のアミノ酸が変化しない場合及び、二つの好ましい変化それぞれの場合）及び三つの部位を含んでいる。従って、既に検討された7つの可能性、つまり、6個の単一の点変異（即ち、三つの部位のそれぞれにおける二つ）及び、どの位置でも変化のない場合を含む、3 × 3 × 3、又は27の全可能性がある。
更に別の局面において、部位飽和変異誘発法は、スクリーニングを通じて、シャッフリング、キメラ化、組換え、及び他の変異方法と一緒に使用されることが可能である。本発明は、飽和変異誘発法を含む、反復方法における任意の変異方法の使用を提供する。ある例示においては、任意の変異方法の反復的な使用が、スクリーニングと組み合わせて使用される。
したがって、非制限的例示において、本発明は、ハイブリットポリヌクレオチドが組換え及び還元的再組み合わせ（reassortment）によって作製されるように、二つ又はそれ以上の関連するポリヌクレオチドが適切な宿主細胞に導入されるような方法などの、追加的な変異方法と組み合わせた、飽和変異誘発法の使用を提供する。
遺伝子の全配列に沿って変異を行うと共に、当発明は、ポリヌクレオチド配列におけるかなり多数の塩基のそれぞれを変異で置換できる（変異させる塩基の数は、できれば15から100,000 までの全整数）と規定している。従って、分子に沿った全位置を変異させるのではなく、独立した数の塩基（できれば15から100,000からなる部分集合）をすべて変異させることができる。可能であれば、各位置、あるいは位置の集合を変異させるために、ポリヌクレオチド配列と共に、別のヌクレオチドを使用する。変異させる三つの位置の集合はコドンである可能性があり、その変異は可能であれば非相同カセット（変異カセットとも言う）を含む、変異導入プライマーを使用して行う。好ましいカセットは、一つの塩基から500の塩基を持っており、上記の非相同カセット内の各ヌクレオチド位置は、N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G、Eで、このEはA、C、G、T以外の一つの塩基を指している（Eはデザイナー・オリゴとも言う）。以下の表は典型的なトリヌクレオチドカセット（N,N,G/T、N,N,N、N,N,A/C 以外に3000以上の可能な組合せがある）を表している。
【０３２１】
ある意味で、飽和変異は、変異させることが決まったポリヌクレオチド配列（変異させる配列はできれば長さ15から100,000の塩基）内の完全な一式の変異カセット（各カセットはできれば長さ1から500の塩基）を変異させることからなっているため、変種集団（1から100の変種）が変異させる各カセットに導入される。一回の飽和変異中に、あるカセットに導入される変種集団は、二つ目のカセットに導入される二つ目の変種集団と異なっていても同じでも構わない。上記の集団の例としては、特定のコドンの削除、追加、集団化でできたもの、また特定のヌクレオチドカセットの集団化でできたものがある。
変異させることが決まった配列（図20参照）は、好ましくは一個の完全な遺伝子、経路、cDNA、一個の完全なオープン・リーディング・フレーム（ORF）、完全なプロモーター、エンハンサー、リプレッサー／トランスアクティベーター、再生起源、イントロン、オペレーター、ポリヌクレオチド機能グループを含んでいる。一般に、この目的のための好ましい「決まった配列」は、ポリヌクレオチドは、15塩基配列を持つポリヌクレオチドや長さ15塩基から15,000塩基（本発明はこの間の全整数を明確に指定）のポリヌクレオチド配列ならどれでも構わない。コドンの集団を選択する際には、縮退突然変異カセットによりエンコードされるアミノ酸のタイプへの考慮が含まれている。
変異カセット（表1-85参照）へ導入される変種集団の特に好ましい実例の中で、本発明は各位置にある2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20アミノ酸と、そこでエンコードされるポリペプチドのライブラリーを規定する縮退コドン置換（縮退オリゴ使用）について規定を設けている。
【０３２２】
キメラ化
“シャッフリング”
核酸シャッフリングは、一個または複数個のポリヌクレオチドを作成するための、より短いか又はより小さいポリヌクレオチドのプールのインビトロ又はインビボ相同的組換え法である。関連した核酸配列又はポリヌクレオチドの混合物にランダムポリヌクレオチドを作成するようにセクシュアル(sexual)PCRを施し、かつ組換えハイブリッド核酸分子又はポリヌクレオチドのライブラリーまたは混合集団を得るように再集成された。
カセット変異とは対照的に、シャッフリング及びエラープローンPCRのみが、盲検的(プライマー以外の配列情報はない)配列プールの変異を可能にするものである。
反復選択に関するエラープローンPCR単独に勝る本発明の変異原性シャッフリングの利点は、抗体の遺伝子操作の例について最も良く説明することができる。DNAシャッフリングをエラープローンPCR(セクシュアルPCRでない)と比べてみる。選択されプールされた配列の最初のライブラリーは、単独の抗体遺伝子の多様な起源(すなわち本来のmRNA由来の抗体)の関連配列からなるか、又はいずれかの種類の変異に由来することができる(シャッフリングを含む)。選択された相補性決定領域(「CDR」)の集合が、第一回の親和性選択後に得られる。該略図において、濃厚な(thick)CDRは、抗体分子に増大した抗原親和性を付与する。シャッフリングは、例えば、CDRlの全てとCDR2の全てとCDR3の全ての自在なコンビナトリアル会合を可能にする。
【０３２３】
本方法のエラープローンPCRとは、逆連鎖反応である点で異なる。エラープローンPCRにおいて、ポリメラーゼ開始部位の数及び分子の数は、指数関数的に増大する。しかし、ポリメラーゼ開始部位の配列及び該分子の配列は本質的に同じである。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの再集合又はシャッフリングする核酸において、開始部位の数及びランダムポリヌクレオチドの数(サイズではない)は、経時的に減少する。全プラスミドに由来したポリヌクレオチドについて、理論的エンドポイントは、一本の巨大なコンカテマー分子である。
相同領域でクロスオーバーが生じるので、組換えは、同じ配列ファミリーのメンバーの間で初めに生じる。これは、総体的に共存性のないCDRの組合せを邪魔する(例えば、同じ抗原の異なるエピトープに対して)。配列の複数のファミリーを同じ反応においてシャッフリングすることができることが考案されている。さらに、シャッフリングは一般に、相対的順番を維持し、その結果、例えば、CDR1は、CDR2の位置には認められないであろう。
稀なシャッフラント（shufflant）は、非常に多数の最良(例えば、最高親和性)のCDRを含み、かつこれらの稀なシャッフラントは、それらの優れた親和性を基に選択することができる。
100種の異なる選択された抗体配列のプールからのCDRは、最大1006種の異なる方法で並べ替えることができる。この非常に多数の並べ替えは、DNA配列の単独のライブラリーにおいては表すことができない。従って、DNAシャッフリングおよび選択の複数のサイクルが、所望の配列長さ及び配列の多様性に応じて必要であると考えられている。
対照的に、エラープローンPCRは、同じ相対的配列において全ての選択されたCDRを維持し、非常に小さい変異体クラウド(cloud)を形成している。
【０３２４】
本発明の方法で使用することができる鋳型ポリヌクレオチドは、DNA又はRNAであることができる。これは、遺伝子のサイズ又は再結合もしくは再集成される短いもしくは小さいポリヌクレオチドに応じて、様々な長さであることができる。好ましい鋳型ポリヌクレオチドは50bp〜50kbである。関心対象のタンパク質をコードしている核酸を含むベクター全体を、本発明の方法において使用することができることが考案されており、かつ実際にうまく使用されている。
鋳型ポリヌクレオチドは、PCR反応を用いる増幅(米国特許第4,683,202号および第4,683,195号)、又は他の増幅もしくはクローニング法により得ることができる。しかしPCR産物のプール及びセクシュアルPCRを施す前に、PCR産物から自在なプライマーを除去することは、より効率的結果をもたらす。セクシュアルPCR前の本来のプールからのこのようなプライマーの適切な除去の失敗は、低頻度のクロスオーバークローンに繋がり得る。
鋳型ポリヌクレオチドは、しばしば、二本鎖である。二本鎖核酸分子は、得られる一本鎖ポリヌクレオチド領域が互いに相補的であり、その結果ハイブリダイズし、二本鎖分子を形成することができることを確実にすることが推奨されている。
この段階では、鋳型ポリヌクレオチドと同じ領域及び鋳型ポリヌクレオチドと異なる領域を有する一本鎖又は二本鎖核酸ポリヌクレオチドが、鋳型ポリヌクレオチドに添加されることが考案されている。さらに二種の異なるが関連したポリヌクレオチド鋳型をこの段階で混合することができると考えられている。
【０３２５】
二本鎖ポリヌクレオチド鋳型及びいずれか添加された二本鎖又は一本鎖ポリヌクレオチドに、遅延又は停止を含むセクシュアルPCRが施され、5bp〜5kb又はそれ以上の混合物が提供される。好ましくは、ランダムポリヌクレオチドのサイズは、約10bp〜1000bpであり、より好ましくはこのポリヌクレオチドのサイズは、約20bp〜500bpである。
あるいは、同じく複数のニックを有する二本鎖核酸を、本発明の方法において使用することが考察されている。ニックは、二本鎖核酸の1本の鎖中の切れ目である。このようなニック間の距離は、好ましくは5bp〜5kbであり、より好ましくは10bp〜1000bpである。これは、例えば、ランダムプライマーから生じるポリヌクレオチドと共に含まれる、より短いか又はより小さいポリヌクレオチドを作成するための自己プライミング域(area)を提供する。
いずれか一種の特異的ポリヌクレオチドの濃度は、総ポリヌクレオチドの１質量％よりも大きくはなく、より好ましくはいずれか一種の特異的核酸配列は、総核酸の0.1質量％よりも大きいことはない。
このような混合物中の様々な特異的ポリヌクレオチドの数は、少なくとも約100個であり、好ましくは少なくとも約500個であり、より好ましくは少なくとも約1000個である。
この段階で、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドは、合成又は天然にかかわらず、ポリヌクレオチド混合物の不均一性を増大するために、ランダム二本鎖のより短いか又は小さいポリヌクレオチドに添加することができる。
さらに二本鎖のランダムに破壊されたポリヌクレオチドの集団を、この段階でセクシュアルPCR法由来のポリヌクレオチドと混合又は一緒にすることができ、かつ任意に一種以上の追加のセクシュアルPCRサイクルを施すことが考案されている。
【０３２６】
鋳型ポリヌクレオチドへの変異の挿入が望ましい場合、鋳型ポリヌクレオチドと同じ領域及び鋳型ポリヌクレオチドと異なる領域を有する一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを、総核酸に対して質量で20倍過剰に添加することができ、より好ましくは総核酸に対して質量で10倍過剰に添加することができる。
異種であるが関連した鋳型ポリヌクレオチドの混合物が望ましい場合には、各鋳型由来のポリヌクレオチドの集団は、約1:100未満の比で、より好ましくは約1:40未満の比で一緒にすることができる。例えば、変異されたポリヌクレオチド集団による野生型ポリヌクレオチドの戻し交配(backcross)は、中立突然変異(例えば、選択される表現型特性における非現実的変更を生じる変異)を排除するために望ましい。このような例において、ランダムに提供されたセクシュアルPCRサイクルハイブリッドポリヌクレオチドに対する、添加することができるランダムに提供された野生型ポリヌクレオチドの比は、およそ1:1〜約100:1であり、より好ましくは1:1〜40:1である。
ランダムポリヌクレオチドの混合された集団は、一本鎖のポリヌクレオチドを形成するために変性され、次いで再アニーリングされる。他の一本鎖ポリヌクレオチドと相同性のある領域をもつ一本鎖ポリヌクレオチドだけが、再アニーリングされると考えられる。
ランダムポリヌクレオチドを加熱によって変性させることができる。当業者は、二本鎖の核酸を完全に変性させるのに必要な条件を決定することができる。好ましくは 80℃から 100℃、より好ましくは、温度は 90℃から 96℃の温度である。ポリヌクレオチドを変性させるために使われうる他の方法は、圧力（36）ならびに pH を含む。
ポリヌクレオチドを冷却によって再アニーリングすることができる。好ましくは温度は 20℃から 75℃の間、より好ましくは、温度は 40℃から 65℃の間である。平均わずか4個の連続する塩基の相同性に基づいて高頻度のクロスオーバー（crossover）を必要とするならば、方法は、より困難になるが、低いアニーリング温度を用いて組換えを強制することができる。産生される立体構造の再生は、一本鎖ポリヌクレオチドの集団間の相同性の程度に依存するであろう。
【０３２７】
再生は、ポリエチレングリコール（「PEG」）あるいは塩の添加によって加速されうる。塩濃度は、好ましくは0 mMから200 mMまで、より好ましくは塩濃度は10 mMから100 mMまでである。塩はKClあるいはNaClでありうる。PEGの濃度は、好ましくは0 ％から20 ％まで、より好ましくは5％から10％までである。
アニーリングされたポリヌクレオチドは、次に、核酸ポリメラーゼ及びdNTP（即ち、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTP）の存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼはクレノー断片、Taqポリメラーゼ、あるいは当技術分野で既知の任意の他のDNAポリメラーゼでありうる。
集合のために用いられうるアプローチは、クロスオーバーが得られる最小程度の相同性に依存している。もし、同一な領域が大きいときは、Taqポリメラーゼを 45℃から 65℃の間のアニーリング温度で使うことができる。もし、同一な領域が小さいときは、クレノーポリメラーゼを 20℃から 30℃の間のアニーリング温度で使うことができる。当業者は、クロスオーバーが達成された数を増加させるために温度を変化させることができる。
アニーリングに先立って、アニーリングと同時に、又はアニーリングの後に、ポリメラーゼをランダムポリペプチドに添加することができる。
ポリメラーゼ存在下での変性、再生及びインキュベーションのサイクルとは、本明細書において核酸のシャッフリング又は集合を指す。このサイクルは所望の回数繰り返される。好ましくは、サイクルは2回から50回繰り返され、より好ましくは、シークエンスは10回から40回繰り返される。
その結果得られた核酸は、約 50 bpから約 100 kbpまでの、より大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、好ましくは、より大きな該ポリヌクレオチドは 500 bpから 50 kbpまでである。
【０３２８】
このより大きなポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドと同じ大きさをもつポリヌクレオチドの数多くのコピーを直列に含みうる。この鎖状体状（concatemeric）のポリヌクレオチドは次に、鋳型ポリヌクレオチドの単一コピーへと変性する。この結果、鋳型ポリヌクレオチドとほぼ同じ大きさをもつポリヌクレオチドの集団ができると考えられる。集団は混合された集団であると考えられ、同一の領域及び異種の領域をもつ一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドが、シャッフリングの前に、鋳型ポリヌクレオチドに加えられる。
これらのポリヌクレオチドは、次に適当なベクター及び細菌の形質転換に用いるライゲーション混合物へクローニングされる。
鎖状体の消化よりはむしろPCR（米国特許第4,683,195号及び米国特許第4,683,202号）を含む種々の方法によって、クローニングの前に単一のポリヌクレオチドを増幅することにより、単一のポリヌクレオチドがより大きな鎖状体状のポリペプチドから得られうることが予測される。
クローニングのために使用されるベクターは、所望の大きさのポリヌクレオチドが受容されるならば、それほど重要ではない。もし、特定のポリヌクレオチドの発現が望ましいのであれば、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させるために、クローニングの媒体は、ポリヌクレオチドの挿入部位の隣に転写シグナル及び翻訳シグナルをさらに含むべきである。好ましいベクターには、pUCシリーズやpBRシリーズのプラスミドが含まれる。
その結果得られた細菌集団は、ランダム変異を有する多くの組換えポリヌクレオチドを含むと考えられる。この混合集団は、所望の組換えポリヌクレオチドを同定するために、試験されうる。選択の方法は、所望のポリヌクレオチドに依存すると考えられる。
【０３２９】
例えば、リガンドへの増大された結合効率をもつタンパク質をコードするポリヌクレオチドが望ましいならば、集団又はライブラリーにおいてポリヌクレオチドそれぞれの部分により発現されたタンパク質は、当技術分野で既知の方法（すなわち、パニングやアフィニティクロマトグラフィ）によって、リガンドへの結合能について試験されうる。もし、増大された薬剤耐性をもつタンパク質をコードするポリヌクレオチドが望ましいならば、集団又はライブラリーにおけるそれぞれのポリヌクレオチドによって発現されたタンパク質は、宿主生物に薬剤耐を付与する性能について試験されうる。所望のタンパク質の知識をもつ当業者は、集団を容易に試験して、所望の特性をタンパク質に付与するポリヌクレオチドを同定することができる。
当業者が、タンパク質の断片を融合タンパク質としてファージ表面に発現させる、ファージディスプレイシステム（Pharmacia, Milwaukee WI）を使えることが予測される。組換えDNA分子は、ある部位でファージDNAにクローニングされ、その結果、その一部が組換えDNAによってコードされた融合タンパク質の転写が起こる。組換え核酸分子を含むファージは細胞の中で複製及び転写をうける。融合タンパク質のリーダー配列は、融合タンパク質の輸送をファージ粒子の先端に向ける。従って、組換えDNA分子によって部分的にコードされた融合タンパク質は、上記の方法による検出及び選択のためにファージ粒子の上に提示される。
【０３３０】
さらに、核酸シャッフリングの多数のサイクルは、亜集団が所望の組換えタンパク質をコードするDNAを含むような、最初の集団の亜集団由来のポリヌクレオチドと共に行われることが予測される。このようにして、より高い結合親和性又は酵素的活性を有するタンパク質が達成される。
亜集団から、アミノ酸変異につながらない核酸の全ての変異体を除くために、核酸シャッフリングの多数のサイクルが、野生型ポリヌクレオチド及び最初又はその後の回の核酸シャッフリング由来の核酸の亜集団の混合物と共に行われることが更に予測される。
精製された形態における核酸の任意の供給源が、開始核酸として使用されうる。従って、過程は、DNA又はRNAが一本鎖又は二本鎖でありうる、DNA又はメッセンジャーRNAを含むRNAを利用することができる。加えて、それぞれの一本鎖を含むDNA-RNAハイブリッドも使用することができる。核酸の配列は、変異される核酸配列の大きさに依存して、さまざまな長さでありうる。好ましくは、特異的な核酸の配列は50塩基対から50000塩基対である。関心対象のタンパク質をコードする核酸を含むベクター全体が、本発明の方法において使用されうることが予測される。
核酸は、任意の供給源、たとえばpBR322のようなプラスミド、クローニングされたDNAもしくはRNA、又は細菌、酵母、ウイルス、及び植物もしくは動物のような高等生物を含む、任意の供給源由来の天然のDNAもしくはRNAから得られうる。DNA又はRNAを、血液又は組織材料から抽出することもできる。鋳型ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド連鎖反応（PCR、米国特許第4,683,202号及び米国特許第4,683,195号）を用いて増幅することにより得ることができる。又はポリヌクレオチドは、細胞中に存在するベクター中に存在しうり、十分な核酸は、当技術分野で既知の方法による細胞の培養及び細胞からの核酸の抽出によって得られうる。
【０３３１】
本方法によって、任意の特異的な核酸配列を、ハイブリッド集団を作製するために用いることができる。特定の核酸配列のハイブリッド配列の小さな集団が存在している又は、本方法の前に作製されることだけが必要である。
変異をもつ特定の核酸配列の最初の小さな集団は、多くの異なった方法で作製される。変異はエラープローンPCRで作製されうる。エラープローンPCRは、長い配列にわたって低いレベルでの点変異をランダムに導入するために、低忠実度の重合条件を用いる。あるいは、オリゴヌクレオチドによる変異誘発によって、鋳型ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。オリゴヌクレオチドによる変異誘発において、ポリヌクレオチドの短い配列が制限酵素消化を用いてポリヌクレオチドから除去され、様々な塩基が本来の配列から変化している合成ポリヌクレオチドで置き換えられる。ポリヌクレオチド配列は、また、化学的突然変異誘発によっても変化されうる。化学的突然変異誘発は、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシアミン、ヒドラジン、又はギ酸を含む。ヌクレオチド前駆体の類似体である他の薬剤は、ニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、又はアクリジンを含む。一般的にこれらの薬剤は、それにより配列が変異されるヌクレオチド前駆体の代わりに、PCR反応に加えられる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのようなインターカレーション試薬もまた使用されうる。ポリヌクレオチド配列のランダム突然変異誘発は、また、X線又はUV光の照射によって達成されうる。一般的に、このように突然変異誘発されたプラスミドポリヌクレオチドを大腸菌に導入し、ハイブリッドプラスミドのプール又はライブラリーとして増殖させる。
又は、同一の遺伝子の異なった対立遺伝子、又は異なった関連する種由来の同一遺伝子（すなわち同族遺伝子）からなるという点で、特定の核酸の小さな混合集団は天然にも見出だされうる。又はそれらは、一つの種の中に見られる関連した遺伝子、例えば、免疫グロブリン遺伝子でありうる。
【０３３２】
一旦特定の核酸配列の混合された集団が作製されると、又は当技術分野でよく知られた技術を用いて、ポリヌクレオチドを直接用いるか、適当なクローニングベクターに挿入することができる。
ベクターの選択は、本発明の方法において使用されるポリヌクレオチド配列の大きさや宿主細胞に依存している。本発明における鋳型はプラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルスなど）、又はその中の選ばれた一部分（例えば、コートタンパク質、スパイクグリコタンパク質、キャプシドタンパク質）でありうる。例えば、変異される特定の核酸配列がより大きい場合には、大きなポリヌクレオチドを安定に保持することのできるベクターであるために、コスミド及びファージミドが好ましい。
もし、特定の核酸配列の混合された集団をベクターにクローニングした場合、各ベクターを一つの宿主細胞に挿入し、その宿主細胞にベクターを増幅させることにより、クローンとして増幅することができる。核酸配列の絶対数が増大してもハイブリッドの数は増大しないので、これは、クローン的な（clonal）増幅とよばれる。有用性を、発現されたポリペプチドをスクリーニングすることで容易に決定することができる。
【０３３３】
本発明のDNAシャッフリング法を、未知の配列のプールにおいて盲目的に行うことができる。オリゴヌクレオチドの再集合混合物（再集合される配列に対して相同的な末端を有する）を添加することで、任意の配列混合物を、任意の特定の部位において、別の配列混合物のなかに組み込むことができる。従って、合成オリゴヌクレオチド、PCRポリヌクレオチド又はたとえ遺伝子全体の混合物でも、規定の部位において別の配列ライブラリーの中に混合することができると予想される。一つの配列（混合物）の挿入は、鋳型の他の部位での配列の挿入に依存しない。それゆえ、組換えの程度、必要な相同性、及びライブラリーの多様性は、再集合されたDNAの長さに沿って独立してかつ同時に変化することができる。
二つの遺伝子を混合するこのアプローチは、ネズミのハイブリドーマ由来の抗体をヒト化するために有用でありうる。二つの遺伝子の混合、又は代替的な配列の遺伝子への挿入のアプローチは、例えば、インターロイキンI、抗体、tPA、及び成長ホルモンなど、治療的に使用される任意のタンパク質に対して有用でありうる。アプローチは、また、タンパク質の発現を増加させるために、又は発現の特異性を変化させるために、任意の核酸、例えば、遺伝子上のプロモーターもしくはイントロン、又は31非翻訳領域もしくは51非翻訳領域に対して有用でありうる。
シャッフリングには、多様性の領域を分けている相同的な領域の存在が必要である。骨格様タンパク質構造は、特にシャッフリングには適しうる。保存された骨格は、特異的結合を媒介する比較的制限されないループを示す一方で、自己会合による全体の折り畳み構造を決定する。このような骨格の例としては、当技術分野で公知の免疫グロブリンβバレル構造及び4-ヘリックスバンドルがあげられる。このシャッフリングは、結合のための変異配列の種々の組み合わせをもつ、骨格様タンパク質を作製するのに使用されうる。
【０３３４】
“インビトロシャッフリング”
いくつかの標準的遺伝子交配と同等のことがインビトロシャッフリングによってもまた実施されうる。例えば、「分子戻し交配」を関心対象の変異に関する選択の際ハイブリッド核酸を野生型核酸と繰り返し混合させることにより実施することができる。伝統的育種と同様に本アプローチを、異なる供給源由来の表現型を、選択したバックグラウンドと組み合わせるために使用することができる。これは、例えば、選択されていない特性（すなわち免疫原性）に影響を与える中立の変異を除去するために有用である。従って、これはタンパク質の変異が増大された生物学的活性に関与するかどうかを判定するために有用であることができ、これはエラープローン変異誘発法又はカセット変異誘発法によっては達成することができない利点である。
大型機能的遺伝子を、小型ランダムポリヌクレオチドの混合物から正確に集合させることができる。本反応は化石の高度に断片化されたDNAから遺伝子を再集合させるために有用でありうる。更に、化石由来のランダムな核酸断片は関連する種由来の類似遺伝子由来のポリヌクレオチドと組み合わされうる。
本発明の方法が、様々な研究および診断応用のために必要とされるような一つの細胞からの全ゲノムのインビトロ増幅のために使用されうることもまた考えられる。PCRによるDNA増幅は、現実的には約 40 kbの長さに限定される。例えば、大腸菌のゲノム（5,000 kb）などの全ゲノムのPCR増幅は、125個の 40 kbポリヌクレオチドを生じる約250個のプライマーを必要とすると考えられる。このアプローチは、十分な配列データが得られないために現実的ではない。一方、セクシュアルPCRを用いたゲノムのポリヌクレオチドのランダム作製及びその後の小さなポリヌクレオチドのゲル精製は、多数の潜在的プライマーを提供すると考えられる。このランダムな小さいポリヌクレオチド混合物をPCR反応においてプライマーとして単独で又は鋳型として全ゲノム DNA をともに用いる使用は、ゲノムの多くのコピーを含む単一のコンカテマーの理論的終了点をもつ、逆連鎖反応をもたらすはずである。
【０３３５】
コピー数の100倍の増幅及び 50 kb超のポリヌクレオチドの平均の大きさは、ランダムポリヌクレオチドのみが使用された場合に得られうる。多数のより小さなポリヌクレオチドの重複による、より大きなコンカテマーが作製されると考えられる。合成プライマーを用いて得られた特異的PCR産物の質は、非増幅DNAから得られた産物と区別できないと考えられる。本アプローチががゲノムマッピングにおいても有用であることが期待される。
実施者の判断で、シャッフリングされるべきポリヌクレオチドは、ランダムまたは非ランダムなポリヌクレオチドとして作製されうる。さらに本発明は、より大きなポリヌクレオチドの再集合において構築ブロックとして使用されるポリヌクレオチドモノマーを産生する段階を含む、広範囲のポリヌクレオチドのサイズおよび型に適用可能なシャッフリング法を提供する。例えば、構築ブロックは遺伝子の断片であることができ、又は遺伝子全体もしくは遺伝子経路またはそれらの任意の組み合わせからなることもできる。
【０３３６】
“インビボシャッフリング”
インビボシャッフリングの態様においては、少なくとも二つの異なる核酸配列が各宿主細胞内に存在するような条件下で、特定の核酸配列の混合集団が細菌性または真核性の細胞内に導入される。ポリヌクレオチドを、様々な異なる方法で宿主細胞に導入することができる。宿主細胞を、当技術分野において既知である方法、例えば、塩化カルシウム処理を用いて、より小型のポリヌクレオチドで形質転換することが可能である。ポリヌクレオチドがファージゲノムに挿入されているならば、宿主細胞は特定の核酸配列を有する組換えファージゲノムを用いてトランスフェクトされうる。又は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、微粒子銃（biolistics）、接合などを用いて、核酸配列を宿主細胞に導入することができる。
一般的には本態様において、宿主細胞内で安定に配列を複製する能力を有するベクター内に特異的核酸配列が存在すると考えられる。さらに、ベクターは、ベクターを有する宿主細胞が選択されうるためのマーカー遺伝子をコードするであろうことが考えられる。これは変異した特異的核酸配列が宿主細胞への導入後に回収されうることを確実にする。しかしながら、特異的核酸配列の全混合集団がベクター配列上に存在する必要がないことが考えられる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入後に各宿主細胞がその中に少なくとも一つの特異的核酸配列を有する一つのベクターを含むことを確実にするために、むしろ十分な数の配列だけがベクターにクローニングされる必要がある。ベクターにクローニングされた特異的核酸配列の集団のサブセットを有するよりもむしろ、このサブセットがが既に安定に宿主細胞に組み込まれうることもまた考えられる。
【０３３７】
同一領域を有する二つのポリヌクレオチドが宿主細胞に挿入される場合、相同組換えが二つのポリヌクレオチド間で生じることが見出された。二つの変異型特異的核酸配列間でのそのような組換えは、ある状況では二重又は三重ハイブリッドの作製をもたらすと考えられる。
いくつかの変異型特異的核酸配列が直鎖状核酸分子上に存在するならば、組換え頻度が増加することもまた見出された。従って、好ましい態様においては、いくつかの特異的核酸配列が直鎖上ポリヌクレオチド上に存在する。
形質転換後、宿主細胞形質転換体は、所望の品質を有する変異型特異的核酸配列を含む宿主細胞形質転換体を同定するための選択下に置かれる。例えば、ある特定の薬剤への耐性の増加が望ましいならば、形質転換された宿主細胞が特定の薬剤の増加濃度に供されうり、薬剤耐性の増加を賦与することができる変異型タンパク質を作製する形質転換体が選択されるであろう。ある特定のタンパク質が受容体に結合する能力の増強が望ましいならば、その後形質転換体からタンパク質発現を誘導することが可能であり、結果として生じるタンパク質は、リガンドに対する結合の増強を示す変異型亜集団を同定するために当技術分野において既知である方法によりリガンド結合アッセイにより評価される。又はタンパク質は適切なプロセシングを確実にするために別の系で発現することができる。
【０３３８】
目的の特性を有する最初の組換え型特異的核酸配列（娘配列）の亜集団が同定されると、それらは続いて別の回の組換えに供される。
二サイクル目の組換えでは、組換え型特異的核酸配列は本来の変異型の特異的核酸配列（親配列）とシャッフリングされてもよく、サイクルは上述の通り繰り返される。このようにして、増強された特性を有する又は増強された特性を有するタンパク質をコードする第二の組換え型特異的核酸配列のセットが同定されうる。このサイクルは望ましいならば多数回繰り返されうる。
二番目又は引き続く組換えサイクルにおいて戻し交配が実施されうることもまた考えられる。少なくとも一つの野生型核酸配列および変異型核酸配列が形質転換後の同一の宿主細胞内に存在するような分子戻し交配は目的の特異的核酸配列を多数の野生型配列とシャッフリングすることにより実施されうる。野生型特異的核酸配列との組換えは免疫原性等の選択されていない特性に影響を与えうるそれらの中立変異を除去し、選択された特性は除去しない。
本発明の別の態様においては、第一回において特異的核酸配列の亜集団は、宿主細胞への導入前にそのPCR増幅を遅くまたは停止することにより、より小さなポリヌクレオチドとして作製することができる。他の配列と相同組換えを起こすようにポリヌクレオチドの大きさはいくつかの他の配列と同一である領域を含む程度には大きくなくてはならない。ポリヌクレオチドの大きさは 0.03 kbから 100 kbの範囲であり、より好ましくは 0.2 kbから 10 kbの範囲であると考えられる。引き続く回において以前の回から選択された配列以外の全ての特異的核酸配列は、宿主細胞への導入前にそのPCRポリヌクレオチドを作製するために使用されてもよい。
【０３３９】
より短いポリヌクレオチド配列は一本鎖又は二本鎖であることができる。配列が本来一本鎖でありそれが二本鎖になったならば、それらは、宿主細胞への導入前に、熱、化学物質、又は酵素を用いて変性することができる。核酸の鎖を分離するのに適した反応条件は当技術分野においてよく知られている。
本過程の段階を無限に繰り返すことができ、達成可能なありうるハイブリッドの数によってのみ制限されている。ある回数のサイクルの後、全ての潜在的なハイブリッドは達成されてしまい、そしてさらなるサイクルは冗長である。
ある態様において、同一の変異型鋳型核酸配列が繰り返し組換えられ、結果としての組換え体は目的に対して選択される。
したがって、変異型鋳型核酸配列の初期のプール又は集団は、大腸菌等の微生物にて複製可能なベクターにクローニングされる。大腸菌で自律的複製が可能である限りは特定のベクターが必須であるわけではない。好ましい態様においては、ベクターは、ベクターに連結された変異型特異的核酸配列によりコードされるタンパク質の発現及び作製を可能にするように設計されている。ベクターが選択標識をコードする遺伝子を含むこともまた好ましい。
【０３４０】
変異型核酸配列のプールを含むベクター集団が大腸菌宿主細胞に導入される。ベクター核酸配列は、トランスフォーメーション、トランスフェクション、またはファージの場合は感染により導入されてもよい。微生物をトランスフォームするために用いられるベクターの濃度は、多数のベクターが各細胞に導入される程度のものである。細胞の中に存在する場合、相同組換えの効率は、相同組換えが様々なベクター間でおこる程度のものである。これは、本来の親変異型配列と異なる変異の組み合わせを有する（娘）ハイブリッドの作製につながる。
その後宿主細胞はクローン状態で複製され、そしてベクターに存在する標識遺伝子により選択される。プラスミドを有するそれらの細胞のみが選択下で増殖すると考えられる。
ベクターを含む宿主細胞は、続いて好ましい変異が存在するかを試験される。そのような試験は、例えば、選択される遺伝子が改良型薬剤耐性遺伝子であるならば、細胞を選択圧下に置くことからなってもよい。もしベクターが変異型核酸配列によりコードされるタンパク質の発現を可能にするならば、そのときはそのような選択は、そのようにコードされるタンパク質を発現させてタンパク質を単離し、及び、例えば、より効率的に目的のリガンドに結合するかを決定するためにタンパク質を試験することを含んでもよい。
目的の特性を与えるある特定の娘変異型核酸配列が同定されると、既にベクターに結合された核酸配列またはベクターから分離された核酸配列が単離される。この核酸は、それから最初の親核酸集団とシャッフリングされ、サイクルが繰り返される。
本方法により増強された目的特性を有する核酸配列が選択されうることが示されている。
【０３４１】
別の態様においては、第一世代のハイブリッドは細胞内に維持され、親変異型配列が再び細胞に添加される。従って、態様Iの最初のサイクルは上述されたように実施される。しかしながら、娘核酸配列が同定された後は、これらの配列を有する宿主細胞は保持される。
変異型特異的核酸配列の親集団は、ポリヌクレオチド又は同一のベクターにクローニングされた形で、すでに娘核酸を含む宿主細胞に導入される。細胞内で組換えが生じることは可能であり、次世代の組換え体、即ち、孫娘が上述された方法により選択される。
このサイクルは目的とする特性を有する核酸又はペプチドが得られるまで多数回にわたり繰り返すことが可能である。引き続くサイクルでは、好ましいハイブリッドに添加される変異型配列の集団は親ハイブリッド又は他のいかなる引き続く世代に由来してもよい。
別の態様において、本発明は、如何なる中立変異も除去するために得られた組換え特異的核酸の「分子」戻し交配を実施する方法を提供する。中立変異は、核酸又はペプチドに目的とする特性を付与しない変異である。しかしながら、そのような変異は、核酸又はペプチドに望ましくない特性を与えてもよい。従って、そのような中立変異を除去することが望ましい。本発明の方法は、それを実施する方法を提供する。
本態様において、目的とする特性を有するハイブリッド核酸が実施態様の方法で得られた後、核酸、その核酸を有するベクター、又はそのベクターと核酸を含む宿主細胞が単離される。
核酸又はベクターは、それから大過剰の野生型核酸とともに宿主細胞に導入される。ハイブリッドの核酸及び野生型配列の核酸は、組換えを行うことが可能である。結果として生じる組換え体は、ハイブリッド核酸と同じ選択下に置かれる。目的とする特性を保持した組換え体のみが選択されるであろう。目的とする特性を与えない如何なるサイレント変異も野生型DNAとの組換えを通して失われるであろう。このサイクルは全てのサイレント変異が除去されるまで多数回繰り返すことができる。
従って、本発明の方法は、不必要な又はサイレントな変異を除去するために分子戻し交配において使用することができる。
【０３４２】
エキソヌクレアーゼ媒介性シャッフリング
特定の態様において、本発明は少なくとも二つのポリヌクレオチドをシャッフリング、集合、再集合、組換え、及び/又はライゲーションさせ一つの子孫ポリヌクレオチド（例えば、ポリペプチド又は遺伝子経路を作製するために発現されうるキメラ子孫ポリヌクレオチド）を形成する方法を提供する。ある特定の態様において、二本鎖ポリヌクレオチド末端（例えば、ハイブリダイゼーション相手として相互にハイブリダイズされた二つの一本鎖配列）がエキソヌクレアーゼにより処理され、二本の鎖の一本からヌクレオチドを遊離させ、望ましいならば、残りの鎖が別の相手へのハイブリダイゼーションを達成するために使用されうるように、残りの鎖を本来の相手から分離させる。
ある特定の局面において、二本鎖ポリヌクレオチド末端（ポリヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド配列の一部であるかそれに接続されていてもよい）がエキソヌクレアーゼ活性供給源に供される。利用可能なエキソヌクレアーゼ活性供給源は、3'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、5'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、3'エキソヌクレアーゼ活性及び5'エキソヌクレアーゼ活性両方を有する酵素、及びそれらの任意の組み合わせであってもよい。エキソヌクレアーゼを、直鎖状二本鎖ポリヌクレオチドの片側又は両側の末端から、及び2つを上回る末端を有する分鎖状ポリヌクレオチドの1つ〜全ての末端から、ヌクレオチドを遊離させるために用いることができる。この遊離作用の機構は、末端ヌクレオチドの酵素触媒性加水分解からなると考えられており、時間依存的様式で進行させることが可能であり、酵素過程の進行の実験的制御を可能にする。
【０３４３】
対照的に、二本鎖ポリヌクレオチドの作用対を一本鎖ポリヌクレオチドに融解できるように、（例えば、温度、pH、及び/又は塩濃度条件を変えることにより）作用試料を変性（又は「融解」）条件に供する段階からなる非酵素的段階が、ポリヌクレオチド構築ブロックをシャッフリング、集合、再集合、組換え、および/またはライゲーションさせるために使用されうる。シャッフリングに関しては、一本鎖ポリヌクレオチドが、異なるハイブリダイゼーション相手とのアニーリングにある程度関与することが望ましい（即ち、かつ変性段階前の以前の相手との排他的再アニーリングに復帰するだけでなく）。しかしながら、反応器の中に以前のハイブリダイゼーション相手が存在することは、一本鎖ポリヌクレオチドが以前の相手と再アニーリングし本来の二本鎖ポリヌクレオチドを再形成することを妨害せず、むしろ時には促進しうる。
二本鎖ポリヌクレオチド構築ブロックを変性に供し、続いてアニーリングする段階からなるこの非酵素的シャッフリング段階と対照的に、本発明は変性を必要としないエキソヌクレアーゼに基づくアプローチをさらに提供し、むしろアニーリング（即ち、非変性）状態における変性条件の回避及び二本鎖ポリヌクレオチド基質の維持が、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼIIIおよびレッドα（red  alpha）遺伝子産物）の作用に必要な条件である。更に対照的に、他の一本鎖ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一本鎖ポリヌクレオチド配列の作製は、ハイブリダイゼーション相手の一方における共有結合開裂の、およびそれ故の配列破壊の結果である。例えば、エキソヌクレアーゼIII酵素は（ポリヌクレオチド鎖の共有結合加水分解を達成するために）一つのハイブリダイゼーション鎖における3'末端ヌクレオチドの酵素的遊離に用いられうる。これは、残りの一本鎖が新しい相手にハイブリダイゼーションするために有利である（その以前の相手は共有結合開裂に供されているため）。
【０３４４】
更なる例示のために、特定のエキソヌクレアーゼ、即ち、エキソヌクレアーゼIIIが3'エキソヌクレアーゼの一例としてここにおいて提供されている。しかしながら、5'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び3'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含み、また未発見の酵素及び未開発の酵素を含む他のエキソヌクレアーゼもまた使用されうる。より最適な割合及び/又はより高度に特異的な活性を有し、及び/又は望ましくない活性をより多く欠如した酵素が、特に開示された本アプローチに関して、同定され、最適化され（例えば、指向進化により操作され）、又は同定及び最適化されることができることが特に評価される。事実、本発明は、このようなデザイナー（designer）酵素の発見及び/又は開発を促進しうると期待される。総合すると、本発明は、現在利用可能な種々のエキソヌクレアーゼ酵素と同様に未発見の酵素および未開発の酵素を用いて実施されうる。
エキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ作用は、平滑又は5'突出型のいずれかの作用二本鎖ポリヌクレオチド末端を必要とし、エキソヌクレアーゼ作用は、3'末端ヌクレオチドの酵素的遊離からなり、エキソヌクレアーゼ作用が進行するにつれますます長くなる一本鎖5'末端を残す（図1を参照されたい）。本アプローチにより作製された任意の5'突出は、ハイブリダイゼーションさせるのに十分な相同性を有する別の一本鎖ポリヌクレオチド配列（また一本鎖ポリヌクレオチド又は部分的二本鎖ポリヌクレオチド突出末端であってもよい）とハイブリダイズさせるために使用されてもよい。他の一本鎖配列にハイブリダイズさせるこれらのエキソヌクレアーゼIII作製一本鎖配列（例えば、5'突出における）の能力が、二つ又はそれ以上のポリヌクレオチドのシャッフリング、集合、再集合、及び/又はライゲーションを可能にする。
【０３４５】
さらに、二本鎖ポリヌクレオチド末端を保護でき、又は必要に応じて利用可能なエキソヌクレアーゼの所望の酵素作用感受性にできることが認識される。例えば、3'突出を有する二本鎖ポリヌクレオチド末端は、エキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ作用感受性ではない。しかしながら、以下の様々な方法により、エキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ作用感受性にされうる。例えば、それはポリメラーゼ処理により平滑化されうり、平滑末端又は、5'突出を作製するために切断されうり、平滑末端又は5'突出を作製するために別の二本鎖ポリヌクレオチドと連結（ライゲーション又はハイブリダイゼーション）されうり、平滑末端又は、5'突出を作製するために一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションされうり、又は、任意の種々の方法により修飾されうる。
ある局面において、エキソヌクレアーゼは直鎖状二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に作用し、完了、ほぼ完了、又は部分的な完了まで進行することが可能であってもよい。エキソヌクレアーゼ作用が完了まで進むことができる場合、「ランデブー点（rendezvous point）」（ポリヌクレオチドの中間点付近のどこかでありうる）と考えられる方向へポリヌクレオチドの中間領域に沿って各5'突出の長さが伸長すると考えられる。最終的には、本来の二本鎖ポリヌクレオチドの各々約半分の長さの（分離されうる）一本鎖ポリヌクレオチドの作製がもたらされうる（図1を参照されたい）。又はエキソヌクレアーゼ媒介性反応は完了まで進行する前に終了されうる。
従って、本エキソヌクレアーゼ媒介性アプローチはポリヌクレオチド構築ブロックのシャッフリング、集合及び/又は再集合、組換えならびにライゲーションのために利用可能であり、ポリヌクレオチド構築ブロックは10塩基の長さ又は数十塩基の長さ、又は数百塩基の長さ、又は数千塩基の長さ、又は数万塩基の長さ、又は数十万塩基の長さ、又は数百万塩基の長さ、又はそれ以上でさえあってもよい。
【０３４６】
本エキソヌクレアーゼ媒介性アプローチは大腸菌（E.Coli）エキソヌクレアーゼIIIの二本鎖DNA特異的エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性の作用に基づく。エキソヌクレアーゼIIIの基質は二本鎖ポリヌクレオチドを断片化させることにより作製されうる。断片化は、機械的手段（例えば、せん断、超音波処理等）、（例えば、制限酵素を用いた）酵素的手段、及びそれらの任意の組み合わせによって達成されうる。より大きなポリヌクレオチド断片は、また、ポリメラーゼ媒介性合成によっても作製されうる。
エキソヌクレアーゼIIIは、四種の既知の活性、エキソデオキシリボヌクレアーゼ（この中では代替的にエキソヌクレアーゼと呼ぶ）、RNaseH、DNA-3'-ホスファターゼ、及びAPエンドヌクレアーゼを有する大腸菌xthA遺伝子産物である28Kの単量体酵素である。エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性は二本鎖DNAに特異的である。作用機構には、ヌクレオシド5'リン酸及び残存一本鎖の形成を伴う、3'末端から連続的に5'方向に向かってのDNAの酵素的加水分解が関与すると考えられている。酵素は、一本鎖DNA、一本鎖RNA、又は二本鎖RNAに対して効率的な加水分解は示さないが、DNA-RNAハイブリッド中のRNAを分解し、ヌクレオシド5'リン酸を放出する。本酵素は、また、DNA上の3'ホスホモノエステル基から特異的に無機リン酸を放出するが、RNA又は短いオリゴ核酸からは放出しない。これらの基の除去により末端は、DNAポリメラーゼ作用のためのプライマーに変換される。
【０３４７】
非確率的合成ライゲーション再集合
ある局面において、本発明は、合成ライゲーション再集合（SLR）と呼ばれる非確率的方法を提供し、これは、核酸構築ブロックがランダムにシャッフリング、又はライゲーション、又はキメラ化されずむしろ非確率的に集合されるという点を除けば、確率的シャッフリングにある程度関連している。
特に目立つ差異は、本SLR法はシャッフリングされるポリヌクレオチド間の高レベルの相同性の存在に依存しないことである。対照的に、以前の方法、特に以前の確率的シャッフリング法は、シャッフリングされるポリヌクレオチド間の、特に、結合部位間における、高レベルの相同性の存在を必要とする。従って、これらの以前の方法は、本来の祖先分子の再作製を有利にし、多数の新規子孫キメラの作製、特に全長子孫の作製にはやや最適である。一方本発明は、10100以上の異なるキメラからなる子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率的に作製するために使用することができる。おそらくSLRは101000を上回る（上限の見こみはなく）の異なる子孫キメラからなるライブラリーを作製するために使用することさえできる。
従って、ある局面において、本発明は、非確率的で、設計により選択された全集合の順序を有する最終的なキメラ核酸分子のセットを作製する方法を提供し、この方法は、設計により利用可能な互いに互換的にライゲーションされうる（mutually compatible ligatable）末端を有する多数の特定の核酸構築ブロックを作製する段階及び、設計された全集合の順序が達成されるように、これらの核酸構築ブロックを集合させる段階からなる。
【０３４８】
構築ブロックを予め決定された順序で結合させることができるなら、集合されるべき核酸構築ブロックの互いに互換的にライゲーションされうる末端は、この型の集合された順序のために「利用可能」であると考えられる。従って、ある局面において、核酸構築ブロックが結合されうる全集合の順序は、ライゲーション可能末端の設計により特定され、複数の集合段階が使用されるならば、その後核酸構築ブロックが結合されうる全集合の順序は集合段階の連続的な順序によっても特定される。図4のパネルCは、5個の核酸構築ブロックに関する設計された（非確率的な）全集合の順序を達成するための二つの連続した段階からなる例示的集合方法を図示している。本発明の好ましい態様においては、アニーリングされた構築部分はリガーゼ（例えば、T4DNAリガーゼ）等の酵素で処理され、構築部分の共有結合を達成する。
好ましい態様においては、最終的なキメラ核酸分子の子孫セットを作製する基礎として働く祖先核酸鋳型セットの配列解析において核酸構築ブロックの設計が得られる。従って、これらの祖先核酸鋳型は変異誘発される、即ち、キメラ化またはシャッフリングされる、核酸構築ブロックの設計を助ける配列情報の供給源として働く。
一つの例示において、本発明は、関連遺伝子ファミリー及びそれらがコードする関連産物ファミリーをキメラ化することを提供する。ある特定の例示において、コードされた産物は酵素である。本発明の局面と一致して変異誘発されうる酵素ファミリーの代表的な一覧として、以下の酵素及びその機能が言及されうる。
【０３４９】
１  脂肪分解酵素/エステル分解酵素
a.  エステル（脂質）/チオエステルのエナンチオ選択的（enantioselective）加水分解
1）ラセミ混合物の分割
2）メソジエステルからの光学活性を有する酸又はアルコールの合成
b.  選択的合成
1）炭水化物エステル部位特異的加水分解
2）環状二級アルコールの選択的加水分解
c.  光学活性を有するエステル、ラクトン、酸、アルコールの合成
1）活性型/非活性型エステルのトランスエステル化
2）相互エステル化
3）ヒドロキシエステルからの光学活性ラクトン
4）無水化合物の部位選択的及びエナンチオ選択的な開環
d.  界面活性剤
e.  固形脂肪/液体脂肪変換
f.  チーズ熟成
２  タンパク質分解酵素
a.  エステル/アミド合成
b.  ペプチド合成
c.  アミノ酸エステルラセミ混合物の分離
d.  非天然アミノ酸合成
e.  界面活性剤/タンパク質加水分解
３  グリコシダーゼ/グリコシル転移酵素
a.  糖/重合体合成
b.  単糖類、二糖類及び多糖類形成のためのグリコシド結合の切断
c.  複合多糖類合成
d.  UDP-ガラクトシル転移酵素を用いたグリコシド合成
e.  二糖類、グリコシルフルオリド、アリールガラクトシドのトランスグリコシル化
f.  多糖類合成におけるグリコシル転移
g.  β−グルコシルスルホキシドのジアステレオ選択的切断
h.  不斉グリコシル化
i.  食物加工
j.  紙加工
【０３５０】
４  脱リン酸化酵素/リン酸化酵素
a.  リン酸エステルの合成/加水分解
1）部位選択的、エナンチオ選択的なリン酸化
2）リン酸エステル導入
3）リン脂質前駆体合成
4）制御されたポリヌクレオチド合成
b.  生物的分子活性化
c.  保護基なしの選択的リン酸結合形成
５  モノ/ジオキシゲナーゼ
a.  非活性型有機基質の直接的酸化機能付与（oxyfunctionalization）
b.  アルカン、芳香族、ステロイドのヒドロキシル化
c.  アルケンのエポキシ化
d.  エナンチオ選択的スルホ酸化（sulphoxidation）
e.  部位選択的及び立体選択的バイエル-ビリジャー（Bayer-Villiger）酸化
６  ハロペルオキシダーゼ
a.  ハロゲンイオンの求核性部位への酸化的付加
b.  次亜ハロゲン酸（hypohalous acid）のオレフィン結合への付加
c.  シクロプロパンの環開裂
d.  活性型芳香族基質のオルト誘導体及びパラ誘導体への変換
e.  1.3ジケトンの2-ハロ誘導体への変換
f.  硫黄および窒素を含有する基質の異原子酸化
g.  エノールアセタート、アルキン、及び活性型芳香環の酸化
７  リグニンペルオキシダーゼ/ジアリールプロパンペルオキシダーゼ
a.  C-C結合の酸化的切断
b.  ベンジルアルコールのアルデヒドへの酸化
c.  ベンジル炭素のヒドロキシル化
d.  フェノール二量体化
e.  ジオール形成のための二重結合のヒドロキシル化
f.  リグニンアルデヒドの切断
【０３５１】
８  エポキシド加水分解酵素
a.  エナンチオ的に純粋な生理活性化合物の合成
b.  エポキシドの部位選択的及びエナンチオ選択的な加水分解
c.  エポキシド形成のためのモノオキシゲナーゼによる芳香族及びオレフィン族のエポキシ化
d.  ラセミエポキシドの分離
e.  ステロイドエポキシドの加水分解
９  ニトリルヒドラターゼ/ニトリラーゼ
a.  脂肪族ニトリルの、カルボキサミドへの加水分解
b.  芳香族、ヘテロ環族、不飽和脂肪族ニトリルの、対応する酸への加水分解
c.  アクリロニトリルの加水分解
d.  芳香族酸、カルボアミド酸、炭素環酸の作製（ニコチンアミド、ピコリンアミド、イソニコチンアミド）
e.  アクリルジニトリルの部位選択的加水分解
f.  α-ヒドロキシニトリル由来のα-アミノ酸
10  アミノ転移酵素
a.  アミノ基のオキソ酸への転移
11  アミダーゼ／アシラーゼ
a.  アミド、アミジン、及びその他のC-N結合の加水分解
b.  非天然アミノ酸の分離及び合成
これらの例示は、本発明のある特定の局面を説明するが、制限を描出するものではなく、また開示された発明の範囲を限定するものではない。
【０３５２】
従って、本発明の一つの局面によると、多数の祖先核酸鋳型配列が一つ又は複数の境界点（demarcation point）を選択するために整列化され、境界点は相同的領域に位置することができ、一つ又は複数の核酸からなり、境界点は少なくとも二つの祖先鋳型により共有される。境界点を、作製されるべき核酸構築ブロックの境界を記述するために使用することができる。従って、祖先分子内で同定および選択された境界点は子孫分子の集合における潜在的なキメラ化点として働く。
好ましくは、利用可能な境界点は、少なくとも二つの祖先鋳型により共有された（少なくとも一つの相同核酸塩基からなる）相同的領域である。より好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも半分の祖先鋳型により共有された相同的領域である。なおより好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも3分の2の祖先鋳型により共有された相同的領域である。更により好ましくは、利用可能な境界点は少なくとも4分の3の祖先鋳型により共有された相同的領域である。更に一層より好ましくは、利用可能な境界点はほとんど全ての祖先鋳型により共有された相同的領域である。なお一層より好ましくは、利用可能な境界点は全ての祖先鋳型により共有された相同的領域である。
核酸構築ブロック設計及び集合されるべき核酸構築ブロックの互いに互換的にライゲーションされうる末端の設計過程は、図6および図7に図示される。示されたように、祖先鋳型セットのアラインメントはいくつかの天然の境界点を明らかにし、これらの鋳型により共有される境界点の同定は、作製され子孫キメラ分子の作製のために使用されるべき構築ブロックを非確率的に決定することのに役立つ。
【０３５３】
好ましい態様において、本発明は、徹底的なライブラリーを作製するために、ライゲーション再集合過程が徹底的に実施されることを提供する。別の言い方をすれば、核酸構築ブロックの全ての可能な順序の組み合わせが、最終キメラ核酸分子のセット中に示される。同時に、特に好ましい態様においては、各組み合わせにおける集合順序（即ち、各最終キメラ核酸の5'から3'配列における各構築ブロックの集合の順序）は設計による（又は非確率的である）。本発明の非確率的性質のために、望ましくない副産物の可能性は大きく減少する。
別の好ましい態様において、例えば、体系的に区分されたライブラリーを作製するために一つずつ体系的にスクリーニングされうる区分を用いてライゲーション再集合過程が体系的に実施されることを本発明は提供する。別の言い方をすれば、連続的段階的集合反応の選択的で適切な使用と組み合わせた、特定の核酸構築ブロックの選択的で適切な使用を通じて、特定のセットの子孫産物が数個の反応容器各々の中で作製される実験的設計が達成されうることを、本発明は提供する。これは体系的な実験及びスクリーニング方法の実施を可能にする。従って、潜在的な非常に多数の子孫分子がより少ない群で体系的に試験されることを可能にする。
【０３５４】
非常に柔軟で更に同時に徹底的ならびに体系的でもある方法でキメラ化を実施する能力があるので、特に、祖先分子間に低いレベルの相同性がある場合、本発明は、多数の子孫分子からなるライブラリー（又はセット）の作製を提供する。本ライゲーション再集合発明の非確率的性質のために作製される子孫分子は、好ましくは設計により選抜される全集合の順序を有する最終キメラ核酸分子のライブラリーからなる。本発明の特に好ましい態様では、そのような作製ライブラリーは、好ましくは103超の異なる子孫分子種、より好ましくは105超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1010超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1015超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1020超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1030超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1040超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1050超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1060超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1070超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは1080超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10100超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10110超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10120超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10130超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10140超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10150超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10175超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10200超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10300超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10400超の異なる子孫分子種、なおより好ましくは10500超の異なる子孫分子種、さらにより好ましくは101000超の異なる子孫分子種からなる。
【０３５５】
ある局面において、記載されたとおり作製された最終的なキメラ核酸分子のセットは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる。ある好ましい態様によると、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、人工遺伝子であってもよい。別の好ましい態様によると、このポリヌクレオチドは、人工遺伝子経路でありうる遺伝子経路である。本発明により作製された一つ及び複数の人工遺伝子は、真核生物（植物を含む）内で実施可能な経路等の、人工遺伝子経路に組み込まれうることを本発明は提供する。
境界点の選択、核酸構築ブロックの大きさおよび数、ならびに結合の大きさおよび設計に関して選択と制御の大きな自由があるので、本発明の力は並はずれていることが認識される。さらに、分子間相同性の必要性が本発明の運用性に対しては非常に緩和されていることが認識される。実際、ほとんど又は全く分子間相同性を有さない領域においても境界点は選択されることさえできる。例えば、コドンゆらぎ（wobble）、即ち、コドンの縮重のために、対応する祖先鋳型に本来コードされるアミノ酸を変更することなく核酸構築ブロックにヌクレオチド置換を導入することができる。又は本来のアミノ酸に関するコードが変更されるようにコドンを変更することができる。分子間相同的な境界点の頻度を増加させ、従って、構築ブロック間での結合数の増加が達成され、その結果より多数の子孫キメラ分子が作製されるようになるように、そのような置換が核酸構築ブロックに導入されうることを本発明は提供する。
【０３５６】
別の例示においては、構築ブロックが作製される段階における合成的性質は、後にインビトロ過程（例えば、変異誘発による）又はインビボ過程（例えば、宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用することによる）において任意に除去されうるヌクレオチド（例えば、コドンもしくはイントロンまたは調節配列であってもよい、例えば、一つ又は複数のヌクレオチド）の設計及び導入を可能にする。利用可能な境界点を作製するという潜在的な恩典に加えて他の多くの理由により、これらの核酸の導入もまた多くの場合望ましくありうることが認識される。
従って、別の態様によると、核酸構築ブロックは、イントロンを導入するために使用されうることを本発明は提供する。従って、機能的イントロンが本発明の人工遺伝子に導入されうることを本発明は提供する。機能的イントロンが本発明の人工遺伝子経路に導入されうることもまた本発明は提供する。従って、一つ（又は複数）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの作製を本発明は提供する。
従って、一つ（又は複数）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの作製もまた本発明は提供する。好ましくは、天然のイントロンが遺伝子スプライシングにおいて機能的に働くのとほぼ同様に、人工的に導入されたイントロンが一つ又は複数の宿主細胞において遺伝子スプライシングに関して機能的である。本発明は、組換え及び/又はスプライシングのために宿主生物に導入されるべき人工イントロン含有ポリヌクレオチドを作製する過程を提供する。
【０３５７】
ここに記載された結合を用いて、祖先分子の中でほとんど又は全く相同性を有さない領域においてキメラ化を達成する能力は特に有用であり、新規遺伝子経路の集合のためには実際必須である。従って、本発明は、合成ライゲーション再集合を用いて新規人工遺伝子経路を作製することを提供する。特定の局面においては、意図された宿主に導入された場合新規遺伝子経路に運用性を附与するために、意図された宿主で実施可能なプロモータ等の調節配列を導入することによりこれは達成される。特定の例示において、本発明は、意図された多数の宿主において（例えば、植物細胞と同様に微生物において）実施可能な新規人工遺伝子経路を作製することを提供する。これは、例えば、最初に意図された宿主で実施可能な調節配列及び別の意図された宿主で実施されうる調節配列からなる多数の調節配列を導入することにより達成される。三番目に意図された宿主種等での遺伝子経路の運用性を達成するために同様の過程が実施されうる。意図された宿主種の数は1から10の間の各整数であることができ、又は代替的に10を超えることができる。又は、例えば、多数の意図された宿主での遺伝子経路の運用性は、多数の意図された宿主における本質的な運用性を有する一つの調節配列の導入により達成されうる。
従って、特定の態様によると、本発明は、核酸構築ブロックが調節配列、特に遺伝子発現の調節配列を導入するために用いられうることを提供する。好ましい調節配列は、人工のもの、ならびに古細菌性、細菌性、真核性（ミトコンドリア性を含む）、ウイルス性、プリオン性及びプリオン様の生物で発見されるものを含むが、これらに限定されない。好ましい調節配列は、プロモーター、オペレーター、及び活性化因子結合部位を含むが、これらに限定されない。従って、本発明は、本発明の人工遺伝子に機能的調節配列を導入してもよいことを提供する。本発明は、また、本発明の人工遺伝子経路に機能的調節配列を導入してもよいことを提供する。
【０３５８】
従って、本発明は、一つ（又は複数）の人工的に導入された調節配列を含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの作製を提供する。従って、本発明はまた一つ（又は複数）の人工的に導入された調節配列を含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの作製を提供する。好ましくは人工的に導入された調節配列は人工ポリヌクレオチドにおいて動作可能に一つ又は複数の遺伝子に連結され、一つ又は複数の宿主細胞において機能的である。
本発明のために利用可能な好ましい細菌性プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびtrpを含む。利用可能な真核性プロモーターは最初期CMV、HSVチミジンキナーゼ、早期及び後期SV40、レトロウイルス由来LTR、およびマウスメタロチオネイン-Iを含む。特定の植物調節配列は、植物又はその部分の用途に依存して、構成的な又はステージ及び/又は組織特異的な、植物における転写の指示において活性なプロモーターを含む。これらのプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター（Guilleyら、1982）等の構成的発現を示すプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター（Coruzziら、1984）等の葉特異的発現のためのプロモーター、グルタミン合成酵素遺伝子由来のプロモーター（Tingeyら、1987）等の根特異的発現のためのプロモーター、アブラナ（Brassica  napus）由来のクルシフェリン（cruciferin）Aプロモーター（Ryanら、1989）等の種子特異的発現のためのプロモーター、ジャガイモ由来クラス1パタチン（Patatin）プロモーター（Rocha-Sasaら、1989、Wenzlerら、1989）等の塊茎特異的発現のためのプロモーター、又はトマト由来ポリガラクツロナーゼ（PG）プロモーター（Birdら、1989）等の果実特異的発現のためのプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０３５９】
本発明のために好ましい他の調節配列は、ターミネーター配列及びポリアデニル化シグナルならびに植物内でそのように機能する任意の配列を含み、その選択は当業者のレベル内である。そのような配列の例は、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリン合成酵素（nos）遺伝子の3'隣接領域である（Bevan、1984）。調節配列は、また、CaMVの35Sプロモーター内に見られるようなエンハンサー配列、及びアルファルファモザイクウイルス（A1MV）RNA4のリーダー配列のようなmRNA安定化配列（Brederodeら、1980）又は類似の様式で機能するその他の任意の配列も含みうる。
本発明を使用して作製された人工遺伝子は、また、他の核酸との組換えのための基質としても働くことができる。同様に、本発明を使用して作製された人工遺伝子経路もまた他の核酸との組換えのための基質としても働くことができる。好ましい例では、人工イントロン含有遺伝子及び組換え相手として働く核酸との間の相同的領域により組換えが促進され、又はそこで組換えがおこる。ある特に好ましい例では、組換え相手は、人工遺伝子又は人工遺伝子経路を含む、本発明により作製された核酸であってもよい。人工遺伝子に人為的に導入された一つ（又は複数）のイントロンに存在する相同的領域により組換えが促進されてもよく、又はそこで組換えがおこってもよい。
【０３６０】
本発明の合成ライゲーション再集合法は多数の核酸構築ブロックを利用し、その各々は好ましくは二つのライゲーション可能末端を有する。各核酸構築ブロック上の二つのライゲーション可能末端は、二つの平滑末端（すなわち各々が0個の核酸の突出を有する）又は好ましくは一つの平滑末端及び一つの突出、またはなおより好ましくは二つの突出であってもよい。
この目的のために利用可能な突出は、3'突出又は5'突出であってもよい。従って、核酸構築ブロックは、一つの3'突出もしくは代替的な一つの5'突出を、もしくは代替的に二つの3'突出を有する、又は別に二つの5'突出を有してもよい。核酸構築ブロックが最終キメラ核酸分子を形成するために集合される全体の順序は、意図的な実験的設計により決定され、ランダムではない。
ある好ましい態様によると、核酸構築ブロックは、二つの一本鎖核酸の化学合成（一本鎖オリゴとも呼ばれる）及び、二本鎖核酸構築ブロックを形成するようにそれらをアニーリングさせるために接触させることにより、作製される。
二本鎖核酸構築ブロックは様々な大きさであることができる。これらの構築ブロックの大きさは実験者の選択により小さくても大きくてもよい。好ましい構築ブロックの大きさは一塩基対（突出は全く含まない）から100,000塩基対（突出は全く含まない）の範囲内である。また他の好ましい大きさの範囲は、一塩基対から10,000塩基対の下限（その間の全整数を含む）及び2塩基対から100,000塩基対の上限（その間の全整数を含む）を有するものとしても与えられる。
【０３６１】
ポリメラーゼに基づく増幅の現在の方法は、数万塩基対ではないとしても数千塩基対長までの二本鎖核酸を高忠実度で作製するために使用することができることが認識される。化学合成（例えば、ホスホラミダイトに基づく）を、数百塩基対長までの核酸を高忠実度で形成するために使用することができる。しかしながら、望ましいならば、数万塩基対ではないとしても、例えば、突出又は粘着末端を用いて、数千塩基対長までの二本鎖核酸を形成させるためにこれらを集合させることができる。
本発明によれば方法の組み合わせもまた使用することができる（例えば、ホスホラミダイトに基づく化学合成及びPCR）。従って、異なる方法で作製された核酸構築ブロックも、また、本発明の子孫分子を作製するために組み合わせて使用されうる。
核酸構築ブロックを作製するための化学合成の使用は本発明において、特に好ましく、そして、手順上の安全性及び容易性を含むその他の理由においても同様に有利である。クローニング又は収集もしくは任意の生物学的試料の実際の操作は必要とされない。核酸構築ブロックの設計を紙上で達成することができる。従って、本発明は、組換え技術における手順の安全性の進展を教示する。
【０３６２】
それにもかかわらずある好ましい態様においては、本発明による二本鎖核酸構築ブロックはポリヌクレオチド鋳型のポリメラーゼに基づく増幅により作製されうる。非制限的な例示においては、図2に図示するように、プライマー、F2およびR1の最初のセットを用いたポリメラーゼに基づく最初の増幅反応が、本質的に産物Aと同一の平滑末端産物（反応1、産物1と標識）を作製するために使用される。プライマー、F1及びR2の第二のセットを用いたポリメラーゼに基づく第二の増幅反応が、本質的に産物Bと同一の平滑末端産物（反応2、産物2と標識）を作製するために使用される。これらの二つの産物が混合ならびに融解およびアニーリングされ、二つの突出を有する潜在的に有用な二本鎖核酸構築ブロックを作製する。図2の実施例において、3'突出を有する産物（産物C）が、例えば、エキソヌクレアーゼIII等の3'作用性エキソヌクレアーゼを用いたその他の三種の産物をヌクレアーゼに基づく破壊を行うことにより選択される。例えば、代わりに産物Dを選択するために、5'作用性エキソヌクレアーゼ（例えば、レッドα）もまた使用されうることが認識される。ハイブリダイゼーションに基づく手段を含む他の選択手段もまた使用されうること、及び所望の産物の分離を容易にするために磁性ビーズに基づく手段などのさらなる手段をこれらの手段に組み入れてもよいこともまた認識される。
本発明で利用可能な二本鎖核酸構築ブロックがそれにより作製されうるような他の多くの方法が存在する。これらは当技術分野において既知であり当業者によって容易に実施されうる。
【０３６３】
本発明の特に好ましい態様によると、最初に二本の一本鎖核酸を作製し、それらをアニーリングさせて、二本鎖核酸構築ブロックを形成させることにより、本発明で利用可能な二本鎖核酸構築ブロックが作製される。二本鎖核酸構築ブロックの二本の鎖は、突出を形成する任意のヌクレオチド以外の全てのヌクレオチドにおいて相補的であってもよく、従って、突出以外にはミスマッチを含まない。別の態様によると、二本鎖核酸構築ブロックの2本鎖は突出を形成する任意のヌクレオチド以外の全ヌクレオチドより少ない数において相補的である。従って、本態様によると、二本鎖核酸構築ブロックを、コドン縮重を導入するために使用することができる。好ましくは一つ又は複数のN、N、G/Tカセットを用いてまたは代替的な一つ又は複数のN、N、Nカセットを用いて、ここに開示された部位飽和性変異誘発を用いて、コドン縮重が導入される。
【０３６４】
本発明による順序集合を達成するための例示的実験的設計のなかには、
1）特定の核酸構築ブロックの設計；
2）各核酸構築ブロックにおける特定のライゲーション可能末端の設計；
3）核酸構築ブロックの特定の集合順序の設計
が含まれる。
突出は、3'突出又は5'突出であってもよい。また、突出は、末端リン酸基を有してもよく、又は末端リン酸基を有さなくてもよい（即ち、例えば、代わりに水酸基を有する）。突出は、任意の数のヌクレオチドからなってもよい。好ましくは突出は、0ヌクレオチド（平滑末端におけるように）から10,000ヌクレオチドからなる。従って、幅広い領域の大きさの突出が利用可能であってもよい。従って、下限は、1-200の間の各整数であってもよく、上限は、2〜10,000の間の各整数であってもよい。ある特定の例示によると、突出は（その間の全ての整数値を含む）、1〜200ヌクレオチドの間のいずれからなってもよい。
全ての設計構築ブロックが集合されるまで、順次二つ又はそれ以上の構築ブロックを一度に集合させることにより、最終キメラ核酸分子は作製されうる。作用試料は、二つの集合段階の実施の間の、大きさ選択もしくは精製または他の選択もしくは濃縮過程のための方法に任意に供されうる。又は最終的なキメラ核酸分子は、全ての設計された構築ブロックが一つの段階において同時に集合することにより作製されうる。
【０３６５】
有用性
本発明のインビボ組換えを、特定のポリヌクレオチド、又は配列が未知のハイブリッド、又は対立遺伝子のプールにおいて盲目的に行うことができる。しかしながら、特定のポリヌクレオチドの実際のDNA配列又はRNA配列を知る必要はない。
混合された遺伝子集団の中での組換えを使うことのアプローチは、任意の有用なタンパク質、例えば、インターロイキンI、抗体、tPA及び成長ホルモンの作製に有用でありうる。このアプローチは、変化した特異性又は活性を持つタンパク質の作製に使われうる。アプローチは、また、ハイブリッド核酸配列、例えば、遺伝子のプロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、31非翻訳領域、又は51非翻訳領域の作製に有用でありうる。従って、このアプローチは、発現において増大した速度を持つ遺伝子の作製に使われうる。このアプローチは、また、繰り返しDNA配列の研究においても、有用でありうる。最後にこのアプローチは、リボザイム又はアプタマーを変異させるためにも有用でありうる。
タンパク質において多様性の領域を分けている骨格様領域は、特に、本発明の方法に適しうる。保存骨格は、特定の結合を媒介する比較的制限されないループ構造を示す一方で、自己会合による全体の折り畳み構造を決定する。このような骨格の例としては、免疫グロブリンβバレル構造や4-ヘリックスバンドルがあげられる。本発明の方法は、結合のための変異配列のさまざまな組み合わせを持つ骨格様タンパク質を作製するのに用いられうる。
いくつかの標準的な遺伝子交配と同等なものもまた、本発明の方法によって行われうる。例えば、「分子」戻し交配を、関心対象の変異の選択の一方で、ハイブリッドの核酸と野生型の核酸との繰り返し混合によって行うことができる。伝統的な品種改良においてみられるように、このアプローチを、異なった供給源からの表現型を結合させ選択のバックグラウンドにするために使用することができる。それは、例えば、選択されない特徴（即ち、免疫原性）に影響を与える中立の変異の除去のためにも有用である。従って、タンパク質におけるどの変異が増強された生物学的活性に含まれるのかどうかを判定することは有用でありうる。
【０３６６】
末端選択
本発明は、出発物質のセットであるポリヌクレオチドからポリヌクレオチドのサブセットを選択する方法を提供し、その方法は、それぞれの選択可能なポリヌクレオチドとしての選択（陽性選択）及び/又はそれぞれの選択可能なポリヌクレオチドに対抗する選択（陰性選択）を行うことが可能になるように、作用しているポリヌクレオチドのどこかに存在している一個又はそれ以上の選択可能な特徴（即ち、選択マーカー）を識別できる能力に基づいている。好ましい局面において末端選択法といわれる方法が提供され、その方法は、選択可能なポリヌクレオチドの末端領域に部分的、又は完全に局在した選択マーカーを使用することに基づいており、そしてそのような選択マーカーは「末端選択マーカー」と命名することができる。
末端選択法は、天然に産生される配列の検出に基づいていてもよいし、もしくは実験的に導入された配列（この中で述べられているどれかの変異誘導性方法による配列やこの中に記載されていない何らかの変異誘導方法による配列を含む）の検出に基づいていてもよく、また同じポリヌクレオチド内にあるならばその両方に基づいていてもよい。末端選択マーカーは構造的な選択マーカーであってもよいし、また機能的選択マーカーであってもよいし、あるいは構造的と機能的の両方の選択マーカーであってもよい。末端選択マーカーは、ポリヌクレオチド配列を含んでいたり、またポリペプチド配列を含んでいたり、また何らかの化学的構造を含んでいたり、また何らかの生物学的もしくは生化学的標識を含んでいたりでき、それには放射活性、酵素活性、蛍光、何らかの光学的特徴、磁気的性質（例えば磁気ビーズを用いる）、免疫応答性、及びハイブリダイゼーションの検出に基づく方法を用いて選択されうるマーカーが含まれる。
【０３６７】
末端選択法は、変異誘発を起こすのに役立つ何らかの方法と組み合わせて適用することができる。このような変異誘発法には、限定するわけではないが、ここに記載された（上記及び下記）方法が含まれる。このような方法には、限定的でない例示の様式でここに記載されている方法、又は次の用語のどれかでこの技術分野の他の人による方法が含まれる。即ち、「飽和変異誘発」、「シャッフリング」、「組換え」、「再集成法」、「エラープローンPCR」、「アセンブリPCR」、「セクシュアルPCR」、「クロスオーバーPCR」、「オリゴヌクレオチドプライマー誘導性変異誘発」、「帰納的（及び/または指数関数的）調和の突然変異誘発（ArkinおよびYouvan、1992参照）」「カセット変異誘発」「インビボでの突然変異誘発」、及び「インビトロでの変異誘発」である。さらに末端選択法は、何らかの突然変異誘発及び/又は増幅法によって生成した分子で行うとよい（例えば、Arnold、1993、Caldwell及びJoyce、1992、Stemmer、1994参照、その方法の後で、望ましい子孫分子を選択する（存在についてのスクリーニングを含む）ことが望ましい。
【０３６８】
さらに、末端選択法を変異誘発法とは別のポリヌクレオチドに対して適用することもできる。好ましい態様ではここに記載したような末端選択法は、例えば、別のポリヌクレオチドにライゲーションする（ベクターへのライゲーションを含む）段階のような、クローニング段階を容易化する目的で使用することが可能である。こうして本発明は、望ましいポリヌクレオチドのライブラリーの構築、選択及び/又は富化を、概して言うと、クローニングを容易にするのに役立つ手段としての末端選択法を提供する。
特に好ましい態様では、末端選択法はポリヌクレオチドとしての（ポジティブ）選択に基づくであろうし、別法の末端選択法はポリヌクレオチドに対抗する（ネガティブ）選択に基づくであろうし、さらに別法では末端選択法はポリヌクレオチドとしての（ポジティブ）選択とポリヌクレオチドに対抗する（ネガティブ）選択との両方に基づくであろう。末端選択法は他の選択及び/又はスクリーニング法と平行して、似ていたり、似ていなかったりする選択及び/又はスクリーニング法と便利な変異誘発法との組み合わせとともに反復方式で実行することができ、そのすべては反復方式で、そして何らかの順番で、組み合わせて、また入れ替えて行うことができる。
本発明のある態様による末端選択法は、また、少なくとも部分的に環状（例えば、プラスミドもしくは何らかの他の環状ベクター、又は部分的に環状である他のポリヌクレオチド）、及び/又は分枝状、及び/又は何らかの化学的置換基もしくは部分で修飾されていたり置換されていたりするポリヌクレオチドを選択するために利用できる点も高く評価される。この態様によるとポリヌクレオチドは、中間体又は中心領域を含む環状分子であってもよく、その領域は5'隣接領域（末端選択法の目的で、非環状ポリヌクレオチドの5'末端領域に類似の方式で役立つ領域）の脇の5'側に隣接し、また3'末端領域（末端選択法の目的で、非環状ポリヌクレオチドの3'末端領域に類似の方式で役立つ領域）の脇の3'側に隣接している。この非限定的な例示で用いられるように、どれか二つの領域の間で重複する配列があるかもしれないし、また三つの領域すべてが同等であるかもしれない。
【０３６９】
本発明のある非限定的な局面における線状ポリヌクレオチドについての末端選択法は、ポリヌクレオチド末端、即ち、末端部（5'末端又は3'末端のいずれであってもよい）に、もしくはその近くに位置する少なくとも一つの末端選択マーカーが存在することに基づいた一般的なアプローチを用いて行われる。ある特定の非限定的な例では、末端選択法は、末端にあるか末端近くにある特定の配列、例えば、限定するわけではないがポリヌクレオチド配列を認識する酵素によって認識される配列に対する選択に基づいている。ポリヌクレオチドの化学的修飾を認識し、触媒する酵素は、この中ではポリヌクレオチド作用性酵素といわれている。好ましい態様では役立つポリヌクレオチド作用性酵素は、ポリヌクレオチド開裂活性を持つ酵素、ポリヌクレオチドメチル化作用を持つ酵素、ポリヌクレオチドライゲーション作用を持つ酵素、及び複数の識別可能な酵素作用を持つ酵素（排他的ではなく、例えば、ポリヌクレオチド開裂作用とポリヌクレオチドライゲーション作用の両方を含む）によって非排他的に例示されている。
従って、関連するポリヌクレオチド作用性酵素には、何らかの商業的に入手可能か、非商業的に入手可能なポリヌクレオチドエンドヌクレアーゼ、及びそれらの仲間のメチラーゼが含まれ、ウェブ部位http://www.neb.com/rebaseでカタログが掲載されているものや次に引用した参照文献（Roberts及びMacelis、1996）で述べられているものが含まれる。好ましいポリヌクレオチドエンドヌクレアーゼには、限定するわけではないがタイプII制限酵素（タイプIISを含む）が含まれ、また二本鎖のポリヌクレオチドの両方の鎖を開裂する酵素（例えば、Not I、これは両方の配列を5'...GC/GGCCGC...3'で開裂する）と、二本鎖のポリヌクレオチドの一方の鎖のみを開裂する酵素、即ち、ポリヌクレオチドニック形成作用を持つ酵素（例えば、N.BstNB I、これは5'...GAGTCNNNN/N...3'で一方の鎖のみを開裂する）も含まれる。また関連するポリヌクレオチド作用性酵素には、タイプIIIの制限酵素も含まれる。
【０３７０】
関連するポリヌクレオチド作用性酵素には、また、現在は入手できないが将来的に開発されるであろう酵素、即ち、ポリヌクレオチドのライゲーションに適合する末端、好ましくは接着末端を生じるのに役立つ酵素も含まれることが評価される。
ある好ましい例示において役立つ選択マーカーは、対応するタイプII（またはタイプIIS）制限酵素が、ライゲーション可能な末端（平滑末端または少なくとも一個の塩基の突出を持つ接着末端を含む）、即ち、ポリヌクレオチドの望ましい内部配列を破壊する様式で内的にポリヌクレオチドを開裂することなく望ましいライゲーション反応を行うことに役立つライゲーション可能な末端を形成するようにポリヌクレオチドの末端を開裂するのを可能にするポリヌクレオチドにおける制限酵素部位である。こうして関連する制限酵素部位に含まれる、特定の作用を行うポリヌクレオチドの内部に産生されない（即ち、末端から離れて産生されない）それらの部位が、対応する制限酵素の使用が作用しているポリヌクレオチドを内的に切断することを意図していない場合に好ましいと規定される。これによって制限的な消化反応を完成物に対して、又はほとんど完成物に対して、作用しているポリヌクレオチドの望ましくない内部開裂を伴うことなく行うことが可能になる。
従って、好ましい局面によると、末端選択法にかけられるポリヌクレオチドの内部に含まれないか、また別の場合は含まれることが期待されないか、また別の場合は含まれる見込みがない（例えば、作用しているポリヌクレオチドに関する配列情報が不完全である場合）制限酵素部位を使用することが好ましい。この局面によるとかなり低い頻度でしか産生されない制限酵素部位が、より頻度が高く産生される制限酵素部位よりも通常好ましいと認識される。これに対して、例えば、末端選択法とともに組換え法や他の変異誘発の方法を達成できるようにポリペプチドの内部の開裂が望まれる機会があることも認識される。
【０３７１】
本発明によると、望ましくない内部制限酵素部位を除去するのに用いることができる方法（例えば、変異誘発法）であることも認識される。また、ポリヌクレオチドの内部に産生されたり、同じ酵素によって認識されたりする感受性の高い制限酵素部位が不足しているのに対し、部分的消化反応（即ち、部分的な完成物に進行させる消化反応）は末端領域にある認識部位で消化を達成するために用いることができる点も認識される。ある局面において部分的消化が有用であるが、それは、認識配列が産生される位置及び環境に応じてある酵素が同じ認識配列の選択的な開列を示す点に価値があるためである。例えば、ラムダDNAが5 EcoR I部位を持っているのに対し、正しい末端に最も近い部位の開裂が分子の中間にある部位よりも10倍も早く起こると報告されていることも認識されている。また、例えば、Sac IIがラムダDNAに4個の部位を持っているのに対して、ラムダの中心に密集している三個は末端近くの残っている部位（40ヌクレオチド、386ヌクレオチドで）よりも50倍も早く開裂する。まとめると部位好適性は、多くの研究によってさまざまな酵素に対して報告されている（例えば、Thomas及びDavis、1975、Forsblumら、1976、Nath及びAzzolina、1981、Brown及びSmith、1977、Gingeras及びBrooks、1983、Krugerら、1988、Conrad及びTopal、1989、Ollerら、1991、Topal、1991、及びPein、1991、ほんの少数以外を名付けるため）。現在入手可能であるか、将来には入手できるかそのいずれかである何らかの役立つポリヌクレオチド作用酵素による部位選択性について、機構的に解釈するだけでなく経験に基づいて観察することも本発明による末端選択法で役立つ可能性があることが認識される。
【０３７２】
また、酵素は特定の制限酵素部位の存在に応答して実行中のポリペプチドを切断してしまうが、保護方法を用いることで、その酵素による望ましくない消化に対して特定の制限酵素部位（例えば、内部部位）を保護できる点、またそのような保護方法には、望ましくない酵素活性を阻害するメチル化や塩基の置換（例えば、Tに代わってUになる）といった修飾法が含まれる点も注目される。大きな（例えば、メガベースの長さ）制限断片を生成するのに充分なほどまれ（例えば、非常に長い認識配列を持つ）である入手可能な制限酵素の数が限られていること、また保護的アプローチ（例えば、メチル化による）が酵素の開裂部位の少なさを増強するのに役立つことが認識される。Not Iの出現の稀少度を約二倍に増加させるためにM.Fnu II(mCGCG)を利用することは、多くの例のうち、一例にすぎない（Qiangら、1990、Nelsonら、1984、Maxam及びGilbert、1980、Raleigh及びWilson、1986）。
本発明の好ましい局面によると、概して、稀少な制限酵素部位の利用が好ましいことが提供される。一般に制限酵素部位の産生頻度は、そこに含まれる塩基の必要条件が曖昧であることによってだけではなく、そこに含まれるヌクレオチドの数によっても決まってくることが正しく認識される。従って、非限定的な例では、一般に、8個の特定のヌクレオチド（例えば、Not I部位、即ちGC/GGCCGCであって、それは48分の1、即ち65,536分の1の相対的産生頻度、ランダム8-mersと見積もられている）からなる制限酵素部位は、例えば、6個のヌクレオチド（例えば、Sma I部位、即ち、CCC/GGGであって、それは46分の1、即ち4,096分の1、ランダム6-mersと見積もられた相対的産生頻度を持っている）からなる制限酵素部位よりも相対的に頻度が小さく、それは順次、例えば、4個のヌクレオチド（例えば、Msp I部位、即ちC/CGGであって、それは44分の1、即ち256分の1、ランダム4-mersと見積もられた相対的産生頻度を持っている）からなる制限酵素部位よりは相対的に頻度が小さいことが認められる。さらに別の非限定的な例示では一般に、曖昧な（特異性だけは除いて）塩基の必要条件（例えば、Fin I部位、即ち、GTCCCであって、それは45分の1、即ち、1024分の1、ランダム5-mersと見積もられた相対的産生頻度を持っている）をもたない制限酵素部位が、曖昧なW（ここでW＝AまたはT）の塩基必要条件（例えば、Ava II部位、即ち、G/GWCCであって、4 × 4 × 2 × 4 × 4 分の1-即ち、512分の1-ランダム5-mersと見積もられた相対的産生頻度を持っている）を持つ制限酵素部位よりも比較的に産生頻度が小さく、それは次に、曖昧なN（ここでN＝A又はCまたはGまたはT）の塩基必要条件（例えばAsu I部位、即ちG/GNCCであって、4 × 4 × 1 × 4 × 4 分の1、即ち、256分の1-ランダム5-mersと見積もられた相対的産生頻度を持っている）を持つ制限酵素部位よりも比較的に産生頻度が小さいことが認められる。これらの相対的産生は、特定のヌクレオチド塩基（特定のヌクレオチド配列を挙げるためでない）が特定のポリヌクレオチドにおいて、また微生物の特定の種において、また微生物の特定の群においては異なる頻度で産生されるため、実際のポリヌクレオチドに対する一般的な見積もりと考えられる。例えば、微生物のうちの異なる種のG＋C含有量％が非常に異なることが多く、範囲が広い。
【０３７３】
相対的に頻度の小さい制限酵素部位を選択マーカーとして使用する場合には、非限定的な記載であるが、好ましくは少なくとも4個のヌクレオチド配列を含む制限酵素部位、より好ましくは少なくとも5個のヌクレオチド配列を含む制限酵素部位、さらに好ましくは6個のヌクレオチド配列（例えば、BamH I部即ちG/GATCC、Bgl II部位、即ち、A/GATCT、Pst I部位、即ち、CTGCA/G、及びXba I部位、即ち、T/CTAGA）を含む制限酵素部位、さらに好ましくは7個のヌクレオチド配列を含む制限酵素部位、さらにより好ましくは8個のヌクレオチド配列（例えば、Asc I部位、即ち、GG/CGCGCC、Not I部位、即ち、GC/GGCCGC、Pac I部位、即ち、TTAAT/TAA、Pme I部位、即ち、GTTT/AAAC、Srf I部位、即ち、GDDD/GGGC、Sse838 I部位、即ち、CCTGCA/GC、及びSwa I部位、即ち、ATTT/AAAT）を含む制限酵素部位、さらにより好ましくは9個のヌクレオチド配列を含む制限酵素部位、そしてさらに好ましくは10個のヌクレオチド配列（例えば、BspG I部位、即ち、CG/CGCTGGAC）を含む制限酵素部位が含まれる。いくつかの制限酵素部位（例えば、クラスIIS酵素に対する）が、相対的に特異性が高い部分（制限酵素部位の産生頻度についての原理的決定因子を含む部分）を含んでいるとともに、相対的に特異性が低い部分も含んでいること、また開裂部位が相対的に特異性の低い部分に含まれていてもよいし、含まれていなくてもよいことがさらに認識される。例えば、Eco57 I部位、即ち、CTGAAG(16/14)には、比較的特異性の高い部分（即ち、CTGAAG部分）と、開裂部位を含む比較的特異性の低い部分（即ち、N16配列）とがある。
本発明の別の好ましい態様において、役立つ末端選択マーカーは、特異的なポリヌクレオチド配列を認識するポリヌクレオチド作用性酵素によって認識される末端配列である。この発明の好ましい局面において用いることのできるポリヌクレオチド作用性酵素には、従来よりあるタイプII制限酵素に加えて、他の酵素も含まれる。本発明のこの好ましい局面によると、役立つポリヌクレオチド作用性酵素にはジャイレース、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、リラキサーゼ、及びそれらに関連する何らかの酵素も含まれる。
【０３７４】
好ましい例の中には、トポイソメラーゼ類（ジャイレースの部分集合として何かでカテゴリー分類されている）と、ポリヌクレオチド開裂作用（好ましくはポリヌクレオチドニック形成作用を含む）及び/又はポリヌクレオチドライゲーション作用を持つ何らかの他の酵素がある。好ましいトポイソメラーゼ酵素にはトポイソメラーゼI酵素があり、それは多くの商業的供給元（Epicentre Technologies, Madison, WI、Invitrogen, Carlsbad, CA、Life Technologies, Gathesburg, MD）から入手可能で、考えられるところではよりプライベートな供給元と同等である。ここで提供されるような末端選択法にとって役立つ同様の酵素が将来開発されるであろうことが認識される。特に好ましいトポイソメラーゼI酵素はワクチンウイルス起源のトポイソメラーゼI酵素であり、それは特異的認識配列（例えば、5'...AAGGG...3'）を持っているとともに、ポリヌクレオチドニック形成作用とポリヌクレオチドライゲーション作用の両方を備えている。この酵素に特定のニック形成作用（一本の鎖の開裂）があるため、内部の認識部位はニックが形成された末端部位の変性を引き起こす温度でニック形成作用に起因するポリヌクレオチドの破壊を起こしそうにない（幾分アニーリングが残っているだけ）。従って、末端選択法で使用するに際して、トポイソメラーゼに基づく末端選択法についてのニック形成部位は、末端から100個以下のヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは末端から50個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から25個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から20個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から15個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から10個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から8個以下のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは末端から6個以下のヌクレオチドであり、そしてさらにより好ましくは末端から4個以下のヌクレオチドである。
【０３７５】
非限定的でしかも明らかに例示であるような特定の好ましい例示においては、トポイソメラーゼに基づく末端選択法に対するニック形成部位が末端から4個のヌクレオチドである場合、末端選択可能なポリヌクレオチドにおいて相補的な配列から変性する可能性のある4個の塩基（末端領域にある）からなる一本鎖のオリゴヌクレオチドを産生すること、これによってライゲーション反応を確実にするために役立つポリヌクレオチドの接着末端（4個の塩基からなる）が提供されることが認識される。クローニングベクター（好ましくは発現ベクター）へのライゲーション反応を達成するために、適合する接着末端を何らかの手段によって、例えば、制限酵素に基づく手段によってクローニングベクターに受け継がせることができる。こうして末端選択可能なポリヌクレオチド末端にある末端ヌクレオチド（この特定の例においては4個の末端塩基からなる）は、ポリヌクレオチドがライゲーションされるべきクローニングベクターで産生させた接着末端との適合性を提供するように広く選択される。
一方、例えば、末端から500個の塩基からなる末端選択可能なポリヌクレオチドの内部ニックの形成は、修復に役立つ（例えば、ニックを形成する同じトポイソメラーゼ酵素によって）のではなく、相補的配列から容易に変化しない500個の塩基からなる一本鎖のオリゴヌクレオチドを形成する。
【０３７６】
こうして本発明は、例えば、ワクシニアトポイソメラーゼに基づく、及び/又はタイプII（もしくはIIS)制限エンドヌクレアーゼに基づく、及び/又はタイプIII制限エンドヌクレアーゼに基づく、及び/又はニック形成酵素に基づく（例えば、N.BstNB Iを用いる)、実行中のポリヌクレオチドの接着末端を形成するための方法であって、その末端がライゲーション反応に適合し、またその末端が少なくとも一個の塩基の突出部を含んでいてもよいような方法を提供する。好ましくはこのような接着末端は少なくとも2塩基の突出を含み、より好ましくはこのような接着末端は少なくとも3塩基の突出を含み、更により好ましくはこのような接着末端は少なくとも4塩基の突出を含み、更により好ましくはこのような接着末端は少なくとも5塩基の突出を含み、更により好ましくはこのような接着末端は少なくとも6塩基の突出を含む。このような接着末端はまた、少なくとも7塩基の突出を含んでいてもよいし、また少なくとも8塩基の突出を、また少なくとも9塩基の突出を、また少なくとも10塩基の突出を、また少なくとも15塩基の突出を、また少なくとも20塩基の突出を、また少なくとも25塩基の突出を、また少なくとも30塩基の突出を含んでいてもよい。これらの突出は、A、C、G、またはTを含むどれかの塩基を含んでいるとよい。
トポイソメラーゼ又はニック形成酵素（例えば、N.BstNB I）を用いて導入した接着末端の突出は、自己二量化反応や他の望ましくないコンカテマー形成反応のような、望ましくない断片シャッフリングを抑制するために、ライゲーション反応の環境に独特になるよう設計されるとよい点が認識される。
【０３７７】
本発明のある局面によると、複数の配列（ただし、必ずしも重複でないかもしれない）が、ポリメラーゼに基づく反応でオリゴヌクレオチドを使用することによって、末端選択可能なポリヌクレオチドの末端領域に導入されうる。関連する場合、ただし、限定的な例を意味するのではないが、このようなオリゴヌクレオチドは、トポイソメラーゼIに基づく末端選択法で有用な好ましい5'末端領域を提供するために用いることが可能で、そのオリゴヌクレオチドは、接着末端に変換可能な1-10個の塩基配列（好ましくはワクシニアトポイソメラーゼIによって）、リボソーム結合部位（即ち、「RBS」であり、それは発現クローニングの際に好適に役立てる）、及びATG開始部位と0-100個の塩基からなる鋳型特異性の配列（ポリメラーゼに基づく反応で鋳型へのアニーリングを容易にするための）が続く任意のリンカー配列を含む。このようにこの例によると、利用可能なオリゴヌクレオチド（フォワードプライマーと言うことができる）は配列、即ち5'[末端配列＝(N)1-10][トポイソメラーゼI部位及びRBS＝AAGGGAGGAG][リンカー＝(N)1-100][開始コドン及び鋳型特異性配列＝ATG(N)0-100]3'を持っているとよい。
類似性を備えて関連する場合、ただし限定的な例を意味するのではないが、あるオリゴヌクレオチドは、トポイソメラーゼIに基づく末端選択法で有用な好ましい3'末端領域を提供するために用いることが可能で、そのオリゴヌクレオチドは、接着末端に変換可能な1-10個の塩基配列（好ましくはワクシニアトポイソメラーゼIによって）及び0-100個の塩基からなる鋳型特異性の配列（ポリメラーゼに基づく反応で鋳型へのアニーリングを容易にするための）が続く任意のリンカー配列とを含む。このようにこの例によると、利用可能なオリゴヌクレオチド（リバースプライマーと言うことができる）は配列、即ち、5'[末端配列＝(N)1-10][トポイソメラーゼI部位＝AAGGG][リンカー＝(N)1-100][鋳型特異性配列＝(N)0-100]3'を持っているとよい。
【０３７８】
末端選択法は、親の鋳型分子（例えば、変異誘発を起こさせるための）を子孫の分子（例えば、変異誘発によって生じた）と区別しかつ分離するために用いることができることが認められる。例えば、プライマーの第1セットは、トポイソメラーゼI認識部位を欠いていて、親の分子の末端領域を修飾するために用いることができる（例えば、ポリメラーゼに基づく増幅で）。異なる第二のセットのプライマー（例えば、トポイソメラーゼI認識部位を持つ）はその場合、増幅された鋳型分子由来の変異した子孫の分子の末端領域を産生させるために用いることができる（例えば、切断合成法、鋳型スイッチングポリメラーゼに基づく増幅法、もしくは切断合成法のようなどれかのポリヌクレオチドキメラ形成法を用いて、又は飽和変異誘発法を用いて、又はここに開示されているようなトポイソメラーゼIの認識部位を変異された子孫分子に導入するための何らかの他の方法を用いて）。トポイソメラーゼIに基づく末端選択法を用いることは、識別を容易化するだけでなく、望ましい子孫分子の選択的トポイソメラーゼIに基づくライゲーション反応を容易にできる。
このように増幅された親分子に第二セットのプライマーをアニーリングすることは、トポイソメラーゼIの認識部位に似ているが、機能的なトポイソメラーゼI酵素の認識を阻害するのに充分なほど異なっている第1セットのプライマー（即ち、一セットの親分子を増幅するために用いられるプライマー）の配列を含むことによって容易化できる。例えば、どこかの1〜5個すべての塩基までにAAGGG部位とは異なる配列を、第1セットのプライマー（変異誘発にかける前に親の鋳型を増幅させるために用いられる）に導入することができる。特定すると、ただし非限定的な局面であるが、こうして親分子は次の例示的な-ただし限定を意味していないが-フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるセットを用いて増幅できるようになった。
【０３７９】
フォワードプライマー：5' CTAGAAGAGAGGAGAAAACCATG（N）10-100 3'
及び
リバースプライマー  ：5' GATCAAAGGCGCGCCTGCAGG（N）10-100 3'
【０３８０】
第1セットのプライマーからなるこの特定の例による（N）10-100は、好ましくは10ヌクレオチド〜100ヌクレオチドの長さの鋳型特異性配列、より好ましくは10ヌクレオチド〜50ヌクレオチドの長さの鋳型特異性配列、さらにより好ましくは10ヌクレオチド〜30ヌクレオチドの長さの鋳型特異性配列、及び更により好ましくは10ヌクレオチド〜25ヌクレオチドの長さの鋳型特異性配列を表す。
特異的で、しかし限定的でない局面によると、この増幅法（正当なトポイソメラーゼIの認識部位に欠如のある開示された第1セットのプライマーを用いている）の後で増幅された親分子は、続いて正当なトポイソメラーゼIの認識部位を持つ一セットまたはそれ以上のセットのフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて突然変異誘発にかけることができる。特定の、しかし限定的でない局面において、こうして親分子が、次の例として挙げた-ただし限定的な意味はない-フォワードプライマー及びリバースプライマーからなる第2セットを用いて、突然変異した子孫分子の産生に対する鋳型として用いることができるようになっている。
【０３８１】
フォワードプライマー：5' CTAGAAGAGAGGAGAAAACCATG 3'
及び
リバースプライマー  ：5' GATCAAAGGCGCGCCTGCAGG 3' (Asc I サイトを含む)
【０３８２】
特定して述べられていないかなりの数の異なるプライマーセットが、本発明と一致する末端選択法のための第1セットのプライマー、第2セットのプライマー、または続くセットのプライマーとして用いることができる。タイプIIの制限酵素部位を導入してもよいことに注目されたい（例えば,上記の例ではAsc I部位）。述べた他の配列に加えて、実験主義では一個又はそれ以上のN、N、G/Tトリプレットを、飽和変異誘発に実行中のポリヌクレオチドをかけるために役立つプライマーに導入できるようにされる。まとめると、第2セット及び/又は続くセットのプライマーを用いることで、トポイソメラーゼI部位を導入することと、子孫のポリヌクレオチドで変異を産生させることからなる二つの目的を達成できる。
従って、提供されたある使用法において役立つ末端選択マーカーは、産生された一本鎖のオリゴヌクレオチドを変性することでライゲーション互換的な末端を生成するために、酵素が特定部位でポリヌクレオチドを開裂させるのを可能にする酵素認識部位である。生成したポリヌクレオチド末端のライゲーション反応は、同じ酵素（例えば、ワクシニアウイルストポイソメラーゼIの場合）によって完成させることができるし、また別法では異なる酵素を利用して完成させることもできる。本発明の一局面によると、何らかの役立つ末端先端マーカーが、似ていようと（例えば、二つのワクシニアウイルストポイソメラーゼIの認識部位）、似ていまいと（例えば、クラスII制限酵素の認識部位とワクシニアウイルスのトポイソメラーゼIの認識部位）いずれにせよ、ポリヌクレオチドを選択するために組み合わせて用いることができる。それぞれの選択可能なポリヌクレオチドはこのように、一つ又はそれ以上の末端選択マーカーを持っていてもよく、そして末端選択マーカーと似ていてもよいし、またにていなくてもよい。特定の局面において複数の末端選択マーカーはポリヌクレオチドの一方の末端に位置していてもよいし、また互いに重複する配列を持っていてもよい。
【０３８３】
かなり多くの酵素が、現存するもの又は開発されるべきもののいずれであっても、この発明による末端選択法において役立つことができる点を強調することが重要である。例えば,この発明の特定の局面においては、ニック形成酵素（例えば、N.BstNB I、これは5'...GAGTCNNNN/N...3'）は末端選択法を達成するためにポリヌクレオチドライゲーション作用の供給源と連結して用いることができる。この態様によるとN.BstN BIに対する認識部位トポイソメラーゼIに対する認識部位の代わりが末端選択可能なポリヌクレオチドに組み入れられるはずである（末端選択法が変異した子孫の選択のために用いられるのであろうと、また末端選択法が変異誘発段階とは別に用いられるのであろうと）。
トポイソメラーゼに基づくニック形成法及びライゲーション反応を用いるここで開示された末端選択アプローチは、以前に適用可能な選択方法を越えるいくつかの利点をもつことが認められる。まとめると、このアプローチによって指示クローニング（発現クローニングを含む）を達成できる。特定するとこのアプローチは、直接的ライゲーション反応（即ち、伝統的な制限分解-精製-ライゲーション反応にかけない）、本来の鋳型分子から子孫分子の分離（例えば、本来の鋳型分子がトポイソメラーゼI部位を欠如し、それが変異誘発後まで導入されない）、サイズ分離段階に対する必要性の回避（例えば、ゲルクロマトグラフィーによって、また他の電気泳動手段によって、またサイズー排除膜を使用することによって）、内部の配列の保存（トポイソメラーゼI部位が存在する場合であっても）、及びうまくゆかなかったライゲーション反応についての懸念の排除（例えば、特に望ましくない残基の制限酵素活性が存在する際のT4 DNAリガーゼの使用に依存する）、及び容易化された発現クローニング（フレームシフト関連の排除を含む）を達成するために用いることができる。特に作用しているポリヌクレオチドにおける内部の制限酵素部位で（または、望ましくないスター活性のしばしばある予期できない部位でと同じく）-作用しているポリヌクレオチドの破壊の潜在的な部位で-起こる望ましくない制限酵素に基づく開裂に対する懸念は、トポイソメラーゼに基づくニック形成反応とライゲーション反応を用いるここで開示した末端選択アプローチによって回避できる。
【０３８４】
付加的なスクリーニング法
ペプチドディスプレイ法
本方法は、任意の開示された方法によるってインビトロ及び/又はインビボでの組換えにより、ならびに任意の組合わせにおいて、結合したポリヌクレオチドが表現型に関して（例えば、予め決められた受容体（リガンド）に対する親和性に関して）スクリーニングされた、提示されたペプチドをコードしているような、ペプチドディスプレイ法によって選択されたポリヌクレオチド配列をシャッフリングするために使うことができる。
生物薬学的薬剤の発展や分子生物学での増大する重要な局面は、ペプチドの又は、生物的巨大分子と相互作用するペプチド模倣物の、一次アミノ酸配列を含むペプチドの構造の同定である。予め決められた生物的巨大分子（例えば、受容体）への結合のような、所望の構造又は機能的特性を持ったペプチドを同定する一つの方法は、ペプチドのアミノ酸配列によって与えられた所望の構造又は機能的特性を持つ個々のライブラリーのメンバーに関する、大きなライブラリー又はペプチドのスクリーニングを含む。
【０３８５】
ペプチドライブラリーを作製するための直接的な化学合成法に加えて、いくつかの組換えDNA法もまた報告されている。一つの型は、バクテリオファージ粒子又は細胞の表面にペプチド配列、抗体、又は他のタンパク質を提示することを含んでいる。一般的にこれらの方法において、それぞれのバクテリオファージ粒子又は細胞は、天然のバクテリオファージ粒子又は細胞タンパク質の配列に加えて提示された、ペプチドの単一の種類を提示する個々のライブラリーのメンバーとして働く。それぞれのバクテリオファージ粒子、又は細胞は、特定の提示されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列情報を含んでいる。即ち、提示されたペプチド配列は、単離されたライブラリーのメンバーのヌクレオチド配列の決定によって確認することができる。
公知のペプチドディスプレイ法は、典型的にはバクテリオファージのコートタンパク質との融合体として、糸状のバクテリオファージの表面にペプチド配列を示すことを含んでいる。バクテリオファージライブラリーは、固定化された予め決められた巨大分子又は小分子（例えば、受容体）とインキュベートされうり、それによって、固定化された巨大分子と結合するペプチド配列を示しているバクテリオファージ粒子は、その予め決められた巨大分子と結合するペプチド配列を示していない粒子から別々に分割されうる。固定化された巨大分子に結合したそのバクテリオファージ粒子（即ち、ライブラリーのメンバー）を次に、続く、親和性の増強及びファージ複製の回のための選択されたバクテリオファージの亜集団を増幅するために、回収し、複製する。数回の親和性の増強及びファージ複製のあと、続いて選択されたバクテリオファージライブラリーのメンバーを単離し、そして、提示されたペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列を決定し、それにより予め決められた巨大分子（例えば、受容体）と結合するペプチドの配列を同定する。このような方法は、国際公開公報第91/17271号、国際公開公報第91/18980号、国際公開公報第91/19818号、及び国際公開公報第93/08278号にさらに詳しく記載されている。
【０３８６】
後者のPCT出版物は、予め決められた巨大分子に強く結合するために利用される、典型的には可変配列からなる最初のポリペプチド部分及びそれぞれの融合タンパク質をコードしているDNAベクターのようなDNAに結合する第二のポリペプチド部分からなるそれぞれの融合タンパク質をもつ融合タンパク質ライブラリーの作製を含むようなペプチドリガンドの提示のための組換えDNA法を記載している。形質転換された宿主細胞が融合タンパク質を発現させる条件下で培養されるとき、融合タンパク質は、それをコードしているDNAベクターと結合する。宿主細胞を溶解させることで、融合タンパク質/ベクターDNA複合体は、バクテリオファージ粒子がファージに基づいた提示システムにおいてスクリニーングされるのと全く同様な手法で選択されたライブラリーのペプチド配列の同定の基礎としてはたらく選択された融合タンパク質/ベクターDNA複合体におけるDNAベクターの複製及び配列決定により、予め決められた巨大分子に対してスクリーニングされうる。
【０３８７】
ペプチド及び類似の重合体ライブラリーを作製する他のシステムは、組換え及びインビトロ化学合成の方法という両方の局面を持っている。これらのハイブリッド法では、ライブラリーのメンバー（即ち、ペプチド又はポリヌクレオチド）のインビトロ合成を行うために、細胞を含まない酵素的な機構が用いられる。ある方法の一つの型では、予め決められたタンパク質又は予め決められた色素分子と結合する能力のあるRNA分子が、選択及びPCR増幅を交互に繰り返すことで選択された（Tuerk及びGold、1991、Ellington及びSzostak、1990）。同様の技術が、予め決められたヒト転写因子と結合するDNA配列を同定するために用いられた（Thiesen及びBach、1990、Beaudry及びJoyce、1992、国際公開公報第92/05258号、及び国際公開公報第92/14843号）。同様の方法により、インビトロ翻訳の技術が、関心対象のタンパク質の合成に使われており、大きなペプチドのライブラリーを作製する方法として提案されている。一般的には安定化されたポリソーム複合体を含む、インビトロ翻訳を元にしたこれらの方法は、国際公開公報第88/08453号、国際公開公報第90/05785号、国際公開公報第90/07003号、国際公開公報第91/02076号、国際公開公報第91/05058号、及び国際公開公報第92/02536号にさらに記述されている。本出願者は、ライブラリーのメンバーがDNA結合活性を持つ第一のポリペプチド部分及びライブラリーのメンバーである独特のペプチド配列を持つ第二のポリペプチド部分からなる融合タンパク質を含む方法を記述している。このような方法は、他の方法の中で、細胞を含まないインビトロ選択の形式における使用に適している。
【０３８８】
提示されたペプチドの配列の長さは変化されうり、典型的には、3〜5000アミノ酸長、又はそれ以上、しばしば5〜100アミノ酸長、そして、たいていは8〜15アミノ酸長である。ライブラリーは、異なった長さの提示されたペプチド配列をもつライブラリーメンバーを含むことができ、又は、固定された長さの提示されたペプチド配列をもつライブラリーメンバーを含みうる。提示されたペプチド配列の一部又は全部は、ランダム、疑似ランダム、明確な一連のカーネルであったり、固定されているなどであることができる。この中に示されたディスプレイ法は、ポリソーム上の発生期のscFv又はファージ上に示されたscfvのような一本鎖の抗体のインビボ提示及びインビトロ提示のための方法を含んでおり、これは可変領域配列及び結合特性の幅広い多様性を持つscfvライブラリーの大規模なスクリーニングを可能にする。
本発明は、また、ランダム配列、偽ランダムな配列、及び定義された配列のフレームワークペプチドライブラリーを提供し、かつそれらのライブラリーを作製し、スクリーニングし、所望のやり方でペプチド又はRNAを改変する、受容体分子又は関心対象のエピトープまたは遺伝子産物に結合する有用な組成物（例えば、一本鎖抗体を含むペプチド）を同定するための方法を提供する。ランダム配列、偽ランダムな配列、及び限定配列のフレームワークペプチドを、ペプチドライブラリーメンバーのライブラリーから作製し、このライブラリーは、ディスプレイされるペプチドまたはディスプレイされるペプチドが合成されるポリヌクレオチド鋳型に接着する、ディスプレイされる一本鎖抗体を含む。接着方法は、選択される本発明の特定の態様に係って変えてもよく、ファージ粒子への封入または細胞への組み込みを含むことができる。
【０３８９】
親和性の高い方法は、ペプチドと一本鎖抗体のかなり大きいライブラリーを選択でき、所望のペプチド又は一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチド配列を選抜することができる。その後、ポリヌクレオチドを単離し、シャッフリングし、選抜されたペプチド（又は予め決定されたその一部）又は一本鎖抗体（又はVHI、VLI又はCDRの一部分のみ）のアミノ酸配列を組み合わせて、再結合することができる。これらの方法を使用して、分子に対する所望の結合親和性を持つペプチド又は一本鎖抗体を同定でき、シャッフリング過程を利用し、所望の高い親和性のペプチド又はscfvにすぐに収束することができる。その後、ペプチド又は抗体は、任意の適当な使用（例えば、治療薬または診断薬として）のための通常の方法によって大量に合成できる。
本発明の重要な利点は、予想されるリガンド構造に関する情報が、関心対象のペプチド性リガンドまたはペプチド性抗体を単離することが予め必要でないことである。同定されるペプチドは、生物活性を持つことができ、その活性とは、選択される受容体分子に少なくとも特異的な結合親和性を含むことを意味し、かついくつかの例においては、さらに他の化合物の結合をブロックし、代謝経路を刺激または阻害し、シグナルまたはメッセンジャーとして機能し、細胞活性などを刺激または阻害できること含む。
本発明は、予め決定された受容体（例えば、ペプチドホルモン受容体、細胞表面受容体、他のタンパク質に結合し、ヘテロ二量体などのような細胞内タンパク質複合体を形成する細胞内タンパク質のようなほ乳類のタンパク質受容体）、またはエピトープ（例えば、固定化タンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖など）に結合する、ライブラリーメンバーのための新生ペプチド（一本鎖抗体を含む）をディスプレイするポリソームライブラリーをスクリーニングする親和性によって、選抜されるポリヌクレオチド配列のプールをシャッフリングするための方法もまた提供される。
【０３９０】
任意のこれらの方法による最初の選抜（典型的には、受容体への結合物(例えば、リガンド）の親和性選抜による）で選択されるポリヌクレオチド配列は、プールされ、そのプールは、インビトロ組換え及び/又はインビボ組換えによってシャッフリングされ、選抜された組換えポリヌクレオチド配列の集団を含むシャッフリングされたプールを作製する。選抜された組換えポリヌクレオチド配列は、その後少なくとも1回選抜される。その後の選抜で選抜されたポリヌクレオチド配列は、直接使用でき、配列決定でき、及び/又は1回又はそれ以上の追加的にシャッフリングされ、その後選抜されることができる。選択された配列は、例えば、選択される配列と実質的に同一の野生型配列又は天然配列と戻し交配し、免疫原性が少なくてもよい天然型様の機能的ペプチドを作製することによって、中間的な配列(例えば、結合への実質的でない機能的な影響を持つ)をコードするポリヌクレオチド配列と戻し交配されることもできる。一般的には、戻し交配の際に、その後の選抜は、予め決定された受容体（リガンド）に結合する性質を保持するように適用される。
選択された配列のシャッフリング前又はシャッフリング時に、配列を変異誘発することができる。一つの態様においては、選択されたライブラリーメンバーは、別個のライブラリーメンバーになる個々のコロニー（又はプラーク）のコレクションが作製される、原核生物ベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、又はバクテリアファージ）へクローニングされる。個々の選抜されたライブラリーメンバーを、その後（例えば、部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、化学的変異誘発、PCR変異誘発などによって）操作し、選抜されたライブラリーメンバーの配列に基づいて配列カーナルの相違を表すライブラリーメンバーのコレクションを作製できる。個々の選択されたライブラリーメンバー又はプールの配列は、ランダム変異、偽ランダムな変異、限定カーナル変異（即ち、可変残基部位と不変残基部位を含み、及び／又はアミノ酸残基の限定された部分集合から選択される残基を含むことができる可変残基部位を含む）、コドンに基づいた変異などを、個々の選択されるライブラリーメンバー配列について部分的にまたは全長にわたって組み込むように操作されうる。選択された変異誘発ライブラリーメンバーは、その後、この中に記述されるインビトロ及び/又はインビボ組換えシャッフリングによってシャッフリングされる。
【０３９１】
本発明は、また、本発明の大多数の個々のライブラリーメンバーを含むペプチドライブラリーであり、(1)前記の大多数の各々個々のライブラリーが、選択される配列のプールをシャッフリングすることによって作製され配列を含み、(2)各々個々のライブラリーメンバーが、可変ペプチド部分の配列もしくは可変ペプチド部分の配列又は該大多数における別の個々のライブラリーメンバーの一本鎖抗体配列と異なる一本鎖抗体部分の配列を含むライブラリーを提供する。
本発明は、過程による生成物(product-by-process)を提供し、予め決定された結合特異性を持つ選択されるポリヌクレオチド配列が以下の過程によって形成される：(1）予め決定された受容体（例えば、リガンド）又はエピトープ（例えば、抗原高分子）に対して、ディスプレイされるペプチド又はディスプレイされる一本鎖抗体ライブラリーをスクリーニングし、かつ予め決定された受容体又はエピトープに結合するライブラリーメンバーを同定及び/又は濃縮し、選択されるライブラリーメンバーのプールを作製する過程、(2）予め決定されたエピトープに結合し、それによってライブラリーから単離及び/又は濃縮され、シャッフリングされたライブラリーを作製する、選択される（又はそのコピーを増幅もしくはクローニングされる）ライブラリーメンバーを組換えによってシャッフリングする過程、及び（3）予め決定された受容体(例えば、リガンド)又はエピトープ(例えば、抗原高分子)に対してシャッフリングされたライブラリーをスクリーニングし、あらかじめ決定された受容体またはエピトープに結合するシャッフリングされたライブラリーメンバーを同定及び/又は濃縮し、選択されるシャッフリングされたライブラリーメンバーのプールを作製する過程。
【０３９２】
抗体のディスプレイ及びスクリーニング方法
本発明は、開示した方法のいずれかによってインビトロ及び/又はインビボで組換えを再編成するため、また抗体のディスプレイ方法によって選択されたいずれかの組み合わせ、ポリヌクレオチド配列で再編成するために用いることができ、そこでは関連するポリヌクレオチドが、表現型について（例えば、予め決められた抗原（リガンド）を結合する親和性について）スクリーニングされるディスプレイ抗体をコードしている。
さまざまな遺伝分子的アプローチは、免疫グロブリン鎖に存在するであろう極めてたくさんの異なる可変領域によって表示された膨大な免疫学上のレパートリーを捕らえるように工夫されてきた。天然に発生する生殖系列の免疫グロブリンの重鎖の遺伝子座は、多様性セグメント遺伝子であるタンデムアレイの上流側に位置する可変セグメント遺伝子からなる分離タンデムアレイを含み、それ自体は連結する（i）領域遺伝子のタンデムアレイの上流側に位置していて、これは定常領域遺伝子の上流側に位置している。Bリンパ球が発生する課程でV-D-J配列が生じるが、その際重鎖の可変領域遺伝子(VH)が転位して融合したDセグメントを形成し、続いてVセグメントとの転位が起こってV-D-J連関生成物遺伝子が、即ち豊富に転位が起きたのであれば重鎖の機能的な可変領域（VH）をコードするV-D-J連関生成遺伝子が形成される。同様に軽鎖の遺伝子座は、数個のVセグメントの一つを数個のJセグメントと転位することによって、軽鎖の可変領域（VL）をコードする遺伝子を形成できる。
【０３９３】
免疫グロブリンでありうる可変領域の非常に多くのレパートリーは、B細胞の発生の転位課程でV及びiセグメント（また、重鎖の遺伝子座の場合ではDセグメント）を連結する非常に多くの組み合わせの可能性から部分的に誘導される。重鎖の可変領域における更なる配列多様性は、V-D-J連結する場合にDセグメントが不均一に転位することから、またN領域が付加することから生じる。さらに特異的なB細胞クローンの抗原選択性は、重鎖と軽鎖の可変領域の一方または両方に非生殖系列の突然変異を持つより高度な親和性可変体について選択され、それは「親和的成熟化」または「親和的鋭敏化」ともいわれる現象である。通常これらの「親和的鋭敏化」突然変異は、可変領域の特定の領域に、最も一般的には相補性-決定領域（CDR）に密集している。
抗原刺激性のβ細胞が発生する（即ち、免疫化する）ことにより親和性の高い免疫グロブリンが産生し同定する場合の多くの制限に対処するために、特定の抗原に対する高-親和性の抗体をスクリーニングできる組み合わせ抗体ライブラリーを作製すべく操作できる種々の前核細胞の発現系を開発した。大腸菌（Escherichia coli）及びバクテリオファージ系における抗体発現についての最近の進歩（「ペプチドディスプレイの別法（Alternative peptide display methods）」下記参照）は、実質的に何らかの特異性が、特徴的なハイブリドーマ由来の抗体遺伝子をクローニングするか、又は抗体遺伝子ライブラリー（例えば、Ig cDNAから）を用いてデノボ選択するかいずれかによって得ることができるという可能性を生じた。
【０３９４】
抗体のコンビナトリアルライブラリーは、バクテリオファージプラークとして、または溶原菌のコロニーとしてスクリーニングできるバクテリオファージラムダ発現系で生じた（Huseら、1989、Caton及びKoprowski、1990、Mullinaxら、1990、Perssonら、1991）。バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリー及びラムダファージ発現ライブラリーについての種々の態様が記載されている（Kangら、1991、Clacksonら、1991、McCaffertyら、1990、Burtonら、1991、Hogenboomら、1991、Changら、1991、Breitlingら、1991、Marksら、1991, p.581、Barbasら、1992、Hawkins及びWinter、1992、Marksら、1992、すべて参照文献としてこの明細書に組み入れられる）。一般にバクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーは、固定化された（例えば、親和性クロマトグラフィーによって反応性のファージを富化するためにクロマトグラフィー樹脂に共有結合させることによって）及び/又は標識された（例えば、プラーク即ちコロニー輸送をスクリーニングするため）受容体（例えば、ポリペプチド、炭水化物、糖タンパク質、核酸）を用いてスクリーニングされる。
ある特定の有利なアプローチでは、いわゆる一本鎖断片可変（scfv)ライブラリーが利用されていた（Marksら、1992, p.779、Winter及びMilstein、1991、Clacksonら、1991、Marksら、1991, p.581、Chaudharyら、1990、Chiswellら、1992、McCaffertyら、1990、及びHustonら、1988）。バクテリオファージ外殻タンパク質でディスプレイされたscfvライブラリーについての種々の態様が記載されている。
1988年に初めてであるが、一本鎖のFv断片アナログとその融合タンパク質が、抗体操作法によって実際に生成された。この第1段階には通常、望ましい結合特性を備えたVH及びVLドメインをコードする遺伝子を得る段階が関与しており、即ち、これらのV遺伝子は、特異的なハイブリドーマ細胞系統から単離してもよいし、組み合わせV遺伝子ライブラリーから選択してもよいし、あるいはV遺伝子合成法によって作製してもよい。この一本鎖Fvは構成要素のV遺伝子を、（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）三または等価のリンカーペプチドのような適当に設計されたリンカーペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと連結することによって形成される。このリンカーは、VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VH'のいずれかの順番で、一つ目のV領域のC末端と、二つ目のN末端を橋掛けする。原理的にはscfvブリッジ部位は、その元の抗体結合部位の親和性と特異性の両方を忠実に複製できる。
【０３９５】
このようにscfv断片は、自由度の高いリンカー断片によって一本のポリペプチド鎖に連結したVHドメインとVLドメインとを含む。scfv遺伝子を組み入れてからそれらをファージミドにクローニングし、バクテリオファージPIII（遺伝子3）外殻タンパク質を持つ融合タンパク質としてM13ファージ（又は同様の繊維状バクテリオファージ）の先端で発現させる。対象の抗体を発現するファージを富化することは、予め決定したエピトープ（例えば、標的抗原、受容体）に結合するscfv群をディスプレイする組換えファージを集めることで達成できる。
ライブラリーのメンバーである連結されたポリヌクレオチドは、スクリーニング段階または選択段階の後で行なわれるライブラリーメンバーの複製の際の基礎を提供するとともに、ディスプレイされたペプチド配列、又はVH及びVLアミノ酸配列の同一性をヌクレオチド配列によって決定する基礎も提供する。ディスプレイされたペプチド、即ち、一本鎖の抗体（例えば、scfv）及び/又はそのVH及びVLドメイン、又はそれらのCDRをクローニングして適当な発現系で発現させるとよい。よくあることに単離されたVH及びVLドメインをコードするポリヌクレオチドは、定常領域(CH及びCL)をコードするポリヌクレオチドに連結することによって、完全な抗体（例えば、キメラまたは全くのヒト）、抗体断片などをコードするポリヌクレオチドを形成できる。単離されたCDRをコードするポリヌクレオチドが、適当な可変領域のフレームワーク（及び任意で定常領域）をコードするポリヌクレオチドに移植されることで（例えば、ヒト様の又は完全にヒトの）完全な抗体、抗体断片などをコードするポリヌクレオチドを形成できることもよくある。抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって抗原の調整的量を単離するために利用できる。このような抗体のさまざまな利用法は、疾患（例えば、新生組織形成）の診断及び/又はステージ分類すること、また、例えば、新生組織形成、自己免疫疾患、AIDS、心臓血管系疾患、感染症などのような疾患を治療するための治療的応用である。
結合種（イディオタイプスペクトル）のレパートリーを広げるべくscfvライブラリーの組み合わせ多様性を大きくするためのさまざまな方法が報告されている。PCRを利用することで可変領域が、特異的なハイブリドーマ源から、または非免疫細胞を形成する遺伝子ライブラリーとしてのいずれかで迅速にクローニングされることが可能になり、組み合わせることのできるVH及びVLカセットの分類に組み合わせ多様性が与えられる。さらにVII及びVLカセットはそれ自体、例えばランダム、偽ランダム、又は指向変異誘発によって多様化されるのであろう。通常VH及びVLカセットは、相補的決定領域(CDRS)内、又はその近くで、多いのは第3のCDR3で多様化される。酵素的逆PCRの変異誘発は、scfv部位指向性ハイブリッドからなる比較的大きなライブラリーを構築するための簡単で信頼性のある方法であることがわかっていて（Stemmerら、1993）、エラープローンPCR及び化学的突然変異誘発を持つのと同様である（Dengら、1994）。Riechmann(Riechmannら、1993)は、変性オリゴヌクレオチドPCRにより部位指向性のランダム化法を用いた抗体scfv断片の半合理的設計法と、得られたscfvハイブリッドの続くファージディスプレイ法を示した。Barbas(Barbasら、1992)は、ヒト破傷風毒素結合性Fabの合成CDR領域において配列をランダム化することにより、偏りのある可変領域配列を利用して得られるレパートリーサイズを制限する問題を回避するよう計画した。
CDRランダム化には、重鎖CDR3のみの場合は約 1 × 1020 個のCDRを作製する能力があり、重鎖のCDR1及びCDR2の変異体と、軽鎖のCDR1-3の変異体の数もだいたい同じである。個々に用いたり又は一緒に用いたりする場合、重鎖及び/または軽鎖のCDRランダム化の組み合わせ可能性にとって、その大部分が非結合性であるようなすべてのあり得る組み合わせを表示するクローンライブラリーを作製するためには極端に多くのバクテリオファージクローンを生じさせる必要がある。このような大量の一次形質転換体を生成させることは、現在の形質転換技術とバクテリオファージディスプレイ系を用いても実行できない。例えば、Barbas(Barbsら、1992)は、 5 × 107 の形質転換体を発生させたにすぎず、それは徹底的にランダム化したCDRの潜在的多様性のうちほんの少しの画分を表示しているにすぎない。
【０３９６】
これらの実質的な限界があるにもかかわらず、scfvのバクテリオファージディスプレイによって、様々な有用な抗体と抗体融合タンパク質がすでに得られている。有効な腫瘍細胞の溶解を仲介することがわかっている二特異性の一本鎖抗体がある（Gruberら、1994）。抗Rev scfvが細胞内で発現すると、インビトロでのHIV-1ウイルスの複製が阻害されることがわかっており（Duanら、1994）、また抗21rar、scfvが細胞内で発現すると、アフリカツメガエル（Xenopus）の卵母細胞の減数分裂の出現が阻害されることがわかっている（Bioccaら、1993）。HIVの感染を診断するために利用できる組換えscfvも報告されており、scfvの診断上の有効性を証明している（Lilleyら、1994）。scfvが第2のポリペプチドである、例えば、毒素又は繊維素溶解活性化タンパク質に結合している融合タンパク質も報告されている（Holvostら、1992、Nichollsら、1993）。
抗体多様性が広く、かつ潜在性のある配列組み合わせからなるほんの小さな画分しかカバーできない従来のCDR突然変異誘発法とランダム化法の持つ多くの限界に対処可能なscfvライブラリーを作製することが可能であるならば、治療用と診断用に使用するにふさわしいscfv抗体の量と品質が大きく改善できるであろう。このことに対応するため、本発明のインビトロとインビボにおける再編成法が、選択されたディスプレイ抗体由来で入手できる核酸から得られた（通常は、PCR増幅またはクローニングによって得られる）CDRを組み換えるために用いられる。このようなディスプレイ抗体は、細胞上、バクテリオファージ粒子上、ポリソーム上、又はコードしている核酸と関連する適当な抗体のディスプレイ系にディスプレイされるであろう。異なる場合ではCDRは、抗体産生細胞（例えば、免疫化した野生型マウス、ヒト、又は国際公開公報第92/03918号、国際公開公報第93/12227号、及び国際公開公報第94/25585号に記載されているようヒト抗体を作製する能力のあるトランスジェニックマウスから得られる血漿細胞/脾臓細胞）由来のmRNA（またはcDNA）からまず得られる。
【０３９７】
これらの方法のどれかによって抗原（例えば、リガンド）に結合するディスプレイ抗体について通常は親和性で選択することによる最初の選択ラウンドで選択されたポリヌクレオチド配列は、インビトロ及び/又はインビボでの組換えを行って再編成することで、特定するとCDRの再編成（一般には、重鎖のCDRを他の重鎖のCDRと再編成し、また軽鎖のCDRを他の軽鎖のCDRと再編成する）を行うことで、組み換えられて選択されたポリヌクレオチド配列の集団を含む再編成されたプールを作製できる。この組換えられて選択されたポリヌクレオチド配列を、ディスプレイされた抗体として選択フォーマットに発現させ、そして続く少なくとも一回の選択ラウンドにかける。この続く選択ラウンドで選択されたポリヌクレオチド配列は、直接的に用いたり、配列を決めたり、及び/又は望ましい結合親和性の抗体が得られるまで再編成と配列選択からなる少なくとも一回の更なるラウンドにかけたりすることができる。選択された配列は、また、中性抗体フレームワーク配列（即ち、抗原結合性に実質的な機能上の影響がない）をコードするポリヌクレオチド配列とともに戻し交雑することもでき、それは、例えば、ヒト様配列抗体を産生するヒト可変領域のフレームワークを用いて戻し交雑することによる。一般に戻し交雑を行う課程で続いて選択を行うことにより、予め決定した抗原に結合する性質を保持できる。
【０３９８】
別法では、即ち、注目した変法と組み合わせた場合では、標的エピトープの抗原価を帰ることで選択されたscfvライブラリーのメンバーの平均的な結合親和性をコントロールできる。標的エピトープは、競合するエピトープを含有させることによったり、希釈したり、あるいは当業者に既知の他の方法によったりしてて種々の密度で表面、即ち、基質に結合できる。予め決められたエピトープの密度（抗原価）が高いと、比較的低い親和性のscfvライブラリーメンバーを富化するために利用でき、一方密度（抗原価）が低いと、高い親和性のscfvライブラリーのメンバーが好適に富化できる。
種々の異なるセグメントを作製するためには、ランダム、偽ランダム、またはペプチド配列の明らかになっている配列中心部のセットをコードする合成オリゴヌクレオチドの集まりを、予め決められた部位（例えば、あるCDR）に連結することで挿入できる。同様に一本鎖抗体カセットの一つまたはそれ以上のCDRの配列多様性は、部位指向性の変異誘発、CDR置換などを用いてCDRを変異させることによって広げることが可能である。得られるDNA分子は、再集合する前にクローニング及び増幅するために宿主に伝達してもよいし、また直接用いてもよく（即ち、宿主細胞にて増殖させると起こるであろう多様性の喪失を避けることができる）、選択されたライブラリーメンバーが続いて再編成される。
対象物の可変セグメントペプチド配列、又は対象物の一本鎖抗体をコードするディスプレイされたペプチド/ポリヌクレオチド複合体（ライブラリーのメンバー）は、親和的富化技術によってライブラリーから選択される。これは、受容体、他の巨大分子、又は他のエピトープ種のような対象物のペプチド配列に特異的な、固定化された巨大分子、即ち、エピトープの手段によって達成される。親和的選択段階を繰り返すことで、望ましい配列をコードするライブラリーメンバーを富化でき、続いてそれを、配列決定のため、及び/又は更なる増殖と親和的富化のためにプールし再編成すべく単離すればよい。
【０３９９】
望ましい特異性を持たないライブラリーメンバーは、洗浄して除去される。必要とされる洗浄の程度及び厳格性は、対象物のそれぞれのペプチド配列または一本鎖抗体について、また固定化された所定の巨大分子又はエピトープについて決定すればよい。確かな程度のコントロールは、結合のためのインキュベート及び続く洗浄の条件を調節することによって回復した新生ペプチド/DNA複合体の結合特性に対して発揮できる。温度、pH、イオン強度、二価のカチオン濃度、及び洗浄の容積と期間は、固定化巨大分子に対する親和性の特定の範囲内で新生ペプチド/DNA複合体に対して選択できる。ゆっくりとした解離速度に基づいた選択は通常親和性が高いと予測され、最も実際的な経路であることが多い。これは、飽和量の遊離の所定の巨大分子の存在でインキュベートを続けることによるか、あるいは洗浄の容量、回数、及び長さを増加することによって行うことができる。それぞれの場合において、解離した新生ペプチド/DNA又はペプチド/RNA複合体の再結合が抑制され、時間がたつにつれて新生ペプチド/DNA又はペプチド/RNA複合体のだんだん高い親和性が回復する。
結合段階と洗浄段階をさらに改変することによって、特定の特徴を備えたペプチドを発見できる。いくつかのペプチドの親和性は、イオン強度、即ち、カチオン濃度に依存している。これは、ペプチドからそのタンパク質を除去するために緩やかな条件が要求される場合、種々のタンパク質の親和的精製で利用できるペプチドにとって有用な特徴である。
scfvライブラリーを、異なる結合特性を持つscfvの多様性について同時にスクリーニングできるように、ある変法には多重結合性標的（多エピトープ種、多受容体種）の使用が関与している。scfvライブラリーの大きさが潜在的なscfv配列の多様性を制限することが多いため、可能な限り大きいサイズのscfvライブラリーが我々には通常望まれる。たくさんの非常に大きなポリソームscFvディスプレイライブラリーを生じる時間と経済性を考慮すると、極端に負担が重くなる可能性がある。この実質的な問題を回避するために、多数の前もって決定したエピトープ種（受容体種）を一つのライブラリーで同時にスクリーニングしたり、あるいは多数のエピトープ種に対して連続的なスクリーニングを利用したりできる。一変法においては、それぞれが別個のビーズ（又は部分的な集合のビーズ）にコードされている多数の標的エピトープ種を、適当な結合条件下でポリソームディスプレイscfvライブラリーと混合してインキュベートしてもよい。集めたビーズは多数のエピトープ種を含んでいて、その後親和的選択によってscfvライブラリーのメンバーを単離するために用いることができる。一般に連続的な親和性スクリーニングラウンドには、ビーズからなる同じ混合物、それらの部分集合、又は一つもしくは二つの個々のエピトープ種のみを含むビーズが関与する。このアプローチは効率的なスクリーニングを提供し、実験室の自動化、バッチ処理、及び高処理量のスクリーニング法と両立できる。
【０４００】
ペプチドライブラリー又は一本鎖抗体ライブラリーを多様化したり、予め決められた巨大分子又はエピトープに対して十分な結合作用を持つように、早期のラウンドで見いだされた可変セグメントのペプチドを再集合する前又は再集合と同時に多様化したりするためにさまざまな技術が本発明では用いられる。一つのアプローチは、ポジティブに選択されたペプチド/ポリヌクレオチド複合体（親和的富化を行う早期のラウンドで同定された複合体）を、活性なペプチドの同定を調べるために配列決定する。続いて、オリゴヌクレオチドをそれぞれの段階で組み入れられたこれらの活性なペプチド配列に基づいて低レベルのすべての塩基を用いた合成によって、わずかな変異を一次オリゴヌクレオチド配列中に形成できる。続いて（わずかに）変異したオリゴヌクレオチドから成るこの混合物を、適当な位置で可変セグメント配列にクローニングする。この方法は、出発物質のペプチド配列からなる計画的にコントロールされた変異体を生成し、さらにそれを再集合することができる。しかしながら、個々の陽性発生期のペプチド/ポリヌクレオチド複合体が変異誘発の前に配列決定されることが必要で、従って、それは、少数の回収された複合体の多様性を拡張する際、また、高い結合親和性及び/又は高い結合特異性を持つ変異体を選択する際に有用である。別の方法、即ち、ポジティブに選択されたペプチド/ポリヌクレオチド複合体（特に可変領域配列）の変異誘発性のPCR増幅では、その増幅生成物がインビトロ及び/又はインビボで再集合され、そして一回又はそれ以上の追加のスクリーニングラウンドが配列決定の前に行なわれる。同様の一般的なアプローチを一本鎖の抗体を用いて行うことによって、通常は再集合の前か再集合と同時にCDR、又は隣接するフレームワーク領域を多様化することによって、結合親和性/特異性を多様化し、高めることができる。望ましい場合には、再集合反応に、選択されたライブラリーのメンバーとインビトロで組換えることのできる変異誘発性のオリゴヌクレオチドをスパイクすることができる。こうして合成オリゴヌクレオチドとPCRが生成したポリヌクレオチド（間違いが起こりやすいか忠実度の高い方法によって合成される）の混合物をインビトロで再集合混合物に添加し、得られる再集合ライブラリーメンバー（再集合物）に組み入れるとよい。
【０４０１】
シャッフリングについての本発明は、CDR変異体一本鎖抗体からなる大きなライブラリーの生成を可能にする。このような抗体を生成するための一方法は、合成のCDRを一本鎖抗体に挿入すること、及び/又は再編成を行う前もしくは再編成と同時にCDRランダム化を行うことである。この合成CDRカセットの配列は、ヒトCDRの既知の配列データを参照することによって選択されるし、また次の指針に従って実務者の判断で選択される。合成CDRは既知のCDR配列に少なくとも40 % の位置的配列同一性を持っており、好ましくは既知のCDR配列に対して少なくとも 50〜70 % の位置的配列同一性を持っているであろう。例えば、合成CDR配列の集団は、Kabat（Kabatら、1991）に列挙された天然に発生するヒトCDR配列に基づいてオリゴヌクレオチド配列の集団を合成することによって作製できる。即ち、合成CDRのプールを解釈することによって、少なくとも一つの既知の天然に発生するヒトCDR配列に対して少なくとも 40 ％ の配列同一性を備えたCDRペプチド配列をコードできる。また天然に発生するCDR配列の集団は、頻繁に起こる残基の位置（即ち、既知のCDR配列の少なくとも 5 ％ で）で用いられるアミノ酸が対応する位置で合成CDRに組み入れられるように、生成した共通配列と比較することができる。一般には数個（例えば、3〜約50個）の既知のCDR配列が比較され、既知のCDRの間で観察された天然の配列の変異が作表され、そして観察された天然の配列の変異のうちのすべて又はほとんどの置換を包含するCDRペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドの集合が合成される。例えば、限定するわけではないが、ヒトVH CDR配列の集団が、Tyr、Val、Phe、又はAspのいずれかからなるカルボキシ末端のアミノ酸を持っている場合、合成CDRオリゴヌクレオチド配列のプールは、カルボキシ末端のCDR残基がこれらのアミノ酸のどれかにうまくなれるように設計される。ある態様では、CDR配列の集団における残基の位置に天然に発生する残基以外の残基が導入され、即ち、保存的なアミノ酸の置換が頻繁に導入され、そして5個までの残基の位置が変化することによって、既知の天然に発生するCDR配列に比較できるような非保存的アミノ酸置換を組み入れることができる。このようなCDR配列は、一次ライブラリーのメンバー（最初のラウンドスクリーニングの前）で用いることもできるし、及び/又は選択されたライブラリーメンバーの配列のインビトロでの再集合反応をスパイクするために用いることもできる。明らかになった配列及び/又は変性した配列からなるこのようなプールを構築することは、当業者によって容易に達成されるであろう。
【０４０２】
合成CDR配列の集団は、天然に発生するCDR配列であるとは知られていない少なくとも一つのメンバーを含んでいる。重鎖CDRにN領域の付加に対応するランダム配列または偽ランダム配列の一部分を含んでいるか、あるいは含んでいないかは、実務者の判断の範疇である。N領域の配列は、V-D及びD-J連結部に発生している1〜約4個のヌクレオチドの範囲にある。合成重鎖CDR配列の集団は、少なくとも約100個の特有のCDR配列、通常は少なくとも約1,000個の特有のCDR配列、好ましくは少なくとも約10,000個の特有のCDR配列、より頻繁には50,000個以上の特有のCDR配列からなるが、しかしながら通常は、集団に含まれる特有のCDR配列は約1×106個以上にはならないものの、時に 1 × 107 から 1 × 108 の特有のCDR配列が存在しており、それは特に、保存的アミノ酸置換基が天然に発生するヒトCDRにおけるその位置に存在しないかまれにしか存在しない（即ち、0.1 ％ 以下）位置で保存的アミノ酸置換が可能になった場合である。一般に、ライブラリーに含まれる特有のCDR配列の数は、ファクター10以上でライブラリーにおける一次の形質転換体について予測された数を越えないはずである。このような一本鎖の抗体は一般に、少なくとも 1 × 10 M-1、好ましくは約 5 × 107  M-1 の親和性を備え、より好ましくは少なくとも 1 × 108  M-1 から 1 × 109 M-1 もしくはそれ以上の親和性を備えており、時に 1 × 1010  M-1 もしくはそれ以上にまで大きな親和性を備えている。よくあるのは、予め決められた抗原がヒトタンパク質、例えば、ヒト細胞抗原（例えば、CD4、CD8、IL-2受容体、EGF受容体、PDGF受容体）、他のヒト生物学的巨大分子（例えば、トロンボモジュリン、プロテインC、炭水化物抗原、シアリルルイス抗原、Lセレクチン）、または非ヒト疾患関連の巨大分子（例えば、細菌性LPS、ビリオンキャプシドタンパク質もしくはエンベロープ糖タンパク質）などようなヒトタンパク質である。
望ましい特異性の高親和性一本鎖抗体を、さまざまなシステムで操作して発現できる。例えば、scfvは植物で産生され（Firekら、1993）、前核細胞系で容易に作製される(Owens及びYoung、1994、Johnson及びBird, 1991)。さらに一本鎖抗体は、完全抗体又はそのさまざまな断片を構築するための基礎として用いることができる（Kettleboroughら、1994）。可変領域をコードする配列を単離でき（例えば、PCR増幅またはサブクローニングによって）、そして望ましいヒト定常領域をコードする配列にスプライシングすることによって、免疫原性が小さくなることが好まれるヒトの治療的使用法のためのより好ましいヒト配列抗体をコードできる。結果物の完全にヒトをコードする配列を持つポリヌクレオチドは宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞における発現ベクターから）で発現させることが可能で、そして薬学的製剤用に生成することができる。
【０４０３】
DNA発現構築物には、通常、自然界に関連するか又は異型のプロモーター領域を含むコード配列に機能的に結合した発現調節DNA配列が含まれる。好ましくはこの発現調節配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換したりトランスフェクトしたりできるベクターに含まれる真核性のプロモーターシステムである。一旦ベクターが適当な宿主に導入されると、宿主はヌクレオチド配列を高レベルで発現させ、また突然変異体が「操作した」抗体を収集し精製するのに好ましい条件下に維持される。
前述したようにDNA配列は、その配列が発現調節配列に機能的に結合した後で宿主で発現させることができる（即ち、構造遺伝子の転写及び翻訳を確実にするように位置づけられる）。これらの発現ベクターは、宿主の染色体DNAのエピソームか内在性部分のいずれかとして宿主の微生物で通常は複製できる。一般に発現ベクターは、選択マーカーである、例えば、テトラサイクリン又はネオマイシンを含むことによって望ましいDNA配列で形質転換された細胞の検出が可能になる（例えば、参照文献としてこの明細書に組み入れられる米国特許第4,704,362号参照）。
酵母のような真核の微生物に加え、哺乳動物の組織細胞培養物も本発明のポリペプチドを産生するために用いることができる（参照文献としてこの明細書に組み入れられる、Winnacker、1987参照）。無傷の免疫グロブリンを分泌する能力のあるたくさんの好ましい宿主細胞系がこの技術分野において開発されているため、真核細胞が実際には好ましく、それにはCHO細胞系、種々のCOS細胞系、Hela細胞、及び骨髄腫細胞系が含まれるが、好ましくは形質転換したB細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞に対する発現ベクターには、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Queenら、1986）、及びリボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列といった必要な処理情報部位のような発現調節配列が含まれる。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、部位メガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、及び同様のものから誘導されたプロモーターである。
【０４０４】
真核生物のDNA転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大させることができる。エンハンサーは、プロモーターによる転写を増加させる 10〜300 bp のシス作用配列である。エンハンサーは、転写ユニットに対して51又は31のいずれかの場合に転写を効率的に増加させることが可能である。またそれらがイントロン内、又はそれ自体のコード配列内に存在していると効率的である。通常ウイルスのエンハンサーが用いられ、即ち、SV40エンハンサー、部位メガロウイルスのエンハンサー、ポリオーマのエンハンサー、及びアデノウイルスのエンハンサーが含まれる。哺乳動物系から得られるエンハンサー配列も一般的に用いられ、例えば、マウスの免疫グロブリン重鎖のエンハンサーである。
また哺乳動物の発現ベクター系には通常、選択可能なマーカー遺伝子が含まれる。適当なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)、チミジンキナーゼ遺伝子(TK)、又は薬物耐性を与える前核細胞遺伝子が挙げられる。最初の二つのマーカー遺伝子は、増殖培地にチミジンを添加しないところでは増殖する能力のない突然変異細胞系を使用する場合に好まれる。形質転換された細胞はその後、補充されていない培地で増殖する能力により同定できる。マーカーとして有用な前核細胞の薬物耐性遺伝子の例には、G418、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンに対する耐性を提供する遺伝子が含まれる。
対象のDNAセグメントを含むベクターは、細胞性宿主のタイプに応じて周知の方法により宿主細胞に移すことができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、前核細胞に対して一般に利用され、これに対してリン酸カルシウム処理、リポフェクション、又はエレクトロポレーションは、他の細胞性宿主に対して利用できる。哺乳動物の細胞を形質転換するために用いられる他の方法には、ポリブレン(Polybrene)、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びミクロ-注入法の利用が含まれる（一般的にはSambrookら、1982及び1989参照）。
【０４０５】
一旦発現すると、抗体、個々の変異した免疫グロブリン鎖、変異した抗体断片、及び本発明の他の免疫グロブリンポリペプチドは、この技術分野で標準的な方法、即ち、硫酸アンモニウム沈殿法、画分カラムクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法などを含む方法（一般的にはScope、1982）により精製できる。上記に記載したように部分的又は均質に精製されると、その後ポリペプチドは治療的に利用することもできるし、検定段階、免疫蛍光染色法などを開発したり実施したりする際に用いることもできる（一般的に、Lefkovits及びPernis、1979及び1981、Lefkovits、1997参照）。
本発明の方法によって産生した抗体は、診断及び治療の際に用いることができる。例示の様式であって限定しているわけではないが、それらは癌、自己免疫疾患、又はウイルス感染症を治療するために利用できる。癌の治療ではこの抗体が、例えば、erbB-2、CEA、CD33のような癌細胞に好んで発現する抗原や、当業者に周知の他の多くの抗原及び結合メンバーに典型的に結合するのであろう。
【０４０６】
ツーハイブリッドに基づくスクリーニングアッセイ法
シャッフリングは、また、予め決められたポリペプチド配列を結合するライブラリーメンバーを同定するためのツーハイブリッドスクリーニングシステムをスクリーニングすることによって得られる選択されたライブラリーメンバーのプールを組換えて多様化するために用いることもできる。この選択されたライブラリーメンバーはプールされて、インビトロ及び/又はインビボでの組換えにより再集合される。再集合されたプールは続いて、前記の予め決められたポリペプチド配列（例えば、SH2ドメイン）を結合するか、別の予め決められたポリペプチド配列（例えば、別のタンパク質種由来のSH2ドメイン）を結合するライブラリーメンバーを選択するために酵母の二ハイブリッドシステムでスクリーニングできる。
予め決められたポリペプチド配列に結合するポリペプチド配列を同定するためのアプローチは、予め決められたポリペプチド配列が融合タンパク質に存在しているいわゆる「ツーハイブリッド」システムを用いている（Chienら、1991）。このアプローチは、転写アクチベーター、即ち、酵母のGal4転写タンパク質を再構築する（Fields及びSong、1989）ことで、インビボでのタンパク質-タンパク質相互作用を同定する。通常この方法は、DNA結合作用と転写の活性化に応答する分離可能なドメインからな酵母のGa14タンパク質の特徴に基づいている。二つのハイブリッドタンパク質、即ち、既知のタンパク質のポリペプチド配列に融合した酵母のGa14 DNA結合性ドメインからなる一つと、第二のタンパク質のポリペプチド配列に融合したGal4活性化ドメインからなるもう一つとをコードするポリヌクレオチドが構築されて酵母の宿主細胞に導入される。二つの融合タンパク質の間の分子間結合は、Gal4活性化ドメインを持つGal4 DNA結合性ドメインを再構築し、それによってGal4結合性部位に機能的に結合するリポーター遺伝子（例えば、lacz、HIS3)の転写活性化に至る。通常ツーハイブリッド法は、既知のタンパク質と相互作用する新規なポリペプチド配列を同定するために用いられる（Silver及びHunt、1993、Durfeeら、1993、Yangら、1992、Lubanら、1993、Hardyら、1992、Bartelら、1993、及びVojtekら、1993）。しかしながらツーハイブリッド法の変法は、第二の既知タンパク質への結合に影響を与える既知のタンパク質の突然変異を同定するために用いられる（Li及びFields、1993、Laloら、1993、Jacksonら、1993、及びMaduraら、1993）。ツーハイブリッドシステムは、また、二つの既知のタンパク質の相互作用している構造的ドメインを同定するため（Bardwellら、1993、Chakrabartyら、1992、Staudingerら、1993、及びMilne及びWeaver、1993）、また一個のタンパク質のオリゴマー形成反応に応答するドメインを同定するため（Iwabuchiら、1993、Bogerdら、1993）にも用いられた。ツーハイブリッドシステムの変法は、タンパク質分解酵素のインビボでの作用を研究するために用いられた（Dasmahapatraら、1992）。また、E.coli/BCCP相互作用のスクリーニングシステム(Germinoら、1993、Guarente、1993)は、相互作用するタンパク質の配列（即ち、ヘテロダイマーを形成するか、より高次のヘテロマルチマーを形成するタンパク質の配列）を同定するために用いることができる。ツーハイブリッドシステムによって選択された配列をプールして、再集合してから一回又はそれ以上の続くスクリーニングラウンドを行うためにツーハイブリッドシステムに導入することによって、所定の結合配列を含むハイブリッドに結合するポリペプチド配列を同定できる。こうして同定された配列は、共通配列及び共通配列の核心部を同定するために比較することができる。
【０４０７】
一般に組換えDNA法についての標準的な技術は、いろいろな刊行物（例えば、Sambrookら、1989、Ausubelら、1987、及びBerger及びKimmel、1987）に記載されており、そのそれぞれは参照文献としてその記載全体がこの明細書に組み入れられる。ポリヌクレオチドを修飾している酵素は、製造者の推薦により用いた。オリゴヌクレオチドは、ABI化学薬品を用いるApplied Biosystems Inc.Model 394 DNA合成装置で合成した。望むのであれば所定のDNA配列を増幅するためのPCR増幅物を、実務者の判断で選択すればよい。
1μgの鋳型DNAからなるサンプルを入手してUV光を照射することによりTTダイマーを含むダイマー、特定するとプリンのダイマーを形成させることができる。UV照射は、数個の光生成物が鋳型DNAのサンプルの遺伝子に対して発生するように制限される。多数のサンプルを照射時間を変えてUV光で処理することによって、UV光から得られるダイマーの数が異なる鋳型DNAサンプルを得ることができる。
非プルーフリーディングポリメラーゼを用いるランダムプライミングキット（例えば、Stratagene Cloning SystemsによるプライムイットIIランダムプライマーラベリングキット(Prime-It II Random Promer Labeling kit)）を用いることによって、UV光によって調整される鋳型（上記に記載したように）のランダム部位で初回感作し、鋳型に沿って伸張することにより異なる大きさのポリヌクレオチドを生じさせることができる。プライムイットIIランダムプライマーラベリングキットに記載されているようなプライミングプロトコールは、プライマーを伸張させるために利用できる。UV露光によって形成されるダイマーは、非プルーフリーディングポリメラーゼによって伸張する際の障害物として作用する。従って、ランダムサイズのポリヌクレオチドのプールは、ランダムプライマーを伴う伸張が終わった後に存在する。
【０４０８】
本発明はさらに、通常は増幅及び/又はクローニングされているポリヌクレオチドの形態で選択された変異ポリヌクレオチド配列（又は選択されたポリヌクレオチド配列の集団）を生成させる方法に向けられており、それによって選択されたポリヌクレオチド配列は、選択可能な少なくとも一つの望ましい表現型の特徴（例えば、ポリペプチドをコードする、結合したポリヌクレオチドの転写を促進する、タンパク質を結合する、及び類似の特徴）を持っている。所定の生物学的巨大分子（例えば、受容体）に対する結合性のような望ましい構造的、又は機能的な特徴を所有するハイブリッドポリペプチドを同定するための方法には、ポリペプチドのアミノ酸配列によって与えられる望ましい構造的又は機能的特徴を備えた個々のライブラリーメンバーについて、ポリペプチドの大きなライブラリーをスクリーニングすることが関与する。
ある態様において、本発明は、親和的相互作用スクリーニング又は表現型スクリーニングに適するディスプレイポリペプチド又はディスプレイ抗体からなるライブラリーを作製するための方法を提供する。この方法には、（1）ディスプレイしたポリペプチド又はディスプレイした抗体、又はそのディスプレイしたポリペプチド又はディスプレイした抗体をコードする関連したポリヌクレオチドを含む第一の複数の選択されたライブラリーメンバーを得る段階、及びその関連するポリヌクレオチドが実質的に同一の配列からなる領域を含む前記関連するポリヌクレオチド又はその複製物を得る段階、任意であるがそのポリヌクレオチド又は複製物に変異を導入する段階、（2）そのポリヌクレオチド又は複製物をプールする段階、（3）ランダム又は特定のプライム段階及び合成段階または増幅段階を妨害することによって、小さい、即ち、短いポリヌクレオチドを生成する段階及び（4）新しく合成したポリヌクレオチドを均一に再結合させるために、増幅、好ましくはPCR増幅と、任意であるが変異誘発を行う段階が含まれる。
【０４０９】
本発明の特定の好ましい目的は、以下の一連の段階によって有用なハイブリッドポリペプチドを発現するハイブリッドポリヌクレオチドを生成するための方法を提供することである：
（a）増幅または合成段階を遮断したり妨害したりするための手段を用いてポリヌクレオチド増幅または合成段階を妨害し、それによりさまざまな完成段階にあるポリヌクレオチドを複製することで複数の小さい、即ち、短いポリヌクレオチドを提供することによってポリヌクレオチドを産生する段階；
（b）一個又はそれ以上の一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドからなる得られた集団に、一個又はそれ以上の一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチド、即ち、その集団の一個又はそれ以上の一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドに異型の領域に対して同一の領域を含むオリゴヌクレオチドを添加する段階；
（c）一本鎖のポリヌクレオチドの混合物を生成するために得られる一本鎖、または二本鎖のオリゴヌクレオチドを編成する段階、さまざまな長さを持つポリヌクレオチドのプールに短い、即ち、小さなポリヌクレオチドを任意で分離する段階、さらに前記ポリヌクレオチドプールの少なくとも一つに含まれる一個又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを増幅させるためにPCR段階にそのポリヌクレオチドを任意でかける段階；
（d）一本鎖のポリヌクレオチドの間の同一領域で結果的に一本鎖のポリヌクレオチドがアニーリングする条件下でポリメラーゼとともに、複数の前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドの少なくとも一つのプールをインキュベートする段階、そしてそれにより変異した二本鎖のポリヌクレオチド鎖を形成する段階；
（e）任意で段階（c）及び（d）を繰り返す段階；
（f）前記ポリヌクレオチド鎖の一本、又は複数から得られる少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドを発現させる段階；及び
（g）有用な作用について前記少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする段階。
本発明の好ましい局面において、増幅段階又は合成段階を遮断したり妨害したりする手段は、UV光、DNA付加物、DNA結合タンパク質を用いることによる。
本発明のある態様においては、DNA付加物、又はそのDNA付加物を含むポリヌクレオチドが、さらに処理が進む前にDNA断片を含む溶液を加熱する処理によるような方法でポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドプールから除去される。
当業者には、本発明の意図および範囲内で多様な代用や修正が可能なことは明らかであろう。ここで記述されている例や局面は、説明目的のみであり、当業者には応用法と請求項目の範囲内で多様な変更や修正が提案されるであろうことは理解されている。
【０４１０】
例
下記の例は、本発明の請求内容を制限するものではなく、説明するために提示されている。
例１  UV照射による光産物を使ったランダムサイズのポリヌクレオチドの製造
1 μg の鋳型DNAからのサンプルを入手してUV光を照射することによりTTダイマーを含むダイマー、特に、プリンのダイマー、を形成させることができる。UV照射は、数個の光生成物が鋳型DNAのサンプルの遺伝子に対して発生するように制限される。多数のサンプルを照射時間を変えてUV光で処理することによって、UV光から得られるダイマーの数が異なる鋳型DNAサンプルを得ることができる。
UV光によって調製される鋳型（上記に記載したように）のランダム部位でプライムさせ、鋳型に沿って伸長させることにより異なる大きさのポリヌクレオチドを作製するために非プルーフリーディングポリメラーゼを用いるランダムプライミングキット（例えば、Stratagene  Cloning  SystemsによるプライムイットIIランダムプライマーラベリングキット(PrimeIt II Random Promer Labeling kit)）が用いられる。プライムイットIIランダムプライマーラベリングキットに記載されているようなプライミングプロトコールは、プライマーを伸張させるために利用できる。UV露光によって形成されるダイマーは、非プルーフリーディングポリメラーゼによって伸長する際の障害物として作用する。従って、ランダムサイズのポリヌクレオチドのプールは、ランダムプライマーを伴う伸長が終わった後に存在する。
【０４１１】
例２  ランダムサイズのポリヌクレオチドの単離
例１によって産生されたポリヌクレオチドは1.5 ％ アガロースで単離する。100−300 bpのポリヌクレオチドをゲルから切り取り、3倍の分量の6 M  NaIがゲルスライスに添加される。混合液は、50℃にて10分間培養され、10μlのグラスミルク（Bio 101)が添加される。混合液は、1分間遠心分離され、上清は取り除かれる。沈殿物は、5 μlのカラムWash（50 ％ エタノール、10 mM Tris-HCl pH 7.5,100 mM NaCl、2.5 ｍM EDTA)にて洗浄され、1分間遠心分離、そして上清は取り除かれる。そして洗浄、遠心分離、除去は繰り返される。グラスミルク沈殿物は、20 μlの水にて懸濁されて1分間遠心分離される。DNAは水溶層に留まっている。
【０４１２】
例３  単離された100 bp 〜 300 bpのランダムサイズポリヌクレオチドのシャッフリング
例２によって得られた100〜300 bpのポリヌクレオチドはプライマーを含まないアニーリング混合液（0.2 ｍM 各dNTP,2.2 ｍM  MｇCl2,50 mM KCl、10 mM Tris-HCl pH 8.8,0.1 % TritonX-100,0.3 U Taq DNAポリメラーゼ、合計50 ul）の中にて組み換えられる。Stratagene社製のRobocyclerを用いて以下の方法にてアニーリングが行われる：95℃にて30秒間、25〜50サイクルの［95℃にて30秒間、50〜60℃（好ましくは68℃）にて30秒間、72℃にて30秒間］そして72℃にて5分間。その結果、100〜300 bpのポリヌクレオチドはより大きな二本鎖ポリヌクレオチドに変換される。再編成された二本鎖ポリヌクレオチドを分離し、一本鎖に編成した後、一部のサンプルは一本鎖の鋳型DNAとしてまたもう一方のサンプルはランダムプライマーとして上記に述べられたサイクルは繰り返されることが可能である。
【０４１３】
例４  シャッフルされたポリヌクレオチドからのポリペプチドスクリーニング
例３のポリヌクレオチドは単離され、ポリペプチドが発現される。初期鋳型DNAは、相補的なポリペプチドを得ることによって、比較コントロールとして利用される。例３でシャッフルされたポリヌクレオチドから得られるポリペプチドは、初期鋳型から得られたポリペプチドの持つ活性についてスクリーニングされ、コントロールの活性レベルと比較された。スクリーニングによって発見された関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、二次的な特質性についてさらに比較される。関心対象には及ばない、スクリーニングされたポリペプチドに相当するポリヌクレオチドは、再シャッフリングの対象となる。
【０４１４】
例５  飽和変異による酵素の指向的進化
部位飽和変異:  サイト飽和変異を達成するため、32 倍の縮重オリゴを使ったサイト主導での変異誘発によって、デハロゲナーゼのあらゆる残基（316）は、20すべてのアミノ酸へ置き換えられた。以下に記述する：
１．デハロゲナーゼ発現構成体を培養し、プラズミドを調整する。
２．それぞれのコドンをランダム化する為、オリゴを作製する-これらは共通の構造X20NN(G/T)X20を持つ。
３．〜50 ugのプラズミド鋳型、125 ngの各プライマー、1x native pfu buffer,200 μMの各ｄNTP、そして2.5ユニットのnative pfu DNAポリメラーゼを含む25ulの反応混合液を調整する。
４．Robo 96 Gradiant Cyclerを使った反応は下記の通りである。
熱変性  95℃にて１分間
20サイクルの95℃にて45秒、53℃にて１分間、そして72℃ にて11分間
伸長反応  72℃にて10分間
５．反応混合液は、メチル化されたDNA を消化するため10ユニットのDpn Iで37℃にて１時間消化する。
６．2ulの反応混合液を、50 ulのXL-1 Blue MRF細胞に導入し、全てのトランスフォーメーション混合液をLB-Amp-Metを含むプレートに添加すると、200〜1000のコロニーが出現する。
７．各コロニーは、爪楊枝によってLB-Amp-IPTGを含む96ウェル培養プレートに移し一晩培養する。
８．これらのプレートのクローンについて翌日アッセイする。
スクリーニング：  各ポジションにつき約200の変異体クローンを液体培地にて培養し、下記の方法によってアッセイする：
１．一晩培養された培地を遠心分離し、培地を取り除く。各ウェルに0.06 mlの1 mM Tris/SO42-ｐH 7.8を添加する。
２．各親プレートにつき0.02 mlの細胞懸濁を含む二つのアッセイプレートが用意される  。
３．一つのアッセイプレートは常温で、もう一方のプレートは高い温度（初期アッセイで  は55℃が使われた）で培養する（初期アッセイでは30分間。）
４．規定された時間の後、常温の0.08 ml基質（TCR飽和された1ｍM  Tris SO42-ｐH 7.8、  1.5 ｍM  NaNO3、そして0.1 ｍM  Bromothymol blue)を各ウェルに添加する。
５．各ウェルの連続カーブを得るため、様々な時間で620nm吸光度を測定する。
６．データを分析し、熱された細胞と熱されていない細胞の挙動を比べる。各プレートに  は、1〜2カラムの（24ウェル）変異していない20F12コントロールが含まれている。
７．耐性が改善されたウェルについては再び培養し、同じ条件にてテストする。
【０４１５】
上記の手順の結果、９つの変異が酵素の耐熱性を増した。この改善に関与した各ポジションのアミノ酸の変化を追及するため、遺伝子配置分析が行われた。その結果、この改善は、７箇所においては一つのアミノ酸のみ、８箇所目は二つのアミノ酸変化、そして９箇所目は３つのアミノ酸変化によってもたらされた。９箇所のうち各複数の変異を持ついくつかのコンビネーションの変異株が作られた。そして、二つの変異が一つのみの変異を含む他の変異よりも勝ることが証明された。
【０４１６】
例６  末端選抜（end-selection）を用いたダイレクトエクスプレッション
エステラーゼ遺伝子は、5'がリン酸化されたプライマーを使って通常のPCRリアクションにより増幅された（10 ng鋳型；PCRコンディション：94℃にて3分間；［94℃にて１分間；50℃にて１分間；68℃にて1分30秒］ｘ30；68℃にて10分間）
フォーワードプライマー＝
9511TopF（CTAGAAGGGAGGAGAATTACATGAAGCGGCTTTTAGCCC）
リバースプライマー＝
9511TopR(AGCTAAGGGTCAAGGCCGCACCCGAGG)
【０４１７】
PCR産物（100bp) はゲルによって分離され、そして定量された。
発現クローニングのベクターpASK3 (Institut fuer Bioanalytik, Goettingen, Germany)は、XbaIとBglIIによって消化され、CIPによりリン酸化された。
0.5 pmolのVaccina  Topoisomerase I（Invitrogen,  Carlsbad, CA）を60 ng（0.1pmol）の精製されたPCR産物に添加し、Buffer NEB I(New England Biolabs, Beverly, MA)の中で、計5 ul、37℃Cにて5 分間培養する。
トポゲートされたPCR産物はｐASKベクターに常温で導入された。
上記の混合液を純水で30分間透析する。
うち、2 ulがDH10B細胞(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)のエレクトロポレーションに用いられた。
効率：実際のクローン数に基づくと、この方法は1 ugのベクターにつき、2ｘ106クローンを産生することが出来る。テストされた全ての組換え体は、アンヒドロテトラサイクリンによる分化誘導の後、エステラーゼの活性を有した。
【０４１８】
例７  デハロゲナーゼの耐熱性
本発明は、厳しいとみなされるような環境を含む改変された環境にある期間従属された分子の改良された残存活性（例えば、酵素活性、免疫応答性、抗菌
活性など）によって、限定された方法の中で、指向進化により造られる好ましい特性が例示されることを可能にする。そのような環境とは以下のような何れの組み合わせを含む（反復性の有無、そして何れの順序または置換）：高温（酵素の変性を生じる温度を含む）、低温、高塩度、低塩度、高ｐH、低ｐH、高圧、低圧、放射源の露出変化（UV放射、可視光、電磁スペクトルを含む。）
下記の例は、高温露出に際し、酵素活性の回復及び/又は保持能力を進化させる定方向進化の応用を示すものである。
デハロゲナーゼ酵素のすべての残基（316）は32倍の縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを用いた部位指向性な変異誘発により20種すべてのアミノ酸へ変換された。これらの突然変異は、すでに改良された変異株Dhla20F12に導入された。各ポジションに対し、約200クローンが液体培地（384ウェルプレート）で培養され、スクリーンされた。
【０４１９】
スクリーン方法は、以下の通りである。
１．384ウェルプレートで一晩培養された培地は、遠心分離し、培養上清を取り除く。各  ウェルに0.06 mlの1 mM Tris/SO42-ｐH7.8を添加する。
２．ロボットにより、各親プレートにつき0.02 mlの浮遊細胞を含む二つのアッセイプレ  ートを作る。
３．一つのアッセイプレートは常温に、もう一方のプレートは高い温度（初期アッセイで  は55℃が使われた）で培養する（初期アッセイでは30分間。）
４．規定された時間の後、常温の0.08 ml基質（TCP 飽和された1 mM  Tris SO42-ｐH 7.8、1.5 ｍM  NaNO3、そして0.1 mM  Bromothymol blue)を各ウェルに添加する。
５．各ウェルの連続カーブを得るため、様々な時間での620 nmの吸光度を測定する。
６．データが分析され、熱された細胞と熱されていない細胞の挙動を比べる。各プレート  には、1〜2カラムの（２４ウェル）変異していない20F12コントロールが含まれている。
７．安定性が改善されたウェルは再び培養し、同じ条件にてテストされる。
上記の手順の結果、Dhla-20F12において、９つの単一突然変異が酵素の耐熱性を増した。遺伝子配置分析により、下記の変異が有益であることが示された：
【０４２０】
D89G
F91S
T159L
G189Q, G189V
I220L
N238T
W251Y
P302A, P302L, P302S, P302K
P302R/S306R
ただ二箇所（189と302）において一つ以上の置換があった。リストのうち、最初の５株は一つの遺伝子（G189Q）に組み合わされた（突然変異体”Dhla 5”と称した。）S306Rを除くすべての置換は、別の変異体に組み入れられ、”Dhla 8” と称した。耐熱性は、酵素を高温（55℃と80℃）にて一定の時間培養し、 30℃にて活性をアッセイすることにより査定された。初期速度は、高温について時間に対し座標で示された。酵素は培養とアッセイの間Tris／SO4ｐH 7.8に保たれた。産物（Cｌ-)は通常方法Fe(NO3)3 と HgSCNを用いて検出された。Dhla20F12は野生型de factoとして用いられた。半減期 (T1/2) は、データを減少指数に組み込むことにより計算された。
【０４２１】
例８  飽和変異
下記の例は、飽和変異を用いた三つの関連のある親ヌクレオチド遺伝子操作を説明する。それぞれの三つの関連した親ヌクレオチドは、分界点を定めるためコンピューターによってアライメントされ、17個のポイントが確認された。それぞれの分界点が定められると、システムは各々の親遺伝子を構成する18個の異なった断片の配列を決定する。親配列からのそれぞれの断片は、独特な5'突出および3'突出を持つので、適切な順序の遺伝子のみコンピューターにより再集合されることができる。18個の断片と3個の親の為、システムは計18ｘ3＝54の断片を分析する。システムが各々の断片を予め連結することは、すべての可能な連結された断片のコンビネーションに一致するデータファイルを保存するために有利である。これによってシステムは、予め決定された子孫個体群（PDF)を産生するため、それぞれの連結反応において予め連結された断片の量を定めることが出来る。そのため、この例においては、コンピューターは、各々の親配列に対し、下記の予め連結された配列を定めて保存する。それゆえ、下記の連結方法は、各々の親配列によって行われ、結果データはコンピューターに保存される。
用語"F1-1"は、選ばれた親配列の始めの断片を指す。"F1-5"は、下記に示すように、選ばれた親配列の1、２，３，４，５番目のコンビネーションを含むデータセットを指す。従って、下記のリストは、システムが与えられた親配列の全ての可能な連結された断片を備えたデータセットを産生することが可能なことを図示する。望ましい最終的な子孫キメラ配列の交叉個体群を生ずるため、このデータセットは、それぞれの連結された断片の適切な量を定めるためシステムによって用いられる。
【０４２２】
18個の断片を持つ親配列のプリライゲーションデータセットのリスト
F1_1 = F1_1
F1_2 = F1_1 + F2_2
F1_3 = F1_1 + F2_2 + F3_3
F1_4 = F1_1 + F2_2 + F3_3 + F4_4
F1_5 = F1_1 + F2_2 + F3_3 + F4_4 + F5_5
F1_6 = F1_1 + F2_2 + F3_3 + F4_4 + F5_5 + F6_6
F1_7 = F1_1 + F2_2 + F3_3 + F4_4 + F5_5 + F6_6 + F7_7
F1_8 = F1_1 + F2_2 + F3_3 + F4_4 + F5_5 + F6_6 + F7_7 + F8_8
F1_9 = F1_1 + F2_2 + F3_3 + F4_4 + F5_5 + F6_6 + F7_7 + F8_8 + F9_9
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F15_15 = F15_15
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F15_17 = F15_15 + F16_16 + F17_17
F15_18 = F15_15 + F16_16 + F17_17 + F18_18
F16_16 = F16_16
F16_17 = F16_16 + F17_17
F16_18 = F16_16 + F17_17 + F18_18
F17_17 = F17_17
F17_18 = F17_17 + F18_18
F18_18 = F18_18
【０４２３】
それぞれの連結された断片の配列が定められたら、システムは望ましいPDFを産生する為に必要なそれぞれの連結された配列の数を推定し始める。上記に述べたように、18個の断片を持つ配列の連結反応は好ましくは18の独立した反応から成る。よってシステムは、18個の独立した連結反応のスターティングセットを産生する。それぞれの連結反応において、次第に少ない連結される分子が使われることに注目されたい。これは、例えば、三番目の連結反応において断片1"F1"または断片2"F2"から始まる連結された断片は3番目の連結反応までにすでに他の断片に連結している為、必要ないのである。第三反応においては、それぞれの親から三番めの断片の結合する断片の連結のみのはずである。
【０４２４】
例えば、下記はコンピューターのメモリーの中で行われた模範的な連結反応である。
連結反応の数：18
それぞれの模擬連結分量（ul)：100
【０４２５】
【表１０９】
2004532038.tif 000110
【０４２６】
【表１１０】
2004532038.tif 000111
【０４２７】
【表１１１】
2004532038.tif 000112
【０４２８】
【表１１２】
2004532038.tif 000113
【０４２９】
前述の連結反応を行うことにより計算されたPDFが得られる。よって、このシステムは、PDF が目的の確率関数となるまで、更なる回数の模擬再集合の間、各々の前連結断片量の調節が可能である。大多数の子孫分子は一回または二回の交叉イベントしかない。下記に示すように連結反応の分量を調整することによって子孫分子がより多くの交叉イベントを持つようにPDFを変えるとができる。
当業者なら、本発明が目的を遂行し、上述の結果や利点、さらに生来持っている結果や利点を得るのに適していることを即座に理解するであろう。ここで記述されている手法は、現時点で典型的な局面を代表しているもので、発明の範囲を限定するものではない。当業者間では、発明の範囲内での変化や他の用法は将来起きてくるもので、これは本発明の精神に包含され、請求項目の範囲で定義されるものである。
【０４３０】
参考文献
特に明記しない限り、ここに引用した参考文献はすべて（以上及び以下）は、全体として組み入れられるものとする。
【０４３１】
2004532038.tif 000114
【０４３２】
2004532038.tif 000115
【０４３３】
2004532038.tif 000116
【０４３４】
2004532038.tif 000117
【０４３５】
2004532038.tif 000118
【０４３６】
2004532038.tif 000119
【０４３７】
2004532038.tif 000120
【０４３８】
2004532038.tif 000121
【０４３９】
2004532038.tif 000122
【０４４０】
2004532038.tif 000123
【０４４１】
2004532038.tif 000124
【０４４２】
2004532038.tif 000125
【図面の簡単な説明】
【０４４３】
【図１】図1：エキソヌクレアーゼ活性  酵素エキソヌクレアーゼIII活性を示す。これはポリヌクレオチド構築ブロックをシャッフリング、集合、再集合、再結合、及び/又は連結するために使用されうる代表的な酵素である。星印は、酵素がポリヌクレオチド基質の3'方向から5'方向に向かって作用することを示している。
【図２】図2：ポリメラーゼに基づく増幅による核酸構築ブロックの産生  ポリメラーゼに基づく増幅反応（例えばPCR）を用いて二つの突出をもつ二重鎖核酸構築ブロックを産生する方法を図示する。示されるように、最初のプライマーセット、F2 及び R1 を用いたポリメラーゼに基づく最初の増幅反応が、本質的に産物Ａと同一な平滑末端産物（反応1、産物1と標記）を産生するために使用される。第二のプライマーセット、F1 および R2 を用いたポリメラーゼに基づく第二の増幅反応が、本質的に産物Bと同一な平滑末端産物（反応2、産物2と標記）を産生するために使用される。これらの二つの産物はその後混合され、融解およびアニーリングされ、二つの突出を有する潜在的に有用な二重鎖核酸構築ブロックを産生する。図1の例では 3' 突出を有する産物（産物C）が、例えばエキソヌクレアーゼIII等の 3' 作用性エキソヌクレアーゼを用いたその他の三つ産物のヌクレアーゼに基づく破壊により選抜される。示されているように、利用可能なプライマーが重複しうり、かつ更に利用可能なプライマーが異なる長さでありうることを図示するために、代替のプライマーが括弧内に示されている。
【図３】図3：ユニークな（unique）突出および独特な結合  各サイズの独特な突出の数（例えば、１、２または３等のヌクレオチドからなる独特な突出の総数）が該サイズの独特な全突出の使用によりもたらされうる独特な結合の数を超える点を図示している。例えば、単ヌクレオチドからなる4つの独特な 3' 突出、及び単ヌクレオチドからなる4つの独特な 5' 突出がある。しかし、全8個の独特な単ヌクレオチド 3' 突出および単ヌクレオチド 5' 突出を用いて作製されうる独特な結合の総数は4である。
【０４４４】
【図４】図4：構築ブロックを順次結合することにより達成される独特の全体集合順序  全体で「n」個の核酸構築ブロックを集合させるためには「n-1」回の結合が必要とされる事実を図示している。しかし用途に利用可能な独特な結合の数は「n-1」値より小さいことが時々ある。これら及び他の状況下では、厳密な非確率論的全体集合順序は、一連の段階の集合過程を実施することによってもなお達成されうる。本例においては二回の連続した段階が5個の核酸構築ブロックに対する設計された全体集合順序を達成するために使用される。この図示では、５個の核酸構築ブロックに対する設計された全体集合順序は5'-(#1-#2-#3-#4-#5)-3'であり、式中、#1が構築ブロック番号1を表す（以下同じ）。
【図５】図5：二ヌクレオチド 3' 突出を用いて利用可能な独特な結合  さらに、各サイズの独特な突出の数（ここでは、例えば、二ヌクレオチドからなる独特な突出の総数）が該サイズの独特な全突出からもたらされうる独特な結合の数を超える点を図示する。例えば、示されているような全32個に対しては、2ヌクレオチドからなる16個の独特な 3' 突出および二ヌクレオチドからなる別の16個の独特な5'突出がある。しかし、全32個の独特な二ヌクレオチド 3' 突出および二ヌクレオチド 5' 突出を用いて作製されうる、独特かつ自己結合しない結合の総数は12個である。いくつかの明らかな独特な結合は「一卵性双生児」（同じ影付けでマークされている）であり、それらはこの図示では視覚的に明らかである。さらに他の突出は、この図において示されおよび標識付けられているように回文構造性様式で自己結合できるヌクレオチド配列を含んでいる。それゆえ、それらは全体集合順序に高い厳密性を寄与しない。
【０４４５】
【図６】図6：合成ライゲーション再集合によるキメラ組み合わせの網羅的なセットの産生  この例において設計された核酸構築ブロックの全ての可能な組み合わせを網羅的かつ体系的に産生する能力における本発明の力を見せている。特に大きな子孫キメラ分子セット（又はライブラリー）が産生されうる。本方法を網羅的かつ体系的に実施することが可能であるため、新規の境界点（demarcation point）を選抜することにより、かつ対応する新規に設計された核酸構築ブロックを用いて、その方法の適用を繰り返すことが可能であり、過去に試験されたおよび拒絶された分子種を再産生および再スクリーニングする負担は回避される。境界点の頻度を増加させるためにコドンゆらぎ（wobble）を有利に使用することが可能であることは理解される。言い換えると、コドン縮重のために、祖先コドンによりコードされるアミノ酸（すなわち現在変更されたコドン）を変更することなしに、ある特定の塩基がある核酸構築ブロックにしばしば置換されうる。図示されているように、境界点は8個の祖先鋳型のアラインメントに基づいて選抜される。それらの（順序付けられた結合形成に役立つ）突出を含む核酸構築ブロックがその後設計及び合成される。この例では、全144個の核酸構築ブロック（又は二重鎖オリゴ）を得るために、8個の祖先鋳型それぞれの配列に基づき18個の核酸構築ブロックが産生される。ライゲーション合成方法を実行することにより、818（又は1.8 X 1016 超）のキメラ収量量からなる子孫分子のライブラリーが作製されると考えられる。
【図７】図7：オリゴからの合成遺伝子  本発明のある一つの態様によると、二重鎖核酸構築ブロックは複数の祖先核酸鋳型を整列化することにより設計される。好ましくはこれらの鋳型は、多少の類似性および多少のの異質性を含む。核酸は、その関連性が機能もしくは構造またはその両方に基づきうる、関連酵素等の関連タンパク質をコードしうる。三個のポリヌクレオチド祖先鋳型のアラインメントおよび全ての祖先分子により共有されている境界点（囲み表示）の選抜を示す。この特定の例においては、各祖先鋳型由来の核酸構築ブロックは約30ヌクレオチド長から50ヌクレオチド長となるように選抜された。
【０４４６】
【図８】図8：合成ライゲーション遺伝子再集合のための核酸構築ブロック  図7の例からの核酸構築ブロックを示す。ここにおいて核酸構築ブロックは、5' 突出および 3' 突出の両方を含む互換的な突出を有する、一般的な漫画の形式で示されている。三個の祖先鋳型の各々に由来する全22個の核酸構築ブロックが存在する。したがってライゲーション合成方法により322（又は3.1 X 1010超）のキメラ収量からなる子孫分子のライブラリーが作製される。
【図９】図9：合成ライゲーション再集合によるイントロンの付加  核酸構築ブロック経由でイントロンがキメラ子孫分子内に導入されうることを、一般的な漫画の形式で示している。それらを動作可能にするために、イントロンはしばしば共通配列を両末端に有することが理解される。遺伝子スプライシングを可能にすることに加えて、他の核酸と類似した部位を提供することにより相同性組換えを可能にするという別の目的のためにイントロンがはたらきうることもまた理解される。この目的および潜在的な他の目的のためには、イントロンを導入するために巨大な核酸構築ブロックを産生することが時には望ましくてもよい。もし2つの一重鎖オリゴの直接化学合成により容易に産生されるよりもサイズが非常に大きいならば、図2に示されているように、そのような特殊化された核酸構築ブロックもまた２を超える一重鎖オリゴの直接化学合成により、またはポリメラーゼに基づく増幅反応を用いることにより産生されうる。
【０４４７】
【図１０】図10：突出の全ヌクレオチドより少ない数を用いたライゲーション再集合関係する突出において全てのヌクレオチドを使用しない様式で結合が起こりうるることを示している。「ギャップライゲーション」または「ギャップド（gapped）ライゲーション」と称されうるものを形成するリガーゼ酵素を用いた処理により結合が補強されるならば、結合は（例えば形質転換された宿主内で）特に存続する可能性が高い。示されているように、この種類の結合は不要なバックグラウンド産物の産生に寄与できるが、また設計されたライゲーション再集合により産生された子孫ライブラリーの多様性を有利に増加させるために使用されうることが理解される。
【図１１】図11：パリンドロミック構造性結合における不要な自己ライゲーションの回避  上述し、かつ図5に示されているように、ある突出は自己結合を受けることが可能であり、パリンドロミック構造性結合を形成する。もしリガーゼ酵素を用いた処理により補強されるならば、結合は実質的に強化される。したがって、示されているようにこれらの突出における5'リン酸の欠失は、この種の回文構造性自己結合を阻止するために有利に使用されうることが理解される。したがって本発明により、ライゲーション再集合過程におけるパリンドロミック構造性自己結合を阻止するために、例えばウシ小腸アルカリフォスファターゼ（CIAP）等の脱リン酸化酵素を用いた処理により、5' リン酸基を欠失する核酸構築ブロックが化学的に作製（または注文）されうる（また一方それらが除去されうる）。
【０４４８】
【図１２】図12：ポリメラーゼに基ずく伸長による部位特異的変異法パネルＡ  この図は、数ある部位特異的変異法のうち、部位飽和変異を行うために役立つある部位特異的変異法を示したものである。セクッション（１）は、環状化した二本鎖プラスミドにアニールした一番目と変異を持つ二番目のプライマーを示している。＞は、変異を持つプライマーにおける変異部位を示している。矢印は合成の方向を示す。セクション（２）は、お互いにアニールした新たに合成（変異）された DNA 鎖を示している。親DNAは制限酵素により処理しておくこ とができる。変異 DNA 鎖は、二本鎖の変異した環状DNA中間体を形成す るためにアニールしているように示してある。＞は、実験的に作られた子孫（変異）DNA鎖における変異部位を示している。変異 DNA 鎖にある 切断断端が付着末端を形成していることに注目。セクッション（３）は、セクション（２）の変異DNA鎖にアニールした一番目と変異を持つ二番目のプライマーを示している。矢印は合成の方向を示す。各変異 DNA 鎖（ それらは結合されていない）の開いている部分に注目。セクッション（４）は、変異 DNA 鎖を鋳型として合成した ”GAPPED PRODUCT”を示し、それは第二世代変異 DNA 鎖を構成している。”GAPPED  PRODUCT” の DNA 鎖は、二本鎖の変異した環状 DNA 中間体を形成ためにアニールしているよう に示してある。＞は、変異 DNA 鎖における変異部位を示している。各 変異DNA鎖における大きなギャップに注目。セクション（５）は、親（変異がない）プラスミドにアニールしている ”GAPPED PRODUCT” を示し、これはポリメラーゼに基ずく合成を可能にする。矢印は合成の方向を示す。セクション（６）は、新たに合成された DNA鎖が二本鎖の変異した環状 DNA 中間体を形成するためにアニールしているように示してある。＞は、変異 DNA鎖における変異部位を示している。変異 DNA ストランドにある切断断端に注目。また、各変異DNAストランドにおける両変異部位の存在に注目。  パネルB  この図は、図12Ａの増幅ステップにより産生される二つの可能な分子構造を示している。分子（Ａ）は、図12Ａのセクション（２）にも示してある。分子（B）は、図12Ａのセクション（６）にも示してある。
【０４４９】
【図１３】図13：ポリメラーゼに基ずく伸長及びリガーゼに基ずく結合による部位特異的変異法パネルＡ  この図は、数ある部位特異的変異法のうち、部位飽和変異を行うために役立つある部位特異的変異法を示したものである。セクション（１）は、環状化した二本鎖プラスミドにアニールした一番目と変異を持つ二番目のプライマーを示している。＞は、変異プライマーにおける変異部位を示している。矢印は合成の方向を示す。セクション（２）は、お互いにアニールした新たに合成（変異）された DNA鎖を示している。親 DNA は制限酵素により処理しておくことが できる。変異 DNA ストランドは、二本鎖の変異した環状 DNA 中間体を形成するためにアニールしているように示してある。＞は、実験的に作られた子孫（変異）DNA鎖における変異部位を示している。変異 DNA鎖にある 切断断端が付着末端を形成していることに注目。セクション（３）は、セクション（２）の二本鎖変異環状 DNA鎖が結合した後（例えば、T4リガ ーゼによって）に結果として産生される二本鎖変異環状 DNA 分子を示してる。 矢印は合成の方向を示す。各変異 DNA鎖（それらは結合されていない ）の開いている部分に注目。セクッション（４）は、セクション（３）の変異DNA鎖にアニールした一番目と変異を持つ二番目のプライマーを示している。矢印は合成の方向を示す。セクッション（５）は、先に作製された DNA ストランド（青）を変異二本鎖の変異した環状DNA中間体を形成ためにアニールしているように示してある。＞は、先に作製された変異 DNA 鎖（青） における変異部位を示している。先に作製された変異 DNA 鎖にある切 断断端が付着末端を形成していることに注目。また、先に作製された二つの各変異DNA鎖における両変異部位の存在に注目。各変異DNA鎖（それらは結合されていない）の開いている部分に注目。セクション（６）は、セクション（５）の二本鎖変異環状 DNA 鎖が結合した後（例えば、T４リガーゼによって）に結果として産生される二本鎖変異環状 DNA 分子を示してい る。＞は、変異 DNA鎖における変異部位を示している。再度、各変異 DNA鎖における両変異部位の存在に注目。パネルＢ  この図は、図13Ａの増幅ステップにより産生される二つの分子構造を示している。分子（Ａ）は、図13Ａのセクション（３）にも示してある。分子（B）は、図13Ａのセクション（６）にも示してある。
【０４５０】
【図１４】図14：遺伝子ワクチンの導入を容易にする核酸結合タンパクの入手及び使用に関する戦略  ここに示すのは、遺伝子ワクチン、特に、ありのままの DNAの標的細胞 への導入を容易にする核酸結合タンパクの入手及び使用に関する戦略である。ここより述べる指向的進化法により得られるライブラリーの構成員は、融合タンパクがファージの表層に発現されるように M13 タンパク VIII のコードされた領 域に結合している。好ましい標的組織に効果的に入るファージが同定され、融合タンパクは遺伝子ワクチンの核酸をコートするために使われる。
【図１５】図15：Ａ 多様な抗原に由来する免疫原領域を持つ多価抗原キメラを作製 するための方法に関する概要の描写  各非キメリック免疫原ポリペプチドに対する抗体は、各生物（Ａ，Ｂ，Ｃ）に特異的である。しかしながら、指向的進化及び本発明の選別法を行った後、三種の免疫原ポリペプチドの各々に対して作製した抗体により認識されるキメリック免疫原ポリペプチドが得られる。
【図１６Ａ】図16Ａ：広域免疫応答を誘導できるポリペプチドを非確率的に得るための方法  ここに示すのは、広域免疫応答を誘導できるポリペプチドを非確率的に得るための概略である。図16Ａにおいて、病原体Ａ，Ｂ及びＣに由来する野生型免疫原ポリペプチドは、ポリペプチドが由来した対応する各々の病原体に対する保護を提供すが、他の病原体には全く交叉保護作用を示さない（パネル左）。進化を行った後、三つの全ての病原のタイプに対する保護免疫応答を誘導し得る Ａ/Ｂ/Ｃ キメリック免疫原ポリペプチドが得られる（パネル右）。図16B において、指向的進化は、二種の病原体株（Ａ，Ｂ）に由来する基質核酸に使われ，それは対応する病原体に対してのみ保護的であるポリペプチドをコードしている。指向的進化の後、結果として得られるキメリックポリペプチドは、その二種の病原体株のみならず第三の病原体（C）に対しても免疫応答を誘導できる。
【図１６Ｂ】図16B：広域免疫応答を誘導できるポリペプチドを非確率的に得るための方法  ここに示すのは、広域免疫応答を誘導できるポリペプチドを非確率的に得るための概略である。図16Ａにおいて、病原体Ａ，Ｂ及びＣに由来する野生型免疫原ポリペプチドは、ポリペプチドが由来した対応する各々の病原体に対する保護を提供すが、他の病原体には全く交叉保護作用を示さない（パネル左）。進化を行った後、三つの全ての病原のタイプに対する保護免疫応答を誘導し得る Ａ/Ｂ/Ｃ キメリック免疫原ポリペプチドが得られる（パネル右）。図16B において、指向的進化は、二種の病原体株（Ａ，Ｂ）に由来する基質核酸に使われ，それは対応する病原体に対してのみ保護的であるポリペプチドをコードしている。指向的進化の後、結果として得られるキメリックポリペプチドは、その二種の病原体株のみならず第三の病原体（C）に対しても免疫応答を誘導できる。
【０４５１】
【図１７】図17：特別なポリヌクレオチドが得に好ましい性質をもった免疫原ポリペプチドをコードするかを決定する可能なファクター  ここに特別なポリヌクレオチドが得に好ましい性質をもった免疫原ポリペプチドをコードするかを決定し得る可能ないくつかのファクター、例えば、免疫原性及び／又は交叉反応性の促進、について示す。特別な性質にポジティブに影響を及ぼすそれらの配列領域は、抗原遺伝子にそってプラスのサインとして示され、一方、ネガティブ効果をもつ配列領域はマイナスサインで示してある。関連した抗原遺伝子のプールは、ここに述べられる方法を用いて非確率的に作成され、正の配列領域が増大され、負の領域をなくした進化した核酸を得るためにスクリーンされる。どの領域が特別な特徴にとってポジティブであるか、ネガティブであるかに関する知識は前もって必要とされない。
【図１８】図18：抗原ライブラリースクリーニングのための戦略  ここに抗原ライブラリースクリーニングのためのスクリーニング戦略の概略を描写する。
【図１９】図19：抗原ライブラリースクリーニングのための採取及び抽出に関する戦略ここに抗原ライブラリースクリーニングのための採取及び抽出に関する戦略を示す。
【図２０】図20：部位特異的変異法の典型的な具体例
【０４５２】
【図２１】図21：マルチモジュール遺伝子ワクチンベクターの概略描写  ここにマルチモジュール遺伝子ワクチンベクターの概略的を描写する。典型的な遺伝ワクチンベクターは、一つまたはそれ以上の指摘された成分を含み、各々の成分はそのままか、あるいはここに述べられる指向的進化法を用いて至適化することができる。これらの指向的進化法は、ここに述べられているような遺伝子部位指向的変異法を含む確率的な方法及び／又は非確率的な方法による点変異の導入を含むことができる。これら指向的進化法は、確率的なポリヌクレオチド再構成法をも含み得る。
【図２２Ａ−２２Ｂ】図22Ａ−図22Ｂ：多様なT細胞エピトープを持つベクターの作製  ここに、例えば、指向的進化法により得られた多様なT細胞エピトープを含むベクターの作製に関する二つの異なる戦略を示す。図60Ａにおいて、非確率的に作製されたエピトープをコードした遺伝子の各々は、単一のプロモーターとリンクされ、多様なプロモーター−エピトープ遺伝子は単一のベクターに組み込むことができる。ここに示し、述べられ、及び／又は引用（引用文献も含まれる）してある概略は、多様なプロモーター−エピトープ遺伝子を単一のプロモーターにリンクさせることに関連している。
【図２３】図23：指向的進化による至適化遺伝子ワクチンの作製  ここに至適化遺伝子ワクチンの作製に応用される指向的進化の概略を示す。既知の機能的（例えば、調節的な、符号的な、及びその類い）性格を持つ異なった型のポリヌクレオチドは、進化され、遺伝子ワクチンとして使用するために改良された性質を持つ亜種を同定するためにスクリーニングされる。
【０４５３】
【図２４】図24：特異的進化及び進化したプロモーター配列の選別のフローサイトメトリーを基にしたスクリーニング法を例とした再帰的応用  ここに述べるような指向的進化法の再帰的応用により進化させた至適化プロモーター配列の選別のためのフローサイトメトリーを基にしたスクリーニング法 （FACS）の概略をここに示す。描写の目的で、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを使用する。
【図２５】図25：皮膚及び筋肉ヘのミクロインジェクションのための装置  ここに遺伝ワクチン及びたの試薬の、例えば、皮膚及び筋肉のような組織ヘのミクロインジェクションのために適した装置を示す。その装置は、インビボで多数の試験薬をスクリーニングするために特に有用なものであり、96 穴プレートを 用いた測定に応用できるようになっている。装置にあるチップは、チップがミクロプレートに合うような調節を可能にするために可動性になっている。プレートから関係のある試薬を採取した後、チップはおよそ2−3ミリインチの距離を調 節され、おおよそ 1.6 X 2.4 cm 〜2.4 X 3.6 cm の領域に 96 種類の異なった サンプルを移すことが可能である。もし必要ならば、移される各サンプルの容量は、典型的には 2−5 μl の範囲で、電気的に調節できる。各試薬は、組織の注 入部位の認識を容易にするために、マーカー試薬または色素を混合できる。例えば、異なったサイズ及び形状の金粒子はその試薬に混合されることができ、顕微鏡及び免疫組織学において各注入部位の同定及び各試薬により誘導された反応を調べるために使用される。筋肉組織に注入された場合は、注入部位は手術により初めて明かとなる。
【０４５４】
【図２６】図26：ポリヌクレオチドの再構成  パネルＡに示してあるのは指向的進化の例である。ウイルスの N 種の異なった株がこの図に使われているが、その技術は、異なる株、種あるいは、他の単一核酸に比べて一つあるいはそれ以上のヌクレオチドの変化を持つ単一核酸を持っている遺伝子ファミリーのための如何なる核酸だけでなく、如何なる単一核酸にも応用が可能である。ここに述べられるように異なる核酸亜種は、実験的に、一つの例においては非確率的に、作製され、好ましい性質を持つそれら亜種の同定にためにスクリーンされる。指向的進化法及びスクリーニングは、更成る改良のために、一回あるいはそれ以上繰り返すことができる。パネルＢは、指向的進化の連続的繰り返しが累進的に向上した性質をつくりだせること、及び個体の利益的な変異の組み合わせが、個体の利益的な変異によって達成される改良に比べて高い改良を導きだせることを示している。
【図２７】図27：プロモーター進化のためのベクター  ここに、この中で述べるような指向的進化法を用いて進化させたプロモーター核酸のライブラリーから改良されたプロモーターを同定するために有用なベクターの例を示す。実験的に作製された想定されるプロモーターは、発現が容易に検出できるように、レポーターのベクター上流に挿入される。多くの応用のために、レポーター遺伝子の産物は、そのレポーター遺伝子が高いレベルで発現している細胞がレポーター遺伝子の産物を用いたフローサイトメトリーを基とした細胞選別により分けられるように、細胞表層タンパク質にすることが好ましい。適当なレポーター遺伝子の例として、例えば、B7-2及びmAb179エピトープが含まれる。ポリアデニン領域（SV40のポリＡが描かれている）は、典型的には、そのレポーター遺伝子の下流に置かれる。ベクターは、また、内部標準である二番目のレポーター遺伝子（GPF：グリーンフルオレスセインタンパク）を含み得、これはプロモーター（SRap）に結合している。典型的なベクターは、また、選択マーカー（カナマイシン／ネオマイシン抵抗性のものを示す）及び哺乳動物細胞（SV40  ori）及び／又はバクテリア（pUC ori）において機能する複製の起源を含む ことができる。
【０４５５】
【図２８】図28：指向的進化法及びフローサイトメトリーを基とした選別を用いた誘導可能プロモーターの反復進化  ここに、ここの中で述べるような指向的進化法及びフローサイトメトリーを基とした選別を用いた誘導可能プロモーターの反復進化の概略を示す。実験的に作製された適当なベクターに存在するプロモーター核酸のライブラリーを細胞に感染させ、非誘導下、マーカー抗原を最も少なく発現する細胞を選択する。ベクター（及び／またはそれらを含む細胞）を回収し、そのベクターを細胞に感染させ（もし、その中にすでに含まれていない場合）誘導条件下で培養する。高いレベルで発現しているそれらの細胞を選択する。
【図２９】図29：経口、血中、筋内、皮下、肛門、膣、あるいは局所投与分布のための遺伝ワクチンベクターの進化法  これは、各組織への好ましい標的を行うための M13 ライブラリー（例えば、こ こに述べられるような指向進化法を用いて実験的に作製されたもの）のスクリーニング戦略についての描写である。ここに示す特別な例は、経口投与を改良するための遺伝ワクチンベクターの改良法を概略したものである。これは、胃の中の酸性条件での安定性や消化器官のたの分解因子に対する抵抗性のための選別を含むことがある。描写した特別な例は、経口投与分布の改良のためのスクリーニングと関連があるが、同じ原理は、経口、血中、筋内、皮下、肛門、膣、あるいは局所など、他の経路により投与されるライブラリーにも応用される。試験動物に投与分布した後、M13ファージ（あるいはその産物）を目的の組織から回収する。その操作は、更成る至適化のために繰り返すことができる。
【図３０】図30：二種のヒト及び一種のサルCMV株の核酸配列のアラインメントここに、二種のヒト及び一種のサル（あかげ猿）のサイトメガロウイルス（CMV）株の核酸配列のアラインメントを示す。このアラインメントは、非確率的ポリヌクレオチドの再集合を行うために使用可能である。典型的かつ非制限的な再集合部位を示すために、二配列を共有する核酸配列は青で、三配列を共有するものは赤で示す。
【０４５６】
【図３１】図31：三種（ヒト、霊長類及び犬）に由来するIL-4ポリヌクレオチド配列のアラインメント  ここに、ヒト、犬及び霊長類のIL-4ポリヌクレオチド配列のアラインメントを示す。このアラインメントは、非確率的ポリヌクレオチドの再集合を行うために使用可能である。典型的かつ非制限的な再集合部位を示すために、二配列を共有する核酸配列は青で、三配列を共有するものは赤で示す。
【図３２】図32：想定されるポリヌクレオチドの合成（インビボあるいはインビトロ）、対応する想定されるポリヌクレオチドを指向的進化させること及びそれに引き続くポリペプチドの発現スクリーニングによるポリペプチドの進化
【図３３】図33：オリゴ特異的な CpG ノックアウトの非確率的再集合ここに、不必要なCpG配列が削除され、有用な CpG 配列を付加可能な、非置換的なCpG配列が同定されているプロモーター配列を作製するためのここに述べる非確率的な方法の概略を示す。さらに、他の配列（その CpG 配列とは別）を使わ れるポリヌクレオチドについて置換挿入及び／又は削除することができる。
【図３４】図34：HbsAg ポリペプチド（PreS2にS領域を加えたもの）から得られる CTIS の一例ここに、HbsAg ポリペプチド（PreS2に S 領域を加えたもの）から得られる細胞 毒性-T細胞に誘導される配列（CTIS）の一例を示す。
【図３５】図35：細胞質部位に結合する異種エピトープを持つ CTISここに、細胞質部位に結合する異種エピトープを持つ CTIS の一例を示す。
【０４５７】
【図３６】図36：免疫原製を持つアゴニスト配列（IAS）の調整方法ここに、免疫原製を持つアゴニスト配列（IAS）の調整方法を示す。可能なアゴニスト配列を含むポリ−エピトープをコードした核酸を得るために、対象とするポリペプチドをコードした野生型（WT）及び変異型核酸を集め、非確率的な再構成を行う。
【図３７】図37：指向的進化法を用いた免疫刺激性配列（ISS）の改良ここに、ここに述べる特異的進化法を用いた免疫刺激性配列（ISS）の改良についての概略を示す。オリゴヌクレオチドのビルディングブロック（例えば、合成的に作製）、既知の ISS を持ったオリゴ、CpG を含んでいるヘキサマーを含ん だオリゴ、ポリＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、等を再集合できる。結果として生ずる分子は、ここに述べる一つあるいはそれ以上の指向的進化法にかけることができる。
【図３８】図38：T細胞の増殖を誘導可能な組換えIL-12 をコードしたIL-12 遺伝しを同定するスクリーニング  ここに、実験的に作製された分子により、例えば、非確率的に作製したヒトIL-12ライブラリーをT細胞の増殖を誘導可能な進化型IL-12 をコードした進化型IL-12 遺伝子を同定するためにスクリーニングすることができるような操作の概略を示す。
【図３９】図39：異なった CD80/CD86 をコードした遺伝子ワクチンによるT細胞活性化 あるいは非感作誘導のモデル  ここに、どのようにして異なった B7(1CD80)及び/又は B7-2(CD86)をコードした遺伝子ワクチンが T 細胞の活性化あるいは非感作を誘導するかをモデルで示す。
【図４０】図40：T 細胞の活性化あるいは非感作を誘導することのできる CD80/CD86 変種のスクリーニング  ここに、T 細胞の活性化あるいは非感作を誘導することのできる改良された能力を持つ CD80/CD86 変種をここに述べる指向的進化法用い得るための方法を示 す。
【図４１】図41：ヒト及び霊長類に由来する二種の CMV に由来したヌクレオチド 配列のアラインメント  ここに、ヒト及び霊長類株に由来する二種の CMV に由来するヌクレオチド配列のアラインメントを示す。このアラインメントは、非確率的ポリヌクレオチドの再集合を行うために使用可能である。典型的かつ非制限的な再集合部位を示すために、二配列を共有する核酸配列は青で、三配列を共有するものは赤で示す。
【０４５８】
【図４２】図42：ヒト、ネコ及びげっ歯類に由来するINF-ガンマのヌクレオチド配列のアラインメント  ここに、ヒト、ネコ及びげっ歯類に由来するINF-ガンマに由来するヌクレオチド配列のアラインメントを示す。このアラインメントは、非確率的ポリヌクレオチドの再集合を行うために使用可能である。典型的かつ非制限的な再集合部位を示すために、二配列を共有する核酸配列は青で、三配列を共有するものは赤で示す。
【図４３】図43は、本発明の新規キャピラリーアレー、例えば、GIGAMATRIX（登録商標）（ Diversa Corporation、San Diego、CA）、の典型的な応用の概略を示している。
【図４４】図44は、本発明による磁気ビーズの使用を示している。
【図４５】図45は、本発明による磁気ビーズの典型的使用例を示している
【図４６】図46は、本発明の新規キャピラリーアレー、例えば、GIGAMATRIX（登録商標）（Diversa Corpora-tion、San Diego、CA）、の典型的な応用の概略を示している。
【図４７】図47は、以下にその詳細を述べるように、本発明の新規遺伝子部位飽和特異法の典型的な応用の概略を示している。
【図４８】図48は、以下にその詳細を述べるように、本発明の新規遺伝子再集合法（GENE-REASSEMBLY（登録商標））の典型的な応用の概略を示している。
【図４９】図49は、以下にその詳細を述べるように、本発明の新規遺伝子再集合法（GENE-REASSEMBLY（登録商標））の典型的な応用の概略を示している。
【０４５９】
【図５０】図50は、以下にその詳細を述べるように、本発明の新規遺伝子再集合法（GENE-REASSEMBLY（登録商標））の典型的な応用の概略を示している。
【図５１】図51は、以下にその詳細を述べるように、本発明の新規遺伝子再集合法（GENE-REASSEMBLY（登録商標））の典型的な応用の概略を示している。
【図５２】図52は、以下にその詳細を述べるように、本発明の新規遺伝子再集合法（GENE-REASSEMBLY（登録商標））の典型的な応用（デハロゲナーゼの再集合）の概略を示している。
【図５３】図53は、以下にその詳細を述べるように、本発明の新規調律遺伝子再集合法（TUNABLE  GENE-REASSEMBLY（登録商標））の典型的な応用の概略を示している。
【図５４】図54は、以下にその詳細を述べるように、本発明の方法に使うことのできるDNAカーペンター（DNA CARPENTER（登録商標））を調節するソフトウエアーの典型的な応 用の概略を示している。
【図５５】図55は、本発明の遺伝子ファミリー再集合法の典型例を概略している。
【図５６】図56は、本発明の遺伝子ファミリー再集合法の典型例を概略している。
【図５７】図57は、以下に詳しく述べられるように、本発明の典型的な方法について概略している。
【図５８】図58は、以下に詳しく考察されるように、抗体作製において現在欠失していることを概略している。
【０４６０】
【図５９】図59は、以下に詳しく述べられるように、本発明による方法、例えば、 NATTUBODIES（登録商標）、によって作製される抗体の概略を示している。
【図６０】図60は、以下に詳しく考察されるように、ヒト２価抗体の構造について概略している。
【図６１】図61は、以下に詳しく考察されるように、本発明の方法により作製された典型的な合成抗体を概略している。
【図６２】図62は、以下に詳しく考察されるように、抗体のV-領域構造及び可変性を概略している。
【図６３】図63は、以下に詳しく述べられるように、抗体のV-可変領域構造を概略している。
【図６４】図64は、以下に述べられるように、本発明の方法により作製された典型的な合成抗体、特に再修飾した CDR 領域、を概略している。
【図６５】図65は、以下に詳しく述べられるように、本発明の方法により作製された典型的な合成新生抗体ライブラリーを概略している。
【図６６】図66は、以下に述べられるように、本発明の方法による合成ヒト抗体の作製及びスクリーニングの典型を概略している。
【図６７】図67は、以下に述べられるように、抗体のスクリーニングのための本発明の典型的方法について概略している。
【図６８】図68は、以下に述べられるように、本発明の方法の組み合わせによる親和性の成熟を含む抗体の作製方法の典型を概略している。
【図６９】図69は、本発明の新規遺伝子再集合法（GENE-REASSEMBLY（登録商標））の典型的な応用の概略を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004532038.tif 000817
2004532038.tif 000818