(57)【要約】ヒトＶＥＧＦ−２ポリペプチド、その生物学的に活性であり、かつ診断的または治療的に有用なフラグメント、アナログ、または誘導体、およびそのようなＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）が開示される。組換え技術によってそのようなポリペプチドを産生するための手順、ならびにそのようなポリペプチドに対する抗体およびアンタゴニストも提供される。そのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、創傷治癒を刺激するため、および血管組織の修復のために、治療的に使用され得る。腫瘍新脈管形成およびそれによる腫瘍増殖、炎症、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および乾癬を阻害するために、この抗体およびアンタゴニストを使用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図３１に示されるｐＶＧＩ．１発現ベクター構築物を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組成物。
【請求項３】
宿主細胞を作製する方法であって、該方法は、請求項１に記載の核酸分子を用いて該宿主細胞を形質導入、形質転換、またはトランスフェクトする工程を包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法によって作製された、宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項６】
患者を処置する方法であって、該方法は、請求項１に記載の核酸分子を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７】
前記患者が慢性的な四肢の虚血を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が心筋虚血を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が以下：
ａ．自己免疫疾患；
ｂ．アレルギー反応または症状；
ｃ．器官拒絶反応；
ｄ．炎症性症状；
ｅ．過剰増殖障害；
ｆ．ウイルス感染に起因する疾患；
ｇ．細菌感染に起因する疾患；
ｈ．真菌類感染に起因する疾患；
ｉ．寄生虫感染に起因する疾患；
ｊ．心臓血管障害；
ｋ．不整脈；
ｌ．心臓弁疾患；
ｍ．心筋疾患；
ｎ．心筋虚血；
ｏ．動脈瘤；
ｐ．動脈閉塞疾患；
ｑ．脳血管障害；
ｒ．塞栓症；および
ｓ．虚血、
からなる群から選択される疾患または障害を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１８５に含まれるｐＶＧＩ．１発現ベクター構築物を含む、単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離された核酸分子を含む、組成物。
【請求項１２】
宿主細胞を作製する方法であって、該方法は、請求項１０に記載の核酸分子を有する該宿主細胞を形質導入、形質転換、またはトランスフェクトする工程を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって作製される、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１０に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１５】
患者を処置する方法であって、該方法は、請求項１０に記載の核酸分子を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記患者が慢性的な四肢の虚血を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が心筋虚血を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者が以下：
ａ．自己免疫疾患；
ｂ．アレルギー反応または症状；
ｃ．器官拒絶反応；
ｄ．炎症性症状；
ｅ．過剰増殖障害；
ｆ．ウイルス感染に起因する疾患；
ｇ．細菌感染に起因する疾患；
ｈ．真菌類感染に起因する疾患；
ｉ．寄生虫感染に起因する疾患；
ｊ．心臓血管障害；
ｋ．不整脈；
ｌ．心臓弁疾患；
ｍ．心筋疾患；
ｎ．心筋虚血；
ｏ．動脈瘤；
ｐ．動脈閉塞疾患；
ｑ．脳血管障害；
ｒ．塞栓症；および
ｓ．虚血、
からなる群から選択される疾患または障害を有する、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本発明のポリペプチドは、血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーとして同定された。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒト血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
【０００２】
新たな血管の形成、すなわち新脈管形成は、胚の発生、それに続く成長、および組織修復のために必須である。新脈管形成はまた、新生物（すなわち、腫瘍および神経膠腫）のような特定の病理学的状態に必須な部分である。異常な新脈管形成は、炎症、慢性関節リウマチ、乾癬、および糖尿病性網膜症のような他の疾患に関連する（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：４４２−４４７，（１９８７））。
【０００３】
酸性および塩基性の両方の線維芽細胞増殖因子分子は、内皮細胞および他の細胞タイプについてのマイトジェンである。アンギオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ）およびアンギオゲニンは、新脈管形成を誘導し得るが、これらの機能は不明である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｅａ　ａｎｄ　Ｆｅｂｉｇｅｒ　Ｐｒｅｓｓ（１５３−１７０頁）（１９９３））。血管内皮細胞に対して高度に選択的なマイトジェンは、血管内皮増殖因子、すなわちＶＥＧＦであり（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：１９−３２，（１９９２））、これは血管透過因子（ＶＰＦ）としても公知である。
【０００４】
血管内皮増殖因子は、その標的細胞特異性が血管内皮細胞に制限されているようである、分泌される脈管形成マイトジェンである。マウスＶＥＧＦ遺伝子は、特徴付けられ、そして胚形成におけるその発現パターンが解析された。ＶＥＧＦの持続的な発現が、有窓内皮に隣接する上皮細胞において（例えば、脈絡叢および腎糸球体において）観察された。このデータは、内皮細胞の増殖および分化の多機能性レギュレーターとしてのＶＥＧＦの役割に一致した（Ｂｒｅｉｅｒ，Ｇ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１４：５２１−５３２（１９９２））。
【０００５】
ＶＥＧＦは、ヒト血小板由来増殖因子ＰＤＧＦａおよびＰＤＧＦｂとの配列相同性を共有する（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１３０６−１３０９、（１９８９））。相同性の程度は、それぞれ、約２１％および２３％である。ジスルフィド結合の形成に寄与する８つのシステイン残基は、これらのタンパク質において厳密に保存される。これらは類似するが、ＶＥＧＦとＰＤＧＦとの間の特異的な相違が存在する。ＰＤＧＦは結合組織についての主要な増殖因子であるが、ＶＥＧＦは、内皮細胞に高度に特異的である。あるいは、スプライシングされたｍＲＮＡが、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、およびＰＤＧＦのいずれにおいても同定されており、そしてこれらの異なるスプライシング産物は、生物学的活性およびレセプター結合特異性が異なる。ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦは、ホモ二量体またはヘテロ二量体として機能し、そしてレセプターに結合し、これはレセプターの二量体化の後に内因性のチロシンキナーゼ活性を誘発する。
【０００６】
ＶＥＧＦは、選択的スプライシングによる、１２１、１６５、１８９、および２０６アミノ酸の４つの異なる形態を有する。ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５は、可溶性でありそして新脈管形成を促進し得る。一方、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ−２０６は、細胞表面におけるヘパリン含有プロテオグリカンに結合される。ＶＥＧＦの時期的および空間的な発現は、血管の生理学的増殖に相関していた（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，Ｃ．Ｍ．，およびＣａｒｂｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３９：５７０−５７９，（１９８９）；ＭｃＮｅｉｌ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：８１１−８２２，（１９８９））。その高親和性結合部位は、組織切片において内皮細胞上のみに位置付けられる（Ｊａｋｅｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：２４４−２５３，（１９８９））。この因子は、下垂体細胞およびいくつかの腫瘍細胞株から単離され得、そしていくつかのヒト神経膠腫と関係している（Ｐｌａｔｅ，Ｋ．Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ　３５９：８４５−８４８（１９９２））。興味深いことに、ＶＥＧＦ１２１またはＶＥＧＦ１６５の発現は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に、ヌードマウス中で腫瘍を形成する能力を与える（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１６０−１７０，（１９９３））。抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体によるＶＥＧＦ機能の阻害は、免疫不全マウスにおける腫瘍増殖を阻害することが示された（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ　３６２：８４１−８４４（１９９３））。さらに、ＶＥＧＦレセプターのドミナントネガティブ変異体が、マウスにおける神経膠芽腫増殖を阻害することが示された。
【０００７】
血管透過因子（ＶＰＦ）はまた、傷害の停止後でさえも血漿タンパク質に対する持続的な微小血管の高透過性（ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）（これは、正常な創傷治癒の特徴的な特性である）を担うことが見出されている。これは、ＶＰＦが、創傷治癒における重要な因子であることを示唆する。Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１３７５−１３７９（１９９２）。
【０００８】
ＶＥＧＦの発現は、血管新生した組織（例えば、肺、心臓、胎盤、および固形腫瘍）において高く、そして時間的および空間的の両方で新脈管形成に相関する。ＶＥＧＦはまた、インビボで脈管形成を誘導することが示されている。新脈管形成は正常組織、特に血管組織の修復に必須であるので、ＶＥＧＦは血管組織修復を促進させる際の使用が提案されてきた（例えば、アテローム性動脈硬化症において）。
【０００９】
Ｃｈｅｎらに１９９１年１２月１７日に発行された米国特許第５，０７３，４９２号は、適切な環境において内皮細胞の増殖を相乗的に増強するための方法を開示する。この方法は、環境に、ＶＥＧＦ、エフェクター、および血清由来因子を添加する工程を包含する。また、血管内皮細胞増殖因子ＣサブユニットＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応技術により調製された。このＤＮＡは、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれとしても存在し得るタンパク質をコードする。このタンパク質は、哺乳動物血管内皮細胞マイトジェンであり、そして、１９９２年９月３０日に公開された欧州特許出願第９２３０２７５０．２号に開示されるように、それ自体が血管の発達および修復の促進のために有用である。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明のポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦに対するアミノ酸配列相同性に基づいて、新規な血管内皮増殖因子として推定的に同定された。
【００１１】
本発明の１つの局面によれば、新規な成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性であり、かつ診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のポリペプチドである。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、それぞれ配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を有する全長または短縮型ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子、あるいはＡＴＣＣ受託番号９７１４９（１９９５年５月１２日に寄託）またはＡＴＣＣ受託番号７５６９８（１９９４年３月４日に寄託）として細菌宿主中で寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列が提供される。
【００１３】
本発明はまた、生物学的に活性であり、かつ診断的または治療的に有用な、ＶＥＧＦ−２のフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
【００１４】
本発明のなお別の局面によれば、組換え技術により、そのようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。このプロセスは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え原核生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿主細胞を、このタンパク質の発現およびその後のこのタンパク質の回収を促進する条件下で培養する工程を包含する。
【００１５】
本発明のなおさらなる局面によれば、治療的目的のため（例えば、新脈管形成、創傷治癒、損傷した骨および組織の増殖を刺激するため、ならびに血管組織の修復の促進のため）に、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。特に、末梢動脈疾患（例えば、重大な四肢虚血および冠状疾患）の処置のために、そのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。
【００１６】
本発明のなお別の局面によれば、そのようなポリペプチドに対する抗体、およびそのようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。
【００１７】
本発明のなお別の局面によれば、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、これは、例えば、そのようなポリペプチドの作用を阻害して、腫瘍の新脈管形成を予防し、それによって腫瘍の増殖を阻害するため、糖尿病性網膜症、炎症、慢性関節リウマチ、および乾癬を処置するために、使用され得る。
【００１８】
本発明の別の局面によれば、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子を含む、核酸プローブが提供される。
【００１９】
本発明の別の局面によれば、本発明の核酸配列およびそのような核酸配列にコードされるタンパク質における変異に関する疾患または疾患に対する感受性を診断する方法が提供される。
【００２０】
本発明のなおさらなる局面によれば、科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロの目的のために、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するプロセスが提供される。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。
【００２２】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明の１つの局面に従って、図１の推定アミノ酸配列（配列番号２）（これは、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定された）を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。ｃＤＮＡクローン（これは、１９９５年５月１２日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ　２０１１０−２２０９に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号９７１４９を与えられた）を配列決定することによって、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を得た。
【００２３】
本発明の別の局面に従って、図２の推定アミノ酸配列（配列番号４）（これは、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定された）を有する短縮型ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。ｃＤＮＡクローン（これは、１９９４年３月４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ　２０１１０−２２０９に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号７５６９８を与えられた）を配列決定することによって、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を得た。
【００２４】
別に示されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することにより決定された全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシーケンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのモデル３７３）を使用することによって決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、上記の決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予測された。従って、この自動化アプローチにより決定される任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知であるように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含み得る。自動化により決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一性、より代表的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％の同一性である。実際の配列は、当該分野で周知の手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによって、より正確に決定され得る。また当該分野で公知のように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列中の単一の挿入または欠失が、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じ、その結果、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列は、配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり、これは、このような挿入または欠失の位置で開始する。
【００２５】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、初期のヒト胚（８〜９週）破骨細胞腫、成体心臓またはいくつかの乳癌細胞株から得られ得る。本発明のポリヌクレオチドは、９週齢の初期のヒト胚由来ｃＤＮＡライブラリー中に発見された。それは、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーに構造的に関連する。それは、約４１９アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、この最初のおよそ２３個のアミノ酸残基は推定のリーダー配列であり、その結果、成熟タンパク質は３９６個のアミノ酸を含む。そしてこのタンパク質は、ヒト血管内皮増殖因子に対して最も高いアミノ酸配列相同性（３０％の同一性）を示し、ＰＤＧＦａ（２４％）およびＰＤＧＦｂ（２２％）がそれに続く。（図４を参照のこと）。８つ全てのシステインが、ファミリーの４つのメンバー内全てで保存されることは特に重要である（図３のボックスで囲んだ領域を参照のこと）。さらに、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの特徴であるＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣＮ（配列番号８）が、ＶＥＧＦ−２において保存される（図３を参照のこと）。ＶＥＧＦ−２と、ＶＥＧＦと２つのＰＤＧＦとの間の相同性は、タンパク質配列レベルにおいてである。ヌクレオチド配列の相同性は、全く検出され得ず、従って、単純なアプローチ（例えば、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション）を介してＶＥＧＦ−２を単離することは困難である。
【００２６】
本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、全長ポリペプチドならびに任意のリーダー配列および全長ポリペプチドの活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。活性フラグメントは、配列番号２に示す全長アミノ酸配列の全４１９アミノ酸よりも少ないアミノ酸を有するが、図３において保存されることが示される８つのシステイン残基をなお含み、そしてＶＥＧＦ−２活性をなお有する、全長アミノ酸配列の任意の部分を含むことを意味する。
【００２７】
正常組織には、少なくとも２つの交互にスプライシングされたＶＥＧＦ２　ｍＲＮＡ配列が存在する。図７、レーン５における２つのバンドは、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする交互にスプライシングされたｍＲＮＡの存在を示す。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含する）であり得る。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖である場合は、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１または図２に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複性または縮重の結果として、図１、図２のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異なるコード配列であり得る。
【００２９】
図１もしくは図２の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドについてのコード配列およびリーダー配列もしくは分泌配列またはプロタンパク質配列のような、さらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’の非コード配列）。
【００３０】
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００３１】
本発明はさらに、図１もしくは図２の推定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。
【００３２】
従って本発明は、図１もしくは図２に示されるような同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図１もしくは図２のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を包含する。
【００３３】
本明細書中上記で示したように、このポリヌクレオチドは、図１もしくは図２に示されるコード配列、または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有するポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
【００３４】
本発明はまた、ポリヌクレオチドを含み、ここで成熟ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌において補助するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同じリーディングフレームで融合され得る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そしてポリペプチドの成熟形態を形成するために、宿主細胞により切断されるリーダー配列を有し得る。このポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる５’アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、そしてタンパク質の不活性形態である。一旦プロ配列が切断されると、活性成熟タンパク質が残存する。
【００３５】
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、あるいはプロ配列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし得る。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００３７】
本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％同一、そしてより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠損するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２の約１〜約３９６の位置のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％同一であり、そしてより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む：（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニンを欠損するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号４の約１〜約３２６の位置のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００３９】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、少なくとも、例えば、９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチド配列がＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５個の点変異まで含み得ることを除いて、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に同一であることを意図する。換言すると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までを、欠失し得るかまたは別のヌクレオチドで置換し得、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドを参照配列中に挿入し得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５Ｎ末端位置または３Ｎ末端位置で、あるいはこれらの末端位置の間のどこかに、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に分散してかまたは参照配列中に１以上の連続した群で分散してかのいずれかで生じ得る。
【００４０】
現実的な問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列に、あるいは寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ、５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ　５３７１１））を使用して従来的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の相同性の最も優れたセグメントを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ　２：４８２〜４８９（１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列に９５％同一であるか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用する場合、当然、同一性の百分率が参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメータを設定する。
【００４１】
以下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドを使用し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起し得、これらは、以下に記載されるようにＶＥＧＦ−２タンパク質の発現を検出するための診断アッセイにおいて、あるいはＶＥＧＦ−２タンパク質の機能を増強または阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、本発明に従う候補アゴニストおよび候補アンタゴニストでもある、ＶＥＧＦ−２タンパク質結合タンパク質を「捕捉」する酵母ツーハイブリッド系において使用され得る。酵母ツーハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ　３４０：２４５〜２４６（１９８９）に記載される。
【００４２】
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドは、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣用的に惹起し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｈａｔ　ｒｅａｃｔ　ｗｉｔｈ　ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｓｉｔｅｓ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：６６０〜６６６を参照のこと。タンパク質反応性血清を惹起し得るペプチドは、しばしば、タンパク質の一次配列で示され、一連の単純な化学法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち免疫原性エピトープ）またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されない。極端に疎水性であるペプチドおよびそれらの６以下の残基は、一般に、模倣されたタンパク質に結合する抗体を誘導する際に非効果的であり；より長い可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含む可溶性ペプチドは、通常、効果的である。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出６６１。例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％をカバーする８〜３９個の残基を含む、これのガイドラインに従って設計された２０個のペプチドのうちの１８個は、ＨＡ１タンパク質またはインタクトなウイルスと反応する抗体を誘導し；そしてＭｕＬＶポリメラーゼ由来の１２／１２ペプチドおよび狂犬病糖タンパク質由来の１８／１８は、それぞれのタンパク質を沈降させた抗体を誘導した。
【００４３】
従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫されたドナー由来の脾臓細胞の融合により得られた、高い割合のハイブリドーマは、一般に、ネイティブなタンパク質と反応する抗体を分泌する。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、６６３。抗原性エピトープ保有ペプチドまたは抗原性エピトープ保有ポリペプチドにより惹起された抗体は、模倣されたタンパク質を検出するために有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の運命をたどるために使用され得る。ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣されたタンパク質についての種々の定性アッセイまたは定量アッセイにおいて、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。なぜなら、短いペプチド（例えば、約９個のアミノ酸）は、免疫沈降アッセイにおいて、より大きいペプチドを結合および置換さえし得ることが示されているからである。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７〜７７８（１９８４）７７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体はまた、例えば、当該分野で周知である方法を使用して吸着クロマトグラフィーにより、模倣されたタンパク質の精製に有用である。
【００４４】
上記のガイドラインに従って設計される本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、および最も好ましくは約１５個〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。しかし、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１５０個のアミノ酸を含む、あるいは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の任意の長さまで、およびその全体を含む、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きい部分を含む、ペプチドまたはポリペプチドはまた、本発明のエピトープ保有ペプチドまたはエピトープ保有ポリペプチドとみなされ、そしてまた、模倣されたタンパク質と反応する抗体を誘導するために有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的に可溶性を提供するように選択され（すなわち、この配列は、比較的親水性の残基を含み、そして非常に疎水性の配列は、好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が、特に好ましい。
【００４５】
ＶＥＧＦ−２特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたはペプチドの非限定的な例には、以下が含まれる：配列番号２の約ｌｅｕ−３７から約ｇｌｕ−４５まで、配列番号２の約Ｔｙｒ−５８から約Ｇｌｙ−６６まで、配列番号２の約Ｇｌｎ−７３から約Ｇｌｕ−８１まで、配列番号２の約Ａｓｐ−１００から約Ｃｙｓ−１０８まで、配列番号２の約Ｇｌｙ−１４０から約Ｌｅｕ−１４８まで、配列番号２の約Ｐｒｏ−１６８から約Ｖａｌ−１７６まで、配列番号２の約Ｈｉｓ−１８３から約Ｌｙｓ−１９１まで、配列番号２の約Ｉｌｅ−２０１から約Ｔｈｒ−２０９まで、配列番号２の約Ａｌａ−２１６から約Ｔｙｒ−２２４まで、配列番号２の約Ａｓｐ−２４４から約Ｈｉｓ−２５４まで、配列番号２の約Ｇｌｙ−２５８から約Ｇｌｕ−２６６まで、配列番号２の約Ｃｙｓ−２７２から約Ｓｅｒ−２８０まで、配列番号２の約Ｐｒｏ−２８３から約Ｓｅｒ−２９１まで、配列番号２の約Ｃｙｓ−２９６から約Ｇｌｎ−３０４まで、配列番号２の約Ａｌａ−３０７から約Ｃｙｓ−３１６まで、配列番号２の約Ｖａｌ−３１９からＣｙｓ−３３５まで、配列番号２の約Ｃｙｓ−３３９から約Ｌｅｕ−３４７まで、配列番号２の約Ｃｙｓ−３６０から約Ｇｌｕ−３７３まで、配列番号２の約Ｔｙｒ−３７８から約Ｖａｌ−３８６まで、および配列番号２の約Ｓｅｒ−３８８から約Ｓｅｒ−３９６まで、のアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラグメントは、ＶＥＧＦ−２タンパク質の抗原性エピトープを有することが、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析により決定されている。
【００４６】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を使用する組換え手段を含むペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の従来の手段により産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間のキャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド（例えば、４週間未満で（ＥＬＩＳＡ型結合研究により）調製されそして特徴づけられたＨＡ１ポリペプチドのセグメントの単一のアミノ酸改変体を表す２４８個の異なる１３残基ペプチドを１０〜２０ｍｇ）の合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３１−５１３５。この「同時多数ペプチド合成（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）に対する米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに入れられ、固相法に包含される多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にしている。完全に手動の手順により、５００〜１０００以上の合成を、同時に行わせることが可能である。Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、第５１３４頁。
【００４７】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。一般的に、動物は、遊離のペプチドで免疫され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、ペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風毒素）に結合体化させることによってブーストされ得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアに結合され得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な結合剤を使用してキャリアに結合させ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、例えば、約１００ｍｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含有するエマルジョンの腹腔内注射および／または皮内注射により遊離ペプチドまたはキャリアに結合したペプチドのいずれかで免疫化される。例えば、いくつかのブースター注射は、約２週間の間隔で、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにより、固相表面に吸着させた遊離のペプチドを使用して検出され得る抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために必要とされ得る。免疫化した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当該分野で周知の方法に従って、固相上のペプチドへ吸着させ、そして選択された抗体を溶出することによる、抗ペプチド抗体の選択により増大され得る。
【００４８】
本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド、すなわち、タンパク質全体が免疫原である場合に抗体応答を誘発するタンパク質のそれらの部分は、当該分野で公知の方法に従って、同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（前出）は、酵素結合免疫吸着アッセイにおいて反応するための、十分に純粋な数百のペプチドの固相支持体上での、迅速な同時発生的合成のための手順を開示する。次いで、合成されたペプチドの抗体との相互作用は、支持体からそれらを除去せずに容易に検出される。このようにして、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを有するペプチドが、当業者により慣用的に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスの外被タンパク質における免疫学的に重要なエピトープは、Ｇｅｙｓｅｎらによって、そのタンパク質の全２１３アミノ酸配列をカバーする全２０８の可能なヘキサペプチドの重複するセットの合成により、７アミノ酸の解像度で位置づけられた。次いで、エピトープ内で全２０アミノ酸が全ての位置で次々と置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応に対して特異性を付与する特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法によって慣用的に作製され得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）に対する米国特許第４，７０８，７８１号は、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載する。
【００４９】
さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第５，１９４，３９２号（１９９０）は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエピトープの幾何学的等価物（すなわち、アミモトープ（Ａｍｉｍｏｔｏｐｅ））であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎに対する米国特許第４，４３３，０９２号（１９８９）は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に対して相補的であるリガンドの幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、ペルアルキル化オリゴペプチド混合物（Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ　Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｍｉｘｔｕｒｅｓ）に関するＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．らに対する米国特許第５，４８０，９７１号（１９９６）は、直線状Ｃ１−Ｃ７アルキルペルアルキル化オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために、このようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを使用するための方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により慣用的に作製され得る。
【００５０】
当業者に理解されるように、上記の本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドおよびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせられ、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの増大した半減期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第一の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰＡ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８４−８６（１９８８））。
【００５１】
本発明に従って、ＶＥＧＦ−２の新規な改変体がまた記載される。これらはＶＥＧＦ−２の一つ以上のアミノ酸を欠失または置換することによって産生され得る。天然の変異は、対立遺伝子改変体と呼ばれる。対立遺伝子改変体は、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化がない）であり得るか、または変化したアミノ酸配列を有し得る。
【００５２】
天然のＶＥＧＦ−２の特徴を改善または変更するための試みにおいて、タンパク質操作が利用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術は、新規のポリペプチドを作製するために使用され得る。ムテインおよび欠失は、例えば、増強された活性または増大した安定性を示し得る。さらに、それらはより高収量で精製され得、そしてより良好な可溶性を少なくとも特定の精製および保存条件下で示す。以下に示すのは、構築され得る変異の例である。
【００５３】
（アミノ末端およびカルボキシル末端欠失）
さらに、ＶＥＧＦ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて泳動した場合、発現の際にタンパク質分解的に切断され、以下のサイズのポリペプチドフラグメントを生じるようである（サイズはおよそである）（例えば、図６〜８を参照のこと）：８０、５９、４５、４３、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３１、２９、２１、および１５ｋＤａ。これらのポリペプチドフラグメントは、そのタンパク質のＮ末端およびＣ末端部分の両方でタンパク質分解的切断された結果である。これらのタンパク質分解的に生成されたフラグメント、特に２１ｋＤａのフラグメントは、活性を有するようである。
【００５４】
さらに、タンパク質操作は、天然のＶＥＧＦ−２の一つ以上の特徴を改善または変更するために利用され得る。カルボキシ末端のアミノ酸の欠失は、タンパク質の活性を増強し得る。１つの例は、タンパク質のカルボキシ末端からの１０アミノ酸残基の欠失により１０倍までの高い活性を示すインターフェロンγである（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：１９９−２１６（１９８８））。従って、本発明の１つの局面は、天然のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対して増強された安定性（例えば、代表的なｐＨ、熱条件、または他の保存条件に曝露された場合）を示すＶＥＧＦ−２のポリペプチドアナログおよびそのようなアナログをコードするヌクレオチド配列を提供することである。
【００５５】
特に好ましいＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、以下に示される（番号付けは、タンパク質中の第一のアミノ酸（Ｍｅｔ）（図１（配列番号１８））で始まる）：Ａｌａ（残基２４）〜Ｓｅｒ（残基４１９）；Ｐｒｏ（２５）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（２６）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（２７）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（２８）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（２９）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（３０）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｐｈｅ（３１）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｕ（３２）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｓｅｒ（３３）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｙ（３４）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｌｅｕ（３５）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｓｐ（３６）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｌｅｕ（３７）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｓｅｒ（３８）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｓｐ（３９）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（４０）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｕ（４１）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｐｒｏ（４２）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｓｐ（４３）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（４４）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｙ（４５）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｇｌｕ（４６）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（４７）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｔｈｒ（４８）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（４９）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｔｙｒ（５０）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｓｅｒ（５２）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｓｐ（５４）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｖａｌ（６２）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｖａｌ（６５）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｍｅｔ（４１８）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｎ（４１７）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｐｒｏ（４１６）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ａｒｇ（４１５）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｎ（４１４）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｔｒｐ（４１３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｔｙｒ（４１２）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｓｅｒ（４１１）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｐｒｏ（４１０）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｖａｌ（４０９）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｃｙｓ（４０８）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ａｒｇ（４０７）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｃｙｓ（４０６）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｖａｌ（４０５）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｕ（４０４）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｕ（４０３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｓｅｒ（４０２）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｇｌｙ（３９８）；Ｍｅｔ（１），Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｐｒｏ（３９７）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｌｙｓ（３９３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｍｅｔ（２６３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ａｓｐ（３１１）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）〜Ｐｒｏ（３６７）；Ｍｅｔ（１）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ｍｅｔ（１）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｇｌｕ（４７）〜Ｓｅｒ（４１９）；Ａｌａ（１１１）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ａｌａ（１１２）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ａｌａ（１１０）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ａｌａ（１１１）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ａｌａ（１１２）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｌｅｕ（２１５）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ａｌａ（１１０）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ａｌａ（１１１）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ａｌａ（１１２）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｓｅｒ（２２８）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ａｒｇ（２２７）；Ａｌａ（１１０）〜Ａｒｇ（２２７）；Ａｌａ（１１１）〜Ａｒｇ（２２７）；Ａｌａ（１１２）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ａｒｇ（２２７）；Ａｓｎ（１１５）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ａｒｇ（２２７）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ａｌａ（１１０）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ａｌａ（１１１）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ａｌａ（１１２）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｈｒ（１０３）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｇｌｕ（１０４）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ａｌａ（１１０）〜Ｌｙｓ（２１４）；Ｇｌｕ（１０５）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｔｈｒ（１０６）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｉｌｅ（１０７）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｌｙｓ（１０８）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｐｈｅ（１０９）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ａｌａ（１１０）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ａｌａ（１１１）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ａｌａ（１１２）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｈｉｓ（１１３）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｔｙｒ（１１４）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ａｓｎ（１１５）〜Ｌｅｕ（２２９）；Ｔｈｒ（１１６）〜Ｌｅｕ（２２９）。
【００５６】
好ましい実施形態には、以下の欠失変異体が含まれる：図１（配列番号１８）のＴｈｒ（１０３）−−Ａｒｇ（２２７）；Ｇｌｕ（１０４）−−Ａｒｇ（２２７）；Ａｌａ（１１２）−−Ａｒｇ（２２７）；Ｔｈｒ（１０３）−−Ｓｅｒ（２１３）；Ｇｌｕ（１０４）−−Ｓｅｒ（２１３）；Ｔｈｒ（１０３）−−Ｌｅｕ（２１５）；Ｇｌｕ（４７）−−Ｓｅｒ（４１９）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）−−Ｍｅｔ（２６３）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）−−Ａｓｐ（３１１）；Ｍｅｔ（１）、Ｇｌｕ（２３）、またはＡｌａ（２４）−−Ｐｒｏ（３６７）；Ｍｅｔ（１）−−Ｓｅｒ（４１９）；およびＭｅｔ（１）−−Ｓｅｒ（２２８）。
【００５７】
本発明にはまた、ＮＢ末端とＣ末端の両方からのアミノ酸欠失を有する欠失変異体が含まれる。このような変異体には、上記のＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせが含まれる。これらの組み合わせは、当業者に公知の組換え技術を使用して作製され得る。
【００５８】
特に、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−３９６により記載され得、ここでｍは、−２３〜３８８の整数であり、ｍは、配列番号２に同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、Ｎ末端欠失は、図３の保存されたボックスで囲んだ領域（ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣＮ）（配列番号８）を保持し、そして以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み：配列番号１に示す本発明のポリペプチドのＮ末端欠失は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：配列番号２のＥ−１〜Ｓ−３９６；Ａ−２〜Ｓ−３９６；Ｐ−３〜Ｓ−３９６；Ａ−４〜Ｓ−３９６；Ａ−５〜Ｓ−３９６；Ａ−６〜Ｓ−３９６；Ａ−７〜Ｓ−３９６；Ａ−８〜Ｓ−３９６；Ｆ−９〜Ｓ−３９６；Ｅ−１０〜Ｓ−３９６；Ｓ−１１〜Ｓ−３９６；Ｇ−１２〜Ｓ−３９６；Ｌ−１３〜Ｓ−３９６；Ｄ−１４〜Ｓ−３９６；Ｌ−１５〜Ｓ−３９６；Ｓ−１６〜Ｓ−３９６；Ｄ−１７〜Ｓ−３９６；Ａ−１８〜Ｓ−３９６；Ｅ−１９〜Ｓ−３９６；Ｐ−２０〜Ｓ−３９６；Ｄ−２１〜Ｓ−３９６；Ａ−２２〜Ｓ−３９６；Ｇ−２３〜Ｓ−３９６；Ｅ−２４〜Ｓ−３９６；Ａ−２５〜Ｓ−３９６；Ｔ−２６〜Ｓ−３９６；Ａ−２７〜Ｓ−３９６；Ｙ−２８〜Ｓ−３９６；Ａ−２９〜Ｓ−３９６；Ｓ−３０〜Ｓ−３９６；Ｋ−３１〜Ｓ−３９６；Ｄ−３２〜Ｓ−３９６；Ｌ−３３〜Ｓ−３９６；Ｅ−３４〜Ｓ−３９６；Ｅ−３５〜Ｓ−３９６；Ｑ−３６〜Ｓ−３９６；Ｌ−３７〜Ｓ−３９６；Ｒ−３８〜Ｓ−３９６；Ｓ−３９〜Ｓ−３９６；Ｖ−４０〜Ｓ−３９６；Ｓ−４１〜Ｓ−３９６；Ｓ−４２〜Ｓ−３９６；Ｖ−４３〜Ｓ−３９６；Ｄ−４４〜Ｓ−３９６；Ｅ−４５〜Ｓ−３９６；Ｌ−４６〜Ｓ−３９６；Ｍ−４７〜Ｓ−３９６；Ｔ−４８〜Ｓ−３９６；Ｖ−４９〜Ｓ−３９６；Ｌ−５０〜Ｓ−３９６；Ｙ−５１〜Ｓ−３９６；Ｐ−５２〜Ｓ−３９６；Ｅ−５３〜Ｓ−３９６；Ｙ−５４〜Ｓ−３９６；Ｗ−５５〜Ｓ−３９６；Ｋ−５６〜Ｓ−３９６；Ｍ−５７〜Ｓ−３９６；Ｙ−５８〜Ｓ−３９６；Ｋ−５９〜Ｓ−３９６；Ｃ−６０〜Ｓ−３９６；Ｑ−６１〜Ｓ−３９６；Ｌ−６２〜Ｓ−３９６；Ｒ−６３〜Ｓ−３９６；Ｋ−６４〜Ｓ−３９６；Ｇ−６５〜Ｓ−３９６；Ｇ−６６〜Ｓ−３９６；Ｗ−６７〜Ｓ−３９６；Ｑ−６８〜Ｓ−３９６；Ｈ−６９〜Ｓ−３９６；Ｎ−７０〜Ｓ−３９６；Ｒ−７１〜Ｓ−３９６；Ｅ−７２〜Ｓ−３９６；Ｑ−７３〜Ｓ−３９６；Ａ−７４〜Ｓ−３９６；Ｎ−７５〜Ｓ−３９６；Ｌ−７６〜Ｓ−３９６；Ｎ−７７〜Ｓ−３９６；Ｓ−７８〜Ｓ−３９６；Ｒ−７９〜Ｓ−３９６；Ｔ−８０〜Ｓ−３９６；Ｅ−８１〜Ｓ−３９６；Ｅ−８２〜Ｓ−３９６；Ｔ−８３〜Ｓ−３９６；Ｉ−８４〜Ｓ−３９６；Ｋ−８５〜Ｓ−３９６；Ｆ−８６〜Ｓ−３９６；Ａ−８７〜Ｓ−３９６；Ａ−８８〜Ｓ−３９６；Ａ−８９〜Ｓ−３９６；Ｈ−９０〜Ｓ−３９６；Ｙ−９１〜Ｓ−３９６；Ｎ−９２〜Ｓ−３９６；Ｔ−９３〜Ｓ−３９６；Ｅ−９４〜Ｓ−３９６；Ｉ−９５〜Ｓ−３９６；Ｌ−９６〜Ｓ−３９６；Ｋ−９７〜Ｓ−３９６；Ｓ−９８〜Ｓ−３９６；Ｉ−９９〜Ｓ−３９６；Ｄ−１００〜Ｓ−３９６；Ｎ−１０１〜Ｓ−３９６；Ｅ−１０２〜Ｓ−３９６；Ｗ−１０３〜Ｓ−３９６；Ｒ−１０４〜Ｓ−３９６；Ｋ−１０５〜Ｓ−３９６；Ｔ−１０６〜Ｓ−３９６；Ｑ−１０７〜Ｓ−３９６；Ｃ−１０８〜Ｓ−３９６；Ｍ−１０９〜Ｓ−３９６；Ｐ−１１０〜Ｓ−３９６；Ｒ−１１１〜Ｓ−３９６；Ｅ−１１２〜Ｓ−３９６；Ｖ−１１３〜Ｓ−３９６；Ｃ−１１４〜Ｓ−３９６；Ｉ−１１５〜Ｓ−３９６；Ｄ−１１６〜Ｓ−３９６；Ｖ−１１７〜Ｓ−３９６；Ｇ−１１８〜Ｓ−３９６；Ｋ−１１９〜Ｓ−３９６；Ｅ−１２０〜Ｓ−３９６；Ｆ−１２１〜Ｓ−３９６；Ｇ−１２２〜Ｓ−３９６；Ｖ−１２３〜Ｓ−３９６；Ａ−１２４〜Ｓ−３９６；Ｔ−１２５〜Ｓ−３９６；Ｎ−１２６〜Ｓ−３９６；Ｔ−１２７〜Ｓ−３９６；Ｆ−１２８〜Ｓ−３９６；Ｆ−１２９〜Ｓ−３９６；Ｋ−１３０〜Ｓ−３９６；Ｐ−１３１〜Ｓ−３９６；Ｐ−１３２〜Ｓ−３９６；Ｃ−１３３〜Ｓ−３９６；Ｖ−１３４〜Ｓ−３９６；Ｓ−１３５〜Ｓ−３９６；Ｖ−１３６〜Ｓ−３９６；Ｙ−１３７〜Ｓ−３９６；Ｒ−１３８〜Ｓ−３９６；Ｃ−１３９〜Ｓ−３９６；Ｇ−１４０〜Ｓ−３９６；Ｇ−１４１〜Ｓ−３９６；Ｃ−１４２〜Ｓ−３９６；Ｃ−１４３〜Ｓ−３９６；Ｎ−１４４〜Ｓ−３９６；Ｓ−１４５〜Ｓ−３９６；Ｅ−１４６〜Ｓ−３９６；Ｇ−１４７〜Ｓ−３９６；Ｌ−１４８〜Ｓ−３９６；Ｑ−１４９〜Ｓ−３９６；Ｃ−１５０〜Ｓ−３９６；Ｍ−１５１〜Ｓ−３９６；Ｎ−１５２〜Ｓ−３９６；Ｔ−１５３〜Ｓ−３９６；Ｓ−１５４〜Ｓ−３９６；Ｔ−１５５〜Ｓ−３９６；Ｓ−１５６〜Ｓ−３９６；Ｙ−１５７〜Ｓ−３９６；Ｌ−１５８〜Ｓ−３９６；Ｓ−１５９〜Ｓ−３９６；Ｋ−１６０〜Ｓ−３９６；Ｔ−１６１〜Ｓ−３９６；Ｌ−１６２〜Ｓ−３９６；Ｆ−１６３〜Ｓ−３９６；Ｅ−１６４〜Ｓ−３９６；Ｉ−１６５〜Ｓ−３９６；Ｔ−１６６〜Ｓ−３９６；Ｖ−１６７〜Ｓ−３９６；Ｐ−１６８〜Ｓ−３９６；Ｌ−１６９〜Ｓ−３９６；Ｓ−１７０〜Ｓ−３９６；Ｑ−１７１〜Ｓ−３９６；Ｇ−１７２〜Ｓ−３９６；Ｐ−１７３〜Ｓ−３９６；Ｋ−１７４〜Ｓ−３９６；Ｐ−１７５〜Ｓ−３９６；Ｖ−１７６〜Ｓ−３９６；Ｔ−１７７〜Ｓ−３９６；Ｉ−１７８〜Ｓ−３９６；Ｓ−１７９〜Ｓ−３９６；Ｆ−１８０〜Ｓ−３９６；Ａ−１８１〜Ｓ−３９６；Ｎ−１８２〜Ｓ−３９６；Ｈ−１８３〜Ｓ−３９６；Ｔ−１８４〜Ｓ−３９６；Ｓ−１８５〜Ｓ−３９６；Ｃ−１８６〜Ｓ−３９６；Ｒ−１８７〜Ｓ−３９６；Ｃ−１８８〜Ｓ−３９６；Ｍ−１８９〜Ｓ−３９６；Ｓ−１９０〜Ｓ−３９６；Ｋ−１９１〜Ｓ−３９６；Ｌ−１９２〜Ｓ−３９６；Ｄ−１９３〜Ｓ−３９６；Ｖ−１９４〜Ｓ−３９６；Ｙ−１９５〜Ｓ−３９６；Ｒ−１９６〜Ｓ−３９６；Ｑ−１９７〜Ｓ−３９６；Ｖ−１９８〜Ｓ−３９６；Ｈ−１９９〜Ｓ−３９６；Ｓ−２００〜Ｓ−３９６；Ｉ−２０１〜Ｓ−３９６；Ｉ−２０２〜Ｓ−３９６；Ｒ−２０３〜Ｓ−３９６；Ｒ−２０４〜Ｓ−３９６；Ｓ−２０５〜Ｓ−３９６；Ｌ−２０６〜Ｓ−３９６；Ｐ−２０７〜Ｓ−３９６；Ａ−２０８〜Ｓ−３９６；Ｔ−２０９〜Ｓ−３９６；Ｌ−２１０〜Ｓ−３９６；Ｐ−２１１〜Ｓ−３９６；Ｑ−２１２〜Ｓ−３９６；Ｃ−２１３〜Ｓ−３９６；Ｑ−２１４〜Ｓ−３９６；Ａ−２１５〜Ｓ−３９６；Ａ−２１６〜Ｓ−３９６；Ｎ−２１７〜Ｓ−３９６；Ｋ−２１８〜Ｓ−３９６；Ｔ−２１９〜Ｓ−３９６；Ｃ−２２０〜Ｓ−３９６；Ｐ−２２１〜Ｓ−３９６；Ｔ−２２２〜Ｓ−３９６；Ｎ−２２３〜Ｓ−３９６；Ｙ−２２４〜Ｓ−３９６；Ｍ−２２５〜Ｓ−３９６；Ｗ−２２６〜Ｓ−３９６；Ｎ−２２７〜Ｓ−３９６；Ｎ−２２８〜Ｓ−３９６；Ｈ−２２９〜Ｓ−３９６；Ｉ−２３０〜Ｓ−３９６；Ｃ−２３１〜Ｓ−３９６；Ｒ−２３２〜Ｓ−３９６；Ｃ−２３３〜Ｓ−３９６；Ｌ−２３４〜Ｓ−３９６；Ａ−２３５〜Ｓ−３９６；Ｑ−２３６〜Ｓ−３９６；Ｅ−２３７〜Ｓ−３９６；Ｄ−２３８〜Ｓ−３９６；Ｆ−２３９〜Ｓ−３９６；Ｍ−２４０〜Ｓ−３９６；Ｆ−２４１〜Ｓ−３９６；Ｓ−２４２〜Ｓ−３９６；Ｓ−２４３〜Ｓ−３９６；Ｄ−２４４〜Ｓ−３９６；Ａ−２４５〜Ｓ−３９６；Ｇ−２４６〜Ｓ−３９６；Ｄ−２４７〜Ｓ−３９６；Ｄ−２４８〜Ｓ−３９６；Ｓ−２４９〜Ｓ−３９６；Ｔ−２５０〜Ｓ−３９６；Ｄ−２５１〜Ｓ−３９６；Ｇ−２５２〜Ｓ−３９６；Ｆ−２５３〜Ｓ−３９６；Ｈ−２５４〜Ｓ−３９６；Ｄ−２５５〜Ｓ−３９６；Ｉ−２５６〜Ｓ−３９６；Ｃ−２５７〜Ｓ−３９６；Ｇ−２５８〜Ｓ−３９６；Ｐ−２５９〜Ｓ−３９６；Ｎ−２６０〜Ｓ−３９６；Ｋ−２６１〜Ｓ−３９６；Ｅ−２６２〜Ｓ−３９６；Ｌ−２６３〜Ｓ−３９６；Ｄ−２６４〜Ｓ−３９６；Ｅ−２６５〜Ｓ−３９６；Ｅ−２６６〜Ｓ−３９６；Ｔ−２６７〜Ｓ−３９６；Ｃ−２６８〜Ｓ−３９６；Ｑ−２６９〜Ｓ−３９６；Ｃ−２７０〜Ｓ−３９６；Ｖ−２７１〜Ｓ−３９６；Ｃ−２７２〜Ｓ−３９６；Ｒ−２７３〜Ｓ−３９６；Ａ−２７４〜Ｓ−３９６；Ｇ−２７５〜Ｓ−３９６；Ｌ−２７６〜Ｓ−３９６；Ｒ−２７７〜Ｓ−３９６；Ｐ−２７８〜Ｓ−３９６；Ａ−２７９〜Ｓ−３９６；Ｓ−２８０〜Ｓ−３９６；Ｃ−２８１〜Ｓ−３９６；Ｇ−２８２〜Ｓ−３９６；Ｐ−２８３〜Ｓ−３９６；Ｈ−２８４〜Ｓ−３９６；Ｋ−２８５〜Ｓ−３９６；Ｅ−２８６〜Ｓ−３９６；Ｌ−２８７〜Ｓ−３９６；Ｄ−２８８〜Ｓ−３９６；Ｒ−２８９〜Ｓ−３９６；Ｎ−２９０〜Ｓ−３９６；Ｓ−２９１〜Ｓ−３９６；Ｃ−２９２〜Ｓ−３９６；Ｑ−２９３〜Ｓ−３９６；Ｃ−２９４〜Ｓ−３９６；Ｖ−２９５〜Ｓ−３９６；Ｃ−２９６〜Ｓ−３９６；Ｋ−２９７〜Ｓ−３９６；Ｎ−２９８〜Ｓ−３９６；Ｋ−２９９〜Ｓ−３９６；Ｌ−３００〜Ｓ−３９６；Ｆ−３０１〜Ｓ−３９６；Ｐ−３０２〜Ｓ−３９６；Ｓ−３０３〜Ｓ−３９６；Ｑ−３０４〜Ｓ−３９６；Ｃ−３０５〜Ｓ−３９６；Ｇ−３０６〜Ｓ−３９６；Ａ−３０７〜Ｓ−３９６；Ｎ−３０８〜Ｓ−３９６；Ｒ−３０９〜Ｓ−３９６；Ｅ−３１０〜Ｓ−３９６；Ｆ−３１１〜Ｓ−３９６；Ｄ−３１２〜Ｓ−３９６；Ｅ−３１３〜Ｓ−３９６；Ｎ−３１４〜Ｓ−３９６；Ｔ−３１５〜Ｓ−３９６；Ｃ−３１６〜Ｓ−３９６；Ｑ−３１７〜Ｓ−３９６；Ｃ−３１８〜Ｓ−３９６；Ｖ−３１９〜Ｓ−３９６；Ｃ−３２０〜Ｓ−３９６；Ｋ−３２１〜Ｓ−３９６；Ｒ−３２２〜Ｓ−３９６；Ｔ−３２３〜Ｓ−３９６；Ｃ−３２４〜Ｓ−３９６；Ｐ−３２５〜Ｓ−３９６；Ｒ−３２６〜Ｓ−３９６；Ｎ−３２７〜Ｓ−３９６；Ｑ−３２８〜Ｓ−３９６；Ｐ−３２９〜Ｓ−３９６；Ｌ−３３０〜Ｓ−３９６；Ｎ−３３１〜Ｓ−３９６；Ｐ−３３２〜Ｓ−３９６；Ｇ−３３３〜Ｓ−３９６；Ｋ−３３４〜Ｓ−３９６；Ｃ−３３５〜Ｓ−３９６；Ａ−３３６〜Ｓ−３９６；Ｃ−３３７〜Ｓ−３９６；Ｅ−３３８〜Ｓ−３９６；Ｃ−３３９〜Ｓ−３９６；Ｔ−３４０〜Ｓ−３９６；Ｅ−３４１〜Ｓ−３９６；Ｓ−３４２〜Ｓ−３９６；Ｐ−３４３〜Ｓ−３９６；Ｑ−３４４〜Ｓ−３９６；Ｋ−３４５〜Ｓ−３９６；Ｃ−３４６〜Ｓ−３９６；Ｌ−３４７〜Ｓ−３９６；Ｌ−３４８〜Ｓ−３９６；Ｋ−３４９〜Ｓ−３９６；Ｇ−３５０〜Ｓ−３９６；Ｋ−３５１〜Ｓ−３９６；Ｋ−３５２〜Ｓ−３９６；Ｆ−３５３〜Ｓ−３９６；Ｈ−３５４〜Ｓ−３９６；Ｈ−３５５〜Ｓ−３９６；Ｑ−３５６〜Ｓ−３９６；Ｔ−３５７〜Ｓ−３９６；Ｃ−３５８〜Ｓ−３９６；Ｓ−３５９〜Ｓ−３９６；Ｃ−３６０〜Ｓ−３９６；Ｙ−３６１〜Ｓ−３９６；Ｒ−３６２〜Ｓ−３９６；Ｒ−３６３〜Ｓ−３９６；Ｐ−３６４〜Ｓ−３９６；Ｃ−３６５〜Ｓ−３９６；Ｔ−３６６〜Ｓ−３９６；Ｎ−３６７〜Ｓ−３９６；Ｒ−３６８〜Ｓ−３９６；Ｑ−３６９〜Ｓ−３９６；Ｋ−３７０〜Ｓ−３９６；Ａ−３７１〜Ｓ−３９６；Ｃ−３７２〜Ｓ−３９６；Ｅ−３７３〜Ｓ−３９６；Ｐ−３７４〜Ｓ−３９６；Ｇ−３７５〜Ｓ−３９６；Ｆ−３７６〜Ｓ−３９６；Ｓ−３７７〜Ｓ−３９６；Ｙ−３７８〜Ｓ−３９６；Ｓ−３７９〜Ｓ−３９６；Ｅ−３８０〜Ｓ−３９６；Ｅ−３８１〜Ｓ−３９６；Ｖ−３８２〜Ｓ−３９６；Ｃ−３８３〜Ｓ−３９６；Ｒ−３８４〜Ｓ−３９６；Ｃ−３８５〜Ｓ−３９６；Ｖ−３８６〜Ｓ−３９６；Ｐ−３８７〜Ｓ−３９６；Ｓ−３８８〜Ｓ−３９６；Ｙ−３８９〜Ｓ−３９６；Ｗ−３９０〜Ｓ−３９６；Ｑ−３９１〜Ｓ−３９６。１つの好ましい実施形態には、配列番号２のアミノ酸Ｓ−２０５〜Ｓ−３９６が含まれる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【００５９】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＣ末端欠失はまた、一般式−２３−ｎにより記載され得、ここでｎは−１５〜３９５の整数であり、ｎは、配列番号２で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、Ｃ末端欠失は、図３の保存されたボックスで囲んだ領域（ＰＸＣＶＸＸＸＲＣＸＧＣＣＮ）（配列番号８）を保持し、そして以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み：同様に、配列番号２に示される本発明のポリペプチドのＣ末端欠失は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：配列番号２のＥ−１〜Ｍ−３９５；Ｅ−１〜Ｑ−３９４；Ｅ−１〜Ｐ−３９３；Ｅ−１〜Ｒ−３９２；Ｅ−１〜Ｑ−３９１；Ｅ−１〜Ｗ−３９０；Ｅ−１〜Ｙ−３８９；Ｅ−１〜Ｓ−３８８；Ｅ−１〜Ｐ−３８７；Ｅ−１〜Ｖ−３８６；Ｅ−１〜Ｃ−３８５；Ｅ−１〜Ｒ−３８４；Ｅ−１〜Ｃ−３８３；Ｅ−１〜Ｖ−３８２；Ｅ−１〜Ｅ−３８１；Ｅ−１〜Ｅ−３８０；Ｅ−１〜Ｓ−３７９；Ｅ−１〜Ｙ−３７８；Ｅ−１〜Ｓ−３７７；Ｅ−１〜Ｆ−３７６；Ｅ−１〜Ｇ−３７５；Ｅ−１〜Ｐ−３７４；Ｅ−１〜Ｅ−３７３；Ｅ−１〜Ｃ−３７２；Ｅ−１〜Ａ−３７１；Ｅ−１〜Ｋ−３７０；Ｅ−１〜Ｑ−３６９；Ｅ−１〜Ｒ−３６８；Ｅ−１〜Ｎ−３６７；Ｅ−１〜Ｔ−３６６；Ｅ−１〜Ｃ−３６５；Ｅ−１〜Ｐ−３６４；Ｅ−１〜Ｒ−３６３；Ｅ−１〜Ｒ−３６２；Ｅ−１〜Ｙ−３６１；Ｅ−１〜Ｃ−３６０；Ｅ−１〜Ｓ−３５９；Ｅ−１〜Ｃ−３５８；Ｅ−１〜Ｔ−３５７；Ｅ−１〜Ｑ−３５６；Ｅ−１〜Ｈ−３５５；Ｅ−１〜Ｈ−３５４；Ｅ−１〜Ｆ−３５３；Ｅ−１〜Ｋ−３５２；Ｅ−１〜Ｋ−３５１；Ｅ−１〜Ｇ−３５０；Ｅ−１〜Ｋ−３４９；Ｅ−１〜Ｌ−３４８；Ｅ−１〜Ｌ−３４７；Ｅ−１〜Ｃ−３４６；Ｅ−１〜Ｋ−３４５；Ｅ−１〜Ｑ−３４４；Ｅ−１〜Ｐ−３４３；Ｅ−１〜Ｓ−３４２；Ｅ−１〜Ｅ−３４１；Ｅ−１〜Ｔ−３４０；Ｅ−１〜Ｃ−３３９；Ｅ−１〜Ｅ−３３８；Ｅ−１〜Ｃ−３３７；Ｅ−１〜Ａ−３３６；Ｅ−１〜Ｃ−３３５；Ｅ−１〜Ｋ−３３４；Ｅ−１〜Ｇ−３３３；Ｅ−１〜Ｐ−３３２；Ｅ−１〜Ｎ−３３１；Ｅ−１〜Ｌ−３３０；Ｅ−１〜Ｐ−３２９；Ｅ−１〜Ｑ−３２８；Ｅ−１〜Ｎ−３２７；Ｅ−１〜Ｒ−３２６；Ｅ−１〜Ｐ−３２５；Ｅ−１〜Ｃ−３２４；Ｅ−１〜Ｔ−３２３；Ｅ−１〜Ｒ−３２２；Ｅ−１〜Ｋ−３２１；Ｅ−１〜Ｃ−３２０；Ｅ−１〜Ｖ−３１９；Ｅ−１〜Ｃ−３１８；Ｅ−１〜Ｑ−３１７；Ｅ−１〜Ｃ−３１６；Ｅ−１〜Ｔ−３１５；Ｅ−１〜Ｎ−３１４；Ｅ−１〜Ｅ−３１３；Ｅ−１〜Ｄ−３１２；Ｅ−１〜Ｆ−３１１；Ｅ−１〜Ｅ−３１０；Ｅ−１〜Ｒ−３０９；Ｅ−１〜Ｎ−３０８；Ｅ−１〜Ａ−３０７；Ｅ−１〜Ｇ−３０６；Ｅ−１〜Ｃ−３０５；Ｅ−１〜Ｑ−３０４；Ｅ−１〜Ｓ−３０３；Ｅ−１〜Ｐ−３０２；Ｅ−１〜Ｆ−３０１；Ｅ−１〜Ｌ−３００；Ｅ−１〜Ｋ−２９９；Ｅ−１〜Ｎ−２９８；Ｅ−１〜Ｋ−２９７；Ｅ−１〜Ｃ−２９６；Ｅ−１〜Ｖ−２９５；Ｅ−１〜Ｃ−２９４；Ｅ−１〜Ｑ−２９３；Ｅ−１〜Ｃ−２９２；Ｅ−１〜Ｓ−２９１；Ｅ−１〜Ｎ−２９０；Ｅ−１〜Ｒ−２８９；Ｅ−１〜Ｄ−２８８；Ｅ−１〜Ｌ−２８７；Ｅ−１〜Ｅ−２８６；Ｅ−１〜Ｋ−２８５；Ｅ−１〜Ｈ−２８４；Ｅ−１〜Ｐ−２８３；Ｅ−１〜Ｇ−２８２；Ｅ−１〜Ｃ−２８１；Ｅ−１〜Ｓ−２８０；Ｅ−１〜Ａ−２７９；Ｅ−１〜Ｐ−２７８；Ｅ−１〜Ｒ−２７７；Ｅ−１〜Ｌ−２７６；Ｅ−１〜Ｇ−２７５；Ｅ−１〜Ａ−２７４；Ｅ−１〜Ｒ−２７３；Ｅ−１〜Ｃ−２７２；Ｅ−１〜Ｖ−２７１；Ｅ−１〜Ｃ−２７０；Ｅ−１〜Ｑ−２６９；Ｅ−１〜Ｃ−２６８；Ｅ−１〜Ｔ−２６７；Ｅ−１〜Ｅ−２６６；Ｅ−１〜Ｅ−２６５；Ｅ−１〜Ｄ−２６４；Ｅ−１〜Ｌ−２６３；Ｅ−１〜Ｅ−２６２；Ｅ−１〜Ｋ−２６１；Ｅ−１〜Ｎ−２６０；Ｅ−１〜Ｐ−２５９；Ｅ−１〜Ｇ−２５８；Ｅ−１〜Ｃ−２５７；Ｅ−１〜Ｉ−２５６；Ｅ−１〜Ｄ−２５５；Ｅ−１〜Ｈ−２５４；Ｅ−１〜Ｆ−２５３；Ｅ−１〜Ｇ−２５２；Ｅ−１〜Ｄ−２５１；Ｅ−１〜Ｔ−２５０；Ｅ−１〜Ｓ−２４９；Ｅ−１〜Ｄ−２４８；Ｅ−１〜Ｄ−２４７；Ｅ−１〜Ｇ−２４６；Ｅ−１〜Ａ−２４５；Ｅ−１〜Ｄ−２４４；Ｅ−１〜Ｓ−２４３；Ｅ−１〜Ｓ−２４２；Ｅ−１〜Ｆ−２４１；Ｅ−１〜Ｍ−２４０；Ｅ−１〜Ｆ−２３９；Ｅ−１〜Ｄ−２３８；Ｅ−１〜Ｅ−２３７；Ｅ−１〜Ｑ−２３６；Ｅ−１〜Ａ−２３５；Ｅ−１〜Ｌ−２３４；Ｅ−１〜Ｃ−２３３；Ｅ−１〜Ｒ−２３２；Ｅ−１〜Ｃ−２３１；Ｅ−１〜Ｉ−２３０；Ｅ−１〜Ｈ−２２９；Ｅ−１〜Ｎ−２２８；Ｅ−１〜Ｎ−２２７；Ｅ−１〜Ｗ−２２６；Ｅ−１〜Ｍ−２２５；Ｅ−１〜Ｙ−２２４；Ｅ−１〜Ｎ−２２３；Ｅ−１〜Ｔ−２２２；Ｅ−１〜Ｐ−２２１；Ｅ−１〜Ｃ−２２０；Ｅ−１〜Ｔ−２１９；Ｅ−１〜Ｋ−２１８；Ｅ−１〜Ｎ−２１７；Ｅ−１〜Ａ−２１６；Ｅ−１〜Ａ−２１５；Ｅ−１〜Ｑ−２１４；Ｅ−１〜Ｃ−２１３；Ｅ−１〜Ｑ−２１２；Ｅ−１〜Ｐ−２１１；Ｅ−１〜Ｌ−２１０；Ｅ−１〜Ｔ−２０９；Ｅ−１〜Ａ−２０８；Ｅ−１〜Ｐ−２０７；Ｅ−１〜Ｌ−２０６；Ｅ−１〜Ｓ−２０５；Ｅ−１〜Ｒ−２０４；Ｅ−１〜Ｒ−２０３；Ｅ−１〜Ｉ−２０２；Ｅ−１〜Ｉ−２０１；Ｅ−１〜Ｓ−２００；Ｅ−１〜Ｈ−１９９；Ｅ−１〜Ｖ−１９８；Ｅ−１〜Ｑ−１９７；Ｅ−１〜Ｒ−１９６；Ｅ−１〜Ｙ−１９５；Ｅ−１〜Ｖ−１９４；Ｅ−１〜Ｄ−１９３；Ｅ−１〜Ｌ−１９２；Ｅ−１〜Ｋ−１９１；Ｅ−１〜Ｓ−１９０；Ｅ−１〜Ｍ−１８９；Ｅ−１〜Ｃ−１８８；Ｅ−１〜Ｒ−１８７；Ｅ−１〜Ｃ−１８６；Ｅ−１〜Ｓ−１８５；Ｅ−１〜Ｔ−１８４；Ｅ−１〜Ｈ−１８３；Ｅ−１〜Ｎ−１８２；Ｅ−１〜Ａ−１８１；Ｅ−１〜Ｆ−１８０；Ｅ−１〜Ｓ−１７９；Ｅ−１〜Ｉ−１７８；Ｅ−１〜Ｔ−１７７；Ｅ−１〜Ｖ−１７６；Ｅ−１〜Ｐ−１７５；Ｅ−１〜Ｋ−１７４；Ｅ−１〜Ｐ−１７３；Ｅ−１〜Ｇ−１７２；Ｅ−１〜Ｑ−１７１；Ｅ−１〜Ｓ−１７０；Ｅ−１〜Ｌ−１６９；Ｅ−１〜Ｐ−１６８；Ｅ−１〜Ｖ−１６７；Ｅ−１〜Ｔ−１６６；Ｅ−１〜Ｉ−１６５；Ｅ−１〜Ｅ−１６４；Ｅ−１〜Ｆ−１６３；Ｅ−１〜Ｌ−１６２；Ｅ−１〜Ｔ−１６１；Ｅ−１〜Ｋ−１６０；Ｅ−１〜Ｓ−１５９；Ｅ−１〜Ｌ−１５８；Ｅ−１〜Ｙ−１５７；Ｅ−１〜Ｓ−１５６；Ｅ−１〜Ｔ−１５５；Ｅ−１〜Ｓ−１５４；Ｅ−１〜Ｔ−１５３；Ｅ−１〜Ｎ−１５２；Ｅ−１〜Ｍ−１５１；Ｅ−１〜Ｃ−１５０；Ｅ−１〜Ｑ−１４９；Ｅ−１〜Ｌ−１４８；Ｅ−１〜Ｇ−１４７；Ｅ−１〜Ｅ−１４６；Ｅ−１〜Ｓ−１４５；Ｅ−１〜Ｎ−１４４；Ｅ−１〜Ｃ−１４３；Ｅ−１〜Ｃ−１４２；Ｅ−１〜Ｇ−１４１；Ｅ−１〜Ｇ−１４０；Ｅ−１〜Ｃ−１３９；Ｅ−１〜Ｒ−１３８；Ｅ−１〜Ｙ−１３７；Ｅ−１〜Ｖ−１３６；Ｅ−１〜Ｓ−１３５；Ｅ−１〜Ｖ−１３４；Ｅ−１〜Ｃ−１３３；Ｅ−１〜Ｐ−１３２；Ｅ−１〜Ｐ−１３１；Ｅ−１〜Ｋ−１３０；Ｅ−１〜Ｆ−１２９；Ｅ−１〜Ｆ−１２８；Ｅ−１〜Ｔ−１２７；Ｅ−１〜Ｎ−１２６；Ｅ−１〜Ｔ−１２５；Ｅ−１〜Ａ−１２４；Ｅ−１〜Ｖ−１２３；Ｅ−１〜Ｇ−１２２；Ｅ−１〜Ｆ−１２１；Ｅ−１〜Ｅ−１２０；Ｅ−１〜Ｋ−１１９；Ｅ−１〜Ｇ−１１８；Ｅ−１〜Ｖ−１１７；Ｅ−１〜Ｄ−１１６；Ｅ−１〜Ｉ−１１５；Ｅ−１〜Ｃ−１１４；Ｅ−１〜Ｖ−１１３；Ｅ−１〜Ｅ−１１２；Ｅ−１〜Ｒ−１１１；Ｅ−１〜Ｐ−１１０；Ｅ−１〜Ｍ−１０９；Ｅ−１〜Ｃ−１０８；Ｅ−１〜Ｑ−１０７；Ｅ−１〜Ｔ−１０６；Ｅ−１〜Ｋ−１０５；Ｅ−１〜Ｒ−１０４；Ｅ−１〜Ｗ−１０３；Ｅ−１〜Ｅ−１０２；Ｅ−１〜Ｎ−１０１；Ｅ−１〜Ｄ−１００；Ｅ−１〜Ｉ−９９；Ｅ−１〜Ｓ−９８；Ｅ−１〜Ｋ−９７；Ｅ−１〜Ｌ−９６；Ｅ−１〜Ｉ−９５；Ｅ−１〜Ｅ−９４；Ｅ−１〜Ｔ−９３；Ｅ−１〜Ｎ−９２；Ｅ−１〜Ｙ−９１；Ｅ−１〜Ｈ−９０；Ｅ−１〜Ａ−８９；Ｅ−１〜Ａ−８８；Ｅ−１〜Ａ−８７；Ｅ−１〜Ｆ−８６；Ｅ−１〜Ｋ−８５；Ｅ−１〜Ｉ−８４；Ｅ−１〜Ｔ−８３；Ｅ−１〜Ｅ−８２；Ｅ−１〜Ｅ−８１；Ｅ−１〜Ｔ−８０；Ｅ−１〜Ｒ−７９；Ｅ−１〜Ｓ−７８；Ｅ−１〜Ｎ−７７；Ｅ−１〜Ｌ−７６；Ｅ−１〜Ｎ−７５；Ｅ−１〜Ａ−７４；Ｅ−１〜Ｑ−７３；Ｅ−１〜Ｅ−７２；Ｅ−１〜Ｒ−７１；Ｅ−１〜Ｎ−７０；Ｅ−１〜Ｈ−６９；Ｅ−１〜Ｑ−６８；Ｅ−１〜Ｗ−６７；Ｅ−１〜Ｇ−６６；Ｅ−１〜Ｇ−６５；Ｅ−１〜Ｋ−６４；Ｅ−１〜Ｒ−６３；Ｅ−１〜Ｌ−６２；Ｅ−１〜Ｑ−６１；Ｅ−１〜Ｃ−６０；Ｅ−１〜Ｋ−５９；Ｅ−１〜Ｙ−５８；Ｅ−１〜Ｍ−５７；Ｅ−１〜Ｋ−５６；Ｅ−１〜Ｗ−５５；Ｅ−１〜Ｙ−５４；Ｅ−１〜Ｅ−５３；Ｅ−１〜Ｐ−５２；Ｅ−１〜Ｙ−５１；Ｅ−１〜Ｌ−５０；Ｅ−１〜Ｖ−４９；Ｅ−１〜Ｔ−４８；Ｅ−１〜Ｍ−４７；Ｅ−１〜Ｌ−４６；Ｅ−１〜Ｅ−４５；Ｅ−１〜Ｄ−４４；Ｅ−１〜Ｖ−４３；Ｅ−１〜Ｓ−４２；Ｅ−１〜Ｓ−４１；Ｅ−１〜Ｖ−４０；Ｅ−１〜Ｓ−３９；Ｅ−１〜Ｒ−３８；Ｅ−１〜Ｌ−３７；Ｅ−１〜Ｑ−３６；Ｅ−１〜Ｅ−３５；Ｅ−１〜Ｅ−３４；Ｅ−１〜Ｌ−３３；Ｅ−１〜Ｄ−３２；Ｅ−１〜Ｋ−３１；Ｅ−１〜Ｓ−３０；Ｅ−１〜Ａ−２９；Ｅ−１〜Ｙ−２８；Ｅ−１〜Ａ−２７；Ｅ−１〜Ｔ−２６；Ｅ−１〜Ａ−２５；Ｅ−１〜Ｅ−２４；Ｅ−１〜Ｇ−２３；Ｅ−１〜Ａ−２２；Ｅ−１〜Ｄ−２１；Ｅ−１〜Ｐ−２０；Ｅ−１〜Ｅ−１９；Ｅ−１〜Ａ−１８；Ｅ−１〜Ｄ−１７；Ｅ−１〜Ｓ−１６；Ｅ−１〜Ｌ−１５；Ｅ−１〜Ｄ−１４；Ｅ−１〜Ｌ−１３；Ｅ−１〜Ｇ−１２；Ｅ−１〜Ｓ−１１；Ｅ−１〜Ｅ−１０；Ｅ−１〜Ｆ−９；Ｅ−１〜Ａ−８；Ｅ−１〜Ａ−７。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【００６０】
さらに、本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方から１つ以上のアミノ酸欠失を有するポリペプチドを提供し、それらは一般に、配列番号２において残基ｍ−ｎを有するとして記載され得、ここで、ｎおよびｍは、上記のような整数である。
【００６１】
同様に、配列番号２に示される本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＣ末端欠失もまた好ましく、これらは以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：配列番号２のＦ−９〜Ｍ−３９５；Ｆ−９〜Ｑ−３９４；Ｆ−９〜Ｐ−３９３；Ｆ−９〜Ｒ−３９２；Ｆ−９〜Ｑ−３９１；Ｆ−９〜Ｗ−３９０；Ｆ−９〜Ｙ−３８９；Ｆ−９〜Ｓ−３８８；Ｆ−９〜Ｐ−３８７；Ｆ−９〜Ｖ−３８６；Ｆ−９〜Ｃ−３８５；Ｆ−９〜Ｒ−３８４；Ｆ−９〜Ｃ−３８３；Ｆ−９〜Ｖ−３８２；Ｆ−９〜Ｅ−３８１；Ｆ−９〜Ｅ−３８０；Ｆ−９〜Ｓ−３７９；Ｆ−９〜Ｙ−３７８；Ｆ−９〜Ｓ−３７７；Ｆ−９〜Ｆ−３７６；Ｆ−９〜Ｇ−３７５；Ｆ−９〜Ｐ−３７４；Ｆ−９〜Ｅ−３７３；Ｆ−９〜Ｃ−３７２；Ｆ−９〜Ａ−３７１；Ｆ−９〜Ｋ−３７０；Ｆ−９〜Ｑ−３６９；Ｆ−９〜Ｒ−３６８；Ｆ−９〜Ｎ−３６７；Ｆ−９〜Ｔ−３６６；Ｆ−９〜Ｃ−３６５；Ｆ−９〜Ｐ−３６４；Ｆ−９〜Ｒ−３６３；Ｆ−９〜Ｒ−３６２；Ｆ−９〜Ｙ−３６１；Ｆ−９〜Ｃ−３６０；Ｆ−９〜Ｓ−３５９；Ｆ−９〜Ｃ−３５８；Ｆ−９〜Ｔ−３５７；Ｆ−９〜Ｑ−３５６；Ｆ−９〜Ｈ−３５５；Ｆ−９〜Ｈ−３５４；Ｆ−９〜Ｆ−３５３；Ｆ−９〜Ｋ−３５２；Ｆ−９〜Ｋ−３５１；Ｆ−９〜Ｇ−３５０；Ｆ−９〜Ｋ−３４９；Ｆ−９〜Ｌ−３４８；Ｆ−９〜Ｌ−３４７；Ｆ−９〜Ｃ−３４６；Ｆ−９〜Ｋ−３４５；Ｆ−９〜Ｑ−３４４；Ｆ−９〜Ｐ−３４３；Ｆ−９〜Ｓ−３４２；Ｆ−９〜Ｅ−３４１；Ｆ−９〜Ｔ−３４０；Ｆ−９〜Ｃ−３３９；Ｆ−９〜Ｅ−３３８；Ｆ−９〜Ｃ−３３７；Ｆ−９〜Ａ−３３６；Ｆ−９〜Ｃ−３３５；Ｆ−９〜Ｋ−３３４；Ｆ−９〜Ｇ−３３３；Ｆ−９〜Ｐ−３３２；Ｆ−９〜Ｎ−３３１；Ｆ−９〜Ｌ−３３０；Ｆ−９〜Ｐ−３２９；Ｆ−９〜Ｑ−３２８；Ｆ−９〜Ｎ−３２７；Ｆ−９〜Ｒ−３２６；Ｆ−９〜Ｐ−３２５；Ｆ−９〜Ｃ−３２４；Ｆ−９〜Ｔ−３２３；Ｆ−９〜Ｒ−３２２；Ｆ−９〜Ｋ−３２１；Ｆ−９〜Ｃ−３２０；Ｆ−９〜Ｖ−３１９；Ｆ−９〜Ｃ−３１８；Ｆ−９〜Ｑ−３１７；Ｆ−９〜Ｃ−３１６；Ｆ−９〜Ｔ−３１５；Ｆ−９〜Ｎ−３１４；Ｆ−９〜Ｅ−３１３；Ｆ−９〜Ｄ−３１２；Ｆ−９〜Ｆ−３１１；Ｆ−９〜Ｅ−３１０；Ｆ−９〜Ｒ−３０９；Ｆ−９〜Ｎ−３０８；Ｆ−９〜Ａ−３０７；Ｆ−９〜Ｇ−３０６；Ｆ−９〜Ｃ−３０５；Ｆ−９〜Ｑ−３０４；Ｆ−９〜Ｓ−３０３；Ｆ−９〜Ｐ−３０２；Ｆ−９〜Ｆ−３０１；Ｆ−９〜Ｌ−３００；Ｆ−９〜Ｋ−２９９；Ｆ−９〜Ｎ−２９８；Ｆ−９〜Ｋ−２９７；Ｆ−９〜Ｃ−２９６；Ｆ−９〜Ｖ−２９５；Ｆ−９〜Ｃ−２９４；Ｆ−９〜Ｑ−２９３；Ｆ−９〜Ｃ−２９２；Ｆ−９〜Ｓ−２９１；Ｆ−９〜Ｎ−２９０；Ｆ−９〜Ｒ−２８９；Ｆ−９〜Ｄ−２８８；Ｆ−９〜Ｌ−２８７；Ｆ−９〜Ｅ−２８６；Ｆ−９〜Ｋ−２８５；Ｆ−９〜Ｈ−２８４；Ｆ−９〜Ｐ−２８３；Ｆ−９〜Ｇ−２８２；Ｆ−９〜Ｃ−２８１；Ｆ−９〜Ｓ−２８０；Ｆ−９〜Ａ−２７９；Ｆ−９〜Ｐ−２７８；Ｆ−９〜Ｒ−２７７；Ｆ−９〜Ｌ−２７６；Ｆ−９〜Ｇ−２７５；Ｆ−９〜Ａ−２７４；Ｆ−９〜Ｒ−２７３；Ｆ−９〜Ｃ−２７２；Ｆ−９〜Ｖ−２７１；Ｆ−９〜Ｃ−２７０；Ｆ−９〜Ｑ−２６９；Ｆ−９〜Ｃ−２６８；Ｆ−９〜Ｔ−２６７；Ｆ−９〜Ｅ−２６６；Ｆ−９〜Ｅ−２６５；Ｆ−９〜Ｄ−２６４；Ｆ−９〜Ｌ−２６３；Ｆ−９〜Ｅ−２６２；Ｆ−９〜Ｋ−２６１；Ｆ−９〜Ｎ−２６０；Ｆ−９〜Ｐ−２５９；Ｆ−９〜Ｇ−２５８；Ｆ−９〜Ｃ−２５７；Ｆ−９〜Ｉ−２５６；Ｆ−９〜Ｄ−２５５；Ｆ−９〜Ｈ−２５４；Ｆ−９〜Ｆ−２５３；Ｆ−９〜Ｇ−２５２；Ｆ−９〜Ｄ−２５１；Ｆ−９〜Ｔ−２５０；Ｆ−９〜Ｓ−２４９；Ｆ−９〜Ｄ−２４８；Ｆ−９〜Ｄ−２４７；Ｆ−９〜Ｇ−２４６；Ｆ−９〜Ａ−２４５；Ｆ−９〜Ｄ−２４４；Ｆ−９〜Ｓ−２４３；Ｆ−９〜Ｓ−２４２；Ｆ−９〜Ｆ−２４１；Ｆ−９〜Ｍ−２４０；Ｆ−９〜Ｆ−２３９；Ｆ−９〜Ｄ−２３８；Ｆ−９〜Ｅ−２３７；Ｆ−９〜Ｑ−２３６；Ｆ−９〜Ａ−２３５；Ｆ−９〜Ｌ−２３４；Ｆ−９〜Ｃ−２３３；Ｆ−９〜Ｒ−２３２；Ｆ−９〜Ｃ−２３１；Ｆ−９〜Ｉ−２３０；Ｆ−９〜Ｈ−２２９；Ｆ−９〜Ｎ−２２８；Ｆ−９〜Ｎ−２２７；Ｆ−９〜Ｗ−２２６；Ｆ−９〜Ｍ−２２５；Ｆ−９〜Ｙ−２２４；Ｆ−９〜Ｎ−２２３；Ｆ−９〜Ｔ−２２２；Ｆ−９〜Ｐ−２２１；Ｆ−９〜Ｃ−２２０；Ｆ−９〜Ｔ−２１９；Ｆ−９〜Ｋ−２１８；Ｆ−９〜Ｎ−２１７；Ｆ−９〜Ａ−２１６；Ｆ−９〜Ａ−２１５；Ｆ−９〜Ｑ−２１４；Ｆ−９〜Ｃ−２１３；Ｆ−９〜Ｑ−２１２；Ｆ−９〜Ｐ−２１１；Ｆ−９〜Ｌ−２１０；Ｆ−９〜Ｔ−２０９；Ｆ−９〜Ａ−２０８；Ｆ−９〜Ｐ−２０７；Ｆ−９〜Ｌ−２０６；Ｆ−９〜Ｓ−２０５；Ｆ−９〜Ｒ−２０４；Ｆ−９〜Ｒ−２０３；Ｆ−９〜Ｉ−２０２；Ｆ−９〜Ｉ−２０１；Ｆ−９〜Ｓ−２００；Ｆ−９〜Ｈ−１９９；Ｆ−９〜Ｖ−１９８；Ｆ−９〜Ｑ−１９７；Ｆ−９〜Ｒ−１９６；Ｆ−９〜Ｙ−１９５；Ｆ−９〜Ｖ−１９４；Ｆ−９〜Ｄ−１９３；Ｆ−９〜Ｌ−１９２；Ｆ−９〜Ｋ−１９１；Ｆ−９〜Ｓ−１９０；Ｆ−９〜Ｍ−１８９；Ｆ−９〜Ｃ−１８８；Ｆ−９〜Ｒ−１８７；Ｆ−９〜Ｃ−１８６；Ｆ−９〜Ｓ−１８５；Ｆ−９〜Ｔ−１８４；Ｆ−９〜Ｈ−１８３；Ｆ−９〜Ｎ−１８２；Ｆ−９〜Ａ−１８１；Ｆ−９〜Ｆ−１８０；Ｆ−９〜Ｓ−１７９；Ｆ−９〜Ｉ−１７８；Ｆ−９〜Ｔ−１７７；Ｆ−９〜Ｖ−１７６；Ｆ−９〜Ｐ−１７５；Ｆ−９〜Ｋ−１７４；Ｆ−９〜Ｐ−１７３；Ｆ−９〜Ｇ−１７２；Ｆ−９〜Ｑ−１７１；Ｆ−９〜Ｓ−１７０；Ｆ−９〜Ｌ−１６９；Ｆ−９〜Ｐ−１６８；Ｆ−９〜Ｖ−１６７；Ｆ−９〜Ｔ−１６６；Ｆ−９〜Ｉ−１６５；Ｆ−９〜Ｅ−１６４；Ｆ−９〜Ｆ−１６３；Ｆ−９〜Ｌ−１６２；Ｆ−９〜Ｔ−１６１；Ｆ−９〜Ｋ−１６０；Ｆ−９〜Ｓ−１５９；Ｆ−９〜Ｌ−１５８；Ｆ−９〜Ｙ−１５７；Ｆ−９〜Ｓ−１５６；Ｆ−９〜Ｔ−１５５；Ｆ−９〜Ｓ−１５４；Ｆ−９〜Ｔ−１５３；Ｆ−９〜Ｎ−１５２；Ｆ−９〜Ｍ−１５１；Ｆ−９〜Ｃ−１５０；Ｆ−９〜Ｑ−１４９；Ｆ−９〜Ｌ−１４８；Ｆ−９〜Ｇ−１４７；Ｆ−９〜Ｅ−１４６；Ｆ−９〜Ｓ−１４５；Ｆ−９〜Ｎ−１４４；Ｆ−９〜Ｃ−１４３；Ｆ−９〜Ｃ−１４２；Ｆ−９〜Ｇ−１４１；Ｆ−９〜Ｇ−１４０；Ｆ−９〜Ｃ−１３９；Ｆ−９〜Ｒ−１３８；Ｆ−９〜Ｙ−１３７；Ｆ−９〜Ｖ−１３６；Ｆ−９〜Ｓ−１３５；Ｆ−９〜Ｖ−１３４；Ｆ−９〜Ｃ−１３３；Ｆ−９〜Ｐ−１３２；Ｆ−９〜Ｐ−１３１；Ｆ−９〜Ｋ−１３０；Ｆ−９〜Ｆ−１２９；Ｆ−９〜Ｆ−１２８；Ｆ−９〜Ｔ−１２７；Ｆ−９〜Ｎ−１２６；Ｆ−９〜Ｔ−１２５；Ｆ−９〜Ａ−１２４；Ｆ−９〜Ｖ−１２３；Ｆ−９〜Ｇ−１２２；Ｆ−９〜Ｆ−１２１；Ｆ−９〜Ｅ−１２０；Ｆ−９〜Ｋ−１１９；Ｆ−９〜Ｇ−１１８；Ｆ−９〜Ｖ−１１７；Ｆ−９〜Ｄ−１１６；Ｆ−９〜Ｉ−１１５；Ｆ−９〜Ｃ−１１４；Ｆ−９〜Ｖ−１１３；Ｆ−９〜Ｅ−１１２；Ｆ−９〜Ｒ−１１１；Ｆ−９〜Ｐ−１１０；Ｆ−９〜Ｍ−１０９；Ｆ−９〜Ｃ−１０８；Ｆ−９〜Ｑ−１０７；Ｆ−９〜Ｔ−１０６；Ｆ−９〜Ｋ−１０５；Ｆ−９〜Ｒ−１０４；Ｆ−９〜Ｗ−１０３；Ｆ−９〜Ｅ−１０２；Ｆ−９〜Ｎ−１０１；Ｆ−９〜Ｄ−１００；Ｆ−９〜Ｉ−９９；Ｆ−９〜Ｓ−９８；Ｆ−９〜Ｋ−９７；Ｆ−９〜Ｌ−９６；Ｆ−９〜Ｉ−９５；Ｆ−９〜Ｅ−９４；Ｆ−９〜Ｔ−９３；Ｆ−９〜Ｎ−９２；Ｆ−９〜Ｙ−９１；Ｆ−９〜Ｈ−９０；Ｆ−９〜Ａ−８９；Ｆ−９〜Ａ−８８；Ｆ−９〜Ａ−８７；Ｆ−９〜Ｆ−８６；Ｆ−９〜Ｋ−８５；Ｆ−９〜Ｉ−８４；Ｆ−９〜Ｔ−８３；Ｆ−９〜Ｅ−８２；Ｆ−９〜Ｅ−８１；Ｆ−９〜Ｔ−８０；Ｆ−９〜Ｒ−７９；Ｆ−９〜Ｓ−７８；Ｆ−９〜Ｎ−７７；Ｆ−９〜Ｌ−７６；Ｆ−９〜Ｎ−７５；Ｆ−９〜Ａ−７４；Ｆ−９〜Ｑ−７３；Ｆ−９〜Ｅ−７２；Ｆ−９〜Ｒ−７１；Ｆ−９〜Ｎ−７０；Ｆ−９〜Ｈ−６９；Ｆ−９〜Ｑ−６８；Ｆ−９〜Ｗ−６７；Ｆ−９〜Ｇ−６６；Ｆ−９〜Ｇ−６５；Ｆ−９〜Ｋ−６４；Ｆ−９〜Ｒ−６３；Ｆ−９〜Ｌ−６２；Ｆ−９〜Ｑ−６１；Ｆ−９〜Ｃ−６０；Ｆ−９〜Ｋ−５９；Ｆ−９〜Ｙ−５８；Ｆ−９〜Ｍ−５７；Ｆ−９〜Ｋ−５６；Ｆ−９〜Ｗ−５５；Ｆ−９〜Ｙ−５４；Ｆ−９〜Ｅ−５３；Ｆ−９〜Ｐ−５２；Ｆ−９〜Ｙ−５１；Ｆ−９〜Ｌ−５０；Ｆ−９〜Ｖ−４９；Ｆ−９〜Ｔ−４８；Ｆ−９〜Ｍ−４７；Ｆ−９〜Ｌ−４６；Ｆ−９〜Ｅ−４５；Ｆ−９〜Ｄ−４４；Ｆ−９〜Ｖ−４３；Ｆ−９〜Ｓ−４２；Ｆ−９〜Ｓ−４１；Ｆ−９〜Ｖ−４０；Ｆ−９〜Ｓ−３９；Ｆ−９〜Ｒ−３８；Ｆ−９〜Ｌ−３７；Ｆ−９〜Ｑ−３６；Ｆ−９〜Ｅ−３５；Ｆ−９〜Ｅ−３４；Ｆ−９〜Ｌ−３３；Ｆ−９〜Ｄ−３２；Ｆ−９〜Ｋ−３１；Ｆ−９〜Ｓ−３０；Ｆ−９〜Ａ−２９；Ｆ−９〜Ｙ−２８；Ｆ−９〜Ａ−２７；Ｆ−９〜Ｔ−２６；Ｆ−９〜Ａ−２５；Ｆ−９〜Ｅ−２４；Ｆ−９〜Ｇ−２３；Ｆ−９〜Ａ−２２；Ｆ−９〜Ｄ−２１；Ｆ−９〜Ｐ−２０；Ｆ−９〜Ｅ−１９；Ｆ−９〜Ａ−１８；Ｆ−９〜Ｄ−１７；Ｆ−９〜Ｓ−１６；Ｆ−９〜Ｌ−１５。配列番号２のアミノ酸残基Ｆ−９からＲ−２０３を含むポリペプチドフラグメント、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。好ましくは、配列番号２のポリペプチドのこのＦ−９〜Ｒ−２０３は、配列番号２のポリペプチドのＳ−２０５〜Ｓ−３９６と結合する。結合は、ジスルフィド、共有、もしくは非共有相互作用、リンカー（例えば、セリン、グリシン、プロリン連結）を介した連結による、または抗体による連結であり得る。
【００６２】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、配列データベースを介して公に利用可能であり、そしてアクセス可能である。これらの配列のいくつかは、配列番号１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号１の１〜１６６０の間の任意の整数であり、ｂは１５〜１６７４の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００６３】
従って、１つの局面において、本発明によりＮ末端欠失変異体が提供される。このような変異体には、図１（配列番号１８）に示されるアミノ酸配列（図１（配列番号１８）の少なくとも最初の２４個のＮ末端アミノ酸残基の欠失（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）−−Ｇｌｕ（２４）の欠失）を除くが、図１（配列番号１８）の最初の１１５個以下のＮ末端アミノ酸残基である）を含むものが含まれる。あるいは、図１（配列番号１８）の最初の２４個のＮ末端アミノ酸残基（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）−−Ｇｌｕ（２４）の欠失）であるが、最初の１０３個以下のＮ末端アミノ酸残基などである。
【００６４】
別の局面において、本発明により、Ｃ末端欠失変異体が提供される。このような変異体には、図１（配列番号１８）に示されるアミノ酸配列（少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基（Ｓｅｒ（４１９））の欠失を除くが、図１（配列番号１８）の最後の２２０個以下のＣ末端アミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基Ｖａｌ（１９９）−Ｓｅｒ（４１９）の欠失である）を含むものが含まれる。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の２１６個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の２０４個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の１９２個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の１５６個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の１０８個以下のＣ末端アミノ酸残基である。あるいは、欠失は、図１（配列番号１８）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を含むが、最後の５２個以下のＣ末端アミノ酸残基である。
【００６５】
なお別の局面において、本発明には、Ｎ末端残基およびＣ末端残基の両方からのアミノ酸欠失を有する欠失変異体もまた含まれる。このような変異体には、上記のＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせが含まれる。
【００６６】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを意味する；それは、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００６７】
本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメントに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントにより、少なくとも１５ｎｔ、そしてより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにもっと好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図され、これらは本明細書で議論したように診断プローブおよびプライマーとして有用である。当然に、
【００６８】
【数１】
2004505619.tif 000002
ヌクレオチド長の大きなフラグメントもまた、本発明に従って、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列あるいは配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列のほとんど（もし全てでなければ）に対応するフラグメントと同様に有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントにより、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列からの２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。
【００６９】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例には、例えば、ヌクレオチド数約
【００７０】
【数２】
2004505619.tif 000003
から配列番号１の最後までの配列、または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡを有するフラグメントが含まれる。この状況において、「約」には、特に列挙した範囲と、いずれかの末端または両方の末端において数ヌクレオチド（５、４、３、２、または１）大きいかもしくは小さい範囲とが含まれる。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。
【００７１】
本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全長ｃＤＮＡを単離するため、および遺伝子に対して高い配列類似性もしくは類似の生物学的活性を有する他のｃＤＮＡを単離するための、ｃＤＮＡライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。この型のプローブは、好ましくは、少なくとも３０塩基を有し、そして例えば、５０以上の塩基を含み得る。プローブはまた、全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン、そして調節領域およびプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロンを含有する完全遺伝子を含むゲノムクローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの例には、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を使用することによって遺伝子のコード領域を単離することが含まれる。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、どのライブラリーのメンバーのプローブがハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用される。
【００７２】
ＶＥＧＦ−２「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１に含まれる配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、または、例えば、ＡＴＣＣ受託番号９７１４９または７５６９８、その相補体に含まれるｃＤＮＡクローンを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、７５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での一晩のインキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣにおける約６５℃でのフィルター洗浄をいう。
【００７３】
低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子がまた意図される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出における変化は、主に、ホルムアミド濃度（ホルムアミドの低パーセントは低ストリンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度を操作することによって達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件には、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ　ＮａＣｌ；０．２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩のインキュベーション；続いて５０℃での１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が含まれる。さらに、さらに低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに続いて行われる洗浄は、より高い塩濃度で行われ得る（例えば、５×ＳＳＣ）。
【００７４】
上記の条件の改変が、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑えるために使用される代替のブロッキング試薬を含ませるか、かつ／またはそれで置換するかにより、達成され得る。代表的なブロッキング試薬には、Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の特許処方物が含まれる。特定のブロッキング試薬を含ませることは、適合性の問題により、上記のハイブリダイゼーション条件を変更することを必要とし得る。
【００７５】
当然、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末端ポリＡ＋領域）、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補ストレッチに対してのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはそれらの相補体を含む任意の核酸分子（例えば、実際の任意の二重鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするので、「ポリヌクレオチド」の定義に含まれない。
【００７６】
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは少なくとも約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。上記および以下でより詳細に議論されるように、これらは、診断的なプローブおよびプライマーとして有用である。
【００７７】
「長さが少なくとも約２０ｎｔ」のポリヌクレオチド部分とは、例えば、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来する２０以上の連続したヌクレオチドを意図する（例えば、寄託されたｃＤＮＡもしくは配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列）。当然、ポリＡ配列（例えば、配列番号１もしくは３に示されるＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡの３Ｎ末端ポリＡ＋領域）、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補ストレッチに対してのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはそれらの相補体を含む任意の核酸分子（例えば、実際には任意の二重鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするので、本発明の核酸の一部分にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
【００７８】
本出願は、ＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらず、配列番号１もしくは３に示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な核酸分子に関する。なぜならこれは、特定の核酸分子がＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者が、この核酸分子の使用方法を依然として理解しているからである（例えば、ハイブリダイゼーションのプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして）。ＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用は、とりわけ以下を含む：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＶＥＧＦ−２遺伝子もしくはそれらの対立遺伝子改変体の単離；（２）ＶＥＧＦ−２遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体展開物へのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および特定の組織におけるＶＥＧＦ−２のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００７９】
しかし、配列番号１もしくは３に示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列（これらは実際に、ＶＥＧＦ−２タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする）に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核酸分子が好ましい。「ＶＥＧＦ−２活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいて、ＶＥＧＦ−２活性を提示するポリペプチドを意図する。例えば、ＶＥＧＦ−２タンパク質活性は、例えば、マイトジェンアッセイおよび内皮細胞遊走アッセイを使用して測定され得る。例えば、Ｏｌｏｆｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：２５７６−２５８１（１９９６）およびＪｏｕｋｏｖら，ＥＭＢＯ　Ｊ．５：２９０−２９８（１９９６）を参照のこと。
【００８０】
当然、遺伝暗号の縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核酸配列または配列番号１もしくは配列番号３に示される核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が、「ＶＥＧＦ−２タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを即座に認識する。事実、これらの核酸配列の縮重改変体は全て同じポリペプチドをコードするので、このことは、上記した比較アッセイを行わなくても当業者にとって明らかである。縮重改変体ではないそのような核酸分子について、合理的な数がまた、ＶＥＧＦ−２タンパク質活性を有するポリぺプチドをコードすることがさらに当業者に認識される。なぜならこれは、当業者が、タンパク質機能に有意に影響を及ぼしそうにないかまたは及ぼさないかのいずれかであるアミノ酸置換を十分に認識しているからである（例えば、脂肪族アミノ酸と第２の脂肪族アミノ酸との置換）。
【００８１】
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をいかにして行うかに関するガイダンスが、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｅｓｓａｇｅ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここでこの筆者らは、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを示している。
【００８２】
従って、本発明は、配列番号２もしくは４のポリペプチド、およびそれらのフラグメント（これらのフラグメントは、少なくとも３０塩基対、好ましくは少なくとも５０塩基対を有する）をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。
【００８３】
配列（ｓｅ）あたりの「同一性」は、当該分野で認識される意味を有し、そして出版された技術を使用して算出され得る（例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＮＡＬ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８８）；ＢＩＯＣＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ　ＡＮＤ　ＧＥＮＯＭＥ　ＰＲＯＪＥＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９３）；ＣＯＭＰＵＴＥＲ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＯＦ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ　Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）；ならびにＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＰＲＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ　Ｓｔｏｃｋｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９１）を参照のこと。）２つのポリヌクレオチド配列間もしくは２つのポリペプチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在する一方で、用語「同一性」は当業者に周知である。（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）。）２つの配列間の同一性もしくは類似性を決定するために通常使用される方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：これらの方法は「Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｈｕｇｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，」Ｍａｒｔｉｎ　Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，（１９９４），ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．および，Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）に開示される。ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを整列するための方法は、コンピュータープログラム内に集成され、これらとしては、以下が挙げられる：ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｃｈ　１２（１）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０），Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ，ユニックス対応バージョン８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｃｈ　Ｐａｒｋ，５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ　５３７１１（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを使用する，Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ　２：４８２−４８９（１９８１））。本発明の参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも、例えば、９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して同一であることを意図する。すなわち、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内の５％までのヌクレオチドが欠失または別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列内の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数が参照配列中に挿入され得る。問い合わせ配列は、配列番号１の全配列、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中に記載されるように特定された任意のフラグメントであり得る。
【００８４】
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵからＴに変換されることによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ　Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ　Ｓｉｚｅ　Ｐｅｎａｌｔｙ　０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ　Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【００８５】
対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。これは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断される対象配列について、問い合わせ配列に対しての同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問い合わせ配列と一致／整列されいていない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。
【００８６】
例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端で最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列は、１００塩基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’に塩基がない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正される。本発明の目的では、他の手動の補正はなされない。
【００８７】
本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドとは、対象ポリぺプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同一であることを意図する。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列におけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列内の１つ以上の近接するグループにおいてのいずれかに散在される。
【００８８】
実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表１に示されるアミノ酸配列に対して、または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを従来的に使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列としても呼ばれる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ　０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ　Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ　Ｓｉｚｅ　＝　配列の長さ、Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ　Ｓｉｚｅ　Ｐｅｎａｌｔｙ　＝　０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ　Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【００８９】
対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末端およびＣ末端で切断される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端側である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側の問い合わせ残基位置のみである。
【００９０】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失は、対象配列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００９１】
（ＶＥＧＦ−２ポリペプチド）
本発明はさらに、図１または図２の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
【００９２】
用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１または図２のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをいう場合は、図３に示すＶＥＧＦタンパク質の保存されたモチーフ、および本質的に同じ生物学的な機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。
【００９３】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２に含まれる短いアミノ酸配列、または寄託したクローンに含まれるｃＤＮＡによりコードされる短いアミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド（このフラグメントが、部分または領域（最も好ましくは単一の連続した領域として）を形成する）内に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸数からなるフラグメントが挙げられる：コード領域の１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、または２８１〜末端。さらに、ポリペプチドフラグメントは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０のアミノ酸の長さであり得る。この文脈において、「おおよそ」とは、いずれかの末端もしくは両方の末端において、特に列挙された範囲より数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな範囲を含む。
【００９４】
好ましいポリペプチドフラグメントとしては、分泌ＶＥＧＦ−２タンパク質およびその成熟形態が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、分泌ＶＥＧＦ−２タンパク質またはアミノ末端およびカルボキシ末端、あるいはその両末端からの連続する一連の欠失した残基を有するその成熟形態が挙げられる。例えば、１〜６０の範囲の多数のアミノ酸が、分泌ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはその成熟形態のいずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、１〜３０の範囲の多数のアミノ酸が、分泌ＶＥＧＦ−２タンパク質または成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上記のアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせが好ましい。同様に、これらのＶＥＧＦ−２ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた好ましい。
【００９５】
構造的ドメインまたは機能的ドメイン（例えば、αヘリックスおよびαヘリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、ならびに高抗原指標領域を含むフラグメント）によって特徴付けられるＶＥＧＦ−２ポリペプチドフラグメントおよびポリヌクレオチドフラグメントもまた好ましい。保存されたドメインの範囲内の配列番号２のポリペプチドフラグメントは、本発明によって特に意図される（図２を参照のこと）。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、意図される。
【００９６】
他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＶＥＧＦ−２フラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの活性と類似であるが、必ずしも同一ではない活性を示すフラグメントである。このフラグメントの生物学的活性としては、所望の活性を改善するか、望ましくない活性を減少させることが挙げられ得る。
【００９７】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００９８】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、そのタンパク質の構造または機能の十分な効果を伴なわないで変化し得ることが当該分野において認識される。配列におけるこのような相違が意図される場合、活性を決定するそのタンパク質上の重要な領域が存在することを記憶しておくべきである。
【００９９】
従って、本発明は、実質的なＶＥＧＦ−２ポリペプチド活性を示すか、または以下に考察するタンパク質部分のようなＶＥＧＦ−２タンパク質の領域を含むＶＥＧＦ−２ポリペプチドの改変体をさらに含む。このような変異体としては、欠失、挿入、反転、反復、および型置換が挙げられる。上で示したように、表現型的にサイレントであると思われるアミノ酸変化に関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ、Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｅｓｓａｇｅ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に見出され得る。
【０１００】
従って、図１または図２のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）と置換されるもの（このような置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい）、または（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリぺプチドが別の化合物（例えば、ポリぺプチドの半減期を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合されるもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるもの（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチド配列もしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列）、または（ｖ）そこで配列番号２または４に示すより少ないアミノ酸残基を含み、そして保存されたモチーフを保持し、そしてなお依然としてＶＥＧＦファミリーのポリペプチドに特徴的な活性を保持しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
【０１０１】
特に重要な関心は、荷電されたアミノ酸の、別の荷電されたアミノ酸および中性または負に荷電されたアミノ酸との置換である。後者は、減少された正電荷を有するタンパク質を生じ、ＶＥＧＦ−２タンパク質の特性を改善する。凝集の防止が非常に所望される。薬学的処方物が調製される場合、タンパク質の凝集は、活性の減少を生じるだけでなく、不確かであり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であるからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　１０：３０７−３７７（１９９３））。
【０１０２】
アミノ酸置換もまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３６１：２６６−２６８（１９９３）は、特定の変異がＴＮＦレセプターの２つの公知の型のうちの１つのみへのＴＮＦ−αの選択的結合を生じることを記載する。従って、本発明のＶＥＧＦ−２は、天然の変異または人為的操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【０１０３】
示されるように、荷電は、タンパク質のフォールディングまたは活性に顕著な影響を与えない、保存的アミノ酸置換のようなわずかな性質であることが好ましい（表１を参照のこと）。
【０１０４】
【表１】
2004505619.tif 000004
もちろん、当業者が多くの因子に依存して作成するアミノ酸置換の数は、上記のものを含む。一般には、任意の所定のＶＥＧＦ−２ポリペプチドについての置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５または３以下である。
【０１０５】
機能に不可欠な本発明のＶＥＧＦ−２タンパク質におけるアミノ酸は、当該分野において公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャンニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０８１−１０８５（１９８９））によって同定され得る。後者の手順は、単一のアラニン変異を分子内のいずれもの残基に誘導する。次いで、得られた変異分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合またはインビトロもしくはインビボでの増殖活性）について試験される。リガンド−レセプター結合に不可欠な部位はまた、構造的分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識）によって決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ　Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０１０６】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは、均一に精製される。
【０１０７】
用語「単離される（された）」は、その物質が最初の環境（例えば、天然に存在する場合はその天然の環境）から除かれることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されないが、天然の系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離された同一のポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離される。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得る。そしてこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないので、さらに単離される。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂ以下の長さである。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦ−２コード配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むが、任意のＶＥＧＦ−２イントロンの全てまたは一部を含まない。別の実施形態において、ＶＥＧＦ−２コード配列を含む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノム中のＶＥＧＦ−２遺伝子の５’または３’）のコード配列を含まない。
【０１０９】
本発明のポリペプチドは、配列番号２および４のポリペプチド（特に、その成熟ポリペプチド）、および配列番号２および４のポリペプチドに少なくとも７０％類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）を有するポリペプチド、およびより好ましくは、配列番号２および４のポリペプチドに少なくとも９０％類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチド、およびさらにより好ましくは配列番号２および４のポリペプチドに少なくとも９５％類似性（なおさらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そして少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を一般に含むポリペプチドのこのような部分を有するこのようなポリペプチドの部分もまた含む。
【０１１０】
当該分野で公知のように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換と第２のポリペプチドの配列との比較によって決定される。
【０１１１】
本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって対応する全長ポリペプチドを作製するために使用され得る；従って、フラグメントは、全長ポリペプチドを作製するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。
【０１１２】
本発明のポリペプチドは、以下を含む：リーダーを含む寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド；リーダーを含まない寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列番号２のアミノ酸およそ−２３〜およそ３９６を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸およそ−２２〜およそ３９６を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸およそ１〜およそ３９６を含むポリペプチド；ならびに、上記のポリペプチドに対して少なくとも９５％同一、およびより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一である、ポリペプチド。そして、本発明のポリペプチドは、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部もまた含む。
【０１１３】
（融合タンパク質）
任意のＶＥＧＦ−２ポリペプチドを用いて、融合タンパク質を作製し得る。例えば、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、第２のタンパク質に融合された場合、抗原性タグとして用いられ得る。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに対して惹起された抗体を用いて、ＶＥＧＦ−２に結合することによって、第２のタンパク質を間接的に検出し得る。さらに、分泌タンパク質は、輸送シグナルに基づいて細胞位置を標的化するので、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、一旦、他のタンパク質に融合されると、標的化分子として用いられ得る。
【０１１４】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列だけでなく、他の異種の機能的領域もまた含む。融合体は、直接的であることをかならずしも必要としないが、リンカー配列を通して得られ得る。
【０１１５】
さらに、融合タンパク質はまた、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの特徴を改善するために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸（特に荷電したアミノ酸）の領域は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＮ末端に対して添加されて、宿主細胞からの精製の間またはその後の取り扱いおよび保存の間の安定性および持続性を改善し得る。また、ペプチド部分は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに付加されて、精製を容易にし得る。このような領域は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの最終的な調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするペプチド部分の付加は、当該分野で精通でありかつ慣用的な技術である。
【０１１６】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチド（フラグメントおよび特にエピトープを含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と合わされて、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そしてインビボで増大した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する（ＥＰ　Ａ　３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド結合された二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する融合タンパク質はまた、他の分子に結合しそしてこの分子を中和する際に、モノマー分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１１７】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ　４６４　５３３（カナダ国対応２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質におけるＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改善された薬物動態学的特性をもたらし得る（ＥＰ−Ａ　０２３２　２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後にＦｃ部分を欠失することが所望される。例えば、Ｆｃ部分は、融合タンパク質が免疫のための抗原として用いられる場合、治療および診断を妨害し得る。薬物の探索では、例えば、ヒトタンパク質（例えば、ｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定する、高スループットスクリーニングアッセイを目的として、Ｆｃ部分と融合された（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０１１８】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、マーカー配列（例えば、ＶＥＧＦ−２の精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９　Ｅｔｏｎ　Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７（１９８４））。
【０１１９】
従って、これら上記の融合物のうちのいずれかは、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドを使用して操作され得る。
【０１２０】
（ＶＥＧＦ−２の生物学的活性）
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドをアッセイに使用して、１つ以上の生物学的活性について試験し得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドが特定のアッセイにおいて活性を示す場合、ＶＥＧＦ−２はその生物学的活性に関連した疾患に関与し得るようである。従って、ＶＥＧＦ−２を使用して、関連した疾患を処置し得る。
【０１２１】
（免疫活性）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することにより、免疫系の欠損または障害の処置において有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発生し、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）ならびにリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫の欠損または障害の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌またはいくつかの自己免疫障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であり得る。さらに、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０１２２】
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、造血細胞の欠損または障害の処置または検出において有用であり得る。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドは、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した障害を処置する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。免疫学的欠損症候群の例としては、血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドをまた使用して、止血性活性（出血を止めること）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活性を増大にすることにより、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドを使用して、血液凝固障害（例えば、無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板障害（例えば、血小板減少症）、または外傷、手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得るＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドを使用して、凝血を阻害または溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、発作または瘢痕の処置において、重要であり得る。
【０１２４】
自己免疫障害の処置または検出において、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドはまた、有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、自己を外来性物質として不適切に認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊をもたらす免疫応答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害し得るＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドの投与は、自己免疫障害の防止において効果的な治療であり得る。
【０１２５】
ＶＥＧＦ−２によって処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑病、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
同様に、ぜん息（特にアレルギー性ぜん息）または他の呼吸の問題のような、アレルギー反応およびアレルギー状態もまた、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドにより処置され得る。さらに、ＶＥＧＦ−２を使用して、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症または血液型不適合性を処置し得る。
【０１２７】
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドをまた使用して、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置および／または予防し得る。器官拒絶は、免疫応答を介する移植組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた関与しているが、この場合、外来性の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤの予防において効果的な治療であり得る。同様に、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドをもまた使用して、炎症を調節し得る。例えば、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドは、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子を使用して、感染に関連する炎症（例えば、敗血症ショック、敗血症、もしくは全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、関節炎に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病に関連する炎症、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症を含む、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を処置し得る。
【０１２８】
（過増殖性障害）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドを使用して、新生物を含む過増殖性障害を処置または検出し得る。ＶＥＧＦ−２アンタゴニストポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２アンタゴニストポリヌクレオチドは、直接的または間接的な相互作用を介してこの障害の増殖を阻害し得る。あるいは、ＶＥＧＦ−２アンタゴニストポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２アンタゴニストポリヌクレオチドは、過増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖させ得る。
【０１２９】
例えば、免疫応答を増大させること、特に過増殖性障害の抗原性の質を増大させることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、過増殖性障害を処置し得る。既存の免疫応答を増強するか、または新たな免疫応答を開始するかのいずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは、免疫応答を減少させることもまた、化学療法剤のような、過増殖性障害を処置する方法であり得る。
【０１３０】
ＶＥＧＦ−２アンタゴニストポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２アンタゴニストポリペプチドによって処置または検出され得る過増殖性障害の例としては、腹部、骨、胸、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸郭、ならびに泌尿生殖器に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
同様に、他の過増殖性障害もまた、ＶＥＧＦ−２アンタゴニストポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２アンタゴニストポリペプチドにより処置または検出され得る。このような過増殖性障害の例としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖障害、パラプロテイン血症、紫斑病、類肉腫症、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過増殖疾患、さらに上記に収載されている器官系に位置している新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
（感染性疾患）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドは、感染因子を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０１３３】
ウイルスは、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはＶＥＧＦ−２ポリペプチドにより処置または検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡウイルス科およびＲＮＡウイルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置または検出され得る。
【０１３４】
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドによって処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、ＳｙｐｈｉｌｉｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または検出し得る。
【０１３５】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置または検出し得る。
【０１３６】
好ましくは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用する処置は、患者に有効量のＶＥＧＦ−２ポリペプチドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０１３７】
（再生）
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。
【０１３８】
本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、血管系（血管内皮を含む）、リンパ（リンパ内皮を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０１３９】
さらに、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本発明の、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
【０１４０】
同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるためにＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて処置され得る。
【０１４１】
（走化性）
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および／または治癒し得る。
【０１４２】
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。走化性分子としてのＶＥＧＦ−２はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る。
【０１４３】
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性のインヒビターとして使用され得る。
【０１４４】
（結合活性）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドに結合する分子、またはＶＥＧＦ−２ポリペプチドが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。ＶＥＧＦ−２とこの分子との結合は、結合したＶＥＧＦ−２または分子の活性を活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または低分子が挙げられる。
【０１４５】
好ましくは、この分子は、ＶＥＧＦ−２の天然のリガンド（例えば、リガンドのフラグメント）、もしくは天然の物質、リガンド、構造的模倣物、または機能的模倣物に密接に関係する。（Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１（２）：第５章（１９９１）を参照のこと）。同様に、この分子は、ＶＥＧＦ−２が結合する天然のレセプター（すなわち、Ｆｌｔ−４）、少なくとも、ＶＥＧＦ−２によって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、活性部位）に密接に関係する。いずれかの場合において、この分子は、公知の技術を使用して合理的に設計され得る。好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ＶＥＧＦ−４を、分泌タンパク質としてかまたは細胞膜上にかのいずれかに発現する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、ＶＥＧＦ−４を発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜）を、好ましくは、ＶＥＧＦ−４またはこの分子のいずれかの結合、活性の刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化合物と接触させる。
【０１４６】
アッセイは、ＶＥＧＦ−２への候補化合物の結合を単純に試験し得、ここで結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がＶＥＧＦ−２への結合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０１４７】
あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。アッセイはまた、候補化合物を、ＶＥＧＦ−２を含む溶液と混合する工程、ＶＥＧＦ−２／分子の活性または結合を測定する工程、およびＶＥＧＦ−２／分子の活性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
【０１４８】
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるＶＥＧＦ−２のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ＶＥＧＦ−２への直接的もしくは間接的のいずれかの結合、または基質についてのＶＥＧＦ−２との競合によって、ＶＥＧＦ−２のレベルまたは活性を測定し得る。
【０１４９】
これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使用され得る。これらのアッセイを使用して発見された分子を使用して、ＶＥＧＦ−２／分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置し得るか、または患者に特定の結果をもたらし得る（例えば、血管成長）。さらに、これらのアッセイは、適切に操作された細胞または組織由来のＶＥＧＦ−２の産生を阻害または増強し得る薬剤を発見し得る。
【０１５０】
従って、本発明は、以下の工程を含むＶＥＧＦ−２に結合する化合物を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物をＶＥＧＦ−２とともにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化合物をＶＥＧＦ−２とともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）ＶＥＧＦ−２の生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
【０１５１】
（他の活性）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、先に議論されるように、造血系統に加えて胚性幹細胞の分化または増殖を増加または減少し得る。
【０１５２】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するために使用され得る。同様に、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
【０１５３】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
【０１５４】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。
【０１５５】
（ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生）
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、および組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなべクターおよび宿主細胞を作製するための方法および組換え技術によるＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはペプチドの産生のためにそれらを使用する方法に関する。
【０１５６】
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る、本発明のベクターを用いて遺伝的操作される（形質導入されるか、形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。このベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するために、形質転換体を選択するために、または本発明のＶＥＧＦ−２遺伝子を増幅するために、適切であるように改変された従来の栄養培地において培養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用された条件であり、当業者に明らかである。
【０１５７】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを生成するために使用され得る。従って、例えば、ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターの任意の１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体の、非染色体の、および合成のＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、痘疹、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病））を含む。しかし、任意の他のプラスミドまたはベクターは、それが宿主において複製可能であり、そして生存可能である限り、使用され得る。
【０１５８】
適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベクター中に挿入され得る。一般的に、ＤＮＡ配列は、当該分野において公知の手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他のものは、当業者の範囲内であると見なされる。
【０１５９】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を指向する適切な発現制御配列（プロモーター）と作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表的な例として、以下が挙げられ得る：ＬＴＲのプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλＰＬプロモーター、および原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳の開始のためのリボゾーム結合部位、および転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、発現を増幅するために適切な配列を含み得る。
【０１６０】
さらに、発現ベクターは、好ましくは１つ以上の選択マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供する。このようなマーカーは、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはネオマイシン耐性、あるいはＥ．ｃｏｌｉおよびタンパク質の細菌に培養するためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を含む。
【０１６１】
上記のような適切なＤＮＡ配列を含むベクターおよび適切なプロモーターまたは制御配列は、宿主がタンパク質を発現することを可能にするために適切な宿主を形質転換するために使用され得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられるが、これらの限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、またはＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
【０１６２】
より詳細には、本発明はまた、上に広範に記載されるように一つ以上の配列を含む組換え構築物を含む。この構築物は、正方向または逆方向で、本発明の配列が挿入されたベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含む。この実施形態の好ましい局面において、この構築物は、例えば、この配列と作動可能に連結されたプロモーターを含む調節配列をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、そして市販されている。以下のベクターが、例示のために提供される。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。好ましい真核生物ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）である。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１６３】
本発明の実施における発現べクターの使用に加えて、本発明はさらに、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結連結されたオペレーターおよびプロモーターエレメントを含む新規な発現ベクターを含む。このようなベクターに１つの例は、以下に詳細に記載されるｐＨＥ４ａである。
【０１６４】
図２８および２９に要約されるように、ｐＨＥ４ａベクター（配列番号１６）の成分は、以下を含む：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．Ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列、６）ラクトースオペロンレプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）および７）マルチクローニング部位リンカー領域。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から誘導される。プロモーター配列およびオペレーター配列は合成的に作製された。核酸配列の合成的生成は、当該分野で周知である。ＣＬＯＮＴＥＣＨ　９５／９６カタログ、２１５−２１６頁ＣＬＯＮＴＥＣＨ，１０２０　Ｅａｓｔ　Ｍｅａｄｏｗ　Ｃｉｒｃｌｅ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ　９４３０３。ｐＨＥ４ａベクターは、１９９８年２月２５日にＡＴＣＣに寄託され、登録番号２０９６４５を与えられた。
【０１６５】
ＶＥＧＦ−２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、このベクターをＨｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩまたはＡｓｐ７１８のいずれかで制限処理し、そしてより大きいフラグメント（マルチプルクローニング部位領域が約３１０ヌクレオチドである）をゲル上に単離することによって、ｐＨＥ４ａのプロモーターおよびオペレーターに作動可能に連結される。適切な制限部位を有するＶＥＧＦ−２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）が、例えば、ＮｄｅＩ（５’プライマーとして）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩまたはＡｓｐ７１８のいずれか（３’プライマーとして）についての制限部位を有するＰＣＲプライマーを使用して、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルに従って、生成される。ＰＣＲ挿入物は、生成されたゲルであり、そして適合性の酵素で制限処理される。挿入物およびベクターは、標準的なプロトコルに従って連結される。
【０１６６】
上記のように、ｐＨＥ４ａベクターは、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む。ＬａｃＩｑは、ｌａｃオペレーターの緊密な調節を与えるｌａｃＩ遺伝子の対立遺伝子である。Ａｍａｎｎ，Ｅ．ら，Ｇｅｎｅ　６９：３０１−３１５（１９８８）；Ｓｔａｒｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ　５１：２５５−２６７（１９８７）。ｌａｃＩｑ遺伝子は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、そして下流（すなわち、３’）配列の転写をブロックするレプレッサータンパク質をコードする。しかし、ｌａｃＩｑ遺伝子産物は、ラクトースまたは特定のラクトースアナログ（例えば、イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））のいずれかの存在下で、ｌａｃオペレーターから解離する。従って、ＶＥＧＦ−２は、ｐＨＥ４ａベクターを含む誘導されていない宿主細胞にかなりの量で生成されない。しかし、ＩＰＴＧのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、ＶＥＧＦ−２コード配列の発現を生じる。
【０１６７】
ｐＨＥ４ａベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号１７）は、Ｔ５ファージプロモーターおよび２つのｌａｃプロモーター配列を含む。一方のオペレーターは、転写開始部位に対して５’に配置され、そして他方は、同じ部位に対して３’に配置される。これらのオペレーターは、ｌａｃＩｑ遺伝子産物と組合せて存在する場合、ｌａｃオペロンインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ）の非存在下で、下流配列の厳しい抑制を与える。ｌａｃオペレーターから下流に配置された作動可能に連結された配列の発現は、ｌａｃオペロンインデューサー（例えば、ＩＰＴＣ）の添加によって誘導され得る。ｌａｃＩｑタンパク質へのｌａｃインデューサーの結合は、ｌａｃオペレーター配列からのそれらの放出および作動可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のＬａｃオペロン調節は、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｗｉｔｈ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ，第４版（１９９７），８０２−８０７頁に総説されている。
【０１６８】
ｐＨＥ４ａシリーズのベクターは、ＶＥＧＦ−２コード配列を除くｐＨＥ４ａベクターの成分の全てを含む。ｐＨＥ４ａベクターの特徴は、最適化された合成Ｔ５ファージプロモーター、ｌａｃオペレーター、およびＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌａｇａｒｎｏ配列を含む。さらに、これらの配列はまた、最適に間隔を空けられ、その結果、挿入された遺伝子の発現が緊密に調節され、そして高レベルの発現が誘導の際に起こる。
【０１６９】
本発明のタンパク質の産生における使用のための適した既知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ．ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターが挙げられる。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ全初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【０１７０】
ｐＨＥ４ａベクターはまた、ＡＵＧ開始コドンに対して５’方向にＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇｒａｎｏ配列を含む。ｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇｒａｎｏ配列は、ＡＵＧ開始コドンから上流（すなわち、５’）に約１０ヌクレオチドの一般に配置された短い配列である。これらの配列は、本質的に、原核生物リボソームをＡＵＧ開始コドンに指向させる。
【０１７１】
従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の生成のために有用な発現ベクターに関する。本発明のこの局面は、ｐＨＥ４ａベクター（配列番号１６）によって例示される。
【０１７２】
プロモーター領域は、選択マーカーを有するＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特定の名づけられた細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λ　ＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐが含まれる。真核生物プロモーターは、以下を含む：ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当該分野の通常のレベル内である。
【０１７３】
さらなる実施形態において、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法により達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【０１７４】
宿主細胞中のこの構築物を従来の様式で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。
【０１７５】
成熟タンパク質が、適切なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現され得る。細胞を含まない翻訳系もまた利用して、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を産生し得る。原核生物宿主および真核生物宿主で用いる適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【０１７６】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入により増加される。エンハンサーは、その転写を増加するためにプロモーター上で作用する、通常、約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのｃｉｓ作用性のエレメントである。例としては、複製起点の後側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１７７】
一般的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＴＲＰ１遺伝子）ならびに下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは、例えば、とりわけ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質のような糖分解酵素をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳の開始配列および終結配列、および好ましくは細胞周辺腔または細胞外の培地中への翻訳されたタンパク質の分泌を指向し得るリーダー配列と適切な段階で構築される。必要に応じて、異種配列は、所望の特性（例えば、安定化、または発現された組換え産物の精製の単純化）を与えるＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【０１７８】
細菌を使用するための有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターを用いて読むことが可能な段階（ｏｐｅｒａｂｌｅ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｐｈａｓｅ）において適切な翻訳の開始および終結のシグナルとともに所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。ベクターは、一つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの保持を保証し、そして必要であれば、宿主中での増幅を提供する複製起点を含む。形質転換に適切な真核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種々の種が含まれるが、選択のために他の宿主もまた利用され得る。
【０１７９】
限定することなく、代表的な例として、細菌を使用するための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的エレメントを含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２の「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」部分は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わされる。
【０１８０】
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度に対する宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘発）によって抑制解除され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【０１８１】
細胞は、代表的に、遠心分離によって回収され、物理的または化学的手段によって破壊され、そして生じた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
【０１８２】
タンパク質の発現に使用された微生物の細胞は、当業者に周知の任意の簡便な方法（凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）によって破壊され得る。
【０１８３】
種々の哺乳動物細胞培養系はまた、組換えタンパク質を発現するためにも使用され得る。哺乳動物発現系の例としては、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ　２３：１７５（１９８１）によって記載される）、および適合性ベクターの発現が可能な、他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、そしてまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナー部位およびスプライシングアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノム（例えば、ＳＶ４０起源、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位）由来のＤＮＡ配列は、必要とされる非転写遺伝的エレメントを与えるために使用され得る。
【０１８４】
本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次宿主細胞、二次宿主細胞、および不死化宿主細胞を包含する。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ＶＥＧＦ−２ド配列）を欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明のＶＥＧＦ−２配列と作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種プロモーター）を含むように操作されており、そして内因性ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドを活性化、改変、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術が、相同組換えを介して、異種制御領域および内因性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＶＥＧＦ−２をコードする配列）を作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ　９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ　９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これら各々の開示は、それら全体が参考として援用される）。
【０１８５】
宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）、または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。挿入された遺伝子配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセスする宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定のインデューサーの存在下で上昇され得る；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現は制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、特徴的かつ特異的な、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび改変（例えば、グリコシル化、リン酸化、切断）の機構を有する。発現されるタンパク質の所望の変更およびプロセシングを保証するために、適切な細胞株が選択され得る。
【０１８６】
このポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈澱、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む従来用いられる方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。精製の間に、存在する低濃度（約０．１〜５μＭ）のカルシウムイオンを有することが好ましい（Ｐｒｉｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：９１７（１９６９））。成熟タンパク質の構成の完了の際に、タンパク質リフォールディング工程が必要に応じて利用され得る。最後に、最終精製工程のために高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が使用され得る。
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物であり得るか、または化学合成手順の産物であり得るか、または原核生物もしくは真核生物の宿主から（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞から）組換え技術によって産生され得る。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、哺乳動物または他の真核生物炭水化物でグリコシル化されても、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【０１８７】
さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ　３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのＶＥＧＦ−２ポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、および一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）であってもまたはＬ（左旋性）であってよい。
【０１８８】
本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変されるＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含む。多数の化学的改変のうちのいずれかが、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など。
【０１８９】
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質の検出および単離を可能にし得る。
【０１９０】
本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、ＶＥＧＦ−２の化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。
【０１９１】
このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。
【０１９２】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ　０　４０１　３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基をにより共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。
【０１９３】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタンパク質（またはペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１９４】
本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発明は、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドのモノマーおよびマルチマー、それらの調製およびそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーである。
【０１９５】
本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチド（本明細書中に記載されるＶＥＧＦ−２のフラグメント、改変体、スプライス改変体、および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含む）またはホモトリマー（例えば、同一および／または異なるアミノ酸配列を有するＶＥＧＦ−２ポリペプチドを含む）である。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマー、または少なくともホモテトラマーである。
【０１９６】
本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドに加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０１９７】
本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合性の結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間接的に連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホモダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に、形成される。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドとの、および／または本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号２に記載されるか、または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ＶＥＧＦ−２融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれる、１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＶＥＧＦ−２−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／レセプターメンバー（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（例えば、国際公開第ＷＯ　９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある。
【０１９８】
本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて、化学的に架橋され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間の、１以上の分子間架橋を形成し得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために、適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれることが所望される、ポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために、適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９９】
あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチドは、本明細書中に記載されるか、さもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、本明細書中に記載されるか、さもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ドメイン（または疎水性ペプチドもしくはシグナルペプチド）を含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０２００】
（治療的用途）
本発明のＶＥＧＦ−２タンパク質は、脈管およびリンパ管内皮細胞についての強力なマイトジェンである。図１２および１３に示されるように、最初の４６個のアミノ酸を引いた配列番号２のＶＥＧＦ−２は、脈管内皮細胞の強力なマイトジェンであり、そしてその成長および増殖を刺激する。このポリペプチドをコードするＶＥＧＦ−２核酸配列について行われたノーザンブロット分析の結果（ここで、いくつかのヒト組織由来のＲＮＡ２０ｍｇは、３２Ｐ−ＶＥＧＦ−２で調査された）は、このタンパク質が、心臓および肺において活性に発現されることを示し、これはマイトジェン活性のさらなる証拠である。
【０２０１】
従って、ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分を使用して、脈管形成を促進することにより脈管の外傷を処置し得る。例えば、冠状動脈バイパス手術が行われた場合に、移植された組織の増殖を刺激するため。創傷治癒を促進するため、特に、損傷組織を脈管再生するためまたは虚血の間および新たな毛細管形成が所望される場合に側副枝の血流を刺激するために、ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分がやはり使用され得る。かなり厚みのある（ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷（例えば、褥瘡、静脈性潰瘍、および糖尿病性潰瘍を含む皮膚潰瘍）を処置するために、ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分が使用され得る。さらに、ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分を使用して、かなり厚みのある火傷および傷害が処置され得、ここでは、皮膚移植片または組織弁を使用して、このような火傷および傷害が修復される。ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分はまた、形成外科における使用のために（例えば、裂傷、火傷、または他の外傷の修復のために）使用され得る。さらにＶＥＧＦ−２を使用して、眼に対する創傷および傷害の治癒を促進し得、そして眼の疾患を処置し得る。
【０２０２】
これらの同じ系に沿って、ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をやはり使用して、損傷した骨組織、歯周組織または靱帯組織の増殖を誘導し得る。ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分はまた、例えば、歯周病または外傷により損傷した歯の支持組織（セメント質および歯周靱帯を含む）を再生するために使用され得る。
【０２０３】
新脈管形成は、創傷を清潔かつ感染しないように維持することにおいて重要であるので、ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分は、手術と関連づけて、ならびに切開および切断の修復後に使用され得る。ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分はまた、感染の危険性が高い腹部創傷を処置するために使用され得る。
【０２０４】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分は、脈管移植手術における内皮化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）促進のために使用され得る。移植材料または合成材料のいずれかを用いる脈管移植片の場合には、ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分は、移植片の表面に、または接合部に適用されて、脈管内皮細胞の増殖を促進し得る。ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をやはり使用して、心筋梗塞の結果として生じた心筋組織の損傷を修復し得る。ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をやはり使用して、虚血後の心血管系を修復し得る。ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をやはり使用して、冠動脈疾患ならびに末梢脈管疾患およびＣＮＳ脈管疾患の結果として損傷した脈管組織を処置し得る。
【０２０５】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をやはり使用して、体内に移植される人工プロテーゼまたは天然の器官をコーティングして、移植材料の拒絶を最小化し、そして移植された材料の脈管形成を刺激し得る。
【０２０６】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分はまた、例えば、アテローム硬化症の間に生じる外傷からもたらされる傷害の脈管組織修復のために使用され得、そして脈管組織が損傷されるバルーン血管形成術後に必要とされ得る。
【０２０７】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をやはり使用して、末梢動脈疾患を処置し得る。従って、さらなる局面において、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを利用して、末梢動脈疾患を処置するためのプロセスが提供される。好ましくは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、末梢動脈疾患を緩和または処置する目的で、個体に投与される。適切な用量、処方、および投与経路は、以下に記載される。
【０２０８】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をまた使用して、リンパ組織およびリンパ管の内皮機能（例えば、リンパ管の損失、リンパ管の閉塞およびリンパ管腫を処置するために）を促進し得る。ＶＥＧＦ−２をまた使用して、リンパ球産生を刺激し得る。
【０２０９】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をまた使用して、新生児における血管腫を処置し得る。従って、さらなる局面において、新生児において血管腫を処置するためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドを利用するためのプロセスが提供される。好ましくは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、新生児における血管腫を軽減または処置するために個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は以下に記載される。
【０２１０】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をまた使用して、未成熟な新生児における異常な網膜の発達を予防または処置し得る。従って、さらなる局面において、未成熟な新生児における異常な網膜の発達を処置するためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドを利用するためのプロセスを提供する。好ましくは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、未成熟な新生児における異常な網膜の発達を軽減または処置するために個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は以下に記載される。
【０２１１】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をまた使用して、ミルロイ病および早発性リンパ水腫を含む原発性（特発性）リンパ水腫を処置し得る。従って、さらなる局面において、ミルロイ病および早発性リンパ水腫を含む原発性（特発性）リンパ水腫を処置するためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドを使用するためのプロセスを提供する。好ましくは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、ミルロイ病および早発性リンパ水腫を含む原発性（特発性）リンパ水腫を軽減または処置するために個体に投与される。ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をまた使用して、動物において、水腫を処置し得、そして血圧に作用し得る。適切な用量、処方物および投与経路は以下に記載される。
【０２１２】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分をまた使用して、（Ｉ）リンパ節およびリンパ管の除去、（ｉｉ）癌の処置における放射線療法および手術、ならびに（ｉｉｉ）外傷および感染から生じる寿命（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を含む２次的な（閉鎖性の）寿命を処置し得る。従って、さらなる局面において、（Ｉ）リンパ節およびリンパ管の除去、（ｉｉ）癌の処置における放射線療法および手術、ならびに（ｉｉｉ）外傷および感染から生じる寿命（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を含む２次的な（閉鎖性の）寿命を処置するためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドを使用するためのプロセスを提供する。好ましくは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、（Ｉ）リンパ節およびリンパ管の除去、（ｉｉ）癌の処置における放射線療法および手術、ならびに（ｉｉｉ）外傷および感染から生じる寿命（ｌｉｆｅｔｉｍｅ）を含む２次的な（閉鎖性の）寿命のために個体に投与される。適切な用量、処方物および投与経路は以下に記載される。
【０２１３】
ＶＥＧＦ−２またはその生物学的に活性な部分はまた、カポージ肉腫を処置するために使用され得る。従って、さらなる局面において、カポージ肉腫を処置するためにＶＥＧＦ−２ポリペプチドを利用するプロセスが提供される。好ましくは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、カポージ肉腫を軽減または処置する目的で個体に投与される。適切な用量、処方、および投与経路は以下に記載される。
【０２１４】
ＶＥＧＦ−２アンタゴニストは、癌および腫瘍増殖を支持するために必要とされる新脈管形成を阻害することによって癌を処置するために使用され得る。
【０２１５】
（心臓血管障害）
本発明者らは、ＶＥＧＦ−２が、血管内皮細胞の成長を刺激すること、内皮細胞移動を刺激すること、ＣＡＭアッセイにおいて新脈管形成を刺激すること、自発性高血圧ラットにおいて血圧を低減すること、およびウサギにおいて虚血性四肢への血流を増加することを示した。従って、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドは、末梢動脈疾患を含む心臓血管障害（例えば、四肢虚血）を処置するために使用され得る。
【０２１６】
心臓血管障害としては、動脈（ａｒｔｅｒｉｏ）−動脈フィステル、動静脈フィステル、大脳動静脈先天異常、先天性心臓欠陥、肺閉鎖、およびシミター症候群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心臓欠陥としては、大動脈縮窄、三房心、冠動脈管異常、交差心、右胸心、動脈管、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心臓中隔欠損（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室心臓中隔欠損）が挙げられる。
【０２１７】
心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓疾患、高心拍出量、低心拍出量、心臓タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓性水腫、心臓肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞形成後心臓裂傷、心室中隔裂傷、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、肺性心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症、シミター症候群、心臓血管梅毒、および心臓血管結核のような心臓疾患が挙げられる。
【０２１８】
不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群、ウォルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻脈、および心室性細動が挙げられる。頻脈としては、発作性頻脈、上室性頻脈、加速性心室固有調律、房室結節性リエントリー頻脈、異所性心房性頻脈、異所性接合部性頻脈、洞房結節リエントリー頻脈、洞性頻脈、トルサード　ド　ポワント、および心室性頻脈が挙げられる。
【０２１９】
心臓弁疾患としては、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、心臓雑音、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁不全、僧帽弁狭窄、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁不全、肺動脈弁狭窄、三尖弁閉鎖症、三尖弁不全、および三尖弁狭窄が挙げられる。
【０２２０】
心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大性心筋症、大動脈弁下部性狭搾症、肺動脈弁下部性狭窄症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、および心筋炎が挙げられる。
【０２２１】
心筋虚血としては、狭心症、冠動脈動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｓｔｕｎｎｉｎｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０２２２】
心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ疾患、クリペル−トルノネ−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈外膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、皮膚紅痛症、痔核、肝性静脈閉塞（ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ）疾患、高血圧症、低血圧症、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺性静脈閉塞疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細管拡張症運動失調症（ａｔａｃｉａ　ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈不全のような血管疾患が挙げられる。
【０２２３】
動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽性動脈瘤、感染性動脈瘤、破裂性大動脈瘤、大動脈動脈瘤、大脳動脈瘤、冠状動脈動脈瘤、心臓動脈瘤、および腸骨動脈瘤が挙げられる。
【０２２４】
動脈性閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄、線維筋性形成異常、腸間膜血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０２２５】
脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、大脳塞栓症および大脳血栓症、頸動脈血栓症、洞性血栓症、ヴァレンベルク症候群、脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血、脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、脳室周囲白質軟化症、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および脊椎脳底不全が挙げられる。
【０２２６】
塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症（ｔｈｒｏｍｏｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ）が挙げられる。血栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、洞性血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０２２７】
虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群、前方仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流障害、および末梢四肢虚血が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ−ストラウス症候群、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘノッホ紫斑病、アレルギー性皮膚血管炎、およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０２２８】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、重篤な四肢虚血、および冠動脈疾患の処置のために特に有効である。実施例１８に示されるように、実験的に誘導した虚血ウサギの後肢へＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを投与することは、血圧比率、血流、血管造影的スコア、および毛細管密度を回復した。
【０２２９】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、当該分野で公知の任意の方法（送達部位での直接的針注射、静脈内注射、局所的投与、カテーテル注入、微粒子銃注射器、粒子加速器、ゲルフォームスポンジ蓄積（ｇｅｌｆｏａｍ　ｓｐｏｎｇｅ　ｄｅｐｏｔ）、他の市販の蓄積物質、浸透圧ポンプ、経口用または座薬用（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｉａｌ）固形薬学的処方物、外科的手術の間のデカントによる（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）適用または局所的適用、エーロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して投与され得る。このような方法は、当該分野において公知である。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、以下に詳細に記載されるように、薬学的組成物の一部として投与され得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドの送達方法は、以下により詳細に記載される。
【０２３０】
（遺伝子治療方法）
本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置するための遺伝子治療方法に対する。遺伝子治療方法は、動物内へ核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を導入して、本発明のＶＥＧＦ−２ポリペプチドの発現を達成することに関する。本方法は、プロモーター、および標的組織によるポリペプチドの発現のために必要とされる任意の他の遺伝的エレメントに作動可能に連結された、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。そのような遺伝子治療および送達技術は、当該分野において公知である。例えば、ＷＯ９０／１１０９２（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０２３１】
従って、例えば、患者由来の細胞を、エキソビボでＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作し得、次いでこの操作された細胞が、このポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。そのような方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１５３：４６０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：３１−３８（１９９６）（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、操作された細胞は、動脈の細胞である。動脈の細胞は、動脈、動脈周辺の組織への直接注射によって、またはカテーテル注入によって、患者に再導入され得る。
【０２３２】
以下でより詳細に議論されるように、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、動物の細胞へ注射可能な物質を送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間隙空間内への注射）によって送達され得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０２３３】
１つの実施形態において、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞内への侵入を補助、促進、または亢進するように作用する任意の送達ビヒクル（ウイルス配列処方物、ウイルス粒子処方物、リポソーム処方物、リポフェクション剤または沈降剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などを含む）を含まない配列をいう。しかし、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドはまた、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクション処方物などは、当業者に周知の方法によって調製され得る。そのような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号（これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０２３４】
遺伝子治療方法において使用されるＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組み込まれず、また複製を可能にする配列を含まない構築物である。適切なベクターとしては、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）；ならびにｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１およびｐＲｃ／ＣＭＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ならびにＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドを含むベクターであるｐＶＧＩ．１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１８５として寄託）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０２３５】
当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＶＥＧＦ−２　ＤＮＡの発現を駆動するために使用され得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、ＶＥＧＦ−２についてのネイティブのプロモーターであり得る。
【０２３６】
他の遺伝子治療技術と異なり、裸の核酸配列を標的細胞へ導入することの１つの主な利点は、細胞内でのポリヌクレオチド合成の一過的性質である。研究により、非複製性ＤＮＡ配列は細胞内に導入されて、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示されている。
【０２３７】
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉組織、皮膚組織、脳組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、骨髄組織、胸腺組織、心臓組織、リンパ組織、血液組織、骨組織、軟骨組織、膵臓組織、腎組織、胆嚢組織、胃組織、腸組織、精巣組織、卵巣組織、子宮組織、直腸組織、神経系組織、眼組織、腺組織、および結合組織を含む）の間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、器官組織の細網線維、管壁もしくは室壁内の弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、の間の細胞間液体ムコ多糖類マトリックス、または筋肉細胞を覆う結合組織内もしくは骨の小腔内の同じマトリクッスを含む。これは同様に、循環の血漿およびリンパチャネルのリンパ液によって占められる空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に議論される理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織内への注射によって都合良く送達され得る。それらは、好ましくは分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてそこで発現されるが、送達および発現は、未分化またはより完全には分化していない細胞（例えば、血液幹細胞または皮膚線維芽細胞）内で達成され得る。インビボの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込みそして発現するその能力において特に適切である。
【０２３８】
裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が理解するように、この投薬量は注射の組織部位に従って変動する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そしてこれは処置される状態および投与経路に依存し得る。
【０２３９】
心筋層送達に関して、複数用量のｐＶＧＩ．１（ＶＥＧＦ−２）が患者に、例えば、２００、８００、および２０００μｇのような種々の用量レベルで投与され得る。この用量を送達するための１つの方法は、例えば、低侵襲手術を用いた心筋層への直接的な注入を介し得る。必要な場合、複数の注射部位が、ＳＰＥＣＴ（シングルフォトンエミッションＣＴ）画像化のようなベースラインの心筋どしゃぶり度研究によって同定された虚血領域に従って選択され得る。
【０２４０】
四肢送達に関して、複数用量のｐＶＧＩ．１（ＶＥＧＦ−２）が患者の四肢に、例えば、２、４、および８ｍｇのような種々の用量レベルで投与され得る。この用量を送達するための１つの方法は、筋内注射を介し得る。
【０２４１】
好ましい投薬経路は、組織の間隙空間への注射の非経口経路による方法である。しかし、他の非経口経路（例えば、特に肺組織もしくは気管支組織、のどまたは鼻の粘膜への送達のためのエーロゾル処方物の吸入）もまた使用され得る。さらに、裸のＶＥＧＦ−２　ＤＮＡ構築物は、この手順において使用されるカテーテルによる血管形成術の間に、動脈に送達され得る。
【０２４２】
裸のポリヌクレオチドは、当該分野において公知の任意の方法（送達部位での直接的な針注射、静脈内注射、局所的投与、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」が挙げられるが、これらに限定されない）によって送達される。これらの送達方法は、当該分野において公知である。
【０２４３】
実施例１８によって証明されるように、裸のＶＥＧＦ−２核酸配列を、インビボ投与し、ウサギの大腿動脈におけるＶＥＧＦ−２ポリペプチドの首尾良い発現を生じ得る。
【０２４４】
この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、沈降剤などのような送達ビヒクルで送達され得る。このような送達方法は、当該分野において公知である。
【０２４５】
特定の実施形態において、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、リポソーム調製物中に複合体化する。本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物、および中性調製物を含む。しかし、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強い荷電複合体が形成され得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、以下のものの細胞内送達を機能的な形態で媒介することが示されている：プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６、これは本明細書中で参考として援用される）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１、これは本明細書中で参考として援用される）；および精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２、これは本明細書中で参考として援用される）。
【０２４６】
カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、特に有用であり、そしてＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．からの商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ下で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６（これは本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと）。他の市販のリポソームは、トランスフェクターセ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含む。
【０２４７】
他のカチオン性リポソームは、当該分野において周知の技術を用いて容易に入手可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明について、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は、文献において説明されており、例えば、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３〜７４１７（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。類似の方法を使用して、他のカチオン性脂質物質からリポソームを調製し得る。
【０２４８】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えばＡｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用して容易に調製可能であり得る。そのような物質は、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。これらの物質はまた、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ開始物質と適切な比で混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製するための方法は、当該分野において周知である。
【０２４９】
例えば、市販のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせで使用して、コレステロールの添加を伴うかまたは伴わずに、従来のリポソームを作製し得る。従って、例えば、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各々５０ｍｇのＤＯＰＧおよびＤＯＰＣを乾燥させることによって調製し得る。このサンプルを、減圧ポンプ下に一晩置き、そして翌日に脱イオン水と水和させる。次いで、このサンプルをキャップをしたバイアル中で２時間、反転カップ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｃｕｐ）（浴槽型）プローブを備えたＨｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓモデル３５０ソニケーターを、浴槽を１５ＥＣで回転させながら最大設定で使用して超音波処理する。あるいは、負荷電の小胞を、多層状小胞を生成するために超音波処理なしで調製し得るか、または別々のサイズの単層状小胞を生成するために核膜孔（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通しての押し出しによって調製し得る。他の方法が公知であり、そして当業者に利用可能である。
【０２５０】
リポソームは、多層状小胞（ＭＬＶ）、小さな単層状小胞（ＳＵＶ）、または大きな単層状小胞（ＬＵＶ）を含み得、ＳＵＶが好ましい。種々のリポソーム−核酸複合体が、当該分野において周知の方法を用いて調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）１０１：５１２〜５２７を参照のこと（これは、本明細書中において参考として援用される）。例えば、核酸を含むＭＬＶは、ガラス管壁上にリン脂質の薄いフィルムを堆積させ、引き続いて封入される物質の溶液と水和させることによって調製され得る。ＳＵＶは、単層状リポソームの均質な集団を生成させるために、ＭＬＶの長時間の超音波処理によって調製される。捕捉される物質を、予め形成したＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥させた脂質フィルムを、適切な溶液（例えば、滅菌水または１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝液）中に再懸濁し、超音波処理し、次いで予め形成したリポソームを、ＤＮＡと直接混合する。リポソームおよびＤＮＡは、カチオン性ＤＮＡへの正荷電のリポソームの結合に起因して、非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小さな核酸フラグメントを用いた使用を見出す。ＬＵＶは、当該分野において周知の多くの方法によって調製される。共通に使用される方法としては、Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：１７）；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）を含む（これらは、本明細書中で参考として援用される）。
【０２５１】
一般に、ＤＮＡ対リポソームの比は、約１０：１〜約１：１０である。好ましくは、この比は、約５：１〜約１：５である。より好ましくは、この比は、約３：１〜約１：３である。さらにより好ましくは、この比は、約１：１である。
【０２５２】
米国特許第５，６７６，９５４号（これは、本明細書中で参考として援用される）は、カチオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注射を報告している。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および国際公開番号ＷＯ９４／９４６９（これらは、本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際の使用のためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および国際公開番号ＷＯ９４／９４６９（これらは、本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達するための方法を提供する。
【０２５３】
特定の実施形態において、細胞は、ＶＥＧＦ−２をコードする配列を含むＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで操作される。レトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺癌ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５４】
レトロウイルスベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例には、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株（その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５−１４（１９９０）に記載される）が挙げられるが、これらに限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段を介してパッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈降を包含するが、これらに限定されない。別のものでは、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル化され得るか、または脂質に結合され得、次いで宿主に投与され得る。
【０２５５】
プロデューサー細胞株は、ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子が、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ＶＥＧＦ−２を発現する。
【０２５６】
特定の他の実施形態において、細胞を、アデノウイルスベクター中に含まれるＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドで、エキソビボまたはインビボで操作する。アデノウイルスは、それがＶＥＧＦ−２をコードし、そして発現するように操作され得、そして同時に正常な溶解性ウイルス生活環で複製するその能力に関して不活化される。アデノウイルス発現は、宿主細胞染色体へのウイルスＤＮＡの組み込みなしに達成され、それによって挿入変異誘発に関する懸念が軽減される。さらに、アデノウイルスは、優れた安全プロフィールを有する生腸ワクチンとして長年の間使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら（１９７４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３〜２３８）。最終的に、アデノウイルス媒介遺伝子移入は、α−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲのコットンラット（ｃｏｔｔｏｎ　ｒａｔ）の肺への移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ　６８：１４３〜１５５）。さらに、ヒトの癌における原因因子としてアデノウイルスを確立する試みへの大規模な研究は、一様に否定的なものであった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：６６０６）。
【０２５７】
本発明において有用な適切なアデノウイルスベクターは、例えば以下において記載されており、それらは本明細書中において参考として援用される：ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ　６８：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ．　Ｔｈｅｒ．４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４号。例えば、アデノウイルスベクターＡｄ２は有用であり、そしてヒト２９３細胞において増殖され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そしてＥ１ａおよびＥ１ｂを構成的に発現し、これはベクターから欠失した遺伝子の産物を提供することによって欠損性アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、アデノウイルスの他の種類（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた本発明において有用である。
【０２５８】
好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよび／またはパッケージング細胞株の補助を必要とする。得られたウイルスは、細胞に感染し得、そしてプロモーター（例えば、本発明のＨＡＲＰプロモーター）に作動可能に連結される目的のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞において複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、以下の遺伝子のすべてまたは一部分の１つ以上が欠失され得る：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａ、またはＬ１〜Ｌ５。
【０２５９】
特定の実施形態において、細胞を、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いてエキソビボまたはインビボで操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生じるためにヘルパーウイルスを必要とする天然に存在する欠損性ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、非分裂細胞へそのＤＮＡを組み込み得るいくつかのウイルスのうちの１つである。ＡＡＶの３００ほどの少ない塩基対を含むベクターは、パッケージングされ得るが、外因性ＤＮＡのための空間は、約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡＶを産生および使用するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号、および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０２６０】
例えば、本発明における使用のための適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キャプシド化、および宿主細胞組み込みのために必要なすべての配列を含む。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において見出される方法のような標準的なクローニング方法を用いてＡＡＶベクターに挿入する。次いで、組換えＡＡＶベクターを、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降などを含む任意の標準的な技術を使用して、ヘルパーウイルスに感染されるパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイルスには、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェクトされそして感染されると、それらは、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を産生する。次いで、これらのウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボのいずれかで真核生物細胞を形質導入する。形質導入された細胞は、そのゲノムに組み込まれたＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を含み、そしてＶＥＧＦ−２を発現する。
【０２６１】
遺伝子治療の別の方法は、異種コントロール領域および内因性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＶＥＧＦ−２をコードする）を相同組換えを介して作動可能に連結する工程を含む（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）。この方法は、標的化細胞中に存在するが、細胞において通常発現されないか、または所望のレベルより低いレベルで発現する遺伝子の活性化を含む。
【０２６２】
プロモーターに隣接する標的化配列とともにプロモーターを含むポリヌクレオチド構築物を、当該分野において公知の標準的な技術を使用して作製する。適切なプロモーターは本明細書中に記載されている。プロモーター−標的化配列と内因性配列との相同組換えを可能にするために、標的化配列は内因性に対して十分に相補的である。標的化配列は、ＶＥＦＧ−２の所望の内因性ポリヌクレオチド配列の５’末端に十分に近いので、プロモーターは、相同組換えの際に内因性配列に作動可能に連結される。
【０２６３】
プロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを用いて増幅し得る。好ましくは、増幅されるプロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されるプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅されるプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されるプロモーターおよび標的化配列を消化し、そして共に連結する。
【０２６４】
プロモーター−標的化配列構築物を、裸のポリヌクレオチドとして、またはリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、全ウイルス、リポフェクション、沈降剤など（先により詳細に記載される）のようなトランスフェクション促進剤と組み合わせてかのいずれかで細胞に送達する。Ｐプロモーター−標的化配列を、直接的な針注射、静脈内注射、局部投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法によって送達し得る。この方法を、以下により詳細に記載する。
【０２６５】
プロモーター−標的化配列構築物は、細胞によって取り込まれる。構築物と内因性配列との間の相同組換えが起こり、その結果、内因性ＶＥＧＦ−２配列がプロモーターの制御下におかれる。次いで、このプロモーターは、内因性ＶＥＧＦ−２配列の発現を駆動する。
【０２６６】
ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドは、他の血管由来（ａｎｇｉｏｎｇｅｎｉｃ）タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドと共に投与され得る。血管由来タンパク質には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：酸性線維芽細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、上皮増殖因子αおよびβ、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激性因子、マクロファージコロニー刺激性因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激性因子、および酸化窒素シンターゼ。
【０２６７】
好ましくは、ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的には、このシグナル配列は、コード領域の５’末端の方向またはその５’末端にて発現されるポリヌクレオチドのコード領域に配置される。このシグナル配列は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランスフェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、このシグナル配列は、当該分野において公知の方法を用いて化学合成され得る。
【０２６８】
上記ポリヌクレオチド構築物のいずれかの任意の投与様式が、その様式が治療効果を提供するために十分な量で１つ以上の分子の発現を生じる限り、使用され得る。これは、直接針注射、全身性注射、カテーテル注入、微粒子銃インジェクター、粒子アクセルレーター（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジ蓄積、他の市販されている蓄積材料、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口もしくは座剤固体（錠剤もしくは丸剤）薬学的処方物、および手術の間のデカントもしくは局所適用を包含する。例えば、ラット肝およびラット脾への裸のリン酸カルシウム沈殿プラスミドの直接注入、またはタンパク質被覆プラスミドのブタ静脈への直接注入が、ラット肝における外来遺伝子の遺伝子発現を生じる（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：３７５（１９８９））。
【０２６９】
局所投与の好ましい方法は、直接注射によることである。好ましくは、送達ビヒクルと複合体化された本発明の組換え分子は、動脈の領域への直接注射により投与されるか、またはその中に局所的に投与される。組成物を動脈の領域内へ局所的に投与するとは、動脈内に組成物を数センチメートル、および好ましくは数ミリメートル注射することをいう。
【０２７０】
局所投与の別の方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を外科的創傷中にまたはその周囲に接触させることである。例えば、患者は、手術を受け得て、そしてポリヌクレオチド構築物は創傷の内側の組織の表面上に被覆され得るか、またはこの構築物は、創傷の内部の組織の領域に注入され得る。
【０２７１】
全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルに複合体化された本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するための適切な送達ビヒクルは、特定の部位に対してビヒクルを標的化するためのリガンドを含むリポソームを含む。
【０２７２】
全身投与の好ましい方法は、静脈注射、エアロゾル、経口および経皮（局所）送達を包含する。静脈注射は、当該分野で標準的な方法を使用して実施され得る。エアロゾル送達もまた、当該分野で標準的な方法を使用して実施され得る（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　１８９：１１２７７−１１２８１、１９９２（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。経口送達は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、動物の腸における消化酵素による分解を耐え得るキャリアに対して複合体化することにより実施され得る。このようなキャリアの例には、当該分野で公知のもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が含まれる。局所送達は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、皮膚に通過し得る親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することにより実施され得る。
【０２７３】
送達されるべき有効量の物質を決定することは、多数の要因に依存し得る。このような要因には、例えば、物質の化学構造および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重度、ならびに投与経路が含まれる。処置の頻度は、多数の要因に依存する。このような要因としては、例えば、１用量当たり投与されるポリヌクレオチド構築物の量、ならびに被験体の健康および医歴が挙げられる。正確な量、投与回数、および投与時期は、かかりつけの医師または獣医によって決定される。
【０２７４】
本発明の治療組成物は、任意の動物に、好ましくは、哺乳動物および鳥類に投与され得る。好ましい哺乳動物には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびブタが含まれる。ヒトが特に好ましい。
【０２７５】
（核酸有用性）
ＶＥＧＦ−２核酸配列およびＶＥＧＦ−２ポリペプチドはまた、科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロの目的のため、およびヒトの疾患を処置するための診断薬および治療薬の生産のために使用され得る。例えば、ＶＥＧＦ−２は、血管内皮細胞のインビトロでの培養のために使用され得、ここで、ＶＥＧＦ−２は１０ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で条件的培地に添加される。
【０２７６】
全長ＶＥＧＦ−２遺伝子のフラグメントは、ｃＤＮＡライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用されて、この遺伝子に対する高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離し得る。このタイプのプローブは、一般に、少なくとも５０塩基対を有するが、それらはさらに多数の塩基を有し得る。このプローブはまた、全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節領域およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全なＶＥＧＦ−２遺伝子を含むゲノムクローン（単数または複数）を同定するために使用され得る。スクリーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を使用することによるＶＥＧＦ−２遺伝子のコード領域を単離することが挙げられる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドが、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、このライブラリーのどのメンバーにこのプローブがハイブリダイズするかを決定するために使用される。
【０２７７】
本発明は、ＶＥＧＦ−２レセプターの同定のための方法を提供する。このレセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎ．，１（２），第５章、（１９９１）））によって同定され得る。好ましくは、発現クローニングを使用し、ここで、ポリアデニル化されたＲＮＡをＶＥＧＦ−２に応答する細胞から調製し、そしてこのＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを複数のプールに分割し、そしてＶＥＧＦ−２に応答しないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするために使用する。ガラススライド上で増殖するトランスフェクトされた細胞を、標識したＶＥＧＦ−２に曝す。ＶＥＧＦ−２を、部位特異的タンパク質キナーゼについての認識部位のヨウ素化または封入を含む、種々の手段によって標識し得る。固定およびインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析に供する。陽性のプールを同定し、そしてサブプールを調製し、そして反復サブプール化および再スクリーニングプロセスを用いて再度トランスフェクトし、最終的に推定のレセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０２７８】
レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識したＶＥＧＦ−２は、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と連結された光学的親和性であり得る。架橋した材料をＰＡＧＥによって分離し、そしてＸ線フィルムに曝す。次いで、ＶＥＧＦ−２を含有する標識した複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分解し、そしてタンパク質微量配列決定に供する。微量配列決定から得られたアミノ酸配列は、縮重オリゴヌクレオチドプローブのセットを設計して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして推定のレセプターをコードする遺伝子を同定するために使用される。
【０２７９】
（ＶＥＧＦ−２アゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法に関する。そのような方法の一例は、コマイトジェン（ｃｏｍｉｔｏｇｅｎ）Ｃｏｎ　Ａの存在下でヒト内皮細胞の増殖を有意に刺激するＶＥＧＦ−２の能力を利用する。内皮細胞を得、そしてＣｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を補充した反応混合物中で９６ウェル平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で培養する。Ｃｏｎ−Ａ、本発明のポリペプチド、およびスクリーニングされるべき化合物を添加する。３７℃でのインキュベーションの後、３［Ｈ］を取り込むに十分な時間、１μＣｉの３［Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１Ｃｉ＝３７ＢＧｑ；ＮＥＮ）を培養物に断続的に添加し、そしてグラスファイバーフィルター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）上に回収する。３連の培養物の平均の３［Ｈ］チミジン取り込み（ｃｐｍ）を、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して決定する。化合物を除いたコントロールアッセイと比較して有意な３［Ｈ］チミジン取り込みは、内皮細胞増殖の刺激を示す。
【０２８０】
アンタゴニストについてアッセイするために、上記のアッセイを行ない、そして化合物がＶＥＧＦ−２の存在下で３［Ｈ］チミジン取り込みを阻害する能力は、この化合物がＶＥＧＦ−２に対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、ＶＥＧＦ−２アンタゴニストは、競合阻害アッセイに適切な条件下で、ＶＥＧＦ−２および潜在的なアンタゴニストと、膜に結合したＶＥＧＦ−２レセプターまたは組換えレセプターとを組み合わせることによって検出され得る。ＶＥＧＦ−２は、例えば、放射能によって標識され得、その結果、レセプターに結合したＶＥＧＦ−２分子の数が潜在的なアンタゴニストの有効性を決定し得る。
【０２８１】
あるいは、ＶＥＧＦ−２とレセプターとの相互作用の後の公知のセカンドメッセンジャーシステムの応答を、この化合物の存在下または非存在下で測定し、そして比較する。そのようなセカンドメッセンジャーシステムは、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加水分解を包含するが、これらに限定されない。別の方法では、ＶＥＧＦ−２レセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物が、この化合物の存在下で、標識したＶＥＧＦ−２と共にインキュベートされる。次いで、この相互作用を増強またはブロックする、この化合物の能力が測定され得る。
【０２８２】
潜在的なＶＥＧＦ−２のアンタゴニストは、抗体、またはいくつかの場合にはオリゴヌクレオチドを含み、これはこのポリペプチドに結合し、そしてＶＥＧＦ−２の機能を有効に消去させる。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−２レセプターに結合する、密接に関連するタンパク質であり得るが、しかし、それらはこのポリペプチドの不活性な形態であり、それによりＶＥＧＦ−２の作用を妨げる。これらのアンタゴニストの例は、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのネガティブドミナント変異体を包含し、例えば、ＶＥＧＦ−２のヘテロ二量体形態の一方の鎖は優性であり得、そして生物学的活性が保持されないように変異され得る。ネガティブドミナント変異体の例は、二量体ＶＥＧＦ−２の短縮バージョンを包含する。これは別の二量体と相互作用して、野生型ＶＥＧＦ−２を形成し得るが、しかし得られるホモ二量体は不活性であり、特徴的なＶＥＧＦ活性を示すことができない。
【０２８３】
別の潜在的なＶＥＧＦ−２アンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、３重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。これらの方法は両方ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、このポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それにより、ＶＥＧＦ−２の転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧＦ−２ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現してＶＥＧＦ−２の産生を阻害し得る。
【０２８４】
潜在的なＶＥＧＦ−２アンタゴニストはまた、ポリペプチドの活性部位に結合し、そしてこの部位を占め、それにより触媒部位が基質に接近できないようにし、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる、低分子を含む。低分子の例は、低分子ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定されない。
【０２８５】
アンタゴニストは、固形腫瘍転移に必要な新脈管形成を限定するために使用され得る。ＶＥＧＦ−２の同定は、血管内皮成長因子の特定のインヒビターの生成のために使用され得る。新脈管形成および新生血管形成は固形腫瘍増殖における必須工程であるので、血管内皮成長因子の新脈管形成活性の阻害は、固形腫瘍のさらなる増殖、遅滞、または抑制さえをも妨害するために非常に有用である。ＶＥＧＦ−２の発現レベルは、胸部を含む正常組織において極度に低いが、悪性腫瘍に由来する少なくとも２つの乳癌細胞株においては中程度で発現されることが見出され得る。従って、ＶＥＧＦ−２が腫瘍脈管形成および増殖に関与することが可能である。
【０２８６】
神経膠腫はまた、本発明のアンタゴニストで処置され得る新生物の１つのタイプである。
【０２８７】
アンタゴニストはまた、血管透過性の増大により引き起こされる慢性炎症を処置するために使用され得る。これらの障害に加えて、アンタゴニストはまた、糖尿病に関連する網膜症、慢性関節リウマチ、および乾癬を処置するために使用され得る。
【０２８８】
アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中以下に記載するような）を有する組成物中で使用され得る。
【０２８９】
（薬学的組成物）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて使用され得る。そのような組成物は、治療的有効量のポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。そのようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せを包含するが、これらに限定されない。処方物は、投与の様式に合わせるべきである。
【０２９０】
本発明はまた、１つ以上の本発明の薬学的組成物の成分で充填した１つ以上の容器を備えた薬学的パックまたはキットを提供する。そのような容器には、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関によって指定される形式の通知を伴い得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。
【０２９１】
薬学的組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によるような好都合な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の適応症を処置および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、薬学的組成物は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほとんどの場合はこれらは一日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。ほとんどの場合、投薬は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２９２】
ＶＥＧＦ−２ポリペプチド、およびポリペプチドであるアゴニストまたはアンタゴニストはまた、上記の、インビボでのそのようなポリペプチドの発現により本発明に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。
【０２９３】
従って、例えば、骨髄細胞のような細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。そのような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。
【０２９４】
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示により当業者には明らかであるはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。
【０２９５】
本明細書中上記で述べたレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス）、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺癌ウイルスを包含するが、これらに限定されない。１つの実施形態において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。
【０２９６】
ベクターは１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９９０（１９８９）に記載される）、または他の任意のプロモーター（例えば、真核生物細胞性プロモーターのような細胞プロモーター（ヒストン、ｐｏｌ　ＩＩＩ、およびβ−アクチンのプロモーターを包含するが、これらに限定されない））を包含するが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から、当業者に明らかである。
【０２９７】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターは、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書上記の改変したレトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御するネイティブプロモーターであり得る。
【０２９８】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入してプロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ｙ−２、ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ｙＣＲＥ、ｙＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株（その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５−１４頁（１９９０）に記載される）を包含するが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手段を介してパッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈澱を包含するが、これらに限定されない。別のものでは、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル化され得るか、または脂質に結合され得、次いで宿主に投与され得る。
【０２９９】
プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子が、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含するが、これらに限定されない。
【０３００】
（診断アッセイ）
本発明はまた、ＶＥＧＦ−２核酸配列における変異の存在に関する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部としての、ＶＥＧＦ−２遺伝子の使用に関する。
【０３０１】
ＶＥＧＦ−２遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によってＤＮＡレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液）、尿、唾液、組織生検、および剖検材料から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出のための直接使用され得るか、または分析の前にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３−１６６（１９８６））を使用して酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的のために使用され得る。例として、ＶＥＧＦ−２をコードする核酸に対して相補的であるＰＣＲプライマーは、ＶＥＧＦ−２変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型に対して比較した増幅産物のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、増幅したＤＮＡを、放射性標識したＶＥＧＦ−２ＲＮＡ、または代替的に、放射性標識したＶＥＧＦ−２ＲＮＡアンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイズさせることによって、同定され得る。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ　Ａ消化または融解温度の違いによって、一致していない二重鎖から区別され得る。
【０３０２】
ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子試験は、変性剤の存在下または非存在下で、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動的な移動度の変化の検出によって達成され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高解像度のゲル電気泳動によって可視化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別され得る。ここで、異なるＤＮＡフラグメントの移動度は、ゲル中で、それらの特異的な融解温度および部分的な融解温度に従って異なる位置において遅れる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２（１９８５）を参照のこと）。
【０３０３】
特定の位置での配列の変化もまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護）または化学的切断法によって示され得る（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ　８５：４３９７−４４０１（１９８５））。
【０３０４】
従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ））、およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。
【０３０５】
より慣用的なゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異誘発もまた、インサイチュ分析によって検出され得る。
【０３０６】
本発明はまた、種々の組織におけるＶＥＧＦ−２タンパク質の変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、通常のコントロール組織サンプルと比較したタンパク質の過剰発現は、疾患（例えば、異常な細胞増殖）の存在またはその疾患に対する感受性を検出し得るからである。宿主由来のサンプル中のＶＥＧＦ−２タンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、そしてこれには、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１（２）、第６章、（１９９１））は、最初に、ＶＥＧＦ−２抗原に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を調製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して調製される。レポーター抗体に対して、検出可能な試薬（例えば、放射能、蛍光、またはこの場合においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）が結合される。サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上のいかなる遊離のタンパク質結合部位も、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることによって覆われる。次に、モノクローナル抗体は、このモノクローナル抗体がポリスチレンディッシュに結合したいかなるＶＥＧＦ−２タンパク質とも結合する時間の間、ディッシュ中でインキュベートされる。すべての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液で洗い流される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたレポーター抗体は、ディッシュ中に置かれ、これは、レポーター抗体の、ＶＥＧＦ−２に結合したモノクローナル抗体への結合を生じる。次いで、未結合のレポーター抗体は洗い流される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がディッシュに添加され、そして所定の時間の期間で発色した色の量は、標準曲線に対して比較した場合に、患者サンプルの所定の容量中に存在するＶＥＧＦ−２タンパク質の量の尺度である。
【０３０７】
競合アッセイが利用され得、ここではＶＥＧＦ−２に特異的な抗体が固体支持体に結合されている。次いで、本発明のポリペプチドは、例えば、放射能によって標識され、そして宿主由来のサンプルが固体支持体を通過し、そして検出された標識の量（例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーによって検出される）は、サンプル中のＶＥＧＦ−２の量と相関し得る。
【０３０８】
「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイと類似している。「サンドイッチ」アッセイにおいて、ＶＥＧＦ−２は、固体支持体を通過し、そして固体支持体に結合している抗体に結合する。次いで、第２の抗体がＶＥＧＦ−２に結合する。次いで、標識されかつ第２の抗体に特異的な第３の抗体は、固体支持体を通過し、そして第２の抗体に結合し、次いで量が定量され得る。
【０３０９】
（染色体の同定）
本発明の配列はまた、染色体同定に価値がある。その配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る。さらに、染色体上の特定の部位を同定する必要性が現在存在する。実際の配列データ（反復多型のデータ）に基づく染色体マーキング試薬は、染色体位置のマーキングのために現在ほとんど利用可能ではない。本発明による、ＤＮＡの染色体へのマッピングは、疾患と関連する遺伝子とそれらの配列とを相関付ける際の重要な第１の工程である。
【０３１０】
手短には、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピングされ得る。ｃＤＮＡのコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮＡにおける１より多くのエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、それによって増幅プロセスは複雑にされる。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを産生する。
【０３１１】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を使用して、特定の染色体または大きなゲノムクローンのプールからのフラグメントのパネルで、サブローカリゼーションが、類似の様式で達成され得る。その染色体にマッピングするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーには、インサイチュハイブリダイゼーション、標識されたフロー選別された（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択が含まれる。
【０３１２】
中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確な染色体位置を提供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプローブとともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　Ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０３１３】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上のその配列の物理的位置を、遺伝子マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　Ｉｎ　Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見い出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を介して同定する。
【０３１４】
次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲノム配列における差を決定することが必要である。変異が、罹患している個体のいくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては観察されない場合、変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。
【０３１５】
物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の現状の分解能を用いて、疾患に関連する染色体領域に正確に位置付けられたｃＤＮＡは、５０と５００の間の潜在的な原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング分解能および２０ｋｂあたり１つの遺伝子を仮定している。）
罹患した個体および罹患していない個体の比較は、一般的に、染色体における構造的変更（例えば、欠失または転座）を探索することを第１に含み、この変更は、染色体のスプレッドから可視的であるか、またはそのｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能である。最終的に、何人かの個体からの遺伝子の完全な配列決定は、変異の存在を確認しかつ多型性からの変異を区別するために必要とされる。
【０３１６】
（アンチセンス）
本発明はさらに、アンチセンス技術の使用によって、インビボでＶＥＧＦ−２を阻害することに関する。アンチセンス技術を用いて、３重らせんの形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御し得る。これらの方法は両方ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、成熟ポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードし、１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）、それにより、ＶＥＧＦ−２の転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＶＥＧＦ−２への翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））。
【０３１７】
あるいは、上記のオリゴヌクレオチドは、当該分野の手順によって細胞に送達され得、その結果、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現して、上記の様式においてＶＥＧＦ−２の産生を阻害し得る。
【０３１８】
従って、ＶＥＧＦ−２に対するアンチセンス構築物は、ＶＥＧＦ−２のＶＥＧＦ−２活性を阻害し得、そして固体腫瘍のさらなる増殖または消失さえ妨げ得る。なぜならば、新ＶＥＧＦ−２および新生血管形成は、固体腫瘍の増殖における必須の段階であるからである。これらのアンチセンス構築物をまた使用して、異常な新ＶＥＧＦ−２によって全て特徴付けられる慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病網膜症およびカポージ肉腫を処置し得る。
【０３１９】
（エピトープ保有部分）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドおよびポリペプチドを提供する。これらのエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、本発明のポリペプチド全体、またはそのフラグメントが免疫原である場合、インビボで抗体応答を誘発するタンパク質の一部として規定される。一方、抗体が結合し得るポリペプチドの領域は、「抗原決定基」または「抗原性エピトープ」として規定される。タンパク質のインビボでの免疫原性エピトープの数は、一般に抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３９９８−４００２を参照のこと。しかし、抗体は、それが免疫原性エピトープであるか否かに関わらず、ファージディスプレイのような方法を用いることによって、任意の抗原性エピトープに対して作製され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　Ｇ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４９：４２５−４３１を参照のこと。従って、本発明には、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの両方が含まれる。
【０３２０】
免疫原性エピトープが、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析によって決定された、予測される重要なアミノ酸残基を含むことが、特に指摘される。従って、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方、のいずれかにおけるさらなるフランキング残基を、これらの配列に付加して、本発明のエピトープ保有ポリペプチドを生成し得る。従って、免疫原性エピトープは、さらなるＮ末端またはＣ末端アミノ酸残基を含み得る。このさらなるフランキングアミノ酸残基は、本発明のポリペプチド由来の連続したフランキングＮ末端および／またはＣ末端配列、異種ポリペプチド配列であり得るか、あるいは、本発明のポリペプチド由来の連続したフランキング配列および異種ポリペプチド配列の両方を含み得る
免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、少なくとも７アミノ酸残基の長さである。「少なくとも」とは、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、７アミノ酸残基の長さであり得るか、または７アミノ酸と本発明の全長ポリぺプチドのアミノ酸残基数との間の任意の整数であり得ることを意味する。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００のアミノ酸残基の長さである。しかし、７と全長ポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の各整数およびどの整数も本発明に含まれることが指摘される。
【０３２１】
免疫および抗原性エピトープ保有フラグメントは、上記のような連続するアミノ酸残基の数のいずれかによって特定され得るか、または配列番号２のアミノ酸配列におけるこれらのフラグメントのＮ末端位置およびＣ末端位置によってさらに特定され得る。例えば、少なくとも７または少なくとも１５の連続したアミノ酸残基の長さのフラグメントが、配列番号２のアミノ酸配列上に占有し得る、Ｎ末端位置およびＣ末端位置のどの組み合わせも本発明に含まれる。再び、「少なくとも７つの連続するアミノ酸残基の長さ」とは、７アミノ酸残基の長さ、または７アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の任意の整数を意味する。詳細には、７と全長のポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の各整数およびどの整数も、本発明に含まれる。
【０３２２】
本発明の免疫原性エピトープ保有ポリペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、例えば本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製するのに有用であり、そして本発明のポリペプチドを検出するイムノアッセイにおいて有用である。この抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフィニティー精製において有用である。この抗体はまた、種々の定性的および定量的イムノアッセイ、特に当該分野において公知の方法を用いる本発明のポリペプチドについて慣用的に使用され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ；第２版、１９８８）を参照のこと。
【０３２３】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野において公知の合成方法および組換え方法を含む、ポリぺプチドを生成するための任意の従来の方法によって、生成され得る。例えば、エピトープ保有ペプチドは、化学合成の公知の方法を用いて合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、大きな数のペプチド（例えば、２４８の個体の１０〜２０ｍｇ）およびＨＡ１ポリペプチドの単一のアミノ酸改変体のセグメントを提示する異なる１３残基のペプチドの合成についての簡単な方法を記載しており、それらの全ては、４週間未満で調製されそして特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ型結合研究によって）（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３１−５１３５（１９８５））。この「同時複数ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよび共同研究者ら（１９８６）に対する米国特許第４，６３１，２１１号においてさらに記載される。この手順において、種々のぺプチドの固相合成についての個々の樹脂は、分離した溶媒浸透パケット中に含まれ、これは、固相方法に関与する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成を同時に行い得る（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５１３１−５１３５、５１３４において）。
【０３２４】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドを使用して、当該分野において周知の方法（インビボでの免疫化、インビトロでの免疫化、およびファージディスプレイ方法を含むが、これらに限定されない）に従って抗体を誘導する。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら（１９８５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４を参照のこと。インビボでの免疫化が用いられる場合、動物は、遊離のペプチドを用いて免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体の力価は、このぺプチドと高分子のキャリア（例えば、キーホールリンペットヘマシアニン（ＫＬＨ）またはジフテリアトキソイド）との結合によってブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、リンカー（例えば、−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒロドキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いてキャリアに結合され得、一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラットおよびマウスのような動物は、例えば、約１００μｇのペプチドもしくはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含む乳濁液の腹腔内注射および／または皮内注射によって、遊離のエピトープまたはキャリアに結合したペプチドのいずれかを用いて免疫化される。いくつかのブースター注射は、例えば、約２週間の間隔で、例えば、固体表面に吸着した遊離ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出され得る、抗ぺプチド抗体の有用な力価を提供するために必要であり得る。免疫化動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択によって、例えば固体支持体上のぺプチドへの吸着および当該分野において周知の方法に従う選択した抗体の溶出によって増大され得る。
【０３２５】
当業者が認識するように、そして上記で議論されるように、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリぺプチドは、異種のポリペプチド配列と融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメイン、またはそれらの一部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、全体のドメインおよびそれらの一部分の両方を含むそれらの任意の組み合わせ）を用いて融合され得、キメラポリペプチドを生ずる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の増大を示す。このことは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている。例えば、ＥＲＡ　０，３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８４−８６を参照のこと。ＩｇＧ部分に起因するジスルフィド架橋した二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体のポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも他の分子を結合および中和する際により有効であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、発現されるポリペプチドの検出および精製を補助するエピトープタグとして、目的の遺伝子と組換えられ得る。
【０３２６】
（抗体）
本発明はさらに、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、ならびにＩｇＹを含む。本明細書中において使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）とは、単鎖抗体の全体を含む抗体全体を含み、そしてそれらの抗原結合フラグメントを含むことを意味する。最も好ましくは、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントを含むが、それらに限定されない本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントである。抗体は、鳥および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。
【０３２７】
抗原結合抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）は、可変領域のみを含み得るか、または以下の全体もしくは一部分と組み合せて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。また、本発明は、可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの任意の組み合わせを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチドを特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。
【０３２８】
本発明の抗体は、単一特異的、二価特異的、三価特異的またはより多価特異的な抗体であり得る。多価特異的抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドならびに異種の組成物（例えば、異種のポリペプチドまたは固体支持物質）の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ，Ａ．ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、５，６０１，８１９号、４，７１４，６８１号、４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照のこと。
【０３２９】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのエピトープもしくは部分（抗体により認識されるかまたは特異的に結合される）に関して記載または特定化され得る。このエピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書において記載のように（例えば、Ｎ末端部分およびＣ末端部分により、隣接するアミノ酸残基のサイズにより）、または表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含み、そしてそれの排除を可能にする。
【０３３０】
本発明の抗体はまた、その交差反応性ついて記載されるか、または特定化され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。さらに本発明には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書において記載のような）で本発明のポリペプチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのみ結合する抗体が含まれる。本発明の抗体はまた、その結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄの親和性が挙げられる。
【０３３１】
本発明の抗体は、インビトロおよびインビボの両方における診断方法ならびに治療方法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのための当該分野で公知の方法を含むがこれに限定されない用途を有する。例えば、この抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを質的および量的に測定するためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（全体が参考として援用されている）を参照のこと。
【０３３２】
本発明の抗体は、単独、または他の組成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種のポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合的結合および非共有結合的結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種のポリペプチド、薬物または毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第０３９６３８７号を参照のこと。
【０３３３】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法により調製され得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術および組換え技術の使用を含む当該分野で公知の広範な技術を用いて調製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　Ｔ−ＣＥＬＬ　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ　５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント作製のため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント作製のため）のような酵素を用いて、タンパク質分解性切断により作製され得る。
【０３３４】
あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を用いる組換えＤＮＡ技術の適用により、または合成化学により作製され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて調製され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原（代表的には、固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原）を用いて直接的に選択することにより、レパートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージである。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｕ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１８２：４１〜５０；Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１８４：１７７〜１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２〜９５８；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら（１９９７）Ｇｅｎｅ　１８７　９〜１８；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら（１９９４）Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５７：１９１〜２８０；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ　９０／０２８０９；ＷＯ　９１／１０７３７；ＷＯ　９２／０１０４７；ＷＯ　９２／１８６１９；ＷＯ　９３／１１２３６；ＷＯ　９５／１５９８２；ＷＯ　９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号および同第５，７３３，７４３号（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０３３５】
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の領域をコードする抗体は、ヒト抗体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを含む抗体の全体を作製するために単離されそして用いられ得、そして哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に作製するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得る。この方法は、例えば、以下に開示される方法である：ＷＯ　９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．ら（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１２（６）：８６４〜８６９；およびＳａｗａｉ，Ｈ．ら（１９９５）ＡＪＲＩ　３４：２６〜３４；およびＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１〜１０４３（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０３３６】
単鎖のＦｖおよび抗体を作製するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２０３：４６〜８８；Ｓｈｕ，Ｌ．ら（１９９３）ＰＮＡＳ　９０：７９９５〜７９９９；およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０３８〜１０４０に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体を作製するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２５：１９１〜２０２；および米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。抗体は、以下含む種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−移植術（欧州特許第０　２３９　４００号；ＷＯ　９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０　５９２　１０６号；欧州特許第０　５１９　５９６号；Ｐａｄｌａｎ　Ｅ．Ａ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２８（４／５）：４８９〜４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ　Ｇ．Ｍ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　７（６）：８０５〜８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ　Ｍ．Ａ．ら（１９９４）ＰＮＡＳ　９１：９６９〜９７３）、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記のファージディスプレイ方法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。また、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ　９８／４６６４５（これらの参考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３３７】
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドに組換え的に融合または化学的に結合（共有結合的結合および非共有結合的結合の両方を含む）した抗体が含まれる。この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体は、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結合することにより、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型へ標的化するために用いられ得る。本発明のポリペプチドに対して融合または結合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いてインビトロイムノアッセイおよび精製方法において用いられ得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出、およびＷＯ　９３／２１２３２；欧州特許第０　４３９　０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａ，Ｍ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ　８９：１４２８〜１４３２；Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ．ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６〜２４５２（これらの参考資料は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３３８】
本発明は、さらに、可変領域以外の抗体ドメインに対して融合または結合した本発明のポリペプチドを含有する組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体のＦｃ領域もしくはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリペプチドに融合する抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインまたはそれらのドメイン全体もしくは部分の任意の組み合わせを含み得る。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのインビボの半減期を延長するためか、または当該分野で公知の方法を用いるイムノアッセイにおける使用のために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融合または結合され、マルチマーを形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドに融合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間のジスルフィド結合を通じてダイマーを形成し得る。より多価の多量体の形態は、ＩｇＡおよびＩｇＭの部分にポリペプチドを融合させることにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分へ融合または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；欧州特許第０　３０７　４３４号、欧州特許第０　３６７　１６６号；ＷＯ　９６／０４３８８、ＷＯ　９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら（１９９１）ＰＮＡＳ　８８：１０５３５〜１０５３９；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０〜５６００；およびＶｉｌ，Ｈ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ　８９：１１３３７〜１１３４１（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３３９】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を部分的にかまたは完全にのいずれかで崩壊させる抗体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガンド結合を妨げないが、レセプター活性化を妨げるレセプター特異的抗体が含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書に記載の技術、または当該分野で公知の他の技術により決定され得る。またリガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体も含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、およびリガンドに結合し、これによりレセプターの活性化を妨げるがリガンドがレセプターと結合することを妨げない抗体が含まれる。さらに、レセプターを活性化する抗体が含まれる。これらの抗体は、リガンド媒介性レセプター活性化により影響される生物学的活性の全てまたは全てではないのいずれかについてのアゴニストとして作用し得る。この抗体は、本明細書において開示される特定の活性を含む生物学的活性についてのアゴニストまたはアンタゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＷＯ　９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ　９２（６）：１９８１〜１９８８；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８〜３６７８；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６〜１７９４；Ｚｈｕ，Ｚ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５８（１５）：３２０９〜３２１４；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０〜３１７９；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７〜２４７；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０５（２）：１７７〜１９０；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ　９（４）：２３３〜２４１；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５〜１１３０１；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ　１４（４）：７５５〜７６２；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　６（９）：１１５３〜１１６７；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら（１９９６）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　８（１）：１４〜２０（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３４０】
抗体は、さらに、特定の個体において腫瘍の存在を検出するためのイムノアッセイにおいて用いられ得る。酵素イムノアッセイは、個体の血液サンプルから実行され得る。ＶＥＧＦ−２のレベルの上昇は、癌の診断とみなされ得る。
【０３４１】
内皮細胞の成長を活性化しないダイマーを形成するように野生型のＶＥＧＦ−２と相互作用し得、従ってこれは内因性のＶＥＧＦ−２を不活化するＶＥＧＦ−２の短縮バージョンがまた産生され得る。または、ＶＥＧＦ−２の変異形態は、それら自身でダイマーを形成し、そして標的細胞表面上の適切なチロシンキナーゼレセプターのリガンド結合ドメインを占有するが、細胞の成長は活性化しない。
【０３４２】
あるいは、本発明のポリペプチドが正常に結合するレセプターに対して結合する、本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストが使用され得る。このアンタゴニストは、密接に関連するタンパク質であり得、その結果、これらは天然のタンパク質のレセプター部位を認識し、そして結合するが、それらは、天然のタンパク質の不活性な形態であり、これによりレセプター部位が占有されるのでＶＥＧＦ−２の作用を妨げる。これらの方法において、ＶＥＧＦ−２の作用は、妨げられ、そしてアンタゴニスト／インヒビターは、ＶＥＧＦ−２により認識される腫瘍のレセプター部位を占有することにより、またはＶＥＧＦ−２自身を不活性化することにより抗腫瘍薬物として治療的に用いられ得る。このアンタゴニスト／インヒビターはまた、ＶＥＧＦ−２の血管透過性作用の上昇に起因して炎症を妨げるために用いられ得る。このアンタゴニスト／インヒビターはまた、固形腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、乾癬および慢性関節リウマチの処置のために用いられ得る。
【０３４３】
このアンタゴニスト／インヒビターは、例えば、本明細書において上記されたような薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて使用され得る。
【０３４４】
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はそのような実施例に限定されないことを理解されたい。全ての部分または量は、他に明記しない限り重量基準である。
【０３４５】
以下の実施例の理解を容易にするために、特定頻度現れる方法および／または用語を記載する。
【０３４６】
「プラスミド」は、大文字および／または数字の前および／または後の小文字のｐにより示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販され制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
【０３４７】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１ｍｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに約２０Ｆｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜５０ｍｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で、より多量の容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。３７ＥＣにての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変動させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
【０３４８】
切断されたフラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０３４９】
「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。そのような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。
【０３５０】
「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、１４６頁）。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
【０３５１】
他に明言しない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載のように実施した。
【０３５２】
（実施例）
（実施例１）
（ヒト組織および乳癌細胞株におけるＶＥＧＦ−２の発現パターン）
ノーザンブロット分析を行い、ヒト組織およびヒト組織中の乳癌細胞株におけるＶＥＧＦ−２の発現のレベルを試験した。全細胞ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌＴＭＢシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて単離した。各々の乳癌組織および特定化された細胞株から単離された約１０ｍｇの全ＲＮＡを、１％アガロースゲル上で分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。標識反応は、５０ｎｇのＤＮＡフラグメントを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡを、５Ｐｒｉｍｅ÷３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）のＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムを用いて精製した。次いで、フィルターを、０．５Ｍ　ＮａＰＯ４および７％ＳＤＳ中１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌの放射性標識した全長ＶＥＧＦ−２遺伝子で、６５℃にて一晩ハイブリダイズした。０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる室温での２回の洗浄および６０℃での２回の洗浄後、次いで、フィルターを、増感スクリーンを用いて−７０℃で、一晩露光した。１．６Ｋｄのメッセージを、２つの乳癌細胞株において観察した。図５、レーン４は、極めて腫瘍化した細胞株を示し、これは、増殖についてエストロゲン非依存である。
【０３５３】
また、１０のヒト成体組織由来の１０ｍｇの全ＲＮＡを、アガロースゲル上で分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした。次いで、そのフィルターを、０．５Ｍ　ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２；１％ＢＳＡ中の放射性標識したＶＥＧＦ−２プローブで、６５℃にて一晩ハイブリダイズした。０．２×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄後、このフィルターを、増感スクリーンを用いて−７０℃で、２４時間フィルムに露光した。図６を参照のこと。
【０３５４】
（実施例２）
（インビトロ転写および翻訳による短縮形態のＶＥＧＦ−２（配列番号４）の発現）
ＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡをインビトロで転写して、そして翻訳し、短縮形態のＶＥＧＦ−２および部分ＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡによりコードされる翻訳可能なポリペプチドの大きさを決定した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫベクター中のＶＥＧＦ−２の２つの挿入物を、以下の３対のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した；１）Ｍ１３逆方向および順方向プライマー；２）Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦプライマーＦ４；ならびに３）Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦプライマーＦ５。これらのプライマーの配列は、以下のとおりである。
【０３５５】
Ｍ１３−２逆方向プライマー：５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ−３’（配列番号９）。この配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中のＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡ挿入物の５’末端の上流に位置し、そしてそのｃＤＮＡとアンチセンスの方向にある。Ｔ３プロモーター配列は、このプライマーとＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡとの間に位置する。Ｍ１３−２順方向プライマー：５’ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１０）。この配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中のＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡ挿入物の３’末端の下流に位置し、そしてそのｃＤＮＡ挿入物とアンチセンスの方向にある。ＶＥＧＦプライマーＦ４：５’−ＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡ−３’（配列番号１１）。この配列は、ＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡ内にアンチセンス方向で、ｂｐ１２５９−１２３９に位置し、これは、このｃＤＮＡの終止コドンの３’末端から約１６９ｂｐ離れており、そしてこのｃＤＮＡの最後のヌクレオチドの約２６６ｂｐ前にある。
【０３５６】
３対全てのプライマーを用いるＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ挿入物の前のＴ３プロモーター配列を含む増幅産物を生成する。第１対および第３対のプライマーは、配列番号４に示されるＶＥＧＦ−２のポリペプチドをコードするＰＣＲ産物を生成する。第２対のプライマーは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドのＣ末端で３６アミノ酸コード配列を欠く、ＰＣＲ産物を生成する。
【０３５７】
第１対のプライマーからの約０．５ｍｇ、第２対のプライマーからの約１ｍｇ、第３対のプライマーからの約１ｍｇのＰＣＲ産物を、インビトロ転写／翻訳のために使用した。インビトロ転写／翻訳反応は、２５Ｆｌの容量で、ＴＮＴＪ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＡＴ＃Ｌ４９５０）を使用して行った。詳細には、その反応は、１２．５ＦｌのＴＮＴウサギ網状赤血球溶解物、２ＦｌのＴＮＴ反応緩衝液、１ＦｌのＴ３ポリメラーゼ、１Ｆｌの１ｍＭのアミノ酸混合物（メチオニン非含有）、４Ｆｌの３５Ｓ−メチオニン（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）、１Ｆｌの４０Ｕ／μｌ；ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター、０．５または１ｍｇのＰＣＲ産物を含む。ヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏを添加して、容量を２５Ｆｌに合わせた。反応を、３０℃で２時間インキュベートした。５μｌの反応産物を、４〜２０％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。２５％イソプロパノールおよび１０％酢酸で固定した後、ゲルを乾燥し、そして７０℃で一晩、Ｘ線フィルムに露光した。
【０３５８】
図７に示されるように、短縮型ＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡ（すなわち、配列番号３に示されるような）を含むＰＣＲ産物、および３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）中の２６６ｂｐを欠くｃＤＮＡが、同じ長さの翻訳産物を生成し、それらの分子量は、３８〜４０ｄｋであると推定される（レーン１および３）。全ての３’ＵＴＲを欠き、かつＣ末端の３６アミノ酸をコードする配列を欠くｃＤＮＡは、推定分子量３６〜３８ｋｄのポリペプチドに翻訳された（レーン２）。
【０３５９】
（実施例３）
（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系を使用するＶＥＧＦ−２のクローニングおよび発現）
Ｎ末端の４６アミノ酸を含まないＶＥＧＦ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ番号９７１４９を参照のこと）を、その遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。
【０３６０】
５’プライマーは、配列ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＡＣＧ　ＡＣＴ　ＣＡＣ　ＴＡＴ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　ＣＣＣ　ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＣ　ＡＣＧ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＧＣ（配列番号１２）を有し、そしてＢａｍＨ１制限酵素部位（下線部）およびＶＥＧＦ−２の５’配列（ヌクレオチド１５０−１６６）に相補的な１７ヌクレオチド配列を含む。
【０３６１】
３’プライマーは、配列ＧＡＴＣ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＣＴ（配列番号１３）を有し、そして制限酵素ＸｂａＩに対する切断部位およびＶＥＧＦ−２の３’配列（終止コドンおよび終止コドン前の１５ヌクレオチド配列を含む）に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０３６２】
増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ．，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）を用いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、このフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１およびＸｂａＩで消化し、次いで、再度１％アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、ｐＡｃＧＰ６７Ａバキュロウイルス転移ベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にＢａｍＨ１およびＸｂａＩ部位で連結した。この連結によってＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡをバキュロウイルスｇｐ６７遺伝子のシグナル配列とインフレームでクローン化し、そしてベクターのシグナル配列の３’末端に位置した。これを、ｐＡｃＧＰ６７Ａ−ＶＥＧＦ−２と称する。
【０３６３】
ｇｐ６７遺伝子のシグナル配列を有するＶＥＧＦ−２を発現のためのｐＲＧ１ベクターにクローン化するために、シグナル配列およびいくらかの上流配列を有するＶＥＧＦ−２を、ＶＥＧＦ−２　ｃＤＮＡの上流に位置するＸｈｏ制限エンドヌクレアーゼ部位およびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素によって、ｐＡｃＧＰ６７Ａ−ＶＥＧＦ−２プラスミドから切り出した。このフラグメントを、１％アガロースゲル上でベクターの残部から分離し、そして「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」キットを使用して精製した。これをＦ２と称した。
【０３６４】
ＰＲＧ１ベクター（ｐＶＬ９４１ベクターの改変）を、バキュロウイルス発現系（総説については；Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、「Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと）を使用するＶＥＧＦ−２タンパク質の発現のために使用する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、続いて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ、Ｓｍａ１、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｐ７１８についての認識部位を含む。制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ１についての部位は、ＢａｍＨ１部位の上流に位置する。Ｘｈｏ１とＢａｍＨ１との間の配列は、ＰＡｃＧｐ６７Ａ（型に静的な）ベクターの配列と同じである。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子が、ポリヘドリンプロモーターと同じ方向で挿入され、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルがこれに続く。ポリヘドリン配列には、同時トランスフェクトされた野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列が両側で隣接される。多くの他のバキュロウイルスベクターが、ｐＲＧ１に代わって使用され得る（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９（１９８９））。
【０３６５】
プラスミドを、制限酵素ＸｂｏＩおよびＸｂａＩで消化し、次いでウシ腸ホスファターゼを使用して、当該分野で公知の手順により脱リン酸した。そのＤＮＡを次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ．，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　Ｃａ）を用いて１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡを、Ｖ２と称する。
【０３６６】
フラグメントＦ２および脱リン酸プラスミドＶ２を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そしてＶＥＧＦ−２遺伝子を有するプラスミド（ｐＢａｃ　ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２）を含む細菌を、酵素ＢａｍＨ１およびＸｂａＩを使用して同定した。クローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０３６７】
５ｍｇのプラスミドｐＢａｃ　ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２を、リポフェクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１７（１９８７））を使用して、１．０ｍｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＪ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトした。
【０３６８】
１ｍｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＪウイルスＤＮＡおよび５ｍｇのプラスミドｐＢａｃ　ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２を、５０ｍｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合した。その後、１０ｍｌのリポフェクチンおよび９０ｍｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７１１）に滴下した。プレートを前後に傾けて、その新しく添加した溶液を混合した。次いで、プレートを、２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーター内に置き戻し、そして培養を、２７℃で４日間継続した。
【０３６９】
４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出に記載されるのと同様にプラークアッセイを行った。改変により、「Ｂｌｕｅ　Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロースゲルを用いて、青色染色されたプラークの容易な単離を可能にした。（「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。
【０３７０】
段階希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加し、青色染色されたプラークをＥｐｐｅｎｄｏｒｆピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００ｍｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに再懸濁した。寒天を手短な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いでそれらを４℃で保存する。
【０３７１】
Ｓｆ９細胞を、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させた。細胞に、１の感染多重度（「ＭＯＩ」）で組換えバキュロウイルスＶ−ｇｐ６７−ＶＥＧＦ−２を感染させた。６時間後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００　ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で置換した。４２時間後、５ｍＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５ｍＣｉの３５Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、そして標識タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０３７２】
培地およびＳｆ９細胞の細胞質由来のタンパク質を、非還元条件下および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。それぞれ、図８Ａおよび図８Ｂを参照のこと。培地を、５０ｍＭ　ＭＥＳ、ｐＨ５．８に対して透析した。透析後、沈殿物を得て、そして１００ｍＭ　クエン酸Ｎａ、ｐＨ５．０中に再懸濁した。再懸濁した沈殿を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより再度分析し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。図９を参照のこと。
【０３７３】
培地上清をまた、５０ｍＭ　ＭＥＳ、ｐＨ５．８中に１：１０で希釈し、そしてＳＰ−６５０Ｍカラム（１．０×６．６ｃｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）に流速１ｍｌ／分で適用した。タンパク質を、２００、３００および５００ｍＭ　ＮａＣｌでの段階勾配で溶出した。ＶＥＧＦ−２は、５００ｍＭでの溶出を用いて得られた。溶出物を、還元剤ｂ−メルカプトエタノールの存在下または非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。図１０を参照のこと。
【０３７４】
（実施例４）
（ＣＯＳ細胞における組換えＶＥＧＦ−２の発現）
プラスミドＶＥＧＦ−２−ＨＡの発現は、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来し、このベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下を含む：（１）ＳＶ４０複製起点、（２）アンピシリン耐性遺伝子、（３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、（４）ＣＭＶプロモーター、それに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位。ＶＥＧＦ−２前駆体全体およびその３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、このベクターのポリリンカー領域内にクローン化した。従って、組換えタンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーター下で指向される。ＨＡタグは、（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７（１９８４））に以前に記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いた、組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
【０３７５】
プラスミド構築ストラテジーは、以下に記載の通りである。
【０３７６】
ＶＥＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ番号９７１４９）を、以下の２つのプライマーを使用するＰＣＲにより構築した：５’プライマー（ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＣ　ＴＡＣ　ＣＣＡ）（配列番号１４）は、ＢａｍＨ１部位を含み、続いて、開始コドンから始まるＶＥＧＦ−２のコード配列の１８ヌクレオチドを含む；３’配列（ＣＧＣ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　ＧＴＡ　ＧＴＣ　ＴＧＧ　ＧＡＣ　ＧＴＣ　ＧＴＡ　ＴＧＧ　ＧＴＡ　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＣＴ　３’）（配列番号１５）は、ＸｂａＩ部位、ＨＡタグ、ＸｈｏＩ部位、およびＶＥＧＦ−２コード配列の１５最後のヌクレオチド（終止コドンは含んでいない）に対する相補配列を含む。従って、ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ部位、コード配列、これに続くＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびインフレームで融合されたＨＡタグ、ＨＡタグに続く翻訳終止コドン、ならびにＸｂａＩ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ　９２０３７）内に形質転換し、形質転換培養物を、アンピシリン培地プレートへプレーティングし、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析によって試験した。組換えＶＥＧＦ−２発現のために、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））により発現ベクターでトランスフェクトした。ＶＥＧＦ−２−ＨＡタンパク質の発現を、放射標識化および免疫沈降法（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））によって検出した。細胞を、トランスフェクションの２日後に３５Ｓ−システインで８時間標識した。次いで、培養培地を収集し、そして細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ＮＰ−４０、０．１％　ＳＤＳ、１％　ＮＰ−４０、０．５％　ＤＯＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ　７．５）（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７（１９８４））で溶解した。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて沈降した。沈降されたタンパク質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【０３７７】
（実施例５）
（血管内皮細胞の増殖に対する部分精製したＶＥＧＦ−２タンパク質の効果）
１日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１６ユニット／ｍｌのヘパリン、および５０ユニット／ｍｌの内皮細胞増殖補完物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含むＭ１９９培地中、２〜５×１０４細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種した。２日目に、培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌのヘパリンを含む、Ｍ１９９で置換した。最初の４５アミノ酸残基を欠く配列番号２のＶＥＧＦ−２タンパク質、（ＶＥＧＦ）および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を、示した濃度で添加した。４日目および６日目に、培地を置換した。８日目に、細胞数を、Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒで決定した（図１２を参照のこと）。
【０３７８】
（実施例６　血管内皮細胞の増殖への精製ＶＥＧＦ−２タンパク質の影響）
１日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１６単位／ｍｌのヘパリン、５０単位／ｍｌの内皮細胞増殖補充物（ＥＣＧＳ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含むＭ１９９培地に２〜５×１０４細胞／３５ｍｍディッシュの密度で播種した。２日目に、培地を、１０％ＦＢＳ、８単位／ｍｌのヘパリンを含むＭ１９９と置き換えた。最初の４５アミノ酸残基を除いた配列番号２の精製ＶＥＧＦ−２タンパク質をこの時点で培地に添加した。４日目および６日目に、培地を新鮮な培地および補充物と置き換えた。８日目に、Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒで細胞数を決定した（図１３を参照のこと）。
【０３７９】
（実施例７　遺伝子治療を介する発現）
線維芽細胞を、被験体から皮膚生検によって得る。得られた組織を組織培養培地中に置き、そして小片に分ける。組織の小塊を、組織培養フラスコの湿った表面上に置き、各フラスコ中におよそ１０片を置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉し、そして室温に一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、そして組織塊をフラスコの底に付着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％　ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、これを３７℃でおよそ１週間インキュベートする。この時点で新鮮な培地を添加し、その後数日ごとに取り替える。さらに２週間の培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコにスケールアップ（ｓｃａｌｅ）する。
【０３８０】
モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復に隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ　７：２１９−２２５（１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分別し、そしてガラスビーズを用いて精製する。
【０３８１】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位をさらに含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス直鎖状骨格、ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を使用して、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いで、これを、適切に挿入された目的の遺伝子をベクターが有することを確認する目的のために、カナマイシン含有寒天上にプレーティングする。
【０３８２】
アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中の組織培養物中で、コンフルエントな密度になるまで増殖させる。次いで、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質導入する。この時点でパッケージング細胞は、遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生する（この時点でパッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる）。
【０３８３】
新鮮な培地を、形質導入したプロデューサー細胞に添加し、その後、コンフルエントなプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから培地を回収する。感染性ウイルス粒子を含む使用済みの培地を、ミリポア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通して濾過して、剥離したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる。培地を、線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去し、そして直ちにプロデューサー細胞からの培地に置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、またはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。
【０３８４】
次いで、操作された線維芽細胞は、単独で、またはｃｙｔｏｄｅｘ　３マイクロキャリアービーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれかで、宿主に注入する。この時点で、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。
【０３８５】
（実施例８　ヒト胎児組織および成体組織におけるＶＥＧＦ−２　ｍＲＮＡの発現）
（実験設計）
ノーザンブロット分析を、ヒト胎児組織および成体組織におけるＶＥＧＦ−２　ｍＲＮＡの発現のレベルを試験するために実行した。ＶＥＧＦ−２タンパク質の完全ヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡプローブを、製造者の指示書に従って、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅｏＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３２Ｐで標識した。標識後、このプローブを、製造者のプロトコール番号ＰＴ１２００−１に従って、ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ−１００＊カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して精製した。次いで、精製した標識化プローブを、ＶＥＧＦ−２　ｍＲＮＡについて種々のヒト組織を試験するために使用した。
【０３８６】
種々のヒト組織（胎児腎臓、胎児肺、胎児肝臓、脳、腎臓、肺、肝臓、脾臓、胸線、骨髄、睾丸、胎盤、および骨格筋）を含む、複数の組織のノーザン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより入手した。ＭＴＮブロットを、製造者のプロトコール番号ＰＴ１１９０−１に従って、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ＊ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、標識化プローブを用いて試験した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、このブロットを、増感スクリーンとともに−７０℃で一晩フィルムに曝露し、そして標準的な手順に従って現像した。
【０３８７】
（結果）
ＶＥＧＦ−２　ｍＲＮＡの発現は、血管平滑筋およびいくつかの高度に血管化された組織において豊富である。ＶＥＧＦ−２は、造血活性および血管形成活性と関連する組織、すなわち胎児腎臓、胎児肺、骨髄、胎盤、脾臓および肺組織において有意により高いレベルで発現される。ＶＥＧＦ−２の発現レベルは、成体腎臓、胎児肝臓、成体肝臓、睾丸において低く；そして胎児脳および成体脳においてはほとんど検出不可能である（図１４を参照のこと）。
【０３８８】
初代培養細胞において、ＶＥＧＦ−２　ｍＲＮＡの発現は、血管平滑筋細胞および皮膚の線維芽細胞において豊富であるが、ヒト臍静脈内皮細胞においてはるかにより低い（図１５を参照のこと）。このｍＲＮＡ分布パターンは、ＶＥＧＦのそれと非常に類似する。
【０３８９】
（実施例９　アミノ末端欠失変異体およびカルボキシ末端欠失変異体の構築）　生物学的に活性なＶＦＧＦ−２ポリペプチドを同定および分析するために、ＶＥＧＦ−２の欠失変異体のパネルを、発現ベクターｐＨＥ４ａを使用して構築した。
【０３９０】
（１．ｐＨＥ４中のＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築）
Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質発現ベクターｐＨＥ４へのＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｌ２１５（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２１５）の、ポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した：
５’プライマー（ＮｄｅＩ／ＳＴＡＲＴおよびコード配列の１８ヌクレオチド）：
５’−ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＡＡＡ−３’（配列番号１９）
３’−プライマー（Ａｓｐ７１８、ＳＴＯＰ、およびコード配列の１５ヌクレオチド）：
５’−ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＧＣＡ−３’（配列番号２０）
上記の５’プライマー（配列番号１９）は、ＮｄｅＩ制限部位を組込み、そして上記の３’プライマー（配列番号２０）は、Ａｓｐ７１８制限部位を組込む。この５’プライマー（配列番号１９）はまた、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、そしてＶＥＧＦ−２コード領域とインフレームであるＡＴＧ配列を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にし、一方３’プライマー（配列番号２０）は、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、そしてＶＥＧＦ−２コード領域とインフレームである１つの終止コドン（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉで利用されるコドン）を含み、これはＥ．ｃｏｌｉにおける正確な翻訳の終結を確かにする。
【０３９１】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、および、鋳型として、例えば実施例３において構築されるような、成熟ＶＥＧＦ−２についてのヌクレオチド配列（配列番号１８のアミノ酸２４〜４１９）を使用して行った。生じたアンプリコンを、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＮｄｅＩ／Ａｓｐ７１８消化したｐＨＥ４ａ発現ベクターにサブクローニングした。
【０３９２】
（２．ｐＨＥ４中のＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築）
Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質発現ベクターｐＨＥ４へのＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｒ２２７（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７）の、ポリメラーゼ連鎖反応を指向する増幅およびサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、以下の塩基配列を用いて合成した：
５’プライマー（ＮｄｅＩ／ＳＴＡＲＴおよびコード配列の１８ヌクレオチド）：
５’−ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＡＡＡ−３’（配列番号１９）
３’−プライマー（Ａｓｐ７１８、ＳＴＯＰ、およびコード配列の１５ヌクレオチド）：
５’−ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＣＡ　ＡＣＧ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＧＧＡ−３’（配列番号２１）
上記のプライマーの場合、ＮｄｅＩまたはＡｓｐ７１８制限部位は、５’プライマーおよび３’プライマーにそれぞれ組込まれていた。この５’プライマー（配列番号１９）はまた、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、そしてＶＥＧＦ−２コード領域とインフレームであるＡＴＧ配列を含み、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクローン化されたフラグメントの翻訳を可能にし、一方３’プライマー（配列番号２１）は、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接し、そしてＶＥＧＦ−２コード領域とインフレームである１つの終止コドン（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉで利用されるコドン）を含み、これはＥ．ｃｏｌｉにおける正確な翻訳の終止を確かにする。
【０３９３】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的な条件、および、鋳型として、例えば実施例３において構築されるような、成熟ＶＥＧＦ−２についてのヌクレオチド配列（配列番号１８のアミノ酸２４〜４１９）を使用して行った。生じたアンプリコンを、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＮｄｅＩ／Ａｓｐ７１８消化したｐＨＥ４ａタンパク質発現ベクターにサブクローニングした。
【０３９４】
（３．ｐＡ２ＧＰ中のＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築）
この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ＧＰを、バキュロウイルスリーダーおよびＳｕｍｍｅｒｓら、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ番号１５５５（１９８７）に記載されるような標準的な方法を用いて、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失させたＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２１５）をコードするクローン化されたＤＮＡをバキュロウイルス中に挿入するために使用して、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失させたＶＥＧＦ−２タンパク質を発現させる。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてバキュロウイルスｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルペプチド（リーダー）ならびにＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような便利な制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同じ方向の弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下にある、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介の相同組換えのために両側がウイルス配列で隣接され、クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。
【０３９５】
多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）を、当業者が容易に認識するように、構築物が転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシグナル（必要とされるようなシグナルペプチドおよびインフレームのＡＵＧを含む）を提供する限りは、上記のベクターの代わりに使用し得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１〜３９（１９８９）に記載される。
【０３９６】
図１における、Ｎ−末端の１０２アミノ酸を有さず、かつＣ−末端の２０４アミノ酸を有さないＶＥＧＦ−２タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
【０３９７】
５’プライマーは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（太字）、続いてベクターによって供給されるシグナルペプチドとともにインフレームにとどまるための１スペーサーヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−２タンパク質のコード配列塩基の１７ヌクレオチドを含む配列
【０３９８】
【化１】
2004505619.tif 000005
を有する。３’プライマーは、ＸｂａＩ制限酵素部位（太字）、続いて終止コドンおよびＶＥＧＦ−２の３’コード配列に相補的な１７ヌクレオチドを含む配列
【０３９９】
【化２】
2004505619.tif 000006
を有する。
【０４００】
増幅した配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ　１０１，Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次いで１％アガロースゲル上で再度精製した。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位において、ｐＡ２　ＧＰバキュロウイルス移入ベクター（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ）と連結した。この連結を通して、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２１５）を表すＶＦＧＦ−２　ｃＤＮＡを、バキュロウイルスＧＰ遺伝子のシグナル配列とともにインフレームでクローン化し、そしてベクターのシグナル配列の３’末端に配置した。これを、ｐＡ２ＧＰＶＥＧＦ−２．Ｔ１０３−Ｌ２１５と命名した。
【０４０１】
（４．ｐＡ２ＧＰ中のＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築）
図１における、Ｎ−末端の１０２アミノ酸を有さず、かつＣ−末端の１９２アミノ酸を有さないＶＥＧＦ−２タンパク質（すなわち、配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７）をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
【０４０２】
【化３】
2004505619.tif 000007
プライマーは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（太字）を含み、続いてベクターによって供給されるシグナルペプチドとともにインフレームにとどまるための１スペーサーヌクレオチド、およびＶＥＧＦ−２タンパク質のコード配列塩基の２６ヌクレオチドを含む配列（配列番号２４）を有する。３’プライマーは、ＸｂａＩ制限部位（太字）続いて終止コドンおよびＶＥＧＦ−２の３’コード配列に相補的な２１ヌクレオチドを含む配列
【０４０３】
【化４】
2004505619.tif 000008
を有する。
【０４０４】
増幅した配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ　１０１，Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲルから単離した。次いで、そのフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次いで１％アガロースゲル上で再度精製した。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位において、ｐＡ２　ＧＰバキュロウイルス移入ベクター（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ）と連結した。この連結を通して、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質（図１または配列番号１８のアミノ酸１０３〜２２７）を表すＶＦＧＦ−２　ｃＤＮＡを、バキュロウイルスＧＰ遺伝子のシグナル配列とともにインフレームでクローン化し、そしてベクターのシグナル配列の３’末端に配置した。この構築物を、ｐＡ２ＧＰＶＥＧＦ−２．Ｔ１０３−Ｒ２２７と命名した。
【０４０５】
（５．ｐＣ１におけるＶＥＧＦ−２の構築）
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８〜４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ　４１：５２１〜５３０（１９８５））のフラグメントを含む。マルチプルクローニングサイト（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を有するもの）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。このベクターはさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３Ｎイントロン、ポリアデニル化および終結シグナルを含む。
【０４０６】
ベクターｐＣ１を、ＶＦＧＦ−２タンパク質の発現のために使用する。プラスミドｐＣ１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ［ＡＴＣＣ受託番号３７１４６］の誘導体である。両方のプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドを用いてトランスフェクトされた、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞を、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（アルファマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において細胞を増殖させることによって選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に引証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７〜１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７〜１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｌ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：６４〜６８を参照のこと）。ＭＴＸの増加した濃度において増殖する細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰増殖させることによって、薬物に対する耐性を発達させる。ＤＨＦＲ遺伝子に第２の遺伝子が連結されている場合、それは通常同時増殖され、そして過剰発現される。１，０００コピーより多い遺伝子を有する細胞株を発達させることは、技術水準である。引き続いて、メトトレキサートが取り除かれた場合には、細胞株は染色体に組込まれた増幅した遺伝子を含む。
【０４０７】
プラスミドｐＣ１は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８５年３月：４３８〜４４７０）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ　４１：５２１〜５３０（１９８５））から単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位である：ＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＮｒｕＩ。これらのクローニング部位の後では、プラスミドは、３つすべてのリーディングフレームにおける翻訳終止コドン、続いて３Ｎイントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化部位を含む。他の高度に効率的なプロモーター（例えば、ヒトｂ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）もまた、発現のために使用され得る。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモン遺伝子またはグロビン遺伝子由来の他のシグナルが、同様に使用され得る。
【０４０８】
染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な細胞株はまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフェクションに際して選択され得る。最初に１つより多くの選択マーカーを使用すること（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）は有利である。
【０４０９】
プラスミドｐＣ１を、当該分野において公知の手順によって、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸化する。次いで、そのベクターを、１％アガロースゲルから単離する。
【０４１０】
ＶＥＧＦ−２（ＡＴＣＣ受託番号９７１４９）をコードするＤＮＡ配列を、ＶＥＧＦ−２遺伝子の５’末端および３’末端に対応する２つのプライマーを使用するＰＣＲによって構築した：５’プライマー（５’−ＧＡＴ　ＣＧＡ　ＴＣＣ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＴＣＧ　ＣＴＧ　ＧＧＣ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＴＧＴ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＴＣ　Ｇ−３’（配列番号２６））は、Ｋｌｅｎｏｗで平滑化されたＢａｍＨＩ部位および開始コドンから開始するＶＥＧＦ−２コード配列の４０ヌクレオチドを含む；３’プライマー（５’−ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＴＡＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＴＡＧ　ＡＴＴ　ＡＧＣ　ＴＣＡ　ＴＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＣ　ＴＴＴ−３’（配列番号２７））は、ＢａｍＨＩ部位および終止コドンを含まないＶＥＧＦ−２コード配列の１６ヌクレオチドを含む。
【０４１１】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを、上記のように１％アガロースゲルから単離し、次いでエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで１％アガロースゲル上で再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化したベクターを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ１を含む細菌を同定する。挿入された遺伝子の配列および方向を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。この構築物を、ｐＣ１ＶＥＧＦ−２と呼ぶ。
【０４１２】
（６．ｐＣ４ＳｉｇＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｌ２１５の構築）
プラスミドｐＣ４Ｓｉｇは、ヒトＩｇＧ　Ｆｃ部分の配列およびタンパク質シグナル配列を含むプラスミドｐＣ４（受託番号２０９６４６）である。
【０４１３】
ＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｌ２１５（図１または配列番号１８におけるアミノ酸１０３〜２１５）のポリメラーゼ連鎖反応による増幅およびｐＣ４Ｓｉｇへのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：
５’プライマー（ＢａｍＨＩおよび２６ｎｔのコード配列）：
５’−ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＧＣ−３’（配列番号３４）：
３’プライマー（ＸｂａＩ、停止、および１５ｎｔのコード配列）
５’−ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＴＣＧ　ＧＣＡ　Ｇ−３’（配列番号３５）。
【０４１４】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および例えば、実施例３で構築された成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）に関するヌクレオチド配列を鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＣ４Ｓｉｇベクターへサブクローニングした。
【０４１５】
（７．ｐＣ４ＳｉｇＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｒ２２７の構築）
ＶＥＧＦ−２　Ｔ１０３−Ｌ２１５（図１または配列番号１８におけるアミノ酸１０３〜２２７）のポリメラーゼ連鎖反応による増幅およびｐＣ４Ｓｉｇへのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：
５’プライマー（ＢａｍＨＩおよび２６ｎｔのコード配列）：
５’−ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＧＣ−３’（配列番号３４）：
３’プライマー（ＸｂａＩ、停止、および２１ｎｔのコード配列）
５’−ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＣＧ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＡＡＣ−３’（配列番号２５）。
【０４１６】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および例えば、実施例３で構築された、成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列を、鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＣ４Ｓｉｇベクターへサブクローニングした。
【０４１７】
（８．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｍ２６３の構築）
発現ベクターｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ　４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。マルチクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。このベクターは、さらにラットプレプロインシュリン遺伝子の３Ｎイントロン、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルを含む。
【０４１８】
この例示的な実施例では、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｍ２６３タンパク質（図１または配列番号１８におけるアミノ酸１〜２６３）をコードするクローン化ＤＮＡを、このＣ末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質を発現させるためにプラスミドベクターｐＣ４へ挿入する。
【０４１９】
ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｍ２６３のポリメラーゼ連鎖反応による増幅および発現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：
５’プライマー　５’−ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＡＴＣ　ＣＧＣ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣ　ＧＣＴ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＣ−３’（配列番号２８）
３’プライマー　５’−ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＡＴＣ　ＡＣＡ　ＴＡＡ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣ−３’（配列番号２９）。
【０４２０】
上記の５’プライマーに関してはＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プライマーに関してはＡｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはまた、ＶＥＧＦ−２コード配列の６ｎｔ、２０ｎｔ、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおけるこのクローン化フラグメントの翻訳を可能にするための、このＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてこの領域とインフレームにある、ＡＴＧ配列を含み、一方、３’プライマーは、ＶＥＧＦ−２コード配列の２ｎｔ、２０ｎｔ、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおいて正確な翻訳終結を保証する、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてこの領域とインフレームにある、１つの終止コドン（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用される）を含む。
【０４２１】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および、例えば、実施例３で構築された、成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）のヌクレオチド配列を鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターへサブクローニングした。この構築物をｐＣ４ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｍ２６３と命名する。
【０４２２】
（９．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｄ３１１の構築）
この例示的実施例では、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｄ３１１タンパク質（図１または配列番号１８におけるアミノ酸１〜３１１）をコードするクローン化ＤＮＡを、このＣ末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質を発現させるためにプラスミドベクターｐＣ４へ挿入する。
【０４２３】
ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｄ３１１のポリメラーゼ連鎖反応による増幅および発現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：
５’プライマー　５’−ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＡＴＣ　ＣＧＣ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣ　ＧＣＴ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＣ−３’（配列番号３０）
３’プライマー　５’−ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＡＴＣ　ＡＧＴ　ＣＴＡ　ＧＴＴ　ＣＴＴ　ＴＧＴ　ＧＧＧ　Ｇ−３’（配列番号３１）。
【０４２４】
上記の５’プライマーに関してはＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プライマーに関してはＡｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはまた、ＶＥＧＦ−２コード配列の６ｎｔ、２０ｎｔ、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおけるクローン化フラグメントの翻訳を可能にするための、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてその領域とインフレームにある、ＡＴＧ配列を含み、一方、３’プライマーは、ＶＥＧＦ−２コード配列の２ｎｔ、２０ｎｔ、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおいて正確な翻訳終結を保証する、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてその領域とインフレームにある、１つの終止コドン（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用される）を含む。
【０４２５】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および、例えば、実施例３で構築された、成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）に関するヌクレオチド配列を鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターへサブクローニングした。
【０４２６】
（１０．ｐＣ４ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｑ３６７の構築）
この例示的実施例では、Ｃ末端欠失ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｄ３１１タンパク質（配列番号１８におけるアミノ酸１〜３１１）をコードするクローン化ＤＮＡを、このＣ末端欠失ＶＥＧＦ−２タンパク質を発現させるためにプラスミドベクターｐＣ４へ挿入する。
【０４２７】
ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｄ３１１のポリメラーゼ連鎖反応による増幅および発現ベクターｐＣ４へのサブクローニングを可能にするために、ＶＥＧＦ−２の所望される領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（以下の塩基配列を有する）を合成した：
５’プライマー　５’−ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＡＴＣ　ＣＧＣ　ＣＡＣ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣ　ＧＣＴ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＣ−３’（配列番号３２）
３’プライマー　５’−ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＴＡＣ　ＣＴＣ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＣ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　ＴＡＣ　ＡＴＴ　Ｃ−３’（配列番号３３）。
【０４２８】
上記の５’プライマーに関してはＢａｍＨＩ制限部位を組み込み、一方、３’プライマーに関してはＡｓｐ７１８制限部位を組み込んだ。この５’プライマーはまた、ＶＥＧＦ−２コード配列の６ｎｔ、２０ｎｔ、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおけるこのクローン化フラグメントの翻訳を可能にするための、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてこの領域とインフレームにある、ＡＴＧ配列を含み、一方、３’プライマーは、ＶＥＧＦ−２コード配列の２ｎｔ、２０ｎｔ、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおいて正確な翻訳終結を保証する、ＶＥＧＦ−２コード領域に隣接しそしてこの領域とインフレームにある、１つの停止コドン（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用される）を含む。
【０４２９】
ポリメラーゼ連鎖反応を、当業者に周知の標準的条件、および、例えば、実施例３で構築された、成熟ＶＥＧＦ−２（アミノ酸２４〜４１９）に関するヌクレオチド配列を鋳型として用いて行った。生じたアンプリコンをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で制限消化し、そしてＢａｍＨＩ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＣ４タンパク質発現ベクターへサブクローニングした。この構築物をｐＣ４ＶＥＧＦ−２　Ｍ１−Ｑ３６７と命名する。
【０４３０】
（実施例１０　ＣＯＳ−７細胞におけるＶＥＧＦ−２タンパク質の一過性発現）
（実験設計）
例えば、実施例４において作製された構築物からのＶＥＧＦ−２−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗおよび共同研究者ら（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８））に記載される方法を用いて、放射性標識化および免疫沈降によって検出した。この目的を達するために、トランスフェクションの２日後に、細胞を３５Ｓシステインを含む培地で８時間インキュベーションすることにより標識した。Ｗｉｌｓｏｎおよび共同研究者ら（前出）によって記載されるように、細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、次いで界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ＮＰ−４０、０．１％　ＳＤＳ、１％　ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶解した。タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈殿させた。次いで、沈殿させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。
【０４３１】
（結果）
図１６に示すように、ｐｃＤＮＡ１　ＶＥＧＦ−２ＨＡでトランスフェクトした細胞は、５６ｋｄおよび３０ｋｄタンパク質を分泌した。この５６ｋｄタンパク質（３０ｋｄタンパク質ではなく）はまた、細胞溶解物において検出され得るが、コントロールでは検出されない。このことは、３０ｋｄタンパク質が５６ｋｄタンパク質の切断から生じるようであることを示唆する。ＨＡタグは、ＶＥＧＦ−２のＣ末端にあるので、この３０ｋｄタンパク質は切断されたタンパク質のＣ末端部分に相当しなければならないが、切断されたタンパク質のＮ末端部分は、免疫沈降によって検出されない。これらのデータは、哺乳動物細胞において発現されたＶＥＧＦ−２タンパク質は、分泌されそしてプロセシングされることを示す。
【０４３２】
（実施例１１　血管内皮細胞の増殖に対するＶＥＧＦ−２の刺激効果）
（実験設計）
ＶＥＧＦ−２の発現は、高度に血管化された組織において豊富である。従って、内皮細胞のいくつかの型の増殖の調節におけるＶＥＧＦ−２の役割を試験した。
【０４３３】
（内皮細胞増殖アッセイ）
増殖因子の有糸分裂活性の評価のために、電子カップリング試薬ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）と共に比色定量ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを行った（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６　ＡＱ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を、９６ウェルプレート（５，０００細胞／ウェル）にて０．１ｍＬの血清を補充した培地に播種し、そして一晩付着させた。０．５％ＦＢＳ中で１２時間の血清飢餓後、ヘパリン（８Ｕ／ｍｌ）を有するかまたは有さずに、条件（０．５％ＦＢＳ中、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ−２）をウェルに４８時間添加した。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（１：０．０５）を、１ウェルあたり加え、３７℃で１時間インキュベートさせて、その後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４９０ｎｍでの吸光度を測定した。コントロールウェル（いくつかの培地、無細胞）からのバックグラウンド吸光度を差し引いて、そして７つのウェルについて各条件を並行して行った。Ｌｅａｋら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５１２−５１８（１９９４）を参照のこと。
【０４３４】
（結果）
ＶＥＧＦ−２は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および皮膚微小血管内皮細胞の増殖をわずかに刺激した（図１７および１８）。ＶＥＧＦ−２の刺激効果は、子宮内膜内皮細胞および微小血管内皮細胞の増殖においてより明白である（図１９）。子宮内膜内皮細胞（ＨＥＥＣ）は、ＶＥＧＦ−２に対する最高の応答（微小血管内皮細胞に対するＶＥＧＦの効果の９６％）を示した。ＶＥＧＦ−２に対する微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）の応答は、ＶＥＧＦと比べると７３％であった。ＶＥＧＦ−２に対するＨＵＶＥＣおよびＢＡＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）の応答は、それぞれかなり低く１０％および７％であった。ＶＥＧＦ−２タンパク質の活性は、他のバッチの刺激効果よりも顕著により高い、ＨＵＶＥＣ増殖に対する特定のバッチの刺激効果を有して、異なる精製の実行の間で変化した。
【０４３５】
（実施例１２　ＰＤＧＦ誘導した血管平滑筋細胞増殖の阻害）
ＶＥＧＦ−２発現は、血管平滑筋細胞において高い。平滑筋は、再狭窄のような血管疾患についての重要な治療標的である。平滑筋細胞に対するＶＥＧＦ−２の潜在的効果を評価するために、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡｏＳＭＣ）増殖に対するＶＥＧＦ−２の効果を試験した。
【０４３６】
（実験設計）
ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えばＢｒｄＵｒｄの取り込みによって測定し得る。簡単に言えば、４−チャンバスライド上で増殖させたサブコンフルエントな休止細胞を、ＣＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、細胞を１０％仔ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌ　ＢｒｄＵｒｄでパルスする。２４時間後、免疫細胞化学を、ＢｒｄＵｒｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いることによって行う。簡単には、細胞を、変性溶液に曝露後、ビオチン化マウス抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と共に４℃で２時間インキュベートし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジンと共にインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、細胞を、顕微鏡試験のためにマウントし、そしてＢｒｄＵｒｄ陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵｒｄ指数を、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ陽性細胞の割合として計算する。さらに、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出を、明視野照明および暗視野ＵＶ蛍光照明の同時使用によって個々の細胞について行う。Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６；２７１（３６）：２１９８５−２１９９２（１９９６）を参照のこと。
【０４３７】
（結果）
ＶＥＧＦ−２は、ＰＤＧＦによって誘導された血管平滑筋細胞の増殖に対して阻害効果を有するが、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）によって誘導された血管平滑筋細胞の増殖に対して阻害効果を有さない（図２０）。
【０４３８】
（実施例１３　内皮細胞移動の刺激）
内皮細胞移動は、新脈管形成に関与する重要な工程である。
【０４３９】
（実験設計）
本実験を用いて、ＶＥＧＦ−２がリンパ内皮細胞移動（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を刺激し得るという可能性を探求する。現在のところ、このようなモデルの刊行された報告は存在しない。しかし、本発明者らは、血管内皮細胞移動のモデルを、本質的に以下のようなに、リンパ内皮細胞での使用について採用している：
内皮細胞移動アッセイを４８ウェル微量走化性（ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）チャンバを用いて行う（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ　Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ　Ｊｈｏｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ，Ｗ．，Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｈ．Ｊ．，およびＬｅｏｎａｒｄ，Ｅ．Ｊ．「Ａ　４８　ｗｅｌｌ　ｍｉｃｒｏ　ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９８０；３３：２３９−２４７）。８μｍの孔径を有するポリビニルピロリドン非含有ポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、０．１％ゼラチンで、少なくとも６時間室温でコートし、そして滅菌空気下で乾燥する。試験物質を、０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＭ１９９中で適切な濃度にまで希釈し、そして２５μｌの最終希釈液を、改変したボイデン装置の下部チャンバに置く。サブコンフルエントな初期の継代（２〜６）のＨＵＶＥＣおよびＢＭＥＣ培養物を、洗浄し、そして細胞脱離を達成するのに必要とされる最小の時間でトリプシン処理する。下部チャンバと上部チャンバの間にフィルターを置いた後、１％ＦＢＳを含む５０μｌのＭ１９９に懸濁した２．５×１０５の細胞を、この上部コンパートメントに播種する。次いでこの装置を、細胞移動を可能にするために５％ＣＯ２で加湿したチャンバ中で３７℃で５時間インキュベートする。インキュベーション期間後、このフィルターを取り出し、そして非移動細胞を有するフィルターの上側を、ラバーポリスマンでスクラップする。このフィルターをメタノールで固定し、そしてＧｉｅｍｓａ溶液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）で染色する。移動を、各ウェル中の３つの無作為の高倍率視野（４０×）の細胞を計数することによって定量し、そして全てのグループを４連で行う。
【０４４０】
（結果）
４８ウェル微量走化性チャンバを用いてＨＵＶＥＣ移動を試験するアッセイにおいて、ＶＥＧＦ−２は、ＨＵＶＥＣの移動を刺激し得た（図２１）。
【０４４１】
（実施例１４　内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激）
血管内皮により放出される一酸化窒素は、血管内皮弛緩の媒介物であると考えられている。ＶＥＧＦ−１は、ＶＥＧＦ−１に応答した内皮細胞による一酸化窒素の生成を誘導することが実証されている。結果として、ＶＥＧＦ−２活性を、ＶＥＧＦ−２に応答した内皮細胞による一酸化窒素の生成を測定することによってアッセイし得る。
【０４４２】
（実験設計）
一酸化窒素を、２４時間の飢餓そして引き続く様々なレベルのＶＥＧＦ−１およびＶＥＧＦ−２に対する４時間の曝露後の、コンフルエントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレートにおいて測定する。培地における一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を使用して、硝酸レダクターゼによる一酸化窒素由来硝酸の還元後の亜硝酸塩の総計を測定することによって、決定する。一酸化窒素放出に対するＶＥＧＦ−２の効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験した。
【０４４３】
簡単に言えば、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出を、ＮＯメーターに接続したＮＯ特異的ポーラログラフィー電極（Ｉｓｏ−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）（１０４９）で測定した。ＮＯ成分の較正を、以下の式に従って行った：
２ＫＮＯ２＋２ＫＩ＋２Ｈ２ＳＯ４６２ＮＯ＋Ｉ２＋２Ｈ２Ｏ＋２Ｋ２ＳＯ４。
標準的な検量線を、段階的濃度のＫＮＯ２（０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）をＫＩおよびＨ２ＳＯ４を含む検量液に添加することによって得た。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性は、標準の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＮＯガスからのＮＯの測定によってあらかじめ決定した（１０５０）。培養培地を除去し、そしてＨＵＶＥＣをダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄した。次いで、細胞を、６ウェルプレート中の５ｍｌの濾過したクレブス−ヘンゼライト溶液に浴し、そして細胞プレートを、スライドウォーマー（Ｌａｂ　Ｌｉｎｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）上で保持して、温度を３７℃に維持した。ＮＯセンサープローブを、ウェル中へ垂直に挿入し、溶液の表面の２ｍｍ下でこの電極のチップを保持しながら、その後、これらの異なる条件を加えた。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を陽性コントロールとして用いた。放出したＮＯの量を、１×１０６個の内皮細胞あたりのピコモル濃度として表わした。報告された全ての値は、各グループ（細胞培養ウェルの数）における４〜６回の測定の平均であった。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照のこと。
【０４４４】
（結果）
ＶＥＧＦ−２は、ＶＥＧＦより高いレベルにまで、ＨＵＶＥＣでの一酸化窒素放出を刺激することが可能であった（図２２）。このことは、ＶＥＧＦ−２が血管透過性および脈管拡張を改変し得ることを示唆した。
【０４４５】
（実施例１５：ＶＥＧＦ−２の新脈管形成における索形成に対する効果）
新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化に顕著な索形成である。このバイオアッセイは、微小血管内皮細胞がインビトロで培養した場合に毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。
【０４４６】
（実験計画）
ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）をＣｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．から増殖（継代２）細胞として購入し、そしてＣｅｌｌ　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓのＣＡＤＭＥＣ増殖培地中（ＣＡＤＭＥＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ）で培養し、そして継代５で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培養プレートのウェルをＣｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓの付着因子培地（Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｍｅｄｉｕｍ）（２００ｍｌ／ウェル）で、３０分間３７℃でコーティングする。ＣＡＤＭＥＣを、このコーティングしたウェルに７，５００細胞／ウェルで播種し、増殖培地中で一晩培養する。次いで、この増殖培地を、コントロール緩衝液またはＨＧＳタンパク質（０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する３００ｍｇのＣｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓの索形成培地（Ｃｈｏｒｄ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ）で置き換え、そして細胞をさらに４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ　ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析機の使用によって定量する。全てのアッセイを３連で行う。
【０４４７】
市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を陽性コントロールとして使用する。β−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を陰性コントロールとして使用する。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして使用する。
【０４４８】
（結果）
ＶＥＧＦ２は、内皮細胞増殖をまた刺激するＩＦＮαに類似して索形成を阻害することが観察された（図２３）。この阻害効果は、索形成プロセスと相互に両立しない内皮細胞増殖の二次的効果であり得る。
【０４４９】
（実施例１６：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果）
ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分確立された系である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化されかつ定量化し得る。ＶＥＧＦ−２がＣＡＭにおいて新脈管形成を刺激し得る能力を試験した。
【０４５０】
（実験計画）
（胚）
Ｗｈｉｔｅ　Ｌｅｇｈｏｒｎニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ）の受精卵およびウズラ（Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ　ｃｏｔｕｒｎｉｘ）の受精卵を、３７．８℃かつ湿度８０％でインキュベートした。１６日齢ニワトリおよび１３日齢のウズラの胚の分化したＣＡＭを、以下の方法を用いて研究した。
【０４５１】
（ＣＡＭアッセイ）
発生４日目に、窓を鶏卵の卵殻に作製した。胚を正常な発生についてチェックし、そして卵をセロテープ（登録商標）で塞いだ。それらを、１３日目までさらにインキュベートした。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を約５ｍｍ直径のディスクに切った。滅菌しかつ無塩の増殖因子を蒸留水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスク上にピペットで移した。風乾後、逆にしたディスクをＣＡＭに適用した。３日後、標本を３％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアミドで固定し、そして０．１２Ｍ　カコジル酸ナトリウム緩衝液でリンスした。それらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ　Ｍ８］で撮影し、そして上記のように半超薄片および超薄片切片化するために包埋した。コントロールをキャリアディスク単独で行った。
【０４５２】
（結果）
このデータは、ＶＥＧＦ−２が未処理コントロールと比較して、ＣＡＭアッセイにおいて新脈管形成を９倍刺激し得ることを実証する。しかし、この刺激は、ＶＥＧＦ刺激のレベルのわずか４５％である（図２４）。
【０４５３】
（実施例１７：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成アッセイ）
（実験計画）
タンパク質活性を試験するために新脈管形成についてインビボモデルを確立するために、マウスおよびラットに、２０ｍｇのＢＳＡ（陰性コントロール）、１ｍｇのｂＦＧＦおよび０．５ｍｇのＶＥＧＦ−１（陽性コントロール）のいずれかを含むメチルセルロースディスクを皮下移植する。
【０４５４】
このＢＳＡディスクは、ほとんど血管新生を含まないはずであるが、陽性コントロールディスクは、血管形成の徴候を示すはずである。９日目、一匹のマウスがｂＦＧＦに対する明瞭な応答を示した。
【０４５５】
（結果）
両方のＶＥＧＦタンパク質は、視覚的な推定によって約２の因子によってＭａｔｒｉｇｅｌ細胞性を増強するようである。
【０４５６】
さらなる３０匹のマウスを、ＢＳＡ、ｂＦＧＦ、および種々の量のＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２−Ｂ８、およびＶＥＧＦ−２−Ｃ４を含むディスクで移植した。各マウスは、１つのコントロールおよび１つの実験ディスクではなく、２つの同一のディスクを受け取った。
【０４５７】
回収された全てのディスクのサンプルを、フォン・ビルブラント因子を使用して免疫化し、ディスク中の内皮細胞の存在について検出し、そしてｆｌｋ−１およびｆｌｔ−４を検出し、血管性内皮細胞とリンパ性内皮細胞との間を区別した。しかし、新生血管形成およびリンパ腫発生（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の最終的な組織学的分析は、決定し得なかった。
【０４５８】
（実施例１８：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出）
（実験計画）
虚血に対するインビボでのＶＥＧＦ−２の効果を研究するため、ウサギ後肢虚血モデルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓら、Ａｍ　Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ　１４７：１６４９−１６６０（１９９５））ように１つの大腿動脈の外科的除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓の逆行性伝播および外腸骨動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は、内腸骨動脈から生じる側副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ　Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ　１４７：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で、ウサギの手術後の回復および内因性の側副血管の発達を可能にする。手術（０日目）後１０日目に、ベースライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、（Ｒｉｅｓｓｅｎ，Ｒ．ら、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２））に記載されるようなヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用いる動脈遺伝子移入技術により、５００ｍｇの裸のＶＥＧＦ発現プラスミドを用いてトランスフェクトする。ＶＥＧＦ−２を処置に用いる場合、５００ｍｇのＶＥＧＦ−２タンパク質またはコントロールの単回ボーラスを、注入カテーテルを通じて１分間にわたり、虚血肢の内腸骨動脈中に送達する。３０日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギで測定する。
【０４５９】
（結果）
ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５、頂部パネル）および裸の発現プラスミド（図２５、中部パネル）は、虚血肢の以下のパラメーターを回復可能である。血流の回復、血管造影スコアは、５００ｍｇのタンパク質の投与と比較して（図２５、底部パネル）、５００ｍｇプラスミドの投与によってわずかに多いようである。この回復の程度は、別々の実験におけるＶＥＧＦによる回復と適合している（データは示されていない）。血管拡張は、同一の結果を活性することができなかったことから、血流の回復は、単純に血管拡張効果に起因しているのではないことを示唆している。
【０４６０】
１．ＢＰ比（図２５ａ）
虚血肢の収縮期血圧　対　正常肢の収縮期血圧の血圧比
２．血流および逆流（図２５ｂ）
停止ＦＬ：非拡張状態の間の血流
最大ＦＬ：完全拡張状態の間の血流（また、血管量の間接的測定）
逆流が、最大ＦＬ：停止ＦＬという比に反映される。
【０４６１】
３．血管造影値（ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｓｃｏｒｅ）（図２５ｃ）
これを側副血管の血管造影により測定する。値を、かぶせたグリッド内の円の百分率（ウサギ大腿の総数ｍで割った、横断する不透明化動脈を用いる）により決定する。
【０４６２】
４．毛細管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）密度（図２５ｄ）
後肢から得た光学顕微鏡用切片において決定した側副毛細血管の数。
【０４６３】
議論されるように、ＶＥＧＦ−２は、同時精製されたＮ末端およびＣ末端フラグメントにプロセシングされる。Ｎ末端フラグメントはインタクトな推定機能的ドメインを含み、そして生物学的活性の原因となり得る。
【０４６４】
（実施例１９：ＶＥＧＦ−２の血管拡張に対する効果）
上記のようにＶＥＧＦ−２は、ＮＯ放出を刺激し得、血管内皮拡張のメディエーターである。血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、自然高血圧ラット（ＳＨＲ）において、ＶＥＧＦ−２が血圧に影響を与える能力を、試験する。ＶＥＧＦ−２は、拡張性血圧の用量依存の減少を引き起こす（図２６ａおよびｂ）。３００ｍｇ／ｋｇの用量が投与された場合に統計学的有意性を達成したＶＥＧＦ−２の漸増用量を用いて、拡張性血圧における着実な減少が存在した。この用量において観察された変化は、アセチルコリン（０．５ｍｇ／ｋｇ）で見出された変化と異なったものではなかった。減少した平均動脈圧力（ＭＡＰ）も同様に観察された（図２６ｃおよびｄ）。ＶＥＧＦ−２（３００ｍｇ／ｋｇ）およびアセチルコリンは、これらのＳＨＲ動物のＭＡＰを正常なレベルまで減少した。
【０４６５】
さらに、ＶＲＧＦ−２のＢ８、Ｃ５、およびＣ４プレップの漸増用量（０、１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）を１３〜１４週齢の自然高血圧ラット（ＳＨＲ）に投与した。データを平均値＋／−標準誤差として示す。統計学的分析を両側ｔ検定を使用して行ない、そして統計的有意性を緩衝液単独への応答に対するｐ＜０．０５として定義した。
【０４６６】
ＶＲＧＦ−２（Ｃ５プレップ）を使用する研究は、血圧を有意に減少するが、応答の大きさは、９００ｍｇ／ｋｇの用量で使用される場合でさえ、ＶＲＧＦ−２（Ｂ８プレップ）を使用して観察される応答ほど大きくなかったことを明らかにした。
【０４６７】
ＶＲＧＦ−２（Ｃ４調製物）を使用する研究は、このＣＨＯ発現タンパク質調製物が、Ｃ５を使用して見出される結果と類似した結果を生じた（すなわち、Ｂ８調製物で観察される大きさよりもはるかに小さいが統計学的に有意である）。
【０４６８】
コントロールとして、そして、ＶＲＧＦ−２のＣ４およびＣ５バッチは、微小な、しかし統計学的に有意な、血圧における変化を生じたので、実験を別のＣＨＯ発現タンパク質Ｍ−ＣＩＦを使用して行なった。１０〜９００ｍｇ／ｋｇで変化する用量のＭ−ＣＩＦの投与は、拡張期の血圧における有意な変化を発生しなかった。平均動脈血圧における微小な統計学的に有意な減少は、１００〜９００ｍｇ／ｋｇの用量で観察されたが、用量応答は言及されなかった。これらの結果は、ＶＲＧＦ−２のＣ４およびＣ５バッチで観察される血圧における減少が特異的（すなわち、ＶＲＧＦ−２関連）であることを示す。
【０４６９】
（実施例２０：ラット虚血皮膚弁モデル）
（実験計画）
評価パラメーターとして、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免疫組織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間のＶＥＧＦ−２の発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用いて研究する。
【０４７０】
このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける：
ａ）虚血皮膚、
ｂ）虚血皮膚創傷、
ｃ）通常の創傷。
【０４７１】
実験プロトコルは以下を含む：
ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ　ｐｅｄｉｃｌｅ　ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ　ｒａｎｄｏｍ　ｓｋｉｎ　ｆｌａｐ）（動物の背下部におよぶ筋皮弁）を生じさせること、
ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくること（直径４〜６ｍｍ）、
ｃ）１ｍｇ〜１００ｍｇの種々の投薬量範囲でＶＥＧＦ−２を用いて、（創傷後の０、１、２、３、４日目に）切除創傷の局所的な処置をすること、
ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集すること。
【０４７２】
（実施例２１：末梢動脈疾患モデル）
ＶＥＧＦ−２を用いる新脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合、虚血周囲の血流の回復を得る新規の治療的ストラテジーとして開発された。
【０４７３】
（実験計画）
実験プロトコルは以下を含む：
ａ）一方の側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮し、他方の側の後肢は、コントロールの役割をする。
【０４７４】
ｂ）ＶＥＧＦ−２を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬量範囲で、一週間あたり静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜３週間、送達する。
【０４７５】
ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、１、２、および３週間目に、ＶＥＧＦ−２の発現の分析ならびに組織学のために収集する。生検もまた、他方の側の対側後肢の正常な筋肉において行う。
【０４７６】
（実施例２２：虚血性心筋疾患モデル）
ＶＥＧＦ−２を、側副血管の発達を刺激し得、そして冠状動脈閉塞後の新しい血管を再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ＶＥＧＦ−２発現の変化を、インサイチュで研究する。
【０４７７】
（実験計画）
この実験プロトコルは、以下を包含する：
ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、細い縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる
ｂ）ＶＥＧＦ−２タンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬量範囲で、静脈内および／または筋肉内に１週間あたり３回（おそらくそれより多く）で２〜４週間にわたり送達する
ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定のために取り出しそして横断切片化し、そしてインサイチュで分析する。
【０４７８】
（実施例２３：ラット角膜創傷治癒モデル）
この動物モデルは、新生血管形成に対するＶＥＧＦ−２の効果を示す。
【０４７９】
（実験計画）
この実験プロトコルは、以下を包含する：
ａ）角膜の中心から支質層へと１〜１．５ｍｍの長さの切開を作ること
ｂ）眼の外側の角に面する切開の唇縁の下にへらを挿入すること
ｃ）ポケットを作ること（その基底は、眼の縁から１〜１．５ｍｍである）
ｄ）５０ｍｇ〜５００ｍｇのＶＥＧＦ−２を含む小丸剤を、このポケット内に配置すること
ｅ）ＶＥＧＦ−２処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬量範囲内で（毎日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得ること。
【０４８０】
（実施例２４：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド損傷創傷治癒モデル）
（実験計画）
この実験プロトコルは、以下を包含する：
（１．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル）
ＶＥＧＦ−２が治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層（ｆｕｌｌ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、十分に特徴付けられ、臨床的に関連性があり、そして再現可能な損傷創傷治癒モデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮ではなく肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。
【０４８１】
この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多くを有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、第４染色体上に単一の常染色体性の劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：２８３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変異糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したまたは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管病変、基底膜肥厚、および糸球体濾過異常が、これらの動物において記載されている（Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　２９（１）：６０−６７（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血糖症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して耐性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７（１９７８））。
【０４８２】
これらの動物において観察された特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖尿病において観察される治癒に類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））。
【０４８３】
（動物）
遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそれらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いる（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入し、そしてこれらの動物は研究の開始時に８週齢である。動物を個別に飼育し、そして自由に食物および水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。
【０４８４】
（外科的創傷）
創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０））に従って行う。簡単には、創傷処理日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよび２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創傷の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間この創傷は開放させたままである。処置の適用を、創傷させた日から開始して５日間連続で、局所的に与える。処置の前に、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【０４８５】
創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の毎日の測定により決定する。創傷を目盛り付き（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎカリパスを用いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続した上皮が覆う場合に治癒したとみなす。
【０４８６】
ＶＥＧＦ−２を、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲のＶＥＧＦ−２（１日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群には、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【０４８７】
動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０４８８】
（実験計画）
各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の以下の３つの群を評価する：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）ＶＥＧＦ−２。
【０４８９】
（創傷面積および創傷閉鎖の測定）
創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、ならびに創傷の面積の合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日目）と処置後（８日目）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこの創傷面積は、６４ｍｍ２（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下の式を用いて行う：
［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］。
【０４９０】
（組織学）
標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復した皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見が、ＫＧＦ−２を用いる処置によって改変されたかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ　ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いる。
【０４９１】
（免疫組織学）
（再上皮形成）
組織切片をまた、ＡＢＣ　Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナルウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上皮形成の程度を評価することによって決定する。
【０４９２】
（細胞増殖マーカー）
皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ　Ｅｌｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし得、そしてヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして用い得る。各標本は、１次抗体の脱落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の順位は、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい増殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
【０４９３】
（統計学的分析）
実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。０．０５未満のｐ値を有意とみなす。
【０４９４】
（Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル）
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系において十分に実証されている（Ｗａｈｌ　Ｓ．Ｍ．，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ　ａｎｄ　Ｗｏｕｎｄ　ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）；Ｗａｈｌ　Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂ　Ｚ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、新脈管形成を阻害すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ　Ｒ．Ｈ．ら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ　Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ　Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））を低下させること、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓ　Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ　Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｗｏｕｎｄ　ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によって創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ　Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ　Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ　Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｗｏｕｎｄ　ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅ　Ｇ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
【０４９５】
ＶＥＧＦ−２が治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治癒が、メチルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全層切除皮膚創傷に対するＶＥＧＦ−２の複数の局所適用の効果を評価する。
【０４９６】
（動物）
若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ）（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用いる。この動物を、８週齢で購入する。研究の開始時は９週齢である。ラットの治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／ｋｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。
【０４９７】
（外科的創傷）
創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この動物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗浄する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創傷をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷の左を開放する。試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与した日から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷を滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【０４９８】
創傷を、創傷の日および処置の最後に、視覚的に試験し、そして固定した距離で写真に取る。創傷の閉鎖は、図に対して１〜５日目および８日目まで毎日測定することにより決定する。創傷を、目盛りのついたＪａｍｅｓｏｎ　ｃａｌｉｐｅｒを使用して水平方向および垂直方向に測定する。肉芽組織が、もはや目に見えなくなり、そして創傷が、連続した上皮で覆われた場合に、創傷が治癒したと考える。
【０４９９】
ＶＥＧＦ−２を、８日間、ビヒクル中４ｍｇ〜５００ｍｇ／創傷／日のＶＥＧＦ−２の異なる用量範囲を使用して投与する。ビヒクルコントロール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受容する。
【０５００】
動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０５０１】
（実験計画）
各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクルプラセボコントロール、３）ＶＥＧＦ−２処置群。
【０５０２】
（創傷面積および閉鎖の測定）
創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の総面積を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこの創傷面積は、６４ｍｍ２（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下の式を用いて行う：
［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］。
【０５０３】
（組織学）
標本を１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見が、ＶＥＧＦ−２を用いる処置によって改善されるかどうかを評価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者が用いて、創傷の隙間の距離を決定する。
【０５０４】
（統計的分析）
実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみなす。
【０５０５】
（実施例２５：ＶＥＧＦ−２モノクローナル抗体産生のための特定のペプチドフラグメント）
４つの特定のペプチド（ＳＰ−４０、ＳＰ−４１、ＳＰ−４２およびＳＰ−４３と命名された）を、産生した。これらを用いて、ＶＥＧＦ−２プロセシングを分析するためのモノクローナル抗体を産生する。このペプチドを以下に示す：
１．「ＳＰ−４０」：ＭＴＶＬＹＰＥＹＷＫＭＹ（配列番号１８のアミノ酸７０〜８１）
２．「ＳＰ−４１」：ＫＳＩＤＮＥＷＲＫＴＱＳＭＰＲＥＶ（配列番号１８のアミノ酸１２０〜１３６（１３１位でＣ−＞Ｓ変異に注意のこと））
３．「ＳＰ−４２」：ＭＳＫＬＤＶＹＲＱＶＨＳＩＩＲＲ（配列番号１８のアミノ酸２１２〜２２７）
４．「ＳＰ−４３」：ＭＦＳＳＤＡＧＤＤＳＴＤＧＦＨＤＩ（配列番号１８のアミノ酸２６３〜２７９）
（実施例２６：リンパ水腫動物モデル）
この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立におけるＭＥＴＨ１および／またはＭＥＴＨ２の治療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを作製することである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リンパの脈管系の量の定量、総血漿タンパク質、および組織病理学により測定される。急性リンパ水腫は、７〜１０日間観察される。おそらく、より重要なことは、水腫の慢性進行は、３〜４週間まで続く。
【０５０６】
（実験的手順）
手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を、７０％ＥｔＯＨに浸したガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定および体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点）に印をつけた後、足へと色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に、０．０５ｍｌの１％　Ｅｖａｎ’ｓ　Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素の注射の後、周径測定および体積測定を行う。
【０５０７】
目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できるように環状に行う。鉗子および止血鉗子を用いて、皮膚弁を切開かつ分離する。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固または縫合結紮（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ　ｃｏａｇｕｌａｔｅｄ　ｏｒ　ｓｕｔｕｒｅ　ｌｉｇａｔｅ）する。
【０５０８】
顕微鏡を用いて、肢の背部の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認する。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
【０５０９】
この手順より生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リンパ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ　Ｂｕｃｋ）を用いることによって密封する。別々の皮膚縁を、それらの下の筋肉組織に、脚の周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要な場合、その下の筋肉に縫合することによって係留し得る。
【０５１０】
感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きなし）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピークは、代表的には５〜７日までに生じた。次いで、プラトーの水腫ピークを観察する。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径および体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タンパク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かもまた調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ　ｍａｎｎｅｒ）で行う。
【０５１１】
周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用して、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コントロールおよび水腫肢の両方から得る。
【０５１２】
体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカーを用いて脚に等しくしるしをつける。脚を、最初に水に漬け、次いでしるしをつけたレベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚をしるしを付けた領域まで漬ける。
【０５１３】
血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
【０５１４】
肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行う。
【０５１５】
組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、切断するまで−８０ＥＣに、標識したサンプルバッグ中に置く。切断の際に、筋肉を、蛍光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
【０５１６】
（実施例２７：ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの産生のための遺伝子治療を使用する処置の方法−インビボ）
本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置するためにインビボでの遺伝子治療方法を使用することである。この遺伝子治療方法は、ＶＥＧＦ−２の発現を増加させるために、動物中への、プロモーターに作動可能連結されるＶＥＧＦ−２を含む裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）の導入に関する。このような遺伝子治療および送達技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａ，Ｈ．ら（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９、Ｃｈａｏ，Ｊら（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１、Ｔｓｕｒｕｍｉ，Ｙ．ら、（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９４（１２）：３２８１−３２９０（本明細書に参照として引用される）を参照のこと。
【０５１７】
ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間質隙に注入するような動物の細胞への注入可能な物質を送達する任意の方法により送達し得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物をまた、直接動脈内に送達し得る。ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、薬学的に受容可能な液体または水溶性キャリア中に送達し得る。
【０５１８】
用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈降剤などを含む細胞への侵入の補助、促進、または亢進のために作用する任意の送達ビヒクルを含まない配列をいう。しかし、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドをまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ　Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ　Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ　８５（１）：１−７に教示されるような）に送達し得る。
【０５１９】
遺伝子治療方法において使用するＶＥＧＦ−２ベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組みこまれないだけでなく複製を可能にする配列を含まない構築物である。他の遺伝子治療技術とは違って、標的細胞への裸の核酸配列の導入の１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一時的な性質である。研究は、非複製ＤＮＡ配列を、細胞内に導入し、６ヶ月までの期間の間所望のポリペプチドの産生を提供し得ることを示した。
【０５２０】
好ましくは、ＶＥＧＦ−２構築物は、図３０に示されるようにｐＶＧＩ．１プラスミドに作動可能に挿入されるＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドを含む。ｐＶＧＩ．１プラスミド構築物（図３１Ａ〜Ｇに示される配列）は、２０００年７月３日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ　２０１１０−２２０９に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号９ＰＴＡ−２１８５を与えられた。このＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドベクター構築物は、当該分野で公知および上記の方法によって、好ましくは治療的適用として裸のポリペプチドを使用する直接注入によって組織へ送達され得る。このような使用は、上の「治療的使用」、および本明細書中の他の所で記載されるように多くの疾患および状態の処置において新脈管形成の促進を包含する。この構築物の好ましい使用は、臨界後肢虚血および環状動脈疾患の処置を含む。
【０５２１】
ＶＥＧＦ−２構築物を動物内の組織の間隙空間に送達し得、この間隙空間は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織を含む。これらの組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維間、血管または室の壁における弾性線維間、繊維性組織のコラーゲン線維間のムコポリ多糖マトリックス、あるいは結合組織覆鞘筋肉細胞内、または骨の裂孔におけるその同じマトリックスを含む。それは、同様に、循環の血漿およびリンパチャネルのリンパ液によって占められる空間である。これらは、これらの細胞を含む組織中への注射によって、都合良く送達され得る。これらは、好ましくは、持続性の、分化した非分裂細胞に送達され、そしてこの非分割細胞において発現されるが、送達および発現を、未分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液幹細胞または皮膚線維芽細胞のような）において達成し得る。好ましくは、これらを動脈中への直接注射によって送達する。
【０５２２】
裸のポリヌクレオチド注射に関して、有効用量のＤＮＡまたはＲＮＡは、約０．０５ｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。好ましくは、この投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が理解するように、この投与量は、注射の組織部位に従って異なる。適切および有効な用量の核酸配列を当業者によって容易に決定し得、そして処置されている条件および投与経路に依存し得る。投与の好ましい経路は、組織の間隙空間内への、または直接的な動脈内への注射の非経口経路による。しかし、他の非経口経路（例えば、特に、肺または気管支組織、喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入）もまた、使用し得る。さらに、裸のＶＥＧＦ−２構築物をこの手順において使用するカテーテルによって血管形成中に動脈に送達し得る。
【０５２３】
注射されたＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物の、動脈中のインビボでの用量応答効果を以下のように決定する。ＶＥＧＦ−２をコードするｍＲＮＡ産生のための適切なテンプレートＤＮＡを標準の組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。テンプレートＤＮＡ（これは、環状または直鎖状であり得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポゾームで複合体化するかのいずれかである。次いで、ウサギの動脈を種々の量のテンプレートＤＮＡで注射する。
【０５２４】
ウサギの後肢虚血を実施例１８に記載されるように外科的に誘導する。この後すぐに、５つの異なる部位（内転筋（２部位）の、内側ラージ（ｌａｒｇｅ）（２部位）、および半膜様筋肉（１部位）における）を小さい皮膚切開を通して、改良型３ｍｌシリンジおよび２ゲージ針を使用して、ＶＥＧＦ−２をコードするプラスミドＤＮＡを直接注射する。次いで、皮膚を４．０ナイロンを使用して閉じる。
【０５２５】
後肢虚血を救済する能力を、非処置ウサギからの虚血性後肢、子ウシ血圧の測定および流速の動脈内ドップラーガイドワイヤー（Ｄｏｐｐｌｅｒ　ｇｕｉｄｅｗｉｒｅ）測定と比較して、処置した後肢から採取された、光学顕微鏡切片中のキャピラリーの数を測定することによって決定する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６６２−６７０（１９９４））。ウサギにおける上記実験の結果を、ＶＥＧＦ−２ポリヌクレオチドの裸のＤＮＡを使用する、ヒトおよび他の動物における適切な投与量および他の処置パラメーターを推測するために使用し得る。
【０５２６】
（実施例２８、遺伝子治療を使用した処置方法−エクソビボ）
遺伝子治療の１つの方法は、線維芽細胞（これは、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドを発現し得る）を患者に移植することである。一般的に、線維芽細胞は皮膚生検によって被験体から得られる。得られた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に置き、約１０片を各フラスコに置く。このフラスコを逆さまにし、密栓し、そして室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させる。そして組織塊は、依然としてフラスコの底に固定されたままであり、そして新鮮な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地）を添加する。次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０５２７】
この時、新鮮な培地を添加し、そして引き続いて数日毎に交換する。培養のさらなる２週間後、線維芽細胞の単層が出現する。この単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコにスケールアップする。
【０５２８】
ｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ、Ｐ．Ｔら、ＤＮＡ、７：２１９−２５（１９８８）（モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接する）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして引き続いて子ウシ腸ホスファターゼで処理する。直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを使用して精製する。
【０５２９】
ＶＥＧＦ−２をコードするｃＤＮＡを実施例１に示すように、５’および３’末端配列にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含み、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等しい量のモロニーマウス肉腫ウイルス直鎖状骨格および増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で共に加える。得られた混合物をこの２つのフラグメントの連結のために適切な条件下で維持する。次いで、この連結混合物を使用して細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いでこの細菌ＨＢ１０１をベクターが適切に挿入されたＶＥＧＦ−２を含むことを確認する目的のため、カナマイシンを含む寒天上にプレートする。
【０５３０】
アンホトロピックなｐＡ３１７パッケージング細胞またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を組織培養物中でコンフルエントな密度まで、１０％の仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させる。次いで、ＶＥＧＦ−２遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質導入する。ここで、パッケージング細胞は、ＶＥＧＦ−２遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と言われる）。
【０５３１】
新鮮な培地を形質導入されたプロデューサー細胞に添加し、引き続いて、この培地を１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から収集する。感染性のウイルス粒子を含む使用済みの培地をミリポアフィルターを通してろ過し、剥離したプロデューサー細胞を除去する。次いで、この培地を使用して、線維芽細胞を感染する。培地を線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去し、そしてプロデューサー細胞からの培地で迅速に置換する。この培地を除去し、そして新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が高い場合、次いで実質的に全ての線維芽細胞が感染され、そして選択は、必要とされない。この力価が非常に低い場合、次いで、選択マーカー（例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。一旦、線維芽細胞が効率的に感染されると、線維芽細胞を分析して、ＶＥＧＦ−２タンパク質が産生されているかどうか決定する。
【０５３２】
次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する。　（実施例２９、遺伝子治療を使用した処置の方法、相同的組換え）
本発明に従った遺伝子治療の別の方法は、例えば、以下に記載されるような相同的組換えを介した、内因性ＶＥＧＦ−２配列をプロモーターと作動可能に結合させる工程を包含する：１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ　９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ　９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８９３２−８９３５　（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８（１９８９）。この方法は、標的細胞中に存在するが、その細胞中で発現しないか、または所望より低いレベルで発現する遺伝子の活性化を包含する。
【０５３３】
プロモーターおよび標的配列を含む、ポリヌクレオチド構築物が作製され、これらの標的配列は、このプロモーターに隣接する、内因性ＶＥＧＦ−２の５’非コード配列に対して相同性である。このプロモーターが、相同的な組換えに際して内因性配列と作動可能に連結されるように、この標的配列は、ＶＥＧＦ−２の５’末端に十分近接している。このプロモーターおよび標的配列をＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、増幅されたプロモーターは、５’および３’末端に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的配列の５’末端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０５３４】
この増幅されたプロモーターおよび増幅された標的配列を適切な制限酵素で消化し、そして引き続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。消化されたプロモーターおよび消化された標的配列をＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で共に加える。得られた混合物をこの２つのフラグメントの連結のために適切な条件下で維持する。この構築物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿によって精製する。
【０５３５】
この実施例において、ポリヌクレオチド構築物をエレクトロポレーションを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス性配列、ウイルス性粒子、沈殿剤など）と共に投与され得る。このような送達の方法は、当該分野で公知である。
【０５３６】
一旦、細胞がトランスフェクトされると、相同的な組換えが生じ、これは、内因性のＶＥＧＦ−２配列と作動可能に連結されているプロモーターを生じる。これは、細胞中でＶＥＧＦ−２の発現を生じる。発現を、免疫学的な染色または当該分野で公知の任意の他の方法によって検出し得る。
【０５３７】
線維芽細胞を皮膚生検によって被験体から得る。得られた組織をＤＭＥＭおよび１０％胎仔ウシ血清中に置く。指数関数的な増殖期または初期の定常期の線維芽細胞をトリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸濁液のアリコートを計数のために除去し、そして残りの細胞を遠心分離に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣｌ、０．７ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭ　デキストロース）中で再懸濁する。この細胞を再度遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を１ｍｇ／ｍｌ　アセチル化ウシ血清アルブミンを含む、エレクトロポレーション緩衝液で再懸濁する。最終的な細胞懸濁物は、約３×１０６細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションは、再懸濁後すぐに行うべきである。
【０５３８】
プラスミドＤＮＡを標準の技術に従って調製する。ＶＥＧＦ−２遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を付加するＰＣＲで増幅する。２つのＶＥＧＦ−２非コード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方のＶＥＧＦ−２非コード配列（ＶＥＧＦ−２フラグメント１）を５’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端のＸｂａ部位を付加して増幅する；他方のＶＥＧＦ−２非コード配列（ＶＥＧＦ−２フラグメント２）を５’末端のＢａｍＨＩ部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加して増幅する。ＣＭＶプロモーターおよびＶＥＧＦ−２フラグメントを適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ＶＥＧＦ−２フラグメント１−ＸｂａＩ；ＶＥＧＦ−２フラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、共に連結する。生じた連結産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＵＣ１８プラスミドで連結する。
【０５３９】
プラスミドＤＮＡを０．４ｃｍの電極ギャップを有する滅菌キュベット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）に添加する。最終のＤＮＡ濃度は、一般に少なくとも１２０μｇ／ｍｌである。次いで、０．５ｍｌの細胞懸濁物（約１．５×１０６細胞を含有）をキュベットに添加し、そして細胞懸濁物およびＤＮＡ溶液を緩やかに混合する。エレクトロポレーションをＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて行う。電気容量および電圧を９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖにそれぞれ設定する。電圧が上がるにつれて、細胞の生存は減少するが、細胞のゲノム内に導入されたＤＮＡを安定に組みこむ生存細胞のパーセンテージが劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、約１４〜２０ｍＳｅｃのパルス時間が認められるはずである。
【０５４０】
エレクトロポレーションされた細胞を室温で約５分間維持し、次いでキュベットの内容物を滅菌したホールピペットを使用して、穏やかに取り出す。この細胞を直接、１０ｃｍディッシュ中で１０ｍｌの予め温めた栄養培地（１５％仔ウシ血清を有するＤＭＥＭ）に加え、そして３７℃（ＥＣ）でインキュベートする。次の日、培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４時間インキュベートする。
【０５４１】
次いで、操作された線維芽細胞を単独で、またはサイトデックス３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントまで増殖させた後のいずれかで、宿主に注射する。ここで、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。
【０５４２】
（実施例３０、ＶＥＧＦ−２トランスジェニック動物）
ＶＥＧＦ−２ポリペプチドもまた、トランスジェニック動物で発現され得る。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、雌ウシおよび非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むが、これらに限定されない）は、トランスジェニック動物を作製するために使用され得る。特定の実施態様において、本明細書中に記載された技術または当該分野の他の公知の技術を遺伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現するために使用する。
【０５４３】
当該分野で公知の任意の技術を使用して、トランスジェニック動物の創始系統を作製するために、動物中に導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）を導入し得る。このような技術は、以下を含むが、これらに限定されない：前核のマイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系統（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ　８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子転移；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を使用する本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）；胚性ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ幹細胞中に核酸構築物を導入する工程および胚盤胞中に幹細胞を移入しもどす工程；ならびに精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ　５７：７１７−７２３（１９８９）；など。このような技術の概要については、Ｇｏｒｄｏｎ，「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌｓ」Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０５４４】
任意の当該分野で公知の技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを作製し得る（例えば、静止状態に誘導された、培養胚性細胞、胎児細胞または成人細胞由来の核の、除核された卵母細胞への核移入）（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ　３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３（１９９７））。
【０５４５】
本発明は、全てのこれらの細胞において導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物、ならびにいくつかの細胞において導入遺伝子を保持するが、全てのこれらの細胞において保持するのではない、動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。この導入遺伝子を単一の導入遺伝子として、または多数のコピーとして（例えば、コンカテマー（例えば、頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム）における）組み込み得る。この導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏら（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６（１９９２））の教示に従って、特定の細胞型に選択的に導入され得、そして特定の細胞型で活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者にとって明らかである。このポリヌクレオチド導入遺伝子が内因性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子標的化が好ましい。
【０５４６】
簡潔には、このような技術が利用されるべき場合、内因性遺伝子と相同性のいくつかのヌクレオチド配列を含むベクターを、染色体配列との相同的な組換えを介して、内因性遺伝子のヌクレオチド配列の機能の中に組み込むの目的のため、およびこの機能を破壊する目的のために設計する。この導入遺伝子をまた特定の細胞型に選択的に導入し得、従って、この遺伝子は、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、その細胞型のみにおいて内因性遺伝子を不活性化する。このような細胞型特異的不活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかである。
【０５４７】
一旦、トランスジェニック動物が作製されると、組換え遺伝子の発現を標準の技術を利用してアッセイし得る。導入遺伝子の組み込みが生じたことを確認するために、最初のスクリーニングをサザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって、動物組織を分析するために達成し得る。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルもまた、その動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むが、これらに限定されない技術を使用して評価し得る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルもまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的にまたは免疫組織化学的に評価し得る。
【０５４８】
一旦、創始動物が作製されると、これらを繁殖し、同系交配し、異系交配し、または交雑種し、特定の動物のコロニーを作製し得る。このような繁殖戦略の例は、以下を含むが、これらに限定されない：分離系統を確立するために１つより多い組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子のさらなる発現の効果のため、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニックを作製するための分離系統の同系交配；発現を増強し、そしてＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性を排除する両方のために所定の組み込み部位に対してホモ接合性の動物を作製するためのヘテロ接合性のトランスジェニック動物の交配；複合へテロ接合体系統または複合ホモ接合体系統を作製するための分離ホモ接合系統の交配；および目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入遺伝子を配置するための繁殖。
【０５４９】
異常なＶＥＧＦ−２発現に関連する状態および／または障害を研究し、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの生物学的な機能を生成する際に、そしてこのような状態および／または障害を回復する際に有効な化合物のスクリーニングの際に有用な動物モデル系を含むが、これらに限定されない本発明のトランスジェニック動物が使用されている。
【０５５０】
（実施例３１、ＶＥＧＦ−２ノックアウト動物）
内因性ＶＥＧＦ−２遺伝子発現はまた、標的化相同性組換えを使用してＶＥＧＦ−２遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ　５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。例えば、内因性のポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード領域か、または調節領域のいずれか）に相同性のＤＮＡによって隣接する、本発明の変異型、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を選択マーカーおよび／または陰性の選択可能マーカーを有するか、または有さずに、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトするために使用し得る。別の実施態様において、当該分野で公知の技術を使用して、目的の遺伝子を含むが発現しない細胞中でノックアウトを生成する。標的化相同的組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性の標的化遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究分野および農業分野において特に適している（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ　１９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ　１９８９、前出）。しかし、このアプローチは、組換えＤＮＡ構築物が当業者に明らかな適切なウイルスベクターを使用してインビボで直接投与されるか、または必要とされる部位に標的化される場合、ヒトにおいての使用に慣用的に適合し得る。
【０５５１】
本発明のさらなる実施態様において、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝子操作される細胞（例えば、ノックアウト）をインビボで患者に投与する。このような細胞を患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから入手し得、そしてこれらの細胞は、線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋肉細胞、内皮細胞などを含み得るが、これらに限定されない。この細胞を、例えば、形質導入（ウイルス性ベクター、および好ましくは細胞のゲノムに導入遺伝子を組みこむベクターを使用して）またはトランスフェクション手順（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームなどの使用を含むがこれらに限定されない）によって、細胞内に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するために、あるいは、本発明のポリペプチドに関連するコード配列および／または内因性調節配列を破壊するために、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチドのコード配列を、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの発現および好ましくは分泌を達成するために、強力な構成的または誘導的なプロモーターもしくは強力な構成的または誘導的なプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分泌する操作された細胞を患者に全身的に（例えば、循環中において、または腹腔内に）導入し得る。
【０５５２】
あるいは、この細胞をマトリックス中に組み込み得、そして身体中に移植し得、例えば、遺伝子操作された線維芽細胞を、皮膚移植片の一部として移植し得る；遺伝子操作された内皮細胞をリンパの移植片または血管移植片の一部として移植し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０５５３】
投与されるべき細胞が非自系の適合細胞または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、これらの細胞を、周知の技術を使用して投与し得、この技術は、導入細胞に対して宿主免疫応答の発生を妨ぐ。例えば、それらの細胞をカプセル化形態で導入し得、これは、すぐ隣接した細胞外環境との成分の交換を可能にするが、導入細胞は、宿主免疫系によって認識されることを可能にしない。
【０５５４】
異常なＶＥＧＦ−２発現に関連する状態および／または障害を研究して、ＶＥＧＦ−２ポリペプチドの生物学的な機能を生成する際、およびこのような状態および／または障害の回復に有効な化合物をスクリーニングする際に、有用な動物モデル系を含むが、これらに限定されない本発明のノックアウト動物を使用している。
【０５５５】
本発明の多数の改変および変更が上記の教示の観点から可能であり、従って、添付の請求項の範囲内で、本発明は、特に記載される以外の別の方法で実施され得る。
【０５５６】
本明細書中で引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術論文、実験室マニュアル、書籍または他の文書を含む）の完全な開示は、本明細書により参考として援用される。
【０５５７】
さらに、２０００年８月４日に出願された仮出願番号６０／２２３，２７６において提出された配列表は、コンピュータ、マイクロフィッシュ、ＣＤ−Ｒ、および／または紙の形式のいずれであっても、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０５５８】
【表２】
2004505619.tif 000009
ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０５５９】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５６０】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ　ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０５６１】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｏａｒｄ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号９７１４９
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０５６２】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５６３】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ　Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ　ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ　Ｉのａｎｎｅｘ　Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５６４】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０５６５】
【表３】
2004505619.tif 000010
ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０５６６】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５６７】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ　ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０５６８】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｏａｒｄ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号７５６９８
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０５６９】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５７０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ　Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ　ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ　Ｉのａｎｎｅｘ　Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５７１】
【表４】
2004505619.tif 000011
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１８５
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０５７２】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５７３】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ　ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０５７４】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｏａｒｄ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１８５
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０５７５】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５７６】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を最終的に受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ　Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ　ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ　Ｉのａｎｎｅｘ　Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０５７７】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定することを意味しない。
【図１】
図１Ａ〜図１Ｅは、ＶＥＧＦ−２の全長ヌクレオチド（配列番号１）配列および推定アミノ酸（配列番号２）配列を示す。このポリペプチドは、およそ２３個がリーダー配列を表す、およそ４１９個のアミノ酸残基を含む。アミノ酸の標準的な一文字の略語を使用する。配列決定を、モデル３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行なった。配列決定の精度は、９７％より大きいことが予測される。
【図２】
図２Ａ〜図２Ｄは、ＶＥＧＦ−２の短縮した、生物学的に活性な形態のヌクレオチド（配列番号３）配列および推定アミノ酸（配列番号４）配列を示す。このポリペプチドは、最初のおよそ２４個のアミノ酸がリーダー配列を表す、およそ３５０個のアミノ酸残基を含む。
【図３】
図３Ａ〜図３Ｂは、ＰＤＧＦａ（配列番号５）と、ＰＤＧＦｂ（配列番号６）と、ＶＥＧＦ（配列番号７）とＶＥＧＦ−２（配列番号４）の間のアミノ酸配列の相同性の例示である。ボックス領域は、保存された配列および８個の保存されたシステイン残基の位置を示す。
【図４】
図４は、表の形式において、ＰＤＧＦａと、ＰＤＧＦｂと、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−２の間の相同性の百分率を示す。
【図５】
図５は、ヒト乳房腫瘍細胞株におけるＶＥＧＦ−２　ｍＲＮＡの存在を示す。
【図６】
図６は、ヒト成体組織におけるＶＥＧＦ−２のノーザンブロット分析の結果を示す。
【図７】
図７は、本発明のポリペプチドのインビトロでの転写、翻訳、および電気泳動の後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。レーン１：１４Ｃおよびレインボー分子量マーカー；レーン２：ＦＧＦコントロール；レーン３：Ｍ１３逆方向プライマーおよびＭ１３順方向プライマーによって産生されたＶＥＧＦ−２；レーン４：Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦ−Ｆ４プライマーによって産生されたＶＥＧＦ−２；レーン５：Ｍ１３逆方向プライマーおよびＶＥＧＦ−Ｆ５プライマーによって産生されたＶＥＧＦ−２。
【図８Ａ】
図８Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、Ｓｆ９細胞からなるバキュロウイルス系において発現された。細胞の培地および細胞質由来のタンパク質を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２ポリペプチドは、Ｓｆ９細胞からなるバキュロウイルス系において発現された。細胞の培地および細胞質由来のタンパク質を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【図９】
図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。本発明の核酸配列で感染したＳｆ９細胞由来の培地を沈澱させた。再懸濁した沈澱物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで染色した。
【図１０】
図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を示す。ＶＥＧＦ−２を培地上清から精製し、そして還元剤であるｂ−メルカプトエタノールの存在下および非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてクマシーブリリアントブルーで染色した。
【図１１】
図１１は、ＲＰ−３００カラム（０．２１×３ｃｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用する精製ＶＥＧＦ−２の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。カラムを０．１％のトリフルオロ酢酸（溶媒Ａ）で平衡化し、そしてタンパク質を、０％〜６０％の溶媒Ｂ（０．０７％ＴＦＡを含むアセトニトリルからなる）の７．５分間の勾配で溶出した。タンパク質溶出を、２１５ｎｍ（「赤」線）および２８０ｎｍ（「青」線）の吸光度によってモニターした。溶媒Ｂの百分率を「緑」線によって示す。
【図１２】
図１２は、塩基性線維芽細胞増殖因子との比較における、血管内皮細胞の増殖に対する部分精製ＶＥＧＦ−２タンパク質の効果を例示する棒グラフである。
【図１３】
図１３は、血管内皮細胞の増殖に対する精製ＶＥＧＦ２タンパク質の効果を例示する棒グラフである。
【図１４】
図１４は、ヒト胎児組織およびヒト成体組織におけるＶＥＧＦ−２　ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１５】
図１５は、ヒト初代培養細胞におけるＶＥＧＦ−２　ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１６Ａ】
図１６Ａは、ＣＯＳ−７細胞中でのＶＥＧＦ−２タンパク質の一過性発現を示す。
【図１６Ｂ】
図１６Ｂは、ＣＯＳ−７細胞中でのＶＥＧＦ−２タンパク質の一過性発現を示す。
【図１７】
図１７は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ−２で刺激した増殖を示す。
【図１８】
図１８は、皮膚微小血管内皮細胞のＶＥＧＦ−２で刺激した増殖を示す。
【図１９】
図１９は、微小血管、臍帯、子宮内膜、およびウシ大動脈内皮細胞の増殖に対するＶＥＧＦ−２の刺激効果を示す。
【図２０】
図２０は、ＰＤＧＦで誘導した血管（ヒト大動脈）平滑筋細胞の増殖の阻害を示す。
【図２１】
図２１は、ＶＥＧＦ−２によるＨＵＶＥＣおよびウシ微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の遊走の刺激を示す。
【図２２】
図２２は、ＶＥＧＦ−２およびＶＥＧＦ−１によるＨＵＶＥＣの一酸化窒素放出の刺激を示す。
【図２３】
図２３は、ＶＥＧＦ−２による微小血管内皮細胞（ＣＡＤＭＥＣ）の索形成の阻害を示す。
【図２４】
図２４は、ＣＡＭアッセイにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−２、およびｂＦＧＦによる、新脈管形成の刺激を示す。
【図２５】
図２５は、ＶＥＧＦ−２タンパク質（図２５、上部パネル）および裸の発現プラスミド（図２５、中部パネル）による虚血性四肢における特定のパラメータの修復を示す：ＢＰ比（図２５Ａ〜Ｃ）；血流およびフロー貯蔵（図２５Ｄ〜Ｉ）；血管造影的スコア（図２５Ｊ〜Ｌ）；毛細血管の密度（図２５Ｍ〜Ｏ）。
【図２６】
図２６Ａ〜Ｇは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において拡張期血圧に影響するＶＥＧＦ−２の能力を示す。図２６Ａおよび２６Ｂは、ＶＥＧＦ−２で達成された拡張期血圧の用量依存性の低下を示す。図２６Ｃおよび図２６Ｄは、ＶＥＧＦ−２で観察された平均動脈圧（ＭＡＰ）の減少を示す。図２６Ｅは、ＳＨＲラットの平均動脈圧（ＭＡＰ）に対する漸増用量のＶＥＧＦ−２の効果を示す。図２６Ｆは、ＳＨＲラットの拡張期圧に対するＶＥＧＦ−２の効果を示す。図２６Ｇは、ＳＨＲラットの拡張期血圧に対するＶＥＧＦ−２の効果を示す。
【図２７】
図２７は、ＶＥＧＦ−２Ｎ＝およびＶＥＧＦ−２誘導性増殖の阻害を示す。
【図２８】
図２８は、ｐＨＥ４ａ発現ベクター（配列番号１６）の模式的な描写を示す。カナマイシン耐性マーカー遺伝子、複数のクローニング部位のリンカー領域、ｏｒｉＣ配列、およびｌａｃＩｑコード配列の位置を示す。
【図２９】
図２９は、ｐＨＥ４ａプロモーター（配列番号１７）の調節エレメントのヌクレオチド配列を示す。２つのｌａｃオペレーター配列、シャイン−ダルガルノ配列（Ｓ／Ｄ）、ならびに末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位（イタリック体）を示す。
【図３０】
図３０は、ＶＥＧＦ−２をコードするポリヌクレオチドを含むｐＶＧＩ．１発現ベクター構築物の模式図を示す。
【図３１】
図３１Ａ〜Ｇは、ＶＥＧＦ−２挿入物を含むｐＶＧＩ．１ベクター構築物のヌクレオチド配列を示す。
【図４】
2004505619.tif 000012
【図５】
2004505619.tif 000013
【図６】
2004505619.tif 000014
【図７】
2004505619.tif 000015
【図８Ａ】
2004505619.tif 000016
【図８Ｂ】
2004505619.tif 000017
【図９】
2004505619.tif 000018
【図１１】
2004505619.tif 000019
【図１２】
2004505619.tif 000020
【図１３】
2004505619.tif 000021
【図１４】
2004505619.tif 000022
【図１５】
2004505619.tif 000023
【図１６Ａ】
2004505619.tif 000024
【図１６Ｂ】
2004505619.tif 000025
【図１７】
2004505619.tif 000026
【図１８】
2004505619.tif 000027
【図１９】
2004505619.tif 000028
【図２０】
2004505619.tif 000029
2004505619.tif 000030
【図２１】
2004505619.tif 000031
【図２２】
2004505619.tif 000032
【図２３】
2004505619.tif 000033
【図２４】
2004505619.tif 000034
【図２５】
2004505619.tif 000035
2004505619.tif 000036
2004505619.tif 000037
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【図２６】
2004505619.tif 000044
2004505619.tif 000045
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【図２７】
2004505619.tif 000049
【図２９】
2004505619.tif 000050
【図３０】
2004505619.tif 000051
【図３１】
2004505619.tif 000052
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2004505619.tif 000057
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【国際公開パンフレット】
2004505619.tif 000059
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2004505619.tif 000061
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【国際調査報告】
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