(57)【要約】白血球に結合するペプチドが、薬剤と複合体になっている。都合のよいことに、ペプチド−薬剤複合体は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を干渉し、白血球に取り込まれ、そこで、複合体の薬剤部分が、副作用を最小限にして、強力な薬剤作用を発現する。好ましい複合体とは、ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１由来の４〜３０残基のペプチドに、白血球関連疾患に効果のある薬剤を、共有結合させたものである。
2004505029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に由来するペプチド配列、ならびにその擬ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ）からなる群より選択される単離されたペプチド配列を、共有結合させた薬剤を含有する複合体。
【請求項２】
前記単離されたペプチド配列が、約４〜３０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記単離されたペプチド配列が、配列番号１〜８およびその擬ペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記ペプチドが、変異により、配列番号１〜８からなる群より選択される該単離されたペプチド配列とは異なる、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔ）が、点変異、欠失、挿入および再編成からなる群より選択される、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
前記薬剤が、抗炎症剤、抗腫瘍剤、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、酵素阻害剤および神経循環剤からなる薬剤群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記薬剤が、メトトレキセート、ロバスタチン、タキソール、アジマリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シクロフォスファミド、フルオロウラシル、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、６−メルカプトプリン、マイトマイシン、マイトキサントロン、パクリタキセル、タキソール、ペントスタチン、プリカマイシン、トポテカン、フルダラビン、エトポシド、ドコソルビシン、ドコソタキセル、ダノルビシン、アルブテロールおよびプロピディウムからなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記薬剤が、メトトレキセートである請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記単離されたペプチド配列が、該配列番号１〜８およびその擬ペプチドの少なくとも１つの配列と、少なくとも約５０％の相同性を有する、請求項３に記載の複合体。
【請求項１０】
薬剤と、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に由来するペプチド配列、ならびにその擬ペプチドからなる群より選択される単離されたペプチド配列とを、含有する複合体を形成し；
白血球、上皮細胞、または内皮細胞と、該複合体とを接触させ、
そして、
該複合体が、白血球（ａ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ）、上皮細胞、または内皮細胞内に取り込まれるようにする；
段階を含む、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）への薬剤輸送方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、抗炎症剤、抗腫瘍剤、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、酵素阻害剤および神経循環剤からなる薬剤群より選択される、請求項１０に記載の薬剤輸送方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、メトトレキセート、ロバスタチン、タキソール、アジマリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シクロフォスファミド、フルオロウラシル、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、６−メルカプトプリン、マイトマイシン、マイトキサントロン、パクリタキセル、タキソール、ペントスタチン、プリカマイシン、トポテカン、フルダラビン、エトポシド、ドコソルビシン、ドコソタキセル、ダノルビシン、アルブテロールおよびプロピディウムからなる群より選択される、請求項１０に記載の薬剤輸送方法。
【請求項１３】
前記薬剤が、メトトレキセートおよびドキソルビシンからなる群より選択される、請求項１０に記載の薬剤輸送方法。
【請求項１４】
前記単離されたペプチド配列が、約４〜３０のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の薬剤輸送方法。
【請求項１５】
前記単離されたペプチド配列が、配列番号１〜８およびその擬ペプチドからなる群より選択される、請求項１０に記載の薬剤輸送方法。
【請求項１６】
前記単離されたペプチド配列が、該配列番号１〜８およびその擬ペプチドのうちの少なくとも１つの配列と、少なくとも約５０％の相同性を有する、請求項１５に記載の薬剤輸送方法。
【請求項１７】
前記薬剤輸送方法が、薬剤とペプチドとを共有結合させる段階を含んで、非標的細胞に対する薬剤の有害性を減じている改良方法を含む、細胞への薬剤投与方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、抗炎症剤、抗腫瘍剤、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、酵素阻害剤および神経循環剤からなる薬剤群より選択される、請求項１７に記載の薬剤投与方法。
【請求項１９】
前記薬剤が、メトトレキセート、ロバスタチン、タキソール、アジマリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シクロフォスファミド、フルオロウラシル、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、６−メルカプトプリン、マイトマイシン、マイトキサントロン、パクリタキセル、タキソール、ペントスタチン、プリカマイシン、トポテカン、フルダラビン、エトポシド、ドコソルビシン、ドコソタキセル、ダノルビシン、アルブテロールおよびプロピディウムからなる群より選択される、請求項１７に記載の薬剤投与方法。
【請求項２０】
前記薬剤が、メトトレキセートおよびドキソルビシンからなる群より選択される、請求項１７に記載の薬剤投与方法。
【請求項２１】
前記単離されたペプチド配列が、約４〜３０のアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の薬剤投与方法。
【請求項２２】
前記ペプチド配列が、配列番号１〜８およびその擬ペプチドからなる群より選択される、請求項１７に記載の薬剤投与方法。
【請求項２３】
前記ペプチド配列が、該配列番号１〜８およびその擬ペプチドのうち、少なくとも１つと、少なくとも約５０％の相同性を有する、請求項２１に記載の薬剤投与方法。
【請求項２４】
ペプチド−薬剤複合体を形成させるために、薬剤と、ＩＣＡＭ−１およびその擬ペプチドに由来するペプチド配列とを結合させて、該ペプチド配列が、ＬＦＡ−１受容体に結合するようにし；
該複合体を白血球（ａ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ）と接触させ；
該複合体が白血球内に取り込まれるようにし；
そして、
該薬剤で、白血球を死滅させる；
段階を含む、白血球関連疾患の治療方法。
【請求項２５】
前記ペプチド配列が、約４〜３０のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の治療方法。
【請求項２６】
前記ペプチド配列が、配列番号１〜８およびその擬ペプチドの内の少なくとも１つと、少なくとも約５０％の相同性を有するペプチド配列からなる群より選択される、請求項２４に記載の治療方法。
【請求項２７】
前記薬剤が、抗炎症剤、抗腫瘍剤、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、酵素阻害剤および神経循環剤からなる薬剤群より選択される、請求項２４に記載の治療方法。
【請求項２８】
前記薬剤が、メトトレキセート、ロバスタチン、タキソール、アジマリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シクロフォスファミド、フルオロウラシル、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、６−メルカプトプリン、マイトマイシン、マイトキサントロン、パクリタキセル、タキソール、ペントスタチン、プリカマイシン、トポテカン、フルダラビン、エトポシド、ドコソルビシン、ドコソタキセル、ダノルビシン、アルブテロールおよびプロピディウムからなる群より選択される、請求項２４に記載の治療方法。
【請求項２９】
薬剤と、ＬＦＡ−１およびその擬ペプチド由来のペプチドとを複合体にし；
該複合体を、白血球、上皮細胞、または内皮細胞と接触させ；
該複合体を、白血球、上皮細胞、または内皮細胞に取り込ませて；
そして、
該複合体により、接触した白血球、上皮細胞、または内皮細胞の機能を変化させる；
段階を含む、上皮または内皮細胞関連疾患の治療方法。
【請求項３０】
前記疾患が、喘息、炎症、クローン病、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、尋常天疱瘡、類天疱瘡（ｐｅｐｈｉｇｏｉｄ）、アレルギー類、ＨＩＶ感染症および表皮剥離症からなる群より選択される、請求項２９に記載の治療方法。
【請求項３１】
前記疾患が、ＩＣＡＭ−１の発現量の増加と関連している、請求項２９に記載の治療方法。
【請求項３２】
前記ペプチドが、ＩＣＡＭ−１受容体と結合するようになっている、請求項２９に記載の治療方法。
【請求項３３】
前記ペプチドが、約４〜３０のアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の治療方法。
【請求項３４】
前記ペプチドが、配列番号１〜８およびその擬ペプチドの内の少なくとも１つと、少なくとも約５０％の相同性を有するペプチド配列からなる群より選択される、請求項２９に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［本発明の属する技術分野］
本発明は、白血病、クローン病（Ｃｈｒｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ）、炎症、喘息、リウマチ性関節炎、およびその他の白血球関連疾患等のＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１が関わる病気の治療に関する。詳しくは、本発明は、白血病、クローン病、炎症、喘息、リウマチ性関節炎、およびその他の白血球関連疾患の治療に、通常使用されている薬剤の効能を向上させ、毒性を低減させる方法に関する。より詳細には、本発明は、白血球、内皮細胞および上皮細胞の細胞表面にある細胞接着受容体に結合して、これらの細胞に取り込まれるペプチドを有する薬剤の複合体に関する。そして、特に詳しくは、本発明は、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１を発現している細胞に対して、その細胞内ドメインへの薬剤輸送に用いられる細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）ペプチドおよび白血球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）ペプチドとを有する薬剤複合体に関する。
【０００２】
［先行技術］
白血球関連疾患は、“自己”抗原に対する白血球の反応を含め、異常な免疫応答の結果、しばしば発症する。そのような反応は、リウマチ性関節炎、インスリン依存性糖尿病、および多発性硬化症を含め、自己免疫疾患の一因となる。同様に、臓器移植における拒絶反応は、白血球、特には、Ｔ細胞による攻撃の結果生じる。したがって、Ｔ細胞の活性および、それによって後発する破壊を抑制することは、そのような疾患と戦う一助となる。
【０００３】
白血球の免疫応答を変化させる１つの手段は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１の受容体間相互作用の阻害剤を利用することである。例えば、同種異系統移植片拒絶反応（Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）、リウマチ性関節炎（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）、および自己免疫性脳脊髄炎（Ｗｉｌｌｅｎｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）等の免疫応答異常において、免疫寛容状態にするために、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が用いられてきた。免疫寛容を誘導する精力的な治療努力にもかかわらず、そのような抗体自体に免疫原性があり、効能を制限してしまう免疫応答を引き起こしてしまうことがある。そのうえ、抗体を作製することは、労力を必要とし高いコストがつく。
【０００４】
免疫応答を変化させるもう１つの方法は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を阻害するＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に由来する小さなペプチド断片を利用することである（Ｒｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２；Ｆｅｃｏｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；Ｂｅｎｅｄｉｃｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４；Ｓｉａｈａａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。これらのペプチドは、抗体よりも物理化学的な安定性が良好で、また、免疫原としての特性を全く有していないこともある。ＩＣＡＭ−１配列由来の環状ペプチド（ｃＩＢＲ）は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を阻害することも明らかとなっている（Ｓｉａｈａａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。
【０００５】
さらに、抗体での治療では、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用や、それに付随する白血球関連疾患を抑制する能力があるにもかかわらず、一般的に、そのような治療は、その一時的な性質のため、長期間経過すると効果がなくなってしまう。その上、一旦、モノクローナル抗体が、免疫応答を引き起こすと、その効能は、著しく制限されてしまう。
【０００６】
白血球を死滅させ、白血球関連疾患と戦うために、毒性のある薬剤を使用すると、多様な副作用に直面する。これらの副作用としては、正常な細胞の増殖抑制だけでなく、標的細胞の他に、非特異的な細胞の死滅も挙げられる。それ故、疾患過程に関与する細胞に、選択的に薬剤を誘導させる新規方法は、患者に対して有益である。例えば、白血球に対して、毒性のある薬剤を選択的に誘導すると、薬剤毒性を低減し、薬効を増加させることになる。
【０００７】
［発明の開示］
本発明では、先行技術に固有の問題を解決し、白血球上の受容体と結合するＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１配列由来のペプチドを提供する。これらのペプチドは、白血球関連疾患の治療に効果のある薬剤と、複合体を形成している。そのようなペプチドおよびその複合体は、その後、白血球内に取り込まれて、複合体の薬剤部分が、毒性を発現する。このように、本発明は、従来の治療方法と比較して、効能を向上させ、毒性を減らすことにより、白血球の細胞内ドメインへの効果的な薬剤輸送手段を提供する。これらのペプチドは、白血球表面の特異的な受容体と結合するので、薬剤輸送は、そのような受容体をもつ細胞に“標的化”されている。これにより、使用される薬剤の非選択性が原因で、一般に、白血球関連疾患の治療に付随する、その他の細胞への毒効を顕著に減らしている。
【０００８】
同様に、これらの薬剤−ペプチド複合体は、炎症、喘息、アレルギー性疾患およびクローン病等の、内皮および上皮細胞上のＩＣＡＭ−１の発現量の増加に関連した疾患の治療に用いることができる。
【０００９】
本発明で用いられるペプチドとは、白血球上のＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１受容体と結合するペプチドを含んでいる。好ましくは、ペプチドは、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１配列に由来し、かつ約４〜３０アミノ酸残基の長さを有するものである。より好ましくは、そのような配列は、約８〜１５のアミノ酸残基を含むものである。特に好ましくは、そのような配列は、約１０〜１２のアミノ酸残基を含むものである。そのような配列は、ある種の白血球、すなわちＴ細胞同士の凝集を抑制する、ＬＡＢ、ｃＬＡＢ．Ｌ、ｃＬＡＢ．Ｃ、およびｃＬＡＢ．Ｒに代表されるＬＦＡ−１のＩ−ドメイン由来の直鎖状および環状ペプチドである。これらの配列は、配列番号１〜４として、本明細書の中に記載されている。その他の配列は、ＩＣＡＭ−１配列由来の配列であるＩＢを含み、配列番号５として本明細書の中に記載されている。ＩＣＡＭ−１配列由来の配列は環状で、ｃＩＢＬ、ｃＩＢＣ、ｃＩＢＲが含まれ、それぞれ、配列番号６〜８として、本明細書の中に記載されている。
【００１０】
配列番号１〜８のいずれか１つと、少なくとも約５０％の相同性があり、取り込み特性を示す配列を含んでいるか有する配列は、本発明の範囲に含まれる。好ましくは、そのような配列は、配列番号１〜８のいずれか１つと、少なくとも約６０％の相同性を有するものである、そして、より好ましくは、少なくとも約７５％の相同性を有するものである。一方で、配列番号１〜８のいずれか１つと、少なくとも約５０％の相同性があり、細胞内に取り込み特性を示す配列を含んでいるか有する配列は、本発明と同等のものである。より好ましくは、そのような配列は、配列番号１〜８のいずれか１つと、少なくとも約６０％の相同性を有するものである、そして、さらにより好ましくは、少なくとも約７５％の相同性を有するものである。
【００１１】
さらに、変異により配列番号１〜８のどの配列とも異なるが、同等の特性を示す配列も、本発明と同等のものである。そのような変異には、点変異、欠失、挿入および再編成が含まれるが、これらに限定されるものではない。その上、この技術分野で公知であるように、本発明の中で詳述されている好ましいペプチドと、同等の変化特性を有する擬ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ）を、構築することもできる。これらの擬ペプチドを作製するために、この分野の公知技術を必要としないので、そのような擬ペプチドは、本発明と同等である。特筆すべきは、このような擬ペプチドの側鎖は、本発明の好ましいペプチドの側鎖と、構造において非常に類似しているが、そのペプチド主鎖は、大きく異なっている、または全体的に同等のものではない。
【００１２】
白血球の活性化を維持するのに主要な相補的シグナルとしては、ＩＣＡＭ−１（ＩＣＡＭ−１，ＣＤ５４としても知られている）およびＬＦＡ−１（ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８を含有する二量体からなる）間の相互作用である。さらに、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１複合体およびＢ７／ＣＤ２８複合体を組み合わせると、白血球活性化の保持期間と程度を変化させることができる。これらの複合体は、細胞骨格において、アクチン分子の動態変化を誘導して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞間の領域で、ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１等の表面受容体の蓄積を引き起こす（Ｗｕｒｆｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、１９９８）。ＬＦＡ−１が、ＩＣＡＭ−２（休止状態の内皮上で優位に発現している）と相互作用する場合、ＬＦＡ−１との相互作用は、活性化していない循環Ｔ細胞にとって、比較的重要なことである。ＩＣＡＭ−３が、単球および休止状態のリンパ球により発現すると、それは、免疫応答の初期段階において主要な役割を演じる（ｄｅ　Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）。
【００１３】
ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用は、ＬＦＡ−１の活性化が必要で、タンパク質リン酸化酵素Ｃ（ＰＫＣ）のメカニズムを刺激することで、ＣＤ２、ＣＤ３、ホルボールエステル（すなわち、ホルボール１２−ミリスチン−１３酢酸、つまり（ＰＭＡ））およびＭＨＣクラスＩＩ分子により引き起こすことができる（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８６；ｖａｎ　Ｋｏｏｙｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）。ＰＭＡは、ＰＫＣを直接活性化することで、ＬＦＡ−１分子を活性化し、一方、抗ＣＤ２および抗ＣＤ３抗体は、イノシトールリン酸脂質系を刺激して、ＰＫＣを活性化する。二価陽イオンは、接着分子の機能活性を高めることにより、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用を補助し（ｖａｎ　Ｋｏｏｙｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）、そしてイオン型（ｉｏｎ ｔｙｐｅ）の必要性は、ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の特異的なドメインと関係している（Ｓｔａｎｌｅｙ　ａｎｄ　Ｈｏｇｇ，１９９８）。
【００１４】
配列番号２は、ＩＣＡＭ−１への結合に必要な残基が含まれていることが知られている、ＬＦＡ−１の“挿入”（Ｉ）−ドメイン由来の１０アミノ酸残基（Ｉｌｅ２３７ −Ｇｌｙ２４６ ）を含む１２残基のペプチドとして合成された（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）。そして、ペニシルアミン（Ｐｅｎ）およびシステイン（Ｃｙｓ）残基を、Ｎ末端およびＣ末端に付加して（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）、Ｐｅｎ１とＣｙｓ１２残基との間のジスルフィド結合により、環状ペプチドを形成させた。この環状ペプチドの形成により、立体構造の安定性を保持するペプチドの立体構造が制限され、それが、直鎖状形態よりも細胞表面受容体への良好な選択性につながっている（Ｓｉａｈａａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。
【００１５】
生成したペプチドであるｃＬＡＢ．Ｌは、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を阻害することで、Ｔ細胞の凝集を抑制する（Ｓｉａｈａａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。この環状ペプチドよって引き起こされる潜在的な阻害機構には、２つある：（ａ）ＩＣＡＭ−１への結合によるＴ細胞接着の阻害、および／または（ｂ）ＬＦＡ−１のβサブユニットへの結合による、αとβサブユニット二量体の形成阻害である。ＬＦＡ−１のαとβサブユニットのヘテロ二量体は、ＩＣＡＭへの結合に必要であるので、ヘテロ二量体の形成阻害は、結果として、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１の相互作用を阻害することになる。
【００１６】
本発明に至るまでの研究では、ｃＬＡＢ．Ｌの結合部位を同定し、その特徴も解析した。ｃＬＡＢ．Ｌは、Ｔ細胞表面上のＩＣＡＭ−３だけでなく、ＩＣＡＭ−１のＤ１−ドメインとも結合することが解明された。Ｄ１ドメインに対するｃＬＡＢ．Ｌの結合は、そのＩＣＡＭ−３への結合よりも効率的に起こる。ｃＬＡＢ．Ｌの結合特性は、活性化したＭｏｌｔ−３細胞に対して、ＦＩＴＣ標識したｃＬＡＢ．Ｌ（ＦＴＩＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ）を用いることで評価した。細胞表面受容体に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合は、非標識−ｃＬＡＢ．Ｌによって阻害されることから、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌは、非標識−ｃＬＡＢ．Ｌと同じ受容体に結合したことが示唆される。さらに、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌは、２つの山をもつ細胞分布（ｂｉｍｏｄａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ）を示しており、活性化したＩＣＡＭ受容体の多様で動的状態の発生を示唆している。ＩＣＡＭｓ（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３）へのペプチドの結合は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋ ）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋ ）を混合物の存在下では増強され、これにより、ペプチド−ＩＣＡＭ相互作用の間における二価陽イオンの関与が示唆される。
【００１７】
その上、このペプチドは、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ受容体によって取り込まれることが判明した。この取り込みの証拠は、共焦点顕微鏡で観察したときに、細胞質内にペプチドが存在することだけではなく、４℃と３７℃の間でペプチドの結合に顕著な差があることにより支持された。薬剤複合体にすると、このペプチドの取り込みにより、ＩＣＡＭ受容体を有する細胞の細胞質領域に薬剤を輸送することができる。こうして、本発明では、白血球にＩＣＡＭ受容体があることから、白血球関連疾患の効果的な治療方法を提供する。
【００１８】
ＩＣＡＭ−１の配列に由来する環状ペプチド（ｃＩＢＲ）は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を阻害することが知られている（Ｓｉａｈａａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。このペプチドは、Ｔ細胞のＬＦＡ−１表面受容体と結合し、取り込まれることが、現在明らかとなっている。さらに、このペプチドの立体構造は、受容体の選択性において、重要な役割があることが判明している。そのような受容体による取り込みは、細胞間接着を補助する機構であるといわれている。
【００１９】
白血球上の受容体に結合するペプチドの取り込みのために、そのようなペプチドとして、配列番号８を複合体試験のために選択した。複合体試験を実施するために、配列番号８を薬剤との複合体にし、標的細胞および非標的細胞に対する毒性の評価を行った。複合体形成過程は、一定量の薬剤を水に溶解し、そこに一定量のペプチドを添加して、その後、一晩、生成溶液を保存した。そのような複合体は、ＬＦＡ−１を発現している白血球と結合し、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用に影響を与えた。ＬＦＡ−１受容体に結合すると、細胞の細胞質ドメインにペプチド−薬剤複合体が取り込まれ、そこで複合体の薬剤部分が、元来有する毒性を発現した。都合のよいことに、このような毒性の発現は、表面にＬＦＡ−１を発現している細胞に限られており、これらの薬剤を特定のタイプの細胞に輸送するのである。白血球だけが、表面にＬＦＡ−１を発現しているので、薬剤の毒効を発現する前に、白血球の表面に薬剤を特異的に輸送して、取り込ませることができ、それ以外の細胞に対する重大な毒性もない。それ故、本発明は、白血球関連疾患の治療において、非常に優れた有用性がある。好ましくは、そのようなペプチド−薬剤複合体により治療することができる疾患としては、クローン病、喘息、炎症、狼瘡、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、尋常天疱瘡、類天疱瘡、アレルギー類、ＨＩＶ感染症および表皮剥離症が挙げられる。
【００２０】
こうして、薬剤とともに取り込まれるペプチド複合体により、白血球による複合体の取り込みは、高度に特異的な標的化された薬剤輸送、および標的細胞に対して毒性があるが、非標的細胞に対する毒性の低下につながる。薬剤と複合体となったＬＦＡ−１配列由来のペプチドの場合、そのような複合体は、細胞表面にＩＣＡＭ受容体を有する白血球、上皮細胞および内皮細胞によって取り込まれる。薬剤と複合体を形成したＩＣＡＭ配列由来のペプチドの場合、そのような複合体は、表面にＬＦＡ−１受容体を有する白血球によって取り込まれる。好ましくは、ペプチドは、白血球を破壊する効能のある薬剤と複合体となっていることである。より好ましくは、複合体のペプチドは、喘息の薬剤、アルブテロールおよびプロポディウムで利用される機構等の、細胞質内の機構により、上皮および内皮細胞の機能を変化させることができるＬＦＡ−１ペプチドである。
【００２１】
好ましくは、薬剤は、抗炎症剤、抗腫瘍剤（すなわち、インターカレート剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、チューブリン凝集阻害剤、アルカリ化剤）、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、酵素阻害剤（すなわち、ＡＣＥ阻害剤、ＨＩＶ−タンパク質分解酵素阻害剤；ウイルスプロテアーゼ阻害剤）および神経循環剤として分類されている薬剤からなる群より選択されるものである。より好ましくは、薬剤は、メトトレキセート、ロバスタチン、タキソール、アジマリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シクロフォスファミド、フルオロウラシル、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、６−メルカプトプリン、マイトマイシン、マイトキサントロン、パクリタキセル、タキソール、ペントスタチン、プリカマイシン、トポテカン、フルダラビン、エトポシド、ドコソルビシン、ドコソタキセル、ダノルビシン、アルブテロールおよびプロピディウムからなる群より選択されるものである。
【００２２】
それ故、ペプチド−薬剤複合体は取り込まれると、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用への干渉と、白血球の破壊の両方を行う。さらに、取り込まれた複合体は、上皮の長細胞および血管内皮細胞に存在しているもののように、上皮および内皮細胞の機能を制御することもある。機能の制御能は、結合してＬＦＡ−１ペプチドを取り込む上皮および内皮細胞上のＩＣＡＭ−１の存在に依存する。
【００２３】
特に、本発明は、標的細胞に対する薬剤の選択性を高めることで、抗腫瘍剤、免疫抑制剤およびその他の薬剤の毒性を低下させる。この選択性により、より低い投与レベルで、効力の上昇にもつながる。一例として、白血病の治療に現在使用されている薬剤であるメトトレキセート（ＭＴＸ）を、ｃＩＢＲペプチドのＮ末端に結合させてＭＴＸ−ｃＩＢＲ複合体にした。そして、複合体の効能および選択性を、ＭＴＸのみの場合と比較した。複合体は、ＭＴＸのみのときよりも、（ＬＦＡ−１受容体を有する）白血病細胞に対して、効能が優れていることが明らかとなった。さらに、複合体は、ＬＦＡ−１受容体がないマディン−ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を殺す能力がない。ＭＴＸを使用して、現在実施されている治療方法には、他の正常な細胞の増殖抑制を含め、深刻な副作用があるので、複合体の効能および選択性は、この技術分野においては、著しい進歩を表している。複合体の向上した効能および選択性のおかげで、患者は、副作用が比較的少ない薬剤を、より少ない投与レベルで受けることができるであろう。
【００２４】
［本発明の好ましい態様の詳細な説明］
本明細書の中で用いるものとして、後述の定義を適用する：“配列相同性”とは、この技術分野で公知のように、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列間、または、２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド間の関係、すなわち、対照配列と比較した目的の配列と、対照配列との間の関係を意味する。配列相同性は、一列にした配列間の適合性によって決まる、配列近似性が最も高くなるように、各配列を最適に並べ替えて、目的の配列を対照配列と比較して決定する。そのようなアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ）において、配列相同性は、位置毎に基づいて確定させる、例えば、ある位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば、その配列は、特定の位置で“相同”である。そして、位置が同一であるものの全数を、対照配列の全ヌクレオチドまたはアミノ酸残基数で除して、配列相同性％を算出する。
【００２５】
配列相同性は、計算機分子生物学、レスク　エー．エヌ．著、オックスフォード大学、ニューヨーク州（１９８８年）（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｌｅｓｋ　Ａ．Ｎ．、ＥＤ．、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ ，ＮｅｗＹｏｒｋ （１９８８））；計算生物学：情報科学とゲノムプロジェクト、スミス、ディー．ダブリュー．、著、アカデミックプレス、ニューヨーク州（１９９３年）（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ ，Ｓｍｉｔｈ　Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ ，ＮｅｗＹｏｒｋ （１９９３））；配列データのコンピューター分析，第１巻、グリフィン　エー．エヌ．、グリフィン　エイチ．ジー．、著、ヒューマナ　プレス、ニュージャージー州（１９９４年）（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ，ＰａｒｔＩ，Ｇｒｉｆｆｉｎ ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４））；分子生物学における配列分析、フォン　ハイジ　ジー．、アカデミックプレス（１９８７年）（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｇｅ　Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ （１９８７））；配列分析プライマー、グリブスコフ、エム．他、著、エム．ストックトンプレス、ニューヨーク州（１９９１年）（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ ，ＮｅｗＹｏｒｋ （１９９１））；およびカリロ　エイチ．、他、応用数学、４８：１０７３（１９８８年）（Ｃａｒｉｌｌｏ Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．Ａｐｌｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８））に記載されているものを含め、公知の方法により速やかに計算することができるが、これらの方法に限定されるものではない。その知見は、引用して本明細書に含まれる。
【００２６】
配列相同性を決定する好ましい方法では、対象となる配列間で、最も適合性が高くなるように設定される。配列相同性を決定する方法は、目的配列間の配列相同性を決定する上市されているコンピュータープログラムの中に組み込まれている。そのようなプログラムの具体例としては、ジーシージー　プログラム　パッケージ（デヴエルクス，ジェー．，他、核酸研究、１２（１）：３８７（１９８４年））（ＧＣＧ　Ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．，１２（１）：３８７（１９８４）））、ブラストピー、ブラストエヌおよびファスタ（アルチュール、エス．エフ．他、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０年））（ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ　ａｎｄ　ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ブラストエックス（ＢＬＡＳＴＸ）プログラムは、米国立医学図書館の生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）やその他（ブラスト　マニュアル、アルチュール、エス．他、エヌシービーアイ、米国国立医学図書館分類表要綱、国立予防衛生研究所、ベスェスダ、エムディー２０８９４；アルチュール、エス．エフ．他、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０年）（ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＮＣＶＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））から提供されているものも、広く利用することができ、それら文献は、本明細書に引用して含まれる。
【００２７】
このようなプログラムは、目的の配列と対照配列との配列相同性を、最も高くするように、もともとのギャップ加重をかけて、最適に配列を並べ替える。一例を挙げると、例えば、少なくとも９５％“配列相同性”があるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでは、目的のポリヌクレオチドが、対照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド毎に、５つまでは点変異を含んでもよいということを除けば、目的のポリヌクレオチドは、対照ヌクレオチド配列と同一であるとみなされる。言い換えれば、対照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の相同性があるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいては、対照配列のヌクレオチドの５％までは、欠失していてもよいし、または他のヌクレオチドにより置換されていてもよい、すなわち、対照配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドが、対照配列の中に挿入されていてもよい。このような対照配列の変異は、対照ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端部分、または、これら末端部分のどこかで、すなわち、対照配列のヌクレオチド内の個々の部分と、対照配列内にある１つもしくは複数の隣接部分のどちらかで、散発して起こる可能性がある。
【００２８】
同様に、例えば、対照アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％配列相同性がある、目的のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは、目的のポリペプチド配列が、対照アミノ酸配列の１００ヌクレオチド毎に、５つまではアミノ酸改変を含んでもよいという点を除けば、ポリペプチドの目的のアミノ酸配列は、対照配列と同一であるとみなされる。言い換えれば、対照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列相同性がある目的のポリペプチド配列を得るためには、対照配列のアミノ酸残基の５％までは、欠失していてもよいし、または他のアミノ酸により置換されていてもよい、すなわち、対照配列中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸が、対照配列の中に挿入されていてもよい。このような対照配列の改変は、対照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端部位、または、これら末端部分のどこでも、すなわち、対照配列中の残基内の個々の部位、または、対照配列内の１つもしくは複数の隣接部位のどちらかで、散発して起こる可能性がある。好ましくは、同一ではないアミノ残基の部位が、保存されたアミノ酸置換とは異なっているものである。しかし、保存された置換は、配列相同性を決定するときには、一致しているものには含めない。
【００２９】
同様にして、本明細書で使用されている“配列相同性”は、２つの配列の関係を決定する方法にも依存する。配列相同性を決定するために、前記の通り、２つまたは複数の配列相同性を最適に並べ替えて、必要に応じてギャップ（ｇａｐ）を導入する。しかし、“配列相同性”とは対照的に、保存されたアミノ酸置換は、配列相同性を決定するときには、一致しているものとして数える。言い換えれば、対照配列と９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るためには、対照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの９５％は、別のアミノ酸またはヌクレオチドと一致、または保存された置換を含んでいなければならない。すなわち、保存された置換を除き、対照配列の全アミノ酸残基または全ヌクレオチドの５％までは、対照配列中に挿入されていてもよい。
【００３０】
“保存された置換”とは、１つのアミノ酸残基または１つのヌクレオチドが、大きさ、荷電状態、疎水性等に挙げられる同等の特徴または特性を有する、別のアミノ酸またはヌクレオチドと置換されていることを意味し、そのため全体的な機能は、大きく変化することがない。
【００３１】
“単離された”とは、その元来ある状態から、「人の手により」変化していることを意味し、すなわち、それが自然に起こるのであれば、それが変化するか、本来の状況から取り除かれてしまうこと、またはその両方である。例えば、本来、生存している有機体の中に存在している、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、“単離されて”はいないが、その本来の状態で共存している物質から分離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、“単離されて”いるのであって、その意味で、本明細書の中で使用している。
【００３２】
“標的細胞”とは、ある種の物理的または機能的な特徴を顕現し、これらの特徴に重要性のある特定のタイプまたは類型に属する細胞を意味する。医学的な処置において、特定のタイプの細胞が、ある種の疾患過程に関与するする場合、疾患過程に関与しないその他の細胞には重大な影響を及ぼすことなく、そのような細胞を選択的に処理することができるなら、治療効果を向上させることができる。このように、細胞を攻撃するということは、“標的を絞って（ｔａｒｇｅｔｅｄ）”、選択的に処置を行い、その一方で、他の細胞には、影響を与えないということである。
【００３３】
同様に、“非標的細胞”とは、“標的細胞”が有する物理的または機能的な特徴を持たない細胞を意味する。好ましくは、非標的細胞は、医学的な処置の間、重要な影響を及ぼさない細胞である。
【００３４】
【実施例】
後述の実施例では、本発明の好ましい態様を提示している。しかし、これらの実施例は、例示として提示されるものであって、どの実施例も、本発明の全体的な範囲の限定としてみなされるべきものではないと、考慮されるべきである。
【００３５】
実施例１
この実施例では、ＬＦＡ−１由来のペプチドは、ＩＣＡＭ配列に結合することにより、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を阻害したことを確認した。また、このペプチドは、ＩＣＡＭに結合後、白血球に取り込まれたことも同定した。このように、ｃＬＡＢ．Ｌ等のペプチドは、白血球内部への従来からある輸送手段（ｓｈｕｔｔｌｅ ｓｏｕｒｃｅ）として用いることもでき、これにより、白血球関連疾患の新規治療方法を提供できる。さらに、これらのペプチドは、内皮および上皮細胞等のＩＣＡＭ−１を発現しているその他の細胞に対して、輸送薬剤（ｓｈｕｔｔｌｅ ｄｒｕｇｓ ）としても使用することができる。
【００３６】
実施材料および実施方法：
【００３７】
細胞培養および細胞の活性化
Ｍｏｌｔ−３細胞を、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル、メリーランド州）から入手し、１０％熱非働化牛胎児血清および１００ｍｇ／Ｌ　ペニシリン／ストレプトマイシンになるように添加した、ＲＰＭＩ１６４０中に懸濁して培養した。３７℃、９５％空気および５％ＣＯ２ の飽和湿度雰囲気下、７５ｃｍ２ 組織培養用フラスコ（コーニング社製）中で、細胞を増殖、または活性化した。細胞を活性化するために、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）から入手したホルボール１２−ミリスチン酸−１３−酢酸（ＰＭＡ）またはケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（テメキュラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ）、カルフォルニア州）から入手した抗ＣＤ３抗体を、それぞれ０．２μＭ、１０μｇ／ｍＬの濃度で使用した。ＰＭＡでの培養時間は、受容体活性化における、その時間依存性を調べるために変化させた（１，２，４，１６，２４，４０および４８時間）。これとは別に、４時間および４８時間ＰＭＡで活性化させた場合について、細胞へのｃＬＡＢ．Ｌ結合の影響を比較した。
【００３８】
ペプチド標識
ｃＬＡＢ．Ｌペプチド５０ｍｇを、最小限のミリキューで調製した水（ミリキュー水、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ　ｗａｔｅｒ）の中に溶解し、ペプチドに対して２倍モルのＦＩＴＣを添加した。ＦＩＴＣは、ｃＬＡＢ．ＬのＮ末端と反応した。溶液のｐＨは、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で９．０に調整し、１時間反応させた。そして、１０％酢酸を加えて、ｐＨを７．０にした。混合溶液を凍結乾燥後、あらかじめ準備していた逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを使用して精製した。ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌを含む画分の分子量は、高速原子衝撃質量分析装置により測定し、Ｍ＋１値が１５８６であった。
【００３９】
ペプチド結合試験
活性化または非活性化細胞を、２０００ｒｐｍで５分間遠心し、３．５×１０６ ／ｍＬの濃度になるように、血清非添加培養溶液の中に懸濁した。ペプチド保存溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で調製した。結合試験には、血清非添加ＲＰＭＩ１６４０培養溶液を使用し、４８ウェル細胞培養クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ ）（コーニング社製）中で、細胞懸濁物、培養溶液、およびペプチド溶液が、４００μＬ／ウェルになるようにした。時間−温度依存性試験では、４時間の培養時間の間、試料を３０分毎に採取した。濃度依存性試験では、２時間培養を行った。ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合をブロックする試験では、ｃＬＡＢ．Ｌを細胞懸濁液に添加後、４℃で１時間培養した。そして、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌを添加し、その後、数時間培養した。これらの全試験では、ペプチドを添加していない細胞懸濁液を対照群（コントロール、ｃｏｎｔｒｏｌ ）として使用した。
【００４０】
培養後に、細胞懸濁液を、３０００ｇ、３分間遠心してからデカンテーションし、１０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＰＢＳでリンスした。細胞のペレットを、室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを使用して固定した。そして、混合物を、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／ＰＢＳで２回洗浄して、ＰＢＳに再溶解した。試料を、フローサイトメトリー（ベクトンディッキンソン社製、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。各試料毎に、１０，０００以上の細胞を計数し、各試料（ｅａｃｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ）は、少なくとも３対（トリプリケート、ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。ペプチド結合親和性は、蛍光強度（ＦＩ）の中間値の平均で、いくつかの試験では、関連する標準条件／対照に対する比で表している。
【００４１】
抗体結合試験
Ｍｏｌｔ−３細胞に対する、ｃＬＡＢ．Ｌの抗体結合のブロック力を解析するために、ＦＩＴＣ標識した抗ＬＦＡ−１抗体、抗ＩＣＡＭ−１抗体、抗ＩＣＡＭ−３抗体を用いて、一段階直接標識法を適用した。試験に使用したＬＦＡ−１のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、アンセル社製（Ａｎｃｅｌｌ）（ベイポート（Ｂａｙｐｏｒｔ ）、ミネソタ州）の抗ヒトＣＤ１１ａクローン３８および抗ヒトＣＤ１８クローンＩＢ４である。細胞凝集および接着を阻害することができることが証明されている、抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体のもう１対クローン（アキュレート社製（Ａｃｃｕｒａｔｅ）（ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、ニューヨーク州）のＤＦ１５２４およびＹＦＣ１１８．３））でも試験した。それぞれ、ＩＣＡＭ−１のＤ１−、Ｄ２−ドメインを認識する、抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体である、クローン１５．２およびクローン８．４Ａ６（アンセル社製）も、本試験において使用した。ＩＣＡＭ−３については、Ｄ１−ドメインを認識するクローン１８６−２Ｇ９を、ペプチド−ＩＣＡＭ−３認識を同定するために使用した。
【００４２】
ＦＩＴＣ−抗体を添加する前に、Ｍｏｌｔ−３細胞をペプチド溶液と１時間培養した。ペプチド結合試験で記載したとおりに、フローサイトメトリーによる解析を実施した。ＬＦＡ−１が、他のインテグリン（すなわち、β３ インテグリン：αｖ β３ 、αＩＩｂ β３ およびβ１ インテグリン）とは異なり、トリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１０）を認識しないので、抗体結合試験を通して、環状Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（シクロ−（２，１０）−Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｅｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−ＮＨ２ ）（配列番号９）を、コントロールペプチドとして使用した。さらに、ＩＣＡＭ−１は、ＲＧＤ配列を含んでいない（Ｄｅｔｍｅｒ　ａｎｄ　Ｗｒｉｇｈｔ、１９８８）。
【００４３】
蛍光および共焦点顕微鏡での観察
４℃および３７℃でのペプチド結合試験の試料について、ニコン社製のエクリプスＴＥ３００（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００ ）および共焦点顕微鏡（ニコン社のダイアフォト２０００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２０００　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）をつないだ、バイオラド社のＭＲＣ１００レーザー・スキャニング・共焦点イメージシステム（Ｂｉｏｒａｄ　ＭＲＣ １００ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ））を使用して写真撮影した。
【００４４】
ｃＬＡＢ．ＬによるＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３への抗体結合の阻害
ペプチドが、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−３に結合するかを同定するために、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３に対するＦＩＴＣ標識したモノクローナル抗体について、ｃＬＡＢ．Ｌの結合阻害能を解析し、環状ＲＧＤペプチドを陰性コントロールとして使用した（図１）。８０μＭおよび１６０μＭの２つのペプチド濃度で、阻害試験を行った。Ｄ１およびＤ２ドメイン指向性の抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体およびＩＣＡＭ−３のＤ１ドメイン指向性の抗ＩＣＡＭ−３抗体を使用して、ｃＬＡＢ．Ｌの結合特性を解析した。ＬＦＡ−１に対する２対のモノクローナル抗体も、この試験で使用した。
【００４５】
一方のペアのモノクローナル抗体は、抗ＣＤ１１ａクローン３８と抗ＣＤ１８クローンＩＢ４であるが、そのどちらも細胞接着を阻害しなかった。もう一方のペアは、抗ＣＤ１１ａクローンＤＦ１５２４と抗ＣＤ１８クローンＹＦＣ１１８．３であるが、両方とも細胞接着を阻害した。
【００４６】
図１は、３つの試験の結果を示している。陰性コントロールに関して、８０μＭおよび１６０μＭの環状ペプチドＲＧＤペプチドは、試験した全てのモノクローナル抗体の結合に影響及ぼさなかった（代表例として、コントロール参照）。図の中で、ＬＦＡ−１ｓｐは、特に、製造業者が、細胞接着／凝集の阻害剤として記載している抗体を使用したことを示している。蛍光強度のデータは、環状ＲＧＤペプチド（コントロールペプチド）の存在下におけるＦＩＴＣ−抗体の蛍光強度と、細胞のみの蛍光強度との間で標準化している。コントロールペプチドとｃＬＡＢ．Ｌの両方を、図１で「＊」および「＊＊」として示されている２種類の濃度、それぞれ８０μＭおよび１６０μＭで試験した。提示されているデータは、６回の測定値の平均値±標準誤差を表している。白抜きの棒グラフは、ブロック効果が観察されなかったことを示している。
【００４７】
Ｄ１−ドメインに対する抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体の結合は、濃度依存的にｃＬＡＢ．Ｌペプチドでブロックされた。しかし、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、Ｄ２−ドメインに対する抗ＩＣＡＭ−１抗体の結合を阻害しなかった。この結果は、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、ＩＣＡＭ−１のＤ１−ドメインとは結合するが、Ｄ２−ドメインとは結合しないことを表している。興味深いことに、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、Ｄ１−ドメインに対する抗ＩＣＡＭ−３抗体の結合をブロックできることから、ＩＣＡＭ−３のＤ１−ドメインとも結合することができる。１６０μＭの濃度で、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、抗ＩＣＡＭ−１抗体（Ｄ１）および抗ＩＣＡＭ−３抗体（Ｄ１）の結合を、それぞれ５９％、７４％ブロックすることができる。このように、ｃＬＡＢ．Ｌは、ＩＣＡＭ−３よりもＩＣＡＭ−１への結合能が高いので、ペプチドの主要な作用機構は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を阻害することであることが示唆されている。
【００４８】
ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、若干ではあるが、抗ＣＤ１１ａ抗体ＤＦ１５２４の結合を阻害することができるが、おそらく、この抗ＣＤ１１ａ抗体によってｃＬＡＢ．Ｌが認識されるためであろう。さらに、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、Ｔ細胞上のＣＤ１１ａに対する抗体の結合を阻害する。言い換えれば、ＣＤ−１１ａ内にあるｃＬＡＢ．Ｌと同じ配列が、この抗ＣＤ１１ａＤＦ１５２４抗体によって認識されるのである。ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、もう一方の抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体の結合を、ブロックしなかった。この結果は、ｃＬＡＢ．Ｌは、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８二量体が崩壊したＣＤ−１８には結合しない可能性があることを示している。
【００４９】
ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合特異性
図２ａおよび２ｂに示されているように、フローサイトメトリー実験から、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌは、Ｍｏｌｔ−３細胞の２つの細胞集団（細胞集団−１、２）に結合することが明らかとなっている。これらの試験に関して、ペプチド濃度は、２５μＭとし、抗体濃度は、製造業者が推奨するように希釈して使用した。対照的に、ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１に対するＦＩＴＣ−標識したモノクローナル抗体は、片方の細胞集団にのみ結合することが示されている。これは、図２ｃで示されている。ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌペプチドに関して、第１の細胞集団（細胞集団−１）は、蛍光強度が低い非常に多くの細胞からなり、一方、第２の細胞集団（細胞集団−２）は、細胞数は少ないものの、高い蛍光強度を示す（図２ａおよびｂ）。このことは、細胞集団−２の受容体は、細胞集団−１よりも高い親和性を有することを示している。
【００５０】
ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの受容体介在性結合特異性を決定するために、２つの試験を実施した。１つは、非標識ｃＬＡＢ．Ｌによる、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合の濃度依存性のブロック効果の試験である。もう１つは、Ｍｏｌｔ−３細胞上の受容体に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合の飽和度の試験である。これらの試験の結果は、図３ａおよび３ｂに示されている。あらかじめ４時間活性化した細胞へのＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合は、細胞集団−１および−２について、それぞれ４００μＭ、８００μＭ付近で飽和に達した。この結果は、図３ａで示されている。非標識ｃＬＡＢ．Ｌのブロック効果を解析するために、前もって活性化した２つの細胞（すなわち、４時間および４８時間活性化）を使用した。これらの結果は、図３ｂで示されている。図３ａにおいては、ＰＭＡで４時間および４８時間、前もって活性化した細胞間で、比較実験を行った。図３ｂの非標識ペプチドによるブロック効果のパーセンテージは、非標識ペプチドを添加しない場合の２５μＭＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合に対する、相対蛍光強度として算出した（非標識ペプチドと標識ペプチドの比＝０）。図３ａの各値は、対照（３．１２μＭＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌでの結合）±標準誤差に対する、蛍光強度の平均値（ｔｈｅ ｍｅａｎ）を表している。図３ａおよび３ｂで示されている両方の実験について、４回測定を行った。記号のサイズよりも小さい場合には、エラーバー（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ ）はなくなっている。ブロック効果実験は、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌを添加する前に、非標識ｃＬＡＢ．Ｌと細胞とを培養して行われた。ペプチドの取り込みを最小限に抑えるために、この反応は、４℃で行った（下記参照）。
【００５１】
その結果から、非標識ｃＬＡＢ．Ｌは、濃度依存的に、細胞集団−１および−２についてＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合を阻害することが明らかとなった（図３ｂ）。細胞集団−１については、４時間と４８時間の細胞活性化時間の両方で、似たような阻害結果を示した。一方、４８時間前もって活性化しておいた細胞集団−２では、４時間のものよりも、非標識ペプチドによるブロック効果を受けやすい傾向がある。これらの結果から、４時間活性化では、比較的受容体の親和性が高いことが明らかとなっている。
【００５２】
ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合における、活性化時間と活性化因子の影響
２つの細胞集団の細胞数と蛍光強度は、ＰＭＡ活性化の時間に応じて変化した。細胞集団−１の蛍光強度は、ＰＭＡ活性化の最初の４時間で、急激に増加し、そして、活性化後４０時間で一定の状態に達した。同じく、細胞集団−２の細胞数は、活性化時間が長くなるにつれて多くなるが、細胞集団−１の細胞数は、それに比例して減少した（図４ａ）。図４ａに示されている各値は、４回の測定の平均値±標準誤差を表している。ＰＭＡ活性化細胞に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ（５０μＭ）の結合による蛍光強度は、非活性化細胞への結合よりも、３から６倍も大きい。そのような差異から、細胞の活性化は、ペプチドの結合に極めて重要であることが分かる。
【００５３】
活性化されたＭｏｌｔ−３細胞上の受容体に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合において、温度と異なる活性化因子（すなわち、ＰＭＡ、抗ＣＤ３抗体およびカルシウムイオン（Ｃａ２＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の両方）の影響を分析した。４℃および３７℃での非活性化Ｍｏｌｔ−３細胞に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合を、陰性コントロールとして用いた。結合実験は、活性化分子の抗ＣＤ３抗体、ＰＭＡまたは二価陽イオン（１．５ｍＭの終濃度で、Ｃａ２＋＋Ｍｇ２＋）の存在下、４℃または３７℃で実施した。４℃で活性化された細胞に対するペプチド結合を、コントロールとして使用した。記載されているデータは、４回測定した対照±標準誤差に対する、蛍光強度の平均値である。記号のサイズよりも小さい場合には、エラーバー（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ ）は見えなくなっている。
【００５４】
図５ａおよび５ｂに示されているように、４℃および３７℃でのペプチドの結合は、ＰＭＡで４時間または４８時間、前もって活性化した細胞を使用して比較した。また、各値は、４回測定して、蛍光強度の平均値±標準誤差を表しており、記号のサイズよりも小さい場合には、エラーバーは見えなくなっている。結合反応を、４時間にわたって観察した。ＰＭＡまたは抗ＣＤ３抗体で活性化したＭｏｌｔ−３細胞は、４℃および３７℃において、非活性化細胞よりも親和性が高いペプチドと結合する。実験を３７℃で行うと、蛍光強度はその４時間の間、増加し続けた。しかし、ペプチドの結合は、４℃では抑制されることから、３７℃では、ペプチドは、受容体に取り込まれたことが示唆されている。対照的に、活性化細胞に対して、Ｃａ２＋とＭｇ２＋の混合物を添加しても、ペプチドの結合を向上させることはできなかった。これらの結果から、図５ｃに示すとおり、二価陽イオンのみが、活性化細胞へのペプチドの結合に影響を及ぼすことが示されている。この実験に関して、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋＋Ｍｇ２＋の終濃度は、１．５ｍＭであった。コントロールは、陽イオンを添加しない場合の、ＰＭＡ活性化細胞に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合の蛍光強度を対照とした。掲載されているデータは、３回測定したコントロール±標準誤差に対する蛍光強度の平均値を表している。非常に数値が小さいため、エラーバーは示していない。
【００５５】
ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合親和性における温度および二価陽イオンの影響
受容体（すなわち、ＩＣＡＭ−１）の活性化状態と、活性化時間との関係を調べるために、Ｍｏｌｔ−３細胞へのＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合における、活性化時間および温度の影響も分析した。細胞を、ＰＭＡで４時間および４８時間、前もって活性化させた。細胞に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合は、４℃および３７℃で、２４０分にわたり、３０分毎に試料を回収した。３０分と２４０分の結合による蛍光強度を、図５ａおよび５ｂに示した。
【００５６】
細胞集団−１および−２の両方について、２つの一貫した傾向がある。まず、ペプチド結合による蛍光強度は、３７℃で培養したときよりも、４℃の方が小さい。この結果は、蛍光顕微鏡でも確かめられた（図６ａ−ｃ）。図６ａ−ｃの各写真について、表面での結合と取り込みを観察するために、それぞれ蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡を使用した。図６ａは、３７℃で培養後のＭｏｌｔ−３細胞塊の蛍光顕微鏡写真を表している。細胞集団−１は、細胞集団−２よりも、低温下における抑制の影響を受けやすい。さらに、３０分毎に採取された試料のフローサイトメトリーの結果から、細胞集団−２のよりも細胞集団−１において、顕著に飽和結合に達することが明らかとなっている。これらの結果は、ペプチドは、受容体介在過程で取り込まれ、細胞集団−１は、細胞集団−２よりも、エネルギー依存的な取り込みの影響を受けやすい、という主張を支持するものである。その上、ペプチドは、４８時間活性化と比較して、４時間活性化した両細胞集団に対する親和性に優れている。このことは、受容体の活性化状態は、時間の経過とともに低下したことを示している。
【００５７】
ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１介在性細胞接着は、二価陽イオン、温度およびインタクトなマイクロフィラメント性の細胞骨格に依存している（Ｄｅｔｍｅｒ　ａｎｄ　Ｗｒｉｇｈｔ、１９８８）。それ故、ＰＭＡ活性化細胞に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合における、二価陽イオンの影響を分析した。この結果を、図５ｃで示している。Ｃａ２＋とＭｇ２＋の混合物は、細胞集団−１および−２に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合を、それぞれ３．４倍、１．８倍向上させたことから、細胞集団−２の受容体よりも、細胞集団−１の受容体へのＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合に関して、大きな影響を与えることが明らかとなっている。同様に、Ｃａ２＋イオンのみを添加すると、細胞集団−１に関して、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合能が、１．５倍上昇したが、細胞集団−２では、そのような影響はなかった。Ｍｇ２＋のみを添加した場合には、ペプチドの結合は観察されなかった。しかし、Ｍｇ２＋を添加すると、細胞集団−２の細胞数が増加した（データ未公表、ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。これらの結果から、表面受容体へのｃＬＡＢ．Ｌの結合は、Ｃａ２＋とＭｇ２＋陽イオンとの協調的な影響を受けることを示している。
【００５８】
ペプチドの結合と取り込みの顕微鏡観察
フローサイトメトリー分析に加えて、４℃および３７℃における、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合および取り込みを、蛍光顕微鏡（図６ａ−ｃ）と共焦点蛍光顕微鏡（図６ｄ−ｆ）を使用して解析した。Ｍｏｌｔ−３細胞塊へのＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの表面結合は、蛍光顕微鏡については緑の蛍光で（図６ａ）、そして共焦点蛍光顕微鏡については、白から灰色（図６ｄ）で示されている。単一細胞の観察では、４℃結合実験（図６ｃ）よりも、３７℃結合実験（図６ｂ）の細胞のほうが、明らかに、大きい蛍光強度を示している。２つの異なる温度の細胞の部分写真は、ペプチド取り込みは、３７℃（図６ｅ）では起こっているが、４℃（図６ｆ）ではほとんど認められないことを示している。
【００５９】
考察
これらの実験では、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１介在性のＴ細胞同士の接着を阻害するときにおける、ｃＬＡＢ．Ｌペプチド［シクロ−（１，１２）−Ｐｅｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨ］（配列番号２）の作用機序を解明した。上述の通り、Ｔ細胞間接着の阻害において、このペプチドの作用機序には、２つの可能性がある。１つは、ｃＬＡＢ．Ｌが、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を阻害するために、ＩＣＡＭｓ（ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３）に結合する、というものである。もう１つは、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、ＬＦＡ−１のβ−サブユニットとも結合することができて、完全なＬＦＡ−１を破壊して、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用を阻害する、というものである。
【００６０】
これらの実験から、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、優先的に、ＩＣＡＭ−１のＤ１−ドメインと結合することが判明した。程度は低くなるが、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、ＩＣＡＭ−３のＤ１−ドメインとも結合する（図１）。これらの結果は、Ｄ１−ドメインには結合するが、Ｄ２−ドメインには結合しない、抗ＩＣＡＭ−１抗体および抗ＩＣＡＭ−３抗体に対する、このペプチドの阻害能によって支持される。抗ＩＣＡＭ−１抗体と比較して、抗ＩＣＡＭ−３抗体の結合におけるｃＬＡＢ．Ｌの弱いブロック効果は、ＩＣＡＭ−１に対するｃＬＡＢ．Ｌの配列および／または立体構造選択性が、ＩＣＡＭ−３よりも高いことによるのかもしれない。ＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−３間の５２％の相同性は、Ｄ２−ドメイン（７７％）に大きく依存するものであるが、多くの研究により、ＩＣＡＭ−３に対するＬＦＡ−１結合における重要な配列は、Ｄ１−ドメインのなかにあることが指摘されている（Ｈｏｌｎｅｓｓ、１９９５；Ｂｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。このように、ＩＣＡＭ−３の内部には、インテグリン結合に関与する非保存配列が存在している。これらの結果からも、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用は、ＩＣＡＭ−３／ＬＦＡ−１相互作用よりも異なる機能を提供していることが裏付けられる。
【００６１】
ｃＬＡＢ．Ｌの結果は、本明細書の中で配列番号９として記載されている９アミノ酸の直鎖状ペプチド（ＴＤＧＥＡＴＤＳＧ）に関する研究結果とも一致する。このペプチドは、ｃＬＡＢ．Ｌと配列相同性があり、ＩＣＡＭ−１可溶タンパク質に対するＭｇ２＋／ＥＧＴＡ活性化Ｔ細胞の結合は阻害するが、ホルボール１２，１３−ブチル酸活性化Ｔ細胞では阻害しなかった。このペプチドは、Ｉ−ドメインから見つけられた、非常に強力なペプチドでもある（ＭｃＤｏｍａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。この直鎖状ペプチドは、この研究において、ＩＣＡＭ−１抗体の結合を阻害するために用いられたｃＬＡＢ．Ｌの濃度（８０μＭおよび１６０μＭ）よりも高い、２ｍＭの直鎖状ペプチドにより、ＩＣＡＭ−１に対するＴ細胞の結合を、７０％まで減少させることが明らかとなった。このことは、環状ペプチドｃＬＡＢ．Ｌの立体構造上の制約が、ＩＣＡＭ−１に対する結合選択性に影響を与えることを示している（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）。
【００６２】
ｃＬＡＢ．Ｌペプチドは、Ｉ−ドメインに対する抗ＬＦＡ−１抗体の結合を阻害することも明らかとなった（図１）。これは、このペプチドが、ＬＦＡ−１のＩ−ドメイン由来であることから、抗ＬＦＡ−１抗体によりｃＬＡＢ．Ｌが認識されることに起因する。対照的に、このペプチドは、ＬＦＡ−１のβ−サブユニットおよびその他のα−サブユニットに対する抗体結合を阻害することができない。この結果は、このペプチドによる結合機構は、主にＩＣＡＭ−１のＤ１−ドメインを介しており、また、弱い結合は、ＩＣＡＭ−３のＤ１−ドメインを介しているが、ＬＦＡ−１とは結合しないことが示している。
【００６３】
ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌについての、非標識ｃＬＡＢ．Ｌのブロック効果の特徴（図３ａ）、飽和度（図３ｂ）および４℃と３７℃の間における著しい結合差は、ｃＬＡＢ．Ｌによる結合を研究するためのモデルとして、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの有効性を裏付けるものである。ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌによる結合では、２つの細胞集団分布を特徴づけており、細胞の活性化時間に対応している（図２および４ａ）が、これにより、ＩＣＡＭ−１および／またはＩＣＡＭ−３の多様で動的な状態が現れていることを示している。細胞集団比が２．５対１であるＴ細胞におけるＬＦＡ−１活性化の結果として、同じような２つの山の発現が観察された（Ｋｕｒｚｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８１；Ｓａｎｄｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８）。かたや、α５ β１ インテグリンの場合には、インテグリンの活性化は、接着シグナルにおいて、別段階を反映した２つまたはそれ以上の異なる立体構造状態を発現する（Ｆａｕｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；Ｇａｒｃｉａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。同様の解釈を、ＩＣＡＭｓへのＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合にあてはめてもよい。短時間（４時間）および長時間（４８時間）の活性化時間では、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌに対する異なる親和性を有する、ＩＣＡＭｓの２つの異なる活性化状態を生み出す。ＰＭＡ活性化時間が長いと（４８時間）、４時間のＰＭＡ活性化時間よりも、細胞集団−２の細胞数が多くなった。細胞集団−２におけるＩＣＡＭｓの活性化状態では、細胞集団−１で示されているものよりも、親和性が高くなる。細胞集団−２は、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌペプチドに対する親和性が高い集団を形成して、ＩＣＡＭが活性化された状態になっている可能性がある。一方、細胞集団−１は、細胞集団−２よりもＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌへの親和性が低い、細胞表面全体に広がった活性化ＩＣＡＭｓを有する。このように、活性化時間が長くなると、細胞膜受容体や細胞骨格に、変化が出てくる。
【００６４】
ＬＦＡ−１に対するＩＣＡＭ−１の構成的結合力が示唆されているにも関わらず、この場合に、ＰＭＡ活性化が、ＬＦＡ−１ペプチド（ｃＬＡＢ．Ｌ）の結合を変化させる理由として、少なくとも２つの解釈が考えられる。まず１つは、接着性分子を介した細胞間接着は、一連の細胞認識と立体構造が関与する多段階で構成されているという事実に基づくと、間接的な活性化機構が考えられる。この現象と関連して、Ｍｏｌｔ−３細胞のＰＭＡによる活性化は、細胞膜の何らかの構成成分を分布を変化させ、細胞骨格から受容体を放出し、その後、ＩＣＡＭ−１に対するｃＬＡＢ．Ｌの結合性を高めるような、その他の細胞メカニズムを引き起こすことは明らかである。参考文献として、細胞活性化に関しては、細胞膜の脂質充填で観察される再分布（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；Ｄｅｌ　Ｂｕｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）や、細胞骨格上に制約されている受容体放出の必要性（Ｋｕｃｉｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）を挙げることができる。２つ目の可能性として、ＰＭＡ刺激により生じた活性化ＬＦＡ−１が、直接、Ｍｏｌｔ−３細胞内において、より多くの活性ＩＣＡＭ−１を生成するというものである。この仮説は、Ｔ細胞刺激が、抗原提示細胞上のＩＣＡＭ−１誘導につながったという、一般性からして妥当であるかもしれない。ＰＭＡを使用すると、ＬＦＡ−１の０〜２００部位μｍ−２内にある、精製したＬＦＡ−１に対するＪＹおよびＳＫＷ３細胞の結合を増加させる効果があり（Ｄｕｓｔｉｎ　ａｎｄ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９８９）、ＰＭＡ刺激に対するＴ細胞表面上のＩＣＡＭ−１の応答を示唆している。その他の研究でも、上皮細胞内でのＩＣＡＭ−１発現を誘導するために、ＰＭＡを使用しており（Ｂｌｏｅｍｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）、ＰＭＡ刺激は、ＩＣＡＭ−３のセリン残基に、急激な一過性のリン酸化を引き起こしている可能性があることを示している（Ｌｏｚａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）。
【００６５】
温度および他の活性化因子については、Ｔ細胞に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌペプチドの結合特性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、抗ＣＤ３抗体には、ＰＭＡと同じ効果がある。しかし、二価陽イオンだけでは、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．ＬとＩＣＡＭｓ間の結合を活性化しなかった。ＰＭＡと抗ＣＤ３抗体に関して、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの蛍光強度は、両細胞集団において、４℃よりも３７℃のほうが大きい。したがって、低温下（４℃）では、ＡＴＰ依存性受容体取り込みが抑制されるので、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌは、ＩＣＡＭ受容体によって取り込まれた。蛍光顕微鏡を使用すると、標識ペプチドの結合性は、４℃よりも３７℃のほうが高い（図６ｄ−ｆ）。ＩＣＡＭ受容体のリガンドの取り込みは、細部表面上の受容体活性を制御する受容体循環の一過程であるかもしれない。それ故、受容体−リガンド結合後のエンドサイトーシスは、受容体活性を終結機構の１つである（Ａｌｍｅｎａｒ−Ｑｕｅｒａｌｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。この受容体−リガンド取り込み過程は、インテグリン（Ｒａｕｂ　ａｎｄ　Ｋｕｅｎｔｚｅｌ、１９８９）やＶＣＡＭ−１（Ｒｉｃａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）の等のその他の細胞接着分子においても見られる。
【００６６】
ＰＭＡ−活性化Ｍｏｌｔ−３細胞の両細胞集団上のＩＣＡＭ−１のＤ１−ドメインに対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋混合物の存在下で、劇的に増加した（図５ｃ）。しかし、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋だけでは、ＩＣＡＭｓに対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合について、それぞれ、あまり急激な変化がないか、全く変化がなかった。Ｃａ２＋は、細胞集団−２よりも細胞集団−１に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合を向上させた。これらの結果は、一部のＩ−ドメインは、二価陽イオンを介してＩＣＡＭ−１と結合するという知見により支持されるものである。ＩＣＡＭ−１結合におけるＬＦＡ−１のＩ−ドメイン上の重要な残基には、Ｍｅｔ１４０ 、Ｇｌｕ１４６ 、Ｔｈｒ２４３ およびＳｅｒ２４５ （Ｈｕａｎｇ　ａｎｄ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９５）が含まれ、最近になって、Ｌｅｕ２０５ およびＧｌｕ２４１ （Ｅｄｗａｒｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）が含まれていると主張されている。ところが一方では、ＩＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−３に関して、ＬＦＡ−１のＩ−ドメインには、明確に、しかし部分的に重複している結合部位が存在する（Ｂｉｎｎｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）が、その報告されている配列のどれもが、ｃＬＡＢ．Ｌの部分配列である。ｃＬＡＢ．Ｌが、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋と結合することができることが、ＣＤ、ＮＭＲおよび分子モデリングを使用して明らかであった。ｃＬＡＢ．Ｌの結合特性も、二価陽イオンの存在下、および非存在下において、ｃＬＡＢ．ＬとＩＣＡＭ−１のＤ１−ドメイン間の融合実験により分析した。ペプチドは、残基番号１（Ｐｅｎ）、２（Ｉｌｅ），６（Ｇｌｕ）および１０（Ｓｅｒ）を介して、ＩＣＡＭ−１のＤ１−ドメインと結合することができる。
【００６７】
結論
結論として、Ｍｏｌｔ−３細胞の表面上のｃＬＡＢ．ＬとＩＣＡＭ−１間の直接結合は、主にＩＣＡＭ−１との結合を介して、そして程度は下がるが、ＩＣＡＭ−３を介している。ＦＩＴＣ−標識ペプチドの結合は、２分布の細胞集団で現れており、飽和状態にある。ＦＩＴＣ−標識ペプチドは、非標識ｃＬＡＢ．Ｌにより阻害され、これは、受容体に対するペプチドの結合の選択性について、受容体介在性結合およびＦＩＴＣ結合の影響がないことを示唆している。ペプチドの結合は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋混合物の影響を受け、ペプチドは、ＩＣＡＭｓにより、取り込まれることもある。したがって、薬剤複合体等の、その他の方法と組み合わせると、受容体介在性取り込みは、白血球関連疾患を目的とした有効な応用例であるかもしれない。
【００６８】
実施例２
ＩＣＡＭ−１由来のペプチドが薬剤と複合体をなし、ＬＦＡ−１表面受容体を発現している細胞と結合することができることを確かめている。さらに、複合体は取り込まれ、複合体を取り込んだ細胞は、濃度依存的に死滅した。複合体のペプチド部分およびそのＬＦＡ−１受容体への親和性のために、複合体の薬剤部分には、ＬＦＡ−１受容体がない細胞を殺す効果がなかった。このように、ペプチド−薬剤複合体は、選択した標的細胞（すなわち、ＬＦＡ−１受容体を発現している細胞）に対して毒性を有するが、非標的細胞に対する薬剤毒性を低減させた。したがって、同等の複合体であれば、ＬＦＡ−１発現細胞と関連した疾患（Ｔ細胞関連疾患）を治療するのに効果がある。
【００６９】
実験材料および実験方法
ＭＴＸ−ｃＩＢＲ複合体の合成：
メソトレキセート（１０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、シグマ社Ａ６７７０）をミリキュー水に溶解し、溶液のｐＨを７．０に調整した。次に、ＥＤＣ（０．０２ｍｍｏｌ）、ｃＩＢＲペプチド（配列番号８）１０ｍｇ（０．００８ｍｍｏｌ）を、ＭＴＸ溶液の中に加えて、室温で一晩貯蔵した。反応溶液を減圧して濃縮し、粗生成物を、Ｃ−１８カラム（１２μＭ、３００Å、２５ｃｍ×内径２１．５ｍｍ）のついた逆相ＨＰＬＣにより精製し、そして波長２２０ｎｍの紫外光で検出した。流速１０ｍｌ／分は、水：アセトニトリル（９５：５）に溶解した０．１％ＴＦＡからなる溶媒Ａと、１００％アセトニトリルからなる溶媒とを用いて、濃度勾配法により行われた。画分を回収し、生成物の純度を決定するためにＨＰＬＣ分析を行った。そして、所望の生成物を含んでいる画分を集め、濃縮して凍結乾燥した。複合体（ＭＴＸ−ｃＩＢＲ）の存在は、質量分析（Ｍ＋１＝１６１１．４）およびＮＭＲにより確認した。
【００７０】
毒性試験：
毒性試験は、活性化および非活性化ＭＯＬＴ−３Ｔ細胞を使用して、ＭＴＴアッセイにより行った。ＭＯＬＴ−３Ｔ細胞の活性化は、終濃度０．２μＭのＰＭＡ（ホルボール１２−ミリスチン酸−１３−酢酸）を使用して実施した。生存率８０％の２．９２×１０５ ｃｅｌｌ／ｍｌの非活性化ＭＯＬＴ−３細胞、または２．４７×１０５ ｃｅｌｌ／ｍｌの活性化ＭＯＬＴ−３細胞を含む細胞懸濁液の一定量を、４８−ウェルプレートに撒いた。それから、ＰＢＳに溶解したＭＴＸ、ＭＴＸ−ｃＩＢＲ、および／またはｃＩＢＲの段階量をプレートに加えて、５％飽和ＣＯ２ ／９５％空気雰囲気下、３７℃で４８時間培養した。変態活性（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の下限値を決定するために、陰性コントロールとして、１０ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で４８時間処理したものを使用した。細胞だけを使用した陽性コントロールは、変態活性の上限値を決定するために使用した。培養過程の最後に、ＭＴＴ（シグマ社製、セイントルイス、ミズーリ州）溶液（５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）４０μｌを各ウェルに添加し、さらに３７℃で２時間培養した。培養後、細胞懸濁液を小型遠心チューブに移して、３，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨てた。生成したホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）の結晶に、イソプロパノール中の０．０４Ｎ塩酸１ｍｌを加えて溶解し、その後、７〜１０分間破砕した。再度、小型遠心チューブを、３，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清１００μＬを９６ウェルプレートに移して、すぐに、タイターテック　マルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）　ＭＣＣ／３４０を使用して波長５４０ｎｍの吸光度を測定した。変態活性は、次のようにして算出した、ここで、Ｏ．Ｄ．とは、測定した５４０ｎｍでの光学密度である。
【００７１】
変態活性＝−（Ｏ．Ｄ．ＩＡＡ −Ｏ．Ｄ．ｓａｍｐｌｅ）／（Ｏ．Ｄ．ＭＴＴ −Ｏ．Ｄ．ＩＡＡ ）
【００７２】
ＭＤＣＫ細胞を用いた毒性試験は、次のように行われた。４８ウェルプレートについて、細胞懸濁液（８×１０５ ｃｅｌｌ／ｍｌ）３００μＬを増殖させて、１層のコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ）にした。完全に１層になったところで、前記の通り、ＭＴＸまたはＭＴＸ−ｃＩＢＲの段階量を処理し培養した。ＭＴＴアッセイは、細胞が１層で、処理後でもプレートに接着したままになっており、剥がして小型遠心チューブに移した：点を除き、上記の通り実施した。
【００７３】
結果：
毒性試験の結果から、ＭＴＸ−ｃＩＢＲ複合体は、濃度依存的に毒性を示し、ＭＴＸだけのときの同等の濃度よりも、約１９倍も毒性があることが明らかとなっている。このような毒性の上昇が、ＭＯＬＴ−３に対するｃＩＢＲ結合によることを証明するために、ｃＩＢＲの添加量を増やすことにより、ＭＴＸ−ｃＩＢＲの毒性は、濃度依存的に阻害されることが明らかとなった。
【００７４】
このようなＬＦＡ−１発現細胞に対する薬剤−ペプチド複合体の特異性は、ＬＦＡ−１を発現していないＭＤＣＫ上皮細胞における毒性と比較することで証明された。Ｔ細胞に対して、ほぼ完全な毒性効果を発現するＭＴＸおよびＭＴＸ−ｃＩＢＲ濃度で、ＭＤＣＫ細胞を処理すると、ＭＴＸ−ｃＩＢＲは、ＭＴＸだけよりも、毒性が約１／５であることが明らかとなった。ＬＦＡ−１受容体がなければ、複合体は、細胞内に運ばれない（例えば、取り込まれない）。ゆえに、Ｔ細胞だけが、ＬＦＡ−１を発現していることから、この結合特異性は、相当の選択性を提供している。したがって、Ｔ細胞関連疾患は、そのような疾患に対して効能のある薬剤での治療で、多くの場合に発生する副作用がない複合体で治療することができる。さらに、投与水準は、標的細胞による取り込み後の薬剤の高い効力により、比較的低くてもよい。喘息、炎症、クローン病（Ｃｈｒｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ）、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、尋常天疱瘡、類天疱瘡、アレルギー類、ＨＩＶ感染症、表皮剥離症等の白血球関連疾患の治療するために、薬剤にペプチドを結合させて使用することができる。さらに、そのような疾患の治療に効能のある薬剤は、非標的細胞に対する毒性を低くすることができることに加えて、薬剤に本発明のペプチドを結合させて標的細胞に対しては、より薬効を強くすることができる。
【００７５】
もう１つの本発明の用途は、Ｔ細胞に対してＨＩＶ−タンパク質分解酵素阻害剤（ＨＩＶ−プロテアーゼインヒビター、ＨＩＶ−ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）輸送することと関係している。本発明の方法は、ＡＩＤＳ患者において増加している、ＨＩＶ−プロテアーゼインヒビターに対する薬剤耐性を回避するのに役立つ。ＨＩＶの複製は、Ｔ細胞内で起こるので、Ｔ細胞を標的にしたペプチド（すなわち、ＬＦＡ−１受容体に結合するペプチド）を使用することは、ＨＩＶ複製を抑制するのに適当である。その上、本発明の方法およびペプチド−薬剤複合体を使用して、細胞外への運搬に関わるポンプ受容体（ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ）から逃れることも可能である。
【００７６】
下記の参考文献の実験手法および知見は、本明細書の中に引用して含まれる。
【００７７】
Ａｌｍｅｎａｒ Ｑｕｅｒａｌｔ ｅｔ ａｌ．， 活性化した内皮上のＩＣＡＭ−１発現における先端解剖分析および修飾。Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：１２７８−１２８８（１９９５） 。
【００７８】
Ｂｅｌｌ ＥＤ， ｅｔ ａｌ．，ＩＣＡＭ−３上の白血球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）−結合部位は、第１免疫グロブリンドメインの両表面上の残基を含んでいる。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：１３６３−１３７０（１９９８） 。
【００７９】
Ｂｅｎｅｄｉｃｔ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．， ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１短鎖ペプチドおよびその使用方法。米国特許２２９，５３１号明細書（１９９４年）。
【００８０】
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Ｇｕｓｏｙ ＲＮ ａｎｄ Ｓｉａｈａａｎ ＴＪ，　Ｔ細胞表面受容体によるＩＣＡＭ−１ペプチドの構造認識：シクロ−（１，１２）−Ｐｅｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨの立体構造に関する研究。　Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｒｅｓ．５３：４３２−４４１（１９９９ｂ年） 。
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Ｈｏｌｎｅｓｓ ＣＬ， ｅｔ ａｌ．， 　白血球インテグリン機能−関連抗原１に対する細胞間接着分子３上の結合部位。　Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８７７−８８４（１９９５年） 。
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Ｋａｔｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， 　抗細胞間接着分子−１抗体および抗白血球機能−関連抗原−１抗体を組み合わせて処置した後における、マウスの移植した胎児腸管同種異系移植片に特異的な免疫寛容。　Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２３：９４−１００（１９９６年） 。
【００９７】
Ｋｕｃｉｋ ＤＦ， ｅｔ ａｌ．， 　接着性活性化ホルボールエステルは、培養リンパ球における、白血球インテグリンであるＬＦＡ−１の動的特性を上昇させる。　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２１３９−２１４４（１９９６ 年） 。
【００９８】
Ｋｕｒｚｉｎｇｅｒ Ｋ， ｅｔ ａｌ．，　重要な白血球機能−関連抗原（ＬＦＡ−１）：細胞上の分布、発現量の変化、および構造。　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５９６−６０２（１９８１年） 。
【００９９】
Ｌｏｚａｎｏ Ｆ， ｅｔ ａｌ．， 　ＣＤ５０白血球抗原のリン酸化および表面発現におけるタンパク質リン酸化酵素Ｃ活性化因子の影響。　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：３２１−３２６（１９９２年） 。
【０１００】
ＭｃＤｏｗａｌｌ Ａ， ｅｔ ａｌ．， 　インテグリンである白血球機能−関連抗原−１のＩドメインは、リガンドである細胞間接着分子−１への結合の高い親和性につながるような立体構造的変化に関与している。　Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７３９６−２７４０３（１９９８年） 。
【０１０１】
Ｎａｋａｍｕｒａ ＥＫ， ｅｔ ａｌ．，　短期間の抗白血球機能−関連抗原−１抗体のモノテラピー （ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）において、器官移植の長期間にわたる定着。　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６２：５４７−５５２（１９９６ 年） 。
【０１０２】
Ｒａｕｂ， ＴＪ ａｎｄ Ｋｕｅｎｔｚｅｌ ＳＬ， 　抗フィブロネクチン受容体βサブユニットのモノクローナル抗体を用いた、哺乳類細胞インテグリン受容体のエンドサイトーシスにおける熱力学的および形態学的証拠。　Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８４：４０７−４２６（１９８９ 年） 。
【０１０３】
Ｒｉｃａｒｄ Ｉ， Ｐａｙｅｔ ＭＤ ａｎｄ Ｄｕｐｕｉｓ Ｇ，　ＶＣＡＭ−１は、ヒト内皮細胞のクラスリン関連経路により取り込まれるが、α４ β１ インテグリンの相手の受容体は、ヒトリンパ球の細胞膜に相互作用したままになっている。　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１７０８−１７１８（１９９８ 年） 。
【０１０４】
Ｒｏｓｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ．， 　ＩＣＡＭ−１配列由来の合成ペプチドによるＭｏｌｔ−４の内皮接着の阻害。　Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８５３７−８５４３（１９９２年） 。
【０１０５】
Ｒｏｔｈｌｅｉｎ Ｒ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＴＡ， 　ホルボールエステルにより刺激されたリンパ球間接着における、白血球機能−関連抗原−１の必要性。　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１１３２−１１４９（１９８６年） 。
【０１０６】
Ｓａｎｄｅｒｓ ＭＥ， ｅｔ ａｌ．， 　ホジキンス細胞株に対するＴリンパ球の自発的なロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ ）における分子接着経路。　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４０１−１４０７（１９８８年） 。
【０１０７】
Ｓｉａｈａａｎ ＴＪ， ｅｔ ａｌ．， 　ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１への結合を妨害または促進する対合受容体の結合ドメイン。ペプチドにおける：化学、構造および生物学（ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｋａｕｍａｙａ ＰＴＰ ａｎｄ Ｈｏｄｇｅｓ ＲＳ著））ｐ．７９２−７９３，メイフラワー　サイエンティフィック（Ｍａｙｆｌｏｗｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、英国（１９９６ 年） 。
【０１０８】
Ｓｍｉｔｈ ＤＭ， ｅｔ ａｌ．， 　リンパ球の細胞膜脂質集合および白血球機能−関連抗原−１依存性凝集。　Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５６：１８２−１８８（１９９３ 年） 。
【０１０９】
Ｓｔａｎｌｅｙ Ｐ ａｎｄ Ｈｏｇｇ Ｎ， 　インテグリンであるＬＦＡ−１のＩ−ドメインは、Ｉのドメイン−１と、グルタミン酸３４のところで相互作用するが、グルタミン７３のところではしない。　Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３３５８−３３６２（１９９８年） 。
【０１１０】
ｖａｎ Ｋｏｏｙｋ Ｙ， ｅｔ ａｌ．，　白血球機能−関連抗原−１のＩ−ドメイン介在性細胞間接着分子３結合および免疫機能における、必須アミノ酸。　Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｃｏｍｍ．１：２１−３２（１９９３ 年） 。
【０１１１】
Ｗｉｌｌｅｎｂｏｒｇ ＤＯ， ｅｔ ａｌ．，　可溶性神経抗原および抗ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）抗体で短時間処理すると、ラットの自己免疫性脳脊髄炎を防ぐことができる：処理は、自己免疫疾患を排除するが、自己免疫性は排除しない。　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１９７３−１９８０（１９９６年） 。
【０１１２】
Ｗｕｒｆｉｎｇ Ｃ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ ＭＭ， 　受容体／細胞骨格の動的変化は、Ｔ細胞活性化の間、共刺激により引き起こされる。　Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２２６６−２２６９（１９９８年） 。
【０１１３】
［配列表］
印刷した配列表を、本出願に添付するとともに、ＣＲＲＯＭ上にコンピューターで読み込むことができるＡＳＣＩＩ形式のファイルにした同じ内容のものも、送付した。
【図面の簡単な説明】
この特許出願には、少なくとも１つのカラーで作成した図面が含まれている。カラー図面付の特許出願の複写は、請求して必要な費用を支払うことで、特許商標庁から提供される。
【図１】図１は、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３およびＬＦＡ−１に対するＦＩＴＣとの複合抗体の結合において、ｃＬＡＢ．Ｌペプチドによるブロック効果を表わす図である。
【図２】図２は、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌへの結合に反応した、Ｍｏｌｔ−３細胞集団の分布を表す図である、その中で、（ａ）ＰＭＡで１時間、あらかじめ細胞を活性化しておく、（ｂ）ＰＭＡで４８時間、あらかじめ細胞を活性化している。一方、ＩＣＡＭ−１のＤ１ドメインに対するＦＩＴＣ結合抗体との結合に応じたＭｏｌｔ−３細胞集団の分布は、（ｃ）の中で示されている。
【図３】図３は、Ｍｏｌｔ−３細胞の細胞集団−１および−２におけるＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合特異性を表す図である。（ａ）ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合の飽和度、（ｂ）濃度依存的に、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合をブロックする、非標識−ｃＬＡＢ．Ｌのブロック能を表している。
【図４ａ】図４ａは、ＰＭＡによる活性化時間に対する、細胞集団−１および−２の割合を表す図である。
【図４ｂ】図４ｂは、細胞集団−１に対する２５μＭＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合における、細胞活性化の効果を表す図である。
【図５ａ】図５ａは、細胞集団−１において、２５μＭＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの時間−濃度依存度を表す図である。
【図５ｂ】図５ｂは、Ｍｏｌｔ−３細胞の細胞集団ー２を表す図である。
【図５ｃ】図５ｃは、ＰＭＡで活性化されたＭｏｌｔ−３細胞に対するＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの結合強度について、陽イオン添加の効果を表す図である。
【図６】図６ａは、３７℃におけるＭｏｌｔ−３細胞集塊について、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合および細胞への取り込みの顕微鏡観察を表す共焦点顕微鏡写真である。
図６ｂは、３７℃における単一のＭｏｌｔ−３細胞について、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合および細胞への取り込みを表す共焦点顕微鏡写真である。
図６ｃは、４℃における単一のＭｏｌｔ−３細胞について、ＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌ結合および細胞への取り込みを表す共焦点顕微鏡写真である。
図６ｄは、３７℃で培養後での、Ｍｏｌｔ−３細胞表面の投影像を表す共焦点顕微鏡鏡写真である。
図６ｅは、図６ｄと同じ領域で、細胞質内のＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの分布を表す共焦点顕微鏡写真である。
図６ｆは、細胞周辺のＦＩＴＣ−ｃＬＡＢ．Ｌの局所分布を表す単焦点領域を示している。
【図７】図７は、本発明のＭＴＸ−ｃＩＢＲ複合体の２つの異なる形態を表す概略図である。
【図８】図８は、本発明のＭＴＸ−ｃＩＢＲ複合体の取り込み過程を表す概略図である。
【図９】図９は、本発明に従い、ＭＴＸ−ｃＩＢＲ複合体およびＭＴＸのみについて、異なる濃度における毒性を比較したＭＴＴアッセイを表す図である。
【図１０】図１０は、ＭＴＸ、ｃＩＢＲおよびＭＴＸ−ｃＩＢＲ複合体で処理後について、細胞の変態活性を表す比較図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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2004505029.tif 000068
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505029.tif 000069
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505029.tif 000070
【国際調査報告】
2004505029.tif 000071
2004505029.tif 000072
2004505029.tif 000073