(57)【要約】【課題】本発明はアレイ上のオリゴヌクレオチドへのｍＲＮＡの結合を検出するための装置および方法に関する。【解決手段】アレイ上のオリゴヌクレオチドはその遊離３′末端に反応性−ＯＨ基を有し、ｍＲＮＡの結合をＲＮＡ依存性核酸修飾酵素を用い検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ転写体をマッピングすることで未変性ＲＮＡの構造パラメータを決定する装置であって、表面支持体上に提示される固定化オリゴヌクレオチドを有し、その提示されたオリゴヌクレオチドがその遊離３’末端に反応性の−ＯＨ基を持つアレイ、および固定化オリゴヌクレオチドと適用されたＲＮＡとの間の相補的塩基対相互作用に依存する前記３’−ＯＨ基を延長する手段とを具備する装置。
【請求項２】
前記固定化延長産物を検出する手段を更に具備する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特定の１種類または複数種類の長さのオリゴヌクレオチドについて考えうるいずれか又は全ての組合せがアレイ表面に提示されている請求項１または２に記載のＲＮＡ転写体をマッピングするための装置。
【請求項４】
６〜８または９〜１５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて考えうる全ての組合せが、アレイ上に提示されている先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドがアレイ上の物理的に離れた位置に提示されている先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが５’末端の化学修飾によりアレイ支持体に固定化されている先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが通常の結合技術を用いアレイに結合されている先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
アレイにオリゴヌクレオチドを結合するのに用いられる結合技術がアミノ結合である請求項７に記載の装置。
【請求項９】
アレイにオリゴヌクレオチドを結合するのに用いられる結合技術がビオチン／ストレプトアビジン結合である請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドが化学スペーサを用い、支持体から空間をあけ離されている先行請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
化学スペーサが６〜４０炭素当量の長さである請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を用い、オリゴヌクレオチドの５’末端を延長することでオリゴヌクレオチドを支持体から空間をあけ離す請求項１〜１１のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
空間を開けるヌクレオチドが天然または合成ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体でよく、そしてホモポリマまたはヘテロポリマでもよい請求項１０〜１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
次の工程が用いられるオリゴヌクレオチドアレイへの前記未変性ＲＮＡの結合を検出することで未変性ＲＮＡの構造パラメータを決定するための方法：
（ａ）未変性ＲＮＡをアレイに適用して前記未変性ＲＮＡ内にある利用可能配列に対し相補的であるオリゴヌクレオチドにアニーリングさせるステップ；
（ｂ）ＲＮＡ依存性修飾酵素を適用し反応させるステップ；および
（ｃ）未結合のＲＮＡもしくは酵素、またはその他の反応成分を洗い流すステップ；および
（ｄ）ＲＮＡ依存性修飾酵素による修飾を検出するステップ。
【請求項１５】
工程（ａ）（ｂ）（ｃ）および（ｄ）のいずれか、または全てが同時的または連続的である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡ依存性修飾酵素による修飾を直接検出する請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ依存性修飾酵素による修飾を間接的に検出する請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ依存性核酸修飾酵素がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＲＮＡ依存性核酸修飾酵素が逆転写酵素活性を持つ酵素である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
逆転写酵素活性を持つ酵素がＲＮａｓｅＨ活性を欠いた修飾逆転写酵素である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
反応バッファがｍＲＮＡをアレイに適用する時に用いられる請求項１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
反応バッファが酵素活性だけでなくＲＮＡの２次および３次構造の維持、ならびに適用ＲＮＡとアレイ上の相補的オリゴヌクレオチド要素間の二重鎖形成にも適合している請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
容積排除剤が反応混合体に加えられる、請求項１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
容積排除剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
容積排除剤が硫酸デキストランである請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
標識デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）がＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共にアレイに適用され二重鎖の検出を可能にする請求項１４〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
標識ジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）をＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共に加えることができ、二重鎖の検出が可能になる請求項１４〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
標識ｄＮＴＰｓまたは標識ｄｄＮＴＰｓが蛍光、燐光イメージングまたはオートラジオグラフィにより検出できる請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
未標識ｄｄＮＴＰｓをＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共にアレイに加え、未反応の余分のｄｄＮＴＰｓを洗い流し、適当なバッファ中に標識ｄＮＴＰｓと共にターミナルトランスフェラーゼを加えることにより二重鎖が検出でき、その結果標識されなかった固定化オリゴヌクレオチドが事前に適用しておいた標的ＲＮＡの利用可能配列に相補的であるオリゴヌクレオチドとなる請求項１４〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
アレイが請求項１〜１３のいずれかに記載の装置である請求項１４〜２９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアレイ上のオリゴヌクレオチドへのｍＲＮＡの結合を検出する方法であって、このｍＲＮＡの結合がＲＮＡ依存性核酸修飾酵素を用い検出される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
研究または治療を目的とした遺伝子発現制御手段としてのアンチセンスが最初に報告されたのは１９７０年代であった。以後、アンチセンスの機能の仕方の解明と、効果的なアンチセンス標的をマッピングする方法の開発に多大の努力が払われてきた。
【０００３】
アンチセンスは、標的ｍＲＮＡに対し相補的である短い合成核酸、アンチセンス作用物質を細胞内に導入することで機能する。このアンチセンス作用物質はその標的ｍＲＮＡに結合して、内因性ヌクレアーゼによる分解のためのタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）と、転座または翻訳を物理的に阻害する働きの両方を有すると考えられるメカニズムによって翻訳を抑制する。
【０００４】
アンチセンス作用物質のデザインは、ｍＲＮＡが極めて複雑な２次および３次構造を有するため複雑である。いかなるｍＲＮＡもそのヌクレオチド配列の少なくとも９０％はその分子の２次および３次構造内の分子内相互作用に関係しており、そのためアンチセンス作用物質との分子間相互作用に利用することはできない。上手く機能するアンチセンス作用物質のデザインにとって最も重要なことは、分子間ハイブリダイゼーションに使用できる潜在的標的ｍＲＮＡの存在する、限られた領域を特定することである。これら利用可能な領域を特異的に標的とするアンチセンス作用物質はインビボで標的ｍＲＮＡに高い確率で結合し、そこにコードされた産物の発現レベルを効果的にノックダウンする。
【０００５】
先行技術にはアンチセンス作用物質を効率的に見つけ出すのに用いることができる様々なインビトロ実験法がある。一般にこれら実験法はオリゴヌクレオチドのライブラリを用いて、ＲＮａｓｅＨによるインビトロＲＮＡ転写体の切断を媒介するか、またはＲＮＡに結合してゲル電気泳動時の標識種の移動を遅延させるか、または別の要素のアレイ上にあるＲＮＡに結合させる方法であり、この時、各要素からの信号が検出され、その位置へ結合できるように関連付けされる。
【０００６】
方法が上手く機能するかは、標的ｍＲＮＡの配列がわかっていること、そして一般に最長２５ヌクレオチドまでの長さが重複するオリゴヌクレオチドのライブラリをデザインすることによっている。オリゴヌクレオチドライブラリにおける標的ｍＲＮＡの配列は、第１オリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡ上の位置１〜１５に対し相補的であり、第２オリゴヌクレオチドが位置２〜１６に対し相補的となり、第３オリゴヌクレオチドが位置３〜１７に対し相補的になるといった様に表される。
【０００７】
先行技術では、アンチセンス作用物質が標的の配列について事前の情報を必要としない装置を用いデザインできる方法が提案されている。このような装置は、可能性のある配列のあらゆる組合せが４から８ヌクレオチド単位のオリゴヌクレオチドで提示されるとうに、ガラスまたはプラスチック製の支持体の上に固定化されたオリゴヌクレオチドのアレイを設けることが提案されている。このタイプの装置は国際特許出願第ＷＯ９８／１５６５１号および米国特許第ＵＳ００６０５４２７０号に開示されている。この特許および特許出願では各オリゴヌクレオチドはアレイ上で物理的に離れていること、および標的ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションと未結合物質の洗い流しの後に結合したオリゴヌクレオチドから信号を検出することが提案されている。その配列の存在とアレイ上の物理的に離れた位置を知ることにより、分子間ハイブリダイゼーションに利用可能である標的ｍＲＮＡの配列を推測することができる。推測された配列はアンチセンスの媒介遺伝子のノックダウンにとって有効な標的である可能性が高い。
【０００８】
第ＷＯ９８／１５６５１号および第ＵＳ００６０５４２７０号は共に考え得るあらゆる４から８塩基の配列の組合せを含むアレイを記載する。この場合、４塩基配列の組合せでは全ての配列組合せを提示するにはアレイ上に２５６の要素が必要である、そして８塩基配列の組合せでは全ての配列組合せを提示するには６５，５３６の要素が必要となり、技術的には可能であるが、このように短い４から８塩基ヌクレオチドをアレイの基本として使用するには困難が伴う。短い４〜８塩基オリゴヌクレオチドをアレイの基本として使用してＲＮＡ構造をマップし、効果的なアンチセンス標的である領域を特定する場合、アレイ上のオリゴヌクレオチドとそれに対しハイブリダイゼーション条件下で加えられた標識転写体との間の相互作用が極めて弱いという困難が伴う。通常の洗浄条件下では転写体は洗い流され、信号は検出されない。この状態は化学的スペーサを用いて短いオリゴヌクレオチドのアレイ要素とアレイ基材との間に間隔をとることで改善される。塩濃度を上げるか、温度を下げると非特異的バックグランドが増す傾向にあるが、信号は改善されない。特許出願第ＷＯ９８／１５６５１号では、信号がＲＮＡを４塩基オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションして検出できることが示されている。しかし記載された方法の条件ではオリゴヌクレオチドではなくＲＮＡを固体支持体に固定化すること、およびオリゴヌクレオチドを液体の状態で変性ＲＮＡに適用する必要がある。このような条件では、ＲＮＡが本来それが持つインビボ構造に折りたたまれることは考えにくく、この実施方法は標的アンチセンスに対し好適なＲＮＡ構造様式をマップしない。
【０００９】
要約すれば固定化されたオリゴヌクレオチドは、二重鎖体の形成のためにハイブリダイゼーション反応を起こすに十分なＲＮＡ濃度の中で、完全長のＲＮＡ転写体にハイブリダイズする。通常の洗浄条件、例えば１ＭのＮａＣｌを使用して４℃〜３０℃の間で洗い流す場合は、用いたＲＮＡを希釈することに伴う動態が変化により、一般に短い二重鎖体が解離しやすく、本来の相互作用、即ちＲＮＡ領域がアンチセンスを媒介するノックダウンに利用できる旨の信号を直接検出することができなくなる。
【００１０】
典型的には、その条件においてはＲＮＡがそのインビボ構造認証例に折りたたまれているＲＮＡ構造をマッピングする確かな条件を得るためには、少なくとも１０ヌクレオチド長を持つオリゴヌクレオチドを用いる必要がある。１０ヌクレオチド長のヌクレオチドの完全変性アレイは１００万を超える要素を含むことになり、極めてコストが高くなる。それゆえＲＮＡと１０ヌクレオチド長より短いオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリの構成要素との間の相互作用を検出できる方法が必要と考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の第１の目的は、未変性のインビトロＲＮＡ転写体と固体支持体上に固定された短いオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを検知する方法を提供することである。
【００１２】
本発明はさらに、ある１種類または複数種類の特定の長さを持つオリゴヌクレオチドの考えうる全ての組合せを提示する最大１００，０００種類の個別構成要素から成る中密度オリゴヌクレオチドアレイを用いてｍＲＮＡ上の利用可能な領域をマッピングするツールを提供することを目的としている。
【００１３】
それぞれが溶液中に物理的に分離された状態を保ち、各溶液中のオリゴヌクレオチドの配列がわかっている１種類または複数種類の特定の長さ、あるいは各種の長さの完全に変性したオリゴヌクレオチドのライブラリをアクセスマッピングアレイの基礎に使用することもできる。前記オリゴヌクレオチドのサブセットまたは全部を配列に従い選び出し、これを用いて目的の標的ＲＮＡに対し相補的なアレイを印刷することができる。前記オリゴヌクレオチドのサブセットはコンピューター制御装置を使い選択し印刷できる。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は二重鎖を直接検出する方法を提供することである。
本発明のよりさらに別の目的は、ＲＮＡとオリゴヌクレオチド間に形成された二重鎖を間接的に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明に従い提供される装置に、ＲＮＡ転写体をマッピングすることにより未変性ＲＮＡの構造パラメータを決定する装置がある。この装置は、その表面支持体上に固定化オリゴヌクレオチドが提示されるアレイを含み、この提示されたオリゴヌクレオチドはその遊離３’−末端に反応性の−ＯＨ基を有し、またこの−ＯＨ基を特定の固定化オリゴヌクレオチドと加えられたＲＮＡとの間の相補的塩基対相互作用によって延長する手段を備えている。
【００１６】
装置は、更に前記の固定化された延長産物を検出する手段も含むことが好ましい。
【００１７】
アレイの表面には特定の１種類または複数種類の長さを持つオリゴヌクレオチドについて可能な全ての組合せが提示されることが好ましい。
【００１８】
６〜８、または９〜１５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドで考えうる全ての組合せを、アレイ上の物理的に離れている位置に提示すればさらに望ましい。
最適には、６〜８塩基オリゴヌクレオチドについて考えうる全ての組合せがアレイ上の物理的に離れた位置に提示される。
【００１９】
アレイはプラスチック製であってもよい。
別の選択肢としてアレイはガラス製でもよい。本発明はアレイの材料により限定されない。
【００２０】
好適には、オリゴヌクレオチドは５’末端を化学修飾することでアレイ支持体に固定される。
好適には、オリゴヌクレオチドは一般的な結合技術を用いてアレイに結合される。
アレイへのオリゴヌクレオチドの結合に使用する結合技術は、アミノ結合を選択してもよい。
アレイへオリゴヌクレオチドを結合する別の選択肢として、ビオチン／ストレプトアビジン結合がある。
【００２１】
本発明はアレイへのオリゴヌクレオチドの結合に用いる結合技術により限定されない。
随意にオリゴヌクレオチドは化学スペーサにより支持体から間隔をおかれる。
好ましくは、化学スペーサは６〜４０炭素当量の長さである。
【００２２】
オリゴヌクレオチドの特定配列は、複数のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を用いオリゴヌクレオチドの５’末端を延長してアレイから間隔を取っても良い。例えば６塩基配列５’ＣＧＧＡＡＣ３’は、それを５’ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＡＣ３’とすることで、アレイから間隔をあけることができる。間隔を取るヌクレオチドは天然のものでも合成のものでも、またはヌクレオチド類似体でもよく、またホモポリマまたはテロポリマでもよい。この場合のヌクレオチドとはデオキシヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドも意味する。
ヌクレオチドスペーサは化学スペーサと共に使用してもよい。
【００２３】
本発明の第２の側面によれば、第１の側面に記載のように、未変性ＲＮＡ内のオリゴヌクレオチドアレイへの結合を検出することで未変性ＲＮＡの構造パラメータを決定する方法を提供するが、その方法では：
（ａ）未変性ＲＮＡをアレイに作用させ、その未変性ＲＮＡ内にある利用可能な配列に相補的なオリゴヌクレオチドにアニーリングさせ；さらに
（ｂ）ＲＮＡ依存性核酸修飾酵素を加え反応させ；続いて
（ｃ）いかなる未結合のＲＮＡもしくは酵素またはその他反応成分を洗い流し、そして
（ｄ）ＲＮＡ依存性修飾酵素による修飾を直接または間接的に検出する。
【００２４】
好ましくはステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれか、または全てが同時に行われるか、または連続して行われる。
好適なＲＮＡ依存性修飾酵素はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼには、逆転写酵素活性を持つ酵素が最適である。
逆転写酵素活性を持つ酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を欠いた修飾逆転写酵素でよい。
反応バッファはｍＲＮＡをアレイに作用させた時点で使用するのが好ましい。
反応バッファは酵素活性に適合し、またＲＮＡの２次および３次構造の維持および加えられたＲＮＡとアレイ上の相補的ヌクレオチド要素との間の二重鎖形成にも適合していることが最も望ましい。
反応混合体には随意に容積排除剤が加えられる。
容積排除剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を選択してもよい。
別の選択肢として、容積排除剤には硫酸デキストランがある。
随意に、標識デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）をＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共にアレイに作用させ、二重鎖を直接検出できるようにする。
あるいは、標識ジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）をＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共に加え二重鎖を直接検出してもよい。
随意、標識ｄＮＴＰｓまたは標識ｄｄＮＴＰＳは蛍光、蛍光体イメージングまたはオートラジオグラフィにより検出できる。
随意、二重鎖は未標識ｄｄＮＴＰｓをＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共にアレイに加え未反応の過剰なｄｄＮＴＰｓを洗い流し、ターミナルトランスフェラーゼを標識ｄＮＴＰｓと共に適切なバッファに加えることにより間接的に検出されるが、この時、標識されない固定化オリゴヌクレオチドは、先に加えられた標的ＤＮＡのなかの利用可能な配列に対し相補的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明をより良く理解するために、次に発明の実施態様を例示のみで説明する。
本発明の第１の態様により、ＲＮＡ転写体のマッピング、およびアンチセンスを媒介する遺伝子ノックダウンに有効な標的となる領域の決定に用いる装置が提供される。装置はアレイを含むが、アレイ上の物理的に分離した位置に、特定の１種類または複数種類の長さのオリゴヌクレオチドに考えうる全ての組合せを提示していことが望ましい。オリゴヌクレオチドはそれらの５’末端に於いて、遊離型の反応性３’ＯＨ基を持つように化学修飾により固体支持体に結合されている。
【００２６】
装置には、特定の固定化オリゴヌクレオチドと加えたＲＮＡとの間の相補的塩基対相互作用に依存する、前記３’ＯＨ基を延長する手段がさらに備えられる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドをアレイ表面に固定化する化学修飾は、通常結合基の付加という形で行なわれる。ビオチン／ストレプトアビジン結合も他の結合技術として本発明に応用可能な通常使用技術であるが、一般にはアミノ結合オリゴヌクレオチドが用いられる。
【００２８】
オリゴヌクレオチドの小集団は、ＲＮＡ濃度が十分であり、二重鎖形成を促す形でハイブリダイゼーション反応を進める条件の下、加えられたＲＮＡとハイブリダイゼーションする。
【００２９】
本発明の第２の態様によれば、上記アレイ装置を用いてアレイ上のオリゴヌクレオチドのサブセットへの未標識ｍＲＮＡの結合を検出できる。
【００３０】
標識ｍＲＮＡのコピーは、新生ＲＮＡがそのインビボ構造認証例に折りたたむことができる条件の下、完全長または部分的なｃＤＮＡクローンよりインビトロで転写される。合成された後、標的ｍＲＮＡはその２次および３次の構造認証例を維持する条件の下に維持される。
【００３１】
標的ＲＮＡは本来の折りたたみが可能である条件下、インビトロで転写されてからアレイに適用される。加えられた高濃度ＲＮＡにより、ＲＮＡとＲＮＡの中の利用可能な領域に対し相補的であるアレイ上のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応は二重鎖形成の方向に進む。こうして形成された二重鎖は、固定化されたオリゴヌクレオチドの指向性から、逆転写酵素等のＲＮＡ依存性ＤＮＡ修飾酵素の基質となる。具体的には、ＡＭＶ−逆転写酵素またはＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の様な酵素が適切である。ＲＮａｓｅＨ活性を停止するよう加工されたＥｘｐａｎｄＲＴ（ロシュ）またはＭ−ＭｕＬＶＲａｓｅＨ−（プロメガ）等の逆転写酵素も、用いることができる。一般には、ＲＮＡは反応バッファ中のアレイに適用されるが、反応バッファは酵素活性だけでなくＲＮＡの２次および３次構造の維持にも適合しており、適用されたＲＮＡとアレイ上に固定化された相補的オリゴヌクレオチド要素との間の二重鎖形成を支持する。典型的には、反応バッファは５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、５〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５〜５０ｍＭのＫＣｌ、１〜１０ｍＭのＤＴＴを約８．５のｐＨで含んでいる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の様な容積排除剤を約６％ｗ／ｖ、または硫酸デキストランを約３０％ｗ／ｖ加えても良い。これら容積排除剤は反応成分の見かけ上の濃度を上げる働きをし、二重鎖形成の動態に好ましい効果がある。
【００３２】
この時形成されるＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖は次に逆転写酵素のようなＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質になるため、次に逆転写酵素を用いてハイブリダイゼーション中のオリゴヌクレオチドの遊離型３’ＯＨ基を修飾し、検出のためにそれにタグを付けることができる。続いてアレイ上の修飾オリゴヌクレオチドを検出することで、ハイブリダイズ可能であった配列、即ち適用したＲＮＡ転写体の中の利用可能域を推測できる。この相互作用はアレイ上のオリゴヌクレオチドのサブセットに対する酵素修飾を直接または間接的に解釈することで推測される。
【００３３】
二重鎖の直接検出
上記の様に、ＲＮＡの適切なバッファをアレイに適用して、ＲＮＡ中の利用可能域に対し相補的であるオリゴヌクレオチドのサブセットにハイブリダイゼーションさせる。
【００３４】
逆転写酵素をハイブリダイズしたアレイに適用し、４℃から６５℃の間で数分間インキュベーションする。標識デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）も加える。これら条件下では、逆転写酵素はハイブリダイズした全てのオリゴヌクレオチドの遊離３’ＯＨ基に標識ｄＮＴＰｓを付加する。標識は放射活性体または蛍光体のいずれでもよく、あるいはその他標準的方法でその後検出できるエピトープ、化学タグまたは酵素でよい。
【００３５】
ＲＮＡ、酵素および過剰な標識ｄＮＴＰｓは全て、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ等の適切な洗浄バッファを使用して洗いながす。そうすると、標識ｄＮＴＰｓが付加されたオリゴヌクレオチドは、蛍光、蛍光体イメージングまたはオートラジオグラフィ等の適切な方法を用いて検出できる。配列は、標識オリゴヌクレオチドのアレイ上の位置から知ることができ、適用したＲＮＡの中の相補的な利用可能配列も推測できる。
【００３６】
二重鎖の直接検出するには、標識ジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）を用いることもできるが、この場合逆転写酵素は先の例で使用のｄＮＴＰではなく、ｄｄＮＴＰを１個だけハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの遊離３’ＯＨ基に付加する。検出はｄＮＴＰｓを用いた場合と同じ方法で行われる。
【００３７】
二重鎖の間接的検出
前記同様ＲＮＡをアレイに適用し、次に逆転写酵素を用いて未標識ｄｄＮＴＰを１個付加し、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの遊離３’ＯＨ基を修飾する。
【００３８】
アレイは、ＲＮＡ、酵素および過剰なｄｄＮＴＰを洗い流して、さらにターミナルトランスフェラーゼバッファで２回洗い流すことにより平衡化する。ターミナルトランスフェラーゼおよび放射標識または蛍光もしくはその他タグの付いたｄＮＴＰｓを、ターミナルトランスフェラーゼバッファ中でアレイに適用してからインキュベーションする。一般には、インキュベーションは３７℃で５分〜３０分間実施される。ターミナルトランスフェラーゼはｄＮＴＰｓを付加して遊離３’ＯＨ基にテールを付けることができるが、この反応は未標識ｄｄＮＴＰｓを添加した結果、遊離３’ＯＨ基を欠いた核酸が生じるため、阻止される。従ってこの一連の反応の結果、遊離３’ＯＨ基を持つオリゴヌクレオチドは、当初加えられたＲＮＡにハイブリダゼーションしなかったものあり、そしてこれらオリゴヌクレオチドはターミナルトランスフェラーゼと標識ｄＴＮＰｓが加えられ時点でテールが加えられる。加えられたＲＮＡとハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドは１個の未標識ｄｄＮＴＰをＲＮＡ依存的に付加して修飾されるが、このようなオリゴヌクレオチドはその後のターミナルトランスフェラーゼを用いたテール付加によっても標識できない。従って、ターミナルトランスフェラーゼステップで標識されない固定化オリゴヌクレオチドは、加えられた標的ＲＮＡの利用可能配列に対し相補的であるオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
上記実施態様は本発明を単に例示したものにすぎず、他にも様々な形態を取ることができる。従ってここに開示した説明は限定的に解釈するべきでなく、単に特許請求の範囲の基礎と考えるべきものであり、そして当業者に対し本発明による適切な手段を使用した様々な方法を教示するものである。
【国際公開パンフレット】
2004538445.tif 000002
2004538445.tif 000003
2004538445.tif 000004
2004538445.tif 000005
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2004538445.tif 000021
2004538445.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成15年5月2日(2003.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボ構造の認証例の形に折りたたまれたＲＮＡの構造パラメータを、インビボ構造の認証例の形に折りたたまれた前記ＲＮＡのオリゴヌクレオチドアレイへの結合を検出することにより決定するための方法であって：
（ａ）そのインビボ構造の認証例である形に折りたたまれたＲＮＡをアレイに適用し、そのインビボ構造の認証例である形に折りたたまれている前記ＲＮＡ内にある利用可能な配列に相補的であるオリゴヌクレオチドにアニーリングさせるステップと；
（ｂ）ＲＮＡ依存性核酸修飾酵素を適用して反応させるステップと；
（ｃ）未結合のＲＮＡまたは酵素、あるいはその他の反応成分を洗い流すステップと；
（ｄ）ＲＮＡ依存性核酸修飾酵素による修飾を検出するステップとを含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）（ｂ）（ｃ）および（ｄ）のいずれか又は全てが同時的または連続的である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ依存性修飾酵素による単一または複数の修飾を直接検出する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡ依存性修飾酵素による単一または複数の修飾を間接的に検出する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡ依存性核酸修飾酵素がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素活性を持つ酵素である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
逆転写酵素活性を持つ酵素がＲＮａｓｅＨ活性を欠いた修飾型逆転写酵素である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
反応バッファがｍＲＮＡをアレイに適用する時に用いられる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
反応バッファが酵素活性だけでなくＲＮＡの２次および３次構造の維持、ならびに適用ＲＮＡとアレイ上の相補的オリゴヌクレオチド要素間の二重鎖形成にも適合している請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
容積排除剤が反応混合体に加えられる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
容積排除剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
容積排除剤が硫酸デキストランである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
標識デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）がＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共にアレイに適用され二重鎖の検出を可能にする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
標識ジデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）をＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共に加えることができ、二重鎖の検出が可能になる請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
標識ｄＮＴＰｓまたは標識ｄｄＮＴＰｓが蛍光、燐光イメージングまたはオートラジオグラフィにより検出できる請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
未標識ｄｄＮＴＰｓをＲＮＡ依存性核酸修飾酵素と共にアレイに加え、未反応の余分のｄｄＮＴＰｓを洗い流し、適当なバッファ中に標識ｄＮＴＰｓと共にターミナルトランスフェラーゼを加えることにより二重鎖が検出でき、その結果標識されなかった固定化オリゴヌクレオチドが事前に適用しておいた標的ＲＮＡの利用可能配列に相補的であるオリゴヌクレオチドとなる請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2004538445.tif 000023
2004538445.tif 000024
2004538445.tif 000025