(57)【要約】本発明は、泡沫細胞発生時に発現が変動するアテローム硬化性動脈硬化症に関連する複数のポリヌクレオチドを含む精製されたポリヌクレオチド及び組成物に関する。本発明は、基板上のエレメントとしてのこの組成物の使用法、並びにこの組成物及びポリヌクレオチドを用いた方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
泡沫細胞の発生において発現が変動するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２７６またはその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）から選択された複数のポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２】
前記各ポリヌクレオチドのそれぞれが、泡沫細胞発生の初期に発現が変動し、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５５、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１−１９６、または
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の相補配列から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記各ポリヌクレオチドが、３倍を超えて発現が変動し、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７−６７、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４−２１３、または
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の相補配列から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが基板に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
サンプルにおける１或いは複数のポリヌクレオチドの発現の変動を検出するためのハイスループット法であって、
（ａ）請求項２の組成物を前記サンプルとハイブリダイズさせて、１或いは複数のハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップと、
（ｃ）前記ハイブリダイゼーション複合体を標準のハイブリダイゼーション複合体と比較するステップとを含み、
ハイブリダイゼーション複合体の大きさ及び強度におけるそれぞれの差が、前記サンプルにおけるポリヌクレオチドの発現の変動を示唆することを特徴とする方法。
【請求項６】
前記サンプルがアテローム性動脈硬化症の患者から得たものであり、標準との比較により、その疾患が初期、中期、後期であるかを決定できることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
分子または化合物のライブラリをスクリーニングして、ポリヌクレオチドと結合するリガンドを同定するためのハイスループット法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１の組成物を前記ライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドと分子または化合物との間の特異的な結合を検出して、前記ポリヌクレオチドに特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、擬態、ペプチド、及びタンパク質から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸分子のライブラリから伸長した或いは完全長の遺伝子を得る方法であって、
（ａ）基板上に個々の配列を整列するステップと、
（ｂ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１から選択されたポリヌクレオチドを前記配列とハイブリダイズさせるステップと、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと１或いは複数の配列との間のハイブリダイゼーションを検出するステップと、
（ｄ）前記ライブラリから前記配列を単離して、伸長した或いは完全長の遺伝子を得るステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５−４８、６８−８０、１９２、１９３、及び２１４−２２２から選択された実質的に精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）タンパク質の発現する条件下で、請求項１２の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）培養した前記宿主細胞から前記タンパク質を回収するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法によって生産されたタンパク質。
【請求項１５】
分子または化合物のライブラリをスクリーニングして、タンパク質と特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定するハイスループット法であって、
（ａ）請求項１４のタンパク質またはその一部を、特異的な結合が許容される条件下で、前記ライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）前記タンパク質と分子または化合物との間の特異的な結合を検出して、前記タンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、擬態、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体またはそれらの断片、免疫グロブリン、インヒビター、薬剤化合物、及び医薬品から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルからリガンドを精製する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１５のタンパク質をサンプルと結合させるステップと、
（ｂ）前記結合したタンパク質を回収するステップと、
（ｃ）前記タンパク質を前記リガンドから分離して、精製されたリガンドを得るステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１４のタンパク質及び医薬用担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１４のタンパク質に特異的に結合する精製された抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ヒト泡沫細胞において発現が調節される遺伝子を検出するために用いられ得る複数のポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、アテローム性動脈硬化症に関連する病態、障害、及び疾患の診断にこれらのポリヌクレオチドを使用することに関する。
【０００２】
（本発明の背景）
アテローム性動脈硬化症、及び関連する冠状動脈疾患及び脳卒中は、先進国において最も一般的な死因である。ある種の重要な危険因子が同定されているが、この複雑な疾患を引き起こす完全な分子機構及びこの疾患に対する医療は確立されていない。アテローム硬化性血管の病巣の成長及び退行の分子機構の解明には、成長、安定、溶解、破裂、閉塞性血管の血栓の発生を含む病変の特徴に関係する遺伝子の同定が必要である。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症の発生の初期段階では、「脂肪条痕」が形成される。コレステロールリッチの低密度リポタンパク（ＬＤＬ）などのリポタンパクが、血管内膜の細胞外空間に蓄積され、化学修飾を受ける。ＬＤＬの酸化は、循環抗酸化物の防御効率が低い内皮下空間において最も活発に起こる。ＬＤＬの酸化の程度が、標的細胞との相互作用に影響を与える。「最少酸化」ＬＤＬ（ＭＭ−ＬＤＬ）はＬＤＬ受容体に結合することができるが、スカベンジャー受容体Ａ型及びＢ型、ＣＤ３６、ＣＤ６８／ｍａｃｒｏｓｉａｌｉｎ、及びＬＯＸ−１を含む同定された酸化ＬＤＬ（ＯＸ−ＬＤＬ）受容体すなわちスカベンジャー受容体には結合できない（Ｎａｖａｂら （１９９４） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １６：８３１−８４２； Ｋｏｄａｍａら （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４３：５３１−５３５； Ａｃｔｏｎら （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２１００３−２１００９； Ｅｎｄｅｍａｎｎら （１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１１８１１−１１８１６； Ｒａｍｐｒａｓａｄら （１９９６） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９２：１４８３３−１４８３８； Ｋａｔａｏｋａら（１９９９） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：３１１０−３１１７）。ＭＭ−ＬＤＬは、単球の接着及び浸透を増大させ、内皮細胞による単球走化タンパク質１（ＭＣＰ−１：ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １）の放出を刺激し、マクロファージにおけるスカベンジャー受容体Ａ（ＳＲＡ）及びＣＤ３６の発現を誘導し得る（Ｃｕｓｈｉｎｇら （１９９０） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８７：５１３４−５１３８； Ｙｏｓｈｉｄａら （１９９８） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １８：７９４−８０２； Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：２０９６３−２０９６６）。ＳＲＡ及び他のスカベンジャー受容体は、ＯＸ−ＬＤＬに結合し、リポタンパク質粒子の取り込みを促進させ得る。
【０００４】
単核食細胞は内膜に進入して、マクロファージに分化し、ＯＸ−ＬＤＬを含む化学修飾を受けた脂質を摂取する。ほとんどの細胞型では、コレステロールの量は、ＬＤＬ受容体及び生合成酵素のフィードバック調節によって厳密に調節されている（Ｂｒｏｗｎ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４−４７）。しかしながら、マクロファージでは、追加のスカベンジャー受容体によりコレステロールが無制限に取り込まれ（Ｂｒｏｗｎ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ （１９８３） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２：２２３−２６１）、泡沫細胞表現型を産生する多数の細胞内脂質滴が蓄積される。コレステロールを貪食して死亡したマクロファージが、初期の「脂肪条痕」プラークの塊及び病変動脈の典型的な進行した病巣のほとんどに関与する。様々な研究から、種々の泡沫細胞応答が、アテローム性動脈硬化症の血管壁プラークの成長及び破裂に関与することが分かった。これらの応答には、隣接する細胞の増殖及び接着を促進する多数の成長因子及びサイトカインの産生、循環単球を成長中のプラーク内に引き寄せるケモカイン、細胞外マトリックスを再構築するタンパク質、血栓症を引き起こし得る組織因子の産生が含まれる（Ｒｏｓｓ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８０１−８０９； Ｑｕｉｎら（１９８７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：２９９５−２９９８）。従って、アテローム硬化性プラーク形成のほとんどの段階で大量に生じるコレステロールを多く含んだマクロファージが、アテローム硬化プロセスの開始及び最終的なプラークの破裂及び閉塞血栓に関係する。
【０００５】
ＯＸ−ＬＤＬの取り込み中に、マクロファージはサイトカイン及び成長因子を産生する。これらのサイトカイン及び成長因子が、平滑筋細胞増殖などのアテローム発生及び細胞マトリックスの形成を調節する更なる細胞現象を引き起こす。更にこれらのマクロファージは、誘導性酸化窒素シンターゼを含む炎症に関与する遺伝子を活性化し得る。従って、泡沫細胞形成時に発現が変動する遺伝子が、アテローム硬化プロセスのマーカーとなると推測できる。
【０００６】
本発明は、診断において複数のプローブ及び精製されたポリヌクレオチドをアテローム性動脈硬化症及び他の心血管疾患のマーカーとして用いるハイスループットのスクリーニング法を提供する。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、添付の配列表に示されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２７６から選択された、泡沫細胞発生において発現が変動する複数のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一実施例では、各ポリヌクレオチドは、泡沫細胞形成の初期マーカーであって、アップレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５５或いはダウンレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１−１９６の何れかである。第２の実施例では、各ポリヌクレオチドは３倍を超えてまたは３分の１未満に発現が変動する、アップレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７−６７またはダウンレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４−２１３の何れかである。更に本発明は、これらのポリヌクレオチドの相補配列、並びにこれらのポリヌクレオチドを基板に固定することを含む。
【０００８】
本発明は、サンプルにおける１或いは複数のポリヌクレオチドの発現の変化を検出するハイスループット法を提供する。この方法は、このポリヌクレオチド組成物をサンプルとハイブリダイズさせて、１或いは複数のハイブリダイゼーション複合体を形成し、ハイブリダイゼーション複合体を検出し、このハイブリダイゼーション複合体を標準のハイブリダイゼーション複合体と比較することを含み、ハイブリダイゼーション複合体の大きさ及び強度におけるそれぞれの差が、サンプルにおけるポリヌクレオチドの発現の変化を示唆するものである。サンプルはアテローム性動脈硬化症の患者から得ることができ、標準と比べることにより疾患の程度が初期、中期、或いは後期であるかを決定することができる。
【０００９】
本発明はまた、分子または化合物のライブラリをスクリーニングしてリガンドを同定するためのハイスループット法を提供する。この方法は、本ポリヌクレオチド組成物を、特異的な結合が許容される条件化で、分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出してリガンドを同定するステップとを含む。分子または化合物のライブラリは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、擬態、ペプチド、及びタンパク質から選択される。本発明は更に、リガンドを生成する方法を提供する。この方法は、本発明のポリヌクレオチドを、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させるステップと、結合したポリヌクレオチドを回収するステップと、本ポリヌクレオチドからリガンドを分離して、精製したリガンドを得るステップとを含む。
【００１０】
本発明はまた、発現核酸配列或いはゲノム核酸配列のライブラリから伸長した或いは完全長の遺伝子を得る方法を提供する。この方法は、基板上に個々のライブラリ配列を整列するステップと、添付の配列表から選択されたポリヌクレオチドを、特異的な結合が許容される条件下で前記ライブラリ配列とハイブリダイズするステップと、このポリヌクレオチドと配列との間のハイブリダイゼーションを検出するステップと、ライブラリ配列を単離して伸長した或いは完全長の遺伝子を得るステップとを含む。
【００１１】
本発明は更に、添付の配列表に示されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５‐４８、６８‐８０、１９２、１９３、２１４−２２４から選択された実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、この発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、タンパク質が発現される条件下でこの宿主細胞を培養するステップと、この培養した宿主細胞からこのタンパク質を回収するステップとを含むタンパク質の生産方法を提供する。
【００１２】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を提供する。本発明はまた、分子または化合物のライブラリをスクリーニングしてこのタンパク質と特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定するためのハイスループット法を提供する。この方法は、特異的な結合が許容される条件下で、このタンパク質またはその一部を分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出してこのタンパク質と特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含む。分子または化合物のライブラリは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、擬態、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体またはそれらの断片、免疫グロブリン、インヒビター、薬剤化合物、及び医薬品から選択される。本発明は更に、タンパク質を用いたリガンドの精製を提供する。この方法は、このタンパク質またはその一部を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させるステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、リガンドからタンパク質を分離して精製されたリガンドを得るステップとを含む。本発明はまた、このタンパク質及び医薬用担体を含む医薬組成物、並びにこのタンパク質と特異的に結合する精製された抗体を提供する。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明の核酸配列及び方法について説明する前に、本発明がここに開示した特定の装置、物質、及び方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例を用いて説明を行うが、これらの実施例に類似した或いは同等の装置、方法、及び物質を用いて本発明を具現可能である。後述の好適な装置、方法、及び物質は、本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。
【００１４】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含む。全ての専門用語及び科学技術用語は、当業者が一般に理解している意味をもつ。本発明に関連する或いは開示した細胞系、ベクター、及び方法を説明するまたは開示する目的で言及した全ての刊行物を本明細書の一部とする。本明細書の如何なる部分も、そのような刊行物が先行発明という理由で本発明が先行していないと解釈すべきではない。
【００１５】
（定義）
「増幅」は、ヌクレオチド配列のコピーを生成することを指し、当分野で周知のＰＣＲ法を用いて行われる。
【００１６】
「相補的な」は、塩基対形成（例えば、５’‐Ａ‐Ｇ‐Ｔ‐３’が３’‐Ｔ‐Ｃ‐Ａ‐５’と塩基対を形成する）によりアニーリングする２つの一本鎖ヌクレオチド配列間の関係を指す。
【００１７】
「Ｅ値（Ｅ−ｖａｌｕｅ）」は、偶然により２つの配列が一致する実質的な確率を指す。
【００１８】
「誘導体」は、化学修飾を受けたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。化学修飾の例には、分子や配列の生物学的活性または寿命を維持或いは増大する、例えば、アセチル基、アシル基、アルキル基、アミノ基、ホルミル基、またはｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ基による水素の置換が含まれる。誘導体ポリヌクレオチドは、自然のポリペプチドの必須の生物学的特性（触媒ドメインや調節ドメインなど）を保持したポリペプチドをコードし得る。
【００１９】
「断片」は、添付の配列表のポリヌクレオチドまたはその相補配列の少なくとも１８個の連続するヌクレオチドを指す。「ユニークな断片」は、添付の配列表のポリヌクレオチドに即位的な特定のポリヌクレオチドまたは相補配列またはその相補配列の少なくとも１８個の連続するヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーション条件下でユニークな断片を含まない関連配列を検出しない。
【００２０】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリン塩基とピリミジン塩基との間の水素結合の形成による２つの核酸分子の複合体を指す。
【００２１】
「相同性」は、基準配列とのポリヌクレオチドの少なくとも断片またはポリペプチドの一部との間の配列類似性を指す。
【００２２】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリンとピリミジンとの水素結合による２つのポリヌクレオチド間の複合体を指す。
【００２３】
「免疫学的に活性」は、動物において抗体を産生する特定の免疫反応を引き起こす天然、組換え、または合成のポリペプチド、またはその一部の能力を指す。
【００２４】
「リガンド」は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の相補的な部位に特異的に結合するあらゆる分子、物質、または化合物を指す。このようなリガンドは、本発明のポリヌクレオチドまたはタンパク質の活性を安定化或いは調節し、核酸、タンパク質、炭水化物、脂肪、及び脂質を含む無機物質及び有機物質の少なくとも１つを含む。
【００２５】
「マイクロアレイ」は、基板上のハイブリダイズ可能なエレメントの規則正しい整列を指す。エレメントは、基板１ｃｍ２当たり好ましくは複数のエレメント、より好ましくは１００エレメント、更に好ましくは１，０００エレメント、最も好ましくは１０，０００エレメントの複数のエレメントが存在するように整列される。エレメントの最大数に制限はないが、少なくとも１００，０００エレメントである。更に、各エレメントからのハイブリダイゼーションシグナルは個別に識別可能である。本実施例及び好適な実施例では、エレメントはポリヌクレオチドプローブを含む。
【００２６】
「調節する」は、分子と本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの間の特的な結合から生じる活性（増減、性靴学的、化学的、または免疫学的な）或いは寿命のあらゆる変化を指す。
【００２７】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、ＰＣＲ法の「プライマー」または「アンプライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）」として或いはアレイエレメントとして用いられる少なくとも約１５から多くても約６０のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を指し、好ましくは約１８〜３０のヌクレオチドであり、最も好ましくは約２０〜２５のヌクレオチドである。
【００２８】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、安定性を高めるためにヌクレオチド塩基が偽ペプチド骨格に結合したＤＮＡ類似物を指す。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸分子、ＤＮＡ分子、またはそれらの任意の断片や相補配列を指す。「ポリヌクレオチド」はまた、ゲノムまたはは合成起源、二本鎖または一本鎖、コード及び／または非コードのＤＮＡ或いはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ分子のエキソンまたはイントロン、または炭水化物、脂質、タンパク質、無機エレメントや物質に結合したものが可能である。
【００３０】
「一部」は、添付の配列表のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも６個の連続するアミノ酸を指す。一部は、関連するタンパク質内の保存されたアミノ酸配列（例えば、触媒ドメインやキナーゼドメイン）であり得る。
【００３１】
ポリペプチドの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、及び蛋白分解による切断などが含まれる。これらのプロセスは、合成的に或いは生化学的に起こり得る。生化学的な修飾は、細胞の位置、細胞型、ｐＨ、及び酵素的環境などにより様々である。
【００３２】
「プローブ」は、サンプルまたは基板上の核酸分子とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその断片である。プローブを用いて、従来の分子生物学の技術によりｃＤＮＡ、内在性遺伝子、または転写ｍＲＮＡの検出、増幅、定量を行うことができる。ここで用いられるプローブは、サザーン、ノーザン、ｉｎ ｓｉｔｕ、ドットブロット、及びアレイなどの技術を含むハイブリダイゼーション反応のレポーター分子である。
【００３３】
「タンパク質」は、ポリペプチドやオリゴペプチドを含むタンパク質またはその一部を指す。ポリペプチドの一部は一般に、未処置のタンパク質の生物学的または免疫学的特性を保持している。「オリゴペプチド」は、少なくとも約５個の残基、好ましくは１０個の残基、最も好ましくは約１５個の残基からなる免疫原性を有するアミノ酸配列であって、抗体を産生する融合タンパク質の一部として用いられる。
【００３４】
「精製された」は、天然の状態で結合していた少なくとも１つの成分から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体などを指す。
【００３５】
「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体などを含むサンプルには、体液や、細胞が成長する培地または細胞調製の可溶性画分や、細胞から単離或いは抽出された染色体、細胞小器官、または膜や、溶液中に存在する或いは基板に結合されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、組織、細胞、組織プリント、またはフィンガープリント、皮膚、髪などが含れ得る。
【００３６】
「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、２つの分子間の相互作用を指す。ポリヌクレオチドの場合、特異的な結合には、センス鎖とアンチセンス鎖との間の水素結合、複製または転写に影響を与える一本鎖とタンパク質との間の水素結合、ＤＮＡ分子の主溝または副溝への分子または化合物の挿入、転写因子、エンハンサー、及びリプレッサー等として機能する少なくとも１つの分子との相互作用が含まれる。ポリペプチドの場合、特異的な結合には、上記したようなポリヌクレオチドとの相互作用、或いはアゴニスト、抗体、またはアンタゴニストなどの分子や化合物との相互作用が含まれる。特異的な結合は、分子間の好適な化学的相互作用または分子相互作用を許容する構造的特性の存在に左右される。
【００３７】
「基板」は、分子または化合物が結合する任意の固体或いは半固体の支持物を指し、膜またはフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、毛細管または他のチューブ、プレート、ポリマー、微小粒子が含まれる。この基板は、孔または溝、ピン、チャネル、細孔を含む様々な表面形態を有する。
【００３８】
（発明）
本発明は、マクロファージが泡沫細胞に分化する時にそのマクロファージにおいてそれぞれが発現が変動して発現される複数のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。この複数のポリヌクレオチドは、添付の配列表に示されている同定された配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２７６の少なくとも断片を含む。更に本発明は、泡沫細胞形成の初期に発現がアップレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５５またはダウンレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１−１９６のポリヌクレオチドのサブセットを提供する。本発明はまた、泡沫細胞形成時にその発現が３倍を超えてアップレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７−６７または３分の１未満にダウンレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４−２１３のポリヌクレオチドのサブセットを提供する。本発明はまた、泡沫細胞発生時にその発現がアップレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５−４８及び６８−８０、またはダウンレギュレートされたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２、１９３、及び２１４−２２２の新規のポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
ポリヌクレオチドを選択する方法
ヒトＴＨＰ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）を２４時間の間、１２−０−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎａｔｉｃｋ ＭＡ）と共に血清を含む培地で成長させて分化させた。次に細胞を、３０分から４日の一定期間Ｏｘ−ＬＤＬの存在下または非存在下の何れかで培養した。Ｏｘ−ＬＤＬに０、０．５、２．５、８、２４、４８、及び９６時間暴露した後、発現プロフィールを作成するために培養した細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製した。実験的なコントロール細胞からのポリ（Ａ）ＲＮＡは別の蛍光色素で標識し、ＵＮＩＧＥＭ Ｖ ２．０アレイ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）上で時間が一致する対にハイブリダイズさせた。
【００４０】
集団クラスター分析（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、応答パターンを同定し、異なった遺伝子発現プロフィール間の関係を確立した。それぞれの遺伝子測定値は、発現値を各時間において最大値で除して標準化した。クラスター化プロセスにより、ツリーの各ブランチレベルにおいて交差するそのレベルにおけるクラスターの数に等しい数のブランチを有する階層ツリーが形成される。ブランチレベル５におけるツリーの分割により、遺伝子が、発現が変動して発現された２７６の遺伝子及びスプライスバリアント、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２７６を含む７つの遺伝子発現クラスターに分割される。
【００４１】
表１は、クラスター分析により同定された泡沫細胞発生に関連して発現が変動して発現された遺伝子及びスプライスバリアントを示す。列１は配列番号を示し、列２はインサイトＩＤ番号を示し、列３は遺伝子アノテーションを示す。列４から列１０は、標準化された発現の変化を示し、各遺伝子は最大値１．０を有する。背景に３種類の陰影を付けて、Ｏｘ−ＬＤＬに応答し相対的な発現を色分けした。特定の遺伝子の発現の最大値に対して白い部分は０〜２５％の発現を示し、薄いグレーの部分は２６〜５０％の発現を示し、濃いグレーの部分は５１〜７５％の発現を示し、黒い部分は７６〜１００％の発現を示す。列１１は、その遺伝子が割り当てられたクラスターを示す。
【００４２】
図１は、各クラスターにおける全ての遺伝子についての各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター１からクラスター４は、１日目、２日目、または４日目の時点でアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター５及びクラスター６は、後半になってダウンレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター７は、８時間目でアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【００４３】
表２は、各配列番号に対する様々なＩＤを示す。列１は配列番号を示し、列２はインサイトＩＤ番号を示す。列３はＵＮＩＧＥＭ Ｖ ２．０マイクロアレイ上のインサイトクローンのクローン番号を示す。列４及び列５は、列２に識別番号が示された遺伝子配列におけるクローンインサート配列の開始部位及び終了部位を示す。
【００４４】
表３は、泡沫細胞分化の初期において発現が変化した遺伝子のリストである。列１は配列番号を示し、列２はインサイトＩＤ番号を示し、列３は遺伝子アノテーションを示す。列４から列１０は各時間において異なる発現の値を示す。この値は、処理したサンプルを同じ時間の未処理のサンプルで除して得られる。列１１及び列１２は、時間経過においてアップレギュレートされた発現またはダウンレギュレートされた発現の最大変化を示す。列１２は、時間経過における最大の差を示す。
【００４５】
表４は、泡沫細胞分化時に、発現の変動が３倍以上の遺伝子のリストである。列１は配列番号を示し、列２はインサイトＩＤ番号を示し、列３は遺伝子アノテーションを示す。列４から列１０は、各時間において異なる発現の値を示す。この値は、処理したサンプルを同じ時間の未処理のサンプルで除して求める。列１１及び列１２はそれぞれ、経過時間においてアップレギュレートされた発現またはダウンレギュレートされた発現における最大の変化を示す。列１２は、経過時間における最大の差を示す。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはペプチド核酸などの任意のＲＮＡ様またはＤＮＡ様物質、分枝ＤＮＡなどが可能である。ポリヌクレオチドプローブは、センス鎖またはアンチセンス鎖が可能である。標的が２本鎖である場合、プローブはセンス鎖或いはアンチセンス鎖のいずれであっても良い。標的が１本鎖の場合は、プローブは相補的な一本鎖である。一実施例では、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。別の実施例では、ポリヌクレオチドはプラスミドである。プラスミドの場合は、目的の配列はｃＤＮＡインサートである。
【００４７】
ポリヌクレオチドは、当分野で周知の様々な合成または酵素的な方法で調製することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で周知の化学的な方法を用いて全体或いは一部を合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ他 （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． （７） ２１５−２３３）。別法では、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ或いはｉｎ ｖｉｖｏ転写により酵素を用いて或いは組換えにより作製することができる。
【００４８】
ヌクレオチド類似体を、当分野で周知の方法によりポリヌクレオチドプローブ内に導入することができる。ただし、プローブに組み込まれるヌクレオチド類似体は標的ヌクレオチドと塩基対を形成しなければならない。例えば、特定のグアニンヌクレオチドを、シトシン残基と塩基対を形成するヒポキサンチンで置換することができる。しかしながら、これらの塩基対はグアニンとシトシンとの間の塩基対より安定性が低い。別法では、アデニンヌクレオチドを、アデニンとチミジンとの間の塩基対よりも強い塩基対をチミジンと形成し得る２， ６−ジアミノプリンと置換することができる。更に、ポリヌクレオチドは、化学的或いは酵素的に誘導されたヌクレオチドを含み得る。典型的な化学修飾には、アシル基、アルキル基、アリル基、またはアミノ基での誘導体化が含まれる。
【００４９】
ポリヌクレオチドは、基板上で合成することができる。基板表面での合成は、化学結合法及びＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２５１１１６）により開示されているピエゾプリント装置（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて行うことができる。別法では、ポリヌクレオチドは、Ｈｅｌｌｅｒら（米国特許第５，６０５，６６２号）に記載されているように試薬が加えられた時に制御する自己アドレス式電子デバイスを用いて基板表面で合成することができる。
【００５０】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を基板上に整列して固定することができる。ポリヌクレオチドは、化学結合法またはＵＶ照射などの共有結合法により固定することができる。このような或る方法では、エポキシドまたはアルデヒド基を含むように化学修飾を受けたガラス表面に結合させる。別法では、ｃＤＮＡプローブをポリリジンコーティングされた表面に載せ、次にＳｈａｌｏｎら（Ｗ０９５／３５５０５）に記載されているようにＵＶ架橋する。別の方法では、電気的な方法（Ｈｅｌｌｅｒ他、前出）によりＤＮＡを溶液から基板上の所定の位置に輸送する。或いは、ポリヌクレオチド、クローン、プラスミド、または細胞を、フィルター上に整列することができる。細胞を用いる場合は、細胞を溶解し、タンパク質及び細胞成分を分解し、そのＤＮＡをＵＶ架橋によりフィルターに結合させる。
【００５１】
更に、ポリヌクレオチドは、基板に直接結合させるのではなく、リンカーなどを介して基板に結合させることができる。このようなリンカーは、典型的には約６個から５０個の原子長であり、付着したプローブを露出させる。好適なリンカーには、エチレングリコールオリゴマー、ジアミン、２酸等が含まれる。基板表面上の反応基がリンカーの末端基と反応して、リンカーが基板に固定される。次に、リンカーの他方の末端がポリヌクレオチドに結合する。
【００５２】
ポリヌクレオチドは、プローブ合成用の試薬を基板表面に連続的に分注して、或いは既製ＤＮＡ断片を基板表面上に分注して基板に固定することができる。典型的なディスペンサーには、基板に対してマイクロピペットの位置を制御する機械装置を備えた基板に溶液を供給するマイクロピペットが含まれる。複数のディスペンサーを配置して反応領域に効率的に試薬を分注することが可能である。
【００５３】
（ポリヌクレオチドの使用）
本発明のポリヌクレオチドを様々な目的に用いることが可能である。例えば、本発明の組成物をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイは、サンプルにおける関連ポリヌクレオチドを検出するため、分子や化合物のライブラリをスクリーニングしてリガンドを同定するため、及びアテローム性動脈硬化症などの特定の心血管疾患、またはその状態や障害の診断のためなどのハイスループット法に用いることができる。別法では、添付の配列表の所定の配列に相補的なポリヌクレオチドを用いて、そのポリヌクレオチドに関連する治療に有効な遺伝子を阻害または不活性化することができる。
【００５４】
本発明の組成物をマイクロアレイのエレメントとして用いる場合、本ポリヌクレオチドエレメントは、各エレメントが基板上の指定の位置に配置されるように規則正しく整列する。エレメントが基板上の指定の位置にあるため、ユニークな発現プロフィールを形成するハイブリダイゼーションパターン及びその強度を、特定の遺伝子の発現レベルと見なすことができる。また、ハイブリダイゼーションパターン及びその強度は、特定の代謝プロセス、病態、障害、疾患、疾患のステージ、または治療に関連性を有し得る。
【００５５】
ハイブリダイゼーション
本発明のポリヌクレオチド、またはその断片や相補配列を、様々なハイブリダイゼーション技術に用いることができる。本ポリヌクレオチドは、天然、組換え、化学的に合成されたものが可能であり、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列に基づいており、ＰＣＲ法或いは酵素的な技術の何れかにより様々なレポーター分子を用いて標識することができる。このようなポリヌクレオチド即ちプローブの標識及び精製に市販のキットを用いることができる。放射標識（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、蛍光標識（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ａｌａｍｅｄａ ＣＡ）、及び化学発光標識（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）は当分野で周知である。別法では、ポリヌクレオチドを市販のベクターにクローニングして、プローブを転写によって生成する。プローブをＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼなどの好適なポリメラーゼ及び少なくとも１つの標識したヌクレオチドを加えて合成及び標識化する。
【００５６】
プローブは、本ポリヌクレオチドの３’非翻訳領域などのユニークな領域或いは保存されたモチーフから設計するか或いはこれらに由来する。このようなプローブをプロトコルに用いて、同一のポリペプチド、アレル変異体、または関連分子をコードする天然の分子を同定することが可能である。プローブはＤＮＡまたはＲＮＡが可能であって、通常は１本鎖であり、本核酸配列の何れかと少なくとも５０％の配列同一性を有しなければならない。プローブは、ポリヌクレオチドの少なくとも１８個の連続するヌクレオチドを含む。このようなプローブは、同一の配列のみとの結合が許容されるハイブリダイゼーション条件下、または少なくとも１つのヌクレオチド置換または欠失を有する関連配列に結合する条件下で用いることができる。また関連配列は、変性プローブのプールを用いた好適なハイブリダイゼーション条件により発見することが可能である。一般に、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーションに用いるためのプローブは、約４００から約４，０００ヌクレオチドの長さである。このようなプローブは一本鎖或いは二本鎖であって、溶液を用いるハイブリダイゼーションまたは基板を用いるハイブリダイゼーションにおいて高い結合特異性を有し得る。プローブはまた、ＰＣＲ法によりサンプルにおける本発明のポリヌクレオチドの検出に用いられるオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００５７】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（厳密性）は、プローブのＧＣ含量、塩濃度、及び温度によって決まる。具体的には、塩濃度を下げたり、ハイブリダイゼーションの温度を上げたりしてストリンジェンシーを高めることができる。あるメンブレンを用いるハイブリダイゼーション用の溶液にホルムアミドなどの有機溶媒を加えて、反応が低い温度で起こるようにすることができる。ハイブリダイゼーションは、バッファー（５×ＳＳＣ、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で、６０℃で行うことができるが、核酸配列間に不適正塩基対を含む複合体が形成され得る。続く洗浄は、４５℃（中程度のストリンジェンシー）或いは６５℃〜６８℃（高いストリンジェンシー）の何れかの温度で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなどのバッファーで行う。高いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、完全に相補的なポリヌクレオチド部分のみが安定して保持される。あるメンブレンを用いるハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは３５％、最も好ましくは５０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げることができる。また、ＳａｒｋｏｓｙｌやＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）などの界面活性剤及び変性サケ精子ＤＮＡなどのブロッキング試薬を用いてバックグラウンドシグナルを減少させることが可能である。ハイブリダイゼーションの成分や条件の選択は当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出、ｐｐ ６． １１−６． １９，１４．１１−１４．３６， 及びＡ１−４３）に記載されている。
【００５８】
ドットブロット、スロットブロット、低密度及び高密度のアレイを準備して当分野で周知の方法を用いて分析する。約１８個から約５，０００個の連続するヌクレオチドから成るプローブすなわちアレイエレメントは、本発明により作製でき、アレイ技術に用いることができる。プローブすなわちアレイエレメントの好適な数は、少なくとも約４０，０００であり、より好適には少なくとも約１８，０００であり、更に好適には少なくとも約１０，０００であり、最も好適には少なくとも約６００から約８００の間である。アレイを用いて多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングして、遺伝的変異、突然変異、及びＳＮＰを同定することが可能である。このような情報を用いて、遺伝子機能の決定、障害の遺伝子レベルの解明、障害の診断、障害の制御或いは治癒に用いられる治療薬の開発及びその活性のモニタリングを行うことができる（例えば、米国特許出願第５，４７４，７９６号、ＰＣＴ出願ＷＯ ９５／１１９９５、ＰＣＴ出願ＷＯ ９５／３５５０５、米国特許出願第５，６０５，６６２号、及び米国特許出願第５，９５８，３４２号を参照）。
【００５９】
スクリーニングアッセイ
ポリヌクレオチドを用いて、複数の分子または化合物即ちライブラリをスクリーニングして、特異的な結合親和性を有するリガンドを同定することができる。リガンドは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、及び生態系においてそのポリヌクレオチドの活性、複製、転写、または翻訳を調節するその他のタンパク質を含み得る。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、このポリヌクレオチドまたはその断片を分子または化合物と結合させ、その結合したポリヌクレオチドを検出して、そのポリヌクレオチドと特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定することを含む。
【００６０】
一実施例では、本発明のポリヌクレオチドを、単離され精製された分子または化合物のライブラリと共にインキュベートし、当分野で周知の方法、例えばゲル遅延アッセイ（ｇｅｌ−ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（米国特許第６，０１０，８４９号）または網状赤血球溶解転写アッセイ（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｓｓａｙ）により結合活性を決定することが可能である。別の実施例では、本ポリヌクレオチドを生検及び／または培養した細胞や組織に由来する核抽出物と共にインキュベートしてもよい。本ポリヌクレオチドと核抽出物における分子または化合物との間の特異的な結合を、まずゲルシフトアッセイを用いて決定し、次にその分子または化合物に対する抗体を上昇させて確認することが可能である。これらの抗体をアッセイに加えると、これによりゲル遅延アッセイによるスーパーシフトが起こる。
【００６１】
別の実施例では、本ポリヌクレオチドを用いて、当分野で周知のアフィニティークロマトグラフィー法で分子または化合物を精製することが可能である。一実施例では、本ポリヌクレオチドを、ポリマー樹脂またはゲル上で臭化シアン基と化学的に反応させる。次に、サンプルを流して本ポリヌクレオチドと反応すなわち結合させる。本ポリヌクレオチドと結合した分子または化合物を、培地を流す塩濃度を上昇させて本ポリヌクレオチドから遊離させて回収する。
【００６２】
リガンドの精製
本ポリヌクレオチドまたはその断片を用いてサンプルからリガンドを精製することができる。哺乳動物ポリヌクレオチドまたはその断片を用いてリガンドを精製する方法は、このポリヌクレオチドまたはその断片を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させて、結合したポリヌクレオチドを回収し、好適な試薬を用いてこのポリヌクレオチドを精製されたリガンドから単離することを含む。
【００６３】
（タンパク質の生産及びその使用）
本明細書のポリヌクレオチドまたはそれらの完全長ｃＤＮＡを用いて、ここに開示しＡｕｓｕｂｅｌ（前出； ｐｐ．１６．１−１６．６２）に記載されている組換えＤＮＡ技術により精製されたポリペプチドを生産することができる。これらの方法によりポリペプチドを生産する１つの利点は、本ポリペプチドを多量に含んだ源を得る能力であり、これにより精製が容易になる。本発明はまた、関係する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性特性における類似性に基づいたアミノ酸の置換、欠失、または挿入を包含する。置換された残基が、元の残基に類似した構造的または化学的特性を有する場合（例えば、ロイシンのイソロイシンやバリンでの置換）はこのような置換は自然において保存されるが、置換された残基が極端に異なっている場合（例えば、グリシンをトリプトファンで置換）はそのような置換は保存されないであろう。ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、ＭＡＣＶＥＣＴＯＲソフトウエア（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、及びＲａｓＭｏｌソフトウエア（ｗｗｗ． ｕｍａｓｓ． ｅｄｕ／ｍｉｃｒｏｂｉｏ／ｒａｓｍｏｌ）に含まれているコンピュータプログラムを用いて、、本ポリペプチドの特定の部分におけるアミノ酸残基を、生物学的または免疫学的活性を損なうことなく、どのようにまたは幾つ、置換、挿入、または欠失できるかを調べることが可能である。
【００６４】
コードされるタンパク質の発現
特定のｃＤＮＡを、そのｃＤＮＡを好適なベクターにクローニングして、このベクターを好適な宿主細胞に導入して形質転換し、発現させることが可能である。ヒト及びラットｃＤＮＡライブラリの作製に用いられるクローニングベクターは、発現のためにも用いることが可能である。このようなベクターは通常、クローニング、プライミング、及び転写に有用なポリリンカー及びプロモーターを含む。典型的なベクターは、β−ガラクトシダーゼのプロモーター、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端メチオニン及びそれに続く７つのアミノ酸残基を含み得る。このベクターを好適な大腸菌の宿主系に導入し形質転換することができる。標準的な方法によるイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）での単離された細菌株の誘導により、Ｎ末端メチオニン、β−ガラクトシダーゼの始めの７つの残基、約１５残基のリンカー、及びこのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質が産生される。
【００６５】
このｃＤＮＡを、特定の宿主においてタンパク質の発現に有用であるとして知られる他のベクターに導入してもよい。このｃＤＮＡの両端のストレッチにハイブリダイズするのに十分なＤＮＡの断片及びクローニング部位を含むオリゴヌクレオチドを、標準的な方法で化学的に合成することが可能である。次に、これらのプライマーを用いて、ＰＣＲ法により目的の断片を増幅することができる。標準的な条件下で、この断片を好適な制限酵素で消化して、電気泳動法で単離することができる。別法では、類似の断片を、好適な制限酵素でこのｃＤＮＡを消化し、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを繋いで作製することができる。２つ以上の遺伝子に由来するコード配列の断片を繋いで発現させることもできる。
【００６６】
可溶性タンパク質の分泌を指令するシグナル配列は、組換え配列の構成成分として特に有用である。例えば、１或いは複数の追加の精製促進ドメインを含むキメラタンパク質を発現さセルことが可能である。このようなドメインは、限定するものではないが、固定された金属上での精製を可能にする金属キレートドメイン、固定された免疫グロブリン上での精製を可能とするプロテインＡドメイン、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）に用いられるドメインが含まれる。このポリペプチドと精製ドメインとの間にＥＮＴＥＲＯＫＩＮＡＳＥＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）などの切断可能なリンカー配列を挿入して、本ポリペプチドを回収することができる。
【００６７】
好適な発現宿主には、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞などの哺乳動物細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、サッカロミセス‐セレビジエなどの酵母細胞、及び大腸菌などの細菌が含まれる。これらの各細胞系の場合、有用な発現ベクターは、複製の起点、及び細菌や形質移入された真核宿主の選択を可能とする１或いは２の選択マーカーを含み得る。真核発現宿主に用いられるベクターは、ポリヌクレオチドがポリ（Ａ）を含まない場合は、３’ポリ（Ａ）尾部を付加する必要がある。
【００６８】
更に、ベクターは、遺伝子発現を増大させるプロモーターまたはエンハンサーを含み得る。ほとんどのプロモーターは宿主特異的であって、ＣＨＯ細胞にはＭＭＴＶ、ＳＶ４０またはメタロチオネインプロモーター、細菌宿主にはｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃまたはＴ７プロモーター、酵母にはα因子、アルコールオキシダーゼ、またはＰＧＨプロモーターを用いることができる。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどのエンハンサーを有するアデノウイルスベクター、または長い末端リピート（ＬＴＲ： ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）プロモーターなどのプロモーターを有するレロウイルスベクターを用いて、哺乳動物細胞系においてタンパク質を発現させることができる。組換え細胞の均一な培養物が得られたら、分泌された多量の可溶性ポリペプチドを条件培地から回収して、当分野で周知のクロマトグラフィー法を用いて分析することができる。多量の分泌タンパク質の別の生産方法は、哺乳動物胚を形質転換して、遺伝子組換え動物、例えばウシ、ヤギ、またはヒツジなどによって分泌される母乳から組換えタンパク質を回収することを含む。
【００６９】
組換えによる生産に加えて、ポリペプチドまたはその一部を固相技術を用いて生産することができる（Ｓｔｅｗａｒｔら （１９６９） Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９６３） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ５：２１４９−２１５４）。この場合、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｎｏｒｗａｌｋ ＣＴ）などの装置を用いるか或いは手動で行うことができる。上記した任意の方法で生産されたポリペプチドを、低発現に関連する障害を治療するために医薬組成物として用いることが可能である。
【００７０】
スクリーニングアッセイ
本ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質またはその一部を用いて、複数の分子または化合物すなわちライブラリをスクリーニングして特異的な結合親和性を有するリガンドを同定したり、サンプルから分子または化合物を精製することができる。このようなスクリーニングに用いられる本ポリペプチドまたはその一部は、溶液中に遊離、或いは有機または無機基板に固定されている、または細胞内に局在化していても良い。例えば、組換え核酸分子で安定的に形質転換され、ポリペプチドを発現してその表面上にポリペプチドが存在する生存可能すなわち安定した原核宿主細胞を、スクリーニングアッセイに用いることができる。この細胞を複数のリガンドすなわちライブラリに対してスクリーニングし、発現ポリペプチドとリガンドとの間の特異的な結合即ち複合体の形成を測定することができる。このリガンドは、本ポリペプチドと特異的に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ分子、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、ペプチド、医薬品、タンパク質、薬剤、またはその他の試験分子または化合物を含み得る。典型的なアッセイは、本哺乳動物ポリペプチドまたはその一部を、特異的な結合が許容される条件下で分子または化合物と結合させて、結合したポリペプチドを検出し、本ポリペプチドと特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定することを含む。
【００７１】
本発明はまた、競合的薬剤スクリーニングアッセイの方法を提供する。このアッセイでは、本ポリペプチドと結合可能な中和抗体が、本ポリペプチド、そのオリゴペプチド、或いはその一部と結合可能な試験化合物と特異的に競合する。極めて微量のアッセイ量及び極めて微量の試験化合物を用いるハイスループットのスクリーニング方法が、米国特許第５，８７６，９４６号に開示されている。スクリーニングによって同定された分子または化合物を用いて、哺乳動物モデル系を作製して、それらの毒性、診断または治療の可能性を評価することができる。
【００７２】
リガンドの精製
本ポリペプチドまたはその一部を用いてサンプルからリガンドを精製することができる。哺乳動物ポリペプチドまたはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、本ポリペプチドまたはその一部を、特異的な結合が許容される条件下でサンプルと結合させて、結合したポリペプチドを回収し、好適なカオトロピック剤を用いて精製されたリガンドから本ポリペプチドを単離することを含む。
【００７３】
（抗体の作製）
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて特異的な抗体を作製する。抗体は、固有の免疫活性を有する本ポリペプチドのオリゴペプチドまたはその一部を用いて作製することができる。抗体を作製する方法は、（１）本ポリペプチド、またはその一部やオリゴペプチドを動物（通常はヤギ、ウサギ、マウス）に注入して、抗体反応を起こさせるステップと、（２）モノクローナル抗体を作製するべくハイブリドーマを作製するステップと、（３）リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導するステップと、（４）組換え免疫グロブリンのライブラリをスクリーニングするステップとを含む。組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されているように作製することができる。
【００７４】
本発明のポリペプチドを用いて作製した抗体は、本ポリペプチドの発現、量、または分布における異常によって特徴付けられる急性或いは慢性の疾患の診断並びに病状が現れる前の診断に有用である。本ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイまたは免疫放射線測定法のための様々なプロトコルが当分野で知られている。イムノアッセイは通常、ポリペプチドとそのポリペプチドに特異的に結合する分子または化合物との間の複合体の形成、及びその複合体の測定を含む。特定のポリペプチドにおける２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる。
【００７５】
イムノアッセイ法を用いて、様々な条件下で、特定の疾患の患者またはモデル動物系の培養細胞における本ポリペプチドの発現を定量することができる。イムノアッセイによりモニタリングされるポリペプチドの産生の増減は、発生経路、作り出した症状や疾患、または治療効果に関連する細胞活性の知見に役立ち得る。所定の組織における所定のポリペプチドの量は、生体サンプルの凍結融解界面活性剤抽出物のイムノアッセイを行い、結合曲線の傾斜を精製されたポリペプチドから作成した結合曲線と比較して決定することができる。
【００７６】
アッセイのための分子の標識化
様々な標識化及び結合技術は当分野で周知であり、種々のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体のアレイやアッセイに用いることができる。標識した分子の合成は、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、またはＣｙ５−ｄＣＴＰなどの標識したヌクレオチドや３５Ｓ‐メチオニンなどのアミノ酸を組み込むためのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈキットまたはＰｒｏｍｅｇａを用いて行うことができる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体を、ＢＩＯＤＩＰＹまたはＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）などの試薬を用いて分子中に存在するアミン、チオール、または他の基に化学的に結合させることで、レポーター分子で直接標識することができる。
【００７７】
アッセイのために本ポリペプチド及び抗体を、検出シグナルを提供するレポーター分子と共有結合または非共有結合により結合して標識化することが可能である。様々な標識及び結合技術が知られており、限定するものではないが米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、及び同第４，３６６，２４１号を含む特許文献及び科学技術文献に記載されている。
【００７８】
（診断）
本ポリヌクレオチドまたはその断片を用いて、遺伝子発現の変化、ｍＲＮＡの存在、非存在、または過剰な発現を検出して測定したり、治療中のｍＲＮＡのレベルをモニタリングすることが可能である。発現の変化に関連する症状、疾患、または障害には、アテローム性動脈硬化症及びそれに関連する合併症が含まれる。これらのポリヌクレオチドを、上記した疾患及び他の心血管疾患、症状、及び障害に対する治療効果のマーカーとして、数日から数ヶ月の範囲に亘って用いることができる。診断アッセイにハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて、患者からの生体サンプルの遺伝子発現レベルを標準的なサンプルの値と比較して、遺伝子発現の変化を検出する。質的または量的なこのような比較法は当分野で周知である。
【００７９】
例えば、本ポリヌクレオチドを標準的な方法で標識して、これをハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者からの生体サンプルに加える。インキュベーションした後、このサンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に関連する標識（またはシグナル）の量を定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおける標識の量が標準値と著しく異なっている場合は、関連する症状や疾患、または障害の存在が示唆される。
【００８０】
遺伝子発現に関連する症状や疾患、または障害の診断基準を設けるために、正常即ち標準的な発現プロフィールを確立する。この発現プロフィールは、正常な動物或いはヒトから採取した生体サンプルを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下でプローブと結合させることによって作成することができる。標準的なハイブリダイゼーションの量は、正常な患者から得た値と、実質的に精製された標的配列を所定量用いた実験値とを比較することによって求めることができる。このように求めた標準値を、特定の症状や疾患、または障害を示す患者のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と特定の症状に関連する値との偏差からその症状を診断する。
【００８１】
またこのようなアッセイを用いて、動物実験や臨床検査における特定の治療計画の効果を評価したり、個々の患者の治療をモニタリングすることができる。症状が確認されたら治療プロトコルを開始し、定期的に診断アッセイを繰り返して、患者の発現レベルが正常な被験者の値に近づき始めたかを調べることができる。連続して行ったアッセイの結果から、数日から数ヶ月に亘る期間の治療効果を推定することができる。
【００８２】
遺伝子発現プロフィール
遺伝子発現プロフィールは、複数のポリヌクレオチド及び複数の検出可能なハイブリダイゼーション複合体を含む。それぞれの複合体は、１或いは複数のプローブとサンプルの１或いは複数の相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって形成される。本発明のポリヌクレオチド組成物をマイクロアレイのエレメントとして用いて、遺伝子発現プロフィールを分析することができる。一実施例では、マイクロアレイを用いて疾患の進行をモニタリングすることができる。研究者は、正常な組織や細胞と病変した組織や細胞の遺伝子発現の差異を検査して記録することができる。遺伝子発現パターンの変化を分析することで、患者に症状が出る前の初期段階で疾患を診断することができる。本発明を用いて医学的な見通しをたて、治療計画を作成することができる。本発明はまた、治療の効果をモニタリングすることもできる。副作用が分かっている治療の場合には、マイクロアレイを用いて治療計画を改善することができる。治療の成功を示す遺伝子発現パターンの変化をもたらす服用量を確立する。望ましくない副作用の発生に関連する発現パターンを回避する。この方法は、患者の改善が不十分であることが分かるまで、或いは副作用が明らかになるまで治療計画を変えない従来の方法よりも高感度で迅速である。
【００８３】
別の実施例では、ヒトの疾患を模した動物モデルを用いて、特定の症状、その症状の障害または疾患または治療、障害または疾患に関連する発現プロフィールを特徴づけることができる。新規の治療計画をこれらの動物モデルにおいて、一定期間における発現プロフィールを確立してそれに従うためにマイクロアレイを用いて検査することができる。更に、マイクロアレイを動物モデルから採取した培養細胞または組織に用いて、多数の候補薬剤分子を迅速にスクリーニングして、治療薬と類似の発現プロフィールを有する分子は類似の治療効果があるという期待の下で、既知の治療薬に類似した発現プロフィールを生成する分子を探した。従って、本発明は、分子レベルの薬剤の作用を迅速に決定する方法を提供する。
【００８４】
抗体を用いるアッセイ
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質のエピトープに対する抗体を、特定のヒト細胞に存在するタンパク質の量を定量するアッセイに用いることができる。このようなアッセイには、抗体及び標識を用いて、正常な状態または疾患状態における発現レベルを検出する方法が含まれる。抗体を、改変して或いは改変しないで、標識部分と共有結合または非共有結合による結合で標識して、用いることができる。
【００８５】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いてタンパク質の発現を検出及び測定するためのプロトコルは当分野で周知である。例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及びＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）が含まれる。このようなイムノアッセイは通常、タンパク質とそのタンパク質に特異的な抗体との間の複合体の形成、及びそのような複合体の測定を含む。これらのアッセイ及び他のアッセイがＰｏｕｎｄ （ｓｕｐｒａ）に記載されている。この方法は、２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイ、または競合的結合アッセイを用い得る（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ； Ｐｏｕｎｄ， 前出、を参照）
（治療）
本発明のポリヌクレオチド及びその断片を用いて遺伝子治療を行うことができる。本発明のポリヌクレオチドを単核食細胞などの標的組織に送達することができる。本ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現させて、内因性標的タンパク質の減少または喪失に関連する疾患状態を治療することができる。ポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏの特定の細胞に送達し得る。形質転換細胞をｉｎ ｖｉｖｏの様々な組織に輸送する。或いは、ポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏに輸送することもできる。ポリヌクレオチドを、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、及び細菌プラスミドなどのベクターを用いて細胞や組織に輸送する。ウイルスを用いない遺伝子輸送方法には、陽イオンリポソーム、ポリリジン結合、人工ウイルスエンベロープ、及びＤＮＡの直接注入が含まれる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９２： ２５−３０； Ｄａｃｈｓら （１９９７） Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ ９： ３１３−３２５； Ｃｈｕら （１９９８） Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６ （３−４）： １８４−１９２； Ａｕｇｕｓｔら （１９９７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４０）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）。
【００８６】
更に、特定のタンパク質の発現は、そのタンパク質をコードする若しくはその発現を誘導する核酸配列にアンチセンスポリヌクレオチド配列を特異的に結合させて調節することができる。このアンチセンスポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸の擬態や類似体が可能である。核酸配列には、細胞ｍＲＮＡ及び／またはゲノムＤＮＡが可能であり、アンチセンス配列の結合により、翻訳及び／または転写のそれぞれが影響を受け得る。アンチセンス配列を、上記したようなウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いて細胞内に送達することができる（Ｗｅｉｓｓら （１９９９） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５ （３）： ３３４−３５８； Ａｇｒａｗａｌ （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【００８７】
ポリヌクレオチド及びアンチセンス配列は何れも、ＡＢＩ核酸シンセサイザーまたは当分野で周知の他の自動化装置の任意のものを用いてｅｘ ｖｉｖｏで作製することができる。ポリヌクレオチド及びアンチセンス配列はまた、好適な宿主細胞を目的の配列を含む発現ベクターで形質転換して生物学的に生産することもできる。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドの発現またはコードされたタンパク質の活性を調節する分子は、免疫応答に関連する症状及び疾患の治療に有用である。このような分子には、本ポリヌクレオチドまたはコードされたタンパク質の活性または発現のそれぞれを増大させるアゴニスト、または本ポリヌクレオチドまたはコードされたタンパク質の活性または発現のそれぞれを低下させるアンタゴニストが含まれる。一実施態様では、このタンパク質に特異的に結合する抗体を、直接抗体として用いて或いはこのタンパク質を発現する細胞や組織に薬剤を送達するための標的すなわち送達機構として間接的に用いることができる。
【００８９】
更に、このタンパク質、そのリガンド、または相補的な核酸配列を、他の好適な薬剤と共に投与することが可能である。組み合わせ治療に用いられる好適な薬剤の選択は、従来の製薬原理に従って当分野の通常の技術を有する者が行うことができる。治療薬を併用することにより、免疫応答に関連する症状や障害の治療または予防に相乗効果が生まれ得る。この方法を用いることにより、各薬剤の服用量を少なくしてなお治療効果を達成し、しかも潜在的な副作用を低下させることが可能である。更に、治療薬を、活性な化合物を医薬的に使用できる製剤にするプロセスを促進する賦形剤及び添加剤を含む医薬的に許容される担体と組み合わせることもできる。調剤及び投与についての詳細な技術については、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に記載されている。
【００９０】
（モデル系）
動物モデルを用いて、ヒトの暴露に相当する暴露条件にして、動物モデルがヒトに類似の表現型反応を示すバイオアッセイを行うことができる。哺乳動物が最も一般的な動物モデルである。大抵の感染症、癌、薬剤、及び毒物の研究には、ラットやマウスなどの齧歯類が用いられる。これは、低コスト、入手の容易性、寿命、生殖能、及び参考文献の豊富さからである。齧歯類近交系及び非近交系は、目的の遺伝子の過剰或いは過少な発現の生理学的な原因を調査するのに有用なモデルであり、疾患の診断及び治療方法の開発にも有用である。特定の遺伝子を大量に発現する（例えば、乳汁中に分泌される）同系哺乳動物は、その遺伝子によって発現されるタンパク質の便利な供給源となり得る。
【００９１】
遺伝子組換え動物モデル
目的の遺伝子を過剰或いは過少に発現する遺伝子組換え齧歯類を同系交配し、それを用いてヒト疾患モデルを作製したり、治療薬検査や毒物検査を行う（例えば、米国特許第５，１７５，３８３号、及び同第５，７６７，３３７号を参照）。場合によっては、導入遺伝子が、胚発生中若しくは出生後の特定の時期に特定の種類の組織で活性化され得る。導入遺伝子の発現は、実験的薬剤治療を施す前、その最中、またはその後の、遺伝子組換え動物における表現型、組織特異的なｍＲＮＡの発現、または血清や組織のタンパク質レベルの分析からモニタリングすることができる。
【００９２】
胚性幹細胞
齧歯類胚から単離された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚組織を形成する可能性を維持している。ＥＳ細胞がキャリアとなる胚の中に導入されると、正常な発生が再開され、生まれる動物の組織の一部を担うことになる。ＥＳ細胞は、実験用のノックアウト及びノックイン齧歯類系を作製するのに好適な細胞である。マウス１２９／ＳｖＪ細胞株などのマウスＥＳ細胞は、マウスの初期胚から採取されてから当分野で周知の培養条件下で増殖されたものである。遺伝子組換え系の作製に用いるベクターは、疾患候補遺伝子及びマーカー遺伝子配列を含み、このマーカー遺伝子により導入された疾患遺伝子の存在を確認することができる。このベクターを、当分野で周知の方法でＥＳ細胞に形質転換し、この形質転換されたＥＳ細胞を特定し、Ｃ５７ＢＬ／６マウス株などからのマウス細胞胚盤胞内に微量注入する。この胚盤胞を複数の偽妊娠メスに外科的に導入して、生まれてくるキメラ子孫のそれぞれがその遺伝子型を有するようにして、それらを交配してヘテロ接合系またはホモ接合系を作り出す。
【００９３】
ヒト胚盤胞に由来するＥＳ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作して８個の異なった細胞系譜に分化することが可能である。これらの細胞系譜を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで様々な細胞型及び組織の分化を研究する。細胞型には、神経細胞、造血系、及び心筋細胞に分化する内胚葉、中胚葉、及び外胚葉細胞型が含まれる。
【００９４】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、遺伝子のある領域を、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非天然介在配列を含むように酵素によって改変する（ｎｅｏ ； Ｃａｐｅｃｃｈｉ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）。改変された遺伝子を培養ＥＳ細胞に形質転換し、相同組換えにより内在性のゲノムに組み込むる。挿入された配列が、内在性遺伝子の転写及び翻訳を阻害する。この形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、この胞胚を偽妊娠メスに移植する。この遺伝子組換え子孫をクロス交配して、この哺乳動物遺伝子の機能的な複製物が存在しないホモ接合近交系を作り出す。
【００９５】
ノックイン分析
ＥＳ細胞を用いてノックインヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換えヒト疾患動物モデル（マウスまたはラット）を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ＥＳ細胞に注入し、そのヒト配列が動物細胞のゲノムの中に組み込まれるようにする。形質転換細胞を胞胚に注入し、この胞胚を上記したように移植する。類似のヒトの症状の治療についての情報を収集するべく、遺伝子組換え子孫即ち近交系を有望な医薬品で処置して観察する。これらの方法を用いて、幾つかのヒト疾患モデルを作り出す。
【００９６】
本明細書の配列表に示されているポリヌクレオチド及びそれらによりコードされるポリペプチドの前記したように用いたが、これは既知の技術の例であり、このように既知の技術に適用したからといって当業者に既知の任意の技術に限定されるものではない。更に、本明細書に示されているポリヌクレオチドを、開発途中の分子生物学技術に用いることが可能である。ただし、その新規の技術が、当業者には現在、例えばトリプレット遺伝子コード、及び特定の塩基対相互作用として知られるヌクレオチド配列の特性に依存する場合である。同様に、言及した方法は、当業者には周知の完全長のｃＤＮＡ配列を得る或いは構築するための２つ以上の方法を組み合わせることを含み得る。
【００９７】
記載した特定の方法、プロトコル、及び試薬等は変更することもあり得、本発明はこれらに限定されるものではないことを理解されたい。本明細書に用いた専門用語は、記載した特定の実施例を記載することのみが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、前記した請求の範囲によってのみ限定されるものでる。また、以下に記載の実施例は、本発明を例示するためのものであって本発明を限定することを目的としたものではない。
【００９８】
【実施例】
１  ｃＤＮＡライブラリの作製
ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から購入したものと様々な組織から単離したものとがある。ある組織をグアニジニウムイソチオシアネート溶液においてホモジナイズして溶解する一方、別の組織を、フェノールにおいて、或いはＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの変性剤の好適な混合液においてホモジナイズして溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおいて遠心分離するか、或いはクロロホルムで抽出した。ＲＮＡは、イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムとエタノールの何れかで、或いは別の一般的な方法で沈殿させた。
【００９９】
ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。殆どの場合、ＲＮＡはＤＮＡ分解酵素で処理した。殆どのライブラリの場合、ポリ（Ａ）ＲＮＡは、オリゴｄ（Ｔ）結合常磁性粒子（ｏｌｉｇｏ ｄ （Ｔ）−ｃｏｕｐｌｅｄ ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ． Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。別法では、ＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【０１００】
ある場合には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）にＲＮＡを提供し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社が対応するｃＤＮＡライブラリを作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、当分野で周知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリを作製した。（Ａｕｓｕｂｅｌ， 前出，ユニット５．１−６．６）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始させた。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１或いは複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、またはアガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ（３００〜１０００ｂｐ）を選択した。ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはｐＩＮＣＹプラスミド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを結合させた。この組換えプラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ， ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦ、ＳＯＬＲコンピテント大腸菌細胞、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、またはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂコンピテント大腸菌細胞に導入し形質転換した。
【０１０１】
或る場合には、ライブラリを、Ｖｉｅｉｒａ ら （１９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３： ３−１１）の方法に従って５×過剰のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７で重感染させ、Ｓｏａｒｅｓ （１９９４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：９２２８−９２３２）、Ｓｗａｒｏｏｐ 他 （１９９１， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： １９５４）、及びＢｏｎａｌｄｏ 他 （１９９６， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６： ７９１− ８０６）による方法を利用して、標準化即ちサブトラクトした。Ｓｏａｒｅｓの標準化方法を変更して、高度に発現される豊富なｃＤＮＡの反復クローニングを減らす一方、ライブラリの全配列の複雑さは維持した。この変更の中には、遺伝子発見率を上げるためにハイブリダイゼーション時間を極めて長くすることによる、標準的な転写イメージでは現われにくい発現頻度が低く存在量が少ないｃＤＮＡに対して比重をおいたライブラリの標準化が含まれる（Ｓｏａｒｅｓ 他， 前出）。
【０１０２】
２  ｃＤＮＡクローンの単離及びシークエンシング
プラスミドは、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）或いは細胞溶解を利用したｉｎ ｖｉｖｏ切除によって宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ、またはＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、またはＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの内の１つを用いた。沈殿させた後、０．１ ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１０３】
別法では、ハイスループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した。（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリングステップは、１つの反応混合液で行った。サンプルを処理してから３８４−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度を、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１０４】
ｃＤＮＡシークエンシング反応は、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）と共にＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）などのハイスループットの装置または標準的な方法を用いて行った。ｃＤＮＡシークエンシング反応液は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈによる試薬またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ サイクルシークエンシングキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのＡＢＩシークエンシングキットに含まれている試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡシークエンシング反応混合物の電気泳動による分離及び標識したポリヌクレオチドの検出は、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡ シークエンシングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、標準的なＡＢＩプロトコル及び塩基呼出しソフトウエア（ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３ ｏｒ ３７７シークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、または当分野で周知の他の配列分析システムを用いて行った。ｃＤＮＡ配列内の読み枠は、標準的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌ， 前出， Ｕｎｉｔ ７ を参照）を用いて特定した。
【０１０５】
３  ｃＤＮＡ配列の伸長
核酸配列配列は、インサイトｃＤＮＡクローン及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いて伸長した。一方のプライマーは既知の断片の５’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを伸長した。
【０１０６】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。大きなｃＤＮＡを含むようにサイズが選択されたライブラリが好ましい。遺伝子の５’及び上流領域を有する配列をより多く含むため、ランダムプライムされたライブラリが好ましい。ランダムプライムされたライブラリは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリから完全長ｃＤＮＡを得られない場合に特に有用である。
【０１０７】
当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）用いて９６ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ５７℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管。
【０１０８】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（１×ＴＥにおける０．２５％の試薬 （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ） 及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分注してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長することに成功したかを決定する。
【０１０９】
伸長した核酸を脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に超音波処理即ちせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化した核酸を低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて伸長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位のオーバーハングを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質転換細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートにおいて３７℃で一晩培養した。
【０１１０】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ７２℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６    ７２℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴサイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ サイクルシークエンシングキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０１１１】
４  配列の構築及び分析
クロマトグラムからの構成成分ヌクレオチドを、ＰＨＲＥＤ分析（Ｐｈｉｌ’ｓ Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍ； Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて分析し、質のスコアを付与した。少なくとも必要な質スコアを有する配列を、様々なプリプロセシングアルゴリズムを用いて、質の低い３’末端、ベクター及びインカー配列、ポリＡ尾部、Ａｌｕリピート、ミトコンドリア及びリボソーム配列、細菌汚染配列、及び５０塩基対よりも小さい配列を排除した。
【０１１２】
配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びＰＲＯＳＩＴＥデータベース（Ｂａｉｒｏｃｈら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ２１７−２２１； Ａｔｔｗｏｏｄら （１９９７） Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｓｃｉ． ３７： ４１７−４２４）に含まれている配列情報に基づいたモチーフ分析プログラムであるＢＬＯＣＫ ２プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いてスクリーニングした。
【０１１３】
１つの配列を１つのビンに割り当てるアセンブリ方法で、プロセシングした配列を分類した。各ビンにおける複数の配列を用いて、コンセンサス配列すなわちテンプレートをアセンブルした。その後の新しい配列は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０； Ｋａｒｌｉｎら （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５： ８４１−８４５）、ＢＬＡＳＴｎ （ｖ． １．４， ＷａｓｈＵ）、及びＣＲＯＳＳＭＡＴＣＨ ソフトウエア （Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， 前出）を用いて既存のビンに加えた。質スコアが１５０以上の候補の対を全てＢＬＡＳＴヒットとした。局所同一性が８２％以上のアラインメントはビンに含めた。各ビンの構成成分配列は、ＰＨＲＡＰ （Ｐｈｉｌ’ｓ Ｒｅｖｉｓｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ； Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， 前出）を用いてアセンブルした。いくつかの重複する構成成分配列を有するビンは、ＤＥＥＰ ＰＨＲＡＰ（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， ｓｕｐｒａ）を用いてアセンブルした。
【０１１４】
各ビンを互いに比較して、８２％以上の局所類似性を有するビンを組み合わせて再アセンブルした。重複が不十分（局所同一性が９５％未満）なテンプレートを有する再アセンブルしたビンを再び分割した。アセンブルしたテンプレートを、ＳＴＩＴＣＨＥＲ／ＥＸＯＮ ＭＡＰＰＥＲアルゴリズムにより分析した。この分析により、スプライスバリアント、選択的にスプライシングされたエキソン、及びスプライス部位の存在、並びに組織の種類及び疾患の状態などにおける選択的にスプライシングされた遺伝子の発現の変動の存在の可能性を調べることができる。これらの得られたビンを上記したアセンブリ方法で数回アセンブルし、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に見られるテンプレート配列を作製した。
【０１１５】
アセンブリにより得られたテンプレートを次に示す方法でアノテーションを付けた。テンプレート配列は、ＧＢｐｒｉ （ＧｅｎＢａｎｋ ｖｅｒｓｉｏｎ １０９）に対してＢＬＡＳＴｎ（ｖ２．０， ＮＣＢＩ）で分析した。「ヒット」は、２００塩基対に対して９５％の局所同一性から１００塩基対に対して１００％までの局所同一性を有する正確な一致、またはＥ値が１×１０−８である相同一致と定義した。これらのヒットは、ＧＥＮＰＥＰＴ（ＧｅｎＢａｎｋ ｖｅｒｓｉｏｎ １０９）に対してフレームシフトＦＡＳＴｘで分析した。この分析では、相同一致をＥ値が１×１０−８と定義した。上記したアセンブリ方法は、１９９９年３月２５日に出願の米国特許出願第０９／２７６，５３４号（名称「Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｔｏｒｉｎｇ， Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」）に記載されており、言及することをもって本明細書の一部とする。またＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤユーザーマニュアル（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）にも記載されている。
【０１１６】
続くアセンブリでは、テンプレート配列に対して、ｍｏｔｉｆ、ＢＬＡＳＴ、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ； Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５： ２４４４−２４４８ ； Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４７： １９５−１９７）、及び機能の分析を行い、１９９７年３月６日に出願の米国特許出願第０８／８１２，２９０号（名称、「Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｅｓ ｆｏｒ Ｖｉｅｗｉｎｇ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ」）、１９９７年１０月９日に出願の米国特許出願第０８／９４７，８４５号（名称、「Ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ｓｔｏｒｉｎｇ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」）、米国特許出願第５，９５３，７２７号（名称、「Ｐｒｏｊｅｃｔ−Ｂａｓｅｄ Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」）、及び１９９８年３月４日に出願の米国特許出願第０９／０３４，８０７号（名称、「Ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｔｏｒｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｎｇ ｔｏ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」）に記載されている方法を用いてタンパク質の階層に分類した。なお、これらの特許出願に言及することを以って本明細書の一部とする。テンプレート配列を更に、ＧｅｎＢａｎｋ齧歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物、原核生物、及びヒトＥＳＴデータベースなどの公共のデータベースに対して問い合わせすることもできる。
【０１１７】
５  マイクロアレイの準備
ヒトＵＮＩＧＥＭ Ｖ ２．０（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）上のポリヌクレオチドは、ｇｂＥＳＴデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）から誘導したＥＳＴ、及びＩＭＡＧＥ（ゲノム及びそれらの発現の統合的分子分析）ｃＤＮＡライブラリクローンに由来する遺伝子指向クラスター（ｇｅｎｅ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｓ）の重複しないセットに基づいたＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤアセンブルヒト配列データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に由来するテンプレート配列である。それぞれの特定のテンプレートを代表する１つのクローンをマイクロアレイに用いた。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いて細菌細胞から増幅した。ＰＣＲを３０サイクル行い、１〜２ｎｇの開始ポリヌクレオチドから５μｇ以上の最終量に増加させた。次に増幅したポリヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。
【０１１８】
精製したポリヌクレオチドをポリマーコートしたスライドガラス上に固定した。顕微鏡スライドガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）は、０．１％ＳＤＳ及びアセトン中で超音波洗浄した。この洗浄中及び洗浄後に大量の蒸留水で洗浄した。スライドガラスを４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水で丁寧に洗浄し、９５％エタノールに溶解した０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）で被覆した。被覆したスライドガラスをオーブンで１１０℃で硬化させた。次にポリヌクレオチドを、米国特許第５，８０７，５２２号（言及することを以って本明細書の一部とする）に記載されている方法によりコーティングガラス基板に固定した。平均濃度が１００ｎｇ／μｌであるポリヌクレオチド１μｌを高速ロボット装置によりオープンキャピラリープリンティング装置（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に導入し、この装置によりスライド１枚に付き５ｎｌのポリヌクレオチドを分柱した。
【０１１９】
マイクロアレイを、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋し、次に室温で０．２％ ＳＤＳで洗浄し、更に蒸留水で３回洗浄した。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）における０．２％カゼインにおいてマイクロアレイを６０℃で３０分間インキュベートし、０．２％ ＳＤＳで洗浄し、更に上記したように蒸留水で洗浄してブロッキングした。
【０１２０】
６  標的ポリヌクレオチドの調製
ヒトＴＨＰ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）を、１０％ 胎児血清（ｖ／ｖ）、０．４５％ グルコース （ｗ／ｖ）、１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｘ１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール、ペニシリン（１００ 単位／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で成長させた。酸化ＬＤＬ負荷実験（ｌｏａｄｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）のために、１２−０−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎａｔｉｃｋ ＭＡ）を含む培地に１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で細胞を播種し、１ｘ１０−７Ｍで２４時間培養した。次に、この培地を、Ｈａｍｍｅｒらの方法（１９９５； Ａｒｔｅｒｉｏ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １５：７０４−７１３）に従って１００μｇ／ｍｌのＣｕＳＯ４「完全」酸化型ＬＤＬ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）を含む或いは含まない培養培地に替えた。培養中は、２日毎に培地を取り替えた。細胞を、３０分〜４日の範囲の各時点で、Ｏｘ−ＬＤＬで処理した。この期間中、細胞は接着したままであり、典型的な細点のあるナイルレッド染色パターンが形成された。ＲＮＡを、０時間、０．５時間、２．５時間、８時間、１日、２日、及び４日におけるＯｘ−ＬＤＬ暴露の発現プロフィールのために準備した。
【０１２１】
全ＲＮＡをＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０キット（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ， Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ ＴＸ）を用いて抽出した。ポリ（Ａ）ＲＮＡをＰＯＬＹＡＴＲＡＣＴ ｍＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。それぞれのポリ（Ａ）ＲＮＡサンプルを、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ ｐｇ／μｌ オリゴ−ｄＴプライマー（２１ｍｅｒ）、１ｘ 第１鎖バッファー、０．０３ 単位／μｌのＲＮＡ分解酵素インヒビター、５００ μＭ ｄＡＴＰ、５００ μＭ ｄＧＴＰ、５００ μＭ ｄＴＴＰ、４０ μＭ ｄＣＴＰ、及び４０ μＭの何れかｄＣＴＰ−Ｃｙ３或いはｄＣＴＰ−Ｃｙ５ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写した。この逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いて２００ｎｇポリ（Ａ）ＲＮＡを含む２５ｍｌの溶液において行った。特定のコントロールポリ（Ａ）ＲＮＡ（ＹＣＦＲ０６、ＹＣＦＲ４５、ＹＣＦＲ６７、ＹＣＦＲ８５、ＹＣＦＲ４３、ＹＣＦＲ２２、ＹＣＦＲ２３、ＹＣＦＲ２５、ＹＣＦＲ４４、ＹＣＦＲ２６）を、非コード酵母ゲノムＤＮＡ（Ｗ． Ｌｅｉ， ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成した。量的コントロールとして、０．００２ｎｇ、０．０２ｎｇ、０．２ ｎｇ、及び２ｎｇのコントロールｍＲＮＡ（ＹＣＦＲ０６、ＹＣＦＲ４５、ＹＣＦＲ６７、及びＹＣＦＲ８５）を逆転写反応液に希釈して、サンプルｍＲＮＡに対する比率がそれぞれ１：１００，０００、１：１０，０００、１：１０００、１：１００ （ｗ／ｗ）となるようにした。異なった発現パターンをサンプリングするために、コントロールｍＲＮＡ（ＹＣＦＲ４３、ＹＣＦＲ２２、ＹＣＦＲ２３、ＹＣＦＲ２５、ＹＣＦＲ４４、及びＹＣＦＲ２６）を、サンプルｍＲＮＡに対して１：３、３：１、１：１０、１０：１、１：２５、２５：１ （ｗ／ｗ）の比率で逆転写反応液に希釈した。反応液を３７℃で２時間インキュベートし、次に２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートして反応を停止させＲＮＡを分解した。
【０１２２】
プローブを、２つの連続したＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲルフィルトレーションスピンカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて精製した。Ｃｙ３及びＣｙ５標識した反応サンプルを、後述するように結合させ、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム、及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させた。次にプローブをＳｐｅｅｄＶＡＣシステム（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて完全に乾燥させ、１４μｌの５Ｘ ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳにおいて再懸濁した。
【０１２３】
７  ハイブリダイゼーション及び検出
ハイブリダイゼーション反応液は、時点が一致する実験細胞とコントロール細胞の対からなるＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成産物を各０．２μｇ含む５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーションバッファーからなる９μｌのプローブ混合液を含む。この標的混合液を、６５℃で５分間加熱し、マイクロアレイ表面上に一定量分注してから１．８ｃｍ２ のカバーガラスで覆った。このマイクロアレイを、顕微鏡スライドよりも僅かに大きいキャビティを有する防水チャンバーに移した。チャンバーの角から１４０μｌの５×ＳＳＣを加えて、チャンバー内を湿度１００％に保持した。このマイクロアレイを含むチャンバーを、６０℃で約６．５時間インキュベートした。マイクロアレイは、ストリンジェンシーの低い洗浄バッファー（１×ＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間、ストリンジェンシーの高い洗浄バッファー（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間それぞれ３回洗浄し、その後乾燥させた。
【０１２４】
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体を、Ｃｙ３を励起するための４８８ｎｍ、及びＣｙ３を励起するための６３２ｎｍのスペクトル線を生成し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出した。２０倍の顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、マイクロアレイ上に励起レーザー光を集中させた。このマイクロアレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御Ｘ−Ｙステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャンした。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンした。
【０１２５】
２つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは２つの蛍光体を連続的に励起した。放射された光は、波長に基づいて２つの蛍光体に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に分割された。マイクロアレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフィルタを用いて信号をフィルタリングした。用いる蛍光体の最大発光は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルタを用いて、蛍光体１つにつき１回スキャンし、通常どおり各マイクロアレイを２回スキャンした。
【０１２６】
スキャンの感度は、ｃＤＮＡコントロール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。較正するｃＤＮＡのサンプルを、２つの蛍光体で別々に標識し、それぞれを等量、ハイブリダイゼーション混合液に添加した。マイクロアレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズする種の重量比１：１００，０００に相関するようにした。
【０１２７】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（ＡＩＤ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化した。ディジタル化したデータは、リニア２０色変換を用いてシグナル強度が青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示した。データはまた、定量的に分析した。２つの異なる蛍光体を同時に励起して測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間の光学的漏話（重複発光スペクトルに起因する）に対して補正した。
【０１２８】
グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルがグリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シグナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用いるソフトウエアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。
【０１２９】
８  データ分析及び結果
アグロメラティブクラスター分析（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、典型的な反応パターンを特定し、異なった遺伝子発現プロフィール間の関係を確立した。それぞれの遺伝子の測定は、まず発現の割合を各時点の最大値で除して標準化した。或る時点とその次の時点との変化を強調するために、連続する２つの時点の発現の差を取って発現ベクトルに傾斜を加えた。ユークリッド距離を、発現反応に対する類似性の基準として用いた。
【０１３０】
用いたアグロメラティブアルゴリズム（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）はデンドログラムを作成する。それぞれが１つの遺伝子を含むＮ個のクラスターで始まり、繰り返しの各ステップでは、最も近い２つのクラスターが１つの大きなクラスターにされた。クラスター間の距離は、それらの平均発現パターン間の距離と定義されている。Ｎ−１ステップの後を、全てのデータポイントがまとめられた。クラスター化プロセスにより階層ツリーが作成された。遺伝子は、一定距離によって分割された１０行（ブランチレベル）のセットを有するそれぞれの遺伝子ブランチとルートとの間のツリーをカットして自動的にクラスターに割り当てられた。ブランチレベルのカットオフによりクラスターが形成された。ツリーは第１に標準化されるため、それぞれのブランチはルートから同じ距離である。最も近い遺伝子間の距離を保持するために、ツリーはリーフから最も遠いブランチで曲げられた。ツリーの各ブランチレベルで交差するブランチの数はそのレベルにおけるクラスターの数に等しい。
【０１３１】
ツリーをブランチレベル５で分割すると、遺伝子が、２７６の発現が変動した遺伝子及びスプライスバリアントを含む７つの遺伝子発現クラスターに分割される。表１における列４〜列１０は、Ｏｘ−ＬＤＬに暴露しない遺伝子発現に対するＯｘ−ＬＤＬ暴露に反応した各時点の遺伝子発現のレベルを示す。差の調節は、それぞれの遺伝子に対して最大値を１として標準化した。白い部分は、特定の遺伝子における最大値に対して０〜２５％の範囲でＯｘ−ＬＤＬに反応した相対発現を示し、薄いグレーの部分は２６〜５０％の範囲であり、濃いグレーの部分は５１〜７５％の範囲であり、黒い部分は７６〜１００％の範囲である。
【０１３２】
９  相補的な核酸分子
本ポリヌクレオチドに相補的な分子またはその断片を用いて、遺伝子発現を検出したり、低下させたり、抑制することができる。約１５〜約３０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、それより小さい或いは大きい配列の断片、またはその誘導体（ＰＮＡ）の場合でも同じ方法を用いることができる。オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２７８を用いて選択した。プロモーターの結合を阻害して転写を阻止するために、最も好ましくはオープンリーディングフレームの開始コドンの前の約１０個のヌクレオチドである最もユニークな５’配列に結合するように相補的なヌクレオチドを設計する。翻訳を阻害するために、本哺乳動物ポリペプチドをコードするｍＲＮＡへのリボソームの結合を阻害するべく相補的なオリゴヌクレオチドを設計する。
【０１３３】
転写または翻訳を阻害するために作製したアンチセンス分子を用いるのに加えて、ゲノム配列（例えばエンハンサーやイントロン）或いはトランス作動性調節性遺伝子に対するアンチセンス分子を設計して遺伝子発現を変化させることができる。同様に、三重らせん塩基対形成として知られているＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対形成法を用いてアンチセンス阻害を行うことができる。三重らせんの塩基対形成に関与するアンチセンス分子は、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子と結合するために二本鎖の間を広げる二重らせんの能力を損なわせる。
【０１３４】
このようなアンチセンス分子を発現ベクターに導入して、好適な細胞または組織を形質転換する。これには、効果を検査するために細胞系への発現ベクターの導入、一過性或いは短期の治療のための器官、腫瘍、滑液キャビティ、または血管系への発現ベクターの導入、または長期或いは安定した遺伝子治療のための単細胞または他の生殖系への発現ベクターの導入が含まれる。一過性の発現は、ベクターの複製を伴わない場合には１ヶ月以上持続し、ベクターの複製を引き起こす好適なエレメントが形質転換／発現系に用いられている場合には３ヶ月以上持続する。
【０１３５】
アンチセンス分子をコードするベクターで好適な分裂細胞を安定的に形質転換することにより、遺伝子組換え細胞系、遺伝子組換え組織、または遺伝子組換え器官を作製することができる（米国特許第４，７３６，８６６号）。ベクターを取り込んで十分な量のベクターを複製するこれらの細胞により、安定した組み込みが可能となり、本ポリヌクレオチドの活性を弱める或いは完全に消失させる十分なアンチセンス分子を産生させることができる。
【０１３６】
１０  ハイブリダイゼーション技術及び分析
火あぶり代ゼーション技術は、ポリマーコートしたスライドガラスやナイロン膜などの様々な基板を用いる。エレメントのポリマーコートスライドへの整列は、本実施例５に記載されており、ポリマーコートスライドを用いるプローブの調整、ハイブリダイゼーション、及び分析はそれぞれ、本実施例６及び７に示されている。
【０１３７】
ポリヌクレオチドを以下に示す方法で基板に固定する。ポリヌクレオチドの混合液をジェル電気泳動により分画後、毛細管輸送によってナイロン膜に移す。別法では、ポリヌクレオチドを個別にベクターに結合して、それを細菌宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次にポリヌクレオチドを以下の方法で基板に配列する。第１の方法では、個別のクローンを含む細菌細胞を機械的に摘み上げてナイロン膜に整列させる。このナイロン膜を、選択薬（用いるベクターによって異なるが、カルベンシリン、カナマイシン、アンピシリン、またはクロラムフェニコールなど）を含むＬＢ寒天培地に載置し、３７℃で１６時間インキュベートする。この膜を寒天培地から取り除き、次にこの膜をコロニー側を上にして１０％ＳＤＳ、変性溶液（１． ５ Ｍ ＮａＣｌ、０． ５ Ｍ ＮａＯＨ）、中和液（１． ５ Ｍ ＮａＣｌ、１ Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８． ０）に入れ、２×ＳＳＣにおいて１０分間づつ２回インキュベートする。次にこの膜を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でＵＶ照射する。
【０１３８】
第２の方法では、インサートに隣接したベクター配列に相補的なプライマーを用いて、ＰＣＲを３０サイクル行い細菌ベクターからポリヌクレオチドを増幅する。ＰＣＲ増幅により、拡散の濃度を開始時の１〜２ ｎｇから最終的に５μｇまで増大させる。約４００ ｂｐ〜約５０００ ｂｐの増幅した拡散をＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。精製した拡散を、手動で或いはドット／スロットブロッティングマニフォールド及び吸入装置でナイロン膜に配列し、上記した変性、中和、及びＵＶ照射によって固定する。
【０１３９】
本配列表のポリヌクレオチドに由来するハイブリダイゼーションプローブは、メンブレンハイブリダイゼーションにおいてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。プローブを準備するために、ポリヌクレオチドを４５μｌ ＴＥバッファにおいて４０〜５０ ｎｇの濃度に希釈し、１００℃で５分間加熱して変性し、短時間遠心分離する。次に、変性したポリヌクレオチドをＲＥＤＩＰＲＩＭＥチューブ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加え、青色が十分に拡散するまで軽く混合し、短時間遠心分離する。５μｌの［３２Ｐ］ ｄＣＴＰをチューブに加え、その内容物を３７℃で１０分間インキュベートする。この標識化反応を５μｌの０． ２Ｍ ＥＤＴＡを加えてストップし、ＰＲＯＢＥＱＵＡＮＴ Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてプローブを組み込まれなかったヌクレオチドから精製する。精製したプローブを１００℃で５分間加熱してから氷上で２分間冷却する。
【０１４０】
メンブレンを、１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ及び１×高リン酸バッファ（０． ５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７）を含むハイブリダイゼーション溶液において５５℃で２時間プレハイブリダイゼーションする。１５ｍｌの新しいハイブリダイゼーション溶液に希釈したプローブをメンブレンに加える。５５℃で１６時間、メンブレンにプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８． ０）、１％Ｓａｒｋｏｓｙｌにおいて２５℃で１５分間洗浄し、１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８． ０）において２５℃で１５分間づつ４回洗浄する。ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、ＸＯＭＡＴ−ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）をメンブレンに−７０℃で一晩暴露し、現像して目で確認する。
【０１４１】
１１  コードされるタンパク質の発現
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現及び精製は、細菌若しくはウイルス系の発現系を用いて行うことができる。細菌で発現させるために、抗生物質耐性遺伝子とｃＤＮＡを高レベルで転写させる誘導性プロモーターとを含むベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、以下に限定するものではないが、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれる。組み換えベクターを、例えばＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導されると、抗生物質耐性細菌がこのタンパク質を発現する。真核細胞での発現は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）という組み換えバキュロウイスルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染させて行う。バキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、相同組み換え或いは転移プラスミド中間体が関係する細菌媒介遺伝子転移の何れかによって、本ポリヌクレオチドで置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高いレベルでポリヌクレオチドが転写される。
【０１４２】
精製を容易にするために、本タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＦＬＡＧ等の別の代替物との融合タンパク質として合成する。融合タンパク質は、タンパク質活性及び抗原性が維持される条件下で、固定されたグルタチオン上で精製する。精製の後、ＧＳＴ部分がタンパク分解的にトロンビンで本タンパク質から切断される。８個のアミノ酸ペプチドであるＦＬＡＧとの融合タンパク質を、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）を用いて精製する。
【０１４３】
１２  特異的抗体の作製
逆相ＨＰＬＣ分離により７５ｍｇの変性ポリペプチドを得る。この変性タンパク質を用いて標準的なプロトコルに従ってマウスまたはウサギを免疫化する。マウスを免疫するには約１００μｇ用い、ウサギを免疫するには１ｍｇ用いる。変性ポリペプチドを放射性ヨウ素標識し、マウスＢ細胞ハイブリドーマとインキュベートし、モノクローナル抗体をスクリーニングする。数千のクローンの標識及びスクリーニングには約２０ｍｇのポリペプチドで十分である。
【０１４４】
別の方法では、本発明のポリヌクレオチドから翻訳されたアミノ酸配列をＰＲＯＴＥＡＮソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）用いて分析し、免疫原性の高い領域を決定する。免疫化に最適な配列は、通常はＣ末端、Ｎ末端、本ポリペプチドが天然のコンフォメーションの場合に外部環境に曝され易い本ポリペプチドの親水性の介在領域である。一般に、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Ｆｍｏｃ化学を用いてＡＢＩ ４３１ペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、次にＭ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒとの反応によりキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ； Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合させる。必要であれば、ペプチドのＮ末端にシステインを導入してＫＬＨとの結合を可能にすることもできる。ウサギを、このオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を含む完全フロイントアジュバントで免疫化する。そのペプチドをプラスチックに結合させて、１％ ＢＳＡでブロッキングし、得られたウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、放射線ヨウ素標識ヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させて、この抗血清の抗ペプチド活性を検査する。
【０１４５】
標準的な方法でハイブリドーマを作製してスクリーニングする。目的のハイブリドーマを放射線ヨウ素標識したポリペプチドでスクリーニングして検出し、本ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生する融合細胞を特定する。通常のプロトコルでは、９６ウェルプレート（ＦＡＳＴ， Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）のウェルを、アフィニティー精製した１０ｍｇ／ｍｌの特異的なウサギ−抗マウス（または好適な抗−種Ｉｇ）抗体でコーティングする。コーティングしたウェルを１％ ＢＳＡでブロックし、洗浄し、ハイブリドーマの上清に暴露する。インキュベートした後、ウェルを１ｍｇ／ｍｌの放射線ヨウ素標識したポリペプチドに暴露する。抗体を産生するクローンは、バックグラウンドを超えて検出可能な量の標識したポリペプチドに結合する。
【０１４６】
このようなクローンを、３ウェルに付き１細胞で２サイクルのクローニングを行って増殖させる。クローニングしたハイブリドーマをｐｒｉｓｔａｎｅ処理したマウスに注入し、腹水を生じさせ、モノクローナル抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により腹水液から精製する。少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは１０９〜１０１０Ｍ−１、またはそれより強い親和性を有するモノクローナル抗体を当分野で周知の方法で作製する。
【０１４７】
１３  特異的な抗体を用いる天然タンパク質の精製
天然或いは組換えのタンパク質を、このタンパク質に特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーで実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、この抗体をＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に共有結合させて作製する。このタンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、このタンパク質を優先的に吸着できるように、界面活性剤の存在下で高イオン強度バッファーでそのカラムを洗浄する。結合後、バッファー（ｐＨ ２〜３）或いは高濃度の尿素やチオシアネートイオンを用いてそのカラムからこのタンパク質を溶離させて抗体とこのタンパク質との結合を切断し、このタンパク質を回収する。
【０１４８】
１４  特異的に結合する分子のスクリーニング
本ポリヌクレオチドやその断片を、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識したり、またはそのタンパク質やその一部をＢＩＯＤＩＰＹやＦＩＴＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でそれぞれ標識する。予め基板上に配列した複数の候補分子または化合物即ちライブラリを、標識したポリヌクレオチドまたはタンパク質の存在下でインキュベートする。ポリヌクレオチド或いはアミノ酸配列のための条件下でインキュベートした後、その基板を洗浄する。特異的な結合或いは複合体形成を示唆する標識が保持されている基板上の全ての部分によりリガンドを同定する。様々な濃度のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドで得られたデータを用いて、標識した核酸またはタンパク質と結合したリガンドとの間の親和性を求める。
【０１４９】
本明細書に記載した全ての特許及び刊行物に言及することを以って本明細書の一部とする。本発明の範囲及び概念から逸脱することなく本発明の方法及びシステムの種々の改変が可能であることは当業者には明らかであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれることが容易に理解できよう。
【０１５０】
（表の簡単な説明）
本明細書の開示の一部には、著作権が保護されるべき資料が含まれている。この著作権の所有権者は、特許庁のファイルや記録にある本発明の開示に関する明細書即ち発明の開示をファクシミリで複写することについての異議はないが、その他の場合は著作権を留保する。
【０１５１】
添付の配列表は、異なったｃＤＮＡのクローンインサート（単離物）をシークエンシングし、マイクロアレイ上のプローブとしてこれらのｃＤＮＡを用いてハイブリッド複合体を形成させ、それにより同定されたポリヌクレオチドを編集したものである。各配列は、配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）及びインサイトＩＤ番号によって識別される。このインサイトＩＤ番号は、クローンインサートを含む遺伝子配列を表す。
【０１５２】
表１は、クラスター分析によって同定された泡沫細胞の発生に関連して発現が変動する遺伝子を示す。列１は、配列番号を示し、列２はインサイトＩＤ番号を示し、列３は遺伝子アノテーションを示す。列４から列１０は、標準化された遺伝子発現の変動を示し、列１１は遺伝子が割り当てられたクラスターを示す。
【０１５３】
表２は、各配列の識別上方を示す。列１は配列番号を示し、列２はインサイトＩＤ番号を示す。列３はＵＮＩＧＥＭ Ｖ ２．０マイクロアレイ上のインサイトクローンのクローン番号を示す。列４及び列５は、列２に示された遺伝子配列に対するクローンインサート配列の開始及び終了部位を示し、添付の配列表に示されている。
【０１５４】
表３は、泡沫細胞発生の初期において発現が変動する遺伝子のリストである。列１は配列番号を示し、列２はインサイトＩＤ番号を示し、列３は遺伝子アノテーションを示す。列４から列１０は、各時点における発現値の変動を示す。列１１及び列１２はそれぞれ、時間経過による発現の上昇または低下の最大の変化を表す。列１３は、時間経過における最大変化を示す。
【０１５５】
表４は、泡沫細胞分化時に発現が３倍以上変動した遺伝子のリストである。列１は配列番号を示し、列２はインサイトＩＤ番号を示し、列３は遺伝子アノテーションを示す。列４から列１０は各時点における発現値の変動を示す。列１１及び列１２はそれぞれ、時間経過による発現の上昇または低下の最大変化を表す。列１３は、時間経過における最大の変化を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
各クラスターに含まれる遺伝子群の各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター１からクラスター４は、１日目、２日目、または４日目においてアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター５及びクラスター６は、後半にダウンレギュレートされた遺伝子を含み、クラスター７は、８時間目にアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【図１Ｂ】
各クラスターに含まれる遺伝子群の各時点における平均的な標準化された発現パターンのグラフを示す。クラスター１からクラスター４は、１日目、２日目、または４日目においてアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスター５及びクラスター６は、後半にダウンレギュレートされた遺伝子を含み、クラスター７は、８時間目にアップレギュレートされた遺伝子を含む。
【表１】2004532602.tif 000002
【表２】2004532602.tif 000003
【表３】2004532602.tif 000004
【表４】2004532602.tif 000005
【表５】2004532602.tif 000006
【表６】2004532602.tif 000007
【表７】2004532602.tif 000008
【表８】2004532602.tif 000009
【表９】2004532602.tif 000010
【表１０】2004532602.tif 000011
【表１１】2004532602.tif 000012
【表１２】2004532602.tif 000013
【表１３】2004532602.tif 000014
【表１４】2004532602.tif 000015
【表１５】2004532602.tif 000016
【表１６】2004532602.tif 000017
【表１７】2004532602.tif 000018
【表１８】2004532602.tif 000019
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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