(57)【要約】銀イオンで前処理したスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂を用いて、共通の基本化学構造を有するラクトン含有高分子量化合物であって、側鎖としてアルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物を、側鎖としてアルケニル基を有するラクトン含有高分子量化合物から分離する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
銀イオンで前処理したスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂を用いて、共通の基本化学構造を有するラクトン含有高分子量化合物であって、側鎖としてアルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物を、側鎖としてアルケニル基を有するラクトン含有高分子量化合物から分離する方法。
【請求項２】
ラクトン含有高分子量化合物の共通の基本化学構造が、三環式化合物である請求項１の方法。
【請求項３】
三環式化合物が、１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ―３―メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０４．９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンである請求項２の方法。
【請求項４】
側鎖としてのアルキル基およびアルケニル基が、各三環式化合物の１７位にそれぞれ置換している請求項３の方法。
【請求項５】
アルキル基がエチルまたはプロピル基であり、アルケニル基がプロペニル基である請求項１の方法。
【請求項６】
銀イオンが、硝酸銀または過塩素酸銀のような銀塩かから供給される請求項１の方法。
【請求項７】
分離が、擬似移動床方式を用いることにより行われる請求項１の方法。
【請求項８】
スルホン酸基含有強カチオン交換樹脂が、ベンゼンスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂である請求項１の方法。
【請求項９】
樹脂が、スチレンモノマーとジビニルベンゼンとの共重合体の基体、またはシリコンポリマーの薄膜で被覆されたシリカゲルの基体で形成される請求項８の方法。
【請求項１０】
樹脂がスチレンモノマーとジビニルベンゼンとの共重合体の基体で形成され、銀イオンで処理したベンゼンスルホン酸基を含有するイオン交換樹脂。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
この発明は類似化合物を分離する方法に関し、さらに詳しくは、銀イオンで前処理したスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂を用いて、側鎖としてアルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物を、側鎖としてアルケニル基を有するラクトン含有高分子量化合物から分離する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
従来、同じ炭素数を有する不飽和脂肪酸のシス−トランス異性体を分離するのに銀イオンを用いることが知られている（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， １４９（１９７８） ４１７−）。しかしながら、分子構造の一部分がわずかに異なる化合物、例えば側鎖としてアルキル基を有する化合物を、側鎖としてアルケニル基を有する化合物からどのようにして効果的に分離するかは見出されていなかった。というのも、それらの化合物は、同一またはほぼ同じ炭素数を有しており、溶媒に対する溶解性や親和性といった物理的性質が互いに似ているためである。
【０００３】
（発明の開示）
本発明者らは、物理的性質が互いに類似した化合物を、化合物自体を変えることなく効果的に分離する方法を鋭意研究した。意外にも、銀イオンで前処理したスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂を用いて、物理的性質が互いに類似した化合物、すなわち共通の基本化学構造を有するラクトン含有高分子量化合物であって、側鎖としてアルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物を、側鎖としてアルケニル基を有するラクトン含有高分子量化合物から分離する方法を見出した。
【０００４】
スルホン酸基含有強カチオン交換樹脂の適当な例としては、極性溶媒で使用できるが、非極性溶媒では使用できないゲルタイプの樹脂およびポーラスな樹脂；ならびに極性溶媒でも非極性溶媒でも使用できるハイポーラスな樹脂のような、合成基体またはシリカゲルの基体が挙げられる。これら樹脂は、用いる溶離液の極性に従って選択することができる。
【０００５】
スルホン酸基含有強カチオン交換樹脂は、末端にベンゼンスルホン酸基を有するベンゼンスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂であってよい。例えば、該樹脂は、スチレンモノマーとジビニルベンゼン（ＤＶＢ）との共重合体の基体またはシリカゲルの基体であってよい。
【０００６】
ベンゼンスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂、すなわちスチレンモノマーとＤＶＢとの共重合体をスルホン化したものの例としては、ダイヤイオン（ＳＫシリーズ、ＲＣＰシリーズ、ＨＰＫシリーズ、ＰＫ２０６ののようなＰＫシリーズ）（商標、日本、三菱化学株式会社製）、アンバーライト（ＩＲ１２０Ｂ、ＩＲ２００）およびデュオライト（Ｃ２０、Ｃ２６）（商標、ローム＆ハース社製）、ダウエックス（５０Ｗ−Ｘ８、ＭＳＣ−１）（商標、ダウケミカル社製）、アイオナック（Ｃ−２４０）（商標、サイブロン・ケミカルズ社製）およびレバチット（Ｓ−１００、ＳＰシリーズ）（商標、バイエル社製）が挙げられる。
【０００７】
シリカゲルを基体として有するベンゼンスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂の例としては、基体をシリコンポリマーの薄膜で被覆した後、スルホン基を末端に導入した、カプセルパック（ＳＣＸシリーズ）（商標、日本、株式会社資生堂製）のようなベンゼンスルホン酸基含有シリコンポリマーで被覆された強カチオン交換樹脂が挙げられる。
これらのベンゼンスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂の中でも、ダイヤイオン（ＲＣＰシリーズおよびＰＫシリーズ）およびカプセルパック（ＳＣＸシリーズ）が特に好ましい。
【０００８】
スルホン酸基含有強カチオン交換樹脂を前処理するのに用いられる銀イオンは、硝酸銀、過塩素酸銀等のような、水中において銀イオンを生ずることができる種々の銀塩から提供されるが好ましい。
【０００９】
スルホン酸基含有強カチオン交換樹脂は、樹脂がＨ型のときは、銀塩の水溶液を通液して、あるいは樹脂がＮａ型のときは、Ｈ型に変え、水洗し、ｐＨ３〜４とした後に銀塩の水溶液を通液して、銀イオンで前処理することができる。この際の銀イオンでの前処理は、銀塩を１ｍｏｌ／Ｌ−Ｒ以上加えて行うのが好ましい。
【００１０】
本発明の精製法は、以下の工程により行うことができる。
（ｉ）「側鎖としてアルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物」および「側鎖にアルケニル基を有するラクトン含有高分子量化合物」を含む混合物、すなわち分離すべき粗物質を、アセトン等の適当な溶媒に溶解し、銀イオンで前処理したスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィーに加えることができる。
（ｉｉ）そして、溶出はアセトン、酢酸エチルとメチルアルコールとの混合物等のような適当な溶離液で行うことができる。
【００１１】
銀イオンで前処理されたスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂を用いた分離方法は、固定床方式または連続床方式で行うことができる。固定床方式には、処理方式の観点から単床式、多床式、複床式、混床式、イオン交換ろ過式、脈動式等が含まれる。固定床方式には、再生方式の観点から下降流再生方式、上昇流再生方式、向流型上昇流再生方式、向流再生方式、塔外再生方式等が含まれる。他方、連続床方式には、流動床式（向流接触式、多段バッチ式）、移動床方式（上昇型（単塔型、多塔型）、下降型（単塔型、多塔型）、擬似移動床方式、エンドレスベルト方式（液−液抽出式）等が含まれ、これらのうち、擬似移動床方式が、効率よくて大量生産に適している。
【００１２】
この発明の分離方法が適用できるラクトン含有高分子量化合物とは、分子内にラクトン環を少なくとも１つ有し、分子量が約４００以上の化合物を意味する。それらは、単環式、二環式、三環式等であってもよい。それらは１２以上の原子で形成されているものがより好ましい。そのような単環式化合物には、エリスロマイシン類、ロイコマイシン類、メチマイシン類等が含まれる。そのような三環式化合物には、ＥＰ０１８４１６２号に記載の三環式化合物；ＥＰ０４２７６８０号、ＥＰ０５３２０８８号またはＷＯ９３／０４６８０号に記載のヘテロ原子含有三環式化合物のような、ラクトン環を有する化合物が含まれる。そして最も好ましいものは、１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ―３―メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０４．９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンである。側鎖としてアルキルまたはアルケニル基で置換される最も好ましい位置は、それらの１７位であり、１７位がアリルで置換された場合はタクロリムスであり、エチルで置換された場合はアスコマイシンである。さらに、ラパマイシン類等も適当なものの例として挙げられる。
【００１３】
ラクトン含有高分子量化合物の側鎖としてのアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等のような炭素数１〜６の直鎖状または分岐状のアルキル基が挙げられ、中でもメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルのような炭素数１〜４のものが好ましい。
【００１４】
上記化合物のような共通の基本化学構造を有するラクトン含有高分子量化合物の側鎖としてのアルケニル基としては、ビニル、プロペニル（アリルまたは１−プロペニル）、ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等のような炭素数２〜６の直鎖状または分岐状のアルケニル基が挙げられ、中でもビニルおよびプロペニルが好ましい。
【００１５】
分離されるべき物質の調製
コーンスターチ（１％）、グリセリン（１％）、グルコース（０．５％）、綿実粉（１％）、乾燥イースト（０．５％）、コーン・スティープ・リカー（０．５％）および炭酸カルシウム（０．２％）を含む培養培地（ｐＨ６．５に調整）（１００ｍＬ）を５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ８個に注ぎ、１２０℃で３０分間滅菌した。ストレプトマイセス・ツクバエンシスＮｏ．９９９３（ブタペスト条約のもと、日本、産業技術総合研究所、生命工学工業技術研究所での寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−９２７）の斜面培養物の１白金耳を、各フラスコ中の培地に接種して、回転振とう器上３０℃で７２時間培養した。予め１２０℃で３０分間滅菌しておいた２００Ｌのジャーファーメンター中の、アデカノール（消泡剤、商標、日本、旭電化工業株式会社製）（０．０５％）およびシリコーン（日本、信越化学工業株式会社製）（０．０５％）を加えた同じ培地（１６０Ｌ）に、この培養物を種培養物として移した。これを、１６０Ｌ／分の通気下、２００ｒｐｍの攪拌下に３０℃で４８時間、前培養した。この前培養物３０Ｌを、予じめ１２０℃で３０分間滅菌しておいた、可溶性スターチ（３％）、小麦胚芽（０．８％）、乾燥イースト（０．４％）、コーン・スティープ・リカー（０．６％）、炭酸カルシウム（０．１％）、アデカノール（商標）（０．０５％）およびシリコーン（０．０５％）を含む、４ｔタンク中の生産培地（ｐＨ６．８、３０００Ｌ）に接種し、１５００Ｌ／分の通気下、１４０ｒｐｍの攪拌下に２５℃で１６８時間、培養した。
【００１６】
このようにして得られた培養ブロスをケイソウ土（５０ｋｇ）を用いてろ過した。菌糸体の塊をアセトン（１，０００Ｌ）で抽出して抽出液１，０００Ｌを得た。菌糸体からのアセトン抽出液とろ液（２，７００Ｌ）とを合わせ、非イオン性吸着樹脂「ダイヤイオンＨＰ−２０」（商標、日本、三菱化学株式会社製）（２００Ｌ）のカラムに通した。５０％アセトン水溶液（６００Ｌ）で洗浄後、７５％アセトン水溶液で溶出した。溶出液の溶媒を減圧下に留去して水性残留物（４０Ｌ）を得た。この残留物を酢酸エチル（４０Ｌ）で２回抽出した。酢酸エチル抽出液を減圧濃縮して油状残渣を得た。油状残渣をｎ−ヘキサンと酢酸エチルとの混液（１：１、ｖ／ｖ、３Ｌ）に溶解し、同溶媒系で充填したシリカゲル（メルク社製、７０−２３０メッシュ）（７０Ｌ）を用いたカラムクロマトグラフィーに付した。
【００１７】
ｎ−ヘキサンと酢酸エチルとの混液（１：１、ｖ／ｖ、４２０Ｌおよび１：２、ｖ／ｖ、４２０Ｌ）、酢酸エチル（２１０Ｌ）次いでアセトン（２１０Ｌ）で順次、溶出を行なった。溶出容量３５０Ｌ〜４２０Ｌ（第１溶出液）、４９０Ｌ〜８４０Ｌ（第２溶出液）および９８０Ｌ〜１，１９０Ｌ（第３溶出液）の画分をそれぞれ集めた。第２溶出液を減圧下に濃縮し、アセトン（５０ｍｇ／ｍＬ）を添加して溶媒置換した。このようにして、カラムクロマトグラフィーで分離されるべき粗物質を得た。
【００１８】
（発明を実施するための最良の形態）
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するためだけでのものである。
実施例１
ダイヤイオンＲＣＰ１６０Ｍ（商標、日本、三菱化学株式会社製）を用いたカラムクロマトグラフィーによる分離
【００１９】
（１）ダイヤイオン（商標）ＲＣＰ１６０Ｍ、イオン交換樹脂の銀塩による処理　１Ｍ硝酸銀水溶液（３カラム容量）をダイヤイオンＲＣＰ１６０Ｍ（Ｈ＋型）に通液した後、水洗（４カラム容量）して過剰の硝酸銀を除去した。そのイオン交換樹脂をメタノール（４カラム容量）、次いで酢酸エチルとメタノールの混液（１：１）で平衡化させた。
【００２０】
（２）単カラムを用いた分離テスト
前記のようにして得られた、カラムクロマトグラフィーで分離されるべき粗物質を、硝酸銀水溶液で処理したダイヤイオン（商標）ＲＣＰ１６０Ｍを用いたカラムクロマトグラフィーに付した。酢酸エチルとメタノールの混液（１：１）を溶離液として、カラム２０ｍｍφ×５００ｍＨ（４２５μｍ）（１５０ｍＬ）を用いて、原料負荷量をタクロリムスとして１０ｇ／Ｌ−Ｒ、流速ｓｖ＝１、温度３０℃で分離を行なった。得られた分離パターンを図１に示す。
【００２１】
タクロリムス、アスコマイシンおよび１７−プロピル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ−［２２．３．１．０４．９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（以下、化合物Ａという）を単離し、同定した。
【００２２】
実施例２
カプセルパックＳＣＸ　ＵＧ８０（商標、日本、株式会社資生堂製）を用いたカラムクロマトグラフィーによる分離
【００２３】
（１）単カラムを用いた分離テスト
実施例１と同様にして得られた、カラムクロマトグラフィーで分離されるべき粗物質を、銀イオンで交換されたカプセルパック（商標）ＳＣＸ　ＵＧ８０を用いたカラムクロマトグラフィーに付した。アセトンを溶離液とし、カラム２０ｍｍφ×５００ｍＨ（２０μｍ）（７８ｍＬ）を用いて、タクロリムスの原料負荷量を５ｇ／Ｌ−Ｒ、流速ｓｖ＝１．５、３０℃で分離および精製を行なった。得られた分離パターンを図２に示す。
【００２４】
（２）小型擬似移動床装置での連続分離
前記と同様にして得られた、カラムクロマトグラフィーで分離されるべき粗物質を、硝酸銀水溶液で処理したカプセルパック（商標）ＳＣＸ　ＵＧ８０を装填した小型擬似移動床装置（日本、オルガノ株式会社製、小型新ＪＯ方式クロマト分離装置、トレゾーネ（商標））による分離に付した。以下の条件で分離および精製を行なった；溶離液−アセトン；チャージ濃度−２５ｇ／Ｌ；チャージ方法−２４ｇ／サイクル×４サイクル；カラム−（２０μｍ）２．２６Ｌ（２８０ｍＬ×８本）；負荷量合計−４２ｇ／Ｌ−Ｒ（一括処理負荷量）；活性区分液量−１．５Ｌ／サイクル（０．６５カラム容量に対して）；および温度２０℃。活性区分の各物質の純度を実施例１（３）と同様にしてＨＰＬＣ分析で測定した。その結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
2004505749.tif 000002
【００２６】
（産業上の利用可能性）
側鎖としてアルキル基を有するラクトン含有高分子量化合物を、側鎖としてアルケニル基を有するラクトン含有高分子量化合物から分離するのに、銀イオンで前処理したスルホン酸基含有強カチオン交換樹脂を適用すると、予期せざる分離効果が得られた。
本発明の分離方法は、その反復可能性、大量スケールでの適用性および／またはその経済的利益のため、極めて有用である。したがって、本発明は、大量生産および目的化合物の純度が重要な化学産業、特に医薬産業に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
銀イオンで前処理したダイヤイオン（商標）ＲＣＰ１６０Ｍを用いたカラムクロマトグラフィーによる分離を表わすチャートである。
【図２】
銀イオンで前処理したカプセルパック（商標）ＳＣＸを用いたカラムクロマトグラフィーによる分離を表わすチャートである。
【図１】
2004505749.tif 000003
【図２】
2004505749.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004505749.tif 000005
2004505749.tif 000006
2004505749.tif 000007
2004505749.tif 000008
2004505749.tif 000009
2004505749.tif 000010
2004505749.tif 000011
2004505749.tif 000012
2004505749.tif 000013
2004505749.tif 000014
2004505749.tif 000015
2004505749.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成12年11月28日(2000.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
（２）小型擬似移動床装置での連続分離
前記と同様にして得られた、カラムクロマトグラフィーで分離されるべき粗物質を、硝酸銀水溶液で処理したカプセルパック（商標）ＳＣＸ　ＵＧ８０を装填した小型擬似移動床装置（日本、オルガノ株式会社製、小型新ＪＯ方式クロマト分離装置、トレゾーネ（商標））による分離に付した。以下の条件で分離および精製を行なった；溶離液−アセトン；チャージ濃度−２５ｇ／Ｌ；チャージ方法−２４ｇ／サイクル×４サイクル；カラム−（２０μｍ）２．２６Ｌ（２８０ｍＬ×８本）；負荷量合計−４２ｇ／Ｌ−Ｒ（一括処理負荷量）；活性区分液量−１．５Ｌ／サイクル（０．６５カラム容量に対して）；および温度２０℃。活性区分の各物質の純度をＨＰＬＣ分析で測定した。その結果を表１に示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【表１】
2004505749.tif 000017
【国際調査報告】
2004505749.tif 000018
2004505749.tif 000019
2004505749.tif 000020