(57)【要約】本発明は、新規なリポキシゲナーゼ遺伝子と、それから誘導されるプロモーター、シグナルペプチド、およびタンパク質について記述する。より詳細には本発明は、化学的誘導性であり傷または病原体誘導性ではない発現を関連ヌクレオチド配列に付与する新規なプロモーターについて記述する。本発明はさらに、関連タンパク質を色素体へ向けることが可能なペプチド、およびカビのマイコトキシンを抑制するために用いることができるリポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質について記述する。本発明はまた、そのようなプロモーター配列、および／または本発明によるシグナルペプチドとタンパク質をエンコードする配列を含有する組換え配列について記述する。上記の組換えＤＮＡ配列は、形質転換植物を創り出すために用いることができるが、特に着目のヌクレオチド配列を傷または病原体に応答してではなく、化学薬品に応答して発現する形質転換植物を創り出すために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
傷または病原体誘導性ではなく化学的誘導性の関連ヌクレオチド配列の発現を推進することが可能な単離核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、受託番号ＤＳＭ １３５２４で供託されているプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａ由来の長さ約４．５ｋｂのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの構成部分である、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるヌクレオチド配列の構成部分である、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示される、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列のｎｔ１〜ｎｔ１３５８を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｎｔ１７０２〜ｎｔ２１０４、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のｎｔ１〜ｎｔ９７、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のｎｔ３６７〜ｎｔ１２８３を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されるヌクレオチド配列のいずれか一つまたはその部分の組合せを含む、請求項１または２に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
緊縮条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、あるいは受託番号ＤＳＭ １３５２４で供託されているプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントとハイブリッドを形成する分離核酸分子であって、前記単離核酸分子が傷または病原体誘導性ではなく化学的誘導性の操作可能に結合したヌクレオチド配列の発現を推進することが可能な単離核酸分子。
【請求項１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の、あるいは受付番号ＤＳＭ １３５２４で供託されているプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントの少なくとも５０ｎｔの連続区間を含み、前記単離核酸分子が傷または病原体誘導性ではなく化学的誘導性の操作可能に結合したヌクレオチド配列の発現を推進することが可能な単離核酸分子。
【請求項１２】
前記少なくとも５０ｎｔの連続区間が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の、あるいは受託番号ＤＳＭ １３５２４で供託されているプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントの少なくとも５０ｎｔの連続区間と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の分離核酸分子。
【請求項１３】
化学的誘導物質が、ＢＴＨ（ベンゾ（１， ２， ３）チアジアゾール−７−カルボチオ酸Ｓ−メチルエステル）、ＩＮＡ（２， ６−ジクロロイソニコチン酸）、およびプロベナゾールからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
化学的誘導物質がジャスモン酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項１５】
関心のあるヌクレオチド配列と操作可能に結合した請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離核酸分子を含む、組換え核酸分子。
【請求項１６】
関心のあるヌクレオチド配列がポリペプチド・コーディング配列を含む、請求項１５に記載の組換え核酸分子。
【請求項１７】
前記コーディング配列が、その５′末端にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の組換え核酸分子。
【請求項１８】
前記コーディング配列が望ましい表現型形質をコードする、請求項１６または１７に記載の組換え核酸分子。
【請求項１９】
前記コーディング配列がアンチセンス方向に存在する、請求項１６に記載の組換え核酸分子。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離核酸分子または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む、核酸発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離核酸分子または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子で安定的に形質転換された宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が植物細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離核酸分子または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子で安定的に形質転換された植物およびその子孫。
【請求項２４】
前記植物が、トウモロコシ、コムギ、サトウモロコシ、ライムギ、カラスムギ、芝生、コメ、オオムギ、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、および油種子用ナタネからなる群から選択される、請求項２１に記載の植物。
【請求項２５】
関心のあるヌクレオチド配列を発現させるために請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子を使用すること。
【請求項２６】
単離核酸分子がポリメラーゼ連鎖反応によって生成され、そこで使用される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の１５個以上のヌクレオチドの連続区間であるヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の単離核酸分子の製造方法。
【請求項２７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列をコードする単離核酸分子であって、前記アミノ酸配列が関連タンパク質を色素体へ向けることが可能な単離核酸分子。
【請求項２８】
前記単離核酸分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項２９】
ストリンジェント条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるヌクレオチド配列とハイブリッドを形成する単離核酸分子。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のいずれか一項のヌクレオチド配列によってコードされるペプチド。
【請求項３１】
請求項２８のヌクレオチド配列によってコードされるペプチド。
【請求項３２】
着目の関連タンパク質を色素体へ向けるための、請求項３０または３１のペプチドの使用。
【請求項３３】
ストリンジェント条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とハイブリッドを形成する単離核酸分子であって、前記ＤＮＡによってエンコードされるタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有し、かつリポキシゲナーゼ活性のあるタンパク質をコードする、単離核酸分子。
【請求項３４】
前記ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示されるタンパク質をコードする、請求項３３に記載の単離核酸分子。
【請求項３５】
請求項３３または３４の単離核酸分子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質。
【請求項３６】
請求項３４の単離核酸分子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質。
【請求項３７】
カビのマイコトキシンを抑制するための、請求項３５または３６に記載のタンパク質を使用。
【請求項３８】
請求項３３または３４の核酸分子で植物を形質転換し、リポキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現することによって植物中のカビのマイコトキシンを抑制する方法。
【請求項３９】
請求項２７〜２９または請求項３３〜３４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、組換え核酸分子。
【請求項４０】
請求項３９の組換え核酸分子で安定的に形質転換される宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞が植物細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
請求項３９の組換え核酸分子で安定的に形質転換される植物およびその子孫。
【請求項４３】
前記植物が、トウモロコシ、コムギ、サトウモロコシ、ライムギ、カラスムギ、芝生、コメ、オオムギ、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、および油種子用ナタネからなる群から選択される、請求項４２に記載の植物。
【請求項４４】
請求項４３の植物およびその子孫の種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規なリポキシゲナーゼ遺伝子と、それから誘導されるプロモーター、シグナルペプチド、およびタンパク質に関する。本発明はまた、新規なリポキシゲナーゼ遺伝子、プロモーター、シグナルペプチド、およびタンパク質の使用方法に関する。本発明はまた、リポキシゲナーゼ活性およびシグナルペプチドを有するポリペプチドをコードする分離核酸分子に関する。より具体的には本発明は、化学的誘導性だが傷または病原体誘導性ではない発現を関連ヌクレオチド配列に付与する新規なプロモーターをコードする単離核酸分子に関する。さらに本発明は、関連タンパク質を色素体へ向けることが可能なペプチドに関する。本発明はまた、リポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、およびカビのマイコトキシンの抑制へのそれらの使用に関する。本発明はさらに、新奇なリポキシゲナーゼ遺伝子、プロモーター、またはシグナルペプチドをエンコードする核酸分子を含む組換え核酸分子に関する。また本発明は、本明細書に記述した核酸分子または組換え分子を含む、宿主細胞、植物、またはその子孫に関する。
【０００２】
植物はそれらのライフサイクルの間ずっとさまざまな微生物にさらされ、それらの多くは病気を引き起こすおそれがある。その結果植物は、住みつきを避けるために多様な防御戦略を編み出した。化学的または生物学的薬品によるある種の処理は、毒性病原体によるその後の接種に対して普通ならば抵抗力のない植物が全身的に抵抗力を持つように誘導することができる。この現象は全身獲得型抵抗すなわちＳＡＲとして知られる。
【０００３】
コメの場合、例えば化学薬品のＮ−シアノメチル−２−クロロイソニコチンアミド、すなわち２， ６−ジクロロイソニコチン酸の誘導体（ＩＮＡ）は、コメいもち病に対するすぐれた抵抗力誘導活性を有する。興味深いことにＮ−シアノメチル−２−クロロイソニコチンアミドによる処理は、リポキシゲナーゼ酵素（ＬＯＸ、リノール酸エステル：酸素オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１３．１１．１２）（Ｓｅｇｕｃｈｉ等の論文、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｐｅｓｔ． Ｓｃｉ． １７， １０７−１１３ （１９９２））、すなわち病原体に対する植物防御と関係することが知られている酵素を誘発した。コメいもち病カビ自体による処理もまたリポキシゲナーゼを誘発した。しかしながら現代農業には、病原体または傷によるのではなく化学薬品による処理のみで誘発されるすぐに使える遺伝子を持ちたいという願望がある。したがって本発明の主要な目的は、病原体または傷によるのではなく化学的に誘発されるリポキシゲナーゼ遺伝子を提供することである。
【０００４】
本発明の別の目的は、農業生物工学で用いられるこのようなリポキシゲナーゼ遺伝子によってエンコードされるプロモーターおよびシグナルペプチドとタンパク質を提供することである。
【０００５】
農業生物工学では、植物を人間の必要性により修飾することができる。これを達成するための一つの方法は、現代遺伝子工学の手法を用いるものである。例えば植物中に関心のある遺伝子を導入することによって、その植物を特に修飾して所望の表現型形質を発現させることができる。この目的で最も一般的には、植物をプロモーター領域、コーディング領域、および終結領域を含む異型遺伝子で形質転換する。植物中で発現させるための異型遺伝子を遺伝学的に設計する場合、プロモーターの選択が重要な要因であることが多い。いくつかの遺伝子を本質的に、すなわち常にその植物全体にわたってまた大部分の組織と器官で発現させることができることが望ましいが、その他の遺伝子は個々の刺激に応答してあるいは特定の細胞または組織に限定してのみ発現することがより望ましい。化学的誘導性プロモーターについては以前に記述がある（例えば欧州特許公開第Ａ−３３２ １０４号を参照されたい）。しかしながら、これらのプロモーターはまた病原体によっても誘発される。しかしながら、病原体または傷ではなく化学的に誘発されるプロモーターを用いることが望ましい場合もある。したがって植物中で関心のあるヌクレオチド配列を発現させるためのそのような別のプロモーターを提供することが本発明の主要な目的である。本発明はまた、本発明のプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子、発現ベクター、および形質転換植物を提供する。関心のある遺伝子を植物中に導入する場合、それらは最も一般的には細胞質中で発現する。別法では、細胞の他のコンパートメント中でこれらの遺伝子を発現させることを望むこともできる。これは、例えば核ゲノムの代わりに色素体ゲノム中に関心のある遺伝子を導入することによって達成することができる。しかしながら、現在、色素体の形質転換は、あらゆる農業の重要な作物にとって日常的な手順ではない。色素体中で関心のあるタンパク質を発現させる別の実行可能な方法は、シグナルペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を、関心のあるタンパク質をコードするＤＮＡ配列の５′末端に加え、核ゲノム由来のこのＤＮＡ配列を発現させることである。シグナルペプチドは、関連タンパク質を色素体へ向けることが可能なペプチドである。したがってこのようなシグナルペプチドを提供することが本発明の別の目的である。本発明はまた、本発明のシグナルペプチドを含む組換えＤＮＡ分子、発現ベクター、および形質転換植物を提供する。このシグナルペプチドは、完全に異型の構築物中で用いるか、またはそれらが生来関連のあるプロモーターまたはコーディング領域と一緒に用いることができる。本発明はまた、本発明のシグナルペプチドを含む組換えＤＮＡ分子、発現ベクター、および形質転換植物を提供する。
【０００６】
農業生物工学では、プロモーターの選択だけでなく、望ましい表現型形質をコードする関連ＤＮＡの選択も重要である。特に望ましい表現型形質は、本発明のリポキシゲナーゼタンパク質である。したがって本発明は、本発明のリポキシゲナーゼタンパク質を含む組換えＤＮＡ分子、発現ベクター、および形質転換植物を提供する。
【０００７】
したがって本発明は、特に関連ヌクレオチド配列の傷または病原体誘導性ではなく化学的誘導性の発現を推進することが可能な単離核酸分子を提供するものであり、
・前記単離核酸分子が、受託番号ＤＳＭ １３５２４の下に供託されたプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａ由来の、長さ約４．５ｋｂのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩのフラグメントの構成部分である。
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるヌクレオチド配列の構成部分である。
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示される。
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される。
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列を含む。
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列のｎｔ１〜ｎｔ１３５８を含む。
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるヌクレオチド配列を含む。
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｎｔ１７０２〜ｎｔ２１０４および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のｎｔ１〜ｎｔ９７および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のｎｔ３６７〜ｎｔ１２８３を含む。
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つまたはその部分の組合せを含む。
・前記単離核酸分子が、ストリンジェント条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９へ、あるいは受託番号ＤＳＭ １３５２４の下に供託されたプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメントとハイブリッドを形成する。前記ヌクレオチド分子は関連ヌクレオチド配列の傷または病原体誘導性の発現ではなく化学的誘導性の発現を推進することが可能である。
【０００９】
・前記単離核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の長さ、あるいは受託番号ＤＳＭ １３５２４の下に供託されたプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメントの長さが、少なくとも５０ｎｔの、好ましくは約５００塩基の、具体的には約１０００塩基と約１５００塩基の間の、より具体的には約２０００塩基の、最も具体的には約３０００塩基と約４５００塩基の間の連続区間を含み、また前記単離核酸分子は関連ヌクレオチド配列の傷または病原体誘導性の発現ではなく化学的誘導性の発現を推進することが可能であり、具体的には前記少なくとも５０ｎｔの連続区間が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、あるいは受付番号ＤＳＭ １３５２４の下に供託されたプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメントの対応する長さの連続区間と、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有する。
【００１０】
・前記核酸分子を誘導することが可能な化学的誘導物質が、ＢＴＨ（ベンゾ（１， ２， ３）チアジアゾール−７−カルボチオ酸Ｓ−メチルエステル）、ＩＮＡ（２， ６−ジクロロイソニコチン酸）、およびプロベナゾールからなる群から選択される。
・前記核酸分子を誘導することが可能な化学的誘導物質が、ジャスモン酸である。
【００１１】
さらに具体的には、着目のヌクレオチド配列と操作可能に連結した本発明による核酸分子を含む組換え核酸分子を提供し、
・前記関心のあるヌクレオチド配列が、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド・コーディング配列を含む。
・前記コーディング配列が、その５′末端にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
・前記コーディング配列が、望ましい表現型形質をコードする。
・前記コーディング配列が、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子である。
・前記コーディング配列が、抗生物質耐性、ウィルスに対する抵抗力、昆虫に対する抵抗力、病気に対する抵抗力、またはその他害虫に対する抵抗性、除草剤耐性、栄養価の改良、工業プロセスにおける性能の向上、あるいは再生能力の改変を付与するタンパク質をコードする。
・前記コーディング配列が、植物に市場価値のある酵素または代謝産物をコードする。
・前記コーディング配列が、アンチセンス方向に存在する。
【００１２】
さらに具体的には、本発明の単離核酸分子または組換え核酸分子、ならびに本発明による単離核酸分子または組換え核酸分子で安定的に形質転換された宿主細胞を提供し、
・前記宿主細胞が細菌である。
・前記宿主細胞が植物細胞である。
・前記宿主細胞は、コメ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、サツマイモ、スイートコーン、マメ、エンドウ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリ、カブ、ハツカダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、カボチャ、ペポカボチャ、麻、ズッキーニ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、ストロベリー、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ナス、キューリ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、および針葉樹および落葉樹などの木質植物の細胞からなる群から選択される植物細胞であるが、特にコメ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キャベツ、カリフラワー、コショウ、カボチャ、メロン、ダイズ、トマト、テンサイ、ヒマワリの細胞からなる群から選択される植物細胞、あるいはワタ、コメ、トウモロコシ、コムギ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、カモガヤ、テンサイ、およびダイズの細胞である。
【００１３】
・前記宿主細胞が双子葉植物由来の植物細胞である。
・前記宿主細胞が、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、および油種子用ナタネからなる群から選択される双子葉植物由来の植物細胞である。
・前記宿主細胞が単子葉植物由来の植物細胞である。
・前記宿主細胞が、トウモロコシ、コムギ、サトウモロコシ、ライムギ、カラスムギ、芝生、コメ、およびオオムギからなる群から選択される単子葉植物由来の植物細胞である。
【００１４】
さらに、本発明による核酸分子または組換え核酸分子で安定的に形質転換された植物およびその子孫を提供する。具体的には前記植物は、トウモロコシ、コムギ、サトウモロコシ、ライムギ、カラスムギ、芝生、コメ、オオムギ、ダイズ、ワタ、タバコ、テンサイ、および油種子用ナタネからなる群から選択される。さらに、形質転換植物およびその子孫由来の種子を提供する。
【００１５】
加えて、関心のあるヌクレオチド配列を発現するための本発明の単離核酸分子の使用法を提供する。
【００１６】
本発明は、さらに下記を開示する。
・着目のヌクレオチド配列を発現するための本発明による単離核酸分子の使用法。
・前記核酸分子がポリメラーゼ連鎖反応によって生成され、使用される少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の１５塩基対以上の連続区間を表すヌクレオチドの配列を含む、本発明による単離核酸分子の生成方法。
【００１７】
本発明はまた、特に関連タンパク質を色素体へ向けることが可能なＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列をエンコードする単離核酸分子を提供し、
・前記ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列である。
・特に前記ヌクレオチド配列がストリンジェント条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４とハイブリッドを形成し、前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヌクレオチド配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有し、エンコードされたペプチドが関連タンパク質を色素体へ向けることが可能である。
【００１８】
さらに、前述の単離核酸分子によってコードされたポリペプチドまたはペプチドと、着目の関連タンパク質を色素体へ向けるための前記ポリペプチドまたはペプチドの使用法とを提供する。
【００１９】
加えて本発明は、ストリンジェント条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とハイブリッドを形成する単離核酸分子を提供する。前記核酸分子によってエンコードされるタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有し、かつリポキシゲナーゼ活性のあるタンパク質をコードする。
【００２０】
本発明はさらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されたタンパク質をコードする前述の核酸分子を提供する。さらに前記核酸分子によってコードされるタンパク質、具体的にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、あるいはリポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチドの部分を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、カビのマイコトキシン、特にアフラトキシンを抑制するための前述のタンパク質の使用法を開示する。本発明はさらに、形質転換植物中でリポキシゲナーゼ活性をエンコードする本発明の単離核酸分子を発現させることによって、植物の病気に対する抵抗力を増す方法、またはカビのマイコトキシンを抑制する方法を提供する。
【００２２】
さらに、上記の核酸分子と、それにより安定的に形質転換された宿主細胞、特に植物細胞と、前述の組換え核酸分子により安定的に形質転換された植物およびその子孫とを含む組換え核酸分子を提供する。
【００２３】
明細書および請求の範囲の明確かつ首尾一貫した理解を確かなものにするために、下記の定義を与える。
【００２４】
ＤＮＡシャッフリング：
ＤＮＡシャッフリングは、ＤＮＡ分子中に再配列を迅速に、容易に、かつ効率的に、好ましくは無作為に導入する方法、または２つ以上のＤＮＡ分子の間でＤＮＡ配列の交換を、好ましくは無作為に生じさせる方法である。ＤＮＡシャッフリングの結果として得られるＤＮＡ分子は、少なくとも１個の鋳型ＤＮＡ分子由来の天然には産出しないＤＮＡ分子であるシャッフリング型ＤＮＡ分子である。
【００２５】
発現：
発現とは、植物中の内因性遺伝子または導入遺伝子の転写および／または翻訳を意味する。例えばアンチセンス構築物の場合、発現はアンチセンスＤＮＡのみの転写を意味する。
【００２６】
機能的に等しい配列：
機能的に等しい配列とは、コメのリポキシゲナーゼ遺伝子プロモーターまたはその部分とほぼ同等のプロモーター活性を有する、またストリンジェント条件下で前記プロモーター配列とハイブリッドを形成するＤＮＡ配列を意味する。
【００２７】
遺伝子：
遺伝子とは、コーディング配列および関連する調節配列を意味し、そのコーディング配列は転写されてｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡになる。調節配列の例は、プロモーター配列、５′および３′非翻訳配列、ならびに終結配列である。存在することができる別の要素は、例えばイントロンである。
【００２８】
着目の遺伝子：
着目の遺伝子とは、植物に転移された場合、その植物に抗生物質耐性、ウィルスに対する抵抗力、昆虫に対する抵抗力、病気に対する抵抗力、またはその他害虫に対する抵抗性、除草剤耐性、栄養価の改良、工業プロセスにおける性能の向上、あるいは再生能力の改変などの所望の特性を付与する任意の遺伝子を意味する。「関心のある遺伝子」はまた、植物中で市場価値のある酵素または代謝産物を生産するために植物に転移される遺伝子であってもよい。
【００２９】
異型：本明細書で用いられる異型とは、別の天然または合成起源のものを意味する。例えば、宿主細胞が非形質転換宿主細胞中には生じない核酸配列で形質転換される場合、その核酸配列を宿主細胞に関して異型であると云う。形質転換用核酸は、異型のプロモーター、異型の解読配列、または異型の終末配列を含むことができる。あるいは形質転換用核酸は、完全に異型でもよく、または異型および内因性の核酸配列の任意の可能な組合せを含んでもよい。
【００３０】
リーダー領域：
リーダー領域は、転写開始部位と翻訳開始部位の間の遺伝子中の領域である。
【００３１】
ＬＯＸ：
ＬＯＸは、リポキシゲナーゼである。
【００３２】
マーカー遺伝子：
マーカー遺伝子とは、選択可能またはスクリーニング可能な形質をコードする遺伝子を意味する。
【００３３】
ｎｔ：
ｎｔは、ヌクレオチド、すなわち天然に産出するまたは合成のヌクレオチドである。
【００３４】
核酸分子：
核酸分子は、一般にはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの任意の一重鎖または二重鎖のポリヌクレオチドであり、天然に産出するまたは合成のヌクレオチドを含むことができる。
【００３５】
操作可能に連結した／会合した：
操作可能に連結した／会合したとは、調節ＤＮＡ配列が解読ＤＮＡ配列の発現に影響するようにその２つの配列が位置している場合、その調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはタンパク質をコード化するＤＮＡ配列と「操作可能に連結した」または「会合した」と云われる。
【００３６】
植物：
植物は、任意の植物、特に種子植物を意味する。
【００３７】
植物細胞：
植物細胞とは原形質体および細胞壁を含む、植物の構造的および生理的単位である。植物細胞は、分離した単細胞または培養細胞の形態、あるいは例えば細胞組織などのより高度に組織化された単位の一部としての形態、あるいは植物器官の形態であってもよい。
【００３８】
植物材料：
葉、茎、根、花または花の一部分、果実、花粉または花粉管、胚珠、胚嚢、卵細胞、接合子、胚、種子、切枝、細胞または組織培養物、あるいは植物の任意のその他の部分または産物を意味する。
【００３９】
ポリヌクレオチド：
（通常は）あるヌクレオチドのグリコース部分の３′位と隣接するヌクレオチドのグリコース部分の５′位との間のリン酸ジエステル結合によって結合した少なくとも約１０個の任意の一重鎖ホモまたはヘテロポリマー、あるいは水素結合によって結合したそのような一重鎖分子２個からなる任意の二重鎖分子。
【００４０】
プロモーター：
関連ＤＮＡ配列の転写を開始させるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター領域はまた、活性化因子、エンハンサー、および／またはリプレッサーなどの遺伝子発現の調節剤として作用する要素が含んでもよく、また５′非翻訳領域の全部または一部が含んでもよい。
【００４１】
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド：
タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドは、本明細書中では区別なく使われ、ペプチド結合によって結合したアミノ酸残基である。
【００４２】
組換えＤＮＡ分子：
組換えＤＮＡ技術を用いてつなぎ合わされるＤＮＡ配列の組み合わせられたもの。
【００４３】
組換えＤＮＡ技術：
例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等の著書、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９） に記述されたＤＮＡ配列をつなぎ合わすために使用される手順。
【００４４】
スクリーニング可能なマーカー遺伝子：
その発現が形質転換細胞に選択的利点を付与しないが、その発現が形質転換細胞を形質転換されていない細胞と表現型的に異なるものにする遺伝子を意味する。
【００４５】
選択可能なマーカー遺伝子：
植物細胞中でのその発現が細胞に選択的利点を付与する遺伝子を意味する。選択可能なマーカー遺伝子で形質転換された細胞によって所持される選択的利点は、非形質転換細胞の成長と比較して抗生物質または除草剤などの負の選択剤の存在下で成長するそれらの能力による可能性がある。非形質転換細胞と比較して形質転換細胞によって所持される選択的利点はまた、栄養、成長因子、またはエネルギー源として加えられた化合物を利用するそれらの向上したまたは新奇な能力による可能性がある。選択可能なマーカー遺伝子はまた、選択剤の存在下で植物細胞中でのその発現が選択剤の不在と比べて、例えば成長に関して形質転換した植物細胞に及ぼすプラスの効果および形質転換されていない植物細胞に及ぼすマイナスの効果を有し、したがって形質転換した植物細胞にプラスの選択的利点を与える。
【００４６】
配列同一性：
配列同一性の割合は、動的計画アルゴリズムに基づくコンピュータ・プログラムを用いて決められる。本発明の範囲内において好ましいコンピュータ・プログラムには、質問がタンパク質かＤＮＡかには関係なく利用可能な配列データベースのすべてを調べるように設計されたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）検索プログラムがある。この検索ツールのバージョンＢＬＡＳＴ ２．０（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）は、インターネット上で公開で利用できるようになった（現在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。それは、全体的位置合わせとは対照的に局部的な位置合わせを捜す帰納的アルゴリズムを使用し、したがって配列の間の関係を検出することができ、それは分離された領域を分配するのみである。ＢＬＡＳＴ検索に割り当てられる得点は、はっきり定義された統計的解釈を有する。前記プログラムは好ましくはデフォルト値に設定されるオプションのパラメータにより実行される。
【００４７】
形質転換：
形質転換とは核酸の細胞への導入を意味する。具体的にはそれは、関心のある生物体のゲノム中へのＤＮＡ分子の安定的組込みを意味する。
【００４８】
本発明は、リポキシゲナーゼ遺伝子、またそれから得られるプロモーター、シグナルペプチド、およびタンパク質に関する。好ましくは病原体または傷によってではなく、化学的に誘導されるリポキシゲナーゼ遺伝子である。特に前記リポキシゲナーゼ遺伝子はコメ由来のものである。このようなリポキシゲナーゼ遺伝子、あるいはそれから得られる部分またはフラグメントは、例えばＰＣＲをベースとする方法によって得ることができる。このためには周知のリポキシゲナーゼ解読配列、例えばコメ由来のもの（Ｐｅｎｇ等の論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ３７５５−３７６１ （１９９４） ； Ｏｈｔａ等の論文、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６， ３３１−３３６ （１９９２））、およびコムギ由来のもの（Ｇｏｒｌａｃｈ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． ８， ６２９−６４３ （１９９６））が当業界で周知のコンピュータ・プログラムを用いて位置合わせされ、保存領域が識別される。この方法によっていくつかの保存領域が識別され、その一つはＣ末端の近くにあり、３つのすべての配列中に不変のアミノ酸配列ＨＡＡＶＮＦＧを含有する。次いで、全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡを、処理されていない対照用の葉から、また１００ ｐｐｍ ＩＮＡ溶液を噴霧し、処理の２４および４８時間後に採取した葉から単離する。
【００４９】
これらＲＮＡ試料は、前進プライマーとして、また逆プライマー（５′−ＡＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３′、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）としての固定されたオリゴｄＴプライマーとして、コメＲＬＬ２リポキシゲナーゼ（Ｐｅｎｇ等の論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ３７５５−３７６１ （１９９４）） のＣ末端領域中のＨＡＡＶＮＦＧアミノ酸配列の図柄に対応する同義性オリゴヌクレオチド５′−ＣＡＹＧＣＮＧＴＮＡＡＮＴＴＹＧＧ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ用鋳型として使用される。この方法がコメ由来の全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡに対して行われる場合、約６００ｂｐのＰＣＲ産物は、対照試料中ではなくＩＮＡ処理試料中にのみ臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上に現れる。当業技術者には、そのＲＮＡが分離される生物体に応じてバンドの大きさがより小さくもなり、より大きくもなる可能性があることが知られている。得られたバンドを当業界で周知の方法によりクローニングし、配列を決め、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして普通長さのリポキシゲナーゼｃＤＮＡまたはゲノムクローンを得るためのプローブとして用いることができる。ＩＮＡ処理した葉から構築されるコメｃＤＮＡをスクリーニングすると、長さ３０１８ ｂｐの普通長さのコメのリポキシゲナーゼｃＤＮＡクローンが得られる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。ＲＣＩ−１（コメから化学的に誘導されるｃＤＮＡ １）と呼ばれるこのｃＤＮＡクローンは、予想Ｍｒが１０５ｋＤａのアミノ酸残基９２２個のタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）をエンコードする２７６６ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の塩基４８〜塩基２８１６）を含有する。５′または３′の非翻訳領域の長さに関して、またそのライブラリーを構築する生物体に関してはそのクローンが普通長さであるかないかに応じて、得られるｃＤＮＡクローンがより小さくまたはより大きくなる可能性があることが当業者に知られている。
【００５０】
ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡは、ＩＮＡ、ＢＴＨ、プロベナゾール、またはジャスモン酸で処理された葉など化学的に処理した葉由来のＲＮＡによるノーザンブロット分析でポローブとして用いた場合、ＲＣＩ−１ ｍＲＮＡの蓄積を示す強いハイブリッド形成シグナルが得られる。傷付けまたは病原体で処理した葉由来のＲＮＡを用いた場合には、このようなｍＲＮＡの蓄積は何も観察されなかった。傷がコメの中の内因性ジャスモン酸のレベルを増加させ、またコメのいもち病感染に対する全身性防御の向上を誘導することが知られている（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １４， ４７５−４８１ （１９９８） ； Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４， ７９−８８ （１９９７））のでこれは驚くべきことである。しかしながら本発明のリポキシゲナーゼは、コメいもち病カビＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａなどの病原体によって誘発されず、また細菌性病原体Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｓｙｒｉｎｇａｅよっても誘発されない。これは、対応する遺伝子のプロモーター領域が、関連コーディング配列に傷または病原体誘導性ではなく、化学的誘導性の発現パターンを付与する調節要素を含有しなければならないことを示す。
【００５１】
ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、オオムギのＬＯＸ２：Ｈｖ：１にほとんど類似している（同一性６０％、類似性６８％）。アミノ酸レベルにおける配列の同一性（類似性）は、穀粒および苗中に主として見つけられるコメのリポキシゲナーゼＬ２については４３％（５２％）（Ｏｈｔａ等の論文、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６， ３３１−３３６ （１９９２））、またＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ誘発性のコメのリポキシゲナーゼＲＬＬ２については５０％（５８％）（Ｐｅｎｇ等の論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ３７５５−３７６１ （１９９４））である。本発明によって包含されるＤＮＡ配列は、緊縮条件下でＲＣＩ−１ ｃＤＮＡクローン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）とハイブリッドを形成し、その解読配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるタンパク質に対してアミノ酸配列の同一性が少なくとも６５％、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、また最も好ましくは９５％であり、リポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
【００５２】
本発明のリポキシゲナーゼｃＤＮＡは、当業界で周知の方法によってＥ．ｃｏｌｉ中で、または真核配列を発現するのに適した任意の他の発現系の中で発現することができる。次いで発現したタンパク質を分析し、また任意選択で精製する。これらの方法はすべて当業技術者に知られている。本発明のｃＤＮＡを発現する Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の抽出物を分析する場合、基質としてリノール酸を用いてＬＯＸ活性の増加が検出されるが、発現構築物を含まないまたはエンプティベクターを含有する対照用抽出物は検出可能なＬＯＸ活性を有しない。ｐＨ８〜９付近で最大活性が観察され、それはＲＣＩ−１がＬＯＸ １型（Ｓｉｅｄｏｗの論文、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４２， １４５−１８８ （１９９１））として分類されなければならないことを示す。しかしながら最近、プラストムシグナルペプチドの存在に基づく第二の分類が導入された（Ｓｈｉｂａｔａ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． １２， ４１−４２ （１９９４））。この体系によればＲＣＩ−１は、ＬＯＸ ２型として分類されなければならない。
【００５３】
本発明の組換えリポキシゲナーゼの反応生成物をＨＰＬＣ（Ｂｏｈｌａｎｄ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４， ６７９−６８５ （１９９７））によって分析した場合、リノール酸またはリノレン酸のどちらが酵素の基質としての役割を果たすかには無関係に（１３Ｓ）−ヒドロペルオキシ−（９Ｚ， １１Ｅ， １５Ｚ）−オクタデカトリエン酸（１３−ＨＰＯＤ）が主な生成物である。（９Ｓ）−ヒドロペルオキシ−（１０Ｅ， １２Ｚ， １５Ｚ）−オクタデカトリエン酸（９−ＨＰＯＤ）が少量で検出されるのみである。１３−ＨＰＯＤから得られる反応生成物は、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａに対して抗菌性物質として作用することが報告されている（Ｓｈｉｍｕｒａ等の論文、Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ４５： １４３１−１４３５ （１９８１）； Ｓｈｉｍｕｒａ等の論文、Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ４７： １９８３−１９８９ （１９８３））。これは本発明のリポキシゲナーゼ、特にＲＣＩ−１ ＬＯＸが、シグナルとして作用するかまたは直接抗菌活性を示す可能性がある脂肪酸誘導体の発生に関係していることを示す（Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｎｄ Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｐａｔｈｗａｙ Ｅｎｚｙｍｅｓ （Ｐｉａｚｚａ， Ｇ． Ｊ．， ｅｄ） 中のＳｌｕｓａｒｅｎｋｏ， Ａ． Ｊ．の概説、「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」ｐｐ．１７６−１９７． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｈａｍｐａｉｇｎ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。一つの特別な実施形態において本発明のリポキシゲナーゼは、これには限らないがアフラトキシンとその前駆物質のステリグマトシスチン、シトリニン、真菌性トレモーゲン類、ルピノシス、オクラトキシン類、パツリン、ルブラトキシン類、スポリデスミン、スタキボチロトキシン類、トリコテセン類、およびゼアラレノンを含む真菌性ミクロトキシン、特にアフラトキシンおよびステリグマトシスチンの活性をなくすか、または実質上低減させるのに適している。
【００５４】
オオムギＬｏｘＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３５９３１）またはコメＬ−２（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９２５０）などの他のリポキシゲナーゼのアミノ酸配列と、本発明のリポキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列との位置合わせの結果、本発明のリポキシゲナーゼがアミノ酸残基３０個から５０個の間のＮ末端延長部を有することを示す。コメのリポキシゲナーゼＲＣＩ−１の場合、延長部の長さはアミノ酸約４７個である。このＮ末端延長部は、穀粒および苗の中に主に見つけられ、またオオムギ由来のＬｏｘＡ、ＬｏｘＢ、およびＬｏｘＣ（ｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３９， １２８３−１２９８ （１９９９））ならびにコメ由来のＬＯＸ Ｌ−２（Ｏｈｔａ等の論文、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６， ３３１−３３６ （１９９２））を含む別のクラスと、このクラスのＬＯＸ種をはっきり分ける。このＮ末端延長部の一部または全部がリポーター遺伝子のＮ末端領域と融合すると、そのリポーター遺伝子は色素体、特に葉緑体へ向けられる。例えばキメラ遺伝子を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の解読配列の５′末端と融合させたＲＣＩ−１ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の最初の１５８ｂｐを用いて構築する場合、そのＮ末端にＲＣＩ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の最初のアミノ酸３７個を含有する修飾されたＧＦＰが得られる。前記構築物を、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いた形質転換系によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ組織中に導入した場合、ＧＦＰの蛍光と葉緑素の自己蛍光の厳密な一致が観察され、これは融合タンパク質が葉緑体中に局在することを示す。したがって本発明のリポキシゲナーゼタンパク質のＮ末端延長部は、関連タンパク質を色素体、特に葉緑体に転移させるためにシグナルペプチドとして働く。
【００５５】
加えて本発明はまた、傷または病原体誘導性ではなく、化学的誘導性の発現を関心のある関連ヌクレオチド配列に付与することが可能なプロモーターを提供する。コメのリポキシゲナーゼ遺伝子ＲＣＩ−１から得ることが可能なプロモーター配列が好ましい。その機能的および／または構造的な等価物を含むヌクレオチド配列もまた本発明に包含される。したがって本発明は、関連ヌクレオチド配列の転写のプロモーターとして働くヌクレオチド配列に関する。このプロモーター領域にはまた、活性化因子、エンハンサー、および／またはリプレッサーなどの遺伝子発現の調節剤として作用する要素が含まれてもよく、また転写されたｍＲＮＡおよび／またはイントロンの、また任意選択でエキソンの５′非翻訳リーダー配列が含まれてもよい。傷または病原体誘導性ではない化学的誘導性の発現とは、関心のあるヌクレオチド配列が、傷または病原体にさらされたときではなく、好ましくは本発明による化合物が加えられる場合に発現されることを意味する。したがって本発明によるヌクレオチド配列は、好ましくはコーディング配列である関心のある関連ヌクレオチド配列の、傷または病原体誘導性ではなく化学的誘導性の発現に有用である。着目の関連コーディング配列がセンスまたはアンチセンス配向中で発現することができることは当業者に知られている。さらに、着目のコーディング配列は、形質転換される植物に関して異種または同種の起源のものであることができる。同種のコーディング配列の場合、本発明によるヌクレオチド配列は前記配列の異所性発現に有用である。本発明の一つの特別な実施形態において、本発明によるヌクレオチド配列の制御下での関心のあるコーディング配列の発現が、それ自体の発現およびコサプレッションと呼ばれるプロセスによる遺伝子のオリジナルコピーの発現を抑制する。
【００５６】
本発明のプロモーターは例えば、当業界で周知の方法を用いて本発明によるｃＤＮＡでコメのゲノムライブラリーを探査することによってコメのゲノムＤＮＡから得ることができる。任意の他の生物体、特に植物由来のゲノムＤＮＡを、着目の任意の生物体からリポキシゲナーゼプロモーターを得るために用いることができることは当業技術者には明らかである。次いでこのゲノムＤＮＡの配列を決め、ｃＤＮＡ配列と位置合わせする。基本的には出発コドンの上流のすべてのヌクレオチド配列は、リポキシゲナーゼプロモーター領域の一部であると考えられる。さらにイントロン、また任意選択でエキソンを、関連解読領域に傷または病原体誘導性ではなく化学的誘導性の発現を付与する機能性プロモーターを形成させるためにこの領域に加えることができる。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態においてリポキシゲナーゼプロモーターは、受託番号ＤＳＭ １３５２４で供託されているプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａ由来の長さ約４．５ｂｐのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの構成部分である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７は、プラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａ由来の長さ約４．５ｂｐのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す。本発明のその他の好ましい実施形態は、前述の４．５ｂｐのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの構成部分であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９、１、２、および３に示されるヌクレオチド配列である。本発明の別の好ましい実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されるヌクレオチド配列のｎｔ１〜ｎｔ１３５８を含む。
【００５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、４．５ｂｐのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの５′末端を含む。このヌクレオチド配列は長さがヌクレオチド３５８個であり、１〜６位にあるその５′末端にＰｓｔＩ部位を含有する。４．５ｂｐのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の間の領域は、長さが約２４０ｂｐと４４０ｂｐの間にある。４．５ｂｐのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの中央領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、長さが２１０４ｂｐである。それは、推定上のＴＡＴＡボックス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１２６１〜１２６６位）、推定上の出発コドン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の１３５９〜１３６１位）、ならびに推定上のＴＡＴＡボックスの上流の５′非翻訳領域およびヌクレオチド配列を含有する。ゲノムＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）とｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の比較は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の１３１２〜１７０１位に位置する配列がエキソン１の全部または一部を含み、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の１７０２〜２１０４位に位置する配列がイントロン１の５′部分であることを示す。４．５ｂｐのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２ とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の間の領域は、長さが約８５と２８５ｂｐの間にある。４．５ｂｐのＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの３′末端は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。この配列は、長さが１５１６個のヌクレオチド配列を示す。それは、５′から３′の方向にイントロン１の３′末端（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１〜９７位）、続いてエキソン２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の９８〜３６６位）、イントロン２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６７〜１２８３位）、およびエキソン３の一部（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の１２８４〜１５１６位）を含有する。ＰｓｔＩ部位は、１５１１〜１５１６位に位置する。
【００５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １〜３で与えられる配列情報に基づいて本発明のＤＮＡ配列を、例えば鋳型としてプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａあるいはコメまたは関心のある任意の他の生物体由来のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲによって得ることができる。当業技術者には、当業界で周知の方法を用いてどのようにしてこのような配列に到達するかが分かっている。次いでこれらの配列をリポーター遺伝子と融合させてプロモーター活性を実証することができる。例えば、ＧＦＰ解読配列と融合したＰＣＩ−１遺伝子の５′調節配列の一部を含むキメラ遺伝子を構築することができる。この目的ではｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａ（実施例９を参照されたい）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型として用いることができる。遺伝子特異的なプライマーを、遺伝子の５′プロモーター領域を増幅するために設計することができる。例えば、逆プライマーＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と正プライマーＦ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）およびＦ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）との組合せを用いて、開始メチオニンの上流の〜１．２ｋｂまでおよび〜２ｋｂまでの調節配列を単離する。正プライマーＦ１および逆プライマーＲ１で増幅されたＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示し、正プライマーＦ２および逆プライマーＲ１で増幅されたＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示す。クローニングを容易にするためにプライマーは、例えばＧＡＴＥＷＡＹ（商標）クローニング技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ ＵＳＡ）用の遺伝子特異的な配列およびａｔｔＢ組換え部位からなる。逆プライマーとして、下記の配列を有するプライマーＲ１を用いることができる。すなわち、５′−ＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＧＡＣＡＡＡＴＴＡＡＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＴＧ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。逆プライマーＲ１の遺伝子特異的な配列にはアンダーラインが引かれ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１３５６〜１３３４位に対応する）、ａｔｔＢ組換え配列はイタリック体で示されている。正プライマーの例は、プライマーＦ１および Ｆ２である。正プライマーＦ１は下記の配列を有する。すなわち、５′−ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＴＡＡＣＡＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＴＴＧＴＧ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）。正プライマーＦ１の遺伝子特異的な配列にはアンダーラインが引かれ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の塩基１５９〜１８１番に対応する）、ａｔｔＢ組換え配列はイタリック体で示されている。Ｒ１とあいまってＦ１は、〜１．２ｋｂまでのフラグメントを増幅する。正プライマーＦ２は下記の配列を有する。すなわち、５′−ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＴＡＣＴＣ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。正プライマーＦ２の遺伝子特異的な配列にはアンダーラインが引かれ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基３１〜４８番に対応する）、ａｔｔＢ組換え配列はイタリック体で示されている。プライマーＲ１とあいまってプライマーＦ２は、〜２ｋｂまでのフラグメントを増幅する。
【００６０】
入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲの方策を用いて、調節配列を最初にプライマーＦ１＋Ｒ１またはＦ２＋Ｒ１で増幅し、続いてプライマーａｔｔＢ１（５′−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５））およびプライマーａｔｔＢ２（５′−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６））による第二のＰＣＲで増幅してもよい。最適なアニーリング温度は、遺伝子特異的なプライマーＦ１＋Ｒ１またはＦ２＋Ｒ１の場合、勾配サーモサイラー（ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ， ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ ＵＳＡ）および下記のＰＣＲ条件を用いて決めることができる。すなわち（９４℃：１０秒）：（９４℃：１０秒／４５℃から７０℃まで勾配：１０秒／７２℃：１０秒）×１５。ＰＣＲの後、生成物をゲル電気泳動法によって視覚化することができ、また可視生成物をもたらす最も高いＴｍを有する反応物由来のＤＮＡをａｔｔＢ１＋ａｔｔＢ２プライマーによる増幅用に選択することができる。後続のＰＣＲ増幅においては下記のＰＣＲ条件を用いることができる。すなわち（９４℃：１０秒）：（９４℃：１０秒／５０℃から７０℃まで勾配：１０秒／７２℃：１０秒）×１５。次いで得られたＰＣＲ生成物はａｔｔＢ組換え部位でフランキングされ、製造業者のプロトコルによるＢＰ反応（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ ＵＳＡ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／を参照されたい）を介してｐＥＮＴＲ中でエントリークローンを生じさせるために用いることができる。得られたプラスミドは、ＰＣＩ−１開始コドンの５′を〜１．２ｋｂまでおよび〜２ｋｂまで含有し、ｐＥＮＴＲ＋ＬＯＸｐ１．２、ｐＥＮＴＲ＋ＬＯＸｐ２と呼ばれる。次いで調節／プロモーター配列を、手引書（ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）に記述された製造業者のプロトコルによるＧＡＴＥＷＡＹ（商標）技術を用いた組換えによってｍＧＦＰ−５リポーター遺伝子（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）と融合させる。手短に言えば、このプロトコルに従ってエントリーベクター中のプロモーターフラグメントを、ａｔｔＲ部位５′を有するｍＧＦＰ−５解読領域を含むバイナリーＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ指定ベクターとのＬＲ反応を介してＧＦＰリポーターへ組み換える。挿入フラグメントの配向はａｔｔ配列によって維持され、最終構築物は配列決定によって検証される。この構築物はｐＬＯＸｐ１．２プロモーター：：ＧＦＰまたはｐＬＯＸｐ２プロモーター：：ＧＦＰと呼ばれ、電気穿孔法によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株に形質転換することができる。任意の他のバイナリーベクターもまた、関連リポーター遺伝子の発現を推進するように修飾して本発明のプロモーターフラグメントを収容すること��できる。当業技術者は、例えばｐＧＰＴＶ−ＢＬＥＯ（ＡＴＣＣ番号７７３９２）、ｐＢＩ １２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはｐＣａｍｂｉａ １３０２（Ｃａｍｂｉａ， Ｃａｎｂｅｒｒａ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）などの市販のバイナリーベクターから出発するそのようなベクターをいかにして構築するかを知っている。
【００６１】
次いで形質転換植物を、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが仲介する形質転換技術を用いて産生する。遺伝子融合タンパク質の発現は、形質転換細胞中でＬｅｉｃａ−ＴＣＳ共焦レーザー走査型顕微鏡および下記のフィルタ設定、すなわち励起４７６／４８８ ｎｍ；ＧＦＰ放出５１５〜５５２ ｎｍ、葉緑素放出６７３〜６９５ ｎｍによるＰＬＡＰＯ×１００油浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた共焦画像によって監視することができる。ＧＦＰ蛍光および葉緑素の自己蛍光は、独立の２チャンネル検出を用いて同時に記録される。
【００６２】
ｐＲＣＩプロモーター：：ＧＦＰ構築物を発現する形質転換コメ植物由来の葉の共焦画像化を行って、非生物および生物誘導物質に応答するプロモーター活性を検定することができる。
【００６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３に示したヌクレオチド配列に基づいて関心のある任意のプライマーの組合せを選択し、本発明により使用することができるさまざまな長さのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することができることは当業技術者には明らかである。したがって関心のある任意の領域をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３から増幅することができる。例えばプライマーは、特にイントロン１またはイントロン２あるいは５′の上流領域を増幅するように設計することができる。５′の上流領域は、本明細書ではリポキシゲナーゼタンパク質の推定上のＴＡＴＡボックスと推定上の出発コドンの間の領域として定義される。当業者はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｎｔ１７０２〜ｎｔ２１０４、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のｎｔ１〜ｎｔ９７、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のｎｔ３６７〜ｎｔ１２８３を含むＤＮＡ分子に到達するために、イントロン１および／またはイントロン２をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、および／または３のさまざまな部分と組み合わせることを考えるはずである。
【００６４】
さらに、これらの配列のいずれかとリポキシゲナーゼｃＤＮＡ配列の３′非翻訳領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の２８１７〜３０１８位）を組み合わせることもまた望ましいかも知れない。
【００６５】
したがって本発明には、本発明に従って作用するコメＲＣＩ−１リポキシゲナーゼ遺伝子、すなわち傷または病原体による誘導ではなく化学的に誘導される関連ヌクレオチド配列の発現を付与することが可能なコメＲＣＩ−１リポキシゲナーゼ遺伝子から得られるフラグメントが含まれる。これは、このようなプロモーターフラグメントを生じさせ、それらを選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子と融合し、その融合構築物が原形質体による過渡発現検定中にまたは安定的に形質転換された植物中でプロモーター活性を保持するかどうかを検定することによって試験することができる。このような検定は、普通の当業技術者の技量の範囲内にある。本発明の好ましい核酸分子のフラグメントは、長さが少なくとも約５００塩基、具体的には約１０００塩基と約１５００塩基の間、より具体的には約２０００塩基、また最も具体的には約３０００塩基と約４５００塩基の間のものである。
【００６６】
１または複数のヌクレオチドの突然変異物、挿入断片、欠失物、および／または置換物を、当業界で知られている方法を用いてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、または３のヌクレオチド配列、あるいはその配列情報から得られるより長いまたはより短いフラグメント中に導入することができることもまた当業技術者には明らかである。加えて本発明の非修飾または修飾ヌクレオチド配列は、本発明の配列をシャッフリングすることによって変えることができる。本発明による種々のヌクレオチド配列の機能を試験するためには関心のある配列を選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子と操作可能に結合させ、そのマーカー遺伝子の発現を原形質体による過渡発現検定でまたは安定的に形質転換された植物で試験する。関連ヌクレオチド配列の発現を推進することが可能なヌクレオチド配列はモジュール方式で構築されることは当業技術者には知られている。したがってより短い核酸分子フラグメント由来の発現レベルは、最も長いフラグメント由来のものとは異なるかも知れず、また互いに異なるかも知れない。例えば、下方調節する上流の要素の欠失は関連ヌクレオチド配列の発現レベルの増加につながることになり、一方上方調節する要素の欠失は関連ヌクレオチド配列の発現レベルを低下させることになる。関連ヌクレオチド配列の調節された発現に必要なプロモーター要素を識別する別の方法は、いわゆるリンカースキャンニング分析である。リンカースキャンニング突然変異誘発は、その突然変異がプロモーター活性を変える短い画定された図柄の識別を可能にする。したがってＧＵＳリポーター遺伝子または別のマーカー遺伝子のコーディング配列と融合した一組のリンカースキャンニング変異体プロモーターを、当業界で知られている方法を用いて構築することができる。次いでこれらの構築物を、例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに形質転換し、ＧＵＳ活性をいくつかの独立の形質転換した系統中で検定する。次いでプロモーター活性に及ぼす各変異の影響を、変異していないコメリポキシゲナーゼ遺伝子プロモーターを含有する同数の形質転換した系統と比較する。傷または病原体による誘導ではなく化学的に誘導される発現に含まれる図柄を変異する場合、リポーター遺伝子の発現のレベルは変わることが予想される。例えば、化学的な誘導物質によるＧＵＳ活性が対照構築物由来のもので検出されるよりも高い平均値の誘導である場合には、負の調節要素がこの構築物中で変異されている可能性が最も大きい。一方、本発明による化学的な調節剤によりＧＵＳ活性の誘発可能性の完全な喪失が観察される場合には、化学的誘導に必要な正の調節要素が変異されている可能性が最も大きい。次のステップにおいて、特に推定上の正の調節要素の場合、変異されたフラグメントに対応する野生型配列を最小のプロモーターと融合し、その新しく創られたプロモーターが関連マーカー遺伝子に調節された発現を付与する能力があるかどうか試験する。
【００６７】
また本発明のＲＣＩ−１プロモーターの機能的等価物、すなわちストリンジェント条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９のいずれか一つとハイブリッドを形成する、あるいは受託番号ＤＳＭ １３５２４で供託されているプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｂｐ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントとハイブリッドを形成するヌクレオチド配列が本発明に包含される。緊縮ハイブリッド形成は、ＳＤＳ ０．１％を含有する２倍の強度（２Ｘ）のクエン酸緩衝塩類液（ＳＳＣ）中で温度６５℃、好ましくは６０℃、また最も好ましくは５５℃で行い、続いて同じ温度だが低いＳＳＣ濃度の緩衝液で支持体を洗浄する。このような低い濃度の緩衝液は一般に、ＳＤＳ ０．１％を含有する１０分の１の強度のＳＳＣ（０．１×ＳＳＣ）、好ましくはＳＤＳ ０．１％を含有する０． ２×ＳＳＣ、また最も好ましくはＳＤＳ ０．１％を含有する半分の強度のＳＳＣ（０． ５×ＳＳＣ）である。実際にはその他の生物体由来のＲＣＩ−１リポキシゲナーゼプロモーターの全部または一部の機能的等価物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のいずれか一つ、あるいは受託番号ＤＳＭ １３５２４で寄託されているプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｂｐ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントを、関心のある生物体、特に別の単子葉植物から分離したゲノムＤＮＡとハイブリッド形成させることによって見つけることができる。他の生物体から同種の配列を識別するには当業界で知られている多くの方法があるので、当業者はそのような配列を見つけるにはどのように進めるべきかを知っている。次いで新たに識別されたＤＮＡ分子の配列を決めることができ、その配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９のいずれか一つ、あるいは受付番号ＤＳＭ １３５２４で供託されているプラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの４．５ｂｐ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントのヌクレオチド配列と比較することができ、またプロモーター活性があるかどうか試験することができる。少なくともヌクレオチド５０個の長さにわたってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のいずれか一つのヌクレオチド配列と、配列が少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、また最も好ましくは９５％同一のＤＮＡ分子は本発明の範囲内にある。配列同一性の比率は、動的計画アルゴリズムに基づくコンピュータ・プログラムを用いて決定される。本発明の範囲内の好ましいコンピュータ・プログラムには、質問がタンパク質かＤＮＡかには関係なくすべての利用可能なデータベースを調べるように設計されたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）検索プログラムがある。この検索ツールのバージョンＢＬＡＳＴ ２．０（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）はインターネット上で公開で利用できるようになった（現在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ ＢＬＡＳＴ ��）。それは、全体的位置合わせとは対照的に局部的な位置合わせを捜す帰納的アルゴリズムを使用し、したがって配列の間の関係を検出することができ、それは分離された領域を分配するのみである。ＢＬＡＳＴ検索に割り当てられる得点は、はっきり定義された統計的解釈を有する。前記プログラムは好ましくはデフォルト値に設定されるオプションのパラメータにより実行される。
【００６８】
所望ならば本発明のプロモーターは、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるヌクレオチド配列を用いて本発明によるシグナルペプチドをエンコードするヌクレオチド配列と融合させ、色素体、特に葉緑体中の着目の関連コーディング領域の化学的に調節された発現を得ることができる。
【００６９】
本発明による化学的調節剤は、化学的に調節可能なＤＮＡ配列を介して遺伝子の発現を調節する物質として定義される。イオン性または中性の形態の、場合によっては溶媒和もしくはその他の錯体分子またはアニオンであるこの物質は、調節が望ましいとき化学的に調節可能な遺伝子を含有する系に対して通常外因性であるはずである。外因性の化学的調節剤の使用は、系の中の調節剤の量の制御がしやすくまた簡便なために好ましい。しかしながら本発明にはまた、内因性の調節剤、例えば系中の他の構成部分によってまたは系に作用することによって系中の活性またはレベルが人為的に制御される化学物質が含まれる。
【００７０】
本発明の化学的調節剤には、安息香酸、サリチル酸、ポリアクリル酸、およびその置換誘導体があり、また好適な置換基には、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、およびハロゲンがあるが、特にＩＮＡ、ＢＴＨ、プロベナゾール、ジャスモナート、およびジャスモン酸メチルがある。
【００７１】
本発明の化学的に調節可能なＤＮＡ配列およびキメラ遺伝子用の調節剤の別の基はベンゾ−１， ２， ３−チアゾール構造に基づいており、これには限定されないが下記の種類の化合物、すなわちベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾールカルボン酸、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾールチオカルボン酸、シアノベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾールカルボン酸アミド、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾールカルボン酸ヒドラジド、およびその誘導体がある。
【００７２】
調節剤の好ましい基には、これには限定されないがベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−チオカルボン酸、７−シアノベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸アミド、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸ヒドラジド、およびその誘導体がある。
【００７３】
好適な誘導体は、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール部分が置換されないか、あるいは低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルチオ、シアノ、ニトロ、およびハロゲンなど農薬の芳香環系に一般に用いられる小さな置換基によって置換される前記種類の化合物の代表例を包含するが、これには限定されない。好適な誘導体はさらに、カルボン酸、チオカルボン酸、カルボン酸アミド、またはカルボン酸ヒドラジドの官能基のいずれかが置換されないか、あるいは脂肪族、芳香脂肪族、または芳香族の残基によって置換される前記ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール化合物の代表例を包含するが、これには限定されない。好適な残基は、その置換基のアルキル部分が置換されないか、あるいはヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、またはニトロによって置換され、またその置換基の芳香部分が置換されないか、あるいは低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルチオ、シアノ、ニトロ、およびハロゲンなど農薬の芳香環系に一般に用いられる小さな置換基によって置換されたアルキル（特に低級アルキル）、アルコキシ（特に低級アルコキシ）、低級アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルアルキル（特にベンジル）、ナフチルアルキル、フェノキシアルキル、アルケニル、およびアルキニルを包含するが、これには限定されない。ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール構造に基づく調節剤は、調節剤として実際に作用する分子を放出することが可能なすべての分子系を包含する。ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール構造に基づく調節剤の好ましい基には、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾールカルボン酸、アルキル基が炭素原子１〜６個を含有するベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾールカルボン酸アルキル、およびこれらの化合物の置換誘導体がある。好適な置換基には、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、およびハロゲンがある。特にベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸およびそのアルキルエステル、例えばベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸メチルは、ＰＲタンパク質遺伝子から分離される化学的に調節可能なＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ配列用の好ましい誘導物質である。上記化学的調節剤の合成法およびそれらの生物致死剤としての有用性は、英国特許第１，１７６，７９９号、およびＫｉｒｂｙ， Ｐ．等の論文、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃ ２２５０ （１９７０） により見分けることができる。
【００７４】
ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール構造に基づく好ましい種の中では、例えばベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸メチル、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸ｎ−プロピル、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸ベンジル、ベンゾ−１， ２， ３−チアジアゾール−７−カルボン酸ｓｅｃ−ブチルヒドラジドなどに言及することができる。
【００７５】
本発明の化学的に調節可能なＤＮＡ配列用の調節剤の別の基は、イソニコチン酸構造、また好ましくはハロイソニコチン酸構造などのピリジンカルボン酸構造に基づいている。ジクロロイソニコチン酸およびその誘導体、例えば低級アルキルエステルが好ましい。このクラスの化合物の好適な調節剤は、例えば２， ６−ジクロロイソニコチン酸およびその低級アルキルエステル、特にメチルエステルである。
【００７６】
化学的調節剤は、純粋な形態で、溶液または懸濁液で、粉末またはダストとして、あるいは農業で用いられるその他の通常の配合物で、あるいはバイオリアクタープロセスで使用することができる。このような配合物は、固体または液体キャリア、すなわち植物、組織、細胞、または組織培養物などへの調節剤の適用を容易にするために、あるいはその貯蔵、取扱い、または輸送特性を改良するために組み合わされる材料を含むことができる。好適なキャリアの例には、ケイ酸塩、クレー、カーボン、イオウ、樹脂類、アルコール類、ケトン類、芳香族炭化水素類などがある。従来の湿潤性粉末または水性エマルションとして配合される場合には調節剤は、湿潤剤、乳化剤、または分散剤などのイオン性または非イオン性いずれかの１または複数種の通常の界面活性剤を含むことができる。
【００７７】
調節剤はまた、植物にとっていくつかの利益、すなわちその調節剤により調節される任意のキメラ遺伝子によって制御される形質に関連するまたは関連のない利益を与えることを求められる別の薬品と組み合わせて植物に施用することができる。例えば、調節剤を受精媒介物と混ぜ合わせ、受精に無関係の形質転換した形質の発現が求められる直前に施用することができる。あるいはそれを除草剤と組み合わせ、普通ならそのような効果が最大になるはずの時間に除草剤の効果を弱めるように施用することができる。
【００７８】
液体配合物として調節剤を植物の葉、茎、または枝へ、植付け前の種子へ、または植物を支える土壌またはその他の成長媒体へスプレーとして散布してもよい。調節剤はまたバイオリアクターに用いることもでき、調節剤配合物を反応媒体に一回加えることによって、または所定の期間にわたって段階的に加えることによって調節が達成される。
【００７９】
調節剤は、所望の調節を行うのに十分な量でまたは十分な期間にわたって施用される。好ましい調節剤は、申請された量で施用される植物、植物組織、または植物細胞に、植物毒性またはその他の有害な影響を何も与えないか、またはほんの少ししか与えないものである。
【００８０】
本発明の別の態様は、傷または病原体誘導性ではなく化学的誘導性の遺伝子の転写を調節する方法であり、その方法は前述の化学的に調節可能なヌクレオチド配列を含有する植物組織、植物、または種子にそのような化学的調節剤を施用することを含む。植物組織、植物、または種子が、好ましい前述の化学的に調節可能なヌクレオチド配列を含有するそのような方法が好ましい。
【００８１】
本発明の別の目的は、着目のヌクレオチド配列に操作可能に結合した本発明によるプロモーターを含む組換え核酸分子を提供することである。関心のあるヌクレオチド配列は、例えばリボソームＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはタンパク質に翻訳されない任意の他のタイプのＲＮＡをコード化することができる。本発明の別の好ましい実施形態において関心のあるヌクレオチド配列は、タンパク質産物に翻訳される。そのプロモーター配列と関連するヌクレオチド配列は、形質転換される植物に関して同種または異種起源のものであることができる。この配列はまた全体的にまたは部分的に合成のものでもよい。起源とは関係なく関連ヌクレオチド配列は、結合するプロモーターの発現特性に従って形質転換される植物中で発現することになる。そのプロモーター配列と関連のある同種のヌクレオチド配列の場合、本発明によるこのプロモーターは前記同種の配列の異所性の発現に有用である。異所性の発現とは、このプロモーター配列と関連のあるヌクレオチド配列が、前記配列がそれ自体のプロモーターの制御下で発現することができない組織または器官で、および／または時期に発現することを意味する。本発明の一つの特別な実施形態においてこのプロモーター配列と関連のあるヌクレオチド配列の発現は、それ自体の発現およびコサプレッションと呼ばれるプロセスによる遺伝子のオリジナルコピーの発現を抑制する。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態において関連ヌクレオチド配列は、傷または病原体誘導性ではなく化学的誘導性やり方で発現することが望ましいタンパク質をコード化する。このようなヌクレオチド配列は、好ましくはそれにより形質転換された植物に望ましい表現型形質を付与するタンパク質をコードする。この例は、抗生物質耐性、ウィルスに対する抵抗力、昆虫に対する抵抗力、病気に対する抵抗力、またはその他害虫に対する抵抗性、除草剤耐性、栄養価の改良、工業プロセスにおける性能の向上、あるいは再生能力の改変を付与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。関連ヌクレオチド配列はまた、植物中で市場価値のある酵素または代謝産物を産生するために植物に転移される遺伝子であってもよい。選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子、すなわち選択可能またはスクリーニング可能な形質をコードする解読領域に操作可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を含む遺伝子もまた本発明に包含される。
【００８３】
選択可能またはスクリーニング可能な遺伝子の例を下記に記述する。いくつかの標的となる種については違った抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましいかも知れない。形質転換に日常用いる選択マーカーには、カナマイシン、パロモマイシン、ゲネチシン、および関係のある抗生物質に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇの論文、Ｇｅｎｅ １９： ２５９−２６８ （１９８２）；Ｂｅｖａｎ等の論文、Ｎａｔｕｒｅ ３０４： １８４−１８７ （１９８３））；アミノグリコシド ３′−アデニリルトランスフェラーゼをエンコードし、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する細菌性ａａｄＡ遺伝子（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔの論文、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４０８３−４０８９ （１９９１））；抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子（ＢｌｏｃｈｉｎｇｅｒおよびＤｉｇｇｅｌｍａｎｎの論文、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４： ２９２９−２９３１ （１９８４））；およびメトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（ＢｏｕｒｏｕｉｓおよびＪａｒｒｙの論文、ＥＭＢＯ Ｊ． ２： １０９９−１１０４ （１９８３））がある。使用することができるその他のマーカーには、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ等の論文、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：１０６２ （１９９０）； Ｓｐｅｎｃｅｒ等の論文、Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ７９： ６２５−６３１ （１９９０））；グリホサート耐性をエンコードする突然変異体ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（Ｈｉｎｃｈｅｅ等の論文、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ９１５−９２２ （１９８８））；イミダゾリオンまたはスルホニル尿素耐性を付与する突然変異体アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子（Ｌｅｅ等の論文、ＥＭＢＯ Ｊ． ７： １２４１−１２４８ （１９８８））；アトラジンに対する耐性を付与する突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子（Ｓｍｅｄａ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０３： ９１１−９１７ （１９９３））；または欧州特許公開第０ ７６９ ０５９号に記載の突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子がある。国際特許公開第ＷＯ ９３／０５１６３号に記載のホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子などの正の選択をもたらす選択マーカーもまた使用される。形質転換した細胞の識別はまた、スクリーニング可能な遺伝子の発現を介して達成することができ、それにはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または形質転換細胞に表現型が異質の形質を付与する任意の他のタンパク質をコード化する遺伝子などがある。本発明の更なる目的は、着目の関連ヌクレオチド配列と融合した本発明のヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供することである。これらベクターにおいては、例えば細菌性または植物起源のものであってもよい相応しい宿主細胞中でこれら外因性配列が発現することができるように、外来の核酸分子をポリリンカー���域に挿入することができる。例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓバイナリーベクターｐＢＩＮ１９から得られるプラスミドｐＢＩ１０１は、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現シグナルを用いてプロモーターのクローニングおよび試験を可能にする（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等の論文、ＥＭＢＯ Ｊ． ６： ３９０１−３９０７ （１９８７））。そのベクターの大きさは１２．２ｋｂである。それは、低コピーＲＫ２複製起点を有し、細菌と植物の両方にカナマイシン耐性を付与する。本発明により用いることができる当業者に周知の多数の他の発現ベクターがある。
【００８４】
本発明の更なる目的は、本発明の組換えＤＮＡ配列を含む形質転換植物を提供することである。したがって本発明は、植物細胞、そのような細胞から得られる植物、植物材料、その子孫、およびそのような植物から得られる種子、ならびに下記に記述する形質転換法のいずれか一つによって得られる改良された特性を有する農業生産物に関する。本発明に従って形質転換される植物は単子葉植物または双子葉植物であってもよく、これには限定されないがコメ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、サツマイモ、スイートコーン、マメ、エンドウ、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリ、カブ、ハツカダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、カボチャ、ペポカボチャ、麻、ズッキーニ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、ストロベリー、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ナス、キューリ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、および針葉樹および落葉樹などの木質植物が含まれる。形質転換することができる好ましい植物は、コメ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キャベツ、カリフラワー、コショウ、カボチャ、メロン、ダイズ、トマト、テンサイ、ヒマワリ、またはワタだが、特にコメ、トウモロコシ、コムギ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、カモガヤ、テンサイ、およびダイズである。
【００８５】
本発明の組換えＤＮＡ配列を複数のよく知られた方法によってこの植物細胞中に導入することができる。当業者は、このような方法の選択が形質転換の標的になる植物の種類、すなわち単子葉植物または双子葉植物に左右される可能性があることを理解するはずである。植物細胞を形質転換するための適切な方法には、微量注入（Ｃｒｏｓｓｗａｙ等の論文、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４： ３２０−３３４ （１９８６））、電気穿孔法（ＲｉｇｇｓおよびＢａｔｅｓの論文、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８３：５６０２−５６０６ （１９８６））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが仲介する形質転換（Ｈｉｎｃｈｅｅ等の論文、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ９１５−９２２ （１９８８）； 欧州特許公開第０ ８５３ ６７５号）、直接遺伝子導入法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等の論文、ＥＭＢＯ Ｊ． ３： ２７１７−２７２２ （１９８４））、ならびにＡｇｒａｃｅｔｕｓ， Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびＤｕｐｏｎｔ， Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｄｅｌａｗａｒｅ）から入手できる装置を用いた衝撃粒子加速法（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号およびＭｃＣＡｂｅ等の論文、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ９２３−９２６ （１９８８）を参照されたい）がある。形質転換することができる細胞は、分化した葉細胞、胚形成細胞、または任意のその他の種類の細胞であってもよい。原形質体の直接遺伝子導入において外因性遺伝材料の原形質体への取込みは、化学薬品または電場の使用によって高めることができる。次いで外因性材料を核ゲノムに組み込むことができる。以前研究が双子葉タバコ植物で行われ、それは外来ＤＮＡが取り込まれ、子孫植物に移入されるという結果であった（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等の論文、ＥＭＢＯ Ｊ． ３：２７１２−２７２２ （１９８４）； Ｐｏｔｒｙｋｕｓ等の論文、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９９：１６９−１７７ （１９８５））。例えばＴｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ（ネズミムギ）、トウモロコシ、およびブラックメキシカンスイートコーンの単子葉原形質体は、この手順によって形質転換される。別の好ましい実施形態は、欧州特許公開第０ ２９２ ４３５号および第０ ８４６ ７７１号に開示されたトウモロコシ用の原形質体形質転換法である。トウモロコシの形質転換についてはまた、Ｋｏｚｉｅｌ等の論文、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １９４−２００ （１９９３）を参照されたい。コメの形質転換は、原形質体または粒子の衝撃を利用する直接遺伝子導入技術によって行うことができる。原形質体が仲介する形質転換がジャポニカ種およびインディカ種について記述されている（Ｚｈａｎｇ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，７： ３７９−３８４ （１９８８）； Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ等の論文、Ｎａｔｕｒｅ ３３８： ２７４−２７６ （１９８９）； Ｄａｔｔａ等の論文、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ７３６−７４０ （１９９０））。上記の２つの種類はまた、粒子の衝撃を用いて型どおりに形質転換可能である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等の論文、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ９５７−９６２ ���１９９１））。欧州特許公開第０ ３３２ ５８１号は、Ｐｏｏｉｄｅａｅの原形質体の発生、形質転換、および再生の手法について記述している。これらの手法は、カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）およびコムギを含むすべてのＰｏｏｉｄｅａｅ植物の形質転換を可能にする。さらにコムギの形質転換については、欧州特許公開第０ ６７４ ７１５号およびＷｅｅｋｓ等の論文（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２： １０７７−１０８４ （１９９３））に記載されている。このように構築された植物発現ベクターは、例えば従来の形質転換法に従ってコメ細胞中に導入することができ、それから根および葉の分化を誘導し、次いで栽培用の植木鉢に移し、それによって形質転換されたコメを得ることができる。
【００８６】
本発明のＤＮＡ配列またはベクターによる形質転換の結果得られる植物は、その植物全体にわたって、またほとんどの組織および器官中で関心のあるヌクレオチド配列を発現することになる。
【００８７】
前述の形質転換植物中へ組み込まれた遺伝特性は、有性生殖または増殖性成長によって伝えられ、こうして子孫植物中で継続され、受継されることができる。一般に前記継続および受継は、耕作、植付け、または収穫などの特定の目的に合うように開発された周知の農耕法を利用する。水耕または温室技術などの特化された方法もまた使用することができる。さらに本発明による形質転換植物の有用な遺伝特性を使用することにより、害虫、除草剤、またはストレスに対する耐性、栄養価の改良、収率の向上、あるいは倒伏または実こぼれによる損失を引き起こすことが少ない改良された構造などの改良された特性を有する植物の開発を目的とする植物の品種改良を行うことができる。さまざまな品種改良のステップは、交雑される系統を選択すること、親の系統の受粉が行われるように仕向けること、または適切な子孫植物を選択することなどの明確に定められたヒトの介入によって特徴づけられる。所望の特性に応じて異なる品種改良尺度が採用される。関連する技術は当業界でよく知られており、これには限定されないが雑種形成、同系交配、戻し交雑育種、多系交配、変種融合、種間交雑、異数体の手法などがある。雑種形成の手法にはまた、機械的、化学的、または生化学的手段によって雄株または雌株に不稔性植物を生じさせるための植物の不稔化が含まれる。別の系統の花粉による雄株不稔性植物の他家受粉は、雄株不稔性だが雌株稔性の植物のゲノムが両方の親の系統の特性を均等に得ることを確実なものにする。したがって本発明による形質転換植物は例えば、除草剤または農薬処理などの従来の方法の有効性を増す、あるいはそれらの改変された遺伝特性により前記方法の手間を省くことを可能にする改良された植物系統の育種のために使用することができる。別法ではこれらの最適化された遺伝的「装置」により、比較的劣悪な生育条件に耐えることができなかった生産物よりも良い品質の収穫産物を生み出す、改良されたストレス耐性を有する新しい穀物を得ることができる。
【００８８】
本発明の別の目的は、希望の生物体中で関心のあるヌクレオチド配列を発現させるために用いることができるヌクレオチド配列を提供することである。このような分子は、一般に「プロモーター」と呼ばれる。この生物体は、細菌、植物、または関心のある任意の他の生物体であってもよい。
【００８９】
さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３の開示は、当業者がポリメラーゼ連鎖反応用のオリゴヌクレオチドを設計することを可能にし、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、または３の任意の連続した配列が１５塩基対、好ましくは２０から３０塩基対以上であることを特徴とするヌクレオチドの配列を含む鋳型からＤＮＡフラグメントの増幅を試みるものである。前記ヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、または３の１５塩基対、好ましくは２０から３０塩基対以上であるヌクレオチドの配列を含む。少なくとも１つのそのようなオリゴヌクレオチドおよびそれらの増幅生成物を用いて行ったポリメラーゼ連鎖反応は、本発明の別の実施形態を構成する。
【００９０】
配列リスト中の配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１　　コメＲＣＩ−１遺伝子の５′上流配列の一部
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２　　推定上のＴＡＴＡボックスおよび推定上の出発コドンを含むコメＲＣＩ−１遺伝子の一部
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３　　イントロン１の一部、エキソン２、イントロン２、およびエキソン３の一部を含むコメＲＣＩ−１遺伝子の一部
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４　　コメリポキシゲナーゼＲＣＩ−１シグナルペプチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５　　コメリポキシゲナーゼＲＣＩ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
【００９１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６　　コメリポキシゲナーゼＲＣＩ−１シグナルペプチドのアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７　　コメリポキシゲナーゼＲＣＩ−１ ｃＤＮＡの推論されたアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８　　縮重プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９　　固定オリゴｄＴ逆プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０　 正プライマー
【００９２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１　 逆プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２　 逆プライマーＲ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３　 正プライマーＦ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４　 正プライマーＦ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５　 プライマーａｔｔＢ１
【００９３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６　 プライマーａｔｔＢ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７　 プラスミドｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４ａ由来の約４．５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８　 正プライマーＦ１および逆プライマーＲ１によるＰＣＲによって得られたコメＲＣＩ−１遺伝子の５′上流配列の一部
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９　　正プライマーＦ２および逆プライマーＲ１によるＰＣＲによって得られたコメＲＣＩ−１遺伝子の５′上流配列の一部
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０　　ＧＩＧリポーター遺伝子を有するＧａｔｅｗａｙ（商標）修飾型ｐＮＯＶ２３４７バイナリーＧａｔｅｗａｙ（商標）指定ベクター
【００９４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１　　ＧＩＧ、ＧＵＳ、イントロンＧＵＳ、イントロンを有するＧＵＳ解読配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２　　ｐＮＯＶ６８００バイナリーベクター
【００９５】
【表１】
2004504031.tif 000002
【００９６】
ｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａの供託は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄで行った。ｐＮＯＶ６８００の供託は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， １８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４ ＵＳＡのＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＮＲＲＬ） で行った。
【００９７】
下記は本発明の例示的実施例である。本発明は、本発明の個々の態様の単なる例示として意図された記載の特定の実施形態による範囲には限定されず、機能的に等価の任意の構築物、プロモーター、シグナルペプチド、または酵素は本発明の範囲内にある。
実施例
ここで使用された標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当業界ではよく知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等の著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ等の著、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）に記述されている。
【００９８】
実施例１：植物材料および処理
コメ植物（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｋｕｓａｂｕｅ）は、鉄分肥料溶液（Ｇｅｓａｌ Ｐｆｌａｎｚｅｎ Ｔｏｎｉｃ， Ｎｏｖａｒｔｉｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に浸した粘土の土壌を有する鉢の中で、２５℃、湿度８０％、明１６時間／暗８時間のサイクル下で生育した。
Ｍ． ｇｒｉｓｅａ（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｔａｍａｇａｗａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍａｃｈｉｄａ−ｓｈｉ， Ｔｏｋｙｏ １９４， Ｊａｐａｎから得た品種００７および０３１）をオートミールデンプン寒天（オートフレーク３０ｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ、デンプン１０ｇ／ｌ、および酵母抽出物２ｇ／ｌ）上で培養した。２７℃で２週間インキュベートした後、気中菌糸を無菌のスパーテルで取り除き、同調胞子形成を不可視光線（３１０〜３６０ ｎｍ）下における更なるインキュベーションによって誘導した。接種のためにスプレー溶液（ゼラチン１ｇ／ｌ、０．１％トィーン２０）中の分生子の濃度を１×１０６／ｍｌに調整した。
【００９９】
植物は、植付けしてから１２〜１４日後に葉の上に分生子のサスペンションを噴霧することによって接種された。暗く湿気の多いチャンバー（２６℃、相対湿度約１００％）中で２４時間インキュベートした後、植物を上記と同じ温度および光の体制下の湿気のある雰囲気中に保管した。
【０１００】
化学的誘導物質による植物処理は、植付けしてから１０日後に３枚目の葉が出現したところで行った。すべての化学薬品濃度はｐｐｍ（施用される溶液１ｌ当たり活性成分ｍｇ）として与えられた。プロベナゾールを純粋物質の２５０ ｐｐｍ溶液として上記のように土壌浸漬によって施用した（Ｔｈｉｅｒｏｎ等の論文、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｒｉｃｅ： Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｒｉｃｅ ｔｏ Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｄｅｄｅｌｉｎｇｅｎ Ｆａｃｕｌｔｅｉｔ Ｌａｎｄｂｏｕｗｋｕｎｄｉｇｅ ｅｎ Ｔｏｅｇｅｐａｓｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｅｎｔ． ６０， ４２１−４３０ （１９９５））。ＢＴＨ（活性成分と水和性粉末１ ： １ （ｗ／ｗ）の混合物）およびＩＮＡ（活性成分と水和性顆粒１ ： ３ （ｗ／ｗ）の混合物）の配合物を噴霧によって葉の上に散布した。すべての対照試料は、活性物質を含まないスプレー溶液の散布が行われた。ジャスモン酸は、前述のようにエタノールに溶かした１ ｍＭ溶液として施用した（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４， ７９−８８ （１９９７））。傷および全身組織中の遺伝子発現の測定は、Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １４， ４７５−４８１ （１９９８）に従って行った。
【０１０１】
実施例２：ｃＤＮＡライブラリーの構築
全ＲＮＡを１００ｐｐｍ ＩＮＡで処理し、２４時間および４８時間後に刈り取ったコメの葉から抽出した。ＰｏｌｙＡ＋−ＲＮＡを実施例２の記載と同様に調製し、両時点で得た等量をプールした。λＺａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）を用いてその製造業者の手引書に従ってｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１０２】
実施例３：コメリポキシゲナーゼｃＤＮＡ ＲＣＩ−１のクローニング
（Ａ）ＰＣＲによるコメリポキシゲナーゼｃＤＮＡフラグメントのクローニング
ＰＣＲベースの方法を用いてＩＮＡ処理したコメの葉からリポキシゲナーゼｃＤＮＡフラグメントを生成した。コメ由来のリポキシゲナーゼ配列（Ｐｅｎｇ等の論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ３７５５−３７６１ （１９９４）； Ｏｈｔａ等の論文、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６， ３３１−３３６ （１９９２））、またコムギ由来のリポキシゲナーゼ配列（Ｇｏｒｌａｃｈ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． ８， ６２９−６４３ （１９９６））の２つの配列を位置合わせすることによって数個の保存領域が確認され、その１つはＣ末端近傍にあり、また３つのすべての配列において不変のアミノ酸配列ＨＡＡＶＮＦＧを含有していた。
【０１０３】
全ＲＮＡを、処理していない対照用の葉から、また１００ｐｐｍ ＩＮＡを噴霧し、処理後２４時間および４８時間の葉から上記と同様（Ｄｕｄｌｅｒ ＆ Ｈｅｒｔｉｇの論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， ５８８２−５８８８ （１９９２））に抽出した。ＰｏｌｙＡ＋−ＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）の急速ｍＲＮＡ分離キットを用いて全ＲＮＡ から調製した。２つの時点で得られたＰｏｌｙＡ＋−ＲＮＡ試料をプールし、ＰｏｌｙＡ＋−ＲＮＡの分割量１μｇを、縮重オリゴヌクレオチド５′−ＣＡＹＧＣＮＧＴＮＡＡＮＴＴＹＧＧ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を用いたＲＴ−ＰＣＲ用の鋳型として使用した。これは、正プライマーおよび固定オリゴｄＴ逆プライマー（５′−ＡＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９））としてのコメＲＬＬ２リポキシゲナーゼ（Ｐｅｎｇ等の論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ３７５５−３７６１ （１９９４））のＣ末端領域中のＨＡＡＶＮＦＧアミノ酸配列の図柄に対応する。
【０１０４】
逆転写は下記のように行った。
ＲＮＡ １μｌ（１μｇ／ｍｌ）、
５ｘ ＲＴ緩衝液８μｌ、
固定オリゴｄＴ逆プライマー（１００ｐモル／μｌ）４μｌ、
ｄＮＴＰ（各１０ ｍＭ）４μｌ、および
Ｈ２ＯＤＥＰＣ １８μｌ
を混ぜ合わせ、９４℃で１５分間インキュベートし、続いて４２℃で１時間インキュベートした。４２℃に移行してから５分後、ＡＭＶ−ＲＴ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）３μｌおよび ＲＮアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） ２μｌを加えた。逆転写を７５℃で５分間インキュベートすることによって終結させた。逆転写したＲＮＡによるＰＣＲを下記のように行った。
【０１０５】
ｃＤＮＡ（上記参照）３μｌ、
１０ ｘ ＰＣＲ緩衝液１０μｌ、
固定オリゴｄＴ逆プライマー（１００ｐモル／μｌ）１μｌ、
縮重プライマー（１００ｐモル／μｌ）１μｌ、
ｄＮＴＰ（各１０ ｍＭ）２μｌ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）０．５μｌ、
Ｈ２Ｏ ８２．５μｌ
を混ぜ合わせ、下記のプログラムにかけた。
【０１０６】
９４℃／１５分−３９℃／２分−７２℃／３分を１サイクル、
９４℃／３０秒−３９℃／３０秒−７２℃／１分を３５サイクル、および
９４℃／１分−３９℃／２分−７２℃／１０分を１サイクル。
【０１０７】
次いで新鮮なＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ０．５μｌ を加え、上記条件群でさらに２０サイクルを行った。
処理した葉および処理しない葉から得られたＰＣＲ産物を、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で可視化した。約６００ｂｐのＰＣＲ産物は、ＩＮＡ処理試料中にのみ現われ、対照試料中には現れない。ＩＮＡ処理したプローブによるレーン中にのみ存在する約６００ｂｐのバンドに対応するゲル部分を切り取った。続いてＤＮＡをゲルから溶離し、クローニングしてｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ）およびそれから得られるｐＫＬ−５と呼ばれるプラスミドにした。
【０１０８】
（Ｂ）普通長さのコメリポキシゲナーゼｃＤＮＡクローンを得るためのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ｐＫＬ−５の３２Ｐで標識した挿入断片を、ＩＮＡ処理したコメの葉から構築したλｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた（実施例２を参照されたい）。正のクローンを精製した。最も大きな挿入断片を持つものをＲＣＩ−１と呼び、製造業者の手引書に従って生体内切除によってｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ファージミドベクターにサブクローニングした。得られたプラスミドはｐＲＣＩ−１と呼ばれる。ＲＣＩ−１挿入断片を、ＣＹ−５で標識したプライマーおよびＡＬＦ ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてプライマーウォーキングによって両鎖上で配列決定した。
【０１０９】
ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡ挿入断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）は３０１８ｂｐからなり、１０５ｋＤａの予想Ｍｒを有するアミノ酸残基９２２個のタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）をコードする２７６６ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の塩基４８番〜塩基２８１６番）のオープンリーディングフレームを含有する。推定される翻訳開始部位は、オープンリーディングフレーム中の第一メチオニンコドンである。配列の比較の結果、ＲＣＩ−１タンパク質はオオムギのＬＯＸ２：Ｈｖ：１（Ｖｏｒｏｓ等の論文、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５１， ３６−４４ （１９９８））に最も類似していることが明らかになり、アミノ酸レベルで６０％の同一性および６８％の類似性を示した。アミノ酸レベルでこの２つのすでに公表されているコメリポキシゲナーゼ形態の配列類似性（同一性）はそれぞれ、Ｌ−２（Ｏｈｔａ等の論文、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６， ３３１−３３６ （１９９２））と比較して５２％（４３％）、ＰＬＬ２（Ｐｅｎｇ等の論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ３７５５−３７６１ （１９９４））と比較して５８％（５０％）であった。
【０１１０】
ＲＣＩ−１コメリポキシゲナーゼは、このクラスのタンパク質をプラスチド、特に葉緑体に向けて送ると考えられるＮ末端延長部（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸１番〜３６番に対応する）を有する。この推定上の葉緑体を標的にする配列は、主として穀粒および種子中に見出される別のクラスから、またオオムギ由来のＬｏｘＡ、ＬｏｘＢ、およびＬｏｘＣ（ｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３９， １２８３−１２９８ （１９９９））、ならびにコメ由来のＬＯＸ Ｌ−２（Ｏｈｔａ等の論文、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６， ３３１−３３６ （１９９２））を含む別のクラスから、このクラスのリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）種をはっきり区別する。
【０１１１】
実施例４：サザンブロット分析
ゲノムＤＮＡを、ＣＴＡＢ手順（Ａｕｓｕｂｅｌ等の著、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７））を用いてコメの葉から抽出した。制限酵素による消化、アガロースゲル上での電気泳動による分離、およびＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（Ｄｕｐｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｒｕｓｓｅｌｓ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）膜への移行は標準の手順に従って行った。フィルタは、１Ｍ ＮａＣｌに溶かしたＲＣＩ−１ ｃＤＮＡの最初の１２８０ｂｐ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、および変性したサケの精液のＤＮＡ １００μｇ／ｍｌを含有するｐＲＣＩ−１のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントからなる３２ Ｐで標識したプローブと６８℃で夜通しハイブリッドを形成した。フィルタを６５℃で０．２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭクエン酸ナトリウム）；０．１％ＳＤＳ中で洗浄した。
プローブの配列内で切り離さない複数の酵素で消化されたＤＮＡを分析した場合、プローブとハイブリッドを形成する１〜３本のバンドが検出された。これは、ＲＣＩ−１に加えてプローブと弱いクロスハイブリッド形成を行う少なくとも１種類の他のコメ遺伝子が存在したことを示唆した。
【０１１２】
実施例５：ＲＣＩ−１発現の検討
夥しいＲＣＩ−１転写物に及ぼすさまざまな刺激の影響をＲＮＡゲルブロット分析を用いて検討した。このために全ＲＮＡを前述と同様に処理および処理しない葉から抽出した（Ｄｕｄｌｅｒ ＆ Ｈｅｒｔｉｇの論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． ２６７， ５８８２−５８８８ （１９９２））。ゲルブロット分析に関しては、１スロット当たり全ＲＮＡの１０μｇを装填し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ膜へ移行させ、ＵＶ架橋剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）を用いて架橋した。レーンの負荷は、移行前の臭化エチジウム染色によって監視した。フィルタは、１ Ｍ ＮａＣｌに溶かしたＲＣＩ−１ ｃＤＮＡの最初の１２８０ｂｐ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、および変性したサケの精液のＤＮＡ １００μｇ／ｍｌを含有するｐＲＣＩ−１のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントからなる３２ Ｐで標識したプローブと６８℃で夜通しハイブリッドを形成した。フィルタを６５℃の０．２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭクエン酸ナトリウム）；０．１％ＳＤＳ中で洗浄した。コメのリボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰ−Ｌ３、受託番号Ｄ１２６３０）の一部をエンコードする５２８ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを構成部分として発現される転写物用のプローブとして用いた。このフラグメントは偶然に増幅され、部分的リポキシゲナーゼクローンｐＫＬ−５と一緒にクローニングされる。ＩＮＡで処理されたコメの葉に関する時間経過実験については、ＲＮＡゲルブロット分析法により分析した。ハイブリッド形成シグナルは、約３２００ｂｐの長さのＲＮＡに対応する明確なバンドおよび約１２００〜１７００ｂｐの不鮮明なシグナルとして現れた。構成部分として発現される遺伝子（ＲＰ−Ｌ３）を有するその膜を剥がし、リプロービングを行うことによって高品質のＲＮＡ調製物であることが確かめられた。したがってその不鮮明なシグナルは、多分高い代謝回転速度のせいでＲＣＩ−１転写物が特に不安定であることを示す。時間経過実験は、ＲＣＩ−１転写物が処理してから８時間後に蓄積され始め、２４〜４８時間後に最高レベルに達することを明らかにした。同様に、耐性活性化因子ＢＴＨ、すなわちＩＮＡの機能的類似体による処理もまた、別の種類の耐性誘導性化学物質を代表するプロベナゾール（商品名オリゼメート）を使用した場合と同じくＲＣＩ−１転写物の蓄積を誘導する（Ｋｅｓｓｍａｎｎ等の論文、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ３２， ４３９−４５９ （１９９４））。プロベナゾール処理に応答するＲＣＩ−１ ｍＲＮＡ蓄積の時間経過の遅れは、シグナルの違いよりもむしろ別の施用形態、すなわちプロベナゾールの土壌浸漬に対するＩＮＡおよびＢＴＨの場合の葉上への噴霧をそれぞれ反映している可能性がある。したがってＲＣＩ−１転写物は、複数の異なる耐薬品性誘導物質を適用すると蓄積される。これに反してＲＣＩ−１ ｍＲＮＡレベルは、非宿主病原体Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｓｙｒｉｎｇａｅ、すなわちコメいもち病に対して抵抗力のある生物学的誘導物質（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｍｅｔｒａｕｘの論文、Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ． ３９， ４５１−４６１ （１９９１））を接種した後も、またＭ． ｇｒｉｓｅａ、すなわちコメいもち病の原因物質に感染させた場合もどちらも増加しない。
【０１１３】
さらにＲＣＩ−１転写物のレベルは、コメの葉上に１ ｍＭジャスモン酸（ＪＡ）溶液を噴霧した７〜１２時間後に強く増加した。傷はコメ中のＪＡの内因性レベルを増加させることが知られており、またいもち病感染に対する全身性防御の向上を誘導する（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １４， ４７５−４８１ （１９９８）； Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４， ７９−８８ （１９９７））が、興味深いことに局所的にも全身的にもＲＣＩ−１転写を活性化させなかった。化学的誘導物質で処理した後に観察されたＲＣＩ−１転写物の蓄積は、コメの葉中のリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）酵素の増加と相関がある。この目的でＬＯＸ活性を、上記で示したＲＮＡゲルブロット分析の場合にも使用したＢＴＨ処理したコメの葉で測定した（上記参照）。ＲＮＡゲルブロット分析の結果と矛盾なく、酵素活性の著しい増加がＢＴＨ処理の２４時間後と４８時間後の間で観察された。これに加えてＲＣＩ−１転写物の蓄積を誘導するのに十分なＢＴＨ用量はまた、ＬＯＸ酵素活性の増加も引き起こす。両方の結果は、酵素活性の増加が主としてＲＣＩ−１（および同種の）遺伝子の活性化のせいであるという仮定と矛盾しない。この仮説をさらに分析するためにＢＴＨ処理したコメ植物から得られたＲＮＡを、病原体誘発遺伝子（ＲＬＬ２；Ｐｅｎｇ等の論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ３７５５−３７６１ （１９９４）；）および苗中で発現した遺伝子（Ｌ−２；Ｏｈｔａ等の論文、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０６， ３３１−３３６ （１９９２））に対応する他のコメＬＯＸ ｃＤＮＡで探査した。ＲＣＩ−１ ｍＲＮＡとは対照的にＩＮＡ、ＢＴＨ、およびプロベナゾールによる処理後、ＲＬＬ２およびＬ−２転写物は蓄積しなかった。
【０１１４】
実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉ中のＲＣＩ−１の発現
ＲＣＩ−１コーディング領域をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下に置いた。より詳細には、ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡをクローニングしてｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、すなわちＳｐｈＩ発現ベクター（Ｓｔｕｂｅｒ等の論文、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｐｐ１２１−１５２ （Ｌｅｖｋｏｖｉｔｓ， Ｉ． ＆ Ｐｅｒｎｉｓ， Ｂ．， ｅｄｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９０）） 中の「Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ， ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ」）にし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いてスティッキーエンドを平滑化した後にＰｓｔＩの消化および再連結反応によってユニークＰｓｔＩ部位を除去した。この新しいベクターをｐＤＳ５６ ／ ＲＢＳＩＩ、すなわちＳｐｈＩ（−ＰｓｔＩ）と名付ける。正プライマー５′−ＧＴＣＡＧＣＡＴＧＣＴＣＡＣＧＧＣＣＡＣ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；ＳｐｈＩ部位はアンダーライン、翻訳開始部位はイタリック体で示す）、および内部ＸｈｏＩ部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５の１４９位ヌクレオチド）の下流をアニールする逆プライマー５′−ＣＡＴＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＡＣＡＡＧ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を用いて１４６ｂｐ ＲＣＩ−１フラグメントをＰＣＲ増幅することにより、ＳｐｈＩ部位をＲＣＩ−１ ｃＤＮＡの翻訳開始部位に導入した。増幅したフラグメントをＳｐｈＩおよびＸｈｏＩで切り離し、ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５の１４９〜２４６８位ヌクレオチド）の中間部分を含有する２．３ｋｂ ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントと単一反応で結合させてｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、すなわちＸｈｏＩ と ＢａｍＨＩで消化した ＳｐｈＩ（−ＰｓｔＩ）にした。得られたベクター（ｐＥｘｐｒ１）を制限分析により点検した。次いでｐＥｘｐｒ１をＰｓｔＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５の８９１番塩基に対応するｃＤＮＡ挿入断片の先端鎖中の８９１位にある）およびＳａｌＩ（ｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ、すなわち挿入断片の下流のＳｐｈＩ（−ＰｓｔＩ）の多重クローニング部位中にある）で切り離し、得られたｃＤＮＡフラグメントを対応するｐＲＣＩ−１のＰｓｔＩ／ＸｈｏＩフラグメント（ＸｈｏＩはｃＤＮＡ挿入断片の下流の多重クローニング部位中で切断する）で置き換えた。続いて、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下で完全なＲＣＩ−１解読領域を含有する、得られた構築物をＭ１５ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｕｂｅｒ等の論文、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｌｅｖｋｏｖｉｔｓ， Ｉ． ＆ Ｐｅｒｎｉｓ， Ｂ．， ｅｄｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９０）） ｐｐ１２１−１５２中の「Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ， ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ」）に形質転換した。
【０１１５】
組換えＲＣＩ−１タンパク質の産生は、ＯＤ６００ が１になるまで成長させたＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５培養物２５０ｍｌに１ｍＭ ＩＰＴＧ（最終濃度）を加え、さらに１９℃で夜通し振とう器上でインキュベートすることによって誘導した。この細胞を遠心分離（５０００ｇ、１０分間）によって採取し、溶菌緩衝液（リゾチーム１ｍｇ／ｌを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．５） ５ｍｌ中に再度懸濁させた。氷上で３０分間インキュベートした後、溶菌液を遠心分離（１２０００ｇ、１５分間）し、ペレットを乳鉢に移し、抽出緩衝液（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）、ポリビニル−ポリピロリドン３０ｍｇ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で磨砕した。遠心分離後、透明な上澄みを更なる生化学的分析用の酵素調製物として使用した。
【０１１６】
この構築物で形質転換したＥ．ｃｏｌｉの抽出物の ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ウェスタンブロット上でＬＯＸ特異的な抗体によって認識される分子質量が約１０３ｋＤａの新奇なタンパク質を明らかにした。このサイズは予想値の１０５ｋＤａと一致する（実施例３を参照されたい）。
【０１１７】
実施例７：ＲＣＩ−１リポキシゲナーゼ活性の生化学的分析
リポキシゲナーゼ活性は、基質としてリノール酸と組換えＲＣＩ−１酵素抽出物から得た５〜２０μｌとを用いて分光測定法により２３４ｎｍ、３０℃で測定した（Ｂｏｈｌａｎｄ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４， ６７９￣６８５ （１９９７））。最適ｐＨを決めるためにｐＨ範囲が重なる異なる緩衝液（ｐＨ４〜６：０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６〜８：０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８〜１０：０．１ＭトリスＨＣｌ）を使用した。反応生成物のモル吸光係数、２．５×１０７／ｃｍ／モルを酵素活性の計算に用いた。
【０１１８】
これら細菌の粗抽出物は基質としてリノール酸を用いてＬＯＸ活性の増加を示したが、発現構築物を含まないかまたはエンプティベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉの対照抽出物は検出し得るＬＯＸ活性を持たなかった。最大活性は、ｐＨ８〜９前後で観察され、ＲＣＩ−１が１型ＬＯＸ（Ｓｉｅｄｏｗの論文、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４２， １４５−１８８ （１９９１））として分類されなければならないことを示した。しかしながら最近プラストムシグナルペプチドの存在に基づく第二の分類が導入されたことに注目されたい（Ｓｈｉｂａｔａ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． １２， ４１−４２ （１９９４））。この体系によればＲＣＩ−１は、２ 型ＬＯＸとして分類されなければならない。
【０１１９】
ＲＣＩ−１タンパク質の酵素活性物質の生成物をＨＰＬＣにより分析した（Ｂｏｈｌａｎｄ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４， ６７９−６８５ （１９９７））。組換えＲＣＩ−１タンパク質から得た約０．２ｎｋａｔの酵素活性物質を、０．１ＭトリスＨＣｌ （ｐＨ８．８）２ｍｌに溶かした基質溶液（それぞれリノール酸またはαリノレン酸１０μｌ、エタノール２０μｌ、Ｈ２Ｏ ２０μｌ）５０μｌで、３０℃において２０分間インキュベートした。希釈したＨＣｌでｐＨを３．０まで下げることによって反応を停止し、ヒドロペルオキシドをＣＨＣｌ３ １ｍｌで抽出し、続いて水で２回洗浄した。反応生成物をＨＰＬＣ分析（粒径４μｍ、Ｓｕｐｒａｓｐｈｅｒｅ−Ｓｉ、４．６×１２５ ｍｍ；Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）にかけた。無勾配溶離をヘキサン：２−プロパノール：アセトニトリル：酢酸（９８．３ ： １．５ ： ０．１ ： ０．１、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いて流量１ｍｌ／分で行った。生成物を２３４ｎｍで検出した。基準は、Ｂｉｏｍｏｌ（Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得るか、あるいは前述のようにリノール酸またはαリノレン酸をそれぞれダイズリポキシゲナーゼでインキュベートすることにより調製した（Ｂｏｈｌａｎｄ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４， ６７９−６８５ （１９９７））。
【０１２０】
組換えＲＣＩ−１の反応生成物をＨＰＬＣで分析した場合、リノール酸またはαリノレン酸のどちらが酵素用の基質としての役割を果たしたかには関係なく、（１３Ｓ）−ヒドロペルオキシ−（９Ｚ， １１Ｅ， １５Ｚ）−オクタデカトリエン酸 （１３−ＨＰＯＤ）が主要な生成物であった。少量の（９Ｓ）−ヒドロペルオキシ−（１０Ｅ， １２Ｚ， １５Ｚ）−オクタデカトリエン酸 （９−ＨＰＯＤ）が検出されるのみであった。
【０１２１】
実施例８：ＲＣＩ−１シグナルペプチド：：ＧＦＰリポーター遺伝子構造および形質転換
ＲＣＩ−１タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）のＮ末端の３７個のアミノ酸、その後ろにあるクローニング手順から得られる４個のアミノ酸、およびその後ろにあるＧＦＰ配列を含有する融合タンパク質をエンコードするキメラ遺伝子を構築した。この目的でｐＲＣＩ−１（実施例３Ｂを参照されたい）を、ｃＤＮＡ挿入断片の１４９位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５の１４９番塩基に対応する）の後ろ、かつ挿入断片の下流の多重クローニング部位中で先端鎖を切り離すＸｈｏＩで消化し、再結合させた。得られたプラスミドは、クローニング部位の下流のベクターのヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５の塩基１５０番〜塩基１５８番と同一であるので、ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡの最初の１５８ｂｐを含有する。このプラスミドはｐＲＣＩ１５８と呼ばれる。シグナルペプチドｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含むこの挿入断片を、多重クローニング部位に割り込むＥ．ｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、スティッキーエンドをクレノウ酵素で充填することによって平滑化した。平滑化したフラグメントをクローニングし、ｍＧＦＰ−５コーディング領域（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を含有するバイナリーｐＣａｍｂｉａ １３０２ベクター（Ｃａｍｂｉａ， Ｃａｎｂｅｒｒａ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を充填され、かつ脱リン酸化されたＳｐｅＩクローニング部位にした。挿入したフラグメントの正しい配向を制限消化によって確認し、最終構築物を配列決定によって検証した。この構築物をｐＲＣＩ−１シグナルペプチド：：ＧＦＰと呼び、三親交配によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ ４４０４に形質転換した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉細胞の形質転換は、発芽１４日後にＫａｐｉｌａ等の方法（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １２２， １０１−１０８ （１９９７））に従ってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、すなわち生態型Ｗａｓｓｉｉｊｅｗｓｋｉｊａ （Ｗｓ）の無傷の葉に染み込ませることによって達成した。融合タンパク質の発現は、Ｌｅｉｃａ−ＴＣＳ共焦レーザー走査型顕微鏡および下記のフィルタ設定（励起４７６／４８８ｎｍ；ＧＦＰ放出５１５〜５５２ｎｍ、葉緑素放出６７３〜６９５ｎｍ）によるＰＬＡＰＯ×１００油浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた共焦画像によって形質転換の２日後に監視を行った。ＧＦＰ蛍光および葉緑素自己蛍光は、独立の２チャンネル検出を用いて同時に記録された。
【０１２２】
ｐＲＣＩシグナルペプチド：：ＧＦＰ構築物を発現する形質転換したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物由来の葉の共焦画像は、ＧＦＰ蛍光および葉緑素自己蛍光の完全な合致を見せ、これは融合タンパク質が葉緑体に局在していることを示した。
【０１２３】
実施例９：ＲＣＩ−１プロモーター領域のクローニング
（Ａ）コメのλ−ＤＡＳＨゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｎｏｒｉｎ植物から得たゲノムＤＮＡを表すλ−ＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡライブラリー を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＵＳＡ）のプロトコルに従って構築した。ライブラリーの力価は２．１２×１０１０ｐｆｕ／ｍｌと決定された。ライブラリーのスクリーニングはＳｔｒａｔａｇｅｎｅのプロトコルに従って行った。ライブラリーを、ＮＺＹ寒天を含有する ４枚の５３０ｃｍ２のバイオアッセイ皿（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＵＳＡ）の上に塗布した。密度を１５０’ ０００ｐｆｕ／ｐｌａｔｅに調整し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのプロトコルに従ってホスト菌株としてＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＵＳＡ）を用いて平板培養を行った。プラークをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ ０．４５μｍ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）上に移し、ＤＮＡをＵＶ架橋剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）中で架橋した。コメＲＣＩ−１リポキシゲナーゼｃＤＮＡクローンｐＲＣＩ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）の５′プライム末端を表す９００ｂｐ ＰｓｔＩフラグメントを３２Ｐで標識し、標準的手順（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、１９８２）に従ってプラーク採取量まで６５℃で夜通しハイブリッド形成した。スクリーニングを２回追加した結果、正のλクローン（λＬＯＸ４）を生じた。
【０１２４】
（Ｂ）推定上のＬＯＸプロモーター領域のサブクローニング
λクローンの液状リザートＤＮＡ調製物を標準的手順に従って調製し、ＰｓｔＩ制限酵素による消化および０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分析した。サザンブロットとそれに続くＲＣＩ−１ ｃＤＮＡ の９００ｂｐ ＰｓｔＩフラグメントに対する膜のハイブリッド形成を標準的手順に従って行った。λＬＯＸ４の４．５ｋｂフラグメントに対応する強いバンドが検出された。４．５ｋｂ ＤＮＡフラグメントをサブクローニングしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＵＳＡ）にした。Ｅ．ｃｏｌｉ 菌株ＤＨ５α細胞の形質転換を標準的手順に従って行い、形質転換細胞をアンピシリンを含有するＬＢ寒天（１００μｇ／ｍｌ）上で選択した。得られたクローンをｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４と呼ぶ。クローンｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４はＤＳＭＺに供託した（２０００年６月６日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨの受付番号ＤＳＭ１３５２４）。クローンｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４は、４．５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメント上にＲＣＩ−１リポキシゲナーゼプロモーターを含有し、さらにＤＮＡ配列決定法によって分析した。クローンｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４は、５′から３′の方向へＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、および３で表されるヌクレオチド配列を備える。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、４．５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの５′末端を備える。このヌクレオチド配列は、長さがヌクレオチド３５８個であり、１〜６位のその５′末端にＰｓｔＩ部位を含有する。４．５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の間の領域は、長さが約２４０と４４０ｋｂの間であった。４．５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの中央領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示され、長さ２１０４ｂｐであった。それは、推定上のＴＡＴＡボックス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の１２６１〜１２６６位）、推定上の出発コドン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の１３５９〜１３６１位）、ならびに５′非翻訳領域および推定上のＴＡＴＡボックスの上流のヌクレオチド配列を含有した。ゲノムＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）とｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）の比較の結果、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の１３１２〜１７０１位に位置する配列はエキソンの全部または一部を備え、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の１７０２〜２１０４位に位置する配列はイントロンの５′部分であることが示された。４．５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２ とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の間の領域は、長さが約８５と２８５ｂｐの間であった。４．５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＰｓｔＩフラグメントの３′末端はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される。この配列は長さ１５１６ｂｐのヌクレオチド配列を示す。これは、５′から３′の方向へイントロン１の３′末端（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の１〜９７位）、続いてエキソン２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の９８〜３６６位）、イントロン２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の３６７〜１２８３位）、およびエキソン３の一部（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の１２８４〜１５１６位）を含有した。ＰｓｔＩ 部位は１５１１〜１５１６位に位置した。
【０１２５】
実施例１０：クローンｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４のプラスミド増幅およびＤＮＡ配列決定
形質転換細胞を、アンピシリンを含有するＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌ）を夜通し培養した培養物５０ｍｌ中で３７℃で成長させた。細胞を採集し、Ｊｅｔｓｔａｒ Ｍｉｄｉプラスミド抽出キット（Ｇｅｎｏｍｅｄ ＧｍｂＨ， Ｂａｄ Ｏｅｙｎｈａｕｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。クローンｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４の配列決定は、鎖成長停止反応法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等の著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９８２））により行った。配列決定反応は、ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターサイクルシークエンスキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を用いて製造業者の手引書に従って行い、また配列は３７３ ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により決定した。これらを集め、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて分析した。アンビギュイティは、対応する電気泳動図模様と比較することによって分類した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １はｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４の４．５ｋｂ挿入断片の５′末端、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２はその中間部分、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３はその３′末端に対応した。
【０１２６】
実施例１１：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター：：ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡ構築物の調製
出発プラスミドは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下でＧＵＳリポーター遺伝子を含有する植物バイナリーベクターｐＢＩ−１ １２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。ＧＵＳリポーター遺伝子をｐＢＩ １２１から取り除き、ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡと置き換えた。このためにｐＢＩ １２１を制限酵素ＳｓｔＩで消化し、スティッキーエンドを標準的な手順に従ってｄＮＴＰとＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで充填した。ＳｍａＩで切り離した後にベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によってＧＵＳリポーター遺伝子から分離し、再度結合させた。このベクターをｐＢＩ １２１（− ＧＵＳ）と名付けた。ｐＢＩ １２１（− ＧＵＳ）をＥｃｏＲＩとＸｂａＩでＲＣＩ−１から切り離し、そのスティッキーエンドをｄＮＴＰとＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した後、ｐＢＩ １２１（− ＧＵＳ）をＢａｍＨＩで切り離し、スティッキーエンドをｄＮＴＰとＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで充填することにより平滑化し、ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡ フラグメントをこのベクターに結合させた。Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換した後、プラスミドを複数のコロニーから調製した。挿入断片の直ぐ上流で切り離すＸｂａＩ、および２６８８番ヌクレオチドの後ろでＲＣＩ−１ ｃＤＮＡの先端鎖を切り離すＢａｍＨＩを用いる制限消化によってＲＣＩ−１フラグメントの配向を点検した。正しい配向は長さ約２７００ｂｐのフラグメントを生じ、間違った配向は長さ約３５０ｂｐのフラグメントを生じた。次いで正しく配向している、すなわち充填されたＥｃｏＲＩ部位がＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのすぐ隣りにあるようなＲＣＩ−１ ｃＤＮＡを含有するプラスミドを選択し、ｐ３５Ｓプロモーター：：ＲＣＩ−１ ｃＤＮＡと呼ぶ。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが仲介する形質転換の場合、プラスミドは電気穿孔によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４に形質転換された。
【０１２７】
実施例１２：コメの形質転換
形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株を、ヒグロマイシンＢ ３０ｍｇ／ｌとテトラサイクリン３ ｍｇ／ｌ を補ったＡＢ液状培地中で３日間成長させ、それを２， ５−Ｄ ２ｍｇ／ｌを含有するＮ６培地（Ｃｈｕ， Ｃ． Ｃ． 等の論文、Ｓｃｉ． Ｓｉｎ． １８， ６５９−６６８ （１９７５））中で成熟した種子の胚盤から誘導した ３週間経たカルスと一緒に、２５℃の暗所中で２〜３日間、１ｍＭベタイン（Ｈｉｅｉ， Ｙ． 等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ６， ２７１−２８２ （１９９４））を補った２Ｎ６−Ａｓ培地上で共培養を行った。共培養したカルスをセホタキシム１００ｍｇ／ｌを含有する滅菌水で洗浄し、再度ヒグロマイシン４０ｍｇ／ｌとセホタキシム２５０ｍｇ／ｌを含有するＮ６培地上で３週間インキュベートした。積極的に成長しているヒグロマイシン耐性カルスを選択培地（例えば、ＭＳ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋ＮＡＡ （ナフタレン酢酸）０．２ｍｇ／ｌ＋カイネチン２ｍｇ／ｌ＋２％ソルビトール＋１．６％ Ｐｈｙｔａｇａｒ（Ｇｉｂｃｏ）＋ヒグロマイシンＢ ５０ｍｇ／ｌ＋セホタキシム２５０ｍｇ／ｌ）上に移し、次いで４０μモル／ｍ２／秒の連続的な光条件下で２〜３週間培養した。こうして得られた苗木を鉢植えし、生育室中で明１０時間／暗１４時間の条件下で成長させて形質転換コメ植物を得た。
【０１２８】
実施例１３：トウモロコシの形質転換
１型胚形成トウモロコシカルス培養物（Ｇｒｅｅｎ等の論文、Ｍｉａｍｉ Ｗｉｎｔｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ２０， １９８３）を温室で生育した材料由来の長さ１．５〜２．５ｍｍの未成熟の胚から育てた。胚は、受粉して約１４日後に表面を無菌にした雌穂から防腐処置して削り取った。胚は２％スクロースおよびクロランベン５ｍｇ／ｌ を含むＤカルス開始培地 （Ｄｕｎｃａｎ等の論文、Ｐｌａｎｔａ １６５： ３２２−３３２ （１９８５））上または３％スクロースおよび２， ４−ｄ ０．７５ｍｇ／ｌを含むＫＭカルス開始培地（ＫａｏおよびＭｉｃｈａｙｌｕｋの論文、Ｐｌａｎｔａ １２６： １０５−１１０ （１９７５））上に置いた。胚および胚形成培養物を引き続き暗所中で培養した。〜１４日後に胚形成応答物を外植片から取り出した。Ｄカルス開始培地由来の胚形成応答物は２％スクロースおよび２， ４−ｄ ０．５ｍｇ／ｌを含むＤカルス維持培地上に置き、一方ＫＭカルス開始培地由来の胚形成応答は２％スクロースおよびＤｉｃａｍｂａ ５ｍｇ／ｌを含むＫＭ維持培地上に置いた。毎週新鮮な維持培地へ淘汰継代培養を行って３〜８週後に高品質で緻密な胚形成培養物が確立された。積極的に成長している胚形成カルス片を遺伝子送達用の標的組織として選択した。このカルス片を、遺伝子送達の約４時間前に１２％スクロースを含む維持培地を入れた標的プレート上に塗布した。このカルス片を標的プレートの中心から半径８および１０ｍｍの環内に配置した。
【０１２９】
プロモーターＲＣＩ−１−ｃＤＮＡ構築物またはＲＣＩ−１−プロモーター−リポーター遺伝子構築物を含有するプラスミドＤＮＡをＤｕＰｏｎｔ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓマニュアルに記述されているように金のミクロキャリア上に沈殿させた。各プラスミド２〜３μｇを各６ショットのミクロキャリア沈殿物に使用した。遺伝子は、ＰＤＳ−１０００Ｈｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ装置を用いて標的組織細胞にデリバリーされた。Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ装置上の設定値は、ラプチャーディスクとミクロキャリアの間が８ｍｍ、ミクロキャリアと停止スクリーンの間が１０ｍｍ、停止スクリーンと標的の間が７ｃｍである。各標的プレートは６５０ｐｓｉ（約４５５ ＭＰａ）ラプチャーディスクを用いて２度撃たれた。２００×２００ステンレススチール製メッシュ（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ， Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， ＮＪ）を停止スクリーンと標的組織の間に置いた。
【０１３０】
遺伝子デリバリーの７日後、標的組織片を高浸透性培地から選択培地へ移した。ＢＡＲ遺伝子を用いる選択の場合は標的組織片を、グルホシネートアンモニウム（Ｂａｓｔａ（登録商標））１００ｍｇ／ｌまたはビアラホス（Ｈｅｒｂｉａｃｅ（登録商標））２０ｍｇ／ｌを含有する維持培地上に置いた。すべてのアミノ酸を選択培地から取り出した。これら高レベル選択培地上での５〜８週間後に、任意の成長しているカルスをＢａｓｔａ（登録商標）３〜２０ｍｇ／ｌを含有する培地に入れて継代培養した。
【０１３１】
マンノースリン酸イソメラーゼ遺伝子を用いた選択の場合は標的組織を、スクロースなしで１％マンノースを含有するそれぞれの維持培地上に置いた。アミノ酸はこれら培地から除去しない。５〜８週間後に成長しているカルスを、スクロースなしで１．５％マンノースを含有するＤカルス維持培地に入れるか、または１％スクロースと０．５％マンノースを含有するＫＭカルス維持培地に入れるかどちらかで継代培養した。十分なカルスが産生されて１０〜２０本の植物が生じるまで、選択培地上で成長する胚形成カルスを２週間ごと４〜８週間継代培養した。元の標的組織片からの選択に生き残った組織を単一コロニーとして継代培養し、独立形質転換事象と呼ぶ。
【０１３２】
その時点でＢａｓｔａ（登録商標）上で選択されたコロニーを、選択剤は含まず３％スクロース（ＭＳＳ）を含有する修飾ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの論文、Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ， １５： ４７３−４９７ （１９６２））に移し、明るいところに置いた。胚発芽を誘導するために、アンシミドール０．２５ｍｇ／ｌまたはカイネチン０．５ｍｇ／ｌのどちらかをこの培地に加えるか、あるいはベンジルアデニン２ｍｇ／ｌを加えた。マンノースを用いて選択したコロニーを、上記と同様にアンシミドールとカイネチンを加えた２％スクロースおよび１％マンノースを含有する改良型ＭＳ培地（ＭＳ２Ｓ＋１Ｍ）上、または上記と同様にベンジルアデニンを加えた２％スクロースおよび０．５％マンノースを含有する改良型ＭＳ培地（ＭＳ２Ｓ＋０．５Ｍ）上に移した。
【０１３３】
Ｂａｓｔａ（登録商標）選択由来の再生コロニーを２週間後にアンシミドールおよびカイネチンベンを含まないまたはベンジルアデニンを含まないＭＳ３Ｓ培地に移した。マンノース選択から得られた再生コロニーを２週間後にそれぞれホルモン類を含まないＭＳ２Ｓ＋１ＭおよびＭＳ２Ｓ＋０．５ Ｍ培地に移した。すべてのコロニー由来の根を伴ったまたは伴わない再生用の茎頂を、ＭＳ３Ｓ培地を入れたマジェンタボックスに移し、最終的には根を伴った小さな植物を回収し、温室中の土壌に移した。
【０１３４】
植物は、スクロースなしで０．５％マンノースを含有する培地の改良型４８ウェルのクロロフェノールレッド検定を用いてＰＭＩ遺伝子の発現が試験された。葉の試料（〜５ｍｍ×５ｍｍ）をこの検定培地上に置き、暗所で〜７２時間生育した。植物がＰＭＩ遺伝子を発現すると、マンノースを代謝することができ培地は黄色に変わるはずである。そうでない場合、培地は赤色のままである。
【０１３５】
形質転換事象はまた、標準的な培養手法を用いて未成熟の接合胚から得た１型カルスを用いて創り出された。遺伝子送達の場合、１型カルス約３００ｍｇを遺伝子送達に先立って１〜２日間新鮮な培地に入れて継代培養し、標的組織片を選択し、それらを再度１２％スクロースを含有する培地上に標的プレートの中心から１０ｍｍのリング状パターン中に置くことによって調製した。約４時間後にＤｕＰｏｎｔ製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ装置を用いて組織に衝撃を与えた。形質転換されるプラスミドは、ＤｕＰｏｎｔの標準プロトコルを用いて１μｍの金粒子上に沈殿させた。遺伝子は、標的プレート当たり２回のショットを用いて６５０ｐｓｉ（約４５５ ＭＰａ）で送達した。遺伝子送達してから約１６時間後にカルスを、選択剤を含まない２％スクロースを含有する標準的な培地に移した。遺伝子送達してから１２〜１３日後に標的組織片を、Ｂａｓｔａまたはビアラホスとしてホスフィノチリシン４０ｍｇ／ｌを含有する選択培地に移した。カルスを選択培地上で１２〜１６週間継代培養した後、生き残り成長しているカルスを植物産生のためのＢａｓｔａとしてホスフィノチリシン３ｍｇ／ｌを含有する標準的な再生培地に移した。
【０１３６】
実施例１４：ダイズの形質転換
Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘの原形質体をＴｒｉｃｏｌｉ等の方法（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ５： ３３４−３３７ （１９８６））、ＣｈｏｗｈｕｒｙおよびＷｉｄｈｏｌｍの方法（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ４： ２８９−２９２ （１９８５））、またはＫｌｅｉｎ等の方法（Ｐｌａｎｔａ １５２： １０５−１１４ （１９８１））によって調製した。原形質体のサスペンションを分割量１ｍｌとしてプラスチック製の使い捨てキュベット中に分配した。形質転換については、ＤＮＡ １０μｇ を無菌蒸留水１０μｌに加え、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等（ＥＭＢＯ Ｊ． ３： ２７１７−２７２２ （１９８４））の記述のように無菌化した。溶液を静かに混合し、次いで室温（２４〜２８℃）で４７１個の電極アセンブリを用いたＢＴＸ−Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ ３００電気穿孔装置からの指数関数型減衰定数１０ｍｓを有する４００Ｖ／ｃｍのパルスにかけた。
【０１３７】
上記が、下記変更の１または複数を伴って繰り返された。
（１）用いた電圧は２００Ｖ／ｃｍ、または１００Ｖ／ｃｍと８００Ｖ／ｃｍの間である。
（２）指数関数型減衰定数は５ｍｓ、１５ｍｓ、または２０ｍｓである。
（３）滅菌水２５μｌに溶かしたせん断粉砕した子ウシ胸腺ＤＮＡ ５０μｇをプラスミドＤＮＡと共に加える。
（４）プラスミドＤＮＡを使用前に適切な制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）で処理することによって直鎖状にする。
【０１３８】
原形質体は、培地の固形化のためのアルギン酸塩の添加なしにＫｌｅｉｎ等の論文（Ｐｌａｎｔａ １５２： １０５−１１４ （１９８１））、ＣｈｏｗｈｕｒｙおよびＷｉｄｈｏｌｍの論文（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ４： ２８９−２９２ （１９８５））、またはＴｒｉｃｏｌｉ等の論文（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ５： ３３４−３３７ （１９８６））に記載のように培養した。
【０１３９】
実施例１５：ワタの形質転換
標準的な方法により構築された形質転換用バイナリーベクターを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を、ｐＨ５．６に調整し、また０．１５％マンニトール、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌ、およびストレプトマイシン１ｍｇ／ｍｌを補ったグルタミン酸塩の培地中で１８〜２４時間成長させた後、抗生物質を含まない同じ培地中でＯＤ６００が０．２になるまで希釈した。次いでその細菌を３〜５時間成長させた後、ＯＤ６００が０．２〜０．４になるまで希釈し、次いで表面を滅菌したワタの種子から切り取ったディスクの接種に用いた。
【０１４０】
ワタの種子を１０％クロロックスに２０分間浸漬し、滅菌水で洗浄した。この種子を０．７％水寒天上で暗所で発芽させた。苗を１週間生育した後、子葉表面に細菌を接種した。
【０１４１】
接種した子葉にカルスを形成させた後、それらを切り取りＭＳ塩、３％スクロース、カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ、およびメホキシム１００μｇ／ｍｌ を含有する０．７％寒天上に置いた。４枚のプレートについて十分な量が得られるまでカルスを３週間ごとに新鮮な培地に移した。毒性のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株から成長させたカルスの半分を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有し、ホルモン類を含まない培地に移した。
【０１４２】
実施例１６：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ／アフラトキシン病の検定
接種物の産生および接種の実験計画：
接種物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓの４種類のきわめて有毒な分離物から得られた分生子の均等な混合物である。各分離物をポテト−デキストロース寒天上で、別々のペトリ皿で１２時間を明るくした状態で２８℃で１２〜１６日間成長させた。これら培地を含む培養物を蒸留水と一緒にブレンドし、二層チーズクロスを通して濾過した。分生子の濃度を血球計を用いて推定し、蒸留水で調整した。１００ｍｌ当たり２滴のトウィーン２０を界面活性剤として加えた。分生子サスペンションを使用の直前に調製し、実験室から現場に輸送する間氷上に保管した。
【０１４３】
１ｍｌ当たり分生子１×１０６個の芽胞サスペンションを各植物の最初の穂に、ミッドシルクが成長した段階（シルクの出現が穂の５０％）でピン・ボード型接種器（Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ７８： ７７８−７８１ （１９９４））を用いて２０〜２４日間接種した。
【０１４４】
穂腐れの格付けおよびアフラトキシン分析：
接種してから４０〜４５日後に穂の皮をむき、視覚的な発病度の格付け１〜９（１＝発病なし、９＝９０〜１００％感染している）を接種した穂各々について行い、実験計画それぞれについて平均した。
必要な場合は穂を強制空気で乾燥し皮を取り去った。実験計画それぞれについて穀粒を混ぜ、マイコトキシン分析用に副次サンプリングを行った。
副次試料をＲｏｍｅｒ Ｍｉｌｌ（２Ａ型）で磨砕し、標準のＡＯＡＣ法を用いた薄層クロマトグラフィにより全アフラトキシンを分析した。
【０１４５】
実施例１７：ＧＵＳまたはＧＦＰリポーター遺伝子に操作可能に結合した５′プロモーターフラグメントを含有する植物形質転換ベクターの構築
プロモーター：：リポーター融合物を生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型としてｐＢＳＫ＋ＬＯＸ４Ａ（実施例９を参照されたい）を使用した。遺伝子の５′プロモーター領域を増幅するために遺伝子特異的なプライマーを使用した。逆プライマーＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を正プライマーＦ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）およびＦ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）と組み合わせて使用して開始メチオニンの上流にある〜１．２ｋｂおよび〜２ｋｂの調節配列を分離した。正プライマーＦ１および逆プライマーＲ１で増幅したＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示し、また正プライマーＦ２および逆プライマーＲ１で増幅したＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示した。クローニングを容易にするためにプライマーは、遺伝子特異的な配列と、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）クローニング技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）用のａｔｔＢ組換え部位からなる。逆プライマーとしてはプライマーＲ１が用いられ、下記の配列、すなわち５′−ＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＧＡＣＡＡＡＴＴＡＡＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＴＧ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を有する。逆プライマーＲ１の遺伝子特異的な配列はアンダーライン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１３５６〜１３３４位に対応する）し、ａｔｔＢ組換え配列はイタリック体で示した。正プライマーはプライマーＦ１およびＦ２である。正プライマーＦ１は下記の配列、すなわち５′−ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＴＡＡＣＡＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＴＴＧＴＧ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）を有する。正プライマーＦ１の遺伝子特異的な配列はアンダーライン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１５９〜１８１位に対応する）し、ａｔｔＢ組換え配列はイタリック体で示した。Ｒ１と共同してＦ１は、〜１．２ｋｂのフラグメントを増幅する。正プライマーＦ２は下記の配列、すなわち５′−ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＴＡＣＴＣ−３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を有する。正プライマーＦ２の遺伝子特異的な配列はアンダーライン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の３１〜４８位に対応する）し、ａｔｔＢ組換え配列はイタリック体で示した。プライマーＦ２はプライマーＲ１と共同して〜２ｋｂのフラグメントを増幅した。
【０１４６】
入れ子式ＰＣＲの方法を用いて、調節配列をまずプライマーＦ１＋Ｒ１またはＦ２＋Ｒ１で増幅し、続いて第二ＰＣＲを用いてプライマーａｔｔＢ１（５′−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ−３′、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）およびプライマーａｔｔＢ２（５′−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ−３′、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）で増幅した。遺伝子特異的なプライマーＦ１＋Ｒ１またはＦ２＋Ｒ１に関しては下記のＰＣＲ条件を用いた。すなわち（９４℃：１５分）：（９４℃：１０秒／５３℃：１０秒／７２℃：１分）×１５：（７２℃：２分）。ＰＣＲ後、生成物をａｔｔＢ１＋ａｔｔＢ２プライマーによる増幅用の第二ＰＣＲ反応に使用した。後続のＰＣＲ増幅では下記のＰＣＲ条件を用いた。すなわち（９４℃：１５秒）：（９４℃：１５秒／６８℃：２分、１５秒）×２５：（６８℃：３分）。次いで得られたＰＣＲ生成物はａｔｔＢ組換え部位でフランキングされ、製造業者のプロトコルに従ってＢＰ反応を介してｐＤＯＮＲ２０１中にエントリークローンを生じさせるために用いられた（ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡの手引書、ｈｔｔｐ： ／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／を参照されたい）。得られたプラスミドは、ＲＣＩ−１開始コドンの〜１．２ｋｂおよび〜２ｋｂ を含有し、ｐＥＮＴＲ＋ＬＯＸｐ１．２、ｐＥＮＴＲ＋ＬＯＸｐ２と呼ばれる。
【０１４７】
１． 産生したエントリーベクター構築物
・ｐＥＮＴＲ＋ＬＯＸ１．２（ａｔｔｐ組換え配列でフランキングされたｐＤＯＮＲ２０１＋１．２ｋｂプロモーターフラグメント）
・ｐＥＮＴＲ＋ＬＯＸ２（ａｔｔｐ組換え配列でフランキングされたｐＤＯＮＲ２０１＋２ｋｂプロモーターフラグメント）
【０１４８】
エントリーベクターは、トウモロコシまたはコメの形質転換用のバイナリープロモーター：： プラスミドを構築するために使用された。この調節／プロモーター配列を、手引書に記載されている製造業者のプロトコル（ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ、ｈｔｔｐ： ／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）に従ってＧＡＴＥＷＡＹ（商標）クローニング技術を用いた組換えによってＧＵＳリポーター遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等の論文、ＥＭＢＯ Ｊ．， ６： ３９０１−３９０７ （１９８７））またはＧＦＰリポーター遺伝子と融合させた。手短に云うと、このプロトコルによればエントリーベクター中のプロモーターフラグメントは、イントロンを有するＧＵＳ 解読領域またはａｔｔＲ部位５′を有するＧＦＰを含有するバイナリーＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ指定ベクターとのＬＲ反応を介してＧＵＳまたはＧＦＰリポーター遺伝子（それぞれｐＮＯＶ２３４７またはｐＮＯＶ２３６１）に組み換えられた。挿入されたフラグメントの配向をａｔｔ配列によって維持し、最終構築物を配列決定により検証した。次いで構築物を電気穿孔によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株に形質転換した。
【０１４９】
ｐＮＯＶ２３４７およびｐＮＯＶ２３６１は、Ｔ−ＤＮＡの左右の端の間にＶＳ１の複製起点、骨格中にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｒＧ遺伝子のコピー、およびトウモロコシユビキチンプロモーター−ＰＭＩ遺伝子−ｎｏｓターミネーター発現カセットを有するバイナリーベクターである。ＰＭＩ（ホスホマンノースイソメラーゼ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｍａｎＡ遺伝子（ＪｏｅｒｓｂｏおよびＯｋｋｅｌｓの論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １６： ２１９−２２１ （１９９６）；Ｎｅｇｒｏｔｔｏ 等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９： ７９８−８０３ （２０００））の解読領域である。ｎｏｓ（ノパリンシンターゼ）ターミネーターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔ−ＤＮＡから得られる（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ等の論文、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １ （６）， ５６１−５７３ （１９８２））。トウモロコシユビキチンプロモーター、ホスホマンノースイソメラーゼ解読領域、およびｎｏｓターミネーターは、ｐＮＯＶ２３４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）のそれぞれｎｔ４１１４〜ｎｔ５１１４、ｎｔ６１９２ 〜ｎｔ７２９５、およびｎｔ７３５６〜ｎｔ７６０４に位置する。ｐＮＯＶ２３６１は、ｐＮＯＶ２３６１がＧＵＳの代わりにＧＦＰリポーター遺伝子を有することを除いてｐＮＯＶ２３４７と同一である。リポーター−プロモーターカセットは、右側の端に最も近く挿入される。バイナリーベクター中の選択マーカー発現カセットは、左側の端に最も近い。ベクターはＧＡＴＥＷＡＹ（商標）組換え構成部分を含有し、それはａｔｔＲ部位、ｃｃｄＢ、およびクロラムフェニコール耐性マーカーを含有する平滑な末端のカセットを、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．）を用いて結合することによってバイナリーベクター骨格に導入された。ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）カセットは、ｐＮＯＶ２３４７のｎｔ２３５１とｎｔ４０５０の間（相補的）、また ｐＮＯＶ２３６１のｎｔ９２０１とｎｔ１０９１０の間に位置した。プロモーターカセットはＬＲ組換え反応（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．）を介して挿入され、それによってｎｔ２３５１とｎｔ４０５０の間のｐＮＯＶ２３４７のＤＮＡ配列が除去され、ａｔｔ配列でフランキングされたＬＯＸプロモーターフラグメントで置き換えられた。この組換えの結果、イントロン（ＧＩＧ）配列を有するＧＦＰまたはＧＵＳリポーター遺伝子と融合したプロモーター配列が得られた。ＧＩＧ遺伝子は、ＧＵＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）のｎｔ３８５〜ｎｔ５７６にＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来のＳＴ−ＬＳ１イントロンを含有する（これはＤｒ． Ｓｔａｎｔｏｎ Ｇｅｌｖｉｎ， Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得られ、Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８： ８７３−８８６ （１９９６）に記述されている）。バイナリーベクター構築物中の選択マーカーおよびプロモーター−リポーターカセットの配向を下記に示す。
【０１５０】
２． 安定な形質転換のための産生構築物
・ｐＮＯＶ６８００（ＲＢ ｎｏｓ＋ＧＩＧ遺伝子＋ＬＯＸ１．２プロモーターフラグメント−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ｎｏｓ ＬＢ）
・ｐＮＯＶ６８０１（ＲＢ ＬＯＸ１．２プロモーターフラグメント＋ＧＦＰ遺伝子＋ｎｏｓ−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ ｎｏｓ ＬＢ）
ｐＮＯＶ６８００のヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示した。ｐＮＯＶ６８００とｐＮＯＶ６８０１は、バイナリーベクターの右と左の端の間に位置する発現カセットが違うだけである。
【０１５１】
３． 比較に用いた構築物
・ｐＮＯＶ２１１０（ＲＢ ＺｍＵｂｉプロモーター＋ ＧＦＰ遺伝子＋ｎｏｓ−ＺｍＵｂｉ＋ＰＭＩ遺伝子＋ ｎｏｓ ＬＢ）
・ｐＮＯＶ３６４０（ＲＢ ｎｏｓ−ＧＩＧ−ＺｍＵｂｉプロモーターｎｏｓ−ＡｔＰＰＯｄｍ−ＺｍＵｂｉプロモーターＬＢ）
【０１５２】
ＧＵＳ−イントロン−ＧＵＳ、ＧＦＰ、またはポリＡフラグメントは、上記のＬＯＸプロモーター構築物に用いられたものと同一である。ＺｍＵｂｉプロモーターは、ｐＮＯＶ２１１０中の塩基１２番から塩基２００９番までに対応し、トウモロコシユビキチン遺伝子のプロモーター、エキソン１、およびイントロン１を含有する。ＡｔＰＰＯｄｍ配列は、通常酵素を不活性化する除草剤（ＰＰＯ阻害剤）に対する耐性を付与するプロトホリノーゲンオキシダーゼの突然変異形態をエンコードする（米国特許第５，９３９，６０２号）。
【０１５３】
実施例１８：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが仲介するトウモロコシの形質転換
未成熟トウモロコシの胚の形質転換は、基本的にはＮｅｇｒｏｔｔｏ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９： ７９８−８０３ （２０００）に記述されているように行った。この実施例については、すべての培地の構成成分はＮｅｇｒｏｔｔｏ等の上記論文の記述と同様である。しかしながらこの資料に記述されている各種培地の構成成分は置換することができる。
【０１５４】
１． 形質転換プラスミドおよび選択マーカー
形質転換に使用した遺伝子は、実施例１７の記述と同様にトウモロコシの形質転換に適したベクターにクローニングされた。使用されたベクターは、選択マーカーとしてホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９： ７９８−８０３ （２０００））を含有する。
【０１５５】
２． Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
植物形質転換プラスミドを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）をＹＥＰ（酵母抽出物（５ｇ／ｌ）、ペプトン（１０ ｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／ｌ）、寒天（１５ ｇ／ｌ）、ｐＨ６．８）固形培地上で２〜４日間、２８℃で成長させた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ約０．８×１０９個を、１００μＭアセトシリンゴン（Ａｓ）を補ったＬＳ−ｉｎｆ培地（ＬＳＡｓ培地）中に懸濁させた（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ 等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９： ７９８−８０３ （２０００））。細菌をこの培地中で３０〜６０分間予備誘導した。
【０１５６】
３． 接種
Ａ１８８またはその他の適切なトウモロコシ遺伝子型由来の未成熟胚を８〜１２日を経た穂から削り取って液状ＬＳ−ｉｎｆ＋１００μＭ Ａｓ（ＬＳＡｓ）中に入れた。胚は一度新鮮な感染培地で洗浄した。次いでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ溶液を加え、胚を３０秒間渦動し、５分間細菌を沈降するに任せた。次いで胚を胚盤側を上にしてＬＳＡｓ培地に移し、暗所中で２〜３日間培養した。その後ペトリ皿当たり２０と２５個の間の胚を、セホタキシム（２５０ｍｇ／ｌ）および硝酸銀（１．６ｍｇ／ｌ）を補ったＬＳＤｃ培地（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ 等の論文（２０００））に移し、２８℃の暗所中で１０日間培養した。
【０１５７】
４． 形質転換細胞の選択および形質転換植物の再生
胚形成カルスを産生する未成熟胚をＬＳＤ１Ｍ０．５Ｓ培地（ダイカンバの代わりに２， ４−Ｄ ０．５ｍｇ／ｌ、マンノース１０ｇ／ｌ、スクロース５ｇ／ｌを含み、硝酸銀を含まないＬＳＤｃ）に移した。培養物を、３週間の継代培養のステップを含む６週間この培地上で選択した。生き残っているカルスを、規模を大きくするためのＬＳＤ１Ｍ０．５Ｓ培地か、またはＲｅｇ１培地（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ 等の論文（２０００）の記述による）のいずれかに移した。明るいところで培養（明１６時間／暗８時間の編成）した後、次いで若い組織を成長調節剤を含まないＲｅｇ２培地（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ 等の論文（２０００）の記述による）に移し、１〜２週間インキュベートした。苗木を、Ｒｅｇ３培地（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ 等の論文（２０００）の記述による）を入れたＭａｇｅｎｔａ ＧＡ−７ボックス（Ｍａｇｅｎｔａ Ｃｏｒｐ， Ｃｈｉｃａｇｏ Ｉｌｌ）に移し、明るいところで生育した。プロモーター−リポーターカセットに対して陽性のＰＣＲを土壌に移し、温室内で生育した。
【０１５８】
実施例１９：ＧＵＳリポーター遺伝子検定
プロモーター活性を、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素の発現に関して組織化学的および蛍光検定法を用いて定性的かつ定量的に評価した。
【０１５９】
１． 組織化学的βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）検定
プロモーター活性の定性的評価についてはさまざまな組織および器官をＧＵＳ組織化学的検定に用いた。組織の全器官または切片のどちらかをＧＵＳ染色液に浸漬した。ＧＵＳ染色液は、１ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ、Ｄｕｃｈｅｆａ、ＤＭＳＯに溶かした２０ｍＭ原液）、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および０．１％トリトンＸ１００を含有する。組織試料を３７℃で１〜１６時間インキュベートした。必要な場合には試料は葉緑素を除去するために７０％ＥｔＯＨで数回洗浄してきれいにすることができる。染色に続いて組織を光学顕微鏡下で調べて、ＧＵＳ発現パターンを示す青い染みを評価した。
【０１６０】
２． βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）蛍光検定
さまざまな組織および器官のプロモーター活性の定性的分析に関しては、ＧＵＳ 発現を蛍光分析により測定した。組織試料を採集し、氷で冷やしたＧＵＳ 抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ１００、０．１％サルコシル）中で磨砕した。磨砕した試料を微量分離装置（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で１０，０００ｒｐｍで４℃において１５分間回転した。遠心分離後、上澄みをＧＵＳ検定およびタンパク質濃度の決定のために取り出した。
【０１６１】
ＧＵＳ活性を測定するために植物抽出物を、３７℃に予熱したＧＵＳ検定緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ１００、０．１％サルコシル、１ｍＭ ４−メチルアンベリフェリル−β− Ｄ−グルクロン酸二水和物（ＭＵＧ））中で検定した。反応物をインキュベートし、分割量１００μｌを１０分間隔で３０分間取り出し、管に２％Ｎａ２ＣＯ３ ９００μｌ を加えることによって反応を停止した。次いで停止した反応物をＴｅｃａｎ式分光蛍光計により励起波長３６５ｎｍ、発光波長４５５ｎｍで読み取った。タンパク質濃度は、ＢＣＡ検定法を用いて製造業者のプロトコルに従って決定した。ＧＵＳ活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの相対的蛍光単位（ＲＦＵ）として発現した。
【０１６２】
実施例２０：ＧＦＰリポーター遺伝子検定
顕微鏡画像の蛍光を用いて定性的に、また緑色蛍光タンパク質の発現に対する蛍光検定を用いて定量的にプロモーター活性を評価した。
１． ＧＦＰ発現の顕微鏡による評価
プロモーター：：ＧＦＰ融合物の発現を、ＧＦＰ２およびＧＦＰ３のフィルタ設定したＬｅｉｃａ ＦＬＩＩＩ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて顕微鏡画像により形質転換細胞中で監視した。
【０１６３】
２． 定量的ＧＦＰ蛍光検定
形質転換植物の組織中のＧＦＰの発現を検定するために、採取した組織を凍結し、凍結した組織を完全に磨砕した。磨砕後、抽出緩衝液（ＥＢ； １０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、および０．１％サルコシル）３００μｌを加えた。十分渦動して試料を混合し、１０分間遠心分離し、次いで上澄みを読取用の新しい管または微量滴定プレートのウェルに移した。次いで試料の管またはプレートを、１０フラッシュおよびゲイン１００で励起波長４６５ｎｍ、発光波長５１２ｎｍ に設定したＴｅｃａｎ式分光蛍光計プレート読取装置に挿入した。発現レベルが高すぎ、その結果試料の一部が限界（例えば細胞のＶＡＬＵＥ）をオーバーする場合には、パラメータを８フラッシュおよびゲイン８０に変更した。
タンパク質濃度は、ＢＣＡ検定法を用いて製造業者のプロトコルに従って決定した。ＧＦＰ活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの相対的蛍光単位（ＲＦＵ）として発現した。
【０１６４】
実施例２１：プロモーター活性の評価
プロモーター：：リポーター融合物の活性を評価するために、組織試料を処理していない対照用植物、および化学的活性化因子すなわちＢＴＨまたはジャスモン酸で処理した植物から採取した。形質転換したコメの場合は化学的誘導物質による処理は、Ｔ１種子を蒔いて１０日後に３枚目の葉が出たところで行った。形質転換したトウモロコシの場合は化学的誘導物質による処理は、Ｔ１種子を蒔いてから３週間後に行った。すべての化学薬品濃度は、ｐｐｍ（適用溶液１ ｌ当たりの活性成分ｍｇ数）として与えられた。プロベナゾールは、前述のとおり土壌浸漬によって純粋物質の２５０ｐｐｍ溶液として適用した（Ｔｈｉｅｒｏｎ等の論文、「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｒｉｃｅ： Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｒｉｃｅ ｔｏ Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ」（Ｍｅｄｅｄｅｌｉｎｇｅｎ Ｆａｃｕｌｔｅｉｔ Ｌａｎｄｂｏｕｗｋｕｎｄｉｇｅ ｅｎ Ｔｏｇｅｐａｓｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｅｎｔ． ６０， ４２１−４３０ （１９９５）））。ＢＴＨの配合物（活性成分と湿潤性粉末の１ ： １（ｗ／ｗ）混合物）は、噴霧によって葉の上に塗布した。すべての対照試験は、活性物質を含まないスプレー溶液の塗布によって行った。ジャスモン酸は、前述のとおりエタノールに溶かした１ｍＭ溶液として塗布した（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ等の論文、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４， ７９−８８ （１９９７））。傷および全身組織中の遺伝子発現の測定は、Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ等の論文（Ｐｌａｎｔ Ｊ． １４， ４７５−４８１ （１９９８））に従って行った。
本明細書に示し説明したものに加えて本発明のさまざまな変更形態が、上記の記述および下記の実施例から当業技術者には明らかになるはずである。そのような変更形態は添付の特許請求の範囲の範囲内に包含するつもりである。
さまざまな参考資料および特許が本明細書中に引用されており、それらはそっくりそのまま本明細書に援用する。
【表２】
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【表３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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