(57)【要約】調節可能な触媒活性の核酸（ＲＣＡＮＡ）を作製、単離、特徴づけ、および使用するための組成物および方法が提供される。ＲＣＡＮＡは、遺伝子発現を調節するために、そしてリガンドの存在を検出するため、または固体支持体（チップ、またはマルチウェルプレート）に結合したＲＣＡＮＡのエフェクターによる活性化を検出するためのアッセイにおいて、用いられ得る。また、本発明の選択手順を自動化するための組成物および方法も開示されている。
2004515219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドによって調節されるポリヌクレオチドであって、以下：
調節可能な触媒活性のポリヌクレオチドであって、該ペプチドは、該ポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチドの触媒活性をもたらす、ポリヌクレオチド、
を含む、ポリヌクレオチド
【請求項２】
前記ペプチドが、タンパク質の一部としてさらに規定される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ペプチドが約７と２０との間のアミノ酸を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ペプチドが約７と１２との間のアミノ酸を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記核酸の前記触媒活性が、核酸標的配列に特異的である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記核酸の前記触媒活性が、該核酸とエフェクターとの相互作用によって調節される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも部分的に一本鎖である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの改変された塩基を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、内因性である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、外因性である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、リン酸化されたペプチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
エフェクターによって調節される核酸であって、以下：
少なくとも１つの触媒残基の改変によって生成された、調節可能な触媒活性の核酸
を含む、核酸。
【請求項１６】
前記核酸の前記触媒活性が、核酸標的配列に特異的である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記核酸の前記触媒活性が、該核酸とエフェクターとの相互作用によって調節される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１８】
前記核酸が、ＲＮＡを含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１９】
前記核酸が、ＤＮＡを含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２０】
前記核酸が、少なくとも部分的に一本鎖である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２１】
前記核酸が、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２２】
前記核酸が、少なくとも１つの改変された塩基を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２３】
前記エフェクターが、内因性である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２４】
前記エフェクターが、外因性である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２５】
前記エフェクターが、タンパク質を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２６】
前記エフェクターが、薬学的因子を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２７】
前記エフェクターが、タンパク質複合体を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２８】
前記エフェクターが、ペプチドを含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２９】
前記エフェクターが、リン酸化されたペプチドを含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３０】
前記エフェクターが、脱リン酸化されたペプチドを含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３１】
前記核酸が、上方制御されるべき標的遺伝子の発現を生じる反応を触媒する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３２】
前記核酸が、下方制御されるべき標的遺伝子の発現を生じる反応を触媒する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３３】
前記核酸が、候補外因性エフェクター分子のライブラリーから少なくとも１つの外因性エフェクターを検出するために用いられる、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３４】
前記核酸および前記エフェクターが、核酸−エフェクター複合体を形成する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３５】
前記核酸および前記エフェクターが、核酸−エフェクター複合体を形成する分子であり、そして該核酸−エフェクター複合体が、該核酸−エフェクター複合体の触媒活性をもたらすように相乗的に作用する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３６】
前記核酸が、オリゴヌクレオチド基質との連結反応を触媒する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３７】
前記核酸が、非オリゴヌクレオチド基質を付加する反応を触媒する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３８】
前記核酸が、該核酸にビオチンを付加する反応を触媒する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項３９】
前記核酸が、オリゴヌクレオチド基質との切断反応を触媒する、請求項１５に記載の核酸。
【請求項４０】
請求項１５に記載の核酸であって、核酸触媒の反応速度論的パラメーターが、該核酸と相互作用する残基エフェクター分子上に作用する１つ以上のエフェクター−エフェクターの存在下で変更される、核酸。
【請求項４１】
核酸触媒の反応速度論的パラメーターが、テオフィリンの存在下で変更される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項４２】
核酸触媒の反応速度論的パラメーターが、超分子構造の存在下で変更される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項４３】
請求項１５に記載の核酸であって、核酸触媒の反応速度論的パラメーターが、ウイルス粒子を含む超分子構造の存在下で変更される、核酸。
【請求項４４】
請求項１５に記載の核酸であって、核酸触媒の反応速度論的パラメーターが、細胞壁を含む超分子構造の存在下で変更される、核酸。
【請求項４５】
核酸であって、以下：
遺伝子；
該遺伝子に挿入された、調節可能な触媒活性の核酸；
を含み、
ここでエフェクターの存在は、該核酸に反応を触媒させる、核酸。
【請求項４６】
前記触媒反応が、自己スプライシング反応である、請求項４５に記載の核酸。
【請求項４７】
前記触媒反応が、連結反応である、請求項４５に記載の核酸。
【請求項４８】
前記触媒反応が、トランス切断反応である、請求項４５に記載の核酸。
【請求項４９】
前記核酸の前記触媒活性が、前記遺伝子の発現の変化を導く、請求項４５に記載の核酸。
【請求項５０】
前記核酸の前記触媒活性が、１つ以上の遺伝子の発現における変化を導く、請求項４５に記載の核酸。
【請求項５１】
前記核酸の前記触媒活性が、前記遺伝子のｍＲＮＡの発現における変化を導く、請求項４５に記載の核酸。
【請求項５２】
前記核酸の前記触媒活性が、前記遺伝子にコードされるタンパク質の発現における変化を導く、請求項４５に記載の核酸。
【請求項５３】
核酸セグメントであって、以下：
核酸のプールから選択された、調節可能な触媒活性核酸であって、該核酸のプールにおいて、触媒残基の少なくとも１つがランダム化されている、核酸、
を含む、核酸セグメント。
【請求項５４】
調節可能な触媒活性の核酸セグメントであって、以下：
エフェクタードメイン；および
核酸触媒ドメインであって、該核酸触媒の１つ以上の重要な触媒残基がランダム化されている、核酸触媒ドメイン；
を含み、
ここで該触媒ドメインの反応速度論的パラメーターが、該エフェクタードメインと相互作用するエフェクターによって調節される、
核酸セグメント。
【請求項５５】
調節可能な触媒活性核酸を単離する方法であって、以下の工程：
触媒活性核酸の触媒ドメインにおける少なくとも１つのヌクレオチドをランダム化して核酸プールを作製する工程；および
該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を該核酸プールから取り出す工程；
を包含する、方法。
【請求項５６】
残りの核酸のプールに対してエフェクターを添加する工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の方法であって、残りの核酸に対してエフェクターを添加する工程をさらに包含し、ここで該エフェクターは、該核酸の触媒活性を変更するように該核酸に作用する、方法。
【請求項５８】
単離された核酸を精製する工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
単離された核酸を配列決定する工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸を取り出す工程が、高度ストリンジェンシーな条件下である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸を取り出す工程が、中度ストリンジェンシーな条件下である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸を取り出す工程が、低度ストリンジェンシーな条件下である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記標的がｍＲＮＡ分子である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
前記エフェクターがタンパク質である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
前記エフェクターがペプチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
前記エフェクターがリンタンパク質である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
前記エフェクターが糖タンパク質である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
前記エフェクターが光である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記エフェクターが可視光である、請求項５６に記載の方法。
【請求項７０】
前記エフェクターが磁石である、請求項５６に記載の方法。
【請求項７１】
前記標的が代謝反応である、請求項５５に記載の方法。
【請求項７２】
触媒特異性が変更された核酸が、エフェクターの存在下で選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項７３】
触媒特異性が変更された核酸が、エフェクターの非存在下で選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項７４】
触媒活性が変更された核酸が、エフェクターの存在下および非存在下で連続的に選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項７５】
前記エフェクタードメインが、完全にランダムな配列プールを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７６】
前記エフェクタードメインが、部分的にランダム化された配列プールを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７７】
調節可能な触媒活性の核酸を作製する方法であって、以下の工程：
核酸のプールを接触させる工程であって、該核酸は、触媒ドメインおよびエフェクタードメインを有し、ここで該核酸の触媒ドメインにおける少なくとも１つのヌクレオチドがランダム化されている、工程；
該核酸プールから、該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を取り出す工程；
残りの核酸にエフェクタータンパク質を添加する工程；および
該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項７８】
調節可能な触媒活性の核酸を単離する方法であって、以下の工程：
触媒活性の核酸の触媒ドメインにおける少なくとも１つのヌクレオチドをランダム化して核酸プールを作製する工程；
該核酸プールから、該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を取り出す工程；
該核酸にエフェクター分子を添加する工程；および
該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項７９】
触媒ドメインおよびエフェクタードメインを有する調節可能な触媒活性の核酸を単離する方法であって、以下の工程：
該核酸の触媒ドメインにおける少なくとも１つのヌクレオチドをランダム化して核酸プールを作製する工程；
該核酸プールから、該触媒ドメインの触媒標的と相互作用するランダム化された核酸を取り出す工程；
該核酸にエフェクターを添加する工程；および
該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項８０】
触媒ドメインおよびエフェクタードメインを有する調節可能な触媒活性の核酸を単離する方法であって、以下の工程：
（ａ）該核酸の触媒ドメインにおける少なくとも１つのヌクレオチドをランダム化して核酸プールを作製する工程；
（ｂ）該核酸プールから、該触媒ドメインの触媒標的と相互作用するランダム化された核酸を取り出す工程；
（ｃ）該核酸にエフェクターを添加する工程；
（ｄ）該エフェクターと特異的に相互作用するエフェクター−エフェクターを添加する工程；および
（ｅ）該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を単離する工程；および
（ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項８１】
調節可能な触媒活性の核酸を用いて標的を検出する方法であって、以下の工程：
調節可能な触媒活性の核酸を標的と接触させる工程；および
該調節可能な触媒活性の核酸と該標的との間の相互作用の効果を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項８２】
調節可能な触媒活性の核酸を用いて標的を改変する方法であって、以下の工程：
標的特異的改変を行い得る調節可能な触媒活性の核酸を提供する工程；および
該調節可能な触媒活性の核酸特異的活性を生じる条件下で該標的を改変する工程、
を包含する、方法。
【請求項８３】
バイオセンサーであって、以下：
固体支持体；および
少なくとも１つの調節可能な触媒活性の核酸であって、標的に対する該核酸の反応速度論的パラメーターは、エフェクター分子と該核酸との相互作用に応答して変化する、触媒活性の核酸；
を備え、
ここで該核酸構築物は、該支持体上に固定されている、バイオセンサー。
【請求項８４】
前記反応が機械読み取り可能である、請求項８３に記載のバイオセンサー。
【請求項８５】
前記固体支持体がマルチウェルプレートを含む、請求項８３に記載のバイオセンサー。
【請求項８６】
前記固体支持体が表面プラズモン共鳴センサーを含む、請求項８３に記載のバイオセンサー。
【請求項８７】
前記調節可能な触媒活性の核酸が、前記固体支持体上に共有結合で固定されている、請求項８３に記載のバイオセンサー。
【請求項８８】
前記触媒反応が、検出可能シグナルを生じる、請求項８３に記載のバイオセンサー。
【請求項８９】
前記触媒反応が、シグナルを生じる前記固定されている核酸へのタグの結合である、請求項８３に記載のバイオセンサー。
【請求項９０】
前記基板が既知の核酸配列を含むとしてさらに規定されており、そして前記核酸が、配列タグに対する非共有結合的ハイブリダイゼーションに基づいて該基板の表面上で選別される、請求項８３に記載のバイオセンサー。
【請求項９１】
バイオセンサーであって、以下：
固体支持体；および
少なくとも１つの調節可能な触媒活性の核酸であって、標的に対する該核酸の反応速度論的パラメーターは、エフェクター分子と該核酸との相互作用に応答して変化する、核酸；
を備え、
ここで触媒ドメインの触媒標的は、該支持体上に固定されている、バイオセンサー。
【請求項９２】
バイオセンサーであって、以下：
固体支持体；および
少なくとも１つの調節可能な触媒活性の核酸であって、標的に対する該核酸の反応速度論的パラメーターは、エフェクター分子と該核酸との相互作用に応答して変化する、核酸；
を備え、
ここで該エフェクターは、該支持体上に固定されている、バイオセンサー。
【請求項９３】
エフェクターを検出するための方法であって、以下の工程：
少なくとも１つの調節可能な触媒活性の核酸を、該核酸の触媒標的および１つ以上のエフェクターと混合する工程であって、ここで標的に対する該核酸の反応速度論的パラメーターは、エフェクター分子と該核酸との相互作用に応答して変化する、工程；
該触媒標的と反応した該ＲＣＡＮＡを単離する工程；ならびに
該触媒標的と反応した該ＲＣＡＮＡを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項９４】
反応したＲＣＡＮＡを固体支持体上での固定によって単離する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
反応したＲＣＡＮＡがタグ配列を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
反応したＲＣＡＮＡが検出可能シグナルを生じる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
調節可能な触媒活性の核酸を選択する方法であって、以下の工程：
核酸のプールを接触させる工程であって、該核酸は、触媒ドメインおよびエフェクタードメインを有し、ここで該核酸の該触媒ドメインにおける少なくとも１つのヌクレオチドがランダム化されている、工程；
該核酸プールから、該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を取り出す工程；
残りの核酸にエフェクターを添加する工程；および
該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を単離する工程；
該核酸を宿主細胞に導入する工程；および
該宿主細胞の該エフェクターへの曝露の際に該核酸の触媒活性を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９８】
前記単離された核酸を精製する工程をさらに包含する、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記単離された核酸を配列決定する工程をさらに包含する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記核酸を取り出す工程が、高度ストリンジェンシーな条件下である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記核酸を取り出す工程が、中度ストリンジェンシーな条件下である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記核酸を取り出す工程が、低度ストリンジェンシーな条件下である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
前記標的がｍＲＮＡ分子である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記エフェクターがタンパク質である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０５】
前記エフェクターがペプチドである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０６】
前記エフェクターがリンタンパク質である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０７】
前記エフェクターが糖タンパク質である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０８】
前記エフェクターが光である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記エフェクターが可視光である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記エフェクターが磁石である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１１】
触媒活性が変更された核酸が、前記エフェクターの存在下および非存在下で連続的に選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１２】
前記エフェクタードメインが、完全にランダムな配列プールを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１３】
前記エフェクタードメインが、部分的にランダム化された配列プールを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１４】
調節可能な触媒活性の核酸を選択する方法であって、以下の工程：
核酸のプールを接触させる工程であって、該核酸は、触媒ドメインおよびエフェクタードメインを有し、ここで該核酸の該触媒ドメインにおける少なくとも１つのヌクレオチドがランダム化されている、工程；
該核酸プールから、該触媒ドメインの該触媒標的と相互作用する核酸を取り出す工程；
残りの核酸にエフェクターを添加する工程；
該触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸を単離する工程；
宿主細胞に該核酸を導入する工程；ならびに
該エフェクターに対する該宿主細胞の曝露の際に該核酸の触媒活性を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１５】
前記単離された核酸を精製する工程をさらに包含する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記単離された核酸を配列決定する工程をさらに包含する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記核酸を取り出す前記工程が、高度ストリンジェンシーな条件下である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記核酸を取り出す前記工程が、中度ストリンジェンシーな条件下である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記核酸を取り出す工程が、低度ストリンジェンシーな条件下である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２０】
前記標的がｍＲＮＡ分子である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
前記エフェクターがタンパク質である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
前記エフェクターがペプチドである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２３】
前記エフェクターがリンタンパク質である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２４】
前記エフェクターが糖タンパク質である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２５】
前記エフェクターが光である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記エフェクターが可視光である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記エフェクターが磁石である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２８】
触媒活性が変更された核酸が、前記エフェクターの存在下および非存在下で連続的に選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２９】
前記エフェクタードメインが、完全にランダムな配列プールを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３０】
前記エフェクタードメインが、部分的にランダム化された配列プールを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３１】
調節可能な触媒活性の核酸を検出する方法であって、以下の工程：
調節可能な触媒活性の核酸を単離する工程：
該核酸がレポーター遺伝子の発現を調節する位置にある構築物を作製する工程；
宿主細胞に該構築物を導入する工程；ならびに
エフェクターに対する該宿主細胞の曝露の際に、該核酸の触媒活性を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３２】
ベクターであって、以下：
調節可能な触媒活性ポリヌクレオチドであって、ペプチド分子が、該ポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチドの触媒活性をもたらす、ポリヌクレオチド、
を含む、ベクター。
【請求項１３３】
ベクターであって、以下：
少なくとも１つの触媒残基の改変によって生成された、調節可能な触媒活性の核酸、
を含む、ベクター。
【請求項１３４】
アプタザイムを自動的に選択するためのデバイスであって、該デバイスは、以下：
使い捨てピペットチップを用いるピペッティングに適した少なくとも１つのプログラム可能なロボットアームを有するプログラム可能なロボット；と
該ロボットに対して接近可能な作業面であって、該作業面は、以下：
試薬用の少なくとも１つのリザーバモジュール、少なくとも１つのピペットチップモジュール、少なくとも１つの磁気ビーズ分離器モジュール、少なくとも１つの触媒冷却器モジュール、および少なくとも１つのサーマルサイクラーモジュール、
を備えるモジュールを有する、作業面；と
を備え、
ここで該プログラム可能なロボットは、プログラムを実行し、これによって調節可能な触媒活性の核酸が、エフェクターに対する曝露によって選択される、デバイス。
【請求項１３５】
請求項１３４に記載のデバイスであって、前記ロボットアームおよび前記作業面の前記モジュールは、お互いに連動して動き、そして該動きは、清浄なピペットチップを該ロボットアームに補充する以外は一方向性である、デバイス。
【請求項１３６】
請求項１３４に記載のデバイスであって、前記作業面は、実質的に静止しており、そして前記ロボットアームは、各モジュールに対してプログラムで動き、プログラムされた仕事を実施する、デバイス。
【請求項１３７】
請求項１３４に記載のデバイスであって、前記ロボットアームは、実質的に静止しており、そして前記作業面は、プログラムされた仕事を実施するための、該ロボットアームによる接近のために各モジュールを整列させるようにプログラムで動く、デバイス。
【請求項１３８】
前記ロボットアームが鉛直方向に動く、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１３９】
請求項１３６に記載のデバイスであって、前記ロボットアームが、該ロボットアームの下に整列されたモジュールの水平寸法内で、水平方向に動く、デバイス。
【請求項１４０】
請求項１３４に記載のデバイスであって、該デバイスは、以下：
ピペットチップを装備したロボットアームを用いて、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合体化されたビオチン化標的およびアロステリックエフェクター分子の存在下でアプタザイムＲＮＡプールをインキュベートして、該インキュベーション混合物の該成分を合わせる；
インキュベーションの終了時に磁気ビーズ分離器に該磁気ビーズを供する；
該インキュベーション混合物から該ビーズを分離する；そして
該ビーズを洗浄して該ビーズに結合した標的に結合したＲＮＡを残す；
のことを行うようにプログラムされている、デバイス。
【請求項１４１】
請求項１３４に記載のデバイスであって、ここで前記ビーズ上のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、逆転写されてＤＮＡオリゴヌクレオチドを生じ；
該ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、酵素冷却器およびサーマルサイクラーで増幅され；そして
該ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、インビトロで転写されてＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じる、デバイス。
【請求項１４２】
前記デバイスが、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの選択に適している、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１４３】
前記デバイスが、改変ＲＮＡオリゴヌクレオチドの選択に適している、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１４４】
前記デバイスが、リボザイムの選択に適している、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１４５】
前記デバイスが、ファージディスプレイタンパク質の選択に適している、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１４６】
前記デバイスが、細胞表面に提示されたタンパク質の選択に適している、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１４７】
前記デバイスが、生物学的戦闘因子を検出するために用いられる、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１４８】
前記アプタザイムが、ＲＮＡを含む、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１４９】
前記アプタザイムが、ＤＮＡを含む、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５０】
前記アプタザイムが、少なくとも部分的に一本鎖である、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５１】
前記アプタザイムが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５２】
前記エフェクター分子が、内因性である、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５３】
前記エフェクター分子が、外因性である、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５４】
前記エフェクター分子が、タンパク質を含む、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５５】
前記エフェクター分子が、薬学的因子を含む、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５６】
前記エフェクター分子が、タンパク質複合体を含む、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５７】
標的遺伝子の発現が上方制御される、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５８】
標的遺伝子の発現が下方制御される、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１５９】
前記アプタザイムが、候補外因性エフェクター分子のラから少なくとも１つの外因性エフェクター分子を検出するために、用いられる、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１６０】
請求項１３４に記載のデバイスであって、ここで前記アプタザイムおよび前記エフェクター分子が、アプタザイム−エフェクター複合体を形成し、ここで該アプタザイム−エフェクター複合体が、該アプタザイム−エフェクター複合体の触媒活性をもたらすように相乗的に作用する、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１６１】
請求項１３４に記載のデバイスであって、ここで前記アプタザイムおよび前記エフェクター分子が、キメラ活性部分を形成し、ここで該キメラ活性部分が、該アプタザイムの活性をもたらすように相乗的に作用する、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１６２】
前記アプタザイムが、細胞の代謝状態を決定するために用いられる、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１６３】
前記アプタザイムが、細胞の代謝を混乱させる少なくとも１つの物質を検出するために用いられる、請求項１３４に記載のデバイス。
【請求項１６４】
アプタマーオリゴヌクレオチドを選択するための自動化方法であって、該方法は、以下：
使い捨てピペットチップを用いるピペッティングに適したプログラム可能なロボットアームを有するプログラム可能なロボットを提供する工程；
該ロボットに対して接近可能な作業面を提供する工程であって、該作業面は、試薬およびピペットチップ用のリザーバ、磁気ビーズ分離器、酵素冷却器、ならびにサーマルサイクラーを備えるモジュール有する、工程；
ランダムプールＲＮＡ、緩衝液、酵素、ストレプトアビジン磁気ビーズ、およびビオチン化標的を含む試薬を調製する工程；
使い捨てピペットチップを提供する工程；
各試薬のための指定されたリザーバーに各試薬を予め充填する工程；
該作業面の指定されたリザーバーにピペットチップを予め充填する工程；
以下の工程を包含する所望の選択を実施するように該ロボットをプログラムする工程：
ピペットチップを装備したロボットアームを用いて、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合体化されたビオチン化標的およびアロステリックエフェクター分子の存在下でＲＮＡプールをインキュベートして、該インキュベーション混合物の該成分を合わせる工程；
インキュベーションの終了時に磁気ビーズ分離器に該磁気ビーズを供する工程；
該インキュベーション混合物から該ビーズを分離する工程；
該ビーズを洗浄して、該ビーズに結合された標的に結合したＲＮＡを残す工程；
該結合したＲＮＡを逆転写してＤＮＡオリゴヌクレオチドを生じる工程；
酵素冷却器およびサーマルサイクラーを用いて該ＤＮＡオリゴヌクレオチドを増幅する工程；
該ＤＮＡオリゴヌクレオチドをインビトロで転写してＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成する工程；
該プログラムを実行する工程；および
該ＲＮＡオリゴヌクレオチドを繰り返しのラウンドの選択において用いる工程、
を包含する、方法。
【請求項１６５】
前記方法が、ＤＮＡ選択に適している、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記方法が、改変ＲＮＡ選択に適している、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
前記方法が、リボザイム選択に適している、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６８】
前記方法が、キメラの選択に適している、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６９】
前記方法が、疾患の診断に適している、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７０】
前記方法が、生物学的戦闘因子の検出に適している、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７１】
アプタザイム反応が生じる場合にシグナルを生じる基板であって、該基板は、以下：
固体支持体；および
調節ドメインを有する調節可能なアプタマーオリゴヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのアプタザイム構築物であって、ここで標的遺伝子に対する該アプタザイムの反応速度論的パラメーターは、アロステリックエフェクター分子と該調節ドメインとの相互作用に応答して変化する、アプタザイム構築物、
を含み、
ここで該アプタザイム構築物は、該支持体上に共有結合で固定されている、基板。
【請求項１７２】
前記基板が機械読み取り可能である、請求項１７１に記載の基板。
【請求項１７３】
前記基板がマルチウェルプレートを含む、請求項１７１に記載の基板。
【請求項１７４】
前記ウェル中にさらにビーズを含む、請求項１７１に記載の基板。
【請求項１７５】
前記アプタザイムが前記ビーズ上に共有結合で固定されている、請求項１７１に記載の基板。
【請求項１７６】
前記アプタザイムがフィルター洗浄される、請求項１７１に記載の基板。
【請求項１７７】
請求項１７１に記載の基板であって、ここで検出されるべき検出可能タグの存在下でアプタザイム反応の発生の際に、該検出可能タグが、該固定されたアプタザイムに結合されて前記シグナルを生じる、基板。
【請求項１７８】
前記検出可能タグが、蛍光タグを含む、請求項１７１に記載の基板。
【請求項１７９】
前記基板が、酵素タグを含む、請求項１７１に記載の基板。
【請求項１８０】
前記基板が、磁気粒子タグを含む、請求項１７１に記載の基板。
【請求項１８１】
アプタザイム反応を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
固体支持体、および該支持体に共有結合で固定されたアプタザイム構築物またはアプタザイム構築物の異種の混合物を含む基板を提供する工程；
少なくとも１つの分析物を提供する工程；
検出可能であるようにタグ化された基質を提供する工程；
該基質および少なくとも１つの分析物を該固定されたアプタザイムに曝す工程であって、これにより該基質は、該分析物による該アプタザイムの活性化の際に、該固定されたアプタザイムに結合されて、シグナルを生じる、工程；
該基板から未結合の基質を洗浄する工程；および
該結合された基質からの該シグナルを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８２】
前記方法が自動化されている、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記シグナルが検出のために増幅される、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８４】
前記アプタザイム構築物が、該アプタザイムの分解を阻害する改変ヌクレオチドを含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８５】
前記アプタザイム構築物が、前記プタザイムの分解を阻害する改変ヌクレオチドを含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８６】
前記アプタザイム構築物が、該アプタザイムの分解を阻害する改変ヌクレオチドを含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８７】
前記アプタザイム構築物が、該アプタザイムの分解を阻害する改変ヌクレオチドを含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８８】
核酸の発現を調節する方法であって、該方法は、以下：
ペプチドによって調節されるポリヌクレオチドを提供する工程であって、該ポリヌクレオチドは、調節可能な触媒活性のポリヌクレオチドを含み、ここで該ペプチドは、該ポリヌクレオチドと相互作用して、該ポリヌクレオチドの触媒活性をもたらす、工程；および
該ポリヌクレオチドと該ペプチドとを接触して、これによって核酸の発現を調節する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８９】
前記ポリヌクレオチドが細胞中で提供される、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記細胞がインビトロで提供される、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】
前記細胞がインビボで提供される、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】
前記細胞が原核生物細胞である、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９３】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９４】
核酸の発現を調節する方法であって、該方法は、以下の工程：
エフェクターによって調節される核酸を提供する工程であって、該核酸は、調節可能な触媒活性の核酸を含み、ここで該調節可能な触媒活性の核酸分子は、少なくとも１つの改変された触媒残基を含む工程；および
該核酸を該エフェクターと接触させ、これにより核酸の発現を調節する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、触媒核酸の分野、および特に、エフェクターの存在に応答してこれらの動的パラメータを調節する調節可能な触媒的に活性な核酸に関する。
【０００２】
（発明の背景）
リボザイムは、酵素のように作用し得そして時々ＲＮＡ酵素と呼ばれるＲＮＡのオリゴヌクレオチドである。一般に、これらは、ＲＮＡ分子の切断を触媒するエンドリボヌクレアーゼのように挙動する能力を有する。切断部位の位置は、高度に配列特異的であり、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼの配列特異性に近い。条件を変化させることによって、リボザイムはまた、ポリメラーゼまたは脱リン酸化酵素のように作用し得る。
【０００３】
リボザイムは、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉａに関連して最初に記載された。Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｒＲＮＡは、ラージリボソームＲＮＡ前駆体からそれ自体を切除し得る介在配列（ＩＶＳ）を含むことが示された。ＩＶＳは、前駆体からの自己スプライシングを媒介する触媒ＲＮＡ分子であり、その後、それ自体を環状形態に変換する。Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ＩＶＳは、現在、Ｉ群イントロンとしてより一般に知られている。
【０００４】
調節可能なリボザイムが記載され、ここで、リボザイムの活性は、リガンド結合部分によって調節される。リガンドを結合する際に、標的ＲＮＡに対するリボザイム活性は、変化される。調節可能なリボザイムは、有機分子または無機分子のような低分子リガンドについてのみ記載されてきた。調節可能なリボザイムは、タンパク質、ペプチド、または他の高分子によって制御される。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、調節可能な触媒的に活性な核酸（ＲＣＡＮＡ）を含み、ここで、ＲＣＡＮＡの触媒活性は、エフェクターによって調節される。従って、本発明のＲＣＡＮＡは、これらの活性がＲＣＡＮＡの第２の部分の制御下にあるという点で、調節可能である。アロステリックなタンパク質酵素が、エフェクターとの相互作用に応答して、これらの動的パラメータにおける変化またはこれらの酵素活性の変化を起こすように、ＲＣＡＮＡの触媒能力は、エフェクターによって同様に調節され得る。従って、本発明は、分子認識を触媒作用に伝達するＲＣＡＮＡに関する。
【０００６】
以下に明らかとなるように、ＲＣＡＮＡは、以下のいくつかの点でアロステリックなタンパク質酵素よりも、頑強である：（１）これらはインビトロで選択され得る（このことは、特定の構築物の操作を容易にする）；（２）触媒調節のレベルは、タンパク質酵素よりもＲＣＡＮＡについて、はるかに大きい；（３）ＲＣＡＮＡは核酸であるので、これらは、タンパク質分子がし得ないような様式で、遺伝機構と潜在的に相互作用し得る。
【０００７】
本明細書中に記載される方法は、任意の型の核酸を含み得ることに注意されるべきである。例えば、これらの方法は、ＲＮＡベースのＲＣＡＮＡに限定されず、ＤＮＡ  ＲＣＡＮＡおよびＲＮＡ  ＲＣＡＮＡまたはＤＮＡ  ＲＣＡＮＡもまた含む。さらに、これらの方法は、リボザイムが実行し得る任意の触媒活性に適用され得る。例えば、これらの方法は、リガーゼまたはスプライシング反応に限定されず、他のリボザイムクラスもまた含み得る。これらの方法はまた、タンパク質リガンドまたはペプチドリガンドに限定されず、他の分子種（例えば、イオン、低分子、有機分子、代謝産物、糖および炭水化物、脂質ならびに核酸）もまた含む。これらの方法はまた、分子ではないエフェクター（例えば、熱または光または電磁場）に及び得る。さらに、これらの方法は、リガンド誘導性の構造変化に限定されず、化学的反応性に必須な残基が核酸およびリガンドの両方によって一斉に提供される「キメラ」触媒もまた考慮し得る。
【０００８】
エフェクターは、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド複合体、または改変されたポリペプチドもしくはペプチドであり得る。このエフェクターは、例えば、酵素またはまさに光（例えば、可視光）またはまさに磁石であり得る。このエフェクターは、第１のエフェクターに作用する第２のエフェクター（本明細書中でエフェクター−エフェクターとしてもまたいわれる）によって活性化され得、これは、無機分子または有機分子であり得る。ポリペプチド、ペプチドまたはポリペプチド複合体は、内因性（すなわち、ポリヌクレオチドと同じ細胞型に由来する）または外因性（すなわち、ポリヌクレオチドが由来する細胞とは異なる細胞型に由来する）のいずれかであり得る。
【０００９】
ポリペプチドまたはペプチドは、リン酸化または脱リン酸化され得る。あるいは、エフェクターは、薬学的因子を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、標的遺伝子の発現が上方制御される原因となる反応を触媒する。他の実施形態において、核酸は、標的遺伝子の発現が下方制御される原因となる反応を触媒する。所望な場合、核酸は、候補外因性エフェクター分子のライブラリー由来の少なくとも１つの外因性エフェクターを検出するために使用され得る。１つの実施形態において、核酸分子およびエフェクターは、核酸−エフェクター複合体を形成する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、核酸触媒の動的パラメータは、超分子構造（例えば、ウイルス粒子または細胞壁）の存在下で変更される。核酸分子はさらに、目的の標的分子を認識し得る調節エレメントを含み得る。核酸分子はさらに、調節エレメントから核酸の触媒的に活性な領域に情報を伝達するトランスデューサエレメントを含み得る。
【００１１】
本発明はまた、少なくとも１つの調節可能な触媒的に活性な核酸が配置される固体支持体を含むバイオセンサーを含む。標的に関する核酸の動的パラメータは、エフェクター分子と核酸との相互作用に応答して、変化する。調節可能な触媒的に活性な核酸は、支持体上に固定され得、そして反応は機械読み取り可能であり得る。固体支持体としては、例えば、マルチウェルプレート、表面プラスモン共鳴センサーが挙げられ得る。調節可能な触媒的に活性な核酸は、固体支持体上に、共有結合的にかまたは非共有結合的に固定され得る。いくつかの実施形態において、触媒反応は、検出可能なシグナルを生成する。基質は、少なくとも１０の調節可能な触媒的に活性な核酸、少なくとも１００の調節可能な触媒的に活性な核酸、少なくとも１０００の調節可能な触媒的に活性な核酸、少なくとも１０，０００の調節可能な触媒的に活性な核酸、またはまさに少なくとも１００，０００の調節可能な触媒的に活性な核酸を含み得る。
【００１２】
タンパク質およびペプチドＲＣＡＮＡ。本発明は、タンパク質またはペプチドによって調節される触媒活性を有するＲＣＡＮＡを含む。本発明の１つの実施形態は、タンパク質によって調節されるＲＣＡＮＡのインビトロ選択を含む。タンパク質補助因子に依存するＲＣＡＮＡの選択スキームが、開発されている。
【００１３】
本発明は、タンパク質依存性のＲＣＡＮＡ（これは、種々の適用において有用であり得る試薬である）の選択を可能にする。例えば、タンパク質依存ＲＣＡＮＡは、本明細書中に記載されるように、使用され得る：（１）全体のプロテオームに関するデータの獲得のためのチップにおいて、（２）疾患状態に特異的なタンパク質（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）またはウイルスタンパク質）を検出するためのインビトロ診断試薬として、（３）生物学的闘争（ｗａｒｆａｒｅ）因子の検出のための歩哨として、（４）薬物開発研究についての細胞ベースアッセイまたは動物モデルにおけるエレメントとして、あるいは（５）遺伝子治療における調節エレメントとして。最初に、多数のタンパク質標的は、選択に対して屈折していると証明し得る。しかし、新規な標的または標的クラスを処理するために、この基礎的な方法の派生物が開発され得る。
【００１４】
ＲＣＡＮＡの触媒残基の改変。本発明の１つの実施形態において、ＲＣＡＮＡは、少なくとも１つの触媒残基の改変によって作製され得る。以前に公開された他のプロトコルと比較した本発明の選択プロトコルの固有の特徴の１つは、本発明は、触媒コアに吊り下がるドメインだけでなく、触媒コアそれ自体の一部分もまた、無作為化することである。従って、リガンド依存性についての選択は、ＲＣＡＮＡの付属領域に結合する種を生じるだけでなく、ＲＣＡＮＡの触媒コアを安定化するのを補助し得る。
【００１５】
核酸プールを作製するために、触媒的に活性な核酸の触媒ドメインにおける少なくとも１つのヌクレオチドを無作為化することによって作製される調節可能な触媒的に活性な核酸を単離する方法もまた、本発明によって提供される。核酸が触媒ドメインの触媒標的と相互作用する核酸プールが、取り除かれる。この方法はさらに、エフェクターを核酸の残りのプールに添加する工程もまた包含し得る。いくつかの実施形態において、この方法はまた、エフェクターを残りの核酸に添加する工程を包含し得、ここで、このエフェクターは、核酸の触媒活性を変更するために、核酸に作用する。この方法は、必要に応じて、単離された核酸を精製する工程、そして所望の場合、単離された核酸を配列決定する工程を包含し得る。種々の実施形態において、核酸を取り除く工程は、高ストリンジェンシー条件下、中程度のストリンジェンシー条件下、または低ストリンジェンシー条件下である。
【００１６】
ＲＣＡＮＡの自動化された選択。本発明はさらに、インビトロ選択の自動化、ならびに一般的なインビトロ選択手順および改変されたインビトロ選択手順の両方を実行する機械化システムを含む。自動化はこの手順の実行を容易にし、かつて数週〜数か月必要としたものを、数時間〜数日で達成する。さらに、機械化されたシステムは、「一般的な」インビトロ選択手順（例えば、相互混入を避けるための専門のロボット操作）において解決されない他の技術的障害を処理する。この自動化方法は、ＤＮＡまたは改変されたＲＮＡを用いる選択、リボザイムの選択、およびファージディスプレイタンパク質または細胞表面ディスプレイタンパク質の選択を含む、多数の異なる型の選択に一般化される。
【００１７】
自動化選択は、実際のピペッティングおよび生物学的操作における人因誤差を非常に減少させる。ロボットをプログラミングすることは平凡な仕事ではなく、そして時間がかかるり得るが、自動化された選択は、手動の選択よりも、はるかに速くかつより効率的である。時間は、実際の選択を行なうことではなく、サンプルを調製することおよびデータを分析することに使用される。さらに、自動化された選択は、リアルタイムモニタリングに基づいた優れた決定を行ない得る選択手順およびソフトウェア中に、リアルタイムモニタリング方法（例えば、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標））を含み得る。
【００１８】
インビトロ感応（ｓｅｎｓｉｎｇ）（または検出）適用。本発明はまた、インビトロで広範な種々の分子種の検出のためのＲＣＡＮＡの使用を提供する。例えば、ＲＣＡＮＡは、チップ（例えば、多重ウェルプレート中のウェル）に固着され得る。分析物および蛍光的にタグ化された基質の混合物は、各ウェルに添加される。同族エフェクターが存在する場合、ＲＣＡＮＡは、それ自体に蛍光タグを、共有結合的に結合する。ＲＣＡＮＡがエフェクターによって活性化されていない場合、タグ化された基質は、ウェルから洗い流される。反応および洗浄後、同時固定された（ｃｏ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）蛍光タグの存在および量は、反応の間に存在したリガンドの量を示す。レポーターは、蛍光タグであり得るが、これはまた、酵素、磁気粒子、または任意の多数の検出可能な粒子であり得る。さらに、ＲＣＡＮＡは、ビーズに固定され得るが、これらはまた、共有結合を介して固体支持体に直接結合され得る。
【００１９】
この実施形態の１つの利点は、レポーターの共有結合的な固定化（ＥＬＩＳＡアッセイにおけるような非共有結合的固定化と反対の）が、ストリンジェントな洗浄工程が使用されるのを可能にすることである。さらに、リボザイムリガーゼは、増幅され得るテンプレートにエフェクターを伝達し得る固有の特性を有し、検出の前にシグナルのさらなる向上を生じる。
【００２０】
改変されたヌクレオチドは、血清および尿のような環境における分解から、これらを実質的に安定化するＲＣＡＮＡに導入され得る。本発明の分析方法は、結合自体に依存しないが、過渡的な相互作用のみに依存する。本発明は、実際の結合ではなく、単なる認識を必要とし、抗体を超えるＲＣＡＮＡの潜在的な利点を提供する。すなわち、特に個々の固定ＲＣＡＮＡが調査される場合（すなわち、量子ドットのリガンド依存性の固定によって）、低親和性でさえ、活性化および引き続く検出に十分である。
【００２１】
細胞におけるＲＣＡＮＡの発現。本発明のＲＣＡＮＡはまた、細胞内で発現され得る。細胞内で発現される本発明のＲＣＡＮＡは、所定のエフェクターに応答性であるだけでなく、遺伝子調節または遺伝子応答性にも関与し得る。特に、自己スプライシングイントロンは、外因性または内因性のエフェクター分子に応答して、遺伝子からそれ自体をスプライスし得る。
【００２２】
本発明は、目的の遺伝子に挿入され得るＲＣＡＮＡ構築物（例えば、遺伝子標的化発現ベクター）を含む。ＲＣＡＮＡ配列は、遺伝子特異的認識ならびにＲＣＡＮＡの動的パラメータの調節を提供する。ＲＣＡＮＡの動的パラメータは、エフェクターに応答して変化する。詳細には、エフェクターの存在下で自己スプライシングを行なうＲＣＡＮＡの場合、ＲＣＡＮＡは、遺伝子の発現を調節するために、エフェクターに応答して、遺伝子からそれ自体をスプライスし得る。
【００２３】
別の局面において、本発明は、ペプチドによって調節されるポリヌクレオチドを提供することによって、核酸の発現を改変する方法を包含する。このポリヌクレオチドは、調節可能な触媒的に活性なポリヌクレオチドであり得、ここで、このペプチドは、その触媒活性に影響するポリヌクレオチドと相互作用する。このポリヌクレオチドは、ポリペプチドと接触され、それにより、核酸の発現を調節する。このポリヌクレオチドは細胞中に提供され得、そしてこの細胞は、例えば、インビトロまたはインビボで提供され得、そして原核生物細胞であってもよいし、まさに真核生物細胞であってもよい。
【００２４】
本発明はまた、調節ドメインを有する調節可能なオリゴヌクレオチド配列を有するＲＣＡＮＡ構築物を含み、その結果、標的遺伝子上のＲＣＡＮＡの動的パラメータは、調節ドメインを有するエフェクターの相互作用に応答して変化する。
【００２５】
インビボ感応（または検出）適用。内因性活性化因子に応答して、操作されたイントロンを含むレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を活性化または抑制することが可能である。この様式において、ルシフェラーゼ操作イントロン構築物は、タンパク質またはサイクリックＡＭＰのような低分子の細胞内レベルをモニターするために使用され得る。この方法は、細胞系（例えば、細胞培養物）および生物全体（例えば、動物モデル）の両方におけるインビボ測定のために使用され得る。このような適用は、ハイスループットスクリーニングに使用され得る。特定の細胞内シグナル（例えば、腫瘍リプレッサーの生成）が所望の場合、シグナル（腫瘍リプレッサー）を誘導するファルマコフォアについての化合物ライブラリーは、レポーター遺伝子の活性化についてスクリーニングされる。従って、所望の情報は、真っ赤に燃える（ｇｌｏｗｉｎｇ）細胞の検出のために、変化または変形される。
【００２６】
遺伝子治療適用。同様に、遺伝子は、遺伝子治療のために外因的に導入されたエフェクター（薬物）に応答して、活性化または抑制され得る。ＲＣＡＮＡは、遺伝子発現の上方制御（遺伝子産物の生成を増加させる）または下方制御（遺伝子産物の生成を減少させる）のために使用され得る。本発明の１つの実施形態の構築物は、触媒ドメインおよびエフェクター結合ドメインをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の核酸ベース技術の利点としては、例えば、さらなる遺伝子治療介入なしで、高度な感受性で、遺伝子発現を連続的に調節する能力、が挙げられる。
【００２７】
別の局面において、本発明は、エフェクター（例えば、ペプチド）によって調節されるポリヌクレオチドを提供することによって細胞中の核酸の発現を調節する方法を包含する。このポリヌクレオチドは、調節可能な触媒的に活性なポリヌクレオチドであり得、ここで、このペプチドは、その触媒活性に影響するために、このポリヌクレオチドと相互作用する。このポリヌクレオチドは、ペプチドと接触され、それにより、核酸の発現を調節する。このポリヌクレオチドは、細胞中に提供され得、そしてこの細胞は、例えば、インビトロまたはインビボで提供され得、そして原核生物細胞であってもよいし、まさに真核生物細胞であってもよい。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明の種々の実施形態の作製および使用は、以下で詳細に考察されるが、本発明は、広範な種々の特定の状況において実施され得る、多くの適用可能な発明的概念を提供する。本明細書中で考察される特定の実施形態は、本発明を作製および使用するための特定の方法の例示のみであり、本発明の範囲を限定しない。
【００２９】
本発明は、調節可能な触媒的に活性な核酸の作製、単離、同定、特徴付けおよび最適化を可能にする、組成物または物質、方法および自動化を含む。さらに、本発明は、インビトロの検出（ｓｅｎｓｉｎｇ）（または検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ））、インビボの検出、および遺伝子治療のためにＲＣＡＮＡを使用する方法を含む。本発明の方法によって選択される調節可能な触媒的に活性な核酸はまた、検出または遺伝子調節に使用され得る他の生体高分子を超えた利点を有する。調節可能な触媒的に活性な核酸は、いくつかの方法で、アロステリックなタンパク質酵素よりも強力である：（１）これらは、インビトロで選択され得る（特定の構築物の操作を容易にする）；（２）触媒的調節のレベルは、タンパク質酵素で代表的に観察されるレベルよりもかなり高い；そして（３）調節可能な触媒的に活性な核酸は、核酸であるので、これらは、潜在的に、タンパク質分子がしないかもしれない方法で遺伝機構と相互作用し得る。
【００３０】
この方法は、ＲＮＡプールに限定されないが、ＤＮＡプールまたは改変されたＲＮＡプールもまた含み得る。改変されたヌクレオチドは、血清または尿のような環境における分解からこれらを実質的に安定化する、調節可能な触媒的に活性な核酸中に導入され得る。この方法は、リガーゼに限定されないが、他のリボザイムクラスもまた包含し得る。この方法は、タンパク質誘導性の立体構造変化に限定されず、化学的活性のために重要な残基が、核酸およびタンパク質の両方一緒によって提供される「キメラ」触媒もまた考慮し得る。最初に、多くのタンパク質標的は、選択に対して屈折性であると分かり得る。しかし、基本的な方法の多くの派生物は、新規の標的または標的クラスを扱うために開発され得る。
【００３１】
（Ａ．タンパク質依存性ＲＣＡＮＡ）
エフェクター依存性リボザイムは、小さい有機化合物（例えば、ＡＴＰおよびテオフィリン）に応答性であることが示されている。本発明者らは、エフェクター依存性のリボザイムの必要性、または本明細書中で使用される場合の「調節可能な触媒的に活性な核酸」が、より大きな分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）に応答性であることを認識する。ペプチド、タンパク質または他のより大きい分子は、内因性の供給源（例えば、細胞または細胞抽出物内で発現される）、または外因性の供給源（細胞または細胞抽出物中に添加されるかまたは発現される）から提供され得る。
【００３２】
本発明を理解するために、本発明らによって、より大きいエフェクターと相互作用し、そしてこれに応答する、触媒的に活性な核酸を作製するための以前の試みが失敗してきたことを、理解することが重要である。最初に、アプタマー（公知の結合配列）のリボザイム（触媒活性ドメイン）への付加によってタンパク質依存性のリボザイムを生成するための試みがなされた。この設計および方法は、調節可能な核酸の提供において、成功しなかった。次に、タンパク質依存性のリボザイムを生成するための試みが、アプタマー（結合）およびリボザイム（触媒）の間にランダムな配列領域を付加し、そしてエフェクター依存性について選択することによってなされた。これらの試みもまた成功しなかった。次に、本発明者らは、リボザイムの触媒的コアに、大きいランダムな配列領域を付加し、そしてエフェクター依存性について選択することによって、タンパク質依存性リボザイムを作製することを試みた。これらの試みもまた、成功しなかった。言い換えれば、小さい有機化合物に依存したリボザイムの作製のための、全ての以前の詳述した方法は、タンパク質に依存性であるリボザイムの作製について、成功しなかった。
【００３３】
今日まで、本発明者らは、多くのタンパク質依存性リボザイムリガーゼおよびペプチド依存性リボザイムリガーゼを選択してきた。一例は、同系のタンパク質エフェクターである、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａのミトコンドリア由来のチロシルｔＲＮＡシンターゼ（Ｃｙｔ１８）の存在下で、標準的なアッセイにおいて７５，０００倍増大された活性を有する、タンパク質依存性の、調節可能な触媒的に活性な核酸である。Ｃｙｔ１８依存性のリボザイムは、非同系のタンパク質（他のｔＲＮＡシンターゼを含む）によって、活性化されなかった。
【００３４】
その同系タンパク質エフェクターである雌ニワトリ卵白リゾチームの存在下で、３，５００倍増大された活性を有する、タンパク質依存性の、調節可能な触媒的に活性な核酸もまた、作製および選択された。このリゾチーム依存性のリボザイムは、ほとんどの非同系タンパク質（Ｔ４リゾチームを含む）によって活性化されなかったが、非常に密接に関連するタンパク質であるシチメンチョウ卵白リゾチームによって活性化された。さらに、このタンパク質依存性のリボザイムは、リゾチームに特異的に結合したＲＮＡ結合種によって阻害された。言い換えれば、これらのタンパク質依存性のリボザイムの活性化は、非常に特異的である。
【００３５】
その同系のペプチドエフェクターである、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質由来のアルギニンリッチモチーフ（ＡＲＭ）の存在下で１８，０００倍増大された活性を有する、ペプチド依存性の、調節可能な触媒的に活性な核酸もまた、作製および選択された。このＲｅｖ依存性の核酸は、他のウイルスタンパク質（例えば、ＨＴＬＶ−１  Ｒｅｘ）由来の他のＡＲＭによって活性化されなかった。本発明を使用して、膨大な数のタンパク質によって調節される調節可能な触媒的に活性な核酸を開発し得る。
【００３６】
続く記載から明らかなように、タンパク質依存性のＲＣＡＮＡは、種々の適用において有用である。例えば、タンパク質に調節される触媒的に活性な核酸を、（１）全プロテオームについてのデータの獲得のため、（２）疾患状態に特異的なタンパク質（例えば、前立腺特異的な抗原またはウイルスタンパク質）を検出するためのインビトロの診断試薬として、（３）生物学的戦闘剤の検出のための歩哨として、または（４）遺伝子治療における調節エレメントとして、使用し得る。
【００３７】
（Ｂ．触媒ドメインにおける残基の改変）
１つの実施形態において、本発明は、触媒コアそれ自体の一部をランダム化するが、触媒コアのペンダントであるドメインを必ずしもランダム化しない。本発明を使用する選択の一例は、Ｌ１リガーゼを使用する選択であった。Ｌ１リガーゼの触媒コアは、欠失分析ならびに部分的ランダム化および再選択によって、マップされている。図１５ａは、プール設計のための開始点であったＬＩリガーゼを示す。ステムＡ、ＢおよびＣが示される。影を付けた領域は、触媒コアおよびライゲーション連結部を含む。プライマー結合部位は小文字で示され、活性に必要なオリゴヌクレオチドエフェクターはイタリック体で示され、そしてライゲーション基質は太字で示される。ライゲーション基質上の「タグ」は、変化し得るが、本明細書中に記載される例示的な選択においては、ビオチンであった。Ｌ１プールは、５０のランダム配列位置を含み、そしてリボザイムコアの一部と重複する。図１５ｂにおいて、ステムＢは、大きさが減少され、そして安定なＧＮＲＡテトラループで終結したが、ステムＡは、変化しなかった。
【００３８】
ランダム配列領域が触媒コアにわたるプールを、合成した。タンパク質依存性のリボザイムを、タンパク質エフェクターの存在下でオリゴヌクレオチドタグを連結する能力について選択し、次に親和性マトリックス上のオリゴヌクレオチドタグを捕捉し、次にインビトロまたはインビボで増幅することによって、このランダム配列プールから選択した。触媒コアは、ランダム化されているので、タンパク質依存性についての選択は、リボザイムの補助的な領域に結合し得る種だけでなく、タンパク質エフェクターが実際にリボザイムの触媒コアを組織化する種も得る。
【００３９】
リボザイムの触媒コアの少なくとも一部がランダム化されているプールからのタンパク質依存性についての選択は、触媒コアがランダム化されていないプールからのタンパク質依存性についての選択とは異なる。例えば、選択されたタンパク質依存性のリボザイムの触媒コアは、元のリボザイムの触媒コアおよび元のリボザイムに基づいて選択される他の非タンパク質依存性のリボザイムの触媒コアとは、実質的に異なる。
【００４０】
図１５ａは、タンパク質活性化された、調節された触媒的に活性な核酸として、Ｃｙｔ１８  ＲＣＡＮＡ中のプール設計のための開始点であったＬＩリガーゼを示す。ステムＡ、ＢおよびＣが示される。影を付けた領域は、触媒コアおよびライゲーション連結部を含む。プライマー結合部位は小文字で示され、活性に必要なオリゴヌクレオチドエフェクターはイタリック体で示され、そしてライゲーション基質は太字で示される。ライゲーション基質上の「タグ」は、変化し得るが、本明細書中に記載される例示的な選択においては、ビオチンであった。ＬＩプールは、５０のランダム配列位置を含み、そしてリボザイムコアの一部と重複する。図１５ｂにおいて、ステムＢは、大きさが減少され、そして安定なＧＮＲＡテトラループで終結したが、ステムＡは、変化しなかった。
【００４１】
触媒コア中の１以上の残基がランダム化されているので、このエフェクターは、所定の反応のために重要な触媒残基を付加し得る。すなわち、エフェクター分子および調節可能な触媒的に活性な核酸の両方が、リボザイムの活性部位の一部に寄与する。例えば、本発明の方法を使用して、独立では乏しい触媒機能を実行するのみであるリボザイムおよびエフェクター分子は、互いに相互作用してその酵素機能を果たす。このように、グアノシンおよびアデノシンに寄与する調節可能な触媒的に活性な核酸、ならびにヒスチジンに寄与するタンパク質エフェクターは、一緒になって個々の化合物のいずれかよりも大きい活性を有する複合体を形成する。本明細書中に開示される方法を使用して、キメラのエフェクター：リボザイム（例えば、タンパク質：ＲＮＡ複合体）の、触媒をもたらす活性部位を同定することが可能である。本発明は、検出可能な基礎的な化学的活性を有するリボザイムを記載し、そしてエフェクターの存在は、この基礎的な化学的活性を調節する。この理由で、本発明は、基礎的な触媒活性がリボザイム単独またはタンパク質単独には存在しない、タンパク質：ＲＮＡ複合体を特許請求した他の発明とは顕著に異なる。
【００４２】
（Ｃ．ＲＣＡＮＡの選択）
図１５ｃは、以下の選択スキームを、模式的に示す：ＲＮＡプールを、ビオチン化されたタグと共にインキュベートし、そして反応性の改変体を、この手段から除去した。残った種を、標的（例えば、タンパク質Ｃｙｔ１８）の存在下で再びビオチン化されたタグと共にインキュベートした。反応性の改変体を、この集団から除去し、そして好ましくは逆転写、ＰＣＲおよびインビトロの転写によって増幅した。
【００４３】
この方法によって選択されるリガンド依存性の、調節可能な触媒的に活性な核酸は、ランダムな配列プールから選択される機能的な核酸とは異なる。リガンド依存性についての選択は、結合についての選択と反対の触媒活性についての選択を必要とする。従って、タンパク質依存性の、調節可能な触媒的に活性な核酸は、アプタマーではない。選択されたタンパク質依存性のリボザイムの物質の組成は、選択されたアプタマーの物質の組成とは異なる。例えば、リゾチーム依存性のリボザイムの配列は、抗リゾチームアプタマーの配列とは異なる。本発明の重要な特徴は、本明細書中に開示される調節可能な触媒的に活性な核酸が、選択または増強された結合能力ではなく、認識のみを必要としたことである。例えば、未処理の選択されていないＲＮＡプールに対するリゾチームの親和性は、選択された、調節可能な触媒的に活性な核酸に対するリゾチームの親和性と同一である。違いは、調節可能な触媒的に活性な核酸によって認識されるリゾチームが活性化を生じるが、全体の非特異的結合としてのプールについては、活性化を生じないという点のみである。言い換えれば、結合は、同時に起こるが、調節可能性についての選択の二次的な機能である；すなわち、本明細書中に開示される調節可能なリボザイムが、エフェクターまたは標的に非常に乏しく結合し得るが、それにもかかわらず、相互作用の際に、リボザイムの活性は調節され得る。
【００４４】
（Ｄ．ＲＣＡＮＡの自動化選択）
ロボットワークステーションは、生物分子の高スループットの操作（例えば、特定の作用機構を有する薬物の高スループットのスクリーニング）に重要になっていする。本発明はまた、インビトロの選択手順の自動化および共通かつ改変されたインビトロの選択手順の両方を実行する機械化システムを含む。自動化は、この手順の実行を容易にし、かつて数ヶ月から数年を要したものを、数時間から数日で達成する。特に、本発明は、アプタマーおよびリボザイムの選択のためのロボットワークステーションを適合させた。しかし、自動化方法は、多くの選択の異なる型（ＤＮＡまたは改変されたＲＮＡによる選択、リボザイムの選択、およびファージディスプレイまたは細胞表面タンパク質の選択を含む）に一般化できる。
【００４５】
簡潔には、インビトロの選択は、以下のいくつかの構成要素を含む：ランダム配列プールの作製、所定の標的を結合するかまたは所定の反応を触媒する核酸種についてのランダム配列プールの篩がけ、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応およびインビトロの転写の組み合わせによる篩にかけられた種の増幅。ランダム配列プールの作製を超えて、これらの工程の各々は、潜在的に、ロボットワークステーションによって実行され得る。このプールは、標的分子と一緒にピペッティングされ得る。この標的が磁気ビーズ上に固定化される場合、核酸：標的複合体は、内蔵された磁気ビーズ収集器を使用して、溶液から篩にかけられ得る。最後に、選択された核酸種は、この複合体から溶出され得、そして内蔵されたサーマルサイクラーによって実行されるポリメラーゼ連鎖反応を含む、一連の酵素的な工程によって増幅され得る。
【００４６】
結合種がランダム配列集団から篩にかけられ得る多くの可能性のある方法が存在する。しかし、これらの全てが、自動化選択を受け入れるわけではない。例えば、アプタマーを選択するために、他者は、マイクロタイタープレート上に固定化され得る標的および結合種が、パニングによって篩にかけられ得ることを示唆してきた。本発明者らは、この方法にほとんど成功せず、これは、おそらく、パニングが、篩がけのためには比較的非効率で、低ストリンジェンシーな方法であるからである。代わりに、本発明者らは、標的がビーズ上に固定化され、そしてランダム配列プールと混合される場合に、結合種が、ビーズの濾過によって、非結合種から効果的に篩にかけられ得ることを発見した。ビーズは、ピペッティングによって容易に操作され得、結合種の容易な回収および溶出を可能にし、次いで、結合種は、増幅され、そしてその後の選択の回へ運ばれる。この方法は、磁気ビーズ捕捉方法とは異なり、そしてより高いストリンジェンシーで実行され得る。この方法は、新規であり、そしてインビトロの選択実験のために、以前には使用されていない。
【００４７】
図１４は、本発明のなお別の実施形態：自動化選択の、例示的な作業表面を模式的に示す。Ｊ．Ｃ．Ｃｏｘら、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１４、８４５  ８５０、１９９８を参照のこと。
【００４８】
（基本的プロトコール）自動化選択は、いくつかの連続的な工程を包含する。いくつかのモジュール（磁気ビーズ分離器、および酵素冷却器、およびサーマルサイクラー）が、ロボット作業表面に配置される。手動で試薬を調製し、そしてこれらの試薬（ランダムプールＲＮＡ、緩衝液、酵素、ストレプトアビジン磁気ビーズおよびビオチン化標的を含む）およびチップをロボット上に予めロードした後、プログラムを実行する。ロボットによって自動化された選択プロセスを、以下のように行う：ＲＮＡプールを、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合体化されたビオチン化標的の存在下でインキュベートする。インキュベーション後、磁気ビーズ分離器上の磁石を出現させ、そしてビーズ（今や、プールＲＮＡ−選択された核酸によって結合されている）を、溶液から引き付ける。このように、ビーズは洗浄され得、ビーズに結合した標的に結合したＲＮＡのみを残す。これらのＲＮＡ分子を、逆転写し、ＰＣＲによって増幅し、そしてこのＰＣＲ  ＤＮＡを、反復回の選択において使用されるべきＲＮＡにインビトロで転写する。
【００４９】
（インビボ選択のためのバイオワーク（Ｂｉｏｗｏｒｋ）方法）このスクリプトプログラミング方法は、自動化選択を容易にするために必要な全ての動作を含む。これは、協調されるべき全ての物理的動作、そしてまた通信ステートメントを含む。例えば、単一の標的に対する５回の自動化選択は、ｘ、ｙ、ｚ、ｔ座標空間で、５，０００を超える別個の動作を必要とする。さらに、この方法はまた、物理的衝突を防止し、そしてデバイス間の関連のある通信を可能にするために必要な、全ての関連の測定、補正、および統合された装置データを含む。
【００５０】
（「フィルター上のビーズ」選択）手動選択の大部分は、ニトロセルロールベースのフィルターで実行されてきたが、極少数はまた、ビーズのような固体表面で実行されてきた。新規の選択スキームが開発され、これによって、選択は、ニトロセルロースフィルター上に配置された磁気ビーズで実行され、そしてビーズが選択標的自体であるかのように洗浄される。この方法は、選択のためのより高い特異性を可能にし、それによって、「勝った（ｗｉｎｎｉｎｇ）」分子がより多い数に増幅されるのを促進し、従って、選択手段を完了させるために必要な回数の全体量を減少させる。手動の選択は、選択を増強させるために表面の組み合わせを含まない。代替の方法は、磁気ビーズ、またはビーズ以外の方法を使用してビーズに結合された核酸、およびビーズを覆い、そしてフィルターを通過する泳動緩衝液を取り込むことである。完全なフィルター洗浄工程が、減少したバックグラウンドに起因して、選択における改善された性能を提供することが見出されている。このような方法の自動化の一例は、フィルター付底を有する９６ウェルプレートにビーズを配置し、ビーズを緩衝液で洗浄し、続いて標的核酸の連続溶出することによって、例えば、ビーズに結合した核酸を除去することである。
【００５１】
（交差汚染の回避）手動選択における核酸鎖の汚染種の導入は、一般的なことであり得る。これは、選択が、複数の標的に対して平行して行われる場合に特に当てはまり、そしてまた、研究者が異なる選択手段について同じプールを再利用する場合にも当てはまる。汚染種は、一部、手動選択を妨害し、その結果選択が完了しないことが示されている。自動化インビトロ選択は、プールと標的との間の交差汚染の可能性を最小化および／または排除するための工程を取る。機械的パッドの作業表面に沿った動作は、潜在的に汚染物質を運ぶ場合に、一方向である。「清浄な」物から離れ、そしてすでにレプリコンに曝露された物へ向かうのみのこの動作は、交差汚染反応の可能性を著しく減少させる。パッドがその方向を逆転させる環境のみが、新たな、清浄なピペットチップを獲得する。さらに、試薬トレイを、周囲と未曝露試薬との間の物理的障壁のために、アルミホイルで密封した。図１４の、交差汚染を減少させるロボット作業表面のレイアウトを参照のこと。
【００５２】
この方法を使用して、本発明者らは、多くのタンパク質標的（Ｃｙｔ１８、リゾチーム、シグナル伝達キナーゼＭＥＫ１、好熱細菌由来のＲｈｏ、およびヘルペスウイルスのＵＳ１１タンパク質を含む）に対するアプタマーを、首尾よく選択した。このロボットは、個々のタンパク質標的に対して、１日６回の選択を実行し得、そして選択は、代表的には１２〜１８回以内に完了する。各例において、選択された集団は、未処理の集団よりも、その同系のタンパク質について実質的により高い親和性を示した。さらに、選択された集団が配列決定された場合、１以上の配列ファミリーが、代表的に支配的であった。配列ファミリーは、首尾よい選択の特徴であり、そしてこのロボット方法が、手動の選択方法を正確に再現していることを示す。
【００５３】
標的固定化のためのビーズの使用は、自動化選択が実質的に任意の標的クラスに一般化されることを可能にする。例えば、小さい有機分子はビーズに直接結合体化され得る。同様に、抗体は、ビーズに結合体化され得、そして次に、高分子構造（例えば、ウイルスまたは細胞）を捕捉するために使用され得る。
【００５４】
別の実施形態において、ロボットワークステーションは、核酸触媒の選択のために使用され得る。例えば、その５’末端にヨウ素脱離基を有するＤＮＡライブラリーを、３’ホスホロチオエート求核試薬および５’ビオチンを含むＤＮＡオリゴヌクレオチド基質と共にインキュベートした。ビオチンは、ストレプトアビジン保有ビーズに捕捉され得、そしてこのビーズは、次に、磁気分離または濾過のいずれかによって捕捉され得る。それ自身をビオチン化基質に連結させるＤＮＡプール中の任意の分子は、この基質と同時に固定化される。固定化された種は、内蔵されたサーマルサイクラーに移された後、直接増幅され得る。増幅に使用されるプライマーの１つにビオチンを含むことは、一本鎖ＤＮＡが塩基中の非ビオチン化鎖の変性、引き続く溶液の中和によって調製されるのを可能にする。この方法は、デオキシリボザイムリガーゼの選択について成功することが証明されたが、バリエーションもまた、試みられ得た。例えば、ビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチド基質を、ビーズに予め固定し得、そしてＤＮＡプールを、このビーズと共にインキュベートし得た。この例において、それ自身を基質に連結するＤＮＡプール中の任意の分子がまた、ビーズに直接捕捉される。
【００５５】
固体化を触媒するためのビーズの使用は、直ぐに、他の選択プロトコールを示唆する。例えば、核酸開裂を、最初にプールをビーズ上に固定化し、次いで、ビーズから離れてそれ自身を開裂する種について選択することによって、選択し得る。同様に、核酸Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒシンターゼを、最初にジエンをビーズ上に固定化し、ジエノフィルで終結する核酸プールを作製し、そして最も効率的にジエンおよびジエノフィルに結合体化する種について選択することによって、検出し得る。
【００５６】
この方法を、ＲＣＡＮＡの選択に適用し得る。リガーゼを選択するためにロボットワークステーションを使用する能力は、調節可能なリボザイムの選択が可能であることを実証する。例えば、タンパク質エフェクターの非存在下でそれ自身を固定化するリガーゼがランダム配列集団から除去されるが、一旦タンパク質エフェクターが添加されるとそれ自身を固体化するリガーゼが、選択のさらなる回のために内蔵されたサーマルサイクラーに移され、増幅され、そして使用されるように、本発明において記載される選択プロトコールを変更し得る。調節可能なリボザイムについての自動化選択方法は、当業者によって、リガーゼ以外の他のクラスまたは触媒（例えば、クリーバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）もしくはＤｉｅｌｓ  Ａｌｄｅｒシンターゼ）に容易に展開され得る。
【００５７】
自動化選択は、実際のピペッティングおよび生物学的操作における人為的なミスを大きく減少させる。ロボットをプログラミングすることは、しばしば、些細な仕事ではなく、そして時間を消費し得るが、自動化選択は、手動の選択よりもはるかに速く、そしてより効果的である。従って、科学者の時間は、実際の選択を実行することよりも、むしろサンプルの調製およびデータの分析に振り向けたほうがよい。さらに、自動化選択は、リアルタイムのモニタリング方法（例えば、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ）およびリアルタイムモニタリングに基づく優れた決定を行い得るソフトウェアを含み得る。
【００５８】
（Ｅ．インビトロの検出適用のためのチップベースのＲＣＡＮＡ）
調節可能な触媒的に活性な核酸は、バイオセンサー適用のために特に有用である。例えば、異なるタンパク質調節性触媒活性核酸（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、表面（例えば、複数ウェルプレート中のウェル）に固着され得る。分析物の混合物および蛍光的にタグ化された物質は、各ウェルに添加される。同族のエフェクターが存在する場合、このタンパク質調節性触媒活性核酸は、それ自身に蛍光タグを共有結合する。タンパク質調節性触媒活性核酸がエフェクターによって活性化されていない場合、タグ化された物質は、ウェルの外に洗い流される。反応および洗浄後、共固定化された蛍光タグの存在および量は、反応中に存在したリガンドの量を示す。
【００５９】
本発明の１つの実施形態において、レポーターは蛍光タグであり得るが、これは酵素でも、磁気粒子でも、または多数の検出可能な粒子でもよい。さらに、タンパク質調節性触媒活性核酸は、ビーズに結合してもいいし、表面に対して、共有結合よりむしろ非共有結合してもよい。
【００６０】
本方法の１つの利点は、レポーターの共有結合的な固定化が（ＥＬＩＳＡアッセイにおけるように、非共有結合的な固定化とは対照的に）、使用されるべきストリンジェントな洗浄工程を可能にすることである。さらに、リボザイムリガーゼは、増幅される核酸テンプレート中にエフェクターを形質転換し得る、独特の能力を有し、これは、検出前に、シグナルにおいてさらなるブーストを生じる。
【００６１】
別の利点は、本発明の分析方法が、それ自体の結合に依存しないが、一過性の相互作用にのみ依存することである。本発明は、物理的に単離されるべき結合事象よりもむしろ、単なる認識を必要とし、これは抗体を越えるタンパク質調節性触媒活性核酸の潜在的な利点を提供する。すなわち、特に個々の固定化されたタンパク質調節性触媒活性核酸が検査される（すなわち、定量点（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）のリガンド依存的固定化による）場合、低い親和性でさえ、活性化および続く検出に十分であるということである。
【００６２】
図１６は、アプタザイム（ａｐｔａｚｙｍｅ）を、本発明の特定の実施形態のためのチップに固着するための１つの方法の概略図を示す。この概略図において、異なるリボザイムリガーゼ（異なる色のアロステリック部位によって示される）は、ウェル中のビーズ上に固定化されて示され、そして分析物の混合物（形および色によって区別される）および蛍光的にタグ化された物質が各ウェルに添加される。この図の中央のパネルにおいて、同族のエフェクターが存在する場合（同じ色の分析物およびアロステリック部位）、アプタザイムは、それ自身に蛍光タグを共有結合する。ＲＣＡＮＡが、エフェクターによって活性化されない場合、タグ化された物質は、ウェルの外に洗い流される。図１６の最後のパネルにおいて、反応および洗浄後、共固定化された蛍光タグの存在および量は、反応の間に存在したリガンドの量を示す。
【００６３】
図１６の実施形態において、レポーターは蛍光タグであり得るが、これは酵素でも、磁気粒子でも、または多数の検出可能な粒子でもよい。さらに、ＲＣＡＮＡは、ビーズに固定され得るが、これはまた、共有結合を介して固相支持体に直接結合し得る。
【００６４】
この実施形態の１つの利点は、レポーターの共有結合的な固定化が、使用されるべきストリンジェントな洗浄工程を可能にすることである。これは、ストリンジェントな洗浄がシグナルを破壊し得る場合、ＥＬＩＳＡアッセイのような非共有結合的な固定化アッセイとは区別され得る。さらなる利点は、リボザイムリガーゼは、増幅され得る核酸テンプレート中にエフェクターを形質転換し得る、独特の能力を有し、これは検出前に、シグナルにおいてさらなるブーストを生じる。
【００６５】
さらに、本発明の方法は、ＲＣＡＮＡ構築物はポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得る、ということを意図する。最後に、この方法は、この構築物のＲＣＡＮＡオリゴヌクレオチド配列は、ＲＮＡヌクレオチドを含み得ることを意図し、その結果この方法はさらに、逆転写酵素を使用するＲＮＡの逆転写を包含し、ＲＮＡテンプレートに対して相補的なＤＮＡを産生する。
【００６６】
修飾されたヌクレオチドは、環境（例えば、血清または尿）における分解からそれらを実質的に安定化するＲＣＡＮＡに導入され得る。本発明の分析的な方法は、それ自身の結合には依存しないが、一過性の相互作用のみに依存する。本発明の方法は、実際の結合よりもむしろ、単なる認識を必要とし、従って、抗体を越えるＲＣＡＮＡの潜在的な利点を提供する。すなわち、特に個々の固定化されたＲＣＡＮＡが検査される（すなわち、定量点のリガンド依存的固定化による）場合、低い親和性でさえ、活性化および続く検出に十分であるということである。
【００６７】
（Ｆ．  インビボ適用のための、ＲＣＡＮＡのインビトロ操作および選択）
上記の議論は、ＲＣＡＮＡのインビトロ作製のための方法を開示し、そしてそのいくつかのインビトロ適用を開示する。以下の節において、本発明者らは、インビボ適用のためのＲＣＡＮＡの設計、操作、およびインビトロ選択を記載する。
【００６８】
本発明は、細胞系においてｍＲＮＡのレベルを変更し得るリボザイムを利用する。１つの実施形態において、このリボザイムは自己スプライシングイントロン（例えば、グループＩイントロン）であり得る。このリボザイムは、遺伝子中に挿入され得る。このリボザイムが活性である場合、このリボザイムは、リボザイム自身を遺伝子から除去する自己スプライシング反応を触媒し、遺伝子の正確な発現を可能にする。別の実施形態において、このリボザイムは、ｍＲＮＡを切断するようにトランスで作用するリボザイムであり得る。再び、リボザイムの活性を変化させることは、細胞におけるｍＲＮＡのレベルの変化を引き起こし、それによってこの遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを変更する。当業者は、他のリボザイムの活性が使用され得ることを認識する。例示の目的のために、ここで、本発明を、自己スプライシングイントロンの使用を用いて詳細に説明する。
【００６９】
このイントロンは、最初に改変されてＲＣＡＮＡとして機能する。簡単にいうと、上に記載されるこの方法を使用して、ＲＣＡＮＡイントロンを産生し得る。潜在的なＲＣＡＮＡイントロンのプールを、イントロンの１つ以上の領域をランダム化することによって作製する。このランダム化された領域は、必要に応じて触媒コア由来の１つ以上の残基を含む。次いで、活性なＲＣＡＮＡイントロンを、不活性なＲＣＡＮＡイントロンから分離することを可能にする選択プロトコールを開発する。例えば、活性なＲＣＡＮＡイントロンを、ゲル電気泳動における移動度に基づいて不活性なＲＣＡＮＡイントロンから分離し得る。他の方法は、当業者に明確である。この分離方法に基づいて、分離の相互作用的な手順、および引き続くＲＣＡＮＡイントロンの増幅を使用して、エフェクターによって調節されるＲＣＡＮＡを選択する。分離方法を除いて、この手順は、ＲＣＡＮＡリガーゼに関して記載される選択と、実質的に同一である。
【００７０】
ＲＣＡＮＡイントロンの選択に対する代替として、ＲＣＡＮＡイントロンを操作することもまた可能である。例えば、イントロンのステムループ構造の１つを、所望のエフェクターのためのアプタマーによって置換し得る。エフェクターのイントロンの、この操作されたＲＣＡＮＡイントロンウィル（ｉｎｔｒｏｎ−ｗｉｌｌ）との相互作用は、ＲＣＡＮＡイントロン活性の調節を生じる。アプタマーは調節エレメントとは異なるので（上に記載されるように）、一般に本方法は、エフェクターによって調節されるＲＣＡＮＡをもたらす。しかし、以下の実施例に示されるように、本発明の重要な局面は、調節のレベルが、インビボ適用のために十分であり得るということである。
【００７１】
（Ｇ．  ＲＣＡＮＡのインビボ選択および最適化）
ここで、本発明者らは、インビボ選択の使用によって、ＲＣＡＮＡを産生する方法を開示する。図４ｂは、図４ａのグループＩ  Ｐ６  ＲＣＡＮＡプールについての選択プロトコールを示す。陽性選択および陰性選択をインビトロで行い、活性化因子に依存するグループＩ  ＲＣＡＮＡを選択する。この選択を、本発明の特定の実施形態（テオフィリン依存性ＲＣＡＮＡ）について、実施例２において上で記載する。インビボのスクリーニングおよび選択を使用して、強力なテオフィリン依存性を示すグループＩ  ＲＣＡＮＡを選択する。ＲＣＡＮＡがバックグラウンドに対して選択され得るレベルを決定するために、この選択されたＲＣＡＮＡを、種々の比で、低いが連続するレベルでスプライシングする変異グループＩリボザイムと共に混合し、ＲＣＡＮＡがバックグラウンドに対して選択され得るレベルを決定する。活性化ドメインはしばしばステムループの形態であるので、変異は、ＲＣＡＮＡイントロンの単一ステムループ構造で濃縮され得る。代替の実施形態において、この変異は、触媒的残基を含み得る。さらに別の実施形態において、この変異は、イントロンにおいてランダムに分散される。最後に、本明細書中に記載される方法のいずれかによって誘導されるほとんどのテオフィリン依存性グループＩアプタザイムは、その配列の部分的なランダム化および改善されたインビボ実行について選択することによりさらなる選択を受ける。
【００７２】
図４ａおよび４ｂに示されものと類似のストラテジーを使用して、任意の所望のエフェクターに対するＲＣＡＮＡを開発し得る。陽性および陰性のインビトロ選択（例えば、図４ｂにおいて記載される）を、本発明の特定の実施形態について実施例２において上に記載する。
【００７３】
１０６〜１０１０個の改変体は、本明細書中に記載されるように効率的に形質転換され得、これまで議論された集団におけるほとんどの改変体を包含するのに十分であり得る。しかし、この形質転換の効率は、完全にランダムなプールの十分な画分を包含するには不十分であるようである。それにも関わらず、配列は、バクテリオファージ感染から細菌を防御し得る、完全にランダムに発現されたプールから選択される。
【００７４】
上の手順は、インビボＲＣＡＮＡを選択する方法を記載する。同様の手順を使用して、操作されたＲＣＡＮＡを最適化し得る。リガンド結合領域、構造的ステムループ、または触媒的残基でさえを含み得るＲＣＡＮＡにおける残基を、変異し得る。次いで、上に記載される選択手順を使用して、最適化されたＲＣＡＮＡについて選択し得る。
【００７５】
最後に、異なる遺伝子状況においてグループＩイントロンのスプライシングを管理するという法則が当業者に周知であるので、当業者は、ＲＣＡＮＡイントロンを１つの状況から取り出し得、そして組み立てて他の遺伝子に挿入し得る。イントロンスプライシングの効率またはエフェクター依存性が、新規な遺伝子において妥協されるべきであるので、このイントロンは、遮断された目的の遺伝子に対する選択マーカーによって、その新規の遺伝環境に再順応され得、そしてエフェクター依存性表現型を選択し得る。
【００７６】
グループＩアプタザイムが自給自足であるという点で、このグループＩアプタザイムはまた、真核生物細胞（ヒト細胞を含む）において機能すべきである。エフェクター依存性について選択することもまた、真核生物細胞において実行し得る。真核生物系における選択は、例えば、目的の遺伝子を、ＧＦＰまたはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に融合させることによって実行され得る。次いで、エフェクター依存性タンパク質の産生を促進するＲＣＡＮＡの改変体を、ＦＡＣＳを使用して選択し得る。１０６〜１０８個の改変体のプールは、先に記載された細菌系と比較できる範囲と、この手順によってスクリーニングされ得る。
【００７７】
（Ｈ．  インビボ検出の適用）
本発明を使用して、内因性タンパク質活性化因子、または内因性タンパク質アクチベーターの翻訳後修飾の形態（例えば、プロテインキナーゼ（例えば、ＥＲＫ  １およびリン酸化ＥＲＫ  １））の応答において、操作されたイントロンを含有するレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼまたはＧＦＰ）を活性化または抑制することが可能である。低分子エフェクター（例えば、サイクリックＡＭＰ、グルコース、生理活性ペプチド、生理活性核酸、または低分子量の薬物（例えば、抗体、抗癌剤など））の応答において、操作されたイントロンを含有するレポーター（例えば、ルシフェラーゼまたはＧＦＰ）を活性化または抑制することもまた、可能である。従って、レポーター遺伝子を操作されたイントロン構築物を使用して、タンパク質の細胞内レベル、タンパク質の翻訳後修飾の形態、またはサイクリックＡＭＰなどのような低分子をモニターし得る。このような適用を高スループット細胞ベースのアッセイのために使用し、そして薬物誘導または薬物の最適化および薬物開発のためにスクリーニングする。
【００７８】
細菌株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または酵母株（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｐｏｍｂｅ）は、イントロンＲＣＡＮＡによって調節されるレポーター遺伝子をコードする発現ベクターで形質転換され得、そしてこれらの操作された微生物細胞株は、細胞ベースのアッセイのために使用され得、そして薬物発見および薬物開発のために試験する。同様に、標準的な哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、および２９３Ｔ）を、適切なベクター（例えば、ｐＣＤＮＡ、ｐＣＭＶ、またはレトロウイルス）（これらはＲＣＡＮＡ調節可能なレポーター遺伝子を含むように操作されている）でトランスフェクトし得、そしてこれらの再操作された細胞株を、細胞ベースのアッセイおよび試験のために引き続いて使用し得る。ＲＣＡＮＡレポーター遺伝子技術の別の使用において、腫瘍形成細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＳＫ−Ｍｅｌ、ＤＬ１、ＰＣ３、Ｔ４７Ｄなど）を、インビトロで、ＲＣＡＮＡ調節可能レポーター遺伝子をコードする適切なベクターでトランスフェクトし得る。これらの再操作された腫瘍形成細胞株を、抗癌剤の発見および開発のための細胞ベースのスクリーニングに使用し得る。
【００７９】
別のインビボ適用において、レポーター遺伝子、すなわちイントロンＲＣＡＮＡ構築物（例えば、ルシフェラーゼまたはＧＦＰ）を使用して、薬物開発において使用するための生きた動物モデルを作製し得る。１つの実施形態において、ＲＣＡＮＡ−イントロン構築物を、操作された腫瘍形成細胞株において使用し、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片を作製するために使用される標的分子のレベルを示し得る。次いで、操作された細胞株から誘導された腫瘍を保有するマウスを使用して、標的分子のレベルを変更させる薬物についてスクリーニングし得る。例えば、タンパク質活性化因子ホスホＥＲＫ  １に対するイントロンの応答による調節可能な制御下で、ＧＦＰ遺伝子を発現するように操作された、トランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−４３５株を使用して、腫瘍増殖の抑制、およびホスホＥＲＫの形成のブロックを両方とも行う薬物についてスクリーニングする。ＲＣＡＮＡイントロンの発明の別の実施形態において、レポーター遺伝子の組織または細胞型の特異的な発現がエフェクター活性化ＲＣＡＮＡイントロンによって制御される、トランスジェニックマウスモデルを作製し得る。例えば、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス）プロモーターの制御下で、ホスホＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）特異的ＲＣＡＮＡ調節化ＧＦＰ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスは、ホスホＶＥＧＦ  ＲＴＫ依存性の様式で、マウス乳房組織におけるＧＦＰの発現を示す。さらに、これらのマウスを使用して、抗ＶＥＧＦ  ＲＴＫ活性について、化合物をスクリーニングし得る。
【００８０】
図５は、本発明の別の実施形態の図示である。グループＩイントロンスプライシングの外因性または内因性の活性化を示す。レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼまたはβ−Ｇａｌ）を、グループＩイントロン（ｔｄ）をまた含む目的の遺伝子に融合する。グループＩイントロンのスプライシングアウト（ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｏｕｔ）を、エフェクター（斜線の楕円によってタンパク質として図中に示される）（この場合においてはＣｙｔ１８）によって誘導する。ＲＣＡＮＡの活性化およびイントロンの自己切除により、所望の反応を検出するレポーター遺伝子の発現を生じる。この実施形態のレポーター遺伝子の使用は、真核生物における使用に適切である。
【００８１】
図６は、本発明の別の実施形態の図である。候補外因性活性化因子（Ｅ１〜ｎ）のライブラリーを、三角によって示すランダム化されたＲＣＡＮＡプールから産生され得る。図５の実施形態におけるように、レポーター遺伝子は、外因性の活性化因子がＲＣＡＮＡを活性化して、この遺伝子からイントロンを放出する場合、細胞において発現される。当業者に対して公知であるように、多くの現在および将来のライブラリーを、本発明を用いて使用し得る。
【００８２】
図７は、外因性活性化因子のライブラリーをスクリーニングするための代替的な実施形態を示す。図７の本発明の実施形態において、グループＩイントロンを、トランススプライシングに誘導する。抽出され、そして増幅されたイントロンを使用して、細胞を形質転換する。
【００８３】
図８は、本発明の外因性活性化因子のライブラリーをスクリーニングするためのさらに別の代替的な実施形態を示す。図８の実施形態において、エフェクター（斜線の楕円）（これはこの例示においてタンパク質Ｃｙｔ１８として示す）を、変異誘発して（三角）、エフェクターライブラリーを形成する。第２のエフェクター（Ｅ１〜ｎ）は、エフェクターライブラリーの１つ以上のメンバーと相互作用し、そしてこれを活性化する。このエフェクター−エフェクター複合体を、グループＩイントロンおよびレポーター遺伝子を両方とも含む遺伝子に曝露する。細胞のソーティングにより、エフェクター−エフェクター複合体によるＲＣＡＮＡの首尾良い活性化を示す、レポーター遺伝子を発現する細胞を明らかにする。
【００８４】
図９は、内因性活性化因子についてスクリーニングするための本発明の実施形態の図である。この実施形態において、内因性エフェクター（この図示において、内因性起源または形質転換された起源由来のタンパク質活性化因子として示される（斜線の楕円））は、グループＩイントロンの自己スプライシングを活性化する。細胞分類を使用して、レポーター遺伝子の発現を明らかにする。イントロンの自発的な自己切除に対して防御するために、この遺伝子を、異なるバックグラウンド系（例えば、酵母またはＥ．ｃｏｌｉ）に移入させ得る。
【００８５】
図１０は、本発明の内因性活性化因子についてスクリーニングするための、図９の実施形態に対する代替を示す。図１０において、スクリーニングされる活性化因子としては、とりわけ、リン酸化タンパク質、ユビキチン化の産物、またはタンパク質−タンパク質複合体が挙げられ得る。例えば、タンパク質活性化因子（斜線の小さな楕円として示す）は、Ｃｙｔ１８のようなエフェクター（斜線の大きな楕円として示す）を、リン酸化（斜線の長方形によって示す）を伴ってリン酸化し得る。このリン酸化されたエフェクターは、レポーター遺伝子（本明細書でルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼとして示される）の同時発現を伴って、イントロンの自己スプライシングを活性化する。
【００８６】
図１１は、細胞代謝を混乱させる化合物をモニターするための、本発明のさらに別の実施形態を示す。この実施形態において、図６において記載され、そしてこの図において三角を有する直線で示されるようなリボザイムを、図１１において斜線の楕円として示すタンパク質エフェクターによって活性化する。このタンパク質エフェクターは、例えば、リンタンパク質、誘導性タンパク質、またはタンパク質複合体であり得る。１つ以上の第２のエフェクター（一連の丸として示す）は、タンパク質エフェクターの修飾のレベルまたは程度を変更する。第２のエフェクターの供給源は、内因性であってもよいし、エフェクターは、細胞を形質転換するために使用される形質転換構築物の産物であってもよい。レベルの変更またはタンパク質エフェクターの修飾は、レポーター遺伝子の発現における変更（「いなずま」を有する黒丸として示される）をもたらす。従って、目的の遺伝子の機能は、混乱され得、この遺伝子もしくは遺伝子産物の機能および／または調節に関する情報を得る。図１１は、図８および１０に記載されるスクリーニングの産物を得るため、およびこの産物を使用して細胞状態または代謝状態をモニターするための方法を記載する。
【００８７】
図１２は、代謝状態の非侵襲性の読出しを提供する、本発明のさらなる実施形態を示す。本発明のＲＣＡＮＡ構築物を、目的の遺伝子に導入し得る。細胞形質転換の産物由来の内因性供給源のいずれか由来のタンパク質サプレッサーは、ＲＣＡＮＡの自己スプライシングを活性化し、内因性遺伝子の発現を誘導する（再び、ここでいなずまを有する黒丸として示される）。目的の遺伝子が、ＲＣＡＮＡイントロンの遺伝子からの放出の際に発現されるか否かによって、目的の遺伝子の代謝状態に関する情報が提供される。従って、図１２の本発明の実施形態は、目的の遺伝子に関して、器官の代謝状態を決定するための非侵襲的な手段を提供する。
【００８８】
図１３は、本発明のさらなる実施形態を示し、ここで、内因性のサプレッサーは、複数の代謝状態の非侵襲的な読出しを提供する。複数のタンパク質活性化因子（内因性または形質転換された）を、本発明のグループＩイントロンに曝露する。このプールは、目的の遺伝子（細線）に存在するグループＩイントロン（太線）を示す線における不連続または切断によって図１３において示す、長さの多型を有するイントロンを示す。ＲＣＡＮＡの活性化は、種々の多型間のトランススプライシングを誘導する。トランススプライシングの産物を、抽出および増幅し得る。ゲル電気泳動によるトランススプライシング産物の分離によって、タンパク質の機能または代謝経路の読出しを提供する。この読出しは、分析のためにデジタル化（ｄｉｇｉｔｉｚｅ）さえされる。
【００８９】
（Ｉ．  遺伝子治療のためのＲＣＡＮＡのインビボでの使用）
遺伝子治療のためにＲＣＡＮＡおよびの本発明の方法を使用することの１つの重要な特徴は、調節されたイントロンを使用して、種々の遺伝子のいずれかについて遺伝子発現を制御し得ることである。なぜなら、これらのイントロンは、実質的に任意の遺伝子に適応するように挿入および操作され得るからである。さらに、ＲＣＡＮＡは、種々のエフェクターのいずれかに応答するように操作され得るので、エフェクターの特徴（経口のアベイラビリティ、合成的接触性、薬物動態学的性質）は、前もって選択され得る。この薬物は、薬物の標的を操作する前に選択される。ある程度これらの異常な能力に起因して、ＲＣＡＮＡは、医学的に首尾良くかつ実際的な遺伝子治療のための実行可能な経路のみを、おそらく提供する。薬物は、単一の初回遺伝子治療を受ける患者の治療の間中（または生涯）、投与され得る。さらに、遺伝子治療を制御可能にすることによって、遺伝子産物の量は、エフェクターの用量を増加または減少することによって、異なる個体において、異なる時間に、処置の間、容易に増加または減少させ得る。
【００９０】
本方法はまた、細胞をＲＣＡＮＡ構築物で形質転換し、その結果、目的の遺伝子にこの構築物を挿入する。エフェクターは、ＲＣＡＮＡを活性化するように提供され、それにより、有効量のエフェクターを細胞に投与することによってＲＣＡＮＡが自分自身をスプライシングするように誘導され、遺伝子の発現が調節される。
【００９１】
本発明の方法は、ＲＣＡＮＡ構築物がプラスミドであり得ることを意図する。次いで、この方法はさらに、プラスミドで細胞を形質転換する工程を包含する。本発明の方法はまた、ＲＣＡＮＡ構築物をベクターに連結し、そしてこのベクターで細胞を形質転換することもまた意図する。
【００９２】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「調節可能な触媒的に活性な核酸」すなわち「ＲＣＡＮＡ」とは、エフェクターによって調節されるリボザイムまたは核酸酵素を意味する。ＲＣＡＮＡの動態学的なパタメーターは、アロステリックエフェクター分子であり得るエフェクターの量に応答して変化し得る。アロステリックタンパク質酵素が、その動態学的なパラメーターまたはエフェクター分子との相互作用に応答するその酵素活性の変化を受けるとすぐ、ＲＣＡＮＡの触媒的能力は、エフェクターによって同様に調節され得る。本明細書中に実証されるように、このエフェクターは低分子、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質、ペプチドもしくは他の分子と相互作用する分子であり得る。ＲＣＡＮＡは、ＲＣＡＮＡの一部と相互作用するエフェクターと相互作用する際に、分子認識を触媒作用に変換する。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、用語「エフェクター」「エフェクター分子」「アロステリック（な）エフェクター」または「アロステリック（な）エフェクター分子」とは、ＲＣＡＮＡの動態学的パラメーターまたは触媒活性を変化させる分子または処理を意味する。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、用語「触媒的残基」とは、ＲＣＡＮＡの活性を減少させるように変異される場合の残基をいう。ＲＣＡＮＡの選択に続いてリボザイムの触媒活性に影響する残基を変異することは、異なる残基を元のリボザイムにおけるよりも、変異に対して感受性になるようにもたらし得る。所定の「触媒的残基」の相対的な変異の感受性は、ＲＣＡＮＡの選択の前および後に変化し得る。これらの二次的な変異もまた、本発明によって包含される。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、用語「アプタマー」とは、標的リガンドに最適に結合するように特異的に選択される核酸をいう。上記のように、アプタマーは、基本的にＲＣＡＮＡと異なることを認識することは重要である。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、用語「反応速度論的パラメータ」とは、この核酸の触媒活性の任意の局面をいう。触媒性ＲＣＡＮＡの反応速度論的パラメータにおける変化は、ＲＣＡＮＡの触媒活性における変化（例えば、反応速度、または基質特性の変化）を生じる。例えば、遺伝子環境からのＲＣＡＮＡの自己スプライシングは、ＲＣＡＮＡの反応速度論的パラメータにおける変化から生じ得る。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、用語「触媒性」または「触媒活性」とは、または許容条件下でそれ自体または基質の変化を与える物質の能力をいう。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質−タンパク質複合体」または「タンパク質複合体」とは、１つ以上のタンパク質の結合をいう。タンパク質複合体を構成するタンパク質は、機能的機構、立体化学的機構、立体配置的機構、生化学的機構または静電的機構によって結合され得る。この用語は、任意の数のタンパク質の結合を含むことが意図される。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、用語「インビボ」とは、細胞系および生物（例えば、培養細胞、酵母、細菌、植物、および／または動物）をいう。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」とは、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸を含む化合物をいい、これらは交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「内因性」とは、その供給源が細胞、細胞抽出物、または反応系の内部にある物質をいう。内因性物質は、例えば、細胞の代謝活性によって産生される。しかし、内因性物質は、それにもかかわらず、例えば、細胞にこの物質をコードする遺伝子を発現させるための細胞代謝の操作の結果として産生され得る。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、用語「外因性」とは、その供給源が、細胞、細胞抽出物、または反応系の外部にある物質をいう。外因性物質は、それにもかかわらず、当業者に公知の種々の代謝的手段または誘導的手段のうちいずれか１つによって、細胞により吸収され得る。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「修飾塩基」とは、任意の種類の非天然ヌクレオチドをいい、ここで、化学修飾は、核酸塩基、糖、またはポリヌクレオチド骨格またはホスホジエステル結合上に見出され得る。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードするデオキシリボ核酸配列のコード領域を意味する。この用語は、このデオキシリボ核酸配列が、このタンパク質ついての全長ｍＲＮＡの長さに対応するように、５’末端および３’末端の両方で、コード領域に隣接して位置する配列を含む。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を含む。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列で中断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントである；イントロンは、調節エレメント（例えば、エンハンサー）を含み得る。イントロンは、核転写産物または１次転写産物から、取り除かれるか、切出されるか、または「スプライスアウト」される；それゆえ、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物においては存在しない。このｍＲＮＡは、翻訳の間に機能し、初期の（ｎａｓｃｅｎｔ）ポリペプチドにおける、配列すなわちアミノ酸の順序を特定する。
【０１０３】
イントロンを含むことに加え、遺伝子のゲノム形態はまた、ＲＮＡ転写産物上に存在する配列の５’端および３’端の両方に位置する、配列を含む。これらの配列は、「隣接」配列または「隣接」領域として称される（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写産物上に存在する非翻訳配列に対して５’または３’に位置する）。５’隣接領域は、調節配列（例えば、この遺伝子の転写を制御するか、またはこの遺伝子の転写に影響を与える、プロモーターまたはエンハンサー）を含み得る。３’隣接領域は、転写の終止、翻訳後切断、およびポリアデニル化を、指向する配列を含み得る。
【０１０４】
ＤＮＡ分子は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言及される。なぜならば、モノヌクレオチドが反応して、１つのモノヌクレオチドのペントース環の５’リン酸が、ある方向の隣の３’酸素にホスホジエステル結合を介して結合するような様式で、オリゴヌクレオチドを生成するからである。従って、オリゴヌクレオチドの末端は、これの５’リン酸がモノヌクレオチドのペントース環の３’酸素に連結してない場合に、「５’末端」として称され、そして、３’酸素が続くモノヌクレオチドのペントース環の５’のリン酸に連結していない場合に、「３’末端」として称される。本明細書中で使用される場合、核酸配列はまた、より大きいオリゴヌクレオチドに対して内部である場合でさえも、５’末端および３’末端を有するといわれる。直鎖状ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ分子のいずれにおいても、個々のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’にあると称される。この専門用語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行する事実を反映する。
【０１０５】
用語「目的の遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、本発明によって、その機能および／または発現が調べられることが所望されるか、またはその発現が調節されることが所望される、遺伝子をいう。本開示において、Ｔ４バクテリオファージのｔｄ遺伝子が目的の遺伝子の例であり、本明細書中で本発明を例示するために記載される。本発明は、任意の生物（原核生物であろうと、真核生物であろうと）の任意の遺伝子に関して有用であり得る。
【０１０６】
用語「ハイブリダイズする」とは、本明細書中で使用される場合、核酸の鎖が、塩基対形成を通して相補鎖と結合する任意のプロセスをいう。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸の鎖の間の結合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの融解温度およびその核酸中のＧ：Ｃ比（また、ＲＮＡについてはＵ：Ｃ比）のような因子によって影響を受ける。
【０１０７】
用語「相補」または「相補性」とは、本明細書中で使用される場合、許容される塩および温度条件下での、塩基対形成による、ポリヌクレオチドの天然の結合をいう。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２本の一本鎖分子間の相補性は、いくつかの核酸のみが結合する場合に部分的であり得るか、または、相補性は、一本鎖分子の間で全相補性が存在する場合に完全であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度において有意な影響を有する。これは、核酸鎖の間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
【０１０８】
用語「相同性」とは、本明細書中で使用される場合、相補性の程度をいう。部分相同性または完全相同性（すなわち、同一性）が存在する。部分相補配列は、同一配列が標的核酸にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する配列である；これは、機能的な用語「実質的に相同」を使用して称される。標的配列に対する完全相補配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットもしくはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して試験され得る。実質的な相同配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、標的配列に対して完全に相同な、配列またはプローブの結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）について完全であり、この結合を阻害する。これは、非特異的な結合が許容されるような低ストリンジェンシー条件を言及しない；低ストリンジェンシー条件は、２本の配列の互いに対する結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の非存在は、部分的な程度の相補性さえも欠く（例えば、約３０％以下の同一性である）第２の標的配列の使用によって試験され得る；非特異的な結合の非存在において、このプローブは、第２の相補的標的配列にハイブリダイズしない。一本鎖核酸配列を参照して使用される場合、用語「実質的に相同」とは、記載したような低ストリンジェンシー条件下で、一本鎖核酸配列に対してハイブリダイズし得る（すなわち、これが一本鎖核酸配列の相補体である）任意のプローブについていう。
【０１０９】
当該分野で公知のように、多数の等価な条件を使用して、低ストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件のいずれかを含み得る。配列の長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物、溶液中の存在物、または固的化など）、ならびに塩およびその他の成分（例えば、ホルムアミド、デキストランサルフェートおよび／またはポリエチレングリコール）の濃度が考慮され、そして上記の条件とは異なるが等価な、低ストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件を生成するためにこのハイブリダイゼーション溶液は変更され得る。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェンシー」は、核酸の選択が実施される、温度、イオン強度、および他の化合物（例えば、有機溶媒）の存在の条件に関して使用される。「高ストリンジェンシー」条件の場合、比較的少数の核酸触媒が、ランダム配列のプールから選択され、一方、「低ストリンジェンシー」下で、より多数の核酸触媒が、ランダム配列のプールから選択される。
【０１１１】
多くの等価条件を使用して、高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシーを含み得る；例えば、この反応のインキュベーションの長さ、この反応の競合阻害剤の存在、反応が実施される緩衝液条件、反応が実施される温度のような因子が考慮され、そして、このハイブリダイゼーション溶液は、変化され、上記の条件とは異なるか、これらと等しい、低ストリンジェンシー選択の条件を生じ得る。
【０１１２】
用語「アンチセンス」とは、本明細書中で使用される場合、特定のＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列をいう。用語「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」に対して相補的な核酸鎖に関して使用される。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに対して逆方向に目的の遺伝子を連結することによる合成を含む任意の方法によって作製され得る。一旦、細胞に導入されると、この転写される鎖は、細胞によって産生される天然配列と一体化し、二重鎖を形成する。次いで、これらの二重鎖は、さらなる転写または翻訳のいずれかをブロックする。この様式において、変異体表現型はまた、生じ得る。「マイナス（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」という呼称が、アンチセンス鎖についてときどき使用され、そして「プラス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」がときどき、センス鎖について使用される。この用語はまた、特定のＲＮＡ配列（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的なＲＮＡ配列について使用される。細菌による遺伝子調節に関連するアンチセンスＲＮＡ（「ａｓＲＮＡ」）分子も、この定義の内に含まれる。
【０１１３】
アンチセンスＲＮＡは、任意の方法（コード鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターとは逆方向である目的の遺伝子のスプライシングによる合成を含む）によって作製され得る。一旦、胚に導入されると、この転写された鎖は、この胚により産生される天然のｍＲＮＡと一体化し、二重鎖を形成する。次いで、これらの二重鎖は、ｍＲＮＡのさらなる転写またはその翻訳のいずれかをブロックする。この様式において、変異体表現型はまた生じ得る。用語「アンチセンス鎖」は、この「センス鎖」に対して相補的な核酸鎖に関して使用される。記号（−）（すなわち、「マイナス（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」）は、ときどき、アンチセンス鎖について使用され、記号（＋）は、ときどきセンス（すなわち、「プラス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」）鎖について使用される。
【０１１４】
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写産物からの異なったスプライシングによって生成される、多数のＲＮＡ種を産生し得る。同一遺伝子のスプライス改変体のｃＤＮＡは、配列同一性または完全相同性である（両方のｃＤＮＡにおける、同じエキソンの存在または同じエキソンの一部分を表す）領域、および完全に非同一性である（例えば、ｃＤＮＡ  １においてエキソン「Ａ」の存在、ｃＤＮＡ  ２において、代りに、エキソン「Ｂ」の存在を表す）領域を含む。２つのｃＤＮＡは配列同一性の領域を含むので、これらは、この遺伝子の全体また両方のｃＤＮＡにおいて見出される配列を含むこの遺伝子の一部分に由来するプローブにハイブリダイズする；従って、この２つのスプライス改変体は、このようなプローブに対して、そして互いに対して、実質的に相同性である。
【０１１５】
「形質転換」は、本明細書中で定義される場合、外因性ＤＮＡが侵入し、そして、レシピエント細胞を変化させるプロセスを記載する。これは、天然条件下または人工的条件下で、当該分野で周知の方法を使用して生じ得る。形質転換は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞に外来核酸配列を挿入するための任意の公知である方法に依存し得る。この方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、そしてこれは、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクチン、および微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を含むがこれらに限定されない。このような「形質転換された」細胞は、導入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとしてか、または宿主の染色体の一部分として複製可能である、安定に形質転換された細胞を含む。用語「形質転換」とは、本明細書中で使用される場合、真核生物細胞内に外来遺伝子を導入することをいう。
【０１１６】
トランスフェクションは、当該分野で公知の種々の方法（例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、およびバイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む）によって達成され得る。従って、用語「安定なトランスフェクション」または「安定にトランスフェクションされた」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノム中への、外来性ＤＮＡの導入および組み込みをいう。用語「安定なトランスフェクト体」とは、外来性ＤＮＡをゲノムＤＮＡに、安定に組み込んだ細胞をいう。この用語はまた、限られた期間で、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを一過的に発現する細胞を含む。従って、用語「一過性トランスフェクション」または「一過的にトランスフェクションされた」とは、細胞への外来性ＤＮＡの導入をいい、ここで、この外来性ＤＮＡは、トランスフェクションされた細胞のゲノムに組み込まれない。この外来性ＤＮＡは、トランスフェクトされた細胞の核の中に数日間存続する。この期間中、この外来性ＤＮＡは、染色体中の内因性遺伝子の発現を支配する調節性制御（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）に支配される。用語「一過性トランスフェクト体」とは、外来性ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを組み込むことはできなかった細胞をいう。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー」とは、酵素活性をコードし、さもなければ必須栄養素であるものを欠く培地の中で増殖する能力を与える遺伝子（例えば、酵母細胞中のＨＩＳ３遺伝子）の使用をいう；さらに、選択マーカーは、選択マーカーが発現された細胞において抗生物質または薬剤に対する耐性を与え得る。哺乳動物細胞系の選択マーカーの使用の概説は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）ｐｐ．１６．９−１６．１５に提供される。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、用語「レポーター遺伝子」とは、１つ以上の偶発性を満足したときに細胞中で発現され、そして発現したときに検出可能な表現型をこの細胞に与え、発現のための偶発性を満足したことを示す遺伝子をいう。例えば、ルシフェラーゼついての遺伝子は、遺伝子が細胞内で発現したときに、この細胞に発光表現型を与える。本発明において、ルシフェラーゼについての遺伝子は、エフェクターに応答してイントロンがスプライスアウトされたときにのみ、この遺伝子が発現するように、レポーター遺伝子として使用され得る。このエフェクターがイントロンのスプライシングを活性化する、これらの細胞は、ルシフェラーゼを葉発現し、そして増殖する。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、ＤＮＡセグメントを、ある細胞から別の細胞に移入する核酸分子について使用される。用語「ビヒクル」は、ときどき、「ベクター」と交換可能に使用される。用語「ベクター」はまた、本明細書中で使用される場合、所望のコード配列、および特に宿主生物内での、この作動可能に連結したコード配列の発現のために必要な、適切である核酸配列を含む、組換えＤＮＡ分子に関連する発現ベクターを含む。原核細胞での発現に必要な核酸配列は、プロモーター、（必要に応じて）オペレーター、およびリボソーム結合部位を、しばしば他の配列に沿って含む。真核生物細胞が、プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを用いることは公知である。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「増幅する」とは、核酸に関して使用される場合、当該分野で公知の任意の方法による、多数の核酸配列のコピーの産生をいう。増幅は、鋳型特異性を含む、核酸複製の特別な場合である。鋳型特異性は、頻繁に、「標的」特異性として記載される。標的配列は、これらが他の核酸から区別される場合における「標的」である。増幅技術は、主にこの区別のために設計されてきた。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」とは、精製された制限消化物中に天然に存在するか、または合成的作製される、オリゴヌクレオチドをいい、このオリゴヌクレオチドは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される（すなわち、ヌクレオチドおよび誘導因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下であって、そして適切な温度およびｐＨにある）条件下におかれたとき、合成の開始点として作用することが可能である。このプライマーは、増幅の最大効率について一本鎖であるが、代替的に、二本鎖であり得る。二本鎖である場合、このプライマーを、最初に処理し、使用する前にこの鎖を分離し、伸長産物を調製する。このプライマーは、誘導因子の存在下にて、伸長産物の合成を開始するために十分に長くなければならない。このプライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、およびこの方法の用途のような多くの因子に依存する。
【０１２２】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」とは、精製された制限消化物中に天然に存在するか、または合成的、組換え的またはＰＣＲ増幅によって作製される、目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をいう。プローブは一本鎖であっても、また、二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の、検出、同定、単離において有用である。本発明で使用される任意のプローブは、任意の「レポーター分子」で標識され、その結果、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素に基づく組織化学的アッセイ）、蛍光系、放射活性系および発光系を含むがこれらに限定されない、任意の検出系で検出可能であることが意図される。本発明が任意の特定の検出系または標識に限定されることは意図されない。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、用語「標的」とは、ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用される場合、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーにより結合される核酸領域をいう。従って、この「標的」が探索され、他の核酸配列から区別される。「セグメント」は、標的配列中の核酸領域として定義される。
【０１２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号、および米国特許第４，９６５，１８８号（これらは、本明細書中で参考として援用される）の方法をいう。これらは、クローニング工程または精製工程を用いず、ゲノムＤＮＡの混合物中で、標的配列のセグメントの濃度を増大するための方法を記載する。この標的配列を増幅するために方法は、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物中に大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、その後に、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での熱サイクルによる正確な配列決定を行う工程からなる。この２つのプライマーは、標的配列の二本鎖のそれぞれの鎖に相補的である。
【０１２５】
増幅をもたらすために、この混合物は変性され、次いで、これらのプライマーが、標的分子中のこれらの相補的配列に対してアニーリングされる。このアニーリングに続き、このプライマーは、ポリメラーゼをにより伸長され、その結果、相補鎖の新しい対が形成される。変性工程、プライマーアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長工程は、何度も反復され得（すなわち、変性、アニーリング、および伸長が、「サイクル」を構成する；多くの「サイクル」が存在する）、高濃度の所望の標的配列の増幅されたセグメントが得られる。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、プライマーの互いの相対位置により決定され、従って、この長さは、制御可能なパラメータである。このプロセスの反復局面によって、この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」と称される（以後、「ＰＣＲ」とする）。標的配列の所望の増幅されたセグメントが、この混合物中で（濃度において）優勢な配列となったとき、これらは、「ＰＣＲ増幅された」といわれる。
【０１２６】
ＰＣＲと共に、いくつかの異なる方法論（例えば、標識したプローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの取り込み後のアビジン酵素結合体検出；３２Ｐ標識デオキシヌクレオチドトリホスフェート（例えば、ＤＣＴＰまたはＤＡＴＰ）の増幅されたセグメントへの取り込み）によって、ゲノムＤＮＡ中にある特定の標的配列の単一コピーを検出可能なレベルまで増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加え、任意のオリゴヌクレオチド配列が、プライマー分子の適切なセットを使用して増幅され得る。特に、ＰＣＲプロセス自体によって作製された増幅したセグメントは、それ自体、それに続くＰＣＲ増幅に対する効率的なテンプレートである。
【０１２７】
（実施例１：ＧＰＩＴＨ１Ｐ６）
（インビボ検出適用のためのＲＣＡＮＡの操作）
最初の実施例は、ＲＣＡＮＡ構築物の作製方法を例示し、エフェクター分子に応答する遺伝子由来のＲＣＡＮＡの自己スプライシングを実証する。
【０１２８】
（ＲＣＡＮＡの構築物）オリゴ（Ｏｌｉｇｏｓ）
【０１２９】
【化１】
2004515219.tif 000003
を、１００ｐｍｏｌの各オリゴ、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、４５単位のＡＭＶ逆転写酵素（ＲＴ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む、３０μｌの反応物中で、３７℃にて３０分間、アニーリングして、そして伸長した。この伸長反応物を、水中で１対５０に希釈した。
【０１３０】
１μｌの伸長希釈物、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（ｐＨ９．０）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ｘ−１００、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４μＭのＧｐＩＷｔ１．７５：
【０１３１】
【化２】
2004515219.tif 000004
、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび１．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含むＰＣＲ反応物を、以下のレジーム（ｒｅｇｉｍｅ）のもと、２０回熱サイクルにかけた：９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で１分間。このＰＣＲ反応物を０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび２．５容量のエタノールの存在下で沈澱させ、ついで、アガロースゲル電気泳動を使用し、分子量標準と比較することよって定量した。
【０１３２】
ＲＣＡＮＡ構築物を、１０μｌ高収量転写反応物（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより）において転写した。この反応物は、５００ｎｇ  ＰＣＲ産物、３．３ｐｍｏｌの３２Ｐ［３２Ｐ］ＵＴＰ、１×ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ転写緩衝液、１０ｍＭ  ＤＴＴ、７．５ｍＭ各ＮＴＰ、および１μｌＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７ポリメラーゼミックスを含有した。この転写反応物を、３７℃で２時間インキュベートした。１ユニットのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅを添加し、そしてこの反応物を３０分間３７℃に戻した。次いで、転写物を、６％変性ポリアクリルアミドゲル上で精製し、不完全な転写物およびスプライスされた産物から全長ＲＮＡを分離し、溶出し、そして分光光度的に定量した。
【０１３３】
インビトロアッセイ。ＲＮＡ（４ｐｍｏｌ／１２μｌ  Ｈ２Ｏ）をサーモサイクラーにおいて９４℃で１分間加熱し、次いで２分にわたって３７℃に冷却した。ＲＮＡを２つのスプライシング反応物（各々９μｌ）に分けた。これらの反応物は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４５）、５００ｍＭ  ＫＣｌおよび１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、テオフィリン（２ｍＭ）（またはテオフィリンなし）を含有する。これらの反応物を即時に３０分間氷上に置いた。ＧＴＰ（１ｍＭ）を反応物（最終容量１０μｌ）に添加し、そしてこれらの反応物を３７℃で２時間インキュベートした。
【０１３４】
これらの反応物を、停止色素（１０μｌ）（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％キシレンシアノール、および０．５％ブロモフェノールブルー）の添加により終結させた。これらの反応物を３分間７０℃に加熱し、そして１０μｌを６％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。このゲルを乾燥し、ホスホルスクリーンに曝露し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて分析した。
【０１３５】
活性化を各反応物における環状イントロンの量から決定した。環化されたイントロンは、直鎖状ＲＮＡよりもゆっくりと移動し、そして図２ａおよび２ｂのゲルの＋Ｔｈｅｏレーンにおいて直鎖状ＲＮＡの濃いバンドの上方のバンドとして見られ得る。
【０１３６】
（グループＩアプタザイムのインビボスクリーニング。）ＲＣＡＮＡ構築物ならびに野生型およびネガティブコントロールを、Ｐ６領域に隣接するＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩを有するＴ４  ｔｄイントロンを含むベクターに連結し、形質転換し、そしてミニプレップした。次いで、このプラスミドをＣ６００：Ｔｈｙ  Ａ  ＫａｎＲ細胞（チミジンシンセターゼを欠損する細胞）に形質転換した。個々のコロニーを釣り上げ、そしてリッチ培地中で一晩増殖させた。テオフィリン（１μｌ：６．６ｍＭ）またはＨ２Ｏ（１μｌ）を２μｌの一晩増殖物に添加し、そして最少培地プレート、またはチミンを有する最少培地プレートのいずれかにスポットした。図３を参照のこと。
【０１３７】
（実施例２：ＧｐＩ６ＴｈＰプール）
（インビボ検出適用のためのＲＣＡＮＡを最適化するためのインビトロ選択）  実施例２は、アプタマーのヌクレオチド配列において変化が存在するようにＲＣＡＮＡの集団をいかにして生成するかを例証する。本実施例は、そのＲＣＡＮＡの集団間からエフェクター分子に対して反応性である表現型についていかにして選択するかもまた例証する。
【０１３８】
（プールの構築。）プールの構築は、個々の操作されたＲＣＡＮＡ構築物の構築と同様であった。オリゴＧｐＩＷｔ３．１２９およびＧｐＩＴｈＰ６プール：５’−ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＴＡＡ  ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＴＡＡ  ＡＣＧ  ＧＧＧ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＴＮ（１−４）Ａ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＡＧＮ（１−４）  ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＣＣＣ  ＴＴ−３’（配列番号５）を上記と同様にして伸長させた。この伸長反応物を希釈し、そしてこれをＰＣＲ反応物のための鋳型として使用した。このＰＣＲ反応物は、以下を除いて記載した反応物と同様であった：容量を２倍にし、そしてＧｐＩＷｔ４．８９をＧｐ１ＭｕｔＧ．１０１：５’−ＣＴＴ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＡＡ  ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＣＧＣ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＣＧＧ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＴＴＡ  ＡＴＣ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴ−３’（配列番号６）に置き換えた。ここで、イントロンの末端残基でＧからＡへの変異が存在する。このプールは、１．１６×１０５分子の多様性を有した。ＲＮＡを上述のようにして作製した。
【０１３９】
インビトロネガティブ選択。ＲＮＡ（１０ｐｍｏｌ／７０μｌ  Ｈ２Ｏ）をサーモサイクラーにおいて９４℃で１分間加熱し、次いで２分にわたって３７℃に冷却した。スプライシング反応物（９０μｌ）は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４５）、５００ｍＭ  ＫＣｌおよび１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有した。この反応物を即時に３０分間氷上に置いた。ＧＴＰ（１ｍＭ）を反応物（最終容量１００μｌ）に添加し、そしてこの反応物を３７℃で２０時間インキュベートした。この反応物を、２０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により終結させ、０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび２．５容量のエタノールの存在下で沈降させた。この反応物を１０μｌ  Ｈ２Ｏおよび１０μｌ停止色素中で再懸濁し、そして３分間７０℃に加熱し、そしてＣｅｎｔｕｒｙＴＭＭａｒｋｅｒラダー（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を有する６％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。このゲルをホスホルスクリーンに曝露し、そして分析した。未反応物ＲＮＡをこのゲルから単離し、１０μｌのＨ２Ｏ中に沈降させ、そして再懸濁した。
【０１４０】
（ポジティブ選択。）ＲＮＡ（ネガティブ選択の５μｌ）をサーモサイクラーにおいて９４℃で１分間加熱し、次いで２分にわたって３７℃に冷却した。ポジティブスプライシング反応物（４５μｌ）は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４５）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭテオフィリンを含有した。この反応物を即時に３０分間氷上に置いた。ＧＴＰ（１ｍＭ）を反応物（最終容量５０μｌ）に添加し、そしてこの反応物を３７℃で１時間インキュベートした。この反応物を、停止色素の添加により終結させ、３分間７０℃に加熱し、そしてＣｅｎｔｕｒｙＴＭＭａｒｋｅｒラダーを有する６％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。このゲルをホスホルスクリーンに曝露し、そして分析した。直鎖状イントロンに対応するバンドをこのゲルから単離し、そして２０μｌのＨ２Ｏ中に沈降させ、そして再懸濁した。
【０１４１】
（増幅および転写。）ＲＮＡを、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＤＴＴ、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ  ２μＭ  ＧｐＩＭｕｔＧ．１０１および４００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含有する反応物において逆転写した。次いで、ｃＤＮＡを上記のようにＰＣＲ増幅し、転写し、そしてゲル精製した。
【０１４２】
図３は、本発明のグループＩイントロンについてのインビボアッセイシステムを示す。ｔｄイントロンは、通常、ファージＴ４中のチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）のｔｄ遺伝子内に存在する。細胞ＴＳを欠損するＴｈｙＡ  Ｅ．ｃｏｌｉ宿主は、外因性チミンまたはチミジンの不在下（−Ｔｈｙ）では増殖し得ない。クローン化されたｔｄ遺伝子は、ＴｈｙＡ細胞を相補し得、そして−Ｔｈｙ培地上で増殖し得る。逆に、ＴＳを欠損する細胞は、チミジンおよびトリメトプリムを含有する培地において選択有利性を有する。従って、テオフィリン応答性グループＩアプタザイムを有する細胞は、テオフィリンの存在下、ならびにチミジンの不在下でより良好に増殖する。対照的に、同じ細胞が、テオフィリンの不在下、ならびにチミジンおよびトリメトプリムの存在下でより良好に増殖する。
【０１４３】
このストラテジーは、テオフィリン依存性活性化についてはポジティブなインビボでのスクリーンおよび選択、およびテオフィリン不在抑制についてはネガティブなインビボでのスクリーンおよび選択の両方を提供する。図３のアッセイシステムを、本発明の特定の実施形態においてグループＩアプタザイムのインビボでのスクリーニングのために、上記の実施例１で用いた。
【０１４４】
図４ａは、本発明のＲＣＡＮＡのプールを生成するためにランダム化された短い領域によって抗テオフィリンアプタマーに結合されたグループＩリボザイムのＰ６領域の必須残基を図示する。図４ａにおいて太字で示した残基はＰ６必須残基であり、そして図４ａにおいて色のうすい残基は、抗テオフィリンアプタマーである。図４ａにおいて、ランダム化された領域を「Ｎ１−４」と称する。約４０のランダムな配列残基を構築物のＮ１−４領域に導入し、ＲＣＡＮＡのプールを合成する。このプールを伝達モジュールプールという。
【０１４５】
（実施例３）
（ポリペプチド依存性の調節可能な触媒的に活性な核酸）
天然核酸は、しばしば、安定化または触媒活性についてタンパク質に依存する。対照的に、インビトロで選択された核酸は、タンパク質の不在下でさえも広範な反応物を触媒し得る。タンパク質機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）を用いて選択された核酸を増強するために、本発明は、タンパク質依存性リボザイムリガーゼの選択のための技術を包含する。
【０１４６】
リボザイムリガーゼの触媒ドメイン（Ｌ１）をランダム化し、そして２つのタンパク質補因子（チロシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｃｙｔ１８）または雌鳥卵白リゾチーム）の１つを必要とする改変体を選択した。得られた調節可能な触媒的に活性な核酸は、それらの同族タンパク質エフェクターによって数千倍活性化され、そしてネイティブタンパク質の構造を特異的に認識し得た。タンパク質依存性の調節可能な触媒的に活性な核酸は、標的タンパク質の検出のための新規なアッセイに適応し得、そして本明細書中で実証されるような選択方法の一般性は、高スループットの方法および装置を用いる、調節可能な触媒的に活性な核酸の同定を可能にする。これらの調節可能な触媒的に活性な核酸は、例えば、プロテオームのかなり大きな画分を認識し得る。
【０１４７】
アロステリックタンパク質に対して驚くべき活性化パラメーターを示すエフェクター調整リボザイム（ＲＣＡＮＡ）を設計および選択することが可能であることが認識されている。例えば、本発明者らは、Ｂｒｅａｋｅｒおよび彼の共同研究者が、低分子であるＡＴＰの存在下で１８０倍阻害されるアロステリックハンマーヘッドリボザイムを操作したことを認識した（Ｔａｎｇ，Ｊ．＆Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４，４５３−４５９（１９９７））。本発明者らはまた、テオフィリンの存在下で１，６００倍活性化されるエフェクター活性化リボザイムリガーゼもまた操作していた  （Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｌｉｇａｓｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，１７５１−１７５９（２０００））。アロステリックドメインはまた、ハンマーヘッドリボザイムに付加されたランダム配列プールから選択された；これらのドメインは、他の低分子（例えば、環状ヌクレオチド一リン酸）によってリボザイムの５，０００倍の活性化を媒介する  （Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｓｏｕｋｕｐ，Ｇ．Ａ．，Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｎ．＆Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ  ｃＧＭＰ  ａｎｄｃＡＭＰ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，１０６２−１０７１（１９９９））。
【０１４８】
本発明者らは、リボザイムだけでなく、タンパク質エフェクターによって活性化される核酸セグメントをもまた同定することができることを認識しており、そしてこれを実証する。本発明者らは、リボザイムを単離しようとする以前の試みがそれらのリボザイム内の活性触媒ドメインを必要としたことをさらに認識していた。以前に単離された全てのリボザイムが、天然または増強された触媒ドメインを伴って設計され、改変され、単離され、または同定されており、従って、これらのリボザイムの単離は、それらの単離のために触媒ドメインに極度に依存している。
【０１４９】
真正細菌由来のＲＮＡｓｅ  Ｐリボザイムが、ｔＲＮＡの切断を触媒することが示されており、通常、その活性を実質的に増強するタンパク質（Ｐ−タンパク質）と複合体化される。同様に、グループＩイントロンＮＤ１は、Ｃｙｔ１８（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａミトコンドリア由来のチロシルｔＲＮＡシンセターゼ）に極度に依存し、一方、イントロンｂＩ５の三次構造がその同族タンパク質であるＣＢＰ２によって安定化される。タンパク質は、ＲＮＡ分子のフォールディングを補助することがしばしば見出されており、そのタンパク質は、ポリアニオン性骨格を部分的に溶媒和するシャペロンとして作用する（Ｗｅｅｋｓ，Ｋ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｆｏｌｄｉｎｇ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７，３３６−３４２（１９９７））。
【０１５０】
本発明は、調節可能な触媒的に活性な核酸の単離についての一般化された選択スキームを包含する。本発明を用いて、リボザイムな新規なクラスというより、むしろタンパク質エフェクター（例えば、Ｃｙｔ１８およびリゾチーム）によって数千倍特異的に活性化される調節可能な触媒的に活性な、核酸の新規なクラスが作出され、単離され、そして同定されている。
【０１５１】
タンパク質依存性リボザイムのインビトロ選択。ペプチド依存性リボザイムおよびタンパク質依存性リボザイムを同定しようと試みる一方、本発明者らは、低分子エフェクターによって活性化されたリボザイムの設計および選択について新規なストラテジーを用いた。しかし、ペプチド結合部位およびタンパク質結合部位が低Ｌ１リガーゼのステムＣに付加された場合（図１７Ａ）、同族のペプチドまたはタンパク質のエフェクターの存在下では活性の調節はほとんどまたは全くなかったことが観察された（データは示さず）。同様に、ステムＣの末端にランダム配列ループが導入された場合、タンパク質依存性改変体についての選択は、非常に控えめな活性化（＜２×）しか生じなかった。
【０１５２】
タンパク質依存性リボザイムの操作は、低分子依存性リボザイムの操作よりも根本的に異なる原則を必要とすることが、次いで発見された。特に、限定されたアロステリック部位に結合し得る低分子が順番に、コアリボザイムの二次構造および三次構造の小さいが有意な再編成を増強することが認識された。より大きなエフェクター分子（例えば、タンパク質）がよりずっと大きな部位に結合し、そして触媒コアを立体的に阻害することがさらに発見された。従って、選択において触媒コアを含むことが必要であった。このために、必須触媒残基もまたランダム化された（図１７Ｂ）Ｌ１リガーゼに基づく核酸セグメントプール（Ｌ１−Ｎ５０）を設計した。
【０１５３】
Ｌ１−Ｎ５０プール（１０１５出発種）を連結活性についてネガティブ選択およびポジティブ選択と反復するレジメに供した（図１７Ｃ）。このプールをまずビオチン化基質とインキュベートし、そして反応性種を取り出した；次いで、このプールをエフェクター分子（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａミトコンドリア由来のチロシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｃｙｔ１８））と混合し、そして反応性種を取り出し、そして増幅した。Ｃｙｔ１８タンパク質をエフェクターとして選択した。なぜなら、これは天然ＲＮＡ触媒（グループＩ自己スプライシングイントロン）と密接に結合（フェムトモル濃度範囲のＫｄ）し、かつ活性化することが公知であったからである。これらの研究の過程で、および一般に本発明を用いるネガティブ選択スクリーニングにおいて、ネガティブ選択のストリンジェンシーは、Ｃｙｔ１８の不在下で連結を可能にする時間および基質濃度を増大させることにより、増大され得る。逆に、ポジティブ選択のストリンジェンシーは、連結を可能にする時間および基質濃度を減少させることにより、増大され得る（図１８Ａ）。
【０１５４】
タンパク質依存性活性化の程度を標準アッセイにおいて評価し、そしてこれは、ラウンド５から先は漸次的に増大した（図１８Ｂ）。ラウンド７までには、タンパク質依存性活性化は、５０，０００倍より大きかった。選択の完了時には、それは７５，０００倍をまで上昇した。選択した集団における最も優勢なクローン（ｃｙｔ７−２）が、Ｃｙｔ１８の存在下では１．６ｈ−１の観察速度で連結反応物を行ったが、このタンパク質を反応物から除いた場合、この速度は、０．００００５ｈ−１に低下した（３４，０００倍の差異）。この選択からの別のクローン（ｃｙｔ９−１８）はなおより良好な活性化パラメーターを有し、その反応においてＣｙｔ１８を含んだ場合２．１ｈ−１の速度で連結するが、タンパク質がなければたった０．００００２ｈ−１の速度であり、９４，０００倍の差異があった。重要なことに、これらの値は、アロステリックタンパク質酵素の既知のリガンド媒介活性化よりも大きな多くの桁のマグニチュードであり、低分子エフェクターによるリボザイムの以前に観察された活性化よりも１０〜１００倍大きい。
【０１５５】
アプタザイムリガーゼのＣｙｔ１８活性化の程度が強い印象を与えた一方、Ｃｙｔ１８がグループＩ自己スプライシングイントロンを同様に活性化することが以前に示された。リボザイム触媒のタンパク質依存性活性化について選択する能力が特定のタイプのタンパク質に特異的であるか、またはより一般的な現象であるかを決定するために、ＲＮＡに結合するとが、通常知られていないタンパク質により活性化され得たリボザイムリガーゼ、雌鳥卵白リゾチームを単離した。同じ選択スキームおよびストリンジェンシーにおける漸増を用いて（図１８Ｃ）、リゾチームにより活性化された調節可能な触媒的に活性な核酸を、１１サイクルの選択および増幅において単離した。最終の選択された集団は、リゾチームにより約８００倍活性化され（図１８Ｄ）、そして単離されたクローンであるｌｙｓ１１−２は、３１００倍の活性化を示し、これは、リゾチームの存在下では０．６ｈ−１の観察速度で連結するが、リゾチームの不在下では０．０００２ｈ−１でしかなかった。
【０１５６】
タンパク質依存性リボザイムの特徴づけ。個々のリボザイムを両選択からクローン化し、そして配列決定した（図１９Ａ）。両場合とも、ほんの少数のファミリーのリボザイムのみが残った。これらの結果は、低有機リガンドを用いるリボザイム選択について以前に観察された結果とより一致する。本発明を用いて、個々の配列は、Ｌ１リガーゼの一般構造状況内で適合するようにフォールディングされ得た（図１９Ｂ）。選択されたリボザイムは、親のＬ１リガーゼと同様に、活性について３’プライマーの存在になお高度に依存性であった。選択した配列が、伸長した「ステムＣ」構造を形成すると仮定した。このような伸長したステムの形成もまた、Ｌ１リガーゼと一致した。
【０１５７】
ヘアピンに隣接するステムＣの遠位部分は、部分ランダム化および再選択後に保存されなかった。このことは、リボザイムのこの部分が活性に必須でないことを示している。さらに、ステムＣの遠位のヘアピン部分は、活性の損失なく短縮化され得、そしてこのヘアピンは、調節可能な触媒的に活性な核酸を生成するために低有機リガンドを結合するアプタマーによって置換され得る。３−アーム接合部に近接するステムＣの中間ループ領域は、ドープされた（ｄｏｐｅｄ）配列選択後に保存されたが、リガーゼ機能についての選択後のこの領域の完全なランダム化は、種々の配列分解（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を生じた。従って、選択されたタンパク質依存性リボザイムは、この領域において親リボザイムとは実質的に異なった。
【０１５８】
活性化の特異性。タンパク質エフェクターによる選択されたリボザイムの活性化の特異性を評価するために、Ｃｙｔ１８依存性集団を、種々のタンパク質とインキュベートした。このようなタンパク質には、リゾチーム、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼ、リシンＡ鎖、およびＭＳ２外被タンパク質が含まれる。単離の間使用されなかったタンパク質による活性化は見られなかった。同様に、リゾチーム依存性クローンを、Ｃｙｔ１８、シチメンチョウリゾチーム、およびヒト乳汁由来リゾチームとインキュベートした。極度に相同（９８％）なシチメンチョウリゾチームのみが交差活性化を示した。一方、他のタンパク質エフェクターは不活性であった。従って、活性化は、高度に特異的であり、そしてタンパク質調製の間に導入され得たいくつかの夾雑因子（塩、マグネシウム）による活性化はなさそうである。さらに、非同族タンパク質のいくつかがＲＮＡを特異的および非特異的の両方で結合することが公知であったので、タンパク質「塩」によるリボザイム構造の一般的な安定化もまた、活性化についてありそうにない機構である。
【０１５９】
それにもかかわらず、各タンパク質調製物に独特の夾雑物質は活性化の原因であることがなお可能であった。交差反応性についてこの原因を割り引くために、調節可能な触媒的に活性な核酸を、不活性化された同族タンパク質とインキュベートした（データは示さず）。Ｃｙｔ１８を、加熱またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とのインキュベーションのいずれかによって変性し、一方、リゾチームを、ジスルフィド結合還元と加熱との組み合わせによって変性した。変性Ｃｙｔ１８は、リボザイム触媒を活性化できなかった。一方、還元および変性の両方を行ったリゾチームのみが、触媒を活性化できなかった。還元および変性の両方が、リゾチーム活性を除去するために必要とされる。選択されたリボザイムがそれらのタンパク質エフェクターについて特異的であっただけではなく、タンパク質のコンフォメーションにも依存し得るかのようであった。実際、抗ペプチド抗体がタンパク質構造を部分的に変性することが示されたとすると、タンパク質活性化リボザイムは、タンパク質コンフォメーションに対して他のタンパク質よりもずっと特異的であることが見出されるとされ得る。
【０１６０】
次に、本発明者らは、タンパク質エフェクターのＲＮＡインヒビターを使用することにより、個々の調節可能な触媒的に活性な核酸の活性化を探索した。以前に選択された抗Ｃｙｔ１８アプタマー（データは示さず）および抗リゾチームアプタマーの両方を、これらの選択に使用したものと同様の緩衝液条件下で使用した。これらおよび他のＲＮＡ分子を、調節可能な触媒的に活性な核酸およびそれらのタンパク質エフェクターと共にインキュベートし、そしてタンパク質依存性活性化を評価した。いくつかのＲＮＡ分子は、クローンｃｙｔ７−２のＣｙｔ１８活性化をわずかに減少した。これは、おそらく、結合についての非特異的競合に起因する。しかし、活性における最も大きい低下は、Ｃｙｔ１８に特異的に結合することが知られるＲＮＡによって観察された。ＮＤ１イントロンは、Ｃｙｔ１８についてのインビボ基質であった。そして、これは、活性において最大の低下を示し、一方、ＮＤ１と相互作用するＣｙｔ１８の能力を阻害することが示されたアプタマー（Ｍ１２；Ｃｏｘ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，未公開の結果）もまた有効なエフェクターであった。対照的に、Ｃｙｔｌ８に結合するが、ＮＤ１とのその相互作用を阻害しないアプタマー（Ｂ１７；データは示さず）は、以下と変わりなく活性化を阻害する：抗リゾチームアプタマー（ｃ１）、ランダム配列プール（Ｎ３０）、またはｔＲＮＡ。その対応する調節可能な触媒的に活性な核酸（ｌｙｓ１１−２）のリゾチーム活性化は、高親和性抗リゾチームアプタマー（ｃｌ、Ｋｄ＝３１ｎＭ）（これは、バックグラウンドレベルにまで活性化を低下した）を除いて全てのインヒビターに対して、比較的影響されないことが分かった。これらの異なるＲＮＡ種で観察された阻害の特異性は、エフェクタータンパク質とそれらの同族の調節可能な触媒的に活性な核酸との間の相互作用の特異性をさらに強調する。
【０１６１】
リゾチーム結合とリボザイム活性化との間の直接の相関が立証できた（図２１）。リゾチームは、その調節可能な触媒的に活性な核酸と見かけのＫｄ  １．５μＭで相互作用し、一方、Ｃｙｔ１８の調節可能な触媒的に活性な核酸は、２．５μＭまでのタンパク質濃度でさえも飽和できなかった。さらに、リゾチーム依存性リボザイムの活性を塩濃度の関数としてアッセイした場合、結合および触媒作用はともに高い（１Ｍ）塩濃度によって抑制された（データは示さず）。興味深いことに、ナイーブなプールの結合を試験した場合、それはＫｄ  １．３μＭで結合した；その２つの結合曲線は、重なり合い得るものであった。従って、結合関数が選択について必要である標準のアプタマー選択とは異なり、本発明の調節可能な触媒的に活性な核酸は、新生結合に影響を及ぼすことなく活性化のために最適化され得る。一般にリゾチームはランダムプールを大きな程度まで活性化しないとすると、このことは、選択された境界面の特異性をさらに強調する。
【０１６２】
天然のリボ核タンパク質において、タンパク質成分は、活性なＲＮＡコンフォマー（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒｓ）を安定化させることにより、それらの核酸対応物を活性化する。酵母ミトコンドリアタンパク質ＣＢＰ２は、イントロンｂＩ５の活性三次構造を優先的に安定化し、一方、Ｃｙｔ１８は、ＮＤ１イントロンのフォールディングおよび安定化を補助する。ＲＮａｓｅ  ＰのＰタンパク質は、リボザイムの活性部位付近に結合し、そして基質特異性に影響を与えることが示されている。しかし、リボヌクレアーゼＰとは異なり、本発明のタンパク質補因子、核タンパク質酵素の機能は、単に一価塩濃度を増大させることによって複製され得ない。従って、本発明の方法は、調節可能な触媒的に活性な核酸を選択するために用いられ得、ここで、活性化された触媒は、改変された触媒ドメインおよびそのタンパク質「補因子」の相乗的性質である。この有利な点から、リボザイムの役割は、タンパク質結合について適応的なプラットフォームを提供する。
【０１６３】
タンパク質エフェクターに対して反応性であるリボザイムを選択する能力は、バイオセンサーアレイの開発のために重要な意味を有する。本発明は、プロテオーム標的に対する抗体の同定と合わせて、またはその代わりとして使用され得、そしてプロテオソーム分析のための抗体ベースのチップが開発中である。しかし、このようなチップの性能は、抗体の性能に固有に結び付けられる。サンドイッチスタイルアッセイを開発するために、重複しないエピトープを認識する少なくとも２つの異なる抗体が、各タンパク質標的について同定される必要があり、抗体：レポーター結合体のバックグラウンド結合は、ＥＬＩＳＡスタイルアッセイの感度を余儀なく制限する。対照的に、タンパク質依存性の調節可能な触媒的に活性な核酸が、チップ上に固定化され、それらのタンパク質標的を一時的にであるが特異的に認識し、オリゴヌクレオチド基質に結合体化されたレポーターを共有結合的に共固定化し、そして次いでストリンジェントに洗浄してバックグラウンドを低減させ得た。本明細書中に開示されるような、インビトロでの選択手順の自動化は、高スループットの調節可能な触媒的に活性な核酸の選択であって、プロテオーム標的およびメタボローム（ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ）標的が検出および定量されることを可能にする、選択を開発することが可能であることを実証する。
【０１６４】
（Ｌ１−Ｎ５０プールおよびプライマーの合成）
Ｌ１−Ｎ５０プールおよびプライマーを標準的なホスホロアミダイト法を用いて合成した。一本鎖プール（５’ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣ−（Ｎ５０）−ＧＡＧＧＴＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＧＣ（配列番号７）の４２４μｇ（計算値、１０１５分子）Ｔ７プロモーターに下線を引いた、Ｎ＝Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ）を１００ｍＬのＰＣＲ反応で、プライマー２０．Ｔ７（５’ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）（配列番号８）および１８．９０ａ（５’ＧＣＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＡＧ）（配列番号９）を用いて増幅した。選択において用いた基質は、Ｓ２８Ａ−ビオチン（ビオチン−（ｄＡ）２２−ｕｇｃａｃｕ；小文字はＲＮＡ）であった。この基質（Ｓ２８Ａ）の非ビオチン化様式を、ほとんどのライゲーションアッセイにおいて用いた。選択の間に、選択的ＰＣＲプライマーセット、２８Ａ．１８０（５’（ｄＡ）２２−ＴＧＣＡＣＴ）／１８．９０ａを用いて結合したリボザイムを増幅した。修復性ＰＣＲプライマーセット、３６．ｄＢ．２（５’ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣ）（配列番号１０）／１８．９０ａは、Ｔ７プロモーターを選択されたプールへ戻して、さらなるラウンドの転写および選択の調製に備えた。
【０１６５】
（タンパク質依存性リボザイムのインビトロ選択）
簡潔には、プールＲＮＡ（５μＭ）および１８．９０ａ（１０μＭ）をまず水中で変性した。次いで、結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）および基質オリゴヌクレオチド（Ｓ２８Ａ−ビオチン、１０μＭ）を標的タンパク質なしで添加した（ラウンドＩを除く）。２５℃でのこのネガティブ（−）インキュベーションの後、選択混合物をストレプトアビジン−アガロース樹脂（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて分離して、ビオチン化基質（遊離しているか、リボザイムに結合している）を捕獲した。未結合のリボザイムを含む溶出液を集め、第２のポジティブ（＋）インキュベーションを標的タンパク質（１０μＭ）およびさらなる基質（Ｓ２８Ａ−ビオチン、１０μＭ）を添加することで開始した。２５℃でのインキュベーション後に、この混合物をストレプトアビジン−アガロースを用いて再び分離した。結合したリボザイムを含む樹脂をよく洗浄し、次いでＲＴ緩衝液中（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３，７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，４００μＭ  ｄＮＴＰ，５ｕＭ  １８．９０ａ）に懸濁し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて逆転写した。次いで、樹脂スラリー中のｃＤＮＡ分子を、第１の選択プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、次いで修復プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。最終的なＰＣＲ産物をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて転写した。ストリンジェンシーを、（ポジティブ選択の）リガンドインキュベーション時間を減じ、（ネガティブ選択の）リガンドインキュベーション時間を増加することによって、選択の工程にわたって着々と増加した（図１８Ａおよび１８Ｃを参照）。
【０１６６】
（ライゲーションアッセイ）
１つの例において、１０ｐｍｏｌの［３２Ｐ］−体（ｂｏｄｙ）−標識リボザイムおよび２０ｍｏｌのエフェクターオリゴヌクレオチドを５μＬの水中で３分間７０℃で変性した。ＲＮＡ混合物を室温まで冷やした後、ライゲーション緩衝液および標的タンパク質（他に記載のない限り２０ｐｍｏｌ、またはリガンド（−）サンプルの場合はリガンドの代りに水）を添加した。５分間の室温での平衡化の後、反応を２０ｐｍｏｌの基質オリゴヌクレオチド（Ｓ２８Ａ）の添加により、最終容量１５μＬで開始した。反応物を２５℃でインキュベートし、４μＬのアリコートを３つの適切な時点で取りだし、１８μＬのＳＤＳ停止混合物（１００ｍＭ  ＥＤＴＡ，８０％  ホルムアミド，０．８％  ＳＤＳ，０．０５％ブロモフェノールブルー，０．０５％キシレンシアノール）を添加することよって、終了した。サンプルを３分間７０℃で変性し、結合した種および結合しなかった種を、８％ポリアクリルアミドゲル（０．１％ＳＤＳ含）上で互いに分離し、形成された産物の量をＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて決定した。タンパク質の広範な濃度（例えば、図２１）にわたって実施したアッセイは、１ｐｍｏｌのリボザイムしか１０μＬの最終容量に存在しない典型的な反応条件とは異なった。
【０１６７】
（タンパク質不活性化）
標準的なライゲーションアッセイを上記のように実施したが、タンパク質サンプルの存在下においては、タンパク質サンプルを以下のように前処理した。Ｃｙｔ１８タンパク質を１０分間７０℃で加熱することにより変性するか、または６％ＳＤＳ（ライゲーション反応物中で０．７％  ＳＤＳ）を添加することよよって変性した。リゾチームを、１０分間１００℃で加熱するか、または室温で１０分間２ｍＭ  ＤＴＴ（最終反応物中で０．３ｍＭ  ＤＴＴ）の存在下で、タンパク質を不活性化せずに、インキュベートした。タンパク質を１０分間７０℃で２ｍＭ  ＤＴＴの存在下で加熱することによって首尾よく不活性化した。ライゲーション反応を１．３μＭのタンパク質を用いて、５分間２５℃でインキュベートした１５μＬの反応物中で実施した。
【０１６８】
（競合アッセイ）
ライゲーションアッセイを上記のように実施し、１０ｐｍｏｌの［３２Ｐ］−体−標識リボザイム（ｃｙｔ７−２またはｌｙｓ１１−２；１μＭ）および２０ｐｍｏｌのエフェクターオリゴヌクレオチドを用いた。変性されアニールされたＲＮＡ混合物を、ライゲーション緩衝液、２０ｐｍｏｌタンパク質（Ｃｙｔ１８、リゾチーム、またはタンパク質サンプル（−）の場合、水；２μＭ）および３０ｐｍｏｌの変性されアニールされた競合ＲＮＡ（３μＭ）と合わせた。競合ＲＮＡは、以下の通りである：
Ｍ１２
ＧＧＧＡＡ  ＵＧＧＡＵ  ＣＣＡＣＡ  ＵＣＵＡＣ  ＧＡＡＵＵ  ＣＧＡＧＵ  ＣＧＡＧＡ  ＡＣＵＧＧ  ＵＧＣＧＡ  ＡＵＧＣＧ  ＡＧＵＡＡ  ＧＵＵＣＡ  ＣＵＣＣＡ  ＧＡＣＵＵ  ＧＡＣＧＡ  ＡＧＣＵＵ）  （配列番号１１），
Ｂ１７
ＧＧＧＡＡ  ＵＧＧＡＵ  ＣＣＡＣＡ  ＵＣＵＡＣ  ＧＡＡＵＵ  ＣＧＵＡＧ  ＣＧＵＡＧ  ＡＧＵＡＵ  ＧＡＧＡＧ  ＡＧＣＣＡ  ＡＧＧＵＣ  ＡＧＧＵＵ  ＣＡＣＵＣ  ＣＡＧＡＣ  ＵＵＧＡＣ  ＧＡＡＧＣ  ＵＵ）  （配列番号１２）
ｃｌ
ＧＧＧＡＡ  ＵＧＧＡＵ  ＣＣＡＣＡ  ＵＣＵＡＣ  ＧＡＡＵＵ  ＣＡＵＣＡ  ＧＧＧＣＵ  ＡＡＡＧＡ  ＧＵＧＣＡ  ＧＡＧＵＵ  ＡＣＵＵＡ  ＧＵＵＣＡ  ＣＵＣＣＡ  ＧＡＣＵＵ  ＧＡＣＧＡ  ＡＧＣＵＵ  （配列番号１３）
ＮＤ１
ＧＡＣＵＡ  ＡＵＡＵＧ  ＡＵＵＵＧ  ＧＵＣＵＣ  ＡＵＵＡＡ  ＡＧＡＵＣ  ＡＣＡＡＡ  ＵＵＧＣＵ  ＧＧＡＡＡ  ＣＵＣＣＵ  ＵＵＧＡＧ  ＧＣＵＡＧ  ＧＡＣＡＡ  ＵＣＡＧＣ  ＡＡＧＧＡ  ＡＧＵＵＡ  ＡＣＡＵＡ  ＵＡＡＵＧ  ＵＵＡＡＡ  ＡＣＣＵＵ  ＣＡＧＡＧ  ＡＣＵＡＧ  ＡＣＧＵＧ  ＡＵＣＡＵ  ＵＵＡＡＵ  ＡＧＡＣＧ  ＣＣＵＵＧ  ＣＧＧＣＵ  ＣＵＵＡＵ  ＵＡＧＡＵ  ＡＡＧＧＵ  ＡＵＡＧＵ  ＣＣＡＡＡ  ＵＵＵＧＵ  ＡＵＧＵＡ  ＡＡＵＡＣ  ＡＡＡＡＵ  ＧＡＵＡＡ  ＡＡＡＡＡ  ＡＡＵＧＡ  ＡＡＵＣＡ  ＵＡＵＧＧ  Ｇ  （配列番号１４）
Ｎ３０
ＧＧＧＡＡ  ＵＧＧＡＵ  ＣＣＡＣＡ  ＵＣＵＡＣ  ＧＡＡＵＵ  Ｃ−Ｎ３０−Ｕ  ＵＣＡＣＵ  ＣＣＡＧＡ  ＣＵＵＧＡ  ＣＧＡＡＧ  ＣＵＵ  （配列番号１５）
ここでＮ＝（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）およびｔＲＮＡ（酵母由来；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。反応物を５分間２５℃でインキュベートし、２０ｐｍｏｌの基質オリゴヌクレオチド（Ｓ２８Ａ；２μＭ）を添加して、最終容量１０μＬで開始した。Ｃｙｔ１８反応物を５分間２５℃でインキュベートし、リゾチーム反応物を１０分間インキュベートした。反応を４５μＬのＳＤＳ／尿素停止混合物（７５ｍＭ  ＥＤＴＡ，８０％ホルムアミド，飽和尿素，飽和ＳＤＳ，０．０５％ブロモフェノールブルー，０．０５％キシレンシアノール）を添加することによって終了し、８％ポリアクリルアミドゲル（０．１％  ＳＤＳ含）上で上記のように分析した。
【０１６９】
（結合アッセイ）
１ｐｍｏｌの［３２Ｐ］−体−標識ＲＮＡ、２０ｐｍｏｌの１８．９０ａおよび種々の量の標的タンパク質（１ｐｍｏｌ〜５ｐｍｏｌ）を、５０μＬのライゲーション緩衝液中で合わせることより結合アッセイを３連で、実施した。３０分間の室温でのインキュベーション後、この混合物を減圧下で、一連のニトロセルロースフィルターおよびナイロンフィルターを通して吸引して、１５０μＬのライゲーション緩衝液で洗浄した。タンパク質結合ＲＮＡ  対  遊離ＲＮＡの比を、ニトロセルロースフィルター上に残ったカウント  対  ナイロンフィルター上に残ったカウントを分析することによって決定した。
【０１７０】
図１７における、Ｌ１  リガーゼ、Ｌ１−Ｎ５０プールおよび選択スキーム。図１７（ａ）は、Ｌ１リガーゼがプール設計のための出発点であったことを示す。ステムＡ、ＢおよびＣを示す。影になった領域は、触媒コアおよび結合接合部を示す。プライマー結合部位は、小文字で示され、活性に必要なオリゴヌクレオチドエフェクターは、イタリック体で示され、ライゲーション基質は太字で示される。ライゲーション基質上の「タグ」は、変えられ得るが、この選択を通しては、ビオチン−（ｄＡ）２２であった。図１７（ｂ）は、Ｌ１−Ｎ５０プールが、５０のランダム配列位置を含み、そしてリボザイムコアの位置にオーバーラップすることを示す。ステムＢは、大きさを減じられ、安定なＧＮＲＡテトラループ（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）で終了される。そしてステムＡの位置Ｕ５を、Ｃ（太字）に変異して、Ｇ６９と塩基対を形成して、このステムの安定性を増大する。図１７（ｃ）は、本発明の１つの選択スキームを示す。ＲＮＡプールをビオチン化基質とインキュベートし、反応生の改変体を集合から取り出した。残っている種を再び、ビオチン化基質と、標的タンパク質（Ｃｙｔ１８またはリゾチーム）の存在下でインキュベートした。反応性の改変体を集合から取りだし、逆転写、ＰＣＲおよびインビトロ転写によって優先的に増幅した。
【０１７１】
図１８は、Ｌ１−Ｎ５０選択の進行を示す。図１８（ａ）は、Ｃｙｔ１８依存性リボザイムの選択条件を示す。「基質」の行は、リボザイムに対する基質の過剰のモル数を示す。図１８（ｂ）は、Ｌ１−Ｎ５０  Ｃｙｔ１８選択の進行を示す。各選択ラウンドについてのライゲーション比を、Ｃｙｔ１８の存在下で実施したアッセイに対しては黒棒として、そしてＣｙｔ１８の非存在下で実施したアッセイに対しては灰色棒としてプロットする。灰色線は、Ｃｙｔ１８による活性化レベルであり、右側の軸に対して、評価される。図１８（ｃ）および１８（ｄ）は、リゾチーム依存性リボザイムの選択条件およびＬ１−Ｎ５０リゾチーム選択を示す。図式の決まり事は、図１８ｂと同様である。
【０１７２】
図１９は、タンパク質依存性に調節可能な触媒的に活性な核酸配列および構造を示す。図１９（ａ）は、リボザイムＮ５０領域の配列を示す。Ｃｙｔ−１８依存性クローンは、接頭語「ｃｙｔ」によって示され、リゾチーム依存性クローンは、接頭語「ｌｙｓ」によって示される。これらの接頭語に続く数は、このリボザイムがクローン化されたラウンドを示す（例えば、ｃｙｔ７−２は、選択ラウンドの７回目であった）。提供されるモチーフが配列決定された集合に（３６の「ｃｙｔ」クローンおよび２４の「ｌｙｓ」クローンから）現れる頻度は、括弧内に示される。個々のクローン間においての配列領域の類似性を線で囲んだ。図１９（ｂ）は、優性なＣｙｔ−１８依存性クローンｃｙｔ７−２の仮説上の２次構造である。
【０１７３】
図２０は、不活性化タンパク質サンプルを用いたリボザイム活性を示す。Ｃｙｔ−１８依存性クローンｃｙｔ９−１８およびリゾチーム依存性クローンｌｙｓ１１−２についてのライゲーションアッセイを、それぞれ処理されたＣｙｔ１８およびリゾチームの存在下で実施した。
【０１７４】
図２１は、アプタマー競合アッセイを実証する。ｃｙｔ７−２およびｌｙｓ１１−２の相対的なライゲーション活性を、種々の特異的および非特異的なアプタマーならびにＲＮＡ構築物の存在下でアッセイした。（＋）示したサンプルは、競合物を伴わない活性化タンパク質を含み、一方（−）示したサンプルは、タンパク質を含まない。他のサンプルは、Ｃｙｔ１８（Ｍ１２、Ｂ１７）もしくはリゾチーム（ｃ１）のいずれかに対するアプタマー、Ｃｙｔ１８（ＮＤ１）を結合するＩ群のイントロン、または教科書で示されるような他の非特異的ＲＮＡを含む。図２１は、タンパク質濃度の関数としての結合活性およびライゲーション活性を示す。リゾチームに結合したｌｙｓ１１−２  ＲＮＡの画分（白ぬき四角型（Ｇ）、左軸）を、ｌｙｓ１１−２  ＲＮＡの反応速度（黒塗り丸（Ｊ）、右軸）上に、リゾチームの濃度範囲にわたって、重ね合わせた。
【０１７５】
（実施例４）
（ペプチド特異的に調節可能な、触媒活性核酸）
（Ｒｅｖ依存性ＲＮＡリガーゼリボザイム）
Ｌ１−Ｎ５０プール（１０１５の出発種）を、ライゲーション活性に対するネガティブおよびポジティブ選択の反復レジメンに供した。プールをまず、ビオチン化基質とインキュベートし、反応種を取り出した；次いでプールをエフェクター分子（ＨＩＶ  Ｒｅｖタンパク質の１７アミノ酸フラグメント）と混合し、反応種を取りだし、増幅した。Ｒｅｖペプチドは、高い塩基性アルギニンに富んだモチーフであり、これは天然では、ＲＮＡ結合ドメインとして機能する。さらに、全長Ｒｅｖタンパク質および１７マーＲｅｖペプチドに対するＲＮＡアプタマーを、インビトロ選択を用いて単離した。研究の工程の間、ネガティブ選択のストリンジェンシーは、ライゲーションさせる時間およびＲｅｖペプチドの非存在下での基質濃度の増加によって、増大した。ポジティブ選択進行のストリンジェンシーは、ライゲーションさせる時間および基質濃度の減少によって、増大した。
【０１７６】
図２２は、ＲＣＡＮＡのネガティブおよびポジティブ選択のための、本発明に従う方法のフローチャートでである。工程１０において，触媒核酸の触媒残基を同定する。次いで、オリゴヌクレオチドのプールは、触媒ドメイン中に少なくとも１残基の変異を生じる（工程１２）。工程１４において、オリゴヌクレオチドプールは、例えば、３’ハイブリッド形成を介して、アフィニティーカラムに固定され、続いて固定化オリゴヌクレオチドプールを、触媒残基の同族基質とインキュベートする（工程１６）。リガーゼの場合、例えば、エフェクターの存在なしで活性が維持されたこれらの変異プールメンバーを、プールから取り出す（工程１８）。工程１８は、ネガティブ選択工程であり、ストリンジェンシーを、例えば酵素とリガンドとの間の露出時間の長さ、塩ならびに温度条件、緩衝液などを変えることによって増大または減少させ得る。維持されるプールの変異されたメンバーを、工程２０（ＲＣＡＮＡに対するポジティブ選択工程）においてエフェクターとインキュベートした。ポジティブ選択のストリンジェンシーはまた、例えば酵素およびリガンドの露出時間、塩ならびに温度条件、緩衝液などを変えることによって影響され得る。工程２２におけるエフェクターへの露出において活性になった（またはより活性になった）プールメンバーを、例えば、捕獲リガーゼを用いて取りだし、配列を工程２４において逆転写して、そして例えば、結合した種に対する選択的オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを用いて単離する。これらのＲＣＡＮＡは、さらに選択され得、引き続く選択のラウンドを通して改善され、この選択のラウンドは、ＲＣＡＮＡの基質結合位置にオーバーラップしない修復性オリゴヌクレオチドの使用を含み得、続いて例えば工程１４でのインビトロ転写および、この系へ再導入し得る。
【０１７７】
【表１】
2004515219.tif 000005
ペプチド依存性活性化の程度は、標準的なライゲーションアッセイにおいて評価した。Ｒｅｖペプチドの存在のライゲーション活性非依存性は、ラウンド６と通して、進行性に増大した（図２４）。ラウンド７によって、集合の標準的な反応速度分析は、２つの異なる相を示し始め、このことは可能性として異なる特性を有する少なくとも２つの異なる種の触媒が、集団において優性になっていることを示す。第１の相は、速いライゲーション速度を有するが、ペプチドの存在によって影響を受けなかった集団を示した。第２の相は、第１の相の集団より６０倍遅いが、わずかなペプチド活性化を示す集団を示した。
【０１７８】
２つのさらなる選択ラウンドを、増大したストリンジェンシーで、ネガティブ選択において実施し、最後の２つの選択ラウンドをクローニングし、配列決定した。個々の単離物の反応速度分析によって、最初のペプチド感受性相の反応速度分析が単一クローン（Ｒ８−１）（これは、速い速度（５２／時）で、ペプチドの存在に依存しないで結合する）に寄与し得ることが明らかになった。クローンＲ８−１は、リゾチーム（ＪＨ１）とほぼ同一であった。第２のクローン（Ｒ８−４）は、Ｒｅｖペプチド誘導性の活性化を示した。クローン８−４は、Ｒｅｖペプチドの存在下で０．８６／時で観察される速度でライゲーション反応したが、この速度は、ペプチドが反応物から取り出された場合に、０．００００４６／時（１８，６００倍違う）まで落ち込んだ。興味深いことに、配列決定された維持される４つのクローン（クローンＲ８−２を含む）（最終的な集団の６５％を占める）は、標準的なライゲーションアッセイにおいて完全に不活性化された。さらに、これらのクローンがラウンド９のプールＲＮＡの存在下で評価される場合に、ライゲーション活性は、検出不可能でのままであり、寄生的なトランスライゲーション機構（基質は、これらのＲＮＡに他のいくつかのリガーゼにより、混合物中で、トランスライゲーション反応において、結合される）を用いることによって、これらのクローンが集団に存在してる可能性を排除した。
【０１７９】
（活性化の特異性）
ペプチドエフェクターによる選択されたリボザイムの活性化の特性性を評価するために、Ｒｅｖ依存性リガーゼリガーゼを種々のペプチド（ＨＩＶ  Ｔａｔ、ＢＩＶ  Ｔａｔ、ｂＲＥＸ，ブラジキニンおよびアルギニンを含む）とインキュベートした。ＨＩＶ  Ｔａｔペプチドのみを用いて、約３０％の活性化を観察した。さらに、完全なＲｅｖタンパク質は、Ｒｅｖペプチドと同様にリガーゼを約１０％活性化し得た。このリガーゼを、異なるキャッピング構造を有するＲｅｖペプチドの異なる調製物の存在下で評価した。Ｒｅｖペプチドの全ての調製物は、リガーゼを活性化するが、程度はわずかに異なる。選択を、ペプチドのαヘリックスの程度を増大して、その構造を全長Ｒｅｖタンパク質中で模倣するキャッピングペプチド（ｓＲＥＶｎ）を用いて実施した。αヘリックス特性がｓＲＥＶｎより少ない、キャップされていないペプチド（ａＲＥＶ）は、２のうち約１つの因子により、最もよいアクチベータであった。これらの結果は、活性化が、非常に特異的であり、特定のペプチド調製の間に導入され得るいくつかの混入因子（塩、マグネシウム）に起因しないことを示唆する。さらに、いくつかの非同族ペプチドは、ＲＮＡに、特異的および非特異的の両方に結合することが知られているので、タンパク質「塩」によるリボザイム構造の全体的な安定化は、活性化の機構ではなかったようである。
【０１８０】
ペプチド調製物のいくつかの非ペプチド混入物が、リガーゼの実際のアクチベーターである可能性をさらに排除するために、ペプチドを処理して、ペプチドを破壊し、次いでサンプルがなおリガーゼを活性化するか否かを見るために分析した。ペプチドを、標準的な酸加水分解またはトリプシン消化のいずれかで処理した。いずれの処理ペプチドサンプルも、リボザイムを活性化することが出来なかった。
【０１８１】
（Ｌ１−Ｎ５０プールおよびプライマーの合成）
Ｌ１−Ｎ５０プールおよびプライマーを、標準的なホスホロアミダイト法を用いて合成した。一本鎖のプール（５’ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣ−（Ｎ５０）−ＧＡＧＧＴＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＧＣ（配列番号７）Ｔ７プロモーターに下線を引いた、Ｎ＝Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ）の４２４μｇ（計算値  １０１５））を１００ｍＬのＰＣＲ反応で、プライマー２０．Ｔ７（５’ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ）（配列番号８）および１８．９０ａ（５’ＧＣＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＡＧ）（配列番号９）を用いて増幅した。選択において用いた基質は、Ｓ２８Ａ−ビオチン（ビオチン−（ｄＡ）２２−ｕｇｃａｃｕ；小文字はＲＮＡ）であった。この基質（Ｓ２８Ａ）の非ビオチン化様式を、ほとんどのライゲーションアッセイにおいて用いた。選択の間に、選択的ＰＣＲプライマーセット、２８Ａ．１８０（５’（ｄＡ）２２−ＴＧＣＡＣＴ）／１８．９０ａを用いて結合したリボザイムを増幅した。修復性ＰＣＲプライマーセット、３６．ｄＢ．２（５’ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣ）（配列番号１０）／１８．９０ａは、Ｔ７プロモーターを選択されたプールへ戻して、さらなるラウンドの転写および選択の調製に備えた。
【０１８２】
（ペプチド依存性リボザイムのインビトロ選択）
タンパク質依存性リガーゼリボザイムについての選択手順は、本明細書中において上記される。簡潔には、プールＲＮＡ（５μＭ）および１８．９０ａ（１０μＭ）をまず水中で変性した。次いで、結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，１００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）および基質オリゴヌクレオチド（Ｓ２８Ａ−ビオチン、１０μＭ）を標的タンパク質なしで添加した（ラウンドＩを除く）。２５℃でのこのネガティブ（−）インキュベーションの後、選択混合物をストレプトアビジン−アガロース樹脂（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて分離して、ビオチン化基質（遊離しているか、リボザイムに結合している）を捕獲した。未結合のリボザイムを含む溶出液を集め、第２のポジティブ（＋）インキュベーションを標的タンパク質（１０μＭ）およびさらなる基質（Ｓ２８Ａ−ビオチン、１０μＭ）を添加することで開始した。２５℃でのインキュベーション後に、この混合物をストレプトアビジン−アガロースを用いて再び分離した。結合したリボザイムを含む樹脂をよく洗浄し、次いでＲＴ緩衝液中（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３，７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，４００μＭ  ｄＮＴＰ，５μＭ  １８．９０ａ）に懸濁し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて逆転写した。次いで、樹脂スラリー中のｃＤＮＡ分子を、第１の選択プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅し、次いで修復プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。最終的なＰＣＲ産物をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて転写した。ストリンジェンシーを、リガンドインキュベーション時間（ポジティブ選択）を減じ、リガンドインキュベーション時間（ネガティブ選択）を増加することによって、選択の工程にわたって着々と増加した（表１を参照）。
【０１８３】
（ライゲーションアッセイ）
ライゲーションアッセイを本明細書中上記のように実施した。典型的に、１０ｐｍｏｌの［３２Ｐ］−体−標識リボザイムおよび２０ｍｏｌのエフェクターオリゴヌクレオチドを５μＬの水中で３分間７０℃で変性した。ＲＮＡ混合物を室温まで冷やした後、ライゲーション緩衝液および標的ペプチド（他に記載のない限り２０ｐｍｏｌ、またはリガンド（−）サンプルにおいてはリガンドの代りに水）を添加した。５分間の室温での平衡化の後、反応を２０ｐｍｏｌの基質オリゴヌクレオチド（Ｓ２８Ａ）の添加により、最終容量１５μＬで開始した。反応物を２５℃でインキュベートし、４μＬのアリコートを３つの適切な時点で取りだし、１８μＬのＳＤＳ停止混合物（１００ｍＭ  ＥＤＴＡ，８０％  ホルムアミド，０．８％  ＳＤＳ，０．０５％ブロモフェノールブルー，０．０５％キシレンシアノール）を添加することよって、終了した。サンプルを３分間７０℃で変性し、結合した種および結合しなかった種を、８％ポリアクリルアミドゲル（０．１％ＳＤＳ含）上で互いに分離し、形成された産物の量をＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて決定した。ペプチドの広範な濃度にわたって実施したアッセイは、１０μＬの最終容量に１ｐｍｏｌしかリボザイムが存在しない典型的な反応条件と異なった。
【０１８４】
（ペプチド不活性化）
標準的なライゲーションアッセイを上記のように実施したが、タンパク質サンプルの存在下においては、タンパク質サンプルを以下のように前処理した。ペプチド（１５ｎｍｏｌ）を、２４時間の間６Ｍ  ＨＣｌ中で１００℃で加水分解するか、またはトリプシン固定化アガロース樹脂で１４時間３７℃で消化するかのいずれかを行った。両方のサンプルを蒸発させて、乾燥し、そして最終濃度が１５０μＭになるよう水中に再懸濁して、ペプチドの代りに標準的ライゲーションアッセイにおいて用いた。さらに、加水分解およびトリプシントリプシン消化についての、ペプチドを含まないコントロールサンプルを、ペプチドサンプルに対して記載されるように処理して、これらがインタクトなペプチドの存在下でライゲーションを阻害しないことを保証するよう試験した。
【０１８５】
図２３は、ペプチド結合についての選択スキームを示す。ＲＮＡプールをビオチン化基質と共にインキュベートし、反応性変異体を集合から取り出した。残った種を再びビオチン化基質と共に、標的ペプチドの存在下でインキュベートした。反応性変異体を集団から取りだし、逆転写、ＰＣＲおよびインビトロ転写によって、優先的に増幅した。
【０１８６】
図２４は、Ｌ１−Ｎ５０  Ｒｅｖ選択の進行を示す。各回の選択に関して、Ｒｅｖペプチドの存在下で実施したアッセイについては黒色のバーとして、Ｒｅｖペプチドの非存在下でのアッセイについては灰色のバーとして、連結速度をプロットしている。灰色の線は、Ｒｅｖペプチドによる活性化レベルを示し、右手のＸ軸に対して測定する。「基質」の列は、リボザイムに対する基質のモル過剰を図示する。
【０１８７】
（実施例５）
（調節可能な触媒的に活性な核酸を用いるインビボ遺伝子調節）
本発明はまた、インビボでの使用のために、設計および選択によってインビトロで生成した調節可能な触媒的に活性な核酸の設計および単離を含む。本明細書中で開示されるこの調節可能な触媒的に活性な核酸は、インビボでの遺伝子調節の制御またはウイルス複製を可能にする。本発明者らは、調節可能な触媒的に活性な核酸を生成し、この核酸は、低分子の外因的な添加によって、指向されるインビボスプライシングの制御を可能にする。遺伝子調節における実質的な差異を、できるだけ少ない単一メチル基によって異なる化合物を用いて観察した。調製可能な触媒作用性の活性な核酸は、ｍＲＮＡのレベルで条件付きノックアウト物のため、または経済的に価値ある遺伝子治療の開発のための遺伝的調節スイッチとしての適用を見出され得る。
【０１８８】
群Ｉの自己スプライシングイントロンを調節可能な触媒的に活性な核酸に変換するために、スプライシングの活性を調節し得るコンフォメーションの、リボザイムの触媒ドメインにおける、配列または構造をまず同定する必要があった。本発明で用いられ得るリボザイム触媒ドメインの１つの例は、群Ｉの自己スプライシングイントロンである。なぜなら、その構造的特性および力学的特性ならびにバクテリオファージＴ４におけるチミジル酸シンターゼ（ｔｄ）遺伝子との相互作用が、広範囲にわたって研究されてきたからである。一連のＰ６ステムループのネスト化欠失は、リボザイム活性を部分的または完全に含む。さらに重要には、マグネシウムまたはアカパンカビ属ミトコンドリア（ＣＹＴ−１８）由来のチロシルｔＲＮＡシンターゼのいずれかが、多数のこれらの欠損を抑制し得る。他のイントロンはまた、Ｐ５ステムループの欠失がリボザイム活性を調節し得ることを明らかにした。欠失がリボザイム活性を調節する部位がまた、核酸に対するコンフォメーション変化が触媒活性を調節し得る部位であることを証明し得ることを、本発明は認識する。一連の群Ｉのアプタマー酵素（ａｐｔｅｚｙｍｅ）を、抗テオフィリンアプタマーがＰ６またはＰ５のいずれかの一部に置換されるように設計した（図２５）。抗テオフィリン配列の接着点を、テオフィリン依存性切断およびテオフィリン依存性連結の設計のために選択した。
【０１８９】
群Ｉの調節可能な触媒的に活性な核酸の自己スプライシング活性を、標準的スプライシングアッセイを用いてインビトロで試験した。スプライシング欠損のリガンド誘導性抑制のストリンジェンシーを、低マグネシウム濃度（３ｍＭ、ストリンジェント）または高マグネシウム濃度（８ｍＭ、許容性）で反応を実施することによって試験した。いくつかの構築物は、不活性であった（例えば、Ｔｈ３Ｐ６、Ｔｈ５Ｐ６、およびＴｈ６Ｐ６）か、または差異のないスプライシング活性を示した（例えば、Ｔｈ４Ｐ６およびＴｈ２Ｐ５）が、４つの構築物（Ｔｈ１Ｐ６、Ｔｈ２Ｐ６、Ｔｈ３Ｐ６、およびＴｈ１Ｐ５）は、テオフィリン存在下で自己スプライシングの増加を示した。Ｔｈ３Ｐ６を除く核酸の全てについて、リガンド誘導性スプライシング活性は、よりストリンジェントなマグネシウム濃度での標準的アッセイにおいて、より大きかった（以下の表を参照のこと）。
【０１９０】
この以下の表は、抗テオフィリンアプタマーを含有する構築物のインビトロでの相対的なスプライシング活性を示す。反応の程度は、テオフィリンを含まない３ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で２時間目の親構築物に相関する。
【０１９１】
【表２】
2004515219.tif 000006
構築物Ｔｈ３Ｐ６は、より低いマグネシウム濃度で不活性であった。そして、より許容性の濃度は、リガンド誘導性スプライシング活性を観察する必要があった。興味深いことに、リガンド依存性活性を示すこれらの構築物は、マグネシウム依存性回復のあるスプライシング活性を示すもとの欠失改変体に非常に似ていた。例えば、その結合と、活性化可能な調節可能な触媒的に活性な核酸Ｔｈ２Ｐ６（スプライシングが３ｍＭのマグネシウムで欠損する構築物ｔｄ□Ｐ６−６に似ていた）中の群Ｉの触媒ドメインとの連結は、８ｍＭのマグネシウムまたはキャッピングテトラループ（ｃａｐｐｉｎｇ  ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）配列の安定化によって抑制された。リボザイムを活性なコンフォーマー（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）と不活性なコンフォーマーとの間で均衡に保つ（ｐｏｉｓｅ）欠損を予め用いて、エフェクター依存的に操作した。
【０１９２】
次に、リガンド依存的活性化の程度を、テオフィリンの存在下または非存在下でのスプライシングの反応速度を試験することによって決定した。Ｐ５（Ｔｈ１Ｐ５）で修飾された核酸は、ほんの少しの活性化（１．６倍）しか示さなかった。Ｐ６で修飾された核酸は、幾分より大きな活性化を示し、テオフィリン存在下で、Ｔｈ２Ｐ６を用いると９倍の活性化を生じ、そしてＴｈ１Ｐ６を用いると１８倍の開始速度の増加を示した（データは示さない）。これらのレベルのリガンド依存的活性化は、ハンマーヘッド型リボザイム構築物を用いて観察された活性化に類似しており、そしてこれは、本発明の材料および方法を用いて活性化をさらに最適化するためにインビトロ選択の使用の可能性を証明し得る。
【０１９３】
本明細書中で開示される核酸における活性化の機構は、他の核酸について観察されてきたのと同様なようである：機能的な核酸配列および構造を安定化するリガンド誘導性コンフォメーションの変化。しかし、群Ｉの自己スプライシング  イントロンは、ハンマーヘッドまたはＬ１リガーゼのいずれかよりも、かなり複雑なリボザイムである；例えば、三次構造の群Ｉのイントロンは、複雑な折り畳み経路によって確立される。従って、テオフィリン結合が、機能的構造の局所のコンフォメーションを単に変更するよりもむしろ、群Ｉの操作されたアプタマー酵素の全体的な折り畳みまたは安定性に影響する可能性があった。この可能性を評価するために、インビトロでのスプライシング反応のテオフィリン依存性を、再折り畳みおよび外因性ＧＴＰを用いた触媒反応の開始を可能にするよう、延長したインキュベーションに続いて試験した。リガンド依存的活性化の程度または速度における変化を、プレインキュベーションによって全く観察しなかった（データは示さない）。同様に、あらかじめＧＴＰで開始したインビトロでのスプライシング反応に、テオフィリンを添加した場合、テオフィリン存在下で既に観察されたスプライシングの速度からレベルにおける増加を観察した（データは示さない）。考え合わせると、これらの結果は、テオフィリンが、操作された群Ｉのアプタマー酵素の折り畳み経路に影響するという仮定にそぐわない。
【０１９４】
アプタマー配列が触媒の核心に共結合（ｃｏｎｊｏｉｎ）するよう変化させることによって、群Ｉのアプタマー酵素のエフェクター特異性を変化させることを試みた。ネイティブなハンマーヘッド型リボザイムおよびＬ１リガーゼの両方の以前の研究は、アロステリック結合部位およびエフェクター特異性のこのような交換が頻繁にあり得ることを示した。Ｓｏｕｋｕｐ，Ｇ．Ａ．＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，３５８４−３５８９（１９９９）、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．＆  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｌｉｇａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，１７５１−１７５９（２０００）。この目的を達成するために、２つの最も首尾良いＰ６構築物（Ｔｈ１Ｐ６およびＴｈ２Ｐ６）を、抗ＦＭＮアプタマーが抗テオフィリンアプタマーの代わりに挿入されるように再操作した。抗ＦＭＮアプタマーの接着点は、他のＦＭＮ依存性リボザイムの設計において首尾良く証明されたのと同様であった（図２６）。フラビン感知性（ｓｅｎｓｉｎｇ）の群Ｉのアプタマー酵素は両方とも、標準的アッセイにおけるＦＭＮによって、テオフィリン感知性の群Ｉのアプタマー酵素と同じくらいかまたはそれよりも良く活性化された。この結果は、ＦＭＮが（例え、本明細書に開示されるよりも高い濃度でも）群Ｉのスプライシング活性を阻害することが特に有意に示される。類似の特異性交換を、抗ＡＴＰ  Ｒｅｖ結合配列および抗ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ結合配列を用いて試みたが、これらの潜在的なアロステリック結合部位はどちらもイントロンの触媒核心と連絡（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｅ）されないようであった。抗ＦＭＮアプタマーは、Ａ：Ｇ塩基対において両方とも終結するので、抗テオフィリンアプタマーにより容易に置換されたかもしれない。これは、異なる連結ステム（すなわち「連絡（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）モジュール」）が、群Ｉのリボザイムとの他のアロステリックドメインの結合を可能にすることであり得る。
【０１９５】
以下の表において、抗ＦＭＮアプタマーを有する構築物のインビトロでのスプライシングの相対的活性を示す。反応の程度を、ＦＭＮを含まない３ｍＭのＭｇＣｌ２中で２時間目の親の構築物と比較する。
【０１９６】
【表３】
2004515219.tif 000007
次いで、本明細書中で開示される首尾良い核酸構築物各々を、親のｔｄ自己スプライシングイントロンに代わって遮断されたチミジル酸シンターゼ遺伝子中にクローニングした。これらのベクターを、機能的なチミジル酸シンターゼ遺伝子を欠き、そしてチミジン栄養素要求株であるＥ．ｃｏｌｉ株（Ｃ６００ＴｈｙＡ：：ＫａｎＲ）に導入した。富化培地で増殖させた細菌を、次いでチミジンを欠く最少培地にプレーティングした場合、Ｔｈ１Ｐ５を除いて、コロニーの増殖を観察しなかった。しかし、テオフィリン（７．５ｍＭ）を最少培地に含ませた場合、イントロンＴｈ２Ｐ６については、コロニーの増殖を観察し、そしてＴｈ１Ｐ５については、コロニーの増殖の増加を観察した。（データは示さない）。興味深いことに、イントロンＴｈ１Ｐ６を含有する構築物については、この核酸がインビトロでかなり高いレベルのテオフィリン増強性スプライシングを示した事実にもかかわらず、増殖を観察しなかった。もともとは、インビトロでスプライシングを示さ無いかまたは低いスプライシングを示したイントロン全て（Ｔｈ３Ｐ６を含む）は、テオフィリン存在下または非存在下のいずれもで細胞をレスキューできなかった。最終的に、非機能的な群Ｉのイントロン（Ｂ１１）を含むネガティブコントロールにおいて増殖は観察されず、そして、テオフィリン存在下または非存在下のいずれかでのテオフィリン結合（Ｔｈ２Ｐ６．Ｄ）を無効にするために変異が導入されたネガティブコントロールにおいて、増殖は変化しなかった。
【０１９７】
イントロンスプライシングにおけるエフェクターの影響をより良好に定量化するために、液体培地中での増殖実験を実施した（図２７（ａ））。核酸Ｔｈ２Ｐ６によって分けられたｔｄ遺伝子を含む一晩の培養物を、新鮮な最少培地に播種し、エフェクターを添加し、そして得られた増殖曲線を、連続的にモニタリングした。固形培地での増殖アッセイからの結果に基づいて予測されたように、テオフィリン非存在下では、増殖はほとんど観察されなかった。しかし、テオフィリン（０．５ｍＭ）を液体培地に添加した場合、細胞は、親のイントロンがｔｄ遺伝子に挿入されたコントロールとほとんど同じくらい増殖した。
【０１９８】
重要なことには、細胞増殖は、構造的に関連するエフェクターのカフェイン（すなわち、７−メチルテオフィリン）によって活性化されず、そしてエフェクター依存性増殖の差異は、非機能的群ＩのイントロンＢ１１によって分けられたｔｄ遺伝子を含む培養物で観察されなかった。抗テオフィリンアプタマーは、１０，０００倍の感度でカフェインとテオフィリンとの間を識別することが公知である。核酸Ｔｈ１Ｐ５によって分けられるｔｄ遺伝子を含む培養物で類似の結果を得た（図２７（ｂ））。しかし、この例において、インビトロでのより高いレベルのバックグラウンドスプライシング活性に対応する、誘導されていない細胞のなんらかのバックグラウンド増殖が存在した。テオフィリンが、インビボでイントロンスプライシングを調節する場合、細胞増殖の程度が培地中に導入したテオフィリン濃度に依存するべきである（図２７（ｃ））。テオフィリンは、細胞に対して毒性であり、そして０．５ｍＭより高い濃度で、親のｔｄイントロンを含有する細胞の増殖を低減させた。低濃度のテオフィリンは、（ｔｄイントロンの活性化によって）細胞増殖を徐々に増加させるが、２ｍＭを超えるテオフィリンの濃度は、細胞増殖を徐々に低減させる（しかし、増殖のレベルは、なおバックグラウンドを超えて良好である）。
【０１９９】
外因性フラビンの存在は、インビボでのエフェクター特異性を試験するのを困難にさせ、そして新規の一連の調節可能な触媒的に活性な核酸を構築し、この核酸は、抗テオフィリン結合配列が３−メチルキサンチン（３ＭｅＸ２Ｐ６）に結合するように変異された。これらの改変体は、インビトロおよびインビボの両方で、３−メチルキサンチンに応答することを証明した（図２８）。しかし、これらの改変体は、もはやテオフィリンには応答せず、また種々の他のアナログ（カフェイン、１−メチルキサンチン、７−メチルキサンチン、１，３−ジメチル尿酸、ヒポキサンチン、キサンチン、およびテオブロミンを含む）にも応答しなかった（データは示さない）。
【０２００】
これらの結果は、テオフィリンがインビボでイントロンスプライシングを調節することを示した。次に、ｍＲＮＡを、テオフィリン存在下または非存在下で処理したＥ．ｃｏｌｉから単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲを用いて、スプライシングされたイントロンの存在を確証した（データは示さない）。インビボでテオフィリンに応答することが公知のイントロン（Ｔｈ２Ｐ６およびＴｈ１Ｐ５）各々について、スプライシングされたｍＲＮＡの増加が観察されるが、インビボでテオフィリンに応答しないこれらのイントロンはスプライシングされたｍＲＮＡのレベルの増加を示さなかった。これについての例外は、Ｔｈ１Ｐ６であり、これは、インビトロでのテオフィリン依存性スプライシングおよびインビボでのテオフィリン依存性スプライシングをもともと示した。しかし、Ｔｈ１Ｐ６は、テオフィリン依存性増殖を媒介しなかった。この細胞のｍＲＮＡを抽出し、クローニングし、そして配列決定した。そしてこれらのうちの半分が潜在的なスプライス部位を使用するようであった。
【０２０１】
調節可能な触媒的に活性な核酸を、エフェクター分子に応答するように操作する能力は、多数の潜在的な適用を有した。例えば、これは、新規遺伝子治療と併せて用いられ得、ここで、患者は導入された遺伝子の内因性発現のセットレベルに依存するよりもむしろ、遺伝子発現を差次的に活性化する薬物に依存している。同様に、これは、インビボでの遺伝子発現をより良好にモニタリングするためにエフェクター依存性スプライシングとともに用いられ得る。特定の器官、細胞、または細胞小器官に局在する薬物、およびこの核酸のスプライシングを、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を介してモニタリングし得る。レポーター遺伝子中に導入された、操作されたイントロンを、薬物の取り込みおよび有効性をモニタリングするハイスループットの細胞ベースのスクリーニングアッセイに用いた。
【０２０２】
（材料および方法：Ｅ．ｃｏｌｉ株および増殖培地）
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｃ６００ＴｈｙＡ：：ＫａｎＲを、プレートアッセイおよびインビボでの増殖曲線のために用いた。ＩＮＶａＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、クローニングおよびプラスミド増幅のために用いた。細菌の開始培養物を、チミジン（５０ｍｇ／１）を補充したＬＢ中で増殖させた。ｔｄ表現型についてのスクリーニングを、０．１％のＮｏｒｉｔ  Ａ−処理されたカザミノ酸で補充された最少培地（ＭＭ）およびチミジン（５０ｍｇ／ｌ）で補充されたＭＭ（ＭＭＴ）中で行った。Ｂａｃｔｏアガー（１．５％）、アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）およびカナマイシン（１００ｍｇ／１）を含有するプレートを、全ての増殖培地に添加した。
【０２０３】
（プラスミド）
野生型プラスミドｐＴＺｔｄ１３０４（Ｍｙｅｒｓら  １９９６）は、野生型の活性を維持する（Ｇａｌｌｏｗａｙ  Ｓａｌｖｏら  １９９０）、ＳｐｅＩ部位を導入するＵ３４ＡおよびＥｃｏＲＩ部位を導入するＵ９７６Ｇのさらなる変異を有する、１０１６ヌクレオチド野生型イントロンの２６５ヌクレオチド誘導体を含む。
【０２０４】
（ｔｄイントロンの調節可能な触媒的に活性な核酸の構築）
構築物を、標準的固相ＤＮＡ合成を用いて作製し、次いで、ＰＣＲ増幅し、そして１０１６ヌクレオチド野生型イントロンの２６５ヌクレオチド誘導体を含んだｐＴＺｔｄ１３０４中にクローニングした。この誘導体はまた、ＳｐｅＩ部位を導入する変異Ｕ３４ＡおよびＥｃｏＲＩ部位を導入するＵ９７６Ｇを含んだ。親のＰ６核酸構築物を、以下の２つの重複オリゴによって作製した：Ｇｐ１Ｗｔ２  Ｇｐ１Ｗｔ２．１２２（ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＴＡＡ  ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＴＡＡ  ＡＣＧ  ＧＧＧ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＡＣＡ  ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＣＣＣ  ＴＴ）（配列番号１６）；および
Ｇｐ１Ｗｔ３．１２９（ＴＡＡ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＴＡＧ）（配列番号１７）。これらのオリゴヌクレオチド（１００ｐｍｏｌ）を、アニーリングさせ、そしてＡＭＶ  ＲＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）およびｄＮＴＰｓ（２００μＭ）中のＡＭＶ逆転写酵素（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；４５単位）を用いて、３７℃にて３０分間伸長させた。得られた二本鎖ＤＮＡを、１：５０に希釈し、そして以下のプライマーを用いて、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣＩ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００５％ゼラチン）、ｄＮＴＰｓ（２００μＭ）およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；１．５単位）中で増幅させた：ＳｐｅＩ．２４（ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＴＡＡ  ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＴＡＡ  ＡＣＧ（配列番号１８）；０．４μＭ）およびＥｃｏＲＩ．２４（ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＴＧ（配列番号１９）；０．４μＭ）。この反応を、９４℃にて３０秒間、４５℃にて３０秒間、７２℃にて１分間の温度循環を１５回させ（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ）、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０２０５】
ＰＣＲ産物を、緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中ＳｐｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；２０単位）およびＥｃｏＲＩ（５０単位）を用いて、３７℃で６０分間消化し、精製し、そしてＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＴＺｔｄ１３０４にクローニングした。ネガティブコントロールおよび核酸構築物を、Ｇｐ１Ｗｔ３．１２９を以下の適切な配列のオリゴヌクレオチドで置換した以外は、記載されるように作製した：
【０２０６】
【化３】
2004515219.tif 000008
【０２０７】
【化４】
2004515219.tif 000009
（インビトロ転写）
イントロンを、上記および２０回のサイクルの条件下で、２５μｌの反応液中の以下：
【０２０８】
【化５】
2004515219.tif 000010
を用いてＰＣＲ増幅した。反応液（５μｌ）の一部を、３％のアガロースゲル上で電気泳動し、そしてＰＣＲ産物のバンドを、ピペットの先で突き刺した。このアガロースプラグを、新鮮なＰＣＲ反応液（１００μｌ）に添加し、そして１５回サイクルした；ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｋｉｔを使用して精製し、そして定量した。ＰＣＲ産物（５０μｌ中に２μｇ）を、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ＲＮａｓｅインヒビター（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；５単位）、低Ｍｇ２＋緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、７．５ｍＭ  ＤＴＴ、４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭスペルミジン）、ＵＴＰ（１．２５ｍＭ）、ＡＴＰ（２．５ｍＭ）、ＧＴＰ（２．５ｍＭ）、ＣＴＰ（７．５ｍＭ）およびａＰ３２−標識化ＵＴＰ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；２０μＣｉ；３０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を含むインビトロ転写反応液に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＤＮａｓｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、２９５単位）を添加し、そしてこの反応物を、さらに３０分間３７℃でインキュベートした。ＲＮＡを、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ）を使用して精製し、そして定量した。
【０２０９】
（インビトロスプライシングアッセイ）
水中のＲＮＡ（５００ｎＭ）を７０℃まで３分間加熱し、次いで１分間氷に移すことによって、アッセイを実施した。スプライシング緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、エフェクター（テオフィリン（１．５ｍＭ）またはＦＭＮ（１ｍＭ））を添加して、その反応物を、さらに１５分間氷上でインキュベートした。この時点で、４．５μｌのアリコートを、ゼロ時間時のために取り出し、そして５μｌの停止色素（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  キシレンシアノール、および０．５％  ブロモフェノール青）でクエンチした。ＧＴＰ（５０μＭ）を残りの反応物に添加して（総容量５μｌ）、スプライシング反応を開始した。この反応物を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで停止色素で終了した。この反応物を、７０℃まで３分間過熱して、そして５μｌを、８％変性ポリアクリルアミドゲルで分析した。このゲルを乾燥し、ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）スクリーンに暴露し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して分析した。
【０２１０】
反応容量を、速度決定アッセイのために増加した。アリコートを、０分と３０分との間の間隔で採取し、そして停止色素で終了した。反応物を上記のように分析した。
【０２１１】
（インビボプレートアッセイ）
種々のＩ群構築物を含むプラスミドを、化学的にコンピテントなＣ６００ＴｈｙＡ：：ＫａｎＲ細胞に形質転換し、そしてカナマイシンを含むＬＢ中で一晩増殖させた。一晩培養した細胞培養物の少量のアリコート（３μｌ）を、エフェクター（テオフィリン（７．５ｍＭ）もしくはＦＭＮ（１０ｍＭ））または水と混合し、プレート上にスポットし、そして３７℃で一晩増殖させた。ポジティブコントロールとして、構築物の全てをまた、チミンを含む細胞培地プレート（ＭＭＴ）上にプレートし、そして生存率についてアッセイした。
【０２１２】
（インビボ増殖曲線）
ＬＢ中で一晩増殖させた細胞を、テオフィリン、カフェイン、３−メチルキサンチンまたはエフェクターなしのいずれかを含むＭＭで１：１００に希釈し、そしてＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ＢｉｏｓｃｒｅｅｎＣ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）で分析した。
【０２１３】
（ＲＴ−ＰＣＲ分析）
ＲＮＡを、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  ＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して一晩培養した培養物から単離し、そしてＴｔｈポリメラーゼについて提供されるプロトコルに従って、５’ｌｅプライマーおよびＧＭ２４プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。産物を、３％アガロースゲルで分離および分析した。
【０２１４】
図２５は、本発明のテオフィリン依存性ｔｄ  Ｉ群構築物を示す。図２５（ａ）は、ｔｄイントロンの２６５ヌクレオチド欠失構築物の予想される二次構造および三次元の相互作用を示す。イントロンは大文字で、そしてエクソンは小文字である。５’スプライシング部位および３’スプライシング部位を、矢印によって示す。Ｐ４−Ｐ６ドメインを四角に囲む。図２５（ｂ）は、ｔｄイントロンのΔ８５−８６３欠失変異体に基づくＢ１１構築物を示し、これは、インビトロまたはインビボにおいて低Ｍｇ２＋（３ｍＭ）で活性がないことを示す。灰色で強調した抗テオフィリンアプタマーを、Ｔｈ１Ｐ６構築物、Ｔｈ２Ｐ６構築物、Ｔｈ３Ｐ６構築物、Ｔｈ４Ｐ６構築物、Ｔｈ５Ｐ６構築物およびＴｈ６Ｐ６構築物中のイントロンのＰ６ａ幹（ｓｔｅｍ）、ならびにＴｈ１Ｐ５構築物およびＴｈ２Ｐ５構築物中のＰ５幹と置換した。抗テオフィリンアプタマーにおける変異を、ＭｅＸ２Ｐ６構築物およびＴｈ２Ｐ６．Ｄ．構築物について黒で四角に囲んだ。ＭｅＸ２Ｐ６におけるＣからＡへの置換は、テオフィリンから３−メチルキサンチンへ特異性を変化する。Ｔｈ２Ｐ６．Ｄ．におけるＡからＵおよびＣからＤへの変異は、テオフィリン結合を消滅させる。
【０２１５】
テオフィリンによるｔｄ  Ｉ群核酸のインビトロ活性をまた、例証した（データは示さず）。親のイントロン、Ｂ１１イントロン、Ｔｈ１Ｐ６イントロン、Ｔｈ２Ｐ６イントロンおよびＴｈ１Ｐ５イントロンのスプライシング活性は、オートラジオグラフィーを使用して１．５ｎＭ  テオフィリンの存在下および非存在下で構築する。ここで、以下の産物を同定した：ＬＩ、線状イントロン；ＣＩ、環状イントロン；Ｅ１−Ｅ２、エクソン１−エクソン２連結産物；Ｃｒｐ、潜在的（ｃｒｙｐｔｉｃ）連結産物；ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、未スプライシングのｍＲＮＡ（データは示さず）。
【０２１６】
図２６は、ＦＭＮ依存性ｔｄ核酸イントロンスプライシング構築物の設計を示す。灰色で強調した抗ＦＭＮアプタマーを、ＦＭＮ１Ｐ６構築物およびＦＭＮ２Ｐ６構築物中のＰ６ａ幹と置換した。インビボスプライシング活性を、アガープレートで例証した。親構築物、Ｂ１１構築物およびテオフィリン構築物を、最小培地（ＭＭ）に７．５ｍＭ  テオフィリンの存在下および非存在下でスポットした。一方、親構築物、Ｂ１１構築物およびＦＭＮ構築物を、５ｍＭ  ＦＭＮの存在下および非存在下でスポットした（データは示さず）。
【０２１７】
テオフィリン依存性インビボ増殖をアッセイしそして定量した。図２７（ａ）、２７（ｂ）および２７（ｃ）は、０．５ｍＭ  テオフィリンまたは０．５ｍＭ  カフェイン（□）のいずれかの存在下（□）および非存在下（□）でＴｈ２Ｐ６（ａ）およびＴｈ１Ｐ５（ｂ）を含むＣ６００：ＴｈｙＡ細胞について示された相対的増殖曲線を示す。親（□）およびＢ１１（□）のコントロールを、比較のために０．５ｍＭ  テオフィリン中で増殖させた。プロットを、親のイントロンを含む細胞の増殖に対して正規化する。各点は、３連の増殖曲線の平均を示す。図２７（ｃ）は、示したテオフィリン濃度範囲の、親、Ｔｈ２Ｐ６およびＴｈ１Ｐ５のイントロンについての１２時間時での増殖程度を示す。バックグラウンド増殖（Ｂ１１）を差し引き、そして結果を、テオフィリンなしでの親の増殖に対して正規化する。
【０２１８】
図２８は、３−メチルキサンチン依存性のインビボ増殖の発達を示す。相対的増殖曲線を、１ｍＭ  ３−メチルキサンチンまたは１ｍＭ  テオフィリン（□）の存在下（□）および非存在下（□）で３ＭｅＸ２Ｐ６を含むＣ６００：ＴｈｙＡ細胞について示す。親（□）およびＢ１１（□）のコントロールもまた、１ｍＭ  ３−メチルキサンチン中で増殖させた。プロットを、親増殖に対して標準化する。各点は、３連の増殖曲線の平均を示す。インビボでのイントロンのスプライシングを示すために、細胞総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。スプライシングしたｍＲＮＡおよびスプライシングしないｍＲＮＡに対応するバンドを、同定した（データは示さず）。サンプルに、テオフィリン非存在下で増殖させた細胞由来のＲＮＡを播き、そして０．５ｍＭ  テオフィリンの存在下で増殖させた細胞由来のＲＮＡを播いたサンプルと比較した。
【０２１９】
（実施例６：整列されたリボザイムリガーゼを使用する多様なセットの分析物の検出）
いくつかの触媒ＲＮＡは、操作に影響を受けやすいことが示されている。いくつかの場合において、特定のリボザイム足場は、広範な種々のエフェクターに応答するように進化および操作され得る。これらの特性は、調節可能な、触媒的に活性な核酸、分子診断の分野における強大な可能性を与える。ハンマーヘッドリボザイムの操作は、改変体をもたらし得る。これは、種々のリガンドによってアロステリックに調節される（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．；Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｎ．；Ｓｏｕｋｕｐ，Ｇ．Ａ．；Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．，１９９９，４２，２７５−２７）。さらに、これらのアロステリックなハンマーヘッド改変体は、順々に、種々の小分子を検出し得るリボザイムアレイをアセンブリするために使用され得た。
【０２２０】
多様な複数の分析物アッセイにおいてリボザイムリガーゼの有用性を実証するために、本発明者らによってすでに開発された一連のリガーゼ（本明細書中に上記された）を、アレイにおいて使用した。特に、このアレイは、多様な範囲の生物学的に関連のある分析物を検出し得る：小分子、核酸、タンパク質およびペプチドを、溶液中でアッセイし得る。
【０２２１】
調節可能なリガーゼ改変体は、ランダム配列プールから最初に選択された小リボザイムリガーゼ（Ｌ１）で始まって進化させられた。このリボザイムの活性は、選択に使用する３’プライマーに依存することが見出され、その存在下で１０，０００倍までリボザイムの活性を増加する。さらなるＬ１改変体は、小分子（ＡＴＰ、ＦＭＮ、テオフィリン）、タンパク質（リボザイム）およびペプチド（Ｒｅｖ）に応答するように設計または選択されてきた。
【０２２２】
調節可能で触媒的に活性な核酸のこの集団の、多様なアッセイにおいて機能する能力の最初の試験として、９６ウェルプレートに対するリガーゼの自己付着をモニタリングするための単純な図式を開発した。ビオチン化基質によって、放射標識されたリボザイムの所定の分析物に対する連結を、ストレプトアビジンコートのポリスチレンプレートに固定化された画分を定量化することによってモニターし得る（図２９）。
【０２２３】
代表的な調節可能で触媒的に活性なリガーゼアレイを、図３０に示す。使用した調節可能で触媒的に活性な核酸の全て（列）を、対応するリガンドのセット（行）に対して試験した。対角線は、調節可能で触媒的に活性な核酸とその同族のリガンドとの間のポジティブ反応を示す。調節可能で触媒的に活性な核酸の全てをまた、複合体混合物における活性（「＋」行、６リガンド全ての混合物）およびエフェクターの非存在下での不活性（「−」行）について試験した。ほとんどの部分について、特に調節可能で触媒的に活性な核酸とその同族のリガンドとの間で非常に高い特異性がある。調節可能で触媒的に活性な核酸の全ては、複合体混合物の状況下で活性を保持した。Ｌ１−ＡＴＰのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）との交差反応性に注意すべきである。これは、ＦＭＮとＡＴＰとの間の化学的類似性に起因し得る。図３０に示されるアレイは、代表的なアッセイの「ポジティブ」画像である；アッセイ後に除去される上清を、バックグラウンドおよび非連結種の定量のために別のプレートに移した。
【０２２４】
アレイの関係で個々のアプタザイムの特性をよりよく特徴付けるために、プレートに結合した基質に対する連結を実施するこれらの能力を、リガンド濃度に応じてモニターした（図３１）。アプタザイム（列）を、対応するセットの分析物（行）に対するアッセイ形式においてアッセイした。多くのアプタザイムの活性は、以前に算出された値と類似する。アッセイされたこれらのリボザイムの全てが、高ｎＭ〜低μＭにおけるＫｄ値を有する応答特性を示した。
【０２２５】
図２９は、リボザイムリガーゼアレイの概略を示す。２９（ａ）の分析物の非存在において、リボザイムは、ビオチン化基質の連結を触媒し得ず、そして上清中に残存する。図２９（ｂ）において、連結を生じるに十分高い分析物濃度は、タグ化基質の自己付着を生じ、次いで、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレートに固定化される。
【０２２６】
図３０は、調節可能で触媒的に活性なリガーゼアレイの結果を示す。調節可能で触媒的に活性な核酸およびエフェクターの組み合わせを、アレイ形式においてアッセイする；「ポジティブ」プレートを示す。対角線は、リボザイムとその同族リガンドとの間のポジティブ反応を示す。
【０２２７】
図３１は、個々のアロステリックなリボザイムリガーゼの滴定を示す。５つのアプタザイム個々についての応答曲線を、算出する。正規化された数を、同族のエフェクター濃度に対してプロットする（例えば、Ｌ１−ＦＭＮ活性対［ＦＭＮ］）。Ｋｄ値を、単一の飽和曲線にデータを合わせることによって算出する（ｙ＝（ｍ１＊ｍ０）・（Ｋｄ＋ｍ０））。「ポジティブ」プレートに結合する最大パーセントを、割り当てられた時間にわたる連結の程度を例証するように報告する。
【０２２８】
（配列）
Ｌ１、Ｌ１−ＡＴＰ、Ｌ１−ＦＭＮおよびＬ１−テオフィリンについての配列は、以前に刊行されているが、Ｌ１−Ｒｅｖは、最近選択された：（ＳＥＱ）。ＰＣＲ増幅に使用した５’プライマーは、Ｔ７プロモーターを組み込むが、３’プライマーは、全てのテンプレートについて普遍的である。
【０２２９】
（ＲＮＡ調製）
個々のリボザイムを、５００ｎｇのＰＣＲ産物、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＤＴＴ、４つのリボヌクレオチドの各々および５０ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む、標準のインビトロ転写反応によって生成した。ゲル精製に続いて、ＲＮＡを、水中に溶出し、沈殿しそして水中に再懸濁した。
【０２３０】
（個々のアプタザイムのアプタザイムアレイおよび滴定）
整列されたアプタザイムアッセイを、１００ピコモルのリボザイムと１２０ピコモルの１８．９０Ａ（５’  ＧＣＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＡＧ  ３’）（配列番号３６）との第一のアニーリングによって実施した。緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）の添加に続いて、１２０ピコモルの基質（Ｓ２８Ａ−ビオチン、５’ビオチン−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡｕｇｃａｃｕ  ３’（配列番号３７）、小文字はリボヌクレオチド）を添加した。反応混合物を、アレイの対応する各ウェルについて複数のアリコートを適応するために調整した。５０μｌを９６ウェルＰＣＲプレート（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の各ウェルに等分した後、緩衝液中に５０μｌのリガンドを添加した。図２９についてのリガンド濃度は以下である：１μＭ  １８．９０Ａ、０．５ｍＭ  フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、５μＭ  リゾチーム、１μＭ  Ｒｅｖペプチド、１ｍＭ  ＡＴＰおよび１ｍＭ  テオフィリン。
【０２３１】
反応物を、２５℃で４時間インキュベートし、次いで、２０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加した。次いで、反応物を、Ｈｉ−Ｂｉｎｄストレプトアビジンコートのポリスチレンプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に移した。プレートを、再度室温で１時間インキュベートし、次いで、上清を、普通のポリスチレン９６ウェルプレートに移した。Ｈｉ−ｂｉｎｄプレート中のウェルを、緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、７Ｍ尿素）で３回洗浄し、次いで、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）でリンスした。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒプレートに暴露することによって、アッセイを定量し、次いで、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で分析した。滴定（図３１）を、基本的には以前に記載されるように、示した濃度範囲で滴定されたリガンドで用いて施した。
【０２３２】
上記の明細書において言及された全ての刊行物は、本明細書中に参考として援用される。記載された本発明の組成物および方法の変更および改変は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は特定の実施形態と組合わせて記載されたが、請求された本発明がこのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことは理解されるべきである。加えて、分子生物学または関連分野の当業者に明らかである、記載された組成物の種々の変更および本発明の実施の様式は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
本発明の特徴および利点のより完全な理解のために、添付の図面と共に、参照がここで、本発明の詳細な説明に対してなされる。異なる図面における対応する数字は、対応する部分を参照する。
【図１】
図１は、バクテリオファージＴ４（野生型）のＩ群テオフィリン依存（ｔｄ）イントロンの二次構造の描写である。
【図２Ａ】
図２Ａは、本発明の１つの実施形態の、ゲルのグラフ表示と共に、ＧｐＩＴｈ１Ｐ６．１３１アプタマー構築物の活性化を示すゲルの写真である。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、本発明の１つの実施形態の、ゲルのグラフ表示と共に、ＧｐＩＴｈ２Ｐ６．１３３アプタマー構築物の活性化を示すゲルの写真である。
【図３】
図３は、本発明の１つの実施形態の、Ｉ群イントロンについてのインビボアッセイ系の概略図である。
【図４】
図４Ａは、本発明のアプタザイム（ａｐｔａｚａｙｍｅ）のプールを作製するために、短い無作為化領域によって抗テオフィリンアプタマーに結合されたＩ群リボザイムのＰ６領域の一部分を示す。図４Ｂは、図４ＡのＩ群Ｐ６アプタザイムプールの選択プロトコルの概略図である。
【図５】
図５は、Ｉ群イントロンスプライシングの外因性または内因性の活性化を示す、本発明の１つの実施形態の図である。
【図６】
図６は、外因性活性化因子のスクリーニングライブラリーのストラテジーを示す、本発明の別の実施形態の図である。
【図７】
図７は、外因性活性化因子のスクリーニングライブラリーについての本発明の代替的な実施形態の図である。
【図８】
図８は、外因性活性化因子のスクリーニングライブラリーについての本発明のなお別の代替的な実施形態の図である。
【図９】
図９は、内因性活性化因子のスクリーニングのための本発明の実施形態の図である。
【図１０】
図１０は、内因性活性化因子をスクリーニングするための本発明の図９の実施形態に対する代替法の図である。
【図１１】
図１１は、細胞内代謝を乱す化合物をスクリーニングするための本発明の別の実施形態の図である。
【図１２】
図１２は、代謝状態の非浸潤性読み出しを提供する本発明のさらなる実施形態の図である。
【図１３】
図１３は、内因性サプレッサーが複数の代謝状態の非浸潤性読み出しを提供する、本発明のなおさらなる実施形態の図である。
【図１４】
図１４は、本発明の１つの実施形態の自動選択手順についての作業表面の一例の概略図である。
【図１５】
図１５Ａは、本発明の１つの実施形態のＬＩリガーゼアプタザイム構築物の説明図である。図１５Ｂは、本発明の図１５Ａの改変されたＬＩリガーゼ酵素構築物の説明図である。図１５Ｃは、本発明の１つの実施形態の選択プロトコルの概略図である。
【図１６】
図１６は、本発明の１つの実施形態において、本発明のアプタザイム構築物を、固体支持体に固着させる方法の概略図である。
【図１７】
図１７（Ａ〜Ｃ）は、Ｌ１リガーゼがプール設計の開始点であったことを示す。
【図１８】
図１８（Ａ〜Ｄ）は、Ｌ１−Ｎ５０選択の進行を示す。
【図１９】
図１９（ＡおよびＢ）は、タンパク質依存性の調節可能な触媒的に活性な核酸の配列および構造を示す。
【図２０】
図２０は、不活化されたタンパク質サンプルを有するリボザイム活性を示す。
【図２１】
図２１は、アプタマー競合アッセイを示す。
【図２２】
図２２は、タンパク質濃度の関数として、結合および連結活性を示す。
【図２３】
図２３は、ＲＣＡＮＡの陰性選択および陽性選択のための方法のフローチャートである。
【図２４】
図２４は、Ｌ１−Ｎ５０  Ｒｅｖ選択の進行を示す。
【図２５】
図２５（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、本発明のテオフィリン依存ｔｄのＩ群イントロン構築物を示す。
【図２６】
図２６は、ＦＭＮ依存ｔｄ核酸イントロンスプライシング構築物の設計を示す。
【図２７】
図２７Ａ〜Ｃは、テオフィリン依存インビボ増殖の相対的増殖曲線を示す。
【図２８】
図２８は、３−メチルキサンチン依存インビボ増殖を示す。
【図２９】
図２９（ＡおよびＢ）は、リボゾームリガーゼアレイの概略図を示す。
【図３０】
図３０は、調節可能な触媒的に活性なリガーゼアレイの結果を示す。
【図３１】
図３１は、個々のアロステリックなリボザイムリガーゼの力価決定を示す。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際公開パンフレット】
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2004515219.tif 000169
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004515219.tif 000170
2004515219.tif 000171
【国際調査報告】
2004515219.tif 000172
2004515219.tif 000173
2004515219.tif 000174
2004515219.tif 000175
2004515219.tif 000176
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