(57)【要約】本発明は、カルシニューリン関連タンパク質（カルサルシン）として知られるポリペプチドに関する。カルサルシン−１、−２、および−３は、カルシニューリン、テレトニン、およびα−アクチニンに結合し、これはこれらの分子と筋節との間での連結を提供する。筋節の機能不全は最終的には、カルシニューリンの活性化を生じ、そして結果として肥大性心筋症を生じる。従って、これらの医学的状態に関してカルサルシンを利用する方法が本明細書中で提供され、そしてこの方法は、カルサルシンと相互作用するペプチドをスクリーニングする工程、カルシニューリンまたはα−アクチニンへのカルサルシンの結合のモジュレーターをルクリーニングする工程を包含する。カルシニューリン活性を調節するための方法、遺伝子の転写のカルシニューリン活性化を阻害するための方法、ならびに心肥大、心不全、およびＩＩ型糖尿病を処置するための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含む、単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２からなる、単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号６を含む、単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号６からなる、単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１０を含む、単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１０からなる、単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項７】
さらなるコード領域をさらに含む、請求項１に記載の単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項８】
さらなるコード領域をさらに含む、請求項３に記載の単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項９】
さらなるコード領域をさらに含む、請求項５に記載の単離されそして精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２をコードする核酸セグメントを含む、単離されそして精製された核酸。
【請求項１１】
真核生物細胞中で活性なプロモーターをさらに含む、請求項１０に記載の単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項１２】
前記核酸が組換えベクターをさらに含む、請求項１０に記載の単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項１３】
配列番号６をコードする核酸セグメントを含む、単離されそして精製された核酸。
【請求項１４】
真核生物細胞中で活性なプロモーターをさらに含む、請求項１３に記載の単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項１５】
前記核酸が組換えベクターをさらに含む、請求項１３に記載の単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項１６】
配列番号１０をコードする核酸セグメントを含む、単離されそして精製された核酸。
【請求項１７】
真核生物細胞中で活性なプロモーターをさらに含む、請求項１６に記載の単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項１８】
前記核酸が組換えベクターをさらに含む、請求項１６に記載の単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項１９】
前記核酸セグメントが、配列番号２を含む融合ポリペプチドをコードする、単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項２０】
前記核酸セグメントが、配列番号６を含む融合ポリペプチドをコードする、単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項２１】
前記核酸セグメントが、配列番号１０を含む融合ポリペプチドをコードする、単離されそして精製された核酸セグメント。
【請求項２２】
カルシニューリン関連筋節タンパク質（カルサルシン）をコードする核酸の欠損対立遺伝子を含む、ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２３】
カルサルシンをコードする核酸の２つの欠損対立遺伝子をさらに含む、請求項２２に記載の動物。
【請求項２４】
前記動物がマウスである、請求項２２に記載の動物。
【請求項２５】
発現カセットを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、該カセットが、真核生物細胞中で活性なプロモーターの制御下に、カルサルシンポリペプチドをコードする核酸を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２６】
前記プロモーターが構成的である、請求項２５に記載の動物。
【請求項２７】
前記プロモーターが組織特異的である、請求項２５に記載の動物。
【請求項２８】
前記プロモーターが誘導性である、請求項２５に記載の動物。
【請求項２９】
前記動物がマウスである、請求項２５に記載の動物。
【請求項３０】
配列番号２またはその抗原性フラグメントを含むポリペプチドに免疫学的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項３１】
その抗体が、配列番号２またはその抗原性フラグメントを含むポリペプチドに免疫学的に結合する、ポリクローナル抗血清。
【請求項３２】
配列番号６またはその抗原性フラグメントを含むポリペプチドに免疫学的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項３３】
その抗体が、配列番号６またはその抗原性フラグメントを含むポリペプチドに免疫学的に結合する、ポリクローナル抗血清。
【請求項３４】
配列番号１０またはその抗原性フラグメントを含むポリペプチドに免疫学的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項３５】
その抗体が、配列番号１０またはその抗原性フラグメントを含むポリペプチドに免疫学的に結合する、ポリクローナル抗血清。
【請求項３６】
カルサルシンポリペプチドまたはそのカルシニューリン結合フラグメントを生物体に投与する工程を包含する、動物のカルシニューリン活性を調節する方法。
【請求項３７】
カルサルシンポリペプチドまたはそのカルシニューリン結合フラグメントのドミナントネガティブ形態を生物体に投与する工程を包含する、動物のカルシニューリン活性を調節する方法。
【請求項３８】
カルサルシンポリペプチドまたはそのカルシニューリン結合フラグメントをコードする核酸を動物に投与する工程を包含し、該核酸が該動物中で作動可能なプロモーターの制御下にある、動物のカルシニューリン活性を調節する方法。
【請求項３９】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プロモーターが筋特異的プロモーターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記筋特異的プロモーターが、ミオシン軽鎖−２プロモーター、αアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳のナトリウム排泄増加性ペプチドプロモーター、αＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、または心房性ナトリウム排泄増加性因子プロモーターである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸がウイルスベクターを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
カルサルシンと相互作用するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞中に以下を導入する工程：
試験ペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む第１の核酸であって、ここで、該試験ペプチドはＤＮＡ結合ドメインに融合される、第１の核酸；および
カルサルシンの少なくとも一部をコードするＤＮＡセグメントを含む第２の核酸であって、ここで、該カルサルシンの少なくとも一部はＤＮＡ活性化ドメインに融合される、第２の核酸；ならびに
（ｂ）該ＤＮＡ結合ドメインと該ＤＮＡ活性化ドメインとの間での相互作用をアッセイすることによって、該試験ペプチドと該カルサルシンの少なくとも一部との間での相互作用をアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記ＤＮＡ活性化ドメインが、ＧＡＬ４およびＬｅｘＡからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
α−アクチニンへのカルサルシンの結合のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）カルサルシンおよびα−アクチニンを提供する工程；
（ｂ）候補モジュレーターの存在下で、該カルサルシンとα−アクチニンとを混合する工程；
（ｃ）カルサルシン／α−アクチニンの結合を測定する工程；ならびに
（ｄ）該候補モジュレーターの非存在下でのカルサルシンとα−アクチニンとの結合と、工程（ｃ）での結合を比較する工程、を包含し、
それによって、該候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、該候補モジュレーターの存在下でのカルサルシンとα−アクチニンとの結合の差異によって、α−アクチニンへのカルサルシンの結合のモジュレーターとして、該候補モジュレーターを同定する、方法。
【請求項４６】
カルサルシンおよびα−アクチニンが、無細胞系の一部である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
カルサルシンおよびα−アクチニンが、インタクトな細胞内に配置される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が筋細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞がＨ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞、または筋管細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記インタクトな細胞が動物中に配置される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記モジュレーターがα−アクチニンへのカルサルシンの結合を増大させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記モジュレーターがα−アクチニンへのカルサルシンの結合を減少させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
カルサルシンおよびα−アクチニンのいずれかまたは両方が標識される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
カルサルシンおよびα−アクチニンの両方が、一方がクエンチ可能な標識で、そして他方がクエンチング剤で標識される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
カルサルシンおよびα−アクチニンの両方が標識されるが、該標識は互いに近位にもたらされない限りは検出不能である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記測定する工程が、カルサルシン、α−アクチニン、またはこれらの両方の免疫学的検出を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
モジュレーターの非存在下でのカルサルシンとα−アクチニンとの結合を測定する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
カルシニューリンへのカルサルシンの結合のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）カルサルシンおよびカルシニューリンを提供する工程；
（ｂ）候補モジュレーターの存在下で、該カルサルシンとカルシニューリンとを混合する工程；
（ｃ）カルサルシン／カルシニューリンの結合を測定する工程；ならびに
（ｄ）該候補モジュレーターの非存在下でのカルサルシンとカルシニューリンとの結合と、工程（ｃ）での結合を比較する工程、を包含する方法であって、
それによって、該候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、該候補モジュレーターの存在下でのカルサルシンとカルシニューリンとの結合の差異によって、カルシニューリンへのカルサルシンの結合のモジュレーターとして、該候補モジュレーターを同定する、方法。
【請求項５９】
カルサルシンおよびカルシニューリンが、無細胞系の一部である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
カルサルシンおよびカルシニューリンが、インタクトな細胞内に配置される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が筋細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞がＨ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞、または筋管細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記インタクトな細胞が動物中に配置される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記モジュレーターがカルシニューリンへのカルサルシンの結合を増大させる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記モジュレーターがカルシニューリンへのカルサルシンの結合を減少させる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
カルサルシンおよびカルシニューリンのいずれかまたは両方が標識される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６７】
カルサルシンおよびカルシニューリンの両方が、一方がクエンチ可能な標識で、そして他方がクエンチング剤で標識される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
カルサルシンおよびカルシニューリンの両方が標識されるが、該標識は互いに近位にもたらされない限りは検出不能である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記測定する工程が、カルサルシン、カルシニューリン、またはこれら両方の免疫学的検出を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項７０】
モジュレーターの非存在下でのカルサルシンとカルシニューリンとの結合を測定する工程をさらに包含する、請求項５８に記載の方法。
【請求項７１】
テレトニンへのカルサルシンの結合のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）カルサルシンおよびテレトニンを提供する工程；
（ｂ）候補モジュレーターの存在下で、該カルサルシンとテレトニンとを混合する工程；
（ｃ）カルサルシン／テレトニンの結合を測定する工程；ならびに
（ｄ）該候補モジュレーターの非存在下でのカルサルシンとテレトニンとの結合と、工程（ｃ）での結合を比較する工程、を包含し、
それによって、該候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した、該候補モジュレーターの存在下でのカルサルシンとテレトニンとの結合の差異によって、テレトニンへのカルサルシンの結合のモジュレーターとして、該候補モジュレーターを同定する、方法。
【請求項７２】
カルサルシンおよびテレトニンが、無細胞系の一部である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
カルサルシンおよびテレトニンが、インタクトな細胞中に配置される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞が筋細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞がＨ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞、または筋管細胞である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記インタクトな細胞が動物中に配置される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記モジュレーターがテレトニンへのカルサルシンの結合を増大させる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記モジュレーターがテレトニンへのカルサルシンの結合を減少させる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７９】
カルサルシンおよびテレトニンのいずれかまたは両方が標識される、請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
カルサルシンおよびテレトニンの両方が、一方がクエンチ可能な標識で、そして他方がクエンチング剤で標識される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
カルサルシンおよびテレトニンの両方が標識されるが、該標識は互いに近位にもたらされない限りは検出不能である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記測定する工程が、カルサルシン、テレトニン、またはそれらの両方の免疫学的検出を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項８３】
モジュレーターの非存在下でのカルサルシンとテレトニンの結合を測定する工程をさらに包含する、請求項７１に記載の方法。
【請求項８４】
心肥大、心不全、またはＩＩ型糖尿病を処置する方法であって、該方法は、心肥大、心不全、またはＩＩ型糖尿病に罹患している動物に、カルサルシンポリペプチドまたはそのカルシニューリン結合フラグメントを投与する工程を包含し、ここで、該カルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントはカルシニューリン活性を阻害する、方法。
【請求項８５】
心肥大、心不全、またはＩＩ型糖尿病を処置する方法であって、該方法は、心肥大、心不全、またはＩＩ型糖尿病に罹患している動物に、心臓組織中で活性なプロモーターの制御下にカルサルシンポリペプチドまたはそのカルシニューリン結合フラグメントをコードしている核酸を投与する工程を包含し、ここで、該カルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントの発現によってカルシニューリン活性を阻害する、方法。
【請求項８６】
前記ポリペプチドがカルサルシンのドミナントネガティブ形態である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記動物を、イオノトロープ、β−ブロッカー、不整脈治療薬、利尿剤、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、アンギオテンシン２型アンタゴニスト、およびサイトカインインヒビター／ブロッカーからなる群より選択される化合物で処置する工程をさらに包含する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
細胞における遺伝子転写のカルシニューリン活性化を阻害する方法であって、該方法は、カルシニューリンが通常に機能する亜細胞性領域以外の亜細胞性領域に融合タンパク質を局在化させる標的化ペプチドに対して融合された、カルサルシンまたはそのカルシニューリン結合フラグメントを含む融合タンパク質を該細胞に提供する工程を包含する、方法。
【請求項９１】
前記標的化ペプチドが、ゲラニルゲラニル基、核局在化シグナル、ミリスチル化シグナル、および小胞体シグナルペプチドを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞が動物中に配置される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記動物がヒトである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記動物を、イオノトロープ、β−ブロッカー、不整脈治療薬、利尿剤、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、カルシウムチャンネルブロッカー、ホスホジエステラーゼインヒビター、アンギオテンシン２型アンタゴニスト、およびサイトカインインヒビター／ブロッカーからなる群より選択される化合物で処置する工程をさらに包含する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
カルサルシンに結合するペプチドを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）カルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントを支持体に付着させる工程；
（ｂ）該カルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントを候補ペプチドに曝す工程；および
（ｃ）該カルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントへの該候補ペプチドの結合をアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項９６】
前記支持体が、ニトロセルロース、カラム、またはゲルからなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
以下の工程を包含する、抗心筋肥大活性または抗心不全活性について候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）機能的なカルサルシンポリペプチドを欠く細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を該候補物質と接触させる工程；および
（ｃ）該細胞に対する該候補物質の影響を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９８】
前記細胞が筋肉細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞がカルサルシンの調節領域中に変異を有する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記変異が、欠失変異、挿入変異、または点変異である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記細胞がカルサルシンのコード領域中に変異を有する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記変異が、欠失変異、挿入変異、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、またはスプライシング変異である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞がインビトロで接触させられる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞がインビボで接触させられる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞が非ヒトトランスジェニック動物中に配置される、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、２０００年１１月７日に提出された同時係属中の米国仮特許出願番号６０／２４６，６２９に対する優先権を主張する。上記の参照される開示の本文の全体は、本明細書中において、特許権の一部放棄を伴わずに、参考として詳細に援用される。政府は、国立衛生研究所からの助成金番号ＨＬ５３３５１−０６に基づいて、本発明において独自の権利を所有し得る。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般的に、細胞生物学および分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、カルシニューリン結合性筋節タンパク質（カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ））を通じたカルシニューリンの活性の調節に関する。より詳細には、本発明は、カルサルシン−１を通じたカルシニューリンの活性の調節に関し、カルサルシン−１はまた、筋節に関連するα−アクチニンと相互作用する。
【０００３】
（２．関連分野の説明）
カルシニューリンは、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼであり、これは、広範な種々の細胞型の発生調節およびホメオスタシス調節における中枢の役割を果たす（Ｋｌｅｅら、１９９８、Ｃｒａｂｔｒｅｅ、１９９９）。白血球におけるＴ細胞レセプターの活性化後の、カルシニューリンのＮＦＡＴファミリーの転写因子との相互作用は、カルシニューリンが遺伝子発現を制御する理由の最良に特徴付けられる例を提供する（Ｒａｏら、１９９７）。細胞内カルシウムの変化は、Ｃａ２＋／カルモジュリンのカルシニューリン（ＣｎＡ）の触媒サブユニットへの結合を促進し、それによって、自己抑制領域を転置し、そしてタンパク質基質の触媒ドメインへの接近を可能にする。活性化カルシニューリンによるＮＦＡＴの脱リン酸化は、細胞質から核へのその移動を促進し、ここで、ＮＦＡＴは、ＡＰ１ヘテロダイマーと共同してＤＮＡを結合して、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）をコードする遺伝子の転写を活性化する。ＮＦＡＴ活性化のこの基本的なモデルは、多くの細胞型において、カルシニューリンを介してＣａ２＋シグナルを変換し、そして各々の細胞内環境に独特な標的遺伝子の多様なセットの転写を制御することが示されている（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９６）。各々の場合において、ＮＦＡＴは、他の転写因子と共同して作用し、この転写因子としては、ＡＰ１（Ｒａｏら、１９９７）、ｃＭＡＦ（Ｈｏら、１９９６）、ＧＡＴＡ（Ｍｅｓａｅｌｉら、１９９９；Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９８；Ｍｕｓａｒｏら、１９９９）またはＭＥＦ２（Ｃｈｉｎら、１９９８；Ｌｉｕら、１９９７；Ｍａｏら、１９９９；ＭａｏおよびＷｉｅｄｍａｎｎ、１９９９）ファミリーのタンパク質が挙げられる。Ｔ細胞活性化に加えて、カルシニューリンシグナル伝達によって制御される細胞応答は、シナプス可塑性（Ｍａｏら、１９９９；Ｇｒａｅｆら、１９９９；Ｚｈｕｏら、１９９９）およびアポトーシス（Ｗａｎｇら、１９９９；Ｙｏｕｎら、１９９９）を含む。
【０００４】
心臓および骨格筋の横紋筋細胞におけるカルシニューリンシグナル伝達の最近の研究は、この遍在して発現されるタンパク質によって制御される重要な生理学的事象および病理学的事象の範囲を拡大した。トランスジェニックマウスの心臓における構成的に活性化形態のカルシニューリンの強制発現は、心肥大を促進し、これは、ヒト疾患の特徴を要約する様式で、拡張した心筋症、心不全および死に進行する（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９８、本明細書中で参考として援用される）。さらに、これらの動物、および心筋症の特定の他の動物モデルにおける肥大および心不全は、カルシニューリンアンタゴニスト薬物、シクロスポリンＡまたはＦＫ−５０６の投与によって予防される（Ｓｕｓｓｍａｎら、１９９８）。骨格筋において、カルシニューリンシグナル伝達は、インスリン様増殖因子−１によって刺激される肥大成長（Ｍｕｓａｒｏら、１９９９；Ｓｅｍｓａｒｉａｎら、１９９９）、および特有の筋原繊維サブタイプを確立する遺伝子発現の特殊化プログラムの制御（Ｃｈｉｎら、１９９８；Ｄｕｎｎら、１９９９）の両方に関係する。これらの観察は、筋細胞において、選択的にカルシニューリン活性を改変する治療可能性における関心を刺激するが、一方、他の細胞型においては、変更されるカルシニューリンシグナル伝達の望まれない結果を回避する（Ｓｉｇａｌら、１９９１）。
【０００５】
哺乳動物細胞におけるカルシニューリンの活性は、他のタンパク質との相互作用によって調節され得る。これらは、免疫抑制薬物（シクロスポリンＡおよびＦＫ−５０６）の標的であるイムノフィリンだけでなく、最近同定された２つの関連のないタンパク質（ＡＫＡＰ７９およびｃａｂｉｎ−１／ｃａｉｎ）をも含む。ＡＫＡＰ７９は、プロテインキナーゼＣおよびプロテインキナーゼＡとともにカルシニューリンを結合し、これは、大きなヘテロ−オリゴマーシグナル伝達複合体のアセンブリについての足場として役立つ（Ｋａｓｈｉｓｈｉａｎら、１９９８）。ｃａｂｉｎ−１／ｃａｉｎは、カルシニューリンおよび転写因子ＭＥＦ２の両方を結合する（Ｓｕｎら、１９９８；Ｌａｉら、１９９８）。ｃａｂｉｎ−１過剰発現の結果として、カルシニューリン活性が阻害され、そしてＭＥＦ２が、不活性状態に隔離される。別のカルシニューリン結合タンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｅｘ１ｐ（ＹＫＬ１５９ｃ）である。予備報告は、この小さな２４ｋＤａタンパク質が、酵母において過剰発現される場合に、カルシニューリンシグナル伝達を阻害することを特筆した（ＫｉｎｇｓｂｕｒｙおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ、１９９８）。
【０００６】
筋細胞において、細胞骨格のアクチンフィラメントは、筋節のＺディスクに安定に固定され、そしてさらに、連続順序の筋節を通じて、筋肉の長さに沿った物理的ひずみの伝達に必要とされる。このＺディスクは、逆平行ダイマーのアクチン結合タンパク質、α−アクチニンからなる（Ｌｕｔｈｅｒ、１９９１）。所定のアクチンフィラメントについて、反対の筋節由来の４つのフィラメントの重複が存在し、これは、α−アクチニンを構成するＺフィラメントによって、ジグザクパターンで交差接続される四角い格子の形成をもたらす。この格子におけるα−アクチニンの周期性は、１５ｎｍと２０ｎｍとの間であり（Ｌｕｔｈｅｒ、１９９１；Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒら、１９９６）、そしてα−アクチニン架橋の数が可変性でも、総数は、所定の筋繊維において、高度に調節される（Ｓｑｕｉｒｅ、１９８１；Ｖｉｇｏｒｅａｕｘ、１９９４）。
【０００７】
筋節のα−アクチニン（ｓ−α−アクチニン）および非筋細胞に存在するα−アクチニン（非−ｓ−α−アクチニン）は、２つの異なる遺伝子によってコードされる。さらに、ｓ−α−アクチニンのアイソフォームは、おそらく選択的スプライシングスキームを介して産生される（Ｂａｒｏｎら、１９８７；ｄｅ  Ａｒｒｕｄａら、１９９０；Ｂｅｇｇｓら、１９９２；Ｐａｒｒら、１９９２）。非−ｓ−α−アクチニン形態のアクチン結合は、Ｃａ２＋感受性であり、一方、ｓ−α−アクチニン形態のアクチン結合は、Ｃａ２＋非感受性である（ＢｕｒｒｉｄｇｅおよびＦｅｒａｍｉｓｃｏ、１９８０；ＤｕｈａｉｍａｎおよびＢａｎｂｕｒｇ、１９８４；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９８４；Ｌａｎｄｏｎら、１９８５）。
【０００８】
ショウジョウバエのα−アクチニン遺伝子変異体は致死的であるが、ハエは、胚発生を越えて生存し得、検出可能な筋肉機能不全が、孵化段階で存在する（Ｆｙｒｂｅｒｇら、１９９８）。幼生発生において、この変異は、段階的に可動性を制限する顕著な筋肉変性を通じて現れ、そして最後に、死に至る。変異体の筋繊維の顕微鏡評価は、１日齢幼生と同じくらい初期に、筋繊維が、ヒトネマリンミオパシーと類似の細胞病理学で、有意に混乱される。
【０００９】
テレトニン（ｔｅｌｅｔｈｏｎｉｎ）は、肢帯筋ジストロフィに関与する遺伝子によってコードされる、心臓および骨格筋の筋節タンパク質である。筋ジストロフィ（ＭＤ）は、進行性の脱力、および運動を制御する骨格筋または随意筋の変性によって特徴付けられる遺伝子疾患の群をいう。心臓の筋肉およびいくつかの他の不随意筋はまた、いくつかの形態のＭＤに影響を及ぼし、そしていくらかの形態は、同様に他の器官を含む。ＭＤの主要な形態としては、筋緊張性ジストロフィ、デュシェーヌジストロフィ、ベッカー筋ジストロフィ、肢帯筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕筋ジストロフィ、先天性筋ジストロフィ、眼咽頭筋ジストロフィ、遠位筋ジストロフィおよびエメリー−ドライフス筋ジストロフィが挙げられる。デュシェーヌは、子供を冒すＭＤの最も一般的な形態であり、そして筋緊張性ＭＤは、成人を冒す最も一般的な形態である。ＭＤは、あらゆる年代の人々を冒し得る。いくつかの形態が、幼年期または幼児期に第一に現れるようになるが、他の形態は、中年またはそれ以降まで現れないかもしれない。筋ジストロフィについての公知の治療は存在せず、従って、カルサルシンを用いた遺伝子治療が、有益であることを証明し得る。
【００１０】
以前の研究（Ｓｕｓｓｍａｎら、１９９８；Ｓｈｉｍｏｙａｍａら、１９９９；Ｈｉｌｌら、２０００；Ｌｉｍら、２０００ａ；Ｌｉｍら、２０００ｂ；Ｔａｉｇｅｎら、２０００）は、カルシウム処理において変更を生じる筋節機能不全が、カルシニューリンの活性化、および引き続く肥大型心筋症をもたらすことを実証した。カルシニューリンと筋節との間の、例えば、カルシニューリン結合タンパク質またはペプチドとの結合は、治療標的を提供する。心臓組織においてカルシニューリン機能を調節する能力を有する新規のより適切な候補物の同定は、現在の研究努力の重要な目標である。
【００１１】
心肥大および心不全におけるカルシニューリンの中心的な役割の最初の発見の時以来（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９８）、非常に多くの追跡研究が存在し、これらは、多様な内因性シグナルおよび外因性シグナルに応答して、心臓の肥大成長におけるこのシグナル伝達経路の重要性を確認した（ＯｌｓｏｎおよびＭｏｌｋｅｎｔｉｎ、１９９９；ＩｚｕｍｏおよびＡｏｋｉ、１９９８において概説される）。心臓におけるこの経路の阻害または活性化は、心臓の細胞増殖に対する十分な結果を有し得、そして重要な治療含意を有する。しかし、Ｔ細胞活性化についてのカルシニューリンの重要性は、カルシニューリンが、器官全体において全体的に阻害される場合、免疫抑制をもたらす。従って、心臓特異的カルシニューリン結合タンパク質の同定は、特異的な亜細胞部位へのタンパク質の標的化、または心臓特異的標的タンパク質の改変を通じて、心臓におけるカルシニューリン活性を変更する可能な組織特異的手段を可能にし得る。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、新規のタンパク質、カルサルシンを利用し、これは、筋節内で、カルシニューリンをα−アクチニンに結合する。「おとり」として、カルサルシンのドミナントネガティブ変異体バージョンを使用して、カルシニューリンは、心筋細胞内において、不適切な細胞内位置に誤って指向され得、それによって、カルシニューリンの肥大シグナル伝達を混乱させる。特定の実施形態において、カルシニューリンに結合するが、α−アクチニンには結合しないカルサルシンの一部分を含み得るこれらのおとりは、アデノウイルス媒介性の遺伝子送達によって、インビトロで心筋細胞において発現され得る。
【００１３】
本発明の実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２を含む、単離され、そして精製されるポリペプチドが存在する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１をコードする核酸セグメントを含む、単離され、そして精製される核酸が存在する。特定の実施形態において、核酸セグメントは、真核生物細胞において活性なプロモーターをさらに含む。別の特定の実施形態において、核酸は、組換えベクターをさらに含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、単離され、そして精製される核酸セグメントが存在し、ここで、上記の核酸セグメントは、配列番号２を含む融合ポリペプチドをコードする。本発明の別の実施形態において、単離され、そして精製される核酸セグメントが存在し、ここで、上記の核酸セグメントは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２を含む融合ポリペプチドをコードする。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、カルサルシンをコードする核酸の欠損対立遺伝子を含む、ノックアウト非ヒト動物が存在する。特定の実施形態において、この動物は、カルサルシンをコードする核酸の２つの欠損対立遺伝子をさらに含む。さらなる特定の実施形態において、この動物は、マウスである。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態において、発現カセットを含むトランスジェニック非ヒト動物が存在し、ここで、上記のカセットは、真核生物細胞において活性なプロモーターの制御下において、カルサルシンポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態において、このプロモーターは、構成的、組織特異的または誘導性である。別の特定の実施形態において、この動物は、マウスである。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、配列番号２を含むポリペプチドに免疫学的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原性フラグメントが存在する。本発明の別の実施形態において、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２を含むポリペプチドに免疫学的に結合するモノクローナル抗体、あるいはその抗原性フラグメントが存在する。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態において、ポリクローナル抗血清、配列番号２を含むポリペプチドに免疫学的に結合する抗体、またはその抗原性フラグメントが存在する。本発明のさらなる実施形態において、ポリクローナル抗血清、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２を含むポリペプチドに免疫学的に結合する抗体、あるいはその抗原性フラグメントが存在する。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態において、動物において、カルシニューリン活性を調節する方法が存在し、この方法は、上記の生物に、カルサルシンポリペプチド、またはそのカルシニューリン結合フラグメントを投与する工程を包含する。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態において、動物において、カルシニューリン活性を調節する方法が存在し、この方法は、上記の生物に、カルサルシンポリペプチド、またはそのカルシニューリン結合フラグメントのドミナントネガティブ形態を投与する工程を包含する。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態において、動物において、カルシニューリン活性を調節する方法が存在し、この方法は、上記の生物に、カルサルシンポリペプチド、またはそのカルシニューリン結合フラグメントをコードする核酸を投与する工程であって、上記の核酸は、上記の動物の細胞において操作可能なプロモーターの制御下にある工程を包含する。特定の実施形態において、このプロモーターは、構成的プロモーターまたは筋特異的プロモーターである。別の特定の実施形態において、この筋特異的プロモーターは、ミオシン軽鎖−２プロモーター、αアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、αＢ−クリスタリン／低分子量熱ショックタンパク質プロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、または心房性ナトリウム利尿因子プロモーターである。別の特定の実施形態において、この核酸は、ウイルスベクターを含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、カルサルシンと相互作用するペプチドについてのスクリーニング方法が存在し、この方法は、試験ペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む第一の核酸（ここで、上記の試験ペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインに融合される）；およびカルサルシンの少なくとも一部分をコードするＤＮＡセグメントを含む第二の核酸（ここで、上記のカルサルシンの少なくとも一部分は、ＤＮＡ活性化ドメインに融合される）を、細胞に導入する工程；ならびに上記の試験ペプチドと上記のカルサルシンの少なくとも一部分との間の相互作用について、上記のＤＮＡ結合ドメインと上記のＤＮＡ活性化ドメインとの間の相互作用についてのアッセイによってアッセイする工程を包含する。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ活性化ドメインは、ＧＡＬ４およびＬｅｘＡからなる群より選択される。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態において、α−アクチニンへのカルサルシン結合のモジュレーターについてのスクリーニング方法が存在し、この方法は、カルサルシンおよびα−アクチニンを提供する工程；候補モジュレーターの存在下で、カルサルシンおよびα−アクチニンを混合する工程；カルサルシン／α−アクチニン結合を測定する工程；ならびに上記の候補モジュレーターの非存在下で、工程（ｃ）における結合を、カルサルシンおよびα−アクチニンの結合と比較し、それによって、上記の候補モジュレーターの非存在下における結合と比較される場合、上記の候補モジュレーターの存在下におけるカルサルシンおよびα−アクチニンの結合における差異が、α−アクチニンへのカルサルシン結合のモジュレーターとして、上記の候補モジュレーターを同定する工程を包含する。特定の実施形態において、カルサルシンおよびα−アクチニンは、無細胞系の一部である。別の特定の実施形態において、カルサルシンおよびα−アクチニンは、インタクトな細胞内に位置する。さらなる特定の実施形態において、この細胞は、筋細胞である。さらなる特定の実施形態において、この細胞は、Ｈ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞、成体心筋細胞または筋管細胞である。さらなる特定の実施形態において、このインタクトな細胞は、動物内に位置する。さらなる特定の実施形態において、このモジュレーターは、α−アクチニンへのカルサルシン結合を増大または減少する。別の特定の実施形態において、カルサルシンおよびα−アクチニンの両方が標識される。別の特定の実施形態において、カルサルシンおよびαアクチニンの両方が標識され、一方は、消光可能な標識で標識され、そして他方は、消光剤で標識される。さらなる特定の実施形態において、カルサルシンおよびα−アクチニンの両方が標識されるが、上記の標識は、互いに近接する場合を除いて、検出不可能である。さらなる特定の実施形態において、この測定工程は、カルサルシン、α−アクチニンまたは両方の免疫学的検出を含む。別の特定の実施形態において、この方法は、モジュレーターの非存在下で、カルサルシンおよびα−アクチニンの結合を測定する工程をさらに包含する。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、カルシニューリンへのカルサルシン結合のモジュレーターについてのスクリーニング方法が存在し、この方法は、カルサルシンおよびカルシニューリンを提供する工程；候補モジュレーターの存在下で、カルサルシンおよびカルシニューリンを混合する工程；カルサルシン／カルシニューリン結合を測定する工程；ならびに上記の候補モジュレーターの非存在下で、工程（ｃ）における結合を、カルサルシンおよびカルシニューリンの結合と比較し、それによって、上記の候補モジュレーターの非存在下における結合と比較される場合、上記の候補モジュレーターの存在下におけるカルサルシンおよびカルシニューリンの結合における差異が、カルシニューリンへのカルサルシン結合のモジュレーターとして、上記の候補モジュレーターを同定する工程を包含する。特定の実施形態において、カルサルシンおよびカルシニューリンは、無細胞系の一部である。別の特定の実施形態において、カルサルシンおよびカルシニューリンは、インタクトな細胞内に位置する。さらなる特定の実施形態において、この細胞は、筋細胞である。さらなる特定の実施形態において、この細胞は、Ｈ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞、成体心筋細胞または筋管細胞である。さらなる特定の実施形態において、このインタクトな細胞は、動物内に位置する。別の特定の実施形態において、このモジュレーターは、カルシニューリンへのカルサルシン結合を増大または減少する。さらなる特定の実施形態において、カルサルシンおよびカルシニューリンの両方が標識される。別の特定の実施形態において、カルサルシンおよびカルシニューリンの両方が標識され、一方は、消光可能な標識で標識され、そして他方は、消光剤で標識される。さらなる特定の実施形態において、カルサルシンおよびカルシニューリンの両方が標識されるが、上記の標識は、互いに近接する場合を除いて、検出不可能である。別の特定の実施形態において、この測定工程は、カルサルシン、カルシニューリンまたは両方の免疫学的検出を含む。さらなる実施形態において、この方法は、モジュレーターの非存在下で、カルサルシンおよびカルシニューリンの結合を測定する工程をさらに包含する。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、テレトニンへのカルサルシン結合のモジュレーターについてのスクリーニング方法が存在し、この方法は、カルサルシンおよびテレトニンを提供する工程；候補モジュレーターの存在下で、カルサルシンおよびテレトニンを混合する工程；カルサルシン／テレトニン結合を測定する工程；ならびに上記の候補モジュレーターの非存在下で、工程（ｃ）における結合を、カルサルシンおよびテレトニンの結合と比較し、それによって、上記の候補モジュレーターの非存在下における結合と比較される場合、上記の候補モジュレーターの存在下におけるカルサルシンおよびテレトニンの結合における差異が、テレトニンへのカルサルシン結合のモジュレーターとして、上記の候補モジュレーターを同定する工程を包含する。特定の実施形態において、カルサルシンおよびテレトニンは、無細胞系の一部である。別の特定の実施形態において、カルサルシンおよびテレトニンは、インタクトな細胞内に位置する。さらなる特定の実施形態において、この細胞は、筋細胞である。さらなる特定の実施形態において、この細胞は、Ｈ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞、成体心筋細胞または筋管細胞である。さらなる特定の実施形態において、このインタクトな細胞は、動物内に位置する。別の特定の実施形態において、このモジュレーターは、テレトニンへのカルサルシン結合を増大または減少する。さらなる特定の実施形態において、カルサルシンおよびテレトニンの両方が標識される。別の特定の実施形態において、カルサルシンおよびテレトニンの両方が標識され、一方は、消光可能な標識で標識され、そして他方は、消光剤で標識される。さらなる特定の実施形態において、カルサルシンおよびテレトニンの両方が標識されるが、上記の標識は、互いに近接する場合を除いて、検出不可能である。別の特定の実施形態において、この測定工程は、カルサルシン、テレトニンまたは両方の免疫学的検出を含む。さらなる実施形態において、この方法は、モジュレーターの非存在下で、カルサルシンおよびテレトニンの結合を測定する工程をさらに包含する。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、心肥大、心不全またはＩＩ型糖尿病を処置する方法が存在し、この方法は、それに罹患する動物に、カルサルシンポリペプチドまたはそのカルシニューリン結合フラグメントを投与する工程を包含し、ここで、上記のカルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントは、カルシニューリン活性を阻害する。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態において、心肥大、心不全またはＩＩ型糖尿病を処置する方法が存在し、この方法は、それに罹患する動物に、カルサルシンポリペプチドまたはそのカルシニューリン結合フラグメントをコードする核酸を、心臓組織において活性なプロモーターの制御下で投与する工程を包含し、ここで、上記のカルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントの発現は、カルシニューリン活性を阻害する。また、インヒビターは、カルシニューリン−カルサルシン、またはα−アクチニン相互作用を妨げる任意の分子であり得る。特定の実施形態において、このポリペプチドは、カルサルシンのドミナントネガティブ形態である。別の特定の実施形態において、この方法は、以下からなる群より選択される化合物を用いて上記の動物を処置する工程をさらに包含する：イオノトロープ（ｉｏｎｏｔｒｏｐｅ）、βブロッカー、抗不整脈薬、利尿薬、血管拡張薬、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、アンギオテンシン２型アンタゴニストおよびサイトカインインヒビター／ブロッカー。さらなる特定の実施形態において、このプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態において、細胞における遺伝子転写のカルシニューリン活性化を阻害する方法が存在し、この方法は、上記の細胞に、標的化ペプチドに融合されるカルサルシンまたはそのカルシニューリン結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供する工程であって、この標的ペプチドは、上記の融合タンパク質を、正常機能の亜細胞領域以外の亜細胞領域に局在化させる工程を包含する。特定の実施形態において、標的ペプチドは、ゲラニルゲラニル基、核局在化シグナル、ミリスチル化シグナルおよび小胞体シグナルペプチドを含む。別の特定の実施形態において、細胞は、動物内に位置する。さらなる特定の実施形態において、この動物は、ヒトである。さらなる特定の実施形態において、この方法は、上記の動物を、以下からなる群より選択される化合物を用いて処理する工程をさらに包含する：イオノトロープ、βブロッカー、抗不整脈薬、利尿薬、血管拡張薬、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、アンギオテンシン２型アンタゴニストおよびサイトカインインヒビター／ブロッカー。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、カルサルシンを結合するペプチドを同定する方法が存在し、この方法は、カルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントを、支持体に接着する工程；上記のカルサルシンポリペプチドまたはフラグメントを、候補ペプチドに曝露する工程；および上記の候補ペプチドの、上記のカルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントとの結合についてアッセイする工程を包含する。特定の実施形態において、この支持体は、ニトロセルロース、カラムまたはゲルからなる群より選択される。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態において、抗心筋症（ａｎｔｉ−ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｉｃ）の肥大活性または抗心不全活性に対する候補物質についてスクリーニングする方法が存在し、この方法は、機能的カルサルシンポリペプチドを欠失する細胞を提供する工程；上記の細胞を、上記の候補物質と接触させる工程；および上記の細胞に対する上記の候補物質の効果を決定する工程を包含する。特定の実施形態において、この細胞は、筋細胞である。別の特定の実施形態において、この細胞は、カルサルシンの調節領域に変異を有する。さらなる特定の実施形態において、この変異は、欠失変異、挿入変異または点突然変異である。特定の実施形態において、この細胞は、カルサルシンのコード領域に変異を有する。別の特定の実施形態において、この変異は、欠失変異、挿入変異、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異またはスプライシング変異である。さらなる特定の実施形態において、この細胞は、インビトロまたはインビボで接触される。さらなる特定の実施形態において、この細胞は、非ヒトトランスジェニック動物内に位置する。
【００３２】
（例示的な実施形態の詳細な説明）
心不全−心臓が、ホメオスタシスを維持するに十分な速度で、血液を押し出せないこと−は、今日の世界における主要な健康問題である。これは、心臓疾患によって引き起こされる早死にに起因するだけでなく、必要とされる患者の援助に起因して陥る莫大な支出（入院期間の延長を含む）に起因して真実である。従って、この高価かつ衰弱させる疾患に取り組む多大な必要性が残存する。
【００３３】
本発明者らは、本明細書中において、カルシニューリンの活性形態を結合し得るカルシニューリン結合ペプチド（カルサルシン−１）を報告する。特定の実施形態において、カルサルシン−１はまた、カルシニューリンの不活性形態を結合する。さらに、カルサルシン−１は、α−アクチニン（筋節形態および非筋節形態の両方）を結合し、これは、筋節に結合される。この筋節は、筋肉組織（例えば、心筋）における重要な筋肉サブユニットであり、これは、多くの点で、横紋筋に似ている。この筋節は、筋肉の最小の収縮成分であり、そしてタンパク質フィラメント（アクチンフィラメントおよびミオシンフィラメントを含む）から構成される。この細いフィラメントは、より小さなアクチンサブユニットから構成されるタンパク質フィラメントであり、このサブユニットが結合して、繊維状のアクチンまたはＦアクチンを形成する。各々の細いフィラメントは、２つの絡み合うアクチンフィラメントからなる。太いフィラメントは、タンパク質分子、ミオシンから構成され、このミオシンは、尾部領域および頭部領域の両方を有し、これにおいて、この頭部領域は、収縮の間に、太いフィラメントを細いフィラメントに接続する。筋節自身は、２つのＺ線（また、Ｚディスクとも呼ばれる）との間の領域として規定され、これは、ある筋節の細いフィラメントが、次の筋節の細いフィラメントに付着する境界（ｄｅｍａｒａｃｔｉｏｎ）である。上記で議論されるように、このＺディスクは、α−アクチニンから構成される。
【００３４】
最新の結果は、カルサルシン−１とカルシニューリンとの間の相互作用が、ヒト心臓疾患の病理生物学、および最終的に治療に関係があることを示す。例えば、肥大型心筋症の家族性形態は、カルシニューリンシグナル伝達を伴うような様式で（Ｍａｒｂａｎら、１９８７）、筋節のタンパク質をコードする遺伝子における変異によって引き起こされる（ＳｅｉｄｍａｎおよびＳｅｉｄｍａｎ、１９９８）。カルシニューリンアンタゴニスト薬物、シクロスポリンＡまたはＦＫ−５０６の投与は、肥大型心筋症の家族性形態のトランスジェニック動物モデルにおいて、心肥大を妨げるが（Ｓｕｓｓｍａｎら、１９９８）、類似の臨床試験は、現存する因子の毒性の副作用（例えば、免疫抑制および高血圧）のために排除される。
【００３５】
カルシニューリンアンタゴニストはまた、ヒト集団において一般的である心筋症の獲得形態のいくつかの（しかしすべてではない）動物モデルにおいて、心肥大および心不全を防ぐが（Ｓｕｓｓｍａｎら、１９９８；Ｄｉｎｇら、１９９９；Ｚｈａｎｇら、１９９９）、臨床試験に対する同じ制約が適用される。心筋におけるカルサルシン−１が比較的多いために、これは薬物開発についての主要な標的となり、最新のカルシニューリンアンタゴニストのこれらの制約を回避する。
【００３６】
本発明の結果は、カルサルシン１、カルサルシン２およびカルサルシン３が、遺伝性筋ジストロフィおよびミオパシーについての候補遺伝子であることをさらに示し；そしてテレトニン（肢帯筋ジストロフィに関与する遺伝子）とのカルサルシンの相互作用によって、これをさらに支持する。筋ジストロフィ（ＭＤ）は、進行性脱力、および運動を制御する骨格筋または随意筋の変性によって特徴付けられる遺伝子疾患の群をいう。心臓の筋肉およびいくつかの他の不随意筋はまた、いくつかの形態のＭＤにおいて冒され、そしていくつかの形態は、同様に、他の器官を冒す。主要な形態のＭＤとしては、筋緊張性ジストロフィ、デュシェーヌジストロフィ、ベッカー筋ジストロフィ、肢帯筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕筋ジストロフィ、先天性筋ジストロフィ、眼咽頭筋ジストロフィ、遠位筋ジストロフィおよびエメリー−ドライフス筋ジストロフィが挙げられる。
【００３７】
心筋症および筋ジストロフィにおけるカルシニューリン結合タンパク質の重要性が、本発明においてさらに示される。インビボでのそれらの相互作用および共局在に基づいて、本明細書中において、カルサルシン−１が、カルシニューリンをＺ膜に結合することがまた提唱され、ここで、これは、筋細胞におけるカルシウムシグナル伝達の変化を感知し得、そして潜在的に、肥大シグナルを変換し得る（図８）。カルサルシン−１および／または他のカルサルシンタンパク質（例えば、カルサルシン−２またはカルサルシン−３）はまた、Ｚ膜の調節、および細胞における他のタンパク質との結合を介して、心筋細胞および骨格筋細胞における構造的役割および／または機械的感覚の役割を果たし得る。Ｚ膜は、筋細胞の構造および機能の調節において、重要な役割を果たすことが示されている。従って、カルサルシンは、これらのプロセスに密接に関与するようであり、そしてヒト心筋症および筋ジストロフィに関与する遺伝子についての強力な候補物である。
【００３８】
（Ｉ．カルサルシンペプチドおよびポリペプチド）
本出願者らは、本明細書中において、ヒトカルサルシン−１（配列番号２）およびマウスカルサルシン−１（配列番号４）、ヒトカルサルシン−２（配列番号６）、マウスカルサルシン−２（配列番号８）、ヒトカルサルシン−３（配列番号１０）ならびにマウスカルサルシン−３（配列番号１２）についてのタンパク質配列を提供する。特定の実施形態において、カルシニューリン結合筋節タンパク質（カルサルシン）ペプチド、カルサルシンポリペプチドまたはカルサルシンタンパク質は、カルサルシン−１、カルサルシン−２またはカルサルシン−３をいう。カルサルシン−１分子全体に加えて、本発明はまた、ポリペプチドのフラグメントに関連し、このフラグメントは、以下に記載される種々の機能を保持するかもしれないし、保持しないかもしれない。フラグメント（分子のＮ末端を含む）は、コード領域内部の翻訳停止部位の遺伝子操作によって作製され得る（以下に議論される）。あるいは、（プロテアーゼとして公知の）タンパク質分解酵素を用いたカルサルシン−１の処理は、種々のＮ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメントおよび内部フラグメントを産生し得る。フラグメントの例としては、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００以上のアミノ酸長の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２の連続した残基が挙げられ得る。これらのフラグメントは、公知の方法（例えば、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム）、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（免疫アフィニティークロマトグラフィーを含む）または種々のサイズ分離（沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過））に従って精製され得る。
【００３９】
（Ａ．構造特徴）
当業者は、カルサルシン−１、カルサルシン−２および／またはカルサルシン−３の構造特徴を決定するための標準的な方法を承知しており、この方法は、例えば、市販のコンピュータプログラムまたはインターネット上で利用可能な政府支援プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／）である。
【００４０】
（Ｂ．機能的局面）
本明細書中の実施例に記載されるように、カルサルシン−１の領域は、α−アクチニンとの結合に関与する。特定の実施形態において、この領域は、アミノ酸１０５と１７６との間に局在する（実施例７を参照のこと）。別の実施形態において、カルサルシン−１の領域は、類似の方法によって、カルシニューリンとの結合に関与することが決定される。さらなる実施形態において、カルサルシン−２および／またはカルサルシン−３は、類似の方法によって、カルシニューリンとの結合に関与することが同定される。別の実施形態において、１を超えるカルサルシンポリペプチドが、カルシニューリンと相互作用し、そして特定の実施形態において、１を超えるカルサルシンポリペプチドが、付随してカルシニューリンと相互作用する。別の実施形態において、１を超えるカルサルシンポリペプチドが、α−アクチニンと相互作用する。さらなる特定の実施形態において、１を超えるカルサルシンポリペプチドが、付随してα−アクチニンと相互作用する。特定の実施形態において、カルサルシン−１アミノ酸配列、カルサルシン−２アミノ酸配列および／またはカルサルシン−３アミノ酸配列が、当該分野で標準的なコンピュータプログラムによって、または肉眼で比較されて、カルシニューリン相互作用についての候補物であるような類似のドメインを探索する。カルサルシン−１、カルサルシン−２および／またはカルサルシン−３におけるこのドメインは、当該分野で標準的な方法（例えば、指向性ツーハイブリッド分析または共同免疫沈降）によって、カルシニューリン結合について試験される。これらの研究は、カルサルシン−１のカルシニューリン結合ドメインが、残基２１７〜２４０に局在することを明らかにした。
【００４１】
（Ｃ．カルサルシンの改変体）
カルサルシンポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、置換改変体、挿入改変体または欠失改変体であり得る。欠失改変体は、ネイティブタンパク質の１以上の残基を欠失し、この残基は、機能または免疫原性活性に不可欠ではない。別の一般的な型の欠失改変体は、分泌シグナル配列、またはタンパク質に細胞の特定の部分に結合することを指向するシグナル配列を欠失する改変体である。挿入改変体は、代表的には、ポリペプチドの非末端地点に物質の付加を含む。これは、免疫反応性エピトープまたは単に１残基の挿入を含み得る。末端付加（融合タンパク質と呼ばれる）は、以下に議論される。
【００４２】
置換改変体は、代表的には、タンパク質内部の１以上の部位で、あるアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含み、そして他の機能または性質を失わずに、ポリペプチドの１つ以上の性質（例えば、タンパク質分解開裂に対する安定性）を調節するように設計され得る。この種類の置換は、好ましくは、保存的であり、すなわち、１つのアミノ酸が、類似の形状および荷電のアミノ酸で置換される。保存的置換は、当該分野で周知であり、そして例えば、以下の変化を含む；アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リジンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシン。
【００４３】
以下は、等価な、または改善さえされる雑種第二代分子を作製するためのタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸の変化に基づいた議論である。例えば、特定のアミノ酸が、構造（例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような）との相互作用性結合能の相当な損失を伴わずに、タンパク質構造において他のアミノ酸について置換され得る。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは、タンパク質の相互作用能および性質であるので、特定のアミノ酸置換は、タンパク質配列およびその基礎をなすＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにもかかわらず、類似の性質を有するタンパク質を獲得し得る。従って、本発明者らによって、種々の変化が、以下に議論されるように、対応するポリペプチドの生物学的有用性または活性の相当な損失を伴わずに、遺伝子のＤＮＡ配列においてなされ得ることが意図される。本明細書中の他の場所に提供される表１は、特定のアミノ酸をコードするコドンを示す。
【００４４】
このような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）指標が考慮され得る。タンパク質への相互作用性の生物学的機能の付与におけるヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、一般に、当該分野で理解される（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特性が、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これは、次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのタンパク質の相互作用を規定することが認められる。
【００４５】
各々のアミノ酸は、その疎水性および荷電特性に基づいて、ヒドロパシー指標を割り当てられており（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）、これらは、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００４６】
当該分野において、特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そして類似の生物学的活性を有するタンパク質をなおもたらす（すなわち、生物学的な機能が等価なタンパク質をなお得る）ことが公知である。このような変化を行う際に、ヒドロパシー指標が、±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が、特に好ましく、そして±０．５以内の置換が、なおより特に好ましい。
【００４７】
当該分野において、類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効に作製され得ることがまた理解される。本明細書中において参考として援用される米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最も大きな局所平均親水性が、その近傍のアミノ酸の親水性によって支配されるように、このタンパク質の生物学的性質に相関することを述べる。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値は、アミノ酸残基に対して割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン＊−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００４８】
アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸について置換され得、そして生物学的に等価かつ免疫学的に等価なタンパク質をなお獲得することが理解される。このような変化において、親水性値が、±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が、特に好ましく、そして±０．５以内の置換が、なおより特に好ましい。
【００４９】
上記で略述されるように、アミノ酸置換は、一般的には、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。種々の上述の特性を考慮する例示的な置換は、当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００５０】
本発明に従ったポリペプチドの調製についての別の実施形態は、ペプチド模倣物の使用である。模倣物は、ペプチド含有分子であり、これは、タンパク質の二次構造の成分を模倣する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３）。ペプチド模倣物の使用の背後の基礎をなす原理は、タンパク質のペプチド骨格が存在して、本質的に、分子相互作用（例えば、抗体および抗原の相互作用）を容易にするような様式で、アミノ酸側鎖を配向することである。ペプチド模倣物は、天然の分子に類似の分子相互作用を可能にすることが期待される。これらの原理が、上記で略述される原理と共に使用されて、カルサルシンの天然の性質の多くを有するが、変更され、そしてなお改善される特性を有する雑種第二代分子を操作し得る。
【００５１】
（Ｄ．ドメインスイッチング）
実施例に記載されるように、本発明者らは、カルサルシンを単離した。当該分野における標準的な手段によって決定される、ヒトカルサルシンと、マウスカルサルシンと、ラットカルサルシンとの間の相同性を考慮すると、興味深い一連の変異体が、種々のタンパク質の相同領域の置換によって作製され得る。これは、特定の状況において、「ドメインスイッチング」として公知である。
【００５２】
ドメインスイッチングは、異なるが、この場合においては関連するポリペプチドを用いたキメラ分子の作製を伴う。種々のカルサルシンタンパク質の比較によって、これらの分子の機能的に有意な領域に関する予測を行い得る。次いで、カルサルシン機能に対するこれらの領域の臨界を決定しようと努力して、これらの分子の関連ドメインをスイッチすることが可能である。これらの分子は、これらの「キメラ」が、天然の分子と区別され得るが、一方、同じ機能を提供するかもしれない点において、さらなる価値を有し得る。
【００５３】
（Ｅ．融合タンパク質）
挿入改変体の特殊化種類は、融合タンパク質である。この分子は、一般的に、Ｎ末端またはＣ末端で、第二のポリペプチドのすべてまたは一部に結合したネイティブ分子のすべてまたは実質的部分を有する。例えば、融合は、代表的には、他の種由来のリーダー配列を利用して、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にする。別の有用な融合は、免疫学的に活性なドメイン（例えば、抗体エピトープ）の付加を含み、融合タンパク質の精製を容易にする。融合点または融合点付近での開裂部位の包含は、精製後の外来ポリペプチドの除去を容易にする。他の有用な融合は、機能的ドメイン（例えば、酵素由来の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的化シグナルまたは膜貫通領域）の結合を含む。特定の実施形態において、カルサルシンを含む融合タンパク質が利用されて、細胞における遺伝子転写のカルシニューリン活性化を阻害し、この細胞において、融合タンパク質は、上記の融合タンパク質カルサルシンを、上記のカルシニューリンについての正常機能の亜細胞領域以外の亜細胞領域に局在させる。カルシニューリン機能の局在化についての亜細胞領域を同定するための方法は、当該分野で周知であり、そして亜細胞分別および免疫局在化を通じて、標識されるカルシニューリンの透過電子顕微鏡法単離を含む。特定の実施形態において、カルサルシンを含む融合タンパク質はまた、標的ペプチドを含み、ここで、この標的ペプチドは、ゲラニルゲラニル基、核局在化シグナル、ミリスチル化シグナルまたは小胞体シグナルペプチドを含む。特定の実施形態において、ゲラニルゲラニル基またはミリスチル化シグナルは、膜に対して融合タンパク質を標的化する。
【００５４】
（Ｆ．タンパク質の精製）
カルサルシンまたはその改変体を精製することが望ましい。タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、１つのレベルにおいて、細胞環境の、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への粗分別を含む。ポリペプチドを他のタンパク質から分離して、目的のポリペプチドは、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を用いてさらに精製されて、部分精製または完全精製（もしくは均質性までの精製）を達成する。純粋なペプチドの精製に特に適した分析方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；および等電点電気泳動が挙げられる。精製ペプチドの特に有効な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣである。
【００５５】
本発明の特定の局面は、コードタンパク質またはペプチドの精製に関し、そして特定の実施形態において、コードタンパク質またはペプチドの実質的精製に関する。本明細書中で使用される場合、用語「精製タンパク質またはペプチド」は、他の成分から単離可能な組成物をいうことが意図され、ここで、このタンパク質またはペプチドは、その天然に獲得可能な状態に対する任意の程度まで精製される。従って、精製タンパク質またはペプチドはまた、天然に存在し得る環境を含まないタンパク質またはペプチドをいう。
【００５６】
一般的に、「精製された」は、分別に供されて、種々の他の成分を除去されるタンパク質またはペプチド組成物をいい、そしてこの組成物は、その発現される生物学的活性を実質的に保持する。用語「実質的に精製される」が使用される場合、この呼称は、タンパク質またはペプチドが、組成物の主要な成分を形成する（例えば、組成物において、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％以上のタンパク質を構成する）組成物をいう。
【００５７】
タンパク質またはペプチドの精製の程度の定量についての種々の方法は、本発明の開示を考慮して、当業者に公知である。これらとしては、例えば、活性画分の特異的活性を決定する工程、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による画分内のポリペプチドの量を評価する工程を包含する。画分の純度の評価についての好ましい方法は、この画分の特異的活性を計算し、それを最初の抽出物の特異的活性と比較し、従って、純度（本明細書中において、「〜倍の精製数」によって評価される）を計算することである。活性の量を表現するために使用される実際の単位は、もちろん、精製を続けるために選択される特定のアッセイ技術、および発現タンパク質またはペプチドが、検出可能な活性を示すか否かに依存する。
【００５８】
タンパク質精製における使用に適切な種々の技術は、当業者に周知である。これらは、例えば、以下を含む：硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈殿、または熱変性による沈殿、遠心分離後の沈殿；クロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー）；等電集束法；ゲル電気泳動；ならびにこのような技術および他の技術の組み合わせ。当該分野において一般的に公知であるように、種々の精製工程の実施の順序が、変化し得るか、または特定の工程が省略され得ることが考えられ、そして実質的に精製されるタンパク質またはペプチドの調製についての適切な方法をなおもたらす。
【００５９】
タンパク質またはペプチドが、常にその最も精製される状態で提供されるという一般的な要件は存在しない。実際に、さほど実質的に精製されない産物が、特定の実施形態において有用性を有することが意図される。部分精製は、組み合わせたより少数の精製工程によってか、または異なる形態の同じ一般的精製スキームの利用によって果たされ得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧のクロマトグラフィー系を利用する同じ技術よりも大きな「〜倍の」精製をもたらすことが理解される。より低い程度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の総回収における利点、または発現されるタンパク質の活性の維持における利点を有し得る。
【００６０】
ポリペプチドの移動が、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件を用いて、時折有意に変化し得ることが公知である（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。従って、異なる電気泳動条件下で、精製発現産物または部分精製発現産物の見かけの分子量が変化し得ることが理解される。
【００６１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、並はずれた分解能のピークを伴う非常に迅速な分離によって特徴付けられる。これは、非常に細かい粒子および高圧の使用によって達成されて、適切な流速を維持する。分離は、約数分、またはせいぜい１時間で果たされ得る。さらに、極めて少量のサンプルのみが必要とされる。なぜなら、この粒子は非常に小さくそして密に詰まっているので、ボイド容量が、総容量の極めて少ない画分であるからである。また、サンプルの濃度が非常に高い必要はない。なぜなら、このバンドは非常に狭いので、このサンプルの非常にわずかな希釈が存在するからである。
【００６２】
ゲルクロマトグラフィーまたは分子篩クロマトグラフィーは、分子サイズに基づく特殊型の分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの背後の理論は、カラム（これは、小孔を含む不活性物質の小さな粒子を用いて調製される）が、分子のサイズに依存して、孔を通過するかまたは回るように、より小さな分子からより大きな分子を分離する。粒子が作製される材料が、分子を吸着しない限りは、流速を決定する唯一の因子はサイズである。従って、分子は、形状が比較的一定である限りは、漸減サイズでカラムから溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、異なるサイズの分子の分離に卓越する。なぜなら、分離は、すべての他の因子（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度など）から独立するからである。また、実質的に吸着は存在せず、より少ないゾーン分離および溶出量が、簡単な事柄で分子量に関連する。
【００６３】
アフィニティークロマトグラフィーは、単離されるべき物質とそれに特異的に結合し得る分子との間の特異的親和性に頼るクロマトグラフィー手順である。これは、レセプター−リガンド型相互作用である。カラム材料は、結合パートナーのうちの１つを不溶性マトリックスに共有結合することによって合成される。次いで、このカラム材料は、溶液から物質を特異的に吸着し得る。溶出は、条件を結合が生じない条件に変化させることによって（ｐＨ、イオン強度、温度などを変更することによって）生じる。
【００６４】
炭水化物含有化合物の精製に有用な特定の型のアフィニティークロマトグラフィーは、レクチンアフィニティークロマトグラフィーである。レクチンは、種々の多糖類および糖タンパク質に結合する物質のクラスである。レクチンは、通常、ブロモシアンによってアガロースに結合される。セファロースに結合されるコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ  Ａ）は、使用されるべきこの種類の第一の物質であり、そして多糖類および糖タンパク質の単離に広範に使用されている。他のレクチンとしては、レンチルレクチン、小麦胚芽凝集素（これは、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基の精製に有用である）およびＨｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａレクチンが挙げられる。レクチン自身は、炭水化物リガンドとのアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。ラクトースが使用されて、ヒマの実およびピーナッツからレクチンを精製する；マルトースは、レンズマメおよびタチナタマメからのレクチンの抽出に有用である；Ｎ−アセチル−Ｄガラクトサミンは、ダイズからのレクチンの精製のために使用される；Ｎ−アセチルグルコサミニルは、小麦胚芽由来のレクチンに結合する；Ｄ−ガラクトサミンは、二枚貝（ｃｌａｍｓ）からのレクチンの獲得に使用されており、そしてＬ−フコースは、ミヤコグサ（ｌｏｔｕｓ）由来のレクチンに結合する。
【００６５】
このマトリックスは、それ自身、どんな有意な程度までの分子も吸着せず、そして広範な化学的安定性、物理的安定性および熱安定性を有する物質であるべきである。このリガンドは、その結合性質に影響を及ぼさないような様式で結合されるべきである。このリガンドはまた、比較的密接な結合を提供するべきである。そしてこれは、サンプルまたはリガンドを破壊することなく、物質の溶出を可能にするべきである。最も一般的な形態のアフィニティークロマトグラフィーのうちの１つは、免疫アフィニティークロマトグラフィーである。本発明に従った使用に適切な抗体の作製は、以下に議論される。
【００６６】
（Ｇ．合成ペプチド）
本発明はまた、本発明の種々の実施形態における使用についてのより小さなカルサルシンペプチドを記載する。その比較的小さなサイズのために、本発明のペプチドはまた、従来技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成器が市販され、そして公知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、（１９８４）；Ｔａｍら、（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９８６）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）（各々は、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。短いペプチド配列、または重複ペプチドのライブラリ（通常、およそ６アミノ酸からおよそ３５〜５０アミノ酸まで）（これは、本明細書中に記載される選択領域に対応する）が容易に合成され得、次いで、反応性ペプチドを同定するように設計されるスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされ得る。あるいは、組換えＤＮＡテクノロジーが利用され得、ここで、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養される。
【００６７】
（Ｈ．抗原組成物）
本発明はまた、抗体の産生に関連する動物の免疫についての抗原として、カルサルシンタンパク質またはペプチドの使用を提供する。カルサルシンまたはその一部分が、リンカー、ポリリンカーまたは誘導体化アミノ酸を介して、１つ以上の因子に結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）、結合（ｂｏｎｄｅｄ）、結合（ｂｏｕｎｄ）、結合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）または化学結合されることが予見される。これが行われ得、その結果、二重特異性組成物または多価組成物あるいはワクチンが産生される。これらの組成物の調製において使用される方法が、当業者に周知であり、そして動物への投与に適切である（すなわち、薬学的に受容可能である）べきであることがさらに予見される。好ましい因子は、キャリア（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））である。
【００６８】
（ＩＩ．核酸）
本発明はまた、別の実施形態において、カルサルシンをコードする核酸を提供する。カルサルシン核酸は、ヒトカルサルシン−１、ヒトカルサルシン−２、ヒトカルサルシン−３、マウスカルサルシン−１、マウスカルサルシン−２およびマウスカルサルシン−３を含む。ヒトカルサルシン−１についての核酸（配列番号１）およびマウスカルサルシン−１についての核酸（配列番号３）が同定されている。さらに、３つのマウスカルサルシン−２  ＥＳＴおよび４つのヒトカルサルシン−２  ＥＳＴが同定された（実施例１を参照のこと）。マウスカルサルシン−２  ＥＳＴは、以下の通りである：ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡ０３６１４２；ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＷ７４２４９４；およびＧｅｎＢａｎｋ番号Ｗ２９４６６。ヒトカルサルシン−２  ＥＳＴは以下の通りである：ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＷ９６４１０８；ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡ１９７１９３；ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＷ０００９８８；およびＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡ１７６９４５。特定の実施形態において、マウスカルサルシン−２  ＥＳＴおよびヒトカルサルシン−２  ＥＳＴは、当該分野で公知のコンピュータプログラムによって整列されて、それぞれ全長のマウスカルサルシン−２配列および全長のヒトカルサルシン−２配列を同定する。本発明は、これらの核酸に対する範囲に限定されない。しかし、当業者は、これらの核酸を用いて、種々の他の種（例えば、ラット、ウサギ、イヌ、サル、テナガザル、ヒト、チンパンジー、類人猿、ヒヒ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよび他の種）における関連ホモログを容易に同定し得る。
【００６９】
別の特定の実施形態において、カルサルシン−３は、カルサルシン１配列およびカルサルシン２配列をデータベースと比較することによって、「インシリコで（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）」発見された。いくつかの相同配列を含むヒトゲノムＤＮＡ（ＡＣ００８４５３．３；公共データベース、Ｃｅｌｅｒａデータベースではない）が、カルサルシン−３のエキソンであることが確認された。プライマーが設計され、そしてヒト骨格筋ライブラリが、ヒトカルサルシン−３に対する全長ｃＤＮＡについてスクリーニングされた（図５）。同様に、マウス骨格筋ライブラリがスクリーニングされ、そしてマウスカルサルシン−３についてコードするいくつかの独立クローンおよび重複クローンが同定された。ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリ由来の全長核酸配列が比較されて、エキソン配列とイントロン配列間を区別する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。さらに、当該分野で周知のコンピュータプログラムは、この核酸配列を使用して、推定アミノ酸配列を作製する。
【００７０】
さらに、本発明が、本明細書中に開示される特定の核酸に限定されないことが明らかであるはずである。以下に議論されるように、「カルサルシン核酸」は、種々の異なる塩基を含み得、そして対応するポリペプチドをまだなお産生し、このポリペプチドは、本明細書中に開示されるヒトおよびマウスの核酸から機能的に区別できず、そしていくつかの場合において、これらの核酸から構造的に区別できない。
【００７１】
同様に、核酸に対する任意の参照は、この核酸を含む宿主細胞、およびいくつかの場合において、この核酸の産物を発現し得る宿主細胞を包含するとして読まれるべきである。治療的考慮に加えて、本発明の核酸を発現する無細胞系の細胞は、カルサルシンの機能を誘導、抑制、阻害、増大、干渉、ブロック、阻止、刺激または増強する因子についてのスクリーニングの状況における有用性を提供し得る。
【００７２】
（Ａ．カルサルシン−１をコードする核酸）
本発明に従った核酸は、カルサルシン核酸、カルサルシンのドメインまたは本明細書中に示されるようなカルサルシン−１の任意の他のフラグメントをコードし得る。好ましい実施形態において、この核酸は、カルサルシンペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードし、これは、機能的活性または免疫原性活性を有する。特定の実施形態において、用語「カルサルシン核酸」または「カルサルシン」は、カルサルシン−１核酸、カルサルシン−２核酸またはカルサルシン−３核酸、それぞれカルサルシン−１のドメイン、カルサルシン−２のドメインまたはカルサルシン−３のドメイン、あるいは本明細書中に示されるようなカルサルシン−１の任意の他のフラグメント、カルサルシン−２の任意の他のフラグメントまたはカルサルシン−３の任意の他のフラグメントをいう。この核酸は、ゲノムＤＮＡに由来し得、すなわち、特定の生物のゲノムから直接クローニングされ得る。しかし、好ましい実施形態において、この核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。また、ｃＤＮＡおよび天然のイントロンまたは別の遺伝子に由来するイントロンが意図される；このような操作される分子は、時折、「ミニ遺伝子」といわれる。最低限において、これらの核酸および本発明の他の核酸は、例えば、ゲル電気泳動において、分子量基準として使用され得る。
【００７３】
用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて調製されるＤＮＡをいうことが意図される。ゲノムＤＮＡあるいはゲノムの非プロセシングＲＮＡ鋳型またはゲノムの部分プロセシングＲＮＡ鋳型から重合されるＤＮＡとは対照的に、ｃＤＮＡを使用する利点は、ｃＤＮＡが、対応するタンパク質のコード配列を主に含むことである。完全なゲノム配列または部分ゲノム配列が好ましい場合が存在し得、これは例えば、非コード領域が、最適発現に必要であるか、またはイントロンのような非コード領域が、アンチセンスストラテジーにおいて標的されるべきである場合である。
【００７４】
また、所定の種由来の所定のカルサルシンが、天然の改変体によって表され得ることが意図され、この改変体は、わずかに異なる核酸配列を有するが、それにもかかわらず、同じタンパク質をコードする（以下の表１を参照のこと）。
【００７５】
本出願において使用されるように、用語「カルサルシンをコードする核酸」は、細胞核酸の全体を離れて単離されているカルサルシン核酸分子をいう。好ましい実施形態において、本発明は、本質的に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１において示されるような核酸配列に関する。用語「配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に示されるような」は、核酸配列が、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１の一部分に実質的に対応することを意味する。用語「機能的に等価なコドン」は、本明細書中において使用されて、同じアミノ酸をコードするコドン（例えば、アルギニンまたはセリンについての６つのコドン（以下の表１））をいい、そしてまた、以下の頁に議論されるように、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンをいう。
【００７６】
【表１】
2004528822.tif 000002
遺伝コードの縮重を考慮して、少なくとも約５０％、通常は少なくとも約６０％、より通常には約７０％、最も通常には約８０％、好ましくは少なくとも約９０％および最も好ましくは、約９５％のヌクレオチド（このヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１のヌクレオチドに等しい）を有する配列が意図される。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に示される配列と本質的に同じ配列がまた、標準的な条件下で、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１の相補体を含む核酸セグメントとハイブリダイズし得る配列として機能的に規定され得る。
【００７７】
本発明のＤＮＡセグメントは、上記のように、生物学的に機能的等価なカルサルシンタンパク質およびペプチドをコードするセグメントを含む。このような配列は、コドンの重複の結果およびアミノ酸の機能的等価の結果として生じ得、これらは、核酸配列内部で自然に生じることが公知であり、従って、タンパク質がコードされる。あるいは、機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、組換えＤＮＡ技術の適用を介して作製され得、これにおいて、タンパク質構造の変化が、交換されているアミノ酸の性質の考慮に基づいて操作され得る。人によって設計される変化は、以下に議論されるように、部位特異的突然変異誘発技術の適用を通じて導入され得るか、またはランダムに導入され得、そしてその後所望の機能についてスクリーニングされ得る。
【００７８】
（Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー）
本来、本発明はまた、ＤＮＡセグメントを包含し、このセグメントは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に示される配列に相補的、または本質的に相補的である。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリックの相補的規則に従って、塩基対合し得る配列である。本明細書中で使用される場合、用語「相補的配列」は、上記に示される同じヌクレオチド比較によって評価され得るように、または本明細書中に記載されるような比較的ストリンジェントな条件下で、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１の核酸セグメントにハイブリダイズし得ると規定されるように、実質的に相補的である核酸配列を意味する。このような配列は、カルサルシンポリペプチドまたはタンパク質の全体、またはその機能的フラグメントもしくはその非機能的フラグメントをコードし得る。
【００７９】
あるいは、このハイブリダイズセグメントは、より短いオリゴヌクレオチドであり得る。１７塩基長の配列は、ヒトゲノムにおいてただ１回生じるはずであり、従って、独特の標的配列の特定に十分である。より短いオリゴマーは作製し易く、インビボ接近を増大するが、多数の他の因子が、ハイブリダイゼーションの特異性の決定に関与する。その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性および配列特異性の両方が、漸増長とともに増大する。８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上の塩基対の例示的なオリゴヌクレオチドが使用されるが、他のオリゴヌクレオチドが意図されることが意図される。２５０、５００、１０００、１２１２、１５００、２０００、２５００または３０００塩基以上をコードするより長いポリヌクレオチドが、同様に意図される。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロットにおけるプローブとしての使用、ならびに増幅反応におけるプライマーとしての使用を見出す。
【００８０】
適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。特定の適用、例えば、部位特異的突然変異誘発によるアミノ酸の置換において、より低いストリンジェンシー条件が必要とされることが理解される。これらの条件下で、ハイブリダイゼーションは、たとえプローブおよび標的鎖の配列が、完全に相補的でなくても生じ得るが、１以上の位置でミスマッチされ得る。条件は、漸増塩濃度および漸減温度によって、より少ないストリンジェンシーにされ得る。例えば、中程度のストリンジェンシー条件は、約３７℃〜約５５℃の温度で、約０．１〜０．２５Ｍ  ＮａＣｌによって提供され得、一方、低いストリンジェンシー条件は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩によって提供され得る。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般的に、所望の結果に依存した選択方法である。
【００８１】
他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、例えば、約２０℃と約３７℃との間の温度で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ジチオトレイトールの条件下で達成され得る。利用される他のハイブリダイゼーション条件は、約４０℃〜約７２℃の範囲の温度で、約１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含み得る。ホルムアミドおよびＳＤＳがまた使用されて、ハイブリダイゼーション条件を変更し得る。
【００８２】
本発明のプローブおよびプライマーを使用する１つの方法は、カルサルシンに関連する遺伝子、またはより特に、他の種由来のカルサルシンのホモログの検索にある。標準的に、この標的ＤＮＡは、ゲノムライブラリまたはｃＤＮＡライブラリであるが、スクリーニングは、ＲＮＡ分子の分析を伴い得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびプローブの領域を変化させることによって、異なる程度の相同性が発見され得る。
【００８３】
本発明のプローブおよびプライマーを利用する別の方法は、部位特異的（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発または部位特異的（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）突然変異誘発にある。部位特異的突然変異誘発は、基礎をなすＤＮＡの特異的突然変異誘発を通じた、個々のペプチドまたは生物学的に機能等価なタンパク質もしくはペプチドの調製に有用な技術である。この技術は、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することによって、１つ以上の上述の考慮を含む配列改変体を調製および試験する容易な能力をさらに提供する。部位特異的突然変異誘発は、特定のオリゴヌクレオチド配列の使用を通じた変異体の産生を可能にし、この配列は、所望の変異のＤＮＡ配列、ならびに十分な数の近傍ヌクレオチドをコードして、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供して、交差されている両側の欠失連結点上に安定な二重鎖を形成する。代表的には、変更されている配列の両側の連結点上に、約５〜１０残基を有する約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。
【００８４】
この技術は、代表的には、バクテリオファージベクターを利用し、このベクターは、一本鎖形態および二本鎖形態の両方に存在する。部位特異的突然変異誘発に有用な代表的なベクターは、Ｍ１３ファージのようなベクターを含む。これらのファージベクターは、市販されており、そしてその使用は、一般的に、当業者に周知である。二本鎖プラスミドはまた、部位特異的突然変異誘発に慣用的に利用され、これは、目的の遺伝子を、ファージからプラスミドに移動する工程を排除する。
【００８５】
一般に、部位特異的突然変異誘発は、一本鎖ベクターの第一の獲得、または二本鎖ベクターの二本鎖の融解によって行われ、これは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、合成によって調製される。次いで、このプライマーは、ハイブリダイゼーション条件を選択する場合のミスマッチの程度を考慮して、一本鎖ＤＮＡ調製物とアニーリングされ、そして変異保有鎖の合成を完全にするために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノウフラグメント）に供される。従って、ヘテロ二重鎖が形成され、ここで、１つの鎖が、本来の非変異配列をコードし、そして第二の鎖が、所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターが使用されて、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換し、そして変異配列の配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【００８６】
部位特異的突然変異誘発を用いた選択遺伝子の配列改変体の調製が、潜在的に有用な種を産生する手段として提供され、そして遺伝子の配列改変体が獲得され得る他の方法が存在するので、限定されることは意味されない。例えば、所望の遺伝子をコードする組換えベクターが、突然変異誘発性因子（例えば、ヒドロキシルアミン）を用いて処理されて、配列改変体を獲得し得る。
【００８７】
（Ｃ．アンチセンス構築物）
アンチセンス方法論は、核酸が、「相補的」配列と対合する傾向にあるという事実を利用する。相補的によって、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン−クリックの相補的規則に従って塩基対合し得るポリヌクレオチドであることが意味される。すなわち、より大きなプリンが、より小さなピリミジンと塩基対合して、シトシンと対合するグアニンの組み合わせ（Ｇ：Ｃ）、およびＤＮＡの場合においてはチミンと対合するアデニンの組み合わせ（Ａ：Ｔ）またはＲＮＡの場合においてはウラシルと対合するアデニンの組み合わせ（Ａ：Ｕ）のいずれかを形成する。より一般的でない塩基（例えば、イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよび他の塩基）のハイブリダイズ配列への包含は、対合を妨げない。
【００８８】
ポリヌクレオチドを用いた二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの標的化は、三重らせん形成を導く；標的ＲＮＡは、二重らせん形成を導く。標的細胞に導入される場合のアンチセンスポリヌクレオチドは、その標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そして転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、翻訳および／または安定性を妨げる。アンチセンスＲＮＡ構築物、またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡが利用されて、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞内で（例えば、ヒト被験体を含む宿主動物内で）、遺伝子の転写または翻訳あるいはその両方を阻害し得る。
【００８９】
アンチセンス構築物は、プロモーターおよび他の制御領域、エキソン、イントロンまたは遺伝子のエキソン−イントロン境界までにも結合するように設計され得る。大半の有効なアンチセンス構築物が、エキソン／イントロンスプライス部位に相補的な領域を含むことが意図される。従って、好ましい実施形態が、イントロン−エキソンスプライス部位の５０〜２００塩基内の領域に対する相補性を有するアンチセンス構築物を含むことが提唱される。いくつかのエキソン配列が、その標的選択性に重く影響を及ぼさずに、この構築物に含められ得ることが観察されている。含められるエキソン物質の量は、使用される特定のエキソン配列およびイントロン配列に依存して変化する。非常に過剰のエキソンＤＮＡが、インビトロで構築物を試験することによって簡単に含められるか否かを容易に試験して、正常な細胞機能が、影響を及ぼされるか否か、または相補的配列を有する関連遺伝子の発現が、影響を及ぼされるか否かを決定し得る。
【００９０】
上記のように、「相補的」または「アンチセンス」は、その全体の長さに渡って実質的に相補性であり、そして極めて少ない塩基ミスマッチを有するポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、１５塩基長の配列が、１３〜１４の位置で相補的ヌクレオチドを有する場合、相補的と呼ばれ得る。本来、完全に相補的な配列は、その全体の長さを通して完全に相補的であり、そして塩基ミスマッチを有さない配列である。より低い程度の相同性を有する他の配列がまた意図される。例えば、高い相同性の限定される領域を有するが、また非相同領域を含むアンチセンス構築物（例えば、リボザイム；以下を参照のこと）が設計され得る。これらの分子は、５０％未満の相同性を有するが、適切な条件下で、標的配列に結合する。
【００９１】
ゲノムＤＮＡの一部分を、ｃＤＮＡまたは合成配列に結合して、特定の構築物を作製することが有利であり得る。例えば、イントロンが、最終的な構築物に所望される場合、ゲノムクローンが使用される必要がある。このｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドは、構築物の一部分の存続についてより簡便な制限部位を提供し得、従って、配列の残部について使用される。
【００９２】
（Ｄ．リボザイム）
タンパク質は、伝統的に、核酸の触媒作用について使用されているが、別のクラスの高分子が、この試みにおいて有用であるとして現れた。リボザイムは、ＲＮＡ−タンパク質複合体であり、これは、部位特異的様式で、核酸を切断する。リボザイムは、特異的な触媒ドメインを有し、これは、エンドヌクレアーゼ活性を有する（ＫｉｍおよびＣｏｏｋ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムが、高度の特異性で、リン酸エステル転移反応を促進し、頻繁に、オリゴヌクレオチド基質におけるいくつかのリン酸エステルのうちのただ１つを開裂する（Ｃｏｏｋら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、この基質が、特異的塩基対合相互作用を介して、化学反応の前に、リボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合するという要件に起因する。
【００９３】
リボザイムの触媒作用は、主に、核酸を伴う配列特異的開裂／連結反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｏｏｋら、１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号は、特定のリボザイムが、既知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも大きく、そしてほぼＤＮＡ制限酵素の配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告する。従って、遺伝子発現の配列特異的なリボザイム媒介性阻害は、治療適用に特に適し得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。最近、リボザイムが、適用されたいくつかの細胞系統において遺伝子変化を誘導したことが報告された；この変更された遺伝子は、癌遺伝子Ｈ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶの遺伝子を含んだ。この研究の大半は、特定のリボザイムによって開裂される特定の変異体コドンに基づいた標的ｍＲＮＡの修飾を含んだ。
【００９４】
（Ｅ．クローニング、遺伝子転移および発現についてのベクター）
特定の実施形態内において、発現ベクターが利用されて、カルサルシンポリペプチド産物を発現し、次いでこれは精製され得、そして例えば、動物のワクチン接種に使用されて、抗血清またはモノクローナル抗体を作製し得、これを用いて、さらなる研究が行われ得る。他の実施形態において、この発現ベクターは、遺伝子治療に使用される。発現は、適切なシグナルが、ベクターにおいて提供される必要があり、そしてこれは宿主細胞において目的の遺伝子の発現を駆動するウイルス供給源および哺乳動物供給源の両方由来の種々の調節エレメント（例えば、エンハンサー／プロモーター）を含む。宿主細胞におけるメッセンジャーＲＮＡの安定性および翻訳能を最適化するように設計されるエレメントがまた規定される。この産物を発現する永続的な安定した細胞クローンの確立についての多くの主要な薬物選択マーカーの使用についての条件が、薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に結合するエレメントであるようにまた提供される。
【００９５】
（（ｉ）調節エレメント）
本出願を通して、用語「発現構築物」は、遺伝子産物についてコードする核酸を含む遺伝子構築物の任意の型を含むことが意味され、この遺伝子産物において、核酸コード配列の一部またはすべてが、転写され得る。この転写物は、タンパク質に翻訳され得るが、翻訳される必要性はない。特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。
【００９６】
特定の実施形態において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、細胞の合成機械によって認識されるか、または合成機械を導入されるＤＮＡ配列をいい、この合成機械は、遺伝子の特異的転写の開始に必要とされる。句「転写制御下」は、プロモーターが、核酸に関して正確な位置および配向にあって、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御することを意味する。
【００９７】
用語プロモーターは、本明細書中で使用されて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩについての開始部位の周囲に密集する転写制御モジュールの群をいう。プロモーターが編成される理由についての見解の多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写単位についてのプロモーターを含むいくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究によって増大したこれらの研究は、プロモーターが、別個の機能モジュールから構成され、各々が、およそ７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質についての１つ以上の認識部位を含むことを示している。
【００９８】
各々のプロモーターにおいて少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成についての開始部位を配置するように機能する。この最も良く知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠失するいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーター）において、その開始部位自身上に重なる別個のエレメントが、開始の場所の固定を助ける。
【００９９】
さらなるプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を調節する。代表的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターが、同様に開始部位の下流に機能的エレメントを含むことが最近示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、しばしば順応性があり、その結果、プロモーター機能が、エレメントが互いに関して逆転または移動される場合に保持される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に、５０ｂｐまで離れて増大され得る。このプロモーターに依存して、個々のエレメントが、協同的または独立的のいずれかで機能して、転写を活性化し得るようである。
【０１００】
特定の実施形態において、このネイティブカルサルシンプロモーターが利用されて、対応するカルサルシン核酸、異種カルサルシン核酸、スクリーニング可能もしくは選択可能なマーカー核酸、または目的の任意の他の核酸のいずれかの発現を駆動する。
【０１０１】
他の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス、長い末端反復配列、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼが使用されて、目的のコード配列の高レベルの発現を獲得し得る。発現のレベルが、所定の目的に十分であれば、当該分野で周知であり、目的のコード配列の発現を達成する他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞性プロモーターまたは細菌性ファージプロモーターの使用が、同様に意図される。
【０１０２】
周知の性質を有するプロモーターを利用することによって、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質発現のレベルおよびパターンが最適化され得る。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導可能な発現を可能にし得る。表２および３は、いくつかの調節エレメントを列挙し、これは、本発明の文脈において利用されて、目的の遺伝子の発現を調節し得る。この一覧表は、遺伝子発現の促進に関与するすべての可能なエレメントの包括であることが意図されないが、単にその例示として意図される。
【０１０３】
エンハンサーは、ＤＮＡの同じ分子上の異なる位置に位置するプロモーターからの転写を増大する遺伝子エレメントである。エンハンサーは、プロモーターのように編成される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、これらの各々は、１つ以上の転写タンパク質に結合する。
【０１０４】
エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な差異は、操作である。全体としてのエンハンサー領域は、少し離れて転写を刺激し得なければならない；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントにも該当する必要はない。一方、プロモーターは、１つ以上のエレメントを有さなければならず、このエレメントは、特定の部位および特定の配向で、ＲＮＡ合成の開始を指向し、一方、エンハンサーは、これらの特異性を欠如する。プロモーターおよびエンハンサーは、頻繁に重複および連続し、頻繁に、極めて類似のモジュラー編成を有するようである。
【０１０５】
以下は、ウイルスプロモーター、細胞性プロモーター／エンハンサーおよび誘導性プロモーター／エンハンサーの一覧表であり、これは、発現構築物において、目的の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて使用され得る（表２および表３）。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核生物プロモーターデータベース、ＥＰＤＢによって示される通り）がまた使用されて、遺伝子の発現を駆動し得る。真核生物細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部、またはさらなる遺伝子発現構築物のいずれかとして提供される場合、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
【表３】
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特に興味深いのは、筋特異的プロモーターであり、そしてより特に、心筋特異的プロモーターである。これらとしては、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Ｆｒａｎｚら、１９９４；Ｋｅｌｌｙら、１９９５）、αアクチンプロモーター（Ｍｏｓｓら、１９９６）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｖｓａｒら、１９９６）、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換輸送体プロモーター（Ｂａｒｎｅｓら、１９９７）、ジストロフィンプロモーター（Ｋｉｍｕｒａら、１９９７）、クレアチンキナーゼプロモーター（Ｒｉｔｃｈｉｅ、１９９６）、α７インテグリンプロモーター（ＺｉｏｂｅｒおよびＫｒａｍｅｒ、１９９６）、大脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら、１９９６）およびαＢ−クリスタリン／低分子量熱ショックタンパク質プロモーター（Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、１９９５）が挙げられる。
【０１０８】
ｃＤＮＡ挿入物が利用される場合、代表的には、ポリアデニル化シグナルを含むことが所望されて、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を達成する。このポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾良い実行に決定的であるとは考えられず、そして任意のこのような配列（例えば、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル）が利用され得る。また、発現カセットのエレメントとして意図されるのは、ターミネーターである。これらのエレメントが、メッセージレベルの増強、および他の配列へのカセットからの通読の最小化に役立ち得る。
【０１０９】
（（ｉｉ）選択マーカー）
本発明の特定の実施形態においては、細胞は、本発明の核酸構築物を含み、細胞は、発現構築物中にマーカーを含むことによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。このようなマーカーは、発現構築物を含有している細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を細胞に対して付与する。通常は、薬剤選択マーカーの包含が、クローニングおよび形質転換体の選択を補助する。例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素が使用され得る。免疫学的マーカーもまた、使用され得る。使用される選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限りは、重要であるとは考えられない。選択マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０１１０】
（（ｉｉｉ）多遺伝子構築物およびＩＲＥＳ）
本発明の特定の実施形態においては、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用が、多遺伝子または多シストロン性メッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’がメチル化されたＣａｐ依存性の翻訳のリボソームスキャンモデルをバイパスすることが可能であり、そして内部部位で翻訳を開始する（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピカノウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）に由来するＩＲＥＳエレメント（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物のメッセージ（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１）に由来するＩＲＥＳが記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結され得る。複数のオープンリーディングフレームがともに転写され、ＩＲＥＳによって互いに分離され、それによって多シストロン性のメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、それぞれのオープンリーディングフレームが十分な翻訳のためにリボソームに接近することが可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するための単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率良く発現され得る。
【０１１１】
任意の異種オープンリーディングフレームがＩＲＥＳエレメントに連結され得る。これは、分泌されたタンパク質、別々の遺伝子によってコードされる多サブユニットのタンパク質、細胞内タンパク質または膜結合タンパク質、および選択マーカーについての遺伝子を含む。この方法で、いくつかのタンパク質の発現が、単一の構築物および単一の選択マーカーを用いて細胞中に同時に操作され得る。
【０１１２】
（（ｉｖ）２方向性プロモーター）
本発明の他の実施形態においては、２方向性プロモーターが、多種のメッセージを作製するために利用される。例えば、アルデヒドレダクターゼの２方向性プロモーター（Ｂａｒｓｋｉら、１９９９）は、化学量論レベルにまで反対方向の転写物を作製することが可能である。従って、当業者は、２つの種のメッセージを同時に作製するために２方向性のアルデヒドレダクターゼプロモーターのようなプロモーターを利用することができ、一方では、発現ベクター中に存在するかまたはその中にクローン化されることを必要とする空間を付随して保存する。２方向性プロモーターによって作製された遺伝子産物はＲＮＡまたはタンパク質であり得、そして２方向性プロモーターは目的の任意の配列に加えて、レポーター遺伝子のメッセージ、およびカルサルシンメッセージ、カルシニューリンメッセージ、またはα−アクチニンメッセージを転写することができる。
【０１１３】
（（ｖ）レポーター配列）
用語「レポーター配列」は、本明細書中で使用される場合には、発現が検出され得るヌクレオチド配列として定義される。発現された産物自体（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）が検出され得るか、あるいは、レポーター産物によって２次的な影響を受ける代謝産物またはそれに特徴的である他のものが、検出され得る。当業者は、経皮性のモニタリングによって、ＵＶ光での視覚化によって、赤外線での視覚化によって、または他の画像化技術（例えば、Ｘ線またはＭＲＩ）での視覚化によって検出され得る任意のレポーター遺伝子が明らかに有用であることを認識する。任意の組織または体液または細胞培養物または無細胞抽出物が、使用されるマーカーに依存して採取される。例えば、蛍光、比色アッセイ、分泌されたタンパク質、組織学的マーカー、トランスジェニック動物における視覚的な変化、および当業者によって使用される他のマーカーが、特異的な核酸の発現を反映するために利用され得る。レポーター配列の例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強型ＧＦＰ，青色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびルシフェラーゼが含まれる。特異的な実施形態においては、エピトープタグを含有しているレポーター遺伝子がモニターされる。
【０１１４】
（（ｖｉ）発現ベクターの送達）
本発明によって意図される治療的な実施形態の１つは、心不全に関係している事象への分子レベルでの介入である。詳細には、本発明者らは、心臓細胞に対して、その細胞にカルサルシンを提供することができる発現構築物を提供することを意図する。発現ベクターおよびその中で使用される遺伝子エレメントの長い考察は、参照によってこの節で引用される。特に好ましい発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびレトロウイルス）である。リポソームでカプセル化された発現ベクターもまた好ましい。
【０１１５】
当業者は、インビボの状況に遺伝子を送達するための方法を十分に認識している。ウイルスベクターについては、一般的には、ウイルスベクターのストックを調製する。ウイルスの種類および到達可能な力価に依存して、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個の感染性粒子を患者に与える。同様の計算が、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソームまたは他の非ウイルス性処方物について推定され得る。薬学的に受容可能な組成物としての処方物が、以下で議論される。種々の経路が意図されるが、心臓への局所的な供給および全身的な供給（動脈内または静脈内）が好ましい。
【０１１６】
発現ベクターが細胞内に導入され得る方法は多数存在する。本発明の特定の実施形態においては、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムから誘導された操作された構築物を含む。レセプターによって媒介されるエンドサイトーシスによって細胞に入り込む、宿主細胞のゲノム中に組み込まれてウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する、特定のウイルスの能力は、それらを哺乳動物細胞中への外来遺伝子の導入のための魅力的な候補にする（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）ならびにアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列について比較的低い能力を有し、そして限定された宿主種を有する。さらに、許容細胞中でのそれらの腫瘍形成遺伝子の能力および細胞変性作用は、安全性の問題を生じる。これらは、わずか８ｋＢまでの外因性遺伝子材料にしか適応することができないが、種々の細胞株および実験動物中に容易に導入され得る（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。
【０１１７】
インビボでの送達のための１つの好ましい方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングをサポートするため、および（ｂ）その中にクローン化されているアンチセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含有しているそのような構築物を含むように意味される。この状況では、発現には遺伝子産物が合成されることは必要ではない。
【０１１８】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝的に操作された形態を含む。アデノウイルスの遺伝子構造についての知見（３６ｋＢ、直鎖状、二本鎖のＤＮＡウイルス）から、７ｋＢまでの外来配列でのアデノウイルスＤＮＡの大きな断片の置換が可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体の組込みを生じない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは強力な遺伝子毒性の可能性を伴わずにエピソーム様式で複製することができるからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そして多量の増幅後のゲノムの再配置は検出されていない。アデノウイルスは、それらの細胞周期の段階にかかわらず実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。これまでのところ、アデノウイルス感染は、ヒトの急性呼吸器疾患のような穏やかな疾患とのみ連関しているようである。
【０１１９】
アデノウイルスは、その中程度の大きさのゲノム、操作の容易さ、高力価、広い標的細胞の範囲、および高い感染性に起因して、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適切である。ウイルスのゲノムの両方の末端は、１００〜２００塩基対の逆反復（ＩＴＲ）を含む。これは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに不可欠なｃｉｓエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡの複製の開始によって分類される異なる転写ユニットを含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび数個の細胞性遺伝子の転写調節に応答するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスのＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子の発現、および宿主細胞の停止に関係している（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。後期遺伝子の産物（ウイルスカプシドタンパク質の大部分を含む）は、主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）によって与えられる単一の主な転写物の重要なプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に存在する）は、感染の後期の間に特に有効であり、そしてこのプロモーターから与えられる全てのｍＲＮＡは、それらを翻訳に好ましいｍＲＮＡにする５’−３者間リーダー（ＴＰＬ）配列を有する。
【０１２０】
現在のシステムでは、組換えアデノウイルスはシャトルベクターとプロウイルスベクターとの間での相同組換えによって作製される。２つのプロウイルスベクター間での組換えの可能性に起因して、野生型アデノウイルスがこのプロセスによって作製され得る。従って、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離し、そしてそのゲノム構造を試験することが重要である。
【０１２１】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、２９３と呼ばれる特有のヘルパー細胞株に依存する。これは、Ａｄ５  ＤＮＡフラグメントによるヒトの胚性腎臓細胞から形質転換され、そしてＥ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムには必ずしも必要ではない（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）ので、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを用いて、Ｅ１、Ｄ３のいずれか、または両方の領域中に外来ＤＮＡを保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖａｃ、１９９１）。天然の状態では、アデノウイルスは、約２ｋｂの余分なＤＮＡの能力と仮定すれば、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージすることができる（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）。Ｅ１およびＥ３領域中に再配置することが可能な約５．５ｋｂのＤＮＡと組合せると、現在のアデノウイルスベクターの最大能力は、７．５ｋｂ以下、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスのウイルスゲノムの８０％より多くがベクター骨格中に残っており、そしてこれはベクターが保有する細胞毒性の供与源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損は不完全である。例えば、ウイルス遺伝子の発現の漏出が、高い感染多重度（ＭＯＩ）で現在利用可能なベクターを用いた場合に観察されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３）。
【０１２２】
ヘルパー細胞株は、ヒトの胚性腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞、または他のヒトの胚性間葉細胞もしくは上皮細胞のようなヒト細胞から誘導され得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトのアデノウイルスに許容性である他の哺乳動物種の細胞から誘導され得る。このような細胞には、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、または他のサルの胚性間葉細胞もしくは上皮細胞が含まれる。上記のように、好ましいヘルパー細胞株は２９３である。
【０１２３】
Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞を培養するため、およびアデノウイルスを増殖させるための改良方法を開示した。１つの形式では、天然の細胞凝集物を、１００〜２００ｍｌの培地を含有している１リットルのシリコナイズされたスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）中に個々の細胞を接種することによって増殖させる。４０ｒｐｍでの攪拌後、細胞の生存性がトリパンブルーを用いて概算される。別の形式では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリアー（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）が以下のように使用される。細胞接種物（５ｍｌの培地中に再懸濁される）が２５０ｍｌの三角フラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加され、そして必要に応じて攪拌しながら、１〜４時間固定して静置される。次いで培地が、５０ｍｌの新しい培地と交換され、そして振盪が開始される。ウイルスの産生のためには、細胞は約８０％のコンフルエンスにまで増殖させられ、その後培地が交換され（２５％の最終容量まで）、そしてアデノウイルスが０．０５のＭＯＩで添加される。培養物は一晩固定して静置させられ、その後、容量が１００％にまで増大させられ、そして振盪がさらに７２時間開始される。
【０１２４】
アデノウイルスベクターが複製欠損であるかまたは少なくとも条件的に欠損であるという要件以外に、本発明の良好な実施のために重要であると考えられるアデノウイルスベクターの性質はない。アデノウイルスは、４２個の異なる公知の血清型または亜群Ａ〜Ｆのいずれかであり得る。亜群Ｃの５型アデノウイルスは、本発明での使用のための条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発材料である。これは、５型アデノウイルスが、生化学的および遺伝的情報の詳細の多くが公知であるヒトアデノウイルスであり、そしてこれがベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物に歴史的に使用されていることに起因する。
【０１２５】
上記のように、本発明の典型的なベクターは複製欠損であり、そしてアデノウイルスＥ１領域は有さない。従って、これは、Ｅ１をコードする配列が除去されている位置に目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入するために最も便利である。しかし、アデノウイルス配列中の構築物の挿入の部位は、本発明には重要ではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）によって記載されているようなＥ３再配置ベクター中の欠失させられたＥ３領域の代わりに、またはＥ４領域（ここでは、ヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を相補する）中に挿入される場合がある。
【０１２６】
アデノウイルスは増殖させることおよび操作することが容易であり、そして広いインビトロおよびインビボの宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高力価（例えば、１０９〜１０１２のプラーク形成単位／ｍｌ）で得ることが可能であり、そしてこれらは感染性が高い。アデノウイルスの生存サイクルは、宿主細胞のゲノム中への組込みには必要ない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子はエピソームであり、従って宿主細胞に対して低い遺伝子毒性を有する。野生型のアデノウイルスを用いたワクチン接種の研究においては副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、これは、それらの安全性およびインビボでの遺伝子導入ベクターとしての治療上の潜在能力を示している。
【０１２７】
アデノウイルスベクターは、真核生物での遺伝子発現に（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）、およびワクチンの開発に（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９１）使用されている。最近、動物実験によって、組換えアデノウイルスを遺伝子治療に使用することができることが示唆された（Ｓｔｒａｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０：Ｒｉｃｈら、１９９３）。種々の組織に対して組換えアデノウイルスを投与する実験には、気管への点滴投与（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位的接種が含まれる（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、１９９３）。
【０１２８】
レトロウイルスは、１本鎖のＲＮＡウイルスの群であり、逆転写のプロセスにより感染した細胞中でそれらのＲＮＡを二本鎖のＤＮＡに転換する能力によって特徴付けられる（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体中に安定に組み込まれ、そしてウイルスタンパク質の合成を指示する。組込みは、レシピエント細胞およびその子孫中でのウイルスの遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスのゲノムは３個の遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を含み、これらはキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする。ｇａｇ遺伝子の上流に見られる配列は、ビリオン中へのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列がウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そして、宿主細胞のゲノムへの組込みにもまた必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１２９】
レトロウイルスベクターを構築するためには、目的の遺伝子をコードする核酸が、複製欠損であるウイルスを産生するための特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入される。ビリオンの産生のためには、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有しているが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を有さないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列とともにｃＤＮＡを含有している組換えプラスミドがこの細胞株中に（例えば、リン酸カルシウム沈澱法によって）導入される場合には、パッケージング配列は、ウイルス粒子中にパッケージされる組換えプラスミドのＲＮＡの転写を可能にし、次いでこれは、培養培地中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含有している培地が回収され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子導入に使用される。レトロウイルスベクターは、広範囲の種々の細胞型に感染することができる。しかし、組込みおよび安定な発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１３０】
レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規のアプローチが、ウイルスのエンベロープへのラクトース残基の化学的な付加によるレトロウイルスの化学的改変に基づいて、最近開発された。この改変による、シアロ糖タンパク質レセプターを介する肝細胞の特異的な感染が可能となり得る。
【０１３１】
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチニル化抗体および特異的細胞レセプターに対するビオチニル化抗体を使用する、組換えレトロウイルスの標的化のための種々のアプローチが設計された。抗体は、ストレプトアビジンの使用によってビオチン成分を介してカップリングされた（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、彼らは、それらの表面抗原を生じる種々のヒト細胞の、インビトロでのエコトロピックウイルスでの感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１３２】
本発明の全ての局面において、レトロウイルスベクターの使用についての特定の制限が存在する。例えば、レトロウイルスベクターは通常は、細胞ゲノム中のランダムな位置に組み込まれる。これは、宿主遺伝子の離断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）により、または隣接している遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入により、挿入変異誘発を導くことができる（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠損型レトロウイルスベクターの使用に付随する別の問題点は、パッケージング細胞中の野生型の複製能力のあるウイルスの出現の可能性である。これは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列の上流の組換えウイルス挿入物によるインタクトな配列が宿主細胞のゲノム中に組み込まれる組換え事象によって生じ得る場合がある。しかし、新しいパッケージング細胞が現在利用可能であり、これは、組換えの可能性を大きく減少させるはずである（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。
【０１３３】
他のウイルスベクターが、本発明の発現構築物として使用され得る。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）、およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターが使用されることがある。これらは、種々の哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を付与する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１３４】
欠損型Ｂ型肝炎ウイルスについての最近の認識を用いて、種々のウイルス配列の構造−機能の関係についての新しい知見が得られた。インビトロでの研究は、ウイルスがそのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存性のパッケージングおよび逆転写の能力を保持することができたことを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。このことは、ゲノムの大部分を外来の遺伝子材料と置きかえることが可能であることを示唆した。肝臓向性および持久性（組込み）は、肝臓を指向する遺伝子導入のために特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇらは最近、ポリメラーゼ、表面、および前表面コード配列の代わりに、アヒルのＢ型肝炎ウイルスのゲノム中にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入した。これを、鳥類肝ガン細胞株中に野生型ウイルスとともに同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含有している培養培地を、アヒルの子の初代肝細胞を感染させるために使用した。安定なＣＡＴ遺伝子の発現が、トランスフェクションの少なくとも２４日後に検出された（Ｃｈａｎｇら、１９９１）。
【０１３５】
センスまたはアンチセンス遺伝子構築物の発現を達成するためには、発現構築物は細胞中に送達されなければならない。この送達は、細胞株の形質転換のための研究室用手順の場合にはインビトロで、または特定の疾患状態の処置の場合にはインビボもしくはエキソビボで達成され得る。送達のための１つの機構はウイルス感染により、ここでは、発現構築物が感染性ウイルス粒子中にキャプシド化される。
【０１３６】
培養された哺乳動物細胞中への発現構築物の導入のためのいくつかの非ウイルス性の方法もまた、本発明によって意図される。これらには、リン酸カルシウム沈澱法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接的なマイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ充填リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）、およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞の超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速マイクロプロジェクタイルを使用する遺伝子衝突（Ｙａｎｇら、１９９０）。およびレセプター媒介性トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が含まれる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボでの使用に良好に適応させられ得る。
【０１３７】
一旦、発現構築物が細胞中に送達されると、目的の遺伝子をコードする核酸が種々の部位に配置されそして発現され得る。特定の実施形態においては、遺伝子をコードする核酸は細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得る。この組込みは、相同組換えによって同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の位置および方向（遺伝子置換）であり得るか、またはこれはランダムな非特異的な位置で組み込まれ得る（遺伝子の増加）。なおさらなる実施形態においては、核酸はＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞中で安定に維持され得る。このような核酸のセグメントまたは「エピソーム」は、宿主の細胞周期に独立するかまたはそれと同調している、維持および複製を可能にするために十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そしてその細胞中に核酸が留まる場所は、使用される発現構築物の型に依存する。
【０１３８】
本発明のなお別の実施形態においては、発現構築物は、単純に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドから構成され得る。構築物の導入は、細胞膜を物理的または化学的に透過させる上記の方法のいずれかによって行われ得る。これは、インビトロでの導入に特に適用可能であるが、インビボでも使用にも十分に適応させることができる。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、ポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生児のマウスの肝臓、脾臓中に、リン酸カルシウム沈澱物の形態で良好に注射し、これによって、活性なウイルスの複製および急性の感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１９８６）もまた、リン酸カルシウムで沈澱させたプラスミドの直接的な腹膜内注射がトランスフェクトされた遺伝子の発現を生じることを実証した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡがまた、インビボで同様の様式で導入され得、そして遺伝子産物を発現することが予想される。
【０１３９】
裸のＤＮＡ発現構築物を細胞中に導入するための本発明のなお別の実施形態には、粒子衝突が含まれることがある。この方法は、ＤＮＡをコーティングしたマイクロプロジェクタイルを、それらが細胞膜を貫き、そして細胞を死滅させることなく細胞内に侵入することを可能にする高速に加速する能力による（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小さい粒子を加速するためのいくつかのデバイスが開発されている。１つのこのようなデバイスは、電流を生じる高電圧の放電により、次いでこれは、動力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。使用されるマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質から構成されている。
【０１４０】
ラットおよびマウスの肝臓、皮膚、および筋肉組織を含む選択された器官が、インビボで衝突させられている（Ｙａｎｇら、１９９０：Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。これは、銃と標的器官との間に存在するあらゆる組織を排除するために、組織または細胞の外科的な露出（すなわち、エキソビボでの処置）を必要とする場合がある。再び、特定の遺伝子をコードするＤＮＡがこの方法によって送達され得、そしてさらに本発明によって取り込まれ得る。
【０１４１】
本発明のさらなる実施形態においては、発現構築物は、リポソーム中に捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重膜および内部の水性の媒体によって特徴付けられる小胞性構造である。多層のリポソームは、水性の媒体によって分離されている複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁された場合に自発的に形成する。脂質成分は閉じた構造の形成の前に自己再配置を受け、そして水を捕捉し、そして脂質二重層の間に溶質を溶解させる（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体もまた意図される。
【０１４２】
インビトロでのリポソームによって媒介される核酸の送達および外来ＤＮＡの発現は、非常に好結果を有している。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養されたニワトリの胚、ＨｅＬａ、および肝ガン細胞中でのリポソームによって媒介される送達および外来ＤＮＡの発現の実現可能性を示した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈内注射後のラットにおいて、リポソームによって媒介される遺伝子導入の成功を達成した。
【０１４３】
本発明の特定の実施形態においては、リポソームは、血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成し得る。これは、細胞膜との融合を促進すること、およびリポソームにカプセル化されたＤＮＡの細胞への侵入を促進することを示している（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施形態においては、リポソームは、核のヒストンではない染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化され得るかまたはそれと組合せて使用され得る（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる実施形態においては、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体化され得るかまたはそれと組み合わせて使用され得る。このような発現構築物が、インビトロおよびインビボでの核酸の導入および発現において良好に使用されている点で、これらは、本発明に適応可能である。細菌性プロモーターがＤＮＡ構築物中で使用される場合には、適切な細菌性ポリメラーゼをリポソーム中に含むこともまた所望される。
【０１４４】
細胞中へ特定の遺伝子をコードする核酸を送達するために使用され得る他の発現構築物は、レセプターによって媒介される送達ビヒクルである。これらは、ほぼ全ての真核生物細胞中でのレセプターによって媒介されるエンドサイトーシスによる高分子の選択的な取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布に起因して、送達は高度に特異的であり得る（ＷｕおよびＷｕ、１９９３）。
【０１４５】
レセプターによって媒介される遺伝子標的化ビヒクルは、一般的には２つの構成要素から構成される：細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合因子。いくつかのリガンドは、レセプターによって媒介される遺伝子の導入のために使用されている。最も広く特徴付けられたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ、１９８７）およびトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒら、１９９０）である。最近、合成のネオ糖タンパク質（ｎｅｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（これは、ＡＳＯＲと同じレセプターを認識する）が、遺伝子送達ビヒクルとして使用されており（Ｆｅｒｋｏｌら、１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４）、そして上皮成長因子（ＥＧＦ）もまた、扁平上皮細胞ガン細胞に遺伝子を送達するために使用されている（Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ第０２７３０８５号）。
【０１４６】
他の実施形態においては、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含むことがある。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、リポソーム中に取り込まれたラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを使用し、そして肝細胞によるインシュリン遺伝子の取り込みの増大を観察した。従って、特定の遺伝子をコードする核酸もまた、リポソームとともにまたはリポソームを伴わずに、任意の数のレセプター−リガンド系によって１つの細胞型に対して特異的に送達することができることが、実行可能である。例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）は、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞中への核酸の媒介された送達のためのレセプターとして使用され得る。マンノースは、肝細胞上のマンノースレセプターを標的化するために使用され得る。ＣＤ５（ＣＬＬ）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（Ｔ細胞白血病）、およびＭＡＡ（黒色腫）に対する抗体もまた、標的化部分として同様に使用され得る。
【０１４７】
特定の実施形態においては、遺伝子導入は、エキソビボの条件下でより容易に行われ得る。エキソビボでの遺伝子治療は、動物からの細胞の単離、インビトロでのその細胞中への核酸の送達、およびそれに次ぐ、動物に改変した細胞を戻すことをいう。これは、動物からの組織／器官の、または細胞および組織の初代培養物の外科手術による採取を含む場合がある。
【０１４８】
（Ｆ．核酸の検出）
使用される核酸は、標準的な方法論に従うと、生物学的サンプル中に含まれる細胞から単離される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。核酸は、ゲノムＤＮＡであり得るか、または分画されたＲＮＡもしくは全細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡが使用される場合は、ＲＮＡを相補性ＤＮＡに転換することが所望されることがある。１つの実施形態においては、ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡであり；別の実施形態においては、ポリ−Ａ  ＲＮＡである。通常は、核酸は増幅させられる。
【０１４９】
形式に依存して、目的の特定の核酸が、増幅を使用して直接、または増幅後に第２の既知の核酸を用いて、サンプル中で同定される。次に、同定された産物が検出される。特定の適用においては、検出は、視覚的な手段（例えば、ゲルのエチジウムブロマイド染色）によって行われる場合がある。あるいは、検出は、放射標識もしくは蛍光標識の化学発光、放射活性シンチグラフィー、またはさらに、電気的もしくは熱性のインパルスシグナルを使用するシステムによる間接的な生成物の同定を含む場合がある（Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｂｅｌｌｕｓ，１９９４）。
【０１５０】
（ｉ）プライマーおよびプローブ
用語プライマーは、本明細書中で定義される場合には、鋳型依存性のプロセスにおいて発生しようとしている核酸の合成を感作する（ｐｒｉｍｅ）ことができる任意の核酸を含むように意味される。典型的には、プライマーは、１０〜２０塩基対の長さまでのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を使用することができる。プライマーは、２本鎖または１本鎖の形態で提供され得るが、１本鎖の形態が好ましい。プローブは、別に定義されるが、これらはプライマーとして作用する場合がある。プローブは、おそらく感作することが可能であるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計され、そして必ずしも増幅プロセスにおいて使用される必要はない。
【０１５１】
好ましい実施形態においては、プローブまたはプライマーは、放射性核種（３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、または他の標識）で、蛍光団（ローダミン、フルオレセイン）で、または化学発光団（ルシフェラーゼ）で標識される。
【０１５２】
（ｉｉ）鋳型依存性の増幅方法
多数の鋳型依存性のプロセスを、所定の鋳型サンプル中に存在しているマーカー配列を増幅するために利用することができる。１つの最も良く知られている増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭと呼ばれる）である。これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号、ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０に詳細に記載されている。これらのそれぞれが、本明細書中で参考としてその全体が援用されている。
【０１５３】
簡潔には、ＰＣＲにおいては、２つのプライマー配列が調製され、これらはマーカー配列の反対側の相補鎖上の領域に対して相補的である。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸が、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合物に添加される。マーカー配列がサンプル中に存在する場合は、プライマーはマーカーに結合し、そしてポリメラーゼによって、プライマーが、ヌクレオチドへの付加によるマーカー配列に沿った伸張を生じる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、伸張されたプライマーが反応産物を形成するようにマーカーから解離し、過剰のプライマーはマーカーおよび反応産物に結合し、そしてプロセスが繰り返される。
【０１５４】
逆転写酵素ＰＣＲ増幅手順は、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために行われ得る。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。逆転写のための別の方法は、熱安定性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、１９９０年１２月２１日に提出されたＷＯ  ９０／０７６４１号に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は当該分野で周知である。
【０１５５】
別の増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。これは、その全体が本明細書中で参考として援用されている、ＥＰＡ第３２０３０８号で開示されている。ＬＣＲにおいては、２つの相補的なプローブの対が調製され、そして標的配列の存在下では、それぞれの対は、これらが隣接するように標的の反対側の相補鎖に結合する。リガーゼの存在下では、２つのプローブの対は単一のユニットを形成するように連結する。ＰＣＲの場合のように、温度の循環によって、結合し連結したユニットが標的から解離し、次いで過剰なプローブ対の連結のための「標的配列」として作用する。米国特許第４，８８３，７５０号は、標的配列に対するプローブ対の結合のためのＬＣＲと同様の方法を記載している。
【０１５６】
「ジオリゴヌクレオチド」を生じる配列を有している核酸の存在下での２つ（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドの連結、それによるジオリゴヌクレオチドの増幅に基づく方法はまた、本発明の増幅工程においても使用され得る。Ｗｕら（１９８９）は、その全体が本明細書中で参考として援用されている。
【０１５７】
（ｉｉｉ）サザン／ノーザンブロッティング
ブロッティング技術は当業者に周知である。サザンブロッティングは、標的としてのＤＮＡの使用を含むが、一方、ノーザンブロッティングは、標的としてのＲＮＡの使用を含む。それぞれが異なるタイプの情報を提供するが、ｃＤＮＡブロッティングは、多くの局面において、ブロッティングまたはＲＮＡ種と同様である。
【０１５８】
簡潔には、プローブが、適切なマトリックス（多くの場合は、ニトロセルロースのフィルター）上に固定されているＤＮＡまたはＲＮＡ種を標的化するために使用される。種々の種が分析を容易にするために空間的に分離されるべきである。これは多くの場合は、核酸種のゲル電気泳動、それに続くフィルターへの「ブロッティング」によって行われる。
【０１５９】
続いて、ブロットされた標的は、変性および再ハイブリダイゼーションを促進する条件下でプローブ（通常は標識されている）とともにインキュベートされる。プローブは標的と塩基対合するように設計されているので、プローブは再生（ｒｅｎａｔｕｒｅ）条件下で標的配列の一部に結合する。次いで、結合していないプローブが除去され、そして検出が上記のように達成される。
【０１６０】
（ｉｖ）分離方法
通常は、１段階でまたはそれ以外で、特異的な増幅が生じたかどうかを決定する目的のために、鋳型および過剰なプライマーから増幅産物を分離することが所望される。１つの実施形態においては、増幅産物は、標準的な方法を使用して、アガロースゲル、アガロース−アクリルアミドゲル、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと。
【０１６１】
あるいは、クロマトグラフィー技術が、分離を達成するために使用され得る。多種のクロマトグラフィー（吸着、分配、イオン交換、および分子量ふるい）が、本発明において使用され得る。そして、それらを使用する多くの専門的な技術には、カラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、および薄層クロマトグラフィー、ならびにガスクロマトグラフィーが含まれる（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、１９８２）。
【０１６２】
（ｖ）検出方法
産物は、マーカー配列の増幅を確認するために視覚化され得る。１つの典型的な視覚化方法には、エチジウムブロマイドでのゲルの染色、およびＵＶ光下での視覚化が含まれる。あるいは、増幅産物が放射標識ヌクレオチドまたは蛍光標識ヌクレオチドで一体的に標識されている場合は、増幅産物は分離後に、ｘ線フィルムに曝されるか、または適切な刺激スペクトル下で視覚化され得る。
【０１６３】
１つの実施形態においては、視覚化は間接的に行われる。増幅産物の分離後、標識された核酸プローブは増幅されたマーカー配列と接触させられる。プローブは好ましくは、発色団（しかし、放射標識である場合がある）に結合させられる。別の実施形態においては、プローブは結合パートナー（例えば、抗体またはビオチン）に結合され、そして結合対の他のメンバーが検出可能な部分を保有する。
【０１６４】
１つの実施形態においては、検出は標識されたプローブによる。関係する技術は当業者に周知であり、そして分子プロトコールについての多くの標準的な文献中に見ることができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。例えば、発色団または放射標識プローブまたはプライマーは、増幅の間または増幅後に標的を同定する。
【０１６５】
上記の一例は、本明細書中で参考として援用されている米国特許第５，２７９，７２１号に記載されている。これは、核酸の自動的な電気泳動および移動のための装置および方法を開示している。この装置は、外部から操作することなくゲルの電気泳動およびブロティングが可能であり、そして本発明の方法を実行するために理想的に適している。
【０１６６】
さらに、上記の増幅産物は、標準的な配列分析技術を使用して特異的な種のバリエーションを同定するための配列分析に供され得る。特定の方法においては、遺伝子の徹底的な分析が、最適な配列決定のために設計されたプライマーのセットを使用する配列分析によって行われる（Ｐｉｇｎｏｎら、１９９４）。本発明は、これらのタイプの分析のいずれかまたは全てが使用され得る方法を提供する。本明細書中に開示されている配列を使用して、次いで直接的な配列決定によって分析され得るカルサルシン遺伝子全体の配列の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーが設計され得る。
【０１６７】
（ｖｉ）キットの成分
カルサルシンおよびその改変体の検出および配列決定に必要な全ての必須の材料および試薬が、キット中に一緒にまとめられ得る。これは一般的には、予め選択されたプライマーおよびプローブを含む。増幅に必要な反応混合物を提供するための、種々のポリメラーゼ（ＲＴ、Ｔａｑ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）など）を含む核酸の増幅に適切な酵素、デオキシヌクレオチド、および緩衝液もまた、含まれ得る。このようなキットはまた、一般的には、適切な手段で、個々の試薬および酵素、ならびに各プライマーまたはプローブについての別々の容器を含む。
【０１６８】
（ＩＩＩ．カルサルシンと反応する抗体の作成）
別の局面においては、本発明は、本発明のカルサルシン分子またはその任意の部分と免疫反応性である抗体を含む。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。好ましい実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体である。抗体の調製および特徴付けのための手段は当該分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８を参照のこと）。
【０１６９】
簡潔には、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを含有している免疫原で動物を免疫し、そしてその免疫した動物から抗血清を回収することによって調製される。広範囲の動物種が、抗血清の産生のために使用され得る。典型的には、抗血清の産生のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、またはウマを含むヒト以外の動物である。ウサギの血液量は比較的多いので、ウサギがポリクローナル抗体の産生のための好ましい選択肢である。
【０１７０】
アイソフォーム抗原に特異的な抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、当業者に公知の従来の免疫化技術を使用して調製され得る。本発明の化合物の抗原性エピトープを含有している組成物が、ウサギまたはマウスのような１つ以上の実験動物を免疫するために使用され得る。次いでこれは、本発明の化合物に対する特異的抗体を産生するように処理される。ポリクローナル抗血清は、単純に動物を放血させ、そして全血から血清サンプルを調製することによって、抗体産生のための時間後に得ることができる。
【０１７１】
本発明のモノクローナル抗体が、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法のような標準的な免疫化学的手順、ならびに組織染色のような免疫組織化学的手順、ならびにカルサルシン関連抗原エピトープに特異的な抗体を利用し得る他の手順において、有用な適用を有することが提起される。さらに、異なる種の特定のカルサルシンに特異的なモノクローナル抗体が他の有用な適用において利用され得ることが提起される。
【０１７２】
一般的には、カルサルシンに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、種々の実施形態において使用され得る。例えば、これらは、他のカルサルシンをコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を得るための抗体クローニングプロトコールにおいて使用され得る。これらはまた、細胞または動物中のカルサルシン関連ペプチドの作用を分析するための阻害研究において使用される場合がある。カルサルシン抗体はまた、種々の細胞性の事象の間のカルサルシンの分布を分析するため（例えば、細胞周期の異なる時点で、カルサルシンポリペプチドの細胞特異的分布または組織特異的分布をそれぞれ決定するため）の免疫局在化研究において有用である。このような抗体の特に有用な適用は、例えば、抗体親和性カラムを使用する、天然のまたは組換えのカルサルシンの精製においてである。全てのこのような免疫学的技術の操作は、本発明の開示を参照して当業者に公知である。
【０１７３】
抗体の調製および特徴付けのための手段は当該分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８；本明細書中で参考として援用されている）。モノクローナル抗体の調製のより特異的な例は、以下の実施例に提供される。
【０１７４】
当該分野で周知であるように、所定の組成物は、その免疫原性において多様であり得る。従って、しばしば、キャリアに対してペプチドまたはポリペプチド免疫原をカップリングさせることによって達成され得るように、宿主免疫システムを追加免疫することが必要である。例示的でありそして好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他のアルブミン（例えば、オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミン）もまた、キャリアとして使用することができる。キャリアタンパク質に対してポリペプチドを結合させるための手段は当該分野で周知であり、そしてグルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス−ビアゾチド化（ｂｉｓ−ｂｉａｚｏｔｉｚｅｄ）ベンジジンが含まれる。
【０１７５】
当該分野で周知であるように、特定の免疫原性組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知である免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって増強することができる。例示的でありそして好ましいアジュバントには、完全なフロイトのアジュバント（死滅したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有している免疫応答の非特異的刺激因子）、不完全なフロイトのアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。
【０１７６】
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原性組成物の量は、免疫原の性質、ならびに免疫化のために使用される動物に依存して変化する。種々の経路（皮下、筋肉内、経皮、静脈内、および腹膜内）が、免疫原の投与のために使用され得る。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化後の種々の時点で免疫化した動物の血液をサンプリングすることによってモニターされ得る。第２回目の追加免疫の注射もまた与えられ得る。追加免疫および力価測定のプロセスは、適切な力価が達成されるまで繰り返される。所望されるレベルの免疫原性が得られると、免疫化された動物は放血させられ、血清が単離されて保存され、そして／またはｍＡｂを作成するためにこの動物が使用され得る。
【０１７７】
ＭＡｂは、本明細書中で参考として援用されている米国特許第４，１９６，２６５号中で説明されているような周知の技術の使用を通じて容易に調製され得る。典型的には、この技術は、選択された免疫原性組成物（例えば、精製されたかもしくは部分的に精製されたカルサルシンタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド、または高レベルのカルサルシンを発現する細胞）で適切な動物を免疫することを含む。免疫用組成物は、抗体産生細胞を刺激するために有効な様式で投与される。マウスおよびラットのようなげっ歯類が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、カエルの細胞の使用もまた可能である。ラットの使用によっては特定の利点が提供されることがある（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６）が、マウスが好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウスが、最も日常的に使用されそして通常は安定な融合体を高い割合で生じるので、最も好ましい。
【０１７８】
本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングのような技術を通じて、健常組織および疾患組織のカルサルシン内容物を特徴付けることにおいて使用され得る。これは、心筋症の存在もしくは非存在についてのスクリーニングを提供するか、または心疾患の予測を提供する場合がある。
【０１７９】
本発明の抗体のＥＬＩＳＡアッセイにおける使用が意図される。例えば、抗カルサルシン−１または抗カルサルシン−２抗体が、選択された表面（好ましくは、タンパク質親和性を示す表面（例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル））上に固定される。不完全に吸着した物質を除去するための洗浄後、アッセイプレートのウェルを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、または粉ミルクの溶液のような試験抗血清に関して抗原的に中性であることが公知の非特異的タンパク質と結合させるかまたはそれでコーティングすることが所望される。これによって、固定表面上の非特異的部位をブロックし、従って表面上への非特異的抗原の結合によって生じるバックグラウンドを減少させる。
【０１８０】
ウェルへの抗体の結合、バックグラウンドを減少させるための非反応性材料でのコーティング、および結合していない材料を除去するための洗浄後、固定表面が免疫複合体（抗原／抗体）の形成を助ける様式で試験されるサンプルと接触させられる。
【０１８１】
試験サンプルと結合した抗体との間での特異的な免疫複合体の形成、およびそれに続く洗浄後、免疫複合体の形成の発生およびその量が、カルサルシン−１に対して１次抗体とは異なる特異性を有している２次抗体に対してそれらを供することによって決定され得る。適切な条件には、好ましくは、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）、およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）のような希釈剤でのサンプルの稀釈が含まれる。これらの添加された試薬もまた、非特異的なバックグラウンドの減少を助ける傾向にある。次いで、層をなした抗血清が約２〜４時間、好ましくは約２５℃から約２７℃程度の温度でインキュベートされる。インキュベーション後、抗血清でコーティングされた表面が、免疫複合体化されていない材料を除去するために洗浄される。好ましい洗浄手順には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）またはホウ酸塩緩衝液のような溶液での洗浄が含まれる。
【０１８２】
検出手段を提供するためには、好ましくは、２次抗体は、適切な色素形成性基質とのインキュベーションの際に発色を生じる連結された酵素を有する。従って、例えば、２次抗体に結合した表面をウレアーゼまたはペルオキシダーゼが結合した抗ヒトＩｇＧとともに、免疫複合体の形成を生じるために好ましい時間および条件下で接触させるかまたはそれとともにインキュベートする（例えば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）のようなＰＢＳを含有している溶液中で室温にて２時間のインキュベーション）ことが所望される。
【０１８３】
酵素標識がペルオキシダーゼの場合には、２次酵素タグ化抗体とのインキュベーション、それに続く結合していない材料を除去するための洗浄後、標識の量が、尿素およびブロモクレゾールパープル、または２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）およびＨ２Ｏ２のような色素形成性基質とのインキュベーションによって定量される。次いで、定量は、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して色素形成の程度を測定することによって達成される。
【０１８４】
上記の形式は、最初にアッセイプレートにサンプルを結合させることによって変更され得る。次いで１次抗体がアッセイプレートとともにインキュベートされ、続いて１次抗体について特異性を有している標識された２次抗体を使用して、結合した１次抗体が検出される。
【０１８５】
本発明の抗体組成物は、イムノブロットまたはウェスタンブロット分析の使用において重要な用途を提供する。抗体は、固体支持マトリックス（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、またはそれらの組合せ）上に固定されたタンパク質の同定のための高親和性の一次的な試薬として使用され得る。免疫沈降、続くゲル電気始動と組合せて、これらは、抗原の検出において使用されるそれに対する２次的な試薬が有害なバックグラウンドを生じる抗原の検出における使用のために一工程の試薬として使用され得る。ウェスタンブロッティングと組合せた使用のための免疫学に基づく検出方法には、これに関する特定の用途が考慮される毒素部分に対する、酵素タグ化、放射標識タグ化、または蛍光タグ化２次抗体が含まれる。
【０１８６】
（ＩＶ．組合せ治療）
多くの臨床的な状況では、異なる治療の組合せの使用が賢明である。従って、本明細書中に記載されている治療に加えて、より「標準的な」薬学的な心臓の治療方法を患者に提供することもまた望まれることが想定される。標準的な治療方法の例には、いわゆる「βブロッカー」、抗高血圧薬、強心剤、抗血栓薬、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、カルシウムチャンネルブロッカー、ホスホジエステラーゼインヒビター、アンギオテンシン２型アンタゴニスト、およびサイトカインブロッカー／インヒビターが含まれる。本明細書中に記載されているスクリーニング方法に従って同定された医薬品との組合せもまた想定される。
【０１８７】
組合せは、両方の試薬を含有している単一の組成物または薬学的処方物と心臓細胞を接触させることによって、あるいは、細胞を同時に２つの異なる組成物または処方物と接触させることによって達成され得る。ここでは、一方の組成物が発現構築物を含有し、そして他方が試薬を含有する。あるいは、数分から数週間の範囲の間隔で他の薬剤での処置に対して、遺伝子治療が先行するかまたはそれに続く場合がある。他の試薬および発現構築物が細胞に対して別々に適用される１つの実施形態においては、一般的には、それぞれの送達時間の間の有意な時点では失活せず、その結果、試薬および発現構築物はなお細胞に対して有利な組合せ作用を発揮することが可能であることを確実にさせられる。このような例では、細胞が互いに１２〜２４時間以内に（好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に）両方の種類と接触させられ、わずかに約１２時間の遅延時間が最も好ましい。一部の状況では、処理時間を有意に延長することが所望される場合があるが、それぞれの投与の間は数日（２、３、４、５、６、または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）の経過である。
【０１８８】
カルサルシンまたは他の試薬の１回以上の投与が所望されることもまた、想定される。以下に示すような種々の組合せが使用され得る。ここでは、カルサルシンは「Ａ」であり、そして他の試薬は「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ／  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ。
他の組合せも同様に意図される。
【０１８９】
（Ｖ．患者への投与のための処方物および経路）
臨床的な適用が意図される場合には、薬学的組成物−発現ベクター、ウイルスストック、および薬物−を、意図される適用に適切な形態で調製することが必要である。一般的には、これは、本質的には発熱性物質、ならびにヒトまたは動物に対して有害であり得る他の不純物を含まない組成物を調製することを必然的に伴う。
【０１９０】
一般的には、ベクターの送達を安定にし、そして標的細胞による取り込みを可能にする適切な塩および緩衝液を使用することが所望される。緩衝液はまた、組換え細胞が患者に導入される際にも使用される。本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性の媒体中に溶解されたかまたは分散された細胞に対する有効量のベクターを含有する。このような組成物は、接種原とも呼ばれる。句「薬学的にまたは薬理学的に受容可能な」は、動物またはヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の所望されない反応を生じない分子構成要素および組成物をいう。本明細書中で使用される場合は、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延剤などを含む。このような媒体および試薬の薬学的に活性な物質についての使用は当該分野で周知である。任意の従来の媒体または試薬が本発明のベクターまたは細胞と不適合である場合を除いて、治療用組成物中でのその使用が意図される。補助的な有効成分もまた、組成物中に取り込むことが可能である。
【０１９１】
本発明の活性な組成物は、古典的な薬学的調製物を含み得る。本発明のこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を通じて利用可能である限りは、任意の一般的な経路による。これには、経口、鼻、バッカル剤、直腸、膣、または局所が含まれる。あるいは、投与は、正常位、皮内、皮下、筋肉内、腹膜内、または静脈内注射によることがある。このような組成物は、通常は、上記のような薬学的に受容可能な組成物として投与される。
【０１９２】
活性な化合物もまた、非経口的にまたは腹膜内で投与され得る。遊離の塩または薬学的に受容可能な塩としての活性な化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製され得る。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるための保存料を含む。
【０１９３】
注射可能薬物の用途に適切な薬学的形態には、滅菌の水溶液または分散物、ならびに滅菌の注射可能薬物の溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、この形態は滅菌でなければならず、そして容易に注射器中に存在する程度に液性でなければならない。これは製造および保存条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用を防がなければならない。キャリアは例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な液性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要な粒子の大きさの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防御は、種々の抗菌剤、抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤（例えば、糖および塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能薬物の組成物の吸収の延長は、組成物中での吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によってもたらされ得る。
【０１９４】
滅菌の注射可能薬物の溶液は、上記に列挙された種々の他の成分とともに適切な溶媒中に必要量の活性な化合物を取り込むこと、必要である場合には，続いて濾過滅菌することによって、調製される。一般的には、分散物は、塩基性分散媒体および上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含有している滅菌のビヒクル中に、種々の滅菌の有効成分を取り込むことによって調製される。滅菌の注射可能薬物溶液の調製のための滅菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術である。これによって、その予め滅菌濾過された溶液から、有効成分および任意のさらなる所望される成分の粉末が得られる。
【０１９５】
本明細書中で使用される場合は、「薬学的に受容可能なキャリア」は、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤、ならびに吸収遅延剤などのいずれかおよび全てを含む。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および試薬の使用は当該分野で周知である。任意の従来の媒体または試薬が有効成分と不適合でない限りは、治療用組成物中でのその使用が意図される。補助的な有効成分もまた、組成物中に取り込むことができる。
【０１９６】
経口投与のためには、本発明のポリペプチドは賦形剤とともに取り込まれ得、そして摂取不可能なうがい薬および歯磨き剤の形態で使用され得る。うがい薬は、適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））中に必要量の有効成分を取り込むことによって調製され得る。あるいは、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、および重炭酸カリウムを含有している防腐剤洗浄液中に取り込まれ得る。有効成分はまた、ゲル、ペースト、粉末、およびスラリーを含む歯磨剤中に分散され得る。有効成分は、水、結合剤、研磨剤、甘味料、発泡剤、および湿潤剤を含み得るペースト状の歯磨剤に対して治療有効量で添加され得る。
【０１９７】
本発明の組成物は、中性または塩の形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩には、酸添加塩（タンパク質の遊離のアミノ基により形成される）が含まれ、そしてこれは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第ニ鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【０１９８】
処方の際には、溶液は、投与量処方物と適合性の様式で、そして治療的に有効である場合にはそのような量で、投与される。処方物は、注射可能薬物の溶液、薬物放出カプセルなどの種々の投薬形態で容易に投与される。水溶液中での非経口投与については、例えば、溶液は、必要な場合には適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコールで等張性にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹膜内投与に特に適切である。この関係においては、使用され得る滅菌の水性媒体は、本発明の開示を参照して当業者に公知である。例えば、１つの投与量は、１ｍｌの等張性のＮａＣｌ溶液中に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入用の液体に添加され得るか、または提起された注入部位で注射され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５−１０３８頁および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。投与量のいくつかのバリエーションが、処置される被験体の症状に依存して必然的に生じる。投与する医師が、任意の症例において、個々の被験体について適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄによって要求される滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たされるべきである。
【０１９９】
（ＶＩ．トランスジェニックマウスの作成方法）
本発明の特定の実施形態は、カルサルシン関連構築物を含むトランスジェニック動物を提供する。カルサルシンを発現するトランスジェニック動物、このような動物に由来する細胞株、およびトランスジェニック胚は、カルサルシンと相互作用し、それぞれ、α−アクチニン、テレトニン、またはカルシニューリンに対するカルサルシンンの結合を調節する薬剤、あるいは、カルサルシンの利用による心肥大または心不全に影響を与える薬剤を、スクリーニングおよび同定するための方法において有用であり得る。構成的に発現されるカルサルシンの使用は、正常な基底レベルの発現と比較して過剰発現またはアップレギュレートされた発現についてのモデルを提供する。また、カルサルシンについて「ノックアウト」されたトランスジェニック動物が、例えば、スクリーニング方法に、または候補化合物についての治療的アッセイのためのモデルとして利用される。
【０２００】
（Ａ．トランスジェニックを産生する方法）
一般的な局面においては、トランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能にする様式でのゲノム中への所定の導入遺伝子の組込みによって産生される。トランスジェニック動物を産生する方法は、一般的には、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号；これは本明細書中で参考として援用されている）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５（これはその全体において本明細書中で参考として援用されている）、および「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｈｏｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＣｏｓｔａｎｔｉｍｉおよびＬｏｎｇ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；これはその全体において本明細書中で参考として援用されている）によって記載されている。
【０２０１】
典型的には、ゲノム配列によって隣接されている遺伝子が、受精卵中へのマイクロインジェクションによって導入される。マイクロインジェクションされた卵は宿主の雌に移植され、そして子孫が導入遺伝子の発現についてスクリーニングされる。トランスジェニック動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、および魚類を含むがこれらに限定されない多数の動物由来の受精卵から産生され得る。
【０２０２】
マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは、当該分野で公知の任意の手段によって調製することができる。例えば、マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは、細菌のプラスミド配列を除去するために適切な酵素で切断することができ、そしてＤＮＡフラグメントが標準的な技術を使用してＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上で電気泳動される。ＤＮＡのバンドがエチジウムブロマイドでの染色によって視覚化され、そして発現配列を含有しているバンドが切り出される。次いで、切り出されたバンドは、０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含有している透析バッグ中に入れられる。ＤＮＡは透析バッグ中に電気的に溶出され、１：１のフェノール：クロロホルム溶液で抽出され、そし２倍容量のエタノールで沈澱させられる。ＤＮＡは、１ｍｌの低塩緩衝液（０．２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、および１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再溶解させられ、そしてＥｌｕｔｉｐ−ＤＴＭカラム上で精製される。このカラムは、３ｍｌの高塩緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、および１ｍＭのＥＤＴＡ）で最初に準備され、続いて５ｍｌの低塩緩衝液で洗浄される。ＤＮＡ溶液は、ＤＮＡをカラムマトリックスに結合させるために、３回カラムを通過させられる。３ｍｌの低塩緩衝液で１回の洗浄後、ＤＮＡは０．４ｍｌの高塩緩衝液で溶出され、そして２容量のエタノールによって沈澱させられる。ＤＮＡ濃度が、ＵＶ分光光度計で２６０ｎｍでの吸光度によって測定される。マイクロインジェクションのために、ＤＮＡ濃度が、５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭのＥＤＴＡ中で３μｇ／ｍｌに調整される。
【０２０３】
マイクロインジェクションのためのＤＮＡの他の精製方法は、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８６）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３００：６１１（１９８２）；Ｔｈｅ  Ｑｉａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第３版（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ．によって出版されている）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されている。これらの全てが、本明細書中で参考として援用されている。
【０２０４】
例示的なマイクロインジェクション手順においては、雌性の６週齢のマウスが、妊娠している成熟した雌の血清のゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ）の５ＩＵの注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）、４８時間後のヒト柔毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）の５ＩＵの注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）で過排卵に誘導される。雌は、ｈＣＧの注射の直後に雄と一緒にされる。ｈＣＧの注射の２１時間後、交尾した雌はＣＯ２での窒息または頚部脱臼によって屠殺され、そして胚が摘出された卵管から取り出され、そして０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水中に入れられる。周辺の卵丘細胞がヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去される。次いで、前核胚が洗浄され、そして注射時まで、０．５％のＢＳＡ（ＥＢＳＳ）を含有しているＥａｒｌｅの平衡化塩溶液中で、５％のＣＯ２、９５％の空気の加湿環境を有する３７．５℃のインキュベーター中に置かれる。胚は、２細胞段階で移植することができる。
【０２０５】
無作為に動き回っている成体の雌性マウスは、精管切除した雄と対にされる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスもしくはＳｗｉｓｓマウスまたは他の相当する株を、この目的のために使用することができる。レシピエントの雌はドナーの雌と同時に交尾させられる。胚の導入時に、レシピエントの雌は、体重１グラムあたり０．０１５ｍｌの２．５％アベルチンの腹腔内注射で麻酔される。卵管が１本の背側正中線切開によって露出させられる。次いで、切開が体壁を通って卵管にわたって直接行われる。次いで、卵巣嚢に、時計用ピンセットを用いて穴を空ける。導入される胚は、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水）中に入れられ、そして導入ピペットのチップの中に入れられる（約１０〜１２個の胚）。ピペットのチップが漏斗に挿入され、そして胚が導入される。導入後、切開が２つの縫合で閉じられる。
【０２０６】
（ＶＩＩ．スクリーニングアッセイ）
従って、本発明はまた、カルシニューリン、テレトニン、またはα−アクチニンと相互作用する、および／またはそれらのカルサルシンとの結合に影響を与える種々の能力について化合物をスクリーニングすることを意図する。特に好ましい化合物は、カルシニューリンへのカルサルシンの結合の阻害または促進に有用な化合物である。本発明のスクリーニングアッセイにおいては、候補物質は最初に、基本的な生化学的活性（例えば、標的分子への結合）についてスクリーニングされ得、次いで、細胞レベル、組織レベル、または動物全体レベルで発現の調節を阻害するその能力について試験され得る。
【０２０７】
（Ａ．モジュレーターおよびアッセイ形式）
用語「調節する」は、本明細書中で使用される場合には、任意の様式でカルシニューリンポリペプチドの活性に影響する、活性を調節する、反映する、調整する、または制御するとして定義される。好ましい実施形態においては、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼとして作用するカルシニューリンの機能は、カルサルシンの投与によって調節される。
【０２０８】
本明細書中で使用される場合、用語「候補物質」は、カルサルシンの活性、またはカルシニューリン、テレトニン、もしくはα−アクチニンへのカルサルシンの結合を潜在的に調節し得る任意の分子をいう。候補物質は、タンパク質またはそのフラグメント、低分子インヒビター、またはさらに核酸分子であり得る。最も有用な薬理学的化合物が、カルサルシンと天然において相互作用する化合物と構造的に関係している化合物であることがこの場合が証明され得る。このような分子を作成し、そしてその作用を試験することは、「合理的な薬物設計」として公知であり、そして標的分子の構造への関係の予測を行うことを含む。
【０２０９】
合理的な薬物の設計の目的は、生物学的に活性なポリペプチドまたは標的化号物の構造的なアナログを産生することである。このようなアナログを作成することによって、天然の分子よりも活性であるかまたは安定である薬物を作ることが可能である。この薬物は、変更に対して種々の感受性を有するか、または種々の他の分子の機能に影響を与え得る。１つのアプローチにおいては、カルサルシンと同様の分子の３次構造を作成し、次いでカルサルシン、α−アクチニン、またはテレトニンの分子と相互作用するその能力について分子を設計する。あるいは、カルサルシンの部分的に機能的な（結合するが活性でない）フラグメントを設計し、これによって競合インヒビターを作成することができる。これは、ｘ線結晶学、コンピューターモデリング、または両方のアプローチの組合せによって達成することができる。
【０２１０】
標的化合物またはインヒビターの構造を確認するために抗体を使用することもまた可能である。原則的には、このアプローチは、続く薬物の設計が基づき得る薬種（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生じる。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作成することによって、タンパク質を結晶学的に完全にバイパスすることが可能である。鏡像の鏡像の場合には、抗イディオタイプの結合部位は、もともとの抗原のアナログであると予想される。次いで、抗イディオタイプは、化学的に産生されたかまたは生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定しそして単離するために使用され得る。次いで、選択されたペプチドは、薬種として作用する。抗イディオタイプは、抗原として抗体を使用して、抗体の産生について本明細書中に記載されている方法を使用して作成され得る。
【０２１１】
この場合には、カルシニューリン、テレトニン、またはα−アクチニンへのカルサルシンの結合を実証する十分な証拠が存在している。カルサルシンのこの標的分子への結合の分析によって、カルシニューリン、テレトニン、またはα−アクチニンを認識するカルサルシンの能力についての多くの情報を収集することができる。この情報を用いて、カルシニューリン活性の潜在的インヒビターまたは活性化因子、あるいはカルシニューリンまたはα−アクチニンへのカルサルシンの結合の促進因子の構造に関して、予測を行うことができる。
【０２１２】
一方、有用な化合物の同定を「強引に行う（ｂｒｕｔｅ  ｆｏｒｃｅ）」試みにおいて有用な薬物の基本的な基準を満たすと考えられる低分子ライブラリーを、種々の商業的な供給源から簡単に獲得することができる。このようなライブラリー（組合せによって作成されたライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）を含む）のスクリーニングは、活性について多数の関連している（および無関係な）化合物をスクリーニングするための迅速かつ効率的な方法である。組合せアプローチはまた、活性についてモデル化された第２、第３、および第４世代の化合物（そうでなければ、所望されない化合物）の作成によって、潜在的な薬物の迅速な進化に、自身を適合させる。
【０２１３】
候補化合物は、天然に存在している化合物のフラグメントまたは一部を含み得るか、あるいはそうでなければ不活性である既知の化合物の活性な組合わせとして見出され得る。天然の供給源（例えば、動物、細菌、真菌、植物供給源（葉および樹皮を含む））から単離された化合物、および海洋性サンプルは、潜在的に有用な薬学的薬剤の存在について、候補としてアッセイされ得る。スクリーニングされる薬学的薬剤はまた、化学的組成物または人工化合物から誘導または合成することも可能であることが理解される。従って、本発明によって同定される候補物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子インヒビター、または肥大性応答の既知のインヒビターから開始する、合理的な薬物設計によって設計され得る任意の他の化合物であり得ることが理解される。
【０２１４】
他の適切なインヒビターには、アンチセンス分子、リボザイム、および抗体（単鎖抗体を含む）が含まれる。これらのそれぞれは、カルシニューリン経路内に位置する標的について特異的である。このような化合物は、この文書において別の場所でより詳細に記載される。
【０２１５】
もちろん、本発明の全てのスクリーニング方法が、有効な候補が見出されないかもしれないという事実にもかかわらず、それ自体が有用であることが理解される。本発明は、このような候補を発見する方法だけではなく、これらをスクリーニングする方法をも提供する。
【０２１６】
本発明の目的に従うと、カルシニューリンへのカルサルシンの結合のモジュレーターをスクリーニングするための方法が存在する。この方法は、カルサルシンおよびカルシニューリンをそれぞれ提供する工程、これらを候補モジュレーターの存在下で混合する工程、カルサルシン／カルシニューリンの結合を測定する工程、ならびに候補モジュレーターの非存在下での、カルサルシンおよびカルシニューリンのそれぞれの結合と、この結合を比較する工程を包含する。候補モジュレーターの非存在下に対する、その存在下でのカルサルシンとカルシニューリンとの結合の差異によって、それぞれ、カルシニューリンに対するカルサルシンの結合のモジュレーターとして候補モジュレーターを同定する。当業者は、これを無細胞系において、またはインタクトな細胞内で行うことができることを認識している。特定の実施形態においては、インタクトな細胞は、筋細胞、Ｈ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞または筋管細胞である。好ましくは、この細胞は、動物中にある。モジュレーターは、カルシニューリンに対するカルサルシンの結合を増大または減少させることができるが、候補モジュレーターがカルシニューリンへのカルサルシンの結合を増大させることが好ましい。
【０２１７】
本発明の他の特定の実施形態においては、この結合は、容易に検出することができる手段によって測定される。これには、蛍光、放射活性、物理的に近い接近の検出、免疫学的検出、比色アッセイ、またはレポーター遺伝子のトランス活性化が含まれる。適用可能である場合は、カルサルシンおよび／またはカルシニューリンの両方が、蛍光アッセイのように、例えば、クエンチ可能な標識およびクエンチング剤で標識される。候補モジュレーターの存在または非存在下での結合をアッセイするためのこのような方法は、特定の実施形態においては、ツーハイブリッドアッセイの前提を利用し得る。
【０２１８】
（Ｂ．インビトロアッセイ）
実行が迅速で、安価かつ容易なアッセイは、結合アッセイである。標的への分子の結合は、立体的、アロステリック、または電荷−電荷相互作用に起因する、それ自体におけるそしてそれ自体の阻害であり得る。これは、溶液または固相中で行うことが可能であり、そして特定の化合物を迅速に排除するための第１回目のスクリーニングとして利用され得、その後、より洗練されたスクリーニングアッセイに移動させられ得る。この種の１つの実施形態においては、カルシニューリンもしくはカルサルシン分子またはこれらのフラグメントに結合する化合物のスクリーニングが提供される。
【０２１９】
標的は、溶液中で遊離であるか、支持体に固定されるか、細胞内もしくは細胞表面上で発現されるかのいずれかであり得る。支持体の例には、ニトロセルロース、カラム、またはゲルが含まれる。標的または化合物のいずれかが標識され得、それによって結合の検出が可能になり得る。別の実施形態においては、アッセイは、天然もしくは人工的な基質もしくは結合パートナー（例えば、カルサルシン）への標的の結合の阻害を測定し得る。試薬の一方（例えば、カルサルシン）が標識される、競合結合アッセイを行うことができる。通常は、標的は、標識が結合部分の機能を妨害する機会を減少させる、標識された種である。結合または結合の阻害を決定するために結合させられた標識に対する、結合していない標識の量を測定し得る。
【０２２０】
化合物の高スループットスクリーニングのための技術は、ＷＯ８４／０３５６４に記載されている。多数の小ペプチド試験化合物が、固体基材（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物は、例えば、カルサルシンと反応させられ、そして洗浄される。結合したポリペプチドは種々の方法によって検出される。
【０２２１】
精製された標的（例えば、カルシニューリン、α−アクチニン、テレトニン、カルサルシン−１、カルサルシン−２、またはカルサルシン−３）を、上記の薬物スクリーニング技術での使用のために、プレートまたは支持体上に直接コーティングすることができる。しかし、ポリペプチドに対する非中和抗体を、固相へのポリペプチドの固定のために使用することができる。また、反応性領域（好ましくは、末端領域）を含む融合タンパク質が、固相または支持体に、活性な領域（例えば、アミノ酸１０５〜１７６）を連結するために使用され得る。
【０２２２】
従って、カルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントのそれぞれを支持体に付着させる工程、このポリペプチドまたはフラグメントを候補ペプチドに曝す工程、そしてこのポリペプチドまたはフラグメントへの候補ペプチドの結合をアッセイする工程による、カルサルシンに結合するペプチドを同定するための方法が、本明細書中で提供される。結合は、当該分野の任意の標準的な手段によって（例えば、放射活性、免疫学的検出、蛍光、ゲル電気泳動、または比色手段を通じて）アッセイされる。特定の実施形態においては、さらなるカルサルシンが同定される。ここでは、カルサルシンは、支持体に付着させられ、そして同様のアッセイに供される。
【０２２３】
（Ｃ．細胞中（ｉｎ  ｃｙｔｏ）アッセイ）
カルサルシンを発現する種々の細胞株が、候補物質のスクリーニングに利用され得る。例えば、操作された指示物質とともにカルサルシンを含有している細胞は、候補化合物の種々の機能的特性を研究するために使用され得る。このようなアッセイでは、化合物は、その生化学的性質を考慮して、そして標的細胞と接触するように適切に処理される。
【０２２４】
アッセイに依存して、培養が必要とされ得る。上記で議論されるように、細胞は、次いで、多数の異なる生理学的アッセイ（増殖、大きさ、Ｃａ−＋＋の影響）によって試験され得る。あるいは、カルサルシンまたは関連する経路の機能が研究され得る分子分析が行われ得る。これには、タンパク質の発現、酵素の機能、基質の利用、ｍＲＮＡの発現（全細胞ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ）などのようなアッセイが含まれる。
【０２２５】
従って、本発明に従うと、機能的なカルサルシンポリペプチドを欠く細胞を提供する工程、細胞を候補物質と接触させる工程、そして細胞に対する候補物質の影響を決定する工程による、抗心筋肥大活性または抗心不全活性について候補物質をスクリーニングする方法が、本明細書中で提供される。機能的なカルサルシンポリペプチドを欠く細胞は、本明細書中で別の場所に記載されており、そして細胞株として、この細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物から誘導され得る。この細胞は、好ましくは筋肉細胞であり、そしてカルサルシンの調節領域中に変異（例えば、欠失変異、挿入変異、または点変異）を、あるいはコード領域中に変異（例えば、欠失変異、挿入変異、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、またはスプライシング変異）を有し得る。この細胞は、当該分野で周知の方法によってインビトロまたはインビボで接触させられ得、そして特定の実施形態においては、非ヒトトランスジェニック動物中に配置される。
【０２２６】
（Ｄ．インビボアッセイ）
本発明は特に、種々の動物モデルの使用を意図する。トランスジェニック動物は、カルサルシンの発現および活性が制御およびモニターされることを可能にする構築物を用いて作成され得る。これらの動物の作成は、本明細書中で別の場所で記載されている。
【０２２７】
これらの動物の試験化合物での処置には、動物への適切な形態の化合物の投与が含まれる。投与は、臨床的な目的または臨床以外の目的に利用され得る任意の経路（経口、鼻、頬、またはさらに局所的経路を含むがこれらに限定されない）によって行われる。あるいは、投与は、気管内点滴、気管支内点滴、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によるものであり得る。全身的な静脈内注射、血液またはリンパの供給を介する局所投与が特に意図される。
【０２２８】
（Ｅ．ツーハイブリッドスクリーニング）
用語「ツーハイブリッドスクリーニング」は、本明細書中で使用される場合、相互作用する他のタンパク質の同定による、タンパク質の機能の解明または特徴付けのためのスクリーニングをいう。未知の機能のタンパク質（本明細書中では、「ベイト」という）は、さらにＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質として産生される。このキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含むプラスミドが、酵母細胞中に形質転換される。酵母細胞はまた、異なる潜在的な標的タンパク質をコードする異なるヌクレオチド配列に融合されたＧＡＬ４活性化ドメインを含むライブラリー由来の代表的なプラスミドを含む。ベイトタンパク質が標的タンパク質と物理的に相互作用する場合、ＧＡＬ４活性化ドメインとＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインが繋がれ、それによってレポーター遺伝子の転写を促進するように共同で作用することが可能になる。特定の細胞中でベイトタンパク質と潜在的な標的タンパク質との間での相互作用が生じない場合には、ＧＡＬ４成分は分離したままであり、そしてそれら自体でレポーター遺伝子の転写を促進することはできない。当業者は、β−ガラクトシダーゼ、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、またはＵＲＡ３を含む異なるレポーター遺伝子を利用することができるることを認識している。さらに、それぞれが異なる誘導性プロモーターの制御下にある複数のレポーター配列が、ＧＡＬ４成分（従って、特異的なベイトおよび標的タンパク質）の相互作用を示すために同じ細胞中で利用され得る。当業者は、複数のレポーター配列の使用が、偽陽性の候補が得られる機会を減少させることを認識している。また、代替のＤＮＡ結合ドメイン／活性化ドメインの成分（例えば、ＬｅｘＡ）が使用され得る。当業者は、任意の活性化ドメインが、それらがレポーター遺伝子のトランス活性化を生じることが可能である限りは、任意のＤＮＡ結合ドメインと対にさせられ得ることを認識している。さらに、当業者は、他の成分が存在しそして、それらがＬｅｘＡ系のように、共同してレポーター遺伝子をトランス活性化させる限りは、２つの成分のいずれかが原核生物起源であり得ることを認識している。
【０２２９】
ツーハイブリッド実験用試薬およびその設計は、当業者に周知であり（「Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｐ．Ｌ．ＢａｒｔｅｌおよびＳ．Ｆｉｅｌｄｓ（編）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７を参照のこと）、系の最も更新された改良（Ｆａｓｈｅｎａら、２０００）が含まれる。当業者は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によるＭａｔｃｈｍａｋｅｒＴＭ  ＳｙｓｔｅｍまたはＨｙｂｒｉＺＡＰ（登録商標）２．１  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のような市販のベクター、あるいは研究社会を通じて入手することができるベクター（Ｙａｎｇら、１９９５；Ｊａｍｅｓら、１９９６）を認識している。代替の実施形態においては、酵母以外の生物体（例えば、哺乳動物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によるＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）またはＥ．ｃｏｌｉ（Ｈｕら、２０００））がツーハイブリッド分析に使用される。
【０２３０】
代替の実施形態においては、タンパク質−タンパク質相互作用が細胞質に基づくアッセイで検出されるツーハイブリッド系が利用される。この実施形態においては、タンパク質は、細胞質中で発現され、このことは、翻訳後の改変が生じることを可能にし、または転写活性化因子およびインヒビターがスクリーニングにおいてベイトとして使用されることを可能にする。このような系の例は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によるＣｙｔｏＴｒａｐ（登録商標）Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍである。ここでは、標的タンパク質は、ｈＳｏｓ（グアニルヌクレオチド交換因子）の酵母ホモログであるｃｄｃ２５遺伝子中に温度感受性変異を含む酵母の細胞膜に繋がれる。標的へのベイトタンパク質の結合の際に、ｈＳｏｓは膜に局在化され、これにより、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換の促進によるＲＡＳの活性化が可能である。次いで、ＲＡＳは、変異体酵母ｃｄｃ２５Ｈの３７℃での増殖を可能にするシグナル伝達カスケードを活性化する。この系についてのベクター（例えば、ｐＭｙｒおよびｐＳｏｓ）および他の実験の詳細は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を通じて当業者が入手することができる。（例えば、本明細書中で参考として援用されている米国特許第５，７７６，６８９号をもまた参照のこと）。
【０２３１】
従って、本発明の１つの実施形態に従うと、細胞中に、試験ペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む第１の核酸（ここで、それぞれ、この試験ペプチドはＤＮＡ結合ドメインに融合される）およびカルサルシンの少なくとも一部をコードするＤＮＡセグメントを含む第２の核酸（ここで、カルサルシンの少なくとも一部は、それぞれＤＮＡ活性化ドメインに融合される）を導入する工程を包含する、カルサルシンと相互作用するペプチドをスクリーニングする方法が存在する。続いて、試験ペプチドとカルサルシンポリペプチドまたはそのフラグメントとの間での相互作用についての、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ活性化ドメインとの間での相互作用をアッセイすることによるアッセイが存在する。好ましい実施形態においては、ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとの間での相互作用についてのアッセイは、β−ガラクトシダーゼの発現の活性化である。
【０２３２】
（ＶＩＩＩ．心臓に関係している医学的症状を処置するための方法）
本明細書中で提供されるカルサルシン−１、カルサルシン−２、またはカルサルシン−３ポリペプチドは、カルシニューリンおよびα−アクチニンに結合し、そして肥大性心筋症に関係している。カルサルシンに結合する能力は、カルサルシン−１、カルサルシン−２、またはカルサルシン−３を利用する治療を標的する機会、特に、心筋でのその高い発現レベル、骨格筋での低いレベルでの発現、および他の組織中で検出の欠乏を活用する機会を提供する。本発明によって使用される治療（例えば、シクロスポリンおよびＦＫ５０６）によるカルシニューリンの活性の阻害は、免疫抑制に起因して所望されない副作用を有する。従って、当業者は、カルシニューリンの活性を調節するため、または心肥大、心不全、もしくはＩＩ型糖尿病を処置するための方法を、本明細書中で提供する。これは、そのような形態を罹患している生物体に、カルサルシンポリペプチド、またはカルサルシンポリペプチドをコードする核酸を投与することによる。従って、好ましくは、正常な基底レベルを上回るレベルで存在するカルサルシンポリペプチドに対してそれを結合させることによるその機能または活性の妨害による、カルシニューリン活性を混乱させることが意図される。これは、カルサルシン活性を誤って局在化させそして阻害する可能性のある手段としての、カルサルシンの野生型または変異形態（例えば、ドミナントネガティブ形態）を投与することによって達成され得る。用語「ドミナントネガティブ」は、本明細書中で使用される場合には、同じ細胞中の野生型形態の機能を混乱させるカルサルシンの形態をいう。従って、カルサルシンのドミナントネガティブ形態はカルサルシンに結合して、亜細胞性の誤った局在化によるようなカルシニューリンの異常な活性を促進し得る。好ましい実施形態においては、投与されたカルサルシンは、細胞中のカルシニューリンに結合するかまたはそれを滴定し、それによって肥大性心筋症の促進のような、それに続くカルシニューリンの作用を軽減する。
【０２３３】
特定の実施形態においては、カルサルシンポリペプチドまたはそのカルシニューリン結合フラグメントをコードする核酸は、例えば、筋特異的プロモーターを用いて、筋肉細胞中で特異的に発現される。特定の実施形態においては、カルサルシンのドミナントネガティブ形態が投与される。
【０２３４】
他の方法においては、細胞中でのカルシニューリンによる遺伝子の転写の活性化の阻害が存在する。これは、それがその機能を発揮する場所以外の亜細胞性の領域に融合タンパク質を局在化させる標的化ペプチドに融合された、カルサルシンまたはそのカルシニューリン結合フラグメントを含有している融合タンパク質を細胞に提供することによる。カルシニューリンは、収縮性の変化を強力に感知することができ、このことは、筋節へのその局在化が、それが収縮に起因するカルシウムの変化に応答することを可能にすることを示唆している。融合タンパク質は、本明細書中の別の場所で議論されている。このような方法によって達成される遺伝子の転写は、直接的な手段によって、または上流のエフェクターの阻害を用いるように間接的に、阻害され得る。特定の実施形態においては、阻害されるカルシニューリンによる遺伝子の転写には、ＩＬ−２のようなサイトカイン、心房性ナトリウム排泄増加性因子（ＡＮＦ）のような胎児の心臓病遺伝子、ｂ型ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）、α−主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、およびα−骨格アクチンをコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。上記で議論されているＮＦＡＴ活性化の基本的なモデルは、多くの細胞型中でのカルシニューリンを介するＣａ２＋シグナルの伝達、およびそれぞれの細胞環境に特有の異なるセットの標的遺伝子の転写の制御を示す（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９６）。
【０２３５】
特定の実施形態においては、伝統的な薬物または化合物を用いる治療が、本明細書に記載されている方法に加えて利用される。これには、イオノトロープ（ｉｏｎｏｔｒｏｐｅ）、β−ブロッカー、不整脈治療薬、利尿剤、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、アンギオテンシン２型アンタゴニスト、およびサイトカインインヒビター／ブロッカーからなる群より選択される化合物の動物への投与が含まれる。
【０２３６】
（Ｘ．実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を示し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが、当業者に理解されるはずである。しかし、当業者は、本発明の開示を参照して、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことが可能であり、そしてなお本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解するべきである。
【０２３７】
（実施例１）
（材料および方法）
酵母のツーハイブリッドスクリーニング。ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合させた全長のマウスＣｎＡ−α  ｃＤＮＡを、以前に記載されているように（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９８）、ヒトの心臓のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の約１．５×１０６個のクローンのツーハイブリッドスクリーニングにおいておとりとして使用した。このスクリーニングによって、本発明者らは、カルサルシン−１をコードするｃＤＮＡを同定した。同じｃＤＮＡライブラリーのさらなるツーハイブリッドスクリーニングを、カルサルシン−１およびカルサルシン−２をおとりとして使用して行った。
【０２３８】
ノーザンブロット分析。ヒトおよびマウスの多組織由来のＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ならびにＣ２Ｃ１２細胞抽出物由来のＲＮＡのノーザンブロットを、記載されているように行った（Ｓｐｅｎｃｅｒら、２０００）。
【０２３９】
カルサルシン抗血清の作製およびウェスタンブロット。ウサギの抗血清を、ＧＳＴとインフレームで融合させたカルサルシン−１のオープンリーディングフレーム全体に対して作製した。ＩｇＧをウサギの血清から精製し、そしてウェスタンブロッティングおよび免疫染色に使用した。
【０２４０】
放射活性インサイチュハイブリダイゼーション。カルサルシン−１およびカルサルシン−２  ｃＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖に対応するＲＮＡプローブを、Ｔ７およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）および３５Ｓ標識ＵＴＰを使用して調製した。マウスの胚および生体の後肢の切片を、以前に記載されているようにインサイチュハイブリダイゼーションに供した（Ｌｕら、１９９８）。
【０２４１】
細胞培養、トランスフェクション、および免疫沈降。Ｃｏｓ−７細胞を、１０％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ中で維持した。２×１０５個の細胞を、カルサルシン−１およびカルサルシン−２、ＣｎＡ、およびα−アクチニン−２の全長形態および短縮型の１μｇの発現プラスミドで、ＦｕＧＥＮＥ  ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してトランスフェクトした。カルサルシンペプチドを、Ｎ末端のＨＡエピトープまたはＣ末端のＭｙｃエピトープと融合し、α−アクチニン−２をＮ末端のＭｙｃエピトープまたはＦＬＡＧエピトープと融合し、そしてＣｎＡ構築物を、Ｎ末端のＦＬＡＧエピトープと融合した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、およびプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ）を含有しているＥＬＢ緩衝液中に回収した。細胞を軽く超音波処理し、そして破片を遠心分離によって除去した、タグ化タンパク質を、プロテインＡ／Ｂアガロースおよび１μｇの適切な抗体（モノクローナル抗ＦＬＡＧ、モノクローナル抗Ｍｙｃ、およびポリクローナル抗Ｍｙｃ）を使用して２〜３時間４℃で免疫沈降させた。続いて、ペレットをＥＬＢ緩衝液で洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ポリビニリデン膜に移し、そしてそれぞれ、抗ＦＬＡＧ、抗Ｍｙｃ、または抗ＨＡ抗体を使用してイムノブロットした。
【０２４２】
免疫染色。カルサルシン−１、α−アクチニン、およびＣｎＡの細胞性局在化を、記載されているように（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９８）回収しそして維持した新生児ラットの心筋細胞中で決定した。免疫染色を、記載されているように行った（Ｓｐｅｎｃｅｒら、２０００）。以下の抗体を使用した：それぞれ、テキサスレッドおよびＦＩＴＣで標識（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）した、抗カルサルシン−１、抗筋節α−アクチニン（Ｓｉｇｍａｎ）、抗ＣｎＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；２次抗体；抗マウス／ウサギ。マウスの心臓および骨格筋の細胞切片を、３．７％のホルマリン中で３分間固定し、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間浸透させ、続いて上記に記載したように染色した。
【０２４３】
カルサルシン−１相互作用ドメインのマッピング。カルサルシン−１のいくつかのＮ末端およびＣ末端短縮型を、ベクターｐＡＳ１中のＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインとインフレームで融合させた。ＣｎＡおよびα−アクチニンを、ツーハイブリッドベクターｐＡＣＴ２中のＧＡＬ４トランス活性化ドメインと融合させた。全長のＣｎＡおよび構成的に活性なＣｎＡの両方が、単独でトランスフェクトされた場合にバックグランドのβ−ガラクトシダーゼ活性を示したので、酵素活性を欠失している変異型ＣｎＡ（Ｓｈｉｂａｓａｋｉら、１９９６）を続く実験で使用し、そしてこれはバックグラウンドのシグナルを全く示さなかった。カルサルシン−１構築物をＣｎＡ、α−アクチニン、またはｐＡＣＴ２（ネガティブコントロールとして）とともに形質転換し、そして適切な選択培地上で３日間増殖させた。β−ガラクトシダーゼ活性を、記載されているような（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、１９８９）フィルター−リフトアッセイを用いて決定し、そして１〜４時間モニターした。いくつかのカルサルシン−１のＣ末端短縮型が、ｐＡＣＴ２とともに同時形質転換した場合にβ−ガラクトシダーゼ活性を示したので、相補性同時免疫沈降実験を、ＣｎＡおよびα−アクチニンについてのカルサルシンの相互作用ドメインをさらに明確にするために上記に記載したように行った。
【０２４４】
（実施例２）
（カルシニューリン関連タンパク質の同定）
カルシニューリン（そして好ましくは、これは、心臓特異的である）に関係しているタンパク質を同定するために、マウスの心臓のｃＤＮＡライブラリーによってコードされるタンパク質についてのツーハイブリッド分析を酵母中で行った。特定の実施形態においては、カルシニューリンの触媒領域を酵母のＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合した。これらのスクリーニングによって、カルシニューリンと会合する筋特異的カルシニューリン関連タンパク質（カルサルシン）−１を同定した。続く哺乳動物細胞中での実験によって、カルサルシン−１とカルシニューリンとがインビボで複合体を形成することができることが示された（以下の実施例を参照のこと）。
【０２４５】
マウスのカルサルシン−１  ｃＤＮＡ配列を用いて、公開されている発現された配列タグ（ＥＳＴ）データベースを検索することによって、ヒトのカルサルシン−１  ｃＤＮＡクローン、ならびに関連する遺伝子であるカルサルシン−２およびカルサルシン−３についてのヒトおよびマウスの配列を同定した。当業者は、タンパク質および核酸配列の両方のそのような検索のために利用可能なデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎｂａｎｋＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）または商業的に入手することができるデータベース（Ｃｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ｗｗｗ．ｃｅｌｅｒａ．ｃｏｍ）を含む）を認識している。カルサルシン−１〜３のアラインメントを図１３に示す。
【０２４６】
ヒトのカルサルシン−１の予想されるアミノ酸配列（図１Ａ）、マウスのカルサルシン−１の予想されるアミノ酸配列（図１Ｂ）、ヒトのカルサルシン−２の予想されるアミノ酸配列（図１Ｃ）、およびマウスのカルサルシン−２の予想されるアミノ酸配列（図１Ｄ）を、マウスのタンパク質のアミノ酸アラインメント（図１Ｅ）とともに示す。ヒトのカルサルシン−１のＤＮＡ配列（図２Ａ）、マウスのカルサルシン−１のＤＮＡ配列（図２Ｂ）、ヒトのカルサルシン−２のＤＮＡ配列（図２Ｃ）、およびマウスのカルサルシン−２のＤＮＡ配列（図２Ｄ）もまた提供する。カルサルシン−１およびカルサルシン−２は、それらのアミノ末端およびカルボキシ末端近くで最も高い相同性を示すが、間のアミノ酸はあまり十分には保存されていない。両方のタンパク質配列を用いたＢＬＡＳＴ検索によっては、既知のタンパク質に対する有意な相同性は全く明らかにならなかった。
【０２４７】
カルサルシン−２を、カルサルシン−１の配列を用いたＥＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）の検索によって同定した。３個のマウスのカルサルシン−２  ＥＳＴを同定した：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号（ＡＡ０３６１４２、ＡＷ７４２４９４、Ｗ２９４６６）。さらに、４個のヒトのカルサルシン−２  ＥＳＴを同定した：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号（ＡＷ９６４１０８、ＡＡ１９７１９３、ＡＷ０００９８８、ＡＡ１７６９４５）。マウスのカルサルシン−２  ＥＳＴは以下である：ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡ０３６１４２；ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＷ７４２４９４；およびＧｅｎＢａｎｋ番号Ｗ２９４６６。ヒトのカルサルシン−２  ＥＳＴは以下である：ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＷ９６４１０８；ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡ１９７１９３；ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＷ０００９８８；およびＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡ１７６９４５。
【０２４８】
カルサルシン−３を、カルサルシン−１およびカルサルシン−２の配列のデータベースとの比較によって「インシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）」で発見した。いくつかの相同配列を含有しているヒトのゲノムＤＮＡ（ＡＣ  ００８４５３．３；公開されていないＣｅｌｅｒａデータベース）を、カルサルシン−３のエキソンであると確認した。プライマーを設計し、そしてヒトの骨格筋ライブラリーで、ヒトのカルサルシン−３の全長のｃＤＮＡをスクリーニングした（図５）。同様に、マウスの骨格筋のライブラリーをスクリーニングし、そしてマウスのカルサルシン−３をコードしているいくつかの独立しそして重複しているクローンを同定した。
【０２４９】
ツーハイブリッド実験用試薬および設計は、本明細書中で別の場所で詳細に議論する。代替の実施形態では、酵母のワンハイブリッドシステム（ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、１９９９；Ｓｉｅｗｅｋｅ，２０００）を、カルサルシンの核酸配列との相互作用を決定するために利用するか、またはスリーハイブリッドシステムを、インビボでＲＮＡ−タンパク質の相互作用を検出するために利用する（ＳｅｎＧｕｐｔａら、１９９６）。
【０２５０】
他の実施形態では、当該分野で周知の他の方法を、カルシニューリンと相互作用するタンパク質またはペプチドを同定するために利用する。例えば、カルサルシンの標識された形態を、当該分野の標準的な手段によって作製し、可能性のある相互作用の候補のプールを標識されたカルシニューリンに対して暴露し、そして得られた相互作用を同定する。あるいは、標識されていない形態のカルシニューリンが標識された候補に対して暴露され、そして標識されていないカルシニューリンへの暴露後に、得られた標識された相互作用因子の候補を特定する。代替の特定の実施形態においては、標識されていない形態のカルシニューリンを、例えば、細胞抽出物中に存在する、３５Ｓ標識メチオニンによる３５Ｓ標識タンパク質に対して暴露する。標識された相互作用因子の候補を単離し、そして例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法によって同定する。別の実施形態においては、免疫沈降を、当該分野で周知の手段によって行う。ここでは、カルシニューリンに対する抗体は、候補の相互作用因子の供給源とともにインキュベートされ、そして抗体は、この抗体が結合するカルシニューリンの形態と相互作用する任意の遺伝子産物を単離するかまたは「引っ張り出す」ように作用する。当業者は、タンパク質−タンパク質相互作用に関する本明細書中に記載された方法が、任意のタンパク質またはポリペプチド（全てのカルサルシンを含む）に対して同様に適用されることを認識している。タンパク質−タンパク質相互作用を決定するための他の方法は、当該分野で周知である。
【０２５１】
従って、ツーハイブリッドシステムに加えて、タンパク質の相互作用を分析するためのさらなる方法には、本明細書中で他の場所でその免疫学的形態で記載される、相互作用の捕捉、親和性精製、ファージに基づく発現クローニング（相互作用クローニングとも呼ばれる）、表面プラズモン共鳴、および同時沈降が含まれる。
【０２５２】
相互作用の捕捉（相互作用因子の捕獲とも呼ばれる）においては、酵母株は、２つのＬｅｘＡオペレーター応答性レポーターを含む：染色体に組み込まれたＬＥＵ２遺伝子、およびプラスミドが保有しているＧＡＬ１プロモーター−ｌａｃＺ融合遺伝子。さらにこの株は、ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインおよび目的のタンパク質を含有している構成的に発現されるキメラタンパク質を含む。これは、レポーター遺伝子を別々に活性化することはできない。誘導性の酵母ＧＡＬ１プロモーターは、酵母中に導入された活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡライブラリーの発現を駆動する。形質転換された酵母の、ロイシンをもまた欠失しているガラクトースを含有している培地上へのプレーティングによって、ライブラリーの発現を誘導する。おとりタンパク質の候補の標的タンパク質との相互作用が生じる場合、ＬＥＵ２が発現され、そしてコロニーの増殖が可能となる。レポーター遺伝子の発現を、Ｘ−ｇａｌを含有している培地上へのプレーティングで確認する。
【０２５３】
親和性精製（ＧＳＴプルダウン精製としてもまた公知である）は、グルタチオン−アガロースビーズに結合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合されたタンパク質を利用する。候補の相互作用因子タンパク質（これは標識されるかまたは精製される場合がある）に対するビーズの暴露には、次の洗浄が続く。保持されている候補の相互作用因子タンパク質の量を、ビーズ／結合したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供するか、またはグルタチオンもしくは塩で溶出するかのいずれかによって決定する。候補の相互作用因子タンパク質の特定の実施形態が公知であるが、この方法はまた、候補の相互作用因子タンパク質に対する抗体を使用するような、他の技術または試薬と組合せて行われる場合には、タンパク質の複雑な混合物（例えば、粗細胞溶解物）を試験するために使用することもできる。
【０２５４】
相互作用クローニング（発現クローニングとも呼ばれる）においては、おとりタンパク質（目的のタンパク質）および適切な発現ライブラリーをコードする核酸（例えば、心臓または筋肉組織由来）は、λｇｔ１１のようなバクテリオファージ発現ベクター中に存在する。特定の実施形態においては、融合タンパク質は、おとりタンパク質およびＧＳＴから構成されるが、環状アデノシン３’，５’−ホスフェート（ｃＡＭＰ）依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）部位の認識部位をもまたそれらの間に含む。ｃＤＮＡを、３２Ｐで放射標識する。おとり融合タンパク質を、ＰＫＡおよび（γ−３２Ｐ）ＡＴＰによって酵素的にリン酸化する。標識したプローブを、インフレームで遺伝子融合体を含有しているβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現する、αバクテリオファージ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために利用する。融合タンパク質を、ファージおよびプラークの形成による細胞の溶解後に、ニトロセルロース膜上に吸着させる。相互作用因子のクローンを、例えば、オートラジオグラフィーによって視覚化する。
【０２５５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、特定の相互作用する可能性のある分析物とともに相互作用を決定するために利用する。従って、特定のタンパク質が目的のタンパク質と相互作用すると予想される場合には、これを最も良く使用する。表面プラズモン共鳴においては、タンパク質を連続的に流れている緩衝液に対して曝されるチッブ上に固定する。潜在的な結合分析物を含有しているサンプルの「プラグ」を、タンパク質の表面上を連続して流す場合には、緩衝液の流れを遮断する。ＳＰＲデバイス上の感知装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器）によって、目的のタンパク質と相互作用する可能性のある分析物の会合の際に生じる界面からの最少反射角の変化を検出する。従って、分子の相互作用の視覚化は、コンピューターモニター上で見られるように、実時間で生じる。
【０２５６】
（実施例３）
（カルシニューリン関連タンパク質をコードする核酸の発現）
カルシニューリン−１およびカルシニューリン−２がどの組織中で発現されるかを決定するために、ノーザン分析を行った。図３では、示したマウス組織由来のポリＡ＋ＲＮＡを、当該分野で周知の方法によって、カルシニューリン−１およびカルシニューリン−２転写物の発現について分析した。データは、カルサルシン−１およびカルシニューリン−２について、多くの平行に走る、筋特異的発現パターンを示す。カルサルシン−１は、心臓および骨格筋で特異的に発現され、ヒト組織中では１．６ｋｂおよび２．６ｋｂの２つのｍＲＮＡがあり、そしてマウス中には１．３ｋｂの単一の転写物のみが存在する。カルサルシン−１のかすかな発現もまた、マウスの肺および肝臓で検出した。１．６ｋｂおよび１．３ｋｂのカルサルシン−２転写物を、成体のヒトおよびマウスの骨格筋中だけでそれぞれ検出した。ヒトとマウスの骨格筋との間でのカルサルシン−１の発現レベルの相対的な差異は、速い単収縮繊維組成物に対する遅い単収縮繊維組成物中での差異を反映し得る。
【０２５７】
特定の実施形態においては、カルサルシン−３の発現パターンを、類似の方法によって決定した（図９）。ＲＮＡを分析するための方法は周知である。簡潔には、ＲＮＡを、標準的な技術を使用して目的の組織から単離し、続いてアガロースゲル上で分画し、膜に移し、そして膜に架橋した。標識プローブを膜にハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイゼーションを検出する。
【０２５８】
骨格筋の肥大症および遅い繊維遺伝子の発現の調節におけるカルシニューリンの重要な役割を仮定すると、カルサルシン−２は骨格筋の機能の調節において重要な役割を果たすようである。
【０２５９】
（実施例４）
（カルシニューリン関連タンパク質をコードする核酸の発現の局在化、ならびに骨格筋中のカルサルシン−１およびカルサルシン−２の繊維型特異性）
時間的および空間的なカルサルシン−１の発現パターンを特徴付けるために、インサイチュハイブリダイゼーションを行った。胚日齢（Ｅ）９．５では、比較的弱いカルサルシン−１の発現が心臓中で観察されたが、Ｅ１２．５およびＥ１５．５では、強いシグナルを、心筋組織および骨格筋組織の両方で検出した。対照的に、カルサルシン−２でプローブした同じ胚に由来する隣接する切片は、Ｅ９．５で有意な心臓での発現を示し、これはＥ１２．５でもなお検出可能であった。舌の骨格筋中でのカルサルシン−２の低レベルの発現はまた、この段階でも見ることができた。Ｅ１５．５では、カルサルシン−２の心臓での発現はダウンレギュレートされ、そして心房中でごく弱く検出されたが、骨格筋での発現はより強くなった。全ての心臓のチャンバー中でのカルサルシン−１の発現は、成体期まで維持された（図４Ｂ）。従って、カルサルシン−１は、全ての平行して走っている筋組織中で発達の間中発現されるが、カルサルシン−２は初期の胚形成の間は心臓中で一時的に発現され、そして後期には骨格筋に限定されるようになる。
【０２６０】
当業者は、組織のインサイチュハイブリダイゼーション（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９４）（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））を使用することによる核酸の発現を決定するための標準的な方法を認識している。インサイチュハイブリダイゼーションのために、特異的に標識した核酸プローブを、それぞれの細胞性の核酸（例えば、サンプル（例えば、組織切片または個々の細胞）中のＲＮＡ）にハイブリダイズさせる。特定の実施形態においては、サンプルを適切な時間固定し、そして段階的なエタノール系列を通して脱水する。次いで、サンプルをパラフィンワックス中に含浸させ、ブロックに鋳造し、そしてミクロトーム上で切片にした。特異的に標識したプローブを、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンを用いて、または蛍光色素タグ化デオキシヌクレオチドを用いて調製した。次に、プローブをサンプルにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション条件は、標識プローブおよび試験するサンプルの性質に依存して変化し得る。特定の実施形態においては、ハイブリダイゼーション後、サンプルを３７℃の５０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ中で３７℃で１５分間、２×ＳＳＣ中で３７℃で１５分間、そして室温の１×ＳＳＣ中で１５分間洗浄した。スライドを、４×ＳＳＣ中で５分間、室温で平衡化させた。スライドの水気を切り、そして風乾させた。次に、検出溶液を添加した。検出溶液中での４５分のインキュベーション後、スライドを洗浄した。ＤＡＰＩまたはヨウ化プロピジウム染色溶液のような対比染色を、このスライドに添加した。スライドを、蛍光顕微鏡を使用して観察した。
【０２６１】
他の実施形態においては、他のカルサルシンでのインサイチュハイブリダイゼーションを同様に行う。当業者は、代替の実施形態においては、ポリペプチドまたはタンパク質の免疫組織化学的局在化を、亜細胞性のまたは組織内の特定の細胞型へのその局在化を決定するために使用する。別の実施形態においては、インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学的局在化を、細胞または組織内での局在化を決定することと組合せて使用し、それによって問題のペプチドまたはタンパク質の機能の性質に関する情報を提供する。
【０２６２】
カルサルシンが骨格筋で発現の繊維型特異性を示し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、カルサルシン−１およびカルサルシン−２プローブを使用して、成体のマウスの後肢の切片を用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行った（図４Ｃ）。カルサルシン−１の発現は、ヒラメ筋および足底筋に局在化し、これは主に遅い単収縮繊維を含む。対照的に、カルサルシン−２の発現は、腓腹筋中で豊富であり、これは主に、速い単収縮筋型である。
【０２６３】
種々の組織抽出物のカルサルシン−１抗血清を使用するウェスタンブロットは、心臓およびヒラメ筋中で単一の３２ｋＤａのタンパク質を明らかにした（図４Ｄ）。肝臓または他の筋肉以外の組織では発現は検出されなかった。カルサルシン−１抗血清は、トランスフェクトしたＣｏｓ細胞由来の抽出物中では組換えカルサルシン−２を認識しなかった。このことは、抗血清の有意な交差反応性がないことを示す（データは示さない）。ごくわずかなカルサルシン−１タンパク質の発現を、腓腹筋由来の抽出物中で検出することができた（図４Ｄ）。これによって、カルシニューリン−１の遅い繊維に限定された発現が確認された。
【０２６４】
カルサルシン−１転写物は、増殖している筋芽細胞の分化培地への移動後のＣ２骨格筋細胞株の分化の間にアップレギュレートされた（図３Ｅ）。対照的に、カルサルシン−２の発現は、Ｃ２細胞中では検出されなかった。
【０２６５】
（実施例５）
（カルサルシン−１およびα−アクチニンの共局在）
カルサルシン−１およびα−アクチニンが相互作用することを示すツーハイブリッド実験を考慮して、２つの遺伝子産物の共局在を試験した。カルサルシン−１の亜細胞性の局在を、新生児ラットの心筋細胞、ならびに成体のマウスの心臓および骨格筋の凍結切片の免疫染色によって決定した。図５に示すように、カルサルシンの染色は、新生児の心筋細胞の筋節に局在化され、そしてｚ線を特異的に標示するα−アクチニンの染色と重複した。同様の染色パターンを、成体のマウスの心臓および骨格筋の切片において観察した。興味深いことに、アミノ酸２４７〜４４９に対する抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出したカルシニューリンもまた、ｚ線に共局在化し、このことは、酵素の筋特異的亜細胞性局在化を示している。後者の知見を、２次ＣｎＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）によって確認した。ＣｎＡ染色もまた核内で検出され、これは、カルシニューリンもまた他の亜細胞性領域に局在化されることを示唆している。別の実施形態においては、同様の実験を、α−アクチニンのようなポリペプチドとの共局在を試験するために、カルサルシン−２抗体またはカルサルシン−３抗体を用いて行う（図１１）。さらに、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞中でのカルサルシン−１の過剰発現が、初期（分化の１日後）に生じ、そして筋節の形成を増進した（図１２）。
【０２６６】
（実施例６）
（カルシニューリン関連タンパク質と相互作用するタンパク質の同定）
カルサルシン−１の機能をさらに理解するために、実施例１および本明細書中で別の場所に記載した方法と同様に、これを、筋肉のｃＤＮＡライブラリーのツーハイブリッドスクリーニングにおいてベイトとして使用した。このスクリーニングによって、α−アクチニンの一部をコードする多数の別々のｃＤＮＡを同定した。特定な実施形態においては、カルサルシン−２および／またはカルサルシン−３を、カルサルシン−２またはカルサルシン−３と相互作用するポリペプチドを検出するための同様の方法においてそれぞれベイトとして使用する。α−アクチニンは、通常は、筋節のＺ線条に関係している。
【０２６７】
カルサルシン−１および−２のα−アクチニンとの会合を、トランスフェクトしたＣｏｓ細胞中のエピトープタグ化タンパク質、および新生児の心筋細胞由来の天然のタンパク質の同時免疫沈降によってさらに試験した。図６Ａに示すように、Ｃ末端のＭｙｃタグ化カルサルシン−１は、ＦＬＡＧタグ化ＣｎＡおよびα−アクチニンを免疫沈降させた。カルシニューリンの触媒活性は、触媒的に不活性なＣｎＡ変異体を免疫沈降させるカルサルシン−１の能力によって示されるように、カルサルシンの相互作用には必要ではない。Ｍｙｃタグ化α−アクチニン、ＨＡタグ化カルサルシン、およびＦＬＡＧタグ化カルシニューリンでの三重免疫沈降アプローチ（図６Ｂ）を使用して、本発明者らは、ＣｎＡだけがカルサルシン−１の存在下でＭｙｃ−α−アクチニンによって沈降させられ得るることを示した。これは、三量体複合体を示している。さらに、α−アクチニンはまた、心筋細胞抽出物由来の天然のカルサルシン−１で同時免疫沈降させられ得た（図６Ｃ）。さらに、カルサルシン１〜３は、図１０に示すように、筋節タンパク質のテレトニンとともに同時免疫沈降した。テレトニンは、肢帯の筋ジストロフィーに関係している疾患遺伝子であり、そして心筋および骨格筋の両方で平行して走る筋肉の攣縮応答において役割を果たし得る。
【０２６８】
（実施例７）
（α−アクチニンとのカルサルシン−１の相互作用のためのドメインの同定）
カルサルシン−１のＮ末端およびＣ末端短縮型を、ＣｎＡおよびα−アクチニン相互作用ドメインを特徴付けるために使用した。酵母のツーハイブリッドアッセイおよび補体免疫沈降実験によって、アミノ酸１５３〜２００がα−アクチニンとのカルサルシンの相互作用に必要であることを明らかにした（図７）。この領域の２７個の残基は、マウスおよびヒトのカルサルシン−１および−２の間で高度に保存されており、このことは、この領域が最少相互作用ドメインを構成し得ることを示唆している。アミノ酸２４５〜２５０の間のモチーフは、ＮＦＡＴ（ＰｘＩｘＩＴ）およびＭＣＩＰ（ＰｘＩｘｘＩＴ）上の既知のカルシニューリンドッキング部位と似ているので、本発明者らは、これらの残基の両方を欠失しているＣ末端短縮型を試験した。しかし、これらのアミノ酸を欠失しているカルサルシンはなおも、ツーハイブリッドアッセイ（ＧＡＬ４−カルサルシン８５〜２４０）および同時免疫沈降（Ｍｙｃ−カルサルシン１〜２４０）の両方によって結合することが可能であった。対照的に、残基２１７〜２６４を欠失しているカルサルシン−１変異体は、ＣｎＡに結合することができず、このことは、残基２１７〜２４０が結合に不可欠であることを意味している。ＣｎＡ上への相互作用ドメインのマッピングは、カルサルシン相互作用ドメインが触媒領域中にあることを明らかにしたが、α−アクチニンのカルサルシン−１相互作用ドメインは、第２および第３のスペクトリン様反復にマップされる。
【０２６９】
特定の実施形態においては、同様の実験を、タンパク質結合を用いる相互作用のためのカルサルシンドメインの同定において、他のカルサルシンを用いて行う。
【０２７０】
（実施例８）
（心筋症および筋ジストロフィーにおけるカルシニューリン関連タンパク質の有意性）
インビボでのそれらの相互作用および共局在に基づいて、カルサルシン−１がＺ線条に対してカルシニューリンと連結し、ここではこれは、筋細胞におけるカルシウムのシグナル伝達における変化を意味し得、そして肥大性シグナルを伝達する可能性があり得ることを、本明細書中で提案する（図８）。カルサルシン−１および／または他のカルサルシンタンパク質（例えば、カルサルシン−２またはカルサルシン−３）はまた、Ｚ線条の調節および細胞中の他のタンパク質とのその会合を通じて、心筋細胞および骨格筋細胞中で構造的および／または機械的感覚的役割を果たし得る。Ｚ線条は、筋肉細胞の構造および機能の調節において重要な役割を果たすことが示されている。従って、カルサルシン−１はおそらく、これらのプロセスに親密に関係しており、そしてヒトの心筋症および筋ジストロフィーに関係している遺伝子についての有力な候補である。
【０２７１】
（参考文献）
以下の参考文献は、それらが本明細書中に示されているものについて補充する、例示的手順のまたは他の詳細を提供する程度に、本明細書中で参考として詳細に援用されている。
【０２７２】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに説明するために含められる。本発明は、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１つ以上のこれらの図面を参照することによってより良好に理解され得る。
【図１】
図１Ａ〜１Ｅは、ヒトおよびマウスのカルサルシン−１およびカルサルシン−２の推定アミノ酸配列を示す。ヒトカルサルシン−１の推定アミノ酸配列（図１Ａ）、マウスカルサルシン−１の推定アミノ酸配列（図１Ｂ）、ヒトカルサルシン−２の推定アミノ酸配列（図１Ｃ）およびマウスカルサルシン−２の推定アミノ酸配列（図１Ｄ）を、マウスタンパク質のアミノ酸整列（図１Ｅ）とともに示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、ヒトカルサルシン−１についてのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、マウスカルサルシン−１についてのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｃ】
図２Ｃは、ヒトカルサルシン−２についてのヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｄ】
図２Ｄは、マウスカルサルシン−２についてのヌクレオチド配列を示す。
【図３】
図３は、成体のヒトおよびマウスの組織におけるカルサルシン−１およびカルサルシン−２のノーザンブロット分析を示す。カルサルシン転写物は、示されるヒトおよびマウスの組織のノーザン分析によって検出された。カルサルシン−１  ｍＲＮＡは、心臓および骨格筋において優位に検出されるが、一方、カルサルシン−２転写物は、両方の種の骨格筋において検出された。
【図４Ａ】
図４Ａ〜４Ｅは、カルサルシン−１およびカルサルシン−２の発生発現を示す。図４Ａ：カルサルシン−１およびカルサルシン−２転写物は、上の各々のセットのパネルに示される胚の時点で、マウス胚矢状切片の放射性インサイチュハイブリダイゼーションによって検出された（ｂ、脳；ｈ、心臓；ｔ、舌）。
【図４Ｂ】
図４Ａ〜４Ｅは、カルサルシン−１およびカルサルシン−２の発生発現を示す。図４Ｂ：カルサルシン−１転写物は、成体マウス心臓の前面切片の放射性インサイチュハイブリダイゼーションによって検出された。転写物は、房（ａ）および室（ｖ）の至る所に検出される。
【図４Ｃ】
図４Ａ〜４Ｅは、カルサルシン−１およびカルサルシン−２の発生発現を示す。図４Ｃ：カルサルシン転写物は、成体マウス後肢筋を通じた切片の放射性インサイチュハイブリダイゼーションによって検出された。カルサルシン−１転写物は、ヒラメ筋（ｓ）および足底筋（ｐ）に局在するが、一方カルサルシン−２転写物は、腓腹筋（ｇ）に局在する。
【図４Ｄ】
図４Ａ〜４Ｅは、カルサルシン−１およびカルサルシン−２の発生発現を示す。図４Ｄ：カルサルシン−１およびα−チューブリンのタンパク質発現は、示される組織由来の抽出物のウェスタンブロット分析によって検出された。
【図４Ｅ】
図４Ａ〜４Ｅは、カルサルシン−１およびカルサルシン−２の発生発現を示す。図４Ｅ：カルサルシン−１転写物は、示される日数について、増殖培地（ＧＭ）または分化培地（ＤＭ）において、Ｃ２細胞由来のＲＮＡのノーザン分析によって検出された。棒目盛は、５００μｍである。
【図５Ａ】
図５Ａは、カルサルシン−１の亜細胞局在を示す。新生児ラット心筋細胞を、カルサルシン−１抗血清ならびにα−アクチニン（上部パネル）およびＣｎＡ（下部パネル）に対して指向される抗体を用いた免疫染色によって分析した。オーバーレイは、カルサルシン−１が、α−アクチニンおよびＣｎＡと共局在することを示す。棒目盛は、１０μｍである。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、カルサルシン−１の亜細胞局在を示す。新生児ラット心筋細胞を、カルサルシン−１抗血清ならびにα−アクチニン（上部パネル）およびＣｎＡ（下部パネル）に対して指向される抗体を用いた免疫染色によって分析した。オーバーレイは、カルサルシン−１が、α−アクチニンおよびＣｎＡと共局在することを示す。棒目盛は、１０μｍである。
【図６Ａ】
図６Ａ〜Ｃは、カルシニューリンおよびα−アクチニンを用いたカルサルシンの同時免疫沈降を示す。図６Ａ：Ｃｏｓ細胞が、ＦＬＡＧ−ｃａｎ、ＦＬＡＧ−α−アクチニン−１またはＭｙｃ−カルサルシン−１（Ｃｓ−１）をコードする発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトされ、そして免疫沈降が行われた。上部パネルは、抗Ｍｙｃ免疫沈降物の抗ＦＬＡＧイムノブロットを示し、そしてＣｎＡおよびα−アクチニンのＣｓ−１との結合を実証する。ＩｇＧ重鎖はまた、二次抗体によって認識される。中央のパネルは、細胞抽出物の抗ＦＬＡＧイムノブロットを示して、ＣｎＡおよびα−アクチニンの存在を実証する。下部パネルは、細胞抽出物の抗Ｍｙｃイムノブロットを示して、カルサルシンの存在を実証する。
【図６Ｂ】
図６Ａ〜Ｃは、カルシニューリンおよびα−アクチニンを用いたカルサルシンの同時免疫沈降を示す。図６Ｂ：Ｃｏｓ細胞が、Ｍｙｃ−α−アクチニン−２、ＨＡ−Ｃｓ−１またはＦＬＡＧ−ＣｎＡをコードする発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトされ、そして免疫沈降が、抗Ｍｙｃ抗体を用いて行われ、その後、ＦＬＡＧ抗体を用いてイムノブロットが行われた。上部パネルは、抗Ｍｙｃ免疫沈降物の抗ＦＬＡＧイムノブロットを示し、そしてＣｎＡのＣｓ−１との結合を実証する。上から２番目のパネルは、細胞抽出物の抗ＦＬＡＧイムノブロットを示して、ｃａｎの存在を実証する。次のパネルは、それぞれ、抗Ｍｙｃイムノブロットを示して、α−アクチニンの存在を実証し、そして抗ＨＡイムノブロットを示して、Ｃｓ−１の存在を実証する。
【図６Ｃ】
図６Ａ〜Ｃは、カルシニューリンおよびα−アクチニンを用いたカルサルシンの同時免疫沈降を示す。図６Ｃ：初代新生児ラット心筋細胞から調製される抽出物が、抗Ｃｓ−１抗体または免疫前血清を用いて免疫沈降され、そして抗α−アクチニン抗体を用いたイムノブロッティングによって分析された。α−アクチニンは、抗Ｃｓ−１と特異的に免疫沈降する。
【図７】
図７は、カルサルシン相互作用ドメイン、カルシニューリン相互作用ドメインおよびα−アクチニン相互作用ドメインのマッピングを示す。Ｎ末端およびＣ末端のカルサルシン−１トランケーションが作製され、そしてＧａｌ４−ＤＮＡ結合ドメインに融合されて、酵母におけるβ−ｇａｌ活性によって評価されるように、ＣｎＡまたはα−アクチニンと相互作用する能力を試験された。相補実験が、それぞれＦＬＡＧタグ化ＣｎＡまたはＦＬＡＧタグ化α−アクチニンとのＭｙｃタグ化カルサルシン−１の同時免疫沈降によって行われた。総合すれば、アミノ酸１５３〜２００は、α−アクチニンとの相互作用に不可欠であるようであるが、一方、アミノ酸２１７〜２４０は、ＣｎＡとのカルサルシンの結合に必要である。
【図８】
図８は、カルサルシン−１のＺディスクへの結合、およびカルシニューリン（ＣＮＡ）とのその結合を示す筋節の概略図である。
【図９】
図９は、成体ヒトおよびマウスの組織におけるカルサルシン−３のノーザンブロット分析を示す。カルサルシン転写物が、示されるヒトおよびマウスの組織のノーザン分析によって検出された。カルサルシン−３  ｍＲＮＡは、両方の種の骨格筋において優位に検出される。
【図１０】
図１０は、カルシニューリンおよびα−アクチニン、テレトニンおよびγ−フィラミンとのカルサルシンの同時免疫沈降を示す。図６に示されるように、カルサルシン１、カルサルシン２およびカルサルシン３は、カルシニューリンおよびα−アクチニン、ならびにγ−フィラミンと相互作用した。さらに、同時免疫沈降によって、すべてのカルサルシンが、心臓の筋節タンパク質および骨格筋のテレトニンと相互作用した。テレトニンは、肢帯筋ジストロフィに関与する疾患遺伝子であり、そして心筋および骨格筋の両方における横紋筋の伸張応答における役割を果たし得る。
【図１１】
図１１は、ｚディスク位置を確認する、抗カルサルシン−３抗体を用いたマウス骨格筋の免疫染色を示す。抗体を、カルサルシン−３に対して惹起し、これは、α−アクチニンとの共局在によって証明される骨格筋におけるｚディスク染色を示す。
【図１２】
図１２は、Ｃ２Ｃ１細胞におけるカルサルシン−１の過剰発現が、（前）筋節形成を促進することを示す。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞におけるカルサルシン−１の過剰発現は、早期（分化の１日後）および増強される筋節形成をもたらす。
【図１３】
図１３は、カルサルシン１〜３の整列を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528822.tif 000172
【国際調査報告】
2004528822.tif 000173
2004528822.tif 000174
2004528822.tif 000175
2004528822.tif 000176
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