(57)【要約】本発明は、グリコサミノグリカン分子に対して特異的親和性を有するペプチド誘導体を提供する。これらのペプチド誘導体には、化学改変ペプチドと共に多量体が含まれ、これらは多様な方法によって調製してもよい。本発明のペプチドは、グリコサミノグリカン媒介シグナル伝達事象の阻害剤およびターゲティング物質としての用途を含むがこれらに限定されない多数の機能を有する。本発明のペプチドは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1およびキトサン2を含む任意のグリコサミのグリカンに対して向けてもよい。本発明のペプチド誘導体はまた、炎症疾患、癌、および癌転移、自己免疫疾患等を含む疾患の治療および予防において治療的用途を有する。
2004532203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を含む人工ペプチド多量体：
(Z)nX(Y)m
式中、Xは、天然に存在する任意のアミノ酸であり、ZおよびYはそれぞれ独立して脂肪族アミノ酸および極性脂肪族アミノ鎖からなる群より選択され、nおよびmはそれぞれ独立して6〜30の範囲の整数である；
ペプチド多量体の結合親和性Kaが、インサイチューで天然に存在するグリコサミノグリカンと比較して5×105 l/molまたはそれ以上である。
【請求項２】
多量体が同じアミノ酸配列を有する二つまたはそれ以上のペプチド単位を含み、Kaが1×106 l/molまたはそれ以上である、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項３】
多量体が異なるアミノ酸配列を有する二つまたはそれ以上のペプチド単位を含み、Kaが1×106 l/molまたはそれ以上である、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項４】
多量体が二量体である、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項５】
多量体が四量体である、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項６】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1およびキトサン2からなる群より選択され、Kaが1×108 l/molまたはそれ以上である、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項７】
構造が一つまたはそれ以上のリンカー分子によって第二の構造に結合している、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項８】
一つまたはそれ以上のリンカー分子が一つまたはそれ以上のアミノ酸を含む、請求項7記載の人工ペプチド多量体。
【請求項９】
リンカーが非ペプチドリンカーである、請求項7記載の人工ペプチド多量体。
【請求項１０】
非ペプチドリンカーがコハク酸を含む、請求項9記載の人工ペプチド多量体。
【請求項１１】
非ペプチドリンカーがポリエチレングリコール（PEG）を含む、請求項9記載の人工ペプチド多量体。
【請求項１２】
ZおよびYが同じであって、nおよびmがそれぞれ6である、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項１３】
構造がさらにN-またはC-末端伸長部Wpを含み、Wが任意の塩基性または中性アミノ酸であって、pが3〜13の整数である、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項１４】
Wがグリシンおよびアルギニンからなる群より選択され、ペプチドサブユニットが末端のセリンを含む、請求項13記載の人工ペプチド多量体。
【請求項１５】
構造が化学改変され、化学改変がアミド化およびポリエチレングリコールによる処置からなる群より選択され、該アミノ酸の一つまたはそれ以上がD-異性体である、請求項1記載の人工ペプチド多量体。
【請求項１６】
それぞれの構造が、Xが任意のアミノ酸である、ペプチド配列
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を含む、請求項1記載のペプチド多量体。
【請求項１７】
以下を含む薬学的組成物：
（a）請求項1記載の人工ペプチド多量体；および
（b）薬学的に許容される担体。
【請求項１８】
インサイチューで天然に存在するグリコサミノグリカンと比較して、結合親和性Kaが5×105 l/molまたはそれ以上でグリコサミノグリカンまたはその断片に対する結合能を有する物質を被験者に投与することを含み、物質の投与がグリコサミノグリカン媒介反応を阻害する、グリコサミノグリカン媒介反応を阻害する方法。
【請求項１９】
グリコサミノグリカン媒介反応が炎症反応である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
物質が抗原提示細胞とT細胞との相互作用を阻害する、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
投与が表面局所、局所、および全身投与からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
物質が以下の構造を含むペプチド化合物であって、人工ペプチドの結合親和性Kaが、インサイチューで天然に存在するグリコサミノグリカンと比較して5×105 l/molまたはそれ以上である、請求項18記載の方法：
(Z)nX(Y)m
式中、Xは、天然に存在する任意のアミノ酸であり、ZおよびYはそれぞれ独立して脂肪族アミノ酸および極性脂肪族アミノ鎖からなる群より選択され、nおよびmはそれぞれ独立して6〜30の範囲の整数である。
【請求項２４】
グリコサミノグリカン媒介反応が腫瘍発生である、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
グリコサミノグリカン媒介反応が癌の転移である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍発生が、脳の癌、肺癌、咽頭癌、食道癌、頭頚部癌、皮膚癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、子宮頚癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、または血液の癌の腫瘍発生である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ペプチドが第二の抗癌療法と共に投与される、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
グリコサミノグリカンの合成、分泌、または分解を調節する物質を被験者に投与することを含む、癌を治療または予防する方法。
【請求項２９】
物質が、ヒアルロニダーゼ、β-D-グルクロニダーゼ、およびβ-N-アセチル-D-ヘキソサミニダーゼからなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1およびキトサン2からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項３１】
（a）グリコサミノグリカンを発現する該細胞を候補物質に接触させる段階；および
（b）該グリコサミノグリカンの合成、分泌、分解、表面発現、または機能を測定する段階、
を含む、グリコサミノグリカン媒介反応の阻害剤をスクリーニングする方法であって、該候補物質によって処置していない類似の細胞と比較して、グリコサミノグリカンの合成、分泌、分解、表面発現、または機能が変化すれば、該候補物質がグリコサミノグリカン媒介反応の阻害物質であると同定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年3月21日に提出された「グリコサミノグリカンの阻害剤」と題する米国特許仮出願第60/277,790号に対する優先権を主張し、本出願の開示は、全ての目的のために本出願にその全文が参照として組み入れられる。
【０００２】
政府の権利
政府は国立衛生研究所の助成金番号RO3 AR47402号に従って、本発明に一定の権利を保有する可能性がある。
【０００３】
発明の分野
本発明は一般的に、癌、免疫、および炎症疾患の分野に関する。より詳しく述べると、本発明は、グリコサミノグリカンのペプチド阻害剤に関する。本発明はまた、炎症疾患、自己免疫疾患、および他のグリコサミノグリカン関連疾患を治療するための治療的および予防的方法を提供する。さらに、本発明は、グリコサミノグリカン結合物質を用いる抗癌治療を提供する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
免疫系の細胞と細胞外マトリクス（ECM）の成分との相互作用は、炎症反応を含む様々な免疫応答の誘導に関与している。細胞外構造の重要な成分であることの他に、ECMはまた、細胞受容体との相互作用によって細胞シグナル伝達事象にも関係している。このように、ECMは、細胞の接着、細胞増殖、細胞分化等を調節する（Schubertら、Trends Cell Biol. 2：63〜66、1992）。ECMの主要な成分には、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、およびプロテオグリカンが含まれ、これらはタンパク質-タンパク質およびタンパク質-糖質間の相互作用を通して特異的細胞表面受容体に結合する。グリコサミノグリカンは、タンパク質のコアにしばしば共有結合した反復二糖類の直鎖状のポリマーである。
【０００５】
ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロネートとしても知られる）（HA）は、タンパク質コアを欠損するグリコサミノグリカンであり、細胞外マトリクスの主要な非構造成分の一つである（Laurentら、F.A.S.E.B.J. 6：2397〜2404、1992；Aruffoら、Cell 61：1303〜1313、1990；Cultyら、J. Cell Biol. 111：2765、1990；Underhillら、Cell. Sci. 103：293〜298、1992；Tooleら、Plenum Press、ニューヨーク、1384〜1386、1991）。HAはまた、細胞表面に発現されて、CD44（Aruffoら、Cell 61：1303〜1313、1990；Miyakeら、J. Exp. Med. 172：69〜75、1990）、HA媒介運動性受容体（RHAMM）（Hardwickら、J. Cell Biol. 117：1343〜1350、1992）、リンクタンパク質（Hardinghamら、Biochem. J. 177：237〜247、1979）、アグリカン（Watanabeら、J. Biol. Chem. 272：28057〜28065、1997）、バーシカン（LeBaronら、J. Biol. Chem. 267：10003〜10010、1992）、ヒアルロネクチン（Delpechら、J. Neurochem. 36：855〜859、1981）、ニューロカン（Rauchら、J. Biol. Chem. 267：19536〜19547、1992）、肝洞様血管内皮HA受容体、インターαトリプシン阻害剤関連タンパク質（10）、BEHAB（脳濃縮HA結合）、CD38、リンパ管内皮HA受容体1、および白色脂肪／骨髄／骨芽細胞HA結合タンパク質を含むいくつかの異なる分子に結合することが示されている。逆に、CD44は、HAのみならず、コラーゲン、フィブロネクチン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、およびセルグリシンにも結合する。このように、CD44（またはHA）は、一般的に一次HA受容体（または主なCD44リガンド）であると考えられているが、HA-CD44相互作用は、それによってHAとCD44とが細胞活性を調節する可能性がある多数のメカニズムの一つである。
【０００６】
HAは、インビボで高分子量の直鎖状の多糖類として存在する[GlcNAcβ1-4GlcUAβ1-3]nの反復二糖類である。HAは、哺乳類において、主に結合組織、皮膚、軟骨、および滑液に認められ、同様に眼の硝子体の主成分でもある。結合組織において、HAに会合した水和の水は、組織のあいだに空間を作製し、このように、細胞が移動および増殖を行うための環境を形成する。HAは、急速な発達、再生、修復、胚形成、胚発達、創傷治癒、血管新生、および腫瘍発生を含む、細胞の運動に関連した生物現象において重要な役割を有する（Tooleら、Plenum Press、ニューヨーク、1384〜1386、1991；Bertrandら、Int. J. Cancer、52：1〜6、1992；Knudsonら、F.A.S.E.B.J. 7：1233〜1241、1993）。HAレベルは、腫瘍の攻撃性と相関することが示されており（Ozelloら、Cancer Res. 20：600〜604、1960；Takeuchiら、Cancer Res. 36：2133〜2139、1976；Kimataら、Cancer Res 43：1347〜1354、1983）、腫瘍細胞の浸潤特性の指標となりうる（Knupferら、Anticancer Res. 18：353〜6、1998）。
【０００７】
HAはまた、免疫応答に、例えばHAのその受容体の一つであるCD44への結合の増加に関係しており、生理的なずれ応力の条件で血管内脾細胞に対するリンパ球の一次接着（「ローリング」）を媒介することが示されており、この相互作用は、インビボでマウスにおいて炎症部位への活性化T細胞の滲出を媒介する（DeGrendeleら、J. Exp. Med. 183：1119〜1130、1996；DeGrendeleら、J. Immunol. 159：2549〜2553、1997；DeGrendeleら、Seicence 278：672〜675、1997b）。HAおよび他のグリコサミノグリカンのレベルの変化もまた、望ましくない免疫応答、およびリウマチ性関節炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、多発性硬化症、移植の拒絶のような疾患および障害に関係している。例えば、HAおよび他のグリコサミノグリカンは、関節炎のような自己免疫障害において変化しており、ヒアルロン酸とコンドロイチン6-硫酸の双方のレベルの減少が、リウマチ性関節炎の大人（Bensouyadら、Ann. Rheum. Dis. 49：301〜307、1990）および若年性リウマチ性関節炎の子供（Spellingら、Clin. Exp. Rheumatol. 9：195〜9、1991）の双方の疾患を有する滑液において認められている。
【０００８】
樹状細胞（DC）は、多様な関連抗原に対する細胞性免疫応答の誘導において本質的な役割を有する。DCは、化学ハプテン、外来タンパク質、感染微生物、および腫瘍関連抗原を含む関連する広範囲の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導において重要な役割を有することが知られている（Steinmanら、Ann. Rev. Immunol. 9：271、1991；Stinglら編、マグローヒル（McGraw Hill and Co.）社、ニューヨーク、172頁、1993）。内皮細胞上に発現されたHAと、T細胞および顆粒球のみならず活性化樹状細胞上に発現されたCD44との相互作用は、そのような白血球のその標的部位へのホーミングを媒介すると考えられている。
【０００９】
グリコサミノグリカン、特にHAはまた、結合および細胞への流入を伴う他の細胞相互作用を媒介することが知られている。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、感染するとHAに結合することが知られていることから、HAはHIVによる哺乳類細胞の感染に関係している。HAおよびその受容体であるCD44に対するモノクローナル抗体はいずれも、単球指向性HIVによる単球のHIV感染を阻害することが判明した（Levesqueら、J. Immunol. 156：1557〜65、1996）。HAはまた、卵母細胞と精子の結合を媒介することによって哺乳類の接合体形成にも関係している。データは、卵丘マトリクスにおけるHAが、卵丘および／または透明帯の成分による先体反応の誘導に関して受精する精子をプライミングするように作用する可能性があることを示している。HAは、PH-20タンパク質に結合することによってこの相互作用を媒介して細胞内カルシウムの基礎レベルを増加させ、それによって先体反応を増強すると考えられている（Sabeurら、Zygote 6：103〜11、1998）。HAは、HA結合タンパク質を含むタンパク質のリン酸化を増強することによって精子の運動性を媒介する（Ranganathanら、Cell Mol. Biol. Res. 41：467〜76、1995）。
【００１０】
多様な生理的および病的状態に関係する他の重要なグリコサミノグリカンには、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1およびキトサン2が含まれる。これらおよび他のグリコサミノグリカン、ならびに特にヒアルロン酸は、そのような多様な生理的プロセスにおいて重要な役割を果たし、それらは治療物質の魅力的な標的となる。しかし、グリコサミノグリカンは、ほとんど非抗原性であることが判明しており、したがって、グリコサミノグリカンを認識する抗体はほとんど単離されていない。抗原性がないことから、グリコサミノグリカンの阻害剤またはプローブを開発することは技術的に困難であった。そのため、グリコサミノグリカン媒介プロセスの阻害剤、特にヒアルロン酸媒介プロセスの阻害剤が当技術分野で必要とされている。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
ヒアルロン酸およびその塩は、発達、再生、修復、胚形成、胚発達、創傷治癒、血管新生、腫瘍形成および免疫応答を含む、細胞の運動に関係する生物現象において重要な役割を有する。本発明は、結合親和性Kaが5×105 l/molまたはそれ以上でHAに結合して、HA依存的プロセスを阻害することができる人工的なペプチド多量体を含む方法および組成物を提供する。特に、炎症反応の阻害、サイトカイン放出の阻害、抗原提示の阻害、T細胞クローン化増殖の阻害、樹状細胞のような抗原提示細胞（APC）の成熟の阻害、APC-T細胞クラスタ形成の阻害、T細胞活性化の阻害、細胞接着の阻害、白血球滲出の阻害等を含む免疫系のいくつかの異なる局面が、本発明によって操作されうる。本発明はさらに、炎症疾患、自己免疫疾患、および他のグリコサミノグリカン関連疾患を治療するための治療的および予防的方法を提供する。さらに、本発明は、腫瘍形成および転移を阻害する抗癌治療を提供する。
【００１２】
第一の態様において、構造(Z)nX(Y)mを含む人工ペプチド多量体を開示し、式中Xは、任意のアミノ酸であり、YおよびZはそれぞれ、アミノ酸残基6〜30個の脂肪族または極性の脂肪族アミノ酸である。ペプチド多量体は、結合親和性Kaが5×105 l/molまたはそれ以上でグリコサミノグリカンまたはその断片に結合するであろう。構造(Z)nX(Y)mは多量体のサブユニット内に含まれる。多量体は、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列の二つまたはそれ以上のペプチド単位を有してもよい。多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体またはそれ以上の多量体であってもよい。結合したグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸もしくはその塩、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1、またはキトサン2であってもよい。
【００１３】
多量体サブユニットは、アミノ酸（ペプチドリンカー）または非ペプチドリンカー（例えば、コハク酸、ポリエチレングリコール（PEG））のような一つまたはそれ以上のリンカー分子によって結合してもよい。ペプチド単位はモチーフZZZXZZZを含んでもよく、式中Zは脂肪族および極性脂肪族残基からなる群より選択されるアミノ酸であり、Xは、任意のアミノ酸である。サブユニットはさらに、N-またはC-末端伸長部Wpを含んでもよく、式中Wは任意の塩基性または中性アミノ酸であり、pは3〜13までの整数であり、例えばWは独立してアルギニンまたはグリシンである。ペプチドサブユニットはまた、末端のセリンを含んでもよい。特定の態様において、伸長部はC-末端のGGGSである。
【００１４】
もう一つの態様において、ペプチド多量体は化学改変してもよい。化学改変には、アミド化、PEG化、グリコシル化、アセチル化、プレニル化、リン酸化、ビオチニル化、カルボキシル化、カルボニル化を含み、または既知の保護／ブロッキング基の添加によってさらに誘導体化してもよい（「かさの高い」側鎖による置換、例えばαヒドロキシルの代わりにメチルを用いる）。他の改変には、D-アミノ酸の利用、環状化、トランスオレフィン結合を用いることが含まれる。特定の態様において、一つまたはそれ以上のペプチド多量体サブユニットは、ペプチド配列
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を含み、式中、Xは任意のアミノ酸である。特定の態様において、多量体は、全ての
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サブユニットを含む。特定の態様において、伸長部はC-末端GGGSである。
【００１５】
もう一つの態様において、（a）構造(Z)nX(Y)mを含み、Xが任意のアミノ酸であり、YおよびZがそれぞれアミノ酸残基6〜30個の脂肪族または極性脂肪族アミノ酸であって、結合親和性Kaが5×105 l/molまたはそれ以上でグリコサミノグリカンまたはその断片に対する結合能を有する、人工ペプチド多量体、ならびに（b）薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００１６】
さらなる態様において、結合親和性Kaが5×105 l/molもしくはそれ以上、好ましくはKaが1×106 l/molもしくはそれ以上で、より好ましくはKaが1×107 l/molもしくはそれ以上、またはさらにより好ましくはKaが1×108 l/molもしくはそれ以上、Kaが1×109 l/molもしくはそれ以上、Kaが1×1010 l/molもしくはそれ以上、Kaが1×1011 l/molもしくはそれ以上でグリコサミノグリカンまたはその断片に結合する物質を被験者に投与する段階を含む、グリコサミノグリカン媒介反応を阻害する方法が提供される。反応は、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞とT細胞との相互作用のような炎症反応であってもよい。活性は、免疫調節因子の分泌、細胞の移動、細胞間相互作用、細胞接着、細胞分化および成熟、細胞の増殖および死、または炎症／免疫反応の変化を含んでもよい。投与は、表面局所もしくは全身投与であってもよく、または罹患した体の部分または臓器に対して局所または限局的であってもよい。さらに、ペプチドは先に考察したように化学改変してもよい。
【００１７】
さらになおさらなる態様において、結合親和性Kaが5×105 l/molまたはそれ以上でグリコサミノグリカンまたはその断片に結合能を有する物質を、それを必要とする被験者に投与する段階を含む、癌、腫瘍発生、または癌転移を治療または予防する方法が提供される。物質は、構造(Z)nX(Y)mを含む人工ペプチド多量体であってもよく、式中Xは任意のアミノ酸であり、YおよびZはアミノ酸残基6〜30個の脂肪族または極性脂肪族アミノ酸であって、結合親和性Kaが5×105 l/molまたはそれ以上でグリコサミノグリカンまたはその断片に対する結合能を有する。癌は、脳の癌、肺癌、咽頭癌、食道癌、頭頚部癌、皮膚癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、子宮頚癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、または血液の癌であってもい。治療は、癌を既に有する患者における近位または遠位転移を阻害することを含んでもよい。ペプチドは、固形腫瘍に対して局所もしくは限局的に、または全身的に投与してもよい。ペプチドは、放射線照射、化学療法、または遺伝子治療のような第二の抗癌治療と併用して投与してもよい。第二の抗癌治療は、ペプチドと同時、ペプチドの前、または後に投与してもよい。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1およびキトサン2であってもよい。ペプチドは、単量体または先に考察した二つまたはそれ以上のペプチドサブユニットを含む多量体であってもよい。ペプチドはまた、先に考察したように化学改変してもよい。ペプチドは、モチーフZZZXZZZを含んでもよく、式中Zは脂肪族および極性脂肪族残基からなる群より選択されるアミノ酸であり、Xは、任意のアミノ酸である。特定の態様において、ペプチド配列は
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であってもよく、式中Xは任意のアミノ酸である。特定の態様において、伸長部はC-末端のGGGSである。
【００１８】
もう一つの態様において、グリコサミノグリカンの合成、分泌、または分解を調節する化合物をそれを必要とする被験者に投与することを含む、癌を治療または予防する方法が提供される。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1またはキトサン2であってもよい。治療は癌を既に有する患者における転移を阻害することを含んでもよい。ペプチドは、固形腫瘍に対して局所もしくは限局的に、または全身的に投与してもよい。方法は第二の抗癌治療を含んでもよい。
【００１９】
さらにもう一つの態様において、（a）グリコサミノグリカンを発現する細胞を提供する段階；（b）細胞を候補物質に接触させる段階；および（c）候補物質を処置していない類似の細胞と比較して、グリコサミノグリカンの合成、分泌、分解、表面発現または機能が変化すれば、候補物質が抗癌物質であると同定される、グリコサミノグリカンの合成、分泌、分解、表面発現または機能を測定する段階、を含む抗癌物質をスクリーニングする方法が提供される。
【００２０】
なおさらにもう一つの態様において、（a）物質に結合したターゲティング部分を含む結合物を提供する段階；および（b）結合物を細胞に接触させる段階、を含むグリコサミノグリカン構造に物質をターゲティングする方法が提供される。ターゲティング部分は物質に共有結合してもよい。細胞は、被験者、例えばヒト被験者に存在してもよい。グリコサミノグリカンは、細胞上に発現されてもよく、または細胞外マトリクス内に含まれてもよい。物質は、放射性核種もしくは癌化学療法剤のような治療物質、または診断物質であってもよい。同様に、ヒアルロニダーゼであってもよい。細胞は癌細胞であってもよく、グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1またはキトサン2であってもよい。
【００２１】
説明的な態様の説明
コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラトスルフェート、キチン、キトサン1、キトサン2、および特にヒアルロン酸（HA）のようなグリコサミノグリカンに結合する物質は、グリコサミノグリカンを伴う多くの生理的プロセスおよび病態に投与される有用な治療物質となりうる。本発明者らは、ファージディスプレイ技術によって、グリコサミノグリカンに結合するペプチドを既に単離した（その全文が参照として本明細書に組み入れられる、同時係属中の米国特許仮出願第60/126,475号；およびMummertら、J. Exp. Med 192：769〜779、2000を参照のこと）。出版物は全て、それらが本明細書に述べた内容を補足する例としての技法または他の詳細を提供する程度に、その全文が特に参照として本明細書に組み入れられる。
【００２２】
一つの例において、同時係属中の米国特許仮出願第60/126,475号は、ファージディスプレイ技術を用いて、「Pep-1」と呼ばれるグリコサミノグリカンに結合する新規ペプチドの開発を記述している。このペプチドは配列GAHWQFNALTVRを有する。Pep-1は、HAの可溶性の固定された細胞会合型に対して特異的結合を示し、HA基質に対する白血球の接着をほぼ完全に阻害した。Pep-1の全身、局所、または表面局所投与は、炎症性白血球の皮膚方向へのホーミングを遮断することによってマウスにおける接触性過敏症反応の発現を阻害した。Pep-1はまた、表皮からのランゲルハンス細胞（LC）のハプテン誘発遊走を遮断することによって感作相を阻害した。これらの知見は、HAが、炎症組織に向かう、そして炎症組織からの白血球の「二方向」の移動において本質的な役割を有すること、そしてこのように炎症性障害に対する治療物質としてHA阻害剤を提供することを示している。
【００２３】
本発明は、インサイチューで天然に存在するグリコサミノグリカンと比較して結合親和性Kaが5×105 l/molまたはそれ以上でグリコサミノグリカンに結合するペプチドの誘導体を提供し、さらに、本発明の分子は、サイトカイン放出、抗原提示、T細胞のクローン化増殖、樹状細胞のような抗原提示細胞（APC）の成熟、APC-T細胞クラスタ形成、T細胞活性化、細胞接着および白血球滲出のような、免疫系の多くの局面を操作するために用いることができることを示す。本発明はまた、腫瘍形成、特に転移を操作するために用いることができる。誘導体には、多量体および／または生物学的、化学的、および物理的特性が驚くほど改善した化学改変誘導体が含まれる。例えば、Pep-1と比較して溶解性、安定性、および生物活性が大きい多量体Pep-1誘導体、特にPep-1二量体およびPep-1四量体を提供する。本明細書に例示するものの他に多様な異なる多量体は、単量体と比較して改善された特性を示し、同等の数の単量体と比較して相乗的改善すら示す可能性があると想定される。
【００２４】
本発明の人工ペプチド多量体は、好ましくは、インビボ、インビトロ、インサイチューまたは結合親和性を測定するための標準的な研究所での実験条件で、結合親和性Kaが少なくとも5×105 l/molもしくはそれ以上、好ましくはKaが1×106 l/molもしくはそれ以上で、より好ましくはKaが1×107 l/molもしくはそれ以上、またはさらにより好ましくはKaが1×108 l/molもしくはそれ以上、Kaが1×109 l/molもしくはそれ以上、Kaが1×1010 l/molもしくはそれ以上、Kaが1×1011 l/molもしくはそれ以上でグリコサミノグリカンに結合する。結合は、任意のグリコサミノグリカンに対してであってもよく、好ましくはヒアルロン酸である。
【００２５】
本発明はまた、グリコサミノグリカンのペプチド阻害剤の誘導体を調製する方法を提供する。一つの態様において、Pep-1多量体化は、コハク酸架橋、PEG結合、様々なリンカーまたは連結基の利用を伴う方法のみならず、架橋することができる、または多量体形成を化学的に媒介することができる他の試薬を用いて行うことができる。例えば、Pep-1二量体は、コハク酸架橋によって調製し、Pep-1四量体は、PRG結合によって調製した。二量体および四量体の他に、本発明者らは、Pep-1の三量体、五量体、六量体等を含む多量体も同様に、強力な生物活性を有すると企図している。本発明のペプチド多量体誘導体は、それぞれのサブユニットがアミノ酸6〜30個を含む、二つまたはそれ以上のペプチドサブユニットを含むと企図される。さらに、本発明者らは、多量体が異なるペプチドサブユニットと共に同一のペプチドサブユニットの双方を含みうることを企図する。
【００２６】
化学改変によって得られた本発明のペプチドの誘導体も同様に提供する。例えば、ペプチドは、アミド化、PEG化、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、カルボキシル化、カルボニル化することができ、または伸長配列の結合によって伸長することができる。一つの態様において、伸長配列はアルギニン残基を含む。他のタイプの伸長配列も同様に企図される。いくつかの態様において、伸長配列はリンカー配列であってもよい。同様に、いくつかの場合において、本発明のペプチドは、一つまたはそれ以上の様々な化学改変法および／または多量体形成法によって誘導体化されるであろうと企図される。
【００２７】
本発明者らはまた、グリコサミノグリカンのペプチド阻害剤の抗癌特性を証明する。例えば、Pep-1単量体は、黒色腫の肺転移を阻害した。このように、本発明は、Pep-1およびその他の化学誘導体を含むグリコサミノグリカンのペプチド阻害剤を用いて、抗癌治療、特に腫瘍転移の予防をねらいとした治療を想定する。本発明はまた、グリコサミノグリカンまたは他のグリコサミノグリカン関連事象の増加を伴う癌にグリコサミノグリカンの単量体および四量体ペプチド阻害剤を用いることを想定する。
【００２８】
グリコサミノグリカンのペプチド阻害剤はまた、抗原提示細胞とT細胞との相互作用を阻害する。例えば、Pep-1単量体およびPep-1四量体は、インビトロで樹状細胞（DC）とT細胞との相互作用を阻害する。より詳しく述べると、Pep-1およびその誘導体は、DO11.10トランスジェニックマウスから新しく単離したCD4+ T細胞の、卵白アルブミン（OVA）ペプチドでパルスした脾臓DCに対する増殖反応によって測定すると、未反応のT細胞のDC依存的活性化を阻害する。Pep-1およびその誘導体はまた、HDK-1 T細胞クローンによる実験においても認められるように、メモリT細胞に対する抗原提示を妨害する。これらの結果は、Pep-1およびその誘導体がHA依存的な二方向の白血球移動を遮断するのみならず、未反応のT細胞（DO11.10）およびメモリT細胞（HDL-1 T細胞クローン）の双方に対するDC依存的抗原提示を妨害することによって、免疫応答を抑制することを示している。さらに、本発明は、Pep-1およびその誘導体が、XS52 DC株、HDK-1 T細胞クローン、およびキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）抗原のような抗原を含む共培養系において、インターフェロン-γ、IL-6、およびTBFαのようなサイトカインの分泌を阻害することを示す。
【００２９】
このように、上記を考慮すると、Pep-1およびその誘導体を含むグリコサミノグリカンのペプチド阻害剤は、免疫細胞によるサイトカインおよび他の調節／エフェクター分子の活性化、分化、増殖、移動、放出の制御を含む、免疫機能の様々な局面に関係している。したがって、グリコサミノグリカンのペプチド阻害剤は、多様な免疫障害における有効な治療物質であろうと企図される。例えば、Pep-1およびその誘導体は、その免疫系抑制能のために、およびより詳しくは白血球の移動の阻止能のために強力な抗炎症分子である。
【００３０】
ここ数年のあいだに、HAの分解産物（すなわち、HA断片）が他の細胞外マトリクス成分の断片（例えば、コラーゲンおよびフィブロネクチン）と同様に、前炎症性メディエータとして作用するという新しい考え方を支持する証拠が蓄積されつつある。本発明者らは、HA断片が、XS52 DC株によるIL-6およびTNFα産生を誘発することを示した。さらに、本発明者らは、Pep-1およびその誘導体を含む本発明のグリコサミノグリカンペプチド阻害剤が、HA断片による刺激後のXS52細胞による双方のサイトカインの産生を有意に遮断することを示した。このように、Pep-1およびその誘導体は、免疫応答を抑制する薬理活性を示す。したがって、本発明者らは、Pep-1およびその誘導体と共に他のグリコサミノグリカン阻害剤を、それを必要とする患者に投与することによって、炎症疾患、自己免疫疾患、移植に関連した移植片対宿主病のような免疫障害の治療方法を企図する。DC細胞株を用いてHA断片の生物活性およびGA代謝を分析する方法も同様に企図される。
【００３１】
本発明者らは、RT-PCR法を用いて、ケラチノサイトにおけるヒアルロニダーゼおよびヒアルロナンシンターゼのmRNAを検出した。HA代謝に関係するいくつかの酵素が、Pam 212ケラチノサイト株によっておよびマウス皮膚において発現されていることが判明した。このことは、ケラチノサイトおよび他の皮膚細胞がおそらく環境刺激に反応してHA断片を生じうることを意味している。このように、本発明者らは、HAおよび局所産生されたHA断片の前炎症活性を中和するために、表面局所治療応用のために本発明のグリコサミノグリカンペプチド阻害剤結合物の薬学的組成物を想定する。ヒアルロナーゼは、この意味において用いられる可能性がある一つのクラスの阻害剤である。HA分解を引き起こす他の物質は、標準的なスクリーニングアッセイ法を用いて同定することができる。
【００３２】
さらに、本発明者らは、HAがT細胞伝達および増殖に関係していること、そして未反応のT細胞を活性化できることを示した。これらの作用は、本発明の分子によって阻害することができ、本発明の分子を利用して広範囲のグリコサミノグリカン関連反応を阻害することができることを示している。
【００３３】
これらの態様のより詳しい考察を以下の頁に提供する。
【００３４】
A．ペプチド
本発明のペプチドは、グリコサミノグリカンまたはその断片に結合して、それによってその機能を調節するペプチドを含む。ペプチドは、アミノ酸残基6〜30個を含むと企図され、化学改変によって形成されたペプチドと共に多量体誘導体が含まれる。本発明はまた、模倣体のようなペプチドの非ペプチド類似体も含む。そのような誘導体および類似体は機能的に活性である、すなわち、グリコサミノグリカンのシグナル伝達に関連した一つまたはそれ以上の機能を阻害することができる。例えば、ペプチド、誘導体、または類似体は、免疫反応を減少させる、炎症反応を予防／減少する、抗原提示細胞-T細胞相互作用を阻害する、白血球の移動を阻害する、および腫瘍の転移を阻害することができる。
【００３５】
さらに、本発明のペプチドの誘導体は、ペプチドシンセサイザーおよび標準的な合成技法を用いて化学合成することができる。例えば、ペプチドは、BocまたはFmoc化学のいずれかを用いて固相支持体（樹脂）上で合成することができる。バッチシンセサイザーおよび連続流シンセサイザーを含む任意のタイプの自動シンセサイザーも用いてもよい。または、手動での合成アプローチを用いて本発明のペプチドを調製してもよい。または、溶液相ペプチド合成法も用いることができる。
【００３６】
一つの態様において、ペプチドは一般式(Z)nX(Y)mのコア配列を有し、式中Xは、任意のアミノ酸、YおよびZはそれぞれ、脂肪族または極性の脂肪族アミノ酸、Xは任意のアミノ酸、ならびにnおよびmは6〜30である。より詳しい態様は、
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であり、式中Xは任意のアミノ酸である。これらの配列に対する付加物は、C-末端またはN-末端のいずれかで伸長配列を含みうる。一つの態様において、この伸長配列は、WpのC-末端伸長部であり、式中Wは任意の塩基性または中性アミノ酸であり、pは3〜13である。もう一つの態様において、伸長配列はグリシン反復配列で構成される。特定の態様において、配列は
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または
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である。特定の態様において、R残基は、アラニンによって置換してもよい。さらなる態様において、サブユニットは配列番号：16または配列番号：17の配列を含む。
【００３７】
本発明はまた、機能的に同等の分子を提供する、置換、付加、または欠失によってコア配列を変化させることによって作製することができるペプチド誘導体を企図する。例えば、企図されるいくつかの置換誘導体には、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、機能的に同等物として作用する類似の極性のもう一つのアミノ酸に置換され、その結果サイレントな変化が起こるペプチドのアミノ酸配列の全てまたは一部を、一次アミノ酸配列として含む誘導体が含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択してもよい。例えば、非極性または疎水性のアミノ酸には、アラニン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。陽性荷電または塩基性アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、陰性荷電または酸性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００３９】
さらに、必要に応じて、非古典的アミノ酸または化学アミノ酸類似体を、置換または付加としてペプチド配列に導入することができる。非古典的なアミノ酸には、一般的アミノ酸のD-異性体、αアミノイソ酪酸、4-アミノ-酪酸、2-アミノ酪酸、γ-アミノ酪酸、ε-6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、β-メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体全般が含まれるがこれらに限定されない。さらに、アミノ酸は、光学異性体のいずれか、D（右旋性）型またはL（左旋性）型となりうる。
【００４０】
本発明のペプチド誘導体および類似体は、当技術分野で既知の様々な方法によって作製することができる。典型的に、塩基性ペプチドは、ペプチドの大きさが人工合成に適しているために合成されるであろう。しかし、当技術分野で既知の多くの任意の戦略も用いて、組み換え型DNA法によってコアペプチドを得てもよい（Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版（1989）、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。配列は、制限エンドヌクレアーゼ（複数）によって適当な部位で切断した後、必要に応じてさらに酵素的改変、単離、およびインビトロでライゲーションすることができる。次に、この産物に化学または酵素的誘導体形成法を行うことができる。
【００４１】
ペプチド配列の化学改変には、グリコシル化、アセチル化（N-末端アセチル化を含む）、カルボキシル化、カルボニル化、リン酸化、PEG化、アミド化、非ペプチド結合の利用（例えば、トランスオレフィン）、α-水素のメチル基への置換、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、環状化、タンパク質分解切断の阻害（例えば、Dアミノ酸を用いて）、抗体分子または他の細胞リガンドとの結合等が含まれる。多数の任意の化学的改変も、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元等による特異的化学切断を含むがこれらに限定されない既知の技術によって行ってもよい。
【００４２】
本明細書において用いられるように、「PEP1」は、配列番号：1と配列類似性または配列同一性を有するポリペプチド、および配列番号：2のような配列番号：1に関連したポリペプチドを含み、ポリペプチドは、配列(Z)nX(Y)mを含み、式中Xは、任意の天然に存在するアミノ酸であり、YおよびZはそれぞれ、脂肪族または極性の脂肪族アミノ酸からなる群より独立して選択され、nおよびmはそれぞれ独立して6〜30の範囲の整数であり、ペプチド多量体は、インサイチューで天然に存在するグリコサミノグリカンと比較して結合親和性Kaが5×105 l/molまたはそれ以上である。PEP1はまた、式ZZZXZZZのポリペプチドを含み、式中Zは脂肪族および極性脂肪族残基からなる群より選択されるアミノ酸であり、Xは、任意のアミノ酸である。サブユニットはさらに、N-またはC-末端伸長部Wpを含んでもよく、式中Wは任意の塩基性または中性アミノ酸であり、pは3〜13までの整数であり、例えばWは独立してアルギニンまたはグリシンである。ペプチドサブユニットはまた、末端のセリンを含んでもよい。特定の態様において、伸長部はC-末端GGGSである。PEP1は、配列番号：1または2に対して少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％の同一性を有しうる、そして約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の同一性を有しうる。配列類似性および配列同一性は参照配列に基づいて計算し、これは長さが少なくともアミノ酸約6個であり、より通常長さが少なくともアミノ酸約10個であり、比較される完全な配列にまで伸長してもよい。一般的に配列同一性のパーセントは、問い合わせ(query)配列と試験(test)配列とのあいだの残基（例えば、ヌクレオチド残基またはアミノ酸残基）のマッチ数を計数して、最も強いアラインメント領域において認められた個々の配列の残基数によってマッチ総数を除することによって計算される。このように、11残基の問い合わせ配列中10残基が試験配列とマッチすれば、上記の同一性のパーセントは、10÷11、または約90.9％となるであろう。BLAST（例えば、Altschulら、J. Mol. Biol. 215：403〜10（1990））、特にMPSRCHプログラム（オックスフォードモレキュラー（Oxford Molecular）社）において実行されているSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムのような、コンピューターに基づく配列分析のアルゴリズムが当技術分野で既知である。本発明の目的に関して。同一性のパーセントを計算する好ましい方法は、以下を用いるSmith-Watermanアルゴリズムである。全体的なDNA配列同一性は、MPSRCHプログラム（オックスフォードモレキュラー（Oxford Molecular）社）において実行されているSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムによって、以下の検索パラメータを用いてアフィンギャップ検索を用いて決定した場合に65％以上でなければならない：ギャップオープンペナルティ12；およびギャップ伸長ペナルティ1。
【００４３】
1．リンカー／カップリング剤／伸長
本発明のペプチド多量体を調製する場合、多様な連結またはカップリング剤を用いてもよい。例えば、個々のペプチドサブユニットを結合させて、選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列のような生物学的に放出可能な結合を用いて多量体を形成することができる。例えば、腫瘍の環境内に選択的に位置する、またはその環境において活性である酵素の切断部位を含むペプチドリンカーが企図される。そのようなペプチドリンカーの例としての形は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第IXa因子、第Xa因子、またはコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、もしくはストロメリシンのようなメタロプロテナーゼによって切断されるリンカーである。
【００４４】
さらに、部分を結合させるために首尾よく用いることができる多数のタイプのジスルフィド結合含有リンカーが既知であるが、特定のリンカーは一般的に、異なる薬理学的特徴および能力に基づいて他のリンカーより好ましい。例えば、立体的に「妨害される」ジスルフィド結合を含むリンカーは、そのインビボでの安定性がより大きく、このように、作用部位での結合の前にその部分の放出を防止することから好ましい。
【００４５】
さらに、例えば抗体抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホアミダイト結合、無水物結合、ジスルフィド結合、イオンおよび疎水性相互作用、双特異的抗体および抗体断片、またはその組み合わせのような、当業者に既知の任意の他の連結／カップリング剤および／またはメカニズムも用いて本発明のペプチドを組み合わせることができる。
【００４６】
クロスリンク剤は、二つの異なる分子、例えば安定化剤と凝固剤の官能基を結合させる分子架橋を形成するために用いられる。しかし、同じ類似体／タンパク質サブユニットの二量体または多量体を作製することができる、または異なる類似体／タンパク質サブユニットを含むヘテロ多量体複合体を作製することができると企図される。二つの異なる化合物を段階的に連結するために、望ましくないホモポリマーの形成を消失させるヘテロ双機能的クロスリンク剤を用いることができる。表1は、ヘテロ双機能的(bifunctional)クロスリンク剤の一覧を提供する。
【００４７】
（表１）ヘテロ双機能クロスリンク剤
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【００４８】
例としてのヘテロ双機能クロスリンカーは、二つの反応基を含む：一つは一級アミン基（例えば、N-ヒドロキシスクシニミド）と反応し、もう一つはチオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲン等）と反応する。一級アミン反応基を通して、クロスリンク剤は、一つのタンパク質（例えば、選択された抗体または断片）のリジン残基（複数）と反応する可能性があり、既に第一のタンパク質に結合しているクロスリンク剤は、チオール反応基を通して他のタンパク質（例えば、選択物質）のシステイン残基（遊離のスルフヒドリル基）と反応する。
【００４９】
血液中で妥当な安定性を有するクロスリンク剤を用いることが好ましい。ターゲティングおよび治療／予防物質を結合させるために首尾よく用いることができる多数のタイプのジスルフィド結合含有リンカーが既知である。立体的に妨害されるジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボでより大きい安定性を生じ、作用部位に達する前にターゲティングペプチドの放出を防止することが判明する可能性がある。このように、これらのリンカーは連結剤の一つのグループである。
【００５０】
もう一つのクロスリンク剤は、SPMTであり、これは隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体的に妨害される」ジスルフィド結合を含む双機能クロスリンク剤である。ジスルフィド結合の立体妨害は、組織および血液中に存在しうるグルタチオンのようなチオレート陰イオンによる攻撃から結合を保護する機能を有し、それによって、結合した物質が標的部位に輸送される前に結合体が脱カップリングすることを防止するために役立つ。
【００５１】
他の多くの既知のクロスリンク剤と同様に、SMPTクロスリンク剤は、システインまたは一級アミン（例えば、リジンのεアミノ基）のSHのような官能基をクロスリンクする能力を与える。可能性があるもう一つのタイプのクロスリンク剤には、スルホスクシニミジル-2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネートのような切断可能なジスルフィド結合を含むヘテロ双機能光反応性フェニルアジドが含まれる。N-ヒドロキシ-スクシニミジル基は一級アミノ基と反応し、フェニルアジド（光分解を受けると）は任意のアミノ酸残基とも非選択的に反応する。
【００５２】
妨害されたクロスリンク剤の他に、非妨害リンカーも同様に本発明において用いることができる。保護されたジスルフィドを含まないまたは生成しないと考えられる他の有用なクロスリンク剤には、SATA、SPDP、および2-イミノチオランが含まれる（Wawrzynczak＆Thorpe、1987）。そのようなクロスリンク剤を用いることは当技術分野で十分に理解されている。もう一つの態様は、柔軟なリンカーを用いることを含む。
【００５３】
米国特許第4,680,338号は、リガンドとアミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質との結合物を作製するために、特にキレート剤、薬剤、酵素、検出可能な標識等と抗体との結合物を形成するために有用な双機能リンカーを記述する。米国特許第5,141,648号および第5,563,250号は、多様なマイルドな条件で切断可能な不安定な結合を含む切断可能な結合物を開示する。このリンカーは、関係する物質をリンカーに直接結合させてもよく、切断によって活性物質が放出されるという点において特に有用である。好ましい使用には、抗体または薬物のようなタンパク質に遊離のアミノまたは遊離のスルフヒドリル基を加えることが含まれる。
【００５４】
米国特許第5,856,456号は、融合タンパク質、例えば一本鎖抗体を作製するためにポリペプチド成分を接続するために用いられるペプチドリンカーを提供する。リンカーは、長さがアミノ酸50個までであり、荷電アミノ酸（好ましくはアルギニンまたはリジン）の後にプロリンが続く配列を少なくとも1回含み、より大きい安定性と凝集の減少を特徴とする。米国特許第5,880,270号は、多様な免疫診断および分離技術において有用なアミノオキシ-含有リンカーを開示する。
【００５５】
これらの他のクロスリンク剤はまた、本発明のペプチドに伸長配列を連結するために用いることができる。例えば、本発明のペプチドの末端、すなわちC-末端および／またはN-末端に伸長ペプチド配列を連結させることができる。このように、任意のペプチド配列またはモチーフも、適した連結剤を用いて本発明のペプチドに連結することができる。
【００５６】
2．化学改変
本発明のペプチド誘導体を得る他の方法は、化学改変を含む。ペプチド組成物は、アミド化、PEG化、グリコシル化、アセチル化、プレニル化、リン酸化、ビオチニル化、カルボキシル化、カルボニル化によって改変することができ、または既知の保護剤／ブロッキング剤の付加によってさらに誘導体化してもよい。これらの化学改変は、当業者に周知の方法によって作製することができる。または、そのような改変を得るために酵素を用いることができる。例えば、リン酸化のために任意のキナーゼ酵素も用いることができ、特にセリン-トレオニンキナーゼ酵素は、セリンまたはトレオニン残基をリン酸化して、チロシンキナーゼは、ペプチドにおけるチロシン残基をリン酸化するために用いてもよい。
【００５７】
非ペプチドリガンドを付加または結合させることによってペプチドを誘導体化することができる。リガンドは、アセトアミド、アセトアセトアミド、アセトアセチル、アセトニル、アセトニリデン、アセチル、アクリル、アジピル、アラニル、βアラニル、アロファノイル、アリル、アリリデン、アミジノ、アミノ、アミル、アニリノ、アニシジノ、アニシル、アントラノイル、アルシノ、アゼラオイル、アジド、アジノ、アゾ、アゾキシ、ベンザル、ベンズアミド、ベンズヒドリル、ベンズイミド、ベンズオキシ、ベンゾイル、ベンジル、ベンズリジン、ベンジリジン(benzyldyne)、ビフェニリル、ビフェニレン、ブロモ、ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ブチリル、カプロイル、カプリル、カプリリル、カバミド(cabmido)、カバモイル、カバミル、カボゾイル、カルベトキシ、カボベンズオキシ、カルボニル、カルボキシ、セチル、クロロ、クロロホルミル、シナミル、シナモイル、シナミリデン、クレシル、クロトキシル、クロチル、シナミド(cynamid)、シアナト、シアノ、デカンジオール、デカノイル、ジアゾ、ジアゾアミン、ジシラニル、ジシロキサノキシ、ジスルフィニル、ジチオ、エナンチル、エポキシ、エテニル、エポキシ、エテニル、エチニル、エチル、エチルチオ、フルオロ、フルオレニル、ホルムアミド、ホルミル、フマロイル、フルフリル、フルフリリデン、フリル、グルタミル、グラリル、グリシジル、グリシンアミド、グリコリル、グリシル、グリオキシリル、グアニジノ、グアニル、ヘプタデカノイル、ヘプタンアミド、ヘプタンジオイル、ヘプタノイル、ヘキサデカノイル、ヘキサメチレン、ヘキサンジオイル、ヒップリル、ヒダントイル、ヒラジノ、ヒドラゾ、ヒドロシナモイル、ヒドロペルオキシ、ヒドロキサミノ、ヒドロキシ、イミノ、インデニル、ヨードソ、イソアミル、イソブテニル、イソブトキシ、イソブチル、イソブチリデン、イソブチリル、イソシアナト、イソシアノ、イソヘキシル、イソロイシル、イソニトロソ、イソペンチル、イソペンチリデン、イソプロペニル、イソプロポキシ、イソプロピル、イソプロピリデン、イソチオシアナト、イソバレリル、ヨード、ケト、ラクチル、ラウロイル、ロイシル、レブリニル、マロニル、マンデリル、メルカプト、メタクリリル、メタリル、メチオニル、メトキシ、メチル、メチレン、メチレンジオキシ、メチレンジスルホニル、メチロル、メチルチオ、ミリスチル、ナフタル、ナフトベンジル、ナフトキシ、ナフチル、ナフチリデン、ネオペンチル、ニトラミノ、ニトロ、ニトロサミノ、ニトロシミノ、ニトロソ、ノナノイル、オレイル、オキサリル、オキサムインド、オキソ、パルミチル、ペラルゴニル、ペンタメチレン、ペンチル、フェナシル、フェナシリデン、フェナンスリル、フェネチル、フェノキシ、フェニル、フェニレン、フェニレンジオキシ、ホスフィノ、ホスフィニル、ホスホ、ホスホノ、フタリル、ピクリル、ピメリル、ピペルジノ、ピペリジル、ピペルノイル、ピバリル、プレニル、プロパルジル、プロペニル、イソプロペニル、プロピオニル、プロポキシ、プロピル、イソプロピル、プロピリデン、ピリジノ、ピリル、サリチル、セレニル、セリル、シロキシ、シ���ル、シリレン、ソルビル、ステアリル、スチリル、スベリル、スクシナミル、スクシニル、スルファミノ、スルファミル、スルファニリル、スルフェノ、スルフヒドリル、スルフィニル、スルホ、スルホニル、テレフタリル、テトラメチレン、テニル、チエニル、チオベンゾイル、チオカルバミル、チオカルボニル、チオカルボキシ、チオシアナト、チオニル、チオフェナシル、チウラム、スロニル、トルイジノ、トルイル、トリル、αトリル、トリレン、αトリレン、トシル、トリアザノ、トリメチレン、トリフェニルメチル、チロシル、ウレイド、バレリル、バリル、ビニル、ビニリデン、キセニル、キシリジノ、キシリル、またはキシリレンリガンドを含んでもよいがこれらに限定されない。
【００５８】
B．グリコサミノグリカンの機能と関連疾患状態
グリコサミノグリカンは、様々な細胞受容体との相互作用に関係していることから、グリコサミノグリカンに結合して調節する物質は、多数の疾患において治療物質として有用である。例えば、HAの細胞受容体の一つであるCD44は、代替スプライシングおよび翻訳後改変によって生成した細胞表面糖タンパク質のファミリーである（Aruffoら、Cell 61：1303〜1313、1990；Lesleyら、Exp. Cell Res. 187：224、1990；Miyakeら、J. Exp. Med 172：69〜75、1990；Cultyら、J. Cell Biol. 111：2765、1990）。CD44の様々なイソ型が、T細胞およびB細胞、顆粒球、単球、マクロファージ、およびLCを含むDCのような異なる細胞タイプによって発現されている。HA-CD44相互作用は、白血球ホーミングにおいて起こる多数のプロセスの一つである内皮細胞上での白血球のローリングを媒介する（DeGrendeleら、J. Exp. Med 183：1119〜1130、1996；Clarkら、J. Cell Bio. 134：1075〜1087、1996）。HA-CD44相互作用はまた、白血球のホーミング、腫瘍の転移、組織発達、造血、サイトカイン産生、T細胞活性化、およびアポトーシスを含む多くの生理的および病理的事象を媒介することが知られている。
【００５９】
このように、本発明のペプチド誘導体の薬理学的処方は、HA-CD44相互作用を調節する治療物質として用いることができ、このようにこの相互作用によって媒介される疾患を有する患者を予防および／または治療するために有用である。調節の性質は、相互作用の阻害または増強のいずれかを含んでもよい。本明細書に提供したペプチド誘導体が有用であると企図される疾患のいくつかには、接触過敏症および遅延型過敏反応（Campら、J. Exp. Med 178：497〜507、1993；Verdrenghら、Scand. J. Immunol. 42：353、1995）、腫瘍の転移（Bartolazziら、J. Exp. Med. 180：53〜66、1994；Guoら、Cancer Res. 54：1561、1994；Zahalkaら、J. Immunol. 154：5345〜5355、1995）、コラーゲン誘発自己免疫関節炎モデル（Verdrenghら、Scand. J. Immunol. 42：353、1995；Mikeczら、Nat. Med. 1：558、1995；Zeidlerら、Autoimmunity 21：245、1995）が含まれる。腫瘍の転移の予防に関連して、本発明者らは、本発明のペプチド、特にPep-1およびその誘導体がマウスの悪性癌モデルにおいて転移を阻害することを示した。
【００６０】
本発明者らはまた、感作相における免疫応答の誘導を予防して、誘発相における炎症反応を阻害するために、HAのペプチド阻害剤を用いることができることを既に証明した。例えば、Mohamadzadehら、J. Invest. Dermatol. 1999は、ケラチノサイトが比較的大量の細胞表面HAを発現し、長期間のLC株であるXS106は、生理的な流動条件でHAコーティングプレートのみならずコンフルエントケラチノサイト単層上で有意なローリングを示すことを示している。このXS106細胞のローリングは、可溶性のHAによって遮断され、可溶性HAをマウスの皮膚に局所注射すると、DNFBの局所適用によって誘発されたLC遊走をほぼ完全に阻害する。このように、本発明のペプチドは、DC遊走のメカニズム、例えばHA（ケラチノサイト上）とCD44（活性化LC上）との相互作用を阻害するために有用である。
【００６１】
CD44の他に、HAはRHAMM、アグリカン、バーシカン、リンクタンパク質、LEC HA受容体、ヒアルロネクション、インターαトリプシン阻害剤関連タンパク質、BEHAB、CD38、CD54、およびヒアルロニダーゼ（HAアーゼ）を含むいくつかの他のリガンドを有する。したがって、本明細書に提供されるグリコサミノグリカンに結合するペプチド誘導体は、これらの受容体分子を通して同様にグリコサミノグリカン媒介活性を増強または阻害するために有用であると考えられる。当業者は、本明細書に提供したペプチド誘導体が、様々な病態において治療物質として有用であること、本発明の範囲が本明細書に言及された疾患および病態に限定されないことを認識するであろう。
【００６２】
C．HAの代謝
Schillerら、J. Biol. Chem. 218：139〜145、1955は、40年前に皮膚におけるHAの限局的代謝回転を初めて研究した。放射活性トレーサーを用いて、これらの研究者たちは、HAの生理的半減期が2〜4日であることを示した。つい最近、FraserおよびLaurent（1989）は、HAの大半が起源となる組織（すなわち局所代謝回転）では分解せずに、分解のために局所リンパ節に輸送されることを示した。リンパ節において分解を逃れたHAは、胸管を通って循環中に入り、そこで主に肝臓によって異化される。3つの酵素反応がHA分解に関与する；すなわちa）ヒアルロニダーゼ（HAアーゼ）、b）β-D-グルクロニダーゼ、およびc）β-N-アセチル-D-ヘキソサミニダーゼ（Rodenら、Ciba Found Symp. 143：60〜76、1989）。今日まで、独自の3つのHAアーゼがヒトにおいて同定されている（Leppendingerら、J. Biol.Chem. 273：22466〜22470、1998；Gmachlら、F.E.B.S. Lett. 336：545〜548、1993）。HAアーゼは、HA多糖類をオリゴ糖に分解するが、β-D-グルクロニダーゼおよびβ-N-アセチル-D-ヘキソサミニダーゼは、オリゴ糖を単糖類（グルクロン酸とN-アセチルグルコサミン）に分解する。グルクロン酸は、一連の酵素反応を通してD-グルコース-6-リン酸に変換される。次に、D-グルコース-6-リン酸は、解糖系に集められる。N-アセチルグルコサミンは、ATP依存的反応においてリン酸化されて、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸を生成する。N-アセチルグルコサミン-6-リン酸は、UDP-N-アセチルグルコサミンまたはフルクトース-6-リン酸に変換される。UDP-N-アセチルグルコサミンは、新たな多糖類合成のための開始材料となるのに対し、フルクトース-6-リン酸は解糖系に入る（Rodenら、Ciba Found Symp. 143：60〜76、1989）。
【００６３】
ヒアルロナンの酵素的分解を直接調節する刺激はなおもわかっていない。しかし、Eliasと共同研究者（Sampsonら、J. Clin. Invest. 90：1492〜1503、1992）は、組み換え型IL-1およびTNFによる刺激後、ヒト肺線維芽細胞においてCD44 mRNAレベルとHA分解のあいだに相関を示した。これらの研究者らは、CD44の発現の増加がHA結合を増強して、HA取り込みを増加させ、その結果分解が起こる可能性があると推測した。
【００６４】
重要なことは、HA異化の産物が生物機能に関係していることである。最近、Nobleと共同研究者は、HA断片が単独またはサイトカインと相乗的に、MIP-1β、MIP-1α、Mig、インターフェロン誘導タンパク質-10、RANTES、サイトカイン反応性遺伝子-2および単球化学遊走タンパク質-1を含むケモカインを生成するようにマクロファージを誘導することを示した（Hortonら、J. Biol. Chem. 273：35088〜35094、1998；McKeeら、J. Clin. Invest. 98：2403〜2413、1996；Hortonら、J. Immunol. 160：3023〜3030、1998；Hodge-Dufourら、J. Immunol. 159：2492〜2500、1997）。HA断片はまた、DCの強力な活性化剤であり、表現型の成熟（MHCクラスII分子、CD80、CD86、およびCD83のアップレギュレーション、およびCD115のダウンレギュレーション）ならびにIL-1β、TNFα、およびIL-12の産生を誘導することが示されている（Termeerら、J. Immunol. 165：1863〜1870、2000）。
【００６５】
新しいHA多糖類の合成はHAシンターゼによって媒介される。HAアーゼと同様に、今日までに3つのシンターゼが同定されている（Itanoら、Biochem. Biophys. Res.Commun. 222：816〜820、1996；Spicerら、J. Biol. Chem. 271：23400〜23406、1996；Spicerら、J. Biol. Chem. 272：8957〜8961、1997；Watanabeら、J. Biol. Chem. 271：22945〜22948、1996）。以下を含む多様な刺激がHA合成を開始することが示されている：a）放射線照射（Liら、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 23：411〜418、2000）、培養条件（Hueyら、Matrix 10：75〜83、1990）、および高圧酸素（Robertsら、Br. J. Dermatol. 131：630〜633、1994）のような環境因子、b）細胞質表面からのHAのHAアーゼ媒介分解（Philipsonら、Biochem. 24：7899〜7906、1985；Larnierら、Biochim. Biophys. Acta 1014：145〜152、1989）およびc）IL-1β、TNFα、PDGF-AA、PDGF-BB、bFGF、EGF、およびTGF-β1を含む様々な因子（Goddenら、Eur. J. Cancer 35：473〜480、1999；Jacobsonら、Biochem. J. 348 Pt 1：29〜35、2000；Kennedyら、J. Pediatr. Surg. 35：874〜879、2000；Uekiら、Biochim. Biophys. Acta 1495：160〜167、2000；Denkら、Curr. Eye. Res. 20：77〜80、2000）。
【００６６】
本発明者らは、ケラチノサイトがHAシンターゼ-2および3と共にHAアーゼ-1、2、および3のmRNAを発現することを証明し、このように、ケラチノサイトがHAを能動的に十分に合成および分解することができることを示している。本発明者らはまた、皮膚にこれらのmRNAsが発現されることを検出し、これはケラチノサイト（およびDCを含む皮膚の他の細胞タイプ）が環境刺激に反応してHA断片をおそらく生じうることを示している。
【００６７】
HA断片は、前炎症性メディエータとして作用することが示されている。さらに、本発明者らは、HA断片がXS52 DC株によるIL-6およびTNFα産生を誘発することを証明した。本発明者らはまた、Pep-1およびその誘導体を含む本発明のグリコサミノグリカンペプチド阻害剤が、HA断片による刺激後のXS52細胞による双方のサイトカインの産生を有意に遮断することを証明した。これらの知見は、とりわけ、本発明のペプチドが、局所的に産生されたHA断片の前炎症性活性を中和できることを利用する治療方法を提供する。
【００６８】
D．治療的利用
本発明のペプチド誘導体は、グリコサミノグリカンの機能に関連した様々なヒトおよび獣医学疾患を治療するための治療および予防物質として用いることができる。ペプチドの特定の活性には、白血球遊走の阻害、白血球活性化の阻害、サイトカイン産生の阻害、リンパ球増殖の阻害、リンパ球分化の阻害、細胞間相互作用の阻害（例えば、抗原提示細胞とT細胞との）、樹状細胞遊走の阻害、免疫反応の減少、樹状細胞遊走の阻害、転移の阻害、またはグリコサミノグリカンおよび／またはその断片に対する結合の阻害が含まれるがこれらに限定されない。これらを適用する場合、本発明のペプチドは、これらの目的を達成するために、単独で、または他の治療物質の併用して用いられるであろうと企図される。
【００６９】
本発明のペプチド誘導体のいくつかは、溶媒の非存在下で可溶性であり、および／または同様に水中で安定に保存される。さらに、多量体ペプチド誘導体のいくつかは特に半減期が増加した。これらの特性によって、それらは治療応用にとって極めて望ましくなる。しかし、他の例において、治療的用途にとってこれらまたは他の望ましい特徴を提供するようにペプチドをさらに改変することが望ましいかも知れない。
【００７０】
治療的に用いる場合、グリコサミノグリカン結合物質の薬学的組成物またはその混合物の適当な用量は、いくつかの十分に確立された任意の方法論によっても決定されるであろう。例えば、キログラム体重あたりの生物活性剤の最大認容量またはMTDを決定するために動物試験が一般的に用いられる。他の毒性および薬動力学プロフィールも同様に決定されるであろう。一般的に、調べる動物種の少なくとも一つは哺乳類である。当業者はヒトを含む他の種に対して、有効性および毒性を回避するために用量を通常外挿する。さらに、治療用量はまた、感染症の重症度および宿主の体格または種のような要因に応じて変更してもよい。
【００７１】
好ましくは、本発明のペプチドを用いて治療してもよい動物宿主には、無脊椎動物、脊椎動物、鳥類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、および特にヒトのような哺乳類が含まれるがこれらに限定されない。
【００７２】
1．炎症状態
本発明のペプチドは、炎症反応に至る多数の事象に関係するため、例えば、白血球の遊走の阻害、白血球活性化の阻害、サイトカイン産生の阻害、リンパ球増殖の阻害、リンパ球分化の阻害、抗原提示細胞とT細胞との相互作用の阻害、および／または樹状細胞遊走の阻害等に関して、これらのペプチドは、炎症の治療および／または予防において有用であると考えられる。例えば、炎症部位に向かう、および炎症部位からの白血球の遊走を阻害する反応は、これらの部位での白血球の蓄積および活性化によって引き起こされる関連する細胞障害を防止する。このように、感染症、自己免疫疾患、移植片対宿主病等を含む多様な炎症疾患を有する患者を、本発明の組成物によって治療してもよい。
【００７３】
感染症には、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、火傷の感染症、創傷感染症等のような、しかしこれらに限定されない全てのタイプの感染症が含まれる。本発明のグリコサミノグリカン特異的ペプチド阻害剤の一つの重要な用途は、HIV感染症の治療、回復、および／または予防である。HIVおよび他の感染性微生物は、細胞に感染するとHA（および他のグリコサミノグリカン）に結合することが知られている。したがって、本発明のペプチドはこれらの相互作用を阻害するために用いることができる。
【００７４】
自己免疫疾患は、非制限的な例として多発性硬化症、リウマチ性関節炎、または全身性紅斑性狼瘡等によって示される。さらに、本発明のペプチドは、骨髄および臓器移植のような技法によって生じる自己免疫性の炎症反応を予防するため、例えば移植片対宿主病を抑制するために有用となる可能性がある。
【００７５】
本発明の抗炎症組成物の投与は、多様な経路によって行ってもよい。例えば、狼瘡の全身治療のために全身、または局所、または限局的な投与；関節炎によって引き起こされた炎症を減少させるために関節への注射；または外部局所感染症のためにクリーム、軟膏、香膏、ゲル等の形での局所適用を行うことができる。または、炎症の標的領域が体内である場合、ペプチド調製物を経口投与によって提供してもよい。さらに、肺の炎症は、非経口投与および吸入治療または鼻腔内投与によってペプチドの適した製剤を肺に直接適用することによって治療してもよい。
【００７６】
これらの炎症状態の他に、脳卒中または心筋梗塞を有する患者に、抗HAペプチドおよびその誘導体を投与してもよい。心筋梗塞を有する患者において、本発明のペプチドは心筋組織に対する圧力の減少を促進、組織の壊死を防止、および浮腫を軽減することができる（MacLeanら、Science 194：199〜200、1976；Opieら、Am. Heart J. 100：531〜52、1980）。心筋梗塞患者の治療にHA活性のペプチド阻害剤を用いることは、ペプチドの活性がHAに対して特異的であり、このようにヘパリンによって阻害されないために、ヒアルロニダーゼ（HAアーゼ）のような治療物質を用いることより都合がよい。ヘパリンはしばしば、心臓発作の際に投与され、このEGFモチーフを含む他のHAアーゼのHAアーゼ活性の非常に強力な阻害剤である。HAのペプチド阻害剤はヘパリンによる調節を受けないために、臨床医は、ヘパリンと抗HAペプチドの同時投与を懸念する必要はない。
【００７７】
HA活性を阻害する本発明のペプチド誘導体はまた、脳腫瘍に関連した、特に多形膠芽腫に関連した浮腫の治療において用いることができる。脳腫瘍に関連した浮腫は、腫瘍に隣接する脳の非癌様部分におけるHAの蓄積が原因である。HA特異的ペプチド阻害剤をヒアルロナン蓄積部位に投与すると（例えば、静脈内注射またはシャントによって）、これらの部位での過剰量のHAに結合してその活性を防止することによって、そのような悪性疾患に関連した浮腫を軽減することができる。このように、HA阻害剤は、腫瘍塊の減少および腫瘍の増殖および／または転移の阻害という点において脳腫瘍の治療に成功しうるのみならず（本発明のペプチドの抗癌特性の考察に関しては下記の章を参照のこと）、悪性疾患に関連した浮腫の軽減においても有用である。
【００７８】
2．複合免疫療法
本発明のグリコサミノグリカン結合阻害剤を含む抗炎症治療は、炎症の治療のために用いられる他の治療と組み合わせて用いることができる。このように、抗炎症剤と併用して本発明のペプチド阻害剤を用いてもよい。抗炎症剤は、炎症の兆候および症状を減少させる物質である。多様な抗炎症剤が当業者に既知である。最も一般的に用いられるものは、プロスタグランジンの産生を阻害することによって作用する非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）である。非制限的な例には、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、サリンダック、セレコキシブ、アスピリン、サブサリチル酸コリン、ジフルニサル、オキサプロジン、ジクロフェナクナトリウム徐放錠、ジクロフェナクカリウム速効錠、エトドラク、ケトロラク、フェノプロフェン、フルビプロフェン、インドメタシン、フェナメート、メクロフェナメート、メフェナム酸、ナブメトン、オキシカム、ピロキシカム、サルサレート、トルメチン、およびサリチル酸マグネシウムが含まれる。他の群の抗炎症薬は、ステロイドに基づく強力な抗炎症剤、例えば、非制限的な例としてデキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロンによって示されるコルチコステロイドを含む。これらの抗炎症薬のいくつかは、周知の商品名で市販されており、例えばイブプロフェンを含むNSAIDには、アドビル、モトリンIB、ヌプリンが含まれる；アセトアミノフェンを含むNSAIDには、タイレノールが含まれる；ナプロキセンを含むNSAIDにはアレベが含まれる。
【００７９】
完全な治癒を得るために、他の抗炎症剤および本発明のペプチドのいずれかを1回以上投与することが、必要であることは想像できる。このように、他の抗炎症剤が「A」であって、本発明の抗グリコサミノグリカンペプチドが「B」である場合、下記の例に示すように様々な組み合わせを用いてもよい：
2004532203.tif 000010
【００８０】
他の組み合わせも同様に企図される。
【００８１】
3．癌治療
本発明者らは、グリコサミノグリカン特異的ペプチド阻害剤（例えば、Pep-1およびその誘導体）と共にグリコサミノグリカン特異的ペプチド誘導体の双方がガンの治療において有用であることを示した。特に、本発明のペプチドは、転移を阻害することが示された。本発明のペプチドは、脳の癌、肺癌、咽頭癌、食道癌、頭頚部癌、皮膚癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、子宮頚癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、血液の癌、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌と共に、HAもしくは他のグリコサミノグリカンレベルの増加に関連した癌、またはグリコサミノグリカン機能の変化に関連した癌の治療において用いられるであろうと企図される。同様に、本発明のペプチドは、通常の放射線療法または化学療法に対して耐性である腫瘍の感受性を増加させる可能性があると企図される。さらに、本発明はまた、ペプチド模倣体を用いることを企図する。
【００８２】
さらに、本発明のもう一つの重要な態様は、グリコサミノグリカンの機能を変化させることによって成功した抗癌作用を初めて提供する。このように、本発明は、グリコサミノグリカンの機能または発現を阻害することができる任意の物質も利用した抗癌治療を想定する。このように、グリコサミノグリカンを阻害する物質をそれを必要とする患者に提供することを含む、HAもしくは他のグリコサミノグリカンのレベルの増加に関連した癌、またはグリコサミノグリカン機能の変化に関連した癌を治療するための療法が提供される。そのような物質には、中でも任意のペプチドまたは非ペプチドグリコサミノグリカン阻害剤が含まれうる。本発明の非ペプチド阻害剤には、任意の生きた生物から単離された産物を含む天然物；人工産物；化学化合物；薬学的化合物；ペプチド模倣体；低分子阻害剤；グリコサミノグリカンの既知の阻害剤から開始した合理的ドラッグデザインによってデザインしてもよい化合物；ポリヌクレオチド；アンチセンス分子；リボザイム；グリコサミノグリカンに対する抗体等が含まれる。
【００８３】
本発明のペプチドおよび非ペプチドグリコサミノグリカン阻害剤は、単独または他の抗癌剤と併用して抗癌治療を提供することが企図される。癌の治療のために、いくつかの癌治療が現在処方されている。これらの治療方法のいくつかに関する考察を下記の章に紹介する。
【００８４】
4．併用癌治療
当業者に既知の多様な癌治療を、本発明の抗癌ペプチドと併用して用いてもよい。このように、本発明のペプチドを用いる抗癌治療の有効性を増加するために、下記に示す癌のようなしかしこれらに限定されない癌の治療において有効な他の物質とこれらの組成物とを併用することが望ましいかも知れない。
【００８５】
例えば、手術および／または放射線療法および／または化学療法、および／または遺伝子治療、および／または局所温熱療法と併用した癌治療のために本発明のグリコサミノグリカンのペプチド阻害剤を用いることができる。他の全ての非ペプチド阻害剤に基づく癌治療は、本明細書において「他の癌治療」と呼ぶ。
【００８６】
他の癌治療は、数分から数日、数週間の間隔をあけてペプチド阻害剤に基づく治療の前または後に行ってもよい。他の癌治療とペプチド阻害剤に基づく治療とを同時に投与する態様において、一般的に、それぞれの輸送時間のあいだに確実に有意な時間が経過しないようにするであろう。そのような場合、双方の様相を互いに約12〜24時間のあいだに患者に投与すること、より好ましくは互いに約6〜12時間、遅延時間が約12時間に過ぎないことが最も好ましいと企図される。しかし、状況によっては、それぞれの投与のあいだに数日（2、3、4、5、6、または7日）から数週間（1、2、3、4、5、6、7、または8週間）経過する場合には、治療期間を有意に延長することが望ましいかもしれない。
【００８７】
同様に、完全な癌の治癒を得るためには、他の癌治療およびペプチド阻害剤に基づく治療のいずれかを1回以上投与することが必要であろうと考えられる。下記に示すように、他の癌治療が「A」であって、ペプチド阻害剤に基づく治療が「B」である様々な組み合わせを用いてもよい：
2004532203.tif 000011
他の組み合わせも同様に企図される。
【００８８】
さらに、ペプチド阻害剤に基づく治療を、例えば標準的なAIDS治療のような他の治療方法と併用して患者に投与することができる。正確な用量および療法は、当業者によって適切に変更することができる。癌治療の例を下記に示す。
【００８９】
a）放射線治療物質
放射線治療物質および要因には、DNA損傷を誘導する放射線および波動、例えば、γ線、X線、UV放射線、マイクロ波、電子放出、放射性同位元素等が含まれる。治療は、上記の型の放射線を局所腫瘍部位に照射することによって行ってもよい。X線の線量範囲は、1日線量50〜200レントゲンを長期間（3〜4週間）照射することから、2000〜6000レントゲンを1回照射することに及ぶ。放射性同位元素の用量範囲は広く異なり、同位元素の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００９０】
b）手術
癌患者の約60％が、何らかのタイプの手術を受け、この中には、予防的、診断または進行期決定、治癒および待期的手術が含まれる。治癒手術には、癌様組織の全てまたは一部を物理的に除去、切除、および／または破壊する切除が含まれる。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを意味する。腫瘍の切除の他に、手術による治療にはレーザー治療、凍結手術、電気外科、および顕微鏡手術（モース外科）が含まれる。本発明は、表層部癌、前癌、または正常組織の随伴量の切除と共に用いてもよいとさらに企図される。癌様細胞、組織または腫瘍の一部または全てを切除すると、体内に腔が形成される可能性がある。治療は、本発明のペプチドのようなさらなる抗癌療法による局所の潅流、直接注射、または局所適用によって行ってもよい。そのような治療は、例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7日ごと、または1、2、3、4、および5週間ごと、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月ごとに繰り返してもよい。これらの治療は同様に用量を変更してもよい。
【００９１】
c）化学療法剤
DNA機能に影響を及ぼす物質は、化学療法剤、例えば、DNAを直接クロスリンクする物質、DNAにインターカレートする物質、および核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体および分裂異常に至る物質として定義される。化学療法剤のいくつかの例には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（ムタマイシンおよび／またはマイトマイシンCとしても知られる）、アクチノマイシンD（ダクチノマイシン）、ブレオマイシン、およびプリコマイシンのような抗生物質化学療法剤；タキソール、ビンクリスチン、およびビンブラスチンのような植物アルカロイド；シスプラチン、VP16、腫瘍壊死因子のようなその他の物質；カルムスチン、メルファラン（アルケラン、L-フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、L-PAM、またはL-サルコリシンとしても知られ、ナイトロジェンマスタードのフェニルアラニン誘導体である）、シクロフォスファミド、クロラムブシル、ブスルファン（ミレランとしても知られる）、ロムスチンのようなアルキル化剤；ならびに他の物質、例えば、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、カンプトテシン、イフォスファミド、ニトロソウレア、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合物質、ゲンシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、およびメソトレキセート、テマゾロミド（DTICの水溶性型）、または前述の任意の類似体もしくは誘導体が含まれる。
【００９２】
d）遺伝子治療
なおもう一つの態様において、他の治療は、本発明のペプチドを投与する前、後、または同時に、治療ポリヌクレオチドを投与する遺伝子治療である。この態様に従って用いられる適当な遺伝子は、腫瘍サプレッサー（p53、Rb、p16）をコードする遺伝子、アンチセンス腫瘍遺伝子（ras、myc、erb）、アポトーシス誘導物質（Bcl-2、Bax）、および他のそのような遺伝子である。
【００９３】
e）他の治療
治療の有効性を改善するために、他の物質を本発明と併用して用いてもよいと企図される。これらのさらなる物質には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびGAP接合部のアップレギュレーションに影響を及ぼす物質、細胞抑制剤および分化誘導剤、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過増殖細胞の感受性を増加させる物質、または他の生体物質が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；ならびに他のサイトカイン；F42Kおよび他のサイトカイン類似体；またはMIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、および他のケモカインが含まれる。他の態様において、細胞抑制または分化誘導剤は、治療の抗過増殖有効性を改善するために本発明と併用して用いることができる。
【００９４】
化学療法、放射線治療、または生物治療と併用して用いるための治療のもう一つの形には、患者の組織を高温（106゜Fまで）に曝露する技法である温熱療法が含まれる。局所、限局的、または全身温熱療法を適用するために外部または内部加熱装置を含んでもよい。局所温熱療法は、腫瘍のような小さい領域に熱を適用することを含む。熱は、体外の装置から腫瘍をターゲティングする高周波波動によって外部で産生されてもよい。内部の熱は、薄い加熱したワイヤもしくは温水を充填した中空管、埋め込み型マイクロ波アンテナ、または高周波電極を含む滅菌プローブを含んでもよい。
【００９５】
患者の臓器または四肢は、限局治療のために加熱し、これは磁石のような高エネルギーを生成する装置を用いて行う。または、患者の血液の一部を採取して加熱してから領域に還流すると内部が加熱される。癌が全身に広がっている場合には、全身の加熱も同様に行ってもよい。温水ブランケット、温ワックス、誘導コイル、および熱室をこの目的のために用いてもよい。
【００９６】
ホルモン治療もまた、本発明と共に、または既に記述した他の癌治療と併用して用いてもよい。ホルモンの利用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頚癌のような特定の癌の治療において、テストステロンまたはエストロゲンのような特定のホルモンのレベルを低下させるまたは作用を遮断するために用いてもよい。この治療はしばしば、治療の選択として、または転移のリスクを減少させるために少なくとも一つの他の癌治療と併用して用いられる。
【００９７】
5．他の治療的利用
HAは卵母細胞に対する精子の結合を媒介することが知られていることから、本発明のペプチドはまた、ある種の避妊としても有用となる可能性がある。そのような結合はHA媒介結合を必要とすることから、HAを阻害するペプチドは、精子と卵母細胞のあいだの結合を阻害する可能性があり、このように、受精を有効に防止して、このように受精卵の形成を有効に防止する。
【００９８】
E．グリコサミノグリカン結合ペプチドを含むターゲティング結合物
他の治療物質を本発明のペプチド誘導体に結合させて、HA断片を特徴とする炎症部位にターゲティングすることは、炎症、癌、または他の免疫疾患の治療介入に本発明のペプチドを用いるもう一つの方法である。物質は、共有結合または放出可能な結合によって結合してもよい。物質が用いられる疾患に応じて、いくつかの異なる治療物質が企図される。癌を治療する場合には、放射性核種または癌化学療法剤を本発明のペプチドに結合してもよい。本発明のペプチドはまた、毒素、例えば、リシンA鎖、コレラ毒素、破傷風毒素等に結合してもよい。または、本発明は、HAレベルを減少させるためにヒアルロニダーゼを用いることを予期する。
【００９９】
他の例において、癌細胞を標的にして破壊するために、免疫エフェクターを本発明のペプチドに結合または連結する免疫治療が企図される。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面上のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であってもよい。抗体単独を治療のエフェクターとして作用してもよく、または細胞障害を実際に行うために他の細胞を動員してもよい。または、エフェクターは、直接または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞障害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【０１００】
さらに、診断物質を本発明のペプチドに結合させて、これを癌細胞にターゲティングしてもよいと企図される。癌の場合、診断物質は、例えば、磁気共鳴画像、X線造影、コンピューター射出断層撮影等によって、腫瘍を造影するために用いられる物質となりうる。磁気共鳴画像（「MRI」）において特に有用な元素には、核磁気スピン共鳴同位元素157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、および56Feが含まれ、ガドリニウムがしばしば好ましい。ガンマシンチレーションカメラまたは検出器を用いて検出してもよいテクネチウム99mまたはインジウム111のような放射活性物質も同様に用いてもよい。本発明において用いるのに適した金属イオンのさらなる例は、123I、131I、131I、97Ru、67Cu、67Ga、125I、68Ga、72As、89Zr、および201TIである。
【０１０１】
炎症疾患の場合、抗炎症反応の増強を得るために、他の任意の抗炎症剤（先の章の例を参照のこと）も結合してもよい。
【０１０２】
F．薬学的調製物および投与様式
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散したグリコサミノグリカンまたはさらなる物質に結合してその機能を調節する一つまたはそれ以上のペプチド誘導体の有効量を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、例えば、適当であればヒトのような動物に投与した場合に、有害な、アレルギー、または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を意味する。本発明の少なくとも一つのペプチド誘導体またはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、マック出版社、1990に例示されるように、本開示に照らして当業者に既知であろう。その上、動物（例えばヒト）に投与する場合、調製物は、FDA生物基準局の要求に応じて滅菌性、発熱原性、全身毒性および純度標準を満たさなければならないと理解されるであろう。
【０１０３】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬剤、薬剤安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、着香料、色素、当業者に既知であろう材料およびその組み合わせが含まれる（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、マック出版社、1990、1289〜1329頁を参照のこと）。任意の慣例的な担体も活性成分と不適合でない限り、治療または薬学的組成物にそれを使用することが企図される。
【０１０４】
本発明のペプチドの薬学的処方は、それが、固体、液体、またはエアロゾル型で投与されるかに応じて、および注射のような投与経路のために滅菌する必要があるか否かに応じて異なるタイプの担体を含んでもよい。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、表面局所、局所、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続的注入、標的細胞の直接局所潅流浴、経カテーテル、経洗浄、クリーム、脂質組成物（例えば、リポソーム）、または当業者に既知であろう他の方法もしくは前述の任意の組み合わせによって投与することができる（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、マック出版社、1990を参照のこと）。
【０１０５】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、疾患の重症度治療すべき疾患のタイプ、これまでのまたは同時治療介入、患者の特発性疾患、および投与経路のような物理的および生理的要因によって決定することができる。投与の責任を有する医師は、任意の事象においても、個々の被験者に関して、組成物中の活性成分（複数）の濃度および適当な用量（複数）を決定するであろう。
【０１０６】
特定の態様において、薬学的組成物は、例えば、活性化合物を少なくとも約0.1％含んでもよい。他の態様において、活性化合物は、単位重量の約2％〜約75％を含んでもよく、または例えば約25％〜約60％、そこで誘導可能な任意の範囲を含んでもよい。他の非制限的な実施例において、用量はまた、投与あたり約1μg/kg体重、約5μg/kg体重、約10μg/kg体重、約50μg/kg体重、約100μg/kg体重、約200μg/kg体重、約350μg/kg体重、約500μg/kg体重、約1 mg/kg体重、約5 mg/kg体重、約10 mg/kg体重、約50 mg/kg体重、約100 mg/kg体重、約200 mg/kg体重、約350 mg/kg体重、約500 mg/kg体重、から約1000 mg/kg体重またはそれ以上、およびそこで誘導可能な任意の範囲を含んでもよい。本明細書に記載した数から誘導可能な範囲の非制限的な例において、上記の数に基づいて約5 mg/kg体重から約100 mg/kg体重、約5 μg/kg体重から約500 mg/kg体重等を投与することができる。
【０１０７】
いずれにせよ、組成物は、一つまたはそれ以上の成分の酸化を遅らせるために様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用の予防は、パラベン（メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサル、またはその組み合わせを含むがこれらに限定されない様々な抗菌剤および抗真菌剤のような保存剤によって得られうる。
【０１０８】
本発明のペプチドは、遊離の塩基、中性、または塩の形に組成物を処方してもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩、例えば、タンパク質様組成物の遊離のアミノ基によって形成された塩、または例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸によって形成された塩、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸のような有機酸によって形成された塩が含まれる。遊離のカルボキシル基によって形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム、もしくは水酸化鉄のような無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインのような有機塩基に由来しうる。
【０１０９】
組成物が液体型である態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）、およびその組み合わせを含むがこれらに限定されない溶媒または分散媒体となりうる。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって；例えば、液体ポリオールまたは脂質のような担体中に分散することによって必要な粒子径を維持することによって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤を用いることによって；またはそのような方法の組み合わせによって維持することができる。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウム、またはその組み合わせのような等張剤を含むことが好ましいであろう。
【０１１０】
他の態様において、本発明において点眼液、点鼻液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤を用いてもよい。そのような組成物は一般的に、標的組織タイプと適合性であるようにデザインされる。非制限的な例において、点鼻液は通常、点鼻液またはスプレーで鼻腔に投与するようにデザインされた水溶液である。点鼻液は、それらが多くの面において鼻の分泌物と類似であるように、正常な毛様体作用が維持されるように調製される。このように、好ましい態様において、点鼻水溶液は通常、pH約5.5〜約6.5を維持するために等張またはわずかに緩衝作用を有する。さらに、必要であれば、眼科用調製物において用いられるものと類似の抗菌保存剤、薬剤、または適当な薬物安定化剤を処方に含めてもよい。例えば、様々な市販の点鼻調製物が既知であり、抗生物質または抗ヒスタミン剤のような薬剤が含まれる。
【０１１１】
特定の態様において、本発明のペプチドは、経口摂取のような経路によって投与するために調製される。これらの態様において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル剤（例えば、硬または軟ゼラチンカプセル）、徐放製剤、口腔内組成物、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェーハ、またはその組み合わせを含んでもよい。経口組成物は、食事の食品に直接組み入れてもよい。経口投与のために好ましい担体は、不活性希釈剤、同化可能な食用担体、またはその組み合わせを含む。本発明の他の局面において、経口組成物は、シロップ剤またはエリキシル剤として調製してもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、例えば、少なくとも一つの活性物質、甘味料、保存剤、着香料、色素、保存剤、またはその組み合わせを含んでもよい。
【０１１２】
特定の好ましい態様において、経口組成物は、一つまたはそれ以上の結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、着香料、およびその組み合わせを含んでもよい。特定の態様において、組成物は以下の一つまたはそれ以上を含んでもよい：例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはその組み合わせのような結合剤；例えば、リン酸カルシウム、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはその組み合わせのような賦形剤；例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸またはその組み合わせのような崩壊剤；例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；例えば、蔗糖、乳糖、サッカリンまたはその組み合わせのような甘味料；例えば、ペパーミント油、ウィンターグリーン油、サクランボ香料、オレンジ香料等のような着香料；または上記の組み合わせ。用量単位剤形がカプセルである場合、上記のタイプの材料の他に、液体担体のような担体を含んでもよい。コーティングとして、または用量単位の物理的形状をそうでなければ修飾するために、他の様々な材料が存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖、または双方によってコーティングしてもよい。
【０１１３】
他の投与様式に適したさらなる剤形には、坐剤が含まれる。坐剤は、通常、直腸、膣、または尿道に挿入するために投薬される様々な重量および形状の固体投与剤形である。挿入後、坐剤は腔の液体中で軟化して、融解または溶解する。一般的に、坐剤の場合、従来の担体には、例えばポリアルキレングリコール、トリグリセリド、またはその組み合わせが含まれてもよい。特定の態様において、坐剤は、例えば、約0.5％〜約10％、好ましくは約1％〜約2％の範囲で活性成分を含む混合物から形成してもよい。
【０１１４】
滅菌注射溶液は、先に列挙した他の様々な成分と共に適当な溶媒中で必要量の活性化合物を組み入れて、必要であればその後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を、基礎分散培地および／または他の成分を含む滅菌容器に入れることによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液、または乳液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、先に濾過滅菌した液体媒体から活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥または凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要であれば、適切に緩衝作用を有しなければならず、液体希釈剤は、十分な生理食塩液またはグルコースと共に注射する前にまず等張にしなければならない。直接注射のための高度濃縮組成物の調製も同様に企図され、溶媒としてDMSOを使用すると、極めて迅速な浸透が得られると想定され、小さい領域に高濃度の活性成分を輸送する。
【０１１５】
組成物は、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。エンドトキシン混入は安全なレベル、例えば0.5 ng/mgタンパク質未満に最少に維持しなければならないと認識されるであろう。
【０１１６】
特定の態様において、注射用組成物の持続的な吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはその組み合わせのような吸収を遅らせる物質を組成物に用いることによって得ることができる。
【０１１７】
G．グリコサミノグリカン代謝を変化させる化合物のスクリーニング
本発明はさらに、グリコサミノグリカン代謝の調節物質を同定する方法を含む。これらのアッセイ法は、候補物質の大きいライブラリをランダムスクリーニングすることを含んでもよい；またはアッセイ法は、それらをグリコサミノグリカン代謝をより調節すると考えられる構造属性に対する眼識で選択した特定のクラスの化合物に集中して用いてもよい。
【０１１８】
代謝によって、グリコサミノグリカン合成、分解、輸送、または結合における変化をアッセイしてもよいと意味される。調節物質を同定するために、一般的に、候補物質の非存在下での代謝と比較して、細胞、組織、臓器、または生物上で候補物質の存在下でのグリコサミノグリカンの代謝を決定し、調節物質は代謝を変化させる任意の物質として定義される。例えば、方法は一般的に以下を含む：候補調節物質を提供する段階；候補調節物質を細胞、組織、または適した実験動物と混合する段階；組織、細胞、または動物におけるグリコサミノグリカン代謝の一つまたはそれ以上の局面を測定する段階；および上記の候補調節物質の非存在下で、段階（c）において測定した局面を細胞、組織、または動物の局面と比較して、局面に差があれば、上記の候補調節物質が、実際にグリコサミノグリカン代謝の調節物質であることが示される段階。アッセイ法はまた、細胞不含系においても同様に行ってもよい。
【０１１９】
当然のこととして、本発明のスクリーニング法は全て、有効な候補物質が認められないという事実にもかかわらず、それ自身有用であると理解されるであろう。本発明は、単にそれらを発見する方法ではなくて、そのような候補物質をスクリーニング方法を提供する。
【０１２０】
1．調節物質
本明細書において用いられるように、「候補物質」という用語は、グリコサミノグリカン代謝を調節する可能性がある任意の分子も意味する。候補物質は、タンパク質もしくはその断片、低分子、または核酸分子でさえあってもよい。最も有用な薬理学的化合物は、グリコサミノグリカン自身に構造的に関連する化合物であることが事実であることが判明するかも知れない。改善された化合物を開発するために役立つリード化合物を用いることは、「合理的なドラッグデザイン」として知られ、これには既知の阻害剤および活性化剤との比較のみならず、標的分子の構造に関する予測が含まれる。
【０１２１】
合理的ドラッグデザインの目標は、生物活性ポリペプチドまたは標的化合物の構造類似体を作製することである。そのような類似体を作製することによって、天然の分子より活性があるか、または安定であって、変化に対して異なる感受性を有する、または様々な他の分子の機能に影響を及ぼす可能性がある薬剤を作製することが可能である。一つのアプローチにおいて、標的分子またはその断片の三次元構造を作製するであろう。これは、X線結晶学、コンピューターモデリング、または双方のアプローチの組み合わせによって行うことができるであろう。
【０１２２】
同様に、標的化合物活性化剤または阻害剤の構造を確認するために抗体を用いることが可能である。原則として、このアプローチはファーマコアを生じ、その後のドラッグデザインはこれに基づくことができる。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製することによって、タンパク質結晶学を全く行わないことも可能である。鏡像のために、抗イディオタイプの結合部位は、当初の抗原の類似体であると予想されるであろう。次に、抗イディオタイプを用いて、化学または生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができるであろう。選択されたペプチドはファーマコアとして役立つであろう。抗イディオタイプは、抗原として抗体を用いて、抗体を産生するために本明細書に記載した方法を用いて作製してもよい。
【０１２３】
一方、有用な化合物の同定を「強力に行う」ための努力において、有用な薬物の基礎的基準を満たすと考えられる低分子ライブラリを、様々な販売元から単純に得てもよい。複合的に作製されたライブラリ（例えば、ペプチドライブラリ）を含むそのようなライブラリのスクリーニングは、大量の関連する（および関連しない）化合物を活性に関してスクリーニングするための迅速かつ有効な方法である。複合アプローチによってまた、活性な、しかしそれ以外は望ましくない化合物をモデルとした第二、第三および第四世代の化合物を作製することによって、可能性がある薬物の迅速な考案を行うことができる。
【０１２４】
候補化合物には、天然に存在する化合物の断片または一部が含まれてもよく、またはそれ以外は不活性である既知の化合物の活性な組み合わせとして認めてもよい。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物起源、ならびに海洋試料のような天然資源から単離された化合物を、有用な可能性がある薬剤の存在に関する候補物質としてアッセイしてもよい。スクリーニングすべき薬剤はまた、化学組成物または合成化合物に由来またはそれらから合成することができると理解されるであろう。このように、本発明によって同定された候補物質は、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子阻害剤、または既知の阻害剤もしくは刺激物質から開始した合理的ドラッグデザインを通してデザインしてもよい他の任意の化合物であってもよいと理解される。
【０１２５】
他の適した調節物質には、そのそれぞれが標的分子に対して特異的であろうアンチセンス分子、リボザイム、および抗体（一本鎖抗体を含む）が含まれる。そのような化合物は、本明細書においてより詳細に記載される。例えば、翻訳もしくは転写開始部位、またはスプライス接合部位に結合したアンチセンス分子は、理想的な候補阻害剤であろう。
【０１２６】
最初に同定された調節化合物の他に、本発明者らはまた、調節物質の構造の重要な部分を模倣するように他の立体的に類似の化合物を形成してもよいと企図する。ペプチド調節物質のペプチド模倣体を含んでもよいそのような化合物は、最初の調節物質と同じように用いてもよい。
【０１２７】
本発明に従う阻害剤は、グリコサミノグリカン産生に対して上流、下流、または直接その阻害または活性化作用を発揮する阻害剤であってもよい。本発明のスクリーニング法によって同定された阻害剤または活性化剤のタイプによらず、そのような化合物による阻害または活性化の作用によって、添加した候補物質の非存在下で認められる場合と比較してグリコサミノグリカン機能の変化が起こる。
【０１２８】
2．インビトロ細胞不含アッセイ法
行うために迅速で安価でかつ容易なアッセイ法はインビトロ細胞不含アッセイ法である。本発明において、細胞不含系は、グリコサミノグリカン産生に至る一つまたはそれ以上の反応を操作可能にするために十分な化合物が含まれることが必要であるに過ぎない。
【０１２９】
3．インサイト（In cyto）アッセイ法
本発明はまた、細胞におけるグリコサミノグリカン代謝を調節する能力に関して化合物をスクリーニングすることを企図する。この目的のために特に操作した細胞を含む様々な細胞株がそのようなスクリーニングアッセイ法のために利用することができる。アッセイ法に応じて培養を必要としてもよい。細胞は、グリコサミノグリカン代謝に関して多数の異なる任意のアッセイ法も用いて調べる。
【０１３０】
4．インビボアッセイ法
インビボアッセイ法は、様々な動物モデルを用いることを含む。その大きさ、取り扱いの容易さ、その生理学に基づく情報および遺伝的構造のために、マウスは好ましい態様である。しかし、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、およびサル（チンパンジー、テナガザル、およびヒヒ）を含む他の動物も同様に適している。調節物質に関するアッセイ法は、これらの任意の種に由来する動物モデルを用いて行ってもよい。
【０１３１】
そのようなアッセイ法において、一つまたはそれ以上の候補物質を動物に投与して、候補物質（複数）によって処置していない類似の動物と比較して、候補物質（複数）が一つまたはそれ以上の特徴を変化させることができれば、調節物質であることが同定される。特徴は、細胞（例えば、増殖、腫瘍形成性、生存）に関して先に考察した如何なる特徴であってもよく、またはその代わりに行動、貧血、免疫応答のようなより広い適応であってもよい。
【０１３２】
これらの動物の試験化合物による処置には、適当な形で化合物を動物に投与することを伴うであろう。投与は、経口、鼻腔、口腔内、または表面局所を含むがこれらに限定されない臨床または非臨床目的のために利用できる任意の経路によっても行われる。または、投与は、気管内注入、気管支注入、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射であってもよい。特に企図される経路は、全身静脈内注射、血液もしくはリンパ供給による局所投与、または罹患部位への直接投与である。
【０１３３】
インビボでの化合物の有効性の決定には、異なる多様な基準を含んでもよい。同様に、毒性および用量反応の測定は、インビトロまたはインサイトアッセイ法より意味のある方法で動物において行うことができる。
【０１３４】
H．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例において開示された技術は、本発明の実践において十分に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、このように実践するために好ましいモデルとなると考えられうることは当業者によって認識されなければならない。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示の特定の態様に多くの変更を行うことができ、それでも同様または類似の結果を生じて、それらも本発明の精神および範囲内に含まれることを認識しなければならない。
【０１３５】
実施例1
Pep-1の化学改変
より高処理量で費用効果の高い誘導体を得るために、Pep-1に化学改変を行った。本発明者らは、有意にその臨床応用性を同様に増強するいくつかの望ましい特性を有する誘導体を発見した。例えば、誘導体は非常に水溶性が高く、溶解するためにさらなる溶媒を必要とせず、グリコサミノグリカン基質（例えば、HA）に対する親和性が高く、および生物学的により有効であった。
【０１３６】
Pep-1二量体の合成
Pep-1二量体は、コハク酸に対して1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの10倍量の存在下で、0.1 N HCl中にコハク酸1モルあたりPep-1 2モルを加えることによって合成して、その後サイズ排除カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０１３７】
Pep-1二量体の特性
Pep-1二量体は、DMSOのような添加溶媒の非存在下で可溶性であり、HA媒介白血球接着を防止するために有意な生物活性を示した。Pep-1二量体処方は溶解性が高いために、治療応用において局所投与するために理想的な選択である。
【０１３８】
Pep-1四量体の合成
Pep-1のPEG結合体とも呼ばれるPep-1四量体は、トリエチルアミンと共にビス(ポリオキシエチレンビス[イミダゾリルカルボニル])にPep-1の10〜20倍過剰量を加えることによって調製した。反応を37℃で5〜7日間進行させる。その後、試薬を空気中で乾燥させて、PBSに再懸濁した。遊離のペプチドをPBSに対する透析によって除去する。または、乾燥させずにSpectra/Por（登録商標）チューブにおいて試薬を直接透析することができる。
【０１３９】
Pep-1四量体の特性
PEG-結合Pep-1によって得られたこのPep-1四量体は、加えた溶媒（例えば、DMSO）の非存在下でなおも可溶性であり、HA媒介白血球接着を防止するために有意な生物活性を示した。PEG-結合Pep-1はまた、HAコーティング基質に対するB16F10黒色腫細胞のインビトロ接着阻害能においてPep-1より少なくとも10倍活性であることが判明した。
【０１４０】
本発明者らは、PEG-結合Pep-1が当初のPep-1と比較して腎臓の濾過およびタンパク質分解消化に対して比較的抵抗性であろうと企図する。このように、PEG結合Pep-1は、全身投与のために理想的な製剤であろうと企図される。
【０１４１】
実施例2
Pep-1と誘導体との比較
Pep-1およびその二量体および四量体誘導体を、インビボで表皮からのハプテン誘発LC遊走を防止できるか否かに関して比較した。DNFB適用前に最初の単量体Pep-1を2カ所局所注射すると、DNFB塗布後24時間で調べたLCの遊走をほぼ完全に阻害した。しかし、LCはその後の時点で（DNFB適用後48および72時間）Pep-1注射した皮膚の部位から遊走し始め、その動態は、ランダムペプチド（RP）注射を行った対照群において認められた動態と同等であった（図3）。これとは著しく対照的に、Pep-1配列のモル濃度に関して同じ濃度の二量体型は、DNFB適用後24および48時間においてLC遊走を有意に阻害した。その上、四量体型は、24および48時間でLC遊走をほぼ完全に防止して、有意な（p＜0.01）阻害は、72時間でも認められた。
【０１４２】
HA媒介細胞接着の阻害を測定した他の試験において、単量体Pep-1は、最適下濃度（150 μM）で、ごく軽度の阻害を示したに過ぎなかった（図2A〜Bを参照）。対照的に、二量体Pep-1および四量体Pep-1は、Pep-1ペプチド配列のモル数に関して同じ濃度で、阻害の有意な改善（p＜0.01）を示し（図2A）、四量体型ではほぼ完全な阻害が得られた（図2B）。このように、Pep-1の多量体誘導体は、Pep-1のインビボ薬理活性の改善の増強を示す。
【０１４３】
実施例3
転移の予防における役割
特定のCD44イソ型の表面発現が多くの癌において認められており、CD44阻害剤は、多くの動物腫瘍モデルにおいて癌の転移を阻害することが示されている。このように、本発明者らは、インビボ注入したB16-F10黒色腫細胞の実験的誘導肺転移に関する十分に確立されたモデルを用いて、HA機能の阻害剤であるPep-1が、腫瘍の転移を阻害することができるか否かを決定した76。
【０１４４】
モデルにおいて、黒色腫細胞およびPep-1（またはランダムペプチド対照もしくはPBS単独）を、同系のC57BL/6マウスに静脈内注射して、肺転移を肉眼的に、そしてマウスの生存を追跡調査することによって調べた。他の研究者による報告として、腫瘍接種の10日後に多数の肉眼的付随体領域が肺に認められた。B16-F10黒色腫細胞と共にPep-1（最初の単量体型）を同時i.v.注射すると、RP対照パネルと比較して肺転移の程度が有意に減少した。その上、Pep-1は、レシピエント動物の生存を有意に延長した（図4A）。一方、Pep-1は、B16-F10黒色腫細胞のインビトロ増殖またはs.c.接種後の動物における局所増殖に対して明白な作用を示さなかった（図4Bおよび図4C）。最後に、B16-F10黒色腫細胞は、HAコーティングプレートに対して著しい接着を示し、この接着相互作用は、Pep-1によって、特に四量体型（図2A〜B）によって効率よく阻害され、それによってPep-1がHA媒介接着および黒色腫細胞の移動を妨害するメカニズムを示した。四つの独立した全ての実験において、Pep-1は常に、黒色腫の転移を阻止して、動物の生存を有意に延長した。したがって、本発明者らは、B16-F10黒色腫細胞株の肺転移がPep-1の同時投与によって阻害できることを証明した。これらの結果は、腫瘍の転移を特異的に防止するためにPep-1のさらなる薬理活性を明らかにした。本発明者らはまた、黒色腫転移に関する動物モデルを用いて多量体Pep-1製剤および他の化学改変したPep-1誘導体の予防的および治療的可能性を調べる予定である。
【０１４５】
実施例4
DC-T細胞相互作用に及ぼすPep-1の影響
抗原特異的相互作用の際に、DCはT細胞に活性化シグナルを輸送し、それによって抗原反応性T細胞の分化およびクローン増殖が起こる。同時に、T細胞は、DCにシグナルを戻し、それによってDCの「最終成熟」が起こる80。この双方向DC-T細胞相互作用に対するPep-1の可能性がある影響を調べるために、本発明者らは、十分に特徴が調べられたインビトロ実験系を用い、この系においてXS52 DCを、抗原（KLH）の存在下でKLH-反応性CD4+ Th1クローンHDK-1と共に培養した81-85。
【０１４６】
Pep-1は、用量依存的にTNFα（XS52およびHDL-1細胞の双方による）、IL-6（双方の細胞タイプによる）、およびインターフェロンγ（HDK-1細胞による）の分泌を阻害することが判明し、500 μg/mlではほぼ完全な阻害を認めた（図7B）。これらの結果は、抗原提示におけるHAのこれまで認識されていないもう一つの機能を報告し、すなわち高分子量HAおよび／またはその分解産物は、抗原特異的DC-T細胞相互作用の際に本質的な刺激シグナルを提供する。重要なことに、本発明はまた、Pep-1のもう一つの薬理活性を明らかにし、これは抗原提示の抑制である。Pep-1はまた、脾臓の樹状細胞による免疫学的に未反応のCD4+ T細胞の活性化も阻害した（図7C）。
【０１４７】
実施例5
HAの分解産物
当技術分野において、HAの分解産物（すなわちHA断片）が、他の細胞外マトリクス成分（例えば、コラーゲンおよびフィブロネクチン）の断片と同様に、前炎症性メディエータとして作用するという新しい概念を支持する証拠が蓄積されつつある。本発明者らは、HA断片がDCからのサイトカイン産生を誘発すること、例えばXS52 DC細胞株によるIL-6およびTNFα産生を誘発することを証明した。さらに、本発明者らは、Pep-1およびその誘導体を含む本発明のグリコサミノグリカンペプチド阻害剤が、HA断片による刺激後にXS52細胞による双方のサイトカインの産生を有意に阻害することを証明した。
【０１４８】
HA分解に及ぼすPep-1の影響を調べるために、本発明者らは、ビオチニル化HAをプレート上に固定して、HAアーゼによって処置した96ウェルに基づくアッセイ法を開発した。次に、ウェルに結合して残っているHAの量を、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを加えることによって決定した（図5A）。Pep-1は、このアッセイ法においてHA基質の分解を行うことができないのに対し、同じ濃度のPep-1は、同時に調製した同じHA基質に対するBW5147細胞の接着を阻害した（図5B）。これは、Pep-1が単にHAに関する非特異的なマスキング試薬として作用するだけではないことを示している。
【０１４９】
HA断片の前炎症性活性に及ぼすPep-1の可能性がある影響を調べるために、低分子量のHA断片を、HAの超音波処理および酵素的消化によって調製し、得られた断片を未成熟なDC株XS52に加えた。本発明のHA断片調製物は、XS52細胞によるIL-6およびTNFαの分泌を誘発した（図5C）。重要なことは、Pep-1は、双方のサイトカインの分泌をほぼ完全に阻害したが、RPは阻害しなかった。これらの結果は、HA断片のDC刺激能を中和することを含むPep-1のさらにもう一つの薬理活性を明らかにした。
【０１５０】
重要な疑問は、上記の知見の生理的重要性に関する。ハプテンを局所適用すると、表皮からのLC遊走のみならずその成熟を誘発することが知られている。このように、局所注射したPep-1がDNFB誘導LC成熟に及ぼす影響を、IA+表皮細胞（すなわちLC）によるCD86の表面発現を調べることによってインサイチューで調べた。溶媒を処置した皮膚から単離したLCは、最小レベルのCD86を発現したのに対し、DNFB処置皮膚からのLCは有意に上昇したCD86発現を示した（図6A）。重要なことは、Pep-1の2回局所注射は、3回の独立した実験においてこのDNFB誘導LC成熟を阻害した（図6Bおよび6C）。これらの結果は、Pep-1がインビボでDCの成熟を防止するために用いることができるという本発明者らの仮説を支持するのみならず、ハプテン適用に反応した表皮区画においてHA分解が起こらなければならないことを意味している。
【０１５１】
実施例6
HAの発現と代謝
上記の実施例に記載した本発明者らの知見は、ケラチノサイトおよびDCが自発的または活性化に伴ってHAを合成および分解できることを示している。3つのHAシンターゼ（I、II、およびIII）および二つのHAアーゼ（IおよびIII）がマウスにおいてクローニングされており、本発明者らは、ESTデータベースからヒトHAアーゼIIのマウス相同体を同定した。RT-PCR実験において、本発明者らは、マウス皮膚においてHAシンターゼ-2および-3、ならびにHAアーゼ-1、-2、および3の構成的mRNA発現を検出した（表2を参照のこと）。同じ酵素に関するPCRシグナルは、Pam 212ケラチノサイト、XS52 DC、XS106 DC、およびNS46線維芽細胞株において検出された。
【０１５２】
表2におけるデータは、RT-PCRの結果を示し、この場合総RNAをBALB/cマウス皮膚または表記の細胞株から単離して、逆転写して、以下のプライマー対を用いてPCRによって表記のmRNAの発現に関して調べた：
HAアーゼ-1に関して
2004532203.tif 000012
および
2004532203.tif 000013
HAアーゼ-2に関して
2004532203.tif 000014
および
2004532203.tif 000015
HAアーゼ-3に関して
2004532203.tif 000016
および
2004532203.tif 000017
HAシンターゼ-1に関して
2004532203.tif 000018
および
2004532203.tif 000019
HAシンターゼ-2に関して
2004532203.tif 000020
および
2004532203.tif 000021
HAシンターゼ-3に関して
2004532203.tif 000022
および
2004532203.tif 000023
。
【０１５３】
HAシンターゼ-1に関してはPCRシグナルを検出しなかった。表2に示すデータは、エチジウムブロマイドで可視化した増幅35サイクル後のPCR産物である。
【０１５４】
ケラチノサイトにおいてヒアルロニダーゼおよびヒアルロナンシンターゼのmRNAが検出されたことは、HA代謝に関係するいくつかの酵素がPam 212ケラチノサイト株によっておよびマウス株において少なくともmRNAレベルで発現されることを証明する。このことは、ケラチノサイト（および皮膚における他の細胞株）が、環境刺激に反応しておそらくHA断片を生じうることを示している。これらの知見はまた、Pep-1の局所適用が、局所的に産生されたHA断片の前炎症活性を中和することを確認する。
【０１５５】
（表２）皮膚における多様な細胞タイプによるHAシンターゼおよびHAアーゼのmRNA発現
2004532203.tif 000024
++  強い発現を示す
+   発現を示す
-   発現なしを示す
【０１５６】
3H-グルコサミンによるXS106 DCの代謝的標識は、ヒアルロニダーゼが最も多く膜に取り込まれることを示した（図8D）。その上、ビオチニル化型のPep-1はXS106 DCの表面に結合した（図8C）。「ランダムペプチド」（RP）と呼ばれる12量体の対照ペプチド（SATPASAPYPLA）は、有意な結合を示さず、Pep-1結合は、DCのヒアルロニダーゼ前処置によってほぼ完全に消失した（図8C）。Pep-1はまた、XS52 DC、脾臓DC、および骨髄由来DCを含む調べた全ての他のDC調製物に結合した（図8D）。XS106 DCをビオチニル化Pep-1またはRPの後にFITC結合ストレプトアビジンおよびPE結合抗CD44 mAbによって二重染色した二重染色実験において、ビオチニル化Pep-1は、細胞体に対する散在性の均一な結合を示したのに対し、フィコエリスリン（PE）結合抗CD44 mAbは、幾分異なる結合プロフィールを示した。
【０１５７】
実施例7
T細胞伝達と増殖におけるHAの機能
DO11.10マウス（BALB/cバックグラウンド）から精製したCD4+ T細胞は、卵白アルブミン（OVA）ペプチド323〜339に対して特異的なトランスジェニックT細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現し、DC上で発現されたHAが、未反応のT細胞を活性化する内因性の能力に対して関与するか否かを調べる独自の機会を提供する。DO11.10 T細胞は、OVA323-329の存在下で脾臓DC（BALB/cマウスから単離した）によって刺激した場合に強い3H-チミジン取り込みを示した（図9A）。対照的に、DCまたは抗原の非存在下では有意な増殖を認めず、DC依存性および抗原特異性を示した。
【０１５８】
HAに特異的に結合してその機能を阻害することが知られているウシプロテオグリカン（bPG）は、DC11.10 T細胞の増殖反応を完全に消失させたのに対し、熱不活化後では阻害能を示さなかった（図9A）。DC依存的抗原特異的T細胞増殖も同様にPep-1によって阻害された（図9B）。Pep-1分子は、Pep-1またはRPの40倍モル過剰量をビス(ポリエチレンビス[イミダゾリルカルボニル])の0.5％トリエチルアミンを含むDMSO溶液と共に7日間インキュベートすることによって、4価のポリエチレングリコール（PEG）誘導体に結合させた。反応を、dH2OまたはPBSに対して十分に透析することによって終了させ、置換の密度をBCAアッセイ法（ペプチド含有量を決定するため）および乾燥重量分析によって推定した。Pep-1/PEGの推定分子比2.3〜2.9を示す得られた調製物は、HAコーティングプレートに対する細胞接着（図2C）と可溶性HAの細胞結合（図9D）との双方の遮断において、最初のPep-1調製物より有意に強力であった。PEG結合Pep-1製剤は、脾臓のDC依存的DO11.10 T細胞増殖を、低濃度（12量体のPep-1配列のモル濃度に関して50〜150 μM）においてもほぼ完全に（80〜100％）阻害した（図9E）。PEG-Pep-1も同様に、骨髄由来DCによって誘発されたDO11.10 T細胞増殖を有効に阻害したがPEG-RPは阻害しなかった（図9F）。抗CD44 mAb（KM81）は、HAコーティングプレートに対するT細胞接着を完全に遮断するために必要な濃度より10倍高い濃度でも、DC誘導T細胞増殖に部分的に影響を及ぼしたに過ぎなかった（図9G）。これは、CD44がDC関連HAに対する唯一の関連する受容体ではないことを示唆している。またはT細胞は、培養プレート上で固定したHA分子に対してDC表面上で発現されたHA部分を認識するために、異なるCD44イソ型を用いる可能性がある。それにもかかわらず、データは、調べたそれぞれの阻害剤によるDC会合HAの遮断によって、DCの内因性のT細胞増殖誘発能が顕著に消失することを示している。
【０１５９】
PEG-Pep-1が細胞死を引き起こすことによってT細胞増殖を阻害するか否かを調べるために、本発明者らは、蛍光色素、5,6-カルボキシ-スクシニミジル-フルオレセインエステル（CSFE）を用いることによってT細胞増殖を調べた。OVA323-339の存在下でDCによって刺激すると、CSFE-標識DO11.10 T細胞は、蛍光強度の著しい減少を示し、その分裂が進行していることを反映した（図10A）。対照的に、抗原の非存在下では有意な分裂活性を認めなかった。3H-チミジン取り込みアッセイ法におけるわれわれの知見と一致して、T細胞分裂は、PEG-Pep-1によって完全に防止されたが、PEG-RPによっては防止されなかった。本発明者らは、ヨウ化プロピジウム（PI）陰性集団内でのCSFEプロフィールを調べたことに注意しなければならない。このように、PEG-Pep-1は、その生存率に影響を及ぼさずにT細胞の増殖を阻害する。PEG-Pep-1は、CD11c+集団内でのPI取り込みによって測定すると、DCの生存率に有意な影響を示さなかった。PEG-Pep-1がDCの全体的なT細胞活性化シグナル輸送能を障害する可能性を調べるために、本発明者らは、T細胞からのサイトカイン放出を測定した。DO11.10 T細胞は、抗原の存在下でDCを刺激した場合に限って、IL-2およびインターフェロン-γ（IFN-γ）の有意な量を分泌した。双方のサイトカインの産生は、PEG-Pep-1によって有効に阻害されたが、PEG-RPによっては阻害されず、抗原特異的DC-T細胞伝達が広く障害されていることを示唆した。PEG-Pep-1が抗原提示の際のDCとT細胞のあいだの接触を物理的に遮断するか否かを調べるために、本発明者らは、DC-T細胞クラスタ形成を調べた。DO11.10 T細胞を、PEG-Pep-1（60μM）、PEG-RP、またはPBS単独の存在下で骨髄由来DCおよび／またはOVA323-329と共に培養した。DO11.10 T細胞は、OVA323-329の存在下で同時培養した16時間後にDCとの比較的大きいクラスタを形成した。対照的に、抗原の非存在下ではごく少数のクラスタを認めたに過ぎなかった。この抗原特異的DC-T細胞クラスタ形成は、PEG-Pep-1によってほぼ完全に遮断されたが、PEG-RPによっては遮断されなかった。このように、DC上に発現されたHA分子は、抗原提示の際のDCとT細胞のあいだの物理的接触の確立およびその後の細胞内伝達を促進する。
【０１６０】
本発明者らは、ホーミング非依存的DC-T細胞相互作用を調べるためのインビボアッセイ法を開発した。この方法は、OVA323-339パルスDCおよびCSFE標識DO11.10 T細胞を腹腔内注射して、腹腔から回収した細胞のCSFEプロフィールを調べることを含む。蛍光強度の有意な減少は、抗原パルスDCを行った動物において検出されたが、PBSパルスDCでは検出されず、新しいアッセイ系の抗原特異性を確認した。PEG-Pep-1を腹腔内投与すると、DO11.10 T細胞の分裂を阻害するように思われたが、PEG-RPは阻害しなかった（図11A）。実際に、PEG-Pep-1処置パネルは、無処置パネルおよびPEG-RP注射を行った第二の対照パネルと比較して、2回の独立した実験において分裂細胞の％の統計学的に有意な減少を示した（図11B）。
【０１６１】
本発明者らは、DCが、HAの合成および分解に関係する様々な酵素に関するmRNAを構成的に発現し、HAを能動的に合成し、新たに合成されたHAを膜分画に選択的に取り込み、そしてその表面上にHAを均一に発現できることを同定した。DC会合HAの機能に関して、CD4+ T細胞のDC依存的抗原特異的増殖は、二つの異なるHA阻害剤（bPGおよびPep-1）によって阻害された。その上、オリゴマーPep-1処方は、抗原特異的DC-T細胞クラスタ形成、T細胞によるDC誘導サイトカイン産生、およびインビボDC-T細胞相互作用をほぼ完全に遮断した。このように、DC上で発現されたHA分子は、抗原提示の際のDCとT細胞との細胞内伝達を媒介することが提唱される。
【０１６２】
実施例8
グリコサミノグリカン媒介反応の阻害剤に関するスクリーニング法
例えば、グリコサミノグリカン、特にHAに結合する他のペプチド、高分子または低分子のような物質は、様々なスクリーニング法を用いて発見することができる。例えば、HAに結合するように処置したビーズまたは他の支持体を、関係する物質と共にプレインキュベートする。一般式(Z)nX(Y)mを含むペプチド、配列番号：1もしくは配列番号：2、一般式(Z)nX(Y)mを含む多量体ペプチド、またはHAに結合する配列番号：15の配列のペプチドを、125Iによって標識してプレインキュベートしたHAコーティングビーズに対する結合に関して50 μg/mlで調べた。ペプチドはボルトン-ハンター試薬を用いてN-末端で放射標識して、4℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを3回洗浄して、結合レベルを検出し、対照実験において検出された結合レベルと比較した。HAに結合する物質は、それらが放射標識ペプチドの結合を阻害することから同定することができ、これによって、対照実験と比較して実験ではより低いレベルの結合が検出された。非標識ペプチドを用いて類似のアッセイ法を行ってもよく、この場合、予めインキュベートした実験試料に対するペプチドの結合が、ペプチドに対する特異的抗体を用いて検出および測定される。
【０１６３】
物質は、さらに、本開示において記述されたプロトコールを用いてHA媒介反応の阻害能に関して評価することができる。
【０１６４】
本明細書において開示および請求した組成物および／または方法は全て、本開示に照らして不当な実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して記述してきたが、本明細書に記載の方法の組成物および／または方法、および段階または段階の順序に変更を加えてもよく、それらも本発明の概念、精神、および範囲に含まれることは当業者に明らかであろう。より詳しく述べると、化学的および生理的に関連する特定の物質を、同じまたは類似の結果が得られる本明細書に記載の物質に置換してもよいことは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念に含まれると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
以下の図面は、本明細書の一部であり、本発明の特定の局面をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書に示した特定の態様の詳細な説明と共に、これらの図面の一つまたはそれ以上を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【図１】（A）35S-標識BW5147胸腺腫細胞を、表記のペプチド（500 μg/ml）によって前処置したHA-コーティングプレート（0.1 μg/ml）上でインキュベートした。示したデータは、1試料あたり4回測定の％結合の平均値+/-S.D.である。（B）FITC結合HA（0.3 μg/ml）を、表記のペプチド（500 μg/ml）と共にプレインキュベートして、BW5147胸腺腫細胞に対する結合に関して調べた。示したデータは、バックグラウンドの自己蛍光レベル（白いヒストグラム）と比較した表記のペプチドの存在下でのFITC結合HAの結合（格子の入ったヒストグラム）である。
【図２】Pep-1二量体および四量体の改善された生物活性。異なる3つのPep-1誘導体を、16量体Pep-1ペプチド配列のモル濃度（150 μM）に関して同じ濃度でその生物活性を比較した。HA-コーティングプレート（0.1 μg/ml）をPep-1（249 μg/ml）、Pep-2二量体（258μg/ml）（A）、またはPep-1四量体（998 μg/ml）（B）によって3時間前処置した。35S-標識B16-F10黒色腫細胞をこれらのプレートに対する結合に関して調べた。示したデータは、1試料あたり4回測定の％結合の平均値+/-S.D.である。星印は統計学的に有意な差を示す（両側のStudentのt-検定による**p＜0.01）。
【図３】ハプテン誘導LC遊走に及ぼす多量体Pep-1誘導体の影響。BALB/cマウスに、0.5％DNFBを両耳に適用する24および3時間前に、表記のPep-1誘導体を右耳に（黒丸）、そして表記のRP誘導体を左耳に、2カ所局所注射した。ペプチドは全て、16量体Pep-1ペプチド配列のモル濃度（24 nmol/注射）に関して同一の用量、すなわち単量体Pep-1およびRPに関しては40 μg/注射/耳、二量体Pep-1およびRPに関しては、41 μg/注射/耳、またはPEG結合四量体Pep-1およびRPに関しては160 μg/ml/注射/耳を投与した。DNFBを塗布した後、表記の時点で耳の皮膚試料を採取して、IA+ LCの表面密度を調べた。示したデータは以下の式を除することによって計算した％LC遊走の平均値+/-S.E.M.（n＝3）である：[(DNFB適用前のLC数−DNFB適用後のLC数)／DNFB適用前のLC数]×100。星印は、Pep-1とRPパネルのあいだの統計学的有意差を示す（両側のStudentのt-検定による**p＜0.01）。
【図４】黒色腫の肺転移に及ぼすPep-1の影響。（A）B16-F10黒色腫細胞を、Pep-1単量体（2または3 mg/ml）（丸）または2％DMSOのみ（三角）を含むPBSに浮遊させた（4×105個/ml）。C57BL/6マウスにこれらの細胞浮遊液（500 μl/マウス）を静脈内注射して、生存を調べた。示したデータは、4回の異なる実験からの累積生存曲線である（Pep-1に関してn＝37、およびPBS対照に関してn＝20）。統計学的有意差（対数順位検定によるp＜0.01）を二つのパネルのあいだに認めた。（B）B16-F10黒色腫細胞（1×105個/動物）をC57BL/6マウスの背部に皮下注射した。Pep-1またはRP（40 μg/注射）を、腫瘍注射後0、3、および6日目に腫瘍接種部位に局所注射した。示したデータは、腫瘍接種後10日目に測定した腫瘍の大きさおよび腫瘍重量の平均値+/-S.E.M.（n＝10）である。（C）B16-F10黒色腫細胞（2×105個/ウェル）をPep-1（黒丸）またはPR（白丸）の表記の濃度の存在下で培養した。示したデータは、24時間での3H-チミジン取り込みの平均値+/-S.E.M.（n＝3）である。
【図５】HA分解産物に及ぼすPep-1の影響。（A）96ウェルプレートにビオチニル化HA（0.1 μg/ml）をコーティングして、Pep-1（白丸）、RP（黒丸）500 μg/ml、またはPBS単独（三角）によって3時間前処置した。次に、これらのプレートをHAアーゼ（ウシ精巣由来）の存在下で30分間インキュベートした。十分に洗浄した後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼを加えた後にp-ニトロフェニルホスフェート基質を加えることによって、プレート上に残っているビオチニル化HAの量を決定した。HA消化の％を吸光度から計算した。示したデータは、双曲線モデルによって分析した1試料あたり3回測定の平均値+/-S.E.M.である。（B）HA消化および細胞接着に及ぼすPep-1の影響を、同時に調製したHAコーティングプレートを用いて平行して実験した。Pep-1、RP、またはPBS単独を上記のHAコーティングプレートに加えて、HAアーゼ媒介HA分解および35S-標識BW5147胸腺腫細胞の接着に及ぼすその影響を比較した。示したデータは、HAアーゼ（左）および％細胞接着（右）の50％阻害用量の平均値+/-S.E.M.（n＝3）である。Pep-1は、細胞接着の有意な阻害（ANOVAによるp＜0.01）を示したが、HA消化は有意に阻害しなかった。（C）低分子量HA断片を、HMW HAの超音波処理後にHAアーゼによって37℃で一晩消化することによって調製した。得られたHA断片（50 μg/ml）を、Pep-1またはRP（500μg/ml）を含むまたは含まない0.5％DMSOを含むRPMI培地において37℃で3時間前処置した後、XS52 DC培養物（5×105個/ml）に加えた。48時間後に採取した細胞上清をELISAによって表記のサイトカインに関して調べた。結果は1試料あたり3回測定の平均値+/-S.E.M.として表記する。
【図６】ハプテン誘導LC成熟に及ぼすPep-1の影響。（A）0.5％DNFBまたは賦形剤単独を局所適用した後17時間でBALB/cマウスから単離した上皮細胞を、FITC結合抗IA mAbおよびPE-結合抗CD86 mAbによって二重染色した。示したデータは、代表的な二色FACSプロフィールであり、DNFB適用後にIA+上皮細胞（すなわち、LC）によるCD86の表面発現が著しく上昇することを示している。（B）BALB/cマウスに、0.5％DNFBを局所適用する24時間前および3時間前に、Pep-1またはRP（40 μg/注射/耳）を皮下に2カ所局所注射して、上皮細胞をLC上でCD86の発現レベルを調べるために17時間後に単離した。示したデータは、代表的な二色FACSプロフィールであり、IA+ LCにおけるDNFB誘導CD86のアップレギュレーションが、局所投与したPep-1によって阻害されることを示している。（C）（B）で示した3つの独立した実験からの％CD86+細胞／IA+ LCのグラフによる表示、丸、三角、および四角はそれぞれの実験において対応する対を示す。バーは、平均値（n＝3）を表し、星印は、Pep-1とRPパネルのあいだの統計学的有意差を示す（マン・ホイトニーU検定による*p＜0.03）。
【図７】抗原提示の際のサイトカイン産生に及ぼす四量体LIPの影響。（A）XS52 DC（0.2×106個/ウェル）をKLH-反応性CD4+ Th1クローンHDK-1（0.2×106個/ウェル）および／またはKLH（100 μg/ml）の存在下または非存在下で培養した。24時間目に採取した培養上清を、ELISAによって表記のサイトカインに関して調べた。示したデータは、1試料あたり3回測定の平均値+/-S.E.M.である。（B）XS52 DCおよびHDK-1 T細胞を表記の濃度のPep-1の存在下でKLHと共に同時培養した。24時間目に採取した細胞上清をELISAによって表記のサイトカインに関して調べた。（C）DO11.10トランスジェニックマウスから単離したCD4+ T細胞（5×104個/ウェル）を、500 μg/ml Pep-1（白丸）、RP（三角）、またはDMSO単独（黒丸）の存在下で、BALB/cマウスから単離した脾臓DCの表記の数およびOVAペプチド（2μg/ml）と共に同時培養した。OVAペプチドの非存在下でのCD4+ T細胞およびDCの同時培養物を対照とした（四角）。培養物は全て、3日目に3H-チミジン取り込みに関して調べた。示したデータは1試料あたり3回測定の平均値+/-S.D.である。
【図８】DCによるHAの合成および表面発現。（B）XS106 DCを3H-グルコサミンによって標識した後、表記の細胞下分画へのヒアルロニダーゼ感受性放射活性の取り込みに関して調べた（平均値+/-S.E.M.；n＝5）。（C）XS106 DCをビオチニル化Pep-1またはRPと共にインキュベートした後、PE結合ストレプトアビジン（格子の入ったヒストグラム）（Mummertら、J. Exp. Med 192：769〜779、2000）、またはウシ精巣ヒアルロニダーゼと共にインキュベートした。PEストレプトアビジン単独による基準値染色レベルを、白いヒストグラムで示す。（D）表記のDC調製物を、ビオチニル化Pep-1（格子）およびRP（白）の結合に関して調べた。脾臓DCおよび骨髄DCに対するペプチドの結合は、CD11c+集団において調べた。ビオチニル化Pep-1の結合は、それぞれのDC調製物においてヒアルロニダーゼ前処置を行った後では有意に消失した（データは示していない）。
【図９】DC会合HAおよびDC依存的T細胞増殖。（A）DO11.10 T細胞を、無傷のbPG（250 μg/ml）、熱変性bPG、またはPBS単独の存在下でγ線照射脾臓DCおよび／またはOVA323-329（2μg/ml）と共に培養した。示したデータは、3H-チミジン取り込みの平均値+/-S.D.（n＝3）である。（B）DO11.10 T細胞をPep-1（300 μM）（白丸）、RP（黒丸）、またはPBS単独（四角）の存在下で表記の数の脾臓DCおよびOVA323-329と共に培養した。（C）Pep-1（白丸）、またはPEG結合Pep-1（白三角）を、HAコーティングプレートに対する35S-標識B16黒色腫の接着の阻害能に関して表記の濃度（12量体Pep-1配列のモル濃度に関して）で比較した（Mummertら、J. Exp. Med 192：769〜779、2000）。非コーティングプレートに対する細胞接着のパーセントは、白四角で示す。RP（黒丸）およびPEG結合RP（黒三角）は対照とした。（D）表記の阻害剤（300 μM）を、BW5147細胞表面に対するFITC標識HAの結合の阻害能に関して比較した（格子の入ったヒストグラム）（Mummertら、J. Exp. Med 192：769〜779、2000）。添加した阻害剤の非存在下での最大結合およびFITC-HAの非存在下での自己蛍光をそれぞれ、実線および破線で示す。（E）Pep-1（白丸）またはPEG-結合Pep-1（白三角）を、脾臓DCによって誘発されるDO11.10 T細胞増殖の阻害能に関して表記の濃度で比較した。（F）DO11.10 T細胞を、PEG-Pep-1（60 μM）（白三角）、PEG-RP（黒三角）、またはPBS単独（白四角）の存在下で表記の数の骨髄由来DCおよびOVA323-329と共に培養した。OVA323-329の非存在下での基準値反応を黒四角で示す。（G）DO11.10 T細胞を表記の濃度の抗CD44 mAb（KM81）（白丸）またはアイソタイプマッチ対照IgG（黒丸）の存在下で、脾臓DCおよびOVA323-329と共に培養した。同じ抗CD44 mAb調製物を平行して、HAコーティングプレートに対する35S-標識T細胞の接着の阻害能に関して調べた（白三角）。この図における全てのデータは、少なくとも2回の独立した実験の代表である。二群を比較するために両側のスチューデントt検定によって、または分散分析（ANOVA）の後に多重比較のためにLSDによって評価した統計学的に有意な差を星印で示す（*p＜0.05、** P＜0.01）。
【図１０】DC会合HAは、抗原提示の際にDC-T細胞伝達を媒介する。（A）CSFE標識DO11.10 T細胞を、PEG-Pep-1（60 μM）、PEG-RP、またはPBS単独の存在下で脾臓DCおよび／またはOVA323-329と共に培養した。示したデータは、PI陰性集団におけるCSFE蛍光プロフィールである。（B）DO11.10 T細胞を、PEG-Pep-1（60 μM）、PEG-RP、またはPBS単独の存在下で脾臓DCおよび／またはOVA323-329と共に培養した。培養上清（24時間）を表記のサイトカインに関してELISAによって調べた。この図において示したデータは全て2回の独立した実験の代表的なものである。
【図１１】PEG-Pep-1によるDC依存的T細胞活性化のインビボ阻害。（AおよびB）CSFE標識DO11.10 T細胞（106個/動物）およびOVA323-329パルスした骨髄DC（3×105個/動物）をBALB/cマウスに腹腔内注射した。これらの動物にはまた、PEG-Pep-1（20 μg/動物）、PEG-Pep-1、またはPBS単独を同時に腹腔内注射した。示したデータは、代表的なCSFE蛍光プロフィールであり、48時間後に腹腔から採取したPI陰性集団内での％分裂細胞（A）および1試料あたり動物3匹からの％分裂細胞の平均値+/-S.E.Mである。この図において示したデータは、2回の独立した動物実験の代表的なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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