(57)【要約】本発明は、ノッチ１レセプターの活性化によって前立腺疾患を緩和する方法に関する。また、ここで提供されるのは、前立腺疾患を検出し診断する方法であり、その特定の疾患は前立腺癌である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノッチ１ポリペプチド又はそのアゴニストの有効量を哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物における前立腺疾患を緩和する方法。
【請求項２】
ノッチ１レセプターとアゴニストを接触させ、それによって前記ノッチ１レセプターを活性化して前立腺細胞の増殖を減じることを含んでなる、前立腺細胞の増殖を低下させる方法。
【請求項３】
接触の段階がインビトロで起こる、請求項２の方法。
【請求項４】
前記アゴニストが抗ノッチ１ポリペプチド抗体である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記アゴニストが抗体断片である、請求項４の方法。
【請求項６】
抗体断片がＦａｂ断片である、請求項４の方法。
【請求項７】
前記アゴニストが可溶性ノッチ１ポリペプチドリガンドである、請求項１の方法。
【請求項８】
前記可溶性ノッチ１ポリペプチドリガンドがＪａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ及びＤｅｌｔａ４で構成される群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
前立腺疾患が前立腺腺癌及び転移性前立腺癌である、請求項１の方法。
【請求項１０】
哺乳動物の前立腺から得た生物学的試料をノッチ１プローブと接触させることを含んでなり、増加したノッチ１ポリペプチドの発現が前立腺癌の存在の兆候である、哺乳動物における前立腺癌を診断する方法。
【請求項１１】
前記ノッチ１プローブが核酸プローブである、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記ノッチ１プローブが抗体プローブである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ノッチ１ポリペプチドを活性化する化合物を同定する方法であって、前記ノッチ１ポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させ、そして前記ノッチ１ポリペプチドの活性化を確かめる前記方法。
【請求項１４】
前記候補化合物が抗ノッチ１抗体を含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記候補化合物がＪａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ、及びＤｅｌｔａ４で構成される群から選択される可溶性ノッチ１リガンドを含む、請求項１３の方法。
【請求項１６】
組成物が哺乳動物の前立腺癌を縮小させるために効果的であり、組成物が前立腺癌を治療するために使用することが可能であることを容器上の標識が示し、及び組成物中の活性剤がノッチ１ポリペプチドを活性化する薬剤である、
容器；
容器上の標識；及び
容器内に含まれる活性剤を含んでなる組成物を含んでなる製造品。
【請求項１７】
ノッチ１ポリペプチドを含有すると思われる試料中の前立腺癌を検出する方法であって、プローブの結合が前記試料中におけるノッチ１ポリペプチドの存在を示す、前記試料をノッチ１プローブと接触させることを含んでなる前記方法。
【請求項１８】
前記試料が前記ノッチ１ポリペプチドを発現すると思われる細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ノッチ１ポリペプチドが検出可能な標識で標識される、又は固体支持層と付着する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、癌細胞の増殖を減じるノッチレセプターシグナル伝達の活性化に関する。
【０００２】
（本発明の背景）
ノッチは、多くのタンデムＥＧＦ様リピートを持つ大きな細胞外ドメインである一本鎖膜貫通ドメインを有する大きなタンパク質をコードする。ノッチレセプターは、細胞の発生と分化で機能するシグナル伝達分子である。このノッチファミリーには、リガンドだけでなくレセプターに関する幾つかのメンバーが含まれる。ノッチレセプターへのリガンドの結合は、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）にあるレセプターの部位における切断を誘導し、その後で核内へ移動する活性化形態のレセプターを遊離する。
男性にとって、前立腺癌は肺癌に次ぐ二番目に最も致死的な癌である。進行した段階で、前立腺癌は骨へ転移する。癌の段階によって、前立腺癌の治療は、次の療法の１つ又は組み合わせを含む：手術によって癌性組織を除く、放射線療法、化学療法、前立腺癌の場合のアンドロゲン欠乏（例えば、ホルモン療法）。ホルモン療法を受ける多くの患者は、アンドロゲン非依存性疾患の発症へと進行する。現在、手術又は放射線療法後に疾患を再発する前立腺癌患者の２０−４０％、或いは診断時に癌が転移していた患者に対する効果的な治療法がない。化学療法には、特に高齢な患者に毒性副作用がある。新しい形態の前立腺癌療法が必要とされている。
本発明は、以下の詳細な説明から明かであろうさらなる利点を提供するだけでなく、これまでの治療法の限界を克服する癌治療の代替方法を提供する。
【０００３】
（本発明の要約）
一実施態様では、本発明は、ノッチレセプターの活性化によって前立腺癌細胞の増殖を低下させる方法に関する。
他の実施態様では、本発明は、前立腺癌と思われる生物学的試料を接触させることによる、前立腺癌の検出、診断及び軽減する方法を提供する。生物学的試料の前立腺癌の検出及び診断には、ノッチ発現のレベルを測定すること、ノッチレセプターへのノッチリガンドの作用、又はノッチレセプターで生物学的試料をプローブすることを含めてもよい。治療には、生物学的試料をノッチ１レセプターに対するアゴニストと接触させること、又は可溶性ノッチリガンドの投与を含めてもよい。
その他の実施態様では、本発明は、むしろ特異的にノッチ１と結合する抗体を提供する。状況に応じて、この抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
【０００４】
本発明のその他の実施態様は、ここで定義されているように、ノッチレセプターのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、このアゴニストは、抗ノッチ１抗体、可溶性ノッチ１リガンド、又は小分子である。
さらにその他の実施態様では、本発明は、ノッチレセプターを候補分子と接触させ、そして前記ノッチレセプターによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含む、ノッチレセプターに対するアゴニストを同定する方法に関する。好ましくは、このノッチレセプターは、天然ノッチレセプターである。
本発明のその他の実施態様は、構成的に活性なノッチレセプター又はそのアゴニストに対して反応性のある症状の治療にとって有用な薬物の調製のための、構成的に活性なノッチレセプター、又はそのアゴニストの用途に関する。
【０００５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、幾つかの側面を包含する。本発明の一側面は、結果としてノッチシグナル伝達の活性化を引き起こすノッチレセプターのアゴニストの投与によって、癌細胞の増殖を阻害又は低下させる方法である。特定の実施態様では、このノッチレセプターはノッチ１であり、この癌は前立腺癌である。本発明のその他の側面は、目的にとって効果的なノッチレセプターの結合パートナーを含む組成物の治療的有効量を患者の必要に応じて投与することによって、ノッチレセプターを発現する癌及び腫瘍細胞を破壊する方法である。本発明のさらなる側面は、ノッチレセプターのアゴニストを投与することによって、癌、特に前立腺癌を軽減する方法である。治療上の用途にとって、ノッチシグナル伝達のアクチベーターは、単独で、或いは、例えばホルモン、抗アンジオゲン、又は放射標識化合物、或いは手術、凍結療法、及び／又は放射線療法との組み合わせで使用できる。
【０００６】
癌細胞、特に前立腺癌細胞を破壊するのに有用なノッチレセプターの結合パートナーには、レセプターの可溶性リガンド、抗体及びその断片、並びにノッチレセプターと結合する小分子が含まれる。この結合パートナーは、細胞傷害剤とコンジュゲートさせることができる。抗体は、好ましくは、内在化及び／又は成長阻害抗体である。細胞傷害剤は、毒素、抗生物質、放射性同位元素又は核酸分解酵素であってよい。好ましい細胞毒性剤は毒素、好ましくは、カリケアマイシン又はメイタンシノイド等の小分子毒素である。
すべての前出の実施態様に含まれる癌は、以下に記載されている。好ましい実施態様では、癌は前立腺癌である。
【０００７】
すべての上の実施態様では、可溶性リガンドには、膜貫通ドメインを欠く未変性又は天然リガンドの切断型、そして、例えば可溶性リガンドがＩｇＧのＦｃ部分と融合しているこれら可溶性リガンドの免疫グロブリン融合物が含まれる。切断の他には、この可溶性リガンドは、天然配列のさらなるアミノ酸変異体を有することができる。天然配列と一致する配列の一部では、この天然リガンドのこれらアミノ酸変異体は、１つ又は複数のアミノ酸変化を有する可能性がある。これらアミノ酸変化は、例えば、インビボで、ノッチレセプターを構成的に活性化する能力、より大きな結合、より長い半減期、そしてより大きな安定性をリガンドに付与することができる。
ノッチレセプターのアゴニスト及び結合パートナーは、合成的に又は組み換え的に産生することが可能であり、そうでなければ単離することが可能である。
【０００８】
本発明は、癌細胞の成長又は増殖を阻害又は低下させるノッチレセプターのアゴニストも提供する。また、提供されているのは、前述の方法での使用にとって効果的なノッチレセプターの１つ又は複数のアゴニストを含む組成物、及び担体である。ノッチレセプターアゴニストには、レセプターの可溶性リガンドを含んでいてレセプターの活性なシグナル伝達形態を生じることができる任意の分子、抗体及びその断片、ノッチレセプターに細胞外から結合するか、又は細胞へ入り細胞内で作用する小分子、並びに活性型を遊離するレセプター切断酵素活性を有する分子が含まれる。好ましい実施態様では、この組成物の抗体は、ヒト化抗体である。好ましい実施態様では、この担体は、医薬的に許容可能な担体である。この組成物は、製造品又はキットとして提供することができる。
【０００９】
本発明のその他の側面は、本発明の内在化又は細胞傷害性抗ノッチレセプター抗体をコードする単離された核酸と同時にその核酸を含むベクターである。ヒトノッチ１ ＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＨＵＭＴＡＮ１を用いて見出すことができる。また、本発明で提供されているのは、上記の抗体を産生する大腸菌及びハイブリドーマを含む細胞である。
「ノッチ」は、ノッチレセプターファミリーのすべてのメンバー、特にノッチ１を含む。
結合ノッチレセプターの他にノッチレセプターの「アゴニスト」は、ノッチレセプターを有する細胞に対して直接的な作用を有する。このノッチレセプターアゴニストは、ノッチレセプターと関連しているシグナル伝達事象を開始又は媒介する上に、例えば、ノッチの細胞内ドメインが切断されて核へ転位すること等が生じ、ノッチレセプターと結合する。ここでは、それは、ＨＥＳ−１として知られている転写レプレッサーの合成を誘導する。ノッチのＥＣＤが切断された形態を試験すると、このＨＥＳ−１プロモーターは強く刺激される。ＨＥＳ−１プロモーターの活性化は、インビトロでアッセイできる。ノッチレセプター活性化は、レポーターコンストラクト、例えばベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）又はルシェフェラーゼ等の当該分野で知られた技術を用いて定量化することができる。
【００１０】
アゴニストのない状況と比較して、癌細胞の増殖は、添加又は投与されたノッチレセプターアゴニスト又はアクチベーターとの接触によってノッチレセプターが活性化する場合に、減少又は停止する。増殖アッセイは、以下に記載されている。
ノッチリガンドは、ジャッグ１（Ｊａｇｇｅｄ１）、ジャッグ２（Ｊａｇｇｅｄ２）、デルタ及びデルタ４を含む。
前立腺癌は、特に、前立腺癌及び関連の転移を含む。
「アミノ酸配列変異体」という用語は、天然配列ポリペプチドと或る程度異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、ノッチレセプターのアミノ酸配列変異体は、天然配列ノッチレセプターと少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有している。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の或る位置において置換、欠失及び／又は挿入を有している。
【００１１】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用する場合は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の夾雑成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を概して妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに十分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれるが、ノッチポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００１２】
ここで使用されている「抗体」（Ａｂ）という用語は、所望する生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここでの「抗体」と相互置き換え可能に用いられる。「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の夾雑成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端又は内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた、還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００１３】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在し得る可能性のある自然発生突然変異を除いて同一である、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに対して「特異的に結合する」抗体、又は「特異的な」抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープと結合するものである。
ここで、モノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、それらの抗体の断片だけでなく、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導されたか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一又は相同であって、その一方でその鎖の残りの部分が他の種から誘導されたか又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： ６８５１−６８５５ ［１９８４］）。ここで対象であるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、Ａｐｅ（ヒトニザル）等）に由来する可変ドメイン抗原−結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「プリマタイズした（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれる。
【００１４】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）： １０５７−１０６２ ［１９９５］）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００１５】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも省略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、このｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成することを可能にする、ＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説としては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５， 以下を参照のこと。
「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、鎖内ではなくて鎖間Ｖドメインを対形成させ、その結果として二価の断片、すなわち２つの抗原−結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間の短いリンカー（約５−１０残基）によりｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することによって調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーである。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開９３／１１１６１号；  及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）にさらに十分に記載されている。
【００１６】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、所望の抗体特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の特性をさらに純化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ ３３２， ３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２， ５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００１７】
「標識」という用語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【００１８】
「エピトープタグ」という用語は、ここで使用される場合、「タグポリペプチド」と融合したポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。このタグポリペプチドは、抗体を作成するエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、十分に短いのでそれが融合するポリペプチドの活性を妨害しない。このタグポリペプチドは、好ましくは、かなり独特でもあるので、抗体は実質的に他のエピトープと交差しない。適切なタグポリペプチドは、概して、少なくとも６つのアミノ酸残基を有し、大抵は約８と５０アミノ酸残基の間である（好ましくは、約１０と２０アミノ酸残基の間）。
ここで使用されるように、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを組み合わせた抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性とアミノ酸配列との融合物（即ち「異種の」）、及び免疫グロブリン定常ドメイン配列を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得てもよい。
【００１９】
「内在化する」抗ノッチレセプター抗体は、哺乳動物細胞の細胞表面ノッチとの結合で、細胞によって取り込まれる（即ち入る）ものである。内在化した抗体には、勿論、抗体断片、ヒト又はヒト化抗体及び抗体コンジュゲートが含まれる。治療的用途として、インビボでの内在化が考慮される。内在化した抗体分子の数は、ノッチ発現癌細胞を死滅させるのに十分又は適切である。抗体又は抗体コンジュゲートの有効性に依存して、幾つかの例では、細胞への単一抗体分子の取り込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある毒素は死滅させるのに非常に有効性があるので、１分子の毒素コンジュゲートの抗体への内在化は、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である。抗体が哺乳動物細胞上の結合ノッチによって内在化するかどうかは、種々のアッセイ、例えば、蛍光又は放射標識抗体を使用した共焦点又は電子顕微鏡検査によって確かめることができる。
【００２０】
ノッチレセプターを発現している癌細胞の成長を阻害する抗体又は「成長阻害性」抗体は、ノッチレセプターを発現又は過剰発現している癌細胞と結合し、結果として測定可能な程の成長阻害を起こすものである。好ましい成長阻害抗ノッチレセプター抗体は、通常は試験されている抗体で処理されていない腫瘍細胞であるコントロールである、適切なコントロールと比較して、２０％より高く、好ましくは約２０％から約５０％、そしてさらにより好ましくは５０％より高く（例えば、約５０％から約１００％）ノッチレセプター発現腫瘍細胞（例えば、前立腺癌細胞）の成長を阻害する。成長阻害は、抗体濃度が約０．１から３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭから２００ｎＭの細胞培養で、腫瘍細胞の抗体への曝露の１−１０日後に測定できる。例えば、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の抗ノッチレセプター抗体の投与が、結果として抗体の最初の投与から約５日から３ヶ月、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞増殖に減少を引き起こしたならば、この抗体はインビボで成長阻害性がある。
【００２１】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は表す。癌の例は、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又は悪性リンパ腫が含まれる。このような癌のより特定な例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平上皮癌）、小細胞型肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓又は腎癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌腫、並びに頭及び頸癌を含む。
【００２２】
「ノッチレセプター発現癌」とは、細胞表面にノッチレセプタータンパク質を表示している細胞を含む癌である。「ノッチレセプター発現癌」は、その細胞の表面に十分なレベルのノッチレセプターを産するので、ノッチレセプターアゴニスト又は抗体はそれに結合し、癌に関して治療的効果を有する。ノッチレセプターを「過剰発現」する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に顕著に高いレベルのノッチレセプターを有するものである。ノッチレセプターの過剰発現は、細胞の表面に存在するノッチレセプタータンパク質の増加したレベルを評価することによる、診断的又は予後的アッセイで確かめ得る（例えば、免疫組織化学アッセイによる；ＦＡＣＳ分析）。或いは、又は付加的に、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開の国際公開９８／４５４７９を参照せよ）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）等のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法によって、細胞内のノッチレセプター−コード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。例えば、抗体ベースアッセイを用いて、血清等の体液中の隠れた抗原を測定することによって、ノッチレセプターの過剰発現を研究してもよい（また、例えば、１９９０年６月１２日に発行の米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開の国際公開９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行の米国特許第５，４０１，６３８号；及びＳｉａｓら． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２： ７３−８０（１９９０）を参照せよ）。前出のアッセイは別として、種々のインビボアッセイが熟練者にとって利用可能である。例えば、患者の体内の細胞を、検出可能な標識、例えば放射活性同位体で状況に応じて標識した抗体へ曝してもよく、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は前もって抗体に曝した患者から取得した生検を分析することによって、抗体の患者の細胞への結合を評価することができる。
【００２３】
「癌の緩和」とは、目的が標的である病理症状又は疾患を予防又は進行を鈍化させる（小さくする）、治療上の処置と事前予防及び予防策の双方を指す。緩和を必要とする者には、疾患の傾向のあるもの又は疾患が予防されるべき者だけでなく、すでに疾患に罹っているものを含む。本発明の方法に従ってノッチレセプターアゴニストの治療的有効量を与えられた後に、患者が次において、又は次の１つ又は複数の非存在下で観察可能及び／又は測定可能な減少を示す場合、被検体又は哺乳動物はノッチレセプター発現癌に関しては「緩和」している：癌細胞の数の減少又は癌細胞が存在しない；腫瘍の大きさの減少；末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（即ち、ある程度の鈍化及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（即ち、ある程度の鈍化及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；１つ又は複数の特定の癌に関連する症状、並びに減少した羅患率及び死亡率の及び／又はある程度の軽減。ある程度、ノッチレセプターアゴニスト又は抗体は、生存する癌細胞の成長及び／又は死滅を防ぐことができ、それは細胞抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。これら兆候の減少は、患者も感じる。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【００２４】
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメーターは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。前立腺癌にとっては、治療の進歩は日常的方法、大抵は血清ＰＳＡ（前立腺特性抗原）のレベルを測定することによって評価できる；血液中のＰＳＡのレベルがより高ければ、癌はさらに大きい。ＰＳＡを検出するための商業用アッセイは入手可能であり、例えば、ハイブリテックＴａｎｄｅｍ−Ｅ及びＴａｎｄｅｍ−Ｒ ＰＳＡアッセイキット、Ｙａｎｇ ＰｒｏｓＣｈｅｃｋポリクローナルアッセイ（Ｙａｎｇ Ｌａｂｓ，ベルビュー，ワシントン）、Ａｂｂｏｔｔ Ｉｍｘ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，アボットパーク，イリノイ）等がある。転移は、ステージング検査によって、並びにボーンスキャン及び骨への広がりを確かめるカルシウムレベルと他の酵素の検査によって確かめることができる。領域の骨盤及びリンパ節への広がりを調べるために、ＣＴスキャンもおこなうことができる。既知の方法による胸のＸ線及び肝臓の酵素レベルの測定を用いて、肺及び肝臓それぞれへの転移を調べる。疾患をモニタリングする他の常套的方法には、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が含まれる。
【００２５】
「治療的有効量」という用語は、被検体又は哺乳類の疾病や疾患を「緩和」するのに有効なアゴニスト、アンタゴニスト又は薬剤の量に相当する。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害（すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害（すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。前出の「緩和すること」の定義を参照せよ。ある程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞傷害性である。
１つ又は複数のさらなる治療薬との「組み合わせ」投与とは、同時（併用）及び任意の順序による連続投与を含む。
【００２６】
ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸バッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００２７】
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ここで用いられる「細胞傷害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を称する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカノイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブチル、ダウノルビシン又は他のインターカレート剤、酵素及びそれらの断片、例えば核分解性酵素、抗体、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素小分子毒素、それらの断片及び／又は変異体、及び以下に開示した種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含む。他の細胞傷害剤を以下に記載する。
【００２８】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、細胞、特にノッチレセプター発現癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。よって、成長阻害剤とは、Ｓ期におけるノッチレセプター発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤（Ｓ期以外の場所において）、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−ＣがＳ期停止に波及する。更なる情報は、Ｍｕｒａｋａｍｉらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬」と題された、ガンの分子的基礎、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ編、第１章（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）、特に１３頁に見出すことができる。
【００２９】
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
「単離された核酸」は、自然に天然配列をともなう、他のゲノムＤＮＡ配列並びにタンパク質又は複合体、例えばリボソーム及びポリメラーゼから実質的に分離された、核酸、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマーである。この用語には、その自然に生じる環境から取り出された核酸配列が含まれ、組換え又はクローンされたＤＮＡ単離物、及び化学的に合成された類似体、又は異種系から生化学的に合成された類似体も含まれる。実質的に純粋な分子には分子の単離された形態が含まれる。
【００３０】
「ベクター」にはシャトル及び発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミドコンストラクトは、細菌でのプラスミドの複製と選択それぞれのための複製開始点（例えばＣｏｌＥ１複製起点）及び選択可能マーカー（例えばアンピシリン又はテトラサイクリン耐性）を含む。「発現ベクター」とは、細菌又は真核生物細胞において、本発明の抗体断片を含む抗体の発現に必要な調節エレメントを含むベクターを意味する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ノッチポリペプチド又はその抗体など）の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列されている。
【００３１】
本発明のノッチレセプターアゴニスト及び前立腺癌細胞成長阻害抗体は、種々の非治療上の用途も有する。前立腺癌をスクリーニング又は診断することへのＰＳＡの利用が議論の的であるという事実を考えると、本発明のアゴニスト及び抗体は、ノッチ発現癌の診断及びステージングにとって有用である可能性がある（例えば、ラジオイメージング）。抗体は、他の細胞の精製段階として、混合細胞集団からノッチ発現細胞を死滅及び除去するための、細胞からのノッチの精製又は免疫沈降にとって、インビトロでのノッチの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにとっても有用である。
ノッチレセプターアゴニスト及び抗体は、異種ポリペプチド配列と融合させることができる。この抗体をＦｃ領域で修飾して、所望するエフェクター機能を提供することができる。下のセクションでさらに詳しく論じているように、適切なＦｃ領域によって、細胞表面に結合した裸抗体は、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して、又は補体依存性細胞傷害性の補体を補充することによって、細胞傷害性、又は幾つかの他の機構を誘導することができる。
【００３２】
このノッチレセプターアゴニスト及び抗体は、哺乳動物において、ノッチレセプター発現癌を治療すること、或いは癌の１つ又は複数の症状を軽減することにとって有用である。そのような癌には、前立腺癌及び白血病が含まれる。この抗体は、少なくとも、哺乳動物においてノッチレセプターを発現している癌細胞の一部分を結合することができ、好ましくは、ＨＡＭＡ反応性を誘導しないか又は最小にするものである（ヒト抗−マウス抗体）。好ましい実施態様では、この抗体は、インビトロ又はインビボで、細胞上のノッチレセプターと結合することで、ノッチレセプター発現腫瘍細胞を破壊又は死滅させるのに、又はそのような腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効である。このような抗体には、裸抗ノッチレセプター抗体（どんな薬剤ともコンジュゲートしない）が含まれる。細胞傷害性又は細胞成長特性を有する裸抗体は、さらに細胞傷害剤とともに利用され、それらに腫瘍細胞破壊に関するよりさらなる効力を付与することができる。例えば、抗体を細胞傷害剤とコンジュゲートさせて、下記のように免疫コンジュゲートを形成させて、細胞傷害特性を抗ノッチレセプター抗体に付与することができる。この細胞傷害剤又は成長阻害剤は、好ましくは小分子である。毒素、例えば、カリケアマイシン又はメイタンシノイド、そしてその類似体又は誘導体が好まれる。
【００３３】
ＩＩ．抗ノッチ１抗体の産生
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより、動物で産生される。それは、免疫化されるべき種で免疫原性であるタンパク質と関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターと、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する抱合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する抱合）、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
【００３４】
例えば、１００μｇ又は５μｇのタンパク質又はコンジュゲート（それぞれウサギ又はマウスの場合）を３容量の完全フロイントアジュバントと混合し、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、動物を抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、この動物を、完全フロイントアジュバントの初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートで複数部位に皮下注射することにで追加免疫する。７ないし１４日後にこの動物を採血し、その血清を抗体価について検定する。力価がプラトーに達するまで、動物を追加免疫する。コンジュゲートは、組換え細胞培養でタンパク融合として調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤を適切に使用して免疫反応を増強する。
【００３５】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）を利用して作成することができる。
ハイブリドーマ法では、ハムスター等のマウス又はその他の適切な宿主動物を上記のようにして免疫し、免疫化に用いたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することのできるリンパ球を誘発する。別法として、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。
【００３６】
好ましくは融合していない親の骨髄腫細胞（融合パートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する１つ又は複数の物質を含む適切な培地に、このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を蒔いて増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いてるならば、ハイブリドーマのための選択培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。
【００３７】
好ましい融合パートナーである骨髄腫細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支え、未融合親細胞を選別する選択培地に対して感受性のある細胞である。好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、アメリカ合衆国より入手することができるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、アメリカ合衆国より入手することができるＳＰ−２及び誘導株、例えばＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３頁、（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。
【００３８】
ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、或いはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０（１９８０）に記載のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が一度同定されると、限界希釈法によりそのクローンをサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。この目的のために適した培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらには、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
【００３９】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ−セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞へ後にトランスフェクトする発現ベクターへこのＤＮＡを挿入し、その組換え宿主細胞でモノクローナル抗体の合成を得てもよい。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説には、Ｓｋｅｒｒａら．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖｓ． １３０： １５１−１８８（１９９２）が含まれる。
【００４０】
更なる実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４ （１９９０）に記載の技術を用いて産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８ （１９９１）及び Ｍａｒｋｓら， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７ （１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリを用いたマウス及びヒト抗体の分離について説明している。その後の刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９−７８３［１９９２］）、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら， Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．， ２１：２２６５−２２６６［１９９３］）について説明している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な代替法である。
【００４１】
例えば、相同的なマウス配列をヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：６８５１［１９８４］）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全部又は一部を共有結合させることによって、抗体をコードするＤＮＡを修飾することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、或いは抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００４２】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野で説明されている。好ましくは、ヒト化抗体には、非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することによりウィンターと共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓほか， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎほか， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎほか， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を用いて実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの高頻度可変領域残基、そしておそらくはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位の残基によって置換されているヒト抗体である。
【００４３】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応（ヒト抗−マウス抗体）を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓほか， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２２９６ （１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１（１９８７））。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる（Ｃａｒｔｅｒほか， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５ （１９９２）；Ｐｒｅｓｔａほか， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２６２３（１９９３））。
【００４４】
更に、抗原に対する高い結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持して抗体をヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基にありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗ノッチレセプター抗体の種々の形態が考えられる。例えば，このヒト化抗体は、免疫コンジュゲートを生成するために１つ又は複数の細胞傷害剤（類）と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。あるいは、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
【００４５】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０：２５５１ （１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８ （１９９３）； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．， ７：３３ （１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、同５，５６９，８２５号、同５，５９１，６６９号（全てＧｅｎＰｈａｒｍ）；同５，５４５，８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【００４６】
別法として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３［１９９０］）を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インヴィトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン−フレームをクローンし、ファージ粒子の表面において機能的抗体断片として表示される。繊維状粒子がファージゲノムの単一ストランドのＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばＪｏｈｎｓｏｎ， Ｋｅｖｉｎ Ｓ． 及びＣｈｉｓｗｅｌｌ， Ｄａｖｉｄ Ｊ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Ｃｌａｃｋｓｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗−オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原（自己抗原を含む）とは異なる配列の抗体を、Ｍａｒｋｓら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７（１９９１）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈら， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４（１９９３）に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号及び同５，５７３，９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインヴィトロ活性化Ｂ細胞により生産することができる（米国特許第５，５６７，６１０号及び同５，２２９，２７５号）。
【００４７】
（ｖ）抗体断片
ある状況においては、全抗体よりも抗体断片を使用する方が有利である。断片のサイズが小さいと迅速にクリアランスされ、固形腫瘍へのアクセス性が改善される。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７ （１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかし、これらの断片は，現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、全て大腸菌中で発現し、そこから分泌されて、多量のこれら断片が容易に生成される。抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリから分離することができる。別法として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７［１９９２］）。他のアプローチ法では、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有し、インヴィボ半減期が増大したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を生産するための他の技術は、当業者には明らかである。他の実施態様において、選択された抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは定常領域を欠く無傷の結合部位を有する唯一の種であり；よってインヴィボ使用に際して非特異的結合の減少に適している。ｓＦｖ融合タンパク質が構成されて、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかにエフェクタータンパク質の融合体が生成される。上掲のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｅｄ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
【００４８】
（ｖｉ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ノッチレセプタータンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では、ノッチレセプター結合部位と他のタンパク質に対する結合部位とが結合し得る。あるいは、抗ノッチレセプターアームは、ノッチレセプター−発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子（例えばＣＤ３）等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合し得る。二重特異性抗体はノッチレセプターを発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用され得る。これらの抗体は、ノッチレセプター結合アーム、及び細胞傷害剤（例えば、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン）と結合するアームを有する。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【００４９】
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５，８３７，２３４号には、二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／Ｆｃγ抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＣＤ３抗体を教示するものである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、二つの鎖は異なる特異性を持っている二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ． １０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【００５０】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性がもたらされる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００５１】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００５２】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合し、他方はビオチンに結合できる。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号）。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は、幾つかの架橋技術と共に当該分野において良く知られており、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１ （１９８５） は、無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、次にメルカプトエチルアミンによる還元でＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作成した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００５３】
最近の進歩によって、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接の回収が容易となっており、それを化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造について説明している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から個別に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００５４】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて生成されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの生産にも用いることができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）に記載の「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作成するための別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによってＶＬと結合しているＶＨを含む。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成し、それによって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって、二重特異性抗体断片を製造する他の方策も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８ （１９９４）を参照されたい。
【００５５】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）。
抗体の半減期を高めるために、例えば，米国特許第５，７３９，２７７号に記載のようなサルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体断片）へ導入してもよい。ここで用いられるように、「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を高める役割を担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【００５６】
（ｖｉｉｉ）所望する特性を有する抗体のスクリーニング
抗体を生成する技術を、上記にて記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体をさらに選択することができる。本発明の抗−ノッチレセプター抗体の成長阻害効果を、例えば、内因的又はノッチレセプター遺伝子によるトランスフェクション後のいずれかでノッチレセプターを発現する細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びノッチレセプタートランスフェクト細胞は、数日間（例えば、２−７）、種々の濃度の本発明の抗−ノッチレセプターモノクローナル抗体で処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色、又は幾つかの他の比色アッセイによって分析し得る。増殖を測定するその他の方法は、本発明の抗−ノッチレセプター抗体の存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ−チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、選択した細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体でその細胞株を処理することが含まれる。好ましくは、ノッチレセプターアゴニストは、約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、より好ましくは約３０−１００％、そしてさらにより好ましくは約５０−１００％又は７０−１００％のノッチレセプター発現腫瘍細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害する。成長阻害は、細胞培養で、約０．５から３０μｇ／ｍｌ又は０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、その成長阻害は、抗体への腫瘍細胞の曝露後１−１０日で確かめられる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の抗−ノッチレセプター抗体の投与が、抗体の最初の投与から約５日から３ヶ月、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍の大きさの減少又は腫瘍細胞増殖の減少を引き起こすならば、抗体はインビボで成長阻害作用がある。
【００５７】
メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明の抗ノッチレセプター抗体（全長又は断片）は、１つ又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから単離されたものである（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４，１３７，２３０号；同４，２４８，８７０号；同４，２５６，７４６号；同４，２６０，６０８号；同４，２６５，８１４号；同４，２９４，７５７号；同４，３０７，０１６号；同４，３０８，２６８号；同４，３０８，２６９号；同４，３０９，４２８号；同４，３１３，９４６号；同４，３１５，９２９号；同４，３１７，８２１号；同４，３２２，３４８号；同４，３３１，５９８号；同４，３６１，６５０号；同４，３６４，８６６号；同４，４２４，２１９号；同４，４５０，２５４号；同４，３６２，６６３号；及び同４，３７１，５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
本発明は、抗体と核分解活性（例えば、リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）を有する化合物との間で形成された免疫コンジュゲートをさらに考慮する。
【００５８】
腫瘍を選択的に破壊するために、抗体はより高度な放射性原子を含有してよい。放射コンジュゲート抗ノッチレセプター抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３を再び、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射−又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりに、例えばフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８０：４９−５７）は、ヨウ素−１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）に記載されている。
【００５９】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン−トリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチターゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）。
【００６０】
別法として、抗−ノッチレセプター抗体及び細胞傷害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体−レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いてキレート剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞傷害剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートする「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【００６１】
（ｘ）抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法（ＡＤＥＰＴ）
また、本発明の抗体は、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号を参照）を活性抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開第８８／０７３７８号及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
【００６２】
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌剤５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７−４５８［１９８７］を参照）。抗体−アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００６３】
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗−ノッチレセプター抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８［１９８４］）。
【００６４】
（ｘｉ）他の抗体の修飾
抗体の他の修飾をここで考察する。例えば、抗体は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。また抗体は、例えばコロイド状薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）、又はマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセル）に捕捉されている。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｌｏ Ａ．編 （１９８０）に開示されている。
【００６５】
（ｉｘ）抗ノッチレセプター抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体を、細胞膜周辺腔において細胞内生産、又は培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内生産されるときは、第一工程として、宿主細胞であれ溶解断片であれ、粒状細片を、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順が記載されている。簡単には、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分以上かけて溶かす。細胞屑は遠心分離により除去可能である。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、好ましくは、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン又はミリポアペリコン限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターを、タンパク分解を阻害するために先の工程の何れかで含めてもよく、また抗生物質を外来性汚染物の成長を防ぐために含めてもよい。
【００６６】
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好適な精製法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡはヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３［１９８３］）。プロテインＧが全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら， ＥＭＢＯ Ｊ． ５：１５６７−１５７５［１９８６］）。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用することができる。調整穴あきガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのように機械的に安定なマトリックスを使用すれば、アガロースの場合よりも速い流速と短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、ベイカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）ＡＢＸ（商品名）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ， ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商品名））によるクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿のような他のタンパク質精製技術も、回収しようとする抗体によっては利用できる。
前段階の精製工程に続いて、関心ある抗体と汚染物質を含有する混合物を、約２．５−４．５のｐＨで溶離バッファーを使用し、好ましくは低い塩分濃度（例えば、約０−０．２５Ｍの塩）で低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてもよい。
【００６７】
ＩＩＩ．医薬製剤
本発明の抗体の治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ抗体を凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ 版， Ｏｓｏｌ， Ａ． 編． ［１９８０］）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸塩、トリス、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウム等の緊張剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ポリソルベート等の界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、好ましくは、５−２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０−１００ｍｇ／ｍｌの間のの濃度の抗体を含む。
【００６８】
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な複数の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、内在化する抗ノッチレセプター抗体の他に、１つの製剤に付加的な抗体、例えば、ノッチレセプター上の異なるエピトープと結合する二番目の抗ノッチレセプター抗体、又は幾つかの他の標的、例えば特定の癌の生育に作用する成長因子に対する抗体を含むことが所望され得る。あるいは、又は付加的に、この組成物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は保護剤をさらに含んでもよい。このような分子は、意図する目的にとって効果のある量での組み合わせで適切に存在する。
【００６９】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に開示されている。
【００７０】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−（−）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。
【００７１】
インビボ投与に用いる製剤は無菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
特定の一実施態様では、細胞傷害剤に結合した抗ノッチレセプター抗体を含有する免疫コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、ノッチレセプタータンパク質に結合した免疫コンジュゲートは細胞によりインターナライズし、結果として、それが結合した癌細胞の殺傷性における免疫コンジュゲートの治療的効果が向上する。好ましい実施態様では、細胞傷害剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞傷害剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
【００７２】
抗ノッチレセプター抗体又は免疫コンジュゲートは、公知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。
他の治療計画を抗−ノッチレセプター抗体の投与と組合せてもよい。この組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方（又は全ての）活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間があるいずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
また、特定の癌に関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗−ノッチレセプター抗体又は抗体類の投与を組合せることが望ましい。
【００７３】
ＩＶ．抗ノッチレセプターアゴニスト及び抗体の投与
他の実施態様では、本発明の抗体治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、抗ノッチレセプター抗体（又は抗体類）及び１つ又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａｔａｘａｎｅｓ）（例えばパクリタキセル及びドキセタキセル）及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ編 Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ（１９９２）にも記載されている。
【００７４】
抗体は、抗ホルモン化合物；例えばタモキシフェン等の抗−エストロゲン化合物；抗−プロゲステロン、例えばオナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）（欧州特許第６１６８１２号を参照）；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、抗−ノッチレセプター抗体（及びあるいはここに記載した他の薬剤）を患者に投与してもよい。
【００７５】
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。抗体の適切な用量は、上記にて定義したように、治療する疾患の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するのか又は治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好ましくは、抗体は静脈注入又は皮下注射により投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば１つ又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇないし５０ｍｇ（例えば０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体を患者への最初の投与量の候補とすることができる。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗−ノッチレセプター抗体を投与することからなってよい。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
【００７６】
Ｖ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様では、抗−ノッチレセプター発現癌、特に前立腺癌の緩和に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明の抗−ノッチレセプター抗体である。ラベル又は能書は、組成物が前立腺癌、アンドロジェン非依存性前立腺癌、又はアンドロジェン依存性癌、又は膀胱癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又は能書は、癌患者にアゴニスト又は抗体組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【００７７】
種々の目的、例えばノッチレセプター細胞殺傷アッセイ、細胞からのノッチレセプターの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ノッチレセプターの単離及び精製において、キットはビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合した抗−ノッチレセプター抗体を含むことが可能である。インビトロにおけるノッチレセプターの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのための抗体を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明の抗ノッチレセプター抗体を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
【００７８】
ＶＩ．実施例
実施例１：  前立腺発生間のノッチ１の発現
ノッチ１が前立腺で発現するかどうか、そしてそれが前立腺の発生において役割を担うかどうかを確かめるために、異なる発生段階のラットより調製した全量の前立腺器官から抽出したＲＮＡを用いて、ＴＡＱＭＡＮ（商品名）定量的ＲＴ−ＰＣＲをおこなった。前立腺組織を、発生ステージ生後１日（Ｐ１）、生後１０日（Ｐ１０）及び成人のラットから解剖し、溶解バッファーに配し、そしてＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ，バレンシア，カリフォルニア）を介してホモジナイズした。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙプロトコールフォーム（Ｑｉａｇｅｎ，バレンシア，カリフォルニア）を使用して即座に単離した。ラットハウスキーピング遺伝子であるｇａｐｄｈをコントロールとして用い、対象である実験結果をｇａｐｄｈ発現レベルに対してノーマライズした。ラットｇａｐｄｈプライマー配列は、Ｚｈｅｎｇら．， （１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌｏｇｙ． ２８：９０１−９１２に報告されている。反応生成物が正しい分子量であることを確かめるために、最初のＲＴ−ＰＣＲ増幅をアガロースゲル電気泳動によって確かめた。ラットノッチ１のプライマー／プローブは以下の通りである：
ラットノッチ１プライマーセット
2004524269.tif 000002
結果
ノッチ１は発生中の前立腺で生後１日から生後１０日（Ｐ１からＰ１０）までに高いレベルの発現がある。ノッチ１発現は、成人ではダウンレギュレーションされていた。これらの結果は、図１Ａのグラフで示されている。
【００７９】
実施例２：ノッチ１発現は基底上皮細胞と関連している。
標識センス及びアンチセンスリボプローブを、転写ベクターへクローンしたＰＣＲ産物から生成した。マウスノッチ１ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン，ラホヤ  カリフォルニア）にクローンし、プローブはマウスノッチ１配列のヌクレオチド３７７３〜４６３９（８６６ｂｐ）までに及んだ。マウスノッチ１配列に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｚ１１８８６を参照せよ。プライマーは、増幅産物から、それぞれセンス又はアンチセンスプローブのインビトロ転写が可能となるように、２７−ヌクレオチドのＴ７又はＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ開始部位をコードする伸長物を含んだ（Ｌｕら． Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １９９４， １：１６９−１７６）。５μｍの厚さの切片を脱パラフィン処理し、３７℃で３０分間にわたって４μｇ／ｍｌのプロティナーゼＫで除タンパクし、そしてさらにインサイツハイブリダイゼーションで処理した。３３Ｐ−ＵＴＰ標識センス及びアンチセンスプローブを、５５℃で一晩にわたってこの切片へハイブリダイズした。３７℃での３０分間にわたる２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡによるインキュベーション、それに続く０．１Ｘ ＳＳＣによる５５℃での高ストリンジェント洗浄、及び等級別濃度のエタノールによる脱水によって、未結合プローブを取り除いた。スライドをＮＢＴ２ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｃｋ ｅｍｕｌｓｉｏｎ（イーストマンコダック）に浸漬し、４℃で４週にわたって乾燥剤を入れた密封スライドボックスで暴露し、現像してヘマトキシリンとエオシンで対比染色した。インサイツハイブリダイゼーションは、常套的に、センス及びアンチセンスプローブによって重複切片に対しておこなった。
結果
インサイツハイブリダイゼーションは、ノッチ１が前立腺の上皮細胞又は間質細胞によって発現しているかどうかを確かめるために用いた。ノッチ１シグナルは、生後３日（Ｐ３）及び生後１６日（Ｐ１６）の双方で、上皮において特異的に見られたが、間質細胞では見られなかった。これは、図１Ｂにグラフにして示されている。
【００８０】
実施例３：基底上皮細胞でのノッチ１発現
実施例２では、放射性インサイツハイブリダイゼーション実験は、前立腺上皮組織での限られたノッチ１発現パターンを示したが、どの上皮細胞型が特異的にノッチ１を発現したのかを見極める結論を提供していない。前立腺上皮組織でのノッチ１の発現パターンを正確に測定するために、ノッチ１プロモーターの制御下でグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のマーカー遺伝子を発現するトランスジェニックマウスから、前立腺組織切片を取り出した。このトランスジェニックマウスでは、ノッチ１を発現している細胞は緑色の蛍光を示す。ノッチ１のためのインサイツハイブリダイゼーションとノッチ１−ＧＦＰマウスとの比較がおこなわれ、文献に報告されている（Ｌｅｗｉｓら．， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９８）７８：１５９−１６３）。
【００８１】
結果
生後３日（Ｐ３）で、出芽上皮性導管の管腔を囲む上皮組織に強力なＧＦＰシグナルがあった。この発生ステージでは、上皮組織のすべての細胞は標識され、基底から管腔へ伸びている典型的なたる型形態を示した（図２Ａ）。生後１２日（Ｐ１２）には、上皮組織の大部分の細胞は、まだＧＦＰポジティブで、幾つかはＧＦＰシグナルを失っていた（図２Ｂ）。成人では、ＧＦＰ標識はより弱くなり、深い上皮組織の基底層にある細胞の小さな部分のみがＧＦＰポジティブであった。成人前立腺のＧＦＰポジティブ細胞は、円柱状又はたる様形状に代わって細い突起を有する小さくて丸い体型を示した（図２Ｃ）。
前立腺におけるＧＦＰポジティブ細胞の基底細胞同一性を確かめるために、前立腺切片を基底細胞マーカーである抗サイトケラチン１４抗体で付加的に標識した（Ｈａｙｗａｒｄら．，（１９９６） Ａｃｔａ Ａｎａｔｏｍｉｃａ １５５：８１−９３）。すべてのＧＦＰポジティブ細胞についても抗サイトケラチン１４抗体によって標識し、それによって基底細胞型を確かめた（図２Ｄ２）。Ｐ１９ノッチ１−ＧＦＰ及びノッチ１−ＧＦＰ／サイトケラチン１４の結果は、図２Ｄ１−２Ｄ３に示してある。
【００８２】
実施例４：ノッチ１は前立腺癌細胞で発現する。
前立腺癌細胞におけるノッチ１のパターンは、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３及び前立腺上皮細胞株ＰｒＥから抽出したＲＮＡでＴＡＱＭＡＮ（商品名）解析をおこなうことによって確かめた（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ウォカーズビル，メリーランド）。全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ（商品名）プロトコール（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，フレンズウッズ  テキサス）を用いてこれら細胞株から単離し、ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ＢＭＢ））によって室温で３０分間処理し、次いでＲＮｅａｓｙプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，バレンシア  カリフォルニア）を用いて精製した。最初のストランド合成は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ゲーサーバーグ  メリーランド）を用いておこなった。この最初のストランド合成は、次いで、発現レベルのコントロールとしてｇａｐｄｈを再び用いたＴＡＱＭＡＮ ＰＣＲ解析によって分析した。ヒトノッチ１ ＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＨＵＭＴＡＮ１を使用することで見出すことができる。ノッチ１に用いるプライマーは以下の通りである：
ヒトノッチ１プライマーセット
2004524269.tif 000003
ヒトＧａｐｄｈプライマーセット
2004524269.tif 000004
結果
ノッチ１はＬＮＣａＰ細胞で極めて高度に発現することが見出されたが、ＤＵ１４５細胞では非常に低く、ＰＣ３細胞では中程度の発現であった。ノッチ１発現のレベルはＰｒＥ細胞で最も高かった。この結果は、図３で図解されている。
【００８３】
実施例５：ノッチ１発現は、ＴＲＡＭＰマウスモデルの悪性及び転移性前立腺腫瘍細胞で上昇している。
ヒト前立腺癌に関して十分に樹立されている動物モデルの１つは、マウス前立腺のトランスジェニック腺癌（商品名）（ＴＲＡＭＰ（商品名））（グリーンバーグ，ニューメキシコ，１９９５，ＰＮＡＳ ９２：３４３９−４３）である。ヒトと比較して、マウス前立腺には有意な解剖学的な違いがあるが、分泌機能及びホルモン制御を含む固有の共通の特徴がある。ＴＲＡＭＰ（商品名）モデルでは、ラットのプロベイスン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）遺伝子の最小プロモーターは、ＳＶ４０ラージＴ−抗原の発現を前立腺上皮組織へ標的化する。すべての雄ＴＲＡＭＰマウスは、通常は８−１２週で前立腺癌に進行する（Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ＪＲら．， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７： ４６８７−９１）。原産ＴＲＡＭＰ（商品名）モデルは、癌の発生が前立腺上皮組織に特異的であり、初期にアンドロジェンによって制御されているという点でヒト前立腺癌腫に関連している。さらには、遠い部位への転移が最終的に生じる（Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ＪＲら．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６： ４０９６−１０２；Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ＪＲら．， １９９９， Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ＆ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２：７０−７５）。
【００８４】
年齢が１０及び２４週の間の雄及び雌成人ＣＤ−１マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。胚の収集のために、妊娠中のマウスを注文した。膣栓の単離は、胚発生の第１日に考慮した。ＩＳＨによって検査した胎児組織はＥ１０、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１７及びＥ１８を含んだ。検査した成人組織は、雄泌尿生殖器系の組織、雌膀胱及び腎臓、思春期乳腺、１４日目の妊娠乳腺、泌乳乳腺、肝臓、心臓、皮膚及び腸を含んだ。すべての組織を４％ホルマリン及びパラフィン包理で固定した。ＴＲＡＭＰ（商品名）トランスジェニックマウスの飼育者対をＮｏｒｍａｎ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ博士（ベイラー医科大学，ヒューストン，テキサス）から得た。同じ年齢のＴＲＡＭＰ（商品名）トランスジェニックマウスとの比較のために、野生型同腹子メイトＣ５７ＢＬ／６の泌尿生殖器組織を１２及び２４歳で取り出した。１２週齢までに、ＴＲＡＭＰ（商品名）マウスは、典型的には、ＰＩＮ及び又は良く分化した腫瘍へと進行した。１２から３９週齢の年齢の間のＴＲＡＭＰ（商品名）雄マウスを生け贄にし、ルーチンな組織学及びＩＳＨ研究のために、組織を収集した。前立腺癌の組織学的グレードを、ＴＲＡＭＰ（商品名）に関して以前に公開された研究（Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ＪＲら．， １９９９， Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ＆ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２：７０−７５）に従って決定した。
【００８５】
結果
実験のこの一組は、ＴＲＡＭＰマウス前立腺、特に前立腺腫瘍形成の間の悪性腫瘍におけるノッチ１発現のレベルの任意の変化を確かめるためにおこなわれた。ＴＲＡＭＰマウスの組織のインサイツハイブリダイゼーションは、正常な前立腺が検出不可能なレベルのノッチ１を発現したことを示している（図４Ａ，４Ｂ）。対照的に、中程度に分化した腺癌細胞（図４Ｃ，４Ｄ）、弱く分化した腺癌細胞、及び前立腺上皮内腫瘍形成（ＰＩＮ）は、高いレベルのノッチ１を発現した。リンパ節へ転移した前立腺腫瘍細胞も、隣接する正常組織と比較した場合、顕著により高いレベルのノッチ１を発現した（図４Ｅ，４Ｆ）。
【００８６】
前立腺の発生の間、ノッチ１発現が基底細胞集団と関連していることから、ノッチ発現がＴＲＡＭＰ前立腺の悪性細胞でアップレギュレーションされているという知見によって、これら悪性細胞が将来の基底細胞を有しているかどうかという問いが生じた。基底細胞マーカーである抗サイトケラチン１４抗体を用いて、ＴＲＡＭＰ及び野生型マウスから調製した前立腺組織で免疫組織化学をおこなった。僅かな数のサイトケラチン１４ポジティブ細胞が観察されたにもかかわらず、ＰＩＮ（データ示さず）及び程良く中程度に分化したＴＲＡＭＰ癌腫（図４Ｈ）では、大部分の細胞がサイトケラチン１４ネガティブであることが見出された。野生型マウスの正常前立腺と比較して、ＰＩＮ及びＴＲＡＭＰマウスの腺癌においては、サイトケラチン１４ポジティブ細胞の数に明かな増加はなかった（図４Ｇ）。実際に、ＴＲＡＭＰの中程度及び弱く分化した癌腫では、実際にすべての細胞はサイトケラチン１４ネガティブであった（データは示さず）。これらの結果は、ＴＲＡＭＰの悪性細胞では、ノッチ１発現がサイトケラチン１４発現とは連関していないことを示す。
【００８７】
実施例６：前立腺癌細胞でのノッチ１リガンドの発現レベル
ノッチ１に対するリガンドがレセプターを活性化するように、ノッチ１リガンドも前立腺癌細胞で発現するかどうかを理解することが必要である。それ故に、４つのノッチ１リガンド、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ及びＤｅｌｔａ４に対してＴＡＱＭＡＮ（商品名）解析をおこなった。この実験のためのＲＮＡは、実施例４に記載のようにして単離した。
Ｊａｇｇｅｄ１プライマーセット
2004524269.tif 000005
Ｊａｇｇｅｄ２プライマーセット
2004524269.tif 000006
デルタプライマーセット
2004524269.tif 000007
デルタ４プライマーセット
2004524269.tif 000008
【００８８】
結果
Ｊａｇｇｅｄ１はＰｒＥ細胞で、及びＬＮＣａＰ細胞では低レベルで発現した。Ｊａｇｇｅｄ２はＬＮＣａＰ細胞で低レベルで発現し、Ｄｅｌｔａ及びＤｅｌｔａ４発現は、検査した４つのすべての細胞で低いから検出不可能であった。これは、図５Ａに図解されている。
Ｊａｇｇｅｄ１の発現プロファイルは、ＴＲＡＭＰマウスモデル（ＴＲＡＭＰマウスモデルの説明については実施例５を参照せよ）から調製した前立腺切片のインサイツハイブリダイゼーション（条件に関しては実施例２を参照せよ）を用いて確かめた。強いハイブリダイゼーションシグナルは、正常及び悪性前立腺組織の血管の上皮細胞で検出された。ＴＲＡＭＰ腫瘍の悪性上皮細胞では、シグナルは見られなかった。このデータは、図５Ｂに示されている。
【００８９】
実施例７：ノッチ１の活性化は、前立腺癌細胞の増殖の減少につながる。
ノッチ１発現は癌細胞で見出されるが、ノッチ１リガンド発現は相対的に低く現れる。ノッチ１シグナルの活性化は、前立腺癌細胞の成長に影響し得る。種々の前立腺癌細胞株は、マウスノッチ１の細胞内ドメインであり、ノッチ１の構成的な活性型であるｍＮ１−ＩＣでトランスフェクトされた。ノッチ１のこの活性型の特徴は、以前に報告されている（Ｎｙｅら．， （１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：２４２４−２４３０）。ＤＮＡ合成を測定するために、同じ数の細胞（４ｘ１０３細胞／ウェル）を無血清前立腺上皮細胞培養培地の９６ウェルプレートにプレートした（ＰｒＥＧＭ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ウォカーズビル  メリーランド）。この場合、トリヨードチロニン、ヒドロコルチゾン、エピネフリン及びヒト組み換え体ＥＧＦ無しでＰｒＥＧＭ培地を使用した。細胞を播種し、２１時間にわたってインキュベートした後の２４時間目に、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を添加した。細胞をトリプシン処理し、次いでＴｏｍｔｅｃ細胞ハーベスターを用いて収集した。次に、マイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてＣｐｍ／ウェルを計測した。各実験群の５又は２４培養ウェルからデータを収集し、平均＋／−標準偏差値として表した。２つの尾状の、対応のないＴ検定を用いて結果を統計的に分析した。
【００９０】
結果
構成的活性型ノッチ１の発現によって、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ及びＰＣ３細胞を含む検査したすべての前立腺癌細胞株のＤＮＡ合成を阻害した。コントロールベクターでトランスフェクトしたものに比べて、３つのすべての前立腺癌細胞株の増殖速度に統計的に有意な減少があった。このデータは、図６Ａに図解して示されている。
【００９１】
実施例８：ノッチ１の活性化はＣＢＦ１活性化につながる。
ＣＢＦ１は、哺乳動物のノッチシグナル伝達の細胞内メディエーターとして説明されているＤＮＡ結合タンパク質である（Ｈｏｎｊｏら．， （１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １： １−９）。ノッチ１によって活性化されるＣＢＦ１は、神経形成（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓら．， （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：２２５−２３２）及び筋細胞分化（Ｎｏｆｚｉｇｅｒら．， （１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６： ６８９−７０２）。デュアルルシェフェラーゼアッセイは、ＬＮＣａＰ及びＰＣ３細胞のノッチシグナル伝達の活性化がＣＢＦ１経路をトランス活性化することを示す。細胞を１２ウェル組織培養プレートに播種し、次の日に、８００ｎｇのｍＮ１−ＩＣプラスミド又はコントロールベクター（ｐｃＤＮＡ３）とともに、ＣＢＦ１−ルシェフェラーゼコンストラクト（１９４ｎｇ）及びウミシイタケルシェフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＴＫプラスミド（６ｎｇ）で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後の４８時間目に、製造者指示書に従って標準デュアルルシェフェラーゼ活性に関して細胞をアッセイした（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン  ウィスコンシン）。データは、相対ルシェフェラーゼ単位の平均、及び３つの独立した実験の標準偏差として表される。
【００９２】
結果
ｍＮ１−ＩＣ活性ノッチ１コンストラクトによる同時トランスフェクションにおいてＣＢＦ１／ルシェフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを用いて、コントロールトランスフェクションと比較した場合には、培養したＰＣ３細胞では３００倍、そしてＬＮＣａＰ細胞では１９００倍のルシェフェラーゼ活性の増加があることが確かめられた。これらの結果は、図６Ｂに図解されている。
【００９３】
実施例９：大腸菌でのノッチの発現
この実施例は、大腸菌での組み換え発現による、ノッチの非グリコシル化形態の調製を例示する。
ノッチをコードするＤＮＡ配列は、最初に、選択したＰＣＲプライマーを使用して増幅する。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位と一致する制限酵素部位を含まなければならない。種々の発現ベクターを用いることが可能である。適切なベクターの例は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を有するｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら．， Ｇｅｎｅ， ２：９５（１９７７））である。このベクターを制限酵素で消化して脱リン酸化する。次に、ＰＣＲで増幅した配列をベクターへライゲートする。このベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ノッチコード化領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
次いで、ライゲーション混合物を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，上掲に記載の方法によって選択した大腸菌株を形質転換する。ＬＢプレート上で生育する能力によって形質転換体を選択し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択した。制限分析及びＤＮＡシーケンシングによって、プラスミドＤＮＡを単離して確かめることができる。
【００９４】
選択したクローンは、例えば抗生物質を補充したＬＢブロス等の液体培養培地で一晩にわたって成長させることができる。より大きなスケールの培養を接種するために、この一晩にわたる培養液を引き続き使用してもよい。次いで、細胞を所望の光学密度に達するまで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
さらに数時間、細胞を培養した後、遠心分離によって細胞を収集することができる。当該分野で公知の様々な薬剤を使用して、遠心分離で得られた細胞ペレットを可溶化することができ、次いで、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下で金属キレート化カラムを用いて、この可溶性ノッチタンパク質を精製することが可能である。
【００９５】
以下の手法を用いて、ノッチを大腸菌でポリ−Ｈｉｓタグ形態で発現させることができる。ノッチをコードするＤＮＡを、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。このプライマーは、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムによる迅速な精製、及びエンテロキナーゼによるタンパク質分解的除去のための他の有用な配列を含む。次いで、ＰＣＲで増幅したポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させる。ついで培養液をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４を混合することで調製）で５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪によって約２０−３０時間成長させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認するために試料を取り出し、バルク培地を遠心分離して細胞をペレットにする。精製及びリフォールディング（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結する。
【００９６】
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）による大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファーで１０容量（ｗ／ｖ）に再懸濁した。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌する。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸でブロックされた変性タンパク質が生じる。この溶液をベックマン超遠心機で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮する。その上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターで濾過して透明にする。その透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷する。そのカラムを、５０ｍＭのイミダゾール（カルバイオケム， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する分画をプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるその吸収から推定する。
【００９７】
試料を２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択する。そのリフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応は、ＴＦＡを最終濃度が０．４％（約３のｐＨ）となるように添加することで停止させる。タンパク質のさらなる精製の前に、その溶液を０．２２ミクロンフィルターで濾過し、アセトニトリルを最終濃度が２−１０％となるように添加する。再生したタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離による０．１％ＴＦＡの移動バッファーを用いるクロマトグラフにかける。Ａ２８０に吸収を示す分画のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、均一な再生タンパク質を含有する分画をプールする。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されている疎水性内部で最もコンパクトであるために、最低濃度のアセトニトリルで溶離される。凝集した種は、通常はより高いアセトニトリル濃度で溶離する。逆相工程は、誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くことの他に、試料からエンドトキシンも除去する。
【００９８】
所望の再生したノッチポリペプチドを含有する分画をプールし、この溶液に窒素の弱い気流を直接あてることでアセトニトリルを除去する。タンパク質は、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（ファルマシア）樹脂及び滅菌濾過を用いて、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製する。
【００９９】
実施例１０：哺乳動物細胞におけるノッチの発現
この実施例は、哺乳動物細胞での組み換え発現によって潜在的にグリコシル化した形態のノッチの調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開の欧州特許第３０７，２４７号参照）を用いる。場合によっては、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載のようなライゲーション方法を用いて、選択した制限酵素によってノッチＤＮＡをｐＲＫ５にライゲーションし、ノッチＤＮＡの挿入を許容する。得られたベクターをｐＲＫ５−ノッチと呼ぶ。
【０１００】
一実施態様では、選択する宿主細胞を２９３細胞にしてもよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）を、ウシ胎児血清及び場合によっては栄養成分及び／又は抗生物質を補充したＤＭＥＭなどの培地の組織培養プレートでコンフルエントになるまでに成長させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ノッチＤＮＡを、約１μｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら， Ｃｅｌｌ， ３１：５４３ （１９８２）］と混合し、５００μｌの１ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に、滴状の５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を添加し、２５℃、１０分間で析出物を形成させる。この析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃、約４時間で定着させる。培地を吸引し、２ｍｌの２０％グリセロールのＰＢＳを３０秒間添加する。２９３細胞を、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、その細胞を約５日間インキュベートする。
【０１０１】
トランスフェクションの約２４時間後、培地を除去し、培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、馴化培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加する。その処理ゲルを乾燥させ、ノッチポリペプチドの存在が明らかになるように選定時間の間にフィルムへ曝してもよい。トランスフェクト細胞を含む培地をさらにインキュベーションしてもよく（無血清培地で）、この培地を選択したバイオアッセイで試験する。
【０１０２】
これに換わる技術では、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １２：７５７５ （１９８１）に記載のデキストラン硫酸法を用いて、ノッチを２９３細胞へ一過的に導入してもよい。２９３細胞をスピナーフラスコで最大密度に達するまで生育させ、７００μｇのｐＲＫ５−ノッチＤＮＡを添加する。細胞を、まずはスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、この馴化培地を遠心分離及び濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで発現したノッチを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１０３】
他の実施態様では、ノッチをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ノッチは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクションすることができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地で置換することができる。ノッチポリペプチドの存在を確かめた後、培地を無血清培地で置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで馴化培地を収集する。次いで、発現したノッチを含む培地は、濃縮し、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０１０４】
また、エピトープタグノッチは、宿主ＣＨＯ細胞で発現させてもよい。ノッチは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施して、バキュロウイルス発現ベクター中のポリ−ｈｉｓタグ等の選択したエピトープタグを持つ枠に融合できる。このポリ−ｈｉｓタグノッチ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択用の選択マーカー、例えばＤＨＦＲを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後的に、ＳＶ４０誘導ベクターでＣＨＯ細胞をトランスフェクション（上記のように）することができる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−ｈｉｓタグノッチを含む培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィー等の選択した方法により精製できる。
また、ノッチは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、又は他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
ＣＨＯ細胞での安定な発現は、以下の方法を用いて実施する。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）、又はポリ−Ｈｉｓタグ形態として発現する。
【０１０５】
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ ３．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に記載のような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ＣＨＯ細胞での発現を用いるベクターは、Ｌｕｃａｓら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ９， １７７４−１７７９ （１９９６）に記載の通りであり、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現の制御にはＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、トランスフェクション後のプラスミドの安定な維持に関する選択を可能にする。
所望するプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販のトランスフェクション試薬であるＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）， Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）及びＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、約１千万のＣＨＯ細胞へ導入する。細胞は、上記のＬｕｃａｓ等に記載のように成長させる。約３ｘ１０７細胞を、下記のような更なる成長及び産生のためにアンプル中で凍結させる。
【０１０６】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合する。内容物を１０ｍＬの培地を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を含む０．２μｍ濾過ＰＳ２０を添加）中に懸濁する。次いで、その細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナーに等分する。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択増殖培地で満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで接種する。遠心分離及び産生培地での再懸濁により、細胞培地を新鮮培地と交換する。どんな適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載の産生培地を使用する。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで接種する。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気による散布を実施する。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ ポリジメチルシロキサン エマルジョン、ダウ・コーニング ３６５  医療用グレード エマルジョン）を用いる。この産生を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持する。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、その細胞培地を遠心分離で回収し、０．２２μｍフィルターで濾過する。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【０１０７】
ポリ−Ｈｉｓタグ作成物に関しては、そのタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。精製の前に、イミダゾールを馴化培地へ５ｍＭの濃度まで添加する。馴化培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムへ４−５ｍｌ／分の流速によって４℃でポンプ供給する。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール，を含むｐＨ６．８の貯蔵バッファーにより２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（ファルマシア）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。
【０１０８】
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を、以下の通りに馴化培地から精製する。馴化培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（ファルマシア）へポンプ注入する。充填後、カラムを平衡バッファーで十分に洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸，ｐＨ３．５で溶離する。溶離したタンパク質は、１ｍｌの分画を２７５μＬのｐＨ９の１Ｍトリスバッファーを含む管で回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質を、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファーで脱塩する。その均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定により評価する。
【０１０９】
実施例１１：酵母でのノッチの発現
以下の方法では、酵母におけるノッチの組換え発現を説明する。
最初に、酵母発現ベクターを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターによるノッチの細胞内生産又は分泌のために作成する。ノッチをコードするＤＮＡ、及びプロモーターを、ノッチの細胞内発現を指示するように、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入する。分泌のために、ノッチをコードするＤＮＡを選択したプラスミドへ、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ノッチシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ノッチの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
【０１１０】
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母細胞を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択した発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くクマシーブルー染色によるゲルの染色による分離によって分析することができる。
続いて組換えノッチは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択したカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ノッチを含む濃縮物は、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１１１】
実施例１２：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのノッチの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるノッチの組換え発現を記載する。
ノッチをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの、市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ノッチ又はノッチコード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、５’及び３’領域に相補的なプライマーによるＰＣＲで増幅する。５’プライマーは、隣接する（選択した）制限酵素部位を包含していてもよい。この生産物を、次いで、選択した制限酵素で消化し、発現ベクターへサブクローニングする。
【０１１２】
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商品名）ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）中にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて同時トランスフェクションすることにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， オックスフォード： オックスフォード大学出版局 （１９９４）に記載されているように実施する。
【０１１３】
次に、発現したポリ−ｈｉｓタグノッチを、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製することができる。抽出物は、Ｒｕｐｅｒｔら， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：１７５−１７９ （１９９３）に記載のように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理する。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡する。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷する。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄する。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファーの０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）で複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析する。溶離したＨｉｓ１０−タグノッチを含む画分をプールして負荷バッファーで透析する。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ノッチの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１１４】
実施例１３：ノッチに結合する抗体の調製
この実施例は、ノッチに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の産生のための技術は、この分野で知られていて、例えば、上記のＧｏｄｉｎｇに記載されている。用いてもよい免疫原は、精製ノッチ、ノッチを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えノッチを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したノッチ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ハミルトン， モンタナ）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ノッチ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１１５】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ノッチ静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択したマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、これを非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するようにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートにプレートすることができる。
ハイブリドーマ細胞は、ノッチに対する反応性に関するＥＬＩＳＡによってスクリーニングされる。ノッチに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を、抗ノッチモノクローナル抗体を含む腹水を生成するように、同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水で生成したモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１１６】
実施例１４：特異的抗体を用いたノッチポリペプチドの精製
天然又は組換えノッチポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ−ノッチポリペプチド、成熟ノッチポリペプチド、又はプレ−ノッチポリペプチドは、対象とするノッチポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般的に、免疫親和性カラムは、抗ノッチポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂へ共有結合することで作成する。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムによる沈殿又は固定化プロテインＡ（ファルマシア ＬＫＢ バイオテクノロジー， ピスカタウェイ， ニュージャージー）による精製のいずれかにより免疫血清から調製する。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製する。部分精製した免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化セファロース（商品名）（ファルマシア ＬＫＢ バイオテクノロジー）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合する。抗体が樹脂に結合し、樹脂がブロックされ、そして誘導体樹脂を製造者の指示に従って洗浄する。
【０１１７】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のノッチポリペプチドを含有する細胞から分画を調製することによるノッチポリペプチドの精製で利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法による微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分分画の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ノッチポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌され得る。
可溶化ノッチポリペプチド含有調製物を免疫親和性カラムへ流し、そのカラムをノッチポリペプチドの優先的吸着を可能にする条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄する。次いで、このカラムを抗体／ノッチポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離し、ノッチポリペプチドを回収する。
【０１１８】
実施例１５：薬物スクリーニング
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術でノッチポリペプチド又はその結合断片を使用することによって化合物をスクリーニングすることにとって特に有用である。そのような試験に用いられるノッチポリペプチド又は断片は、溶液中での遊離状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ノッチポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質転換する真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質転換細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、ノッチポリペプチド又は断片と試験される試薬の間の複合体の形成を測定してもよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるノッチポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプター間の複合体形成の減少を調べることができる。
【０１１９】
従って、本発明は、ノッチポリペプチド関連疾患又は障害に作用することのできる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で良く知られており、その試薬をノッチポリペプチド又は断片に接触させ、（ｉ）試薬とノッチポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は（ｉｉ）ノッチポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ノッチポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、遊離型ノッチポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、遊離型又は未複合の標識の量が、特定の試薬がノッチポリペプチドに結合する又はノッチポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１２０】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開された国際公開８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ノッチポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はノッチポリペプチドと反応して洗浄される。結合したノッチポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したノッチポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ノッチポリペプチドに結合可能な中和抗体がノッチポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も考慮する。この方法において、抗体は、ノッチポリペプチドと１つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１２１】
実施例１６：合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ノッチポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ノッチポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでノッチポリペプチドの機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： １９−２１ （１９９１））。
【０１２２】
１つの方法において、ノッチポリペプチド、又はノッチポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ノッチポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ノッチポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ノッチポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｂｒａｘｔｏｎ及びＷｅｌｌｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１： ７７９６−７８０１ （１９９２）に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はＡｔｈａｕｄａら，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１３： ７４２−７４６ （１９９３）に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１２３】
また、上記のような機能アッセイによって選択した標的特異的な抗体を単離し、その結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコアを生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体（抗−ｉｄｓ）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄｓの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗−ｉｄは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のノッチポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したノッチポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ラット前立腺組織でのノッチ１発現のＴＡＱＭＡＮ（商品名）ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図１Ｂ】発生中のマウス前立腺でのノッチ１発現のインサイツハイブリダイゼーションを示す。
【図２】（Ａ）ノッチ１−ＧＦＰトランスジェニックマウスモデルを用いた、発生（Ｐ３）の間の前立腺の出芽管上皮単位の管腔を囲う上皮でのノッチ１発現を示す。（Ｂ）発生段階Ｐ１２でのノッチ１発現を示す。上皮組織の大部分の細胞は、ノッチ１−ＧＦＰシグナルに関してポジティブである。（Ｃ）成人動物において弱いノッチ１−ＧＦＰ発現を示す上皮組織の基低層の細胞を示す。（Ｄ１）発生段階Ｐ１９の前立腺切片でのノッチ１−ＧＦＰ発現を示す。（Ｄ２）ノッチ１−ＧＦＰトランスジェニックマウスから取り出して、基底細胞マーカーである抗ケラチン１４で標識した前立腺切片を示す。（Ｄ３）ノッチ１が前立腺の基底細胞で発現していることを追認する、ケラチン１４抗体染色によるノッチ１シグナルの共局在化を示す。
【図３】原発性ヒト前立腺上皮及び前立腺癌細胞のノッチ１のＴＡＱＭＡＮ（商品名）ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４】（Ａ）ＴＲＡＭＰマウスモデルにおける、ノッチ１でプローブした正常前立腺のインサイツハイブリダイゼーションを示す。（Ｂ）ＴＲＡＭＰマウスモデルにおける、ノッチ１でプローブした正常前立腺のインサイツハイブリダイゼーションを示す。（Ｃ）ＴＲＡＭＰマウスモデルにおける、ノッチ１でよりプローブした中程度に分化した腺癌のインサイツハイブリダイゼーションを示す。（Ｄ）ＴＲＡＭＰマウスモデルにおける、ノッチ１でよりプローブした中程度に分化した腺癌のインサイツハイブリダイゼーションを示す。（Ｅ）ＴＲＡＭＰマウスモデルにおける、ノッチ１でプローブしたリンパ節へ転移した前立腺腫瘍細胞のインサイツハイブリダイゼーションを示す。（Ｆ）ＴＲＡＭＰマウスモデルにおける、ノッチ１でプローブしたリンパ節へ転移した前立腺腫瘍細胞のインサイツハイブリダイゼーションを示す。（Ｇ）野生型マウスの正常な前立腺のケラチン１４に関する染色を示す。（Ｈ）ＴＲＡＭＰマウスモデルにおける、良く分化した癌腫のケラチン１４に関する染色を示す。
【図５Ａ】４つの既知のノッチリガンドのＴＡＱＭＡＮ（商品名）分析 を示す。
【図５Ｂ】ＴＲＡＭＰマウス及び野生型マウスから調製した前立腺切片における、ノッチリガンドジャッグ１のインサイツハイブリダイゼーションを示す。
【図６Ａ】ノッチ１の構成的活性型の発現が細胞増殖を減じることを示す。
【図６Ｂ】ノッチ１の構成的活性型による細胞の処理がＣＢＦ−１／ルシェフェラーゼコンストラクトの発現を増加させることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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