(57)【要約】本発明は、グリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質が、支持体に結合する条件下で、第１の結合タンパク質測定を行うことによって、そしてグリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質が、実質的に支持体に結合しない条件下で、第２の結合タンパク質測定を行うことによって、固相支持体を使用して、生物学的サンプル中のグリコ化タンパク質の定量のための方法を提供する。本発明の方法を含む診断デバイスおよびキットもまた、提供される。
2004532388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のグリコ化タンパク質の定量の方法であって、該方法が：
（ａ）負に荷電した基およびヒドロキシボリル化合物を含み、測定領域を有する固相支持マトリクスを、該測定領域を覆うのに十分な生物学的サンプルのアリコートとを接触させる工程；
（ｂ）該固相支持マトリクスを、結合しないタンパク質をすすぎ落とすのに十分な第１の緩衝液のアリコートと接触される工程であって、ここで該第１の緩衝液が、グリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質の両方を、該固相支持マトリクスに結合させるように選択されたｐＨを有する、工程；
（ｃ）第１の結合タンパク質の読み取りを得るために、該タンパク質の選択された特徴の測定を使用して、該測定領域に結合されるタンパク質を定量する工程；
（ｄ）該固相支持マトリクスを、結合されないタンパク質をすすぎ落とすのに十分な第２の緩衝液のアリコートと接触させる工程であって、該第２の緩衝液が、グリコ化タンパク質を、該固相支持マトリクスに結合させるが、非グリコ化タンパク質が、該固相支持マトリクスに実質的に結合しないように選択されたｐＨを有する、工程；
（ｅ）第２の結合タンパク質の読み取りを得るために、工程（ｃ）において測定された特徴の測定を使用して、該測定領域に結合されるタンパク質を定量する工程；ならびに
（ｆ）該第１および第２の結合タンパク質の読み取りを使用して、グリコ化タンパク質のパーセンテージを計算する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記測定される特徴が、光学的読み取りである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光学的読み取りが、特定の波長での吸光度または反射率である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコ化タンパク質が、グリコ化ヘモグロビンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
グリコ化タンパク質が、グリコ化アルブミンである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
生物学的サンプル中のグリコ化タンパク質の量の定量の方法であって、該方法が：
（ａ）負に荷電した基およびヒドロキシボリル化合物を含み、測定領域を有する固相支持マトリクスを、該測定領域を覆うのに十分な生物学的サンプルのアリコートと接触させる工程；
（ｂ）該固相支持マトリクスを、結合しないタンパク質をすすぎ落とすのに十分な第１の緩衝液のアリコートと接触させる工程であって、ここで該第１の緩衝液が、約５．０〜約７．０のｐＨを有する、工程；
（ｃ）第１の結合タンパク質の読み取りを得るために、該測定領域に結合されるタンパク質を定量する工程；
（ｄ）該固相支持マトリクスを、結合されないタンパク質をすすぎ落とすのに十分な第２の緩衝液のアリコートと接触させる工程であって、該第２の緩衝液が、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程；
（ｅ）第２の結合タンパク質の読み取りを得るために、該測定領域に結合されるタンパク質を定量する工程；ならびに
（ｆ）該第１の結合タンパク質の読み取りおよび第２の結合タンパク質の読み取りを使用して、該サンプル中のグリコ化タンパク質のパーセンテージを計算する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
前記第１および第２の結合タンパク質の読み取りが、同じ特徴を測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記測定される特徴が、光学的読み取りである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
光学的読み取りが、特定の波長での吸光度または反射率である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記グリコ化タンパク質が、グリコ化ヘモグロビンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記グリコ化タンパク質が、グリコ化アルブミンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
生物学的サンプル中のグリコ化ヘモグロビンの定量の方法であって、該方法が：
（ａ）負に荷電した基およびヒドロキシボリル化合物を含み、測定領域を有する固相支持マトリクスと連絡するサンプル適用部位に、該サンプルを添加する工程；
（ｂ）第１の緩衝液のアリコートを該サンプル適用部位に添加する工程であり、
ここで該第１の緩衝液が、約５．０〜約７．０のｐＨを有する、工程；
（ｃ）ヘモグロビンが光を吸収する波長で、該測定領域の第１の光学的読み取りを行う、工程；
（ｄ）第２の緩衝液のアリコートを該サンプル適用部位に添加する工程であり、
ここで該第２の緩衝液が、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程；
（ｅ）ヘモグロビンが光を吸収する波長で、該測定領域の第２の光学的読み取りを行う工程；ならびに
（ｆ）該第１および第２の結合タンパク質の読み取りを使用して、該サンプル中のグリコ化ヘモグロビンのパーセンテージを計算する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記ジヒドロキシボリル化合物が、以下の式：
【化１】
2004532388.tif 000013
を有し、ここでＲは、フェニル、置換されたフェニル、水素、および１から約６炭素原子のアルキルからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒが、フェニル、ｍ−アミノフェニル、水素、エチル、１−プロピルおよび２−メチル−１−ブチルからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒが、ｍ−アミノフェニルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記負に荷電した基が、カルボキシレート、スルフェート、スルホナート、スルフィナートおよびホスフェートからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記負に荷電した基が、カルボキシレートである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記固相支持マトリクスが、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースポリアクリルアミドコポリマー、アガロース、デンプン、ナイロン、ナイロンポリエステル、デキストラン、架橋デキストラン、デキストランアクリルアミドコポリマー、架橋ヒドロキシメチルメタクリレート置換架橋ポリスチレン、およびポリビニルアルコールからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記固相支持マトリクスが、カルボキシセルロースである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の緩衝液が、ＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の緩衝液が、酢酸アンモニウムまたはタウリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的サンプル中の非ヘモグロビングリコ化タンパク質の定量の方法であって、該方法が：
（ａ）負に荷電した基およびジヒドロキシボリル化合物を含み、測定領域を有する固相支持マトリクスと連絡するサンプル適用部位に、該サンプルを添加する工程；
（ｂ）第１の緩衝液のアリコートを該サンプル適用部位に添加する工程であり、
ここで該第１の緩衝液が、約５．０〜約７．０のｐＨを有する、工程；
（ｃ）標識化薬剤が光を吸収する波長で、該測定領域の第１の光学的読み取りを行う工程；
（ｄ）第２の緩衝液のアリコートを該サンプル適用部位に添加する工程であり、
ここで該第２の緩衝液が、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程；
（ｅ）該標識化薬剤が光を吸収する波長で、該測定領域の第２の光学的読み取りを行う工程；ならびに
（ｆ）該第１および第２の読み取りを使用して、該サンプル中のグリコ化タンパク質のパーセンテージを計算する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記ジヒドロキシボリル化合物が、以下の式：
【化２】
2004532388.tif 000014
を有し、ここでＲは、フェニル、置換されたフェニル、水素および１から約６炭素原子のアルキルからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒが、フェニル、ｍ−アミノフェニル、水素、エチル、１−プロピルおよび２−メチル−１−ブチルからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒが、ｍ−アミノフェニルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記負に荷電した基が、カルボキシレート、スルフェート、スルホナート、スルフィナートおよびホスフェートからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記負に荷電した基が、カルボキシレートである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記固相支持マトリクスが、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースポリアクリルアミドコポリマー、アガロース、デンプン、ナイロン、ナイロンポリエステル、デキストラン、架橋デキストラン、デキストランアクリルアミドコポリマー、架橋ヒドロキシメチルメタクリレート置換架橋ポリスチレン、およびポリビニルアルコールからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記固相支持マトリクスが、カルボキシセルロースである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の緩衝液が、ＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の緩衝液が、酢酸アンモニウムまたはタウリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルが、タンパク質特異的標識化薬剤で標識化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが、血清または血漿である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記非ヘモグロビングリコ化タンパク質が、グリコ化アルブミンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法を使用する、グリコ化ヘモグロビンの定量のための、診断デバイス。
【請求項３６】
請求項６に記載の方法を使用する、グリコ化タンパク質の定量のための、診断デバイス。
【請求項３７】
請求項１２に記載の方法を使用する、グリコ化タンパク質の定量のための、診断デバイス。
【請求項３８】
請求項２２に記載の方法を使用する、グリコ化タンパク質の定量のための、診断デバイス。
【請求項３９】
前記グリコ化非ヘモグロビンタンパク質が、アルブミンである、請求項２２に記載の診断デバイス。
【請求項４０】
第１の緩衝液が、約５．０〜約７．０のｐＨを有し、該第２の緩衝液が、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の診断デバイスを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権情報）
本出願は、２００１年１月３１日に出願された米国特許出願番号６０／２６５，２２９の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、反射率メーターでの使用に適切な、生物学的サンプル中のグリコ化タンパク質のパーセントを定量するための方法（例えば、糖尿病患者による血糖濃度の自己モニタリングに使用される）に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
糖尿病患者の血糖濃度のコントロールは、疾患の長期の微小血管および神経学的な合併症の頻度および重症度を減少させることが示された。血液中のグリコ化ヘモグロビンおよびグリコ化タンパク質の測定法は、血糖濃度が延長時間にわたってどのくらい処理されたかを決定するために使用される。
【０００４】
グリコ化ヘモグロビンの形成速度は、血液中のグルコース濃度と直接的に関係がある。平均の赤血球寿命は１２０日であり、ヘモグロビンのグリコ化パーセントの定量は、２〜３ヶ月前にわたるグルコースの平均の濃度の基準（これは、その期間にわたる糖血症コントロールの基準である）と関連がある（例えば、「Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ」，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３２９，９７７−９８６（１９９３）および「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｔｅｓｔｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｅｍｉａ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ」，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２０（前出１）、Ｓ１８−Ｓ２０（１９７７）を参照のこと）。
【０００５】
グルコースもまた、血液中の非ヘモグロビンタンパク質（例えば、アルブミン）に接触する。アルブミンは、最も豊富な血清タンパク質であり、そしてその循環する半減期は、約２０日であるので、グリコ化タンパク質の濃度は、２〜３週間前にわたる、平均のグルコース濃度の基準である。このグルコースの基準は、測定時間でのグルコース濃度を直接与える。
【０００６】
固定化ジヒドロキシボリル化合物は、グリコ化タンパク質の炭水化物の１，２のシスジオールに結合してグリコ化タンパク質を非グリコ化タンパク質から分離するために有用であるとして報告されている。グリコ化パーセントを決定するために、カラムクロマトグラフィー方法でのこの技術の使用が報告されている（Ｄｅａｎから１９８１年５月２６日に発行された米国特許第４，２６９，６０５号およびＲｏｓｅｎｔｈａｌから１９９４年２月８日に発行された米国特許第５，２８４，７７７号を参照のこと）。これらの方法は、サンプル中の非グリコ化タンパク質からグリコ化タンパク質を分離するために、カラムのアガロースビーズ上に固定されたホウ酸塩誘導体を使用するために言及される。これらの方法は、アガロースビーズに付着されたアフィニティー結合剤の容量を過剰に充填しないように、サンプルの特定の希釈およびピペッティングを必要とする。アガロースビーズ上に固定されたホウ酸塩誘導体の使用は、適切な適用に役立つようではない。
【０００７】
Ｋｒｉｃｋａらから１９９２年５月５日に発行された米国特許第５，１１０，７４５号は、サンプル中のグリコ化タンパク質を検出する方法を記載し、ここでこのサンプルは、溶液中で定義された過剰のホウ素酸塩化合物と接触される。得られた非結合ホウ素酸塩は、サポートマトリックス上の固定化グリコ化分子にそれを結合し、そして複合体化されていないグリコ化分子の量を測定することによって測定されることが言及されている。この方法は、以下に挙げられる多数の工程を必要とするようである：固相支持への適用前に溶液中で分離反応させる工程、生物学的サンプルに添加された結合剤の量が過剰であることを確実にするためにサンプルを希釈する工程であって、タンパク質のグリコ化のパーセンテージを決定するための分離アッセイを実行する工程ならびに複数の結合および洗浄をする工程。
【０００８】
グリコ化ヘモグロビンの測定法のためのディップスティック方法は、Ｗａｇｎｅｒから１９８９年８月２９日に発行された米国特許第４，８６１，７２８号に記載される。この方法は、蛍光標識に結合したジヒドロキシボリルと混合する前に、溶解血液サンプルと固相支持に結合したヘモグロビン結合剤を接触させる工程を包含することが言及されている。このサポートは、非グリコ化ヘモグロビンおよび蛍光標識したグリコ化ヘモグロビンに結合することが言及されている。蛍光標識は、ジヒドロキシボロニル化合物を介して、グリコ化ヘモグロビンに結合することが言及されている。この固相は、サンプルから取り除かれ、そして全ヘモグロビンが反射率測光によって測定されるのに対し、グリコ化ヘモグロビンは蛍光を使って測定される。この方法は、一定量のサンプルに蛍光標識されたジヒドロキシボリル試薬の添加およびサンプルから取り除いた後、リンスする工程を必要とすることが言及されている。さらに、定量のための２つの異なる測定法方法が必要である。
【０００９】
他のアッセイにおいて（例えば、日本国特許番号第６，０５８，９３６号、欧州特許番号第４５５２２５号および公開ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０３６５７を参照のこと）、検出可能な標識に結合したホウ素酸塩誘導体（例えば、蛍光性化合物、化学発光化合物、アイソトープ、酵素、あるいは他の標識）が、使用されることが言及されている。グリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質の両方は、一般的なアフィニティー結合剤（例えば、抗体）を用いて、固相支持に結合される。ホウ素酸塩ラベル化複合体が、添加され、そして固相支持に結合しているままの標識の量が測定される。これらの型のそれぞれの方法は、グリコ化タンパク質の標識するさらなる工程を必要とする。さらに、これらのアッセイは、全部のタンパク質およびグリコ化タンパク質を定量化するための異なる測定方法を使う。
【００１０】
公開ＰＣＴ出願ＷＯ９８４０７５０（１９９８年９月１７日に公開）は、固定化ホウ酸塩がサンプル中のグリコ化ヘモグロビンに結合する、グリコ化ヘモグロビンのパーセンテージを決定する方法を記載される。このグリコ化ヘモグロビン結合の量は、サンプル中のグリコ化ヘモグロビンのフラクションに比例していることが言及されている。これは、グリコ化パーセントを決定するために非グリコ化ヘモグロビンを測定する必要性を排除する。しかし、方法の結果は、ホウ酸化サポートとのグリコ化タンパク質のインキュベーション時間に依存して変化し得るようである。
【００１１】
その結果、生物学的サンプル中のグリコ化タンパク質の量を定量化するための、シンプルで、迅速な効果的な方法であってサンプルの希釈を必要とせず、最小の手順工程を必要とし、シンプルな検出デバイス（例えば、携帯型の反射率メーター）と組み合わせて使用され得，そして標準的なストリップアッセイ（ｓｔｒｉｐ  ａｓｓａｙ）に適応可能である、方法の必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、生物学的サンプル中のグリコ化タンパク質の定量のための方法、これらの方法を使用するデバイス、およびこれらのデバイスを含むキットに関する。
【００１３】
グルコース、グリコ化タンパク質およびグリコ化ヘモグロビンの測定法からの結果は、糖血症コントロールのより完全な像を提供し得る。直接的なグルコース濃度の測定法は、薬物治療、ダイエットおよび運動のための調節に使用され得る。培養期間の糖血症コントロールの測定のために、グリコ化アルブミン濃度の測定法は、ライフスタイルの最近の変化の効果に従わせ得る。長期の糖血症コントロールの測定法のために、グリコ化ヘモグロビン濃度の測定法は、変化の総体的な効果をモニターすることを可能にする。医者のオフィスラボで使用され得、その結果、訪問の間の患者と議論し得または、あるいは家にいる患者によって使用され得るフォーマットで全ての３つのテストをするのが適当である。現在、血糖は、携帯型のメーターおよび簡単に使用するための一片を使って、規定通りにモニターされる。残念ながら、グリコ化タンパク質およびヘモグロビンの類似のテストは、利用可能ではなかった。
【００１４】
本発明の方法は、生物学的サンプル中のグリコ化タンパク質を定量化する方法を提供する。生物学的サンプルは、条件下で固相支持マトリックスと接触される。グリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質の両方は、固相支持マトリックスに結合される。第１の緩衝液の量は、非結合のタンパク質をリンスするために十分に添加される。第１の結合タンパク質の測定は、全体の（グリコ化および非グリコ化）結合タンパク質を測定してなされる。第２の緩衝液は、条件を変える固相支持マトリックスに添加され、その結果、グリコ化タンパク質は、結合され、そして非グリコ化タンパク質は、実質的結合されず、そして非結合（非グリコ化）タンパク質をリンスするために十分な量を添加される。第２の結合タンパク質測定法が作られる。グリコ化タンパク質は、第１および第２の結合タンパク質測定法を用いて定量化される。
【００１５】
１つの局面に従って、本発明は、以下を含むサンプル中のグリコ化タンパク質の定量方法に関する：（ａ）負に荷電した基およびヒドロキシボリル化合物を含み、そして測定領域を有する固相支持マトリックスと、上記測定領域をカバーするために十分な生物学的サンプルのアリコートとを接触する工程；（ｂ）非結合タンパク質をリンスするために十分な第１の緩衝液のアリコートと上記固相支持マトリックスとを接触する工程であって、ここで上記第１の緩衝液は、グリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質の両方が上記固相支持マトリックスに結合するのが可能となるように選択されたｐＨを有する、工程；（ｃ）上記タンパク質の選択した特性の測定法を用いて、上記測定領域に結合したタンパク質を定量して、第１の結合タンパク質読み取りを与える、工程；（ｄ）非結合タンパク質をリンスするために十分な第２の緩衝液のアリコートと上記固相支持マトリックスとを接触する工程であって、ここで上記第２の緩衝液は、グリコ化タンパク質が上記固相支持マトリックスに結合するのが可能となるように選択されたｐＨを有するが、非グリコ化タンパク質は、上記固相支持マトリックスに十分に結合しない、工程；（ｅ）工程（ｃ）において測定された特性の測定法を用いて、上記測定領域に結合するタンパク質を定量して第２の結合タンパク質読み取りを与える、工程；および（ｆ）上記第１および第２の結合タンパク質読み取りを用いてグリコ化タンパク質のパーセンテージを計算する工程。
【００１６】
代替の局面に従って、本発明は、以下を含む生物学的サンプル中のグリコ化タンパク質の量を定量化する方法に関する：（ａ）負に荷電した基およびヒドロキシボリル化合物を含み、そして測定領域を有する固相支持マトリックスと上記測定領域をコートするための十分な生物学的サンプルのアリコートとを接触する工程；（ｂ）非結合タンパク質をリンスするために十分な第１の緩衝液のアリコートと上記固相支持マトリックスとを接触する工程であって、ここで上記第１の緩衝液は約５．０〜約７．０のｐＨを有する、工程；（ｃ）上記測定領域に結合するタンパク質を定量して、第１の結合タンパク質読み取りを与える工程；（ｄ）非結合タンパク質をリンスするために十分な第２の緩衝液のアリコートと上記固相支持マトリックスとを接触する工程であって、ここで上記緩衝液は、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程；（ｅ）上記測定領域に結合するタンパク質を定量して、第２の結合タンパク質読み取りを与える工程；ならびに（ｆ）上記第１の結合タンパク質の読み取りおよび上記第２の結合タンパク質の読み取りを用いて、サンプル中のグリコ化タンパク質のパーセンテージを計算する工程。
【００１７】
好ましくかつ便利には、第１および第２の結合タンパク質の読み取りは、同じ性質を測定する。好ましくは、測定される性質が、光学読み取りである。より好ましくは、光学読み取りは、特定された波長での吸光度または反射率である。
【００１８】
本発明の１つの好ましい局面に従って、生物学的サンプル中のグリコ化ヘモグロビンの定量化のための方法は、提供され、この方法は以下を包含する：（ａ）負に荷電した基およびジヒドロキシボリル化合物を含み、そして上記支持マトリックスと連絡するサンプル適用部位に測定領域を有する固相支持マトリックスと生物学的サンプルを接触させる工程；（ｂ）第１の緩衝液のサンプルのアリコートをサンプル適用部位に添加する工程であって、ここで第１の緩衝液は約５．０〜約７．０のｐＨを有する、工程；（ｃ）ヘモグロビンが光を吸収する波長で上記測定領域の第１の光学読み取りを行う工程；（ｄ）第２の緩衝液のアリコートをサンプル適用部位に添加する工程であって、ここで第２の緩衝液は約８．０〜約１０．０のｐＨを有する、工程；（ｅ）ヘモグロビンが光を吸収する波長で上記測定領域の第２の光学読み取りを行う工程；および（ｆ）第１および第２の光学読み取りを用いて、血液サンプル中のグリコ化ヘモグロビンのパーセンテージを計算する工程。生物学的サンプルが、赤血球を含む血液サンプルである場合、サンプルを、第１の光学読み取りを行う前に、赤血球溶解剤と接触させる。血液サンプルは、固相支持体と接触させる前に赤血球溶解剤で前処理され得る。あるいは、第１の緩衝液は、赤血球溶解剤をさらに含み得るか、または固相支持マトリックスは、生物学的サンプルが接触する前に赤血球溶解剤で処理され得る。
【００１９】
本発明の別の好ましい局面に従って、グリコ化非ヘモグロビンタンパク質を定量化するための方法が、提供され、この方法は以下を包含する：（ａ）負に荷電した基およびジヒドロキシボリル化合物を含み、そして測定領域を有する固相支持マトリックスサンプルと連絡するサンプル適用部位に生物学的サンプルを接触させる工程；（ｂ）第１の緩衝液のアリコートをサンプル適用部位に添加する工程であって、ここで第１の緩衝液は約５．０と約７．０との間のｐＨを有する、工程；（ｃ）タンパク質が光を吸収する波長で測定領域の第１の光学読み取りを行う工程；（ｄ）第２の緩衝液のアリコートをサンプル適用部位に添加する工程であって、ここで第２の緩衝液は約８．０と約１０．０との間のｐＨを有する、工程；（ｅ）タンパク質が光を吸収する波長で上記測定領域の第２の光学読み取りを行う工程；および（ｆ）第１および第２の光学読み取りを用いて、生物学的サンプル中のグリコ化タンパク質のパーセンテージを計算する工程。本発明のこの局面の方法で使用するための適切な生物学的サンプルは、血漿サンプルおよび血清サンプルを含む。この局面に従って定量化するための適切なグリコ化タンパク質は、アルブミンである。特定のグリコ化タンパク質の定量化のために、好ましくは、タンパク質は、適切なタンパク質特異的標識薬剤で標識され得る。
【００２０】
第１の緩衝液として使用のための好ましい緩衝液系は、ＭＥＳ［２（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、ＭＯＰＳ［３（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸］およびＨＥＰＥＳ［Ｎ−２ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸］を含む。
【００２１】
第２の緩衝液として使用のための好ましい緩衝液は、酢酸アンモニウムおよびタウリン緩衝液を含む。
【００２２】
本発明の別の局面に従って、上記の方法を使用するグリコ化タンパク質の定量化のための診断デバイスが、提供される。好ましいタンパク質は、ヘモグロビンまたはアルブミンである。
【００２３】
別の局面において、上記の診断デバイス；約５．０〜約７．０のｐＨを有する第１の緩衝液；および約８．０〜約１０．０のｐＨを有する第２の緩衝液を含むキットが、提供される。
【００２４】
（定義）
本発明に従って、そして本明細書中で使用される場合、以下の用語は、明白に他を述べない限り、以下の意味を有すると定義される：
用語「アルキル」は、直鎖、分枝鎖および環状基（多環基を含む）を含む飽和脂肪族基をいう。
【００２５】
用語「カルボキシレート」または「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨ基をいう。
【００２６】
用語「ホスフェート」は、−ＰＯ４基をいう。
【００２７】
用語「スルフェート」は、−ＳＯ４基をいう。
【００２８】
用語「スルフィナート」は、−ＳＯ２Ｈ基をいう。
【００２９】
用語「スルホニル」は、−ＳＯ３Ｈをいう。
【００３０】
「Ｈｂ」は、ヘモグロビンをいう。
【００３１】
「ＨＥＰＥＳ」は、［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸］をいう。
【００３２】
光吸収および光反射の量の測定の関係で使用される場合、「Ｋ」は、吸収係数をいう。
【００３３】
「ＭＥＳ」は、［２（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］をいう。
【００３４】
「ＭＯＰＳ」は、［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸］をいう。
【００３５】
光吸収および光反射の量の測定の関係で使用される場合、「Ｓ」は、散乱係数をいう。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
１局面によれば、本発明は、生物学的サンプルにおけるグリコ化タンパク質を定量するための方法を提供し、ここで、サンプルおよび試薬は、負に荷電した基およびジヒドロキシボリル化合物を好ましくは含む、固体支持体マトリクスに適用される。全タンパク質およびグリコ化タンパク質の測定は、固体支持体上の一箇所において行われる。この測定は、そのタンパク質の選択された特性を測定することによって簡便に行われ得る。有利なことに、この方法は、生物学的サンプルの容量の測定を必要としない。
【００３７】
１局面において、本発明は、サンプルにおけるグリコ化タンパク質を定量するための方法に関し、ここで、負に荷電した基およびヒドロキシボリル化合物を含み、測定領域を有する固体支持体マトリクスは、この測定領域をカバーするのに十分な生物学的サンプルのアリコートと接触される。次いで、この固体支持体マトリクスは、グリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質の両方が固体状態マトリクスに結合できるように選択されたｐＨを有する第１の緩衝液（未結合タンパク質をリンス除去するのに十分な量）と、接触される。測定領域に結合したタンパク質の量は、そのタンパク質の選択された特性の測定によって定量され、第１の結合タンパク質読み取りを与える。次いで、この固体支持体マトリクスは、グリコ化タンパク質がこの固体支持体マトリクスには結合できるが、非グリコ化タンパク質はこの固体支持体マトリクスに実質的には結合しないように選択されたｐＨを有する第２の緩衝液（未結合タンパク質をリンス除去するのに十分な量）と接触される。測定領域に結合したタンパク質の量は、（第１の結合タンパク質読み取りを得るために使用されたものと）同じ選択された特性の測定によって定量され、第２の結合タンパク質読み取りを与える。グリコ化タンパク質のパーセンテージは、第１および第２の結合タンパク質読み取りを使用して、計算される。
【００３８】
代替の局面によれば、本発明は、サンプルにおけるグリコ化タンパク質を定量するための方法に関し、ここで、負に荷電した基およびヒドロキシボリル化合物を含み、測定領域を有する固体支持体マトリクスが、その測定領域をカバーするのに十分な生物学的サンプルのアリコートと接触される。次いで、この固体支持体マトリクスは、約５．０〜約７．０のｐＨを有する第１の緩衝液（未結合タンパク質をリンス除去するのに十分な量）と接触される。この測定領域に結合したタンパク質の量が定量され、第１の結合タンパク質読み取りを与える。次いで、この固体支持体マトリクスは、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する第２の緩衝液（未結合のタンパク質をリンス除去するのに十分な量）と接触される。この測定領域に結合したタンパク質の量が定量され、第２の結合タンパク質読み取りを与える。生物学的サンプルにおけるグリコ化タンパク質のパーセンテージは、第１の結合タンパク質読み取りおよび第２の結合タンパク質読み取りを使用して、計算される。
【００３９】
本発明の方法は、グリコ化ヘモグロビンタンパク質またはグリコ化非ヘモグロビンタンパク質（例えば、アルブミン）のいずれかの量を定量するために、簡便に使用され得る。
【００４０】
グリコ化ヘモグロビンの定量において、代表的には、血液サンプルが使用される。血液サンプルは、第１の結合タンパク質読み取りがなされる前に、赤血球溶解因子と接触される。このサンプルは、（例えば、サンプルの前処理によって）固体支持体に添加される前に、赤血球溶解因子と接触され得る。また、赤血球溶解因子は、サンプルが支持体に添加される前に、前リンスによって固体支持体に添加され得る。あるいは、第１の緩衝液は、赤血球溶解因子を含み得る。適切な赤血球溶解因子は、当業者に公知であり、そのような因子としてはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０が挙げられる。
【００４１】
好ましくは、第１および第２の結合タンパク質読み取りは、光学的読み取りを含む。より好ましくは、測定される選択された特性は、特定の波長における吸光度または反射率である。
【００４２】
本発明の好ましい局面によれば、この固体支持体マトリクスのジヒドロキシボリル化合物は、以下：
【００４３】
【化３】
2004532388.tif 000003
の構造を有し、ここで、Ｒは、フェニル、置換されたフェニル、水素、および１〜約６個の炭素原子のアルキルからなる群から選択される。Ｒがアルキルである場合、適切なアルキル基として、エチル、１−プロピル、および３−メチル−１−ブチルが挙げられる。好ましくは、Ｒは、ｍ−アミノ−フェニルである。
【００４４】
適切な固体支持体マトリクスとして、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースポリアクリルアミドコポリマー、アガロース、デンプン、ナイロン、ナイロンポリエステル、デキストラン、架橋デキストラン、デキストランアクリルアミドコポリマー、架橋ヒドロキシエチルメタクリレート置換した架橋ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ウール、金属酸化物、親水性有機ポリマーでコートした多孔性セラミックおよびガラスからなる群から選択される支持体が挙げられる。好ましくは、この固体支持体マトリクスは、負に荷電した基を含む。好ましい固体支持体マトリクスは、セルロースである。好ましくは、この負に荷電した基は、リン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、スルフィン酸塩および炭酸塩（またはカルボキシ）から選択される。好ましくは、この負に荷電した基は、カルボキシレートである。
【００４５】
（Ｉ  アッセイ）
本発明の方法の１局面によれば、グリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質の両方が、あるｐＨ条件下で、負に荷電した基および固定されたジヒドロキシボリル含有化合物を含む固体支持体マトリクスに結合される。次いで、この結合した非グリコ化タンパク質は、第２のｐＨ条件下で、選択的に除去される。このグリコ化タンパク質は、第２のｐＨ条件下で、支持体に結合されたままである。総タンパク質の測定は、第１のｐＨ条件下での結合に続いて、行われる。グリコ化タンパク質の測定は、未結合タンパク質を除去するために第２のｐＨ条件下で支持体結合タンパク質複合体をリンスした後、行われる。グリコ化のパーセントは、第１の測定値に対する第２の測定値のパーセントから計算される。このアッセイは、血液サンプル、血清サンプルまたは血漿サンプルにおけるグリコ化ヘモグロビンおよびグリコ化タンパク質の測定に、特に、有用である。
【００４６】
この方法は、毛細血管血、全血、血清または血漿のような、生物学的サンプルについて使用され得る。好ましい局面によれば、１波長が、両方（全タンパク質およびグリコ化タンパク質）について使用され得る。このアッセイは、糖尿病患者による自己血液グルコースモニタリングにおいて使用される同じメーターを用いて使用されるのに容易に適応可能である。両方の測定は、固体支持体上の同じ位置において行われ得るため（実施例５を参照のこと）、支持体における位置間のいかなる差異も、結果に干渉しない。
【００４７】
（ＩＩ  固体支持体マトリクスおよび固定されたバインダー）
固体支持体マトリクスは、多くの天然ポリマー材料または合成ポリマー材料のうちの１つであり得、この材料に、負に荷電した基およびジヒドロキシボリル化合物が結合し得、この材料を通して、サンプルおよび試薬が通過し得る。適切な支持体マトリクスとして、例えば、セルロース、ナイロン、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｎｄｅ）、アガロースポリアクリルアミドコポリマー、アガロース、デンプン、ナイロンポリエステル、デキストラン、架橋デキストラン、デキストランアクリルアミドコポリマー、架橋ヒドロキシエチルメタクリレート置換した架橋ポリスチレンおよびポリビニルアルコールが挙げられる。本発明を用いて利用され得る他の支持体として、米国特許第４，２６９，６０５号に列挙された支持体が挙げられる。さらに、他の適切な支持体は、当業者に公知である。好ましい固体支持体マトリクスは、セルルース紙である。
【００４８】
ジヒドロキシボリル化合物（好ましくは、フェニルボロン酸、ホウ酸または他のボロン酸、より好ましくは、ｍ−アミノフェニルボロン酸）が、機械的手段、物理的手段または化学的手段（好ましくは、共有化学結合）によって、固体支持体に結合され得る。固体支持体マトリクスへの結合は、当該分野で公知の方法によって行われ得る。このような方法として、例えば、Ｄｅａｎらに対する米国特許第４，２６９，６０５（１９８９年５月２６日発行）に列挙された方法が挙げられる。
【００４９】
ジヒドロキシボリル化合物が支持体に結合した後、この支持体は、緩衝液または水によってリンス除去され得る。アッセイされる生物学的サンプルが赤血球を有する場合、このアッセイがグリコ化ヘモグロビンを測定するためである場合、界面活性剤または他の赤血球溶解因子が、必要に応じて、リンスに含まれ得る。赤血球溶解因子としての使用に適した界面活性剤として、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられる。支持体における溶解因子の存在は、全血サンプルからの赤血球の溶解を容易にし得る。あるいは、このサンプルは、赤血球溶解因子で前処理され得るか、またはこの赤血球溶解因子は、第１の緩衝液に含まれ得る。
【００５０】
（ＩＩＩ  固体支持体マトリクスの構成）
本発明の１局面によれば、固体支持体マトリクスは、サンプルおよび緩衝液の流れを操縦するために、他の成分と共にストリップ型の形態で設置される。このサンプルおよび緩衝液は、結合が生じる固体支持体マトリクスを通って流れ、次いで、過剰な溶液を吸収する材料に流れ、これにより適切な容量の緩衝液が通過するのが可能になる。このストリップを通る溶液の流れは、側方流動デバイスにおけるように固体支持体マトリクスの長さに沿って流れ得るか、または垂直流動デバイスにおけるように、固体支持体の厚みを通って流れ得る（このようなストリップ形態の例は、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示される）。
【００５１】
固体支持体における使用に適切な材料として、例えば、セルロース（セルロース紙を含む）、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースポリアクリルアミドコポリマー、アガロース、デンプン、ナイロン、ナイロンポリエステル、デキストラン、架橋デキストラン、デキストランアクリルアミドコポリマー、架橋ヒドロキシエチルメタクリレート置換した架橋ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ウール、金属酸化物、親水性有機ポリマーでコートした多孔性セラミックおよびガラスが挙げられる。
【００５２】
（ＩＶ  サンプルおよび好ましい緩衝液）
本発明の方法に従う使用に適した生物学的サンプルとして、全血、血清および血漿が挙げられる。赤血球は、所望される場合、当該分野で記載された方法の使用によって、サンプルから除去され得る。ガラスファイバー（１０／１６／８４にＶｏｇｅｌらに対して発行された米国特許第４，４７７，５７５号）、キャリア含有炭水化物（７／７／８７にＲａｐｋｉｎに対して発行された米国特許第４，６７８，７５７号）またはポリオールを含むマトリクス（３／１０／９８にＮｅｙｅｒに対して発行された米国特許第５，７２５，７７４号）を使用するこのような方法が、挙げられる。
【００５３】
（特に、非ヘモグロビングリコ化タンパク質の定量についての）好ましい局面によれば、このサンプルは、タンパク質を標識するための「色素」のようなタンパク質特異的結合因子で前処理され得、これは、それらのタンパク質の濃度の測定を容易にし得る。当業者に公知の種々のこのような色素は、本発明の方法を用いて、利用され得る。例えば、フルオレセインイソチオシアネート（「ＦＩＴＣ」）のような蛍光色素が、使用され得る。
【００５４】
サンプルを、固体支持体に添加し、そして支持体を通って流れさせる。この流れは、支持体の長さを通り抜け得るか、または厚さを通り抜け得る。添加されるサンプルの容量は、測定領域を均一にカバーするのに十分な大きさの容量（例えば、約３〜５μＬ）から合理的な時間で支持体を通り抜ける容量（約４０μＬ）の範囲であり得る。実際の容量の制限は、固体支持体および他のストリップ成分の大きさに依存する。より大きな（より広いまたはより長い）ストリップは、より大きな容量のサンプルを処理し得るが、測定領域をカバーするためにより大きな最小容量を必要とする。より小さなストリップは、小さい容量で機能するが、大きな容量を処理することは不可能である。
【００５５】
サンプルが、ストリップに吸収された後、第１の緩衝液が添加される。第１の緩衝液のｐＨは、好ましくは約５．０と約７．０との間である。より好ましくは、第１の緩衝液のｐＨは、グリコ化ヘモグロビンの定量について約５．５〜約７．０であり、そしてグリコ化ヘモグロビンの定量について約５．０〜約６．５である。この緩衝液は、所定の範囲内でのｐＨの制御について適切なｐＫａを有するが、タンパク質の結合に影響しない、適切な緩衝剤を含む。第１の緩衝液における使用に適切な緩衝剤は、当業者に公知である。第１の緩衝液における使用のための好ましい緩衝剤としては、ＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳが挙げられる。緩衝剤は、所望の範囲にｐＨを維持するのに十分な濃度で存在する。緩衝剤について適切な濃度は、約５ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲であり得る。生物学的サンプルが、赤血球細胞を含む場合、緩衝液は、細胞溶解剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０）をさらに含み得る。添加される緩衝液の容量は、過剰の結合していないサンプルを洗い流すのに十分な特定の数の滴下に標準化され得る。リンスの十分さはまた、変化が基本的に０である場合に取られる最終の測定値と共に複数の測定値をとる反射率メーターによってモニターされ得る。
【００５６】
第２の緩衝液は、好ましくは、約８．０〜約１０．０のｐＨを有する。第２の緩衝液は、所定の範囲内でのｐＨの制御について適切なｐＫを有するが、固定化ジヒドロキシボロネート化合物に対するグリコ化タンパク質の結合に干渉しない、適切な緩衝剤を含む。第２の緩衝液における使用ついて適切な緩衝剤は、当業者に公知である。第２の緩衝液における使用のための好ましい緩衝剤としては、酢酸アンモニウムおよびタウリンが挙げられる。緩衝剤は、所望の範囲にｐＨを維持するのに十分な濃度で存在する。緩衝剤についての適切な濃度は、約５ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲であり得るか、あるいは、緩衝剤の溶解度の限界までであり得る。リンスの十分さは、第１の緩衝液について記載されるようにモニターされ得る。必要に応じて、緩衝液は、ボロネートに対するタンパク質の結合の安定化を助ける二価の金属イオン（例えば、Ｍｇ＋＋）を含み得る。
【００５７】
（Ｖ．定量）
各リンスの後、支持体に結合したタンパク質の量は、適切な波長での吸光度または反射率の測定を含む、当業者に公知の測定方法を用いて定量され得る。
【００５８】
この方法の好ましい局面に従って、第１の反射率の測定は、サンプルが添加され、過剰を第１の緩衝液を用いて洗い流した後の固体支持体でなされる。この反射率の測定値は、較正データ由来のアルゴリズムを用いてか、または濃度に比例する値として「Ｋ／Ｓ」値を用いて総タンパク質濃度の計算することに、使用される。第２の反射率の測定は、第２の緩衝液を用いて固体支持体から非グリコ化タンパク質を洗い流した後になされる。この測定値は、第１の測定値と同じ方法でグリコ化タンパク質濃度を計算するために使用される。グリコ化タンパク質のパーセントは、総タンパク質濃度に対するグリコ化タンパク質濃度の比×１００として計算される。
【００５９】
光が透明な媒体に入射する場合、そのいくつかは、吸収され、そしていくつかは媒体を通り抜ける。ベール−ランバートの法則は、吸収される光の量（「Ａ」）が、光を吸収する物質の濃度（「ｃ」）と媒体を透過する光の長さ（「ｄ」）の積である（すなわち、Ａ＝ｅｃｄ、ここでｅは、吸収物質の吸効率である）。光が、固体に入射する場合、固体から反射しない（ｒｅｆｌｅｃｔ  ｏｆｆ）量は、固体によって吸収されるもの、および固体によって散乱されるものによって決定される。この関係性を定義するために使用されるモデルは、クベルカ−ムンク理論である。このモデルは、固体を透過する場合、および固体から散乱して戻される場合の光強度における変化について２つの異なる方程式を定義する。この方程式は、固体相における吸収率であるシンボル「Ｋ」および散乱率であるシンボル「Ｓ」を含む。簡易化された微分において、方程式は、以下に換算される：Ｋ／Ｓ＝［（１−Ｒ）＾２］／（２Ｒ）、ここでＲは、測定された反射率であり、そしてＫ／Ｓは、吸収／散乱物質の濃度に比例する。特定の図（例えば、図７および８を参照のこと）において、反射率メーターを用いて得られるデータは、分析物の濃度に比例するＫ／Ｓのｙ値を用いてプロットされる。
【００６０】
このアッセイにおいて使用される方法論は、グルコースアッセイにおいて使用される手持ち型の反射率メーターとともに使用され得るストリップにおける使用に適用可能である。
【００６１】
固体支持体に結合するタンパク質の総量は、支持体上に固定化される陰性に荷電された基の結合能によって制御される。本発明者らは、グリコ化タンパク質および非グリコ化タンパク質が、サンプル中と同じ比で誘導体化された支持体に迅速に結合することを観察した。支持体に添加されたサンプルの容量は、任意の過剰物が、洗い流されるので測定される必要はない。
【００６２】
報告されるグリコ化のパーセントは、ストリップにおける固体支持体上の同じ位置でなされる２回の測定の比から計算される。それ故、異なるストリップによって結合されるタンパク質の総量における変動は、報告された結果に影響しない。総タンパク質およびグリコ化タンパク質の両方が、固体支持体上の同じ位置で同じ方法を用いて測定されるので、測定に影響し得る変動は、両方の測定に同様に影響し、「ノイズ」を最小化する。
【００６３】
理解の補助のために、ここで、本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。本発明に関連するこれらの実施例は、当然、本発明を特異的に制限するように解釈されるべきではない。また、当業者の範囲内である、現在公知であるか、または後に展開される本発明のこのような改変は、本明細書に記載され、そして本明細書上記で特許請求されるように、本発明の範囲内に含まれると考えられる。
【００６４】
（実施例）
（実施例１）
（ボロネート化固体支持体マトリックスの調製）
本発明の検出方法の好ましい局面に従って、ストリップの構造における使用に適切な固体支持体マトリックスを、従来の結合化学を用いて、カルボキシセルロースベースの材料に対してボロネートの誘導体である、ｍ−アミノフェニルボロネートを共有結合することによって調製する。
【００６５】
（材料）
１．固体支持体マトリックス：共有結合したカルボン酸基を有するセルロースベースの固体（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｃ膜、Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）
２．ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）（Ｐｉｅｒｃｅ）
３．ボロネート誘導体：ｍ−アミノフェニルボロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
４．緩衝液：０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５。
【００６６】
（手順）
４６．７ｍｇ部のｍ−アミノフェニルボロネートを、２５ｍＬの１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液に溶解する。ボロネートが溶解した後に、ｐＨを再度６．５に調整する。２８．９ｍｇ部のＥＤＣを、ＭＥＳボロネート溶液に溶解する。固体支持体マトリックスを、所望される時間の間、この溶液に浸す（２５ｍＬの溶液は、３０ｃｍ２片のマトリックスを処理するのに十分である）。このマトリックスを、この溶液から取り出し、そしてＭＥＳ緩衝液中でリンスし、そして空気乾燥させる。
【００６７】
異なる浸漬時間を用いて上記のように調製されたボロネート化固体支持体マトリックスの結合特性を、実施例２に記載される溶出アッセイを用いて測定した。総ヘモグロビン（白三角形）およびグリコ化ヘモグロビン（黒三角形）の生じた結合を、図１に描写する。白丸は、総ヘモグロビンに対するグリコ化ヘモグロビンの比を示す。
【００６８】
多くのボロネート基を、固体支持体マトリックスに付加するほど、イオン結合のために残されるカルボキシル基が、少ない。総ヘモグロビンに対するグリコ化ヘモグロビンの比は、ボロネート基が十分に存在するまで増加し、次いでこの比は、総結合が減少しても同じままである。
【００６９】
（実施例２）
（可変インキュベート時間の効果）
単一測定アッセイ（「単測法（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ）」）における実施例１のボロネート化支持体を用いるアッセイを、本発明の方法と比較して、それぞれの方法を用いて得られる濃度の結果における可変インキュベート時間の効果を測定した。
【００７０】
以下のアッセイを実行して、２つの方法を比較した。単測法アッセイにおいて、糖尿病でない個体および糖尿病の個体由来の血液溶解物サンプルを、５０ｍＭ  Ｍｇ＋＋を有する５００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝９．５）を用いて１：１に希釈し、そしてこのサンプルを、実施例１のように調製したボロネート化固体支持体マトリックスと種々の時間接触させた。インキュベーションに続いて、このボロネート化固体支持体を、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝９）を用いてリンスした。グリコ化ヘモグロビンを、２００ｍＭのソルビトールを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）からなる溶出緩衝液を用いて溶出した。この溶出液の吸光度を、４１５ｎｍで測定した。
【００７１】
第２のアッセイにおいて、本発明の方法に対応して、糖尿病でない個体および糖尿病の個体由来の血液溶解物サンプルを、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）を用いて１：１に希釈した。このサンプルを、第１のアッセイで用いた時間と同じ時間、ボロネート化固体支持体マトリックスと接触させ、そして第１のアッセイで行った時間と同様の時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、希釈したサンプルを捨て、そしてボロネート化固体支持体を、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）を用いてリンスした。次いで、この固体支持体マトリックスを、５０ｍＭ  Ｍｇ＋＋を含む５００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝９．５）を用いて２回目にリンスした。リンス液の吸光度を、非グリコ化ヘモグロビンに対応する４１５ｎｍで測定した。グリコ化ヘモグロビンを、マトリックスから溶出して除き、そしてこのリンス液の吸光度を測定した。糖尿病のサンプルから得られたデータを、表１に提供する（図２および図３もまた参照のこと）。
【００７２】
【表１】
2004532388.tif 000004
このデータの線形回帰分析は、単測法を用いて得られた結果が、インキュベート時間に非常に依存していたことを明らかに示した。しかし、本発明の方法を用いる場合、得られた結果は、インキュベート時間から独立しており、これはより信頼できる結果を提供し、そしてアッセイをより強固にし、そして訓練されていない使用者にも適すると考えられる。
【００７３】
（実施例３）
（結合におけるｐＨの効果）
緩衝液のｐＨは、ボロネート化支持体に結合するヘモグロビンの量に影響する、ｐＨが低い場合、グリコ化ヘモグロビンおよび非グリコ化ヘモグロビンの両方が結合する。ｐＨが高い場合、グリコ化ヘモグロビンのみが結合する。図４は、実施例２に記載されるアッセイの手順に従う、カルボキシセルロース膜（ボロネート基は存在しない）に対するヘモグロビンの結合を示す。この膜は、ボロネートが存在しない場合、ｐＨ６と７との間でヘモグロビンのイオン結合を損失する。
【００７４】
図５は、実施例１に記載されるように調製された、付加されたボロネート基を有するカルボキシセルロース支持体のヘモグロビンおよびヒト血清アルブミン結合特性を示す。タンパク質の結合は、陰性に荷電したカルボキシル基に起因して、低いｐＨで生じる。フェニルボロネートに起因して高いｐＨで結合するタンパク質は、サンプル中に存在するグリコ化タンパク質である。
【００７５】
（実施例４）
（例示的なストリップ設計構造の説明）
陰性に荷電した基を含むボロネート化固体支持体マトリックスは、非グリコ化タンパク質からのグリコ化タンパク質の分離が必要とされる、任意のアッセイに組込まれ得る。本発明の好ましいアッセイ方法に従って、ボロネート化固体支持体マトリックスを、サンプルおよび緩衝液の流れを指向するための他の成分と組み合わせて使用する。これらの成分は、定量のための小さい手持ち型の反射率メーター中に配置され得る、ストリップの形態中にあり得る。ストリップについての適切な代替の構造を、図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃに示す。
【００７６】
横方向の流動ストリップ構造（図６Ａ）において、流体は、ボロネート化支持体の長さ（支持体の表面に平行）を通って移動する。垂直流動（図６Ｂ）および組合せのストリップ構造（図６Ｃ）において、流体の動きは、固体支持体マトリックスの厚さ（表面に垂直）を通って移動する。
【００７７】
示される各構造は、サンプル適用部位（１、１１または２１）を有し、これはプラスチック片（通常白い外観）（４、１４または２４）における穴である。ボロネート化固体支持体（２、１２または２２）は、ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）材料（６、１６または２６）と接触する。図６Ａに示される構造において、流体は、適用領域（１）からウィッキング材料（６）を通って支持体（２）へ流れ、そして支持体を通ってレザバ（３）へ流れる。図６Ｂおよび６Ｃにおいて示される構造において、流体は、適用領域（１１または２１）およびボロネート化支持体（１２または２２）からウィッキング材料（１６または２６）およびレザバ（１３または２３）へ流れる。全ての成分を、その構造に依存して白（１５）または透明（５または２５）のいずれかの底部のプラスチック片の上に置く。ボロネート化支持体の反射率を、支持体表面上に選択された波長の光を照射すること、およびその強度を測定すること（７、１７または２７）によって測定する。図６Ｂおよび６Ｃに示される構造において、一片の白い反射材料（１８または２８）が支持体の背面に配置され、支持体を通り抜ける光を反射して支持体に通し戻して、強度の損失を減少する。
【００７８】
（実施例５）
（アッセイの比例性：グリコ化ヘモグロビン）
実施例４に記載され、そして図６Ｂに示される垂直の流動ストリップ設計を、正常な血液サンプルおよび糖尿病の血液サンプル由来の血液溶解物の混合物のアッセイに使用した。約８μｌの血液溶解物を、実施例１において調製したボロネート化固体支持体マトリックス上に置いた。次いで、適用部位を、約５０μＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）（１００ｍＭ）を用いてリンスし、そして４３０ｎｍでの反射率測定値を記録した。次いで、この適用部位を、５０ｍＭのＭｇ＋＋を含む、約５０μＬの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝９．５）（５００ｍＭ）を用いてリンスし、そして４３０ｎｍでの第２の反射率測定値を適用部位で記録した。この反射値を、測定されたヘモグロビンの濃度に比例するＫ／Ｓ値に変換した。データを以下の表ＩＩに示す（図７および８を参照のこと）。
【００７９】
【表２】
2004532388.tif 000005
データプロットの回帰統計値を、以下の表ＩＩＩに示す。
【００８０】
【表３】
2004532388.tif 000006
＊各画分についての平均値を用いて計算した
プロットであるＳｙ．ｘおよび得られたＣ．Ｖは、測定された総量およびグリコ化値が、ストリップ間で変動することを示す。しかし、これらの大きな変動は、２つの値の比が取られる場合、減少され、本発明の方法を用いる利点を実証する。これらの結果は、計測されたグリコ化画分が、サンプル中に存在するグリコ化ヘモグロビンの割合に比例することを示す。
【００８１】
用語ＣＶは、変動係数であり、そして平均値周辺の二連の測定値の散乱の尺度である。この係数は、二連からの標準偏差（「ＳＤ」）および平均値（「Ｍ」）から計算される（すなわち、ＣＶ＝１００×ＳＤ／Ｍ）。この値を使用することの利点は、それが、パーセンテージとして発現されるので、平均値を知る必要なく他のＣＶ値と比較し得ることである。
【００８２】
用語Ｓｙ．ｘは、線形回帰計算において使用される変動性の尺度である。これは、「ｘ」の効果を除いた後の「ｙ」の変動性の尺度である（すなわち、これは、回帰直線の周辺データの変動性を測定する）。
【００８３】
（実施例６）
（アッセイの比例性：グリコ化タンパク質）
正常なアルブミンサンプルを、糖尿病でない個体由来の血清から得た。上昇したグリコ化アルブミンサンプルを、インビトロでグリコ化されたヒト血清アルブミンから調製した（１９９６年１２月３１日に発行されたＭｉｃｈａｅｌ  Ｄ．Ｆｉｅｃｈｔｎｅｒらに対する米国特許第５，５８９，３９３号を参照のこと）。
【００８４】
両方のサンプルを、Ｔｉｅｔｚ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｃａｒｌ  Ａ．Ｂｕｒｔｉｓ，Ｅｄｗａｒｄ  Ａｓｈｗｏｏｄ，Ｅｄｓ．，１９９４）９８６〜９８８頁に基づく手動のフラクトサミンアッセイの説明書を用いて、フラクトサミンの量についてアッセイした。上昇したグリコ化アルブミンサンプルは、標準のアルブミンサンプルのフラクトサミンの５．５倍の濃度を含むことが見出された。これらのサンプルを、表ＩＶ（図９および１０もまた参照のこと）に示される割合で共に混合した。生じたサンプルを、実施例２に記載されるようにアッセイし、そして上記のようにＡ２８０での吸光度を記録した。
【００８５】
【表４】
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上記プロットに関する回帰統計を、以下の表Ｖに示す。
【００８６】
【表５】
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計算された、グリコ化アルブミン分画は、フルクトサミン含量に比例していることが認められた。この結果は、Ｒ２の回帰統計によって示されるように、低いサンプル濃度からその５．５倍の低い濃度まで比例する。従って、グリコ化アルブミンを測定するために使用されたこのアッセイ方法は、グリコ化アルブミンの測定に対してもまた適切である。
【００８７】
（実施例７）
（サンプル容積の効果）
実施例４に記載され、図６Ａに示されるような、横方向の流れストリップの形態は、種々のサンプル容積で非糖尿病全血および糖尿病全血を、アッセイするために使用され、アッセイに対するサンプル容積の効果を決定し、実施例５に記載される方法を、その後行った。測定された吸光度値（４１５ｎｍ）は、表ＶＩに示される（図１１および図１２を参照のこと）。
【００８８】
【表６】
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回帰統計は、表ＶＩＩに示される。
【００８９】
【表７】
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この結果は、アッセイにおいて、全ヘモグロビンおよびグリコ化全ヘモグロビンの結合は、全血のアッセイにおいて、容積が、約１０μｌから約４０μｌまでの範囲である場合、サンプル容積に依存しないことを示す。
【００９０】
（実施例８）
（総ヘモグロビン濃度の変化の効果）
希釈された血液サンプルをアッセイするために、アッセイにおける種々の量の総ヘモグロビンの効果を、実施例２に記載される手順を使用して決定した。以下の表ＶＩＩＩは、因子、２、４、８および１６によって希釈された、非糖尿病血液溶解物および糖尿病血液溶解物のアッセイからの吸光度値（４１５ｎｍ）を列挙する（図１３〜図１５を参照のこと）。
【００９１】
【表８】
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回帰統計を、グラフに関する以下の表ＩＸに列挙する。
【００９２】
【表９】
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固相支持マトリクスに結合する、総ヘモグロビン量およびグリコ化ヘモグロビンの量は、総ヘモグロビン濃度の減少と共に減少する。しかし、計算されたグリコ化ヘモグロビン／全ヘモグロビンは、回帰統計で見られるように、アッセイされた希釈物にわたって一定であった（すなわち、傾きが、実質的に０である）。これは、本発明の方法の利点を明示する（すなわち、２つの測定値の比を使用して、サンプルの希釈またはヘモグロビンの濃度に対して独立な結果を生じる）。
【００９３】
（実施例９）
（他の市販のアッセイとの比較）
２５の全血サンプルを、図６Ｃに示されそして実施例４に記載されるストリップ配置を使用し、実施例５に記載されるアッセイ方法に従ってアッセイした。サンプルをまた、ヘモグロビンＡ１ｃに対する、２つの市販の試験を使用して、アッセイした。
【００９４】
本発明の方法と比較される、市販の試験は、以下のとおりである：
（１．Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））
アッセイを、製造業者の使用説明書に従って、ヘモグロビンまたはＨｂＡ１ｃ中のグリコＮ末端バリンの、β鎖の免疫濁度分光法的決定を使用したデスクトップの多重サンプル分析器によって、実行した。各々のサンプルを、本方法で１回、アッセイした。
【００９５】
（２．ＤＣＡ  ２０００（Ｂａｙｅｒ））
アッセイを、製造業者の使用説明書に従って、ＨｂＡ１ｃの免疫濁度分光法的決定を使用したデスクトップのシングルアッセイ分析器によって、実行した。各々のサンプルを、本方法を使用して、１回、アッセイした。
【００９６】
この結果は、図１６Ａおよび図１６Ｂにプロットされ、そしてこの結果は、比較される方法および本発明の方法を使用して得られた結果が、関連することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、浸漬時間に対する、アッセイ中に固体支持体に結合したグリコ化ヘモグロビン（黒三角）および総ヘモグロビン（白三角）の吸光度のグラフ、ならびに総ヘモグロビンに対するグリコ化ヘモグロビンの比のグラフを示す。増加する長さの時間で、ボロネートで誘導体化した、異なる支持体を使用した。
【図２】図２は、単一測定アッセイ（グリコ化物について「＊」）と本発明の方法（総Ｈｂについては黒丸、グリコ化Ｈｂについては白三角）とを比較する、４１５ｎｍでの結合したヘモグロビンの吸光度  対  糖尿病サンプルの血液溶解物についてのインキュベーション時間のグラフを示す。
【図３】図３は、単一測定アッセイ（公開ＰＣＴ出願ＷＯ９８／４０７５０の方法を適応する「＊」）と本発明の方法（白三角）とを比較する、グリコ化ヘモグロビンまたはグリコ化ヘモグロビンの画分の４１５ｎｍでの吸光度  対  糖尿病サンプルの血液溶解物についてのインキュベーション時間のグラフを示す。
【図４】図４は、ｐＨ範囲にわたる、カルボキシセルロース支持体（ボロネート基が付加されていない）に結合したヘモグロビンの吸光度のグラフを示す。
【図５】図５は、ｐＨ範囲にわたる、ボロネート化支持体に結合したヘモグロビン（黒丸）およびアルブミン（白三角）の吸光度のグラフを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の方法に従って使用され得る、３つのストリップ構造を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の方法に従って使用され得る、３つのストリップ構造を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の方法に従って使用され得る、３つのストリップ構造を示す。
【図７】図７は、Ｋ／Ｓ  対  グリコ化ヘモグロビン（「＊」）のグラフを示し、これは、本発明の方法を使用するストリップアッセイ形式におけるサンプル中のグリコ化ヘモグロビンの濃度に対する、本発明のアッセイ結果の比例性を示す（白三角は、総ヘモグロビンを表す）。
【図８】図８は、グリコ化ヘモグロビンのＫ／Ｓ率（グリコ化ヘモグロビンを総ヘモグロビンで除算した）  対  グリコ化ヘモグロビン％のグラフを示し、これは、総ヘモグロビン本発明の方法を使用するストリップアッセイ形式におけるサンプル中のグリコ化ヘモグロビンの濃度に対する、Ｋ／Ｓ率の比例性を示す。
【図９】図９は、サンプル中の、総アルブミン（白三角）およびグリコ化アルブミン（「＊」）  対  相対的フルクトサミン含量（グリコ化アルブミンの部分量に対して比例する）についての２８０ｎｍでの吸光度のグラフを示す。
【図１０】図１０は、サンプル中の、総アルブミンに対するグリコ化アルブミンの比（２８０ｎｍでの吸光度）  対  相対的フルクトサミン含量（グリコ化アルブミンの部分量に対して比例する）のグラフを示す。
【図１１】図１１は、横方向流動デバイス（図６Ａを参照のこと）における、結合した総ヘモグロビン（黒三角）およびグリコ化ヘモグロビン（白三角）の４１５ｎｍでの吸光度  対  全血液サンプル容量のグラフを示す。
【図１２】図１２は、横方向流動デバイス（図６Ａを参照のこと）における、総ヘモグロビンで除算したグリコ化ヘモグロビンの比  対  全血液サンプル容量のグラフを示す。
【図１３】図１３は、総ヘモグロビン（白三角）およびグリコ化ヘモグロビン（「＊」）の４１５ｎｍでの吸光度  対  正常血液溶解物の希釈度のグラフを示す。
【図１４】図１４は、総ヘモグロビン（白三角）およびグリコ化ヘモグロビン（「＊」）の４１５ｎｍでの吸光度  対  糖尿病血液溶解物の希釈度のグラフを示す。
【図１５】図１５は、総ヘモグロビンの４１５ｎｍでの吸光度で除算したグリコ化ヘモグロビンの４１５ｎｍでの吸光度  対  正常血液溶解物（「＊」）および糖尿病血液溶解物（白三角）の希釈度のグラフを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ヘモグロビンＡ１ｃについての、本発明のアッセイを使用する全血液アッセイの結果と、２つの他の市販のアッセイを使用する全血液アッセイの結果との間の相関関係を示すグラフを示す。図１６Ａは、本発明のアッセイを使用して得られた結果（実施例９を参照のこと）  対  Ｒｏｃｈｅ（登録商標）Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して得られた結果のプロットを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ヘモグロビンＡ１ｃについての、本発明のアッセイを使用する全血液アッセイの結果と、２つの他の市販のアッセイを使用する全血液アッセイの結果との間の相関関係を示すグラフを示す。図１６Ｂは、本発明のアッセイを使用して得られた結果（実施例９を参照のこと）  対  ＤＣＡ  ２０００（Ｂａｙｅｒ）を使用して得られた結果のプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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