(57)【要約】本発明は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を引起こすＳＣＮ５Ａ中の特定の突然変異に指向される。該突然変異を有する個人は、ある種の薬剤を投与した場合に、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を発病し易い。この素因は、個人のＳＣＮ５ＡのＤＮＡ配列を分析することによって本発明により診断し得る。該突然変異について個人をスクリーニングすることによって、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を回避し得る。さらに、薬物を試験して、それがトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を引起こすかを判定し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４で示されるポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号：１で示されるＤＮＡに核酸プローブがハイブリダイズするのを妨害するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１記載のＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸プローブ。
【請求項３】
請求項２記載のプローブの薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動に対する素因を引起こす多型を含む核酸に対するハイブリダイゼーションは許容するが該プローブの配列番号：１で示される核酸に対するハイブリダイゼーションは妨害するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＤＮＡまたはＲＮＡの患者の試料に該プローブをハイブリダイズさせることを含み、ここにハイブリダイゼーションシグナルの存在が該多型の存在を示すことを特徴とする該多型を診断する方法。
【請求項４】
患者のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅させておき、該増幅ＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイズさせる請求項３記載の方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーションをイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で行う請求項３記載の方法。
【請求項６】
配列番号：４で示されるポリペプチドをコードするＳＣＮ５Ａを生じる多型の存在を同定する手段によって行う、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動に対する素因を引起こすヒトＳＣＮ５Ａ中の多型の存在を診断する方法。
【請求項７】
該手段が、
ａ）一本鎖立体構造多型技術を用いて該多型についてアッセイし；
ｂ）ヒトＳＣＮ５Ａを配列決定し；
ｃ）ＲＮアーゼアッセイを行い；
ｄ）対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを行い；
ｅ）単一塩基伸長アッセイを行い；
ｆ）対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応を行い；
ｇ）患者の試料からのＳＣＮ５Ａ遺伝子の全体または一部分を増幅させて増幅配列を作成し、その増幅配列を配列決定し；
ｈ）患者の試料からのＳＣＮ５Ａ遺伝子の全体または一部分を分子クローン化してクローン化配列を作成し、そのクローン化配列を配列決定し；
ｉ）患者の試料中のＳＣＮ５Ａ遺伝子配列を増幅させ、その増幅配列を野生型ＳＣＮ５Ａ遺伝子配列を含む核酸プローブにハイブリダイズさせ；
ｊ）該組織中のＳＣＮ５Ａ遺伝子配列を増幅させ、その増幅配列を突然変異ＳＣＮ５Ａ遺伝子配列を含む核酸プローブにハイブリダイズさせ；
ｋ）ＳＣＮ５Ａ遺伝子配列または突然変異ＳＣＮ５Ａ遺伝子配列を含む１またはそれを超える核酸プローブを用いて患者の試料からのＳＣＮ５Ａ遺伝子のイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションを測定し；
ｌ）イムノブロッティングを行い；ついで
ｍ）免疫組織化学を行う
ことを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
配列番号：４で示される単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項８記載のポリペプチドに結合するが、野生型ＳＣＮ５Ａポリペプチドには結合しない抗体。
【請求項１０】
患者の試料と請求項９記載の抗体とを反応させることによって患者における突然変異ＳＣＮ５Ａポリペプチドの存在についてアッセイすることからなり、ここに陽性の反応が薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動に対する素因を示すことを特徴とする薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動に対する素因を診断する方法。
【請求項１１】
該抗体がモノクローナル抗体である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該アッセイがイムノブロッティングを含む請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
該アッセイが免疫組織化学技術を含む請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
個人からのＳＣＮ５Ａポリペプチドを配列決定するかまたは該個人由来の核酸から合成したＳＣＮ５Ａポリペプチドを配列決定することを含み、ここにアミノ酸残基１１０３にチロシンが存在することが薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動に対する素因を示すことを特徴とする該個人における薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動に対する素因を診断する方法。
【請求項１５】
請求項１記載のＤＮＡでトランスフェクトした細胞。
【請求項１６】
請求項１記載の単離されたＤＮＡを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６記載のベクターでトランスフェクトした細胞。
【請求項１８】
請求項１記載のＤＮＡを含む非ヒト−トランスジェニック動物。
【請求項１９】
（ａ）突然変異を有するＳＣＮ５Ａを発現する第１のセットの細胞を浴用溶液に入れ；
（ｂ）工程（ａ）の細胞において第１の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｃ）該第１の誘導Ｎａ＋電流を測定し；
（ｄ）野生型ＳＣＮ５Ａを発現する第２のセットの細胞を浴用溶液に入れ；
（ｅ）工程（ｄ）の細胞において第２の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｆ）該第２の誘導Ｎａ＋電流を測定し；
（ｇ）薬剤を工程（ａ）の浴用溶液に添加し；
（ｈ）工程（ｇ）の細胞において第３の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｉ）該第３の誘導Ｎａ＋電流を測定し；ついで
（ｊ）該第３の誘導Ｎａ＋電流が第１の誘導Ｎａ＋電流よりも第２の誘導Ｎａ＋電流により類似しているかを判定し、ここに第１の誘導Ｎａ＋電流よりも第２の誘導Ｎａ＋電流に近接する第３の誘導Ｎａ＋電流を生じる薬剤が該個人を治療するのに有用であることを含み、該突然変異が配列番号：４で示されるポリペプチドをコードするＳＣＮ５Ａを生じることを特徴とする、ＳＣＮ５Ａ中に突然変異を有する個人を治療するのに有用である薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
該第１のセットの細胞、該第２のセットの細胞または両セットの細胞をトランスジェニック動物から得る請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該第１のセットの細胞、該第２のセットの細胞または両セットの細胞をヒトＳＣＮ５ＡのＲＮＡでトランスフェクトする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）野生型ＳＣＮ５Ａを発現する細胞を浴用溶液に入れて電流を測定し；
（ｂ）工程（ａ）の細胞において第１の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｃ）該第１の誘導Ｎａ＋電流を測定し；
（ｄ）突然変異ＳＣＮ５Ａ（ここに該突然変異ＳＣＮ５Ａは配列番号：４で示されるポリペプチドをコードする）を発現する細胞を浴用溶液に入れて電流を測定し；
（ｅ）工程（ｄ）の細胞において第２の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｆ）該第２の誘導Ｎａ＋電流を測定し；
（ｇ）薬剤を工程（ｄ）の浴用溶液に入れ；
（ｈ）工程（ｇ）の細胞において第３の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｉ）該第３の誘導Ｎａ＋電流を測定し；ついで
（ｊ）該薬剤が、該第２の誘導Ｎａ＋電流と比較して該第１の誘導Ｎａ＋電流により類似するかまたはあまり類似しない該第３の誘導Ｎａ＋電流を生じるかを判定することを含み、
ここに該第２の誘導Ｎａ＋電流よりも該第１の誘導Ｎａ＋電流により類似する該第３の誘導Ｎａ＋電流を生じる薬剤が薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を治療または予防するのに有用であることを特徴とする、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を治療または予防するのに有用である薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
ｉ）工程（ａ）の該細胞、ｉｉ）工程（ｄ）の該細胞またはｉｉｉ）工程（ａ）および（ｄ）の該細胞をＲＮＡでトランスフェクトする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）野生型ＳＣＮ５Ａでトランスフェクトしたトランスジェニック動物を調製し；
（ｂ）該トランスジェニック動物のトランスジェニック細胞において第１の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｃ）該第１の誘導Ｎａ＋電流を測定し；
（ｄ）突然変異ＳＣＮ５Ａでトランスフェクトしたトランスジェニック動物を調製し、ここに該突然変異ＳＣＮ５Ａは配列番号：４で示されるポリペプチドをコードし；
（ｅ）工程（ｄ）のトランスジェニック動物のトランスジェニック細胞において第２の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｆ）該第２の誘導Ｎａ＋電流を測定し；
（ｇ）薬剤を工程（ｄ）のトランスジェニック動物に投与し；
（ｈ）工程（ｇ）の該トランスジェニック動物のトランスジェニック細胞において第３の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
（ｉ）該第３の誘導Ｎａ＋電流を測定し；ついで
（ｊ）該第３の誘導Ｎａ＋電流が該第２の誘導Ｎａ＋電流と比較して該第１の誘導Ｎａ＋電流により類似しているかまたはあまり類似していないかを判定することを含み、
ここに該第２の誘導Ｎａ＋電流よりも該第１の誘導Ｎａ＋電流により類似する該第３の誘導Ｎａ＋電流を生じる薬剤が薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を治療または予防するのに有用であることを特徴とする薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を治療または予防するのに有用である薬剤についてスクリーニングする方法。
【請求項２５】
ａ）突然変異ＳＣＮ５Ａ（ここに該突然変異ＳＣＮ５Ａは配列番号：４で示されるポリペプチドをコードする）を発現する細胞を浴用溶液に入れて電流を測定し；
ｂ）工程（ａ）の細胞において第１の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
ｃ）該第１の誘導Ｎａ＋電流を測定し；
ｄ）薬剤を工程（ｃ）の浴用溶液に添加し；
ｅ）工程（ｄ）の細胞において第２の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
ｆ）該第２の誘導Ｎａ＋電流を測定し；ついで
ｇ）該薬剤が該第１の誘導Ｎａ＋電流とは異なる該第２の誘導Ｎａ＋電流を生じるかを判定し、ここに異なる電流が誘導された場合に、該薬剤が該患者にトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を誘導する危険性を有するとすることを含む該薬剤が該患者にトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を誘導する危険性を有するかを判定する方法。
【請求項２６】
該細胞をトランスジェニック動物から得る請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該細胞を配列番号：４で示されるポリペプチドをコードするヒトＳＣＮ５ＡのＲＮＡでトランスフェクトする請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
ａ）突然変異ＳＣＮ５Ａでトランスフェクトしたトランスジェニック動物を調製し、ここに該突然変異ＳＣＮ５Ａは配列番号：４で示されるポリペプチドをコードし；
ｂ）工程（ａ）の該トランスジェニック動物のトランスジェニック細胞において第１の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
ｃ）該第１の誘導Ｎａ＋電流を測定し；
ｄ）薬剤を該トランスジェニック動物に投与し；
ｅ）工程（ｄ）の該トランスジェニック動物のトランスジェニック細胞において第２の誘導Ｎａ＋電流を誘導し；
ｆ）該第２の誘導Ｎａ＋電流を測定し；ついで
ｇ）該第２の誘導Ｎａ＋電流が該第１の誘導Ｎａ＋電流とは異なるかを判定し；
ここに異なる電流を生じる薬剤が配列番号：４で示されるポリペプチドをコードする遺伝子を含む個人にトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を誘導する危険性を示すことを特徴とするトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を誘導する危険性を示す薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
（ａ）突然変異ＳＣＮ５Ａでトランスフェクトしたトランスジェニック動物を調製し、ここに該突然変異ＳＣＮ５Ａは配列番号：４で示されるポリペプチドをコードし；
（ｂ）薬剤を工程（ａ）のトランスジェニック動物に投与し；ついで
（ｃ）該薬剤が該トランスジェニック動物に薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を誘導したかを判定することを含むトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を誘導する危険性を示す薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項３０】
ａ）請求項１５記載の宿主細胞を準備し；
ｂ）試験すべき化合物の不存在下で配列番号：４で示されるタンパク質の活性を測定し；
ｃ）該宿主細胞と該化合物とを接触させ；ついで
ｄ）該化合物の存在下で該タンパク質の該活性を測定することを含み、
ここに工程（ｂ）で測定した活性と工程（ｄ）で測定した活性との間の差異が該化合物による調節を示すことを特徴とする配列番号：４で示されるタンパク質の活性を該化合物が調節できるかを判定する該化合物を試験する方法。
【請求項３１】
該宿主細胞をＲＮＡでトランスフェクトする請求項３０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
心臓不整脈による突然死は全自然死の１１％と概算される。不整脈は頻繁に薬物療法、最も一般的には抗不整脈薬剤から生じる。
【０００２】
ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）は、心電図上でのＱＴ間隔の延長ならびに失神、発作および突然死の存在によって特徴付けられる心血管障害である。Ｒｏｍａｎｏ−Ｗａｒｄ症候群、ＬＱＴＳの常染色体優性形態においては５の遺伝子が関係付けられている。これらの遺伝子はＫＶＬＱＴ１、ＨＥＲＧ、ＳＣＮ５Ａ、ＫＣＮＥ１およびＫＣＮＥ２である。ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１中の突然変異は、常染色体劣性様式で遺伝する表現型異常である聾と関連するＬＱＴＳ形態であるジャーベル・ランゲ・ニールセン症候群をも引起こす。
【０００３】
本発明は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子中の変化ならびに該変化を検出するための方法に関する。
本明細書中で用いる刊行物および他の材料は、発明の背景を説明し、または実施に関するさらなる詳細を供し、出典明示して本明細書の一部とみなし、簡便性のために、各々、添付する参考文献のリストにグループ化する。
本発明は、薬物誘導型トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動と関連しているＳＣＮ５Ａ遺伝子中およびその遺伝子産物中の変化、ならびにこれらの障害の診断および予防方法に指向される。これらの薬物誘導型の身体的障害は、試験すべき個人のＳＣＮ５Ａ遺伝子のＤＮＡ配列を分析し、そのＤＮＡ配列を正常遺伝子の公知のＤＮＡ配列と比較することによって、本発明により診断する。薬物誘導型トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の予測により、医療実務者は、既存の医療療法を用いてこの障害を予防することができる。
【０００４】
心臓不整脈は、全自然死のほぼ１１％と概算される、病的状態および死亡の一般的な原因である（Ｋａｎｎｅｌ，１９８７；Ｗｉｌｌｉｃｈら，１９８７）。一般的に、生命を脅かす心室不整頻搏を患う個人の前症候的な診断および治療はほとんど存在せず、医療管理が実際には不整脈および死の危険性を増大する場合もある（Ｃａｒｄｉａｃ Ａｒｒｙｔｈｍｉａ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｉａｌ ＩＩ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ， １９９２）。これらの因子により、心臓不整脈の危険の高い個人の早期の検出および不整脈の予防は、優先順位が高いものとなっている。
【０００５】
遺伝性および後天性の両方の因子が、心臓不整脈を発病する危険性に寄与している。ＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）は、心室不整頻搏、詳細にはトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動、から突然の意識喪失、失神、発作および突然死を引起こす先天性の心臓不整脈である（Ｗａｒｄ，１９６４；Ｒｏｍａｎｏ，１９６５；Ｓｃｈｗａｒｔｚら，１９７５；Ｍｏｓｓら，１９９１）。この障害は通常若年期のほか、健康な個人でも起こる（Ｗａｒｄ，１９６４；Ｒｏｍａｎｏ，１９６５；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９７５）。大部分のＬＱＴ遺伝子は心電図上におけるＱＴ間隔の明白な延長、異常な心臓再分極の徴候を運搬している（Ｖｉｎｃｅｎｔら，１９９２）。ＬＱＴの臨床的な特徴は、エピソード的な心臓不整脈、詳細にはこの不整脈および心室細動における心電図の特徴的な波形性質について命名された、トルサード・デ・ポワンツのような再分極に関連する心室不整頻搏から生じる（Ｓｃｈｗａｒｔｚら， １９７５； ＭｏｓｓおよびＭｃＤｏｎａｌｄ， １９７１）。トルサード・デ・ポワンツは、心室細動、特に致死不整脈に変性し得る。ＬＱＴは一般的な診断ではないが、心室不整脈は非常に一般的であり；３００，０００人を超える合衆国国民が毎年突然死亡している（Ｋａｎｎｅｌら，１９８７；Ｗｉｌｌｉｃｈら，１９８７）。そして、多くの症例において、根底にある機作は異常な心臓再分極とし得る。したがって、ＬＱＴは、分子レベルで生命を脅かす心臓不整脈を研究する唯一の機会を提供する。
【０００６】
先天性および後天性の両方の形態のＬＱＴが明らかにされている。後天性ＬＱＴおよび続発性の不整脈は、心臓虚血、徐脈ならびに低い血清カリウムまたはカルシウム濃度のごとき代謝異常から生じ得る（Ｚｉｐｅｓ， １９８７）。ＬＱＴは、抗生物質、抗ヒスタミン剤、全身麻酔を含む特定の薬物療法、および最も一般的には抗不整脈薬剤療法を用いた治療からも生じ得る（Ｚｉｐｅｓ， １９８７）。先天性形態のＬＱＴは、少なくとも５の異なる遺伝子中の突然変異から発生し得る。以前の研究においては、ＬＱＴ遺伝子座は染色体１１ｐ１５．５（ＫＶＬＱＴ１またはＬＱＴ１）（Ｋｅａｔｉｎｇら， １９９１ａ； Ｋｅａｔｉｎｇら， １９９１ｂ）、７ｑ３５−３６（ｚＨＥＲＧまたはＬＱＴ２）、３ｐ２１−２４（ＳＣＮ５ＡまたはＬＱＴ３）（Ｊｉａｎｇら， １９９４）にマッピングされた。これらの中で、先天性ＬＱＴの最も一般的な原因はＫＶＬＱＴ１である。本発明者らのデータは、この遺伝子中の突然変異が５０％を超える先天性ＬＱＴの原因であることを示している。第４のＬＱＴ遺伝子座（ＬＱＴ４）は４ｑ２５−２７にマッピングされた（Ｓｃｈｏｔｔら， １９９５）。また、ＫＣＮＥ１（ＬＱＴ５）も、ＱＴ延長症候群と関連付けられている（Ｓｐｌａｗｓｋｉら， １９９７ｂ； Ｄｕｇｇａｌら， １９８８）。これらの遺伝子は心臓活動電位の発生に関与するイオンチャンネルをコードする。突然変異はチャンネル機能喪失および延長型の心細胞再分極に通じ得る。心筋でのチャンネル発現の領域的ヘテロジェネイティー（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）のため、異常な心臓再分極は不整脈の基礎を作り出している。ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１は内耳においても発現している（Ｎｅｙｒｏｕｄら，１９９７；Ｖｅｔｔｅｒら，１９９６）。本発明者らは、これらの各遺伝子の同型接合または複合異型接合突然変異が聾およびジャーベル・ランゲ・ニールセン症候群の重篤な心臓表現型（Ｎｅｙｒｏｕｄら，１９９７；Ｓｐｌａｗｓｋｉら，１９９７ａ；Ｓｃｈｕｌｔｚｅ−Ｂａｈｒら，１９９７；Ｔｙｓｏｎら，１９９７）を引起し得ることを示している。耳における機能性チャンネルの消失は明らかに内リンパの生成を破壊し、聾に通じる。
【０００７】
現在、ＬＱＴの前症候診断は心電図のＱＴ間隔の延長に基づいている。０．４４秒よりも長いＱＴｃ（心臓の速度に対して補正したＱＴ間隔；Ｂａｚｚｅｔｔ， １９２０）は、伝統的にその個人が患っていると分類している。しかしながら、大部分のＬＱＴ患者は心電図を有していない若年であるか、さもなくば健全な個人である。さらに、遺伝的研究により、ＱＴｃは感受性でも特異的でもないことが示されている（Ｖｉｎｃｅｎｔら，１９９２）。遺伝子キャリアーおよび非キャリアーについてのＱＴｃ間隔のスペクトルは重複し、誤分類に通じる。非キャリアーはＱＴ延長間隔を有し得、患っていると診断される。逆に言えば、＜０．４４秒のＱＴｃ間隔を有するＬＱＴ遺伝子キャリアーも存在するが、なお不整脈について危険性の高い状態にある。正確な前症候診断は、ＬＱＴの有効な遺伝子−特異的な治療のために重要である。
【０００８】
この障害の常染色体優性および常染色体劣性形態が報告されている。常染色体劣性ＬＱＴ（ジャーベル・ランゲ・ニールセン症候群としても知られている）は、先天的神経性聾と関連付けられており；この形態のＬＱＴは稀である（ＪｅｒｖｅｌｌおよびＬａｎｇｅ−Ｎｉｅｌｓｅｎ， １９５７）。常染色体優性ＬＱＴ（Ｒｏｍａｎｏ−Ｗａｒｄ症候群）はより一般的であり、他の表現型異常と関連付けられていない（Ｒｏｍａｎｏら， １９６３； Ｗａｒｄ， １９６４）。後天性ＬＱＴに酷似する障害も、通常、薬理学的療法の結果として獲得し得る（Ｓｃｈｗａｒｔｚら， １９７５； Ｚｉｐｅｓ， １９８７）。
【０００９】
データは、ＬＱＴにおける不整脈の機構について意味を有する。ＬＱＴについての２の仮説が以前から提唱されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚら， １９９４）。その１は、左自律神経神経感応の優性が異常な心臓再分極および不整脈を引起こすことを示している。この仮説は、右側の星状神経節の切除によってイヌにおいて不整脈が誘導し得るという知見によって支持されている。また、逸話的な事実は、β−アドレナリン遮断剤によっておよび右側の星状神経節摘出術によって効果的に治療されるＬＱＴ患者が存在することを示している（Ｓｃｈｗａｒｔｚら， １９９４）。ＬＱＴに関連する不整脈についての第２の仮説は、心臓に特異的なイオンチャネル遺伝子または心臓のイオンチャネルを調節する遺伝子における突然変異が筋細胞再分極延長を引起こすことを示している。筋細胞再分極延長はＬ型カルシウムチャネルの再活性化を促進して、二次的な脱分極を生じ得るであろう（ＪａｎｕａｒｙおよびＲｉｄｄｌｅ， １９８９）。これらの二次的な脱分極は、可能性として存在するトルサード・デ・ポワンツ不整脈の細胞機構である（Ｓｕｒａｗｉｃｚ， １９８９）。この仮説は、カリウムチャネルの薬理学的遮断がヒトおよび動物モデルにおけるＱＴ延長および再分極に関連する不整脈を誘導し得るという知見によって支持されている（ＡｎｔｚｅｌｅｖｉｔｃｈおよびＳｉｃｏｕｒｉ， １９９４）。１の形態のＬＱＴが心臓カリウムチャネル遺伝子中の突然変異から生じるという発見は、筋細胞仮説を支持している。
【００１０】
理論的に、心臓ナトリウムチャネル遺伝子中の突然変異はＬＱＴを引起こし得るであろう。電位依存性ナトリウムチャネルは心室筋細胞における迅速な脱分極を媒介し、活動電位のプラトー相の間に微小電流も伝導する（Ａｔｔｗｅｌｌら， １９７９）。ナトリウムチャネル機能の微小な異常（例えば、ナトリウムチャネル不活化延長またはチャネル不活化の変化した電位依存性）は心臓再分極を延長し、ＱＴ延長および不整脈に通じ得る。１９９２年に、Ｇｅｌｌｅｎｓおよび共同研究者は、心臓ナトリウムチャネル遺伝子、ＳＣＮ５Ａをクローン化し特徴付けした（Ｇｅｌｌｅｎｓら， １９９２）。この遺伝子の構造は以前に特徴付けられた他のナトリウムチャネルに類似し、２０１６アミノ酸の大きなタンパク質をコードしている。これらのチャネルタンパク質は４の相同ドメイン（ＤＩ−ＤＩＶ）を含み、その各々には６の推定される膜に広がる（ｓｐａｎｎｉｎｇ）セグメント（Ｓ１−Ｓ６）が含まれる。ＳＣＮ５Ａは染色体３ｑ２１にマッピングされており、ＬＱＴ３の最も有力な候補遺伝子となり（Ｇｅｏｒｇｅら， １９９５）、その後にこの遺伝子はＬＱＴ３と関連することが証明された（Ｗａｎｇら， １９９５）。
【００１１】
１９９４年に、ＷａｒｍｋｅおよびＧａｎｅｔｚｋｙは新規なヒトｃＤＮＡ、ヒトｅｔｈｅｒ ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子を同定した（ＨＥＲＧ、ＷａｒｍｋｅおよびＧａｎｅｔｚｋｙ，１９９４）。ＨＥＲＧは体細胞ハイブリッド・パネルのＰＣＲ分析によってヒト第７染色体に位置決定され（ＷａｒｍｋｅおよびＧａｎｅｔｚｋｙ，１９９４）、ＬＱＴ２の候補となっている。カリウムチャネルに対するアミノ酸配列ホモロジーが予想されている。ＨＥＲＧは、カルシウム調節カリウムチャネルをコードするキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｅｔｈｅｒ ａ−ｇｏ−ｇｏ遺伝子（ｅａｇ）に対するホモロジーによって海馬ｃＤＮＡライブラリーから単離された（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，１９９３）。ＨＥＲＧはｅａｇのヒト相同物ではないが、〜５０％のアミノ酸配列ホモロジーしか共有していない。ＨＥＲＧはＬＱＴ２と関連することが示されている（Ｃｕｒｒａｎら， １９９５）。
【００１２】
ＬＱＴ１は、遺伝子ＫＶＬＱＴ１と連鎖することが見出されている（Ｑ． Ｗａｎｇら， １９９６）。ＫＶＬＱＴ１中に突然変異を有する１６の家族が同定され、特徴付けられ、１６すべての家族においてＬＱＴ１とＫＶＬＱＴ１との間に完全な連鎖が存在することが示された。ＫＶＬＱＴ１は選書抗体１１ｐ１５．５にマッピングされ、ＬＱＴ１の候補遺伝子となっている。ＫＶＬＱＴ１はカリウムチャネルの構造特徴を有するタンパク質をコードし、ノザンブロット分析によって測定したこの遺伝子の発現は、ＫＶＬＱＴ１は心臓で最も強く発現していることを示した。ＬＱＴを引起こす１の遺伝子内の欠失および１０の異なるミスセンス突然変異がＫＶＬＱＴ１中に同定された。これらのデータは、ＫＶＬＱＴ１が新規な心臓カリウムチャネル遺伝子であることを明確にし、この遺伝子中の突然変異が心室不整頻搏および突然死に対する感受性を引起こすことを示している。
【００１３】
ＩＫｓチャネルの１のコンポーネントがｍｉｎＫ、単一の推定貫膜ドメインを有する１３０アミノ酸のタンパク質であることが知られていた（Ｔａｋｕｍｉら， １９８８； ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｉｌｌｅｒ， １９９１； Ｈａｕｓｄｏｒｆｆら， １９９１； Ｔａｋｕｍｉら， １９９１； Ｂｕｓｃｈら， １９９２； ＷａｎｇおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ， １９９５； ＫＷ Ｗａｎｇら， １９９６）。このタンパク質のサイズおよび構造は、ｍｉｎＫが単独で機能性チャネルを形成するのではなさそうなものとしている（Ａｔｔａｌｉら， １９９３； Ｌｅｓａｇｅら， １９９３）。ＫＶＬＱＴ１およびｍｉｎＫが共同会合して心臓ＩＫｓカリウムチャネルを形成する事実が示された（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら， １９９６）。ＩＫｓ機能不全は心臓不整脈の原因である。ＫＣＮＥ１中の突然変異（ｍｉｎＫをコードする）もＬＱＴを生じることが後に示された（Ｓｐｌａｗｓｋｉら， １９９７ｂ）。
【００１４】
発明の概要
本発明は、薬物誘導型トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動と関連付けられたＳＣＮ５Ａ中の１の突然変異に指向される。
本発明の１の態様において、ＳＣＮ５Ａ中の特定の突然変異とトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動との関連を提供する。
【００１５】
本発明の第２の態様において、薬物誘導型トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に感受性の対象を早期に診断するためのＳＣＮ５Ａ遺伝子の解析を提供する。当該診断法には、試験すべき個人のＳＣＮ５ＡのＤＮＡ配列を解析し、ついで天然の非変異型遺伝子のＤＮＡ配列とそれを比較することが含まれる。薬物誘導型トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因を予想する能力により、医師は、適当な薬物療法を指示することによって感受性患者におけるこれらの症状を予防することが可能となるであろう。
【００１６】
本発明は、個人を薬物誘導型トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に罹りやすくするＳＣＮ５Ａ突然変異を有する個人におけるトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を治療または予防するのに使用し得る薬剤候補をスクリーニングする方法にも指向される。本発明のもう１の態様は、薬剤をＳＣＮ５Ａ中に突然変異を有する個人に投与した場合にトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動の発生を生じるかを判定する該薬剤のスクリーニング方法である。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に患者を罹りやすくするであろうＳＣＮ５Ａ中の特定の突然変異を患者が有するかを判定することに指向される。さらに、本発明は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を引起こすこのＳＣＮ５Ａ遺伝子変異型の存在ついてヒトをスクリーニングする方法に指向される。ここでは、この罹りやすさはより早期（すなわち、病徴が現れる前に）かつより明確に検出し得るため、突然変異を有すると同定された個人について、より良好な治療選択肢が利用可能であろう。本発明は、トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を治療または予防するのに有用な薬剤をスクリーニングする方法にも指向される。
【００１８】
本発明は、特定の突然変異を同定するためのＳＣＮ５Ａ遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。さらに、かかる方法は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の一部分を増幅する工程を含み得、さらに、該ＳＣＮ５Ａの一部分を増幅するためのプライマーである１セットのポリヌクレオチドを得る工程を含み得る。当該方法は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因の診断または予測のいずれかに使用するための突然変異を同定するのに有用である。
【００１９】
さらに、本発明は、トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を治療または予防するのに有用な薬剤を同定するための薬剤候補をスクリーニングする方法に指向される。薬剤スクリーニングは、卵母細胞、哺乳動物細胞またはトランスジェニック動物のごとき細胞中で突然変異ＳＣＮ５Ａを発現させ、ついでＳＣＮ５Ａナトリウムチャネルに対する薬剤候補の効果をアッセイすることによて行う。その効果を野生型ＳＣＮ５Ａナトリウムチャネル活性と比較する。
【００２０】
さらに、本発明は、突然変異ＳＣＮ５Ａを有する個人に特定の薬剤を投与した場合に当該個人にトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動が生じるかを判定する薬剤をスクリーニングする方法にも指向される。
【００２１】
最後に、本発明は、化合物が突然変異ＳＣＮ５Ａタンパク質の活性を調節し得るかを判定するために当該化合物を試験する方法に指向される。
【００２２】
ＱＴ延長症候群は、心臓不整脈、具体的にはトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動により突然死を引起こす遺伝性または後天性の疾患である。ＬＱＴは以前に４の遺伝子座：染色体１１ｐ１５．５上のＫＶＬＱＴ１、７ｑ３５−３６上のＳＣＮ５Ａ、３ｐ２１−２４上のＳＣＮ５Ａおよび染色体２１ｑ２２．１−２２．２上のＫＣＮＥ１、にマッピングされた。
【００２３】
ＳＣＮ５Ａ遺伝子中の変化は、Ｎａ＋チャネルの多くの身体的特徴における変化を生じ得る。これらには、限定されるものではないが、イオン特異性、不活化の長さ、電流の大きさ、活性化または不活化の電位依存性、動態力学、活性化するための電位閾値が含まれる。先行技術は、変化したＳＣＮ５Ａの存在の結果として変化した活性を有する種々の身体的特徴を教示している。これらの変化の幾つかを論じている刊行物には、Ｖｅｌｄｋａｍｐら（２０００）、Ｋａｍｂｏｕｒｉｓら（２０００）、Ｄｅｓｃｈｅｎｅｓら（２０００）、Ｒｏｏｋら（１９９９）、Ａｎｔｚｅｌｅｖｉｔｃｈら（１９９９）、Ｃｏｕｄｅｒｃら（１９９９）およびＷａｎｇら（１９９６）が含まれる。これらの身体的特徴は調節し得る。例えば、それらを測定可能な量で、ある種の薬剤での治療によって増大または低下し得る。突然変異ＳＣＮ５Ａチャネルを調節するであろう薬剤についてスクリーニングすることが望ましい。大部分の症例においては、突然変異ＳＣＮ５Ａチャネルがより野生型ＳＣＮ５Ａチャネルのように振る舞い、ゲノムが突然変異ＳＣＮ５Ａを含み、これらの薬剤で治療されるべき個人に有利な効果を生じるであろうように、突然変異ＳＣＮ５Ａチャネルを調節することが望ましいであろう。ある種の薬剤の不存在下では野生型ＳＣＮ５Ａチャネルと比較した場合に活性において何ら検出可能な差異を有していない突然変異ＳＣＮ５Ａチャネルの場合においては、野生型ＳＣＮ５Ａチャネルと比較した場合に突然変異ＳＣＮ５Ａチャネルの活性を調節しないであろう薬剤を見出すための突然変異ＳＣＮ５Ａの使用が望ましいであろう。
【００２４】
本発明の診断および予測方法によれば、野生型ＳＣＮ５Ａ遺伝子の変化が検出される。加えて、当該方法は、野生型ＳＣＮ５Ａ遺伝子を検出し、この遺伝子座の結果としての薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の欠如を確認することによって行い得る。
【００２５】
有用な診断技術には、限定されるものではないが、後に詳細に論じる蛍光イン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ解析、サザンブロット解析、一本鎖立体構造解析（ＳＳＣＡ）、ＲＮアーゼ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット解析およびＰＣＲ−ＳＳＣＰが含まれる。また、ＤＮＡマイクロチップ技術の最近開発された技術も有用である。
【００２６】
ヒトを薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に罹りやすくするＳＣＮ５Ａ突然変異の存在は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の突然変異についてヒトのいずれかの組織を試験することによって確認し得る。例えば、生殖細胞系にＳＣＮ５Ａ突然変異を遺伝している個人は薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に罹りやすいであろう。このことは、個人の身体のいずれかの組織からのＤＮＡを試験することによって判定し得る。最も単純には、採血し、かかる血液の細胞からＤＮＡを抽出し得る。加えて、出生前診断は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の突然変異について胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を試験することによって行い得る。野生型ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子の変化は、本明細書中に論じるいずれかの手段によって検出し得る。
【００２７】
ＤＮＡ配列変異型を検出するために用い得る幾つかの方法が存在する。手動配列決定または自動化蛍光配列決定かのいずれかの直接ＤＮＡ配列決定により、配列変異を検出し得る。もう１つのアプローチは、一本鎖ＤＮＡ立体構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ）（Ｏｒｉｔａら，１９８９）である。この方法は全ての配列変化を検出せず、特にＤＮＡフラグメントのサイズが２００ｂｐよりも大きい場合には検出せず、最適化して大部分のＤＮＡ配列変異を検出し得る。検出感度の低下は不利であるが、ＳＳＣＰを用いて可能である処理量の増大は、研究ベースの突然変異検出について直接配列決定を魅力的な、価値ある別法としている。ついで、ＳＳＣＰゲル上でシフトした移動度を有するフラグメントを配列決定して、ＤＮＡ配列変異の正確な性質を決定する。２の相補的ＤＮＡ鎖間の誤対合の検出に基づく他のアプローチには、クランプド変性ゲル電気泳動（ｃｌａｍｐｅｄ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＣＤＧＥ）（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら， １９９１）、ヘテロデュプレックス解析（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＨＡ）（Ｗｈｉｔｅら，１９９２）および化学的誤対合切断（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ）（ＣＭＣ）（Ｇｒｏｍｐｅら，１９８９）が含まれる。ＤＮＡ配列変異を検出する現在利用可能な方法のレビューは、Ｇｒｏｍｐｅ（１９９３）による最近のレビューに見出し得る。突然変異が分かったら、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションのごとき対立遺伝子特異的な検出アプローチを利用して、同一突然変異について多数の他の試料を迅速にスクリーニングし得る。かかる技術は、金ナノ粒子で標識したプローブを利用して、目に見える色彩結果を得ることができる（Ｅｌｇｈａｎｉａｎら，１９９７）。突然変異を検出するためのほかの技術は当該技術分野で知られており、使用することができる。例えば、米国特許第５，８４６，７１０号、第６，００４，７４４号、第５，８８８，８１９号および第５，８５６，０９２号に記載されている単一塩基伸長法を使用して単一の塩基の同一性を決定し、その場所が突然変異しているかを判定し得る。
【００２８】
点突然変異の検出は、ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子を分子クローニングし、当該技術分野でよく知られている技術を用いて該対立遺伝子を配列決定することによって行い得る。また、遺伝子または遺伝子の一部分は、例えばＰＣＲまたは他の増幅技術によって増幅し、増幅した遺伝子または増幅した遺伝子の一部分を配列決定し得る。
【００２９】
感受性対立遺伝子の存在を確認するためのより完全な、しかしなお間接的な試験のための６のよく知られた方法が存在する：１）一本鎖立体構造解析（ＳＳＣＰ）（Ｏｒｉｔａら，１９８９）；２）変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌら，１９９０；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら，１９８９）；３）ＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら，１９９０；Ｋｉｎｓｚｌｅｒら，１９９１）；４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）（Ｃｏｎｎｅｒら，１９８３）；５）イー・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ｍｕｔＳタンパク質のごとき、ヌクレオチド誤対合を認識するタンパク質の使用（Ｍｏｄｒｉｃｈ，１９９１）；および６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＲｕａｎｏおよびＫｉｄｄ，１９８９）。対立遺伝子特異的ＰＣＲについては、特定のＳＣＮ５Ａ突然変異に３’末端でハイブリダイズするプライマーを用いる。特定の突然変異が存在しない場合には、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開番号０３３２４３５号およびＮｅｗｔｏｎら，１９８９に開示されているごとき、増幅耐性突然変異系（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）も用い得る。遺伝子の挿入および欠失は、クローニング、配列決定および増幅によっても検出し得る。加えて、遺伝子または周辺のマーカー遺伝子用の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを用いて、対立遺伝子の変化または多型フラグメント中の挿入を評価し得る。かかる方法は罹った個人に見出される突然変異の存在について、その個人の親族をスクリーニングするのに特に有用である。当該技術分野で知られている挿入および欠失を検出するための他の技術を用い得る。
【００３０】
最初の３の方法（ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥおよびＲＮアーゼ保護アッセイ）においては、新たな電気泳動バンドが現れる。配列変化が一本鎖、分子内塩基ペアリング中に相違を発生するため、ＳＳＣＰは異なって移動するバンドを検出する。ＲＮアーゼ保護には、突然変異ポリヌクレオチドの２またはそれを超えるより小さなフラグメントへの切断が含まれる。ＤＧＧＥは、変性グラジエントゲルを用いて、野生型配列と比較した突然変異配列の移動速度における相違を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいては、特定の配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、アッセイはハイブリダイゼーション・シグナルの有無を検出することによって行う。ｍｕｔＳアッセイにおいては、突然変異配列と野生型配列との間のヘテロデュプレックス中にヌクレオチド誤対合が含まれる配列にのみ該タンパク質が結合する。
【００３１】
本発明によれば、誤対合とは、２の鎖が１００％相補的ではないハイブリダイズした核酸デュプレックスである。全体ホモロジーの欠如は、欠失、挿入、逆位または置換に起因し得る。誤対合検出を用いて、遺伝子中またはそのｍＲＮＡ産物中の点突然変異を検出し得る。これらの技術は配列決定よりも感度が低いが、それらは多数の試料に対して行うのにより単純である。誤対合切断技術の一例は、ＲＮアーゼ保護法である。本発明の実施において、該方法はヒト野生型ＳＣＮ５Ａ遺伝子コード配列に相補的である標識リボプローブの使用を含む。リボプローブと個人から単離したｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとを一緒にアニーリング（ハイブリダイズ）させ、その後デュプレックスＲＮＡ構造中の幾つかの誤対合を検出することができる酵素ＲＮアーゼＡで消化する。ＲＮアーゼＡによって誤対合が検出された場合には、それが誤対合の部位を切断する。したがって、アニーリングしたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックス上で分離された場合に、誤対合が検出され、ＲＮアーゼＡによって切断されている場合には、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡについての完全長デュプレックスＲＮＡよりも小さなＲＮＡ産物が見られるであろう。リボプローブはｍＲＮＡまたは遺伝子の完全長である必要はなく、いずれかのセグメントとし得る。
【００３２】
同様にして、酵素または化学的切断を介して、ＤＮＡプローブを用いて誤対合を検出し得る。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら，１９８８；Ｓｈｅｎｋら，１９７５；Ｎｏｖａｃｋら，１９８６を参照されたい。別法として、誤対合は、対合デュプレックスに対する誤対合デュプレックスの電気泳動移動度におけるシフトによっても検出し得る。例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ，１９８８を参照されたい。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用いれば、突然変異を含み得る細胞性ｍＲＮＡまたはＤＮＡをハイブリダイゼーションの前にＰＣＲを用いて増幅し得る（後記を参照されたい）。ＳＣＮ５Ａ遺伝子のＤＮＡ中の変化は、サザンハイブリダイゼーションを用いても検出し得る。
【００３３】
ＰＣＲを使用することによって増幅したＳＣＮ５Ａ遺伝子のＤＮＡ配列は、対立遺伝子特異的プローブを用いてもスクリーニングし得る。これらのプローブは、その各々が公知の突然変異を収容している遺伝子配列の領域を含む核酸オリゴマーである。例えば、１のオリゴマーは、遺伝子配列の一部分に対応する、約３０ヌクレオチド長とし得る。一連のかかる対立遺伝子特異的プローブの使用により、ＰＣＲ増副産物をスクリーニングして、遺伝子中の以前に同定された突然変異の存在を同定し得る。増幅したＳＣＮ５Ａ配列と対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロン・フィルター上で行い得る。高ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーション条件下における特定のプローブに対するハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブ中と同一の突然変異が組織中に存在することを示している。
【００３４】
マイクロチップ技術を介する新たに開発された核酸解析の技術も、本発明に適用可能である。この技術においては、逐語的に、何千もの異なるオリゴヌクレオチド・プローブをシリコン・チップ上にアレイで構築する。分析すべき核酸を蛍光標識し、チップ上のプローブにハイブリダイズさせる。また、これらの核酸マイクロチップを用いて核酸−タンパク質相互作用を研究することも可能である。この技術を用いれば、突然変異の存在を判定しもしくは解析すべき核酸を配列決定することさえでき、あるいは関心の遺伝子の発現レベルを測定することができる。当該方法は、多くの、数千さえのプローブの同時の平行プロセシングのうちの１つであって、解析速度をおびただしく増大し得る。この技術を用いる幾つかの論文が発表されている。これらのうちの幾つかは、Ｈａｃｉａら，１９９６；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら，１９９６；Ｃｈｅｅら，１９９６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら，１９９６；ＤｅＲｉｓｉら，１９９６；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，１９９５である。この方法は、乳ガン遺伝子ＢＲＣＡ１中の突然変異につき人々をスクリーニングするためにすでに用いられている（Ｈａｃｉａら，１９９６）。この新たな技術は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ中のｎｅｗ ａｒｔｉｃｌｅ（Ｂｏｒｍａｎ，１９９６）にレビューされており、論説の主題になっている（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９６）。Ｆｏｄｏｒ（１９９７）も参照されたい。
【００３５】
候補遺伝子座中の突然変異についての最も完成した試験は、患者からのゲノムＳＣＮ５Ａ配列と対照集団からのものとを直接比較することである。別法として、例えばＰＣＲによって増幅した後にメッセンジャーＲＮＡを配列決定し得、それによって候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要性がなくなる。
【００３６】
野生型遺伝子の変化は、野生型ＳＣＮ５Ａタンパク質の変化をスクリーニングすることによっても検出し得る。例えば、ＳＣＮ５Ａと免疫反応性のモノクローナル抗体を用いて組織をスクリーニングし得る。血族抗原の欠如は突然変異を示すであろう。突然変異対立遺伝子の産物に特異的な抗体を用いて、突然変異遺伝子産物を検出することもできるであろう。かかる免疫アッセイは、当該技術分野で知られているいずれの簡便な形式でも行い得る。これらには、ウエスタン・ブロット、免疫組織化学アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。変化したＳＣＮ５Ａタンパク質を検出するいずれかの手段を用いて、野生型ＳＣＮ５Ａ遺伝子の変化を検出し得る。タンパク質結合性判定のごとき機能性アッセイを用い得る。加えて、ＳＣＮ５Ａの生化学的機能を検出するアッセイを用い得る。
【００３７】
突然変異ＳＣＮ５Ａ遺伝子または遺伝子産物は、血清、便、尿および唾液のごとき他のヒト身体試料中にも検出し得る。組織中の突然変異遺伝子または遺伝子産物を検出するための前記で論じたものと同じ技術は、他の身体試料にも適用し得る。かかる身体試料をスクリーニングすることによって、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因について単純な早期診断を達成し得る。
【００３８】
本発明のプライマー・ペアは、ＰＣＲを用いる特定のＳＣＮ５Ａ対立遺伝子のヌクレオチド配列を決定するのに有用である。ＳＣＮ５Ａに対する一本鎖ＤＮＡプライマーのペアは、遺伝子自体の増幅ＤＮＡ合成を開始するために、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の中またはそれを取り囲む配列にアニーリングし得る。対立遺伝子特異的プライマーも用い得る。かかるプライマーは特定のＳＣＮ５Ａ突然変異対立遺伝子にのみアニーリングし、したがって、鋳型としての突然変異対立遺伝子の存在下でのみ産物を増幅するであろう。
【００３９】
野生型ＳＣＮ５Ａ遺伝子を有する個人が薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に罹りやすくないことが知られている。しかしながら、ＳＣＮ５Ａ遺伝子産物の機能を妨害する特異的突然変異が薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因に関与していることを本明細書中に示す。したがって、機能損失または変化した機能を有するタンパク質を産生する変化した（または突然変異）ＳＣＮ５Ａ遺伝子の存在は、トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因を直接的に引起こす。ＳＣＮ５Ａ遺伝子突然変異を検出するために、生物試料を調製し、分析すべき対立遺伝子の配列と野生型対立遺伝子の配列との間の相異につき分析する。突然変異ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子は、前記した技術のいずれかによって最初に同定し得る。ついで、突然変異対立遺伝子を配列決定して、特定の突然変異対立遺伝子の特定の突然変異を同定する。別法として、突然変異対立遺伝子は、慣用技術を用いて、突然変異（変化した）タンパク質を同定することによって最初に同定し得る。ついで、突然変異対立遺伝子を配列決定して、各対立遺伝子についての特定の突然変異を同定する。ついで、突然変異を、本発明の診断および予測法に用いる。
【００４０】
定義
本発明は以下の定義を用いる。
“ポリヌクレオチドの増幅”は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）およびＱ−ベータレプリカーゼの使用に基づく増幅方法のごとき方法を利用する。また、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、好熱性ＳＤＡ、および核酸配列ベース増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）も有用である。これらの方法は当該技術分野でよく知られており、広く実施されている。例えば、（ＰＣＲについては）米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；（ＬＣＲについては）ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，１９８９；（ＳＤＡについては）米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号ならびにＷａｌｋｅｒら，１９９２；（好熱性ＳＤＡについては）Ｓｐａｒｇｏら，１９９６、ならびに３ＳＲおよびＮＡＳＢＡについては米国特許第５，４０９，８１８号、Ｆａｈｙら，１９９１およびＣｏｍｐｔｏｎ，１９９１を参照されたい。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは市販されている。ＳＣＮ５Ａ領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくはＳＣＮ５Ａ領域中またはその中の標的領域に近接する領域中の配列に相補的であって、特異的にハイブリダイズする。増幅によって生成したＳＣＮ５Ａ配列は直接的に配列決定し得る。別法として、あまり望ましくないが、増幅した配列（群）は配列分析の前にクローン化し得る。酵素的に増幅したゲノム・セグメントの直接クローニングおよび配列分析方法は、Ｓｃｈａｒｆら，１９８６によって記載されている。
【００４１】
“分析物ポリヌクレオチド”および“分析物鎖”とは、標的配列を含有すると予想される一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドをいい、生物試料を含む種々のタイプの試料中に存在し得る。
“抗体”　本発明は、ＳＣＮ５ＡポリペプチドおよびそのフラグメントまたはＳＣＮ５Ａ領域からのポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができる、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメント、ならびにそれらの免疫学的結合等価物をも提供する。“抗体”なる語は、均一な分子基、または複数の異なる分子基から構成される血清生成物のごとき混合物の双方をいうために用いる。ポリペプチドは、ペプチド合成機で合成的に調製し、担体分子（例えば、キーホール・カサガイ・ヘモシアニン）にカップリングし、数ヶ月にわたりウサギに注射し得る。ウサギ血清は、ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはフラグメントに対する免疫反応性について試験する。モノクローナル抗体は、タンパク質ポリペプチド、融合タンパク質またはそれらのフラグメントでマウスを注射することによって生成し得る。モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはそのフラグメントとの特異的免疫反応性について試験されるであろう。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８を参照されたい。これらの抗体は、アッセイならびに医薬において有用であろう。
【００４２】
十分量の目的のポリペプチドを得たら、それを種々の目的に用い得る。典型的な用途は、結合性につき特異的な抗体の生成である。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかとし得、当該技術分野でよく知られているイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）技術によって生成し得る。ポリクローナル抗体の生成については、適当な標的免疫系、典型的にはマウスまたはウサギを選択する。実質的に精製した抗原は、動物に適した方法および免疫学者によく知られた他のパラメータによって決定した様式で免疫系に提示する。注射用の典型的な部位は、フットパッド中、筋肉内、腹膜内または皮内的である。もちろん、マウスまたはウサギを他の種に置き換え得る。ついで、目的の特異性に調整した、ポリクローナル抗体を当該技術分野で知られている技術を用いて精製する。
【００４３】
免疫学的応答は、通常、免疫アッセイを用いてアッセイする。普通、かかる免疫アッセイには、例えば同一細胞によって生成されるおよび抗原として同一の様式で生成される抗原の起源の幾分かの精製が含まれる。種々の免疫アッセイ法が当該技術分野でよく知られている。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８またはＧｏｄｉｎｇ，１９８６を参照されたい。
【００４４】
１０−８Ｍ−１、または好ましくは１０−９ないし１０−１０Ｍ−１またはより強力なアフィニティーを有するモノクローナル抗体は、典型的には、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８またはＧｏｄｉｎｇ，１９８６に記載されている標準的な手法によって生成されるであろう。簡単には、適当な動物を選択し、目的の免疫化プロトコールがそれに続く。適当な期間の後に、かかる動物の脾臓を取出し、適当な選抜条件下にて、個々の脾臓細胞を典型的には不死化ミエローマ細胞に融合させる。その後に、細胞をクローン的に分離し、各クローンの上清を抗原の目的の領域に特異的な適当な抗体のその生成について試験する。
【００４５】
他の好適な技術には、抗原性ポリペプチドに対するリンパ球のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）暴露、または別法として、ファージまたは同様なベクター中の抗体のライブラリーの選抜に対するリンパ球のイン・ビトロ暴露が含まれる。Ｈｕｓｅら，１９８９を参照されたい。本発明のポリペプチドおよび抗体は修飾するかまたはしないで用い得る。頻繁には、ポリペプチドおよび抗体は、共有的または非共有的に、検出可能なシグナルを供する物質に結合することによって標識するであろう。広範な種々の標識およびコンジュゲート技術が知られており、科学文献および特許文献の双方に多数報告されている。好適な標識には、放射性核種、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、マグネティック粒子等が含まれる。かかる標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号が含まれる。また、組換え免疫グロブリンも生成し得る（米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。
【００４６】
“結合パートナー”とは、高い特異性でリガンド分子を結合することができる分子をいい、例えば、抗原と抗原−特異的な抗体または酵素とそのインヒビターのごときである。一般的に、特異的結合パートナーは、単離条件下にて分析物コピー／（ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションの場合においては）相補鎖デュプレックスを不動化させるのに十分なアフィニティーで結合しなければならない。特異的な結合パートナーは当該技術分野で知られており、例えば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、膨大な公知のレセプター−リガンド結合物ならびに相補的ポリヌクレオチド鎖が含まれる。相補的ポリヌクレオチド結合パートナーの場合においては、パートナーは通常少なくとも約１５塩基長であって少なくとも４０塩基長とし得る。１５塩基よりも短い長さ（例えば、８塩基）、１５ないし４０塩基、および４０塩基よりも長いものも用い得ることは当業者によってよく認識される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ヌクレオチド・アナログより構成し得る。さらなる結合パートナーは、例えば本明細書中に記載するごとき２−ハイブリッド酵母スクリーニング・アッセイを用いて同定し得る。
【００４７】
“生物試料”とは、個人からの分析物ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有すると予想される組織または流体の試料をいい、限定されるものではないが、例えば血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の表面切片、呼吸管、消化管および尿生殖器管、涙、唾液、血液細胞、ガン、器官、組織およびイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞培養構成物の試料が含まれる。
【００４８】
“コードする”　ポリヌクレオチドは、その天然の状態で、または当業者によく知られている方法によって操作した場合に、それが転写および／または翻訳されてｍＲＮＡおよび／もしくはポリペプチドまたはそれらのフラグメントを生成し得る場合には、ポリペプチドを“コードする”という。アンチセンス鎖はかかる核酸の相補体であって、コード配列はそれから推定可能である。
“単離した”または“実質的に純粋な”　“単離した”または“実質的に純粋な”核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）とは、天然のヒト配列またはタンパク質、例えばリボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒトゲノム配列およびタンパク質を自然に伴う他の細胞コンポーネントから実質的に分離されたものである。この語は、その天然に発生した環境から取り出された核酸配列またはタンパク質を包含し、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離体ならびに化学合成アナログまたは不均一系によって生物学的に合成したアナログが含まれる。
【００４９】
“ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子”とは、ＳＣＮ５Ａ遺伝子座の正常な対立遺伝子ならびに薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を引起こす変異を運搬しているＳＣＮ５Ａの対立遺伝子をいう。
【００５０】
“ＳＣＮ５Ａ遺伝子座”、“ＳＣＮ５Ａ遺伝子”、“ＳＣＮ５Ａ核酸”または“ＳＣＮ５Ａポリヌクレオチド”とは、各々、その全てが正常な組織中で発現されているようであり、ＳＣＮ５Ａ領域中に存在し、そのある種の対立遺伝子が薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を生じる、ポリヌクレオチドをいう。ＳＣＮ５Ａ遺伝子座は、コード配列、介在配列、ならびに転写および／または翻訳を制御する調節エレメントを含むことが意図される。ＳＣＮ５Ａ遺伝子座はＤＮＡ配列の全対立遺伝子変異を含むことが意図される。
【００５１】
これらの用語は、核酸に適用する場合には、例えばタンパク質融合物または欠失を含む、ヒトＳＣＮ５Ａのポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは変異型をコードする核酸をいう。本発明の核酸は、天然ＳＣＮ５Ａ−コード遺伝子に由来するかまたはそれと実質的に類似するかのいずれかである配列、または天然ＳＣＮ５Ａ−コード遺伝子またはその一部分と実質的なホモロジーを有する配列を所有するであろう。
【００５２】
ＳＣＮ５Ａ遺伝子または核酸には、ＳＣＮ５Ａポリヌクレオチドのアミノ酸配列に対して効果を有しないサイレント対立遺伝子を含むＳＣＮ５Ａ遺伝子の正常な対立遺伝子、ならびにその機能に実質的に影響しないＳＣＮ５Ａポリペプチドのアミノ酸配列変異型に通じる対立遺伝子が含まれる。これらの用語は、ＳＣＮ５Ａポリペプチドの機能に悪影響する１またはそれを超える突然変異を有する対立遺伝子も含む。突然変異は、ＳＣＮ５Ａ機能の部分的または完全な消失を生じる、ＳＣＮ５Ａポリポリペプチドのアミノ酸配列中に有害な変化を生成するＳＣＮ５Ａ核酸配列中の変化、または効果的なＳＣＮ５Ａ発現の消失もしくは異常な形態のＳＣＮ５Ａポリペプチドの生成を生じる核酸配列中の変化となり得る。
【００５３】
ＳＣＮ５Ａ核酸は配列番号：１（野生型）または配列番号：３（突然変異体）に示すものとし得、それは薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に罹りやすい特定の特前変異を含み得る。
【００５４】
本発明による核酸は、配列番号：１および３に示す配列とは異なる配列を含み得、なお、配列番号：２および４に示すのと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。すなわち、本発明の核酸には、遺伝コードの結果として縮重となる配列が含まれる。
【００５５】
ＳＣＮ５Ａ遺伝子は、（ａ）（ｉ）高ストリンジェントな条件下（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９２）で配列番号：１または配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズする、および（ｉｉ）配列番号：２または配列番号：４に機能的に等価である遺伝子産物をコードする、いずれのＤＮＡ配列、あるいは（ｂ）（ｉ）中度にストリンジェントな条件のごとき（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９２）、より低くストリンジェントな条件下で配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列のうちの１をコードするＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズする、および（ｉｉ）配列番号：２または４によって示されるＳＣＮ５Ａに機能的に等価である遺伝子産物をコードする、いずれのＤＮＡ配列をもいう。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチド組成物には、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形、ならびにセンスおよびアンチセンス鎖の双方の混合ポリマーが含まれ、当業者により容易に理解されるごとく、化学的または生化学的に修飾し得、あるいは非−天然または誘導化ヌクレオチド塩基を含み得る。かかる修飾には、例えば、標識、メチル化、アナログでの１またはそれを超える天然に発生するヌクレオチドの置換、非電荷結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート他）、電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート他）、ペンダント基（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン他）、キレート剤、アルキル剤、および修飾結合（例えば、アルファ−アノマー核酸他）のごときヌクレオチド間修飾が含まれる。また、水素結合およびその他の化学的相互作用を介して設計した配列に結合するその能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。かかる分子は当該技術分野で知られており、例えば、その中で分子の骨格中のリン酸結合の代わりにペプチド結合が用いられているものが含まれる。
【００５７】
本発明は、ＳＣＮ５Ａ領域の全部または一部分を含む組換え核酸を提供する。組換え構築物は宿主細胞で自律的に複製することができる。別法として、組換え構築物は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。かかる組換えポリヌクレオチドには、その起源または操作によって、１）天然ではそれと関連するポリヌクレオチドの全部または一部分と関連しない；２）天然ではそれに結合するもの以外のポリヌクレオチドに結合する；または３）天然では発生しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドが含まれる。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合には、示した配列に参照して、Ｔに代えてＵを用いて、ＲＮＡ等価物を参照すると解釈しなければならない。
【００５８】
したがって、天然に発生しない他の配列を含む組換え核酸が本発明によって提供される。野生型配列も用い得るが、それはしばしば、例えば欠失、置換または挿入によって変化されるであろう。種々のタイプのｃＤＮＡまたはゲノミック・ライブラリーは、本発明の核酸の天然起源としてスクリーニングし得、あるいはかかる核酸はゲノムＤＮＡまたは他の天然起源に内在する配列の、例えばＰＣＲによる増幅によって提供され得る。ｃＤＮＡライブラリーの選択は、通常、目的タンパク質のｍＲＮＡに富む組織起源に対応する。ファージ・ライブラリーが普通は好ましいが、他のタイプのライブラリーも用い得る。ライブラリーのクローンをプレート上にひろげ、スクリーニング用の基体に移し、変性させ、ついで目的の配列の存在について釣上げる。
【００５９】
本発明において用いるＤＮＡ配列は、通常、少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド）、より通常には少なくとも約７−１５コドン、および最も好ましくは、少なくとも約３５コドンを含むであろう。１またはそれを超えるイントロンも存在し得る。このヌクレオチドの数は、通常、ＳＣＮ５Ａをコードする配列と特異的にハイブリダイズするであろう首尾よいプローブに必要なほぼ最小限の長さである。この文章において、８ヌクレオチドほども短いオリゴマー、より一般的には８−１７ヌクレオチドを、とりわけチップ技術と連結して、プローブに使用し得る。
【００６０】
核酸操作操作の技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９またはＡｕｓｕｂｅｌら，１９９２に一般的に記載されている。制限酵素等のごとき、かかる技術を適用するのに有用な試薬は当該技術分野で広く知られており、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社のごとき業者および多数の他の供給源から市販されている。本発明の融合タンパク質を生成するために用いる組換え核酸配列は、天然または合成配列由来とし得る。多くの天然遺伝子配列が、適当なプローブを用いて種々のｃＤＮＡからまたはゲノミック・ライブラリーから入手可能である。ＧｅｎＢａｎｋ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈを参照されたい。
【００６１】
本明細書中で用いる場合、ＳＣＮ５Ａの遺伝子座または領域または対立遺伝子の“一部分”は、少なくとも約８ヌクレオチド、または好ましくは約１５ヌクレオチド、またはより好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小限サイズを有すると定義され、少なくとも約４０ヌクレオチドの最小限サイズを有し得る。この定義には、８−４０ヌクレオチドの範囲の全てのサイズならびに４０ヌクレオチドを超えるものが含まれる。したがって、この定義には、８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドの核酸、またはこれらの値の範囲内のいずれかの数のヌクレオチド（例えば、９、１０、１１、１６、２３、３０、３８、５０、７２、１２１他のヌクレオチド）を有する核酸、または５００を超えるヌクレオチドを有する核酸が含まれる。本発明は、配列番号：１または配列番号：３、その相補体または機能的に等価な核酸配列由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての新規な核酸を含む。本発明は、先行技術に存在する核酸を含むものではない。すなわち、本発明は、配列番号：１または配列番号：３由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての核酸を含むが、但し、先行技術に存在する核酸は含まない。
【００６２】
“ＳＣＮ５Ａタンパク質”または“ＳＣＮ５Ａポリペプチド”とは、ＳＣＮ５Ａ遺伝子座、変異型またはそれらのフラグメントによってコードされるタンパク質またはポリペプチドをいう。“ポリペプチド”なる語は、アミノ酸およびその等価物のポリマーをいうのであって、特定の長さの生成物をいうものではない；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質がポリペプチドの定義の中に含まれる。この語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のようなポリペプチドの修飾をいうものではなく、あるいはそれを排除する。定義の中に含まれるのは、例えば、（例えば、非天然アミノ酸他を含む）１またはそれを超えるアミノ酸のアナログを含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチドならびに天然および非天然に発生する当該技術分野で公知の他の修飾である。通常、かかるポリペプチドは、天然ＳＣＮ５Ａ配列に対して少なくとも約５０％相同であり、好ましくは約９０％を超えて相同であり、より好ましくは少なくとも約９５％相同であろう。また、高または低ストリンジェンシー条件下でＳＣＮ５Ａをコードする核酸にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質、ならびにＳＣＮ５Ａタンパク質に対する抗血清によって回収された関連の高いポリペプチドまたはタンパク質も含まれる。
【００６３】
ＳＣＮ５Ａポリペプチドは、単離および／または精製形態の、天然には関連する材料を含まないまたは実質的に含まないものとし得る、配列番号：２または配列番号：４に示したものとし得る。ポリペプチドは、原核生物細胞中の発現によって生成するかまたは合成的に生成する場合には、グリコシル化のごとき天然の翻訳後プロセシングを欠き得る。別法として、本発明は、ＳＣＮ５Ａポリペプチドの配列変異型、対立遺伝子または誘導体であるポリペプチドにも指向される。かかるポリペプチドは、１またはそれを超えるアミノ酸の１またはそれを超える付加、置換、欠失または挿入によって、配列番号：２または配列番号：４に記載のものとは異なるアミノ酸配列を有し得る。好ましいかかるポリペプチドはＳＣＮ５Ａ機能を有する。
【００６４】
置換変異型は、典型的には、タンパク質内の１またはそれを超える部位で１のアミノ酸から他のものへの交換を含み、他の機能または特性を消失することなく、タンパク質加水分解切断に対する安定性のごとき、１またはそれを超えるポリペプチドの特性を調節するように設計し得る。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒的性質における類似性に基づいて作成し得る。好ましい置換は、保存的、すなわち１のアミノ酸を同様な形態および電荷のもので置換えたものである。保存的置換は当該技術分野でよく知られており、典型的には、以下のグループ内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびチロシン、フェニルアラニン。
【００６５】
ある種のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位もしくはＳＣＮ５Ａポリペプチドと相互作用するタンパク質上の結合部位のごとき、構造との相互作用結合能力のかなりの消失なしに、タンパク質構造中で他のアミノ酸に置換し得る。タンパク質の生物学的機能活性を決めるのはタンパク質の相互作用能力および性質であるため、ある種のアミノ酸置換をタンパク質配列およびその基礎をなすＤＮＡコード配列中に作成し得、それにもかかわらず、同様な特性を有するタンパク質を得ることができる。かかる変化を作成することにおいて、アミノ酸のハイドロパシー・インデックスを考慮し得る。タンパク質に相互作用的生物機能を付与することにおける疎水性アミノ酸インデックスの重要性は、一般的に当該技術分野で理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。別法として、アミノ酸のようなものの置換は、親水性に基づいて効果的に作成し得る。タンパク質の相互作用的生物機能を付与することにおける親水性の重要性は、一般的に当該技術分野で理解されている（米国特許第４，５５４，１０１号）。ポリペプチドを設計することにおいて疎水性インデックスまたは親水性を用いることは、米国特許第５，６９１，１９８号にさらに論じられている。
【００６６】
ホモロジーについて比較したポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約１６アミノ酸、通常、少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型には少なくとも約２８残基、および好ましくは約３５を超える残基であろう。
“作動可能に結合した”とは、かく記載したコンポーネントがその意図する様式で機能することを許容する関係で存在する並びをいう。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、該プロモーターはコード配列に作動可能に結合している。
【００６７】
ペプチド模倣物または模倣物なる語は、ＳＣＮ５Ａポリペプチドの本質的な生物活性を有する物質をいうことを意図する。ペプチド模倣物は、タンパク質二次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子とし得る（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９３）。ペプチド模倣物の使用の背後に存在する根本的理由は、主として、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原、酵素と基質または足場タンパク質のもののごとき、分子相互作用を促進するように、アミノ酸側鎖を方向付けるために存在することである。ペプチド模倣物は、天然分子と同様な分子相互作用を許容するように設計される。模倣物は、必ずしもペプチドでなくてもよいが、それは天然ＳＣＮ５Ａポリペプチドの本質的な生物活性を保持しているであろう。
【００６８】
“プローブ”　トルサード・デ・ポワンツおよび心室細動へ罹りやすくするＳＣＮ５Ａ対立遺伝子と関連するポリヌクレオチド多型は、ストリンジェントないし中度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標的配列のポリヌクレオチドと安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチド・プローブとのハイブリダイゼーションによって検出される。プローブが標的配列に対して完全に相補的であろうと予想される場合には、高ストリンジェンシー条件を用いるであろう。幾つかの誤対合が予想される場合、例えば、プローブが完全に相補的ではないであろうという結果でもって変異型が予想される場合には、ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを低下させ得る。非特異的／偶然の結合を除外、すなわちノイズを最小限化する条件を選択する。（本明細書全体を通して、“ストリンジェントな”条件を用いると単純に述べられている場合には、“高ストリンジェンシー”条件を用いたと読むことを意味する）。かかる指摘は中性ＤＮＡ多型性ならびに突然変異を同定するため、これらの指摘は、ＳＣＮ５Ａ感受性対立遺伝子の検出を示すためにさらなる分析を必要とする。
【００６９】
ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子用のプローブは、ＳＣＮ５Ａ領域の配列、そのｃＤＮＡ、機能的等価配列、またはそれらの相補体由来とし得る。プローブは、ＳＣＮ５Ａ領域の全体または一部分にひろがるいずれの好適な長さのものであってもよく、それは領域に対する特異的なハイブリダイゼーションを許容する。標的配列がプローブのものと同一の配列を含む場合には、ハイブリッドはストリンジェント条件下でさえ比較的安定であろうため、プローブを例えば８−３０塩基対の範囲の短いものとし得る。ある程度の誤対合がプローブと予想される場合、すなわち、プローブが変異型領域にハイブリダイズするであろうと予想される場合には、必要な特異性で標的配列にハイブリダイズするより長いプローブを用い得る。
【００７０】
プローブは、標識またはレポーター分子に結合した単離ポリヌクレオチドを含み、標準的な方法によって配列類似性を有する他のポリヌクレオチド配列を単離するために用い得る。プローブを調製および標識する技術については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９またはＡｕｓｕｂｅｌら，１９９２を参照されたい。他の同様なポリヌクレオチドは、相同ポリヌクレオチドを用いることによって選択し得る。別法として、これらまたは同様なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子コードの縮重を使用することによって合成または選択し得る。種々のコドン置換を、例えばサイレント変化（それによって、種々の制限部位を生成する）によって導入し、あるいは特定の系に対する発現を最適化し得る。突然変異を導入して、ポリペプチドの特性を修飾し、おそらくポリペプチドの分解または代謝速度を変化させ得る。
【００７１】
本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含むプローブは、天然発生または組換え一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド由来とし得、あるいは化学合成し得る。プローブは、ニック・トランスレーション、クレノウ・フィル−イン反応、または当該技術分野で知られている他の方法によっても標識し得る。
【００７２】
ＳＣＮ５Ａをコードするポリヌクレオチド配列からの、少なくとも約８ヌクレオチド、通常少なくとも約１５ヌクレオチドを有し、かつ約９ｋｂよりも小さい、通常約１．０ｋｂよりも小さいポリヌクレオチド配列の部分が、プローブとして好ましい。したがって、この定義には、８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドのプローブ、またはこれらの値の範囲内のいずれかの数（例えば、９、１０、１１、１６、２３、３０、３８、５０、７２、１２１他のヌクレオチド）のヌクレオチドを有するプローブ、あるいは５００を超えるヌクレオチドを有するプローブが含まれる。該プローブを用いて、ＳＣＮ５ＡをコードするｍＲＮＡが細胞または組織中に存在するかを判定することもできる。先行技術に存在ｓるプローブを含まない。すなわち、本発明は、配列番号：１または配列番号：３由来の少なくとも８のヌクレオチドを有する全てのプローブを含むが、但し、それには先行技術に存在するプローブは含まれない。
【００７３】
同様な考察およびヌクレオチド長は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の全体または一部分の増幅に用い得るプライマーにも適用し得る。したがって、プライマーについての定義には、８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドのプライマー、またはこれらの値の範囲内のいずれかの数のヌクレオチド（例えば、９、１０、１１、１６、２３、３０、３８、５０、７２、１２１他のヌクレオチド）を有するプライマー、あるいは５００を超えるヌクレオチド、あるいは５００ないし９０００のいずれかの数のヌクレオチドを有するプライマーが含まれる。このプライマーを用いて、ＳＣＮ５ＡをコードするｍＲＮＡが細胞または組織中に存在するか否かを判定することもできる。本発明は、ＳＣＮ５Ａ遺伝子を増幅するための、ＳＣＮ５Ａ遺伝子座由来の少なくとも８のヌクレオチドを有する全ての新規なプライマー、その相補体または機能的に等価な核酸配列が含まれる。本発明は、先行技術に存在するプライマーを含むものではない。すなわち、本発明は、少なくとも８ヌクレオチドを有する全てのプライマーを含むが、但し、先行技術に存在するプライマーは含まない。
【００７４】
“タンパク質修飾またはフラグメント”は、一次構造配列に実質的に相同であるが、例えば、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の化学および生化学修飾を含むかまたは異常なアミノ酸を取入れた、ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはそのフラグメントに関する本発明によって供される。かかる修飾には、例えば、当業者によって容易に認識されるであろう、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種での標識ならびに種々の酵素的修飾が含まれる。ポリペプチドを標識する種々の方法およびかかる目的につき有用な種々の置換または標識は当該技術分野でよく知られており、３２Ｐのごときラジオアイソトープ、標識化抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、発蛍光団、化学ルミネセンス剤、酵素、ならびに標識リガンドに対する特異的結合ペア・メンバーとして作用し得る抗リガンドが含まれる。標識の選択は、必要な感度、プライマーとのコンジュゲーションの容易性、安定性要件、および入手可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当該技術分野でよく知られている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９またはＡｕｓｕｂｅｌら，１９９２を参照されたい。
【００７５】
実質的に完全長のポリペプチドに加えて、本発明は、ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを提供する。重要な生物活性には、ＳＣＮ５Ａポリペプチドに特徴的な、リガンド結合性、免疫学的活性および他の生物活性が含まれる。免疫学的活性には、標的免疫系における免疫学的機能、ならびにＳＣＮ５Ａタンパク質のエピトープに対する競合物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）または置換抗原のいずれかとして作用する、結合するための免疫学的エピトープの共有性の双方が含まれる。本明細書中で用いる“エピトープ”とは、ポリペプチドの抗原決定基をいう。エピトープには、エピトープにユニークな空間立体構造で３のアミノ酸が含まれ得る。一般的に、エピトープは、少なくとも５のかかるアミノ酸、およびより通常には、少なくとも８−１０のかかるアミノ酸からなる。かかるアミノ酸の空間立体構造を決定する方法は、当該技術分野で知られている。
【００７６】
免疫学的目的のため、タンデム−リピート・ポリペプチド・セグメントを免疫原として用い、それによって非常に抗原性の高いタンパク質を作成し得る。別法として、かかるポリペプチドは特異的結合についての非常に効率的な競合物として作用するであろう。ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体の生成を以下に記載する。
【００７７】
本発明は、ＳＣＮ５Ａポリペプチドおよびフラグメントを含む融合ポリペプチドをも提供する。相同ポリペプチドは、２またはそれを超えるＳＣＮ５Ａポリペプチド配列間またはＳＣＮ５Ａと関連タンパク質との配列の間の融合物とし得る。同様にして、誘導タンパク質の特性または活性の組合せを示すであろう異種融合物を構築し得る。例えば、リガンド−結合性のまたは他のドメインは、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメント間で“交換”し得る。かかる相同または異種の融合ポリペプチドは、例えば、変化した強さまたは特異性の結合性を示し得る。融合パートナーには、免疫グロブリン、細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、アルファ・アミラーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼおよび酵母アルファ接合因子が含まれる。Ｇｏｄｏｗｓｋｉら，１９８８を参照されたい。
【００７８】
融合タンパク質は、典型的には、下記するごときいずれかの組換え核酸法によって作成し得、あるいは化学合成し得る。ポリペプチドを合成する技術は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３に記載されている。
【００７９】
“タンパク質精製”とは、ＳＣＮ５Ａをコードする組換え核酸で形質転換した細胞からのごとき、他の生物材料からＳＣＮ５Ａポリペプチドを単離するための種々の方法をいい、当該技術分野でよく知られている。例えば、かかるポリペプチドは、例えば本発明によって提供される抗体、を用いた免疫アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製し得る。タンパク質精製の種々の方法は当該技術分野でよく知られており、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０およびＳｃｏｐｅｓ，１９８２に記載されているものが含まれる。
【００８０】
“単離された”、“実質的に純粋な”および“実質的に均一な”なる語は、その天然の状態でそれに付随するコンポーネントから分離されたタンパク質またはポリペプチドを説明するために相互交換的に用いる。モノメリック（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）タンパク質は、少なくとも約６０ないし７５％の試料が単一のポリペプチド配列を示す場合は実質的に純粋である。実質的に純粋なタンパク質は、典型的には、約６０ないし９０％Ｗ／Ｗのタンパク質試料、より通常には約９５％を超えて、および好ましくは約９９％を超えて純粋であろう。タンパク質の純度または均一度は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動につづくゲル染色時の単一のポリペプチド・バンドの視覚化のごとき、当該技術分野でよく知られている多数の方法によって示し得る。特定の目的のため、より高い分解能を、精製に用いられている当該技術分野でよく知られているＨＰＬＣまたは他の方法を用いることによって得ることができる。
【００８１】
ＳＣＮ５Ａタンパク質は、その天然状態でそれに付随する天然の夾雑物からそれを分離した場合には、天然に関連するコンポーネントを実質的に含まない。したがって、化学合成したか、またはそれからそれが天然に生じる細胞とは異なる細胞系で合成したポリペプチドは、その天然に関連するコンポーネントを実質的に含まないであろう。タンパク質は、当該技術分野でよく知られているタンパク質精製技術を用いて、単離することによって天然に関連するコンポーネントを実質的に含まないものとし得る。
単離し、操作した遺伝子配列の発現産物として産生されるポリペプチドは、相同細胞型中で発現させた場合でさえ、本明細書中で用いるごとき“単離されたポリペプチド”である。合成的に作成した形態または異種細胞によって発現された分子は、本来的に単離分子である。
【００８２】
“組換え核酸”とは、天然に発生しない、または配列の２の他の分離したセグメントの人工的組合せによって生成した核酸である。この人工的組み合わせは、しばしば、化学合成法、または例えば遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの人工的な操作のいずれかによって行う。かかるものは、通常、コドンを、同一または保存的アミノ酸をコードする縮重コドンで置換えるために行われ、一方、典型的には配列認識部位を導入するかまたは除去する。別法として、目的の機能の核酸セグメントを一緒に結合して、目的の機能組み合わせを生成するためにもそれを行う。
【００８３】
“調節配列”とは、普通は遺伝子座のコード配列の１００ｂｐ内の配列をいうが、それはコード領域からより遠くに離れていることもあり、それは（遺伝子の転写、およびメッセンジャーＲＮＡの翻訳、スプライシング、安定性等を含む）遺伝子の発現に影響する。
“実質的ホモロジーまたは類似性”　他の核酸（またはその相補鎖）と（適当なヌクレオチドの挿入または欠失を有して）最適に並べた場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５−９８％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列の同一性が存在する場合には、核酸またはそのフラグメントは、もう１のものに“実質的に相同である”（“または実質的に類似である”）。
【００８４】
２の異なる核酸の間のホモロジーを決定するためには、ＢＬＡＳＴＮプログラム“ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”を用いて％ホモロジーを決定する。このプログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）から公共用途で入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）。用いるべきパラメーターは、括弧内のデフォルト・パラメーターで、以下のどの組み合わせが最高の算出％ホモロジーを与えるかである：
【００８５】
プログラム−ｂｌａｓｔｎ
マトリックス−０ ＢＬＯＳＵＭ６２
対合に対するリワード− ０ または １ （１）
誤対合に対するペナルティー−０， −１， −２ または−３ （−２）
オープンギャップ・ペナルティー− ０， １， ２， ３， ４ ｏｒ ５ （５）
伸長ギャップ・ペナルティー−０または１ （１）
ギャップ ｘ ドロップオフ−０または５０ （５０）
予測−１０
【００８６】
種々の他の結果と一緒に、このプログラムは完全鎖を横切る（ａｃｒｏｓｓ）または対合する２の核酸の領域を横切る％同一性を示す。プログラムは、比較する２の鎖のアライメントおよび同一性を結果の一部として示す。鎖が同じ長さのものである場合には、同一性は核酸の完全長を横切って計算されるであろう。鎖が等しくない長さのものである場合には、短い方の核酸の長さを用いるべきである。核酸がそれらの配列の部分を全く同様に横切るがそれらの配列の残りを異なって横切る場合には、ｂｌａｓｔｎプログラム“ＢＬＡＳＴ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”は類似部分のみを横切る同一性を示し、これらの部分は別個に報告される。本明細書中のホモロジーを決定する目的について、％ホモロジーとは比較する２の配列のうちの短い方をいう。いずれか１の領域が異なる％同一性で異なるアライメントで示される場合には、最高のホモロジーを与えるアライメントを用いるべきである。平均化は、配列番号：５および６のこの例におけるごとく行う。
【００８７】
【化１】
2004504054.tif 000002
【００８８】
プログラム“ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”は、選択したパラメータに依存してこれら２の核酸の異なるアライメントを示す。例えば、配列番号：５および６を比較するために４セットのパラメータを選択し（ギャップ ｘ　ドロップオフは全ケースにつき５０とした）、結果を表１に示す。表１に示すごとく選択したパラメータのセットのいずれもが、必ずしもこれらの配列を比較するためのパラメータの最良のセットであるとは限らないことは注意すべきである。％ホモロジーは、同一性を示す各領域につき、領域内の短い方の鎖の塩基のフラクションとその領域についての％同一性を乗じ、これら全てを一緒に加算することによって算出される。例えば、表１に示す第１セットのパラメータを用いれば、配列番号：５が短い方の配列（６３塩基）であり、同一性の２の領域が示される。第１のものは配列番号：６に対して９２％同一性を有する配列番号：５の塩基４−２９（２６塩基）を含み、第２のものは配列番号：６に対して１００％同一性を有する配列番号：５の塩基３９−５９（２１塩基）を含む。塩基１−３、３０−３８および６０−６３（１６塩基）は、配列番号：６といずれかの同一性を有すると示されていない。％ホモロジーは：（２６／６３）（９２）＋（２１／６３）（１００）＋（１６／６３）（０）＝７１．３％ホモロジーとして算出される。示した各４セットのパラメータを用いて算出したホモロジーの％を表１に掲載する。他の幾つかのパラメータの組み合わせも可能であるが、それらは簡潔性のために掲載しない。各セットのパラメータが異なる算出％ホモロジーとなることが示されている。最高％ホモロジーを与える結果を用いるべきであるため、ただこれら４セットのパラメータに基づいて、配列番号：５および６は８７．１％のホモロジーを有するというであろう。再度、他のパラメータを用いれば配列番号：５および６についてのより高いホモロジーを示し得るが、簡潔性のため、全ての可能な結果は示さない。
【００８９】
【表１】
2004504054.tif 000003
【００９０】
別法として、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、核酸またはそのフラグメントがもう１の核酸（またはその相補鎖）にハイブリダイズするであろう場合には、鎖またはその相補体に対する実質的なホモロジーまたは（類似性）が存在する。特異性の全体的欠如よりも実質的により選択的であるハイブリダイゼーションが起こる場合には、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。典型的には、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％のホモロジーが存在する場合には、選択的ハイブリダイゼーションが生じるであろう。Ｋａｎｅｈｉｓａ，１９８４を参照されたい。ホモロジー比較の長さは、記載したごとく、より長いストレッチにわたるとし得、ある種の具体例においては、少なくとも約９ヌクレオチド、通常には少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６またはそれを超えるヌクレオチドのストレッチにわたるものとしばしばされよう。
【００９１】
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるごとく、塩基の組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズした核酸間のヌクレオチド塩基誤対合の数に加えて、塩濃度、温度、または有機溶媒のごとき条件によって影響されるであろう。ストリンジェントな温度条件には、一般的に、３０℃を超える、典型的には３７℃を超える、および好ましくは４５℃を超える温度が含まれるであろう。ストリンジェントな塩濃度は、普通には１０００ｍＭより低い、典型的には５００ｍＭより低い、および好ましくは２００ｍＭより低いものであろう。しかしながら、パラメータの組み合わせは、いずれの単一のパラメータの測定よりも遥かに重要である。ストリンジェンシー条件は、核酸の長さおよび核酸の塩基組成に依存し、当該技術分野でよく知られている技術によって決定し得る。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ，１９６８を参照されたい。
【００９２】
プローブ配列も、ある種の条件下でデュプレックスＤＮＡに特異的にハイブリダイズして、トリプレックスまたは他のより高次元のＤＮＡ複合体を形成し得る。かかるプローブの調製および好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術分野でよく知られている。
【００９３】
“実質的ホモロジー”または“実質的同一”なる語は、ポリペプチドについていう場合には、問題のポリペプチドまたはタンパク質が全体的に天然に発生するタンパク質またはその一部分と、少なくとも約３０％同一、通常には少なくとも約７０％同一、より通常には少なくとも約８０％同一、好ましくは少なくとも約９０％同一、およびより好ましくは少なくとも約９５％同一を示すことを示す。　ポリペプチドに関するホモロジーは、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定する。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， ９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５の Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅを参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾にあてたホモロジーの測定を用いて類似配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には、以下のグループの置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００９４】
“実質的に同様な機能”とは、野生型ＳＣＮ５Ａ核酸または野生型ＳＣＮ５Ａポリペプチドに参照した、修飾核酸または修飾タンパク質の機能をいう。修飾ポリペプチドは、野生型ＳＣＮ５Ａポリペプチドに対して実質的に相同であって、実質的に同一の機能を有するであろう。修飾ポリペプチドは変化したアミノ酸配列を有し得、かつ／または修飾アミノ酸を含み得る。機能の同様性に加えて、修飾ポリペプチドは、より長い半減期のごとき他の有用な特性を有し得る。修飾ポリペプチドの機能（活性）の同様性は、野生型ＳＣＮ５Ａポリペプチドの活性と実質的に同一となり得る。別法として、修飾ポリペプチドの機能（活性）の同様性は、野生型ＳＣＮ５Ａポリペプチドの活性よりもより高いものとなり得る。修飾ポリペプチドは、慣用技術を用いて合成するか、あるいは修飾核酸によってコードさせて、慣用技術を用いて産生させる。修飾核酸は慣用技術によって調製する。野生型ＳＣＮ５Ａ遺伝子機能と実質的に同様な機能を有する核酸は、前記した修飾タンパク質を産生する。
【００９５】
ポリペプチドの“フラグメント”、“一部分”または“セグメント”とは、少なくとも約５ないし７の隣接アミノ酸、しばしば少なくとも約７ないし９の隣接アミノ酸、典型的には少なくとも約９ないし１３の隣接アミノ酸、および最も好ましくは、少なくとも約２０ないし３０またはそれを超える隣接アミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。
【００９６】
本発明のポリペプチドは、可溶性である場合には、固相支持体、例えばニトロセルロース、ナイロン、カラム充填材（例えば、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズ）、マグネティック・ビーズ、ガラスウール、プラスチック、金属、ポリマーゲル、細胞または他の基体にカップリングさせ得る。かかる支持体は、例えば、ビーズ、ウェル、ディップスティックまたはメンブレンの形態をとり得る。
【００９７】
“標的領域”とは、増幅および／または検出する核酸の領域をいう。“標的配列”なる語は、所望の条件下でそれとプローブまたはプライマーが安定なハイブリッドを形成するであろう配列をいう。
本発明の実施は、別段指摘しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学および免疫学の慣用技術を用いる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９２；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５；Ａｎａｎｄ，１９９２；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ，１９９１を参照されたい。ヒト第１染色体のマッピングを含むヒト遺伝子マッピング用の技術および材料の一般的議論は、例えばＷｈｉｔｅおよびＬａｌｏｕｅｌ，１９８８に提供されている。
【００９８】
組換えまたは化学合成核酸の調製；ベクター、形質転換、宿主細胞
大量の本発明のポリヌクレオチドは、好適な宿主細胞中の複製によって産生し得る。目的フラグメントをコードする天然または合成ポリヌクレオチド・フラグメントは、原核生物または真核生物細胞に導入し、そこで複製することができる、組換えポリヌクレオチド構築物、通常はＤＮＡ構築物に取り込ませる。通常、ポリヌクレオチド構築物は、酵母または細菌のごとき単細胞宿主中の複製に好適であろうが、（ゲノム内へ組込ませるか組込ませないで）培養哺乳動物もしくは植物または他の真核生物セルラインへの導入も意図し得る。本発明の方法によって作製した核酸の精製は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９またはＡｕｓｕｂｅｌら，１９９２に記載されている。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１によって記載されているホスホルアミダイト法またはＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１によるトリエステル法による化学合成によって生成することもでき、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機で行い得る。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列とＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加するかのいずれかによって、化学合成の一本鎖生成物から得ることができる。
【０１００】
原核生物または真核生物宿主に導入するために調製したポリヌクレオチド構築物は、目的ポリペプチドをコードする意図するポリヌクレオチド・フラグメントを含み、および、好ましくはポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に結合した転写および翻訳開始調節配列も含むであろう、宿主によって認識される複製系を含み得る。発現ベクターは、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）ならびに発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、およびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列およびｍＲＮＡ安定化配列のごとき必要なプロセシング情報部位を含み得る。かかるベクターは、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９またはＡｕｓｕｂｅｌら，１９９２に論じられている標準的な組換え技術によって調製し得る。
【０１０１】
適当なベクターおよび他の必要なベクター配列は、宿主中で機能するように選択され、適当な場合には、ＳＣＮ５Ａ遺伝子と天然に関連するものを含み得る。セルラインと発現ベクターとの作動可能な組合せの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９またはＡｕｓｕｂｅｌら，１９９２に記載されており；またＭｅｔｚｇｅｒら，１９８８も参照されたい。多くの有用なベクターが当該技術分野で知られており、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社等のごとき業者から得ることができる。ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージ・プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖酵素プロモーターのごときプロモーターを原核生物宿主で用い得る。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはエノラーゼもしくはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、マルトースおよびガラクトース利用に寄与する酵素他のごとき他の解糖酵素のプロモーター領域が含まれる。酵母発現において使用するのに好適なベクターおよびプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎら，ＥＰ ７３，６７５Ａにさらに記載されている。適当な非−天然哺乳動物プロモーターには、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら，１９７８）またはモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウイルスまたはポリオーマ由来のプロモーターが含まれ得る。昆虫プロモーターは、バキュロウイルス由来とし得る。加えて、構築物は、遺伝子の複数コピーを生成し得るように、増幅性遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に結合し得る。適当なエンハンサーおよび他の発現制御配列に関しては、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）も参照されたい。また、例えば、米国特許第５，６９１，１９８号；第５，７３５，５００号；第５，７４７，４６９号および第５，４３６，１４６号も参照されたい。
【０１０２】
かかる発現ベクターは自律的に複製し得るが、それらは当該技術分野でよく知られている方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入することによっても複製し得る。
発現およびクローニングベクターは、選択マーカー、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子をおそらく含むであろう。この遺伝子の存在は、インサートを発現する宿主細胞のみの増殖を保証する。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えばアンピシリン、ネオマシン、メトトレキサート他に対する抵抗性を付与する、ｂ）栄養要求性欠損を補う、またはｃ）複合培地から利用できない必須栄養素を供給する（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タンパク質をコードする。適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主に対する適当なマーカーは当該技術分野でよく知られている。
【０１０３】
注目する核酸を含有するベクターはイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写し、得られたＲＮＡをよく知られている方法、例えばインジェクション（Ｋｕｂｏら，１９８８を参照されたい）によって宿主細胞に導入し、あるいはベクターは、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル・ボンバード法；リポフェクション；インフェクション（ベクターがレトロウイルス・ゲノムのごとき感染性因子である場合）；ならびに他の方法を含む、細胞宿主のタイプに依存して変化する、当該技術分野でよく知られている方法によって宿主細胞に直接的に導入し得る。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９２を参照されたい。とりわけ前記したものを含む当該技術分野で知られているいずれかの方法によってポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを、本明細書中で“形質転換”という。前記した核酸が導入された細胞は、かかる細胞の子孫をも含むことを意味する。
【０１０４】
大量の本発明の核酸およびポリヌクレオチドは、和合性の原核生物または真核生物宿主細胞において、ベクターまたは他の発現担体中でＳＣＮ５Ａ核酸またはその一部分を発現させることによって調製し得る。バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはシュードモーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のごとき他の原核生物も用い得るが、最も一般的に用いられる原核生物宿主はエスシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ． ｃｏｌｉ）の菌株である。
【０１０５】
哺乳動物、あるいは酵母、糸状菌、植物、昆虫または両生類もしくは鳥類種のごとき他の真核生物宿主細胞も、本発明のタンパク質の産生に有用となり得る。培養における哺乳動物細胞の繁殖はそれ自体よく知られている。ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ（編），１９７９を参照されたい。例えばより高い発現性、望ましいグリコシル化パターンまたは他の特徴を提供するためには他のセルラインが適当となり得ることは熟練実務者によって理解されるが、一般的に用いられる哺乳動物セルラインの例はＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫおよびＣＯＳセルラインである。一般的に用いられる昆虫セルラインの例はＳＦ９である。
【０１０６】
クローンは、ベクター構築のモードに依存するマーカーを用いることによって選抜する。マーカーは同一または異なるＤＮＡ分子、好ましくは同一ＤＮＡ分子上に存在し得る。原核生物宿主においては、形質転換体は、例えばアンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する抵抗性によって、選択し得る。温度感受性に基づく特定の生成物の産生も適当なマーカーとして作用し得る。
【０１０７】
本発明のポリヌクレオチドで形質転換した原核細胞または真核細胞は、本発明の核酸およびポリペプチドの生成のみならず、例えば、ＳＣＮ５Ａポリペプチドの特徴を研究することにおいても有用であろう。
本明細書中に開示するＳＣＮ５Ａ遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを用いて、他の種の相同ＳＣＮ５Ａ遺伝子配列およびタンパク質を同定する。これらの遺伝子配列およびタンパク質は、それらを単離した種についての本明細書中に記載する診断／予測、治療および薬剤スクリーニング法に用いる。
【０１０８】
使用方法：薬剤スクリーニング
本発明は、形質転換細胞、トランスフェクト卵巣細胞またはトランスジェニック動物にＳＣＮ５Ａタンパク質を用いることによって化合物をスクリーニングするのに特に有用である。突然変異ＳＣＮ５Ａタンパク質中の突然変異は心臓ナトリウムチャネルの機能を変化し得るため、候補薬剤は、正常ＳＣＮ５Ａタンパク質または突然変異ＳＣＮ５Ａタンパク質のいずれかを含有する細胞を用いたチャネルに対する効果についてスクリーニングする。当該薬剤を培養中の細胞に添加するかまたはトランスジェニック動物に投与し、野生型ナトリウムチャネルの誘導電流に対する作用を突然変異ナトリウムチャネルを含有する細胞または動物の誘導電流に対するものと比較する。誘導電流をより正常なレベルに変化させる薬物候補は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を治療または予防するために有用である。同一タイプの実験を行って、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を治療または予防する能力についてではなく、薬物がトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を誘導し得るものであるかを判愛知することについて、薬剤をスクリーニングする。突然変異ＳＣＮ５Ａを発現する細胞または動物に薬剤を添加すると当該薬剤が存在しない場合の誘導Ｎａ＋電流とは異なる電流を生じる場合、その薬剤は、突然変異を有する個人にトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を誘導し得るものである。同様な実験を野生型ＳＣＮ５Ａを発現する細胞または動物に対して行い、試験薬剤が野生型の細胞または動物における誘導Ｎａ＋電流に対して同様な効果を有するかを判定し得る。同様な効果が示された場合には、突然変異ＳＣＮ５Ａを有する個人は野生型ＳＣＮ５Ａを有する個人よりも高い危険性を有するものとされないが、薬物処理した細胞または動物における誘導電流が非薬物処理細胞または動物細胞からの薬物処理した野生型細胞または動物におけるものよりも大きな量でもって異なる場合には、突然変異を有する個人は薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の危険性の高い状態にある。
【０１０９】
本発明は、種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかでＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはその結合フラグメントを用いることによって化合物をスクリーニングするのに特に有用である。
かかる試験に用いるＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中に遊離しているか、固体支持体に固定化されているか、または細胞表面に結合させるかのいずれかとし得る。薬剤スクリーニングの１の方法は、好ましくは競合結合アッセイで、ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現している組換えポリヌクレオチドで安定して形質転換した真核生物または原核生物の宿主細胞を用いる。生存可能または固定化形態のかかる細胞は、標準結合アッセイに用い得る。例えば、ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはフラグメントと試験する剤との間の複合体の形成を測定し得、またはＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはフラグメントと公知のリガンドとの間の複合体の形成が試験する剤によって妨害される程度を調べることができる。
【０１１０】
かくして、本発明は、かかる剤とＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはそのフラグメントとを接触させて、当該技術分野でよく知られている方法によって、（ｉ）剤とＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはフラグメントとの間の複合体の存在について、または（ｉｉ）ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはフラグメントとリガンドとの間の複合体の存在についてアッセイすることを含む薬剤をスクリーニングする方法を提供する。かかる競合結合アッセイにおいては、ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはフラグメントは典型的には標識する。遊離ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはフラグメントは、タンパク質：タンパク質複合体で存在するものから分離し、遊離（すなわち非複合体形成）標識の量は、各々、ＳＣＮ５Ａに対して試験すべき剤の結合性またはＳＣＮ５Ａ：リガンド結合性のその妨害の測定値である。また、遊離よりむしろ、結合したＳＣＮ５Ａの量を測定することもできる。また、ＳＣＮ５Ａよりむしろ、リガンドを標識し、試験すべき薬剤の存在または不存在下でＳＣＮ５Ａに結合するリガンドの量を測定することも可能である。
【０１１１】
薬剤スクリーニングのもう１つの技術は、ＳＣＮ５Ａポリペプチドに対して好適な結合アフィニティーを有する化合物の高処理量スクリーニングを提供し、Ｇｅｙｓｅｎ（国際公開 ＷＯ８４／０３５６４）に詳記されている。簡単に述べると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、プラスチック・ピンまたは他の表面のごとき固体基体上で合成する。ペプチド試験化合物をＳＣＮ５Ａポリペプチドと反応させ、洗浄する。ついで、結合したＳＣＮ５Ａポリペプチドを当該技術分野でよく知られている方法によって検出する。
【０１１２】
精製ＳＣＮ５Ａは、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するためのプレート上に直接コートし得る。しかしながら、ポリペプチドに対する非−中和抗体を用いて抗体を捕捉して、固相上にＳＣＮ５Ａポリペプチド固定化し得る。
本発明は、ＳＣＮ５Ａポリペプチドに特異的に結合することができる中和抗体を、ＳＣＮ５Ａポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する試験化合物と競合させる競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも考慮している。この様にして、抗体を用いて、ＳＣＮ５Ａポリペプチドの１またはそれを超える抗原決定基を共有するいずれかのペプチドの存在を検出し得る。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは、コンビナトリアル・ライブラリー技術の結果として開発された化合物をスクリーニングするのにも用い得る。コンビナトリアル・ライブラリー技術は、潜在的な膨大な数の異なる物質をポリペプチドの活性を調節する能力について膨大な数の異なる物質を試験する有効な方法を提供するｌ。かかるライブラリーおよびその使用は当該技術分野で知られている。ポリペプチドライブラリーの使用が好ましい。例えば、ＷＯ ９７／０２０４８号を参照されたい。
【０１１４】
簡単には、ポリペプチドの活性を調節させる物質をスクリーニングする方法には、好適な反応培地中で１またはそれを超える試験物質をポリペプチドと接触させ、処理したポリペプチドの活性を試験し、その活性を試験物質または物質群で処理していない匹敵する反応培地中のポリペプチドの活性と比較することを含み得る。処理ポリペプチドと非処理ポリペプチドとの間の活性の差は、関連試験物質または物質群の調節効果の暗示である。
【０１１５】
活性の調節についてスクリーニングする前、ならびにしている間に、試験物質を、例えば、酵母２−ハイブリッド系（例えば、Ｂａｒｔｌｅら，１９９３；ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９；ＣｈｅｖｒａｙおよびＮａｔｈａｎｓ，１９９２；Ｌｅｅら，１９９５）で、ポリペプチドと相互作用する能力についてスクリーニングし得る。この系は、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質を試験する前の粗いスクリーニングとして用い得る。別法として、該スクリーニングを用いて、ＳＣＮ５Ａ特異的結合パートナーへの結合性について試験物質をスクリーニングし、またはＳＣＮ５Ａポリペプチドの模倣物を見出すことができるであろう。
【０１１６】
ポリペプチド活性を調節またはそれに影響する物質を同定した後に、その物質をさらに調べ得る。さらに、それは、調製物、すなわち製造物または処方、あるいは医薬、医薬組成物または薬剤のごとき組成物で製造および／または使用し得る。これらは、個人に投与し得る。
【０１１７】
かくして、本発明は、ポリペプチド活性のモジュレーターとして核酸分子を用いて同定される物質のみならず、本明細書中に開示するものと一致して、かかる物質を含む医薬組成物、医薬、薬剤または他の組成物、かかる物質を含むかかる組成物を投与することを含む方法、かかる組成物を、例えば薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を治療する（予防的治療をも含み得る）ために患者に投与することを含む方法、例えば薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を治療するために、投与する組成物の製造におけるかかる物質の使用、ならびに、かかる物質と医薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体、および所望により他の成分とを混合することを含む医薬組成物の製造方法をも包含する種々の態様に及ぶ。
【０１１８】
ポリペプチド機能のモジュレーターとして同定した物質は、本来、ペプチドまたは非−ペプチドとし得る。非−ペプチド“小分子”はしばしば多くのイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）医薬用途に好ましい。したがって、（特に、ペプチドの場合）物質の模倣物または擬似物を医薬用途に設計し得る。
【０１１９】
公知の医薬上有効な化合物に対する模倣物の設計は、“リード”化合物に基づく医薬の開発の公知のアプローチである。このことは、有効化合物が合成することが困難であるか高価となる場合、あるいはそれが特定の投与方法に好適でない場合（例えば純粋なペプチドは、それが消化管中のプロテアーゼによって迅速に分解されがちなため口腔組成物に好適でない有効剤である）に、このことは望ましい。模倣物の設計、合成および試験は、一般的に、標的特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避けるために用いる。
【０１２０】
所定の標的特性を有する化合物から模倣物を設計するために一般的にとられる幾つかの工程が存在する。第１に、標的特性を決定することにおいて極めて重要および／または重要である化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合においては、このことは、ペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることによって、例えば、順次各残基を置換することによって、行い得る。ペプチドのアラニン・スキャンを一般的に用いて、かかるペプチド・モチーフを清澄にする。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その“ファーマココア”として知られている。
【０１２１】
ファーマココアを見出したら、線源の範囲からのデータ、例えば分光光学的技術、ｘ線回折データおよびＮＭＲを用いてその物理学的特性、例えばステレオケミストリー、結合性、サイズおよび／または電荷、に従ってその構造をモデルする。コンピュータ解析、同様なマッピング（原子間の結合よりもむしろ、ファーマココアの電荷および／または容積をモデルする）および他の技術をこのモデリング工程で用い得る。
【０１２２】
このアプローチの変形において、リガンドとその結合パートナーの三次元構造をモデル化する。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが結合の際に立体構造を変化させ、模倣物の設計においてこのことを考慮するモデルを許容する。
【０１２３】
ついで、ファーマココアを擬似する化学基が移植される鋳型分子を選択する。鋳型分子およびそれに移植した化学基は、模倣物が合成しやすく、薬理学的に許容できるようであり、かつイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で分解されないが、リード化合物の生物活性は保持するように、慣用的に選択し得る。別法として、模倣物がペプチドに基づく場合には、ペプチドを環化させることによってさらなる安定性を達成し、その剛直性を増大し得る。ついで、このアプローチによって見出された模倣物または模倣物群は、それらが標的特性を有するか否か、またはそれらがそれをどの程度まで示すかを理解するためにスクリーニングし得る。ついで、さらなる最適化または修飾を行って、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）または臨床試験用の１またはそれを超える最終模倣物に到達し得る。
【０１２４】
使用方法：核酸診断および診断キット
個人を薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に罹りやすくさせるＳＣＮ５Ａ対立遺伝子の存在を検出するために、血液のごとき生物試料を調製し、ＳＣＮ５Ａの感受性対立遺伝子の存在または不存在について分析する。薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因または予測インジケーターとしての存在を検出するために、生物試料を調製し、ＳＣＮ５Ａの突然変異対立遺伝子の存在または不存在について分析した。これらの試験の結果および解釈情報を、試験個人へのコミュニケーションのためにヘルスケア・プロバイダーに戻す。かかる診断は、診断研究室によって行い得、あるいは別法として、診断キットを製造し、ヘルスケア・プロバイダーまたは自己診断用に個人に販売し得る。
【０１２５】
最初に、スクリーニング法には、関連ＳＣＮ５Ａ配列の増幅が含まれる。本発明のもう１つの好ましい態様において、該スクリーニング方法には非−ＰＣＲベースの戦略が含まれる。かかるスクリーニング方法には、当該技術分野でよく知られている二段階標識増幅法が含まれる。ＰＣＲおよび非−ＰＣＲベースのスクリーニング戦略は双方とも、高レベルの感度で標的配列を検出し得る。
【０１２６】
今日用いられている最もなじみ深い方法は標的増幅である。ここでは、標的核酸配列をポリメラーゼを用いて増幅する。ポリメラーゼ−作動増幅を用いる１つの特に好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ポリメラーゼ連鎖反応および他のポリメラーゼ−作動増幅アッセイは、ポリメラーゼ−作動増幅サイクルの使用を通してコピー数で１００万倍を超える増加を達成し得る。増幅したら、得られた核酸を配列決定し、またはＤＮＡプローブ用の基体として用い得る。
【０１２７】
プローブを用いて標的配列の存在を検出する場合には、血液または血清のごとき分析すべき生物試料を処理し、望むなら、核酸を抽出し得る。試料核酸は種々の方法で調製して、標的配列の検出、例えば変性、制限分解、電気泳動またはドット・ブロッティングを促進し得る。分析物核酸の標的領域は、通常、少なくとも部分的に一本鎖であって、プローブの標的配列とハイブリッドを形成しなければならない。配列が本来一本鎖である場合には、変性は必要でないであろう。しかしながら、配列が二本鎖である場合には、該配列はおそらく変性させる必要があるであろう。変性は当該技術分野で知られている種々の方法によって行い得る。
【０１２８】
分析物核酸およびプローブは、プローブ中の標的配列と分析物中の推定標的配列との安定なハイブリッド形成を促進する条件下でインキュベートする。分析物に結合させるために用いるプローブの領域は、ヒト第７染色体の標的化領域に完全に相補的にし得る。したがって、偽陽性を予防するためには、高ストリンジェンシー条件が望ましい。しかしながら、高ストリンジェンシー条件は、プローブがゲノムにユニークである染色体の領域に相補的である場合にのみ用いる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、塩基組成、プローブ長、およびホルムアミド濃度を含む、ハイブリダイゼーションの間および洗浄工程の間の多くの因子によって決る。これらの因子は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら，１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に概説されている。ある種の環境下においては、トリプレックス、クアドラプレックス他のごとき、より高次のハイブリッドの形成が、標的配列を検出する方法を供するために望ましいこともあり得る。
【０１２９】
いずれにせよ、得られたハイブリッドの検出は、通常、標識プローブを用いることによって行う。別法として、プローブは非標識とし得るが、直接または間接的に標識したリガンドと特異的に結合させることによって検出し得る。好適な標識、ならびにプローブおよびリガンドを標識する方法は当該技術分野で知られており、例えば、公知の方法（例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたはキネーシング（ｋｉｎａｓｉｎｇ））によって取り込ませ得る放射性標識、ビオチン、蛍光基、化学ルミネセンス基（例えば、ジオキセタン、特に活性化ジオキセタン）、酵素、抗体、金ナノ粒子等が含まれる。この基本的スキームの変形は当該技術分野で知られており、外来材料および／または標識基からのシグナルを増幅させるものから、検出すべきハイブリッドの分離を促進する種々の変形が含まれる。多数のこれらの変形は、例えばＭａｔｔｈｅｗｓおよびＫｒｉｃｋａ，１９８８；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，１９８８；Ｍｉｆｆｌｉｎ，１９８９；米国特許第４，８６８，１０５号；およびＥＰＯ公開番号２２５，８０７号にレビューされている。
【０１３０】
前記したごとく、非−ＰＣＲベースのスクリーニングアッセイも、本発明に考慮されている。この手法は、核酸プローブ（または、正常なホスホジエステルに代るホスホン酸メチルのごときアナログ）を低レベルのＤＮＡ標的にハイブリダイズさせる。このプローブは、共有結合がハイブリダイゼーションの特異性を妨害しないように、プローブと共有結合した酵素を有し得る。ついで、この酵素−プローブ−コンジュゲート−標的核酸複合体を、プローブを含まない酵素コンジュゲートから単離し、酵素検出のために基質を添加する。酵素活性は、感度で１０３−１０６の上昇を生じる発色またはルミネセント出力における変化として観察される。オリゴデオキシヌクレオチド−アルカリホスファターゼ・コンジュゲートの調製に関する例、およびハイブリダイゼーション・プローブとしてのその用途に関してはＪａｂｌｏｎｓｋｉら，１９８６を参照されたい。
【０１３１】
二工程標識増幅法は当該技術分野で知られている。これらのアッセイは、（ジゴキシゲニン、ビオチン等のごとき）小さなリガンドがＳＣＮ５Ａを特異的に結合することができる核酸プローブに結合するという原理で働く。対立遺伝子特異的なプローブもこの例の範囲内に意図され、例示的な対立遺伝子特異的なプローブには、この開示の素因突然変異を包含するプローブが含まれる。
【０１３２】
１つの例において、核酸プローブに結合した小リガンドは、抗体−酵素コンジュゲートによって特異的に認識される。この例の１つの具体例において、ジゴキシゲニンを核酸プローブに結合する。ハイブリダイゼーションは、化学ルミネセンス基質を代謝させる抗体−アルカリホスファターゼ・コンジュゲートによって検出する。この具体例による核酸プローブを標識する方法に関しては、例えばＭａｒｔｉｎら，１９９０を参照されたい。第２の例においては、小リガンドは、第１のリガンドに特異的に複合体形成（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ）することができる第２のリガンド−酵素コンジュゲートによって認識される。この例のよく知られている具体例は、ビオチン−アビジン型の相互作用である。核酸プローブを標識するための方法およびビオチン−アビジンをベースとするアッセイに関しては、Ｒｉｇｂｙら，１９７７およびＮｇｕｙｅｎら，１９９２を参照されたい。
【０１３３】
本発明の核酸プローブアッセイがＳＣＮ５Ａを検出することができる核酸プローブのカクテルを用いるであろうことも本発明の趣旨の範囲内に考慮される。かくして、細胞試料中のＳＣＮ５Ａの存在を検出するための１つの例において、遺伝子に相補的な１を超えるプローブを用い、特に、異なるプローブの数は択一的に２、３または５の異なる核酸プローブ配列である。もう１つの例において、患者のＳＣＮ５Ａ遺伝子配列中の突然変異の存在を検出するために、これらの遺伝子に相補的な１を超えるプローブを用い、ここにカクテルはＳＣＮ５Ａ中に変化を有する患者の集団中に同定される対立遺伝子−特異的突然変異に結合することができるプローブを含む。この具体例において、いずれの数のプローブをも用い得、好ましくはＬＱＴへの個人の素因を作るものとして同定された腫瘍遺伝子突然変異に対応するプローブが含まれるであろう。
【０１３４】
使用方法：ペプチド診断および診断キット
薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因の存在は、野生型ＳＣＮ５Ａポリペプチドの変化に基づいても検出し得る。かかる変化は、慣用技術による配列分析によって判定し得る。より好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を用いて、ＳＣＮ５Ａペプチド中の相異またはＳＣＮ５Ａペプチドの不存在を検出する。抗体を生起し、精製する技術は当該技術分野でよく知られており、いずれのかかる技術を選択して、本発明に特許請求した調製を達成し得る。本発明の好ましい具体例において、抗体は溶液からＳＣＮ５Ａタンパク質を免疫沈降させ、ならびにポリアクリルアミド・ゲルのウエスタンまたはイムノブロット上のこれらのタンパク質と反応するであろう。もう１つの好ましい具体例において、免疫組織化学技術を用いて、抗体はパラフィンまたは凍結組織切片中のＳＣＮ５Ａタンパク質を検出するであろう。
【０１３５】
ＳＣＮ５Ａまたはそれらの突然変異を検出する方法に関連する好ましい具体例には、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いる、サンドイッチアッセイ酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）およびイムノ酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が含まれる。例示的なサンドイッチアッセイは出典明示して本明細書の一部とみなす、米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号中で、Ｄａｖｉｄらによって記載されている。
【０１３６】
使用方法：合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目標は、例えば、より活性または安定な形態のポリペプチドであるか、または例えばポリペプチドの機能をイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で高めるか妨害する薬剤を形成する目的で、目的の生物学的に活性なポリペプチドの構造アナログまたはそれと相互作用する小分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター）の構造アナログを作成することである。例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎら，１９９１を参照されたい。１つのアプローチにおいて、まず目的のタンパク質（例えば、ＳＣＮ５Ａポリペプチド）の三次元構造をｘ線結晶学によるか、コンピュータ・モデリングによるか、または最も典型的には組合せアプローチによって決定する。あまり頻繁にあることではないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づいてモデリングすることによって得ることができる。合理的ドラッグ・デザインの例は、ＨＩＶプロテアーゼ・インヒビターの開発である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，１９９０）。加えて、ペプチド（例えば、ＳＣＮ５Ａポリペプチド）はアラニン・スキャンによって分析する（Ｗｅｌｌｓ，１９９１）。この技術においては、アミノ酸残基をＡｌａで置換し、ペプチドの活性に対するその効果を判定する。ペプチドの各アミノ酸残基をこの様にして分析して、ペプチドの重要な領域を決定する。
【０１３７】
機能アッセイによって選抜した標的−特異的抗体を単離し、ついでその結晶構造を解像することも可能である。原則的に、このアプローチにより、二次的ドラッグ・デザインが基礎とし得るファーマココアが得られる。機能的で、薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオ抗体（抗−ｉｄｓ）を生成することによって、タンパク質結晶学を全く迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄｓの結合部位は、元の受容体のアナログであると予想されよう。ついで、抗−ｉｄｓを用いて、ペプチドの化学的または生物学的に生成したバンクからペプチドを同定し、単離し得るであろう。ついで、選択したペプチドはファーマコアとして作用するだろう。
【０１３８】
かくして、例えば、改善されたＳＣＮ５Ａポリペプチド活性または安定性を有する、またはＳＣＮ５Ａポリペプチド活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニスト他として作用する薬剤を設計し得る。クローン化ＳＣＮ５Ａ配列の入手可能性によって、ｘ−線結晶学のごとき分析研究を行うために有用な十分な量のＳＣＮ５Ａポリペプチドを作成し得る。加えて、本明細書中に記載するＳＣＮ５Ａタンパク質配列の知見は、ｘ−線結晶学の代わりまたはそれに加えて、コンピュータ・モデリング技術を用いることに案内するであろう。
【０１３９】
使用方法：遺伝子治療
本発明により、突然変異ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子を運搬する細胞に野生型ＳＣＮ５Ａ機能を供給する方法も提供される。かかる機能を供給することは、レシピエント細胞の正常機能化を許容するだろう。野生型遺伝子または遺伝子の一部分は、遺伝子が染色体外に残るようなベクターで、細胞に導入し得る。かかる状況においては、遺伝子は染色体外の場所から細胞によって発現されるであろう。より好ましくは、細胞中に存在する内因性突然変異遺伝子と野生型遺伝子またはその一部分とが組換わるように、突然変異細胞に野生型遺伝子またはその一部分を導入する状況である。かかる組換えには、遺伝子突然変異の修正を生じる二重組換え事象を必要とする。組換え用および染色体外維持用の双方の遺伝子を導入するためのベクターは当該技術分野で知られており、いずれの好適なベクターも用い得る。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈およびウイルス導入のごときＤＮＡを細胞に導入するための方法は当該技術分野で知られており、方法の選択は実施者の能力範囲内である。
【０１４０】
前記に一般的に論じたごとく、ＳＣＮ５Ａ遺伝子またはフラグメントは、適用可能な場合には、細胞におけるかかる遺伝子の発現産物の量を増加させるために、遺伝子療法に用い得る。また、それは、突然変異遺伝子が“正常”レベルで発現されているが遺伝子産物が完全に機能的でない心細胞中でさえ、所与の野生型ＳＣＮ５Ａの発現のレベルを増大させるのにも有用となり得る。
【０１４１】
遺伝子治療は、一般的に受入れられている方法に従って、例えばＦｒｉｅｄｍａｎ（１９９１）またはＣｕｌｖｅｒ（１９９６）によって記載されているごとく、行われるであろう。患者からの細胞は、まず、前記した診断方法によって分析して、細胞中のＳＣＮ５Ａポリペプチドの産生を確認するであろう。発現制御エレメントに連結したＳＣＮ５Ａ遺伝子のコピーを含み、細胞の内側で複製することができるウイルスまたはプラスミド・ベクター（下記のさらなる詳細を参照されたい）を調製する。ベクターは細胞の内側で複製することができる。別法として、ベクターは複製欠損とすることができ、それは遺伝し治療において使用するためにヘルパー細胞中で複製する。米国特許第５，２５２，４７９号および国際公開ＷＯ９８／０７２８２号および米国特許第５，６９１，１９８号；第５，７４７，４６９号；第５，４３６，１４６号および第５，７５３，５００号に開示されているごとき、好適なベクターが知られている。ついで、ベクターを患者に注射する。トランスフェクトした遺伝子が各標的細胞のゲノムに不変的に取り込まれない場合には、治療を定期的に繰返さなければならない。
【０１４２】
当該技術分野で知られている遺伝子移入系は、本発明の遺伝子治療の実施に有用となり得る。これらには、ウイルスおよび非ウイルス移入法が含まれる。多種のウイルスが遺伝子移入ベクターまたは遺伝子移入ベクターを調製するための基礎として用いられており、それには、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０，Ｍａｄｚａｋら，１９９２）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９９２；Ｂｅｒｋｎｅｒら，１９８８；ＧｏｒｚｉｇｌｉａおよびＫａｐｉｋｉａｎ，１９９２；Ｑｕａｎｔｉｎら，１９９２；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９２；ＷｉｌｋｉｎｓｏｎおよびＡｋｒｉｇｇ，１９９２；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，１９９０；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，１９９８）、ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓ，１９９２；Ｍｏｓｓ，１９９６）、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２；Ｏｈｉら，１９９０；ＲｕｓｓｅｌｌおよびＨｉｒａｔａ，１９９８）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス類（Ｍａｒｄｏｌｓｋｅｅ，１９９２；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９２；Ｆｉｎｋら，１９９２；ＢｒｅａｋｅｆｉｅｌｄおよびＧｅｌｌｅｒ，１９８７；Ｆｒｅｅｓｅら，１９９０；Ｆｉｎｋら，１９９６）、レンチウイルス（Ｎａｌｄｉｎｉら，１９９６）、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス（Ｂｅｒｇｌｕｎｄら，１９９３）、ならびに鳥類の（ＢａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙおよびＴｅｍｉｎ，１９８４；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓら，１９９２）、げっ歯類の（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２；Ｍｉｌｌｅｒら，１９８５；Ｓｏｒｇｅら，１９８４；ＭａｎｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８５；Ｍｉｌｌｅｒら，１９８８）およびヒト起源の（Ｓｈｉｍａｄａら，１９９１；Ｈｅｌｓｅｔｈら，１９９０；Ｐａｇｅら，１９９０；ＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒおよびＰａｎｇａｎｉｂａｎ，１９９２）レトロウイルスが含まれる。大部分のヒト遺伝子治療プロトコールは、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスも用いられているが、無力化したげっ歯類のレトロウイルスに基づいている。
【０１４３】
当該技術分野で知られている非ウイルス性遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， １９７３；Ｐｅｌｌｉｃｅｒら，１９８０）；例えば、マイクロインジェクションのような機械的技術（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９８０；Ｇｏｒｄｏｎら，１９８０；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８１；ＣｏｓｔａｎｔｉｎｉおよびＬａｃｙ，１９８１）；リポソームを介する膜融合媒介移入（Ｆｅｌｇｎｅｒら，１９８７；ＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ，１９８９；Ｋａｎｅｄａら，１９８９；Ｓｔｅｗａｒｔら，１９９２；Ｎａｂｅｌら，１９９０；Ｌｉｍら，１９９１）；ならびに直接ＤＮＡ取込みおよび受容体−媒介ＤＮＡ移入（Ｗｏｌｆｆら，１９９０；Ｗｕら，１９９１；Ｚｅｎｋｅら，１９９０；Ｗｕら，１９８９；Ｗｏｌｆｆら，１９９１；Ｗａｇｎｅｒら，１９９０；Ｗａｇｎｅｒら，１９９１；Ｃｏｔｔｅｎら，１９９０；Ｃｕｒｉｅｌら，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌら，１９９１）。ウイルス−媒介遺伝子移入は、リポソーム・デリバリーを用いる直接イン・ビボ遺伝子移入と組合せて、ウイルス・ベクターを腫瘍細胞に指向させるが周りの非分裂細胞には指向させないことが許容される。別法として、レトロウイルスベクター産生（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）セルラインを腫瘍に注射し得る（Ｃｕｌｖｅｒら，１９９２）。その場合、プロデューサー細胞の注射により、ベクター粒子の連続した供給源が提供されるであろう。この技術は、手術不可能な脳腫瘍を患う患者における使用につき認可されている。
【０１４４】
生物学的遺伝子移入法と物理学的遺伝子移入法とを組合せるアプローチにおいては、いずれかのサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソンタンパク質に特異的なポリリシン−コンジュゲート抗体と組合せ、得られた複合体をアデノウイルス・ベクターに結合する。この場合、三分子複合体を用いて、細胞に感染させる。アデノウイルス・ベクターにより、効果的な結合、内在化、およびカップリングしたＤＮＡが損傷される前のエンドソームの分解が許容される。アデノウイルスベースのベクターをデリバリーする他の技術に関しては、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８）および米国特許第５，６９１，１９８号；第５，７４７，４６９号；第５，４３６，１４６号および第５，７５３，５００号を参照されたい。
【０１４５】
リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接イン・ビボ遺伝子移入を媒介し得ることが示されている。標準的なリポソーム調製物では遺伝し移入プロセスは非特異的であるが、例えば、直接イン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）投与に従って、局在化したイン・ビボ取込みおよび発現が腫瘍デポジットで報告されている（Ｎａｂｅｌ，１９９２）。
【０１４６】
遺伝子治療の文章における発現ベクターは、その中にクローン化されたポリヌクレオチドを十分に発現する配列を含有する構築物を含むことを意味する。ウイルス発現ベクターにおいては、構築物には当該構築物のパッケージングを支持するのに十分なウイルス配列が含まれる。ポリヌクレオチドがＳＣＮ５Ａをコードする場合には、発現によりＳＣＮ５Ａが産生されるであろう。ポリヌクレオチドがアンチセンス・ポリヌクレオチドまたはリボザイムをコードする場合には、発現によりアンチセンス・ポリヌクレオチドまたはリボザイムが産生されるであろう。したがって、この文章において、発現はタンパク質が合成されることを必要としない。発現ベクターにクローン化したポリヌクレオチドに加えて、ベクターには、真核生物細胞におけるプロモーター機能も含まれる。クローン化したポリヌクレオチド配列は、このプロモーターの制御下にある。好適な真核生物プロモーターには、前記したものが含まれる。発現ベクターには、本明細書中に記載した選択マーカーおよび他の配列のごとき配列も含まれ得る。
【０１４７】
ＤＮＡを心臓組織に直接標的化する遺伝子移入技術が好ましい。受容体−媒介遺伝子移入は、例えば、ポリリシンを介して（通常は共有的に超コイル化したプラスミドの形態の）ＤＮＡをタンパク質リガンドにコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞／組織タイプの細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。これらのリガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、望なら血液に直接注射して、ＤＮＡ−タンパク質コンジュゲートの受容体結合および内在化が起こる標的組織に指向させ得る。ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服するためには、アデノウイルスの同時感染を含めてエンドソーム機能を破壊し得る。当該治療は以下の通りである：ＳＣＮ５Ａ感受性対立遺伝子を運搬する患者を、その心臓先駆細胞の幾つかまたは全てが機能性正常ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子の少なくとも１のさらなるコピーを受けるように、遺伝子デリバリーで治療する。この工程において、治療した個人は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の危険性が正常対立遺伝子の存在によって感受性対立遺伝子の効果が押しとどめられる程度まで低下する。
【０１４８】
使用方法：ペプチド治療
ＳＣＮ５Ａ活性を有するペプチドを、突然変異または欠失ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子を運搬する細胞に供給することができる。タンパク質は、例えば公知の発現ベクターを用いて、細菌中のｃＤＮＡ配列を発現させることによって産生し得る。別法として、ＳＣＮ５ＡポリペプチドはＳＣＮ５Ａ−産生哺乳動物細胞から抽出し得る。加えて、合成化学の技術を用いてＳＣＮ５Ａタンパク質を合成し得る。かかる技術のいずれかにより、ＳＣＮ５Ａタンパク質を含む本発明の調製物が提供され得る。該調製物は、実質的に他のヒトタンパク質を含まない。このことは、微生物中またはイン・ビトロで合成することによって容易に達成される。
【０１４９】
活性ＳＣＮ５Ａ分子は、例えば、マイクロインジェクションによってかまたはリポソームを使用することによって細胞に導入し得る。別法として、ある種の活性分子は、能動的または拡散によって細胞によって取り込まれ得る。ＳＣＮ５Ａ活性を有する分子の供給は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の部分的な復帰に通じるにちがいない。ＳＣＮ５Ａ活性を有する他の分子（例えば、ペプチド、薬剤または有機化合物）を用いてもかかる復帰に作用し得る。実質的に同様な機能を有する修飾ポリペプチドもペプチド治療に用いる。
【０１５０】
使用方法：形質転換宿主
治療剤をテストするための動物は、完全な動物の突然変異の後に、または生殖細胞または接合体の処理後に選択できる。かかる処理は、通常、別の動物種からの突然変異ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子の挿入、ならびに破壊した相同遺伝子の挿入を含む。あるいは、動物の内因性ＳＣＮ５Ａ遺伝子は、従来技術（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８９；ＶａｌａｎｃｉｕｓおよびＳｍｉｔｈｉｅｓら， １９９１；Ｈａｓｔｙら， １９９１；Ｓｈｉｎｋａｉら， １９９２；Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら，１９９２；Ｐｈｉｌｐｏｔｔら， １９９２；Ｓｎｏｕｗａｅｒｔら，１９９２；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら，１９９２）を用いて、挿入または欠失の突然変異、または他の遺伝子変更によって破壊できる。試験物質を動物に投与した後、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因を評価しなければならない。試験物質が薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の出現を防止するか、あるいは抑制する場合、試験物質は薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の予防のための候補治療剤である。これらの動物モデルは、潜在的な治療製品用の非常に重要な試験ビヒクルを供する。
【０１５１】
ＳＣＮ５Ａ遺伝子突然変異と薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動との間の関連性の同定は、個人の早期の前症候性スクリーニングが薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の発生について危険性のある個人を同定することを可能とする。かかる個人を同定するために、ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子を、突然変異につき直接的にまたは対立遺伝子のクローニング後のいずれかにスクリーニングする。対立遺伝子はいずれかの適当な技術、限定されるものではないが、以下の方法のうちの一を用いて、正常な対立遺伝子からの核酸配列の差異の存在につき試験する：蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット解析、一本鎖立体構造解析（ＳＳＣＰ）、連鎖解析、ＲＮアーゼ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析。また、最近開発された技術のＤＮＡマイクロチップ技術も有用である。例えば、（１）クローン化した対立遺伝子および正常ＳＣＮ５Ａ遺伝子の両方のヌクレオチド配列または適当なフラグメント（コード配列またはゲノム配列）を決定し、ついで比較する、あるいは、（２）ＳＣＮ５Ａ遺伝子または遺伝子フラグメントのＲＮＡ転写体を、試験すべき個人からの一本鎖全ゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、得られたヘテロデュプレックスをリボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）で処理し、変性ゲル上で泳動させていずれかの誤対合の位置を検出する。これらの方法のうちの２は以下の手順により行うことができる。
【０１５２】
試験すべき個人のＳＣＮ５Ａ遺伝子の対立遺伝子を、従来技術を用いてクローニングする。例えば、血液試料を個人から得る。この試料中の細胞から単離したゲノムＤＮＡを、ほぼ２０ｋｂの平均フラグメントサイズに部分的に消化する。１８−２１ｋｂの範囲にあるフラグメントを単離する。得られたフラグメントを、適当なベクターに連結する。ついで、クローンの配列を決定し、正常ＳＣＮ５Ａ遺伝子と比較する。
【０１５３】
別法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＳＣＮ５Ａ遺伝子の５’領域またはＳＣＮ５Ａ遺伝子のエクソンについてのプライマー・ペアを用いて行う。また、ＰＣＲは、正常ＳＣＮ５Ａ遺伝子のいずれかの配列に基づいたプライマーを用いて行うこともできる。例えば、イントロンの１のプライマー・ペアを調製し、利用できる。最終的に、ＲＴ−ＰＣＲをｍＲＮＡに対して行ってもよい。ついで、増幅産物を、従来技術を用いる一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）によって解析していずれかの差異を同定し、ついでこれらを配列決定し、正常な遺伝子配列と比較する。
【０１５４】
適当なプライマー・ペアを用いて個人のＤＮＡを増幅させ、その増幅産物を、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プローブを用いるドットブロット・ハイブリダイゼーションによって分析することによって、個人を一般的なＳＣＮ５Ａ遺伝子変異について迅速にスクリーニングし得る。
【０１５５】
第ニの方法は、正常ＳＣＮ５Ａ遺伝子と欠陥遺伝子との間の差異の検出を補助するためにＲＮアーゼＡを用いる。この比較はプローブとしてＳＣＮ５Ａ遺伝子の小さな（〜５００ｂｐ）制限フラグメントを用いる工程で行なう。最初に、ＳＣＮ５Ａ遺伝子を、遺伝子配列をほぼ５００ｂｐのフラグメントに切断する制限酵素（群）で消化する。これらのフラグメントを電気泳動ゲル上で分離し、ゲルから精製し、個別に、両方の向きでＳＰ６ベクター（例えば、ｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５）にクローニングする。ＳＣＮ５Ａ遺伝子フラグメントのインサートを含むＳＰ６ベースのプラスミドを、［α−３２Ｐ］ＧＴＰの存在下にて、当該技術分野においてよく知られたＳＰ６転写系を用いてイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写させ、当該遺伝子の両鎖のラジオアイソトープ標識ＲＮＡ転写物を作り出す。
【０１５６】
個々に、これらのＲＮＡ転写物を用いて、従来技術を用いて対立遺伝子ＤＮＡとヘテロデュプレックスを形成させる。ＳＣＮ５Ａフラグメントと個人からのＳＣＮ５Ａ対立遺伝子サブクローンとの間の配列の差異のためにＲＮＡ：ＤＮＡヘテロデュプレックスに生じた誤対合は、ＲＮアーゼＡで処理した場合にそのＲＮＡ鎖中に切断を生じる。かかる誤対合は個人の対立遺伝子中の点突然変異または小さな欠失の結果である可能性がある。ＲＮＡ鎖の切断により２以上の小さなＲＮＡフラグメントが得られ、それは、ＲＮＡプローブ自体よりも変性ゲル上で速く泳動される。
【０１５７】
遺伝試験により、実務者は、出生時または出生前でさえ、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の危険性のある個人を同定することができるであろう。薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の前症候診断により、この障害の予防が可能となるであろう。薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の遺伝試験および改善された機作的理解は、合理的な療法を通して生命を脅かす不整脈を予防する機会を提供する。例えば、ナトリウムチャネル遮断剤は、ＳＣＮ５Ａの機能を変化させる突然変異を有する患者に有効な治療となり得る。最後に、不整脈がしばしば異常な心臓再分極と関連し、先天性および後天性因子の組合せから生じ得るため、これらの研究は一般的な不整脈の基礎をなす機作に対する洞察を提供し得る。
【０１５８】
医薬組成物および投与経路
本発明のＳＣＮ５Ａポリペプチド、抗体、ペプチドおよび核酸は、医薬組成物中に処方され、それは慣用的な医薬調合技術によって調製される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８版（１９９０，　Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）を参照されたい。当該組成物は、有効剤または有効剤の医薬上許容し得る塩を含み得る。これらの組成物は、有効物質のうちの１に加えて、医薬上許容し得る賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当該技術分野においてよく知られている他の物質を含有できる。かかる物質は、無毒であり、有効成分の効力を妨害しないものでなければならない。担体は、例えば、静脈内、経口、鞘内、神経弓上または非経口的に投与するのに望ましい調製物の形態に依存して非常に様々な形態をとり得る。
【０１５９】
経口投与については、該化合物は、カプセル剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ、メルト、散剤、懸濁剤または乳剤のような固体または液体の調製物に処方化し得る。経口投与形態に組成物を調製することにおいて、（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤のごとき）経口液体調製物の場合には、例えば、水、グリコール、油剤、アルコール、矯味剤、保存剤、着色剤、懸濁化剤等のごときいずれの通常の医薬媒体；または（例えば、散剤、カプセル剤および錠剤のごとき）経口固体調製物の場合には、デンプン、砂糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のごとき担体を用いてもよい。投与における容易さのために、錠剤およびカプセル剤は、最も有利な経口投与単位形態を示し、その場合には、固体医薬担体を明らかに用いる。望むなら、錠剤は、標準的技術によって糖衣または腸溶性コーティングし得る。有効剤は、胃腸管を安定に通過し、同時に脳血液関門を安定に通過するのを可能とするためにカプセル化し得る。例えば、ＷＯ９６／１１６９８を参照されたい。
【０１６０】
非経口投与については、該化合物は、医薬担体に溶解し、液剤または懸濁剤のいずれで投与してもよい。適当な担体の例示は、水、生理食塩水、ブドウ糖溶液、果糖溶液、エタノール、または動物、植物または合成の起源の油である。また、該担体は、他の成分、例えば、保存剤、懸濁化剤、可溶化剤、緩衝剤等を含有し得る。化合物を髄腔内投与する場合、それは脳脊髄液に溶解することもできる。
【０１６１】
有効剤は、好ましくは、治療上有効量で投与する。投与する実際の量および投与の速度および時間経過は、治療すべき症状の性質および重篤度に依存するであろう。治療の処方、例えば、投与量、時期等の決定は、開業医または専門医の責任内にあり、典型的には、治療すべき疾患、個々の患者の症状、出井バリー部位、投与方法および医師に知られた他の因子を考慮する。技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。
【０１６２】
あるいは、ターゲティング療法を用いて、抗体または細胞特異的リガンドのごときターゲティング・システムの使用によって、ある種のタイプの細胞に有効剤をより特異的にデリバリーし得る。ターゲティングは、例えば、薬剤が受入れられない毒性であるか、あるいはそれが余りにも高用量を必要とするか、あるいは標的細胞に入ることができないよおうな場合には、様々な理由のために望ましい。
【０１６３】
これらの薬剤を直接投与する代わりに、それを、標的細胞、例えば、前記のウイルス・ベクターで、または患者への埋込みのために設計された、米国特許第５，５５０，０５０号に記載され、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９４／２５５０３、ＷＯ９５／０１２０３、ＷＯ９５／０５４５２、ＷＯ９６／０２２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、ＷＯ９６／４０９５９およびＷＯ９７／１２６３５に記載されているごとき細胞ベースのデリバリーシステムで産生できる。当該ベクターは、治療すべき特定の細胞にターゲッティングでき、標的細胞により組織特異的である調節エレメントを含み得る。細胞ベースのデリバリーシステムは、所望の標的部位にて、患者の体に埋込むように設計され、有効剤のためのコード配列を含有する。別法として、該剤は、治療されるべき細胞において産生されるか、あるいはそれにターゲティングされる有効剤によって活性形態に変換するための前駆体形態でも投与し得る。例えば、ＥＰ ４２５，７３１ＡおよびＷＯ９０／０７９３６を参照されたい。
【０１６４】
実施例
本発明を以下の実施例でさらに詳細に説明するが、それは説明目的のものであって如何なる場合においても本発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野でよく知られている標準的な技術または以下に詳細に説明する技術を利用する。
【０１６５】
実施例１
薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツと関連するＳＣＮ５Ａ突然変異の同定
不整脈はしばしが薬物療法、最も一般的には抗不整脈薬を用いた治療から生じる。この不整脈の遺伝的基礎を決定するために、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に罹った個人を、公知の不整脈遺伝子中の突然変異についてスクリーニングした。スクリーニングされた遺伝子のうちの１はＳＣＮ５Ａであり、その配列を配列番号：１に示す。コードされるＳＣＮ５Ａタンパク質を配列番号：２に示す。この配列は、受託番号ＮＭ０００３３５としてＧｅｎＢａｎｋからも入手可能である。配列番号：３に示すＳＣＮ５Ａ５変異型が４のアフリカ系アメリカ人において見出され、そのうちの３はアミオダロン治療後に、１はブレビタルの注入後に不整脈を経験した。この変異型は２のさらなるアフリカ系アメリカ人においても見出された。６の個人はすべて、４の薬剤誘導型不整脈症例において悪化した心電図上のＱＴ間隔の延長を有していた。
【０１６６】
これらの個人において示された突然変異は、ＳＣＮ５Ａコード配列の塩基３３０８における変化であり、そこでは野生型のＣが突然変異版においてはＡとなっている。これは、この場所で野生型において見出されるセリンの代わりにアミノ酸残基１１０３にチロシンを有するコードタンパク質を生じる。このＳ１１０３変異型は試験したアフリカ系アメリカ人の１１％に存在したが、他の人種群においては見出されなかった。
【０１６７】
Ｓ１１０３Ｙ変異型は、５００Ｖ、室温にて一晩泳動した０．５×ＭＤＥゲル（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ； ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）上で検出した。
【０１６８】
実施例２
薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を治療または予防するのに有用な薬物候補のスクリーニングアッセイ
配列番号：４のタンパク質をコードするＳＣＮ５Ａを有する個人は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対して感受性である。薬剤は、例えば薬剤誘導効果を妨害するように突然変異ＳＣＮ５Ａに結合することによって、これらの効果を予防し得る。薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を予防することにおけるかかる薬剤の作用の機構が無関係なかかる薬剤をスクリーニングするためのアッセイを行い得る。
【０１６９】
Ａ．イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイ
当該アッセイは、突然変異ＳＣＮ５Ａを発現する第１のセットの細胞を浴用溶液に入れ、ＳＣＮ５Ａナトリウムチャネルを横切る電流を誘導し、最初に誘導された電流を測定する。野生型ＳＣＮ５Ａを発現する第２のセットの細胞を別の浴用溶液に入れ、電流を誘導し、第２の誘導電流を測定する。薬剤を溶液中の第１のセットの細胞に添加し、電流を誘導し、第３の誘導電流を測定する。第１および第３の電流の測定に対する第２の電流の測定の順番は無関係である。薬剤が第１の誘導電流よりも第２の誘導電流により類似する第３の誘導電流を生じた場合には、当該薬剤は突然変異ＳＣＮ５Ａを有する個人を治療する薬剤候補であり、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動の発生を治療または予防する。好ましくは、突然変異ＳＣＮ５Ａを発現し、野生型ＳＣＮ５Ａは発現しない細胞を用いる。かかる細胞は、トランスジェニック細胞を作製するかまたはカエル卵母細胞のごとき細胞に突然変異ＳＣＮ５Ａを発現するＲＮＡを注入することによって調製する。この開示における“細胞”なる語には、組織試料ならびに単一細胞が含まれる。
【０１７０】
Ｂ．イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）アッセイ
イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）法に類似するアッセイを、野生型ＳＣＮ５Ａまたは突然変異ＳＣＮ５Ａのいずれかを発現するトランスジェニック動物に対して行う。電流を誘導し、誘導電流の測定を行う。突然変異ＳＣＮ５Ａを発現するトランスジェニック動物は薬剤処理なしおよび薬剤処理ありで測定し、その測定を野生型ＳＣＮ５Ａを発現する動物における誘導電流と比較する。薬剤処理したトランスジェニック動物における誘導電流が野生型動物における誘導電流と比較した非薬剤処理突然変異動物における誘導電流よりも野生型動物における誘導電流により類似する場合には、当該薬剤は突然変異ＳＣＮ５Ａを有する個人を治療するための薬剤候補である。
【０１７１】
薬剤がＳＣＮ５Ａを有する個人においてトルサード・デ・ポワンツを誘導し得るかを判定するアッセイ
ある種の薬剤がある種の個人においてトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を引起こすことが知られている。本明細書中で示したごとく、ＳＣＮ５Ａ　Ｓ１１０３Ｙ突然変異を有する個人はある種の薬剤でもってかかる薬剤誘導効果に罹りやすい。他の薬剤もこの突然変異を有する個人においてトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を引起こし得るかを判定するアッセイを行い得る。
【０１７２】
Ａ．イン・ビトロアッセイ
１のアッセイは、突然変異ＳＣＮ５Ａを発現する細胞を浴用溶液に入れ、ＳＣＮ５Ａ Ｎａ＋チャネルを横切る電流を誘導してその誘導電流を測定し、ついで試験すべき薬剤を浴用溶液に添加し、電流を誘導し、この第２の誘導電流を測定することを含む。当該薬剤が誘導電流に対して何ら効果を有していない場合には、それは、突然変異の結果としてこの突然変異を有する個人にトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を誘導しないであろう。当該薬剤が誘導電流に対して実際に影響する場合、それは該突然変異を有する個人にトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を誘導し得る。
【０１７３】
Ｂ．イン・ビボアッセイ
薬剤がＳＣＮ５Ａ中に特定の突然変異を有する個人にトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を引起こし得るかを試験するためのイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）アッセイは、突然変異ＳＣＮ５Ａを発現するように突然変異ＳＣＮ５Ａを有するトランスジェニック動物を調製し、突然変異ＳＣＮ５Ａを発現する細胞のＳＣＮ５Ａ　Ｎａ＋チャネルを横切る電流を誘導し、試験すべき薬剤をトランスジェニック動物に投与し、電流を誘導し、この第２の電流と薬剤不存在下で誘導された電流とを比較することである。当該薬剤が誘導電流に対して何ら効果を有していない場合には、それは、突然変異の結果としてＳＣＮ５Ａ突然変異を有する個人においてトルサード・デ・ポワンツまたは心室細動を引起こさないであろう。
【０１７４】
Ｃ．イン・ビボアッセイ
第２のイン・ビボアッセイは、突然変異ＳＣＮ５Ａ遺伝子を発現するトランスジェニック動物を調製し、ついで試験すべき薬剤を該動物に投与することである。ついで、該動物を観察して、トルサード・デ・ポワンツまたは心室細動が引き起こるかを判定する。何らかかる有害な事象が起こらなければ、該薬剤は突然変異を有する個人にそれらの障害を誘導しないであろう。薬剤を投与した場合に、かかる事象がトランスジェニック動物においては実際に起こるが、野生型ＳＣＮ５Ａを発現する動物において起こらなければ、当該薬剤は突然変異の結果としてＳＣＮ５Ａ突然変異を有する個人にトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を誘導し得る。
【０１７５】
実施例４
ＳＣＮ５Ａに対するポリクローナル抗体の生成
ＳＣＮ５Ａコード配列のセグメントをイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で融合タンパク質として発現させる。過剰発現されたタンパク質をゲル溶出によって精製し、それを用いてＨａｗｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）によって記載されている手法に類似する手法を用いてウサギおよびマウスに免疫接種する。この手法は種々のほかのタンパク質に対する抗体（Ａｂ）を生成することが示されている（例えば、Ｋｒａｅｍｅｒら， １９９３を参照されたい）。
【０１７６】
簡単には、ＳＣＮ５Ａコーディング配列のストレッチをプラスミドｐＥＴ５Ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中に融合タンパク質としてクローン化する。ＩＰＴＧで誘導した後に、予想分子量を有する融合タンパク質の過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって確認する。融合タンパク質は電気溶出によってゲルから精製する。ＳＣＮ５Ａ融合産物としてのタンパク質の同定は、Ｎ−末端のタンパク質配列決定によって確認する。つぎに、精製したタンパク質をウサギにおける免疫源として用いる。ウサギを完全フロイントアジュバント中の１００μｇのタンパク質で免疫接種し、３週間隔で２回、最初に不完全フロイントアジュバント中の１００μｇの免疫源を用い、つづいてＰＢＳ中の１００μｇの免疫源を用いて追加免疫する。抗体を含有する血清をその後２週間に採取する。
【０１７７】
この手法を繰返して、ＳＣＮ５Ａ遺伝子産物の突然変異形態に対する抗体を生成する。野生型ＳＣＮ５Ａに対する抗体と組み合わせたこれらの抗体を用いて、種々の組織および生物流体中の突然変異形態の存在および相対的レベルを検出する。
【０１７８】
実施例５
ＳＣＮ５Ａに対して特異的なモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体は以下のプロトコールに従って生成する。よく知られているごとくグルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用いてキーホール・リンペット・ヘモシアニンにコンジュゲートしたインタクトＳＣＮ５ＡまたはＳＣＮ５Ａペプチド（野生型または突然変異型）を含む免疫源をマウスに免疫接種する。
【０１７９】
該免疫源をアジュバントと混合する。各マウスには、１０ないし１００μｇの免疫源を４回注射し、４回目の注射の後にマウスから採血し、血清が抗原に対する抗体を含んでいるかを判定する。血清価はＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって測定する。免疫源に対する抗体の存在を示す血清を有するマウスをハイブリドーマ作成用に選抜する。
【０１８０】
免疫マウスから脾臓を取出し、単細胞懸濁液を調製する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８を参照されたい）。細胞融合は、本質的にはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって記載されているごとく行う。簡単には、Ｐ３．６５．３ミエローマ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）によって記載されているごとくポリエチレングリコールを用いて免疫脾臓細胞と融合する。９６ウェル組織培養プレートに、細胞を２×１０５細胞／ウェルの密度で播く。増殖について個々のウェルを調べ、増殖しているウェルの上清を野生型または突然変異ＳＣＮ５Ａ標的タンパク質を用いるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによってＳＣＮ５Ａ特異的抗体の存在について試験する。陽性ウェル中の細胞を広げ、サブクローニングしてモノクローナル性を確立し、確認する。
所望の特異性を有するクローンをマウス中で腹水としてまたは中空糸系において広げ、増殖させて、特徴付けおよびアッセイ開発に十分な量の抗体を生成する。
【０１８１】
実施例６
ＳＣＮ５Ａについてのサンドイッチアッセイ
モノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビーズまたは粒子のごとき固体表面に結合させる。好ましくは、抗体は９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル表面に結合させる。ＳＣＮ５Ａペプチド／タンパク質（野生型および突然変異型）を含有する１００μＬの試料（例えば、血清、尿、組織サイトゾル）を固相の抗体に添加する。その試料を室温にて２時間インキュベートする。つぎに、試料流体をデカンテーションし、固相を緩衝液で洗浄して結合しなかった物質を除去する。１００μＬの（ＳＣＮ５Ａペプチド／タンパク質上の異なる抗原決定基に対する）第２のモノクローナル抗体を固相に添加する。この抗体をディテクター分子（例えば、１２５Ｉ、酵素、発蛍光団または発色団）で標識し、第２の抗体を有する固相を室温にて２時間インキュベートする。第２の抗体をデカンテーションし、その固相を緩衝液で洗浄して結合しなかった物質を除去する。
【０１８２】
試料中に存在するＳＣＮ５Ａペプチド／タンパク質の量に比例する結合標識の量を定量化する。野生型ＳＣＮ５Ａに対して特異的なモノクローナル抗体ならびにＳＣＮ５Ａ中に同定した各突然変異に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて別のアッセイを行う。
【０１８３】
実施例７
ＳＣＮ５Ａ　Ｎａ＋チャネルに影響する薬剤をスクリーニングするアッセイ
ＳＣＮ５Ａが心臓ナトリウムチャネルを形成するという知見を用いれば、ここでこのチャネルに対して効果を有するであろう薬剤についてスクリーニングするためのアッセイを発明することができる。この遺伝子ＳＣＮ５Ａを卵母細胞または哺乳動物細胞にトランスフェクトし、前記のごとく発現させる。トランスフェクションは野生型または特異的に突然変異したＳＣＮ５Ａを用いて行う。トランスフェクションに用いる遺伝子が薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動に対する素因を引起こす突然変異を含む場合、野生型遺伝子でトランスフェクトしたものと比較して誘導電流における変化が見られる。薬剤候補をトランスフェクトした細胞の浴用溶液に添加して、誘導電流に対する薬剤候補の効果を試験する。野生型ＳＣＮ５Ａでトランスフェクトした細胞で見られる電流に近いように誘導電流を変化させる薬剤候補は、薬剤誘導型のトルサード・デ・ポワンツおよび心室細動を治療するのに有用である。
【０１８４】
本発明の好ましい態様の詳細に参照して本特許出願に本発明を開示したが、この開示は限定的な意味ではなく説明目的のものであって、当業者であれば、本発明の趣旨および添付した請求の範囲内で変形が容易に思い付くことは予想される。
【０１８５】
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特許および特許出願：
欧州特許出願公開番号０３３２４３５
ＥＰＯ公開番号２２５，８０７
Ｈｉｔｚｅｍａｎ ら， ＥＰ ７３，６７５Ａ
ＥＰ ４２５，７３１Ａ
ＷＯ ８４／０３５６４
ＷＯ ９０／０７９３６
ＷＯ ９２／１９１９５
ＷＯ ９３／０７２８２
ＷＯ ９４／２５５０３
ＷＯ ９５／０１２０３
ＷＯ ９５／０５４５２
ＷＯ ９６／０２２８６
ＷＯ ９６／０２６４６
ＷＯ ９６／１１６９８
ＷＯ ９６／４０８７１
ＷＯ ９６／４０９５９
ＷＯ ９７／０２０４８
ＷＯ ９７／１２６３５
米国特許第３，８１７，８３７
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米国特許第６，００４，７４４
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504054.tif 000112
【国際調査報告】
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