(57)【要約】組換えタンパク質と非組換えタンパク質の精製と紡糸のための方法が記載される。具体的には、細菌の溶解と生糸タンパク質の精製は、有機酸の単一の溶液中で起きる。生糸タンパク質を未変性のまま残して、細菌タンパク質を加水分解する。生糸タンパク質は可溶性のまま、濃縮されて、繊維紡糸のための水性混合物になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む方法：
ａ）ｉ）１つ以上の構造ポリペプチドを含む生物的試料と；ｉｉ）酸とを提供し；
ｂ）１つ以上のポリペプチドが溶液中で回収されるような条件下で、該試料を該酸で処理する。
【請求項２】
ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１１から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
生物的試料は、組換えポリペプチドを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
生物的試料は、非組換えポリペプチドを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
酸は、有機酸を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
有機酸は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸から選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
不溶性繊維が製造される条件下で、該溶液を操作する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項８】
請求項７のプロセスにより製造される繊維。
【請求項９】
以下を含む方法：
ａ）ｉ）１つ以上の組換え構造ポリペプチドを発現する宿主細胞と、ｉｉ）有機酸を含む溶液とを提供し；
ｂ）該宿主細胞を該溶液で処理して混合物を作成し；
ｃ）該混合物から不溶性物質を除去し；そして
ｄ）溶液中の１つ以上の組換えポリペプチドを回収する。
【請求項１０】
１つ以上のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１１から選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
有機酸は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸から選択される、請求項９の方法。
【請求項１２】
溶液中の回収された１つ以上の組換えポリペプチドは、不溶性繊維が製造される条件下で操作される、請求項９の方法
【請求項１３】
請求項１２のプロセスにより製造される繊維。
【請求項１４】
以下を含む方法：
ａ）ｉ）１つ以上の組換え構造ポリペプチドを発現する細菌細胞と、ｉｉ）蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸から選択される有機酸を含む溶液とを提供し；
ｂ）該細菌細胞を該溶液で処理して混合物を作成し；
ｃ）該混合物から不溶性物質を除去し；そして
ｄ）溶液中の１つ以上の組換えポリペプチドを回収する。
【請求項１５】
１つ以上のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、および配列番号１１から選択される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
不溶性繊維が製造される条件下で、該回収された１つ以上の組換えポリペプチドを操作する工程をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１７】
以下を含む請求項１６の方法：
ａ）該回収された１つ以上の組換えポリペプチドを濃縮して、濃縮溶液を作成し；そして
ｂ）紡糸口金を介して該濃縮溶液を押し出す。
【請求項１８】
請求項１７のプロセスにより製造される繊維。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府の権益の宣言）
本発明は、米国政府が特許権使用料を支払うことなく政府の目的のために使用または使用許可を与えることができる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、クモの生糸（ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋｓ）と他の構造タンパク質の精製法と紡糸法に関する。具体的には、有機酸を使用して、組換え細胞または他の生物的試料（例えば、非組換え法由来の細胞）を溶解し、構造タンパク質を未変性のまま残して、多くの巨大分子を加水分解して構造タンパク質の純度と収率を大幅に上昇させる。生糸タンパク質の場合、生じる溶解物は、さらにイオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーにより精製され、処理されて繊維紡糸ための水性混合物となる。
【０００３】
（背景）
クモは、異なる機能のための多くの生糸を産生し、従って多様な構造タンパク質を産生するのに有用な生物である。ゴールデンオーブウィーバースパイダー（ｇｏｌｄｅｎ ｏｒｂ−ｗｅａｖｅｒ ｓｐｉｄｅｒ）（ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）の構造繊維は、極めて強く可撓性があり、破壊することなく、飛んでくる昆虫の衝突エネルギーを吸収することができる。ドラグライン生糸繊維は、広い範囲にわたってエネルギーを放散させ、剛性、強度、および伸長性をバランスさせる。さらに生糸タンパク質は、非常に抗原性が低い。従って生糸繊維は、軽量の高性能繊維、複合および医療応用に充分適している。これらのタンパク質の組成は、主にグリシン、アラニン、および他の短い側鎖アミノ酸であり、これらは水素結合や疎水性相互作用により抗平行ベータ折り畳みシートを形成する（ルーカス（Ｌｕｃａｓ）ら、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２５：１９， １９６４）。多くのクモの生糸は、タンパク分解酵素による消化に対して抵抗性であり（チリンガースト（Ｔｉｌｌｉｎｇｈａｓｔ）とカバノー（Ｋａｖａｎａｕｇｈ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｌｏｇｙ ２０２：２１２， １９７７）、希酸と塩基に不溶性である（メロ（Ｍｅｌｌｏ）ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５４４、生糸ポリマー：材料科学とバイオテクノロジー、６７〜７９頁、１９９５年）。クモは、その可能性を現実に使用することを可能にする充分な量のタンパク質を産生することができない。この問題を解決するために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中で組換え型のクモの生糸が発現されている（アルシジアコノ（Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ）ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４９：３１， １９９８；ファーネストック（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ）とアーウィン（Ｉｒｗｉｎ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７：２３， １９９７；ファーネストック（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ）とアーウィン（Ｉｒｗｉｎ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７：３３， １９９７；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７：４００， １９９５；プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０８７９， １９９５）。しかし繊維紡糸のためのタンパク質の精製と調製は、クモの生糸と他のタンパク質との溶解度特性とユニークな性質のために、特に困難である。
【０００４】
未変性のネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）クモのドラグライン繊維は、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に部分的に溶解されており、乾燥してフィルムにされる。ＨＦＩＰ中のフィルムの２．５％（ｗ／ｗ）溶液が、紡糸に使用された（ジエリンスキー（Ｊｅｌｉｎｓｋｉ）ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３１：６７３３， １９９８）。紡糸は、シリンジポンプを６μｌ／秒で使用して紡糸口金（ｓｐｉｎｎｅｒｅｔ）から凝固浴槽に押し出して行った。
【０００５】
組換えタンパク質中の作成した標識に結合させて、一方細菌タンパク質を洗い流すことにより、精製のための親和性クロマトグラフィーを行った（アルシジアコノ（Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ）ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４９：３１， １９９８；ファーネストック（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ）とアーウィン（Ｉｒｗｉｎ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７：２３， １９９７；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ７：４００， １９９５；プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０８７９， １９９５）。１つの通常使用される標識は、ヘキサ−ヒスチジン標識であり、これは高親和性でニッケル親和性樹脂に結合する。細菌タンパク質を洗い流した後、標識組換えタンパク質を樹脂から溶出することができる。この方法にはいくつかの欠点がある：１）大量の変性緩衝液が必要であり、複数の工程が関与する；２）必ずしもすべてのタンパク質が回収されない；３）他の細菌タンパク質が残存し、しばしば追加の精製（すなわち、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））が必要である；４）この方法は容易にスケールアップできない；５）および組換えタンパク質上の親和性標識の存在が抗原性を上昇させ、高強度の繊維に必要な分子の整列を妨害することがある。従って、構造タンパク質の精製、作成した標識が欠如した生糸繊維の紡糸、および可能性を妨害することなく巨大分子構造の組み立てを可能にするための新しい方法を開発する継続したニーズがある。
【０００６】
（発明の要約）
先行技術の上記に関連した欠陥に対する対策として、本発明は、有機酸を使用して、不要な細菌タンパク質を除去しながら大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）から組換え型のクモの生糸または他の非組換え構造タンパク質を精製することを企図する。本発明は、これらのタンパク質のユニークな溶解性と安定性特性に基づき、これらは室温での長期間の酸加水分解に対して耐性であるが、多くのタンパク質はそうではない。精製したタンパク質溶液は処理されて、繊維の製造のための紡糸可能な水性混合物になる。本発明はまた、クモの天然の紡糸プロセスを密接に模倣する水性タンパク質紡糸法を企図し、天然の生糸繊維の性質に似ているかこれを改良している性質を有する繊維を製造する可能性を有する。本発明は、生糸タンパク質を紡糸して繊維にするための水性プロセスの最初に知られた例である。さらに本発明は、組換え生糸タンパク質を紡糸して繊維にする、今日までに報告されている唯一の報告である。本発明は、先行技術に対して多くの利点を示し、より少ない工程で、より短時間で、かつより少量の試薬を使用して、有機酸で精製する方法を含む。本発明はまた、より高純度のタンパク質のより良好な回収を与える。例えば、（ＳＰ１）７ タンパク質は、現行の技術による回収率７ｍｇ／ｌ（プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、前述）に比較して、１５０ｍｇ／ｌのレベルで回収することができる。回収が行われる機構に限定されないが、従来の方法による低いタンパク質回収率は、一部は親和性樹脂へのタンパク質の不完全な結合により引き起こされる。そのような従来の方法には、特に限定されないが、イオン交換クロマトグラフィーや親和性クロマトグラフィーがある。これらのタンパク質が樹脂に結合できないことは、高濃度の変性剤の存在下でも、高度の２次構造が維持されることが原因である。本発明の試料の純度は、アミノ酸分析により測定すると９４〜９７％の範囲で得られる（例１と２を参照、下記）。現行法は、７０％（プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、前述）〜９９％（ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、１９９６年、前述）の、広い一貫しない範囲である。親和性クロマトグラフィーにより現行法を使用して高試料純度が可能であるが、ヒスチジン親和性標識の存在がタンパク質の抗原性を大きく上昇させ、物質内で必要な正しい分子配向を破壊することにより、繊維、フィルムまたは他の物質の性質に悪影響を与える。また多くの場合現行の方法では、他の細菌タンパク質が混入し、ＨＰＬＣのような追加の精製が必要な試料が得られる（プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら、前述）。最後に本発明の方法は、容易にスケールアップでき、環境にやさしい溶液で繊維を紡糸することができて有害な廃液の蓄積とコストを低下させる。例えば、本発明は、環境に無害な水性系での生糸タンパク質の紡糸を企図する。本発明のある実施態様において、有機酸の溶液を使用して、細菌の溶解を行い、組換え生糸と未変性の構造タンパク質の精製を開始する。球状タンパク質が加水分解され、一方生糸タンパク質は未変性のまま残る。生糸タンパク質が残り、濃縮されて繊維紡糸のための水性混合物になる。実施態様は以下の工程を含む：ａ）濃縮有機酸中に細胞ペレットを再懸濁し、水（＋／−変���剤および＋／−界面活性剤）で２．３Ｎに希釈して、均一混合物を形成する；ｂ）攪拌しながら室温で１時間インキュベートし、遠心分離して細胞破片を除去する；ｃ）限外ろ過により容量を１０〜１００倍減少させ、遠心分離により不溶性物質を除去する；ｄ）透析と、遠心分離による不溶性物質の除去；ｅ）イオン交換クロマトグラフィーによる精製と処理緩衝液への透析；ｆ）限外ろ過による１１〜４０％（ｗ／ｗ）タンパク質への溶液の濃縮と、溶液の繊維への紡糸。この実施態様は例示のために与えられるが、当業者は、本発明の精神と範囲内でいくつかの工程を追加または選択してもよい。例えば、繊維溶液の紡糸があるかまたは無い精製法を使用してもよい。いくつかの未変性のおよび組換え構造タンパク質が、この方法で精製されている。目的の構造タンパク質（未変性または組換え体）を含有する任意の生物的試料に、本発明で概説した方法を応用することができる。生物的試料の例は、特に限定されないが、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞、他の細菌細胞、真核生物細胞、構造タンパク質が分泌される培地、骨、組織、または臓器がある。多くの変数がプロセスで試験され最適化されており、各変数と最適化は、全体の一般的方法の変数を例示する。種々のパラメータから選択することは、調製されるタンパク質に大きく依存する。表１は、当業者への指針である。
【０００７】
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【０００８】
多様な実施態様が企図される。ある実施態様において本発明は、ａ）ｉ）１つ以上の構造ポリペプチドを含む生物的試料とｉｉ）酸とを提供し；ｂ）該１つ以上のポリペプチドが溶液中で回収される条件下で、該試料を該酸で処理することを含む方法を企図する。広範な構造タンパク質が企図され、特に限定されないが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１１から選択されるポリペプチドを含み、ポリペプチドは組換え型または未変性ポリペプチドでもよい。
【０００９】
多様な酸が企図される。有機酸が好適である。ある実施態様において本発明は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸から選択される１つ以上の有機酸を含む。
【００１０】
目的は、繊維を製造することである。従ってある実施態様において本方法は、不溶性繊維が製造される条件下で、該溶液を操作する工程をさらに含む。実際本発明は具体的に、上記プロセスに従って製造される繊維を企図する。
【００１１】
本発明は具体的に、組換え構造タンパク質が操作される方法を企図する。ある実施態様において本発明は、ａ）ｉ）１つ以上の組換え構造ポリペプチドを発現する宿主細胞とｉｉ）有機酸を含む溶液とを提供し；ｂ）該宿主細胞を該溶液で処理して混合物を作成し；ｃ）該混合物からの不溶性物質を除去し；そしてｄ）溶液中の１つ以上の組換えポリペプチドを回収することを含む方法を企図する。再度多様なペプチドが企図される。ある実施態様において、１つ以上のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１１から選択される。再度多様が酸が企図され、特に限定されないが、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸から選択される有機酸がある。
【００１２】
繊維を製造するために本方法は、溶液中の該回収された１つ以上の組換えポリペプチドを、不溶性繊維が製造される条件下で操作することを含む。本発明は具体的には、上記プロセスにより製造される繊維自体を企図する。
【００１３】
多様な宿主細胞が、組換え製造に企図される。すなわちある実施態様において本発明は、ａ）ｉ）１つ以上の組換え構造ポリペプチドを発現する細菌細胞とｉｉ）蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸から選択される有機酸を含む溶液とを提供し；ｂ）該細菌細胞を該溶液で処理して混合物を作成し；ｃ）該混合物から不溶性物質を除去し；そしてｄ）溶液中の１つ以上の組換えポリペプチドを回収することを含む方法を企図する。上記したように、多様なペプチドが企図され、特に限定されないが、１つ以上のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、および配列番号１１から選択される。
【００１４】
繊維を製造するために、該回収された１つ以上の組換えポリペプチドを、不溶性繊維が製造される条件下で維持する。好適な実施態様において、該操作は、ａ）該回収された１つ以上の組換え生糸ポリペプチドを濃縮して、濃縮溶液を作成し；そしてｂ）該溶液を紡糸口金を通して押し出すことを含む。本発明は具体的には、このプロセスにより製造される繊維自体を企図する。
【００１５】
要約すると本発明は、ポリペプチドと酸からなる生物的試料を提供し、生物的試料を、ポリペプチドが精製されて実質的に水性混合物になる条件下で操作することを含む方法を企図する。
【００１６】
いくつかの実施態様において本方法は、本発明の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１１から選択されるポリペプチドの使用を含むが、他のアミノ酸配列も企図される。
【００１７】
本発明の別の実施態様において、生物的試料は、特に限定されないが組換えおよび非組換えポリペプチドを含む多くの型のポリペプチドを含む。構造ポリペプチド（例えば、生糸ポリペプチド）もまた企図される。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様において、混合物が処理されて繊維になる条件下で、有機酸を使用して水性混合物を操作する。使用される有機酸は、特に限定されないが、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸を含む。本発明はさらに、本明細書に記載の方法により得られる生成物を企図する。
【００１９】
本明細書に記載の方法と生成物の多様な応用が企図されるが、応用は限定されるものではない。例えば本発明の組成物は、スキー、スケートボード、およびテニスラケットの製造のような応用のための、高強度の軽量合成ポリマー（例えば、ケブラー（Ｋｅｖｌａｒ）（登録商標））の置換または混合の任意の型を含む。本発明の方法を、多くの物質（特に限定されないが、フィルム、繊維、織物（例えば、衣服）、縫合糸、防弾、パラシュートおよびパラシュートのヒモを含む）の作成の前駆体として使用することができる。
【００２０】
定義
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を定義する。
本明細書で定義される用語「水性」は、水と混ざる溶液を意味する。
本明細書で定義される用語「水性混合物」は、水溶液中のタンパク質を意味する。混合物は、タンパク質精製、繊維紡糸、フィルム形成または他の材料に使用される。
【００２１】
用語「水性繊維紡糸」は、水溶液から繊維が形成されるプロセスを意味する。
本明細書で定義される用語「紡糸」、「紡糸可能」は、繊維を形成することができ、操作中に繊維は未変性のまま残る混合物を意味する（すなわち、凝固浴からの延伸と除去）。
【００２２】
本明細書で定義される用語「生物的試料」は、本発明の方法に適した、目的の構造タンパク質（未変性または組換え）を含有する任意の試料を意味する。生物的試料の例は、特に限定されないが、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞、他の細菌細胞、真核生物細胞、構造タンパク質が分泌される培地、骨、組織または臓器がある。
【００２３】
本明細書で定義される用語「組換えタンパク質」は、外来宿主中の組換えＤＮＡ配列の発現により産生される生成物を意味する。本明細書の例１に記載される（ＳＰ１）７タンパク質は、組換えタンパク質を例示する。
【００２４】
用語「組換え」または「組換えること」は、ベクター（例えば、自立複製性プラスミドまたはウイルス）または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれる核酸配列を意味し、これは、他のＤＮＡ配列から独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）として存在する。この定義はまた、追加のアミノ酸配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【００２５】
本明細書で使用される用語「組換えＤＮＡベクター」は、所望のコード配列、および特定の宿主生物（例えば、細菌）中で機能的に連結したコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を、含有するＤＮＡ配列を意味する。原核生物中の発現に必要なＤＮＡ配列は、プロモーター、場合によりオペレーター配列、リボゾーム結合部位、およびおそらく他の配列を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【００２６】
「非組換え」という用語は、組換え手段以外の方法で得られるタンパク質を意味する。非組換えタンパク質は、構造タンパク質または非構造タンパク質でもよい。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＯｍｐＦ膜タンパク質（本明細書の例６に記載）は、この場合、非組換えタンパク質の例として機能する天然に存在するタンパク質である。
【００２７】
「凍結乾燥ペレット」という用語は、凍結し真空下で乾燥（−５０℃と１０〜１００ミクロンＨｇ）されて粉末が製造される、生物的試料から得られる試料である。
【００２８】
本明細書に記載のポリペプチドの「精製された」または「純粋な調製物」という用語は、天然には一緒に存在する他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。ポリペプチドはまた、それを精製するために使用される物質、例えば抗体またはゲルマトリックス（例えば、ポリアクリルアミド）から分離される。本発明の「実質的に精製された」ポリペプチドという用語は、アミノ酸分析に基づき精製調製物の少なくとも５０％およびしばしば９０％を越えることを意味する。
【００２９】
本発明の目的において用語「酸」は、生糸または他の構造タンパク質を未変性のまま残し、混入しているタンパク質を加水分解することができる任意の有機酸を意味する。蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸はすべて、有機酸の例であるが、他の酸も企図される。
【００３０】
本発明の目的において、我々は「タンパク質」とは、そのモノマーがアミノ酸であり、これらがアミド結合で結合されているポリマーとして定義し、これはポリペプチドとも呼ばれる。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、同義で使用される。アミノ酸の標準的な略語が使用される（例えば、プロリンについてはＰ）。これらの略語は、ストライヤー（Ｓｔｒｙｅｒ）、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３版（１９８８年）に記載されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００３１】
用語「生糸ポリペプチド」は、未変性の生糸タンパク質および繊維の分子的および構造的プロフィールに近いタンパク質を意味する。
【００３２】
用語「構造タンパク質」または「構造ポリペプチド」は、生物学的構造支持体として機能し得るクラスの非触媒性タンパク質を意味する。このタンパク質は、それ自体が生物学的構造支持体として、他のタンパク質とともに、または他の物質のマトリックスもしくは支持体として、機能し得る。このクラスの例には、特に限定されないが、クモの巣の作成に使用されるクモの生糸；生物膜中でチャネルを形成するポリンタンパク質；毛髪の主要な構造成分であるケラチン；結合組織中の主要な細胞外タンパク質であるコラーゲンがある。本明細書に記載の生糸、ＯｍｐＦおよびレコグニンタンパク質は、構造タンパク質の例である。
【００３３】
用語「回収される」は、タンパク質が局所的に隔離されるか、または捕捉されるプロセスを意味する。
【００３４】
用語「有機酸」は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉草酸のようなクラスの酸を意味し、生きている生物中に存在するが、必ずしも生きている生物由来ではない。該有機酸はまた、販売業者（例えば、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ））から得られる。
【００３５】
本明細書において用語「宿主細胞」は、他の細胞または生物から導入された機能性遺伝子および／または遺伝子産物を発現することができる任意の細胞を意味する。この定義には、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ならびに他の生物を含む。
【００３６】
用語「不溶性繊維」は、水溶液中で溶解しないタンパク質性繊維を意味する。
用語「細菌」は、無数の群の顕微鏡的な単細胞生物を意味し、特に限定されないが、原核生物界の真性細菌門がある。
用語「濃縮」は、タンパク質性溶液のモル濃度を上昇させる任意のプロセスを意味する。
用語「濃縮溶液」は、調整前のタンパク質性溶液より高いあらかじめ決定したモル濃度に調整されたタンパク質性溶液を意味する。
用語「紡糸口金」は、繊維形成に使用される小さい孔を意味する。
【００３７】
（発明の説明）
例に示すように多くの異なる実施態様が企図され、本発明の方法のスケールアップ、方法の自動化、または他の構造タンパク質を精製するための本方法の使用が含まれる。
【００３８】
当業者は、本発明の実施が、特に明記しない場合は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡの従来法（これらの当該分野の技術範囲内である）を使用することを理解するであろう。そのような方法は、文献に記載されており、例えばモレキュラークローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッツ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス：１９８９年）；ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第Ｉ巻と第ＩＩ巻（ディー・エヌ・グローバー（Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ）ら編、１９８５年）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（エム・ジェイ・ゲイト（Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ）編、１９８４年）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ビー・ディー・ヘームズ（Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ）とエス・ジェイ・ヒグンズ（Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４年）；転写と翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（ビー・ディー・ヘームズ（Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ）とエス・ジェイ・ヒグンズ（Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４年）；動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ）（アール・アイ・フレッシュネイ（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、アラン・アール・リス・インク（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．）、１９８７年）；固定化細胞と酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（アイアールエルプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、１９８６年）；ビー・パーバル（Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ）、モレキュラークローニングへの実際的ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４年）；学位論文、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（アカデミックプレスインク（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州）；哺乳動物細胞のための遺伝子移動ベクター（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）（ジェイ・エィチ・ミラー（Ｊ． Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ）とエム・ピー・カロス（Ｍ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ）編、１９８７年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）；メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１５４巻と１５５巻（ウー（Ｗｕ）ら編）がある。
【００３９】
本発明のタンパク質は、直接合成（化学的にまたは生物学的に）できるか、またはクローン化ＤＮＡから発現することができる。タンパク質の供給源は、組換え手段に限定されない。本明細書に記載の方法を使用して、非組換えタンパク質を精製または遠心分離してもよい。実際、下記の例６は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＯｍｐＦ膜タンパク質（これは、この場合天然に存在する（すなわち、非組換えタンパク質）タンパク質である）の精製を説明する。
【００４０】
クローン化ＤＮＡを発現するための方法は、当該分野で公知である。しかし、本発明のクモの生糸タンパク質をコードするＤＮＡを発現するには、普通とは異なる発現ベクターの設計を考慮する。例えばこのタンパク質の構造は、非常に反復性が高い。従ってクローン化ＤＮＡは、染色体外成分（例えば、シュア（ＳＵＲＥ）（登録商標）細胞、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中で反復性配列を維持する宿主細胞株中で、増殖させ発現させなければならない。またアラニン、グリシン、プロリン、およびグルタミンの含量が多いため、これらのアミノ酸のｔＲＮＡを過剰発現する宿主細胞を利用することが好ましい。
【００４１】
本発明は、ポリペプチドが実質的に精製されるような条件下で、組換えおよび非組換え生物的試料を操作するために、多くの異なる有機酸の使用を企図する。蟻酸、プロピオン酸および吉草酸とともに大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の使用が企図されるが、本発明はこれらの具体的な実施態様に限定されず、他の有機酸（例えば、酢酸、酪酸もすべて例として機能する）を使用して実施してもよい。本発明はまた、他の原核生物または真核生物細胞（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞以外の、またはこれとともに）、目的のタンパク質が分泌される培地、臓器、組織、骨および他の成分（これらはすべて、生物的試料の例である）を使用して行われる。
【００４２】
（実験）
以下の例は、本発明のいくつかの実施態様と側面を例示するものであり、決してその範囲を限定するものと解釈してはならない。
【００４３】
例１
蟻酸とイオン交換クロマトグラフィーによる組換え生糸タンパク質の精製
本例では、図１に記載のｐＱＥ（ＳＰ１）７（配列番号１）が、別に記載（プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、１９５５年）の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中で、図２に記載の組換え生糸タンパク質ｐＱＥ（ＳＰ１）７（配列番号２）として発現される。（ＳＰ１）７遺伝子は、発現ベクターｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））中にクローン化し、宿主細胞株ＳＧ１３００９ｐＲＥＰ４（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に形質転換した。培養物を、４００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する４×ＹＴ培地（１リットルあたり：３２ｇトリプトン、２０ｇ酵母エキス、５ｇ　ＮａＣｌ）中でＡ６００＝１．５〜２．０まで増殖させた。イソプロピル−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭになるように加えて、タンパク質発現を誘導した。１〜４時間後、細胞を遠心分離して集め、精製のために保存した。凍結乾燥ペレットを２３Ｎ蟻酸中で溶解（１００ｍｌ／ｇ細胞ペレット）して、蒸留脱イオン水で４．５Ｎの酸まで希釈し、室温で１時間攪拌した。細胞溶解物を遠心分離して清澄化し、限外ろ過により２０倍濃縮した。遠心分離して溶液を清澄化し、上清を、８Ｍ尿素、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８）で充分透析した。沈殿した物質を遠心分離して除去し、清澄化した上清を、８Ｍ尿素、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８）で平衡化しておいた親和性クロマトグラフィー樹脂（ニッケル−ＮＴＡアガロース）に適用した。クロマトグラフィー条件は、組換え生糸タンパク質を結合するが、残存する細菌タンパク質はカラムを通過するように設計した。カラムを８Ｍ尿素、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７）で洗浄した。８Ｍ尿素、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ３）でカラムからｐＱＥ（ＳＰ１）７タンパク質を溶出した。試料は、定量アミノ酸分析で測定すると、純度９４％であった。図１２は、従来の精製法と本出願に記載の方法との比較を示す。蟻酸で溶解した細胞は、Ｎｉ（ニッケル）−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーを用いる６Ｍグアニジン溶解と比較すると、同様の純度でより多くの生糸タンパク質を与えた。
【００４４】
例２
プロピオン酸とイオン交換クロマトグラフィーによる組換え生糸タンパク質の精製
本例では、図３に記載のｐＱＥ（ＳＰ１）７［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４（配列番号３）の遺伝子産物を、図４に記載の組換え生糸タンパク質ｐＱＥ（ＳＰ１）７［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４（配列番号４）として、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、１９９５年）で発現させる。［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４遺伝子を、発現ベクターｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））中にクローン化し、宿主細胞株ＳＧ１３００９ｐＲＥＰ４（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に形質転換した。培養物を、４００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する４×ＹＴ培地（１リットルあたり：３２ｇトリプトン、２０ｇ酵母エキス、５ｇ　ＮａＣｌ）中でＡ６００＝１．５〜２．０まで増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加えて、タンパク質発現を誘導した。１〜４時間後、細胞を遠心分離して集め、精製のために保存した。凍結乾燥ペレットを１３．３Ｎプロピオン酸中で溶解（２ｍｌ／ｇ細胞ペレット）して、蒸留脱イオン水で２．３Ｎの酸まで希釈し、室温で１時間攪拌した。細胞溶解物を遠心分離して清澄化し、限外ろ過により２０倍濃縮した。酸に対して安定なタンパク質の多くが不溶性になり、遠心分離して除去した。清澄化した上清を、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で充分透析した。透析した溶液を、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で平衡化しておいた強陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ−セファデックスＡ５０）に適用した。クロマトグラフィー条件は、陽性に荷電した生糸タンパク質はカラムに結合しないが、低等電点と真の陰性荷電を有する残存するタンパク質はカラムに結合するように設計した。カラムを２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で洗浄して、残存する生糸タンパク質を回収した。洗浄液を非結合生糸含有画分とともにプールし、処理した。定量アミノ酸分析で測定すると、試料の純度は９７％であった。
【００４５】
例３
プロピオン酸とイオン交換クロマトグラフィーによる組換え生糸タンパク質の精製
本例では、図５に記載のｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４（配列番号５）の遺伝子産物を、図６に記載の組換え生糸タンパク質ｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４（配列番号６）として、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、１９９５年）で発現させる。［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４遺伝子を、発現ベクターｐＥＴ２４（ノバゲン・インク（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．））中にクローン化し、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に形質転換した。培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を有する規定培地（１リットルあたり：１３．３ｇ　ＫＨ２ＰＯ４、４ｇ　（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１．７ｇクエン酸、２５ｇグルコース、１．２ｇ　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、３９ｍｇ　ＦｅＣｌ３、１３ｍｇ　ＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ　ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、３ｍｇ　Ｈ３ＢＯ３、２．５ｍｇ　Ｎａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ、２．５ｍｇ　ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、１．８ｍｇ　Ｃｕ（ＣＨ３ＣＯＯ）２−Ｈ２Ｏ、６．７ｍｇ　ＥＤＴＡ、４．５ｍｇ　チアミン−ＨＣｌ）中で、１６リットル／分の空気と６００ｒｐｍ で、Ａ６００＝１９まで増殖させた。１ｍＭ　ＩＰＴＧで１時間誘導し、細胞を遠心分離して集め、精製のために保存した。凍結乾燥ペレットを１３．３Ｎプロピオン酸中で溶解（２ｍｌ／ｇ細胞ペレット）して、蒸留脱イオン水で２．３Ｎの酸まで希釈し、室温で１時間攪拌した。細胞溶解物を遠心分離して清澄化し、限外ろ過により２０倍濃縮した。酸に対して安定なタンパク質の多くが不溶性になり、遠心分離して除去した。清澄化した上清を、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で充分透析した。透析した溶液を、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で平衡化しておいた強陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ−セファデックスＡ５０）に適用した。クロマトグラフィー条件は、陽性に荷電した生糸タンパク質はカラムに結合しないが、低等電点と真の陰性荷電を有する残存するタンパク質はカラムに結合するように設計した。カラムを、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で洗浄して、残存する生糸タンパク質を回収した。洗浄液を非結合生糸含有画分とともにプールし、処理した。ポリアクリルアミドゲルのクマシーブルー染色により測定すると、試料の純度は７５〜８５％であった（図１３を参照）。
【００４６】
例４
変性剤を含有するプロピオン酸とイオン交換クロマトグラフィーによる組換え生糸タンパク質の精製
本例では、図５に記載のｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４（配列番号５）の遺伝子産物を、図６に記載の組換え生糸タンパク質ｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４（配列番号６）として、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、１９９５年）で発現させる。凍結乾燥ペレットを１３．３Ｎプロピオン酸中で溶解（２ｍｌ／ｇ細胞ペレット）して、６ＭグアニジンＨＣｌ（最終濃度３Ｍ）と蒸留脱イオン水で２．３Ｎの酸まで希釈し、室温で１時間攪拌した。細胞溶解物を遠心分離して清澄化し、限外ろ過により３倍濃縮した。沈殿した物質を遠心分離して除去し、清澄化した上清を、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で充分透析した。酸に対して安定なタンパク質の多くは不溶性となり、遠心分離により除去した。透析した上清を、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で平衡化しておいた強陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ−セファデックスＡ５０）に適用した。クロマトグラフィー条件は、陽性に荷電した生糸タンパク質はカラムに結合しないが、低等電点と真の陰性荷電を有する残存するタンパク質はカラムに結合するように設計した。カラムを２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ９）で洗浄して、残存する生糸タンパク質を回収した（図１４を参照）。洗浄液を非結合生糸含有画分とともにプールし、例９に記載のように処理した。クマシーブルー染色すると、試料の純度は約８０％であった。
【００４７】
例５
変性剤を含有する蟻酸と親和性クロマトグラフィーによる組換え生糸タンパク質の精製
本例では、図７に記載のＰＥＴＮｃＤＳ（配列番号７）の遺伝子産物を、図８に記載の組換え生糸タンパク質ＰＥＴＮｃＤＳ（配列番号８）として、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（アルシジアコノ（Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ）ら、１９９８年）で発現させる。ＮｃＤＳ遺伝子を発現ベクターＰＥＴ２４（ノバゲン・インク（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．））中にクローン化し、宿主細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に形質転換した。培養物を、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を有する４×ＹＴ培地（１リットルあたり：３２ｇトリプトン、２０ｇ酵母エキス、５ｇ　ＮａＣｌ）中で、１リットル／分の空気と８００ｒｐｍ で、Ａ６００＝４まで増殖させた。１ｍＭ　ＩＰＴＧで３時間誘導し、細胞を遠心分離して集め、精製のために保存した。凍結乾燥ペレットを２３Ｎ蟻酸中で溶解（５ｍｌ／ｇ細胞ペレット）して、６ＭグアニジンＨＣｌ（最終濃度３Ｍ）と蒸留脱イオン水で２．３Ｎの酸まで希釈し、室温で１時間攪拌した。細胞溶解物を遠心分離して清澄化し、限外ろ過により２０倍濃縮した。溶液を遠心分離して清澄化し、８Ｍ尿素、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８）で充分透析した。沈殿した物質を遠心分離して除去し、清澄化した上清を、８Ｍ尿素、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８）で平衡化しておいた親和性クロマトグラフィー樹脂（ニッケル−ＮＴＡアガロース）に適用した。クロマトグラフィー条件は、組換え生糸タンパク質を結合するが、残存する細菌タンパク質はカラムを通過するように設計した。カラムを８Ｍ尿素、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７）で洗浄した。８Ｍ尿素、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ３）でカラムからＮｃＤＳタンパク質を溶出した。次に、精製したタンパク質を、例８に記載のように繊維紡糸のために処理することができた。
【００４８】
例６
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＯｍｐＦ膜タンパク質の吉草酸精製
この例では、図９に記載のように、未変性の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ｏｍｐＦ膜タンパク質（配列番号９）を精製した。例３に記載のように細胞を増殖させ、回収した。ＯｍｐＦは未変性の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）タンパク質であるため、その産生はＩＰＴＧの添加により誘導されなかった。凍結乾燥ペレットを９．２Ｎ吉草酸（２ｍｌ／ｇペレット）で溶解し、蒸留脱イオン水で２．３Ｎの酸まで希釈し、室温で１時間攪拌した。細胞溶解物を遠心分離して清澄化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用して電気泳動を行った。図１５は、凍結乾燥大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞ペレットからの未変性の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）構造タンパク質であるｏｍｐＦのこの精製を示すポリアクリルアミドゲルである。ｏｍｐＦタンパク質をニトロセルロース膜にブロットしてＮ末端配列決定を行った。Ｎ末端配列の生じる３０アミノ酸により、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）外膜タンパク質であるｏｍｐＦが同定された。この簡単な抽出法により、クマシーブルー染色に基づき約８５％の純度が得られた。
【００４９】
例７
レコグニンＢ１タンパク質の有機酸抽出
この例では、図１０に示すように、レコグニンＢ１（配列番号１０）の遺伝子産物を、図１１に示すように組換え合成コイルドタンパク質レコグニンＢ１（配列番号１１）として大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中で発現させた（マグラス・ケー・ピー（ＭｃＧｒａｔｈ， Ｋ． Ｐ．）とカプラン・ディー・エル（Ｋａｐｌａｎ， Ｄ． Ｌ．）、Ｍａｔ． Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｐｒｏｃ． ２９２， ８３−９１）。レコグニンＢ１遺伝子を発現ベクターｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））中にクローン化し、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主細胞株ＳＧ１３００９ｐＲＥＰ４（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））中に形質転換した。培養物を、アンピシリン（４００μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する４×Ｙｔ培地（１リットルあたり：３２ｇトリプトン、２０ｇ酵母エキス、５ｇ　ＮａＣｌ）中でＡ６００＝１まで増殖させた。１ｍＭ　ＩＰＴＧを加えて、２時間発現を誘導し、遠心分離して細胞を集め、精製のために保存した。個々の凍結乾燥ペレットを２３Ｎ蟻酸、１７．５Ｎ酢酸、１３．４Ｎプロピオン酸、１０．９Ｎ酪酸または９．２Ｎ吉草酸中で別々に溶解（２ｍｌ／ｇ細胞ペレット）して、蒸留脱イオン水で２．３Ｎの酸まで希釈し、室温で１時間攪拌した。細胞溶解物を遠心分離して清澄化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１６は、組換え多重らせん構造タンパク質であるレコグニンＢ１のポリアクリルアミドゲルを示す。細胞ペレットを、ローディング緩衝液、蟻酸および吉草酸で溶解した。ゲルにのせた細胞ペレットの相対量は、ローディング緩衝液、蟻酸および吉草酸についてそれぞれ８５、４００、９００μｇである。酢酸、プロピオン酸、および酪酸は、このタンパク質を抽出することができなかった。結果は、蟻酸と吉草酸が、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ペレットから多量のレコグニンＢ１を抽出することができることを示した。抽出されたタンパク質は、これらの有機酸に暴露しても分解されないようであった。２つの酸のうち、吉草酸は、比較的純粋な形でレコグニンＢ１を抽出することができた。
【００５０】
例８
組換え生糸タンパク質の処理と繊維紡糸
組換えＰＥＴＮｃＤＳタンパク質を例５のように精製し、限外ろ過により１００倍濃縮し、１Ｍ尿素を含有する１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ５）で透析した。透析した試料を遠心分離により清澄化し、限外ろ過により、繊維紡糸のための２５％（ｗ／ｗ）溶液に濃縮した。ハーバード装置注入／回収ポンプ（Ｈａｒｖａｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ／Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ Ｐｕｍｐ）（ハーバードインストルメンツ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ナチック（Ｎａｔｉｃｋ）、マサチューセッツ州）を、特殊化ミクロスピナー（空洞容積０．５ｍｌ）と６ｃｍ（０．００５Ｉ．Ｄ．）片のチューブ（これは紡糸口金として使用した）とともに使用した。生糸溶液を、５〜１０μｌ／分の速度で紡糸口金から、９０％メタノールからなる凝固浴中に押し出した。水不溶性繊維（直径１０〜６０μｍ）を製造し、光学顕微鏡のために調製した（図１７を参照）
【００５１】
例９
ｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４組換え生糸タンパク質の処理と繊維紡糸　ｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４（配列番号６）を、例４に記載のように精製した。試料を遠心分離して清澄化し、繊維紡糸のために限外ろ過により９．３％（ｗ／ｗ）溶液に濃縮した。ハーバード装置注入／回収ポンプ（Ｈａｒｖａｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ／Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ Ｐｕｍｐ）（ハーバードインストルメンツ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ナチック（Ｎａｔｉｃｋ）、マサチューセッツ州）を、特殊化ミクロスピナー（空洞容積０．５ｍｌ）と６ｃｍ（０．００５Ｉ．Ｄ．）片のチューブ（これは紡糸口金として使用した）とともに使用した。生糸溶液を、２〜５μｌ／分の速度で紡糸口金から、９０％メタノールからなる凝固浴中に押し出した。繊維を溶液から産生した。９．３％溶液からの繊維を凝固浴から取り出した：該繊維は水不溶性であり、次に光学顕微鏡のために調製した。
【００５２】
例１０
ｐＱＥ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４ 組換え生糸タンパク質の処理と繊維紡糸　ｐＱＥ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４ タンパク質を、例５に記載のように蟻酸／グアニジン塩酸中で溶解して精製し、１６０ｍＭ尿素を含有する１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭトリス、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ５）で透析した。透析した試料を遠心分離により清澄化し、限外ろ過により、繊維紡糸のための６．５％よ１２．５％（ｗ／ｗ）溶液に濃縮した。ハーバード装置注入／回収ポンプ（Ｈａｒｖａｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ／Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ Ｐｕｍｐ）（ハーバードインストルメンツ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ナチック（Ｎａｔｉｃｋ）、マサチューセッツ州）を、特殊化ミクロスピナー（空洞容積０．５ｍｌ）と６ｃｍ（０．００５”Ｉ．Ｄ．）片のチューブ（これは紡糸口金として使用した）とともに使用した。生糸溶液を、５〜１０μｌ／分の速度で紡糸口金から、９０％メタノールからなる凝固浴中に押し出した。各溶液から繊維を製造した。１２．５％溶液からの繊維のみを凝固浴から取り出した；これらは水不溶性であり、光学顕微鏡のために調製した（図１８を参照）
【００５３】
上記説明と例から、本発明は、構造タンパク質を精製し、クモの生糸タンパク質を紡糸するための改良された方法を提供することが明らかであろう。従って本発明は、開示された特定の実施態様に限定されず、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神と範囲内であるすべての修飾を包含する。
【図面の簡単な説明】
本発明の理解を促進するために、多くの図が含まれる。
【図１】
図１は、ｐＱＥ（ＳＰ１）７と呼ぶ組換え生糸タンパク質の核酸配列（配列番号１）を示す。
【図２】
図２は、配列番号１に示す核酸配列の遺伝子産物である、ｐＱＥ（ＳＰ１）７と呼ぶ組換え生糸タンパク質（配列番号２）を示す。
【図３】
図３は、ｐＱＥ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４と呼ぶ組換え生糸タンパク質の核酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】
図４は、配列番号３に示す核酸配列の遺伝子産物である、ｐＱＥ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４と呼ぶ組換え生糸タンパク質（配列番号４）を示す。
【図５】
図５は、ｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４と呼ぶ組換え生糸タンパク質の核酸配列（配列番号５）を示す。
【図６】
図６は、配列番号５に示す核酸配列の遺伝子産物である、ｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４と呼ぶ組換え生糸タンパク質（配列番号６）を示す。
【図７】
図７は、ｐＥＴＮｃＤＳと呼ぶ組換え生糸タンパク質の核酸配列（配列番号７）を示す。
【図８】
図８は、配列番号７に示す核酸配列の遺伝子産物である、ｐＥＴＮｃＤＳと呼ぶ組換え生糸タンパク質（配列番号８）を示す。
【図９】
図９は、ｏｍｐＦと呼ぶ細菌膜タンパク質（配列番号９）を示す。
【図１０】
図１０は、レコグニン（Ｒｅｃｏｇｎｉｎ）Ｂ１と呼ぶ組換え構造タンパク質の核酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１１】
図１１は、配列番号１０に示す核酸配列の遺伝子産物である、レコグニンＢ１と呼ぶ組換え構造タンパク質（配列番号１１）を示す。
【図１２】
図１２は、組換え生糸タンパク質ｐＱＥ（ＳＰ１）７ の酸溶解精製を従来の変性法と比較するポリアクリルアミドゲルを示す。ｐＱＥ（ＳＰ１）７ タンパク質は、変性条件（例えば８Ｍ尿素）下での溶解と比較して酸溶解により濃縮される。以後の蟻酸のＮｉ−ＮＴＡによる親和性クロマトグラフィー精製により、従来の変性溶解の精製に匹敵する収率が得られる。
【図１３】
図１３は、プロピオン酸抽出したｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４タンパク質試料を用いるＱＡＥ−セファデックスを示すポリアクリルアミドゲルである。
【図１４】
図１４は、３Ｍグアニジン−ＨＣｌを有するプロピオン酸による溶解と、ＱＡＥ−セファデックスＡ５０を使用するイオン交換クロマトグラフィーによる、ｐＥＴ［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４ の精製を示すポリアクリルアミドゲルである。
【図１５】
図１５は、凍結乾燥大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞ペレットからの未変性の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）構造タンパク質であるｏｍｐＦの精製を示すポリアクリルアミドゲルである。細胞ペレットは吉草酸を使用して抽出した。この抽出法は、クマシーブルー染色に基づくと約８５％の純度を与えた。
【図１６】
図１６は、組換え型の多重らせん構造タンパク質であるレコグニンＢ１のポリアクリルアミドゲルを示す。細胞ペレットを、ゲルローディング緩衝液、蟻酸または吉草酸中で溶解した。ゲルにのせた細胞ペレットの相対量は、ローディング緩衝液、蟻酸および吉草酸についてそれぞれ８５、４００、９００μｇである。酢酸、プロピオン酸、および酪酸は、このタンパク質を抽出することができなかった。
【図１７】
図１７は、吸光係数により測定した２５％（ｗ／ｗ）のタンパク質溶液から紡糸したＰＥＴＮｃＤＳ繊維の顕微鏡写真を示す。繊維は、１０μｌ／分の速度で９０％メタノール凝固浴中で作成した。約６０μｍの一貫した直径が観察された。偏光下で、光の角度を変化させると色は均一に青から黄色に変化し、繊維中の指向性を示していた。
【図１８】
図１８は、ｐＱＥ（ＳＰ１）７［（ＳＰ１）４／（ＳＰ２）１］４の１２．５％溶液から９０％メタノール凝固浴炭中に５μｇ／分の速度で紡糸した繊維を、ａ）白色光とｂ）着色板を有する偏光で観察した顕微鏡写真を示す。繊維は、約３０μｍの一貫した直径を示す。
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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