(57)【要約】本発明は、ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズまたはアゴナイズする分子をスクリーニングするための方法を提供する。本発明の一つの側面は、半固形培地におけるＲＡＮＫ応答性細胞の成長を含み、ここにおいてＲＡＮＫアンタゴニストに曝すことでコロニー形成が促進する。本発明の別の側面は、ＭＭＰ−９およびＴＲＡＰ遺伝子由来のＲＡＮＫ応答性プロモーターを用いたプロモーター／レポーターのコンストラクトに依存する。本発明のさらなる側面は、ＲＡＮＫがｃ−ｓｒｃ活性、Ｆ−アクチンリング形成、およびＣａＰＯ４吸収の活性化が可能なことを利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイスまたはアゴナイズすることが可能な分子をスクリーニングする方法であって、ＲＡＮＫが配列番号２のアミノ酸１−６１６、または配列番号４のアミノ酸１−６２５を含むポリペプチドであり、以下の工程：
（ａ）ＲＡＮＫ応答性細胞を一つ又はそれより多くの候補分子と接触させ、該細胞は半固形培地で培養される；
（ｂ）接触させたＲＡＮＫ応答性細胞におけるコロニー形成率またはコロニー成長率が、半固形培地において培養されるが候補分子（群）と接触させない一つ又はそれより多くのリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞におけるコロニー形成率または成長率と比較して、高められたか、または低められたかを判定し；そして
（ｃ）接触させた細胞のコロニー形成率またはコロニー成長率が比較上高められるときは、分子をアンタゴニストとして同定し、そして、接触させた細胞のコロニー形成率またはコロニー成長率が比較上低められるときは、分子をアゴニストとして同定する
を含む、前記方法。
【請求項２】
該方法がさらに、以下の（ａ）−（ｅ）：
（ａ）ＲＡＮＫ応答性細胞をＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドと接触させる、ここにおいて、ＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドが配列番号６のアミノ酸１６２−３１７または配列番号８のアミノ酸１６１−３１６を含む；
（ｂ）ＲＡＮＫ応答性細胞をアゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体と接触させる；
（ｃ）ＲＡＮＫ応答性細胞を、ＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドを発現する一つ又はそれより多くの細胞と接触させる、該ＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドが配列番号６のアミノ酸１６２−３１７、または配列番号８のアミノ酸１６１−３１６を含む；
（ｄ）該ＲＡＮＫ応答性細胞において、ＲＡＮＫを過剰発現させる；および
（ｅ）該ＲＡＮＫ応答性細胞において、配列番号１０に示したアミノ酸配列を有するＲＡＮＫの変異型を発現させる。
からなる群より選択される方法により、該ＲＡＮＫ応答性細胞のＲＡＮＫ活性を刺激する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
ＲＡＮＫ応答性細胞をＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドと接触させ、そしてさらに該ポリペプチドが、天然のＲＡＮＫ−Ｌ、可溶性ＲＡＮＫ−Ｌ、ＲＡＮＫ−Ｌのロイシンジッパー融合体、およびＲＡＮＫ−ＬのＦＬＡＧ（登録商標）ポリＨｉｓ融合体からなる群より選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
応答性細胞をアゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体と接触させることにより、ＲＡＮＫ活性が刺激される、請求項２の方法。
【請求項５】
抗ヒトＭ３３０抗体、抗ヒトＭ３３１抗体、抗マウスＭ３９５抗体、および抗マウスＭ３９６抗体からなる群より抗体が選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
接触させたＲＡＮＫ応答性細胞においてコロニー形成率またはコロニー成長率を判定する工程が、接触させたＲＡＮＫ応答性細胞において形成されたコロニーの大きさを、一つ又はそれより多くのリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞において形成されたコロニーの大きさと視覚的に比較することを含み、該視覚的比較がＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させた後少なくとも１日でなされる、請求項１の方法。
【請求項７】
ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させる工程が、候補分子を構成する核酸分子またはタンパク質分子をコードする導入ＤＮＡ分子を、該細胞において発現させることを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
該導入ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、請求項７の方法。
【請求項９】
該導入ＤＮＡ分子が該ＲＡＮＫ応答性細胞のゲノムに組み込まれる、請求項７の方法。
【請求項１０】
該導入ＤＮＡ分子が該ＲＡＮＫ応答性細胞のゲノムに組み込まれない、請求項７の方法。
【請求項１１】
該候補分子が導入ＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質である、請求項７の方法。
【請求項１２】
該候補分子が導入ＤＮＡ分子によりコードされた核酸分子であり、そして、該候補分子がアンチセンス核酸分子およびリボザイム活性を有する核酸分子からなる群より選択される、請求項７の方法
【請求項１３】
さらに該接触ＲＡＮＫ応答性細胞より形成されたコロニーから該導入ＤＮＡ分子を単離することを含む、請求項８の方法。
【請求項１４】
候補分子がタンパク質であり、そしてＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させる工程が、細胞が培養される半固形培地に該タンパク質を添加することを含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
接触させる工程が、細胞が培養される半固形培地に候補分子である複数のタンパク質を加えることを含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
ＲＡＮＫ応答性細胞が、骨髄、脾臓、胎児の肝臓または末梢血由来の造血前駆細胞；および骨髄、脾臓、胎児の肝臓または末梢血由来であり破骨細胞前駆体に富んでいる初代造血細胞、からなる群より選択される初代造血細胞である、請求項１の方法。
【請求項１７】
ＲＡＮＫ応答性細胞が、ＲＡＷ２６４．７細胞；Ｃ７細胞；およびＢＣＬ−Ｘ１／タグ細胞からなる群より選択される細胞株である、請求項１の方法。
【請求項１８】
半固形培地がメチルセルロースを含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
さらに、接触させたＲＡＮＫ応答性細胞におけるコロニー形成率もしくはコロニー成長率が、比較上高められまたは低められるのを検出した後、接触させた細胞から該候補分子を精製する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
ＲＡＮＫ活性を調節する分子をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）培養されたＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させ、該ＲＡＮＫ応答性細胞がレポータータンパク質をコードする核酸分子を含み、該核酸分子が、ＭＭＰ−９プロモーターおよびＴＲＡＰプロモーターからなる群より選択されるＲＡＮＫ応答性制御核酸配列に機能可能なように連結されており、ここにおいて、該候補分子と接触させる前、間または後に、ＲＡＮＫ応答性細胞はＲＡＮＫトリガーに曝される；
（ｂ）接触させたＲＡＮＫ応答性細胞におけるレポーター分子発現のレベルが、候補分子と接触させないリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞の培地におけるレポーター分子発現のレベルと比較して、高められるかまたは低められるかを判定し；そして
（ｃ）接触させた細胞におけるレポーター分子発現のレベルが比較上高められるときは、候補分子をＲＡＮＫアゴニストとして同定し、接触させた細胞におけるレポーター分子発現のレベルが比較上低められるときは、候補分子をＲＡＮＫアンタゴニストとして同定する。
を含む、前記方法。
【請求項２１】
以下の（ａ）−（ｅ）：
（ａ）ＲＡＮＫ応答性細胞をＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドと接触させる、ここにおいて、ＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドが配列番号６のアミノ酸１６２−３１７または配列番号８のアミノ酸１６１−３１６を含む；
（ｂ）ＲＡＮＫ応答性細胞をアゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体と接触させる；
（ｃ）ＲＡＮＫ応答性細胞をＲＡＮＫ−Ｌを発現する細胞と接触させる、ここにおいて、ＲＡＮＫ−Ｌが配列番号６のアミノ酸１６２−３１７または配列番号８のアミノ酸１６１−３１６を含む；
（ｄ）該ＲＡＮＫ応答性細胞においてＲＡＮＫを過剰発現させる；および
（ｅ）該ＲＡＮＫ応答性細胞において、配列番号１０において示したアミノ酸配列を有する欠損したＲＡＮＫポリペプチドを発現させる
からなる群より選択される方法により、ＲＡＮＫ応答性細胞においてＲＡＮＫを誘発する、請求項２０の方法。
【請求項２２】
配列番号６のアミノ酸１６２−３１７または配列番号８のアミノ酸１６１―３１６を含むＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドと細胞を接触させることにより、ＲＡＮＫ応答性細胞においてＲＡＮＫが誘発され、さらに該ＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドが、天然のＲＡＮＫ−Ｌ、ＲＡＮＫ−Ｌのロイシンジッパー融合体、およびＲＡＮＫ−ＬのＦＬＡＧポリＨｉｓ融合体からなる群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
ＲＡＮＫ応答性制御核酸がＭＭＰ−９プロモーターである、請求項２０の方法。
【請求項２４】
ＭＭＰ−９プロモーターが、配列番号１１のヌクレオチド１７６９−３５９１を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させる工程が、候補核酸分子または候補タンパク質分子をコードする導入ＤＮＡ分子を該ＲＡＮＫ応答性細胞において発現させることを含む、請求項２０の方法。
【請求項２６】
該導入ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
該導入ＤＮＡ分子が該ＲＡＮＫ応答性細胞のゲノムに組み込まれる、請求項２５の方法。
【請求項２８】
該導入ＤＮＡ分子が該ＲＡＮＫ応答性細胞のゲノムに組み込まれない、請求項２５の方法。
【請求項２９】
該候補分子が導入ＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質である、請求項２５の方法。
【請求項３０】
該候補分子が導入ＤＮＡ分子によりコードされる核酸分子である、請求項２５の方法。
【請求項３１】
該核酸分子がリボザイム活性を有する、請求項２５の方法。
【請求項３２】
さらに該接触ＲＡＮＫ応答性細胞より形成されたコロニーから該導入ＤＮＡ分子を単離することを含む、請求項２５の方法。
【請求項３３】
ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させる工程が、候補分子の存在下において該ＲＡＮＫ応答性細胞を培養することを含み、そしてさらに該候補分子がタンパク質である、請求項２０の方法。
【請求項３４】
ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させる工程が、複数の候補タンパク質の存在下において該ＲＡＮＫ応答性細胞を培養することを含む、請求項２０の方法。
【請求項３５】
該レポーター分子が、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、および異種表面タンパク質からなる群より選択される、請求項２０の方法。
【請求項３６】
レポーター分子が、ヒトＩＬ−２受容体、マウスＩＬ−４受容体、ヒトＣＤ２タンパク質、ヒトＣＤ４タンパク質、ヒトＣＤ８タンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、および緑色蛍光タンパク質からなる群より選択される異種表面タンパク質である、請求項３５の方法。
【請求項３７】
該ＲＡＮＫ応答性細胞が、欠損したＲＡＮＫ分子を発現し、そして該スクリーニングが、該欠損ＲＡＮＫ活性を相補するアゴニストに対するものである、請求項２０の方法。
【請求項３８】
該ＲＡＮＫ応答性細胞が造血細胞である、請求項２０の方法。
【請求項３９】
該ＲＡＮＫ応答性細胞がＲＡＷ２４６．７細胞である、請求項２０の方法。
【請求項４０】
さらに、発現するレポーター分子のレベルが比較上高められまたは低められると判定される細胞から候補分子を精製する工程を含む、請求項２０の方法。
【請求項４１】
さらに、精製された候補分子がＲＡＮＫと相互作用することを証明する工程を含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】
レポーター分子発現のレベルが、蛍光に基づくアッセイ法、固相アッセイ法、および放射性化合物を使用するアッセイ法からなる群より選択されるアッセイ法により判定される、請求項２０の方法。
【請求項４３】
発現するレポーター分子のレベルを判定することが、該レポーター分子を発現している細胞を蛍光に基づくセルソーティングにより物理的に単離することを含む、請求項２０の方法。
【請求項４４】
ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズまたはアゴナイずする分子をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させ、ここにおいて、ＲＡＮＫ応答性細胞は該細胞におけるＲＡＮＫの誘発に応答して破骨細胞に分化することが可能である；そして
（ｂ）該接触細胞におけるｃ−ｓｒｃ活性またはＦ−アクチン形成のレベルが、候補分子と接触させないリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞におけるｃ−ｓｒｃ活性またはＦ−アクチン形成のレベルと比較して高められるのを観察する
を含む、前記方法。
【請求項４５】
ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズまたはアゴナイズする分子をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させ、ここにおいて、ＲＡＮＫ応答性細胞は該細胞におけるＲＡＮＫの誘発に応答して破骨細胞に分化することが可能である；
（ｂ）該接触細胞においてＲＡＮＫを誘発し；
（ｃ）ＣａＰＯ４のフィルム上に接触させた細胞を培養し；
（ｄ）接触させ培養した細胞により生じる該フィルムにおけるピットの数を、ＲＡＮＫを誘発させるが候補分子と接触させないリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞により生じるＣａＰＯ４のフィルムにおけるピットの数と比較して測定し；そして
（ｅ）接触させた細胞がリファレンス細胞よりも多数のピットを生じさせときは、候補分子をＲＡＮＫアゴニストとして同定し、そして接触させた細胞が生じさせたピット数が、リファレンス細胞が生じさせた数よりも少ないときは、候補分子をＲＡＮＫアンタゴニストとして同定する
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、全体が本明細書に参照として援用される２０００年９月２２日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願６０／２３５，１５７から、優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＮＦ−κＢの受容体活性化剤（ＲＡＮＫ）に関連するアゴニストおよび／またはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関するものである。
【０００３】
発明の背景
ＮＦ−κＢの受容体活性化剤の頭字語であるＲＡＮＫは、腫瘍懐死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーであるタイプＩ膜タンパク質であり、そして、誘発されたときに転写因子ＮＦ−κＢを活性化する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３９０：１７５−１７９（１９９７）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第６，０１７，７２９号）。ヒトＲＡＮＫ（６１６アミノ酸）はシグナルペプチド（２８アミノ酸）、Ｎ末の細胞外ドメイン（１８４アミノ酸）、短い膜貫通ドメイン（２１アミノ酸）、および大きいＣ末の細胞質ドメイン（３８３アミノ酸）を有しており、そして、マウスＲＡＮＫも同様に配列される（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７）。ＲＡＮＫの細胞外ドメインは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの特徴である４つのシステインに富むシュードリピート、および２つのＮ−グリコシル化部位を含む。ＲＡＮＫは、ＣＤ４０と４０％の相同性を有しており（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７）、Ｔ細胞、樹状細胞、および破骨細胞において発現する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７；Ｈｏｆｂａｕｅｒら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ  Ｒｅｓ１５：２−１２（２０００））。
【０００４】
ＲＡＮＫの細胞質ドメインは、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、およびＴＲＡＦ６を含む、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦｓ；ＢａｋｅｒおよびＲｅｄｄｙ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１２：１（１９９６））のいくつかと細胞内で結合する（Ｇａｌｉｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７３：３４１２０−２７（１９９８））。これらのＴＲＡＦ結合部位は、ＲＡＮＫ細胞質内末端において２つの異なったドメインに集中している。ＴＲＡＦ（群）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーによって、しばしばシグナル伝達を仲介する細胞質タンパク質であり、これらは、例えば免疫応答および炎症応答の制御において重要である。ＲＡＮＫは、ＴＲＡＦ結合部位を含む事象のカスケードを通じて、その生物学的活性のいくらか、またはすべてを仲介する（例えば、Ｇａｌｉｂｅｒｔら、１９９８を参照されたい）。
【０００５】
膜結合型または可溶性のＲＡＮＫ−Ｌとの接触によることなどで、ＲＡＮＫを誘発する結果、ＲＡＮＫを仲介した細胞性応答が刺激される。これらの細胞性応答は、免疫系の細胞において広く用いられる遍在した転写因子である、転写因子ＮＦ−κＢの活性化、またはＪｕｎキナーゼの活性化（ＪＮＫ；例えばＧａｌｉｂｅｒｔら、１９９８を参照されたい）を含むこともあり得る。破骨前駆細胞におけるＲＡＮＫ活性化は、前駆細胞を誘導して成熟した破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）に分化させる。この分化工程に付随して、染色によって検出可能な特異化された構造である「Ｆ−アクチンリング」へのアクチンの再構成が生じる（Ｌａｋｋａｋｏｒｐｉ、Ｐ．およびＶａａｎａｎｅｎ，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ  Ｒｅｓ  ６：８１７−８２６（１９９１））。ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ活性のレベルが高められるのも、ＲＡＮＫの活性化と関連している（Ｗｏｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４：１０４１−１０４９（１９９９））。
【０００６】
ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫ−Ｌ）は，ＲＡＮＫを結合し活性化する細胞表面タンパク質である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第６，０１７，７２９号）。このタンパク質は、ＴＲＡＮＣＥ、ＯＤＦまたはＯＰＧリガンドとしても知られている（Ｗｏｎｇら、１９９９）。ＲＡＮＫ−Ｌは、タイプ２膜貫通タンパク質であり、約５０またはそれより短いアミノ酸の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および約２４０−２５０アミノ酸の細胞外ドメインを有する。ＲＡＮＫ−Ｌの細胞外ドメインはＲＡＮＫ結合部位を含む。ＲＡＮＫ−Ｌは、それが属するＴＮＦファミリーの他のメンバーと同様に、膜貫通ドメインと受容体結合ドメインとの間に、受容体の結合に不必要な「スペーサー」領域を有する。
【０００７】
骨においてＲＡＮＫ−Ｌは、破骨細胞の分化を刺激し、成熟した破骨細胞の活性を高め、そして破骨細胞のアポトーシスを阻害し、それにより活性化された破骨細胞のプールを広げる（例えば、Ｈｓｕら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６：３５４０−４５（１９９９）を参照されたい）。破骨細胞は、骨髄において造血前駆細胞から形成される、大きな、食作用を示す多核細胞である。破骨細胞は、骨組織間充質の分離、および骨組織の塩の可溶化を促進し、そして骨組織の適切な発生および成長に必要とされる。
【０００８】
ＲＡＮＫノックアウトマウスは、重い骨石化症（ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｔｉｃ）であり、かつ末梢リンパ節を欠失している（Ｄｏｕｇａｌｌら，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．  １３：２４１２−２４（１９９９））。ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌ活性の調節は、例えば骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、パジェット病、高カルシウム血症などを含む、骨減少症（ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ）または骨石化症（ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ）を含む様々な障害を治療するための手段として提案されてきた（例えば，ＰＣＴ国際公報ＷＯ  ９８／４６７５１およびＷＯ  ９９／５８６７４を参照されたい）。
【０００９】
ＲＡＮＫおよびそのリガンドは、免疫応答、炎症応答、破骨細胞の活性化を通じた骨組織再構築など、生物系の広範囲の制御において不可欠な役割を果たす。生物系の広範囲の制御におけるＲＡＮＫの重要性を考えると、ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズまたはアゴナイズする分子をスクリーニングするための方法が必要である。
【００１０】
発明の概要
本発明は、ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズまたはアゴナイズする分子をスクリーニングするための方法を提供する。
【００１１】
本発明の１つの態様において、ＲＡＮＫアゴニストまたはアンタゴニストのアッセイ法は、候補分子存在下における半固形培地においてＲＡＮＫ応答性細胞を培養し、そして、対照培地と比較してコロニー形成率またはコロニー成長率が、候補分子と接触させた細胞において高められまたは低められたかどうかを判定することを含む。このアッセイ法において、「テスト細胞」とも呼ばれる接触細胞において、コロニー形成率またはコロニー成長率が、候補分子と接触させない対照のリファレンス細胞におけるコロニー形成率または成長率と比較して高められる場合は、候補分子がＲＡＮＫアンタゴニストとして同定され、その率が比較上低められる場合は、ＲＡＮＫアゴニストとして同定される。候補分子との接触を除いて、参照のリファレンス細胞はそのほか、テスト培地と同様の方法で培養され、かつ取り扱われる。
【００１２】
本発明の１つの側面において、使用された半固形培地は、メチルセルロースであるが、一方、軟寒天、軟アガロースなども使用しうる。
【００１３】
望ましいならば、候補分子は、このアッセイ法のために、群にされてもよい（ｃａｎ  ｂｅ  ｂａｔｃｈｅｄ）。この方法においては、複数の候補分子がテスト培地に加えられる。ＲＡＮＫ活性の調節が当該培地において観察されるならば、当該バッチの各候補分子は、独立に試験され、そしてアンタゴニストまたはアゴニストが個別に同定されることも可能である。
【００１４】
半固形培地アッセイ法を使用して、ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズする分子をスクリーニングする場合、ＲＡＮＫは、テスト細胞を候補分子に曝す前、曝す間、および／または、曝した後に、ＲＡＮＫ応答性細胞において誘発される。本明細書において使用されるものとして、ＲＡＮＫの誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）は、ＲＡＮＫタンパク質を刺激して、それが発現されている細胞にシグナルを伝達する事象を意味する。本発明のこの最初の側面において有用な細胞は、ＲＡＮＫタンパク質を発現し、半固形培地においてコロニーを形成することが可能であり、そして、一つ以上のＲＡＮＫを仲介した細胞シグナル経路の作用によって刺激され、半固形培地においてコロニーを形成できない細胞型へ分化する。
【００１５】
ＲＡＮＫ活性が、本発明の半固形培地アッセイ法のために、ＲＡＮＫ応答性細胞において刺激されるとき、好ましい刺激方法は、：ＲＡＮＫ応答性細胞を、配列番号６のアミノ酸１６２−３１７または配列番号８のアミノ酸１６１−３１６を含むＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドなどの、ＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドと接触させること；ＲＡＮＫ応答性細胞をアゴニスト性（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）抗ＲＡＮＫ抗体と接触させること；ＲＡＮＫ応答性細胞をＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドを発現する一つ又はそれより多くの細胞と接触させること；ＲＡＮＫ応答性細胞においてＲＡＮＫを過剰発現させること；および、ＲＡＮＫ応答性細胞において、ＲＡＮＫ−Ｌの不存在下における通常のＲＡＮＫ発現レベルのＲＡＮＫシグナリングを誘導するＲＡＮＫの変異型を発現させることを含む。ＲＡＮＫの後者の型の例は、ＦＥＯ  ＲＡＮＫ（配列番号９および１０）である。
【００１６】
ＲＡＮＫ活性を刺激するＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドの例は、細胞表面で発現する内因性ＲＡＮＫ−Ｌなどの天然のＲＡＮＫ−Ｌ、可溶性ＲＡＮＫ−Ｌ、ＲＡＮＫ−Ｌのロイシンジッパー融合体、およびＲＡＮＫ−ＬのＦＬＡＧ（登録商標）ポリＨｉｓ融合体を含む。対象のアッセイ法のためにＲＡＮＫ活性を刺激する別の方法は、ＲＡＮＫ応答性細胞をアゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体と接触させることである。この目的のためのアゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体の例は、ヒトＲＡＮＫ向けのＭ３３０抗体およびＭ３３１抗体の両抗体、およびマウスＲＡＮＫ向けのＭ３９５およびＭ３９６抗体の両抗体を含む。
【００１７】
本発明の１つの側面において、半固形培地におけるコロニー形成率またはコロニー成長率は、細胞が候補分子に曝された後、プレートの視覚的検査により判定される。コロニーの数または観察されるコロニーの大きさは、候補分子に曝されるプレートと、候補分子に曝されない同様の培地に関して比較される。
【００１８】
ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させる１つの手段は、候補核酸分子または候補タンパク質分子をコードするＤＮＡ分子を、テスト細胞に導入することを含む。例えば、導入ＤＮＡは、単一のタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子、または試験されるタンパク質群をコードするｃＤＮＡライブラリーでもよい。このＤＮＡは、細胞へ導入された後、ＲＡＮＫ応答性細胞のゲノムに組み込まれても、組み込まれなくてもよい。安定なトランスフェクション、および一時的なトランスフェクションのための技術は公知であり、いずれかの型の技術を使用することも可能である。ある場合において、コードされた候補分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボザイム活性を有するＲＮＡなどの核酸分子ある。本発明の１つの側面において、ＲＡＮＫアゴニストまたはアンタゴニストをコードすると判定されるｃＤＮＡは、半固形培地において成長しているテスト細胞のコロニーから単離かつ精製される。
【００１９】
ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させる他の手段は、プレートに注ぐ前にそれを培地と混合することにより、または注がれたプレートを候補分子含む培地の層と重ねることにより、候補分子を半固形培地に直接的に加えることを含む。例えば、候補分子がタンパク質または小さい有機分子であるときに、前述の方法が用いられてもよい。望ましいならば、複数のタンパク質またはテスト分子がテスト培地に加えられてもよい。
【００２０】
本発明の１つの側面において、欠損したＲＡＮＫ分子を発現するＲＡＮＫ応答性細胞が用いられ、そして、この欠損ＲＡＮＫ分子を相補するアゴニストがスクリーニングされる。この目的のための欠損ＲＡＮＫの１つの例は、ヒトＲＡＮＫΔ３４０−４２１である。
【００２１】
上記のアッセイ法のための適したＲＡＮＫ応答性細胞は、骨髄、脾臓、胎児の肝臓または末梢血由来の造血前駆細胞、および骨髄、脾臓、胎児の肝臓または末梢血由来であり破骨細胞前駆体に富んでいる初代造血細胞などの、初代造血細胞を含む。本発明の他の側面において、ＲＡＮＫ応答性細胞は細胞株である。適した細胞株は、ＲＡＷ２６４．７細胞、Ｃ７細胞、およびＢＣＬ−Ｘ１／タグ細胞を含む。
本発明の別の側面は、酒石酸抵抗性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）遺伝子（配列番号１２）またはＭＭＰ−９遺伝子（配列番号１１）由来のプロモーター配列が、ＲＡＮＫ誘発で生じるシグナル伝達に直接的に応答する能力を利用する。好ましい態様において、ＭＭＰ−９プロモーターは、配列番号１１のヌクレオチド１７６９−３５９１を含む。本発明は、ＴＲＡＰまたはＭＭＰ−９がレポータータンパク質をコードする核酸分子と機能可能なように連結された組換えＤＮＡコンストラクトを用いることにより、ＲＡＮＫアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法を提供する。この目的に適したレポータータンパク質は、例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、または抗体結合法により検出可能である異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）表面タンパク質を含む。後者の例は、ヒトＩＬ−２受容体、マウスＩＬ−４受容体、ヒトＣＤ２タンパク質、ヒトＣＤ４タンパク質、およびヒトＣＤ８タンパク質を含む。
【００２２】
これらのアッセイ法のために、本明細書に記載されたレポーター／プロモーターコンストラクトは、培養されたＲＡＮＫ応答性細胞に導入される。適したＲＡＮＫ応答性細胞は、造血細胞を含む。適した造血細胞の例は、ＲＡＷ２６４．７細胞を含む。この手法を使用してＲＡＮＫアンタゴニストをスクリーニングするために、コンストラクトがテスト細胞に導入される。テスト細胞は、細胞においてＲＡＮＫを誘発しそれによりコンストラクトのプロモーター活性を活性化してレポーター遺伝子の発現をもたらす、可溶性ＲＡＮＫ−ＬなどのＲＡＮＫ活性アゴニストで処理される。候補アンタゴニスト分子を、誘発された細胞と接触させ、ＲＡＮＫが仲介されたこのレポーター遺伝子発現を抑制する能力を試験する。ＲＡＮＫが誘発する工程の前、間、または後に、テスト細胞を候補アンタゴニストと接触させる。
【００２３】
候補分子は、例えば培養培地に加えられてもよい。本発明の１つの態様において、候補分子はタンパク質であり；別の態様においては小さい有機分子である。
【００２４】
本発明の１つの側面において、候補分子は、細胞がＲＡＮＫトリガーに曝される前にテスト細胞に導入されたｃＤＮＡによってコードされるタンパク質またはタンパク質の群である。一般的には、ｃＤＮＡは、ＲＡＮＫを誘発する前、少なくとも４８時間に導入される。ｃＤＮＡは、レポーター遺伝子発現のレベルの変化を示す細胞から単離されてもよい。
【００２５】
上記のレポーター／プロモーターコンストラクトアッセイ法においてＲＡＮＫを誘発するのに適した方法は、表面においてＲＡＮＫ−Ｌを発現する細胞にテスト細胞を曝すこと、可溶性ＲＡＮＫ−Ｌにテスト細胞を曝すこと、テスト細胞においてＲＡＮＫを過剰発現させること、テスト細胞においてヒトＲＡＮＫΔ３４０−４２を発現すること、またはＲＡＮＫタンパク質に特異的なアゴニスト抗体にテスト細胞を曝すことを含む。本発明の１つの側面において、ＲＡＮＫは、配列番号６のアミノ酸１６２−３１７または配列番号８のアミノ酸１６１−３１６を含むＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドと接触させることにより、ＲＡＮＫ応答性細胞において誘発される。
【００２６】
ＲＡＮＫが誘発されたテスト細胞は、候補分子と接触され、そして細胞が解析されて、この接触の結果としてレポータータンパク質発現のレベルが高められ、または低められるかが判定される。レポーター発現のレベルは、蛍光に基づくアッセイ法、比色アッセイ法、固相法、放射性化合物を用いたアッセイ法などの、いずれかの適したアッセイ法により判定される。レポーター遺伝子産物のレベルを判定する一つの手段は、慣用法を用いて、レポーター分子を発現している細胞を蛍光に基づくセルソーティングにより物理的に単離することである。テスト細胞におけるレポータータンパク質発現の増加または減少は、テスト細胞におけるレポータータンパク質発現のレベルを、候補分子と接触させない対照培地における発現のレベル比較することによって判定される。候補分子がＲＡＮＫアンタゴニストであるならば、レポーター発現のレベルは、比較上低められるであろう。
【００２７】
上記のコンストラクトは、ＲＡＮＫアゴニストをスクリーニングするためにも用いられる。この場合においては、ＲＡＮＫがテスト細胞において意図的に誘発されることはないが、一方で、候補分子がＲＡＮＫを誘発する能力に関して評価される。本発明のこの側面において有用な細胞は、ＲＡＮＫタンパク質を発現し、そしてＲＡＮＫの活性化により刺激される少なくとも一つのシグナル伝達経路を含む。ある場合において、アゴニストは、候補タンパク質アゴニストをコードするｃＤＮＡを細胞に導入することにより、または複数の候補タンパク質アゴニストをコードするｃＤＮＡライブラリーを導入することにより、アゴニストを細胞と接触させる。当該例において、アゴニストは、レポーター遺伝子発現が高められることを示すコロニーからｃＤＮＡを回収かつ精製することにより単離されてもよい。さらに、慣用の技術を使用して、精製された候補分子が実際にＲＡＮＫと相互作用することを証明してもよい。
【００２８】
本発明の１つの側面において、レポーター／プロモーターコンストラクトを使用して、欠損型ＲＡＮＫ分子を発現する細胞を用いることによりＲＡＮＫアゴニストを同定し、そして欠損型ＲＡＮＫ活性を相補するアゴニストをスクリーニングする。例えば、ヒトＲＡＮＫΔ３４０−４２を発現する細胞がこの目的のために用いられてもよい。
【００２９】
本発明の別の側面において、ＲＡＮＫ活性のアンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニングは、候補分子を、ＲＡＮＫの誘発に応答して破骨細胞に分化することが可能なＲＡＮＫ応答性細胞と接触させることを含む。ＲＡＮＫアンタゴニストをスクリーニングするために、細胞においてＲＡＮＫを誘発させ、細胞を候補アンタゴニストに曝し、そして、ｃ−ｓｒｃ活性またはＦ−アクチン形成のレベルを、候補分子と接触させないリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞におけるｃ−ｓｒｃ活性またはＦ−アクチン形成のレベルと比較して観察する。候補分子がアンタゴニストであるならば、ｃ−ｓｒｃ活性化率およびＦ−アクチンリング形成率が、比較上低められるであろう。候補分子がＲＡＮＫアゴニスト活性に関してスクリーニングされたものならば、ＲＡＮＫ誘発の工程が省略され、そして、陽性の結果は、ｃ−ｓｒｃ活性およびＦ−アクチン形成が高められる観察からなるであろう。
【００３０】
本発明のさらに別の側面において、候補ＲＡＮＫアゴニストまたはアンタゴニストは、候補分子を該細胞におけるＲＡＮＫの誘発に応答して破骨細胞に分化することが可能なＲＡＮＫ応答性細胞と接触させ、細胞においてＲＡＮＫを誘発し、そしてＣａＰＯ４のフィルム上で細胞を培養することにより、スクリーニングされる。分化した破骨細胞は、そのすぐ周辺においてＣａＰＯ４を吸収し、そしてフィルム上にピットを生成するであろう。そして、接触させ培養された細胞により生じるフィルムのピット数を、ＲＡＮＫが誘発されるが候補分子と接触させないリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞により生じる同様のフィルムのピット数を比較する。そして、候補分子で処理された細胞により生じるピット数が、リファレンス細胞よりも大きいならば、候補分子をＲＡＮＫアゴニストとして同定し、処理細胞により生じるピット数が対照細胞により生じる数よりも小さいならば、ＲＡＮＫアンタゴニストとして同定する。
【００３１】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズまたはアゴナイズする分子をスクリーニングする方法を提供する。ＲＡＮＫのアンタゴニストおよびアゴニストを検出するための様々なアッセイ法が当技術分野において公知であるが（例えば、米国特許第６，０１７，７２９号を参照されたい）、本明細書に記載しているスクリーニング戦略は、以前に記載されているものではない。
【００３２】
本明細書で用いられるものとして、用語「ＲＡＮＫアゴニスト」、またはその文法的に同等なものは、ＲＡＮＫを誘発する分子など、ＲＡＮＫ活性を刺激する分子を意味する。ＲＡＮＫアゴニストは、ＲＡＮＫと直接的に相互作用してもよく、または間接的にＲＡＮＫ活性を高めてよい。例えば、ＲＡＮＫ−ＬはＲＡＮＫアゴニストと考えられるであろう。また、ＲＡＮＫに特異的に結合する抗体も、しばしばＲＡＮＫ活性のアゴニストとして作用する。
【００３３】
本明細書において用いられるものとして、用語「ＲＡＮＫアンタゴニスト」、またはその文法的に同等なものは、ＲＡＮＫ活性を阻害する分子を意味する。ＲＡＮＫアンタゴニストは、直接的または間接的にＲＡＮＫと相互作用する。ＲＡＮＫ：Ｆｃ（米国特許第６，０１７，７２９号に記載されている）およびオステオプロテゲリン（米国特許第６，０１５，９３８号）がＲＡＮＫアンタゴニストの例であり、前者は、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合されたＲＡＮＫの細胞外ドメインを含む融合タンパク質であり、そして後者は、自然発生のタンパク質である。これらの２つのタンパク質は、ＲＡＮＫ−Ｌを結合することによりＲＡＮＫにアンタゴナイズし、それによりＲＡＮＫ−ＬがＲＡＮＫ応答性細胞と結合するのを妨げる。
【００３４】
本明細書で用いられるものとして用語「ＲＡＮＫ」は、ＮＦ−κＢを活性化する能力またはＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、もしくはＴＲＡＦ６と結合する能力を有するタンパク質、並びに、配列番号２または配列番号４に示しているアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質を意味する。本発明のＲＡＮＫタンパク質は、配列番号２または配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体と結合可能である。
【００３５】
用語「ＲＡＮＫ−Ｌ」は、ＲＡＮＫを結合して活性化するタイプ２膜貫通型タンパク質である、ＲＡＮＫリガンドの頭字語である。代表的なＲＡＮＫ−Ｌタンパク質をコードする２つの核酸分子の配列は、配列番号５（ヒトＲＡＮＫ−Ｌ）および配列番号７（マウスＲＡＮＫ−Ｌ）において示し、そして、これらの２つの核酸配列によりコードされるＲＡＮＫ−Ｌタンパク質の配列は、それぞれ配列番号６および配列番号８に示す。本明細書において用いられるものとして「ＲＡＮＫ−Ｌ」は、完全長ＲＡＮＫ−Ｌタンパク質、並びにＲＡＮＫ−Ｌの部分を含むキメラ分子および多量体ＲＡＮＫ−Ｌ分子などの、膜結合型もしくは可溶型のＲＡＮＫ−Ｌタンパク質の、両方を含む。
【００３６】
ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌは、骨吸収に関する初期細胞型である、成熟破骨細胞の形成の制御に関与している。骨吸収率の増加（骨形成率を超える）は、集合的に骨減少症群（ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａｓ）を意味し、骨粗鬆症、骨髄炎、高カルシウム血症、外科手術もしくはステロイド投与によりもたらされる骨減少症、パジェット病、骨懐死、関節リュウマチによる骨喪失、歯周の骨喪失、人工装具の喪失もしくは緩み、および骨溶解性転移を含む、様々な骨障害を誘導することもあり得る。ＲＡＮＫのアゴニストおよびアンタゴニストは、破骨細胞の形成を調節するために用いられ、また、骨障害の患者に投与されて病状を改善することもあり得る。
【００３７】
さらに、多くの癌は、骨に転移し、そして通常の骨再構成を局所的に崩壊させることにより、骨の崩壊を誘導する。当該癌は、高カルシウム血症をもたらす、破骨細胞数の増加および破骨細胞の骨組織吸収量の増加と関連していることがあり得る（例えば、Ｇｕｉｓｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９（１）：１８−５４，１９９８を参照されたい）。他の癌は、必ずしも骨に転移しないが、高カルシウム血症および骨喪失をもたらす（例えば、扁平上皮細胞癌）。ＲＡＮＫのアゴニストおよびアンタゴニストは、限定されるわけではないが、乳ガン、多発性骨髄腫、黒色腫、肺ガン、前立腺癌、血液の癌、頭および首の癌、並びに腎癌などの、癌に苦しむ患者に投与されてその症状を改善してもよい。ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ相互作用のアンタゴニストは、特に癌の治療に有用である。
【００３８】
加えて、本スクリーニングアッセイ法により同定されたＲＡＮＫアンタゴニストまたはアゴニストは、心疾患、および動脈石灰化により特徴づけられる他の病状を予防または治療するために用いられてもよい。また、本明細書において同定されたＲＡＮＫのアンタゴニストおよびアゴニストは、毒性もしくは敗血性ショック、または移植片対宿主反応など、免疫疾患および／または炎症疾患を（ＮＦ−κＢ活性化の抑制を通じるなどして）治療するにおいて有用である。ＲＡＮＫの誘発はＴ細胞の活性を刺激するので、本明細書において同定されたＲＡＮＫアゴニストはワクチンアジュバントとしても有用である。
【００３９】
腫瘍細胞は、ＮＦ−κＢが阻害されたとき放射線に対して応答性が増す；このようにＲＡＮＫシグナリングのアンタゴニストは、ＲＡＮＫを発現する新生細胞により特徴づけられる疾患に関する付属の治療法として有用であろう。反対に、ＲＡＮＫのアゴニストは、ＲＡＮＫを仲介した細胞応答を刺激するために有用と思われ、そして、あるＲＡＮＫアゴニストは、不活性なＲＡＮＫ変異体を相補可能であることがあり得る。
【００４０】
ＲＡＮＫアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して試験される候補分子：
候補分子の例はまた、本明細書において「テスト分子」として言及され、ＲＡＮＫアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して試験され、
限定されるわけではないが、炭水化物、小分子（通常は有機分子またはペプチド）、タンパク質、および核酸分子（典型的に８から３０の核酸残基からなるオリゴヌクレオチド断片など）を含む。試験されるペプチドは、典型的に５から２５アミノ酸残基からなる。また、候補核酸分子は、アンチセンス核酸配列であってもよく、そして／または、リボザイム活性を有していてもよい。望ましいならば、アンチセンスまたはリボザイムＲＮＡは、アンチセンスまたはリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を細胞に導入することにより、標的細胞に導入されてもよい。
【００４１】
本明細書において記載しているスクリーニングアッセイ法を用いてスクリーニングされる小分子は、典型的には、経口により、または注射されることによりそれを必要とする患者に投与されてもよい。経口により投与されることも可能な小分子は、特に好ましい。本発明の小分子は、好ましくは、それらが薬学的物質として有効であるために必要とされる量で、毒性が無いと思われるものであり、またそれらは、好ましくは、迅速な酵素的または化学的分解により生じるであろう活性の喪失などの、体内における活性の迅速な喪失を受けない。加えて、薬学的に有用な小分子は、好ましくは免疫原性ではない。
【００４２】
本発明の方法は、ＲＡＮＫ依存細胞応答を仲介する一つ又はそれより多くのタンパク質をコードする一つ又はそれより多くのｍＲＮＡ分子の機能的な発現で干渉することによりＲＡＮＫ活性を阻害するアンチセンス分子をスクリーニングするために、使用されてもよい。アンチセンス核酸分子は、宿主細胞において発現する標的の核酸と相補的であり、そして標的と二本鎖を形成することにより標的が機能するのを妨げる。アンチセンス核酸は、遺伝子をコードするＤＮＡ鎖と二本鎖を形成することにより、または標的遺伝子の発現を制御する制御領域と二本鎖を形成することにより、標的遺伝子の転写を阻止することもあり得る。または、それはｍＲＮＡと二本鎖形成し、その翻訳を妨げまたは阻止する。アンチセンス核酸分子は、標的遺伝子の発現に干渉可能なものとして提供される複数の異なる方法で作成されてもよい。スクーリングされる典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、長さが２０−５０ヌクレオチドであり、また、より好ましくは長さが３０−４０ヌクレオチドである。アンチセンス核酸分子は通常、ヌクレオチド配列において標的遺伝子の一本鎖と実質上同一であるであろう。最小の同一性は、典型的には約６５％より大きいであろうが、同一性がより高いならば、内因性の配列の発現の抑制をより有効に行うことも可能だろう。従って、約８０％より実質的に大きい同一性が好ましく、一方で約９５％から完全な同一性がもっとも好ましい。
【００４３】
候補核酸分子は、リボザイム活性を有することがあり得る。従って、本発明の方法は、ＲＡＮＫ依存性細胞応答を仲介する一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上のｍＲＮＡ分子の機能的な発現を阻害するリボザイム分子のスクリーニングに使用されることも可能である。リボザイムは、完全または部分的にリボザイムの配列に相同な配列を有する核酸分子を切断することも可能である触媒のＲＮＡ分子である。標的ＲＮＡと特異的に組み合わされ、そして特異的な領域においてリン酸ジエステルバックボーンを切断し、それにより標的ＲＮＡを機能的に不活性化する、ＲＮＡリボザイムをコードするリボザイム導入遺伝子を設計することも可能である。この切断の実行において、リボザイムそれ自体は変化されず、かつ、他の標的ＲＮＡ分子を切断し続けることが可能である。アンチセンスＲＮＡ内のリボザイム配列の包含は、それらについてのＲＮＡ切断活性を与え、それによりアンチセンスコンストラクトの活性を増大させる。
【００４４】
標的のＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用は、Ｈａｓｅｌｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１（１９８８））（米国特許第５，６４６，０２３号も参照されたい）に記載され、両出版物は、参考文献として本明細書に援用される。Ｔａｂｌｅｒら（Ｇｅｎｅ１０８：１７５（１９９１））は、アンチセンスＲＮＡの利益、および単一コンストラクトにおけるリボザイム技術を組み合わせることにより、触媒のＲＮＡのコンストラクションを大きく単純化した。リボザイムの触媒作用に必要とされるのは、より小さい相同性領域であり、そのためこれは、切断部位が保存されているならば大きい遺伝子ファミリーの異なるメンバーの抑制を促進させることも可能である。
【００４５】
ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌ分子
一般的に、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ法は、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫ−Ｌタンパク質を含む。
【００４６】
ＲＡＮＫおよびその結合相手ＲＡＮＫ−Ｌ、並びにこれらのタンパク質をコードする核酸は、当技術分野において知られており、また、それらの物理的特性、細胞内における性質の点、並びに、ＲＡＮＫとＲＡＮＫ−Ｌの結合と関連している多くの生物活性の点で、良く特徴づけられてきた。マウスおよび／またはヒトＲＡＮＫの例、並びにマウスおよび／またはヒトＲＡＮＫ−Ｌの例は、米国特許第６，０１７，７２９号、米国特許第５，８４３，６７８号（本明細書においてマウスＲＡＮＫ−Ｌとして記載している「オステオプロテゲリン結合タンパク質」を開示している）、ＰＣＴ国際公報ＷＯ  ９８／２５９５８（本明細書においてマウスＲＡＮＫ−Ｌとして記載している「４８８Ｅ９」を開示している）；ＷＯ  ９８／４４７５１（本明細書においてマウスＲＡＮＫとして言及しているマウス「ＯＤＡＲ」を開示している）；および欧州特許第０  ９１１  ３４２号（本明細書においてマウスＲＡＮＫ−Ｌとして言及している「ＯＣＩＦ結合分子」を開示している）に開示されている。他のものもＲＡＮＫ−Ｌを開示しており、それを「ＴＲＡＮＣＥ」として言及している（例えば、Ｗｏｎｇら、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  ４：１０４１−４９（１９９９）を参照されたい）。これらのＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌ分子のいずれも、本明細書に記載されたアッセイ法において使用されてよい。
【００４７】
代表的なＲＡＮＫタンパク質をコードする２つの核酸分子の配列は、配列番号１（ヒトＲＡＮＫ）および配列番号３（マウスＲＡＮＫ）に示され、そして、これらの核酸分子によってコードされるアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２および４に示される。ヒトおよびマウスのＲＡＮＫ−Ｌ配列の例は、配列番号６および８に示され、そして配列番号５および７にこれらのタンパク質をコードする核酸が示される。また一方で、当該技術分野において公知のＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌ分子、またはＲＡＮＫのＲＡＮＫ−Ｌへの結合もしくはこの結合から通常にもたらされるＲＡＮＫの誘発に影響を与えないアミノ酸相違を有する変異体など、前記の例において示されたもの以外の他のＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌ変異型が、本明細書において開示されたアッセイ法において用いられてもよい。
【００４８】
天然のＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドの配列変異体は、アッセイ法に必要とされるいずれかの生体活性を有する限り、天然のＲＡＮＫまたはＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドが利用されるいずれかの例において、本発明の実施に有用である。通常これらのアッセイ法に適したＲＡＮＫ変異体は、ＲＡＮＫ−Ｌを結合し、それによりＲＡＮＫ活性を刺激するであろう、そして、適したＲＡＮＫ−Ｌの変異体は、ＲＡＮＫに結合し、それによりＲＡＮＫ活性を刺激するであろう。当該変異体において存在する変異は、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および挿入を含む。ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌのアリル型または突然変異型は、例えば、部位特異的突然変異導入、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入など、当該技術分野で公知の様々な技術を用いることにより、これらのアッセイ法における使用のために得ることも可能である。
【００４９】
開示された方法に有用なＲＡＮＫ分子は、野生型ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫの変異型を含む。変異体は、アミノ酸配列において配列番号２または４のＲＡＮＫ分子と異なっているかもしれないが、ＮＦ−κＢの活性化など、野生型ＲＡＮＫの誘発と関連した生体シグナルの少なくとも一つを導入する能力を維持するであろう。適した変異体（ｖａｒｉａｎｔ）は、自然発生するアリル変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ）、ＲＡＮＫの突然変異型（ｍｕｔａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）（例えばＦＥＯ  ＲＡＮＫ）、またはＤＮＡ組換え技術を用いて作成された変異体を含む。
【００５０】
ＲＡＮＫを誘発するために有用な、ＲＡＮＫ−Ｌの可溶型を含むＲＡＮＫ−Ｌタンパク質は、分子の細胞外領域に含まれるＲＡＮＫ結合ドメインを含むであろう。ヒトＲＡＮＫ−Ｌに関しては、細胞外ドメインが、タンパク質のカルボキシ末端に約２４９アミノ酸を含み（配列番号６のアミノ酸６９−３１７）、そしてマウスＲＡＮＫ−Ｌに関しては、タンパク質のカルボキシ末端に約２４７アミノ酸を含む（配列番号８のアミノ酸７０−３１６）。ＲＡＮＫを誘導するための可溶性ＲＡＮＫ−Ｌは、細胞外領域全体を含んでいてもよく、またはＲＡＮＫ結合ドメインを含むＲＡＮＫ−Ｌの部分のみを含んでいてもよい。ＲＡＮＫ結合ドメインは、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに関して、配列番号６のアミノ酸６９−３１７を有する断片、もしくはより好ましくは配列番号６のアミノ酸１６２−３１７を有する断片で見られ、または、マウスＲＡＮＫ−Ｌに関して、配列番号８のアミノ酸７０−３１６を有する断片、もしくはより好ましくは配列番号８のアミノ酸１６１−３１６を有する断片で見られる。
【００５１】
ＲＡＮＫを誘発するための可溶性ＲＡＮＫ−Ｌはさらに、可溶性タンパク質の分泌を導くシグナルペプチドを含んでもよく、そしてまたさらに、例えば、存在下において可溶性ＲＡＮＫ−Ｌ融合タンパク質の多量体化を刺激すると思われるポリペプチドなどの、第２のポリペプチドを含んでもよい。可溶性ＲＡＮＫ−Ｌを作成するためのＲＡＮＫ−Ｌ断片は、公知の組換え技術を用いて調製され、細胞外領域の望ましい部分を単離してもよい。ＲＡＮＫを誘発するための様々なＲＡＮＫ−Ｌ誘導体は、組換え培地における合成によるＮ末もしくはＣ末の融合体としてなど、タンパク質もしくはその断片と他のタンパク質もしくはポリペプチドとの、共有結合性もしくは集合性の結合を含む。例えば、結合されたペプチドは、細胞膜または細胞壁の外側において、タンパク質の合成場所から機能場所までの運搬を、翻訳と共にまたは翻訳後に導くタンパク質のＮ末領域におけるシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（例えば、酵母α−因子リーダー）であってもよい。または、ＲＡＮＫ−Ｌは、ある場合において、米国特許第６，０１７，７２９号において記載されたように、ポリＨｉｓまたはＦＬＡＧ（登録商標）タグと結合されてもよい。
【００５２】
一般的に、ＲＡＮＫ−ＬがＲＡＮＫを誘発するために用いられる場合、ＲＡＮＫ−ＬはＲＡＮＫが由来する種と同種（例えば、ヒト）由来である。一方で、マウスＲＡＮＫ−Ｌは、ヒトＲＡＮＫを誘発することも可能であり、またヒトＲＡＮＫ−ＬはマウスＲＡＮＫを誘発することも可能である。
【００５３】
本発明の実施において有用なＲＡＮＫタンパク質は、典型的には、配列番号２または４に示した天然のＲＡＮＫアミノ酸配列の全体もしくは部分と、少なくとも８０％の同一性、もしくは少なくとも８５％の同一性、または好ましくは少なくとも９０％の同一性であるアミノ酸配列を有する。本発明の実施において有用なＲＡＮＫ−Ｌタンパク質は、典型的には、配列番号６または８に示した天然のＲＡＮＫ−Ｌアミノ酸配列の全体もしくは部分と、少なくとも８０％の同一性、もしくは少なくとも８５％の同一性、または好ましくは少なくとも９０％の同一性であるアミノ酸配列を有する。本発明のＲＡＮＫタンパク質は、誘発されたときにＮＦ−κＢ活性を活性化することが可能である。
【００５４】
同一性のパーセントは、以下のように判定される。アミノ酸配列の同一性は、配列番号２，４，６，もしくは８に示したアミノ酸残基の、これらと同一性がある他のタンパク質配列の部分もしくは全体（より大きなタンパク質配列の部分でありうる）との、配列を並べ、必要ならば最大の比率の同一性が達成されるようにギャップを導入した後の、パーセントとして定義される。異なる長さのアミノ酸配列を比較するためには、同一性のパーセントは、２つの配列のより小さい方に基づいて計算される。同一性のパーセントは、コンピュータプログラム、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：３８７，１９８４）により記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、または、２つ以上のアミノ酸配列を並べて比較可能な、いずれかの他の適したコンピュータプログラムを用いて判定されてもよい。ＧＡＰプログラムを用いるときは、比較を行うための好ましいデフォルトパラメータは：（１）アミノ酸に関する単項の（ｕｎａｒｙ）比較行列（同一に関して１の数字、不同一に関して０の数字を含む）、並びにＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ、編、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９により記載されたように、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重された比較行列；（２）各ギャップに３．０のペナルティ、および各ギャップでの各符号にさらなる０．１０のペナルティ；並びに（３）末端ギャップにペナルティ無しであることを含む。同一性のパーセントを判定するために有用な他のプログラムは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムでありまた、ＧＣＧコンピュータパッケージの一部として、ウィスコンシン大学から入手可能である。ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いたデフォルトパラメータは、ＧＡＰプログラムを用いた上述のものと同様である。
【００５５】
本発明のある態様は、ＲＡＮＫタンパク質の突然変異型を用いる。このＲＡＮＫ突然変異型の１つの例は、骨のパジェット病に類似性を有する稀な常染色体優性の骨組織形成不全症である「家族性膨張性骨溶解症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｌｅ  ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ）」（ＦＰＯ）として知られる病状の患者から単離したＲＡＮＫの突然変異型である。これらの疾患は、増加した骨組織再構成の焦点領域により特徴づけられる。ＦＥＯ遺伝子および家族性パジェット病と関連する遺伝子は、ＲＡＮＫ遺伝子を含む同じ領域である染色体１８ｑ２１にマッピングされる。ＦＥＯ  ＲＡＮＫ  ＤＮＡの例は、Ｈｕｇｈｅｓら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４：４５−４８（２０００）に記載されている。
【００５６】
ＲＡＮＫの突然変異型は、ＲＡＮＫのこの型を発現する細胞において欠損を相補することが可能である分子を同定するために設計されたアッセイ法において特に有用であり、なぜならそのような分子は、ＲＡＮＫ変異と関連する疾患を治療するための治療剤として役立つことがあり得るからである。本明細書において記載されたアッセイ法は、ＦＥＯ  ＲＡＮＫ遺伝子においてＲＡＮＫ欠損を相補する能力を有する分子をスクリーニングするために有用である。ＦＥＯ  ＲＡＮＫの配列は、配列番号９および１０で与えられる。この能力を有する分子は「ＦＥＯ  ＲＡＮＫアゴニスト」であり、そして、ＦＥＯ、パジェット病、もしくは関連する疾患に苦しむ患者を治療するため、またはこの目的に使用される剤を開発するために有用である。ＲＡＮＫ突然変異体は、ＦＥＯおよびパジェット病以外の骨疾患においても機能を果たすことが発見されるであろうことが予想される。ＲＡＮＫのこれらの突然変異型をコードするＤＮＡは、疾患の治療を同定するために、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ法で単離され、そして試験されるであろう。
【００５７】
ＲＡＮＫ活性化
本明細書に記載されたアッセイ法の多くは、ＲＡＮＫ応答性細胞の使用を含む。本明細書において用いられるものとして「ＲＡＮＫ応答性細胞」の語句は、ＲＡＮＫ−Ｌと結合することによりＲＡＮＫタンパク質が誘発されるとき、またはある他の手段によりＲＡＮＫが誘発されるときに、細胞内シグナルを伝達し、もしくは細胞における識別可能な（例えば、一つの細胞型と別の細胞型との差異）生体応答を刺激することが可能な膜結合型ＲＡＮＫタンパク質を発現する細胞を意味する。
【００５８】
本明細書で用いられるものとして「ＲＡＮＫ活性」の語句は、ＲＡＮＫそれ自身が活性化を受けた後に、すなわちＲＡＮＫが「誘発され」た後に、生じる細胞における生体活性を意味する。一般的に「ＲＡＮＫ活性」は、ＲＡＮＫを誘発することにより起こされ、また、このＲＡＮＫ活性は、誘発された野生型ＲＡＮＫタンパク質により直接的または間接的に特徴的に誘導される、一つ又はそれより多くの生体応答を評価することにより検出される。ＲＡＮＫが誘発されたとき、細胞膜のすぐ近傍において他のＲＡＮＫ分子と多量体化する。例えば、ＲＡＮＫ特異的なアゴニスト抗体が、ＲＡＮＫを誘発するために用いられるならば、抗体は２つのＲＡＮＫ分子をすぐ近傍に運び、そしてこれらの二量化を可能にし、それによってＲＡＮＫ活性を誘発する。ＲＡＮＫが誘発されたときに、２つより多くのＲＡＮＫ分子が多量体化すると考えることも可能である。おそらく、多量体化は、ＲＡＮＫタンパク質の細胞質末端における構造変化を刺激し、それにより識別可能な生体応答をもたらす事象の連鎖を開始させる。
【００５９】
ＲＡＮＫの誘発は、特にＲＡＮＫアンタゴニストをスクリーニングすることが望まれる場合に、本明細書に記載している多くのスクリーニングアッセイ法のために必要な工程である。これは、ＲＡＮＫ結合ドメインを有するＲＡＮＫ−Ｌタンパク質に曝すことなどの、多くの異なった方法により達成されうる。膜結合型ＲＡＮＫ−Ｌなどの完全長ＲＡＮＫ−Ｌ、または上記のものなどの可溶性ＲＡＮＫ−Ｌ分子を用いてもよい。少なくとも、ＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドは、ＲＡＮＫに結合できなければならず、そしてこの能力を有するＲＡＮＫ−Ｌ細胞外領域の部分を有しなければならない。ＲＡＮＫ活性を刺激するために有用なＲＡＮＫ−Ｌの型の１つの例は、米国特許第６，０１７，７２９号に記載されたＲＡＮＫ−Ｌのロイシンジッパー融合体、またはその参考文献もしくは他のものに記載された他のロイシンジッパーコンストラクトなどの、ＲＡＮＫ−Ｌのロイシンジッパー融合体である。
【００６０】
ＲＡＮＫ活性を刺激するために有用なＲＡＮＫ−Ｌの型の別の例は、米国特許出願第６，０１７，７２９号に記載されたＲＡＮＫ−ＬのＦＬＡＧ（登録商標）ポリ−Ｈｉｓ融合体などの、ＲＡＮＫ−ＬのＦＬＡＧ（登録商標）ポリ−Ｈｉｓ融合体である。
【００６１】
ＲＡＮＫの誘発は、限定されるわけではないが、細胞におけるＲＡＮＫの過剰発現；ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−Ｌの同じ細胞における共発現；膜結合型ＲＡＮＫを発現する細胞を可溶性ＲＡＮＫ−Ｌと接触させること；ＲＡＮＫ発現細胞を膜結合型ＲＡＮＫ−Ｌを発現する細胞と接触させること；並びに、ＲＡＮＫを発現する細胞にＲＡＮＫ向けのアゴニスト抗体を加えることなど、様々な方法で誘発されることが可能である。前記のものに加えて、ＲＡＮＫを誘発するいくらかの他の望ましい方法が、本明細書において開示されるアッセイ法において用いられてもよい。
【００６２】
ある好ましいＲＡＮＫ誘発方法は、アゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体、すなわち、ＲＡＮＫと結合してＲＡＮＫ活性を刺激する抗体と、ＲＡＮＫ応答性細胞を接触させることである。アゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体の例は、抗ヒトＭ３３０抗体、抗ヒトＭ３３１抗体、抗マウスＭ３９５抗体、および抗マウスＭ３９６抗体を含む。
【００６３】
ＲＡＮＫ応答性細胞においてＲＡＮＫ活性を刺激するさらにもう一つ方法は、表面にＲＡＮＫ−Ｌを発現する細胞もしくは可溶性ＲＡＮＫ−Ｌタンパク質を分泌する細胞などのＲＡＮＫ−Ｌを発現する一つ又はそれより多くの細胞型と、ＲＡＮＫ応答性細胞を接触させるものである。例えば、ＲＡＮＫ応答性細胞は、ＲＡＮＫ−Ｌを発現する一つ又はそれより多くの細胞株とともに、液体もしくは半固形培地において共培養されてもよい。ＲＡＮＫ−Ｌを発現する細胞型の代表的な例は、トランスフェクトされた細胞によりＲＡＮＫ−Ｌの機能的発現が可能になる条件下（一時的または安定的に）で、ＲＡＮＫ−ＬｃＤＮＡをコードする核酸分子がトランスフェクトされた任意の細胞型を含む。ＲＡＮＫ−Ｌを発現する細胞型のさらなる例は、初期Ｔ細胞（抗ＣＤ３抗体で活性化される）、Ｂ細胞（例えば７０ｚ３細胞株）、およびマウス胸腺腫細胞株ＥＬ−４（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：１７５−１７９（１９９７））を含む。加えて、ＳＴ２（Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：３５９７−３６０２（１９９８））、およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１，ｈＭＳ（Ｈｏｆｂａｕｅｒら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１５：２−１２，２０００）、並びに骨肉腫細胞株ＲＯＳおよびＭＧ−６３（Ｈｏｆｂａｕｅｒら、２０００）など、ヒト起源およびマウス起源両方の、複数の破骨細胞および骨髄ストローマ細胞は、ＲＡＮＫ−Ｌを発現する。ＲＡＮＫ−Ｌの発現は、グルココルチコイド、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦα、プロスタグランジンＥ２、またはパラチロイドホルモンなどの骨吸収因子を用いて、これらの前述の細胞型において上昇制御させることも可能である（Ｈｏｆｂａｕｅｒら、２０００を参照されたい）。
【００６４】
また、可溶性ＲＡＮＫ−Ｌを発現する細胞は、培養ウェルの個体表面上およびＲＡＮＫ応答性細胞において培養され、半固形培地において再懸濁され、そしてＲＡＮＫ−Ｌ発現細胞の上端で重ねられてもよい。これらのＲＡＮＫ応答性細胞におけるＲＡＮＫは、半固形培地において分泌かつ拡散されたＲＡＮＫ−Ｌと接触させることにより誘発される。
【００６５】
ある態様においては、ＲＡＮＫ−Ｌを発現する細胞は、分子の可溶型を分泌する。可溶性ＲＡＮＫ−Ｌを分泌する細胞型の代表的な例は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体で活性化された初期Ｔ細胞（Ｋｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ４０２：３０４−３０９（１９９９））、並びにＲＡＮＫ−Ｌをコードする核酸分子をトランスフェクトしたヒト２９３繊維芽細胞（Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ９３：１６５−１７８（１９９８））を含む。
【００６６】
ＲＡＮＫ応答性細胞において、ＲＡＮＫ活性を刺激するもう一つの方法は、例えば、強力で構成的なプロモーターの制御下でＲＡＮＫをコードする核酸配列を含むＤＮＡコンストラクトで、ＲＡＮＫ応答性細胞を遺伝学的に形質転換することにより、ＲＡＮＫ応答性細胞においてＲＡＮＫを過剰発現することである。例えば、外来的に加えられるＲＡＮＫ−Ｌ不存在下において、発現ベクター（ｐＤＣ４０９−ｈＲＡＮＫ）をトランスフェクトされた２９３／ＥＢＮＡ細胞は、ＲＡＮＫを過剰発現する結果として、ＮＦ−κＢ活性（前記Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７を参照されたい）およびＮＦ−κＢ応答性プロモーター−レポーターを活性化する（Ｇａｌｉｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３４１２０−２７（１９９８）を参照されたい）。ＲＡＮＫを過剰発現する細胞の膜におけるＲＡＮＫの濃度は、非常に高いので、ＲＡＮＫは自発的にこれらの膜で多量体化し、それによりＲＡＮＫ活性を誘発する。ＲＡＮＫの過剰発現を誘導するためのコンストラクトの使用に適したＲＡＮＫ核酸は、配列番号２および４（当該ＤＮＡは、配列番号１および３に示した核酸配列により例示される）に示したＲＡＮＫタンパク質をコードすることが可能であるＤＮＡ、または、配列番号２もしくは４に関するタンパク質と少なくとも８５％のアミノ酸配列相同性を有するタンパク質をコードするその変異体であって、該タンパク質がさらに細胞において過剰発現されたときＲＡＮＫ活性を誘発する能力を維持しているものを含む。
【００６７】
ＲＡＮＫを過剰発現するために用いることが可能である発現ベクターの代表的な例は、限定されるわけではないが：ｐＤＣ４００系列ベクター（Ｇｉｒｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：２８２２−２８３０（１９９４））；ｐＤＣ３００系列ベクター；モロニーの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターを利用したレトロウイルスベクターｐＢＭＮＺ（ＫｉｎｓｅｌｌａおよびＮｏｌａｎ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１４０５−１４１３（１９９６））、またはＣｌｏｎｔｅｃｈ（１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ、カリフォルニア州パロアルト９４３０３−４２３０、ＵＳＡ）から入手可能なハイブリドテトラサイクリン誘導領域（ｐＲＥＶＴＲＥ）を含むレトロウイルスベクターなどを含む。これらの同じベクターは、該ＤＮＡの導入が本発明の他の側面に必要とされることがあり得る場合に、ＲＡＮＫもしくはＲＡＮＫ−ＬのＤＮＡを細胞に導入するために用いられてもよい。
【００６８】
ＲＡＮＫ活性を誘発する別の方法は、ＦＥＯ  ＲＡＮＫ（配列番号１０）のように、ＲＡＮＫ応答性細胞において通常のレベルで発現するとき、ＲＡＮＫ−Ｌを結合することなく一つ以上のＲＡＮＫを仲介したシグナリング経路を活性化するＲＡＮＫタンパク質の型を、ＲＡＮＫ応答性細胞において発現させることである。
【００６９】
ＮＦ−κＢの活性化に加えて、ＲＡＮＫの誘発よりもたらされる検出可能な生体応答は、例えば、ｃ−ｓｒｃキナーゼの活性化、ＪＮＫの活性化、破骨細胞前駆体の破骨細胞への分化、Ｔ細胞の活性化などを含む。ｃ−ｓｒｃは、適切な破骨細胞の機能において重要である（例えば、Ｌｏｗｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：４４８５−８９（１９９３）を参照されたい）。本発明の１つの側面において、ＲＡＮＫ活性は、レポーター遺伝子がＲＡＮＫ応答性プロモーターに機能可能なように連結されているプロモーター／レポーター  コンストラクトにより、発現されるレポータータンパク質の量もしくはレベルを評価することにより判定される。
【００７０】
本明細書において用いられるものとして「機能可能なように連結されている」の用語は、互いに機能的に関係し、そして、好ましくは単一の核酸鎖において連続的に位置する、核酸配列を意味する。例えば、制御核酸配列が、（それ自身により、または一つ以上の他の制御核酸配列とともによるどちらかで）コーディング配列の転写を制御するならば、制御核酸配列は、コーディング配列（例えば、レポータータンパク質をコードする配列）に機能的に可能なように連結されている。典型的には、機能可能なように連結されている核酸配列は、同じ核酸分子において連続的であるが、ある例においては、制御配列は、「トランス作用」であり、異なる核酸分子上に存在していてもよい。
【００７１】
ＲＡＮＫアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングアッセイ法：
半固形培地アッセイ法
本発明の１つの態様において、提供される方法は、以下の：（ａ）ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させ，ＲＡＮＫ応答性細胞は半固形培地において培養される；そして（ｂ）半固形培地においてＲＡＮＫ応答性細胞を接触させることにより、候補分子と接触させない一つ又はそれより多くのリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞と比較し、コロニー形成率が高められ、または低められるのを観察する、工程を含む。本発明のこの側面の方法は、ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズする分子をスクリーニングするために用いられる場合において、さらに、ＲＡＮＫ応答性細胞におけるＲＡＮＫ活性を刺激する工程を含む。
【００７２】
本明細書において記載されるものとして、用語「半固形培地」は、細胞が付着可能な固形基質を与えることなく、そして、半固形培地に加えられる細胞がそこにおいて懸濁され、かつそれにより半固形培地において沈み、半固形培地が配合された容器の内表面に接触し付着することが予防されるくらい、十分な粘性を有している、細胞成長培地を意味する。本発明の実施において有用な半固形培地は、典型的には、液体培地に０．１％から５％（ｗ／ｖ）の量で溶解されたゲル化薬剤（例えば、寒天またはメチルセルロース）を含む。
【００７３】
本発明のこの態様において、ＲＡＮＫ応答性細胞は、半固形培地において、ＲＡＮＫ活性を調節する能力に関して試験するための一つ又はそれより多くの分子の存在下で広げられる。本発明のこの態様の実施において用いられる細胞は、ＲＡＮＫを発現し、半固形培地においてコロニーを形成することが可能であり、ＲＡＮＫの活性化により刺激されて、半固形培地においてゆっくり成長する細胞型、あるいは半固形培地において成長できない細胞型に分化する。半固形培地に広げられる前もしくは同時に、または広げられた後に、テスト分子を細胞と接触させることも可能である。
【００７４】
これらのアッセイ法において、ＲＡＮＫ応答性細胞は半固形培地に懸濁され、そして、細胞が懸濁された半固形培地より高濃度のゲル化剤を含む半固形培地の層の表面に注がれてもよい。例えば、ＲＡＮＫ応答性細胞は、濃度が０．３％（ｗ／ｖ）である寒天を含む半固形培地に懸濁されることも可能である。また、懸濁された細胞は、寒天をより高濃度で、例えば０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で含む半固形培地の層上に広げられてもよい。
【００７５】
アンタゴニストを検出するアッセイ法はより典型的には、アンタゴニストの存在下にでは、測定される応答が失われることが予定されるのに対し、ＲＡＮＫアンタゴニストを検出するための、この半固形培地方法の珍しい特徴は、アンタゴニストが存在するときに陽性の応答（すなわち、コロニー形成および／またはコロニー成長）が高められる点である。さらに、本アッセイ法は、アンタゴニストに応答している細胞の再生を可能にし、テスト分子が組換えｃＤＮＡライブラリーの形式で細胞に供給されたときに特に有用な特徴を可能にする（以下を参照されたい）。
【００７６】
半固形培地アッセイ法を用いることにより、ＲＡＮＫをアゴナイズするテスト分子の能力は、ＲＡＮＫ応答性細胞をテスト分子と接触させ、そして、半固形培地におけるコロニー形成率またはコロニー成長率が、テスト分子を接触させない同じＲＡＮＫ応答性細胞のリファレンス培地におけるコロニー形成率と比較して減少するのを観察することにより、検出される。ＲＡＮＫアゴニストを検出するために望ましいならば、陽性対照培地を用いて、リファレンス細胞をＲＡＮＫ−Ｌまたはアゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体などの公知のＲＡＮＫアゴニストと接触させる比較のリファレンスを提供してもよい。
【００７７】
半固形培地を含むアッセイ法に有用な細胞は、一般的に、半固形培地におけるコロニー形成が可能であり、また、ＲＡＮＫの誘発で刺激されることにより半固形培地におけるコロニー形成が不可能な細胞型に分化する、ＲＡＮＫを発現する任意の細胞が含まれる。一般的に、これらの細胞は、ＲＡＮＫが誘発されるときに破骨細胞に分化する。本発明のこの側面の実施において有用な細胞の代表的な例は、ＲＡＷ２６４．７細胞株（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ−５１）、任意の哺乳動物種の脾臓、末梢血液、または骨髄細胞から入手可能な未分化造血細胞、破骨細胞特異的酵素マーカーであると一般的に思われている、ＴＲＡＰを発現する破骨細胞に分化することが可能であるＢＣＬ−Ｘ１／タグ細胞株（Ｈｅｎｔｕｎｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：８８−９７（１９９８））、およびマウスマクロファージ様破骨細胞前駆細胞株Ｃ７（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５３：３９５−４００（１９９８））を含む。ＲＡＷ２６４．７細胞（マウスマクロファージ細胞株）は、ＲＡＮＫ−Ｌを加えることにより刺激され、多核の破骨細胞（半固形培地においてコロニーを形成することが不可能である）に分化する。
【００７８】
コロニー形成は、テスト分子と接触させた培地におけるコロニーの大きさおよび／または数を、ＲＡＮＫの潜在的アゴニストまたはアンタゴニストと接触させていない同じＲＡＮＫ応答性細胞の対照培地において存在するリファレンスコロニーの大きさおよび／または数と、視覚的に比較することにより評価される。コロニーの大きさおよび／または数は、例えばＲＡＮＫ応答性細胞をテスト分子と接触させた後１日から１０日、またはより好ましくは、細胞をテスト分子と接触させた後５日から１０日といった望ましい期間の後に、評価される。培地の視覚的比較は、例えば、光学顕微鏡または位相差顕微鏡を用いてなされることも可能である。
【００７９】
再度例示としては、分光光度法で測定される可視光伝達の変化を用いて、一つの培養ウェル内におけるコロニー形成率を測定することも可能である。加えて、半固形培地における成長の前に重要な蛍光染色を用いて細胞を標識するならば、コロニー形成率は、蛍光分析的に測定されることも可能である。また、培養ウェルにおける細胞のＤＮＡ含有物が、コロニー形成率を評価する標準的な手段を用いて測定されることも可能である。
【００８０】
前述の半固形培地手法が、ＲＡＮＫアンタゴニストを検出するために用いられるならば、アッセイ法は、細胞におけるＲＡＮＫの活性化を含む工程を含むであろう。細胞は、ＲＡＮＫ活性化工程の前、間、または後にテスト分子（すなわち、推定上のＲＡＮＫアンタゴニスト）と接触される。ＲＡＮＫ活性化は、例えば細胞においてＲＡＮＫを過剰発現することにより、または細胞をアゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体もしくはＲＡＮＫ−Ｌと接触させることにより、達成されることも可能である。一方で、誘発は、ＲＡＮＫ応答性細胞においてＲＡＮＫ−Ｌを共発現させ、可溶性ＲＡＮＫ−ＬとしてＲＡＮＫ−Ｌを培地に加えることにより、達成されることも可能であり、または、それは本明細書に記載される他の手段により提供されてもよい。テスト分子がＲＡＮＫアンタゴニストであるならば、細胞は、テスト分子が加えられない同様の培地のものよりも多く分裂するであろう。ＲＡＮＫアンタゴニストであるテスト分子が、ＲＡＮＫの誘発の前に加えられるならば、テスト分子と接触させる培地におけるコロニーが、テスト分子と接触させない培地におけるコロニーよりも、多く現れるであろう。アゴニストがコロニー形成の後に加えられるならば、アゴニストに曝されたコロニーは、アゴニストに曝されていない対照培地におけるコロニーよりも、大きく成長するであろう。
【００８１】
前記の細胞を用いて、ＲＡＮＫアゴニストとして機能するテスト分子の能力は、ＲＡＮＫ応答性細胞をテスト分子と接触させ、そして、半固形培地におけるコロニー形成率をテスト分子と接触させない同様のＲＡＮＫ応答性細胞の対照培地におけるコロニー形成率と比較して低められているのを観察することにより、検出される。本アッセイ法において、ＲＡＮＫアゴニストは、細胞を刺激して、半固形培地におけるコロニー形成が不可能である細胞型に分化させるであろう。これらのアッセイ法のために典型的に用いられる細胞は、ＲＡＮＫアゴニストであるテスト分子に曝されるとき、破骨細胞に分化するであろう。これらのアッセイ法に用いることが可能である対照のＲＡＮＫアゴニストは、膜結合型のＲＡＮＫ−Ｌおよび可溶型のＲＡＮＫ−Ｌを含む。
【００８２】
半固形培地アッセイ法の１つの変形において、この戦略は、ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズするまたはアゴナイズする能力がスクリーニングされる候補タンパク質分子の群をコードするｃＤＮＡライブラリーなどの、核酸ライブラリーをスクリーニングするために用いられる。ｃＤＮＡライブラリーは、任意の当該技術分野で認識された手段、例えばトランスフェクションまたは形質転換により、さらに詳しくは下記のように、ＲＡＮＫ応答性細胞の群に導入される。ＲＡＮＫアンタゴニストが求められているならば、ｃＤＮＡ分子が導入された細胞は半固形培地において培養され、また、ＲＡＮＫは、本明細書に記載された方法の一つにより、または別の適した方法により、細胞において誘発される。懸濁され遺伝学的に修飾された細胞におけるコロニー形成率またはコロニー成長率は、対照のＤＮＡ以外のＤＮＡが導入されていない同様の細胞のものと比較される。適した対照細胞は、例えば、ｃＤＮＡライブラリーの代わりにベクターＤＮＡを受け入れることも可能である。遺伝学的に修飾された群におけるコロニーで、対照の群におけるコロニーより顕著に早く成長しているものを単離し、またさらに研究することも可能である。そのようなコロニーから外来ＤＮＡを回収し、コロニーの高められた成長の原因であるＲＮＡＫアンタゴニストを同定し、単離することもできる。例えば、導入される核酸分子は、速く成長しているコロニーから単離されることも可能であり、また、それぞれの核酸配列が決定されることも可能である。単離され配列決定された核酸分子によりコードされるタンパク質は、発現および／または化学的に合成し、そして、ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズする能力を確認し研究することも可能である。
【００８３】
ＲＡＮＫのアゴニストは、このアッセイ法において、上記のようにアッセイを行うことによるがＲＡＮＫを誘導することなしに、認識される；ＲＡＮＫアゴニストをコードするｃＤＮＡを含む細胞は、よりゆっくり成長し、またはコロニー形成が不可能であろう。ＲＡＮＫアゴニストをコードするｃＤＮＡは、上記のゆっくり成長するものから回収される。
【００８４】
哺乳類遺伝子を運搬し発現するベクターは、ＲＡＮＫ活性を調節する能力に関して上記の半固形培地アッセイ法において試験されるタンパク質をコードするｃＤＮＡライブラリーを導入するのに適している、多数の異なる型のものが開発されている（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ、編、「哺乳類細胞のための遺伝子運搬ベクター」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍ．  Ｂｉｏｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク１９８７）。裸のＤＮＡは、多数の技術のいずれか一つ、限定されるわけではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション（Ｂｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ８１：７１７６，１９８４）；ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合体（Ｄｅａｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１２９２，１９８４）；エレクトロポレーション、リポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３，１９８７）、ポリブレントランスフェクション（ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｚａｗａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２，１９８４）および細胞膜のレーザーマイクロパンクチャーによる直接的な遺伝子運搬（Ｔａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４１８０，１９８７）などを用いたトランスフェクションにより、哺乳類細胞に物理的に導入されることも可能である
加えて、遺伝子運搬のために、組換え体の感染性ウイルス粒子を利用する様々な感染技術が開発されている。この方法において用いられてきたウイルスのベクターは、シミアンウイルス４０由来のウイルスベクター（ＳＶ４０；Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１５８，１９８５）；アデノウイルス（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２３７７，１９８６）；アデノ関連ウイルス（ＬａＦａｃｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６２：４８３，１９８８）およびレトロウイルス（Ｃｏｆｆｉｎ、１９８５、Ｗｅｉｓｓら（監修），ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２編、２巻．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨークのｐ１７−７１）を含む。これらの同じウイルスベクターは、該ＤＮＡの導入が本発明の他の側面に必要とされるかもしれない場合に、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫ−ＬのＤＮＡを細胞に導入するために用いられてもよい。
【００８５】
遺伝子の運搬および発現の方法は、数多く、そして哺乳類細胞において遺伝物質を導入し発現するために本質的に機能する。いくらかの上記の技術、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション（Ｂｅｒｍａｎら、上記、１９８４）；プロトプラスト融合（Ｄｅａｎｓら、上記、１９８４）；エレクトロポレーション（Ｃａｎｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３：１２３，１９８８）並びに、組換えアデノウイルス（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、上記；Ｒｕｅｔｈｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：１２３，１９８６）；アデノ関連ウイルス（ＬａＦａｃｅら、上記）；および、レトロウイルスベクター（Ｏｖｅｒｅｌｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：１４２５，１９８９）での感染などは、造血性またはリンパ球の細胞を形質転換するために用いられている。初期Ｔリンパ球は、エレクトロポレーション（Ｃａｎｎら、上記、１９８８）およびレトロウイルス感染（Ｎｉｓｈｉｈａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ４８：４７３０，１９８８；Ｋａｓｉｄら、上記、１９９０）によりうまく形質転換されている
前記の半固形培地スクリーニング戦略を含むアッセイ法は、小さい有機分子またはペプチドのライブラリーなどの、分子の収集物（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をスクリーニングするために下記のとおり有効である。マイクロタイタープレート、例えば９６ウェルマイクロタイタープレートを用いることも可能であり、そして、異なった候補のＲＡＮＫ活性アゴニストまたはアンタゴニストを各ウェルに、ＲＡＮＫ応答性細胞の半固形培地のアリコートとともに入れる。このアッセイ法に用いられる細胞は、ＲＡＮＫの誘発に応答して分化し、そして、分割を停止するものと通常思われる細胞である（適した細胞の記載に関しては、上記を参照されたい）。ＲＡＮＫアゴニスト活性を有する分子を検出することが望ましいならば、培地に加えることも可能であり、または本明細書に記載したある他の手段により提供されることも可能であるＲＡＮＫ−Ｌなどの、ＲＡＮＫを誘発する刺激物が提供される。再度例示としては、候補分子を溶解し、そして半固形培地全体にくまなく分配する、あるいは半固形培地の上表面に注ぎ、かつくまなく拡散することも可能である。
【００８６】
望ましいならば、ＲＡＮＫ応答性細胞に導入された核酸分子は、ＲＡＮＫ応答性細胞ゲノムに安定的に組み込まれてもよい。例えば、レトロウイルスベクターにおいて作成されたｃＤＮＡライブラリーを、ＲＡＮＫ応答性細胞株をトランスフェクトするために利用してもよい。導入ＤＮＡ分子をＲＡＮＫ応答性細胞のゲノムに安定的に組み込む利点は、連続的で高いレベルの遺伝子発現が典型的に得られることである。本明細書における実施例２は、ＲＡＷ２６４．７細胞およびレトロウイルス発現ライブラリーを用いて、ＲＡＮＫシグナリングのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするための代表的なプロトコールを開示する。
【００８７】
本発明の方法の別の応用は、欠損ＲＡＮＫシグナルを相補する分子（例えばｃＤＮＡ、タンパク質、およびペプチド）をスクリーニングすることである。例えば、ＴＲＡＦ６結合部位が欠落している、ヒトＲＡＮＫの型（用語を「ＲＡＮＫΔ３４０―４２１」とする）は、造血前駆細胞からの破骨細胞形成を刺激することが不可能である。ＲＡＮＫのこの型は、Ｇａｌｉｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３４１２０，１９９８に記載されており、ヒトＲＡＮＫ（配列番号２）のその型に対応するアミノ酸配列を有するが、ＴＲＡＦ６結合部位（配列番号２のアミノ酸３４０−４２１）を欠失している。本発明の方法は、よって、ＲＡＮＫΔ３４０−４２１シグナリング変異を相補し、そして、それにより造血前駆体細胞からの破骨細胞形成も可能になる、分子のスクリーニングに用いられうる。本明細書における実施例３は、ＲＡＮＫΔ３４０−４２１を発現するＲＡＮＫ応答性細胞株の調製を記載する。
【００８８】
ＭＭＰ−９またはＴＲＡＰプロモーターを用いたプロモーター／レポーターアッセイ法
本発明のさらなる側面において、本明細書において、プロモーターが機能可能なように連結された配列をコードするタンパク質の発現が高められることにより、ＲＡＮＫ活性に対して応答可能であることが以前に公知ではないプロモーターを用いたプロモーター／レポーターコンストラクトを用いるスクリーニングアッセイ法が提供される。特に、本プロモーター／レポーターコンストラクトは、ＴＲＡＰ遺伝子由来またはＭＭＰ−９遺伝子由来のプロモーターを用いる。本明細書における実施例４は、ヒトＩＬ−２α受容体に融合されたマウスＭＭＰ−９プロモーター（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３４６０−６８（１９９３）；ＳａｔｏおよびＳｅｉｋｉ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：３９５−４０５（１９９３））のコンストラクトを記載する。ヒトＭＭＰ−９プロモーターまたはＴＲＡＰプロモーター（ヒトまたはマウス；例えばＲｅｄｄｙら、Ｂｏｎｅ１６：５８７−５９３（１９９５）を参照されたい）もまた、これらのスクリーニング方法に用いられてもよい。
【００８９】
本発明のこの側面に関するアッセイ法は、以下の：（ａ）培養されたＲＡＮＫ応答性細胞をテスト分子と接触させ、ＲＡＮＫ応答性細胞がレポーター分子をコードする核酸分子を含み、核酸分子がＲＡＮＫ応答性制御核酸配列と機能可能なように連結されたレポーター分子である、そして（ｂ）接触させたＲＡＮＫ応答性細胞におけるレポーター分子の発現レベルが、候補分子と接触させない一つ又はそれより多くのリファレンスＲＡＮＫ応答性細胞におけるレポーター分子の発現レベルと比較して、高められ、または低められるのを観察する、工程を含む。ＲＡＮＫ活性にアンタゴナイズする分子をスクリーニングするために用いられる場合、本発明のこの側面の方法は、さらにＲＡＮＫ応答性細胞におけるＲＡＮＫ活性を刺激する工程を含む。
【００９０】
ＲＡＮＫアゴニストは、この型のアッセイ法において同定され、ＲＡＮＫアゴニストと接触させたＲＡＮＫ応答性細胞におけるレポーター分子発現のレベルが、ＲＡＮＫアゴニストと接触させていない対照のＲＡＮＫ応答性細胞におけるレポーター分子発現のレベルと比較して、増大されるのを観察することにより検出される。対照の細胞は、典型的に、ＲＡＮＫアゴニストと接触させたＲＡＮＫ応答性細胞と同じ型のＲＡＮＫ応答性細胞である。アッセイが、ＲＡＮＫアゴニストの同定に向けられる場合、プロトコールは、例えば意図的に細胞をＲＡＮＫ−Ｌと接触させるなどの、ＲＡＮＫを誘発する工程を含まない。
【００９１】
ＲＡＮＫアンタゴニストの存在は、ＲＡＮＫが誘発され、かつ候補アゴニストと接触させられた、ＲＡＮＫ応答性細胞におけるレポーター分子発現のレベルが低められ、または欠如するのを観察することにより検出される。レベルまたはレポーターの発現は、ＲＡＮＫ活性化剤と接触させたが、候補ＲＡＮＫアンタゴニストと接触させていない対照ＲＡＮＫ応答性細胞におけるレポーター発現のレベルとの比較により評価される。対照の細胞は、典型的には、ＲＡＮＫアンタゴニストと接触させたＲＡＮＫ応答性細胞と同じ型のＲＡＮＫ応答性細胞である。
【００９２】
この型のアッセイ法を用いて、ＲＡＮＫ活性のアンタゴニストをスクリーニングするとき、ＲＡＮＫ活性はＲＡＮＫ応答性細胞において刺激されなければならない。典型的に、ＲＡＮＫ活性は、ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子（群）と接触させる前または同時に誘発される。ある場合において、ＲＡＮＫ応答性細胞を候補分子と接触させた後にＲＡＮＫ活性を刺激することが望ましいかもしれない。ＲＡＮＫ活性を刺激する手順には、上記のＲＡＮＫ活性を刺激する手順が利用されてもよい。
【００９３】
本発明のこの側面において有用な細胞は、ＲＡＮＫタンパク質を発現し、そして、ＲＡＮＫの活性化により刺激される少なくとも一つのシグナル伝達経路を含む。本発明のこの側面において有用ないくつかの細胞は、天然にＲＡＮＫタンパク質を発現し、そして、ＲＡＮＫの活性化により刺激される少なくとも一つのシグナル伝達経路を含む。細胞のこの型の例は、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＴＲＡＰ＋破骨細胞に分化させることが可能であるＢＣＬ−Ｘ１／タグ破骨細胞株（Ｈｅｎｔｕｎｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２：８８−９７（１９９８））、およびマウスマクロファージ様破骨細胞前駆体細胞株Ｃ７（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５３：３９５−４００（１９９８））を含む。
【００９４】
本発明のこの側面において有用な他の細胞は、遺伝学的に修飾されており、ＲＡＮＫを発現し、かつ／または、ＲＡＮＫの活性化により刺激される少なくとも一つのシグナル伝達経路を含む。この後者の細胞型の例は、２９３／ＥＢＮＡ細胞を含む。実質的に、培地における成長が可能な任意の細胞型は、遺伝学的に修飾され、これらのアッセイ法の目的のためにＲＡＮＫを発現することが可能である。細胞にＲＡＮＫＤＮＡを導入するために適した多数の他の方法は、この明細書の他の場所に記載されており、また、ウイルスベクターおよび他の方法、例えばエレクトロポレーション、リポフェクチンなどを含む。
【００９５】
ＲＡＮＫ応答性細胞は、例えば、上記のこれらの手順を利用することによる、または他の任意の望ましい方法によるなど、任意の許容可能な方法において１つ又はそれより多くの候補分子と接触させることも可能である。
【００９６】
本発明のこの態様において有用であるレポーター分子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、および異種タンパク質向けの特異的な抗体などを用いることにより、ＲＡＮＫ応答性細胞の表面において検出されることも可能な任意の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）表面タンパク質を含む。有用なヘテロ表面タンパク質の例は、ヒトＩＬ−２受容体、マウスＩＬ−４受容体（ｍＩＬ−４Ｒと略する）、ヒトＣＤ２、ＣＤ４またはＣＤ８タンパク質を含む。
【００９７】
ｃ−ｓｒｃ活性またはＦ−アクチンリングの検出に基づいたアッセイ法
本発明の別の側面において、候補分子がｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ活性および／またはＦ−アクチンリング形成のＲＡＮＫに仲介された誘導を高め、または阻害する程度を測定することにより、ＲＡＮＫ分子およびＲＡＮＫ−Ｌアンタゴニストをスクリーニングするアッセイ法が提供される。Ｆ−アクチンリングは、活性化破骨細胞の特徴である細胞骨格構造である（ＬａｋｋａｋｏｒｐｉおよびＶａａｎａｎｅｎ，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．６：８１７−２６（１９９１）。
【００９８】
Ｆ−アクチンリングを検出するために、例えば３％パラフォルムアルデヒドに曝すことなどにより細胞を固定し、そしてアクチンと特異的に結合する蛍光プローブで細胞を染色することにより視覚化する。適した蛍光タグは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーンから入手可能なファロイジンである。蛍光シグナルは、例えば、標準的な蛍光顕微鏡を使用して検出することができ、そして、Ｆ−アクチンリングを有する細胞の数は視覚的に定量化できる。Ｆ−アクチンリングは、細胞の周辺におけるＦ−アクチンの連続リングとして同定され、そしてこれらの明確な構造は、顕微鏡で見ることも可能である。Ｆ−アクチンリングは、破骨細胞以外の細胞型には現れない。
【００９９】
ｃ−ｓｒｃ活性を検出するために、この酵素のリン酸基転移活性は、ｐ３４／ｃｄｃ２ペプチド（ＫＶＥＫＩＧＴＹＧＶＶＹＫ）（配列番号１３）などの、酵素の基質として機能する合成基質を用いて、測定される。ｃ−ｓｒｃ活性を測定するアッセイ法の例は、実施例８において提供される。
【０１００】
本発明のこの側面は、細胞を活性化して、破骨細胞、または、ｃ−ｓｒｃ活性を活性化することによりＲＡＮＫ誘発に応答する任意の細胞に、分化させることが可能である、ＲＡＮＫタンパク質を発現する細胞を利用する。本発明のこの側面の好ましい態様において、ＲＡＮＫタンパク質は、細胞が分化している間にｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ活性のレベルの上昇、およびＦ−アクチンリング形成を誘導する。この態様において有用な細胞の例は、ＲＡＮＫ誘発に応答して破骨細胞に分化することが可能であり、そして、ｃ−ｓｒｃ活性及びＦ−アクチン形成を誘導することが可能なＲＡＮＫの型を発現する任意の細胞である。そのような細胞は、破骨細胞前駆体に富んでいる初期造血細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞などの細胞株を含む。適した初期造血前駆体は、骨髄細胞、胎児の肝臓、または末梢血液由来であってもよい。適した細胞は、上記の方法を用いて、遺伝学的に修飾されており、ＲＡＮＫを発現する細胞をも含む。
【０１０１】
この型のアッセイ法に関して、テスト分子は、分化が完成した後、約５日までの間、培養培地に加えられてもよい。ｃ−ｓｒｃ活性またはＦ−アクチンリング形成は、細胞が任意の都合の良い時間、テスト分子に曝された後にアッセイされる。例えば、活性は、曝してから６−１２時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、またはより長い期間の後に測定される。テスト分子に曝した後に細胞において検出されたＦ−アクチンリングの量またはｃ−ｓｒｃ活性が、ＲＡＮＫ  ＤＮＡが導入されていない対照のＲＡＮＫ−／−細胞において観察されるレベルと比較して増大されるならば、テスト分子はＲＡＮＫアゴニストであるとして同定される。
【０１０２】
この型のアッセイ法において、テスト分子は、野生型ＲＡＮＫタンパク質に特有な、ある生体活性を相補する能力が評価されてもよい。一般的にこの型のアッセイ法は、野生型ＲＡＮＫタンパク質が、破骨細胞への分化の過程を実行中の細胞においてｃ−ｓｒｃ活性およびＦ−アクチンリング形成を誘導可能である事実を利用する。しかしながら、ＲＡＮＫ活性化が破骨細胞の分化を誘導可能であるためにＴＲＡＦ６結合ドメインは必要とされない一方、ＲＡＮＫのこれらの２つの活性は、ＲＡＮＫタンパク質からＴＲＡＦ６結合ドメインを欠失することにより、排除されることも可能である（実施例８を参照されたい）。このように、ＲＡＮＫタンパク質のＴＲＡＦ６欠失突然変異体が破骨細胞前駆体において発現されるとき、誘導しているＲＡＮＫは細胞を分化させるであろうが、より高いレベルのｃ−ｓｒｃ活性を発現させることはなく、また、これらの細胞はＦ−アクチンリングを示すことはないであろう。ヒトＲＡＮＫタンパク質に関しては、ＴＲＡＦ６結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸３４０−４２１により規定される領域内に含まれる。従って、該ＲＡＮＫ突然変異体が発現する細胞は、突然変異体ＲＡＮＫにおけるＴＲＡＦ６結合部位の欠失を相補することが可能である分子をスクリーニングするアッセイ法において、用いられることも可能である。テスト分子がこの欠失を相補する能力は、ＲＡＮＫ突然変異体を発現している細胞とテスト分子を接触させる場合において、ＲＡＮＫが誘発されるとき、ｃ−ｓｒｃ活性化およびＦ−アクチン形成が起こることを観察することにより検出される。
【０１０３】
ＲＡＮＫのＴＲＡＦ６突然変異を有する使用に適した細胞は、ＲＡＮＫノックアウト動物、例えば以前に記載されたＲＡＮＫ−／−マウス由来の初期造血前駆細胞含む（Ｄｏｕｇａｌｌら、１９９９）。このアッセイ法を実行するために、ＲＡＮＫノックアウト動物由来の細胞は、ＴＲＡＦ６結合領域を欠落した突然変異体ＲＡＮＫタンパク質をコードしたＤＮＡを導入することにより遺伝学的に修飾される。この目的のためのＤＮＡの例は、ＴＲＡＦ６結合ドメインコーディング配列を欠失したマウスまたはヒトＲＡＮＫのＤＮＡである。ＲＡＮＫ  ＤＮＡを導入するために適した手段は、タンパク質をコードするＤＮＡが連結されたウイルスベクター（例えばレトロウイルスまたはアデノウイルスベクター）での感染、または上記のいくらかの他の手段を含む。ＲＡＮＫ突然変異体ＤＮＡを導入後、上記のＲＡＮＫを誘発するいくらかの手段、またはＲＡＮＫを誘発するいくらかの他の望ましい手段を用いて、ＲＡＮＫタンパク質を誘発することにより、細胞を誘導して破骨細胞に分化させる。テスト分子がＲＡＮＫのこの突然変異型における欠失を相補するかどうかを判定するために、細胞が分化を行っているインキュベーション時間の一部または全体に、分子を培養培地に加える。
【０１０４】
ＣａＰＯ４の吸収に関するスクリーニングアッセイ法
また、リン酸カルシウムの合成基質のＲＡＮＫ依存性吸収に基づくアッセイ法においてＲＡＮＫアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法も提供される。野生型ＲＡＮＫタンパク質は、細胞を、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）を吸収可能な破骨細胞に分化させることも可能であり、一方でＴＲＡＦ６結合部位を欠落したＲＡＮＫタンパク質からのシグナルは、ＣａＰＯ４吸収を開始させない。このスクリーニングアッセイ法に有用な細胞は、ＲＡＮＫの活性がＣａＰＯ４吸収を誘導する任意の細胞、即ち、ＲＡＮＫが誘発されるときに破骨細胞に分化する細胞を含む。このアッセイ法において使用される細胞の例は、初期造血前駆体、初期造血細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、または、この活性を維持する型のＲＡＮＫをトランスフェクトした任意の細胞（例えば、ＲＡＮＫ−／−マウス由来の破骨前駆細胞）を含む。
【０１０５】
本発明の１つの態様において、この方法は、上記のＴＲＡＦ６欠失突然変異体などの不活性ＲＡＮＫ突然変異体を相補する分子をスクリーニングするために用いられる。
【０１０６】
このアッセイ法を行うために適した手順は、実施例９において示したものによって例示される。一般的に、細胞は、ＣａＰＯ４で薄く被覆した商業的に使用可能な薄い顕微鏡スライド上で培養される。このように成長したＲＡＮＫ応答性細胞は、ＣａＰＯ４を吸収する細胞に分化することにより、ＲＡＮＫの誘発に応答するであろう、ＣａＰＯ４フィルムにおける離散的なピットの形成をもたらす。ＲＡＮＫアンタゴニストを検出するために、テスト分子と接触させたスライド上のピット数を、テスト分子と接触させていないスライド上のピット数と比較する。
【０１０７】
ＲＡＮＫアゴニストは、この型のアッセイ法において、ＣａＰＯ４フィルム上で適した細胞を成長させ、かつ、細胞において最初にＲＡＮＫを誘発することなく細胞をテスト分子と接触させることにより、検出される。
【０１０８】
以下の実施例は、本発明を実施するために現在意図される最も良い態様（ベストモード）を明らかにするが、その発明に限定されると解釈してはならない。
【０１０９】
実施例１．
本実施例は、ＲＡＮＫ−Ｌ刺激の不存在下における内因性ｃ−ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）を活性化する相対能力に関して、ヒトＦＥＯＲＡＮＫ（配列番号９）をコードするＤＮＡを含むプラスミドがトランスフェクトされたマウス３Ｔ３細胞、および、ヒト野生型ＲＡＮＫ（配列番号１）をコードする組換えＤＮＡを発現するマウス３Ｔ３細胞の評価を記載する。ＪＮＫは、ＲＡＮＫシグナル伝達の結果として活性化されることが公知である。
【０１１０】
ＪＮＫアッセイ法に関して、トランスフェクション後２４時間で３Ｔ３細胞から全細胞抽出物を調製した。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  β−グリセロールリン酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭナトリウムＯ−バナジウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、１０％グリセロールおよび、プロテアーゼ阻害因子ロイペプチン、ペプスタチンＡ、およびＰＭＳＦを含む緩衝液に細胞を溶解した。浄化された溶解液を、抗ＪＮＫ（ＦＬ）抗体および抗ＪＮＫ（Ｃ１７）抗体（両方ともＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州サンタクルズより入手可能）それぞれ１μｇで免疫沈降した。免疫複合体を溶解緩衝液で３回、洗浄緩衝液（５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ）で２回、そしてアッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で３回洗浄した。ＪＮＫ活性は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとｃ−ｊｕｎキナーゼのアミノ酸１−１６９との融合タンパク質（ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−１６９））（ＵＢＩ、ニューヨーク州レイクプラシド）１μｇ、およびアッセイ緩衝液４０μｌの基質として［３２Ｐ］−ＡＴＰ５μＣｉを用いて、２０分間３０℃で免疫複合体アッセイ法によって判定した。反応産物を４−２０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で分離し、オートラジオグラフィーによって視覚化した。
【０１１１】
ＪＮＫは、ＦＥＯ  ＲＡＮＫの発現に応答して活性化されたが、野生型ＲＡＮＫの発現には応答しなかった。
【０１１２】
実施例２．
本実施例は、半固形培地アッセイ法において、ＲＡＷ２６４．７細胞およびレトロウイルス発現ライブラリーを用いたＲＡＮＫシグナリングのアンタゴニストのスクリーニング法を記載する。
【０１１３】
レトロウイルスｃＤＮＡライブラリーをｐＢＭＮＺにおいて構築する。好ましくは、破骨細胞を形成しない細胞、すなわちＲＡＮＫ活性のアンタゴニストを発現することが可能な細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１０で活性化されたマクロファージ）から単離されたｍＲＮＡに対してｃＤＮＡを合成する。レトロウイルス粒子は、フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）細胞株（Ｇａｒｙ  Ｎｏｌａｎ博士、スタンフォード大学、ＵＳＡにより提供される）および適切なエンベロープタンパク質（例えば、エコトロピックエンベロープタンパク質、アンフォトロピックエンベロープタンパク質、またはポリトロピックエンベロープタンパク質など）を用いて詰め込まれる。例えば、一時的に産生されたレトロウイルスベクターの場合において、フェニックスパッケージング細胞を、ｐＢＭＮＺレトロウイルスベクターにおいて作成されたコンストラクトでトランスフェクトし、そして、培地の上清をトランスフェクション後４８時間で回収する。レトロウイルス粒子は、標準的な技術を用いて単離される。例えば、ウイルス粒子は、０．４５マイクロフィルターを通して殺菌濾過することにより、膜断片から精製される。
【０１１４】
最適な感染を誘導する条件下で、ＲＡＷ２６４．７細胞を、封入されたレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーで感染させる。例えば、最適な感染条件は、テストレトロウイルスコンストラクトから発現されたレポーター遺伝子の発現をモニターすることにより、判定されることも可能である。β−ガラクトシダーゼをコードするレトロウイルスコンストラクト（例えば、ｐＢＭＮＺ／ＬＺＲＳ；ＫｉｎｓｅｌｌａおよびＮｏｌａｎ、１９９６、上記）は、レトロウイルス粒子を産生するために用いられることも可能である。ウイルスストックの希釈系列での細胞の感染の後、β−ガラクトシダーゼが発現する細胞の数を感染後２４時間モニターすることも可能である。様々な条件、例えば、エンベロープタンパク質の選択、感染の重複、感染インキュベーション時間の長さ、細胞周期を促進させるための条件下の細胞の前処理、ポリブレンまたは組換えフィブロネクチン断片などのコファクターなどは、最大量のテストウイルスが細胞に入る条件を判定するために変えられることも可能である。
【０１１５】
感染細胞におけるｃＤＮＡの発現を可能にする適切な時間の後、細胞を半固形培地おいて広げる。感染細胞を広げるための例示的条件は、２４ウェルプレートの各ウェルにおいて、細胞密度１Ｘ１０５細胞／ｍｌから１Ｘ１０６細胞／ｍｌで感染させた細胞を含む０．３％（ｗ／ｖ）メチルセルロース培地３ｍｌを広げるものである。ＲＡＮＫ−Ｌの可溶性ロイシンジッパー型（２００ｎｇ／ｍｌ）は、半固形培地に含まれる。
【０１１６】
５日から８日に渡って細胞を培養し、そして、非感染の対照群由来のコロニーよりも著しく速く成長している感染細胞群由来のコロニーを、さらなる解析のために単離する。例えば、関心のあるコロニーは、細胞数を増大させるためにＲＡＮＫ活性の不存在下において、無菌で単離され、そしてさらに成長させられる。各コロニーの細胞内のｃＤＮＡクローンは、当業者に認識された任意の技術、例えば、発現したウイルスの導入遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ、取り込まれたプロウイルスのＰＣＲ、またはヘルパーウイルスの組換えおよびウイルス粒子の回収により、回収される。例えば、組み込まれたｃＤＮＡの増殖は、Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９１４６−９１５０（１９９５）、により記載されている。
【０１１７】
このアッセイ法の変形は、ＲＡＷ２６４．７細胞をＲＡＮＫ−Ｌに接触させるときに生じる細胞融合および最終的分化を利用する。アッセイ法のこの変形を実行するにあたり、ＲＡＷ２６４．７細胞を６ウェル培養プレートにおいて広げ、ＲＡＮＫ−Ｌの可溶性ロイシンジッパー型をウェルに加え、そしてプレートをロイシンジッパーＲＡＮＫ−Ｌポリペプチドの存在下において、３から５日間インキュベーションする。ＲＡＮＫ−Ｌトリガーに対して陽性に応答する細胞は、大きい多核の分化破骨細胞に融合し、かつ、培地において分裂する能力を失うであろう。望ましいならば、ロイシンジッパーＲＡＮＫ−Ｌ以外の他の型のＲＡＮＫ−Ｌが、このアッセイ法において刺激物として用いられてもよい。ＲＡＮＫにアンタゴナイズする能力に関して様々な剤を試験するためのこのアッセイ法を用いて、ＲＡＮＫ−Ｌ刺激物に曝す前および／または曝す間に、推定上のアンタゴニストをウェルに加える。候補アンタゴニスト、例えば発現されたｃＤＮＡが、ＲＡＮＫ−Ｌに対する細胞の応答性を排除するならば、細胞はこれらの培地において分裂する能力を維持するであろう。培地における成長能力を維持するこれらのプレートからの細胞は、力強いピペッティングにより、またはトリプシン消化により、融合され分化させられた破骨細胞から分離し回収することも可能である。これらの回収された細胞は、ＲＡＮＫ−Ｌの不存在下において通常の成長培地における成長が可能であり、慣用の技術を用いて数え、また増殖させることも可能であろう。上記のように、増殖された細胞内のｃＤＮＡは、慣用の技術、例えば、発現したウイルスの導入遺伝子の逆転写ＰＣＲ、取り込まれたプロウイルスのＰＣＲ、またはヘルパーウイルスの組換えおよびウイルス粒子の回収により、回収される。
【０１１８】
実施例３．
本実施例は、ＲＡＮＫΔ３４０−４２１（ＲＡＮＫΔ３４０−４２１の記載に関してＧａｌｉｂｅｒｔら、１９９８を参照されたい）を発現するＲＡＮＫ応答性細胞株の調製を記載する。
【０１１９】
３−６週齢のＲＡＮＫ−／−マウス（破骨細胞形成において欠失を有し、かつ骨石化的である）から脾臓細胞を単離し、そして系統を以下の方法で除去した。ビオチン化された抗ＣＤ３抗体を用いる免疫吸着によりＴ細胞を取り除き；ビオチン化された抗Ｔｅｒ−１１９抗体を用いる免疫吸着により赤血球系細胞を取り除き；そして、ビオチン化された抗ＧＲ−１抗体を用いる免疫吸着により顆粒球を取り除いた。ビオチン部分をストレプトアビジンが結合された磁気ビーズに結合させることにより、抗体−細胞複合体を取り除き、金属のＭＡＣＳ除去カラムに通した。
【０１２０】
系統が除去された細胞を、４０ｎｇ／ｍｌ  ＣＳＦ−１で４８時間インキュベートし、そして、４０ｎｇ／ｍｌ  ＣＳＦ−１でさらなる４８時間、フィブロネクチン断片（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐ、ウィスコンシン州マディソン）の存在下、レトロウイルス上清（５ＭＯＩ）を用いて感染させた。感染後、脾臓細胞を回収して、４０ｎｇ／ｍｌＣＳＦ−１および２００ｎｇ／ｍｌマウスＲＡＮＫ−Ｌを含むＭＥＭ１０％ＦＢＳに広げた。５日間これらの条件下で細胞を培養して、破骨細胞の分化を可能にした。
【０１２１】
トランスフェクションに用いられるレトロウイルスは、ＲＡＮＫΔ３４０−４２１をコードするＤＮＡをｐＢＭＮＺベクターにサブクローニングすることにより調製された（ＫｉｎｓｅｌｌａおよびＮｏｌａｎ、１９９６、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１４０５−１４１３）。制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いて、ｐＤＣ３０４／ＲＡＮＫΔ３４０−４２１（Ｇａｌｉｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３４１２０，１９９８）からＲＡＮＫΔ３４０−４２１ｃＤＮＡ全体を切断した。このｃＤＮＡ挿入断片を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化されたレトロウイルスベクターｐＢＭＮＺ（ＫｉｎｓｅｌｌａおよびＮｏｌａｎ、１９９６、上記）に連結した。結果として得られたプラスミドを精製し、ＤＮＡ配列を確かめ、そしてｐＢＭＮＺ／ＲＡＮＫΔ３４０−４２１と名付けた。２９３−Ｅフェニックスパッケージング細胞における感染性のレトロウイルスベクターの作製を記載されたように行った（ＫｉｎｓｅｌｌａおよびＮｏｌａｎ、１９９６、上記）。
【０１２２】
実施例４．
本実施例は、ヒトＩＬ−２αレセプターに融合されたマウスＭＭＰ−９プロモーター（配列番号１１）のプロモーター／レポーター  ベクターの調製を記載する。
【０１２３】
マウスＭＭＰ−９遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片は、以下のようにヒトＩＬ−２α受容体をコードするｃＤＮＡ分子に融合された。４．１５ｋｂのマウスＭＭＰ−９プロモーター領域（配列番号１１）を含むプラスミドは、Ｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ  ２０８：１１７−１２２（１９９８）により記載されたようにルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプロモーター欠失ｐＧＬ２基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）にサブクローニングされた。得られたプラスミドをｐＧＢ−ｃｏｌＮＫ１と名付けた。プロモーター配列の５’側に位置するＭＭＰ−９（配列番号１１）を含む約３．５ｋｂのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＧＢ−ｃｏｌＮＫ１から切断し、そして、ＳＩＮレトロウイルスベクターｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、平滑末端にされたＢａｍＨＩ部位でサブクローニングした。
【０１２４】
ヒトＩＬ−２α受容体をコードするｃＤＮＡは、「リンフォカイン：リンフォカインの分子クローニングと解析（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）、Ｄ．Ｒ．ＷｅｂｂおよびＤ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（監修）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、ｐ．１０９にあるＣｏｓｍａｎ，Ｄら「ヒトおよびマウスＩＬ−２受容体ｃＤＮＡのクローニングと発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃＤＮＡｓ）」」に記載されているように、ＣＡＶＮＯＴにサブクローニングされた。
【０１２５】
ヒトＩＬ−２α受容体ｃＤＮＡは、ＰＣＲを用いて、５’末端がＢｇｌＩＩ部位を含むように修飾され、また、３’末端がＰｆｌＭ１部位を含むように変更されるように、ＣＡＶＮＯＴコンストラクトから増幅された。この増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。ヒトＩＬ−２α受容体ｃＤＮＡは、ＢｇｌＩＩおよびＰｆｌＭ１制限部位を用いてこのプラスミドから切断され、そして、ルシフェラーゼレポーターｃＤＮＡを切断するためにＢｇｌＩＩおよびＰｆｌＭ１で消化されたｐＧＬ２基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結された。このようにヒトＩＬ−２α受容体をｐＧＬ２のルシフェラーゼレポーターと置き換え、そして得られたプラスミドをｐＧＬ２／ｈＩＬ−２受容体と名付けた。
【０１２６】
ｐＧＬ２／ｈＩＬ−２受容体は、ヒトＩＬ−２αをコードするｃＤＮＡの上流のポリリンカー内のＫｐｎＩおよびＢｇｌＩＩで消化された。ＭＭＰ−９プロモーター（配列番号１１）をコードするｐＧＢ−ｃｏｌＮＫ１プラスミドから単離された３．５ｋｂＫｐｎＩ／ＮｈｅＩ断片、および、残りのＭＭＰ−９プロモーターの隣接するＮｈｅＩからＢｇｌＩＩ（６５３ｂｐ）の断片が、３分子ライゲーションでｐＧＬ２／ｈＩＬ−２受容体と連結されて、マウスＭＭＰ−９隣接領域の４．１５ｋｂ５’隣接配列全体がｈＩＬ−２α受容体ｃＤＮＡの上流に直接的に融合され、ｐＧＬ２−ＭＭＰ−９／ヒトＩＬ−２受容体と名付けたプラスミドを形成した。このコンストラクトは、ＲＡＮＫに対して応答性を示した。
【０１２７】
この系を用いて候補分子の阻害活性を試験するため、ＲＡＮＫ活性アゴニストを加える前、同時、または後に、候補分子を加えてもよい。表面におけるＩＬ−２α受容体発現のレベルは、ＲＡＮＫ活性のレベルの基準である。
【０１２８】
ＭＭＰ−９プロモーターのＲＡＮＫ応答性部分の領域は、プロモーターのさらなる切断試験により、もっと狭く同定された。ＭＭＰ−９プロモーターの５’近接の１８２２ｂｐを含むＰＶＵＩＩ／ＢＧＬ２制限断片は、ｐＳＩＲレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のマルチクローニング部位において、ヒトＩＬ−２受容体αをコードするＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限断片と融合された。ｐＳＩＲ／ＭＭＰ−９と名付けられた、得られたプラスミドは、ＲＡＮＫ応答性であり、またＲＡＮＫアンタゴニストを同定するアッセイ法において有用である。ｐＳＩＲ／ＭＭＰ−９に存在するＭＭＰ−９プロモーターの領域は、配列番号１１のヌクレオチド１７６９−３５９１に対応する。
【０１２９】
ｐＳＩＲ／ＭＭＰ−９を以下のようにＲＡＮＫ応答性細胞に導入した。ｐＳＩＲ／ＭＭＰ−９での２９３／Ｅパッケージング細胞のトランスフェクション後に、レトロウイルス粒子を調製した。ＲＡＷ２６４．７細胞をこれらの粒子で感染させ、そして安定的にレポーターを発現するネオマイシン抵抗性コロニーを単離した。これらの細胞のＲＡＮＫでの処理は、ＩＬ−２Ｒを検出するための試薬としてマウスｍＡｂ（クローン２Ａ３）抗ヒトＩＬ−２αＲを用いて、フローサイトメトリーにより検出されたように、細胞表面におけるｈＩＬ−２αＲの発現の増加を誘導した。ｈＩＬ−２α受容体の発現は、４時間以内に観察され、そして４８時間以内に最大レベルになるのが観察された。
【０１３０】
ヒトＩＬ−２α受容体の表面の発現を、以下の方法でフローサイトメトリーにより検出する。細胞を回収し、そして、５％標準ヤギ血清を含むＰＢＳの溶液を用いて４℃で３０分間、公知の特異的な抗体の結合部位をブロックする。細胞を洗浄し、そして、４℃で１時間、抗体濃度５μｇ／ｍｌで、抗ヒトＩＬ−２α受容体モノクローナル抗体クローンとともに、インキュベーションする。このインキュベーションの後、細胞を洗浄し、そして、４℃でさらに３０分間、蛍光に結合された抗マウスＩｇＧ第２抗体を細胞とともにインキュベートする。細胞を洗浄後、ＦＡＣＳスキャン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）などのフローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定する。
【０１３１】
さらに、ＩＬ−２α受容体に対する放射性抗体を用いて、ヒトＩＬ−２α受容体の表面の発現を解析してもよい。ｍＩＬ−４Ｒ特異的ラジオイムノアッセイ法に関して、ｍＩＬ−４Ｒと反応するマウス抗ヒトＩＬ−２αモノクローナル抗体を、クロラミンＴ反応法により１２５Ｉで標識し；得られる特異的活性は、典型的には１．５Ｘ１０１６ｃｐｍ／ｎｍｏｌである。４８時間後、ｐＧＬ２−ＭＭＰ−９／ヒトＩＬ−２受容体でトランスフェクトされた細胞を、培地（ＤＭＥＭ，１２５％ＦＢＳ）で一度洗浄した。５％非脂肪ドライミルクを含む前もって暖められた結合培地を加え、そして、１時間、組織培養インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションすることにより、非特異的結合部位をブロックした。ブロッキング培地を静かに注ぎ、そして、１２５Ｉ抗ｍＩＬ−４Ｒ（クローンＭ１；ラットＩｇＧ１）を含む結合緩衝液を細胞に加え、そして、１時間室温で振とう培養した。細胞を放射性標識抗体でインキュベーションした後、結合緩衝液（２Ｘ）で繰り返し、およびリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回、細胞を洗浄した。細胞を０．５Ｍ  ＮａＯＨ  １ｍｌに溶解し、そして全放射活性をガンマカウンターで測定した。このアッセイ法を用いて、ＲＡＮＫをコードするＤＮＡが共にトランスフェクトされた２９３／ＥＢＮＡは、細胞表面におけるｍｕＩＬ−４Ｒの検出により示されるものとして、転写活性が明らかにされる。ＲＡＮＫの過剰発現は、ＲＡＮＫ−ＬによりＲＡＮＫが誘発されるように、ｍｕＩＬ−４Ｒの転写を生じさせた。ＲＡＮＫがアゴニスト抗体により誘発されるとき、同様の結果が観察される。
【０１３２】
さらに、表面においてヒトＩＬ−２α受容体を発現する細胞は、例えばＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｐ、ＰＮＡＳ  ８４：８５７３−８５７７（１９８７）により記載された技術といった、パンニング技術を用いて単離されることも可能である。簡潔には、第１抗体を認識する第２抗体を、バクテリアの６０ミリメータープレートに固定する。広げられる細胞は、０．５ｍＭＥＤＴＡおよび５％ＦＢＳを含むＰＢＳにおいて単一の細胞懸濁液として調製される。細胞表面マーカーに対する抗体は、約５μｇ／ｍｌで加えられた後、３０分間氷上でインキュベーションされる。細胞は一度洗浄され、そしてＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５％ＦＢＳにおいて第２抗体で被覆されたプレートに加えられ、そして１−３時間室温でインキュベーションされる。皿に付着しない余分な細胞は、ＰＢＳ／５％ＦＢＳでの穏やかな洗浄により取り除かれる。
【０１３３】
実施例５．
本実施例は、ＴＲＡＰプロモーターの活性化を記載する。プラスミドｐＢＬ２ＨＴ２．２を制限酵素ＡｐａＩで消化することにより、ヒトＴＲＡＰプロモーターを含む２．６ｋｂＤＮＡ断片を得た。ヒトＴＲＡＰ遺伝子５’領域のクローニング、およびｐＢＬ２ＨＴ２．２の構築は、Ｒｅｄｄｙら（Ｂｏｎｅ  １６：５８７−５９３（１９９５））において十分に記載されている。また、マウスＴＲＡＰプロモーター（配列番号１２）を含むＤＮＡ、およびマウスＭＭＰ−９プロモーター（配列番号１１）を含むＤＮＡも、これらの実験に使用した。プロモーターを含むＤＮＡをルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合した。これらのプロモーター／レポーターコンストラクトは、完全長ヒトＲＡＮＫ（配列番号２）および完全長ヒトＲＡＮＫ−Ｌ（配列番号６）をコードする様々な組み合わせの発現ベクターとともに、ヒト２９３／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトされた。
【０１３４】
マウスＴＲＡＰプロモーター（配列番号１２）に関して、２Ｘ１０５
２９３／ＥＢＮＡ細胞は、ルシフェラーゼレポーターに融合された約２ｋｂのマウスＴＲＡＰプロモーター（配列番号１２）をコードするプラスミド４０ｎｇ、ＲＡＮＫ−Ｌをコードする発現ベクター（配列番号６）の２０ｎｇ、およびＲＡＮＫをコードする発現ベクター（配列番号２）０．４ｎｇを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクション後２４時間、ＥＧ＆Ｇ／Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターを用いて製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、細胞溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＡＮＫの発現は、レポーター発現を増大させるのに（約２倍）十分であり、その上ＲＡＮＫ（配列番号２）およびＲＡＮＫ−Ｌ（配列番号６）の組み合わせは、レポーター発現を約４倍に増大させた。
【０１３５】
ヒトＴＲＡＰプロモーターに関して、ヒトＴＲＡＰ遺伝子（Ｒｅｄｄｙら、１９９５）の上流領域から単離されたプロモーター活性を含む１．９ｋｂＡｐａＩＩ断片を、ルシフェラーゼレポーターに融合し、そして２９３／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした（４０ｎｇ）。ヒトＲＡＮＫ（配列番号２）およびヒトＲＡＮＫ−Ｌ（配列番号６）の組み合わせは、レポーター発現を約１．５倍に増大させた。
【０１３６】
マウスＭＭＰ−９プロモーター実験に関して、マウスＭＭＰ−９プロモーター（配列番号１１）４．１ｋｂをルシフェラーゼレポーターに融合し、そして２９３／ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした（４０ｎｇ）。ＲＡＮＫ（配列番号２）単独、またはＲＡＮＫ（配列番号２）およびＲＡＮＫ−Ｌ（配列番号６）の組み合わせは、レポーター発現を２．５倍に増大させた。
【０１３７】
加えて、ＲＡＷ２６４．７細胞（６Ｘ１０６細胞）を、１５μｇの、ＭＭＰ−９（配列番号１１）／ルシフェラーゼ  プラスミドＤＮＡで、ＤＥＡＥ／デキストランを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後２時間で、細胞は分裂して２倍量になり、そしてさらに２４時間インキュベーションされた。１８時間マウスＲＡＮＫ−Ｌロイシンジッパー型１μｇ／ｍｌを加えることは、ＭＭＰ−９（配列番号１１）／ルシフェラーゼプロモーターを１０−１５倍に誘導するのに十分だった。
【０１３８】
様々な時間、マウスＲＡＮＫＬ／ＬＺ（２００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理した後のＲＡＷ２６４．７細胞におけるマウスＴＲＡＰおよびマウスＭＭＰ−９の定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定により、ＴＲＡＰｍＲＮＡは、ＲＡＮＫ−Ｌにより２５０倍よりも大きく高められるが、ＴＮＦαによると約２．３倍しか増大されないことが明らかになった。ＭＭＰ−９ｍＲＮＡは、ＲＡＮＫ−Ｌにより３５０倍よりも大きく高められるが、ＴＮＦαによると増大されない。この特異性は、ＲＡＮＫシグナル伝達の阻害剤のスクリーニングにおいて有益である。
【０１３９】
実施例６．
本実施例は、ＲＡＮＫ−Ｌに対するモノクローナル抗体の調製を説明する。精製された組換えＲＡＮＫ−Ｌの調製物、例えば高いレベルのＲＡＮＫ−Ｌを発現するトランスフェクトされた細胞は、慣用の技術、例えば本明細書に参照として援用される米国特許第４，４１１，９９３号において開示されたものなどを用いて、ＲＡＮＫ−Ｌに対するモノクローナル抗体を生成するために使用される。ＲＡＮＫ−ＬをコードするＤＮＡは、例えば、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：１６５，１９９５においてＰａｒｄｏｌｌおよびＢｅｃｋｅｒｌｅｇにより論評されたように、免疫原として用いられることも可能である。該抗体は、ＲＡＮＫ−ＬもしくはＲＡＮＫ−Ｌ活性を診断もしくは研究するアッセイ法の構成要素としてＲＡＮＫ−Ｌシグナリングへの干渉において、またはＲＡＮＫ−Ｌの親和性精製において有用である可能性がある（アンタゴニスト抗体またはブロッキング抗体）。
【０１４０】
齧歯類を免役化するために、アジュバント（例えば、完全もしくは不完全なフロイントのアジュバンド、ミョウバン、またはＲｉｂｉアジュバントＲ７００（Ｒｉｂｉ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）などの他のアジュバント）でＲＡＮＫ−Ｌ免疫原を乳化し、そして、１０−１００μｇの範囲の量で、選択された齧歯類、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＬｅｗｉｓラットに皮下注射する。ＤＮＡは、皮内（Ｒａｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９５１９，１９９４）または筋肉内（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４１５６，１９９３）に与えられることも可能であり；生理食塩水は、ＤＮＡに基づく抗原に適した希釈剤であることが見出されている。１０日から３週間後、免疫化された動物を追加の免疫原で追加免疫し、そして、その後１週間ごと、２週間ごと、または３週間ごとの免疫スケジュールで定期的に追加免疫する。
【０１４１】
ドットブロットアッセイ法（抗体サンドイッチ法）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ法）、免疫沈降法、またはＦＡＣＳ解析などの他の適したアッセイ法による試験のために、血清試料を眼窩出血または日先端切開により定期的に採取する。適切な抗体力価を検出した後に、陽性動物は、生理食塩水で抗原の静脈注射がされる。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を回収し、そしてマウス骨髄腫細胞株に融合する（例えば、ＮＳ１または好ましくはＡｇ８．６５３［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０］）。この手順により産生されたハイブリドーマ細胞株は、非融合細胞、骨髄腫−骨髄腫ハイブリド、および脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリドの増殖を阻害するために選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン、またはＨＡＴを含むもの）の複数のマイクロタイタープレートに広げられる。
【０１４２】
このように産生されたハイブリドーマクローンは、ＲＡＮＫ−Ｌとの反応に関して、例えば、Ｅｎｇｖａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８１７（１９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適応によって、ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングされることも可能である。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２１２（１９９０）により記載された抗体捕捉技術である。次に陽性クローンを同型のネズミの腹膜腔に注入し、高濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗ＲＡＮＫモノクローナル抗体を含む腹水を生産する。得られるモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿に続く、ゲル排除クロマトグラフィーにより精製されることも可能である。あるいはまた、プロテインＡまたはプロテインＧと抗体との結合に基づく親和性クロマトグラフィーが、ＲＡＮＫ−Ｌタンパク質との結合に基づく親和性クロマトグラフィーとして用いられることも可能である。本明細書において記載された方法を用いてｍＡｂの活性をモニターし、ブロッキング（すなわち、ＲＡＮＫ−Ｌを結合し、かつＲＡＮＫとの結合を阻害する抗体）と非ブロッキング（すなわち、ＲＡＮＫ−Ｌと結合し、かつＲＡＮＫとの結合を阻害しない抗体）の両方を単離する。
【０１４３】
実施例７．
本実施例は、ＲＡＮＫに対するモノクローナル抗体の調製を説明する。精製された組換えＲＡＮＫの調製物、例えば高いレベルのＲＡＮＫを発現するトランスフェクトされた細胞は、慣用の技術、例えば本明細書に参照として組み入れられる米国特許第４，４１１，９９３号において開示されたものなどを用いて、ＲＡＮＫに対するモノクローナル抗体を生成するために使用される。ＲＡＮＫをコードするＤＮＡは、例えば、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：１６５，１９９５においてＰａｒｄｏｌｌおよびＢｅｃｋｅｒｌｅｇにより論評されたように、免疫原として用いられることも可能である。
【０１４４】
齧歯類を免役化するために、アジュバント（例えば、完全もしくは不完全なフロイントのアジュバンド、ミョウバン、またはＲｉｂｉアジュバントＲ７００（Ｒｉｂｉ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）などの他のアジュバント）で、ＲＡＮＫ免疫原を乳化し、そして、１０−１００μｇの範囲の量で、選択されたネズミ、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＬｅｗｉｓラットに皮下注射する。ＤＮＡは、皮内（Ｒａｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９５１９，１９９４）または筋肉内（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４１５６，１９９３）に与えられることも可能であり；生理食塩水は、ＤＮＡに基づく抗原に適した希釈剤であることが見出されている。１０日から３週間後、免疫化された動物を追加の免疫原で追加免疫し、そして、その後１週間ごと、２週間ごと、または３週間ごとの免疫スケジュールで定期的に追加免疫する。
【０１４５】
ドットブロットアッセイ法（抗体サンドイッチ法）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ法）、免疫沈降法、またはＦＡＣＳ解析などの他の適したアッセイ法による試験のために、血清試料を眼窩出血または尾先端切除によって定期的に採取する。適切な抗体力価を検出した後に、陽性動物は、生理食塩水で抗原が静脈注射される。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を回収し、そしてマウス骨髄腫細胞株に融合する（例えば、ＮＳ１または好ましくはＡｇ８．６５３［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０］）。この手順により産生されたハイブリドーマ細胞株は、非融合細胞、骨髄腫−骨髄腫ハイブリド、および脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリドの増殖を阻害するために選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン、またはＨＡＴを含むもの）の複数のマイクロタイタープレートに広げられる。
【０１４６】
このように産生されたハイブリドーマクローンは、ＲＡＮＫとの反応に関して、例えば、Ｅｎｇｖａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８１７（１９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適応によって、ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングされることも可能である。好ましいスクリーニング法は、Ｂｅｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４２１２（１９９０）により記載された抗体捕捉法である。次に陽性クローンを同型ネズミの腹膜腔に注入し、高濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗ＲＡＮＫモノクローナル抗体を含む腹水を生産する。結果として得られるモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿に続くゲル排除クロマトグラフィーにより精製されることも可能である。あるいはまた、プロテインＡまたはプロテインＧと抗体との結合に基づく親和性クロマトグラフィーが、ＲＡＮＫタンパク質との結合に基づく親和性クロマトグラフィーとして用いられることも可能である。
【０１４７】
免疫原としてＲＡＮＫ／Ｆｃ融合タンパク質を用いて、モノクローナル抗体を産生した。ＲＡＮＫタンパク質に対する反応性を確かめるためにこれらの試薬をスクリーニングした。本明細書に記載された方法を用いてｍＡｂの活性をモニターし、ブロッキング（すなわち、ＲＡＮＫを結合し、かつＲＡＮＫへのリガンドの結合を阻害する抗体）と非ブロッキング（すなわち、ＲＡＮＫと結合し、かつリガンドの結合を阻害しない抗体）の両方を単離する。
【０１４８】
実施例８．
本アッセイ法において、ＲＡＮＫと関連する活性を調製することが可能なテスト分子は、テスト分子存在下においてｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼまたはＦ−アクチンリング形成の誘導を測定することにより同定される。
【０１４９】
野生型またはヒトＲＡＮＫ／ＴＲＡＦ６結合突然変異体（ＲＡＮＫΔ３４０−４２１）をコードするＤＮＡを、ＲＡＮＫ−／−マウスから単離された造血細胞に導入する実験を行った。完全長および突然変異体ヒトＲＡＮＫＤＮＡを、以前に記載されたようにｐＢＭＮＺレトロウイルスベクターにサブクローニングした（ＫｉｎｓｅｌｌａおよびＮｏｌｅｎ、１９９６、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１４０５−１４１３）。ＲＡＮＫを含んだ感染性レトロウイルスを、記載されたように２９３−Ｅフェニックスパッケージング細胞において作製した（ＫｉｎｓｅｌｌａおよびＮｏｌａｎ、１９９６）。これらの細胞からの上清を、感染性ウイルス粒子の供給源として用いた。
【０１５０】
これらのアッセイ法において用いられるＲＡＮＫ−／−マウスの作製は、以前に記載されている（Ｄｏｕｇａｌｌら、１９９９）。３−６週齢のＲＡＮＫ−／−マウスから脾臓細胞を単離し、そして、最初の細胞群から破骨細胞前駆体以外の様々な型を除去することにより、破骨細胞前駆体で富むものとした。この「除去」工程に関して、ＣＤ３（Ｔ細胞に特異的である）、Ｔｅｒ−１１９（赤血球に特異的である），およびＧＲ−１（顆粒細胞に特異的である）に対するビオチン化された抗体で細胞をインキュベーションした。抗体が応答性標的細胞に結合した後、ストレプトアビジンが結合された磁気ビーズを培地に加え、そして、細胞の混合液を磁気カラム（ＭＡＣＳ除去カラム；ＭＩＬＬＴＥＮＮＹＩ）に通した。ＭＡＣＳカラムに付着しない細胞は、破骨細胞前駆体に富んでいると考えられ、そして本アッセイ法に用いられた。
【０１５１】
破骨細胞前駆体に富む細胞を、４０ｎｇ／ｍｌＣＳＦ−１で４８時間インキュベーションし、そして、レトロウイルス上清（５ＭＯＩ）で、４０ｎｇ／ｍｌＣＳＦ−１においてさらなる４８時間、組換えフィブロネクチン断片（レトロネクチン、ＰａｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐ、ウィスコンシン州マディソン）の存在下において感染させた。細胞およびウイルス粒子の両方ともフィブロネクチンに付着する傾向があり、このためフィブロネクチン断片は、細胞およびウイルス両方の高濃度の局在を作り出すことによって感染率を高める働きをした。感染後、細胞を回収し、そして４０ｎｇ／ｍｌＣＳＦ−１および２００ｎｇ／ｍｌｍＲＡＮＫ−Ｌを含むＭＥＭ１０％胎児ウシ血清に広げ、そしてこの培地において５日間インキュベーションした。
【０１５２】
野生型ＲＡＮＫＤＮＡを受け入れた感染培地に関して、ｃ−ｓｒｃレベルは、かなり高く以下のように異なっていた。典型的な実験において、野生型ＲＡＮＫを発現する細胞の細胞膜からの抽出液は、ＲＡＮＫを欠失した細胞からの抽出液よりも約１５倍多い３２Ｐをｃ−ｓｒｃ特異的基質に取り込む。胎児ウシ血清およびＣＳＦ−１の両方とも、ｃ−ｓｒｃ活性の基礎レベルに寄与し、この基礎レベルは、１０％胎児ウシ血清の代わりに０．５％のもの、および４０ｎｇ／ｍｌＣＳＦ−１の代わりに１０ｎｇ／ｍｌのものを含むＭＥＭにおいて１８時間、次いで０．５％ＦＢＳを含みかつＣＳＦ−１を含まないＭＥＭにおいて２時間、「飢餓状態である」細胞により低められた。
【０１５３】
ｃ−ｓｒｃおよびＦ−アクチンリングを誘導するために、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１０％グリセロール、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液に細胞を懸濁した後、組換えｍＲＡＮＫ−Ｌ／ロイシンジッパータンパク質を、１μｇ／ｍｌの濃度で様々な時間、培地に加えた。モノクローナル抗体ＧＤ−１１を用いて免疫沈降によりｃ−ｓｒｃタンパク質を精製した。商業的に入手可能なアッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ニューヨーク州レイクプラシド）を用いて免疫複合体でのｃ−ｓｒｃ活性をモニターした。簡潔には、ｃ−ｓｒｃ活性の測定は、γ標識されたＡＴＰ、およびｃ−ｓｒｃキナーゼの基質を与えるｐ３４／ｃｄｃ２ペプチド（ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ）（配列番号１３）を用いて、ホスホトランスフェラーゼ活性を測定することを要した。１０μＣｉのγ標識されたＡＴＰ、ＭｎＣｌ２（７５ｍＭ）、ＡＴＰ（５００μＭ）、ＭＯＰＳ（２０ｍＭ）、β−グリセロールリン酸（２５ｍＭ）、ＥＧＴＡ（５ｍＭ）、ナトリウムＯ−バナジウム（１ｍＭ）、およびジチオスレイトール（１ｍＭ）を含む緩衝液において１０分間３０℃で、キナーゼアッセイをインキュベーションした。ホスホセルロース紙を用いて、残存する標識ＡＴＰから、リン酸化された基質ペプチドを分離し、そして、シンチレーションカウンターを用いて、標識されたペプチドを定量した。免疫沈降およびインビトロ免疫複合体キナーゼアッセイ法は、記載されたように行われた（Ｍｕｓｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：７９２３−７９２８）。
【０１５４】
ｃ−ｓｒｃ誘導を上記のようにアッセイした際、完全長ＲＡＮＫ導入遺伝子の導入後に細胞を誘導して分化させたときに、細胞が高レベルのｃ−ｓｒｃ活性を含むのが観察された。一方で、ｃ−ｓｒｃ活性は、対照ウイルス（ｌａｃＺをコードする）、またはＴＲＡＦ６結合ドメイン（ＲＡＮＫΔ３４０−４２１）を欠落したＲＡＮＫ  ＤＮＡのいずれかでの感染後に分化させた細胞の抽出液における背景レベルと、見かけ上異ならなかった。背景レベルは、レトロウイルスで感染させないＲＡＮＫ−／−細胞を用いて判定された。
【０１５５】
Ｆ−アクチンリングを検出する手順を以下のように行った。完全長ヒトＲＡＮＫｃＤＮＡまたはＲＡＮＫ／ＴＲＡＦ６結合変異体（ＲＡＮＫΔ３４０−４２１）のいずれかをコードするレトロウイルスコンストラクトで、ＲＡＮＫ−／−マウス由来の初期造血細胞を感染させた。＃１ホウケイ酸カバーグラスを有するＬａｂＴｅｋＣｈａｍｂｅｒスライドにおいて、細胞を培養した。１０％胎児ウシ血清、４０ｎｇ／ｍｌＣＳＦ−１、および２００ｎｇ／ｍｌｍＲＡＮＫ−Ｌを含むＭＥＭにおいて５日間インキュベーションした後、培地を吸引し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして３％パラフォルムアルデヒド溶液で１０分間固定し、続いて５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌで急冷した。アクチンの蛍光プローブ、ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）で細胞を染色することにより、Ｆ−アクチンリングを視覚化した。標準の蛍光顕微鏡を用いて、蛍光シグナルを検出し、そしてＦ−アクチンリングを、各細胞の周辺でのＦ−アクチンの連続的リングとして同定した。
【０１５６】
蛍光ファロイジンで染色することにより、細胞におけるＦ−アクチンリングを視覚化した。野生型ＲＡＮＫＤＮＡを感染させた細胞に関して、Ｆ−アクチンリングは、５０％以上の細胞において検出された。一方で、ヒトＲＡＮＫ／ＴＲＡＦ６結合変異体で細胞をトランスフェクトした場合、全ての細胞がＦ−アクチン細胞骨格構造を分解しており、またＦ−アクチンリングは認められなかった。
【０１５７】
ＲＡＮＫ活性のアゴニストをアッセイするために、ＲＡＮＫ−Ｌを曝す工程の間、または分化工程が完了した後、テスト分子を培養培地に加える。テスト分子がＲＡＮＫ活性のアゴニストならば、上記の欠失変異体を感染させた細胞は、Ｆ−アクチンリングを発現し、または検出可能なｃ−ｓｒｃ活性を発現し、もしくはその両方を発現するであろう。しかしながら、ＲＡＮＫ分子においてＴＲＡＦ６結合部位の存在を必要とするＲＡＮＫアゴニストは、ＲＡＮＫＴＲＡＦ６欠失変異体を感染したＲＡＮＫ−／−細胞において、陽性を示さないであろう。
【０１５８】
実施例９．
本アッセイ法に基づくＣａＰＯ４吸収は、破骨細胞活性の評価であると考えられる。脾臓細胞を、３−６週齢のＲＡＮＫ−／−マウスから単離し、そして実施例９において記載したように処理し、ＣＤ３、Ｔｅｒ−１１９、およびＧＲ−１抗原を発現する細胞を取り除いた。これらの抗原のいずれも発現しない細胞を回収し、そして実施例９に記載したようにＲＡＮＫの完全長またはＴＲＡＦ６結合部位欠失変異を含むレトロウイルスベクター粒子で感染させた。
【０１５９】
感染させた後、脾臓細胞を回収し、そして、ＣａＰＯ４の薄いフィルムで覆った１６ウェルの石英スライド（Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｃ，ＢＤ  バイオシステムズ）上に４０ｎｇ／ｍｌ  ＣＳＦ−１および２００ｎｇ／ｍｌ  ｍＲＡＮＫ−Ｌを含んだ１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭにおいて広げた。培地において５日間の後、スライドを洗浄し、漂白剤で洗浄することにより細胞を取り除き、そして緩衝液で再度スライドを洗浄した。完全長ＲＡＮＫを感染させた細胞は、ＣａＰＯ４基質（ｍａｔｒｉｘ）を吸収し、位相差顕微鏡により視覚化される多数の明確なピット（吸収孔（ｒｅｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｌａｃｕｎａｅ）とも呼ばれる）により判定された。ＣａＰＯ４フィルムにおけるピット数は、ＲＡＮＫ−Ｌがスライド上で成長した細胞を誘導して破骨細胞に分化させる度合いの評価である。
【０１６０】
望ましいならば、ＣａＰＯ４フィルムは、水での洗浄前に、４から５分間０．５％のアリザリンレッド溶液を用いて染色されてもよい。染色後、吸収孔は、赤の背景上で明確な領域として位相差顕微鏡により視覚化される。
【０１６１】
完全長ＲＡＮＫ導入遺伝子を用いて分化させた細胞は、高いレベルのＣａＰＯ４吸収を含んだ。一方で、対照のウイルス（ｌａｃＺをコードする）、またはＴＲＡＦ６結合ドメインを欠落したＲＡＮＫコンストラクト（ＲＡＮＫΔ３４０−４２１）のいずれかで、分化させた細胞は、ＣａＰＯ４吸収のレベルがわずかだった。
【０１６２】
本発明の好ましい態様が説明および記載された一方で、様々な変化が、発明の精神および範囲から出発することなく、その中においてなされることもあり得ると評価されるであろう。
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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