(57)【要約】【課題】ｈｄｍ２蛋白質に向けられたＴ−細胞受容体α―ＴＣＲおよびβ―ＴＣＲのネズミ遺伝子を利用可能とする目的に基づく。【解決手段】本発明は、ｈｄｍ２蛋白質−特異的Ｔ−細胞受容体を媒介するネズミα／β  Ｔ−細胞受容体からのポリペプチド、またはその機能的変異体又は部分、これをコードする核酸、その機能的変異体または部分に関する。上記発明の効果は、ｈｄｍ２蛋白質−発現細胞が遺伝子を誘発するＴ−細胞によって認識され、サイトカインが発現され、腫瘍又は白血病細胞の溶解及び／又はアポトーシスが誘導されるというものである。
2004535778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号２によるｈｄｍ２蛋白質−特異的Ｔ−細胞応答を媒介するネズミα／βＴ−細胞受容体のポリペプチド、またはその機能的変異体または部分またはこれをコードする核酸、その機能的変異体または部分。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドを含む融合蛋白質、またはその機能的変異体または部分、またはこれをコードする核酸、その機能的変異体または部分。
【請求項３】
ＣＤ３および／またはＣＤ８、ＣＤ１６またはその部分のζ―領域、特にヒトＣＤ３および／またはＣＤ８、ＣＤ１６またはその部分のζ―領域を含むことを特徴とする請求項２記載の融合蛋白質。
【請求項４】
柔軟なリンカー、特にアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３のリンカーを含む請求項２または３記載の融合蛋白質。
【請求項５】
特に配列番号３または配列番号４による、キメラの、少なくとも部分的にヒト化融合蛋白質であることを特徴とする請求項２記載の融合蛋白質。
【請求項６】
特に配列番号５または配列番号６による、一本鎖Ｔ−細胞受容体であることを特徴とする請求項２〜５いずれか１記載の融合蛋白質。
【請求項７】
特に配列番号７または８による二本鎖Ｔ−細胞受容体であることを特徴とする請求項２〜４いずれか１記載の融合蛋白質。
【請求項８】
蛋白質ｈｄｍ２の、またはｈｄｍ２  ８１−８８およびＨＬＡ−Ａ２の複合体のアミノ酸８１〜８８に特異的な抗体の抗原認識配列を含むＴ−細胞受容体のα―またはβ―鎖。
【請求項９】
ポリペプチドが合成により調製されたことを特徴とする請求項１〜８いずれか１記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ、特に少なくとも８つのヌクレオチドの長さを有する、好ましくは少なくとも１８のヌクレオチドを有する、特に少なくとも２４のヌクレオチドを有する二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする請求項１または２記載の核酸。
【請求項１１】
核酸の配列が少なくとも１つのイントロンおよび／または１つのポリＡ配列を含むことを特徴とする請求項１、２または１０いずれか１記載の核酸。
【請求項１２】
相補的な「アンチセンス」配列の形態である請求項１、２、１０または１１いずれか１記載の核酸。
【請求項１３】
核酸が合成により調製されたことを特徴とする請求項１、２、または１０〜１２いずれか１記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１、２または１０〜１３いずれか１記載の核酸を含むベクター、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファゲミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療で活性なベクターの形態であるベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のベクターでトランスフェクトされた、または粒子で感染もしくは形質導入された宿主細胞。
【請求項１６】
Ｔ−細胞またはＴ―細胞前駆体細胞もしくは幹細胞であることを特徴とする請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜９いずれか１記載のポリペプチドまたは融合蛋白質がその表面で発現されることを特徴とする請求項１５または１６記載の宿主細胞。
【請求項１８】
もし腫瘍が、発現されたポリペプチドまたは融合蛋白質がそれに対して特異的なｈｄｍ２蛋白質―特異的抗原を提示するならば、腫瘍細胞またはその画分が溶解されるに過ぎない条件下で、ｈｄｍ２−提示腫瘍細胞またはその画分を請求項１７記載の宿主細胞と合わせることを特徴とするｈｄｍ２蛋白質―特異的抗原の同定方法。
【請求項１９】
抗体―生産生物が、請求項１〜９いずれか１記載の、少なくとも６つのアミノ酸を有する、好ましくは少なくとも８つのアミノ酸を有する、特に少なくとも１２のアミノ酸を有する、ポリペプチドまたはその機能的同等体またはその部分で免疫化し、またはこれをコードする核酸でワクチン接種されることを特徴とする、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の診断、治療および／またはその治療のモニタリングのための、および／または薬理学的に活性な物質の同定のための請求項１〜１３いずれか１記載のポリペプチド、融合蛋白質または核酸に対して向けられた抗体、好ましくはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の生産方法。
【請求項２０】
請求項１〜９いずれか１記載のポリペプチドに対して向けられたことを特徴とする請求項１９記載のごとく調製された抗体。
【請求項２１】
蛋白質ｈｄｍ２の、またはｈｄｍ２  ８１−８８およびＨＬＡ−Ａ２の複合体のアミノ酸８１〜８８に特異的なＴ−細胞受容体のα―またはβ―鎖の抗原認識配列を含むことを特徴とする組換え抗体。
【請求項２２】
前記請求項いずれか１記載の少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの宿主細胞または少なくとも１つの抗体を適当な添加剤および賦形剤と一緒に合わせることを特徴とする、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の治療のための医薬の生産方法。
【請求項２３】
もし適当であれば、適当な添加剤および賦形剤と一緒に、前記請求項いずれか１記載の少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの宿主細胞または少なくとも１つの抗体を含むことを特徴とするｈｄｍ２蛋白質に関連する病気を治療するための医薬。
【請求項２４】
ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気を治療するための請求項２３記載の医薬の使用。
【請求項２５】
前記請求項いずれか１記載の少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチドまたは少なくとも１つの抗体を適当な添加剤および賦形剤と一緒に合わせることを特徴とする、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気に関する機能的に作用するものを発見するためのテストの作成方法。
【請求項２６】
前記請求項いずれか１記載の少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチドまたは少なくとも１つの抗体を、もし適当であれば、適当な添加剤および賦形剤と一緒に含むことを特徴とする、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気に関する機能的に作用するものを同定するためのテスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈｄｍ２蛋白質―特異的Ｔ−細胞応答を媒介するネズミα／β  Ｔ−細胞受容体、これらをコードする核酸、およびｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の治療、診断および／または予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球（ＴＣＬ）による抗原認識は効果的な免疫応答の精製および調節で非常に重要である。特徴的なＴ−細胞系マーカーはＴ−細胞抗原受容体（ＴＣＲ）である。２つのはっきりとしたタイプのＴＣＲがあり：１つは２つのジスルフィド結合したポリペプチド（αおよびβ）のヘテロダイマーであり；もう１つは構造的に同様であることが認められているが、γ―およびδ―ポリペプチドよりなる。双方の受容体は、５つのポリペプチドの組、ＣＤ３複合体と会合し、かくして、一緒にＴ−細胞受容体複合体（ＴＣＲ−ＣＤ３複合体）を形成する。α／β−ＴＣＲは最も機能的には重要である。というのは、それは全てのＴ−細胞の９５％にわたって発現され、主要な免疫応答を媒介するからである。
【０００３】
α／β  Ｔ−細胞は２つの異なる重複する集団に分類することができる：ＣＤ４マーカーを担い、主として免疫応答（ＴＨ）を助けるサブグループおよびＣＤ８マーカーを担い、本質的に細胞毒性（ＴＣ）であるサブグループ。ＣＤ８＋  Ｔ−細胞はＭＨＣクラスＩ分子と一緒に抗原を認識する。そのような抗原は、とりわけ、腫瘍―特異的または腫瘍―関連ペプチド抗原であり得る。ペプチド抗原の認識の後、注目する細胞は、標的細胞を溶解させおよび／またはこれらの標的細胞のアポトーシスを誘導し、またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）を放出するＴ−細胞によって破壊される。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩ分子の意味で、腫瘍細胞の表面に提示される腫瘍―関連ペプチド抗原（ＴＡＡ）の中で、「普遍」ＴＡＡは特に興味がある。これらのＴＡＡは、正常細胞では弱く発現され、腫瘍細胞では過剰発現される細胞蛋白質から主として誘導される。これらの蛋白質は、とりわけ、「ＭＯＵＳＥ  ＤＯＵＢＬＥ  ＭＩＮＵＴＥ  ２」プロト−抗原（ｍｄｍ２）、「ヒトｍｄｍ２」または簡潔には「ｈｄｍ２」プロト−腫瘍蛋白質（Ｒｏｔｈら，  １９９８）のヒトホモログを含み、これは、多数の固体腫瘍のみならず、血液学的過形成（悪性血液学的全身病）ＡＭＬ、ＡＬＬおよびＣＬＬ（Ｚｈｏｕら，  ２０００）において過剰発現される。
【０００５】
ｈｄｍ２蛋白質のオリゴペプチドはＭＨＣクラスＩ分子の関係で細胞−表面に提示させることができ、ＣＤ８−陽性Ｔ−細胞についての魅力的な標的構造を表す。この場合のＴ−細胞応答の程度ははっきりとした動的ウインドーにて進行する（Ｋｅｒｓｈら，  １９９８）。ペプチドＭＨＣおよびＴＣＲ−ＣＤ３の複合体は多量体化して、効果的なシグナル変換、正確な化学量論および依然として議論されているオリゴマー化の範囲をもたらす。
【０００６】
悪性腫脹の治療のための免疫治療方法の開発での要件は腫瘍蛋白質−特異的Ｔ−細胞受容体の同定である。そのようなＴ−細胞受容体を用い、ある種の条件下では、Ｔ−細胞がある種の腫瘍の緩和および根絶をもたらすことを狙って、Ｔ−細胞に、一般に、抗原特異性、特に腫瘍反応性を備えさせることができる。高―親和性ペプチド−特異的ＴＣＲの同定のための記載された方法は、「ファージ」または「酵母−表示」方法（Ｈｏｌｌｅｒら，  １９９９）またはテトラマー依存性「ＴＣＲ表示」方法（Ｋｅｓｓｅｌｓら，  ２０００）を含む。
【０００７】
Ｔｈｅｏｂａｌｄら（「一般的腫瘍抗原としての標的化ｐ５３」，  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ９２，  ｐｐ．１１９９３−１１９９７，  １９９５）から、ｐ５３の配列からのペプチドの注入後におけるｐ５３−特異的細胞毒性Ｔ−細胞の調製が知られている。これらのＴ―細胞系によって、ヒト腫瘍細胞の選択的に引き続いて溶解させることが可能であった。ｐ５３に対して向けられた溶解Ｔ−細胞の特異的Ｔ−細胞受容体の遺伝子の単離は記載されていない。ＷＯ９７／３２６０３は、一般に、腫瘍組織に向けられた特異的Ｔ−細胞受容体を発現する組換えＴリンパ球の製法を記載する。このプロセスにおいては、ＨＬＡ−トランスジェニックマウス（この場合、ＨＬＡ−Ａ２）に腫瘍―関連抗原で免疫化して、かくして、その表面に特異的Ｔ−細胞受容体を発現する細胞毒性Ｔリンパ球の生産をもたらす。腫瘍―関連抗原として、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｒａｓ，ｐ５３、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥおよびＭＵＣ−１のごとき種々の遺伝子のペプチドが記載されている。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−特異的Ｔリンパ球から、対応する非−ヒトＴ−細胞受容体のα―およびβ―鎖の少なくとも１つの可変領域を含むヌクレオチド配列が単離され、分子生物学によって修飾された種々の遺伝子（とりわけ、「ヒト化」）ＴＣＲ構築体の形態で用いられる。かくしてＷＯ９７／３２６０３は、ＣＤ３またはＣＤ８またはＣＤ１６のζ―領域とＴＣＲの可変領域との融合蛋白質、およびアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３のフレキシブルリンカーの使用を記載する。
【０００８】
Ｃｌａｙら（「ヒト末梢血液リンパ球への腫瘍抗原―反応性ＴＣＬの効果的な導入は抗−腫瘍反応性を付与する」；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９９９，  １６３：５０７−５１３）は、ＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲのα―ＴＣＲおよびβ―ＴＣＲ鎖の遺伝子の単離およびヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）におけるその発現を記載する。該ＴＣＲはＭＡＲＴ−１のアミノ酸２５〜３５に対して向けられる。さらに、ＩＲＥＳエレメントを用いる種々の転移性メラローマ細胞系およびレトロウイルスベクター系の溶解が記載されている。
【０００９】
Ｄａｒｃｙら（「エクス・ビボにて遺伝子工学により作成されたＣＴＲによる結腸癌腫の再指向性ペルフォリン−依存性溶解」，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０００，  １６４：３７０５−３７１２）は、ｓｃＦｖ抗−ＣＥＡ受容体導入ＣＴＬ、ペルフォリンおよびγ―ＩＦＮを用いる結腸癌種のための免疫治療方法を記載する。キメラ特異的受容体構築体がレトロウイスルベクターによって一次マウスＴ−リンパ球に導入される。すでに結腸癌腫細胞系で接種されたマウスにこれらの細胞が注入された。
【００１０】
Ｗｅｉｊｔｅｎｓら（「最適化された一本鎖抗体キメラ受容体遺伝子構造と組み合わせたレトロウイスルベクター系“ＳＴＩＴＣＨ”はヒトＴ−リンパ球における効果的な遺伝子導入および発現を可能とする」，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９８）  ５，  １９９５−１２０３）およびＷｉｌｌｅｍｓｅｎら（「癌―特異的一本鎖および二本鎖ＴＣＲでの一次ヒトＴリンパ球のグラフティング」，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）  ７，  １３６９−１３７７）は、活性化されたＴ−リンパ球への遺伝子の導入のためのレトロウイルスベクター系を記載する。この系は、Ｔ−細胞の膜における抗体−ベースのキメラ受容体の発現をもたらすのに用いられる。従って、これらのＴ−細胞は特異的癌細胞に対して使用することができる。レトロウイルスベクター系の活性は、腎臓細胞癌腫の特異的認識および細胞溶解によって記載される。同様に、Ｅｓｈａｒら（「免疫グロブリンの抗体―結合ドメインおよびγまたはζサブユニットならびにＴ−細胞受容体よりなるキメラ一本鎖を介する細胞毒性リンパ球の特異的活性化および標的化」、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ，  ９０，  ｐｐ．７２０−７２４，  １９９３）は、腫瘍―特異的リンパ球の調製およびＴ−細胞受容体（「一本鎖ＴＣＲ」（ｓｃＴＣＲ））の定常領域を持つ抗体（ｓｃＶＳ）の可変領域を含むキメラに基づく免疫治療におけるその使用を記載する。これらのキメラ遺伝子は、細胞溶解性Ｔ−細胞ハイブリドーマの表面で発現させることができ、それは抗原との接触の後にインターロイキン−２の分泌をもたらした。
【００１１】
ｈｄｍ２に対して特異的に向けられたＴＣＲおよびその使用は、しかしながら、前記した刊行物および他の文献によって記載も示唆もされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明は、ｈｄｍ２蛋白質に向けられたＴ−細胞受容体α―ＴＣＲおよびβ―ＴＣＲのネズミ遺伝子を利用可能とする目的に基づく。これらは、ＣＤ８−陽性Ｔ−細胞のｈｄｍ２蛋白質−発現細胞が認識されるようにし、サイトカインが分泌されるようにし、Ｔ−細胞―誘導溶解および／または腫瘍または白血病細胞のアポソーシスが生じるようにさせる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によると、この目的は、配列番号１および配列番号２による、ｈｄｍ２蛋白質−特異的Ｔ−細胞応答を媒介するネズミα／β  Ｔ−細胞受容体のポリペプチド、またはその機能的変異体または部分、またはこれをコードする核酸、その機能的変異体または部分によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子バックグラウンドにおける二重−Ａ２．１トランスジェニックマウス［ｈｕＣＤ８α／β×Ａ２．１／Ｋｂ］Ｆ１から、ｈｄｍ２蛋白質−特異的Ｔ−細胞応答を媒介するネズミα／β  Ｔ−細胞受容体の遺伝子が単離され、これは、ＨＬＡ−Ａ２．１−制限され、ｈｄｍ２蛋白質のアミノ酸８１〜８８のペプチドに向けられた特異的Ｔ−細胞応答を媒介する。このＴＣＲのポリペプチドは従来知られていなかった。遺伝子は野生型（ＷＴ）または修飾された構築体としてレトロウイルスによりヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）に挿入され、ＨＬＡ−制限された抗原認識が、５１クロム−放出テストにおいて種々の細胞系のＣＤ−８媒介細胞毒性溶解によって機能がチェックされた。本発明によるｈｄｍ２−特異的ＴＣＲの遺伝子は、例えば、完全に新規な治療アプローチが本発明に由来するように、適応のごとき診断および／または例えばｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の変調のごとき治療のための、または薬理学的に活性な物質の同定のための、従来知られた適当な標的ではない。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、本発明によるポリペプチド、その機能的変異体または部分、これをコードする核酸、その機能的変異体または部分を含む融合蛋白質に関する。
【００１６】
該融合蛋白質は、それが、ＣＤ３またはＣＤ８またはＣＤ１６またはその部分のζ−領域、特にヒトＣＤ３またはＣＤ８またはＣＤ１６またはその部分のζ―領域を含むことを特徴とすることができる。本発明による融合蛋白質は、フレキシブルリンカー（Ｗｈｉｔｌｏｗら，「減少した凝集および増強された蛋白質分解安定性を持つ一本鎖Ｆｖについての改良されたリンカー」、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇｉｎ．  ６（８）ｐｐ．９８９−９９５，  １９９３）、特にアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３のリンカーを含むものが好ましい。特に、本発明による融合蛋白質はＣＤ３−複合体のζ―鎖またはζ―鎖もしくは部分のＩＴＡＭモチーフ、特にヒトＣＤ３のζ―鎖またはその部分を含むことができる。該融合蛋白質は、さらに、それが特にヒトＣＤ８αのＣＤ８αまたはＣＤ８αのＬｃｋ−結合モチーフまたはその部分を含むことを特徴とすることができる。
【００１７】
本発明による融合蛋白質は、さらに、特に配列番号３または配列番号４による、キメラな部分的にまたは完全にヒト化されたαおよび／またはβＴＣＲ鎖であり得る。本発明のさらなる態様は、特に配列番号５または配列番号６による、一本鎖Ｔ−細胞受容体である融合蛋白質に関する。しかしながら、本発明による融合蛋白質は、それが、特に配列番号７または配列番号８による、他の機能的成分にカップリングしたα／β―ＴＣＲであることを特徴とすることもできる。
【００１８】
本発明のさらなる主題は、例えば、適当な宿主細胞における、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の診断および／または治療のための、または薬理学的に活性な物質の同定のための、本発明の融合蛋白質の製法であり、ここに、本発明による核酸が用いられる。
【００１９】
ここに、前記した本発明によるポリペプチドを含む融合蛋白質が調製され、ここに、融合蛋白質は、それ自体、本発明のポリペプチドの機能をすでに有しているか、あるいは特別の機能が融合部分の除去後にのみ活性である。これらは、特に、約１〜２００、好ましくは約１〜１５０、特に約１〜１００、特別には約１〜５０の外来性アミノ酸の割合を有する融合蛋白質を含む。そのようなペプチド配列の例は原核生物ペプチド配列であり、これは、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉのガラクトシダーゼから由来することができる。さらに、例えば、バクテリオファージＭ１３のごときウイルスペプチド配列も、かくして、当業者に知られた「ファージ表示」プロセスのための融合蛋白質を生産するのに用いることもできる。
【００２０】
本発明による蛋白質の精製では、さらなるポリペプチド（「タグ」）を付加することができる。本発明による蛋白質タグは、例えば、マトリックスへの高親和性吸収、認識できる程度に複合体を溶出させることのない適当な緩衝液を用いた厳重な洗浄、および引き続いての制御された様式での吸収された複合体の溶出を可能とする。当業者に知られた蛋白質タグの例は（Ｈｉｓ）６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、ヘマグルチニンタグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、親和性キチン−結合タグまたはマルトース−結合蛋白質（ＭＢＰ）タグを持つインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）である。これらの蛋白質タグはＮ−、Ｃ−末端におよび／または内部に位置することができる。
【００２１】
細胞から単離された天然ポリペプチド以外に、本発明によるすべてのポリペプチドまたはその部分は、例えば、合成によって、またはイン・ビトロ翻訳によって、無細胞条件下で調製することができる。かくして、全ポリペプチドまたはそのペプチドの、古典的な合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術）の助けを借りて合成することができる。本発明によるポリペプチドの部分は、特に、その適当な遺伝子発現バンクをサーチして、かくして、本発明によるポリペプチドのさらなる変異体を得ることができるという助けを借りて、抗血清を得るのに適当である。
【００２２】
また、本発明は、特に、ＨＬＡ−Ａ２．１の関係で提示された、ｈｄｍ２−８１−８８ペプチドに対する特異性を有する抗体の誘導体であるポリペプチドに関する。
【００２３】
本発明は、さらに、配列番号１〜配列番号８のポリペプチド配列によるレトロ−逆ペプチドまたは偽ペプチド、またはその機能的変異体または部分を含む。−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド結合の代わりに、これらのペプチドは−ＮＨ−ＣＯ−結合を有する。
【００２４】
本発明の目的は、さらに、本発明の核酸によって達成され、これはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）またはｐ−ＮＡ（ピラノシル核酸）、好ましくはＤＮＡであり、特に、少なくとも８ヌクレオチドの長さを有する、好ましくはすくなくとも１８ヌクレオチドを有する、特に少なくとも２４ヌクレオチドを有する二本鎖ＤＮＡである。核酸は、該核酸の配列が少なくとも１つのイントロンおよび／または１つのポリＡ配列を有することを特徴とすることができる。また、それはそのアンチセンス配列の形態で存在することもできる。
【００２５】
注目する遺伝子の発現では、一般に、二本鎖ＤＮＡが好ましく、ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域が特に好ましい。この領域は、ＡＴＧに関して同一のリーディングフレームにある次の停止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、例えばＴＡＡ）に至るまで、コザックコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，  １９８７，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：８１２５−４８）中の第１の開始コドン（ＡＴＧ）で始まる。本発明による核酸配列のさらなる使用は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＺｈｅｎｇおよびＫｅｍｅｎｙ，  １９９５，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １００：３８０−２）および／またはリボザイム（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら，  １９９８，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ５４：１１７５−２０２；  Ｖａｉｓｈら，  １９９８，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：５２３７−４２；  Ｐｅｒｓｉｄｉｓ，  １９９７，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：９２１−２）の構築である。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、本発明による核酸の安定性を低下させおよび／または本発明による核酸の翻訳を阻害させることができる。かくして、例えば、イン・ビボおよびイン・ビトロ双方において細胞中の対応する遺伝子の発現を減少させることができる。従って、オリゴヌクレオチドは治療剤として適切であり得る。この戦略は、例えば、特に、もしアンチセンスオリゴヌクレオチドがリポソームと複合体化すれば、皮膚、表皮および皮細胞で適当である（Ｓｍｙｔｈら，  １９９７，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １０８：５２３−６；  Ｗｈｉｔｅら，  １９９９，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：６９９−７０５）。プローブとして、または「アンチセンス」オリゴヌクレオチドとして用いるには、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましい。
【００２６】
細胞から単離された天然核酸以外に、本発明によるすべての核酸またはその部分は合成により調製することもできる。さらに、本発明を実施するには、合成により調製された核酸を用いることができる。かくして、本発明による核酸は、例えば、ホスホトリエステル方法（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，  Ｅ．  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，  Ａ．（１９９０）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ９０，  ５４３−５８４参照）に従い、遺伝子暗号を利用し、配列番号１〜配列番号８に記載された蛋白質配列の助けを借りて化学的に合成することができる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドは、一般に、細胞中で生じるエンド−またはエキソヌクレアーゼによって、特にＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅによって迅速に分解される。従って、高濃度の核酸が長期間にわたって細胞で維持されるように、分解に対して安定化するために、核酸を修飾することが有利である（ＷＯ９５／１１９１０；  Ｍａｃａｄａｍら，  １９９８，  ＷＯ９８／３７２４０；  Ｒｅｅｓｅら，  １９９７，  ＷＯ９７／２９１１６）。典型的には、そのような安定化は、１以上のインターヌクレオチドリン基の導入によって、または１以上の非リンインターヌクレオチドの導入によって得ることができる。
【００２８】
適当な修飾されたインターヌクレオチドはＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎｎにまとめられている（１９９０  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ９０，  ５４４）（ＷＯ９５／１１９１０；  Ｍａｃａｄａｍら，  １９９８，  ＷＯ９８／３７２４０；  Ｒｅｅｓｅら，  １９９７，  ＷＯ９７／２９１１６）。本発明による使用の１つで用いることのできる核酸中の修飾されたインターヌクレオチドリン酸ラジカルおよび／または非リンブリッジは、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステルを含み、他方、非リンインターヌクレオチドアナログは、例えば、シロキサンブリッジ、カルボネートブリッジ、カルボキシメチルエステル、アセトアミデートブリッジおよび／またはチオエーテルブリッジを含む。また、この修飾は、本発明による使用の１つで用いることができる医薬組成物の安定性を改良することを意図する。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、本発明による核酸を含む、好ましくはプラスミドの形態のベクター、シャトルベクター、ファゲミド、コスミド、発現べクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（Ｍｉｌｌｅｒら，  「遺伝子導入および発現のための改良されたレトロウイルスベクター」，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｖｏｌ．７，  Ｎｏ．９，  Ｐ９８０，  １９８９）および／または遺伝子治療活性を有するベクターに関する。
【００３０】
かくして、本発明による核酸は、ベクター、好ましくは発現ベクターまたは遺伝子治療で活性なベクターに含まれることができる。好ましくは、遺伝子治療で活性なベクターは、本発明による核酸に機能的に結合したＴ−細胞―特異的調節配列を含む。発現ベクターは原核生物または真核生物発現ベクターであり得る。原核生物発現ベクターの例は、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける発現では、例えば、ベクターｐＧＥＭまたはｐＵＣ誘導体であり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現用の真核生物発現ベクターでは、例えば、ベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬｌ（Ｍｕｍｂｅｒｇら，  （１９９４）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  ５７６７−５７６８）であり、昆虫細胞における発現では、例えば、ＥＰ−Ｂ１−０  １２７  ８３９またはＥＰ−Ｂ１−０  ５４９  ７２１に開示されたごときバキュロウイルスベクターであり、および哺乳動物細胞での発現では、例えば、ベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶまたはＳＶ４０ベクターであり、それは、全て一般に入手することができる。
【００３１】
一般に、発現ベクターは、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける発現用のｔｒｐプロモーター（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０  １５４  １３３参照）、酵母における発現用のＭｅｔ２５、ＧＡＬ１またはＡＤＨ２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌら（１９８３），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８，  ２６７４−２６８２；  Ｍｕｍｂｅｒｇ，  前掲）、昆虫細胞における発現用のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター（例えば、１３．  ＥＰ−Ｂ１−０  １２７  ８３９参照）のようにそれぞれの宿主細胞に適当なプロモーターも含む。哺乳動物細胞における発現では、適当なプロモーターは、例えば、真核生物細胞において構成的、調節可能な、組織―特異的、細胞周期―特異的または代謝的に特異的な発現を可能とするものである。本発明による調節可能なエレメントはプロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サイレンサーおよび／またはリプレッサー配列である。真核生物における構成的発現を可能とする適当な調節可能なエレメントの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターまたはウイルスプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ−ＬＴＲハイブリッド、例えば、ＭＭＴＶ（マウス腫乳癌ウイルス；  Ｌｅｅら（１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２１４，  ２２８−２３２）のＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーター、およびさらには例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶに由来するウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列である。真核生物において調節可能な発現を可能とする調節可能エレメントの例は適当なリプレッサーと組み合わせたテトラサイクリンオペレーターである（Ｇｏｓｓｅｎ  Ｍ．ら（１９９４）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５，５１６−２０）。
【００３２】
真核生物においてＴ−細胞―特異的発現を可能とする調節可能エレメントの例は、これらの細胞型のみで発現される蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーのプロモーターまたはアクチベーター配列である。
【００３３】
真核生物において細胞周期―特異的発現を可能とする調節可能エレメントの例は以下の遺伝子：ｃｄｃ２５、サイクリンＡ、サイクリンＥ、ｃｄｃ２、Ｅ２Ｆ、Ｂ−ｍｙｂまたはＤＨＦＲのプロモーターである（Ｚｗｉｃｋｅｒ  Ｊ．  およびＭuｌｌｅｒ  Ｒ．（１９９７）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １３，３−６）。真核生物において代謝的に特異的発現を可能とする調節可能エレメントの例は、低酸素によって、グルコース欠乏によって、ホスフェートの濃度によって、または熱ショックによって調節されるプロモーターである。
【００３４】
本発明によるベクターは、優先的にＴ−細胞である宿主細胞のトランスフェクションで用いることができる。特に好ましいのは、その表面で本発明によるポリペプチドまたは融合蛋白質を発現することを特徴とする宿主細胞である。
【００３５】
本発明による核酸の導入、かくして、トランスフェクション、形質導入、形質転換または感染による真核生物または原核生物細胞におけるポリペプチドの発現を可能とするには、核酸はプラスミドとして、ウイルスまたは非ウイルスベクターまたは粒子の一部として存在させることができる。この場合に適当なウイルスベクターまたは粒子は、特に、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルスおよびヘルペスウイルスである。この場合における適当な非ウイルスキャリアーは、特に、ビロソーム、リポソーム、カチオン性脂質、またはポリ−リシン−複合ＤＮＡである。
【００３６】
遺伝子治療で活性なベクターの例はウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎら，  １９９７，  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．  ３：４６６−７６；  Ｓｐｒｉｎｇｅｒら，  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  ２：５４９−５８；  Ｗｅｉｊｔｅｎｓら「最適化された一本鎖抗体キメラ受容体遺伝子構造と組み合わせたレトロウイルスベクター系  “ＳＴＩＴＣＨ”は、ヒトＴ−リンパ球において効果的な遺伝子導入および発現を可能とする」，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９８）５，  １９９５−１２０３）。
【００３７】
イン・ビボにて本発明によるポリペプチドを発現させるための好ましいメカニズムは、特に、レトロウイルス粒子の助けを借りるウイルス遺伝子導入である。これらは、好ましくは、形質導入によって本発明によるポリペプチドをコードする遺伝子またはヌクレオチド配列と共にエクス・ビボでの患者の適当な標的細胞、好ましくはＴ−リンパ球を供するのに利用される。標的細胞は、後に、養子細胞導入の意味において、再度、患者に注入して、デ・ノボで挿入された特異性を用いて腫瘍殺傷および／または免疫変調エフェクター機能を受け継ぐことができる。最近、このようにして、養子免疫系の種々のエフェクター細胞への分化に必須である、子供で生じるγ―鎖遺伝子の非機能的突然変異変体の同様な無傷トランスジーンが血液学的前駆体細胞にレトロウイルスにより供された新生児において免疫無能力によって特徴付けられるＳＣＩＤ−Ｘ１病の治療で、非常に良好な遺伝子治療結果が達成された（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら，  ２０００）。
【００３８】
さらに、一方では、感染性粒子の優先的定位的注入によって、他方では、ウイルス−生産細胞の直接的投与によって、イン・ビボ遺伝子導入を行う可能性がある（Ｏｌｄｆｉｅｌｄら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎ．  Ｔｈｅｒ．，  １９９３，  ４：３９−６９）。
【００３９】
現在の技術水準によると、遺伝子の導入でしばしば使用されるウイルスベクターは、主として、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−関連ウイルスベクターである。これらは天然ウイルスに由来する環状ヌクレオチド配列であり、ここに、少なくともウイルス構造蛋白質―コーディング遺伝子は、導入すべき構築体によって置き換えられる。
【００４０】
レトロウイルスベクター系は、宿主ゲノムへの安定であるが指令されない組み込みによるトランズジーンの長く続く発現のための要件を生じる。より若い世代のベクターは無関係で潜在的に免疫原性の蛋白質を保有せず、加えて、ベクターに対する受容体の先在する免疫性はない。レトロウイルスは、宿主の細胞膜およびウイルス蛋白質の一部よりなる脂質コートにパッケージされるＲＮＡゲノムを含有する。ウイルス遺伝子の発現では、ＲＮＡゲノムは逆転写され、酵素インテグラーゼで標的細胞ＤＮＡに取り込まれる。これは後に感染細胞によって転写され翻訳され、それにより、組み合わされてレトロウイスルを与えるウイルス構成がもたらされる。従って、ＲＮＡは、専ら新しく形成されたウイルスに挿入される。レトロウイルスのゲノムは３つの必須遺伝子：ウイルス構造蛋白質、「グループ−特異的抗原」をコードするｇａｇ、逆転写酵素およびインテグラーゼのごとき酵素についてのｐｏｌ、および宿主特異的受容体の結合を担うコート蛋白質（「エンベロープ」）についてのｅｎｖを保有する。複製−不能ウイルスの生産は、加えて、ｇａｇ−ｐｏｌ−コーディング遺伝子を備え、これらを「トランスで」発現し、かくして、複製−不能（すなわち、ｇａｇ／ｐｏｌ−欠失）トランスジェニックウイルス粒子の形成を補う「パッケージング細胞系」におけるトランスフェクションの後に起こる。その代替法は必須ウイルス遺伝子の共トランスフェクションであり、該ベクターのみがパッケージングシグナルを運ぶトランスジーンを含む。
【００４１】
これらの遺伝子の分離は、一方において、種々の株から得られるｅｎｖリーディングフレームとｇａｌ／ｐｏｌ−リーディングフレームの任意の組合せを可能とし、それにより、修飾された宿主トロピズムを有する偽型がもたらされ、他方、パッケージング細胞内の複製−能力のあるウイルスの形成がそれにより劇的に低下し得る。「スイッチ」または「ブレット」ベクター系で用いられる「テナガザル白血病ウイルス」（ＧＡＬＶ）に由来するコート蛋白質はヒト細胞を形質導入することができ、両種性宿主範囲でパッケージング細胞系ＰＧ１３内において確立されている（Ｍｉｌｌｅｒら，  １９９１）。加えて、相同組換えの防止および、かくして、複製−能力のある粒子の生産には、非必須ウイルス配列の選択的欠失によって、安全性が増加する。
【００４２】
新規な非ウイルスベクターは、例えば、リポソームトランスフェクションによって宿主細胞に導入され、最初に、哺乳動物細胞においてヒトトランスジーンの発現で成功して使用された、自律的自己組込ＤＮＡ配列、トランスポゾンよりなる（Ｙａｎｔら，  ２０００）。
【００４３】
また、遺伝子治療で活性なベクターは、本発明による核酸をリポソームと複合体化させることによって得ることができる。というのは、それにより特に皮膚細胞の非常に高いトランスフェクション効率が達成できるからである（ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＡｋｈｕｒｓｔ，  １９９５，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４：２２７９−８５）。核酸の細胞への導入を増大させる賦形剤は、例えば、核酸の細胞核への輸送を可能とするＤＮＡまたは合成ペプチド−ＤＮＡ分子に結合した蛋白質またはペプチドであり得る（Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９９９）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，  ２８２；Ｂｒａｎｄeｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７，  ７８４）。賦形剤は、細胞の細胞質への核酸の放出を可能とする分子（Ｐｌａｎｃｋら（１９９４）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９，  １２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒら（１９９７）  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ８，  ２１３）または、例えば、リポソーム（ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎｎ（１９９０）前掲）を含む。遺伝子治療ベクターのもう１つの特に適当な形態は、本発明による核酸を金粒子に適用し、「遺伝子銃」の助けを借りて、これらを組織、好ましくは皮膚または細胞に打ち込むことによって得ることができる（Ｗａｎｇら，  １９９９，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １１２：７７５−８１）。
【００４４】
本発明による核酸の遺伝子治療適用では、もし、ポリペプチドをコードする核酸の１部が、好ましくはポリペプチドのプロモーターおよび開始コドンの間のイントロン配列、および／または特に遺伝子の３‘−末端にポリＡ−配列、特に天然に生じるポリＡ−配列またはＳＶ４０ウイルスポリＡ−配列を含めた１以上の非コーディング配列を含めばやはり有利である。というのは、この手段により、ｍＲＮＡの安定化が達成できるからである（Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｒ．  Ｊ．（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７４，  ９−１４およびＰａｌｍｉｔｅｒ，  Ｒ．  Ｄ．ら（１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８，  ４７８−４８２）。
【００４５】
本発明のさらなる主題は宿主細胞、特にＴ−細胞であり、これは、本発明によるベクターまたは本発明によるもう１つの遺伝子構築体を用いて形質転換される。宿主細胞は原核生物または真核生物細胞であり得、原核生物宿主細胞の例はＥ．ｃｏｌｉであり、真核生物細胞の例はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは昆虫細胞である。
【００４６】
特に好ましい形質転換された宿主細胞はトランスジェニックＴ−前駆体細胞または幹細胞であり、これは、それが、本発明による遺伝子構築体または本発明による発現カセットを含むことを特徴とする。宿主細胞および／または幹細胞の形質転換または形質導入方法は当業者に良く知られており、例えば、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを含む。特に好ましい形質転換された宿主細胞は患者自身のＴ−細胞であり、これは、除去後に、本発明による遺伝子構築体を用いてトランスフェクトされる。本発明による宿主細胞は、特に、患者から１以上の細胞、好ましくはＴ−細胞、特にＣＤ８＋−Ｔ−細胞を取り出すことによって得ることができ、これは、次いで、本発明による１以上の遺伝子構築体を用いてエクス・ビボにてトランスフェクトまたは形質導入して、かくして、本発明による宿主細胞を得る。次いで、引き続いて、エクス・ビボで生じた特異的Ｔ−細胞を再度患者に移植することができる。かくして、該プロセスは、ｓｃＦｖ抗−ＣＥＡ受容体、ペルフォリンおよびγ−ＩＦＮによって形質導入されたＣＴＬを用いるＤａｒｃｙらで記載されたプロセスと同様である（「エクス・ビボにて遺伝子工学により作成されたＣＴＬによる結腸癌腫の再度向けられたペルフォリン−依存性溶解」  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０００，  １６４：３７０５−３７１２）。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、もし腫瘍が、発現されたポリペプチドまた融合蛋白質がそれに対して特異的なｈｄｍ２蛋白質−特異的抗原を提示すれば、腫瘍細胞またはその画分のみが溶解される条件下で、ｈｄｍ２−提示腫瘍細胞またはその画分を本発明による宿主細胞と合わせること特徴とするｈｄｍ２蛋白質−特異的抗原の同定方法に関する。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の診断およびモニタリングのための、または薬理学的に活性な物質の同定のための、抗体、好ましくはポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製法に関し、ここに、抗体−生産生物が、少なくとも６つのアミノ酸を有する、好ましくは少なくとも８つのアミノ酸を有する、特に少なくとも１２のアミノ酸を有する本発明によるポリペプチドまたはその機能的同等体またその部分で免疫化するか、あるいは本発明によるポリペプチドをコードする核酸でワクチン接種する。
【００４９】
該製法は、もし適当であれば、例えば、不完全フロイントアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で、哺乳動物、例えばウサギを本発明によるポリペプチドまたはその部分で免疫化することによって、一般に、当業者に知られた方法に従って行われる（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ，  Ｂ．Ａ．ら（１９８１）  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １３４４−１３４９参照）。次いで、免疫学的反応により動物に形成されたポリクローナル抗体は、一般に公知の方法に従って血液から容易に単離することができ、例えば、カラムクロマトグラフィーによって精製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，  ３４９，２９３−２９９）の公知の方法に従って調製することができる。
【００５０】
本発明のさらなる主題は、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の診断および／または治療のための、または本発明によるポリペプチドに向けられた、かつ本発明によるポリペプチドと特異的に反応する薬理学的に活性な物質の同定のための抗体であり、ここに、前記ポリペプチドの部分はそれ自体免疫原性であるか、あるいは例えば、ウシ血清アルブミンのごとき適当な担体に結合させることによって、その免疫原性を増加させることができる。この抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり、モノクローナル抗体が好ましい。本発明による、抗体の用語は、遺伝子工学によって調製された、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、一価またはオリゴ化抗体、バイ−またはオリゴ特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２断片のごとき所望により修飾された抗体またはその抗原−結合部分を意味する（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０  ３６８  ６８４，  ＵＳ  ４，８１６，５６７，  ＵＳ  ４，８１６，３９７，  ＷＯ８８／０１６４９，  ＷＯ９３／０６２１３，  ＷＯ９８／２４８８４参照）。本発明による抗体はｈｄｍ２蛋白質に関連した病気の診断および／または治療のために、または薬理学的に活性な物質の同定のために用いることができる。
【００５１】
本発明は、さらに、前記請求項いずれか１記載の少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの宿主細胞または少なくとも１つの抗体を適当な添加剤および賦形剤と合わせることを特徴とするｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の治療用医薬の生産方法に関する。
【００５２】
本発明は、さらに、もし適当であれば、適当な添加剤および賦形剤と共に本発明による少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチドまたは少なくとも１つの抗体を含有する、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の治療のためのこの製法によって調製された医薬に関する。本発明は、さらに、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の治療のためのこの医薬の使用に関する。
【００５３】
ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の治療は、例えば、本発明による医薬を含有する注入または注射によって、慣用的な方法で行うことができる。本発明による医薬の投与は、さらに、所望により、リポソーム複合体または金粒子複合体の形態で行うことができる。しかしながら、本発明による医薬による治療は、経口投与形態、例えば、錠剤またはカプセル剤を介して、例えば、鼻腔または口腔の粘膜を介して、または皮膚下に移植されたディスポジタリーの形態で行うこともできる。ＴＴＳは、例えば、ＥＰ  ０  ９４４  ３９８  Ａ１、ＥＰ  ０  ９１６  ３３６  Ａ１、ＥＰ  ０  ８８９  ７２３  Ａ１またはＥＰ  ０  ８５２  ４９３  Ａ１から公知である。本発明によるポリペプチドおよびその誘導体は、病気を持つ患者の能動的および／または受動的免役化のために使用することもでき、これは、ｈｄｍ２と結合させて、ｈｄｍ−特異的ＣＴＬの誘導、生産および増加を達成し、具体的には、注目する患者の腫瘍および白血病細胞を破壊するのに使用することもできる。そのような病気は、例えば、多重ミエローマ（またはプラストサイトーマ）、組織球腫リンパ腫およびＣＭＬ骨髄芽球クライシスの形態である、固体腫瘍症状、リンパ造血新形成、悪性血液学的病気を含む。
【００５４】
特に好ましい治療のタイプにおいては、１以上の細胞、好ましくはＴ−細胞、特にＣＤ８＋−Ｔ−細胞を患者から採取し、ついで、これをエクス・ビボにて本発明による１以上の遺伝子構築体で形質導入し、またはトランスフェクトする。エクス・ビボで生じた特異的Ｔ−細胞を、ついで、患者に再移植することができる。かくして、該方法は、ｓｃＦｖ抗−ＣＥＡ受容体によって形質導入されたＣＴＬ、ペルフォリンおよびγ−ＩＦＮを用いる結腸癌種の場合におけるＤａｒｃｙらに記載された免疫治療方法と同様である（「エクス・ビボにて遺伝子工学により作成されたＣＴＬによる結腸癌種の再指向化ポルフォリン−依存性溶解」  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０００，  １６４：３７０５−３７１２）。
【００５５】
本発明は、さらに、本発明による少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリぺプチドまたは少なくとも１つの抗体を適当な添加剤および賦形剤と合わせることを特徴とする、ｈｄｍ２蛋白質−関連病に関連する機能的に作用するものの発見用のテストの作成方法に関する。
【００５６】
本発明の意味における用語「機能的に作用するもの」は、適当な条件下で、適当であれば適当な添加剤および賦形剤と一緒に本発明による核酸、ポリペプチドまたは抗体と相互作用することができる全ての分子、化合物および／または組成物および物質混合物を意味すると理解されるべきである。可能な作用するものは単純な有機または無機分子または化合物であるが、ペプチド、蛋白質またはその複合体を含むこともできる。その相互作用では、機能的に作用するものはイン・ビボ、又はイン・ビトロにて核酸、ポリペプチドまたは抗体の機能に影響することができるか、あるいは、本発明による核酸、ポリペプチドまたは抗体に結合できるに過ぎず、あるいは共有結合または非共有結合にてそれと他の相互作用をすることもできる。
【００５７】
本発明は、さらに、もし適当であれば適当な添加剤および賦形剤と一緒に本発明による少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのポリペプチドまたは少なくとも１つの抗体を含有するｈｄｍ２蛋白質に関連する病気と結合した機能的に作用するものの同定のための本発明に従って作成されたテストを含む。かくして、しばしば、イン・ビトロでの細胞の病理学的挙動を模倣することができ、細胞の正常な挙動を回復させ、治療能力を保有する物質を求めることができる。さらに、このテストシステムは、本発明によるポリペプチドおよび機能的に作用するものの間の相互作用を阻害する物質のスクリーニングで利用することができる。
【００５８】
また、本発明の主題は、本発明による核酸または本発明によるポリペプチドおよび、もし適当であれば適当な添加剤または賦形剤を含有する、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の同定および治療用の医薬、および本発明による核酸または本発明によるポリペプチドを医薬上許容される担体とで処方する、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の治療のためのそのような医薬の生産方法である。
【００５９】
可能な治療剤および／または予防剤は、活性化合物として、（ａ）本発明によるＴＣＲ−受容体ポリペプチドおよび／またはその誘導体および／または（ｂ）本発明による核酸および／または（ｃ）ｈｄｍ２に対して特異的に向けられたＴＣＲを含むイン・ビトロまたはエクス・ビボで生産されたＴ−リンパ球を含有する、特にワクチン、組換え粒子または注射または注入溶液である。
【００６０】
ヒトにおける遺伝子治療適用では、裸の形態の、前記した遺伝子治療で活性なベクターのうちの一つの形態の、またはリポソームまたは金粒子と複合体化した形態の、本発明による核酸を含有する医薬および／または組換え粒子が特に適当である。医薬担体は、例えば、好ましくは約６．０〜８．０、好ましくは約６．８〜約７．８、特に約７．４のｐＨおよび／または約２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモル／リットルの浸透圧を有する生理学的緩衝溶液である。加えて、医薬担体は、例えば、ヌクレアーゼ阻害剤のごとき適当な安定化剤、好ましくは当業者に知られたＥＤＴＡおよび／または他の賦形剤のごとき複合体化剤を含有することができる。
【００６１】
本発明のさらなる主題は、本発明による核酸が適当な手法で発現されることを特徴とする、ｈｄｍ２蛋白質に関連した病気の診断および／または治療のための、又は適当な宿主細胞における薬理学的に活性な物質の同定のための、ポリペプチドの製造方法に関する。
【００６２】
該ポリペプチドは、かくして、例えば、当業者に一般に知られた方法に従い、すでに前記した適当な発現系における本発明による核酸の発現によって調製される。適当な宿主細胞は、例えば、全て一般に入手可能である、Ｅ．  ｃｏｌｉ株ＤＨＳ、ＨＢ１０１またはＢＬ２１、酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからの昆虫細胞系、または動物細胞ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、２９３、ＨａＣａＴおよびＨｅＬａである。
【００６３】
治療モニタリングのための本発明による診断剤は、前記にてかなり詳細に記載した本発明によるポリペプチドまたはその免疫学的に活性な部分を含む。例えば、ニトロセルロースまたはナイロンの固相に好ましくは結合したポリペプチドまたはその部分を、調べるべき体液とインビトロにて接触させて、例えば、血液と自己免疫抗体と反応させることができる。ついで、例えば、標識された抗−ヒト−ＩｇＧまたは抗−ヒト−ＩｇＭ抗体の助けを借りて、抗体−ペプチド複合体を検出することができる。該標識は、例えば、発色反応を触媒するペルオキシダーゼのごとき酵素である。存在する自己免疫抗体の存在および量は、かくして、発色反応によって容易かつ迅速に検出することができる。
【００６４】
治療モニタリングのためのもう１つの診断剤は、本発明による抗体それ自体を含む。これらの抗体の助けを借りて、例えば、注目するポリペプチドが増大した量にて存在するか否かに関して組織試料を容易かつ迅速に調べて、かくして、ｈｄｍ２蛋白質に関連する病気の同定することができる。この場合、本発明による抗体は、例えば、すでに前記した酵素で標識する。それにより、特異的抗体−ペプチド複合体は、酵素発色反応によって容易かつ同様に迅速に検出することができる。
【００６５】
本発明によるさらなる診断剤はプローブ、好ましくはＤＮＡプローブおよび／またはプライマーを含む。これは、例えば、適当なプローブの助けを借りて、適当なジーンバンクから単離することによって、本発明による核酸を得るさらなる可能性を開く（例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ，  ＮＹ，  第８章  頁８．１〜８．８１，  第９章頁９．４７〜９．５８および第１０章頁１０．１〜１０．６７参照）。
【００６６】
適当なプローブは、その配列が配列表の配列番号１〜配列番号８のポリペプチドに由来することができる、約１００〜１０００ヌクレオチドの長さを有する、好ましくは約２００〜５００ヌクレオチドの長さを有する、特に約３００〜４００ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡまたはＲＮＡ断片である。
【００６７】
あるいは、誘導した核酸配列の助けを借りて、ポリメラーゼ鎖反応のプライマーとして適当なオリゴヌクレオチドを合成することができる。適当なプライマーは、例えば、その配列が配列表の配列番号１〜配列番号８のポリペプチドに由来することができる、約１０〜１００ヌクレオチドの長さを有する、好ましくは約１５〜５０ヌクレオチドの長さを有する、特に２０〜３０ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡ断片である。
【００６８】
用語「コーディング核酸」とは、本発明による単離可能な生物活性ポリペプチドまたは前駆体をコードするＤＮＡ配列に関する。該ポリペプチドは、特異的、例えば酵素活性が保持される限り、コーディング配列の全長またはいずれかの部分によってコードされ得る。
【００６９】
例えば、遺伝子暗号の縮重のため、本発明による核酸の配列において小さな変化が存在し得るか、あるいは非翻訳配列が、その活性が有意に変化されることなく、核酸の５‘および／または３’末端に付加することができることが知られている。従って、本発明は本発明による核酸の「機能的変異体」も含む。
【００７０】
用語「機能的変異体」とは、ストリンジェントな条件下で、誘導された参照配列またはその部分、特に超可変Ｖ（Ｄ）ＪＣ領域とハイブリダイズし、本発明による対応するポリペプチドと同様または同一の活性を有する、ＤＮＡ配列に相補的な全てのＤＮＡ配列をいう。
【００７１】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、２．５×ＳＳＣ緩衝液中６０℃においてハイブリダイゼーションが起こり、続いて、より低い緩衝液濃度で３７℃にて多数の洗浄工程が行われ、安定なままである条件を意味すると理解されるべきである。
【００７２】
本発明の意味内の用語「機能的変異体」は、本発明によるポリペプチドに機能的に関連する、すなわち、ポリペプチドの構造的特徴を有するポリペプチドを意味すると理解される。機能的変異体の例は、マウス以外の生物、すなわち、ヒトから、または好ましくは、例えば、サル、ブタ、およびラットのごとき非ヒト哺乳動物から由来する対応するポリペプチドである。機能的変異体の他の例は、種々の個体において、または生物の種々の器官において、異なる対立遺伝子によってコードされるポリペプチドである。本発明は、特に、ｈｄｍ２ポリペプチドの同一のエピトープを認識し、特異的Ｔ細胞応答を誘導する機能的ＴＣＲ変異体も網羅する。
【００７３】
さらなる意味において、これらは、配列番号１〜配列番号８のうちの１つおよび／またはペプチド配列の助けを借りて誘導されたＤＮＡ配列によるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して配列相同性、特に約７０％の、好ましくは約８０％の、特に約９０％、特別には約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを意味すると理解される。これらの中には、約１〜６０、好ましくは約１〜３０、特に約１〜１５、特別には約１〜５のアミノ酸の範囲のポリペプチドの付加、逆位、置換、欠失、挿入または化学的／物理的修飾および／または置き換えまたは部分も含まれる。例えば、最初のアミノ酸は、有意な修飾がされるペプチドの機能を失うことなく、メチオニンを欠くことができる。
【００７４】
さて、添付の実施例および図面の助けを借りて本発明をさらに説明するが、これに限定されるものではない。図面は以下のものを示す：
配列番号１：野生型遺伝子マウスαＴＣＲのポリペプチド（ｍｕｖα−ｍｕｃα）、
配列番号２：野生型遺伝子マウスβＴＣＲのポリペプチド（ｍｕｖβ−ｍｕｃβ）、
配列番号３：キメラな部分的にヒト化されたＴＣＲ遺伝子のポリペプチド（ｍｕｖα−ｈｕｃα）、
配列番号４：キメラな部分的にヒト化されたＴＣＲ遺伝子のポリペプチド（ｍｕｖβ−ｈｕｃβ）
配列番号５：一本鎖ＴＣＲｍｕｖα−Ｌｉ−ｍｕｖβ−ｍｕｃβのポリペプチド、
配列番号６：一本鎖ＴＣＲｍｕｖβ−Ｌｉ−ｍｕｖα−ｍｕｃαのポリペプチド、
配列番号７：ヒトＣＤ３ζ鎖ｍｕｖα−ｈｕｃα−ｈｕＣＤ３ζと融合した二本鎖ＣＲのポリペプチド、
配列番号８：ヒトＣＤ３ζ鎖ｍｕｖβ−ｈｕｃβ−ｈｕＣＤ３ζと融合した二本鎖ＴＣＲのポリペプチド、
配列番号９：プライマーｆｏｒ＿ｂＴＣＲ＿ｖ４、
配列番号１０：プライマーｒｅｖ＿ｂＴＣＲ＿ｃ４、
配列番号１１：プライマーｆｏｒ＿Ｅｃｏ＿ｂＴＣＲ＿ｖ５、
配列番号１２：プライマーｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ｂＴＣＲ＿ｃ６、
配列番号１３：プライマーｆｏｒ＿Ｅｃｏ＿ｂＴＣＲ＿ｃ２、
配列番号１４：プライマーｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ｂＴＣＲ＿ｃ２、
配列番号１５：プライマーｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ａＴＣＲ＿ｃ１、
配列番号１６：プライマーｒｅｖ＿ａＴＣＲ＿ｃ５、
配列番号１７：プライマーｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ａＴＣＲ＿ｃ４、
配列番号１８：プライマーｆｏｒ＿Ｅｃｏ＿ａＴＣＲ＿ｃ６、
配列番号１９：プライマーｆｏｒ＿ＮｃｏＩ＿ａＴＣＲ＿４、
配列番号２０：プライマーｆｏｒ＿ＮｃｏＩ＿ａＴＣＲ＿５ｂ；  ５‘−末端でホスホリル化、
配列番号２１：プライマーｆｏｒ＿ＮｃｏＩ＿ｂＴＣＲ＿４、
配列番号２２：プライマーｆｏｒ＿ＮｃｏＩ＿ｂＴＣＲ＿５ｂ；５‘−末端でホスホリル化、
配列番号２３：プライマーｒｅｖ＿ａＴＣＲ＿ＢａｍＨＩ＿１、
配列番号２４：プライマーｒｅｖ＿ｂＴＣＲ＿ＢａｍＨＩ＿１、
配列番号２５：プライマーｆｏｒ＿ｈｕｃａＴＣＲ＿２、
配列番号２６：プライマーｒｅｖ＿ｈｕｃａＴＣＲ＿２、
配列番号２７：プライマーｆｏｒ＿ｈｕｃａＴＣＲ＿ＡｌｗＮＩ＿３、
配列番号２８：プライマーｒｅｖ＿ｈｕｃａＴＣＲ＿ＢａｍＨＩ＿１、
配列番号２９：プライマーｆｏｒ＿ｈｕｃｂＴＣＲ＿３、
配列番号３０：プライマーｒｅｖ＿ｈｕｃｂＴＣＲ＿２、
配列番号３１：プライマーｆｏｒ＿ｈｕｃｂＴＣＲ＿４；５‘−末端においてホスホリル化、
配列番号３２：プライマーｒｅｖ＿ｈｕｃｂＴＣＲ＿ＢａｍＨＩ＿１、
配列番号３３：プライマーＴ７＿ｆｏｒ、
配列番号３４：プライマーＴ７＿ｒｅｖ、
配列番号３５：プライマーｒｅｖ＿ｈＺｅｔａ＿ＢａｍＨＩ＿４、
配列番号３６：プライマーｒｅｖ＿ｈｕｃａ−ｈｕ＿ｔｍ＿Ｚｅｔａ、
配列番号３７：プライマーｒｅｖ＿ｈｕｃｂ＿ｈｕ＿ｔｍ＿Ｚｅｔａ、
配列番号３８：配列番号１からの野生型遺伝子マウスαＴＣＲのポリヌクレオチド（ｍｕｖα−ｍｕｃα）、
配列番号３９：配列番号２からの野生型遺伝子マウスβＴＣＲのポリヌクレオチド（ｍｕｖβ−ｍｕｃβ）、
配列番号４０：配列番号３からのキメラな部分的にヒト化されたＴＣＲ遺伝子のポリヌクレオチド（ｍｕｖα−ｈｕｃα）、
配列番号４１：配列番号４からのキメラな部分的にヒト化されたＴＣＲ遺伝子のポリヌクレオチド（ｍｕｖβ−ｈｕｃβ）、
配列番号４２：配列番号５からの一本鎖ＴＣＲ  ｍｕｖα−Ｌｉ−ｍｕｖβ−ｍｕｃβのポリヌクレオチド、
配列番号４３：配列番号６からの一本鎖ＴＣＲ  ｍｕｖβ−Ｌｉ−ｍｕｖα−ｍｕｃαのポリヌクレオチド、
配列番号４４：配列番号７からのヒトＣＤ３ζ鎖ｍｕｖα−ｈｕｃα−ｈｕＣＤ３ζと融合させた二本鎖ＴＣＲのポリヌクレオチド；および
配列番号４５：配列番号８からのヒトＣＤ３ζ鎖ｍｕｖβ−ｈｕｃβ−ｈｕＣＤ３ζと融合させた二本鎖ＴＣＲのポリヌクレオチド。
【００７５】
プライマー配列において、Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ；Ｗ＝Ａ／Ｃ／Ｔ
【実施例】
【００７６】
二重−トランスジェニックマウスｈｕＣＤ８×Ａ２ＫｂからのＴ−細胞受容体αＴＣＲおよびβＴＣＲの遺伝子を調製し、これは、ＨＬＡ−Ａ２．１−制限されたおよびｈｄｍ２蛋白質／８１−８８ペプチド−特異的Ｔ−細胞応答を媒介する。得られた遺伝子を、野生型（ＷＴ）または修飾された構築体としてヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）にレトロウイルスによって挿入し、５１クロム放出テストにおける種々の細胞系のＣＤ８−媒介細胞毒性溶解によって、ＨＬＡ−制限された抗原認識を機能的にチェックした。
１．）Ｔ−細胞受容体のα−およびβ−鎖をコードする遺伝子の取得
１．１）細胞質ＲＮＡの調製
細胞質ＲＮＡを、単離して、一方において、主として細胞核に位置する依然としてプロセッシングされていないイントロン−含有ＲＮＡ，ＤＮＡ断片およびリボソームＲＮＡを分離し、および所望の「メッセンジャー」ＲＮＡの豊富化を達成した。プロトコルおよび物質は、少し修飾したが、ほとんどは、ＱＩＡＧＥＮからの「Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」に対応する；１つの調製では、「２４−ウェルプレート」の培養皿からのｈｄｍ２／８１−８８−特異的Ｔ−細胞クローン３の平均５０×１０６ネズミ細胞を合わせ、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中、無血清で洗浄した。インキュベーションチューブ当たり各々１２．５×１０６細胞の無ＲＮａｓｅ条件下で細胞をアリコットし、細胞膜溶解緩衝液（４℃に冷却）中で氷上にて２０分間インキュベートした。
【００７７】
細胞膜溶解緩衝液：
５０ｍＭ  トリスＨＣｌｐＨ８．０
１４０ｍＭ  ＮａＣｌ
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．５％ノニデットＰ４０（Ｒｏｃｈｅ  １  ３３２  ４７３）
１０００ユニットのＲｎａｓｅ阻害剤／ｍｌ  ＺＭＬ−Ｐ（Ｒｏｃｈｅ  ７９９  ０１７）
１ｍＭ  ＤＴＴ
この緩衝液では、調製されるべき全ての他の水溶液のように、ＤＥＰＣ−処理および二重−オートクレーブ処理脱イオン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭｉｌｌｉＱ）水を用いた。
【００７８】
さらなる工程は、室温にて無Ｒｎａｓｅ条件下、ＱＩＡＧＥＮプロトコルの助けを借りて、当業者に慣用されるプロセスに従って行った。この工程を簡潔に説明する。
【００７９】
穏やかに可溶化し、アリコットした細胞を３００ｇ／２分／４℃において遠心し、上清を除去した。６００μｌのβ−メルカプトエタノール（ＭＳＨ）−含有（１．４５ｍＭ）「ＲＬＴ」緩衝液を添加し、よく混合し、混合しつつ４３０μｌの９６％ＥＴＯＨを添加した。アリコット当たり溶液をシリカＭｉｎｉｓｐｉｎカラムに添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆテーブル遠心機にて１０，０００ｒｐｍ（分当たりの回転数）において１５秒間遠心した。７００μｌの「ＲＷ１」および５００μｌの７７％ＥＴＯＨ−含有「ＲＰＥ」緩衝液中の洗浄を、各々の場合に行った。最後に、５００μｌの同一「ＲＰＥ」緩衝液を添加し、最大の１４，０００ｒｐｍにてカラムを２分間乾燥した。５４μｌの無Ｒｎａｓｅ水を用い、１０，０００ｒｐｍにて２分間ＲＮＡを溶出させた。収率は１２．５×１０６ネズミＴ−細胞当たり３０μｇであった。ＲＮＡを−２０℃において６μｇ／１０μｌで凍結した。
【００８０】
１．２  カップリングしたＲＴ−ＰＣＲによるβ−鎖遺伝子の増幅
それをクローン化するのが可能となる前に、ＴＣＲ−コーディングＲＮＡはＤＮＡに特異的に転写し、増幅しなければならなかった。このために、ＲＴ−ＰＣＲを方法として用い、これは、Ｒｏｃｈｅからの同様の名称のキット「Ｔｉｔａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ」（１８８８  ３８２）で行う。「一工程プロトコル」を選択したが、ここに、ポリメラーゼ鎖反応のさらなる介入なしに逆転写を次に行う。用いた酵素はＡＭＶ逆転写酵素およびＴｈｅｒｍｕｓ  Ａｑｕａｔｉｃｕｓ／Ｐｗｏ−熱安定性ポリメラーゼ（「ＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ」酵素ミックス）の混合物であり、これは、広く使用されている反応緩衝液中で用いた。ＴＣＲ遺伝子の転写速度および、ＴＣＲ遺伝子の偏差のため、可変ドメインをコードする遺伝子配列の保存は低いので、「ネステッドＰＣＲ」（ポリメラーゼ鎖反応）を付加して、増幅されたＤＮＡの特異性およびシグナル強度を増大させた。シグナルペプチド後の第１の保存されたアミノ酸コーディングのための塩基配列に対応する縮重プライマー（ｆｏｒ＿ｂＴＣＲ＿ｖ４；配列番号９）を用い、そのサブファミリーメンバーシップが先見的に予測できないｖ−遺伝子セグメントの多様性を決定しようと試みた。まず、合成オリゴヌクレオチドによって、ネズミＴＣＲシグナルペプチドをコードする人工遺伝子セグメントを付加して、イン・ビボで合成された蛋白質の小胞体のルーメンへの方向付けを保証すべきである。一定遺伝子セグメント内の逆方向−ハイブリダイジングプライマー（ｒｅｖ＿ｂＴＣＲ＿ｃ４；配列番号１０）を選択して、その３‘−末端にいくつかの塩基の差を有するβ−鎖の２つの可能なｃ−遺伝子セグメント（ｃ−β１またはｃ−β２）のさらなる偏差を回避した。「ネステッドＰＣＲ」のオリゴヌクレオチドは、ＴＣＲ相補性以外に、その５’−末端にＥｃｏＲＩまたはＡｓｃＩについての制限切断部位の配列を保有した。ネステッド「ＰＣＲ」の順方向にハイブリダイズするプライマー（ｆｏｒ＿Ｅｃｏ＿ｂＴＣＲ＿ｖ５；配列番号１１）は縮重ＲＴ−ＰＣＲプライマーに対してｖ−遺伝子セグメントの配列において等しく、他方、厳密に「３‘−に位置したネステッドＰＣＲ」が関連するように、逆方向にハイブリダイズするｃ遺伝子セグメントに相補的なプライマー（ｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ｂＴＣＲ＿ｃ６；配列番号１２）を、ＴＣＲリーディングフレームの逆方向第１プライマーに対して１２０未満の塩基だけ内方向に移動させた。これによって、ＰＣＲの特異性は増大した。というのは、２つの異なる位置における２つの独立したＰＣＲ工程においては、配列−特異的認識事象が起こるはずだからである。完全なｃ−遺伝子セグメントを含め、２つの潜在的に可能なｃβ１／ｃβ２遺伝子セグメントを含めるための逆方向縮重プライマー（ｒｅｖ＿Ａｓｃ＿  ｂＴＣＲ＿ｃ２；配列番号１４）によって、及び追加の「ネステッドＰＣＲ」なくしてＲＴ−ＰＣＲによるｃβ遺伝子セグメントのリーディング方向の対応するプライマー（ｆｏｒ＿Ｅｃｏ＿ｂＴＣＲ＿ｃ２；配列番号１３）によってクローン化した。ｃβ範囲の２つの増幅体の重複する範囲において、唯一のＮｃｏＩ切断部位が位置し、それによって、引き続���てのサブクローニングにおいて切形ｖβ／ｃβおよび完全なｃβ遺伝子セグメントを合わせることができた。
【００８１】
ピペッティングスキームおよびＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲプロトコルは、原理的には、Ｒｏｃｈｅによって記載されたプロセスに対応した。引き続いての「ネステッドＰＣＲ」は、オートクレーブ処理した水による成分Ｒｎａｓｅ阻害剤およびＤＴＴの置き換えと同様に行った。２μｌのＲＮＡ（０．１〜１μｇ）の代わりに、ＲＴ−ＰＣＲの２μｌの増幅体を使用した。ＰＣＲ装置の技術的要件は、３６℃、３９℃、４４℃、５２℃および５６℃の５つの選択された温度につき間隔を設けた３５℃〜５５℃の温度グラジエントでの古典的ＰＣＲサイクルの２番目の工程における種々のハイブリダイゼーション温度の同時テストを可能とした。４４〜５６℃のより高い温度では、その強度が２番目のＰＣＲによって増加され、ベクターに挿入されるのに十分である、所望の長さの単一バンドを達成することができた。
【００８２】
８つの細菌クローンの配列決定はいくつかのランダム化された塩基置換を示し、これは他のポリメラーゼに対するＥｘｐａｎｄＴＭ酵素ミックスの比較的高いエラー率に基づくものであった。さらに、選択されたクローンは、全て、シグナルペプチドおよび１００未満の塩基の非暗号、５，−非翻訳領域の短い領域についての配列情報を運び、従って、これより、ｖ−遺伝子セグメント−特異的縮重プライマーが同様な上流配列を認識し、野生型シグナルペプチドのさらなる配列を生じたと推定することができた。
【００８３】
１．３  ＲＡＣＥ−ＰＣＲによるα−鎖遺伝子の増幅
α−鎖の配列決定では、ＲＡＣＥ−ＰＣＲは標的に至る戦略であった：前記したバッチと同様に設計した縮重オリゴヌクレオチドは、ＣＤＲ３ループにおけるリーディングフレームシフトにより非機能的なＴ−細胞受容体の暗号配列を専ら提供した。対立遺伝子排除は、ＴＣＲのβ−鎖に関しては同程度効果的ではない。ＲＡＣＥ−技術はＲｏｃｈｅ（１  ７３４  ７９２）の同様な名称のシステムで確立されており、αＴＣＲ遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドで補わなければならず：このため、「５‘−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ」の関係では、暗号配列の５’に位置した偏差は、ターミナルトランスフェラーゼによって逆転写されたｃＤＮＡ配列の３‘−末端に既知の短いアデニンオリゴヌクレオチド配列を生じさせることによって回避され、これは、結果として、リーディング方向において５’に位置するＰＣＲプライマーについての認識配列として機能する。逆方向ＰＣＲプライマーは、定常ドメインをコードする不変配列内にある。逆転写では、プライマーｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ａＴＣＲ＿ｃ１（配列番号１５）を用い、これは、ｆｏｒ＿Ｅｃｏ＿ａＴＣＲ＿ｃ６（配列番号１８）と共に、全長ｃαセグメントのＲＴ−ＰＣＲを介する増幅でも用いた。プライマー対「オリゴｄ（Ｔ）−アンカープライマー」（ＲＡＣＥ−ＰＣＲキットの成分）／ｒｅｖ＿ａＴＣＲ＿ｃ５（配列番号１６）および「ＰＣＲアンカープライマー」（ＲＡＣＥ−ＰＣＲキットの成分）／ｒｅｖ＿Ａｓｃ＿ａＴＣＲ＿ｃ４（配列番号１７）の助けを借りる連続的２−工程「ネステッドＰＣＲ」の概念を続いて行い、従って、ここでは、定常ドメインをコードする完全な配列のサブクローニングも付加した。ＰＣＲプライマーは、単一のＮｃｏＩ切断部位が増幅された遺伝子セクションの重複領域に存在するように位置させなければならなかった。５‘−ＳａｌＩ−３’−ＡｓｃＩによって、ｖα遺伝子セグメントを含む切り取ったＰＣＲ増幅体をｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローン化し、他方、ＥｃｏＲＩおよびＡｓｃＩによって、定常遺伝子セグメントをｐＮＥＢ１９３に挿入した。ＬＭＰゲルおよびフェノール／クロロホルム抽出を介する精製によって、増幅体を慣用的方法によりクローン化し（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、しかる後、制限酵素によってそれらを消化し、「高純度ＰＣＲ産物精製キット」（Ｒｏｃｈｅ，  １  ７３２  ６６８）の助けを借りて末端を除去した。
【００８４】
多工程プロトコルは、プログラム可能なＰＣＲ装置の助けを借りる商業的プロトコルに主として従い：逆転写、トランスフェラーゼ反応および引き続いての２−工程「ネステッドＰＣＲ」をＥｐｐｅｎｄｏｒｆからのＰＣＲ装置「ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ」で行った。特異的α−鎖増幅の関係では、温度３９℃、４４℃、５２℃および５６℃でのハイブリダイゼーション工程でグラジエント技術を用いた。Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を選択した。というのは、この時点では、これは、最低のエラー取込率を有する酵素とみなされたからであった。第１のＰＣＲは全温度スペクトルにおいて０．９ｋＢと予測されるサイズの弱いバンドを既に与えており、その強度は、引き続いてのＰＣＲによって増加し、さらに起こった「プライマーダイマー」を希釈することができた。最後のＰＣＲにおいては、移動したハイブリダイジングプライマーの理論的位置に従い、７０ｂｐだけの増幅体の切り取りがもたらされた。アガロースゲルにおいては、１００ｂｐの長さの差の二重バンドが出現し、これは、機能的および非機能的α−鎖の存在を示した。バンドを共に調製ゲルにおいて切り出して、引き続いてのクローニングにおいて双方の増幅体を含ませることができた。機能的リーディングフレームをコードし、同一の配列を保有した７つのクローンが見出された。
１．４）見出されたサブファミリーメンバーシップの調査
ネズミｈｄｍ２蛋白質／８１−８８−特異的Ｔ−細胞クローン３におけるｖβ６−またはｖα１０−遺伝子セグメントの存在は種々の方法で証明された：
ａ）ｖβ６−特異的プライマーまたはｖα１０−特異的プライマーによるＲＴ−ＰＣＲ。抗−ｈｕＣＤ８磁気標識抗体によりネズミ「フィーダー」細胞から特異的Ｔ−細胞を分離することによって、ネズミｈｄｍ２−Ｐ２−特異的Ｔ−細胞クローン３から予めＲＮＡを精製した。用いた陰性対照はインフルエンザマトリックス蛋白質−（ＦｌｕＭ１  ５８−６６）−特異的Ｔ−細胞クローンであった。
ｂ）ｖβ６−特異的ＦＩＴＣ−標識抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によるＦＡＣＳ分析（図１）。それから得られたネズミＴ−細胞系およびクローン３を共に調査した。用いた陽性対照は、サブファミリーから独立したβ−鎖部分を認識するＦＩＴＣ−標識抗体であった。
【００８５】
ｃ）細胞毒性５１クロム放出テストにおけるネズミＴ−細胞クローン３のｖβ６−特異的抗体ブロック（図２）。
【００８６】
２．）ｈｄｍ２−特異的構築体の設計の例（図３「配列番号３８〜４５」および図４「配列番号１〜８」）
レトロウイルスベクターｐＢｕｌｌｅｔ、ｐＳｔｉｔｃｈの機能的誘導体（Ｗｅｉｊｔｅｎｓら，１９９８）は「スプライスベクター」に属し、ここに、トランスジーンはｅｎｖ遺伝子としてスプライスアクセプターおよびドナーエレメントＳＡおよびＳＤに対して同一配列の関係でクローン化して、最大発現を保証しなければならない。このために、適当なプライマーによって、ＮｃｏＩ切断部位を開始コドン「ｃｃＡＴＧｇ」内に設計する。これは、野生型鎖αＴＣＲおよびβＴＣＲ双方につき、第２のアミノ酸をＬｙｓからＧｌｕへ、またはＡｓｎからＡｓｐへ変化させた。リーディングフレームの３‘−末端では、唯一のＢａｍＨＩ−切断部位を選択した。制限酵素および修飾酵素はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から得た。熱安定性ポリメラーゼは、一般に、天然であるかまたはクローン化されたＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。
【００８７】
２．１）ネズミ野生型遺伝子αＴＣＲ（ｍｕｖα−ｍｕｃα；配列番号１〜３８）およびβＴＣＲ（ｍｕｖβ−ｍｕｃβ；配列番号２〜３９）のクローニング
ＮｃｏＩ切断部位が内部に存在しない場合（部分的にヒト化された鎖）、ＮｃｏＩについての配列を含有するプライマー（ｆｏｒ＿ＮｃｏＩ＿ａＴＣＲ＿４，配列番号１９；  ｆｏｒ＿ＮｃｏＩ＿ｂＴＣＲ＿４，配列番号２１）によって、直接遺伝子セグメントを増幅しクローン化することができた。
【００８８】
野生型鎖についてのＮｃｏＩ−切断部位は定常ドメインのための遺伝子セグメントで生じたので、５‘−末端にこのタイプの切り取られた平滑末端ＮｃｏＩ切断部位を保有し、従って、これらは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの助けを借りたＮｃｏＩ−切断ベクターＤＮＡの平滑末端充填の後に、後者を補って完全なＮｃｏＩ切断部位を与えるオリゴヌクレオチド（ｆｏｒ＿ＮｃｏＩ＿ａＴＣＲ＿５ｂ、配列番号２０；ｆｏｒ＿ＮｃｏＩ＿ｂＴＣＲ＿５ｂ、配列番号２２）によって暗号リーディングフレームを増幅した。ｒｅｖ＿ａＴＣＲ＿ＢａｍＨＩ（配列番号２３）およびｒｅｖ＿ｂＴＣＲ＿ＢａｍＨＩ＿１（配列番号２４）を全てのネズミ二本鎖および一本鎖構築体用の最終逆方向プライマーとして用いた。
【００８９】
２．２）キメラな部分的にヒト化されたＴＣＲ遺伝子ｈｕαＴＣＲ（ｍｕｖα−ｈｕｃα；配列番号４０）およびｈｕβＴＣＲ（ｍｕｖβ−ｈｕｃβ；配列番号４１）の創製
ネズミＴＣＲの機能的キメラ化のためには、二つの基準を満足しなければならない：
ａ）ネズミ定常ドメインは、これらのドメインがそれらの免疫グロブリン−様折畳構造に完全に含まれるように、対応するヒトドメインによって置き換えられなければならない。完全な可変ドメインは、同様に、ほとんどのカルボキシ−末端存在ＣＤＲ３ループの損傷を引き起こさないように含まれるべきであった。
【００９０】
ｂ）融合は、転位が、もし可能であれば、意図しない免疫反応に導くネオ抗原を生じさせないように起こるべきであった。
【００９１】
ｂ）の場合、一般に、ヒトとネズミ配列の比較において双方の鎖につき、以下の特性が得られた：ＣＤＲ３ループを完成する最後のコンセンサスモチーフ「ＧｘＧ」の後の８つまでのアミノ酸の領域において、位置は比較的強く保存される。この領域は、１１までのアミノ酸の高度に保存された配列によって完成される。この後、ネズミ配列は、ヒト配列とは異なり始め、各種では高度に保存されている。中央の領域は、可変ドメインを定常ドメインと結合させる延長ループ内にある（基準ａ）参照）。理想的な場合、高度に保存されたアミノ酸（ＡＡ）トリプレット配列内でのキメラ化は好ましかった。
【００９２】
αＴＣＲの場合には、高度に保存されたトリプレット配列は「Ｑ−Ｎ−Ｐ」（ネズミαＴＣＲの開始コドンに対して塩基４００〜４０８）よりなるものであった。位置４０７〜４１５では、唯一のＡｌｗＮＩ切断部位が付着し、これは、融合のために用いることができた：３‘−シフト位置またはＡｌｗＮＩは、ヒト配列で保存されたアスパルテートの代わりに、ネズミ配列で保存されたグルタメートが存在することを必要とした。この保存的アミノ酸置き換えはあまり免疫原性があるとは考えられず、かくして、許容されると考えられた。キメラが高度に保存された領域はＩ１３３−Ｑ−Ｎ−Ｐ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｑ−Ｌ−Ｒ１４４と読まれ、ここに、Ｒ１４４は最初のヒト−特異的アミノ酸を表す。Ｉ１３３は、ＣＤＲ３ループを完成するコンセンサスモチーフ「ＧｘＧ」の後の９番目の位置に位置する。
【００９３】
クローニング戦略はＬＭＰ−アガロース−単離ＥｃｏＲＩ／ＡｌｗＮＩ−切断ｖαセグメントをＡｌｗＮＩ／ＢａｍＨＩ−消化ｃαＰＣＲ増幅体に連結させることを企画したものであり、引き続いて、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて混合連結産物を切断し、潜在的に正しい断片の長さに調製された連結産物を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。非対称テスト消化により、連結出発物質の所望の配列を有するクローンが得られた。
【００９４】
前記したＲｏｃｈｅキットの一部として実施される慣用的ＲＴ−ＰＣＲ、続いて「ネステッド」ＰＣＲによって、ヒト定常遺伝子セグメントｃαおよびｃβをヒト白血病細胞系Ｊｕｒｋａｔから単離した。ヒトｃα遺伝子セグメントの場合、２位置における突然変異原性ＰＣＲプライマーの助けを借りて、一方において、ＡｌｗＮＩ切断部位（ＴからＡ；以下の表参照）を生じさせなければならず、他方、ネズミ配列との適合性が生じなければならなかった。（ｃからａ；以下の表参照）。というのは、ＡｌｗＮＩ切断部位の中央の３つの位置は縮重が可能だからである。
【００９５】
【表１】
2004535778.tif 000003
【００９６】
ネズミ配列において天然に生じるＡｌｗＮＩ切断部位を太文字で示し、３‘−シフト切断位置に下線を施す。縮重トリプレットは小文字でタイプする。マウス配列−適合ＡｌｗＮＩ切断部位の延長のためのヒト「プライマー」に必要な塩基置換を太文字で示す。突然変異原性プライマーの５’開始塩基はイタリック体である。得られたキメラＡＡ配列を太文字で示す。（テキスト参照）；高度に保存されたＡＡトリプレットにさらに下線を施す。
【００９７】
ｃα断片の増幅は「ネステッド」ＰＣＲによって行った。突然変異は「ネステッド」プライマー（ｆｏｒ＿ｈｕｃａＴＣＲ＿ＡｌｗＮＩ＿３；配列番号２７）に置き、他方、ＲＴ−ＰＣＲプライマー（ｆｏｒ＿ｈｕｃａＴＣＲ＿２；配列番号２５）は依然としてヒト野生型配列に対応した。逆方向「ネステッド」プライマーｒｅｖ＿ｈｕｃａＴＣＲ＿ＢａｍＨＩ＿１（配列番号２８）は停止コドンおよびクローン化可能なＢａｍＨＩ切断部位を共に保有し、他方、逆方向ＲＴ−ＰＣＲプライマー（ｒｅｖ＿ｈｕｃａＴＣＲ＿２；配列番号２６）は３‘−存在非暗号領域を認識した。
【００９８】
βＴＣＲの場合には、平滑末端連結とカップリングさせた「ネステッド」ＰＣＲの原理を同様に用いた（配列番号２９〜３２）。高度に保存されたトリプレット配列は「Ｅ−Ｄ−Ｌ」（ネズミβＴＣＲの開始コドンに対して塩基４００〜４０８）よりなるものであった。可変遺伝子セグメントを含み、唯一であるＢｓｔＹＩ切断部位は等しく位置した（塩基４０２〜４０７）。ヒト定常ドメイン遺伝子セグメントに特異的なプライマー（ｆｏｒ＿ｈｕｃｂＴＣＲ＿４；配列番号３１）は、その５‘末端を介して補うべきであり、それに関し、ホスホリル化「Ｔ」はＢｓｔＹＩの潜在的に回分認識配列の最後の塩基を表し、正しいリーディングフレームの意味が保持されるように、ＢｓｔＹＩ消化（ｄＮＴＰの付加を補うＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで満たし、分解されない突出５’−末端を生じ）、ネズミ可変ドメイン遺伝子セグメントの３‘−の末端は平滑末端化され、満たされている。引き続いて、ＥｃｏＲＩを用いてｖβ断片を切断し、ＬＭＰゲルから単離し、さらに酵素によるホスホリル化されたＣＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ＮＥＢ一方向平滑末端化ＢａｍＨＩ断片として連結でｃβＰＣＲ増幅体を使用した。引き続いて、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩを用いて混合された連結産物を切断し、潜在的に正しい断片長さを有する断片をｐｃＤＮＡ３．１（−）にクローン化した。非対称テスト消化は、連結出発物質の所望の配列および向きを有するクローンを示した。
【００９９】
【表２】
2004535778.tif 000004
【０１００】
ネズミ配列において天然に生じるＢｓｔＹＩ切断部位を太文字で示し、５‘−突出を生じる５’シフト切断位置に下線を施す。キメラ構築体中のＢｓｔＹＩの最後の塩基を補う、ヒト「ネステッド」プライマーの５‘開始およびホスホリル化塩基「Ｔ」はイタリック体である。得られたキメラＡＡ配列を太文字で示し（テキスト参照）；高度に保存されたＡＡトリプレットにさらに下線を施す。
【０１０１】
キメラが高度に保存された領域はＥ１３３−Ｄ−Ｌ−Ｎ１３６を読み、ここに、Ｎ１３６は最初のヒト−特異的アミノ酸を表す。Ｅ１３３は、ＣＤＲ３ループを完成する保存された「ＧｘＧ」モチーフの後の７番目の位置に位置する。
【０１０２】
２．３）一本鎖ＴＣＲ  ｍｕｖα−Ｌｉ−ｍｕｖβ−ｍｕｃｃβ（配列番号４２）およびｍｕｖβ−Ｌｉ−ｍｕｖα−ｍｕｃｃα（配列番号４３）の創製
一本鎖ＴＣＲは、可変ドメインｖαとｖβとの融合および付加された定常ドメインｃαまたはｃβよりなる（Ｅｓｈａｒら、１９９３）。そのような利点は、構築体における２つの可変ドメインのはっきりとした１：１化学量論、および排除すべき外因性二本鎖ＴＣＲとの内因性の異種対合のためのはっきりとした反応性にある。可変ドメインは、冗長な（ＧＧＧＧＳ）３モチーフのフレキシブルなポリリンカーを介して連結した。合成オリゴヌクレオチドの末端は唯一の切断部位を収容し、それにより、必須のＣＤＲ３ループの後に置かれた１つの可変ドメインのカルボキシ−末端を、シグナルペプチドをコードする配列の後に存在する他の可変ドメインの始まりと連結することができた。概念的には、５つの基準を考慮に入れた；
ａ）ポリリンカーは、可変端部の末端を連結するのに十分な長さでなければならなかった。このためには、ＭＨＣ−Ｈ−２Ｋｂ特異性のネズミＴＣＲ結晶構造を調べた。
【０１０３】
ｂ）ポリリンカーは、末端が、一方において、ＣＤＲ３ループの特異性に悪影響を与えず、他方において、その機能的構造の延長を持つ付加された可変ドメインのシグナルペプチドを適切に排除するように、該末端に連結しなければならなかった。これを行うために、各可変ドメインのアミノ酸配列は、加えて、唯一の切断部位が理想的には存在しない場合のためにポリリンカーに含ませた。
【０１０４】
ｃ）ポリリンカーは、一方においては、フレキシブルでなければならず、これは、グリシン残基の立体的に好都合なカテネーションの助けを借りて行わなければならず、他方において凝集体形成および沈殿を避けるのに十分に可溶性でなければならなかった：セリン残基のヒドロキシル基は、溶媒和する水分子とで水素結合を形成し、局所的な双極子を形成する。正しいリーディングフレームにおける転写に悪影響しないように、グリシン残基に対する暗号トリプレットを変化させた（「ＧＧＣ」および「ＧＧＡ」）。
【０１０５】
ｅ）ポリリンカーは、野生型配列と同一の内部の唯一の切断部位を保有して、２−工程クローニングプロセスにおいて中間体を切断し、これらの唯一の切断部位を介して３‘−末端において野生型配列をほとんど完成しなければならなかった。
【０１０６】
これらの条件下で、可変ドメインの二つの向きが可能であった；
構築体ｍｕｖα−Ｌｉ−ｍｕｖβ−ｍｕｃβ（配列番号４２；図５）の場合には、可変ｖαドメインの最後のコンセンサスモチーフ「ＧｘＧ」およびＤｒａＩＩＩの後の唯一の切断部位ＫｐｎＩを、ｖβドメインにおけるシグナルペプチド暗号配列を完成する制限切断部位として選択した。最初の工程において、ハイブリダイズした二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＫｐｎＩを用いて両側で切断し、野生型αＴＣＲのｖα−コーディングおよびｃα−コーディング配列の間にクローン化した。この後、ＤｒａＩＩＩ／ＢａｍＨＩおよびβＴＣＲ−コーディング配列を用いてキメラ中間体を切断し、これにより、ＤｒａＩＩＩ／ＢａｍＨＩ消化によりそのシグナルペプチド−コーディング配列が失われ、クローン化された。ポリリンカーの最初のグリシンは、ｖα中の「ＧｘＧ」コンセンサスモチーフのアミノ−末端Ｇｌｙに対して位置６にあり、間にある平滑末端連結により、ポリリンカーの最後のセリンは、ｖβドメインの位置Ａｓｐ２２の前でアルギニンを介して連結した。
【０１０７】
構築体ｍｕｖβ−Ｌｉ−ｍｕｖα−ｍｕｃα（配列番号４３；図６）の場合には、可変ｖβドメインの最後のコンセンサスモチーフ「ＧｘＧ」およびＢｓｇＩの後の唯一の切断部位ＳｃａＩを、ｖαドメイン中のシグナルペプチドコーディング配列を完成する制限切断部位として選択した。第１の工程において、ＳｃａＩを用いて、ハイブリライズされた二本鎖オリゴヌクレオチドを両側で切断し、野生型βＴＣＲのｖβ−コーディングおよびｃβ−コーディング配列の間にクローン化した。この後、ＢｓｇＩ／ＢａｍＨＩおよびαＴＣＲ−コーディング配列を用いてキメラ中間体を切断し、これにより、ＢｓｇＩ／ＢａｍＨＩ消化によってそのシグナルペプチド−コーディング配列が失われ、クローン化された。ポリリンカーの最初のグリシンは、ｖβ中の「ＧｘＧ」コンセンサスモチーフのアミノ−末端Ｇｌｙに対して位置６にあり、ポリリンカーの最後のセリンはｖαドメインの位置Ｖａｌ２４の前にある。
【０１０８】
２．４）ヒトＣＤ３ζ−鎖ｍｕｖα−ｈｕｃα−ｈｕＣＤ３ζ（配列番号４４；図７）およびｍｕｖβ−ｈｕｃβ−ｈｕＣＤ３ζ（配列番号４５；図８）と融合した二本鎖ＴＣＲの創製
二本鎖ＴＣＲのシグナル変換は最適化すべきである。このために、各二本鎖α／βＴＣＲをＣＤ３複合のほとんど完全なＣＤ３ζサブユニットと融合させた。種々の刊行物（Ｅｓｈａｒら，  １９９４）に従い、この融合は、カスケード中の上流または下流に存在するエフェクターＬｃｋ５６またはＺＡＰ−７０へのＴＣＲの効果的かつＣＤ３−独立性カップリングをもたらす。
【０１０９】
修飾された連結ＰＣＲベースの技術が確立されており、唯一の切断部位とは独立して、キメラ蛋白質の調製のために、いずれかの所望の融合を作り出すことが可能であり、得られたＰＣＲ増幅体の特異性は、慣用的な連結ＰＣＲと比較して顕著に増加した。遺伝子融合は、逆方向キメラプライマー（ｒｅｖ＿ｈｕｃａ−ｈｕ＿ｔｍ＿Ｚｅｔａ、配列番号３６、図７；ｒｅｖ＿ｈｕｃｂ−ｈｕ＿ｔｍ＿Ｚｅｔａ；配列番号３７、図８）によって、規定され、それにより、ＰＣＲ増幅体としての順方向プライマー（Ｔ７＿ｆｏｒ；配列番号３３）は「メガプライマー」を生じ：最初の慣用的連結ＰＣＲ工程においては５‘存在融合パートナーのために、「メガプライマー」を生じさせ、これは、さらに、配列付属として、３’−存在融合パートナーに対して、特異的な短い配列を担う。ＰＣＲシグナルの特異性を顕著に増加させるためには、最初のＰＣＲにおいて、できる限り早く、最初に導入された「鋳型」（Ｔ７＿ｆｏｒ；Ｔ７＿ｒｅｖ；配列番号３３，３４）に対して暗号キメラ増幅体の外部でハイブリライズするプライマーを用いて、次いで、第２のＰＣＲにおいて、内側に存在する（「ネステッド」）プライマーを用いる。これにおいて、メガプライマーは、３‘−存在融合パートナーにハイブリライズする逆方向「ネステッド」プライマー（ｒｅｖ＿ｈＺｅｔａ＿ＢａｍＨＩ＿４；配列番号３５）と共に、第３の順方向プライマー「ｆｏｒ＿ａＴＣＲ＿ＮｃｏＩ＿５ｂ；ｆｏｒ＿ｂＴＣＲ＿ＮｃｏＩ＿５ｂ；配列番号２０，２２」にて、５’−末端において「ネステッド」存在する中間体産物を生じ、これは、末端がトリムされたＰＣＲ増幅体を生じる。
【０１１０】
融合点をシステインに制限し、ジスルフィドブリッジを形成し：これにより、ＴＣＲは二量体化システインまでの細胞膜外に存在する細胞膜配列、トランスメンブランおよびアミノ酸の短い領域を失い、ヒトα□−鎖は同様に短い細胞膜外セクションを失うが、そのシスチン−形成システインは、専ら、３つの二価「ＩＴＡＭ」モチーフを含めたトランスメンブランおよびサイトゾル領域をコード化すべきである。逆方向キメラプライマーは、各部分的にヒト化されたＴＣＲの３‘−末端に存在する２１の塩基およびヒトＣＤ３ζ鎖の５’末端に存在する２１の塩基をコードする（図７）。キメラ構築体は、定常ドメインから先をヒト化する。
【０１１１】
３．）ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の形質導入
ヒト末梢Ｔ−リンパ球の形質導入のために、ｐＳｔｉｔｃｈ系の機能的誘導体を用いた（Ｗｅｉｊｔｅｎｓら、１９９９）。パッケージングに必要なレトロウイルス遺伝子は、パッケージング細胞系２９３Ｔの共トランスフェクションの間に個々のプラスミドによってコードされ（Ｓｏｎｅｏｋａら、１９９５）：ｐＨｉｔ６０は、モロニーネズミ白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）からｇａｇ−ｐｏｌ構造およびポリメラーゼ遺伝子をコードし、ｐＣＯＬＴ−Ｇａｌｖは、ヒト細胞のＮａ＋／ホスフェート共同輸送体ピットに結合することができ、かくして、後者を形質導入できる「テナガザル白血病ウイルス」のｅｎｖコート蛋白質をコードする。かくして、キメラウイルス粒子は両種性シュードタイプを保有し、マウス除いて種々の哺乳動物細胞を形質導入することができる。
【０１１２】
３．１）パッキング細胞系２９３Ｔのトランスフェクション
残存するエンドトキシン（Ｑｉａｇｅｎ，製品１２３６２）の除去を約束するプラスミド調製物によって、ｐＳｔｉｔｃｈ誘導体にクローン化したＴ−細胞受容体遺伝子の単離された細菌クローンを精製し、１μｇ／μｌに調製した。リン酸カルシウム沈殿（ＧｉｂｏＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  製品１８３０６−０１９）によって、ＤＮＡをパッキング細胞系２９３Ｔに一次的に挿入した。この関連で、野生型または修飾された二本鎖Ｔ−細胞受容体αＴＣＲおよびβＴＣＲの関係で、８０μｇまでのＤＮＡを使用する：
２０μｇのαＴＣＲ構築体
２０μｇのβＴＣＲ構築体
２０μｇのｐＣｏｌｔ−Ｇａｌｖ
２０μｇのｐＨｉｔ６０
一本鎖ＴＣＲの場合、６０μｇのＤＮＡを使用する。２９３Ｔは、修飾されたＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｈ）中で培養した：
ＤＭＥＭ、４．５％グルコース（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）
１０％の熱不活化ＦＣＳ
２ｍＭグルタミン
１×ペニシリン／ストレプトマイシン
１×非必須アミノ酸
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
トランスフェクションの前日、細胞２９３Ｔを、Ｔ２５ビンおよびトランスフェクションバッチ当たり０．９×１０６細胞にて５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｈに接種した。トランスフェクションの４時間前に、室温（ＲＴ）まで加温した新鮮なＤＭＥＭ−Ｈ（３ｍｌ）によって培地を置き換えた。商業的プロトコルの指令（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、トランスフェクションを行った。注意深く滴加しつつ、１ｍｌのトランスフェクションバッチをピペットで各ビンに入れた。ＤＮＡ―Ｃａ３（ＰＯ４）２沈殿は、微細に分散した形態で接着性細胞上に沈積するはずである。
【０１１３】
翌朝、ＲＴまで加温した新鮮なＤＭＥＭ／Ｈで培地を交換した。６時間後、活性化されたＰＢＬでの共培養を行った。
【０１１４】
３．２）活性化されたＰＢＬの形質導入
３．２．１）末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の活性化
予定した共培養の３日前に、フィコール処理したＰＢＬを、各場合、２ｍｌの２４−ウエルプレート（細胞組織−処理表面）中、ｈｕＲＰＭＩ−Ｐ中に２×１０６細胞／ｍｌにて接種した。架橋抗体ＯＫＴ−３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって活性化を２０ｎｇ／ｍｌまで行った。
【０１１５】
ｈｕＲＰＭＩ−Ｐ：
ホスフェートを含まないＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭグルタミン）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃ．，１１８７７−０３２）
１０％ヒト熱不活化ＡＢ血清（ＨＬＡ−Ａ２．１血清陽性）
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃ．）
プレートを５％ＣＯ２下で３７℃にてインキュベーター中でインキュベートした。
【０１１６】
３．２．２）共培養
共培養のために、２４−ウエルプレートの各中空からの活性化されたＰＢＬを合わせ、カウントした。接着性単球を捨てた。細胞を遠心し（１５００ｒｐｍ，  ５分，  ＲＴ）、新鮮なｈｕＲＰＭＩ−Ｐ中２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で採取し、インキュベーターに戻した。培地を予め４００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ）および５μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ）に調整した。
【０１１７】
培地交換の６時間後、各トランスフェクションバッチを順次トリプシン処理し：このため、各Ｔ２５を３ｍｌのＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、１ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にせいぜい５分間インキュベートし、溶解された細胞を定量的に採取し、攪拌しつつ、最初に導入した４ｍｌのｈｕＲＰＭＩ−Ｐ（ＲＴ）に滴加した。２９３Ｔ細胞に２５００ｒａｄを照射する。これらの細胞を遠心し（１５００ｒｐｍ，５分，ＲＴ）、４００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および５μｇ／ｍｌのＰｏｌｙｂｒｅｎｅを補強した、４ｍｌの新鮮な調整ｈｕＲＰＭＩ−Ｐに再懸濁した。１ｍｌの調整ＰＢＬをバッチに添加し、バッチ（０．５×１０６ＰＢＬ／ｍｌ）をインキュベーター中で、３日間インキュベートした（３７℃，  ５％ＣＯ２）。
【０１１８】
共培養から３日後、懸濁したＰＢＬを取り出し、ＩＬ−２（４００Ｕ／ｍｌ）を補充した新鮮な培地ｈｕＲＰＭＩ−Ｐを、０．５×１０６細胞／ｍｌまで再懸濁した。３日後、新鮮な培地への反復分割を行った。７日以内に、培養は、最大、Ｔ７５ビンへの交換まで行った。これらの細胞を免疫学的染色（ＦＡＣＳ分析；３．３章，  図９）に、又は慣用的５１クロム放出テスト（３．４章，図１０〜１５）で直接的に使用できた。
【０１１９】
３．３）ＦＡＣＳ分析の例
「蛍光標示式細胞分取」（ＦＡＣＳ）中でのレトロウイルス形質導入の後、２．）に記載した構築体を分析した。このために、０．２５×１０６細胞を、飽和条件下、フルオロフォア−標識抗体で染色し：異種的に発現されたβ−鎖を抗−ｖβ６−ＦＩＴＣ（ＢＤ）を用いて検出し；Ｔ−細胞の全てを標識抗−ＣＤ３−ＰＣ５（Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｂｅｃｋｍａｎ）によって検出した（図９）。
【０１２０】
用いた陰性対照は、空のｐＳｔｉｔｃｈ誘導体で形質導入した試料であった。野生型ｍｕｖα−ｍｕｃα／ｍｕｖβ−ｍｕｃβ（２．１）およびキメラ構築体ｍｕｖα−ｈｕｃα／ｍｕｖβ−ｈｕｃβ（２．２）は、共培養の６日後、１０〜２５％の範囲の形質導入効率を達成した。多数のＨＬＡ−Ａ２−陽性Ｔ−細胞のドナーにおいて、発現を再現することができた。サイトゾルで発現された緑色の蛍光を発する蛋白質（ｅＧＦＰ，ＣｌｏｎｔｅｃｈからのｅＧＦＰ−Ｎ１から再クローン化）を外部標準として用い、成功して形質導入されたＴ−細胞のパーセンテージ検出の表現としての比較的弱い形質導入効率は方法論的な問題であり、ＴＣＲトランスジーンの固有の問題ではないことが示された。
【０１２１】
３．３．１）磁気ソーティングによるｖβ６−陽性Ｔ−細胞の豊富化
成功して形質導入されたＴ−細胞を豊富化するために、（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃの手法に従い）磁気標識されたｖβ６抗体によって、これらを磁場で分けた。このために、ｖβ６−特異的抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ「ヤギ抗―ラットＩｇＧ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ」，  製品４８５−０１）のラットＩｇＧ成分を認識する磁気標識抗体を用いた。９０％を超えるｖβ６−陽性ＣＤ３＋−Ｔ−細胞の豊富化を達成することが可能であった。
【０１２２】
３．４）形質導入されたＴ−細胞の細胞溶解活性
慣用的５１クロム放出テストにおいて、形質導入されたＴ−細胞をその細胞毒性特異性につきチェックした。この系において、５１クロムの取込によって標的細胞を放射性標識した。もしレトロウイルスにより修飾されたエフェクター細胞が標的細胞をペプチド−特異的に認識すれば、後者は、Ｔ−細胞のエフェクター機能によってアポトーシスに駆動され、溶解によって破壊される。放出されたクロム核種の程度は、細胞認識および溶解の有効性について示す。該有効性は、標的細胞に対する使用したエフェクター細胞の比率（Ｅ：Ｔ）の広い範囲によりテストした。用いた参照は、それからＴ−細胞受容体遺伝子が単離されたネズミｈｄｍ２−８１−８８ペプチド−特異的Ｔ−細胞クローン３であった。用いた標的細胞は以下の通りであった：
Ｔ２：いずれかの所望のペプチドを外因的に負荷したヒトＴＡＰ−欠乏細胞系。特異的ペプチドは、インフルエンザマトリックス蛋白質ＦｌｕＭ１に由来する無関係対照ペプチドであるｈｄｍ２−８１−８８であった。
【０１２３】
Ｓａｏｓ−２／６：ｈｄｍ２を発現し、それを内因的に加工するヒトＳａｏｓ−２細胞系のトランスフェクタント。
【０１２４】
Ｓａｏｓ２／１４３：ｐ５３突然変異体Ｖａｌ１４３Ａｌａを担うヒトＳａｏｓ−２細胞系のトランスフェクタント。該Ｐ５３突然変異体は陽性的にｈｄｍ２の発現を調節する。
【０１２５】
ＪＹ：ＥＢＶ−形質転換ＬＣＬ−Ｂ細胞系
ＵｏｃＢ  １  １，  ＥＵ−３：プレ−Ｂ細胞白血病
ＩＭ−９：プラズマ細胞腫。
【０１２６】
３．４．１）ペプチド価滴定（図１０〜１２）
細胞系Ｔ２に、１×１０−６Ｍ〜１×１０−１２Ｍの濃度シリーズのｈｄｍ２−８１−８８ペプチドを外因的に負荷した。ｍｕｖα−ｍｕｃα／ｍｕｖβ−ｍｕｃβ（２．１）およびｍｕｖα−ｈｕｃα／ｍｕｖβ−ｈｕｃβ（２．２）双方につき、ペプチド−特異的および用量−依存性細胞毒性Ｔ−細胞応答を観察することができた。２つの構築体については、Ｅ：Ｔ＝２０：１において、半最大溶解が、使用したペプチドのナノモル下範囲に存在する。非機能的一本鎖Ｔ−細胞受容体は陰性対照として機能し、これは、３．３．１）に従って発現され、豊富化することができたが、溶解活性は示さなかった。用いた陽性対照は、ネズミｈｄｍ２−８１−８８ペプチド−特異的Ｔ−細胞クローン３であった。
【０１２７】
３．４．２）悪性形質転換細胞系の認識（図１３〜１５）
前記した細胞系は、ペプチド−特異的に溶解することができた。プレ−Ｂ−細胞白血病のあるものは、野生型鎖の場合、高いＥ：Ｔにおいて１００％まで溶解できた。丁度ペプチド価滴定の場合におけるごとく、野生型鎖（２．１）は、部分的にヒト化されたキメラ鎖（２．２）と比較てより高い溶解効率を示した。非機能的一本鎖Ｔ−細胞受容体は陰性対照として機能し、それは、３．３．１）に従って発現され、豊富化できたが、溶解活性は示さなかった。用いた陽性対照は、ネズミｈｄｍ２−８１−８８ペプチド−特異的Ｔ−細胞クローン３であった。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、ｖβ６−特異的ＦＩＴＣ−標識抗体（ファーミゲン）によるＦＡＣＳ分析を示す（１．４参照）。それから得られたネズミＴ−細胞系およびクローン３双方をチェックした。用いたイソタイプ対照は抗−ＴＣＲ  Ｖα２−ＦＩＴＣ（ＢＤ）、陽性対照は抗−ｐａｎ  βＴＣＲ−ＦＩＴＣ−抗体（ＢＤ）であった。用いた陰性対照は、インフルエンザマトリックス蛋白質−特異的Ｔ−細胞クローン５８であった。
【図２】図２は、細胞毒性５１クロム放出テストにおいてネズミＴ−細胞クローン３のｖβ６−特異的抗体ブロックを示す（１．４参照）。ブロックは用量−依存的に評価した。用いた陰性対照は、一方において、抗−Ｖα３．２抗体（ＢＤ）であり、他方において、ｐ５３−２６４−２７２−特異的Ｔ−細胞クローン４６であり、これは、ｐ５３ペプチドを認識するその個体に対して交差チェックした。１０−８Ｍペプチドを外因的に負荷したＴＡＰ−欠乏細胞系Ｔ２は標的細胞として機能した。
【図３】図３は、ＤＮＡレベルにおけるｈｄｍ２−特異的構築体の設計の例を示し（２．参照）、ここに、ｍｕＶ  α／βはネズミ可変α／β遺伝子セグメントであり；ｍｕＣ  α／βはネズミ定常α／β遺伝子セグメントであり；ｈｕＣ  α／βはヒト定常α／β遺伝子セグメントであり；ＴＭ：トランスメンブランをコードする遺伝子セグメントであり；Ｌｉ：（ＧＧＧＧＳ）３モチーフおよびＨｕＣＤ３ζをコードする遺伝子セグメントはヒトＣＤ３ζ−鎖遺伝子セグメントである。クローニングに関連する制限切断部位を示す。
【図４】図４は、蛋白質レベルにおけるｈｄｍ２−特異的構築体の設計の同一の例を示し（２．参照）、ここに、ｍｕＶ  α／βはネズミ可変α／βドメインであり；ｍｕＣ  α／βはネズミ定常α／βドメインである；ｈｕＣ  α／βはヒト定常α／βドメインであり；ＳＰ：ネズミ野生型シグナルペプチド；ＴＭ：トランスメンブラン；Ｌｉは（ＧＧＧＧＳ）３モチーフおよびｈｕζを持つリンカー：３連続ＩＴＡＭモチーフを持つヒトＣＤ３ζ−鎖である。細菌クローンに由来する番号を個々の鎖につき示す。
【図５】図５は、構築体ｍｕｖα−Ｌｉ−ｍｕｖβ−ｍｕｃβのポリリンカーを示す（２．３参照）。該ポリリンカーは、最後には、Ｋｐｎ  ＩおよびＤｒａ  ＩＩＩによって得られた構築体に挿入した。
【図６】図６は、構築体ｍｕｖβ−Ｌｉ−ｍｕｖα−ｍｕｃαのポリリンカーを示す（２．３参照）。該ポリリンカーは、最後には、Ｓｃａ  ＩおよびＢｓｇ  Ｉによって該構築体に挿入された。
【図７】図７は、ヒトＣＤ３ζ−鎖ｍｕｖα−ｈｕｃα−ｈｕＣＤ３ζに融合したキメラ二本鎖ＴＣＲの融合部位を示す（２．４参照）。ジスルフィドブリッジを介して二量体化するサイトゾル外システインは、開始メチオニンに対する相対的位置によって示す。
【図８】図８は、ヒトＣＤ３ζ−鎖ｍｕｖβ−ｈｕｃβ−ｈｕＣＤ３ζに融合したキメラ二本鎖ＴＣＲの融合部位を示す（２．４参照）。ジスルフィドブリッジを介して二量体化するサイトゾル外システインは、開始メチオニンに対する相対的位置によって示す。
【図９】図９は、レトロウイルス形質導入後における、２．）に記載した構築体の「蛍光標示式細胞分取」（ＦＡＣＳ）分析を示す。形質導入から６日後における、ＯＫＴ３−活性化ＰＢＬ培養についての平均形質導入効率の例を示す。これらは、使用したＣＤ３＋リンパ球の１０〜２５％の範囲である。用いた陰性対照は、空のレトロウイルスベクターｐＢｕｌｌｅｔを含むトランスフェクション／形質導入バッチであった。
【図１０】図１０〜１２はペプチド価滴定を示し（３．４．１参照）、ここに、Ｔ２標的細胞を、１×１０−６Ｍ〜１×１０−１２Ｍの濃度シリーズにて、ｈｄｍ２−８１−８８ペプチドを外因的に負荷した。用いた参照物質は、ｈｕＣＤ８×Ａ２ＫｂトランスジェニックマウスのネズミＴ−細胞クローン３  ｈｄｍ２−８１−８８（同義：Ｐ２）であった。示された５１クロム放出テストは形質導入されたＰＢＬを用いて行い、これは、ｖβ６に向けられた磁気細胞−分取（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ）によって、９０％を超えるｖβ６＋Ｔ−細胞まで豊富化された。図１０：用いた陰性対照は非機能的一本鎖Ｔ−細胞受容体（ｎｆＴＣＲ）の構築体であり、これは、Ｔ−細胞の表面で比較的良く発現でき、それにより、磁気細胞分取によって豊富化もできたが、ＣＴＬテストでは機能性を示さなかった。
【図１１】ネズミヘテロダイマー野生型構築体ｍｕＴＣＲ／８−１８のペプチド価滴定。
【図１２】キメラヘテロダイマー構築体ｈｕＴＣＲ／１０〜２９のペプチド価滴定。
【図１３】図１３〜１５は、悪性形質転換細胞系の認識を示す。選択された標的細胞はＨＬＡ−Ａ２＋であった。用いた参照は、ｈｕＣＤ８×Ａ２Ｋｂ−トランスジェニックマウスのネズミＴ−細胞クローン３  ｈｄｍ２−８１−８８（同義：Ｐ２）であった。示された５１クロム放出テストは、ｖβ６に向けられた磁気細胞分取（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ）によって９０％を超えるｖβ６＋−Ｔ−細胞まで豊富化された形質導入ＰＢＬを用いて行った。図１３：用いた陰性対照は、非機能的一本鎖Ｔ−細胞受容体（ｎｆＴＣＲ）の構築体であり、これは、Ｔ−細胞の表面で比較的良く発現でき、それにより、磁気細胞分取によって豊富化もできたが、ＣＴＬテストでは機能性を示さなかった。
【図１４】ネズミヘテロダイマー野生型構築体ｍｕＴＣＲ／８−１８。
【図１５】キメラヘテロダイマー構築体ｈｕＴＣＲ／１０−２９。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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