(57)【要約】本発明は、核酸鎖を解析する方法に関する。本方法の基礎は、ポリメラーゼにより伸長中の核酸鎖に組み込まれた、色素で標識された個々のヌクレオチド分子の蛍光シグナルの検出である。反応は平面的表面上で行われる。個々の核酸分子が非常に多く該表面に固定化されている。これらの核酸分子はすべて同じ条件下にあり、それ故合成反応をすべての核酸分子において同時に行うことができる。
2004529650.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全体配列の重複部分配列に相当し得る長さ約５０−１０００ヌクレオチドの一本鎖核酸配列（核酸鎖、ＮＡＣｓ）の断片（ＮＡＣＦｓ）を形成し、
該ＮＡＣＦｓを、１つの均一またはいくつかの相異なるプライマーを用いるＮＡＣＦプライマー複合体の形で、反応表面上にランダムな配置で結合し、
以下のステップa)からf)を適すれば数回繰り返すことにより、ＮＡＣＦｓの相補鎖の周期的合成反応を一つまたはそれ以上のポリメラーゼを使用して実行し、
連続的サイクルのステップd)において各々の位置で検出された蛍光シグナルをＮＴｓに具体的に割り当てることにより、反応表面上の個々のＮＡＣＦプライマー複合体の相対的位置およびこれらＮＡＣＦｓの配列を決定する、
ＮＡＣｓの並行配列解析方法：
ａ)  表面上に結合したＮＡＣＦプライマー複合体に、一つまたはそれ以上のポリメラーゼ、および蛍光色素で標識された一つから四つの修飾ヌクレオチド（ＮＴｓ*）であって、少なくとも二つのＮＴｓ*を併用した場合に相異なる蛍光シグナルを測定することにより使用したＮＴｓ*を互いに区別できるようにそのＮＴｓ*に存在する蛍光色素が選択されており、伸長中の相補鎖におけるこのようなＮＴｓ*の組み込みに続いてポリメラーゼが同じ鎖にさらにＮＴ*を組み込むことができないようにその塩基において構造的に修飾されており、その蛍光色素が切断可能であり、およびその構造的修飾が切断可能な立体要求リガンドであるＮＴｓ*を含む溶液を添加し、
b)  ステップa)で得られた固定相を、相補鎖を伸長するのに適した条件下でインキュベートし、その相補鎖をいずれの場合にも１ＮＴ*ずつ伸長させ、
c)  ステップb)で得られた固定相を、相補鎖に組み込まれなかったＮＴｓ*を除去するのに適した条件下で洗浄し、
d)  それぞれの蛍光色素に特徴的なシグナルを測定することにより相補鎖に組み込まれた単一ＮＴｓ*を検出し、同時に個々の蛍光シグナルの反応表面上の相対的位置を測定し、
e)  非標識（ＮＴｓまたは）ＮＡＣＦｓを形成するため、相補鎖に添加したＮＴｓ*の蛍光色素および立体要求リガンドを切断除去し、
f)  ステップe)で得られた固定相を、蛍光色素およびリガンドを除去するのに適した条件下で洗浄する。
【請求項２】
各サイクルにおいて標識ＮＴ＊を一つだけ使用して周期的合成反応のステップａ）からステップｆ）を数回繰り返すことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
各サイクルにおいて相異なるよう標識された二つのＮＴ＊を使用して周期的合成反応のステップａ）からステップｆ）を数回繰り返すことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
各サイクルにおいて相異なるよう標識された四つのＮＴ＊を使用して周期的合成反応のステップａ）からステップｆ）を数回繰り返すことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＮＡＣｓが既知の参照配列の変異体であり、相異なるよう標識された二つのＮＴ＊および二つの非標識ＮＴｓをサイクルにおいて交互に使用して周期的合成反応のステップａ）からｆ）を数回繰り返し、参照配列と比較して全体配列を決定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
プライマー結合部位（ＰＢＳ）をＮＡＣＦｓに導入し、二本鎖ＮＡＣｓの場合には両方の相補的一本鎖にＰＢＳを一つ導入し、全てのＮＡＣＦｓについてプライマー結合部位が同一または相異なる配列を示すことを特徴とする、請求項１から５記載の方法。
【請求項７】
ＮＡＣＦｓを、ＮＡＣＦｓのプライマー結合部位（ＰＢＳｓ）に対する互いに同一または相異なる配列を示すプライマーのハイブリダイゼーションに適した条件下に溶液中でプライマーと接触させ、次いで形成されたＮＡＣＦプライマー複合体を反応表面に結合させることを特徴とする、請求項１から６記載の方法。
【請求項８】
はじめにＮＡＣＦｓを反応表面に固定化し、その後に限り、ＮＡＣＦｓのプライマー結合部位（ＰＢＳｓ）に対する互いに同一または相異なる配列を示すプライマーのハイブリダイゼーションに適した条件下にプライマーと接触させ、ＮＡＣＦプライマー複合体を形成することを特徴とする、請求項１から６記載の方法。
【請求項９】
はじめにプライマーを反応表面に固定化し、その後に限り、ＮＡＣＦｓのプライマー結合部位（ＰＢＳｓ）に対する互いに同一または相異なる配列を示すプライマーのハイブリダイゼーションに適した条件下にＮＡＣＦｓと接触させ、それによりＮＡＣＦｓを表面に結合し、ＮＡＣＦプライマー複合体を形成することを特徴とする、請求項１から６記載の方法。
【請求項１０】
伸長可能なＮＡＣＦプライマー複合体の密度が、１００μｍ２につき約１０から１００の間であることを特徴とする、請求項１から９記載の方法。
【請求項１１】
核酸配列（ＮＡＣｓ）が、全体配列の一部分の配列であり、プライマーが配列特異的プライマーであり、
全体配列の重複部分配列に相当する長さ約３０−１０００ヌクレオチドの一本鎖ＮＡＣＦｓを準備し、
得られたＮＡＣＦ分子をランダムな配置で直接平面的表面に結合し、
固定化ＮＡＣＦｓと一つまたはそれ以上の配列特異的プライマー集合体とのハイブリダイゼーション（アニーリング）を行い、個々の伸長可能なＮＡＣＦプライマー複合体の密度を１００μｍ２につき１０から１００の間とし、
以下のステップa)からf)を適すれば数回繰り返して、ＮＡＣＦｓに相補的な鎖の周期的合成反応を行い、
連続的サイクルのステップd)において各々の位置で検出された蛍光シグナルをＮＴｓに具体的に割り当てることにより、反応表面上の個々のＮＡＣＦプライマー複合体の相対的位置およびこれらＮＡＣＦｓの配列を決定することを特徴とする、請求項１記載の方法：
ａ)  結合したＮＡＣＦプライマー複合体に、一つまたはそれ以上のポリメラーゼ、および蛍光色素で標識された一つから四つの修飾ヌクレオチド（ＮＴｓ*）であって、少なくとも二つのＮＴｓ*を併用する場合に相異なる蛍光シグナルを測定することにより使用したＮＴｓ*を互いに区別できるようにそのＮＴｓ*に存在する蛍光色素が選択されており、伸長中の相補鎖におけるこのようなＮＴｓ*の組み込みに続いてポリメラーゼが同じ鎖にさらにＮＴ*を組み込むことができないようにその塩基において構造的に修飾されており、蛍光色素を伴う停止をもたらす基が切断可能であるＮＴｓ*を含む溶液を添加し、
b)  ステップa)で得られた固定相を、相補鎖を伸長するのに適した条件下でインキュベートし、その相補鎖をいずれの場合にも１ＮＴ*ずつ伸長させ、
c)  ステップb)で得られた固定相を、相補鎖に組み込まれなかったＮＴｓ*を除去するのに適した条件下で洗浄し、
d)  それぞれの蛍光色素に特徴的なシグナルを測定することにより相補鎖に組み込まれた単一ＮＴｓ*を検出し、同時に個々の蛍光シグナルの反応表面上の相対的位置を決定し、
e)  非標識（ＮＴｓまたは）ＮＡＣＦｓを形成するため、相補鎖に添加したＮＴｓ*から蛍光色素を伴う停止をもたらす基を切断除去し、
f)  ステップe)で得られた固定相を、蛍光色素を伴う停止をもたらす基を除去するのに適した条件下で洗浄する。
【請求項１２】
検出ステップ（ｄ）において以下の検出タイプ；広視野エピフルオレッセンス顕微鏡、レーザー走査蛍光顕微鏡、ＴＩＲＦ顕微鏡、を用いることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ハイブリダイゼーション（アニーリング）中の個々の配列特異的プライマーの濃度が１０ｐｍｏｌ／ｌから１μｍｏｌ／ｌの間であることを特徴とする、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
ハイブリダイゼーション（アニーリング）中の個々の配列特異的プライマーの濃度が１μｍｏｌ／ｌから１ｍｍｏｌ／ｌの間であることを特徴とする、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１５】
ＳＮＰ解析のための方法であること、および全体配列中の各ＳＮＰ位置の同定に配列特異的プライマーを使用することを特徴とする、請求項１１から１４記載の方法。
【請求項１６】
並行して解析しようとするＳＮＰ位置の数が２より多いこと、および各ＳＮＰ位置に対して配列特異的プライマーを使用することを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
構造的修飾のため用いられる立体要求リガンドが標識に使用される蛍光色素であることを特徴とする、請求項１から１６記載の方法。
【請求項１８】
反応表面が、シリコン、ガラス、セラミック、プラスチック、ゲルより成る群から選択されることを特徴とする、請求項１から１７記載の方法。
【請求項１９】
プラスチックがポリカーボネートもしくはポリスチレンまたはそれらの誘導体であることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ゲルがアガロースもしくはポリアクリルアミドゲルまたはそれらの誘導体であることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ゲルが１から２％のアガロースゲルまたは１０から１５％のポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ポリメラーゼが３’−５’エンドヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１から２１記載の方法。
【請求項２３】
ポリメラーゼが不耐熱性ウィルス、細菌、真核細胞ＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定性細菌ポリメラーゼよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から２１記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡポリメラーゼが、Sequenase Version 2、３’−５’ヌクレオチド分解活性を有さない大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、哺乳類由来ポリメラーゼベータ、TaqポリメラーゼまたはProHA-DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＮＴｓ＊がアルファ-フォスフォロチオエートＮＴｓ＊であり、ポリメラーゼが大腸菌ポリメラーゼＩのクレノーフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１から２４記載の方法。
【請求項２６】
蛍光色素が、シアニン色素、ローダミン、キサンチン、およびそれらの誘導体を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１から２５記載の方法。
【請求項２７】
ＮＡＣＦｓがランダムな配置で表面に固定化され、固定化ＮＡＣＦ分子の密度が１００μｍ２につき１０から１００の間であることを特徴とする、請求項１１から２６記載の方法を実施するための担体。
【請求項２８】
ＮＡＣＦｓがランダムな配置で表面に固定化され、固定化ＮＡＣＦ分子の密度が１００μｍ２につき１００から１，０００，０００の間であることを特徴とする、請求項１１から２６記載の方法を実施するための担体。
【請求項２９】
反応表面（固定担体）、方法の実施に必要な反応溶液、一つまたはそれ以上のポリメラーゼ、およびヌクレオチド（ＮＴｓ）を含み、ヌクレオチドの一つから四つが蛍光色素で標識されており、標識ＮＴｓがさらに構造的に修飾されて、伸長中の相補鎖におけるこのようなＮＴｓ*の組み込みに続いてポリメラーゼが同じ鎖にさらにＮＴ*を組み込むことができないようなっており（ＮＴ＊またはＮＴｓ＊）、その蛍光色素が切断可能であり、かつその構造的修飾が切断可能な立体要求リガンドであることを特徴とする、請求項１から２６記載の方法を実施するためのキット。
【請求項３０】
構造的修飾のため用いる立体要求リガンドが標識に使用する蛍光色素であることを特徴とする、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
構成要素；
ａ）二本鎖から一本鎖を形成するのに必要な試薬、
ｂ）ＰＢＳとしてＮＡＣＦｓに導入される核酸分子、
ｃ）オリゴヌクレオチドプライマー、
ｄ）蛍光色素および立体要求リガンドを切断除去するのに必要な試薬、
および／または
ｅ）洗浄溶液、
をさらに含むことを特徴とする、請求項２９または３０記載のキット。
【請求項３２】
反応表面が、シリコン、ガラス、セラミック、プラスチック、ゲルより成る群から選択されることを特徴とする、請求項２９から３１記載のキット。
【請求項３３】
プラスチックがポリカーボネートもしくはポリスチレンまたはそれらの誘導体であることを特徴とする、請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
ゲルがアガロースもしくはポリアクリルアミドゲルまたはそれらの誘導体であることを特徴とする、請求項３２記載のキット。
【請求項３５】
ゲルが１から２％のアガロースゲルまたは１０から１５％のポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする、請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
反応表面が請求項２７および２８記載の担体であることを特徴とする、請求項２９から３５記載のキット。
【請求項３７】
ＤＮＡポリメラーゼが３’−５’エンドヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項２９から３６記載の方法。
【請求項３８】
ポリメラーゼが不耐熱性ウィルス、細菌、真核細胞ＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定性細菌ポリメラーゼよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項３７記載のキット。
【請求項３９】
ＤＮＡポリメラーゼが、Sequenase Version 2、３’−５’ヌクレオチド分解活性を有さない大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、哺乳類由来ポリメラーゼベータ、TaqポリメラーゼまたはProHA-DNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項３８記載のキット。
【請求項４０】
ＮＴｓ＊がアルファ-フォスフォロチオエートＮＴｓ＊であり、ポリメラーゼが大腸菌ポリメラーゼＩのクレノーフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項２９から３９記載のキット。
【請求項４１】
蛍光色素が、シアニン色素、ローダミン、キサンチン、およびそれらの誘導体を含む群から選択されることを特徴とする、請求項２９から４０記載の方法。
【請求項４２】
式７ｅ-１）：
【化１】
2004529650.tif 000009
式７ｅ-２）：
【化２】
2004529650.tif 000010
で示されるヌクレオチド。
【請求項４３】
式７ｆ-１）：
【化３】
2004529650.tif 000011
式７ｆ-２）：
【化４】
2004529650.tif 000012
式７ｆ-３）：
【化５】
2004529650.tif 000013
式７ｆ-４）：
【化６】
2004529650.tif 000014
で示されるヌクレオチド。
【請求項４４】
式７ｇ-１）：
【化７】
2004529650.tif 000015
式７ｇ-２）：
【化８】
2004529650.tif 000016
で示されるヌクレオチド。
【請求項４５】
蛍光色素が末端アミノ基に連結していることを特徴とする、請求項４２から４４記載のヌクレオチド。
【請求項４６】
式７ｈ）：
【化９】
2004529650.tif 000017
で示されるヌクレオチド。
【請求項４７】
式７ｉ）：
【化１０】
2004529650.tif 000018
で示されるヌクレオチド。
【請求項４８】
式７ｊ）（dNTP-SS-TRITC(L14)）：
【化１１】
2004529650.tif 000019
で示されるヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項１から２６記載の方法における請求項４２から４８記載のヌクレオチドのＮＴ＊としての使用。
【請求項５０】
請求項１から２６記載の方法における図７ｋ、７Ｌ、７ｍ記載のヌクレオチドのＮＴ＊としての使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸鎖の解析方法に関する。本方法の基礎は、ポリメラーゼによって伸長中の核酸鎖に取り込まれた色素で標識された、個々のヌクレオチド分子の蛍光シグナルの検出である。この反応は平面的表面上で起こる。非常に多くの個々の核酸分子が該表面に結合している。これら核酸分子はすべて同じ条件下にあり、故にすべての核酸分子において合成反応が同時に起こり得る。
【０００２】
本方法は基本的に以下のステップを含む：
１）平面的表面への核酸鎖（ＮＡＣＦｓ）の結合およびそれに続くプライマーのハイブリダイゼーション、あるいはプライマーの結合およびそれに続くＮＡＣＦのハイブリダイゼーション（これによりＮＡＣＦｓプライマー複合体が形成される）。
２）各サイクルが以下のステップよりなる周期的合成反応の実行：
a)結合ＮＡＣＦプライマー複合体への標識ヌクレオチド（ＮＴｓ＊）およびポリメラーゼを含む溶液の添加、
b)ＮＴによる相補鎖の伸長に適した条件下の、結合ＮＡＣＦプライマー複合体と本溶液とのインキュベーション、
c)洗浄、
d)個々の分子のシグナルの検出、
e)取り込まれたヌクレオチドからの標識の除去、
f)洗浄。
３）検出された個々の分子のシグナルの解析。
４）個々のデータから得られた配列の再構築。
【０００３】
１． 略語および用語の説明
ＤＮＡ  相異なる起源および相異なる長さのデオキシ核酸 (ゲノムＤＮＡ、cＤＮＡ、ssＤＮＡ、dsＤＮＡ)
ＲＮＡ  リボ核酸 (通常mＲＮＡ)
ポリメラーゼ  伸長中のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖に相補的ヌクレオチドを組み込むことができる酵素 (例えば ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ)
dＮＴＰ - 2'-デオキシヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の基質
ＮＴＰ  リボヌクレオシド三リン酸、ＲＮＡポリメラーゼの基質
ＮＴ  天然ヌクレオチド、別段の明示がない限り通常ｄＮＴＰ。
略語「ＮＴ」は、核酸配列の長さを示すときにもまた、例えば1,000ＮＴのように使用される。この場合、「ＮＴ」はヌクレオシド一リン酸を表す。
文中、略語の場合、大部分は接尾辞「s」を用いて形成される。「ＮＴ」は例えば「ヌクレオチド（単数）」を、「ＮＴｓ」はいくつかのヌクレオチドを意味する。
ＮＴ* - 修飾ヌクレオチド、別段の明示がない限り通常ｄＮＴＰ。  ＮＴｓ*は修飾ヌクレオチド（複数）を示す。
ＮＡＣ  核酸鎖。それら本来の長さのＤＮＡまたはＲＮＡ。
ＮＡＣＦ  全体配列の一部に相当する核酸鎖断片 (ＤＮＡまたはＲＮＡ)、ＮＡＣＦｓ  核酸鎖断片（複数）。ＮＡＣＦｓを全て合わせたものが全体配列と等しくなる。このＮＡＣＦｓは、例えば断片化ステップの後に形成されたＤＮＡまたはＲＮＡ全体配列の断片であり得る。
全体配列  配列決定反応で使用した一の配列または複数の配列（通常ＮＡＣＦｓに変換される）。それらは本来一つまたはそれ以上のＮＡＣより成り得る。これに関し、全体配列は、別の配列または配列集合体（例えばmＲＮＡ、cＤＮＡ、挿入配列を有するプラスミドＤＮＡ、ＢＡＣ、ＹＡＣ）で、かつ一種類または異なる種のものの一部またはそれ同等のものを意味し得る。
プライマー結合部位 (PBS)  プライマーが結合するＮＡＣまたはＮＡＣＦ中の配列の部分。
参照配列  調べようとする配列または調べようとする複数の配列（全体配列）における偏向が決定されている既知の配列。データベースにおいて、例えばNCBIデータベースから、利用可能な配列が参照配列として使用できる。
Ｔｍ  融解温度
【０００４】
平面的表面：好ましくは以下の性質を示す表面： 1)それが、各レンズ-表面距離のレンズ位置において、同時に個々の分子いくつか、好ましくは100以上、より良くは1000以上を検出可能とする。2) 固定化された個々の分子が等焦点面に位置し、それが再現性よく調節可能である。
広視野光学的検出系  ある領域上（その領域はおよそ100μｍ2かそれ以上）に分布する個々の分子からの蛍光シグナルを同時に検出できる検出系。広視野検出光学の例は、Plan-neofluar油浸レンズ 100x NA 1.4 (Zeiss)、またはplanapochromat油浸レンズ 100x NA 1.4 (Zeiss)を有する蛍光顕微鏡Axiovert 200またはAxioplan 2e (Zeiss)；これに関して、蛍光の励起は、ランプ、例えば水銀蒸気ランプ、またはレーザーもしくはダイオードで起こすことができる。エピフルオレッセンスモード、および全反射蛍光顕微鏡（TIRF顕微鏡）またはレーザー走査顕微鏡モードの両方が使用できる。これらの広視野検出光学を本出願に使用する。
立体障害：ポリメラーゼによる伸長反応において連続して組み込まれ得ないように,
その基に結合したＮＴｓ*の性質をその化学構造によって改変する、立体要求基。
停止の定義:本出願では、修飾非切断ＮＴｓ*の組み込みの可逆的停止を停止として定める。この用語は、常套的配列決定におけるジデオキシＮＴPによる「停止」の語の通常の使用とは区別されるべきである。
停止は修飾ＮＴ*の組み込みの後に起こる。組み込まれた修飾ＮＴｓ*は、この塩基に可逆的に結合する立体基を有し、それは、ポリメラーゼにより伸長中の鎖における以降の相補的ＮＴ*の組み込みの阻害につながる。
遺伝子産物  遺伝子産物とは、その遺伝子の一次遺伝子産物である。基本的にこれらは、標的配列（または標的核酸配列）としてもまた定められる該遺伝子のＲＮＡ転写産物である。これら標的配列はまた、mＲＮＡに加えてそれら由来の一本鎖および二本鎖cＤＮＡ、cＤＮＡ由来のＲＮＡまたはcＤＮＡより増幅したＤＮＡを含む。
一塩基変異多型(SNPs)  置換（転移もしくは転換）として、または単一ＮＴの欠失もしくは挿入として起こり得る、配列中の変化。
【０００５】
２． 当業界の現状
核酸鎖配列解析は、多くの科学領域において重要な手段となっている。解析にはいくつかの方法が開発されている。
最もよく知られた方法は、サンガーによる連鎖停止物質の組み込みに基づく連鎖停止配列決定(F. Sanger et al. PNAS 1977 v. 74 p. 5463)、および核酸鎖の塩基特異的修飾および切断に基づくマキサム-ギルバート法である(A.M. Maxam and W. Gilbert PNAS 1977, v. 74 p. 560)。両方法とも多数の長さの異なる核酸鎖断片を生じる。これら断片は、ゲル中でそれらの長さに従い分離される。これと関連して、電気泳動の全ての欠点（例えば泳動時間が長いこと、一回で決定できる配列の距離が比較的短いこと、一回に並行してできる数が限られること、および比較的多量のＤＮＡが必要なこと）が許容されなければならない。これらの方法は非常に手間がかかり遅い。
配列決定の更なる方法は、核酸鎖と短いオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づく。この方法においては、完全配列を決定するのに特定の長さのオリゴヌクレオチドがいくつ存在すべきかを、数学的方法により計算する(Z.T. Strezoska et al. PNAS 1991 v. 88 p. 10089 RS Drmanac et al. Science 1993 v. 260 p. 1649)。この方法もまたいくつかの問題に悩まされる：一回に一配列しか決定できず、二次構造がハイブリダイゼーションを阻害し、かつ配列の反復が正しい解析を妨げる。
【０００６】
配列決定の別の方法が、いくつかのチームにより開発されている（例えば、Dower US Patent 5.547.839、Canard et al. US Patent 5.798.210、Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999 v. 18 p. 1021 Metzker et al. NAR 1994 v. 22 p. 4259、Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999 v. 18 p. 197)。この方法は、ＢＡＳＳ (Base Addition Sequencing Scheme)またはＳＢＳ (Sequencing by Synthesis)と略される。この方法においては、非常に多数の同一一本鎖ＤＮＡ片が表面上の規定の位置に固定され、これら多数の同一ＤＮＡ断片すべてからのシグナルが解析される。ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含む溶液をこの固定化ＤＮＡに添加することで相補鎖が合成できる。ポリメラーゼはこれに関して段階的に働くことになる：すなわち、単一のヌクレオチドのみが各ステップで組み込まれる。続くサイクルでポリメラーゼが次のヌクレオチドを組み込むとすぐに後のものが検出される。この方法においては、デオキシリボースの３'ＯＨ基が修飾されたヌクレオチドが使用された。方法中の個々のステップを数少なくすることに成功したにも関わらず、それは機能的方法へと発展しなかった。これはおそらく、例えば、以下の事実による：相補鎖の合成中、合成の脱同調が非常にすばやく起こり、それ故各ステップで不備が蓄積する。このためほんの短い断片しか配列決定できない。記載したＢＡＳＳ法はすべて個々の分子の検出に基づいていないことは強調されるべきである。かわりに、規定の位置に固定された多数の同一分子からシグナルが記録される。これに関しては、「個々の分子」および「分子」なる用語の使用は、互いに分離された個々の分子ではなく多数の同一分子より成る集合体を対象とするものである。まさに同様に、これら分子は同じ配列を有する。
【０００７】
更なる問題が３'位で修飾されたヌクレオチドによってもたらされる。一方では、ヌクレオチドのこの位置に大きな置換基が結合すると、多くの場合、ポリメラーゼによる組み込み反応が妨げられる。他方ポリメラーゼは３'位の修飾を多数切断できる。
それゆえ本発明の目的は、上記方法の欠点を示さず、とりわけ、より費用がかからず、より速く、かつより効率的な核酸配列解析を可能とする、核酸鎖の配列解析法を提供することにある。特に、該方法は多数の配列を並行して決定できるはずである。従ってそれは、例えば一回での非常に長い核酸鎖（数Ｍｂ）の解析または多数の短い鎖における変異体解析（変異解析、ＳＮＰ解析）に使用できる。
【０００８】
３．簡単な説明
本発明の目的は、核酸配列（核酸鎖、ＮＡＣｓ）の並行配列解析のための方法により、本発明に従い達成されるが、その方法においては、
全体配列の重複部分配列に相当する約５０−１０００ヌクレオチドの長さの一本鎖ＮＡＣｓの断片（ＮＡＣＦｓ）を生産し、
ＮＡＣＦｓが、一つの均一な、またはいくつかの異なったプライマーを用いて、ＮＡＣＦプライマー複合体の形でランダムな配置で反応表面上に結合し、
ＮＡＣＦｓの相補鎖の周期的合成反応を、一つまたはそれ以上のポリメラーゼを用いて以下の方法により実行する：
ａ)表面上に結合したＮＡＣＦプライマー複合体に、一つまたはそれ以上のポリメラーゼ、および、蛍光色素で標識された一つから四つの修飾ヌクレオチド（ＮＴｓ*）であって、少なくとも二つのＮＴｓ*を併用した場合に相異なる蛍光シグナルを測定することにより使用したＮＴｓ*を互いに区別できるようにそのＮＴｓ*に存在する蛍光色素が選択さされており、伸長中の相補鎖におけるこのようなＮＴｓ*の組み込みに続いてポリメラーゼが同じ鎖にさらにＮＴ*を組み込むことができないようにその塩基において構造的に修飾されており、その蛍光色素が切断可能であり、かつその構造的修飾が切断可能な立体要求リガンドであるＮＴｓ*を含む溶液を添加し、
b)ステップa)で得られた固定相を、相補鎖を伸長するのに適した条件下でインキュベートし、その相補鎖をいずれの場合にも１ＮＴ*ずつ伸長させ、
c)ステップb)で得られた固定相を、相補鎖に組み込まれなかったＮＴｓ*を除去するのに適した条件下で洗浄し、
d)それぞれの蛍光色素に特徴的なシグナルを測定することにより相補鎖に組み込まれた単一ＮＴｓ*を検出し、同時に測定している個々の蛍光シグナルの反応表面上の相対的位置を決定し、
e)非標識（ＮＴｓまたは）ＮＡＣＦｓを形成するため、相補鎖に添加したＮＴｓ*の蛍光色素および立体要求リガンドを切断除去し、
f)ステップe)で得られた固定相を、蛍光色素およびリガンドを除去するのに適した条件下で洗浄し、
ステップa)からf)を適すれば数回繰り返し、
連続的サイクルのステップd)において各々の位置で検出された蛍光シグナルをＮＴｓに具体的に割り当てることにより、反応表面上の個々のＮＡＣＦプライマー複合体の相対的位置およびこれらＮＡＣＦｓの配列を決定する。
【０００９】
ＮＡＣｓの全体配列は、例えば、決定された部分配列から定められる。これに関し、並行配列解析は、均一なＮＡＣ集合体またはいくつかの異なったＮＡＣ集合体に由来する多数のＮＡＣＦ（例えば１，０００，０００から１０，０００，０００）の同時配列解析を意味すると解される。
ＮＡＣｓの全体配列を形成するため、例えば市販のプログラムによる新規配列決定において得られた重複部分配列の集合体を統合することができる(Huang et al. Genom Res. 1999 v. 9 p. 868, Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21, Bonfield et al. NAR 1995 v. 23 p. 4992, Miller et al. J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)。
既知の参照配列の変異体解析において、変異または一塩基多型は、得られた重複部分配列を参照配列と比較することにより明らかにできる。
本発明の具体的態様に従い、ａ）各サイクルで標識ＮＴ*を一つだけ使用するか、ｂ）各サイクルで二つの異なる標識ＮＴ*を使用するか、またはｃ）各サイクルで四つの異なる標識ＮＴ*を使用して、周期的合成のステップa)からf)を数回繰り返すことにより、該方法を実施できる。
【００１０】
ＮＡＣｓが既知の参照配列の変異体であるならば、二つの異なる標識をしたＮＴｓ*および二つの非標識ＮＴｓをサイクル中で交互に使用して、標識周期的合成反応のステップa)からf)を数回繰り返し、全体配列を参照配列と比較して決定することによってもまた、この方法を実施できる。
本発明の目的はさらに、図７e、７f、および７gに図示されるヌクレオチド、および、例えば末端アミノ基に蛍光色素が結合した対応する標識ヌクレオチド、または図７h、７iまたは７jに図示される標識ヌクレオチドより成る。
本発明の目的はさらに、図７e、７f、および７gに図示されるヌクレオチドおよび蛍光色素で標識された対応するヌクレオチドの、本発明による方法についての使用である。
本発明の目的はさらに、その塩基が修飾されたＮＴｓ*（例えば、図７k、７Lおよび７m参照）および蛍光色素で標識された対応するヌクレオチドの、本発明による方法についての使用である。
【００１１】
本発明の目的はさらに、この方法を実行するためのキット（反応表面、方法を実行するために必要な反応溶液、一つまたはそれ以上のポリメラーゼ、およびヌクレオチド（ＮＴｓ）（一つから四つが蛍光色素で標識されており、伸長中の相補鎖におけるこのようなＮＴ*の組み込みに続いてポリメラーゼが同じ鎖にさらにＮＴ*を組み込むことができないようにさらに構造的に修飾されており、その蛍光色素が切断可能で、かつその構造的修飾は切断可能な立体要求リガンドである（ＮＴ*またはＮＴｓ*））を含む）である。ヌクレオチドは好ましくは本発明に従う前述のヌクレオチドである。
本発明の具体的態様に従い、このキットはさらに、二本鎖から一本鎖を生産するのに必要な試薬、ＮＡＣＦｓにＰＢＳとして導入される一本鎖核酸分子、オリゴヌクレオチドプライマー、蛍光色素および立体要求基を切断除去するのに必要な試薬および／または洗浄液を含む。
本発明による方法は、核酸配列を決定するのに役立ち、遺伝学の様々な領域において使用可能である。これらは特に、未知の長い配列の決定、配列多型の解析および点突然変異および非常に多くの遺伝子配列の並行解析を含む。
解析しようとする物質（一本鎖および二本鎖核酸配列）の調製は課題の種類に依存し、かつ、長い核酸鎖から比較的小さい一本鎖核酸鎖断片（ＮＡＣＦｓ）の集合体を形成し、これら断片を配列決定反応の開始に適したプライマーとともに（ＮＡＣＦプライマー複合体）提供し、それらを平面的表面上に固定することを目的をする。
【００１２】
これに関し、個々のＮＡＣＦｓは、これら分子において酵素反応が起こり得るように平面的表面上に固定される。基本的に、様々な種類の固定化が可能であり、それは、目的、ＮＡＣの性質および反応に用いられるポリメラーゼに依存する。固定化または結合の間、ＮＡＣＦｓは表面上にランダムに分布し、すなわち、それ故に個々の鎖を確実に正確に位置させる必要はない。ＮＡＣＦプライマー複合体は、ＮＡＣＦまたはプライマーを介して表面に結合できる。これに関し、ＮＡＣＦプライマー複合体は、個々のＮＡＣＦに組み込まれたＮＴ*からその後検出されるシグナルを確実にはっきりと割り当てられるような密度で、表面に固定しなければならない。
ＮＡＣＦｓの調製に続き、表面上に固定されたすべてのＮＡＣＦプライマー複合体分子で配列決定反応が開始する。個々の結合ＮＡＣＦのそれぞれに対する相補鎖の合成が、配列決定の基礎となる。これに関し、標識ＮＴ*は新規に合成された鎖に組み込まれる。ポリメラーゼは、伸長中の鎖に標識ＮＴ*を一つだけ組み込む。これは、停止をもたらす立体要求基をそのＮＴｓ*に可逆的に結合することによりなされる。それにより、さらに標識ＮＴ*を組み込むことが不可能になる。この立体要求基は、蛍光色素であることが好ましい。
【００１３】
配列決定反応はいくつかのサイクルで進行する。１サイクルは以下のステップを含む：
a)結合ＮＡＣＦプライマー複合体への標識ヌクレオチド（ＮＴｓ＊）およびポリメラーゼを含む溶液の添加、
b)ＮＴによる相補鎖の伸長に適した条件下の、結合ＮＡＣＦプライマー複合体と本溶液とのインキュベーション、
c)洗浄、
d)個々の分子のシグナルの検出、
e)取り込まれたヌクレオチドからの標識化の除去、
f)洗浄。
適すれば、サイクル（aからf)を繰り返す。
サイクル中のステップb)の反応条件は、ポリメラーゼが、１サイクルで配列決定反応に関与するＮＡＣＦｓ（伸長可能なＮＡＣＦプライマー複合体）の５０％以上、好ましくは９０％以上に標識ＮＴ*を組み込むことができるように選択する。
これに関し、実行するサイクル数は、それぞれの問題のタイプに依存し、理論的には無限であり、好ましくは２０から５０００の間である。
固定された各ＮＡＣＦの場合、その特異的配列は、組み込まれたＮＴｓ＊の配列からその後決定される。重複ＮＡＣＦ配列から再構築できる
【００１４】
ある具体的態様においては、本来のＮＡＣ配列は重複ＮＡＣＦ配列から再構築できる（自動化ＤＮＡ配列決定および解析(”Automated ＤＮＡ sequencing and analysis” p. 231 et seq. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al Genom Res. 1999 v. 9 p. 868, Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21, Bonfield et al. NAR 1995 v. 23 p. 4992, Miller et al. J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)。これに関し、ＮＡＣＦｓ配列中の一致／重複は、ＮＡＣＦ配列集合体の全体において検索する。ＮＡＣＦは、これらの一致／重複を介して、例えば以下のように一列に並べることができる：
2004529650.tif 000003
既知の配列を配列決定するとき、配列既決定断片中の300bp以上の長さを得るのに価値があることが実際証明されている。これにより、ショットガン法において真核生物から得たゲノムの配列を決定することができる。
これに関し、本方法における誤りは、様々な手段により検出し、訂正できる。本方法の全てのステップが幅広く自動化できる。
前述のＢＡＳＳ法を上回るいくつかの利点が、個々の分子に働くことから生じる：
１. 分子が個々に検出されるので、集合体における脱同調の結果としてシグナルに誤りが生じる危険性がない。各固定ＮＡＣＦについてそれ自身の配列が決定される。その結果、近隣分子において合成がさらに進行してるか、または脱落してしまったかは重要でない。
２. シグナルが個々の分子から発され、空間的に規定された集合体から発されるのではないため、分子を表面上に規定の配置で固定する必要がない（ＢＡＳＳ法にはこれが必要である）。
【００１５】
４．詳しい説明
４．１  反応の一般的原理
反応の一般的原理は、長さ数ＭｂのＤＮＡ断片の配列決定を用いた例により、以下に図示される。ショットガン原理が核酸配列の配列決定および再構築の基礎である(”Automated DNA sequencing and analysis” p. 231 et seq. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v. 9 p. 868, Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21, Bonfield et al. NAR 1995 v. 23 p. 4992, Miller et al. J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)。これに関し、ＤＮＡの長い断片の配列は、小さなＤＮＡ断片の配列決定およびその後の再構築により決定される。好ましくは長さ５０から１０００ｂｐの断片に分解することにより、解析しようとする材料（1）を配列決定反応のため調製する（2）。その後、各断片をプライマー結合部位およびプライマーと共に準備する（3）。次にこの様々なＤＮＡ断片の混合物を平面的表面上に固定する（4）。非結合ＤＮＡ断片を洗浄ステップにより除去する。その後、全反応表面上で配列決定反応を行う。この反応は周期的に進行する。サイクルのステップ１において、蛍光色素で標識されたＮＴ＊が伸長中の鎖に組み込まれる：ポリメラーゼが、各サイクルにおいて標識ＮＴ＊を一つだけ伸長中の鎖に組み込めるように、反応を調節する。これは、停止をもたらす可逆的結合基を有するＮＴｓ＊を使用することで達成される。それにより、さらに標識ＮＴ＊を組み込むことが不可能となる。ポリメラーゼおよび標識ＮＴｓ＊は、この反応中で同時に用いられる（5）。その後、反応混合物を除去し、表面を適切に洗浄する（6）。次に検出ステップが続く（7）：表面を単一分子検出に適した装置（光源、顕微鏡、カメラ、走査台、制御および画像認識または画像処理ソフトウェアを伴うコンピューターより成る）でスキャンし、、組み込まれた個々の標識ＮＴ＊のシグナルを同定する。検出ステップの後、組み込まれた全てのＮＴｓ＊から、標識および停止をもたらす基を除去する（8）。続く洗浄ステップの後、新しいサイクルが開始可能である。再構築をショットガン原理に従い行うならば、より大きい本来のＤＮＡ配列（例えば長さ数MbのＤＮＡ断片）を再構築するために、ＤＮＡ断片は長さ数百ＮＴでなければならない(”Automated ＤＮＡ sequencing and analysis” p. 231 et seq. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v. 9 p. 868, Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21, Bonfield et al. NAR 1995 v. 23 p. 4992, Miller et al. J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)。１サイクルにつきＮＴ＊が一つだけ組み込まれるので、配列決定を目的としては少なくとも３００サイクルが必要である。
【００１６】
４．２  材料の選択
本発明による方法を用いて、あらかじめ選択されたＤＮＡ配列（例えば、ＹＡＣ、ＰＡＣまたはＢＡＣベクター中のゲノムのクローン化部分 (R. Anand et al. NAR 1989 v. 17 p. 3425, H. Shizuya et al. PNAS 1992 v. 89 p. 8794, ”Construction of bacterial artificial chromosome libraries using the modified PAC system” in ”Current Protocols in Human genetics” 1996 John Wiley & Sons Inc.)および前もって選択されていないＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ、cＤＮＡ混合物）の両方を解析できる。事前選択を通して、大量の遺伝情報から、例えばゲノムまたは遺伝子産物の集合体から得られる配列部分のような適切な情報を前もってふるい分け、それによって解析する配列数を限定できる。
【００１７】
４．３  材料の調製
材料調製の目的は、好ましくは長さ５０−１０００ＮＴｓで、単一のプライマー結合部位およびハイブリダイズしたプライマーを有する結合一本鎖ＮＡＣＦｓ（結合ＮＡＣＦプライマー複合体）を得ることである。これらＮＡＣＦプライマー複合体は、例えば、図２に示される構造を有する。特に、高度に変化に富む構造がこの一般構造から誘導できる。より明確にするため、次に、個々にまたは組み合わせて使用可能な前述の方法と共に、いくつかの例が以下に続く。
【００１８】
４．３．１  短核酸鎖断片（５０−１０００ＮＴｓ）の生産（断片化ステップ）
全体配列の部分配列に相当する断片が得られるように、ＮＡＣｓの断片化を行うことが重要である。これは、切断産物として相異なる長さの断片がランダムな分布で形成される方法により達成できる。本発明に従い、いくつかの方法により、例えば、出発材料を超音波、または、例えば非特異的エンドヌクレアーゼ混合物のようなエンドヌクレアーゼ(”Molecular cloning” 1989 J. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press)により断片化することによって、核酸鎖断片（ＮＡＣＦｓ）を生産することができる。本発明によれば、超音波断片化が好ましい。平均長１００ｂｐから１ｋｂの断片が形成されるように条件を調節できる。その後、クレノーフラグメント（大腸菌ポリメラーゼI）またはＴ4-ＤＮＡポリメラーゼ(”Molecular cloning” 1989 J. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press)によりこれら断片の末端を埋める。
加えて、相補的短ＮＡＣＦｓは、長ＮＡＣより任意選択プライマーを用いて合成できる。この方法は特に、遺伝子配列の解析において好まれ、この場合、任意選択プライマーおよび逆転写酵素を伴うｍＲＮＡにおいて一本鎖ＤＮＡ断片が形成される（Zhang-J et al. Biochem. J. 1999 v. 337 p. 231, Ledbetter et al. J. Biol. Chem. 1994 v. 269 p. 31544, Kolls et al. Anal. Biochem. 1993 v. 208 p. 264, Decraene et al. Biotechniques 1999 v. 27 p. 962)。
【００１９】
４．３．２  ＮＡＣＦにおけるプライマー結合部位の導入
プライマー結合部位（ＰＢＳ）は、ＮＡＣＦに対するプライマーの選択的結合を許容することを意味する配列部分である。
ある態様においては、プライマー結合部位が異なる場合があり、故にいくつかの異なるプライマーを使用しなければならない。この場合、全体配列の特定の配列部分が、特定のプライマーに対する天然のＰＢＳｓとしての役割を果たし得る。この態様は、既知のSNP部分の検討に特に適している（実施例５「配列特異的プライマーによるＳＮＰ解析」参照）。
別の態様においては、解析を単純化するため、均一なプライマー結合部位が全てのＮＡＣＦｓに存在することが好ましい。本発明の好ましい態様に従い、それゆれ、プライマー結合部位をＮＡＣＦｓにさらに導入する。こうして、構造の均一なプライマーが反応に使用できる。
本態様は以下に詳しく記載される。
プライマー結合部位の組成は限定されない。その長さは２０から５０ＮＴｓの間であることが好ましい。プライマー結合部位は、例えばＮＡＣＦを固定するための機能基を有することができる。この機能基は、例えばビオチン基であってよい。
均一なプライマー結合部位の導入の例として、ＤＮＡ断片におけるライゲーションおよびヌクレオチドテーリングを以下に記載する。
【００２０】
a)ライゲーション
この工程では、プライマー結合部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を使用する（図３a）。これを市販のリガーゼによりＤＮＡ断片に結合する(”Molecular cloning” 1989 J. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press)。プライマー結合部位が一つだけＤＮＡ断片に結合することが重要である。これは、例えば両鎖においてオリゴヌクレオチド複合体の片側を修飾することにより達成される（図３b）。ライゲーション後またはそれに続く変性後の結果は、図３bおよび図３dに示す。オリゴヌクレオチド複合体上の修飾基は固定化に役立ち得る。このようなオリゴヌクレオチド複合体の合成および修飾は、標準化された教授に従い行うことができる。例えば、ＤＮＡ合成機380A Applied Biosystemsが合成に使用できる。しかしながら、特定の組成の修飾済または未修飾オリゴヌクレオチドもまた応用合成物として、例えばMWG-Biotech GmbH, Germanyから市販されている。
b)ヌクレオチドテーリング
オリゴヌクレオチドとのライゲーションのかわりに、末端デオキシヌクレオチド転移酵素によりいくつか（例えば１０から２０の間）のヌクレオチド一リン酸をss-ＤＮＡ断片の３’末端に結合でき(”Molecular cloning” 1989 J. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press, ”Method in Enzymology” 1999 v. 303, pp. 37-38)、それは例えばいくつかのグアノシン一リン酸である（(Ｇ)n-テーリングと呼ばれる）。形成される断片はプライマーと結合するのに使用され、この例においては(Ｃ)nプライマーである。
【００２１】
４．３．３  一本鎖調製
一本鎖ＮＡＣＦｓが配列決定反応に必要である。出発材料が二本鎖形態で存在する場合、二本鎖ＤＮＡから一本鎖形態を生産するにはいくつかの方法がある（例えば、熱変性またはアルカリ変性）(”Molecular cloning” 1989 J. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press)。
【００２２】
４．３．４  配列決定反応のためのプライマー
これは、ＮＡＣＦの単一の位置での開始を可能とする機能を有する。それは、ＮＡＣＦ中のプライマー結合部位に結合する。プライマーの組成および長さは限定されない。開始機能とは別に、プライマーはまた、例えば反応表面への結合の構築のような別の機能を担うことができる。プライマーがそれぞれのポリメラーゼによる配列決定反応の開始を可能とするように、プライマー結合部位の長さおよび組成にプライマーを合わせなければならない。
相異なるプライマー結合部位（例えば本来の全体配列中の天然のプライマー結合部位）を使用するとき、それぞれのプライマー結合部位に配列特異的なプライマーを使用する。この場合、プライマー混合物を配列決定に用いる。
均一なプライマー結合部位、例えばライゲーションによりＮＡＣＦｓに結合したプライマー結合部位、の場合、均一なプライマーを使用する。
プライマーの長さは６から１００ＮＴｓの間であることが好ましく、理想的には、１５から３０ＮＴｓの間である。プライマーは、ＮＡＣＦを固定化するのに役立つ機能基を有することができ、例えばそのような機能基はビオチン基である（固定化についての節参照）。それは配列決定反応を阻害すべきでない。このようなプライマーの合成は、例えばＤＮＡ合成機380 A Applied Biosystemsにより行うことができ、あるいは例えばMWG-Biotech GmbH, Germanyのような市販業者によって応用合成として行われ得る。
【００２３】
ハイブリダイゼーションに先立って、プライマーは様々な技術により表面上の解析しようとするＮＡＣＦｓに固定でき、または、表面上で直接合成できる（例えば以下に従う：McGall et al. US Patent 5412087, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, ”Microarray biochip technology” 2000 M. Schena Eaton Publishing, ”ＤＮＡ Microarrays” 1999 M. Schena Oxford University Press, Fodor et al. Science 1991 v. 285 p. 767, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v. 24 p. 3142, Ghosh et al. NAR 1987 v. 15 p. 5353, Gingeras et al. NAR 1987 v. 15 p. 5373, Maskos et al. NAR 1992 v. 20 p. 1679）。
プライマーは、例えば１００μｍ2につき１０−１００、１００μｍ2につき１００-１０，０００、または１００μｍ2につき１０，０００-１，０００，０００の密度で表面上に結合する。
プライマーまたはプライマー混合物を、それがプライマー結合部位に選択的に結合するようなハイブリダイゼーション条件下、ＮＡＣＦｓとインキュベートする。このプライマーハイブリダイゼーション（アニーリング）は、ＮＡＣＦｓの表面への結合の前（１）、間（２）、または後（３）に行うことができる。ハイブリダイゼーション条件の最適化は、プライマー結合部位およびプライマーの正確な構造に依存し、Rychlik et al. NAR 1990 v. 18 p. 6409に従い計算できる。これらのハイブリダイゼーション条件は、以下では標準化ハイブリダイゼーション条件として示される。
全ＮＡＣＦｓに共通する既知構造のプライマー結合部位が、例えばライゲーションにより導入される場合、均一構造のプライマーが使用できる。プライマー結合部位は、その３’末端に、例えば固定化に役立つ機能基を有することができる。この基は、例えばビオチン基である。プライマーはプライマー結合部位に相補的な構造を有する。
プライマー結合部位およびプライマーの例を以下に示す：
2004529650.tif 000004
【００２４】
４．３．５  ＮＡＣＦプライマー複合体の表面への固定（ＮＡＣＦｓの結合または固定化）
固定（固定化）の目的は、周期的酵素的配列決定反応が起こり得るように、ＮＡＣＦプライマー複合体を適した平面的表面上に固定することである。これは例えばプライマー（上記参照）またはＮＡＣＦを表面に結合することにより行える。
ＮＡＣＦプライマー複合体の固定におけるステップの順序は変化してよい：
１）はじめに溶液中でハイブリダイゼーション（アニーリング）によりＮＡＣＦプライマー複合体を形成し、その後表面へ結合できる。
２）はじめにプライマーを表面に結合し、その後ＮＡＣＦｓを結合プライマーにハイブリダイズし、ＮＡＣＦプライマー複合体を形成できる（ＮＡＣＦｓは間接的に表面に結合）。
３）はじめにＮＡＣＦｓを表面に結合し（ＮＡＣＦｓは直接表面に結合）、次のステップでプライマーをこれら結合ＮＡＣＦｓにハイブリダイズし、ＮＡＣＦプライマー複合体を形成できる。
それゆえ、表面に対するＮＡＣＦｓの固定化は直接的または間接的結合により行える。
本目的については、表面および反応表面は、別の意味が特に示されていなければ同一の概念として考えられるべきである。いずれの材料の固層表面でも反応表面の役目を果たす。この材料は、酵素反応に対し不活性で、かつ検出を妨げないことが好ましい。シリコン、ガラス、セラミック、プラスチック（例えばポリカーボネートまたはポリスチレン）、金属（金、銀、またはアルミニウム）またはこれら機能的要求を満たす他の材料が使用できる。表面は変形可能でないことが好ましく、なぜならそうでなければ繰り返し検出するとシグナルの歪みが予想されるからである。
【００２５】
ゲル様固層（ゲル表面）を使用する場合、このゲルは例えばアガロースまたはポリアクリルアミドゲルであってよい。ゲルは、分子量５０００Ｄａ未満の分子を自由に通せることが好ましい（例えば、１から２％のアガロースゲルまたは１０から１５％のポリアクリルアミドゲルを使用できる）。このようなゲル表面は、表面に対するＮＴ*の非特異的結合が他の固層表面と比較してかなり低くしか起こらないという利点を有する。表面上にＮＡＣＦプライマー複合体が結合するので、組み込まれたＮＴ*の蛍光シグナルの検出が可能である。遊離ＮＴ*はゲル材料に結合しておらず、従って固定化されていないため、それらのシグナルは検出できない。ゲルは固体表面上に連結していることが好ましい（図５）。この固体表面は、シリコン、ガラス、セラミック、プラスチック（例えばポリカーボネートまたはポリスチレン）、金属（金、銀、またはアルミニウム）または他の材料であってよい。ゲルの厚さは０．１ｍｍ以下であることが好ましい。ゲル厚さはレンズの単一物体深度より大きいことが好ましく、それにより非特異的に固体表面に結合したＮＴｓ*が最終的に焦点面に存在してしまわず、それ故に検出される。物体深度が例えば０．３μｍの場合、ゲル厚さは１μｍから１００μｍの間であることが好ましい。表面は、連続表面として、または個々の小さい構成要素（例えばアガロースビーズ）により構成される非連続表面として形成できる（図５b）。反応表面は、必要数のＮＡＣＦｓを対応する密度で固定化できるのに十分な程大きくなければならない。反応表面は、好ましくは２０ｃｍ2を超えないべきである。
【００２６】
様々なサイクルステップで、表面上での様々な反応液の交換が必要となる。反応表面は反応槽の一部を形成することが好ましい。言い換えれば、反応槽は流動装置を有する反応機器の一部を形成することが好ましい。流動装置が反応槽における溶液の交換を可能とする。交換は、コンピューターにより、または手動で制御されるポンプ装置により行うことができる。これに関し、表面が乾燥しきらないことが重要である。反応槽の容量は、５０μｌ未満であることが好ましい。理想的には、その容量は１μｌ未満である。このような流動系の例は、図６に示される。
【００２７】
ＮＡＣＦプライマー複合体の表面上での固定がＮＡＣＦｓを介して起こる場合、これは例えばＮＡＣＦｓが二つの鎖末端の一方で結合して起こり得る。これは、対応する共有結合、アフィン結合、または他の結合により達成できる。核酸固定化の多くの例が知られている(McGall et al. US Patent 5412087, Nikiforov et al. US Patent 5610287, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, ”Microarray biochip technology” 2000 M. Schena Eaton Publishing, ”ＤＮＡ Microarrays” 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v. 198, p. 138, Allemand et al. Biophysical JouＲＮＡl 1997, v. 73, p. 2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v. 71, p. 279, Osborne et al. Analytical Chemistry 2000, v. 72, p. 3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v. 24 p. 3142, Ghosh et al. NAR 1987 v. 15 p. 5353, Gingeras et al. NAR 1987 v. 15 p. 5373, Maskos et al. NAR 1992 v. 20 p. 1679)。固定はまた、例えばＮＡＣＦｓを含む試料を平面的表面上で乾燥させることによる非特異的結合によっても、達成できる。
ＮＡＣＦｓは、例えば１００μｍ2につき１０−１００ＮＡＣＦｓ、１００μｍ2につき１００-１０，０００、または１００μｍ2につき１０，０００-１，０００，０００の密度で表面上に結合する。
検出に必要な伸長可能なＮＡＣＦプライマー複合体の密度は、１００μｍ2につき約１０−１００である。それは、遺伝子産物に対するプライマーのハイブリダイゼーションの前、間、または後に達成できる。
【００２８】
例として、ＮＡＣＦプライマー複合体を結合するいくつかの方法を、以下にさらに詳しく記載する：ある態様においては、ＮＡＣＦｓの固定化は、ビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジン結合を介して起こる。これに関し、アビジンまたはストレプトアビジンは表面に共有結合し、プライマーの５’末端がビオチンを含む。（溶液中における）標識プライマーのＮＡＣＦｓとのハイブリダイゼーションに続き、これらはアビジン／ストレプトアビジンで覆われた表面上に固定される。ビオチンで標識されたハイブリダイゼーション産物の濃度および表面と本溶液とのインキュベーションの持続時間は、この場面により配列決定反応に適した密度が達成されるように選択する。
別の好ましい態様においては、配列決定反応に適したプライマーは、配列決定反応の前に、適した方法により表面上に固定される（上記参照）。それについて、各々が１ＮＡＣＦにつきプライマー結合部位を一つ有する一本鎖ＮＡＣＦｓを、ハイブリダイゼーション条件（アニーリング）のもとインキュベートする。これに関し、それらは固定プライマーに結合し、それにより結合し（間接的結合）、プライマーＮＡＣＦ複合体を形成する。一本鎖ＮＡＣＦｓの濃度およびハイブリダイゼーション条件は、１００μｍ2につき１０-１００の伸長可能ＮＡＣＦプライマー複合体の配列決定に適した固定化密度が達成されるように選択する。ハイブリダイゼーション後、非結合ＮＡＣＦｓを洗浄ステップで除去する。この態様においては、所望のＮＡＣＦプライマー複合体密度がより速く形成されるのでプライマー密度の高い表面が好ましく、それは例えば１００μｍ2につき約１，０００，０００プライマーかさらにそれより高い密度で、この場合、一部のプライマーにしかＮＡＣＦｓは結合しない。
【００２９】
別の態様においては、ＮＡＣＦｓを表面に直接結合し（上記参照）、その後ハイブリダイゼーション条件下プライマーとインキュベートする。１００μｍ2につき約１０−１００ＮＡＣＦの密度で、全ての利用可能なＮＡＣＦｓをプライマーと共に提供し、それらを配列決定反応に利用できるようにすることが試みられるであろう。これは、例えばプライマー濃度を高くすることで達成でき、例えば１から１００ｍｍｏｌ／ｌである。表面上の固定ＮＡＣＦｓの密度が高い（例えば１００μｍ2につき１０，０００−１，０００，０００）場合、光学検出に必要とされるＮＡＣＦプライマー複合体の密度は、プライマーハイブリダイゼーション中に達成できる。これに関し、プライマーが固定化ＮＡＣＦｓの一部にしか結合しないようにハイブリダイゼーション条件（例えば温度、時間、緩衝液、プライマー濃度）を選択する（実施例５、６参照）。
固層（例えばシリコンまたはガラス）の表面を固定化に使用する場合、ブロッキング溶液は、各サイクルにおいてステップ（ａ）の前に表面に加えられることが好ましく、それにより、表面におけるＮＴｓ＊の非特異的吸収を防ぐことができる。ブロッキング溶液についてのこれらの条件は、例えばｐＨ８から１０の間のアルブミン溶液（ＢＳＡ）により満たされる。
【００３０】
４．４  ポリメラーゼの選択
基本的に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼの全てが、ポリメラーゼとして適しており（ＤＮＡ-Replication” 1992 Ed. A. Kornberg, Freeman and company NY)、例えば”Sequenase Version 2” タイプの改変Ｔ７ポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ＤＮＡ ポリメラーゼ Iの3'-5' エキソヌクレアーゼフリークレノーフラグメント(Amersham Pharmacia Biotech)、様々な起源のポリメラーゼベータ (Animal Cell ＤＮＡ Polymerases” 1983, Fry M.、CRC Press Inc.、Chimerxより市販) 例えば Taq ポリメラーゼ(GibcoBRL)のような熱安定性ポリメラーゼ、proHATM ポリメラーゼ (Eurogentech)である。
既存の３’−５’エキソヌクレアーゼを抑制する反応条件を選択するか、または組み込み反応へＮａＦを添加すれば、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが使用可能であり（例えば大腸菌ポリメラーゼ I のクレノーフラグメント)、それは例えばクレノーフラグメントにおいては低ｐＨ（ｐＨ６．５）である(Lehman and Richardson, J. Biol. Chem. 1964 v. 239 p. 233)。別の可能性は、フォスフォロチオエート化合物とともにＮＴｓ＊を使用することにある(Kunkel et al. PNAS 1981, v. 78 p. 6734)。この場合、組み込まれたＮＴｓ＊は、ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼによる攻撃を受けない。これらのポリメラーゼ型は全て、以下「ポリメラーゼ」と示される。
【００３１】
４．５  化学
４．５．１  一般原理
個々の核酸分子についての高度並行配列解析（１０，０００，０００までのＮＡＣＦ配列）に関する配列決定反応には、組み込まれた各ＮＴ＊を同定することが重要である。これには、各サイクルにつき単一のＮＴ＊のみが核酸鎖に組み込まれることが必要である。ポリメラーゼが同じサイクルでいくつかのＮＴｓ＊を連続的に組み込むと、これが配列決定における誤りにつながる。このため、ＮＴｓ＊の組み込みは調節されなければならない。
例えば、ＢＡＳＳ法において可逆的３’−ＯＨ修飾ＮＴｓが示されている(Dower US Patent 5.547.839, Canard et al. US Patent 5.798.210, Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, v. 18 p. 1021, Metzker et al. NAR 1994, v. 22, p. 4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, v. 18, p. 197)。これに関し、切断は、穏やかな条件下光化学的に（The cleavage is in this connection to take place photochemically (Dower US Patent 5.547.839, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, v. 18, p. 197)または化学的に(Canard et al. US Patent 5.798.210, Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, v. 18 p. 1021)行うべきである。
【００３２】
光化学的に切断可能な３’−ＯＨ修飾ＮＴ＊の合成は非常に費用がかかる。ポリメラーゼがこれらのヌクレオチド類縁体に対してかなり異なる親和性を示すため、核酸合成が非常に不均一な方法で起こるか、または多くのＤＮＡ位置で全く起こらない(Metzker et al. NAR 1994 v. 22 p. 4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, v. 18, p. 197)。これらの理由により、これら類縁体は配列決定反応に適さないか、または非常に限定された方法にしか適さない。切断可能な３’エステル結合(Canard et al. US Patent 5.798.210)もまた、合成の可逆的停止の基礎とは考えられない。次の相補的ＮＴ３’−ＯＨエステル化合物が利用可能な場合ほとんどのポリメラーゼが切断するので、３’−ＯＨ基に結合した標識が溶液中に放出され、もはや停止剤として機能できない(Rasolonjatovo et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, v. 18 p. 1021, Canard et al. PNAS 1995 v. 92 p. 10859)。ポリメラーゼがいくつかの同一ＮＴｓ＊を連続的に組み込める位置において、このことは誤ったシグナルをもたらす。ＢＭＢＦコンソーシアムプロジェクト「複数色素およびキャピラリー電気泳動を用いた配列解析」G. Sagner, 1999の最終報告において、ヌクレオチドの３’位における修飾は、ポリメラーゼに対するそれらの基質特性を消去することが報告された。
【００３３】
本方法に適したＮＴ類縁体の開発における困難性は、以下の基本的条件に基づく：
１）ポリメラーゼが個々にＮＴｓ＊を組み込むように、反応を調節しなければならない（さらなる組み込みの停止）。
２）ＮＴｓ＊が検出に必要とされる条件を満たす色素を有する。
３）ＮＡＣＦプライマー複合体もこの系の個々の構成要素も障害を受けないように、色素が穏やかな条件下切断できねばならない。
４）切断ができる限り速くかつ適量で起こらなければならない。
５）組み込みの停止が可逆的で、かつ穏やかな条件下で終わらせることができなければならない。
今までのところ、これらの問題についての実際的解決方法は、関連の文献において提唱されていない。
【００３４】
従来知られている問題が、本発明により初めて解決された。本発明に従い、その塩基に立体要求基を有するＮＴｓ＊を配列決定に使用する。
塩基に結合した立体要求基は更なる合成を妨げることができ、この妨害は、技術文献においては核酸の修飾における修飾ＮＴｓの望ましくない性質と見なされている。ビオチン、ジゴキシゲニン、およびフルオレセインのような蛍光色素、テトラメチルローダミンおよびＣｙ３色素は、この種の立体要求基の例である(Zhu et al. Cytometry 1997, v. 28, p. 206, Zhu et al. NAR 1994, v. 22, p. 3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v. 15, p. 4513, Wiemann et al. Analytical Biochemistry 1996, v. 234, p. 166, Heer et al. BioTechniques 1994 v. 16 p. 54)。
本反応に従う方法における配列決定反応では、標識ＮＴｓ＊をポリメラーゼおよび核酸と共にインキュベートするが、ここでＮＴｓ＊はその塩基に可逆的に結合した立体要求基を有する。修飾ＮＴｓ＊しか含まない反応混合物を反応に使用すれば、ポリメラーゼは単一のＮＴ＊しか組み込むことができない。以降のＮＴ＊の組み込みは立体的に妨害される。それゆえこれらＮＴｓ＊は合成停止剤として働く。立体要求基の除去に続き、次の相補的ＮＴ＊を組み込むことができる。これらのＮＴｓ＊はさらなる合成を完全には妨害せず、標識ＮＴ＊をさらに一つ組み込むのを阻害するだけなので、それらは半停止剤と呼ばれる。
３’−ＯＨ停止剤法との違いは、合成に必要な３’−ＯＨ基の遮断は必要とされず、かわりに塩基に結合した基を更なる組み込みの立体障害に利用することにある。これに関し、３’−ＯＨ基はずっと遊離したままである。
【００３５】
４．５．２  ＮＴ＊の一般構造
その一般的特徴は、図７ａ、ｂ、ｄに示される。
この構造は、立体基（Ｄ）および蛍光マーカー（Ｆ）がその塩基に切断可能なリンカー（Ａ−Ｅ）を介して結合していることを特徴とする。
アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）およびチミジン（Ｔ）をヌクレオシド残基として有するデオキシヌクレオシド三リン酸は、ＮＴｓ＊の基礎となる。チミジンのかわりに、ウリジンがヌクレオシド残基として好んで使用される。イノシンをグアノシンのかわりに用いることができる。
【００３６】
４．５．３  マーカー、フルオロフォア
各塩基は、それに特徴的なマーカー（Ｆ）で標識される（図７）。マーカーは蛍光を発する色素である。いくつかの因子が蛍光色素の選択に影響する。色素が以下の必要条件を満たせば、その選択は限定されない：
ａ）用いる検出装置が、穏やかな条件（好ましくは反応条件）のもと、このマーカーをＤＮＡに結合した単独の分子として同定できなければならない。色素は、かなりの光安定性を有していることが好ましい。それらの蛍光は、ＤＮＡによって消されることがないか、またはあってもほんのわずかあることが好ましい。
ｂ）ＮＴに結合する色素は、酵素反応のいかなる非可逆的妨害も引き起こしてはならない。
ｃ）色素で標識されたＮＴｓ＊が、ポリメラーゼによって核酸鎖に組み込まれなければならない。
ｄ）様々な色素による標識の場合、これら色素の発光スペクトルが大幅には重複していない。
【００３７】
本発明に関し使用できる蛍光色素は、構造式とともに、”Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals” 6th ed. 1996, R. Haugland, Molecular Probesに挙げられている。本発明に従い、以下の色素類がマーカーとして好んで使用される：シアニン色素およびそれらの誘導体 (例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＣＹ７、Amersham Pharmacia Biotech, Waggoner US Patent 5.268.486)、ローダミンおよびそれらの誘導体(例えばＴＡＭＲＡ，ＴＲＩＴＣ，ＲＧ６、Ｒ１１０、ＲＯＸ、Molecular Probes、ハンドブック参照)、キサンチン誘導体(例えばＡｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ５９４、Molecular Probes, Mao et al. US Patent 6.130.101)。これらの色素は市販されている。
スペクトルの性質および利用可能な装置に依存して、これに関し対応する色素が選択できる。色素は、例えばチオシアネートまたはエステル結合を介して、リンカーに結合する(”Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals” 6th ed. 1996, R. Haugland, Molecular Probes, Jameson et al. Methods in Enzymology 1997 v. 278 p. 363, Waggoner Methods in Enzymology 1995 v. 246 p. 362)実施例１および２参照。
【００３８】
４．５．４  立体要求基の性質
基（Ｄ）（図７ａ、ｂ、ｄ）は、ポリメラーゼによるさらなる標識相補的ＮＴの組み込みの妨害を意味する。ビオチン、ジゴキシゲニンおよび蛍光色素が、この種の立体要求基の例にあたる(Zhu et al. Cytometry 1997, v. 28, p. 206, Zhu et al. NAR 1994, v. 22, p. 3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v. 15, p. 4513, Wiemann et al. Analytical Biochemistry 1996, v. 234, p. 166, Heer et al. BioTechniques 1994 v. 16, p. 54)。この基の化学構造は、それが結合する標識ＮＴ＊の組み込みをそれほど妨げず、かつ酵素反応を非可逆的に妨害しないならば、限定されない。
この基はリンカー中で独立の部分として存在してもよく（７ａ）、または色素（７ｂ）または切断可能基（７ｄ）と同一であってもよい。リンカー切断の結果、ポリメラーゼがさらに標識ＮＴ＊を組み込めるように、シグナルの検出に続いてこの立体要求基（Ｄ）が除去される。７ｄに示される構造の場合、立体基は切断により除去される。
好ましい態様においては、標識ヌクレオチドが図７ｂ、ｋ、ｌに記載される構造を示すように、蛍光色素がこの種の立体要求基の機能を果たす。
別の好ましい態様においては、感光切断可能基が、この種の立体要求基の機能を果たす（図７ｄ）。
【００３９】
４．５．５  リンカー
マーカー（蛍光色素）は、リンカーと呼ばれる様々な長さのスペーサーブロックを介して塩基に結合することが好ましい。リンカーの例は、図７ｅ、ｆ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、に示される。このリンカーは、塩基対合に関与しない塩基上の位置の一つに結合することが好ましい。より好ましくは、リンカーの結合する位置は、ピリミジン環の５位およびプリン環の７位または８位である。塩基に対するリンカー結合の例は以下の出典より得られる(Hobbs et al. US Patent 5.047.519, Khan et al. US Patent 5.821.356, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v. 274, p. 403, Zhu et al. NAR 1994 v. 22 p. 3418, Herman et al. Methods in Enzymology 1990 v. 184 p. 584, J.L. Ruth et al. Molecular Pharmacology 1981 v. 20 p. 415, L. Otvos et al. v. 15 p. 1763, G.E. Wright et al. Pharmac Ther. 1990 v. 47, p. 447 ”Nucleotide Analogs; Synthesis and Biological Function” K.H. Scheit 1980, Wiley-Interscience Publication, ”Nucleic acid chemistry” Ed. L.B. Townsend, v. 1-4, Wiley-Interscience Publication, ”Chemistry of Nucleosides and Nucleotides” Ed. L.B. Townsend, v. 1-3, Plenum Press)。
リンカーの全長は様々であってよい。それは、Ａ、Ｃ、Ｅの部分における炭素原子数に対応し（図７ａ、ｂ、ｄ、）、好ましくは３から２０の間である。最適には４から１０の間である。リンカー（図７ａ、ｂ、ｄのＡ、Ｃ、Ｅ部分）の化学組成は、それが反応条件下で安定であり酵素反応を妨害しないかぎり、限定されない。
【００４０】
４．５．６  切断可能化合物、切断
リンカーは、切断可能化合物または切断可能基を有する（図７ａ、ｂ、ｄの（Ｂ）部分および、図７ｋ、ｌの（Ｃ）部分）。この切断化合物は、各サイクルの終わりにマーカーおよび立体障害を除去することを可能にする。その選択は、それが酵素的配列決定反応の条件下で安定であり、ポリメラーゼを非可逆的に妨害せず、かつ穏やかな条件下で切断除去できる限り、限定されない。「穏やかな条件」とは、ＮＡＣＦプライマー複合体を破壊しないような条件を意味すると解されるべきであり、例えば、好ましくはｐＨ３から１１の間、温度０℃から温度値（ｘ）の間である。この温度値（ｘ）は、ＮＡＣＦプライマー複合体のＴｍに依存し（Ｔｍはその「融点」である）、例えばＴｍ（ＮＡＣＦプライマー複合体）マイナス５℃として計算される（例えばＴｍが４７℃ならば最高温度は４２℃である；これらの条件下、エステル、チオエステル、ジスルフィド化合物、および感光化合物が、切断可能化合物として適している）。
【００４１】
該化合物は、化学的または酵素的に切断可能な化合物か、または感光化合物に属することが好ましい。化学的切断可能基の例としては、エステル、チオエステル、およびジスルフィド化合物が好ましい（図７ｋ、ｌ）(”Chemistry of protein conjugation and crosslinking” Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 v. 184 p. 584, Lomant et al. J. Mol. Biol. 1976 v. 104  243, ”Chemistry of carboxylic acid and esters” S. Patai 1969 Interscience Publ.)。感光化合物（図７ｍ）の例は、文献中以下の所に見ることができる：”Protective groups in organic synthesis” 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 p. 1, V. Pillai Org. Photochem. 1987 v. 9 p. 225、学術論文”Neue photolabile Schutzgruppen fur die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese” H. Giegrich, 1996, Konstanz、学術論文”Neue photolabile Schutzgruppen fur die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese” S.M. Buhler, 1999, Konstanz)。
リンカー中の切断可能化合物／基の位置は、塩基から１０原子以上離れていないことが好ましいが、塩基から３原子以上でないことがより好ましい。特に好ましいのは、塩基上に直接存在する切断可能化合物または基である。
【００４２】
切断および除去ステップは全てのサイクルに存在し、かつ核酸が障害または改変されないように穏やかな条件下（上記参照）で進行しなければならない。
切断は、化学的に（例えばエステル化合物については弱酸または弱アルカリ環境において、またはジスルフィド化合物の切断に関しては、例えばジチオスレイトールまたはメルカプトエタノール（Sigma)のような還元剤を添加して）（実施例１参照）、または物理的に（例えば感光基の切断に特異的な波長の光を表面に照射して；学術論文”Neue photolabile Schutzgruppen fur die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese” H. Giegrich, 1996, Konstanz)進行することが好ましい。
切断に続き、リンカーラジカル（Ａ）が塩基上に残る（図７ｃ）。切断後遊離したリンカーラジカル上のメルカプト基がさらなる反応を妨げるならば、既知の方法（例えばジスルフィドまたはヨウ素酢酸化合物）によってそれを化学的に修飾できる。
切断可能リンカーの合成は、実施例により説明する（実施例１および２参照）。
【００４３】
４．５．７  ポリメラーゼおよびＮＴ＊の組み合わせ
全体的にみると、マーカーの大きさ、電荷、および化学構造、切断可能リンカーおよびリンカー残基、およびポリメラーゼの選択もまた重要な役割を果たす。それらは一緒になて、ポリメラーゼにより標識ＮＴ＊が伸長中の核酸鎖に組み込まれるか、および、次の標識ＮＴ＊の組み込みがそれにより障害されるか、を決定する。これに関し二つの条件を特に考慮しなければならない：
一方では、リンカーの切断後、組み込まれた修飾ＮＴ＊によりポリメラーゼがさらに核酸鎖を伸長できるかが重要である。それゆえ、切断後にリンカー残基「Ａ」（図７ｃ）が更なる合成をそれほど妨害しないことが重要である。他方、組み込まれた非切断ＮＴｓ＊は妨害を示さなければならない。反応に適した多くのＮＴｓ＊が合成できる。特に、配列決定のための特定のＮＴ＊型の適性を試験する一連の予備試験は、ポリメラーゼとＮＴｓ＊の全ての組み合わせについて行うべきである。
【００４４】
緩衝液条件は、ポリメラーゼ製造者から得られる情報に従い選択する。反応温度は、非熱安定性ポリメラーゼについて、製造者から得られる情報に従い選択する（例えばSequenase Version 2については３７℃）；熱安定性ポリメラーゼ（例えばTaqポリメラーゼ）については、反応温度は高くても温度値（ｘ）である。この温度値（ｘ）はＮＡＣＦプライマー複合体のＴｍに依存し、例えばＴｍ（ＮＡＣＦプライマー複合体）マイナス５℃として計算される（例えばＴｍが４７℃ならば最大反応温度は４２℃である）。これらの緩衝液条件および反応温度は、以下に「最適緩衝液および温度条件」として示される。
反応時間（サイクル中の組み込みステップの持続時間に相当する）は、1時間未満であることが好ましい；理想的には、反応時間は１０秒から１０分の間である。
以下の組み合わせが、ＮＴ＊とポリメラーゼの適した組み合わせの例として挙げられる。
ａ）短いリンカー残基を有するＮＴ＊（合成、実施例２参照、図７ｅ、ｈ、ｉ）：nTP-SS-TRITC (L7)、dNTP-SS-Cy3 (L11)（Sequenase Version 2、クレノーフラグメント大腸菌DNAポリメラーゼI、Taqポリメラーゼ(GibcoBRL)との組み合わせ）。
ｂ）長いリンカー残基を有するＮＴ＊（合成、実施例１参照、図７ｆ、ｇ、ｊ）：dNTP-SS-TRITC (L14)（sequenase version 2 または、クレノーフラグメント大腸菌DNAポリメラーゼI、またはProHATM ポリメラーゼ (Eurogentech)との組み合わせ）。
【００４５】
ある試験系によって塩基（Ａ）におけるリンカー残基の反応に対する適性を調べるが、ここでは切断されたＮＴｓ＊が核酸鎖に連続的に組み込まれる。例えば、切断された所望のリンカー残基を有するｄＵＴＰ＊、マトリックスとしてポリ-ｄＡ、オリゴｄＴ２０プライマー、所望のポリメラーゼを使用し、それぞれのポリメラーゼに適した最適緩衝液および温度条件のもと、反応を行う。ＮＴ＊濃度は、５μｍｏｌ／ｌおよび２００μｍｏｌ／ｌの間であることが好ましい。反応後、核酸鎖に組み込まれたＮＴ＊の数を、例えばゲル中で長さに基づいて分離することによって解析する。リンカー残基の適性の結論としては、以下の情報が使用できる：ポリメラーゼが２０ＮＴ＊より多く組み込めるならば、このリンカー残基は配列決定反応に適している。切断されたＮＴ＊が２０より少なくしか組み込まれない場合、このＮＴ＊とポリメラーゼの組み合わせは配列決定反応に最適ではない。
【００４６】
適したリンカーラジカルを定めたら、未切断標識ＮＴｓ＊が半停止剤として機能するかについて、別の試験系において調べる。これは、反応に適した最適緩衝液および温度条件のもと、標識ＮＴｓ＊をポリメラーゼおよびマトリックスとともにインキュベートして調べる。ＮＴ＊濃度は、５μｍｏｌ／ｌおよび２００μｍｏｌ／ｌの間であることが好ましい。マトリックスは、連続していくつかのＮＴ＊が組み込まれることが期待できるように選択すべきであり、例えば前述の例にあるように、ｄＵＴＰ＊の場合ポリ-ｄＡが使用できる。理想的には、ポリメラーゼはＮＴ＊を一つしか組み込まない。
【００４７】
所定の最適緩衝液および温度条件のもと、ポリメラーゼによっていくつかのＮＴ＊が連続的に組み込まれるならば、反応パラメーター（例えばＮＴ＊濃度、反応濃度）を変えて、それぞれのＮＴ＊とポリメラーゼの組み合わせに合わせることができる。これに関し最も重要なことは、特定時間内に（好ましくは１０秒から１０分の間）、ポリメラーゼが二番目のＮＴ＊を組み込まないことである。
本発明に従い、ある態様におけるこの適合は、他の反応パラメーターを一定に保ったまま反応温度を変更することによって行う。
【００４８】
これらの実験におけるＮＴ＊濃度は、通常５μｍｏｌ／ｌおよび２００μｍｏｌ／ｌの間であり、好ましくは１０μｍｏｌ／ｌおよび１００μｍｏｌ／ｌの間である。ポリメラーゼの濃度および緩衝液条件は製造者の教授に従い選択する。反応所要時間は様々であってよく、好ましくは、１０秒から１０分の間であり、これは１サイクル中の組み込みステップ（ａ）の所要時間に相当する。例えばSequenase Version 2（Amersham Pharmacia Biotech）、ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼフリークレノーフラグメント（Amersham Pharmacia Biotech）のような非熱安定性ポリメラーゼの場合、常套的な３７℃から２０−３０℃まで反応温度を下げる。例えばTaqポリメラーゼ（GibcoBRL）、ProHATMポリメラーゼ（Eurogentech）のような熱安定性ポリメラーゼの場合、常套的な７０−７５℃から、好ましくは３０℃から温度値（ｘ）の間まで反応温度を下げる。この温度値（ｘ）は、ＮＡＣＦプライマー複合体のＴｍに依存し、Ｔｍ（ＮＡＣＦプライマー複合体）マイナス５℃として計算される（例えばＴｍが４７℃ならば温度値（ｘ）は４２℃である。
【００４９】
本発明の別の好ましい態様においては、他の反応パラメーター（緩衝液条件、温度条件）を一定に保ったまま、ＮＴ＊濃度を５μｍｏｌ／ｌ未満まで下げて、反応条件を適合させる。この適合の場合、ＮＴ＊濃度は、０．５μｍｏｌ／ｌから５μｍｏｌ／ｌの間であることが好ましい。反応の所要時間は１０秒から１０分の間である。ＮＴ＊濃度の選択において最も重要なことは、ポリメラーゼが特定時間内に（好ましくは１０秒から１０分の間）二番目のＮＴ＊を組み込まないことである。
個々のＮＴ＊の組み込みについての反応条件の最適化に続き、反応は、切断されたＮＴｓ＊と繰り返されなければならない。ポリメラーゼは、それに応じて変更された反応パラメーターのもと、切断されたＮＴｓ＊を連続的に組み込めなければならない。
最適化反応は、サイクル中の組み込みステップ、ステップ（ｂ）に相当する。最適反応のため決められる条件、温度、ＮＴ＊濃度、緩衝液条件、反応所要時間は、表面における反応のために選択する。
これらの反応条件下、１サイクルで配列決定反応に関与するＮＡＣＦプライマー複合体の５０％、好ましくは９０％よりも多くに標識ＮＴ＊が組み込まれるように、ＮＡＣＦプライマー複合体におけるＮＴｓ＊の組み込みを行うことが好ましい。
これは、反応が多くの核酸鎖において非常にゆっくりと進行する事実と関連する。各サイクルにおいて各相補的位置にＮＴｓ＊を組み込こもうとするが、成功した組み込み反応のみが検出され評価されるので必要ではない；次のサイクルにおける遅れた反応は配列決定の誤りはもたらさない。
同じポリメラーゼが全てのＮＴｓ＊に使用されることが好ましい。しかしながら、相異なるＮＴｓ＊に相異なるポリメラーゼもまた使用できる。
【００５０】
４．５．８  カラーコーディングの仕組み、色素の数
１サイクルは、
ａ）相異なるよう標識された４つのＮＴｓ＊、
ｂ）相異なるよう標識された２つのＮＴｓ＊、
ｃ）１つの標識ＮＴ＊、
ｂ）相異なるよう標識された２つのＮＴｓ＊および二つの非標識ＮＴｓ、
により行うことができ、即ち、
ａ）４つのＮＴｓすべてを相異なる色素で標識でき、反応において４つすべてを同時に使用できる。この場合、最低限のサイクル数で核酸鎖の配列決定が達成できる。しかしながら、本発明のこの変法は検出系に多大な要求を与える：４つの相異なる色素が各サイクルにおいて同定されなければならない
ｂ）検出を単純化するため、二つの色素で標識することが選択できる。ここでは、相異なるよう標識された二組のＮＴｓ＊を形成するが、例えばＡおよびＧが標識「Ｘ」を有し、ＣおよびＵが標識「Ｙ」を有するようにである。サイクル（ｎ）の反応中、相異なるよう標識された２つのＮＴｓ＊、例えばＡ＊と組み合わせてＣ＊、を同時に使用し、そしてその後Ｕ＊およびＧ＊を次のサイクル（ｎ＋１）に添加する。
ｃ）さらに、４つすべてのＮＴｓ＊を標識するのに単一の色素のみ使用し、各サイクルにつき１つのＮＴ＊だけを使用できる。
ｄ）技術的に単純化された態様においては、各サイクルにつき相異なるよう標識された２つのＮＴｓ＊と２つの非標識ＮＴｓ（２ＮＴｓ＊／ＮＴｓ法と呼ばれる）を使用する。この態様は、既知の配列の変異体（例えば変異または選択的スプライシングを受けた遺伝子）を決定するのに使用できる。
【００５１】
４．６  検出装置
表面上の個々の分子は、様々な方法によって調べられる。いくつかの方法が知られている：例えば、AtomForce顕微鏡、電子顕微鏡、近磁界蛍光顕微鏡、広視野蛍光顕微鏡、ＴＩＲ顕微鏡、などである(Science 1999 v. 283 1667, Unger et al. BioTechniques 1999 v. 27 p. 1008, Ishijaima et al. Cell 1998 v. 92 p. 161, Dickson et al. Science 1996 v. 274 p. 966, Xie et al. Science 1994 v. 265 p. 361, Nie et al. Science 1994 v. 266 p. 1018, Betzig et al. Science 1993 v. 262 p. 1422)。
本発明に従い、核酸鎖に組み込まれた個々のＮＴｓ＊の蛍光シグナルは、広視野蛍光顕微鏡（エピフルオレッセンス）またはレーザー走査顕微鏡（エピフルオレッセンス）またはＴＩＲＦ顕微鏡（全反射蛍光顕微鏡）によることが、好ましい。
【００５２】
このような装置構築の種々の変形が可能である(Weston et al. J. Chem. Phys. 1998 v. 109 p. 7474, Trabesinger et al. Anal. Chem. 1999 v. 71 p. 279, Adachi et al. Journal of Microscopy 1999 v. 195 p. 125, Unger et al. BioTechniques 1999 v. 27 p. 1008, Ishijaima et al. Cell 1998 v. 92 p. 161, Dickson et al. Science 1996 v. 274 p. 966, Tokunaga et al. Bichem. Biophys. Res. Com. 1997 v. 235 p. 47, ”Confocal Laser Scanning Microscopy” 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, ”New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy” 1991 Ed. R. Cherry CRC Press, Inc., ”Fluorescence microscopy” 1998 2. ed. Herman BIOS Scientific Publishers, ”Handbook of biological confocal microscopy” 1995 J Pawley Plenum Press)。それらの具体的構造における違いは、それらの構成要素が変化に富むことにから生じる。励起光のための機器は、例えばレーザー、ランプ、またはダイオードに基づいて機能しうる。ＣＣＤカメラとＰＭＴの両者が検出機器として働き得る。技術的詳説の他の例については、以下参照(”Confocal Laser Scanning Microscopy” 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, ”New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy” 1991 Ed. R. Cherry CRC Press, Inc., ”Fluorescence microscopy” 1998 2 ed. Herman BIOS Scientific Publishers, ”Handbook of biological confocal microscopy” 1995 J. Pawley Plenum Press)。全ての可能な検出機器の技術的変形を挙げることが、本発明の目的ではない。適した装置の図式的構造は、図式、図８において説明する。それは以下の要素を含む：
蛍光を励起するための光源（１）、
光誘導部分（２）、
走査台（３）、
スペクトルを選択する装置（４）、
検出機器（５）、
制御および解析機能を有するコンピューター（６）。
これらの装置の要素は市販されている(顕微鏡会社: Zeiss, Leica, Nikon. Olympus)。
【００５３】
以下は、個々の分子の検出に適したこれら要素の組み合わせを提案することを意図している：
水銀蒸気ランプを有する広視野蛍光顕微鏡 Axioplan 2 (Zeiss)、
Plan-neofluar 100x レンズ, NA 1.4 (Zeiss)、
Photometrix or AxioCam カメラ (Zeiss)、
制御および解析用ソフトウェアを伴うコンピューター。
【００５４】
以下は、検出手順を説明すること意図している。これに関しては、蛍光顕微鏡の一般的規則に従うべきである(”Confocal Laser Scanning Microscopy” 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, ”New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy” 1991 Ed. R. Cherry CRC Press, Inc., ”Fluorescence microscopy” 1998 2. ed. Herman BIOS Scientific Publishers, ”Handbook of biological confocal microscopy” 1995 J Pawley Plenum Press)。
検出は以下の相を含む：
１）検出のための調製
２）各サイクルにおける検出ステップの実行（各検出ステップは走査工程として行われ、以下の操作を含む）：
ａ）レンズ位置の調節（Ｘ、Ｙ軸）
ｂ）焦点面の調節（Ｚ軸）
ｃ）個々の分子のシグナルの検出、ＮＴ＊に対するシグナルの割り当て、およびそれぞれのＮＡＣＦに対するシグナルの割り当て。
ｄ）表面上の次の位置への移動
ＮＡＣＦｓに組み込まれたＮＴｓ＊のシグナルは、表面を走査して記録する。走査工程は様々な方法で行える(”Confocal Laser Scanning Microscopy” 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, ”New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy” 1991 Ed. R. Cherry CRC Press, Inc., ”Fluorescence microscopy” 1998 2. ed. Herman BIOS Scientific Publishers, ”Handbook of biological confocal microscopy” 1995 J. Pawley Plenum Press)。例えば、不連続走査工程を選択したら、各表面位置の２次元画像（２Ｄ画像）を形成するように、レンズが表面上を段階的に移動する（図８ａ）、（図８ｂ、ｃ）；試験的セットアップについては実施例６参照。
２Ｄ画像は様々な方法、例えば顕微鏡視野の位置を走査するレーザー（レーザー走査顕微鏡）、またはある位置におけるカメラショットにより生み出すことができる（顕微鏡ハンドブック参照）。例として、ＣＣＤカメラによる個々の分子の検出を記載する。
【００５５】
検出は、長さ１ＭｂのＤＮＡ断片の配列決定の例に基づいて概説する。
１）検出のための調製：
はじめに、本来の配列を再構築するのにいくつのＮＡＣＦ配列を解析すべきかを定める。ショットガン法による再構築の場合(”Automated DNA sequencing and analysis” p. 231 et seq. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al, Genom Res. 1999 v. 9 p. 868, Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21, Bonfield et al. NAR 1995 v. 23 p. 4992, Miller et al. J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)、以下の因子が関与する：１）各ＮＡＣＦのうち、約３００−５００ＮＴｓの配列が、配列決定中に決定される。２）解析しようとする配列の全長が重要である。３）配列決定の間、精度を上げ、誤りを正すため、ある種の冗長性測定を行わなければならない。概して、本来の配列のほとんどは、再構築するのにおよそ１０から１００倍量の原配列が必要であり、すなわち、１Ｍｂについてのこの例では、１０から１００Ｍｂの原配列データが使用される。従って、各ＮＡＣＦにつき平均配列長４００ｂｐの場合、２５，０００から２５０，０００のＤＮＡ断片が必要である。
２）各サイクルにおける検出ステップの実行
配列決定のため、ＮＡＣＦｓの位置は、シグナルを割り当てるための基盤が存在するように決定しなければならない。これらの位置について知ることにより、個々の分子のシグナルが、組み込まれたＮＴｓ＊に由来するか、または表面にランダムに結合したＮＴｓ＊に由来するかを定めることが可能になる。これらの位置は様々な方法により同定できる。
【００５６】
好ましい態様においては、結合ＮＡＣＦプライマー複合体の位置は、配列決定の間に同定される。核酸鎖に組み込まれたＮＴｓ＊からのシグナルは常に同じ座標を有するという事実をこれに利用する。これは、核酸鎖を固定することにより保証される。非特異的に結合したＮＴｓ＊は、表面の様々な位置にランダムに結合している。
固定ＮＡＣＦｓの位置を同定するため、いくつかの連続するサイクルから得られるそれらの座標の一致について、シグナルを調べる。これは、例えば配列決定の始めに行える。一致する座標を評価し、そのＤＮＡ断片の座標として保存する。
走査系は、複数のサイクルにわたり再現可能な方法で表面を走査できなければならない。各表面位置に定まっているＸ、Ｙ、およびＺ軸をコンピューターで調べられる。各走査工程におけるレンズ位置の調節の安定性および再現性は、検出の質、つまり個々の分子のシグナルの同一性を決定する。
【００５７】
ａ）レンズ位置の調節（Ｘ、Ｙ軸）
市販の走査台が機械的に不安定なこと、および同じＸ、Ｙ位置の反復調節の再現性のレベルが低いことが、数サイクルにわたり個々の分子のシグナルを正確に解析することを難しくする。反復調節の場合に座標の整合性を改良する方法、または起こり得る不適合を監視する方法、は多く存在する。ある監視オプションを例として挙げる。レンズ位置を大まかに機械的に調節した後、表面にしっかりと結合したパターンの対照画像を形成する。機械的調節が正確に同じ座標を示さない場合でも（最大１０μｍまでの逸脱がよく起こり得る）、光学検査により訂正できる。パターンの対照画像は、組み込まれたＮＴｓ＊からのシグナルによる画像にとって座標系として機能する。このような訂正に必要なのは、これら二つの画像間でそれ以上表面を動かさないことである。そのパターン位置におけるＸ、Ｙ偏差が、個々の分子のシグナル位置におけるＸ、Ｙ偏差と同じになるように、個々の分子からのシグナルをそのパターンに対して位置づける。パターンの対照画像は、個々の分子の検出の前、間、または後に形成できる。この種の対象画像は、新しい表面位置におけるいずれの調節に対しても形成しなければならない。
【００５８】
ｂ）焦点面の調節（Ｚ軸）
表面は完全には平面でなく、様々な窪みを示す。従って、表面-レンズ距離は、周辺の位置が走査されているときは変化する。これらの距離の違いから、個々の分子が焦点面から離れ、従って解析されにくくなる。
このため、表面を走査するときは、全てのレンズ位置において焦点面の調節が再現可能であることが重要である。
焦点面を再現性よく調節するには、様々な方法がある。例えば、以下の方法が使用できる：個々の分子の励起がそれらの蛍光の励起をもたらすので、焦点面の調節に役立つマーカーをその表面に加える。その後個々の分子のシグナルの検出を続ける。マーカーはいずれの性質のもの（例えば色素またはパターン）であってもよいが、検出および反応を障害してはならない。
【００５９】
ｃ）個々の分子の検出、ＮＴ＊に対するシグナルの割り当て、およびそれぞれのＮＡＣＦに対するシグナルの割り当て。
検出系により生み出された反応表面の二次元画像は、ＮＡＣＦｓに組み込まれたＮＴｓ＊のシグナル情報を含む。さらに処理する前に、画像情報のデータ全体から適した方法によりこれらを抽出しなければならない。画像情報の計量、変換、およびフィルタリングに必要なアルゴリズムは、デジタル画像処理およびパターン認識の標準的レパートリーの一部である(Haberacker P. ”Praxis der Digitalen Bildverarbeiting und Mustererkennung”. Hanser-Verlag, Munich, Vienna, 1995; Galbiati L.J. ”Machine vision and digital image processing fundamentals”. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1990)。シグナル抽出は、それぞれの蛍光チャンネルに対する反応表面の明度分布を描くグレースケール画像値により行うことが好ましい。相異なる蛍光色素を有する複数のヌクレオチドを配列決定反応に使用する場合、始めに使用した各蛍光標識ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵ）について別個のグレースケール値画像を形成できる。原則として、これには二つの方法が使用できる：
１、適したフィルター（Zeiss フィルターセット）を用いて、各蛍光チャンネルに対してグレースケール値画像を生成する。
２、画像処理プログラムを用いる適したアルゴリズムにより、記録されたマルチチャンネルカラー画像から適切なカラーチャンネルを抽出し、それぞれの場合においてグレースケール値画像として個々にさらに処理する。これに関し、チャンネル抽出のため、問題のチャンネルに特異的なカラー閾値アルゴリズムを用いる。このように、はじめにマルチチャンネルカラー画像から、１からＮの個々のグレースケール値画像が形成される。これらの画像は以下のように規定される：
GBN = (s (x,y))  単一チャンネルグレースケール値画像
N = {1, ... 蛍光チャンネルの数}。
M = {0, 1, ... , 255}  グレースケール値の量
S = (s (x, y))  グレースケール値画像の画像マトリックス
X = 0, 1, ... , L-1  画像ライン
Y = 0, 1, ... , R-1  画像カラム
(x, y)          画像点の空間座標
s (x, y)εM  画像点のグレースケール値。
【００６０】
次に、適したプログラムを用いて適切な画像情報をこの多量のデータから抽出する。このようなプログラムは、以下のステップを行うべきである：
ＧＢ１からＧＢＮのため以下を行う：
Ｉ．画像の前処理、例えば、適すれば、画像情報のデジタル化の結果生じる画像ノイズの減少（例えばグレースケール値補整による）。
ＩＩ．各画像点（ｘ、ｙ）が、それを取り囲む直接点およびより離れた近接点とともに、蛍光点の性質を満たすかを定めるための、そのグレースケール値画像の各画像点のの試験。これらの性質は、とりわけ使用する検出装置およびグレースケール値画像の解像度に依存する。それらは、例えば画像点を取り囲むマトリックス上の明度値の典型的分布パターンを示すであろう。これに使用可能な画像分割法は、単純閾値法から普通のネットワークの使用までにわたる。
画像点（ｘ、ｙ）が、これらの要求を満たす場合、事前に行った配列決定サイクルにおいて同定したＮＡＣＦｓの座標軸との比較を次に行う。適合する場合、それぞれの蛍光チャンネルから生じるヌクレオチドについてのシグナルをこのＮＡＣＦに割り当てる。不適合座標を有するシグナルを評価し、バックグラウンドシグナルとして却下する。シグナルの解析は走査工程と並行して行える。
【００６１】
典型的な態様においては、１３１７ｘ１０３５ピクセルの解像度の８-ビットグレースケール値画像を用いた。デジタル化により生じる画像における変化を減らすため、画像全体の前処理をはじめに行った：各画像点にその近隣の８つの明度の平均を割り当てた。それにより選択した解像度で、最も強い明度値を有し、かつ明度を有する近隣の画像点がすべての側に向かって減少している中心画像点のパターンを形成するが、そのパターンは蛍光点の特色を示すものである。画像点がこれらの指標を満たし、かつ明度における遠心性落下が特定の閾値を上回った場合（弱い蛍光点を排除するため）、この中心画像点を蛍光点の座標として評価した。
ｄ）表面上の次の位置へのレンズの移動。個々の分子のシグナルの検出に続き、表面上の別の位置の上にレンズを位置させる。
全体として、連続した画像は、例えばＸ、Ｙ位置の監視、焦点面の調節、および新しい各レンズ位置での分子の検出により形成できる。これらのステップはコンピューターにより制御できる。
【００６２】
工程ステップの時間的順序
走査工程および生化学的反応は一定の時間がかかる。これらの工程を連続して行えば、装置の最適な動作が達成できる。好ましい態様においては、二つの別個の表面において反応を行う（図９）。例として、反応が２つの部分でお互い独立して進行できるように、結合ＮＡＣＦプライマー複合体を有する表面を空間的に分離された２つの部分に分けることができる。別の例では、最初からＮＡＣＦｓを２つの別個の表面に固定化することもできる。
その後、反応を開始する。その背後にある原理は、反応および洗浄ステップが表面の一部分で進行する間、二番目の部分が走査されるというものである。このように、絶え間ない連続した解析が達成でき、配列決定率が増加する。
反応が進行する表面の数は、２よりも多くてもよい。これは、反応が時間的律速段階として起こる場合、すなわち表面上のシグナルの検出が反応および洗浄ステップより速く進行する場合に、適切と思われる。反応の全所要時間を検出時間に適合するため、反応における個々の各ステップは、次の表面と比較して時間的に遅らして一方の表面上で進行できる。
【００６３】
以下、本発明を実施例により説明する：
【実施例】
【００６４】
実施例１
長い切断可能なリンカーをもつ修飾dUTP（図7f-1）。出発物質として、5-(3-アミノアリル)-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート、AA-dUTP(Sigma)、3,3'-ジチオ-ビス(プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、DTBP-NHS(Sigma)、2-メルカプロエチルアミン, MEA(Sigma)を用いる。DMF(25μlの0.4mol/l溶液)中の３当量のDTBP-NHSを100mmol/l ホウ酸塩緩衝液(pH8.5)中の50 mmol/l AA-dUTP溶液100μlに加える。反応混合物を室温にて4時間インキュベートする。次いで、反応溶液中のCH3COONH4の総濃度が100 mmol/lになるまで濃酢酸アンモニウム溶液(pH9)を加え、反応物をさらにインキュベートする。次いで、1mol/l MEA溶液(pH 9)200μlを加え、室温にて1時間インキュベートする。次いで、この混合物に、0.3mol/l KI溶液中のI2の飽和溶液を、ヨウ素色が残るまで滴下する。DEAEセルロースカラムにて、炭酸アンモニウム勾配(pH8.5)により、修飾ヌクレオチドを他の反応生成物から分離する。RP-HPLCにて、切断可能なリンカーをもつヌクレオチドの単離を行う。種々の方法によって、このリンカーに色素を結合させることができる(”Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals” 6th ed. 1996, R. Haugland, Molecular Probes, Waggoner Method in Enzymology 1995 v. 246, p. 362, Jamesonら、Method in Enzymology 1997, v. 278, p. 363)。
【００６５】
他のヌクレオチド類縁体(たとえば、Hobbsら、US Patent 5,047,519、Khanら、US Patent 5,821,356など)も、図7f-2、3、4および7g-1、2に示す構造をもつヌクレオチド類縁体を製造することができる反応に用いることができる。
TRITC(テトラメチルローダミンイソチオシアネート)の結合を、色素のリンカーへの結合の例として示す(NT*構造、図7j)。
切断可能なリンカーで修飾されたdNTP(300nmol)を30μlの100mmol/l ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9)(10mmol/l NT*)に溶解する。このために、10μlの10mmol/l TRITCをジメチルホルムアミド(DMF)に加え、室温にて4時間インキュベートする。色素で修飾されたNT*の精製は、メタノール−水勾配を用いてRP-HPLCにて行なう。
このように製造されたNT*は、本発明方法が成功するのに必要な、DNA鎖における組み込み、蛍光のプルーフおよび組み込み後の連鎖停止ならびに阻害の終結のための要求を満たしている。
修飾NT*におけるジスルフィド化合物の切断の例。切断は、反応表面に20〜50mmol/l ジチオスレイトール溶液(DTT)またはメルカプトエタノール溶液(Sigma)(pH8)を添加することによって行なわれる。該表面をこの溶液とともに10分間インキュベートする；次いで、溶液を除去し、表面を緩衝液で洗浄してDTTまたはメルカプトエタノール残渣を除去する。
【００６６】
実施例２
短い切断可能なリンカーをもつ修飾dUTP(dUTP-SS-CH2CH2NH2)(図7e-1)。出発物質として、Hanna(Enzymology 1989、v. 180、p. 383に記載の方法)にしたがって合成されたビス-dUTP、2-メルカプトエチルアミン(MEA)(Sigma)を用いる。
H2O中の100μlの100mmol/l MEA溶液(pH8.5)を40mmol/l ホウ酸塩緩衝液(pH8.5)中の400μlの100mmol/l ビス-dUTPに加え、室温にて1時間インキュベートする。次いで、この混合物に、0.3mol/l KI溶液中のI2の飽和溶液を、ヨウ素色が残るまで滴下する。たとえば、エタノール沈殿または炭酸アンモニウム勾配(pH8.5)を用いるDEAEセルロースカラムによって、ヌクレオチド(ビス-dUTPおよびdUTP-SS-CH2CH2NH2)を他の反応生成物から分離することができる。ビス-dUTPは、次に起こるリンカーのアミノ基への色素の結合において妨害効果をもたないので、ビス-dUTPからのdUTP-SS-CH2CH2NH2の分離を最終精製ステップで行うことができる。
同様に、dCTP(図7e-2)をビス-dCTPを出発物質として用いて修飾することができる(Hannaら、Nucleic Acid Research 1993、v. 21、p. 2073にしたがって合成)。
種々の方法によって、このリンカーに色素を結合させることができる(”Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals” 6th ed. 1996, R. Haugland, Molecular Probes, Waggoner Method in Enzymology 1995 v. 246, p. 362, Jamesonら、Method in Enzymology 1997, v. 278, p. 363)。
【００６７】
FluoroLinkTM Cy3 単官能性色素(Amersham Pharmacia biotech)(NT*構造、図7i)の結合を、色素のリンカーへの結合の例として示す。これは、単官能性NHSエステル蛍光色素である。反応は、使用説明書にしたがって行う：
切断可能なリンカーで修飾されたdNTP(300nmol)を300μlの100mmol/l ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)に溶解する。このために、色素(300nmol)を加え、室温にて1時間インキュベートする。色素で修飾されたNT*の精製は、メタノール−水勾配を用いてRP-HPLCにて行なう。
TRITC(テトラメチルローダミン-5-イソチオシアネート、Molecular Probes)の結合を、色素のリンカーへの結合のさらなる例として示す(dUTP-SS-TRITC、図7h)。
【００６８】
切断可能なリンカーで修飾されたdNTP(300nmol)を30μlの100mmol/l ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9)(10mmol/l NT*)に溶解する。このために、10μlの10mmol/l TRITCをジメチルホルムアミド(DMF)に加え、室温にて4時間インキュベートする。色素で修飾されたNT*の精製は、メタノール−水勾配を用いてRP-HPLCにて行なう。
このように製造されたNT*は、本発明方法が成功するのに必要な、DNA鎖における組み込み、蛍光のプルーフおよび組み込み後の連鎖停止ならびに阻害の終結のための要求を満たしている。
修飾NT*におけるジスルフィド化合物の切断の例。切断は、反応表面に20〜50mmol/l ジチオスレイトール溶液(DTT)またはメルカプトエタノール溶液(Sigma)(pH8)を添加することによって行なわれる。該表面をこの溶液とともに10分間インキュベートする；次いで、溶液を除去し、表面を緩衝液で洗浄してDTTまたはメルカプトエタノール残渣を除去する。
たとえば、図7k、7l、7mに示すように、さらに、NT*は、実施例１および２に記載したNT類縁体に対する同様な方法で合成することができ、本発明方法に用いることができる。個々の合成ステップについては、たとえば、J.L. Ruthら、Molecular Pharmacology 1981 v. 20 p. 415、L. Otvosら、NAR 1987 v. 15 p. 1763、G.E. Wrightら、Pharmac Ther. 1990 v. 47、p. 447 ”Nucleotide Analogs; Synthesis and Biological Function” K.H. Scheit 1980、Wiley-Interscience Publication、”Nucleic acid chemistry” Ed. L.B. Townsend、v. 1-4、Wiley-Interscience Publication、”Chemistry of Nucleosides and Nucleotides” Ed. L.B. Townsend、v. 1-3、Plenum Pressを参照のこと。
【００６９】
実施例３
４つの標識NT*に関する配列解析
本発明の好ましい実施態様においては、反応に用いるすべての４つのNT*を蛍光色素で標識する。
【００７０】
３Ａ．ショットガン原理にしたがった本来の配列の再構築(”Automated DNA sequencing and analysis” p. 231 et seq. 1994 M. Adamsら、Academic Press、Huangら、Genom Res. 1999 v. 9 p. 868、Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21、Bonfieldら、NAR 1995 v. 23 p. 4992、Millerら、J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)。(この原理は、新しい、未知の配列の解析に特に適している。)
【００７１】
３Ａ−１．DNAの長い片の配列決定(図１)
長い核酸鎖の配列決定は、1Mbの長片DNAの配列決定を用いて、図式的に記載されるべきである(図1)。配列決定は、ショットガン原理に基づく(”Automated DNA sequencing and analysis” p. 231 et seq. 1994 M. Adamsら、Academic Press、Huangら、Genom Res. 1999 v. 9 p. 868、Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21、Bonfieldら、NAR 1995 v. 23 p. 4992、Millerら、J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)。好ましくは50〜1000bp長さの断片に分断することによって、配列決定反応のための解析材料を調製する。次いで、各断片にプライマー結合部位およびプライマーを与える。このDNA断片の混合物を平面的表面に固体する。洗浄ステップによって非結合DNA断片を除去する。次いで、完全な反応表面上で配列決定反応を行う。1Mbの長いDNA配列を再構築するために、NACFの配列は、300NTよりも長くあるべきであり、平均約400bpである。1つの標識NT*のみを1つのサイクルに組み込み、配列決定には、少なくとも400サイクルが必要である。
本来の配列の再構築のためには、すべてにおいて、約10から100倍の原(raw)配列の定量、すなわち、10から100Mbが必要である。したがって、NACF当り約400bpの平均配列長の場合、完全配列の99.995％以上をカバーするためには、25,000〜50,000個のDNA断片が必要である。
決定されたNACF配列は、市販のプログラムを用いて、NACの全体配列になるように合わせることができる、オーバーラップしている部分的配列の集合体を表す(”Automated DNA sequencing and analysis” p. 231 et seq. 1994 M. Adamsら、Academic Press、Huangら、Genom Res. 1999 v. 9 p. 868、Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21、Bonfieldら、NAR 1995 v. 23 p. 4992、Millerら、J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)。
【００７２】
３Ａ−２．cDNAの配列決定の例に基づく遺伝子産物の配列決定
好ましい実施態様において、1つの配列の代わりに、一回に、幾つかの配列を解析することができる。たとえば、ショットガン原理によって得られた原データから、本来の配列を再構築することができる。
まず第１に、NACFを製造する。たとえば、mRNAを二本鎖cDNAに変換し、このcDNAを超音波で断片化することができる。次いで、これらのNACFにプライマー結合部位を与え、変性し、固定し、次いで、プライマーをハイブリダイズする。サンプル製造のこの変法では、cDNA分子が、不完全なmRNA配列を表すことに留意すべきである(Method in Enzymology 1999、v. 303、p. 19 およびこの著書における他の論説である”cDNA library protocols” 1997 Humana Press)。
mRNAの一本鎖NACFの生成のための他の選択肢は、ランダム化プライマーによるmRNAの逆転写にある。これに関しては、多くの比較的短いアンチセンスDNA断片が形成される(Zhang-Jら、Biochem. J. 1999 v. 337 p. 231、Ledbetterら、J. Biol. Chem. 1994 v. 269 p. 31544、Kollsら、Anal. Biochem. 1993 v. 208 p. 264、Decraeneら、Biotechniques 1999 v. 27 p. 962)。次いで、これらの断片にプライマー結合部位を与える（上記参照）。続いてのステップは、前述の手順にしたがう。ランダム化プライマーはmRNAの全長にわたって結合するので、この方法によって、完全mRNA配列(5'から3'末端)を解析する。
前述の配列決定の実施態様の１つを用いて、固定化したNACFを解析する。mRNAの配列は、たとえば、ゲノムDNAよりもかなり少ない反復配列しか示さないので、NACFが組み込まれたNT*から検出されるシグナルの数は、300よりも少なく、20〜1000の間であるのが好ましい。解析されなければならないNACFの数は、ショットガンの長い配列の再構築に関するものと同じ原理によって計算される。
オリジナルの遺伝子配列は、ショットガン法の原理にしたがって、NACF配列から再構築される。
この方法は、予備クローニングを必要とすることなく、多くのmRNAの同時配列決定を可能にする。
【００７３】
３Ｂ．配列変異体の解析
すでにわかっている配列またはこの配列の変異体の検査の確認においては、決定されたNACF配列の長さおよび重複性についての要求は非常に少ない。配列プロセシングもまた、この場合、より単純である。全配列を再構築することを必要としない。むしろ、市販のプログラムを用いて、NACF配列が、全配列に割り当てられる。このようなプログラムは、たとえば、BLASTまたはFASTAアルゴリズムに基づくことができる(”Introduction to computational Biology” 1995 M.S. Waterman Chapman & Hall)。
前述の方法の１つによって、解析される配列をNACFに変換する。使用できることを調査される（実施例５を参照）全体配列において起こる、均一プライマーおよび均一プライマー結合部位の両方ならびに異なる配列特異的プライマーおよび天然のプライマー結合部位を用い、本発明方法によって、これらのNACFの配列決定を行う。次いで、決定されたNACFの配列をショットガン法にしたがって合わせるのではなく、参照配列と比較し、このような方法で、全配列中のそれらの位置を割り当てる。ゲノムまたはcDNA配列が含まれる。
ショットガン法による再構築とは異なって、配列変異体の解析は、非常に少ない原配列データしか必要としない。したがって、全配列の新規変異体の復元には、原配列の5〜10倍量で十分である。ショットガン法を用いると、復元には10から100倍量の原配列が必要である(”Automated DNA sequencing and analysis” p. 231 et seq. 1994 M. Adamsら、Academic Press、Huang et al、Genom Res. 1999 v. 9 p. 868、Huang Genomics 1996 v. 33 p. 21、Bonfieldら、NAR 1995 v. 23 p. 4992、Millerら、J. Comput. Biol. 1994 v. 1 p. 257)。
決定されたNACF配列の長さは、参照配列における特定の位置を明確に割り当てるのに十分でなければならない；したがって、たとえば、20NTの長さをもつ配列（たとえば、ヒトゲノムにおける非反復セクションを含む）でさえ、明確に同定することができる。反復セクションの比較解析には、課題に応じて配列の正確な長さをもつ、より長い配列が必要である。非反復セクションの解析のために決定されたNACF配列の長さは、20NT以上が好ましい。反復セクションについては、500NT以上が好ましい。
予め既知の完全配列の新規変異体の配列決定における目的は、まったく異なるものであってよい。既知の完全配列をもつ新たに決定された配列／参照配列の比較が、主として追及される。２つの配列は、この点に関し、進化という条件において大きく異なる種から始まる。これらの２つの配列の構成の種々のパラメーターを比較することができる。以下の記載は、このような解析の例である：突然変異または多型解析および選択的にスプライスされた遺伝子産物の解析。
解析される配列の前もっての再構築を行うことなく参照配列と調査される配列を比較することは、以下においては、図式的に、および典型的な基準に基づいて検討されるべきである。このような比較は、たとえば、突然変異またはSNP解析に用いることができる。
【００７４】
３Ｂ−１．
たとえば、１Mbなどの解析される長い配列を、前述の方法の１つによってNACFに分割する。本発明方法により、均一プライマーを用いて、これらのNACFの配列決定を行う。決定された各個のNACFの配列を参照配列と直接比較する。参照配列は、ショットガン法による高価な再構築をなしですませるように、この点に関し、決定されたNACF配列の割り当てのための基準となる。非反復セクションの解析において決定されたNACF配列の長さは、20NT以上が好ましい。反復セクションの解析については、500NT以上が好ましい。解析されるNACFの数は、この点に関し、調査される配列の全長、NACF配列の平均長および配列決定の必要な正確さによって決定される。決定されたNACF配列の平均長が100NTであり、調査される配列の全長が１Mbであり、および原配列決定に対応する正確さ（すなわち、各位置が、一度だけ配列決定されることが可能な場所である）である場合、全体配列にわたってNACFの分布がランダムに生じるので、原配列の約5倍量、すなわち5Mbが必要である。全体として、全セクションの９９％以上をカバーするために、50,000NACFを解析しなければならない。
次いで、市販のプログラムによって、決定されたNACF配列を全配列に割り当て、不適合を検出する。このようなプログラムは、たとえば、BLASTまたはFASTAアルゴリズム(”Introduction to computational Biology” 1995 M.S. Waterman Chapman & Hall)に基づく。
【００７５】
実施例４
２つの標識NT*および２つの非標識NTを用いる配列解析(2NT*/2NT法)。
もう１つの実施態様においては、配列の解析のために２つの修飾NT*および非修飾NTを用いる。
この方法は、配列変異体の解析（たとえば、SNPまたは突然変異解析など）に特に適しており、参照配列の認識を必要とする。この方法に関しては、全配列の再構築は行わない；その代わりに、プログラムを用いて、決定された配列を参照配列に割り当て、不適合を記録する。このようなプログラムは、たとえば、BLASTまたはFASTAアルゴリズム(”Introduction to computational Biology” 1995 M.S. Waterman Chapman & Hall)に基づく。
この実施態様は、２つのシグナル（標識NT*）の配列が、配列を同定するための十分な情報を含むことができるという原理に基づいている。決定された配列を参照配列と比較し、特定の位置、たとえば：
2004529650.tif 000005
を割り当てる
【００７６】
解析される参照配列の未知の変異体を、前述のように配列決定のために調製する(NACをNACFに変換し、これらをPBSにライゲートし、次いで、プライマーとハイブリダイズさせ、反応表面に固定化する)。このような方法で調製されたNACFを2NT*/2NT法によって配列決定を行う。2NT*の配列を表している各NACF配列を用いて、NACF配列を得る。決定された配列の既知の参照配列への明確な割り当てを促進するために、この配列は、十分な長さをもたなければならない。決定されたNACF配列の長さは、40NT*以上であるのが好ましい。２つの標識NT*は、配列の一部のみを表すので、合成された相補鎖の全長は、検出されたNT*の配列の約２倍である(40 NT*が検出された場合、全長は、たとえば、平均80NTである)。
相補鎖の合成には、４つのヌクレオチドが必要である。蛍光色素で標識されたNT*は、本発明においては、半停止剤として生じる、すなわち、もし修飾NT*が利用できるならば停止が単独で起こるので、非修飾NTが、各サイクルの追加のステップにおいて反応に加えられなければならない。サイクルにおけるこのステップの正確な位置は、変更することができる。この点について、標識NT*および非修飾NTをそれぞれ用いることが重要である。
【００７７】
この実施態様におけるサイクルは、たとえば、以下のように現れる：
a)提供されたNACFをもつ表面への修飾NT*およびポリメラーゼを含む溶液の添加
b)NTにより相補鎖を伸長するのに適した条件下での、この溶液と固定化核酸鎖のインキュベーション
c)洗浄
d)NACFに相補的な新たに合成された鎖に組み込まれた個々の修飾NT*分子のシグナルの検出
e)組み込まれたヌクレオチドの場合、標識および停止基の除去
f)洗浄
g)２つの非修飾NTおよびポリメラーゼの添加
h)洗浄。
【００７８】
この2NT*/2NT法は、たとえば、遺伝子のゲノムセクションのSNP解析または二本鎖cDNA解析に適している。それは、以下の原理に基づいている。
1)１つの鎖において失われた情報を、他方の鎖からの情報によって完全にすることができるように、２つの各相補的DNA鎖おけるゲノム情報は、同一である。
2)二本鎖DNAからの完全な情報は、標識NT*の特定の対の組み合わせによって、２つのNT*のみから得ることができる。この実施態様におけるNT*の許容しうる組み合わせは、次のとおりである：A*C*; A*G*; C*T*/C*U*; G*T*/G*U*。C*およびU*の組み合わせが好ましい。
3)既知の参照配列が解析の基礎となる。
4)NACFは、解析されるNACの両方の鎖から生じ、決定された該NACF配列は、解析される配列の全長をカバーする。
【００７９】
次の実施例によって、２つの標識NT*のみをもつ二本鎖DNA断片からどのように情報が得られるか、および本来のまたは非突然変異配列(参照配列／比較配列)との差異をどのように決定することができるかを説明する。1)および2)における配列は、１つの位置（下線）以外は同一である。A*およびC*を標識する。
1)試験される配列：
NACF配列の集合体(決定されたNACF配列)が生じるように、2NT*/2NT法によって、試験される配列の配列決定を行う。決定されたこれらのNACF配列は、あらゆる鎖からの情報を含む：
2004529650.tif 000006
２）比較配列：
解析には、比較配列（参照配列）が必要である：
2004529650.tif 000007
３）決定された適合NACF配列をもつ比較配列：
プログラムを用いて、決定されたNACF配列を比較配列中の特定の位置に割り当て、不適合を検出する：
2004529650.tif 000008
【００８０】
この実施態様において、SNPまたは突然変異について、二本鎖核酸を調査することができる。この点に関し、決定されたNACF配列を参照配列と比較する。２つの標識NTのみを用いる解析の場合、部分配列および完全配列の比較の基本規則は、すべての４つの標識NT*を用いる配列の比較に適用される規則とは原則的には異ならない。さらなる情報については、４つのNT*(実施例3B)による突然変異解析およびSNP解析に対する配列比較を参照のこと。
【００８１】
実施例５
配列特異的プライマーをもつ単一ヌクレオチド多型の解析は、本発明方法の特別の実施態様を表す。セクション１の”用語の略語および説明”に加えて、以下の用語をこの実施例のために定義する。
「プライマー」−発明の意図を明確にするために、本実施例では、次の用語を区別する：
a) ”プライマー”は、一般的に理解される本発明の目的にとっては、均一構造をもつプライマー分子の集合体を意味する。
b) ”数個のプライマー”または類語は、理解される主題において、異なる構造をもつプライマー分子の数個の集合体を意味する。
c) ”プライマー分子”は、単独のオリゴヌクレオチド分子を意味する。
d) ”数個のプライマー分子”は、数個の個別のオリゴヌクレオチド分子を意味する；それらは、均一または異なる構造を示す。
「SNP位置」−SNPの存在または不在について調査されるNACにおける位置。
「標的配列」−配列決定反応において配列特異的プライマーの使用によって配列決定／決定される全体配列の一部。全体配列は、数個の標的配列を含むことができる。標的配列は、全体配列内で標的配列の位置決定をほとんど確実にするのに十分長い。標的配列は、たとえば、１つまたはそれ以上のSNP位置を含むことができる。
「認識配列」−全体配列におけるこの標的配列の割り当てのために用いられる標的配列の一部。
【００８２】
SNP解析のこの実施態様において、解析されるNACにおいて調査される参照配列における数個の潜在的SNP位置が選ばれる。これに対応して、異なる、配列特異的プライマーが、これらの位置に対して提供される。これらのプライマーは、特定の問題に関してSNP解析のために用意された標準化プライマーを形成し、問題となっている解析のためのキットとして一律に用いられる。
本発明によれば、解析される材料の調製は、１つまたはそれ以上の核酸鎖（全体配列）から、相対的に小さい、30〜2000NTの長さの一本鎖核酸鎖断片(NACF)集合体を形成する目的をもつ。
これらのNACF分子を平面的表面に、10〜1,000,000／100μm2、好ましくは、10〜100 NACF／100μm2、100〜10,000／100μm2または10,000〜1,000,000／100μm2の密度でランダムに固定化する。伸長可能なNACFプライマー複合体の密度が約10〜100F／100μm2となるように、表面に結合したNACFにプライマーをハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、非結合のプライマーを除去し、配列決定反応を開始する。
標的配列および配列特異的プライマーの選択を介して、全体配列のうち関連するセクションのみが調査され、それによって無関係の情報の量が減少し、解析時間が短縮される。
【００８３】
以下の原理が、SNP解析方法の本実施態様の根拠をなす。
調査されるNAC(全体配列）における単一ヌクレオチド多型(SNP)について、参照配列における検査されるべき位置を選択する。
1)各選択されたSNP位置の解析のために、調査される各SNP位置がプライマーの３方向にすぐ次の位置を占めるか、またはプライマーの３方向に2〜100、好ましくは、2〜50、理想的には、2〜20位置の範囲内にあるように、特異的プライマーを準備する。したがって、SNP位置は、配列決定反応中に決定された標的配列の範囲内にある。数個の特異的プライマーを用いる必要があるように、数個のSNP位置を同時に決定するのが好ましい。可能である場合、それらが均一アニーリング温度をもつ（すなわち、個々のプライマー集合体の融解温度の間の差異が、たとえば、約４度、好ましくは２度、より好ましくは１度の範囲内にある）ような方法でプライマーを選択するのが好ましい。
2)全体配列から短い核酸鎖断片(NACF)が誘導され、これらの断片は、一本鎖であり、20〜2000NT、好ましくは、30〜500NTの長さをもつ。
3)NACF分子をランダム配列で表面に固定化する。
4)表面に固定化されたNACFにおける配列特異的プライマーのハイブリダイゼーション(アニーリング)後、反応に関与する各NACF分子について標的配列を決定する周期的配列決定反応を行う。配列決定反応は、多数の分子において同時に進行する。
5)決定された標的配列は、全体配列における特定のセクションへの加入に関する情報および調査されるサンプルに関連したこのセクションにおけるSNPに関する情報を含む。標的配列の長さおよび周期の数は、配列の同定が保障されうるような方法で選択されるべきである。
【００８４】
有利な態様において、決定された標的配列を参照配列と比較し、配列マッチングを割り当てる。十分に長い決定された標的配列の場合、それらをほとんど確実に参照配列中の特定の位置に割り当てることができる。たとえば、10NTを含む配列は、106以上の異なる組み合わせを形成することができ、したがって、わずか100,000NTのNACにおいてほとんど確実に明確に同定することができる。決定された標的配列の参照配列内の特定の位置への割り当てに続いて、配列における差異、SNPが認識できるようになる。
標的配列を同定するために、別の有利な態様において、既知のプライマーの数、それらの組成およびプライマー結合部位に連結する参照配列の既知の配列セクションを用いる。考慮されねばならないプライマー結合部位の近くに位置する配列のみを用い、プライマーへの標的配列の加入にしたがって、決定された標的配列をこの点に関して解析する。もし、たとえばわずか1000個のプライマーを用いるならば、10NT以下の決定された標的配列でも、対応するプライマーへの割り当てを促進するのに十分である。
【００８５】
解析されるサンプルは、大部分は、たとえば、組織細胞からの数コピーのゲノムDNAまたは組織細胞からの数個の同一のmRNA集合体などの数個の同一の全体配列分子を含む。
a)SNP部位の選択
本発明方法により、既知のSNP部位を解析すること、および新たなSNP部位を決定することの両方ができる。NACにおけるいずれの位置でも、潜在的SNP部位として機能することができる。選択は、たとえば、それらの産物がある疾患に関連している遺伝子におけるSNP解析、または膜受容体をコードする遺伝子の保存されたコーディングセクションにおけるSNP解析、または細胞分割にとって重要な遺伝子の調節配列における既知のSNP部位の試験などの問題によって決定される。
解析されるSNP部位は、配列決定反応中に決定される標的配列内に位置する。数個のSNP部位は、標的配列内で決定することができる。一方、数個の標的配列を、たとえば、遺伝子内で選択することもできる。これに関連して、全体配列の中で、標的配列が互いから十分な距離に位置することが重要である。NACF当り１つの配列特異的プライマーのみがハイブリダイズするように、この距離が必要であり、該距離は、平均NACF長に従属する：NACFが短いほど、標的配列は近づくことができる。適当なプライマー選択によって、二本鎖核酸鎖の両方の鎖において、SNP部位を解析することができる。
本発明方法は、たとえば、多くの個体(集合体のランダムサンプルとして)からの数個の部位などの同時チェックの可能性も提供する。集合体のSNPプロフィールを、たとえば、それによって調査することができる。
【００８６】
b)配列決定反応のためのプライマー
個々のNACF分子における配列決定反応は、プライマー分子によって促進される。全体配列内で特別な／特異的標的配列において配列決定反応を行ないうるために、本発明の配列特異的プライマーが必要である。SNP部位または標的配列の解析に使用される配列特異的プライマーは、同一構造のプライマー分子の集合体を意味する。数個の異なる標的配列の解析には、数個の異なるプライマー集合体が必要である。
配列特異的プライマーの使用を介して、当該配列セクション、標的配列のみが解析される。本発明方法においては、解析速度が増すように、配列決定される配列の長さをできるだけ短くする。
【００８７】
配列特異的プライマーは、解析される配列において、そのプライマーに特異的なプライマー結合部位であるPBSに結合する。プライマーの組成および長さをいずれかの潜在的SNP部位または標的配列に対して最適化する。最適化ステップの例は、Rychlikら、NAR 1990 v. 18 p. 6409に記載されている。プライマーの選択またはPBS（プライマー結合部位）の選択において、次の面に特に留意すべきである：
1)解析されるSNP部位は、プライマーの3'末端の直後または次の2〜50NT、好ましくは、2〜20NT以内のいずれかに位置すべきである。
2)SNP部位におけるPBSの位置決定(配列の長さおよび組成の選択)は、種々のPBS配列および対応するプライマー配列が、理想的には均一なハイブリダーゼーション条件下で結合するために、できるだけ類似する”アニーリング温度”をもつような方法で行うべきである。このことは、たとえば、解析される当該SNP部位に関してPBS位置を変更することによって、またはプライマー配列の長さを変更することによって行うことができる(Rychlikら、NAR 1990 v. 18 p. 6409)。
3)全体配列中で同じ鎖に結合するプライマー間の最小距離は、平均NACF長よりも短いべきではない。
【００８８】
プライマーは、二本鎖NACの両方の鎖に対して用いることができる。したがって、互いに近くに位置するSNP部位を、たとえば、記録することができ、または両方の鎖におけるSNP部位についてのチェックを行うことができる。
プライマーの長さは、6〜100NTであるのが好ましく、10〜30または30〜40または40〜50が最適である。異なるSNP部位または標的配列には異なる長さのプライマーを用いることができる。
配列特異的プライマーを用いるSNP解析のために、本発明にしたがって、プライマーをハイブリダイゼーション溶液中で、反応表面に固定化されたNACFにハイブリダイズさせる(アニーリング反応)。
【００８９】
c)NACFの固定化
この実施態様では、本発明にしたがって、ランダム配列で平面的表面に結合しているNACF分子を用いて、NACFを介して、表面に対してNACFプライマー複合体を排他的に結合させる(表面に対するNACFの直接結合)。
２つの鎖の末端の１つでNACFの固定化を行うのが好ましい(上記参照)。たとえば、平面的表面上のNACFを含むサンプルを乾燥することなどの非特異的結合によっても固定化を達成することができる。固定化の密度は、100 μm2当り10〜100、100〜10,000、10,000から1,000,000NACFである。
d)ハイブリダイゼーション
のNACFの対応するプライマー結合部位へのできるだけ選択的であるプライマーの結合(アニーリング)を許容するストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション結合したNACFおよびプライマーをインキュベートする。最適ハイブリダイゼーション条件は、プライマー結合部位の正確な構造およびそれぞれのプライマー構造に従属し、たとえば、Rychlikら、NAR 1990 v. 18 p. 6409にしたがって計算することができる。
プライマーは、プライマー混合物を意味するのが好ましい。個々の配列特異的プライマーの濃度(プライマー集合体の個々の濃度)は、たとえば、10 pmol/l〜1mmol/l、好ましくは、0.1 μmol/l〜10 μmol/lである。プライマー混合物中のプライマーの総濃度は、好ましくは、1nmol/l〜10mmol/lである。個々のプライマー集合体間の比率は、多様である。ハイブリダイゼーション時間が短くなるように、プライマーを、固定化NACFに明らかに過剰に加えてもよい。
検出に必要な伸張可能なNACFプライマー複合体の密度は、約10〜100／100μm2である。それは、プライマーのハイブリダイゼーション前、中または後に達成することができる。
既知のNACF濃度では、１つの態様において、固定化条件を、NACFが約10〜1000／100μm2の密度で結合するような方法で選択することができる。したがって、NACFはNACFプライマー複合体の密度を決定する。
【００９０】
１つの実施態様では、固定化NACFの密度を、たとえば、1,000,000／100μm2などのように1000NACF／100μm2よりも非常に大きくすることができる。光学的検出に必要なNACFプライマー複合体の密度は、プライマーハイブリダイゼーション中に達成される。ハイブリダイゼーション条件(たとえば、温度、時間、緩衝液)は、これに関連して、プライマーが固定化NACFの一部のみに結合するような方法で選択されるべきである(実施例６を参照)。
NACFの濃度が未知であり、それに対応して固定化密度が未知である場合、NACFに対するプライマーのハイブリダイゼーション(アニーリング)によって、最適密度よりも大きいNACFプライマー複合体の密度が導かれる。
【００９１】
この理由のために、有利な実施態様では、最適密度の決定のためにNACFの一部を含むサンプルを用いる。この部分を反応表面に固定化し、NACFに対してプライマーをハイブリダイズし、形成されたNACFプライマー複合体を蛍光色素含有NT*の組み込みによって標識する(たとえば、Cy3-dCTP、Amersham Pharmacia Biotech)。一方では、決定された密度(ハイブリダイゼーション条件が維持される)から、最終配列決定バッチのためのオリジナルサンプルのいずれかの必要な希釈または濃度を決定することができる。他方では、たとえば、一定のままであるNACF固定化密度によるハイブリダイゼーション時間の短縮化といったような、このことから必要となるハイブリダイゼーション条件の変化を計算することができる。
プライマー集合体間の量的比率は、相異しても同一であってもよい。高濃度のプライマーを用いることによって、特定の時間中に、たとえば、より稀な配列といったような、ある配列をほとんど確実に結合することができる。
表面に固定化された配列特異的プライマーを用いる手順配列およびそれに続くこれらのプライマーに対するサンプルのハイブリダイゼーションと比較して記載した手順配置の大きな利点は、反応表面における配列特異的プライマーおよび解析されるサンプル間のハイブリダイゼーション(アニーリング)時間の明らかな短縮化である。
【００９２】
実施例６
配列決定反応の準備と実行
ゲル表面の調製：
電気泳動分離用ゲル調製の一般的規定(Electrophoresis A.T. Andrews、Oxford science publications 1995)にしたがって、個々の分子との反応の解析のためのポリアクリルアミドゲルを製造する。
たとえば、紫外線または残基フォーマーによって重合反応を行う。本実施例では、残基反応に、たとえば、TEMED 0.01％ v/vおよびAPS 0.04％ w/vなどの過硫酸アンモニウム(APS)およびTEMED(テトラメチルエチレンジアミン)を用いる。成分組成物は、広範に変化する；個々の成分の濃度は、次の範囲にある(ready-to-use水性AA-ビスAA溶液について計算)：
アクリルアミドモノマー(AA)3〜30％、理想的には、10〜20％、アクリルアミドモノマーに対するビス−アクリルアミド(ビス−AA)比率は1:10〜1:50、好ましくは1:20。
【００９３】
製造目的のために、２つの清浄なガラス板(アセトン、次いで、水で洗浄)を用いる。ガラス板(P１)を好ましくは、たとえばRepel−シラン（ジメチルジクロロシラン溶液、Amersham Pharmacia-Biotech)などの撥水剤で前処理する。P２は、ゲルのための固相担体として働き、ゲルとガラス表面の間の共有結合が形成されるように、たとえばBind-シラン(メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、Amersham Pharmacia-Biotech)などのゲル結合剤で前処理する。ゲル結合剤によるP２の前処理は、幾つかの反応を固定化分子と行わなければならない場合に有用である。反応の数が少ない場合、このような前処理は不要である。これらの場合、ゲルがガラス表面に対する接着力を介して純粋に付着し続けるために、P２にとって、清浄なガラス表面であれば十分である。
【００９４】
厚さ約5〜30μｍの層が生じるように、終了した重合溶液(残基フォーマーを含むAA/ビスAA溶液)をP1およびP2の間に注ぐ。たとえば、スペーサーブロックによってゲルの厚さをチェックすることができる。硬化後、P１を除去する。ゲルはP２に張り付いて残る。それを脱イオン水で洗浄する。
ゲルは、そのまま直接使用するか、または製造の種々のステップにおいて乾燥して貯蔵することができる。標識分子との反応の前に、通常、数分間ゲルを反応緩衝液で膨潤させ、次いで、反応に使用する。
この方法で調製したゲル表面に、乾燥によってNACFを固定化する。
たとえば、プラスミドDNAの溶液(約１μＬ)(加熱によって一本鎖型に転換された、約3400NT長、濃度0.1 μｇ/μＬのHind IIIで直線化されたpMOS−ブルー−プラスミドDNA)を約10mm2のゲル表面に滴下し、90℃にて乾燥する。固定化プラスミド分子の計算密度は、約1000／1μｍ2であった。
オリゴヌクレオチド5'−AGTGAATTCGAGCTCGGTAC−3'をプライマーとして用いる。解析に関連する伸長部と一緒になったプライマー結合部位(下記の二重下線)は、以下の配列を有する：
5'−ATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACT−3'
【００９５】
カバーとして反応表面をもつフローセル(マイクロ流体チャネル、MFC)、図６を組み立てた。このようなMFCは、ゲル表面下での迅速な流体交換を行うことができる。予備試験として、プライマー(計算されたTm(融解温度)45.3℃、50mmol/l tris-HCl pH8.7中、0.1 μmol/l)を表面において45度にて10分間プラスミドDNAとハイブリダイズした(アニーリング)。洗浄ステップの後、プラスミドプライマー複合体の密度をチェックした。チェックは、クレノーフラグメントを用い、dCTP-Cy3(Amersham Pharmacia Biotech)の組み込みによって行った(5mmol/l MgCl2を含む20mmol/l tris-HCl緩衝液、pH8.5中、2ユニット／50μＬ、30℃にて15分間)。この点に関して、単一のdCMP-Cy3のみが成長する鎖に組み込まれる。
CCDカメラAxioCam(Zeiss)をもつAxioplan 2e(Zeiss)、図8を検出装置として用いた。
【００９６】
個々の組み込まれたdCMP-Cy3分子の信号密度は、伸長可能なプラスミドプライマー複合体の密度に対応する。上記条件下、プラスミドプライマー複合体の密度は、平均約15／100μｍ２であり、したがって、所望の大きさの位数であった(図8a−c)。同様の方法で調製された第２の表面(ハイブリダイズされたプライマーをもつ、加熱によって一本鎖型に転換された、約3400NT長、濃度0.1 μｇ/μＬのHind IIIで直線化されたpMOS−ブルー−プラスミドDNA)において、可逆的停止剤として用いられるdUTP-SS-CH2CH2NH-R-Cy3)(dUTP*)およびdCTP-SS-CH2CH2NH-R-Cy3)(dCTP*)(実施例２を参照)により、周期的配列決定反応を行う。検出装置は、予備試験と同じである。周期的配列決定反応に用いた溶液は、以下の構成である：
a)組み込み反応用の反応溶液：20mmol/l tris-HCl緩衝液、pH8.5、5mmol/l MgCl2、10グリセロール、クレノーフラグメント(Amersham Pharmacia-Biotech)2U／50μＬ、dUTP*またはdCTP*、またはdATPおよびdGTP／10 μmol/l。
b)洗浄液：20mmol/l tris-HCl pH8.5、0.01％ナトリウムアジド。
c)切断反応用反応溶液：20mmol/l tris-HCl、pH8.5、50mmol/l メルカプトエタノール。
【００９７】
標識 NT*の組み込み反応を30℃にて15分間行った。
配列決定反応の第１のサイクルにおいて、dCTP*を含む反応溶液を加えた。洗浄ステップの後、表面において、記録されている割り当てられたｘ，ｙ座標をもつ単一分子シグナルを用いて検出ステップを行った(合計約11200シグナル)。次いで、組み込まれたNT*の標識を切断し(室温にて10分間)、表面を洗浄する。
第２のサイクルにおいて、dUTP*を含む反応溶液を加え、30℃にて15分間インキュベートした。続いての洗浄ステップの後、表面において単一分子シグナルを検出した(合計約200シグナル)。これは、表面へのNT*の非特異的結合によって形成されたバックグラウンドシグナルに相当する。NT*の標識を切断し(室温にて10分間)、表面を洗浄液で洗浄する。
第３のサイクルにおいて、dATPおよびdGTPを含む反応溶液を加え、30℃にて15分間インキュベートした。次いで、表面を洗浄した。
サイクル１〜３を３回繰り返し、合計約9900CCUの標的配列が決定された。これらの配列は、プライマーに明確に割り当てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】長い核酸鎖の配列決定の図式的表現  長い核酸配列(NAC)の配列決定および再構築は、ショットガン原理に基づく。DNAの長片の配列は、小断片(NACF)の配列決定および続いての再構築によって、これに関連して決定される。  1)出発物質−解析される核酸配列、全体配列  2)50〜1000 bpの断片−全体配列から断片化ステップにおいて作成されたNACF  3)それぞれ１つのプライマーを持つ断片−NACFプライマー複合体  4)固定化断片−平面的表面に対して結合したNACFプライマー複合体、本実施態様において、結合はNACFの３'末端に対して行われる  5)ポリメラーゼおよびNT*を含む溶液の添加−配列決定のサイクルにおける第１のステップ  6)洗浄ステップ組み込みステップの後、表面を洗浄する  7)検出−組み込まれた個々のNT*のシグナルを検出する  8)標識および停止をもたらす基の除去−配列決定反応を継続するために、標識および立体障害を除去する
【図２】NACFプライマー複合体の一般構造の例  図２ａ：本実施態様では、均一プライマー結合部位(PBS)をNACFの３'末端に連結し、均一プライマーがこのPBSに対して結合する。  図２ｂ：本実施態様では、天然のプライマー結合部位を用いる；結果として、特異的プライマーの混合物を用いる。  1)プライマー  2)プライマー結合部位  3)NACF
【図３】表面に対する結合のための官能基を持つ均一プライマー結合部位(PBS)の連結の例  この場合、たとえば、両方の鎖に修飾などを有する(３ｂ)二本鎖オリゴヌクレオチド複合体(３ａ)を二本鎖NACFにライゲートする(３ｃ)。変性後、均一PBSをもつ一本鎖NACFが形成される(３ｄ)。
【図４】均一プライマー結合部位(PBS)の製造の別例  この場合、NTを一本鎖NACFの３'末端に連結する(いわゆる、テーリング)。均一NTの使用を介して、均一PBSが形成される。
【図５】ゲル様反応表面へのNACFの結合の例  ゲル層(２)、たとえばポリアクリルアミドゲル(図5a)、または多数のゲルビーズ(５)、たとえばアガロースビーズ(図5b)、を固体基盤(１)に接着する。NACF(４)をゲルの表面に結合する。NACFは、たとえば、ビオチンなどの官能基を有し、ストレプトアビジンまたはアビジン(３)を介してゲルに結合する。
【図６】流動装置の例  ゲル様反応表面(１)を励起光および蛍光を透過する固定基盤(２)に固定する。それらは、一緒になって、フローセルのカバーを形成する。フローセル中の液体を、流動装置を形成する貯蔵容器(３)、ポンプ(４)およびバルブ(５)と一緒になったフローセルを用いる管理下様式に交換してもよい。NACFプライマー複合体(ここでは、図示せず)を反応表面に結合する。検出装置(６)によって組み込まれたNT*のシグナルを検出する。
【図７ａ】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。図7a−切断可能基および停止をもたらす立体要求基が、リンカーの部分を形成するNT構造の図式的表現。リンカーは、核酸塩基および蛍光色素の間の連結部である。  A、B、C、D、E−リンカー、A−切断後のリンカー残基、B−切断可能基、D−停止をもたらす立体要求基、F−蛍光色素。
【図７ｂ】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーの一部を形成する切断可能基、および停止をもたらす立体要求基を同時に表す蛍光色素をもつNT構造の図式的表現。  A、B、C−リンカー、A−切断後のリンカー残基、B−切断可能基、D−停止をもたらす立体要求基、F−蛍光色素。
【図７ｃ】切断ステップ後に組み込まれたNT*の構造の図式的表現。残存するリンカー残基(A)をもつ２つのNT*を示す。
【図７ｄ】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーの一部を形成する停止をもたらす立体要求基を同時に構成する切断可能基をもつNT構造の図式的表現。  A、B、C、D−リンカー、A−切断後のリンカー残基、B−切断可能基、D−停止をもたらす立体要求基、F−蛍光色素。
【図７ｅ−１】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーがピリミジン環の５位に連結する好ましいNT構造の表現。
【図７ｅ−２】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーがピリミジン環の５位に連結する好ましいNT構造の表現。
【図７ｆ−１】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーがピリミジン環の５位に連結する別の好ましいNT構造の表現。
【図７ｆ−２】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーがピリミジン環の５位に連結する別の好ましいNT構造の表現。
【図７ｆ−３】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーがピリミジン環の５位に連結する別の好ましいNT構造の表現。
【図７ｆ−４】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーがピリミジン環の５位に連結する別の好ましいNT構造の表現。
【図７ｇ−１】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーがプリン環の７位に連結する好ましいNT構造の表現。
【図７ｇ−２】本発明方法に用いることができる２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーがプリン環の７位に連結する好ましいNT構造の表現。
【図７ｈ】リンカーへの色素の連結の例。
【図７ｉ】リンカーへの色素の連結の例。
【図７ｊ】リンカーへの色素の連結の例。
【図７ｋ】本発明方法に用いうる他の２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーはピリミジン環の５位に連結する。  置換基R1,2,3,4は、選択可能であり、互いに独立して存在することができる。  １つの具体例(7k-1)において、Z基はリンカーと塩基の間の結合を表す。それは選択可能であり、アミド、カルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ基であってよい。  １つの具体例(7k-1)において、E基はリンカーの内部の一部を表す。もう１つの具体例(7k-2)において、それはリンカーと塩基の間の結合を表す。この基は選択可能であり、炭素原子数が好ましくは１〜５である非分枝アルキルまたはアルケニル鎖であってよい。しかし、E基は内部アミドカルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ結合をもつアルキルまたはアルケニル鎖であってもよい。  本実施例において、C基は化学的に切断可能な基である。具体例(7k-1,2)において、それはリンカーの内部の一部を表す。別の具体例(7k-3)において、それはリンカーと塩基の間の結合を表す。この基は選択可能であり、エステル、チオエステルおよびジスルフィド化合物であってよい。  Y基は、切断可能基(C)と蛍光色素(F)の間の結合を形成するリンカーの内部の一部を表す。この基は選択可能であり、分枝もしくは非分枝アルキルまたはアルケニル鎖であってよく、あるいは置換もしくは非置換アリール基であってもよい。さらなる可能な選択肢は、内部アミドカルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ結合をもつアルキルまたはアルケニル鎖である。  X基は、蛍光色素とリンカーの間の結合であり、この結合はリンカーおよび蛍光色素(F)の両方から誘導されうる結合である。それは選択可能であり、アミド、カルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ基であってよい。
【図７ｌ】本発明方法に用いうる他の２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーはプリン環の７位に連結する。  置換基R1,2,3,4は、選択可能であり、互いに独立して存在することができる。  １つの具体例(7l-1)において、Z基はリンカーと塩基の間の結合を表す。それは選択可能であり、アミド、カルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ基であってよい。  １つの具体例(7l-1)において、E基はリンカーの内部の一部を表す。もう１つの具体例(7l-2)において、それはリンカーと塩基の間の結合を表す。この基は選択可能であり、炭素原子数が好ましくは１〜５である非分枝アルキルまたはアルケニル鎖であってよい。しかし、E基は内部アミドカルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ結合をもつアルキルまたはアルケニル鎖であってもよい。  本実施例において、C基は化学的に切断可能な基である。具体例(7l-1,2)において、それはリンカーの内部の一部を表す。別の具体例(7l-3)において、それはリンカーと塩基の間の結合を表す。この基は選択可能であり、エステル、チオエステルおよびジスルフィド化合物であってよい。  Y基は、切断可能基(C)と蛍光色素(F)の間の結合を形成するリンカーの内部の一部を表す。この基は選択可能であり、分枝もしくは非分枝アルキルまたはアルケニル鎖であってよく、あるいは置換もしくは非置換アリール基であってもよい。さらなる可能な選択肢は、内部アミドカルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ結合をもつアルキルまたはアルケニル鎖である。  X基は、蛍光色素とリンカーの間の結合であり、この結合はリンカーおよび蛍光色素(F)の両方から誘導されうる結合である。それは選択可能であり、アミド、カルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ基であってよい。
【図７ｍ】本発明方法に用いうる他の２'−デオキシヌクレオシド三リン酸の構造。リンカーはピリミジン環の５位に連結する。  置換基R1,2,3,4は、選択可能であり、互いに独立して存在することができる。  Y基は、切断可能基(C)と蛍光色素(F)の間の結合を形成するリンカーの内部の一部を表す。この基は選択可能であり、分枝もしくは非分枝アルキルまたはアルケニル鎖であってよく、あるいは置換もしくは非置換アリール基であってもよい。さらなる可能な選択肢は、内部アミドカルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ結合をもつアルキルまたはアルケニル鎖である。  X基は、蛍光色素とリンカーの間の結合であり、この結合はリンカーおよび蛍光色素(F)の両方から誘導されうる結合である。それは選択可能であり、アミド、カルボアルコキシ(エステル)、スルホキシ、エーテル、チオエーテルまたはアミノ基であってよい。
【図８】検出システムの例  広視野光学検出システムを示す。標識NT*の組み込みの後、NTに連結した個々の色素分子の蛍光シグナルを検出して、表面(7)を走査しする。  図8a：走査される反応表面（グレー）のセクションの図式的表現。各ケースにおいて、円は、二次元イメージの記録に対応し、蛍光シグナルが検出される領域を表す。このことに関して、個々の分子からの幾つかのシグナル(たとえば、100〜10,000個)が同時に写真で記録される。反応表面をサイクル毎に走査し、走査処理中、幾つかの写真を表面上の異なるポイントについて撮る。このことに関して、組み込まれたNT*の数百万以下の信号を記録することができる。高度の並列処理が、この処理の速度の基準を形成する。  図8b：組み込まれた個々のNT*からのシグナルの写真(2次元イメージ)。  図8c：図8bの一部分。この部分は、組み込まれた４つのNT*のシグナルを示す。各シグナルは、個々の分子シグナルの特徴的な特性をもち(本明細書の記載を参照)、これに基づいて同定することができる(コンピュータープログラムを用いるのが好ましい)。対応するＸ、Ｙ軸を同定されるシグナルのそれぞれに割り当てる。
【図９】反応表面の有利な配列の例  ２つの別のフローセル(マイクロ流体チャネル、MFC)の使用によって、スループットは増加する。生化学反応および化学反応は一方のフローセルにおいて行なうが、検出は他方において行なう。次いで、フローセルを交換する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ−１】
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【図７ｅ−２】
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【図７ｆ−１】
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【図７ｆ−２】
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【図７ｆ−３】
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【図７ｆ−４】
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【図７ｇ−１】
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【図７ｇ−２】
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【図７ｈ】
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【図７ｉ】
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【図７ｊ】
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【図７ｋ−１】
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【図７ｋ−２】
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【図７ｋ−３】
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【図７ｌ−１】
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【図７ｌ−２】
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【図７ｌ−３】
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【図７ｍ−１】
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【図７ｍ−２】
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【図７ｍ−３】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529650.tif 000173
2004529650.tif 000174
【国際調査報告】
2004529650.tif 000175
2004529650.tif 000176
2004529650.tif 000177
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