(57)【要約】本発明は、抗癌活性を示すRUNX3遺伝子及びその用途に関するものである。より詳細には、TGF-β依存性アポトーシス機序にRUNX3遺伝子が必須的に関与し、優秀な癌形成抑制活性を示し、多様な胃癌及び肺癌細胞株でのRUNX3遺伝子の発現抑制がRUNX3遺伝子のエクソン1付近に存在する典型的なCpG島での非正常的なDNAメチル化に起因したものであることを明らかにしたものである。本発明のRUNX3遺伝子及びその遺伝子産物は、抗癌剤の開発に有用に利用できるだけではなく、RUNX3遺伝子のエクソン1付近の非正常的なDNAメチル化程度を測定して癌を診断する検査方法の開発と、非正常的なDNAメチル化を調節することによって、RUNX3遺伝子の発現を誘導する方法の開発に有用に利用出来る。
2004529619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1で記載されるcDNA塩基配列からなる、抗癌活性を示すヒトRUNX3遺伝子。
【請求項２】
配列番号：2で記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1のRUNX3遺伝子の転写開始コドンと転写終止コドン間のオープンリーディングフレームによりコードされるRUNX3蛋白質。
【請求項３】
請求項1のRUNX3遺伝子が正方向に挿入され、センスRUNX3遺伝子を発現できる発現プラスミド。
【請求項４】
請求項1のRUNX3遺伝子が逆方向に挿入され、アンチセンス RUNX3遺伝子を発現できる発現プラスミド。
【請求項５】
請求項3の発現プラスミドを有し、請求項1のRUNX3遺伝子を過発現する細胞株。
【請求項６】
請求項3の発現プラスミドがMKN28細胞株にトランスフェクトされることによって確立される、請求項5に記載のMKN28-Rx3細胞株(寄託番号: KCTC 0933BP)。
【請求項７】
請求項4の発現プラスミドを有し、RUNX3遺伝子の発現が選択的に阻害された細胞株。
【請求項８】
RUNX3遺伝子の発現が選択的に阻害され、請求項4の発現プラスミドがSNU16細胞株にトランスフェクトされることによって確立される、SNU16-Rx3-AS-cl1(寄託番号: KCTC 0934BP)である、請求項7記載の細胞株。
【請求項９】
RUNX3遺伝子の発現が選択的に阻害され、請求項4の発現プラスミドがSNU16細胞株にトランスフェクトされることによって確立される、SNU16-Rx3-AS-cl2(寄託番号: KCTC 0935BP)である、請求項7に記載の細胞株。
【請求項１０】
請求項3の発現プラスミドを含有する抗癌剤としての製薬組成物。
【請求項１１】
請求項1のRUNX3遺伝子を含有する抗癌剤としての製薬組成物。
【請求項１２】
配列番号：1で記載される塩基配列を有するRUNX3 cDNAを含有する抗癌剤としての製薬組成物。
【請求項１３】
請求項1のRUNX3遺伝子から転写されるRUNX3 RNAを含有する抗癌剤としての製薬組成物。
【請求項１４】
請求項2のRUNX3蛋白質を含有する抗癌剤としての製薬組成物。
【請求項１５】
RUNX3遺伝子のエクソン1付近のCpG島を含む、配列番号：3の塩基配列の、ヒストンデアセチラーゼ活性およびメチル化を調節することができる物質を含有する、抗癌剤としての製薬組成物。
【請求項１６】
被験者の癌組織からゲノムDNAを単離する段階、
該ゲノムDNAをDNAメチル化に感受性の制限酵素で消化する段階、
該ゲノムDNA消化物をアガロースゲル上で電気泳動により分離し、膜に移動させる段階、
該ゲノムDNA消化物を放射標識されたRUNX3遺伝子のDNAプローブとハイブリダイズさせる段階、及び
該膜をフィルムに露出させ、RUNX3遺伝子の発現を検出する段階
を含む、RUNX3遺伝子のエクソン1付近のCpG島を含む、配列番号：3の塩基配列のメチル化を検出することによって癌を診断する方法。
【請求項１７】
被験者の血液または癌組織からゲノムDNAを単離する段階、
該ゲノムDNAをDNAメチル化に感受性の制限酵素で消化する段階、
該ゲノムDNA消化物を鋳型として利用し、かつ配列番号：3の塩基配列の一部をプライマーとして利用する、重合酵素連鎖反応(PCR)を遂行する段階、及び
アガロースゲル上で電気泳動によりPCR反応産物を分離して、対象のDNA配列の増幅を検出する段階
を含む、RUNX3遺伝子のエクソン1付近のCpG島を含む、配列番号：3の塩基配列のメチル化を検出することによって特徴付けられる、癌を診断する方法。
【請求項１８】
配列番号：1のRUNX3 cDNAの一部、またはこのcDNAから産生されたRUNX3蛋白質に対する抗体を利用する、癌を診断するための生物学的マイクロチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗癌活性を示すRUNX3遺伝子及びその用途に関するものである。より詳細には、TGF-β依存性アポトーシス(programed cell death, apoptosis)機序にRUNX3遺伝子が必須的に関与し、優秀な癌形成抑制活性を示し、多様な胃癌及び肺癌細胞株でのRUNX3遺伝子の発現抑制がRUNX3遺伝子のエクソン1付近に存在する典型的なCpG島(CpG island)での非正常的なDNAメチル化(DNA methylation)に起因するものであることを明らかにしたものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の技術
腫瘍は、自律的な過剰増殖を示す細胞の集合であり、死に至らせる可能性がある悪性腫瘍(例えば癌)とそうではない良性腫瘍に区別されるが、例外も多く厳格な区別は困難である。特に、癌は発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子のような遺伝子に変異が起きて発生する遺伝的疾患であり、細胞次元に原因がある疾患である。癌遺伝子産物は、細胞でお互いにネットワークを成し、細胞の分裂や分化に関係する信号伝達体系を調節する役割を行なっている。つまり、これらの調節が非正常的になれば細胞の分化過程が断絶され無限定分裂を継続するようになる。このような間違った信号伝達経路を正常的に還元させることができれば、副作用が少なく卓越した治療効果を得られる抗癌剤が開発されると期待されている。
【０００３】
現在、癌の主要治療法は、外科的治療法、薬物療法、放射線療法の三つであり、現実的には、これらまたはこれらとレーザー療法等とを組み合わせた集学的療法が広く行なわれているが、治療に伴った苦痛、転移等を考慮すると薬物療法に対する期待が大きのは当然であると言える。ゆえに、それに答えるに値する多くの抗癌剤が開発され使用されているが、これら抗癌剤の大部分は、活発に分裂する細胞を選択的に殺すことによって抗癌効果を現す原理に準じて開発されたものである。しかし、このような抗癌剤は、人の体内で活発に分裂する免疫細胞、毛根細胞のような正常細胞も一緒に殺してしまうために深刻な副作用を同伴するので、長期間使用が不可能な問題点が指摘されている。それで、癌発病の原因糾明に基づいた新しい抗癌剤の開発が求められている。
【０００４】
一方、癌を誘発する発癌遺伝子の非正常的な活性化は、細胞の増殖を誘導するのに反して、癌抑制遺伝子は、細胞の非正常的な増殖を抑制したり時には細胞死滅プログラム(cell death program)を作動させ特定細胞を死滅させることによって癌細胞の生成を阻害する。一旦非正常的に活性化された癌遺伝子を持った細胞だとしても、癌抑制遺伝子が正常的な活性を示すようになれば、その細胞は癌を形成できないで死滅する。したがって、癌細胞になるためには癌遺伝子の活性化だけではなく癌抑制遺伝子の不活性化が一つの細胞で同時になされなければならない。
【０００５】
癌抑制遺伝子の不活性化が起きる機序中の一つは、CpG島での非正常的なDNAメチル化である(ジョーンズとレイアード(Jones and Laird), Nature genet. 1999年、第21巻、P.163-167参照)。CpG島のメチル化は、DNAメチラーゼという酵素によってなされメチル化が蓄積されるとMeCP2のような蛋白質がメチル化されたDNAに結合するようになり、それによってヒストンデアセチラーゼ (histone deacethylase)を呼び集めるようになる。ヒストンデアセチラーゼは、再びヒストンに結合されたアセチル基を除去し、その結果その付近のDNA構造が稠密になり遺伝子発現もまた抑制される。DNAメチル化によって遺伝子発現が抑制された場合は、DNAメチラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤によって遺伝子の発現が誘導され得る。DNAメチル化によって発現が抑制される癌抑制遺伝子としては、現在までRB1、TP53、VHL、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、APC等が報告されている(ジョーンズとレイアード(Jones and Laird), Nature genet. 1999年、第21巻、P.163-167参照)。
【０００６】
前述したように、ヒストンアセチル化及び脱アセチル化(deacetylation)が真核細胞での転写調節にとても重要な役割をするということは報告されていて(Grunstein M., Nature, 1997年、第389巻、P.349-352)、トラポキシン(trapoxin)、トリコスタチンA(trichostatin A)、デプデシン(depudecin)のような天然HDAC抑制剤の癌細胞に対する形質転換抑制(detransforming)活性が報告されている。その中で、デプデシンの血管形成抑制活性(anti-angiogenic activity)がインビボ及びインビトロの両方で明らかにされ、細胞周期停止、遺伝子発現様相の変化及びアポトーシス誘導等を含むHDAC抑制剤の細胞性反応が報告されている。
【０００７】
癌抑制活性が起きるまた他の機序の一つとして、TGF-β信号伝達系が報告されている。TGF-βがTGF-β受容体に結合するようになれば細胞内のSmad蛋白質を燐酸化して活性化させる。活性化されたSmad蛋白質は、細胞核内に移動して遺伝子発現を調節することによって細胞の分裂を抑制したりアポトーシス(programed cell deathまたはapotosis)を誘導することによってTGF-βによる癌抑制活性を示すようになる(マッサグエ(Massague)等, Cell, 2000年、第103(2)巻、P.295-309参照)。TGF-β受容体またはSmad4蛋白質の不活性化は、多様な癌細胞で観察されている。また、TGF-β受容体が不活性化された細胞株にTGF-β受容体を過発現させた形質転換細胞株を製造し、前記細胞株が導入されたヌードマウスを利用した癌抑制効果分析実験においてもTGF-β受容体は強力な癌抑制活性を持っていることが確認された(チャン(Chang)等, Cancer Res., 1997年、第57(14)巻、P.2856-2859参照)。TGF-β信号伝達系がSmad蛋白質を通してCDK阻害蛋白質のp21の発現を促進することによって細胞増殖を抑制する過程は、よく解明されているが、アポトーシスを誘導する機序はほとんど明らかにされていない。
【０００８】
一方、PEBP2ファミリー遺伝子には、RUNX1/PEBP2αB/CBFA2/AML1とRUNX2/PEBP2αA/CBFA2/AML3、そしてRUNX3/PEBP2αC/CBFA3/AML2の3種類が報告されている(ぺおよびイトー(Bae and Ito), Histol. Histopathol., 1999年、第14(4)巻、P.1213-1221参照)。RUNX1、RUNX2、RUNX3遺伝子相互間には全体的に約60〜70%程度のアミノ酸配列の類似性を見せているが、これらは進化的に大変良く保存されマウス遺伝子とヒト遺伝子間のアミノ酸配列の類似性は、各々約95%程度である。
【０００９】
RUNX1は、染色体転移(chromosome translocation)によって他の遺伝子と接合することによって、ヒトの急性骨髄性白血病または急性リンパ腺白血病を起す遺伝子として重要な白血病原因遺伝子である(ミヨシ(Miyoshi)等, EMBO J., 1993年、第12巻、P.2715-2721、ロマナ(Romana)等, Blood, 1995年、第85巻、P.3662-3670、オクダ(Okuda)等, Blood, 1996年、第91巻、P.3134-3143参照)。RUNX2は骨組織形成に非常に重要な役割をしていて、ヒトの骨組織形成異常を誘発する鎖骨頭蓋異骨症(cleidocranial dysplasia)の原因遺伝子であることが明らかにされた (コモリ(Komori)等, Cell, 1997年、第89巻、P.755-764、リー(Lee)等, Nat. Genet., 1997年、第15巻、P.303-306、ムンドロス(Mundlos)等, Cell, 1997年、第89巻、P.773-779、オット(Otto)等, Cell, 1997年、第89巻、P.756-771参照)。また、Runx2遺伝子は、T-cellリンパ腫(lymphoma)を形成できる癌遺伝子活性を持っていることが報告されている(ステワート(Stewart)等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997年、第94(16)巻、P.8646-8651参照)。
【００１０】
PEBP2ファミリーに属する3番目の遺伝子としてRUNX3遺伝子の存在は、本発明者らによって数年前に明らかにされたことがあるが(ぺ(Bae)等, Gene, 1995年、第159(2)巻、P.245-248、レバノン(Levanon)等, Genomics, 1994年、第23(2)巻、P.425-532参照)、RUNX3遺伝子の活性と関連疾病に対しては全く報告されたことはない。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
これらの問題を鑑みて、本発明者らは、RUNX3遺伝子の活性と関連疾病に対して明らかにすべく研究を継続した結果、PEBP2ファミリーに属する他の遺伝子(RUNX1, RUNX2)が癌誘導機能を持っているのに反して、本発明のRUNX3遺伝子産物は癌抑制活性を持っていて、TGF-βによる細胞死滅機序に必須的に関与し多様な癌細胞株においてRUNX3遺伝子の発現とRUNX3エクソン1付近のDNAメチル化の間に深い相関関係があることを発見して本発明を完成した。
【００１２】
本発明の目的は、癌抑制遺伝子及び前記遺伝子の癌抑制機序と発現調節機序を糾明して、癌の診断方法開発と治療剤開発に利用するために、RUNX3遺伝子の活性及び作用機序を提供することである。
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、センスRUNX3遺伝子を含みRUNX3遺伝子を過発現させた細胞株、及びアンチセンスRUNX3遺伝子を含みRUNX3遺伝子の発現を選択的に阻害させた細胞株を提供する。
【００１４】
また、本発明は、癌形成抑制活性を示すRUNX3遺伝子及びその蛋白質を提供する。
【００１５】
本発明では、前記RUNX3遺伝子を過発現させた細胞株及びRUNX3遺伝子の発現を選択的に阻害させた細胞株を利用して、TGF-β依存性アポトーシス機序にRUNX3遺伝子が必須的であることを明らかにする。
【００１６】
また、本発明では、多様な癌細胞株においてRUNX3遺伝子の発現抑制がRUNX3遺伝子のエクソン1付近のDNAメチル化に起因したものであることを明らかにする。
【００１７】
合わせて、本発明は、前記RUNX3遺伝子及びその蛋白質を有効成分とする製薬組成物を提供する。
【００１８】
最後に、本発明は、前記RUNX3遺伝子及びその蛋白質を抗癌剤の開発及び癌を診断する検査方法の開発に使用する用途を提供する。
【００１９】
発明の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、センスRUNX3遺伝子を含みRUNX3遺伝子を過発現させた細胞株及びアンチセンスRUNX3遺伝子を含みRUNX3遺伝子の発現を選択的に阻害させた細胞株を提供する。
【００２０】
本発明者らは、RUNX3遺伝子の活性と作用機序を明らかにするためにセンス RUNX3遺伝子とアンチセンスRUNX3遺伝子を過発現する細胞株を製造した。
【００２１】
まず、本発明者らは、RUNX3遺伝子のセンス遺伝子を発現するプラスミドベクターを製造するために1995年に本発明者によって発表されたことがあるヒトのRUNX3遺伝子を利用した(ペ(Bae)等, Gene, 1995年、第159(2)巻、P.245-248、cDNA塩基配列順序GenBank 寄託番号 Z35278)。RUNX3遺伝子のcDNAは、配列番号：1で記載される塩基配列を持ち、これからRUNX3遺伝子の転写開始コドンと転写終止コドン間に現れるオープンリーディングフレーム(open reading frame)から推定される配列番号：2で記載される415個のポリペプチドがコードされる(図1Aから1C参照)。また、RUNX3遺伝子のエクソン1付近のCpG島を含む遺伝子断片は、配列番号：3で記載される塩基配列で構成されている(図2A及び2B参照)。
【００２２】
RUNX3遺伝子のセンス遺伝子を発現するプラスミドベクターは、配列番号：1で記載されるRUNX3遺伝子のcDNA中、RUNX3 cDNAのコーディング部位(coding region)全体を含む2,244bp大きさのDNA断片(図1A参照)をpEF-BOSベクター(ミズシマ(Mizushima)等, Nucleic Acids Res., 1990年、第18(17)巻、P.5322)に、正しい方向に挿入して製造し、これをpEF-BOS-Rx3と命名した。また、RUNX3遺伝子のアンチセンス遺伝子を発現するプラスミドベクターは、RUNX3 cDNAをpEF-BOSベクターに逆方向に挿入して製造して、これをpEF-BOS-Rx3-ASと命名した。
【００２３】
前記のように製造したプラスミドベクターpEF-BOS-Rx3を多様な癌細胞株に同時-トランスフェクト(co-transfection)させた後、pEF-BOS-Rx3が安定的に導入されたトランスフェクタント(stable transfectant)を選別してセンスRUNX3遺伝子を過発現する細胞株を樹立した。本発明では、好ましい実施例としてリポフェクタミン(Lipofectmin, Gibco-BRL)を利用してプラスミドベクターpEF-BOS-Rx3をRUNX3遺伝子を発現しないMKN28細胞株にネオマイシン選別マーカー(neo selection marker)を持ったプラスミドと同時-トランスフェクトさせた後、トランスフェクタントをG418で選別した。このように選別したセンスRUNX3遺伝子を過発現する細胞株をMKN28-Rx3と命名し、これを韓国生命工学研究院遺伝子銀行に2001年1月9日付けで寄託した(寄託番号: KCTC 0933BP)。
【００２４】
また、アンチセンスRUNX3遺伝子を過発現する細胞株は、前記で製造したプラスミドベクターpEF-BOS-Rx3-ASを利用してp53遺伝子が不活性化された胃癌細胞株であり(キム(Kim)等, J. Natl. Cancer Inst., 1991年、第8(13)巻、P.938-943)TGF-β信号伝達体系は正常的に維持している(パク(Park)等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994年、第91(10)巻、P.8772-8776)SNU16細胞株に前記と同じ方法で選別マーカーを含むプラスミドと同時-トランスフェクトさせた後、pEF-BOS-Rx3-ASが安定的に導入されたトランスフェクタントを選別した。このように選別されたアンチセンスRUNX3遺伝子を過発現してRUNX3遺伝子の発現が選択的に阻害された細胞株を各々SNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2と命名した。これらを韓国生命工学研究院遺伝子銀行に2001年1月9日付けで寄託した (寄託番号: KCTC 0934BP及びKCTC 0935BP)。
【００２５】
本発明のMKN28-Rx3、SNU16-Rx3-AS-cl1及びSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株でセンスRUNX3遺伝子及びアンチセンスRUNX3遺伝子が実際に過発現されるかどうか確認するために配列番号：1のRUNX3 cDNAをDNAプローブに使用してノーザンブロット分析を遂行した結果、センスRUNX3遺伝子を過発現させたMKN28-Rx3細胞株では、18S RNAとほとんど一致する位置にRUNX3遺伝子の転写体が単一バンドで検出され、RUNX3遺伝子が前記細胞株で実際に発現されていることを確認した。反面、アンチセンスRUNX3遺伝子を過発現させたSNU16-Rx3-AS-cl1及びSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株では、多様な大きさのアンチセンスRUNX3 RNAが検出された。対照群SNU16細胞株での内生的(endogenous)RUNX3遺伝子の発現は、ノーザンブロット分析方法では検出されなかった(図3参照)。
【００２６】
また、本発明は、抗癌活性を示すRUNX3遺伝子及びその産物を提供する。
【００２７】
本発明者らは、RUNX3遺伝子の活性と作用機序を明らかにするため、前記で樹立されたRUNX3遺伝子が過発現されるMKN28-Rx3細胞株及びRUNX3遺伝子の発現が選択的に阻害されたSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株を利用した。
【００２８】
まず、TGF-βによって誘導されるアポトーシス効果を分析するために、正常的なSNU16細胞株と本発明のアンチセンスRUNX3遺伝子が過発現されRUNX3遺伝子の発現が選択的に阻害されるSNU16-Rx3-AS-cl1及びSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株にTGF-β1を処理した後、生存する細胞の数を対照群と比較した結果、SNU16細胞株でTGF-β1処理により細胞が死滅したことを観察した。詳細には、生存するSNU16細胞の数は、TGF-β1の処理後急激に減少して2日後には完全に死滅したことが分かった。しかし、アンチセンスRUNX3遺伝子を過発現させRUNX3遺伝子の発現を選択的に阻害させたSNU16-Rx3-AS-cl1細胞株では、このようなTGF-β1による細胞死滅現象が全く観察されなかった。SNU16-Rx3-AS-cl2細胞株でも同じ現象が観察された(図4A参照)。したがって、TGF-β1によるSNU16細胞株の死滅にはRUNX3遺伝子が関与することが分かった。
【００２９】
また、本発明者らは、SNU16細胞株で TGF-βにより誘導される細胞死滅が、 アポトーシス(programed cell death of apoptosis)機序によるものであるのかまたは細胞壊死(necrosis)によるものであるのか糾明するために、アポトーシス機序特異的なアポトーシス性DNAバンドを分析した。その結果、SNU16細胞株では、TGF-β1処理後明白な細胞死滅機序特異的なアポトーシス性DNAバンドが生成されたが(図4B参照、レーン1及び2)、アンチセンスRUNX3遺伝子が過発現されRUNX3遺伝子の発現が選択的に抑制されたSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株では、このようなアポトーシス性DNAバンドが観察されなった(図4A参照、レーン3から6)。このような結果から本発明者らは、SNU16細胞株ではTGF-β1刺激によるアポトーシス機序によって細胞が死滅し、この過程にRUNX3が必須的であることを確認した。
【００３０】
TGF-β1刺激によるアポトーシス機序は、正常細胞が癌細胞に変化することを抑制する大変重要な機序であり、このような過程に重要な役割をする因子は大部分、抗癌効果を持っていることが良く知られている(チャン(Chang)等, Cancer Res., 1997年、第57(14)巻、P.2856-2859)。それで、本発明者らは、RUNX3遺伝子もまた抗癌効果を持っているものと期待し、RUNX3遺伝子の抗癌効果を分析するためにヌードマウスを利用した癌形成能(tumorigenecity)分析を行なった。癌形成能は、各々の細胞株を同量ずつ皮下注射した後、実験期間の癌組織の大きさ変化を定期的に外部から測定して分析した。最終日には、マウスを犠牲死させて癌組織を摘出して大きさを比較した。
【００３１】
その結果、RUNX3の発現が阻害されたSNU16細胞株である本発明のSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2が注射されたマウスでは、対照群細胞に比べて顕著に速い速度で癌が形成されることを観察した(図5A参照)。詳細には、最終日に対照群の癌組織大きさは800mm3であるのに反して、SNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2が注射された実験群の癌組織大きさは、1,600mm3に達して癌組織の形成能が2倍程度増加したことが分かった。約98日経過後、マウスから癌を摘出してその大きさを直接比較した結果、やはり対照群から摘出した癌組織よりSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2が注射された実験群から摘出した癌組織の大きさが顕著に肥大していることを観察した(図5C参照)。
【００３２】
また、対照群-MKN28細胞株と本発明のセンスRUNX3遺伝子を過発現させた MKN28-Rx3細胞株を利用して、SNU16の場合と同じ方法でヌードマウスを利用して癌形成抑制効果を分析した結果、対照群-MKN28細胞株を注射したマウスに比べてセンスRUNX3遺伝子を過発現させたMKN28-Rx3細胞株を注射したマウスで癌形成能が顕著に抑制されたことを確認した(図5B参照)。詳細には、最終日に対照群の癌組織大きさは600mm3であるのに反し、MKN28-Rx3が注射された実験群の癌組織大きさは250mm3で、癌組織の形成能が58%程度減少した。約30日経過後、マウスから癌を摘出してその大きさを直接比較した結果、やはり対照群から摘出した癌組織よりMKN28-Rx3が注射された実験群から摘出した癌組織の大きさが肉眼で識別可能な程度に小さいことが観察された(図5C参照)。
【００３３】
このような結果から本発明者らは、RUNX3遺伝子が癌形成抑制活性を持っていることを確認した。
【００３４】
また、本発明者らは、多様な癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現様相を分析するために、15種の胃癌細胞株と17種の肺癌細胞株から全体RNAを分離した後、RT-PCR方法を利用してRUNX3遺伝子のmRNA発現可否を調査した。胃癌細胞株としては、SNU1、SNU5、SNU719、NUGC3、MKN1、MKN7、MKN28、MKN45、MKN74、AGS、KatoIII、RF1、RF48及びAZ521を使用した。肺癌細胞株としては、NCI-H522、86-2、A549、LK79、LK87、LCSC#1、LCSC#2、NCI-H23、NCI-H226、NCI-460、NCI-H322、Sq-19、NCI-H1915、NCI-H630、Hs 888Lu、Lu65及びLX-1を使用した。前記細胞株は、韓国生命工学研究院遺伝子銀行(KRIBB)から入手して使用した。
【００３５】
その結果、胃癌細胞株中、SNU5、SNU16、SNU719、MKN1、MKN45、RF1、RF48、MKN7、AZ521細胞株では、PS-NとPS-Cプライマー対を利用した増幅で予想された大きさ(PS-Nプライマー対 = 1,080bp; PS-Cプライマー対 = 870bp)のRT-PCR産物が生成され、この中のMKN7の場合は、とても少量の産物が生成された(図6B参照)。一方、SNU1、NUGC3、MKN28、MKN74、AGS、KatoIII細胞株では、PS-NとPS-C プライマー対を利用した増幅でRT-PCR産物を全く生成しなかった。
【００３６】
また、同じ方法で肺癌細胞株でもRUNX3遺伝子の発現をRT-PCR方法で分析した結果、Hs888Lu細胞株では、RUNX3遺伝子の発現が顕著に抑制されていて、NCI-H226、NCI-460、NCI-H630、Lu65では、RUNX3遺伝子の発現が完全に抑制されていた(図6C参照)。
【００３７】
前記でRT-PCR増幅により生成されたPCR産物が、RUNX3遺伝子のcDNAから増幅された産物であることを立証するために、サザンブロット分析を遂行した結果、RT-PCRから生成された産物がRUNX3 cDNAから増幅された産物であることを確認した(図6B参照、PS-3 ST)。同じ第一鎖(first strand)cDNAからPEBP2β(図6B参照、PEBP2β)とβ-アクチンcDNA(図6B、β-actin)を増幅できることを観察することによって前記実施例 <4-1>で胃癌細胞株のSNU1、NUGC3、MKN28、MKN74、AGS、KatoIII、NCI-H226、NCI-460、NCI-H630、Lu65でRUNX3 cDNAが増幅されないのは、前記細胞株でRUNX3遺伝子が発現されないためであることを確認した。同様にMKN7、Hs888Lu細胞株で非常に少量のRT-PCR産物が生成されたこともRUNX3遺伝子の発現水準が非常に低いためであることが分かった。
【００３８】
以上のような結果から本発明者らは、胃癌細胞株の約47%そして肺癌細胞株の約30%でRUNX3遺伝子の発現が顕著にまたは完全に抑制されていることが分かった。 RUNX3遺伝子が発現できないとTGF-βによるアポトーシスが起きず、癌細胞の癌形成能も増大されるものと見る時、RUNX3遺伝子の発現抑制は、約47%の胃癌と約30%の肺癌(胃癌と肺癌全体的には、約37%)において重要な診断指標になることを確認した。
【００３９】
合わせて、本発明者らは癌細胞株でRUNX3遺伝子の突然変異分析時、各種癌細胞株からRUNX3遺伝子の全てのエクソンが増幅される事実から、数種の癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現が観察されないことは、RUNX3遺伝子が細胞内に存在するがただ発現されないだけであることを知るに至った。それで本発明者らはRUNX3遺伝子の発現抑制がDNAメチル化に起因するかどうか明らかにするためRUNX3遺伝子の発現状態とエクソン1付近に存在するCpG島の高メチル化(hypermethylation)間の相関関係をDNAメチル化に対して感受性の制限酵素を使用したゲノムDNAサザンブロット分析を行なって調査した。この時、癌細胞株から分離・精製されたゲノムDNAは、DNAがメチル化されていると切断できない制限酵素またはDNAメチル化とは関係なしに切断できる制限酵素で処理した。本発明の好ましい実施例では、DNAメチル化により切断できない制限酵素にSmaIを、DNAメチル化とは関係なしに切断する制限酵素にBamHIを使用した。
【００４０】
その結果、RUNX3遺伝子の発現が観察されない胃癌細胞株SNU1、NUGC3、MKN28、MKN74、AGS、Kato IIIでだけ特異的にSmaI切断が大きく阻害された結果が観察出来た。前記で発現水準が特に低かったMKN7細胞株は、部分的にメチル化された様相を示した(図7B参照)。このような結果は、癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現抑制とRUNX3エクソン1付近に存在するCpG島の高メチル化間に深い相関関係があることを意味するものである。
【００４１】
前記で観察されたDNAメチル化がRUNX3遺伝子の発現を抑制する直接的な原因であるかどうかを分析するために、本発明者らはDNAメチラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤を処理した時、RUNX3遺伝子の発現が再活性化されるかどうか調査した。この時、DNAメチラーゼ阻害剤には、5-アザ-2-デオキシシチジン(5-aza-2-deoxycytidine，AZA, 300nM)を使用した。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤には、トリコスタチン(trichostatin A, TSA, 1mM)を使用した。その結果、DNAメチラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤を処理した時、RUNX3遺伝子の発現が再び誘導されることを確認した(図8参照)。このような結果から約37%の胃癌、肺癌細胞株でRUNX3遺伝子のエクソン1付近に存在するCpG島の高メチル化によってRUNX3遺伝子の発現が抑制されていることが証明された。このような結果は、RUNX3遺伝子の発現を促進する薬剤がDNAメチラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤から開発され、抗癌剤として使用できることを意味する。
【００４２】
前記のような結果を通して本発明者らは、RUNX3遺伝子産物がTGF-β1依存性アポトーシス機序に関与することによって抗癌活性を持ち、癌と細胞株の実質的部分におけるRUNX3遺伝子の発現が、前記遺伝子のエクソン1付近に存在するCpG島の高メチル化によって抑制されていることを確認した。
【００４３】
合わせて、本発明は、前記センスまたはアンチセンスRUNX3遺伝子を発現する発現ベクター及びその蛋白質を有効成分とする製薬組成物を提供する。
【００４４】
前記製薬組成物は、癌の予防、診断または治療に使用出来る。より詳細には、TGF-β依存性アポトーシス機序の非正常化に起因する疾患または胃癌、肺癌等を含む多様な癌疾患を予防、診断または治療する目的に使用出来る。
【００４５】
この時、前記製薬組成物の有効成分には、RUNX3 cDNA、RUNX3 RNAまたはこれから生産された蛋白質を使用出来る。より好ましくは、その発現ベクター自体を使用することが良い。それは、RUNX3遺伝子発現ベクターを投与するとそれから持続的にRUNX3蛋白質が生産され得るからである。前記発現ベクターを有効成分とする製薬組成物を非経口で生体組織に投与すれば、投与された生体組織はRUNX3を生産できる。したがって、本発明のRUNX3遺伝子またはこれを含む発現ベクターは、遺伝子治療療法に使用される製薬組成物の有効成分として利用出来る。
【００４６】
前記RUNX3 cDNA、それから生産されたRUNX3 RNAまたはRUNX3蛋白質は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能であり、特に、非経口注射投与が好ましい。
【００４７】
即ち、前記発現ベクターまたはそれから生産されたRUNX3蛋白質は、実際の臨床投与時に経口または非経口の色々な剤形で投与出来る。製剤化する場合には、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の稀釈剤または賦形剤を使用して製造される。経口投与の為の固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は少なくても一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、蔗糖またはラクトース、ゼラチン等を混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与の為の液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤等が該当する。よく使用される単純稀釈剤の水、リキッドパラフィン、この他にも色々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与の為の製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等が使用できる。座薬の基剤には、ハードファット(witepsol)、マグロコール、ツイーン(tween)61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用できる。細胞内吸収を助ける為にリポソームのような剤形が利用できる。
【００４８】
前記RUNX3 cDNAの有効用量は、0.002〜1mg/kgであり、好ましくは、0.02〜0.2mg/kgである。RUNX3 RNAの有効用量は、0.001〜0.5mg/kgであり、好ましくは、0.01〜0.1mg/kgである。前記RUNX3 蛋白質の有効用量は、0.04〜4mg/kgであり、好ましくは、0.4〜1mg/kgである。
【００４９】
最後に、本発明は、前記RUNX3遺伝子及びその蛋白質を抗癌剤の開発及び癌を診断する検査方法の開発に使用する用途を提供する。
【００５０】
前記で詳しく見たように、本発明のRUNX3遺伝子は優秀な抗癌活性を示し、TGF-β依存性アポトーシス機序に必須的に関与する。詳細には、RUNX3の発現は、約47%の胃癌細胞株及び約30%の肺癌細胞株(胃癌と肺癌全体的には、約37%)で抑制されていることを確認した。また、多様な胃癌及び肺癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現抑制は、RUNX3遺伝子のエクソン1付近に存在する典型的なCpG島での非正常的なDNAメチル化に起因するものであり、DNAメチラーゼ抑制剤またはヒストンデアセチラーゼ抑制剤処理によってRUNX3遺伝子の発現を誘導できることを確認した。したがって、本発明のRUNX3遺伝子及びその遺伝子産物は、抗癌剤の開発だけではなくRUNX3遺伝子のエクソン1付近の非正常的なDNAメチル化を測定して癌を診断する検査方法の開発に有用に利用出来る。また、RUNX3の発現が抑制された癌の治療目的で、RUNX3遺伝子の発現を誘導する活性物質の開発にも利用出来る。
【００５１】
このような研究の一環として、RUNX3遺伝子のエクソン1付近のCpG島を含む塩基配列のメチル化を調節する活性を持った物質を有効成分とする抗癌用製薬組成物を開発出来る。
【００５２】
また、RUNX3遺伝子のエクソン1付近のCpG島を含む塩基配列のメチル化を検出することによって癌を診断する検査方法は、
被験者の癌組織からゲノムDNAを単離する段階、
このゲノムDNAをDNAメチル化に感受性の制限酵素で消化する段階、
このゲノムDNAをアガロースゲルに電気泳動した後、膜に移動させる段階、
この膜をRUNX3遺伝子DNAプローブとハイブリダイズさせる段階、
この膜をフィルムに露出させRUNX3遺伝子の発現を検出する段階
を含む。
【００５３】
本発明の他の態様によると、癌を診断する方法は、
被験者の血液または癌組織からゲノムDNAを分離・精製する段階、
このゲノムDNAをDNAメチル化に感受性の制限酵素で切断する段階、
このゲノムDNAを鋳型に利用して配列番号：3の塩基配列一部をプライマーに利用して重合酵素連鎖反応(PCR)を遂行する段階、及び
アガロースゲルに電気泳動して反応産物を検出する段階で構成できる。
【００５４】
PCRを利用する前記検査方法は、目的とする遺伝子部位がメチル化されていればPCR産物が現れ、メチル化されていなければPCR産物が現れない原理を利用した。
【００５５】
また、本発明の配列番号：1で記載されるRUNX3 cDNA塩基配列の一部またはこれから生産されたRUNX3 蛋白質は、癌を診断するための生物学的マイクロチップ形態で提供出来る。
【００５６】
マイクロチップは、分子生物学的知識と機械及び電子工学的技術を総合して製造されるもので、少ないもので数十個から多いもので数万個のDNAまたは蛋白質を非常に小さな空間に高密度に付着させたものである。これによってマイクロチップは、同時に最少で数百個以上の遺伝子または蛋白質を速い時間内に検索でき、前記マイクロチップを利用すれば、既存の生命工学的技術を利用したものより新しい遺伝子探索及び診断を迅速で簡便に行なえる。マイクロチップは遺伝物質の大きさによりオリゴヌクレオチドチップ(Oligonucleotide chip)及びcDNAチップに分けられ、探そうとする遺伝子及び実験目的によって選択して使用出来る。したがって、前記のRUNX3 cDNA塩基配列の一部またはこれから生産されたRUNX3 蛋白質に対する抗体を利用したマイクロチップは、胃癌及び肺癌を含む各種癌と疑われる数多くの患者らの診断に利用出来る。
【００５７】
実施例
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００５８】
＜実施例 1＞ SNU16-Rx3-ASとMKN28-Rx3細胞株の樹立
本発明者らはRUNX3遺伝子の活性と作用機序を明らかにするためにセンスRUNX3遺伝子とアンチセンスRUNX3遺伝子を過発現する細胞株を下記のように樹立した。
【００５９】
＜1-1＞ センス及びアンチセンスRUNX3遺伝子発現プラスミドベクターの製造
まず、本発明者らはRUNX3遺伝子のセンス遺伝子を発現するプラスミドベクターを製造するために、1995年に本発明者によって発表されたことがあるヒトのRUNX3遺伝子を利用した(ペ(Bae)等, Gene, 1995年、第159(2)巻、P.245-248；cDNAヌクレオチド配列GenBank寄託番号Z35278)。RUNX3遺伝子のcDNAは、配列番号：1で記載される塩基配列を持っていて、これから配列番号：2で記載されるアミノ酸配列で構成された415個のポリペプチドがコードされる(図1A〜1C)。また、RUNX3遺伝子のエクソン1付近のCpG島を含む遺伝子断片は、配列番号：3で記載される塩基配列で構成されている(図2A及び2B)。
【００６０】
詳細には、RUNX3遺伝子のセンス遺伝子を発現するプラスミドベクターは、配列番号：1で記載されるRUNX3遺伝子のcDNA中、RUNX3 cDNAのコーディング部位(coding region)全体を含む2,244bpの大きさのBamHI断片(図1A)をpEF-BOSベクター(ミズシマ(Mizushima)等, 1990年；Nucleic Acid Res., 18(17):5322)の制限酵素XbaI部位に正しい方向に挿入して製造し、これをpEF-BOS-Rx3と命名した。
【００６１】
また、RUNX3遺伝子のアンチセンス遺伝子を発現するプラスミドベクターは、配列番号：1で記載されるRUNX3 cDNAをpEF-BOSベクターの制限酵素XbaI部位に逆方向に挿入して製造し、これをpEF-BOS-Rx3-ASと命名した。
【００６２】
＜1-2＞ 安定なトランスフェクション
センスRUNX3遺伝子を過発現する細胞株を製造するために前記実施例＜1-1＞で製造されたプラスミドベクターpEF-BOS-Rx3をRUNX3遺伝子を発現しないMKN28細胞株にリポフェクタミン(Lipofectmin, Gibco-BRL)を利用してネオマイシン選別マーカー(neo selection marker)を持ったpcDNA3.1プラスミドと同時-トランスフェクト(co-transfection)させた後、pEF-BOS-Rx3が安定的に導入されたトランスフェクタント(stable transfectant)をG418で選別した。このように選別されたセンスRUNX3遺伝子を過発現する細胞株をMKN28-Rx3と命名した。これを韓国生命工学研究院遺伝子銀行に2001年1月9日付けで寄託した(寄託番号: KCTC 0933BP)。
【００６３】
また、アンチセンスRUNX3遺伝子を過発現する細胞株は、前記実施例＜1-1＞で製造されたプラスミドベクターpEF-BOS-Rx3-ASをp53遺伝子が不活性化された胃癌細胞株であり(キム(Kim)等, J. Natl. Cancer Inst., 8(13):938-943, 1991年)TGF-β正常的な信号伝達体系は正常的に維持している(パク(park)等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91(10):8772-8776, 1994年)SNU16細胞株に前記と同じ方法でpcDNA3.1プラスミドと同時-トランスフェクトさせた後、pEF-BOS-Rx3-ASが安定的に導入されたトランスフェクタントを選別した。このように選別されたアンチセンスRUNX3遺伝子を過発現してRUNX3遺伝子の発現が選択的に阻害された細胞株をSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2と命名した。これらを各々韓国生命工学研究院遺伝子銀行に2001年1月9日付けで寄託した(寄託番号: KCTC 0934BP及びKCTC 0935BP)。
【００６４】
対照群には、SNU16とMKN28細胞株にpcDNA3.1プラスミドだけをトランスフェクトさせG418で選別して得たクローンである対照群-SNU16と対照群-MKN28を使用した。
【００６５】
＜1-3＞ ノーザンブロット分析
前記実施例＜1-2＞で確保されたMKN28-Rx3、SNU16-Rx3-AS-cl1及びSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株で、センスRUNX3遺伝子及びアンチセンスRUNX3遺伝子が実際に過発現されるかどうか確認するためにノーザンブロット分析を遂行した。
【００６６】
詳細には、全体細胞性(total cellular)RNAを標準化された方法にしたがって各々の細胞株から分離した(サムブロック(Sambrook)等,「分子クローニング」(Molecular cloning),コールドスプリングハーバー研究所,実験室マニュアル第2版(a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory)、1988年)これから得られた各々のRNA5μgを1.2%ホルムアルデヒド/アガロースゲル(formaldehyde/agarose gel)に電気泳動した後、ハイボンド-N+ナイロン膜(Hybond-N+ nylon membrane, Amersham)に移動させた。プローブDNAは、[α-32P]dCTP(3,000 Ci/mmol; NEN)で標識された配列番号：1のRUNX3 cDNA(ペ(Bae)等, Gene, 1995年、第159(2)巻、P.245-248)を利用した。ハイブリダイゼーションは、ハイボンド-N+ナイロン膜を106cpm/mlのRUNX3プローブDNAを含んだ5×SSPE、5×デンハルツ溶液(Denhardts solution)、0.5%SDS及び100mg/ml鮭精子(salmon sperm)DNA溶液内で65℃、16時間遂行した。ハイブリダイゼーションが終わった膜を2×SSPE/0.1% SDS溶液で室温で15分間2回、0.1×SSPE/0.1%SDS溶液で65℃で15分間2回洗浄した。遺伝子の発現は、前記膜を-70℃で16時間、コダックXAR-5フィルムに露出させた後、現象して観察した。
【００６７】
その結果、センスRUNX3遺伝子を過発現させたMKN28-Rx3細胞株では、18S RNAと似た位置でRUNX3遺伝子の転写体が単一バンドで検出され、RUNX3遺伝子が前記細胞株で実際に発現されていることを確認した。アンチセンスRUNX3遺伝子を過発現させたSNU16-Rx3-AS-cl1及びSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株では、アンチセンスRUNX3 RNAが多様な大きさで発現しているのが観察された。対照群SNU16細胞株での内生的な(endogenous)RUNX3遺伝子の発現は、ノーザンブロット分析方法では検出されなかった(図3参照)。
【００６８】
＜実施例2＞ TGF-βにより誘導されるアポトーシス効果分析及びRUNX3遺伝子の役割
＜2-1＞ TGF-βにより誘導されるアポトーシス効果分析
TGF-βによって誘導されるアポトーシス効果を分析するために、正常的なSNU16細胞株と本発明のアンチセンスRUNX3遺伝子が過発現されRUNX3遺伝子の発現が選択的に阻害されるSNU16-Rx3-AS-cl1及びSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株にTGF-β1を1ng/ml濃度で処理した後、生存する細胞の数を数えてグラフに示した。
【００６９】
その結果、図4Aに示したように、SNU16細胞株は、1ng/ml濃度のTGF-β1処理により細胞が死滅するのが観察された。詳細には、生存するSNU16細胞の数は、TGF-β1の処理後急激に減少して2日後には完全に死滅することが分かった。しかし、アンチセンスRUNX3遺伝子を過発現させRUNX3遺伝子の発現を選択的に阻害させたSNU16-Rx3-AS-cl1細胞株では、このようなTGF-β1による細胞死滅現象が全く観察されなかった。SNU16-Rx3-AS-cl2細胞株でも同じ現象が観察された。したがって、TGF-β1によるSNU16細胞株の死滅には、RUNX3遺伝子が関与することが分かった。
【００７０】
＜2-2＞ TGF-βにより誘導されるアポトーシスにおけるRUNX3遺伝子の役割
また、本発明者らは、前記実施例＜2-1＞で確認されたSNU16細胞株でTGF-βにより誘導される細胞死滅がアポトーシス(programed cell death of apoptosis)機序によるものであるのかまたは細胞壊死(necrosis)によるものであるのか糾明するためにアポトーシス機序特異的なアポトーシス性DNAバンドを分析した。詳細には、対照群-SNU16、SNU16-Rx3-AS-cl1そしてSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株を1ng/mlのTGF-β1で6時間処理した後、各々の細胞からゲノムDNAを分離・精製して定量した(サムブロック(Sambrook)等,「分子クローニング」(Molecular cloning),コールドスプリングハーバー研究所,実験室マニュアル第2版(a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)、1988年)。0.2μgの精製されたゲノムDNAを1.5%アガロースゲルに電気泳動し臭化エチジウムで染色して、アポトーシスで現れる特異的なアポトーシス性バンドを観察した。
【００７１】
その結果、SNU16細胞株では、TGF-β1処理後明白な細胞死滅機序特異的な アポトーシス性DNAバンドが生成されたが(図4B、レーン1及び2)、アンチセンスRUNX3遺伝子が過発現されRUNX3遺伝子の発現が選択的に抑制されたSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株では、このようなアポトーシス性DNAバンドが観察されなかった(図4B、レーン3、4、5及び6)。
【００７２】
このような結果から本発明者らは、SNU16細胞はTGF-β1刺激によってアポトーシス機序により死滅し、この過程にRUNX3が関与することを確認した。
【００７３】
＜実施例 3＞ RUNX3の癌形成能(Tumorigenicity)抑制活性調査
TGF-β1刺激によるアポトーシス機序は、正常細胞が癌細胞に変わることを抑制するとても重要な機序であり、このような過程に重要な役割をする因子は大部分抗癌効果を持っていることが良く知られている。それで本発明者らは、RUNX3遺伝子もまた抗癌効果を持つものと期待してRUNX3遺伝子の抗癌効果を分析するためにヌードマウスを利用して癌形成能分析を遂行した。
【００７４】
詳細には、本発明のアンチセンスRUNX3遺伝子を過発現させてRUNX遺伝子の発現が選択的に阻害されたSNU16-Rx3-AS-cl1及びSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株と対照群-SNU16細胞株を0.85%燐酸塩緩衝食塩水(phosphate buffered saline)溶液に3×107cells/ml 濃度で懸濁させ、0.3mlをヌードマウスに皮下注射した。また、センスRUNX3遺伝子を過発現するMKN28-Rx3細胞株と対照群-MKN28細胞株を前記と同じ溶液に5×107cells/ml濃度で懸濁させ、0.3mlをヌードマウスに皮下注射した。各々の細胞株クローンを9匹のヌードマウスに各々皮下注射して、これを一つの実験群とした。MKN28-Rx3と対照群-MKN28細胞株の癌形成能は、注射後、37日間観察した。SNU16-Rx3-AS-cl1、SNU16-Rx3-AS-cl2細胞株そして対照群-SNU16細胞株の癌形成能は、98日間観察した。この期間中、癌組織の大きさを定期的に外部から測定し、最終日にはマウスを犠牲死させて癌組織を摘出して大きさを比較した。
【００７５】
その結果、RUNX3の発現が阻害されたSNU16細胞株である本発明のSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2が注射されたマウスで、対照群細胞に比べて顕著に速い速度で癌が形成されたことを観察した(図5A)。詳細には、最終日に対照群の癌組織大きさは800mm3なのに反し、SNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2が注射された実験群の癌組織大きさは1,600mm3に達し、癌組織の形成能が2倍程度増加したことが分かった。98日経過後、マウスから癌を摘出してその大きさを直接比較した結果やはり対照群から摘出した癌組織よりSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2が注射された実験群から摘出した癌組織の大きさが顕著に肥大していることが観察された(図5C)。
【００７６】
また、対照群-MKN28細胞株と本発明のセンスRUNX3遺伝子を過発現させたMKN28-Rx3細胞株を利用して、SNU16の場合と同じ方法でヌードマウスを利用して癌形成抑制効果を分析した結果、対照群-MKN28細胞株を注射したマウスに比べてセンスRUNX3遺伝子を過発現させたMKN28-Rx3細胞株を注射したマウスで癌形成が顕著に抑制されたことを確認した(図5B
)。詳細には、最終日に対照群の癌組織大きさは600mm3なのに反し、MKN28-Rx3が注射され
た実験群の癌組織大きさは250mm3で、癌組織の形成能が58%程度減少した。約30日経過後、マウスから癌を摘出してその大きさを直接比較した結果、やはり対照群から摘出した癌組織よりMKN28-Rx3が注射された試験群から摘出した癌組織の大きさが肉眼で識別可能な程度に小さいことが観察された(図5C)。
【００７７】
このような結果から本発明者らは、RUNX3遺伝子が癌形成抑制活性を持っていることを確認した。
【００７８】
＜実施例 4＞ 癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現様相分析
＜4-1＞ RT-PCR分析
多様な癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現様相を分析するために、15種の胃癌細胞株と17種の肺癌細胞株から全体RNAを分離した後、RT-PCR方法を利用してRUNX3遺伝子のmRNA発現可否を調査した。胃癌細胞株には、SNU1、SNU5、SNU719、NUGC3、MKN1、MKN7、MKN28、MKN45、MKN74、AGS、Kato III、RF1、RF48及びAZ521を使用した。肺癌細胞株には、NCI-H522、86-2、A549、LK79、LK87、LCSC#1、LCSC#2、NCI-H23、NCI-H226、NCI-460、NCI-H322、Sq-19、NCI-H1915、NCI-H630、Hs888Lu、Lu65及びLX-1を使用した。前記細胞株は、韓国生命工学研究院遺伝子銀行から入手して使用した。
【００７９】
全体RNAは、標準化された単一段階グアニジウム方法(single step guanidium method)(サムブロック(Sambrook)等,「分子クローニング」(Molecular cloning),コールドスプリングハーバー研究所,実験室マニュアル第2版(a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory)、1988年)にしたがって、各々の癌細胞株から分離・精製した。このように精製されたRNAを鋳型に使用して、オリゴ-dT(oligo-dT)をプライマーに使用してスーパークリフトキット(Superscript kit (Gibco-BRL))を利用して製造社の指針にしたがってcDNAを合成した。前記cDNAを基礎にしてRT-PCR方法でRUNX3 mRNA発現可否を分析した。RUNX3遺伝子の増幅の為に二対のPCRプライマー(Ps-NとPs-C)を製造した。Ps-Nプライマー対は、配列番号：4で記載される正方向プライマーPS-NAと配列番号：5で記載される逆方向プライマーPS-NBで構成されていて、Ps-Cプライマー対は、配列番号：6で記載される正方向プライマーPs-CAと配列番号：7で記載される逆方向プライマーPs-CBで構成されている。各々の前記二対のPCRプライマーは、配列番号：1のRUNX3遺伝子のcDNA塩基配列を基礎にデザインして合成した(図5A)。
【００８０】
対照群のRT-PCRの為にPEBP2β/CBFB cDNA及びβ-アクチンcDNA塩基配列を利用して、PEBP2β/CBFBを特異的に認識する配列番号：8で記載される正方向プライマーh-β5と配列番号：9で記載される逆方向プライマーh-β3のプライマー対と、β-アクチンを特異的に認識する配列番号：10で記載される正方向プライマーh-アクチン5と配列番号：11で記載される逆方向プライマーh-アクチン3のプライマー対を製造した。これらのプライマー対は、ヒトのPEBP2βcDNAまたはβ-アクチンcDNAの塩基配列を基礎にデザインして合成した。
【００８１】
RT-PCR反応は、遺伝子増幅装置(Perkin-Elmer Cetus, model 9600)を利用した。全体反応溶液を50μlにし、初期に95℃で2分間処理した後、変性(denaturation)段階95℃で15秒、アニーリング(annealing)段階50℃で1分、酵素反応段階72℃で1分の反応を連続的に30回反復した。反応が終結後、反応液中から5μlを取って1.2%アガロースゲル上に電気泳動した後、臭化エチジウム染色して観察した。
【００８２】
その結果、胃癌細胞株中、SNU5、SNU16、SNU719、MKN1、MKN45、RF1、RF48、MKN7、AZ521細胞株で、PS-NとPS-Cプライマー対を利用した増幅で予想される大きさ(PS-Nプライマー対 = 1080bp; PS-Cプライマー対 = 870bp)のRT-PCR産物を生成した。この中のMKN7の場合は非常に少量の産物が生成された(図6B)。一方、SNU1、NUGC3、MKN28、MKN74、AGS、KatoIII細胞株では、PS-NとPS-Cプライマー対を利用した増幅でRT-PCR産物を全く生成しなかった。
【００８３】
また、17種の肺癌細胞株でも同じ方法でRUNX3遺伝子の発現をRT-PCR方法で分析した結果、Hs888Lu細胞株では、RUNX3遺伝子の発現が顕著に抑制されていて、 NCI-H226、NCI-460、NCI-H630、Lu65の4種では、RUNX3遺伝子の発現が完全に抑制されていた(図6C)。
【００８４】
＜4-2＞ DNAサザンブロット分析
前記実施例＜4-1＞でRT-PCR増幅により生成されたPCR産物がRUNX3遺伝子のcDNAから増幅された産物であることを立証するために、サザンブロット分析を遂行した。RT-PCR産物を1.5%アガロースゲルに電気泳動した後、ハイボンド-N+ナイロン膜に移動させた。
【００８５】
プローブとしてRUNX3 cDNAのBamHI断片2,244bpを利用して前記実施例＜1-3＞に記述したノーザンブロット分析方法と同じ方法でハイブリダイズしてXAR-5フィルムに露出させて観察した。
【００８６】
その結果、RT-PCRから生成された産物がRUNX3 cDNAから増幅された産物であることを確認した(図6B、PS-3 ST)。同じ第一鎖(first strand)cDNAからPEBP2β(図6B、PEBP2β)とβ-アクチンcDNA(図6B、β-actin)を増幅し得ることを観察することによって、前記実施例＜4-1＞で胃癌細胞株であるSNU1、NUGC3、MKN28、MKN74、AGS、Kato IIIでRUNX3 cDNAが増幅されないことは、前記細胞株でRUNX3遺伝子が発現されないためであることを確認した。同様に、MKN7細胞株で非常に少量のRT-PCR産物が生成されたのもRUNX3遺伝子の発現水準が非常に低いためであることが分かった。
【００８７】
以上の結果から、本発明者らは、胃癌細胞株の約47%そして肺癌細胞株の約30%でRUNX3遺伝子の発現が顕著にまたは完全に抑制されていることが分かった。RUNX3遺伝子が発現されないとTGF-βによるアポトーシスが起きないため癌細胞の癌形成能も増大になると見る時、RUNX3遺伝子の発現抑制は約47%の胃癌と約30%の肺癌(胃癌と肺癌全体的には、約37%)において重要な診断指標になり得ることを確認した。
【００８８】
＜実施例 5＞ 癌細胞株でのRUNX3遺伝子のエクソン1付近メチル化状態分析
＜5-1＞ ゲノムDNAサザンブロット分析を利用したメチル化状態調査
それで、本発明者らは、RUNX3遺伝子の発現抑制がDNAメチル化に起因したものであるかどうかを明らかにするため、RUNX3遺伝子の発現状態とエクソン1付近に存在するCpG島の高メチル化(hypermethylation)間の相関関係をDNAメチル化に対して感受性の制限酵素を使用したゲノムDNAサザンブロット分析を遂行して調査した。
【００８９】
まず、癌細胞株からゲノムDNAを標準化されたSDS/プロテナーゼK(proteinase K)方法(サムブロック(Sambrook)等, 1988年)によって分離・精製した。精製されたゲノムDNAをDNAがメチル化されていれば切断できない制限酵素(SmaI)、またはDNAメチル化とは関係なく切断できる制限酵素(BamHI)で処理し、1.5%アガロースゲルに電気泳動した後、ハイボンド-N+ナイロン膜に移動させた。RUNX3遺伝子のCpG島を含むゲノムDNA Nhe1/MluI断片(図7A)をDNAプローブに利用して前記実施例＜1-3＞に記述されたノーザンブロット分析方法と同じ方法でハイブリダイズしてXAR-5フィルムに露出させて観察した。ゲノムDNAは、ヒトゲノムDNAライブラリーを配列番号：1のRUNX3 cDNAをプローブに検索して分離した。
【００９０】
その結果、RUNX3遺伝子の発現が観察されない胃癌細胞株、SNU1、NUGC3、MKN28、MKN74、AGS、Kato IIIでだけ特異的にSmaI制限酵素によるDNA切断が大きく阻害された結果を観察出来た(図7B)。前記実施例4で発現水準が特に低かったMKN7細胞株は、部分的にメチル化された様相を示した(図7B)。このような結果は、癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現抑制とRUNX3エクソン1付近に存在するCpG島の高メチル化間に深い相関関係があることを意味するものである。また、メチル化程度の差はあるけれど全ての細胞株でRUNX3遺伝子特異的なバンドが現れたことから本発明者らは、数種の癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現が観察されなかったことは、RUNX3遺伝子が細胞内に存在するが比正常的なメチル化によって発現されなかったことを確認した。
【００９１】
＜5-2＞ RUNX3遺伝子の再活性化
前記実施例＜5-1＞で観察されたDNAメチル化がRUNX3遺伝子の発現を抑制する直接的な原因であるかどうかを確認するために、DNAメチラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤を処理した時、RUNX3遺伝子の発現が再活性化されるかどうか調査した。
【００９２】
詳細には、RT-PCR分析方法によってRUNX3遺伝子の発現が検出されない細胞株中から3種類の細胞株、NUGC3、MKN28、MKN74を任意に選択して、DNAメチラーゼ阻害剤である5-アザ-3-デオキシシチジン(5-aza-3-deoxycytidine, AZA, 300nM)またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤のトリコスタチン(trichostatin A, TSA, 1mM)を単独で処理するか、または2種の阻害剤を同時に処理した。3日間の処理後、各々の細胞株から全体RNAを前記実施例＜4-1＞と同様に標準化された単一段階グアニジウム方法にしたがって分離・精製した。配列番号：4及び配列番号：5のPS-Nプライマー対を利用したRT-PCR方法でRUNX3遺伝子の発現の可否を分析した。
【００９３】
その結果、DNAメチラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤を処理した時、RUNX3遺伝子の発現が再び誘導されることを確認した(図8)。このような結果から約37%の胃癌、肺癌細胞株でRUNX3遺伝子のエクソン1付近に存在するCpG島の高メチル化によってRUNX3遺伝子の発現が抑制されていることが証明された。
【００９４】
一方、前記実施例＜1-1＞のセンスRUNX3遺伝子を発現する発現プラスミドの急性毒性を調べるために下記の実験を行なった。
【００９５】
＜実施例 6＞ ラットに対する非経口投与急性毒性実験
6週齢の特定病原体不在(SPF)SD系ラットを使用して、急性毒性実験を実施した。前記実施例＜1-1＞のpEF-BOS-Rx3を1mlの生理食塩水に懸濁して、1mg/kgの用量で前記ラット2匹の前脛骨筋(anterior tibialis)に筋肉内注射投与した。試験物質投与後、動物の斃死有無、臨床症状、体重変化を観察して血液学的検査と血液生化学的検査を実施した。剖検して肉眼で腹腔臓器と胸腔臓器の異常有無を観察した。その結果、試験物質を投与した全ての動物で特記に値する臨床症状や斃死した動物は無く、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見等でも毒性変化は、観察されなかった。以上の結果から、pEF-BOS-Rx3ベクターは、ラットで1mg/kgまで毒性変化を示さず非経口投与最小致死量(LD50)は、1mg/kg以上の安全な物質であると判断された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
産業上の利用の可能性
前記で詳しく見たように、本発明のRUNX3遺伝子は、優秀な抗癌活性を示し、TGF-β依存性アポトーシス機序に必須的に関与する。また、多様な胃癌及び肺癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現抑制は、RUNX3遺伝子のエクソン1付近に存在する典型的なCpG島での非正常的なDNAメチル化に起因するものである。したがって、本発明のRUNX3遺伝子及びその遺伝子産物(RNA及び蛋白質)は癌の遺伝子治療法開発に利用出来、RUNX3遺伝子のエクソン1付近の非正常的なDNAメチル化程度を測定することによって癌診断に有用に利用出来る。また、RUNX3遺伝子のエクソン1付近の非正常的なDNAメチル化を調節する薬物は、RUNX3遺伝子の発現を促進させることによって 癌治療剤に利用出来る。
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【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】ヒトのRUNX3遺伝子のcDNA塩基配列を示したもので、RT-PCR分析に利用されたプライマーの位置を矢印で表示し、転写開始コドン(ATG)と転写終止コドン(TGA)を太い文字で表示したものである。
【図１Ｂ】図1AのヒトRUNX3遺伝子のcDNA塩基配列の続きである。
【図１Ｃ】図1AのヒトRUNX3遺伝子のcDNA塩基配列から推定されたアミノ酸配列順序である。
【図２Ａ】ヒトのRUNX3遺伝子のエクソン1部位に存在するCpG島の塩基配列を示したもので、ゲノムDNAサザンブロット分析(genomic DNA Southern blot analysis)のプローブに利用された部位を下線で表示し、エクソンI内に位置する転写開始コドン(ATG)を太い文字で表示したものである。
【図２Ｂ】図2AのヒトRUNX3遺伝子のエクソン1部位に存在するCpG島の塩基配列の続きである。
【図３】本発明のアンチセンスRUNX3遺伝子を発現するSNU16細胞株SNU16-Rx3-AS-cl1及びSNU16-Rx3-AS-cl2とセンスRUNX3遺伝子を発現するMKN28細胞株MKN28-Rx3から、各々のセンス及びアンチセンスRUNX3遺伝子が発現されるかどうかをノーザンブロット分析(northern blot analysis)で確認した結果である。
【図４Ａ】TGF-βによって誘導されるアポトーシス効果を分析するためにSNU16-Rx3-AS-cl1細胞株にTGF-β1を1ng/ml濃度で処理した後、生存する細胞数を数えて対照群SNU16細胞株と比較した結果である。
【図４Ｂ】TGF-β1によるSNU16細胞株の死滅がアポトーシス機序によるものであるかどうかを確認するために本発明のSNU16-Rx3-AS-cl1とSNU16-Rx3-AS-cl2細胞株に1ng/mlのTGF-β1を6時間処理した後、ゲノムDNAを精製してアポトーシス特異的なアポトーシス性バンド(apoptotic band)を検査した結果である。
【図５Ａ】RUNX3遺伝子の癌形成能抑制活性を調査するためにアンチセンスRUNX3遺伝子を過発現させ、RUNX3の発現を選択的に阻害させたSNU16-Rx3-AS-cl1、SNU16-Rx3-AS-cl2細胞株及びRUNX3を正常的に発現する対照群-SNU16細胞株を各々ヌードマウスに同量ずつ皮下注射した後、98日間癌組織の大きさの変化を測定した結果である。
【図５Ｂ】RUNX3遺伝子を発現しない対照群-MKN28細胞とRUNX3を過発現するMKN28-Rx3細胞を各々ヌードマウスに同量ずつ皮下注射した後、37日間癌組織の大きさの変化を測定した結果である。
【図５Ｃ】この実験の最終日にマウスを犠牲死させて癌組織を摘出して癌組織の大きさを直接比較した結果である。
【図６Ａ】RUNX3 cDNAの全体的な構造を簡略に示した模式図で、RT-PCRプライマーの大略的な位置とRUNX3蛋白質がDNAに結合するのに重要な役割をするラントドメイン (Runt domain)の位置を斜線で表示したものである。
【図６Ｂ】癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現様相を分析するために15種の胃癌細胞株で全体RNAを分離した後、RT-PCR方法でRUNX3 mRNAの発現の可否を分析した結果である。 PS-N：PS-Nプライマー対を利用したRT-PCR PS-C：PS-Cプライマー対を利用したRT-PCR PS-C ST：PS-Cプライマー対を利用したRT-PCR後、RUNX3 cDNAをプローブにしてサザンブロット分析 PEBP2β：ヒトのPEBP2β/CBFB cDNAプライマー対を利用したRT-PCR β-アクチン：ヒトのβ-アクチンcDNAプライマー対を利用したRT-PCR
【図６Ｃ】癌細胞株でRUNX3遺伝子の発現様相を分析するために17種の肺癌細胞株で全体RNAを分離した後、RT-PCR方法でRUNX3 mRNAの発現の可否を分析した結果である。 PS-N：PS-Nプライマー対を利用したRT-PCR PS-C：PS-C プライマー対を利用したRT-PCR β-アクチン：ヒトのβ-アクチンcDNAプライマー対を利用したRT-PCR
【図７Ａ】RUNX3エクソン1付近の制限酵素配置、および典型的なCpG島内でCpGが示す頻度を概略的に示した模式図であり、ゲノムDNAサザンブロット分析に利用したプローブDNA断片の大略的な位置を太いラインで表示したものである。
【図７Ｂ】多様な胃癌細胞株でRUNX3遺伝子エクソン1付近のメチル化(methylation)状態を分析するために、制限酵素処理後CpG島の一部を認知するDNAプローブでゲノムサザンブロット分析を遂行した結果である。 上側：メチル化されたDNAには活性を示せない制限酵素のSmaI処理 下側：DNAメチル化とは関係ない活性を示す制限酵素のBamHI処理
【図８】DNAメチラーゼ阻害剤またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤処理によるRUNX3遺伝子の発現の可否を調査するために、正常的にはRUNX3を発現しないことが確認されたNUGC3、MKN28、MKN74細胞株にDNAメチラーゼ阻害剤の5-アザ-2-デオキシシチジン(5-aza-2-deoxycytidine, AZA, 300nM)またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤のトリコスタチンA(trichostatin A, TSA, 1mM)または二種類の阻害剤を同時に処理した後、これらの細胞から分離・精製された全体RNAをRT-PCRで分析した結果である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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