(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞における、ウイルス起源の外因性遺伝子の発現の選択的な転写後サイレンシングの方法に関する。この方法は、siRNA構築物を哺乳動物細胞中に導入することを含み、この際siRNA構築物は外因性遺伝子のmRNA配列の一部に相同である。本発明はまた、ウイルス起源の外因性遺伝子のmRNA配列の一部に相同なヌクレオチド配列を持つsiRNA、ならびにこうした構築物の医薬としての使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞において、ウイルス起源の外因性遺伝子の発現を選択的に転写後サイレンシングする方法であって、該遺伝子のmRNA配列の一部に相同なsiRNA構築物を該哺乳動物細胞中に導入することを含む前記方法。
【請求項２】
前記が、前記siRNAの導入前に哺乳動物細胞中に存在している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、前記遺伝子の非切断mRNA配列または連続mRNA配列に相同である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ウイルス起源の外因性遺伝子が、哺乳動物細胞において疾病を引き起こす任意の遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ウイルス起源の外因性遺伝子が癌遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
外因性遺伝子がパピローマウイルスによってコードされている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
癌遺伝子がHPV E7遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
癌遺伝子がHPV E6遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
以下のi)〜iii)：
i)   図11中の任意の核酸配列によって示される核酸分子；
ii)  (i)中の任意の核酸配列とハイブリダイズし、かつsiRNA活性を有する核酸分子；および
iii) 上記(i)および／または(ii)の核酸配列に対して遺伝暗号の結果として縮重している核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子に由来するsiRNA。
【請求項１０】
ウイルス起源の外因性遺伝子のmRNA配列の一部に相同なヌクレオチド配列を有するsiRNA構築物。
【請求項１１】
癌遺伝子の少なくとも一部をコードする核酸分子またはその一部を含むsiRNAであって、該核酸分子が以下のi)〜iii)：
i)   図11中の任意の核酸配列によって示される核酸分子；
ii)  (i)中の任意の核酸配列とハイブリダイズし、かつsiRNA活性を有する核酸分子；
iii) 上記(i)および／または(ii)の核酸配列に対して遺伝暗号の結果として縮重している核酸分子、
からなる群から選択される、前記siRNA。
【請求項１２】
前記RNAi分子が１５〜２５塩基対の長さである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のsiRNA。
【請求項１３】
前記RNAi分子が２２塩基対未満の長さである、請求項１２に記載のsiRNA。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載のsiRNAを含む、ベクター。
【請求項１５】
前記siRNAの発現に適合させた発現ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、siRNA構築物またはベクター。
【請求項１７】
癌、ヒト子宮頚部癌、HIV、天然痘、インフルエンザまたは感冒の治療用医薬の製造のための、siRNAの使用。
【請求項１８】
ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾病の治療用医薬の製造のための、siRNAの使用。
【請求項１９】
疾病が、生殖器いぼ、子宮頚部癌、陰茎癌、悪性扁平上皮癌および尋常性ゆうぜいからなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
治療を必要とする患者に、有効用量のsiRNAを投与することを含む、該治療の方法。
【請求項２１】
本発明のsiRNA構築物を製薬上許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は遺伝子発現をサイレンシングするためのsiRNAの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
真核生物遺伝子の転写後サイレンシングは、サイレンシングさせるべき遺伝子に相同なdsRNAを細胞内へ導入することによって達成することができる(以下で概説されている：Plasterk & Fenning, 2000; Sharp, 2001; Carthew, 2001; Bass, 2001)。サイレンシングは、相同mRNAの選択的ターゲティングおよび分解を含むいくつかのレベルで達成される。RNA干渉(RNAi)は半化学量論的であり、大過剰の細胞mRNAが完全かつ選択的に破壊される。また、いくつかの系では、RNAiは細胞塊中で50〜100倍増加することによって、選択的遺伝子サイレンシングを維持することができる。(Carthew, 2001、参照)。
【０００３】
RNAiの機序についての現行のモデルは、導入されたdsRNAが、エンドヌクレアーゼRNAase IIIと結合し、これによって切断されて、21および22ヌクレオチド産物を生成するという観察に基づいている。これらの干渉性小RNA(small interfering RNA; siRNA)はエンドヌクレアーゼと安定的に複合体化されたまま残る。生成したdsRNA-タンパク質複合体は相同性mRNAの選択的分解の活性エフェクターを提示するものと見られる(Hamilton & Baulcombe, 1999; Zamoreら、2000; Elbashirら、2001a)。実際、哺乳動物細胞中で、21ヌクレオチドRNAの二本鎖は内在性遺伝子の発現を抑制するのに十分であることが明らかにされている(Elbashirら、2001b)。このことは、同族siRNA二本鎖の導入後の、ヒト上皮細胞中での内在性ラミンA/C発現の選択的サイレンシングによって証明された。このように、哺乳動物細胞へのsiRNAの導入により、相同性mRNAを選択的に標的として、遺伝子発現をサイレンシングすることができる。重要なのは、siRNAが30ヌクレオチドより長いdsRNAを用いる際に観察される非特異的インターフェロン応答を誘発しないことである(Minksら、1979)。
【発明の開示】
【０００４】
発明の説明
本発明によって、哺乳動物細胞においてウイルス起源の外因性遺伝子の発現を選択的に転写後サイレンシングする方法であって、この遺伝子のmRNA配列の一部に相同なsiRNA構築物をその哺乳動物細胞中に導入することを含む方法が提供される。
【０００５】
本発明の好ましい方法では、遺伝子は前記siRNAの導入前に哺乳動物中に存在している。
【０００６】
本発明のさらに好ましい方法では、ヌクレオチド配列は該遺伝子の非切断(unbroken)mRNA配列または連続(contiguous)mRNA配列に相同である。
【０００７】
本発明のさらになお好ましい方法では、ウイルス起源の外因性遺伝子は哺乳動物細胞において疾病を引き起こす任意の遺伝子である。
【０００８】
本明細書で使用する用語「疾病」とは、身体(もしくはその一部)または精神のあらゆる異常な状態または不健康な状態を意味する。
【０００９】
本発明のさらに好ましい方法では、外因性遺伝子はウイルス起源の任意の癌遺伝子である。
【００１０】
好ましくは、その癌遺伝子はパピローマウイルス、好ましくはヒトパピローマ遺伝子(HPV)にコードされている。
【００１１】
ヒトパピローマウイルスの病的作用は様々である。例えば、ヒト中、HPV-6およびHPV-11などのいわゆる低リスク型HPVは生殖器いぼ(尖形コンジロームとも称される)などの良性過形成の原因となるが、例えばHPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-52, HPV-54およびHPV-56などの高リスク型HPVは子宮頚部癌または陰茎癌などの癌の原因となり得る。HPV-16およびHPV-18は子宮頚部癌に原因として関連している。HPV-1は尋常性ゆうぜいの原因となる。HPV-5およびHPV-8は皮膚の悪性扁平上皮癌の原因となる。HPV-2は皮膚および扁平(口内)上皮の悪性および非悪性病変中に認められる。
【００１２】
好ましくは、癌遺伝子はHPV E7遺伝子である。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、癌遺伝子はHPV E6遺伝子である。
【００１４】
本発明の好ましい１実施形態では、siRNAは以下のi)〜iii)からなる群から選択される核酸分子に由来するものである：
i)   図11中の任意の核酸配列によって示される核酸分子；
ii)  (i)中の任意の核酸配列とハイブリダイズし、かつsiRNA活性を有する核酸分子；および
iii) 上記(i)および／または(ii)の任意の核酸配列に対して遺伝暗号の結果として縮重している核酸分子。
【００１５】
本発明はまた、ウイルス起源の外因性遺伝子のmRNA配列の一部に相同なヌクレオチド配列を有するsiRNA構築物をも提供する。
【００１６】
本発明の好ましい１実施形態では、siRNA構築物は、癌遺伝子の少なくとも一部をコードする核酸分子またはその一部を含み、かつ、該核酸分子は以下のi)〜iii)からなる群から選択されるものである：
i)   図11中の任意の核酸配列によって示される核酸分子；
ii)  (i)中の任意の核酸配列とハイブリダイズし、かつsiRNA活性を有する核酸分子；
iii) 上記(i)および／または(ii)の任意の核酸配列に対して遺伝暗号の結果として縮重している核酸分子。
【００１７】
本発明の好ましい１実施形態では、前記核酸分子はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【００１８】
典型的には、ハイブリダイゼーション条件は以下を用いる：4〜6 × SSPE (20 × SSPEは、１リットルに溶解したNaCl 175.3g、NaH2PO4 H20 88.2 gおよびEDTA 7.4 gを含有し、pHを7.4に調整した); 5〜lO × Denhardts溶液(50 × Denhardts溶液はFicoll(type 400, Pharmacia)5 g, ポリビニルピロリドン 5 gおよびウシ血清アルブミン5 gを含有する); 100μg〜1.0 mg/ml 超音波破砕サケ／ニシンDNA; 0.1〜1.0% ドデシル硫酸ナトリウム; 場合によって40〜60% 脱イオンホルムアミド。ハイブリダイゼーション温度は核酸標的配列のGC含量に応じて異なるが、典型的には42℃-65℃となる。当該核酸の配列がわかっている場合に、最適ハイブリダイゼーション条件を算出することができることは、当分野で周知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件を、ハイブリダイゼーションに供する核酸のGC含量によって決定することができる。Sambrookら、(1989) Molecular Cloning ; A Laboratory Approachを参照されたい。特定の相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を算出するための一般式は以下の通りである：
Tm = 81. 5℃ + 16.6 Log [Na+] + 0.41 [% G + C] - 0.63 (% ホルムアミド)。
【００１９】
好ましい相同性の程度は、少なくとも75%の配列同一性、好ましくは少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも97%の同一性、または少なくとも99%の同一性である。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施形態では、RNAi分子は15bp〜25bp、さらに好ましくはこの分子は21bpまたは22bpである。最も好ましくはこの分子は22 bp未満である。
【００２１】
本発明の好ましい１実施形態では、前記構築物はベクターの一部分である。
【００２２】
好ましくは、そのベクターはsiRNAの発現に適合させた発現ベクターである。
【００２３】
siRNAは組換え法によるか、オリゴヌクレオチド合成によって製造することができる。前者では、センスおよびアンチセンス分子を合成するプロモーターを提供することにより、その後に分子がアニールしてsiRNA分子が形成されるように、ベクターを適合させる。
【００２４】
本発明のなおさらに好ましい実施形態では、siRNA分子は修飾ヌクレオチド塩基を含む。
【００２５】
天然塩基であるシトシン、ウラシル、アデノシンおよびグアノシンとともに修飾塩基を含ませると、その修飾塩基を含有するsiRNA分子に有利な特性を与えることができることは、当業者にとって明らかであろう。例えば、修飾塩基はsiRNA分子の安定性を増大させ、それによって所望の効果をもたらすのに必要とされる量を低減させることができる。修飾塩基を提供することによって安定性がより大きいかまたはより小さいsiRNA分子をもたらすこともできる。
【００２６】
用語「修飾ヌクレオチド塩基」は、共有結合によって修飾された塩基および／または糖を持つヌクレオチドを包含する。例えば、修飾ヌクレオチドとしては、3'位置でヒドロキシル基以外の、そして5'位置でリン酸基以外の低分子量有機基に、共有結合により結合した糖を有するヌクレオチドが含まれる。例えば修飾ヌクレオチドとして、以下のものも含まれる：2'-O-メチル- ; 2-O-アルキル; 2-O-アリル; 2'-S-アルキル; 2'-S-アリル； 2'-フルオロ- ; 2'-ハロもしくは2-アジド-リボースなどの2'置換糖、炭素環式糖類似体αアノマー糖;アラビノース、キシロースもしくはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、およびセドヘプチュロース。
【００２７】
修飾ヌクレオチドは当分野で公知であり、限定するわけではないが例として以下のものが含まれる：アルキル化プリンおよび／もしくはピリミジン;アシル化プリンおよび／もしくはピリミジン; またはその他のヘテロ環。これらのピリミジン類およびプリン類のクラスは当分野で公知であり、以下のものが含まれる：シュードイソシトシン; N4, N4-エタノシトシン; 8-ヒドロキシ-N6-メチルアデニン; 4-アセチルシトシン；5- (カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル; 5-フルオロウラシル; 5-ブロモウラシル; 5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル; 5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル; ジヒドロウラシル; イノシン; N6-イソペンチルアデニン; 1-メチルアデニン; 1-メチルシュードウラシル; 1-メチルグアニン; 2,2-ジメチルグアニン; 2-メチルアデニン; 2-メチルグアニン; 3-メチルシトシン; 5-メチルシトシン; N6-メチルアデニン; 7-メチルグアニン; 5-メチルアミノメチルウラシル; 5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル;β-D-マンノシルクエオシン; 5-メトキシカルボニルメチルウラシル; 5-メトキシウラシル;2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン; ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル; シュードウラシル(psueouracil); 2-チオシトシン; 5-メチル-2-チオウラシル, 2-チオウラシル; 4-チオウラシル; 5-メチルウラシル; N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル; ウラシル-5-オキシ酢酸; クエオシン; 2-チオシトシン; 5-プロピルウラシル; 5-プロピルシトシン;5-エチルウラシル; 5-エチルシトシン; 5-ブチルウラシル; 5-ペンチルウラシル; 5-ペンチルシトシン; および2,6-ジアミノプリン; メチルシュードウラシル; 1-メチルグアニン; 1-メチルシトシン。
【００２８】
本発明のsiRNAi分子は、従来からのホスホジエステルに結合したヌクレオチドを使用して合成することができ、また当分野で知られた標準的固相もしくは溶液相合成技法を使用して合成することができる。ヌクレオチド間の連結に別の連結用分子を使用することができる。例えば以下の式の連結基：P(O)S,(チオエート); P(S)S,(ジチオエート); P(O)NR'2; P(O)R' ; P(O)OR6; CO; またはCONR'2（式中、RはH(もしくは塩)またはアルキル(1〜12C)であり、さらにR6はアルキル(1〜9C)である）が、隣接するヌクレオチドと-O-もしくは-S-を介して結合される。
【００２９】
本発明は医薬として使用するためのsiRNA構築物またはベクターをも提供する。
【００３０】
本発明はまた、癌（特にヒト子宮頚部癌）、HIV、天然痘、インフルエンザおよび感冒の治療用医薬の製造のためのsiRNAの使用をも提供する。
【００３１】
本発明の好ましい１実施形態では、ヒトパピローマウイルスに起因する疾病の治療用医薬の製造のためのsiRNAの使用が提供される。
【００３２】
本発明の好ましい１実施形態では、疾病は以下からなる群から選択される: 生殖器いぼ; 子宮頚部癌; 陰茎癌; 悪性扁平上皮癌; 尋常性ゆうぜい。
【００３３】
本発明は、こうした治療を必要とする患者に、有効量のsiRNAを投与することを含む、治療方法をも提供する。
【００３４】
本発明は、本発明のsiRNA構築物を製薬上許容される賦形剤とともに含む医薬組成物をも提供する。
【００３５】
以下では、ヒトパピローマウイルス(HPV)のE6タンパク質の産生をもたらす遺伝子の選択的サイレンシングと、それによりp53が蓄積され、その結果としてHPV陽性子宮頚部癌細胞のアポトーシスがもたらされることを例にとる。HPVのE7タンパク質の産生をもたらす遺伝子の選択的サイレンシングと、それによりアポトーシス性細胞死が誘発されることをも例にとる。しかし、本発明はウイルス性外因性遺伝子の哺乳動物細胞中への導入の結果であるその他の多くの疾病に応用することができる。その他の例として、HIV、CMV、インフルエンザ、感冒、天然痘および生物戦争の際に導入される遺伝子が含まれる。
【００３６】
図面の説明
本発明を説明するための例を、添付する図面を参照して以下に記載する。
【００３７】
図１は、HPV16 E6遺伝子中の相同配列の位置に基づいて選択したE6 siRNAおよびその予測されるRNA二次構造を示す。a, HPV16 E6 配列(GenBank NC-001526)、E6 siRNA配列の位置を示した(太字、下線付き)。 b, 5種の候補HPV16 E6 siRNA配列およびその二次構造形成について予測されるポテンシャル。HPV18 E6からの配列の変更を太字の下線付きヌクレオチドで示す。選択した配列をアスタリスクによって示す。c, 対照siRNAの配列、全体としてHPV16 E6に非相同であるが、ただし、hpvl6 e6 NTS 339-347と相同な短い配列を含んでいる。こうした短い相同性はdsRNAサイレンシングには不十分であることが知られている(Elbashirら、2001b)。
【００３８】
図２は、siRNAによって引き起こされるCaSKi細胞中のHPV16 E6 mRNAレベルの低下を示す。a, E6 siRNAでのトランスフェクションの24時間後、または擬似トランスフェクションの24時間後のCaSKi細胞から精製した総mRNAのノーザンブロットによって示されたE6 mRNAレベル。対照siRNAを用いて得られた結果は擬似トランスフェクトした細胞についてのものと同様であった。b, 示したように、E6 siRNAおよび対照siRNAでのトランスフェクションの15時間後および24時間後にRT-PCRによって測定したE6およびmRNAならびにp53 mRNAレベル。時点 0時間 ＝ 実験開始時の非トランスフェクト対照細胞。N/C ＝ 細胞性総RNAを添加しない陰性RT-PCR対照。aおよびb中のヒストグラムは、ゲルスキャンニングによって測定した、各実験におけるHPV16 E6 mRNA(黒塗りバー)およびp53 mRNA(白抜きバー)の相対量を示す。c, 示したように、細胞性総RNAサンプルの連続希釈後、半定量的RT-PCRによって測定したE6 mRNAレベル。サンプルは、示したようにE6 siRNAまたは対照siRNAでのトランスフェクションの0時間、15時間および24時間後に調製した。pSP6E6 ＝ HPV16 E6 cDNAプラスミドであり、開始濃度は1 pgとした。
【００３９】
図３。E6 siRNAは、CaSKi細胞中のp53タンパク質の安定化を引き起こす。a, E6 siRNA でトランスフェクトし、指示したようにトランスフェクションの15時間、24時間、39時間および48時間後に回収した細胞の溶解物サンプルのp53タンパク質のイムノブロット。時点 0時間 ＝ 実験開始時の非トランスフェクト細胞。b, RT-PCRによって測定したp53 mRNAレベル。c, (i) 擬似トランスフェクト細胞と比較したE6 siRNAでトランスフェクトした細胞におけるp53タンパク質のレベル：(実線)および (ii) 擬似トランスフェクト細胞と比較した対照siRNAでトランスフェクトした細胞におけるp53タンパク質のレベル(破線)を示す別個の実験。タンパク質のゲル負荷量は細胞数に対して標準化し、Ponceau染色によって確認した。
【００４０】
図４。E6 siRNAによるp53の安定化が、p53標的遺伝子の１つであるp21のアップレギュレートと相関する。図3cについて使用したCaSKi細胞溶解物からのサンプルについてp21に対するプロービングを行った。イムノブロットは a, E6 siRNA、b, 対照 siRNA、および c, siRNAを含まない擬似トランスフェクション、によるトランスフェクション後の各種時点でのp21タンパク質レベルを示す。サンプル間のタンパク質の等量性はアクチンレベルによって確認した。
【００４１】
図５。siRNA配列およびトランスフェクション効率を示す。a, 本研究で使用したsiRNA配列、ならびにHPV16 E6およびE7 mRNA内のその相対的位置。予測された二次構造(二量体およびループ)はVector NTIを使用して得た。b, 本研究で使用した各細胞系について得たトランスフェクション効率(3回の平均)。
【００４２】
図６。E6 siRNAおよびE7 siRNAがそれぞれE6およびE7 mRNAの選択的喪失をもたらす。a, ノーザンブロッティングによるmRNAの定量、および b, 半定量的RT-PCRによるmRNAの定量は、同様の結果を与えた。示した結果は対照siRNAおよびE6 siRNAについて48時間後のものを示す。c〜e, 示したように様々なsiRNAで処理してから、0、24、および48時間後に細胞を分析した。CaSkiおよびSiHaについて得られた結果は基本的に同一であった。aおよびbはCaSkiの例、そしてc〜eはSiHa細胞の例である。ウイルスE6およびE7 mRNA、ならびに細胞性p53 mRNAをヒストグラムの上に注記する(c〜e)。
【００４３】
図７。E6 siRNAによる処理は細胞性p53タンパク質の活性化を誘導する。a, イムノブロッティングで測定すると、E6 siRNAで処理したSiHa細胞はp21発現に伴ってp53タンパク質の顕著な増加を示す。b, E7 siRNA または c, 対照 siRNAでの並行したトランスフェクションは、p53およびp21タンパク質について同様の効果をもたらさない。CaSki細胞について、同様の結果が得られた。dに示すように、E6 siRNA処理サンプルについて、イムノブロットについてサンプル負荷が等量であることがアクチンレベルによりすべての場合に確認された。
【００４４】
図８。E6 siRNAがp53タンパク質の核内蓄積をもたらす。対照siRNAおよびE6 siRNAで処理した細胞を、示したように核についてHeochstで、p53についてDO-1抗体で染色した。トランスフェクションの48時間後のCaSki細胞ついて示す。SiHa細胞について、同様の結果が得られた。
【００４５】
図９。E7 siRNAが過剰リン酸化細胞性pRbの選択的喪失をもたらす。対照siRNA、E6 siRNAまたはE7 siRNAで処理したSiHa細胞からの溶解物をイムノブロッティングによってpRbについてプロービングした。Rb* ＝ 過剰リン酸化pRb ; Rb ＝ 過少リン酸化pRb。
【００４６】
図１０。E7 siRNAの単回投与がヒト子宮頚部癌細胞のアポトーシスを誘発する。a〜c, 示したように対照siRNA、E6 siRNAおよびE7 siRNAで処理したSiHa細胞の位相差画像。a, 対照siRNAは、SiHa細胞増殖に影響を及ぼさない。b, E6 siRNAは細胞増殖を遅滞させ、96 時間目に非トランスフェクト細胞におそらく由来する細胞の島が観測される。c, E7 siRNAはアポトーシスを誘発し、これは fに示すアネキシン(annexin) Vで染色した細胞のFACS分析によって確認される。d, E7 siRNAは一次ヒト正常二倍体線維芽細胞(NDF)、および e, HCT116結腸癌細胞、の増殖に影響を及ぼさない。NDFおよびHCT116の増殖は対照siRNAおよびE6 siRNAによっても影響を受けない(示していない)。 f, 対照 siRNA(白抜き), E6 siRNA(網掛け)、およびE7 siRNA (黒塗り)。
【００４７】
図１１。a, HPV 18 E6の配列、b, HPV 18 E7の配列、c, HPV 16 E6の配列、d, HPV 16 E7の配列。
【００４８】
発明の詳細な説明
ヒト子宮頚部癌は世界中の女性において二番目に一般的な種類の癌である。ヒト子宮頚部癌の90%を超える割合のものがHPVについて陽性であり、このHPVがこの疾病の主要なリスク要因である。細胞性p53の腫瘍サプレッサー経路がHPV E6によって妨害され、これはp53の無制御な分解を促進する。HPV E6発現の選択的抑制がp53の蓄積につながり、その結果HPV陽性の子宮頚部癌細胞のアポトーシスをもたらす。その上、細胞内HPV E6を選択的に標的とするどの薬剤も、細胞レベルで同様に選択的であり、HPV陽性細胞中でのみ、p53を活性化する。正常細胞および正常組織が影響を受けることはない。
【００４９】
p53レベルの上昇は致死的であり、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発する。p53タンパク質は正常細胞中では連続的に合成され、高速で分解され、その結果低い定常状態レベルとなる。分解からの逸脱は活性化されたp53の急速な蓄積とアポトーシスを導く。
【００５０】
癌研究の主要なゴールは腫瘍細胞中のp53を活性化し、これによって悪性細胞のアポトーシスを誘発することである。実際、p53の活性化によって多くの腫瘍においてアポトーシス性細胞死が十分に誘発されることがすでに確認されている。大部分の悪性腫瘍は生き残るためにp53を遮断するので、その結果、p53の活性化は新規な抗癌治療のための最も価値があるゴールの１つを提供することになる。この課題へのいくつかのアプローチが種々の研究室で開発中である (Woods & Vousden, 2001; Huppら、2000、参照)。これらとして以下のものが含まれる：(i) 遺伝子治療によるp53の再導入、 (ii) 小分子を使用する突然変異体p53の野生型タンパク質コンホメーションの薬理学的復元(例えばFosterら、1999、参照)、および(iii) p53-hdm2相互作用の妨害による野生型p53の代謝安定化。これらのおよびその他のアプローチがWoods & Vousden(2001)およびHuppら(2000)に概説されている。
【００５１】
常にそうであるように、主要な課題は、正常な非腫瘍細胞に対して有害な影響を及ぼさないような、腫瘍細胞の選択的ターゲティングに関する。しかし、ヒト子宮頚部癌の場合、HPVが関与することから、無秩序な細胞増殖をもたらす発癌ウイルス遺伝子を介した腫瘍細胞の選択的ターゲティングの可能性が示される。特に、HPV E6は治療的介入のための魅力的な標的である。なぜならば、E6はp53の機能を妨害して、p53タンパク質の無制御な分解を引き起こすからである。p53は高速で合成されながら構成的に発現され、その分解を排除すれば細胞性p53タンパク質の急速な蓄積につながる。
【００５２】
ヒトパピローマウイルスの高リスク型であるHPV-16およびHPV-18はヒト子宮頚部癌の症例の約90%の発症に原因として関連している。これらの高リスク型ウイルスのHPV E6タンパク質は正常増殖制御および腫瘍サプレッサー経路の妨害に重要な役割を果たす。HPV E6は細胞性タンパク質p53およびE6-AP (ユビキチンリガーゼの１つ)と複合体化して、ユビキチン依存性タンパク質分解システムにより、p53の無制御な分解を引き起こす(Scheffnerら、1990; Scheffner, 1998)。正常細胞中では、p53タンパク質の急速な代謝回転が細胞性hdm2タンパク質によって調節されるが、これはユビキチンシステムによる分解についてもp53を標的とする(Hauptら、1997; Kubbutatら、1997)。しかし、p53分解のためのhdm2経路はHPV陽性子宮頚部癌細胞中では遮断されている(Hietanenら、2000)。したがって、もっぱらHPV E6/E6-AP経路がHPV陽性子宮頚部癌細胞でのp53分解の原因となっているものと見られる。大部分のHPV陽性ヒト子宮頚部癌は内在性野生型p53を保持している(Woods & Vousden, 2001、参照)。本研究計画では、HPV E6のサイレンシングによって内在性野生型p53を活性化し、それによってヒト子宮頚部癌細胞のアポトーシスを開始させることを目指す。
【００５３】
HPV陽性ヒト子宮頚部癌細胞中でp53を活性化させるための従来の試みとして以下のものが挙げられる：(i) アンチセンスRNA戦略(Steelら、1993)；(ii) E6を抑制するためのHPV E2の使用(Dowhanickら、1995); および(iii)レプトマイシンBの使用、これは核輸送シグナルを含む核輸送のインヒビターであって、子宮頚部癌細胞中のp53の核内蓄積の原因となる(Freedman and Levine, 1998)。レプトマイシンB ＋ アクチノマイシンDによるヒト子宮頚部癌細胞系の併用処理はウイルスmRNAを減少させ、またp53-依存性アポトーシスを活性化する(Hietanenら、2000)。しかし、これらの手法はすべて治療薬への手がかりという意味では、大きな限界がある。例えば、アンチセンスRNA戦略は問題が多く、良くても非効率的であり、またレプトマイシンBおよびアクチノマイシンDはいずれも毒性が強い薬剤である。
【００５４】
本発明はヒト子宮頚部癌細胞中でp53を活性化するための完全に新規な手法を提示する。ヒト子宮頚部癌細胞中でE6発現が変更され、それによって内在性p53が活性化される。正常細胞は影響を受けない。HPV E6のサイレンシングは、RNA干渉(RNAi)の現象を用いる、転写後遺伝子サイレンシングでの最近の進歩を活用することによって、達成される。
【００５５】
siRNAは、樹立された細胞系を使用して、ヒト子宮頚部癌細胞中でHPV E6 mRNAを標的とするように設計される。次にこれらの新規siRNA薬剤を使用して、子宮頚部癌細胞中でE6発現をサイレンシングさせる。P53タンパク質、ならびに細胞の増殖および生存性に対するE6サイレンシングの影響をモニターする。正常なHPV陰性細胞系を使用して、毒性および特異性を評価する。
【実施例】
【００５６】
特定の実施例(1)
ヒトの癌で最も重要なウイルス癌遺伝子、すなわちHPV16のE6遺伝子をサイレンシングするためにsiRNAを使用することができることを証明するため、CaSKi細胞、すなわち宿主細胞ゲノム中にHPV16の約600の縦列反復配列が組み込まれたヒト子宮頚部癌細胞系、を使用した。HPV16 E6遺伝子の配列を図laに示す。
【００５７】
E6サイレンシングを試みるために用いるRNA配列を選択する際に、以下を考慮した：(i) E6 mRNA中の相同配列の中央位置、 (ii) 二次RNA構造の形成のための最小ポテンシャル、および(iii) HPV16およびHPV18のE6遺伝子間での進化的保存。これらのHPV16およびHPV18は両者ともにヒト子宮頚部癌の高リスク型である。中央位置に、理論上の最小二次構造を組み合わせて、優先度が与えられた。なぜならば、その両要因がRNAサイレンシングの効率に影響を及ぼし得るからである(Elbashirら、2001a)。選択された二本鎖(ds)オリゴヌクレオチドをE6 siRNA (図lb, アステリスクで示す)と命名する。陰性対照(対照siRNA;図lc)として、長さと予測される二次構造が同等なdsRNAを使用した。しかし、これはHPV E6遺伝子のどの部分に対しても広範囲の相同性は欠如していた。[2'-デオキシチミジン]から構成される対称型2ヌクレオチド3'オーバーハングを持ち、それぞれ塩基対となった21ヌクレオチド(nt) RNAを合成した。なぜならば、これがsiRNAsのヌクレアーゼ耐性を強化するらしいからである (Elbashirら、2001aおよびElbashirら、2001b)。
【００５８】
HPV16ウイルス遺伝子発現は宿主細胞の転写／翻訳機構によって仲介される(zur Hausen, 2000)。CaSKi細胞中のウイルスE6遺伝子発現のサイレンシングを試験するため、ウイルスE6 mRNAのレベルをE6 siRNAのトランスフェクションの前およびその後の各種時点で測定した。トランスフェクションの15時間後、E6 mRNAのレベルはE6 siRNAによって影響されないことがわかったが、ノーザンブロッティングによって測定したところ、24時間までにE6 mRNAレベルが70%低下した(図2a)。逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR、図2b、上部パネル)および半定量的RT-PCR (図2c)を使用して、同様の結果が観察された。E6 siRNAの作用は特異的であることがわかった。なぜならば21ヌクレオチド対照siRNAでのトランスフェクションはE6 mRNAレベルに何の影響も及ぼさなかったからである(図2bおよび2c)。このように、E6 mRNAの喪失は短いdsRNA分子の導入に対する非特異的なウイルス応答または細胞応答によるものではない。
【００５９】
E6 siRNAでのトランスフェクション後、p53 mRNAのレベルが影響を受けなかったことから、E6 siRNAサイレンシングの選択性についてさらなる確認がなされた(図2b)。p53 mRNAレベルは対照siRNAによっても影響を受けなかった(図2b)。その上、細胞増殖および生存性はE6 siRNAまたは非特異的対照siRNAのいずれによってもトランスフェクションの63時間後まで影響を受けないことがわかったので(結果は示していない)、これはsiRNA分子の哺乳動物細胞中への導入自体は非毒性であることを意味し、Elbashirら(2001a)の観察と一致している。総合的に、これらの結果は、siRNAが安定的に宿主哺乳動物細胞ゲノム中に組み込まれたとき、siRNAがウイルス遺伝子の発現を選択的にサイレンシングすることができることを証明している。
【００６０】
CaSKi細胞は野生型p53を発現するが、このp53は正常細胞中では、Hdm2による制御された分解を受ける(Levine, 1997)。内在性Hdm2タンパク質のレベルはCaSKiおよびその他のHPV陽性ヒト子宮頚部癌細胞系中では非常に低く(Hietenanら、2000)、E6媒介型経路がもっぱらこれらの細胞中でのp53分解を担っているようである(Hietenanら、2000 およびHengstermann、2001)。E6発現のサイレンシングは効果的にp53分解を停止させ、その結果HPV陽性細胞中のp53タンパク質のレベルが増加するはずである。この予測を証明するため、CaSKi細胞にE6 siRNAをトランスフェクトし、その後、E6 mRNAの分解(図2参照) ＋ 既存のE6タンパク質の代謝回転にかかる時間を見越して、48時間にわたってp53タンパク質のレベルをモニターした。p53のレベルはイムノブロッティングによって測定した。トランスフェクトしていない対照細胞中では、p53はほとんど検出されなかった(図3a、時点 0時間)。しかし、p53タンパク質レベルはE6 siRNAでのトランスフェクションの24時間後に増加し始め、48時間まで蓄積し続けた(図3a)。p53 mRNAレベルはこの24〜48時間までの間にわたり、一定のままだった(図3b)ことに注目すべきである。p53の蓄積の開始にはある程度の差異が示され、5回の実験のうち2回で、E6 siRNAでのトランスフェクションの39〜48時間後に生じた(例えば図3c、実線を参照)。非特異的対照siRNAでのトランスフェクションは擬似トランスフェクト細胞に比較して、p53タンパク質のレベルに影響を与えなかった(図3c、破線)。p53はストレス応答性タンパク質であり、哺乳動物細胞中で遺伝毒性ストレスがp53を安定化することができることから(Levine, 1997)、これは重要な対照である。したがって、以下のように結論づけることができる：(i) E6 siRNAでトランスフェクトしたCaSKi細胞中で観察されるp53の安定化を誘導するためには、siRNAのみでは十分でない(図3a)、および(ii) したがってp53の安定化は、HPV E6遺伝子の選択的転写後サイレンシングと、これに伴う、E6が媒介する無制御な分解のp53に対するターゲティングの喪失を反映している。
【００６１】
HPV陽性細胞中でのE6のサイレンシング後、安定化されたp53タンパク質が機能的に適格であるかどうかを判定するため、p21タンパク質の発現をアップレギュレートするその能力を評価した。p21はp53標的遺伝子の産物であり、正常細胞中でp53が誘導する細胞周期の停止に関与する(Levine, 1997)。イムノブロッティングにより、p21タンパク質は正常な増殖条件下ではCaSKi細胞中で非常に低いかまたは検出不能であり、トランスフェクションの15時間後に観察されたレベルと同等のレベルであることが証明された(図4a参照)。しかし、p21はE6 siRNAでトランスフェクトした細胞中では明確に検出し得るようになり、強いシグナルはトランスフェクションの48時間後に最初に得られたが(図4a)、これはこれらの細胞中でのp53の安定化と符合している(図3c参照、実線)。全実験で、p21の誘導はp53タンパク質の安定化と相関していた。対照的に、対照siRNAでトランスフェクトした細胞(図4b)、または擬似トランスフェクト細胞(図4c)はp21タンパク質発現の顕著な誘導を示さなかった。これはこの細胞中のp53の安定化の欠如と関連している。E6 siRNAの存在下で観察されたp21のアップレギュレートについての最も妥当な説明は、E6サイレンシングによる分解から保護されたp53が野生型の機能を保持しており、p21標的遺伝子をトランス活性化するというものである。これはHPV陽性細胞中の野生型p53がその機能的可能性を保持していること、およびその残存活性が発現されたHPV E6のレベルに反比例することを示した以前の研究と完全に一致している(Butz, 1995,1996および2000)。
【００６２】
HPV E6は高リスクタイプのHPVに感染したヒト子宮頚部癌細胞の悪性トランスフォーメーションにおける主要なプレーヤーである(zur Hausen 2000)。HPV E6の発癌作用にはp53依存性経路およびp53非依存性経路の両方が関与することが示された(zur Hausen 2000, Pimら、1994, Panら、1994, Panら、1995, Liuら、1999およびThomasら、1999)。HPV E7とともにHPV E6が連続的に発現することが、HPV陽性細胞中での悪性状態の維持に必要であるものと見られる(von-Knebel-Doeberitzら、1992)。したがって、HPV遺伝子発現および／またはウイルスタンパク質の機能の治療的介入が、ヒト子宮頚部癌の予防および／または治療のための新規戦略の開発にとって第１の目的であることが示されることになる(zur Hausen 2000, von Knebel-Doeberitzら、1992, Huら、1995, Venturiniら、1999, Beer-Romeroら、1997、およびTraidejら、2000)。こうしたウイルスを標的とする手法は、正常細胞および組織に（あったとしても）ほとんど影響を及ぼさずに、HPV陽性細胞のみが標的とされるはずなので、腫瘍細胞選択性というおまけも得られる。こうして、siRNAがHPV E6発現を選択的にサイレンシングする能力を持つことの証明は、siRNAをヒト子宮頚部癌の治療のための強力な手段として認めるものである。
【００６３】
siRNAを哺乳動物細胞でのウイルス遺伝子発現の選択的サイレンシングのために使用することができるという発見は、広い意味を持つ。siRNAの適用は、ウイルスの病原性に関与する重要な遺伝子を明らかにするのに役立つはずである。さらに、DNAウイルスおよびRNAウイルスは両方とも選択的siRNAサイレンシングを受けやすいことを示すものと思われ、したがってヒトおよびその他の哺乳動物における多様なウイルス誘導性疾病のための抗ウイルス治療法の開発が可能になる。
【００６４】
方法
RNAの調製およびmRNAの検出
21ヌクレオチドRNA(図1)を合成し、GENSET SA(Paris,France)によってHPLC精製した。siRNAのアニーリングについては、20μMの一本鎖をアニーリングバッファー(20mM Tris-HCl pH7.5 ; 10mM MgCl ; and 50mM NaCl)中、90℃で1分間、その後37℃で1時間インキュベートした。ノーザンブロットについては、Oligotex (Qiagen)を使用して総RNAを調製し、標準条件下、室温で1%アガロースゲルで泳動した。放射標識[32P]-HPV E6 cDNAを使用して、HPV16 E6 mRNA を検出した。すべてのRT-PCR反応に、RNeasyキット(Qiagen)を使用して調製した総RNAを利用した。RT-PCRについては、Reverse-iTワンステップキット(Advanced Biotechnologies)を使用した。E6 mRNAについては、プライマー 5'cggaattcatgcaccaaaagagaactgca3'および 5'cccaagcttacagctgggtttctctacg3'を以下の熱サイクルで使用した: 47℃で30分; 94℃で2分; その後、94℃で45秒、55℃で45秒および72℃で1分を35サイクル; その後72℃で5分。p53 mRNAに対して、プライマー 5'atggaggagccgcagtcagat3'および 5'tcagtctgagtcaggcccttc3'を使用し、また熱サイクルは以下の通りであった: 47℃で30分；94℃で2分; 次に、94℃で45秒、58℃で45秒、72℃で2分を35サイクル; および72℃で5分。半定量的RT-PCRについては、100ngの細胞性総RNAを1/20および1/400に希釈した。ノーザンブロットを2回反復し、またE6 RT-PCRおよびp53 RT-PCRは、再現性のある結果を得るまで少なくとも4回反復した。
【００６５】
細胞培養およびトランスフェクション
CaSKi細胞を、5% C02空気中37℃で、RPMI ＋ 10% ウシ胎仔血清(Life technologies)、ペニシリン 100単位 ml-1 およびストレプトマイシン 100μg ml-1中で維持した。細胞の倍増時間は約24時間だった。トランスフェクションのため、細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない6ウェルプレート(10 cm2)中、1ウェルについて1.5 x 105 細胞として継代培養した。24時間後、リポソーム(Oligofectamine, Life Technologies)中に調製したsiRNAにより、製造元の説明書にしたがって細胞をトランスフェクトした。siRNA濃度は1ウェルについて0.58μgとした。培養培地の最終容量は1ウェルについて1.5 mlとした。結果に示したようにその後の各種時点で分析のために細胞を回収した。各実験を4回以上実施した。
【００６６】
イムノブロッティング
トランスフェクトした細胞をトリプシン処理し、PBS中で洗浄し、細胞計数のために一部を取り出した。残りの細胞を氷上で、50μl溶解バッファー(150mM NaCl ; 0.5% NP40; 50mM Tris pH 8.0)中で30分かけて溶解させた。次にサンプルを4×濃度のLaemlliサンプルバッファー中、1：1に希釈した(細胞ペレット中に残留している残渣不溶性タンパク質を直接 Laemlliバッファー中に取り、これも分析したが、被実験細胞および対照細胞間で有意な差は示されなかった；結果は示していない)。ヒトp53タンパク質を検出するため、マウスモノクローナル抗体DO-1を使用し、そしてp21タンパク質を検出するために、抗p21 (SX118) (PharMingen)を使用した。ポリクローナル抗体(Sigma)を使用してアクチンを検出した。信頼性のある定量に利用できる抗体がないため、トランスフェクトした細胞中ではE6タンパク質レベルをモニターすることはできなかったことに注意すべきである。等量の総細胞性タンパク質を負荷し、Ponceau染色によるかアクチンレベルによるかのいずれかで評価した。BM強化した化学発光(Roche)を使用して、可視化を行った。定量は比較可能な露光下シグナルのゲルスキャンニングによって行った。
【００６７】
特定の実施例(2)
臨床上関連性があるウイルス標的として、ヒトパピローマウイルス(HPV)を選択した。高リスク型のHPVはヒト子宮頚部癌の発病と悪性進行に、原因として関連しており、少なくとも3つの癌性タンパク質、すなわちE5、E6およびE7をコードしている(zur Hausen 2000, Thomasら、1999, McMurray 2001)。これらの中で、E6およびE7について最もよく解明されている。本発明者らの研究のために、本発明者らはCaSKiおよびSiHaを使用した。これらは高リスク型HPV16に陽性の2つのヒト子宮頚部癌細胞系であって、HPVが誘導する細胞トランスフォーメーションの研究モデルとしてよく特性決定されているものである(Hengstermannら、2001,Butzら、1995, Scheffnerら、1991, Butzら、1996, Hietenanら、2000, Bakerら、1987)。HPVのE6およびE7遺伝子産物は多面性を示し、細胞増殖調節と関連する細胞性タンパク質と直接または間接的に結合することにより、そのトランスフォーメーション特性を発揮するものと見られる(zur Hausen)。特に重要なのは、E6のp53との相互作用、そしてE7の網膜芽腫タンパク質(pRb)との相互作用である。p53およびpRbタンパク質は哺乳動物細胞中の主要な腫瘍サプレッサーおよび細胞周期インヒビターである。E6のp53への結合はE6と結合したタンパク質リガーゼ(E6-AP)によって仲介され、ユビキチン化およびプロテオソ−ム分解についてp53を標的とする(Scheffnerら、1990, Scheffnerら、1993)。E6はコアクチベーターCBPおよびp300を抑制することによって、増殖阻害性遺伝子のトランス活性化についてのp53の能力を低下させるらしい(Patelら、1999)。並行して、E7のpRbへの結合は、pRbの過剰リン酸化およびE2F転写因子の放出をもたらし、これは細胞増殖のための遺伝子を活性化する。HPV E6およびE7は独立して細胞を不死化することができるが、それらの協働的相互作用は不死化効果を大幅に強化する。
【００６８】
HPV E6およびE7遺伝子発現をサイレンシングすること、および個々のウイルスmRNAを標的とするようにsiRNAを設計することが模索された。その結果は、E6およびE7 mRNAの選択的分解を示している。サイレンシングはsiRNAの単回投与後少なくとも4日間持続した。E6サイレンシングは、細胞性p53タンパク質の蓄積、細胞周期制御p21遺伝子のトランス活性化、および細胞増殖の低減を誘発した。対照的に、E7のサイレンシングはアポトーシス性細胞死を誘発した。HPV陰性細胞は抗ウイルスsiRNAによって影響を受けないことがわかった。従って、本発明者らは以下のことを初めて証明する： (i) siRNAは哺乳動物細胞中で外因性ウイルス遺伝子の選択的サイレンシングを誘発することができる；および(ii) siRNA干渉のプロセスはウイルス遺伝子発現によって予め阻害された細胞調節システムの回復を妨害しない。
【００６９】
ウイルス遺伝子のサイレンシングのためのsiRNA配列の選択
siRNA干渉はRNA二次構造および完全mRNA分子内の同族配列の位置によって影響を受ける。この研究のために選択したsiRNAを図5aに示す。対照siRNAをどの実験にも組み入れたが、それはHPV E6およびE7との相同性を欠如しているものである。どのsiRNAも既知のヒト遺伝子のエクソンとの相同性を持たない。各21ヌクレオチド(nt) RNAを、ヌクレアーゼ耐性の増強のために、[2'-デオキシチミジン]から構成される対称型2ヌクレオチドオーバーハングを持つように合成した。トランスフェクションによって、siRNAを細胞中に導入した(材料および方法)。各細胞系についてのトランスフェクション効率を図5bに示す。
【００７０】
siRNAはHPV E6およびE7 mRNAの選択的喪失を引き起こす
非処理対照に比較して、対照siRNAで処理した細胞中ではウイルスmRNAの変化は（あるとしても）ほとんど観察されなかった。しかし、E6 siRNAまたはE7 siRNAのいずれかによる処理は、CaSkiおよびSiHa細胞中の両方でそれぞれのE6およびE7 mRNAレベルに顕著な低下をもたらした(図6)。同様の結果がノーザンブロットおよび半定量的RT-PCRによって得られた。示した例は対照siRNAまたはE6 siRNAで処理した細胞について48時間目のものである(図6aおよびb)。E6およびE7 mRNAの低下は24時間で最大となり、少なくとも4日間持続した。重要なことであるが、細胞性p53 mRNAレベルはすべての条件下で影響を受けないことがわかった(図6c〜e)。これは抗ウイルスsiRNAが細胞性mRNAの一般的な分解を活性化しないことを意味している。E6 siRNAでの処理後、E6 mRNAに約70%の低下が観察された(図6c)。トランスフェクション効率は70〜80%であったので(図5b)、これはトランスフェクトされた細胞中のウイルスE6 mRNAの完全な喪失に近いことを示している。E7 siRNAで処理した細胞中、E7 mRNAの低下は約50〜60%だった(図6d)。個々のウイルスmRNAの選択的ターゲティングが以下の観察によって証明された: (i) p53 mRNAレベルはE6およびE7 siRNA処理に耐性であった(図6cおよびd); (ii) E6 mRNAレベルはE7 siRNAおよび対照siRNAに耐性であった(図6dおよびe); さらに(iii) E7 mRNAレベルはE6 siRNAおよび対照siRNAに耐性であった(図6cおよびe)。従って本発明者らは、E6 siRNAおよびE7 siRNAでの処理がヒト子宮頚部癌細胞中で同族ウイルスE6およびE7 mRNAの選択的および示差的分解を誘発するものと結論付ける。
【００７１】
哺乳動物細胞による以前の研究では、内在性遺伝子のsiRNAサイレンシングをタンパク質産物のレベルで評価した(Elbashirら、2001c、 Caplenら、2001、 Harborthら、2001、 Kisielowら、2002)。siRNAの内在性mRNAに対する影響は今後確認されなければならない。本発明者らのこれまでの結果はsiRNAが哺乳動物細胞中の標的mRNAの分解を誘発することの最初の証拠を提供するものである(図6)。この場合、標的は外因性ウイルスmRNAであった。mRNAのsiRNA誘導性分解には多くの要因が影響するものと見られ(考察参照)、CaSKiおよびSiHa細胞中の両方で、E7 mRNAの低下パーセントがE6 mRNAについて観察されたものよりも一貫して低かった(70% に対して約40〜50%)ことに着目することは興味深い。それにも関わらず、E6 siRNAまたはE7 siRNAのいずれかによる細胞の処理は、予測された表現型応答を誘発した(下記参照)。
【００７２】
RNA干渉のプロセスは、哺乳動物細胞の増殖調節機序、すなわちp53の活性化に有害な影響を与えない
実験用ツールとして、および／または治療適用のためにsiRNAを開発する場合は、RNA干渉のプロセスが細胞制御機序に有害な影響をもたらさないことを確認することが重要である。これを考慮しながら、本発明者らはsiRNAで処理した細胞中の細胞性p53タンパク質をモニターした。CaSKi細胞およびSiHa細胞は両方とも野生型p53を発現する。正常細胞中では、p53レベルはHdm2媒介型分解によって調節される。しかし、CaSKiおよびSiHa中ではHdm2が欠損しており、これらの細胞中ではE6媒介型経路がもっぱらp53分解を担っている(Hengstermamnら、2001)。したがってE6 siRNAで処理した細胞中でE6の喪失がp53タンパク質を安定化するはずである。
【００７３】
イムノブロッティングによって、本発明者らはE6 siRNAでの処理後のp53タンパク質の蓄積を調べた(図7a)。間接的免疫蛍光法によって明らかになったように、p53の蓄積は主として核にあった(図8)。p53 siRNAレベルはE6 siRNAで処理した細胞中で一定に保たれることが示されたので(図6e)、本発明者らはp53タンパク質レベルの増加(図7a)がp53タンパク質の安定化を示すものと結論付ける。しかし、p53はストレス応答性タンパク質なので、siRNAトランスフェクションのプロセス単独ではp53応答を活性化するのに十分でないことを確認する必要もあった。対照siRNAまたはE7 siRNAで細胞をトランスフェクトすることによって、これを調べた。両方の場合にp53タンパク質レベルのわずかな増加が観察されたが、その反応速度はE6 siRNAで処理した細胞よりもはるかに遅く、またp21(953 標的遺伝子)のトランス活性化は起こらなかった(図7bおよびc)。対照的に、E6 siRNAで処理した細胞中のp53の安定化にはp21発現の誘導が伴った(図7a)。このように、本発明者らの結果はE6 siRNA処理細胞中ではp53が安定化して活性化されることを示している。この効果はE6 siRNAに特異的であり、一般化されたストレス応答ではなく、選択的E6遺伝子のサイレンシングを反映している。
【００７４】
p21タンパク質は細胞周期インヒビターであり、pRb機能を調節することによってG1細胞周期停止を誘導する(Levine 1997)。P21を発現するE6 siRNA処理細胞では細胞増殖が低下したが、FACS分析によると、実質的なGl停止は観察されなかった(対照に比較して約10%)。考えられる説明は、p21に媒介される作用がE7によるpRbの持続的不活性化によって弱められたことである。このことは細胞周期停止について、E6 siRNAよりもE7タンパク質が優勢であることを意味している。
【００７５】
E7サイレンシングはpRbの脱リン酸をもたらす
HPV E7のpRbおよびRbに関係する細胞性タンパク質への結合は、それらの過剰リン酸化およびE2F転写因子の放出をもたらす。したがって、HPV E7のサイレンシングはpRbの過剰リン酸化形態の減少または喪失を引き起こすかもしれない。この場合はその通りであることが証明された。SiHa細胞のE7 siRNAによる処理の結果、ゲル電気泳動で過少リン酸化タンパク質よりも遅く移動するpRbの上方バンドの喪失が認められた。対照的に、対照siRNAまたはE6 siRNAのいずれかで処理した細胞はpRbの両方のリン酸化形態を保持していた(図9に示す過剰リン酸化 ＋ 低リン酸化pRbタンパク質の一対で示される)。これらの観察からE7 siRNAで処理した細胞中でのHPV E7遺伝子の選択的サイレンシングが確認される。
【００７６】
E7 siRNAはHPY陽性細胞のアポトーシスが誘導される
理想的には、ヒト子宮頚部癌の治療に使用する治療薬は周囲の正常組織に影響を及ぼさずに、腫瘍細胞を選択的に破壊の標的とすべきである。悪性化の原動力は外因性なので、HPV陽性子宮頚部癌の場合、これは現実的な目標である。HPV E6およびE7の両方が細胞のアポトーシス性応答に影響を及ぼすことが知られている(zur Hausen 2000)。siRNAを使用するこれらの2つの外因性ウイルス遺伝子を選択的にサイレンシングすることの実現可能性が証明されたので(上記参照)、本発明者らはウイルス遺伝子のサイレンシングがHPV陽性細胞の選択的殺傷を含むかどうかを調査した。E6 siRNAの適用は細胞増殖抑制を引き起こしたが、有意な細胞死はもたらさなかった(図10bおよびf)。これに対して、E7 siRNAは細胞を１つに集め、アポトーシスを起こさせた(図10cおよびf)。
【００７７】
本発明者らはE7 siRNAが、細胞の生存性に重要な何らかのこれまでに同定されていない内在性遺伝子を標的とすることによって、アポトーシス性細胞死を誘発するのではないかという可能性を考えた。しかし、E7 siRNAをHPV陰性原発性ヒト二倍体線維芽(NDF)細胞およびヒト結腸直腸(colorectal)癌HCT116細胞に適用したとき、細胞増殖または生存性に対する有害な影響は観察されなかった(図10dおよびe、ならびに細胞増殖分析)。こうして、本発明者らはE7 siRNAで処理した細胞中のアポトーシスがHPV E7遺伝子発現のサイレンシングによって開始されること、したがってそのアポトーシスはHPV陽性癌細胞に選択的であることを結論づけた。
【００７８】
他研究者が、p53の利用性が、E6および／またはE7で不死化し、そしてp53を安定化するためにプロテアソームインヒビターで処理した一次ヒトケラチノサイト中のCD95誘発性アポトーシスにとって重要であることを示している(Aguilar-Lemarroyら、2002)。しかし、本発明者らの今回の結果との有意義な比較を導き出すことはできない。なぜならば２つの実験は基本的に異なっているからである。実際、HPV E6およびE7の遮断後のアポトーシス効果についての多数の対立する観察は折り合いをつけるのが困難である(zur Hausen 2000)。本発明者らの今回の結果は、HPV-18 E6およびE7の開始コドンを標的とするために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する以前の研究を確認し、さらに大幅に進展させる。E7アンチセンスによる反復投与は、単純な光学顕微鏡で測定すると、HPV陽性細胞の選択的死滅をもたらしたが、一方E6アンチセンスは明白な影響は認められなかった(Steele 1993)。今後の研究で、RNA干渉の適用により、HPV感染から悪性へと進行する際のさまざまな段階でのE6およびE7機能のより詳細な分析が可能になるものと見られる。
【００７９】
考察
RNA干渉、アンチセンスRNAおよびリボザイムはすべて転写後レベルで遺伝子発現を抑制するように作用する。しかし、RNA干渉のプロセスはアンチセンスまたはリボザイム戦略よりも数桁高いレベルでより効果的である(Elbashirら、2001c)。これはまた、高レベルの細胞性ATPを消費する (Nykanenら、2001)。したがって、RNA干渉が正常細胞の生化学的プロセス中および調節システムにおける不均衡を引き起こす可能性がある。本発明の知見の場合はこれが当てはまらないことを示している。本発明者らはRNA干渉がヒト細胞中でのウイルス遺伝子のsiRNAによって誘発されるサイレンシングの際に内在性調節システムの回復を妨害しないことを証明する。HPV E6サイレンシングの場合は、p53タンパク質が安定化され、p21細胞周期制御遺伝子が発現されて、細胞増殖が低減した。他方、E7サイレンシングではアポトーシスのプロセスが開始された(結果の節を参照)。このように、本発明者らは、RNA干渉を受けている細胞が、示差的遺伝子発現およびアポトーシスに関与する、高度に複雑で生化学的に組み込まれたプロセスを実行する能力を保持していることを示す。これは、RNA干渉のプロセスが哺乳動物細胞中でそれの重要な機能を弱めないことを証明する、重要で新規な結果である。
【００８０】
siRNAを使用して哺乳動物遺伝子発現を選択的にサイレンシングする能力は、哺乳動物の細胞生物学およびその病理学を理解するための新規で魅力的なルートを切り開く。しかし、すべての遺伝子がRNA干渉に等しく感受性であることを示すと仮定することはできない。そのプロセスはmRNAの接近能に依存し、また標的mRNA分子中では、siRNAプライマーに相同な短い内部ヌクレオチド配列の接近能に依存する。したがって、所与のmRNAについてのsiRNA媒介型分解の受けやすさには、各種の要因（mRNAの二次構造、およびその細胞内での転位のためにmRNAをパッケージングするタンパク質(Orphanidesら、2002)を包含する）が影響を及ぼすことになろう。その他のタンパク質-mRNA相互作用も関連性があり、例えば所定のmRNAを特定の細胞下部位へと誘導することができるタンパク質(Guら、2002)、およびp53などのそれがコードするタンパク質と結合することができるmRNA(Mosnerら、1995)などがある。
【００８１】
本発明者らは、HPVによってコードされた病原性ウイルスmRNAが哺乳動物細胞内でRNA干渉を受けやすいことを証明する。siRNAによる外因性ウイルス遺伝子発現の選択的サイレンシングが特にヒトの疾病に適切である。第一に、哺乳動物ウイルスの病原の基礎的な研究のため、および新規な治療の標的の同定を可能にするためである。その上、siRNA自体がウイルス感染および疾病に対抗するための新規な抗ウイルス薬剤として開発されるかもしれない。RNA干渉は自己複製可能なプロセスであるので、非常に効果的である。本発明者らは抗ウイルス性siRNAの単回投与によるウイルス遺伝子のサイレンシングが十分長期間持続して、細胞調節システムを回復させることができることを示す。HPV陽性ヒト子宮頚部癌の場合、これは癌細胞の選択的殺傷をもたらす。
【００８２】
siRNAの治療適用のために、標的mRNAは理想的には進化的に保存されたヌクレオチド配列(群)によって認識されるべきである。これは遺伝的突然変異によるsiRNAおよび標的mRNA間の相同性の喪失の可能性を最小にする。異なる細胞型は短い二本鎖siRNA分子の導入に対する応答が異なるかもしれないという可能性も考慮しなければならない。特に適切な例は、E6およびE7タンパク質の、本研究で観察されるsiRNA媒介型作用の効果において、インターフォーム(interform)およびインターフェロン誘導性遺伝子の発現を妨害する能力に関するものである。
【００８３】
本発明者らの観察は、E7 siRNAがヒト子宮頚部癌の治療、およびおそらく予防についての重要な治療上の潜在可能性を持っていることを示している。本発明者らはその他の病原性ウイルス因子が、対応するsiRNAの投与によって同様にサイレンシングされると確信する。基礎を成す原因が異常遺伝子(群)の発現によってもたらされるような、様々な疾病についてのアプローチ。
【００８４】
方法
RNAの調製およびmRNAの定量
21ヌクレオチドRNA(図5)を合成し、MWG (Germany)によってHPLC精製した。siRNAのアニーリングのため、20μM 相補的一本鎖RNAをアニーリングバッファー(20mM Tris-HCl pH7.5; lOmM MgCl; および50mM NaCl)中、90℃で1分、その後37℃で1時間、インキュベートした。ノーザンブロッティングによるmRNAの定量のため、Oligotex (Qiagen)を使用して調製した総RNA 0.3μgを、サイズマーカーとともに、標準条件下、室温で1%アガロースゲルで泳動した。プローブとして放射標識[32p]-HPV cDNAを使用して、HPV16 mRNAを検出し、オートラジオグラフィーによって可視化した。RNeasyキット(Qiagen)を使用して、細胞性総RNAを調製した。RT-PCRのため、Reverse-iTワンステップキット(Advanced Biotechnologies)を利用した。RT-PCR反応のため、総RNA 0.1μgを使用した。E6 mRNA増幅のため、プライマー 5'CGGAATTCATGCACCAAAAGAGAACTGCA-3'および 5'CCCAAGCTTACAGCTGGGTTTCTCTACG-3'を以下の熱サイクルで使用した: 47℃で30分; 94℃で2分; その後、94℃で45秒、55℃で45秒および72℃で1分を35サイクル; その後72℃で5分。E7 mRNAを増幅するため、プライマーは、5'-CGGAATTCATGCATGGAGATACACCTACAT-3'および5'-CGGGAAGCTTATGGTTTCTGAGAACAGATGG-3'とし、そして熱サイクルは以下の通りとした：47℃で30分; 94℃で2分; その後、94℃で45秒、58℃で45秒および72℃で2分を30サイクル; その後72℃で5分。p53 mRNAについては、プライマー 5'atggaggagccgcagtcagat3'および 5'tcagtctgagtcaggcccttc3'を使用し、熱サイクルは以下の通りとした: 47℃で30分; 94℃で45秒、58℃で45秒および72℃で2分; その後72℃で5分。半定量的RT-PCRのため、細胞性総RNA 100 ngを1/20および1/400に希釈した。ノーザンブロットを2回反復し、また半定量的RT-PCRを反復して4回のうち2回再現性のある結果を得た。
【００８５】
細胞系およびトランスフェクション
CaSKiおよびSiHa上皮細胞系はヒト子宮頚部癌に由来するが、これらはHPV-16ゲノムの約600コピー(CaSKi)および1〜2コピー(SiHa)を組み込んで含有している。CaSKi細胞をRPMI ＋ 10%ウシ胎仔血清(FCS, Life technologies)中で培養した。SiHa細胞はMEM ＋ 10% FCS、1.0 mM ピルビン酸ナトリウム、および0.1 mM 非必須アミノ酸中で、培養した。NDFはMEM ＋ 15% FCS、1.0 mM ピルビン酸ナトリウム、および0.2 mM 必須アミノ酸中で培養した。HCT116は10% FCSを含むDMEM中とした。全細胞系をペニシリン100単位 ml-1およびストレプトマイシン 100μg ml-lを加えて37℃、5% C02空気中で培養した。トランスフェクションのため、細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない6ウェルプレート(10 cm2)に1.5 x 105 細胞／ウェルにて分注した。24時間後、リポソーム(Oligofectamine, Life Technologies)中に製造元の説明書に従って調製したsiRNA製剤で、細胞をトランスフェクトした。siRNA濃度は、1.5 x 105 細胞／ウェルについて0.58μgとした。培養培地の最終容量は1.5 ml／ウェルとした。その後、結果に示した各種時点で、分析のために細胞を回収した。各実験を4回またはそれ以上実施した。FITC-デキストラン(FD-150; Sigma)を含有するリポソームで細胞をトランスフェクトすることによって、トランスフェクション効率を確認した。
【００８６】
イムノブロッティング
トランスフェクトした細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、細胞計数のために１アリコートを取り出した。残りの細胞を溶解バッファー(150mM NaCl; 0.5% NP40; 50mM Tris pH 8.0) 50μl中で、氷上で30分溶解した。サンプルを4×濃度のLaemlliバッファー中、1：1に希釈した。タンパク質を15% SDS-PAGEによって分離し、抗体検出のために、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングした。必要に応じてマーカーとして、分子量マーカーおよび精製組換えヒトp51を含めた。ヒトp53タンパク質を検出するためにモノクローナル抗体 DO-1 (Oncogene)を使用した。p21およびpRbタンパク質を検出するために抗p21 (SX118)および抗pRb (G3-245; PharMingen)をそれぞれ使用した。アクチンはポリクローナル抗体(Sigma)を使用して検出した。信頼性のある定量に利用できる抗体がないので、HPV E6またはE7タンパク質レベルをモニターすることはできなかった。なぜならば、。結合した抗体の可視化は強化した化学発光(Roche)によって行った。シグナルの定量は線形範囲のシグナルのスキャンニングによって行った。
【００８７】
細胞増殖、細胞周期分析およびアポトーシス
細胞計数によって細胞増殖曲線を決定した。細胞周期分析のために、細胞を回収し、PBSで洗浄し、90%エタノール中、-20℃で一晩固定した。固定した細胞をペレット化し、PBSで洗浄し、0.1μg/ml ヨウ化プロピジウムおよび200 U/ml RNase Aを含有するPBS中に再懸濁して、FACSによって分析した。アネシン-V-Fluos (Beobringer)を使用し、製造元のプロトコルにしたがって、アポトーシスを起こした細胞を同定した。
【００８８】
参考文献:
Aguilar-Lemarroyら、(2002) Oncogene 21, 165-175.
Andersson B. S.ら、(1987) Cancer Genet. Cytogenet. 24, 335-343
Bakerら、(1987) J Virology 61,962-971.
Bass B. L. (2001) Nature 411,428-429.
Beer-Romeroら、(1997), Oncogene 14, 595-602.
Blume-Jensen P. & Hunter T. (2001) Nature 411, 355-365.
Butz K.ら、(1995) Oncogene 10,927-36.
Butz K. ら、(1996) Int. J. Cancer 68,506-13.
Butz K. (2000) Proc Natl Acad Sci 97,6693-7.
Caplen N J ら、(2001) Proc Natl Acad Sci 98 9742-9747.
Carthew, R. W. (2001) Curr. Op. Cell. Biol 13, 244-248.
Deininger M. W. N. ら、(2000) Blood 96,3343-3356.
Deininger M. W. N. ら、(1997) Blood 90,3691-3698.
Druker B. J.ら、(2001a) N. Engl. J. Med. 344, 1031-1037.
Druker B. J. ら、(2001b) N. Engl. J. Med. 344, 1038-1042.
Elbashir S. M.ら、(2001a) Genes & Dev. 15, 188-200.
Elbashir S. M.ら、(2001b) Nature 411, 494-498.
Elbashir S. M ら、(2001c) Nature 411, 428-9
Fire A.ら、(1998) Nature 391, 806-811.
Gong J. G.ら、(1999) Nature 399, 806-809.
Gu ら、(2002) J Cell Biol 156, 41-51.
Hamilton A. J. & Baulcombe D. C. (1999) Science 286, 950-952.
Harborth ら、(2001) J Cell Sci 114 4457-4565.
Hengstermann ら、(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 1218-1223
Hietanen ら、(2000) Proc Natl Acad. Sci 97,8501-8506.
Horita M.ら、(2000) J. Exp. Med. 191, 977-984.
Hu ら、(1995) Cancer Gene Ther 2, 19-32.
Hubbard S. R. & Till J. H. (2000) Ann Rev Biochem 69, 373-398.
Ketting ら、(2001) Genes Dev 15 2654-2659.
Kisielow M ら、(2002) Biochem J 363, 1-5.
Knight and Bass (2001) Science 293, 2269-2271.
Konopka J. B.ら、(1984) Cell 37,1035-1042.
Koromilas and Matlashewski (2001) Cytokine Growth Factor Rev, 12, 157-70.
Levine, A. J. (1997) Cell 88, 323-331.
Lipardi ら、 Cell 107, 297-307.
Liu ら、(1999) J Virol 73,7297-307.
McMurray ら、(2001) Int J Exp Pathol 82, 15-33.
McWhirter J. R. & Wang J. Y. (1993) EMBO J. 12,1533-1546.
McWhirter J. R.ら、(1993) Mol. Cell. Biol. 13, 7587-7595
Minks M. A.ら、(1979) J. Biol. Chem. 254, 10180-10183.
Mosner ら、(1995) EMBO J 14L4442-4449.
Nykanen ら、(2001) Cell 107, 309-321.
Orphanides and Reinberg (2002) Cell 108, 439-451.
Pan ら、(1994) Genes Dev 8,1285-99.
Pan ら、(1995) Genes Dev 9,2157-9.
Patel ら、(1999) EMBO J, 18 5061-5072.
Pim ら、(1994) Oncogene 9, 1869-76.
Plasterk R.H.A.& Ketting R.F.(2000) Curr.Op.Genetics & Dev.10,562-567.
Scheffnerら、(1990) Cell 63 1129-36.
Scheffnerら、(1993) Cell 75 495-505.
Scheffnerら、(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 5523-5527.
Sharp P.A.(2001) Genes Dev.15,485-490.
Steeleら、(1993) Cancer Res 53,2330-2337.
Thomasら、(1999) Oncogene 18,7690-700.
Veldhoen N & Milner J.(1998) Oncogene 16,1077-1084.
Venturiniら、(1999) Nucleic Acids Res 27,585-92.
Vigneri P. & Wang J.Y.J.(2001) Nature Medicine 7,228-234.
von Knebel-Doeberitzら、(1992),Int J Cancer 51,831-4.
Wang J.Y.J.(2000) Oncogene 20,5643-5650.
Zamore P.D.ら、(2000) Cell 101,25-33.
Zur Hausen,H.(2000) J Natl Cancer Inst. 92,690-8.
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】HPV16 E6遺伝子中の相同配列の位置に基づいて選択したE6 siRNAおよびその予測されるRNA二次構造を示す図である。
【図２】siRNAによって引き起こされるCaSKi細胞中のHPV16 E6 mRNAレベルの低下を示す図である。
【図３】E6 siRNAが、CaSKi細胞中のp53タンパク質の安定化を引き起こすことを示す図である。
【図４】E6 siRNAによるp53の安定化がp53標的遺伝子の１つであるp21のアップレギュレートと相関することを示す図である。
【図５】siRNA配列およびトランスフェクション効率を示す図である。
【図６】E6 siRNAおよびE7 siRNAがそれぞれE6およびE7 mRNAの選択的喪失をもたらすことを示す図である。
【図７】E6 siRNAによる処理が細胞性p53タンパク質の活性化を誘導することを示す図である。
【図８】E6 siRNAがp53タンパク質の核内蓄積をもたらすことを示す図である。
【図９】E7 siRNAが過剰リン酸化細胞性pRbの選択的喪失をもたらすことを示す図である。
【図１０】E7 siRNAの単回投与がヒト子宮頚部癌細胞のアポトーシスを誘発することを示す図である。
【図１１】HPV 18 E6、HPV 18 E7、HPV 16 E6、およびHPV 16 E7の配列を示す図である。
【図１】
2004535813.tif 000002
【図２】
2004535813.tif 000003
【図３】
2004535813.tif 000004
【図４】
2004535813.tif 000005
【図５】
2004535813.tif 000006
【図６】
2004535813.tif 000007
【図７】
2004535813.tif 000008
【図８】
2004535813.tif 000009
【図９】
2004535813.tif 000010
【図１０】
2004535813.tif 000011
【図１１】
2004535813.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004535813.tif 000013
2004535813.tif 000014
2004535813.tif 000015
2004535813.tif 000016
2004535813.tif 000017
2004535813.tif 000018
2004535813.tif 000019
2004535813.tif 000020
2004535813.tif 000021
2004535813.tif 000022
2004535813.tif 000023
2004535813.tif 000024
2004535813.tif 000025
2004535813.tif 000026
2004535813.tif 000027
2004535813.tif 000028
2004535813.tif 000029
2004535813.tif 000030
2004535813.tif 000031
2004535813.tif 000032
2004535813.tif 000033
2004535813.tif 000034
2004535813.tif 000035
2004535813.tif 000036
2004535813.tif 000037
2004535813.tif 000038
2004535813.tif 000039
2004535813.tif 000040
2004535813.tif 000041
2004535813.tif 000042
2004535813.tif 000043
2004535813.tif 000044
2004535813.tif 000045
2004535813.tif 000046
2004535813.tif 000047
2004535813.tif 000048
2004535813.tif 000049
2004535813.tif 000050
2004535813.tif 000051
2004535813.tif 000052
2004535813.tif 000053
2004535813.tif 000054
2004535813.tif 000055
2004535813.tif 000056
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535813.tif 000057
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月16日(2003.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞において、ウイルス癌遺伝子の発現を選択的に転写後サイレンシングする方法であって、該遺伝子のmRNA配列の一部に相同であり１５〜２５塩基対の長さであるsiRNAを該哺乳動物細胞中に導入することを含む、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞において、HPV E6遺伝子の発現を選択的に転写後サイレンシングする方法であって、該遺伝子のmRNA配列の一部に相同であり１５〜２５塩基対の長さであるsiRNAを該哺乳動物細胞中に導入することを含む、前記方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞において、HPV E7遺伝子の発現を選択的に転写後サイレンシングする方法であって、該遺伝子のmRNA配列の一部に相同であり１５〜２５塩基対の長さであるsiRNAを該哺乳動物細胞中に導入することを含む、前記方法。
【請求項４】
前記siRNAが、HPV E7遺伝子の非切断mRNA配列または連続mRNA配列に相同である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
HPV E7遺伝子がHPV-16 E7遺伝子またはHPV-18 E7遺伝子である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
HPVが、前記siRNAの導入前に哺乳動物細胞中に存在している、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記siRNAが２２塩基対未満の長さである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下のi)およびii)：
i)   図11(a)または(c)中の任意の核酸配列によって示される核酸分子；
ii)  (i)中の任意の核酸配列とハイブリダイズし、かつsiRNA活性を有する核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子に由来する、１５〜２５塩基対の長さであるsiRNA。
【請求項９】
以下のi)およびii)：
i)   図11(b)または(d)中の任意の核酸配列によって示される核酸分子；
ii)  (i)中の任意の核酸配列とハイブリダイズし、かつsiRNA活性を有する核酸分子、
からなる群から選択される核酸分子に由来する、１５〜２５塩基対の長さであるsiRNA。
【請求項１０】
前記RNAi分子が、２２塩基対未満の長さである、請求項８または９に記載のsiRNA。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のsiRNAを含む、ベクター。
【請求項１２】
前記siRNAの発現に適合させた発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
医薬としての使用のための、請求項８、９もしくは１０に記載のsiRNAまたは請求項１１もしくは１２に記載のベクター。
【請求項１４】
HPV誘導性疾病の治療用医薬の製造のための、請求項８、９もしくは１０に記載のsiRNAまたは請求項１１もしくは１２に記載のベクターの、使用。
【請求項１５】
疾病が、生殖器いぼ、子宮頚部癌、陰茎癌、悪性扁平上皮癌および尋常性ゆうぜいからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
HPV陽性細胞におけるアポトーシスの誘発のための、請求項９に記載のsiRNAの使用。
【請求項１７】
前記細胞が子宮頚部癌細胞である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
治療を必要とする患者に、請求項８、９もしくは１０に記載のsiRNAまたは請求項１１もしくは１２に記載のベクターを有効用量にて投与することを含む、該治療の方法。
【請求項１９】
請求項８、９もしくは１０に記載のsiRNAまたは請求項１１もしくは１２に記載のベクターを製薬上許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
2004535813.tif 000058
2004535813.tif 000059
2004535813.tif 000060
2004535813.tif 000061