(57)【要約】本発明は、７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリン塩基を含んでなる核酸結合性化合物、このような化合物の製造に有用な化合物、それらの種々の使用および診断分野においてこのような化合物を使用して核酸を決定する方法の分野である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核塩基に対して塩基対合することができる結合した複素環式基を有する主鎖を含んでなる核酸結合性化合物であって、前記複素環式基が一般式Ｉ：
【化１】
2004505988.tif 000071
〔式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　ニトロ、
（３）　シアノ、
（４）　−ＣＯＯ−
（５）　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ（式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−であり、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である）、
（１０）　置換基（５）〜（９）（ここで、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは、−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である）、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　−Ｈ、
（２）　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　 （Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−（ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である）、
（７）　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは、−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置である〕
の基であることを特徴とする化合物、又はそれらの任意の塩。
【請求項２】
式中、Ｒ１がアルキニル−アミノ−Ｃ≡Ｃ−Ｅ−ＮＲ５Ｒ６、アルケニル−アミノ−Ｃ＝Ｃ−Ｅ−ＮＲ５Ｒ６および−Ｅ−ＮＲ５Ｒ６であり、ここでＥは−［（ＣＨ２）ｒＦ］ｓ−（ＣＨ２）ｒ−であり、ここでＦ＝ＯまたはＳそしてｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数であり、Ｒ５およびＲ６は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、Ｒ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
請求項１に記載の核酸結合性化合物。
【請求項３】
前記核酸化合物が一般式ＩＩ：
【化２】
2004505988.tif 000072
〔式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｎ−ＣＯ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルから成る群から選択され、
Ｌはオキシ、スルファンジイル、−ＣＨ２−および−ＮＲ２２−から成る群から選択され、
Ｔはオキソ、チオキソおよびセレノキソから成る群から選択され、
Ｕは−ＯＨ、Ｏ−、−Ｏ−リポーター基、−ＳＨ、−Ｓ−リポーター基、−ＳｅＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−ＮＲ２３Ｒ２４、および−（−Ｏ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル）ｎ−Ｒ２５から成る群から選択され、ここでｎは１〜６の任意の整数であることができるか、あるいは−ＮＲ２３Ｒ２４はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環であることができ、
Ｖはオキシ、スルファンジイル、−ＣＨ２−および−ＮＲ２２から成る群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−Ｏ−アリル、−Ｏ−アルキニル、およびＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルから成る群から独立して選択され、
Ｒ２３およびＲ２４は−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ２）ｃ］ｄ−ＮＲ２６Ｒ２７およびリポーター基から成る群から独立して選択され、
Ｒ２５は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＯ （Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよびリポーター基から成る群から選択され、
Ｒ２６およびＲ２７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数であり、そして
ＢはＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＸが請求項１において特定した通りである式Ｉの部分であり、
ここで任意のアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である〕
の１または２以上の部分を含んでなる、請求項１〜２のいずれかに記載の核酸結合性化合物またはそれらの任意の塩。
【請求項４】
主鎖が一般式ＩＩＩ：
【化３】
2004505988.tif 000073
〔式中、
ｔは０または１であり、
ｔ＝１である場合、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
Ｍはオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−から成る群から選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基およびリポーター基から成る群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アリル、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−（Ｏ−ＣＨ２）ｎ−（ここでｎは１〜１８の整数であることができる）、−ハロゲン、−アジド、ＳＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相および−ＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ１５は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、固相および式ＩＶの基から成る群から選択され、
【化４】
2004505988.tif 000074
式中、
Ｔはオキソ、チオキソおよびセレノキソから成る群から選択され、
Ｕは−ＯＨ、Ｏ−、−Ｏ−リポーター基、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−ＮＲ２３Ｒ２４、および−（−Ｏ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル）ｎ−Ｒ２５から成る群から選択され、ここでｎは１〜６の任意の整数であることができるか、あるいはＮＲ２３Ｒ２４はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環であることができ、
Ｒ２３およびＲ２４は−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ２）ｃ］ｄ−ＮＲ２６Ｒ２７から成る群から独立して選択され、
Ｒ２５は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＯ （Ｃ１−Ｃ４）−アルキルから成る群から選択され、
Ｒ２６およびＲ２７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から独立して選択され、
Ｒ２９は−ＯＲ３０および−ＳＲ３０から成る群から選択され、
Ｒ３０は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、保護基、固相およびリポーター基から成る群から選択され、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数であり、そして
ＢはＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＸが請求項１において特定した通りである式Ｉの部分であり、
ここで任意のアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基であり、
そしてｔ＝０である場合、Ｒ１５は−Ｈである〕
の部分を含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸結合性化合物またはそれらの任意の塩。
【請求項５】
式中ｔ＝０である場合、Ｒ１５が−ＨでありかつＲ１４が−Ｈである、請求項４に記載の核酸結合性化合物。
【請求項６】
主鎖が一般式Ｖ：
【化５】
2004505988.tif 000075
〔式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
Ｍ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、保護基、リポーター基および−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルから成る群から独立して選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相およびＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ１６は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基または式ＩＶの化合物から成る群から選択され、
【化６】
2004505988.tif 000076
式中、
Ｔはオキソ、チオキソおよびセレノキソから成る群から選択され、
Ｕは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−ＮＲ２３Ｒ２４、および−（−Ｏ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル）ｎ−Ｒ２５から成る群から選択され、ここでｎは１〜６の任意の整数であることができるか、あるいはＮＲ２３Ｒ２４はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環であることができ、
Ｒ２３およびＲ２４は−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ２）ｃ］ｄ−ＮＲ２６Ｒ２７から成る群から独立して選択され、
Ｒ２５は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＯ （Ｃ１−Ｃ４）−アルキルから成る群から選択され、
Ｒ２６およびＲ２７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から独立して選択され、
Ｒ２９は−ＯＲ３０および−ＳＲ３０から成る群から選択され、
Ｒ３０は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、保護基、固相およびリポーター基から成る群から選択され、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数であり、そして
ＢはＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＸが請求項１において特定した通りである式Ｉの部分であり、
ここで任意のアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である〕
の部分を含んでなる、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸結合性化合物およびそれらの任意の塩。
【請求項７】
Ｍ’がＯであり、Ｒ１６がＨであり、そしてＲ１４が−Ｈおよび−ＯＨから成る群から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
主鎖が糖およびリン酸塩部分を含んでなる、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸結合性化合物。
【請求項９】
糖がロックされたコンフォメーションである、請求項８に記載の核酸結合性化合物。
【請求項１０】
核酸結合性化合物がピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそれらのアナローグである複素環式環を含んでなる、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸結合性化合物。
【請求項１１】
保護基が−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレン、または−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子を置換する、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸結合性化合物。
【請求項１２】
前記核酸結合性化合物がリポーター基を含有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸結合性化合物。
【請求項１３】
請求項１において定義した式Ｉの複素環式基がリポーター基が結合しているヌクレオチドから分離された１〜５ヌクレオチドである、請求項１２に記載の核酸結合性化合物。
【請求項１４】
複素環式基が７−ブロモ−７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたは７−ヨード−７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンである、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸結合性化合物。
【請求項１５】
核酸結合性化合物のみまたは核酸結合性化合物および相補的核酸結合性化合物は一緒になって主鎖を含んでなる核酸結合性化合物であり、前記主鎖は核塩基に対する塩基対合することができる結合した複素環式基を有し、ここで複素環式基は置換されたピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とする、異なる配列を有する複数の核酸結合性化合物のアレイを含んでなり、前記複数の核酸結合性化合物が既知の位置において固体状支持体に結合されておりかつ相補的核酸結合性化合物に結合するように選択される、核酸結合性化合物間の相互作用を分析する組成物。
【請求項１６】
置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグがアデニンまたはグアニンのピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグまたはアデニンまたはグアニンの７−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
核酸結合性化合物のみまたは核酸結合性化合物および相補的核酸結合性化合物が請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸結合性化合物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記固体状支持体がシリカ、ポリマー物質、ガラス、多孔質ガラス、ビーズ、チップ、およびスライドから成る群から選択される、請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が５〜２０ヌクレオチド長さの核酸結合性化合物のアレイを含んでなる、請求項１５〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれかに記載の第１核酸結合性化合物または請求項１６〜１９のいずれかに記載の組成物と、第２核酸結合性化合物または請求項１〜１４のいずれかに記載の第２核酸結合性化合物との結合性生成物、ここで第１核酸結合性化合物および組成物および第２核酸結合性化合物は平行または逆平行の向きで塩基対合により互いに結合されている結合性生成物。
【請求項２１】
一般式ＶＩＩＩ：
【化７】
2004505988.tif 000077
〔式中、
ＰＰＰはトリホスフェート基、チオトリホスフェート基またはそれらのアナローグであり、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジドおよびＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ３６は−Ｈおよび−ＯＨの群から選択され、そして
Ｂは請求項１において定義された式Ｉの基であり、
そしてここで必要に応じて少なくとも１つの保護基は−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子を置換する〕
の化合物およびそれらの任意の塩。
【請求項２２】
Ｒ１４がＨであり、そしてＢが７−ブロモ−７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリンまたは７−ヨード−７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリンである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
式ＶＩ：
【化８】
2004505988.tif 000078
〔式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、Ｏ−保護基、Ｓ−保護基、ＮＨ−保護基、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相および−ＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ１５およびＲ１６は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基および式ＩＶの基から成る群から独立して選択され、
ただしＲ１５またはＲ１６は式ＩＶの基であり、
【化９】
2004505988.tif 000079
式中、
Ｔはオキソ、チオキソおよびセレノキソから成る群から選択され、
Ｕは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−ＮＲ２３Ｒ２４、および−Ｏ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｒ２５から成る群から選択され、またはＮＲ２３Ｒ２４はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環であることができ、
Ｒ２３およびＲ２４は−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ２）ｃ］ｄ−ＮＲ２６Ｒ２７から成る群から独立して選択され、
Ｒ２５は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＯ （Ｃ１−Ｃ４）−アルキルから成る群から選択され、
Ｒ２６およびＲ２７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から独立して選択され、
Ｒ２９は−ＯＲ３０および−ＳＲ３０から成る群から選択され、
Ｒ３０は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、保護基、ホスフェート、ジホスフェートおよびリポーター基から成る群から選択され、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルの群から選択され、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数であり、そして
Ｂは式Ｉの部分であり、
【化１０】
2004505988.tif 000080
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして請求項１における式Ｉ中のＲ１についての置換基（１）〜（１０）および下記の（１１）から成る群から選択され、
【化１１】
2004505988.tif 000081
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして請求項１における式Ｉ中のＲ２およびＲ３についての置換基（１）〜（７）の群から選択され、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ここで必要に応じて少なくとも１つの保護基は−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子を置換する〕
の化合物およびそれらの任意の塩。
【請求項２４】
式ＶＩＩ：
【化１２】
2004505988.tif 000082
〔式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルの群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＲ３１、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、ＮＨＲ３１、ＳＲ３１から成る群から選択され、
Ｒ３１は保護基またはリポーター基であり、
Ｒ３２およびＲ１７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールから成る群から独立して選択されるか、あるいはＮＲ３２Ｒ１７はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環を形成することができ、
Ｒ１８は−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルオキシ、置換または非置換の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、または置換または非置換の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシから成る群から選択され、ここで置換基は−ハロゲン、ｐ−ニトロアリールオキシおよび−シアノから成る群から選択される１または２以上の置換基であり、
Ｂは式Ｉの基であり、
【化１３】
2004505988.tif 000083
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして請求項１における式Ｉ中のＲ１についての置換基（１）〜（１０）および下記の（１１）から成る群から選択され、
【化１４】
2004505988.tif 000084
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして請求項１における式Ｉ中のＲ２およびＲ３についての置換基（１）〜（７）の群から選択され、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている〕
の化合物およびそれらの任意の塩。
【請求項２５】
式ＩＸ：
【化１５】
2004505988.tif 000085
〔式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルの群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＲ３１、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、ＮＨＲ３１、ＳＲ３１、またはリＯ−ポーター基から成る群から選択され、
Ｒ３１は保護基またはリポーター基であり、
Ｒ３２およびＲ１７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールから成る群から独立して選択されるか、あるいはＮＲ３２Ｒ１７はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環を形成することができ、
Ｒ１８は−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルオキシ、置換または非置換の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、または置換または非置換の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシから成る群から選択され、ここで置換基は−ハロゲン、ｐ−ニトロアリールオキシおよび−シアノから成る群から選択される１または２以上の置換基であり、
Ｂは式Ｉの基であり、
【化１６】
2004505988.tif 000086
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして請求項１における式Ｉ中のＲ１についての置換基（１）〜（１０）および下記の（１１）から成る群から選択され、
【化１７】
2004505988.tif 000087
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして請求項１における式Ｉ中のＲ２およびＲ３についての置換基（１）〜（７）の群から選択され、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている〕
の化合物およびそれらの任意の塩。
【請求項２６】
式Ｘ：
【化１８】
2004505988.tif 000088
〔式中、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルの群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＲ３１、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、ＮＨＲ３１、ＳＲ３１、またはリＯ−ポーター基から成る群から選択され、
Ｒ３１は保護基またはリポーター基であり、
Ｂは式Ｉの基であり、
【化１９】
2004505988.tif 000089
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして請求項１における式Ｉ中のＲ１についての置換基（１）〜（１０）および下記の（１１）から成る群から選択され、
【化２０】
2004505988.tif 000090
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして請求項１における式Ｉ中のＲ２およびＲ３についての置換基（１）〜（７）の群から選択され、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている〕
の化合物およびそれらの任意の塩。
【請求項２７】
一般式ＶＩ：
【化２１】
2004505988.tif 000091
〔式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基およびリポーター基の群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＲ３１、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、Ｏ−保護基、Ｓ−保護基、ＮＨ２−保護基、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルメルカプト、およびＯ−固相から成る群から選択され、
Ｒ１５およびＲ１６は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基および固相から成る群から独立して選択され、
Ｂは式Ｉの部分に対する結合であり、
【化２２】
2004505988.tif 000092
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして請求項１における式Ｉ中のＲ１についての置換基（１）〜（１０）および下記の（１１）から成る群から選択され、
【化２３】
2004505988.tif 000093
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして請求項１における式Ｉ中のＲ２およびＲ３についての置換基（１）〜（７）の群から選択され、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている〕
の部分を含んでなる主鎖を含んでなる核酸結合性化合物の合成用前駆体およびそれらの任意の塩。
【請求項２８】
一般式ＩＩＩ：
【化２４】
2004505988.tif 000094
〔式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
Ｍはオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、Ｏ−ＣＯ−、−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−から成る群から選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基およびリポーター基から成る群から独立して選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、ＳＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相および保護基結合−ＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ１５は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルおよび固相から成る群から選択され、
Ｂは式Ｉの部分に対する結合であり、
【化２５】
2004505988.tif 000095
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして請求項１における式Ｉ中のＲ１についての置換基（１）〜（１０）および下記の（１１）から成る群から選択され、
【化２６】
2004505988.tif 000096
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして請求項１における式Ｉ中のＲ２およびＲ３についての置換基（１）〜（７）の群から選択され、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ここでＲ１４はＯ−固相であるか、あるいはＲ１５は固相であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている〕
の部分を含んでなる主鎖を含んでなる核酸結合性化合物の合成用前駆体およびそれらの任意の塩。
【請求項２９】
複素環式基が一般式Ｉ：
【化２７】
2004505988.tif 000097
〔式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして請求項１における式Ｉ中のＲ１についての置換基（１）〜（１０）および下記の（１１）から成る群から選択され、
【化２８】
2004505988.tif 000098
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして請求項１における式Ｉ中のＲ２およびＲ３についての置換基（１）〜（７）の群から選択され、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ここで前記主鎖は結合した固相であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている〕
の基であることを特徴とする、結合した複素環式基を有する主鎖を含んでなる前駆体または中間体化合物およびそれらの任意の塩。
【請求項３０】
プライマーのエクステンション用鋳型として核酸を使用してトリホスフェートサブユニットをプライマーと反応させ、ここでトリホスフェートは請求項２１または２２に記載の化合物である、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸結合性化合物を酵素的に合成する方法。
【請求項３１】
請求項２３〜２９のいずれかに記載の化合物を含有する活性化サブユニットを使用する、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸結合性化合物を酵素的に合成する方法。
【請求項３２】
合成された核酸結合性化合物をそれ以上の化合物と反応させる追加の工程を含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
それ以上の化合物が標識である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
複素環式基が置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とする、第１核酸結合性化合物および／または第２核酸結合性化合物が主鎖を含んでなり、前記主鎖が核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有する、第２核酸結合性化合物と平行または逆平行のデュプレックスを形成するハイブリダイゼーション反応における第１核酸結合性化合物の使用。
【請求項３５】
ハイブリダイゼーション反応が多重ハイブリダイゼーション反応である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
複素環式基が置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とする、主鎖が核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有する、捕捉プローブとして主鎖を有する核酸結合性化合物の使用。
【請求項３７】
核酸結合性化合物または第１および／または第２核酸結合性化合物が請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸結合性化合物である、請求項３４〜３６のいずれかに記載の使用。
【請求項３８】
第１核酸結合性化合物中の複素環式基が第２核酸結合性化合物中の複素環式基に対して相補的である、第２核酸結合性化合物との平行または逆平行のデュプレックスの溶融温度を増加させ、これにより溶融温度の増加を第１核酸結合性化合物と第２核酸結合性化合物との平行または逆平行のデュプレックスの溶融温度と比較するための、第１核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグの使用。
【請求項３９】
第１核酸結合性化合物中の複素環式基が第２核酸結合性化合物中の複素環式基に対して相補的である、増幅反応において使用するプライマーの溶融温度に比較して第２核酸結合性化合物との平行または逆平行のデュプレックスの溶融温度を増加させ、これにより溶融温度の増加を第１核酸結合性化合物と第２核酸結合性化合物との平行または逆平行のデュプレックスの溶融温度と比較するための、増幅反応においてプローブとして使用する第１核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグの使用。
【請求項４０】
第２核酸結合性化合物との平行または逆平行のデュプレックスの溶融温度に対する各塩基対の寄与を調和させるための第１核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグの使用。
【請求項４１】
第１核酸結合性化合物とのデュプレックスにおけるミスマッチを有する第２核酸結合性化合物中の配列の検出を増強させるための第１核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグの使用。
【請求項４２】
核酸結合性化合物中の複素環式基が核酸結合性化合物中のハイブリダイゼーションする部分の複素環式基に対して相補的である、核酸結合性化合物の分子内デュプレックスの溶融温度を増加させ、これにより溶融温度の増加を核酸結合性化合物の分子内デュプレックスの溶融温度と比較するための、核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグの使用。
【請求項４３】
ターゲット核酸中のサブタイプの検出を増強するための核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグの使用。
【請求項４４】
１つまたは２つのリポーター基が核酸結合性化合物または第１および／または第２核酸結合性化合物に結合されている、請求項３９〜４３のいずれかに記載の使用。
【請求項４５】
複素環式基の代わりの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグがリポーター基の結合点から１〜５ヌクレオチド離れている、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグがアデニンまたはグアニンの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグまたはアデニンまたはグアニンの７−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグである、請求項３４〜４５のいずれかに記載の使用。
【請求項４７】
置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグが置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体である、請求項３４〜４５のいずれかに記載の使用。
【請求項４８】
置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体が式Ｉを有し、置換基が式Ｉにおいてにおいて定義した通りである、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
下記工程：
−　核酸を含有することが推測される試料を準備し、
−　主鎖を含んでなる核酸結合性化合物を準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであり、核酸の一部分またはすべてに対して本質的に相補的であることを特徴とし、
−　核酸結合性化合物を核酸に結合させる条件下に前記試料を核酸結合性化合物と接触させてデュプレックスを形成させ、
−　結合性生成物または核酸と核酸結合性化合物との間のハイブリダイゼーションの程度を核酸の存在、不存在または量の測度として決定する、
を含んでなる核酸の存在、不存在または量を決定する方法。
【請求項５０】
下記の工程：
ａ）　定義した配列を有する核酸結合性化合物を準備し、ここで核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、
ｂ）　２つの関係するヌクレオチド配列を有する核酸を準備し、ヌクレオチド配列の各々はターゲット配列を含んでなり、ここでヌクレオチド配列の一方は核酸結合性化合物に対して完全に相補的であり、そしてセグメントの一方は関係するターゲット配列であり、
ｃ）　ハイブリダイゼーション条件下に核酸を核酸結合性化合物とインキュベートしてデュプレックスを形成し、そして
ｄ）　核酸結合性化合物とセグメントの各々との間のハイブリダイゼーションの程度を決定する、
を含んでなる、核酸中の関係するヌクレオチド配列を区別する方法。
【請求項５１】
核酸結合性化合物がリポーター基を含んでなる、請求項４９〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
リポーター基が蛍光性標識である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
核酸結合性化合物が蛍光性標識の蛍光をクエンチするクエンチング剤をさらに含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
蛍光性標識がフルオレセインであり、そしてクエンチング剤が蛍光性ローダミンまたはシアニンである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ハイブリダイゼーションに引き続いて蛍光性標識とクエンチング剤との間の空間的関係を変更する工程をさらに含んでなる、請求項５３〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
蛍光性標識とクエンチング剤との間の空間的関係を核酸結合性化合物のエキソヌクレアーゼにより達成し、ここでエキソヌクレアーゼの加水分解の結果、標識が解放される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ハイブリダイゼーションに引き続いて核酸結合性化合物から解放される標識の量により、核酸結合性化合物と核酸との間のハイブリダイゼーションの程度を決定する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
核酸結合性化合物のプライミング能力により、核酸結合性化合物と核酸との間のハイブリダイゼーションの程度を決定する、請求項４９〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
ポリメラーゼ連鎖反応の一部分としてプライミングが起こる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
２以上の核酸結合性化合物を使用する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
２つのの核酸結合性化合物を使用する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
２つの核酸結合性化合物の第１が蛍光ドナーを含んでなり、そして２つの核酸結合性化合物の第２が蛍光アクセプターを含んでなり、そして蛍光ドナーの放射波長が蛍光アクセプターの吸収波長とオーバーラップする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
蛍光ドナーと蛍光アクセプターとの間で移動しかつ蛍光アクセプターにより放射された光の量により、ハイブリダイゼーションの程度を測定する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
核酸結合性化合物と核酸との間の溶融温度の測定により、ハイブリダイゼーションの程度を決定する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
下記の工程：
ａ）　ターゲット配列の存在について試験すべき核酸を準備し、
ｂ）　主鎖を含んでなる核酸結合性化合物を準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、核酸結合性化合物はターゲット配列に対して実質的に相補的であり、
ｃ）　核酸および核酸結合性化合物をハイブリダイゼーション条件下にインキュベートし、そして
ｄ）　ハイブリダイゼーションした核酸を同定する、
を含んでなる、核酸中のターゲット配列の存在を検出する方法。
【請求項６６】
多数の核酸をターゲット配列の存在について試験し、そして核酸が関係するターゲット配列を有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
核酸結合性化合物がエクステンション可能な３’−ヒドロキシ基を含んでなるプライマーである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
重合性酵素を使用するプライマーのエクステンションにより、ハイブリダイゼーションした核酸を同定する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
核酸結合性化合物がポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
下記の工程：
ａ）　ターゲット配列を含有する核酸を準備し、
ｂ）　ターゲット配列に対して相補的な１または２以上の核酸結合性化合物を準備し、ここで核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、
ｃ）　重合性酵素およびヌクレオチド基質を準備し、そして
ｄ）　重合に好適な条件下に核酸、核酸結合性化合物、酵素および基質をインキュベートする、
を含んでなる、プライマーをエクステンションする方法。
【請求項７１】
この方法がポリメラーゼ連鎖反応の一部分である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
この方法をｃＤＮＡ分子の合成において使用する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
下記の工程：
ａ）　異なる既知の配列を有する核酸結合性化合物のアレイを準備し、ここで核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、ただし核酸結合性化合物はリポーター基を含有せず、
ｂ）　ハイブリダイゼーション条件下に核酸をアレイとインキュベートし、そして
ｃ）　アレイ中のどの核酸結合性化合物が核酸にハイブリダイゼーションするかを決定する、
を含んでなる、核酸のヌクレオチド配列を決定する方法。
【請求項７４】
下記の工程：
ａ）　ターゲット配列を含有する核酸を準備し、
ｂ）　主鎖を含んでなる少なくとも２つ核酸結合性化合物を準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたは既知の配列をもつそのアナローグであることを特徴とし、ここで少なくとも２つ核酸結合性化合物の一方はターゲット配列に対して完全に相補的でありかつ核酸結合性化合物の少なくとも１つの他のものは関係するターゲット配列を有し、
ｃ）　ハイブリダイゼーション条件下に少なくとも２つ核酸結合性化合物を核酸とインキュベートし、そして
ｄ）　核酸結合性化合物の各々と核酸との間のハイブリダイゼーションの程度を測定する、
を含んでなる、核酸中のターゲット配列のヌクレオチド配列を決定する方法。
【請求項７５】
少なくとも１つの他の核酸結合性化合物がターゲット配列と単一のヌクレオチドミスマッチを有する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
下記の工程：
ａ）　細胞中で発現された遺伝子を代表する核酸の集団を準備し、
ｂ）　異なる配列を有する核酸結合性化合物のアレイを準備し、ここで核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、ただし核酸結合性化合物はリポーター基を含有せず、
ｃ）　ハイブリダイゼーション条件下に核酸の集団をアレイとインキュベートし、そして
ｄ）　アレイ中のどの核酸結合性化合物に核酸がハイブリダイゼーションするようになるかを決定する、
を含んでなる、細胞中の遺伝子の発現を検査する方法。
【請求項７７】
下記の工程：
ａ）　ターゲット配列を含んでなる核酸を準備し、
ｂ）　主鎖を含んでなる核酸結合性化合物のアレイを準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、ここで核酸結合性化合物は異なる配列を有し、異なる配列は野生型ターゲット配列および異なる突然変異ターゲット配列を包含し、ただし核酸結合性化合物はリポーター基を含有せず、
ｃ）　ハイブリダイゼーション条件下に核酸をアレイとインキュベートし、そして
ｄ）　アレイ中のどの核酸結合性化合物が核酸とハイブリダイゼーションするようになるかを決定する、
を含んでなる、問題の遺伝子のターゲット配列中の突然変異を同定する方法。
【請求項７８】
置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグがアデニンまたはグアニンの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグまたはアデニンまたはグアニンの７−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグである、請求項４９〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグが置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体である、請求項４９〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体が請求項１において定義した式Ｉを有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
核酸結合性化合物が請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸結合性化合物である、請求項４９〜８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
平行または逆平行のデュプレックスが形成される、請求項４９〜８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
核酸結合性化合物が請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸結合性化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項８４】
医学において使用するための請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸結合性化合物。
【請求項８５】
置換基が下記式を有するフタルイミドアルキル、フタルイミドアルケニル、またはフタルイミドアルキニル基の群から選定される塩基部分に結合している、ヌクレオシドアデノシンまたはデソキシアデノシン、グアノシンまたはデソキシグアノシン、イソグアノシンまたはデソキシイソグアノシン、シチジンまたはデオキシシチジン、ウリジンまたはデソキシウリジン、チミジンまたはデソキシチミジン、またはこれらのヌクレオシドのアナローグを含んでなるオリゴヌクレオチドを合成するための構築ブロック：
【化２９】
2004505988.tif 000099
式中Ｎｕｃは塩基部分に対する置換基の結合位置であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
ただしフタルイミドアルキニルまたはフタルイミドアルキル基はデソキシウリジンのＣ５−原子に結合していず、そしてただしフタルイミドアルキニル基は７−デアザ−デオキシグアノシンのＣ７−原子に結合していない。
【請求項８６】
これらのヌクレオシドのアナローグがピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグである、請求項８５に記載の構築ブロック。
【請求項８７】
構築ブロックがホスホルアミダイト誘導体である、請求項８５〜８６のいずれかに記載の構築ブロック。
【請求項８８】
オリゴヌクレオチドを合成するための請求項８５〜８６のいずれかに記載の構築ブロックの使用。
【請求項８９】
塩基部分に結合した−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、または−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２のアミノ基がフタロイル基で誘導化されており、そしてｎが１〜１８の整数であり、ただし−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２または−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基はデオキシウリジンのＣ５−原子に結合していず、そしてただし−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基が７−デアザ−デオキシグアノシンのＣ７−原子に結合していない、ヌクレオシドアデノシンまたはデソキシアデノシン、グアノシンまたはデソキシグアノシン、イソグアノシンまたはデソキシイソグアノシン、シチジンまたはデオキシシチジン、ウリジンまたはデソキシウリジン、チミジンまたはデソキシチミジン、またはこれらのヌクレオシドのアナローグを含んでなるオリゴヌクレオチドを合成するための構築ブロックからオリゴヌクレオチドを合成する方法における保護基としてのフタロイル 基の使用。
【請求項９０】
これらのヌクレオシドのアナローグがピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグである、請求項８９に記載の使用。
【請求項９１】
構築ブロックがホスホルアミダイト誘導体である、請求項８８〜９０のいずれかに記載の使用。
【請求項９２】
請求項８５〜８７のいずれかに記載の構築ブロックからオリゴヌクレオチドを合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリン塩基を含んでなる核酸結合性化合物、このような化合物の製造に有用な化合物、それらの種々の使用および診断分野においてこのような化合物を使用して核酸を決定する方法の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
核酸は、ヒトの体液、食品または健康管理の分野における環境中の遺伝子または微生物の存在または非存在を決定するために有用な被検体であることが見出された。核酸の分析はポリメラーゼ連鎖反応のような核酸増幅の導入後に広く使用されてきている（ＰＣＲ、米国特許第４，６８３，２０２号参照）。こうして、十分な量の核酸が各試料から入手可能である。核酸はこの前処理した試料から、特定の目的に依存して、種々の異なる技術を使用して決定することができる。大部分のアッセイはプローブを使用し、このプローブは固定化されるか、あるいは固定化可能であるか、あるいは１または２以上のリポーター基の取り付けにより標識化される。
【０００３】
リポーター基はそれ自体決定可能であるという特性を有するか、あるいは前記リポーター基を介してプローブを測定可能とする試薬とリポーター基を反応させることができる。こうして、例えば、リポーター基により標識化されたプローブを測定することができ、そしてプローブと測定すべき核酸とを含有するハイブリッドであることができる。固定化されたプローブの場合において、プローブと測定すべき核酸との間のハイブリッドをプローブが結合した固相において測定する。特定の形態のアッセイにおいて、特異的配列を有する１つの核酸ばかりでなく、かつまた異なる配列の多数の核酸を測定する。
【０００４】
この目的のために、プローブを平らな表面、例えば、ガラスチップ上でアレイ中の小さいスポットで固定化する（ＥＰ−Ａ −０ ４７６ ０１４およびＴＩＢＴＥＣＨ（１９９７）、Ｖｏｌ． １５、４６５−４６９、ＷＯ８９／１０９７７、ＷＯ８９／１１５４８、米国特許第５，２０２，２３１号、米国特許第５，００２，８６７号、ＷＯ９３／１７１２９６）。さらに、非常に小さい面積の中に非常に大きいアレイのオリゴヌクレオチドプローブを作る方法が開発された（米国特許第５，１４３，８５４号、ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９２／１００９２）。多数のオリゴヌクレオチドプローブのミクロ製作アレイ、「ＤＮＡチップ」と呼ぶ、は、広範な種類の応用のために大きい有望性を提供する（例えば、下記文献を参照のこと、米国特許第６，１５６，５０１号および米国特許第６，０２２，９６３号）。
【０００５】
しかしながら、核酸の測定は天然塩基ＡおよびＴおよびＣおよびＧ間の塩基対合が異なる安定性を有するという問題にしばしば悩まされる。これは水素結合を形成するこれらの塩基の能力が異なるに起因する。こうして、ｄＡ−ｄＴ−塩基対は２つの水素架橋を有するが、ｄＧ−ｄＣ−塩基対は３つの水素架橋を有する。これは、ＧＣ含量［１〜３］に依存して、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）を異ならせる。ＧＣ含量が高いほど、Ｔｍはより高い。ハイブリダイゼーションの強度またはハイブリダイゼーションの程度は、生ずるデュプレックスのＴｍの測定により研究することができる。これは次のようにして実施できる。デュプレックスを溶液中で徐々に増加する温度に暴露させ、例えば、紫外線の吸収により、デュプレックスの変性をモニターする。紫外線の吸収は変性を伴う塩基対の崩壊とともに増加する。Ｔｍは一般に完全にデュプレックスの構造から完全な変性、すなわち、２つの単離された一本鎖の形成までの温度の中点として定義される。
【０００６】
したがって、日常的核酸分析において、核酸分子のＴｍを変化させることがしばしば望まれる。例えば、ある目的で、同一長さの核酸のＴｍを等しくまたは均質化するか、あるいはＴｍを核酸または結合領域の長さから独立としてすべてのアッセイについて同様なハイブリダイゼーション条件を適用する位置にあるようにすることが好都合であることがある。これはアレイを使用するアッセイ、例えば、各プローブのハイブリダイゼーション条件が同一でなくてはならないアレイ上のアッセイのために特に必要である。１つの解決法は低いハイブリダイゼーション温度を使用することであった。このような条件下に、低度の塩基配列相補性を有する多数の核酸はプローブに結合するであろう。これは非特異的結合と呼び、同様な配列間の識別を可能としない。
【０００７】
他の提案はハイブリダイゼーション混合物中で化学的試薬の使用、例えば、塩化トリテトラアンモニウム（ＴＭＡＣ）の添加に関する。この試薬はｄＧ−ＤｃおよびｄＡ−ｄＴ塩基対の安定性間の差を減少するが、短いオリゴヌクレオチドについて効果は不十分である。さらに、ＴＭＡＣのような塩の添加はアッセイの最適化を複雑化するので、好ましくないことがある。他の提案は１つのアッセイにおいて異なる濃度の各異なる（固定化された）プローブを使用することに関する。これはチップ表面上で不可能である場合、技術的に複雑ことが見出された。それ以上のオプションとして、デオキシリボヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド中のリボヌクレオチドの置換および逆もまた同じがＤＮＡ安定性の適応のために適用された、Ｈｏｈｅｉｓｅｌ（１９９６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４、４３０−４３２。
【０００８】
しかしながら、所定の核酸のＴｍを増加させることが好都合であることもある。これはアンチセンス療法、ミスマッチに、および診断において使用する核酸に有用な核酸の分野において重要である。核酸はプライマーまたはプローブとして使用することができる。この目的は多重反応において使用するプライマーおよびプローブのデザインをいっそう簡単にし、そしてチップ上で使用するより短い捕捉プローブを合成することである。アッセイに使用するチップ表面上のオリゴヌクレオチドの化学的合成は日常的オリゴヌクレオチド合成におけるように有効ではない。ハイブリッドの溶融温度に対する各塩基対の相対的寄与は、オリゴヌクレオチドが短くなればなるほど、より高くなる。結局、ミスマッチおよび完全な合致間の差はより短いオリゴヌクレオチドについてより高い。しかしながら、短いオリゴヌクレオチドは弱くハイブリダイゼーションし、したがって、ハイブリダイゼーション反応は低いストリンジェンシイにおいて実施すべきである。
【０００９】
結局、より短いオリゴヌクレオチドにより異なる配列間を識別する、潜在的により高い能力は、低いストリンジェンシイの条件下においてのみ使用することができる。ストリンジェント条件下に、例えば、増幅反応に使用する温度において特に短いオリゴヌクレオチドについて、高いレベルのミスマッチ識別を可能とすることはかなり好都合であろう。さらに、アレイに使用する固体支持体上の化学的合成は日常的合成のように有効でないので、アレイにおいて高い識別力を有する短いオリゴヌクレオチドを使用することは技術水準において望ましい。したがって、ストリンジェント条件下により短いオリゴヌクレオチドを使用する能力はかなり有利である。その相補的鎖に対してハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドのＴｍを増加させる塩基が見出される場合、他の塩基を同一オリゴヌクレオチドにおいて使用して、使用すべき試験系の採択に従いＴｍをさらに調節することができる。
【００１０】
理論的には、他の三座配位塩基対を形成するオリゴヌクレオチドデュプレックスは同様なまたはより高い安定性、例えば、チミジンと反対に２−アミノアデニンを使用する安定性を示すべきである。それにもかかわらず、２−アミノアデニン−チミジン／ウラシル塩基対は低い熱安定性のみを示すことが示された［４〜１０］。これまで発表されたデータから、２’−デオキシアデノシン−２−アミン（分子１（下文参照）；ｎ２Ａｄ）の追加のＮＨ２基はＤＮＡデュプレックスの塩基対安定性に非常にわずかに寄与することを結論することができる。Ｔｍ増加はわずかに１〜２ ℃の範囲である。さらに、この安定性はＤａの代わりにデュプレックスの中に組込まれたｎ２Ａｄの総数に対応しない［１１］。デュプレックスＤＮＡについて報告されているような、より強い安定化は、デュプレックスＲＮＡについて、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドについて見出される［９］［１０］［１２］。２−アミノアデニンをＲＮＡ［１３］またはヘキシトール核酸［１４］の中に導入するとき、むしろ高い塩基対安定性が観測される。ＤＮＡまたはＲＮＡ以外の修飾された主鎖は、２−アミノアデニン−チミジン／ウラシル塩基対の安定性を増強するように見える。
【００１１】
ｎ２Ａｄ−ｄＴ残基を含有するオリゴヌクレオチドデュプレックスの異常な挙動は、グアニン−シトシン塩基対と同一の、またはそれよりも高い安定性を示すアデニン−チミジン認識モチーフの開発に重要である。下記の化合物において、化合物のプリン部分は８−アザ−７−デアザプリン（ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）または７−デアザプリン（ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）で置換してヌクレオシドに導く（２ａ［１５］、２ｂ、２ｃまたは３［１６］、［１７］下文参照）。
【００１２】
【化３０】
2004505988.tif 000002
【００１３】
同様な化学的構造の化合物は先行技術において研究された。７−置換−７−デアザおよび８−アザ−７−デアザプリン２’−デオキシリボヌクレオチドの合成、オリゴヌクレオチドの中へのそれらの組込み、および対応するデュプレックスの安定性は研究されてきている（Ｓｅｅｌａ他、（１９９７） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６、９６３−９６６）。この文献は７−置換７−デアザ−８−アザ−ジアミノ−プリンを開示していない。ピラゾロピリミジン塩基アナローグによりデュプレックスの安定化は報告された（Ｓｅｅｌａ他、（１９８８） Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ７１、１１９１−１１９８；Ｓｅｅｌａ他、（１９８８） Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ７１、１８１３−１８２３；およびＳｅｅｌａ他、（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７、９０１−９１０）。
【００１４】
オリゴヌクレオチド中のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基は、また、種々の基の取り付け部位として有効である（ＷＯ９０／１４３５３）。１または２以上のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンを組込んで有するオリゴヌクレオチドはトリプレックスを形成する増強した傾向を有する（Ｂｅｌｏｕｓｏｖ他、（１９９８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６、１３２４−１３２８）。
【００１５】
化合物７−ヨード、７−シアノおよび７−プロピニル−７−デアザ−２−アミノ−２’−デオキシアデノシンは合成され（Ｂａｌｏｗ他、（１９９７） Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６、９１４−９４４）、オリゴヌクレオチド配列の中に組込まれた。これらのオリゴヌクレオチドは、非修飾配列に関係してＲＮＡ補体に対する増強されるアフィニティーを示す。しかしながら、対応する８−アザ−化合物が作られ、研究された。Ｓｅｅｌａ他、（１９９９、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８、１３９９−１４００）は、７−置換８−アザ−７−デアザプリンＤＮＡ、その合成および安定性を開示している。この著者は開示された化合物の可能な使用を扱っていない。
【００１６】
ＷＯ９０／０３３７０には、インターカレーター、求電子性架橋剤またはリポーター基が結合しているＣ３位にリンカーを有する、３，４−二置換および３，４，６−三置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、特に４，６−ジアミノ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンが開示されている。これらの化合物は糖に取り付けられ、オリゴヌクレオチドの中に組込まれ、これにより問題の相補的核酸配列の同定、単離、定位および／または検出に使用される。米国特許第５，５９４，１２１号には、デュプレックス尾ｒトリプレックスを形成する能力が増強された新規なオリゴマーが開示されている。オリゴマーは７位にプロピニルおよびアリールを有する７−置換８−アザ−７−デアザ−ジアミノ−プリンを含有する。これらのオリゴマーを含有する組成物は診断目的に使用することができる。
【００１７】
高い識別力および短い長さを有するプローブを提供することが要求されており、プローブのＴｍはストリンジェント条件下に高くかつ診断分野における種々の方法において、例えば、ＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒＴＭ系（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ国マンハイム）、ＴａｑＭａｎＴＭ（ＷＯ９２／０２６３８および対応する米国特許第５，２１０，０１５号、米国特許第５，８０４，３７５号、米国特許第５，４８７，９７２号）。
【００１８】
用語および定義
分子生物学およびな化学の慣用技術は、技術水準内に入り、文献に十分に説明されている。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ、編、１９８４）；および系列、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、これらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる。すべての特許、特許出願、および刊行物（前掲および後掲）は引用することによって本明細書の一部とされる。
【００１９】
用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、およびプリンまたはピリミジン塩基、または修飾されたプリンまたはピリミジン塩基のＮグリコシドである、任意の他のタイプのポリヌクレオチドを意味する。用語「核酸」と「オリゴヌクレオチド」との間に長さの意図する区別は存在せず、そしてこれらの用語は互換的に使用されるであろう。それらの用語は分子の一次構造のみを意味する。こうして、これらの用語は二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを包含する。用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」について互換的に使用されるであろう。
【００２０】
本発明による核酸結合性化合物について用語「主鎖」または「核酸主鎖」は、核酸結合性化合物中の核塩基を結合する化学的部分の構造を意味する。塩基は主鎖に結合されており、水素結合を介する相補的核酸結合性化合物に対する塩基対合に関与する。これはヌクレオチドを化学的に結合する任意のかつすべての手段から形成された構造物、例えば、天然に存在するホスホジエステルリボース主鎖または非天然結合、例えば、ホスホルチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよびホスホルトリエステルを包含することができる。ペプチド核酸は非天然結合を有する。
【００２１】
したがって、「修飾された主鎖」は、本明細書において使用するとき、前述のヌクレオチド間の化学的結合に対する修飾、ならびに安定性および親和性を増強する使用できる他の修飾、例えば、糖構造に対する修飾を包含する。例えば、デオキシリボースのα−アノマーを使用することができ、ここで塩基は天然のβ−アノマーに関して逆向きである。ある態様において、糖基の２’−Ｏ Ｈは２’−Ｏ−アルキルまたは２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）に変更することができ、これはアフィニティーを含まない分解に対する抵抗を提供する。ホスホジエステル主鎖を有する非修飾ヌクレオチド配列および核塩基を含有する配列が同一の塩基配列決定結果を有する場合、非修飾ヌクレオチド配列は核塩基を含有する配列に対して「コンパティブル」である。こうして、このような配列の主鎖もまたコンパティブルである。
【００２２】
用語「核酸結合性化合物」は、任意の配列の核酸とアソシエートしかつ実質的に相補性の核酸に対する結合相手として機能することができる物質を意味する。核酸結合性化合物が一本鎖の形態であるとき、結合は好ましくは相補的塩基対間の水素結合を介して起こる。好ましくは、核酸結合性化合物に結合した非天然塩基、すなわち、本発明の主題は、また、水素結合に関係するが、また、一部分のみまたはすべての天然に存在する塩基、例えば、イノシンに対する水素結合を形成することができる。この分野における専門家は認識するように、大部分のよく知られている「核酸結合性化合物」はＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸である。
【００２３】
用語「プローブ」は、設計または選択により、定められた前もって決定したストリンジェンシイ下に、プローブを特異的に（すなわち、優先的に）ターゲット核酸に対してハイブリダイゼーションさせることができる特異的ヌクレオチド配列を含有する、合成的または生物学的に産生された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。「プローブ」は「捕捉プローブ」の意味で同定されることができ、捕捉プローブはターゲット核酸を「捕捉」することができるので、それはその検出を不明瞭することがある望ましくない物質から分離することができる。いったん分離が達成されると、捕捉されたターゲット核酸の検出は適当な手順を使用して達成することができる。「捕捉プローブ」はしばしば既に固相に結合されている。
【００２４】
ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖間または小さいミスマッチ領域を含有する「実質的に相補的な」核酸鎖間で起こることができる。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイゼーションする条件は、「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と呼ぶ。実質的に相補的な配列の安定なデュプレックスは、低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件下に達成することができる：許容されるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条件の適当な調節によりコントロールすることができる。
【００２５】
核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さおよび塩基対濃度、イオン強度、およびミスマッチ塩基対の発生率を包含する変数の数を実験的に考慮して、この分野において提供された手引きに従いデュプレックスの安定性を測定することができる（例えば、下記文献を参照のこと、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＷｅｔｍｕｒ、１９９１、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６（３／４）：２２７−２５９；両方は引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００２６】
用語「プライマー」は、核酸鎖に対して相補的なプライマーエクステンション産物の合成が誘導される条件下に、すなわち、適当な緩衝液中の適当な温度において４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよびエクステンション因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写）の存在下に、ＤＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書において使用するとき、「プライマー」は結合仲介増幅プロセスにおいて使用するオリゴヌクレオチドを包含することを意図し、ここで増幅プロセスにおいて１つのオリゴヌクレオチド隣接する位置においてハイブリダイゼーションする第２オリゴヌクレオチドに対する結合により「エクステンション」される。
【００２７】
こうして、用語「プライマーエクステンション」は、本明細書において使用するとき、ＤＮＡ合成の開始点としてプライマーを使用する個々のヌクレオシドトリホスフェートの重合、および２つのプライマーを結合してエクステンションされた産物を形成することを意味する。プライマーは好ましくは一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適当な長さはプライマーの意図する使用に依存するが、典型的には６〜５０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般に鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。プライマーは鋳型核酸の正確な配列を反映しないが、鋳型とハイブリダイゼーションするために十分に相補的でなくてはならない。
【００２８】
所定のターゲット配列を増幅するために適当なプライマーの設計はこの分野においてよく知られており、そして本明細書において引用する文献に記載されている。プライマーは、プライマーの検出または固定化を可能とするが、プライマーの基本的性質、ＤＮＡ合成の開始点として作用する性質を変更しない、追加の特徴組込むことができる。例えば、プライマーは、ターゲット核酸に対してハイブリダイゼーションしないが、増幅された産物のクローニングを促進する、追加の核酸配列を５’末端に含有することができる。鋳型に対して十分に相補的であるプライマーの領域を、本明細書において、ハイブリダイゼーション領域と呼ぶ。
【００２９】
用語「ターゲット」、「ターゲット配列」、「ターゲットセグメント」、「ターゲット領域」、および「ターゲット核酸」は、増幅または研究すべき核酸の領域または配列を意味する。
【００３０】
本明細書において使用するとき、プライマー配列とターゲット配列との間に存在するミスマッチの数が、プライマー配列と試料の中に存在することがある非ターゲット配列との間に存在するミスマッチの数より小さい場合、プライマーはターゲット配列に対して「特異的」である。存在するミスマッチの数がプライマー配列とターゲット配列との間に存在する数以下である場合にのみ、安定なデュプレックスが形成するハイブリダイゼーション条件を選択することができる。このような条件下に、プライマーはターゲット配列とのみ安定なデュプレックスを形成することができる。こうして、適当なストリンジェントの増幅条件下にターゲット特異的プライマーを使用すると、ターゲットプライマー結合性部位を含有するターゲット配列を特異的に増幅することができる。配列特異的増幅条件を使用すると、正確に相補的なプライマー結合性部位を含有するターゲット配列を特異的に増幅することができる。
【００３１】
ハロゲンはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード基を意味する。最も好ましいハロゲン基は−Ｉおよび−Ｂｒである。
アルキル基は好ましくは直鎖状、分枝鎖状または環状の形態で配置された１〜１０個の炭素原子を含有するアルキル基から選択される。アルキル基の実際の長さは、アルキル基が位置する特定の位置における立体的位置に依存する。立体的拘束が存在する場合、アルキル基はより小さく、メチルおよびエチル基は最も好ましい。すべてのアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は非置換または置換であることができる。上に概説したヘテロ原子による置換は、水溶液中の溶解度の増加を促進するであろう。
【００３２】
アルケニル基は好ましくは２〜１０個の炭素原子を含有するアルケニル基から選択される。選択のために、アルキル基についてと同様な考察が適用される。また、それらは直鎖状、分枝鎖状または環状であることができる。最も好ましいアルケニル基はエチレン基である。
アルキニル基は好ましくは２〜１０個の炭素原子を含有する。再び、それらの炭素原子は直鎖状、分枝鎖状または環状の方法で配置されている。さらに、アルキニル基の中には２以上の三重結合が存在する。最も好ましいアルキニル基は３−プロパルギル基である。
【００３３】
アルコキシ基は好ましくは１〜６個の炭素原子を含有し、酸素原子を介して部分の残部に結合している。アルコキシ基の中に含有されるアルキル基について、アルキル基についてと同様な考察が適用される。最も好ましいアルコキシ基はメトキシ基である。
【００３４】
「アリール」および「ヘテロアリール」（またはヘテロ芳香族）は、物理的および化学的性質が類似する化合物を有する少なくとも１つの環を含んでなる炭素環式または複素環式基、例えば、５〜６個の環原子および４〜２０個の炭素原子、通常４〜９または４〜１２個の炭素原子を有する芳香族基を意味し、ここで１〜３個の環原子はＮ、ＳまたはＯであり、ただし隣接する環原子はＯ−Ｏ、Ｓ−Ｓ、Ｏ−ＳまたはＳ−Ｏではない。アリールおよびヘテロアリールは下記のものを包含する：フェニル、２−、４−および５−ピリミジニル、２−、４−および５−チアゾイル、２−ｓ−トリアジニル、２−、４−イミダゾイル、２−、４−および５−オキサゾリル、２−、４−および４−ピリジル、２−および３−チエニル、２−および３−フラニル、２−および３−ピロリル、必要に応じて好ましくは環Ｃ上で酸素、１〜４個の炭素原子のアルキルを代表するハロゲンにより置換されている。
【００３５】
ヘテロアリール基は、また、１〜４個の炭素原子のアルキルまたは１〜４個の炭素原子および１〜４個のハロゲン原子のハロアルキルによる環Ｎ上の任意の置換を含む。アリールまたはヘテロアリール基上の典型的な置換基は、メチル、エチル、トリフルオロメチルおよびブロモを包含する。このような置換されたアリールまたはヘテロアリール基は、ベンジルおよびその他を包含する。「ヘテロアリール」は、また、２またはそれ以上の環を有する系を意味し、二環式部分、例えば、ベンズイミダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾキサゾール、およびインドールを包含する。アリール基はフェニルまたはナフチル部分であり、これらは置換されていないか、あるいは下記の置換基の一または２以上により置換されている：−アミノ、−シアノ、−アミノアルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、スルホニル、スルフェニル、スルフィニル、ニトロおよびニトロソ。
【００３６】
最も好ましいアリール基はフェニル基である。好ましくはアリールアルキル基はベンジル基である。好ましくはアルキルアミノ基はエチルアミノ基である。好ましい−ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基はアルキル部分の中に１つまたは２つの炭素原子を含有する（メチルまたはエチルエステル）。他のアリール基はヘテロアリール基、例えば、ピリミジン、プリン、ピロール、またはピラゾールである。アリールおよびヘテロアリール。本発明によれば、用語アリールはまたすべてのヘテロアリールを包含する。
【００３７】
アリールオキシ基は好ましくは６〜２０個の炭素原子を含有する。それらの炭素原子は１または２以上の芳香族環の中に、および芳香族部分に結合された側鎖（例えば、アルキル鎖）の中に含有される。好ましいアリールオキシ基はフェノキシおよびベンゾキシ基である。
【００３８】
「保護基」は、官能部分（例えば、ヒドロキシル基中の酸素またはアミノ基中の窒素）に結合して、官能基が望ましくない方法で反応するのを防止する化学的基である。さらに、保護基は形成される分子の生物学的活性、ここで核酸に対する核酸結合性化合物の結合、を破壊しないで除去できるという事実により、保護基は定義される。適当な保護基は当業者に知られている。例えば、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端におけるヒドロキシル基のために、特に好ましい保護基は、トリチル基、例えば、ジメトキシトリチル基から選択される。式Ｉ中の環外アミノ基における好ましい保護基はアシル基、最も好ましくはベンゾイル基（Ｂｚ）、フェノキシアセチルまたはアセチルまたはホルミル、およびアミジン保護基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジアルキルホルムアミジン基、好ましくはジメチル−、ジイソブチル−、ジイソブチリル−およびジ−ｎ−ブチルホルムアミジン基から選択される。
【００３９】
好ましいＯ−保護基はアロイル基、ジフェニルカルバモイル基、アシル基、およびシリル基である。これらの最も好ましい例はベンゾイル基である。好ましいシリル基はトリアルキルシリル基、例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリルおよび第三級ブチル−ジメチル−シリルである。他の好ましいシリル基はトリメチルシリル−オキシ−メチル基（ＴＯＭ）である（スイス国特許出願０１９３１／９７）。さらに、好ましい保護基はオルトニトロ−ベンジル保護基、例えば、２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）または光活性化合物、例えば、２−ニトロフェニルプロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）のような基である（Ｇｉｅｇｒｉｃｈ他、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８、１７、１９８７）。本発明によれば、フタロイル基を使用することもできる。
【００４０】
本発明において表される式の範囲内の定義中の任意の原子は特定のアイソトープに限定されない。こうして、リン原子（Ｐ）は正規の３１Ｐまたは放射性３２Ｐまたはそれらの混合物であることができる。同一のことが水素（Ｈ／Ｄ／Ｔ）、炭素（Ｃ）、ヨウ素（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）および窒素（Ｎ）に適用される。
【００４１】
化学的合成の間に、任意の反応性基、例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレン、−ＮＨ−アリール （リポーター基中のそれらの基を包含する）は適当な保護基で保護すべきである、すなわち、本発明は式または置換基が選択されるオリゴヌクレオチドの合成用化合物を包含し、ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレン、−ＮＨ−アリール基中の１つまたは２つのハロゲン原子は保護基により置換されている。さらに、化学的合成の間に、化合物は便宜上固相に取り付けられるであろう。これらの場合において、前述の置換基の定義をそれに応じて選択する。
【００４２】
リポーター基は、一般に、核酸結合性化合物およびそれに結合した核酸を液体、すなわち、試料の残部から区別可能とする基である（リポーター基を結合して有する核酸結合性化合物はまた標識化された核酸結合性化合物、標識化されたプローブまたはちょうどプローブと命名することができる）。用語リポーター基および特定の態様は好ましくはリンカーを包含し、ここでリンカーは使用することを意図する部分（実際の固相または発蛍光団部分）をリポーター基として結合位置に接続するために使用される。リンカーは、固相による主要な妨害を与えないで、測定すべき核酸配列に核酸結合性化合物を結合させることができるという融通性を提供するであろう。同様に、特に疎水性ではないもの、例えば、連続的エチレンオキシ単位に基づくもの、例えば、ＤＥ ３９４３５２２に開示されているものはこの分野において知られている。
【００４３】
「アレイ」とは、装置上の処理可能な位置の配置を意味する。位置は二次元のアレイ、三次元のアレイ、または他のマトリックスの形態で配置することができる。位置の数は小さい数から数百万の範囲であることができる。最も重要なことには、各位置は完全に独立の部位を表す。各位置は核酸結合性化合物を保持し、核酸結合性化合物は第２核酸結合性化合物、核酸、特にターゲット核酸のための結合相手として働くことができる。
【００４４】
用語「構築ブロック」または「サブユニット」は、オリゴヌクレオチド合成において使用できる化合物を意味し、ここで引き続いて単一の構築ブロックは化学的に結合して、いっそう複雑な構造、すなわち、オリゴヌクレオチド前駆体を形成する。構築ブロックの例はホスホルアミダイトまたはホスホネートである。
用語「置換された化合物」は、化合物が化合物それ自体以外のそれ以上の化学的基、部分または置換基を保持することを意味する。これらの置換基は原理的には下記のものを包含するが、これらに限定されない：ハロゲンまたはアルキル、アルケニルまたはアルキニル化合物、これらはそれ以上の異種原子置換されていてもよい。
【００４５】
発明の説明
前述の問題は、７−置換８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノ−プリンが組込まれた核酸結合性化合物、これらのオリゴヌクレオチドおよび合成に有用な化合物を開示する本発明の発見により解決することができる。さらに、本発明は、本発明による化合物を使用することができる方法を開示する。
【００４６】
驚くべきことには、アデニン残基の代わりに組込まれた７−ヨードまたは７−ブロモ−８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノ−プリンを有するオリゴヌクレオチドは、溶融温度の予期されざる増加を示す。この発見は５−ハロゲン置換ピリミジンの挙動と対照的である。この効果は平行デュプレックスならびに逆平行デュプレックスについて観測された。これらの発見は技術水準に基づいて予測することができないが、驚くべき発見は、疎水性残基（ハロゲン置換基は疎水性である）で７位（プリンのナンバリング）において置換された、あるいは７位に結合した疎水性部分を含有する残基で置換された、他の８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノ−プリンに対して一般化することができる。さらに、これらの教示は電子求引性置換基に対して一般化することができる。
【００４７】
したがって、この位置において好ましい他の置換基、例えば、アルキル、アルケニルおよびアルキニル、好ましくは６個の炭素原子の長さ、より好ましくは３個の炭素原子の長さを有する置換基は本発明において適する。７位は置換基をＤＮＡの主要な溝の中にエクステンションさせ、ここで置換基は十分な空間を見出し、ＤＮＡ二重らせんを混乱させない。この効果について可能な説明は、主要な溝からの水の除去、および同時の主要な溝の疎水性化、これによるＤＮＡ塩基のスタッキングの増加である。これらの必要条件を満足する置換基は、また、他の官能基、例えば、リポーター基を保持することができる。
【００４８】
要約すると、本発明は、７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリン塩基を含んでなる核酸結合性化合物、このような化合物の製造に有用な化合物、それらの種々の使用および診断分野においてこのような化合物を使用して核酸を決定する方法を開示する。
本発明の主題は、複素環式基が一般式Ｉの基であることを特徴とする、核塩基に対して塩基対合することができる結合した複素環式基を有する主鎖を含んでなる核酸結合性化合物およびそれらの任意の塩である：
【００４９】
【化３１】
2004505988.tif 000003
【００５０】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
【００５１】
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【００５２】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【００５３】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【００５４】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【００５５】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【００５６】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置である。
【００５７】
本発明による核酸結合性化合物が結合することができる核塩基は、天然に存在する核塩基、例えば、アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンまたはそれらの２’−デソキシ誘導体、または天然に存在しない核塩基、例えば、本発明による複素環式基を有する核塩基であることができ、複素環式基の例はピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンまたはピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそれらのアナローグ、好ましくはグアニンまたはアデニンの前記アナローグまたは７−デアザ−グアニンである。他の非天然複素環式基はこの分野において知られており、そしてここにおいて明白に説明しない。
【００５８】
好ましい態様において、本発明は、上に定義した一般式Ｉおよび残基Ｒ２およびＲ３を有する核酸結合性化合物に関する。これらの核酸結合性化合物は７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンの７位に電子求引性または疎水性置換基を有する。したがって、好ましくは複素環式基置換基に加えて、７位における他の好ましい置換基は特質が疎水性であり、例えば、アルキル、アルケニルおよびアルキニル残基である。しかしながら、主要な溝の中にエクステンションする第１残基が疎水性である場合、それは十分である。詳細には、７位における他の好ましい置換基は下記の残基である：
【００５９】
（１）　（５）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（２）　（５）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（３）　（５）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（４）　（５）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（５）　置換基（１）〜（４） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【００６０】
置換基（１）〜（４）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（１）〜（３）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない。
より好ましくは、残基（１）は１〜６個の炭素原子の長さ、より好ましくは１〜３個の炭素原子の長さを有し、そして残基（２）および（３）は２〜６個の炭素原子の長さ、より好ましくは２〜３個の炭素原子の長さを有する。
【００６１】
最も好ましい態様において、複素環式基は７−ブロモ−７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたは７−ヨード−７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンである。さらに、極めて酸不安定性グリコシド結合を有し、特定の条件を使用する場合においてのみオリゴヌクレオチド合成において使用できる２−アミノ−アデノシンに比較して、本発明による核酸結合性化合物は非常に安定なグリコシド結合を有するという利点を有する。本発明のそれ以上の態様において、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンの７位におけるハロゲン化物は擬ハロゲン化物、例えば、−ＳＣＮまたは−ＣＮで置換することができる。
前述の好ましい置換基は、また、本発明による方法および使用において好ましい。
【００６２】
一般式Ｉの複素環式基は主として下記の性質により特徴づけられる：
−　塩基は９位（プリンのナンバリング）を介して主鎖に、好ましくは糖部分に結合している。
−　塩基は他の核酸構成成分とスタッキング相互作用を形成することができる芳香族π−電子系を含有する。
−　塩基は特質ヌクレオシドＴに対する水素結合のための１または２以上のドナーおよび／またはアクセプター部位を含有する。
【００６３】
核酸結合性化合物におけるＴｍを増加させるために、測定すべき核酸におけるＴに対して相補的な１または２以上のＡを本発明による複素環式基で置換することができる。次いでオリゴヌクレオチドは、Ｇ−Ｃ塩基対の順序で結合エネルギーで、しかしＡ−Ｔよりも高い安定性で、本発明による塩基と反対にＴを含有するターゲット配列に特異的に結合するであろう。これは逆平行または平行のデュプレックスについて等しく十分に働き、それによって天然Ａ−Ｔ塩基対は平行または逆平行のデュプレックスに結合する等しい能力を有するが、平行デュプレックスにおいて結合エネルギーはより低い。
【００６４】
しかしながら、本発明による複素環式基は、核酸結合性化合物の中に組込まれるとき、平行または逆平行のデュプレックスにおいて反対の鎖中のＴに等しく十分に結合するであろう。デュプレックスにおいて逆平行の結合を行うために、逆平行デュプレックス中で通常Ｇ−Ｃ塩基対を形成する天然ＧまたはＣ塩基を前述したように非天然塩基対、例えば、Ｇ−ｉＣ（イソシトシン）またはよりすぐれたＧ−ｍｅｉＣ（メチル化イソシトシン）またはＣ−ｉＧ（イソグアノシン）で置換しなくてはならない。平行デュプレックスおよび逆平行デュプレックスの要約はＥＰ ０ ６２４ １６１またはＳｅｅｌａ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５５（１９９９）、９４８１−９５００）の中に見出され、そして実施例４中のスキーム１１および１２の中に概略的に示されている。
【００６５】
この一般的原理はもちろん限定されない。なぜなら、６員環において同一の特性を示す塩基は本発明による構造を含有するために前述の説明に基づいて同一の性質を有するからである。特に、塩基対合に参加する部分から複素環式基の部分が遠くなるほど、オリゴマーは化学的構造の修飾、例えば、複素環式基のこの部分への基の結合に対する許容性が大きくなる。下記において、本発明の複素環式基について言及するとき、一般式Ｉに従う複素環式基について言及する。
【００６６】
また、本発明は、式Ｉの複素環式基の互変異性体の形態および塩を包含する。
本発明による核酸結合性化合物は好ましくは１００サブユニットより小さい長さ、より好ましくは１０〜３０サブユニットの長さを有する。核酸結合性化合物として活性であるために、結合すべき核酸における複素環式基に対する水素結合が、塩基対合により、例えば、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合により可能であるように、置換基を選択すべきである。置換基がこのような好ましい水素結合を可能としない化合物は、核酸結合性化合物を製造するための中間体として有用であることがある。本発明の好ましい核酸結合性化合物は、化学的に合成された化合物である。
【００６７】
核酸結合性化合物は、それが測定すべき核酸または平行または逆平行のデュプレックスの形成に依存して塩基対合により結合させることを意図する核酸に対して実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含有するように構築される。それらの核酸は通常少なくとも１つの天然に存在する核塩基、Ａｄｅ、Ｃｙｔ、ＧｕａおよびＵｒａを含有するので、本発明による核酸結合性化合物もまたそれらの４つの塩基のいずれかを含有するであろう。しかしながら、本発明によれば、複素環式基の少なくとも１つは式Ｉの少なくとも１つにより置換される。
【００６８】
核酸結合性化合物を核酸の測定用プローブとして使用するか、あるいは化合物または核酸のいずれか他の同定を意図する場合、置換基のいずれかをリポーター基を含有するように選択する。核酸結合性化合物を十分に標識するために有効である数のリポーター基を結合させることができるが、プローブがハイブリダイゼーションアッセイにおいて有効でないように、核酸の認識、核酸に対するアフィニティーおよび溶解度が影響を受けないように、制限された数のリポーター基のみを単一のサブユニットに結合させることが好ましい。非常に好ましい場合において、わずかに１〜４、より好ましくは１または２、最も好ましくはただ１つのリポーター基が各核酸結合性化合物の中に存在するであろう。プローブに結合した２以上のリポーター基を必要とする核酸測定用フォーマットが存在する。このようなフォーマットの１例はＷＯ ９２／０２６３８に開示されている。この場合において、リポーター基の１つは蛍光放射体であるが、他方は蛍光クエンチャーである。
【００６９】
また、リポーター基を式Ｉに従わない複素環式塩基に結合することができる。
本発明の好ましい態様において、Ｒ１はアルキニル−アミノ−Ｃ≡Ｃ−Ｅ−ＮＲ５Ｒ６、アルケニル−アミノ−Ｃ＝Ｃ−Ｅ−ＮＲ５Ｒ６および−Ｅ−ＮＲ５Ｒ６であり、ここでＥは−［（ＣＨ２）ｒＦ］ｓ−（ＣＨ２）ｒ−であり、ここでＦ＝ＯまたはＳそしてｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数であり、ここでＲ５およびＲ６は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、Ｒ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である。
【００７０】
リポーター基は一般に核酸結合性化合物ならびにそれに結合した核酸を液体、例えば、試料の残部と区別可能とする基である（結合したリポーター基を有する核酸結合性化合物もまた標識化された核酸結合性化合物、標識化されたプローブまたはちょうどプローブと命名することができる）。この区別は直接的または間接的に検出可能な基から、または固定化されたまたは固定化可能な基から選択することによって実施することができる。直接検出可能な基は例えば蛍光性化合物、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、例えば、ヘキサクロロフルオレセインおよびヘキサフルオロフルオレセイン、ローダミン、プソラレン、スクアレン、ポルフィリン、蛍光性粒子、生物発光性化合物、例えば、アクリジニウムエステルおよびルミノール、またはシアニン色素、例えば、Ｃｙ−５である。このような化合物の例はＥＰ ０ ６８０ ９６９に開示されている。
【００７１】
さらに、スピン標識、例えば、ＴＥＭＰＯ、電気化学的に検出可能な基、フェロセン、ビオローゲン、重金属キレートおよび電気化学発光性標識、例えば、ルテニウムビスピリジル錯体、およびナフトキノン、クエンチャー色素、例えば、ダビシル、およびヌクレアーゼ活性錯体、例えば、ＦｅおよびＣｕは有用な検出可能な基である。このような化合物の他の例はユーロピウム錯体である。間接的に検出可能な基は、直接的または間接的に標識化される他の部分により認識されることができる基である。このような間接的に検出可能な基の例は、ハプテン、例えば、ジゴキシゲニンまたはビオチンである。例えば、ジゴキシゲニンはジゴキシゲニンに対する抗体により認識されることができる。それらの抗体は直接標識化することができるか、あるいは（ジゴキシゲニン）に対して向けられた標識化抗体により認識されることができる。
【００７２】
ジゴキシゲニンの認識をベースとするフォーマットはＥＰ−Ｂ−０ ３２４ ４７４に開示されている。ビオチンはアビジンおよび同様な化合物、例えば、ストレプトアビジンおよび他のビオチン結合性化合物により認識されることができる。再び、それらの化合物は直接的または間接的に標識化することができる。それ以上の重要な標識は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）または走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）により直接検出可能なものである。さらに、リポーター基は試料中の他のヌクレオチド配列を妨害しないヌクレオチド配列であることができる。したがって、配列は相補的配列を含有するヌクレオチドにより特異的に認識されることができる。このヌクレオチド配列は直接的または間接的に標識化することができるか、あるいは固定化可能であるか、あるいは固定化することができる。さらに、リポーター基は固相であることができる。
【００７３】
核酸結合性化合物と固相との結合は、検出可能な基について上に指摘したように直接的または間接的であることができる。このような固相の例はラテックスビーズまたは金粒子である。本発明の態様において、核酸結合性化合物に結合したそれ以上のリポーター基は任意の正に帯電したまたは負に帯電した基、好ましくはカルボキシレートまたはアンモニウムＮ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２であることができ、ここで置換基は前述の式Ｉにおいて特定した通りである。これらは、例えば、プロパギレンリンカーを介して塩基に結合させることができ、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の感度（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリックス補助レーザー脱着／イオン化飛行時間）を積極的または消極的モードで増強することができる。アンモニウム基の置換基は好ましくは後標識化を介してオリゴヌクレオチドの中に導入することができる、すなわち、適当な反応性基、例えば、フタロイル基でオリゴヌクレオチド合成前駆体中において保護されたアミノ基がオリゴヌクレオチド合成間に導入されるとき、結合性化合物をリポーター基で後標識化することができる。
【００７４】
直接的標識化は、核酸結合性化合物を固相上の反応性基に共有結合させることによって、すなわち、好ましくはリンカーを介して、実施することができる。間接的標識化は検出可能な基するための上に開示したように実施することができる。好ましくは、間接的取り付けは非共有結合的に生物特異的相互作用、例えば、ハプテン−抗体、ビタミン−レセプターおよび核酸−相補的核酸により達成される。再び、それらの相互作用および核酸アッセイにおけるそれらの使用はこの分野において知られている。
【００７５】
本発明によるプローブの固定化に有効である固相は、好ましくはポリスチレン、ポリエチレン、プロピレン、ガラス、ＳｉＯ２およびＴｉＯ２から成る群から選択される。このような固相のフォーマットはアッセイの計装およびフォーマットの必要性に従い選択することができる。例えば、固相はビーズまたは容器の形態であることができる。
【００７６】
最も普及されている主鎖は、リボヌクレオシド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含有する核酸の天然に存在する糖ホスフェート主鎖である。したがって、好ましい態様において、核酸結合性化合物の主鎖はホスホジエステル結合およびリボースを含んでなる。過去数年において、オリゴヌクレオチドと同様な性質を有するが、それらの主鎖が異なり、天然に存在するホスホジエステルリボース主鎖と対照的に化学的に結合性天然に存在するヌクレオチド天然に存在するいずれかまたはすべてのから形成された構造を有する、核酸結合性化合物が記載されてきている。
【００７７】
したがって、核酸結合性化合物の主鎖が厳密な意味においてオリゴヌクレオチドでない、すなわち、それが修飾される構造を有する場合でさえ、本発明は有効であることが明らかである。主鎖は、例えば、ホスホルチオエート、メチルホスホルチオエート、ホスホルアミデートおよびホスホルトリエステル結合を含む。主鎖の修飾は核酸結合性化合物の性質を変化させる、すなわち、それは安定性およびアフィニティーを増強させることができる。したがって、好ましい態様において、核酸結合性化合物は、主鎖が一般式ＩＩの１または２以上の部分を含んでなる化合物またはそれらの任意の塩である：
【００７８】
【化３２】
2004505988.tif 000004
【００７９】
式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｎ−ＣＯ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルから成る群から選択され、
Ｌはオキシ、スルファンジイル、−ＣＨ２−および−ＮＲ２２−から成る群から選択され、
Ｔはオキソ、チオキソおよびセレノキソから成る群から選択され、
Ｕは−ＯＨ、Ｏ−、−Ｏ−リポーター基、−ＳＨ、−Ｓ−リポーター基、−ＳｅＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−ＮＲ２３Ｒ２４、および−（−Ｏ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル）ｎ−Ｒ２５から成る群から選択され、ここでｎは１〜６の任意の整数であることができるか、あるいは−ＮＲ２３Ｒ２４はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環であることができ、
Ｖはオキシ、スルファンジイル、−ＣＨ２−および−ＮＲ２２から成る群から選択され、
【００８０】
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−Ｏ−アリル、−Ｏ−アルキニル、およびＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルから成る群から独立して選択され、
Ｒ２３およびＲ２４は−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ２）ｃ］ｄ−ＮＲ２６Ｒ２７およびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【００８１】
Ｒ２５は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＯ （Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよびリポーター基から成る群から選択され、
Ｒ２６およびＲ２７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数であり、そして
Ｂは式Ｉの部分であり、
【００８２】
【化３３】
2004505988.tif 000005
【００８３】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　ニトロ、
（３）　シアノ、
（４）　−ＣＯＯ−
（５）　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【００８４】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【００８５】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【００８６】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【００８７】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【００８８】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【００８９】
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置である。
式Ｉにおいて定義した好ましい基は、特記しない限り、式ＩＩおよび下記の式に適用される。
【００９０】
好ましくは、式ＩＩの化合物において、Ｒ１４は水素である。Ｌの好ましい定義はオキシである。Ｕの好ましい定義は−ＯＨおよび−Ｏ−リポーター基である。Ｖの好ましい定義はオキシである。ｃの好ましい定義は２〜４の整数であり、そしてｄのそれは０〜２である。式ＩＩの化合物は、核酸結合性化合物の統合された部分（好ましくは末端の１つにおいてではない）として本発明の複素環式部分を含有するために特に適する。基ＮＲ２３Ｒ２４は好ましくはジアルキルアミノ基から成る群から選択される。この基が一緒になって５〜６員環を形成する場合において、それは好ましくはモルホリニル、ピロリジニルまたはピペリジニルである。
【００９１】
それ以上の好ましい態様において、糖立体配置はα−Ｄ−、β−Ｄ−、α−Ｌ−およびβ−Ｌ−立体配置から成る群から選択され、最も好ましくは化合物は少なくとも１つの２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル部分または１つのβ−Ｄ−リボフラノシル部分を含有する。本発明の好ましい態様において、Ｄは本発明による化合物の糖部分のグリコシドＣ−１である。
【００９２】
本発明の他の態様において、糖はロックされたコンフォメーションである。ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）は核酸アナローグの新規なクラスである。ＬＮＡはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合ルールに従い、相補的オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションする。しかしながら、ＤＮＡおよび他の核酸誘導体と比較したとき、ＬＮＡは非常に改良されたハイブリダイゼーション性能を提供する。ＬＮＡ／ＤＮＡまたはＬＮＡ／ＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡにより形成された同様なデュプレックスよりも非常にいっそう熱的に安定である。事実、ＬＮＡはこれまで報告された相補的ＤＮＡおよびＲＮＡに対して最高のアフィニティーを有する。一般に、ＬＮＡ／ＤＮＡデュプレックスの熱安定性はオリゴ中の修飾された塩基当たり３ ℃〜８ ℃増加する。
【００９３】
一般的分子生物学および分子診断の分野内において、ＬＮＡの応用の主要な５つの分野は同定され、これらは捕捉プローブ、試料調製、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）の検出、アレレ特異的ＰＣＲ、およびハイブリダイゼーションプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、Ｔａｑｍａｎプローブ（ＷＯ ９２／０２６３８および対応する米国特許第５，２１０，０１５号、米国特許第５，８０４，３７５号、米国特許第５，４８７，９７２号）およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションするためのプローブである。大部分の面において、ＬＡＮはＤＮＡと同様に取扱われる。ＬＡＮは少なくともＤＮＡのように安定であり、水性緩衝液中に可溶性である。ＬＡＮはエタノール沈降させ、乾燥し、再懸濁させることができ、そしてゲル、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ上で分析することができる。
【００９４】
ＬＡＮは新規な核酸アナローグであり、遺伝情報をプロービングしかつ評価する診断アッセイばかりでなく、かつまたアンチセンスおよび他の遺伝的医療のアプローチの性能を劇的に増加させることができる。これらのアナローグは、ちょうど天然の対応物と同様に大部分の応用において利用することができ、ハイブリダイゼーションのために大部分の産生的コンフォメーション中に核酸をロックする。遺伝的プローブのハイブリダイゼーション、または相補的ドッキングは、診断において遺伝情報を評価する主要な形態である。ＬＮＡの広範な種類の応用が開発されてきており、個々の遺伝子における特定の疾患を引き起こす単一塩基の突然変異を検出することができる、多数の典型的な感受性かつ特異的アッセイを包含する。
【００９５】
我々の遺伝子における小さい変動であり、疾患の素因を引き起こすことがあるＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）の検出において、わずかに８ヌクレオチドの捕捉プローブが非常に長い慣用核酸捕捉プローブよりも試料中の突然変異した遺伝子と野生型遺伝子とをいっそう効果的に識別させることができることを示すデータが存在する。したがって、本発明は、また、例えば、糖部分の少なくとも１つの原子、例えば、炭素原子または酸素原子が少なくとも１つの原子を含有する少なくとも１つの架橋部分を介して糖部分の少なくとも１つの他の原子に結合されており、それによりコンフォメーション的に拘束された糖が上に概説したように形成されている、本発明による化合物を包含する。
【００９６】
本発明による化合物の合成について、下記の文献を参照のこと：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｐａｒｔ １、編者Ｌ． Ｂ． Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）、Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｕｒｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ｐｐ． １１３−２８１または米国特許第５，５９４，１２１号。しかしながら、いっそう情報は以下において提供される。
【００９７】
核酸結合性化合物の主鎖において、種々の化学的構造を使用することができる。当業者は核酸結合性化合物がまた修飾された３’末端を有することができるという事実を認識する。したがって、本発明の好ましい主題は、主鎖が一般式ＩＩＩの１または２以上の部分を含んでなり、ｔが０または１である、上に概説した核酸結合性化合物またはそれらの任意の塩である：
【００９８】
【化３４】
2004505988.tif 000006
【００９９】
式中、
ｔ＝１である場合、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
Ｍはオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−から成る群から選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基およびリポーター基から成る群から選択され、
【０１００】
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アリル、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−（Ｏ−ＣＨ２）ｎ−（ここでｎは１〜１８の整数であることができる）、−ハロゲン、−アジド、ＳＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相および−ＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ１５は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、固相および式ＩＶの基から成る群から選択され、
【０１０１】
【化３５】
2004505988.tif 000007
【０１０２】
式中、
Ｔはオキソ、チオキソおよびセレノキソから成る群から選択され、
Ｕは−ＯＨ、Ｏ−、−Ｏ−リポーター基、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−ＮＲ２３Ｒ２４、および−（−Ｏ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル）ｎ−Ｒ２５から成る群から選択され、ここでｎは１〜６の任意の整数であることができるか、あるいはＮＲ２３Ｒ２４はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環であることができ、
Ｒ２３およびＲ２４は−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ２）ｃ］ｄ−ＮＲ２６Ｒ２７から成る群から独立して選択され、
【０１０３】
Ｒ２５は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＯ （Ｃ１−Ｃ４）−アルキルから成る群から選択され、
Ｒ２６およびＲ２７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から独立して選択され、
Ｒ２９は−ＯＲ３０および−ＳＲ３０から成る群から選択され、
Ｒ３０は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、保護基、固相およびリポーター基から成る群から選択され、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数であり、そして
Ｂは式Ｉの部分であり、
【０１０４】
【化３６】
2004505988.tif 000008
【０１０５】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　ニトロ、
（３）　シアノ、
（４）　−ＣＯＯ−
（５）　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０１０６】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【０１０７】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０１０８】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０１０９】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０１１０】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、そして
ｔ＝０である場合において、Ｒ１５は−Ｈである。
【０１１１】
定義および好ましさについて、特記しない限り、事項は式Ｉおよび式ＩＩにおける置換基について概説したように、式ＩＩＩに適用される。好ましい態様において、３’末端は２’，３’−ジデソキシリボース、すなわち、ここでｔ＝０、Ｒ１５はであり、そしてＲ１４は−Ｈである、またはそのアナローグを有する。本発明による核酸結合性化合物を、天然にも存在するトリホスフェート化合物でエクステンションするとき、酵素的停止が必要である場合、これは重要である。天然に存在するトリホスフェート化合物は、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンまたはチミジンのトリホスフェート、またはアデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンまたはチミジンのトリホスフェートのデソキシ誘導体である。しかしながら、本発明は、また、式ＶＩＩＩを有する本発明によるトリホスフェート化合物で天然に存在するヌクレオチドのみまたは本発明による核酸結合性化合物を含有するプライマーをエクステンションすることに関する。
【０１１２】
式Ｉ天然に存在する基が化合物の３’末端におけるサブユニット、例えば、ヌクレオチドに結合している核酸結合性化合物は、より長い化合物の合成用出発化合物としておよび／または末端標識化プローブとして有効である。プローブの末端位置は化学的部分の結合にかんがみて最も許容性であるので、このグループの化合物は特に好ましい。
核酸結合性化合物の３’末端に対する修飾にかんがみて、核酸結合性化合物の５’末端もまた修飾することができることが明らかである。したがって、本発明の他の好ましい主題は、式Ｖの主鎖部分を含んでなる上に概説した核酸結合性化合物およびそれらの任意の塩である：
【０１１３】
【化３７】
2004505988.tif 000009
【０１１４】
式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
Ｍ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、保護基、リポーター基および−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルから成る群から独立して選択され、
【０１１５】
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相およびＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ１６は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基または式ＩＶの化合物から成る群から選択され、
【０１１６】
【化３８】
2004505988.tif 000010
【０１１７】
式中、
Ｔはオキソ、チオキソおよびセレノキソから成る群から選択され、
Ｕは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−ＮＲ２３Ｒ２４、および−（−Ｏ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル）ｎ−Ｒ２５から成る群から選択され、ここでｎは１〜６の任意の整数であることができるか、あるいはＮＲ２３Ｒ２４はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環であることができ、
【０１１８】
Ｒ２３およびＲ２４は−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アリール、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ２）ｃ］ｄ−ＮＲ２６Ｒ２７から成る群から独立して選択され、
Ｒ２５は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２および−ＣＯＯ （Ｃ１−Ｃ４）−アルキルから成る群から選択され、
Ｒ２６およびＲ２７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、および−（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から独立して選択され、
Ｒ２９は−ＯＲ３０および−ＳＲ３０から成る群から選択され、
Ｒ３０は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、保護基、固相およびリポーター基から成る群から選択され、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数であり、そして
Ｂは式Ｉの部分であり、
【０１１９】
【化３９】
2004505988.tif 000011
【０１２０】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　ニトロ、
（３）　シアノ、
（４）　−ＣＯＯ−
（５）　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０１２１】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【０１２２】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０１２３】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　 −Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０１２４】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０１２５】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０１２６】
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置である。
非常に好ましい化合物は、Ｍ’がＯであり、Ｒ１６がＨであり、そしてＲ１４が水素およびヒドロキシルから選択される、式Ｖの化合物である。
それらの化合物は、例えば、５’末端で標識化されたプローブとして使用することができる。置換基の定義に関すると、特記しない限り、前述の定義が適用される。
【０１２７】
核酸結合性化合物の主鎖は、化合物が相補的配列を有する核酸に結合することができるように、塩基対合複素環を保持する機能を有する。好ましくは、天然に存在する塩基における相補性の程度は、結合すべき核酸領域において同一長さのストレッチに比較して、結合を実施する領域における塩基のストレッチにおいて７０％から１００％までの範囲であろう。したがって、各配列におけるサブユニットの欠失および挿入は、この計算において、次の適合塩基までギャップとしてカウントされ、こうして含有されるギャップと同数だけ相補性を減少させる。
好ましくは主鎖は糖−ホスフェート部分を含有する。これらから、デオキシ糖を含有する主鎖はさらに好ましい。
【０１２８】
本発明の部分を包含する、相補的配列の核酸に対して塩基対合することができる部分を保持する主鎖中の各部分はサブユニットと呼ばれる。
異なる種類のサブユニットの主鎖混合物を有する化合物は知られている。最近、新しい種類の非天然核酸結合性化合物が記載された。それらはサブユニット間の少なくとも１つのペプチド結合を含有するので、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と命名された（ＷＯ ９２／２０７０２）。本発明の核酸結合性化合物は任意の長さを有することができる。しかしながら、化学的合成の好都合性のために、１００より小さい、より好ましくは１０〜３０サブユニットの長さの化合物、例えば、ヌクレオシドは好ましい。
【０１２９】
本発明による複素環式基および他のアナローグを使用する、本発明による核酸結合性化合物、例えば、プローブとして使用する化合物と、第２核酸結合性化合物との間で形成されたデュプレックスの熱安定性（Ｔｍ）を変更すると、デュプレックスの安定性およびミスマッチの識別を最適化することができる（例えば、下記文献を参照のこと、Ｋｗｏｋ、Ｓｈｉｒｌｅｙ；Ｃｈａｎｇ、Ｓｈｅｎｇ Ｙｕｎｇ；Ｓｎｉｎｓｋｙ、Ｊｏｈｎ Ｊ．；Ｗａｎｇ、Ａｌｉｃｅ。Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ。ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． （１９９４）、３（４）、３９−４７。Ｔｍを変更する１つの有用な面は、アデニン−チミングアニン−シトシン（Ａ−Ｔ）デュプレックスが（Ｇ−Ｃ）デュプレックスよりも低いＴｍを有するという事実から発生する。これは一部分Ａ−Ｔデュプレックスが塩基対当たり２つの水素結合を有するが、Ｇ−Ｃデュプレックスは塩基対当たり３つの水素結合を有するという事実による。
【０１３０】
例えば、塩基が不均質に分布されている、不均質オリゴヌクレオチドアレイにおいて、すべてのプローブについてハイブリダイゼーション条件を同時に最適化することは困難であることがある。こうして、ある態様において、Ｇ−Ｃに富んだデュプレックスを脱安定化しおよび／またはＡ−Ｔに富んだデュプレックスを増加させると同時に、ハイブリダイゼーションの配列特異性を維持することが望ましい。これにより、デュプレックスの溶融温度に対して各塩基対の寄与は調和または等化される。これは、例えば、プローブとして使用する核酸結合性化合物中の複素環式基の１または２以上をある種の修飾された、非標準的塩基で置換させることによって達成される。したがって、他の態様において、本発明は、式Ｉの複素環式基に加えて核酸結合性化合物は一般式Ｉの基と異なる複素環式基、すなわち、少なくとも１つの他の複素環式基をさらに含有する、本発明による核酸結合性化合物に関する。
【０１３１】
例えば、グアニン残基を７−デアザ−グアニンで置換すると、一般にデュプレックスは脱安定化するが、アデニン残基を２，６−ジアミノプリンで置換すると、デュプレックスの安定性は増強される。また、種々の他の修飾された塩基を核酸の中に組込んで、デュプレックスの安定性を増強または減少させると同時に、ハイブリダイゼーションの特異性を維持する。オリゴヌクレオチドプローブの中に６−アザピリミジンアナローグを組込むと、一般に相補的核酸に対するプローブの結合アフィニティーは減少する。多数の５−置換ピリミジンは、配列中の天然ピリミジンが置換されているハイブリッドの安定性を増加させる。
【０１３２】
例はシトシンおよびウラシルの５−ブロモ−、５−メチル−、５−プロピニル−、５−（イミダゾル−２−イル）−および５−（チアゾル−２−イル）−誘導体を包含する。好ましくは、追加の複素環式基はピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンまたはピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグ、特にアデニンまたはグアニンの前記アナローグである。本発明は、また、すべての他の複素環式基がアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンまたはチミンとして天然に存在するものである場合に関することを強調すべきである。ヌクレオシドの中に組込むために適当な多数の修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチドおよび種々の塩基は、下記を包含する、種々の製造会社から商業的に入手可能である：
【０１３３】
ＳＩＧＭＡ化学会社（ミゾリー州セントルイス）、Ｒ ＆ Ｄシステムス（ミネソタ州ミネアポリス）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （カリフォルニア州パルアルト）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． （マリーランド州ガイサーバーグ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ （Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、スイス国ブクス）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （カリフォルニア州サンディゴ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （カリフォルニア州フォスターシティー）、ならびにこの分野において知られている多数の商業的源。塩基を糖部分に結合させてヌクレオシドを形成する方法は知られている。
【０１３４】
例えば、例えば、下記の文献を参照のこと：ＬｕｋｅｖｉｃｓおよびＺａｂｌｏｃｋａ （１９９１）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｓｙｎｔｅｓｉｓ：Ｏｒｇａｎｏｓｉｌｉｃｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、英国ウェストサセックス州およびその中の参考文献。ヌクレオシドをリン酸化してヌクレオチドを生成する方法、およびヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの中に組込む方法もまた知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：Ａｇｒａｗａｌ（編者）（１９９３） Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ２０、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トウォタ、およびその中の参考文献。また、下記の文献を参照のこと：ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ、およびＳａｎｇｈｖｉおよびＣｏｏｋ、およびその中に引用された参考文献、両方共前掲。
【０１３５】
なお他の態様において、本発明は、本発明による核酸結合性化合物が３’末端において式Ｉの複素環式基に加えて一般式Ｉの基と異なる複素環式基、すなわち、少なくとも１つの他の複素環式基をさらに含有する、本発明による核酸結合性化合物に関する。好ましくは、本発明による核酸結合性化合物はピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンまたはピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグ、好ましくはグアニンまたはアデニンの前記アナローグをさらに含んでなる。
【０１３６】
本発明は、さらに、本発明による核酸結合性化合物および第２核酸結合性化合物の結合性生成物を包含し、本発明による核酸結合性化合物および第２核酸結合性化合物は平行または逆平行の向きで塩基対合により互いに結合されている。置換基が上に定義したとおりである式Ｉの複素環式基に加えて、本発明による核酸結合性化合物は他の天然核塩基または非天然核塩基、例えば、本発明による複素環式基、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンまたはピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグ、好ましくはグアニンまたはアデニンの前記アナローグまたは７−デアザ−グアニンのような複素環式基を有する核塩基を含有することができる。それ以上の非天然複素環式基はこの分野において知られている。
【０１３７】
本発明の他の態様は、リポーター基の結合により生ずる融点の減少を補償するために、リポーター基が結合されているヌクレオチドから好ましくは１〜５ヌクレオチドだけ離れて、上に定義した式Ｉの複素環式基が組込まれている、核酸結合性化合物である。なぜなら、リポーター基は、それが結合された点またはヌクレオチドに密接する核酸結合性化合物のハイブリダイゼーション効率を混乱させるからである。
【０１３８】
本発明の他の態様は、ミスマッチの識別により生ずる融点の減少を補償するために、上に定義した式Ｉの複素環式基が組込まれている、核酸結合性化合物である。この問題は下記の参考文献において論じられている：Ｋｗｏｋ、Ｓｈｉｒｌｅｙ；Ｃｈａｎｇ、Ｓｈｅｎｇ Ｙｕｎｇ；Ｓｎｉｎｓｋｙ、Ｊｏｈｎ Ｊ．；Ｗａｎｇ、Ａｌｉｃｅ。Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ。ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． （１９９４）、３（４）、３９−４７。これはウイルスサブタイプの増幅のために有効であり、ここでハイブリダイゼーションストレッチはストレッチの全長にわたって相補的塩基を含有しない。
【０１３９】
ある態様において、本発明は、保護基が−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレン、または−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子を置換する、本発明による核酸結合性化合物に関するが、本発明による核酸結合性化合物はわずかの複素環式基のみを含有するか、あるいは何もを含有しないことが好ましい。
【０１４０】
１つの特定の態様は、固体表面に結合した核酸結合性化合物のアレイの分野における核酸結合性化合物の使用であり（例えば、下記文献を参照のこと、米国特許第５，１４３，８５４号、米国特許第６，０２２，９６３号、米国特許第６，１５６，５０１号、ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９２／１００９２）、固体表面はこれらの参考文献に記載されているような性質を有し、本明細書に記載するように、または下記の文献に記載されているようにして製造することができる：ＮｉｅｍｅｙｅｒおよびＢｌｏｈｍ、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． １９９９、２８６５−２８６９。したがって、好ましい態様において、本発明は、１つの核酸結合性化合物がターゲット核酸である、核酸結合性化合物間の相互作用を分析する組成物に関する。
【０１４１】
この組成物は異なる配列を有する複数の核酸結合性化合物のアレイを含んでなり、ここで前記複数の核酸結合性化合物は既知の位置において固体状支持体に結合されておりかつ相補的核酸結合性化合物またはターゲット核酸に結合するように選択され、それによって核酸結合性化合物のみまたは核酸結合性化合物および相補的核酸結合性化合物 （またはターゲット核酸） は一緒になって主鎖を含んでなる核酸結合性化合物であり、前記主鎖は核塩基に対する塩基対合することができる結合した複素環式基を有し、ここで複素環式基は置換されたピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグである。異なる種類の支持体、例えば、非多孔質支持体または典型的なペプチド合成支持体よりも低い多孔質の他の固体状支持体が可能である；しかしながら、本発明のある種の応用について、非常に多孔質のビーズ、樹脂、または他の支持体は十分に有効であり、しばしば好ましい。
【０１４２】
１つのこのような支持体はビーズの形態の樹脂である。一般に、ビーズのサイズは１ ｎｍ〜１０ μｍの範囲であるが、１ ｍｍまでのサイズのいっそう大きい固体状支持体を時には使用することができる。特に好ましい樹脂は下記のものを包含する：Ｓａｒｉｎ樹脂 （Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、スイス国、から入手可能であるポリスチレン樹脂）；およびＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＡＣ、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＰＨＢ、またはＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＮＨ２樹脂 （ポリスチレン−ポリエチレングリコールのコポリマー、Ｒａｐｐｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ国ツビンゲン）。他の好ましい支持体は商業的に入手可能であり、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラジョラ、により記載されている。他の態様において、固体状支持体は平坦であるか、あるいは選択的に別の表面立体配置を取ることができる。
【０１４３】
例えば、固体状支持体は上昇したまたは窪んだ 領域であることができ、そこで合成を行うか、あるいは多孔質ＳｉＯ２／ガラスで被覆することができる。ある態様において、固体状支持体は適当な光吸収特性を提供するように選択されるであろう。例えば、支持体は重合したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、修飾されたシリコン、または種々のゲルまたはポリマーの任意の１つ、例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、フッ化（ポリ）ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネート、または組み合わせであることができる。他の適当な固体状支持体物質は当業者にとって容易に明らかである。好ましくは、固体状支持体の表面は反応性基を含有し、それらの反応性基はカルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオール、またはその他であることができる。
【０１４４】
より好ましくは、表面は光学的に透明であり、表面Ｓｉ−ＯＨ機能性を有し、例えば、シリカ表面上に見出される。したがって、固体状支持体がシリカ、ポリマー物質、ガラス、多孔質ガラス、ビーズ、チップ、およびスライドから成る群から選択される、組成物は特に好ましい。核酸結合性化合物のみまたは核酸結合性化合物および相補的核酸結合性化合物 （またはターゲット核酸） が本発明による核酸結合性化合物である、すなわち、それらが前述の式Ｉの複素環式基を含有する、本発明による組成物は好ましい。相補的核酸結合性化合物（またはターゲット核酸）が前述の式Ｉの複素環式基を含有する本発明によるトリホスフェートの存在下に、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応により、増幅されるとき、それらは前述の式Ｉに従う複素環式基を含有することができる。
【０１４５】
複素環式基が置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とする、核酸結合性化合物が主鎖を含んでなり、ために適当主鎖が核塩基に対して塩基対合することができる結合した複素環式基を有する、本発明による組成物は好ましい。好ましい態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグは置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体である。
【０１４６】
本発明の他の態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグはアデニンまたはグアニンのピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグまたはアデニンまたはグアニンの７−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグであり、ここでアデニンまたはグアニンのアナローグは、置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンについて後述するのと同一の置換基Ｒ１を７位にまたはＮ−置換基Ｒ２およびＲ３を保持することが好ましい。本発明の非常に好ましい態様において、置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体は一般式Ｉを有する：
【０１４７】
【化４０】
2004505988.tif 000012
【０１４８】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０１４９】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【０１５０】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０１５１】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　 −Ｈ、
（２）　 （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　 （Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０１５２】
（７）　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０１５３】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置である。
【０１５４】
非常に好ましい態様において、核酸結合性化合物は、好ましくはＲ１＝ＢｒまたはＲ１＝Ｉである、本発明による核酸結合性化合物である。５〜２０ヌクレオチド長さの核酸結合性化合物のアレイを含んでなる組成物はさらに好ましい。
本発明は、さらに、第１本発明による核酸結合性化合物または本発明による組成物と、第２核酸結合性化合物または第２本発明による核酸結合性化合物との結合性生成物に関し、ここで第１核酸結合性化合物または組成物および第２核酸結合性化合物は平行または逆平行の向きで塩基対合により互いに結合されている。
【０１５５】
本発明は、さらに、本発明による核酸結合性化合物の合成およびこれらの方法において有用な化合物に関する。本発明による核酸結合性化合物は溶液中で、好ましくは固相上で製造することができ、適当ならば自動的合成装置を使用する。適当に誘導化された支持体上に、または成長するオリゴマー鎖上に、各場合においてヌクレオチド塩基を有する、モノヌクレオチドを連続的に縮合させることによって、オリゴマーを段階的にアセンブルすることができる。選択的に、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを一緒に結合することによって、核酸結合性化合物をアセンブルすることができる［Ｓ． Ｂｅａｕｃａｇｅ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８（１２）、２２２３−２３１１、（１９９２）；およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８（２８）、６１２３−６１９４、（１９９３）］。修飾されたホスフェート架橋を有するオリゴヌクレオチドを合成するとき、これは特に好都合である。
【０１５６】
当業者に知られている方法、例えば、トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法またはホスホルアミダイト法を使用して、オリゴヌクレオチドをアセンブルする［Ｅ． Ｓｏｎｖｅａｕｘ、（１９８６）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４、２７４−３２５；Ｓ． Ｌ． Ｂｅａｕｃａｇｅ他、（１９９２）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８、２２２３−２３１１］。
本発明による化合物はオリゴヌクレオチド合成において好都合に使用することができる。なぜなら、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオシドの保護基のアンモニア加水分解は数日間を必要とする２−アミノ−アデノシンのアンモニア加水分解よりも非常に速いからである。
【０１５７】
したがって、本発明のそれ以上の主題は、活性化されたサブユニットを使用する本発明による核酸結合性化合物の化学的合成法であり、ここで前記サブユニットは式Ｉ基を含有する。最も好ましい化学的合成法はホスホルアミダイトアプローチを使用する。特に好ましい方法は 一般式ＶＩＩの活性化されたサブユニットの１または２以上の化合物を使用する。この方法は、非常に好都合でありかつ必要な試薬、例えば、式Ｉの基を含有するホスホルアミダイトは含めることが非常に容易であるという利点を有する。
したがって、本発明のそれ以上の主題は、一般式ＶＩＩの化合物およびそれらの任意の塩である：
【０１５８】
【化４１】
2004505988.tif 000013
【０１５９】
式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルの群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＲ３１、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、ＮＨＲ３１、ＳＲ３１から成る群から選択され、
【０１６０】
Ｒ３１は保護基またはリポーター基であり、
Ｒ３２およびＲ１７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールから成る群から独立して選択されるか、あるいはＮＲ３２Ｒ１７はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環を形成することができ、
Ｒ１８は−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルオキシ、置換または非置換の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、または置換または非置換の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシから成る群から選択され、ここで置換基は−ハロゲン、ｐ−ニトロアリールオキシおよび−シアノから成る群から選択される１または２以上の置換基であり、
Ｂは式Ｉの基であり、
【０１６１】
【化４２】
2004505988.tif 000014
【０１６２】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
【０１６３】
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ　−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０１６４】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
（１１）
【０１６５】
【化４３】
2004505988.tif 000015
【０１６６】
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０１６７】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
【０１６８】
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　 　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０１６９】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０１７０】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている。
【０１７１】
位置２および６におけるアミノ基およびこのような糖部分の遊離５’−ヘキシル基ために適当な保護基が導入された後、モノマーを対応するホスホネートまたはホスホルアミダイト誘導体に変換する。適当なアミノ保護基、例えば、アシル保護基の形態（例えば、イソブチリル、アセチルまたはフェノキシアセチル）をよく知られている方法に従い挿入する［Ｊ． Ｃ． Ｓｃｈｕｌｈｏｆ、Ｄ． Ｍｏｌｋｏ、Ｒ． Ｔｅｏｕｌｅ、（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５、３９７−４１６］。
【０１７２】
糖の遊離５’−ＯＨために適当な保護基の例は４，４’−ジメトキシトリチル残基であり、その挿入は同様に既知の方法に従い実施される［Ｃ． Ｂ． Ｒｅｅｓｅ（１９７８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３４、３１４３；Ｄ． Ｆｌｏｃｋｅｒｚｉ他、（１９８１）、Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ． Ｃｈｅｍ． １５６８］。このようにして保護されたモノマーを下記の文献に記載されているプロトコルに従い対応するホスホネートに変換する：Ｂ． Ｃ． Ｆｒｏｅｈｌｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４、５３９９］。シアノエチル−ホスホルアミダイト誘導体は、例えば、モノマーをクロロ−β−シアノエトキシ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスファンと水性ジクロロメタン中で反応させることによって製造することができる［Ｎ． Ｄ． Ｓｉｎｈａ他、（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２、４５３９］。
【０１７３】
本発明のそれ以上の主題は、式ＩＸの化合物およびそれらの任意の塩である：
【化４４】
2004505988.tif 000016
【０１７４】
式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルの群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＲ３１、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、ＮＨＲ３１、ＳＲ３１、またはリＯ−ポーター基から成る群から選択され、
【０１７５】
Ｒ３１は保護基またはリポーター基であり、
Ｒ３２およびＲ１７は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールから成る群から独立して選択されるか、あるいはＮＲ３２Ｒ１７はＮと一緒になって５〜６員の複素環式環を形成することができ、
Ｒ１８は−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルオキシ、置換または非置換の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、または置換または非置換の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシから成る群から選択され、ここで置換基は−ハロゲン、ｐ−ニトロアリールオキシおよび−シアノから成る群から選択される１または２以上の置換基であり、
Ｂは式Ｉの基であり、
【０１７６】
【化４５】
2004505988.tif 000017
式中、
【０１７７】
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ　−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０１７８】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
（１１）
【０１７９】
【化４６】
2004505988.tif 000018
【０１８０】
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０１８１】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　 　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０１８２】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０１８３】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている。
【０１８４】
本発明のそれ以上の主題は、式Ｘの化合物およびそれらの任意の塩である：
【化４７】
2004505988.tif 000019
【０１８５】
式中、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈおよび−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルの群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＲ３１、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、ＮＨＲ３１、ＳＲ３１、またはリＯ−ポーター基から成る群から選択され、
Ｒ３１は保護基またはリポーター基であり、
Ｂは式Ｉの基であり、
【０１８６】
【化４８】
2004505988.tif 000020
【０１８７】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ　−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０１８８】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
（１１）
【０１８９】
【化４９】
2004505988.tif 000021
【０１９０】
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０１９１】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０１９２】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０１９３】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている。これらの化合物は前述の核酸結合性化合物およびそれらの前駆体の化学的合成において有用である。
【０１９４】
長いオリゴマーおよび天然主鎖をベースとするオリゴマーにいっそう適する他のオプションにおいて、オリゴマーは酵素的に製造される。この場合において、出発オリゴマーをポリメラーゼおよびトリホスフェートまたは修飾されたトリホスフェートと反応させて、モノホスフェートまたは修飾されたモノホスフェートをオリゴマーの末端に結合させ、こうしてオリゴマーを伸長させる。また、この方法のために、当業者はいくつかの可能なフォーマット、例えば、ニックトランスレーションのアプローチ、または簡単なプライマーエクステンションを知っているであろう（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）。
【０１９５】
したがって、本発明のそれ以上の主題は、プライマーのエクステンション用鋳型として核酸を使用して、トリホスフェートサブユニットをプライマーと反応させることを含んでなる本発明による核酸結合性化合物を酵素的に合成する方法であり、ここでトリホスフェートのサブユニットは式Ｉの複素環式基を含有する。好ましくは、トリホスフェートのサブユニットは式ＶＩを有する。例えば、７−または８−置換７−デアザ−２’−ジオキシアデノシンおよびグアノシン−トリホスフェートを種々のＤＮＡポリメラーゼさせることによってＤＮＡの中に酵素的に容易に導入することができる（ＷＯ００／６８４２２）。
本発明のそれ以上の主題は、一般式ＶＩの化合物およびそれらの任意の塩である：
【０１９６】
【化５０】
2004505988.tif 000022
【０１９７】
式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基およびリポーター基の群から選択され、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＲ３１、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、Ｏ−保護基、Ｓ−保護基、ＮＨ２−保護基、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルメルカプト、およびＯ−固相から成る群から選択され、
Ｒ１５およびＲ１６は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基および固相から成る群から独立して選択され、
Ｂは式Ｉの部分に対する結合であり、
【０１９８】
【化５１】
2004505988.tif 000023
【０１９９】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ　−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０２００】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
（１１）
【０２０１】
【化５２】
2004505988.tif 000024
【０２０２】
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０２０３】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０２０４】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０２０５】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている。
【０２０６】
これらの化合物において、最も好ましくは−Ｍ’Ｒ１６はトリホスフェート基でありかつ−ＭＲ１５はＯＨである。最も好ましい化合物はＲ１４が−Ｈである化合物である。本発明による核酸結合性化合物の酵素的合成のために特に好ましい化合物は、一般式ＶＩＩＩの化合物およびそれらの任意の塩である：
【０２０７】
【化５３】
2004505988.tif 000025
【０２０８】
式中、
ＰＰＰはトリホスフェート基、チオトリホスフェート基またはそれらのアナローグであり、
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジドおよびＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ３６は−Ｈおよび−ＯＨの群から選択され、そして
Ｂは式Ｉの基であり、
【０２０９】
【化５４】
2004505988.tif 000026
【０２１０】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０２１１】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【０２１２】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０２１３】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０２１４】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０２１５】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ここで必要に応じて少なくとも１つの保護基は−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子を置換する。
【０２１６】
例えば、式ＶＩＩＩに従う３’−デオキシ−および２’，３’−ジデオキシトリホスフェートサブユニットを配列決定法において停止ヌクレオチドとして使用することができる。
より好ましくは、前述の酵素的合成法は上に定義した式ＶＩＩＩの化合物をトリホスフェートサブユニットとして使用する。
前述の方法により、本発明の部分を含有するただ１つのモノマーを１つの核酸結合性化合物の中に導入することが原理的に可能であるが、場合に応じて２以上を使用することもできる。核酸結合性化合物を合成する化学的方法を使用するとき、これは特に可能である。
【０２１７】
これらの本発明による核酸結合性化合物はハイブリダイゼーション法において有効に適用可能である。したがって、本発明のそれ以上の主題は、下記の工程を含んでなる核酸を決定する方法である：前記核酸を含有することが推測される試料を準備し、前記核酸の一部分またはすべてに対して本質的に相補的である、核酸結合性化合物を準備し、前記核酸結合性化合物を前記核酸に結合させる条件下に前記試料を前記核酸結合性化合物と接触させ、そしてハイブリダイゼーションの程度または前記核酸および前記核酸結合性化合物から形成された結合性生成物を前記核酸の存在の測度として決定する。
【０２１８】
ハイブリダイゼーションにより核酸を決定する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上に引用した）から知られている。それらの方法を本発明のプローブの使用に容易に採用することができる。
また、本発明のプローブは、細菌またはウイルスのような病原体、例えば、Ａ、ＢまたはＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト乳頭腫ウイルスまたはパルボウイルスＢ１９の測定を可能とする。しかしながら、任意の他のウイルスも可能である。
【０２１９】
本発明の好ましい態様において、核酸結合性化合物（以後において第１核酸結合性化合物と呼ぶ）をハイブリダイゼーション反応において使用して、第２核酸結合性化合物と平行または逆平行のデュプレックスを形成し、ここで第１および／または第２核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる結合した複素環式基を有し、ここで複素環式基、すなわち、前記少なくとも１つの複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とする。好ましくは、ハイブリダイゼーション反応は多重ハイブリダイゼーション反応である、すなわち、第２核酸結合性化合物として複数のターゲット核酸および多重第１核酸結合性化合物が存在する。
【０２２０】
これは好ましくはアレイの形態で実施する、すなわち、第１核酸結合性化合物は複数の異なる配列を有する異なる核酸結合性化合物を含んでなり、アレイの形態で異なる処理可能な位置上で固相に結合される。それ以上の態様において、核酸結合性化合物を捕捉プローブとして使用し、ここで核酸結合性化合物は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基が結合した主鎖を有し、ここで複素環式基、すなわち、前記少なくとも１つの複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とする。最も好ましくは、核酸結合性化合物は式Ｉの複素環式基およびそれについて記載した置換基を有する核酸結合性化合物である。７位における複素環式基置換基、例えば、ブロモおよびヨードは最も好ましい。
【０２２１】
好ましい態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグを第１核酸結合性化合物の代わりに使用して、第２核酸結合性化合物との平行または逆平行のデュプレックスの溶融温度を増加させ、ここで溶融温度の増加は第１核酸結合性化合物と第２核酸結合性化合物とのデュプレックスの溶融温度に比較して増加し、ここで第１核酸結合性化合物中の複素環式基は第２核酸結合性化合物中で複素環式基に対して相補的である。好ましくは、アデニン塩基のような天然複素環式基は第１核酸結合性化合物において本発明による複素環式基により置換されている。
【０２２２】
好ましい態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグを増幅反応においてプローブとして使用する第１核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりに使用して、増幅反応において使用するプライマーの溶融温度に比較して第２核酸結合性化合物とのデュプレックスの溶融温度を増加させ、それによって溶融温度の増加を第１核酸結合性化合物と第２核酸結合性化合物とのデュプレックスの溶融温度と比較し、ここで第１核酸結合性化合物中の複素環式基は第２核酸結合性化合物中で複素環式基に対して相補的である。好ましくは、増幅反応は下記においていっそう詳しく説明するＴａｑＭａｎＴＭフォーマットである。好ましくは、アデニン塩基のような天然複素環式基は本発明による複素環式基により置換されている。
【０２２３】
他の態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグを第１核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりに使用して、第２核酸結合性化合物との平行または逆平行のデュプレックスの溶融温度に対する各塩基対の寄与を調和させる。本発明による複素環式基の寄与の順序で溶融温度に寄与する他の非天然化合物が存在するとき、これは特に重要である。次いで、各複素環式基または塩基の寄与を等化（または調和）させるために、本発明による複素環式基を使用することが重要である。これは既に前述した。この使用は多重反応およびアレイにおいて重要である。
【０２２４】
他の好ましい態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグを第１核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりに使用して、第１核酸結合性化合物とのデュプレックスにおいてミスマッチを有する第２核酸結合性化合物中の配列の検出を増強させる。好ましくは、第２核酸結合性化合物はターゲット核酸、例えば、ウイルスのサブタイプである。置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグは原理的に核酸結合性化合物中のどこにも位置することができる。この使用は、第２核酸結合性化合物がターゲット核酸、ウイルスターゲット、および増幅し、検出しなくてはならないウイルスの異なるサブタイプであるとき、特に重要である。したがって、本発明の他の態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグを核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりに使用して、ターゲット核酸中のサブタイプの検出を増強させる。
【０２２５】
他の態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグを核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりに使用して、核酸結合性化合物の分子内デュプレックスまたはヘアピンの溶融温度を増加させ、それによって溶融温度の増加を核酸結合性化合物の分子内デュプレックスの溶融温度と比較し、ここで核酸結合性化合物中の複素環式基は核酸結合性化合物のハイブリダイゼーションする部分中の複素環式基に対して相補的である。クエンチングを効率よくするために２つの蛍光性標識を密接させるとき、分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）およびＴａｑＭａｎ技術（ＷＯ９２／０２６３８および対応する米国特許第５，２１０，０１５号、米国特許第５，８０４，３７５号および米国特許第５，４８７，９７２号）において、これは特に重要である。
【０２２６】
核酸結合性化合物またはプローブの長さを選択することは、ハイブリダイゼーション特異性を最適化するとき、また重要な考察である。より短いプローブはより長いプローブよりも いっそう特異的であり、単一塩基のミスマッチはハイブリッドデュプレックスに対してより大きい脱安定化効果を有する。しかしながら、ハイブリッドの全体の熱力学的安定性は長さとともに減少するので、ある態様において、短いプローブについてデュプレックスの安定性を全体的に増強することが望ましい。したがって、それ以上の態様において、本発明による複素環式基が溶融温度に対して、したがって短いプローブのデュプレックスの長さに対して高い寄与を有するので、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグを核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりに使用して、検出反応において核酸結合性化合物の長さを減少させることができる。
【０２２７】
好ましくは、前述した使用において、少なくとも１つ、好ましくは１つまたは２つのリポーター基を核酸結合性化合物またはプローブに取り付ける。好ましくは、複素環式基の代わりに使用する置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグはリポーター基の１つまたはすべての結合点から１〜５ヌクレオチドだけ離れている。好ましくは、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグを核酸結合性化合物中の複素環式基の代わりに使用する。
【０２２８】
前述した使用のすべては、多重ハイブリダイゼーション反応の形態において、すなわち、第２核酸結合性化合物として複数のターゲット核酸および複数の核酸結合性化合物を存在させて、実施することが好ましい。これは好ましくはアレイの形態で実施する、すなわち、第１核酸結合性化合物は複数の異なる配列を有する異なる核酸結合性化合物を含んでなり、アレイの形態で異なる処理可能な位置上で固相に結合される。
【０２２９】
本発明のすべての使用において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグは好ましくはアデニンまたはグアニンの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグまたはアデニンまたはグアニンの７−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグであり、ここでアデニンまたはグアニンのアナローグは好ましくは置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体について直接記載したのと同一の７位における置換基Ｒ１またはＮ−置換基Ｒ２およびＲ３を保持できる。
【０２３０】
より好ましくは、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグは置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体である。なおより好ましくは、置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体は式Ｉを有し、置換基は下記において定義する通りである。
【０２３１】
前述の使用において、最も好ましい態様において、置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体およびそれらの任意の塩は一般式Ｉを有する：
【０２３２】
【化５５】
2004505988.tif 000027
【０２３３】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０２３４】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【０２３５】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０２３６】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０２３７】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０２３８】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置である。
最も好ましい態様において、核酸結合性化合物は、好ましくはＲ１＝ＢｒまたはＲ１＝Ｉである、本発明による核酸結合性化合物である。
【０２３９】
また、測定すべき核酸が増幅される場合、本発明による核酸結合性化合物は核酸測定法において使用することができる。核酸の増幅の最初の刊行物以来、種々のプライマーをベースとする核酸の増幅法が記載されてきており、これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない：リガーゼ連鎖反応 （ＬＣＲ、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、１９８９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９およびＢａｒａｎｙ、１９９１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応 （Ｂａｒａｎｙ、１９９１、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ． １：１６）；ギャップ−ＬＣＲ （ＰＣＴ特許公開Ｎｏ． ＷＯ９０／０１０６９）；修復連鎖反応（欧州特許公開Ｎｏ． ４３９，１８２ Ａ２）、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ他、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）；Ｇｕａｔｅｌｌｉ他、１９９０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８；ＰＣＴ特許公開Ｎｏ． ＷＯ ９２／０８８０Ａ）、およびＮＡＳＢＡ （米国特許第５，１３０，２３８号）。
【０２４０】
さらに、鎖置換増幅 （ＳＤＡ）、転写仲介増幅 （ＴＭＡ）、およびＱβ−増幅 （外観については下記の文献を参照のこと：ＷｈｅｌｅｎｏｙおよびＰｅｒｓｉｎｇ （１９９６）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５０、３４９−３７３；ＡｂｒａｍｓｏｎおよびＭｅｙｅｒｓ、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４１−４７）。好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。本発明は、また、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、それらの置換変異型またはそれらのアナローグ、特に好ましくはそれらの７−置換変異型として本発明による複素環式基のトリホスフェートの存在における、ターゲット核酸の増幅である。置換基が上に定義したとおりである、一般式Ｉの複素環式基のトリホスフェートは最も好ましい。
【０２４１】
本発明による核酸結合性化合物はプライマーおよびプローブとして、例えば、捕捉プローブとして使用することができる。化合物をプローブとして使用する場合、それは好ましくは検出可能なリポーター基を含有する。次いで、検出可能なリポーター基を介して、核酸結合性化合物および核酸から形成されたハイブリッドを決定することができる。アッセイのこのグループをさらに２つのグループに分割することができ、１つは均質アッセイのグループであり、そして他は不均質アッセイである。不均質アッセイにおいて、好ましくは固相に結合させるとき、ハイブリッド（結合性生成物）が決定されるであろう。この態様において、過剰のプローブおよび他の成分はハイブリッドから容易に除去することができ、こうして決定をいっそう容易に実施できるという利点を有する。形成されたハイブリッドは、共有結合的、非共有結合的、特異的または非特異的に固相に結合させることができる。この分野において知られている、いくつかの態様が存在する。
【０２４２】
いわゆる均質アッセイにおいて、形成されたハイブリッドを固相に結合させないが、溶液中で直接的または間接的に決定する。このようなアッセイの好ましい例はＰＣＴ／ＵＳ ９１／０５５７１に開示されており、これは引用することによって本明細書の一部とされる。
【０２４３】
特に、いくつかの核酸結合性化合物を使用するとき、例えば、ＰＣＲ−、多重−ＰＣＲ−または多重−ハイブリダイゼーション法を使用するとき、より低い安定性をまた意味する、より低いＴｍから生じた、いくつかの特異的ハイブリダイゼーション複合体を喪失しないで、すぐれた特異性を保証する適当なハイブリダイゼーション条件を見出すことはしばしば困難である。診断法において、これは誤った負の結果に導くことがあり、これは回避すべきである。それ以上の困難は生物学的試料、例えば、血液または痰の複雑性の中に存在する。このような試料はしばしばバックグラウンドの核酸を有し、これらは測定法を混乱させ、例えば、誤った正の結果に導く。
【０２４４】
したがって、式Ｉの複素環式基はまた多重ハイブリダイゼーション法において使用して、アッセイにおいて形成した１または２以上のハイブリダイゼーション複合体のＴｍを増加させることができる。そのアッセイにおいて使用した核酸結合性化合物の中に含有される天然塩基の代わりに式Ｉの複素環式基を導入することによって、ターゲット核酸と形成したハイブリダイゼーション複合体のＴｍを増加させることができる。なお、このようなＴｍの変化は、異なる温度におけるそのターゲット核酸との核酸化合物の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする。好ましい応用分野はチップ上の多重ハイブリダイゼーション法であり、数百〜数千のプローブを使用する。
【０２４５】
また、記載した核酸結合性化合物の化学的合成のための中間体および前駆体が本発明に包含される。好ましい中間体および前駆体を後述する。
主鎖を含んでなる核酸結合性化合物を合成するために、固相結合前駆体は好ましく、ここで主鎖は一般式ＶＩの部分およびそれらの任意の塩を含んでなる：
【０２４６】
【化５６】
2004505988.tif 000028
【０２４７】
式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
ＭおよびＭ’ はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−、または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基およびリポーター基の群から選択され、
【０２４８】
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、Ｏ−保護基、Ｓ−保護基、ＮＨ２−保護基、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相および−ＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ１５およびＲ１６は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１８）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基および固相から成る群から独立して選択され、
Ｂは式Ｉの部分に対する結合であり、
【０２４９】
【化５７】
2004505988.tif 000029
【０２５０】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ　−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０２５１】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
（１１）
【０２５２】
【化５８】
2004505988.tif 000030
【０２５３】
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０２５４】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０２５５】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
【０２５６】
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている。このような式ＶＩの化合物は、本発明による核酸結合性化合物を化学的的に合成するために前駆体として使用することができる。この場合において、
化合物を固相に結合させ、好ましいＲ１４、Ｒ１５、またはＲ１６はＯ−固相であり、最も好ましいＲ１５は固相である。また、反応性基を保護基で保護することが好ましい。
また、本発明は核酸結合性化合物の前駆体および中間体であり、ここで主鎖は主鎖が一般式ＩＩＩの部分およびそれらの任意の塩を含んでなる：
【０２５７】
【化５９】
2004505988.tif 000031
【０２５８】
式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ２およびＮ− （Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから成る群から選択され、
Ｍはオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ２２−、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−または−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−、および−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｏ−および−ＮＲ２２−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル−Ｏ−から成る群から選択され、
Ｒ２２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、保護基およびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０２５９】
Ｒ１４は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルコキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニルオキシ、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、ＳＨ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相および保護基に結合した−ＮＨ２から成る群から選択され、
Ｒ１５は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ３−Ｃ１９）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキルおよび固相から成る群から選択され、
Ｂは式Ｉの部分に対する結合であり、
【０２６０】
【化６０】
2004505988.tif 000032
【０２６１】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ　−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０２６２】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
（１１）
【０２６３】
【化６１】
2004505988.tif 000033
【０２６４】
式中、
Ｎｕｃは式Ｉに対する結合であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、
ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０２６５】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　 　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０２６６】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０２６７】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されており、
ここでＲ１４はＯ−固相であるか、あるいはＲ１５は固相である。
【０２６８】
本発明による核酸結合性化合物を化学的に合成するための固相は、好ましくはまた、成長する核酸結合性化合物を固定するためのリンカーを含む。このようなリンカーはこの分野において知られている。好ましくは、このようなリンカーは合成後に切断して前記核酸結合性化合物を遊離させ、例えば、前記核酸結合性化合物の中に遊離３’−ヒドロキシ基を発生させることができる。このようなリンカーはこの分野において知られており、例えば、固相に結合したアミド結合を介しておよびエステルを介して前駆体または中間体に結合したコハク酸である。好ましいＲ１５は固相であるが、式ＩＩＩの核酸結合性化合物を化学的に合成するための前駆体において、選択的に、Ｒ１５は固相であることもできる。前記化合物の反応性基は好ましくは保護基により保護されている。
本発明による好ましい前駆体および中間体のより一般的な式は主鎖を含んでなる化合物であり、前記主鎖は複素環式基が一般式Ｉの基およびそれらの任意の塩であることを特徴とする、結合した複素環式基を有する：
【０２６９】
【化６２】
2004505988.tif 000034
【０２７０】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０２７１】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【０２７２】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０２７３】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０２７４】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０２７５】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、
Ｄは核酸結合性化合物の残部に対する基の結合位置であり、
ここで前記主鎖は結合した固相であり、
ただし−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−アルケニレン、−ＮＨ−アルキニレンまたは−ＮＨ−アリール基の１つまたは２つの水素原子は保護基により置換されている。
【０２７６】
前駆体の化合物または中間体が主鎖において固相にカップリングされるという可能性の他に、また前記化合物の中に含められた式Ｉの複素環式基において、例えば、−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＮＨ２を取り付け部位として使用して、それを結合することもできる。前記化合物の他の反応性基を保護基により保護することが好ましい。
【０２７７】
本発明の他の好ましい態様は、下記の工程を含んでなる核酸の存在、不存在または量を決定する方法である：核酸を含有することが推測される試料を準備し、主鎖を含んでなる核酸結合性化合物を準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであり、核酸の一部分またはすべてに対して本質的に相補的であることを特徴とし、核酸結合性化合物を核酸に結合させる条件下に前記試料を核酸結合性化合物と接触させ、結合性生成物または核酸と核酸結合性化合物との間のハイブリダイゼーションの程度を核酸の存在、不存在または量の測度として決定する。
【０２７８】
本発明のそれ以上の態様は、核酸結合性化合物を捕捉プローブとして使用する核酸の存在、不存在または量を決定する方法であり、ここで核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とする。
【０２７９】
本発明のなお他の態様は、下記の工程を含んでなる核酸中の関係するヌクレオチド配列を区別する方法である：主鎖を含んでなる核酸結合性化合物を準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグでありかつ限定された配列を有することを特徴とし、２つの関係するヌクレオチド配列を有する核酸を準備し、ヌクレオチド配列の各々はターゲット配列を含んでなり、ここでヌクレオチド配列の一方は核酸結合性化合物に対して完全に相補的であり、そしてセグメントの一方は関係するターゲット配列であり、ハイブリダイゼーション条件下に核酸を核酸結合性化合物とインキュベートし、そして核酸結合性化合物とセグメントの各々との間のハイブリダイゼーションの程度を決定する。
【０２８０】
好ましくは、いずれかの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグはｄＴと対合しかつその相補的核酸鎖に対してハイブリダイゼーションした核酸結合性化合物の溶融温度を増加させるように前記化合物の中に存在する。当業者は理解するように、本発明による核酸結合性化合物の融点の増加は、本発明による複素環式基の環境により影響される。しかしながら、好ましくは、融点はｄＡ−ｄＴ対のＴｍよりも４．７〜７ ℃高く、好ましくは５または５．５ ℃〜７ ℃、より好ましくは６〜７ ℃高い。
非常に好ましい態様において、本発明による方法において、核酸は生物学的物質から、好ましくはヒトまたは動物から単離される。好ましくは、本発明による方法は診断分野において使用される。
【０２８１】
本発明のなお他の態様において、本発明による核酸結合性化合物が蛍光性標識、好ましくはフルオレセインであるリポーター基を含んでなる、前述の方法が包含される。好ましくは、本発明による核酸結合性化合物は複数の蛍光性標識を含んでなり、蛍光性標識の１つの放射波長は他の蛍光性標識の吸収波長とオーバーラップする。核酸結合性化合物はクエンチング剤をさらに含んでなり、クエンチング剤はフルオレセインであることができる蛍光性標識の蛍光放射をクエンチする。好ましくは、クエンチング剤は蛍光性ローダミンまたはシアニンである。好ましくは、この方法はハイブリダイゼーションに引き続いて蛍光性標識とクエンチング剤との間の空間的関係を、好ましくは核酸結合性化合物のエキソヌクレアーゼの加水分解により、変更する工程をさらに含んでなり、ここでエキソヌクレアーゼの加水分解の結果、標識が解放される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションに引き続いて核酸結合性化合物から解放される標識の量により、核酸結合性化合物と核酸との間のハイブリダイゼーションの程度を決定する。
【０２８２】
本発明の好ましい態様において、関係する配列が好ましくは単一ヌクレオチドだけ異なる、関係するヌクレオチド配列を区別する方法が開示される。好ましくは、核酸結合性化合物のプライミング能力により、核酸結合性化合物と核酸との間のハイブリダイゼーションの程度を決定し、ここで最も好ましくは前述の増幅反応であることができる増幅反応の一部分としてプライミングが起こる。増幅反応は好ましくはポリメラーゼ連鎖反応である。
【０２８３】
核酸の存在、不存在または量を決定する方法または関係するヌクレオチド配列を区別する方法において、２以上の核酸結合性化合物を使用することができ、ここで核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる結合した複素環式基を有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とする。好ましくは、２つのの核酸結合性化合物を使用する。好ましい態様において、２つの核酸結合性化合物の第１は蛍光ドナーを含んでなり、そして２つの核酸結合性化合物の第２は蛍光アクセプターを含んでなり、ここで蛍光ドナーの放射波長は蛍光アクセプターの吸収波長とオーバーラップする。次いで、蛍光ドナーと蛍光アクセプターとの間で移動しかつ蛍光アクセプターにより放射された光の量により、ハイブリダイゼーションの程度を測定する。他の態様において、核酸結合性化合物と核酸との間の溶融温度の測定により、ハイブリダイゼーションの程度を決定する。
【０２８４】
本発明のなお他の態様において、核酸中のターゲット配列の存在を検出する方法が開示され、この方法は下記の工程を含んでなる：ターゲット配列の存在について試験すべき核酸を準備し、ターゲット配列に対して実質的に相補的である配列を有しかつ主鎖を含んでなる核酸結合性化合物を準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、核酸および核酸結合性化合物をハイブリダイゼーション条件下にインキュベートし、そしてハイブリダイゼーションした核酸を同定する。好ましくは、多数の核酸をターゲット配列の存在について試験し、ここで核酸は関係するターゲット配列を有する。
【０２８５】
最も好ましくは、核酸はターゲット配列内の単一ヌクレオチドだけ互いに異なる。好ましくは、核酸結合性化合物はエクステンション可能な３’−ヒドロキシ基を含んでなるプライマーである。好ましい態様において、重合性酵素を使用するプライマーのエクステンションにより、ハイブリダイゼーションした核酸を同定し、重合性酵素は熱安定性酵素であることができ、そして核酸結合性化合物は増幅反応、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーである。好ましくは、熱安定性酵素はテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からのＤＮＡポリメラーゼ、いわゆるＴａｑ−ポリメラーゼである。
【０２８６】
本発明のなお他の態様において、下記の工程を含んでなるプライマーをエクステンションする方法が開示される：ターゲット配列を含有する核酸を準備し、ターゲット配列に対して相補的な１または２以上の核酸結合性化合物を準備し、ここで核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することができる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、重合性酵素およびヌクレオチド基質を準備し、そして重合に好適な条件下に核酸、核酸結合性化合物、酵素および基質をインキュベートする。好ましくは、この方法は増幅反応、最も好ましくはポリメラーゼ連鎖反応の一部分である。この方法はｃＤＮＡ分子の合成において使用することができる。
【０２８７】
本発明の他の態様は、核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であり、この方法は下記の工程を含んでなる：異なる既知の配列を有しかつ主鎖を含んでなる核酸結合性化合物のアレイを準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することはできる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、ただし核酸結合性化合物はリポーター基を含有せず、ハイブリダイゼーション条件下に核酸をアレイとインキュベートし、そしてアレイ中のどの核酸結合性化合物が核酸にハイブリダイゼーションするかを決定する。
【０２８８】
本発明のなお他の態様は、核酸中のターゲット配列のヌクレオチド配列を決定する方法であり、この方法は下記の工程を含んでなる：ターゲット配列を含有する核酸を準備し、主鎖を含んでなる少なくとも２つ核酸結合性化合物を準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することはできる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたは既知の配列をもつそのアナローグであることを特徴とし、ここで少なくとも２つ核酸結合性化合物の一方はターゲット配列に対して完全に相補的でありかつ核酸結合性化合物の少なくとも１つの他のものは関係するターゲット配列を有し、ハイブリダイゼーション条件下に少なくとも２つ核酸結合性化合物を核酸とインキュベートし、そして核酸結合性化合物の各々と核酸との間のハイブリダイゼーションの程度を測定する。好ましくは、少なくとも１つの他の核酸結合性化合物はターゲット配列と単一のヌクレオチドミスマッチを有する。
【０２８９】
さらに、本発明は、細胞中の遺伝子の発現を検査する方法を包含し、この方法は下記の工程を含んでなる：細胞中で発現された遺伝子を代表する核酸の集団を準備し、主鎖を含んでなる核酸結合性化合物のアレイを準備し、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することはできる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、ただし核酸結合性化合物はリポーター基を含有せず、ハイブリダイゼーション条件下に核酸の集団をアレイとインキュベートし、そしてアレイ中のどの核酸結合性化合物に核酸はハイブリダイゼーションするようになるかを決定し、核酸は必要に応じて、例えば、標識にカップリングされたアデノシントリホスフェートの組込みにより標識する。
【０２９０】
本発明のなお他の態様は、問題の遺伝子のターゲット配列中の突然変異を同定する方法であり、この方法は下記の工程を含んでなる：ターゲット配列を含んでなる核酸を準備し、異なる配列の核酸結合性化合物のアレイを準備し、ここで異なる配列は野生型ターゲット配列および異なる突然変異ターゲット配列を包含し、ここで核酸結合性化合物は主鎖を含んでなり、前記主鎖は核塩基に対して塩基対合することはできる複素環式基を結合して有し、ここで複素環式基は置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグであることを特徴とし、ただし核酸結合性化合物はリポーター基を含有せず、ハイブリダイゼーション条件下に核酸をアレイとインキュベートし、そしてアレイ中のどの核酸結合性化合物は核酸とハイブリダイゼーションするようになるかを決定する。
【０２９１】
前述のすべての方法において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンまたはそのアナローグは置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリンまたはその誘導体であることができる。本発明の他の態様において、置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグはアデニンまたはグアニンの置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグまたはアデニンまたはグアニンの７−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグであり、ここでアデニンまたはグアニンのアナローグは好ましくは置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体について直接記載したのと同一の７位における置換基Ｒ１またはＮ−置換基Ｒ２およびＲ３を保持できる。
【０２９２】
好ましい態様において、置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体または７−置換７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリンまたはその誘導体は一般式Ｉを有する：
【０２９３】
【化６３】
2004505988.tif 000035
【０２９４】
式中、
Ｒ１はＸ、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ、
（２）　　ニトロ、
（３）　　シアノ、
（４）　　−ＣＯＯ−
（５）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（６）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、
（７）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（８）　　（１０）に従い置換された−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（９）　　−Ｗ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｗ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｗ−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｗ−Ｈ、式中Ｗ＝−Ｓ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
【０２９５】
（１０）　置換基（５）〜（９） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＳＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＯＲ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２、ＯＲ１２、および−ＳＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、リポーター基は細胞内吸収を促進する基であるか、あるいは核酸結合性化合物がその相補的核酸に対してハイブリダイゼーションするとき、結合、架橋または切断の間に後者を攻撃する基である、
【０２９６】
置換基（５）〜（１０）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ただし基（５）〜（７）が−ＮＲ５Ｒ６、ＮＨＲ１２、−ＯＲ１２、またはＳＲ１２により置換されている場合、Ｒ５、Ｒ６またはＲ１２はリポーター基ではない、
【０２９７】
Ｒ２、Ｒ３はＸ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３から独立し、そして下記の基から成る群から選択される：
（１）　　−Ｈ、
（２）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、
（３）　　（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、
（４）　　（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、
（５）　　（Ｃ６−Ｃ２２）−アリール、
（６）　　−Ｚ− （Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−Ｚ−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルケニル、−Ｚ−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−Ｚ− （Ｃ６−Ｃ２２）−アリールまたは−Ｚ−Ｈ、ここでＺ＝−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＳ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−、ここでｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に１または２である、
【０２９８】
（７）　　置換基（２）〜（６） 、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは−ハロゲン、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＣＮ、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−ＮＲ５Ｒ６、−Ｎ＋Ｒ５Ｒ６Ｒ１２、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されることができ、ｒおよびｓは、互いに独立して、１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１であり、ここでＲ１１は−ＮＨＲ１２およびＯＲ１２から成る群から選択され、ここでＲ５、Ｒ６およびＲ１２は−Ｈ、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルケニル、−（Ｃ２−Ｃ１０）−アルキニル、−（Ｃ６−Ｃ２２）−アリールおよびリポーター基から成る群から独立して選択され、
【０２９９】
置換基（２）〜（７）中の前記アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリールは置換されていないか、あるいは−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ６、−ＣＯＲ１１、−ＮＨ−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨ−ＣＳＮＲ５Ｒ６および−（ＣＨ２）ｎ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｒ］ｓ−ＮＲ５Ｒ６から成る群から選択される１または２以上の部分により置換されており、ｒおよびｓは互いに独立して１〜１８の整数でありそしてｎはｒおよびｓから独立に０または１である、
ＸはＲ１、Ｒ２またはＲ３から独立であり、そしてＮおよびＣＨから成る群から選択され、そして
Ｄは核酸結合性化合物またはそれらの任意の塩の残部に対する基の結合位置である。
【０３００】
なお他の好ましい態様において、核酸結合性化合物は本発明による核酸結合性化合物であり、好ましくはＲ１は上に定義した疎水性または電子求引性置換基、好ましくは複素環式基置換基であり、ここでＢｒまたはＩは最も好ましい。
本発明のすべての方法または使用において、本発明による複素環式基を組込んで有する核酸結合性化合物は反対の鎖に結合して平行または逆平行のデュプレックスを形成する。
【０３０１】
本発明は、さらに、式Ｉの複素環式基を含有する１または２以上の核酸結合性化合物と、生理学的に許容される賦形剤と、適当ならば、適当な添加剤および／または慣用の助剤とを含んでなる医薬組成物に関する。したがって、本発明の１つの態様は本発明による核酸結合性化合物を含んでなる医薬組成物である。他の態様は医学において使用するための本発明による核酸結合性化合物である。非常に一般的方法において、本発明は、療法的に有効な組成物においてこのような核酸結合性化合物を使用することに拡張される。このような組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、アプタマーまたはリボザイム、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドとして本発明による核酸結合性化合物を含むことを意味すると理解される。
【０３０２】
本発明は、さらに、フタル酸から誘導された保護基を包含する（例えば、下記文献を参照のこと、Ｒａｍｚａｅｖａ他、（１９９９）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８、１４３９−１４４０；Ｒｉｃｈ Ｂ． Ｍｅｙｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６（１９９４）、ｐｐ． ７３−９１、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． 米国ニュージャージー州トトワ；Ｇｒｉｆｆｅｙ他、（１９９６）、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９、５１００−５１０９；ＧｉｂｓｏｎおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ （１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５、６４５５−６４６７）。デソキシアデノシン、デソキシ−グアノシンまたはデソキシ−イソグアノシンのピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグのアミノアルキニルまたはアミノアルケニル側鎖はフタル酸で保護することができ、それによってイミドが形成する。オリゴヌクレオチドから比較的容易に除去することができるトリフルオロアセチル保護基と対照的に、脂肪族側鎖からのフタロイル基の除去は、例えば、ペプチドについてように容易ではない。
【０３０３】
したがって、ヒドラジンを使用しなくてはならないであろう。しかしながら、ピリミジンヌクレオシドが分解するので、オリゴヌクレオチドこれらの場合においてヒドラジンを使用することができない。アルキニル化合物、特にプロパルギルアミンのアミン基ならびに連鎖中の他の位置上のアリル位置に存在するものは塩基性が低い。これにより、フタロイル基はいっそう容易に除去することができ、そしてメチルアミンを使用してはならない。脱保護は標準的条件、すなわち、濃アンモニア溶液全部でないにしても、６０ ℃において１２時間実施する。フタロイル基の利点は、アミノ基の両方のＨ原子位置がアシル化されることである。通常のアシル基、例えば、米国特許第５，１５１，５０７号において使用されるトリフルオロアセチル（ＴＦＡ） 基について、アミノ基はアシル化によりキャップされ、その後モノ機能化される。後にＴＦＡ基を除去し、それによってアセチル基は結合して止まり、除去が困難である。このような目的のためのフタロイル基の利点は明らかである。
【０３０４】
それゆえ、本発明の１つの態様において、置換基が下記式を有するフタルイミドアルキル、フタルイミドアルケニル、またはフタルイミドアルキニル基の群から選定される塩基部分に結合している、ヌクレオシドアデノシンまたはデソキシアデノシン、グアノシンまたはデソキシグアノシン、イソグアノシンまたはデソキシイソグアノシン、シチジンまたはデオキシシチジン、ウリジンまたはデソキシウリジン、チミジンまたはデソキシチミジン、またはこれらのヌクレオシドのアナローグを含んでなるオリゴヌクレオチドを合成するための構築ブロックが提供される：
【０３０５】
【化６４】
2004505988.tif 000036
【０３０６】
式中Ｎｕｃは塩基部分に対する置換基の結合位置であり、そしてｎは１〜１８の整数であり、ただしフタルイミドアルキニルまたはフタルイミドアルキル基はデソキシウリジンのＣ５−原子に結合していず、そしてただしフタルイミドアルキニル基は７−デアザ−デオキシグアノシンのＣ７−原子に結合していない。他の好ましい態様において、これらのヌクレオシドのアナローグはピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグである。他の好ましい態様において、構築ブロックはホスホルアミダイト誘導体である。
【０３０７】
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドを合成するための本発明による構築ブロックの使用に関する。さらに、塩基部分に結合した−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、または−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２のアミノ基がフタロイル基で誘導化されており、そしてｎが１〜１８の整数であり、ただし−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２または−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基がデオキシウリジンのＣ５−原子に結合していず、そしてただし−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基が７−デアザ−デオキシグアノシンのＣ７−原子に結合していない、ヌクレオシドアデノシンまたはデソキシアデノシン、グアノシンまたはデソキシグアノシン、イソグアノシンまたはデソキシイソグアノシン、シチジンまたはデオキシシチジン、ウリジンまたはデソキシウリジン、チミジンまたはデソキシチミジン、またはこれらのヌクレオシドのアナローグを含んでなるオリゴヌクレオチドを合成するための構築ブロックからオリゴヌクレオチドを合成する方法において、保護基としてフタロイル基を使用することが考えられる。
【０３０８】
他の好ましい態様において、これらのヌクレオシドのアナローグはピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンアナローグである。本発明のそれ以上の態様において、構築ブロックはホスホルアミダイト誘導体である。本発明のなお他の態様において、本発明による構築ブロックからオリゴヌクレオチドを合成する方法が開示される。
下記の実施例により、本発明を説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。
下記の実施例により、本発明を詳細に説明する。
【０３０９】
実施例
実施例１： ７−ブロモ−８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシドについての合成およびデータ
１．１．　モノマーの合成および性質
−　アルコキシヌクレオシド４ａ、ｂ［１８］は、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミン（ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン）ヌクレオシド２ａ、ｂ（プリンのナンバリングを説明の節を通じて使用する）の合成の前駆体として働く。アミン化を鋼ボンベ中で実施した（４日間、２５％水性ＮＨ３、７０ ℃）。両方のヌクレオシド（２ａ、ｂ）を結晶形態で単離した。わずかの関係する８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシドは以前に製造された［１９〜２２］。
【０３１０】
化合物２ａをアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）で処理すると、８−アザ−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン［１８］が生成した。反応を紫外線分光光度測定的に追跡した（第１ａ図）。
時間従属的スペクトルは２つの等吸収点（λ＝２３４ ｎｍおよび２６７ ｎｍ）を示し、出発物質がただ１つの反応生成物に変換されたことが指示される。２ａの脱アミン化はプリンヌクレオシドのそれよりも非常にゆっくり起こる。７−ブロモ誘導体３ｂ［１８］は、以前に観測されたように［２０］、それらの条件下に高い酵素濃度においてさえ脱アミン化されなかった。
【０３１１】
【化６５】
2004505988.tif 000037
【０３１２】
次に、酸性媒質中の化合物２ａ、ｂのＮ−グリコシル結合の半減期を測定し、化合物１と比較した。反応を０．５Ｎ ＨＣｌ中で温室において実施し、紫外線分光光度測定的にならびにＨＰＬＣ分析により追跡した（第１表）。
【０３１３】
【表１】
2004505988.tif 000038
【０３１４】
第１表のデータから明らかなように、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド（２ａ）は親２−アミノ−２’−デオキシグアノシン（１）よりも約１５倍高いグリコシル結合を示す。２ｂのグリコシル結合はこれらの条件下に安定である。応を２Ｎ ＨＣｌ中で実施するとき、加水分解が起こる（第１表）。さらに、７−ブロモ置換基は、逆相ＨＰＬＣ上で化合物２ａまたは１に比較して、分子の親油性特性を増加させ、これにより化合物２ｂのクロマトグラフィー移動度を減少させる（第１ｂ図）。
【０３１５】
糖部分のＮ←→Ｓ擬回転平衡に対する核塩基の影響を研究するために、ヌクレオシド１〜３の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＤ２Ｏ中で測定した。ＰＳＥＵＲＯＴプログラムを使用して５つのビシナル１Ｈ、１Ｈカップリングに基づいて解析を実施した［２３］。表２に従い、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ａは対応するプリンヌクレオシド１よりもいっそう顕著なＮ−配座異性体集団を示すが、関係する７−デアザプリンヌクレオシド３のＮ−型集団は減少する。これは８−アザ−７−デアザプリン系の□−電子欠乏の増加と一致する。電子求引性７−ブロモ置換基の追加の効果は観測されなかったが、８−アザ−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン［２４］の７−位置の中に導入されたいっそう電子誘引シアノ基について見出された。Ｃ（４’）−Ｃ（５’）結合の回りのコンフォメーションが示すように、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ａおよびｂは８−アザ−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン［２４］のようにγｔ−（−ｓｃ）−回転異性体集団を好むが、正規のプリンヌクレオシドについてγ（＋）ｇ−（＋ｓｃ）−コンフォメーションが優勢を占める［２５］。
【０３１６】
【表２】
2004505988.tif 000039
【０３１７】
過去において、いくつかの研究所は２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（１）について簡単なプロトコルを報告した。ベンゾイル保護基を完全に除去するために猛烈な加水分解条件を必要とする［４］が、いっそう不安定性のフェノキシアセチル（ｐａｃ）残基は困難なく除去された［２６］、［２７］。それにもかかわらず、Ｎ−ビス−アシル化誘導体の生成は分子のモノ保護［２８］および脱プリン化に付されるアシル化誘導体の傾向の増加［４］のために困難に直面する。ヌクレオシド２ａ、ｂはプリンヌクレオシド１よりも有意にいっそう安定という観測（第１表）に従い、Ｎ−アシル誘導体２ａ、ｂは同様な性質を示すであろう。したがって、一時的保護のプロトコルに従いフェノキシアセチル誘導体５ａならびにベンゾイル化合物５ｂを製造した［２９］。２，４，５−トリクロロフェニルフェノキシアセテート［２７］または塩化ベンゾイル［３０］をアシル化剤として使用した。プリン化合物１について記載された［１９］ように、ビス−フェノキシアシル化誘導体５ａを形成した。しかしながら、５ａの収率はむしろ低かった（３０％）。
【０３１８】
ビス−ベンゾイル化ヌクレオシド５ｂは非常によりすぐれた収率で単離された（６３％）（スキーム２；ａ）６ａ：ピリジン、Ｍｅ３ＳｉＣｌ、２，４，５−トリクロロフェニルフェノキシアセテート、４０ ℃、１２時間、６ｂ：ピリジン、Ｍｅ３ＳｉＣｌ、ＰｈＣＯＣｌ、温室、１２時間、ｂ）ピリジン／（ＭｅＯ）２ Ｔｒ−Ｃｌ、温室、４時間、ｃ）ＴＨＦ、２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト、温室、３０分）。標準的反応条件［３１］を使用して、両方の化合物（５ａ、ｂ）をＤＭＴ−誘導体６ａ、ｂに変換した。２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイトおよび（ｉＰｒ）２ＥｔＮの存在下にホスフィチル化すると、ホスホルアミダイト７ａ、ｂが得られた［３２］。しかしながら、ベンゾイル化誘導体６ｂはＴＨＦ溶液中で低い溶解度を有するので、大きい体積を使用しなくてはならなかった。これに従い、ホスフィチル化は有効ではなく、通常８０％の範囲であるホスホルアミダイトの収率は６７％に減少した（スキーム２）。
【０３１９】
【化６６】
2004505988.tif 000040
【０３２０】
化合物５ａの脱保護（２５％水性、ＮＨ３、４０ ℃、ＨＰＬＣのモニター）は、第１ ｐａｃ基が５分以内に除去されることを示したが、第２ ｐａｃ基の除去は２０分であった。温室において、完全な脱保護は１時間よりも短い時間で起こる。化合物５ｂの２つのベンゾイル基の完全な除去（２５％水性、ＮＨ３、４０ ℃、ＨＰＬＣのモニター）は８〜９時間を必要とするが、ビス−ベンゾイル化プリンヌクレオシド１の脱保護は数日を与えた［４］［７］。この観点から、ベンゾイル保護されたホスホルアミダイト７ｂはオリゴヌクレオチド中の化合物２ａの組込みに有用な構築ブロックを提供する。それにもかかわらず、中間体６ｂの低い溶解度は問題を提示する。
【０３２１】
これにもかかわらず、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルメチリデン誘導体８ａ、ｂの合成を実施した。プリンヌクレオシド１の中にＮ，Ｎ’−ジメチルアミノメチリデンを導入する最初の試みは、保護基が不安定であったために、失敗におわった［２８］。２’−デオキシグアノシンの８−アザ−７−デアザプリンアナローグの環外アミノ機能を保護するためにＮ，Ｎ’−ジブチルアミノメチリデン［３３］が以前に使用された［３４］。同一基が今回ヌクレオシド２ａ、ｂの中に導入された。ビス−アミジン８ａ、ｂが主要な生成物（５０％の収率）として得られたが、モノ付加物（９ａ、ｂ）が主要な化合物（１７％）として生成した。いっそう激しい条件を使用するとき、モノ付加物の形成を回避することができる。保護されたヌクレオシド８ａ、ｂについて、完全な脱保護時間（濃アンモニア、４０ ℃、２６０ ｎｍにおけるＨＰＬＣのモニター）は８ａについて４４０分であり、そして８ｂについて４５０分であると、測定された。モノ保護された中間体が形成するので、半減期値を与えることができない。
【０３２２】
【化６７】
2004505988.tif 000041
【０３２３】
引き続いて、４，４’−ジメトキシトリチル残基を導入した。反応を仕上げ、次いでシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにかけた後、１つのＮ，Ｎ’−ジブチルアミノメチリデン残基が加水分解してホルミル基が得られた（スキーム３；ａ）ピリジン／（ＭｅＯ）２ Ｔｒ−Ｃｌ、温室、４時間、ｂ）ＴＨＦ、２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト、温室、３０分）。この基は現在２−アミノ機能を保護しているが、６−アミノ基はまだジブチルアミノメチリデン残基を保持している。ＮＭＲスペクトルをベースとして化合物１０ａ、ｂの構造を確立した。アミノ基（１０．７７ ｐｐｍ）およびホルミル残基のプロトン（９．５６ ｐｐｍ）はＪ＝９．８８ Ｈｚで二重項に分割されている。
【０３２４】
この特徴的なカップリングパターンは、５−アザ−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン［３５］および２−アミノ−８−アザ−７−デアザプリン２’−デオキシヌクレオシド［３６］のホルミル誘導体について既に観測されている。ＤＭＴ誘導体１０ａ、ｂのホスフィチル化をＴＨＦ中でクロロ（２−シアノエチル）−（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンの存在下に実施して、ホスホルアミダイト１０ａ、ｂを生成した（スキーム３）。これらのホスホルアミダイトならびにベンゾイル保護基を保持する対応する構築ブロック７ｂを固相オリゴヌクレオチド合成において効率よく使用して、高いカップリング収率を得ることができる。すべての化合物を１Ｈ−、１３Ｃ−、および３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルおよび元素分析により特性決定した（第３表および実験部分）。
【０３２５】
【表３】
2004505988.tif 000042
【０３２６】
１．２．　オリゴヌクレオチド
合成および特性決定
−　ホスホルアミダイト７ｂおよび１１ｂならびに標準的ホスホルアミダイトを使用して、オリゴヌクレオチド１０２〜１１６の自動化固相合成（第４〜６表）を実施した。オリゴヌクレオチドを脱トリチル化し、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ上でまたは逆相ＨＰＬＣにより精製した（精製条件については実験部分を参照のこと）。化合物の均質性は４×２５０ ｍｍのＮｕｃｌｅｏＰａｃ ＰＡ−カラム（ＤＩＯＮＥＸ、Ｐ／Ｎ ０４３１８、米国）上でイオン交換クロマトグラフィーにより証明された。記載するようにヘビ毒液ホスホジエステラーゼおよびアルカリ性ホスファターゼにより、オリゴヌクレオチドの組成を決定した（第２ａ図、第２ｂ図参照）［２］。
【０３２７】
８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ａはｄＡよりもわずかに移動する。ブロモ化合物２ｂは第２ｂ図から理解できるように、非常に疎水性である。修飾されたオリゴヌクレオチドから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を実施した（第６表、実験部分）。正しい質量がすべての場合において見出され、６０ ℃において１０時間のアンモニア処理の間にすべての保護基が分離されたことを強調される。
【０３２８】
１．２．２．　デュプレックスの安定性
３つの水素結合が存在するために、ｎ２Ａｄ−ｄＴ塩基対（ＩＩ）はｄＧ−ｄＣ対（ＩＩＩ）と同一または類似する安定性を有することが期待される。ＤＮＡ溶融実験から得られた実験データが示すように、ｎ２Ａｄ−ｄＴ塩基対を含有するデュプレックスの熱安定性はｄＡ−ｄＴ対を使用するときよりも多少高いが、ｄＧ−ｄＣ対のそれよりもなお非常に低いままである。このジレンマを説明するために種々の研究が実施されてきているが、確信できる答えは得られてきていない。この事柄のむしろ詳細な検査がＳａｇｙ他［１１］によりなされた。この著者はモチーフｄＡ−ｄＵ、ｄＩ−ｄＣ、ｄＡ−ｄＴおよびｄＩ−ｍ５Ｃｄにより表される二座の塩基対の熱安定性を三座の対、例えば、ｎ２Ａｄ−ｄＴ、ｄＧ−ｄＣ、ｄＧ−ｍ５Ｃｄおよびその他のそれと比較した。
【０３２９】
酵素的に合成された交互オリゴヌクレオチドを使用して、実験は実施された。２−アミノ基が非存在であるかぎり（二座の塩基対）、種々のデュプレックスのすべては特定の塩基構造から独立して非常に類似する安定性を示す。三座の塩基対に導く２−アミノ基を挿入することによって、この類似性は消失する。ｄＧ−ｄＣ塩基対は現在ｎ２Ａｄ−ｄＴ対よりも非常にいっそう安定である。また、著者らはピリミジン部分に結合した５−置換基の有意な効果を認めた；５−メチル基の存在はむしろ小さい安定性を生ずるが、より大きいアルキル基はＤＮＡを脱安定化する。
【０３３０】
【化６８】
2004505988.tif 000043
【０３３１】
プリンヌクレオシドに比較して塩基対安定性に対する８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ａ、ｂの影響を評価するために、すべての３つの化合物を非自己相補的デュプレックス５’−ｄ（ＴＡＧＧＴＣＡＡＴＡＣＴ）（１０２）および５’−ｄ（ＡＧＴＡＴＴＧＡＣＣＴＡ）（１０３）の中に組込んだ。このデュプレックスを我々の研究所において標準として使用して、熱安定性およびらせん形成の構造的挙動に対する修飾されたヌクレオシドの影響を研究した。（１０２・１０３）のＴｍ値は０．１ Ｍ ＮａＣｌ中で１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ ｍＭ Ｎａ−カコジレート緩衝液の存在下に４６ ℃である。
【０３３２】
６ ｄＡ残基の代わりに６ ｎ２Ａｄ残基を組込むと、Ｔｍ値を４ ℃だけ増加させる（デュプレックス１０４・１０５、第４表参照）。これは０．７ ℃のＴｍ増加／残基に対応する。他の研究所において実施された実験から同様な発見が報告された［５〜１２］。４つの８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ａをｄＡで置換したとき、既に４６ ℃から５２ ℃へＴｍ値が増加したことが測定され、これは１．５ ℃／修飾された残基に対応する（デュプレックス１０２・１０３対１０８・１０９の比較）。ｎ２Ａｄ残基により引き起こされる安定性の増加はわずかに０．７ ℃であるので、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンはプリン−２，６−ジアミンのそれよりもｄＴといっそう安定な三座の塩基対を形成する。
【０３３３】
【表４】
2004505988.tif 000044
【０３３４】
７−デアザプリンならびに８−アザ−７−デアザプリンはＤＮＡの主要な溝の中に十分に収容されることが示された［１〜３］。特に、ハロゲンはデュプレックスの安定性に関して非常に好適な性質を示す。これにより、７−ブロモ誘導体２ｂでｄＡ残基を今回置換する。表４によれば、デュプレックス（２０・２１）は顕著な安定性を示す。Ｔｍ値は６８ ℃であり、これに対してｄＡ−ｄＴ対を使用するデュプレックスのそれは４６ ℃であった。デュプレックスの安定性は５．５ ℃／修飾された塩基だけ強化される。同一位置に４つのｄＧ残基を含有するデュプレックス（１０６・１０７）は６５ ℃のＴｍ値に導き、これは５ ℃のＴｍの増加に対応する。こうして、ｄＡ−ｄＴ認識モチーフに従う塩基対のモチーフＩＶ（スキーム４）の安定性は現在ｄＧ−ｄＣ対（塩基対ＩＩＩ）と同程度に安定性である。
【０３３５】
この予期されざる観測は、プリン−２，６−ジアミンヌクレオシド１のそれに比較して８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ａ、ｂのアミノ基の塩基性の差に基づいて説明することができる。前述したように、化合物１の第３水素結合はｎ２Ａｄ−ｄＴ塩基対の安定性に対する寄与は非常にわずかである（スキーム４、塩基対ＩＩＩ）が、ｄＧ−ｄＣ対の安定性に対するｄＧの２−アミノ基の寄与は大きい。この分子の化学的構造に関すると、ｄＧおよびイソＧｂの両方のアミノ基はアシル化グアニジン部分の一部分であり、これはｎ２Ａｄの２−アミノ基よりも塩基性がかなり低いことが期待され、ｎ２Ａｄの２−アミノ基もまた現在芳香族であるグアニジン系の一部分であるが、電子誘引部分に結合されていない。
【０３３６】
これらの差はｄＧまたはイソＧｂに比較して１の２−アミノ基の塩基性を低くさせる。この性質はアルカリ性に対する１のアシル化２−アミノ基の非常に高い抵抗性において既に認められる（上を参照）。次に、化合物１および２ａ、ｂが異なる理由を説明しなくてはならない。化合物１と反対に、２−または６−アミノ基において正電荷およびピラゾール窒素−２において負電荷を有する化合物２ａ、ｂ塩基のメソメリー構造を描くことができる。
【０３３７】
これらのメソメリー式は１のそれを超えた２ａの２−アミノ基の酸性度（塩基度の減少）を説明する。ブロモまたは他の電子誘引置換基を７位に導入すると、この効果はさらに強化される。こうして、２ａの２−アミノ基は１の２−アミノ基よりもｄＴとの水素結合のよりすぐれたドナーである。追加のブロモ置換基はいくつかの好適な効果を引き起こすことができる：（ｉ） それは２−アミノ基をさらに酸性化する；（ｉｉ） それはＤＮＡ−デュプレックスの主要な溝の中の疎水性基を表す；（ｉｉｉ） それは２−アミノ基と水素結合を形成する。モノマー単位のそれらの性質を別として、核酸デュプレックス内の塩基の環境的条件はｎ２Ａｄ−ｄＴ塩基対の安定性をモジューレートするに違いない。そうでなければ、このような塩基対の安定性がＤＮＡ−デュプレックス、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ−デュプレックスにおいて異なる理由を説明することができない。
【０３３８】
【化６９】
2004505988.tif 000045
【０３３９】
しかも、Ｔｍ値が組込まれた８−アザ−７−デアザプリン残基の数とともに直線的に増加するかどうかは証明されてきていない。化合物１の場合において、このような研究が行われ、ポリ（ｄＡ−ｄＴ）において、ｎ２Ａｄ−残基によるｄＡの置換が５０％を超えなかったとき、直線的関係が存在することが示された。しかしながら、低い塩濃度においてＴｍ値を測定したとき、より高いｎ２Ａｄ−組込みにおいてＴｍ値はそれ以上増加しなかった。ｄＡの代わりにｎ２Ａｄを含有するシアノファージＳ−２ＬのＤＮＡについて、合成オリゴヌクレオチドについて実施されたのと同様な観測が得られた［３８］。
【０３４０】
デュプレックスのらせん構造を同定するために、デュプレックス１０２・１０３〜１１０・１１１のＣＤスペクトルを測定した［３９］。すべてのデュプレックスのＣＤスペクトルはＢ様ＤＮＡ構造を示し、２７０ ｎｍ〜２９０ ｎｍ付近において正のコットン効果および２５０ ｎｍ付近において負のローブを有する（第３ａ図参照）。
【０３４１】
プリンヌクレオシド１はＤＮＡとよりも相補的ＲＮＡといっそう安定なデュプレックスを形成することが報告された［４０］。したがって、１または２ａ、ｂを含有するオリゴヌクレオチドは相補的オリゴヌクレオチド１１４とハイブリダイゼーションした（第５表）。第５表によれば、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド１０４・１１４は親１０２・１１４のそれを超えたＴｍ増加を示す。８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミン残基は１のそれと同様な効果を示す。ブロモ化合物２ｂが組込まれたとき、追加の安定化が観測される。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＣＤスペクトル（第３ｂ図参照）はＡ−ＤＮＡの形態を採用する。
【０３４２】
【表５】
2004505988.tif 000046
【０３４３】
最後に、ヌクレオシド１および２ａ、ｂの塩基対合性質は平行鎖化ＤＮＡ（ｐｓ−ＤＮＡ）において研究された［３７］、［４２］。この目的のために、ｄＣ−ｄＧをｍ５ｉＣｄ−ｄＧおよび／またはｄＣ−ｉＧｄ対と交換することが必要であった。標準的デュプレックスとして、ハイブリッド（１０２・１１５）または（１１６・１０３）を選択した。両方の系列の実験において、プリン−２，６−ジアミン（１）はｐｓ−ハイブリッド（１０４・１１５および１１６・１０５）を脱安定化した。ヌクレオシド２ａは既にわずかにより安定なデュプレックスに導いた（第６表参照）。逆平行ＤＮＡの場合におけるように、ブロモ誘導体２ｂはＴｍ値（１１０・１１５および１１６・１１１）をわずかに増加させた。ｐｓ−ハイブリッドの２組のＣＤ−スペクトル（第４ａ図、第４ｂ図）はむしろａｐｓ−ハイブリッドのそれらと異なる（第４ａ図参照）。
【０３４４】
これらの結果から明らかなように、２−アミノ基はプリン化合物の系列を脱安定化し、ａｐｓ−ＤＮＡにおいて観測される安定化効果を有意に減少させる。モノ置換プリン−２−アミンまたは８−アザ−７−デアザプリン−２−アミンはｐｓ−ＤＮＡの安定性に対してむしろ好ましくない影響を有することが既に観測されたので、この挙動は驚くべきことではない［３６］［４２］。
【０３４５】
【表６】
2004505988.tif 000047
【０３４６】
８−アザ−７−デアザプリンヌクレオシド２ａ、ｂの２つのアミノ基をベンゾイル残基またはジブチルアミノメチレン基で保護することができ、ここで酸性脱トリチル化またはアンモニア中の標準的条件下の脱保護の間に脱プリン化の問題は発生しない。脱プリン化およびプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド１のアミノ保護基の非常に高い安定性の問題は観測されない。
【０３４７】
１．　３　実験の部分
モノマー：一般的事項［２］参照。フラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）：シリカゲル６０Ｈ（Ｍｅｒｋ、ドイツ国ダーマシュタット）上で０．４バール。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：アルミニウムシートシリカゲル６０ Ｆ２５４（０．２ ｍｍ、Ｍｅｒｋ、ドイツ国）。ＴＬＣ走査：ＣＳ−９３０ ＴＬＣスキャナー（Ｓｈｉｍａｚｕ、日本国）。フラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）およびＴＬＣのための溶媒系：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９８：２（Ａ）、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９５：５（Ｂ）、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９：１（Ｃ）、ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン ９５：５（Ｄ）、ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン ９：１（Ｅ）、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ ８５：１５（Ｆ）。融点：Ｂｕｅｃｈｉ−ＳＭＰ−２０装置（Ｂｕｅｃｈｉ、スイス国）；未補正。ＮＭＲスペクトル：Ａｖａｎｃｅ−ＤＰＸ−２５０およびＡＭＸ−５００スペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ国）；δ値（ｐｐｍ）は内部ＳｉＭｅ４ （１Ｈ、１３Ｃ）からダウンフィールドである。Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅｓ Ｌａｂｏｒ Ｂｅｌｌｅｒ （Ｇｅｕｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ国）により、微量分析を実施した。
【０３４８】
オリゴヌクレオチド：
オリゴヌクレオチド１０２〜１１６の合成および精製。合成は自動化ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ホスホロアミダイト化学用ＡＢＩ ３９２−０８）により１ μｍｏｌの規模で［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｉｂ２Ｇｄ、［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｂｚ６Ａｄ、［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｂｚ４Ｃｄおよび［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］Ｔｄの３’−ホスホロアミダイトならびに誘導体７ｂおよび１１ｂのホスホロアミダイトを使用して実施した。オリゴマーの合成は、ホスホロアミダイトのＤＮＡ合成装置の正規プロトコルに従った。固体支持体から切断後、オリゴヌクレオチドを２５％ＮＨ３／Ｈ２Ｏ（１２〜１５時間、６０ ℃）中で脱保護した。
【０３４９】
５’−（ジメトキシトリチル）−オリゴマーの精製をＯＰＣカートリッジならびに逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８）により実施した。下記の溶媒の勾配を使用した（Ａ、ＭｅＣＮ；Ｂ、０．１Ｍ （Ｅｔ３ＮＨ）ＯＡｃ（ｐＨ ７．０）／ＭｅＣＮ ９５：５）：３分Ｂ中の２０％Ａ、１２分Ｂ中の１５〜４０％Ａ、１．０ ｍｌ／分の流速。４，４’−ジメトキシトリチル残基を除去するために、温室において５分間２．５％ＣＨＣｌ２ＣＯＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で処理した。脱トリチル化オリゴマーを逆相ＨＰＬＣで精製した：勾配、２０分Ｂ中の１〜２０％Ａ、流速１ ｍｌ／分。塩を溶離するためにＨ２Ｏを使用してオリゴマーを短いカラム（ＲＰ−１８、シリカゲル）上で脱塩したが、オリゴマーをＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ ３：２で溶離した。オリゴマーをＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ蒸発装置で凍結乾燥すると、無色固体状物が得られ、これを−２４ ℃において凍結させた。
【０３５０】
【表７】
2004505988.tif 000048
【０３５１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルはＢｉｆｌｅｘ ＩＩＩでＴ． Ｗｅｎｚｅｌ博士（Ｂｒｕｋｅｒ Ｓａｘｏｎｉａ、ドイツ国）により測定された。ヌクレオシド組成の分析。分析は［３７］に記載されているように実施された。ヌクレオシド成分の吸光係数：ε２６０：ｄＡ １５４００、ｄＴ ８８００、ｄＧ １１７００、ｄＣ ７６００、ｉＧｄ ７４００、ｍ５ｉＣｄ ６３００、２ａ ８８００、２ｂ ８７００。ヘビ毒液ホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．４．１．、Ｃｒｏｔａｌｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ）およびアルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１．、Ｅ． ｃｏｌｉ）をＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（ドイツ国）から入手した。
【０３５２】
Ｔｍ値の測定および熱力学的データ。Ｃａｒｙ熱電制御装置を装備したＣａｒｙ−１／１Ｅ ＵＶ／ＶＩＳスペクトロメーター（Ｖａｒｉａｎ、オーストラリア国）で、吸収対温度のプロファイルを測定した。Ｐｔ−１００抵抗器を有する参照電池でＴｍ値を測定し、メルトウィン（Ｍｅｌｔｗｉｎ）３．０プログラムを使用して熱力学的データを計算した［４３］。
円偏光二色スペクトル。サーモスタット（Ｌａｕｄａ−ＲＣＳ−６浴）制御の１ ｃｍのキュベットを有するＪａｓｃｏ−６００（Ｊａｓｃｏ、日本国）でＣＤ−スペクトルを記録した。紫外線スペクトル：１５０−２０スペクトロメーター（Ｈｉｔａｃｈｉ、日本国）。
３−ブロモ−１−［２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（２ｂ）。水性２５％ＮＨ３（８０ ｍｌ）中の化合物４Ｂ［１８］（１．０ ｇ、２．６ ｍｍｏｌ）の溶液を鋼容器中で７０ ℃に４日間加熱した。溶媒を蒸発させ、残留物を熱Ｈ２Ｏ中に溶解した。冷却すると、結晶化が起こった。
【０３５３】
無色針状結晶（６４６ ｍｇ、７２％）。融点１５５ ℃。ＴＬＣ （Ｃ） ： Ｒｆ ０．２． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２６０ （８７００）， ２７８ （９０００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ２．１６， ２．６８ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （２’）） ； ３．３８， ３．４８ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．７７ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．３６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７２ （ｔ， Ｊ＝４．９， ＨＯ−Ｃ （５’）） ； ５．１９ （ｄ， Ｊ＝４．１， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．３２ （‘ｔ’Ｊ＝６．５， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ６．３９ （ｓ， ＮＨ２） ； ６．７７ （ｂｒ， ＮＨ２）． 分析：計算値：Ｃ１０Ｈ１３ＢｒＮ６Ｏ３ （３４５．２） ： Ｃ ３４．８０， Ｈ３．８０， Ｎ２４．３５ ； 実測値：Ｃ３４．９７， Ｈ３．９７， Ｎ２４．２１。
【０３５４】
Ｎ４，Ｎ６−ビス（フェノキシアセチル）−１−［２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（５ａ）。化合物２ａ［１５］（１．５ ｇ、５．６ ｍｍｏｌ）をピリジンとの共蒸発により乾燥した。残留物をピリジン（２５ ｍｌ）中に溶解し、温室において攪拌しながら塩化トリメチルシリル（３．３ ｍｌ、２６ ｍｍｏｌ）を添加した。１５分間攪拌し、ピリジン（１５ ｍｌ）中の２，４，５−トリクロロフェニルフェノキシアセテート（５．４ ｇ、１６．４ ｍｍｏｌ）［２７］の溶液を一度に添加した。反応混合物を４０ ℃において１６時間攪拌した。それを冷却し（氷浴）、Ｈ２Ｏ（４．２ ｍｌ）を添加した。５分後、水性２５％ＮＨ３（６ ｍｌ）を導入し、この混合物を濃縮乾固した。残留物をＦＣ（溶離剤：Ａ→Ｃ）に適用すると、無色泡状物が得られた（９００ ｍｇ、３０％）。
【０３５５】
ＴＬＣ （Ｃ） ： Ｒｆ ０．４． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２６６ （９１００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ２．２６， ２．８２ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （２’）） ； ３．３４， ３．４８ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．８２ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４４ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７３ （ｔ， Ｊ＝５．５， ＨＯ−Ｃ （５’）） ； ５．１４ （ｓ， ＯＣＨ２）） ； ５．１７ （ｄ， Ｊ＝４．３， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．６０ （‘ｔ’Ｊ＝６．３， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ６．９２−７．３２ （ｍ， 原子． Ｈ） ； ８．４１ （ｓ， Ｈ−Ｃ （３）） ； １０．７７ （ｓ， ＮＨ） ； １１．３０ （ｓ， ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ２６Ｈ２６Ｎ６Ｏ７ （５３４．５） ： Ｃ ５８．４２， Ｈ４．９０， Ｎ１５．７２ ； 実測値：Ｃ５８．６８， Ｈ４．７８， Ｎ１５．２０。
【０３５６】
Ｎ４，Ｎ６−ビス（フェノキシアセチル）−１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（６ａ）。化合物５ａ （０．８ ｇ、１．５ ｍｍｏｌ）をピリジンと２回の共蒸発させた。残留物をピリジン（２ ｍｌ）中に溶解し、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（０．６ ｇ、１．７７ ｍｍｏｌ）を添加した。４時間攪拌し、次いで溶液をＭｅＯＨ（５ ｍｌ）で希釈し、５％水性重炭酸ナトリウム（３×２０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮乾固した。残留物をＦＣ（溶離剤：Ｄ→Ｅ）により精製すると、無色泡状物が得られた（３１０ ｍｇ、２５％）。
【０３５７】
ＴＬＣ （Ｅ） ： Ｒｆ ０．３． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２６６ （８９００）． １Ｈ−ＮＭＲ ： （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ２．３２， ２．８１ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （２’）） ； ２．９９ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．６７ （２ｓ， ＯＣＨ３） ； ３．９５ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．５３ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ５．１５ （ｓ， ＯＣＨ２）） ； ５．３３ （ｄ， Ｊ＝４．７， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．６２ （‘ｔ’Ｊ＝６．３， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ６．６９−７．３１ （ｍ， 原子． Ｈ） ； ８．３６ （ｓ， Ｈ−Ｃ （３）） ； １０．８３ （ｓ， ＮＨ） ； １１．５６ （ｓ， ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ４７Ｈ４４Ｎ６Ｏ９ （８３６．９） ： Ｃ ６７．４５， Ｈ５．３０， Ｎ１０．０４ ； 実測値：Ｃ６６．９５， Ｈ５．４１， Ｎ１０．１５。
【０３５８】
Ｎ４，Ｎ６−ビス（フェノキシアセチル）−１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト］（７ａ）。ＴＨＦ（０．５ ｍｌ）中の化合物７ａ（０．１５ ｇ、０．１８ ｍｍｏｌ）の溶液に、（ＩＰｒ）２ＥｔＮ（０．１２ ｍｌ、０．７１ ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト（６４ ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ）を添加した。アルゴ雰囲気下に温室において３０分間攪拌した。次いで、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２ （２０ ｍｌ）および５％水性ＮａＨＣＯ３で希釈した。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×１５ ｍｌ）で抽出した。一緒にした有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、蒸発すると、油状物が得られた。残留物をＦＣ（溶離剤：Ｆ）にかけると、無色泡状物が得られた（８０ ｍｇ、４３％）。ＴＬＣ（Ｆ）：Ｒｆ ０．８。３１Ｐ− ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４９．２、１４９．４。
【０３５９】
Ｎ４，Ｎ６−ビス（ベンゾイル）−１−［２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（５ａ）。化合物２ａ［１７］（１ ｇ、３．８ ｍｍｏｌ）をピリジンとの共蒸発させ、ピリジン（４０ ｍｌ）およびＴＭＳ−Ｃｌ（４．０ ｇ、３６．８ ｍｍｏｌ）中に溶解した。反応混合物をアルゴ雰囲気下に攪拌し、０ ℃に冷却し、ＰｈＣＯＣｌ（６．６ ｍｌ、５７ ｍｍｏｌ）を溶液に３０分かけて滴下した。温室において一夜攪拌した後、この混合物をＥｔＯＡｃ（２００ ｍｌ）中で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液（２００ ｍｌ）および氷冷Ｈ２Ｏ（２００ ｍｌ）で洗浄した。水性層をＥｔＯＡｃ（２×４００ ｍｌ）で抽出した。一緒にした有機層を蒸発乾固し、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ ５：４：１（２５０ ｍｌ）中に溶解した。暗色黄色溶液を０ ℃に冷却し、２Ｎ ＮａＯＨ（２５ ｍｌ）を添加し、４０分間攪拌した。残留物をＦＣ（溶離剤：Ａ→Ｃ）により精製すると、１．１ ｇ（６１％）の非晶質固体状物が得られた。
【０３６０】
ＴＬＣ （Ｂ） ： Ｒｆ ０．３． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２４５ （１６４００）， ２７４ （１５２００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ２．１３， ２．６７ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （２’）） ； ３．３８， ３．５２ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．８４ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７２ （ｔ， Ｊ＝５．７， ＨＯ−Ｃ （５’）） ； ５．２９ （ｄ， Ｊ＝４．４， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．６６ （‘ｔ’Ｊ＝６．５， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ７．５１−８．１１ （ｍ， 原子． Ｈ） ； ８．４０ （ｓ， Ｈ−Ｃ （３）） ； １０．９５ （ｓ， ＮＨ） ； １１．４９ （ｓ， ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ２４Ｈ２２Ｎ６Ｏ５ （４７４．５） ： Ｃ ６０．７５， Ｈ４．６７， Ｎ１７．７１ ； 実測値：Ｃ６１．０３， Ｈ４．７０， Ｎ１７．５８。
【０３６１】
Ｎ４，Ｎ６−ビス（ベンゾイル）−１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（６ａ）。６ａについて記載したように、ピリジン（３ ｍｌ）中の５ａ （５００ ｍｇ、１．０５ ｍｍｏｌ）およびＤＭＴ−Ｃｌ（４６０ ｍｇ、１．３５ ｍｍｏｌ）を使用した。残留物をＦＣ（溶離剤：Ｄ→Ｅ）により精製すると、４００ ｍｇ（４９％）の無色泡状物が得られた。
ＴＬＣ （Ｅ） ： Ｒｆ ０．４． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２４４ （１６４００）， ２７５ （１５２００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ２．３５， ２．６７ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （２’）） ； ３．０７， ３．１０ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．６８， ３．６９ （２ｓ， ＯＣＨ３） ； ３．９７ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．５６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ５．３５ （ｄ， Ｊ＝４．８， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．７２−８．１１ （ｍ， 原子． Ｈ） ； ８．３６ （ｓ， Ｈ−Ｃ （３）） ； １１．０１ （ｓ， ＮＨ） ； １１．５４ （ｓ， ＮＨ）。
【０３６２】
Ｎ４，Ｎ６−ビス（ベンゾイル）−１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト］（７ｂ）。７ａについて記載したように、ＴＨＦ（３ ｍｌ）中の６ｂ（１１０ ｍｇ、０．４３ ｍｍｏｌ）、（ＩＰｒ）２ＥｔＮ（７５ μｌ、０．４３ ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト（３８ μｌ、０．１７ ｍｍｏｌ）を６０ ℃において使用した。油状残留物をＦＣ（溶離剤：Ｆ）にかけると、９２ ｍｇ（６７％）の無色泡状物が得られた。ＴＬＣ（Ｆ）：Ｒｆ ０．８。３１Ｐ− ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４９．８２、１４９．６３。
【０３６３】
Ｎ４，Ｎ６−ビス（（ジ−ｎ−ブチルアミノ）メチレン）−１−［２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（８ａ）。ＭｅＯＨ（５ ｍｌ）中の２ａ（３００ ｍｇ、１．１３ ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液に、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルアミドジメチルアセタール（７９０ μｌ、３．３９ ｍｍｏｌ）を添加した。４０ ℃において２時間攪拌した。反応混合物を蒸発乾固し、残留物をシリカゲル上に吸収させた。ＦＣ（溶離剤：Ａ→Ｂ）に適用すると、２つの主要な生成物が得られた。より速く移動するゾーンから、８ａの無色泡状物（３３０ ｍｇ、５３％）が単離された。
【０３６４】
ＴＬＣ （Ｂ） ： Ｒｆ ０．４． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２３５ （２２８００）， ２７４ （１３８００）， ３２２ （２５７００）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） ： ０．８７−０．９５ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．２６−１．３８ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．５７−１．６０ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ２） ； ２．４２−２．９２ （ｍ， Ｈ２−Ｃ （２’）） ； ３．２６−３．７２ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）， ＮＣＨ２） ； ３．８８ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．３９ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７８ （ｔ， Ｊ＝５．８， ＨＯ−Ｃ （５’）） ； ５．２１ （ｄ， Ｊ＝４．８， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．５５ （‘ｔ’Ｊ＝６．９， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ７．９３ （ｓ， Ｈ−Ｃ （３）） ； ８．６６ （ｓ， Ｎ＝ＣＨ） ； ８．８８ （ｓ， Ｎ＝ＣＨ）． 分析：計算値：Ｃ２８Ｈ４９Ｎ８Ｏ３ （５４４．７） ： Ｃ ６１．７４， Ｈ８．８８， Ｎ２０．５７ ； 実測値：Ｃ６１．７１， Ｈ８．９１， Ｎ２０．５７。
【０３６５】
より遅く移動するゾーンから、１−［２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−Ｎ６−ビス（（ジ−ｎ−ブチルアミノ）メチレン）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（９ａ）（８０ ｍｇ、１７％）が得られた。
ＴＬＣ （Ｂ） ： Ｒｆ ０．３． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２３５ （２３０００）， ２７５ （１４９００）， ３２０ （２２１００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ０．８８−０．９５ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．２７−１．３６ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．５３−１．６２ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ２） ； ２．２１ （ｍ， Ｈ−Ｃ （２’）） ； ２．９１ （ｍ， Ｈ−Ｃ （２’）） ； ３．３８−３．５９ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）， ＮＣＨ２） ； ３．７９ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４０ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７８ （ｔ， Ｊ＝５．８， ＨＯ−Ｃ （５’）） ； ５．１９ （ｄ， Ｊ＝４．４， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．３６ （ｓ， ＮＨ２） ； ６．４０ （‘ｔ’Ｊ＝６．５， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ７．７７ （ｓ， Ｈ−Ｃ （３）） ； ８．６９ （ｓ， Ｎ＝ＣＨ）． 分析：計算値：Ｃ１９Ｈ３１Ｎ７Ｏ３ （４０５．５） ： Ｃ ５６．２８， Ｈ７．７１， Ｎ２４．１８ ； 実測値：Ｃ５５．９８， Ｈ７．５２， Ｎ２４．０５。
【０３６６】
Ｎ４，Ｎ６−ビス（（ジ−ｎ−ブチルアミノ）メチレン）−３−ブロモ−１−［２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（８ｂ）。８ａについて記載したように、ＭｅＯＨ（７ ｍｌ）中の２ｂ（３５０ ｍｇ、１ ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルアミドジメチルアセタール（７２０ μｌ、３．１ ｍｍｏｌ）を４０ ℃において２時間使用した。ＦＣ（溶離剤：Ａ→Ｂ）後、２つの主要な生成物が単離された。より速く移動するゾーンから、８ｂが泡状物（３１０ ｍｇ、５０％）として得られた。
ＴＬＣ （Ｂ） ： Ｒｆ ０．３． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２３５ （２２５００）， ２７５ （１４５００）， ３２０ （２２１００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ０．９４−０．９９ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．３２−１．４４ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．５９−１．７３ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ２） ； ２．２１ （ｍ， Ｈ−Ｃ （２’）） ； ２．９１ （ｍ， Ｈ−Ｃ （２’）） ； ３．３２−３．７８ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）， ＮＣＨ２） ； ３．８９ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４０ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７８ （ｔ， Ｊ＝５．８， ＨＯ−Ｃ （５’）） ； ５．１９ （ｄ， Ｊ＝４．４， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．８１ （‘ｔ’Ｊ＝６．５， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ８．６９ （ｓ， Ｎ＝ＣＨ） ； ８．９４ （ｓ， Ｎ＝ＣＨ）． 分析：計算値：Ｃ２８Ｈ４７ＢｒＮ８Ｏ３ （６２３．６） ： Ｃ ５３．９３， Ｈ７．６０， Ｎ１７．９７ ； 実測値：Ｃ５４．０１， Ｈ７．５２， Ｎ１８．０５。
【０３６７】
より遅く移動するゾーンから、３−ブロモ−１−［２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−Ｎ６−ビス（（ジ−ｎ−ブチルアミノ）メチレン）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（９ｂ）（７５ ｍｇ、１６％）が得られた。
ＴＬＣ （Ｂ） ： Ｒｆ ０．３． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２３６ （２１６００）， ２７６ （１４０００）， ３２０ （２１９００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ０．９０−０．９６ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．３０−１．３９ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．５９−１．７３ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ２） ； ２．２３ （ｍ， Ｈ−Ｃ （２’）） ； ２．８９ （ｍ， Ｈ−Ｃ （２’）） ； ３．３５−３．７８ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）， ＮＣＨ２） ； ３．８４ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４３ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．８０ （ｔ， Ｊ＝５．７， ＨＯ−Ｃ （５’）） ； ５．２３ （ｄ， Ｊ＝４．６， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．４０ （ｓ， ＮＨ２） ； ６．８１ （‘ｔ’Ｊ＝６．４， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ８．６５ （ｓ， Ｎ＝ＣＨ）． 分析：計算値：Ｃ１９Ｈ３０ＢｒＮ７Ｏ３ （４８４．４） ： Ｃ ４７．１１， Ｈ６．２４， Ｎ２０．２４ ； 実測値：Ｃ４７．２３， Ｈ６．５２， Ｎ２０．３５。
【０３６８】
１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−Ｎ４− （（ジ−ｎ−ブチルアミノ）メチレン）−Ｎ６−ホルミル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（１０ａ）。６ａについて記載したように、ピリミジン（０．５ ｍｌ）中の８ａ（８０ ｍｇ、０．１５ ｍｍｏｌ）、ＤＭＴ−Ｃｌ（６０ ｍｇ、０．１８ ｍｍｏｌ）を使用した。残留物をＦＣ（溶離剤：Ｄ→Ｅ）により精製すると、８５ ｍｇ（７７％）の無色泡状物が得られた。
ＴＬＣ （Ｅ） ： Ｒｆ ０．３． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２３５ （２２８００）， ２７６ （２００００）， ３２０ （２４８００）． １Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） ： ０．９８−１．０５ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．１４−１．４８ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．６５−１．７８ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ２） ； ２．４２−２．９２ （ｍ， Ｈ２−Ｃ （２’）） ； ３．３５−３．７０ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）， ＮＣＨ２） ； ３．７１ （ｓ，ＯＣＨ３） ； ４．０６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．３９ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ５．２１ （ｄ， Ｊ＝４．８， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．５５ （‘ｔ’Ｊ＝６．６， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ６．７６−７．９６ （ｍ， 原子． Ｈ） ； ７．９４ （ｄ， Ｊ＝１０．５， ＮＨ） ； ７．９６ （ｓ， Ｈ−Ｃ （３）） ； ８．８１ （ｓ， Ｎ＝ＣＨ） ； ９．５７ （ｄ， Ｊ＝１０．５， ＣＨＯ）． 分析：計算値：Ｃ４１Ｈ４９Ｎ７Ｏ６ （７３５．９） ： Ｃ ６６．９２， Ｈ６．７１， Ｎ１３．３２ ； 実測値：Ｃ６６．８５， Ｈ６．５６， Ｎ１３．４０。
【０３６９】
３−ブロモ−１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−Ｎ４− （（ジ−ｎ−ブチルアミノ）メチレン）−Ｎ６−ホルミル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（１０ｂ）。６ａについて記載したように、ピリミジン（２ ｍｌ）中の８ａ（３１０ ｍｇ、０．５ ｍｍｏｌ）、ＤＭＴ−Ｃｌ（２０２ ｍｇ、０．６ ｍｍｏｌ）を使用した。残留物をＦＣ（溶離剤：Ｄ→Ｅ）により精製すると、２５０ ｍｇ（６１％）の無色泡状物が得られた。
ＴＬＣ （Ｅ） ： Ｒｆ ０．３． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２３５ （２２９００）， ２７６ （２１１００）， ３２０ （２５３００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ０．９０−０．９６ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．２８−１．３７ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ３） ； １．６１−１．６８ （ｍ， ＣＨ２ＣＨ２） ； ２．２１ （ｍ， Ｈ−Ｃ （２’）） ； ２．９１ （ｍ， Ｈ−Ｃ （２’）） ； ３．０３ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．３５−３．５２ （ｍ， ＮＣＨ２） ； ３．６９　（ｓ，ＯＣＨ３） ； ３．９０ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４８ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ５．３２ （ｄ， Ｊ＝４．７， ＨＯ−Ｃ （３’）） ； ６．４６ （‘ｔ’Ｊ＝６．２， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ６．７３−７．３１ （ｍ， 原子． Ｈ） ； ８．９９ （ｓ， Ｎ＝ＣＨ） ； ９．５６ （ｄ， Ｊ＝９．８９， ＮＨ） ； １０．７７ （ｄ， Ｊ＝９．８８， ＣＨＯ）． 分析：計算値：Ｃ４１Ｈ４８ＢｒＮ７Ｏ６ （８１４．８） ： Ｃ ６０．４４， Ｈ５．９４， Ｎ１２．０３ ； 実測値：Ｃ６０．３６， Ｈ５．７３， Ｎ１１．８５。
【０３７０】
１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−Ｎ４− （（ジ−ｎ−ブチルアミノ）メチレン）−Ｎ６−ホルミル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト］（１１ａ）。７ａについて記載したように、ＴＨＦ（２ ｍｌ）中の１０ａ（１１０ ｍｇ、０．１５ ｍｍｏｌ）、（ＩＰｒ）２ＥｔＮ（７８ μｌ、４５ ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト（４７ μｌ、０．２ ｍｍｏｌ）を使用した。油状残留物をＦＣ（溶離剤：Ｆ）にかけると、７５ ｍｇ（５３％）の無色泡状物が得られた。ＴＬＣ（Ｆ）：Ｒｆ ０．８。３１Ｐ− ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４９．５８、１４９．５２。
【０３７１】
３−ブロモ−１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−Ｎ４− （（ジ−ｎ−ブチルアミノ）メチレン）−Ｎ６−ホルミル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（１１ｂ）。７ａについて記載したように、ＴＨＦ（１ ｍｌ）中の１０ｂ（９０ ｍｇ、０．１１ ｍｍｏｌ）、（ｉＰｒ）２ＥｔＮ（６３ μｌ、３６ ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト（３１ μｌ、０．１４ ｍｍｏｌ）を使用した。油状残留物をＦＣ（溶離剤：Ｆ）にかけると、８０ ｍｇ（７２％）の無色泡状物が得られた。ＴＬＣ（Ｆ）：Ｒｆ ０．８。３１Ｐ− ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４９．５８、１４９．５３。
【０３７２】
実施例２：７−ヨード−誘導体の合成
ハロゲン化「プリン」およびピリミジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドを合成した。ブロモおよびヨード置換基を８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミン（２ｂ、ｃ）の７位またはウラシル残基（３ｂ、ｃ）の５位の中に導入した。２ｂを保護するためにイソブチリル残基および２ｃを保護するためにベンゾイル基を使用して、ホスホルアミダイトを合成した。残基２ｂまたは２ｃを含有するデュプレックスは、同一位置に２’−デオキシアデノシン、プリン−２，６−ジアミン２’−デオキシリボヌクレオシド（１）または２ａを含有する非修飾対応物よりも常により高いＴｍ値を与えた。
【０３７３】
デュプレックス５’−ｄ（ＴＡＧＧＴＣＡＡＴＡＣＴ）（１０２）・５’−ｄ（ＡＧＴＡＴＴＧＡＣＣＴＡ）（１０３）中のｄＡを置換する６つの２ｄ残基は、Ｔｍ値を４８ ℃から７５ ℃（４．５ ℃／修飾）に上昇させた。これと反対に、オリゴヌクレオチドデュプレックスの中に５−ハロゲン化２’−デオキシウリジン３ｂまたは３ｃを組込んでも、「プリン」がそれらに対して反対に位置することに無関係に、熱安定性に対する影響は非常にわずかであった。ＤＮＡにおいて観測されたデュプレックスの熱安定性に対する正の効果が、また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたは平行の向きを有する鎖を有するＤＮＡにおいて見出された。
【０３７４】
下記のデータは、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミン２’−デオキシリボヌクレオシド２ｂ、ｃおよび２’−デオキシウリジン誘導体３ｂ、ｃの７位の中に導入されたハロゲン置換基、例えば、ブロモおよびヨード置換基の効果を比較する（プリンのナンバリングを使用する；スキーム６参照）。これらのヌクレオシドをデュプレックスＤＮＡの種々の位置の中に組込み、そして組込みの数を段階的に増加させる。ハロゲン置換基は主要な溝の中に向けられるので、「プリン」およびピリミジンヌクレオシドの両方の系列において、効果を定量することは重要であった。
【０３７５】
さらに、安定化効果は修飾されたヌクレオシドの組込み数の増加とともに安定することが他のデュプレックス安定化ヌクレオシドから知られているので、多重組込みの効果を研究した（Ｃ． Ｂａｉｌｌｙ、Ｍ． Ｊ． Ｗａｒｉｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８、２６、４３０９およびその中の参考文献；Ｊ． Ｓｅｕｇｉ、Ｅ． Ｓｚａｋｏｎｙｉ、Ｍ． Ｖｏｒｌｉｃｋｏｖａ、Ｊ． Ｋｙｐｒ、Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｄｙｎ． １９９６、１３、１０３５）。７−ハロゲン化７−デアザプリン（＝ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）を組込んだオリゴヌクレオチドデュプレックスは、７−ヨードおよび７−ブロモ化合物の系列において差を示し（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、Ｃｈｅｍ． Ｅｕｒ． Ｊ． １９９８、４、１７８１）、これらはハロゲンの空間的必要条件（ファンデルワールス半径：Ｂｒ＝１．８５Å；Ｉ＝１．９８Å（Ａ． Ｂｏｎｄｉ、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． １９６４、６８、４４１）から生じ、および／またはブロモ残基に比較してヨード置換基のいっそう疎水性の特性から生ずる。
【０３７６】
こうして、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド（２ｃ）の７−ヨード誘導体を合成し、ホスホルアミダイトに変換し、そして７−ヨード化８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ｃを含有する多数のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのデュプレックスの熱安定性を比較すると、Ｂ−ＤＮＡの主要な溝の同様な環境の中に位置するピリミジンまたは８−アザ−７−デアザプリン残基の中に導入されたハロゲンの間における、デュプレックス安定化における顕著な差が例示される。
【０３７７】
【化７０】
2004505988.tif 000049
【０３７８】
２．１．　モノマーの合成および性質
６−イソプロポキシ化合物４（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８、２、２０７）からオートクレーブ中において７０ ℃において水性ＮＨ３で４日間処理することによって、７−ヨード化８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミン２’−デオキシヌクレオシド２ｃを合成した。ハロゲン化ヌクレオシド２ａ、ｂ （Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８、２、２０７）ならびに２’−デオキシウリジン誘導体３ａ〜ｃはどこかで記載された（Ｊ． Ａｓａｋｕｒａ、Ｍ． Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓ、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９０、５５、４９２８）。ハロゲン置換基は、最も遅く移動する化合物としてヨード化２ｃおよび３ｃを有するＲＰ−ＨＰＬＣカラム上のヌクレオシドの移動度を変化させる（第５ａ図および第５ｂ図）。保持時間はヌクレオシドの疎水特性を意味する；塩基−修飾されたオリゴヌクレオチドの組成を後に分析するためにデータを使用した。
【０３７９】
【表８】
2004505988.tif 000050
【０３８０】
修飾されたヌクレオシド２ａ〜ｃおよび３ａ〜ｃの核塩基は、糖部分のＮ←→Ｓ擬回転平衡に影響を及ぼす。これはＤＮＡの糖ホスフェート主鎖のコンフォメーションに影響を与える。この目的のために、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオシド２ｃならびにピリミジンヌクレオシド３ａ〜ｃの１Ｈ ＮＭＲスペクトルをＤ２Ｏ中で測定し、そして３Ｊ［１Ｈ，１Ｈ］ＮＭＲカップリング定数を測定した。プログラムＰＳＥＵＲＯＴ（Ｖａｎ Ｊ． Ｗｉｊｋ、Ｃ． Ａｌｔｏｎａ、‘ＰＳＥＵＲＯＴ ６．２−Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｖｅ−Ｍｅｍｂｅｒｅｄ Ｒｉｎｇｓ’，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｉｄｅｎ， Ｊｕｌｙ １９９３）を使用して、３Ｊ［１Ｈ，１Ｈ］カップリングに基づいてコンフォメーションを解析した。表９によれば、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ａは対応するプリンヌクレオシド１よりも高いＮ−配座異性体の集団を示す。
【０３８１】
Ｃ（４’）−Ｃ（５’）結合の回りのコンフォメーションは、８−アザ−７−デアザプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド２ｃは８−アザ−７−デアザ−２’−デオキシ−グアノシン（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｈ． Ｒｏｓｅｍｅｙｅｒ、Ｈ． Ｒｅｕｔｅｒ、Ｇ． Ｋａｓｔｎｅｒ、Ｉ． Ａ． Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９９９、８２、１０５）のようにγｔ−（−ｓｃ）−回転異性体の集団を好むことを示すが、正規のプリンヌクレオシドについて、γ（＋）ｇ−（＋ｓｃ）−またはγ（−）ｇ−（ａｐ）−コンフォメーションが優勢を占める （Ｇ． Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ、‘Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ’、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９０、ｐ． ２８）。また、ピリジンヌクレオシド３ａ〜ｃの糖部分のコンフォメーションは５位における置換基により影響を受ける（第９表）。５−置換基をもたない３ａとＭｅまたはハロゲン置換基をもつ誘導体３ｂ、ｃとの間で主要な変化が観測される。
【０３８２】
【表９】
2004505988.tif 000051
【０３８３】
ヌクレオシド２ｂのアミノ基の反応性はむしろ１と異なるので、種々の残基を塩基の保護について研究した。以前に、ヌクレオシド２ｂはＮ，Ｎ−ジ−（ｎ−ブチル）ホルムアミジン（ｄｎｂ）残基で保護した。今回、一時的保護のプロトコルを使用して、イソブチリル基を導入した（２ｂ→１３ａ）（Ｇ． Ｓ． Ｔｉ、Ｂ． Ｌ． Ｇａｆｆｎｅｙ、Ｒ． Ａ． Ｊｏｎｅｓ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８２、１０４、１３１６）。副生物として、モノ−保護されたヌクレオシド１４が単離された（２２％）。モノ−アシル化化合物の生成が他の２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの場合において観測されてきている（Ｉ． Ｌｕｙｔｅｎ、Ａ． Ｖ． Ａｅｒｓｃｈｏｔ、Ｊ． Ｒｏｚｅｎｓｋｉ、Ｒ． Ｂｕｓｓｏｎ、およびＰ． Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９７、１６、１６４９）。
【０３８４】
２５％水性ＮＨ３中で４０ ℃において化合物１３ａまたは１４のアルカリ性加水分解を実施するとき、速い脱保護が観測された（スキーム７参照）。１３ａまたは１４の半減期を測定し、それぞれ、４．５分および２０．５分であった。それが示すように、この保護基は固相オリゴヌクレオチド合成に適当である。ヨードヌクレオシ２ｃを保護するために、２ｂにおけるように一時的保護のプロトコルをを使用したが、この場合において、ベンゾイル基を選択した（２ｃ→１３ｂ）。１３ｂの完全な脱保護時間（２５％水性ＮＨ３中で４０ ℃、２６０ ｎｍにおけるＨＰＬＣモニター）は４５０分であった。段階的反応のために、半減期を測定しなかった。
【０３８５】
標準的反応条件を使用して、塩基保護ヌクレオシド１３ａ、ｂならびにピリジンヌクレオシド３ａ〜ｃをＤＭＴ−誘導体１５ａ、ｂ、および１７ａ〜ｃに変換した（Ｙ． Ｓ． Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｇ． Ｄ． Ｈｏｋｅ、Ｓ． Ｍ． Ｆｒｅｉｅｒ、Ｍ． Ｃ． Ｚｏｕｎｅｓ、Ｃ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｌ． Ｃｕｍｍｉｎｓ、Ｈ． Ｓａｓｍｏｒ、Ｐ． Ｄ． Ｃｏｏｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９３、２１、３１９７）。ＤＭＴ−誘導体１５ａ、ｂのホスフィチル化をＴＨＦ中で２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイトの存在下に実施して、ホスホルアミダイト１６ａ、ｂ（スキーム７）を生成した；ジクロロメタン中で１７ａ〜ｃから、ピリミジン構築ブロック１８ａ〜ｃを製造した（Ｙ． Ｓ． Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｇ． Ｄ． Ｈｏｋｅ、Ｓ． Ｍ． Ｆｒｅｉｅｒ、Ｍ． Ｃ． Ｚｏｕｎｅｓ、Ｃ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｌ． Ｃｕｍｍｉｎｓ、Ｈ． Ｓａｓｍｏｒ、Ｐ． Ｄ． Ｃｏｏｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９３、２１、３１９７）。
【０３８６】
それらのホスホルアミダイト（１６ａ、ｂおよび１８ａ〜ｃ）を固相オリゴヌクレオチド合成において使用した。すべての化合物を１Ｈ−、１３Ｃ−、および３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルおよび元素分析により特性決定した（第１０表）。８−アザ−７−デアザプリンの１３Ｃ ＮＭＲデータならびにピリミジンヌクレオシドのそれらを第１１表に要約する。ゲーテッド・デカップルド・スペクトル（ｇａｔｅｄ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ）に従い、割りあてを実施した。その事柄について情報をわずかの情報与えた文献の検索として、３ａ〜ｃのＮＭＲデータを含めた。
【０３８７】
【化７１】
2004505988.tif 000052
【０３８８】
【表１０】
2004505988.tif 000053
【０３８９】
２．２．　オリゴヌクレオチド
２．２．１．　合成および特性決定
ホスホルアミダイト１６ａ、ｂおよび１８ａ〜ｃならびに標準的構築ブロックを使用して、オリゴヌクレオチドの自動化固相合成（表１１〜１７）を実施した。合成は標準的プロトコル（Ｓ． Ｌ． Ｂｅａｕｇｅ、Ｍ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９８１、２２、１８５９）に従い、そしてカップリング収率は常に９７％より高かった。ハロゲン化ｄＵ−残基を含有するオリゴヌクレオチドは、カノニカルホスホルアミダイトを保護するために４−ｔ−ブチルフェノキシアセチル（ｔａｃ）基の使用を必要とする（Ｅ． Ｆｅｒｒｅｒ、Ｃ． Ｆａｂｒｅｇａ、Ｒ． Ｇ． Ｇａｒｃｉａ、Ｆ． Ａｚｏｒｉｎ、Ｒ． Ｅｒｉｔｊａ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９６、１５、９０７；Ｊ． Ｃ． Ｓｃｈｕｌｈｏｆ、Ｄ． Ｍｏｌｋｏ、およびＲ． Ｔｅｏｕｌｅ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８７、１５、３９７；Ｒ． Ｄ． ＳｈｅａｒｄｙおよびＮ． Ｃ． Ｓｅｅｍａｎ、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９８６、５１、４３０１）。
【０３９０】
これらの場合において、温室において濃アンモニアを使用して脱保護を実施したが、すべての他の場合において、脱保護は６０ ℃において実施した。オリゴヌクレオチドを脱トリチル化し、精製カートリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、‘Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ’）または逆相ＨＰＬＣ（精製条件、実験の部分参照）により精製した。化合物の均質性はイオン交換クロマトグラフィーにより証明された（実験の部分参照）。記載されたように（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｃ． Ｗｅｉ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９９９、８２、７２６）ヘビ毒液ホスホジエステラーゼおよび適用を使用するタンデム加水分解および引き続くＲＰ−１８ ＨＰＬＣにより、オリゴヌクレオチドの組成を決定した。典型的な例は第５ｃ図および第５ｄ図に示されている。新しく組込まれたヨードヌクレオシド２ｃまたは３ｃはカノニカルＤＮＡ構成成分よりもゆっくり移動する。また、オリゴヌクレオチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により特性決定した。検出された質量は計算値とよく一致する（第１８表）。
【０３９１】
【表１１】
2004505988.tif 000054
【０３９２】
２．２．２　オリゴヌクレオチドデュプレックスの塩基対安定性
７−ブロモヌクレオシド２ｂはＤＮＡデュプレックスを強く安定化することが見出されたが、非ハロゲン化化合物２ａのデュプレックスに対する寄与は非常にわずかである（また、下記の文献を参照のこと：Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ２０００、８３、９２８；Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９、１８、１３９９）。デュプレックス安定性に対するプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド１の寄与はより低い（Ｃ． Ｃｈｅｏｎｇ、Ｉ． Ｊ． Ｔｉｎｏｃｏ、Ａ． Ｃｈｏｌｌｅｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８８、１６、５１１５；Ｊ． Ｄ． Ｈｏｈｅｉｓｅｌ、Ｈ． Ｌｅｈｒａｃｈ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ． １９９０、２７４、１０３）。こうして、化合物１−チミン塩基対を含有するＤＮＡデュプレックスはｄＡ−ｄＴ対をもつものよりもほんのわずかに安定である。
【０３９３】
ブロモヌクレオシド２ｂの安定化作用が組込み数の増加により連続的に増加するか、あるいは多重組込みにより安定化するかどうかは知られていなかったので−他の修飾されたヌクレオシドについて報告されているように （Ｃ． Ｂａｉｌｌｙ、Ｍ． Ｊ． Ｗａｒｉｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８、２６、４３０９およびその中の参考文献）−１系列のオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドは連続的方法でまたは離れた位置にハロゲン化化合物２ｂを含有した。修飾された残基を二本鎖ＤＮＡの一方または両方の鎖の中に組込んだ。組込みの総数をデュプレックスにおいて１から６に増加させた。化合物２ａを含有する非ハロゲン化デュプレックスを比較のために製造した。ブロモヌクレオシド２ｂの組込みを別として、ヨード化合物２ｃをまた合成した。すべての実験について、非自己相補的デュプレックス５’−ｄ（ＴＡＧＧＴＣＡＡＴＡＣＴ）（１０２）・５’−ｄ（ＡＧＴＡＴＴＧＡＣＣＴＡ）（１０３）を選択した。
【０３９４】
非ハロゲン化ヌクレオシド２ａは標準的デュプレックス１０２・１０３のＴｍ値をわずかに１ ℃／修飾された残基だけ増加させる（第１１表およびＦ． Ｓｅｅｌａ、Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、２００１、提出）。逆に、ブロモ化合物２ｂは４〜５ ℃の安定化／修飾された残基を寄与し、これは非カノニカル塩基により誘導された、顕著に高い安定化を表す。この効果の強さは配列従属的であるが、デュプレックスの安定性は第６図に示すように２ｂの組込み数とともに増加する。ヨードヌクレオシド２ｃをブロモ化合物２ｂで置換したとき、デュプレックス安定化に関する同様な効果が観測される（第１１表）。ｄＧ（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９９９、８２、１６４０） またはｄＡ（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １ １９９９、４７９）のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体の中に導入されたハロゲン置換基の効果はわずかに２ ℃／修飾された残基である。
【０３９５】
ハロゲン化２’−デオキシウリジン誘導体３ｂまたは３ｃを使用して、ハロゲン化８−アザ−７−デアザプリンヌクレオシド２ｂまたは２ｃを含有するデュプレックスについて記載した実験と同様な組の実験を実施した（第１２表）。ブロモヌクレオシド３ｂまたはヨードヌクレオシド３ｃのいずれも、非ハロゲン化３ａまたはｄＴのそれに比較してデュプレックスの安定性を有意に増加しない。こうして、８−アザ−７−デアザプリン（ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）部分の７位に位置するハロゲン置換基を有する型Ｉ（スキーム８）の塩基対のみがハロゲン置換基により安定化されるが、ピリミジン塩基の５位に結合した型ＩＩ（スキーム８）の塩基対はｄＡ−ｄＴ対を有するものに比較してわずかの影響を発揮する。
【０３９６】
【化７２】
2004505988.tif 000055
【０３９７】
【表１２】
2004505988.tif 000056
【０３９８】
【表１３】
2004505988.tif 000057
【０３９９】
【表１４】
2004505988.tif 000058
【０４００】
ｄＴに対して反対に組込まれたハロゲン化ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン化合物２ｂまたは２ｃに比較して、ｄＡをもつハロゲン化ピリミジンヌクレオシド３ｂまたは３ｃの塩基対の安定性は低かったので、ｄＡの代わりにプリン−２，６−ジアミンヌクレオシド１に対して反対にハロゲン化ピリミジンヌクレオシド３ａ〜ｃが位置する、三座の塩基対を形成する（スキーム９、ｂｐ型ＩＩＩ）。この場合において、第３水素結合が可能である場合、塩基対の強化を期待することができる。しかしながら、ｄＡ−残基をヌクレオシド１で置換することによって、これらのデュプレックスのＴｍ値もまた影響を有意に受けなかった（第１３表）。
【０４０１】
これにより示されるように、ＩＩＩａ〜ｃ（スキーム９）に示すように２−アミノ基は可能な塩基対に参加せず、これは１とｄＴとの間の塩基対について観測されたものに類似する（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、２００１、提出；Ｃ． Ｃｈｅｏｎｇ、Ｉ． Ｊ． Ｔｉｎｏｃｏ、Ａ． Ｃｈｏｌｌｅｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８８、１６、５１１５；Ｊ． Ｄ． Ｈｏｈｅｉｓｅｌ、Ｈ． Ｌｅｈｒａｃｈ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ． １９９０、２７４、１０３）。ヌクレオシド２ａとピリミジンヌクレオシド３ａ〜ｃとの間で形成した塩基対ＩＶａを含有するデュプレックス（スキーム９）の場合において、同様な挙動が見出された（第１３表）。それにもかかわらず、塩基対ＩＶｂ、ｃを組込んだデュプレックスは塩基対ＩＩＩｂ、ｃを含有するものよりもわずかに安定である。
【０４０２】
【化７３】
2004505988.tif 000059
【０４０３】
【表１５】
2004505988.tif 000060
【０４０４】
ピリミジンヌクレオシド３ｂ〜ｃに対して反対にハロゲン化８−アザ−７−デアザプリンヌクレオシド２ｂまたは２ｃを組込むとき、有意なデュプレックス安定化が観測された（第１４表およびスキーム１０、型ＶおよびＶＩのｂｐ）。Ｔｍ−増加は約４〜５ ℃／ハロゲン化ヌクレオシド２ｂまたは２ｃの組込まれた残基である。ハロゲン化ヌクレオシド２ｂまたは２ｃを含有するすべてのデュプレックス（スキーム１０）は、どのピリミジンモノマーがそれに対して反対に位置するかどうかにかかわらず、非常に同様なＴｍ値を与える。こうして、修飾されたプリン残基に結合したハロゲン置換基のみがデュプレックス安定化に導くが、２’−デオキシウリジンの５位に結合したハロゲンのデュプレックス安定性に対する寄与は非常にわずかである（Ｓ． Ｍ． ＦｒｅｉｅｒおよびＫ．−Ｈ． Ａｌｔｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７、２５、４４２９；Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｙ． Ｈｅ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ２０００、８３、２５２７；Ｓ． Ｗａｎｇ、Ｅ． Ｔ． Ｋｏｏｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５、３４、４１２５）。
【０４０５】
【化７４】
2004505988.tif 000061
【０４０６】
【表１６】
2004505988.tif 000062
【０４０７】
２．２．３　塩基の識別
４つのカノニカルＤＮＡ−構成成分に対するヨードヌクレオシド２ｃの識別を研究するために、第１５表に従いハイブリダイゼーション実験を実施した。期待されるように、塩基対２ｃ−ｄＴは最も強い（１０２・１００、Ｔｍ＝５９ ℃）が、ミスマッチを形成するデュプレックスのそれらは有意により低い温度において溶融する（第１５表）。ヨードヌクレオシド２ｃの識別はカノニカルヌクレオシドのそれに類似し、ただしデュプレックス４０１・１００（Ｔｍ＝５２ ℃）はデュプレックス１０２・１００（Ｔｍ＝５９ ℃）よりも７ ℃低いＴｍ値を示すが、デュプレックス４０１・１０３ （Ｔｍ＝４６ ℃）は親デュプレックス１０２・１０３（Ｔｍ＝４８ ℃）とほとんど同一の安定性を有する。４０１・１０３の高いＴｍ値は、ｄＧと化合物２ｃとの間で明らかに形成されないｄＧ−ｄＡフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）対が形成する結果である。
【０４０８】
【表１７】
2004505988.tif 000063
【０４０９】
２−アミノ−８−アザ−７−デアザ−デニン誘導体を含有するデュプレックスのＣＤ−スペクトルを次に測定した。第７ａ図に表示された曲線から、Ｂ様ＤＮＡ構造を推定することができる。２７０〜２９０ ｎｍ付近に正のコットン効果および２５０ ｎｍにおいて負のローブが、標準的デュプレックス（１０２・１０３）について観測される。１を含有するデュプレックス１０４・１０５のＣＤスペクトルは１１０・１１１のそれに類似する有意差を示すが、デュプレックス１０８・１０９は２６０ ｎｍ付近により強いコットン効果および２３５ ｎｍにおいて正のものを示す。７−置換８−アザ−−７−デアザ−７−ヨードグアニンを含有するオリゴヌクレオチドについて、同様な差が観測された（Ｎ． Ｒａｍｚａｅｖａ、Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９９６、７９、１５４９）。
【０４１０】
２．４　ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの安定性に対する２、６−ジアミノヌクレオシド１および２ａ、ｂの影響を研究するために、オリゴデオキシリボヌクレオチド１１０、３００、３０２、３０４、３０４、１０４および１０２をオリゴリボヌクレオチド４０３とハイブリダイゼーションさせた。第１６表は種々の修飾がＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのデュプレックス安定性に対して有意な影響を発揮するを示す。非ハロゲン化ヌクレオシド１または２ａの組込みはＤＮＡ−ＲＮＡ構造を非常にわずかに安定化するが、２ｂを含有するオリゴヌクレオチドと４０３（１１０・４０３）とのハイブリダイゼーションはＤＮＡにおけるようなデュプレックス安定性の有意な増加を示す。化合物３ｂおよび３ｃはＤＮＡ−ＲＮＡの熱安定性を小さい程度に増強し、これはまた２’−デオキシウリジンの他の修飾について観測される（Ｂ． Ｃ Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、Ｓ． Ｗａｄｗａｎｉ、Ｔ． Ｊ． Ｔｅｒｈｏｒｓｔ、Ｓ． Ｒ． Ｇｅｒｒａｒｄ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２、３３、５３０７；Ｊ． Ｓａｇｉ、Ａ． Ｓｚｅｍｚｅｕ、Ｋ． Ｅｂｉｎｇｅｒ、Ａ． Ｓｚａｂｏｃｌｃｓ、Ｇ． Ｓａｇｉ、Ｅ． Ｒｕｆｆ、Ｌ． Ｅｕｔｖｅｕｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９３、３４、２１９１）。キメラハイブリッドの淡色性はＤＮＡ−ＤＮＡデュプレックスのそれらを超えてわずかに減少される（データは示されていない）。第７Ｂ図のＣＤ−スペクトルから理解できるように、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはＡ−形態を採用する（Ｎ． Ｒａｍｚａｅｖａ、Ｃ． Ｍｉｔｔｅｌｂａｃｈ、Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９９７、８０、１８０９）。
【０４１１】
【表１８】
2004505988.tif 000064
【０４１２】
２．５　平行鎖の向きを有するデュプレックス
また、ヌクレオシド１、２ａ〜ｃの塩基対合を平行鎖ＤＮＡにおいて研究された［２９］。この目的のために、ｄＣ−ｄＧ対をｍ５ ｉＣｄ−ｉＣｄ対で置換することが必要であった。デュプレックス１０２・１１５および１１６・１０３を標準として使用した（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｃ． Ｗｅｉ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、Ｐ． Ｌｅｏｎａｒｄ、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２０００、１０、２８９）。ｄＡ−残基をジアミノヌクレオシド１で置換すると、ｐｓ−デュプレックス１０４・１１５および１１６・１０５の安定性はわずかに減少した（第１７表）。
【０４１３】
２ａ〜ｃをｐｓ−ＤＮＡの中に組込むと、Ｔｍ値が有意に増加した。ｄＴの代わりに置換ピリミジンヌクレオシド３ｂ、ｃを組込むと、Ｔｍ値はわずかに小さく変化するだけである。これから、逆平行連鎖の向きを有するＤＮＡと同様に、「プリン」ヌクレオシド２ｂ、ｃのハロゲン置換基はこれらのデュプレックスを安定化するが、デュプレックス安定性に対するピリミジンヌクレオシドのハロゲン置換基の寄与は非常にわずかであると結論することができる。
【０４１４】
【表１９】
2004505988.tif 000065
【０４１５】
２．３．　結論
８−アザ−７−デアザプリン２’−デオキシヌクレオシド（２ｂ、ｃ）の７位または２’−デオキシウリジン残基（３ａ〜ｃ）の５位の中に導入されたハロゲン置換基は、核酸デュプレックスの安定性に対して非常に異なる影響を有する。７−ハロゲン化８−アザ−７−デアザプリン２’−デオキシヌクレオシド２ｂ、ｃの場合において、各モノマーはデュプレックス安定性に対して約４ ℃〜５ ℃を寄与するが、ピリミジンヌクレオシド３ａ〜ｃは非常にわずかの影響を示すか、あるいは効果を示さないことさえある。
【０４１６】
これは驚くべきことである。なぜなら、両方の系列のヌクレオシドはＢ−ＤＮＡの主要な溝の中に向けられ、両方は同一ではなく、非常に類似する環境であるからである。両方の、ハロゲン化ピリミジンおよびハロゲン化８−アザ−７−デアザプリンヌクレオシドがＤＮＡ−デュプレックスの中に存在するとき、後者のみがデュプレックス安定性に寄与する。結局、親油性ハロゲン置換基により誘導された主要な溝の疎水性特性および水分子の駆逐は、主要な溝のハロゲン化により誘導される主要な効果ではない。明らかなように、最も近い隣の存在物間のスタッキング相互作用は２ｂ、ｃの場合において強化されるが、３ｂ、ｃでは強化されない。
【０４１７】
２．４．　実験の部分
モノマー。一般的事項。前述の文献を参照のこと（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ２０００、８３、９２８；Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９、１８、１３９９；Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １ １９９９、４７９）。フラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）：シリカゲル６０Ｈ（Ｍｅｒｋ、ドイツ国ダーマシュタット）上で０．４バール。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：アルミニウムシート、シリカゲル６０ Ｆ２５４（０．２ ｍｍ、Ｍｅｒｋ、ドイツ国）。ＦＣおよびＴＬＣのための溶媒系：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９：１（Ａ）、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９５：５（Ｂ）、ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン９：１（Ｃ）、ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ ８５：１５（Ｄ）、ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン９５：５（Ｅ）。融点：Ｂｕｃｈｉ−ＳＭＰ−２０装置（Ｂｕｃｈｉ、スイス国）；未補正。ＮＭＲスペクトル：Ａｖａｎｃｅ−ＤＰＸ−２５０およびＡＭＸ−５００スペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ国）；δ値（ｐｐｍ）は内部ＳｉＭｅ４ （１Ｈ、１３Ｃ）からダウンフィールドである。Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅｓ Ｌａｂｏｒ Ｂｅｌｌｅｒ （Ｇｅｕｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ国）により、微量分析を実施した。
【０４１８】
オリゴヌクレオチド。−オリゴヌクレオチドの合成はＤＮＡ合成装置、モデル３９２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ国ウェイテルシュタット）により実施した。
Ｃａｒｙ熱電制御装置を装備したＣａｒｙ−１／３ ＵＶ／ＶＩＳスペクトロメーター（Ｖａｒｉａｎ、オーストラリア国）で、溶融曲線を測定した。Ｐｔ−１００抵抗器を有する参照電池で温度を連続的に測定し、メルトウィン（Ｍｅｌｔｗｉｎ）３．０プログラム（Ｊ． Ａ． ＭｃＤｏｗｅｌｌＤ． Ｈ． Ｔｕｒｎｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６、３５、１４０７７）を使用して、デュプレックス形成の熱力学的データを計算した。
【０４１９】
サーモスタット（Ｌａｕｄａ−ＲＣＳ−６浴）制御の１ ｃｍのキュベットを有するＪａｓｃｏ−６００（Ｊａｓｃｏ、日本国）でＣＤ−スペクトルを記録した。紫外線スペクトル：１５０−２０スペクトロメーター（Ｈｉｔａｃｈｉ、日本国）。記載されたように（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ２０００、８３、９２８；Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、 Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９、１８、１３９９） 下記の吸光係数を使用してオリゴマーの酵素的加水分解実施した：ε２６０：７Ｇｄ ２７００、ｄＴ ８８００、ｄＣ ７３００、ｄＡ １５４００、ｄＧ １１７００、２ａ ８８００、２ｂ ８７００、２ｃ ８７００、３ａ １００００、３ｂ ４８００、３ｃ ３７００。ヘビ毒液ホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１５．１．、Ｃｒｏｔａｌｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ）およびアルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１．、Ｅ． ｃｏｌｉ）をＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（ドイツ国）から入手した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルはＢｉｆｌｅｘ ＩＩＩ （Ｂｒｕｋｅｒ Ｓａｘｏｎｉａ、ドイツ国）により測定された。
【０４２０】
オリゴヌクレオチドの合成および精製。−合成は１ μｍｏｌの規模で２ａ〜ｃを含有するオリゴヌクレオチドの合成に［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｉｂ２Ｇｄ、［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｂｚ６Ａｄ、［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｂｚ４Ｃｄおよび［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］Ｔｄおよび３ａ〜ｃを含有するオリゴヌクレオチドの合成に［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｔａｃ２Ｇｄ、［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｔａｃ６Ａｄ、［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］ｔａｃ４Ｃｄおよび［（ＭｅＯ）２Ｔｒ］Ｔｄの３’−ホスホロアミダイトを使用して実施した。固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断した後、第１のオリゴヌクレオチドを２５％ＮＨ３中で１２〜１５時間、６０ ℃において脱保護した。後者を脱保護のために２５％ＮＨ３中で１２〜１５時間、６０ ℃においてインキュベートした。５’−（ジメトキシトリチル）−オリゴマーの精製を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８）により実施した。
【０４２１】
下記の溶媒の勾配を使用した（Ａ、０．１Ｍ （Ｅｔ３ＮＨ）ＯＡｃ（ｐＨ ７．０）／ＭｅＣＮ ９５：５；Ｂ、ＭｅＣＮ）：３分Ａ中の２０％Ｂ、１２分Ａ中の２０〜４０％Ｂ、１．０ ｍｌ／分の流速。濃縮したオリゴヌクレオチド溶液を温室において５分間２．５％ＣＨＣｌ２ＣＯＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で処理して４，４’−ジメトキシトリチル残基を除去した。脱トリチル化オリゴマーを逆相ＨＰＬＣで精製した：勾配、２０分Ａ中の０〜２０％Ｂ、流速１ ｍｌ／分。オリゴマーを短いカラム（ＲＰ−１８、シリカゲル）上で脱塩し、次いでＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ蒸発装置で凍結乾燥すると、無色固体状物が得られ、これを−２４ ℃において凍結させた。精製したオリゴマーを１００μｌの２回蒸留したＨ２Ｏ中に溶解し、純度をＤｉｏｎｅｘ−Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ−ＰＡ−１００ ＨＰＬＣカラム（４×２５０ ｎｍ、Ｐ／Ｎ ０４３０１０；Ｄｉｏｎｅｘ、ドイツ国イドステイン）。
【０４２２】
ヌクレオシド組成の分析。−オリゴヌクレオチドを０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．３）中に溶解し、３７ ℃においてヘビ毒液ホスホジエステラーゼ（３ μｌ）で４５分間処理し、次いでアルカリ性ホスファターゼ（３ μｌ）でさらに３０分間処理した。反応混合物を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８、２６０ ｎｍ、勾配Ａ、０．７ ｍｌ／分）。２ａ〜ｃおよび３ａ〜ｃの保持時間を標準として使用した（第５図）。ヌクレオシドの吸光係数およびピーク面積をオリゴヌクレオチドの組成の定量に使用した（第５ａ図〜第５ｄ図）。
【０４２３】
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン （２ｃ）。水性２５％ＮＨ３溶液（８０ ｍｌ）中の６−アミノ−１−［２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−３−ヨード−４−イソプロポキシ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン１２（Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８、２、２０７）（１ ｇ、２．３ ｍｍｏｌ）の溶液を７０ ℃に４日間加熱した。溶媒を蒸発乾固し、残留物を熱水中に溶解し、結晶化させた。融点１５４ ℃。ＴＬＣ （Ａ） ： Ｒｆ ０．２． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２２３ （３１８００）， ２６０ （８７００）， ２７８ （９１００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ２．１２ （ｍ， Ｈα−Ｃ （２’）） ； ２．６７ （ｍ， Ｈβ−Ｃ （２’）） ； ３．３８， ３．４４ （ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．７３ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．３３ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７３ （ｔ， Ｊ＝５．７， ＯＨ−Ｃ （５’）） ； ５．１７ （ｄ， Ｊ＝４．３， ＯＨ−Ｃ （３’）） ； ６．２７ （‘ｔ’Ｊ＝６．５， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ６．３４ （ｂｒ， ＮＨ２） ； ６．６２ （ｂｒ， ＮＨ２）． 分析：計算値：Ｃ１０Ｈ１３ＩＮ６Ｏ３ （３９２．２） ： Ｃ ３０．６３， Ｈ３．３４， Ｎ２１．４３ ； 実測値：Ｃ３０．９１， Ｈ３．６１， Ｎ２１．２７。
【０４２４】
３−ブロモ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４，６−［（２−メチルプロパノイル）アミノ］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン （１２ａ）。化合物２ｂ （Ｆ． Ｓｅｅｌａ、Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８、２、２０７）（０．７４ ｇ、２．１４ ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと３回共蒸発させ、温室において攪拌しながら無水ピリジン（５ ｍｌ）中に溶解した。Ｍｅ３ＳｉＣｌ（１．３７ ｍｌ、１０．８ ｍｍｏｌ）、および１５分後無水イソ酪酸（３．５６ ｍｌ、２１．５　ｍｍｏｌ）を添加した。攪拌を３時間続けた。反応混合物を氷浴中で冷却し、Ｈ２Ｏで希釈し、５分後、水性２５％ＮＨ３ （４．３ ｍｌ）を添加した。３０分後、反応混合物を蒸発乾固し、トルエンと共蒸発させた（３回）。残基をＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９：１）により精製すると、２つのゾーンが得られた。速く移動するゾーンから、化合物１３ａが無色非晶質固体状物が得られた（５００ ｍｇ、４８％）。
【０４２５】
Ｒｆ （Ａ） ０．４． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２８４ （９５００）， ２３９ （３３９００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： １．１５ （ｍ， ２ＣＨ （ＣＨ３）２） ； ２．２５ （ｍ， Ｈα−Ｃ （２’）） ； ２．７５ （ｍ， Ｈβ−Ｃ （２’）） ； ２．８６ （ｍ， ２ＣＨ （ＣＨ３）２） ； ３．４７ （ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．８１ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４４ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７３ （ｔ， Ｊ＝５．５， ＯＨ−Ｃ （５’）） ； ５．３２ （ｄ， Ｊ＝４．３， ＯＨ−Ｃ （３’）） ； ６．５４ （‘ｔ’Ｊ＝６．６， Ｈ−Ｃ （１’）） ； １０．５９， １０．７２ （２ｓ， ２ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ１８Ｈ２５ＢｒＮ６Ｏ５ （４８５．３） ： Ｃ ４４．５５， Ｈ５．１９， Ｎ１７．３２ ； 実測値：Ｃ４４．９０， Ｈ５．２８， Ｎ１６．８１。
【０４２６】
４−ブロモ−３−ブロモ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−６−［（２−メチルプロパノイル）アミノ］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン （１４）。上記反応において、ゆっくり移動する移動するゾーンから、無色非晶質固体状物が得られた（０．２ ｇ、２２％）。
Ｒｆ （Ａ） ０．３６． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２８２ （１０９００）， ２３７ （４９５００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： １．０４， １．０７ （ｍ， ＣＨ （ＣＨ３）２） ； ２．２１ （ｍ， Ｈα−Ｃ （２’）） ； ２．７１ （ｍ， Ｈβ−Ｃ （２’）） ； ２．９０ （ｍ， ＣＨ （ＣＨ３）２） ； ３．４６ （ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．７８ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．３８ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７２ （ｔ， Ｊ＝５．６， ＯＨ−Ｃ （５’）） ； ５．２８ （ｄ， Ｊ＝４．３， ＯＨ−Ｃ （３’）） ； ６．４２ （‘ｔ’Ｊ＝６．４， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ６．９６， ７．７６ （ｂｒ， ＮＨ２） ； １０．０８ （ｂｒ， ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ１４Ｈ１９ＢｒＮ６Ｏ４ （４１５．２） ： Ｃ ４０．４９， Ｈ４．６１， Ｎ２０．２４ ； 実測値：Ｃ４０．５８， Ｈ４．７２， Ｎ１９．９３。
【０４２７】
１−［２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−４，６−ジベンズアミド−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン （１２ａ）。化合物２ｃ （１．０ ｇ、２．５５ ｍｍｏｌ）をトルエンと２回共蒸発させた。それを無水ピリジン（４０ ｍｌ）およびＴＭＳ−Ｃｌ（３．２５ ｍｌ、２５．５ ｍｍｏｌ）を攪拌しながら添加した。反応混合物をアルゴ雰囲気下に攪拌し、０ ℃に冷却し、ＰｈＣＯＣｌ（３．０ ｍｌ、２５．８ ｍｍｏｌ）を３０分以内にを滴下した。温室において一夜攪拌した後、この混合物をＥｔＯＡｃ（２００ ｍｌ）で希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３溶液（２００ ｍｌ）および氷冷Ｈ２Ｏ（２００ ｍｌ）で洗浄した。水性相をＥｔＯＡｃ（２×４００ ｍｌ）で抽出した。一緒にした有機相を蒸発乾固し、残留物をＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２５０ ｍｌ、５：４：１）中に溶解した。暗色有機溶液を０ ℃に冷却し、次いで２Ｎ ＮａＯＨ（２５ ｍｌ）を添加し、さらに４０分間攪拌した。残留物をＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９８：２ → ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５）により精製すると、非晶質固体状物が得られた（１．１５ ｇ、７５％）。
【０４２８】
ＴＬＣ （Ｂ） ： Ｒｆ ０．４． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２４４ （１７４００）， ２７６ （１４２００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ２．１３ （ｍ， Ｈα−Ｃ （２’）） ； ２．６７ （ｍ， Ｈβ−Ｃ （２’）） ； ３．３８， ３．５２ （ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．８４ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ４．７２ （ｔ， Ｊ＝５．７， ＯＨ−Ｃ （５’）） ； ５．２９ （ｄ， Ｊ＝４．４， ＯＨ−Ｃ （３’）） ； ６．６６ （‘ｔ’Ｊ＝６．５， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ７．５１−８．１１ （ｍ， 原子． Ｈ） ； １０．５４， １０．７８ （ｓ， ２ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ２４Ｈ２１ＩＮ６Ｏ５ （５８６．４） ： Ｃ ４８．０１， Ｈ３．５３， Ｎ１４．００ ； 実測値：Ｃ４７．９３， Ｈ３．５３， Ｎ１４．０５。
【０４２９】
３−ブロモ−１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−４，６−ジイソブチリルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン （１５ａ）。化合物１３ａ （０．５ ｇ、１．０３ ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと３回共蒸発させ、ピリジン（１．５ ｍｌ）中に溶解した。ＤＭＴ−Ｃｌ（０．４５ ｇ、１．３３ ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を温室において３時間攪拌した。反応をＭｅＯＨの添加によりクエンチし、この混合物を蒸発乾固し、トルエンと３回共蒸発させた。ＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ１０：１）により、無色泡状物として１５ａが得られた（０．５７ ｇ、７０％）。
Ｒｆ （Ｂ） ０．３． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２３７ （５２０００）， ２８３ （１０５００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： １．０４−１．１７ （ｍ， ２ （ＣＨ３）２ＣＨ）） ； ２．２９ （ｍ， Ｈα−Ｃ （２’）） ； ２．８５ （ｍ， Ｈβ−Ｃ （２’）） ； ２．８９ （ｍ， ２ （ＣＨ３）２ＣＨ）） ； ３．０７ （ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．７１ （ｓ， ２ ＭｅＯ） ； ３．９４ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．４６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ５．３５ （ｍ， ＯＨ−Ｃ （３’）） ； ６．５７ （ｍ， Ｈ−Ｃ （１’）） ； １０．５７， １０．７４ （ｓ， ２ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ３９Ｈ４３ＢｒＮ６Ｏ７ （７８７．２） ： Ｃ ５９．４７， Ｈ５．４６， Ｎ１０．６７ ； 実測値：Ｃ５９．０８， Ｈ５．３７， Ｎ１０．３９。
【０４３０】
３−ブロモ−１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−４，６−ジイソブチリルアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（１６ａ）。無水ＣＨ２Ｃｌ２（３ ｍｌ）中の化合物１５ａ（０．２４ ｇ、０．３ ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ａｒ）（ｉＰｒ）２ＥｔＮ（０．１６ ｍｌ、０．９ ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト（９１ μｌ、０．４１ ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を温室において３０分間攪拌した。反応をＴＬＣによりモニターした。次いで、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水性５％ＮａＨＣＯ３溶液で２回洗浄し、ブラインで洗浄した。有機相を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、生成物をＦＣにより分離すると、無色泡状物が得られた（０．２５ ｇ、８４％）。
【０４３１】
Ｒｆ （Ｅ） ０．６３， ０．６９． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２８２ （１００００）， ２３７ （４９５００）． ３１Ｐ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）， １４９．６１， １４９．６５． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： １．１１−１．３５ （ｍ， ４ＣＨ （ＣＨ３）２） ； ２．５１ （ｍ， Ｈα−Ｃ （２’）） ； ２．６６ （ｍ， Ｈβ−Ｃ （２’）） ； ２．９５−３．９１ （ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ＣＨ （ＣＨ３）２ ； ＣＨ２ＣＨ２） ； ３．８０ （ｓ， ＭｅＯ）， ４．２６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．８２ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； ６．７１ （ｍ， Ｈ−Ｃ （１’）） ； ６．７５−７．４４ （ｍ， 原子． Ｈ） ； ８．３９， ８．５９ （ｂｒ， ２ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ４８Ｈ６０ＢｒＮ８Ｏ８Ｐ （９２１．２） ： Ｃ ５８．３６， Ｈ６．０８， Ｎ１１．３５ ； 実測値：Ｃ５８．８６， Ｈ６．１８， Ｎ１１．５５。
【０４３２】
１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−４，６−ジベンズアミド−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（１５ｂ）。化合物１３ｂ（４５０ ｍｇ、０．７５ ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと２回共蒸発させた。残留物をピリジン（２ ｍｌ）中に溶解し、塩化ジメトキシトリチル（３０５ ｍｇ、０．９ ｍｍｏｌ）を添加した。４時間攪拌した後、溶液を５ ｍｌのＭｅＯＨで希釈し、水性５％ＮａＨＣＯ３溶液（３×２０ ｍｌ）で洗浄した。有機相を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮乾固した。残留物をＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン、９５：５→ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン、９：１）により精製すると、３７５ ｍｇ（５５％）の無色泡状物が得られた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン、９：１）：
【０４３３】
Ｒｆ （Ｂ） ０．４． ＵＶ （ＭｅＯＨ） ： ２４４ （１６９００）， ２７６ （１６２００）． １Ｈ−ＮＭＲ （（Ｄ６） ＤＭＳＯ） ： ２．３５ （ｍ， Ｈα−Ｃ （２’）） ； ２．６７ （ｍ， Ｈβ−Ｃ （２’）） ； ３．０７， ３．０９ （２ｍ， Ｈ２−Ｃ （５’）） ； ３．７０ （ｓ， ２０Ｈ３） ； ３．９６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （４’）） ； ４．５６ （ｍ， Ｈ−Ｃ （３’）） ； （ｄ， Ｊ＝４．８， ＯＨ−Ｃ （３’）） ； ６．７２−８．１１ （ｍ， 原子． Ｈ） ； １０．５４， １０．７８ （２ｓ， ２ＮＨ）． 分析：計算値：Ｃ４５Ｈ３９ＩＮ６Ｏ７ （９０２．７３） ： Ｃ ５９．８７， Ｈ４．３５， Ｎ９．３１ ； 実測値：Ｃ５９．９３， Ｈ４．３３， Ｎ９．３９。
【０４３４】
１−［２−デオキシ−５−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−４，６−ジベンズアミド−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（１６ｂ）。化合物１５ｂ（３３０ ｍｇ、０．３７ ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ ｍｌ）中に溶解した。（ｉＰｒ）２ＥｔＮ（１８６ μｌ、１．０７ ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト（１０８ μｌ、０．４８ ｍｍｏｌ）をアルゴ雰囲気下に添加した。３０分後、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２ （２０ ｍｌ）および水性５％ＮａＨＣＯ３溶液（２×２０ ｍｌ）で希釈した。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×１５ ｍｌ）で抽出した。一緒にした有機相を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、蒸発させると、油状物が得られた。残留物をＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ、８５：１５）により精製すると、２８０ ｍｇ（６９％）の無色泡状物が得られた。ＴＬＣ（Ｄ）：Ｒｆ ０．８。３１Ｐ− ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１４９．３７、１４９．３８。
【０４３５】
実施例３．アレイ前駆体化合物の研究
標準的方法に従い、スキーム１１における本発明によるホスホルアミダイト１９（＝８ａおよび１６ａ）〜２３および既に前述した標準的Ａ、Ｇ、ＣおよびＴホスホルアミダイトから第１９表に示すオリゴヌクレオチドを合成した。また、ホスホルアミダイトはグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能であり、製造業者の推奨に従い使用した（注文番号：１０−１９０６−０２（２０）、１０−１９６４−０２（２１）、１０−１０５６−０２（２２）、１０−１０６７−０２（２３））。記載されたように、２６０ ｎｍの波長における温度従属的吸収を測定するＵＶ／ＶＩＳ分光法により、ハイブリダイゼーション挙動を研究した。
【０４３６】
【化７５】
2004505988.tif 000066
【０４３７】
【化７６】
2004505988.tif 000067
【０４３８】
【表２０】
2004505988.tif 000068
【０４３９】
リポーター基で標識化するときでさえ、溶融挙動は平行および逆平行のモードにおいて非常に類似することを示すことができるであろう。この状況は、本発明の有用性を例示する、本発明による核酸結合性化合物を表面に結合しまたはアレイを構築するとき、あるいは天然または非天然の核酸結合性化合物のアレイにそれが結合するときの状況に類似する。これはリンカーを含有するオリゴヌクレオチド５０１により例示され、ここでリンカーによりオリゴヌクレオチドは固相に結合し、オリゴヌクレオチド５０３と同様な標識化ターゲット核酸に対してハイブリダイゼーションすることができる。
【０４４０】
実施例４．逆平行および平行ハイブリダイゼーションの可視化
平行または逆平行のデュプレックスにおける水素結合の相互作用パターンをスキーム１２および１３において可視化する。
【０４４１】
【化７７】
2004505988.tif 000069
【０４４２】
【化７８】
2004505988.tif 000070
【０４４３】
参考文献
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［４２］ Ｆ． Ｓｅｅｌａ， Ｃ． Ｗｅｉ， Ｇ． Ｂｅｃｈｅｒ， Ｍ． Ｚｕｌａｕｆ， Ｐ． Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｂｉｏ． Ｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２０００， １０， ２８９。
［４３］ Ｊ．Ａ． ＭｃＤｏｗｅｌｌ， Ｄ．Ｈ． Ｔｕｒｎｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９６， ３５， １４０７７。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
第１Ａ図：化合物２ａのデミネイション（ｄｅｍｉｎａｔｉｏｎ）の紫外線スペクトル。
【図１Ｂ】
第１Ｂ図：化合物１、２ａおよび２ｂの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロファイル。
【図２Ａ】
第２Ａ図：２ａを含有するオリゴヌクレオチドのヘビ毒液ジエステラーゼ／アルカリ性ホスファターゼ加水分解物の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロファイル。
【図２Ｂ】
第２Ｂ図：２ｂを含有するオリゴヌクレオチドのヘビ毒液ジエステラーゼ／アルカリ性ホスファターゼ加水分解物の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロファイル。
【図３】
第３図：逆平行ＤＮＡ／ＤＮＡデュプレックス（第３Ａ図）および逆平行ＤＮＡ／ＲＮＡデュプレックス（第３Ｂ図）の円偏光二色性スペクトル。
【図４】
第４図：平行ＤＮＡ／ＤＮＡデュプレックス（第４Ａ図）および平行ＤＮＡ／ＲＮＡデュプレックス（第４Ｂ図）の円偏光二色性スペクトル。
【図５】
第５図：ヌクレオシド１、２ａ〜ｃ（ａ）および３ａ〜ｃおよびｄＴ（ｂ）のＨＰＬＣプロファイル。ヌクレオシドの混合物を逆相ＨＰＬＣ上で２６０ ｎｍにおいて分析した（ＲＰ−１８、勾配：０．１ Ｍの（Ｅｔ３ＮＨ）ＯＡｃ（ｐＨ ７．０）／ＭｅＣＮ（９５：５）、０．７　ｍｌ／分、中で ０〜２０）。０．１ ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．３）中で３７ ℃においてヘビ毒液ホスホジエステラーゼで、次いでアルカリ性ホスファターゼで酵素的に加水分解した後における、オリゴヌクレオチド１００（ｃ）および３０４（ｄ）のＨＰＬＣプロファイル。ＨＰＬＣはＲＰ−１８カラム（２００×１０ ｍｍ）上、０〜３０、上で０．１ Ｍの（Ｅｔ３ＮＨ）ＯＡｃ（ｐＨ ７．０）／ＭｅＣＮ（９５：５）、０．７　ｍｌ／分、中で実施した。ピーク検出：２６０ ｎｍ。
【図６】
第６図：Ｔｍ増加の傾向ｖｓ ２ｂ残基の数。
【図７】
第７図：（ａ） １００ ＭｍのＮａＣｌ、１００ ｍＭのＭｎＣｌ２、および６０ ｍＭのＮａ−カコジレート（ｐＨ ７．０）中のデュプレックス１０２・１０３・１０８・１０９・１１１・１０４・１０５のＣＤスペクトル。（ｂ） １００ Ｍｍ ＮａＣｌ、１００ ｍＭのＭｎＣｌ２、および６０ ｍＭのＮａ−カコジレート（ｐＨ ７．０）中のデュプレックス１０２・４０３・１０８・４０３・１１０・４０３・１０４・４０３のＣＤスペクトル、オリゴヌクレオチドの濃度は５ μＭ＋５ μＭ（一本鎖濃度）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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