(57)【要約】本発明は、一般的に、哺乳動物サイトカイン様分子および関連試薬の使用に関する。より具体的には、本発明は、哺乳動物サイトカイン様タンパク質、ならびに骨障害および炎症障害のような医学的な状態に影響を及ぼすそのインヒビターの同定に関する。骨沈着および骨吸収の機能不全に関する骨障害のための処置方法が提供される。これらの骨障害は、炎症、癌などの結果であり得る。サイトカイン分子のアゴニストおよびアンタゴニストを用いる方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨吸収を調節する方法であって、該方法は、細胞と：
ａ）ＨＥＭＡＥ８０のアゴニスト；または
ｂ）ＨＥＭＡＥ８０のアンタゴニスト、
とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ＨＥＭＡＥ８０は、配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記ＨＥＭＡＥ８０のアンタゴニストは、抗体またはその結合フラグメントである、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、以下：
ａ）ポリクローナル抗体；または
ｂ）モノクローナル抗体、
である、方法。
【請求項５】
骨吸収障害を処置する方法であって、該方法は、ＨＥＭＡＥ８０のアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記投与する工程は、別の治療剤と組み合わされる、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記アンタゴニストは、ＨＥＭＡＥ８０に特異的に結合し、骨の鉱物質密度の喪失を予防する抗体である、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、前記骨吸収障害は、以下：
ａ）骨粗鬆症であるか；
ｂ）大理石骨病であるか；
ｃ）ぺージェット病であるか；
ｄ）骨形成異常症であるか；
ｅ）造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）過形成の結果であるか；
ｆ）免疫障害の結果であるか；または
ｇ）癌の結果である、
方法。
【請求項９】
骨沈着障害を処置する方法であって、該方法は、ＨＥＭＡＥ８０のアゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記アゴニストは、骨沈着を阻害する、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記骨沈着障害は、以下：
ａ）骨格の骨の過剰な骨化であるか；
ｂ）軟骨の骨化であるか；または
ｃ）ファンブッヘム病である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、哺乳動物サイトカイン様分子および関連試薬の使用に関する。より具体的には、本発明は、哺乳動物サイトカイン様タンパク質、ならびに骨障害および炎症障害のような医学的な状態に影響を及ぼすそのインヒビターの同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格系は、一見したところ、しっかりと固定され、かつ存在を変化させないようである。しかし、この系は、実際には、骨マトリックスの沈着と吸収との間の注意深く調節された平衡状態に関連する動的プロセスの結果である。これらの反対の作用は、種々の骨関連細胞（それぞれ、骨芽細胞および破骨細胞を含む）を通して媒介される。
【０００３】
骨芽細胞（主な型の骨形成細胞）は、骨の表面に位置する。これらの細胞は、多くの骨マトリクスタンパク質を合成し、輸送し、そして整える（ａｒｒａｎｇｅ）。骨芽細胞は、いくつかの細胞表面レセプター（ホルモン（例えば、副甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、およびエストロゲン）、サイトカイン、および増殖因子に対するレセプターを含む）（Ｃｏｔｒａｎｅら（編）（１９９４）Ｒｏｂｂｉｎｓ：Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．）を発現する。
【０００４】
破骨細胞は、骨吸収を担う細胞である。これらの多核性顆粒球−単球系列由来の細胞はまた、骨の表面に位置する。破骨細胞は、マトリクスタンパク質のアミノ酸への分解に作用する多数の酵素の放出を担う。破骨細胞の放出した酵素はまた、特定の増殖因子および他の酵素（例えば、コラゲナーゼ）を活性化する。
【０００５】
骨芽細胞および破骨細胞の反対の作用は、骨格の完全性およびカルシウム代謝を維持するために、平衡状態で維持されなければならない。この平衡状態の調節不全に関連した最も一般的な問題は、吸収速度が沈着速度を超えた場合に生じる。このことは、例えば、骨粗鬆症、炎症状態（例えば、慢性関節リウマチ）、および多くの癌においてみられるように、骨質量の喪失を生じる（例えば、Ｒｏｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１５０８−１５１４を参照のこと）。
【０００６】
破骨細胞調節のいくつかの分子的機構が、最近発見された。１つのこのような分子であるＲＡＮＫＬは、増強した破骨細胞機能に関与している（例えば、Ｓｕｄａら（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０：３４５−３５７を参照のこと）。ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦファミリーのメンバーである）は、通常、骨芽細胞および活性化Ｔ細胞上で発現され、破骨細胞および樹状細胞上で発現されるＲＡＮＫに結合する（例えば、Ｗｏｎｇら（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．６５：７１５−７２４を参照のこと）。ＲＡＮＫがＲＡＮＫＬへの結合を介して活性化される場合、シグナル伝達分子のカスケードが活性化されて、破骨細胞の成熟およびそれらの骨吸収機能の増強を生じる。
【０００７】
骨吸収と沈着の平衡状態は、いくつかの調節分子の複雑なネットワークに関連するようである。未だに、多くのこれらの分子およびそれらの機能が、解明されていない。本発明は、この要求を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（本発明の要旨）
本発明は、一部、骨沈着および吸収におけるサイトカイン様分子ＨＥＭＡＥ８０の役割の発見に基づく。
【０００９】
本発明は、細胞と、ＨＥＭＡＥ８０のアゴニスト；ＨＥＭＡＥ８０のアンタゴニストとを接触させる工程による、骨吸収を調節する方法を提供する。ＨＥＭＡＥ８０はさらに、配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列を含む。別の実施形態において、ＨＥＭＡＥ８０のアンタゴニストは、抗体またはその結合フラグメントである。この抗体は、ポリクローナル抗体；またはモノクローナル抗体である。
【００１０】
本発明はまた、骨吸収障害を処置する方法を提供し、この方法は、ＨＥＭＡＥ８０のアンタゴニストを投与する工程を包含する。別の実施形態において、ＨＥＭＡＥ８０は、別の治療剤と組み合わせて投与される。なお別の実施形態において、アンタゴニストは、ＨＥＭＡＥ８０に特異的に結合し、骨の鉱物質密度の喪失を予防する抗体である。具体的に例示される骨吸収障害は、骨粗鬆症；大理石骨病；ぺージェット病；骨形成異常症；造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）過形成の結果；免疫障害の結果；または癌の結果である。
【００１１】
本発明はさらに、骨沈着障害を処置する方法を例示し、この方法は、ＨＥＭＡＥ８０のアゴニストを投与する工程を包含する。このアゴニストは、骨沈着を阻害し、骨格の骨の過剰な骨化；軟骨の骨化；またはファンブッヘム病を処置するために使用される。
【００１２】
（好適な実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．一般的事項）
骨格系の特徴は、骨の沈着と骨吸収との間の精巧な平衡状態に対する健康状態が、予測される動的な存在である。骨芽細胞および破骨細胞は、この調節プロセスを担う重要な細胞型である。
【００１３】
本発明は、分泌型サイトカイン分子であるＨＥＭＡＥ８０に関する研究に由来する。ＨＥＭＥＡ８０は、ＣＤ３４＋造血幹／前駆体細胞（ＨＳＰＣ；例えば、Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５：２８３−２９２を参照のこと）、軟骨、軟骨細胞、内皮細胞、および骨芽細胞により発現されるようである。ヒトおよびマウスの細胞および組織における定量的ＰＣＲは、マウス大動脈および耳（皮膚／軟骨組織）における高レベルの発現を示した。ヒトにおいては、胎児脾臓、胎児胆嚢、ＣＤ１４＋エキソビボ由来樹状細胞、およびマクロファージにおいて高い発現が見いだされた。
【００１４】
ＨＳＰＣは、骨髄間質細胞と接触した状態で骨髄に存在する。骨髄の間質細胞は、骨芽細胞と同じ系統であり、間質細胞と骨芽細胞の交換を可能にする表現型形成性が証明されている（例えば、Ｋｒｅｂｓｂａｃｈら（１９９９）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０：１６５−１８１を参照のこと）。従って、ＨＳＰＣは、破骨細胞発生に影響を及ぼす因子を分泌し得る。このことは、ＨＳＰＣの過形成が骨粗鬆症を導き得るという事実（例えば、Ａｓｃｅｎｚｉ（１９７６）Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ．  Ｇ．Ｂｏｕｒｎｅ（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；およびＴｕｎａｃｉら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｒａｄｉｏｌ．９：１８０４−１８０９）を参照のこと）により証明される。さらに、骨格発生の間に、ＨＳＰＣによる発生しようとする骨への浸潤は、過剰な骨化を防止するために必要である（例えば、ＴａｖａｓｓｏｌｉおよびＹｏｆｆｅｙ（編）（１９８３）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｏｔｏｈら（１９９５）Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．５６：２４６−２５１；ならびにＧｕｎｄｌｅら（１９９５）Ｂｏｎｅ  １６：５９７−６０１を参照のこと）。
【００１５】
軟骨細胞は、軟骨の主な細胞型であり、やはり骨髄／破骨細胞系統の細胞である。軟骨組織の骨化を防止するために、骨芽細胞活性は、軟骨組織への侵入を防止するために阻害されなければならない。これらの共通する系統を考慮すると、軟骨細胞もまた、ＨＥＭＡＥ８０の潜在的な標的である。
【００１６】
ＨＥＭＡＥ８０タンパク質のマウスへのアデノウイルス送達は、処置動物  対  未処置動物において、有意に減少した骨鉱物質密度を生じた。精製ヒトＨＥＭＡＥ８０タンパク質で処置した新生仔マウスは、コントロール処置を受けたマウスより低下した骨鉱物質密度を有した。精製ヒトＨＥＭＡＥ８０タンパク質の成体マウスへの投与は、処置前レベルと比較して骨鉱物質密度の１０％減少を導き、コントロール処置動物と比較して、四肢の骨の長さが有意に減少した。最後に、ヒトの骨を移植したＳＣＩＤマウスへのＨＥＭＡＥ８０の、アデノウイルス送達およびタンパク質送達の両方が、正常骨と比較して差異を生じた。特に、ＨＥＭＡＥ８０処置骨は、減少した骨髄細胞性（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）、均一な細胞沈着、および骨棘（ｂｏｎｅ  ｓｐｉｎａｃｌｅ）への細胞接着を有した。まとめると、ＨＥＭＡＥ８０は、骨吸収および沈着の調節を標的となり得る。
【００１７】
構造的に、ヒトＨＥＭＡＥ８０ポリヌクレオチト゛（配列番号１）は、造血性サイトカインファミリーのメンバーであるポリペプチド（配列番号２）をコードし、４つのα−ヘリックス束（ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ）構造の存在により特徴付けられる。同様に、マウスＨＥＭＡＥ８０ポリヌクレオチド（配列番号３）は、ポリペプチド（配列番号４）をコードする。図１は、ヒトＨＥＭＡＥ８０ポリペプチド（配列番号２）とマウスＨＥＭＡＥ８０ポリペプチド（配列番号４）との間の配列整列を示す。
【００１８】
ＣＤ３４＋造血性前駆体細胞からのＨＥＭＡＥ８０の分泌は、この分子が、免疫細胞の分化および増殖に対してさらなる活性を有し得ることを示唆する。ＨＥＭＡＥ８０は、多発性骨髄腫において頻発する染色体転座［ｔ（４；１４）（ｐ１６．３；ｑ３２）］が既知の領域においてヒト第４染色体にマッピングされる。このことは、ＨＥＭＡＥ８０が、この異常性の標的であり得、その腫瘍形成性に寄与し得ることを示唆する。
【００１９】
（ＩＩ．アンタゴニストおよびアゴニスト）
ＨＥＭＡＥ８０の活性のブロックは、サイトカインのアンタゴニスト（例えば、そのリガンドに対する抗体、レセプターに対する抗体など）により達成され得る。リガンド−レセプター相互作用の妨害は、アンタゴニストの開発のための有効なストラテジーであることが判明した。
【００２０】
リガンドにより媒介される活性を拮抗するために、種々の手段がある。２つの明らかな手段は、リガンドを抗体でブロックすることであり；第２は、抗体でレセプターをブロックすることである。種々のエピトープが存在し、その各々に対してそれらの相互作用をブロックする（例えば、立体障害により相互作用をブロックする）。シグナル伝達をブロックする能力の相関は、リガンドまたはレセプターのいずれかに対する結合親和性と相関させるために必ずしも必要でないことが予測される。別の手段は、レセプター結合活性を保持するが、レセプターシグナル伝達を誘導できないリガンドムテインを使用することである。このムテインは、シグナル伝達リガンドの競合的インヒビターであり得る。
【００２１】
あるいは、低分子ライブラリーは、同定されたリガンド−レセプター対形成により媒介される相互作用またはシグナル伝達をブロックし得る化合物についてスクリーニングされ得る。
【００２２】
本発明は、特定のサイトカインリガンド、好ましくは哺乳動物（例えば、霊長類、ヒト、ネコ、イヌ、ラット、またはマウス）に特異的に結合する、抗体または結合組成物の使用を提供する。抗体は、種々のサイトカインタンパク質（個体改変体、多型改変体、対立遺伝子改変体、株改変体、または種の改変体を含む）、およびこれらのフラグメントに対して惹起され得、種々のサイトカインタンパク質およびこれらのフラグメントは、ともに、天然に存在する（全長）形態であってもよいし、その組換えであってもよい。さらに、抗体は、レセプタータンパク質に対して惹起され得、ともに、ネイティブ（または活性な）形態またはそれらの不活性な（例えば、変性した）形態であってもよい。抗イディオタイプ抗体もまた使用され得る。
【００２３】
多くの免疫原は、リガンドまたはレセプタータンパク質と特異的に反応する抗体を生成するために選択され得る。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生成のための好ましい免疫原である。適切な供給源（例えば、霊長類、齧歯類など）からの天然に存在するタンパク質はまた、純粋形態または非純粋形態のいずれかにおいて使用され得る。適切なタンパク質配列を使用して作製された合成ペプチドはまた、抗体の生成のための免疫原として使用され得る。組換えタンパク質は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９５年編および定期的補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編．１９８７および定期的補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにおいて記載される真核生物細胞または原核生物細胞において発現および精製され得る。適切な場合、抗体を生成するために、天然に折りたたみされたまたは変性された物質が使用され得る。例えば、タンパク質を測定する免疫アッセイにおけるその後の使用のために、または免疫精製方法のために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが生成され得る。
【００２４】
ポリクローナル抗体を生成するための方法は、当業者に周知である。代表的には、免疫原、好ましくは、精製タンパク質は、アジュバントと混合され、動物が、その混合物を用いて免疫される。動物のその免疫原調製物に対する免疫応答は、試験採血を行い、目的のタンパク質に対する反応性の力価を測定することによってモニターされる。例えば、通常、免疫を反復した後に、免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得られた場合、血液を動物から回収し、抗血清を調製する。そのタンパク質に対して反応性の抗体を富化するための抗血清のさらなる分画は、所望であれば行われ得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ；またはＣｏｌｉｇａｎを参照のこと。免疫はまた、他の方法（例えば、ＤＮＡベクター免疫）を介して、行われ得る。例えば、Ｗａｎｇら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２８：２７８−２８４を参照のこと。
【００２５】
モノクローナル抗体は、当業者が精通した種々の技術により得られ得る。代表的には、所望の抗原で免疫した動物由来の脾細胞が、通常は、骨髄腫細胞との融合によって、不死化される。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９を参照のこと。不死化の別の方法としては、エプスタインバーウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当該分野で公知の他の方法が挙げられる。例えば、Ｄｏｙｌｅら（編．１９９４および定期的補遺）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．を参照のこと。単一の不死化細胞から発生したコロニーは、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の生成のためにスクリーニングされ、このような細胞により生成されるモノクローナル抗体の産生は、種々の技術（脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む）によって増強され得る。あるいは、例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１に概説される一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞に由来するＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列が単離され得る。
【００２６】
リガンドまたはレセプタータンパク質の所定のフラグメントに対する抗体または結合組成物（結合フラグメントおよび単鎖バージョンを含む）は、そのフラグメントとキャリアタンパク質との結合体で動物を免疫することにより、惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常または欠損タンパク質への結合についてスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１ｍＭのＫＤ、より通常は、少なくとも約３００μＭ、代表的には、少なくとも約１０μＭ、より代表的には、少なくとも約３０μＭ、好ましくは、少なくとも約１０μＭ、およびより好ましくは、少なくとも約３μＭまたはより良好なＫＤで結合する。
【００２７】
いくつかの場合、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど）に由来するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製することが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、およびそこに引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹに見いだされ得、特にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（これは、モノクローナル抗体を精製する１つの方法を議論している）において見いだされ得る。簡単にまとめると、この方法は、動物に免疫原を注射する工程を包含する。次いで、この動物は屠殺され、その脾臓から細胞が採取され、次いで、この細胞は、骨髄腫細胞と融合される。その結果は、インビトロで再生し得るハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」である。次いで、ハイブリドーマ集団はスクリーニングされて、個々のクローンが単離され、このクローンの各々は、免疫原に対する単一の抗体種を分泌する。このようにして、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質に対して認識された特定の部位に応答して生成された免疫動物に由来する、不死化されかつクローニングされたＢ細胞の産物である。
【００２８】
他の適切な技術は、ファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を包含する。例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変（キメラ抗体またはヒト化抗体を含む）ありまたはなしで使用され得る。頻繁には、このポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する基質を（共有結合または非共有結合のいずれかで）結合することによって標識される。広範な種々の標識および結合の技術が公知であり、学術文献および特許文献において広く報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンが生成され得（Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３を参照のこと）；またはトランスジェニックマウスにおいて作製され得る（Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６を参照のこと；ＡｂｇｅｎｉｘおよびＭｅｄａｒｅｘ技術もまた参照のこと）。
【００２９】
抗体は、特定の結合組成物の１つの形態に過ぎない。しばしば類似の用途を有する他の結合組成物としては、リガンドまたはレセプターに特異的に結合する分子（例えば、結合パートナー−結合パートナー様式、抗体−抗原相互作用において、または共有結合もしくは非共有結合のいずれかで天然の生理学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用（例えば、所望のタンパク質と特異的に会合するタンパク質）において）が挙げられる。この分子は、ポリマーであってもよいし、化学的試薬であってもよい。機能的アナログは、構造改変を有するタンパク質であってもよく、例えば、適切な結合決定基と相互作用する分子形状を有する構造的に関連しない分子であってもよい。本発明の抗体結合化合物（結合フラグメントを含む）は、有意な診断的価値または治療的価値を有し得る。これらの化合物は、非中和結合組成物として有用であり得、この結合化合物が抗原に結合する場合に、例えば細胞表面に抗原を発現する細胞が、殺傷されるように、毒素または放射性核種に結合され得る。さらに、これらの結合化合物は、薬物または他の治療剤に、直接的にまたはリンカーによって間接的にのいずれかで結合体化され得、薬物標的化をもたらし得る。
【００３０】
アゴニストとしては、同定されたサイトカインタンパク質（例えば、配列番号２および４を参照のこと）が挙げられる。それらの配列のタンパク質または改変体は、レセプターシグナル伝達を誘導するために使用される。
【００３１】
（ＩＩＩ．診断用途；治療的組成物、方法）
本発明は、種々の骨、免疫、または癌に関連する障害に対処するための手段を提供する。原因および病原は、しばしば、十分に理解されていないが、患者において重大な不快感または病的状態を引き起こす。上記のように、精製タンパク質またはアデノウイルス生成タンパク質の投与は、種々の動物モデルにおいて骨密度の喪失を生じる。まとめると、これらの研究は、適切な実態を用いてこのサイトカインまたはそのレセプターを作動する（ａｇｏｎｉｚｅ）または拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）ことは、しばしば、骨、免疫、または癌に関連する障害における治療的様相をもたらし得ることを示唆する。
【００３２】
診断方法は、予後の予測；特定の治療過程に応答するかまたは応答しないかいずれかの患者のサブセットの規定；骨もしくは免疫に関連する障害またはこれらの障害のサブセットの診断；あるいは治療に対する応答の評価として、このような局面を包含する。ＨＥＭＡＥ８０活性に対するアンタゴニストまたはアゴニストは、例えば、症状の発生を低下または予防するために、有意な治療的効果を示唆する様式で関連づけられ得る。本発明のアンタゴニストおよび／またはアゴニストは、単独で、または同じまたは付随する経路の別のインヒビターもしくはアゴニストと；あるいは症状の処置のために使用される他の化合物（例えば、アンタゴニスト、またはグルココルチコイドのようなステロイド）と組み合わせて投与され得る。
【００３３】
特定のアンタゴニストまたはアゴニストは、骨密度喪失または骨化のプロセスを遅延するために有用であり得る。障害（骨粗鬆症、骨形成異常、大理石骨病、免疫関連障害もしくは癌関連障害の結果としての骨喪失、またはページェット病が挙げられるが、これらに限定されない）における骨喪失の予防は、有利である。増強された骨吸収は、障害（骨格の骨化、軟骨の骨化、およびファンブッヘム病が挙げられるが、これらに限定されない）において同様に有利である。
【００３４】
このことは、アゴニストまたはアンタゴニストの直接的投与、またはおそらく遺伝子治療ストラテジーを使用することのいずれかにより、もたらされ得る。拮抗作用は、例えば、ＨＥＭＡＥ８０効果のアンチセンス処置、抗体、または他の抑制によってもたらされ得る。
【００３５】
抗体、その結合組成物、サイトカインアゴニスト、または低分子アンタゴニストを含む薬学的組成物または滅菌組成物を調製するために、その実体は、好ましくは不活性な、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と、混合される。このような薬学的組成物の調製は、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照のこと）。
【００３６】
抗体、結合組成物、またはサイトカインは、通常、非経口的に投与され、好ましくは、静脈内投与される。このようなタンパク質またはペプチドは、免疫原性であり得るので、それらは、好ましくは、例えば、Ｔｏｍａｓｉら、米国特許第４，７３２，８６３号により教示されるように、従来のＩＶ投与設定によるかまたは皮下デポーからかのいずれかで、ゆっくりと投与される。免疫学的反応を最小限にするための手段が適用され得る。低分子実体が、経口的に活性であり得る。
【００３７】
非経口投与される場合、その生物学的物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）は、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルとともに、単位投薬注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に処方される。このようなビヒクルは、代表的には、本質的に非毒性であって非治療的である。治療剤は、種々の添加剤および／または希釈剤ありまたはなしで、水性ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、または緩衝化ビヒクル）中で投与され得る。あるいは、懸濁液（例えば、亜鉛懸濁液）は、ペプチドを含むように調製され得る。このような懸濁液は、皮下（ＳＱ）注射または筋肉内（ＩＭ）注射に有用であり得る。生物学的物質と添加剤との割合は、ともに有効量にて存在する場合に限り、広い範囲にわたって変化され得る。抗体は、好ましくは、凝集物質、他のタンパク質、内毒素などを実質的に含まない精製形態にて、約５〜３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。好ましくは、この内毒素レベルは、２．５ＥＵ／ｍｌ未満である。例えば、Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ第２版，Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９０編）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  第２版，Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９０編）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｆｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３，Ｃｏｌｉｇａｎ（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｈｏｏｄら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ；Ｐａｕｌ（編）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｐａｒｃｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２４３−２４７；Ｏｗｉｃｋｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４００７−４０１１；ならびにＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００３８】
治療についての投与レジメンの選択は、いくつかの要因（実体の血清ターンオーバー速度または組織ターンオーバー速度、症状のレベル、実体の免疫原性、および標的細胞の接近可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）、投与タイミングなどが挙げられる）に依存する。好ましくは、投与レジメンは、患者に送達される治療剤の量を最大にし、その患者は、副作用の許容可能なレベルと一致する。従って、送達される生物学的物質の量は、特定の実体および処置される状態の重篤度に一部依存する。適切な抗体用量を選択する差異の手引きは、例えば、Ｂａｃｈら、Ｆｅｒｒｏｎｅら（１９８５編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＮＪの第２２章；およびＨａｂｅｒら（編）（１９７７）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（Ｒｕｓｓｅｌｌ、第３０３−３５７頁、およびＳｍｉｔｈら、３６５−３８９頁において見いだされる。あるいは、サイトカインまたは低分子の用量は、標準的方法論を使用して決定される。
【００３９】
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響を及ぼすかまたは処置に影響を及ぼすと推測されることが当該分野で公知または疑われているパラメーターまたは要因を使用して、医師によって行われる。一般に、用量は、最適用量よりいくらか少ない量で始めて、その後、任意のネガティブな副作用と比較して、所望のまたは最適な効果が達成されるまで、少量ずつ増加される。重要な診断的手段としては、例えば、炎症の症状、生成される炎症的サイトカインのレベルの診断が挙げられる。好ましくは、使用される生物学的物質は、処置について標的とされる動物と同じ種に由来し、それにより、試薬に対する体液性応答は最小にされる。
【００４０】
リガンドまたはレセプターに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントについて１週間の合計用量範囲は、一般に、体重１ｋｇあたり、約１０μｇ、から、より一般的には、約１００μｇから、代表的には、約５００μｇから、より代表的には、約１０００μｇから、好ましくは、約５ｍｇから、およびより好ましくは約１０ｍｇから変動する。一般に、その範囲は、体重１ｋｇあたり、１００ｍｇ未満、好ましくは約５０ｍｇ未満、およびより好ましくは約２５ｍｇ未満である。アゴニストまたは低分子の治療剤は、類似のモル濃度にて使用され得る。
【００４１】
サイトカインレセプター媒介性シグナル伝達のアンタゴニスト（例えば、抗体または結合フラグメント）についての１週間の用量範囲は、体重１ｋｇあたり、約１μｇから、好ましくは、少なくとも約５μｇ、およびより好ましくは、少なくとも約１０μｇで変動する。一般に、その範囲は、体重１ｋｇあたり、約１０００μｇ未満、好ましくは、約５００μｇ未満、およびより好ましくは、約１００μｇ未満である。投薬量は、所望の処置を及ぼし、より短期間またはより長期間にわたって断続的であり得る計画に基づく。一般的に、範囲は、体重１ｋｇあたり、少なくとも約１０μｇ〜約５０ｍｇ、好ましくは、約１００μｇ〜約１０ｍｇである。サイトカインアゴニストまたは低分子の治療剤は、代表的には、類似のモル濃度量にて使用されるが、これらの治療剤は、より低分子量であるので、より少ない重量用量である。
【００４２】
本発明はまた、例えば、炎症と関連する症状を緩和する既知の治療剤（例えば、ステロイド（特にグルココルチコイド）または抗生物質または抗感染剤（ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ））と組み合わせた生物学的物質の投与を提供する。グルココルチコイドの一日投薬量は、１日あたり、少なくとも約１ｍｇ、一般に、少なくとも約２ｍｇ、および好ましくは少なくとも約５ｍｇの範囲である。一般に、投薬量は、１日あたり、約１００ｍｇ未満、代表的には、約５０ｍｇ未満、好ましくは約２０ｍｇ未満、およびより好ましくは、少なくとも約１０ｍｇ未満である。一般に、これらの範囲は、１日あたり、少なくとも約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは、約２ｍｇ〜５０ｍｇである。抗生物質、抗感染剤または抗炎症剤との適切な用量の組み合わせもまた公知である。
【００４３】
句「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を改善するに十分な量を意味する。代表的な哺乳動物宿主としては、マウス、ラット、ネコ、イヌ、および霊長類（ヒトを含む）が挙げられる。特定の患者についての有効量は、処置される状態、患者の健康状態全般、投与方法、投与経路および投与量ならびに副作用の重篤度のような要因に依存して変動し得る。組み合わされる場合、有効量は、成分の組み合わせの比率であり、その効果は、個々の成分単独に制限されない。
【００４４】
治療剤の有効量は、代表的には、少なくとも約１０％；通常は、少なくとも約２０％；好ましくは少なくとも約３０％；またはより好ましくは、少なくとも約５０％、症状を低減させる。本発明は、本明細書中のいずれかの場所で記載されるように、例えば、上記の適応症と関連する障害を処置するための一般的説明において治療的適用における用途を見いだす試薬を提供する。Ｂｅｒｋｏｗ（編）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．；Ｔｈｏｒｎら，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ；Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；およびＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）；Ｃｏｔｒａｎら（編）前出；ならびにＤａｌｅおよびＦｅｄｅｒｍａｎ（編）（２０００）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅａｌｔｈｅｏｎ／ＷｅｂＭＤ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ。
【００４５】
本発明の広い範囲が、以下の実施例を参照することによってもっともよく理解されるが、特定の実施形態に本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【００４６】
（Ｉ．一般的方法）
標準的方法のいくつかが、例えば、以下に記載されるかまたは以下が参照される：Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７および補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。タンパク質精製のための方法としては、硫酸アンモニウム沈澱、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法が挙げられる。例えば、  Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７および定期的補遺）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１８２巻、およびこのシリーズの他の巻；ならびにタンパク質精製製品の使用に対する製造業者の文書（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，またはＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を参照のこと。組換え技術との組み合わせは、適切なセグメント（例えば、ＦＬＡＧ配列またはプロテアーゼ除去可能な配列を介して融合され得る等価物）への融合を可能にする。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ」Ｓｅｔｌｏｗ（編）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：８７−９８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＣｒｏｗｅら（１９９２）ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ．を参照のこと。
【００４７】
コンピューター配列分析は、例えば、入手可能なソフトウェアプログラム（ＧＣＧ（Ｕ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびＧｅｎＢａｎｋ情報源からのプログラムを含む）を用いて行われる。公の配列データベースもまた使用した（例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどから）。
【００４８】
（ＩＩ．ＨＥＭＥＡ８０の同定）
ヒトＨＥＭＡＥ８０クローンは、ＰＳＯＲＴおよびＳｉｇｎａｌＰリーダー推定アルゴリズムを用いて、候補分泌タンパク質として、ＨＧＳ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）データベースにおいて同定された。ＰＣ５哺乳動物発現ベクター中のＨＧＳクローンＨＥＭＡＥ８０を調製し、配列を確認した。２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトし、新たに合成したタンパク質を、［３５Ｓ］メチオニンを用いて代謝的に標識した。トランスフェクション上清を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した。ＨＥＭＡＥ８０トランスフェクト細胞は、ＩＶＲによると、１５ｋＤのタンパク質を分泌する。
【００４９】
マウスＨＥＭＡＥ８０クローンは、２つの公開されたＥＳＴ（ＢＢ５６８０３３，ＢＦ４４９６５０，ｄｂＥＳＴ）によりコードされ、ヒトＨＥＭＡＥ８０のコード領域を使用して、ＢＬＡＳＴにより同定された。マウスＥＳＴを使用して、マウス１７−ｄａｙ  ｅｍｂｒｙｏ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして使用して、ネスト化ＰＣＲにより遺伝子のコード領域の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位をクローニングオリゴヌクレオチドへ組み込むことにより、アデノウイルス発現ベクターへのクローニングを可能にした。
【００５０】
（ＩＩＩ．ＨＥＭＡＥ８０タンパク質の生成）
アデノウイルス移入ベクターを生成するために、ＨＥＭＡＥ８０クローンを、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化し、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩ部位にてＱＢＩ  ＡｄＣＭＶ５−ＧＦＰ−Ｍ＃１にクローニングした。このベクターおよび組換えアデノウイルス生成を、Ｈｏｅｋ，Ｒ．ら，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１７６８−１７７１に記載のように行った。哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞に、この組換えアデノウイルスを感染させ、その上清を、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによる精製に供した。そのタンパク質生成物を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより特徴付け、精製した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥクーマシー染色ゲルの可視化に基づくと、タンパク質純度の推定は約９０％であった。Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  ＱＣＬ−１０００（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）により測定した場合の調製物中の内毒素レベルは、６．７ＥＵ／ｍｌであった。
【００５１】
（ＩＶ．ＨＥＭＡＥ８０メッセージの分布）
ＲＮＡ−ｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）またはＲＮＡｚｏｌＢ（Ｔｅｌ−ｔｅｓｔ  Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）のいずれかを使用して、製造業者の説明書に従って、ＲＮＡを組織または培養細胞から単離した。２μｇの総ＲＮＡを、５００ｎｇ  オリゴ（ｄＴ）１２−１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、５０ｎｇ  ｐ（ｄＮ６）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、５ｍＭ  ＤＴＴおよび２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡ’ｓｅ  Ｈ−ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、  ２０μｌの反応系において４２℃にて５０分間、ｃＤＮＡに逆転写した。あるいは、種々のライブラリー由来のｃＤＮＡｓを、定量的ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。
【００５２】
１反応系あたり２０〜５０ｎｇのｃＤＮＡを、定量的ＰＣＲのためのテンプレートとして使用し、蛍光５’−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイ［Ｈｏｌｌａｎｄ，１９９１  ＃２８］により、ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００またはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、ヒトサイトカイン、サイトカインレセプター、または転写因子遺伝子の発現について分析した。ヒトＨＥＭＡＥ８０のために使用されるアンプリコンは、それぞれ、ｂｐ３５８〜４０５およびマウスＨＥＭＡＥ８０  ｘｘ（開始コドンで番号付け開始）を包含し、ＦＡＭ標識プローブまたは插入蛍光色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎのいずれかを用いて分析した。配列は、以下の通りであった。
ｈＨＥＭＡＥ８０（正方向）：
ＡＴＧＡＣＴＧＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＧＡＡＴ（配列番号５）
ｈＨＥＭＡＥ８０（逆方向）：
ＴＣＣＣＴＴＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴ（配列番号６）、および
ｈＨＥＭＡＥ８０プローブ：
６ＦＡＭ−ＣＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＧＧＴＣＣＴＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号７）。
【００５３】
ヒトサイトカインおよびサイトカインレセプターの発現を検出するプライマーおよびプローブを、予め開発したアッセイ試薬（ＰＤＡＲ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）として得た。ＰＣＲ反応物を、Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘまたはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＡＢＩ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を用いて、製造業者のプロトコルに従ってアセンブリして、１×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび４００μＭのｄＵＴＰ、５．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５Ｕ  ＡＭＰＬＩＴＡＱ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｉ、および０．５Ｕ  ＡＭＰ−ＥＲＡＳＥウラシルＮ−グリコシラーゼの終濃度を得た。正方向のプライマーおよび逆方向のプライマーを各々９００ｎＭにて、およびＦＡＭ標識プローブを２５０ｎＭにて、添加した。１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現を、各サンプルにおいて多重アッセイにおいて測定して、投入ｃＤＮＡの量に対する内部コントロールとして供した。
【００５４】
多重アッセイに、１８Ｓ  ｒＲＮＡ正方向プライマー、逆方向プライマーおよびＶＩＣ標識プローブを、ＰＣＲ反応系に５０ｎＭ含めた。正方向プライマーおよび逆方向プライマーを、シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ａｓｓａｙｓにおいて２００ｎＭにて使用した。サーマルサイクリング条件は、５０℃で２分間および９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５分間の増幅ならびに変性およびアニーリング伸長のために５５℃で１分間の４０サイクルを含めた。絶対定量は、挿入物として目的の遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡの１０倍連続希釈により得られ、標準曲線に対する比較に基づき、内部コントロールの発現により決定されたｃＤＮＡの量に対して補正した。
【００５５】
（Ｖ．  ＨＥＭＡＥ８０のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび新生仔マウスへのアデノウイルス送達）
１４週齢Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスへのＨＥＭＡＥ８０のアデノウイルス送達を、以下のように行った。１４週齢の雌性Ｃ５７／ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０＾１０のｍＨＥＭＥＡ８０（配列番号４）を発現する複製欠損アデノウイルスまたはＧＦＰを発現するコントロールアデノウイルスを静脈内注射した。１４日後、脛骨を取り出し、近位端部を、末梢骨定量コンピューター断層撮影法（ｐＱＣＴ）により海面質鉱物質密度について分析した。処置した骨は、コントロール動物より有意に小さな海綿質を有した（ｐ＝０．０２９）（ｎ＝３（処置）および３（コントロール））。
【００５６】
新生仔マウスに、６．５μｇのヒトＨＥＭＡＥ８０タンパク質を一日おきにｉ．ｐにより与えた。それらのマウスは、８回のｉ．ｐ．注射（合計５２μｇ／マウス）を受けた。それらのマウスを、タンパク質の最後の注射をした１日後に屠殺し、その脛骨を７０％  エタノール中に入れ、続いて骨密度測定を行った。
【００５７】
（ＶＩ．新生仔および成体マウスの組換えＨＥＭＡＥ８０タンパク質での処置）
新生仔マウスに、別の日に、６．５μｇの組換えヒトＨＥＭＡＥ８０タンパク質（またはＰＢＳコントロール）の８回のｉ．ｐ．注射の過程を与えた（合計５２μｇ／マウス）。そのマウスを、タンパク質の最後の注射をした１日後に屠殺し、その脛骨の骨鉱物質密度を、ｐＱＣＴにより分析した。骨鉱物質密度（ＢＭＤ）は、コントロール注射を受けた動物と比較して、ＨＥＭＡＥ８０処置マウスにおいて有意に減少した（ｐ＝０．０１１）。
【００５８】
年齢、性別および体重を合わせた成体Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに、別の日に、６．５μｇの組換えヒトＨＥＭＡＥ８０タンパク質（またはＰＢＳコントロール）の１０回のｉ．ｐ．注射の過程を与えた（ｎ＝８（処置）、８（コントロール））。各マウスの左側脛骨のＢＭＤを、処置過程の前後でｐＱＣＴにより分析した。左側脛骨の長さを、処置後に測定した。ＢＭＤの変化は、コントロール動物よりＨＥＭＡＥ８０処置動物において有意に大きく（ｐ＝０．０１０５）、処置動物は、１０％の平均ＢＭＤ減少を示した。平均脛骨長は、コントロールマウスよりＨＥＭＡＥ８０処置マウスにおいて有意に短かった（ｐ＝０．０２１７）。ＨＥＭＡＥ８０処置マウスは、ボディーマスに影響がなかった。
【００５９】
（ＶＩＩ．  ＳＣＩＤマウスにおけるＨＥＭＡＥ８０）
Ｒａｇ２×ｇｃ−／−１２９ｓｖマウスは、Ｔ細胞を欠き、Ｂ細胞およびＮＫ細胞は免疫システムが損なわれており、ｓｃｉｄ−ｈｕマウスを構築するために有害な効果なしでヒト組織を移植し得る。今までに首尾よく移植されたヒト器官としては、胎児肝臓、胎児骨、胎児胸腺、ＰＢＭＣおよび胎児皮膚が挙げられる。ＨＥＭＡＥ８０は、多量の軟骨を含む組織のライブラリーにおいて豊富に発現されることが見いだされたので、ｒａｇ２×ｇｃ−／−マウスに、ヒト胎児骨を移植して、その生物学的影響を試験した。
【００６０】
ヒト胎児骨片（マウスあたり２つ）を、各脇腹の皮膚の下に移植し、４週間にわたり定着させた。その後、精製タンパク質またはＨＥＭＡＥ８０  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルスのいずれかとして、Ｈｅｍａｅ８０をマウスに投与した。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現するアデノウイルス、またはヒトＨＥＭＡＥ８０タンパク質を発現するアデノウイルスを、１０１０ｃｆｕ．にてｉｖ注射した。投与の１６日後に、マウスを屠殺し、ヒト骨を回収した。各マウスの一方の骨を鉱物質除去し、組織学により試験した。細胞を両側の骨から回収し、造血および骨代謝に関与する遺伝子の発現を、ｃＤＮＡを調製した後に定量的「リアルタイム」ＰＣＲにより分析した。さらに、マウスの後肢を解剖し、近位脛骨の海綿質鉱物質密度を含む骨特徴について分析した。動物のアデノ−ＨＥＭＡＥ８０での処置は、骨喪失に向かう傾向を生じた。
【００６１】
アデノウイルス−ＧＦＰ処置マウスからのヒト骨スライドのヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色により、顆粒球を含む造血細胞を含む骨髄を有する正常骨形態が示された。対照的に、ＨＥＭＡＥ８０処置マウスからのスライドでは、骨髄の細胞性の激しい減少およびおそらく結合組織の沈着を有する間質のより多くの存在が示された。さらに、骨断片は、大きな結合組織細胞に隣接していた。これらの結果は、ＨＥＭＡＥ８０が、骨髄組成および骨形態に対して顕著な効果を有することを示す。
【００６２】
定量的ＰＣＲ分析により、ＨＥＭＡＥ８０処置マウスから調製されたｃＤＮＡサンプル中、コラーゲン１０Ａ型レベルの２４倍増加；コラーゲン７Ｂレベルの２．２倍増加；  ＲＡＮＫＬレベルの４倍増加；ＩＬ−６レベルの２．５倍増加；およびＣＤ１４レベルの３倍増加が示された。このことは、ＩＬ−８、コラーゲン１Ａ２、コラーゲン５Ａ２、コラーゲン６Ａ３、Ｔｉｍｐ１、ＩＬ−７、ＲＡＮＫ、ＩＬ−１、ＣＤ４０、γ−ｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−１５およびＴＧＦ−Ｐを含む、骨再構築に関与する他の遺伝子の発現レベルが、２倍を超えて影響を受けないので、特異的であった。
【００６３】
ＨＥＭＡＥ８０精製タンパク質を、１日あたり１０μｇ／マウス、２μｇ／マウス、および０．４μｇ／マウスの濃度で７日間ｉｐ投与した。マウスを屠殺し、ヒト骨を回収し、細胞を最後の投与から２４時間後に採取した。造血および骨代謝に関与する遺伝子の発現を、定量的「リアルタイム」ＰＣＲにより分析した。さらに、マウスの後肢を解剖し、海綿質鉱物質密度を含む骨特徴について分析した。
【００６４】
骨密度測定により、海綿質においてわずかな減少が示された。定量的ＰＣＲ分析によっても、ＲＮＡＫ、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＣＤ４０、ＩＬ−１５、およびＧＣＳＦの２倍を超える増加が示された。
【００６５】
本明細書中の全ての引用は、各々個々の刊行物または特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されていることが示されるのと同程度に、本明細書中に参考として援用される。
【００６６】
本発明の多くの改変およびバリエーションが、当業者に明らかなように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示により提供されるにすぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲が権利が付与される等価物の全範囲とともに、特許請求の範囲によって制限されるべきである；本発明は、実施例によって本明細書中に提示された特定の実施形態によって限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ヒトＨＥＭＡＥ８０ポリペプチド（配列番号２）とマウスＨＥＭＡＥ８０ポリペプチド（配列番号４）との間の配列整列を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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