(57)【要約】本発明は、ファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの使用に関するものであって、そのペプチドは少なくとも１つのアミノ酸の置換又は欠失又は付加により改変され、この改変は該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の初期転写配列への該ＲＮＡポリメラーゼの感受性を減少させる効果を有し、所定のヌクレオチド配列からの該ＲＮＡ又は該ＲＮＡにコードされるたんぱく質の生産の方法のために、該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、この転写は上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの制御下にある。該方法は、対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に見出されるのと同じ非共通のＩＴＳの存在下で野生型ＲＮＡポリメラーゼの使用時に得られる収量より高い該ＲＮＡ収量を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼのペプチド鎖は由来する野生型ＲＮＡポリメラーゼに比して少なくとも一つのアミノ酸の置換又は欠失又は付加により改変されており、この改変は、対象のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に含まれるＩＴＳへの該ＲＮＡポリメラーゼの感受性を減少させる効力を有し、対象の該ＲＮＡ又はこのＲＮＡにコードされるたんぱく質の生産の方法の実施のために、対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列から始まり、この転写は、上記野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター制御下にあり、該方法は、対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に含まれるものと同じ非共通のＩＴＳ存在下で野生型ＲＮＡポリメラーゼの使用場合に得られる収量より多い該ＲＮＡ生産収量を有する、ファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項２】
対象のＲＮＡの収量が、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合に得られる収量のおおよそ１０倍まで多い請求項１記載の使用。
【請求項３】
野生型ファージ単量体ポリメラーゼ由来、特にＴ７、Ｔ３、Ｋ１１、ＳＰ６のようなバクテリオファージの単量体ＲＮＡポリメラーゼ由来の変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
１位とおおよそ４１０位間又はおおよそ９０位と３２０位間又は１１５位と３００位間に位置する少なくとも一つのアミノ酸が置換又は欠失している野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導される請求項１から３のいずれか１項記載の変異型ＲＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項５】
以下から選択される変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１から４のいずれか１項記載の使用：
−野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの２６６位に位置するプロリン又はＴ３の２６７位、Ｋ１１の２８９位、ＳＰ６の２３９位に位置するプロリンようなバクテリオファージ野生型ＲＮＡポリメラーゼの相同位置に位置するプロリンに代えて２６６位にロイシンを含むもの、
−及び／又は、上記のプロリン周辺に位置し、すなわち対象のプロリンからおおよそ１０オングストロームに等しいかそれ以下の距離に位置する少なくとも１つアミノ酸が置換又は欠失で改変されたもの。
【請求項６】
以下の変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１から５のいずれか１項記載の使用：
＊野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−バリン（Ｖ）による１１７位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−バリン（Ｖ）による１１９位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−アラニン（Ａ）による１３４位のバリン（Ｖ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による１４７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−アルギニン（Ｒ）による２３０位のヒスチジン（Ｈ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６６位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９１位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３９位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１０位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１４８位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６７位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９２位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６４０位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１１位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１６７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２８９位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による３１４位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６６２位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８３３位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１１７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２３９位のプロリン（Ｐ）の置換、
任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３１位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８０４位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
【請求項７】
次の変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１から６のいずれか１項記載の使用：
−プロリンに代えて２６６位のロイシンを含む配列番号２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１７位のバリン、及びバリンに代えて１３４位のアラニンを含む配列番号４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、及びアスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギンを含む配列番号６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−ヒスチジンに代えて２３０位のアルギニン。及びアルギニンに代えて２９１位のシステインを含む配列番号８で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン。及びチロシンに代えて６３９位のフェニルアラニンを含む配列番号１０で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、アスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
ファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼを調製するための方法であって、対象のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、転写が由来する野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの制御下におかれる所定のヌクレオチド配列転写活性が、野生型ＲＮＡポリメラーゼによるこの所定の配列の転写活性より高いものであって、特に該所定のヌクレオチド配列からの対象のＲＮＡ生産のための方法の実施の適用範囲内では該野生型ＲＮＡポリメラーゼよりおおよそ４０倍までの活性である変異型ＲＮＡポリメラーゼを調製するための方法であって、
該方法は：
−該野生型ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコドンの置換又は欠失又は付加によるファージ起源の野生型ＲＮＡポリメラーゼのペプチド鎖の改変及び上記の改変遺伝子を含むベクターによる大腸菌のような適当な細胞の形質転換の工程、
−大腸菌のような適当な細胞内、特に前述の細胞内での特定のマーカーの生産収量が同じ条件下で野生型ＲＮＡポリメラーゼの使用で得られるこの同じマーカーの生産収量より多い上述の変異型ＲＮＡポリメラーゼを生産する細胞を検出する工程であって、特定のマーカーが、上記のＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの下流に挿入されるヌクレオチド配列によりコードされる色原性マーカー又は抗生物質耐性マーカーのようなマーカーであり、このマーカーをコードする配列及びプロモーターは野生型ＲＮＡポリメラーゼの活性に影響を及ぼすことが知られる最初のおおよそ６から１２ヌクレオチドの性質によるＩＴＳにより分離されている工程、
−前工程で検出された細胞からの上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼの精製工程、
を含む方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法の実施より得られるファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの請求項１から７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
請求項８記載の方法の実施より得られるファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
野生型ファージ単量体ポリメラーゼの改変に由来する、特にＴ７、Ｔ３、Ｋ１１、ＳＰ６のようなバクテリオファージの単量体ＲＮＡポリメラーゼに由来する請求項１０記載のファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼを除外するために、１位及びおおよそ４１０位間又はおおよそ９０位及び３２０位間又は１１５位及び３００位間に位置する少なくとも一つのアミノ酸が置換又は欠失したファージ起源の野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異を含むファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
グルタミン酸による２２２位のリジン（Ｋ）の置換。
【請求項１３】
以下から選択される請求項１２記載のファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの２６６位に位置するプロリン、又はＴ３の２６７位、Ｋ１１の２８９位及びＳＰ６の２３９位に位置するプロリンのようなバクテリオファージの野生型ＲＮＡポリメラーゼの相同位置に位置するプロリンに代えて２６６位にロイシンを含むもの。
−及び／又は、上記のプロリン周辺に位置し、すなわち対象のプロリンからおおよそ１０オングストロームに等しいかそれ以下の距離に位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換又は欠失により改変されたもの。
【請求項１４】
次から選択される変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
＊野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−バリン（Ｖ）による１１７位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−バリン（Ｖ）による１１９位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−アラニン（Ａ）による１３４位のバリン（Ｖ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による１４７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−アルギニン（Ｒ）による２３０位のヒスチジン（Ｈ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６６位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９１位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３９位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１０位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１４８位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６７位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９２位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６４０位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１１位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１６７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２８９位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による３１４位のアルギニン（Ｒ）の置換。
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６６２位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８３３位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１１７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２３９位のプロリン（Ｐ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３１位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８０４位のイソロイシン（Ｉ）の置換。
【請求項１５】
次から選択される変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−プロリンに代えて２６６位のロイシンを含む配列番号２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１７位のバリン、及びバリンに代えて１３４位のアラニンを含む配列番号４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、及びアスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギンを含む配列番号６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−ヒスチジンに代えて２３０位のアルギニン、及びアルギニンに代えて２９１位のシステインを含む配列番号８で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びチロシンに代えて６３９位のフェニルアラニンを含む配列番号１０で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、アスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギン及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
請求項１０から１５のいずれか１項記載のＲＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のたんぱく質配列をそれぞれコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のヌクレオチド配列、又は遺伝コードの縮重により上記のヌクレオチド配列から誘導され、上記のたんぱく質をコードする特性を保持する全てのヌクレオチド配列から選択される請求項１６記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】
請求項１６記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載のベクターにより形質転換された細胞。
【請求項２０】
対象のＲＮＡをインビトロ調製するための方法であって、適当な培地中で請求項１０から１５のいずれか１項記載の少なくとも一つの変異型ＲＮＡポリメラーゼと対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を結合し転写を上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下に行うことを含む方法。
【請求項２１】
対象のＲＮＡをインビボ調製するための方法であって、ゲノムが対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下で行われる、請求項１０から１５のいずれか１項記載の少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを生産する請求項１９記載の細胞の培養を含む方法。
【請求項２２】
対象のたんぱく質をインビボ調製するための方法であって、ゲノムが対象の該たんぱく質をコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下行われる、請求項１０から１５のいずれか１項記載の少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼを生産する請求項１９記載の細胞の培養を含む方法。
【請求項２３】
請求項２０から２２のいずれか１項記載の対象のＲＮＡ又はたんぱく質をインビトロ又はインビボで調製するための方法であって、合成ポリアミンの添加の工程も含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、ＲＮＡポリメラーゼから誘導されるポリペプチド、また指定される変異型ＲＮＡポリメラーゼ、同様にそれらの使用、特に対象のＲＮＡのインビボ又はインビトロ調製法にある。
【０００２】
完全に明白な配列の大量のＤＮＡ分子を得るときは、高純粋で、小サイズ（１０から１００ｎｔ）の化学合成法が、現在もっとも経済的な方法である。現在、市場には必要に応じてこれらの合成を行う非常に多数の企業がある。これらの同じ会社はまたＲＮＡ合成も提供している、しかし、その技術はとても費用がかかり、これはＤＮＡ対するより少なくとも１０倍高く、現在非常に高いものとなっている。
【０００３】
それゆえ酵素的合成法が、化学的合成又はプラスミド起源のＤＮＡ鋳型につないだＲＮＡポリメラーゼの使用で好まれている。これは使用するポリメラーゼのプロモーター配列の下流に転写される配列を含むものである。必要な要素（ポリメラーゼ、ｒＮＴＰ、クローニングベクター）は、最適化されたキットの形で入手できる。
【０００４】
バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、組換えＤＮＡの鋳型からＲＮＡの大量合成（ミリグラムまで）の目的で、インビトロ転写反応を行うために非常に広範囲に使われる。これらのインビトロ合成ＲＮＡは、生物学、バイオテクノロジー、医薬で多くの使用のために必要である；特に以下で述べられる：
−インビトロ翻訳、
−ＲＮＡ成熟の研究、
−遺伝子発現へのアンチセンスＲＮＡの効果、
−ＲＮＡ−たんぱく質相互作用、
−小細胞ＲＮＡｓ（ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ）相同物の合成、
−リボザイムの生産。
【０００５】
より一般的にはこれらのＲＮＡは、また分子プローブや構造研究の基質として使われる。
【０００６】
少数のＴ７ポリメラーゼ変異がすでに記述されている。これらは、野生型Ｔ７ポリメラーゼから誘導された変異型ＲＮＡポリメラーゼであり、次の変異のひとつを含む。
・グルタミン酸のよる２２２位のリジン（Ｋ）の置換；このように変異されたＲＮＡポリメラーゼは、この変異により変更したプロモーター認識特性を有し、そして米国特許５，３８５，８３４に記述されている。
・フェニルアラニン（Ｆ）による６３９位のチロシン（Ｙ）の置換；このように変異されたＲＮＡポリメラーゼは、リボヌクレオチドの代わりにデオキシリボヌクレオチドを取り込む特性を有す、それゆえＲＮＡの代わりにＤＮＡを合成し、そして米国特許６，１０７，０３７に記述されている。
・セリン（Ｓ）による８１０位のイソロイシン（Ｉ）の置換；このように変異されたＲＮＡポリメラーゼは、野生型ＲＮＡポリメラーゼより遅い特性を有し、そしてBonner等、The Journal of Biochemical Chemistry, 269, pp. 25120-25128 (1994)に記述されている。
【０００７】
本発明で解決される課題は、供与ＤＮＡ鋳型上でのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（及び、さらに他の既知のＲＮＡポリメラーゼのすべて）の活性が、供与ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の転写される最初の６から１２ヌクレオチド（最初の転写配列、ＩＴＳ）の性質に強く依存する（Miligan et al., 1987）という事実と結びついている。もしＩＴＳが共通配列５′ＧＧＧＡＧＡ．．．から違いすぎると、そのときポリメラーゼは、しばしば中断し大量のリボヌクレシド３リン酸が希望の大ＲＮＡｓを損なった中断の小ＲＮＡｓの合成のために消費される。
【０００８】
それゆえ、実験者は一般的に効率的な転写を得るために都合のよいＩＴＳ（また、共通（consensus）又は共通の（consensual）ＩＴＳといわれる）を付加する転写配列の改変をせざるおえない。多くの場合は、この強制は非常に面倒でさらに受け入れられにくい。
【０００９】
全ての非共通の５′末端ＲＮＡを得るための潜在的方法は、共通ＩＴＳの下流に希望の配列を含むＲＮＡの後処理を使う；後者
（目的）のＲＮＡはそれゆえ大量に生産される。さらに、削除されるようにＲＮＡの３′末端に補完されるＤＮＡ配列のキメラＤＮＡ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学的に合成する必要があり、それから目的の転写物とオリゴとで形成するハイブリッドがＲｎａｓｅ  Ｈで消化される。この複雑で煩わしい方法は、もし希望のＲＮＡが非常に大サイズで、その５′末端が厳密に明らかならばもっともである。
【００１０】
反応培地への合成ポリアミンの添加は、中断サイクル数を減少させることでＲＮＡ生産を増加するらしい；しかしながら、最適な実験条件の決定は（ポリアミン、使用濃度の選択）研究ごとに必要である。さらに、鋳型がプラスミド起源（二本鎖）のときには、これらポリアミンの効果は弱く、無いことさえあるということを注意べきである（Frugier et al., 1994）。
【００１１】
これら２つの方法は、共通で使用できず（特定のポリアミン又はオリゴヌクレオチド）お決まりの使用には不向きな試薬を使用する。はじめに、中断の少ない性質のポリメラーゼの獲得の実現がこの課題を解決するもっと簡単な方法であるということは明らかである。
【００１２】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼのペプチド配列の改変で転写されるヌクレオチド配列のＩＴＳの性質への上記の改変型ＲＮＡポリメラーゼの感受性が減少できるという事実の発明者による実証の結果である。
【００１３】
本発明は、対象のＲＮＡ生産に通常使用される野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導されるポリペプチドを提供することを目的とする。これは、該野生型ＲＮＡポリメラーゼより非共通のＩＴＳの性質への感受性が際立って低い。
本発明は、野生型ＲＮＡポリメラーゼが、対象の該ＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列のＩＴＳに過敏である時、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用する方法より多い収量で対象のＲＮＡを生産する新しい方法を提供することをまた目的とする。
【００１４】
本発明の主題は、ファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの使用で、すなわちファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであって、そのＲＮＡポリメラーゼのペプチド鎖は誘導される野生型ＲＮＡポリメラーゼに対して少なくともひとつのアミノ酸の置換、又は欠失、又は付加により改変される変異型ＲＮＡポリメラーゼであって、この改変は対象のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に含まれるＩＴＳへの該ＲＮＡポリメラーゼの感受性を減らす効果を有しており、対象の該ＲＮＡ又は対象のこのＲＮＡにコードされるたんぱく質を生産するための方法の実施のために、対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチドから始まり、この転写は、上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの制御下にあり、該方法は（対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に含まれるものと同じ非共通のＩＴＳの存在下で）野生型ＲＮＡポリメラーゼの使用の場合に得られる収量より多い該ＲＮＡの生産収量を有する方法である。
【００１５】
対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の転写において上記の変異型該ＲＮＡポリメラーゼ活性は、このＤＮＡ配列の非共通のＩＴＳを構成するヌクレオチドの性質により目立った影響を受けず、誘導された野生型ＲＮＡポリメラーゼにはなく、これによってこれら変異型ＲＮＡポリメラーゼを野生型ポリメラーゼよりもおおよそ４０倍まで活性にし、それゆえ本発明の上記の方法においてこの同じ非共通のＩＴＳの存在下で野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合に得られる収量より多い該ＲＮＡの生産収量で特徴図けられる。
【００１６】
本発明の別の特に有利な概念には、本発明の変異型ＲＮＡポリメラーゼが対象の該ＲＮＡをコードする配列に存在下するいかなるＩＴＳでも対象のＲＮＡを実際的に同一収量で得ることを可能とすることである。
【００１７】
有利的には、上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼの使用は、非共通のＩＴＳの存在下で野生型ＲＮＡポリメラーゼの使用場合に得られる収量よりおおよそ１０倍まで多い収量で対象のＲＮＡを生産する方法を実施させる。
【００１８】
上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼを使用する本発明に従った方法の実施で大量に生産しうる対象のＲＮＡは、天然又はキメラＲＮＡｓであり、もし１つあるいはそれ以上の非標準のヌクレオシド単リン酸（すなわち、もしこの類似物がポリメラーゼにより認識されるならば天然の核酸塩基の１つの類似物を任意に所持できる該糖自身たとえばリボースの代わりのデオキシリボース）を含むならば該ＲＮＡｓである。後者の場合、本発明の主題はまた核酸分子の配列決定のための方法の実施における該上記のＲＮＡポリメラーゼ使用の上記の方法の使用である。
【００１９】
使用される変異型ＲＮＡポリメラーゼは、野生型ファージ単量体ポリメラーゼから有利的に誘導されるもので、W. T. McAllister及びC. A. Raskin, Molecular Microbiology (1993), 10 (1), 1-6.の論文で特に記述されており、特にそれぞれT7, T3, K11, SP6のようなバクテリオファージの単量体ＲＮＡポリメラーゼに由来するものである。
【００２０】
好ましくは、上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼは、１位及びおおよそ４１０位間、特におおよそ９０位及び３２０位間、より特に１１５位及び３００位間に位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換又は欠失で改変される野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導されるものである。
【００２１】
有利的には、使用されるＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの２６６位に位置するプロリン又はＴ３の２６７位、Ｋ１１の２８９位及びＳＰ６の２３９位に位置するプロリンのようにバクテリオファージ野生型ＲＮＡポリメラーゼの相同位置に位置するプロリンに代えて２６６位のロイシンを含むものである。
【００２２】
本発明のより特定の主題は、上記のすべての変異型ＲＮＡポリメラーゼの上記の使用であって、上で定義のプロリン及び／又は上記のプロリン周辺に位置する少なくとも１つのアミノ酸、すなわち該ＲＮＡポリメラーゼがその３次元構造で考えられたときに対象のプロリンからおおよそ１０オングストロームに等しいかそれ以下の距離に位置するアミノ酸（Cheetham, G. M. & Steitz, T. A. (1999), Science 286, 2305-2309; Cheetham, G. M. et al., Nature 399, 80-83; Sousa, R. et al., Nature 364, 539-599に記述されるように）が置換又は欠失で改変されるすべての変異型ＲＮＡポリメラーゼの使用である。
【００２３】
本発明は、また特に好ましくは次から選択される変異型ＲＮＡポリメラーゼの上記の使用に関する。
＊野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−バリン（Ｖ）による１１７位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−バリン（Ｖ）による１１９位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−アラニン（Ａ）による１３４位のバリン（Ｖ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による１４７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−アルギニン（Ｒ）による２３０位のヒスチジン（Ｈ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６６位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９１位のアルギニン（Ｒ）の置換、
＊野生型Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１４８位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６７位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９２位のアルギニン（Ｒ）の置換、
＊野生型Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１６７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２８９位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による３１４位のアルギニン（Ｒ）の置換、
＊野生型ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、次の変異の少なくとも１つを含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１１７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２３９位のプロリン（Ｐ）の置換。
【００２４】
本発明のより特定の主題は、次の変異型ＲＮＡポリメラーゼの上記の使用である。
−プロリンに代えて２６６位のロイシンを含む配列番号２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１７位のバリン、及びバリンに代えて１３４位のアラニンを含む配列番号４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、及びアスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギンを含む配列番号６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−ヒスチジンに代えて２３０位のアルギニン、及びアルギニンに代えて２９１位のシステインを含む配列番号８で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びチロシンに代えて６３９位のフェニルアラニンを含む配列番号１０で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、アスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
【００２５】
本発明の主題は、また上記のアミノ酸の改変と同様にＤＮＡ配列の転写の適用範囲内におけるＩＴＳへの感受性以外の機構に関与する少なくとも一つの他のアミノ酸の置換又は欠失又は付加による改変であって、たとえば上記の改変型ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ鎖に非標準のヌクレオシド３リン酸（たとえば、ｄＮＴＰ）を取り込むことを可能とし、それゆえにＤＮＡ合成が可能となるアミノ酸の改変、そして／又は遅いＲＮＡポリメラーゼの獲得を可能とし、それゆえに本発明の変異と関係して対象のたんぱく質の合成収量の向上が可能となるアミノ酸の改変を含む上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼの上記の使用である。
【００２６】
それゆえ本発明のより特定の主題は、上記の変異と同様にフェニルアラニンによるＴ７の６３９位、又は上記の他のポリメラーゼの類似位置のチロシンの置換に相当する変異、そして／又、セリン又はアスパラギンによるＴ７の８１０位、又は上記の他のポリメラーゼの類似位置のイソロイシンの置換に相当する変異を含む上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼの上記の使用である。
【００２７】
それゆえ本発明はまた配列番号１０で表される上記の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの使用とより特に関係する。
【００２８】
本発明の主題は、また：
＊  １１７、１１９、１３４、１４７、２３０、２６６又は２９１位で上記の変異の少なくとも１つ、及び任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３９位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１０位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊  １４８、２６７、又は２９２位で上記の変異の少なくとも１つ、及び任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む野生型Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６４０位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１１位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊  １６７、２８９、又は３１４位で上記の変異の少なくとも１つ、及び任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む野生型Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６６２位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８３３位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊  １１７、又は２３９位で上記変異の少なくとも１つ、及び任意で次の追加変異の少なくとも一つを含む野生型ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３１位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８０４位のイソロイシン（Ｉ）の置換。
【００２９】
本発明は、また上記のファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの調製のためのすべての方法に関する、すなわち、対象のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み、転写がそれらが由来するファージ起源の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターの制御下におかれるＲＮＡポリメラーゼの所定のヌクレオチド配列転写活性が、野生型ＲＮＡポリメラーゼによるこの所定の配列の転写活性より高いものであって、特に該所定のヌクレオチド配列で始まる対象のＲＮＡを生産するための方法の実施の適用範囲内では該野生型ＲＮＡポリメラーゼよりおおよそ４０倍までの活性である変異型ＲＮＡポリメラーゼの調製の方法に関するものであって、該方法は：
−  該野生型ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコドンの置換又は欠失又は付加によるファージ起源の野生型ＲＮＡポリメラーゼのペプチド鎖の改変の工程、そして上記の改変遺伝子を含むベクターでの大腸菌のような適当な細胞の形質転換の工程、
−大腸菌のような適当な細胞内、特に前述の細胞内での特定のマーカーの生産収量が同じ条件下で野生型ＲＮＡポリメラーゼの使用で得られるこの同じマーカーの生産収量より多い上述の変異型ＲＮＡポリメラーゼを生産する細胞を検出する工程であって、特定のマーカーが、上記のＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの下流に挿入されるヌクレオチド配列によりコードされる色原性マーカー又は抗生物質耐性マーカーのようなマーカーであり、このマーカーをコードする配列及びプロモーターは野生型ＲＮＡポリメラーゼの活性に影響を及ぼすことで知られる最初のおおよそ６から１２ヌクレオチドの性質によるＩＴＳにより分離されている工程、
−前工程で検出された細胞からの上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼの精製工程、
を含む方法。
【００３０】
本発明のより特定の主題は、上記の調製方法の実施により得られるファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの上記の使用である。
【００３１】
本発明は、また上記の調製方法の実施により得られるファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼに関する。
【００３２】
本発明のより特定の主題は、上記の調製方法の実施により得られるファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼで野生型ファージ単量体ポリメラーゼの改変に由来するもので、特にＴ７、Ｔ３、Ｋ１１、ＳＰ６のようなバクテリオファージの単量体ＲＮＡポリメラーゼに由来するものである。
【００３３】
本発明の主題は、また野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼを除外するために１位とおおよそ４１０位間、特におおよそ９０位と３２０位間、より特に１１５位と３００位間に位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換又は欠失したファージ起源の野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導される次の変異を含むファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
・グルタミン酸による２２２位のリジン（Ｋ）の置換。
【００３４】
本発明のより特定の主題は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの２６６位、又はＴ３の２６７位、Ｋ１１の２８９位、及びＳＰ６の２３９位のような野生型バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの相同位置のプロリンに代えて２６６位のロイシンを含む上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼである。
【００３５】
本発明のより特定の主題は、また上記のすべての変異型ＲＮＡポリメラーゼにおいて上記のプロリン、及び／又は上記のプロリン周辺に位置する少なくとも１つのアミノ酸、すなわち該ＲＮＡポリメラーゼがその３次元構造で考えられたときに対象のプロリンからおおよそ１０オングストロームに等しいかそれ以下の距離に位置するアミノ酸が置換又は欠失で改変されるすべての変異型ＲＮＡポリメラーゼである。
【００３６】
本発明のより特定の主題は、Ｔ７、Ｔ３、Ｋ１１、又はＳＰ６のような野生型ＲＮＡポリメラーゼから誘導される変異型ＲＮＡポリメラーゼに関するもので、次から選ばれる：
＊野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、少なくとも１つの次の変異を含むもの：
−バリン（Ｖ）による１１７位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−バリン（Ｖ）による１１９位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
−アラニン（Ａ）による１３４位のバリン（Ｖ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による１４７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−アルギニン（Ｒ）による２３０位のヒスチジン（Ｈ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６６位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９１位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３９位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１０位のイソロイシン（Ｉ）の置換、
＊野生型Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、少なくとも１つの次の変異を含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１４８位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２６７位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による２９２位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６４０位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８１１位のイソロイシン（Ｉ）の置換。
＊野生型Ｋ１１ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、少なくとも１つの次の変異を含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１６７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２８９位のプロリン（Ｐ）の置換、
−システイン（Ｃ）による３１４位のアルギニン（Ｒ）の置換、
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６６２位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８３３位のイソロイシン（Ｉ）の置換。
＊野生型ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから誘導され、少なくとも１つの次の変異を含むもの：
−アスパラギン（Ｎ）による１１７位のアスパラギン酸（Ｄ）の置換、
−ロイシン（Ｌ）による２３９位のプロリン（Ｐ）の置換。
任意で次の付加的変異の少なくとも１つを含む該変異型ＲＮＡポリメラーゼ：
−フェニルアラニン（Ｆ）による６３１位のチロシン（Ｙ）の置換、
−アスパラギン（Ｎ）による８０４位のイソロイシン（Ｉ）の置換。
【００３７】
本発明のより特定の主題は、次の変異型ＲＮＡポリメラーゼである：
−プロリンに代えて２６６位のロイシンを含む配列番号２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１７位のバリン、及びバリンに代えて１３４位のアラニンを含む配列番号４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、及びアスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギンを含む配列番号６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−ヒスチジンに代えて２３０位のアルギニン、及びアルギニンに代えて２９１位のシステインを含む配列番号８で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びチロシンに代えて６３９位のフェニルアラニンを含む配列番号１０で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１２で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−プロリンに代えて２６６位のロイシン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１４で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
−イソロイシンに代えて１１９位のバリン、アスパラギン酸に代えて１４７位のアスパラギン、及びイソロイシンに代えて８１０位のアスパラギンを含む配列番号１６で表される変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ。
【００３８】
本発明は、また上記のファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼをコードしたヌクレオチド配列に関する。
【００３９】
それゆえ本発明のより特定の主題は、上記の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のたんぱく質配列をそれぞれコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のヌクレオチド配列、又は遺伝コードの縮重により上記のヌクレオチド配列から誘導され上記のたんぱく質をコードする性質を保持するヌクレオチド配列。
【００４０】
本発明の主題は、また上記のヌクレオチド配列を含むすべてのベクター、特にすべてのプラスミドである。
【００４１】
本発明の主題は、また上記ベクターで形質転換される全ての細胞、特に細菌（たとえば大腸菌）、酵母、又は高等真核生物から選ばれる該細胞である。
【００４２】
本発明は、またファージ起源の上記の変異型ＲＮＡポリメラーゼの調製のための全ての方法に関するものであって、適当な培養培地での上記の形質転換細胞の培養及び該細胞で生産されるＲＮＡポリメラーゼの精製を含む。
【００４３】
本発明の主題は、また対象のＲＮＡをインビトロ調製する全ての方法であって、適当な培地中で、上記の少なくとも一つの変異型ＲＮＡポリメラーゼ、対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を結合し、転写を上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下に行うことを含む方法。
【００４４】
本発明は、また対象のＲＮＡをインビボ調製する全ての方法に関するものであって、ゲノムが対象の該ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下で行われる本発明に記載の少なくとも一つのファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼを生産する該細胞の培養を含む方法。
【００４５】
本発明の主題は、また上記の細胞培養を含む対象のたんぱく質をインビボ調製する全ての方法であって、ゲノムが対象の該たんぱく質をコードするＤＮＡ配列を含む所定のヌクレオチド配列を含むように改変され、転写が上記の野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーターの制御下で行われる本発明に記載の少なくとも一つのファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼを生産する該細胞の培養を含む方法。
【００４６】
有利的には、上記の対象のたんぱく質を調製するための全ての方法の実施の場合、細胞で生産される変異型ＲＮＡポリメラーゼは配列番号：１２、１４及び１６から選ばれる。
【００４７】
本発明は、また対象のＲＮＡ又はたんぱく質をインビトロ又はインビボで調製するための全ての方法に関するものであって、さらに、Ｆｒｕｇｉｅｒ等に記述の合成ポリアミンの添加の工程も含む。使用できるポリアミン間には、次のものが記述されている：
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）１０ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２
ＮＨ２（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）１０ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２
【００４８】
本発明では、さらに本発明記載のファージ起源の変異型ＲＮＡポリメラーゼの生産、及び野生型ＲＮＡポリメラーゼ使用での同じＲＮＡｓ生産と比べた所定のＲＮＡｓ生産の増大のためのそれらの使用について以下の詳細な記述を使って説明される。
【００４９】
バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼは、通常、伸長工程では非常に進行的であるが、ＩＴＳの転写中においてはそのケースでない：この場合、初期転写は、未熟なまま放される（中断転写）可能性が高い。これは、酵素がＩＴＳを上手く転写し伸長工程に入る前に平均に果たしている中断サイクルの回数であり、これが完全転写の合成頻度を決定している。この回数は、ＩＴＳがバクテリオファージＴ７のクラスIII遺伝子の５′配列（‘共通の’ＩＴＳ；５′ＧＧＧＡＧＡ．．．）に対応しているときが最小である。しかしながら、これらの条件でさえ、中断転写物は、全転写物の大部分（４０％から６０％）を構成する。この比率は、ＩＴＳが共通から除かれたり、又はＲＮＡポリメラーゼが伸長率を減らす変異を有しＩＴＳの通過の必要時間を増加する時には非常に急激に増大する（Bonner et al., 1994; Bonner et al., 1992）。場合により非共通のＩＴＳ及び遅いポリメラーゼの組み合わせは、酵素が中断工程のいつまでもループである状況に至り：そこから大転写物は合成されない。この特性は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現している大腸菌細胞において、インビトロだけではなくインビボにおいても観察される（Lopez et al., 1997; Makarova et al., 1995）。われわれが野生型酵素のそれよりＩＴＳの性質への感受性が少ない活性でＴ７ＲＮＡポリメラーゼの変異体を選択するために開発したのは後者の状況である。
【００５０】
われわれは、Ｔ７プロモーターの制御下に標的遺伝子を置いた、この発現は、非共通のＩＴＳにより先導され−ｌａｃＺ遺伝子でその産物はΒガラクドシダーゼである−容易に検出可能である。この遺伝子は、それから触媒部位に変異のＴ７ポリメラーゼ（すなわち、‘遅い’ポリメラーゼ）をコードするプラスミドをさらに含む細菌細胞に導入される。上で示したように中断工程で妨げられるシステムでは大転写物を生産しない、それゆえにΒガラクドシダーゼを生産しない。しかしながら、プラスミドのランダム変異導入後に標的遺伝子を発現できる新変異の酵素を合成する細菌クローンを選択することは可能である。われわれは、触媒部位の初期変異の復帰変異以外で、触媒に関与していない酵素のＮ末端部分の変異体をこのようにして単離した。これら新変異が野生型酵素、すなわち触媒部位に変異のない野生型酵素に導入された時、我々はそれらがＩＴＳの厳格な性質への酵素の感受性を減らすことを観察した。これらが、本発明の主題を形成しここで、より特に記述される点変異Ｐ２６６Ｌである。実際、野生型酵素がほとんど動作しない鋳型で使用レベルの転写を可能とする。
【００５１】
詳細な記述
ａ）調整、精製及び保存
得られた点変異配列番号２は、Ｔ７ポリメラーゼ配列のプロリン２６６のロイシン（Ｐ２６６Ｌ）への変換に対応している。この変異型Ｔ７ポリメラーゼの遺伝子は、誘導プロモーター（ｐＬａｃ  ＵＶ５）の制御下でｐＡＲ１２１９プラスミドに含まれる。このたんぱく質（ポリメラーゼ）は、大腸菌ＢＬ２１（ｏｍｐＦ−）で過剰発現される。抽出、精製及び精製たんぱく質の保存のプロトコールは、野生型ポリメラーゼのそれらと同一である。精製を促進するために、ポリメラーゼは、ｐＢＨ１６１プラスミド（He et al., 1977）中の同等のコード配列に代えて変異領域を移すことにより６個のＮ末端ヒスチジンで標識される。この標識は決してポリメラーゼの触媒活性特性を改変しない。その後＞９０％の純粋たんぱく質を得るためにはニッケルアフィニティーカラムに細菌上清を通すことだけで十分である。−２０℃での長期間（２年）の保存は、酵素特性を変えない。
【００５２】
ｂ）触媒活性
野生型ポリメラーゼで使用される標準条件下でこの変異体は供給される全てのｒＮＴＰｓをＲＮＡにまた転換できる。しかしながら、この取り込みが実行される率は変異体でおおよそ３倍低い、すなわち完全転写には長時間を必要とする（たとえば、２時間に代わりに６時間）。
【００５３】
以下で言及するように、野生型ポリメラーゼと変異体間の主な区別は、得られるＲＮＡｓのサイズ作用としての分布レベル（それゆえ集団）で見出されることである。ＲＮＡの２つの型：中断ＲＮＡ及び大ＲＮＡは、インビトロ転写の完了で観察できる。
【００５４】
われわれは、７箇所の非常に異なるＩＴＳ上での野生型ポリメラーゼ及び変異体で得られたインビトロ転写の結果を以下で示す。鋳型は、プロモーターの下流３１から７１ｎｔに位置する制限部位で線状化されたプラスミドＤＮＡｓ（約６ｋｂｐ）である。反応は、場合により１０、２０、又は３０分で止められ、そして表示は、α３２ＰＧＴＰ、α３２ＰＵＴＰ、又はγ３２ＰＧＴＰである。使用された実験条件は、J. Mol. Biol. (1997) 269:41-51に記述されている。転写物は、高解像度の変性ポリアクリルアミドゲルで分離された。
【００５５】
Ｇ１０（５′ＧＧＧＡＧＡＣＣＡ．．３３ｎｔで線状化）は、共通のＩＴＳを保持する。事実、この場合の最初の３０ヌクレオチドはＴ７ポリメラーゼでよりよく転写されるものの一つであるファージＴ７の遺伝子１０配列に対応する。
【００５６】
ＧＧＬａｃ（５′ＧＧＧＧＡＡＵＵ．６９ｎｔで線状化）は、Ｔ７転写を任意に抑制するためにＬａｃリプレッサーの結合部位を含む市販プラスミドｐＥＴ１５ｂ（ナルゲン）に見出されるＩＴＳを保持する。
【００５７】
Ｌａｃ（５′ＧＧＡＡＵＵＧ．３０ｎｔで線状化）は、前記のものと同等のプラスミドであり、その作動部位がプロモーターの２ヌクレオチド近づく。
【００５８】
ＴｙｒＧ（５′ＧＵＣＵＣＧＧ．７８ｎｔで線状化）、Ｇｌｙ（５′ＡＣＵＣＵＵＵ．７１ｎｔで線状化）、Ｔｙｒ（５′ＣＵＣＵＣＧＧ．７８ｎｔで線状化）、及びＶａｌ（５′ＧＧＵＵＵＣＧ．３１ｎｔで線状化）は、ｔＲＮＡ又はｔＲＮＡ断片のインビトロ合成に意図された鋳型に対応するプラスミドで転写困難である。
【００５９】
図１から７は、観察された中断ＲＮＡｓを示す詳細な結果で、ＩＴＳ  Ｇ１０（図１）、ＧＧＬａｃ（図２）、ＴｙｒＧ（図３）、Ｌａｃ（図４）、Ｇｌｙ（図５）、Ｔｙｒ（図６）、Ｖａｌ（図７）の存在下、変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２使用の場合（またＰ２６６Ｌと指定し、灰色カラムを使って表示）及び野生型Ｔ７ポリメラーゼ使用の場合（またｗｔと指定し、黒カラムを使って表示）における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、２ｍｅｒと１３ｍｅｒ間に分布している（Ｘ軸に沿った２から１３で番号付けしている）。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている（Ｘ軸に沿ったＬＴ）。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがＹ軸で使われている。
【００６０】
これらの結果は、明らかに全ての場合で変異体は、５番目、６番目、そして７番目ヌクレオチド取り込みにおいて野生型ポリメラーゼより困難性が少ないことを示している。そして／又、もしこれらの位置でポリメラーゼがピリミジン（Ｕ又はＣ）を取りこまなければならないならば、野生型ポリメラーゼの中断率は上昇し、全てで変異体のハンディキャップ除去率がより大きくなる。
【００６１】
当座の結論が図８にまとめられている。これは、前記の結果を含み、次第に好ましくなくなるＩＴＳｓに対する２つのポリメラーゼの生産性の比較の図である。示された値は、野生型Ｔ７ポリメラーゼ（ｗｔ，黒カラム）の使用の場合及び変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２（Ｐ２６６Ｌ、灰色カラム）使用の場合での大転写物へのｒＮＴＰの取り込みパーセンテージに対応して示してある。
【００６２】
２つのポリメラーゼが完全な履行を与えるＧ１０及びＧＧＬａｃ以外では、他の全ての場合において野生型ポリメラーゼは低い収量、２２％と１％間を含む非常に低い収量であるが、一方変異体のそれは３０％と８５％間を含む理にかなったままである。
【００６３】
【表１】
2004535163.tif 000002
2004535163.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、観察された中断ＲＮＡｓを示す詳細な結果で、ＩＴＳ  Ｇ１０の存在下、変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２使用の場合（またＰ２６６Ｌと指定し、灰色カラムを使って表示）及び野生型Ｔ７ポリメラーゼ使用の場合（またｗｔと指定し、黒カラムを使って表示）における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、２ｍｅｒと１３ｍｅｒ間に分布している（Ｘ軸に沿った２から１３で番号付けしている）。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている（Ｘ軸に沿ったＬＴ）。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがＹ軸で使われている。
【図２】図２は、観察された中断ＲＮＡｓを示す詳細な結果で、ＩＴＳ  ＧＧＬａｃの存在下、変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２使用の場合（またＰ２６６Ｌと指定し、灰色カラムを使って表示）及び野生型Ｔ７ポリメラーゼ使用の場合（またｗｔと指定し、黒カラムを使って表示）における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、２ｍｅｒと１３ｍｅｒ間に分布している（Ｘ軸に沿った２から１３で番号付けしている）。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている（Ｘ軸に沿ったＬＴ）。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがＹ軸で使われている。
【図３】図３は、観察された中断ＲＮＡｓを示す詳細な結果で、ＩＴＳ  ＴｙｒＧの存在下、変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号の２使用の場合（またＰ２６６Ｌと指定し、灰色カラムを使って表示）及び野生型Ｔ７ポリメラーゼ使用の場合（またｗｔと指定し、黒カラムを使って表示）における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、２ｍｅｒと１３ｍｅｒ間に分布している（Ｘ軸に沿った２から１３で番号付けしている）。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている（Ｘ軸に沿ったＬＴ）。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがＹ軸で使われている。
【図４】図４は、観察された中断ＲＮＡｓを示す詳細な結果で、ＩＴＳ  Ｌａｃの存在下、変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２使用の場合（またＰ２６６Ｌと指定し、灰色カラムを使って表示）及び野生型Ｔ７ポリメラーゼ使用の場合（またｗｔと指定し、黒カラムを使って表示）における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、２ｍｅｒと１３ｍｅｒ間に分布している（Ｘ軸に沿った２から１３で番号付けしている）。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている（Ｘ軸に沿ったＬＴ）。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがＹ軸で使われている。
【図５】図５は、観察された中断ＲＮＡｓを示す詳細な結果で、ＩＴＳ  Ｇｌｙの存在下、変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２使用の場合（またＰ２６６Ｌと指定し、灰色カラムを使って表示）及び野生型Ｔ７ポリメラーゼ使用の場合（またｗｔと指定し、黒カラムを使って表示）における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、２ｍｅｒと１３ｍｅｒ間に分布している（Ｘ軸に沿った２から１３で番号付けしている）。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている（Ｘ軸に沿ったＬＴ）。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがＹ軸で使われている。
【図６】図６は、観察された中断ＲＮＡｓを示す詳細な結果で、ＩＴＳ  Ｔｙｒの存在下、変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２使用の場合（またＰ２６６Ｌと指定し、灰色カラムを使って表示）及び野生型Ｔ７ポリメラーゼ使用の場合（またｗｔと指定し、黒カラムを使って表示）における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、２ｍｅｒと１３ｍｅｒ間に分布している（Ｘ軸に沿った２から１３で番号付けしている）。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている（Ｘ軸に沿ったＬＴ）。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがＹ軸で使われている。
【図７】図７は、観察された中断ＲＮＡｓを示す詳細な結果で、ＩＴＳ  Ｖａｌの存在下、変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２使用の場合（またＰ２６６Ｌと指定し、灰色カラムを使って表示）及び野生型Ｔ７ポリメラーゼ使用の場合（またｗｔと指定し、黒カラムを使って表示）における全転写物数に対するそれらのパーセンテージ、同様に中断工程を逃れた長い転写物に対する同等図も示す。中断転写物は、２ｍｅｒと１３ｍｅｒ間に分布している（Ｘ軸に沿った２から１３で番号付けしている）。中断工程を逃れたポリメラーゼ由来の転写物は、長い転写物として同定されている（Ｘ軸に沿ったＬＴ）。あまり十分とはいえない転写物を定量化できるように対数スケールがＹ軸で使われている。
【図８】図８は、前記の結果を含み、次第に好ましくなくなるＩＴＳｓに対する２つのポリメラーゼの生産性の比較の図である。示された値は、野生型Ｔ７ポリメラーゼ（ｗｔ，黒カラム）の使用場合及び変異型ＲＮＡポリメラーゼ配列番号２（Ｐ２６６Ｌ、灰色カラム）使用場合での大転写物へのｒＮＴＰの取り込みパーセンテージに対応して示してある。
【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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