(57)【要約】本発明は、ＴＮＦ−アルファ刺激したヒト微細血管内皮細胞からクローニング、単離および同定した、細胞シグナル伝達カスケードに関与するタンパク質（ＲＥＴ１６と称する）をコードする新たに見出されたポリヌクレオチド、並びにマウスおよびラットのＲＥＴ１６オーソログを記載する。本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドに関連する、ＲＥＴ１６ポリペプチド配列、発現ベクター、宿主細胞、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンス分子、および抗体をも記載する。ヒトＲＥＴ１６タンパク質のモデュレーター、とりわけインヒビターをスクリーニングする方法、および治療剤および診断剤のためのＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用を記載する。
2004532619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド：
（ａ）細胞内シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、またはその機能性の断片であって、該ポリペプチドが配列番号２、配列番号４および配列番号７よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を含むもの；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６および配列番号８よりなる群から選ばれた配列を含む単離ポリヌクレオチド；
（ｃ）細胞シグナル伝達カスケードに関与するシグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号２または配列番号４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するもの；
（ｄ）（i）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６および配列番号８よりなる群から選ばれた配列；（ii）遺伝子コードの縮重の結果として、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６および配列番号８よりなる群から選ばれた配列からの核酸配列縮重物；または（iii）これらに相補的な核酸配列、を有する核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド；
（ｅ）ヒトＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１のヌクレオチド１５１〜１５７５を含み、配列番号２マイナス開始コドンのアミノ酸２〜４７６に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１のヌクレオチド１４８〜１５７５を含み、開始コドンを含む配列番号２のアミノ酸１〜４７６に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１２と少なくとも８２.０％同一のヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド；
（ｉ）ヒトＲＥＴ１６.２ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号１２のヌクレオチド１１４〜１２６２を含み、配列番号１３マイナス開始コドンのアミノ酸２〜３８４に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１２のヌクレオチド１１１〜１２６２を含み、開始コドンを含む配列番号１３のアミノ酸１〜３８４に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｌ）ヒトＲＥＴ１６.３ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号１４のヌクレオチド１３９〜１６４１を含み、配列番号１５マイナス開始コドンのアミノ酸２〜５０２に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１４のヌクレオチド１３６〜１６４１を含み、開始コドンを含む配列番号１５のアミノ酸１〜５０２に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｏ）マウスＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号６のヌクレオチド２２〜１４４３を含み、配列番号４マイナス開始コドンのアミノ酸２〜４７５に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号６のヌクレオチド１９〜１４４３を含み、開始コドンを含む配列番号７のアミノ酸１〜４７５に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｒ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１の核酸配列を有する、（ａ）から（ｑ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；
（ｓ）（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド；
（ｔ）相補的な核酸配列が、（ａ）から（ｒ）のいずれかから選ばれる核酸配列を含む変性した二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に中くらいまたは高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、単離ポリヌクレオチド；
（ｕ）中くらいのストリンジェンシーの条件が、０.２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣおよび０.２％ＳＤＳ中、約４２℃〜約５０℃の温度で洗浄することを含む、（ｔ）に記載の単離ポリヌクレオチド；
（ｖ）高いストリンジェンシーの条件が、０.０１８Ｍ ＮａＣｌ中、約６５℃で安定なハイブリッドを生成する核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にするものである、（ｔ）に記載の単離ポリヌクレオチド；
（ｗ）細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号１３の配列と少なくとも８２％の配列同一性を有するもの；
（ｘ）細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号１５の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するもの；
（ｙ）番号１２の配列と少なくとも６８.２％の配列同一性を有する、単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片；および
（ｚ）番号１４の配列と少なくとも９３.１％の配列同一性を有する、単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
以下よりなる群から選ばれるポリペプチド配列を含む実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質：
（ａ）配列番号２または配列番号４に示す配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；
；
（ｂ）配列番号２または配列番号４に示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；
（ｃ）配列番号２または配列番号４に示す配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；
（ｄ）細胞シグナル伝達カスケードに関与し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１の核酸配列によりコードされる、単離および実質的に精製したヒト細胞シグナル伝達タンパク質；
（ｅ）配列番号７または配列番号９に示す配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；
（ｆ）配列番号７または配列番号９に示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；
（ｇ）細胞シグナル伝達カスケードに関与し、配列番号１または配列番号３に記載の核酸配列、または遺伝子コードの縮重の結果として配列番号１または配列番号３からの核酸配列縮重物を有するポリヌクレオチドによりコードされる、実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；
（ｈ）配列番号７または配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２〜４７６を含む単離ポリペプチドであって、該アミノ酸２〜４７６が配列番号２マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの；
（ｊ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるＲＥＴ１６変異体タンパク質；
（ｋ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１の核酸配列によってコードされる単離ＲＥＴ１６.２変異体タンパク質；
（ｌ）配列番号１２のポリヌクレオチド配列によってコードされるＲＥＴ１６変異体タンパク質；
（ｍ）配列番号１３のアミノ酸２〜３８４を含む単離ポリペプチドであって、該アミノ酸２〜３８４が配列番号１３マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの；
（ｎ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるＲＥＴ１６変異体タンパク質；
（ｏ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１の核酸配列によってコードされる単離ＲＥＴ１６.３変異体タンパク質；
（ｐ）配列番号１４のポリヌクレオチド配列によってコードされるＲＥＴ１６変異体タンパク質；
（ｑ）配列番号１５のアミノ酸２〜５０２を含む単離ポリペプチドであって、該アミノ酸２〜５０２が配列番号１５マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの；
（ｒ）配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるＲＥＴ１６タンパク質；
（ｓ）配列番号６のポリヌクレオチド配列によってコードされるＲＥＴ１６タンパク質；
（ｔ）配列番号７のアミノ酸２〜４７５を含む単離ポリペプチドであって、該アミノ酸２〜４７５が配列番号７マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの；
（ｕ）配列番号１３に示す配列と少なくとも８２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；および
（ｖ）配列番号１５に示す配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載のタンパク質またはポリペプチド、またはその抗原性エピトープに特異的に結合する、精製した抗体。
【請求項７】
細胞シグナル伝達カスケードに関与するタンパク質の製造方法であって、工程：
（ａ）請求項４に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、ついで
（ｂ）該ポリペプチドを宿主細胞培養液から回収する
ことを含む方法。
【請求項８】
生物学的試料中の細胞シグナル伝達カスケードタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはその断片を検出する方法であって、工程：
（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドを生物学的試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによってハイブリダイゼーション複合体を生成させ、ついで
（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、その際、該複合体の検出はユビキチン結合酵素をコードするポリヌクレオチド、またはその断片の該生物学的試料中の存在と相関関係を有する
ことを含む方法。
【請求項９】
分子または化合物のライブラリーを細胞シグナル伝達カスケードに関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでスクリーニングして、該ライブラリー中に該ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する少なくとも１の分子または化合物を同定する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドを被験分子または化合物のライブラリーと特異的な結合が可能な条件下で混合し、ついで
（ｂ）特異的な結合を検出し、それによって該ポリヌクレオチド配列に特異的に結合する被験分子または化合物を同定する
ことを含む方法。
【請求項１０】
細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達タンパク質の活性を変調することのできる候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験化合物を請求項５に記載のタンパク質を発現する細胞または組織と接触させ、ついで
（ｂ）候補変調化合物として、細胞シグナル伝達カスケードに関与するタンパク質の活性を変調する被験化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項１１】
請求項５に記載のタンパク質を炎症関連疾患または障害を治療するのに有効な量にて投与することを含む、炎症関連疾患または障害の治療方法。
【請求項１２】
該疾患または障害が、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節炎、乾癬、喘息、虚血−再潅流、多発性硬化症、臓器または組織移植の拒絶、慢性閉塞性肺疾患、炎症性胃腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、亜急性呼吸障害症候群、全身性エリテマトーデス、嚢胞性線維症、自己免疫疾患、癌、腫瘍および新生物よりなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト細胞シグナル伝達タンパク質が第二の細胞シグナル伝達タンパク質に結合するのを抑制または妨害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験化合物の存在下または不在下、請求項５に記載の細胞シグナル伝達タンパク質を該タンパク質が結合または会合する第二の細胞シグナル伝達分子と結合が可能な条件下で接触させ、ついで
（ｂ）該被験化合物の存在下での結合レベルを該被験化合物の不在下での結合レベルと比較することによって、該細胞シグナル伝達タンパク質と該第二の細胞シグナル伝達分子との結合レベルが低減または抑制されたか否かを決定する
ことを含む方法。
【請求項１４】
プロテインキナーゼによる細胞シグナル伝達カスケードタンパク質のリン酸化を抑制する化合物の同定方法であって、
（ａ）請求項５に記載の細胞シグナル伝達カスケードタンパク質を、３２Ｐ−ガンマ−ＡＴＰを含む反応緩衝液中、該細胞シグナル伝達タンパク質の固相基体への結合を可能とする条件下で該基体に結合させ、
（ｂ）被験化合物の存在下または不在下でプロテインキナーゼを加え、ついで
（ｃ）該被験化合物の不在下で観察されるリン酸化レベルと比較して、該被験化合物の存在が該細胞シグナル伝達カスケードタンパク質に取り込まれる３２Ｐ標識の量の低減という結果となるか否かを決定し、それによって細胞シグナル伝達カスケードタンパク質のリン酸化を抑制する被験化合物を同定する
ことを含む方法。
【請求項１５】
以下よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド：
（ａ）ヒトＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１５１〜１５７５からなり、配列番号２マイナス開始コドンのアミノ酸２〜４７６に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド１４８〜１５７５からなり、開始コドンを含む配列番号２のアミノ酸１〜４７６に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｄ）ヒトＲＥＴ１６.２ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１２のヌクレオチド１１４〜１２６２からなり、配列番号１３マイナス開始コドンのアミノ酸２〜３８４に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１２のヌクレオチド１１１〜１２６２からなり、開始コドンを含む配列番号１３のアミノ酸１〜３８４に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１２と少なくとも６８.２％同一のヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド；
（ｈ）ヒトＲＥＴ１６.３ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号１４のヌクレオチド１３９〜１６４１からなり、配列番号１５マイナス開始コドンのアミノ酸２〜５０２に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号１４のヌクレオチド１３６〜１６４１からなり、開始コドンを含む配列番号１５のアミノ酸１〜５０２に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１４と少なくとも９３.１％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる単離ポリヌクレオチド；
（ｌ）マウスＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号６のヌクレオチド２２〜１４４３からなり、配列番号４マイナス開始コドンのアミノ酸２〜４７５に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号６のヌクレオチド１９〜１４４３からなり、開始コドンを含む配列番号７のアミノ酸１〜４７５に対応するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｏ）（ａ）から（ｎ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド；
（ｐ）相補的な核酸配列が、（ａ）から（ｏ）のいずれかから選ばれる核酸配列を含む変性した二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に中くらいまたは高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、単離ポリヌクレオチド；
（ｑ）中くらいのストリンジェンシーの条件が、０.２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣおよび０.２％ＳＤＳ中、約４２℃〜約５０℃の温度で洗浄することを含む、（ｐ）に記載の単離ポリヌクレオチド；
（ｒ）高いストリンジェンシーの条件が、０.０１８Ｍ ＮａＣｌ中、約６５℃で安定なハイブリッドを生成する核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にするものである。（ｐ）に記載の単離ポリヌクレオチド；
（ｓ）細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号１３の配列と少なくとも８２％の配列同一性を有するもの；
（ｔ）細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号１５の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するもの；
（ｕ）番号１２の配列と少なくとも６８.２％の配列同一性を有する、単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片；および
（ｖ）番号１４の配列と少なくとも９３.１％の配列同一性を有する、単離および精製したポリヌクレオチド、またはその断片。
【請求項１６】
請求項１５に記載の単離核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１８】
以下よりなる群から選ばれるポリペプチド配列からなる実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸２〜４７６からなる単離ポリペプチドであって、該アミノ酸２〜４７６が配列番号２マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの；
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるＲＥＴ１６変異体タンパク質；
（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１の核酸配列によってコードされる単離ＲＥＴ１６.２変異体タンパク質；
（ｄ）配列番号１２のポリヌクレオチド配列によってコードされるＲＥＴ１６変異体タンパク質；
（ｅ）配列番号１３のアミノ酸２〜３８４からなる単離ポリペプチドであって、該アミノ酸２〜３８４が配列番号１３マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの；
（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるＲＥＴ１６変異体タンパク質；
（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１の核酸配列によってコードされる単離ＲＥＴ１６.３変異体タンパク質；
（ｈ）配列番号１４のポリヌクレオチド配列によってコードされるＲＥＴ１６変異体タンパク質；
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸２〜５０２からなる単離ポリペプチドであって、該アミノ酸２〜５０２が配列番号１５マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるＲＥＴ１６タンパク質；
（ｋ）配列番号６のポリヌクレオチド配列によってコードされるＲＥＴ１６タンパク質；
（ｌ）配列番号７のアミノ酸２〜４７５からなる単離ポリペプチドであって、該アミノ酸２〜４７５が配列番号７マイナス開始メチオニンのポリペプチドを含むもの；
（ｍ）配列番号１３に示す配列と少なくとも８２％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；および
（ｎ）配列番号１５に示す配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、細胞シグナル伝達カスケードに関与する実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質。
【請求項１９】
該疾患または障害が、ＴＮＦ−α経路の異所性の活性化と関連する障害、異所性の細胞移動と関連する障害、異所性の細胞増殖と関連する障害、異所性の細胞転移と関連する障害、喘息、若年性特発性関節炎、腫瘍細胞の造血性転移、高インスリン血症、２型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、心血管性疾患、腫瘍の進行、転移、直腸癌、ヴェーゲナー肉芽腫症、幹細胞移植合併症、サラセミア、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血−再潅流障害、急性肺障害、慢性関節リウマチ、移植拒絶、全身性エリテマトーデス、冠状動脈石灰化、虚血性心、およびアレルギー性炎症よりなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号１２、または配列番号１４から選ばれるＲＥＴ１６ポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスＲＥＴ１６オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な完全長ヒトＲＥＴ１６遺伝子およびそのコードされたポリペプチド生成物（ＴＮＦ刺激されたヒト肺微細血管内皮細胞で発現される）の同定およびクローニングに関する。本発明はさらに、ＲＥＴ１６のオーソログ（orthologs）、およびＲＥＴ１６ポリヌクレオチド配列およびそのコードされた生成物の細胞内シグナル伝達カスケードにおける細胞シグナル伝達分子としての推定の役割に関する。本発明はまた、炎症および炎症性疾患、状態、または障害が関与する、および／または制御できない細胞の増殖、たとえば癌、腫瘍、新生物などが関与する治療剤および方法におけるＲＥＴ１６ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそのモデュレーターの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性疾患の発生は、循環血球、たとえば白血球が内皮を通って組織中に浸潤することを特徴とする。この「ゲートウエイ（gateway）」機能を媒体する多くの重要な事象が内皮細胞で起こる。内皮細胞はレセプターやケモカインを発現し、これらレセプターやケモカインは白血球を順につなぎ、活性化させ、強固に付着させ、内皮細胞接合間に遊出させる。このプロセスは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの初期炎症メディエーターの産生によって開始される。
【０００３】
この一連のレセプターおよびケモカインの発現の協同（coordinated）刺激は、転写因子、キナーゼおよびスカフォードタンパク質を含む細胞内シグナル伝達分子によって媒体される。これらシグナル伝達分子はシグナル伝達カスケードを形成し、該カスケードは炎症プロセスの発生の「マスタースイッチ」である。ＮＦ−κＢなどのこのカスケードの成員は知られている。ＴＮＦ活性化内皮で差別的に発現される遺伝子の分析は、上記「マスタースイッチ」カスケードの成員の同定の手助けとなりうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＴＮＦ−アルファ活性化ヒト内皮細胞で発現されるＲＥＴ１６遺伝子を提供するものであり、該遺伝子のコードされた産物は細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達分子として機能すると考えられる。細胞シグナル伝達カスケードにおいて役割を果たす分子は、炎症因子、たとえばサイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ロイコトリエンなどへの細胞応答に関与している。さらに、ＲＥＴ１６は細胞シグナル伝達カスケードに関与する細胞シグナル伝達タンパク質の候補として、様々な細胞増殖関連疾患または障害に関与していると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＲＥＴ１６と称する新たに発見されたヒト遺伝子およびそのコードされた産物を提供するものであり、該ＲＥＴ１６はＴＮＦ−アルファで刺激されたヒト微細血管内皮細胞で発現されることがわかった。本発明によれば、ＲＥＴ１６は細胞シグナル伝達タンパク質としての機能を有する細胞質タンパク質である。
【０００６】
本発明の一つの側面は、配列番号１に示すＲＥＴ１６ポリヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、配列番号１の相補鎖、または配列番号１の変異体を含むポリヌクレオチド配列をも提供する。さらに、本発明は、中くらいまたは高いストリンジェンシーの条件下で配列番号１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列にも関する。
【０００７】
本発明の他の側面は、配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされ配列番号２のアミノ酸配列を有するＲＥＴ１６ポリペプチド、または機能性のまたは生物学的に活性なその部分を提供する。本発明に従い、単離され実質的に純粋なＲＥＴ１６タンパク質が提供される。
【０００８】
本発明のさらなる側面は、ヒトＲＥＴ１６オープンリーディングフレームｃＤＮＡの単離したポリヌクレオチド配列（１５３２ｂｐ；配列番号３）および該オープンリーディングフレームヒトＲＥＴ１６によってコードされ配列番号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、または機能性のまたは生物学的に活性なその部分を提供する。単離した実質的に純粋なＲＥＴ１６タンパク質またはポリペプチド、たとえば配列番号４が提供される。また、本発明に従い、ベクター中にクローニングした１５３２ｂｐのヒトＲＥＴ１６（ＲＥＴ１６.１とも称する）オープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列を、ブダペスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア２０１１０−２２０９）にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１にて２００１年３月７日に寄託してある。クローニングしたＲＥＴ１６変異体ｃＤＮＡ、すなわちＲＥＴ１６.２およびＲＥＴ１６.３を含むベクターもまた、ブダペスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア２０１１０−２２０９）にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１にて２００１年３月７日に寄託してある。従って、本発明はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１を含むＲＥＴ１６ ｃＤＮＡ核酸配列を提供する。
【０００９】
本発明のさらなる側面は、配列番号３の相補鎖、またはその変異体を含むポリヌクレオチド配列を提供する。さらに、本発明は、中くらいまたは高いストリンジェンシーの条件下で配列番号３のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列にも関する。さらに、ヒトＲＥＴ１６の６３０ｂｐの部分核酸配列（配列番号５）が提供される。
【００１０】
本発明の他の側面は、ＲＥＴ１６の変異体を提供する。本発明に従い、単離したＲＥＴ１６.２変異体ポリヌクレオチド（配列番号１２）およびコードされたそのアミノ酸配列（配列番号１３）が提供される。さらに、単離したＲＥＴ１６.３変異体ポリヌクレオチド（配列番号１４）およびコードされたそのアミノ酸配列（配列番号１５）が提供される。これら配列の部分または断片、好ましくは機能性のまたは生物学的に活性な部分または断片も提供される。
【００１１】
本発明のさらなる特色は、ヒトＲＥＴ１６タンパク質のマウスおよびラットオーソログを提供する。本発明に従い、配列番号６はマウスＲＥＴ１６オーソログのポリヌクレオチド配列を示す。配列番号７は、配列番号６によってコードされるマウスＲＥＴ１６ポリペプチドオーソログのアミノ酸配列を示す。配列番号８はラットＲＥＴ１６オーソログの部分ポリヌクレオチド配列を示し、配列番号９は配列番号８によってコードされるラットＲＥＴ１６オーソログの部分ポリペプチド配列のアミノ酸配列を示す。
【００１２】
本発明の他の特色は、好ましくはヒトＲＥＴ１６のＲＥＴ１６ポリヌクレオチド配列、またはその断片、またはコードされたＲＥＴ１６ポリペプチド、またはその断片または部分を含む組成物を提供する。また、少なくとも１のＲＥＴ１６ポリペプチド、または機能的なその部分を含む医薬組成物であって、薬理学的に許容しうるビヒクル、たとえば担体、賦形剤、または希釈剤をも含む医薬組成物も本発明により提供される。
【００１３】
本発明のさらなる側面は、コードされたＲＥＴ１６ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端または内部での欠失ポリペプチドおよびこれら欠失ポリペプチドを含む組成物を提供する。これら欠失ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。欠失ポリペプチドの免疫原および／または抗原性エピトープとしての使用は本明細書においてさらに記載する。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、ＲＥＴ１６.３およびマウスＲＥＴ１６の結果として得られるコードされたポリペプチドに加えて、ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、ＲＥＴ１６.３および最初の開始コドンを欠くＲＥＴ１６マウスオーソログのポリヌクレオチド配列を提供する。さらに詳細には、配列番号１のヌクレオチド１５１〜１５７５に対応するポリヌクレオチド、および配列番号２のアミノ酸２〜４７６に対応するポリペプチドが提供される；配列番号１２のヌクレオチド１１４〜１２６２に対応するポリヌクレオチド、および配列番号１３のアミノ酸２〜３８４に対応するポリペプチドが提供される；配列番号１４のヌクレオチド１３９〜１６４１に対応するポリヌクレオチド、および配列番号１５のアミノ酸２〜５０２に対応するポリペプチドが提供される；および配列番号６のヌクレオチド１９〜１４４３に対応するポリヌクレオチド、および配列番号７のアミノ酸２〜４７５に対応するポリペプチドが提供される。ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、ＲＥＴ１６.３およびマウスＲＥＴ１６コード配列を含む組換えベクター、およびここで記載のベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
【００１５】
本発明の他の側面は、ＲＥＴ１６核酸配列のアンチセンス、好ましくはヒトＲＥＴ１６核酸配列に対するアンチセンス、並びにＲＥＴ１６核酸分子またはアンチセンス分子のオリゴヌクレオチド、断片、または部分を提供する。ヒトＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその部分または断片を含む発現ベクターおよび宿主細胞もまた提供される。
【００１６】
本発明のさらに他の側面は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片の製造方法であって、工程（ａ）本発明によるヒトＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも機能的な断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で培養し、ついで（ｂ）該ポリペプチドを宿主細胞から回収することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる特色は、治療剤および診断剤として使用するための、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはそのエピトープに特異的に結合する抗体およびその結合フラグメントを提供する。
【００１８】
本発明のさらに他の特色は、ＲＥＴ１６ポリペプチド、好ましくはヒトＲＥＴ１６ポリペプチドに結合および／または変調する因子または分子、たとえばインヒビター、他の細胞内シグナル伝達分子およびアンタゴニストのスクリーニング方法、並びにモデュレーター、とりわけインヒビターおよびアンタゴニスト、とりわけ本明細書に記載のスクリーニング法によって得られるものを提供する。また、ＲＥＴ１６と１またはそれ以上の他の細胞シグナル伝達タンパク質との相互作用、たとえば結合相互作用のインヒビターまたはアクチベーターのスクリーニング方法も提供される。
【００１９】
本発明の他の側面は、本発明のＲＥＴ１６ポリペプチド、たとえば配列番号２、配列番号４、配列番号１３、または配列番号１５の実質的に精製したアンタゴニストまたはインヒビターを提供する。この点に関し、制限されない一例として、本発明のＲＥＴ１６ポリペプチドのアミノ酸配列、たとえば配列番号２、配列番号４、配列番号１３、または配列番号１５の全てまたは免疫原性および／または抗原性の部分を含むポリペプチドに結合する精製した抗体が提供される。
【００２０】
本発明のさらに他の側面は、本発明のＲＥＴ１６ポリペプチド、たとえば配列番号２、配列番号４、配列番号１３、または配列番号１５の実質的に精製したアゴニストまたはアクチベーターを提供する。
【００２１】
本発明の他の側面は、本明細書に記載の細胞シグナル伝達カスケードに関与するＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびそのコードされたポリペプチドの発現に関連する障害または疾患の診断および／またはスクリーニングに使用するための、ＲＥＴ１６核酸配列、ポリペプチド、ペプチドおよび抗体を提供する（たとえば図９を参照）。
【００２２】
本発明の他の側面は、ＲＥＴ１６関連疾患の検出および／またはＲＥＴ１６関連疾患または障害の治療または処置への患者の応答のモニターのためのＲＥＴ１６プローブまたはプライマーを提供する。プローブまたはプライマーの配列は、本明細書に記載のＲＥＴ１６の核酸配列またはアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明の他の特色は、本明細書に記載のＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびそのコードされたポリペプチドの異所性または制御されない細胞発現と関連する障害のスクリーニングおよび診断用キットを提供する。そのようなキットは、ヒトＲＥＴ１６アレルのヌクレオチド配列の決定に用いることができる。キットは、増幅ベースのアッセイ、核酸プローブアッセイ、タンパク質核酸プローブアッセイ、抗体アッセイ、またはこれらアッセイの組み合わせの試薬および指示を含んでいてよい。
【００２４】
他の側面において本発明は、生物学的試料中のＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法であって、工程（ａ）配列番号２または配列番号４をコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖を生物学的試料中の核酸物質にハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション複合体を生成させ、ついで（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出することを含み、その際、該複合体の存在が生物学的試料中のＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関することを特徴とする方法を提供する。核酸物質は、ハイブリダイゼーションの前に複製連鎖反応によってさらに増幅することができる。
【００２５】
本発明のさらに他の側面は、本明細書にさらに記載する種々のＲＥＴ１６関連疾患、障害、または状態の遺伝的素因、罹病性および／または処置または治療への応答の検出方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる側面、特色および利点は、発明の詳細な説明を読み、添付の図面と関連させて考慮したときに一層よく理解されるであろう。
【００２７】
本発明を種々の側面でより完全に記載するため、以下の定義を提供する。これら定義は手引きおよび解明に有用であることを意図したものであって、開示した本発明およびその態様を限定することを意図するものではない。
【００２８】
定義
ＲＥＴ１６ポリペプチド（またはタンパク質）とは、単離し、好ましくは実質的に精製したＲＥＴ１６タンパク質のアミノ酸配列をいい、本発明に従ってヒトｃＤＮＡライブラリー源から単離されるが、あらゆる種、好ましくは哺乳動物（マウス、ラット、非ヒト霊長類を含む）、最も好ましくはヒトから、および様々な採取源（天然、合成、半合成、または組換えを含む）から得ることができる。実際、本発明は、さらに詳細には、（i）完全長のヒトＲＥＴ１６転写物のヒトＲＥＴ１６ポリヌクレオチド配列（配列番号１）およびコードされたヒトＲＥＴ１６ポリペプチド配列（配列番号２）（図１〜３）；（ii）ヒトＲＥＴ１６オープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（配列番号３）およびコードされたヒトＲＥＴ１６ポリペプチド配列（配列番号４）；（iii）マウスＲＥＴ１６ポリヌクレオチド配列（配列番号６）およびコードされたマウスＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号７）（図５および６）および；（iv）ラットＲＥＴ１６オーソログの部分核酸配列（配列番号８）およびコードされたラットＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号９）（図１３〜１４）を提供する。本明細書に記載したＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの機能性の断片および部分もまた本発明に包含される。
【００２９】
アゴニスト（たとえば、アクチベーター）とは、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたは機能性のその断片に結合したときに、ＲＥＴ１６ポリペプチドの作用を増大または作用の持続を延ばす分子をいう。アゴニストとしては、ＲＥＴ１６ポリペプチドに結合してその作用を変調するタンパク質、核酸、炭水化物その他の分子が挙げられる。アンタゴニスト（たとえば、インヒビター）とは、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたは機能性のその断片に結合したときに、ＲＥＴ１６ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性の量または作用の持続を低減または排除する分子をいう。アンタゴニストとしては、ＲＥＴ１６ポリペプチドの作用および／または機能を低減、低下または排除するタンパク質、核酸、炭水化物、抗体その他の分子が挙げられる。
【００３０】
本明細書において「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド（たとえば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、およびその断片または部分、およびゲノムまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡをいい、一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を表す。制限されない例として、断片としては、長さが約１０〜６０ヌクレオチドよりも長い、好ましくは約２０〜６０ヌクレオチドである核酸配列が挙げられ、好ましくは少なくとも７０〜１００ヌクレオチドである断片が挙げられ、これはまた長さが少なくとも１０００ヌクレオチドまたはそれ以上であってもよい。プローブまたはプライマーとして使用する核酸は、本明細書に記載のものと長さが異なっていてよい。
【００３１】
同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、その断片または部分をいい、天然または合成分子をいう。アミノ酸配列断片は、一般に長さが約４または５〜約３５、好ましくは約５〜約１５または２５アミノ酸であり、最適にはＲＥＴ１６ポリペプチドの生物学的活性または機能を保持している。しかしながら、目的に応じて一層大きなアミノ酸断片、たとえば約１５〜約５０または６０アミノ酸の断片を使用可能であることが理解されるであろう。
【００３２】
本明細書において天然のタンパク質分子のアミノ酸配列に対して「アミノ酸配列」という場合、「アミノ酸配列」などの術語、たとえば「ポリペプチド」や「タンパク質」は、該アミノ酸配列を指称したタンパク質分子に関係する完全で天然のアミノ酸配列に限定することを意図するものではない。さらに、ＲＥＴ１６ポリペプチドおよびＲＥＴ１６タンパク質なる術語は、本発明のＲＥＴ１６核酸配列のコードされた生成物をいうものとして、しばしば相互に交換可能に用いられる。
【００３３】
ＲＥＴ１６ポリペプチドの変異体は、１またはそれ以上のアミノ酸が変化したアミノ酸配列をいう。変異体は「保存された」変化を有していてよく、その場合はたとえばロイシンをイソロイシンで置換する場合のように置換されるアミノ酸は類似の構造的または化学的特性を有する。より稀には、変異体は「保存されない」変化、たとえばグリシンのトリプトファンによる置換を有していてよい。より少ない変異としては、アミノ酸欠失または挿入、およびその両者が挙げられる。機能的な生物学的または免疫学的活性を損なうことなくどのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失できるかを決定する手引きは、当該技術分野でよく知られたコンピュータープログラム、たとえばＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアを用いて見出すことができる。
【００３４】
アレルまたはアレル配列は、ＲＥＴ１６核酸配列の別の形態である。アレルは、核酸配列中の少なくとも１の変異の結果生じ、変化したｍＲＮＡまたはポリペプチド（その構造または機能は変化しているかまたは変化していない）を生成する。天然のものか組換えのものかに拘わらず、いかなる遺伝子もアレル形を有しないか、または１または多くのアレル形を有し得る。アレルに生じる一般的な変異による変化は、一般にヌクレオチドの天然の欠失、付加または置換に帰する。これら変化の各々は、所定の配列において単独で、または他の変化とともに、１回またはそれ以上生じる。
【００３５】
ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする変化した核酸配列は、同じまたは機能的に同等のＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドという結果となる異なるヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換を含む核酸配列を包含する。変化した核酸配列はさらに、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの多型を包含する；そのような多型は、特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出することができてもよいしまたは検出できなくともよい。コードされたタンパク質はまた、サイレントな変化を生成し、本発明の機能的に同等のＲＥＴ１６タンパク質という結果となるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含んでいてよい。ＲＥＴ１６タンパク質の生物学的活性または機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、ハイドロフォビシティー、ハイドロフィリシティー、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行うことができる。たとえば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリシンおよびアルギニンが含まれ、類似のハイドロフィリシティー値を有する非電荷の極性頭部基を有するアミノ酸にはロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；およびフェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【００３６】
「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、アミノ酸残基のペプチド骨格（リシンで終わる）に連結したオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）を含むアンチセンス分子またはアンチジーン因子（anti-gene agent）をいう。ＰＮＡは一般に、アミノ酸残基に連結した少なくとも５ヌクレオチドのオリゴを含む。これら小さな分子は、核酸の相補鎖に結合することによって転写の伸長を停止させる（P. E. Nielsenら、1993, Anticancer Drug Des., 8: 53-63）。ＰＮＡは、ポリエチレングリコール処理して（pegylated）細胞内での寿命を延ばすことができ、該細胞で相補的な一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡに優先的に結合する。
【００３７】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー（「オリゴ」）とは、典型的に少なくとも約６ヌクレオチドから約６０ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約８〜１０ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが少なくとも約１２ヌクレオチド、たとえば約１５〜３５ヌクレオチド、または約１５〜２５ヌクレオチド、または約２０〜３５ヌクレオチドの連続したヌクレオチドを好ましくは含む核酸配列をいい、典型的にたとえばＰＣＲ増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたはマイクロアレイにおいてプローブまたはプライマーとして用いることができる。オリゴヌクレオチドなる語は、当該技術分野で一般に定義されるプライマー、プローブまたはアンプリマーなる語と実質的に同等であることが理解されるであろう。また、より長いオリゴヌクレオチドプローブ、またはプローブの混合物、たとえば縮重プローブを、より長く一層複雑な核酸配列、たとえばゲノムＤＮＡを検出するのに用いることができることも当業者には理解されるであろう。そのような場合、プローブは少なくとも２０〜２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは５０〜１００ヌクレオチドを含んでいてよい。
【００３８】
増幅とは核酸配列のさらなるコピーの産生をいい、一般に複製連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて行うことができる。ＰＣＲ法は当該技術分野でよく知られている（D. W. DieffenbachおよびG. S. Dveksler, 1995, PCR Primer, a Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、プレインビュー、ニューヨークを参照）。
【００３９】
マイクロアレイは、基体上、たとえば紙、ナイロン、または他のタイプのメンブレン；フィルター；チップ；ガラススライド；または他のタイプの適当な固体支持体上に合成した別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアレイである。
【００４０】
アンチセンスとは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列および核酸配列を含む組成物をいう。「アンチセンス鎖」なる語は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖を参照する際に用いる。アンチセンス（すなわち相補的な）核酸分子としてはＰＮＡが挙げられ、合成および転写を含むいかなる方法によっても製造することができる。細胞内に導入されると、相補的なヌクレオチドは細胞によって産生された天然の配列に結合して二本鎖を形成し、これが転写かまたは翻訳のいずれかを妨害する。「マイナス」の表示がアンチセンス鎖を参照して時々用いられ、「プラス」はセンス鎖を参照して時々用いられる。
【００４１】
コンセンサスとは、一連の関連するＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の配列の各位置での塩基またはアミノ酸の最も共通した選択を反映する配列をいう。特に良好な一致を示す領域は、しばしば保存された機能性のドメインを表している。
【００４２】
欠失とは、ヌクレオチド配列かまたはアミノ酸配列のいずれかにおける変化をいい、１またはそれ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基の不在という結果となるものをいう。対照的に、挿入（「付加」ともいう）とは、天然分子と比較して１またはそれ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基の付加という結果となるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化をいう。置換とは、１またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置き換えをいう。
【００４３】
誘導体核酸分子とは、コードされたＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするまたはコードされたＲＥＴ１６ポリペプチドに相補的な核酸の化学的修飾をいう。そのような修飾としては、たとえば、水素原子のアルキル、アシル、またはアミノ基による置換が挙げられる。核酸誘導体は、天然分子の必須の生物学的および／または機能的な特徴を保持したポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレングリコール処理（pegylation）、またはそれが由来するポリペプチドの生物学的および／または機能的または免疫学的活性を保持する同様のプロセスによって修飾したものである。
【００４４】
「生物学的に活性な」（すなわち機能性の）とは、天然分子の構造的、制御的、または生化学的な機能を有するタンパク質またはポリペプチドまたはそのペプチド断片をいう。同様に、「免疫学的に活性な」とは、天然、組換えまたは合成のＲＥＴ１６またはそのオリゴペプチドが適当な動物または細胞において特異的な免疫応答を引き起こす能力、たとえば抗体を産生させ、特定の抗体に結合する能力をいう。
【００４５】
ハイブリダイゼーションとは、核酸の鎖が相補鎖に塩基対形成により結合するプロセスをいう。
【００４６】
「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的なＧおよびＣ塩基間および相補的なＡおよびＴ塩基間の水素結合の形成により２つの核酸配列間で生成する複合体をいう。水素結合は塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化することができる。２つの相補的な核酸配列は、逆平行の立体配置で水素結合を形成する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成することができ（たとえば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）、または溶液に存在する一方の核酸配列と固体支持体（たとえば、メンブレン、フィルター、チップ、ピン、またはガラススライド、または細胞またはその核酸を付着した他の適当な基体）上に固定化した他方の核酸配列との間で形成することができる。
【００４７】
ストリンジェンシーまたはストリンジェントな条件とは、核酸組成、塩および温度によって定められるハイブリダイゼーションの条件をいう。これら条件は当該技術分野でよく知られており、試料中の同一または関連するポリヌクレオチド配列を同定および／または検出すべく変更することができる。低い、中くらいまたは高いストリンジェンシーを含む様々な等価な条件は、配列の長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、反応環境（溶液中または固相基体上に固定化）、標的核酸の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、塩の濃度および他の反応成分（たとえば、ホルムアミド、デキストラン硫酸および／またはポリエチレングリコール）の存在または不在および反応温度（プローブの融解温度より約５℃低い温度から融解温度より約２０℃〜２５℃低い温度の範囲内）などの因子に依存する。１またはそれ以上の因子を変化させることにより、以前の条件とは異なるが同等の条件（低いかまたは高いストリンジェンシー）を生成することができる。
【００４８】
当業者には理解されるであろうように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは同一または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更することができる。熟練した実施者によってさらに評価されるであろうように、Ｔｍは幾つかのパラメータ、たとえばハイブリッドまたはプローブのヌクレオチド数の長さ、またはハイブリダイゼーション緩衝液の成分および条件などに依存して、当該技術分野で知られた等式により近似することができる（たとえば、T. Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８２およびJ. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９；Current Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら編、Vol. 1, “Preparation and Analysis of DNA”、John Wiley and Sons, Inc., 1994-1995、補遺２６，２９，３５および４２；pp. 2.10.7-2.10.16；G. M. WahlおよびS. L. Berger（1987; Methods Enzymol. 152: 399-407）；およびA. R. Kimmel, 1987; Methods of Enzymol. 152: 507-511を参照）。一般的な手引きとして、Ｔｍは配列ホモロジーが１％下がる毎に約１℃〜１.５℃下がる。また、一般にハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は最初は低いストリンジェンシーの条件下で行い、ついで異なる、しかしより高いストリンジェンシーで洗浄する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、たとえば高い、中くらい、または低いストリンジェンシーへの言及は、一般にそのような洗浄条件に関する。
【００４９】
それゆえ、制限されない例として、高いストリンジェンシーとは、０.０１８Ｍ ＮａＣｌ中、約６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう（すなわち、ハイブリッドが０.０１８Ｍ ＮａＣｌ中、約６５℃で安定でないなら、それは高いストリンジェンシー条件下で安定ではないであろう）。高いストリンジェンシー条件は、たとえば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ（食塩水 リン酸ナトリウム ＥＤＴＡ）（１×ＳＳＰＥ緩衝液は０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）、（または１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７.０を含む１×ＳＳＣ緩衝液）、０.２％ＳＤＳ中、約４２℃でハイブリダイゼーションし、ついで１×ＳＳＰＥ（または食塩水 クエン酸ナトリウム、ＳＳＣ）および０.１％ＳＤＳ中、少なくとも約４２℃、好ましくは約５５℃、さらに好ましくは約６５℃の温度にて洗浄することにより提供することができる。
【００５０】
中くらいのストリンジェンシー条件とは、制限されない例として、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ（またはＳＳＣ）、０.２％ＳＤＳ中、４２℃（から約５０℃）でハイブリダイゼーションすることができ、ついで０.２×ＳＳＰＥ（またはＳＳＣ）および０.２％ＳＤＳ中、少なくとも約４２℃、好ましくは約５５℃、さらに好ましくは約６５℃の温度にて洗浄することのできる条件をいう。
【００５１】
低いストリンジェンシー条件とは、制限されない例として、１０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ（またはＳＳＣ）、０.２％ＳＤＳ中、４２℃でハイブリダイゼーションすることができ、ついで１×ＳＳＰＥ（またはＳＳＣ）および０.２％ＳＤＳ中、少なくとも約４５℃、好ましくは約５０℃の温度にて洗浄することのできる条件をいう。
【００５２】
さらなるストリンジェンシー条件についてはT. Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２）を参照のこと。低い、中くらいおよび高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション／洗浄条件は、熟練した実施者によく知られ実施されている種々の成分、緩衝液および温度を用いて変えることができることが理解されなければならない。
【００５３】
相補的なまたは相補性とは、許容される塩および温度の条件下での塩基形成によるポリヌクレオチドの天然の結合をいう。たとえば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間での相補性は「部分的」であってよく、その場合は核酸の一部のみが結合し、あるいは一本鎖間に全体にわたる相補性が存在するときには相補性は完全なものである。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間でのハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意の影響を及ぼす。このことは、ＰＮＡ分子のデザインおよび使用の場合と同様、増幅反応（核酸鎖間の結合に依存する）において特に重要である。
【００５４】
ホモロジーとは相補性の程度をいう。部分的な配列ホモロジーまたは完全なホモロジーがあり、完全なホモロジーは同一性、たとえば１００％同一性と同等である。同一配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する部分的に相補的な配列は、機能的な用語「実質的に相同な」を用いて表す。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低いストリンジェンシー条件下、ハイブリダイゼーションアッセイ（たとえば、サザーンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べることができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低いストリンジェンシー条件下、完全に相同な配列またはプローブの標的配列への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合または抑制するであろう。にも拘わらず、低いストリンジェンシーの条件は非特異的な結合を可能にはしない；低いストリンジェンシー条件では、２つの配列の結合が互いに特異的な（すなわち、選択的な）相互反応である必要がある。非特異的な結合の欠如は、相補性の部分的な程度さえも欠いている（たとえば、約３０％未満の同一性）第二の標的配列を用いることによって試験することができる。非特異的な結合の不在下、プローブは第二の非相補的な標的配列にハイブリダイズしないであろう。
【００５５】
当業者であれば、当該技術分野で知られているにように、たとえばＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（J. D. Thompsonら、1994, Nucleic Acids Research, 2(22): 4673-4680）またはＦＡＳＴＤＢ（Brutlagら、1990, Comp. App. Biosci., 6: 237-245）に基づくものなどのアルゴリズムを用いて配列間のパーセント同一性を決定する方法を知っているであろう。ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは典型的にその計算において配列の内部のマッチングしない欠失または付加（すなわち、ギャップ）を考慮していないが、このことは％同一性を過度に評価するのを避けるべく人為的に補正することができる。しかしながら、ＣＬＵＳＴＡＬＷはその同一性の計算においてギャップを考慮に入れている。
【００５６】
ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２.０アルゴリズム（Altschulら、1977, Nuc. Acids Res., 25: 3389-3402およびAltschulら、1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410）もまた当業者に利用できる。核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォールトとしてワードレンクス（wordlength；Ｗ）１１、エクスペクテーション（expectation；Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォールトとしてワードレンクス（Ｗ）３、およびエクスペクテーション（Ｅ）１０を使用する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 10915）は、アラインメント（Ｂ）５０、エクスペクテーション（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【００５７】
所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物とは、広く該所定のポリヌクレオチド配列を含むあらゆる組成物をいう。組成物は乾燥した調合物または水性の溶液を包含する。ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１または配列番号３）またはその断片を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとしてまたはプライマーとして用いることができる。プローブおよびプライマーは凍結乾燥した形態で貯蔵することができ、炭水化物などの安定化剤と混合することができる。ハイブリダイゼーションではプローブは、塩（たとえば、ＮａＣｌ）、界面活性剤（たとえば、ＳＤＳ）および他の成分（たとえば、デンハルト溶液、粉乳、サケ精子ＤＮＡなど）を含む水溶液中で用いることができる。
【００５８】
「実質的に精製した」とは、核酸配列またはアミノ酸配列をその天然環境から種々の手段により除去、すなわち単離または分離し、天然の状態では結合していた他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％〜８５％含まない、最も好ましくは９０％またはそれ以上含まないことをいう。
【００５９】
試料または生物学的試料の語は、その最も広義で解釈されることを意図する。ＲＥＴ１６タンパク質をコードする核酸またはその断片、またはＲＥＴ１６タンパク質自体を含むと思われる生物学的試料としては、体液、細胞または組織からの抽出物、細胞から単離した染色体（たとえば、中期染色体のスプレッド（spread））、オルガネラ、または細胞から単離した膜、細胞、ゲノムＤＮＡ（溶液中のもの、またはサザーン分析のように固相支持体に結合したもの）、ＲＮＡ（溶液中のもの、またはノーザン分析のように固相支持体に結合したもの）、ｃＤＮＡ（溶液中のもの、または固相支持体に結合したもの）などの核酸、組織、組織プリントなどが挙げられる。
【００６０】
形質転換とは、外来ＤＮＡがレシピエント細胞に入り変化させるプロセスをいう。形質転換は、当該技術分野でよく知られた種々の方法を用いて天然または人為的な条件下で行うことができる。形質転換は、異種核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入する既知の方法に依存して行うことができる。この方法は、形質転換すべき宿主細胞の種類に基づいて選択し、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクチン、および部分衝撃（partial bombardment）が挙げられるが、これらに限られるものではない。そのような「形質転換した」細胞には、挿入ＤＮＡが自己複製プラスミドとしてかまたは宿主染色体の一部として複製できる安定に形質転換した細胞が含まれる。形質転換した細胞にはまた、挿入ＤＮＡまたはＲＮＡを限られた期間のみ一過性に発現する細胞も含まれる。
【００６１】
「ミメチック」とは、その構造をＲＥＴ１６タンパク質またはその部分の構造に関する知見に基づいて開発した分子をいい、そのようなものとしてＲＥＴ１６タンパク質の作用の一部または全てを奏することができる。
【００６２】
タンパク質に関連して「部分」（「所定のタンパク質の部分」のように）とは、該タンパク質の断片またはセグメント、たとえばペプチドをいう。断片は、サイズが４または５アミノ酸残基のものから全体のアミノ酸配列から１のアミノ酸を差し引いたものまでの範囲にわたる。それゆえ、「配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも部分を含む」タンパク質は、完全長のＲＥＴ１６ポリペプチド、および完全長のＲＥＴ１６の断片またはセグメントを包含する。
【００６３】
抗体とは、完全な分子並びにエピトープまたは抗原決定基に結合することのできるＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖなどのフラグメントをいう。ＲＥＴ１６ポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチド、または目的とする小さなペプチドを含むまたは免疫用抗原として組換えにより調製した断片を用いて調製することができる。動物の免疫に使用するポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの転移（transition）から得るかまたは化学的に合成することができ、所望なら担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。ペプチドに化学的に結合させるために一般に使用される担体としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびチログロブリンが挙げられる。ついで、結合したペプチドを用いて動物（たとえば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫する。
【００６４】
「ヒト化」抗体とは、ヒト抗体に一層近似させるために非抗原結合領域のアミノ酸を置換しながら元々の抗原結合能は保持している抗体分子をいい、たとえばC. L. Queenらの米国特許第５,５８５,０８９号に記載されている。
【００６５】
抗原決定基とは、特定の抗体と接触する分子の部分（すなわち、エピトープ）をいう。タンパク質またはタンパク質の断片を用いて宿主動物を免疫する場合、該タンパク質の多くの領域が該タンパク質上の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発することができる；これら領域または構造を抗原決定基という。抗原決定基は、抗体への結合に対して完全な抗原（すなわち、免疫応答を誘発するのに用いた免疫原）と競合することができる。
【００６６】
「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク質またはペプチドと結合性分子、たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、または抗体との相互作用をいう。相互作用は、結合性分子によって認識されるタンパク質の特定の構造（たとえば、抗原決定基またはエピトープ、または構造的な決定基）の存在に依存する。たとえば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的であるなら、標識した「Ａ」および該抗体を含む反応液中のエピトープＡ（または遊離の非標識のＡ）を含むタンパク質の存在は、標識したＡの該抗体への結合を低減させるであろう。
【００６７】
「ポリヌクレオチドの発現と相関関係がある」とは、配列番号１または配列番号２と類似のリボ核酸の存在のノーザン分析による検出が、試料中のＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在を示し、それによって該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関関係があることをいう。
【００６８】
配列番号１または配列番号２のポリヌクレオチドにおける変更には、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列におけるあらゆる変更が含まれ、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出できる欠失、挿入、および点変異が含まれる。この定義に含まれるのは、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの変更の検出（たとえば、配列番号１または配列番号３にハイブリダイズすることのできる制限断片長多型のパターンの変化により）、配列番号１または配列番号３の選択した断片がゲノムＤＮＡの試料にハイブリダイズできないこと（たとえば、アレル特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用い）、およびＲＥＴ１６タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座へのハイブリダイゼーションのような不適切または予期しないハイブリダイゼーション（たとえば、中期染色体スプレッドへの蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用い）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
本発明は、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびコードしたポリペプチドに関する。特に本明細書で記載しているのはＲＥＴ１６（本明細書ではＲＥＴ１６.１ともいう）および変異体ＲＥＴ１６.２およびＲＥＴ１６.３である。「ＲＥＴ１６」との言及はすべて、特に断らない限り、ＲＥＴ１６（ＲＥＴ１６.１）、ＲＥＴ１６.２およびＲＥＴ１６.３に適用されるものとする。
【００７０】
本明細書に記載する新規なＲＥＴ１６遺伝子は、ＴＮＦ刺激したヒト肺微細血管内皮細胞で発現され、アップレギュレーションされることがわかった。本発明に従い、ＴＮＦ刺激したヒト肺微細血管内皮細胞で発現されたＲＮＡを分析して、細胞制御事象に関与すると思われる遺伝子産物を同定した。静止細胞をＴＮＦ−アルファで１時間刺激し、該細胞からＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡから、当業者に知られ用いられている常法を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を製造した。微細血管内皮細胞をＴＮＦ−アルファで刺激した後にアップレギュレーションされたｃＤＮＡを、サブトラクティブハイブリダイゼーションを用いて同定した（実施例１参照）。このアプローチで同定したポリヌクレオチドｃＤＮＡを、以下に記載するようにシグナル伝達カスケードでの可能な役割について評価した。
【００７１】
従って、本明細書に記載のＲＥＴ１６遺伝子の役割をアンチセンス戦略を用いて特徴付けた（実施例５および６参照）。この目的のため、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、ＴＮＦ−アルファで刺激した。ＲＥＴ１６ ＲＮＡを抑制できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ発現を妨害できるオリゴを選択すべく評価した。最も活性なＲＥＴ１６遺伝子アンチセンスは、下記配列：
ＵＧＣＡＣＡＵＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＵＣＵ（配列番号１６）
を有する１１５８７オリゴであることがわかった。この１１５８７オリゴはトランスフェクションした細胞の表面上のＥ−セレクチンタンパク質のアップレギュレーションを抑制したので、ＲＥＴ１６の細胞シグナル伝達カスケードでの役割が示唆された（実施例６および図９）。ＲＥＴ１６遺伝子のＲＮＡレベルの低減は、細胞内でのＲＥＴ１６タンパク質レベルを低減させると推定される。それゆえ、細胞内でのＲＥＴ１６タンパク質レベルの低減はＴＮＦ−アルファシグナル伝達カスケードを妨害でき、細胞表面でのＥ−セレクチンの発現の低減という結果となった。
【００７２】
実施例６に記載し、図９に示すように、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドはＴＮＦ−刺激したＨＭＶＥＣ細胞でのＥ−セレクチン発現の有意の抑制という結果となった。これら結果は、ＲＥＴ１６が直接かまたは間接的にＥ−セレクチン発現を少なくとも変調していることを意味している。好ましくは、これら結果は、ＲＥＴ１６がＥ−セレクチン（多くの炎症性疾患と関連していることが当該技術分野で知られている）の正のモデュレーターを表していることを示している。それゆえ、以下にさらに検討するように、ＲＥＴ１６のアンタゴニストは炎症性疾患の治療、予防、および／または改善に有用である。
【００７３】
さらに、本発明に従えば、ＲＥＴ１６に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドはまたＶ−ｃａｍ発現の抑制という結果となった。これら結果は、ＲＥＴ１６が直接かまたは間接的にＶ−ｃａｍ発現を少なくとも変調していることを意味している。好ましくは、これら結果は、ＲＥＴ１６がＶ−ｃａｍの正のモデュレーターを表していることを示している。
【００７４】
Ｅ−セレクチンは炎症状態の正のマーカーを表しており（D. J. Lefer, 2000, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 40: 283-94; A. BlannおよびM. Seigneur, 1997, Clin. Hemorheol. Microcirc., 17(1): 3-11）、種々の細胞および組織細胞型の細胞外膜上で発現されるＥ−セレクチンが増大している。この関係は、血管内皮細胞上で循環白血球の細胞ローリング（rolling）を変調するうえで果たしているＥ−セレクチンの役割によって媒体される。可溶形態のＥ−セレクチンおよびＶ−ｃａｍの発現もまた、炎症性疾患と関係している（A. J. GearingおよびW. Newman, 1993, Immunol. Today, 14(10): 506-12）。最近の研究は、Ｅ−セレクチンおよびＶ−ｃａｍの発現が喘息の発症、特に重篤な喘息の発症と関係することを示している（A. Hamzaouiら、2001, Am. J. Inflamm., 10(6): 339-42）。
【００７５】
さらに、Ｅ−セレクチンは若年性特発性関節炎の発症と関係していることが示されている（C. Y. Chenら、2002, Ann. Rheum. Dis., 61(2): 167-70）。Ｅ−セレクチンはまた、腫瘍細胞の造血性転移の発生と関係付けられている（K. Itoら、2001, J. Gastroenterol., 36(12): 823-9）；Ｅ−セレクチンは、高インスリン血症および２型糖尿病の発症と関係付けられている（B. R. Winkelmannら、2001, Curr. Med. Res. Opin., 17(2): 132-4；およびG. Targherら、2001, Diabetes Care, 24(11): 1961-6）；Ｅ−セレクチンは、アテローム性動脈硬化症および心血管性疾患と関係付けられている（E. Demerathら、2001, Ann. Hum. Biol., 28(6): 664-78）；Ｅ−セレクチンおよびＶ−ｃａｍは、一般におよび特に結腸癌の腫瘍の進行および転移と関係付けられている（D. Alexiouら、2001, Eur. J. Cancer, 37(18): 2392-7）；Ｅ−セレクチンは、ヴェーゲナー肉芽腫症の発症と関係付けられている（N. Ohtaら、2001, Auris. Nasus. Larynx., 28(4): 311-4）；Ｅ−セレクチンおよびＶ−ｃａｍは、幹細胞移植の合併症の発症と関係付けられている（Y. Matsudaら、2001, Bone Marrow Transplant., 27(9): 977-82）；Ｅ−セレクチンおよびＶ−ｃａｍは、サラセミアの発症と関係付けられている（D. S. Kyriakouら、2001, Ann. Hematol., 80(10): 577-83）；Ｅ−セレクチンは、アテローム性動脈硬化症の発症と関係付けられている（C. M. Ballantyne, 2001, Clin. Cardiol., 24(8補遺): III 13-7）；Ｅ−セレクチンは、自己免疫疾患の発症と関係付けられている（R. W. McMurray, 1996, Semin. Arthritis. Rheum., 25(4): 215-33）；Ｅ−セレクチンは、アテローム性動脈硬化症、虚血−再潅流障害、急性肺障害、慢性関節リウマチ、および移植拒絶の発症と関係付けられている（M. P. Bevilacquaら、1994, Ann. Rev. Med., 45: 361-78）；およびＥ−セレクチンは、アレルギー性炎症の発症と関係付けられている（C. H. Smithら、1993, Am. Rev. Respir. Dis., 148(6 Pt2): S75-8）。それゆえ、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＲＥＴ１６の断片またはアンタゴニストも含めて、上記障害の治療、予防、および／または改善に有用である。
【００７６】
Ｅ−セレクチンの多型形態もまた幾つかの疾患および障害と関係付けられている。たとえば、Ａ５６１Ｃ Ｅ−セレクチン多型は、全身性エリテマトーデスと関係付けられている（Magadmiら、2001, J. Rheumatol., 28(12): 2650-2）；Ｅ−セレクチンＳ１２８Ｒ多型は、冠状動脈石灰化と関係付けられている（D. L. Ellsworthら、2001, J. Mol. Med., 79(7): 390-8）；およびさらなるＥ−セレクチン多型が、虚血性心疾患の発症と関係付けられている（F. Andreottiら、2002, Heart., 87(2): 107-12）。それゆえ、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＲＥＴ１６の断片またはアンタゴニストも含めて、上記障害の治療、予防、および／または改善に有用である。
【００７７】
本発明は、その態様の一つにおいて、図２および３に示す配列番号２のアミノ酸配列または図４Ｂに示す配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＲＥＴ１６ポリペプチドに関する。ＲＥＴ１６ポリペプチド産物は長さが４７６アミノ酸である（配列番号２、図２）。ヒトＲＥＴ１６ポリペプチドは、図１０Ｅに示すようにPodospora anserina Ｈｅｔ−ｅ−１タンパク質の部分と３１％の同一性、およびThermomonospora curvata ＰＫＷＡタンパク質の部分と３３％の同一性を有する。さらに、本明細書に記載するようにヒトＲＥＴ１６の完全長マウスオーソログおよび部分ラットオーソログが同定された。たとえば、図５および６は、それぞれマウスＲＥＴ１６オーソログ核酸配列（配列番号６）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号７）を示す。図１３は部分ラットＲＥＴ１６オーソログの核酸配列（配列番号８）を示し、図１４は部分ラットＲＥＴ１６オーソログのコードされたアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【００７８】
ＲＥＴ１６アミノ酸配列は、ＳＥＱＷＥＢ ＧＣＧにおいてＭＯＴＩＦＳプログラムを用いて他の既知のタンパク質と共通する幾つかの配列モチーフを含んでいることがわかった。ＭＯＴＩＦＳは、ＰＲＯＳＩＴＥディクショナリーに記載されている規則的な発現パターンについてタンパク質配列を探索することによってタンパク質モチーフを調べる。ＲＥＴ１６は、アミノ酸位置１５０、３６５、４６０に３つの潜在的なアスパラギングリコシル化部位を含んでいる。さらに、ＲＥＴ１６アミノ酸配列は、潜在的な環状アデノシン一リン酸（アミノ酸４４１および４４２）、カゼインキナーゼII（アミノ酸７、３８、１３６、１５９、１６４、１８４、１９４、２６８、３３３、および３７０）、およびプロテインキナーゼＣ（アミノ酸３３、３８、１２８、１３６、１７５、４３９、４６２）リン酸化部位を含んでいる。
【００７９】
ＲＥＴ１６アミノ酸配列を用い、他のタンパク質ドメインについてＰＦＡＭ−ＨＭＭデータベースを探索した。ＰＦＡＭ−ＨＭＭデータベースはタンパク質ファミリーおよびドメインのコレクションであり、多彩なタンパク質アラインメントを含んでいる（A. Batemanら、1999, Nucleic Acids Research, 27: 260-262）。１つのステリルアルファモチーフ（ＳＡＭ）ドメインに加え、７つの潜在的なＷＤ４０、ベータ−トランスデューシン（Ｇ−ベータ）リピートが同定された（図７）。
【００８０】
ベータ−トランスデューシン（Ｇ−ベータ）は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質；膜貫通レセプターによって生成されたシグナルの伝達の媒介体として作用する）の３つのサブユニット（アルファ、ベータ、およびガンマ）の一つである。構造的にはＧ−ベータは８つの約４０残基のタンデムリピートからなり、各リピートは中央にＴｒｐ−Ａｓｐモチーフを含んでいる（このタイプのリピートは、しばしばＷＤ−４０リピートと呼ばれる）。そのような繰返しセグメントは、他の多数のタンパク質（Ｇ−ベータ様ペプチド、酵母ＳＴＥ４、ＭＳＩ１、ＣＤＣ４、ＣＤＣ２０、ＭＡＫ１１、ＰＲＰ４、ＰＷＰ１およびＴＵＰ１、粘菌ＡＡＣ３およびコロニン（coronin）、およびショウジョウバエGrouchoタンパク質を含む）にも存在することが示されている。これらタンパク質内のリピートの数は、５（ＰＲＰ４、ＴＵＰ１、およびGroucho）から８（Ｇ−ベータ、ＳＴＥ４、ＭＳＩ１、ＡＡＣ３、ＣＤＣ４、ＰＷＰ１など）にわたる。Ｇ−ベータおよびＧ−ベータ様タンパク質ではリピートは配列の全体の長さにわたって分布するが、他のタンパク質ではリピートは、Ｎ末端、中央、またはＣ末端部分に含まれる（E. J. Neerら、1994, Nature, 371: 297-300）。
【００８１】
ステリルアルファモチーフ（ＳＡＭ）ドメインは、多くの生物学的プロセスに関与する広範な様々なタンパク質に存在する推定のタンパク質相互作用モデュールである。約７０残基のＳＡＭドメインが様々な真核生物に認められる。ＳＡＭドメインは、低い結合親和性でだがホモおよびへテロオリゴマー形成し、特定のタンパク質−タンパク質相互作用を媒体することが示されている。構造的分析は、ＳＡＭドメインが２つの大きな界面とともに小さな５ヘリックスの束にて配置されることを示している。ＥｐｈチロシンキナーゼＥｐｈＢ２のＳＡＭドメインの場合は、これら界面はそれぞれ二量体を形成できる。これら２つの別個の結合表面の存在は、ＳＡＭドメインが伸長した重合構造をを形成できることを示唆している（D. Stapletonら、1999, Nature Struct. Biol., 6: 44-49）。
【００８２】
Incyte Genomics Lifeseq Goldデータベースを用い、ＲＥＴ１６の予備的発現分析を行った。Incyteデータベースでの電子ノーザンによれば（テンプレートＩＤ １５８９２３.９；クローンＩＤ ３１１１１２７）、ＲＥＴ１６遺伝子配列は５６のｃＤＮＡライブラリーで同定された。ＲＥＴ１６遺伝子を発現することがわかったこれらライブラリーを図１２に示す。特に興味がもたれることには、ＲＥＴ１６は幾つかの腫瘍組織（腎臓、前立腺、下垂体、食道、卵巣、膀胱、肺、結腸、パラガングリオン、副腎、肝臓、子宮、および膵臓組織からのものを含む）で発現されることがわかった。さらに、ＲＥＴ１６は以下の疾患状態からの組織で発現されることがわかった：ハンチントン病、白血病、胆石症、癲癇、慢性潰瘍性大腸炎、アルツハイマー病、およびリンパ球性甲状腺炎。特に注目すべきことに、ＲＥＴ１６は、２０％の煙で２０時間処理した気管支上皮細胞、ＣＤ３抗体で処理したＣＤ４＋Ｔリンパ球、１μＭの５−アザ−２'−デオキシシチジンで処理したＫ−５６２慢性骨髄性白血病前駆細胞株、およびＩＬ−５で処理した臍帯単核球で発現されることがわかった。
【００８３】
本発明の他の態様は、ヒトＲＥＴ１６（ｈｕＲＥＴ６）遺伝子のマウスオーソログ、すなわちｍｕＲＥＴ１６を包含する。ｈｕＲＥＴ１６のマウスオーソログを同定するため、ｈｕＲＥＴ１６のコード配列を用いてマウスＥＳＴデータベース［ベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）分析を行うために当業者に利用できる］を探索した。以下のマウスＥＳＴが同定された：ＡＵ０３５６９３、ＡＡ１１８７１８、ＡＡ２０４６０８、Ｗ４１０５６、ＡＷ１４６０１８、ＡＩ４５０４９５、ＡＩ８７５４４３、ＡＩ３１６５４４、ＡＷ４９４７９６、ＡＷ１４６０１８およびＢＥ９８３８９０。ｍｕＲＥＴ１６核酸配列（配列番号６）は、ｈｕＲＥＴ１６と８０％の同一性を有する。コードされたｍｕＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号７）は、ｈｕＲＥＴ１６と８２.５％の同一性（８６.５％の類似性）を有する。ｍｕＲＥＴ１６は７つの予測されたＷＤリピートおよび１のＳＡＭドメインを有し、全て＞１０のスコアを有する。
【００８４】
ＲＥＴ１６のカルボキシル末端は、１.７８ｅ−２３のヒドンマルコフモデル（Hidden Markov Model）Ｅ値に基づいて決定されるように、Ｕボックスドメインを含む。ＲＥＴ１６のＵボックスドメインとタンパク質ＰＲＰ１９のＵボックス（S. C. Chengら、1993, Mol. Cell. Biol., 13(3): 1876-82）とのホモロジーおよびコンセンサス残基のアラインメントを図２１に示す（保存された残基の注釈はAravindおよびKoonin, 2001, Current Biology, 10(4): R132-R134から改変した）。ＰＲＰ１９は、Ｕボックスに加えてＷＤ４０リピートを含むプレｍＲＮＡスプライシング因子である。
【００８５】
ＵＦＤ２を典型例とするＵボックスドメイン含有タンパク質は、Ｅ３ユビキチン結合反応を媒体する（AravindおよびKoonin、上掲）。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｅ２ユビキチンリガーゼから基質タンパク質へのユビキチンの移転に参画する。最近の刊行物は、一連のＵボックス含有タンパク質のユビキチンリガーゼ活性に関する強力な証拠を提供している（たとえば、Hatakeyamaら、2001, J. Biol. Chem., 276(35): 33111-33120; Murataら、2001, EMBO, 21(121): 1133-1138; Meachemら、2001, Nature Cell Biology, 3: 100-105；およびPringaら、2001, J. Biol. Chem., 276(22): 19617-19623）。再構成アッセイにおいて、Ｕボックス含有タンパク質は、Ｅ１およびＥ２ユビキチンリガーゼの存在下でＥ３ユビキチンリガーゼ活性を提供した。さらに、Ｕボックスの欠失、またはＵボックスタンパク質中の重要な保存された残基の変異は、ユビキチンリガーゼ活性を廃棄した（Hatakeyamaら、2001、上掲）。ＵボックスユビキチンリガーゼはＨＥＣＴまたはＲＩＮＧフィンガーＥ３と構造的に異なっており、基質タンパク質のポリユビキチン化を触媒できる能力によって機能的に識別することができる。
【００８６】
細胞中の多彩な重要な制御タンパク質がユビキチンの添加によって修飾される。ユビキチン化タンパク質のプロテオソーム分解は、細胞周期、分化、免疫応答および折り畳みを間違えたタンパク質のクリアランスなどの多くの細胞事象を制御している。ＲＥＴ１６は、そのＵボックスドメインの観点から（Ｕボックスはユビキチン化、とりわけＥ３ユビキチン結合反応を媒体するタンパク質の特徴である）、ユビキチンリガーゼとして特徴付けられる。
【００８７】
Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を決定するため、Hatakeyamaら、2001（上掲）、Murataら、2001（上掲）およびMeachemら、2001（上掲）に記載のアッセイを行うことができる。ユビキチンリガーゼ活性に必要なユビキチンリガーゼタンパク質中のアミノ酸を同定するため、部位特異的突然変異誘発を用いることができる。さらに、Ｕボックスの全てまたは一部の欠失を行ってユビキチンリガーゼ活性を媒体するうえでのＵボックスのＵボックスの役割を確認することができる。欠失したまたは変異したＵボックスを含むＲＥＴ１６をコードするポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクションし、発現されたＲＥＴ１６タンパク質の細胞内での機能的役割を明らかにすることができる。この同じアプローチは、ユビキチンリガーゼの細胞での基質を単離および同定するうえでも利用できる。
【００８８】
ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、ＲＥＴ１６ポリペプチド（配列番号２または配列番号４）をコードするヒトＲＥＴ１６核酸配列（配列番号１または配列番号３）、および特にＴＮＦ−活性化内皮において一般に炎症プロセス、細胞活性化、または制御されない細胞増殖に関与する他の細胞シグナル伝達成員とのＲＥＴ１６の相互作用のアンタゴニストまたはインヒビターをスクリーニングする方法における、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはその組成物の使用を包含する。
【００８９】
本発明はさらに、本発明によるＲＥＴ１６核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％または９９.９％同一である単離核酸またはポリペプチド分子を包含する。さらに詳細には、本発明は、配列番号１２の配列と少なくとも８２.０％同一であるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド、またはその断片；配列番号１２の配列と少なくとも６８.２％同一であるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド、またはその断片；および配列番号１４の配列と少なくとも９３.１％同一であるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド、またはその断片を包含する。さらに、本発明は、細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドまたはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号１３の配列と少なくとも８２％の配列同一性を有するもの；および細胞シグナル伝達ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドまたはその断片であって、該ポリペプチドが配列番号１５の配列と少なくとも９５.０％の配列同一性を有するものを包含する。本発明はさらに、配列番号１３に示す配列と少なくとも８２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離したおよび／または実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質；および配列番号１５に示す配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離したおよび／または実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質を包含する。
【００９０】
さらに本発明に包含されるのは、炎症および細胞炎症プロセスと関連する、または細胞増殖または細胞活性化プロセスと関連する障害または疾患の診断、治療または予防法における、ＲＥＴ１６核酸配列およびＲＥＴ１６ポリペプチド、またはＲＥＴ１６核酸またはアミノ酸配の全てまたは部分と相互作用する分子の使用である。さらに、ＲＥＴ１６遺伝子およびポリペプチドは、ＲＥＴ１６と関連し、レセプター活性化、刺激、または制御されない細胞増殖によって駆動される炎症プロセスや細胞内シグナル伝達事象の発生に関係するマスタースイッチと関与しうるシグナル伝達カスケードのための重要なシグナルを提供する細胞シグナル伝達分子を決定するのに有用である。
【００９１】
本発明に従い、ヒトＲＥＴ１６タンパク質をコードする核酸を、まずＴＮＦ−アルファ刺激したヒト肺微細血管内皮細胞からサブトラクションｃＤＮＡライブラリーで同定した。完全長のＲＥＴ１６遺伝子を、実施例１に記載するようにIncyteおよびパブリックＥＳＴデータベースから利用できるクローン配列を伸長することにより単離した。
【００９２】
その１態様において、本発明は、図２および３に示す配列番号２のアミノ酸配列および図４Ｂに示す配列番号４のオープンリーディングフレームアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ヒトＲＥＴ１６ポリペプチドは長さが４７６アミノ酸である。図１０Ａ〜図１０Ｅは、ＲＥＴ１６と他の幾つかのタンパク質、すなわちPodospora anserina植物不適合（vegetable incompatibility）タンパク質Ｈｅｔ−Ｅ−１の部分；Thermomonospora curvata推定セリン／トレオニンキナーゼＰＷＫＡの部分；ＲＥＴ１６マウスオーソログ、および部分ＲＥＴ１６ラットオーソログとの構造上の類似性を描写するものである。
【００９３】
ＲＥＴ１６ポリペプチドの変異体もまた本発明により包含される。１つの側面では、ＲＥＴ１６変異体は、本明細書に記載するアミノ酸配列（配列番号２または配列番号４）と少なくとも７５〜８０％、好ましくは少なくとも８５〜９０％、さらに好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、これはＲＥＴ１６ポリペプチドの少なくとも１の生物学的、免疫学的、または他の機能的な特性または活性を保持している。最も好ましいのは配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する変異体である。ＲＥＴ１６のアミノ酸配列は、以下の３つのうちの１またはそれ以上に類別することができる：置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体。そのような変異体は、典型的にカセットまたはＰＣＲ突然変異誘発、または当業者によく知られた他の方法を用い、ＲＥＴ１６タンパク質をコードするＤＮＡにおいてヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発を行って変異体をコードするＤＮＡを生成することによって調製する。その後、このＤＮＡを本明細書に記載するように組換え細胞培養液で発現させる。約１００〜１５０残基までを有する変異体ＲＥＴ１６タンパク質断片は、常法を用いてインビトロ合成により調製できる。２つの変異体ＲＥＴ１６.２およびＲＥＴ１６.３を本明細書に記載する［実施例２；図１６（マルチプルシークエンスアラインメント）；図１８（エクソン構造）；図１９Ａおよび１９Ｂ（それぞれ変異体ＲＥＴ１６.２のポリヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列（配列番号１３））；および図２０Ａおよび２０Ｂ（それぞれ変異体ＲＥＴ１６.３のポリヌクレオチド配列（配列番号１４）およびアミノ酸配列（配列番号１５））を参照；］。
【００９４】
アミノ酸配列変異体は、該変異体の前もって決定した性質、すなわちＲＥＴ１６タンパク質アミノ酸配列の天然のアレルまたは種間変異とは異なったものにする特性によって特徴付けることができる。修飾した特性を有する変異体を選択することもできるけれども、変異体は典型的に天然のアナログのものと同じ性質の生物学的活性を示す。アミノ酸配列の変異を導入する部位または領域は前もって決定することができるが、変異自体は前もって決定する必要がない。たとえば、所定の部位での変異の実行を最適にするため、標的コドンまたは領域でランダム突然変異誘発を行い、発現されたＲＥＴ１６変異体を所望の活性の最適の組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡ中の前もって決定した部位で置換変異を行う方法はよく知られており、たとえばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発がある。変異体のスクリーニングはＲＥＴ１６タンパク質活性のアッセイを用いて行い、たとえば結合ドメインの変異については競合結合試験を行うことができる。
【００９５】
アミノ酸置換は典型的に単一の残基のものである；挿入は、通常１〜２０アミノ酸のオーダーであるが、相当長い挿入も許容しうる。欠失は約１〜約２０残基の範囲であるが、幾つかの場合には欠失は一層長いものであってもよい。
【００９６】
置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせを用い、最終的なＲＥＴ１６誘導体とすることができる。一般に、これら変化は、分子の変化を最小にするために幾つかのアミノ酸にのみ影響を及ぼす。しかしながら、ある場合には一層長い変化も許容しうる。ＲＥＴ１６タンパク質の特性において小さな変化を望むか請け負う場合には、置換は一般に下記表１に従って行う。
【００９７】
表１
【表１】
2004532619.tif 000003
【００９８】
表１に示すものよりも保存的でない置換を選択することにより、機能または免疫学的な同一性において実質的な変化を生じさせる。たとえば、変化させる領域のポリヌクレオチド骨格の構造、たとえばアルファらせん、またはベータシート構造；標的部位の分子のハイドロフォビシティー；または側鎖の嵩張りに一層有意に影響を及ぼす置換を行うことができる。一般にポリペプチドの特性を最も大きく変化させると予測される置換は、（ａ）親水性残基、たとえばセリンまたはトレオニンを疎水性残基、たとえばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンで置換（またはこの逆）；（ｂ）システインまたはプロリンを他の残基で置換（またはこの逆）；（ｃ）正の荷電の側鎖を有する残基、たとえばリシン、アルギニンまたはヒスチジンを負の荷電の残基、たとえばグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換（またはこの逆）；または（ｄ）嵩張った側鎖を有する残基、たとえばフェニルアラニンを側鎖を有しない残基、たとえばグリシンで置換（またはこの逆）するものである。
【００９９】
ＲＥＴ１６変異体は通常は天然のアナログと同じ性質の生物学的活性または機能を示し、同じ免疫応答を誘起するが、必要に応じてＲＥＴ１６タンパク質の特性を修飾した変異体もまた選択できる。あるいは、変異体はＲＥＴ１６タンパク質の生物学的活性が変化するようにデザインすることができる。
【０１００】
他の態様において、本発明はＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。従って、ＲＥＴ１６ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いてＲＥＴ１６タンパク質を発現する組換え分子を製造することができる。特別の態様において、本発明は、図１および図４Ａにそれぞれ示す配列番号１および配列番号３の核酸配列を含むＲＥＴ１６ポリヌクレオチド、および配列番号６の核酸配列を含むヒトＲＥＴ１６のマウスオーソログ；並びに配列番号８の核酸配列を含むヒトＲＥＴ１６のラットオーソログを包含する。さらに詳細には、本発明は、ブダペスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア２０１１０−２２０９）にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１にて２００１年３月７日に寄託してある、クローニング完全長オープンリーディングフレームのヒトＲＥＴ１６ ｃＤＮＡ（１５３２ｂｐ；ＲＥＴ１６.１ともいう）を提供する。
【０１０１】
好ましい態様において、本発明は、その結果得られたＲＥＴ１６.１のコードされたポリペプチドに加えて、最初の開始コドンを欠くポリヌクレオチドを包含する。とりわけ、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１５１〜１５７５に対応するポリヌクレオチド、および配列番号２のアミノ酸２〜４７６に対応するポリペプチドを包含する。また、本明細書に記載するように、ＲＥＴ１６.１コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【０１０２】
他の好ましい態様において、本発明は、その結果得られたＲＥＴ１６.２のコードされたポリペプチドに加えて、最初の開始コドンを欠くポリヌクレオチドを包含する。とりわけ、本発明は、配列番号１２のヌクレオチド１１４〜１２６２に対応するポリヌクレオチド、および配列番号１３のアミノ酸２〜３８４に対応するポリペプチドを包含する。また、本明細書に記載するように、ＲＥＴ１６.２コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【０１０３】
他の好ましい態様において、本発明は、その結果得られたＲＥＴ１６.３のコードされたポリペプチドに加えて、最初の開始コドンを欠くポリヌクレオチドを包含する。とりわけ、本発明は、配列番号１４のヌクレオチド１３９〜１６４１に対応するポリヌクレオチド、および配列番号１５のアミノ酸２〜５０２に対応するポリペプチドを包含する。また、本明細書に記載するように、ＲＥＴ１６.３コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【０１０４】
他の好ましい態様において、本発明は、その結果得られたマウスＲＥＴ１６のコードされたポリペプチドに加えて、最初の開始コドンを欠くポリヌクレオチドを包含する。とりわけ、本発明は、配列番号６のヌクレオチド１９〜１４４３に対応するポリヌクレオチド、および配列番号７のアミノ酸２〜４７５に対応するポリペプチドを包含する。また、本明細書に記載するように、マウスＲＥＴ１６コード配列を含む組換えベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【０１０５】
当該技術分野における熟練した実施者には評価されるであろうように、遺伝暗号の縮重は本発明のＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列を生じる結果となる。これらの配列の幾つかは、既知のおよび天然の遺伝子のヌクレオチド配列とは最小のホモロジーしか有しない。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づいた組み合わせを選択することにより作製できるヌクレオチド配列の可能な全ての変化物を包含する。これら組み合わせは、天然のＲＥＴ１６のヌクレオチド配列に適用されるように標準トリプレット遺伝コードに従って作製し、そのような全ての変化物は個別に開示されるものと考えなければならない。
【０１０６】
ＲＥＴ１６ポリペプチドおよびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適当に選択したストリンジェンシーの条件下で天然のＲＥＴ１６ポリペプチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズできるのが好ましいが、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその誘導体をコードするが実質的に異なるコドン使用頻度のヌクレオチド配列を製造するのが有利である。コドンの選択は、特定の原核または真核宿主細胞において、該宿主細胞、たとえば植物細胞または酵母細胞または両生類細胞によって利用される特定コドンの使用頻度に従い、ペプチド／ポリペプチドの発現速度を増大させるように行うことができる。コードされるアミノ酸配列を変えることなくＲＥＴ１６ポリペプチドおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変える他の理由としては、天然の配列から生成する転写物に比べてより望ましい特性、たとえばより長い半減期を有するｍＲＮＡ転写物を産生することが挙げられる。
【０１０７】
本発明はまた、ＲＥＴ１６ポリペプチドおよびその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはその部分を完全に合成化学により製造することを包含する。製造後、合成した配列を当業者によく知られ実施されている試薬を用いて多くの利用できる発現ベクターおよび細胞系のいずれにも挿入することができる。さらに、合成化学を用いてＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその断片をコードする配列に変異を導入することができる。
【０１０８】
また、本発明により包含されるのは、配列番号１または配列番号３に示すものなどのＲＥＴ１６の特許請求したヌクレオチド配列に様々なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は典型的に核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づくものであり（G. M. WahlおよびS. L. Berger, 1987; Methods Enzymol., 152: 399-407およびA. R. Kimmel, 1987; Methods of Enzymol., 152: 507-511を参照）、定めたストリンジェンシーにて用いることができる。たとえば、本発明に包含されるのは、配列番号１または配列番号３のＲＥＴ１６核酸配列およびＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列の縮重である他の配列に中くらいのストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる配列、である（たとえば、制限されない例として、２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ、１.０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０のプレ洗浄溶液、および５０℃のハイブリダイゼーション条件、５×ＳＳＣ、一夜）。
【０１０９】
本発明の他の態様において、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片（ペプチド）は、適当な宿主細胞中でＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその断片またはその機能的等価物の発現を指令する組換えＤＮＡ分子に用いることができる。遺伝コードがもともと縮重しているため、実質的に同じかまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を製造することができ、これら配列もＲＥＴ１６タンパク質を発現させるのに用いることができる。
【０１１０】
当業者により評価されるであろうように、天然に存在しないコドンを有するＲＥＴ１６ポリペプチドコードヌクレオチド配列を製造することは有利である。たとえば、特定の原核または真核宿主細胞に好まれるコドンを選択し、タンパク質の発現速度を増大させたり、または所望の特性、たとえば天然の配列から生成する転写物よりも長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を製造することができる。
【０１１１】
本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変（これらに限られるものではない）を含む様々な理由からＲＥＴ１６ポリペプチドコード配列を変化させるため、当該技術分野で一般に知られた方法を用いて遺伝子操作することができる。ランダムフラグメント形成（fragmentation）および遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとのＰＣＲ再アセンブリーによるＤＮＡシャフリングを用いてヌクレオチド配列を遺伝子操作することができる。たとえば、部位特異的突然変異誘発を用いて、新たな制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドンの優先性の変化、スプライス変異体の作製、または変異の導入などを行うことができる。
【０１１２】
本発明の他の態様において、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする天然の、修飾した、または組換えの核酸配列またはその断片を、融合タンパク質をコードする異種配列にライゲートすることができる。たとえば、ＲＥＴ１６活性または結合のインヒビターまたはモデュレーターをペプチドライブラリーでスクリーニングするには、市販の抗体により認識できるキメラＲＥＴ１６タンパク質をコードするのが有用である。融合タンパク質はまた、ＲＥＴ１６タンパク質を異種残基部分から開裂および精製できるようにＲＥＴ１６タンパク質コード配列と異種タンパク質配列との間に開裂部位を含むように遺伝子操作することができる。
【０１１３】
従って、本発明は、細胞シグナル伝達カスケードに関与し、配列番号１、３、５、６、８、１２または１４に示す核酸配列または遺伝子コードの重複の結果、配列番号１、３、５、６、８、１２または１４の配列の縮重核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる実質的に精製した細胞シグナル伝達タンパク質を包含する。そのような融合タンパク質はさらに、配列番号２、４、７、９、１３または１５のアミノ酸配列の全てまたは部分、または配列番号２、４、７、９、１３または１５に示す配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および第二のタンパク質のアミノ酸配列を含んでいてよい。
【０１１４】
他の態様において、ＲＥＴ１６産物の機能を妨害するインヒビター化合物、またはＲＥＴ１６産物の機能を刺激するアクチベーター化合物を同定するのに、リガンド結合アッセイが有用である。そのようなアッセイは、タンパク質の機能が不明であっても有用である。これらアッセイは、特定の標的分子、たとえばタンパク質やペプチドへの被験化合物の結合を検出すべくデザインする。検出には結合を直接測定することが含まれる。あるいは、結合の間接的な表示として、タンパク質構造の安定化、または生物学的機能の妨害または促進が含まれる。有用なリガンド結合アッセイの制限されない例を以下に詳記する。
【０１１５】
結合タンパク質の検出および単離に有用な１つの方法は、Pharmacia Biosensorによって開発され、製造業社のプロトコール（LKB Pharmacia，スウェーデン）に記載されているBiomolecular Interaction Assay（BIAcore）システムである。BIAcoreシステムは、アフィニティー精製した抗ＧＳＴ抗体を用いてＧＳＴ−融合タンパク質をセンサーチップに固定化する。このセンサーは、屈折率の変化を検出する最適の現象である表面プラズモン共鳴を利用している。従って、目的とするタンパク質、たとえば本発明のＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその断片をチップ上に固定化し、被験化合物をチップに通す。結合は屈折率の変化（表面プラズモン共鳴）により検出する。
【０１１６】
異なるタイプのリガンド結合アッセイは、米国特許第４,５６８,６４９号に記載されているようにシンチレーション近似アッセイ（scintillation proximity assays；ＳＰＡ）を含む。現在開発中のこのアッセイの変法では、シャペロニン（chaperonin）を用いて折り畳まれたタンパク質と折り畳まれていないタンパク質とを識別する。標識したタンパク質をＳＰＡビーズに付着させ、被験化合物を加える。ついで、ビーズを穏やかな変性条件、たとえば熱、ＳＤＳへの暴露などに供し、精製した標識シャペロニンを加える。もしも被験化合物が標的タンパク質に結合しておれば標識シャペロニンは結合しないであろう；逆に被験化合物が結合していなければ、該タンパク質はいくらかの変性を受け、シャペロニンは結合するであろう。他のタイプのリガンド結合アッセイでは、ミトコンドリアターゲティングシグナルを含むタンパク質を単離したミトコンドリアにインビトロで移入させる（Hurtら、1985, EMBO J., 4: 2061-2068; EilersおよびSchatz, 1986, Nature, 322: 228-231）。ミトコンドリア移入アッセイでは、特定の標的タンパク質をコードする核酸をミトコンドリア移入シグナルをコードする配列の下流に挿入した発現ベクターを構築する。キメラタンパク質を合成し、該キメラタンパク質が被験化合物の不在下および存在下で単離ミトコンドリア中に移送されることができるか否かについて試験する。標的タンパク質に結合する被験化合物は、それが単離ミトコンドリア中にインビトロで取り込まれるのを抑制するに違いない。
【０１１７】
本発明に従って用いるのに適した他のタイプのリガンド結合アッセイは、酵母２ハイブリッド系である（FieldsおよびSong, 1989, Nature, 340: 245-246）。酵母２ハイブリッド系は、酵母S. cerevisiaeのＧＡＬ４タンパク質の特性を利用している。ＧＡＬ４タンパク質は、ガラクトースの利用に関与する酵素をコードする遺伝子の発現に必要な転写アクチベーターである。ＧＡＬ４タンパク質は、２つの分離できる機能的に必須のドメインからなっている：すなわち、特定のＤＮＡ配列（ＵＡＳＧ）に結合するＮ末端ドメイン；および酸性領域を含むＣ末端ドメイン（転写を活性化するのに必要である）。両ドメインを含む天然のＧＡＬ４タンパク質は、酵母菌体がガラクトース培地で増殖するときに転写の強力なアクチベーターである。Ｎ末端ドメインはＤＮＡに配列特異的に結合するが、転写を活性化することはできない。Ｃ末端ドメインは活性化領域を含むが、ＵＡＳＧに配置できないので転写を活性化することができない。２ハイブリッド系では、２つのハイブリッドタンパク質の系がＧＡＬ４の部分を含む：（１）タンパク質「Ｘ」に融合したＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン；および（２）タンパク質「Ｙ」に融合したＧＡＬ４活性化領域。タンパク質ＸとＹとがタンパク質−タンパク質複合体を形成し、ＧＡＬ４ドメインの近接性を再構築できれば、ＵＡＳＧによって制御される遺伝子の転写が起こる。それぞれ相互作用タンパク質ＸおよびＹを含む２つのハイブリッドタンパク質の生成が、ＵＡＳＧの活性化領域をその通常の作用部位にもってくることを可能にする。
【０１１８】
Fodorら、1991, Science, 251: 767-773に記載された結合アッセイもまた有用であり、これは固相基体上に合成した複数の所定のポリマーに対する被験化合物の結合親和性を試験することを含む。本発明によるＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその部分に結合する化合物は、治療用組成物に使用するための薬剤として有用な可能性がある。
【０１１９】
他の態様において、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列は、その全体または一部を当該技術分野でよく知られた化学的方法を用いて合成することができる（たとえば、M. H. Caruthersら、1980, Nucl. Acids Res. Symp. Ser., 215-223およびT. Horn, Tら、1980, Nucl. Acids Res. Symp. Ser., 225-232を参照）。別法として、タンパク質自体を化学的方法を用いて製造してＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその断片または部分のアミノ酸配列を合成することができる。たとえば、ペプチド合成は種々の固相法（J. Y. Robergeら、1995, Science, 269: 202-204）を用いて行うことができ、たとえばABI 431A Peptide Synthesizer（PE Biosystems）を用いて自動合成を達成することができる。
【０１２０】
新たに合成したペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（たとえば、T. Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles、WH Freeman and Co.、ニューヨーク、ニューヨーク）により、逆相高速液体クロマトグラフィーにより、または当該技術分野でよく知られた他の精製法により実質的に精製することができる。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングにより確認することができる（たとえば、エドマン分解法；Creighton、上掲）。さらに、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその部分のアミノ酸配列は、直接合成の際におよび／または化学合成法を他のタンパク質からの配列またはその部分と組み合わせて変化させて変異体ポリペプチドを製造することができる。
【０１２１】
ヒトＲＥＴ１６タンパク質の発現
生物学的に活性な／機能性のＲＥＴ１６ポリペプチドまたはペプチドを発現するため、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクター、たとえば挿入したコード配列の転写および翻訳に必要な配列を含むベクターに挿入することができる。ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列および適当な転写および翻訳調節配列を含む発現ベクターを構築するため、当業者によく知られ実施されている方法を用いることができる。これら方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような方法は、J. Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、プレインビュー、ニューヨークおよびF. M. Ausubelら、1989, Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨークに記載されている。
【０１２２】
様々な発現ベクター／宿主系を利用してＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列を含ませ発現させることができる。そのような発現ベクター／宿主系としては、これらに限られるものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母または真菌発現ベクターで形質転換した酵母または真菌；ウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））または細菌発現ベクター（たとえば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。使用した宿主細胞は本発明を限定するものではない。
【０１２３】
「調節配列」または「制御配列」とは、ベクターの非翻訳領域、たとえばエンハンサー、プロモーター、５'および３'非翻訳領域（宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う）である。そのような配列は、その強度および特異性において様々であってよい。使用するベクター系および宿主に応じて、適当な転写および翻訳配列（構成的および誘導性プロモーターを含む）を幾つ用いてもよい。たとえば、細菌系にクローニングする場合は、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene、ラジョラ、カリフォルニア）またはPSPORT1プラスミド（Life Technologies）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に用いることができる。植物細胞のゲノムに由来する（たとえば、熱ショック、RUBISCO；および貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルスに由来する（たとえば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）プロモーターまたはエンハンサーをベクターにクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子に由来するまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが好ましい。ＲＥＴ１６をコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーとともに用いることができる。
【０１２４】
細菌系では、発現されたＲＥＴ１６産物に使用する意図に応じて多くの発現ベクターを選択することができる。たとえば、抗体を誘起するために多量の発現タンパク質を必要とする場合は、融合タンパク質の高レベルの発現を指令し、該融合タンパク質を容易に精製できるベクターを用いることができる。そのようなベクターとしては、これらに限られるものではないが、BLUESCRIPT（Stratagene）（ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはそのペプチドをコードする配列をアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列とインフレームでライゲートし、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにすることができる）；ｐＩＮベクター（たとえば、G. Van HeekeおよびS. M. Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 264: 5503-5509を参照）などの多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられる。ｐＧＥＸベクター（Promega、マジソン、ウイスコンシン）もまたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後に遊離のグルタチオンの存在下で溶出することにより溶解細胞から容易に精製することができる。そのような系で製造したタンパク質は、目的とするクローニングポリペプチドを所望によりＧＳＴ残基から放出できるように、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインすることができる。
【０１２５】
酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構成的および誘導性のプロモーターを含む多くのベクターを用いることができる（概説として、F. M. Ausubelら、上掲、およびGrantら、1987, Methods Enzymol., 153: 516-544を参照）。
【０１２６】
植物発現ベクターが望ましく、使用する場合には、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列の発現は多くのプロモーターのいずれによっても駆動することができる。たとえば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独またはＴＭＶからのオメガリーダー配列と組み合わせて用いることができる（N. Takamatsu, 1987, EMBO J., 6: 307-311）。あるいは、RUBISCOの小サブユニット、または熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを用いることができる（G. Coruzziら、1984, EMBO J., 3: 1671-1680; R. Broglieら、1984, Science, 224: 838-843；およびJ. Winterら、1991, Results Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これら構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒体トランスフェクションにより植物細胞に導入することができる。そのような方法は、多くの一般に利用できる概説に記載されている（たとえば、S. HobbesまたはL. E. Murry, In: McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill、ニューヨーク、ニューヨーク、pp. 191-196を参照）。
【０１２７】
昆虫系を用いてＲＥＴ１６ポリペプチドを発現することもできる。たとえば、そのような１つの系として、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をSpodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeで外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いる。ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列をポリヘドリン遺伝子などの該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。ＲＥＴ１６ポリペプチドがうまく挿入しておればポリヘドリン遺伝子は不活化され、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが産生される。ついで、組換えウイルスを用いてたとえばS. frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeを感染させることができ、この中でＲＥＴ１６ポリペプチドを発現させることができる（E. K. Engelhardら、1994, Proc. Nat. Acad. Sci., 91: 3224-3227）。
【０１２８】
哺乳動物宿主細胞では多くのウイルスベースの発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび３連のリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートすることができる。感染した宿主細胞でＲＥＴ１６ポリペプチドを発現できる生きたウイルスを得るため、ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域を用いることができる（J. LoganおよびT. Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 3655-3659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【０１２９】
特定の開始シグナルを用いてＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列の一層効率的な翻訳を達成することもできる。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクターに挿入する場合には、さらに転写または翻訳調節シグナルは必要ない。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入する場合には、外来の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）を提供しなければならない。さらに、全挿入物の翻訳を確実にするため、開始コドンは正しい読取り枠になければならない。異種翻訳配列および開始コドンは、天然および合成の両者とも様々な起源のものであってよい。発現の効率は、文献記載のもののような（D. Scharfら、1994, Results Probl. Cell Differ., 20: 125-162）、使用した特定の細胞系に適したエンハンサーを含めることによって促進することができる。
【０１３０】
さらに、宿主細胞株は、挿入配列の発現を変調したり発現タンパク質を所望の仕方でプロセシングする能力について選択することができる。そのようなポリペプチドの修飾としては、これらに限られるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）、およびアシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」形を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳みおよび／または機能を容易にするために用いることができる。そのような翻訳後活性のための特別の細胞機構および特徴的なメカニズムを有する種々の宿主細胞（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８）が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１ユニバーシティー・ブールバール、マナサス、バージニア２０１１０−２２０９）から利用でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にすべく選択することができる。
【０１３１】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには安定した発現が好ましい。たとえば、ＲＥＴ１６タンパク質を安定に発現する細胞株を、ウイルスの複製起点および／または内生の発現配列および選択マーカー遺伝子を同じかまたは別個のベクター上に含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターを導入後、選択培地に切り換える前に細胞を富んだ細胞培養培地で１〜２日間増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在が導入配列を首尾よく発現している細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換した細胞の耐性クローンは、その細胞のタイプに適した組織培養法を用いて増殖させることができる。
【０１３２】
形質転換した細胞株を回収するため、幾つの選択系も用いることができる。これらとしては、これらに限られるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ＴＫ）（M. Wiglerら、1977, Cell, 11: 223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（I. Lowyら、1980, Cell, 22: 817-23）遺伝子が挙げられ、これらはそれぞれｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞で用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を選択の基礎として用いることができる；たとえば、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（M. Wiglerら、1980, Proc. Natl. Acad. Sic., 77: 3567-70）；アミノグリコシドのネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｐｔ（F. Colbere-Garapinら、1981, J. Mol. Biol., 150: 1-14）；およびそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するａｌｓまたはｐａｔ（Murry、上掲）。さらなる選択遺伝子が記載されている、たとえば、トリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるｔｒｐＢ、またはヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるｈｉｓＤ（S. C. HartmanおよびR. C. Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8047-51）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、およびルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンなどのマーカーのような可視性のマーカーの使用が一般的になってきており、これらマーカーは形質転換体を同定するのみならず、特定のベクター系に帰せられる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するうえでも広く用いられている（C. A. Rhodesら、1995, Methods Mol. Biol., 55: 121-131）。
【０１３３】
マーカー遺伝子発現の存在／不在は目的遺伝子が存在することをも示唆するものであるが、目的とする所望の遺伝子の存在および発現は確認する必要がある。たとえば、ＲＥＴ１６核酸配列ポリペプチドがマーカー遺伝子配列内に挿入されていると、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列を含む組換え細胞はマーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。あるいは、マーカー遺伝子はＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列とタンデムに単一のプロモーターの制御下に配置することができる。誘発または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデム遺伝子の同時発現を示す。
【０１３４】
あるいは、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ＲＥＴ１６ポリペプチド産物を発現する宿主細胞は、当業者に知られた様々な方法により同定することができる。これら方法としては、これらに限られるものではないが、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ法（メンブレン、溶液、またはチップベースの方法を含む）が挙げられる。
【０１３５】
好ましくは、ＲＥＴ１６ポリペプチドは発現後に実質的に精製する。ＲＥＴ１６タンパク質は、試料中に他のどのような成分が存在しているかにより、当業者に知られ実施されている様々な仕方で単離または精製することができる。標準的な精製法としては、電気泳動法、分子生物学的方法、免疫学的方法およびクロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィー、疎水性アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むが、これらに限られるものではない）が挙げられる。たとえば、ＲＥＴ１６タンパク質は、標準的な抗ＲＥＴ１６抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク質濃度と組み合わせた限外濾過およびダイアフィルトレーション法を用いることもできる。適当な精製法の一般的な手引きとしては、R. Scopes, 1982, Protein Purification, Springer-Verlag、ニューヨークを参照。熟練した実施者には理解されるであろうように、必要な精製の程度はＲＥＴ１６タンパク質の使用目的により変わりうる；場合によっては精製が必要ないこともあるであろう。
【０１３６】
組換え製造に加え、ＲＥＴ１６ポリペプチドの断片は固相法を用いた直接ペプチド合成により製造できる（J. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154）。タンパク質合成は、手動法を用いるかまたは自動化により行うことができる。自動合成は、たとえば、ABI 431A Peptide Synthesizer（PE Biosystems）を用いて達成することができる。ＲＥＴ１６の様々な断片を別々に化学合成し、ついで化学法を用いて組み合わせることにより完全長の分子を生成することができる。
【０１３７】
ヒトＲＥＴ１６ポリヌクレオチドの検出
ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにより、またはＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは部分または断片を用いた増幅により検出することができる。核酸増幅ベースのアッセイは、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを使用することにより、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む形質転換体を検出することを含む。
【０１３８】
広範な様々な標識およびコンジュゲート法が当業者に知られ、用いられており、様々な核酸およびアミノ酸アッセイに用いることができる。ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを生成する手段としては、オリゴ−標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその部分または断片をコードする配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることができる。そのようなベクターは当該技術分野で知られ市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ（６）および標識ヌクレオチドなどの適当なＲＮＡポリメラーゼを加えることによりインビトロでＲＮＡプローブを合成するのに用いることができる。これら方法は、様々な市販のキット（たとえば、Amersham Pharmacia Biotech, PromegaおよびU. S. Biochemical Corp.）を用いて行うことができる。使用できる適当なリポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、または色原体、並びに基質、補因子、インヒビター、マグネチック粒子などが挙げられる。
【０１３９】
ヒトＲＥＴ１６ポリペプチド−産生、検出、単離
ＲＥＴ１６タンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその断片で形質転換した宿主細胞は、該タンパク質の細胞培養からの発現および回収に適した条件下で培養することができる。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用した配列および／またはベクターに依存して分泌されるかまたは細胞内に含まれている。当業者には理解されるであろうように、ＲＥＴ１６タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通したＲＥＴ１６タンパク質の分泌を指令するシグナル配列を含むようにデザインすることができる。
【０１４０】
ＲＥＴ１６タンパク質をコードする核酸配列を可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させるため、他の構築を用いることができる。そのような精製を容易にするドメインとしては、これらに限られるものではないが、固定化した金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモデュールなどの金属キレート形成ペプチド；固定化した免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン；およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Immunex Corp.、シアトル、ワシントン）で利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインとＲＥＴ１６タンパク質との間に第ＸＡ因子やエンテロキナーゼに特異的なもの（Invitrogen、サンジエゴ、カリフォルニア）などの開裂可能なリンカー配列を含めることを精製を容易にするために用いることができる。１つのそのような発現ベクターは、ＲＥＴ１６コード配列とチオレドキシンに先行する６ヒスチジン残基またはエンテロキナーゼ開裂部位をコードする核酸とを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、J. Porathら、1992, Prot. Exp. Purif., 3: 263-281に記載されているようにＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）での精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からの精製手段を提供する。融合タンパク質の産生に適したベクターの論考については、D. J. Krollら、1993, DNA Cell Biol., 12: 441-453を参照。
【０１４１】
プラスミドベクターに含まれ発現されるものよりも大きなＤＮＡ断片を送達するため、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることができる。ＨＡＣは、サイズが１０Ｋ〜１０ＭのＤＮＡ配列を含むことができ、安定な有糸分裂による染色体分離および保持に必要な全ての配列を含む線状の微小染色体である（J. J. Harringtonら、1997, Nature Genet., 15: 345-355を参照）。６〜１０ＭのＨＡＣを構築し、治療目的のために通常の送達手段（たとえば、リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、またはベシクル）により送達する。
【０１４２】
タンパク質に特異的なポリクローナル抗体かまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いてＲＥＴ１６ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコールが当該技術分野で知られ、実施されている。例としては、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。ＲＥＴ１６ポリペプチド上の２つの相互に妨害しないエピトープと反応性のモノクローナル抗体を用いた２部位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる。これらおよび他のアッセイは、R. Hamptonら、1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press、セントポール、ミネソタおよびD. E. Maddoxら、1983; J. Exp. Med., 158: 1211-1216の刊行を代表として当該技術分野に記載されている。
【０１４３】
抗ヒトＲＥＴ１６抗体およびその使用
精製したＲＥＴ１６タンパク質またはその断片は、抗体を産生するため、または医薬または他の化合物、とりわけ小さな分子のライブラリーをスクリーニングしてＲＥＴ１６に特異的に結合するものを同定するのに用いることができる。そのような抗体は本発明のＲＥＴ１６ポリペプチドのアンタゴニストまたはインヒビターとして有用であり、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換えにより製造したものであってよい。
【０１４４】
ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその免疫原性のペプチド断片に特異的な抗体は、当該技術分野で長く知られ通常用いられている方法を用いて製造することができる。そのような抗体としては、これらに限られるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーによって製造されるフラグメントが挙げられる。中和抗体（すなわち、二量体形成を抑制する抗体）は治療用に使用するのに特に好ましい。
【０１４５】
抗体を産生するには、種々の宿主（ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、ヒトその他を含む）をＲＥＴ１６ポリペプチドまたは免疫原性の特性を有するそのペプチド断片またはオリゴペプチドを注射して免疫することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を増大させることができる。適当なアジュバントの制限されない例としては、フロイントの（不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムやシリカなどの金属ゲル、および表面活性物質、たとえばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ＫＬＨ、およびジニトロフェノールが挙げられる。ヒトに典型的に使用するアジュバントとしては、ＢＣＧ（bacilli Calmette Guerin）およびCorynebacterium parvumnが挙げられる。
【０１４６】
好ましくは、ＲＥＴ１６ポリペプチドに対する抗体を誘発するのに使用するペプチド、断片またはオリゴペプチド（すなわち、免疫原）は、少なくとも５つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも７〜１０のアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。また、免疫原は天然のタンパク質のアミノ酸配列の部分と同一であるのが好ましい；免疫原はまた、小さな天然分子の全アミノ酸配列を含んでいてよい。ペプチド、断片またはオリゴペプチドは、単一のエピトープまたは抗原決定基または複数のエピトープを含んでいてよい。ＲＥＴ１６アミノ酸の短いストレッチを他のタンパク質のアミノ酸（たとえば、ＫＬＨ）と融合させ、このキメラ分子に対して抗体を産生させる。
【０１４７】
ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその免疫原性の断片に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供するあらゆる方法を用いて製造することができる。これら方法としては、これらに限られるものではないが、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法が挙げられる（G. Kohlerら、1975, Nature, 256: 495-497; D. Kozborら、1985, J. Immunol. Methods, 81: 31-42; R. J. Coteら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030；およびS. P. Coleら、1984, Mol. Cell Biol., 62: 109-120）。モノクローナル抗体の産生は当該技術分野でよく知られており、日常的に用いられている。
【０１４８】
さらに、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術である、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライスして適当な抗原特異性と生物学的活性とを備えた分子を得ることを用いることができる（S. L. Morrisonら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855; M. S. Neubergerら、1984, Nature, 312: 604-608；およびS. Takedaら、1985, Nature, 314: 452-454）。あるいは、当該技術分野で知られた方法を用いて一本鎖抗体を産生するために記載された技術を採用し、ＲＥＴ１６ポリペプチドに特異的な一本鎖抗体を生成することができる。関連した特異性を有するが異なるイディオタイプ組成の抗体は、ランダムコンビネーション免疫グロブリンライブラリーからの鎖シャフリングにより生成することができる（D. R. Burtonら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11120-3）。抗体はまた、文献に開示されているように（R. Orlandiら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3833-3837およびG. Winterら、1991, Nature, 349: 293-299）、リンパ球集団におけるインビボ産生で誘発することにより、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても産生することができる。
【０１４９】
ＲＥＴ１６ポリペプチドに特異的な結合部位を含む抗体フラグメントを生成することもできる。たとえば、そのようなフラグメントとしては、これらに限られるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生成することのできるＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって生成することのできるＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とすることができる（W. D. Huseら、1989, Science, 254, 1275-1281）。
【０１５０】
所望の特異性を有する抗体を同定するため、様々なイムノアッセイを用いてスクリーニングすることができる。確立した特異性を有するポリクローナル抗体かまたはモノクローナル抗体を用いた競合結合または免疫放射測定アッセイのための多数のプロトコールが当該技術分野でよく知られている。そのようなイムノアッセイは、典型的にＲＥＴ１６ポリペプチドとその特異的な抗体との間での複合体の生成を測定することを含む。２つの相互に妨害しないＲＥＴ１６ポリペプチドエピトープと反応性のモノクローナル抗体を用いた２部位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる（Maddox、上掲）。
【０１５１】
治療剤／処置
本発明の１つの態様において、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片または相補鎖は治療目的に用いることができる。１つの側面において、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスは、ＲＥＴ１６ ｍＲＮＡの転写を妨害することが望ましい状況で用いることができる。とりわけ、本明細書の実施例４に記載するように、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換またはトランスフェクションすることができる。かくして、相補的な分子を用いてヒトＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびポリペプチド活性を変調し、または遺伝子機能の制御を達成することができる。そのような技術は今や当該技術分野でよく知られており、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のコード領域または非コード領域の種々の位置からセンスまたはアンチセンスのオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドまたは一層大きな断片をデザインすることができる。
【０１５２】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス、または他の様々な細菌プラスミド由来の発現ベクターを、ヌクレオチド配列を標的生物、組織または細胞集団に送達するのに用いることができる。ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする核酸配列に相補的な核酸配列を発現する組換えベクターを構築するため、当業者によく知られた方法を用いることができる。これら技術は、J. Sambrookら、上掲およびF. M. Ausubelら、上掲にともに記載されている。
【０１５３】
ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする遺伝子は、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換することにより作り出す（turned off）ことができる。そのような構築物は、翻訳できないセンスまたはアンチセンス配列を細胞中に導入するのに用いることができる。そのようなベクターは、ＤＮＡに組み込まれなくとも、内生のヌクレアーゼにより不能にされるまでＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は、非複製ベクターでは１ヶ月またはそれ以上、適当な複製配列をベクター系の一部に含めるようにデザインされておれば一層長い期間持続しうる。
【０１５４】
遺伝子発現の修飾は、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域、５'領域、または制御領域（たとえば、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、およびイントロン）に対するアンチセンス分子または相補的核酸配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ）をデザインすることにより得ることができる。転写開始部位からのオリゴヌクレオチド、たとえば開始部位から−１０と＋１０との間の位置からのオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、抑制は「三本鎖らせん」塩基対形成法を用いて達成できる。三本鎖らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合に充分なほど二本鎖らせんが開く能力を抑制するゆえに有用である。三本鎖ＤＮＡを用いた近年の治療の進歩は記載されている（たとえば、J. E. Geeら、1994, In: B. E. HuberおよびB. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co.、マウントキスコ、ニューヨークを参照）。アンチセンス分子または相補的配列はまた、転写物がリボソームに結合するのを妨害することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止すべくデザインすることもできる。
【０１５５】
リボザイム、すなわち酵素的ｍＲＮＡ分子もまたＲＮＡの特異的開裂を触媒するのに用いることができる。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的な標的ＲＮＡへの配列特異的なハイブリダイゼーションと、それに続く内ヌクレオチド鎖分解的開裂を含む。適当な例としては、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列内ヌクレオチド鎖分解的開裂を特異的かつ有効に触媒することのできる遺伝子操作により調製したハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が挙げられる。
【０１５６】
リボザイム開裂部位（以下の配列を含む：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ）について可能性のあるＲＮＡ標的分子をスキャニングすることにより、該標的ＲＮＡ分子内の特異的なリボザイム開裂部位をまず同定する。同定されたら、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを機能できなくさせ得る二次構造の特徴について評価することができる。候補標的の適切さはまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近性（accessibility）を試験することによって評価することができる。
【０１５７】
本発明による相補的リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子の合成のための当該技術分野で公知の方法により調製することができる。そのような方法としては、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法、たとえば固相ホスホルアミダイト化学合成法が挙げられる。別法として、ＲＮＡ分子はヒトＲＥＴ１６をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列をＴ７やＳＰなどの適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する広範なベクター中に導入することができる。あるいは、相補的なＲＥＴ１６ ＲＮＡを構成的かまたは誘導性に合成するｃＤＮＡ構築物を細胞株、細胞、または組織に導入することができる。
【０１５８】
ＲＮＡ分子は、細胞内での安定性および半減期を増大すべく改変することができる。可能な改変としては、これらに限られるものではないが、分子の５'末端および／または３'末端へのフランキング配列の付加、または分子の骨格内での（ホスホジエステル結合の代わりに）ホスホルアミダイトまたは２'Ｏ−メチルの使用が挙げられる。この概念はＰＮＡの生成に元々あるものであり、イノシン、キューオシン、およびワイブトシンなどの非伝統的な塩基、並びにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および内生のエンドヌクレアーゼによって容易に認識されない同様の修飾形を含めることによってこれら分子の全てに拡張することができる。
【０１５９】
細胞または組織中にベクターを導入する多くの方法が利用でき、インビボ、インビトロ、およびイクスビボに使用するのに同等に適している。イクスビボ療法のため、ベクターを患者から採取した幹細胞中に導入し、自家移植のためにクローン的に増殖させて同じ患者に戻すことができる。トランスフェクションによるおよびリポソーム注射による送達は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて行うことができる。
【０１６０】
本発明の他の態様において、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補鎖、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターを、炎症性疾患または障害および／または制御されない細胞増殖、過剰活性または刺激に関連する疾患または障害を治療または予防すべく個体に投与することができる。様々な特殊化したオリゴヌクレオチド送達法、たとえば、ＲＮＡおよびＤＮＡ送達のための単ラメラリポソーム中の包括および再構成センダイウイルスエンベロープを用いることができる（Aradら、1986, Biochem. Biophys. Acta., 859: 88-94）。
【０１６１】
他の態様において、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的配列、またはベクターを、他の適当な治療剤とともに投与することができる。組み合わせ療法に使用する適当な治療剤の選択は、通常の製薬原理に従って当業者により行うことができる。治療剤の併用は、相乗的に作用して上記の様々な障害を治療または予防することができる。このアプローチを用いれば各薬剤を一層低投与量で使用して治療効果を達成することができ、それゆえ副作用の可能性を低減することができる。
【０１６２】
上記の治療法はいずれも、たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を含む、そのような治療を必要とするあらゆる個体に適用することができる。
【０１６３】
スクリーニング法
ＲＥＴ１６タンパク質および核酸は、炎症性障害、たとえば、活性化したおよび／または過剰活性の細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞および好酸球）が関与する障害を治療するための潜在的な使用について、ＲＥＴ１６生物活性を変調する候補の生物活性剤のスクリーニングアッセイに用いることができる。さらに、ＲＥＴ１６タンパク質およびコードする核酸、並びにＲＥＴ１６活性または機能を変調する生物活性剤は、細胞活性化を制御する方法においてエフェクターとして用いることができる。
【０１６４】
ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、相互作用性の分子によって変調することができる。本明細書において「変調」とは、ＲＥＴ１６の生物活性を変えること、すなわちアゴニストによるなどで、増大、強化、または促進するか、またはアンタゴニストによるなどで、低減、抑制、または阻止することを意味する。好ましい態様において、ＲＥＴ１６の生物活性は抑制される。ＲＥＴ１６はＴＮＦ−アルファによって刺激された細胞で発現され、炎症応答に関与する因子であり候補ユビキチンリガーゼであることから、細胞内シグナル伝達において役割を果たし、または炎症プロセスの発生のマスタースイッチの一部として働くことができる。従って、ＲＥＴ１６は、細胞シグナル伝達カスケードにおけるその機能または発現のアンタゴニストまたはインヒビターをスクリーニングするための標的として用いることができる。
【０１６５】
本発明の他の態様において、ＲＥＴ１６タンパク質および核酸は、過剰活性化したＢ細胞および／またはＴ細胞によって引き起こされうる疾患、たとえば自己免疫疾患の治療、並びにサイトカイン、および炎症を促進、加速、または悪化させる因子を産生する細胞、たとえば白血球、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、好酸球、多形核白血球などが関与する炎症性疾患、または種々の体組織における細胞傷害の治療のための潜在的な使用について、ＲＥＴ１６の生物活性を変調する候補生物活性剤を同定および検出するためのスクリーニングアッセイに用いることができる。細胞内シグナル伝達カスケードのマスタースイッチをアップレギュレーション、刺激、またはその他で関与しうる炎症性疾患の制限されない例としては、関節炎（慢性関節リウマチおよび若年性慢性関節炎の両者）；乾癬；喘息；虚血−再潅流；臓器または組織移植の拒絶；慢性閉塞性肺疾患；炎症性胃腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）；亜急性（inacute）呼吸障害症候群；全身性エリテマトーデス、多発性硬化症および嚢胞性線維症が挙げられる。ＲＥＴ１６を変調する生物活性剤を使用できる他の疾患または障害としては、自己免疫疾患、癌、腫瘍および新生物、および様々な組織、とりわけＲＥＴ１６の発現が認められない組織での細胞の制御されない増殖と関連する他の疾患が挙げられる（たとえば、図７Ａ〜図７Ｄを参照）。
【０１６６】
一般にそのようなスクリーニング法を行うに際しては、ＲＥＴ１６ポリペプチドを、隔離した試料受容領域を有する不溶性の支持体（たとえば、マイクロタイタープレート、アレイなど）に非拡散的に結合させる。適当な不溶性支持体の基準は、ポリペプチドを結合できる限りいかなる組成からなっていてもよいこと、可溶性の物質から容易に分離できること、および他の面ではスクリーニング法の全体と適合できることである。そのような支持体の表面は固体または多孔性であってよく、いかなる都合のよいサイズまたは形状であってよい。適当な不溶性支持体の例としては、マイクロタイター、プレート、アレイ、メンブレンおよびビーズが挙げられる。これらは典型的にガラス、プラスチック（たとえば、ポリスチレン）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロースで作る。マイクロタイタープレートおよびアレイは特に都合がよい、なぜなら少量の試薬および試料を用いて多数のアッセイを同時に行うことができるからである。ポリペプチドを結合させる特定の仕方は、本発明の試薬および方法全体と適合でき、ペプチドの活性が保持され、非拡散性である限り、重要ではない。
【０１６７】
好ましい結合法としては、抗体の使用（これは、その結合タンパク質へのＲＥＴ１６の結合を妨害してはならない）、「粘着性」またはイオン性の支持体への直接結合、化学的架橋などが挙げられる。ポリペプチドの結合後、過剰の未結合物質を洗浄により取り除く。ついで、必要なら試料受容領域をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の無害／非反応性のタンパク質とともにインキュベートしてブロッキングすることができる。
【０１６８】
候補生物活性剤をアッセイに加える。新規の結合剤としては、特異的な抗体、化学ライブラリーのスクリーニングで同定した天然に存在しない結合剤、ペプチドアナログなどが挙げられる。特に興味が持たれるのは、ヒトの細胞に対して低い毒性を有する剤のスクリーニングアッセイである。この目的のために広範な様々なアッセイを用いることができ、たとえば、標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合のためのイムノアッセイなどが挙げられる。本明細書で使用する「薬剤」なる語は、ＲＥＴ１６タンパク質の生物活性を直接または間接に変える能力を有するあらゆる分子、たとえばタンパク質、オリゴペプチド、小さな有機分子、多糖、ポリヌクレオチドなどをいう。一般に、複数のアッセイ混合物を種々の濃度の剤で平行して行って、種々の濃度に対する異なる応答を得る。典型的に、これら濃度のうちの１つは負の対照、すなわちゼロの濃度、または検出レベル以下である。
【０１６９】
候補薬剤は、典型的には有機分子、好ましくは分子量が１００を超えて約１０,０００ダルトン未満、好ましくは約２０００〜５０００ダルトン未満（制限されない例として）の小さな有機化合物であるが、多くの化学クラスを包含する。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、とりわけ水素結合に必要な官能基を含み、典型的に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む。候補薬剤はしばしば、環式炭素またはへテロ環式構造および／または芳香族または多芳香族構造（上記官能基の１またはそれ以上で置換）を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、その構造的アナログまたはその組み合わせを含む生体分子にも見出される。
【０１７０】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む様々な採取源から得られる。たとえば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、広範な様々な有機化合物および生体分子のランダムなおよび指令した合成を利用できる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを利用できるかまたは容易に生成できる。さらに、天然または合成により生成したライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変できる。既知の薬理学的剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指令したまたはランダムな化学的修飾に供して構造的なアナログを生成することができる。
【０１７１】
候補生物活性剤のＲＥＴ１６ポリペプチドへの結合の決定は、当該技術分野で実施されている多くの仕方で行うことができる。１つの側面において、候補生物活性剤を標識し、結合を直接決定する。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合は、１またはそれ以上の分子を標識に供し、その際、該標識は直接または間接に検出しうるシグナルを生成することができる。種々の標識には、放射性同位元素、蛍光および化学ルミネセンス化合物、特異的結合分子、粒子、たとえばマグネチック粒子などが含まれる。特異的結合分子としては、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどのペアが挙げられる。特異的結合成員については、相補的な成員を通常、公知の方法に従って検出を可能とする分子で標識する。幾つかの態様では１のみの成員を標識する。あるいは、１を超える成員を異なる標識で標識することができる；たとえば、ＲＥＴ１６ポリペプチドを１の蛍光団で標識し、候補薬剤を他の蛍光団で標識することができる。
【０１７２】
１つの態様において、候補生物活性剤を標識する。標識した候補生物活性剤をＲＥＴ１６ポリペプチドとともに結合を形成するのに充分な時間（もしも存在するなら）インキュベートする。インキュベーションは最適な活性を容易にする温度、典型的に４℃〜４０℃で行うことができる。インキュベーション時間は最適活性のために選択するが、迅速な高処理量スクリーニングを容易にすべく最適化することもできる。典型的に０.１〜１時間で充分である。過剰の試薬は一般に取り除くかまたは洗浄して除く。標識成分の存在または不在を検出して結合を決定し指示する。
【０１７３】
様々な他の試薬をスクリーニングアッセイに含めることができる。そのような試薬としては、これらに限られるものではないが、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、および／または非特異的なまたはバックグラウンドの相互反応を低減することのできる、塩、中性タンパク質、たとえばアルブミン、界面活性剤などが挙げられる。さらに、アッセイの効率を他の仕方で改善する試薬、たとえば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などを用いることができる。さらに、本方法における成分の混合物は、必要な結合を提供するいかなる順で加えることもできる。
【０１７４】
キットが本発明の態様として含まれ、該キットは被験化合物をスクリーニングするのに必要な試薬を入れた容器を含む。試験のデザインおよび化合物の種類に応じて、そのようなキットはヒトＲＥＴ１６ポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアッセイを実施する教示を含んでいてよい。
【０１７５】
分子進化による本発明のＲＥＴ１６タンパク質の生物学的活性／機能的特徴の促進
知られた大抵の生物学的に活性なタンパク質の多くは生体内でのその特別の機能について極めて有効ではあるが、トランスジェニック、治療的、薬理学的、および／または工業的な応用には望ましくないものにする特徴または特性を有する。これら特徴または特性のなかでも短い半減期が最も顕著な問題であり、これはタンパク質レベルでもタンパク質のｍＲＮＡレベルでも存在する。たとえば、半減期を延ばすことができることは、遺伝子療法、トランスジェニック動物の生成、バイオプロセシング、タンパク質の製造および精製でのタンパク質の使用、およびとりわけ化学モデュレーターとしてのタンパク質の使用に際して特に重要である。それゆえ、タンパク質の一般的な工業的および薬理学的応用に加えて動物由来の疾患の治療用の治療剤としての応用を促進する特徴を有する単離タンパク質の新規な変異体を同定することの必要性が存在する。
【０１７６】
それゆえ、本発明の１つの側面に従い、本発明たとえばＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の特定の特徴を指令（directed）分子進化により促進する能力が提供される。そのような促進は、制限されない例として、以下のような利点がある：キットにおける必須成分としての本発明の有用性；本発明の物理的な貢献、たとえばその溶解度、構造、またはコドン最適化；本発明の特定の生物学的活性、たとえば関連酵素活性、タンパク質の酵素動力学、タンパク質のＫｉ、Ｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、Ｋｄ；タンパク質−ＤＮＡ結合活性；アンタゴニスト／抑制活性（直接または間接の相互作用を含む）；アゴニスト活性（直接または間接の相互作用を含む）；タンパク質の抗原性（たとえば、タンパク質の抗原性の可能性を増大または低減するのが望ましい）；タンパク質の免疫原性；タンパク質がそれ自体または他のタンパク質と二量体、三量体、またはマルチマーを形成する能力；および本発明の抗原性としての効力（疾患または疾患状態の予防的処置として、または標的疾患遺伝子に対するエフェクターとしてのその後の使用を含む）。さらに、タンパク質の特定の特徴を促進する能力はまた、特徴付けられた酵素の特徴を最初に特徴付けられた活性とは全く関係のない活性に変えることに応用できる。本発明の他の望ましい促進は個々のタンパク質に特異なものであり、それゆえ当該技術分野でよく知られており、本発明により包含されるであろう。
【０１７７】
たとえば、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、その基質との結合後に構成的に活性なものにすることができる。あるいは、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、基質結合の不在下で構成的に活性なものにすることができる。さらに他の例として、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、ユビキチンリガーゼ酵素活性化に通常必要とされる制御因子および／または条件（たとえば、基質結合、リン酸化、コンホメーションの変化など）の全てよりも少ないもので活性化されうる。そのようなユビキチンリガーゼ酵素は、本明細書に記載した使用のなかでもとりわけ、ユビキチンリガーゼ酵素モデュレーターを同定するためのスクリーニングに有用である。あるいは、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、変化した基質特異性、および／または促進されたユビキチンリガーゼ酵素活性を有していてよい。あるいは、遺伝子操作したユビキチンリガーゼ酵素は、低減したユビキチンリガーゼ酵素活性を有していてよい。
【０１７８】
指令進化は幾つかの工程からなる。第一の工程は、目的とする遺伝子またはタンパク質についての変異体のライブラリーを確立する。ついで、最も重要な工程は同定すべき活性を備えた変異体を選択することである。スクリーニングのデザインは最も重要である、というのはスクリーニングは有用でない変異体を排除するに充分なほど選択的でなければならないが全ての変異体を排除してしまうほど厳格であってはならないからである。ついで、最後の工程は、その前のスクリーニングからの最良の変異体を用いて上記工程を繰返すことである。ついで、各連続サイクルは、たとえばスクリーニングの厳格さを増大させるなど必要に応じて改変することができる。
【０１７９】
ＤＮＡシャフリング反応を行うため、種々の反応条件を用いることができる。しかしながら、たとえばPNASUSA, 91: 10747 (1994)に記載されているように、ＤＮＡシャフリングの特別の反応条件が提供されている。簡単に説明すると、ＤＮＡシャフリング反応に供すべきＤＮＡ基質を調製する。調製は、ＤＮＡを単に混入細胞物質、化学物質、緩衝液、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド、ＲＮＡなどから精製する形態であってよく、ＤＮＡ精製キット、たとえばQiagen, Inc.やPromega, Corp.によって提供されるものなどを使用することができる。
【０１８０】
ＤＮＡ基質が精製されたら、ＤＮアーゼＩ消化に供する。約２〜４μｇのＤＮＡ基質を１００μｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４／１ｍＭ ＭｇＣｌ２中の０.００１５単位／μｌのＤＮアーゼＩ（Sigma）で室温にて１０〜２０分間消化する。ついで、得られた１０〜５０ｂｐのＤＮＡ断片を、低融点アガロースゲル（２％）の電気泳動および／またはＤＥ８１イオン交換紙（Whatman）に供して精製する。あるいは、ＤＮＡ断片の精製は、適当な分子量カットオフのMicroconコンセントレーター（Amicon）を用いて行うことができ、または当該技術分野で知られた他の方法に加えてオリゴヌクレオチド精製カラム（Qiagen）を用いることができる。ＤＥ８１イオン交換紙を用いる場合は、１Ｍ ＮａＣｌを用いて１０〜５０ｂｐ断片を紙から溶離し、ついでエタノール沈殿させる。
【０１８１】
ついで、得られた精製断片を、ＰＣＲ混合物（２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２.２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス・ＨＣＬ、ｐＨ９.０および０.１％Triton X-100を含有）中に１０〜３０ｎｇ／μｌの最終断片濃度にて再懸濁することによってＰＣＲアセンブリー反応に供する。この時点ではプライマーは加えない。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）を１００μｌの反応混合物当たり２.５単位にて用いる。９４℃で６０秒、９４℃で３０秒、５０〜５５℃で３０秒および７２℃で３０秒のＰＣＲプログラムを３０〜４５サイクル、ついで７２℃で５分間をMJ Research（ケンブリッジ、マサチューセッツ）ＰＴＣ−１５０サーモサイクラーを用いて行う。
【０１８２】
アセンブリー反応が完了後、ついでプライマーなしで得られた生成物を０８μｍの各プライマーを含むＰＣＲ混合物（アセンブリー反応に用いたのと同じ緩衝液混合物を使用）に入れ、この混合物を１５サイクルのＰＣＲ（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で３０秒）に供する。好ましいプライマーは、シャフリング反応に用いたポリヌクレオチドの核酸配列に対応するものである。そのようなプライマーは、当該技術分野で知られ本明細書でも言及している方法を用いて修飾した核酸塩基対からなっていてよいし、またはさらなる配列（すなわち、制限部位の付加、特定の塩基対の変異などのため）を含んでいてもよい。かくして得られたシャフリングし、アセンブリーし、増幅した生成物は当該技術分野でよく知られた方法（たとえば、Qiagen ＰＣＲ精製キット）を用いて精製し、ついで引き続き適当な制限酵素を用いてクローニングすることができる。
【０１８３】
今日まで多くのＤＮＡシャフリングの改変法が刊行されているが、そのような改変法は当業者にはよく理解されており、本発明により包含される。ＤＮＡシャフリング法はまた、Zhaoら、1997, Nucl. Acid Res., 25(6): 1307-1308に記載されている方法を用いて所望のレベルの突然変異誘発を得るために改変することもできる。
【０１８４】
上記のように、ランダム化したプールが生成されたら、ついで所望の特性を有する変異体を同定すべく特定のスクリーニングに供することができる。変異体が同定されたら、ついで変異体に対応するＤＮＡをＤＮＡ基質として用いて他のＤＮＡシャフリングを開始することができる。このシャフリング、目的とする最適変異体の選択、および再シャフリングのサイクルを、最終的な変異体が得られるまで繰返すことができる。ＤＮＡシャフリング法を用いて生成した変異体を同定するのに適用するモデルスクリーニングの例は、以下の刊行物に見出すことができる：J. C. Mooreら、1997, J. Mol. Biol., 272: 336-347; F. R. Crossら、1998, Mol. Cell. Biol., 18; 2923-2931；およびA. Crameriら、1997, Nat. Biotech., 15: 436-438。
【０１８５】
ＤＮＡシャフリングには幾つかの利点がある。第一に、ＤＮＡシャフリングは有益な変異を用いる。ＤＮＡシャフリングは、スクリーニングと組み合わせると最良の変異の組み合わせの発見を可能とし、最良の組み合わせが集団中の全ての変異を含んでいることを想定しない。第二に、組換えが点変異と同時に生じる。小断片ＤＮＡプールから完全長遺伝子を合成することをＤＮＡポリメラーゼに強いることの効果は、バックグラウンドの突然変異誘発率という結果となる。厳格な選択法と組み合わせると、酵素活性は野生型の酵素に比べて１６０００倍まで増大させることができた。本質的に、バックグラウンドの突然変異誘発は遺伝子変動性（genetic variability）を生成し、この遺伝子変動性に対して組換えは酵素活性を促進すべく作用する。
【０１８６】
組換えの第三の特徴は、有害な変異を除去するために用いることができることである。上記で検討したように、ランダム化のプロセスの際に各々の有益な変異について少なくとも１またはそれ以上の中立または抑制的な変異が生じうる。そのような変異は、アセンブリー反応中に前の選択から選択した変異体のランダムサイズの断片に加えて過剰の野生型ランダムサイズ断片を加えることによって除去することができる。つぎの選択の際に、ポリヌクレオチド／ポリペプチド／酵素の殆どの活性変異体の幾つかは抑制的変異体を失っているに違いない。
【０１８７】
最後に、組換えは平行したプロセシングを可能にする。このことは極めて有利である、というのはタンパク質を一層望ましいものにする複数の特徴（たとえば、溶解性、活性など）が存在しやすいからである。１を超える望ましい特徴または特性を一度にスクリーニングすることはますます困難であるので、分子進化の他の方法は抑制的となりやすい。しかしながら、組換えを用いれば種々の特性について最良の代表的変異体のランダム化断片を組み合わせ、ついで複数の特性を一度に選択することができる。
【０１８８】
ＤＮＡシャフリングはまた、特定の宿主における免疫原性を低減するために本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに適用することができる。たとえば、ＤＮＡシャフリング法を用いて本発明の特定の変異体を生成し、単離することができる。そのような変異体は、その新規な固有の構造ゆえに宿主において高度に免疫原性であるかもしれないが、所望の特徴の全てを有していることができる。詳細には、所望の特徴はポリペプチドに非天然の構造を有するようにさせ、この構造がもはや「自己の」分子としては認識されず「外来のもの」として認識され、かくして新規な変異体に向けられた宿主の免疫応答を活性化することになる。そのような問題は、たとえば、天然タンパク質の生体異物オーソログの遺伝子配列のコピーを新規な変異体遺伝子の遺伝子配列とともにＤＮＡシャフリングの１またはそれ以上のサイクルに含めることによって克服することができる。オーソログと新規な変異体ＤＮＡとのモル比はしかるべく変えることができる。理想的には、その結果得られる同定したハイブリッド変異体は、生体異物タンパク質を宿主の免疫系から回避させるコード配列の少なくとも幾つかと、所望の特徴を付与する元々の新規な変異体のコード配列とを含んでいる。
【０１８９】
同様に、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの進化にＤＮＡシャフリング法を適用することを包含し、その際、ＤＮＡシャフリングの１またはそれ以上のサイクルは、遺伝子鋳型ＤＮＡに加えて既知のアレル配列をコードするオリゴヌクレオチド、最適化コドン配列、既知の変異体配列、既知のポリヌクレオチド多型配列、既知のオーソログ配列、既知のホモログ配列、付加的な相同配列、付加的な非相同配列、他の種からの配列、およびこれらのあらゆる組み合わせを含む。
【０１９０】
上記方法に加え、ある種の場合にこの観点から適用でき、または望ましい多くの関連する方法がある。これら方法の代表例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３１７００およびＷＯ９８／３２８４５（参照のため本明細書に引用する）に記載されている方法である。さらに、ＰＣＴ出願ＷＯ９８／１３４８５、ＷＯ９８／１３４８７、ＷＯ９８／２７２３０．ＷＯ９８／３１８３７、およびA. Crameriら、1997, Nat. Biotech., 15: 436-438にそれぞれ記載されているように、遺伝子療法、タンパク質工学、変異体を含む全細胞の進化、または本発明のポリヌクレオチドを含む全酵素経路の進化に使用するための理想的な変異体を生成するため、本発明のポリヌクレオチド配列に関連法を適用することもできる。
【０１９１】
「ＤＮＡシャフリング」法を本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに適用するさらなる方法は、その提唱された適用も含めて米国特許第５,６０５,７９３号；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２２６２５；ＰＣＴ出願ＷＯ９７／２００７８；ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３５９６６；およびＰＣＴ出願ＷＯ９８／４２８３２に見出すことができる。ＰＣＴ出願ＷＯ００／０９７２７はとりわけＤＮＡシャフリングを除草剤選択的作物の同定に適用する方法を提供しており、これを本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに適用することができる。さらに、ＰＣＴ出願ＷＯ００／１２６８０は、植物種に検出可能な表現型特性を付与するポリヌクレオチド配列を生成、改変、適合、および最適化する方法および組成物を提供している。上記の各出願は、全ての目的のためその全体を本明細書に引用する。
【０１９２】
医薬組成物
本発明のさらなる態様は、ＲＥＴ１６核酸、コードされたポリペプチド、またはペプチド、ＲＥＴ１６ポリペプチドに対する抗体、またはそのフラグメント、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのミメチック、アゴニスト（たとえば、アクチベーター）、またはアンタゴニスト（たとえば、インヒビター）を含む、生理的に許容しうるおよび薬理学的に許容しうる組成物を包含する。本発明にはまた、上記治療用の使用および効果のために、薬理学的または生理的に許容しうる組成物を薬理学的に許容しうる担体、希釈剤、または賦形剤とともに投与することが包含される。組成物は単独または少なくとも１の他の薬剤、たとえば安定化化合物と組み合わせて投与することができ、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水を含む（これらに限られるものではない）滅菌した生体適合性の薬理学的担体中にて投与することができる。組成物は、単独または他の薬剤、医薬、ホルモン、または生物応答調節剤と組み合わせて患者に投与することができる。
【０１９３】
本発明に使用する医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、くも膜下、脳室内、皮内、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、膣内、または直腸内手段を含む（これらに限られるものではない）多くの経路で投与することができる。
【０１９４】
医薬組成物は、活性成分（すなわち、ＲＥＴ１６核酸、またはポリペプチド、またはその機能性の断片）に加えて適当な薬理学的に許容しうる担体または賦形剤（活性成分を薬理学的に使用できる調製物にプロセシングするのを容易にする補助剤を含む）を含んでいてよい。製剤化および投与の技術に関するさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing Co.、イーストン、ペンシルベニア）の最新版に記載されている。
【０１９５】
経口投与用の医薬組成物は、当該技術分野でよく知られた薬理学的に許容しうる担体を用い、経口投与に適した剤型にて製剤化することができる。そのような担体は、患者が摂取するために錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ、スラリー、懸濁剤などに製剤化することを可能にする。
【０１９６】
経口使用のための医薬製剤は、活性成分を固形賦形剤と組み合わせ、得られた混合物を任意に破砕し、ついで所望なら適当な補助剤を加えた後に顆粒混合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。適当な賦形剤は、炭水化物または炭水化物充填剤、たとえば糖（ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む）；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物からのデンプン；セルロース、たとえばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム；ガム（アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含む）、およびゼラチンやコラーゲンなどのタンパク質である。所望なら、崩壊剤または可溶化剤、たとえば架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸、または生理学的に許容しうるその塩、たとえばアルギン酸ナトリウムを加えることができる。
【０１９７】
糖衣錠コアを生理学的に適したコーティング、たとえば濃縮した糖溶液（アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタンを含んでいてよい）、ラッカー（lacquer）溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物とともに用いることができる。染料または色素を製品の識別のため、または活性成分の量（すなわち、投与量）を特徴付けるために錠剤または糖衣錠のコーティングに加えることができる。
【０１９８】
経口で使用できる医薬製剤としては、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル剤、並びにゼラチンおよびコーティング（グリセリンまたはソルビトールなど）で作られた軟計量カプセル剤が挙げられる。プッシュフィットのカプセル剤は、活性成分を充填剤または結合剤（ラクトースやデンプンなど）、滑沢剤（タルクやステアリン酸マグネシウムなど）、および任意に安定化剤と混合して含んでいてよい。軟カプセル剤では、活性化合物は適当な液体（脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなど）中に安定化剤とともにまたは安定化剤なしで溶解または懸濁する。
【０１９９】
腹腔内投与に適した医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（ハンク液、リンゲル液、または生理緩衝食塩水など）中で製剤化する。水性の注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、たとえばカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランを含んでいてよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当に油状の注射懸濁液として調製できる。適当な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルやトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。任意に、懸濁液はまた、高度に濃縮した溶液の調製を可能とすべく、適当な安定化剤または化合物の安定性を増大する薬剤を含んでいてよい。
【０２００】
局所または鼻内投与のためには、特定のバリヤーを透過性にするのに適した浸透剤または透過剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は当該技術分野で一般に知られている。
【０２０１】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で知られた仕方で、たとえば通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣生成、すりつぶし、乳濁化、カプセル化、包括、または凍結乾燥プロセスにより製造することができる。
【０２０２】
医薬組成物は塩の形態で提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む（これらに限られるものではない）多くの酸を用いて製剤化することができる。酸は、対応の遊離塩基形態と比べて水性溶媒、または他のプロトン性溶媒中で溶解度が高い傾向がある。他の場合において、好ましい製剤は以下のいずれかまたは全てを含む凍結乾燥粉末であってよく：１〜５０ｍＭヒスチジン、０.１％〜２％ショ糖、および２〜７％マンニトール（４.５〜５.５のｐＨ範囲）、使用前に緩衝液と混合する。医薬組成物を調製後、適当な容器に入れ、指示した条件の処置について表示することができる。ＲＥＴ１６生成物の投与のためには、そのような表示としては投与の量、頻度、および方法が挙げられる。
【０２０３】
本発明に使用するのに適した医薬組成物は、意図した目的を達成するのに有効な量で活性成分を含む組成物を包含する。有効な投与量または量の決定は、充分に当業者がなし得る範囲である。いずれの化合物についても、治療学的に有効な量は、たとえば新生物細胞を用いた細胞培養アッセイにて、または動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタ）にて最初に評価することができる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路を決定するのにも用いることができる。ついで、そのような情報を用いてヒトの投与に有用な投与量および投与経路を決定するのに外挿することができる。
【０２０４】
治療学的有効量とは、症状または状態を改善、低減、または除去する、活性成分、たとえばＲＥＴ１６ポリペプチド、または活性なその断片、ＲＥＴ１６ポリペプチドに対する抗体、ＲＥＴ１６ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの量をいう。治療の有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準医薬手順、たとえばＥＤ５０（集団の５０％において治療学的に有効な投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な投与量）により決定することができる。治療効果に対する毒性効果の投与量の比は治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験で得られたデータは、ヒトに使用する投与量の範囲を決定するのに用いる。医薬組成物中に含まれる好ましい投与量は、毒性が殆どまたは全くなしのＥＤ５０を含む循環濃度の範囲である。投与量は、使用した剤型、患者の感受性、および投与経路に応じて上記範囲内で変わるであろう。
【０２０５】
正確な投与量は、個々の必要な治療と関連した因子を考慮した実施者によって決定されるであろう。投与量および投与は、活性成分の充分なレベルを与えるよう、または所望の作用を保持するよう、調節する。考慮に入れる因子としては、個々の疾患状態の重篤さ、患者の一般的健康状態、年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および頻度、薬剤の併用、反応の感受性、および治療に対する耐性／応答が挙げられる。一般的な手引きとして、長期間作用する医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて３〜４日ごと、１週間ごと、または２週間ごとに投与することができる。
【０２０６】
通常の投与量は、投与経路に応じて０.１〜１００,０００μｇから合計約１ｇまでの範囲であってよい。特定の投与量および送達方法に関する手引きは文献に記載されており、一般に当該技術分野の実施者に利用できる。当業者であればヌクレオチドについてはタンパク質またはそのインヒビターとは異なる製剤を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。
【０２０７】
アッセイおよび診断
本発明の他の態様において、ＲＥＴ１６タンパク質に特異的に結合する抗体は、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現（または過剰発現）を特徴とする状態または疾患の診断、ＲＥＴ１６ポリペプチド、またはそのアゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターで処置した患者をモニターするアッセイに用いることができる。診断目的に有用な抗体は、治療法に使用するために上記に記載したのと同じ仕方で調製することができる。ＲＥＴ１６ポリペプチドの診断アッセイとしては、抗体および標識を利用してヒトの体液または細胞もしくは組織の抽出物中のタンパク質を検出する方法が挙げられる。抗体は改変してまたは改変せずに用いることができ、共有結合によるかまたは非共有結合のいずれかによりリポーター分子に結合することにより標識することができる。当該技術分野で知られた広範な様々なリポーター分子を用いることができ、その幾つかは本明細書に記載してある。
【０２０８】
ＲＥＴ１６ポリペプチドを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを含む幾つかのアッセイプロトコールが当該技術分野で知られており、ＲＥＴ１６ポリペプチド発現の変化したまたは異常なレベルを診断するための基礎を提供する。ＲＥＴ１６ポリペプチド発現の正常なまたは標準の値は、正常な哺乳動物主体、好ましくはヒトから採取した体液または細胞抽出物をＲＥＴ１６ポリペプチドに対する抗体と複合体を生成するのに適した条件下で混合することにより確立される。標準的な複合体生成の量は、種々の方法により定量することができる；測光手段が好ましい。患者試料、対照試料、および生検組織からの疾患試料で発現されるＲＥＴ１６ポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と患者の値との間の偏差は疾患を診断するパラメータを確立する。
【０２０９】
本発明の他の態様に従い、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを診断目的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、およびＰＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチドは、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドの発現（または過少もしくは過剰発現）が疾患と相関関係を有する生検組織におけるＲＥＴ１６コード核酸配列の発現を検出および定量するのに用いることができる。診断アッセイは、ＲＥＴ１６の不在、存在、および過剰発現を識別するため、および本発明の治療法の際にＲＥＴ１６ポリヌクレオチドレベルの制御をモニターするのに用いることができる。
【０２１０】
関連する側面において、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することのできるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする核酸配列を同定するのに用いることができる。プローブの特異性、すなわちそれが高度に特異的な領域、たとえば５'調節領域中の約８ないし１０または１２または１５の連続したヌクレオチドからできているのか、またはより特異的でない領域、たとえば特に３'非コード領域からできているのかという点、およびハイブリダイゼーションまたは増幅の厳格さは、プローブがＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする天然の配列、そのアレル、または関連配列のみを同定するか否かを決定するであろう。
【０２１１】
プローブはまた関連配列の検出に用いることもでき、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするヌクレオチドの少なくとも５０％、好ましくは８０％以上を含んでいるのが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列から、またはプロモーター、エンハンサー配列、および天然ＲＥＴ１６タンパク質のイントロンを含むゲノム配列からのものであってよい。
【０２１２】
ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするＤＮＡの特定のハイブリダイゼーションプローブを製造する方法は、ＲＥＴ１６ポリペプチド、またはＲＥＴ１６誘導体をコードする核酸配列のｍＲＮＡプローブ産生用ベクターへのクローニングを含む。そのようなベクターは当該技術分野で知られており、市販されており、適当なＲＮＡポリメラーゼおよび適当な標識ヌクレオチドを加えることによりインビトロでＲＮＡプローブを合成するのに用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のデテクター／リポーター基、たとえば３２Ｐや３５Ｓなどの放射性核種、またはアビジン／ビオチン結合系によりプローブに結合したアルカリホスファターゼなどの酵素標識により標識することができる。
【０２１３】
ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、患者生検からの流体または組織を用い、サザーンまたはノーザン分析、ドットブロット、または他のメンブレンベースの方法；ＰＣＲ法；またはディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡまたはチップアッセイに用いてＲＥＴ１６の状態、たとえばＲＥＴ１６のレベルまたは過剰発現を検出し、または変化したＲＥＴ１６発現を検出することができる。そのような定性的または定量的方法は当該技術分野でよく知られている。
【０２１４】
特別の側面において、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、種々の炎症性疾患、新生物または癌、とりわけ上記に記載したものの活性化または誘発を検出するアッセイに有用である。ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は標準法により標識することができ、ハイブリダイゼーション複合体を生成するのに適した条件下で患者からの流体または組織試料に加えることができる。適当なインキュベーション時間の後、試料を洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。生検試料または抽出試料におけるシグナルの量が比較対照試料からのものに比べて有意に変わっておれば、該ヌクレオチド配列は試料中に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズしたのであり、試料中のＲＥＴ１６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在または変化したレベルは関連する疾患の存在を示している。そのようなアッセイはまた、動物実験、臨床試験、または個々の患者の処置のモニタリングにおける特定の治療処置計画の有効性を評価するのに用いることもできる。
【０２１５】
ＲＥＴ１６の発現と関連する疾患の診断の基礎を与えるため、正常なまたは標準の発現プロフィルを確立する。このことは、正常な主体（動物かまたはヒト）から採取した体液または細胞抽出物を、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする配列またはその断片とハイブリダイゼーションまたは増幅に適した条件下で混合することにより達成することができる。標準ハイブリダイゼーションの定量は、正常な主体から得た値を既知の実質的に精製したポリヌクレオチドを使用した実験で得られた値と比較することにより行うことができる。正常な主体から得た標準値を、疾患の症状を有する患者からの試料から得た値と比較することができる。標準値と主体（患者）の値との偏差を用いて疾患の存在を確立する。
【０２１６】
疾患が確立され、治療プロトコールが開始されたら、ハイブリダイゼーションアッセイを規則的に繰返して患者における発現レベルが正常個体で観察される発現レベルに近づいているか否かを評価することができる。連続したアッセイで得た結果は、数日から数ヶ月にわたる期間での治療の有効性を示すのに用いることができる。
【０２１７】
癌に関しては、個体からの生検組織中の異常な量の転写物の存在は、疾患の発症の素因を示すことがあり、急性の臨床徴候の出現前に疾患を検出する手段を提供することができる。このタイプの一層明確な診断は、健康の専門家が予防的手段またはより早期の攻撃的処置を採用することを可能とし、それによって癌の発生またはさらなる進行を防ぐことができる。
【０２１８】
ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする核酸配列からデザインしたオリゴヌクレオチドの他の診断的用途は、ＰＣＲの使用を含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、化学的に合成し、酵素を用いて生成し、または組換え源から生成することができる。オリゴマーは好ましくは２つのヌクレオチド配列を含み、１つはセンス方向（５'から３'方向）のものであり、他はアンチセンス方向（３'から５'方向）のものであって、特定の遺伝子または状態の同定に最適な条件下で用いる。同じ２つのオリゴマー、オリゴマーのネステッドセット、またはオリゴマーの縮重プールでさえも、密接に関連したＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出および／または定量のためにより厳格でない条件下で用いることができる。
【０２１９】
ＲＥＴ１６の発現を定量するのに適した方法としては、ヌクレオチドの放射性標識またはビオチン化、対照核酸の同時増幅、および実験結果を外挿する標準曲線が挙げられる（P. C. Melbyら、1993, J. Immunol. Methods, 159: 235-244；およびC. Duplaaら、1993, Anal. Biochem., 229-236）。複数の試料の定量スピードは、目的オリゴマーを種々の希釈で提示し、分光測光応答または比色応答が迅速な定量を与えるＥＬＩＳＡ形態のアッセイを行うことにより加速することができる。
【０２２０】
本発明の他の態様において、本明細書に記載するＲＥＴ１６ポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチド、またはより長い断片は、マイクロアレイにおいて標的として用いることができる。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターしたり（転写像を生成する）、遺伝子変異体、変異および多型を同定するのに用いることができる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾患の遺伝子ベースでの理解、疾患の診断、および治療剤の開発およびその活性のモニターに用いることができる。特別の態様において、マイクロアレイは、ＷＯ９５／１１９９５（Cheeら）；D. J. Lockhartら、1996, Nature Biotechnology, 14: 1675-1680；およびM. Schenaら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 10614-10619に記載された方法に従って調製および使用することができる。マイクロアレイはさらにP. Lalらの米国特許第６,０１５,７０２号に記載されている。
【０２２１】
本発明のさらなる態様において、ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードすっる核酸配列はまた、天然のゲノム配列のマッピングに有用なハイブリダイゼーションプローブを生成するのに用いることもできる。配列は、C. M. Price, 1993, Blood Rev., 7: 127-134およびB. J. Trask, 1991, Trends Genet., 7: 149-154に概説されているように、特定の染色体、染色体の特定の領域、または人工染色体構築物（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌ＰＩ構築物、または単一染色体ｃＤＮＡライブラリーにマッピングすることができる。
【０２２２】
本発明の他の態様において、ＲＥＴ１６ポリペプチド、その触媒的または免疫原性の断片またはオリゴペプチドは、様々な医薬スクリーニング法のいずれにおいても化合物のライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。そのようなスクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離の状態、固相支持体に付着、細胞表面上に生成、または細胞内に位置していてよい。ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその部分と試験した薬剤との結合複合体の生成は、当該技術分野で通常実施され上記に記載した方法を用いて測定することができる。
【０２２３】
使用できる医薬スクリーニングの他の方法は、ＷＯ８４／０３５６４に記載されているように、目的タンパク質に対する適した結合親和性を有する化合物の高処理量スクリーニングを提供する。この方法では、ＲＥＴ１６タンパク質に適用する場合、多数の異なる小さな被験化合物を固相基体、たとえばプラスチックピンまたは他の表面上に合成する。被験化合物をＲＥＴ１６ポリペプチドまたはその断片と反応させ、洗浄する。ついで、結合したＲＥＴ１６ポリペプチドを当該技術分野で知られた方法により検出する。上記医薬スクリーニング法に使用するため、精製したＲＥＴ１６ポリペプチドをプレート上に直接コーティングすることもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、固相支持体上に固定化することができる。
【０２２４】
所定のタンパク質、すなわちＲＥＴ１６タンパク質に結合することのできる小さな分子の検出または同定を含む他のスクリーニングおよび小分子（たとえば、医薬）検出アッセイが本発明により包含される。特に好ましいのは、高処理量スクリーニング法に適したアッセイである。そのような結合ベースのスクリーニングまたは検出アッセイでは、機能的なアッセイは一般に必要ではない。必要なのは、標的タンパク質、好ましくは実質的に精製したもの、および該タンパク質標的への結合についてスクリーニングまたはアッセイすべき化合物（たとえば、リガンド、医薬、小分子）のライブラリーまたはパネルだけである。好ましくは、標的タンパク質に結合する大抵の小分子は、該タンパク質の機能性の領域または部位に優先的にかつ一層高い親和性にて結合するため、何らかの仕方で活性を変調させるであろう。
【０２２５】
そのようなアッセイの例は、Pantolianoらの米国特許第６,０２０,１４１号および同第６,０３６,９２０号に記載されている（J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20(8)をも参照）蛍光ベース熱シフトアッセイ（3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.、３ＤＰ、エクソン、ペンシルベニア）である。このアッセイは、タンパク質−医薬またはリガンド複合体の熱変性曲線を分析することにより、発現され好ましくは精製したＲＥＴ１６ポリペプチドに結合する小分子（たとえば、医薬、リガンド）の検出を結合決定基の親和性に基づいて可能にする。この方法で決定した医薬または結合分子は、所望なら本明細書に記載した方法などの方法によりさらにアッセイして、該分子が標的タンパク質の機能または活性に影響を及ぼすあるいは変調するか否かを決定することができる。
【０２２６】
本発明のさらなる態様において、競合医薬スクリーニングアッセイを用いることができ、この場合、ＲＥＴ１６ポリペプチドに結合することのできる中和抗体がＲＥＴ１６ポリペプチドへの結合に対して被験化合物と特異的に競合する。この方法では、これら抗体を用い、ＲＥＴ１６ポリペプチドと１またはそれ以上の抗原決定基が共通するペプチドの存在を検出することができる。
【０２２７】
トランスジェニックおよびノックアウト
本発明はさらに、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むヒトＲＥＴ１６をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスを包含する。
【０２２８】
組換えタンパク質を産生するのに有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、それに必要な発現ベクターおよびトランスジェニック動物を生成する技術と同様、熟練した実施者によく知られている。一般に、トランスジェニック動物は組換え発現ベクターを含んでいるが、該組換え発現ベクターでは、ヒトＲＥＴ１６をコードする核酸配列が組織特異的なプロモーターに作動可能に連結して含まれており、それによってコード配列が該特異的組織でのみ発現される。たとえば、組織特異的なプロモーターは哺乳動物細胞特異的なプロモーターであってよく、かくして発現された組換えタンパク質は動物の乳から回収する。
【０２２９】
ヒトＲＥＴ１６をコードする核酸分子を含むトランスジェニック動物、とりわけトランスジェニックマウスは、ＲＥＴ１６の過剰発現をインビボで調べる動物モデルとして、並びに医薬評価、およびＲＥＴ１６の活性を抑制または変調するのに有効な化合物、たとえば炎症性障害、疾患、または状態を治療するための化合物を探索する活動に使用することができる。当業者であれば、標準技術、たとえばWagnerの米国特許第４,８７３,１９１号（１９８９年１０月１０日発行）およびLederの米国特許第４,７３６,８６６号（１９８８年４月１２日発行）に教示されているものを用い、ヒトＲＥＴ１６を生成するトランスジェニック動物を産生し、該動物を医薬評価や新規発見プロジェクトに用いることができる。
【０２３０】
本発明の他の側面は、ノックアウトマウスおよびその使用方法に関する。とりわけ、よく知られた方法を用いて動物に導入した変異した非機能性のＲＥＴ１６遺伝子についてホモ接合性であるトランスジェニックマウスを生成することができる。ノックアウトマウスは機能性のＲＥＴ１６を産生しないため、ＲＥＴ１６の機能を調べるのに有用である。さらに、ノックアウトマウスは、ＲＥＴ１６を欠く動物における被験化合物の効果を調べるアッセイに用いることができる。たとえば、ＲＥＴ１６を欠くマウスは、ＲＥＴ１６インヒビターが動物に作用を及ぼすか否か、どのようにして、またどの程度作用を及ぼすかを決定するのに用いることができ、それゆえ該分子の活性を抑制することに関連する懸念に対処することができる。
【０２３１】
遺伝的に欠失した「ノックアウト」マウスを生成する方法はよく知られており、M. R. Capecchi, 1989, Science, 244: 1288-1292およびP. Liら、1995, Cell, 80: 401-411に開示されている。たとえば、マウス（またはヒト）ＲＥＴ１６ ｃＤＮＡクローンを用いてマウスＲＥＴ１６ゲノムクローンを単離することができる。ゲノムクローンを用い、マウス中のＲＥＴ１６遺伝子を相同組換えにより破壊することのできるＲＥＴ１６ターゲティング構築物を調製できる。ターゲティング構築物はＲＥＴ１６遺伝子の非機能性の部分を含んでおり、これが天然のマウス遺伝子の機能性の部分の代わりにを挿入される。非機能性の挿入は、一般に、ＲＥＴ１６の活性領域をコードするエクソン中の挿入を含む。ターゲティング構築物は、正および負の両選択のためのマーカーを含んでいてよい。正の選択マーカーは該マーカーを含んでいない細胞の選択的排除を可能とし、一方、負の選択マーカーは該マーカーを含む細胞の排除を可能とする。
【０２３２】
たとえば、第一の選択マーカーは正のマーカーであって、該マーカーを含む細胞の生存を可能にするであろう。ある場合には、第一の選択マーカーはネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子であり、これをＲＥＴ１６遺伝子のコード配列中において該遺伝子を非機能性にする一方、同時に構築物を選択的にすることができる。抗生物質遺伝子は、天然配列と組み換えることのできる相同領域内にある。それゆえ、相同組換えの後、非機能性の遺伝子配列および抗生物質耐性遺伝子配列が取り込まれるであろう。ノックアウトマウスは、炎症関連障害を調べたりこれら障害を治療する化合物をスクリーニングするためのモデルとして用いることができる。
【０２３３】
ターゲティング構築物はまた、負の選択マーカーである第二の選択マーカーをも含んでいる。負の選択マーカーを有する細胞は排除されるであろう。第二の選択マーカーは、組換え領域の外側にある。それゆえ、全構築物が細胞内に存在しておれば両マーカーが存在するであろう。もしも構築物が天然の配列と組換えを起こせば、第一の選択マーカーはゲノム中に取り込まれ、第二のマーカーは失われるであろう。単純ヘルペスウイルスチミンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ）遺伝子は負の選択マーカーの例であり、これを第二のマーカーとして用いてこれを含む細胞を排除することができる。ＨＳＶ ｔｋ遺伝子を有する細胞はガンシクロビアの存在下で選択的に殺される。
【０２３４】
細胞をターゲティング構築物でトランスフェクションし、ついで第一の選択マーカーの存在および第二の選択マーカーの不在について選択する。ついで、構築物／ＤＮＡを胚盤胞段階に注射し、偽妊娠のメスに移植する。組換え遺伝子をその生殖細胞に移すことのできるキメラ子孫を選択し、交配し、その子孫を組換え遺伝子のへテロ接合性キャリヤについて調べる。ついで、へテロ接合性の子孫の交配を用いてＲＥＴ１６欠失ノックアウトマウスを構成する完全にホモ接合性の子孫を生成することができる。
【０２３５】
本発明の他の態様は、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド、その断片、またはそれに対する抗体の使用方法を包含する。さらに詳細には、そのような方法は、試料中のポリヌクレオチド配列に特異的に結合する分子または化合物を精製するために該ポリヌクレオチドを使用する方法を含む。そのような方法は、本発明のＲＥＴ１６ポリヌクレオチドを特異的結合を可能とする条件下で混合し；ＲＥＴ１６ポリヌクレオチドと試料中の分子または化合物との特異的結合を検出し；結合したポリヌクレオチドを回収し；ついで該ポリヌクレオチドを該分子または該化合物から分離し、それによって精製した分子または化合物を得ることを含む。
【０２３６】
本発明による他の方法は、細胞シグナル伝達タンパク質、たとえばＲＥＴ１６の活性を変調することのできる候補化合物をスクリーニングことに関し、被験化合物、たとえばアンタゴニストまたはアゴニストをＲＥＴ１６タンパク質、またはその機能性の断片を発現する細胞または組織と接触させ、ついで細胞シグナル伝達カスケードに関与するＲＥＴ１６タンパク質の活性を変調する被験化合物を候補変調化合物として選択することを含む。そのような方法において、ＲＥＴ１６細胞シグナル伝達カスケードタンパク質活性は、第二の細胞内細胞シグナル伝達タンパク質の相互作用ドメインへの結合であってよい。
【０２３７】
本発明によって包含される他の方法は、ＲＥＴ１６細胞シグナル伝達タンパク質またはその断片に結合することのできる候補化合物のスクリーニングに関し、被験化合物を、（i）本発明によるＲＥＴ１６細胞シグナル伝達タンパク質を発現する細胞または組織、または（ii）その単離タンパク質と接触させ、ついでＲＥＴ１６細胞シグナル伝達タンパク質に結合する被験化合物を選択することを含む。
【０２３８】
本発明の他の方法は、ＲＥＴ１６タンパク質と第二の細胞シグナル伝達タンパク質との結合を促進、増大、または加速させる化合物を同定するための化合物のスクリーニング法である。そのような方法は、被験化合物の存在下または不在下、本発明によるＲＥＴ１６タンパク質を該タンパク質と結合または会合する第二のシグナル伝達分子と、結合を可能とする条件下で接触させ、ついで被験化合物の存在下での結合レベルを被験化合物の不在下での結合レベルと比較することにより、第二の細胞シグナル伝達分子へのＲＥＴ１６タンパク質の結合レベルが促進、増大または加速されたか否かを決定することを含む。上記方法は高処理量スクリーニングにより行うのに適していることが評価されるであろう。
【０２３９】
実施例
以下の実施例は本発明を説明するために提供されるのであって、本発明を限定することを意図するものではない。これら実施例は、使用した従来法、たとえばベクターの構築、ｃＤＮＡのそのようなベクター中への導入、または得られたベクターの適当な宿主への導入などの詳細な記載は含んでいない。そのような方法は当業者によく知られており、多くの刊行物、たとえばSambrook, FritschおよびManiatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、米国に記載されている。
【０２４０】
実施例１
方法
Ａ．ヒトＲＥＴ１６完全長ＯＲＦコード配列の単離
ＲＥＴ１６の予測されるコード配列を含むクローンを、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）で６時間処理したヒト微細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）から逆転写／複製連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）を用いて単離した。以下の条件を用い、３つのプライマーセット（各４００ｎＭの最終濃度）を用いて１５３２ｂｐ配列を増幅した：
ＪＮＦ３４６（５'−ＴＣＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＡＣＣＣ−３'）（配列番号１７）；
ＪＮＦ４９３（５'−ＴＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３'）（配列番号１８）；
ＪＮＦ４９４（５'−ＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣ−３'）（配列番号１９）、
２５０μｌの反応液中の２００μＭ ｄＮＴＰ、１×アドバンテージ２ポリメラーゼＰＣＲ緩衝液、１×アドバンテージ２ポリメラーゼ、および２.０μｌ ＤＮＡ。９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、および７２℃で２分の実験サイクルを３５サイクル行った。反応完了後、６.０μｌの負荷染料を加え、臭化エチジウムを含む１.２％アガロースゲルでのゲル電気泳動により全反応を分離した。〜１.６ｋｂのサイズのバンドをゲルから切り出し、QIAgenゲル抽出キット（QIAgen、バレンシア、カリフォルニア）を用いて精製した。この断片をｐＴＡｄｖクローニングベクター（Clontech、パロアルト、カリフォルニア）にライゲートし、標準法を用いてシークエンシングした。ＲＥＴ１６ｐＴＡｄｖ Ｅｎｄｏ ０１は、予測されたＲＥＴ１６コード配列に対応する１５３２ｂｐ配列を含んでいる。
【０２４１】
ＲＥＴ１６ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＴＮＦ−アルファ刺激したヒト肺微細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）からのサブトラクションライブラリーからまず同定した。このサブトラクションクローン配列は、６３０ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列（配列番号５；図４Ｃに示す）をコードしていた。コンセンサス配列（配列番号１；図１および図３）は、以下の重複および／または拡張核酸配列から得た：Incyteクローン２５５２５２３（ＬＵＮＧＴＵＴ０６）、４６３２８２８（ＧＢＬＡＤＩＴ０２）、１６８７７０４（ＰＲＯＳＴＵＴ１０）、２６７４７４２（ＫＩＤＮＮＯＴ１９）、およびパブリックＥＳＴクローンＡＩ１８７８７５（testis）。
【０２４２】
Ｂ．マウスＲＥＴ１６遺伝子オーソログの同定
ヒトＲＥＴ１６遺伝子のマウスオーソログを同定するため、ｈｕＲＥＴ１６のコード配列を用いて上記マウスＥＳＴデータベースに対して探索した。幾つかのマウスＥＳＴが同定された。それらは以下のとおりである：ＡＵ０３５６９３、ＡＡ１１８７１８、ＡＡ２０４６０８、Ｗ４１０５６、ＡＷ１４６０１８、ＡＩ４５０４９５、ＡＩ８７５４４３、ＡＩ３１６５４４、ＡＷ４９４７９６、ＡＷ１４６０１８およびＢＥ９８３８９０。ｍｕＲＥＴ１６核酸配列は、ｈｕＲＥＴ１６と８０％の同一性を有している。ｍｕＲＥＴ１６アミノ酸配列は、ｈｕＲＥＴ１６と８２.５％同一である（８６.５％の類似性）。ｍｕＲＥＴ１６は７つの予測されたＷＤリピートおよび１つのＳＡＭドメインを有しており、全てスコアは＞１０であった。
【０２４３】
Ｃ．ヒトＲＥＴ１６遺伝子のゲノム構成
ＲＥＴ１６遺伝子配列を含むゲノムクローンを同定した。クローンｈＲＰＫ.３５ Ａ １（ジーンバンクＡＮ ＡＣ００６５０１）を用いてＲＥＴ１６のエクソン−イントロン境界を解読した（図１８）。ＲＥＴ１６は１１のエクソン断片からなっている。エクソン１はヌクレオチド１〜１２３からなる。エクソン２はヌクレオチド１２４〜５４５からなる。エクソン３はヌクレオチド５４６〜７３０からなる。エクソン４はヌクレオチド７３１〜８２３からなる。エクソン５はヌクレオチド８２４〜９１７からなる。エクソン６はヌクレオチド９１８〜９５１からなる。エクソン７はヌクレオチド９５２〜９９２からなる。エクソン８はヌクレオチド９９３〜１０９９からなる。エクソン９はヌクレオチド１１００〜１２７９からなる。エクソン１０はヌクレオチド１２８０〜１４２０からなる。エクソン１１はヌクレオチド１４２１〜１８１０からなる。エクソン１１の次にはポリＡテールが続く。ポリアデニル化部位（ＡＡＴＡＡ）は１７９５〜１７９９に位置する。ＡＣ００６５０１によれば、イントロン１〜イントロン１０は、それぞれ長さが３４８９、２７５５、４１２３、３７５０、１１８５９、１８２４、８０、１３８２、７６８３、および１２１８１ヌクレオチドである。
【０２４４】
Ｄ．細胞培養のためのＨＭＶＥＣ
単一のドナーからのヒト肺微細血管内皮細胞の一次培養を、Clontech（サンジエゴ、カリフォルニア）から得た。提供されたプロトコールに従い、細胞を内皮細胞増殖対置−キット（ＣＣ−３２０２）中、５％ウシ血清アルブミン（Hyclone、ローガン、ユタ）とともに増殖させた。細胞をトリプシン処理により継代した。細胞をまずＴ−２５組織培養フラスコに接種し、約９０％のコンフルエンシーに達した後、ついでＴ−２２５組織培養フラスコに１.２×１０６細胞／フラスコにて継代した。細胞が約９０％のコンフルエンシーに達するまで増殖したら、Ｔ−２２５フラスコに１.８×１０６細胞／ｍｌにて継代し、接種した。正常な増殖条件のため、培地を４８時間ごとに交換した。
【０２４５】
Ｅ．ＲＮＡ単離のためのＨＭＶＥＣ細胞処理
ＨＭＶＥＣ細胞のサブコンフルエントな（すなわち、９０％コンフルエント）Ｔ−２２５フラスコを、培地を除いてフラスコ当たり４０ｍｌの培地に調節した。フラスコの幾つかを１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファで１時間、６時間および２４時間処理し；他のフラスコは対照としてＴＮＦ−アルファで処理しなかった。ＴＮＦ−アルファ処理した細胞を未処理の細胞と比較した。ＴＮＦ−アルファを添加する時点では培地を交換しなかった。
【０２４６】
Ｆ．ＲＮＡの単離
ＨＭＶＥＣ細胞の処理フラスコをトリプシンで簡単に処理した（フラスコ当たり１０ｍｌのトリプシン）。ウシ血清アルブミンを５０％の最終濃度で添加することによりトリプシン処理を終了させ、フラスコをＰＢＳ、ｐＨ７.４（Gibco、グランドアイランド、ニューヨーク）で濯いだ。フラスコからのプールした細胞およびＰＢＳ濯ぎ液をプールし、１０分間遠心分離し（５３４×ｇ）、細胞ペレットをＰＢＳに再浮遊し、再度遠心分離にかけた。上澄み液を除去し、細胞ペレットをＲＮＡ単離に用いた。ポリＡ＋ＲＮＡをFast Track 2.0ＴＭ（Invitrogen、カールスバード、カリフォルニア）を用いて直接単離した。
【０２４７】
Ｇ．サブトラクションライブラリーの構築
ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブトラクションキットＴＭ（Clontech、パロアルト、カリフォルニア）を用い、製造業社のプロトコールに従って未処理のＨＭＶＥＣポリＡ＋ＲＮＡ（テスター）および１時間ＴＮＦ処理したＨＭＶＥＣポリＡ＋ＲＮＡ（ドライバー）からサブトラクションライブラリーを生成した。１０の二次ＰＣＲ反応を組み合わせ、２％アガロースゲル上で泳動した。約０.３ｋｂ〜１０ｋｂの範囲の断片をQIAgenゲル抽出キット（QIAgen、バレンシア、カリフォルニア）を用いてゲル精製し、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２.１（Invitrogen）に挿入した。ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント大腸菌（Invitrogen）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを入れたＬＢプレート上にプレーティングした。クローンを単離し、同様の濃度のアンピシリンを含むＬＢブロスで増殖させた。プラスミドを標準法に従ってシークエンシングした。
【０２４８】
Ｈ．多組織ノーザンプロトコール
多組織ノーザンブロット（ＭＴＮ）をClontech（パロアルト、カリフォルニア）から入手した。使用したＭＴＮは、ヒトＭＴＮ（＃７７６０−１）、ヒトＭＴＮII（＃７７５９−１）、ヒトＭＴＮIII（＃７７６７−１）、およびヒト癌細胞株ＭＴＮ（＃７７５７−１）であった、
【０２４９】
メンブレンをExpressHybハイブリダイゼーション溶液（Clontech）で６８℃にて１時間プレハイブリダイズし、ついで以下のように調製した３２Ｐ標識プローブと２時間ハイブリダイズした：元々の単離ＲＥＴ１６サブトラクションクローンをＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（Life Technologies、ゲイサーズバーグ、メリーランド）で消化した。５４０ｂｐの部分ｃＤＮＡ断片を、ランダムプライムド標識キット（Roche Biochemicals、インディアナポリス、インディアナ）を用い、製造業社の教示に従って３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。放射性プローブを、２×１０６カウント／分／ｍｌ（ハイブリダイゼーション溶液）の比活性にて加えた。
【０２５０】
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを低ストリンジェンシー溶液（２×ＳＳＣ／０.０５％ＳＤＳ）とともに室温で３０分間連続振盪し、溶液を２回交換することによって洗浄した。ついで、メンブレンを高ストリンジェンシー溶液（０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ）で室温にて３０分間洗浄した（溶液を１回交換）。メンブレンを強化スクリーンとともにＸ線フィルムに−７０℃にて１０日間暴露した（図７Ａ〜７Ｄ）。
【０２５１】
実施例２
ｈｕＲＥＴ１６の別のスプライス変異体
ＲＥＴ１６（本明細書ではＲＥＴ１６.１ともいう）の２つの別のスプライス形、すなわちＲＥＴ１６.２およびＲＥＴ１６.３を同定した。ＲＥＴ１６.２はＰＣＲ増幅を用いてＴＮＦ−α処理したヒト微細血管内皮細胞から単離した。簡単に説明すると、ＲＥＴ１６の完全長のコード配列のクローニングを試みるなかで、１５００ｂｐのＲＥＴ１６アンプリマーに加えてより小さなサイズの第二のバンドを増幅した。この第二のアンプリマーは、１３００ｂｐよりもわずかに小さく移動した。両断片をｐＴＡｄｖ ＴＡクローニングベクターにクローニングし、シークエンシングした。ＲＥＴ１６からのエクソン断片を第二のアンプリマー配列（ＲＥＴ１６.２という；ＲＥＴ１６のスプライス変異体）とアラインメントした。ＲＥＴ１６.２では４つのエクソンが欠失していることがわかった。これらエクソンはエクソン５〜８であり、ＷＤリピート＃６および＃７に対応する。ＲＥＴ１６.２のｃＤＮＡクローンは、ブダペスト条約の規定に従い、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ−３１６１にて２００１年３月７日に寄託してある。従って、本発明はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１を含むＲＥＴ１６.２ ｃＤＮＡ核酸配列を提供する。
【０２５２】
第二のＲＥＴ１６スプライス変異体（ＲＥＴ１６.３）を、Incyteクローン同定ナンバー３１１１１２７（Incyte Genomics、パロアルト、カリフォルニア）で同定した。クローン３１１１１２７をシークエンシングしたところ余分のエクソン断片（９Ｘ）を含むことがわかった。このエクソンはエクソン９とエクソン１０との間に挿入されている。このエクソンのアミノ酸配列は極めて疎水性である。ＲＥＴ１６.３変異体のアミノ酸配列をＳＥＱ−ＷＥＢで分析したところ、膜貫通ドメインの存在が示された。この余分のエクソンはまたＳＡＭドメインを破壊する。ＲＥＴ１６.３スプライス変異体のｃＤＮＡクローンは、ブダペスト条約の規定に従い、ＡＴＣＣに受託番号ＰＴＡ−３１６１にて２００１年３月７日に寄託してある。また、本発明はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１６１を含むＲＥＴ１６.３ ｃＤＮＡ核酸配列を提供する。
【０２５３】
Ａ．ＲＥＴ１６.２核酸配列の同定（図１９Ａおよび１９Ｂ）
ヒトＲＥＴ１６（ＲＥＴ２１.１）について記載したように、ＲＥＴ１６の予測されるコード配列を含むクローンを、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）で６時間処理したヒト微細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）から逆転写／複製連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）を用いて単離した。以下の条件を用い、３つのプライマーセット（各４００ｎＭの最終濃度）を用いて１５３２ｂｐ配列を増幅した：
ＪＮＦ３４６（５'−ＴＣＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＡＣＣＣ−３'）（配列番号１７）；
ＪＮＦ４９３（５'−ＴＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣ−３'）（配列番号１８）；
ＪＮＦ４９４（５'−ＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣ−３'）（配列番号１９）、
２５０μｌの反応液中の２００μＭ ｄＮＴＰ、１×アドバンテージ２ポリメラーゼＰＣＲ緩衝液、１×アドバンテージ２ポリメラーゼ、および２.０μｌ ＤＮＡ。９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、および７２℃で２分の実験サイクルを３５サイクル行った。反応完了後、６.０μｌの負荷染料を加え、臭化エチジウムを含む１.２％アガロースゲルでのゲル電気泳動により全反応を分離した。１.６ｋｂのＲＥＴ１６.１転写物に加え、１.３ｋｂのＲＥＴ１６.２転写物をゲルから切り出し、QIAgenゲル抽出キット（QIAgen、バレンシア、カリフォルニア）を用いて精製した。この断片をｐＴＡｄｖクローニングベクター（Clontech、パロアルト、カリフォルニア）にライゲートし、標準法を用いてシークエンシングした。変異体ＲＥＴ１６.２（ＲＥＴ１６ｐＴＡｄｖ Ｅｎｄｏ ０３）（配列番号１２）は、予測されたＲＥＴ１６コード配列に対応する１２７２ｂｐ配列を含んでいることがわかったが、エクソン−イントロン構造の分析はエクソン５〜８の欠失を明らかにした。ＲＥＴ１６.２の導き出したアミノ酸配列は配列番号１３に示してある。
【０２５４】
Ｂ．ＲＥＴ１６.３核酸配列の同定（図２０Ａおよび２０Ｂ）
５'ＥＳＴをIncyte ＥＳＴデータベースから同定し、Incyte Genomics（パロアルト、カリフォルニア）から購入した。このクローンを製造業社のプロトコールに従って調製し、シークエンシングした。クローンＩＤ３１１１１２７内に含まれる配列はＲＥＴ１６（ＲＥＴ１６.１ともいう）に対応することがわかったが、エクソン９とエクソン１０との間にさらなる断片が存在していた。このエクソンは７８ヌクレオチド長であり、配列の読取り枠を変更せず、付加的な２３アミノ酸残基をタンパク質配列に付加する。この配列は極めて疎水性である。このIncyte ３１１１１２７挿入は長さが１９０８ｂｐである。この変異体は本明細書ではＲＥＴ１６.３と称し、その導かれたアミノ酸配列は配列番号１５に示してある。
【０２５５】
実施例３
ＲＴ−ＰＣＲによるヒトＲＥＴ１６組織発現分析
ＲＥＴ１６の組織発現を分析するため、多組織ｃＤＮＡパネルをClontech Laboratories（パロアルト、カリフォルニア）から購入し、複製連鎖反応に用いた。簡単に説明すると、各組織からの１.０μｌのｃＤＮＡを以下の試薬を含む２４μｌの反応混合物に加えた：０.４μＭの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、１×アドバンテージポリメラーゼ緩衝液（Clontech）、および１×アドバンテージポリメラーゼ（Clontech）。プライマー配列は、ＪＮＦ２３２（５'−ＧＧＣＡＧＡＴＧＣＴＡＧＴＣＴＣＡＧＧＧ−３'）（配列番号２０）およびＪＮＦ２３３（５'−ＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＴＧ−３'）（配列番号２１）であった。ＰＣＲ反応を９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、および７２℃で３０秒のサイクルを３５サイクル行った。ＰＣＲ産物を２.０％アガロースゲル上のゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡを臭化エチジウム染色により視覚化した。発現の結果を図１１に示す。
【０２５６】
実施例４
ＨＭＶＥＣ細胞のトランスフェクション
トランスフェクションの前日にＨＭＶＥＣ細胞を３.５×１０５細胞／ウエルにて６ウエルプレートにプレーティングした。細胞を組織培養フラスコ中、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートした。この接種の結果、トランスフェクションの当日には８５〜９０％コンフルエントのウエルという結果となった。遠心分離はすべて１５ｍｌのポリスチレン管（ＶＷＲ、カタログ＃２１００８−２１２）かまたは５０ｍｌのポリスチレン管（Costar-Corning、カタログ＃２５３３９−５０）で行った。ＯｐｔｉＭＥＭＩで２５μｇ／ｍｌに希釈することによりオリゴフェクチンＧ（Sequitur, Inc.、ナチック、マサチューセッツ）の１０×ストックをまず調製した。ついで、ＯｐｔｉＭＥＭＩ １ｍｌ当たり１２.５ｍｌのオリゴフェクチンＧを加えた。脂質の希釈ストックを室温で１５分間静置した。
【０２５７】
ＯｐｔｉＭＥＭＩ １ｍｌ当たり１０μｌのオリゴマー（Sequitur, Inc.）を加えることにより、ＯｐｔｉＭＥＭＩ中の各オリゴマーの１０×ストック（１μＭ）を調製した。等容量のオリゴマーおよび脂質の１０×溶液を混合し、５×混合物とした。室温で１５分間インキュベートすることにより、オリゴマーと脂質とで複合体を生成させた。ついで、オリゴマー／脂質複合体を、５％ＦＢＳを含有する４容量のＨＭＶＥＣ完全増殖培地（Clonetics、サンジエゴ、カリフォルニアからのＥＧＭブレット（bullet）キット培地）を加えることにより１×に希釈した。ついで、培地を細胞（低継代数ＨＭＶＥＣ、Clonetics）から吸引し、適当なオリゴマー／脂質複合体と置換した（６ウエルプレートについて、１.５〜２ｍｌのトランスフェクション培地をウエル当たり用いた）。
【０２５８】
細胞をトランスフェクション培地で１５〜１８時間インキュベートした。ついで、ＴＮＦ−α（R & D systems、ミネアポリス、ミネソタ）を直接、増殖培地に加えることにより、細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで６時間刺激した。オリゴマーの取り込みを、蛍光オリゴマーの取り込みにより顕微鏡で評価した。細胞の生存性を細胞死染色分析（Sequitur, Inc.）により評価した。ついで、細胞をＲＮＡ単離およびＴａｑＭａｎ分析のために回収した。
【０２５９】
実施例５
ＲＥＴ１６遺伝子発現のアンチセンス抑制
この実施例では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマーまたは「オリゴ」）を用いてＲＥＴ１６発現の抑制を決定する実験を行った。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドベースまたはキメラデオキシリボヌクレオチド／リボヌクレオチドベースのものであり、以下に記載してある。オリゴヌクレオチドの合成は、米国特許第５,８４９,９０２号（参照のためその全体を本明細書に引用する）に本質的に記載されている化学を用いて行った。
【０２６０】
アンチセンスオリゴマーは以下のとおりであった：
１１５８７：５'−ＵＧＣＡＣＡＵＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＵＣＵ−３'（配列番号１６）および
１１５９０：５'−ＧＣＡＣＵＵＵＡＣＵＡＣＧＣＡＧＵＣＣＵＡＧＡＧＡ−３'（配列番号２２）。１１５８７および１１５９０アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＥＴ１６ポリヌクレオチド（配列番号１）にハイブリダイズするのみならず、２つのＲＥＴ１６スプライス変異体ポリヌクレオチド、すなわちＲＥＴ１６.２（配列番号１２）およびＲＥＴ１６.３（配列番号１４）にもハイブリダイズする。
【０２６１】
ＨＭＶＥＣ細胞を、２.５μｇ／ｍｌのオリゴフェクチンＧと複合体を生成した１００ｎＭ（最終濃度）のアンチセンスオリゴマー（１１５８７）または対照オリゴマー（１１５９１：ＡＧＡＧＡＵＣＣＵＧＡＣＧＣＡＵＣＡＵＵＵＣＡＣＧ）（配列番号２３）でトランスフェクションした。トランスフェクション開始の４時間後、実施例４に記載のようにトランスフェクション培地を細胞から吸引し、完全増殖培地で置換した。トランスフェクション開始の１８時間後、細胞をＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。刺激後、細胞をグアニジニウム緩衝液で溶解し、全ＲＮＡを溶解液から単離した。
【０２６２】
実施例６
ＴＮＦ−α刺激したＨＭＶＥＣ細胞：Ｅ−セレクチン発現のＥＬＩＳＡ検出
アンチセンスオリゴでトランスフェクションした細胞（実施例５参照）を上記増殖条件（実施例３参照）により２４ウエルプレートで維持した。培地を交換することなく細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファで６時間処理した。
【０２６３】
処理期間の後、培地を除去し、プレートを４℃ＰＢＳ（Gibco BRL、グランドアイランド、ニューヨーク）で２回洗浄し、細胞をＰＢＳ中の０.５％グルタルアルデヒドで４℃にて１０分間固定した。ついで、プレートを穏やかに軽く叩いて固定溶液を除去し、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中の３％ヤギ血清（２００μｌ；ブロッキング緩衝液）を加えた。ついで、プレートを軽く叩き、ビオチン化抗Ｅ−セレクチン（R & D Systems、ミネアポリス、ミネソタ）をブロッキング緩衝液中に０.２５μｇ／ｍｌにて３７℃で１時間加えた。ウエルを冷ＰＢＳで４回洗浄した。ついで、ブロッキング緩衝液中の１００μｌ／ウエルのストレプトアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：４０００希釈；Vector Labs SA-5004）を加え、ついで３７℃で１時間インキュベートした。ついで、ウエルを冷ＰＢＳで４回洗浄した。
【０２６４】
ついで、１００μｌのＴＭＢ発色試薬（Sigma T8540）を加え、発色完了後、１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。発色試薬を９６ウエルプレートに移した後、マルチウエルプレートリーダーでＯＤ４５０を読み取った。
【０２６５】
実施例７
相補的ポリヌクレオチド
ＲＥＴ１６タンパク質コード配列に相補的なアンチセンス分子または核酸配列、またはその部分を用い、天然のＲＥＴ１６の発現を低減または抑制させる。約１５〜３５塩基対を含むアンチセンスまたは相補的オリゴヌクレオチドの使用を記載してあるが、本質的に同じ手順がより小さなまたは大きな核酸配列断片にも用いることができる。ＲＥＴ１６タンパク質のコード配列に基づくオリゴヌクレオチド、たとえば図１および図４Ａ、または配列番号１または配列番号３に示すものを用いて天然のＲＥＴ１６の発現を抑制する。相補的オリゴヌクレオチドは、典型的に最も独特の５'配列からデザインし、コード配列へのプロモーターの結合を妨害することにより転写を抑制するか、またはＲＥＴ１６タンパク質コード転写物へのリボソームの結合を妨害することにより翻訳を抑制するのに用いる。
【０２６６】
配列番号１または配列番号３のシグナルおよび５'配列の適当な部分を用い、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図２または図４に示すポリペプチドのシグナルまたは５'コード配列に翻訳する領域にまたがる約１５〜３５ヌクレオチドのいずれかを含んでいる。適当なオリゴヌクレオチドのデザインは、ＯＬＩＧＯ４.０６ソフトウエアおよびＲＥＴ１６タンパク質コード配列（配列番号１、配列番号３および配列番号５）を用いて行う。幾つかの目的のためには、マウスＲＥＴ１６核酸配列（配列番号６）またはラットＲＥＴ１６核酸配列（配列番号８）を用いることができる。
【０２６７】
実施例８
ノーザン分析
ノーザン分析は遺伝子の転写物の存在を検出するのに用い、特定の細胞または組織型からのＲＮＡを結合したメンブレンへの標識ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを含む（J. Sambrookら、上掲を参照）。ＢＬＡＳＴ（S. F. Altschul, 1993, J. Mol. Rvol., 36: 290-300およびS. F. Altschulら、1990, J. Mol. Evol., 215: 403-410）を用いた類似のコンピューター法を用い、ジーンバンクやＬＩＦＥＳＥＱデータベース（Incyte Pharmaceuticals）などのヌクレオチドデータベース中の同一または関連する分子をサーチする。この分析は、複数のメンブレンベースのハイブリダイゼーションを行うものに比べて遥かに迅速で労力も少なくてすむ。さらに、コンピューターサーチの感度を変更して、特定のマッチングが正確な（同一の）または相同のものとして分類できるかを決定することができる。
【０２６８】
サーチの基礎はプロダクトスコア（product score）であり、以下の定義による：（％配列同一性×最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００。プロダクトスコアは、２つの配列間の類似性の程度および配列マッチングの長さの両者を考慮する。たとえば、４０のプロダクトスコアではマッチングは１〜２％の誤差内で正確であろう；７０のプロダクトスコアでは正確であろう。相同な分子は、通常、１５〜４０のプロダクトスコアを示すものを選択することにより同定するが、より低いスコアも関連分子を同定することができる。ノーザン分析の結果は、ＲＥＴ１６をコードする転写物が存在するライブラリーのリストとして報告される。存在量およびパーセント存在量も報告される。存在量はｃＤＮＡライブラリー中に示される特定の転写物の回数を直接反映しており、パーセント存在量は存在量をｃＤＮＡライブラリーで調べた配列の総数で除したものである。
【０２６９】
実施例９
マイクロアレイ
マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドを生成するため、たとえば配列番号１または配列番号３をコンピューターアルゴリズム（ヌクレオチド配列の３'末端から開始する）を用いて調べる。アルゴリズムは、遺伝子に独特であり、ハイブリダイゼーションに適した範囲のＧＣ含量を有し、ハイブリダイゼーションを妨害する予測された二次構造を欠く所定の長さのオリゴマーを同定する。アルゴリズムは、長さが２０ヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチド、すなわち２０−ｍｅｒを同定する。各配列の中央の１のヌクレオチドを変えたオリゴヌクレオチドのマッチングしたセットを生成する。このプロセスを各遺伝子についてマイクロアレイで繰返し、蛍光または放射性ヌクレオチドの存在下で２０−ｍｅｒの二重のセットを合成し、基体の表面に配置する。基体がシリコンチップの場合は、光照射（light-directed）化学プロセスを沈着に用いる（ＷＯ９５／１１９９５、M. Cheeら、）。
【０２７０】
あるいは、化学カップリング法およびインクジェットデバイスを用いてオリゴマーを基体表面上に合成する（ＷＯ９５／２５１１６、J. D. Baldeschweilerら）。他の別法として、ドット（またはスロット）ブロットと類似の「グリッド化（gridded）」アレイを用い、たとえば真空システム、または熱、ＵＶ、機械的、または化学的な結合法を用いてｃＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを基体表面上に配置および結合する。典型的なアレイは手で、または利用できる材料および装置を用いて製造することができ、８ドット、２４ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット、または６１４４ドットのグリッドを含んでいてよい。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去し、検出デバイスを用いて放射能または蛍光のレベルおよびパターンを決定する。検出デバイスは、Ｘ線フィルムのように簡単なものであっても、光スキャニング装置のように複雑なものであってもよい。スキャニングした蛍光像を調べ、マイクロアレイ中の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度および相対的な存在量／発現レベルを決定する。
【０２７１】
実施例１０
特異的抗体を用いた天然のＲＥＴ１６タンパク質の精製
天然のまたは組換えのＲＥＴ１６ポリペプチドを、ＲＥＴ１６ポリペプチドまたはそれに由来するペプチドに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗ＲＥＴ１６ポリペプチド抗体を活性なクロマトグラフィー樹脂、たとえばＣＮＢｒ活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Amersham Pharmacia Biotech）に共有結合させることにより構築する。結合後、製造業社の指示に従って樹脂をブロッキングし、洗浄する。
【０２７２】
ＲＥＴ１６ポリペプチドを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、カラムをＲＥＴ１６ポリペプチドの優先的な吸着が可能な条件下（たとえば、界面活性剤の存在下の高イオン強度の緩衝液）で洗浄する。カラムを抗体／ＲＥＴ１６ポリペプチド結合を破壊する条件下（たとえば、ｐＨ２〜３の緩衝液、または尿素やチオシアン酸イオンなどの高濃度のカオトロピック剤）で溶出し、ＲＥＴ１６ポリペプチドを回収する。
【０２７３】
実施例１１
ＲＥＴ１６タンパク質と相互作用する分子の同定
ＲＥＴ１６または生物学的に活性なその断片を１２５Ｉ Bolton-Hunter試薬（Boltonら、1973, Biochem. J., 133: 529）で標識する。マルチウエルプレートのウエル中に前もってアレイに並べた候補分子を標識ＲＥＴ１６ポリペプチドとともにインキュベートし、洗浄し、標識ＲＥＴ１６ポリペプチド−候補分子の複合体を有するウエルをアッセイする。濃度の異なるＲＥＴ１６ポリペプチドを用いて得たデータを用い、候補分子とＲＥＴ１６ポリペプチドとの数、親和性および結合の値を計算する。
【０２７４】
ＲＥＴ１６ポリペプチドと相互作用するタンパク質、ペプチドまたは他の分子を同定するのに適した他の方法としては、本明細書に記載する酵母２ハイブリッド系などのリガンド結合アッセイが挙げられる。
【０２７５】
実施例１２
本発明のＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２またはＲＥＴ１６.３ポリペプチドに対応するＮ末端またはＣ末端欠失変異体の製造方法
本明細書に記載のように、本発明は、本発明のＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２またはＲＥＴ１６.３ポリペプチドに対応するＮ末端またはＣ末端欠失変異体（Ｎ末端およびＣ末端欠失の組み合わせに加えて）の生成を包含する。そのような変異体を生成するために多くの方法が当業者に利用できる。そのような方法としては、ＰＣＲ増幅と遺伝子クローニング法との組み合わせが挙げられる。分子生物学の当業者であれば、本明細書に提供するまたは言及する方法、および／または標準法として当該技術分野で知られた他の方法により、本発明の各欠失変異体を容易に生成できるであろうが、以下に例示の方法を記載する。
【０２７６】
簡単に説明すると、完全長ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、またはＲＥＴ１６.３ポリペプチド配列をコードする単離ｃＤＮＡクローンを用い、配列番号１、配列番号１２、または配列番号１４の所望の５'および３'位に由来する約１５〜２５ヌクレオチドの適当なプライマーをデザインしてＰＣＲ増幅することができ、引き続き意図するＮ末端および／またはＣ末端欠失変異体をクローニングすることができる。そのようなプライマーは、たとえば、５'および３'プライマーのためにそれぞれ開始コドンおよび停止コドンを含んでいてよい。そのようなプライマーはまた、増幅後の欠失変異体のクローニングを容易にするために制限部位を含んでいてもよい。さらに、プライマーはまた、たとえばフラグ−タグ配列、コザック配列、または本明細書で検討および／または言及する他の配列などの付加的な配列を含んでいてよい。
【０２７７】
以下に代表的なＰＣＲ増幅条件を記載するが、当業者であれば効率的な増幅のために他の条件が必要であり、用いることができることを評価するであろう。１００μｌのＰＣＲ反応混合物を、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ（すなわち、ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、またはＲＥＴ１６.３のｃＤＮＡクローン）、２００μＭの４ｄＮＴＰ、１μＭのプライマー、０.２５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ）、および標準Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を用いて調製することができる。典型的なＰＣＲサイクル条件は以下のとおりである：
２０〜２５サイクル：４５秒、９３℃
２分、５０℃
２分、７２℃
１サイクル：        １０分、７２℃
ＰＣＲの最後の伸長工程の後、５ＵのKlenow断片を加え、３０℃で１５分間インキュベートすることができる。
【０２７８】
断片をＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化後、同様に消化しておいた適当な発現および／またはクローニングベクター（たとえば、とりわけｐＳｐｏｒｔ１）に断片をクローニングすることができる。当業者であれば、他のプラスミドも同様に置換することができ、ある場合には望ましいことを評価するであろう。消化した断片およびベクターをＤＮＡリガーゼを用いてライゲートし、ついで本明細書に記載したおよび／または当該技術分野で知られた方法を用いてコンピテントな大腸菌細胞を形質転換する。
【０２７９】
付加的なＮ末端欠失変異体を増幅するための５'プライマー配列は、下記式を参照して決定することができる：
（Ｓ＋（Ｘ＊３））から（（Ｓ＋（Ｘ＊３））＋２５）
［式中、「Ｓ」はＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２またはＲＥＴ１６.３遺伝子（すなわち、配列番号１、配列番号１２、または配列番号１４）の開始コドンの最初のヌクレオチド位置に等しく、「Ｘ」は意図するＮ末端欠失変異体の最もＮ末端側のアミノ酸に等しい］。第一の項は、配列番号１、配列番号１２、または配列番号１４のセンス鎖に対応する５'プライマーの開始５'ヌクレオチド位置を提供し、第二の項は５'プライマーの終了３'ヌクレオチド位置を提供する。プライマーの対応するヌクレオチド位置が決定されたら、たとえば配列の５'末端に適用可能な制限部位配列を付加することにより最終的なヌクレオチド配列を生成することができる。ここで記載したように、５'プライマーへの他の配列の付加は、ある場合には望ましいし、および／または用いることができる（たとえば、コザック配列など）。
【０２８０】
付加的なＮ末端欠失変異体を増幅するための３'プライマー配列は、下記式を参照して決定することができる：
（Ｓ＋（Ｘ＊３））から（（Ｓ＋（Ｘ＊３））−２５）
［式中、「Ｓ」はＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２またはＲＥＴ１６.３遺伝子（配列番号１、配列番号１２、または配列番号１４）の開始コドンの最初のヌクレオチド位置に等しく、「Ｘ」は意図するＮ末端欠失変異体の最もＣ末端側のアミノ酸に等しい］。第一の項は、配列番号１、配列番号１２、または配列番号１４のアンチセンス鎖に対応する３'プライマーの開始５'ヌクレオチド位置を提供し、第二の項は３'プライマーの終了３'ヌクレオチド位置を提供する。プライマーの対応するヌクレオチド位置が決定されたら、たとえば配列の５'末端に適用可能な制限部位配列を付加することにより最終的なヌクレオチド配列を生成することができる。ここで記載したように、３'プライマーへの他の配列の付加は、ある場合には望ましいし、および／または用いることができる（たとえば、コザック配列など）。当業者であれば、ＰＣＲ増幅を最適化するために上記ヌクレオチド位置の改変を使用できることを評価するであろう。
【０２８１】
本発明のＣ末端欠失変異体を増幅するための５'および３'プライマー配列を同定するに際して、上記の同じ一般式を用いることができる。さらに、本発明のＮ末端およびＣ末端欠失変異体の組み合わせを増幅するための５'および３'プライマー配列を同定するに際しても、上記の同じ一般式を用いることができる。当業者であれば、ＰＣＲ増幅を最適化するために上記ヌクレオチド位置の改変を使用できることを評価するであろう。
【０２８２】
あるいは、本発明の好ましいポリペプチドは、たとえば、配列番号２、配列番号１３、または配列番号１５のＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２またはＲＥＴ１６.３ポリペプチドの内部領域に対応するポリペプチド配列（たとえば、ＮおよびＣの両末端ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、またはＲＥＴ１６.３ポリペプチド欠失の組み合わせ）を包含する。たとえば、内部領域は、式：アミノ酸ＮＸからアミノ酸ＣＸ［ここでＮＸは、ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、またはＲＥＴ１６.３（配列番号２、配列番号１３、または配列番号１５）のＮ末端欠失ポリペプチドアミノ酸であり、ＣＸは、ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、またはＲＥＴ１６.３（配列番号２、配列番号１３、または配列番号１５）のＣ末端欠失ポリペプチドアミノ酸である］により定義することができる。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。本発明はまた、これらポリペプチドの本明細書に記載する免疫原および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０２８３】
本明細書に引用した全ての特許、特許出願、公開されたＰＣＴ出願および論説、書籍、参照文献、参照マニュアルおよび要約の内容は、本発明が関連する技術分野の状態を一層完全に記載するためにその全体を参照のため本明細書に引用する。
【０２８４】
上記に記載した主題には本発明の範囲および精神から逸脱することなく種々の改変をなすこことができるので、上記の記載に含まれる、または添付の特許請求の範囲に定める主題は全て本発明を説明するにすぎないものと解釈されることを意図している。上記の教示に照らして本発明の多くの改変および変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】図１は、予測されたヒトＲＥＴ１６転写物の完全長配列を含む、本発明のヒトＲＥＴ１６ ＤＮＡの１８１８ｂｐポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。図１の核酸配列（配列番号１）は、本明細書において配列番号３として示す１５３２ｂｐのヒトＲＥＴ１６オープンリーディングフレームポリヌクレオチド配列（図４Ａ）並びにさらなる３'および５'配列を含む。ＲＥＴ１６のコード配列（ＣＤＳ）は配列番号１のヌクレオチド１４８〜ヌクレオチド１５７５に含まれる。
【０２８６】
【図２】図２は、配列番号１のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ＲＥＴ１６、すなわちＲＥＴ１６.１の予測される分子量は５２.８キロダルトン（Ｋｄ）である。
【０２８７】
【図３】図３は、ヒトＲＥＴ１６ポリヌクレオチドコード配列（配列番号１）および１８１８ｂｐのヒトＲＥＴ１６配列の導かれるアミノ酸配列（配列番号２）の両者を示す。図に示すように、コード配列は配列番号１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド位置番号１４８〜１５０のＡＴＧ（メチオニン）開始コドンから始まる。
【０２８８】
【図４】図４Ａは、配列番号３のヒトＲＥＴ１６オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ポリヌクレオチド配列を示す。図４Ｂは、配列番号３のＯＲＦポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのヒトＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号４）を示す。図４Ｃは、ヒトＲＥＴ１６ ｃＤＮＡの６３０塩基対の部分核酸配列（配列番号５）を示す。
【０２８９】
【図５】図５は、マウス由来のＲＥＴ１６ポリヌクレオチド配列、すなわちマウスＲＥＴ１６オーソログ（配列番号６）を示す。マウスＲＥＴ１６のコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号６のヌクレオチド１９〜ヌクレオチド１４４３に含まれる。
【０２９０】
【図６】図６は、マウスＲＥＴ１６ ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列（配列番号６）によってコードされるマウスＲＥＴ１６ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。マウスＲＥＴ１６の予測された分子量は５１.８Ｋｄである。
【０２９１】
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ＲＥＴ１６遺伝子に対応する部分ｃＤＮＡでプローブした１０日間の多組織ノーザン（ＭＴＮ）を示す（実施例１Ｈを参照）。１.８ｋｂ転写物が幾つかの組織で検出された。図７Ａは、ヒトＭＴＮブロットの結果を示し、全ての組織でＲＥＴ１６転写物が種々のレベルで検出された。図７Ａでは、発現は腎臓、膵臓および心臓で最も高く、胎盤、骨格筋および肝臓では一層低い発現レベルが観察され、肺および脳ではさらに低いレベルが観察された。図７Ｂは、ヒトＭＴＮブロットIIの結果を示し、全ての組織でＲＥＴ１６転写物が種々のレベルで検出された。図７Ｂでは、発現は精巣で最も高く、卵巣、前立腺および脾臓では一層低い発現レベルが観察され、胸腺、小腸、結腸および末梢血白血球ではさらに低いレベルが観察された。図７Ｃは、ヒトＭＴＮブロットIIIの結果を示し、殆どの組織でＲＥＴ１６転写物が検出された。図７Ｃでは、発現は甲状腺で最も高く、胃、脊髄、リンパ節、気管および副腎では一層低い発現レベルが観察された。ＲＥＴ１６転写物は骨髄では実質的に検出できなかったが、より大きな約２.４ｋｂ転写物は骨髄で検出された。図７Ｄは、ヒト癌細胞株ＭＴＮブロットの結果を示し、幾つかの腫瘍株でＲＥＴ１６転写物が検出された。図７Ｄでは、発現はバーキットリンパ腫細胞株ＲＡＪＩで最も高く、黒色腫細胞株Ｇ−３６１および慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２では一層低い発現レベルが観察され、ＨｅＬａ Ｓ３、リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４および結腸直腸腺癌ＳＷ４８０細胞株ではさらに低いレベルが観察された。前骨髄性白血病ＨＬ−６０細胞株および肺癌腫Ａ５４９細胞株では検出しうる発現は観察されなかった。
【０２９２】
【図８】図８は、アンチセンスオリゴマーを用いたＲＥＴ１６発現の抑制の結果を示す。図８に示してあるのは、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現に正規化した後のＲＥＴ１６ ｍＲＮＡ発現のレベルである。各棒グラフは、３回のトランスフェクションの平均±標準偏差を示す。対照オリゴマー（７６.６％）と比べてオリゴマー１１５８７では強い抑制が観察された（実施例５参照）。
【０２９３】
【図９】図９は、アンチセンスＥ−セレクチンおよびアンチセンスＲＥＴ１６オリゴヌクレオチドのトランスフェクションによるＥ−セレクチンタンパク質発現の抑制がＴＮＦ刺激ＨＭＶＥＣ細胞に及ぼす影響を決定するために行った試験の結果を示す。細胞を、実施例６に記載するようにアンチセンスまたは対照のオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。ついで、細胞をＴＮＦ−アルファで６時間刺激し、Ｅ−セレクチンの細胞表面発現をＥＬＩＳＡアッセイにより決定した（実施例６参照）。図９では、棒グラフはＨＶＥＣの表面上でのＥ−セレクチンの相対発現を示す。
【０２９４】
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｅは、ヒトＲＥＴ１６アミノ酸配列と他の既知のおよび新たに提供された配列との種々のアラインメントを示す。配列残基間の垂直の線はアミノ酸の同一を示す。配列残基間の２つの点はアミノ酸の類似を示す。配列残基間の１つの点はアミノ酸の非類似を示す。PileUpをSEQ-WEB GCG、Blosum62スコアリングマトリックス、ギャップ生成ペナルティ（gap creation penalty）８、およびギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）２で行ってマルチプルシークエンスアラインメントを生成した。当業者には理解されるであろうように、PileUpはFengおよびDoolittle（1987, J. Mol. Evol., 25: 351-360）のプログレッシブアラインメントの簡略化を用いてマルチプルシークエンスアラインメントを生成する。使用した方法はHigginsおよびSharpによって記載されたもの（1989, CABIOS, 5: 151-153）に似ている。特に、図１０Ａは、配列番号２または配列番号４からのヒトＲＥＴ１６アミノ酸配列の一部（上段）とPodospora anserinaのＨｅｔ−Ｅ−１アミノ酸配列の一部（配列の下段）との配列アラインメントを示す。ｈｅｔ−ｅ−１遺伝子によってコードされるPodospora anserinaベータトランスデューシン様タンパク質の刊行されたアミノ酸配列を配列番号１０として提供してある。図１０Ｂは、配列番号２または配列番号４からのヒトＲＥＴ１６アミノ酸配列の一部（上段）とThermomonospora curvataのＰＫＷＡアミノ酸配列の一部（配列の下段）との配列アラインメントを示す。Thermomonospora curvata ＰＫＷＡ（ｐｋｗＡ）遺伝子（受託番号ＡＦ１１５３１３）の刊行されたアミノ酸配列を配列番号１１として提供してある。図１０Ｃは、ヒトＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号２または配列番号４）（上段）とマウスＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号７）（下段）との配列アラインメントを示す。図１０Ｄは、ヒトＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号２または配列番号４）（上段）とラットＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号９）（下段）との配列アラインメントを示す。図１０Ｅは、ヒトＲＥＴ１６アミノ酸配列（配列番号２または配列番号４）（上段）とPodospora anserinaのＨｅｔ−Ｅ−１アミノ酸配列（中段）；およびThermomonospora curvataのＰＫＷＡアミノ酸配列（配列番号１１）（配列の下段）とのマルチプルシークエンスアラインメントを示す。
【０２９５】
【図１１】図１１は、様々な組織採取源からのヒトＲＥＴ１６転写物の逆転写複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を示す（実施例３）。
【０２９６】
【図１２】図１２は、ヒト（ｈｕ）ＲＥＴ１６発現を示す電子ノーザンを示す。「クローンカウント」は列記した組織ライブラリー（Incyteデータベース）中のＲＥＴ１６クローンのランダムな分析でＲＥＴ１６配列が出現する回数を指しており、それによってＲＥＴ１６遺伝子が列記した組織で発現されたことが確認される。
【０２９７】
【図１３】図１３は、ラットから単離した部分ＲＥＴ１６ポリヌクレオチド配列（配列番号８）、すなわちヒトＲＥＴ１６遺伝子のラットオーソログを示す。
【０２９８】
【図１４】図１４は、ラットＲＥＴ１６ ｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチド配列（配列番号８；図１３参照）によってコードされるラットＲＥＴ１６の部分ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【０２９９】
【図１５】図１５は、図１０Ａ〜図１０Ｅに記載したPileUpプログラムを用いた、ヒト（配列番号２または配列番号４）、マウス（配列番号７）およびラット（配列番号９）のＲＥＴ１６アミノ酸配列のマルチプルシークエンスアラインメントを示す。濃い陰影の部分は３つの全てのオーソログでの保存を示し、一方、淡い陰影の部分は２つのオーソログ間での保存を示す。ラットのＲＥＴ１６は部分的なポリペプチド配列のみであることに注意。ヒトＲＥＴ１６はマウスＲＥＴ１６（ｍｕＲＥＴ１６）と８２.５％同一であり、部分的なラットＲＥＴ１６（ｒＲＥＴ１６）と９２.９％同一である。ｍｕＲＥＴ１６は部分的なｒＲＥＴ１６と９８.５％同一である。
【０３００】
【図１６】図１６は、ＲＥＴ１６.１、ＲＥＴ１６.２、ＲＥＴ１６.３スプライス変異体ポリペプチド配列のマルチプルシークエンスアラインメントを示す。淡く陰影を付して囲んだ部分は、ＲＥＴ１６.２で欠失しているアミノ酸（ＲＥＴ１６.１の見当たらないエクソン５〜８である）を示す。濃い陰影を付して囲んだ部分は、ＲＥＴ１６.３には存在するが他のＲＥＴ１６配列には存在しないさらなるアミノ酸を示す。
【０３０１】
【図１７】図１７は、ヒトＲＥＴ１６（配列番号２または配列番号４）およびマウスＲＥＴ１６（配列番号７）ポリペプチド配列中のＷＤドメインおよびＳＡＭドメインのアラインメントを示す。図示するように、淡い陰影の領域はＷＤリピートを示し、濃い陰影の領域はＳＡＭドメインを示す。同一の残基は囲んだ領域によって示してある。
【０３０２】
【図１８】図１８は、ヒトＲＥＴ１６（ＲＥＴ１６.１とも称する）、およびＲＥＴ１６.２およびＲＥＴ１６.３スプライス変異体のエクソン構造を示す。
【０３０３】
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、ヒトＲＥＴ１６.２スプライス変異体のポリヌクレオチド配列（配列番号１２）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１３）を示す（実施例２）。ヒトＲＥＴ１６.２のコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１２のヌクレオチド１１１〜ヌクレオチド１２６２に含まれる。ＲＥＴ１６.２の予測された分子量は４２.７Ｋｄである。
【０３０４】
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂは、ヒトＲＥＴ１６.３スプライス変異体のポリヌクレオチド配列（配列番号１４）およびコードされたアミノ酸配列（配列番号１５）を示す（実施例２）。ヒトＲＥＴ１６.３のコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１４のヌクレオチド１３６〜ヌクレオチド１６４１に含まれる。ＲＥＴ１６.３の予測された分子量は５５.６Ｋｄである。
【０３０５】
【図２１】図２１は、本発明のＲＥＴ１６のＵボックスドメイン（配列番号２４）とタンパク質ＰＲＰ１９のＵボックスドメイン（配列番号２５）とのコンセンサス残基のアラインメントを示す。図２１に示す保存されたコンセンサス残基の注釈は、AravindおよびKoonin, 2002, Current Biology, 10(4): R132-R134から改変してある。
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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