(57)【要約】本発明は、精神障害を生じる中枢神経系の疾患を治療又は予防する医薬を調製する為のSMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの反応を調節する薬剤の使用に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精神障害を生ずる中枢神経系の疾患を予防又は治療する医薬を調製する為のSMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの相互作用を調節する薬剤の使用。
【請求項２】
前記メタロペプチダーゼが膜亜鉛メタロペプチダーゼである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記メタロペプチダーゼが中性エンドペプチダーゼ(NEP)である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記疾患が行動障害である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記疾患が障害性対人障害(impaired interpersonal disorder)である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患が性的及び性同一性障害である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記疾患が回避性人格障害である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記疾患が注意力欠陥／多動性障害である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記疾患が気分障害である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記疾患が、単純恐怖症、社会恐怖症、強迫性障害、及び急性ストレス障害からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記疾患が疼痛障害に関連する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
中枢神経系の疾患を予防又は治療する方法であって、SMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの相互作用を調節することを含んで成る方法。
【請求項１３】
QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位に対して特異的に結合するリガンド分子をスクリーニングする方法であって:
a)  QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位を含む培養細胞もしくは器官標本もしくは組織試料を調製し;
b)  半飽和濃度の標識されたペンタペプチドとの競合下で試験される候補的分子を添加し;
c)  標識された候補的分子の存在下で、特異的結合が生じるのに十分な時間の間及び条件下で段階a)の培養細胞、器官標本又は組織試料をインキュベートし;
d)  様々な濃度の前記候補的分子の存在下で培養細胞、器官標本又は組織試料に対して特異的に結合する標識を定量化する;
段階を含んで成る方法。
【請求項１４】
QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位に対して特異的に結合するリガンド分子の相対親和性を決定する為の方法であって、各候補的分子に対する請求項３に記載の方法の段階a)、b)、c)及びd)を含んで成り、そして更に、段階d）において定量した各候補的分子の親和性を、他の候補的分子の一つに対して比較する段階e)を含んで成る方法。
【請求項１５】
QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位に対して特異的に結合するリガンド分子の親和性を決定する方法であって:
a)  QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位を含む培養細胞もしくは器官標本もしくは組織試料を調製し;
b)  放射性又は非放射性標識で予め標識された候補的分子を添加し;
c)  標識された候補的分子の存在下で、特異的な結合が生じるのに十分な時間の間及び条件下で段階a)の培養細胞、器官標本又は組織試料をインキュベートし;そして
d)  様々な濃度の標識された候補的分子の存在下で、培養細胞、器官標本又は組織試料に対して特異的に結合する標識を定量化する;
段階を含んで成る方法。
【請求項１６】
QHNPRペンタペプチドのNEP結合部位に対してアゴニス生物活性を有するリガンド分子をスクリーニングする方法であって:
a)  QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位を含む培養細胞もしくは器官標本もしくは組織試料を調製し;
b)  候補的分子、半飽和濃度のQHNPR及びNEP基質の存在下で、初速度条件下でNEP基質の加水分解活性が生じるのに十分な時間の間、初速度条件下でのNEP酵素活性の測定を可能にする濃度で段階a)の培養細胞、器官標本又は組織試料をインキュベートし;
c)  候補的リガンド分子の存在下もしくは不在下及びQHNPRの存在下もしくは不在下のそれぞれで、NEP基質の加水分解のレベルを測定することによって、段階a)の生物材料中に存在するNEPの活性を定量化する;
段階を含んで成る方法。
【請求項１７】
QHNPRペンタペプチドのNEP結合部位に対してアンタゴニスト生物活性を有するリガンド分子をスクリーニングする方法であって:
a)  QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位を含む培養細胞もしくは器官標本もしくは組織試料を調製し;
b)  亜最大濃度のXQHNPRペプチド、特にQHNPRペプチド及びNEP基質の存在下、候補的分子の存在下で、初速度条件下でNEP基質の加水分解活性が生じるのに十分な時間の間、初速度条件下でのNEP酵素活性の測定を可能にする濃度で段階a)の培養細胞、器官標本又は組織試料をインキュベートし;
c)  候補的リガンド分子の存在下もしくは不在下及びQHNPRの存在下もしくは不在下のそれぞれで、NEP基質の加水分解のレベルを測定することによって、段階a)の生物材料中に存在するNEPの加水分解活性を定量化する;
段階を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対人関係障害及び行動障害等の精神障害を生ずる中枢神経系の疾患を予防又は治療する方法に関連する。その方法は、SMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの相互作用の調節を含んで成る。
【背景技術】
【０００２】
以前、本発明者により特性決定され、SMR１(submandibular rat 1 protein)と命名された新規ラット顎下腺タンパク質は、プロホルモン様の構造を有し、そしてそれはアンドロゲンによる調節の下で合成される(Rosinsky−Chupin ら、(1988), Proc. Natl  Acad. Sci. USA; 85(22) : pp.8553〜7及びPCT特許出願第WO90／03981)。新規多遺伝子ファミリー、VCSファミリーに属するSMR1をコードする遺伝子は、ラット14番染色体のバンドｐ21〜ｐ22に局在しており(Courtyら、(1996) Mol.Biol. Evol. 13(6):pp.758〜66; Rosinsky−Chupinら、(1995) Mamm.Genome 6(2):pp.153〜4)、それに関するいくつかのヒトの遺伝子群に関しては特性決定がなされている(Isemuraら、1997、J.Biochem 121:pp.1025〜1030; Isemura ら、1994, J.Biochem 115:pp.1101〜1106; Isemuraら1979,J.Biochem 86:pp.79〜86;Dickisonら,1996,Curr Eye Res, 15:pp.377〜386)。前記遺伝子は多くのホルモン前駆体遺伝子と類似する機構を有する(Rosinsky−Chupinら、(1990) DNA Cell. Biol. 9(8): pp.553〜９)。SMR１mRNAは非常に、組織、年齢、及び性別特異的にオスラット顎下腺(SMG)の腺房細胞及び前立腺で発現している(Rosinsky−Chupinら、(1993) Histochem.Cytochem .41(11):pp.1645〜9)。
【０００３】
in vivoで、SMR1がペプチドホルモン前駆体の突然変異経路に類似的に、組織及び性特異的に、塩基性アミノ酸が対合している部位で選択的にプロセッシングを受け成熟ペプチドを生ずることが記載されてきた(Rougeotら, (1994) Eur. J. Biochem. 219(3):765〜73)。アルギニン残基対の解裂によってSMR1から生じる構造的関連性のあるペプチド(例えば、ウンデカペプチド:VRGPRRQHNPR;ヘキサペプチド:RQHNPR;及びペンタペプチド:QHNPR)は、Furineコンベルターゼ等の塩基性アミノ酸対転換酵素による塩基性アミノ酸残基対でのプロセッシングを受けた後に、前駆体からin vivo 選択的に成熟し、組織、年齢、性別に関連した態様で示差的に蓄積をされ、そして多因子神経内分泌調節(multifactorial neuroendocrine control)により局在的及び全身的に放出される(Rougeotら,1994)。
【０００４】
かかる背景において、シアロルフィンともいう、SMR1ペンタペプチド(SMR1−QHNPR)と命名された、SMR1から生成される最終成熟ペプチドは、主にアンドロゲンステロイドに応答して合成され、そして基底状態で血流中へと連続的に放出され、そしてSMGの分泌応答性を調節するアドレノレセプターの活性化の状態に依存して環境ストレスに応じて鋭敏に放出される。
【０００５】
次に、循環するSMR1ペンタペプチドは、主に腎臓、骨及び歯の組織内の特異的結合部位を介してin vivoで急速且つ選択的に末梢標的器官により摂取される。
【０００６】
ペプチドの標的部位は、主にイオンを捕獲、輸送及び調節する主要組織内に局在するという事実により、in vivoでSMR1ペンタペプチドは無機イオンの恒常性作用(homeostasic process)の調節において局所的及び全身的な役割をしうる証拠が得られる。更に、アンドロゲンによる調節を受けるSMR１ペンタペプチドは、環境ストレスにより鋭敏に分泌されるという事実に関連して、これらの結果が本発明者にもたらした仮定とは、このSMG特異的シグナル生成ペプチドが動態的恒常性応答の統合的再生の仲介に加わりうるということである。動的恒常性応答とは、即ち、オスのラットに特異的な行動特性、例えば、攻撃的及び／又は性交、並びにメスに特異的な生理特性、例えば、妊娠及び泌乳等ストレスの多い状況に対応する応答である。
【０００７】
SMR１タンパク質の突然変異産物、詳細には構造式XQHNPRのペプチドは、無機イオン濃度に深く関わる器官の特異的標的部位を認識することがWO98／37 100に開示されている。この発見により、本発明者がSMR１ペプチド(特にSMR1ペンタペプチド、ヘキサペプチド又はウンデカペプチド)に生体流体及び組織中での金属イオン濃度の調節における積極的な役割をさせ、そして、無機イオンの不均衡に関連する全ての代謝性疾患においてこれらのペプチドに治療上の役割をさせることにつながった。
【０００８】
即ち、生体流体又は組織中の無機イオンの不均衡によって生ずる、骨、歯、腎臓、腸、すい臓、胃、又は唾液腺の疾患、即ち、副甲状腺機能亢進症、又は副甲状腺機能低下症、骨粗鬆症、膵炎、顎下腺結石症、腎結石症又は骨形成異常症を治療又は予防する為に、そこで開示された治療ペプチドは有用である。
【０００９】
上記の仮定を基にして、行動薬理学的(behavioral pharmacological)な方法がとられてきた。SMR１ペプチド、特にSMR1ペンタペプチドで分かったことはコントロールのラットにみられるような攻撃的衝動行動を欠くオス成獣ラットの性行動に対して用量依存的改善を誘発することである(PCT特許出願WO01／00 221)。
【００１０】
SMR1ペプチド作用中に生ずる経路を評価する為に欠かすことの出来ない段階の一つは、ペプチドレセプター部位の分子特性を探索することである。全身投与又は放射性同位体標識されたSMR1ペンタペプチドにアクセスしやすい膜結合部位が、特に腎外部の髄質内の膜結合部位が単離されてきた。そのアミノ酸配列を同定することにより明らかになったことは、in vivoで前記ペプチドと結合する細胞表層分子は膜メタロペプチダーゼであり、そして一層詳細には、ネプリリシンファミリーに属する、エンケファリナーゼとも命名された、ほ乳類2型内在性亜鉛含有エンドペプチダーゼ、即ち中性エンドペプチダーゼ24−11又はNEPだということであり、それは、様々なペプチド作用性シグナルを機能させること(functional potency)において重要な役割を果たす。更に、ラット腎臓NEPとSMR1ペンタペプチドとのin vivo 直接相互作用が、ウサギ腎臓の精製されたNEPを用いることで、in vitro で示された。
【００１１】
更に、循環する放射性同位体標識されたSMR１ペンタペプチドにアクセスしやすい標的器官の分布と公知のNEP阻害物質の分布との間での良い(位相的及び動力学的)関係がラットの体全体のレベルでin vivoで見られた(Salesら、(1999) Regulatory  Peptide 33, pp. 209〜22)。他方、SMR1ペプチドはSMG誘導中性モジュレーター、特にNEP活性の阻害物質であるという仮定は多くの観察により裏付けられる。観察は即ち、
１．   組織によるSMR1ペンタペプチドの摂取はin vivoでは薬物動力学的及び生物化学的に安定であることが分かり、
２．   NEPがX−Phe結合の間で優先的にペプチドの解裂を行うから、SMR１ペプチドはNEP基質として必要な残基を共有せず、そして
３．   SMR1ペンタペプチドは有力な合成NEP阻害物質を目的として設計された強力な亜鉛キレート基を有する
ことである。
【００１２】
多くの生理的NEP基質(即ち、ペプチドホルモン:エンケファリン、サブスタンスP、ブラジキニン、アンギオテンシンII、及び心房性ナトリウム利尿ペプチド)を考慮すると、NEP／SMR1ペプチド相互作用の生理的な結果により中枢及び末梢の疼痛知覚、炎症性の症状、動脈拍動及び／又は無機物の交換の調節に対する影響が与えられることが予測される(Roquesら、1993)。
【００１３】
中性のエンドペプチダーゼ、NEP24−11は、哺乳動物の神経組織及び末梢組織中に分布しており、そして末梢では特に腎臓及び胎盤において豊富である。これらの組織において、細胞表層メタロペプチダーゼNEPは神経ペプチド、全身性免疫調節ペプチド及びペプチドホルモンの後分泌プロセッシング及び代謝に関与する。循環する又は分泌される調節ペプチドの活性レベルを調節することによって、NEPによるそれらの生理的レセプター介在反応の調節がなされる。故に、細胞膜結合型NEPは:サブスタンスP、ブラジキニン(BK)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、及びアンギオテンシンII(AII) 等の有力な血管作用ペプチド；サブスタンスP及びBK及びfMet−Leu−Phe(fMLP)等の有力な炎症性／免疫調節ペプチド；Met及びLeuエンケファリン(Enk)等の有力なオピオイド神経ペプチド、並びにANP、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)及びB型のナトリウム利尿ペプチド(BNP)等の有力な無機物交換及び流体恒常性調節ペプチド:の活性調節に関わる。しかし、これらのペプチドのレベルは、NEPにより誘導される形成／分解を介してそれらが持続的に放出される領域又はそれらの放出が刺激により誘発される領域においてのみ変化する。
【００１４】
統合的な観点から、NEPの生物学的な作用とは、動脈内血圧の調節、炎症性の現象及び水−無機物の恒常性、並びに疼痛処理に関わるペプチドシグナルの活性レベルを調節することである。臨床的観点から、NEPは様々な病状における重要な薬物標的であるという事実がこのことにより証明される。例えば、NEPを阻害することによって、中枢もしくは末梢の内生オピオイドの作用のレベル及び持続時間を高めることが鎮痛薬及び下痢止め薬で達成でき、又は内生AII形成及びサブスタンスP、BK及びANPの不活性化を阻害することによって、降圧剤、ナトリウム利尿薬及び利尿薬が得られうる。NEP阻害物質を使用して内生ペプチドの濃度の調節をすることの主な利点は、天然エフェクターによる刺激を受けたレセプターでのみ薬理作用が生ずること、及び薬理作用は環境的、行動的及び生理病理的なストレスが多い状況により生ずる天然エフェクターの持続的放出又は刺激誘発放出にとても依存的であることだ。（Roquesら、(1993) Pharmacological  Reviews 45、pp.87〜146）。かかるストレスが多い状況においてストレスを加えることは重要である。天然の有力なNEPモジュレーターのSMR１ペプチドも急速且つ持続的に放出され、分配されてその全身の標的組織、特に腎臓のNEP部位によって取り込まれるだろう(Rougeotら、1997)。従って、SMR1ペプチドはin vivoでの動力学的な生態利用効率があり、NEP活性を調節してストレスに対する局所及び全身炎症性、血圧増進及び／又はイオン恒常性の応答を至適化するだろう。統合的な視点とは、循環する顎下腺(SMG)誘導因子が、安静時の恒常性定状状態に貢献するというよりむしろ、生理的又は病理的「ストレス状況」(傷害、外傷又は感染症)に対する恒常性応答の統合的回復に関与しうるという仮定に基づく(Rougeoutら、(2000) Peptides 21、pp. 443〜55)。
【００１５】
通常の観点から、生理的に有意な証拠により頸部交感神経幹（CST）−SMG神経内分泌軸の存在が明らかになる。それは、特に組織の損傷、炎症、及び攻撃的行動を伴うげっ歯類で見られるような「ストレス状態」下での生理的順応における統合的な役割を果たし、そして哺乳動物における恒常性の維持に貢献する。実験室において得られたデータにより、SMR1ペプチドは新規シグナリングモジュレ−ターであり、性的、種特異的環境、行動、及び生理的特性に順応し、緊急の状況で、膜結合型NEP活性を調節することにより局所的且つ全身的に非傷害性、炎症性の血圧増進及び／又はイオン恒常性応答を至適化する方法で持続的且つ動的に流動することの確実な証拠(convincing evidence)が供される。一方で、今迄のところ前記SMR１ペプチドは、最初に末梢NEP活性が確認された天然の調節物質であり、見かけ上新たなクラスの治療分子として設計されるようである。何故なら、このメタロペプチダーゼは、特に、配列相同性≧９０％を有し、ラット、ウサギ及びヒトの種間で十分に保存されているからである(Genbankアクセス番号P08473、Molfroyら、FEBS  Lett, 1998,229(1),pp.206〜210; Genbankアクセス番号NP258428、Bonvouloirら、DNA Cell Biol, 2001,20(8),pp.493〜498; Genbankアクセス番号NP036740、Molfroyら、Biochem Biophys Res. Commun, 1987, 144, pp.59〜66)。
【００１６】
種間でのNEP配列の著しい相同性とともに本発明者によって供される証拠により更に分かることは、前記SMR1ペプチドは、膜メタロペプチダーゼ、特に亜鉛メタロペプチダーゼの天然のモジュレ−ター／阻害物質として働くことである。
【発明の開示】
【００１７】
従って、本発明の対象は精神異常を生じる中枢神経系の疾患を予防又は治療する方法であり、その方法は、SMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの相互作用を調節することを含んで成る。
【００１８】
本発明の他の対象は、精神異常を生じる中枢神経系の疾患を予防又は治療する医薬を調製する為にSMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの相互作用を調節する薬剤を使用することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
メタロペプチダーゼ:
ほ乳類膜メタロペプチダーゼの例には、NEPに加えて、ECE(エンドセリン転換酵素)、特にECE1及びECE2、赤血球表層抗原KELL及び伴性染色体遺伝性低リン血症性クル病に関連するPEX遺伝子産物、並びにACE(アンギオテンシン転換酵素)が挙げられる。
【００２０】
天然のNEP基質は主にペプチドホルモン:エンケファリン、サブスタンスP、ブラジキニン、アンギオテンシンII及び心房性ナトリウム利尿ペプチドであり中枢及び末梢疼痛知覚、炎症現象及び／又は動脈の律動(arterial tone)の調節において主要な役割を果たす。
【００２１】
調節剤:
「調節剤」とは、メタロペプチダーゼ活性を増加もしくは減少させる能力又は内生のSMR1ペプチドと前記メタロペプチダーゼとの正常な相互作用を妨害する能力がある薬剤であると解される。
【００２２】
「内生の」とは、治療される患者の組織中で天然に発現する又は成熟する分子(本明細書中ではSMR１ペプチド)を言及する。
【００２３】
本発明により、SMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの相互作用を調節する薬剤がスクリーニング法によって同定されて良く、そして／又は、内生のSMR1タンパク質及びペプチドの構造を考慮する等して設計されて良い。
【００２４】
調節剤を設計する目的の為に、当業者はSMR1タンパク質、SMR1から生じるペプチド、またの名をSMR1タンパク質の成熟産物、又は前記タンパク質もしくは前記成熟産物の生物学的に活性のある誘導体の一つの構造を考慮しうる。
【００２５】
ある当業者は更に構造式（1）:X1QHX2X3X4
（式中、X1は水素原子を示す又はX1はアミノ酸鎖であり、以下の:X1＝RもしくはG、X1＝RR又は X1＝PRR、もしくは X1＝GPRRもしくは X1＝RGPRRもしくは X1＝VRGPRRから選択され、X2はN、G又はDを示し、X3はP又はLを示し、そしてX4はR又はTを示す）
の化合物を考えうる。
【００２６】
好適なペプチドは以下の配列のペプチドを含んで成る。
ドブネズミ(Ratus norvegius)由来のQHNPR、RQHNPR、及びVRGPRRQHNPR、
ラット(Ratus ratus)由来のQHNLR及びRQHNLR、
マウス由来のGQHGPR及びGQHDPT
上記アミノ酸配列において:
Qはグルタミンを示し、
Hはヒスタミンを示し、
Nはアスパラギンを示し、
Gはグリシンを示し、
Pはプロリンを示し、
Rはアルギニンを示し、
Lはロイシンを示し、
Tはトレオニンを示し、
Dはアスパラギン酸を示し、そして
Vはバリンを示す。
【００２７】
内生のSMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの相互作用を調節できる薬剤にはペプチド、又は他の有機分子が挙げられる。それは、化合物又は天然抽出物等、化合物の混合物であって良い。SMR1ペプチドとメタロペプチダーゼとの相互作用を調節する能力を示す調節剤に限り、このような調節剤の構造は特性決定されている又は今尚非公知でありうる。
【００２８】
本発明の目的の為に、「ペプチド」とは、ペプチド結合によって直線的な並びで互いに連結しあうアミノ酸残基の直鎖状配列を含んで成る分子である。かかる直鎖状の配列は任意的に環状、即ち、直鎖状ペプチドの末端又はペプチド内のアミノ酸の側鎖が、化学結合等によってつながっている状態であって良い。本発明のかかるペプチドは約3〜約500個のアミノ酸を含んで良く、そして更に二次、三次、又は四次構造、並びに他のペプチド分子もしくは他の非ペプチド分子との分子間結合を含んで良い。かかる分子間結合は、限定ではないが、 (ジスルフィド結合等による) 共有結合、又はキレート化、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、イオン双極子相互作用、双極子相互作用又は上記の任意の組み合わせによるものであってもなくても良い。
【００２９】
本発明のペプチドは、当業界で知られている方法(Merrifield, J. Am Chem. Soc. 85: pp. 2149〜2154を参照のこと)を用いることで都合よく合成されて良い。
【００３０】
ペプチドミメティクス(peptidomimetics)も注目の化合物である。
【００３１】
好適なペプチドミメティクスは、親ペプチドの上記のような結合特異性及び／又は生理活性を維持する。本明細書中で用いられる場合、「ペプチドミメティクス」とはペプチドのある特性、好ましくはそれらの結合特異性及び／又は生理活性を真似た有機分子である。本発明によりペプチドの構造的修飾をすること、好ましくはLアミノ酸の代わりに非中性のＤアミノ酸を用いること、構造的な抑制、等配電子置換、環状化又は他の修飾をすることによって好適なペプチドミメティクスが得られる。他の好適な修飾法には、限定ではないが、一もしくは複数のアミド結合が非アミド結合によって置換されるもの、及び／もしくは一もしくは複数のアミノ酸側鎖が様々な化学成分によって置換されるもの、又は１もしくは複数のN末端、C末端もしくは1もしくは複数の側鎖が保護基によって保護されるもの、並びに／又は二重結合及び／もしくは環状化及び／もしくは構造的特異性がアミノ酸の鎖に導入され剛性及び／もしくは結合親和性が高まるものが挙げられる。
【００３２】
更に他の好適な修飾法として挙げられるものは、酵素による分解に対する耐性を高める意図のもの、特に神経及び生殖腺組織による生体利用効率及び更に一般には薬理特性を高めるものが挙げられ、そして特に:
−脂質親和性アルコールによるエステル化(COOH)によって、もしくはアミド化(COOH)によって、及び／もしくはアセチル化(NH2)によって又はNH2末端にカルボキシアルキルもしくは芳香族疎水性鎖を添加することによって、NH2及びCOOH親水基を保護すること;
−CO−NHアミド結合のレトロ転換(retroinversion)もしくは還元異性体又はアミド官能基のメチル化(もしくは、ケトメチレン、メチレンオキシ、ヒドロキシエチレン);
−Lアミノ酸のDアミノ酸への置換;
−アミノ酸ペプチド鎖の二量体化:
を含んで成る。
【００３３】
これらの変形版は全て当業者に周知である。従って、ペプチド配列が与えられることで、かかるペプチドに対して結合特性が類似する又は秀でるペプチドミメミメティクスを当業者は設計及び生産できる（例えば、Horwellら、 Bioorg. Med. Chem. 4: 1537 (1996);Liskampら、Recl. Trav. Chim. Pays−Bas 1: 113(1994);Ganteら,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:1699(1999); Seebeachら、Helv. Chim. Acta 79: 913(1996)を参照のこと）。
【００３４】
本発明により用いられるペプチドは、(液層ではN末端からC末端、固層ではC末端からN末端で)導入される様々なアミノ酸残基の連続カップリングによる液層又は固層でのペプチド合成による常用の方法で調製されて良い。この方法では、N末端及び反応側鎖は予め常用の基によって遮断されている。
【００３５】
固層合成に関して、Merrifieldにより記載された方法が特に用いられて良い。もう一つの方法としては、1974年にHoubenweylにより記載された方法も用いられて良い。
【００３６】
更に詳細については、WO98／37 100を参照のこと。
【００３７】
本発明の治療方法において用いられるペプチドは、遺伝子工学技術を用いても得られうる。完全な、146アミノ酸のSMR1タンパク質をコードするcDNAの核酸配列は、PCT特許出願WO90／03891(Rougeonら)中に記載されている。SMR1ペプチドの生物学的に活性がある誘導体、例えば、X1QHX2X3X4の誘導体に関して、当業者は、一般刊行物を参考にして所望のペプチドを合成するのに用いられて良い適切なコドンを決定するだろう。
【００３８】
同じ標的に対して結合し且つアゴニストもしくはアンタゴニスト生物活性を有する、本発明のSMR1ペプチドの生物学的に活性のある誘導体を当業者が選択及び精製できるようにする方法がこの後に記載されている。
【００３９】
本発明の調節剤はタンパク質であって良く、ペプチド、ホルモン、抗体又はペプチドもしくは非ペプチド分子である合成化合物、例えば、有機化学の常用の方法によって合成できる任意の化合物であって良い。
【００４０】
QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位に対する候補的リガンド分子の結合を評価すること、並びにこの候補的分子がその標的上にあることによって誘発される代謝的変化、例えば、プロテインキナーゼ又はアデニル酸シクラーゼ及びGファミリータンパク質の活性化、もしくは特に天然のNEP基質の代謝に対するNEPの酵素活性の変化によりシグナルが伝達されることによってもたらされる一次もしくは二次メッセンジャー代謝産物の合成及び／もしくは放出を特定すること、の両方において本発明の調節剤の選択が行われて良い。
【００４１】
一般に4℃〜25℃又は37℃で候補的分子の結合アッセイが行われる。この後に記載されたプロトコルの読解を促す為に、QHNPRペンタペプチドは候補的分子の代わり又は競合において用いられても良い。
【００４２】
従って、本発明の他の対象は、QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位に対して特異的に結合するリガンド分子をスクリーニングする方法である。その方法は:
a)  QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位を含む培養細胞もしくは器官標本もしくは組織試料(凍結切片もしくは薄片もしくは膜調製物もしくは粗製のホモジネート)を調製し;
b)  半飽和濃度の標識されたペンタペプチドとの競合下で試験される候補的分子を添加し;
c)   候補的分子の存在下で、特異的な結合が生じるのに十分な時間の間及び条件下で段階a）の培養細胞、器官標本又は組織試料をインキューベートし;
d)  様々な濃度の候補的分子(10−10〜10−5Mが好ましい)の存在下で培養細胞、器官標本、又は組織試料に対して特異的に結合する標識を定量化する;
段階を含んで成る。
【００４３】
前記方法において、半飽和濃度とは標識したQHNPRペンタペプチドが50％のNEP結合部位に結合する濃度である。
【００４４】
この方法により、QHNPRの親和性に比較して候補的分子の相対親和性を明らかにすることも可能になる。
【００４５】
本発明の他の対象は、QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位に対して特異的に結合するリガンド分子の相対親和性を決定する方法である。その方法は、各候補的分子に関する上記方法の段階a)、b)、c)及びd)を含んで成り、そして更に、段階d)において定量化した各候補的分子の親和性を他の候補的分子の1つの親和性と比較する段階e)を含んで成る。
【００４６】
本発明の他の対象は、QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位に対して特異的に結合するリガンド分子の親和性を決定する方法である。その方法は:
a)  QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位を含む培養細胞もしくは器官標本もしくは組織試料(凍結切片もしくは薄片もしくは膜調製物もしくは粗製のホモジネート)を調製し;
b)  予め放射性標識又は非放射性標識された候補的分子を添加し;
c)  標識された候補的分子の存在下で、特異的な結合が生じるのに十分な時間の間及び条件下で段階a）の培養細胞、器官標本又は組織試料をインキューベートし;そして
d)  様々な濃度の標識された候補的分子(10−10〜10−5Mが好ましい)の存在下で培養細胞、器官標本、又は組織試料に対して特異的に結合する標識を定量化する;
段階を含んで成る。
【００４７】
候補的分子は放射性標識(例えば、32P、35S、3H、125I)又は非放射性標識(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光)されて良い。
【００４８】
従って、本発明はQHNPRペンタペプチドのNEP結合部位に対してアゴニスト活性を有するリガンド分子をスクリーニングする方法にも関連する。その方法は:
a)  QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位を含む培養細胞もしくは器官標本もしくは組織試料(凍結切片もしくは薄片もしくは膜調製物もしくは粗製のホモジネート)を調製し;
b)候補的分子(10−10〜10−5Mが好ましい)、半飽和濃度のQHNPR及びNEP基質の存在下で、初速度条件下でのNEP基質の加水分解が生じるのに十分な時間の間、（例えば、実施例１の材料と方法によって決定される）初速度条件下でのNEP酵素活性の測定を可能にする濃度で段階a）の培養細胞、器官標本又は組織試料をインキューベートし;
c)  候補的分子の存在下もしくは不在下及びQHNPRの存在下もしくは不在下のそれぞれで、NEP基質が加水分解するレベルを測定することによって、段階a)の生物材料中に存在するNEPの活性を定量化する;
段階を含んで成る。
【００４９】
前記方法において、半飽和濃度とは、NEP基質の分解を半減させるQHNPRペンタペプチドの濃度である。
【００５０】
本発明の他の対象は、QHNPRペンタペプチドのNEP結合部位に対してアンタゴニスト活性を有するリガンド分子をスクリーニングする方法を含んで成る。その方法は:
a)  QHNPRペンタペプチドの為のNEP結合部位を含む培養細胞もしくは器官標本もしくは組織試料(例えば、凍結切片もしくは薄片もしくは膜調製物もしくは粗製のホモジネート)を調製し;
b) 亜最大濃度のXQHNPRペプチド、特にQHNPRペプチド及びNEP基質の存在下、候補的分子の存在下で、初速度条件下でNEP基質の加水分解が生じるのに十分な時間の間、初速度条件下でのNEP酵素活性の測定を可能にする濃度で段階a）の培養細胞、器官標本又は組織試料をインキューベートし、;
c)  候補的分子の存在下もしくは不在下及びQHNPRの存在下もしくは不在下のそれぞれで、NEP基質が加水分解するレベルを測定することによって、段階a)の生物材料中に存在するNEPの活性を定量化する;
段階を含んで成る。
【００５１】
前記方法の好適な実施態様において、亜最大濃度とは基質の分解を50%以上及び好ましくは75％以上減らすペンタペプチドの濃度である。
【００５２】
先に説明したように、候補的リガンド分子のアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を評価する為の他の代謝的アッセイは、ラット、マウスもしくはヒト由来の初代培養細胞もしくは確立された細胞系統もしくは組織試料及び内生もしくは外生NEP基質の存在下での候補的リガンドのインキュベーション、並びに量的及び質的のどちらか又はその両方でのNEP基質の加水分解の測定を含んで成る。
【００５３】
本発明のスクリーニング法において用いられる好適な組織試料は、ラット由来の脊髄の膜調製物又は薄片、NEP活性測定に適切であることが知られている組織である。
【００５４】
かかる手順は、マウスもしくはヒト由来の組織及び／もしくは細胞又はヒトNEP cDNAによりトランスフェクションされた細胞系統に対して適用されても良い。
【００５５】
本発明の方法において、本発明のペプチド又はペプチドミメミメティクスは任意の様々な方法によって投与されて良い。ある好適な実施態様において、投与は非経口投与であって良く、最も好ましくは静脈内投与であって良い。他の好適な実施態様において、投与は鼻腔内、経口、舌下、経粘膜、呼吸器内投与又は不活性パッチもしくはイオントフォレティックパッチにより投与されて良い。
【００５６】
投与されるペプチドもしくはペプチドミメティクスの用量は患者、症状、及び投与経路に特に依存するだろうし、そして上下する投与計画に合わせて上記の病的疾患に直接結び付けて減らすこと又は除くことによって実験的に決定されて良い。好適な用量は、約0.1μg／kg〜約1mg／kg、一層好ましくは、約1μg／kg〜約100μg／kgであり、そして最も好ましくは、約1μg／kg〜約50μg／kgである。
【００５７】
中枢神経系の疾患:
本発明は、ほ乳類において精神異常を生ずる中枢神経系(CNS)の疾患を予防又は治療に焦点を当てる。
【００５８】
本発明の目的の為に、用語「ほ乳動物」とは、その分類学上の意味において用いられ、そして特にヒトを含む。
【００５９】
本発明のCNS疾患とは、障害性対人及び行動障害(impaired interpersonal and behavioral disorders)等の、精神的な疾患を言及する。
【００６０】
PCT特許出願WO01／00221中に様々な精神障害が記載されている。本発明は、精神障害の症状を緩和又は取り除く新たなる治療経路を提供する。
【００６１】
本明細書中で用いられる場合、「精神障害を有する」とは、一般に精神異常の症状として認められる、臨床的に確認可能な行動又は身体的特性を1つ以上示すことである。用語「精神異常の症状を緩和すること又は取り除くこと」とは、一般に精神異常の症状として認められる１もしくは複数の行動もしくは身体的特性において、臨床的に確認可能な有利な変化を得ることである。精神異常は、精神科医のワーキンググループにより記されたマニュアルによって提供される基準による診断上の分類である。このようなマニュアルは、American psychiatric Associationによって刊行されており、「Diagnostic and Statistical Manual of Mental  Disorder,  1992」が挙げられる。このようなマニュアル中でのそれらの治療法によっても分かるように、以下に議論される各疾患は周知である。従って、後に論ずる疾患に関する簡潔な定義のみが本明細書で供される。
【００６２】
ある実施態様において、精神異常は回避性障害である。本明細書中で用いられる場合、「回避性障害」とは、本質的な特徴として、広汎性型の、社会的不安、否定的評価に関する恐れ、及び臆病さを有する障害である。それには馴染みの無い人々と接触することからの過度の萎縮が含まれる。本発明は、回避性疾患の人格に特に関連する。その人格は広汎性型の「早期成人期によって始まりそして様々な背景において存在する社会的抑制、自分にはあまり価値が無いという感情、及び否定的評価に対する過敏性」として定義される (DSMP−IV−TR コード 301.82、p718−21、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、 American Psychiatric Assoc.、1992)。
【００６３】
本発明のある実施態様において、精神障害は知覚低下障害(decreased awareness disorder)である。本明細書中で用いた場合、「知覚低下障害」とは、他人の存在又は感情に気付くことの欠如を特徴とする(例えば、あたかも彼又は彼女を家具であるかのように扱う人;他人の嘆きに気付かない人等)疾患を意味する。これらの障害は自閉症の要素でありうる。
【００６４】
ある好適な実施態様において、精神障害は注意力欠如／他動性障害である。本明細書中で用いられる場合、「注意力欠如障害」とは、不適切且つ著しい不注意が発展的に永続するのが主な特徴の障害である。欠如／多動性障害には、複合型、注意力障害優位型、及び多動性−衝動性優位型が挙げられる(DSMP−IV−TR コード 314.01、314,00、314,01 pp.87〜93、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、 American Psychiatric Assoc.、1992)。
【００６５】
ある好適な実施態様において、精神障害は覚醒障害である。本明細書中で用いられる場合、「覚醒障害」とは、最も社会的な交流を始める又はそれに応答することを持続的に欠く等の反応性アタッチメント障害である。これは、「成長障害(failure to thrive)」とか「ホスピタリズム」と呼ばれる、子供における重度な形態につながりうる。環境への興味の低下は反応性アタッチメント障害の他の要素であり、目、顔又は声の視覚的追跡の不足、対象に対しての反応の欠如として共通に顕症される。
【００６６】
ある実施態様において、精神障害は、外界に対する対人的機能及び関係の障害である。本明細書中で用いられる場合、「外界に対する対人的機能及び関係の障害」とは、他の対人関係の問題であり、その例は、同僚又は恋愛相手との問題である。これらの障害には、広汎性型の、社交上の間柄(social relationships)への無関心さ及び感情的な経験及び表現の範囲が制限されたある分裂病質性人格障害、並びに統合失調症又は鬱病も含まれる。
【００６７】
ある好適な実施態様において、精神障害は気分障害であり、特に気分変調性障害(メンタルコード 300.4、p380−1、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、 American Psychiatric Assoc.、1992)、及び他に規定のない限り鬱病(メンタル p381−2、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、 American Psychiatric Assoc.、1992);他に規定のない限り循環病及び双極性障害(メンタルコード それぞれ、301−13及び296.80、p400、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、American Psychiatric Assoc.、1992)である。
【００６８】
ある実施態様において、精神障害は性に関連する対人的活動の障害であり、本明細書中で用いられる場合、「性に関連する対人的活動の障害」とは性的な相手に対する社会的関係の障害であり、それは職業的機能(occupational functioning)の障害につながる。
【００６９】
ある実施態様において、精神障害は性障害である。本明細書中で用いられる場合、「性障害」とは性的活動に対する性的な幻想及び欲望が持続的且つ再発的に不足する又は欠くとして定義された、性的欲求低下障害(H.S.D.D. )(メンタルコード それぞれ、302.71、p543−4、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、American Psychiatric Assoc.、1992)に関連する性的及び性同一性障害を含み、そして更に性に関する不十分な感覚、例えば、不時の射精も含む。
【００７０】
ある実施態様において、精神障害は、参考文献Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、American Psychiatric Assoc.、1992による、単純恐怖症（メンタルコード300.29、p443−9）、社会恐怖症（メンタルコード300.23、p.450）強迫性障害（メンタルコード300.3、pp.456〜63）、又は急性ストレス障害（メンタルコード308.3、p471−２）である。
【００７１】
ある実施態様において、精神障害は、更に、精神的要因又は精神的要因及び一般の病状の両方もしくは一般の症状よる疼痛障害(メンタルコード 307.80、p499−503、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、 American Psychiatric Assoc.、1992)に関連する。
【００７２】
ある実施態様において、精神障害は、複数のこれら障害による症状を含んで成る。
【００７３】
本発明は、これら所定の実施態様の範囲を多少なりとも限定することはない以下の図及び例において詳細に説明されている。
【実施例】
【００７４】
実施例１:SMR1−QHNPRペプチドとNEPとの相互作用によりもたらされる機能的重要性のex vivo研究
Met−エンケファリン及びサブスタンスPの細胞外レベルにおいて外生NEP感受性ペプチドがSMR1ペンタペプチドによって保護されることの重要性の評価がラット神経組織の膜調製物及び新鮮薄片を用いてなされてきた。
【００７５】
１．   材料と方法
1.1.動物及び組織調製物
性的に成熟 (7〜9週) しているオスのWisterラット(Iffa Credo)を用いた。実験の日迄、ラットを一定の、穏和な温度(24℃)及び光サイクル(オン8時間／オフ20時間)の条件下に維持し、そして適宜エサ及び水を与えて飼った。実験の日に、ペントバルビタール(Sanofi、腹膜腔内45mg／体重kg)もしくはケタミン(Imalgene 500、Rhone Merieux、腹膜腔内150mg／体重kg)麻酔による心臓穿刺又は代わりに二酸化炭素による窒息をさせて動物を犠牲にした。
【００７６】
●新鮮組織の薄片
器官を迅速に除去し、氷上で切開し、神経繊維及び脂肪組織を取り出して、冷却酸素添加グルコース及び重炭酸含有Krebs Ringer(KRBG)溶液中で洗浄した。この溶液の組成は以下の:120mM NaCl、5mM KCl、1.2mM KH2PO4、27.5mM NaHCO3、2.6mM CaCl2、0.67mM MgSO4、5.9mMグルコースである。組織の薄片を外科用メスで手によって(1〜2mm厚)又は「Tissue Chopper」を用いて機械的に調製(1mm厚)した。次いで、薄片を反応チューブ中に分散させた。このチューブでそれらは氷冷酸素添加KRBG中での3回の連続洗浄に委ねられる。この後、すぐにそれらを酵素源として用いる迄10μMのベスタチン(膜アミノペプチダーゼ、（APN）、阻害物質、Roche)を加え、そして95％O2−5％CO2の大気環境下で酸素を含ませた同じ緩衝液中4℃で保った。
【００７７】
●膜調製物
切開して氷冷KRBG中で洗浄した器官を、4℃、pH7.2で緩衝化した10体積(体積／重量)の50mMのトリス／HCl中でテフロンガラスホモジナイザー(3×5秒)を用いて、ホモジナイズした。4℃、1,000gで5分の第１遠心により、ペレット中の組織片及び核を除去することができる。5℃、10,000gでの上清の第２遠心により膜片がペレット中に濃縮され、それを冷トリス／HCl緩衝液により表面的に3回洗浄してKontesホモジナイザーを用いて新鮮緩衝液中で再懸濁し、等量に分けて、酵素源として用いるのを待つ間、少なくとも3ケ月迄−80℃で保存する。
【００７８】
1.2タンパク質の測定
組織及び膜のタンパク質濃度を測定する為に、Bio−Rad DCタンパク質アッセイ(Bio−Rad)を用いた。Lowryアッセイ同様、前記Bio−Rad DC キットは、含有試料タンパク質とアルカリ性酒石酸銅溶液及びFolin 試薬との反応に基づく。試薬を添加した15分〜2時間後に、750nmでの吸光度を読む。BSA(ウシ血清アルブミン)標準溶液の0.2〜1.44mg／タンパク質mlの希釈により検量線を作成した。
【００７９】
1.3.NEP酵素活性の測定
1.3.1.  NEP源−基質及び阻害物質
NEPペプチダーゼ活性の分析をする実験の為に、NEPペプチダーゼ活性の研究に適切なことが知られている神経組織、即ち、ラット背部の脊髄に由来する膜及び新鮮組織薄片調製物のインキュベーションを用いてex vivoモデルを最初に作成した。侵害刺激反応のシグナリングに関わる両NEP基質、即ち、神経ペプチドMet−エンケファリン及びサブスタンスPを用いて、NEP感受性ペプチドの代謝速度を測定した。天然のMet−エンケファリン(Peninsula、10μM)及び修飾トリチウム化サブスタンスP、即ち、40Ci／mmolの比放射能を持つ〔（3,43H）Pro2−Sar9−Met(O2)11〕−サブスタンスP(MEN、12.5〜25nM)を用いた。
【００８０】
目的は、これらの基質のNEP特異的エンドタンパク質分解を測定することである。これについて、各テストでは、NEPの特異的合成阻害物質(10μMのホスホラミドン、Roche及び／又は1〜10チオルファン、Sigma)の存在下及び不在下、並びに全ての場合APNの阻害物質ベスタチン(10μM)の存在下で基質の加水分解を分析した。更にSMR1−QHNPRの機能的役割を調べる為に、SMR1ペプチドが単独で存在する場合の反応又はQHNPRペプチドをそのC末端で解裂することによって不活性化できる膜ペプチダーゼの特異的阻害物質、即ち、カルボキシペプチダーゼBの阻害物質(GEMSA、10μM、Sigma)及びジペプチジルペプチダーゼIVの阻害物質(DPPIV阻害物質、10μM、Roche)とを組み合わせたSMR1ペプチドの存在下での反応を行った。
【００８１】
1.3.2.酵素活性アッセイ
●新鮮組織の薄片
先ず、10μMのベスタチン含有するKRBG培地中で、NEP阻害物質の存在下又は不在下において25℃、30℃、又は37℃で水浴を一定に動揺させ且つ95％O2−5％CO2の大気環境下で新鮮組織切片の前インキュベーションをする。前インキュベーション時間(15分)の最後で、培地を新鮮培地と交換する。その新鮮培地は基質を単独で含む又はNEP阻害物質もしくはSMR1−QHNPRと組み合わせて基質を含んでいる。そして、前インキュベーションと同じ条件でインキュベーションを行う。インキュベーション時間(5〜30分)の最後で、HClの最終濃度が0.1Nになるようにその培地を塩酸が含まれている氷冷チューブに培地を移す。試料を、それらの完全な基質及びその代謝産物含量を測定する時迄−30℃で保存する。
【００８２】
インキュベーションの温度及び時間、並びに基質及び組織酵素の濃度を、例えば、初速度条件下で測定されるNEP加水分解活性の結果に従い決定する。
【００８３】
●膜調製物
pH7.2で緩衝化してそして10μMのベスタチンを含有する50mMのトリス／HCl中で、NEP阻害物質の存在下又は不在下において25℃、30℃又は37℃で水を一定に動揺させながら膜調製物を前インキュベートする。前インキュベーション時間(10分)の最後で、基質を単独で又はNEP阻害物質もしくはSMR1−QHNPRと組み合わせて加え、そして前インキュベーションと同じ条件でインキュベーションを行う。インキュベーション時間の最後で、冷やして４℃にすること、及び塩酸、HClの最終濃度が0.3NなるようにHClを加えることによって反応を停止させる。試料の完全な基質及びその代謝産物含量を測定する時迄それらを−30℃で保存する。
【００８４】
インキュベーションの温度及び時間、並びに基質及び組織酵素の濃度を、例えば、初速度条件下で測定されるNEP加水分解活性の結果に従い決定する。
【００８５】
1.3.3.基質及びその代謝産物の検出
完全な基質及びその代謝産物を、分離、検出及び定量化する為に、 (基質を放射性同位体標識するかどうかによる) 様々な方法を用いた。反応産物を選択的に単離する為の逆相クロマトグラフィー(C−18 Sep−Pakカートリッジ及びRP−HPLC)の原理に２つは基づいており、そして第3は、ラジオイムノアッセイ(RIA)による基質の特異的検出に基づく。
【００８６】
●C−18 Sep−Pakカートリッジ
C−18 Sep−Pakカートリッジ(Waters)を用いて放射性同位体標識したペプチドの加水分解を分析した。そのカートリッジは、それらの極性の違いにより化合物を分離する。このような 固相抽出方法により基質をその代謝産物から単離することが可能になる。その理由は、完全ペプチド基質に比べて、ペプチド代謝産物は疎水特性が減少していること又は失われてさえもあることにある。
【００８７】
放射性同位体標識されたサブスタンスPの3H−代謝産物を2つの段階で溶出させる。即ち、一つは、H2O−0.1％TFAによる段階であり、第2の段階は、20％メタノール−0.1％TFAによる段階である。一方で、完全3H−サブスタンスPは、70〜100％メタノール−0.1％TFAによる第3の段階において溶出される。溶出及び単離した化合物の放射能を液体シンチレーション分光分析によって決定する。
【００８８】
●RP−HPLC(逆相高性能液体クロマトグラフィー)
HPLCは非常に分解力のある方法であり、分光光度計による分析と組み合わせることによって、少なくともその濃度が1〜10μMの非放射能ペプチドを単離及び検出できる。C−18 RP−HPLCはC−18 Sep−Pakカートリッジと同じ原理に基づいている。クロマトグラフィーによる分析を用いてMet−エンケファリンの加水分解を調べた。直径5μmのビーズが詰まっているC−18LUNA分析カラム(内径150×4.6mm、AIT)によってその分析を行った。
【００８９】
H2O−0.1％TFAから100％アセトニトリル−0.1％TFAの幅の1段階30分の線形勾配で、1ml／分の流速で行ったRP−HPLCにより、二つのMet−エンケファリン代謝産物と完全基質の溶解分離(resolutive separation)がもたらされる。それらの同定及び相対定量(ピークの高さ)をカラム流出物の254nmでのUV吸収率を連続的にモニタリングすることによって確認した。
【００９０】
●RIAアッセイ(ラジオイムノアッセイ)
RIAは微量分析法であり、それにより濃度が１〜100nM又はそれ未満の化合物の定量が可能になる。本明細書中では、競合的RIA系を用いてきた。即ち、標準溶液又は試料中に含まれる抗原の量に反比例して減少する態様で抗体に対して結合する量の放射能抗原を用いてきた。免疫沈降によって遊離放射性抗原は放射性抗原―抗体複合体から分離する。
【００９１】
初期Met−エンケファリン基質の消失を定量化することによってエンケファリナーゼNEPの活性をモニタリングした。Met−エンケファリンのC−末端に対して向けられたウサギの抗体(代謝産物又は他のペプチドとの交差反応性は1％) (Gorosら、J.Neourochem.（1978）,31; pp.29〜39 .Radio immunoassay of methionine and leucine enkepharins in reagion  of rabbit brain and comparison with endorphins estimated by a radioreceptor assay )が用いた第1抗体である。第2抗体は、ウサギイムノグロブリンに対して向けられたウマの抗体である。放射性同位体標識した抗原は、3000Ci／mmolと見積もられた非放射能を有するヨウ化Met−エンケファリン(125I−Met−Enk エンケファリン)である。
【００９２】
pH8.6で緩衝化し且つ0.1％BSA及び0.1％Triton X100を含有する100mMのトリス／HCl中でMet−エンケファリンRIAを手早く行った。標準(1〜100nM)又は試料(100μM)、希釈された抗Met−エンケファリン抗体(100μl、1／2000)及び125I−Met−Enk(10000cpm、100μl)を4℃で一晩インキュベーションした。ポリエチレングリコール6000(6％)の存在下での第2抗ウサギ免疫グロブリンによる免疫沈降によって、結合した断片と遊離断片を分離した。遠心後、γ分光光度計を用いて沈殿物の結合放射能を定量した。
【００９３】
2.結果
SMR1−QHNPRペプチドがNEP酵素活性を阻害する役割を特定する為には、初速度測定条件下でサブスタンスP又はMetエンケファリンペプチドの加水分解を実行可能にする実験プロトコールを最初に作成することが欠かせない。
【００９４】
2.1.NEPエンドペプチダーゼ活性の初速度を測定する為の実験条件の探索
2.1.1.天然Met−エンケファリンの加水分解
一連の実験において、脊髄組織の薄片及び膜調製物をそれぞれ、30℃、最終体積1mlのKRBG、及び37℃、最終体積0.25mlの50mM、pH7.2のトリス／HCl中でインキュベートした。
【００９５】
●RP−HPLC分析
RP−HPLCクロマトグラフィー系の較正により明らかになることは、マーカーのMet−エンケファリンは保持時間18.8分で溶出することである。試料の場合、NEP特異的阻害物質の存在下でその高さが著しく増加するピークを同定する。保持時間が18.8±0.2分であるこのピークは完全Met−エンケファリン基質に対応する。逆に、5.8±0.2分及び12.8±0.1分の保持時間を有する2つのピークは、代謝産物Tyr−Gly−Gly及びPhe−Metにそれぞれ対応し、NEP阻害物質の不在下で表れる。このような結果により示されることは、脊髄組織の酵素が基質を主にペプチドのGly3−Phe4アミド結合で解裂していることであり、その解裂は、既述のエンケファリナーゼ活性に対応するものである。
【００９６】
膜調製物並びに新鮮組織切片のレベルでは、37℃、10分間のインキュベーションで外生Met−エンケファリンの高いNEP特異的加水分解が確認された。即ち、脊髄エンケファリナーゼ活性によりMet−エンケファリンピークの消失が招かれた。そしてそれは10μMのホスホラミドン又は１μMのチオルファン(80〜90％の阻害率)の存在下では逆転する。加えて、これらの条件下では、両方の特異的NEP阻害物質は確かに、37℃で10分〜30分の時間に渡るインキュベーションでエンケファリナーゼ活性をほぼ完に阻害する。
【００９７】
故に、温度37℃でのインキュベーションの10分以内で明らかに最大加水分解に到達した。次の実験では、インキュベーションの温度を30℃〜25℃に漸進的に下げた。事実上、新鮮組織薄片を30℃でインキュベートする代わりに、Met−エンケファリンの加水分解レベルを時間(0〜30分)により高めた。同様の方法において、膜調製物を30℃でインキュベートする代わりに、酵素濃度(0〜2mg／ml)に関連して加水分解のレベルを高める事にも気付くことができる。しかし、明らかな関係を確認できなかった。
【００９８】
確かに、分光高度解析と結びつけたHPLCクロマトグラフィーは半定量的な方法であり、そしてピークの高さ及びエリアの単一測定は、定量的に比例関係を計算するのに十分な正確さがない。その結果、Met−エンケファリンを正確に定量する為に、特異的な定量的RIA検出を用いた。
【００９９】
2.1.2修飾トリチウム化サブスタンスPの加水分解
神経組織に含まれるNEPにより加水分解される基質、Met−エンケファリン及びサブスタンスPの初速度測定の条件下での研究を可能にする実験パラメーターを確立した。
【０１００】
そのような観点において、30℃でのインキュベーションの15分後、サブスタンスP(25nM)の加水分解のレベルに対する、ラット脊髄の膜タンパク質濃度(最終濃度、0.03〜1mg／ml)の影響を最初に調べた。図1−Aに示したように、3H−サブスタンスPが分解するレベルを初期基質濃度の％で表した。膜タンパク質濃度に対して比例的に、一次関数(linear related-function)において2〜25％増加する。10μMのホスホラミドンの不在下r＝0.98、n＝7、存在下r＝0.99、n=7での密接な相関性が確認された。更に同様の実験条件下でホスホラミドンを添加することにより、サブスタンスPの分解が明らかに減少(外生ペプチドの50〜65％保護)する。
【０１０１】
同様に、25℃でのインキュベーション時間(5〜20分)の関数としてサブスタンスP(12.5nM)が加水分解するレベルも調べた。選択した膜タンパク質の濃度は1mg／mlであった。脊髄膜によるサブスタンスPの異化作用はインキュベーション時間と共に直線的に増加し、r＝0.97、n＝18の密接な相関性を有する (図1−B)。サブスタンスPをも解裂する、アンギオテンシン転換酵素(ACE)の有力な阻害物質、カプトプリル(Captopril)(10μM)は、膜調製物酵素の活性に影響を及ぼさず、並びにCPB及びDPPIV酵素の有力な阻害物質(C末端SMR1−QHNPRによる有力な異化作用の保護化合物)に対する影響を持たない。
【０１０２】
従って、脊髄組織含有NEPによるサブスタンスPの加水分解を初速度測定する条件が見かけ上確立される。しかし、両NEP阻害物質(ホスホラミドン及びチオルファン)の活性は、インキュベーション持続時間の関数として見かけ上比例的安定性が無い。よって、SMR1−QHNPRペプチドのNEP活性に対する作用は、インキュベーションの時間に対して体系的に調べられるのが良いだろう。
【０１０３】
2.1.3.記録
初速度測定の条件下で、Met−エンケファリン及びサブスタンスPの脊髄組織によるex vivoでの異化作用の研究を可能にする実験条件を、下記の表に報じている。
【表１】
2004532181.tif 000002
【０１０４】
2.2 SMR1−QHNPRペプチドとNEPとの相互作用からもたらされる機能的重要性の研究
2.1.1 NEP脊髄によるMet−エンケファリンの分解
2.1.3章で定義した実験条件下で、脊髄薄片のMet−エンケファリナーゼ活性に対する、定濃度のSMR1−QHNPR(10μM)の影響を最初に調べた。
【０１０５】
●RP−HPLC分析
図2−Bに示すように、25℃でのインキュベーションの20分以内で脊髄薄片によりMet−エンケファリン基質は非常にNEP特異的に加水分解されることが、HPLC分析によりわかる。10μMの濃度でホスホラミドンは確かにMet−エンケファリナーゼ活性を完全に阻害し、そしてチオルファン(10μM)の添加によりMet−エンケファリン分解が明らかに80％減少した。
【０１０６】
同様の実験において、10μMの濃度でQHNPRペプチドは、単独又はCPB及びDPPIVプロテアーゼの阻害物質との組み合わせで、70％又は80％の阻害活性を有する。従って、SMR1ペンタペプチドはエンケファリンペンタペプチドと両方が等濃度において、NEP結合部位に対する競合状態に入ることができる。脊髄膜調製物によりサブスタンスPが分解される場合、CBP及びDDPIVの阻害物質単独では、新鮮脊髄薄片によるMet−エンケファリン分解に対する任意の固有阻害活性を持たない。更に、それらは見かけ上は、新鮮脊髄組織の薄片に潜在するペプチダーゼ活性からSMR1−QHNPR自身を、特にそのC末端で、保護する為に必要ではない。
【０１０７】
NEP活性及び阻害性を細かく定量する為に、特異的Met−エンケファリンRIAを用いて同様の実験の分析を行った。
【０１０８】
●RIAアッセイ
概して、逆相HPLC法よって得られた生の結果はRIAアッセイにより得られたもの (図2−A) により裏付けられる。25℃でのインキュベーションの20分内で、NEP分解活性からMet−エンケファリンを保護する為の非常に有力な化合物としてホスホラミドン、チオルファン、並びにSMR1−QHNPRが考えられる。従って、新鮮脊髄組織による10μMのMet−エンケファリンの分解をそれらは10μMの濃度で殆ど完全に妨害した。それぞれ96％、100％、及び96％の保護率であった。
【０１０９】
結論として、これら全ての結果により、ex vivoでラット神経組織のMet−エンケファリナーゼ活性に対してSMR1−QHNPRペプチドにより発揮される負の調節の役割が示される。
【０１１０】
2.2.2  NEP脊髄によるサブスタンスPの分解
●SMR1−QHNPR、サブスタンスPの異化作用に対するNEP活性の阻害物質
第一に、Met−エンファリンに対して既に行ったように、サブスタンスPの加水分解に対するQHNPRペプチドの作用を調べた。その為に、2.1.3で定義した初速度測定の条件下で、脊髄薄片を用いて時間30分に渡るインキュベーション時間での反応を行った。
【０１１１】
図3−Aに示すように、事実上、初速度条件下でサブスタンスPの加水分解反応を行う。即ち、サブスタンスPの加水分解の％と25℃でのインキュベーション時間との間でr＝0.99の緊密な関係が確認された。10μMのホスホラミドン又は10μMのチオルファンは比較的同様の阻害活性(60〜65％の阻害率)を示す。QHNPRペプチド(10μM)は、有効な阻害物質であることが分かった。即ち、それが単独である場合に、サブスタンスP分解の阻害率は75％であり、更に、それをGEMBA（10μM）及びDPPIV(10μM)阻害物質と組み合わせた場合には阻害率は90％超である。しかし、これら後者のものは新鮮脊髄組織によるサブスタンスP分解の固有の阻害活性を見かけ上示す。
【０１１２】
他方、この実験において、阻害物質による作用は、30分に渡るインキュベーション時間の間の関数として比較的に安定(r＝0.99)している。
【０１１３】
●IC50の決定
脊髄膜調製物による3H−サブスタンスP分解に対するSMR1−QHNPR阻害作用の用量反応曲線を図３−Bの右のパネルに示す。これにより約1.10−7MのIC50値(3H−サブスタンスPの分解を半減させる阻害物質の濃度)の計算が可能になる。同様の実験において、ホスホラミドンとの比較により明らかになったことは、SMR1−QHNPRによる外生サブスタンスPの保護はホスホラミドンにより得られた保護(図、3−B  左のパネル)と尚等しいことである。更に、QHNPRペプチドをCPB及びDPPIVの阻害物質と組み合わせることにより、ホスホラミドンによって示されるよりも非常に高いNEP阻害活性が示される(図3−B、左のパネル)。
【０１１４】
2.2.3.記録
クロマトグラフィー分析と共にトリチウム化基質(サブスタンスP)を用いて、又は特異的RIA定量と共に天然基質(Met−エンケファリン)を用いてNEP感受性ペプチドの代謝速度を測定した。NEP酵素活性の初速度測定条件下で、SMR1−ペンタペプチドを添加することにより、外生Met−エンケファリン又はサブスタンスPの異化作用がほぼ完全に阻害されることが確認された。即ち、脊髄組織によるサブスタンスPの分解を半減させるSMR1−QHNPRの濃度は、1.10−7Mであると計算され、そしてその阻害効率は、２つの周知のNEP特異的阻害物質、チオルファン及びホスホラミドンに等しい。これらの結果より、ex vivoで、見かけ上SMR1−ペンタペプチドは、脊髄疼痛認知の調節に関係する両神経ペプチド、例えば、サブスタンスP及びMet−エンケファリンのNEP誘導分解を効率的に妨げるようである。
【０１１５】
実施例２:行動断念テスト(Behavioral Despair test)におけるSMR1−QHNPRペプチドの抗鬱作用
体重300〜320ｇのオスのWistar／AF EOPSラット(Iffa−Credo Breeding Centre、69−St−Germain sur l´Arbresle、France)を14匹用いた。到着時にラットを標識してランダムに一組ずつF型のポリカーボネートゲージ(48×27×20cm、U.A.R.、91−Epinay−Sur−Orge、France)に振り分けた。22〜24℃の温度に空調管理された動物小屋で動物を飼った(stabled)。ラットに飼料(M25 croquettes、Ets pietrement、77−Provins、France)及び飲料を適宜与えて、12時間の明−暗サイクルに委ねた。
【０１１６】
実験室条件による１週間の馴養(familiarization)の後、ラットの体重を量り、そしてランダムに3つの処理グループ(n=12)に分けた。様々なグループのラットは同じように扱いそして同じ条件下においてよい。
【０１１７】
２つのセッション:
−15分のテストセッション;
−24時間後に行われる5分の再テストセッション;
に渡り行動断念テストを行う。
【０１１８】
テストセッションの間、 (25℃の水が入っている直径20cm及び高さ50cmの)Plexiglas シリンダー中でラットに遊泳をさせて、その行動を15分に渡り記録した。テストの最後で、ラットを水から移して穏やかに乾かし、次いでそれらの住まいのケージへと戻した。
【０１１９】
24時間後の再テストの間、ラットを再度水中に置いて、その行動を5分に渡り記録した。
【０１２０】
テスト及び再テストの両方の最初の動かない5分の間の変動を記録した。
【０１２１】
ペプチドFG−005(SMR1−QHNPR)を500μg／0.1Nの酢酸5mlの割合で懸濁し、そして50及び100μg／kgの用量で静脈経路を介して、ラットの背面仙骨静脈(dorsal caudal vein)へとテスト直後及び翌日の再テストの300分及び5分前に投与をする為に、PBSで希釈した。
【表２】
2004532181.tif 000003
【０１２２】
階乗測定におけるANOVAを用いて、グループ間での異質性の存在を特定した。両側確率に対応するt検定(bilateral probability paired t test)を用いて、各グループのテストと再テストのものの、不動時間2つを比較した。平均値±標準誤差(SEM)として結果を表した(図4)。Statview5及びDeltaGraphic（登録商標）Pro3.5ソフトウェアを用いて統計的及びグラフ的処理を行った。
【０１２３】
分散分析〔F(3.36)＝1.57;N.S.〕は、任意の処理をする前のテスト１の間の様々なグループに関して不動時間の異質性は無いことを示し、そして処理後にこれらの不動時間の中では異質性があること〔F(3.36)＝13.12;p＜0.001〕を明らかにする。
【０１２４】
両側確率に対応するt検定により示されたことは、コントロールのラットは、テストの間の不動時間に比べて再テストの間の不動時間を有意に増加することである。反対に、8−OH−DPATによる処理をしたラットでは、それらの再テスト間の不動時間が前記テストの間の不動時間に比べて有意に減る。
【０１２５】
50μg／kgの用量のFG−005で処理したラットの再テストの間の不動時間は増加し、そして100mg／kgの用量で処理したものの不動時間は減った。しかしながら双方の場合において、この違いは統計的に有意では無い(NS)。
【表３】
2004532181.tif 000004
【０１２６】
我々の実験条件下で、コントロールラットの再テストの間の不動時間はテストの間の不動時間に比べて有意に長い。これにより明らかに分かることは、ラットの断念であり、それは、もはや雨の水のある環境(rainy aquatic environment)へと逃げようとはしないことである。
【０１２７】
意気消沈(depression)テストの直後、並びに次の日の再テストの300及び5分前に、静脈内に、50μg／kg及び100μg／kgの用量でペプチドFG−005による処理をしたラットは再テストの間のそれらの不動時間が増加しなかった。２セッションの間、２グループのラットは等しい遊泳活性を示す。行動上の断念をラットが示さないので、前記ペプチドFG−005は、ラットにおいて抗鬱作用を有すると考えられる。対象物質として用いた8−OH−DPATは有意な抗断念作用を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１−Ａ】合成NEP阻害物質のホスホラミドン10μMの存在下又は不在下でのサブスタンスP(25nM)に対する脊髄膜タンパク質濃度の影響である。各々の点が示すのは、最終体積250μlのトリス／HCl緩衝液中30℃で、15分のインキュベートで脊髄膜による加水分解を受けた3H−サブスタンスPの％である。
【図１−Ｂ】最終濃度10μMでの様々なペプチダーゼ阻害物質の存在下又は不在下でのラット脊髄膜調製物によるサブスタンスP(12.5nM)の加水分解の時間経過である。ペプチダーゼ阻害物質は、ACE阻害物質のカプトリトル、CPB及びDPPIV阻害物質のGEMSA及びDPPIV阻害物質である。各々点が示すのは、最終体積250μlのトリス／HCl緩衝液中25℃でのインキュベーションで膜タンパク質250μgにより加水分解された3H−サブスタンスPの％である。
【図２】最終濃度10μMでの様々なペプチダーゼ阻害物質の存在下又は不在下での脊髄薄片中でのMet−エンケファリン活性である。ペプチダーゼ阻害物質は、NEP阻害物質のホスホラミドン、NEP阻害物質のチロファン、CPB及びDPPIV阻害物質のGEMSA及びDPPIV阻害物質、SMR1−QHNPR単独又はCPB及びDPPIV阻害物質と組み合わせたSMR1−QHNPRである。コントロールは、組織薄片の不在下でのMet−エンケファリン回収率を示す。2−A :最終体積1mlのKRBG緩衝液中で1mgの新鮮組織薄片と共に25℃でのインキュベーションの20分後に回収してRIA分析によって測定された完全及び免疫反応性Met−エンケファリンの濃度(μM)を示す値(測定2回の平均)である。２−B : 最終体積1mlのKRBG緩衝液中で1mgの新鮮組織薄片と共に25℃でのインキュベーションの20分後に回収してRP−HPLC分析(保持時間18.9分でのピーク高さ)によって決定された完全Met−エンケファリンの量(測定2回の平均)を示す値である。
【図３−Ａ】最終濃度10μMでの様々なペプチダーゼ阻害物質の存在又は不在下でのラット脊髄薄片によるサブスタンスP(25nM)の加水分解である。ペプチダーゼ阻害物質は、NEP阻害物質のホスホラミドン、NEP阻害物質のチロファン、CPB及びDPPIV阻害物質のGEMSA及びDPPIV阻害物質、SMR1−QHNPR単独又はCPB及びDPPIV阻害物質と組み合わせたSMR1−QHNPRである。コントロールは、組織薄片不在下での3H−サブスタンスPの加水分解を示す。各点が示すのは、組織薄片不在下での、最終体積1mlのKRBG緩衝液中25℃でインキュベーションした１mgの新鮮組織薄片より加水分解された3H−サブスタンスPの％である。
【図３−Ｂ】ラット脊髄膜調製物による異化作用を受けた3H−サブスタンスP(12.5nM)のSMR1−QHNPRによる濃度依存性阻害である。NEP阻害物質の、ホスホラミドン、及びCPB及びDPPIV阻害物質の、GEMSA＋DPPIV阻害物質の比較である。QHNPRペプチド単独又はCPB及びDPPIV阻害物質と組みあわせたQHNPRペプチドによって発揮された阻害活性の比較である。各点が示すのは、250μlのトリス／HCl緩衝液中25℃で、250μgの膜タンパク質とのインキュベーション10分後の完全体3H−サブスタンスPの平均回収率(％)(測定２回の平均)である。
【図４】行動断念テストにおける、テスト及び再テストの間の不動の時間のグラフを示す。
【図１Ａ】
2004532181.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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