(57)【要約】ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）をコードするポリヌクレオチド、およびそれを得るための方法を提供する。さらに、原核生物および／または真核生物宿主細胞における発現を可能にする発現制御配列に作用可能に連結した上記ポリヌクレオチドを含むベクターを記載する。さらに、上記ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの抗体、およびそれらの生成方法を提供する。さらに、宿主細胞、植物細胞、植物組織または植物における本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を含む、アセチルＣｏＡ合成を高めるための方法、ならびに脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、ろうエステル、（多）糖類および／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸もしくはケトン体）の生成方法を記載する。ＰＮＯを活性化または阻害可能な化合物の同定方法も記載する。さらに、上記阻害化合物および抗体を含む医薬組成物を記載する。さらに、上記ポリヌクレオチドおよびベクターを含むトランスジェニック植物、植物組織および植物細胞を記載し、同じくアセチルＣｏＡ代謝産物（例えば脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、（多）糖類、ろうエステルおよび／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体））、ならびに医薬組成物の生成における上記ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、抗体および／または本発明の方法により同定された化合物の使用を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｌ）および（ａ）〜（ｌ）のいずれか１つの相補鎖からなる群より選択される核酸分子を含むポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列ＴＳＧＰＫＰＡＳＸＩ（配列番号６）、ＴＳＧＰＫＰＡＳＸＩＥＶＳＸＡＫ（配列番号７）またはＡＡＡＰＳＧＮＸＶＴＩＬＹＧＳＥＥＧＮＳ（配列番号８）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドではない、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１または３（図５）に示すポリペプチドの成熟型を少なくともコードする核酸分子；
（ｂ）配列番号２（図５）に示すコード配列を含み、該ポリペプチドの成熟型を少なくともコードする核酸分子；
（ｃ）ヌクレオチド配列が（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列に対して遺伝子コードの縮重したものである核酸分子；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドのアミノ酸配列の１つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加により、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドからもたらされるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｅ）（ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と配列が６０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの核酸分子によりコードされるポリペプチドの断片もしくはエピトープ担持部分を含み、かつアセチル−ＣｏＡ合成調節活性を有する核酸分子；
（ｇ）配列番号４および５に示すプライマーを用いてミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）核酸ライブラリーから増幅された核酸分子の配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子；
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つにコードされるポリペプチドのピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性断片、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ活性断片、および／もしくはＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性断片をコードする核酸分子；
（ｉ）（ａ）もしくは（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子；
（ｊ）（ａ）〜（ｈ）のいずれか１つの核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して産生された抗体に認識されるピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のいずれか１つの核酸分子の配列を有するプローブを用いて適切なライブラリーをストリンジェントな条件下でスクリーニングすることにより得られ、かつＰＮＯ活性を有する核酸分子；
（ｌ）（ａ）もしくは（ｋ）のいずれか１つの核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする相補鎖を有し、かつＰＮＯ活性を有する核酸分子。
【請求項２】
ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
シグナル配列をコードする核酸配列に作用可能に連結した、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記シグナル配列が、プラスチド（ｐｌａｓｔｉｄａｌ）輸送シグナル配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチドをベクターに挿入することを含む、組換えベクターの作製方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチドを含むか、請求項５の方法により作製される、組換えベクター。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが発現制御配列に作用可能に連結された、原核生物または真核生物宿主細胞におけるその発現を可能とする、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６または７のベクターを宿主細胞に導入することを含む、組換え宿主細胞の作製方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチドまたは請求項６または７のベクターにより遺伝子操作された、宿主細胞。
【請求項１０】
大腸菌、バキュロウイルス、アグロバクテリウム、または植物細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９または１０の宿主細胞を培養すること、および前記ポリヌクレオチドによりコードされ、該宿主細胞により該培養物または該宿主細胞から発現されるポリペプチドを回収することを含む、ＰＮＯ活性を有するポリペプチドを生成するためのプロセス。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するか、請求項１１のプロセスにより得ることができる、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項１４】
（ａ）〜（ｌ）のいずれか１つの相補配列を含む、アンチセンス核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、または請求項６もしくは７のベクターを植物、植物組織もしくは植物細胞のゲノムに導入することを含む、トランスジェニック植物、植物細胞または植物組織の作製方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクターを含むか、または請求項１５の方法により得ることができる、植物細胞。
【請求項１７】
請求項１６の植物細胞を含む、トランスジェニック植物または植物組織。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターの存在下で、改変型アセチル−ＣｏＡ合成を有する、請求項１７に記載のトランスジェニック植物または植物組織。
【請求項１９】
請求項９の宿主細胞を得ること、または請求項８の方法のステップを含み、さらに請求項１２のポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡ合成をモジュレートする方法。
【請求項２０】
前記発現されたポリペプチドが細胞のプラスチドに局所化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１６もしくは１７の植物、植物組織もしくは植物細胞を得ること、または請求項１５の方法のステップを含み、さらに請求項１２のポリペプチドの発現を可能にする条件下で該植物、植物組織もしくは植物細胞を培養することを含む、植物、植物組織もしくは植物細胞においてアセチル−ＣｏＡ合成をモジュレートする方法。
【請求項２２】
前記アセチル−ＣｏＡ合成が増大している、請求項１７または１８のトランスジェニック植物、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１９〜２０のいずれか１項の方法。
【請求項２３】
脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、ろうエステル、（多）糖類、および／またはポリヒドロキシアルカノエートの合成が増大している、請求項１６、１７もしくは２２のトランスジェニック植物、請求項９もしくは２２の前記宿主細胞、または請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法、。
【請求項２４】
請求項１６の植物細胞を含む、請求項１７、１８、２２または２３のトランスジェニック植物の収穫可能部分。
【請求項２５】
請求項１６の細胞を含む、請求項１７、１８、２２または２３のトランスジェニック植物の増殖物質。
【請求項２６】
請求項１９〜２２のいずれか１項の方法のステップを含むこと、さらに細胞、培養物、植物または組織から該化合物を単離することを含む、脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、および／またはポリヒドロキシアルカノエートの生成方法。
【請求項２７】
脂肪酸、カロテノイド、ヘキソース、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、および／またはポリヒドロキシアルカノエート生成細胞、組織および／または植物を作製するための、請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクター、または請求項１２のポリペプチドの使用。
【請求項２８】
（ａ）請求項１２のポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させること；
（ｂ）ＰＮＯ活性をアッセイすること；
（ｃ）ＰＮＯ活性を、該候補化合物の不在下で得られる標準的応答と比較し；標準を上回る高いＰＮＯ活性は該化合物がアゴニストであることを示し、低いＰＮＯ活性は該化合物がアンタゴニストであることを示すこと、
を含む、ＰＮＯ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法により同定される化合物。
【請求項３０】
請求項１２のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストである請求項２８の方法により同定された、化合物。
【請求項３１】
請求項２９または３０の化合物を特異的に認識する抗体。
【請求項３２】
ＰＮＯ活性を活性化または阻害する化合物を同定および／または生成するための、請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクター、請求項１２のポリペプチド、請求項１３もしくは３１の抗体、または請求項２９もしくは３０の化合物の使用。
【請求項３３】
アンタゴニストとして請求項１４のアンチセンス核酸分子、請求項１３もしくは３１の抗体、または請求項３０の化合物、および任意に製薬上許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
寄生生物感染の治療用の医薬組成物の調製のためのアンタゴニストとしての、請求項１４のアンチセンス核酸分子、請求項１３もしくは３１の抗体、または請求項３０の化合物の使用、
【請求項３５】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクター、請求項９、２２もしくは２３の宿主細胞、請求項１２のポリペプチド、請求項１４のアンチセンス核酸、請求項１３もしくは３１の抗体、請求項１６の植物細胞、請求項１７、１８、２２もしくは２３の植物もしくは植物組織、請求項２４の収穫可能部分、請求項２５の増殖物質、または請求項２９もしくは３０の化合物を含むキット。
【請求項３６】
請求項２８の方法のステップ、および
（ａ）  ステップ（ｃ）において同定された化合物を製薬上許容可能な形態に剤形化すること
を含む、医薬組成物の生成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）をコードするポリヌクレオチド、およびそれを得るための方法を提供する。さらに、原核生物および／または真核生物宿主細胞における発現を可能にする発現制御配列に作用可能に連結した上記ポリヌクレオチドを含むベクターを記載する。また、上記ポリヌクレオチドにコードされたポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、およびそれらの生成方法を提供する。宿主細胞もしくは植物細胞、植物組織、または植物において本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現させることを含む、アセチルＣｏＡ合成を高める方法、ならびに脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、ろうエステル、（多）糖類および／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸もしくはケトン体）の生成方法をさらに記載する。ＰＮＯを活性化または阻害可能な化合物の同定方法も記載する。さらに、上記阻害化合物および抗体を含む医薬組成物を記載する。さらに、上記ポリヌクレオチドおよびベクターを含むトランスジェニック植物、植物組織および植物細胞、ならびにアセチルＣｏＡ代謝産物（例えば、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、（多）糖類、ろうエステルおよび／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体））、ならびに医薬組成物の生成における、本発明の方法により同定された上記ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、抗体および／または化合物の使用を記載する。
【０００２】
本明細書の本文においていくつかの文献を、名前または完全な参照のいずれかを記して引用する。参考文献の完全な参照は本明細書の終わりに記載する。本明細書で引用する各文献（製造元の仕様書、指示書等を含む）は、参照により本明細書に援用するが、どの文献についても実際に本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【０００３】
発明の背景
細胞において自然に生じる代謝プロセスの特定の産物および副産物は、食品、飼料、化粧品および医薬品業界を含む幅広い業界において利用価値がある。これらの分子（集合的に「精製化学物質」と呼ぶ）は、例えば、脂質、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂肪酸、ろうエステル、（多）糖類、ポリヒドロキシアルカノエート、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸、および／またはケトン体、および／または補因子を含む。精製化学物質は、１つ以上の所望の分子を大量に生成および分泌するように開発された微生物の大規模培養により、微生物において生成できる。
【０００４】
これらの生成は、１つ以上の所望の分子を大量に生成および／または分泌するように開発された微生物の大規模培養により最も都合よく行われる。株選択により、一連の所望の化合物を生成するそれぞれの微生物の多数の変異株が開発されてきた。しかし、特定の分子の生成のために改善された株の選択は、時間がかかり、難しいプロセスである。
【０００５】
あるいはまた、精製化学物質の生成は、上記精製化学物質の１つを生成するように開発された植物の大規模生成により最も都合よく行われる。この目的のために特によく適した植物は、ナタネ、カノーラ、アマニ（ｌｉｎｓｅｅｄ）、ダイズおよびヒマワリなど、多量の脂質化合物を含む脂肪種子植物である。しかし、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、（多）糖類、ろうエステルおよび／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体）を含有する他の穀物植物も、本発明の詳細な説明で記載するように良く適している。従来の繁殖により、一連の所望の脂質および脂肪酸、カロテノイド、補因子、ならびに酵素を生成する多数の変異型植物が開発されてきた。
【０００６】
生物学的プロセスによる（例えば、精製化学物質を生成する微生物、細胞もしくは植物の培養による）精製化学物質の生成は、該化合物を生成するための遊離体（ｅｄｕｃｔ）（例えば、アセチルＣｏＡ）の濃度が低いことが多いために限定される。
【０００７】
最近、精製化学物質生成（特に脂肪酸および脂肪）の効率を高めるためのいくつかの分子生物学的アプローチが開発されている。一部の報告は、高い脂肪酸量を得るためのアセチルＣｏＡ生成の増加を記載している。
【０００８】
ＷＯ ００／００６１４は、細胞においていくつかの酵素（すなわち、アセチルＣｏＡシンターゼ、プラスチドピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ）を過剰発現させて、植物中のアセチルＣｏＡ含量を変化させることを報告している。ＷＯ ００／１１１９９は、植物における脂肪酸およびカロテノイドの生合成を高めるためにアセチルＣｏＡシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む組成物を記載する。
【０００９】
従って、本発明の根底にある技術的課題は、精製化学物質（例えば、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、（多）糖類、ろうエステルおよび／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、例えば、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体））の効率的な生物学的生成のための、このような生成の費用を抑えることができる代替的な（好ましくは有利な）手段および方法を提供すること、ならびに多量の精製化学物質（特に、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、（多）糖類、ろうエステルおよび／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、例えば、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体））を合成する微生物、細胞、または植物を提供することである。
【００１０】
この技術的課題の解決は、請求の範囲により特徴付けられる実施形態を提供することで達成される。
【００１１】
従って、本発明は：
（ａ）  配列番号１もしくは３（図５）に示す成熟型のポリペプチドを少なくともコードする核酸分子；
（ｂ）  成熟型のポリペプチドを少なくともコードする、配列番号２（図５）に示すコード配列を含む核酸分子；
（ｃ）  （ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果、ヌクレオチド配列が縮重した核酸分子；
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドのアミノ酸配列の１つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加により、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから誘導されたポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｅ）  （ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と配列が６０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｆ）  （ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの核酸分子によりコードされるポリペプチドの断片もしくはエピトープ担持部分を含み、かつアセチル−ＣｏＡ合成調節活性を有する核酸分子；
（ｇ）  配列番号４および５に示すプライマーを用いてミドリムシ核酸ライブラリーから増幅された核酸分子の配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子；
（ｈ）  （ａ）〜（ｇ）のいずれか１つにコードされるポリペプチドのピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性断片、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ活性断片、および／もしくはＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性断片をコードする核酸分子；
（ｉ）  （ａ）もしくは（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子；
（ｊ）  （ａ）〜（ｈ）のいずれか１つの核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して生じさせた抗体に認識されるピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｋ）  （ａ）〜（ｊ）のいずれか１つの核酸分子の配列を有するプローブを用いて適切なライブラリーをストリンジェントな条件下でスクリーニングすることにより得られ、かつピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）活性を有する核酸分子；
（ｌ）  （ａ）もしくは（ｋ）のいずれか１つの核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする相補鎖を有し、かつピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）活性を有する核酸分子；
からなる群より選択される核酸分子、または（ａ）〜（ｌ）のいずれか１つの相補鎖を含むポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列ＴＳＧＰＫＰＡＳＸＩ（配列番号６）、ＴＳＧＰＫＰＡＳＸＩＥＶＳＸＡＫ（配列番号７）またはＡＡＡＰＳＧＮＸＶＴＩＬＹＧＳＥＥＧＮＳ（配列番号８）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外の、ポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
本明細書で使用する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」、または「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのどちらでもよい）の重合体形態を指す。この用語は、分子の一次構造のみを指す。
【００１３】
従って、この用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。例えばメチル化、１つ以上の天然型ヌクレオチドと類似体との「キャップ（ｃａｐｓ）」置換などの公知の種類の改変も含む。本発明のＤＮＡ配列は、上記定義したポリペプチドをコードするコード配列を含むことが好ましい。
【００１４】
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にｍＲＮＡに転写および／またはポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コード配列の境界線は、５’末端にある翻訳開始コドンおよび３’末端にある翻訳停止コドンにより決定される。コード配列としては、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列、またはゲノムＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されず、特定の状況下ではイントロンも存在し得る。
【００１５】
「ハイブリダイズする」というのは、このような核酸分子が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９））に記載されるような従来のハイブリダイゼーション条件下で、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。このようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、４×ＳＳＣ、６５℃でのハイブリダイゼーション、その後０．１×ＳＳＣ、６５℃での１時間の洗浄である。あるいはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣにて、４２℃である。他の生物から誘導したＰＮＯは、緩和したハイブリダイゼーション条件下でユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）の配列にハイブリダイズし、ＰＮＯと相互作用する能力を有するペプチドの発現をコードする他のＤＮＡ配列にコードされ得る。さらに、一部の適用は、ハイブリダイゼーションの特異性をもたらさない低いストリンジェンシー条件下で行わなければならない。例えば、実施例２に記載するように、ミドリムシ合計ＤＮＡのサザンブロット分析は、以下にさらに定義する本発明のポリヌクレオチド（ｐＦｇＰＮＯ３）でプローブし、低いストリンジェンシー（２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃）にて洗浄した。ハイブリダイゼーション分析から、ミドリムシＰＮＯをコードする遺伝子のみ単純なパターンが示された（図１ｂ）。このような非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の別の例は、４×ＳＳＣ、５０℃、または４２℃にて３０〜４０％ホルムアミドを用いるハイブリダイゼーションである。このような分子は、本発明のピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）の断片、類似体または誘導体であるものを含み、例えば、上記アミノ酸配列またはそれらの基礎をなすヌクレオチド配列と、アミノ酸および／もしくはヌクレオチドの欠失、挿入、置換、付加および／もしくは組換え、または当該分野で公知のその他の改変のみもしくは組合せにより、異なる。
【００１６】
「相同性」という用語は、それぞれの核酸分子またはコードされるタンパク質が、機能的および／または構造的に等価であることを意味する。上記核酸分子と相同的、および該核酸分子の誘導体である核酸分子は、例えば、同じ生物学的機能を有する改変を表す（特に、同じまたは実質的に同じ生物学的機能を有するタンパク質をコードする）該核酸分子の変種である。これらは、他の植物種類または種から得た配列などの天然に存在する変種または変異体であり得る。これらの変異体は、自然に生じてもよいし、突然変異誘発技術により得てもよい。対立遺伝子変種は、天然型対立遺伝子変異体でも、合成的に生成または遺伝子操作された変異体でもよい。構造的等価物は、例えば、該ポリペプチドと抗体との結合をテストすることにより、同定できる。構造的等価物は、同様の免疫学的特徴（例えば、同様のエピトープを含むなど）を有する。
【００１７】
「断片」、「配列の断片」または「配列の一部」という用語は、言及する元の配列の平滑末端化配列を意味する。平滑末端化配列（核酸またはタンパク質配列）は、長さが幅広く異なり得る；最小サイズは、言及する元の配列の少なくとも匹敵する機能および／または活性を有する配列を得るのに十分な大きさの配列であり、最大サイズは決定的ではない。一部の応用においては、最大サイズは、通常、元の配列の所望の活性および／または機能を得るのに必要なものよりも実質的に大きくない。
【００１８】
典型的に、平滑末端化アミノ酸配列は、約５〜約６０アミノ酸の長さにわたり得る。しかし、より典型的には、配列は、最大約５０アミノ酸の長さ、好ましくは最大約３０アミノ酸である。通常、少なくとも約１０、１２または１５アミノ酸、最大約２０または２５アミノ酸の配列を選択することが望ましい。
【００１９】
「エピトープ」という用語は、抗原中の特異的な免疫反応部位（抗原決定基としても知られる）に関する。これらのエピトープは、重合体組成物中の単量体の直線アレイ（タンパク質中のアミノ酸など）であってもよいし、またはより複雑な二次または三次構造からなるか、それを含んでいてもよい。当業者は、全ての免疫原（すなわち、免疫応答を引き出すことが可能な物質）が抗原であること；ただし、ハプテンなどの一部の抗原は、免疫原ではないが、担体分子に結合することにより免疫原性にすることができることを認めるであろう。「抗原」という用語は、それに対して抗体を生成でき、および／またはそれに対して抗体が特異的に免疫反応性を有する物質に対する言及も含まれる。
【００２０】
「１つまたは複数のアミノ酸」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸、ただし、同一性が６０％の相同性を生じるアミノ酸の数以下のアミノ酸に関する。同一性は、好ましくは７０％または８０％、より好ましくは８５％、９０％または９５％、さらにより好ましくは９６％、９７％、９８％または９９％の同一性である。
【００２１】
「ＰＮＯ」または「ＰＮＯ活性」という用語は、以下に記載、または実施例５に記載のように決定できるポリペプチドの酵素活性に関する。さらに、実施例５に記載のアッセイにおいて不活性であるが、ＰＮＯに特異的に結合する抗体に認識される（すなわち、１つ以上のＰＮＯエピトープを有する）ポリペプチドも、「ＰＮＯ」という用語に含まれる。この場合、活性とは、それらの免疫学的活性を指す。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、「単離」ポリヌクレオチドまたは核酸分子も指す。「単離」核酸分子は、核酸の天然由来源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。「単離」核酸は、核酸を誘導する生物のゲノムＤＮＡの核酸に自然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’端部に位置する配列）を含まないことが好ましい。例えば、様々な実施形態で、ＰＮＯポリヌクレオチドは、核酸を誘導する細胞（例えば、ミドリムシ細胞）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に自然に隣接する約５ ｋｂ、４ ｋｂ、３ ｋｂ、２ ｋｂ、１ ｋｂ、０．５ ｋｂまたは０．１ ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。また、本発明のポリヌクレオチド、特に「単離」核酸分子（ｃＤＮＡ分子など）は、他の細胞物質、組換え技術により生成される場合は培養培地、または化学的に合成される場合は化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００２３】
本発明によれば、前記技術的課題は、本発明のポリヌクレオチドを得ることにより解決できる。ＰＮＯをコードする本発明のポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞、植物細胞、植物組織および／または植物において発現して、アセチルＣｏＡの生合成、従ってその代謝産物の生合成をモジュレートし得る。
【００２４】
Ｉｎｕｉらは、既に１９９１年に、天然型Ｅ．グラシリスＰＮＯ酵素の処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）Ｎ末端、および短い内在ポリペプチド配列、Ｅ．グラシリスＰＮＯ酵素のＮＡＤＰＨジアホラーゼ（ｄｉａｐｏｒａｓｅ）トリプシン断片のＮ末端をコードする１６および２０アミノ酸の長さの２本の短いＰＮＯポリペプチドを報告している。驚くべきことに、これらのペプチドの発表から９年以上経っても、ＰＮＯ一次構造は未だに解明されていない。
【００２５】
上記配列に基づき、上記ペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズできる縮重プライマーを構築した。次いで、プライマーを使用して、Ｅ．グラシリスｃＤＮＡを増幅させ、Ｅ．グラシリスｃＤＮＡをコードするポリヌクレオチド断片を明らかにした。しかし、全てのアプローチが失敗に終わった。様々なＰＣＲ条件を使用したにも関わらず、Ｉｎｕｉら、１９９１で発表された情報に基づいてｃＤＮＡ断片をコードするＰＮＯを単離することは不可能であった。
【００２６】
従って、本発明の課題を解決し、ＰＮＯコードポリヌクレオチドを得るために、新しい単離アプローチを開発しなければならなかった。
【００２７】
ＰＮＯは、現時点でユニークな酵素であり、これまで、Ｅ．グラシリスにおいてのみ生じることが知られている。従って、詳細な進化論的研究では、Ｅ．グラシリスに進化論的に最も近い微生物を決定し、それらとＥ．グラシリスとの関係をマッピングした。上記関連生物のＰＦＯのタンパク質ドメインを分析、特に、異なるＰＦＯの反応中心を比較して、共通の構造特徴を同定した。最終的にＰＦＯの２つの進化論的保存性ドメインを明らかにすることができた。上記保存ＰＦＯドメインをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするプライマーを合成し、Ｅ．グラシリスｃＤＮＡを鋳型として共に増幅反応（ＰＣＲ）に入れた。
【００２８】
驚くべきことに、Ｅ．グラシリスｃＤＮＡを鋳型とし、ただしＰＦＯポリヌクレオチドに対するプライマーを用いた上記増幅反応では、約７００ ｂｐ ＰＮＯ ＤＮＡ断片が明らかになり、これは、単離、配列決定でき、さらにｃＤＮＡライブラリースクリーニングのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用でき、ＰＮＯのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の最初の同定を得た。完全な遺伝子の配列決定から、Ｉｎｕｉが開示したＮ末端ＰＮＯ配列の約３０％が間違っていたことが明らかになり、最初のＰＮＯ同定の試みにおけるネガティブの結果が釈明された。
【００２９】
ＰＮＯは高等植物細胞に存在しないため、ミドリムシＰＮＯ遺伝子の異種発現は、植物細胞におけるアセチル−ＣｏＡ生成の代替的な経路である。有利なことに、この外因性経路は、植物に存在する内因性調節メカニズムにより制御されない。
【００３０】
ピルビン酸からアセチル−ＣｏＡへの酸化的脱炭酸反応は、中間代謝において鍵となる反応である。ほとんどの好気性真正細菌およびミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｔｅ）生物において、この反応は、よく研究されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体（ＰＤＨ）により触媒される。これまで研究されてきたほとんどの嫌気性真正細菌および古細菌、ならびに多くの嫌気性原生生物において、ピルビン酸からアセチル−ＣｏＡへの酸化的脱炭酸反応は、電子受容体であるフェレドキシンと作用するピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯ）により行われる。ＰＦＯはチアミンピロリン酸を補因子として含み、１−３［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターが酸化還元中心として関与する。
【００３１】
光合成原生生物ユーグレナ・グラシリスの条件的嫌気性ミトコンドリアは、ミトコンドリア担持真核生物における特有の例外を表す。ＰＤＨの活性は、これまで納得できるように実証されていない。代わりに、Ｅ．グラシリスは、酸素感受性ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）、つまりろうエステル発酵の鍵となる酵素を含む（Ｉｎｕｉら， １９８４ｂ）。好気性Ｅ．グラシリスを嫌気性条件へ移すことにより、ろうエステルの迅速な合成が生じるに伴い、貯蔵多糖類パラミロンが低下した（Ｉｎｕｉら， １９８２）。この嫌気性ろうエステル形成は、解糖における基質レベルリン酸化によるＡＴＰの純合成（ｎｅｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を伴い、従って、生物を３０日間まで嫌気生活で生存させる（Ｂｕｅｔｏｗ、１９８９）。細胞を好気生活に戻した場合、逆の変化が生じる；ろうエステルが急速に分解し、パラミロンが合成される（Ｉｎｕｉら、１９８２）。好気性条件下では、ＰＮＯにより生成されるアセチル−ＣｏＡが、改変型クレブス回路を介して酸化的リン酸化を増長する（Ｂｕｅｔｏｗ、１９８９）。
【００３２】
Ｅ．グラシリスのＰＮＯをコードする本発明において得られるポリヌクレオチドは、中間代謝の間に内因性ＰＤＨから形成されるアセチル−ＣｏＡに加えて、特異的に標的化された様々な（例えば、植物細胞の）細胞小器官において、ピルビン酸からアセチル−ＣｏＡを合成する独特の可能性を提供する。
【００３３】
高等植物プラスチドにおけるアセチル−ＣｏＡ合成は、多サブユニット酵素（ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｅｎｚｙｍｅ）複合体（ＰＤＨ）を介して進行する。従って、Ｅ．グラシリス由来のユニークな単一サブユニットＰＮＯ酵素のクローンは、例えば、ＰＮＯタンパク質をプラスチドに方向づける適切なプラスチド−シグナルペプチドに融合したＰＮＯを発現することにより、宿主細胞（例えば、微生物または植物細胞）の代謝を変化させる多大な潜在性を有する。
【００３４】
アセチルＣｏＡ自体は、経済的関心が高い精製化学物質の生合成を生じるいくつかある生化学的経路の出発物質である。例えば、アセチルＣｏＡは、脂肪酸の生合成のための中心的遊離体であり、これはその後さらにトリアシルグリセロール、膜脂質およびプロスタグランジンに転換される。脂肪酸および脂肪アルコールは、さらに、ろうエステルの一部になるように代謝される。イソプレノイドは、プレニル転移反応を介した一連のイソプレンの重合化により合成される成分である。生物学的に重要なイソプレノイドのいくつかの例としては、コレステロール、ゴングリオシド、メバロン酸、ファルネシルピロリン酸、スクアレン、プロトステロール（ｐｒｏｔｏｓｔｅｒｏｌ）などが挙げられる。さらなる例は、当業者に周知である。イソプレンの合成のためのイソペンテニルピロリン酸およびジメチルアリルピロリン酸の炭素原子は、アセチル−ＣｏＡおよびアセトアセチル−ＣｏＡに基づく。カロテノイドは、他のほとんどの動物と同様、ヒトにより合成されない。主な供給源は、果物、野菜、およびどちらかといえば間接的な菌類、藻類および細菌である。全てのテルペノイドと同様、カロテノイドは、ヒドロキシメチルグルタリル−補酵素Ａから合成され、これはまずメバロン酸に転換される。多量に生成されるカロテノイドの１つは、βカロテンである。プロスタグランジンは、仮説化合物プロスタン酸（ｐｒｏｓｔａｎｉｃ ａｃｉｄ）の誘導体と見なされる化合物のファミリーを含む。これらは、ＰＧＥ、ＰＧＦ、および当業者に周知のいくつかの別の化合物を含む。さらに、アセチルＣｏＡは、ヒドロキシメチルグルテリル（ｇｌｕｔｅｒｙｌ）ＣｏＡを介する、ケトン体およびコレステロールの生合成の前駆体である。コレステロールは、胆汁酸およびステロイドホルモンにさらに代謝される。さらに、一部の微生物またはトランスジェニック植物において、アセチルＣｏＡは、ポリヒドロキシアルカノエートなどの重合体の生合成のための遊離体である。例えば、米国特許第５，６５０，５５５号および米国特許第５，６１０，０４１号、ならびにその中の参考文献は、ポリ−β−Ｄ−ヒドロキシブチル酸（ＰＨＢ）および関連するポリヒドロキシアルカノエートを生成する遺伝子改変された植物を開示している。ＰＨＢは、例えば、生分解可能な非常に有用な重合体である。さらに、アセチルＣｏＡは、ビタミン（ビタミンＥ）の代謝における前駆体であることが知られている。さらに、嫌気性条件下において、一部の微生物（特にＥ．グラシリス）は、ろうエステルを生成する（主にＣ２８エステルと共に、相当量の飽和Ｃ２６およびＣ２７エステルを形成するが、非飽和のものは形成されない）。前記化合物全ての生化学的性質が、当業者に周知であり、任意の生化学文献において容易に見つけることができる（例えば、Ｒａｗｎ， Ｊ．Ｄ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， １９８３， Ｓｔｒｅｙｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８など）。
【００３５】
「精製化学物質」という用語は、医薬、農業および化粧品業界など（ただしこれらに限定されない）の様々な業界において用途を有する、生物により生成される分子を含む。このような化合物としては、イソプレノイド、プロスタグランジン、トリアシルグリセロール、コレステロール、ポリヒドロキシアルカノエート、補因子および酵素、タンパク質生成アミノ酸および非タンパク質生成アミノ酸の両方、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ６， Ｒｅｈｍら編， ＶＣＨ： Ｗｅｉｎｈｅｉｍに掲載のＫｕｎｉｎａｋａ， Ａ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， ｐ． ５６１−６１２およびその中の参考文献に記載）、脂質、ろうエステル、飽和脂肪酸および多非飽和（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ）脂肪酸（例えば、アラキドン酸）の両方、ジオール（例えば、プロパンジオール、およびブタンジオール）、炭水化物（例えば、（多）糖類またはヒアルロン酸およびトレハロース）、芳香族化合物（例えば、芳香族アミン、バニリンおよびインディゴ）、ビタミン（特にビタミンＥ）、および補因子（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． Ａ２７， Ｖｉｔａｍｉｎｓ， ｐ． ４４３−６１３ （１９９６） ＶＣＨ： Ｗｅｉｎｈｅｉｍおよびその中の参考文献；ならびにＯｎｇ， Ａ．Ｓ．， Ｎｉｋｉ， Ｅ．およびＰａｃｈｅｒ， Ｌ． （１９９５） Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， Ｌｉｐｉｄｓ， Ｈｅａｌｔｈ， ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＮＥＳＣＯ／Ｃｏｎｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｌａｙｓｉａ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ａｓｉａ， １９９４年９月１〜３日 Ｐｅｎａｎｇ， Ｍａｌａｙｓｉａにて開催， ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ， （１９９５）に記載）、酵素、ならびにＧｕｔｃｈｏ（１９８３） Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｂｙ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＩＳＢＮ： ０８１８８０５０８６およびその中の参考文献に記載の他の全ての化学物質が挙げられる。
【００３６】
例えば、高等植物の種子貯蔵脂質は、脂肪酸、主に１６〜１８炭素原子からなる。これらの脂肪酸は、様々な植物属の種子油に存在する。アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）などの少数の植物は、Ｃ２０およびＣ２２の油を蓄積する。上記油の生成は、本発明のポリヌクレオチドの発現により増加させることができる。特に、産業的な用途のために、（例えば、高いエルカ酸レベルを有する）野菜油が有用である。これらの油は、ディーゼル燃料、および一連の生成物（プラスチック、医薬品および潤滑剤など）の材料として使用できる。従って、本発明において使用する「脂質」という用語は、種子貯蔵脂質および種子油にも関する。
【００３７】
例えば、膜の合成は、多数の成分（そのうち最も重要なのは脂質分子）が関与するよく特徴づけられたプロセスである。脂質合成は、２部に分けられ得る：すなわち、脂肪酸の合成、およびそれらのｓｎ−グリセロール−３−リン酸への付着、および極性基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）の付加または改変。細菌膜において利用される典型的な脂質としては、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質およびホスホグリセリドが挙げられる。脂肪酸合成は、アセチルＣｏＡから、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼによるマロニルＣｏＡ、またはアセチルトランスアシラーゼによるアセチル−ＡＣＰのいずれかへの転換から開始する。縮合反応の後、これらの２つの生成分子は互いとアセトアセチル−ＡＣＰを形成し、これは、一連の縮合、還元および脱水反応により転換され、所望の鎖長さを有する飽和脂肪酸分子を産生する。このような分子からの非飽和脂肪酸の生成は、特定のデサチュラーゼにより、分子（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）酸素に助けられて好気的に、または嫌気的に触媒される（微生物における脂肪酸合成についての参考としては、Ｆ．Ｃ． Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら （１９９６） Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ． ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ： Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ｐ． ６１２−６３６およびその中の参考文献；Ｌｅｎｇｅｌｅｒら（編） （１９９９） Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｔｈｉｅｍｅ： Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびその中の参考文献；ならびに、Ｍａｇｎｕｓｏｎ， Ｋ．ら， （１９９３） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７： ５２２−５４２およびその中の参考文献を参照）。さらに、脂肪酸は、様々な改変後に、トリアシルグリセロール貯蔵脂質に輸送され、取り込まれなければならない。植物脂肪酸生合成、不飽和化（ｄｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）、リポ化合物（ｌｉｐｏｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の脂肪代謝および膜輸送、β−酸化、脂肪酸改変および補因子、トリアシルグリセロール貯蔵およびアセンブリについては、以下の文献およびその中の参考文献を参照のこと：すなわち、Ｋｉｎｎｅｙ， １９９７， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ， ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ編， １９：１４９−１６６；ＯｈｌｒｏｇｇｅおよびＢｒｏｗｓｅ， １９９５， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７： ９５７−９７０；ＳｈａｎｋｌｉｎおよびＣａｈｏｏｎ， １９９８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４９：６１１−６４１；Ｖｏｅｌｋｅｒ， １９９６， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ， ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ編， １８：１１１−１３；Ｇｅｒｈａｒｄｔ， １９９２， Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒ． ３１：３９７−４１７；Ｇｕｈｎｅｍａｎｎ−ＳｃｈａｆｅｒおよびＫｉｎｄｌ， １９９５， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２５６：１８１−１８６；Ｋｕｎａｕら， １９９５， Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３４：２６７−３４２；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｌｉｐｉｄｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ， ＭｕｒａｔａおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ編， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ａｍｅｒ���ｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ， １５０−１５８に掲載のＳｔｙｍｎｅら１９９３， ＭｕｒｐｈｙおよびＲｏｓｓ １９９８， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ． １３（１）：１−１６。脂質合成における別の重要なステップは、例えばグリセロール−リン酸−アシルトランスフェラーゼによる、極性基への脂肪酸の輸送である（Ｆｒｅｎｔｚｅｎ， １９９８， Ｌｉｐｉｄ， １００ （４−５）：１６１−１６６を参照）。
【００３８】
様々な前駆体分子および生合成酵素の組合せは、膜の組成物に対して強い影響を有する異なる脂肪酸分子の生成を生じる。
【００３９】
ビタミン、補因子、および栄養補助物質（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）は、高等動物が失った合成能力のある分子のグループを含む。これらの分子は、それら自体で生活性物質であるか、または様々な代謝経路において電子担体または中間体として作用し得る生物学的に活性な物質の前駆体である。それらの栄養価とは別に、これらの化合物また、着色剤、抗酸化剤および触媒、または他のプロセスの補助的存在として有意な産業的価値を有する。（これらの化合物の構造、活性および産業的用途については、例えば、Ｕｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｉｔａｍｉｎｓ ｖｏｌ． Ａ２７， ｐ． ４４３−６１３， ＶＣＨ： Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， １９９６を参照）。
【００４０】
多非飽和脂肪酸の場合、Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ １９９９， Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， ７０ （３ Ｓｕｐｐｌ）： ５６０−５６９、Ｔａｋａｈａｔａら， Ｂｉｏｓｃ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９９８， ６２（１１）：２０７９−２０８５、ＷｉｌｌｉｃｈおよびＷｉｎｔｈｅｒ， １９９５， Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ， １２０ （７）：２２９ ｆｆ、ならびにその中で引用される参考文献を参照のこと。
【００４１】
「補因子」という言葉は、正常酵素活性が生じるのに必要な非タンパク質性化合物を含む。このような化合物は、有機性でも無機性でもあり得る：本発明の補因子分子は有機性であることが好ましい。栄養補助物質という用語は、植物および動物（特にヒト）において健康的利点を有する補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）を含む。このような分子の例としては、ビタミン、抗酸化剤、および特定の脂質（例えば、多非飽和脂肪酸）が挙げられる。これらの分子を生成可能な生物（例えば、細菌）におけるこれらの分子の生合成は、十分に特徴付けられている（Ｕｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｉｔａｍｉｎｓ ｖｏｌ． Ａ２７， ｐ． ４４３−６１３， ＶＣＨ： Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， １９９６；Ｍｉｃｈａｌ， Ｇ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ： Ａｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｏｎｇ， Ａ．Ｓ．， Ｎｉｋｉ， Ｅ．およびＰａｃｋｅｒ， Ｌ． （１９９５） Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， Ｌｉｐｉｄｓ， Ｈｅａｌｔｈ， ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＮＥＳＣＯ／Ｃｏｎｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｌａｙｓｉａ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ａｓｉａ， １９９４年９月１〜３日 Ｐｅｎａｎｇ， Ｍａｌａｙｓｉａにて開催， ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｈａｍｐａｉｇｎ， ＩＬ Ｘ， ３７４ Ｓ）。
【００４２】
従って、本発明は、アセチルＣｏＡの生合成に関与するポリヌクレオチドおよびポリペプチド、さらにアセチルＣｏＡの代謝の産物（例えば、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ろうエステル、ビタミン、脂質、（多）糖類および／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体）、ならびに／またはさらなる補因子および当業者に周知の分子）を提供する。本発明の分子は、コリネバクテリウムなどの微生物、繊毛虫類、菌類、藻類、および植物（トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、コメ、オオムギ、ダイズ、ピーナッツ、綿、ナタネ、カノーラおよびアブラナ（ｔｕｒｎｉｐ ｒａｐｅ）などのアブラナ種、トウガラシ、ヒマワリおよびセンジュギク、ジャガイモ、タバコ、ナスおよびトマトなどのナス科植物、ソラマメ種、エンドウ、キャッサバ、アルファルファ、低木（ｂｕｓｈｙ）植物（コーヒー、カカオ、茶）、ヤナギ種、樹木（ギニアアブラヤシ、ヤシ）および多年草および飼料作物）などの植物から、直接的（例えば、脂肪酸生合成タンパク質の過剰発現または最適化が、改変型生物からの脂肪酸の収率、生成および／または生成効率に直接的影響を有する）、または所望の化合物の収率、生成および／もしくは生成効率の増加、または所望でない化合物の減少をそれでもなお生じる間接的な影響（例えば、アセチルＣｏＡ、脂質、脂肪酸、カロテノイドなどの代謝のモジュレーションにより、細胞における所望の化合物の組成物の収率、生成および／または生成効率）が変化して、これにより本明細書で言及する１つ以上のアセチルＣｏＡ代謝利用化合物の生成に影響を有する）のいずれかによる、精製化学物質（好ましくは上記化合物）の生成のモジュレーションにおいて利用し得る。
【００４３】
従って、ＰＮＯ微生物の発現により、細胞または植物代謝経路が、産生生成率および／または生成効率の点でモジュレートされる。
【００４４】
「生成」または「生成率」という用語は、当該分野で認知されており、所与の時間および所与の発酵容量における、発酵産物（例えば、脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステルおよび／もしくはポリヒドロキシアルカノエートなどの重合体、ならびに／またはその代謝産物、または本明細書で言及するその他の所望の精製化学物質）の濃度（例えば、ｋｇ生成物／時間／リットル）を含む。
【００４５】
生成「効率」という用語は、特定のレベルの生成を得るために必要とされる時間（例えば、上記アセチルＣｏＡ代謝産物（特に、脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、ポリヒドロキシアルカノエートなど）の特定のアウトプット率を細胞が得るのにかかる時間）を含む。
【００４６】
「収率」または「生成物／炭素収率」という用語は、当該分野で認知されており、炭素ソースから生成物（すなわち、アセチルＣｏＡ、脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、ポリヒドロキシアルカノエートなど、および／または上記定義し、生合成が上記生成物に基づくその他の化合物）への転換の効率を含む。これは、一般的に、例えば、ｋｇ生成物／ｋｇ炭素ソース、として記される。化合物の収率または生成を増加することで、所与の時間量にわたる、所与量の培養物における該化合物の回収分子の量、または有用な回収分子の量が増加する。
【００４７】
「生合成」（細胞、組織植物などにおける「生物学的生成」の「合成」と同義的に使用）または「生合成経路」という用語は、当該分野で認知されており、多段階かつ高度に調節されたプロセスであり得る、中間化合物からの細胞による化合物（好ましくは有機化合物）の合成を含む。
【００４８】
「代謝」という言葉は、当該分野で認知されており、生物において生じる全ての生化学反応を含む。従って、特定の化合物の代謝（例えば、アセチルＣｏＡ、脂肪酸、ヘキソース、脂質、イソプレノイド、ろうエステル、ビタミン、ポリヒドロキシアルカノエートなどの代謝）は、その化合物に関連する細胞における全体的な生合成、改変および分解経路を含む。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、配列番号２に示すヌクレオチド配列の１つを含むことが好ましい。配列番号２の配列は、本発明のユーグレナ・グラシリスＰＮＯ ｃＤＮＡに対応する。
【００５０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの１つのヌクレオチド配列の相補体またはその一部である核酸分子を含む。配列番号２に示すヌクレオチド配列の１つに相補的な核酸分子は、配列番号２に示すヌクレオチド配列の１つとハイブリダイズして、安定した二重らせんを形成できるほど、配列番号２に示すヌクレオチド配列の１つと十分に相補的なものである。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２Ａに示すヌクレオチド配列またはその一部と、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５〜７０％、より好ましくは少なくとも７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜９５％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同なヌクレオチド配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２に示すヌクレオチド配列の１つまたはその一部とハイブリダイズ（例えば、本明細書で定義するストリンジェントな条件下でハイブリダイズ）するヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の１つの配列のコード領域の一部（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用できる断片、またはＰＮＯの生物学的に活性な部分をコードする断片）のみを含むことができる。Ｅ．グラシリス由来のＰＮＯ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物におけるＰＮＯ相同体の同定および／またはクローニングにおいて使用するために設計されるプローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、（例えば、配列番号２に示す）上記配列の１つのセンス鎖、（配列番号２に示す）配列の１つのアンチセンス配列、またはその天然型変異体の少なくとも約１２、１５、好ましくは約２０もしくは２５、より好ましくは約４０、５０もしくは７５の連続するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。本発明のヌクレオチドに基づくプライマーは、ＰＮＯ相同体をクローニングするためのＰＣＲ反応に使用できる。ＰＮＯヌクレオチド配列に基づくプローブは、転写産物、または該転写産物もしくは相同タンパク質をコードするゲノム配列を検出するために使用できる。プローブは、それに付着した標識グループをさらに含むことができる（例えば、標識グループは、放射同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。このようなプローブをゲノムマーカーテストキットの一部として使用して、サンプル細胞中のＰＮＯコード核酸分子のレベルを測定する（例えば、ＰＮＯ ｍＲＮＡレベルを検出、またはゲノムＰＮＯ遺伝子が変異または欠失されたかを決定する）ことなどにより、ＰＮＯを発現する細胞を同定できる。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質またはその一部がアセチルＣｏＡの合成に参加する能力（特に、実施例に記載する微生物または植物におけるＰＮＯ活性）を維持するために配列番号１または３のアミノ配列と十分に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその一部をコードする。本明細書で使用する「十分に相同」という言葉は、配列番号１または３のアミノ酸配列と最少数の同一または等価のアミノ酸残基（例えば、本発明のポリペプチドの配列の１つにおけるアミノ酸残基と同様の側鎖を有するアミノ酸残基）を有して、タンパク質またはその一部が微生物または植物におけるアセチル−ＣｏＡの合成に参加可能なタンパク質またはその一部を指す。ＰＮＯ活性の例も本明細書に記載する。従って、ＰＮＯの機能は、アセチルＣｏＡ、またはアセチルＣｏＡが遊離体である経路の生成物（例えば、脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、ポリヒドロキシアルカノエートおよび／またはそれらの代謝の１つ以上の前記その他の産物）の収率、生成、および／または生成効率に直接的または間接的に寄与する。
【００５４】
タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列全体と、少なくとも約６０〜６５％、好ましくは約６６〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上相同である。
【００５５】
本発明のＰＮＯポリヌクレオチドにコードされるタンパク質部分は、このＰＮＯのうちの１つの生物学的に活性な部分であることが好ましい。
【００５６】
本明細書で言及する「ＰＮＯの生物学的に活性な部分」という用語は、アセチル−ＣｏＡの代謝に参加するか、ＰＮＯに特異的に結合する抗体に結合するような免疫学的活性を有する（例えば、実施例に記載するような活性を有する）部分（例えば、ドメイン／モチーフ）を含むことを意図する。ＰＮＯまたはその生物学的に活性な部分が、代謝に参加できるか否かを決定するために、酵素活性のアッセイを行ってもよい。このようなアッセイ方法は、当業者に周知であり、実施例に詳細に記載する。ＰＮＯの生物学的に活性な部分をコードするさらなる核酸断片は、配列番号２の配列の１つの一部を単離し、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換え発現により）ＰＮＯまたはペプチドのコード部分を発現し、ＰＮＯまたはペプチドのコード部分の活性を評価することにより調製できる。
【００５７】
本発明は、遺伝子コードの縮重により、配列番号２に示すヌクレオチド配列の１つ（およびその部分）と異なるが、配列番号２に示すヌクレオチド配列によりコードされるＰＮＯと同じものをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１または３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１または３のアミノ酸配列に実質的に相同な完全長Ｅ．グラシリスタンパク質をコードする。
【００５８】
さらに、アミノ酸配列の変化を生じるＤＮＡ配列多形が、集合（例えば、Ｅ．グラシリス集合）中に存在し得ることが当業者に理解されるであろう。ＰＮＯ遺伝子におけるこのような遺伝子多形は、天然型変種のために集合中の個体において存在し得る。
【００５９】
本明細書で使用する「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＰＮＯ（好ましくはＥ．グラシリスＰＮＯ）をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような天然型変種は、典型的に、ＰＮＯ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変化を生じ得る。任意または全てのこのようなヌクレオチド変化、および天然型変種により生じ、ＰＮＯの機能的活性は変化させない、ＰＮＯにおいて生じるアミノ酸多形は、本発明の範囲内にあることを意図する。
【００６０】
天然型変種に対応するポリヌクレオチド、および本発明のＰＮＯ ｃＤＮＡの非Ｅ．グラシリス相同体は、標準的ハイブリダイゼーション技術に従い、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書に開示するＥ．グラシリスＰＮＯポリヌクレオチドとそれらとの相同性に基づき単離できる。従って、別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチドの長さである。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、配列番号２）を含む核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが好ましい。他の実施形態では、核酸は、少なくとも２０、３０、５０、１００、２５０以上のヌクレオチドの長さである。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、上記定義されており、互いと少なくとも６０％同一なヌクレオチド配列が互いと典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を表すことを意図する。条件は、互いと少なくとも約６５％または７０％、より好ましくは少なくとも約７５％または８０％、さらにより好ましくは約８５％、９０％または９５％以上の同一性を有する配列が、互いと典型的にハイブリダイズしたままであることが好ましい。ストリンジェントな条件下で、配列番号２の配列とハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドは、天然型核酸分子に対応する。
【００６１】
本明細書で使用する「天然型」核酸分子とは、自然に生じる（例えば、天然型タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。ポリヌクレオチドは、天然型Ｅ．グラシリスＰＮＯをコードすることが好ましい。
【００６２】
集合中に存在し得るＰＮＯ配列の天然型変種に加えて、当業者は、さらに、ＰＮＯをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に突然変異により変化を導入して、ＰＮＯの機能的能力を変えることなく、コードするＰＮＯのアミノ酸配列に変化を生じることができることを理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換を生じるヌクレオチド置換は、ＰＮＯをコードするポリヌクレオチドの配列（例えば、配列番号２）において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＰＮＯの活性を変化させることなくＰＮＯの１つの野生型配列から変えられる残基であり、「必須」アミノ酸残基はＰＮＯ活性に必要なものである。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＰＮＯ活性を有するドメインにおいて保存されないか部分的にしか保存されない（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）もの）は、活性のためには必須ではなく、従って、ＰＮＯ活性を変化させることなく変化の影響を受け易いと思われる。
【００６３】
従って、本発明は、ＰＮＯ活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含む、ＰＮＯをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなＰＮＯは、配列番号１または３に含まれる配列とアミノ酸配列が異なるが、本明細書に記載するＰＮＯ活性は保持している。ポリヌクレオチドは、配列番号１または３のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の同一性を有し、アセチル−ＣｏＡの合成に参加可能なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。核酸分子によりコードされるタンパク質は、配列番号１または３における配列と少なくとも約６０〜６５％同一、より好ましくは配列番号１または３の配列の１つと少なくとも約６０〜７０％同一、さらにより好ましくは配列番号１または３における配列と少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％相同、最も好ましくは配列番号１または３における配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％同一であることが好ましい。
【００６４】
２本のアミノ酸配列（例えば、配列番号１または３の１つ、およびその変異型形態）または２本の核酸の相同性％を決定するために、最適な比較目的のために配列をアラインさせる（例えば、一方のタンパク質または核酸との最適アライメントのために他方のタンパク質または核酸の配列にギャップを導入できる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。一方の配列（例えば、配列番号１、２または３の配列の１つ）における位置が、他方の配列（例えば、選択した配列の変異型形態）における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されている場合、その位置において分子は相同である（すなわち、本明細書で使用するアミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」と等価である）。２本の配列の相同性％は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の合計数×１００）。相同性は、例えばコンピュータプログラム（例えば、Ｂｌａｓｔ ２．０）により決定され得る。図６は、ｂｌａｓｔ検索の結果を示す。
【００６５】
配列番号１または３のタンパク質配列に相同なＰＮＯをコードする核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を本発明のポリヌクレオチド（特に配列番号２）のヌクレオチド配列に導入して、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失をコードタンパク質に導入することにより作製され得る。突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ仲介型突然変異誘発などの標準的技術により、例えば配列番号２の配列に導入できる。１つ以上の予想非必須アミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を行うことが好ましい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ＰＮＯ中の予想非必須アミノ酸残基は、同じファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられることが好ましい。あるいはまた、別の実施形態では、突然変異は、ＰＮＯコード配列の全体または一部に沿って飽和突然変異誘発などによりランダムに導入でき、得られる変異体を、本明細書に記載するＰＮＯ活性についてスクリーニングして、ＰＮＯ活性を保持する変異体を同定できる。配列番号２の配列の１つの突然変異誘発の後、コードタンパク質を組換え的に発現させ、タンパク質の活性を例えば本明細書に記載するアッセイを用いて決定できる（実施例を参照）。
【００６６】
従って、１つの好適な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号２のヌクレオチド配列を有する核酸分子）またはその一部は、標準的分子生物学的技術および本明細書で提供する配列情報を用いて単離できる。例えば、ＰＮＯ ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして本発明のポリヌクレオチドの配列の１つの全体または一部、および標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて、ライブラリーから単離できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載）。さらに、本発明のポリヌクレオチドの配列の１つの全体または一部を包含するポリヌクレオチドは、この配列に基づき設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により単離できる（例えば、本発明のポリヌクレオチドの配列の１つの全体または一部を包含する核酸分子は、本発明のポリヌクレオチドの同じ配列に基づき設計された、例えば配列番号４または５のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により単離できる）。例えば、ｍＲＮＡは、細胞（例えば、ミドリムシ）から単離でき（例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら （１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８： ５２９４−５２９９のグアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）−チオシアネート抽出手順により）、ｃＤＮＡは、逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから入手可能なモロニーＭＬＶ逆転写酵素；またはＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ， ＦＬから入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を用いて調製できる。ポリメラーゼ連鎖反応増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２に示すヌクレオチド配列の１つに基づき設計できる。本発明のポリヌクレオチドは、鋳型としてｃＤＮＡあるいはまたゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的ＰＣＲ増幅技術に従い増幅できる。このように増幅されたポリヌクレオチドは、適切なベクターにクローニングされて、ＤＮＡ配列分析により特徴決定できる。さらに、ＰＮＯヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術により（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて）調製できる。
【００６８】
本発明の別の好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナル配列をコードする核酸配列に作用可能に連結されている。
【００６９】
本発明による核酸分子が細胞で発現される場合、タンパク質が植物細胞の任意の所望の画分に位置するようにコード配列を改変することが原則的に可能である。これらとしては、核、小胞体、液胞、ミトコンドリア、アミロプラスト、葉緑体、有包体、アポプラストなどのプラスチド、細胞質、細胞外間隙、油体、ペルオキシソーム、ならびに植物細胞の他の画分が挙げられる（概論については、Ｋｅｒｍｏｄｅ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １５， ４ （１９９６）， ２８５−４２３、およびその中で引用されている参考文献を参照のこと）。Ｅ．グラシリスＰＮＯは、ミトコンドリアへの輸送のための、３７のアミノ酸の長さのＮ末端輸送ペプチドを担持する。ペプチド配列を図１に示す。本発明のポリペプチドを上記さらなる画分の１つに輸送する場合、上記ＰＮＯミトコンドリア輸送シグナルは、突然変異または欠失され得る（これはポリヌクレオチドレベルで都合良く行われる）。次いで、ポリヌクレオチドを、所望の画分に輸送するためのシグナルをコードする適切なポリヌクレオチド（例えば、ベクター）に作用可能に融合され得る。
【００７０】
一般的に、ＰＮＯの発現により、細胞の細胞質においてアセチル−ＣｏＡ濃度を変えることができる。しかし、重要なアセチルＣｏＡ利用産物（例えば、脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、ポリヒドロキシアルカノエート、および／またはそれらの上記定義された代謝化合物）の生合成のいくつかの経路は特定の細胞小器官（例えば、プラスチド）で生じるため、対応するシグナル配列をポリヌクレオチドに導入して本発明のタンパク質を所望の画分に方向付ける。この改変を実施する方法、および所望の画分での局所化を確実にするシグナル配列は、当業者に周知である。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドの発現により、このような細胞小器官またはプラスチドなどにおいてアセチルＣｏＡ濃度が有利に高められる。その結果、増加した量のアセチルＣｏＡは、主に脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、ポリヒドロキシアルカノエート、および／または上記定義した該化合物の代謝に基づく産物に代謝される。
【００７２】
細胞画分におけるアセチルＣｏＡの増加は、ポリペプチドを、このような画分へのアセチルＣｏＡの輸送に関与する分子（例えば、カルニチン−アセチルＣｏＡトランスフェラーゼ）と同時発現させることにより達成され得る。プラスチドにおけるアセチルＣｏＡの増加は、適切なシグナル配列をさらに含む本発明のポリヌクレオチドにコードされるＰＮＯを発現することにより達成されることが好ましい。
【００７３】
従って、１つの好適な実施形態では、本発明は、シグナル配列がプラスチド輸送シグナル配列であるポリヌクレオチドに関する。
【００７４】
従って、ミトコンドリアＰＮＯ輸送シグナルが、プラスチド輸送シグナル配列に置き換えられることが好ましい。例えば、シロイヌナズナＰＲＰＰ−アミドトランスフェラーゼのＮ末端塩基アミノ酸がプラスチド輸送シグナルとして使用できる（Ｈｅｉｊｎｅ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８０， １９８９， ５３５−５４５， Ｋｅｒｍｏｄｅ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ． Ｓｃｉ． １５， １９９６， ２８５−４２３）。このようなシグナル配列をコードする配列は、例えば既存のシグナル配列（すなわち、ミトコンドリア輸送ペプチド）を置き換える本発明のベクターとして、植物形質転換ベクターにクローニングされ得る。
【００７５】
他の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドをベクターに挿入することを含む、組換えベクターの作製方法に関する。
【００７６】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むか、または本発明の上記方法により生成された組換えベクターに関する。
【００７７】
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、それが連結したポリヌクレオチドを輸送可能な核酸分子を指す。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡまたはＰＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートできるウイルスベクターである。特定のベクターは、導入される宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細胞ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作用可能に連結した遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術において利用可能な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは最もよく使用されるベクター形態であるため、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターも含むことを意図する。
【００７８】
本発明はまた、本発明による核酸分子を含む、遺伝子操作において都合よく使用されるコスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および他のベクターにも関する。当業者に周知の方法を使用して、様々なプラスミドおよびベクターを構築できる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９） Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載の技術を参照。あるいはまた、本発明の核酸分子およびベクターは、標的細胞に送達するためにリポソームに再構築できる。
【００７９】
他の好適な実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドが、原核生物または真核生物宿主細胞における発現を可能にする発現制御配列に作用可能に連結したベクターに関する。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物においては、制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含む。真核生物においては、一般的に、制御配列は、プロモーター、ターミネーター、場合により、エンハンサー、トランス作用因子；または転写因子を含む。
【００８０】
「制御配列」という用語は、発現のために存在することが必要な成分を少なくとも含むこと、および追加の有利な成分を含み得ることを意図する。
【００８１】
「作用可能に連結」という用語は、そのように記載する生物が意図するように機能するような関係にある並置状態を指す。コード配列に「作用可能に連結した」制御配列は、制御配列に適合する条件下で、コード配列の発現が達成されるようにライゲートされている。制御配列がプロモーターの場合、二本鎖核酸を使用することは当業者には明らかである。
【００８２】
このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）に記載されている。または、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ編， 第７章， ８９−１０８に掲載のＧｒｕｂｅｒおよびＣｒｏｓｂｙ、ならびにその中の参考文献を参照。調節配列は、様々な種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞または特定の条件下でのみヌクレオチド配列の発現を指示するものを含む。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現のレベルなどの要素に応じ得ることが理解されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入して、本明細書に記載するポリペプチドにコードされたタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）を生成することができる。
【００８３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞におけるＰＮＯの発現のために設計できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをコードする遺伝子は、大腸菌、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母および他の菌類細胞（Ｒｏｍａｎｏｓ， Ｍ．Ａ．ら （１９９２） Ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ： ａ ｒｅｖｉｅｗ， Ｙｅａｓｔ ８： ４２３−４８８；Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ， Ｊ．Ｗ． ＢｅｎｎｅｔおよびＬ．Ｌ． Ｌａｓｕｒｅ編， ｐ． ３９６−４２８： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに掲載のｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ， Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら （１９９１） Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ；ならびにＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ， Ｐｅｂｅｒｄｙ， Ｊ．Ｆ．ら編， ｐ． １−２８， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃａｍｂｒｉｄｇｅに掲載のｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ， Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．およびＰｕｎｔ， Ｐ．Ｊ． （１９９１） Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉを参照）、藻類（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら， １９９９， Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． １， ３：２３９−２５１）、全毛類、縁毛類、旋毛類、吸管虫類、テトラヒメナ、ゾウリムシ、コルピディウム（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）、グラウコマ、プラティオフリア（Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）、ポトマカス（Ｐｏｔｏｍａｃｕｓ）、シュードコニレンバス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌｅｍｂｕｓ）、ユープロテス、エンゲルマニエラ（Ｅｎｇｅｌｍａｎｉｅｌｌａ）およびスチロニキア（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ）（特にＷＯ９８０１５７２に記載されている形質転換方法に従うベクターを有するスチロニキア・レムナエ（Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ ｌｅｍｎａｅ）属のもの）の種類の繊毛虫類、ならびに多細胞植物細胞（Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｒ．およびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｌ． （１９８８）， Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｌｅａｆ ａｎｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｅｘｐｌａｎｔｓ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．： ５８３−５８６）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， 第６／７章， Ｓ． ７１−１１９ （１９９３）；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ， Ｖｏｌ． １， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， ＫｕｎｇおよびＲ．Ｗｕ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９３）， １２８−４３に掲載のＦ．Ｆ． Ｗｈｉｔｅ， Ｂ． Ｊｅｎｅｓら， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ４２ （１９９１）， ２０５−２２５（およびこれらの中で引用される参考文献）を参照）、または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）においてさらに議論されている。あるいはまた、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳され得る。
【００８４】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導可能なプロモーターを含むベクターを用いて最も多く行われる。融合ベクターは、その中でコードされるタンパク質に（通常は組換えタンパク質のアミノ末端に、ただしＣ末端にも、またはタンパク質の適切な領域内に融合するように）いくつかのアミノ酸を追加したものである。このような融合ベクターは、典型的に３つの目的を果たす：すなわち、１）組換えタンパク質の発現を高める；２）組換えタンパク質の可溶性を高める；および３）親和性精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を助ける。さらに、融合ベクターは、発現することにより細胞におけるアセチルＣｏＡの代謝産物の増加を助ける追加のタンパク質もコードすることができる（例えば、細胞または細胞の画分における前駆体の増加を提供するか、またはアセチルＣｏＡに基づく代謝経路の産物を輸送する輸送体）。他の酵素は、当業者に周知であり、例えば、植物脂肪酸生合成、不飽和化、リポ化合物の脂質代謝および膜輸送、β酸化、アセチルＣｏＡ利用代謝の遊離体および産物の脂肪酸改変などに関与するエロンガーゼ（ｅｎｌｏｎｇａｓｅ）、カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位を融合部分と組換えタンパク質との接合部において導入して、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分から分離可能にすることが多い。このような酵素およびそれらのコグネイト認識配列としては、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【００８５】
典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ， Ｋ．Ｓ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）が挙げられる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのコード配列をｐＧＥＸ発現ベクターにクローニングして、Ｎ末端からＣ末端にかけてＧＳＴ−トロンビン切断部位−Ｘタンパク質を含む融合タンパク質をコードするベクターを作製する。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。例えば、融合タンパク質をトロンビンで切断することにより、ＧＳＴに融合していない組換えＰＮＯを回収できる。
【００８６】
適切な誘導可能非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら， （１９８８） Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） ６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）により仲介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下にＴ７ ｇｎ１遺伝子を置く常在性λプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【００８７】
組換えタンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する潜在能力が欠損している宿主細菌において、タンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。別の戦略は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変して、各アミノ酸の個々のコドンが、発現のために選択された細菌（大腸菌またはＣ．グルタミカムなど）において優先的に利用されるものであるようにすることである（Ｗａｄａら （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこのような改変は、標準的なＤＮＡ合成技術により行うことができる。
【００８８】
さらに、ＰＮＯベクターは酵母発現ベクターであり得る。酵母Ｓ．セレビシエにおける発現のためのベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら， （１９８７） Ｅｍｂｏ Ｊ． ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， （１９８２） Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら， （１９８７） Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ならびにｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）が挙げられる。糸状菌などの他の菌類における使用のために適したベクターの構築のためのベクターおよび方法としては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ， Ｊ．Ｆ． Ｐｅｂｅｒｄｙら編， ｐ． １−２８， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃａｍｂｒｉｄｇｅに掲載のｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ， Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．およびＰｕｎｔ， Ｐ．Ｊ． （１９９１） ”Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ”に詳細に記載されているものが挙げられる。
【００８９】
あるいはまた、本発明のポリヌクレオチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞に導入できる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ ９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら （１９８３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５）、およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ （１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
【００９０】
あるいはまた、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞に導入できる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ， Ｂ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能はウイルス調節エレメントにより提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアン・ウイルス４０から誘導される。原核生物および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９の第１６および１７章を参照のこと。
【００９１】
組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指示することが可能であり得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの限定しない例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら （１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ （１９８８） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８：７２９−７３３）およびイムノグロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ （１９８９） ＰＮＡＳ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公報第２６４，１６６号）が挙げられる。例えばマウスホックス（ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびフェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ （１９８９） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ３：５３７−５４６）などの発生調節プロモーターも包含する。
【００９２】
本発明のポリヌクレオチドは、植物発現制御配列（例えば、発現カセット）に作用可能に連結されることが好ましい。植物発現カセットは、植物細胞における遺伝子発現を駆動可能に、および作用可能に連結されて、各配列（ポリアデニル化シグナルなど）がその機能（転写の終結など）を果たすことが好ましい。好ましいポリアデニル化シグナルは、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のオクトピンシンターゼとして知られる遺伝子３（Ｇｉｅｌｅｎら， ＥＭＢＯ Ｊ． ３ （１９８４）， ８３５ ｆｆ）、またはその機能的等価物など、アグロバクテリウム・ツメファシエンｔ−ＤＮＡに由来するものであるが、植物において機能的に活性な他のターミネーターも適している。
【００９３】
植物遺伝子発現が転写レベルにおいて制限されることはほとんどない。なぜなら、植物発現カセットは好ましくは、ＲＮＡあたりのタンパク質の比率を向上させるタバコモザイクウイルス由来の５’非翻訳リーダー配列を含む過駆動（ｏｖｅｒｄｒｉｖｅ）配列などの翻訳エンハンサーのような他の作用可能に連結した配列を含むからである（Ｇａｌｌｉｅら１９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８６９３−８７１１）。
【００９４】
従って、ポリヌクレオチドは、適時に細胞または組織特異的な遺伝子発現をもたらす適切なプロモーターに作用可能に連結できる。好ましいのは、３５Ｓ ＣＡＭＶ（Ｆｒａｎｃｋら， Ｃｅｌｌ ２１ （１９８０） ２８５−２９４）、１９Ｓ ＣａＭＶ（ＵＳ５３５２６０５およびＷＯ８４０２９１３も参照）のような植物ウイルスに由来するもの、またはＵＳ４９６２０２８に記載のルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニットに由来するもののような植物プロモーターなど、構成的発現を駆動するプロモーターである（Ｂｅｎｆｅｙら， ＥＭＢＯ Ｊ． ８ （１９８９） ２１９５−２２０２）。
【００９５】
植物遺伝子発現は、化学的に誘導可能なプロモーターを介しても促進され得る（概説については、Ｇａｔｚ １９９７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８：８９−１０８を参照のこと）。化学的に誘導可能なプロモーターは、遺伝子発現を時間特異的に生じさせたい場合に特に適している。このようなプロモーターの例は、サリチル酸誘導可能プロモーター（ＷＯ ９５／１９４４３）、テトラサイクリン誘導可能プロモーター（Ｇａｔｚら， （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２， ３９７−４０４）、およびエタノール誘導可能プロモーター（ＷＯ ９３／２１３３４）である。
【００９６】
病原体誘導可能ＰＲＰ１−遺伝子プロモーター（Ｗａｒｄら， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２ （１９９３）， ３６１−３６６）、トマト由来の熱誘導可能ｈｓｐ８０プロモーター（ＵＳ５１８７２６７）、ジャガイモ由来の低温誘導可能のαアミラーゼプロモーター（ＷＯ９６１２８１４）、または創傷（ｗｏｕｎｄ）誘導可能ｐｉｎＩＩプロモーター（ＥＰ３７５０９１）など、生物または非生物ストレス条件に応答するプロモーターも適切なプロモーターである。
【００９７】
特に、内乳および発生胚の細胞などの種子細胞において脂質および油生合成が生じる、組織および器官における遺伝子発現をもたらすプロモーターが好ましい。適切なプロモーターは、ナタネ由来のナピン遺伝子プロモーター（ＵＳ５６０８１５２）、ソラマメ由来のＵＳＰプロモーター（Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ， １９９１， ２２５ （３）：４５９−６７）、シロイヌナズナ由来のオレオシンプロモーター（ＷＯ９８４５４６１）、インゲンマメ由来のファセオリンプロモーター（ＵＳ５５０４２００）、アブラナ由来のＢｃｅ４−プロモーター（ＷＯ９１１３９８０）、またはレグミンＢ４プロモーター（ＬｅＢ４；Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら， １９９２， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２ （２）：２３３−９）、ならびにトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、コメなどの単子葉植物における種子特異的発現をもたらすプロモーターである。付記すべき適切なプロモーターは、オオムギ由来のｌｐｔ２またはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（ＷＯ９５１５３８９およびＷＯ９５２３２３０）、またはＷＯ９９１６８９０に記載のもの（オオムギホルデイン遺伝子、コメグルテリン遺伝子、コメオリジン（ｏｒｙｚｉｎ）遺伝子、コメプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートコムギグルテリン遺伝子、サトウモロコシカシリン（ｋａｓｉｒｉｎ）遺伝子、ライムギセカリン（ｓｅｃａｌｉｎ）遺伝子由来のプロモーター）である。
【００９８】
プラスチドが脂質生合成の前駆体および一部最終産物が合成される画分であることから、プラスチド特異的遺伝子発現をもたらすプロモーターも、同じく特に適している。適切なプロモーターは、ＷＯ９５１６７８３およびＷＯ９７０６２５０に記載のウイルスＲＮＡ−ポリメラーゼプロモーター、ならびにＷＯ９９４６３９４に記載のシロイヌナズナ由来のｃｌｐＰプロモーターなどである。
【００９９】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングできる。すなわち、ＤＮＡ分子を、ＰＮＯ ｍＲＮＡにアンチセンスなＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にするように、調節配列に作用可能に連結する。様々な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の継続的な発現を指示する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作用可能に連結した調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーなど）を選択できるか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指示する調節配列を選択できる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸分子が高効率調節領域の制御下で生成される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱化ウイルスの形態であってよく、この活性は、ベクターを導入する細胞型により決定できる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６およびＭｏｌら， １９９０， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６８：４２７−４３０を参照のこと。
【０１００】
一実施形態では、本発明は、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを含む、組換え宿主細胞の作製方法に関する。
【０１０１】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核生物または真核生物細胞に導入できる。本明細書で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」、接合および形質導入という用語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認知された様々な技術を指すことを意図し、カルシウムリン酸またはカルシウム塩酸同時沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介型トランスフェクション、リポフェクション、天然型受容能、化学物質仲介型導入、またはエレクトロポーレーションが挙げられる。植物細胞を含む宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）、およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９５， Ｖｏｌ． ４４， Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ＧａｒｔｌａｎｄおよびＤａｖｅｙ編， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙなどの他の実験マニュアルで見つけることができる。
【０１０２】
哺乳動物の安定したトランスフェクションのために、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、少ない割合の細胞のみがそれらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込む得ることが知られている。これらの組込み体を同定および選択するために、（例えば、抗生物質に耐性な）選択可能マーカーをコードする遺伝子を通常、目的遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなど薬剤に対する耐性を授けるもの、または植物においてグリホサートまたはグルホシネートなどの除草剤に対する耐性を授けるものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸を、本発明のポリペプチドをコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入するか、または別のベクターに導入できる。導入された核酸で安定してトランスフェクトされる細胞は、例えば薬剤選択により同定できる（例えば、他の細胞が死ぬのに対して、選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存している）。
【０１０３】
相同組換え微生物を作製するために、欠失、付加または置換が導入されて、ＰＮＯ遺伝子が改変（例えば機能的に破壊）された本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部を含むベクターを調製する。このＰＮＯ遺伝子は、Ｅ．グラシリスＰＮＯ遺伝子であることが好ましいが、関連するまたは異なる由来源に由来する相同体であってもよい。好適な実施形態では、相同組換えの際に、内因性ＰＮＯ遺伝子が機能的に破壊されるように（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしないように；ノックアウトベクターとも呼ばれる）ベクターを設計する。あるいはまた、ベクターは、相同組換えの際に、内因性ＰＮＯ遺伝子が突然変異されるか、さもなくば改変されるが、機能的タンパク質はコードしたままであるように設計できる（例えば、上流調節領域を改変して、内因性ＰＮＯの発現を改変できる）。相同組換えを介して点突然変異を行うために、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら１９９９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７（５）：１３２３−１３３０およびＫｍｉｅｃ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． １９９９， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ． ８７（３）：２４０−２４７から知られるキメラ形成法として知られているＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドも使用できる。
【０１０４】
ベクターを細胞に導入し、導入したポリヌクレオチド遺伝子が内因性ＰＮＯ遺伝子と相同組換えした細胞を、当該分野で公知の技術を用いて選択する。
【０１０５】
導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択系を含むさらなる宿主細胞を生成できる。例えば、ｌａｃオペロンの制御下に置いてベクター上に本発明のポリヌクレオチドを含むことにより、ＩＰＴＧの存在下でのみポリヌクレオチドの発現が可能になる。このような調節系は当該分野において周知である。
【０１０６】
導入される核酸分子は宿主細胞に対して外来であることが好ましい。
【０１０７】
「外来」というのは、核酸分子が宿主細胞に対して異種（つまり、異なるゲノムバックグラウンドを有する細胞または生物に由来することを意味する）、または宿主細胞に対して同種であるが、該核酸分子の天然型対応部分と異なるゲノム環境に位置することを意味する。これは、つまり、核酸分子が、宿主細胞に対して同種である場合に、該宿主細胞のゲノムにおいてその自然な位置に存在せず、特に異なる遺伝子に囲まれることを意味する。この場合、核酸分子は、それ自身のプロモーターの制御下、または異種プロモーターの制御下にのいずれかにあり得る。宿主細胞に存在する本発明のベクターまたは核酸分子はいずれも、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、染色体外でなんらかの形態で維持され得る。この点で、本発明の核酸分子を使用して、相同組換えにより変異型遺伝子を再現または作製できることも理解されるべきである（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ（編）， Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ． Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９９４））。
【０１０８】
従って、別の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターにより遺伝子操作された宿主細胞に関する。
【０１０９】
「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において互換的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞のみではなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫を指すことが理解される。突然変異または環境的影響のいずれかにより、後続の世代において特定の改変が生じ得るため、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で使用する用語の範囲に含まれる。
【０１１０】
例えば、本発明のポリヌクレオチドは、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、哺乳細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞など）、藻類、繊毛虫類、植物細胞、菌類、またはＣ．グルタミカムなどの他の微生物に導入できる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。好ましいのは、大腸菌、バキュロウイルス、アグロバクテリウム、または真菌細胞、例えば、サッカロミセス属のもの（例えば、Ｓ．セレビシエ種のもの）である。
【０１１１】
さらに、宿主細胞は、細胞におけるアセチルＣｏＡの増加またはアセチルＣｏＡの代謝産物の増加を支持するようにさらなる酵素およびタンパク質（例えば、細胞もしくは細胞画分における前駆体の増加を提供するか、またはアセチルＣｏＡに基づく代謝経路の産物を輸送する輸送体）が（過剰）発現されるように形質転換できる。他の酵素は、当業者に周知であり、エロンガーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、デヒドロゲナーゼなど、植物脂肪酸生合成、不飽和化、リポ化合物の脂質代謝および膜輸送、β酸化、アセチルＣｏＡ利用代謝の遊離体および産物の脂肪酸改変が挙げられる。
【０１１２】
さらに好ましいのは、本明細書で言及する植物のうちの１つの細胞、特に上記油生成植物および／またはトウモロコシ、コメ、ダイズ、ナタネまたはヒマワリの細胞である。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明は、本発明の宿主細胞を培養すること、上記ポリヌクレオチドにコードされ、該宿主細胞により発現されるポリペプチドを培養物または細胞から回収することを含む、ＰＮＯ活性を有するポリペプチドを生成するためのプロセスに関する。
【０１１４】
「発現」という用語は、細胞におけるタンパク質またはヌクレオチド配列の生成を意味する。しかし、この用語はまた、細胞を含まない系におけるタンパク質の発現も含む。これは、ＲＮＡ産物への転写、該産物をコードするＤＮＡからタンパク質産物またはポリペプチドへの転写後改変および／または翻訳、ならびに可能性のある翻訳後改変を含む。
【０１１５】
使用する特定の構築物および条件に応じて、タンパク質を細胞、培養培地、またはその両方から回収できる。当業者には、天然型タンパク質が発現できるだけではなく、融合ポリペプチドとしてタンパク質を発現すること、またはタンパク質を宿主細胞の特定の画分に方向付ける（例えば、培養培地などへのタンパク質の分泌を確実にする）シグナル配列を付加することなどが周知である。さらに、このようなタンパク質およびその断片は、例えば以下に記載する標準的方法により化学的に合成および／または改変することができる。
【０１１６】
培養中の原核生物または真核生物細胞などの本発明の宿主細胞を用いて、好ましくはＰＮＯ活性を有する本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを生成（すなわち発現）できる。エレクトロポーレーションまたはアグロバクテリウム培地遺伝子導入を介した発生中の花への直接ＤＮＡ導入により、植物において代替的な方法をさらに適用してもよい。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いたＰＮＯの生成方法をさらに提供する。一実施形態では、本方法は、ＰＮＯが生成されるように適切な培地中で本発明の宿主細胞を培養することを含む。さらに、本方法は、培地または宿主細胞からＰＮＯを単離回収することを含む。
【０１１７】
本発明のポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により生成されることが好ましい。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を、（上記したように）発現ベクターにクローニングし、（上記したように）発現ベクターを宿主細胞に導入し、該ポリペプチドを宿主細胞において発現させる。その後、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームにより、このポリペプチドを細胞から単離できる。組換え発現の代わりに、標準的ペプチド合成技術を用いて、ＰＮＯポリペプチドまたはペプチドを化学的に合成できる。さらに、例えば、ＰＮＯまたはその断片（すなわち、本発明のポリペプチド）を用いた標準的技術により生成できる以下に記載する本発明の抗体（特に、抗ＰＮＯ抗体）を用いて、天然型ＰＮＯを細胞（例えば、内皮細胞）から単離できる。
【０１１８】
一実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるか、または本発明のプロセスにより得られるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
【０１１９】
本明細書において使用する「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は互換性を有する。「ポリペプチド」は、アミノ酸重合体（アミノ酸配列）を指し、特定の長さの分子を指すものではない。従って、ペプチドおよびオリゴペプチドはポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの翻訳後改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を指すかまたは含む。定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然型アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、置換された連結部を有するポリペプチド、ならびにその他の天然型および非天然型の改変である。
【０１２０】
ポリペプチドは単離されることが好ましい。「単離」もしくは「精製」タンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、組換えＤＮＡ技術で生成された場合には細胞物質を、または化学的に合成された場合には化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
【０１２１】
「細胞物質を実質的に含まない」という言葉使いは、自然にまたは組換え的にタンパク質が生成される細胞の細胞画分からタンパク質が分離された本発明のポリペプチドの調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言葉使いは、約３０％未満（乾燥重量）の「汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ）タンパク質」、より好ましくは約２０％未満の「汚染タンパク質」、さらにより好ましくは約１０％未満の「汚染タンパク質」、そして最も好ましくは約５％未満の「汚染タンパク質」を有する調製物を含む。「汚染タンパク質」という用語は、本発明のポリペプチドではないポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分が組換え的に生成された場合、培養培地を実質的に含まない（すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す）ことも好ましい。「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉使いは、タンパク質合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から本発明のポリペプチドが分離した調製物を含む。「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉使いは、約３０％未満（乾燥重量）の化学物質前駆体または非ＰＮＯ化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学物質前駆体または非ＰＮＯ化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学物質前駆体または非ＰＮＯ化学物質、そして最も好ましくは約５％未満の化学物質前駆体または非ＰＮＯ化学物質を有する調製物を含む。好適な実施形態では、単離タンパク質またはその生物学的に活性部分は、本発明のポリペプチドが誘導される同じ生物に由来する汚染タンパク質を欠いている。典型的に、このようなタンパク質は、例えば、植物、または大腸菌もしくはＣ．グルタミカムなどの微生物、繊毛虫類、藻類、または菌類におけるＥ．グラシリスＰＮＯの組換え発現により生成される。
【０１２２】
本発明のポリペプチドは、タンパク質またはその部分がアセチル−ＣｏＡを合成する能力を維持する、配列番号１または３のアミノ酸配列と十分な相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましいポリペプチドまたはその部分に関連し得る。タンパク質の部分は、本明細書に記載するような生物学的に活性な部分であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、配列番号１または３と同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。さらに、ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズ（好ましくは上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ）するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を有し得る。従って、ＰＮＯは、配列番号１または３のアミノ酸配列の１つと少なくとも約６０〜６５％、好ましくは少なくとも約６６〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を有する。本発明の好ましいポリペプチドは、本明細書に記載するＰＮＯ活性（例えば、その酵素的または免疫学的活性）を少なくとも１つ所有することも好ましい。例えば、本発明の好ましいポリペプチドは、上記定義したように、配列番号２のヌクレオチド配列にハイブリダイズする（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする）またはそれと相同な、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
従って、本発明のポリペプチドは、本明細書に詳細に記載する、アミノ酸における天然の変異または突然変異誘発による変異により、配列番号１または３より得られるものであってよい。従って、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列全体と、少なくとも約６０〜６５％、好ましくは少なくとも約６６〜７０％、そしてより好ましくは少なくとも約７０〜８０、８０〜９０、９０〜９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
本発明のポリペプチドの生物学的に活性な部分は、完全長ＰＮＯまたはＰＮＯに相同な完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、ＰＮＯの少なくとも１つの活性を示す、ＰＮＯのアミノ酸配列から誘導したアミノ酸配列（例えば、配列番号１もしくは３に示すアミノ酸配列、またはＰＮＯに相同なタンパク質のアミノ酸配列）を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に（または免疫学的に）活性な部分（ペプチド、例えば、５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００以上のアミノ酸の長さのペプチド）は、ＰＮＯの少なくとも１つの活性またはエピトープを有するドメインまたはモチーフを含む。さらに、ポリペプチドの他の領域が欠失した他の生物学的に（または免疫学的に）活性な部分を、組換え技術により調製し、本明細書に記載する１つ以上の活性について評価できる。ＰＮＯの生物学的に活性な部分は、生物学的活性を有する１つ以上の選択されたドメイン／モチーフまたはその一部を含むことが好ましい。
【０１２５】
本発明はまた、キメラまたは融合タンパク質を提供する。
【０１２６】
本明細書で使用する「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＰＮＯポリペプチドに作用可能に連結したポリペプチドを含む。
【０１２７】
「ＰＮＯポリペプチド」とは、ＰＮＯ（例えば、生物学的または免疫学的）活性を有するポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、「非ＰＮＯポリペプチド」は、ＰＮＯと実質的に相同ではないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、ＰＮＯとは異なる、同じまたは異なる生物から誘導されたタンパク質）を指す。
【０１２８】
融合タンパク質のうち、「作用可能に連結」とは、ＰＮＯポリペプチドおよび非ＰＮＯポリペプチドが互いと融合して、両方の配列が、使用する配列に関する提案の機能を満たすことを指すことを意図する。非ＰＮＯポリペプチドは、ＰＮＯポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合できる。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、ＰＮＯ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合したＧＳＴ−ＬＭＲＰ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＰＮＯの精製を促進できる。別の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端に異種シグナル配列を含むＰＮＯである。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、異種シグナル配列の使用によりＰＮＯの発現および／または分泌を高めることができる。
【０１２９】
本発明のＰＮＯキメラまたは融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術により生成されることが好ましい。例えば、従来の技術に従って（例えば、ライゲーションのための平滑末端または付着末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切であれば付着末端を埋めること、望ましくない連結を避けるためのアルカリリン酸処理、ならびに酵素ライゲーションを採用して）、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片をインフレームで互いとライゲートする。融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成できる。あるいはまた、２つの連続する遺伝子断片の間で相補的な突出部分を生じるアンカープライマーを用いて、これをその後アニールおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することにより、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ： １９９２を参照）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードする多くの発現ベクターが市販されている。融合部分がインフレームでＰＮＯに連結するように、ＰＮＯコードポリヌクレオチドをこのような発現ベクターにクローニングできる。
【０１３０】
さらに、本発明のタンパク質の構造モチーフの折り畳みシミュレーションおよびコンピュータ再設計を、適切なコンピュータプログラムを用いて行うことができる（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２５ （１９９６）， ２８６−２９９；Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｃｏｍｐｕｔ， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． １１ （１９９５）， ６７５−６７９）。タンパク質折り畳みのコンピュータモデリングを用いて、細かいペプチドおよびタンパク質モデルのコンホメーションおよびエネルギー分析を行うことができる（Ｍｏｎｇｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４７ （１９９５）， ９９５−１０１２；Ｒｅｎｏｕｆ， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３７６ （１９９５）， ３７−４５）。特に、適切なプログラムを使用し、相補ペプチド配列についてのコンピュータ支援型検索により、マイトジェンシプリン（ｃｙｐｌｉｎ）と、その受容体、そのリガンドまたは他の相互作用タンパク質との相互作用部位を同定できる（Ｆａｓｓｉｎａ， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ （１９９４）， １１４−１２０）。タンパク質およびペプチドの設計のためにさらに適したコンピューターシステムは、例えば、Ｂｅｒｒｙ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ２２ （１９９４）， １０３３−１０３６；Ｗｏｄａｋ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５０１ （１９８７）， １−１３；Ｐａｂｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５ （１９８６）， ５９８７−５９９１などの従来技術に記載されている。上記コンピュータ分析から得た結果を使用して、例えば、本発明のタンパク質またはその断片のペプチド模倣体を調製できる。タンパク質の天然型アミノ酸配列のこのような擬似ペプチド類似体は、親タンパク質を非常に効率的に模倣し得る（Ｂｅｎｋｉｒａｎｅ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１ （１９９６）， ３３２１８−３３２２４）。例えば、本発明のタンパク質またはその断片への入手し易いアキラルなＱアミノ酸残基の組込みは、脂肪族鎖のポリメチレンユニットによるアミド結合の置換を生じて、ペプチド模倣体を構築するための都合のよい戦略を提供する（Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３９ （１９９６）， ７６９−７７７）。
【０１３１】
他の系に入った小さいペプチドホルモンの超活性（ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅ）ペプチド模倣類似体が、従来技術に記載されている（Ｚｈａｎｇ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２４ （１９９６）， ３２７−３３１）。本発明のタンパク質の適切なペプチド模倣体はまた、連続したアミドアルキル化を介したペプチド模倣体コンビナトリアルライブラリーの合成、ならびに得られる化合物の（例えば、結合および免疫学的性質についての）テストによっても同定できる。ペプチド模倣体コンビナトリアルライブラリーの生成および使用のための方法は、例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６７ （１９９６）， ２２０−２３４およびＤｏｒｎｅｒ， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４ （１９９６）， ７０９−７１５などの従来技術に記載されている。
【０１３２】
さらに、本発明のタンパク質の三次元および／または結晶学的構造を使用して、本発明のタンパク質の生物学的活性のペプチド模倣体インヒビターを設計できる（Ｒｏｓｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５ （１９９６）， １２９３３−１２９４４；Ｒｕｔｅｎｂｅｒ， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４ （１９９６）， １５４５−１５５８）。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドまたは部分に特異的に結合する抗体（すなわち、このようなタンパク質に特異的な断片またはエピトープ）に関する。
【０１３４】
本発明の抗体は、任意の生物、好ましくは藻類において他のＰＮＯおよび遺伝子を同定および単離するために使用できる。これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または合成抗体、ならびに抗体のフラグメント（Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメントなど）であり得る。モノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５、ならびにＧａｌｆｒ６， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３ （１９８１）， ３に元々記載された、マウス骨髄腫細胞と免疫化哺乳動物由来の脾臓細胞との融合を含む技術により調製できる。
【０１３５】
さらに、上記ペプチドに対する抗体またはその断片は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８８に記載の方法を用いて得ることができる。これらの抗体は、例えば、本発明のタンパク質の免疫沈降および免疫局所化、例えば組換え生物におけるこのようなタンパク質の合成のモニタリング、ならびに本発明のタンパク質と相互作用する化合物の同定のために使用できる。例えば、ＢｌＡｃｏｒｅシステムで採用される表面プラスモン共鳴を用いてファージ抗体選択の効率を高め、本発明のタンパク質のエピトープに結合するファージ抗体の単一ライブラリーから親和性の高い増分を産生することができる（Ｓｃｈｉｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７ （１９９６）， ９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３ （１９９５）， ７−１３）。多くの場合、抗体と抗原との結合現象は、他のリガンド／抗リガンド結合と等価である。
【０１３６】
一実施形態では、本発明は、（ａ）〜（ｌ）のうちの任意の１つの相補配列を含むアンチセンス核酸分子に関連する。
【０１３７】
発現レベルおよび／または活性の改変方法は、当業者に知られており、例えば、過剰発現、同時抑制、リボザイムの使用、センスおよびアンチセンス戦略、遺伝子サイレンシングアプローチが挙げられる。「センス鎖」は、二本鎖ＤＮＡ分子のｍＲＮＡ転写体に相同な鎖を指す。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」の配列に相補的な反転配列を含む。
【０１３８】
「アンチセンス」核酸分子は、タンパク質をコードする「センス」核酸分子に相補的な（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的なまたはｍＲＮＡ配列に相補的な）ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸分子は、センス核酸分子に水素結合できる。アンチセンス核酸分子は、ＰＮＯコード鎖全体、またはその一部のみに対して相補的であり得る。従って、アンチセンス核酸分子は、ＰＮＯをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスであり得る。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。さらに、アンチセンス核酸分子は、ＰＮＯをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」にアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、ポリペプチドに翻訳されない、コード領域に隣接する５’および３’配列（つまり、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）を指す。
【０１３９】
本明細書に開示するＰＮＯをコードするコード鎖配列を考えると、本発明のアンチセンス核酸分子はワトソンおよびクリック塩基対合の規則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子は、ＰＮＯ ｍＲＮＡのコード領域に全体に相補的であり得るが、ＰＮＯ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみにアンチセンスなオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＯ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子は、当該分野で公知の手順を使用した化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて構築できる。例えば、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、分子の生物学的安定性を高めるため、またはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重らせんの物理的安定性を高めるために設計された天然型ヌクレオチドまたは様々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成できる（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換型ヌクレオチドが使用できる）。アンチセンス核酸を生成するために使用できる改変型ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシ−カルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボシキプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいはまた、アンチセンス核酸は、ポリヌクレオチドがアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成できる（すなわち、以下の副節にさらに記載するように、挿入ポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡは、目的の標的ポリヌクレオチドに対してアンチセンス方向である）。
【０１４０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的に、細胞に投与されるか、ｉｎ ｓｉｔｕで生成されて、ＰＮＯをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合して、（例えば、転写および／または翻訳を阻害して）タンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、従来のヌクレオチド相補性により安定した二重らせんを形成するか、または例えばＤＮＡ二重らせんに結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主要溝（ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介して行うことができる。アンチセンス分子は、選択された細胞表面上で発現された受容体または抗原に（例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることにより）特異的に結合するように改変できる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達できる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るために、アンチセンス核酸分子が、強力な原核生物、ウイルスまたは真核生物（植物プロモーターを含む）の制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、αアノマー核酸分子であり得る。αアノマー核酸分子は、通常のβユニットとは対照的に鎖が互いと平行に延びる相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（ｉｎｏｕｅら （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら （１９８７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５：３２７−３３０）を含む。
【０１４２】
さらに、本発明のアンチセンス核酸分子はリボザイムであり得る。リボザイムは、ｍＲＮＡなどの一本鎖核酸に対する相補領域を有してそれらを切断可能なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１に記載））を使用して、ＰＮＯ ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害できる。ＰＮＯコード核酸分子に対する特異性を有するリボザイムを、本明細書に開示するＰＮＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、または本発明において教示する方法により単離される異種配列に基づいて設計できる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がコードｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列と相補的なテトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体が構築できる。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号、およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいはまた、ＰＮＯ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択できる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ， Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ， Ｊ．Ｗ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【０１４３】
あるいはまた、ＰＮＯヌクレオチド配列の調節領域（例えば、ＰＮＯプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞におけるＰＮＯ遺伝子の転写を防ぐ三重らせん構造を形成することにより、ＰＮＯ遺伝子発現を阻害できる。全般的に、Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ． （１９９１） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ．ら （１９９２） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ， Ｌ．Ｊ． （１９９２） Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５を参照のこと。
【０１４４】
さらに、一実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物、植物細胞または植物組織の生成方法に関し、該方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを、該植物、植物組織、または植物細胞のゲノムに導入することを含む。
【０１４５】
植物細胞におけるセンスまたはアンチセンス方向での本発明の核酸部分の発現のためには、分子を調節エレメントの制御下に置くことで、植物細胞における発現を確実にする。これらの調節エレメントは、発現される核酸分子および形質転換する植物種に対して異種でも同種であってもよい。
【０１４６】
一般的に、このような調節エレメントは、植物細胞においてプロモーター活性を有する。トランスジェニック植物の全ての組織において発現を得るために、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３１３ （１９８５）， ８１０−８１２）、またはトウモロコシのポリユビキチン遺伝子のプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８ （１９８２）， ６７５−６８９）などの構成的プロモーターを使用することが好ましい。トランスジェニック植物の特定の組織において発現を得るために、組織特異的プロモーターを使用することが可能である（例えば、Ｓｔｏｃｋｈａｕｓ， ＥＭＢＯ Ｊ． ８ （１９８９）， ２２４５−２２５１を参照）。ジャガイモの塊茎または異なる植物種（トウモロコシ、ソラマメ、コムギ、オオムギなど）の種子において特異的に活性なプロモーターも知られている。誘導可能なプロモーターを使用して、発現を正確に制御することができる。
【０１４７】
誘導可能なプロモーターの例は、熱ショックタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターである。小胞子特異的調節エレメントおよびそれらの使用も記載されている（ＷＯ９６／１６１８２）。さらに、化学的に誘導可能なＴｅｔ系を採用してもよい（Ｇａｔｚ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２７ （１９９１）； ２２９−２３７）。さらに適したプロモーターは、当業者に知られており、例えば、Ｗａｒｄ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２ （１９９３）， ３６１−３６６）に記載されている。調節エレメントは、植物細胞において機能的な転写および／または翻訳エンハンサーをさらに含み得る。さらに、調節エレメントは、転写産物へポリＡテイルを付加してその安定性を改善するポリＡシグナルなどの転写終結シグナルを含み得る。
【０１４８】
外来ＤＮＡの植物への導入方法も当該分野において周知である。これらとしては、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡでの植物細胞または組織の形質転換、プロトプラストの融合、直接遺伝子導入（例えば、ＥＰ−Ａ １６４ ５７５を参照）、インジェクション、エレクトロポーレーション、粒子衝撃法などのバイオリスティック法、花粉仲介型形質転換、植物ＲＮＡウイルス仲介型形質転換、リポソーム仲介型形質転換、傷ついたもしくは酵素分解された未熟胚または傷ついたもしくは酵素分解された胚形成カルスを用いた形質転換、ならびに当該分野で公知の他の方法が挙げられる。本発明の方法において使用されるベクターは、さらなる機能的エレメント（例えば、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡの「左側境界」配列および「右側境界」配列など）を含んで、植物ゲノムへの安定した組込みを可能にし得る。さらに、マーカーを含まない（つまり、選択可能またはスコア付け可能マーカー遺伝子が植物発生または植物繁殖の特定の段階で失われた）トランスジェニック植物の生成を可能にする方法およびベクターが当業者に公知である。これは、例えば、同時形質転換（Ｌｙｚｎｉｋ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３ （１９８９）， １５１−１６１；Ｐｅｎｇ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７ （１９９５）， ９１−１０４）、および／または植物において相同組換えを促進可能な酵素を利用する系の使用（例えば、ＷＯ９７／０８３３１；Ｂａｙｌｅｙ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８ （１９９２）， ３５３−３６１；Ｌｌｏｙｄ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅ Ｇｅｎｅｔ． ２４２ （１９９４）， ６５３−６５７；Ｍａｅｓｅｒ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３０ （１９９１）， １７０−１７６；Ｏｎｏｕｃｈｉ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９ （１９９１）， ６３７３−６３７８を参照）により達成することができる。適切なベクターの調製方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版 （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）に記載されている。
【０１４９】
適切なアグロバクテリウム・ツメファシエン株およびベクター、アグロバクテリアの形質転換、ならびに適切な成長および選択培地は、当業者に周知であり、従来技術に記載されている（ＧＶ３１ ０１ （ｐＭＫ９０ＲＫ）， Ｋｏｎｃｚ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０４ （１９８６）， ３８３−３９６；Ｃ５８Ｃ１ （ｐＧＶ ３８５０ｋａｎ）， Ｄｅｂｌａｅｒｅ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １３ （１９８５）， ４７７７；Ｂｅｖａｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２ （１９８４）， ８７１１；Ｋｏｎｃｚ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６ （１９８９）， ８４６７−８４７１；Ｋｏｎｃｚ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０ （１９９２）， ９６３−９７６；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ｖｏｌ ２， ＧｅｌｖｉｎおよびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ（編）， Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ： Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌ． （１９９４）， １−２２に掲載のＫｏｎｃｚ， Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔａｇｇｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ；ＥＰ−Ａ−１２０ ５１６；Ｈｏｅｋｅｍａ： Ｔｈｅ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｏｆｆｓｅｔｄｒｕｋｋｅｒｉｊ Ｋａｎｔｅｒｓ Ｂ．Ｖ．， Ａｌｂａｓｓｅｒｄａｍ （１９８５）、第Ｖ章， Ｆｒａｌｅｙ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ． Ｓｃｉ．， ４， １−４６；Ａｎ， ＥＭＢＯ Ｊ． ４ （１９８５）， ２７７−２８７）。
【０１５０】
本発明の方法においてアグロバクテリウム・ツメファシエンの使用が好ましいが、アグロバクテリウム・リゾゲネスなど他のアグロバクテリウム株も該株により得られる表現型が所望の場合には使用してもよい。
【０１５１】
バイオリスティック法を用いた形質転換の方法は、当業者に周知である；例えば、Ｗａｎ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４ （１９９４）， ３７−４８；Ｖａｓｉｌ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１ （１９９３）， １５５３−１５５８、およびＣｈｒｉｓｔｏｕ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １， ４２３−４３１を参照のこと。マイクロインジェクションは、ＰｏｔｒｙｋｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ（編）， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， ＮＹ （１９９５）に記載のように行うことができる。
【０１５２】
ほとんどの双子葉植物の形質転換は上記方法で可能である。単子葉植物の形質転換のためにも、いくつかの上手くいく形質転換技術が開発されている。これらとしては、例えば上記したもののようなバイオリスティック方法を用いた形質転換、プロトプラスト形質転換、部分的に浸透化された細胞のエレクトロポーレーション、ガラス繊維を用いたＤＮＡ導入などが挙げられる。
【０１５３】
本明細書で使用する「形質転換」という用語は、導入のために使用する方法に関わらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。ポリヌクレオチドは、宿主細胞に一過的または安定して導入され、非組込み状態で（例えば、プラスミドまたはキメラ連結部（ｌｉｎｋ）として）維持されてもよいし、あるいまた宿主ゲノムに組み込まれてもよい。その後、得られる形質転換植物細胞を使用して、当業者に公知のように形質転換植物を再生できる。
【０１５４】
一般的に、本発明により改変でき、かつ本発明のタンパク質の過剰発現またはこのようなタンパク質の合成の減少のいずれかを示す植物は、任意の所望の植物種から誘導できる。これらは、単子葉植物でも双子葉植物であってもよく、好ましくは、穀物植物（例えば、トウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギなど）、ジャガイモ、油生成植物（例えば、セイヨウアブラナ、ヒマワリ、ピーナッツ、ダイズなど）、綿、テンサイ、サトウキビ、豆科植物（例えば、マメ（ｂｅａｎ）、エンドウマメなど）、木材生成植物（好ましくは、木）などの農業、林業または園芸的対象の目的の植物種に属する。
【０１５５】
さらに一実施形態では、本発明は、本発明の方法により得られるポリヌクレオチドまたはベクターを含む植物細胞に関する。
【０１５６】
従って、本発明は、植物細胞においてポリヌクレオチドを発現させる調節エレメントに連結した（好ましくはゲノムに安定して組み込まれた）本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物細胞にも関する（該ポリヌクレオチドはトランスジェニック植物細胞に対して外来である）。外来の意味については上記参照。
【０１５７】
トランスジェニック植物細胞におけるポリヌクレオチドの存在および発現は、アセチルＣｏＡの合成をモジュレート（好ましくは増加）し、このような細胞を含む植物の生理学的変化（好ましくは表現型変化）をもたらす。
【０１５８】
従って、本発明は、本発明のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物および植物組織にも関する。例えば、発生段階および／または植物脂肪における（例えば、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、ろうエステル、（多）糖類および／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸、ケトン体など）生合成に関与する）本発明のポリペプチドの（過剰）発現により、これらのトランスジェニック植物は、野生型植物と比べて、様々な生理学的、発生的および／または形態学的改変を示し得る。
【０１５９】
例えば、ＰＮＯ遺伝子を発現するトランスジェニック植物を得るために、そのコード領域を例えばｐＢｉｎＡＲベクターにクローニングできる（ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｐｌａｎｔ−Ｓｃｉｅｎｃｅ， ６６， １９９０， ２２１−２３０）。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術に従い、実施例及び図面に示すプライマー（例えば、配列番号４および配列番号５）を用いてＰＮＯのコード領域を増幅できる。
【０１６０】
得られたＰＣＲ断片を精製し、その後、断片をベクターにクローニングできる。
【０１６１】
得られたベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンに導入できる。この株を形質転換に使用し、その後トランスジェニック植物を選択できる。別の実施形態では、本発明は、本発明の植物細胞を含むトランスジェニック植物または植物組織に関する。
【０１６２】
さらに、植物細胞、植物組織または植物も、さらなる酵素およびタンパク質（例えば細胞または細胞の画分における前駆体の増加を提供するか、またはアセチルＣｏＡに基づき代謝経路の産物を輸送する輸送体）が（過剰）発現されて、その発現が細胞におけるアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡの代謝産物の増加を支持するように形質転換できる。他の酵素は当業者に周知であり、エロンガーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、デヒドロゲナーゼなど、植物脂肪酸生合成、不飽和化、リポ化合物の脂質代謝および膜輸送、β酸化、アセチルＣｏＡ利用代謝の遊離体および産物の脂肪酸改変が挙げられる。
【０１６３】
特に、改変された脂肪酸伸長系を示す植物の商業的価値のために、該系に関与するＤＡＮＮ配列（例えば、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ）も、植物細胞、植物組織または植物だけではなく上記宿主細胞においても過剰発現され得る。さらに、プラスチドに局所化し、アシルキャリヤータンパク質に結合した中間体に関わる新生脂肪酸合成の酵素が、本発明のポリヌクレオチドと共に過剰発現され得る。
【０１６４】
本発明は、本発明のタンパク質の発現を示す上記したトランスジェニック植物細胞を含む培養植物組織にも関する。
【０１６５】
本発明により得られる任意の形質転換植物を、従来の繁殖スキームまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ植物増殖に使用して、同じ特徴を有するより多くの形質転換植物を生成できる、および／または同じまたは関連する種の他の変種に同じ特徴を導入するために使用できる。このような植物も本発明の一部をなす。形質転換植物から得た種子も、遺伝的に同じ特徴を含み、本発明の一部をなす。上記したように、本発明は、原則的に、当業者に公知の任意の形質転換方法により形質転換できる任意の植物および穀物（例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、脂肪種子穀物、綿、樹木種、テンサイ、キャッサバ、トマト、ジャガイモ、多数の他の野菜、果物を含む）に適用可能である。
【０１６６】
好適な実施形態では、本発明のトランスジェニック植物または植物組織は、ポリヌクレオチドまたはベクターが存在する場合に、改変されたアセチル−ＣｏＡ合成を有する。
【０１６７】
さらなる実施形態では、本発明は、宿主細胞を得るかまたは本発明の方法のステップを含むこと、そして本発明のポリペプチドを発現させる条件下で細胞を培養することをさらに含む、宿主細胞においてアセチル−ＣｏＡ合成をモジュレートする方法に関する。
【０１６８】
別の好適な実施形態では、本発明の方法において、発現されたポリペプチドが、植物細胞のプラスチドに局所化される。外来ポリペプチドの（例えばＰＮＯポリペププチドの）プラスチド局所化を達成するための方法は上述した。例えば、輸送シグナル配列を該ポリペプチドと融合させる。
【０１６９】
さらに、一実施形態では、本発明は、植物、植物組織または植部細胞におけるアセチル−ＣｏＡ合成のモジュレート方法に関し、該方法は、本発明の植物、植物組織または植物細胞を得ること、または本発明の方法のステップを含み、そして本発明のポリペプチドを発現させる条件下で該植物、植物組織または植物細胞を培養することを含む。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明は、アセチルＣｏＡ合成が高められた、本発明のトランスジェニック植物、宿主細胞、または方法に関する。
【０１７１】
さらに、一好適実施形態では、本発明は、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、ろうエステル、脂質、（多）糖類、および／またはポリヒドロキシアルカノエートの合成が高められた、本発明のトランスジェニック植物、宿主細胞または方法に関する。さらに本明細書で言及する他の生成物の生合成も高めることができる。従って、本発明は、上記化合物（特に、ステロイドホルモン、コレステロール、プロスタグランジン、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／またはケトン体）の１つから出発する化合物の生合成が高められた、植物細胞、宿主細胞または方法にも関する。高いビタミンＥ合成も好ましい。
【０１７２】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子を発現するトランスジェニック植物細胞を含むか、または低いレベルの記載のタンパク質を示す細胞を含む、本発明のトランスジェニック植物の収穫可能部分および増殖物質にも関する。
【０１７３】
収穫可能部分は、原則的に、例えば、花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子、根など、植物のあらゆる有用な部分であり得る。増殖物質としては、例えば、種子、果実、挿木、実生、塊茎、台木などが挙げられる。
【０１７４】
一実施形態では、本発明は、脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステルおよび／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびにその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体）の生成方法に関し、該方法は、本発明の方法のステップ、さらに細胞、培養物、植物または組織から該化合物を単離することを含む。
【０１７５】
別の実施形態では、本発明は、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、ろうエステル、（多）糖類および／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびにその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、コレステロール、プロスタグランジン、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体）を生成する細胞、組織および／または植物を作製するための本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはポリペプチドの使用に関する。
【０１７６】
本発明のＰＮＯポリヌクレオチドの操作は、野生型ＰＮＯとは機能的な違いを有するＰＮＯの生成を生じ得る。これらのタンパク質は、効率もしくは活性が改善されるか、細胞において通常よりも多い数で存在するか、または効率もしくは活性を低下され得る。
【０１７７】
脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、ろうエステル、脂質、（多）糖類および／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、コレステロール、トリアシルグリセロール、プロスタグランジン、胆汁酸および／もしくはケトン体）、またはこのような改変型タンパク質を取り込む上記定義された精製化学物質の収率、生成および／または生成効率に直接影響し得る本発明のＰＮＯの変化をもたらすメカニズムが多数ある。Ｃ．グルタミカム、繊毛虫類、藻類または菌類の大規模培養物からの上記化合物の回収は、細胞が所望の化合物を分泌する場合に有意に改善される。なぜなら、このような化合物は、（培養細胞の集合からの抽出とは対照的に）培養培地から精製し易いからである。ＰＮＯを発現する植物の場合、輸送の増加により植物組織および器官における区画化（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）が改善される。多くの生成物（例えば、細胞中の脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、（多）糖類、ろうエステルおよび／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、プロスタグランジン、ステロイドホルモン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体））の基礎となるアセチル−ＣｏＡの発現を高めるか、生成された該化合物の量を高めて収穫および精製を大幅に容易にするか、または植物の場合にはより効率的な区画化が可能であり得る。逆に、アセチル−ＣｏＡおよびさらに１つ以上の上記アセチルＣｏＡ代謝産物を効率的に過剰生成するためには、適切な生合成経路のための補因子、前駆体分子、および中間化合物の量が高い必要があり得る。従って、炭素ソース（すなわち、糖）、窒素ソース（すなわち、アミノ酸、アンモニア塩）、リン酸および硫黄などの栄養物質の輸送に関与する輸送タンパク質の数および／または活性を高めることで、生合成プロセスに対するあらゆる栄養物質供給の限定が無くなるため、アセチル−ＣｏＡおよび上記したその代謝産物の生成を改善することが可能であり得る。特に、藻類、植物、菌類またはＣ．グルタミカムなどの他の微生物において、上記化合物（例えば、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、ろうエステル、脂質、（多）糖類、および／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特に、ステロイドホルモン、コレステロール、プロスタグランジン、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体分子など））の収率、産生および／または生成効率を高めることが可能であり得る。
【０１７８】
上記化合物の収率を高めるためのＰＮＯの上記突然変異誘発戦略は、限定することを意図しない；これらの戦略の改変が当業者には容易に明らかになるであろう。このような戦略を使用し、本明細書に開示するメカニズムを取り入れ、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを利用して、上記所望の化合物の収率、生成および／または生成効率が改善されるように野生型ＰＮＯまたは変異型ＰＮＯポリヌクレオチドおよびタンパク質分子を発現する藻類、繊毛虫類、植物、菌類または他の微生物（Ｃ．グルタミカムなど）を作製し得る。この所望の化合物は、生合成経路の最終産物、および天然型代謝経路の中間体を含む藻類、繊毛虫類、植物、菌類またはＣ．グルタミカムの任意の天然型生成物、ならびに該細胞の代謝において自然に生じないが該本発明の細胞により生成される分子であり得る。
【０１７９】
さらに、一実施形態では、本発明は、ＰＮＯ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法に関し、該方法は、
（ａ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させること；
（ｂ）ＰＮＯ活性をアッセイすること；
（ｃ）ＰＮＯ活性を、該候補化合物の不在下において生じる標準的応答と比較し、標準を上回るＰＮＯの増加は該化合物がアゴニストであることを示し、低いＰＮＯ活性は該化合物がアンタゴニストであることを示すこと
を含む。
【０１８０】
上記化合物は、化学的に合成されるかもしくは微生物学的に生成され、および／または例えばサンプル（例えば、植物、動物もしくは微生物からの細胞抽出物）に含まれ得る。さらに、上記化合物は当該分野で公知であり得るが、これまでＰＮＯを抑制または活性化することが可能なことは知られていないものである。反応混合物は、細胞を含まない抽出物であり得るか、または細胞もしくは組織培養物を含み得る。本発明の方法のために適切な構成は当業者に公知であり、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， 第３版 （１９９４）， 特に第１７章に全般的に記載されている。化合物は、例えば、反応混合物、培養培地に添加されるか、細胞に注射されるか、または植物に噴霧され得る。
【０１８１】
本発明の方法において化合物を含むサンプルを同定する場合には、ＰＮＯを抑制もしくは活性化可能な化合物を含むと同定された元のサンプルから該化合物を単離することが可能であるか、または元のサンプルが複数の異なる化合物からなる場合にはそれをさらに再分割して、例えばサンプル当たりの異なる物質の数を減らして、元のサンプルの再分割部分で方法を繰り返すことができる。サンプルの複雑度に応じて、上記ステップを何回か、好ましくは本発明の方法により同定されたサンプルが限定数または単一の物質のみを含むようになるまで、行うことができる。上記サンプルは、類似した化学的および／または物理的性質の物質を含むことが好ましく、最も好ましくは上記物質は同一である。上記方法により同定される化合物またはその誘導体は、植物繁殖、または植物細胞および組織培養における適用に適した形態でさらに剤形化されることが好ましい。
【０１８２】
本発明の方法によりテストおよび同定できる化合物は、発現ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリー）、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小有機化合物、ホルモン、ペプチド模倣体、ＰＮＯなどであり得る（Ｍｉｌｎｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １ （１９９５）， ８７９−８８０；Ｈｕｐｐ， Ｃｅｌｌ ８３ （１９９５）， ２３７−２４５；Ｇｉｂｂｓ， Ｃｅｌｌ ７９ （１９９４）， １９３−１９８および上記引用した参考文献）。上記化合物は、公知のインヒビターまたは作用因子の機能的誘導体または類似体であり得る。化学誘導体および類似体の調製方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．， １７５ Ｆｉｆｔｈ Ａｖｅｎｕｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １００１０ Ｕ．Ｓ．Ａ．およびＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡに記載されている。さらに、上記誘導体および類似体は、当該分野で公知の方法によりそれらの影響についてテストできる。さらに、適切な誘導体および類似体のペプチド模倣体および／またはコンピュータ支援型設計も、例えば上述した方法に従って使用できる。本発明の方法において採用され得る細胞または組織は、本明細書で上述した実施形態に記載した本発明の宿主細胞、植物細胞または植物組織であることが好ましい。
【０１８３】
化合物がＰＮＯを抑制または活性化可能であるか否かを決定することは、実施例に記載するように行うことができる。上記方法により同定されるインヒビターまたは作用因子は、化学療法薬（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｋｕｍ）および／または植物成長レギュレーターとして有用であることが認められ得る。従って、別の実施形態では、本発明は、本発明の方法により得られるかまたは同定される、ＰＮＯのアンタゴニストまたはアゴニストである化合物に関する。
【０１８４】
従って、一実施形態では、本発明は、本発明の方法により同定される化合物にさらに関する。
【０１８５】
上記化合物は、例えばＰＮＯの相同体である。ＰＮＯの相同体は、突然変異誘発（例えば、別々の点突然変異誘発）またはＰＮＯの平滑末端化により生成できる。本明細書で使用する「相同体」という用語は、ＰＮＯの活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するＰＮＯの変形形態を指す。ＰＮＯのアゴニストは、ＰＮＯの生物学的活性と実質的に同じまたはその一部を保持する。ＰＮＯのアンタゴニストは、例えば、ＰＮＯを含むアセチルＣｏＡ代謝カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合するかまたはＰＮＯに結合して活性を妨げることにより、ＰＮＯの天然型形態の１つ以上の活性を阻害できる。
【０１８６】
一実施形態では、本発明は、本発明の化合物を特異的に認識する抗体に関する。
【０１８７】
本発明はまた、上記ポリヌクレオチド、核酸分子、ベクター、タンパク質、抗体または化合物の少なくとも１つ、および任意に適切な検出手段を含む診断組成物に関する。
【０１８８】
細胞からｍＲＮＡを単離すること、および得られたｍＲＮＡを上記核酸プローブを含むプローブとハイブリダイズ条件下で接触させ、プローブにハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を検出して、細胞におけるタンパク質の発現を検出することを含む。本発明のタンパク質の存在を検出するためのさらなる方法は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイなどの当該分野で周知の免疫技法を含む。さらに、本発明の核酸分子を、植物繁殖における分子マーカーとして使用できる。
【０１８９】
別の実施形態では、本発明は、本発明のアンチセンス核酸分子、本発明の抗体または化合物、および任意に製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【０１９０】
本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤をさらに含み得る。適切な製薬的担体の例は、当該分野で周知であり、リン酸緩衝化生理食塩水、水、エマルジョン（油／水エマルジョンなど）、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このような担体を含む組成物は、周知の従来方法により剤形化できる。これらの医薬組成物は、適切な用量で被検体に投与できる。適切な組成物の投与は、異なる手法により（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所、皮内、鼻腔内、気管支内投与により）行われ得る。用量投薬計画は、主治医および臨床的要因により決定される。医療分野において周知であるように、任意の一患者のための用量は、患者の体重、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与の時間および経路、身体全体の健康状態、ならびに同時に投与される他の薬剤を含む多くの要因に依存する。タンパク質性医薬活性物質は１用量当たり１ ｎｇ〜１０ ｍｇの量で存在し得る；しかし、この例示の範囲を下回るまたは上回る用量も、特に上記要因を考慮して想定される。適切な組成物の投与は、異なる方法により（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所または皮内投与により）行われ得る。投薬計画が連続的な輸液である場合、体重１キログラム／分当たりそれぞれ１μｇ〜１０ ｍｇ単位の範囲内にあるべきである。進行は、定期的な評価によりモニターできる。本発明の組成物は、局所的または全身的に投与し得る。投与は、一般的に、非経口的（例えば静脈内）である。本発明の組成物は、例えば内部もしくは外部標的部位へのバイオリスティック送達または動脈内の部位へのカテーテルにより、標的部位に直接投与されてもよい。非経口投与のための調製物としては、滅菌水溶または非水溶性溶剤、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水溶性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、野菜油（オリーブオイルなど）、および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水溶性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液（食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸化リンガー溶液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充薬、電解質補充薬（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、その意図する使用に応じて、インターロイキン、インターフェロンおよび／またはＣｐＧ含有ＤＡＮＮ配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）などさらなる薬剤を含み得る。
【０１９１】
例えば、本明細書で定義する医薬組成物はワクチンである。
【０１９２】
一実施形態では、本発明は、寄生生物感染の治療用の医薬組成物の調製のための、本発明のアンタゴニストであるアンチセンス核酸分子、抗体または化合物の使用に関する。
【０１９３】
ＰＮＯポリペプチドも、薬剤標的として、および新規薬剤の開発のために有用である。例えば、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼは、前ミトコンドリア（ａｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｔｅ）寄生生物における薬剤標的として知られている。メトロニダゾール（１−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチル−５−ニトロイミダゾール）は、嫌気性または微好気性微生物による感染の治療のための化学療法で使用される選択薬剤である（Ｆｒｅｅｍａｎら， １９９７）。この薬剤の抗菌効果は、反応性フリーラジカルの放出を生じる、標的細胞におけるその代謝反応に依存する（Ｅｄｗａｒｄｓ， １９９３）。５−ニトロイミダゾールに感受性がある生物の共通の性質は、薬剤のニトロ基へ電子を伝達可能な電子生成および電子伝達系の存在である。薬剤は、受動拡散により細胞に侵入し、そこで優先的な電子受容体として作用する。メトロニダゾールの還元（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）活性化のための電子のソースを提供する電子伝達タンパク質は、ピルビン酸の酸化発酵に関与する。この経路において鍵となるタンパク質はＰＦＯ、および微好気性細菌および原生生物寄生生物において特異的に見とめられるヒドロゲナーゼなどいくつかの他の酵素である。これらのタンパク質は、真核生物の好気性細胞を欠いている。
【０１９４】
メトロニダゾールは、フェレドキシンに供与される電子の受容体として、プロトンと置き換わる。薬剤の不在下では、プロトンは通常、ヒドロゲナーゼの作用により分子状水素に還元される（Ｊｏｈｎｓｏｎ １９９３， Ｍａｒｃｚａｋら１９８３， Ｙａｒｌｅｔｔら １９８５）。薬剤活性化におけるＰＦＯおよびフェレドキシンの重要性は、薬剤に対して耐性になった細菌および原生動物の特定の株が、ＰＦＯ（ＢｒｉｔｚおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎ， １９７９；Ｓｉｎｄｅｒら １９８２；Ｃｅｒｋａｓｏｖｏｖａら １９８４）またはフェレドキシン（Ｙａｒｌｅｔｔら １９８６；Ｌｌｏｙｄら １９８６；Ｑｕｏｎら １９９２）のいずれかについての活性を変化させたことを示すデータにより実証されている。
【０１９５】
還元メトロニダゾールの抗菌活性は、薬剤のニトロ基が単一電子ステップでヒドロキシルアミンに還元する際に形成される中間体の反応性から生じることが提議されている。他のフリーラジカルの作用との類似性により、毒性中間体が、ＤＮＡ、タンパク質および膜などの様々な細胞性成分と相互作用することが示唆されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ， １９９３）。メトロニダゾールのニトロ基の還元は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方におけるＤＮＡ損傷と相関されている（Ｉｎｇｓら１９７４， Ｅｄｗａｒｄｓ １９８６）。
【０１９６】
メトロニダゾールでの治療は通常非常に効果的であるが、メトロニダゾール耐性は、様々な細菌および原生動物種についてよく記録されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ １９９３；Ｓｉｎｄａｒら １９８２）。異なる好気性原生動物および細菌におけるメトロニダゾール耐性の基礎をなす正確なメカニズムは未知であるが、研究は、多くの耐性株が薬剤を活性化する能力について変化するらしいことを示している。薬剤活性化に関与する１つ以上のタンパク質の活性は、減少または無くなることが多い（Ｊｏｈｎｓｏｎ， １９９３）。これらのタンパク質としては、ＰＦＯ、フェレドキシン、末端オキシダーゼおよびヒドロゲナーゼが挙げられる。従って、薬剤活性化の鍵となる酵素であるＰＦＯは、寄生生物における薬剤耐性の理解および解決においても重要な役割を果たす。
【０１９７】
従って、寄生生物（例えばプラスモジウム、特に熱帯熱マラリア原虫）は、いくつかの段階において、ＰＦＯポリペプチド、ＰＮＯポリペプチド、または本発明のＰＮＯポリペプチドに相同な関連する酵素を介するアセチルＣｏＡ合成に依存する。寄生生物は、好気性または微好気性段階を有し得る。ＰＦＯまたはＰＮＯ経路により活性化されるＰＦＯまたはＰＮＯの活性を特異的に阻害する薬剤で処理されることが好ましい。これらの薬剤は、ＰＤＨまたは関連する経路と相互作用しないため、宿主生物／細胞に対して毒性でないことが好ましい。
【０１９８】
ＰＮＯおよびＰＦＯにおける保存的構造により、本発明のポリペプチドは、ＰＦＯのアンタゴニストまたはアゴニストを同定するために使用できる。従って、本発明の方法は、ＰＦＯアンタゴニストの同定に関連する１つ以上のさらなるステップ（例えば、ＰＦＯを阻害する活性についてＰＮＯアンタゴニストをテストすること）を含むことができる。例えばプラスモジウムなどの寄生生物ＰＦＯのアンタゴニストが好ましい。
【０１９９】
別の実施形態では、本発明は、請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクター、請求項９の宿主細胞、請求項１２のポリペプチド、請求項１４のアンチセンス核酸、請求項１３もしくは３１の抗体、請求項１６の植物細胞、請求項１７の植物もしくは植物組織、請求項２４の収穫可能部分、請求項２５の増殖物質、または請求項３０もしくは３１の化合物を含むキットに関連する。
【０２００】
本発明のキットの化合物は、任意に緩衝液および／または溶液と共に／に入れられて、バイアルなどの容器にパッケージングされ得る。適切であれば、１つ以上の該成分を、１つの同じ容器にパッケージングしてもよい。さらにまたは代替的に、１つ以上の上記成分を、固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ガラスプレート、チップもしくはナイロン膜）またはマイクロタイタープレートのウェルに吸着させてもよい。キットは、本明細書に記載するいずれの方法および実施形態（例えば、宿主細胞の作製、トランスジェニック植物、医薬組成物、相同配列の検出、アンタゴニストまたはアゴニストの同定など）のためにも使用できる。
【０２０１】
さらに、キットは、任意の上記実施形態のためにキットを使用（特に、宿主細胞、植物細胞、植物組織または植物においてアセチルＣｏＡ生合成をモジュレートするために使用）するための指示書を含み得る。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明は、医薬組成物の生成方法に関し、該方法は、本発明の方法のステップ、および
（ａ）ステップ（ｃ）において同定された化合物を製薬上許容可能な形態に剤形化すること、を含む。
【０２０３】
本発明は、さらなる使用および方法に関するいくつかの実施形態にも関する。
【０２０４】
本明細書に記載するポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質相同体、融合タンパク質、プライマー、ベクター、宿主細胞は、以下の１つ以上の方法で使用できる：すなわち、Ｅ．グラシリスおよび関連生物の同定；Ｅ．グラシリスに関連する生物のゲノムのマッピング；目的のＥ．グラシリス配列の同定および局所化；進化論的研究；機能に必要なＰＮＯ領域の決定；ＰＮＯ活性のモジュレーション；アセチル−ＣｏＡの代謝のモジュレーション、ならびに所望の化合物（脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ろうエステル、ビタミン、脂質、（多）糖類および／もしくはポリヒドロキシアルカノエート、ならびに／またはその代謝産物（特にステロイドホルモン、プロスタグランジン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸および／もしくはケトン体）など）の細胞生成のモジュレーション。
【０２０５】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、様々な用法を有している。まず、Ｅ．グラシリスまたはその密接な関連体として生物を同定するために使用され得る。また、微生物の混合集合においてＥ．グラシリスまたはその関連体の存在を同定するために使用され得る。ユニークなまたは混合した微生物集合の培養物の抽出ゲノムＤＮＡを、この生物特有のＥ．グラシリス遺伝子の領域にわたるプローブを用いて、ストリンジェントな条件下でプロービングすることにより、この生物が存在するか否かを確認することができる。
【０２０６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、関連種の配列と、これらの核酸分子が関連生物におけるゲノムマップの構築のためのマーカーとして作用するのに十分な程に相同であり得る。
【０２０７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、進化論およびタンパク質構造研究のために有用である。本発明のＰＮＯの配列と、他の生物由来の類似酵素をコードするものとを比較することにより、生物の進化論的関連性を評価できる。同様に、このような比較は、配列のどの領域が保存されどの領域が保存されていないかの評価を可能にし、これは、酵素の機能のために必須なタンパク質の領域を決定する助けになり得る。この種の決定は、タンパク質操作研究のために価値があり、タンパク質が機能を失うことなく突然変異誘発において何を寛容できるかを示し得る。
【０２０８】
上記および他の実施形態は、本発明の記載および実施例により開示および包含される。さらに、本発明により採用される全ての方法、使用及び化合物に関する文献は、例えば電子機器を用いて公の図書館から検索することができる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌでインターネットで利用可能な公のデータベース”Ｍｅｄｌｉｎｅ”を利用してもよい。ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／などの別のデータベースおよびアドレスは、当業者に公知であり、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍを利用して得ることもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概要、ならびに遡及的な調査および現行認識のための有用な特許情報の関連ソースの調査は、Ｂｅｒｋｓ， ＴＩＢＴＥＣＨ １２ （１９９４）， ３５２−３６４に記載されている。
【０２０９】
本発明は、以下の実施例（限定するものと解釈されるべきではない）によりさらに例示される。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許出願、特許および公開特許出願は、参照により本明細書に援用される。
【０２１０】
実施例
実施例１：全般的なプロセス
培養条件
ユーグレナ・グラシリス株ＳＡＧ １２２４−５／２５を、連続照明下で、１０ ｌ発酵槽に入ったミネラルを含むミドリムシ培地（Ｂｏｔａｎｉｃａ Ａｃｔａ（１９９７） １０７：１１１−１８６）において通気状態（２ ｌ／分）で５ ｌの培養物として培養させた。好気性培養のために２％ ＣＯ２含有雰囲気、嫌気性培養のために２％ ＣＯ２含有Ｎ２を使用した。４日後に培養物を回収した。暗所処置については、ミドリムシ培養物を明所で２日間培養し、暗所に供し、さらに２日後に収穫した。
【０２１１】
分子的方法
ユーグレナ・グラシリスのためのメッセンジャーＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、および？ＺａｐＩＩにおけるクローニングは、記載されるように行った（Ｈｅｎｚｅら， １９９６）。ｃＤＮＡライブラリーを、好気的に明所培養した細胞から単離したｍＲＮＡから調製した。データベースから抽出した原核生物および真核生物ＰＦＯのアライメントにより同定された保存的アミノ酸モチーフＬＦＥＤＮＥＦＧ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）Ｇ（配列番号９）およびＧＧＤＧＷＡＹＤＩＧ（Ｆ／Ｙ）（配列番号１０）に対して設計したオリゴヌクレオチドの組合せを用いた、ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲにより、ミドリムシ由来のＰＮＯのためのハイブリダイゼーションプローブを単離した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒサーモサイクラーを用いて、９５℃にて１０分間を１サイクル、ならびに９５℃にて３０秒間、６７℃にて３０秒間、７２℃にて１分間を２９サイクルを、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３）、５０ ｍＭ ＫＣｌ、２ ｍｍ Ｍｇ２＋、各ｄＮＴＰを５０μＭ、それぞれのプライマーを４０ ｐｍｏｌ、１０ ｍｇの鋳型ＤＮＡ、および０．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）において、最終容量２５μｌで行った。プライマーｐｎｏ１Ｆ９５３ ５’−ＴＩＴＴＹＧＡＲＧＡＹＡＡＹＧＣＩＧＡＲＴＴＹＧＧＩＴＴＹＧＧ−３’（配列番号４）およびｐｎｏ２Ｒ１０９５ ５’−ＡＡＩＣＣＤＡＴＲＴＣＲＴＡＩＧＣＣＣＡＩＣＣＲＴＣＩＣＣ−３’（配列番号５）は約７００ ｂｐ増幅産物を産出し、これはクローニングされ、配列決定により確認され、ｃＤＮＡスクリーニングのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用された。このように同定されたクローンの配列決定を、ネステッド欠失および合成プライマーを用いて決定した。ノーザン（Ｈａｎｎａｅｒｔら， ２０００）および標準的分子方法を記載のように行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９）。
【０２１２】
系統発生方法。データベース検索、配列操作、配列類似性検索、および複合アライメントをＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら １９８９）およびＧＣＧパッケージ・バージョン９．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）により行った。アライメントは、手作業で再調査および調節した。
【０２１３】
ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）アグロバクテリウム・ツメファシエン株（ＫｏｎｃｚおよびＳｃｈｅｌｌ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２０４ （１９８６）， ３８３−３９６） を用いて、アグロバクテリウム仲介型植物形質転換を行った。形質転換対象（ｃａｕｓｅ）は、標準的形質転換技術により行った（Ｄｅｂｌａｅｒｅら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｔｅｓ． １３ （１９８４）， ４７７７−４７８８）。
【０２１４】
植物形質転換
アグロバクテリウム仲介型植物形質転換対象は、標準的形質転換および再生技術を用いて行った（Ｇｅｌｖｉｎ， Ｓｔａｎｔｏｎ Ｂ．；Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ， Ｒｏｂｅｒｔ Ａ， ”Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ”， 第２版−Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ： Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌ．， １９９５−ｉｎ Ｓｅｃｔ．， Ｒｉｎｇｂｕｃ Ｚｅｎｔｒａｌｅ Ｓｉｇｎａｔｕｒ： ＢＴ１１−Ｐ ＩＳＢＮ ０−７９２３−２７３１−４；Ｇｌｉｃｋ， Ｂｅｒｎａｒｄ Ｒ．；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｅ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３．−３６０ Ｓ．， ＩＳＢＮ ０−８４９３−５１６４−２）。
【０２１５】
ナタネ対象は、子葉形質転換を介して形質転換した（Ｍｏｌｏｎｅｙら， Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ８ （１９８９）， ２３８−２４２；Ｄｅ Ｂｌｏｃｋら， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１ （１９８９， ６９４−７０１））。アグロバクテリウムおよび植物選択のためにカナマイシンを使用した。
【０２１６】
ダイズの形質転換は、例えば、ＥＰ ０４２４ ０４７、ＵＳ ３２２ ７８３（Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、またはＥＰ ０３９７ ６８７、ＵＳ ５ ３７６ ５４３、ＵＳ ５ １６９ ７７０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｏｌｅｄｏ）に記載の技術により行うことができる。
【０２１７】
アグロバクテリア仲介型植物形質転換の代わりに、粒子衝撃、ポリエチレングリコール仲介型ＤＮＡ摂取、または炭化ケイ素繊維技術を代替的に使用できる（ＦｒｅｅｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ ”Ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｈａｎｄｂｏｏｋ” （１９９３） ＩＳＢＮ ３−５４０−９７８２６−７， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０２１８】
実施例２
ミドリムシミトコンドリアＰＮＯの同定および発現
ミドリムシ由来のＰＮＯについてのＩｎｕｉおよび共同研究者らのこれまでの生化学的研究（Ｉｎｕｉら１９８７， １９９０， １９９１）は、単離酵素のトリプシン消化により放出される「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性断片」（Ｉｎｕｉら１９９１）がＰＦＯドメインに対応することを示唆してきた。Ｅ．グラシリスＰＮＯ活性酵素のＮ末端（ＴＳＧＰＫＰＡＳＸＩ、配列番号６；ＴＳＧＰＸＰＡＳＸＩＥＶＳＸＡＫ、配列番号７）、およびＰＮＯ ＣＰＲドメインのＥ．グラシリスＮ末端（ＡＡＡＰＳＧＮＸＶＴＩＬＹＧＳＥＥＧＮＳ、配列番号８）が、Ｉｎｕｉら， １９９１により決定されている。上記配列を図１に示す。しかし、上記配列をコードするポリヌクレオチド配列に対して構築したプライムによるＰＣＲ反応は有用な生成物を全くもたらさなかった。従って、新しい単離戦略を開発する必要がある。ミドリムシ合計ＤＮＡを基質としたＰＦＯアライメントの保存領域由来のプライマーでのＰＣＲを用いて、３００ ｂｐのコード領域（この推定アミノ酸配列は、真核生物および真正細菌由来の公知のＰＦＯ配列に対しておおよそ５０％のアミノ酸同一性を共有した）、ならびに２２１および１７４ ｂｐのイントロンを含む６９５ ｂｐ断片を単離した。このプローブを用いて、ＰＦＯに対して配列類似性を示し、重複領域において同一である１２の独立したポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を３００，０００ｃＤＮＡクローンにおいて見とめた。光合成原生生物ユーグレナ・グラシリスのミトコンドリア由来のＰＮＯをコードする２つの完全な大きさのｃＤＮＡ（ｐＥｇＰＮＯ３およびｐＥｇＰＮＯ１２）を単離した。ｐＥｇＰＮＯ３は、ｐＥｇＰＮＯ１２と比べて、ｃＤＮＡの５’端部で１５ ｂｐ短く、３’端部で１２ ｂｐ短かった。両方とも５’端部および３’端部において約２００ ｂｐの領域にわたり同一であることが証明された。ｐＥｇＰＮＯ３のインサートは５８１２ ｂｐであり、計算上のＭｒが１９９８１９ ＤａかつＮ末端部分においてＰＦＯに対する広域な類似性を有する（約１２５０ ａａ残基）タンパク質、ならびに残りのＣ末端の約５５０ ａａにわたりＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）および関連タンパク質に対応する１８０３アミノ酸（ａａ）のＯＲＦをコードしている（以下参照）。さらに、ｐＥｇＰＮＯ３は、３７ ａａの長さのＮ末端輸送ペプチドをミトコンドリアへの輸送のために担持する。従って、ミドリムシミトコンドリア由来のＰＮＯは、完全ＰＦＯおよびＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼの翻訳的融合体からなる。
【０２１９】
推定タンパク質は、ミドリムシミトコンドリアから精製された活性酵素から既に決定されたペプチドと同一である（Ｉｎｕｉら １９９１）。
【０２２０】
位置９における１つの不特定のアミノ酸”Ｘ”以外は、ミドリムシミトコンドリア由来の精製ＰＮＯのＮ末端配列の最初の１２残基（Ｉｎｕｉら １９９１）は、ｐＥｇＰＮＯ３によりコードされるタンパク質のアミノ酸位置３８から開始する配列と同一である（図１Ａ）。さらに、精製ＰＮＯから得た小さいトリプシン断片のＮ末端からアミノ酸配列決定により決定された１５の明白な残基（「ＮＡＤＰＨジアフォラーゼ活性断片」（Ｉｎｕｉら １９９１））は、ｐＥｇＰＮＯ３にコードされるタンパク質のアミノ酸位置１２４９から開始する配列と同一である（図１Ａ）。精製タンパク質の２つの異なる領域から生じる２７のアミノ酸と、ｐＥｇＰＮＯ３の推定アミノ酸配列との同一性は、ｐＥｇＰＮＯ３にコードされるタンパク質が、ミドリムシミトコンドリアＰＮＯの前駆体（ＥｇＰＮＯｍｔと称する）であり、輸送ペプチドの切断部位が図１Ａに示すとおりであることの強くかつ直接的な証拠を提供する。
【０２２１】
ｃＤＮＡスクリーニングにおいて見とめられるポジティブの頻度および同定は、ミドリムシが好気性条件下で明所において１つのＰＮＯ遺伝子のみを発現することを示唆した。ｐＥｇＰＮＯ３でプロービングされ、低いストリンジェンシー（２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中５５℃）で洗浄された合計ミドリムシＤＮＡのサザンブロットは、非常に単純なパターンを明確にし、ゲノムにおいて１から多くても３つの遺伝子の存在を示した（図１Ｂ）。好気性および嫌気性条件下で培養した細胞から抽出したポリＡ＋ミドリムシＲＮＡを５μｇ各レーンに充填し、ＰＦＯに対する縮重プライマーを用いたＰＣＲで得た約７００ ｂｐ増幅産物でプロービングしたノーザンブロットは、明所において、遺伝子は好気性条件下で強力に発現されるが、嫌気性培養細胞においては強く低下することを明らかにした。暗所に移した嫌気性培養物においてより高い発現レベルが見とめられた（図１Ｃ）。このＰＮＯ ｍＲＮＡレベルは、好気性および嫌気性条件下の両方でＥ．グラシリスにおけるＰＮＯ活性が非常に高いという発見と一致するが、嫌気生活への移行はＰＮＯ活性レベルの劇的な変化と一致しない（Ｋｉｔａｏｋａら １９８９）。
【０２２２】
Ｅ．グラシリスＰＦＯ／ＣＰＲ融合タンパク質の構造モデルを図２に示す。Ｅ１？、Ｅ１？、Ｅ２？およびＥ３タンパク質の凝集多酵素複合体であるＰＤＨとは対照的に、ＰＮＯは同一サブユニットの二量体である。ＰＮＯにおける電子の流れは、ピルビン酸からＴＰＰ、ＰＦＯドメインの保存［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスター、そして最終的に、Ｃ末端ＣＰＲ融合体の対応ドメインに結合したＮＡＤＰ＋であると予想できる（Ｉｎｕｉら １９９１）。
【０２２３】
実施例３
ＰＮＯのＰＦＯおよびＣＰＲドメインにおける配列類似性
ミドリムシＰＮＯ、ならびにそれらの構成ＰＦＯおよびＣＰＲドメインのデータベース検索により、図３にまとめるように、配列類似性の極端に複雑なパターン、タンパク質間の共有ドメイン、遺伝子融合、および見かけ上の組換え事象が明確になった。これらのパターンを理解するのに重要なガイドは、結晶構造から推測された、デスルホビブリオ・アフリカヌス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）由来ＰＦＯ（Ｃｈａｂｒｉｅｒｅら， １９９９；Ｃｈａｒｏｎら， １９９９）およびラットミクロソームＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ｗａｎｇら， １９９７）の機能的ドメインである（図３ａ）。ＥｇＰＮＯｍｔにおける完全ＰＦＯとＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼとの融合は、現在までに報告されている配列においてユニークであるが（図３ｄ）、真核生物において２つのドメインの部分的融合体が見とめられている。図３ｅは、ＢＬＡＳＴおよびＤＯＴＰＬＯＴにより明らかになった、ＰＮＯ、および推定亜硫酸レダクターゼと記したサッカロミセス・セレビシエゲノム由来の仮説的タンパク質と、シゾサッカロミセス・ポンベゲノムにおけるこの仮説的タンパク質の相同体との類似性パターンを示す。これらのタンパク質は、ＰＦＯドメインＩ、ＩＩ（部分的）およびＩＶと、ＣＰＲのＦＭＮドメインとの翻訳的融合体（ＥｇＰＮＯｍｔおよびＣｐＰＮＯのように）を構成し、これがヘムタンパク質ドメインに融合する。ＰｕＳＲのＰＦＯドメインは、保存領域において、真正細菌ＰＦＯと約３０％の同一性を共有する。ＦＭＮドメインは、真正細菌および真核生物ＣＰＲ由来のＦＭＮドメインと約３０％の同一性を共有する（しかしＥｇＰＮＯｍｔおよびＣｐＰＮＯのＦＭＮドメインと約２０〜２５％の同一性しかない）一方で、Ｃ末端ヘムタンパク質ドメインは、真正細菌亜硫酸レダクターゼのヘムタンパク質成分と約４０％の同一性、および亜硝酸レダクターゼと約２５％の同一性を共有する。ＰＦＯのドメインＩＩＩおよびドメインＩＩの一部は、酵母およびＳ．ポンベゲノムの両方における別々のタンパク質（ＭＥＴ１０）に位置する（図３ｆ）。
【０２２４】
ＥｇＰＮＯｍｔおよびＣｐＰＮＯのＣＰＲドメインも、多数の他のタンパク質およびタンパク質成分と類似性を共有する。その中には、活性のためにヘムタンパク質？成分ＣｙｓＩ（図３ｃに示す酵母ＰｕＳＲのＣ末端ドメインに類似）を必要とする（図３ｅにおける酵母ＰｕＳＲのＣ末端ドメインと同様）、？サブユニットのサルモネラ由来ＮＡＤＰＨ亜硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＪ、図３ｈ）（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉら， １９８９）がある。さらなる類似性は、ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）（図３ｈ）、多数の化合物の酸化代謝（例えば脂肪酸酸化）に関与する酵素（Ｗａｎｇら， １９９７）において見とめられる。ＣＰＲのコグネイト基質は、典型的に、バシラス・メガテリウム由来の脂肪酸ヒドロキシラーゼＰ４５０ＢＭ−３（図３ｉ）（ＧｏｖｉｎｄａｒａｊおよびＰｏｕｌｏｓ， １９９７）ならびに菌類フサリウム・オキシスポラムのゲノム中の同一構成（ｉｄｅｎｔｉｃａｌｌｙ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ）タンパク質の両方において、ＣＰＲドメインに融合して見とめられるシトクロムＰ４５０である（Ｗａｎｇら， １９９７）。ＣＰＲドメインは、後生動物一酸化窒素シンターゼのＣ末端においても生じる（図３ｊ）。最終的に、ＣＰＲドメインの構成成分は、電子を光合成膜からＮＡＤＰ＋へ伝達してＮＡＤＰＨ（図３ｋ）および可溶性タンパク質フラボドキシン自身（図３ｌ）を産出する、シアノバクテリアおよび葉緑体のフェレドキシン：ＮＡＤＰレダクターゼを含む個別のタンパク質として見とめられる。
【０２２５】
実施例４
ユーグレナ・グラシリスにおける脂肪酸合成
嫌気性条件下で、ＰＮＯ反応から得たアセチル−ＣｏＡは、マロニル−ＣｏＡ依存型脂肪酸合成に使用されてＮＡＤ（Ｐ）を再生する点で、酸化グルコース分解から生じる電子の最終受容体として役割を果たす（Ｉｎｕｉら１９８４ｂ）：脂肪酸は、最後のステップがアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．３．９９．３， Ｉｎｕｉら１９８４ａ）の代わりにトランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．３．１．−）により触媒されること以外は？−酸化の逆転により合成される。このミトコンドリア局所化系は、ＮＡＤＨを電子供与体として使用し、ＡＴＰを全く必要としない、プライマーおよびＣ２−供与体の両方として役割を果たすアセチル−ＣｏＡから直接脂肪酸を合成する能力を有する（Ｉｎｕｉら１９８４ａ）。このミトコンドリア脂肪酸合成系の主要生成物は、脂肪酸、およびＣ１０〜Ｃ１７にわたるアルコールである（主なものはミリスチン酸およびミリシル（ｍｙｒｉｓｔｙｌ）アルコール）（Ｉｎｕｉら１９８２， １９８４ａ）。脂肪酸は、アシルカルニチントランスフェラーゼの作用により細胞質ゾルに輸送され、そこで部分的に脂肪アルコールに還元され、最終的にミクロソームにおいてろうエステルにエステル化されると思われる（Ｉｎｕｉら １９８３）。嫌気性培養細胞中のろうエステルの組成も重要である：相当量の飽和化Ｃ２６およびＣ２７エステルを有する飽和化Ｃ２８エステルが主に形成され、非飽和化のものはいずれも形成されなかった（Ｉｎｕｉら １９８３）。
【０２２６】
実施例５：
嫌気性培養大腸菌細胞における過剰発現によるＥｇＰＮＯｍｔの機能分析
クローニングｃＤＮＡの過剰発現は、ｐＥｇＰＮＯ３ ｄＤＮＡとピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼとの機能的同一性についてのさらなる証明を提供する。これまで唯一の既知のＰＦＯとして、デスルホビブリオ・アフリカヌスにおいてピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードするｐｏｒ遺伝子は、イソプロピル−？−Ｄ−チオガラクトピラノシド誘導可能ｔａｃプロモーターの下で、嫌気性培養大腸菌細胞において発現され、活性形態のＰＯＲの生成をもたらしている（Ｐｉｅｕｌｌｅら １９９７）。組換えタンパク質の性質は、組換えＰＦＯが天然型Ｄ．アフリカヌス酵素のように作用することを示す（Ｐｉｅｕｌｌｅら １９９７）。このように得た酵素は、活性かつ結晶化されており、この酵素の三次構造は公知である（Ｐｉｅｕｌｌｅら１９９９， Ｃｈａｒｏｎら １９９９）。同様に、ミドリムシｐＥｇＰＮＯ３の過剰発現は、嫌気性培養大腸菌細胞において行われる。組換えタンパク質は、ＰＮＯ活性のアッセイのためにさらに単離および使用される。
【０２２７】
電子受容体としてＮＡＤＰ＋を有するピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの活性は、ＮＡＤＰＨの形成による３４０ ｎｍにおける吸光度変化のアッセイにより測光的に決定できる。ＰＮＯのための反応混合物は、５ ｍＭピルビン酸、０．２ｐ ｍＭ ＣｏＡ、１ ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１００ ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、および酵素溶液を合計容量２ ｍｌで含有する（Ｉｎｕｉら １９８４ｂ）。酵素反応は、酵素の添加により開始され、３０℃において嫌気性条件下で行われる。嫌気生活は、ゴム蓋付き石英キュベットまたは試験管において酵素なしに１分間反応混合物中でアルゴンを泡立てることにより得ることができる。酵素溶液から酸素を除去し、微量注射器を用いて嫌気的に添加する。
【０２２８】
あるいはまた、Ｉｎｕｉら１９８４ｂに従って一部改変したヒドロキシルアミン法（Ｒｅｅｄら １９６６）により、ピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼを測定できる。アッセイ混合物は、５ ｍＭピルビン酸、０．２ ｍＭ ＣｏＡ、５ ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１０ Ｕのホスホトランスアセチルアーゼ、１００ ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．８）、および酵素溶液を合計容量０．５ ｍｌで含有する。開始および実施は上述のように行う。
【０２２９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａは、膣トリコモナスヒドロゲノソームＰＦＯの処理されたアミノ末端リーダー配列、およびユーグレナ・グラシリスミトコンドリア複合体ＩＩＩとＰＮＯとの輸送ペプチド領域の比較である。実線は、細胞小器官または生物から単離された成熟タンパク質のアミノ末端を示す。ミドリムシＰＮＯの両方のタンパク質分解断片の決定されたＮＨ２末端アミノ酸配列に下線を引いた。ＥｇＰＮＯｍｔ、ミドリムシミトコンドリアＰＮＯ；ＣＩＩＩ、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ；ＳＵ、サブユニット（ＨｒｄｙおよびＭｕｌｌｅｒ １９９５、Ｃｕｉら １９９４、Ｉｎｕｉら １９９１）。図１ｂは、Ｅ．グラシリスゲノムＤＮＡ中のＰＮＯ遺伝子のサザンブロット分析；２０μｇの核ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（レーン１）、ＫｐｎＩ（レーン２）、ＥｃｏＲＩ（レーン３）およびＳａｌＩ（レーン４）で消化した。プローブは、Ｅ．グラシリス由来のＰＮＯに対する縮重ＰＣＲプライマーで得た７００ ｂｐ増幅産物であった。左側の数字はＤＮＡマーカーの大きさ（ｋｂ）を示す。図１ｃは、好気性および嫌気性条件（明所および暗所）下で培養した細胞から抽出されたＥ．グラシリス由来のＲＮＡのノーザンブロット分析。ブロットは、１レーン当たり５μｇ充填し、ｐＥｇＰＮＯ３でプロービングした。
【図２】
図２は、Ｅ．グラシリス ＰＦＯ／ＣＰＲ融合タンパク質の構造モデルを示す。ピルビン酸からＴＰＰ、ＰＦＯの保存された［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスター、ＦＭＮ、ＦＡＤ、そして最終的にＣ末端ＣＰＲ融合体の対応するドメインに結合したＮＡＤＰ＋への、電子の流れが予想できる。［Ｆｅ−Ｓ］、硫酸鉄クラスター；ＦＡＤ、フェレドキシンアデニンジヌクレオチド；ＦＭＮ、フェレドキシンモノヌクレオチド；ＴＰＰ、チアミンピロリン酸。
【図３】
図３は、ＰＮＯのＰＦＯおよびＣＰＲドメインの配列類似性を示す図である。ａは、デスルホビブリオＰＦＯの分子ドメイン構造（Ｃｈａｒｏｎら １９９９）、および結晶構造から推測したラット肝臓ミクロソーム由来のＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（Ｗａｎｇら １９９７）であり、黒丸は、硫酸鉄中心の結合に関わりのあるシステイニル残基をそれぞれが保存したことを示し、小さい四角は、推定ＴＰＰ結合モチーフの始めの保存されたＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙを示す。ｂは、ホモ二量体真核生物ＰＦＯ、真正細菌ＰＦＯおよびｎｉｆＪ、ならびにクロロビウムＰＦＯ／ＰＳ（ピルビン酸シンターゼ）の推定ドメイン組織である。ｃは、テルモトーガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）およびヘリコバクターに由来するヘテロ四量体古細菌ＰＦＯ／ＰＳ（ピルビン酸シンターゼ）およびヘテロ四量体真正細菌ＰＦＯのドメイン構造である。ｄは、Ｎ末端約４０アミノ酸ミトコンドリア輸送ペプチド（Ｔ）を有する完全ＰＦＯおよびＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼからなるミドリムシＰＮＯ融合タンパク質であり、大きい星印は、ＰＮＯ−およびＣＰＲドメインの決定されたアミノ末端を示し（Ｉｎｕｉら １９９１）、矢印はＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマーを示す。ｅは、ＢＬＡＳＴおよびＤＯＴＰＬＯＴ（ＧＣＧ）により明らかになった、推定亜硫酸およびＳ．ポンベゲノムと付記したＰＮＯとＳ．セレビシエゲノム由来の仮説的タンパク質との類似性のパターンである。ｆは、ＢＬＡＳＴおよびＤＯＴＰＬＯＴ（ＧＣＧ）により明らかになった、Ｓ．ポンベゲノム（Ｔ４１４３９）の酵母およびその相同体の両方におけるＰＮＯと、ＭＥＴ１０と称されたタンパク質（亜硫酸レダクターゼ、αサブユニット）との類似性のパターンである。ｇは、サルモネラおよび紅色硫黄細菌（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ）由来のＮＡＤＰＨ亜硫酸レダクターゼ（αサブユニット）である。ｈは、真正細菌、菌類、植物および動物由来のＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ならびに菌類、植物および動物由来のＮＡＤＰＨ：フェリへモプロテインレダクターゼである。ｉは、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（ＧｏｖｉｎｄａｒａｊおよびＰｏｕｌｏｓ， １９９７）ならびにフサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃ． ＡＢ０３００３７）由来の脂肪酸ヒドロキシラーゼＰ４５０ＢＭ−３である。ｊは、後生動物一酸化窒素シンターゼである。ｋとｌは、シアノバクテリアおよび植物由来のフェレドキシン：ＮＡＤＰレダクターゼならびに真正細菌および植物フラボドキシンである。
小さいアステリスクは、ＢＬＡＳＴでいずれとも類似性を明らかにしなかった領域を示し、グレイで網掛けされた領域は、上記および以下のタンパク質のドメインと類似性を有さないドメインを示す。
【図４】
図４は、好気性寄生生物におけるメトロニダゾール活性化のスキーム。メトロニダゾールの存在下において、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯ）により生成される電子は、フェレドキシン［２Ｆｅ−２Ｓ］により、それらの天然型受容体ヒドロゲナーゼ（ＨＹ）ではなく薬剤に伝達される。その結果、Ｈ２の生成が終わる一方でメトロニダゾール還元が生じる。細胞障害性ラジカル（Ｒ−ＮＯ２−）が、薬剤還元の中間産物として形成される。（Ｋｕｌｄａ， １９９９）。
【図５】
図５ａは、Ｅ．グラシリスＰＮＯのポリペプチド配列（配列番号１）、図５ｂは、Ｅ．グラシリスＰＮＯのポリヌクレオチド配列（配列番号２）である。
【図６】
図６は、Ｅ．グラシリスＰＮＯポリペプチド配列のｂｌａｓｔ検索の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月11日(2002.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群より選択される核酸分子、または（ａ）〜（ｌ）のいずれか１つの相補鎖を含む、アセチルＣｏＡ代謝調節活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列ＴＳＧＰＫＰＡＳＸＩ（配列番号６）、ＴＳＧＰＫＰＡＳＸＩＥＶＳＸＡＫ（配列番号７）またはＡＡＡＰＳＧＮＸＶＴＩＬＹＧＳＥＥＧＮＳ（配列番号８）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外の、ポリヌクレオチド：
（ａ）  配列番号１または３（図５）に示すポリペプチドの成熟型を少なくともコードする核酸分子；
（ｂ）  配列番号２（図５）に示すコード配列を含み、該ポリペプチドの成熟型を少なくともコードする核酸分子；
（ｃ）  ヌクレオチド配列が（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列に対して遺伝子コードの縮重したものである核酸分子；
（ｄ）  （ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドのアミノ酸配列の１つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加により、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドからもたらされるポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｅ）  （ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と配列が６０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｆ）  （ａ）〜（ｅ）のいずれか１つの核酸分子によりコードされるポリペプチドの断片もしくはエピトープ担持部分を含み、かつアセチル−ＣｏＡ合成調節活性を有する核酸分子；
（ｇ）  配列番号４および５に示すプライマーを用いてミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）核酸ライブラリーから増幅された核酸分子の配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子；
（ｈ）  （ａ）〜（ｇ）のいずれか１つにコードされるポリペプチドのピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性断片、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ活性断片、および／もしくはＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性断片をコードする核酸分子；
（ｉ）  （ａ）もしくは（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸分子；
（ｊ）  （ａ）〜（ｈ）のいずれか１つの核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して産生された抗体に認識されるピルビン酸：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ（ＰＮＯ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｋ）  （ａ）〜（ｊ）のいずれか１つの核酸分子の配列を有するプローブを用いて適切なライブラリーをストリンジェントな条件下でスクリーニングすることにより得られ、かつＰＮＯ活性を有する核酸分子；
（ｌ）  （ａ）もしくは（ｋ）のいずれか１つの核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする相補鎖を有し、かつＰＮＯ活性を有する核酸分子。
【請求項２】
ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
シグナル配列をコードする核酸配列に作用可能に連結した、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記シグナル配列が、プラスチド（ｐｌａｓｔｉｄａｌ）輸送シグナル配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチドをベクターに挿入することを含む、組換えベクターの作製方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチドを含むか、請求項５の方法により作製される、組換えベクター。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが発現制御配列に作用可能に連結された、原核生物または真核生物宿主細胞におけるその発現を可能とする、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６または７のベクターを宿主細胞に導入することを含む、組換え宿主細胞の作製方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチドまたは請求項６または７のベクターにより遺伝子操作された、宿主細胞。
【請求項１０】
大腸菌、バキュロウイルス、アグロバクテリウム、または植物細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９または１０の宿主細胞を培養すること、および前記ポリヌクレオチドによりコードされ、該宿主細胞により該培養物または該宿主細胞から発現されるポリペプチドを回収することを含む、ＰＮＯ活性を有するポリペプチドを生成するためのプロセス。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するか、請求項１１のプロセスにより得ることができる、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項１４】
（ａ）〜（ｌ）のいずれか１つの相補配列を含む、アンチセンス核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、または請求項６もしくは７のベクターを植物、植物組織もしくは植物細胞のゲノムに導入することを含む、トランスジェニック植物、植物細胞または植物組織の作製方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクターを含むか、または請求項１５の方法により得ることができる、植物細胞。
【請求項１７】
請求項１６の植物細胞を含む、トランスジェニック植物または植物組織。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターの存在下で、改変型アセチル−ＣｏＡ合成を有する、請求項１７に記載のトランスジェニック植物または植物組織。
【請求項１９】
請求項９の宿主細胞を得ること、または請求項８の方法のステップを含み、さらに請求項１２のポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡ合成をモジュレートする方法。
【請求項２０】
前記発現されたポリペプチドが細胞のプラスチドに局所化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１６もしくは１７の植物、植物組織もしくは植物細胞を得ること、または請求項１５の方法のステップを含み、さらに請求項１２のポリペプチドの発現を可能にする条件下で該植物、植物組織もしくは植物細胞を培養することを含む、植物、植物組織もしくは植物細胞においてアセチル−ＣｏＡ合成をモジュレートする方法。
【請求項２２】
前記アセチル−ＣｏＡ合成が増大している、請求項１７または１８のトランスジェニック植物、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１９〜２０のいずれか１項の方法。
【請求項２３】
脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、ろうエステル、（多）糖類、および／またはポリヒドロキシアルカノエートの合成が増大している、請求項１６、１７もしくは２２のトランスジェニック植物、請求項９もしくは２２の前記宿主細胞、または請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法、。
【請求項２４】
請求項１６の植物細胞を含む、請求項１７、１８、２２または２３のトランスジェニック植物の収穫可能部分。
【請求項２５】
請求項１６の細胞を含む、請求項１７、１８、２２または２３のトランスジェニック植物の増殖物質。
【請求項２６】
請求項１９〜２２のいずれか１項の方法のステップを含むこと、さらに細胞、培養物、植物または組織から該化合物を単離することを含む、脂肪酸、カロテノイド、（多）糖類、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、および／またはポリヒドロキシアルカノエートの生成方法。
【請求項２７】
脂肪酸、カロテノイド、ヘキソース、ビタミン、イソプレノイド、脂質、ろうエステル、および／またはポリヒドロキシアルカノエート生成細胞、組織および／または植物を作製するための、請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクター、または請求項１２のポリペプチドの使用。
【請求項２８】
（ａ）請求項１２のポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させること；
（ｂ）  ＰＮＯ活性をアッセイすること；
（ｃ）  ＰＮＯ活性を、該候補化合物の不在下で得られる標準的応答と比較し；標準を上回る高いＰＮＯ活性は該化合物がアゴニストであることを示し、低いＰＮＯ活性は該化合物がアンタゴニストであることを示すこと、
を含む、ＰＮＯ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法により同定される化合物。
【請求項３０】
請求項１２のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストである請求項２８の方法により同定された、化合物。
【請求項３１】
請求項２９または３０の化合物を特異的に認識する抗体。
【請求項３２】
ＰＮＯ活性を活性化または阻害する化合物を同定および／または生成するための、請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクター、請求項１２のポリペプチド、請求項１３もしくは３１の抗体、または請求項２９もしくは３０の化合物の使用。
【請求項３３】
アンタゴニストとして請求項１４のアンチセンス核酸分子、請求項１３もしくは３１の抗体、または請求項３０の化合物、および任意に製薬上許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
寄生生物感染の治療用の医薬組成物の調製のためのアンタゴニストとしての、請求項１４のアンチセンス核酸分子、請求項１３もしくは３１の抗体、または請求項３０の化合物の使用、
【請求項３５】
請求項１〜４のいずれか１項のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７のベクター、請求項９、２２もしくは２３の宿主細胞、請求項１２のポリペプチド、請求項１４のアンチセンス核酸、請求項１３もしくは３１の抗体、請求項１６の植物細胞、請求項１７、１８、２２もしくは２３の植物もしくは植物組織、請求項２４の収穫可能部分、請求項２５の増殖物質、または請求項２９もしくは３０の化合物を含むキット。
【請求項３６】
請求項２８の方法のステップ、および
（ａ）  ステップ（ｃ）において同定された化合物を製薬上許容可能な形態に剤形化すること
を含む、医薬組成物の生成方法。
【国際調査報告】
2004515223.tif 000125
2004515223.tif 000126
2004515223.tif 000127
2004515223.tif 000128