(57)【要約】本発明は、蛍光消光にあまり敏感でない希土類金属クリプテートの測定媒体に、１回以上置換されたかまたは置換されていない、少くとも１つのピリジン基を含む前記希土類金属クリプテートを導入することによって、蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消光を減少させる方法に関する。本発明はまた、測定媒体によって生じる蛍光消光にあまり敏感でない新規の希土類金属クリプテートに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの蛍光標識を使用する分析物の蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消光を減少させる方法であって、
希土類金属マクロ多環式錯体が測定媒体に導入され、該錯体は、
式
【化１】
2004509075.tif 000035
（式中、Ｚは３または４価の原子であり、Ｒは存在しないかまたは水素、水酸基、アミノ基もしくは炭化水素基を表し、２価の基
【数１】
2004509075.tif 000036
は、それぞれ独立して、１以上のヘテロ原子を任意に含有し、ヘテロマクロ環で所望により中断されていてもよい炭化水素に基づく鎖であって、基
【数２】
2004509075.tif 000037
の少なくとも１つはさらに、少なくとも１つの分子単位を含むかまたは錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位から本質的に成り、前記分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない基
【数３】
2004509075.tif 000038
の少なくとも１つは、１回以上置換されたかまたは置換されていないピリジン基を含む）
のマクロ多環式化合物と錯体形成した少なくとも１つの希土類金属塩から成ることを特徴とする、少なくとも１つの蛍光標識を使用する分析物の蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消光を減少させる方法。
【請求項２】
前記錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない２つの基
【数４】
2004509075.tif 000039
は、１回以上置換されたかまたは置換されていないピリジン基を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位は、電子供与基で置換されることを特徴とする、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位は、フェナントロリン、アントラセン、ベンゼン、ナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、アゾベンゼン、アゾピリジン、ビピリジンおよびビスイソキノリンから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位はビピリジン基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ビピリジン基は、特にカルボキシレート、−ＮＨ２、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）２、ＯＨ、Ｏ−、−ＯＡｌｋ、Ａｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）２、−Ｃ（Ａｌｋ）３、−ＮＨＣＯＡｌｋ、および置換されたまたは置換されていないフェニル基（ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である）から選択される電子供与基で置換されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１以上のビピリジン単位はカルボキシレート基で置換されることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記マクロ多環式錯体は、式ＩＩ：
【化２】
2004509075.tif 000040
（式中、以下の式
【化３】
2004509075.tif 000041
の環は以下の式：
【化４】
2004509075.tif 000042
のビス−ビピリジンマクロ環であり；
ｎ＝０、１または２であり；
Ａは生体物質に共有結合することが可能な官能基であり、
Ｒ１は−ＣＯＯＲ３基（式中、Ｒ３は水素であるかまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル基であり、好ましくはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチル基を表す）であるかあるいはＲ１は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａであるかまたは−Ｙ−Ａ基であり；
Ｒ２は水素、電子供与基、特にカルボキシレート、−ＮＨ２、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）２、ＯＨ、Ｏ−、−ＯＡｌｋ、Ａｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）２、−Ｃ（Ａｌｋ）３、−ＮＨＣＯＡｌｋ、置換されたもしくは置換されていないフェニル基、ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基であるか、または−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａもしくは−Ｙ−Ａ基であり、但し、Ｒ１およびＲ２の１つを超えない置換基は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基を表し、Ｒ１およびＲ２置換基は同時に−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基を表さず；
Ｙは、１以上の二重結合および／または酸素、窒素、イオウもしくはリンなどの１以上のヘテロ原子または１以上のカルバモイルもしくはカルボキシアミド基を任意に含有する直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基から選択されるか、あるいはＣ５〜Ｃ８シクロアルキレン基またはＣ６〜Ｃ１４アリーレン基から選択される２価の有機ラジカルから成るスペーサー基あるいはスペーサーアームであり、前記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、任意にアルキル基、アリール基またはスルホン酸基で置換される）
に対応するマクロ多環式化合物と錯体形成する少なくとも１つの希土類金属塩から成ることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記錯体形成した希土類金属イオンはユウロピウムイオンであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記希土類金属マクロポリ環式錯体は、ユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂ｐｙ．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２］、
［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｐｙ（ＮＨ２）２］　および
［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．　ｐｙ（ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＲ４）２
（式中、
【化５】
2004509075.tif 000043
である）
から選択されることを特徴とする、請求項１〜７および９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記希土類金属マクロポリ環式錯体は唯一の標識としてまたはアッセイにおける標識の１つとして使用されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定媒体は、生体媒体、特に血清媒体であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
式
【化６】
2004509075.tif 000044
（式中、Ｚは３または４価の原子であり、Ｒは存在しないかまたは水素、水酸基、アミノ基または炭化水素に基づくラジカルを表し、２価の基
【数５】
2004509075.tif 000045
は、それぞれ独立して、１以上のヘテロ原子を任意に含有し、ヘテロマクロ環で任意に中断される炭化水素に基づく鎖であって、基
【数６】
2004509075.tif 000046
の少なくとも１つはまた、少なくとも１つの分子単位を含むかまたは錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位から本質的に成り、
前記分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない基
【数７】
2004509075.tif 000047
の少なくとも１つは、１回以上置換されたピリジン基を含むか、
あるいは前記分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない基
【数８】
2004509075.tif 000048
の少なくとも１つは、１回以上置換されたかまたは置換されていないピリジン基を含み、前記基以外の基
【数９】
2004509075.tif 000049
は電子供与基で置換される）
のマクロ多環式化合物と錯体形成した少なくとも１つの希土類金属塩から成る希土類金属マクロ多環式錯体。
【請求項１４】
前記錯体形成した希土類金属イオンはユウロピウムイオンである、請求項１３に記載の錯体。
【請求項１５】
前記錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない２つの基
【数１０】
2004509075.tif 000050
は、１回以上置換されたかまたは置換されていないピリジン基を含むことを特徴とする、請求項１３および１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位は、フェナントロリン、アントラセン、ベンゼン、ナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、アゾベンゼン、アゾピリジン、ビピリジンおよびビスイソキノリンから選択されることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項１７】
錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位はビピリジン基である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項１８】
ビピリジン基は、特にカルボキシレート、−ＮＨ２、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）２、ＯＨ、Ｏ−、−ＯＡｌｋ、Ａｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）２、−Ｃ（Ａｌｋ）３、−ＮＨＣＯＡｌｋ、および置換されたまたは置換されていないフェニル基（ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である）から選択される電子供与基で置換されることを特徴とする、請求項１７に記載の錯体。
【請求項１９】
前記ビピリジン単位はカルボン酸基で置換されることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の錯体。
【請求項２０】
前記錯体は、式ＩＩ：
【化７】
2004509075.tif 000051
（式中、以下の式
【化８】
2004509075.tif 000052
の環は以下の式：
【化９】
2004509075.tif 000053
のビス−ビピリジンマクロ環であり；
ｎ＝０、１または２であり；
Ｙは、１以上の二重結合および／または酸素、窒素、イオウもしくはリンなどの１以上のヘテロ原子または１以上のカルバモイルもしくはカルボキシアミド基を任意に含有する直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基から選択されるか、あるいはＣ５〜Ｃ８シクロアルキレン基またはＣ６〜Ｃ１４アリーレン基から選択される２価の有機ラジカルから成るスペーサー基あるいはスペーサーアームであり、前記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、任意にアルキル、アリールもしくはスルホン酸基で置換され；
Ａは生体物質に共有結合することが可能な官能基であり；
Ｒ１は−ＣＯＯＲ３基（式中、Ｒ３は水素であるかまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル基であり、好ましくはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチル基を表す）であるかあるいはＲ１は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａであるかまたは−Ｙ−Ａ基であり；
Ｒ２は水素、電子供与基、特にカルボキシレート、−ＮＨ２、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）２、ＯＨ、Ｏ−、−ＯＡｌｋ、Ａｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）２、−Ｃ（Ａｌｋ）３、−ＮＨＣＯＡｌｋ、置換されたもしくは置換されていないフェニル基、ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である、または−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａもしくは−Ｙ−Ａ基であり、但し、Ｒ１およびＲ２置換基の１つを超えない置換基は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基を表し、Ｒ１およびＲ２は同時に−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基を表さない、ならびに但し、ｎ＝０の場合、Ｒ２は水素以外である）
に対応するマクロ多環式化合物と錯体形成する少なくとも１つの希土類金属塩から成ることを特徴とする、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の錯体。
【請求項２１】
前記錯体は、式ＩＩ（式中、
ｎ＝０であり、
Ｙ、ＡおよびＲ１は請求項２０に記載の通りであり、
Ｒ２は請求項２０に記載の通りであり、Ｒ２置換基は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基である）
に対応するマクロ多環式化合物と錯体形成する少なくとも１つの希土類金属塩から成ることを特徴とする、請求項２０に記載の錯体。
【請求項２２】
前記錯体は、ユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂ｐｙ．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２］、
［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｐｙ（ＮＨ２）２］　および
［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．　ｐｙ（ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＲ４）２
（式中、
【化１０】
2004509075.tif 000054
である）
から選択されることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の錯体。
【請求項２３】
特にポリペプチド、タンパク質、細胞レセプター、抗原、抗体または核酸に特異的に相互に結合可能な分子の対のメンバーの１つに共有結合した、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の錯体から成る蛍光複合体。
【請求項２４】
分析物の蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消光を減少させるための請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のマクロ多環式錯体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、蛍光消光にあまり敏感でない希土類金属クリプテートの測定媒体に導入することによって、蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消光を減少させる方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、測定媒体によって生じる蛍光消光にあまり敏感でない新規な希土類金属クリプテートに関する。
【０００３】
生物学に関する知識の向上により、生体分子のモニターまたは定量が可能な診断方法に対するニーズが高まっている。
【０００４】
同時に、対照アッセイ法に一般的に伴う放射性標識には不都合がある。一般に、現在、放射性トレーサーを他の標識、主に蛍光標識に置き換えるための努力が払われている。理想条件下で蛍光標識を使用すると、放射性トレーサーで得られる感度と理論的に同等の高感度を得ることが可能である。
【０００５】
この種のアッセイにおいてトレーサーとして使用することができる多くの蛍光分子については先に記載されており、これらのうち希土類金属錯体は有利な特性を有する。
【０００６】
特定の錯体、希土類金属クリプテートの使用については、例えば、欧州特許出願ＥＰ　０　１８０　４９２号および同ＥＰ　０　３２１　３５３号において開示されている。
【０００７】
実際には、第１にしばしば高いバックグラウンドノイズが存在するため、第２に蛍光トレーサーはその環境の変化に一般に極めて敏感であるという事実のために、蛍光トレーサーの定量性能には限度がある。ｐＨの微細な変化、極性、溶存酸素の存在または重原子（例えば、ヨウ素）の接近または吸収基により、（励起または消光の意味での）量子収量が変化したり、発光波長がシフトする可能性がある。
【０００８】
蛍光測定による分析方法に内在する問題については、総説記事に列挙されている（Ｉ．　Ｈｅｍｍｉｌａｅ，　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３１／３，　３５９−３７０　（１９８５））。
【０００９】
生物学的サンプルに存在するタンパク質並びに他の生体分子の固有の蛍光から生じるバックグラウンドノイズに内在する問題は、希土類金属（主にユウロピウム）の錯体から形成される蛍光標識を使用して解決することができ、これによって、特定のシグナルの時間的選択を可能にしている。ユウロピウム錯体の特徴たる特に長い寿命（約０．１ｍｓ〜１ｍｓ）は、分解時間測定（ｒｅｓｏｌｖｅｄ−ｔｉｍｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）例えば、比較的短い寿命（約４ｎｓ）を特徴とする血清タンパク質からのバックグラウンドノイズの上昇を除くことを可能とする。
【００１０】
均質型の形式は、免疫学的複合体の形成の動力学的リアルタイムモニタリングを可能にするという顕著な利点を有するが、標識と生体媒体中に存在する分子との間の望ましくない任意の相互作用（蛍光の消光）を除くことはできない。
【００１１】
欧州特許ＥＰ　０　５３９　４３５号において開示されているように、媒体にフッ化物イオンを添加することによって、血清媒体における光物理特性、特に寿命の回復を得ることができる。
【００１２】
それにもかかわらず、測定媒体中に存在する分子によって生じる干渉の問題は、これらの方法のいずれによっても充分に解決されない。蛍光による測定感度の限界の主な原因が、アッセイにおいて標識として使用される蛍光分子の蛍光を阻害することが可能な媒体中に存在する分子によって生じる消光プロセスの存在であることがその理由である。希土類金属の錯体の場合、消光は、接近による電子伝達機構（ここで、阻害分子が錯体の遊離の配位部位を占める）の結果である可能性がある。特に、基底状態または励起状態にある蛍光分子と媒体中に存在する分子との間に生じる酸化還元反応にあるといえる。これらの機構は、励起された蛍光を相当変更する可能性がある。
【００１３】
阻害因子は測定媒体の成分（例えば、血清中の尿酸）として天然に存在するかまたはアッセイのための添加物もしくは安定化剤として測定媒体に添加されるため、電子伝達に関与する機構および消光機構によって蛍光が阻害されることは実際にかなり不都合である。
【００１４】
これらの阻害剤は、標識分子の蛍光を顕著に損なう。実際には、酸化還元反応が干渉を受ける場合、酸化還元機構による希土類金属イオンの酸化状態から還元状態への移行の際、測定感度が顕著に損なわれるほどの寿命の短縮および該希土類金属イオンを含有する錯体の励起スペクトルの変化を伴う。
【００１５】
今回、ピリジンから成る少なくとも１つの分子単位を含むマクロ多環式化合物と錯体形成した希土類金属塩から成る新規の希土類金属クリプテートが見出されたが、これは新規かつ予期されない光物理特性を示す。
【００１６】
該マクロ多環式化合物が電子供与基で置換される錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位を含む場合にも、これらの有利な特性が得られることも見出された。
【００１７】
この点に関する機構的な１つの仮説として、立体的によりかさ高い分子単位をピリジンに置き換えると、マクロ環の間隙が減少し、その酸化状態を促進することによって希土類金属イオンの酸化還元平衡に影響を及ぼす。
【００１８】
電子供与基の存在も、希土類金属イオンの酸化還元能に影響する可能性がある。
【００１９】
従って、本発明の希土類金属クリプテートは、ピリジン単位および／または電子供与基による置換を含まない対応クリプテートと比較して、媒体中に存在する分子との相互作用から生じる蛍光消光の現象に対してそれほど感受性ではないという有利な特性を有する。
【００２０】
このことにより、フッ化物イオンなどのアジュバントを使用せずに生物学的媒体において蛍光測定を実施することが可能であるため、この観察は極めて重要である。
【００２１】
従って、本発明の化合物は、認識の役割を有する生体分子に結合することができ、且つパートナーに結合可能であって、他方その耐消光特性を維持する新規の標識を構成する。
【００２２】
従って、第１の態様によれば、本発明は、希土類金属マクロ多環式錯体が測定媒体に導入され、前記錯体は、
式
【化１１】
2004509075.tif 000002
（式中、Ｚは３または４価の原子であり、Ｒは存在しないかまたは水素、水酸基、アミノ基もしくは炭化水素に基づく基を表し、２価の基
【数１１】
2004509075.tif 000003
は、それぞれ独立して、１以上のヘテロ原子を任意に含有し、所望によりヘテロマクロ環で中断されていてもよい炭化水素に基づく鎖であって、基
【数１２】
2004509075.tif 000004
の少なくとも１つはまた、少なくとも１つの分子単位を含むかまたは錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位から本質的に成り、そして、前記分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない基
【数１３】
2004509075.tif 000005
の少なくとも１つは、１回以上置換されたかまたは置換されていないピリジン基を含む）
のマクロ多環式化合物と錯体形成した少なくとも１つの希土類金属塩から成ることを特徴とする、少なくとも１つの蛍光標識を使用する分析物の蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消光を減少させる方法に関する。
【００２３】
式（Ｉ）のマクロポリ環式化合物が置換されたピリジン基を含む場合、該化合物は１以上の置換基で置換することができ、該置換基は、例えば、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１−Ｃ６カルボン酸エステル、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、−ＣＨ２ＮＨＣＯＮＨ−アリール、−ＣＨ２ＮＨＣＳＮＨ−アリール、−ＮＨＣＯＮＨ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−ＮＨＣＳＮＨ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−ＮＨＣＯＮＨ−アリール、−ＮＨＣＳＮＨ−アリール、ピペリジル、−Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボキシピペリジル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ−アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、２〜１０個の炭素原子を含有するアルケニル、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキニル、３〜８個の炭素原子を含有するシクロアルキル、１〜５個の炭素原子を含有するヒドロキシアルキル、１〜１０個の炭素原子を含有するアルコキシ、２〜１０個の炭素原子を含有するアルコキシアルキル、３〜１０個の炭素原子を含有するアルコキシアルコキシアルキル、２〜１０個の炭素原子を含有するアルコキシアルコキシ、２〜１０個の炭素原子を含有するアルケニルオキシ、１〜１０個の炭素原子を含有するアルキルチオ、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキルチオアルキル、１〜７個の炭素原子を含有するアシルアミノ、２〜８個の炭素原子を含有するアシルアミノアルキル、２〜５個の炭素原子を含有するカルバモイルアルキル、３〜９個の炭素原子を含有するアルキルアミノカルボニルアルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボキサミド、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボキサミド（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびカルボキシ（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルなどであり、同一であってもまたは異なっていてもよい。
【００２４】
好ましくは、置換されたピリジンは、１つまたは２つの置換基を含む。本発明の目的に好適な置換基としては、例えば、以下の置換基：アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、特にアミノメチルまたはアミノエチル；アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボキサミド、特にアミノエチルカルボキサミド、フェニルカルバモイル；フェニルチオカルバモイル；ニトリル；ピペリジル；Ｃ１−Ｃ６カルボン酸エステル、特にカルボン酸メチルまたはカルボン酸エチル；アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボキサミド（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、特にアミノカプロイルアミドメチルおよびアミノカプロイルアミドエチルまたはカルボキシ（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルがある。
【００２５】
本明細書では、用語「分析物」は、任意の物質あるいは物質の群、ならびに検出および／または定量が望まれるそれらの類似体を意味する。
【００２６】
本発明の方法の１つの好適な態様によれば、錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない２つの基
【数１４】
2004509075.tif 000006
は、置換されたかまたは置換されていないピリジン基を含む。
【００２７】
有利には、錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位は、電子供与基で置換される。
【００２８】
好ましくは、錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位は、フェナントロリン、アントラセン、ベンゼン、ナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、アゾベンゼン、アゾピリジン、ビピリジンおよびビスイソキノリンから選択され、ビピリジンが好適である。
【００２９】
本発明の方法の他の好適な態様によれば、１以上のビピリジン単位は、特に以下の基：カルボキシレート、−ＮＨ２、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）２、ＯＨ、Ｏ−、−ＯＡｌｋ、Ａｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）２、−Ｃ（Ａｌｋ）３、−ＮＨＣＯＡｌｋ、置換されたまたは置換されていないフェニル（ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である）から選択される電子供与基で置換される。
【００３０】
フェニルが置換される場合、フェニルは、例えば、スルフォネート、カルボキシレート、メチルカルボキシレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、メトキシエチルカルボキシレートおよびカルボキサミドから選択される１以上の置換基（同一であっても異なっていてもよい）で置換することができる。
【００３１】
カルボキシレート基は、本発明の目的に特に好適である電子供与基である。
【００３２】
用語「カルボキシレート基」は、−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯ−対を意味し：具体的には、マクロ環式錯体は、その合成中に、カルボン酸基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｇｒｏｕｐ）−ＣＯＯＨを含むことができ、測定媒体におけるその使用中に該基はカルボキシレート基（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　ｇｒｏｕｐ）−ＣＯＯ−にイオン化される。
【００３３】
本発明の方法の１つの有利な態様によれば、マクロ多環式化合物は、式（ＩＩ）：
【化１２】
2004509075.tif 000007
（式中、以下の式
【化１３】
2004509075.tif 000008
の環は以下の式：
【化１４】
2004509075.tif 000009
のビス−ビピリジンマクロ環であり；
ｎ＝０、１または２であり；
Ａは生体物質に共有結合することが可能な官能基であり、
Ｒ１は−ＣＯＯＲ３基（式中、Ｒ３は水素であるかまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル基であり、好ましくはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチル基を表す）であるかあるいはＲ１は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａであるかまたは−Ｙ−Ａ基であり；
Ｒ２は水素、電子供与基、特にカルボキシレート、−ＮＨ２、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）２、ＯＨ、Ｏ−、−ＯＡｌｋ、Ａｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）２、−Ｃ（Ａｌｋ）３、−ＮＨＣＯＡｌｋ、置換されたもしくは置換されていないフェニル基、ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である、または−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａもしくは−Ｙ−Ａ基であり、但し、Ｒ１およびＲ２の１つを超えない置換基は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基を表し、Ｒ１およびＲ２置換基は同時に−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基を表さず；
Ｙは、１以上の二重結合および／または酸素、窒素、イオウもしくはリンなどの１以上のヘテロ原子または１以上のカルバモイルもしくはカルボキシアミド基を任意に含有する直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基から選択されるか、あるいはＣ５〜Ｃ８シクロアルキレン基またはＣ６〜Ｃ１４アリーレン基から選択される２価の有機ラジカルから成るスペーサー基あるいはスペーサーアームであり、前記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、任意にアルキル、アリールもしくはスルホン酸基で置換される）
に対応するマクロポリ環式化合物と錯体形成する少なくとも１つの希土類金属塩から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ　ｏｆ）。
【００３４】
本明細書において、用語「生体物質に共有結合することが可能な官能基」は、天然に存在するかまたは前記生体物質に人工的に導入された少なくとも１つの官能基と直接にまたは活性化後に共有結合を介して結合可能な任意の官能基を表す。そのような官能基は特にＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＳＨおよびＯＨ官能基である。そのような官能基および活性化方法については、Ｐ．　Ｔｉｊｓｓｅｎ、「Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　１９８５に詳細に記載されている。
【００３５】
本発明の目的に適した官能基の例としては、特に、アミノ、チオ、シアノ、イソシアノ、イソチオシアノ、チオシアノ、カルボキシル、水酸基、マレイミド、スクシンイミド、メルカプト、フェノール、イミダゾール、アルデヒド、エポキシド、ハロゲン、チオニル、スルホニル、ニトロベンジル、カルボニル、トリアゾ、無水物、ハロ酢酸、ヒドラジノ基、アクリジンなどの基が挙げられる。
【００３６】
特に好適な基は、生体物質への共有結合の前に活性化されなければならないアミノ、チオールおよびカルボキシル基、ならびに生体物質に直接結合することができるマレイミド、スクシンイミドおよびイソチオシアネート基である。
【００３７】
錯体形成した希土類金属イオンは、好ましくはユウロピウムイオンである。
【００３８】
本明細書において、「クリプテート」の概念ならびにマクロ環および多環の命名については、Ｊ．Ｍ．　Ｌｅｈｎ、「Ｓｔｒｕｃｔ．　Ｂｏｎｄｉｎｇ　（Ｂｅｒｌｉｎ）」１６，　１，　１９７３および「Ａｃｃ．　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｓ．」１１，　４９，　（１９７８）に規定されている通りである。
【００３９】
マクロ（多）環の構成分子単位を表すために、以下の省略記号を使用するものとする：
２，２’−ビピリジン＝ｂｐｙ
ピリジン＝Ｐｙ
４−メチルイソニコチネート＝Ｐｙ（ＣＯ２Ｍｅ）
２，２’−ビピリジン−４，４’−ジエチルカルボキシレート＝ｂｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２
２，２’−ビピリジン−４，４’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボキシレート＝ｂｐｙ（ＣＯ２ｔｂｕ）２
２，２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸＝ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２
ピリジン−３，５−ジエチルカルボキシレート＝Ｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２
３，５−ビス［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキシアミジル］ピリジン＝Ｐｙ（ＮＨ２）２
３，５−ビス［Ｎ−（４−マレイミドメチルシクロヘキシルカルボキシアミド−２−エチル）カルボキシアミジル］　ピリジン＝Ｐｙ［ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＲ４］２
（式中、
【化１５】
2004509075.tif 000010
である）。
【００４０】
本発明の目的に特に好適な希土類金属マクロ多環式錯体は、ユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂ｐｙ．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２］（実施例４、ｂ）、［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｐｙ　（ＮＨ２）２］（実施例６）および［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｐｙ（ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＲ４）２
（式中、
【化１６】
2004509075.tif 000011
である）
である。
【００４１】
本発明の方法の１つの好適な態様によれば、希土類金属マクロ環式錯体は唯一の標識としてまたはアッセイにおける標識の１つとして使用される。
【００４２】
有利には、測定媒体は生体媒体、特に血清媒体である。
【００４３】
本発明の方法に使用することができるマクロ（多）環式化合物は、公知の方法によって調製される。トシル中間体を経由するビピリジンマクロ環の調製については、特に、Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．　１９８３，　４８，　４８４８に記載されており、ｂｐｙ．ｂｐｙ．（Ｒ２）２型の官能基化マクロ環類似体は、該アプローチによって得られた。
【００４４】
一般に、マクロ二環式リガンドは、それぞれ欧州特許ＥＰ　０　３２１　３５３号およびＨｅｌｖ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ，　１９８８，　７１，　１０４２に開示されている技術に従って調製される。特に、これらの分子は、塩基およびテンプレートイオンとして作用するアルカリ性カーボネートの存在下において、極性非プロトン性溶媒中で実施されるマクロ環式ジアミンをアルキル化することによって調製された。
【００４５】
本発明に従って使用することができる希土類金属マクロ環式錯体は、錯体形成すべきカチオンを供与する化合物と錯体形成化合物とを反応させることから成る金属錯体を調製するための従来の方法によって調製した。
【００４６】
例えば、マクロ多環式錯体は、希土類金属カチオンを供与する化合物と上記で規定される特性を有する化合物とを反応させることによって得ることができ、それぞれの化合物は、有利なことに、溶液中において、好ましくは、同じ溶媒または錯体形成に不活性な相溶性の複数溶媒中に存在する。一般に、アセトニトリルまたはメタノールが溶媒として使用され、還流のために加熱される。
【００４７】
更なる態様によれば、本発明はまた、式
【化１７】
2004509075.tif 000012
（式中、Ｚは３または４価の原子であり、Ｒは存在しないかまたは水素、水酸基、アミノ基もしくは炭化水素基を表し、２価の基
【数１５】
2004509075.tif 000013
は、それぞれ独立して、１以上のヘテロ原子を所有により含有し、ヘテロマクロ環で所望により中断される炭化水素に基づく鎖であって、基
【数１６】
2004509075.tif 000014
の少なくとも１つはまた、少なくとも１つの分子単位を含むかまたは錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位から本質的に成り、
前記分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない基
【数１７】
2004509075.tif 000015
の少なくとも１つは、１回以上置換されたピリジンに基づく基を含むか、
あるいは前記分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない基
【数１８】
2004509075.tif 000016
の少なくとも１つは、１回以上置換されたかまたは置換されていないピリジン基を含み、前記基以外の基
【数１９】
2004509075.tif 000017
は電子供与基で置換される）
のマクロポリ環式化合物と錯体形成した少なくとも１つの希土類金属塩から成る希土類金属マクロポリ環式錯体に関する。
【００４８】
ピリジンに基づくラジカル上の１つ以上の置換基は、例えば、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１−Ｃ６カルボン酸エステル、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ２、−ＣＨ２ＮＨＣＯＮＨ−アリール、−ＣＨ２ＮＨＣＳＮＨ−アリール、−ＮＨＣＯＮＨ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、−ＮＨＣＳＮＨ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、−ＮＨＣＯＮＨ−アリール、−ＮＨＣＳＮＨ−アリール、ピペリジル、−Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−カルボキシピペリジル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルアミノ−アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、２〜１０個の炭素原子を含有するアルケニル、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキニル、３〜８個の炭素原子を含有するシクロアルキル、１〜５個の炭素原子を含有するヒドロキシアルキル、１〜１０個の炭素原子を含有するアルコキシ、２〜１０個の炭素原子を含有するアルコキシアルキル、３〜１０個の炭素原子を含有するアルコキシアルコキシアルキル、２〜１０個の炭素原子を含有するアルコキシアルコキシ、２〜１０個の炭素原子を含有するアルケニルオキシ、１〜１０個の炭素原子を含有するアルキルチオ、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキルチオアルキル、１〜７個の炭素原子を含有するアシルアミノ、２〜８個の炭素原子を含有するアシルアミノアルキル、２〜５個の炭素原子を含有するカルバモイルアルキル、３〜９個の炭素原子を含有するアルキルアミノカルボニルアルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボキサミド、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボキサミド（Ｃ１−Ｃ６）アルキルおよびカルボキシ（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルから選択することができる。
【００４９】
好ましくは、置換されたピリジンは１つまたは２つの置換基を含む。本発明の目的に好適な置換基としては、例えば、以下の置換基：アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、特にアミノメチルまたはアミノエチル；アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボキサミド、特にアミノエチルカルボキサミド、フェニルカルバモイル；フェニルチオカルバモイル；ニトリル；ピペリジル；Ｃ１−Ｃ６カルボン酸エステル、特にカルボン酸メチルまたはカルボン酸エチル；アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボキサミド（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、特にアミノカプロイルアミドメチルおよびアミノカプロイルアミドエチルまたはカルボキシ（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルがある。
【００５０】
好ましくは、錯体形成した希土類金属イオンはユウロピウムイオンである。
【００５１】
有利には、錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位を含まないかまたは前記分子単位から本質的に成らない２つの基
【数２０】
2004509075.tif 000018
は、１回以上置換されたかまたは置換されていないピリジン基を含む。
【００５２】
１つの好適な態様によれば、錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位は、フェナントロリン、アントラセン、ベンゼン、ナフタレン、ビフェニル、テルフェニル、アゾベンゼン、アゾピリジン、ビピリジンおよびビスイソキノリンから選択される。
【００５３】
有利には、錯体形成した希土類金属イオンの発光レベルの３重項エネルギーより大きな３重項エネルギーを有する分子単位はビピリジン基である。
【００５４】
好ましくは、ビピリジン基は、特にカルボキシレート、−ＮＨ２、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）２、ＯＨ、Ｏ−、−ＯＡｌｋ、Ａｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）２、−Ｃ（Ａｌｋ）３、−ＮＨＣＯＡｌｋ、および置換されたまたは置換されていないフェニル基、ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である、から選択される電子供与基（カルボキシレートが特に有利である）で置換される。
【００５５】
フェニルが置換される場合、フェニルは、例えば、スルフォネート、カルボキシレート、カルボン酸メチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、カルボン酸メトキシエチルおよびカルボキサミドから選択される１以上の置換基（同一であっても異なっていてもよい）で置換することができる。
【００５６】
本発明は、特に、式ＩＩ：
【化１８】
2004509075.tif 000019
（式中、以下の式
【化１９】
2004509075.tif 000020
の環は以下の式：
【化２０】
2004509075.tif 000021
のビス−ビピリジンマクロ環であり；
ｎ＝０、１または２であり；
Ｙは、１以上の二重結合および／または酸素、窒素、イオウもしくはリンなどの１以上のヘテロ原子または１以上のカルバモイルもしくはカルボキシアミド基を任意に含有する直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基から選択されるか、あるいはＣ５〜Ｃ８シクロアルキレン基またはＣ６〜Ｃ１４アリーレン基から選択される２価の有機ラジカルから成るスペーサー基あるいはスペーサーアームであり、前記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、任意にアルキル、アリールもしくはスルホン酸基で置換され；
Ａは生体物質に共有結合することが可能な官能基であり；
Ｒ１は−ＣＯＯＲ３基（式中、Ｒ３は水素であるかまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル基であり、好ましくはメチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチル基を表す）であるかあるいはＲ１は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａであるかまたは−Ｙ−Ａ基であり；
Ｒ２は水素、電子供与基、特にカルボキシレート、−ＮＨ２、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）２、ＯＨ、Ｏ−、−ＯＡｌｋ、Ａｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）２、−Ｃ（Ａｌｋ）３、−ＮＨＣＯＡｌｋ、置換されたもしくは置換されていないフェニル基、ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である、または−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａもしくは−Ｙ−Ａ基であり、
但し、Ｒ１およびＲ２置換基の１つを超えない置換基は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基を表し、Ｒ１およびＲ２は同時に−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基を表さない、ならびに
但し、ｎ＝０の場合、Ｒ２は水素以外である）
に対応するマクロ多環式化合物と錯体形成する少なくとも１つの希土類金属塩から成るマクロ多環式錯体に関する。
【００５７】
好適な化合物は、マクロ多環式化合物が式ＩＩ（式中、
ｎ＝０であり、
Ｙ、ＡおよびＲ１は上記で規定の通りであり、
Ｒ２は上記で規定の通りであり、
Ｒ２置換基は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ａまたは−Ｙ−Ａ基である）
に対応する錯体である。
【００５８】
特に有利な錯体は、ユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂ｐｙ．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２］、［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｐｙ（ＮＨ２）２］　および［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．　Ｐｙ（ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＲ４）２（式中、
【化２１】
2004509075.tif 000022
である）
である。
【００５９】
本発明の希土類金属マクロ多環式錯体は、上記の方法によって調製される。
【００６０】
本発明はまた、特にポリペプチド、タンパク質、細胞レセプター、抗原、抗体または核酸に特異的に相互に結合可能な分子の対のメンバーの１つに共有結合された、上記で規定された希土類金属マクロ環式錯体から成る蛍光複合体に関する。
【００６１】
更なる態様によれば、本発明はまた、分析物の蛍光アッセイにおいて、測定媒体によって生じる蛍光消光を減少するための上記で規定された希土類金属マクロ環式錯体の使用にも関する。
【００６２】
本発明を以下の実施例によって例示するが、それらの中で該化合物を特徴付け、同定するために使用した技術は以下の通りである。
【００６３】
融点は、キャピラリ融点装置：電熱ＩＡ８１０３を使用して決定した。測定値は補正していない。
【００６４】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌプレート：蛍光指示薬を含有するＡｌ２Ｏ３（Ｐｏｌｙｇｒａｍ　Ａｌｏｘ　Ｎ／ＵＶ２５４）およびＳｉＯ２（Ｐｏｌｙｇｒａｍ　ＳＩＬ　６／ＵＶ２５４）上で行った。
【００６５】
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、以下のコンポーネント：２１５２マイクロプロセッサー、２１５０ポンプ、Ｕｖｉｃｏｒｄ　２１５８検出器；Ｍｅｒｃｋ　５０７３４　Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｓ　１００ＲＰ１８カラム；適用勾配［時間（分）−溶媒Ｂの流速／ｍｌ割合（％）：０−１−１５；５−１−１５；３５−１−１００］；溶媒Ａ＝１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ、溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮから構成されるＬＫＢクロマトグラフィーシステムを使用して行った。
【００６６】
保持時間Ｔｒは、分で表現する。
【００６７】
ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ　ＡＣ　２５０装置［２５０　（１Ｈ）；６２．９　（１３Ｃ）］を使用して記録した。化学シフトは、対応する内部基準と比較してｐｐｍで表す。
【００６８】
（１Ｈ）に関する測定について、ＣＨＣｌ３＝７．２６；ＣＨ３ＯＨ＝３．３４；ｔＢｕＯＨ＝１．３６である。以下の符号を使用した：
ｓ＝一重項
ｄ＝二重項
ｔ＝三重項
ｍ＝多重項
ＡＢ＝結合系
Ｊ＝結合定数。
【００６９】
（１３Ｃ）　に関する測定について、ＣＨＣｌ＝７７．０であり、以下の符号を使用した：Ｃｔ＝３級炭素；Ｃｑ＝４級炭素。
【００７０】
マススペクトルのために使用したイオン化方法は、ＦＡＢ＋＝正モード（ＭＮＢＡマトリックス：メタ−ニトロベンジルアルコールまたはチオグリセロール）での高速原子衝撃および電子衝撃ＥＩである。
【００７１】
１０−５Ｍ溶液でＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒλ１５分光光度計を使用して、吸収スペクトル（ＵＶ〜可視）を記録した。
【００７２】
以下の実施例により本発明を例示する。実施例では以下の省略記号を使用するものとする：
ＡＩＢＮ：アゾビスイソブチロニトリル
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｍ．Ａ．：マイクロ分析
ｍ．ｐ．：融点
Ｍ．Ｓ．：質量分析
ＮＢＳ：Ｎ−ブロモコハク酸イミド
１Ｈ　ＮＭＲ：陽子核磁気共鳴
１３Ｃ　ＮＭＲ：１３Ｃ核磁気共鳴
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート
Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ＝４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳ：テトラメチルシラン
【００７３】
実施例１：式（６）ｂｐｙ．ｂｐｙ．ｐｙ（ＣＯ２Ｍｅ）のマクロ二環の調製
ジブロモメチル誘導体（４）によるマクロ環式ジアミンのアルキル化により、以下に示す化合物（６）が得られる。
【化２２】
2004509075.tif 000023
【００７４】
ａ）４−メチル２，６−ジブロモメチルイソニコチネート（４）の調製
以下に示す一連の反応により、化合物（４）を単離することができる。
【化２３】
2004509075.tif 000024
【００７５】
４−シアノ−２，６−ジメチルピリジン（１）
アミンオキシド塩のシアノ化に関するＷ．Ｅ．　ＦｅｅｌｙおよびＥ．Ｍ．　Ｂｅａｖｅｒｓ、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１９５９，　８１，　４００４に記載の研究により、化合物（１）を得ることが可能である。
【００７６】
２，６−ジメチルイソニコチン酸（２）
１ｇ（７．５６ｍｍｏｌ）の（１）および５ｍｌの濃硫酸の混合物を５時間、１００℃で加熱する。次いで、得られる溶液を氷浴上で冷却し、１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ３．５とし、次いで乾固するまで濃縮する。得られる残渣の一部を４８時間エーテルで抽出（ソックスレー）すると、分析のための５０ｍｇの２，６−ジメチルイソニコチン酸（２）が得られる。残りの粗反応物（エーテルで処理していない）は、更なる精製を行うことなく、そのままの形でエステル化反応に使用する。
【００７７】
ＮＭＲ：１Ｈ（Ｄ２Ｏ）；内部基準ｔＢｕＯＨ１．２９ｐｐｍ。
２．８２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３）；８．０５（ｓ，２Ｈ，Ｐｙ）。
ＭＳ（ＥＩ）：１５１（Ｍ＋，１００）；１３４（Ｍ＋−ＯＨ，７．２）；１０６（Ｍ＋−ＣＯ２Ｈ，１６．４）
ＭＡ：Ｃ８Ｈ９ＮＯ２＋０．１ＮａＨＳＯ４（１６３．１６）
計算値：Ｃ５８．８９　　Ｈ５．６２　　Ｎ８．５８　　Ｏ２３．５３
測定値：Ｃ５８．７３　　Ｈ５．９０　　Ｎ８．３７　　Ｏ２３．７
【００７８】
４−メチル２，６−ジメチルイソニコチネート（３）
２ｇの２，６−ジメチルイソニコチン酸（２）（未精製）、１００ｍｌのメタノールおよび１ｍｌの９８％硫酸を２４時間、還流する。冷却後、反応媒体を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で中和し、次いで、６０ｍｌのＣＨＣｌ３で５回抽出する。次いで、合わせたクロロホルム相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、次いで、濃縮する。次いで、得られる固体を５０ｍｌのエーテルで４回抽出し、その後、エーテル相を濃縮する。得られる白色残渣のアルミナ上でのクロマトグラフィー［勾配：クロロヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２（５０／５０）〜純ＣＨ２Ｃｌ２］により、１ｇの４−メチル２，６−ジメチルイソニコチネート（３）を得る。
【００７９】
ｍ．ｐ．：４５〜４７℃
ＴＬＣ：Ｒｆ　：０．３　［ＳｉＯ２／ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ　（９７／３）］
ＨＰＬＣ：Ｔｒ：２．４
ＵＶ：ＣＨＣｌ３：２９０．６ｎｍ　（３６５０）
ＮＭＲ：１Ｈ　ＣＤＣｌ３；内部基準ＴＭＳ
２．５９　（ｓ，　６Ｈ，　ＣＨ３）；３．９３　（ｓ，　３Ｈ，　ＣＯ２ＣＨ３）；７．５１　（ｓ，　２Ｈ，　Ｐｙ）
１３Ｃ　ＣＤＣｌ３；内部基準７７．０ｐｐｍ
２４．５　（ＣＨ３）；５２．５　（ＯＣＨ３ｓ）；１１９．５　（Ｃｔ）；１３７．９，　１５８．９　（Ｃｑ）；１６６．１　（Ｃ＝Ｏ）。
ＭＳ　（ＥＩ）：１６５　（Ｍ＋，　２４）；１３４　（Ｍ＋−ＯＣＨ３，　１３）；１０６　（Ｍ＋−ＣＯ２Ｍｅ）
【００８０】
４−メチル−２，６−ジブロモメチルイソニコチネート（４）
１２０ｍｌのＣＣｌ４中１．３７２ｇ（８．３ｍｍｏｌ）の（３）、６０ｍｇのＡＩＢＮおよび２．８６６ｇ（１６．１ｍｍｏｌ）のＮＢＳの混合物を、窒素大気下および１００Ｗランプによる照射下で８時間還流する。次いで、反応媒体を室温に戻し、その後、該媒体を２００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄する。下相（ＣＣｌ４）を取り出した後、水相を５０ｍｌのＨ２Ｏで４回抽出し、次いで、合わせた有機相を１００ｍｌのＨ２Ｏで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、次いで、乾固するまで濃縮する。得られた残渣をシリカ上でのクロマトグラフィー［勾配：シクロヘキサン−ＣＨ２Ｃｌ２（８０／２０）〜純ＣＨ２Ｃｌ２］によって精製すると、ポリブロモ種、対称および非対称ジブロモ誘導体の異性体混合物からおよび形成されたモノブロモ種からも、ブロモ誘導体（４）の第１の画分を分離することが可能である。
【００８１】
より大量のメチル−２，６−ジブロモメチルイソニコチネートを　　にするために、上記で単離されたモノブロモ化合物［０．５４３ｇ（２．２ｍｍｏｌ）］を０．４ｇ（２．２ｍｍｏｌ）のＮＢＳ、２３ｍｇのＡＩＢＮおよび５０ｍｌのＣＣｌ４と混合し、次いで、上記の臭素化条件下で処理して、（４）の第２の画分を得る。
【００８２】
最後に、ジブロモ異性体（上記で単離された２つの反応物）の混合物をシリカ上でのクロマトグラフィー［勾配：純シクロヘキサン〜シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ（８５／１５）］によって精製すると、（４）の最終画分（即ち、合計で５９６ｍｇ（２２％））が得られる。
【００８３】
ｍ．ｐ．：９０〜９２℃
ＴＬＣ：Ｒｆ：０．６（ＳｉＯ２／ＣＨ２Ｃｌ２）
ＨＰＬＣ：Ｔｒ：２０分５秒
ＵＶ：ＣＨＣｌ３：２９０．８ｎｍ（４２７０）；２４０．３ｎｍ（３０１０）
ＮＭＲ：１Ｈ　ＣＤＣｌ３；内部基準ＴＭＳ
３．９８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；４．５８（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２）；７．９２（ｓ，２Ｈ，Ｐｙ）
１３Ｃ　ＣＤＣｌ３；内部基準７７．０ｐｐｍ
３２．８（ＣＨ２）；５２．９（ＯＣＨ３）；１２２．２（Ｃｔ）；１３９．８，１５７．９（Ｃｑ）；１６４．７（Ｃ＝Ｏ）。
ＭＳ（ＥＩ）：３２２．９（Ｍ＋，１５）；２４３．９（Ｍ＋−Ｂｒ，１００）；１６３（Ｍ＋−２Ｂｒ，１５．７）．
ＭＡ：Ｃ９Ｈ９ＮＯ２Ｂｒ２（３２２．９８）
計算値：Ｃ３３．４７　　Ｈ２．８０　　Ｎ４．３３　　Ｏ９．９０
測定値：Ｃ３３．６９　　Ｈ２．８１　　Ｎ４．２９　　Ｏ１０．１７
【００８４】
ｂ）式（６）のアルカリ金属クリプテート［Ｎａ＋⊂ｂｐｙ．ｂｐｙ．ｐｙＣＯ２Ｍｅ］Ｂｒ−の精製
４００ｍｌのＣＨ３ＣＮ中０．２ｇ（０．５０８ｍｍｏｌ）のビピリジンマクロ環式ジアミン（５）（Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　１９８３，　４８，　４８４８に記載されている）および０．３７６ｇ（５．０８ｍｍｏｌ）のＬｉ２ＣＯ３の混合物を窒素大気下で４０分間、還流する。得られる懸濁液に、１００ｍｌのＣＨ３ＣＮ中０．１６５ｇ（０．５０８ｍｍｏｌ）の４−メチル２，６−ジブロモメチルイソニコチネート（４）を段階的（２時間）に添加する。添加終了時に、さらに２２時間、同条件下で撹拌を継続し、次いで、反応媒体を氷浴上で冷却する。次いで、カルボネートを濾過により除去し、濾液をエバポレートして乾固する。得られた残渣をシリカ上でのクロマトグラフィー［勾配：１０％ＭｅＯＨを含有するＣＨ２Ｃｌ２］によって精製すると、１１７．５ｍｇの化合物（６）（３５％）が得られる。
【００８５】
ＴＬＣ：Ｒｆ：０．４［Ａｌ２Ｏ３／ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９０／１０）］
ＨＰＬＣ：Ｔｒ：４分１秒
ＵＶ：ＣＨＣｌ３：２４６ｎｍ（２７９５０）；２９１ｎｍ（２７４１０）。
ＮＭＲ：１Ｈ（ＣＤＣｌ３）；内部基準ＴＭＳ。
３．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；４．００（ｄ，Ｊ＝１５Ｈｚ，ＡＢ，４Ｈ，ＣＨ２）；
４．０８（ｄ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，ＡＢ，４Ｈ，ＣＨ２）；４．０９（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２）；
７．３９−７．４２（ｍ，４Ｈ，ＢＰｙ）；７．７７（ｓ，２Ｈ，Ｐｙ）；７．８５−７．８９（ｍ，８Ｈ，ＢＰｙ）。
１３Ｃ（ＣＤＣｌ３）；内部基準７７ｐｐｍ。
５２．９（ＣＨ３，ＣＯ２Ｍｅ）；５９．４（ＣＨ２）；５９．５（ＣＨ２）；
Ｃｔ（１１９．９；１２２．１；１２３．４；１３８．８）
Ｃｑ（１３９．２；１５４．６；１５８．５；１５９．６）；１６５．３（ＣＯ２Ｍｅ）。
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：チオグリセロールマトリックス。
５７８．２（リガンド−Ｌｉ＋＋Ｎａ＋，１００％）；５５６．２（リガンド−Ｌｉ＋＋Ｈ，１０％）。
チオグリセロールマトリックス＋１％ＴＦＡ
５７８（リガンド−Ｌｉ＋＋Ｎａ＋，２０％）；５５６．１（リガンド−Ｌｉ＋＋Ｈ，１００％）。
ＭＡ：Ｃ３３Ｈ２９Ｎ７Ｏ２ＮａＢｒ，３Ｈ２Ｏ（７１２．５３）。
計算値：Ｃ５５．６２　　Ｈ４．９５　　Ｎ１３．７６
測定値：Ｃ５５．９３　　Ｈ４．７３　　Ｎ１３．６１
【００８６】
実施例２：ユウロピウムクリプテートの調製
実施例（１）のリガンド（６）の［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ．ｂｐｙ．ｐｙＣＯ２Ｍｅ］Ｃｌ−３
１１．８ｍｇのＥｕＣｌ３，６Ｈ２Ｏ（３．２２×１０−５ｍｏｌ）を、５ｍｌの無水メタノールに含有する２０．２ｍｇ（２．８４×１０−５ｍｏｌ）のマクロ二環（６）に添加する。得られる均質な混合物を窒素大気下で２３時間、還流する。次に、室温に冷却して、４ｍｌのエーテルをこの溶液に添加すると、１４．２ｍｇ（５２％）のユウロピウムクリプテートの結晶が生じる。
【００８７】
ＨＰＬＣ：Ｔｒ：１４．１
ＵＶ：Ｈ２Ｏ：２５０ｎｍ（１８２７０）；３０９ｎｍ（２４４００）。
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ニトロベンジルアルコールマトリックス
７７８［（Ｅｕ３＋⊂Ｌ＋２Ｃｌ−）＋，４０％］；７４３［（Ｅｕ２＋⊂Ｌ＋Ｃｌ−）＋，９０％］；
７０７［（Ｅｕ３＋⊂Ｌ−２Ｈ）＋，１００％］
ＭＡ：Ｃ３３Ｈ２９Ｎ７Ｏ２ＥｕＣｌ３，０．１３ＥｕＣｌ３，ＮａＢｒ，２ＣＨ３ＯＨ（１０１４．５１）
計算値：Ｃ４１．４３　　Ｈ３．６７　　Ｎ９．６６
測定値：Ｃ４１．２３　　Ｈ３．９５　　Ｎ９．６３
【００８８】
実施例３：式（１２）Ｐｙ．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２のマクロ二環の調製
本化合物は、以下に示すスキームに従って調製される。
【化２４】
2004509075.tif 000025
【００８９】
ａ）式（１１）のマクロ環の調製
以下の反応系列によって、ｂｐｙ．ｂｐｙジアミンテトラエステルマクロ環（１１）が得られる。
【化２５】
2004509075.tif 000026
【００９０】
トシルｂｐｙ．ｂｐｙテトラエステルマクロ環（９）
５．５ｇ（１２ｍｍｏｌ）の６，６’−ジメチル２，２’−ジブロモメチル４，４’−ビピリジンジカルボキシレート（８）（Ｈｅｌｖ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ，　１９８８，７１，１０４２に記載されている）、４．６４ｇの新たに調製したトシルアミド（２４ｍｍｏｌ）のナトリウム塩および９００ｍｌの無水エタノールの混合物を窒素大気下で２６時間、還流する。次いで、この溶液を１時間、氷浴上で冷却し、その後、該溶液を濾過する。次いで、単離した沈殿物を、７００ｍｌの水、５００ｍｌのエタノールおよび２０ｍｌのクロロホルムで洗浄して、１．８８ｇ（３１．６％）の（９）を得る。
【００９１】
ＴＬＣ：Ｒｆ：０．７［ＳｉＯ２／ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９９／１）］
ＨＰＬＣ：Ｔｒ：３６．１
ＭＳ（ＦＡＢ）＋：ＭＮＢＡマトリックス
９９１（Ｍ＋，４５％）；８３５（Ｌ−Ｔｏｓ，１２％）。
ＭＡ：Ｃ５０Ｈ５０Ｏ１２Ｎ６Ｓ２　ＮａＢｒ．（１０９４）
計算値：Ｃ５４．８９　　Ｈ４．６　　Ｎ７．６８　　Ｓ５．８６　　Ｎａ２．１
測定値：Ｃ５５．６６　　Ｈ４．６４　　Ｎ７．７５　　Ｓ６．０４　　Ｎａ３．１９
【００９２】
Ｂｐｙ．Ｂｐｙ．テトラ酸マクロ環（１０）
１ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４中０．１５ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のトシルマクロ環（９）の溶液を窒素大気下で３時間、１００℃で加熱する。次いで、反応媒体を氷浴上で冷却し、５ｍｌの水を添加することによって希釈し、次いで、７ｍｌの５Ｎ　ＮａＯＨを添加することによってｐＨ３．０とする。次いで、形成した沈殿物を濾過によって除去し、水（５０ｍｌ）で徹底的に洗浄し、次いで乾燥する。このようにして単離したテトラ酸マクロ環（１０）（おそらくアミン塩の形態）は、次の工程では更なる精製を行うことなく使用する。
【００９３】
Ｂｐｙ．Ｂｐｙ．ジアミンテトラエチルエステルマクロ環（１１）
１００ｍｌの無水エタノールおよび０．５ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４中５３ｍｇの化合物（１０）の懸濁液を、窒素大気下で２８時間、還流する。次いで、得られる均質な溶液を、順次、氷浴上で冷却し、飽和ＮａＣＯ３溶液で中和し、８０ｍｌのＣＨＣｌ３で処理（４×２０）して、６０ｍｇの化合物（１１）を得る（定量的）。
【００９４】
ＴＬＣ：Ｒｆ：０．７［Ａｌ２Ｏ３／ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（８０／２０）］
ＨＰＬＣ：Ｔｒ：１７．２
ＵＶ：ＣＨＣｌ３：２４３．１ｎｍ（２４１５０）；３０３．２ｎｍ（２５２１０）。
ＮＭＲ：１Ｈ（ＣＤＣｌ３）；内部基準ＴＭＳ。
１．４４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１２Ｈ，ＣＨ３）；２．２９（ｓ，ブロード，ＮＨ）；４．１７（ｓ，８Ｈ，ＣＨ２）
４．３９（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，８Ｈ，ＣＨ２　エステル）；７．４３（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，４Ｈ，ＢＰｙ）；
８．２９（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，４Ｈ，ＢＰｙ）。
１３Ｃ　（ＣＤＣｌ３）；内部基準７７．０ｐｐｍ。
１４．９（ＣＨ３，ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３）；５６．８（ＣＨ２）；６２．３（ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３）；
Ｃｔ（１１９；１２２．５）；Ｃｑ（１３８．９；１５８．９；１６１．４）；１６５．７（ＣＯ２Ｃ２Ｈ５）
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：チオグリセロールマトリックス
６８３（Ｍ＋，１００）
ＭＡ：Ｃ３６Ｈ３８Ｎ６Ｏ８，Ｈ２Ｏ（７００．７４）
計算値：Ｃ６１．７　　Ｈ５．７５　　Ｎ１１．９９
測定値：Ｃ６２．２　　Ｈ６．０１　　Ｎ１１．４８
【００９５】
ｂ）式（１２）［Ｎａ＋⊂Ｐｙ．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２］Ｂｒ−のアルカリ金属クリプテートの調製
３６０ｍｌの無水ＣＨ３ＣＮ中１８０．７ｍｇ（０．２６５ｍｌ）のマクロ環式ジアミン（１１）および１９５．５ｍｇ（２．６５ｍｍｏｌ）のＬｉ２ＣＯ３の混合物を窒素大気下で３５分間、還流する。得られた懸濁液に、３６０ｍｌの無水ＣＨ３ＣＮ中７０．７ｍｇ（０．２６７ｍｍｏｌ）の２，６−ジブロモメチルピリジン（７）を徐々に（５時間）添加する。還流を７２時間、維持し、次いで、反応媒体を氷浴上で冷却する。不溶性のカルボネートを濾過した後、濾液をエバポレートして乾固する。得られた残渣固体を、溶出液としてＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＨ（９９／１〜８５／１５）を有するアルミナのカラム上でクロマトグラフィーし、７８　ｍｇの（１２）（３３％）を得る。
【００９６】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６［Ａｌ２Ｏ３／ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（９０／１０）］
ＨＰＬＣ：Ｔｒ＝２０．８
ＵＶ：ＣＨＣｌ３：２５０ｎｍ（２４９００）；３１６ｎｍ（１８９００）
ＮＭＲ：１Ｈ（ＣＤＣｌ３）；内部基準ＴＭＳ
１．４５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１２Ｈ，ＣＨ３）；４．０７（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２）；４．１４
（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，ＡＢ，４Ｈ，ＣＨ２）；４．２２（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，ＡＢ，４Ｈ，ＣＨ２）；
４．４６（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，８Ｈ，ＣＨ２　エステル）；７．２７（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｙ）；
７．６６（ｔ，ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｐｙ）；７．９３（ｓ，４Ｈ，Ｂｐｙ）；８．４２（ｓ，４Ｈ，Ｂｐｙ）。
１３Ｃ（ＣＤＣｌ３）；内部基準７７ｐｐｍ。
１４．３（ＣＨ３，ＣＯ２Ｅｔ）；５９．４（ＣＨ２）；５９．５（ＣＨ２）；６２．５（ＣＨ２，ＣＯ２Ｅｔ）；
Ｃｔ（１１９．３；１２２．８；１２３；１３８．１）；Ｃｑ（１４０．５；１５５．１；１５７．８；１６０．１）；
１６４．５（ＣＯ２Ｅｔ）。
ＭＳ：（ＦＡＢ＋／ＮＢＡマトリックス）
８０８．４（リガンド−Ｌｉ＋＋Ｎａ＋，１００％）；６６３．３（リガンド＋Ｎａ＋−２ＣＯ２Ｅｔ，５％）．
ＭＡ：Ｃ４３Ｈ４３Ｎ７Ｏ８ＮａＢｒ，ＣＨ２Ｃｌ２（９７２．６８）
計算値：Ｃ５４．３　　Ｈ４．６　　Ｎ１０
測定値：Ｃ５４．９　　Ｈ４．０　　Ｎ９．８
【００９７】
実施例４：式１２ａ　［Ｅｕ３＋⊂Ｐｙ．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２］のユウロピウムクリプテートの調製
【化２６】
2004509075.tif 000027
【００９８】
ａ）実施例３のリガンド１２のユウロピウム錯体の調製
［Ｅｕ３＋⊂Ｐｙ．Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２Ｂｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２］
３２ｍｌの無水ＣＨ３ＣＮに含有される６９ｍｇ（７．７×１０−５ｍｏｌ）のナトリウムクリプテート（１２）に３３ｍｇ（９×１０−５ｍｏｌ）のＥｕＣｌ３．６Ｈ２Ｏを添加する。得られる懸濁液を窒素大気下で２７時間、還流し；冷却後、溶媒をエバポレートにより除去する。次に、得られた残渣の逆相クロマトグラフィーにより、２５ｍｇのユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂１２］　（２５％）を得る。
【００９９】
ＨＰＬＣ：Ｔｒ：２１
ＵＶ：ＥｔＯＨ　／　３３０　ｎｎｍ　（２１０００）
ＭＳ：（ＦＡＢ＋）チオグリセロールマトリックス
１１６４．２　［（Ｅｕ３＋⊂１２　＋２ＣＦ３ＣＯ２−）＋，６４％
１０５１．８　［Ｅｕ３＋⊂１２　＋　ＣＦ３ＣＯ２−　＋　Ｈ］　１００％］
９３７．４　［（Ｅｕ２＋⊂１２　−１Ｈ）　３５％］
【０１００】
ｂ）式１２ａの酸クリプテートの調製
１０ｍｇ（７．８３×１０−６ｍｏｌ）のユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂１２］の水溶液に１００μｌの１．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加する。得られる混合物を室温で２時間、撹拌し、次いで、乾固するまで蒸発させる。得られた残渣を、溶出液として１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮを含有するＨ２Ｏでクロマトグラフィーし、８ｍｇ（定量的）の式１２ａのユウロピウムクリプテートを得る。
【０１０１】
実施例５：式（１６）のピリジンジエチルビスピリジンテトラ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルマクロ二環の調製
【化２７】
2004509075.tif 000028
【０１０２】
ａ）式（１４）のジエチル２，６−ジブロモメチル−３，５−ピリジンカルボキシレートの調製
本化合物は、市販のジエチル２，６−ジメチル−３，５−ピリジンカルボキシレートから出発する従来のフリーラジカル臭素化手順によって合成する。
【化２８】
2004509075.tif 000029
【０１０３】
２０ｍｌの四塩化炭素中０．５ｍｇ（２ｍｍｏｌ）の２，６−ジエチル３，５−ジメチルピリジンカルボキシレート、０．８９ｍｇ（５ｍｍｏｌ）のＮＢＳおよび４ｍｇのＡＩＢＮの混合物を、１００Ｗ可視ランプによる照射下で２時間還流する。次に、懸濁液を氷浴上で冷却し、次いで、形成したスクシンイミドを取り出すために濾過する。次いで、濾液を濃縮して乾固し；得られた残渣をシリカ上で溶出液としてヘキサン／クロロホルム混合液（勾配：５０／５０〜３０／７０）によってクロマトグラフィーすることにより、１９５ｍｇの式（１４）のブロモ誘導体（２６％）を得る。
【０１０４】
ＴＬＣ：Ｒｆ　＝　０．４　（ＳｉＯ２　／　ＣＨ２Ｃｌ２）
ＨＰＬＣ：Ｔｒ　＝　２５．５
ＵＶ　：ＣＨＣｌ３　／　２４５　ｎｍ　（９４００）
ＮＭＲ：１Ｈ　（ＣＤＣｌ３）；内部基準ＴＭＳ
１．４５　（ｔ，　Ｊ　＝　７．０　Ｈｚ，　６Ｈ，　ＣＨ３）；４．４７　（ｑ，　Ｊ　＝　７．２　Ｈｚ，　４Ｈ，　ＣＨ２）；
５　（ｓ，　４Ｈ，　ＣＨ２Ｂｒ）；８．８０　（ｓ，　１Ｈ，　Ｐｙ）．
【０１０５】
ｂ）式（１５）のジアミンビスビピリジンテトラ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルマクロ環の調製
【化２９】
2004509075.tif 000030
【０１０６】
本化合物は、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシドおよび実施例３のマクロ環（１１）から出発する簡単なエステル交換反応により合成する。
【０１０７】
２５１ｍｇのマクロ環（１１）（０．３６ｍｍｏｌ）、３６３ｍｇ（４．５ｍｍｏｌ）のリチウムｔｅｒｔ−ブトキシド、３５ｍｇの乾燥トルエンおよび３５ｍｌの乾燥ｔｅｒｔ−ブタノールの混合物を、窒素流下、８０℃で約３時間、加熱する。冷却後、ｔｅｒｔ−ブタノールをエバポレーションにより取り出し、まず、残渣の有機相を水で洗浄して中性のｐＨとし（６×５０ｍｌ）、次いで、順次、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮して乾固する。得られた残渣を、溶出液としてＣＨ３ＣＮおよび１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏによる逆相クロマトグラフィーにかけることにより、１１７ｍｇのマクロ環（１５）（４０％）を得る。
【０１０８】
ＨＰＬＣ：Ｔｒ　＝　２２．４
ＵＶ：ＣＨＣｌ３　／　３１１　ｎｍ　（１８０００）；２８０　ｎｍ　（８３００）；２６８　ｎｍ　（７２００）
ＮＭＲ：１Ｈ　（ＣＤＣｌ３）；内部基準ＴＭＳ
１．６５　（ｓ，　３６Ｈ，　ＣＨ３）；４．６９　（ｓ，　８Ｈ，　ＣＨ２）；
７．９７　（ｓ，　４Ｈ，　Ｈ，　ｂｐｙ）；
８．５１　（ｓ，　４Ｈ，　Ｈｂｐｙ）。
ＭＳ：（ＥＳ）　７９６　（Ｍ＋Ｈ）。
【０１０９】
ｃ）式（１６）［Ｌｉ＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２ｔｂｕ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２ｔｂｕ）２．Ｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２］Ｂｒ−のアルカリ金属クリプテートの調製
２５ｍｌの無水ＣＨ３ＣＮ中２５．３ｍｇ（３．１８×１０−５ｍｏｌ）のマクロ環（１５）および２７ｍｇ（３．６５×１０−４ｍｏｌ）のＬｉ２ＣＯ３を、窒素流下で１５分間、還流する。得られた懸濁液に、１２ｍｌの無水ＣＨ３ＣＮ中１２．７ｍｇ（３．１×１０−５ｍｏｌ）の２，６−ジエチル３，５−ジブロモメチルピリジンカルボキシレート（１４）の溶液を１０分間に段階的に添加する。これらの条件下で２３時間、撹拌を継続し、次いで、反応媒体を氷浴上で冷却し、その後、該媒体を濾過する。濾液をエバポレートして乾固した後、得られた残渣の逆相クロマトグラフィーにより、１２ｍｇ（３５％）のマクロ二環（１６）を得る。
【０１１０】
ＨＰＬＣ：Ｔｒ　＝　２８．５
ＭＳ：（ＥＳ）　１０４２．３　［リガンド−Ｌｉ＋−Ｂｒ−　（１００％）］；
１０６４．３　［リガンド−Ｌｉ＋−Ｂｒ−＋Ｎａ＋（３０％）］
【０１１１】
実施例（６）：式（１９）［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．Ｐｙ（ＮＨ２）２］のユウロピウムクリプテートの調製
【化３０】
2004509075.tif 000031
【０１１２】
ａ）実施例（６）のリガンドのユウロピウム錯体［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２ｔｂｕ）２．ｂｐｙ．（ＣＯ２ｔｂｕ）２．Ｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２
１０ｍｌの無水アセトニトリル中１．７１ｍｇ（１．５１×１０−５ｍｏｌ）のリチウムクリプテート（１６）に１２．８ｍｇ（３．５×１０−５ｍｏｌ）のＥｕＣｌ３．６Ｈ２Ｏを添加する。次いで、窒素流下で反応媒体を３時間、還流する。冷却後、溶媒をエバポレートにより除去し、得られた残渣（ｍ＝２７．６ｍｇ）は、以下の工程でさらなる精製を行うことなく使用する。
【０１１３】
ｂ）酸ユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．Ｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２］（ＣＦ３ＣＯ２−）３の調製
本反応は、純トリフルオロ酢酸での処理によってビピリジンサブユニットによりｔｅｒｔ−ブチルエステル骨格を選択的に加水分解することから成る。
【０１１４】
実施例６の段落ａ）で得られた残渣の２７．６ｍｇを１４ｍｌのトリフルオロ酢酸に溶解する。得られた均質な溶液を室温で４時間撹拌し、次いで、減圧下でエバポレートすることにより、乾固するまで濃縮する。溶出液として１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮを含有するＨ２Ｏの混合物で逆相クロマトグラフィーを行うことにより、１０．４ｍｇのユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．Ｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２］（ＣＦ３ＣＯ２−）３が得られる。
【０１１５】
ＨＰＬＣ：Ｔｒ　＝　１３．７
ＵＶ：ＭｅＯＨ　／　３２４．６ｎｍ　（１６０００）；３３７ｎｍ　（１３３００）
【０１１６】
ｃ）式（１９）のユウロピウムクリプテートの調製
２ｍｌの無水ＭｅＯＨ中１０ｍｇ（８．０３×１０−６ｍｏｌ）のユウロピウムクリプテート［Ｅｕ３＋⊂ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．ｂｐｙ（ＣＯ２Ｈ）２．Ｐｙ（ＣＯ２Ｅｔ）２］の溶液に、３００μｌの無水ＭｅＯＨ中３００μｌのエチレンジアミン（４．４５×１０−３ｍｏｌ）の溶液を５分間、氷浴上で冷却しながら窒素流下で添加する。次いで、媒体の温度を徐々に２０℃まで上昇させ、続いて、これらの条件下で２．５時間、撹拌する。溶媒をエバポレートして除去した後、得られた残基を、溶出液として１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮを含有するＨ２Ｏの混合物で逆相クロマトグラフィーにかけることにより、５．５ｍｇのクリプテート（１９）（４５％）を得る。
【０１１７】
ＵＶ：ＭｅＯＨ　／　３２５ｎｍ　（１７０００）
【０１１８】
実施例７：式（２０）のユウロピウムクリプテートの調製
本化合物は、以下に示すスキームに従って調製する。
【化３１】
2004509075.tif 000032
【０１１９】
氷浴上で冷却した２００μｌの０．１Ｍ　ｐＨ７．０リン酸緩衝液中０．２ｍｇ（１．２８×１０−７ｍｏｌ）の化合物（１９）の溶液に、１６８μｌのリン酸緩衝液中１９５μｇ（４．４５×１０−７ｍｏｌ）のｓｕｌｆｏＳＭＣＣを４５分間で段階的に添加する。添加の終了時に、媒体の温度を２０〜２５℃に保持し、これらの条件下で３時間、反応を継続させる。次に、溶出液として１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮを含有するＨ２Ｏの混合物で逆相クロマトグラフィーにかけることにより直接精製し、１００μｇのクリプテート（２０）（５０％）を得る。
【０１２０】
実施例８：式（２０）の化合物とタンパク質との結合
ａ）タンパク質の活性化
２ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰエタノール溶液を２６．２μｌ　添加することにより（初期の試薬／タンパク質のモル比：８）、３．１４ｍｇ（４．４３ｍｇ／ｍｌ）の抗体（ＰＳＡなし、クローンＡ４５５、ＣＩＳ　ｂｉｏ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｆｒａｎｃｅ）を、０．１　Ｍ　ｐＨ　７．０リン酸緩衝液中、室温で３０分間活性化する。この期間の終了時に、反応媒体に、０．１　Ｍ　ｐＨ　７．０リン酸緩衝液中６１．７ｍｇ／ｍｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を３７μｌ添加し、室温で１５分間、インキュベートすることによって、チオール基（ＳＨ）を作製する。次に、活性化中に使用した緩衝液を溶出液として使用してＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５　ＨＲ１０−１０カラム上で混合物を精製する。
【０１２１】
ｂ）活性化したタンパク質と式（２０）のクリプテートとの結合
０．１Ｍ　ｐＨ７．０リン酸緩衝液中１ｍｇ／ｍｌを含有する式（２０）のクリプテートの溶液の５５μｌを、実施例８の段落ａ）に記載の手順によって活性化した３８６μｌの抗体Ａ４５５溶液（同緩衝液中１．２ｍｇ／ｍｌ）に添加し、続いて、４℃で２０時間、インキュベートし、この期間の終了時に、結合反応用の緩衝液を溶出液として使用してＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５　ＨＲ１０−３０カラム上で反応混合物を精製する。２８０ｎｍおよび３２５ｎｍでの抗体−クリプテート複合体の吸光度測定により、８．０の標識化の程度および８０％の収率を得る。
【０１２２】
実施例９：血清中における実施例２、４（ｂ）、６（ｃ）、７および８のピリジンクリプテートの消光の感度が低いことの実証
以下の決定は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＬＳ５０分光光度計によって行った。
【０１２３】
試験したクリプテートの蛍光寿命の測定は、欧州特許ＥＰ　０　６０１　１１３号に開示されている手順に従って行った。
【０１２４】
化合物は、０．１Ｍ　ｐＨ　７．０リン酸緩衝液および仔ウシ血清（ＮＣＳ）中で試験した。緩衝液のみかまたは２／３緩衝液〜１／３血清の混合物でストック溶液を１／１００に希釈することによって、約１０−６Ｍ／Ｉのクリプテート濃度を測定するための溶液を調製した。
【０１２５】
実施例２、４（ｂ）、６（ｃ）、７および８のピリジンクリプテートは、トリスビスピリジンジアミンクリプテート（ＫＮＨ２）およびピリジン−ビスピリジンクリプテート［Ｅｕ３＋Ｃｐｙ．Ｂｐｙ．Ｂｐｙ］と比較して試験したが、それらの調製については、それぞれ欧州特許ＥＰ　０　３２１　３５３号およびＨｅｌｖ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ，　１９８８，　７１，　１０４２に記載されている。
【０１２６】
これらの２つの分子の式を以下に示す：
【化３２】
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【０１２７】
結果を以下の表１に示す。
【０１２８】
【表１】
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表１
【０１２９】
これらの結果は、トリスビスピリジンクリプテート構造において、ビピリジン単位をピリジン単位に置き換えると、血清により生じる蛍光消光を減少する効果をもたらすことを示す。これらの結果はまた、ビピリジン単位上にカルボン酸基が存在すると、消光の減少に好ましい影響を及ぼすことを実証する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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