(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、親水性活性成分（インスリン）を運搬するための粒子の懸濁液に関する。前記キャリア粒子は、ポリエチレングリコール／疎水性中性ポリアミノ酸ダブル−ブロックポリマーを基礎とする。前記ポリエチレングリコール／疎水性中性ポリアミノ酸粒子は、親水性活性成分（インスリン）と会合する。本発明は、前記輸送粒子が由来する粉末状固体、及び前記固体の調製、及びポリエチレングリコール／疎水性中性ポリアミノ酸ダブル−ブロックポリマーを基礎とする粒子及びインスリンを輸送する前記懸濁液にも関する。前記調製は、Ｎ−メチル／ピロリドン、メタノールの存在下に、疎水性中性ポリアミノ酸粒子のＮ−カルボキシ無水物とアミン−官能化ポリエチレングリコールの共重合を含み、もって、ポリエチレングリコール／疎水性中性ポリアミノ酸であって、後者には、インスリンが会合しているものを得；キャリア粒子を得るように水で沈殿し、場合に応じて中和、透析、濃縮及び水の除去を行い、もって、粉末固体又は懸濁キャリア粒子を生産し、及び薬学的物品を調製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の活性成分（ＡＰ）を保持するために特に使用することができるサブミクロン粒子のコロイド懸濁液であって、これらの粒子が、
・次のものを含む両親媒性コポリマを基礎とし；
−α−ペプチド結合を有する疎水性線状ポリアミノ酸（ＰＡＡ）のブロック少なくとも１つであって、このＰＡＡブロックを構成する前記疎水性アミノ酸ＡＡＯが同一であるか又は異なるもの；及び
−ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）タイプの、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タイプの親水性ポリマのブロック少なくとも１つ；並びに
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１つのＡＰを会合することができ、且つ、特にインビボで、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができる
個別化された超分子配列であって、それが含有する粒子が、親水性ＡＰ、好ましくはタンパク質から選択される少なくとも１種のＡＰと会合しているか及び／又は会合し得、このＡＰは、特に好ましくはインスリンからなることを特徴とする懸濁液。
【請求項２】
キャリア粒子のインスリンとの載荷ファクタＴａにより特徴付けられ、使用したインスリンの重量に対する載荷したインスリンの重量％により表され、且つ手順Ｍａにより測定されるＴａが、
７≦Ｔａ、
好ましくは、８≦Ｔａ≦５０、
特に好ましくは、１０≦Ｔａ≦３０
である請求項１の懸濁液。
【請求項３】
ＰＡＧ、好ましくはＰＥＧが、重量平均分子量５００ないし５０，０００Ｄ、好ましくは１０００ないし１０，０００Ｄ、特に好ましくは１００ないし５０００Ｄを有することを特徴とする請求項１又は２の懸濁液。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項の懸濁液であって、
−前記ＡＡＯは、疎水性中性アミノ酸ＡＡＮＯであり、
−ＰＡＧ／ＡＡＮＯの割合は、＞１であり、及び
−ＰＥＧブロックの絶対長は、＞２モノマ、好ましくは＞１０モノマ、特に好ましくは＞２０モノマであることを特徴とする懸濁液。
【請求項５】
前記ＡＡＮＯを基礎とするＰＡＡブロックは、少なくとも５の、好ましくは少なくとも１０の、特に好ましくは１０ないし５０のＡＡＮＯを含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項の懸濁液。
【請求項６】
前記粒子が、ＰＥＧ／ＡＡＮＯの「ジブロック」である請求項１ないし５のいずれか１項の懸濁液。
【請求項７】
前記ＡＡＮＯが、
・天然中性アミノ酸：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、それらの混合物、
・希少又は合成中性アミノ酸：ノルロイシン、ノルバリン、及び
・極性アミノ酸の誘導体：メチルグルタメート、エチルグルタメート、ベンジルアスパラテート、Ｎ−アセチルリシン
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項の懸濁液。
【請求項８】
水性且つ安定なことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項の懸濁液。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液から得られることを特徴とする粉末固体。
【請求項１０】
請求項９の粉末固体の調製方法であって、
１）少なくとも１種のＰＡＧ切片を少なくとも１種のＰＡＡ切片と反応させ、各々の切片は、それぞれ少なくとも１のアルキレングリコール又はアミノ酸モノマ、及び少なくとも１のＰＡＡ−ＰＡＧ結合（好ましくは、アミド結合）を形成するための反応性基を少なくとも１種含み、ＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯブロックコポリマを得；
２）工程１で得た前記ＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯブロックコポリマを、好ましくは水中に沈殿させ、ＡＰキャリア粒子を自発的形成させ；
３）少なくとも１種の親水性活性成分ＡＰを粒子と会合させ；
４）必要に応じて、反応媒体を透析して構造体粒子の水性懸濁液を精製し；
５）必要に応じて、前記工程４の懸濁液を濃縮し；及び
６）前記粒子を含有する粉末固体を収集できるように液体媒体を除去する
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記工程１において、
１．１）疎水性アミノ酸ＡＡＯのアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）で形成されるモノマ間の共重合を実施し、この共重合が、次のものの存在下に実施される：
−少なくとも１種の非芳香性極性溶媒、好ましくはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＮＡｃ）及びピロリドンからなる群から選択される溶媒であって、ピロリドン、ＮＭＰがさらに特に好ましい；及び
−場合に応じて、少なくとも１種の、非プロトン性溶媒（好ましくは、１，４−ジオキサン）、及び／又はプロトン性溶媒（好ましくは、ピロリドン）、及び／又は水、及び／又はアルコールから選択される共溶媒であって、メタノールが特に好ましい；
１．２）少なくとも１種のポリアルキレングリコールＰＡＧ（好ましくは、ＰＥＧ又はＰＰＧ）ポリマーブロックを得るか又はアルキレングリコールモノマ（好ましくは、エチレン又はプロピレエングリコール）の重合により調製し、このＰＡＧブロックを、少なくとも１種の求核反応性基であって、好ましくはアミン（具体的には、１級又は２級アミン）、アルコール又はチオールを含む群から選択される求核反応性基により、（有利には、一端又は両端を）官能化する；並びに
１．３）前記工程２の官能化されたＰＡＧを、重合前、重合中又は重合後にポリ−ＡＡＯブロック重合媒体に添加する
ことを特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１２】
官能化されたＰＡＧブロックを重合前及び／又は重合開始時に導入し、好ましくはこれを標準大気圧において２０ないし１２０℃の温度で行う請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記請求項９の粉末固体及び／又は前記請求項１０の方法で得られた粉末固体が、ＡＡＯに対して非溶媒である水性媒体と接触させることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液調製方法。
【請求項１４】
請求項１０の方法の、工程１、２、３、４及び場合に応じて工程５を含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液調製方法。
【請求項１５】
親水性ＡＰを含有する液相を粒子のコロイド懸濁液と接触させることにより、前記親水性ＡＰを前記粒子に会合させることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液を調製する方法。
【請求項１６】
固体の状態にある前記ＡＰを粒子のコロイド懸濁液と接触させることにより、前記粒子を前記親水性ＡＰと会合させることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液を調製する方法。
【請求項１７】
前記請求項９の粉末固体及び／又は前記請求項１０の方法で得られた粉末固体を、前記親水性ＡＰを含む液相と接触させることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液を調製する方法。
【請求項１８】
前記請求項９の粉末固体及び／又は前記請求項１０の方法で得られた粉末固体を、固体の形態にある親水性ＡＰと接触させること、並びにこの固体混合物を液相、好ましくは水溶液に分散することを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液を調製する方法。
【請求項１９】
請求項１０又は１１の方法の中間体であって、前記中間体が、ＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯコポリマ、好ましくはＰＥＧ／ポリ−ＡＡＮＯコポリマであって、粒子の前駆体であるものからなることを特徴とする中間体。
【請求項２０】
請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液、及び／又は請求項１０ないし１８のいずれか１項の方法により得られた懸濁液、及び／又は請求項９の粉末固体であって、好ましくは次のものから選択される親水性活性成分を少なくとも１種含有する懸濁液：
・ワクチン；
・タンパク質及び／又はペプチドであって、中でも次のものがより好ましく選択される：ヘモグロビン、チトクロム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリスロポエチン、インシュリン、成長ホルモン、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子、インターロイキン又はこれらの混合物、及び造血刺激因子；
・多糖体であって、特にヘパリンが選択される；
・核酸、好ましくはＲＮＡ及び／又はＤＮＡオリゴヌクレオチド；
・様々な抗癌化学療法の範疇に属する非ペプチドタンパク質分子、特にアントラサイクリン及びトキソイド；及び
・これらの混合物
【請求項２１】
医薬、栄養、植物の健康又は化粧用の特許製品であって、前記製品が請求項１ないし８のいずれか１項の懸濁液、及び／又は請求項１０ないし１８のいずれか１項の方法により得られた懸濁液、及び／又は請求項９の粉末固体を含有することを特徴とする製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性成分（ＡＰ）の投与に有用な担体粒子（ＣＰ）の分野に関する。活性成分は、経口又は経鼻、経膣、経眼、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、非経口、又は他の経路で動物又はヒトの生体へ投与する薬物、又は栄養分であることが好ましい。しかし、これらは、化粧品、又は除草剤、農薬、殺虫剤、殺菌剤などの植物用薬品でもよい。これらの化学的性質の観点から、本発明がより具体的に関連するＡＰは、これらに限定されるものではないが、疎水性のものであり、例えば、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖体、リポ多糖、又はオリゴヌクレオチドである。
【０００２】
より正確には、本発明は、疎水性ポリアミノ酸及びポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）タイプ（好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タイプ）の親水性ポリマのブロックを基礎としたキャリア粒子（有利には、サブミクロンタイプ）のコロイド懸濁液に関する。
【０００３】
本発明は、裸の粒子自体、及び１以上のＡＰが載荷された（ｌｏａｄｅｄ）粒子からなる親水性ＡＰ（インスリン）のためのキャリアシステムの両者に関する。
【０００４】
さらに、本発明は、これらのＣＰを含む粉末状固体に関する。
【０００５】
さらに、本発明は、親水性ＡＰ（インスリン）を載荷された粒子の前記コロイド懸濁液を調製する方法に関する。
【０００６】
【従来の技術】
ＡＰをＣＰ中に封入又は吸着させる目的は、特に、これらの作用持続時間を加減し、及び／又は処置部位にこれらを運搬し、及び／又は前記ＡＰの生物学的利用能を増加させることである。多数の封入技術がすでに提案されている。このような技術の目的は、一方では、生体の攻撃（加水分解、酵素による消化など）からそれを保護しつつＡＰをその治療作用部位に輸送することを可能にし、他方で、生体が利用できる量を所望のレベルに維持するようにＡＰのその作用部位での放出を制御することである。生体内での輸送及び滞留のかかる変化に関与するＡＰは、例えば、タンパク質であるが、合成又は天然由来の有機分子とは全く異なる生成物である可能性もある。Ｍ．Ｊ．ＨＵＭＰＨＲＥＹ（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｄｒｕｇｓ、Ｓ．ＤＡＶＩＳ及びＬ．ＩＬＬＵＭ編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．１９８６）による総説では、ＡＰの生物学的利用能の改善に関連する問題、及びキャリアと制御放出システムの利点について考察している。
【０００７】
ＣＰを形成するために検討し得る全ての材料のうちで、ポリマはその固有の諸特性のためにますます広範に使用されている。ＣＰが獲得することが望ましい仕様書は、個々に要求が厳しく、特に以下の仕様（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含んでいる。
【０００８】
１　ＣＰに求められる第１の仕様は、ＣＰを構成するポリマが生体適合性であり、排除可能（排泄によって）及び／又は生分解可能であり、特に生体に無毒の産物に代謝されるということである。さらに、生体内での生分解は十分に短時間であるべきである。
【０００９】
２　有機溶剤及び／又は界面活性剤を使わずに、ＣＰが安定な水性懸濁液を形成することができれば有利であろう。
【００１０】
３　ＣＰが、液体懸濁液中で、細孔直径が０．２μｍ以下のフィルタを用いた滅菌濾過を行うことができる十分な小ささであることも望ましいであろう。
【００１１】
４　ＡＰを変質させない方法によってＣＰ及びＣＰ−ＡＰシステムが得られることが望ましい。
【００１２】
５　ＣＰは、有利には、ＡＰの放出速度の制御を可能にすべきである。
【００１３】
６　別の重要な仕様は、ＣＰ−ＡＰシステムが優れた注射用薬物を構成できることである。この注射投与（例えば静脈内又は筋肉内注射）に対する適合性の向上、すなわち「注射適性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）」は、
（ｉ）注射容量の減少（所与の治療量に対する）、及び
（ｉｉ）低粘度
によって特定される。この２つの特性は、治療量のＡＰが最少量のＣＰと結び付いたときに充足される。換言すれば、ＣＰのＡＰ載荷ファクタ（ｌｏａｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）は高くなければならない。
【００１４】
７　注射用製剤中のＣＰ固有のコストは低減されなければならず、ここでもまた、ＣＰは高いＡＰ載荷ファクタを持つべきである。実際、小径と高載荷ファクタがＣＰに求められる主要な仕様である。
【００１５】
８　ＣＰの構成ポリマが免疫応答を誘発しなければ、これもまた有利である。
【００１６】
９　親水性ＡＰ、具体的にはタンパク質、より具体的にはインスリンのファミリーに対して、ＣＰは、会合及び放出の容易性の観点並びに非変性の観点から、ＡＰのこのファミリーに適合するべきである。
【００１７】
以下に記述するこれまでの技術的な提案は、これらのすべての仕様を満たそうとしたものである。これまでの提案（ａ）〜（ｊ）を、説明のために示す。
【００１８】
（ａ）　米国特許第５　２８６　４９５号は、反対の電荷を有する材料、すなわちアルギネート（負に帯電）とポリリジン（正に帯電）を利用して、水相中のタンパク質を気化させて封入する方法に関する。この製造方法によって、約３５μｍを上回る大きさの粒子が生産される。
【００１９】
（ｂ）　また、ＡＰを載荷する微粒子の調製に、乳化技術が一般に使用される。例えば、国際出願第９１／０６２８６号、同９１／０６２８７号、及び同８９／０８４４９号は、ポリマ（例えば、ポリ乳酸型）を可溶化するために有機溶剤を用いるそのような乳化技術を開示している。しかし、その溶媒が、特にペプチド又はポリペプチドＡＰを変性させ得ることが判明した。
【００２０】
（ｃ）　プロテイノイド（ｐｒｏｔｅｉｎｏｉｄ）と称される生体適合性ＣＰも知られており、１９７０年以降、Ｘ．ＦＯＸ及びＫ．ＤＯＳＥによって「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｌｉｆｅ」（Ｍａｒｃｅｌ　ＤＥＫＫＥＲ　Ｉｎｃ．によって出版された（１９７７））に記載された。例えば、国際出願第８８／０１２１３号は、その溶解度がｐＨに依存する合成ポリペプチド混合物に基づく系を提案している。この発明によるマトリックス微粒子を得るために、発明者らはポリペプチド混合物を可溶化し、次いで、ｐＨ変化によってプロテイノイド粒子を沈殿させている。ＡＰの存在下で沈殿が起こると、ＡＰが粒子中に封入される。
【００２１】
（ｄ）　米国特許第４　３５１　３３７号は、本発明特有のＡＰ輸送分野とは異なる分野に関係するものであるが、関心のため引用する。この特許は、生体中の極めて特異的な場所に固定され、局在化された多数の移植片を開示している。これらの移植片は、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）モノマを共重合して得られるポリアミノ酸コポリマ、例えばポリ（グルタミン酸／ロイシン）又はポリ（グルタミン酸ベンジル／ロイシン）コポリマからなる、顕微鏡サイズ（１６０μｍ、長さ２０００μｍ）の管又は中空カプセルである。溶媒蒸発技術によって、ポリマとＡＰの混合物からＡＰを含有させる。米国特許第４　４５０　１５０号は、先に考察した米国特許第４　３５１　３３７号と同じ系統に属し、主題が本質的に同じある。成分ＰＡＡは、ポリ（グルタミン酸／グルタミン酸エチル）コポリマである。
【００２２】
（ｅ）　ＰＣＴ／ＦＲ特許出願ＷＯ　９７／０２８１０は、少なくとも部分的に結晶である生分解性ポリマ（乳酸ポリマ）の薄板状粒子複数及び前記粒子上に吸収（ａｂｓｏｒｂｅ）されたＡＰを含む活性成分の制御された放出のための組成物を開示している。この場合、活性成分は、脱着により放出される。
【００２３】
（ｆ）「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＬＥＴＴＥＲＳ　１９９５、７０７、ＡＫＩＹＯＳＨＩら」の刊行物は、コレステロールと接合することにより疎水性にした多糖類との超分子複合体によるインスリンの安定化に関する。
【００２４】
（ｇ）「ＭＡＣＲＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ　１９９７、３０、４０１３−４０１７」に公開される論文には、Ｌ−フェニル−アラニンを基礎としたポリペプチドブロック（ベンジル−Ｌ−グルタメート又はＯ−（テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｌ−セリン）、及び合成ブロック（例えば、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）又はポリ（２−フェニル−２−オキサゾリン））から構成される共重合体が記載されている。重合体は、水性媒体中で凝集し、酵素リパーゼと会合することができる４００ｎｍ粒子を形成する。ここで、「会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）」の用語は、タンパク質が物理的現象（共有結合ではない）により粒子上に吸着していることをいう。
【００２５】
（ｈ）ＰＣＴ特許出願ＷＯ　９６／２９９９１は、ＡＰ（特に、インスリンのような疎水性ＡＰを含む）を担持するために有用なポリアミノ酸の粒子に関する。これらの粒子は、１０ないし５００ｎｍのサイズを有する。ＷＯ　９６／２９９９１に従う粒子は、ＰＡＡが水性溶液と接触したとき、自発的に形成する。このＰＡＡは、疎水性中性アミノ酸モノマＡＡＯ及び親水性イオン化可能なモノマＡＡＩを含む。
【００２６】
これらの粒子は、インスリンに載荷可能であり、好ましくは、ＰＡＡの質量に基づいて、インスリンの乾燥質量の６．５％の量載荷可能である。Ｔａは、以下に記載する手順Ｍａにより測定される。
【００２７】
（ｉ）ＥＰ　５８３　９５５は、疎水性ＡＰを物理的に補足し得るポリマーミセルを開示している。これらのミセルは、ＰＥＧ／ポリ−ＡＡＮＯブロックコポリマから構成される（ＡＡＮＯ＝Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｅ　Ｎｅｕｔｒｅ　ｈｙｄｒｏｐｈＯｂｅ＝疎水性中性アミノ酸）。
【００２８】
ＡＡＮＯは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｂｚ−Ｏ−Ｇｌｕ又はＢｚ−Ｏ−Ａｓｐであり得、後者が好ましい。これらのＰＥＧ／ポリ−ＡＡＮＯミセルに捕獲された疎水性活性成分ＡＰは、例えば、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、インドメタシン、ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）及びミトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）である。
【００２９】
前記特許出願に提示される唯一の例は、ＰＥＧ／ポリＧｌｕ−Ｏ−Ｂｚを基礎とするミセルである。さて、これらのエステルＧｌｕ−Ｏ−Ｂｚは、水性媒体中で加水分解に対して安定ではない。さらに、この文献には、コアが疎水性中性ポリアミノ酸で形成されたＰＥＧ／ポリーＡＡＮＯブロックコポリマからなり、ＰＥＧを基礎とする親水性外格子を含む粒子であって、これらの粒子は、親水性ＡＰを会合し、インビボでそれらを放出し得る粒子に全く言及していない。
【００３０】
（ｉ）キャリアーナノ粒子であって、ＰＥＧ鎖が接合されたものも、既知であり、その例は、ポリラクチド又はリポソームのナノ粒子である。このＰＥＧ鎖でコートすることは、これらのＰＥＧにコートされたナノ粒子上のタンパク質（疎水性）の吸着を回避する有効な手段であることが当業者に知られている。そのようなナノ粒子又はリポソームを説明するために使用される用語は、「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」である。表面上にタンパク質が接合により吸着することをＰＥＧが回避させることは、非常に多くの論文に記載されている。例えば、Ｌ．Ｉｌｌｕｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７２、１０８６（１９８３）。「ステルスリポソーム」の説明は、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ、Ｆ．Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ、「ステルスリポソーム」、ＣＲＣ出版（ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ）１９９５；Ｍ．Ｃ．Ｗｏｏｄｌｅ、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ、「立体的に安定化されたリポソーム」、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１９９２、１１１３、１７１−１９９；Ｍ．Ｃ．Ｗｏｏｄｌｅ、「表面接合ポリマによるリポソーム血液クリアランスの制御」、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｒｉｖａｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１９９８、３２、１３９−１５２に見出すことができる。これらの質問の要約は、「ポリエチレングリコール塗布された生分解性ナノ球、Ｒ．Ｇｒｅｆら、「タンパク質及びワクチンの配達のためのミクロ粒子」、Ｓ．Ｃｏｈｅｎら、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　１９９６発行」にも見出すことができる。これらのステルスナノ粒子は、活性成分に載荷されることから回避されるので、これらの著者は、活性成分は、有機溶媒を使用する方法によりコア内に封入されることを推奨している。さて、このタイプの方法は、上に規定する仕様書の仕様２及び４に合致していない。
【００３１】
これら上述のこれまでの技術的提案、特に提案（ｉ）は、上記仕様書の仕様、特に、粒子の、親水性活性成分（インスリンのようなタンパク質）との会合、及び輸送により悪影響を及ぼされることなく親水性ＡＰを載荷するこれらの粒子を、インビボでＡＰを放出する能力、を不完全にしか満足しない。
【００３２】
【発明が解決しようとする課題】
これらの既成事実に対して、一つの本質的目的は、界面活性剤又は有機溶剤を利用せずに、ＣＰの安定水性懸濁液を自発的に形成する新規なＣＰを提供できることである。この目的は、親水性活性成分、好ましくはインスリンのようなタンパク質を載荷する粒子の懸濁液を得ることである。
【００３３】
本発明の別の本質的目的は、安定な水性コロイド懸濁液又は粉末状の、ポリアミノ酸（ＰＡＡ）に基づく新規なＣＰを提供することであって、これらの新規なＣＰは上述の仕様書の仕様１〜９に適合することが好ましい。
【００３４】
本発明の別の本質的目的は、ＰＣＴ特許出願ＥＰ　０　５８３　９５５号に開示されている粒子を改善することである。
【００３５】
本発明の別の本質的目的は、特にＡＰ載荷ファクタ及びＡＰ放出動力学の制御の点で、その特徴が完全に制御された新規なＣＰの懸濁液を提供することである。
【００３６】
本発明の別の本質的目的は、注射用薬用懸濁液を提供することである。このような懸濁液に必要な仕様は、注射用量が少ないことと、粘度が低いことである。治療効力を損なわないようにこれらの粒子によって輸送される活性成分ＡＰの量を制限することなく、治療的効果を損じないことが重要である。
【００３７】
本発明の別の本質的目的は、前述の仕様に適合する活性成分キャリア粒子を含み、ヒト又は動物への、例えば経口的な、投与に適した適切なガレヌス製剤（ｇａｌｅｎｉｃａｌ　ｆｏｒｍ）を構成する水性コロイド懸濁液又は粉末固体を提供することである。
【００３８】
本発明の別の本質的目的は、滅菌の目的で０．２μｍフィルターによって濾過できる活性成分キャリア粒子を含むコロイド懸濁液を提供することである。
【００３９】
本発明の別の本質的目的は、特に親水性活性成分（特にインスリンのようなタンパク質）のためのキャリアとして有用なＰＡＡ粒子（乾燥した又は液体懸濁液の）を調製する方法であって、簡単に実施でき、活性成分を変性させず、さらに得られる粒子の平均サイズを常に微調整することができる方法を提案することである。
【００４０】
本発明の別の本質的目的は、薬物（例えば、ワクチン）、特に経口、経鼻、経膣、経眼、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、又は非経口投与用薬物を調製するために、前述の粒子を使用することであり、特に、これらの薬物の親水性活性成分が、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖体、リポ多糖、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドである。
【００４１】
本発明の別の目的は、生産が容易且つ経済的であり、生体適合性でもあり且つＡＰの極めて高レベルの生物学的利用能を確保することもできる、活性成分の持続放出用システムからなるタイプの薬を提供することである。
【００４２】
（中でも）製品に関連した目的は、１以上の活性成分（ＡＰ）を保持するために特に使用することができるサブミクロン粒子のコロイド懸濁液にまず第一に関係する本発明によって達成され、これらの粒子は、
・次のものを含む両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）コポリマを基礎とし；
−α−ペプチド結合を有する疎水性線状ポリアミノ酸（ＰＡＡ）のブロック少なくとも１つであって、このＰＡＡブロックを構成する前記疎水性アミノ酸ＡＡＯが同一であるか又は異なるもの；及び
−ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）タイプの、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タイプの親水性ポリマのブロック少なくとも１つ；並びに
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１つのＡＰを会合することができ、且つ、特にインビボで、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができる
個別化された超分子配列であって、それが含有する粒子が、親水性ＡＰ、好ましくはタンパク質から選択される少なくとも１種のＡＰと会合しているか及び／又は会合し得、このＡＰは、特に好ましくはインスリンからなることを特徴とする。
【００４３】
【課題を解決するための手段】
安定な水性コロイド懸濁液又は粉末状固体の形のこれら新規キャリア粒子ＣＰの発明の主要な側面の一つは、界面活性剤又は溶媒の非存在下で安定なコロイド水性懸濁液を形成し、且つ親水性ＡＰに好適なサブミクロンサイズの粒子を得るための、親水性ポリマ／疎水性ポリアミノ酸ブロックコポリマの新規な選択に関する。
【００４４】
ポリアルキレングリコール親水性ポリマ／疎水性ポリアミノ酸ブロックコポリマを基礎とする粒子であって、疎水性活性成分を捕獲することが知られているもの（ＥＰ　０　５８３　９５５）が、親水性ＡＰ、特にインスリンのようなタンパク質と会合し得、且つインビボでそれらを放出し得ることは、特に驚くべき且つ予測し得ないことである。
【００４５】
さらに、親水性タンパク質の吸着を回避するためのＰＥＧの外側層の使用に精通していれば、対照的に、多量の親水性タンパク質を吸着すると言われているナノ粒子の思想を支持するこの溶液を当業者が破棄することは全く自然であろう。すべての予測に反して、本発明のフレームワーク内では全くそうではなかった。
【００４６】
ＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯブロックコポリマの構造及びアミノ酸ＡＡＯの性質は、次のように選択される：
・ポリマ鎖自体が小粒子（ＣＰ）に自発的に組織化する；
・前記粒子が水中及び生理的媒体中で安定なコロイド懸濁液を形成する；
・前記ＣＰが水性媒体中のタンパク質または他の親水性ＡＰと、タンパク質に対して変性しない自発的メカニズムにより会合する；及び
・前記ＣＰが、生理的媒体中、より正確には、インビボで親水性ＡＰを放出し、この放出動力学が、ＣＰの前駆体であるＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯコポリマの性質に依存する。
【００４７】
すなわち、コポリマの特異的構造を変更することにより、動力学及び量的観点から、ＡＰ会合及び放出減少を制御することが可能である。
【００４８】
好ましくは、ＰＡＧは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）に相当し、ＰＥＧが特に好ましい。
【００４９】
本発明の他の特徴によれば、ＰＡＧ−好ましくはＰＥＧは、重量平均分子量５００ないし５０，０００Ｄ、好ましくは１０００ないし１０，０００Ｄ、特に好ましくは１００ないし５０００Ｄを有する。
【００５０】
有利には、本発明の懸濁液は、キャリア粒子のインスリンとの載荷ファクタＴａにより特徴付けられ、Ｔａは、使用したインスリンの重量に対する載荷したインスリンの重量％により表され、手順Ｍａにより測定される。Ｔａは、
７≦Ｔａ、
好ましくは、８≦Ｔａ≦５０、
特に好ましくは、１０≦Ｔａ≦３０
である。
【００５１】
手順Ｍａ
（ａ）インスリンの水性溶液の調製：凍結乾燥ヒト組替えインスリン（シグマｎｏ．１０２５９）を０．１ＮのＨＣｌ溶液に５分かけて２５℃で注ぐ。次いで、この溶液をリン酸緩衝溶液に注ぎ、これを最終的に、０．１ＮのＮａＯＨの添加により中和する。引き続き、溶液を３０分間室温に放置し、次いで、０．８〜０．２μｍ「アクロディスク（ａｃｒｏｄｉｓｃ）（登録標章）」膜で濾過する。インスリンの重量は、６０ＩＵ／ｍｌの濃度になる溶液の所望の体積の関数として計算する。
【００５２】
（ｂ）インスリン溶液と会合すべきＰＡＡキャリア粒子の分散：前記凍結乾燥ＣＰを、前記インスリン溶液に１０ｍｇＣＰ／ｍｌ溶液の割合で添加する。この混合物をＶｏｒｔｅｘで２又は３回攪拌し、次いで振盪攪拌機内に室温で１８時間置く。次いで、前記コロイド懸濁液を４℃で保存する。
【００５３】
（ｃ）会合インスリンからの遊離インスリンの分離及び遊離インスリンのアッセイ：前記インスリン及びＣＰを含有する溶液を６０，０００ｇで１時間２０℃において遠心分離する。上清を限外濾過膜（分離閾値：１００，０００Ｄａ）を備えた試験管に移し、３０００ｇで２時間２０℃において遠心する。インスリン及び濾液は、ＨＰＬＣでアッセイする。
【００５４】
粒子を構成するコポリマのわずかに良い規定のために、交互配列タイプ（ブロック）のものであることが指摘される。
【００５５】
すなわち、本発明のＣＰの懸濁液の１つの好ましい態様において：
−ＡＡＯは、疎水性中性アミノ酸ＡＡＮＯであり、
−ＰＡＧ／ＡＡＮＯの割合は、＞１であり、及び
−ＰＥＧブロックの絶対長（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｌｅｎｇｔｈ）は、＞２モノマ、好ましくは＞１０モノマ、特に好ましくは＞２０モノマである。
【００５６】
有利には、ＡＡＮＯを基礎とするＰＡＡブロックは、少なくとも５の、好ましくは少なくとも１０の、特に好ましくは１０ないし５０のＡＡＮＯを含む。
【００５７】
さらにより好ましくは、粒子は、ＰＥＧ／ＡＡＮＯの「ジブロック（ｄｉ−ｂｌｏｃｋｓ）」である。
【００５８】
実用的には、これらの疎水性中性アミノ酸（ＡＡＮＯ）は、
・天然中性アミノ酸：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、それらの混合物、
・希少又は合成中性アミノ酸：ノルロイシン、ノルバリン、及び
・極性アミノ酸の誘導体：メチルグルタメート、エチルグルタメート、ベンジルアスパラテート、Ｎ−アセチルリシン
を含む群から選択される。
【００５９】
本発明の好ましい特性によれば、粒子を構成するブロックＰＡＡは、重合度ＤＰが３０〜６００、好ましくは５０〜２００、特に好ましくは６０〜１５０である。
【００６０】
本発明は、先に定義した裸の粒子の懸濁液だけでなく、少なくとも１つの活性成分ＡＰを含む粒子の懸濁液にも関する。本発明による懸濁液は、水性であり安定であることが好ましい。これらの粒子は、ＡＰを載荷していてもあるいはしていなくても、液体（懸濁液）、好ましくは水性液体中に分散した形態が有利であるが、先に定義したＣＰの懸濁液から得られる粉末状固体の形態でもよい。
【００６１】
このことから、本発明は、ＣＰのコロイ（好ましくは、水性）ド懸濁液だけでなく、本発明による懸濁液から得られるＣＰを含む粉末状固体にも関係することになる。
【００６２】
本発明の別の本質的な対象は、選択された粒子（上述した通り）の調製であって、コロイド懸濁液の形態又は粉末状固体の形態にあるものに関する。問題の調製方法は、前駆体ＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯコポリマを合成し、それらを構造化粒子に変換することから本質的になる。
【００６３】
より正確には、本調製方法は、まず第一に、上述した粉末固体であって、１以上の活性成分を保有するために特に使用することができるサブミクロン構造化粒子により構成される粒子の調製方法であって、これらの粒子は、
・次のものを含む両親媒性コポリマを基礎とし；
−α−ペプチド結合を有する疎水性線状ポリアミノ酸（ＰＡＡ）のブロック少なくとも１つであって、このＰＡＡブロックを構成する前記疎水性アミノ酸ＡＡＯが同一であるか又は異なるもの；及び
−ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）タイプの、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タイプの親水性ポリマのブロック少なくとも１つ；並びに
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１つのＡＰを会合することができ、且つ、特にインビボで、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができる
分離した超分子配列である。
【００６４】
この方法は、
１）少なくとも１のＰＡＧ切片を少なくとも１のＰＡＡ切片と反応させ、各々の切片は、それぞれ少なくとも１のアルキレングリコール又はアミノ酸モノマ、及び少なくとも１のＰＡＡ−ＰＡＧ結合（好ましくは、アミド結合）の形成のための反応性基を少なくとも１含み、ＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯブロックコポリマを得；
２）工程１で得た前記ＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯブロックコポリマを、好ましくは水中に沈殿させ、ＡＰキャリア粒子を自発的形成させ；
３）少なくとも１の親水性活性成分ＡＰを粒子と会合させ；
４）必要に応じて、反応媒体（ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ）を透析して構造体粒子の水性懸濁液を精製し；
５）必要に応じて、この工程４の懸濁液を濃縮し；
６）粒子を含有する粉末固体を収集できるように液体媒体を除去する
ことを特徴とする。
【００６５】
工程１のＰＡＧ及びＰＡＡ切片の官能基は、アミン又はカルボン酸基であり得る。ＰＡＧ及び／又はＰＡＡブロックに導く重合を、ＰＡＧ−ＰＡＡ結合の形成前、形成中又は形成後に実施することを予想することができる。
【００６６】
すべてのこれらの変形は、当業者の範囲内にある。
【００６７】
好ましくは、工程１において、
１．１）疎水性アミノ酸ＡＡＯのアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）で形成されるモノマ間の共重合を実施し、この共重合が、次のものの存在下に実施される：
−少なくとも１の非芳香性極性溶媒、好ましくはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＮＡｃ）及びピロリドンからなる群から選択される溶媒であって、ピロリドン、ＮＭＰがさらに特に好ましい；及び
−場合に応じて、少なくとも１の共溶媒であって、非プロトン性溶媒（好ましくは、１，４−ジオキサン）から選択される、及び／又はプロトン性溶媒（好ましくは、ピロリドン）、及び／又は水、及び／又はアルコール（メタノールが特に好ましい）から選択されるもの；
１．２）少なくとも１のポリアルキレングリコールＰＡＧ（好ましくは、ＰＥＧ又はＰＰＧ）ポリマーブロックを得るか（ｔａｋｅｎ）又はアルキレングリコールモノマ（好ましくは、エチレン又はプロピレエングリコール）の重合により調製し、このＰＡＧブロックを、少なくとも１の求核反応性基により（有利には、一端又は両端を）官能化し、前記求核反応性官能基が、好ましくは、アミン（具体的には、１級又は２級アミン）、アルコール又はチオールを含む群から選択される；並びに
１．３）工程２の官能化されたＰＡＧを、重合前、重合中又は重合後にポリ−ＡＡＯブロック重合媒体に添加する。
【００６８】
この方法の工程１．１は、α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を重合する既知の技術を基礎としており、例えば、「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１５、１８６９（１９７６）」の論文、及び「α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物及び関連するヘテロ環」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）、と題されるＨ．Ｒ．ＫＲＩＣＨＥＬＤＯＲＦの業績中に説明されている。
【００６９】
一つの変形例において、工程１．１の後に、得られたポリ（ＡＡＯ／ｐＡＡＩ）コポリマを、（好ましくは水中で）沈殿させ、この沈殿を回収する。この変形例は、ポリ（ＡＡＯ／ｐＡＡＩ）コポリマを安定な中間体を構成する沈殿の形態で分離する粒子の調製のバッチ様式に対応する。この沈殿は、例えば、濾過、洗浄及び乾燥することができる。
【００７０】
特に好ましくは、ＮＣＡ−ｐＡＡＩは、Ｏ−アルキル化グルタミン酸又はアスパラギン酸のＮＣＡ、例えば、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｍｅ、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｅｔ又はＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｂｚ（Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチル）である。
【００７１】
好ましくは、官能化されたＰＡＧブロックを重合前及び／又は重合開始時に導入し、重合は標準大気圧において２０ないし１２０℃の温度において行う。
【００７２】
有利には、工程１．２のＰＡＧは、商業的に入手可能な製品（例えば、ＰＥＧ）であるか、又はそれ自体は既知のエチレンオキシドの重合方法により得られる。
【００７３】
ポリマ濃度、反応混合物の温度、親水性ポリマの添加方法、減圧の使用、反応時間等のような他のパラメータは、当業者に周知の所望の作用に従い調節する。
【００７４】
１以上のＡＰの粒子との会合（工程３）は、数個の本発明の方法を用いることにより行うことができる。これらの方法の例を以下に列挙するが、本発明を限定するものではない。
【００７５】
第一の方法によれば、ＡＰを含有する液相（水性又は非水性）を粒子のコロイド懸濁液と接触させることにより、ＡＰを粒子に会合させる。
【００７６】
第二の方法によれば、固体の状態にあるＡＰを粒子のコロイド懸濁液と接触させることにより、粒子をＡＰと会合させる。固体ＡＰは、例えば、凍結乾燥、沈殿又は粉体又はその他の形態にあることができる。
【００７７】
第三の方法によれば、生成物として及びその調製特性により上述した粉末固体（ＰＡＡ）を、ＡＰを含有する液相（水性又は非水）と接触させる。
【００７８】
第四の方法によれば、生成物として及びその調製特性により上述した粉末固体（ＰＡＡ）を、固体の形態にあるＡＰと接触させる。次いで、この固体混合物を液相、好ましくは水溶液中で分散する。
【００７９】
これらすべての方法において、使用するＡＰは、純粋な形態又は予備処方された（ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）形態であり得る。
【００８０】
任意の工程５によれば、例えば、ダイアフィルトレーション（透析）（工程４）、濾過、ｐＨ修飾、クロマトグラフィーのような適切な物理的分離手段により不純物（塩）及び溶媒を除去する。
【００８１】
これにより、構造化粒子の水性懸濁液が得られ、これは、例えば蒸留又は限外濾過若しくは遠心のような他の好適な物理的手段により濃縮することができる。
【００８２】
粒子を濃縮（工程６）又は粒子をその液体懸濁液媒体から分離（工程７）するために、必要に応じて、例えば、蒸留、乾燥（例えば、乾燥機）、凍結乾燥又は限外濾過若しくは遠心のような他の適切な物理的分離手段により、液相を除去する。白色粉末固体がこの工程７の終了時に回収される。
【００８３】
上記方法の工程１、２、３、４及び場合に応じて工程５の実施は、高親水性ＡＰ載荷ファクタを有するサブミクロン粒子のコロイド懸濁液の調製に対応することを指摘する。
【００８４】
このコロイド懸濁液の調製において、工程１のＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯ両親媒性コポリマを水性媒体中に置く。水性媒体において、ＰＡＧの少なくとも一部分及びＡＡＮＯの少なくとも一部分は、不溶性である。ＰＡＧ／ポリ−ＡＡＮＯコポリマは、この水性媒体中において、ナノ粒子の形態で存在する。
【００８５】
本発明のＣＰの懸濁液の代替の調製方法には、生成物として及びその調製特性により上述した粉末固体を、ＡＡＮＯのための溶媒ではない（ｎｏｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ）水性媒体と接触させることが含まれる。
【００８６】
粒子がナノメータサイズであるが故に、懸濁液は、滅菌フィルタ上で濾過することができ、滅菌注射可能な医薬液を容易且つ低コストで入手することを可能にする。本発明により可能になった粒子サイズを制御し且つＤｈ値２５ないし１００ｎｍに到達する能力は、重要な利点である。
【００８７】
本発明は、粒子前駆体であるＰＡＧ／ポリ−ＡＡＯからなることを特徴とする、上述した方法の新規な中間体にも関する。
【００８８】
別の特徴によれば、本発明は、上で規定した及び／又は上述した方法により得られた懸濁液及び／又は粉末固体に関し、この懸濁液及びこの固体には、次のものから選択される親水性活性成分少なくとも１が含まれる：
・ワクチン；
・タンパク質及び／又はペプチド（中でも次のものがより好ましく選択される：ヘモグロビン、チトクロム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリスロポエチン、インシュリン、成長ホルモン、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子、インターロイキン又はこれらの混合物、及び造血刺激因子）；
・多糖体（特にヘパリンが選択される）；
・核酸、好ましくはＲＮＡ及び／又はＤＮＡオリゴヌクレオチド；
・様々な抗癌化学療法の範疇に属する非ペプチドタンパク質分子、特にアントラサイクリン及びトキソイド（ｔａｘｏｉｄｓ）；及び
・これらの混合物。
【００８９】
最後に、本発明は、栄養、植物の健康又は化粧用特許製品（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ　ｐｒｏｄｕｃｔ）であって、親水性ＡＰを載荷した、上で規定した懸濁液及び／又は粉末状固体を含むことを特徴とするものに関する。
【００９０】
本発明の別の対象によれば、本発明は、さらに、ＡＰの制御放出用システムからなるタイプの薬物を製造するための、ＡＰを載荷するこれらのＣＰ（懸濁液又は固体状の形態にある）の使用に関する。
【００９１】
薬物の例は、経口、経鼻、経膣、経眼、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、又は非経口経路によって好ましくは投与することができるものである。
【００９２】
考えられる化粧用途の例は、本発明に従ってＣＰに会合されたＡＰを含み、且つ経皮的に投与される組成物である。
【００９３】
以下の実施例により、本発明が、その様々な製品／方法／用途の特徴に従って、よりよく理解されるであろう。これらの実施例は、活性成分を担持していてもいなくともよいポリアミノ酸粒子の調製法を説明するものであり、構造上の特性及びこれらの粒子の性質も提示するものである。
【００９４】
実施例
例１　ポリ（ロイシン／エチレングリコール）ブロックコポリマの調製
ＮＣＡをブロック又はランダムな構造のポリマに重合するのに使用される技術は、当業者には周知であり、「α−Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）と題するＨ．Ｒ．ＫＲＩＣＨＥＬＤＯＲＦの著書に詳述されている。そのような１つのポリマの合成を以下に具体的に示す。
【００９５】
ポリ（Ｌｅｕ）４０−ＰＥＧの合成：１０ｇのＮＣＡ−Ｌｅｕを、１５０ｍｌのＮＭＰに、６０℃で溶解させる。ＮＭＰ５０ｍｌ中のアミノエチル−ＰＥＧ（Ｍｗ＝５０００Ｄ）２ｇの溶液５ｍｌを、全量一度にモノマに添加する。２時間後、反応媒体を１ｌの水に注ぐ。形成した沈殿を濾過し、洗浄及び乾燥する。収量＞９５％。
【００９６】
例２　ポリ（フェニルアラニン・エチレングリコール）ブロックコポリマの調製
ポリ（Ｐｈｅ）４０−ＰＥＧの合成：１０ｇのＮＣＡ−Ｐｈｅを、１５０ｍｌのＮＭＰに、６０℃で溶解させる。ＮＭＰ５０ｍｌ中のアミノエチル−ＰＥＧ（Ｍｗ＝５０００Ｄ）２ｇの溶液５ｍｌを、全量一度にモノマに添加する。２時間後、反応媒体を１ｌの水に注ぐ。形成した沈殿を濾過し、洗浄及び乾燥する。収量＞９５％。
【００９７】
例３　光散乱（ＬＳ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるナノ粒子の証明　ポリマ１の粒子１０ｍｇを、１０ｍｌの水又は塩の水溶液に懸濁させる。次いで、Ｃｏｕｌｔｅｒ粒度分析計（又はレーザー回折計）にこの溶液を導入する。試験した様々な生成物の粒径分析の結果を下記表１に示す。
【００９８】
【表１】
2004510729.tif 000002
【００９９】
例４　ナノ粒子とタンパク質（インシュリン）との会合試験
ｐＨ７．４の等張性リン酸緩衝液を用いて、ヒトインシュリンを１．４ｍｇ／ｍｌ（４０ＩＵ／ｍｌ相当）含む溶液を調製する。例１で調製したＣＰ１０ｍｇを、このインシュリン溶液１ｍｌ中に分散する。室温で１５時間インキュベーションした後、ＣＰと会合したインシュリンと遊離のインシュリンとを遠心分離（６０，０００ｇ、１時間）及び限外濾過（濾過閾値：３００，０００Ｄ）により分離する。濾液から回収した遊離のインシュリンをＨＰＬＣ又はＥＬＩＳＡでアッセイし、会合しているインシュリンを差から推算する。ＣＰと会合しているインシュリンの量は０．７７ｍｇを超え、用いた全インシュリンの５５％を超える。
【０１００】
下記の表は、異なるＣＰについて実施した会合度の測定結果をまとめたものである。会合度は、１．４ｍｇ／ｍｌのインシュリンと１０ｍｇ／ｍｌのＣＰを含有する調製物中に使用されたインシュリンに対する会合したインシュリンの百分率で表される。この値を、タンパク質が１００％結合した状態の処方を表す載荷ファクタ（ＣＰ１００ｍｇ当たりのインシュリンのｍｇ）に変換する。
【０１０１】
【表２】
2004510729.tif 000003
【０１０２】
例５　絶食した健康なイヌにおけるインシュリン載荷ＣＰの薬物動態学及び薬力学
この例のプロトコールは、以下のとおりである。
【０１０３】
例４の調製物を、膵全摘術により糖尿病性を付与し、前夜から絶食中のイヌに注射した。午前１１時に、動物の生体重ｋｇ当たりインシュリン０．５ＩＵの用量で、この調製物を胸郭中に皮下投与した。投与容積は、０．１８〜０．２４ｍｌである。−４、−２、０、１、２、４、６、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４及び４８時に、減圧下、頚静脈穿刺によりヘパリンナトリウム管中に１ｍｌの血液を採取する。３０μｌの全血を即時に使用して血糖を測定する。次いで、この管を遠心し、上清をデカントし、インシュリンをアッセイするために血漿を−２０℃で貯蔵する。以下の図１の結果から、インシュリンが注射後１２時間まで放出され（実線）、実質的な血糖降下効果が注射後２０時間まで持続する（破線）ことが分かる。
【０１０４】
【表３】
2004510729.tif 000004
【０１０５】
この例から、本発明によるＣＰの存在下で、インシュリンが変性されないことが示される。
【０１０６】
また、処方されていないインシュリンと比較して、インシュリンの作用持続時間が増加し、したがって、インシュリンの制御放出用システムとしてのＣＰの有用性も実証されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０．５ＩＵ／ｋｇの割合にインスリンを載荷されたＣＰの処方を注射した後の、血糖Ｇの変化［・・−○・・−］（ベースレベルに対する平均％）及び平均インスリン血糖（ｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ）Ｉ（ｍｌＵ／ｌ）の変化「−・−」を、時間Ｔ（時間）の関数として示すグラフである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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