(57)【要約】本発明は、反射主表面を有する基体を含むバイオチップに関するものである。本発明のバイオチップは、主表面が厚み（２ｋ＋１）λ／４（ｋは正または０の整数であり、λは蛍光が励起される波長λ0〜蛍光が発光される波長λ1の間に含まれる波長を表わす）の透明層にて蛍光検出に対して感受性を有するようにされている領域を提供することを特徴とする。上記バイオチップを、基体上に厚みｍλ′／２の透明層を付着させ、そして感受性を有する領域を形成するために、上記層に厚み（２ｋ＋１）λ／４のピットまたはバンプを形成することで製造することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反射主表面を示す基体からなり、前記主表面（６）が、光学的な厚み（２ｋ＋１）λ／４（ｋは正または０の整数であり、λは蛍光が励起される波長λ0〜蛍光が発光される波長λ1の範囲にある波長を表わす）を有する透明層によって蛍光検出に対して感受性を有するようにされた局所部位（５）を示すことを特徴とするバイオチップ。
【請求項２】
蛍光検出に対して感受性を有するようにされている部位（５）を覆う前記透明層が、（２ｋ＋１）λ1／４（ｋは、正または０の整数）に等しい光学的な厚みを有することを特徴とする請求項１によるバイオチップ。
【請求項３】
感受性を有する部位（５）の外部で、主表面（６）が、厚みｍλ′／２（ｍは正または０の整数であり、λ′はλ0〜λ1の範囲にある波長を表わす）の透明層で覆われていることを特徴とする請求項１または請求項２によるバイオチップ。
【請求項４】
感受性を有する部位の外部で、主表面（６）が、厚みｍλ0／２の透明層で覆われていることを特徴とする請求項３によるバイオチップ。
【請求項５】
感受性を有する部位（５）の外部で、基体（１）の表面（６）が、薄層（２２）、特に第一の物質の分子の単層で覆われており、その第一の物質は、一端で共有結合を物質で作らせるようにするシランまたはシラノールのような捕捉保持基を有し、他端で安定した不活性な化学官能基、例えばＣＨ3およびそのハロゲン化誘導体を有する（ＣＨ2）ｐ（１＜ｐ＜３０）タイプの炭化水素鎖からなることを特徴とする先のいずれかの請求項による方法。
【請求項６】
第一の物質が、疎水性のシランであることを特徴とする請求項５によるバイオチップ。
【請求項７】
感受性を有する部位（５）が、薄層（２３）、特に第二の物質の分子の単層で覆われており、その第二の物質は、例えばシラン官能基またはシラノール官能基のような、共有結合で基体に固定させるのに適した基を一端で示し、そして、例えば酸ＣＯＯＨ官能基またはアルコールＯＨ官能基を示す基のような共有結合でプローブ分子に固定させるのに適した基を他端で示すことを特徴とする先のいずれかの請求項によるバイオチップ。
【請求項８】
前記第二の物質が、疎水性のシランであることを特徴とする請求項７によるバイオチップ。
【請求項９】
基体の表面が、前記第二の物質Ｂの層で覆われ、そして感受性を有する部位の外部（５）で、前記第二の物質Ｂの前記層が停止物質Ｃで覆われていることを特徴とする先にいずれかの請求項によるバイオチップ。
【請求項１０】
以下の工程、
ａ）厚みｍλ′／２の透明層（１０）を基体（１）上に付着させ、そして
ｂ）前記感受性を有する部位を形成するように、透明層の厚みが（２ｋ＋１）λ／４に等しい前記透明層内で、ウエルまたはスタッド（５）を作製する、
を行うことを特徴とする先のいずれかの請求項によるバイオチップを製造する方法。
【請求項１１】
以下の工程：
ｃ）選択的な転写にて、第一の物質Ａの前記薄層（２２）を付着させ、そして
ｄ）基体を、前記第二の物質Ｂを含む溶液に浸漬させる、
を行うことを特徴とする先のいずれかの請求項による方法。
【請求項１２】
工程ｃ）および／またはｄ）が、共有結合の形成を容易にさせるために、続いて熱処理することを特徴とする請求項１１による方法。
【請求項１３】
工程ｂ）の後、以下の工程、
ｅ）前記第二の物質Ｂの薄層（３０）を、基体（１）の全表面（６）にわたって付着させ、そして
ｆ）前記感受性を有する領域（５）の外部で、停止物質Ｃの層３１を付着させる、
を行うことを特徴とする請求項１０による方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的または生化学的なプローブを蛍光にて検出するタイプのバイオチップに関するものであり、また本発明はその製造方法に関する。
【発明の開示】
【０００２】
バイオチップは、分子生物学に関連する分野において、非常に高性能な解析ツールである。それらを製造する技術は、確立されつつあるプロセスである。それらの使用は、研究を加速させることができ、そして特に新規な診断技術につながるであろう。
【０００３】
バイオチップは、生物学的な分子のような生物学的な認識物質の一組のシステムであり、全てを並行して操作する。バイオチップの中で、これまでで最も広く発展したものは、ＤＮＡチップであり、分子遺伝学の分野において、それらは認識の成果を大いに高めさせるという大いなる望みがある。
【０００４】
物理的に、バイオチップは、一般に微細な寸法で、その上に配置されている個々の領域を有し、共通の生物学的な認識プローブ物質を支持している固形支持体にて構成されている構造であり、各々の領域または部位は生物学的または生化学的な起源であってもよい単一型の物質を有している。認識は、支持体上に固定されるプローブ物質と、分析される溶液中に含まれる標的物質との間での特異的な親和性相互作用にて行われる。バイオチップは、マーカー、一般に蛍光マーカーを使って標的物質をマークすることで読み取られる。認識を通して、標的物質は、プローブ物質を支持する領域に対するそのマーカーを持っている。プローブの特性を知ることは、親和性反応が起こった標的物質を識別することを可能にする。
【０００５】
本発明は、第一にバイオチップの技術的な品質を改善し、そして第二に蛍光を読み取ることができる品質を改善させようとすることである。
【０００６】
バイオチップを作製するために、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ鎖のような分子を支持体上に固定させるのに、固体表面で起こる化学反応に依存している。通常、固定するためのプローブの生物学的な分子は、溶液中に存在する。支持体、および固定されるプローブを含む溶液の相対的な表面特性に依存して、付着（deposit）される溶液は、基質上に広がる傾向があり、制御されたサイズで、小さな寸法の問題の領域を得ることを不可能にしている。
【０００７】
同様に、オリゴヌクレオチドのような生物学的な分子の直接的で局所的な合成は、試薬、特にホスホロアミダイトの一部を基質表面に局所的に付着させることで実行できる。これら様々な試薬は、一般に、アセトニトリルのような溶媒での溶液中で存在する。この溶媒は、必要な予防策を講じなければ、表面にわたって試薬が広がるようになることを意味する高湿潤性という特性を有する。つまり、これらの特性は、合成が制御されて行われる領域を妨げ、その結果、問題の領域が幾何学的に画定されるのを妨げる。
【０００８】
加えて、分析は、バイオチップを、接触前後に蛍光群（またはできうることならば、それらは、放射性法でマークされている）でマークされる標的分子を含む溶液と接触させることで行われる。認識は、プローブと分析物との間の相対的に強い生化学的な結合（例えば、水素結合を形成することによる）の結果である。つまり、分析物を、認識領域上に固定し、前記領域または部位に、結合または固定されるプローブの識別をすることで同定することができる。
この特異的な認識と平行して、支持体の特性に依存して標的分子を、（一般に、吸着プロセスにて）その上に、非−選択的な方法で固定させることもできる。この付随的な現象は、読み取り時に、ノイズに対するシグナルの比率を減少させる効果を有する。
【０００９】
本発明の対象は、チップの生物学的な品質を改善させるために、その光学的な品質に作用して、これら課題に対する解決法を提供することである。
加えて、有利な変形において、局所的な二重機能化（double functionalization）によるチップの物理化学的な品質における改善が、生物学的なプローブ分子を支持する部位を幾何学的により十分に画定させ、一方部位の全てがサイズおよび配列において同一なことを確かなものにし、および標的分子の非−選択的な吸着をかなり減少させる。
【００１０】
その結果、反射主表面を示す基体からなり、前記主表面が、光学的な厚み（２ｋ＋１）λ／４（ｋは正または０の整数であり、λは蛍光が励起される波長λ0〜蛍光が発光される波長λ1の範囲にある波長を表わす）を有する透明層（transparent layer）によって蛍光検出に対して感受性を有するようにされている局所部位を示すことを特徴とするバイオチップを、本発明は提供する。用語「光学的な厚み」は、実際の物理的な厚みに、透明層の屈折率を掛けた積を意味するのに使用される。
バイオチップは、主表面が、（２ｋ＋１）λ1／４（ｋは、正または０の整数）に等しい光学的な厚みの透明層によって蛍光検出に対して感受性を有するようにされ、その結果、蛍光の発光を増強させる部位を示すことを特徴としていてもよい。
【００１１】
バイオチップは、感受性を有する部位の外部で、主表面が厚みｍλ′／２（ｍは正または０の整数であり、λ′はλ0〜λ1の範囲にある波長を表わす）の透明層で覆われていることを特徴としていてもよい。
好ましくは、感受性を有する部位の外部で、主表面は、厚みｍλ0／２の透明層で覆われており、それゆえ蛍光が励起されるのを妨げる。
局所的なシラン化を利用した有利な実施の形態において、バイオチップは、感受性を有する部位の外部で、基体の表面が、第一の薄層、特に第一の物質Ａの分子の単層で覆われており、その第一の物質は、一端で共有結合を形成させるようにするシランまたはシラノールのような基を有し、他端で安定した不活性な化学官能基、例えばＣＨ3およびそのハロゲン化誘導体を有する（ＣＨ2）ｐ（１＜ｐ＜３０）タイプの炭化水素鎖からなることを特徴とする。前記第一の物質は疎水性である。
【００１２】
好ましい実施の形態において、バイオチップは、感受性を有する部位が、第二の薄層、特に第二の物質Ｂの分子の単層で覆われており、その第二の物質は、共有結合で基体に固定させるのに適した基、例えばシラン官能基またはシラノール官能基を一端で示し、そして共有結合でプローブ分子に固定させるに適した基、例えば酸ＣＯＯＨ官能基またはアルコールＯＨ官能基を示す基を他端で示すことを特徴とする。
前記第二の物質は疎水性である。
バイオチップは、基体の表面が、前記物質Ｂの層で覆われ、そして感受性を有する部位の外部で、前記層が停止層Ｃで覆われていることを特徴としていてもよい。
【００１３】
本発明は、また、以下の工程：
ａ）厚みｍλ′／２の透明層を基体上に付着させ、そして
ｂ）前記感受性を有する部位を形成するように、透明層の厚みが（２ｋ＋１）λ／４に等しい前記透明層内で、ウエルまたはスタッドを作製する
を行うことを特徴とする前記のようなバイオチップを製造する方法を提供する。
ｋおよびｍの値に従って、ウエルまたはスタッドの形態にある感受性を有する部位を作製することができる。
【００１４】
感受性を有する領域がウエルである場合、その方法は、以下の工程：
ｃ）続いて任意に熱処理を行う前記第一の薄層の選択的な付着による、局在化二重シラン化（double silanization）、そして
ｄ）第二の物質Ｂを含む溶液への基体の浸漬、
を行うことが特徴といえる。
【００１５】
感受性を有する領域がスタッドである場合、方法は、以下の工程：
ｃ′）続いて任意に熱処理を行うスタッド上の物質Ｂの選択的な付着による、局在化二重シラン化、
そして
ｄ）支持体を、物質Ａを含む溶液に浸漬させる
を行うことを特徴とする。
別の実施の形態において、局所化二重シラン化は、（ｂの後）次のように：
ｅ）物質Ｂの層を、例えば物質Ｂを含む溶液に浸漬させることで、基体の全表面にわたって付着させる、
ことで行う。そして、プローブ物質を固定させる官能基が脱保護されおよび活性化される。
【００１６】
ｆ）そして、停止物質Ｃの分子の単層を、感受性を有する領域５を露出して残す方法で、表面に局所的に付着させる。物質Ｃの分子は、物質Ｂの活性化された官能基と反応する官能基を末端に有する。分子の他端は、メチル基、または実際にフッ素置換されたメチル基のような化学的に非常に不活性な基を有する。つまり、活性化された感受性を有する領域のみがプローブ物質を固定するのに適しており、感受性を有する領域の外表面は生物学的な物質を捉えるのに対して結果的に不活性にされる。
【００１７】
物質Ｃの分子の官能基の間で、（ＣＨ2）ｑ（０＜ｑ＜３０）タイプの脂肪鎖のような有機鎖が存在していてもよい。
官能化層は、１ナノメータ（ｎｍ）〜１０ｎｍのオーダーの厚みを有し、それゆえ透明層と比べて無視できる光学的な厚みを有し、従ってバイオチップの光学的な特性に直接の作用をしないことを観察することが重要である。
任意には、工程ｃ）および／またはｄ）、および／またはｅ）、および／またはｆ）、および／またはｇ）、および／またはｈ）は、シラン化を容易にするために、熱処理を伴ってもよい。
【００１８】
本発明の別の特性および利点は、図１ａ〜１ｅが製造方法の第一の実施の形態を示した付随的な記載を引用して得られる続く記載をよく表すであろう。好ましい実施の形態を、図１ａ〜１ｄおよび図２ａ〜２ｃで示す。変形を図３に示す。
アメリカ特許第6 008 892号は、薄いプレートの光学的な特性を利用した構造を記載している。反射する（または部分的に反射する）基体上に、１／４波長または１／４波長の奇数倍に等しい光学的な厚みの透明層を置いた場合、この波長で発光する蛍光源で発した光は、最大となる。その方法で、基体の全表面を、蛍光の発光が増加するように均一に処理する。その結果、生物物質が感受性を有する領域の外部で吸収させるための寄生蛍光（parasitic fluorescence）は、活性領域における蛍光と同様な方法で改善されるが、それによって感受性を有する領域と感受性を有さない領域との間のノイズに対するシグナルの比率は改善されない。
【００１９】
基体の透明層の厚みを構築し、それによって感受性を有する領域の蛍光を改善させ、一方で感受性を有する領域の外部で蛍光を抑制することで、本発明は、それらの欠点を是正する。
本発明で、最適化された構造は、読み取り波長で反射する基体１の表面６上に付着される透明物質、例えばシリコン基体上でのシリカあるいはシリコンニトライドの層１０、または金属基体上で金属酸化物の層、例えばチタン上でのＴｉＯ2、ジルコニウム上でのＺｒＯ2の層などで作られる光学的な厚みλ／２（または一般にｍλ／２以上）を有する層１０から作られる（図１ａ）。感光性樹脂の薄膜７をこの層１０上に付着させる（図１ｂ）。この樹脂を、現像した後、チップ上に感受性を有する部位を形成するように働く開口４を樹脂２内で開口させるマスク３を介して露光する（図１ｃ）。そしてチップの感受性を有する部位を構築するウエル５を形成するために、局所領域１２で、（２ｋ＋１）λ／４に等しい薄膜（図１ｄ）について光学的な厚みに達するようにケミカルエッチングを行う。
【００２０】
好ましくは、感受性を有する部位における蛍光の発光は、（２ｋ＋１）λ1／４の光学的な厚みの透明層を選択することで増強される。蛍光の励起は、ｍλ0／２の光学的な厚みを有する透明層を選択することで、感受性を有する部位の外部で優先的に増強される。
樹脂２を除去した後、末端に生物学的な分子を固定するのに適した官能基を有するシラン１５の薄膜を、有利にはウエル５に付着させる（図１ｅ）。そして、構築物を、シラン化を増強させるために、温度を上げる。この薄層（一般には単一分子）の厚みは、構築物の光学的な特性を著しく変化させることはない。
【００２１】
その後、プローブの生物学的な分子を、種々の感受性を有する部位上に、その場以外またはその場での手法で固定する。最後に、層のフリーな最表面を、前述した段階の間で反応しなかった活性官能基を効果的に中和させる温度に付す。しかしながら、付着液があふれ、分子が感受性を有する領域の外部で固定されるようになる場合、その結果、例えば感受性を有する領域の外部で、蛍光シグナルが約２００の因子（factor）によって、感受性を有する領域内から発生するシグナルよりも弱められ、多くの場合、そのことは読み取りに影響を及ぼさない。
つまり、ウエルの内部と外部との間の光学的な経路の違いは、ウエル外部で蛍光シグナルを最小限にし、ウエル内部で蛍光シグナルを最大限にすることで蛍光を読み取る場合に、ノイズに対するシグナルの比率を改善させる。
【００２２】
基体の光学的な品質と物理化学的な品質との両方を同時に改善することで、バイオチップのいずれも改善することができる。
基体を、前記のように層に感受性を有する部位を作製するためにケミカルエッチングにてミクロ機械加工する（図１ａ〜１ｄ）。そして、転写操作を行う。
【００２３】
ケミカルエッチングおよび樹脂を除去した後（図１ｄ）、チップを、その上で付着されるＡタイプの物質、例えば疎水性シランを含む溶媒の薄い層２１を有する転写表面３０と接触させる（図２ａ）。その結果、疎水性シランは、薄層２２を形成するために、チップの最表面上に転写される（図２ｂ）。シランは、シラン含有溶液を使ったインキ付け装置でも、付着されうる。熱処理は、チップの表面上で起こるシラン化を促進する。第二のシラン化工程は、例えば第二のシランを含む溶液にチップを浸漬させることで着手され、そして最初に露出したウエルの底部上で、薄層２３をシラン化に供する（第二のシランは、第一に固定されない）（図２ｃ）。特定の第二のシランは、そのフリーな末端に、それ自体公知であり、その場に該生物学的な物質を保持するために、生物学的な物質と共有結合を行うか、またはプローブの生物学的な分子の、現場での合成を開始させることを可能にするある種の官能基を有する。この開始反応は、共有結合を確立することとも対応する。
【００２４】
薄層２２および２３（分子の二、三の層以下）の厚みは、表面の光学特性を有意に修飾するのに十分ではなく、従って２つの技術によって得られる選択的な特性を組み合わせる。
つまり、その方法は、物理化学的な制限を利用している。それは、感受性を有する部位の間での領域で、疎水性の単層を形成する分子を付着させるマイクロ転写を局所的に用いることによって、疎水特性のプローブを受容するであろう領域を区別する。つまり、感受性を有する部位の内部は、予め合成されたプローブ上で保持すること、または生物学的な分子の現場での合成に適したシランを用いるために、シラン化される。疎水性の単層のミクロ転写は、平坦であってもよく、また浮き彫りになった転写領域を示すマイクロパッドにて構成されていてもよい転写表面３０を使って行われる。
【００２５】
転写表面３０を、疎水性のシランを含む溶液に接触させる。そして、溶液の薄い薄膜２２は、基体１の層１０上の局所的な位置で接触させることで転写される。そして、基体１を、シラン化を容易にさせるため、約１００℃の温度まで上げる。特定のプロトコルを用い、適切な分子を選択することで、自己集合単層（self-assembled monolayer）（ＳＡＭ）として知られている組織化された緻密な単層を得ることができる。そして、その場でオリゴヌクレオチドの合成を行わせるようにする官能基（例えば、ヒドロキシル基）、または予め合成されているか、あるいは生物学的な起源の生物学的な分子を、適切な官能基（例えば、酸）を使ってその場で保持されるようにする官能基を、フリーな末端に有するその他のシランで覆われるようにするために、シランを受容しなかった領域を処理する。第二のシランのグラフト反応は、シリカのシラノール基または基体を構成するガラスで起こるが、固定された第一のシランの単層では起こりえない。それゆえ、感受性を有する部位として作用するこれらの領域のみが官能化される。
【００２６】
加えて、疎水性シランは、非選択的な吸収が非常に強く制限され、そして結果として蛍光（またできうることなら放射線マーカー）にて、非選択的な吸収が発生したであろう露出した領域から生じるであろうあらゆるシグナルに対して、生物学的なプローブを保持する領域における真のシグナルの割合が増大することで読み取る場合、ノイズに対するシグナルの比率を大変著しく改善させる。
一般に、シラン以外の物質を用いて同様な作用を遂行することは可能である。
【００２７】
感受性を有する部位の外部で、支持体の最上部で物理的および化学的に不活性な層を付着させることは可能であり、それゆえバイオチップを作製すると同時にプローブの生物分子の吸収と固定とを制限し、そして生物学的な分析を通して、標的の生物分子の吸収と固定を制限し、それによって測定ノイズに対するシグナルの比率を改善する。
【００２８】
この内層は、（ＣＨ2）ｐ（１＜ｐ＜３０）タイプの炭化水素鎖あるいはポリマー鎖、例えばポリエチレングリコールなどからなる分子、または一端で、共有結合、例えばシランまたはシラノール結合を、支持体で形成させる基を有し、同時に、他方の末端がＣＨ3またはα鎖（ＣＨ2）ｐおよびＣＨ3で全てあるいは幾つかのハロゲンを置換しているそのハロゲン化誘導体のような安定した不活性な化学官能基、またはそのハロゲンを有する官能基を有する様々な鎖部分の集合体からなる分子によって構成されている。
形成される層は、第一末端基の特性によって、単一分子または複合分子であってもよい。層を、有利には、該分子の溶液で予め覆われた平坦な表面と接触させることで付着させてもよい。
【００２９】
その後、各々の末端で異なる機能を示す分子の単層は、感受性を有する部位上で付着され、一方は、基体上で共有結合、例えばシラノール官能基によって分子を固定するようにし、他方は、共有結合様式、例えば酸性官能基ＣＯＯＨまたはアルコール官能基ＯＨで、プローブの生物分子を固定するようにする。その結果、この単層は、予め合成されたか、あるいは天然の起源の生物分子を保持させるか、または、事実、プローブの生物分子（オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、タンパク質など）をウエル内で、その場にて合成させる。
【００３０】
別の方法を図３に引用して記載する。
基体の表面を物質Ｂの層３０で覆い、そして停止物質Ｃの層３１を感受性を有する部位の外部、この場合ウエル５に局所的に付着させる。
【００３１】
好ましくは、感受性を有する部位は、相補的な効果、部位の内部と外部との間での大きな違いと関連する物理的な効果および部位の内部と外部との間での表面特性の違いと関連する物理化学的な効果を有する２つの技術を使って、検出を効果的にする。結果として、マイクロテクノロジー的なタイプの技術にて得られる感受性を有する部位の形状および相対的な位置は、十分に定義されている。このことは、高品質なチップを得ること、およびその読み取りを改善することに寄与する。
【００３２】
最後に、２つの技術、支持体を三次元的に構築すること、および好ましい方法、例えば二重シラン化によって、付着を、感受性を有する部位で起させる表面を調製することを結びつけることで、チップの品質を改善させ、そして各々または一緒に実行されうる４つの側面
・マスキングおよび／または転写技術を使ってチップの幾何学的な解像力を改善すること、
・物理化学的な制約と部位の効果と機械加工とを組み合わせることによって、感受性を有する部位の大きさを増大させること、
・例えばマイクロ転写による疎水性シランの単層を付着させることで、部位間の領域上で非特異的な吸収を増大させること、および
・透過支持層の厚みを最適化することでチップを読み取る光学的な品質を改善すること
に基づいて作用させることで、その読み取りを最適化することを可能にする。
【国際公開パンフレット】
2004535585.tif 000003
2004535585.tif 000004
2004535585.tif 000005
2004535585.tif 000006
2004535585.tif 000007
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2004535585.tif 000009
2004535585.tif 000010
2004535585.tif 000011
2004535585.tif 000012
2004535585.tif 000013
2004535585.tif 000014
2004535585.tif 000015
2004535585.tif 000016
2004535585.tif 000017
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535585.tif 000018
2004535585.tif 000019
【国際調査報告】
2004535585.tif 000020
2004535585.tif 000021
2004535585.tif 000022
2004535585.tif 000023
2004535585.tif 000024
2004535585.tif 000025