(57)【要約】本発明は、３−ヒドロキシニトリルから３−ヒドロキシカルボン酸を調製するための方法に関する。特に、酵素触媒として微生物細胞の１）ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性または２）ニトリラーゼ活性を利用して、変換率が最大１００％という高い収率で３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に変換する。３−ヒドロキシ吉草酸は高度に分枝したコポリエステルを調製するにあたってｅ−カプロラクトンに代わるものとして用いられるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水性反応混合物中の３−ヒドロキシニトリルを、１）ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性または２）ニトリラーゼ活性を特徴とする酵素触媒と接触させ、
（ｂ）場合により、段階（ａ）で生成する３−ヒドロキシカルボン酸を回収する
段階を含んでなる、３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシカルボン酸に加水分解するための方法。
【請求項２】
３−ヒドロキシニトリルが、３−ヒドロキシプロピオニトリル、３−ヒドロキシブチロニトリル、３−ヒドロキシバレロニトリル、３−ヒドロキシヘキサンニトリル、３−ヒドロキシヘプタンニトリル、３−ヒドロキシオクタンニトリル、３−ヒドロキシノナンニトリル、３−ヒドロキシ−３−イソプロピル−４−メチルペンタンニトリル、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリル、２−プロピル−３−ヒドロキシペンタンニトリル、および３−ヒドロキシ−３−メチル−ｎ−ペンタンニトリルよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）（１）の酵素触媒が、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５４）、Ｓｙｃｔａｌｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．３ＬＤ−１２２Ｐ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．２５−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５６）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ（ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６８）よりなる群から選択される微生物細胞のニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を特徴とし、
段階（ａ）（２）の酵素触媒が、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、および熱処理してニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を失活させたＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）よりなる群から選択される微生物細胞のニトリラーゼ活性を特徴とする、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酵素触媒が、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１もしくはそれ以上の成分、部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酵素触媒が可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化されている請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）水性反応混合物中の３−ヒドロキシバレロニトリルを、
１）Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５４）、Ｓｙｃｔａｌｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．３ＬＤ−１２２Ｐ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．２５−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５６）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ（ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６８）よりなる群から選択される微生物細胞のニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性、または
２）Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、および熱処理してニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を失活させたＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）よりなる群から選択される微生物細胞のニトリラーゼ活性
を特徴とする酵素触媒と接触させ、
（ｂ）場合により、段階（ａ）で生成する３−ヒドロキシ吉草酸を回収する
段階を含んでなる３−ヒドロキシ吉草酸の製造方法。
【請求項７】
酵素触媒が、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１もしくはそれ以上の成分、部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵素触媒が可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化されている請求項７に記載の方法。
【請求項９】
構造Ｒ２Ｏ−ＣＲ４Ｒ５ＣＲ６Ｒ７Ｃ（Ｏ）ＯＲ１で表される少なくとも１種の線状３−ヒドロキシカルボン酸またはそのエステルと、構造（Ｒ２Ｏ）ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ１］ｍで表される少なくとも１種の高分枝性ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル（式中、Ｒはｎ＋ｍの自由原子価をもつＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ１はＨ、Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基またはヒドロキシル置換Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７はＨまたはＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ２はＨまたは（Ｏ）ＣＲ３であり、ｎ＋ｍは３またはそれ以上であり、ただしｎおよびｍの一方は１である）から誘導される少なくとも２つの繰返し単位を含んでなる高度に分枝したコポリエステル。
【請求項１０】
線状３−ヒドロキシカルボン酸が３−ヒドロキシ吉草酸であり、高分枝性ヒドロキシカルボン酸がジメチロールプロピオン酸および／またはトリメチオロ酢酸である請求項９に記載の高度に分枝したコポリエステル。
【請求項１１】
（ａ）１）構造（Ｒ２Ｏ）ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ１］ｍで表される少なくとも１種の高分枝性ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル（式中、Ｒはｎ＋ｍの自由原子価をもつＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ１はＨ、Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基またはヒドロキシル置換Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７はＨまたはＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ２はＨまたは（Ｏ）ＣＲ３であり、ｎ＋ｍは３またはそれ以上であり、ただしｎおよびｍの一方は１である）、
２）構造Ｒ２Ｏ−ＣＲ４Ｒ５ＣＲ６Ｒ７Ｃ（Ｏ）ＯＲ１で表される線状３−ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル、および
３）エステル化触媒
の混合物を接触させ且つ加熱し、
（ｂ）段階（ａ）の高度に分枝したコポリエステル生成物を捕集する
段階を含んでなる、高度に分枝したコポリエステル生成物の合成方法。
【請求項１２】
高分枝性ヒドロキシカルボン酸がジメチロールプロピオン酸および／またはトリメチロール酢酸であり、線状３−ヒドロキシカルボン酸が３−ヒドロキシ吉草酸であり、エステル化触媒がジカルボン酸スズまたはプロトン酸である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）水性反応混合物中の３−ヒドロキシニトリルを、
１）Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５４）、Ｓｙｃｔａｌｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．３ＬＤ−１２２Ｐ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．２５−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５６）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ（ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６８）よりなる群から選択される微生物細胞のニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性、または
２）Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）、およひ熱処理してニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を失活させたＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）よりなる群から選択される微生物細胞のニトリラーゼ活性
を特徴とする酵素触媒と接触させ、
（ｂ）（１）構造（Ｒ２Ｏ）ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ１］ｍで表される少なくとも１種の高分枝性ヒドロキシカルボン酸（式中、Ｒはｎ＋ｍの自由原子価をもつＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ１はＨ、Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基またはヒドロキシル置換Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７はＨまたはＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ２はＨまたはＯ（Ｏ）ＣＲ３であり、ｎ＋ｍは３またはそれ以上であり、ただしｎおよびｍの一方は１である）、
（２）段階（ａ）で回収した、構造Ｒ２Ｏ−ＣＲ４  Ｒ５ＣＲ６  Ｒ７Ｃ（Ｏ）ＯＲ１で表される線状３−ヒドロキシカルボン酸、および
（３）エステル化触媒
の混合物を接触させ且つ加熱し、
（ｃ）段階（ｂ）の高度に分枝したコポリエステル生成物を捕集する
高度に分枝したコポリエステル生成物の合成方法。
【請求項１４】
３−ヒドロキシニトリルが、３−ヒドロキシプロピオニトリル、３−ヒドロキシブチロニトリル、３−ヒドロキシバレロニトリル、３−ヒドロキシヘキサンニトリル、３−ヒドロキシヘプタンニトリル、３−ヒドロキシオクタンニトリル、３−ヒドロキシノナンニトリル、３−ヒドロキシ−３−イソプロピル−４−メチルペンタンニトリル、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリル、２−プロピル−３−ヒドロキシペンタンニトリル、および３−ヒドロキシ−３−メチル−ｎ−ペンタンニトリルよりなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酵素触媒が、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１もしくはそれ以上の成分、部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）の酵素触媒が、微生物細胞全体または部分精製または精製酵素（単数もしくは複数）の形態であり、（ａ）の酵素触媒が、可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化されており、高分枝性ヒドロキシカルボン酸がジメチロールプロピオン酸および／またはトリメチロール酢酸であり、線状３−ヒドロキシカルボン酸が３−ヒドロキシ吉草酸であり、エステル化触媒がジカルボン酸スズまたはプロトン酸である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を特徴とし、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５４）、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．３ＬＤ−１２２Ｐ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５５）、およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．２５−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５６）よりなる群から選択されることを特徴とする単離された微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、３−ヒドロキシニトリルから３−ヒドロキシカルボン酸を調製するための方法に関する。特に、触媒として微生物細胞のニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性あるいはニトリラーゼ活性を利用して、変換率１００％という高い収率で３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に変換する。３−ヒドロキシ吉草酸は高度に分枝したポリエステルを調製するにあたってε−カプロラクトンに代わるものとして用いられるものである。
【０００２】
背景技術
ポリマー技術においては、新たな特性に対する需要や費用対効果の向上、生態環境および品質に対する必要性を満たすべく、正確な巨大分子エンジニアリングが主流となりつつある。構造が緻密で枝分れした反応性基を末端に持つ機能性ポリマーが、従来の線状統計コポリマーよりも内部粘度が低い上に反応性が高いことから性能／コスト面で優れた特色を示すのではないかと考えられている。これらのポリマーについては、高分枝性ヒドロキシカルボン酸コモノマー（高分枝性ＡＢｎ型であり、ＡおよびＢはヒドロキシル誘導反応性基またはカルボキシル誘導反応性基を持つ部分であり、ｎは２またはそれ以上である）（Ｈｕｌｔら、第６５６〜６５８頁およびＶｏｉｔら、第６５８〜６５９頁、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ、Ｊ．Ｃ．Ｓａｌｏｍｏｎｅ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９９）と３−ヒドロキシ吉草酸をはじめとするさまざまな線状ヒドロキシカルボン酸コモノマー（線状ＡＢ型）とを共重合することで調製が可能である。
【０００３】
３−ヒドロキシ吉草酸は、線状ポリエステルを製造するための（コ）モノマーとしても有用である。ポリエステルは、熱可塑性素材、熱硬化性素材、半結晶性素材、非晶質素材、剛性素材および弾性素材として有用である。このような素材は、繊維、フィルム、コーティングなどのベースになるものである（Ｇｏｏｄｍａｎ、第７９３〜７９９頁、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９０）。
【０００４】
３−ヒドロキシ吉草酸はＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａを用いる発酵時に吉草酸をβ−水酸化して調製されており（Ｈａｓｅｇａｗａら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５９：２５７〜２６２（１９８１）；特公昭５９−５３８３８Ｂ４）、３−ヒドロキシ吉草酸の唯一のエナンチオマーも同様に吉草酸をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓおよびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｉｅｔｅｓで発酵β−水酸化して調製された（米国特許第３，５５３，０８１号）。このように吉草酸を発酵によって酸化させる方法では一般に、３−ヒドロキシ吉草酸が低めの生成物濃度で生成されるため、発酵ブロスから３−ヒドロキシ吉草酸を分離する複雑かつ費用のかかる工程が必要になる。さらに、ポリ（３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシバレレート）を化学分解（Ｓｅｅｂａｃｈら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７７：２００７〜２０３４（１９９４））または発酵自己分解（ＷＯ９９２９８８９）することで（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸が調製されているが、ヒドロキシ酪酸／ヒドロキシ吉草酸コポリマーを分解するにも副産物である３−ヒドロキシ吉草酸から３−ヒドロキシ酪酸を分離する厄介な工程が必要になる。（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸は、３−オキソ吉草酸を酵素還元する方法（Ｂａｙｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：５４３〜５４７（１９９４））やメチル３−オキソ吉草酸を不斉水素化した後、鹸化する方法（Ｂｕｒｋら、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  ９：２６５３〜２６５５（１９９０））でも調製されている。
【０００５】
ニトリルはさまざまな化学プロセスで容易に対応するカルボン酸に変換される。これらのプロセスでは一般に強酸性または強塩性の反応条件と高い反応温度が必要であり、不要な副産物および／または大量の無機塩が不要な廃棄物として生成されてしまうのが普通である。３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に変換するなどニトリルを化学的に加水分解するための反応条件に水酸基も含まれるような場合、炭素−炭素二重結合を形成する際に、１級水酸基、２級水酸基または３級水酸基が不必要に除去されてしまうのが普通である。
【０００６】
酵素触媒によってニトリル基質を対応するカルボン酸に加水分解する方法のほうが化学的な方法より好ましいことが多い。酵素触媒による方法では反応が周囲温度で実施されることが多く、強酸性または強塩基性の反応条件も必要とせず、選択性の高い所望の生成物が高い変換率で得られるためである。
【０００７】
ニトリルヒドラターゼとアミダーゼという２種類の酵素を組み合わせて使用すれば、水溶液中にて脂肪族ニトリルを対応するカルボン酸に変換することができる。まず、脂肪族ニトリルをニトリルヒドラターゼによってアミドに変換し、続いてこのアミドをアミダーゼによって対応するカルボン酸に変換する。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓをはじめとするさまざまな細菌属が異なるスペクトルのニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を持つことが知られている（Ｓｕｇａｉら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１４１９〜１４２７（１９９７））。真菌であるＦｕｓａｒｉｕｍ  ｍｅｒｉｓｍｏｉｄｅｓ  ＴＧ−１も脂肪族ニトリルおよびジニトリルを加水分解するための触媒として用いられている（Ａｓａｎｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４４：２４９７〜２４９８（１９８０））。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉから入手したＳＰ４０９）から得られる固定化したニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼを用いて、３−ヒドロキシプロピオニトリル、３−ヒドロキシヘプタンニトリル、３−ヒドロキシオクタンニトリルおよび３−ヒドロキシノナンニトリルを、それぞれ６３％、６２％および８３％の収率で対応する３−ヒドロキシカルボン酸に加水分解した（ｄｅ  Ｒａａｄｔら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、１３７〜１４０（１９９２））。対応するアミドの形成はＴＬＣでも観察された。これとは対照的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ  Ｄａｃ５２１の精製ニトリルヒドラターゼを用いると、さまざまな脂肪族ニトリルが加水分解されたが、３−ヒドロキシプロピオニトリルは加水分解されなかった（Ｃｒａｍｐら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４３１：２４９〜２６０（１９９９））。
【０００８】
酵素としては唯一、ニトリラーゼは水溶液中でニトリルを対応するカルボン酸とアンモニアにも変換したが、アミドの中間体は形成されなかった。また、さまざまな脂肪族ニトリルを対応するカルボン酸にする加水分解を触媒するＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｋ２２から単離した脂肪族ニトリラーゼについて、Ｋｏｂａｙａｓｈｉらによる説明がある（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４６：５５８７〜５５９０（１９９０）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７２：４８０７〜４８１５（１９９０））。一定範囲の脂肪族α，ω−ジニトリルを対応するω−シアノカルボン酸またはジカルボン酸のいずれかに変換することができるＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのニトリラーゼが単離されている（カナダ特許第２，１０３，６１６号；Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌら、Ｇｅｎｅ  １６１：１５〜２０（１９９５））。また、脂肪族ニトリラーゼは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＣＩＭＢ  １１２１６（Ｂｅｎｇｉｓ−Ｇａｒｂｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：１１〜１６（１９８９）；Ｇｒａｄｌｅｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．１６：４１〜４６（１９９４））、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＰＡ−３４（Ｂｈａｌｌａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：１８４〜１９０（１９９２））、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｍｅｌｏｎｉｓ（Ｇｏｌｄｌｕｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：５８１〜６０１（１９８９））、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＫ  ２２６（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：１４５９〜１４７３（１９９１））、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ８７５０（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３：４２５〜４３０（１９９２））およびＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（Ｇａｖａｇａｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：４７９２〜４８０１（１９９８））によっても生成される。
【０００９】
したがって、解決すべき課題は、ニトリルを高い収率でその対応するカルボン酸に変換するために有用である新規な触媒を提供することである。具体的には、除去されてしまう可能性のある水酸基の存在下で、化合物に含まれるニトリル官能基を対応するカルボン酸に変換する機能が特に有用となるであろう。
【００１０】
発明の開示
３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシカルボン酸に加水分解するための方法を開示する。この方法は、（ａ）水性反応混合物中の３−ヒドロキシニトリルを、１）ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性または２）ニトリラーゼ活性を特徴とする酵素触媒と接触させ、（ｂ）場合により、段階（ａ）で生成する３−ヒドロキシカルボン酸を回収する段階を含んでなる。特に、本発明では酵素触媒として微生物細胞の１）ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性または２）ニトリラーゼ活性を利用して変換率が最大１００％という高い収率で３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に変換する。
【００１１】
３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシカルボン酸に加水分解するための本発明の別の実施形態では、１）ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性または２）ニトリラーゼを持つ酵素触媒を、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞、微生物細胞抽出物の１もしくはそれ以上の細胞成分、部分精製酵素（単数もしくは複数）または精製酵素（単数もしくは複数）の形態で利用する。好ましくは、酵素触媒の形態は微生物細胞全体または部分精製または精製酵素（単数もしくは複数）である。このようなさまざまな形態の酵素触媒を可溶性支持体または不溶性支持体の上または中に固定化することが可能である。ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を特徴とし、本方法において有用な微生物としては、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（ＡＴＣＣ  ５５７４４）、Ｄｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５４）、Ｓｙｃｔａｌｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．３ＬＤ−１２２Ｐ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．２５−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５６）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ（ＮＲＲＬ−Ｂ−１８６６８）が挙げられる。ニトリラーゼ活性を特徴とし、本方法において有用な微生物としては、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）（５０℃で０．５〜１時間加熱して不要なニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を失活させた後の状態）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）およびＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）が挙げられる。
【００１２】
本発明は、構造Ｒ２Ｏ−ＣＲ４Ｒ５ＣＲ６Ｒ７Ｃ（Ｏ）ＯＲ１で表される少なくとも１種の線状３−ヒドロキシカルボン酸またはそのエステルと、構造（Ｒ２Ｏ）ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ１］ｍで表される少なくとも１種の高分枝性ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル（式中、Ｒはｎ＋ｍの自由原子価をもつＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ１はＨ、Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基またはヒドロキシル置換Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７はＨまたはＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ２はＨまたは（Ｏ）ＣＲ３であり、ｎ＋ｍは３またはそれ以上であり、ただしｎおよびｍの一方は１である）から誘導される少なくとも２つの繰返し単位を含んでなる高度に分枝したコポリエステルを生成する上で役立つものである。
【００１３】
さらに、本発明は、高度に分枝したコポリエステル生成物を合成するための方法であって、（ａ）（１）構造（Ｒ２Ｏ）ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ１］ｍで表される少なくとも１種の高分枝性ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル（式中、Ｒは、ｎ＋ｍの自由原子価をもつＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ１はＨ、Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基またはヒドロキシル置換Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７はＨまたはＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ２はＨまたは（Ｏ）ＣＲ３であり、ｎ＋ｍは３またはそれ以上であり、ただしｎおよびｍの一方は１である）、（２）構造Ｒ２Ｏ−ＣＲ４Ｒ５ＣＲ６Ｒ７Ｃ（Ｏ）ＯＲ１で表される線状３−ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル、および（３）エステル化触媒の混合物を接触させ且つ加熱し、（ｂ）段階（ａ）の高度に分枝したコポリエステル生成物を捕集する段階を含んでなる方法を含むものである。この方法では、高分枝性ヒドロキシカルボン酸がジメチロールプロピオン酸またはトリメチロール酢酸であると好ましく、線状ヒドロキシカルボン酸は３−ヒドロキシ吉草酸であると好ましい。線状３−ヒドロキシカルボン酸の一例としては、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−３−イソプロピル−４−メチルペンタン酸、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパン酸、２−プロピル−３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシ−３−メチル−ｎ−吉草酸および３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸などの化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル化触媒は、プロトン酸やルイス酸、あるいは、スルホン酸、リン酸およびホスホン酸をはじめとする塩基性触媒、チタンアルコキシド、ジアルキルスズオキシド、さらにはスズ、亜鉛、マンガン、カルシウム、マグネシウムまたはアンチモンの酸化物、炭酸塩およびカルボン酸塩など、従来から周知のものでよい。エステル化触媒はジカルボン酸スズまたはプロトン酸であると好ましい。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、本願明細書に記載したような酵素触媒を用いて生成した線状３−ヒドロキシカルボン酸を利用し、高度に分枝したコポリエステル生成物を合成する。酵素的に生成した線状３−ヒドロキシカルボン酸を、本願明細書に記載したような少なくとも１種の高分枝ヒドロキシカルボン酸またはそのエステルならびにエステル化触媒と接触させて加熱する。
【００１５】
生物の寄託に関する簡単な説明
本願出願人らは、ブタペスト条約の定めにより、以下の生物の寄託を行った。
【００１６】
【表１】
2004535754.tif 000002
【００１７】
本願明細書において使用する「ＡＴＣＣ」とは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  Ｕ．Ｓ．Ａ．に所在する米国菌株保存機関の国際寄託当局を示す。本願明細書において使用する「ＮＲＲＬ」とは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ  ６１６０４，Ｕ．Ｓ．Ａ．に所在する米国農業研究サービス機関の系統保存におけるＭｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｎｉｔを示す。「国際寄託の表示」とは、ＡＴＣＣまたはＮＲＲＬでの寄託培養の受入番号を示す。
【００１８】
列挙した寄託物（単数もしくは複数）は、表記の国際寄託当局にて少なくとも３０年間保管され、これについて開示している特許の付与時に一般公開される。寄託物を利用できることがすなわち政府の措置により付与された特許権の適用範囲内で当該発明を実施するための実施許諾をなすものではない。
【００１９】
発明の詳細な説明
本願出願人らは、除去される可能性のある水酸基の存在下にて３−ヒドロキシニトリルのニトリル官能基をその対応するカルボン酸に変換する上で酵素触媒を使用して上述した問題を解決した。この方法を用いることで、たとえば３−ヒドロキシ吉草酸または３−ヒドロキシプロピオン酸の調製時にニトリルを加水分解する他の化学的な方法や酵素的な方法に比べて大きな利点が得られ、比較的安価かつ容易に調製される開始材料から副産物や廃棄物をほとんど生成することなく高い収率で３−ヒドロキシ吉草酸または３−ヒドロキシプロピオン酸などの３−ヒドロキシカルボン酸を調製することが可能になる。
【００２０】
本発明は、主にコーティングに用いられるが、繊維やフィルム、成型品などにも用いられるポリエステルの改良品を生成することに関する。本発明の材料は架橋剤としても役立つ。本発明によって生成される３−ヒドロキシ吉草酸は、特に高度分枝ポリエステルを高分枝性ヒドロキシカルボキシルコモノマーとの組み合わせで調製する場合の成分として有用であり、生分解性ポリエステルを製造する際の（コ）モノマーとして役立つ。
【００２１】
具体的には、微生物細胞の１）ニトリラーゼ活性または２）ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を利用する、３−ヒドロキシバレロニトリルから３−ヒドロキシ吉草酸を高い収率で調製する方法について説明する。ニトリラーゼ酵素は、対応するアミド中間体を形成することなく脂肪族または芳香族のニトリルを対応のカルボン酸に直接変換（式１）し、一方、ニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）の場合は脂肪族または芳香族のニトリルを一旦アミドに変換した後、このアミドがアミダーゼによって対応するカルボン酸に変換される（式２）。
【００２２】
【化１】
2004535754.tif 000003
【００２３】
以下の実施例で説明するように、精製酵素（単数もしくは複数）、細胞抽出物、微生物細胞および固定化微生物細胞を利用して、３−ヒドロキシ吉草酸でも同様の収率が得られている。
【００２４】
分枝用コモノマーとしてのジメチロールプロピオン酸ならびに各種線状ヒドロキシカルボン酸およびラクトンを利用して、いくつかのクラスの高度に分枝したコポリエステルポリオールを調製した。これらのポリマーの中には魅力的な特徴を持つものがある。全体の組成は類似しているが微細構造は異なる対応のブロックコポリマーについてはすでに報告されている（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３０：８５０８（１９９７）およびＪ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ  （Ａ）：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：２７９３（１９９８）に記載のＤＭＰＡ／ε−カプロラクトンブロックコポリマーなど）。ジメチロールプロピオン酸またはトリメチロール酢酸との共重合時の線状コモノマーとしてε−カプロラクトンの代わりに３−ヒドロキシ吉草酸または３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸などの３−ヒドロキシカルボン酸を用いたところ、本発明によってＴｇが大幅に改善された所望の値の反応性コーティング用の高度に分枝したコポリエステルポリオール基質が得られている。Ｔｇが高いほど分枝したコポリエステルを適用できる用途の範囲が広がることになる。
【００２５】
３−ヒドロキシカルボン酸を調製するための特許請求の範囲に記載の発明では、廃棄物または反応副産物がほとんど生成されず、混合生成物から３−ヒドロキシカルボン酸が容易に回収される。３−ヒドロキシニトリルを加水分解するためのすでに知られている化学的な方法では、酵素触媒によるニトリルの加水分解で得られるような高い収率および３−ヒドロキシカルボン酸に対する高い選択性を得ることはできない。非酵素的なニトリルの加水分解反応では一般に、多くの場合は強い酸または塩基の存在下で、ニトリルの溶液を高温で加熱する必要があるが、上述した酵素触媒反応は、水溶液中にて酸または塩基を加えることなく中性のｐＨで周囲温度にて実施されるものである。たとえば、水酸化バリウム水溶液を用いて、３−アミノプロピオニトリルを８５から９０％の収率で３−アラニンに加水分解（Ｆｏｒｄ、Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．、Ｃｏｌｌ．第ＩＩＩ巻：３４〜３６（１９５５））したり、３−シアノ酪酸を７２％の収率でメチルコハク酸に加水分解（Ｂｒｏｗｎ、Ｏｒｇ  Ｓｙｎｔｈ．、Ｃｏｌｌ．第ＩＩＩ巻：６１５〜６１７（１９５５））することが行われている。この２つのうち最初の方法を３−ヒドロキシバレロニトリルで行っても検出可能な３−ヒドロキシ吉草酸は得られなかった（比較例参照）。
【００２６】
本発明を開示するにあたり、多くの専門用語および略語を使用する。これについては、以下のように定義する。
【００２７】
「ニトリルヒドラターゼ」をＮＨａｓｅと略記する。
【００２８】
「ニトリルヒドラターゼ欠乏」とは、熱処理によってニトリルヒドラターゼ活性が失われた細胞を示す。
【００２９】
「酵素触媒」とは、１）ニトリラーゼ活性または２）ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を特徴とする触媒を示す。酵素触媒は、微生物細胞全体、浸透化処理した微生物細胞（単数もしくは複数）、微生物細胞抽出物の１またはそれ以上の細胞成分、部分精製酵素または精製酵素の形態であってもよい。
【００３０】
飽和「ヒドロカルビル基」とは、炭素および水素のみで構成される基であると定義される。この場合、炭素原子同士の結合には単結合のみが用いられる。したがって、少なくとも１つの炭素原子を含む炭素原子と水素原子からなる安定した配列が飽和炭化水素基の範囲に包含される。
【００３１】
「高分枝」、「高度分枝」および「樹状巨大分子」（デンドリマー）という用語は、広義には樹木のような構造を持つ三次元の高度分枝分子であるとすることができる。デンドリマーは非常に対称性が高いのに対し、高分枝または高度分枝と呼ばれる同様の巨大分子は、高度に分枝した樹木のような構造が維持されていればある程度は非対称なものであってもよい。デンドリマーは高分枝巨大分子が単分散したものであると言うことができる。高分枝、高度分枝および樹状巨大分子は、１つまたはそれ以上の反応部位を有する開始剤または核と、その周囲を取り囲む多数の分枝層と、場合により、連鎖停止分子からなる層とで構成されているのが普通である。これらの層は一般に世代と呼ばれる。
【００３２】
「３−ヒドロキシニトリル」は「β−ヒドロキシニトリル」と同じである。３−ヒドロキシニトリルは、３−ヒドロキシプロピオニトリル、３−ヒドロキシブチロニトリル、３−ヒドロキシバレロニトリル、３−ヒドロキシヘキサンニトリル、３−ヒドロキシヘプタンニトリル、３−ヒドロキシオクタンニトリル、３−ヒドロキシノナンニトリル、３−ヒドロキシ−３−イソプロピル−４−メチルペンタンニトリル、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリル、２−プロピル−３−ヒドロキシペンタンニトリル、３−ヒドロキシ−３−メチル−ｎ−ペンタンニトリルなどの化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
「３−ヒドロキシカルボン酸」は「β−ヒドロキシカルボン酸」と同じである。３−ヒドロキシカルボン酸としては、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−３−イソプロピル−４−メチルペンタン酸、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパン酸、２−プロピル−３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸、３−ヒドロキシ−３−メチル−ｎ−吉草酸などの化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
「３−ヒドロキシバレロニトリル」は、３−ヒドロキシペンタンニトリルおよびβ−ヒドロキシバレロニトリルとしても知られている。
【００３５】
「３−ヒドロキシ吉草酸」は、３−ヒドロキシペンタン酸およびβ−ヒドロキシ吉草酸としても知られている。
【００３６】
「３−ヒドロキシプロピオニトリル」は、ヒドロアクリロニトリル（ｈｙｄｒａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、３−シアノエタノール、３−ヒドロキシエチルシアニド、３−ヒドロキシプロピオニトリル、１−シアノ−２−ヒドロキシエタン、２−シアノエタノール、２−シアノエチルアルコール、２−ヒドロキシシアノエタン、２−ヒドロキシエチルシアニド、３−ヒドロキシプロパンニトリル、３−ヒドロキシプロピオニトリル、エチレンシアノヒドリン、グリコールシアノヒドリンとしても知られている。
【００３７】
「３−ヒドロキシプロピオン酸」は、ヒドロアクリル酸、β−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロパン酸、３−乳酸、２−デオキシグリセリン酸、エチレン乳酸としても知られている。
【００３８】
「ジメチロールプロピオン酸」は、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸およびα，α−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸としても知られている。
【００３９】
「トリメチロール酢酸」は、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−プロパン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−ヒドロアクリル酸、２−カルボキシ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール；３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸；３−ヒドロキシ−２，２−ジヒドロキシメチルプロピオン酸；トリス（ヒドロキシメチル）酢酸としても知られている。
【００４０】
「プロトン酸（ｐｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）」および「プロトン酸（ｐｒｏｔｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）」という用語は、強酸性または弱酸性のイオン化可能なプロトンを持つ（すなわちプロトン供与体として作用できる）酸を示す。これらの酸としては、芳香族または脂肪族のカルボン酸、芳香族または脂肪族のスルホン酸、リン酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、過塩素酸、塩酸など（ローリー・ブロンステッド酸と呼ばれることが多い）が挙げられるが、これに限定されるものではない。非プロトン酸（すなわち、電子対を受け取って共有結合を形成できる酸）の例としては、三フッ化ホウ素、三塩化アルミニウムおよび塩化第二スズなどのルイス酸が挙げられる。
【００４１】
好ましい実施形態の説明
微生物酵素触媒の成長：
３−ヒドロキシニトリルの変換に用いる微生物株については、後述するようにして単離した。冷凍保存した１５％グリセロールストックを−６５℃から−７０℃に保持した。
【００４２】
Ｅ２基礎培地（表１）（ｐＨ７．２）での標準的な強化手順を用いて、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２ＷおよびＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄを、米国テキサス州オレンジで集めた土壌から強化した。
【００４３】
【表２】
2004535754.tif 000004
【００４４】
上述した強化用にＥ２基礎培地に対して施した変更の内容を表２に示す。
【００４５】
【表３】
2004535754.tif 000005
【００４６】
ＰＲ基礎培地（表３）（ｐＨ７．２）での標準的な強化手順を用いて、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．３ＬＤ−１２２ＰおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐを米国テキサス州オレンジで集めた土壌から強化した。
【００４７】
【表４】
2004535754.tif 000006
【００４８】
上述した強化用にＰＲ基礎培地に対して施した変更の内容を表４に示す。
【００４９】
【表５】
2004535754.tif 000007
【００５０】
Ｄｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１を強化培養から単離した。この強化培養は、ねじ蓋の付いた５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコにてスラッジ１ｍＬをＳ１２−Ｎ培地１０ｍＬに接種して得たものである。Ｓ１２−Ｎ培地には、Ｎａ２ＳＯ４、１０ｍＭ；リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０、５０ｍＭ；ＭｇＣｌ２、２ｍＭ；ＣａＣｌ２、０．７ｍＭ；ＭｎＣｌ２、５０μＭ；ＦｅＣｌ３、１μＭ；ＺｎＣｌ３、１μＭ；ＣｕＳＯ４、１．７２μＭ；ＣｏＣｌ２、２．５３μＭ；Ｎａ２ＭｏＯ２、２．４２μＭ；ＦｅＳＯ４、０．０００１％；酵母エキス、０．００１％；塩酸チアミン、２μＭを含む。このスラッジは、テキサス州ビクトリアのイー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーが使用している排水処理試験システムから得たものである。強化培養には、１００ｐｐｍのアジポニトリルを培養液に直接加えて補充し、繰返し振盪しながら３０℃でインキュベートした。この強化培養を、トルエン１００ｐｐｍを２〜３日ごとに加えながら保管した。１０日ごとに培養９ｍＬを同量のＳ１２−Ｎ培地と交換して培養を希釈した。唯一の炭素源、窒素源、エネルギ源としてアジポニトリルを利用する細菌を、強化培養試料をＳ１２−Ｎ寒天（１．５％Ｄｉｆｃｏ  Ｎｏｂｌｅ  Ａｇａｒを含むＳ１２−Ｎ培地）に拡げて単離した。各ペトリ皿の蓋の内側にアジポニトリル（１０μＬ）を塗布した。ペトリ皿をパラフィンで密封し、上下を逆さにして２８℃でインキュベートした。次に、各ペトリ皿の蓋の内側にアジポニトリルを補充した状態でＳ１２−Ｎ寒天上にて代表的な細菌コロニーをシングルコロニーで複数回継代した。ペトリ皿をパラフィンで密封し、上下を逆さにして２８℃でインキュベートした。単離した何種類かの株のうち１つがＤｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１であった。
【００５１】
ニトリル変換活性について試験するために、以下の条件（表５および表６）下にてさまざまな株を好気的に成長させた。
【００５２】
【表６】
2004535754.tif 000008
【００５３】
さらに、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗを好気的に成長させた。接種時、発酵槽には発酵槽培地（表６）８．５Ｌに加えてＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ溶液（後述）２１８ｇを入れ、開始濃度をグリセロール約７ｇ／Ｌとしておいた。３２℃、ｐＨ６．８〜７．０にて溶存酸素を飽和度の２５％に維持した。接種後１８時間の時点で、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ溶液の供給を開始した。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ溶液には、その成分として、脱イオン水０．２５Ｌに入れたリン酸二水素カリウム１９．６ｇ；硫酸マグネシウム七水和物３．３ｇに加えて硫酸４ｍＬを脱イオン水０．１５Ｌに入れたもの；微量金属（表６）溶液６７ｍＬに加えてグリセロール４００ｇを脱イオン水０．８０Ｌに入れたものを別々に滅菌して冷却後に混合して含む。まず、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ溶液をフィード０．４ｇ／分（グリセロール０．１５ｇ／分）の速度で添加した。２６時間の時点で、供給速度をフィード０．９ｇ／分（グリセロール０．３ｇ／分）まで高めた。供給速度を最後にフィード１．８ｇ／分（グリセロール０．６ｇ／分）まで高める作業は３４時間の時点で行った。５８時間の時点で７２Ｗ細胞を収穫した。
【００５４】
【表７】
2004535754.tif 000009
【００５５】
収穫した細胞をニトリル変換に使用するまで−６５から−７０℃で冷凍保存した。ニトリラーゼ活性しか持たない酵素触媒として使用するために、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ細胞を０．３５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加えた１０から５０％（湿細胞重量）の懸濁液をまず１時間かけて５０℃まで加熱し、ニトリラーゼ活性を測定可能なほど低下させることなく存在するニトリルヒドラターゼ酵素およびアミダーゼ酵素を失活させた。５０℃での熱処理を施していないため、ニトリラーゼ活性ならびにニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を持つＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ細胞では、３−ヒドロキシ吉草酸の収率がニトリラーゼのみを含有する熱処理細胞の場合と同様であった。
【００５６】
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）株の２種類の変異体が調製されている（本願明細書に援用する米国特許第５，８５８，７３６号）が、この変異体では、脂肪族ジニトリルの非位置選択的なニトリル加水分解につながる望ましくないニトリルヒドラターゼ活性が極めて低いレベルでしか発生しない。これらのニトリルヒドラターゼ欠乏変異株であるＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ  ５５７４７）およびＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ  ５５７４５）では、３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に加水分解するための酵素触媒として使用する前に細胞を熱処理しなくてよい。ニトリラーゼの位置選択性が不要な場合には、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）株を熱処理して非位置選択性のニトリルヒドラターゼ活性を失活させる必要はない。
【００５７】
細胞抽出物の調製：
この手順に含まれる工程については、いずれも５℃およびｐＨ７．５で実施した。１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および２．０ｍＭのジチオトレイトール中にて、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１８５３）湿細胞ペーストの２５ｗｔ％懸濁液を調製した。また、従来技術において周知の方法でフレンチプレス（米国メリーランド州シルバースプリングスのアメリカンインスツルメント社）に通し、上記懸濁液の抽出物を調製した。２７，５００ｇで３０分間遠心分離して細胞片を除去し、細胞抽出物を調製した。
【００５８】
３−ヒドロキシバレロニトリルの調製：
３−ヒドロキシバレロニトリルについては、シアン化水素と１，２−エポキシブタンとをトリエチルアルミニウム（フランス特許第１４４６１２７号）の存在下で反応させる方法ならびにジ−ｎ−ブチルボリルトリフレートの存在下でのアセトニトリルおよびプロピオンアルデヒドの反応（Ｈａｍａｎａら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４０１〜１４０４（１９８２））によって過去に調製されている。光学的に活性の３−ヒドロキシバレロニトリルについては、２−シアノ−１−メチルエチルアセテートのリパーゼ触媒加水分解によって過去に調製されている（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：９１６５〜９１７２（１９９７））。
【００５９】
３−ヒドロキシニトリルの３−ヒドロキシカルボン酸への加水分解：
たとえば３−ヒドロキシバレロニトリルなどの３−ヒドロキシニトリルと適当な酵素触媒の水性懸濁液とを混合し、加水分解反応を実施する。酵素触媒には、微生物細胞全体を前処理なしで用いることが可能である。あるいは、このような細胞をポリマーマトリックス（アルギン酸ビーズまたはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）粒子など）の中または不溶性固体支持体（セライトなど）の表面に固定化し、酵素触媒の回収および再利用をしやすくすることも可能である。また、細胞全体から酵素（単数もしくは複数）を単離して触媒として直接利用してもよいし、この酵素（単数もしくは複数）をポリマーマトリックス中または不溶性支持体表面に固定化してもよい。細胞または単離した酵素を固定化するための方法は広く報告されており、当業者間で周知である（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ編；  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、ＵＳＡ；１９９７）。
【００６０】
水性反応混合物中における酵素触媒の濃度は酵素触媒ごとの触媒活性に左右され、所望の反応速度が得られるように選択される。加水分解反応で触媒として用いられる微生物細胞の湿細胞重量は一般に、総反応容量１ｍＬあたりの湿細胞で０．００１グラムから０．１００グラムの範囲であり、好ましくは１ｍＬあたりの湿細胞で０．００２グラムから０．０５０グラムの範囲である。微生物細胞の比活性（ＩＵ／グラム湿細胞ｗｔ．）については、微生物細胞触媒の既知の重量を利用して、３−ヒドロキシバレロニトリルの０．１０Ｍ溶液が２５℃で３−ヒドロキシ吉草酸に変換される率を測定して求める。酵素活性のＩＵ（国際単位）は、毎分１マイクロモルの基質を生成物に変換するのに必要な酵素活性量と定義される。
【００６１】
反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を最適化できるように加水分解反応の温度を選択する。反応の温度は懸濁液の氷点（約０℃）を微妙に上回る温度から６５℃までの範囲であればよいが、好ましい反応温度の範囲は５℃から３５℃である。反応の初期ｐＨを５．０から１０．０の間に維持し、好ましくは６．０から９．０の間に維持する蒸留水または緩衝液の水溶液中に細胞を懸濁させ、微生物細胞触媒の懸濁液を調製してもよい。反応が進むにつれて、対応するニトリル官能基からカルボン酸のアンモニウム塩が形成されて反応混合物のｐＨが変化する場合がある。ｐＨを制御せずに反応を実施して３−ヒドロキシニトリルの変換を完了させてもよいし、反応実施時に好適な酸または塩基を加えて所望のｐＨを維持するようにしてもよい。
【００６２】
３−ヒドロキシバレロニトリルは、２５℃においてどのような比率でも水に完全に混和することが明らかになった。３−ヒドロキシバレロニトリルの溶解性が水性相における溶液の温度および／または塩濃度（緩衝液または生成物の３−ヒドロキシ吉草酸アンモニウム塩）にも左右されるように反応条件を選択する場合、最初に酵素触媒と溶存３−ヒドロキシバレロニトリルとを含有する水性相および有機相（溶解していない３−ヒドロキシバレロニトリル）の２つの相で反応混合物を構成するようにしてもよい。反応が進むにつれて、３−ヒドロキシバレロニトリルが水性相に溶解し、最終的には単相の混合生成物が得られる。３−ヒドロキシバレロニトリルを酵素加水分解による反応速度とほぼ同じ速度で反応混合物に加え、単相の水性反応混合物を維持し、かつ開始材料濃度が高い場合に酵素の基質阻害が起こる潜在的な問題を回避して、反応を実施してもよい。
【００６３】
３−ヒドロキシ吉草酸は、プロトン化カルボン酸とその対応するアンモニウム塩（混合生成物のｐＨに依存）との混合物として混合生成物に存在してもよいし、混合生成物中にさらに含有させることが可能な緩衝液と共にカルボン酸の塩としてさらに存在してもよい。３−ヒドロキシ吉草酸生成物については、必要に応じてプロトン化カルボン酸として反応混合物から単離することもできるし、カルボン酸の塩として単離することもできる。
【００６４】
３−ヒドロキシバレロニトリルの完全変換時の混合生成物中における３−ヒドロキシ吉草酸の最終濃度は０．００１Ｍから３−ヒドロキシ吉草酸生成物の溶解限界までの範囲であればよい。好ましくは、３−ヒドロキシ吉草酸の濃度を０．１０Ｍから２．０Ｍの範囲とする。（触媒の除去後に）濃塩酸を加えて反応混合物のｐＨを１．０から２．５の間に調整し、得られる溶液を塩化ナトリウムで飽和させ、メチルｔ−ブチルエーテル、エチルエーテルまたはジクロロメタンなどの好適な有機溶媒を用いて３−ヒドロキシ吉草酸を抽出して、混合生成物から３−ヒドロキシ吉草酸を単離してもよい。この混合有機抽出物を混合し、好適な乾燥剤（硫酸マグネシウムなど）と一緒に攪拌し、濾過し、（ロータリーエバポレーションなどにより）溶媒を除去して、所望の生成物を高収率および高純度（一般に純度９８〜９９％）で生成する。必要であれば、この生成物を再結晶化または蒸留によってさらに精製してもよい。
【００６５】
３−ヒドロキシバレロニトリルについて上述した方法（添付の実施例を参照）と同様の方法を用いて３−ヒドロキシプロピオニトリルを３−ヒドロキシプロピオン酸に酵素加水分解し、３−ヒドロキシプロピオニトリルの完全変換時に３−ヒドロキシプロピオン酸を９９％から１００％の収率で生成した。本発明の方法によって対応する３−ヒドロキシカルボン酸に変換できる他の３−ヒドロキシニトリルとしては、３−ヒドロキシブチロニトリル、３−ヒドロキシヘキサンニトリル、３−ヒドロキシヘプタンニトリル、３−ヒドロキシオクタンニトリル、３−ヒドロキシノナンニトリル、３−ヒドロキシ−３−イソプロピル−４−メチルペンタンニトリル、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリル、２−プロピル−３−ヒドロキシペンタンニトリルおよび３−ヒドロキシ−３−メチル−ｎ−ペンタンニトリルが挙げられるが、これに限定されるものではない。３−ヒドロキシニトリル（またはその加水分解生成物）が水に完全に混和するものではない場合、上述したように当業者間で周知の方法を用いて水性／有機反応混合物の２相で反応を実施する。
【００６６】
少なくとも２つの繰返し単位が、構造Ｒ１Ｏ−ＣＲ４Ｒ５ＣＲ６Ｒ７Ｃ（Ｏ）ＯＲ１で表される少なくとも１種の線状３−ヒドロキシカルボン酸またはそのエステルと、構造（Ｒ２Ｏ）ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ１］ｍで表される少なくとも１種の高分枝性ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル（式中、Ｒはｎ＋ｍの自由原子価をもつＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ１はＨ、Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基またはヒドロキシル置換Ｃ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７はＨまたはＣ１〜１２ヒドロカルビル基であり、Ｒ２はＨまたは（Ｏ）ＣＲ３であり、ｎ＋ｍは３またはそれ以上であり、ただしｎおよびｍの一方は１である）と、から誘導される高度に分枝したコポリエステルを生成するために本願明細書にて説明する重合ではいずれも、これらの繰返し単位を、ヒドロキシカルボン酸のエステルなどのポリエステルを形成する等価な化合物から誘導することも可能である。化合物（Ｒ２Ｏ）ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ’］ｍは、三官能性またはそれ以上であることから、高分枝性モノマーと呼ばれる場合がある。このような重合時に上記のようなモノマーが２種類以上存在していてもよい。ｎ＋ｍが３または４であると好ましい。従来技術において周知の通常のエステル化触媒を上記のモノマーと併用し、ポリエステルを形成するようにしてもよい（たとえば、プロトン酸、ルイス酸、あるいは、スルホン酸、リン酸およびホスホン酸をはじめとする塩基性触媒、チタンアルコキシド、ジアルキルスズオキシド、さらにはスズ、亜鉛、マンガン、カルシウム、マグネシウムまたはアンチモンの酸化物、炭酸塩およびカルボン酸塩など）。ポリエステルを製造するための方法は従来技術において周知である。
【００６７】
以下の実施例は、本発明をさらに説明することを目的とするものであって、本発明を限定するものではない。この実施例における３−ヒドロキシニトリルの回収率（％）および３−ヒドロキシカルボン酸および３−ヒドロキシカルボン酸アミドの収率（％）は、反応混合物に含まれる３−ヒドロキシニトリルの最初の量を基準にして求めた。このデータは、屈折率検出器と、１０ｍＭ酢酸／１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液に７．５％（ｖ／ｖ）のメタノールを加えた溶液を移動相とした（３−ヒドロキシバレロニトリル反応用）Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−ＤＢカラム（１５ｃｍ×直径４．６ｍｍ）または０．０１Ｎの硫酸を移動相とした（３−ヒドロキシプロピオニトリル反応用）Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３０ｃｍ×直径７．８ｍｍ）のいずれかとを用いて、ＨＰＬＣによって求めたものである。以下の実施例で述べる３−ヒドロキシ吉草酸の単離後の収率は、生成物を完全に回収すべく最適化したものではない。
【００６８】
実施例
細胞培養の管理と増殖に適した材料および方法が従来技術において周知である。以下の実施例において使用するのに適した手法が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ；  Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編；  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４）またはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版；  Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．：  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）などに記載されている。特に明記しない限り、細菌細胞の増殖および管理に用いる試薬および材料はいずれも、アルドリッチケミカルズ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（ミシガン州デトロイト）、ギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）またはシグマケミカル社（ミズーリ州セントルイス）から入手した。
【００６９】
略語の意味は以下のとおりである。「ｈ」は時間（単数もしくは複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数もしくは複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数もしくは複数）を意味し、「ｄ」は日（単数もしくは複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
【００７０】
比較例
Ｆｏｒｄ、Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．、Ｃｏｌｌ．第ＩＩＩ巻：３４〜３６（１９５５）による、水酸化バリウム水溶液を用いた３−ヒドロキシバレロニトリルの加水分解
オーバーヘッドスターラー、滴下漏斗および加熱用マントルを取り付けた１リットル容の三首丸底フラスコに、水酸化バリウム八水和物（３６ｇ、０．１１モル）を仕込み、フラスコを９１℃まで加熱した。水酸化バリウムをその結晶水に溶解させた後、８９℃にて３−ヒドロキシバレロニトリル（３２．７ｇ、０．３３モル）を滴下しながら添加した。添加を終えた後、反応混合物をさらに４０分間攪拌した。続いてこのフラスコにセライト１５ｇと蒸留水３６７ｇとを加え、得られた混合物を９０℃に維持しつつ、この反応混合物にドライアイス１６．２ｇを加えて二酸化炭素で飽和させた。反応混合物を濾過し、固形分をフラスコに戻し、続いて水２００ｇを加え、９０℃にて攪拌しながらさらに２０分間混合物を加熱した。反応混合物を再度濾過し、ガスクロマトグラフィおよびＩＲ分光法によって混合濾液の３−ヒドロキシ吉草酸の有無を分析した。最終的な混合生成物に３−ヒドロキシ吉草酸は検出されなかった。
【００７１】
実施例１
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（０．４４８Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．４４４ｇ（０．４４８Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．５０９ｇ（乾燥細胞重量で０．１０７ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。２．０時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００７２】
実施例２
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（０．４００Ｍ）の加水分解
（ビス−トリス緩衝液、ｐＨ６．０）
０．３９７ｇ（０．４００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．２５７ｇ（乾燥細胞重量で０．０５４２ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とを水性ビス−トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。７２．０時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００７３】
実施例３
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（０．４００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０）
０．３９７ｇ（０．４００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．２６５ｇ（乾燥細胞重量で０．０５６０ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。７．５時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００７４】
実施例４
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（０．４００Ｍ）の加水分解
（Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、ｐＨ９．０）
０．３９７ｇ（０．４００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．２２２ｇ（乾燥細胞重量で０．０４６８ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とをＢｉｃｉｎｅ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。７．５時間後、３−ヒドロキシ吉草酸アミドは残っておらず、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は９９％であった。
【００７５】
実施例５
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１抽出物を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（０．４００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
１ｍＭのジチオトレイトールと０．１Ｍのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）とを含有する０．１０Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．６９ｍＬに湿細胞１．６９ｇを懸濁させ、続いてこの懸濁液をフレンチプレスに通して、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１の細胞抽出物を調製した。得られた混合物を遠心分離し、上清（細胞抽出物２．０７ｍＬ）を得られたペレットからデカントした。０．１３７ｍＬのＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞抽出物と０．１９８ｇ（０．４００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルとを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。４５時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００７６】
実施例６
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（１．００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．４９６ｇ（１．００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．２９６ｇ（乾燥細胞重量で０．０６２５ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．４００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。２４時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００７７】
実施例７
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（２．００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．９９１ｇ（２．００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．５１６ｇ（乾燥細胞重量で０．１０９ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．９００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。２６．５時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換は１００％、３−ヒドロキシ吉草酸および３−ヒドロキシ吉草酸アミドの収率はそれぞれ９９％および１％であった。
【００７８】
実施例８
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシ吉草酸（０．９７５Ｍ）の調製
（緩衝液なし）
９．６６ｇ（０．９７５Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で７．２０ｇのＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とを蒸留水に加えた反応混合物１００ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．９００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。３−ヒドロキシバレロニトリルの完全な変換は５時間後に起こり、３−ヒドロキシ吉草酸が唯一の生成物であった。この反応混合物を遠心分離し、上清をデカントした。細胞ペレットを水３０ｍＬで洗浄し、洗浄液と上清との混合物を濾過（０．２２ミクロン）し、濃ＨＣｌを用いてｐＨ１．１０に調整した。得られた溶液を塩化ナトリウムで飽和させ、続いて１００ｍＬずつのエチルエーテルを１０回用いて抽出した。この混合有機抽出物を硫酸マグネシウム上にて乾燥させ、濾過し、高真空下での蒸留によってエーテルを除去したところ、収率は３−ヒドロキシ吉草酸８．９９ｇ（収率７９％）であった。
【００７９】
実施例９
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（０．４００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．３９７ｇ（０．４００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．５００ｇ（乾燥細胞重量で０．０８６ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞とをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。４．０時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００８０】
実施例１０
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（１．００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．４９６ｇ（１．００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．２５１ｇ（乾燥細胞重量で０．０４３２ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞とをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．４００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。２４時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００８１】
実施例１１
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（２．００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．９９１ｇ（２．００Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．５２４ｇ（乾燥細胞重量で０．０９０ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞とをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．９００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１４４時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００８２】
実施例１２
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシ吉草酸（１．００Ｍ）の調製
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
３００ｇ（１．０Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で１３４ｇのＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞とを２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加えた反応混合物３Ｌを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．９００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。３−ヒドロキシバレロニトリルの完全な変換は４６．５時間後に起こり、３−ヒドロキシ吉草酸が唯一の生成物であった。この反応混合物を遠心分離し、上清をデカントした。この上清を濾過（分子量３０，０００で切り捨て）した後、濃ＨＣｌを用いてｐＨ１．９に調整した。得られた溶液を塩化ナトリウムで飽和させ、続いて１．５Ｌずつのエチルエーテルを４回用いて抽出した。この混合有機抽出物を硫酸マグネシウム上にて乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーションによってエーテル溶液を２．４Ｌまで濃縮した。このエチルエーテル濃縮物にヘキサン（１．６Ｌ）を加え、得られた混合物をドライアイス／アセトン中にて冷却した。得られた結晶性沈殿を真空濾過によって捕集し、冷却したヘキサンで洗浄し、真空下にて乾燥させたところ、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は２７４ｇ（収率７７％；融点４３．０〜４４．５℃）であった。
【００８３】
実施例１３
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリルの加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ（ＡＴＣＣ  ５５７４６）細胞を０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加えた５０ｗｔ％の細胞懸濁液（湿細胞重量で０．２５ｇ、乾燥細胞重量で０．０６０ｇ）を調製し、続いて５０℃で０．５時間加熱してニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を失活させた。加熱処理したＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ細胞懸濁液（ニトリラーゼ活性のみを持つ）０．５０ｍＬと、３−ヒドロキシバレロニトリル２５．４ｍｇ（５１．２ｍＭ）とを含む反応混合物に５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて全体の容積が５．０ｍＬになるようにし、２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１８時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は９９％であった。
【００８４】
実施例１４
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリルの加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
２５．１ｍｇ（５０．６ｍＭ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．１９２６ｇ（乾燥細胞重量で０．０４６ｇ）のＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ  ７２Ｗ細胞（ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を失活させるために５０℃で細胞を加熱処理していない）とを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１８時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸および３−ヒドロキシ吉草酸アミドの収率はそれぞれ９７％および３％であった。
【００８５】
実施例１５
Ｄｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（０．４０９Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．２０３ｇ（０．４０９Ｍ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．２５８ｇのＤｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１細胞とをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。３０時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００８６】
実施例１６
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリルの加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
２５．０ｍｇ（５０．４ｍＭ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．２５８ｇのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ５Ｂ−ＭＧＮ−２Ｐ細胞とをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。４７時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸および３−ヒドロキシ吉草酸アミドの収率はそれぞれ９６％および１．１％であった。
【００８７】
実施例１７
Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．３ＬＤ−１２２Ｐ細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリルの加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
２５．７ｍｇ（５１．９ｍＭ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．３３９ｇのＳｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．３ＬＤ−１２２Ｐ細胞とをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物５ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．１００ｍＬ）を蒸留脱イオン水０．１００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６ＮのＨＣｌ０．０１５ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。７５時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００８８】
実施例１８
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．２５−１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリルの加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
９９．２ｍｇ（１００ｍＭ）の３−ヒドロキシバレロニトリルと湿細胞重量で０．５０ｇのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．２５−１細胞とをリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．３００ｍＬ）を６ＮのＨＣｌ０．０３２ｍＬと混合し、濾過（分子量１０，０００で切り捨て）し、濾液をＨＰＬＣで分析した。１時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸が約１００ｍＭの濃度で生成された唯一観察された生成物であった。
【００８９】
実施例１９
アルギン酸カルシウムにおける細胞の固定化
実施例１９は、ＧＡ／ＰＥＩ架橋アルギン酸カルシウムへの細胞の一般的な固定化について示すものである。
【００９０】
マグネチックスターラーバーを取り付けた２５０ｍＬ容の培地用ボトル（ｍｅｄｉａ  ｂｏｔｔｌｅ）に蒸留脱イオン水６８．７ｇを入れた中に５０℃にてＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｏｔａｎａｌ（Ｒ）  ＬＦ  １０／６０アルギン酸塩３．３０ｇを高速に攪拌しながら加えた。アルギン酸塩が完全に溶解するまでこの混合物を高速に攪拌しながら７５〜８０℃に加熱し、得られた溶液を水浴中にて２５℃まで冷却した。Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞（湿細胞重量で２８．６ｇ、乾燥細胞重量で２１％）を０．１８５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（１９．４ｍＬ、ｐＨ７．０）に加えた懸濁液を２５℃で調製し、２５℃にて攪拌しながらアルギン酸塩溶液に添加した。この細胞／アルギン酸塩混合物を２５℃にて攪拌しながら注射器で滴下することで０．２０Ｍの酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）６４０ｍＬに加えた。２時間攪拌した後、得られたビーズから緩衝液をデカントし、このビーズを０．２０Ｍの酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）２９３ｍＬに２５℃にて再懸濁させた。攪拌しながら、２５ｗｔ％のグルタルアルデヒド（ＧＡ）６．０ｇを水に加えたものを添加し、２５℃で１．０時間かけてビーズを混合した。次に、この懸濁液に１２．５ｗｔ％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ＢＡＳＦ  Ｌｕｐａｓｏｌ（Ｒ）  ＰＲ９７１Ｌ、平均分子量約７５０，０００）２４．０ｇを水に加えたものを添加し、ビーズを２５℃にてさらに１時間混合した。続いて、架橋したビーズを０．２０Ｍの酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍＬで２５℃にて２回洗浄し、同じ緩衝液中に５℃にて保管した。
【００９１】
実施例２０
固定化したＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（１．０Ｍ）の加水分解
（緩衝液なし）
５０ｍＬ容のジャケット付き反応容器（再循環温度浴を用いて１５℃で温度制御）に、実施例１９で説明したようにして調製したＧＡ／ＰＥＩ架橋Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞／アルギン酸ビーズ４．０ｇを仕込んだ。この反応容器に、蒸留脱イオン水１３．４５ｍＬと、０．２０Ｍの酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度５．０ｍＭ）０．５ｍＬと、３−ヒドロキシバレロニトリル２．０５ｍＬ（１．９８ｇ、１．０Ｍ）とを加え、混合物を１５℃で攪拌した。反応混合物の試料（０．１００ｍＬ）を水０．４００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料０．２００ｍＬを、０．２００Ｍの酪酸ナトリウム（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬを水に加えた溶液および６．０Ｎの氷酢酸０．０２０ｍＬと混合した。得られた試料を遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。２４．２５時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は９９．８％であった。
【００９２】
実施例２１
固定化したＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（１．０Ｍ）の加水分解
（緩衝液なし）
５０ｍＬ容のジャケット付き反応容器（再循環温度浴を用いて２５℃で温度制御）に、実施例１９において説明した方法で調製したＧＡ／ＰＥＩ架橋Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞／アルギン酸ビーズ４．０ｇを仕込んだ。この反応容器に、蒸留脱イオン水１３．４５ｍＬと、０．２０Ｍの酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度５．０ｍＭ）０．５ｍＬと、３−ヒドロキシバレロニトリル２．０５ｍＬ（１．９８ｇ、１．０Ｍ）とを加え、混合物を２５℃で攪拌した。反応混合物の試料（０．１００ｍＬ）を水０．４００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料０．２００ｍＬを、０．２００Ｍの酪酸ナトリウム（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬを水に加えた溶液および６．０Ｎの氷酢酸０．０２０ｍＬと混合した。得られた試料を遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。７時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００９３】
反応終了時、混合生成物を触媒ビーズからデカントした。触媒については、上述したような条件下で続く３回の連続したバッチ反応で再利用した。反応２、３、４では、それぞれ９時間、９時間、５時間の時点での３−ヒドロキシ吉草酸の収率が９９．７％、９９．７％、９９．６％であった。再利用した材料での４回目の反応が終わった時点で、最終的な混合生成物中における３−ヒドロキシ吉草酸の最終濃度は１．２９Ｍであった。
【００９４】
実施例２２
固定化したＤｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１細胞を用いた３−ヒドロキシバレロニトリル（１．０Ｍ）の加水分解
（緩衝液なし）
５０ｍＬ容のジャケット付き反応容器（再循環温度浴を用いて２５℃で温度制御）に、実施例１９において説明した方法で調製したＧＡ／ＰＥＩ架橋Ｄｉｅｔｚｉａ  ｓｐ．ＡＤＬ１細胞／アルギン酸ビーズ４．０ｇを仕込んだ。この反応容器に、蒸留脱イオン水１３．４５ｍＬと、０．２０Ｍの酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度５．０ｍＭ）０．５ｍＬと、３−ヒドロキシバレロニトリル２．０５ｍＬ（１．９８ｇ、１．０Ｍ）とを加え、混合物を２５℃で攪拌した。反応混合物の試料（０．１００ｍＬ）を水０．４００ｍＬと混合し、続いてこの希釈試料０．２００ｍＬを、０．２００Ｍの酪酸ナトリウム（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬを水に加えた溶液および６．０Ｎの氷酢酸０．０２０ｍＬと混合した。得られた試料を遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。２３時間後、３−ヒドロキシバレロニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は９８．６％であった。
【００９５】
実施例２３
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．１００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．０７１１ｇ（０．１００Ｍ）の３−ヒドロキシプロピオニトリルと湿細胞重量で０．３８ｇ（乾燥細胞重量で０．０８０ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．２００ｍＬ）を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６Ｎの酢酸０．０２０ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１．０時間後、３−ヒドロキシプロピオニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００９６】
実施例２４
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．４００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．２８４３ｇ（０．４００Ｍ）の３−ヒドロキシプロピオニトリルと湿細胞重量で０．３８ｇ（乾燥細胞重量で０．０８０ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．２００ｍＬ）を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６Ｎの酢酸０．０２０ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１．０時間後、３−ヒドロキシプロピオニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は９９％であった。
【００９７】
実施例２５
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞を用いた３−ヒドロキシプロピオニトリル（１．００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．７１０８ｇ（１．００Ｍ）の３−ヒドロキシプロピオニトリルと湿細胞重量で０．４４ｇ（乾燥細胞重量で０．０９２ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ２２−１細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．２００ｍＬ）を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６Ｎの酢酸０．０２０ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１５．０時間後、３−ヒドロキシプロピオニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００９８】
実施例２６
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．１００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．０７１１ｇ（０．１００Ｍ）の３−ヒドロキシプロピオニトリルと湿細胞重量で０．３７ｇ（乾燥細胞重量で０．０７０ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．２００ｍＬ）を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６Ｎの酢酸０．０２０ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１．０時間後、３−ヒドロキシプロピオニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【００９９】
実施例２７
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．４００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．２８４３ｇ（０．４００Ｍ）の３−ヒドロキシプロピオニトリルと湿細胞重量で０．３９ｇ（乾燥細胞重量で０．０７４ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．２００ｍＬ）を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６Ｎの酢酸０．０２０ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１．０時間後、３−ヒドロキシプロピオニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【０１００】
実施例２８
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシプロピオニトリル（１．００Ｍ）の加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．７１０８ｇ（１．００Ｍ）の３−ヒドロキシプロピオニトリルと湿細胞重量で０．４２ｇ（乾燥細胞重量で０．０７９ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合した。試料（０．２００ｍＬ）を０．２００Ｍの酪酸ナトリウム水溶液（ＨＰＬＣ外部標準）０．２００ｍＬおよび６Ｎの酢酸０．０２０ｍＬと混合し、遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。１５．０時間後、３−ヒドロキシプロピオニトリルの変換率は１００％であり、３−ヒドロキシ吉草酸の収率は１００％であった。
【０１０１】
実施例２９
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞を用いた３−ヒドロキシニトリルの加水分解
（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）
０．１００Ｍから１．０Ｍの３−ヒドロキシニトリル（以下の表に列挙）と湿細胞重量で０．３７ｇ（乾燥細胞重量で０．０７０ｇ）のＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ細胞とを水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に加えた反応混合物１０ｍＬを２５℃で混合する。試料（０．２００ｍＬ）をＨＰＬＣ外部標準溶液０．２００ｍＬおよび６Ｎの酢酸０．０２０ｍＬと混合し、遠心分離し、各上清をＨＰＬＣで分析する。３−ヒドロキシニトリルが完全に変換された時点で、３−ヒドロキシカルボン酸の収率は９９％から１００％であると思われる。
【０１０２】
【表８】
2004535754.tif 000010
【０１０３】
実施例３０
３−ヒドロキシ吉草酸およびジメチロールプロピオン酸からスズ（ＩＩ）触媒を用いて高度に分枝したコポリエステルを合成
メカニカルスターラーと、熱電対と、窒素流下での復水器付き短路（ｓｈｏｒｔ  ｐａｔｈ）蒸留ヘッドとを設けた５００ｍＬ容の三首フラスコに、ジメチロールプロピオン酸（５０ｇ、０．３７モル）と、３−ヒドロキシ吉草酸（４９．６ｇ、０．４２モル）と、スズ（ＩＩ）ジ（２−エチルヘキサン酸）（Ｓｎ（Ｏ２ＣＣ７Ｈ１５）２（１ｇ、０．００２５モル）と、キシレン（１０ｇ）とを仕込み、１８０℃で加熱した。酸価の測定値と回収された水の量とによって反応の進み具合をモニタリングした。１２時間後、水１４ｍＬが回収された。試料１ｇを抜き出し、ジメチルスルホキシド１０ｍＬに溶解し、０．１Ｎの水酸化カリウムのメタノール溶液で滴定して酸価（１７）を求めた。合計で２１時間経過後、酸価が５．８になった時点で反応を停止（ヒートオフ）した。高温で粘性のある透明な黄色いポリマーが反応器から吐出された。このポリマーのＭｗを、ジメチルアセトアミド中にて１３５℃でポリスチレン標準に対するゲル透過クロマトグラフィで求めたところ、１９，１００であり、固有粘度は０．１０１、示差走査熱量測定で求めたＴｇ＝０℃であった。これは、３−ヒドロキシ吉草酸の代わりにε−カプロラクトンを用いた類似のコポリマーのＴｇ＝−２８℃と比して望ましい形で有意に高い値であった。
【０１０４】
実施例３１
３−ヒドロキシ吉草酸およびジメチロールプロピオン酸からプロトン酸触媒を用いて高度に分枝したコポリエステルを合成
メカニカルスターラーと、熱電対と、窒素流下での復水器付き短路蒸留ヘッドとを設けた５００ｍＬ容の三首フラスコに、ジメチロールプロピオン酸（５０ｇ、０．３７モル）と、３−ヒドロキシ吉草酸（４９．６ｇ、０．４２モル）と、ドデシルベンゼンスルホン酸（０．３ｇ、０．０００９２モル）と、キシレン（１０ｇ）とを仕込み、溶融するまで１７２℃で２０分間加熱した後、加熱を１４０℃まで落とした。酸価の測定値と回収された水の量とによって反応の進み具合をモニタリングした。１２時間後、水９ｍＬが回収された。試料１ｇを抜き出し、ジメチルスルホキシド１０ｍＬに溶解し、０．１Ｎの水酸化カリウムのメタノール溶液で滴定して酸価（１０６）を求めた。１４時間後、反応温度を１６０℃まで上昇させた。合計で１７時間経過後の酸価は１００であり、合計で４０時間経過後の酸価は６８であった。合計で４３時間経過後、反応温度を１８０℃まで上昇させた。合計で５７時間経過後、酸価が４９になった時点で反応を停止（ヒートオフ）した。高温で粘性のある透明な黄色いポリマーが反応器から吐出された。このポリマーのＭｗを、ジメチルアセトアミド中にて１３５℃でポリスチレン標準に対するゲル透過クロマトグラフィで求めたところ、４，２００であり、固有粘度は０．００４５、示差走査熱量測定で求めたＴｇ＝−１３℃であった。これは、３−ヒドロキシ吉草酸の代わりにε−カプロラクトンを用いた類似のコポリマーのＴｇ＝−２８℃と比して望ましい形で有意に高い値であった。
【０１０５】
実施例３２
３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸およびジメチロールプロピオン酸からスズ（ＩＩ）触媒を用いて高度に分枝したコポリエステルを合成
メカニカルスターラーと、熱電対と、窒素流下での復水器付き短路蒸留ヘッドとを設けた５００ｍＬ容の三首フラスコに、ジメチロールプロピオン酸（１００ｇ、０．７４モル）と、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸（２００ｇ、０．９８モル）と、スズ（ＩＩ）ジ（２−エチルヘキサン酸）（Ｓｎ  （Ｏ２ＣＣ７Ｈ１５）２（２ｇ、０．００５モル）と、キシレン（１０ｇ）とを仕込み、１８０℃で加熱した。酸価の測定値と回収された水の量とによって反応の進み具合をモニタリングした。合計で１２時間経過後に反応を停止（ヒートオフ）させ、水２０ｍＬを回収し、試料１ｇを抜き出し、ジメチルスルホキシド１０ｍＬに溶解し、０．１Ｎの水酸化カリウムのメタノール溶液で滴定して酸価（１．１）を求めた。高温で粘性のある透明なポリマーが反応器から吐出された。このポリマーのＭｗおよび多分散性を、ジメチルアセトアミド中にて１３５℃でポリスチレン標準に対するゲル透過クロマトグラフィで求めたところ、それぞれ１，４００および２．９であった。また、固有粘度は０．０１９、示差走査熱量測定で求めたＴｇ＝−２８℃であった。これは、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピル−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸の代わりにε−カプロラクトンを用いた類似のコポリマーのＴｇ＝−３８℃と比して望ましい形で有意に高い値であった。
【０１０６】
実施例３３
スズ（ＩＩ）触媒を用いて３−ヒドロキシ吉草酸およびトリメチロール酢酸から高度に分枝したコポリエステルを合成
２０ｍＬ容のガラスバイアルに、トリメチロール酢酸（１ｇ、０．００６７モル）と、３−ヒドロキシ吉草酸（１ｇ、０．００８５モル）と、スズ（ＩＩ）ジ（２−エチルヘキサン酸）（Ｓｎ  （Ｏ２ＣＣ７Ｈ１５）２（０．０１ｇ、０．００００２５モル）とを仕込み、真空度２０ｉｎ．Ｈｇの真空オーブン中にて１５０℃で加熱した。酸価の測定値によって反応の進み具合をモニタリングした。合計で３．５時間経過後に反応を停止（ヒートオフ）させ、試料０．１ｇを抜き出し、ジメチルスルホキシドに溶解し、０．１Ｎの水酸化カリウムのメタノール溶液で滴定して酸価（１１２）を求めた。この透明なポリマーＴｇを示差走査熱量測定で求めたところ、−３℃であった。これは、３−ヒドロキシ吉草酸の代わりにε−カプロラクトンを用いた類似のコポリマーのＴｇ＝−３２℃と比して望ましい形で有意に高い値であった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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