(57)【要約】本発明において、癌（特に肺癌）の治療および診断のための組成物および方法が、開示される。本発明の例示的な組成物は、１つ以上の肺腫瘍ポリペプチド、それらの免疫原性部分、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、およびこのようなポリペプチドを発現する細胞に特異的なＴ細胞を含む。この開示された組成物は、例えば、疾患（特に肺癌）の診断、予防および／または処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列；
（ｂ）配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される該配列の相補体；
（ｃ）配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列の少なくとも２０個の連続する残基からなる配列；
（ｄ）中程度にストリンジェントな条件下で配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列にハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３の配列に少なくとも７５％同一性を有する配列；
（ｆ）配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３の配列に少なくとも９０％同一性を有する配列；ならびに
（ｇ）配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列の縮重改変体、からなる群より選択される配列を含む、ポリヌクレオチド
【請求項２】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号５８４〜５８７；
（ｂ）請求項１に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる配列；および
（ｃ）請求項１に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる配列に少なくとも７０％同一性を有する配列；および
（ｄ）請求項１に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる配列に少なくとも９０％同一性を有する配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
発現制御配列に作動可能に連結された、請求項１に記載されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載される発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項５】
請求項２に記載されるポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
患者において癌の存在を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）請求項２に記載されるポリペプチドに結合する結合因子と該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｃ）該結合因子に結合するポリペプチドの量を該サンプルにおいて検出する工程；および
（ｄ）予め決定されたカットオフ値と該ポリペプチドの量を比較して、そしてそこから該患者における癌の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項２に記載される少なくとも１つのポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項８】
中程度にストリンジェントな条件下で配列番号３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に示される配列にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
腫瘍タンパク質に対して特異的なＴ細胞を刺激ならびに／または拡張する方法であって、該方法は、Ｔ細胞の該刺激ならびに／または拡張を可能にするのに十分な条件下および時間で以下：
（ａ）請求項２に記載されるポリペプチド；
（ｂ）請求項１に記載されるポリヌクレオチド；および
（ｃ）請求項１に記載されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群より選択される少なくとも１つの成分とＴ細胞を接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載される方法に従って調製されるＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
【請求項１１】
生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫刺激剤からなる群より選択される第１の成分、ならびに以下：
（ａ）請求項２に記載されるポリペプチド；
（ｂ）請求項１に記載されるポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項５に記載される抗体；
（ｄ）請求項７に記載される融合タンパク質；
（ｅ）請求項１０に記載されるＴ細胞集団；および
（ｆ）請求項２に記載されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群より選択される第２の成分を含む、組成物。
【請求項１２】
患者において免疫応答を刺激する方法であって、該方法は、請求項１１に記載される組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
患者における癌の処置の方法であって、該方法は、請求項１１に記載される組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
患者における癌の存在を検出する方法であって、以下：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）請求項８に記載されるオリグヌクレオチドと該生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｃ）該オリグヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を該サンプルにおいて検出する工程；および
（ｄ）予め決定されたカットオフ値と該オリグヌクレオチドにハイブリダイズする該ポリヌクレオチドの量を比較して、そしてそこから該患者における該癌の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項８に記載される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、診断キット。
【請求項１６】
請求項５に記載される少なくとも１つの抗体および検出試薬を含む、診断キットであって、ここで、該検出試薬がレポーター基を含む、キット。
【請求項１７】
患者における癌の発達を阻害する方法であって、以下：
（ａ）（ｉ）請求項２に記載されるポリペプチド；（ｉｉ）請求項１に記載されるポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）請求項２に記載されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞、からなる群より選択される少なくとも１つの成分と患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞をインキュベートし、その結果、Ｔ細胞が増殖する工程；
（ｂ）該増殖Ｔ細胞の有効量を該患者に投与し、そしてそれにより該患者における癌の発達を阻害する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般に、癌（例えば、肺癌）の治療および診断に関する。本発明は、より具体的には、肺腫瘍タンパク質の少なくとも１部を含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、肺癌の診断および処置のための薬学的組成物（例えば、ワクチン）および他の組成物において有用である。
【０００２】
（発明の背景）
肺癌は、米国における男性および女性の両方の間における癌での死亡の主な原因であり、１９９４年には概算１７２，０００件の新しい症例が報告された。全ての肺癌患者の間における５年間の生存率は、診断時における疾患の病期に関わらず、たった１３％である。これは、検出される症例の間における４６％の５年間生存率と対照的であるが、この疾患は、なお局在される。しかし、肺癌の１６％のみしか、この疾患が広がる前に発見されない。
【０００３】
早期発見は難しい。なぜなら、臨床症状は、この疾患が進行した病期に達するまでしばしばみられないからである。現在のところ、診断は、胸部Ｘ線、痰に含まれる細胞型の分析および気管支道の光ファイバー試験の使用により補助される。処置の養生法は、癌の型および病期により決定され、そして手術、放射線治療および／または化学療法を含む。これらの疾患のための治療へのかなりの研究にも関わらず、肺癌は、処置することが困難なままである。
【０００４】
従って、当該分野において、肺癌のための改善されたワクチン、処置方法および診断技術の必要性が残っている。
【０００５】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、以下からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド組成物を提供する：
（ａ）配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列、
（ｂ）配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列の相補体、
（ｃ）配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列の少なくとも２０個連続する残基からなる配列、
（ｄ）中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列にハイブリダイズする配列、
（ｅ）配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３の配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する配列、
（ｆ）配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列、
（ｇ）配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に提供される配列の縮重改変体。
【０００６】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド組成物は、正常組織のレベルよりも、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、そして最も好ましくは少なくとも約１０倍高いレベルで、試験した肺腫瘍サンプルの少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、そして最も好ましくは少なくとも約５０％に発現される。
【０００７】
別の局面において、本発明は、上記のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
【０００８】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号３９１、３９３、３９５、３９７、４２１、４２５〜４２７、４３４〜４３９、および５８４〜５８７に示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
【０００９】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、免疫原性であり、すなわち、これらは、本明細書中にさらに記載されるように、免疫応答（特に、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を誘発し得る。
【００１０】
本発明はさらに、開示されるポリペプチド配列および／またはポリヌクレオチド配列のフラグメント、改変体および／または誘導体を提供し、ここで、このフラグメント、改変体および／または誘導体は、好ましくは、配列番号３９１、３９３、３９５、３９７、４２１、４２５〜４２７、４３４〜４３９、および５８４〜５８７に示されるポリペプチド配列または配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列の免疫原性活性のレベルの、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、およびより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性のレベルを有する。
【００１１】
本発明はさらに、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１２】
他の局面において、本発明は、上記のポリペプチドまたはポリヌクレオチドならびに生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００１３】
本発明の関連する局面において、予防適用または治療適用のための薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）が提供される。このような組成物は、一般的に、本発明の免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリヌクレオチドならびに免疫促進剤（例えば、アジュバント）を含む。
【００１４】
本発明はさらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。例示的な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【００１６】
関連する局面において、（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）免疫促進剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００１７】
他の局面において、本発明はさらに、上記のような少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、代表的に薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）（生理学的に受容可能なキャリアおよび／または免疫促進剤を含む）の形態で提供する。融合タンパク質は、本明細書中に記載されるような複数の免疫原性ポリペプチドまたはその一部／改変体を含み得、そしてさらに、ポリペプチドの発現、精製および／または免疫原性を促進する１つ以上のポリペプチドセグメントを含み得る。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は、患者における免疫応答（好ましくはヒト患者におけるＴ細胞応答）を刺激するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する。患者が、肺癌に冒され得る場合、この方法は、この疾患のための処置を提供するか、またはこのような疾患の危険性があると考えられる患者は、予防的に処置され得る。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発生を阻害するための方法を提供し、この方法は、上に列挙された薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する。患者が肺癌に冒され得る場合、この方法は、この疾患を処置するために提供され得るか、またはこのような疾患の危険があると考えられる患者は、予防的に処置され得る。
【００２０】
他の局面において、本発明はさらに、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去する方法を提供し、その方法は、生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞と接触させる工程を包含する。ここで接触させる工程は、サンプルから、このタンパク質を発現する細胞の除去を可能にするための十分な条件および時間で行われる。
【００２１】
関連する局面において、患者における癌の発生を阻害する方法が提供され、この方法は、上記のように処置された生物学的サンプルを、患者に投与する工程を包含する。
【００２２】
他の局面において、本発明のポリペプチドに特異的なＴ細胞を刺激および／または拡大するための方法がさらに提供され、この方法は、Ｔ細胞の刺激および／または拡大することを可能にするのに十分な条件および時間の下で、Ｔ細胞を、以下の１つ以上と接触させる工程を包含する：（ｉ）上記のポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞。上記のように調製されたＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団もまた、提供される。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発生を阻害するための方法を提供し、この方法は、上記のようなＴ細胞集団の有効量を、患者に投与する工程を包含する。
【００２４】
本発明は、さらに、患者における癌の発生を阻害するための方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の１以上とともにインキュベートする工程：（ｉ）本明細書中に開示されたポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリヌクレオチドを発現する抗原提示細胞；ならびに（ｂ）有効量の増殖したＴ細胞を患者に投与し、そしてそれによって患者における癌の発生を阻害する工程。増殖した細胞は、患者への投与の前にクローン化され得るが、それは必要ではない。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌（特に、肺癌）の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、上に列挙されたポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）この結合因子に結合するポリペプチドのサンプル中の量を検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドの量を、予め決定されたカットオフ値と比較し、それから患者における癌の存在または非存在を決定する工程。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２６】
他の局面において、本発明はまた、患者における癌の進行をモニタリングするための方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１の時点で、患者より得た生物学的サンプルを、上に列挙されたポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）この結合因子に結合するポリペプチドのサンプル中の量を検出する工程；（ｃ）続く時点で、患者より得た生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で検出されたポリペプチドの量を、工程（ｂ）で検出された量と比較し、そしてそれから、患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００２７】
他の局面において、本発明は、患者における癌の存在または非存在を決定するための方法をさらに提供し、その方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡ、のサンプル中のレベルを検出する工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを、予め決められたカットオフ値と比較し、それから患者における癌の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー（上に列挙されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする）を使用するポリメラーゼ連鎖反応を通じて検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーション技術を使用して検出される。
【００２８】
関連する局面において、患者における癌の進行をモニタリングするための方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのサンプル中の量を検出する工程；（ｃ）続く時点で、患者より得られた生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で検出されたポリヌクレオチドの量を、工程（ｂ）で検出された量と比較し、それから患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、上記のようにポリペプチドに結合するモノクローナル抗体のような抗体、ならびにそのような抗体を備える診断キットを提供する。上記のような１以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを供える診断キットもまた、提供される。
【００３０】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照すれば明確になる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、各々が個別に援用されるように、そのすべてが本明細書中で参考として援用される。
【００３１】
（配列識別子（ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＲＳ））
配列番号１は、Ｌ３６３Ｃ１．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２は、Ｌ２６３Ｃ２．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３は、Ｌ２６３Ｃ２ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４は、Ｌ２６３Ｃ１．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５は、Ｌ２６３Ｃ１ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号６は、Ｌ１６４Ｃ２．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号７は、Ｌ１６４Ｃ１．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号８は、Ｌ３６６Ｃ１ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号９は、Ｌ２６０Ｃ１．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、Ｌ１６３Ｃ１ｃに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１は、Ｌ１６３Ｃ１ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２は、Ｌ２５５Ｃ１．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３は、Ｌ２５５Ｃ１ｂに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４は、Ｌ３５５Ｃ１．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５は、Ｌ３６６Ｃ１．ｃｏｎｓに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６は、Ｌ１６３Ｃ１ａに対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７は、ＬＴ８６−１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８は、ＬＴ８６−２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１９は、ＬＴ８６−３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２０は、ＬＴ８６−４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１は、ＬＴ８６−５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２は、ＬＴ８６−６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３は、ＬＴ８６−７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４は、ＬＴ８６−８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５は、ＬＴ８６−９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６は、ＬＴ８６−１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７は、ＬＴ８６−１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８は、ＬＴ８６−１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９は、ＬＴ８６−１３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０は、ＬＴ８６−１４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１は、ＬＴ８６−１５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２は、ＬＴ８６−１に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号３３は、ＬＴ８６−２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号３４は、ＬＴ８６−３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号３５は、ＬＴ８６−４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号３６は、ＬＴ８６−５に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号３７は、ＬＴ８６−６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号３８は、ＬＴ８６−７に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号３９は、ＬＴ８６−８に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４０は、ＬＴ８６−９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４１は、ＬＴ８６−１０に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４２は、ＬＴ８６−１１に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４３は、ＬＴ８６−１２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４４は、ＬＴ８６−１３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４５は、ＬＴ８６−１４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４６は、ＬＴ８６−１５に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４７は、（ｄＴ）１２ＡＧプライマーである。
配列番号４８は、プライマーである。
配列番号４９は、Ｌ８６Ｓ−３に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０は、Ｌ８６Ｓ−１２に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１は、Ｌ８６Ｓ−１６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２は、Ｌ８６Ｓ−２５に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３は、Ｌ８６Ｓ−３６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４は、Ｌ８６Ｓ−４０に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５は、Ｌ８６Ｓ−４６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６は、Ｌ８６Ｓ−３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号５７は、Ｌ８６Ｓ−１２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号５８は、Ｌ８６Ｓ−１６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号５９は、Ｌ８６Ｓ−２５に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号６０は、Ｌ８６Ｓ−３６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号６１は、Ｌ８６Ｓ−４０に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号６２は、Ｌ８６Ｓ−４６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号６３は、Ｌ８６Ｓ−３０に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号６４は、Ｌ８６Ｓ−４１に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号６５は、ＬＴ８６−９の５’末端由来の推定アミノ酸配列である。
配列番号６６は、ＬＴ８６−４に対して決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号６７は、ＬＴ８６−４に対する推定伸長アミノ酸配列である。
配列番号６８は、ＬＴ８６−２０に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号６９は、ＬＴ８６−２１に対して決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７０は、ＬＴ８６−２２に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７１は、ＬＴ８６−２６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７２は、ＬＴ８６−２７に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７３は、ＬＴ８６−２０に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号７４は、ＬＴ８６−２１に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号７５は、ＬＴ８６−２２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号７６は、ＬＴ８６−２６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号７７は、ＬＴ８６−２７に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号７８は、Ｌ８６Ｓ−１２に対して決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号７９は、Ｌ８６Ｓ−３６に対して決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８０は、Ｌ８６Ｓ−４６に対して決定された伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８１は、Ｌ８６Ｓ−１２に対する推定伸長アミノ酸配列である。
配列番号８２は、Ｌ８６Ｓ−３６に対する推定伸長アミノ酸配列である。
配列番号８３は、Ｌ８６Ｓ−４６に対する推定伸長アミノ酸配列である。
配列番号８４は、Ｌ８６Ｓ−６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８５は、Ｌ８６Ｓ−１１に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８６は、Ｌ８６Ｓ−１４に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８７は、Ｌ８６Ｓ−２９に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８８は、Ｌ８６Ｓ−３４に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号８９は、Ｌ８６Ｓ−３９に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号９０は、Ｌ８６Ｓ−４７に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号９１は、Ｌ８６Ｓ−４９に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号９２は、Ｌ８６Ｓ−５１に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号９３は、Ｌ８６Ｓ−６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号９４は、Ｌ８６Ｓ−１１に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号９５は、Ｌ８６Ｓ−１４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号９６は、Ｌ８６Ｓ−２９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号９７は、Ｌ８６Ｓ−３４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号９８は、Ｌ８６Ｓ−３９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号９９は、Ｌ８６Ｓ−４７に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１００は、Ｌ８６Ｓ−４９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１０１は、Ｌ８６Ｓ−５１に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１０２は、ＳＬＴ−Ｔ１に対して決定されたＤＮＡ配列である。
配列番号１０３は、ＳＬＴ−Ｔ２に対して決定された５’ＤＮＡ配列である。
配列番号１０４は、ＳＬＴ−Ｔ３に対して決定された５’ＤＮＡ配列である。
配列番号１０５は、ＳＬＴ−Ｔ５に対して決定された５’ＤＮＡ配列である。
配列番号１０６は、ＳＬＴ−Ｔ７に対して決定された５’ＤＮＡ配列である。
配列番号１０７は、ＳＬＴ−Ｔ９に対して決定された５’ＤＮＡ配列である。
配列番号１０８は、ＳＬＴ−Ｔ１０に対して決定された５’ＤＮＡ配列である。
配列番号１０９は、ＳＬＴ−Ｔ１１に対して決定された５’ＤＮＡ配列である。
配列番号１１０は、ＳＬＴ−Ｔ１２に対して決定された５’ＤＮＡ配列である。
配列番号１１１は、ＳＬＴ−Ｔ１に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１１２は、ＳＬＴ−Ｔ２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１１３は、ＳＬＴ−Ｔ３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１１４は、ＳＬＴ−Ｔ１０に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１１５は、ＳＬＴ−Ｔ１２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１１６は、ＳＡＬＴ−Ｔ３に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１７は、ＳＡＬＴ−Ｔ４に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１８は、ＳＡＬＴ−Ｔ７に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１１９は、ＳＡＬＴ−Ｔ８に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２０は、ＳＡＬＴ−Ｔ９に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２１は、ＳＡＬＴ−Ｔ３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１２２は、ＳＡＬＴ−Ｔ４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１２３は、ＳＡＬＴ−Ｔ７に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１２４は、ＳＡＬＴ−Ｔ８に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１２５は、ＳＡＬＴ−Ｔ９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１２６は、ＰＳＬＴ−１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２７は、ＰＳＬＴ−２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２８は、ＰＳＬＴ−７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１２９は、ＰＳＬＴ−１３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３０は、ＰＳＬＴ−２７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３１は、ＰＳＬＴ−２８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３２は、ＰＳＬＴ−３０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３３は、ＰＳＬＴ−４０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３４は、ＰＳＬＴ−６９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３５は、ＰＳＬＴ−７１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３６は、ＰＳＬＴ−７３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３７は、ＰＳＬＴ−７９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３８は、ＰＳＬＴ−０３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１３９は、ＰＳＬＴ−０９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４０は、ＰＳＬＴ−０１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４１は、ＰＳＬＴ−０４１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４２は、ＰＳＬＴ−６２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４３は、ＰＳＬＴ−６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４４は、ＰＳＬＴ−３７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４５は、ＰＳＬＴ−７４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４６は、ＰＳＬＴ−０１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４７は、ＰＳＬＴ−０１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４８は、ＰＳＬＴ−０３７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号１４９は、ＳＡＬ−３に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５０は、ＳＡＬ−２４に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５１は、ＳＡＬ−２５に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５２は、ＳＡＬ−３３に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５３は、ＳＡＬ−５０に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５４は、ＳＡＬ−５７に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５５は、ＳＡＬ−６６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５６は、ＳＡＬ−８２に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５７は、ＳＡＬ−９９に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５８は、ＳＡＬ−１０４に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１５９は、ＳＡＬ−１０９に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６０は、ＳＡＬ−５に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６１は、ＳＡＬ−８に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６２は、ＳＡＬ−１２に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６３は、ＳＡＬ−１４に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６４は、ＳＡＬ−１６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６５は、ＳＡＬ−２３に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６６は、ＳＡＬ−２６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６７は、ＳＡＬ−２９に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６８は、ＳＡＬ−３２に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１６９は、ＳＡＬ−３９に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７０は、ＳＡＬ−４２に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７１は、ＳＡＬ−４３に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７２は、ＳＡＬ−４４に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７３は、ＳＡＬ−４８に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７４は、ＳＡＬ−６８に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７５は、ＳＡＬ−７２に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７６は、ＳＡＬ−７７に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７７は、ＳＡＬ−８６に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７８は、ＳＡＬ−８８に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１７９は、ＳＡＬ−９３に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８０は、ＳＡＬ−１００に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８１は、ＳＡＬ−１０５に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号１８２は、ＳＡＬ−３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１８３は、ＳＡＬ−２４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１８４は、ＳＡＬ−２５に対する第１の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８５は、ＳＡＬ−２５に対する第２の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８６は、ＳＡＬ−３３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１８７は、ＳＡＬ−５０に対する第１の推定アミノ酸配列である。
配列番号１８８は、ＳＡＬ−５７に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１８９は、ＳＡＬ−６６に対する第１の推定アミノ酸配列である。
配列番号１９０は、ＳＡＬ−６６に対する第２の推定アミノ酸配列である。
配列番号１９１は、ＳＡＬ−８２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１９２は、ＳＡＬ−９９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１９３は、ＳＡＬ−１０４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１９４は、ＳＡＬ−５に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１９５は、ＳＡＬ−８に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１９６は、ＳＡＬ−１２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１９７は、ＳＡＬ−１４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１９８は、ＳＡＬ−１６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号１９９は、ＳＡＬ−２３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２００は、ＳＡＬ−２６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０１は、ＳＡＬ−２９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０２は、ＳＡＬ−３２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０３は、ＳＡＬ−３９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０４は、ＳＡＬ−４２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０５は、ＳＡＬ−４３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０６は、ＳＡＬ−４４に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０７は、ＳＡＬ−４８に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０８は、ＳＡＬ−６８に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２０９は、ＳＡＬ−７２に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２１０は、ＳＡＬ−７７に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２１１は、ＳＡＬ−８６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２１２は、ＳＡＬ−８８に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２１３は、ＳＡＬ−９３に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２１４は、ＳＡＬ−１００に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２１５は、ＳＡＬ−１０５に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号２１６は、ＳＡＬ−５０に対する第２の推定アミノ酸配列である。
配列番号２１７は、ＳＳＬＴ−４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１８は、ＳＳＬＴ−９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２１９は、ＳＳＬＴ−１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である
配列番号２２０は、ＳＳＬＴ−１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２１は、ＳＳＬＴ−１９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２２は、ＳＳＬＴ−３１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２３は、ＳＳＬＴ−３８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２４は、ＬＴ４６９０−２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２５は、ＬＴ４６９０−３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２６は、ＬＴ４６９０−２２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２７は、ＬＴ４６９０−２４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２８は、ＬＴ４６９０−３７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２９は、ＬＴ４６９０−３９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３０は、ＬＴ４６９０−４０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３１は、ＬＴ４６９０−４１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３２は、ＬＴ４６９０−４９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３３は、ＬＴ４６９０−５５に対して決定された３’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３４は、ＬＴ４６９０−５５に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３５は、ＬＴ４６９０−５９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３６は、ＬＴ４６９０−６３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３７は、ＬＴ４６９０−７１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３８は、２ＬＴ−３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２３９は、２ＬＴ−６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４０は、２ＬＴ−２２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４１は、２ＬＴ−２５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４２は、２ＬＴ−２６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４３は、２ＬＴ−３１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４４は、２ＬＴ−３６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４５は、２ＬＴ−４２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４６は、２ＬＴ−４４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４７は、２ＬＴ−５４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４８は、２ＬＴ−５５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２４９は、２ＬＴ−５７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５０は、２ＬＴ−５８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５１は、２ＬＴ−５９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５２は、２ＬＴ−６２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５３は、２ＬＴ−６３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５４は、２ＬＴ−６５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５５は、２ＬＴ−６６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５６は、２ＬＴ−７０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５７は、２ＬＴ−７３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５８は、２ＬＴ−７４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２５９は、２ＬＴ−７６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６０は、２ＬＴ−７７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６１は、２ＬＴ−７８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６２は、２ＬＴ−８０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６３は、２ＬＴ−８５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６４は、２ＬＴ−８７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６５は、２ＬＴ−８９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６６は、２ＬＴ−９４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６７は、２ＬＴ−９５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６８は、２ＬＴ−９８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２６９は、２ＬＴ−１００に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７０は、２ＬＴ−１０３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７１は、２ＬＴ−１０５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７２は、２ＬＴ−１０７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７３は、２ＬＴ−１０８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７４は、２ＬＴ−１０９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７５は、２ＬＴ−１１８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７６は、２ＬＴ−１２０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７７は、２ＬＴ−１２１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７８は、２ＬＴ−１２２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７９は、２ＬＴ−１２４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８０は、２ＬＴ−１２６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８１は、２ＬＴ−１２７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８２は、２ＬＴ−１２８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８３は、２ＬＴ−１２９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８４は、２ＬＴ−１３３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８５は、２ＬＴ−１３７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８６は、ＬＴ４６９０−７１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８７は、ＬＴ４６９０−８２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８８は、ＳＳＬＴ−７４に対して決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２８９は、ＳＳＬＴ−７８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９０は、ＳＣＣ１−８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９１は、ＳＣＣ１−１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９２は、ＳＣＣ１−３３６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９３は、ＳＣＣ１−３４４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９４は、ＳＣＣ１−３４５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９５は、ＳＣＣ１−３４６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９６は、ＳＣＣ１−３４８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９７は、ＳＣＣ１−３５０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９８は、ＳＣＣ１−３５２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２９９は、ＳＣＣ１−３５４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３００は、ＳＣＣ１−３５５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０１は、ＳＣＣ１−３５６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０２は、ＳＣＣ１−３５７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０３は、ＳＣＣ１−５０１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０４は、ＳＣＣ１−５０３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０５は、ＳＣＣ１−５１３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０６は、ＳＣＣ１−５１６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０７は、ＳＣＣ１−５１８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０８は、ＳＣＣ１−５１９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３０９は、ＳＣＣ１−５２２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１０は、ＳＣＣ１−５２３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１１は、ＳＣＣ１−５２５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１２は、ＳＣＣ１−５２７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１３は、ＳＣＣ１−５２９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１４は、ＳＣＣ１−５３０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１５は、ＳＣＣ１−５３１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１６は、ＳＣＣ１−５３２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１７は、ＳＣＣ１−５３３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１８は、ＳＣＣ１−５３６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３１９は、ＳＣＣ１−５３８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２０は、ＳＣＣ１−５３９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２１は、ＳＣＣ１−５４１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２２は、ＳＣＣ１−５４２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２３は、ＳＣＣ１−５４６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２４は、ＳＣＣ１−５４９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２５は、ＳＣＣ１−５５１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２６は、ＳＣＣ１−５５２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２７は、ＳＣＣ１−５５４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２８は、ＳＣＣ１−５５８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２９は、ＳＣＣ１−５５９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３０は、ＳＣＣ１−５６１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３１は、ＳＣＣ１−５６２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３２は、ＳＣＣ１−５６４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３３は、ＳＣＣ１−５６５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３４は、ＳＣＣ１−５６６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３５は、ＳＣＣＩ−５６７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３６は、ＳＣＣＩ−５６８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３７は、ＳＣＣ１−５７０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３８は、ＳＣＣ１−５７２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３９は、ＳＣＣ１−５７５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４０は、ＳＣＣ１−５７６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４１は、ＳＣＣ１−５７７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４２は、ＳＣＣ１−５７８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４３は、ＳＣＣ１−５８２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４４は、ＳＣＣ１−５８３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４５は、ＳＣＣ１−５８６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４６は、ＳＣＣ１−５８８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４７は、ＳＣＣ１−５９０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４８は、ＳＣＣｌ−５９１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４９は、ＳＣＣ１−５９２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５０は、ＳＣＣ１−５９３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５１は、ＳＣＣ１−５９４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５２は、ＳＣＣＩ−５９５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５３は、ＳＣＣ１−５９６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５４は、ＳＣＣ１−５９８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５５は、ＳＣＣ１−５９９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５６は、ＳＣＣＩ−６０２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５７は、ＳＣＣ１−６０４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５８は、ＳＣＣ１−６０５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３５９は、ＳＣＣ１−６０６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６０は、ＳＣＣ１−６０７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６１は、ＳＣＣ１−６０８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６２は、ＳＣＣ１−６１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６３は、クローンＤＭＳ７９Ｔ１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６４は、クローンＤＭＳ７９Ｔ２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６５は、クローンＤＭＳ７９Ｔ３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６６は、クローンＤＭＳ７９Ｔ５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６７は、クローンＤＭＳ７９Ｔ６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６８は、クローンＤＭＳ７９Ｔ７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３６９は、クローンＤＭＳ７９Ｔ９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７０は、クローンＤＭＳ７９Ｔ１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７１は、クローンＤＭＳ７９Ｔ１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７２は、クローン１２８Ｔ１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７３は、クローン１２８Ｔ２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７４は、クローン１２８Ｔ３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７５は、クローン１２８Ｔ４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７６は、クローン１２８Ｔ５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７７は、クローン１２８Ｔ７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７８は、クローン１２８Ｔ９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３７９は、クローン１２８Ｔ１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８０は、クローン１２８Ｔ１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８１は、クローン１２８Ｔ１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８２は、クローンＮＣＩＨ６９Ｔ３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８３は、クローンＮＣＩＨ６９Ｔ５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８４は、クローンＮＣＩＨ６９Ｔ６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８５は、クローンＮＣＩＨ６９Ｔ７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８６は、クローンＮＣＩＨ６９Ｔ９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８７は、クローンＮＣＩＨ６９Ｔ１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８８は、クローンＮＣＩＨ６９Ｔ１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３８９は、クローンＮＣＩＨ６９Ｔ１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９０は、１２８Ｔ１に対する全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９１は、１２８Ｔ１に対するアミノ酸配列である。
配列番号３９２は、２ＬＴ−１２８に対する全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９３は、２ＬＴ−１２８に対するアミノ酸配列である。
配列番号３９４は、クローンＳＣＣ１−５４２に対する伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９５は、配列番号３９４に対応するアミノ酸配列である。
配列番号３９６は、クローンＳＣＣ１−５９３に対する伸長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９７は、配列番号３９６に対応するアミノ酸配列である。
配列番号３９８は、５５５０８．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３９９は、５５５０９．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４００は、５４２４３．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０１は、５４２５１．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０２は、５４２５２．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０３は、５４２５３．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０４は、５５５１８．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０５は、５４２５８．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０６は、５４５７５．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０７は、５４５７７．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０８は、５４５８４．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４０９は、５５５２１．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１０は、５４５８９．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１１は、５４５９２．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１２は、５５１３４．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１３は、５５１３７．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１４は、５５１４０．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１５は、５５５３１．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１６は、５５５３２．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１７は、５４６２１．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１８は、５５５４８．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４１９は、５４６２３．１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２０は、Ｌ３９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２１は、Ｌ３９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４２２は、ＳＣＣ２−２９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２３は、ＳＣＣ２−３６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２４は、ＳＣＣ２−６０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４２５は、ＳＣＣ２−２９に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４２６は、ＳＣＣ２−３６に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４２７は、ＳＣＣ２−６０に対する推定アミノ酸配列である。
配列番号４２８は、クローン２０１２９に対する伸長ｃＤＮＡ配列であり、配列番号２３８に示される２ＬＴ−３とも呼ばれる。
配列番号４２９は、クローン２０３４７に対する伸長ｃＤＮＡ配列であり、配列番号２４２に示される２ＬＴ−２６とも呼ばれる。
配列番号４３０は、クローン２１２８２に対する伸長ｃＤＮＡ配列であり、配列番号２４９に示される２ＬＴ−５７とも呼ばれる。
配列番号４３１は、クローン２１２８３に対する伸長ｃＤＮＡ配列であり、配列番号２５０に示される２ＬＴ−５８とも呼ばれる。
配列番号４３２は、クローン２１４８４に対する伸長ｃＤＮＡ配列であり、配列番号２６８に示される２ＬＴ−９８とも呼ばれる。
配列番号４３３は、クローン２１８７１に対する伸長ｃＤＮＡ配列であり、配列番号２７９に示される２ＬＴ−１２４とも呼ばれる。
配列番号４３４は、配列番号４２８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号４３５は、配列番号４２９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号４３６は、配列番号４３０によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号４３７は、配列番号４３１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号４３８は、配列番号４３２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号４３９は、配列番号４３３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号４４０は、クローン１９Ａ４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４１は、クローン１４Ｆ１０に対して決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４２は、クローン２０Ｅ１０に対して決定された５’ｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４３は、クローン５５１５３に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４４は、クローン５５１５３に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４５は、クローン５５１５４に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４６は、クローン５５１５４に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４７は、クローン５５１５５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４８は、クローン５５１５６に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４４９は、クローン５５１５６に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５０は、クローン５５１５７に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５１は、クローン５５１５７に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５２は、クローン５５１５８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５３は、クローン５５１５９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５４は、クローン５５１６１に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５５は、クローン５５１６１に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５６は、クローン５５１６２に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５７は、クローン５５１６２に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５８は、クローン５５１６３に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４５９は、クローン５５１６３に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６０は、クローン５５１６４に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６１は、クローン５５１６４に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６２は、クローン５５１６５に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６３は、クローン５５１６５に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６４は、クローン５５１６６に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６５は、クローン５５１６６に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６６は、クローン５５１６７に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６７は、クローン５５１６７に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６８は、クローン５５１６８に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４６９は、クローン５５１６８に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７０は、クローン５５１６９に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７１は、クローン５５１６９に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７２は、クローン５５１７０に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７３は、クローン５５１７０に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７４は、クローン５５１７１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７５は、クローン５５１７２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７６は、クローン５５１７３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７７は、クローン５５１７４に対する第１の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７８は、クローン５５１７４に対する第２の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４７９は、クローン５５１７５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８０は、クローン５５１７６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８１は、コンティグ５２５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８２は、コンティグ５２６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８３は、コンティグ５２７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８４は、コンティグ５２８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８５は、コンティグ５２９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８６は、コンティグ５３０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８７は、コンティグ５３１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８８は、コンティグ５３２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４８９は、コンティグ５３３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９０は、コンティグ５３４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９１は、コンティグ５３５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９２は、コンティグ５３６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９３は、コンティグ５３７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９４は、コンティグ５３８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９５は、コンティグ５３９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９６は、コンティグ５４０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９７は、コンティグ５４１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９８は、コンティグ５４２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号４９９は、コンティグ５４３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５００は、コンティグ５４４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０１は、コンティグ５４５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０２は、コンティグ５４６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０３は、コンティグ５４７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０４は、コンティグ５４８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０５は、コンティグ５４９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０６は、コンティグ５５０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０７は、コンティグ５５１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０８は、コンティグ５５２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５０９は、コンティグ５５３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１０は、コンティグ５５４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１１は、コンティグ５５５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１２は、クローン５７２０７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１３は、クローン５７２０９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１４は、クローン５７２１０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１５は、クローン５７２１１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１６は、クローン５７２１２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１７は、クローン５７２１３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１８は、クローン５７２１５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５１９は、クローン５７２１９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２０は、クローン５７２２１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２１は、クローン５７２２２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２２は、クローン５７２２３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２３は、クローン５７２２５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２４は、クローン５７２２７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２５は、クローン５７２２８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２６は、クローン５７２２９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２７は、クローン５７２３０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２８は、クローン５７２３１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５２９は、クローン５７２３２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３０は、クローン５７２３３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３１は、クローン５７２３４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３２は、クローン５７２３５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３３は、クローン５７２３６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３４は、クローン５７２３７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３５は、クローン５７２３８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３６は、クローン５７２３９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３７は、クローン５７２４０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３８は、クローン５７２４２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５３９は、クローン５７２４３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４０は、クローン５７２４５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４１は、クローン５７２４８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４２は、クローン５７２４９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４３は、クローン５７２５０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４４は、クローン５７２５１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４５は、クローン５７２５３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４６は、クローン５７２５４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４７は、クローン５７２５５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４８は、クローン５７２５７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５４９は、クローン５７２５８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５０は、クローン５７２５９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５１は、クローン５７２６１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５２は、クローン５７２６２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５３は、クローン５７２６３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５４は、クローン５７２６４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５５は、クローン５７２６５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５６は、クローン５７２６６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５７は、クローン５７２６７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５８は、クローン５７２６８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５５９は、クローン５７２６９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６０は、クローン５７２７０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６１は、クローン５７２７１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６２は、クローン５７２７２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６３は、クローン５７２７４に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６４は、クローン５７２７５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６５は、クローン５７２７７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６６は、クローン５７２８０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６７は、クローン５７２８１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６８は、クローン５７２８２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５６９は、クローン５７２８３に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７０は、クローン５７２８５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７１は、クローン５７２８７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７２は、クローン５７２８８に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７３は、クローン５７２８９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７４は、クローン５７２９０に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７５は、クローン５７２９２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７６は、クローン５７２９５に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７７は、クローン５７２９６に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７８は、クローン５７２９７に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５７９は、クローン５７２９９に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８０は、クローン５７３０１に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８１は、クローン５７３０２に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８２は、肺腫瘍特異的Ｔ細胞レセプターのβ鎖に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８３は、肺腫瘍特異的Ｔ細胞レセプターのα鎖に対して決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号５８４は、配列番号５８３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５８５は、配列番号５８２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５８６は、１４Ｆ１０の５’末端によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５８７は、配列番号５８６に含まれるＴ細胞エピトープのアミノ酸配列である。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的に、組成物ならびに癌（特に、肺癌）の治療および診断におけるその使用に関する。以下にさらに記載するように、本発明の例示的な組成物としては、ポリペプチド（特に、免疫原性ポリペプチド）、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体および他の抗原結合因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の実施には、特に逆に示さない限り、当業者の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組み換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。その多くが例示の目的で以下に記載されている。このような技術は、これらの文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ、編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００３４】
本願に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、前出であっても後出であっても、その全体が参考として本明細書に援用される。
【００３５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ）、（ａｎ）」および「この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が明白に他を示さない限り、複数の言及を含む。
【００３６】
（ポリペプチド組成物）
本明細書中において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味で（すなわち、アミノ酸の配列として）使用される。ポリペプチドは、生成物の特定の長さに限定されず；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれ、そしてこのような用語は、他に特に示されない限り、本明細書中において交換可能に使用され得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該分野で公知の他の修飾（天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方））を言及も、排除もしない。ポリペプチドは、タンパク質全体であっても、またはその部分配列であってもよい。本発明の状況における目的の特定のポリペプチドは、エピトープ（すなわち、ポリペプチドの免疫原性特性を実質的に担い、かつ、免疫応答を誘起し得る抗原性決定基）を含むアミノ酸の部分配列である。
【００３７】
詳細には、本発明の例示的なポリペプチドは、配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、あるいは中程度にストリンジェントな条件下かまたは高度にストリンジェントな条件下で配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列によってコードされるポリペプチドを含む。本発明の特定の他の例示的なポリペプチドは、配列番号３９１、３９３、３９５、３９７、４２１、４２５〜４２７、４３４〜４３９、および５８４〜５８７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、ときどき本明細書中において、その同定が肺腫瘍サンプルにおけるそれらの増加した発現レベルに少なくとも一部基づく指標として、肺腫瘍タンパク質または肺腫瘍ポリペプチドといわれる。従って、「肺腫瘍ポリペプチド」または「肺腫瘍タンパク質」は、一般的に、本明細書中に提供される代表的なアッセイを用いて決定された場合に、正常組織における発現レベルよりも、少なくとも２倍、そして好ましくは少なくとも５倍高いレベルで、肺腫瘍サンプルの実質的な割合（例えば、試験した肺腫瘍サンプルの好ましくは約２０％より多く、より好ましくは約３０％より多く、そして最も好ましくは約５０％以上）に発現される、本発明のポリペプチド配列またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をいう。腫瘍細胞における増加した発現レベルに基づく本発明の肺腫瘍ポリペプチド配列は、以下にさらに記載されるように、診断マーカーならびに治療標的の両方としての特定の有用性を有する。
【００３９】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、免疫原性であり、すなわち、本発明のポリペプチドは、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＴ細胞刺激アッセイ）において肺癌を有する患者由来の抗血清および／またはＴ細胞と検出可能に反応する。免疫原性活性についてのスクリーニングは、当業者に周知の技術を用いて実行され得る。例えば、このようなスクリーニングは、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載のような方法を使用して行われ得る。１つの例示的な例において、ポリペプチドを固体支持体に固定し、そして患者の血清と接触させて、その血清中の抗体をその固定されたポリペプチドに結合させ得る。次いで、結合されなかった血清を除去し、結合された抗体を、例えば、１２５Ｉ標識化プロテインＡを使用して検出し得る。
【００４０】
当業者に認識されるように、本明細書中に開示されるポリペプチドの免疫原性部分がまた、本発明によって含まれる。本明細書中に使用される場合、「免疫原性部分」は、本発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントであり、このフラグメントは、それ自体がこのポリペプチドを認識するＢ細胞および／またはＴ細胞表面抗原レセプターと免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に結合する）。免疫原性部分は、一般的にＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに引用される参考文献に要約されるような周知技術を使用して、同定され得る。このような技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／あるいはＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程を包含する。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてそのタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない）場合、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を使用して調製され得る。
【００４１】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に小さくないレベルで抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）。好ましくは、免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドについての免疫原性の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは約９０％よりも大きい免疫原性のレベルである。いくつかの例において、対応する全長ポリペプチドの免疫原性活性のレベルよりも大きい免疫原性活性のレベルを有する好ましい免疫原性部分（例えば、約１００％より上または１５０％以上の免疫原性活性を有する）が、同定される。
【００４２】
特定の他の実施形態において、例示的な免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されたペプチドを含み得る。他の例示的な免疫原性部分は、成熟タンパク質に対して、小さいＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含む。
【００４３】
別の実施形態において、本発明のポリペプチド組成物はまた、本発明のポリペプチド（特に、本明細書中に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）に対して作製されたＴ細胞および／または抗体と免疫学的に反応性である１つ以上のポリペプチド、あるいはその免疫原性フラグメントまたは改変体を含み得る。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチド、または本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に含まれる連続する核酸配列（またはその免疫原性フラグメントまたは改変体）もしくは中程度から高いストリンジェンシーの条件下でこれらの配列の１つ以上にハイブリダイズする１つ以上の核酸配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドと、免疫学的に反応性であるＴ細胞および／もしくは抗体を誘発し得る１つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドが提供される。
【００４５】
別の局面において、本発明は、本明細書中に示されるポリペプチド組成物（例えば、配列番号３９１、３９３、３９５、３９７、４２１、４２５〜４２７、４３４〜４３９、および５８４〜５８７に示されるようなもの、または配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３および４４０〜５８３の配列に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるようなもの）の、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくは１００個またはそれより多く連続するアミノ酸（全ての中間の長さを含む）を含むポリペプチドフラグメントを提供する。
【００４６】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド組成物の改変体を提供する。本発明によって一般的に含まれるポリペプチド改変体は、代表的に、本明細書中に示されるポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％またはそれより高い同一性（下記のように決定した）を示す。
【００４７】
１つの好ましい実施形態において、本発明によって提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチドと反応性である抗体および／またはＴ細胞と免疫学的に反応性である。
【００４８】
別の好ましい実施形態において、本発明によって提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチド配列によって示される免疫学的活性のレベルの、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、および最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれより高い免疫学的活性のレベルを示す。
【００４９】
本明細書中に使用される用語としてのポリペプチド「改変体」は、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入によって、本明細書中に詳細に開示されるポリペプチドとは典型的に異なるポリペプチドである。このような改変体は、天然に存在してもよいし、例えば、本発明の上記のポリペプチド配列の１つ以上を改変し、そして本明細書中に記載されるようにそれらの免疫原性活性を評価することによって、および／または当該分野で周知の多数の技術の内のいずれかを使用して、合成的に作製されてもよい。
【００５０】
例えば、本発明のポリペプチドの特定の例示的な改変体は、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が除去されている改変体を含む。他の例示的な改変体としては、小さい部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が、成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去されている改変体を含む。
【００５１】
多くの例において、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換されている置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、実質的に変化していないポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー性質を予測する。上記のように、改変は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお、所望の特徴を有する（例えば、免疫原性特徴を有する）、改変体または誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を獲得し得る。本発明のポリペプチドの等価物または改善された免疫原性改変体または部分を作製するために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望の場合、当業者は代表的に、表１に従ってコードＤＮＡ配列の１つ以上のコドンを変化させる。
【００５２】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、容易に感知できる程度の相互作用的な結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知できる程度の損失なしで、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが意図される。
【００５３】
【表１】
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このような変化を作製する際に、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次には、そのタンパク質の他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００５４】
特定のアミノ酸が同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお同様の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として具体的に援用される）は、タンパク質の生物学的特性と相関するその隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、そのタンパク質の最大局所的平均親水性に言及する。
【００５５】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、同様の親水性値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的に等価なタンパク質（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【００５６】
上記に概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する例示的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【００５７】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに修飾され得る。可能な修飾には以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；バックボーンにおいて、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）結合よりはむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
【００５８】
アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；ならびに類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性性質に最小限の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【００５９】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【００６０】
ポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列におけるアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大一致について整列される場合に同じであるときに、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列が、連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
【００６１】
比較のための配列の最適な整列は、生命情報科学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターで行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００６２】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同定整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【００６３】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメーターを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスは、累積スコアを算出するために使用され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。
【００６４】
１つの好ましいアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００６５】
他の例示的な実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質（発現エンハンサー）を発現する際に補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性を増加するように、またはポリペプチドが所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーには、親和性タグ（これは、ポリペプチドの精製を容易にする）が挙げられる。
【００６６】
融合ポリペプチドは、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において、組換えポリペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々にアセンブルし得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同じ相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳を可能にする。
【００６７】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合ポリペプチド中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）フレキシブルな伸長したコンホメーションを採る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【００６８】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【００６９】
融合ポリペプチドは、関連しない免疫原性タンパク質と共に、本明細書中に記載されるようなポリペプチド（例えば、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る）を含むこのようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【００７０】
１つの好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来Ｒａ１２フラグメント）に由来する。Ｒａ１２組成物および異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を強化する際の使用のための方法が、米国特許出願６０／１５８，５８５（この開示は、その全体が本明細書において参考として援用されている）において記載されている。手短にいうと、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａ核酸のサブ配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、病原性および非病原性株のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中の遺伝子によってコードされる３２ＫＤ分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が記載されている（例えば、米国特許出願６０／１５８，５８５；Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８−４００７もまた参照のこと（本明細書中に参考として援用される））。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは、高いレベルで発現し、そして精製プロセスの間中、可溶性ポリペプチドとして残ったままであった。さらに、Ｒａ１２は、それが融合される異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を強化し得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする、少なくとも約１５連続するヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含み得るか、またはこのような配列の改変体を含み得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、コードされた融合ポリペプチドの生物学的活性が、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して、実質的に減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。改変体は、好ましくは、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性を示す。
【００７１】
他の好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ  ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、ほぼ３分の１のタンパク質（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端に含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
【００７２】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその一部（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）への親和性を担う。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために開発された。アミノ末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【００７３】
なお別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号において記載されるような、ポリペプチドをエンドソーム／リソソーム区画に指向し得る標的化シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的化シグナルと融合される場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子とより効率的に結合し、それにより、ポリペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の強化されたインビボ刺激を提供する。
【００７４】
本発明のポリペプチドは、種々の周知の合成技術および／または組換え技術（後者は以下にさらに記載される）のいずれかを使用して調製される。一般に、約１５０アミノ酸未満のポリペプチド、部分および他の改変体は、当業者に周知の技術を使用して、合成手段によって生成され得る。１つの例示的な実施例において、このようなポリペプチドは、任意の市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（ここでは、アミノ酸が連続的に付加されて、アミノ酸鎖を成長させる））を使用して、合成される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給者から市販され、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。
【００７５】
一般に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドはまた精製され、例えば、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
【００７６】
（ポリヌクレオチド組成物）
他の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で実質的に交換可能に用いられ、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、実質的に他のコード配列から離れており、そしてＤＮＡ分子が無関係のコードＤＮＡ（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子あるいはポリペプチドコード領域）の大部分を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、最初に単離され、そして人の手によってセグメントに加えられた後に後で遺伝子またはコード領域を除外しないＤＮＡ分子をいう。
【００７７】
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現するように適応され得るゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【００７８】
また当業者に認識されるように、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（イントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（イントロンを含まない）を含む。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
【００７９】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質をコードする内因性配列またはその部分）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体または誘導体、好ましくは抗原性の改変体または誘導体をコードする配列を含み得る。
【００８０】
従って、本発明の別の局面に従い、配列番号２１７〜３１９、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３、および４４０〜５８３のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、配列番号２１７−３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３、および４４０〜５８３のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の相補体、および配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３、および４４０〜５８３のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の縮重改変体のいくつかまたは全てを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に示されるポリヌクレオチド配列は、上述のような免疫原性ポリペプチドをコードする。
【００８１】
他の関連する実施形態において、本発明は、本明細書中で配列番号２１７〜３９０、３９２、３９４、３９６、３９８〜４２０、４２２〜４２４、４２８〜４３３、および４４０〜５８３において開示される配列に実質的な同一性を有するポリヌクレオチド改変体（例えば、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％。９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の配列同一性を含むポリヌクレオチド改変体）を提供する。配列同一性は、本明細書中に記載される方法（例えば、以下に記載されるような標準的なパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ分析）を用いて本発明のポリヌクレオチドに対して比較される。当業者は、これらの値が、コドンの縮重を考慮することにより２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置決めなどを決定するために適切に調節されることを理解する。
【００８２】
代表的に、ポリヌクレオチド改変体は、特に本明細書中に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと比較して、好ましくは、この改変体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの免疫原性が実質的に減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含む。用語「改変体」はまた、異種間の起源の相同な遺伝子を含むことが理解される。
【００８３】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の開示された１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含むポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書中に開示される配列の１つ以上のポリヌクレオチド（少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上、ならびにその間の全ての中間の長さの連続したヌクレオチドを含む）が、本発明によって提供される。この状況において、「中間の長さ」が、示される値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
【００８４】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、もしくはその相補配列に中程度から高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野において周知である。例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続く０．１％  ＳＤＳを含む２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣで各２０分、６５℃で２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、容易に操作され得る（例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度および／またはハイブリダイゼーションが実施される温度を変更することにより）ことを理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、ハイブリダイゼーションの温度が上昇している（例えば、６０〜６５℃、または６５〜７０℃に）ことを除いて、上述されるようなハイブリダイゼーション条件が挙げられる。
【００８５】
特定の好ましい実施形態において、ポリペプチド配列に対して免疫学的に交差反応性である上記のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド改変体、フラグメント、およびハイブリダイズする配列、コードされるポリペプチド）が、本明細書中に詳細に示される。他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド配列に対する免疫原活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性のレベルを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、本明細書中に詳細に示される。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なＤＮＡセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
【００８７】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドの配列が、以下に記載されるように最大一致について整列されるときに同一である場合、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局部領域を同定および比較するために、比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列が連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
【００８８】
比較のための配列の最適な整列は、生命情報科学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００８９】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同定整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【００９０】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメーターを用いて使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅｄ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘまで低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）は、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を整列する。
【００９１】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、もしくは１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００９２】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの使用における差異に起因して変化するポリヌクレオチドが、本発明によって詳細に意図される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【００９３】
従って、本発明の別の実施形態において、変異誘発のアプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）が、本明細書中に記載される免疫原性改変体および／またはそのポリペプチドの誘導体の調製のために用いられる。このアプローチにより、ポリペプチド配列中の特定の改変が、それらをコードする内在するポリヌクレオチドの変異誘発を介して作製され得る。これらの技術は配列改変体（例えば、１つ以上のヌクレオチド配列の変化をそのポリヌクレオチドに導入することにより、前述の考慮の１つ以上を組み込んだ配列）を調製および試験するための直接的なアプローチを提供する。
【００９４】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の産生を可能にし、横断される欠失結合部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズのプライマー配列および配列複雑性を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、改変するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成物、安定性もしくは一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【００９５】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの抗原性）を変更するような開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。そのような実施形態において、代表的におよそ１４ヌクレオチド〜およそ２５ヌクレオチドくらいの長さから成るプライマーが使用され、配列の両側の結合部にある、およそ５残基〜およそ１０残基が変更される。
【００９６】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに伝達する工程を排除する部位指向性変異誘発において慣用的に使用される。
【００９７】
一般的に、本発明に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む、一本鎖ベクターを最初に入手する工程またはその配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実施される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ  クレノウフラグメント）に供される。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さない本来の鎖をコードし、そして第２の鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異配列の配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【００９８】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を生成する手段を提供し、そしてこれは、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列が入手され得る他の方法が存在する場合、限定を意味するものではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；ならびにＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、鋳型依存的プロセスおよびベクター媒介増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語、鋳型依存的プロセスとは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいい、ここで新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対形成（ｐａｉｒｉｎｇ）の周知の法則によって決定され得る（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介方法論は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法論の例は、具体的にその全体が参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０１００】
本発明のポリペプチド改変体の生成のための別のアプローチにおいて、米国特許第５，８３７，４５８号に記載されるような、再帰的配列組換え（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が、用いられ得る。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の繰り返しサイクルが、例えば、増強された免疫原性活性を有する本発明の個々のポリヌクレオチド改変体を「進化」させるために用いられる。
【０１０１】
本発明の他の実施形態において、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸のハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。そのようなものとして、本明細書中で開示される１５ヌクレオチド長の連続した配列と同じ配列か、またはこの連続した配列に相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続した配列の配列領域を含む核酸セグメントが、特定の有用性を見出すことが意図される。より長い連続した同一または相補的な配列（例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間長さを含む）およびさらに全長配列までの配列）はまた、特定の実施形態において使用される。
【０１０２】
このような核酸プローブの、目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプルにおける相補配列の存在の検出におけるそれらの使用を可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異体種プライマーの調製のための配列情報の使用、または他の遺伝的構築物の調製における使用のためのプライマーの使用）もまた想定される。
【０１０３】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、またはさらに１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチを含む配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。同様のフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
【０１０４】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定および選択的の両方の二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチにわたって連続した相補配列を有する分子は、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善する。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０１０５】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に記載される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。本明細書中に示される配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む約１５〜２５ヌクレオチド長まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分を再検討することが、必要とされる全てである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の終端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０１０６】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産物のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、獲得され得る。
【０１０７】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントのいずれかの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度に達するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低い塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）が選択される）を使用することが望ましい。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０１０８】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、より低いストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖の形成を可能にするために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、そして一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
【０１０９】
本発明の他の実施形態に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、効果的かつ標的化されたタンパク質合成のインヒビターであることが示され、結果的に、疾患に寄与するタンパク質合成を阻害することによってこの疾患を処置し得るような、治療アプローチを提供する。タンパク質合成阻害のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力はよく確証されている。例えば、ポリガラクツロナーゼの合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターの合成は、これらのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｎｅｃｅ．１９８８  Ｊｕｎ  １０；２４０（４８５８）：１５４４〜６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、Ｃａｎｓｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５〜３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｊｕｎ  １５；５７（２）：３１０〜２０；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号）。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号）。
【０１１０】
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはこの誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、そしてより好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列の分析ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、相対的安定性の決定に基づく。アンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが相対的に形成できないことに基づいて選択された。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのバージョン４および／またはＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７、２５（１７）：３３８９〜４０２）を使用して実施され得る。
【０１１１】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０  Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊｕｌ  １５；２５（１４）：２７３０〜６）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる。
【０１１２】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書において記載されるポリヌクレオチド組成物は、腫瘍細胞中の本発明の腫瘍ポリペプチドおよびタンパク質の発現阻害のためのリボザイム分子の設計および調製において使用される。リボザイムは、部位特異的な様式で核酸を切断するＲＮＡタンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９８７  Ｄｅｓ；８４（２４）：８７８８〜９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｓｏｎｓ、Ｃｅｌｌ；１９８７  Ａｐｒ  ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９８１  Ｄｅｓ；２７（３Ｐｔ２）：４８７〜９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｄｅｓ  ５；２１６（３）：５８５〜６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９２  Ｍａｙ  １４；３５７（６３７４）：１７３〜６）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
【０１１３】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的種類が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０１１４】
リボザイムの酵素的特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は容易に核酸標的に結合して、その翻訳をブロックする））よりも有益である。これは、治療的処置に影響を及ぼすのに有効なリボザイムの濃度が、アンチセンスオリグヌクレオチドの濃度よりも低いからである。この利点は、リボザイムが酵素的に作用する能力を反映する。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、標的ＲＮＡに結合する塩基対化機構だけではなく、標的ＲＮＡ切断の機構にも依存する阻害に特異性を有する高特異性のインヒビターである。切断の部位に近い単一のミスマッチ、すなわち塩基置換は、完全にリボザイムの触媒活性を除去し得る。アンチセンス分子における同様のミスマッチは、その作用を妨げない（Ｗｏｏｌｆら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２  Ａｕｇ  １５；８９（１６）７３０５−９）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位を結合するアンチセンスオリグヌクレオチドの特異性よりも大きい。
【０１１５】
この酵素的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフにおいて形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら、Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９２  Ｓｅｐ  １１；２０（１７）：４５５９〜６５に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９  Ｊｕｎ  １３；２８（１２）：４９２９〜３３；Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９０  Ｊａｎ  ２５；１８（２）：２９９〜３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２  Ｄｅｃ  １；３１（４７）：１１８４３〜５２に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｃｅｌｌ．１９８３  Ｄｅｃ；３５（３Ｐｔ２）：８４９〜５７に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０  Ｍａｙ  １８；６１（４）：６８５〜９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９１  Ｏｃｔ  １；８８（１９）：８８２６〜３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３  Ｍａｒ  ２３；３２（１１）：２７９５〜９）に記載される。そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される。本発明の酵素的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する基質結合部位内にヌクレオチド配列を有することまたはこの基質結合部位を取り囲むヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
【０１１６】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験されるように合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０１１７】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願番号ＷＯ  ９２／０７０６５；国際特許公開番号ＷＯ  ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９１／０３６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／１３６８８（これには、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
【０１１８】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによる、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠剤形態またはピル形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０１１９】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される。このようなプロモーターから発現されるリボザイムは、哺乳動物細胞において機能することが示されている。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０１２０】
本発明の別の実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物が提供される。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７  ７（４）  ４３１〜３７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した複数の方法において利用され得る。時々、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡまたはＤＮＡ配列よりも技術的により良く機能し、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有していた。産生方法、使用の特徴付け、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７  Ｊｕｎ；１５（６）：２２４〜９）によって提供される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ  ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与される宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０１２１】
ＰＮＡは、正常なＤＮＡのホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  Ｄｅｃ  ６；２５４（５０３７）１４９７〜５００；Ｈａｎｖｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２  Ｎｏｖ  ２７；２５８（５０８７）１４８１〜５；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｊａｎ；４（１）：５〜２３）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要がない）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルを、固相ペプチド合成に使用する。一方、改変型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用される。
【０１２２】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９５  Ａｐｒ；３（４）：４３７〜４５）。このマニュアルプロトコールは、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
【０１２３】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産生の際に、１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、非効率的に加えられているようである残基の連結を繰り返すべきであることを提案する。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである。
【０１２４】
所定の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要性の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析法によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を産生および利用した
【０１２５】
【化１】
2004526401.tif 000003
。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生体中でタンパク質を調節すること、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０１２６】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づける方法は、Ｒｏｓｅ（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３  Ｄｅｃ  １５；６５（２４）：３５４５〜９）およびＪｅｎｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７  Ａｐｒ  ２２；３６（１６）：５０７２〜７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、ＰＮＡのこれらの相補的オリゴヌクレオチドへの結合を決定し、相対的な結合速度および化学量論を測定する。同様の型の手段は、Ｊｅｎｓｅｎらによって、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術を用いて作られた。
【０１２７】
記載され、当業者に明らかであるＰＮＡの他の適用は、ＤＮＡ鎖侵襲、アンチセンス阻害、変異分析、転写のエンハンサー、核酸精製、転写活性遺伝子の単離、転写因子結合のブロッキング、ゲノム切断、バイオセンサー、インサイチュハイブリダイゼーションなどにおける使用を含む。
【０１２８】
（ポリヌクレオチドの同定、特徴づけ、および発現）
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９などを参照のこと）のいずれかを用いて同定、調製、および／または操作され得る。例えば、以下に詳細に記載されるように、ｃＤＮＡのマイクロアレイを腫瘍に関連した発現（すなわち、本明細書において提供される例示的アッセイを用いて決定されるように、腫瘍において、正常組織の少なくとも２倍を超える発現）についてスクリーニングすることによって、ポリヌクレオチドは、同定され得る。例えば、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のマイクロアレイ技術を、製造者の指示に従って用いることによって、および、本質的には、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４〜１０６１９、１９９６ならびにＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０〜２１５５、１９９７に記載されるように、このようなスクリーニングは、実施され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。
【０１２９】
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼが、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０１３０】
多数の他のテンプレート依存性プロセス（これらの多くは、ＰＣＲＴＭ増幅技術のバリエーションである）のいずれかは、当該分野において、容易に知られ、利用可能である。例示されるように、いくつかのこのような方法は、以下を含む：例えば、欧州特許出願公開番号３２０，３０８および米国特許第４，８８３，７５０号に記載されるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲとして示される）を含み；ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載されるＱｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ；Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）およびＲｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＣＲ）。英国特許出願番号２  ２０２  ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に記載されるなお他の増幅方法は、本発明に従って使用され得る。他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／１０３１５）が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。欧州特許出願公開番号３２９，８２２は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増幅プロセスを開示する。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８９／０６７００（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、プロモーター／プライマー配列の多くのＲＮＡコピーの転写の前の、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキームを開示する。「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ（Ｏｈａｒａ、１９８９）」のような他の増幅方法がまた、当業者に周知である。
【０１３１】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。無作為に刺激されたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましい。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【０１３２】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして拡大する。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中にアセンブルし得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントに連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０１３３】
あるいは、上記のような増幅技術は、部分的ｃＤＮＡ配列から、全長をコードする配列を得るのに有用であり得る。このような増幅技術の１つは、インバースＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内のフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環状化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ  ９６／３８５９１に記載される。このような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内側プライマーおよび外側プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０１３４】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
【０１３５】
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現を指向するように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの先天的な縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【０１３６】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するヌクレオチド配列をコードするポリペプチドを作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０１３７】
さらに、本発明のポリペプチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為フラグメント化によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドン優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異を導入したりなどし得る。
【０１３８】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から精製され得る。
【０１３９】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｈ，Ｔら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体が、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇ，Ｊ．Ｙら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０１４０】
新たに合成されたペプチドは、分離高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドまたはその任意の部分のアミノ酸配列は、直接合成の間に改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
【０１４１】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０１４２】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系。
【０１４３】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その長さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターが使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に都合良く使用され得る。
【０１４４】
細菌系において、多数の発現ベクターが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要とされる場合（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を方向づけるベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）はまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローン化された目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１４５】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０１４６】
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）を、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０１４７】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおける外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローン化され得、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そして外殻タンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０１４８】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが、発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０１４９】
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
【０１５０】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。そのようなポリペプチドの改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。
【０１５１】
組換えタンパク質の長期間での高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間、増殖され得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０１５２】
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高くなっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０１５３】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリヌクレオチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
【０１５４】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術およびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
【０１５５】
ポリヌクレオチドにコードされる産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドにコードされる産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイが他の場所に記載される（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６））。
【０１５６】
広範な種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの作製のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローン化され得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０１５７】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、発現および細胞培養からタンパク質を回収するのに適した条件下において培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌または含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を方向付けるシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））の封入体を使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｏｉｌ，１２：４４１−４５３）において提供される。
【０１５８】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して組み合わせられ得る。
【０１５９】
（抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子）
別の局面に従って、本発明はさらに、本明細書に開示される腫瘍ポリペプチド、またはその一部、改変体もしくは誘導体に対して免疫学的結合を示す、結合因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明のポリペプチドに対して「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」といわれ、そして／または、抗体またはその抗原結合フラグメントが検出可能レベルでこのポリペプチドと（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）反応し、そして類似の条件で関連しないポリペプチドと検出可能に反応しない場合、本発明のポリペプチドに対して「免疫学的に反応性」である。
【０１６０】
免疫学的結合とは、この文脈において用いる場合、一般に免疫グロブリン分子とこの免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共有的相互作用の型をいう。免疫グロブリン結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）として表され得る。ここでＫｄが小さいほど、大きい親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を用いて定量され得る。このような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴う。ここでこれらの速度は、複合パートナーの濃度、相互作用の親和性、および幾何学的パラメーター（両方向きで速度に等しく影響する）に依存する。従って、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実質速度の計算によって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの率によって、親和性に関係しない全てのパラメーターの削除が可能になり、従ってこれは、解離定数Ｋｄに等しい。一般的にはＤａｖｉｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９〜４７３を参照のこと。
【０１６１】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分をいう。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変領域（「Ｖ」）のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に相違するストレッチを、「超可変領域」とよぶ。この超可変領域は、「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」として公知の、さらに保存された隣接するストレッチの間に差し挟まれている。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間にそして隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子においては、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間においてお互いに対して配置され、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、そして各重鎖および軽鎖の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。
【０１６２】
結合因子は、本明細書に提供される代表的アッセイを用いて、肺癌のような癌の存在する患者と存在しない患者との間をさらに識別し得る。たとえば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくはこの疾患を有する患者の少なくとも２０％において、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において、癌の存在を示すシグナルを生じる。あるいは、またはさらに、この抗体は、この癌の無い個体の少なくとも約９０％においてこの疾患が存在しないことを示す陰性のシグナルを生成する。結合因子がこの要件を満たすか否かを決定するために、癌を有する患者および有さない患者（標準的臨床試験を用いて決定した）由来の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、喀痰、尿、および／または腫瘍生検）を、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されるようにアッセイし得る。好ましくは、この疾患を有するサンプルおよび有さないサンプルの統計学的に有意な数をアッセイする。各結合因子は、上記の基準をみたすべきである；しかし、結合因子が感度を改善するために組み合わせて用いられ得ることを当業者は認識する。
【０１６３】
上記の要件を満足する任意の因子が結合因子であり得る。例えば、結合因子は、リボソーム（ペプチド成分を含むか、または含まない）、ＲＮＡ分子、またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術によって調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、組み換え抗体の産生を可能にするために、本明細書に記載のようなモノクローナル抗体の生成を含む、細胞培養技術によって、または適切な細菌宿主もしくは哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原を、任意の広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に最初に注射する。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変することなく、免疫原として供給され得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドに関しては、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に連結される場合に、優れた免疫応答が誘導され得る。好ましくは、１つ以上のブースター免疫化を組み込む予め決定された計画に従って、この免疫原を動物の宿主内に注射し、そしてこの動物を定期的に採血する。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製し得る。
【０１６４】
目的の抗原性ポリペプチドについて特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術、ならびにその改良型を使用して調製され得る。手短に言うと、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように、免疫された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間合わせられ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地上に低密度でプレートされる。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常約１〜２週間）後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてそれらの培養上清が、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０１６５】
モノクローナル抗体を、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離し得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注入）が、収量を増大させるために利用され得る。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から収集し得る。夾雑物を、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出）によって抗体から除去し得る。本発明のポリペプチドを、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程における精製工程において使用し得る。
【０１６６】
多数の治療的に有用な分子が、当該分野で公知であり、これらの分子は、抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む。タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断し、いくつかのフラグメントを生じ、これら（「Ｆ（ａｂ）」フラグメント）のうち２つは、それぞれインタクトな抗原結合部位を含む共有結合したヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断し得、いくつかのフラグメントを提供する。これらのフラグメントは、両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質切断（ＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子については、まれにしか起こらない）によって生成され得る。しかし、より一般的には、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して誘導される。Ｆｖフラグメントとしては、非共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体（多くの抗原認識およびネイティブな抗体分子の結合能力を保持する抗原結合部位を含む）が挙げられる。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９〜２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６〜２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０１９〜４０９６。
【０１６７】
一本鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体であり、これはペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子の融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９〜５８８３。天然に凝集しているが、化学的に別個の、抗体のＶ領域由来の軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドの、ｓＦｖ分子（これは、抗原結合部位の構造に実質的に類似の三次元構造に折り畳まれている）への変換について、化学的構造を識別するための多数の方法が、記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎらに対して）；および米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒらに対して）を参照のこと。
【０１６８】
上記分子はそれぞれ、重鎖ＣＤＲセットおよび軽鎖ＣＤＲセットを含み、それぞれ重鎖ＦＲセットと軽鎖ＦＲセット（これらは、ＣＤＲＳに対して補助を提供し、そして相互に関連してＣＤＲの空間的な関係を規定する）との間に挿入される。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を言う。重鎖または軽鎖のＮ末端から生じるこれらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」として示される。従って、抗原結合部位は、各々重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域由来のＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中では、「分子認識ユニット」と呼ばれる。多数の抗原−抗体複合体の結晶構造解析によって、ＣＤＲのアミノ酸残基が、結合抗原と広範な接触を形成し、ここで最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３との接触であることが、実証された。従って、分子認識ユニットは、主に抗原結合部位の特異性に寄与する。
【０１６９】
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを形成する４つの隣接するアミノ酸配列を言う。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得るが、ＦＲは、主にＶ領域が、抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳まれていることに寄与する。ＦＲ内において、特定のアミノ残基および特定の構造的特徴は、非常に高度に保存されている。この観点において、全てのＶ領域の配列は、約９０のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含んでいる。Ｖ領域が結合部位へ折り畳まれる場合、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして示される。特定の「標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」構造（正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく）に折り畳まれた形態のＣＤＲループに影響するＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に理解されている。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合ドメイン間接触に関係することが公知である。
【０１７０】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む多数の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体分子が記載されており、これらとしては、以下が挙げられる：げっ歯類Ｖ領域およびこれらに関連するヒト定常ドメインに融合されたＣＤＲを有するキメラ抗体（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０〜４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４〜４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７〜３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインと融合される前にヒト補助ＦＲにグラフト化されたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６；およびＪａｎｅｓら（１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５）、および組換えでベニア化されたげっ歯類ＦＲによって補助されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開第５１９，５９６号（１９９２年１２月２３日公開））。これらの「ヒト化」分子は、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答（これは、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的な適用の持続時間および有効性を制限する）を最小にするように設計される。
【０１７１】
本明細書中で使用される場合、用語「ベニア化されたＦＲ」および「組換えでベニア化されたＦＲ」は、例えば、げっ歯類重鎖Ｖ領域またはげっ歯類軽鎖Ｖ領域由来のＦＲ残基の、ヒトＦＲ残基での選択的な置換（これは、実質的に全てのネイティブなＦＲポリペプチド折り畳み構造を保持する抗原結合部位を含む異種間分子を提供するためである）を言う。ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性が、主に抗原結合表面での重鎖および軽鎖ＣＤＲセットの構造ならびに相対的な配置によって決定されるという理解に基づいている。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９〜４７３。従って、抗原結合特異性は、ヒト化抗体においてのみ保存され得、ここで、ＣＤＲ構造、これらの相互の相互作用、および残りのＶ領域ドメインとのこれらの相互作用は、慎重に維持される。ベニアリング技術を使用することによって、外側の（例えば、溶媒に接近可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系によって容易に攻撃される（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ））は、ヒト残基で選択的に置き換えられて、弱い免疫原性のベニア化された表面または実質的に免疫原性のないベニア化された表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【０１７２】
ベニアリング工程は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ、１９８７））によって集められたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列のデータを利用して、Ｋａｂａｔのデータベース、ならびにアクセス可能な米国のデータベースおよび外国のデータベース（両方とも核酸およびタンパク質）を最新のものとする。Ｖ領域のアミノ酸の溶媒への接近性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）は、ヒト抗体フラグメントおよびマウス抗体フラグメントについての公知の三次元構造から予測され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする工程には、一般的な２つの工程がある。最初は、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲを、上で同定された供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較する。次いで、最も相同なヒトＶ領域を、対応するマウスアミノ酸に対する残基によって残基を比較する。ヒトの対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）とは異なるマウスＦＲの残基を、当該分野で周知の組換え技術を使用してヒトの部分に存在する残基によって置き換える。残基の置き換えは、少なくとも部分的に曝露された（溶媒に接近可能な）部分でのみ実施可能であり、アミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシン、および荷電したアミノ酸は、Ｖ領域ドメインの三次元構造に有意な影響を有し得る）の置き換えは、慎重に実施される。
【０１７３】
この様式において生じた「ベニア化された」マウス抗原結合部位は、従って、マウスＣＤＲ残基を保持するように設計され、この残基は実質的にＣＤＲに隣接し、この残基は、この残基は埋まっている（ｂｕｒｙ）か、またはほとんど埋まっている（溶媒に接近し得ない）として同定され、この残基は、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な（例えば、静電気的および疎水的）接触と関係すると考えられ、そしてこの残基はＣＤＲループの「標準的な」三次元構造に影響すると考えられているＦＲの保存された構造領域由来である。次いで、これらの設計基準を使用して、組換えヌクレオチド配列を調製する。この組換えヌクレオチド配列は、マウス抗原結合部位の重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲを、ヒト様（ｈｕｍａｎ−ａｐｐｅａｒｉｎｇ）ＦＲ（これは、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のための哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る）に組み合せる。
【０１７４】
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療薬剤に結合され得る。この点において適切な薬剤は、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびその誘導体を含む。好ましい放射性核種には、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが含まれる。好ましい薬物には、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが含まれる。好ましい分化誘導剤には、ホルボールエステルおよび酪酸が含まれる。好ましい毒素には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれる。
【０１７５】
治療剤は、直接的にかまたは間接的（例えば、リンカー基を介して）にかのいずれかで適切なモノクローナル抗体に結合（例えば、共有結合によって）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が互いに反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物）または良好な遊離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基などと反応し得る。
【０１７６】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるために働き得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にし得、そうでない場合には、化学的反応性の増大は可能ではない。
【０１７７】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０１７８】
本発明の免疫結合体の抗体部分がない場合に治療剤がより強力である場合、細胞中への内部移行の間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきた。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０１７９】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、複数の薬剤の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０１８０】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアには、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）を含む。キャリアはまた、例えばリポソームベシクル内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０１８１】
（Ｔ細胞組成物）
別の局面において、本発明は、本明細書中に開示の腫瘍ポリペプチド、またはその改変体もしくはその誘導体に特異的なＴ細胞を提供する。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連するか、または関連のないヒト、非ヒト哺乳動物の細胞株または培養物から誘導され得る。
【０１８２】
Ｔ細胞は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはこのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激され得る。このような刺激は、目的のポリペプチドに特異的なＴ細胞の生成を可能にするために十分な条件下で十分な時間、行われる。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特異的Ｔ細胞の生成を容易にする。
【０１８３】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、またはポリペプチドで被覆されるかもしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、本発明のポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに組み込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間の肺腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、代表的には、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じる。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように、Ｔ細胞の活性化を生じるはずであり、ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ  １９９８）を参照のこと）。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して増殖され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは関連のないドナーに由来し、そして刺激および増殖後にその患者に投与される。
【０１８４】
治療目的で、腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に増殖され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチド、および／または肺腫瘍ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再度曝露され得る。あるいは、腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０１８５】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物に、単独でか、または１つ以上の他の治療部分と組み合わせでかのいずれかで投与するための、１つ以上の薬学的に受容可能な溶液中に本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の処方物に関する。
【０１８６】
所望である場合、本明細書中で開示される組成物は、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤）とも組み合わせて投与され得る。事実、含まれ得る他の成分にもまた制限はない、但し、さらなる薬剤が標的細胞または宿主組織との接触に有意に有害な効果を生じない。従って、これらの組成物は、特定の場合に必要とされる種々の他の薬剤とともに送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物は、置換されたか、または誘導体化されたＲＮＡまたはＤＮＡ組成物をさらに含み得る。
【０１８７】
従って、本発明の別の局面において、薬学的組成物が提供され、これは１以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはＴ細胞組成物（本明細書中では、生理学的に受容可能なキャリアとの組合せで記載される）を含む。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防的なワクチン適用および治療的なワクチン適用における使用のための本発明の免疫原性ポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ（編）「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）に記載される。一般的に、このような組成物は、本発明の１以上のポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物を、１以上の免疫刺激物質との組み合せで含む。
【０１８８】
本明細書中に記載される薬学的組成物のいずれかが、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることが明らかである。このような塩は、例えば、有機塩基（例えば、第一級アミンの塩、第二級アミンの塩および第三級アミンの塩、ならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩）を含む薬学的に受容可能な無毒の塩基から調製され得る。
【０１８９】
別の実施形態において、例示的な本発明の免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）は、インサイチュでこのポリペプチドが生成されるように上記のような１以上のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。上記のように、このポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の多様な系のいずれかにおいて投与され得る。実際に、多数の遺伝子送達技術が、当該分野で公知であり、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３〜１９８、１９９８、およびそこに列挙されている参考文献に記載の技術がある。当然のことながら、適切なポリヌクレオチド発現系は、患者での発現のために必要な調節ＤＮＡの調節配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。あるいは、細菌送達系は、細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）細胞表面のポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはそのようなエピトープを分泌する細菌の投与を含み得る。
【０１９０】
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知のウイルスに基づく系のいずれかを使用して、発現のための適切な哺乳動物宿主細胞中に導入される。１つの例示的な実施形態において、レトロウイルスは、遺伝子送達系について簡便かつ有効なプラットホーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を使用して、ベクター中に挿入され得、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され得、そして被験体に送達され得る。多数の例示的なレトロウイルス系が、記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０〜９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｒａｐｙ  １：５〜１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９〜８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３〜８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２〜１０９）。
【０１９１】
さらに、多数の例示的なアデノウイルスに基づく系がまた記載されている。宿主ゲノム中に組込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に保持され、従って挿入性の変異誘発に関連する危険性を最小限にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７〜２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１〜５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７〜７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３〜９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１〜５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１〜４７６）。
【０１９２】
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系がまた、ポリヌクレオチド送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を使用して容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ  ９２／０１０７０および同ＷＯ  ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８〜３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３〜５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３〜８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５〜１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７〜１８７５を参照のこと。
【０１９３】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを遺伝子転移によって送達するために有用なさらなるウイルスベクターとしては、ウイルスのポックスファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよびアビポックスウイルス）に由来するウイルスベクターが挙げられる。例としては、新規な分子を発現するワクシニアウイルス組替え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、最初に適切なベクター中に、このＤＮＡがワクシニアプロモーターに隣接し、そしてワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように挿入される。次いで、このベクターを使用して、細胞にトランスフェクトし、これは同時にワクシニアに感染される。相同組替えは、ワクシニアプロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする遺伝子をウイルスゲノム中に挿入するように働く。得られたＴＫ．ｓｕｐ．（−）組替え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、そしてそれに耐性であるウイルスプラークを選ぶことによって選択され得る。
【０１９４】
ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系は、都合よく使用されて、生物体の宿主細胞において、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの誘導性で一過性の、発現または同時発現を提供する。この特定の系において、細胞は、最初にインビトロでワクシニアウイルス組替え体（これはバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする）で感染される。このポリメラーゼは、このポリメラーゼがＴ７プロモーターを保有するテンプレートのみを転写するという精巧な特異性を示す。感染後、細胞はＴ７プロモーターで駆動されて目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドでトランスフェクトされる。ワクシニアウイルス組替え体由来の原形質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトしたＤＮＡをＲＮＡ中に転写し、これは次いで、宿主の翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法は、高レベルで一過性の、大量のＲＮＡの原形質産物およびその翻訳産物を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３〜６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２〜８１２６を参照のこと。
【０１９５】
あるいは、アビポックスウイルス（例えば、家禽ポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルス）はまた、目的のコード配列を送達するために使用され得る。組替えアビポックスウイルス（哺乳動物病原体から免疫原を発現する）は、非トリ種に投与する場合、保護的免疫を与えることが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属は、感受性のトリ種においてのみ生産的に複製され得、従って哺乳動物細胞において感染的ではないからである。組替えアビポックスウイルスを産生する方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上述のように、遺伝的組替えを使用する。例えば、ＷＯ９１／１２８８２；ＷＯ８９／０３４２９；およびＷＯ９２／０３５４５を参照のこと。
【０１９６】
多くのアルファウイルスベクターのいずれかはまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用され得、例えば、これらのベクターは、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４号に記載される。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクターもまた使用され得、これらの例示的な例は米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号において見出され得る。
【０１９７】
さらに、分子結合体ベクター（例えば、アデノウイルスキメラベクター（Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載される）など）はまた、本発明下で遺伝子送達のために使用され得る。
【０１９８】
これらおよび他の公知のウイルスベースの送達系についてのさらなる例示的な情報は、例えば、以下において見出され得る：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ  ２，２００，６５１：ＥＰ  ０，３４５，２４２号；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。
【０１９９】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノム中に組み込まれ得る。この組み込みは、相同組替え（遺伝子置換）を介する特異的な配置および配向であっても良いし、またはランダムな非特異的な配置（遺伝子増強）で組み込まれても良い。なおさらなる実施形態において、このポリヌクレオチドは、細胞中に、ＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして安定に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントすなわち「エピソーム」は、宿主細胞周期と独立してか、または宿主細胞周期と同調した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そしてこの細胞において、ポリヌクレオチドが残存する様式は、使用される発現構築物の型に依存する。
【０２００】
本発明の別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載されそしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３により概説されるような「裸」のＤＮＡとして投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【０２０１】
さらに別の実施形態において、本発明の組成物は、微粒子銃アプローチを介して送達され得、この微粒子銃の多くが記載されている。１つの例示的な例において、ガス駆動粒子加速は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｎｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されているようなデバイスを使用して達成され得、これらのいくつかの例は、米国特許第５，８４６，７９６号、同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；および欧州特許第０５００７９９号に記載される。このアプローチは、針無し送達アプローチを提供し、ここで、微視的な粒子の乾燥粉末処方物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド粒子）は、手持ち型デバイスによって生成されるヘリウムガスジェット中で、高速に加速されこの粒子を目的の標的組織へと推進する。
【０２０２】
関連する実施形態において、本発明の組成物のガス駆動針無し注入に有用であり得る他のデバイスおよび方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるようなものを含み、これらのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号および同第５，９９３，４１２号に記載される。
【０２０３】
別の実施例に従って、本明細書中に記載される薬学的組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫刺激因子を含む。免疫刺激因子は、外因性抗原に対する（抗体および／もしくは細胞介在）免疫応答を亢進（ｅｎｈａｎｃｅ）または増強（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ）する、基本的に任意の物質をいう。免疫刺激因子の１つの好ましい例は、アジュバントを含む。多くののアジュバントは、抗原を迅速な異化から防御するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激因子（例えば、リピドＡ（脂質Ａ）、Ｂｏｒｔｅｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質）を含む。特定のアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化したチロシンの不溶性懸濁液；アシル化した糖；カチオン性かまたはアニオン性に誘導される多糖類；ポリフォスファーゼン；生分解性ミクロスフェア、モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ  Ａとして市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７もしくはインターロイキン−１２および他の増殖因子様のもの）もまた、アジュバントとして使用され得る。
【０２０４】
本発明の特定の実施形態において、そのアジュバント組成物は、好ましくは、優勢にＴｈ１型の免疫応答を誘導するアジュバント組成物である。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０２０５】
優勢なＴｈ１型応答を惹起するための特定の好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ）とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（そのＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、優勢にＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ  ９６／０２５５５、ＷＯ  ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列もまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２、１９９６により記載されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａもしくはその誘導体（ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を含む））；エスチン（Ｅｓｃｉｎ）；ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａもしくはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組合わせにおいて１つよりも多くのサポニン（例えば、以下を含む群：ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスチンまたはジギトニンのうち少なくとも２つの組み合わせを含む）。
【０２０６】
あるいは、このサポニン処方物は、ワクチンビヒクルと組合わされ得、このワクチンビヒクルは、キトサンもしくは他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチドおよびポリラクチド−ｃｏ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリクス、多糖類もしくは化学的に改変された多糖類からなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などからなる。このサポニンはまた、コレステロールの存在下で処方されてリポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒子構造を形成し得る。さらに、このサポニンは、非粒子性溶液もしくは非粒子性懸濁液のいずれかにおいてか、または少層状（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒子構造において、ポリオキシエチレンのエーテルもしくはエステルと共に処方され得る。このサポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような賦形剤と共に処方されて粘度を増加させても良いし、またはラクトースのような粉末の賦形剤を用いて乾燥粉末の形態で処方されても良い。
【０２０７】
１つの好ましい実施形態において、このアジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ  ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）との組み合わせ）またはＷＯ  ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応生成が低い（ｌｅｓｓ  ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）組成物を含む。他の好ましい処方物は、水中油エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを利用する、特に好ましい別のアジュバント処方物が、ＷＯ  ９５／１７２１０に記載されている。
【０２０８】
別の増強されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１との組合わせは、ＷＯ００／０９１５９において記載されている。好ましくは、この処方物はさらに、水中油エマルジョンおよびトコフェロールを含む。
【０２０９】
本発明の薬学的組成物において使用するためのさらなる例示的なアジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｕｉｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、および他のアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国特許出願番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０（これらの開示は、その全体において本明細書中で参考として援用される）、ならびにポリオキシエチレンエステルアジュバント（例えば、ＷＯ９９／５２５４９Ａ１に記載される）が挙げられる。
【０２１０】
他の好ましいアジュバントとしては、以下の一般式のアジュバント分子を含み：
（Ｉ）：  ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、単結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
【０２１１】
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは１と５０との間であり、好ましくは４〜２４、最も好ましくは９であり；Ｒ成分は、Ｃ１〜５０アルキル、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキルであり、最も好ましくはＣ１２アルキルであり、そしてＡは、単結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲であり、好ましくは０．１〜１０％の範囲であり、そして最も好ましくは０．１〜１％の範囲であるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル）は、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版：エントリー７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。
【０２１２】
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望される場合、別のアジュバントと組合わされ得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中のＵＫ特許出願ＧＢ９８２０９５６．２に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
【０２１３】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書中に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）を介して宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいは受け手（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）と免疫学的に適合性であるように遺伝学的に改変され得るが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離され得、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であり得る。
【０２１４】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバンドとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹枝状結晶）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、処理し、そして提示するそれらの能力、および未処置の（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原装荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０２１５】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドならびに／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組合わせによって、樹状細胞に分化され得る。
【０２１６】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、２つの十分に特徴付けられた表現型の間を区別する単純な方法を与える。しかしこの命名法は、全ての可能な分化の中間段階を排除するように解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化の原因である細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０２１７】
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の改変体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、コードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原装荷は、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。装荷の前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助（例えば、キャリア分子）を提供する免疫学的パートナーに共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、別々にかまたはポリペプチドの存在下で、結合体化していない免疫学的パートナーと同調（ｐｕｌｓｅ）され得る。
【０２１８】
当業者に公知である任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物において使用されているが、キャリアの型は代表的に投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物は、投与の任意の適切な様式で処方され得、これには、例えば局所投与、経口投与、経鼻投与、粘膜投与、静脈投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与および筋肉内投与が挙げられる。
【０２１９】
このような薬学的組成物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた、生分解性であり得る。特定の実施形態において好ましくはその処方物は、比較的一定なレベルの活性成分放出を提供する。しかし他の実施形態において、投与の際すぐのより速い放出の速度が所望され得る。このような組成物の処方は、公知の技術を使用した当業者のレベル内である。この点において有用である例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示的な遅延性放出キャリアとしては、超分子バイオベクター（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）が挙げられ、これは、非水性親水性コア（例えば、架橋した多糖またはオリゴ糖）と、必要に応じて両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含む外層とを含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ  ９６／０６６３８を参照のこと）。徐放性処方物中に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予想持続期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０２２０】
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号、同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変されたＢ型肝炎コアタンパク質系（例えば、ＷＯ／９９  ４０９３４およびそこで引用される文献に記載されるような）もまた、多くの応用について有用である。別の例示的なキャリア／送達系は、米国特許第５，９２８，６４７号に記載される微粒子−タンパク質複合体を含むキャリアを使用し、このようなキャリアは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０２２１】
本発明の組成物は、しばしば１つ以上の緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性またはわずかに高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤をさらに含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
【０２２２】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単容量または複容量容器（例えば、密封アンプルもしくはバイアル）中で処方され得る。このような容器は、代表的に使用まで処方物の滅菌性および安定性を保つような方法で密封される。一般に、処方物は油性ビヒクルかまたは水性ビヒクル中で、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして貯蔵される。あるいは、薬学的組成物は、フリーズドライ状態で貯蔵され得、これは使用の直前に滅菌水性キャリアの添加を必要とするだけである。
【０２２３】
種々の治療レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内および筋肉内投与が挙げられる）ならびに処方における、本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な用量レジメンおよび治療レジメンの開発は、当該分野で周知であり、そのうちのいくつかは一般的な例示の目的のために以下で簡単に議論される。
【０２２４】
特定の適用において、本明細書に開示される薬学的組成物は、経口投与を介して動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性な希釈剤とともに処方され得るか、もしくは吸収可能な食用キャリアとともに処方され得るか、または、それらは、硬質殻または軟質殻のゼラチンカプセルに封入され得るか、またはそれらは、錠剤に圧縮され得るか、またはそれらは、治療食の食物と、直接混合され得る。
【０２２５】
活性な化合物は、賦形剤となお混合され得、そして経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用され得る（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７年３月２７日；３８６（６６２３）４１０〜４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １９９８；１５（３）：２４３〜８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、例えば、以下の種々の対か成分のいずれかを含み得る：バインダー（例えば、カラヤゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、添加され得るスクロース、ラクトースまたはサッカリン）または矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、冬緑油、またはチェリー香料）。投薬単位形態が、カプセルである場合、それは、上記の型の材料に加えて、液体キャリアを含み得る。種々の他の材料は、コーティングとして存在し得るか、または投薬単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、シェラック、糖、または両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の投与単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であるべきであり、そして使用される量で実質的に無毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放性調製物および処方物に組み込まれ得る。
【０２２６】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含むが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合に、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上のとの間であり得る。当然、治療的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような要因、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そしてそのように、種々の投薬量および処置レジメンが、所望され得る。
【０２２７】
あるいは、経口投与について、本発明の組成物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、バインダー、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０２２８】
特定の状況において、本明細書に開示される薬学的組成物を、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、または腹腔内にでさえ、送達することが所望される。このようなアプローチは、当業者に周知であり、アプローチの幾つかは、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬理学的受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、水中で界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合されて、調製され得る。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、そしてオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、一般的に、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０２２９】
注入用途のために適切な例証となる薬学的形態は、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤を含む（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、滅菌でなければならず、そして容易な注射能力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、溶媒または、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そしてまたは、界面活性剤に使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合いおいて、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０２３０】
１つの実施形態において、水溶液中での非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張のＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して、必ず生じる。さらに、ヒト投与に対して、調製物は、当然好ましくは、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、および一般的な安全性標準および純度標準を満たさなくてはならない。
【０２３１】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に開示される組成物は、中性形態または塩形態として処方され得る。例証される薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含み、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸、リン酸など）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成された塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄（ＩＩＩ））、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
【０２３２】
キャリアは、さらに、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である限りを除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生成しない分子実体および組成物をいう。
【０２３３】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８  Ｍａｒ  ２；５２（１−２）：８１−７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での例示的な経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。
【０２３４】
特定の実施形態において、小胞は、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子小胞などは、本発明の組成物の適切な宿主細胞／宿主生物体への導入のために、使用される。特に、本発明の組成物は、脂質粒子小胞、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化されて、送達のために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に結合（共有結合的にかまたは非共有結合的にかのいずれかで）され得る。
【０２３５】
潜在的な薬物キャリアとしての、リポソームおよびリポソーム様調製物の形成および使用は、一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８  Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９８  Ｍａｒ；５６（３）６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎら，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；３５（８）８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２−３）：２３３−６１；米国特許５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許５，５６５，２１３号；米国特許５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号を参照のこと（各々、その全体が、参考として本明細書中で特に援用される））。
【０２３６】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェトすることが通常難しい多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０  Ｓｅｐ  ２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達システムを代表するＤＮＡ長制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養された細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答または受容可能ではない毒性と関連しないようである。
【０２３７】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層の同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。
【０２３８】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、安定かつ再現可能な様式で、一般的に化合物を捕捉し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｍ．１９８８  Ｄｅｃ；２４（１２）１１１３−２８を参照のこと）。過剰な細胞内ポリマー負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微細粒子（約０．１μｍの大きさ）が、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。このような粒子は、記載されるように（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１−２０；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８  Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ  Ｃｏｍｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８  Ｊａｎ  ２；５０（１−３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号）、作製され得る。
【０２３９】
（癌治療方法）
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載される薬学的組成物は、癌の治療、特に肺癌の免疫治療に使用され得る。このような方法において、本明細書中に記載される薬学的組成物は、患者（代表的には、温血動物（好ましくはヒト））に投与される。患者は、癌に冒されていてもよいしまたはそうでなくてもよい。従って、上記薬学的組成物は、癌の発症を予防するため、または癌に罹患した患者を処置するために、使用され得る。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去および／もしくは処置（例えば、放射性治療もしくは従来の化学療法薬物の投与）の前あるいは後のいずれかに投与され得る。上で議論されるように、薬学的組成の投与は、適切な任意の方法（静脈内経路、腹腔内経路、筋内経路、皮下経路、鼻内経路、皮内経路、肛門経路、膣経路、局所経路および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
【０２４０】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動免疫療法であり得、この能動免疫療法において、処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中に提供されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与による、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０２４１】
他の実施形態において、免疫療法は受動免疫療法であり得、この受動免疫療法において、処置は、抗腫瘍効果を直接または間接に媒介し得そしてインタクトな宿主免疫系に必ずしも依存しない腫瘍免疫反応性が確立された因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および本明細書中に提供されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、クローニングされ得、発現され得、そして養子免疫療法のために他のベクターもしくはエフェクター細胞に移入され得る。本明細書中に提供されるポリペプチドをまた、受動免疫療法のために使用して、抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載されるような）を生成し得る。
【０２４２】
エフェクター細胞は、一般的には、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖による養子免疫療法に十分な量で得られ得る。インビボで抗原認識を保持しつつ、単一の抗原特異的エフェクター細胞から数十億個へと数が増殖するための培養条件は、当該分野で周知である。このようなインビトロ培養条件は、代表的には、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂中でないフィーダー細胞の存在下で、抗原による間欠性刺激を使用する。上記のように、本明細書中に提供されるような免疫反応性ポリペプチドは、免疫療法のために十分な数の細胞を生成するために、抗原特異的Ｔ細胞培養物を迅速に増殖するために使用され得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞および／またはＢ細胞）が、当該分野で周知の標準的技術を使用して、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞が、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増加するために適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療における使用のための培養エフェクター細胞は、インビボで増殖し得、そして広範に分布し得、そして長期に生存し得なければならない。研究により、培養エフェクター細胞が、インビボで増殖するように、そしてかなりの数で長期間生存するように、ＩＬ−２を補充した抗原による反復刺激によって誘導され得ることが示された（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０２４３】
あるいは、本明細書中に列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から採取された抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に移植し戻すためにエキソビボでクローン増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段を使用して、好ましくは滅菌形態で、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与または腫瘍内投与によって、その患者に再導入され得る。
【０２４４】
本明細書中に記載される治療組成物の投与の経路および頻度、ならびに投与量は、個体間で変化し、そして標準的技術を使用して容易に確立され得る。一般的には、その薬学的組成物およびワクチンは、注射投与（例えば、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射または皮下注射）、鼻内投与（例えば、吸引）または経口投与により投与され得る。好ましくは、１用量と１０用量との間が、５２週間にわたって投与され得る。好ましくは、６用量が、１ヶ月間隔で投与され、そしてブースターワクチン接種が、その後定期的に与えられ得る。代替プロトコルが、個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与される場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、かつ基礎（すなわち、未処置）レベルを少なくとも１０〜５０％超える、化合物の量である。このような応答は、患者における抗腫瘍抗体を測定することによってか、またはその患者の腫瘍細胞をインビトロで殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性生成によって、モニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較した場合、ワクチン接種された患者において改善した臨床成果（例えば、より頻繁な完全または部分的な寛解、あるいは疾患を伴わないより長期の生存）をもたらす免疫応答を生じ得る。一般的に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびベクターについて、１用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主１ｋｇあたり約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量の大きさは、患者のサイズとともに変化するが、代表的には、約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０２４５】
一般的に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的利益および／または予防的利益を提供するために十分な量で活性化合物を提供する。このような応答は、未処置の患者と比較した場合に、処置された患者において、改善された臨床成果（例えば、より頻出する完全または部分的な寛解、あるいは疾患を伴わないより長い生存）を確立することによってモニターされ得る。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増加は、一般的に、改善された臨床的成果に相関する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイまたはサイトカインアッセイを用いて評価され得、これらのアッセイは、処置の前および後に患者から得たサンプルを用いて実行され得る。
【０２４６】
（癌の検出ならびに診断組成物、診断方法および診断キット）
一般的に、癌は、患者から得た生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰尿および／または腫瘍生検材料）中の１以上の肺腫瘍タンパク質および／または、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいてその患者において検出され得る。言いかえると、このようなタンパク質は、肺癌のような癌の存在または不在を示すマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出のために有用であり得る。本明細書中で提供される結合因子は、一般的に、この生物学的サンプルにおいてこの因子に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、これはまた、癌の存在または不在を示す。一般的に、肺腫瘍配列は、正常組織においてよりも少なくとも３倍高いレベルで腫瘍組織において存在するべきである。
【０２４７】
サンプルにおいてポリペプチドマーカーを検出するために結合因子を使用する、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または不在は、（ａ）患者から得た生物学的サンプルを結合因子と接触させる工程；（ｂ）この結合因子に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルを予め決定してカットオフ値と比較する工程、によって決定され得る。
【０２４８】
好ましい実施形態において、アッセイは、サンプルの残り由来のポリペプチドに結合してそれを除去するために、固体支持体に固定化された結合因子の使用を含む。次いで、結合ポリペプチドは、レポーター基を含みかつ結合因子／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合因子あるいはこの結合因子に特異的に結合する他の因子（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、利用され得、このアッセイにおいて、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルとの結合因子のインキュベーション後に、固定化された結合因子に結合することを可能にする。サンプルの成分が、結合因子への標識されたポリペプチドの結合を阻害する程度は、固定化された結合因子とのそのサンプルの反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドとしては、上記のような、全長肺腫瘍タンパク質および結合因子に結合するそのポリペプチド部分が挙げられる。
【０２４９】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る、当業者に公知な任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロース膜もしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、この支持体は、ガラス、ファイバーガラス、ラテックスまたはプラスチック材料（例えば、ポリスチレンもしくはポリビニルクロリド）のようなビーズあるいはディスクであり得る。この支持体はまた、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるような、磁気粒子または光ファイバーセンサーであり得る。結合因子は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これは、特許および科学文献において詳細に記載されている。本発明の文脈において、用語「固定化」は、吸着のような非共有結合的会合および共有結合的付着（これは、抗原と支持体上の官能基との間の直接的結合であり得るか、または架橋剤による結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートにおけるウェルまたは膜に対する吸着による固定化が、好ましい。このような場合において、吸着は、適切な緩衝液中で、適切な長さの時間の間、結合因子と固体支持体とを接触することによって達成され得る。接触時間は、温度とともに変化するが、代表的には約１時間と約１日との間である。一般に、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド）のウェルと約１０ｎｇ〜約１０μｇの範囲、および好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合因子とを接触させることは、結合因子の適切な量を固定化するために十分である。
【０２５０】
固体支持体に対する結合因子の共有結合的付着は、一般的に、この支持体および結合因子上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬を、この支持体とまず反応させることによって達成され得る。例えば、この結合因子を、ベンゾキノンを使用するか、または結合パートナーのアミンおよび活性な水素と支持体のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に対して共有結合的に付着し得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２〜Ａ１３を参照のこと）。
【０２５１】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定化されている抗体をサンプルと接触させて、サンプル内のポリペプチドを固定化抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去され、そしてレポーター基を含む検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体）が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである第２の抗体の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０２５２】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的には、ブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定化抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、肺癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡が少なくとも約９５％で達成される結合レベルを達成するのに十分な期間である。当業者は、ある期間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０２５３】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基としては、上記で列挙された基が挙げられる。
【０２５４】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある期間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の期間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０２５５】
癌（例えば、肺癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのこのカットオフ値は、固定化抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られた平均シグナルである。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果について可能なカットオフ値の各々に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０２５６】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合因子は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過する際に固定化結合因子に結合する。次いで、第２の標識化された結合因子が、この第２の結合因子を含む溶液がその膜を介して流れる際に、結合因子−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合因子の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合因子が結合される膜の一端をサンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合因子を含む領域を通って、そして固定化結合因子の領域まで移動する。固定化抗体の領域での第２の結合因子の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合因子の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合因子の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおいて使用するための好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０２５７】
もちろん、本発明の腫瘍タンパク質または結合因子との使用に適する多数の他のアッセイプロトコルが存在する。上記の記載は、例示のみを意図する。例えば、上記のプロトコルは、生物学的サンプルにおいてこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出するための腫瘍ポリペプチドを使用するように容易に改変され得ることが、当業者に明らかである。このような腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在に相関し得る。
【０２５８】
癌はまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法において、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルが、腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてそのＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるが、これに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用的技術（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離）によって、患者から単離され得る。Ｔ細胞は、ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともに、３７℃で２〜９日間（代表的には４日間）、インビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立つように、腫瘍ポリペプチドの非存在下でインキュベーションすることが、所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞について、活性化は、好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞について、活性化は、細胞溶解活性を評価することによって、好ましくは検出される。疾患に罹患していない患者においてよりも少なくとも２倍高いレベルの増殖、および／または少なくとも２０％高いレベルの細胞溶解活性は、その患者における癌の存在を示す。
【０２５９】
上記のように、癌はまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、生物学的サンプル由来の腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて使用され得、このオリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、この増幅されたｃＤＮＡは、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、分離および検出される。同様に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、生物学的サンプル中のこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するために、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。
【０２６０】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの本発明の腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有する、オリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記のように、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書に記載される配列を有するＤＮＡ分子のうちの、少なくとも１０個連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３、１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）。
【０２６１】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ＰＣＲが、逆転写と組み合わせて適用される。代表的には、ＲＮＡが、生検組織のような生物学的サンプルから抽出され、そしてｃＤＮＡ分子を生成するように逆転写される。少なくとも１つの特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅は、例えば、ゲル電気泳動を使用して分離および可視化され得る、ｃＤＮＡ分子を生じる。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された、生物学的サンプルに対して実施され得る。この増幅反応は、２桁の大きさに及ぶｃＤＮＡのいくつかの希釈物に対して実施され得る。非癌性サンプルの同じ希釈物と比較して、試験患者サンプルのいくつかの希釈物における２倍以上の発現の増加は、代表的に陽性とみなされる。
【０２６２】
別の実施形態において、本明細書中に記載される組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断のための上記のようなアッセイが、経時的に実施され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年の期間に２４〜７２時間ごとに実施され得、その後も必要ならば実施され得る。一般的に、癌は、検出されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増加する患者において進行している。対照的に、この癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままであるかまたは時間とともに減少するかのいずれかである場合には、進行していない。
【０２６３】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合因子と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合因子が、レポーター基を介して直接的または間接的に検出され得る。このような結合因子はまた、組織学的適用において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブが、このような適用において使用され得る。
【０２６４】
上記のように、感度を改善するために、複数の腫瘍タンパク質マーカーが、所定のサンプルにおいてアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合因子が、単一のアッセイ中で組み合わされ得ることは、明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的実験に基づき得る。さらに、またはあるいは、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質についてのアッセイが、他の公知の腫瘍抗原についてのアッセイと組み合わせられ得る。
【０２６５】
本発明は、上記の診断方法のうちのいずれかにおける使用のためのキットをさらに提供する。このようなキットは、代表的には、診断アッセイを実施するために必要な２つ以上の成分を含む。成分は、化合物、試薬、容器および／または装置であり得る。例えば、キット中の１つの容器が、腫瘍タンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように、支持体材料に結合して提供され得る。１つ以上のさらなる容器が、このアッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を含み得る。このようなキットはまた、またはあるいは、抗体結合の直接検出または間接検出に適切な、レポーター基を含む上記のような検出試薬を含み得る。
【０２６６】
あるいは、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するための、キットが設計され得る。このようなキットは、一般的に、上記のような、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。このようなキット中に存在し得るさらなる成分としては、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするための、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは診断容器が挙げられる。
【０２６７】
以下の実施例は、例示として提供され、限定としては提供されない。
【０２６８】
（実施例１）
（ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲを使用する、肺腫瘍特異的ｃＤＮＡ配列の調製）
本実施例は、ディファレンシャルディスプレイスクリーニングを使用する、肺腫瘍特異的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子の調製を例示する。
【０２６９】
組織サンプルを、患者からサンプルを取り出した後に病理学によって確認された肺癌を患う患者の肺腫瘍および正常組織から調製した。正常なＲＮＡおよび腫瘍ＲＮＡを、このサンプルから抽出して、そしてｍＲＮＡを単離して、そして（ｄＴ）１２ＡＧ（配列番号４７）アンカー３’プライマーを使用して、ｃＤＮＡに変換した。次いで、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲを、無作為に選択されたプライマー（配列番号４８）を使用して行った。増幅条件は、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｐｍｏｌのプライマー、５００ｐｍｏｌ  ｄＮＴＰおよび１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を含む標準的な緩衝液であった。４０サイクルの増幅を、９４℃で３０秒間の変性、４２℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長を使用して行った。腫瘍のＲＮＡフィンガープリントパターンに特異的であることが繰り返し観察されたバンドを、銀染色ゲルから切り出して、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にサブクローニングして、そして配列決定した。単離された３’配列を、配列番号１〜１６に提供する。
【０２７０】
ＢＬＡＳＴＮプログラムを使用する、公的なデータベースの配列に対するこれらの配列の比較は、配列番号１〜１１に提供されている配列に対して有意な相同性を示さなかった。本発明者らの知識が及ぶ限り、単離されたＤＮＡ配列のいずれもが、正常な肺組織よりもヒト肺腫瘍組織において、より高いレベルで発現されることが以前に示されていなかった。
【０２７１】
（実施例２）
（肺腫瘍抗原をコードするＤＮＡ配列を同定するための患者血清の使用）
本実施例は、自系の患者血清を用いる肺腫瘍サンプルの発現スクリーニングによる、肺腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡ配列の単離を例示する。
【０２７２】
ヒト肺腫瘍指向性ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて構築した。このライブラリーの総ＲＮＡを、ヒト扁平上皮肺癌腫を継代した後期（ｌａｔｅ）ＳＣＩＤマウスから採取して、そしてポリＡ＋ＲＮＡを、Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｍａｋｅｒキット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して単離した。得られたライブラリーを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９）に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ吸着自系患者血清を使用してスクリーニングした（ここで２次抗体は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で発色する、アルカリホスファターゼに結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ａ−Ｍ（Ｈ＋Ｌ）である）。免疫反応性抗原を発現している陽性プラークを、精製した。プラークからのファージミドをレスキューして、そしてこのクローンのヌクレオチド配列を、決定した。
【０２７３】
１５個のクローン（本明細書中以降、ＬＴ８６−１〜ＬＴ８６−１５という）を単離した。ＬＴ８６−１〜ＬＴ８６−８およびＬＴ８６−１０〜ＬＴ８６−１５の単離されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号１７〜２４および２６〜３１に提供し、ここで対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３２〜３９および４１〜４６に提供する。ＬＴ８６−９の決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号２５に提供し、ここで３’端および５’端の対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４０および６５に提供する。これらの配列を、上記の遺伝子バンクにおける配列と比較した。クローンＬＴ８６−３、ＬＴ８６−６〜ＬＴ８６−９、ＬＴ８６−１１〜ＬＴ８６−１３およびＬＴ８６−１５（それぞれ、配列番号１９、２２〜２５、２７〜２９および３１）は、以前に同定された発現配列タグ（ＥＳＴ）にいくらかの相同性を示すことが見出され、ここでクローンＬＴ８６−６、ＬＴ８６−８、ＬＴ８６−１１、ＬＴ８６−１２およびＬＴ８６−１５は、互いに同様または同一であるようであった。クローンＬＴ８６−３は、ヒト転写リプレッサーといくらかの相同性を示すことが見出された。クローンＬＴ８６−６、８、９、１１、１２および１５は、酵母ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ転写調節メディエーターにいくらかの相同性を示すことが見出された。クローンＬＴ８６−１３は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓロイシンアミノペプチダーゼといくらかの相同性を示すことが見出された。クローンＬＴ８６−９は、２つのインサートを含むようであり、ここで５’配列は、以前に同定された、インターフェロンαにより誘導されるＰ２７のアンチセンス配列に対する相同性を示し、そして３’配列は、ＬＴ８６−６に類似である。クローンＬＴ８６−１４（配列番号３０）は、トリトラックス（ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）遺伝子に対していくらかの相同性を示すことが見出され、そして「ＲＧＤ」細胞接着配列、およびペニシリンの加水分解において機能するβ−ラクタマーゼＡ部位を有する。クローンＬＴ８６−１、ＬＴ８６−２、ＬＴ８６−４、ＬＴ８６−５およびＬＴ８６−１０（それぞれ、配列番号１７、１８、２０、２１および２６）は、以前に同定された遺伝子といくらかの相同性を示すことが見出された。ＬＴ８６−４についてその後に決定された伸長ｃＤＮＡ配列を、配列番号６６に提供し、ここで対応する推定アミノ酸配列を、配列番号６７に提供する。
【０２７４】
その後の研究は、５個のさらなるクローン（ＬＴ８６−２０、ＬＴ８６−２１、ＬＴ８６−２２、ＬＴ８６−２６およびＬＴ８６−２７といわれる）の単離をもたらした。ＬＴ８６−２０、ＬＴ８６−２２、ＬＴ８６−２６およびＬＴ８６−２７について決定された５’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６８および７０〜７２に提供し、ここでＬＴ８６−２１について決定された３’ｃＤＮＡ配列を、配列番号６９に提供する。ＬＴ８６−２０、ＬＴ８６−２１、ＬＴ８６−２２、ＬＴ８６−２６およびＬＴ８６−２７についての対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号７３〜７７に提供する。ＬＴ８６−２２およびＬＴ８６−２７は、互いに高度に類似することが見出された。上記のような、遺伝子バンクにおける配列に対するこれらの配列の比較は、ＬＴ８６−２２およびＬＴ８６−２７に対する有意な相同性を示さなかった。ＬＴ８６−２０、ＬＴ８６−２１およびＬＴ８６−２６は、以前に同定された遺伝子に対する相同性を示すことが見出された。
【０２７５】
さらなる研究において、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、肺小細胞癌腫細胞株由来のｍＲＮＡを使用して調製して、そして２つの肺小細胞癌腫の患者の血清のプールを用いて、上記のようにスクリーニングした。この血清プールを、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物を用いて吸着させ、そしてヒトＰＢＭＣ溶解物を、血清に添加して、正常組織に見出されるタンパク質に対する抗体をブロックした。７３個のクローンを単離した。これらのクローンの決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号２９０〜３６２に提供する。配列番号２８９〜２９２、２９４、２９６〜２９７、３００、３０２、３０３、３０５、３０７〜３１５、３１７〜３２０、３２２〜３２５、３２７〜３３２、３３４、３３５、３３８〜３４１、３４３〜３５２、３５４〜３５８、３６０および３６２の配列は、以前に単離された遺伝子といくらかの相同性を示すことが見出された。配列番号２９３、２９５、２９８、２９９、３０１、３０４、３０６、３１６、３２１、３２６、３３３、３３６、３３７、３４２、３５３、３５９および３６１の配列は、以前に同定されたＥＳＴに対していくらかの相同性を示すことが見出された。
【０２７６】
（実施例３）
（肺腫瘍抗原をコードするＤＮＡ配列を同定するためのマウス抗血清の使用）
本実施例は、マウス抗腫瘍血清を用いて肺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによる、肺腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡ配列の単離を例示する。
【０２７７】
指向性ｃＤＮＡ肺腫瘍発現ライブラリーを、上記の実施例２に記載されるように調製した。血清を、後期継代ヒト扁平上皮細胞および腺癌腫瘍を含むＳＣＩＤマウスから得た。これらの血清をプールして、そして正常マウスに注射して、抗肺腫瘍血清を生成した。およそ２００，０００ＰＦＵを、この抗血清を使用して、未増幅ライブラリーからスクリーニングした。ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａ−Ｍ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ２次抗体の使用により、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＢＲＬ  Ｌａｂｓ．）で発色させ、約４０個の陽性プラークを、同定した。ファージを精製して、そして原核生物または真核生物の細胞での発現のために、ファージミドを、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター中にインサートを有する９つのクローンについて切り出した。
【０２７８】
単離されたクローンのうち７つ（本明細書中以降、Ｌ８６Ｓ−３、Ｌ８６Ｓ−１２、Ｌ８６Ｓ−１６、Ｌ８６Ｓ−２５、Ｌ８６Ｓ−３６、Ｌ８６Ｓ−４０およびＬ８６Ｓ−４６といわれる）について決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号４９〜５５に提供し、ここで対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５６〜６２に提供する。残りの２つのクローン（本明細書中以降、Ｌ８６Ｓ−３０およびＬ８６Ｓ−４１といわれる）についての５’ｃＤＮＡ配列を、配列番号６３および６４に提供する。Ｌ８６Ｓ−３６およびＬ８６Ｓ−４６は、同じ遺伝子を示すことがその後に決定された。上記のような、公的データベースにおける配列に対するこれらの配列の比較は、クローンＬ８６Ｓ−３０、Ｌ８６Ｓ−３６およびＬ８６Ｓ−４６（それぞれ、配列番号６３、５３および５５）に対して有意な相同性を示さなかった。Ｌ８６Ｓ−１６（配列番号５１）は、胎児肺および生殖細胞腫瘍において以前に同定されたＥＳＴに対していくらかの相同性を示すことが見出された。残りのクローンは、以前に同定されたヒト遺伝子に対して、少なくともいくらかの程度の相同性を示すことが見出された。Ｌ８６Ｓ−１２、Ｌ８６Ｓ−３６およびＬ８６Ｓ−４６についてその後に決定された伸長ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号７８〜８０に提供し、ここで対応する推定アミノ酸配列を、配列番号８１〜８３に提供する。
【０２７９】
その後の研究により、さらなる９つのクローン（Ｌ８６Ｓ−６、Ｌ８６Ｓ−１１、Ｌ８６Ｓ−１４、Ｌ８６Ｓ−２９、Ｌ８６Ｓ−３４、Ｌ８６Ｓ−３９、Ｌ８６Ｓ−４７、Ｌ８６Ｓ−４９およびＬ８６Ｓ−５１といわれる）についての５’ｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号８４〜９２）の決定がもたらされた。対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９３〜１０１に提供する。Ｌ８６Ｓ−３０、Ｌ８６Ｓ−３９およびＬ８６Ｓ−４７は、互いに類似することが見出された。上記のような、遺伝子バンクにおける配列とのこれらの配列の比較は、Ｌ８６Ｓ−１４に対して有意な相同性を示さなかった。Ｌ８６Ｓ−２９は、以前に同定されたＥＳＴに対していくらかの相同性を示すことが見出された。Ｌ８６Ｓ−６、Ｌ８６Ｓ−１１、Ｌ８６Ｓ−３４、Ｌ８６Ｓ−３９、Ｌ８６Ｓ−４７、Ｌ８６Ｓ−４９およびＬ８６Ｓ−５１は、以前に同定された遺伝子に対していくらかの相同性を示すことが見出された。
【０２８０】
さらなる研究において、指向性ｃＤＮＡライブラリーを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅキットをＬａｍｂｄａ  Ｚａｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓベクターとともに使用して構築した。このライブラリーについての総ＲＮＡを、２つの初代扁平上皮肺腫瘍から単離して、そしてポリＡ＋ＲＮＡを、オリゴｄＴカラムを使用して単離した。抗血清を、ヒト扁平上皮肺癌腫を移植した３匹のＳＣＩＤマウス由来の血清のプールを使用して、正常マウスにおいて発達させた。およそ７００，０００ＰＦＵを、Ｅ．ｃｏｌｉ吸着マウス抗ＳＣＩＤ腫瘍血清を用いて、未増幅ライブラリーからスクリーニングした。陽性クローンを、上記のように同定した。ファージを精製して、そして原核生物および真核生物の細胞における発現のために、ファージミドを、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター中にインサートを有する１８０個のクローンについて切り出した。
【０２８１】
単離されたクローンのうち２３個について決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号１２６〜１４８に提供する。上記のような、公的データベースにおける配列とのこれらの配列の比較は、配列番号１３９および１４３〜１４８の配列に対して有意な相同性を示さなかった。配列番号１２６〜１３８および１４０〜１４２の配列は、以前に同定されたヒトポリヌクレオチド配列に対して相同性を示すことが見出された。
【０２８２】
（実施例４）
（ＳＣＩＤマウスから調製した肺腫瘍ライブラリーをスクリーニングするためのマウス抗血清の使用）
本実施例は、マウス抗腫瘍血清を用いて、ＳＣＩＤマウスから調製された肺腫瘍ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによる、肺腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡ配列の単離を例示する。
【０２８３】
指向性ｃＤＮＡ肺腫瘍発現ライブラリーを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅキットをＬａｍｂｄａ  Ｚａｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓベクターとともに使用して調製した。このライブラリーについての総ＲＮＡを、ＳＣＩＤマウスにおいて増殖した後期継代肺腺癌から採取した。ポリＡ＋ＲＮＡを、Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｍａｋｅｒ  Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を使用して単離した。血清を、肺腺癌を移植した２匹のＳＣＩＤマウスから得た。これらの血清をプールして、そして正常マウスに注射して、抗肺腫瘍血清を生成した。およそ７００，０００ＰＦＵを、Ｅ．ｃｏｌｉ吸着マウス抗ＳＣＩＤ腫瘍血清を用いて、未増幅ライブラリーからスクリーニングした。陽性プラークを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で発色する、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ａ−Ｍ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ２次抗体を用いて同定した。ファージを精製して、そして原核生物および真核生物の細胞における発現のために、ファージミドを、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター中にインサートを有する１００個のクローンについて切り出した。
【０２８４】
単離したクローンの３３個について決定した５’ｃＤＮＡ配列を、配列番号１４９〜１８１に提供する。配列番号１４９、１５０、１５２〜１５４、１５６〜１５８および１６０〜１８１についての対応する推定アミノ酸配列を、配列番号１８２、１８３、１８６、１８８〜１９３および１９４〜２１５にそれぞれ提供する。配列番号１５１のクローン（ＳＡＬ−２５と呼ぶ）が、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことを見出した。これらのＯＲＦによってコードされる推定アミノ酸配列を、配列番号１８４および１８５に提供する。配列番号１５３のクローン（ＳＡＬ−５０と呼ぶ）が、配列番号１８７および２１６の推定アミノ酸配列をコードする２つのオープンリーディングフレームを含むことを見出した。同様に、配列番号１５５のクローン（ＳＡＬ−６６と呼ぶ）が、配列番号１８９および１９０の推定アミノ酸配列をコードする２つのオープンリーディングフレームを含むことを見出した。単離した配列と公開データベースにおける配列との比較は、配列番号１５１、１５３および１５４の配列に対する有意な相同性がないことを明らかにした。配列番号１４９、１５２、１５６、１５７および１５８の配列が、以前に単離された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対するある程度の相同性を示すことを見出した。配列番号１５０、１５５および１５９〜１８１の配列が、ヒトにおいて以前に同定した配列に対して相同性を示すことを見出した。
【０２８５】
上記の手順を使用して、２つの指向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）ｃＤＮＡライブラリー（ＬＴ４６−９０およびＬＴ８６−２１と呼ぶ）を、ＳＣＩＤマウス中で増殖した２つの後期継代肺扁平上皮癌腫から調製し、そしてヒト扁平上皮肺癌腫を移植したＳＣＩＤマウスから得た血清でスクリーニングした。単離したクローンについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号２１７〜２３７および２８６〜２８９に提供する。配列番号２８６が、ＬＴ４６９０−７１（配列番号２３７）のより長い配列であることを見出した。これらの配列と公開データベースの配列との比較は、配列番号２１９、２２０、２２５、２２６、２８７および２８８の配列に対する既知の相同性がないことを明らかにした。配列番号２１８、２２１、２２２および２２４の配列が、未知の機能を有する以前に同定された配列に対するある程度の相同性を示すことを見出した。配列番号２３６の配列が、既知のマウスｍＲＮＡ配列に対して相同性を示すことを見出した。配列番号２１７、２２３、２２７〜２３７、２８６および２８９の配列は、既知のヒトＤＮＡおよび／またはＲＮＡの配列に対するある程度の相同性を示した。
【０２８６】
上記の技術を使用するさらなる研究において、上記のｃＤＮＡライブラリーの１つ（ＬＴ８６−２１）を、Ｅ．ｃｏｌｉ吸収マウス抗ＳＣＩＤ腫瘍血清を用いてスクリーニングした。この血清を、ヒト扁平上皮肺癌腫を移植したＳＣＩＤマウスから採取した３つの血清のプールで免疫した正常なマウスから得た。単離したクローンについて決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号２３８〜２８５に提供する。これらの配列と公開データベースの配列との比較は、配列番号２５３、２６０、２７７および２８５の配列に対する有意な相同性がないことを明らかにした。配列番号２４９、２５０、２５６、２６６、２７６および２８２の配列が、以前に単離された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対するある程度の相同性を示すことを見出した。配列番号２３８〜２４８、２５１、２５２、２５４、２５５、２５７〜２５９、２６１〜２６３、２６５、２６７〜２７５、２７８〜２８１、２８３および２８４の配列が、以前に同定されたＤＮＡまたはＲＮＡの配列に対するある程度の相同性を示すことを見出した。
【０２８７】
正常な組織における発現レベルと比較した、肺腫瘍組織において単離した特定の抗原の発現レベルを、マイクロアレイ技術によって決定した。これらの研究の結果を、これらの配列についてのデータバンク分析と共に、以下の表２に示す。
【０２８８】
（表２）
【０２８９】
【表２】
2004526401.tif 000004
2004526401.tif 000005
ＬＴ＋Ｆ／Ｎ＝肺腫瘍および正常組織を超える胎児組織
ＳＣ＋Ｍ／Ｎ＝肺スモール細胞癌および正常組織を超える転移性組織
Ｓｑｕａ／Ｎ＝正常組織を超える扁平上皮肺腫瘍
Ａｄｅｎ／Ｎ＝正常組織を超える腺癌。
【０２９０】
抗原２ＬＴ−１２８（配列番号２８２）についての全長配列決定研究は、配列番号３９２に提供される全長ｃＤＮＡ配列の単離を生じた。この全長ｃＤＮＡ配列によってコードされるこのアミノ酸配列を、配列番号３９３に提供する。この抗原は、扁平上皮癌における２０倍の過剰発現、および肺腺癌における２．５倍の過剰発現を示した。この遺伝子は、潜在的なｒａｓ癌遺伝子として記載されている（Ｆｅｎｗｉｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：８６９−８７３，２０００）。
【０２９１】
拡張した配列情報を、クローン２ＬＴ−３（配列番号２３８）、２ＬＴ−２６（配列番号２４２）、２ＬＴ−５７（配列番号２４９）、２ＬＴ−５８（配列番号２５０）、２ＬＴ−９８（配列番号２６８）および２ＬＴ−１２４（配列番号２７９）について得た。これらのクローンについてのこの拡張したｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号４２８〜４３３に示し、これらは、それぞれ、配列番号４３４〜４３９に示されるポリペプチド配列をコードする。
【０２９２】
（実施例５）
（肺腫瘍ポリペプチドの組織特異性の決定）
遺伝子特異的プライマーを使用して、代表的な肺腫瘍ポリペプチドについてのｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、種々の正常組織および腫瘍組織において試験した。
【０２９３】
手短かに言うと、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して、種々の正常組織および腫瘍組織から抽出した。第１鎖合成を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに２μｇの総ＲＮＡを４２℃で１時間使用して、実行した。次いで、そのｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＲＴ−ＰＣＲの半定量的性質を確実にするために、β−アクチンを、試験した組織の各々についての内部コントロールとして使用した。ｃＤＮＡの１：３０希釈物１μｌを使用して、β−アクチンテンプレートの線形範囲増幅を可能にした。そしてこのｃＤＮＡの１：３０希釈物は、最初のコピー数で差異を反映するに十分感度が良かった。これらの条件を使用して、このβ−アクチンレベルを、各組織からの各逆転写反応について決定した。ＤＮＡ夾雑物を、ＤＮａｓｅ処理により、そして逆転写酵素を添加することなく調製した第１鎖ｃＤＮＡを使用する場合には、ネガティブなＰＣＲの結果を確実にすることによって、最小にした。
【０２９４】
ｍＲＮＡ発現レベルを、５つの異なる型の腫瘍組織（３人の患者由来の肺扁平上皮腫瘍、肺腺癌、前立腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍）において、ならびに異なる正常組織（４人のドナー由来の肺、前立腺、脳、腎臓、肝臓、卵巣、骨格筋、皮膚、小腸、心筋層、網膜および精巣を含む）において試験した。Ｌ８６Ｓ−４６が、肺扁平上皮腫瘍、結腸腫瘍および前立腺腫瘍において高レベルで発現され、そしてこれらは、試験された他の組織において検出不可能であることを見出した。Ｌ８６Ｓ−５が、肺腫瘍サンプル中で発現され、そして４つの正常肺サンプルのうち２つにおいて発現されるが、試験した他の正常組織または腫瘍組織においては発現されないことを見出した。Ｌ８６Ｓ−１６が、正常な肝臓および正常な胃を除いて、全ての組織において発現することを見出した。リアルタイムＰＣＲを使用して、Ｌ８６Ｓ−４６が、肺扁平上皮組織および正常な扁桃において過剰発現され、そして試験した他の全ての組織において、発現は低いかまたは検出不可能であることを見出した。
【０２９５】
（実施例６）
（肺腫瘍抗原をコードするＤＮＡ配列の単離）
扁平上皮細胞肺腫瘍の形成に潜在的に関与する抗原をコードするＤＮＡ配列を、以下のように単離した。
【０２９６】
肺腫瘍指向性ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、λＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて構築した。このライブラリーのための総ＲＮＡを、２つのヒト扁平上皮肺癌腫のプールから採取し、そしてポリＡ＋ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴセルロース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して単離した。ファージミドをランダムにレスキューし、そして単離したクローンのｃＤＮＡ配列を決定した。
【０２９７】
クローンＳＬＴ−Ｔ１について決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号１０２に提供し、そしてクローンＳＬＴ−Ｔ２、ＳＬＴ−Ｔ３、ＳＬＴ−Ｔ５、ＳＬＴ−Ｔ７、ＳＬＴ−Ｔ９、ＳＬＴ−Ｔ１０、ＳＬＴ−Ｔ１１およびＳＬＴ−Ｔ１２について決定した５’ｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１０３〜１１０に提供する。ＳＬＴ−Ｔ１、ＳＬＴ−Ｔ２、ＳＬＴ−Ｔ３、ＳＬＴ−Ｔ１０およびＳＬＴ−Ｔ１２についての対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１１１〜１１５に提供する。ＳＬＴ−Ｔ２、ＳＬＴ−Ｔ３、ＳＬＴ−Ｔ５、ＳＬＴ−Ｔ７、ＳＬＴ−Ｔ９およびＳＬＴ−Ｔｌ１の配列と、上記のような公開データベースの配列との比較は、有意な相同性がないことを明らかにした。ＳＬＴ−Ｔ１０およびＳＬＴ−Ｔ１２についての配列が、ヒトにおいて以前に同定された配列に対するある程度の相同性を示すことを見出した。
【０２９８】
ＳＬＴ−Ｔ１の配列が、未知タンパク質機能を有するＰＡＣクローンに対するある程度の相同性を示すことを決定した。ＳＬＴ−Ｔ１のｃＤＮＡ配列（配列番号１０２）が、突然変異誘発因子（ＭＵＴＴ）ドメインを含むことを見出した。このようなドメインは、損傷したグアニンのＤＮＡからの除去において機能し、ＡからＧへの塩基転換を生じ得ることが公知である（例えば、ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．、１９９７  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９：７９−８７；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ら  １９９６  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５：４３７−４１；Ｗｕ，Ｃ．ら  １９９５  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：１２３９−４５；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら  １９９６  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．９：１３７５−８１を参照のこと）。従って、ＳＬＴ−Ｔ１は、ＤＮＡ修復における崩壊によって生じるかまたはこの崩壊に関連する肺癌の、遺伝子治療による処置において使用され得る。
【０２９９】
さらなる研究において、腺癌肺腫瘍形成に潜在的に関与する抗原をコードするＤＮＡ配列を、以下のように単離した。ヒト肺腫瘍指向性ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、λＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて構築した。このライブラリーのための総ＲＮＡを、ヒト腺癌継代後期ＳＣＩＤマウスから採取し、そしてポリＡ＋ＲＮＡを、Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｍａｋｅｒ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して単離した。ファージミドを、ランダムにレスキューし、そして単離したクローンのｃＤＮＡ配列を決定した。
【０３００】
５つの単離したクローン（ＳＡＬＴ−Ｔ３、ＳＡＬＴ−Ｔ４、ＳＡＬＴ−Ｔ７、ＳＡＬＴ−Ｔ８、およびＳＡＬＴ−Ｔ９と呼ぶ）について決定した５’ｃＤＮＡ配列を、配列番号１１６〜１２０に提供し、そして対応する推定アミノ酸配列を、配列番号１２１〜１２５において提供する。ＳＡＬＴ−Ｔ３が、以前に同定されたヒトトランスデューシン様エンハンサータンパク質ＴＬＥ２に対して９８％の同一性を示すことを見出した。ＳＡＬＴ−Ｔ４は、マウスＨβ５８遺伝子のヒトホモログであるようである。ＳＡＬＴ−Ｔ７が、ヒト３−メルカプトピルベート硫黄転移酵素に対して９７％の同一性を有していることを見出し、そしてＳＡＬＴ−Ｔ８が、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質１−８Ｕに対して相同性を示すことを見出した。ＳＡＬＴ−Ｔ９は、ヒトムチンＭＵＣ  ５Ｂに対して約９０％の同一性を示した。
【０３０１】
スモール細胞肺癌の発達に潜在的に関与する抗原をコードするｃＤＮＡ配列を、以下のように単離した。ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、スモール細胞肺癌細胞株ＮＣＩＨ６９、ＮＣＩＨ１２８およびＤＭＳ７９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから全て入手可能）由来のｍＲＮＡから、λＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて構築した。ファージミドをランダムにレスキューし、そして２７個の単離されたクローンのｃＤＮＡ配列を決定した。この決定したｃＤＮＡ配列の比較は、配列番号３７２および３７３の配列に対する有意な相同性がないことを明らかにした。配列番号３６４、３６９、３７７、３７９および３８６の配列は、以前に単離されたＥＳＴに対するある程度の相同性を示した。残りの２０クローンの配列は、以前に同定された遺伝子に対するある程度の相同性を示した。これらのクローンのｃＤＮＡ配列を、配列番号３６３、３６５〜３６８、３７０、３７１、３７４〜３７６、３７８、３８０〜３８５および３８７〜３８９に提供し、ここで、配列番号３６３、３６６〜３６８、３７０、３７５、３７６、３７８、３８０〜３８２、３８４および３８５は、全長配列である。
【０３０２】
配列番号３７２のｃＤＮＡ配列の比較は、このクローン（１２８ＴＩと呼ぶ）が、推定７回膜貫通タンパク質のファミリーの新規なメンバーであることを示す。詳細には、コンピュータアルゴリズムＰＳＯＲＴを使用して、このタンパク質が、ＩＩＩＡ型原形質膜７回膜貫通タンパク質であると推定される。ゲノムクローンを、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて同定し、これは、配列番号３７２によってコードされるアミノ酸配列から不足している推定Ｎ末端の５８アミノ酸を含んだ。１２８ＴＩクローンについて決定した全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号３９０に提供し、そして対応するアミノ酸配列を、配列番号３９１に提供する。
【０３０３】
正常な組織における発現レベルと比較した、肺腫瘍組織において単離した特定の抗原の発現レベルを、マイクロアレイ技術によって決定した。これらの研究の結果を、これらの配列についてのデータバンク分析と共に、以下の表３に示す。
【０３０４】
（表３）
【０３０５】
【表３】
2004526401.tif 000006
ＬＴ＋Ｆ／Ｎ＝肺腫瘍および正常組織を超える胎児組織
ＳＣ＋Ｍ／Ｎ＝肺スモール細胞癌および正常組織を超える転移性組織
Ｓｑｕａ／Ｎ＝正常組織を超える扁平上皮肺腫瘍
Ａｄｅｎ／Ｎ＝正常組織を超える腺癌
（実施例７）
（ポリペプチドの合成）
ポリペプチドを、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化を伴うＦＭＯＣ化学反応を使用して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ４３０Ａペプチドシンセサイザー上で合成し得る。Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列は、結合体化、固定された表面への結合、またはペプチドの標識化の方法を提供するためにそのペプチドのアミノ末端に結合され得る。固体支持体からのそのペプチドの切断は、以下の切断混合物を使用して実施され得る：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間の切断の後、そのペプチドを、冷却メチル−ｔ−ブチル−エーテル中で沈殿させ得る。次いで、そのペプチドペレットを、水含有０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解し得、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精製の前に凍結乾燥し得る。水（０．１％ＴＦＡを含む）中０％〜６０％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用して、ペプチドを溶出し得る。純粋な画分の凍結乾燥後、そのペプチドを、エレクトロスプレーまたは他の型の質量分析法を使用し、そしてアミノ酸分析によって特徴付け得る。
【０３０６】
（実施例８）
（Ｔ細胞発現クローニングによる、肺腫瘍抗原をコードするＤＮＡ配列の単離および特徴付け）
肺腫瘍抗原はまた、Ｔ細胞発現クローニングによって同定され得る。腫瘍特異的Ｔ細胞の１つの供給源は、ヒト患者から外科的に切り出された腫瘍からである。
【０３０７】
非スモール細胞肺癌をミンスして、そして数時間、酵素により消化して、腫瘍細胞および浸潤性リンパ球（腫瘍浸潤性Ｔ細胞、すなわちＴＩＬ）を放出させた。この細胞を、ＨＢＳＳ緩衝液中で洗浄して、そしてＦｉｃｏｌｌ（１００％／７５％／ＨＢＳＳ）不連続勾配に通して、非生存細胞から腫瘍細胞およびリンパ球を分離した。２つのバンドをこの界面から回収した（７５％／ＨＢＳＳ界面の上側のバンドは、主に腫瘍細胞を含み、一方、１００％／７５％／ＨＢＳＳ界面の下側のバンドは、リンパ球の大部分を含んだ）。ＴＩＬを、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７および１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充した培養培地を含む２４ウェルプレート、あるいは抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３で予めコーティングした２４ウェルプレートのいずれかで、培養において増殖させた。得られたＴＩＬ培養物を、ＦＡＣＳ分析によって分析して、ＣＤ８＋Ｔ細胞が高い割合を占め（ゲートした（ｇａｔｅｄ）集団の９０％を超える）、ＣＤ４＋細胞は、低い割合のみを占めたことを確認した。
【０３０８】
さらに、非スモール細胞肺癌腫細胞を、腫瘍細胞株（ＬＴ３９１−０６と呼ぶ）を樹立する標準的な技術を使用して、培養において増殖させた。これは、免疫組織化学分析によって肺癌腫細胞株であることが後に確認された。この腫瘍細胞株を、ヒトＣＤ８０を発現するレトロウイルスベクターで形質導入して、そしてＦＡＣＳ分析によって特徴付けして、ＣＤ８０、クラスＩ  ＭＨＣおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の高発現レベルを確認した。
【０３０９】
ＴＩＬ株が自己肺腫瘍を特異的に認識する能力を、サイトカイン放出アッセイ（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）ならびに５１Ｃｒ放出アッセイによって実証した。手短に言うと、２１日目の培養物由来のＴＩＬ細胞を、自己または同種異系腫瘍細胞、ＥＢＶ不死化ＬＣＬまたはコントロール細胞株ＤａｕｄｉおよびＫ５６２のいずれかとともに同時培養して、そしてこの培養上清を、サイトカンの存在について、ＥＬＩＳＡによってモニターした。ＴＩＬは、自己腫瘍を特異的に認識したが、同種異系腫瘍を特異的に認識しなかった。さらに、ＥＢＶ不死化ＬＣＬまたはコントロール細胞株については認識しなかった。このことは、ＴＩＬ株が、腫瘍特異的であり、そして自己ＭＨＣ分子により提示される腫瘍抗原を潜在的に認識していることを示す。
【０３１０】
この特徴付けられた腫瘍特異的ＴＩＬ株を、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で、照射したＥＢＶ形質転換ＬＣＬおよびＰＢＬフィーダー細胞を含む培養物において、可溶性抗ＣＤ３抗体を使用するＴ細胞発現クローニングに適切な数まで増殖させた。増殖したＴＩＬ株由来のクローンを、標準的な限界希釈技術によって生成した。詳細には、ＴＩＬ細胞を、９６ウェルＵ字底プレート中に０．５細胞／ウェルにて播種して、そして５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で、ＣＤ８０形質導入自己腫瘍細胞、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、およびＰＢＬフィーダー細胞で刺激した。これらのクローンを、５１Ｃｒ微量細胞毒性（ｍｉｃｒｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）およびＩＦＮ−γバイオアッセイによって自己腫瘍特異性について確認した。
【０３１１】
これらのＣＴＬクローンは、抗体ブロック実験によって制限されるＨＬＡ−Ｂ／Ｃであることを実証した。代表的なＣＴＬクローンを、同種肺癌腫のパネル上で試験し、そしてこれは自己腫瘍および肺扁平上皮細胞癌（９３６Ｔ）の両方を認識する。これらの腫瘍の間で共有される唯一のクラスＩ  ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ｃｗ１２０３であるため、このことは、ＨＬＡ−Ｃｗ１２０３がＣＴＬによって使用される制限エレメントであることを示す。この知見を、ＣＴＬによって、ＨＬＡ−Ｃｗｌ２０３をコードするレトロウイルスベクターで形質導入された多くの同種肺癌腫の認識によって確認した。
【０３１２】
ポリＡ  ｍＲＮＡを、ＬＴ３９１−０６と呼ばれる肺腫瘍細胞株からＭｅｓｓａｇｅ  Ｍａｋｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して調製した。ｃＤＮＡ合成を含む引き続く工程を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのクローニングマニュアル（ｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプラスミド系）に従って行った。このプロトコルに対する改変を、以下のように行った。アダプター付加工程において、ＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩアダプター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を置換した。サイズ画分したｃＤＮＡを、発現ベクター系ＨｉｓＭａｘ  Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結して、３つ全てのコードフレームにおけるタンパク質発現について最適化した。次いで、ライブラリープラスミドを、約１００ＣＦＵ／ウェルで９６ウェルブロックにアリコートし、一晩液体増幅した。これらの培養物から、グリセロールストックを作製しそしてプールしたプラスミドを、自動化ロボット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって調製した。このライブラリープレートの各ウェル中のプラスミドＤＮＡの濃度を、約１５０ｎｇ／ｕｌと決定した。このｃＤＮＡ発現ライブラリーの最初の特徴付けを、２４の一次形質転換体のランダム配列決定、および得られた配列を利用可能なデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索に供することによって行った。決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号４４３〜４８０に提供し、そしてＢＬＡＳＴ検索の結果を、表４に提供する。
【０３１３】
（表４）
【０３１４】
【表４】
2004526401.tif 000007
Ｔ細胞スクリーニングについて、約８０ｎｇのライブラリープラスミドＤＮＡおよび８０ｎｇのＨＬＡ−Ｃｗ１２０３プラスミドＤＮＡを、製造業者の指示に従って脂質Ｆｕｇｅｎｅと混合し、そしてＣＯＳ−７細胞へ２連でトランスフェクトした。３７℃で４８時間インキュベーション後、トランスフェクション混合物を除去し、そして１００００のＬＴ３９１−０６  ＣＴＬをヒト血清を含む新鮮培地中の各ウェルへ添加した。
【０３１５】
ライブラリー中の抗原を認識するＴ細胞の能力を、６時間後（ＴＮＦ−α、ＷＥＨＩバイオアッセイ）または２４時間後（ＩＦＮ−γ、ＥＬＩＳＡ）にサイトカイン放出によって評価した。約２．０×１０５のクローン（１００のプラスミドプール中）をＣＯＳ−７細胞におけるこの系を使用してスクリーニングした。ＬＴ３９１−０６  ＣＴＬによって認識される３つのプラスミドプールを、同定した（１４Ｆ１０、１９Ａ４、および２０Ｅ１０と呼ばれる）。ＣＯＳ−７細胞へのこれらのプラスミドプールのトランスフェクションは、バックグランドより有意に上のレベルでＬＴ３９１−０６ＣＴＬからＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α両方の生成を導いた。プール１４Ｆ１０、１９Ａ４および２０Ｅ１０を数百の個々のプラスミドＤＮＡへ「分解し」、そして再試験した。プール１４Ｆ１０から単離された２４個の新規のクローンの配列は、配列番号４８１〜５１１に提供される。
【０３１６】
プール１４Ｆ１０由来の１つのプラスミド（３Ｄ９）、プール２０Ｅ１０由来の１つのプラスミドおよびプール１９Ａ４由来の５つのプラスミド（２Ａ６、２Ｅ１１、２Ｆ１２、３Ｆ４、３Ｈ８）は、Ｔ細胞認識を再構成し得た。これらのプラスミドの配列決定は、７．８ｋＢのｃＤＮＡ挿入物（クローン１４Ｆ１０と呼ばれる）、２．２ｋＢのｃＤＮＡ挿入物（クローン１９Ａ４と呼ばれる、配列番号４４０）、および２０Ｅ１０と呼ばれるクローンの同定を導いた。１４Ｆ１０についての全長ｃＤＮＡ配列を、配列番号４４１に提供する。クローン１４Ｆ１０は、１９Ａ４の５’末端に見出される最初の２つの「Ｇ」ヌクレオチドを含まず、そして１９Ａ４の３’近位２４ｂｐが１４Ｆ１０の対応する領域（ヌクレオチド２１４５〜２１６５）とは異なる。さらに、３８３７ｂｐの３’付加配列を、クローン１４Ｆ１０について単離した。クローン２０Ｅ１０の５’末端ｃＤＮＡ配列（３３７ｂｐ）を、配列番号４４２に提供する。２０Ｅ１０は、５’最末端でさらに３つのヌクレオチドを含む（１９Ａ４と比較して）。クローン２０Ｅ１０の５’末端由来の付加配列は、「ＡＴＧ」を含み、従って新規なオープンリーディングフレームの翻訳開始部位を含むようである。ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対するＢＬＡＳＴ探索分析は、短縮されたヒトシスチン／グルタミン酸トランスポーター遺伝子と有意な相同性を有するようなこれらの配列を同定した。しかし、公開された配列とは異なり、クローン１４Ｆ１０および１９Ａ４は、１８１ヌクレオチドからなる独特な５’末端を含む。この新規な配列は、公開された５’領域で置き換わり、そして報告された開始メチオニン（開始コドン）およびこの報告されたトランスポータータンパク質のさらなる２つのアミノ酸の除去を生じる。従って、クローン１４Ｆ１０および１９Ａ４の翻訳産物は、シスチン／グルタミン酸トランスポータータンパク質とは異なる。さらに、他の肺腫瘍のＴ細胞認識は、この抗原が他の腫瘍細胞によって同様に発現されることを示す。
【０３１７】
抗ＬＴ３９１−０６細胞のＴ細胞認識を再構成するクローン１９Ａ４および１４Ｆ１０内にコードされるエピトープならびにアミノ酸配列を、以下のようにマッピングした。Ｃｏｓ−７細胞を、８０ｎｇ／ウェルのＨＬＡ−Ｃｗ１２０３でクローン１９Ａ４、１９Ａ４の独特な５’末端に位置される潜在的なオープンリーディングフレーム、またはシスチン／グルタミン酸（Ｃｙｓ−Ｇｌｕ）トランスポーター遺伝子由来のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡ（真核生物発現ベクターへクローニングする）の滴定量と共にトランスフェクトし、そしてＴＮＦアッセイにおける抗ＬＴ３９１−０６  Ｔ細胞の刺激について試験した。陽性コントロールとして、Ｃｏｓ−７細胞を、ＨＬＡ−Ｃｗ１２０３および上記の陽性プラスミドクローン１９Ａ４で同時トランスフェクトした。このＣｙｓ−Ｇｌｕトランスポーター発現構築物を、テンプレートとして１９Ａ４を用い、トランスポーターの公知のＯＲＦに特異的な５’プライマーおよび３’プライマーを使用してＰＣＲによって単離した。さらに、各５’プライマーは、ポリペプチドの翻訳を駆動するためにＫｏｚａｋ翻訳開始部位および開始メチオニンを含んでいた。ＬＴ３９１−０６に対するＣＴＬは、Ｃｙｓ−Ｇｌｕトランスポーター構築物を発現するトランスフェクタントを認識しなかったが、１９Ａ４および１９Ａ４由来の５’ＯＲＦを発現するトランスフェクタントを認識した。
【０３１８】
引き続く発現において、Ｃｏｓ−７細胞を、転位変異体それぞれＦ１０およびＣ１２のＤＮＡの滴定量と共に８０ｎｇ／ウェル  ＨＬＡ−Ｃｗ１２０３で同時トランスフェクトし、そしてＴＮＦアッセイにおける抗ＬＴ３９１−０６  Ｔ細胞の刺激について試験した。陽性コントロールトして、Ｃｏｓ−７細胞を、ＨＬＡ−Ｃｗ１２０３および１９Ａ４の５’ＯＲＦのクローンで同時トランスフェクトした。転位変異体Ｆ１０およびＣ１２を、１４Ｆ１０クローンのトランスポゾン媒介変異および配列分析による挿入部位についてのスクリーニングによって得た。変異体Ｆ１０のトランスポゾンに、１４Ｆ１０  ｃＤＮＡの５’ＥｃｏＲＩクローニング部位由来の約３０４ｂｐを挿入した。この変異は、Ｔ細胞エピトープの翻訳を中断させなかった。対照的に、１４Ｆ１０  ｃＤＮＡの５’ＥｃｏＲＩクローニング部位由来の約１１６ｂｐを挿入した変異体Ｃ１２のトランスポゾンが、Ｔ細胞エピトープの翻訳を妨げることを見出した。従って、１４Ｆ１０におけるエピトープは、これら２つのトランスポゾン挿入部位間にマッピングされる。Ｃ１２およびＦ１０トランスポゾン挿入部位間の領域のアミノ酸配列を、配列番号５８６に提供する。
【０３１９】
配列番号５８６に示される領域に対する一連の１１個の重複１６マーおよび１５マーペプチドを調製し、そして抗ＬＴ３９１−０６細胞の刺激（ＴＮＦおよびＩＦＮ−γアッセイにおけるサイトカイン放出によって決定される）について試験した。配列番号５８７に提供するペプチド（配列番号５８６の残基５〜２０に対応する）のみが、サイトカイン放出を刺激した。これらの研究は、ＬＴ３９１−０６抗原のＨＬＡ−Ｃｗ１２０３拘束エピトープが配列番号５８７に含まれることを示す。
【０３２０】
（実施例９）
（ＰＣＲ減算による肺腫瘍抗原をコードするＤＮＡ配列の単離および特徴づけ）
本実施例は、上記のヒト肺腫瘍細胞株ＬＴ３９１−０６から調製されるＰＣＲ減算発現ライブラリーからのｃＤＮＡクローンの単離および特徴づけを記載する。
【０３２１】
テスターポリＡ  ｍＲＮＡを、上記の細胞株ＬＴ３９１−０６から調製した。駆動ポリＡ  ｍＲＮＡを、非肺細胞由来であり、かつＬＴ３９１−０６反応性Ｔ細胞によって認識されないヒト急性Ｔ細胞白血病／Ｔリンパ球細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）から単離した。この減算を、以下を変更してＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の方法に従って実行した：１）ｃＤＮＡの第２の制限消化反応を酵素（ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｔｕＩおよびＤｒａＩ）のプールを使用して終えた。このことを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ推薦のＲｓａＩを用いる単一の制限酵素消化に加えて、この消化とは別に行った。各制限消化セットを、別個のライブラリーとして処理して、確実に最終混合ライブラリーが重複フラグメントを含むようにした。従って、Ｔ細胞によって認識されるエピトープは、ライブラリー中のフラグメント上に示されるべきであり、そしてその中の単一の制限部位の存在によって破壊されるべきではない。２）駆動対テスターｃＤＮＡの比をハイブリダイゼーション工程において増加し、減算ストリンジェンシーを増加した。この減算の有効性を解析するために、アクチンを、減算ならびに非減算ＰＣＲサンプルの希釈液からＰＣＲ増幅した。この第２の増幅工程は、通常使用されるプライマーから改変したプライマーを利用した。３つの入れ子ＰＣＲプライマーを操作して、３つのフレームのうちの１つに切断可能なＥｃｏＲＩ部位（クローニングの間は利用されない）を含ませた。従って、これらのプライマーを用いる二次増幅は、真核生物の発現プラスミドｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ／Ｍａｘ−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ直接連結され得る産物を生じた。このことは、ライブラリー内のどこかにインフレームで示されるＰＣＲ減算および増幅フラグメントを生じた。この減算の力学に起因して、５０％のフラグメントのみが、正しい方向付けにある。ライブラリーの複雑さおよび重複を、最終的にプールされるＰＣＲ減算発現ライブラリー（ＬＴ３９１−０６ＰＣＲと呼ぶ）からランダムに選び取られた９６個のクローンを配列決定することによって特徴づけした。これらの配列（配列番号５１２〜５８１）を、公に利用可能なデータベースにおける配列と比較することによって分析した（表５）。
【０３２２】
【表５】
2004526401.tif 000008
2004526401.tif 000009
2004526401.tif 000010
2004526401.tif 000011
（実施例１０）
（肺腫瘍抗原に特異的なＴ細胞クローン由来のＴ細胞レセプターの単離および特徴づけ）
本実施例は、肺腫瘍細胞株ＬＴ３９１−０６によって発現される抗原に特異的なＣＤ８Ｔ細胞クローン由来のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）αおよびβ鎖クローニングおよび配列決定を記載する。Ｔ細胞は、限られた寿命を有する。ＴＣＲ鎖のクローニングおよび引き続く転移は、本質的にＴ細胞特異性の無限伝播を可能にする。腫瘍抗原ＴＣＲ鎖のクローニングは、ＴＣＲ  ＭＨＣ拘束対立遺伝子を共有する患者から単離したＴ細胞への特異性の転移を可能にする。次いで、このようなＴ細胞を、拡張して、そして養子転移技術で使用して、抗原を発現する腫瘍を保有する患者へ腫瘍抗原特異性を導入し得る（例えば、Ｃｌａｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５０７（１９９９）を参照のこと）。
【０３２３】
肺腫瘍細胞株ＬＴ３９１−０６に特異的な細胞障害性のＴリンパ球（ＣＴＬ）クローンを産生した。このような１５個のクローン由来の２×１０６細胞由来の総ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して単離し、そしてｃＤＮＡを、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して合成した。これらのクローンにおけるＶａおよびＶｂ配列を決定するために、ＶａおよびＶｂサブタイプ特異的プライマーのパネルを合成し、そして各クローンから産生したｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、各クローンがＶｂ１３サブファミリーに対応する共通Ｖｂ配列を発現することを示した。１つのクローンから産生したｃＤＮＡ（１１０５と呼ぶ）を使用して、発現されるＶａ配列をＶａ２２と決定した。クローン１１０５から全ＴＣＲαおよびβ鎖をクローニングするために、ＴＣＲヌクレオチドをコードするイニシエーターおよびターミネーターにわたるプライマーを、設計した。標準的な３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＣＴＬクローンおよびプライマーから合成されるｃＤＮＡを使用して熱安定なポリメラーゼとしてＰＷＯ（ＢＭＢ）を用いて達成した。生じる特異的バンド（α鎖については約８５０ｂｐおよびβ鎖については約９５０ｂｐ）を、ＰＣＲ平滑ベクター（ｂｌｕｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉへ形質転換した。全長αおよびβ鎖を含むプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、同定し、そして対応するプラスミドのラージスケールの調製物を産生した。全長ＴＣＲαおよびβ鎖を含むプラスミドを配列決定した。決定した、αおよびβ鎖のｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号５８３および５８２に提供し、その対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５４および５８５に提供する。
【０３２４】
前述から、本発明の特定の実施形態は、例示目的のために本明細書中に記載され、種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱せずになされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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