(57)【要約】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を治療する効果的な薬投薬計画の同定において使用される抗ウイルス薬の感受性および耐性試験に関し、更に、表現型感受性アッセイもしくは遺伝型アッセイを使用した、ＨＩＶ感染の臨床上の進行、並びに、抗レトロウイルス療法、特にヌクレオシド逆転写酵素阻害療法に対するその反応をモニタリングする手段および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２３０における突然変異を単独で、またはコドン１０３における突然変異もしくはコドン１８１における突然変異と共に有する、ＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み；
このような突然変異の存在が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激における減少と相関している方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２３０がロイシン（Ｌ）をコードする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項５】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２３０における突然変異を単独で、またはコドン１０３における突然変異もしくはコドン１８１における突然変異と共に含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞における前記インジケータ遺伝子の発現を測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータ遺伝子の発現測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータ遺伝子の発現測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項６】
耐性試験ベクターであって：
（ｉ）コドン２３０、コドン１０３またはコドン１８１の少なくとも一つにおける突然変異を有する逆転写酵素を含むＨＩＶ患者由来の切片と；
（ｉｉ）インジケータ遺伝子とを含み、
前記インジケータ遺伝子の発現は、前記患者由来の切片に依存しているベクター。
【請求項７】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと：
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２３０における突然変異を単独で、またはコドン１０１、コドン１０３、コドン１９０、コドン２２１およびコドン２８３からなる群から選択されるコドンにおける少なくとも一つの突然変異と共に有する、ＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み；前記突然変異の存在が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激における減少と相関している方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２３０がロイシン（Ｌ）をコードする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０１がグルタミン酸（Ｅ）をコードし、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードし、前記突然変異したコドン１９０がセリン（Ｓ）をコードし、前記突然変異したコドン２２１がチロシン（Ｙ）をコードし、または前記突然変異したコドン２３８がスレオニン（Ｔ）をコードする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項１１】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２３０における突然変異を単独で、またはコドン１０３、コドン１９０、コドン２２１もしくはコドン２３８における突然変異と共に含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞の中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞における前記インジケータ遺伝子の発現を測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータ遺伝子の発現測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータ遺伝子の発現測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項１２】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２３０、１０１、１０３、１９０、２２１および／または２３８に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項１３】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４１および１０３もしくは１３５に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４１がセリン（Ｓ）をコードする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードし、前記突然変異したコドン１３５がスレオニン（Ｔ）をコードする方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項１７】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４１および１０３もしくは１３５における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項１８】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４１、１０３および／または１３５に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項１９】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４１および１０１、１０６、１３５、１３８もしくは１９０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４１がイソロイシン（Ｉ）をコードする方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０１がグルタミン酸（Ｅ）をコードし、前記突然変異したコドン１０６がメチオニン（Ｍ）をコードし、前記突然変異したコドン１３５がスレオニン（Ｔ）をコードし、前記突然変異したコドン１３８がアラニン（Ａ）をコードし、および／または前記突然変異したコドン１９０がアラニン（Ａ）をコードする方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項２３】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４１および１０１、１０６、１３５、１３８もしくは１９０における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項２４】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４１、１０１、１０６、１３５、１３８および／または１９０に突然変異を有する逆転写酵素を含む、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項２５】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４５および９８、１３５、および／または１８１に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４５がグルタミン酸（Ｅ）をコードする方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、前記突然変異したコドン９８がグリシン（Ｇ）をコードし、前記突然変異したコドン１３５がスレオニン（Ｔ）をコードし、および／または前記突然変異したコドン１８１がシステイン（Ｃ）をコードする方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項２９】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５および９８、１３５、および／または１８１における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項３０】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５、９８、１３５、および／または１８１に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項３１】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４５および１０１、１０３、１３５、および／または１９０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４５がグルタミン酸（Ｅ）をコードする方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０１がグルタミン酸（Ｅ）をコードし、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードし、前記突然変異したコドン１３５がスレオニン（Ｔ）をコードし、および／または前記突然変異したコドン１９０がアラニン（Ａ）をコードする方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項３５】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５および１０１、１０３、１３５、および／または１９０における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項３６】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５、１０１、１０３、１３５、および／または１９０に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項３７】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の効果を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４５および１０３、２２５、および／または２７０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４５がグルタミン酸（Ｅ）をコードする方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードし、前記突然変異したコドン２２５がヒスチジン（Ｈ）をコードし、および／または前記突然変異したコドン２７０がメチオニン（Ｍ）をコードする方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項４１】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５および１０３、２２５、および／または２７０における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項４２】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５、１０３、２２５、および／または２７０に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項４３】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４５および１３５、および／または１３８に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４５がスレオニン（Ｔ）をコードする方法。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１３５がスレオニン（Ｔ）をコードし、および／または前記突然変異したコドン１３８がグリシン（Ｇ）をコードする方法。
【請求項４６】
請求項４３に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項４７】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５および１３５、および／または１３８における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項４８】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５、１３５、および／または１３８に突然変異を有する逆転写酵素を含む、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項４９】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４５および９８、１０３、１３５、１８１および／または１９０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４５がスレオニン（Ｔ）をコードする方法。
【請求項５１】
請求項４９に記載の方法であって、前記突然変異したコドン９８がグルタミン酸（Ｇ）をコードし、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードし、前記突然変異したコドン１３５がスレオニン（Ｔ）をコードし、前記突然変異したコドン１８１がシステイン（Ｃ）をコードし、および／または前記突然変異したコドン１９０がアラニン（Ａ）をコードする方法。
【請求項５２】
請求項４９に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項５３】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５および９８、１０３、１３５、１８１および／または１９０における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項５４】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５、９８、１０３、１３５、１８１および／または１９０に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項５５】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４５および１０３に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４５がスレオニン（Ｔ）をコードする方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードする方法。
【請求項５８】
請求項５５に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項５９】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５および１０３における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項６０】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５および１０３に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項６１】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４５および１０３、１３５および／または２２５に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４５がメチオニン（Ｍ）をコードする方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードし、前記突然変異したコドン１３５がスレオニン（Ｔ）をコードし、および／または前記突然変異したコドン２２５がヒスチジン（Ｈ）をコードする方法。
【請求項６４】
請求項６１に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項６５】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５および１０３、１３５および／または２２５における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項６６】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４５、１０３、１３５および／または２２５に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項６７】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２７０および１０３、および／または１３５に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２７０がセリン（Ｓ）をコードする方法。
【請求項６９】
請求項６７に記載の方法であって、前記突然変異したコドン１０３がアスパラギン（Ｎ）をコードし、および／または前記突然変異したコドン１３５がスレオニン（Ｔ）をコードする方法。
【請求項７０】
請求項６７に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項７１】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２７０および１０３および／または１３５における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項７２】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２７０、１０３、および／または１３５に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項７３】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２３０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項７４】
請求項７３に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２３０がロイシン（Ｌ）をコードする方法。
【請求項７５】
請求項７３に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項７６】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２３０における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項７７】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２３０に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項７８】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２４１に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項７９】
請求項７８に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２４１がセリン（Ｓ）をコードする方法。
【請求項８０】
請求項７８に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項８１】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２４１における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項８２】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２４１に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【請求項８３】
ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）前記ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；
（ｂ）前記生物学的サンプルが、コドン２７０に突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を含むかどうかを評価することとを含み、前記突然変異の存在が、ＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の減少と相関する方法。
【請求項８４】
請求項８３に記載の方法であって、前記突然変異したコドン２７０がセリン（Ｓ）をコードする方法。
【請求項８５】
請求項８３に記載の方法であって、前記ＨＩＶ感染患者が抗レトロウイルス剤で治療されている方法。
【請求項８６】
ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって：
（ａ）患者由来の切片を含み、更に、コドン２７０における突然変異を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞中に導入することと；
（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；
（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータを測定することと；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータの測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータの測定値と比較することとを含み、
試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）；工程（ｂ）〜（ｃ）；または工程（ｃ）において存在せしめる方法。
【請求項８７】
ＨＩＶ患者由来の切片を含み、更に、コドン２７０に突然変異を有する逆転写酵素を含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターであって、前記インジケータ遺伝子の発現は前記患者由来の切片に依存する耐性試験ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願の全体にわたり様々な刊行物が本文中で著者名および発行日により参照される。これらの刊行物の完全な書誌的事項は、発明の詳細な説明の終わりにアルファベット順の一覧で記載される。引用が先（ｓｕｐｒａ）または後（ｉｎｆｒａ）の何れであるにせよ、本願明細書において引用した全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体を本願明細書に援用したものとする。それら刊行物の開示内容の全体は、本願の明細書に記載し且つ特許請求の範囲に記載した発明を達成した時点の当業者に既知の技術水準をより完全に記載するために、本出願に援用される。
【０００２】
【発明の技術分野】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を治療する効果的な薬投薬計画（ｄｒｕｇ ｒｅｇｉｍｅｎｓ）の同定に使用される抗レトロウイルス薬の感受性および耐性試験に関する。本発明は、更に表現型もしくは遺伝型感受性アッセイを使用して、ＨＩＶ感染の臨床上の進行および抗レトロウイルス療法に対する反応をモニタリングする手段および方法に関する。また本発明は、表現型感受性試験を実行するための新規ベクター、宿主細胞および組成物に関する。本発明は、更に感染が特定の抗レトロウイルス薬投薬計画に対して低感受性（「耐性」）となった患者を同定する様々な遺伝学的方法論の使用に関する。また本発明は、ウイルス、選択されたウイルス配列および／またはウイルス蛋白質を抑制する能力に対する抗レトロウイルス薬の候補のスクリーニングに関する。より具体的には、本発明は、抗レトロウイルス剤の存在下で複製の薬物依存性刺激（ｄｒｕｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を提示するウイルス／ウイルス群を有する患者を同定する表現型感受性試験および／または遺伝型試験の使用に関する。
【０００３】
【発明の背景】
ＨＩＶ感染は、疾患経過全体にわたりウイルス・ターンオーバーが高い速度で生じることで特徴づけられ、最終的にはＣＤ４欠乏および疾患進行に至る （Ｗｅｉ Ｘ， Ｇｈｏｓｈ ＳＫ， Ｔａｙｌｏｒ ＭＥ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３４３，１１７−１２２） （Ｈｏ ＤＤ， Ｎａｕｍａｎｎ ＡＵ， Ｐｅｒｅｌｓｏｎ ＡＳ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７３，１２３‐１２６）。抗レトロウイルス療法の目的は、ウイルス複製の実質的および持続的な抑制を達成するためである。持続的なウイルス制御を達成することは、一連の療法の使用を含むことが考えられ、一般的には、各々の療法は３以上の抗レトロウイルス薬の併用を含むものである。従って、開始時および引き続く療法の選択は、理論的な根拠に基づいた療法の決定に重要である耐性および交差耐性パターンの知見を踏まえてなされるべきである。併用療法の主要な原理は、ウイルス複製の大きな抑制を達成するための相乗的もしくは相加的な活性に関係する。治療は多年にわたり維持されるので、薬投薬計画の許容性（ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）も重要である。
【０００４】
非治療患者において、およそ１０１０の新規ウイルス粒子が日ごとに産生される。エキソヌクレアーゼ性の校正（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）により転写エラーを修正するＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）の校正間違いに関連する、この高いレベルのウイルスのターンオーバーは、日ごとにＨＩＶゲノムの各ポジションで１０４から１０５の突然変異を生じる。これは、広範な遺伝型バリエーションの迅速な達成が生じた結果である。いくつかの鋳型ポジションはよりエラーを生じがちであるが（Ｍａｎｓｋｙ ＬＭ， Ｔｅｍｉｎ ＨＭ （１９９５） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９，５０８７−５０９４） （Ｓｃｈｉｎａｚｉ ＲＦ， Ｌｌｏｙｄ ＲＭ， Ｒａｍａｎａｔｈａｎ ＣＳ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３８，２６８−２７４）、数学的モデルは感染した個体では突然変異が各々のヌクレオチド・ポジションにおいて日に１０４回生じ得ることを示唆している。
【０００５】
生じる抗レトロウイルス薬耐性に対して、標的酵素は、前記阻害剤の存在下でその機能を保持すると同時に修正されなければならない。アミノ酸置換を生じる点突然変異（Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）は、前記酵素の活性部位、基質結合部位、もしくは周囲領域の形状、サイズもしくは荷電（ｃｈａｒｇｅ）における変化を生じ得る。抗レトロウイルス剤に耐性である突然変異体は、療法の開始前に低レベルながら検出された（Ｍｏｈｒｉ Ｈ， Ｓｉｎｇｈ ＭＫ， Ｃｈｉｎｇ ＷＴＷ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，２５−２９） （Ｎａｊｅｒａ Ｉ， Ｒｉｃｈｍａｎ ＤＤ， Ｏｌｉｖａｒｅｓ Ｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０，１４７９−１４８８） （Ｎａｊｅｒａ Ｉ， Ｈｏｌｇｕｉｎ Ａ， Ｑｕｉｎｏｎｅｓ−Ｍａｔｅｕ Ｅ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９，２３−３１）。
【０００６】
しかしながら、これらの突然変異体株は、総ウイルス負荷（ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）のうちのほんの僅かな割合を代表するものであり、野生型ウイルスと比較して複製もしくは競争において不利である （Ｃｏｆｆｉｎ ＪＭ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７，４８３−４８９）。抗レトロウイルス療法の選択圧は、これらの薬耐性突然変異体を競争上の利点から出現させ、このようにして優勢な準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）を出現させることになり（Ｆｒｏｓｔ ＳＤＷ， ＭｃＬｅａｎ ＡＲ （１９９４） ＡＩＤＳ ８，３２３−３３２） （Ｋｅｌｌａｍ Ｐ， Ｂｏｕｃｈｅｒ ＣＡＢ， Ｔｉｊｎａｇａｌ ＪＭＧＨ （１９９４） Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７５，３４１−３５１）、究極的には患者に薬剤耐性およびウイルス不全（ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ ｆａｉｌｕｒｅ）を生じさせることになる。
【０００７】
薬の存在下で複製できないウイルス（即ち、耐性ウイルス）だけでなく、薬不存在下よりも薬存在下で実際上より効率的に複製できうるウイルス（即ち、ウイルスの薬物依存性刺激）を生じる１つの突然変異（Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ）もしくは複数の突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）は、特に重要な同定すべき表現型を提示するだろう。この場合、薬は免疫系の破壊および疾患の進行の速度を実際に加速し得る。
【０００８】
《非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ）》
非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ；Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）は、インビトロでのＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）の強力な阻害剤である化合物の化学的に多様なグループである。これらの化合物は、ピリジノン誘導体（ｐｙｒｉｄｉｎｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）およびアテビルジン（ａｔｅｖｉｒｄｉｎｅ）などのビス（ヘテロアリル）ピペラジン（ＢＨＡＰｓ）、ジピリドジアゼピノン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ；ネビラピン）、チミン誘導体群（ＴＳＡＯ および ＨＥＰＴ）、ａ−アニリノフェニルアセトアミド（ａ−ＡＰＡ）化合物（ｌｏｖｉｒｉｄｅ；ロビライド）、キノキサリン−クラス阻害剤（ＨＢＹ−０９７）、ベンゾジアゼピン−オンおよび−チオン（ＴＩＢＯ）化合物、並びにピリジノン誘導体 （Ｌ−６９７，６６１）を含む。概要は、（ＤｅＣｌｅｒｃｑ Ｅ． （１９９６） Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ６，９７−１１７） （Ｅｍｉｎｉ ＥＡ （１９９６） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ｅｄ． ＤＤ Ｒｉｃｈｍａｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ）を参照のこと。
【０００９】
３つのＮＮＲＴＩｓ：ネビラピン（ＮＶＰ， Ｖｉｒａｍｕｎｅ， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ， Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ ａｍ Ｒｈｅｉｎ， ドイツ）， デラビルジン （ＤＬＶ， Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ， Ｋａｌａｍａｚｏｏ， ＭＩ， 米国）， およびエファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ；ＥＦＶ， Ｓｕｓｔｉｖａ， Ｄｕｐｏｎｔ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ， 米国）は、 米国での使用に対してライセンスされている。
【００１０】
個々の化合物に対する高レベルの耐性は、迅速〔しばしば単独療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）開始後の数週間内〕に発生するようであり、頻繁に単一部位点突然変異（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を生じ、そして多くの場合、他のＮＮＲＴＩｓに対して少なからぬ交差耐性を生じる。大抵の報告された突然変異は、コドングループ１００〜１０８ および １８１〜１９０（これはＲＴ酵素の触媒部位に近接する２つのｂ−シートをコードする）で生じる（Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ ＬＡ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＪＭ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，１７８３−９０）。ＮＮＲＴＩ結合ポケット（記載されたように）とは、これらの薬がＲＴと直接相互作用するＲＴの疎水性非基質結合領域である。それらは「親指」サブドメイン（’ｔｈｕｍｂ’　ｓｕｂｄｏｍａｉｎ）の可動性に影響することにより、または触媒活性に必須の保存されたアスパラギン酸側鎖の方向性を乱すことにより活性を阻害する（Ｄ’Ａｑｕｉｌｌａ ＲＴ． （１９９４） Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｍｅｄ １４，３９３−４２３） （Ａｒｎｏｌｄ Ｅ．， Ｄｉｎｇ Ｊ．， Ｈｕｇｈｅｓ ＳＨ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ５，２７−３８）。
【００１１】
2004503253.tif 000002
【００１２】
単独療法に使用したロビライドに対する耐性は、２４週までに大抵の患者で発生する。それはＨＩＶ　ＲＴコドン１００〜１１０； １８１〜１９０の範囲にマップされる（最も一般的にはコドン１０３）（Ｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ Ｓ， Ｍｉｌｌｅｒ Ｖ， Ｋｏｂｅｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒ １，４２−５０）。ロビライドと共にジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）もしくはジドブジン　プラス　ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）を使用した併用療法の間で、コドン９８ および１０３での突然変異体は２４週で検出される最も頻繁な突然変異であった （Ｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ Ｓ， Ｍｉｌｌｅｒ Ｖ， Ｒｅｈｍｅｔ Ｓ， ｅｔ ａｌ．（１９９６） ＡＩＤＳ １０， Ｆ１−７）。
【００１３】
Ｋ１０１Ｅ， Ｋ１０３Ｎ， および Ｙ１８１Ｃ突然変異もＢＨＡＰｓに対する交差耐性を付与するが（Ｂａｌｚａｒｉｎｉ Ｊ， Ｋａｒｌｓｓｏｎ Ａ， Ｐｅｒｅｚ‐Ｐｅｒｅｚ Ｍ−Ｊ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９２，２４６−２５３）、これらの薬剤によりインビトロで選択された特徴的なＰ２３６Ｌ置換は、いくつかの他のＮＮＲＴＩｓに対してＲＴを敏感にする（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）ようであり、ネビラピンのＩＣ５０をヌクレオシド・アナログに対する感受性に影響することなしに減少する（例えば、７から１０倍）（Ｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ Ｓ．， Ｉｂｉｄ）。このコドン２３６の突然変異は、アテビルジン療法の間の臨床分離株で観察され、コドン１０３および１８１での他の耐性付与突然変異は単独療法の間、同様にコドン１０１，１８８，２３３ および ２３８ではジドブジンとの併用療法の間で報告された。
【００１４】
ＨＢＹ−０９７は、ＨＩＶ　ＲＴ　コドン１９０の突然変異をインビトロにおいて当初選択するが、更なる継代は一貫してＨＩＶ ＲＴ コドン ７４ および ７５での突然変異を選択し、いくつかの突然変異体ウイルスはジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）およびスタブジン（ ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）に対して減少した感受性を示す（しかし、ジドブジンに対しては示さない） （Ｋｌｅｉｍ Ｊ−Ｐ， Ｒｏｓｎｅｒ Ｍ， Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ １０ Ｓｕｐｐｌ ３， ２）。
【００１５】
コドン１８１での突然変異は、典型的な４１および２１５コドン突然変異に起因するジドブジン耐性を拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）させると報告されており（Ｚｈａｎｇ Ｄ， Ｃａｌｉｅｎｄｏ ＡＭ， Ｅｒｏｎ ＪＪ， ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３８，２８２−２８７）、このことはいくつかのＮＮＲＴＩｓおよびジドブジンでの併用療法が可能であることを示唆している。ジドブジン、ジダノシンおよびネビラピンに対する３重耐性（ｔｒｉｐｌｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を有するＨＩＶ突然変異株が、インビトロ試験で分離され記載されているが（Ｌａｒｄｅｒ ＢＡ， Ｋｅｌｌａｍ Ｐ， Ｋｅｍｐ ＳＤ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６５， ４５１−４５３）、この３薬併用での治療は、ＣＤ４細胞カウント＜ ３５０／ｍｍ３の患者の４８週期間にわたるジドブジン　プラス　ジダノシンのみの療法よりも優れた免疫学的およびウイルス学的な応答を惹起させる。
【００１６】
ジドブジンおよびピリジノン誘導体 Ｌ−６９７， ６６１による併用療法は、このＮＮＲＴＩによる単独療法の間に典型的に選択されるコドン１８１突然変異の出現を阻害し、この化合物に対する高レベルの耐性の出現を遅延させる。ジドブジンに対する感受性の変化は、本試験では調査しなかった（Ｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ Ｓ， Ｍａｓｓａｒｉ ＦＥ， Ｋｏｂｅｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７１，１１５９‐１１６５）。同時（Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）、もしくは交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）ジドブジン療法は、ネビラピン療法の際の耐性の出現を遅延させない（Ｒｉｃｈｍａｎ ＤＤ， Ｉｂｉｄ） （Ｎｕｎｂｅｒｇ ＪＨ， Ｓｃｈｌｅｉｆ ＷＡ， Ｂｏｏｔｓ ＥＪ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５，４８８７−４８９２） （ＤｅＪｏｎｇ ＭＤ， Ｌｏｅｗｅｎｔｈｌ Ｍ， Ｂｏｕｃｈｅｒ ＣＡＢ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １６９， １３４６−１３５０） （Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ ＳＨ， Ｈａｖｌｉｒ Ｄ， ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＭＭ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ ８，１４１−１５１。しかしながら、１８１突然変異体は、この併用による治療の間で観察されず、突然変異は最も一般的にはコドン１９０で生じる （Ｒｉｃｈｍａｎ ＤＤ， Ｉｂｉｄ）。この結果は、コドン１８１突然変異（インビトロでのジドブジン耐性に対して拮抗的である）は、インビボにおいては適合しないか、または好適ではないものであり、ジドブジン耐性に付随したネビラピンに対する減少した感受性を可能にする他の突然変異を選択する方が有利であることを示唆している。
【００１７】
ＮＮＲＴＩｓに対する減少した感受性の迅速な発生は、これらの薬の限定的な有用性（特に単独療法としての）を示唆し、また、薬剤耐性ウイルスの出現を遅延させる試みを通じてこれらの分子の改良へと導いた。第二世代の「ＮＮＲＴＩ」であるピリジノン誘導体Ｌ−７０２，０１９は、野生型とコドン１８１突然変異体ＨＩＶ−１の間のＩＣ５０において、ほんの３倍の変化を示しただけであり、高レベルの耐性を引き起こすためには複数の突然変異を必要とした （Ｇｏｌｄｍａｎ ＭＥ， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＪＡ， Ｒｕｆｆｉｎｇ ＴＬ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３７， ９４７−９４９）。
【００１８】
同様にエファビレンツ（ＥＦＺ）は、第二世代ＮＮＲＴＩとして比較的最近導入された。エファビレンツは、代表的なＲＴ突然変異Ｙ１８１Ｃを保持するウイルスに対して活性を保持するというユニークなプロファイルを有している。インビトロにおいて、エファビレンツは、コドン１００，１０１，１０３， １０８，１７９，１８１， および １８８における突然変異を選択する。これは、コドン１００， １０３，１０８，１９０ および ２２５， （並びに、おそらく １０１，１７９，１８１ および １８８）における突然変異を含むインビボ耐性プロファイルと類似するものである。（Ｗｉｎｓｌｏｗ ＤＬ， Ｇａｒｂｅｒ Ｓ， Ｒｅｉｄ Ｃ， ｉｔ ａｌ． Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １９７７； ｌ （Ｓｕｐｐｌ． １） ： ６． Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＨＩＶ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｓａｒｄｉｎｉａ， Ｉｔａｌｙ， （１９９５） （Ｗｉｎｓｌｏｗ ＤＬ， Ｇａｒｂｅｒ Ｓ， Ｒｅｉｄ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９７； １ （ｓｕｐｐｌ． ｌ） ： ６） （Ｙｏｕｎｇ ＳＤ， Ｂｒｉｔｃｈｅｒ ＳＦ， Ｔｒａｎ ＬＯ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １９９５； ３９．２６０２−２６０９．） （Ｂａｃｈｅｌｅｒ ＬＴ， Ａｎｔｏｎ Ｅ， Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｓ， ｅｔ． ａｌ． Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９８； ３ （Ｓｕｐｐｌ． １） ： １５−１６） （Ｂａｃｈｅｌｅｒ ＬＴ， Ｗｅｉｓｌｏｗ Ｏ， Ｓｎｙｄｅｒ Ｓ ＆ Ｈａｎｎａ Ｇ． １２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， １９９８， Ｇｅｎｅｖａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， Ａｂｓｔｒａｃｔ ４１２１３．）
本発明の課題は、患者におけるウイルス集団が処方され投与された薬に耐性であるかどうかを提示できる薬の感受性および耐性の試験を提供することである。本発明の別の課題は、療法経過後に投与された薬もしくは薬群に耐性となった患者のための治療上の投薬計画において、医者に１以上の薬の置換を可能とする試験を提供することである。本発明の更に別の課題は、ＨＩＶ感染および／またはＡＩＤＳの治療に対する効果的な薬投薬計画の選択を可能とする試験を提供することである。本発明の更に別の課題は、患者が耐性となった薬を同定する、特に非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ）に対する耐性を同定する手段を提供することである。本発明のなお別の課題は、特定のウイルス、ウイルス遺伝子および／またはウイルス蛋白質〔特に非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ）のウイルスの薬耐性に関連するもの〕に作用する薬候補化合物の生物学的な有効性を評価する試験および手段を提供することである。また本発明の課題は、ＨＩＶ抗レトロウイルス薬の耐性および感受性を評価する手段および組成物を提供することである。本発明のなお別の課題は、抗レトロウイルス薬候補が増大もしくは刺激されたウイルス複製を生じさせるかどうかを決定する手段を提供することである。本発明の本課題および他の課題は、全体として本明細書から明白に理解されるだろう。
【００１９】
【発明の概要】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス感染の臨床進行および抗ウイルス療法の実施に対する反応をモニターする表現型および遺伝型に基づく手法を使用する方法に関する。また、本発明は部分的に発見に基づいたものであり、その発見とは、抗レトロウイルス療法に耐性を付与するＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）における遺伝的変化（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ）が、直接患者プラズマＨＩＶ　ＲＮＡから表現型もしくは遺伝型に基づく方法を使用して迅速に決定し得るということである。前記方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に準拠するアッセイを利用する。或いは、増幅ステップが無い条件下でウイルス核酸もしくはウイルス蛋白質を評価する方法においても、抗レトロウイルス療法をモニターおよび／または修正する本発明の教示を利用し得る。本発明は、ＮＮＲＴＩ阻害剤で治療した患者におけるＨＩＶ　ＲＴのコドン２３０の突然変異（単独またはコドン１０３もしくは１８１の突然変異との組み合わせにおける）の発見に部分的に基づいたものであって、前記突然変異の存在は、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性、並びにデラビルジン、ネビラピンもしくはエファビレンツの存在下のウイルス複製の薬物依存性刺激と相関している。前記突然変異は、療法開始後の一定期間経過後にプラズマＨＩＶ　ＲＮＡ中で発見された。ＨＩＶ　ＲＴにおけるコドン２３０での突然変異（加えて、コドン１０３もしくは１８１での突然変異）の発生は、耐性の発生の指標、究極的には免疫の低下の指標となることが見つけられた。逆転写酵素のコドン２３０（Ｍ２３０Ｌ）での単一部位突然変異、および１０３ （Ｋ１０３Ｎ） もしくは １８１ （Ｙ１８１Ｃ）の何れか１つの突然変異と組み合わせたＭ２３０Ｌ突然変異を含む耐性試験ベクター（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｅｓｔ ｖｅｃｔｏｒｓ）を、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して構築した （Ｓａｒｋａｒ Ｇ， Ｓｏｍｍｅｒ ＳＳ． （１９９０）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８： ４０４−４０７）。これらの突然変異は、ＮＮＲＴＩの減少した感受性と関連し、いくつかの組み合わせにおいてはウイルス複製の薬物依存性刺激と関連することが観察された。
【００２０】
本発明は、ＮＮＲＴＩ治療患者におけるＨＩＶ　ＲＴのコドン２３０の突然変異（コドン１０１，１０３，１９０，２２１ および ２３８の突然変異との組み合わせにおける）の発見に部分的に基づいたものであって、前記突然変異の存在は、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する感受性の減少、並びにデラビルジン、ネビラピンもしくはエファビレンツの存在下のウイルス複製の薬剤依存的刺激と相関している。
【００２１】
本発明は、ＮＮＲＴＩ治療患者で出現することが発見されたＲＴのコドン２４１での突然変異の発見に部分的に基づいている。他のＮＮＲＴＩ耐性突然変異（これらの突然変異は、上述のＮＮＲＴＩ耐性突然変異、例えば： Ｋ１０１Ｅ， Ｋ１０３Ｎ， Ｖ１０６Ｍ， Ｉ１３５Ｔ， Ｅ１３８Ａ および Ｇ１９０Ａなどを含んでもよい）に加えて２４１での突然変異の存在は、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性と相関している。これらの突然変異を有する患者の配列を含む耐性試験ベクターは、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性、同様に３つ全ての薬の存在下で複製の薬剤依存性刺激を提示した。
【００２２】
本発明は、ＮＮＲＴＩ治療患者で出現することが発見されたＲＴのコドン２４５での突然変異の発見に部分的に基づいている。他のＮＮＲＴＩ耐性突然変異（これらの突然変異体は、上述のＮＮＲＴＩ耐性突然変異、例えば：Ａ９８Ｇ， Ｋ１０１Ｅ， Ｋ１０３Ｎ， Ｉ１３５Ｔ， Ｅ１３８Ａ， Ｙ１８１Ｃ， Ｇ１９０Ａ および Ｐ２２５Ｈなどを含んでもよい）に加えて２４５での突然変異の存在は、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性と相関している。これらの突然変異を有する患者配列を含む耐性試験ベクターは、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性、同様に３つ全ての薬の存在下で複製の薬剤依存性刺激を提示した。ＲＴのコドン２４５（Ｖ２４５Ｅ もしくは Ｔ）での単一部位突然変異を含む耐性試験ベクター、並びに、同様に１０３ （Ｋ１０３Ｎ） および １３５ （Ｉ１３５Ｔ）での突然変異との組み合わせたＶ２４５Ｅ もしくは Ｔを含む試験ベクター（ｔｅｓｔ ｖｅｃｔｏｒｓ）は、部位特異的突然変異誘発を使用して構築された。Ｖ２４５Ｅ単独は前記ＮＮＲＴＩに対する感受性において如何なる効果も有していないが、突然変異の３合同（Ｋ１０３Ｎ， Ｉ１３５Ｔ および ２４５ Ｅ もしくは Ｔ）は、前記ＮＮＲＴＩに対する減少した感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激と関連することが観察された。
【００２３】
本発明は、ＮＮＲＴＩ治療患者で出現することが発見されたＲＴのコドン２７０での突然変異の発見に部分的に基づいている。他のＮＮＲＴＩ耐性突然変異（これらの突然変異は、上述のＮＮＲＴＩ耐性突然変異、例えば：Ｋ１０３Ｎ， Ｉ１３５Ｔ およびＰ２２５Ｈなどを含んでもよい）に加えて２７０での突然変異の存在は、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性、並びにウイルス複製の薬物依存性刺激と相関している。本発明は、ＮＮＲＴＩ治療患者で発見されたＲＴのＨＩＶ　ＲＴコドン３５，６７，６９，７０，１０６，１８９，２００，２０２，２０８，２１１，２１５， ２１８，２１９，２２１，２２７，２２８，２８３，２８４，２８６，２９３ および ２９７での複数の突然変異を含む患者由来の切片患者由来の切片（ｐａｔｉｅｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｅｇｍｅｎｔ）の発見に部分的に基づくものである。これらの突然変異を有する患者の配列を含む耐性試験ベクターは、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性、同様に３つ全ての薬の存在下で複製の薬剤依存性刺激を提示した。多くの突然変異がウイルス複製の薬物依存性刺激に役割をもつが、突然変異の何れもがかかる効果を自身に生じるのに十分ではないことを、特定の突然変異の部位特異的復帰（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）は示した。具体的には１０６，１８９，２２７， ２８３，２８４ および ２８６での突然変異は、これと共に認められる耐性およびウイルス複製の刺激を調節することが観察された。
【００２４】
【発明の詳細な記述】
本発明は、抗レトロウイルス療法、特に非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）抗レトロウイルス療法を受けている患者において、ＨＩＶ感染の臨床的進行をモニタリングする方法に関し、また１以上のＮＮＲＴＩｓの存在下で複製の薬物依存性刺激を提示するＨＩＶのバリアントの検出に関する。
【００２５】
一態様において、本発明は、患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＲＴのコドンの１以上のポジションに突然変異を有するＨＩＶ　ＲＴをコードする核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。前記突然変異（群）は表現型の感受性／耐性における変化とポジティブに相関する。
【００２６】
特定の一態様において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；および （ｉｉ）前記生物学的サンプルが、コドン２３０および１０３もしくは１８１に突然変異を有するＨＩＶ　ＲＴをコードする核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。表現型感受性アッセイを使用して、本発明は、コドン２３０における突然変異（単独またはＨＩＶ　ＲＴのコドン１０３もしくは１８１における突然変異との組み合わせの何れかにおいて）がデラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性と相関することを立証した。突然変異Ｍ２３０Ｌ（単独または他のＮＮＲＴＩ耐性突然変異との組み合わせの何れかにおいて）を含む患者由来の耐性試験ベクターは、デラビルジンに対し１０倍から ＞ ４５０倍、エファビレンツに対し５倍から ＞ ２５０倍、およびネビラピンに対し１０倍から ＞ ６００倍の範囲の感受性における減少を示した。ＨＩＶ　ＲＴのコドン２３０での突然変異を含む患者由来の耐性試験ベクターにおけるウイルス複製のパーセント刺激は、３つ全てのＮＮＲＴＩｓに対して０％から〜１００％の範囲である。２３０（単独または１０３もしくは１８１との組み合わせの何れかにおいて）における突然変異を含む部位特異的耐性試験ベクターが構築された。２３０における突然変異単独は、デラビルジン （５８倍）， ネビラピン （４０倍）およびエファビレンツ （２３倍）に対する減少した感受性を生じ、またネビラピン（〜５０％） および デラビルジン （〜５０％）の存在下で複製の薬物依存性刺激を生じる。２３０および１０３における突然変異の組み合わせは、デラビルジン （ ＞ ２５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および エファビレンツ （ ＞ ４７０倍）に対する減少した感受性を生じ、またデラビルジン （〜１００％） ネビラピン （〜７０％）， および エファビレンツ （〜４０％）の存在下で複製の薬物依存性刺激を生じる。２３０および１８１における突然変異の組み合わせは、デラビルジン （ ＞ ２５０倍）， ネビラピン （ ＞ ８００倍） および エファビレンツ （ ２５倍）に対する減少した感受性を生じたが、デラビルジン， ネビラピン， もしくは エファビレンツの存在下で複製の薬物依存性刺激を生じなかった。
【００２７】
特定の別態様において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；および （ｉｉ）前記生物学的サンプルが、コドン２４１，１０３ および １３５における突然変異、或いはコドン２４１と共に１０１，１０６， １３５，１３８ および １９０における突然変異を有するＨＩＶ　ＲＴをコードする核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。表現型感受性アッセイを使用して、本発明は、ＨＩＶ　ＲＴのコドン２４１における突然変異、コドン１０３での突然変異との組み合わせ、または１０１，１０６ および １９０での突然変異が、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性（増大した耐性）と相関することを立証した。患者由来の耐性試験ベクター〔２４１での突然変異、加えて他のＮＮＲＴＩ耐性突然変異（例えば１０１，１０３，１０６，１３５，１３８ および １９０）を含む〕は、デラビルジンに対し４１倍 から ＞ ２５０倍の範囲の感受性の減少を示し、またネビラピン （ ＞ ６００倍） および エファビレンツ （ ＞ ４７０倍）に対する感受性において、高レベルの減少を示した。患者由来の耐性試験ベクター〔２４１における突然変異と共に他のＮＮＲＴＩ耐性突然変異（例えば１０１，１０３，１０６，１３５，１３８ および １９０）を含む〕は、３つ全てのＮＮＲＴＩｓに対し７０〜１００％の範囲でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【００２８】
特定の別態様において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、コドン２４５，１０３ および １３５を有する、または コドン ２４５における突然変異と共に９８，１０１，１０３，１３５，１３８，１８１，１９０ および／または ２２５が含まれる付加的な突然変異を有するＨＩＶ　ＲＴをコードする核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。表現型感受性アッセイを使用して、本発明は、ＨＩＶ ＲＴのコドン２４５における突然変異と共にコドン１０３ および １３５における突然変異、或いはコドン２４５における突然変異と共に付加的な突然変異（ＨＩＶ ＲＴの９８，１０１，１０３，１３５，１３８，１８１，１９０ および ２２５を含んでもよい）が、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性と相関することを立証した。患者由来の耐性試験ベクター（２４５における突然変異および上述の付加的なＮＮＲＴＩ耐性突然変異を含む）は、デラビルジンに対し２０倍から ＞ ２５０倍、ネビラピン に対し８倍 から ＞ ６００倍 および エファビレンツに対し５倍 から ＞ ４７０倍の範囲で感受性の減少を提示した。患者由来の耐性試験ベクター（２４５における突然変異および上述の付加的なＮＮＲＴＩ耐性突然変異を含む）は、３つ全てのＮＮＲＴＩｓに対し２０−１００％の範囲でウイルス複製の薬物依存性刺激を提示した。部位特異的耐性試験ベクター（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｅｓｔ ｖｅｃｔｏｒｓ）は、２４５，１０３ および １３５における突然変異を含むように、および上述の様々な組み合わせで構築された。ＨＩＶ　ＲＴ　コドン　２４５（Ｖ２４５Ｅ もしくは Ｖ２４５Ｔ）における突然変異単独は、デラビルジン， ネビラピン もしくは エファビレンツに対する感受性において、顕著な減少を生じない。２４５ （Ｖ２４５Ｅ）における突然変異と１０３ （Ｋ１０３Ｎ） および １３５ （Ｉ１３５Ｔ）との組み合わせは、デラビルジン （１６９倍）， ネビラピン （２４４倍） および エファビレンツ （９３倍）に対して減少した感受性を生じ、並びにデラビルジン （〜２０％）
および ネビラピン （〜１５％） の存在下において、複製の薬物依存性刺激を生じる（しかしエファビレンツでは生じない）。２４５ （Ｖ２４５Ｔ）における突然変異と１０３ （Ｋ１０３Ｎ） および １３５ （Ｉ１３５Ｔ）との組み合わせは、デラビルジン （ ＞ ２５０倍）， ネビラピン （５４４倍） および エファビレンツ （１７４倍）に対して減少した感受性を生じ、並びにデラビルジン （〜５０％）， ネビラピン （〜４０％）， および エファビレンツ （〜２５％） の存在下で複製の薬物依存性刺激を生じる。
【００２９】
特定の別態様において、本発明は、患者のＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、コドン２２５における突然変異の存在下もしくは不存在下で、コドン２７０における突然変異並びにコドン１０３ および １３５における付加的な突然変異を有するＨＩＶ ＲＴをコードする核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法を提供する。表現型感受性アッセイを使用して、本発明は、ＨＩＶ ＲＴのコドン２２５における突然変異の存在下もしくは不存在下で、コドン２７０における突然変異と共にコドン１０３ および １３５における突然変異が、デラビルジン、ネビラピンおよびエファビレンツに対する減少した感受性、並びにデラビルジン、ネビラピンおよび エファビレンツ の存在下の複製の薬物依存性刺激と相関することを立証した。患者由来の耐性試験ベクター〔２７０における突然変異に加え他のＮＮＲＴＩ耐性突然変異（例えば２２５の存在下もしくは不存在下での１０３，１３５， ）を含む〕は、３つのＮＮＲＴＩｓの全てに対し高レベルの減少した感受性、並びに３つ全てのＮＮＲＴＩｓに対し８０−１１０％の範囲でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【００３０】
上記の状況下、患者に感染したＨＩＶウイルスの表現型の感受性および／または耐性プロファイル並びに遺伝型プロファイルは変更され、このことは抗レトロウイルス薬剤への応答におけるいくつかの変化に反映する。ＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス療法の場合、患者に感染したＨＩＶウイルスは、本願明細書中に記載される３つのＮＮＲＴＩｓ の任意の組み合わせに対して耐性となり得る。その上、前記ウイルスは、１以上の薬の存在下において、それらの薬の不存在下に比べより効率的に複製することが見つけられるだろう。従って、前記突然変異を検出後、患者治療の薬物投薬計画に対して、抗レトロウイルス薬剤の用量の増加、別の抗レトロウイルス薬剤への変更、または１以上の付加的な抗レトロウイルス薬剤の付加の何れかの処置をなすことが望まれる。例えば、もし２３０ および １０３突然変異が生じた際に患者がエファビレンツ （ＤＭＰ−２６６）で治療されたならば、患者の治療の薬物投薬計画は ＮＮＲＴＩ抗レトロウイルス薬剤（デラビルジン， エファビレンツ もしくは ネビラピンなど）を排除することと、および／または（ｉｉ）患者治療の薬物投薬計画に別の抗レトロウイルス薬剤を添加することと、により変更されることが望ましい。療法の修正の有効性は、ＨＩＶ　ＲＮＡコピー数をなどによるウイルス負荷をモニタリングすることにより評価できる。ＨＩＶ　ＲＮＡコピー数の減少は、治療投薬計画の有効性とポジティブに相関している。
【００３１】
本明細書中で使用される「ポジティブに相関する」という用語は、特定の結果が他の結論よりも、より特定の結論を示すことを意味している。
【００３２】
本発明の別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち： 患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって、（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉＶ）コドン２３０， １０３ および １８１において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと、並びに （Ｖ）前記配列からコドン２３０，１０３ および １８１における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００３３】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち： 患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉＶ）コドン２３０，１０１，１０３，１９０，２２１， および ２３８において野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（Ｖ）前記配列からコドン２３０，１０１，１０３，１９０，２２１， および ２３８における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００３４】
また、本発明は、ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって： （ａ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　並びに （ｂ）コドン２３０における突然変異単独で、またはコドン１０３における突然変異もしくはコドン１８１における突然変異と共に有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を、前記生物学的サンプルが含むかどうかを評価することと、を含み、かかる突然変異の存在が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激における減少と相関する方法を提供する。
【００３５】
また、本発明は、ＨＩＶ抗レトロウイルス薬候補化合物の生物学的有効性を評価する方法であって： （ａ）患者由来の切片患者由来の切片を含み、更に、コドン２３０における突然変異を単独で、またはコドン１０３における突然変異もしくはコドン１８１における突然変異と共に含み、且つインジケータ遺伝子を含む耐性試験ベクターを、宿主細胞に導入することと；　（ｂ）工程（ａ）から得られた宿主細胞を培養することと；　（ｃ）標的宿主細胞において前記インジケータ遺伝子の発現を測定することと；　並びに（ｄ）工程（ｃ）で得られた前記インジケータ遺伝子の発現測定値を、前記抗レトロウイルス薬候補化合物の不存在下で前記工程（ａ）〜（ｃ）を実行したときの前記インジケータ遺伝子の発現測定値と比較することと、を含み；　試験濃度の前記抗レトロウイルス薬候補化合物を、工程（ａ）〜（ｃ）、工程（ｂ）〜（ｃ）、または工程（ｃ）において存在せしめ、且つ前記抗レトロウイルス薬候補化合物の存在において測定される前記インジケータ遺伝子の発現における減少が、前記化合物の生物学的有効性の指標である方法を提供する。
【００３６】
本発明は、耐性試験ベクターであって： （ｉ）コドン２３０，１０３ もしくは １８１のうち少なくとも１つにおける突然変異を有する逆転写酵素を含むＨＩＶ患者由来の切片患者由来の切片、並びに（ｉｉ）およびインジケータ遺伝子を含み、前記インジケータ遺伝子の発現が患者由来の切片患者由来の切片に依存する耐性試験ベクターを提供する。
【００３７】
また本発明は、ＨＩＶ感染患者の非ヌクレオシド逆転写酵素抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：
（ａ）ＨＩＶ感染患者の生物学的サンプルを採取することと、並びに
（ｂ）コドン２３０における突然変異単独またはコドン１０１， コドン １０３， コドン １９０， コドン ２２１ および コドン ２３８からなる群から選択されるコドンにおける少なくとも１つの突然変異と共に有するＨＩＶ逆転写酵素をコードする核酸を、前記生物学的サンプルが含むかどうかを評価することと、を含み、
前記突然変異の存在が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤の感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激における減少と相関する方法を提供する。
【００３８】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち： 患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉＶ）コドン２４１，１０３ および １３５において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（Ｖ）前記配列からコドン２４１，１０３ および １３５における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００３９】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち： 患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉＶ）コドン２４１，１０１，１０６，１３５，１３８， および １９０において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（Ｖ）前記配列からコドン２４１，１０１，１０６，１３５，１３８， および １９０における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４０】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉＶ）コドン２４５，９８，１３５ および １８１において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（Ｖ）前記配列からコドン２４５，９８，１３５ および １８１における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４１】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉｖ）コドン２４５，１０１，１０３，１３５ および １９０において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（ｖ）前記配列からコドン２４５，１０１， １０３，１３５， および １９０における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４２】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉＶ）コドン２４５，１０３，２２５， および ２７０において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（Ｖ）前記配列からコドン２４５，１０３，２２５ および ２７０における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４３】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉｖ）コドン２４５，１３５ および １３８において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（ｖ）前記配列からコドン２４５，１３５ および １３８における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４４】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉｖ）コドン２４５，９８，１０３，１３５，１８１， および １９０において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（ｖ）前記配列からコドン２４５，９８，１０３，１３５，１８１， および １９０における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４５】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉｖ）コドン２４５， および １０３において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（ｖ）前記配列からコドン２４５， および １０３における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４６】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉｖ）コドン２４５，１０３，１３５ および ２２５において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（ｖ）前記配列からコドン２４５，１０３，１３５ および ２２５における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４７】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：患者のＮＮＲＴＩ療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　（ｉｉ）前記生物学的サンプルのＨＩＶコードＲＮＡをｃＤＮＡに転写することと；　（ｉｉｉ）ＲＴ遺伝子を含む産物を生じるＨＩＶ　ＰＣＲプライマーを使用して、患者由来の切片（ＰＤＳ）を増幅することと；　（ｉＶ）コドン２７０，１０３ および １３５において、野生型もしくは突然変異アミノ酸を含む配列を生じるプライマーを使用してシークエンス反応を実行することと；　並びに（Ｖ）前記配列からコドン２７０，１０３ および １３５における突然変異の存在もしくは不存在を決定することと、を含む方法である。
【００４８】
ＨＩＶ ＲＴのコドン２３０ および １０３ もしくは １８１の何れかにおける突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２３０における突然変異と共に１０３ もしくは １８１の何れかにおける突然変異は、薬物感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００４９】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴ遺伝子の コドン２３０，１０１，１０３，１９０， ２２１， および ２３８における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２３０，１０１，１０３，１９０，２２１ および ２３８における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５０】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴ遺伝子のコドン２４１，１０３， および １３５における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４１，１０３， および １３５における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５１】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２４１，１０１，１０６，１３５， １３８， および １９０における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４１，１０１，１０６，１３５，１３８， および １９０における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５２】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２４５，９８，１３５， および １８１における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４５， ９８， １３５， および １８１における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５３】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２４５，１０１，１０３，１３５， および １９０における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４５，１０１，１０３，１３５， および １９０における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５４】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２４５，１０３，２２５， および ２７０における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４５，１０３，２２５， および ２７０における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５５】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２４５，１３５， および １３８における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４５，１３５， および １３８における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５６】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２４５，９８，１０３，１３５， １８１， および １９０における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４５，９８，１０３，１３５， １８１， および １９０における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５７】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２４５および１０３における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４５および１０３における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５８】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２４５，１０３，１３５， および ２２５における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２４５，１０３，１３５， および ２２５における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００５９】
同様に、本発明の手段と方法を使用することによるＨＩＶ　ＲＴのコドン２７０，１０３， および １３５における突然変異の存在は、現行もしくは将来のＮＮＲＴＩ療法の有効性が減少したことを示す。本発明により示されるように、コドン２７０，１０３， および １３５における突然変異は、薬感受性を減少し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じる。本発明の方法を使用して、ＮＮＲＴＩ療法の変更が示される。
【００６０】
本発明の別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：　ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　並びに（ｉｉ）前記生物学的サンプルがＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２３０ および コドン１０３ もしくは １８１の何れかにおける突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２３０ および コドン１０３ もしくは １８１の何れかにおける突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２３０はロイシン（Ｌ）をコードし、一方で突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードする。なお更なる特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２３０はロイシン（Ｌ）をコードし、また突然変異したコドン１８１はシステイン（Ｃ）をコードする。
【００６１】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２３０，１０１，１０３，１９０，２２１， および ２３８における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２３０，１０１，１０３，１９０，２２１， および ２３８における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２３０はロイシン（Ｌ）をコードし、突然変異したコドン１０１はグルタミン酸（Ｅ）をコードし、突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードし、突然変異したコドン１９０はセリン（Ｓ）をコードし、突然変異したコドン２２１はチロシン（Ｙ）をコードし、および突然変異したコドン２３８はスレオニン（Ｔ）をコードする。
【００６２】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４１，１０３， および １３５における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４１，１０３， および １３５における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４１はセリン（Ｓ）をコードし、突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードし、および突然変異したコドン１３５はスレオニン（Ｔ）をコードする。
【００６３】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４１，１０１，１０６，１３５，１３８， および １９０における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４１，１０１，１０６，１３５，１３８， および １９０における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４１はイソロイシン（Ｉ）をコードし、突然変異したコドン１０１はグルタミン酸（Ｅ）をコードし、突然変異したコドン１０６はメチオニン（Ｍ）をコードし、突然変異したコドン１３５はスレオニン（Ｔ）をコードし、突然変異したコドン１３８はアラニン（Ａ）をコードし、および突然変異したコドン１９０はアラニン（Ａ）をコードする。
【００６４】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：　ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４５，９８，１３５， および １８１における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４５，９８，１３５， および １８１における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４５はグルタミン酸（Ｅ）をコードし、突然変異したコドン９８はグリシン（Ｇ）をコードし、突然変異したコドン１３５はスレオニン（Ｔ）をコードし、および突然変異したコドン１８１はシステイン（Ｃ）をコードする。
【００６５】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：　ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４５，１０１，１０３，１３５， および １９０における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４５，１０１，１０３，１３５， および １９０における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４５はグルタミン酸（Ｅ）をコードし、突然変異したコドン１０１はグルタミン酸（Ｅ）をコードし、突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードし、突然変異したコドン１３５はスレオニン（Ｔ）をコードし、および突然変異したコドン１９０はアラニン（Ａ）をコードする。
【００６６】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４５，１０３，２２５， および ２７０における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４５，１０３，２２５， および ２７０における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。特定の別態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４５はグルタミン酸（Ｅ）をコードし、突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードし、突然変異したコドン２２５はヒスチジン（Ｈ）をコードし、および突然変異したコドン２７０はメチオニン（Ｍ）をコードする。
【００６７】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：　ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４５，１３５， および １３８における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４５，１３５， および １３８における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４５はスレオニン（Ｔ）をコードし、突然変異したコドン１３５はスレオニン（Ｔ）をコードし、および突然変異したコドン１３８はグリシン（Ｇ）をコードする。
【００６８】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：　ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４５，９８，１０３，１３５，１８１， および １９０における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４５，９８，１０３，１３５，１８１， および １９０における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４５はスレオニン（Ｔ）をコードし、突然変異したコドン９８はグルタミン酸（Ｇ）をコードし、突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードし、突然変異したコドン１３５はスレオニン（Ｔ）をコードし、突然変異したコドン１８１はシステイン（Ｃ）をコードし、および突然変異したコドン１９０はアラニン（Ａ）をコードする。
【００６９】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：　ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４５ および １０３における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４５ および １０３における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４５はスレオニン（Ｔ）をコードし、および突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードする。
【００７０】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：　ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２４５，１０３，１３５， および ２２５における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２４５，１０３，１３５， および ２２５における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２４５はメチオニン（Ｍ）をコードし、突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードし、突然変異したコドン１３５はスレオニン（Ｔ）をコードし、および突然変異したコドン２２５はヒスチジン（Ｈ）をコードする。
【００７１】
本発明のなお別の好適な制限されない特定の態様は、下記のもの即ち：　ＨＩＶ感染患者の抗レトロウイルス療法の有効性を評価する方法であって：　（ｉ）ＨＩＶ感染患者から生物学的サンプルを採取することと；　および（ｉｉ）前記生物学的サンプルが、ＨＩＶ　ＲＴ遺伝子をコードし、且つコドン２７０，１０３， および １３５における突然変異を有する核酸を含むかどうかを決定することと、を含む方法である。表現型感受性アッセイを使用して、コドン２７０，１０３， および １３５における突然変異の存在が、デラビルジン， ネビラピン， および エファビレンツに対する減少した感受性とポジティブに相関し、そしてウイルス複製の薬物依存性刺激を生じることが観察された。別の特定の態様において、ＨＩＶ　ＲＴの突然変異したコドン２７０はセリン（Ｓ）をコードし、突然変異したコドン１０３はアスパラギン（Ｎ）をコードし、および突然変異したコドン１３５はスレオニン（Ｔ）をコードする。
【００７２】
また本発明は、薬スクリーニングのためにＨＩＶ遺伝子を含み、更にＮＮＲＴＩ突然変異を含む耐性試験ベクターを使用する手段および方法を提供する。より具体的には、本発明は、薬スクリーニングのためにコドン２３０ および １０３ もしくは １８１の何れかにおいて突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２３０ 並びに １０１，１０３，１９０，２２１， および ２３８における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４１，１０３， および １３５における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４１，１０１，１０６，１９０，１３５， および １３８における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４５，９８，１３５， および １８１における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４５， １０１，１０３，１３５， および １９０における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４５，１０３，２２５， および ２７０における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４５，１３５ および １３８における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４５，９８，１０３，１３５，１８１， および １９０における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４５ および １０３における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２４５，１０３，１３５， および ２２５における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。また本発明は、コドン２７０，１０３ および １３５における突然変異を有するＨＩＶ逆転写酵素を含む耐性試験ベクターを記載する。
【００７３】
本発明の薬の感受性および耐性試験において試験されるウイルスの構造、生活環および遺伝的要素は、当該技術における当業者に公知である。例えば、レトロウイルスの生活環、同様にレトロウイルスのレスキューおよび感染性に必要なウイルス遺伝子の理解などは、本発明を実施する上で有用である。レトロウイルス機構で感染された細胞は、２倍体ＲＮＡゲノムを含む膜ウイルスを遊離（ｓｈｅｄ）する。エンベロープ糖蛋白質（感染性の宿主域の決定に寄与する）を点在的に有する（ｓｔｕｄｄｅｄ ｗｉｔｈ）ウイルスは、感染する細胞の形質膜の細胞レセプターに付着する。レセプター結合後、ウイルスはインターナライズされ、宿主細胞の細胞質を介して通過する際に脱殻する。核への進行途上もしくは核内の何れかで、ウイルスコア内に存在する逆転写酵素分子が、二重鎖ＤＮＡプロウイルスの合成を駆動し、合成はゲノムウイルスＲＮＡへのｔＲＮＡ分子の結合によりプライムされる。二重鎖ＤＮＡプロウイルスは、続いて宿主細胞のゲノム内に統合され、ウイルス蛋白質およびビリオンゲノムＲＮＡ（ウイルスコア粒子内にパッケージされる）をコードする双方のｍＲＮＡの転写鋳型として作用できる。感染細胞からの遊離の途上で、コア粒子は細胞質を介して移動し、新規に感染した細胞の形質膜の内側に付着し、そしてウイルスにコードされたエンベロープ糖蛋白質遺伝子産物を有する膜の区域（ｔｒａｃｔｓ）にそれらを取り込んで出芽する。この感染のサイクル（逆転写、転写、翻訳、ウイルス集合、および出芽）は、感染が伝播するにつれ繰り返し反復することになる。
【００７４】
ウイルスＲＮＡおよび（結果として）プロウイルスＤＮＡは、ウイルス生活環の成功裏の達成に重要ないくつかのシス作用性因子をコードする。ビリオンＲＮＡは、その３’端にウイルスプロモータを保持している。ゲノムは逆転写される際に、複製の曲芸的な作用（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｃｒｏｂａｔｉｃｓ）は、ウイルスプロモータをプロウイルスゲノムの５’端に配置する。５’レトロウイルスＬＴＲのちょうど３’側は、ウイルスパッケージング部位に位置する。レトロウイルスの生活環は、ウイルスによりコードされるトランス作用性因子の存在を必要とする。ウイルスＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）逆転写酵素は、ウイルス生活環にとって重要なものであり、ウイルスコア内に含まれる。該酵素は、前記生活環においてゲノムＲＮＡから統合性の中間プロウイルスＤＮＡ（ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｖｉｒａｌ ＤＮＡ）への変換を担うものである。ウイルスエンベロープ糖蛋白質（ｅｎｖ）は、未感染細胞へのウイルス付着、およびウイルス伝播に必要とされる。いわゆるトランスアクチベータと呼ばれる、統合された親プロウイルスの転写レベルを調節できる転写のトランス活性化因子も存在する。典型的には、複製可能（非欠陥、ｎｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ウイルスは、自給的（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）であり、その中に彼らはそれら全てのトランス作用性因子をコードしている。それらの対応する欠陥型（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）は、自給的ではない。
【００７５】
ＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓなどの）の場合、生活環および感染において必要なウイルス遺伝子の理解は、本発明の実施に有用である。ＨＢＶ侵入のプロセスは、いまだよく定義されていない。ＨＢＶの複製は、ＲＮＡ中間鋳型（ａｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を使用する。感染細胞内での、複製の第一工程は、非対称リラックス環状ＤＮＡ（ｒｃ−ＤＮＡ）から共有結合的に閉環したＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）への変換である。このプロセス（感染肝臓細胞の核内で生じる）は、ＤＮＡポジティブ鎖合成およびＤＮＡ端のライゲーションを完成させる。第二工程において、前記ｃｃｃＤＮＡは、３．５ｋＢ　ＲＮＡ鋳型（プレゲノム）を産生するため宿主ＲＮＡポリメラーゼにより転写される。このプレゲノムは、ウイルスコア中で蛋白質と集合している。第三工程は、ウイルスがコードするＰ蛋白質　逆転写酵素を用いプレゲノムＲＮＡをコピーして第一ネガティブセンスＤＮＡ鎖の合成を生じる。また、前記Ｐ蛋白質は、マイナス鎖ＤＮＡプライマーとして作用する。最終的に、第二ポジティブセンスＤＮＡ鎖の合成は、Ｐ蛋白質ＤＮＡポリメラーゼ活性と、プライマーとしてのウイルスＲＮＡのオリゴマーとを使用して、第一ＤＮＡ鎖をコピーすることによって生じる。また、プレゲノムは主要構造コア蛋白質のｍＲＮＡを転写する。
【００７６】
以下のフローチャートは、本発明に使用し得る様々なベクターおよび宿主細胞のいくつかを説明する。これは全てを含むものであることを意図して記載されたものではない。
【００７７】
2004503253.tif 000003
＜宿主細胞＞
パッケージング宿主細胞（パッケージング発現ベクターでトランスフェクションした）
耐性試験ベクター宿主細胞（耐性試験ベクターでトランスフェクションしたパッケージング宿主細胞）
標的宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞により産生された耐性試験ベクターウイルス粒子で感染された宿主細胞）
《耐性試験ベクター》
「耐性試験ベクター」は、患者由来の切片およびインジケータ遺伝子を含むＤＮＡまたはＲＮＡを共に含有する１以上のベクターを意味する。耐性試験ベクターが２ベクター以上を含む場合、患者由来の切片は１ベクターに、インジケータ遺伝子は異なる１ベクターに含まれてもよい。明瞭化するために、本明細書では２以上のベクターを含むかかる耐性試験ベクターを耐性試験ベクター系というが、これも耐性試験ベクターであると理解されるべきである。耐性試験ベクターのＤＮＡもしくはＲＮＡは、それゆえ１以上のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の中に含まれてもよい。一態様において、耐性試験ベクターは、インジケータ遺伝子ウイルスベクターへの患者由来の切片の挿入により作出される。別態様において、耐性試験ベクターは、パッケージングベクターへの患者由来の切片の挿入により作出され、一方でインジケータ遺伝子は第二のベクター（例えば、インジケータ遺伝子ウイルスベクター）内に含まれる。本明細書中で使用される、「患者由来の切片」は、例えば、感染患者の細胞（例えば、末梢血単核球、ＰＢＭＣ）、血清もしくは他の体液中に存在するウイルスＲＮＡから調製したウイルスＤＮＡもしくは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を利用し、患者由来の切片の集団を分子クローニングもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅するなどの様々な手段を使用して患者から直接得られた１以上のウイルス切片を意味する。ウイルス切片が患者から「直接得られる」場合においては、培養を介したウイルスの継代なしに得られ、また、もしウイルスを培養する場合においては、培養中の突然変異の選択を実質的に排除するために最小回数の継代で培養される。「ウイルス切片」という用語は、抗ウイルス薬の標的である任意の機能的ウイルス配列または遺伝子産物（例えば、蛋白質）をコードするウイルス遺伝子を意味する。本明細書で使用される「機能的ウイルス配列」という用語は、エンハンサー、プロモータ、ポリアデニル化部位、トランス作用因子の作用部位（例えば、ｔａｒ および ＲＲＥ）、パッケージング配列、統合配列（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、またはスプライシング配列などの機能的活性を有する任意の核酸配列（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を意味する。もし薬が２以上の機能的ウイルス配列またはウイルス遺伝子産物を標的とするなら、各々の前記ウイルス遺伝子に対応する患者由来の切片が耐性試験ベクター中に挿入される。２つの異なる機能的ウイルス配列またはウイルス遺伝子産物を標的とする２以上の抗ウイルスが評価される併用療法の場合、各々の機能的ウイルス配列またはウイルス遺伝子産物に対応する患者由来の切片が耐性試験ベクター中に挿入される。本明細書中に記載のように使用される特定の構築物に依存するインジケータ遺伝子ウイルスベクターもしくは例えばパッケージングベクターのユニークな制限酵素認識部位もしくは特定位置（患者配列アクセプター部位と呼ばれる）に、患者由来の切片が挿入される。
【００７８】
本明細書で使用される「患者由来の切片」は、ヒトおよび様々な動物種に由来する切片を含む。かかる種は、チンパンジー、ウマ、ウシ、ネコおよびイヌを含むが、これらに限定されない。
【００７９】
また、患者由来の切片は、いくつかの異なるクローニング技術中の任意の技術を使用して耐性試験ベクターに導入することができる。例えば、プラスミド骨格および患者由来の切片の双方へのクラスＩＩ制限酵素認識部位の導入を介したクローニング、またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ・プライマ・クローニング（ｒｅｆｓ）などによるものである。
【００８０】
患者由来の切片は、耐性試験ベクター内に導入される患者由来の切片の端に下記のように患者配列アクセプター部位を導入することにより、分子クローニングもしくは遺伝子増幅の任意の方法、またはそれらの方法の修飾方法を利用して取得し得る。例えば、ＰＣＲなどの遺伝子増幅方法において、患者配列アクセプター部位に対応する制限酵素認識部位は、ＰＣＲ反応に使用したプライマーの端に導入できる。同様に、ｃＤＮＡクローニングなどの分子クローニング方法において、前記制限酵素認識部位は第一もしくは第二鎖のｃＤＮＡ合成に使用されるプライマー端に導入できる、或いは、ＤＮＡ（クローン化ＤＮＡであれ非クローン化ＤＮＡであれ）のプライマーリペアなどの方法において、前記制限酵素認識部位はリペア反応に使用されるプライマーに導入できる。患者配列アクセプター部位およびプライマーは、患者由来の切片の発現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を改善するように設計される。設計した患者配列アクセプター部位を有する耐性試験ベクターのセットは、１つの耐性試験ベクター単独では発現不十分（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）であろう患者由来の切片の発現を可能にする。
【００８１】
耐性試験ベクターは、患者配列アクセプター部位を導入し、患者由来の切片を増幅もしくはクローニングし、そして増幅もしくはクローニングした配列をインジケータ遺伝子ウイルスベクターに患者配列アクセプター部位で正確に挿入して、インジケータ遺伝子ウイルスベクター（下記）を修正することにより調製される。耐性試験ベクターは、インジケータ遺伝子ウイルスベクターから構築され、このウイルスベクターは、ゲノムのウイルスベクターもしくはサブゲノムのウイルスベクターおよびインジケータ遺伝子カセット（各々は以下に記載される）に由来するものである。そして耐性試験ベクターは、宿主細胞に導入される。或いは、耐性試験ベクター（耐性試験ベクターシステムとも呼称される）は、患者配列アクセプター部位をパッケージングベクターに導入し、患者由来の切片を増幅もしくはクローニングし、そして増幅もしくはクローニングした配列をパッケージングベクターに患者配列アクセプター部位で正確に挿入し、そしてインジケータ遺伝子ウイルスベクターと共にこのパッケージングベクターを共トランフェクションすることにより調製される。
【００８２】
好適な一態様において、耐性試験ベクターは、薬の耐性および感受性試験に使用される耐性試験ベクターウイルス粒子を産生するためにパッケージング発現ベクターと共にパッケージング宿主細胞に導入し得るものであり（以下に定義のように）、この試験は本明細書において、「粒子ベース試験」と呼称される。好適な他態様において、耐性試験ベクターは、薬の耐性および感受性試験を実行するためパッケージング発現ベクターの不存在下で宿主細胞に導入してもよく、この試験は本明細書中で「非粒子ベース試験」と呼称される。本明細書中で使用される「パッケージング発現ベクター」は、パッケージング蛋白質（例えば、コアおよびエンベロープポリペプチドなどの構造蛋白質）、トランス作用因子、または複製欠陥レトロウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）もしくはヘパドナウイルス（ ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）に必要とされる遺伝子などの因子を供給する。このような状況で複製可能ウイルスゲノムは、それ自身では複製できないような様式で弱められている。このことは、減弱ゲノム（ｅｎｆｅｅｂｌｅｄ ｇｅｎｏｍｅ）を含む細胞内に存在する欠陥ウイルスゲノムをレスキューするのに必要とされるトランス作用する遺伝子、もしくは欠損した遺伝子をパッケージング発現ベクターが産生できるが、減弱ゲノムは自身をレスキューできないことを意味している。
【００８３】
《インジケータまたはインジケータ遺伝子》
「インジケータまたはインジケータ遺伝子」は、蛋白質、ＤＮＡもしくはＲＮＡ構造をコードする核酸を意味し、該構造は直接的もしくは反応を介して測定可能もしくは感知可能な特徴（ａｓｐｅｃｔ）（例えば、測定可能な波長の色もしくは光、またはＤＮＡもしくはＲＮＡがインジケータとして使用される場合は特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ構造の変化もしくは産生）を生じる。インジケータ遺伝子の好適な例は、大腸菌ｌａｃＺ 遺伝子（ベータ−ガラクトシダーゼをコードする）、ｌｕｃ 遺伝子〔例えばＰｈｏｔｏｎｓ ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）もしくは Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ｓｅａ ｐａｎｓｙ、海スミレ）の何れかのルシフェラーゼをコードする〕、 大腸菌 ｐｈｏＡ 遺伝子（アルカリフォスファターゼをコードする）、緑色蛍光蛋白質および細菌性ＣＡＴ 遺伝子（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコードする）である。インジケータ遺伝子の好適な追加例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、もしくは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）などのアッセイにより容易に測定できる分泌蛋白質もしくは細胞表面蛋白質であり、例えば成長因子、サイトカインおよび細胞表面抗原（例えば、それぞれ成長ホルモン、ＩＬ−２もしくはＣＤ４など）を含んでいる。「インジケータ遺伝子」は選択遺伝子をも含むと理解され、選択マーカーとも呼称される。哺乳類細胞の適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシンもしくは大腸菌 ｇｐｔである。インジケータ遺伝子の上記例の場合、インジケータ遺伝子および患者由来の切片は別個、即ち、区別可能で、且つ分離した遺伝子である。いくつかの例では、患者由来の切片は、インジケータ遺伝子としても使用され得る。かかる一態様（患者由来の切片が抗ウイルスの標的である２以上のウイルス遺伝子に対応する態様）において、該ウイルス遺伝子の１つはインジケータ遺伝子として作用してもよい。例えば、ウイルスプロテアーゼ遺伝子は、色素原基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を開裂する能力、または色素原基質を開裂する不活性酵素原を活性化する能力の効果によりインジケータ遺伝子として作用し得る。インジケータ遺伝子の上記例の全てにおいて、インジケータ遺伝子は、「機能的」もしくは「非機能的」の何れかであってもよいが、何れの場合においても標的細胞におけるインジケータ遺伝子の発現は、最終的には患者由来の切片の作用に依存する。
【００８４】
《機能的インジケータ遺伝子》
「機能的インジケータ遺伝子」の場合、インジケータ遺伝子は、患者由来の切片と独立して「パッケージング宿主細胞／耐性試験ベクター宿主細胞」（以下に定義される）中で発現されるが、前記機能的インジケータ遺伝子は、機能的耐性試験ベクター粒子の産生および標的宿主細胞へのそれらの効果的な感染なしでは以下で定義される標的宿主細胞中で発現されない。機能的インジケータ遺伝子の一態様において、制御因子およびインジケータ蛋白質をコードする遺伝子を含むインジケータ遺伝子カセットは、インジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入され、それはウイルスベクターの内在性もしくは外来性のエンハンサー／プロモータと同一もしくは反対の転写方向性で挿入される。ＨＩＶもしくはＨＢＶの場合の機能的インジケータ遺伝子の一例は、インジケータ遺伝子およびそのプロモータ（ＣＭＶ　ＩＥエンハンサー／プロモータ）を、前記ウイルスベクターと関連する夫々ＨＩＶ−ＬＴＲもしくはＨＢＶエンハンサ−プロモータ、またはＣＭＶ　ＩＥエンハンサー／プロモータと同一もしくは反対の転写方向性に配置するものである。
【００８５】
《非機能的インジケータ遺伝子》
或いは、インジケータ遺伝子は「非機能的」であってもよく、この場合インジケータ遺伝子は、それが１以上の患者由来切片の産物の作用を介して機能的インジケータ遺伝子へと転換されるまで、耐性試験ベクターでトランスフェクションされたパッケージング宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞と呼称される）中で効率的に発現されない。インジケータ遺伝子は、本発明に基づく遺伝的操作を介して非機能的とされる。
【００８６】
１．変更プロモータ（Ｐｅｒｍｕｔｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）　一態様において、インジケータ遺伝子は、プロモータの局在により非機能的とされる。この場合、前記プロモータは、インジケータ遺伝子と同一の転写方向性であるが、インジケータ遺伝子コーディング配列の（に先行するというよりむしろ）後に前記プロモータが続くものである。このミス配置プロモータは「変更プロモータ」と呼称される。変更プロモータに加え、非機能的インジケータ遺伝子の方向性は、前記ウイルスベクターの内在性もしくは外来性のプロモータ／エンハンサーの方向性とは反対に配置される。従って、非機能的インジケータ遺伝子のコーディング配列は、変更プロモータによっても、ウイルスプロモータによっても転写されうるものではない。非機能的インジケータ遺伝子およびその変更プロモータは、１以上のウイルス蛋白質の作用により機能的なものにされる。ＨＩＶの場合の変更プロモータを有する非機能的インジケータ遺伝子の一例は、Ｔ７ ファージ ＲＮＡ ポリメラーゼプロモータ（本明細書中でＴ７プロモータと呼称される）をインジケータ遺伝子と同一の転写方向性で５’ＬＴＲに配置するものである。インジケータ遺伝子カセットがＴ７　プロモータの上流に配置される際には、インジケータ遺伝子はＴ７　プロモータにより転写されない。耐性試験ベクター中の非機能的インジケータ遺伝子は、標的細胞の感染に際して逆転写酵素により機能的インジケータ遺伝子に変換される。これはインジケータ遺伝子コーディング領域に対するＴ７　プロモータの再配置（５’ＬＴＲから３’ＬＴＲへコピーすることによる）から生じる。ＨＩＶインテグラーゼによる標的細胞染色体内への修復されたインジケータ遺伝子の統合に続き、標的細胞により発現される核Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼはインジケータ遺伝子を転写する。ＨＢＶの場合の変更プロモータを有する非機能的インジケータ遺伝子の一例は、エンハンサープロモータ領域を、インジケータ遺伝子の下流もしくは３’に配置するものである（双方は同一の転写方向性を有する）。インジケータ遺伝子カセットは上流に配置されるので、インジケータ遺伝子は、エンハンサープロモータにより転写されない。耐性試験べクターにおける非機能的インジケータ遺伝子は、機能的インジケータ遺伝子に変換される。この変換はＨＢＶインジケータ遺伝子ウイルスベクターの逆転写および環化（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、インジケータ遺伝子コーディング領域の上流へのエンハンサープロモータの再配置によるものである。
【００８７】
変更プロモータは、標的宿主細胞内で転写される任意の真核細胞性もしくは原核細胞性のプロモータであってもよい。好ましくは、前記プロモータのサイズは小さく、ウイルス複製を邪魔することなくウイルスゲノムに挿入可能なサイズである。より好ましくは、サイズが小さく且つ標的宿主細胞に導入された単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼにより転写可能なプロモータ（バクテリオファージプロモータなどの）が使用される。かかるバクテリオファージプロモータおよびそれらと同系（ｃｏｇｎａｔｅ）のＲＮＡポリメラーゼは、ファージＴ７， Ｔ３ および Ｓｐ６のものを含む。ＲＮＡポリメラーゼの発現を核に局在化するために、核局在配列（ＮＬＳ）をＲＮＡポリメラーゼに付加してもよく、核では修復インジケータ遺伝子の転写にそれらが必要とされる。かかるＮＬＳは、ＳＶ４０　Ｔ抗原などの任意の核輸送蛋白質（ｎｕｃｌｅａｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）から取得し得る。もしファージＲＮＡポリメラーゼが採用されるならば、ＥＭＣウイルス５’非翻訳領域（ＵＴＲ）などの内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を、一般的には非キャップである転写物の翻訳のためにインジケータ遺伝子の前に付加してもよい。ＨＩＶの場合、変更プロモータ自身は、ＬＴＲ機能が邪魔されない限り５’ＬＴＲ（逆転写の間に３’ＬＴＲへとコピーされる）内の任意の位置、好ましくはＬＴＲのＵ５およびＲ部分内の任意の位置、および最も好ましくはＵ５およびＲの機能的に重要で且つ高度に保存された領域の外側の任意の位置に導入できる。ＨＢＶの場合、変更プロモータは、ＨＢＶ　ＤＮＡ複製に必要なシス作用因子を混乱させない任意の位置に配置できる。トランスフェクションの人為的な影響（ＤＮＡ連結；ＤＮＡ ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）による非機能的インジケータ遺伝子の不適切な発現が存在するであろう（ｓｈｏｕｌｄ ｔｈｅｒｅ ｂｅ）耐性試験ベクターの端にブロッキング配列（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を付加してもよい。上記の変更Ｔ７プロモータのＨＩＶ例において、かかるブロッキング配列は、Ｔ７転写ターミネーターからなるものであってもよく、ＤＮＡ連結の結果生じるリードスロー転写をブロックするため配置されるが、逆転写による５’ＬＴＲから３’ＬＴＲへの変更Ｔ７プロモータの再配置の結果生じる転写はブロックしない。
【００８８】
２．変更コーディング配列　第二態様において、インジケータ遺伝子は、インジケータ遺伝子の５’および３’コーディング領域の相対的位置により非機能的とされる。ここで３’コーディング領域は５’コーディング領域に（引き続くというよりむしろ）先行する。このミス配置されたコーディング領域は、変更コーディング領域と呼称される。機能的インジケータ遺伝子をコードするｍＲＮＡが何れの方向性のイベントにおいても産生されるので、非機能的インジケータ遺伝子の方向性は、ウイルスベクターの内在性もしくは外来性のプロモータ／エンハンサーの方向性と同一もしくは反対であってもよい。非機能的インジケータ遺伝子およびその変更コーディング領域は、１以上の患者由来切片の産物の作用により機能的となる。ＨＩＶの場合の変更コーディング領域を有する非機能的インジケータ遺伝子の第二例は、関連するプロモータを有する５’インジケータ遺伝子コーディング領域を３’ＬＴＲ　Ｕ３領域に配置し、３’インジケータ遺伝子コーディング領域をＨＩＶゲノムの上流位置に配置するものであり、各々のコーディング領域はウイルスＬＴＲと同一の転写方向性を有する。双方の例において、５’および３’コーディング領域も、それぞれ関連するスプライス　ドナーおよびアクセプター配列を有してもよく、それは異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）もしくは人工的なスプライシング・シグナルであってもよい。インジケータ遺伝子は、関連するプロモータもしくはウイルスプロモータの何れによっても機能的に転写されない、変更コーディング領域が機能的にスプライスされる転写物の形成を阻害するからである。耐性試験ベクターにおける非機能的インジケータ遺伝子は、標的細胞での感染の際に逆転写酵素により機能的インジケータ遺伝子に変換される。これは３’ＬＴＲが５’ＬＴＲへコピーされることによる、５’および３’インジケータ遺伝子コーディング領域の相互の再配置から生じる。５’コーディング領域に関連するプロモータによる転写に続いて、ＲＮＡスプライシングにより５’および３’コーディング領域が接合される（機能的インジケータ遺伝子産物を産生するために）。ＨＢＶの場合の変更コーディング領域を有する非機能的インジケータ遺伝子の一例は、３’インジケータ遺伝子コーディング領域を、エンハンサープロモータおよびインジケータ遺伝子の５’コーディング領域の上流もしくは５’側に配置するものである。インジケータ遺伝子５’および３’コーディング領域の転写方向性は、相互に一致し、インジケータ遺伝子ウイルスベクターの方向性と同一である。しかしながら、インジケータ遺伝子５’および３’コーディング領域は耐性試験ベクター内で変更されているので（即ち、５’コーディング領域が３’コーディング領域の下流である）、機能的インジケータ遺伝子コーディング領域を生成するためにスプライスされるｍＲＮＡは転写されない。インジケータ遺伝子ウイルスベクターの逆転写および環化に続き、インジケータ遺伝子３’コーディング領域は、エンハンサープロモータおよび５’コーディング領域に対し下流もしくは３’に配置され、それゆえ機能的インジケータ遺伝子コーディング領域を生成するためにスプライスされるｍＲＮＡの転写を許容する。
【００８９】
３．逆方向イントロン（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｉｎｔｒｏｎ）　第三態様において、インジケータ遺伝子は「逆方向イントロン」（即ち、インジケータ遺伝子の転写方向性に対して反対の方向性を有するインジケータ遺伝子のコーディング配列中に挿入されているイントロン）の使用により非機能的とされる。インジケータ遺伝子カセット（それ自身にリンクするプロモータを含む）の全体としての転写方向性は、ウイルス制御因子の方向性と反対であるが、一方で人工的イントロンの方向性はウイルス制御因子と同一である。自身にリンクするプロモータによるインジケータ遺伝子の転写は、機能的転写物の産生を生じない、この理由は逆方向イントロンがこの方向性ではスプライスされないからである。しかしながら、ウイルス制御因子によるインジケータ遺伝子の転写は、ＲＮＡスプライシングによる逆方向イントロンの除去を生じるが、生じた転写物はアンチセンスの方向性を有しているのでインジケータ遺伝子はやはり機能的に発現されない。この転写産物の逆転写および生じたレトロウイルスＤＮＡの統合、またはヘパドナウイルスＤＮＡの環化に続いて、インジケータ遺伝子は、それ自身にリンクするプロモータを使用して機能的に転写される、なぜなら逆方向イントロンが既に除去されているからである。この場合、インジケータ遺伝子自身が、ウイルス制御因子に対して反対の方向性の完全な転写単位と共に、それ自身の機能的プロモータを含有してもよい。このようにして、非機能的インジケータ遺伝子は、ウイルス制御因子により転写されうる間違った方向性で存在しており、それ自身のプロモータによっては機能的に転写されない（なぜなら逆方向イントロンがスプライシングによって適切に除去されないからである）。しかしながら、レトロウイルス（具体的にはＨＩＶ）およびヘパドナウイルス（具体的にはＨＢＶ）の場合、ウイルスプロモータ（ＨＩＶ　ＬＴＲもしくはＨＢＶ　エンハンサープロモータ）による転写は、スプライシングによって逆方向イントロンの除去を生じる。スプライスされて生じた転写物の逆転写および生じたプロウイルスの宿主細胞染色体への統合またはＨＢＶベクターの環化の結果、インジケータ遺伝子は、それ自身のプロモータにより機能的に転写される。逆方向イントロン（イントロンを除去するためのスプライス　ドナーおよびアクセプター部位からなる）は、好ましくはインジケータ遺伝子の翻訳を邪魔するためインジケータ遺伝子のコーディング領域に配置される。スプライス　ドナーおよびアクセプターは、任意のスプライス　ドナーおよびアクセプターであればよい。好適なスプライス　ドナー　―　レセプターは、ＣＭＶ　ＩＥ　スプライス　ドナーおよびヒト　アルファ　グロブリン遺伝子（「イントロンＡ」）の第二エクソンのスプライス　アクセプターである。
【００９０】
《インジケータ遺伝子ウイルスベクターの構築》
本願明細書で使用される用語「インジケータ遺伝子ウイルスベクター」は、インジケータ遺伝子およびその制御因子および１以上のウイルス遺伝子を含むベクター（群）を意味する。インジケータ遺伝子ウイルスベクターは、以下で定義するインジケータ遺伝子カセットおよび「ウイルスベクター」から組み立てられる。インジケータ遺伝子ウイルスベクターは、エンハンサー、スプライシング・シグナル、ポリアデニル化配列、転写ターミネーター、または他の制御配列を付加的に含んでもよい。さらに、インジケータ遺伝子ウイルスベクターは、機能的または非機能的であってもよい。抗ウイルス薬の標的であるウイルス切片が、インジケータ遺伝子ウイルスベクター内に含まれない場合、それらは第二のベクターにより供給される。「インジケータ遺伝子カセット」は、インジケータ遺伝子および制御因子を含む。「ウイルスベクター」は、遺伝子産物をコードするウイルス遺伝子、制御配列、ウイルスパッケージング配列、およびレトロウイルスの場合にはインテグレーション配列、のうちのいくつか又は全てを含んでいるベクターを意味する。前記ウイルスベクターは、付加的な１以上のウイルス切片を付加的に含んでもよく、該切片の１以上が抗ウイルス薬の標的であってもよい。ウイルス遺伝子を含有するウイルスベクターの２つの例は、本明細書中で「ゲノミック　ウイルスベクター」および「サブゲノミック　ウイルスベクター」と呼称される。「ゲノミック　ウイルスベクター」は、ウイルスの複製を不可能とするために、１以上のウイルス遺伝子の欠損を有するベクターであってもよいが、それは完全ウイルスの特性であるｍＲＮＡの発現およびプロセッシングの機能を保存するものである。ＨＩＶ薬の感受性および耐性試験に関する一態様において、ゲノミック　ウイルスベクターは、ＨＩＶ ｇａｇ−ｐｏｌ， ｖｉｆ， ｖｐｒ， ｔａｔ， ｒｅｖ， ｖｐｕ， および ｎｅｆ 遺伝子（ｅｎｖの一部、大部分もしくは全てが削除されていてもよい）を含む。「サブゲノミック　ウイルスベクター」は、抗ウイルス薬の標的である蛋白質をコードし得る１以上のウイルス遺伝子のコード領域を含むベクターを意味する。ＨＩＶの場合、好適な態様は、ＨＩＶ ｇａｇ−ｐｏｌ 遺伝子を含んでいるサブゲノミック　ウイルスベクターである。ＨＢＶの場合、好適な態様は、ＨＢＶ　Ｐ遺伝子を含むサブゲノミック　ウイルスベクターである。ＨＩＶの場合、ウイルスベクター構築に使用されるプロウイルス　クローンの２つの例は、ＨＸＢ２ （Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ， ３２０，３６７−３７１） および ＮＬ４−３， （Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ５９，２８４−２９１）である。ＨＢＶの場合、多数の完全長ゲノム配列が特徴を調べられており、ＨＢＶ ウイルスベクター（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏｓ． Ｍ５４９２３， Ｍ３８６３６， Ｊ０２２０３ および Ｘ５９７９５）の構築に使用できる。ウイルスをコードする遺伝子は、内在性のエンハンサー／プロモータまたは外来性のウイルス性もしくは細胞性のエンハンサー／プロモータの制御下に存在してもよい。ＨＩＶ薬の感受性および耐性試験の好適な態様は、ゲノミックもしくはサブゲノミック　ウイルスコーディング領域を、ＨＩＶ−ＬＴＲ　Ｕ３領域の内在性のエンハンサー／プロモータまたはＣＭＶ早期（ＩＥ、ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ）エンハンサー／プロモータの制御下に配置することである。ＨＢＶ薬の感受性および耐性試験の好適な態様は、ゲノミックもしくはサブゲノミック　ウイルスコーディング領域を、ＣＭＶ早期（ＩＥ）エンハンサー／プロモータの制御下に配置することである。インジケータ遺伝子ウイルスベクター（抗ウイルス薬の標的となる標的物もしくは蛋白質をコードする１以上のウイルス遺伝子を含有する）の場合、該ベクターは患者配列アクセプター部位を含有する。患者由来の切片は、インジケータ遺伝子ウイルスベクター中の患者配列アクセプター部位に挿入され、そして上記のように耐性試験ベクターと呼称される。
【００９１】
「患者配列アクセプター部位」は、患者由来の切片を挿入するベクター中の部位であって、該部位は：　 １）ベクター中に部位特異的突然変異誘発により導入されるユニークな制限酵素認識部位；　２）前記ベクター中の天然のユニークな制限酵素認識部位；　または３）別のクローニング方法（例えば、ＵＤＧクローニング）を使用して患者由来の切片を挿入し得る選択部位であってもよい。一態様において、患者配列アクセプター部位は、前記インジケータ遺伝子ウイルスベクターに導入される。患者配列アクセプター部位は、好ましくは前記抗ウイルス薬の標的であるウイルス蛋白質のコード領域内またはそれに近接して配置される。患者配列アクセプター部位の導入に使用されるウイルス配列は、好ましくは変化しないように、または保存的変化（その位置に認められるアミノ酸コード配列内で作成される）であるように選択される。好ましくは、患者配列アクセプター部位は、患者由来の切片の導入を円滑にするためにウイルスゲノムの比較的保存された領域内に配置される。或いは、患者配列アクセプター部位は、機能的に重要な遺伝子または制御配列の間に配置される。患者配列アクセプター部位は、患者由来の切片内に対応する制限酵素認識部位を導入する目的で使用されるプライマーによって、プライミング可能な比較的保存されたウイルスゲノムの領域に（もしくはその付近に）配置される。患者由来の切片の発現を更に改善するため、かかるプライマーは、ウイルス配列の異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）に対応するディジェネレート・プールとして設計されてもよい、または複数塩基対合能を有するデオキシイノシン（Ｉ）などの残基を導入してもよい。同一もしくは重複する制限酵素認識部位インターバルを備えた患者配列アクセプター部位を有する耐性試験ベクターのセットを、患者由来切片（特定の患者配列アクセプター部位と一致する内部の制限酵素認識部位を含み、何れかの耐性試験ベクター単独では発現不十分となるであろう切片）を発現させるため薬の耐性および感受性試験において共に使用してもよい。
【００９２】
《宿主細胞》
耐性試験ベクターは、宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は哺乳類細胞である。好適な宿主細胞は、ウイルス感染の重要な標的であるヒトの組織および細胞に由来するものである。ＨＩＶの場合、それらはヒトＴ細胞、単核球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、造血幹細胞もしくは前駆細胞などのヒト細胞、および他の細胞を含む。ＨＢＶの場合、適切な宿主細胞は、肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２， Ｈｕｈ ７）、ヒトプライマリー肝細胞、偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ＨＢＶにより感染される哺乳類細胞、および他の細胞を含む。ヒト由来宿主細胞は、抗ウイルス薬が効率的に細胞に侵入し、そして前記薬が細胞性の酵素機構により抗ウイルス阻害剤の代謝上の適切な形態へと変換されることを保証する。本明細書において、宿主細胞は、「パッケージング宿主細胞」、「耐性試験ベクター宿主細胞」、または「標的宿主細胞」を意味する。「パッケージング宿主細胞」は、耐性試験ベクター粒子を産生するために、本明細書中で使用される複製欠陥ウイルスベクター（耐性試験ベクターなどの）が要求するトランス作用因子およびウイルスパッケージング蛋白質を供給する宿主細胞を意味する。パッケージング蛋白質は、耐性試験ベクター自身、パッケージング発現ベクター、またはそれら双方の内に含まれるウイルス遺伝子の発現により供給される。パッケージング宿主細胞は、１以上のパッケージング発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞であり、耐性試験ベクターでトランスフェクションされた際には本明細書中で「耐性試験ベクター宿主細胞」と呼ばれ、時々はパッケージング宿主細胞／耐性試験ベクター宿主細胞とも呼ばれる。ＨＩＶのパッケージング宿主細胞として使用するのに好適な宿主細胞は、２９３ヒト胎生腎臓細胞（２９３， Ｇｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６： ５９，１９７７）， ＢＯＳＣ２３ （Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０，８３９２，１９９３）， ｔｓａ５４ および ｔｓａ２０１ 細胞株（Ｈｅｉｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２， ３７３８，１９８８）であり、 ＨＢＶに対しては ＨｅｐＧ２ （Ｇａｌｌｅ および Ｔｈｅｉｌｍａｎｎ， Ｌ． Ａｒｚｈｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｙ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． （１９９０） ４０，１３８０−１３８２）． （Ｈｕｈ， Ｕｅｄａ， Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ＊１９８９） １６９，２１３−２１６）を含む。「標的宿主細胞」は、耐性試験ベクター宿主細胞により産生される耐性試験ベクターウイルス粒子で感染される細胞を意味し、該細胞でインジケータ遺伝子の発現もしくは阻害が生じる。標的宿主細胞として使用される好適な宿主細胞は、Ｊｕｒｋａｔ （ＡＴＣＣ Ｔ１Ｂ−１５２）， Ｈ９ （ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１７６）， ＣＥＭ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１１９）， ＨＵＴ７８ （ＡＴＣＣ Ｔ１Ｂ−１６１）、およびそれらから派生した細胞を含むヒトＴ細胞白血病細胞株を含む。
【００９３】
本発明は、以下に記載される実施例において例証される。これら実施例は、本発明の理解を助けるために記載されるが、本願の特許請求の範囲の請求項に記載される本発明を如何なる限定をもすることを意図しておらず、また限定すると解釈されるべきでもない。
【００９４】
【実施例】
【００９５】
【実験の詳細】
［実施例１］
《耐性試験ベクターを使用した表現型薬感受性および耐性試験》
表現型薬感受性および耐性試験は、１９９７年１月２９日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６０９号に記載された手段および方法を使用して実行され、該出願は本願明細書中に参照により援用される。
【００９６】
これらの実験において、ＨＩＶプロテアーゼ（ＰＲ）および逆転写酵素のコード領域に対応する患者由来の切片（ＰＤＳ）は、ＨＩＶ感染個体の血清に存在するウイルス粒子から分離したウイルスＲＮＡを使用した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅した患者由来の切片であるか、または耐性試験ベクター　ＤＮＡの親クローンの部位特異的突然変異誘発により作出される野生型ＨＩＶ−１の変異体の何れかであった。ウイルスＲＮＡの分離を、標準的な処理（例えば、ＲＮＡｇｅｎｔｓ 総ＲＮＡ 分離システム， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ または ＲＮＡｚｏｌ， Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ， Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ）を用いて実行した。ＲＴ−ＰＣＲプロトコールは、２つの工程に分けられる。レトロウイルス逆転写酵素〔 例えば モロニー ＭｕＬＶ 逆転写酵素 （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）， または 鳥類ミエロブラストーシス　ウイルス（ＡＭＶ） 逆転写酵素， （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）〕を、ウイルスＲＮＡをｃＤＮＡへと転写するために使用した。そして前記ｃＤＮＡを、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ〔例えば、Ｔａｑ （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）， Ｔｔｈ （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）， ＰｒｉｍｅＺｙｍｅ （ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓから分離， Ｂｉｏｍｅｔｒａ， Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）〕、或いは「ロングＰＣＲ」の実施論文に記載されたような熱耐性ポリメラーゼの併用（Ｂａｒｎｅｓ， Ｗ． Ｍ．， （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９１， ２２１６−２２２０）〔例えば、 Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｔａｑ ＋ Ｐｗｏ）， （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ． Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ） もしくは ＧｅｎｅＡｍｐ ＸＬ ＰＣＲ ｋｉｔ （Ｔｔｈ ＋ Ｖｅｎｔ）， （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）〕を使用して増幅した。
【００９７】
「試験」患者由来の切片を増幅するために使用されたプライマー〔ＡｐａＩ プライマー （ＰＤＳＡｐａ） および ＡｇｅＩ プライマー （ＰＤＳＡｇｅ）〕は、ＰＣＲ産物の５’および３’端に導入される夫々ＡｐａＩ および ＡｇｅＩ 認識部位を生じる配列を含むものであり、１９９７年１月２９日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６０９号に記載されている。
【００９８】
「試験」患者由来の切片を導入する耐性試験ベクターは、１９９７年１月２９日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６０９号に記載のように構築された。即ち、鋳型としてウイルスＲＮＡ並びにプライマーとしてオリゴヌクレオチド　ＰＤＳＡｐａ （１） および ＰＤＳＡｇｅ （２）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより調製された１．５ｋＢの増幅ＤＮＡ産物を使用し、次にＡｐａＩ および ＡｇｅＩ（もしくはイソ制限酵素ＰＩＮＡＩ）で消化して構築した。生じた耐性試験ベクターに対応するプラスミドＤＮＡが特定患者の血清に存在するＨＩＶウイルス準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）の代表的サンプルを含むように、特定の耐性試験ベクターの構築中に得られた多数（＞１００）の独立した大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）形質転換体をプールして、プラスミドＤＮＡの調製に使用した。
【００９９】
両種指向性ＭｕＬＶ ４０７０Ａ ｅｎｖ遺伝子産物をコードするパッケージング発現ベクターは、ヒト標的細胞に効率良く感染できる耐性試験ベクターウイルス粒子の耐性試験ベクター宿主細胞内での産生を可能とする。ｅｎｖを除く全てのＨＩＶ遺伝子をコードしている耐性試験ベクターを、パッケージング宿主細胞（前記宿主細胞は、一度トランスフェクションしたら「耐性試験ベクター宿主細胞」と呼称される）をトランスフェクションするために使用した。前記両種指向性ＭｕＬＶ ４０７０Ａ ｅｎｖ遺伝子産物をコードするパッケージング発現ベクターが、感染性で偽型の耐性試験ベクターウイルス粒子の耐性試験ベクター宿主細胞での産生を可能とするために耐性試験ベクターと共に使用された。
【０１００】
耐性試験ベクターで実施した耐性試験は、パッケージング宿主、並びにヒト胎生腎臓細胞株２９３（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ， ＵＣ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＳＦ， ＣＡ）もしくはＪｕｒｋａｔ 白血病Ｔ−細胞株 （Ａｒｔｈｕｒ Ｗｅｉｓｓ， ＵＣ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＳＦ， ＣＡ）から構成される標的宿主細胞を使用して実行された。
【０１０１】
耐性試験は、２つの宿主細胞タイプを用いて耐性試験ベクターで実行した。耐性試験ベクターウイルス粒子は、最初の宿主細胞（耐性試験ベクター宿主細胞）により産生された。該細胞は、パッケージング宿主細胞を耐性試験ベクターおよびパッケージング発現ベクターでトランスフェクションすることにより調製された。そして耐性試験ベクターウイルス粒子は、インジケータ遺伝子の発現が測定される第二の宿主細胞（標的宿主細胞）を感染させるために使用された。
【０１０２】
機能的ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子カセットを含んでいる耐性試験ベクターを構築し、宿主細胞を耐性試験ベクターＤＮＡでトランスフェクションした。耐性試験ベクターは、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ）およびプロテアーゼ阻害剤などの抗レトロウイルス薬剤に対して感受性または耐性の何れかである患者由来の逆転写酵素およびプロテアーゼの配列を含むものであった。ＰＲＩｓの存在もしくは非存在の何れかの条件下で宿主細胞に耐性試験ベクターＤＮＡをトランスフェクションすることにより産生された耐性試験ベクターウイルス粒子は、ＮＲＴＩｓ もしくは ＮＮＲＴＩｓの非存在下または前記薬の増加濃度（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）の存在下の何れかの条件下で成育した標的宿主細胞を感染するために使用された。薬の変動濃度（ｖａｒｙｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）の存在下で感染した標的宿主細胞内で産生されたルシフェラーゼ活性量は、薬の非存在下で感染した標的宿主細胞において産生されたルシフェラーゼ量と比較された。「薬耐性」は、薬の非存在下で検出されたルシフェラーゼ活性を５０％阻害するのに必要とされる薬の量として測定された（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）。ＩＣ５０値は、ｌｏｇ１０薬濃度に対してパーセント薬阻害をプロットすることにより決定された。ウイルス複製の刺激は、薬の非存在下と比較して薬の存在下で感染が生じた際に検出されたルシフェラーゼ活性のパーセント増加として測定された。
【０１０３】
宿主細胞を、１０ｃｍ直径の培養皿に播種し、そして耐性試験ベクタープラスミドＤＮＡおよびエンベロープ発現ベクターを添加後に数日間トランスフェクションした。トランスフェクションを、リン酸カルシウム沈殿処理を使用して実行した。ＤＮＡ沈殿を含有する細胞培養液を、トランスフェクション後の１から２４時間で新たな培養液で交換した。耐性試験ベクターウイルス粒子を含有する細胞培養液を、トランスフェクション後の１から２４時間で収穫し、そして標的宿主細胞の感染に使用する前、または−８０℃で保存する前に０．４５ｍｍフィルターを通した。収穫した細胞培養液中のＨＩＶカプシド蛋白質（ｐ２４）レベルは、製造者（ＳＡＩＣ； Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）が記載したＥＩＡ法により決定された。感染前、標的細胞（２９３および２９３／Ｔ）を細胞培養液中に播種した。コントロール感染を、モックトランスフェクション（ＤＮＡ無し）または耐性試験ベクタープラスミッドＤＮＡを含むトランスフェクション（エンベロープ発現プラスミッド無し）の細胞培養液を使用して実行した。感染後１から３日以上経過後に、培養液を除去し、各ウェルに細胞溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。ルシフェラーゼ活性の測定のために細胞ライセートをアッセイした（図３）。薬の阻害効果を以下の式を使用して決定した：
％ ルシフェラーゼ阻害 ＝ １− （ＲＬＵｌｕｃ ［薬）÷ＲＬＵｌｕｃ） ｘ
１００
式中でＲＬＵｌｕｃ ［薬］ は、薬の存在下での感染細胞におけるルシフェラーゼ活性の相対光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ）であり、ＲＬＵｌｕｃは薬の非存在下での感染細胞におけるルシフェラーゼ活性の相対光単位である。ＩＣ５０値は、ｌｏｇ１０薬濃度に対してルシフェラーゼ活性のパーセント阻害をプロットしたデータから作成されたシグモイド曲線から算出された。薬阻害曲線を図３に示す。パーセント・ルシフェラーゼ刺激は、上記の式を用いて計算された％阻害の負数（ｎｅｇａｔｉｖｅ）である。ウイルス複製の薬物依存性刺激を示す曲線を図４に示す。
【０１０４】
［実施例２］
《相関する表現型感受性および遺伝型の分析》
＜患者ＨＩＶサンプルの表現型感受性分析＞
耐性試験ベクターを実施例１に記載のように構築した。耐性試験ベクター、または耐性試験ベクタープールに由来するクローンは、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験された。この群の抗レトロウイルス薬には、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ）、およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＲＩｓ）として知られる薬剤類（ｃｌａｓｓｅｓ）のメンバーを含んでもよい。新規薬または新規薬標的が利用可能な場合には、前記一群の薬の範囲を拡大することができる。各耐性試験ベクタープールに関して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬に対する感受性のパターンが調査され、既知の感受性パターンと比較された。ウイルス複製上の薬の効果（即ち、ルシフェラーゼ活性）については、ウイルス複製の薬物依存性刺激（薬感受性グラフ中で負のパーセント阻害として表現される）の何らかの徴候が存在するかとの観点で更に分析された。患者サンプルを、観察された感受性のパターンと相関する遺伝型変化に関して更に調査される。
【０１０５】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型分析＞
耐性試験ベクターＤＮＡ（プールまたはクローンの何れか）は、当業者に公知の任意の遺伝型決定方法により分析された（１９９７年１月２９日に出願されたＰＣＴ国際出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１６０９号を参照のこと）。本発明の一態様において、患者ＨＩＶサンプル配列は、ウイルスＲＮＡ精製、ＲＴ／ＰＣＲおよびＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシング（ＡＢＩ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を使用して決定された。決定された配列は、もし可能であれば、データベースに存在するコントロール配列と比較されるか、または療法の開始前に患者のサンプルと比較される。遺伝型は、コントロールもしくは前処理配列と異なる配列を対象に調査し、観察された表現型と相関させた。
【０１０６】
＜部位特異的突然変異誘発した突然変異体の表現型感受性分析＞
薬感受性の表現型パターンにおける変化と相関して観察された遺伝型変化は、規定の野生型（薬感受性）の遺伝的背景に特定の突然変異を含む耐性試験ベクターの構築により評価される。突然変異は、単独および／または特定の薬もしくは薬剤類に対するＨＩＶの感受性を調節すると考えられる他の既知の薬耐性突然変異との組み合わせとして導入されてもよい。突然変異は、周知の部位特異的突然変異誘発法の任意の方法を用いて、耐性試験ベクターに導入される。本発明の一態様において、ｍｅｇａ−プライマー ＰＣＲ法による部位特異的突然変異誘発が使用された（Ｓａｒｋａｒ Ｇ， Ｓｏｍｍｅｒ ＳＳ． （１９９０）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８： ４０４−４０７）。特定の突然変異もしくは突然変異群を含む耐性試験ベクターを、上記の表現型感受性アッセイを使用して試験し、感受性プロファイルを特定の突然変異を欠く遺伝的に定義された野生型（薬感受性）耐性試験ベクターのものと比較した。試験した抗レトロウイルス薬に対する表現型感受性のパターンにおいて観察された変化は、耐性試験ベクターに導入された特定の突然変異に起因する。
【０１０７】
［実施例３］
《耐性試験ベクターおよび部位特異的突然変異誘発変異体を使用して、ＨＩＶ（Ｍ２３０Ｌ ＋ Ｙ１８１Ｃ）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者ＡＲＧ−０１４ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
１６週間にわたる３つの別々の時点で、単一患者（ａｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐａｔｉｅｎｔ）から採取したウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。この患者は、２つのＮＲＴＩｓ （ジダノシン およびラミブジン）並びにＰＲＩ　インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）で以前治療されたことがあった。最初のサンプル（９８‐７７３と指定される）が採取された時点で、前記患者はＮＲＴＩ （アバカビル、ａｂａｃａｖｉｒ）、ＮＮＲＴＩ （ネビラピン、ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ） および２つのＰＲＩ’ｓ （ネルフィナビル、ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ およびサクイナビル、 ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ） （ＰＲＩｓ）を含む新規の抗ウイルス投薬計画の投与を開始した。第二のサンプル （９８−１０４６） は８週後（８ ｗｅｅｋｓ ｌａｔｅｒ）に採取され、第三のサンプル（９８−８８７）は１６週後（１６ ｗｅｅｋｓ ｌａｔｅｒ）に採取された。前記患者がウイルス負荷の一時的な減少（４週で）、引き続いて８および１６週で基準値ウイルス負荷（〜６０， ０００ コピー／ｍｌ）への復帰を経験したことをウイルス負荷（Ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）測定は示した。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳｓ）を生成した。
【０１０８】
前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−７７３， ＲＴＶ−１０４６ および ＲＴＶ−８８７と指定された耐性試験ベクターを生成するためにインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、これらのＲＴＶｓを、一群の抗レトロウイルス薬に対する正確且つ定量的な感受性レベルを決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ 〔ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）， および アバカビル〕， ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ 〔アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）， および サクイナビル〕として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０を決定した。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者サンプルＲＴＶ−１０４６ および ＲＴＶ−８８７において、観察され、それはエファビレンツ感受性において中等度の減少（５倍）並びにネビラピン （ ＞ ６００倍） およびデラビルジン （ ＞ ２５０倍）感受性において高度の減少を示すものであった。
【０１０９】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−７７３， ＲＴＶ−１０４６ および ＲＴＶ−８８７ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレード　Ｂ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−７７３（基準値サンプル；ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓａｍｐｌｅ）において、突然変異は、コントロール配列と比較してＨＩＶ ＲＥ コドン ４１，７４，１８４，２１０，２１１，２１５，２２８， および ２９６で認められた。突然変異Ｍ４１Ｌ， Ｌ７４Ｉ， Ｍ１８４Ｖ， Ｌ２１０Ｗ および Ｔ２１５Ｙは、ＮＲＴＩ耐性と関連した。突然変異Ｒ２１１Ｋ および Ｔ２９６Ｓは、ＨＩＶの異なる野生型（薬感応性）バリアントの間に見つけられた既知の配列多型である。ＲＴＶ−１０４６ および ＲＴＶ−８８７において、２つの付加的な突然変異が１８１ および ２３０に出現した。突然変異 Ｙ１８１Ｃは、ＮＮＲＴＩｓ ネビラピン および デラビルジン（しかしエファビレンツとは関連しない）に対する耐性と関連することが以前から示されている。遺伝型において観察された変化と表現型とを相関させるために、我々は、突然変異Ｍ２３０Ｌ単独および Ｙ１８１Ｃとの組み合わせを、部位特異的突然変異誘発およびインビトロ表現型感受性試験を使用して調査した。
＜ＨＩＶの抗レトロウイルス薬に対する表現型感受性において、特定の突然変異の役割を確認するために部位特異的突然変異誘発が使用された＞
Ｍ２３０Ｌ 突然変異を、部位特異的突然変異誘発のメガプライマー法 （Ｓａｋａｒ および Ｓｏｍｍａｒ， Ｉｂｉｄ．）を使用して野生型 （薬感応性） 耐性試験ベクターに導入した。結果として生じるＭ２３０Ｌ 突然変異を含む耐性試験ベクター （Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶ）を、先に記載した表現型アッセイを使用して試験し、その結果を、ポジション２３０において野生型である遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定された結果と比較した。我々は、Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶにおけるＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型の背景（即ち、Ｍ２３０Ｌ 突然変異単独）、Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶは、野生型コントロールＲＴＶと比較して、エファビレンツ （２３倍）， ネビラピン （３９倍） および デラビルジン （５８倍）に対する感受性の中等度の損失を提示した。Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶは、デラビルジン （〜５０％） および ネビラピン （〜５０％） の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示したが、エファビレンツでは示さなかった。Ｍ２３０Ｌ 突然変異 および Ｙ１８１Ｃ 突然変異を含む耐性試験ベクター（Ｙ１８１Ｃ／Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験し、その結果をポジション１８１ および ２３０で野生型である遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、Ｙ１８１Ｃ／Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶにおけるＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、Ｙ１８１Ｃ／Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶは、エファビレンツ （２５倍）に対する感受性の中等度の減少、並びにネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍）に対する感受性の高レベルの減少を提示した。Ｙ１８１Ｃ／Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶは、任意のＮＮＲＴＩｓの存在下において、如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかった。
【０１１０】
［実施例４］
《耐性試験ベクターおよび部位特異的突然変異誘発変異体を使用して、ＨＩＶ（Ｍ２３０Ｌ ＋ Ｋ１０３Ｎ）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者ＣＣＴＧ−２１６５ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
１５週間にわたる２つの別々の時点で単一患者から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。この患者は、２つのＮＲＴＩｓ 〔スタブジン、ラミンブジン（ｌａｍｉｎｖｕｄｉｎｅ） および ＰＲＩ　ネルフィナビル〕で以前治療されたことがあった。最初のサンプル（９９−２−００９０８９と指定される）が採取された時点で、前記患者は２つのＮＲＩ’ｓ （ジドブジン， ラミブジン および ＮＮＲＴＩ　１剤）を含む新規の抗ウイルス投薬計画の投与を開始した。第二サンプル（９９−２−００９８３９） はウイルス負荷が検出されなかった４週後に採取され、第三サンプル（９９−２−０１０８３５）は基準値後の１５週後に採取された。療法の短期間の休止期（８日間）が、第二（ｗｋ ４） と 第三 （ｗｋ １５） の訪問時の間にあった。ウイルス負荷測定は、前記患者がウイルス負荷の一時的な減少（４週で）、引き続いて１５週で基準値ウイルス負荷（〜２， ０００ コピー／ｍｌ）への復帰を経験したことを示した。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、基準値および１５週サンプルからＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−００９０８９ および ＲＴＶ−０１０８３５と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、これらのＲＴＶを、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ　ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。各耐性試験ベクタープールに関して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに関する感受性のパターンが、患者サンプルＲＴＶ−０１０８３５において観察され、それはエファビレンツ （２７０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍）感受性において高度の減少を示すものであった。
【０１１１】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−００９０８９， および ＲＴＶ−０１０８３５ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングにより分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−００９０８９において、突然変異は、コントロール配列と比較してポジション４９，１０２，１２２，１６９，１７８， １８４，１９５，２００，２１１，２４５，２５０，２７５，２７６，２７７，２８６， および ２９４で認められた。ＲＴＶ−０１０８３５において、付加的な突然変異が、コドン１０３ および ２３０に出現した。突然変異Ｋ１０３Ｎが、ＮＮＲＴＩｓ　ネビラピン， デラビルジン および エファビレンツに対する耐性と関連することは以前から示されている。遺伝型において観察された変化と表現型とを相関させるために、我々は、突然変異Ｍ２３０Ｌ単独および Ｋ１０３Ｎとの組み合わせを、部位特異的突然変異誘発およびインビトロ表現型感受性試験を使用して調査した。
【０１１２】
＜ＨＩＶの抗レトロウイルス薬に対する表現型感受性において、特定の突然変異の役割を確認するために部位特異的突然変異誘発が使用された＞
Ｍ２３０Ｌ突然変異が単独で試験され、上記の実施例３に記載された。Ｍ２３０Ｌ 突然変異 および Ｋ１０３Ｎ 突然変異を含む耐性試験ベクター（Ｋ１０３Ｎ／Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験し、その結果をポジション１０３ および ２３０で野生型である遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、１０３Ｎ／Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶにおけるＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、Ｋ１０３Ｎ／Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶは、ネビラピン （ ＞ ６００倍）， エファビレンツ （ ＞ ４７０倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍）に対する感受性の高レベルの減少を提示した。また、Ｋ１０３Ｎ／Ｍ２３０Ｌ−ＲＴＶは、ネビラピン （〜７０％）， エファビレンツ （〜４０％） および デラビルジン （〜１００％）の存在下において、高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。Ｍ２３０Ｌ， Ｋ１０３Ｎ および Ｍ１８４Ｖ 突然変異を含む耐性試験ベクター（Ｋ１０３Ｎ／Ｍ２３０Ｌ／Ｍ１８４Ｖ−ＲＴＶ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験し、その結果をポジション１０３，１８４ および ２３０で野生型である遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。Ｋ１０３Ｎ， Ｍ２３０Ｌ遺伝背景へのＭ１８４Ｖ 突然変異の付加は、ウイルス複製の薬物依存性刺激の反転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を生じる。
【０１１３】
［実施例５］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶ（Ｍ２３０Ｌ ＋ Ｋ１０１Ｅ ＋ Ｋ１０３Ｎ ＋ Ｇ１９０Ｓ）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者ＣＣＴＧ−１０２５　ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
４８週間にわたる２つの別々の時点で単一患者から採取したウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。この患者は、４つのＮＲＴＩｓ （ジドブジン、スタブジン、ジダノシン、ラミブジン）およびＰＲＩ　ネルフィナビルで以前治療されたことがあった。最初のサンプル（ＡＡ２９１９と指定される）が採取された時点で、前記患者はＮＲＴＩｓ （スタブジン および アバカビル）、および１剤のＰＲＩ（インジナビル）を含む新規の抗ウイルス投薬計画の投与を開始した。この患者のウイルス負荷は、検出可能域より低く、付加的な４８週においてもなお検出されないままであった。エファビレンツは、９週後に前記投薬計画に加えられた。第二サンプル（００−２−０１２０９０）を、ウイルス負荷が４５５に増加した試験開始後４８週で採取した。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、３つ全てのサンプルからＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−２９１９ および ＲＴＶ−０１２０９０と指定された耐性試験ベクターを生成するためにインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、これらのＲＴＶｓを、一群の抗レトロウイルス薬に対する正確且つ定量的な感受性レベルを決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ （ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。各耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−０１２０９０において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （１４４倍）に対する感受性の高度の減少、並びにネビラピン （〜８０％）， デラビルジン （〜３０％） および エファビレンツ （〜４０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１１４】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−２９１９ および ＲＴＶ−０１２０９０ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−２９１９において突然変異は、コントロール配列と比較してＨＩＶ ＲＴ コドン ６７，８６，１０２，１１８， １２２，１５８，１６２，１７４，１７７，２１１，２１４，２１５，２７２，２７５，２７６， ２７７，２７８，２８１，２８６ および ２９３で認められた。ＲＴＶ−０１２０９０において、付加的な突然変異がコドン１０１，１０３，１９０ および ２３０に出現した。突然変異Ｋ１０１Ｅ， Ｋ１０３Ｎ および Ｇ１９０Ｓが、ＮＮＲＴＩｓ　ネビラピン， デラビルジン および エファビレンツに対する耐性と関連することは以前から示されている。この患者サンプルに関して、突然変異 Ｋ１０１Ｅ， Ｋ１０３Ｎ， Ｇ１９０Ｓ および Ｍ２３０Ｌの出現は、３つ全てのＮＮＲＴＩｓに対する反応における高度のウイルス複製の薬物依存性刺激と相関している。
【０１１５】
［実施例６］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶ（Ｖ２４１Ｓ ＋ Ｋ１０３Ｎ ＋ Ｉ１３５Ｔ ）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者０１１０７３ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者０１１０７３から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−０１１０７３と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−０１１０７３を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ （ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン および アバカビル）， ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。各耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−０１１０７３において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍） 感受性において高度の減少、並びにネビラピン （〜７０％）， デラビルジン （〜９０％） および エファビレンツ （〜８０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１１６】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−０１１０７３ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−０１１０７３において、突然変異は、コントロール配列と比較してＨＩＶ ＲＴ コドン ２０，６７，６９，７０，１０２，１０３，１１８， Ｉ１３５Ｔ， １６２，２１１，２１４，２１８，２１９，２４１ および ２７７で認められた。
【０１１７】
＜ＨＩＶの抗レトロウイルス薬に対する表現型感受性において、特定の突然変異の役割を確認するために部位特異的突然変異誘発が使用された＞
ＲＴＶ−０１１０７３に存在する全ての突然変異を含む耐性試験ベクター（Ｖ２４１Ｓ および Ｔ２７７Ｋを除く）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−０１１０７３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−０１１０７３／２４１Ｖ／２７７Ｔにおける、ＮＮＲＴＩｓ，　デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−０１１０７３／２４１Ｖ／２７７Ｔは、ネビラピン （１２６倍）， エファビレンツ （５４倍） および デラビルジン （５０倍）に対する感受性において高レベルの減少を提示した。試験した何れのＮＮＲＴＩの存在下においても、ＲＴＶ−０１１０７３／２４１Ｖ／２７７Ｔは、如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかった。ＲＴＶ−０１１０７３に存在する全ての突然変異を含む耐性試験ベクター（ Ｖ２４１Ｓ を除く）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−０１１０７３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−０１１０７３／２４１Ｖにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−０１１０７３／２４１Ｖは、ネビラピン （１４６倍）， エファビレンツ （５４倍） および デラビルジン （５９倍）に対する感受性において高レベルの減少を提示した。試験した何れのＮＮＲＴＩの存在下においても、ＲＴＶ−０１１０７３／２４１Ｖは、如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかった。この患者サンプルに関して、Ｖ２４１Ｓでの突然変異とウイルス複製の薬物依存性刺激との相関性は、非常に著しいものである。Ｖ２４１Ｓ の単一突然変異を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｖ２４１Ｓ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、野生型コントロールＲＴＶを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｖ２４１Ｓにおける、ＮＮＲＴＩｓ，　デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｖ２４１Ｓは、ネビラピン （９倍）， エファビレンツ （３倍） および デラビルジン （６倍）に対する感受性において低度な減少を提示した。ＲＴＶ−Ｖ２４１Ｓは、ネビラピン （〜３０％）， デラビルジン （〜２５％）の存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を示したが、エファビレンツの存在下においては如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかった。
【０１１８】
［実施例７］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶ（Ｖ２４１Ｓ ＋ Ｋ１０１Ｅ ＋ Ｖ１０６Ｍ ＋ Ｉ１３５Ｔ ＋ Ｅ１３８Ａ ＋ Ｇ１９０Ａ）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者０１４４５１ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
３２週間の期間を隔てた２つの時点において単一患者から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、３つ全てのサンプルからＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−０１４４５９ および ＲＴＶ−０１４４５１と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、これらのＲＴＶを、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ　ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル）　ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。各耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−０１４４５１において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （４１倍） 感受性において高度の減少、並びにネビラピン （〜１００％）， デラビルジン （〜９０％） および エファビレンツ （〜７０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１１９】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−０１４４５９ および ＲＴＶ−０１４４５９ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−０１４４５９において、突然変異は、コントロールＮＬ４−３配列と比較して、ＨＩＶ ＲＴ ３５Ｉ， ４１，４９，８３，１０２，１２３， １３５，１３８，１７４，１７７，１７８，１８４，２１５，２４１，２５７，２６１，２７７， ２８６，２９３ および ２９７で認められた。ＲＴＶ−０１４４５１において、付加的な突然変異がコドン１０１，１０６ および １９０に出現した。突然変異Ｋ１０１Ｅ， Ｖ１０６Ｍ および Ｇ１９０Ａが、ＮＮＲＴＩｓ　ネビラピン， デラビルジン および エファビレンツに対する耐性と関連するが、ウイルス複製の刺激とは関連しないことは以前から示されている。この患者サンプルに関して、このウイルスの特定の遺伝的背景における突然変異 Ｋ１０１Ｅ， Ｖ１０６Ｍ および Ｇ１９０Ａの出現は、３つ全てのＮＮＲＴＩｓに対する反応において認められた高度のウイルス複製の薬物依存性刺激と相関している。上記実施例６に示された結果は、突然変異 Ｖ２４１Ｉが、このウイルスに見られたウイルス複製の刺激に寄与し得ることを示唆している。
【０１２０】
［実施例８］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶ （Ｖ２４５Ｅと組み合わせた複数の他の突然変異）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者００５７３８ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者００５７３８から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、双方のサンプルからＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−００５７３８と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−００５７３８を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ　ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。各耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者サンプルＲＴＶ−００５７３８において観察され、それはエファビレンツ （１７倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （６３倍） 感受性の中等度な減少、並びにネビラピン （〜２０％）， デラビルジン （〜４０％） および エファビレンツ （〜２０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１２１】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−００５７３８ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−００５７３８において、突然変異は、コントロール配列と比較して、ポジションＤ６７Ｎ， Ｋ７０Ｒ， Ｒ８３Ｋ， Ａ９８Ｇ， Ｑ１０２Ｋ， Ｋ１２２Ｐ， Ｉ１３５Ｔ， Ｉ１４２Ｖ， Ｃ１６２Ｓ， Ｋ１７３Ｑ， Ｉ１７８Ｌ， Ｙ１８１Ｃ， Ｇ１９６Ｅ， Ｉ２０２Ｖ， Ｔ２１５Ｆ， Ｄ２１８Ｅ， Ｋ２１９Ｑ， Ｖ２４５Ｅ， Ａ２７２Ｐ， Ｒ２７７Ｋ， Ｖ２９３Ｉ および Ｅ２９７Ｑで認められた。
【０１２２】
＜患者００７１３０ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者００７１３０から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−００７１３０と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−００７１３０を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ　ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−００７１３０において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍） 感受性の高度の減少、並びにネビラピン （〜５０％）， デラビルジン （〜３０％） および エファビレンツ （〜４０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１２３】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−００７１３０ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−００７１３０において、突然変異は、コントロール配列と比較して、コドン ６７，１０１，１０２，１０３，１２２，１３５，１６２，１７４， １８４，１９０，２０８，２２１，２４５，２７２，２７７，２８３，２９３で認められた。
【０１２４】
［実施例９］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶ（Ｖ２４５Ｔと組み合わせた複数の他の突然変異）のＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者００６７８２ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者００６７８２から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−００６７８２と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−００６７８２を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−００７１３０において観察され、それはエファビレンツ （５倍）， ネビラピン （８倍） および デラビルジン （１８．５倍） 感受性の低度な減少、並びにネビラピン （〜６０％）， デラビルジン （〜７０％） および エファビレンツ （〜２５％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１２５】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−００６７８２ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−００６７８２において、突然変異は、コントロール配列と比較して、ＨＩＶ ＲＴ コドン Ｑ１０２Ｋ， Ｄ１２３Ｅ， Ｉ１３５Ｔ， Ｅ１３８Ａ， Ｃ１６２Ｓ， Ｇ１９６Ｅ， Ｉ２０２Ｖ， Ｖ２４５Ｔ， Ｒ２７７Ｋ， Ｔ２８６Ａ， Ｖ２９３Ｉ， Ｐ２９４Ｔ および Ｅ２９７Ｋで認められた。
【０１２６】
＜患者０１２１２３ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者０１２１２３から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−０１２１２３と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−０１２１２３を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性パターンが、患者ＲＴＶ−０１２１２３において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍） 感受性の高度の減少、並びにネビラピン （〜２０％）， デラビルジン （〜８０％） および エファビレンツ （〜７０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１２７】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−０１２１２３ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−０１２１２３において、突然変異は、コントロール配列と比較して、ＨＩＶ ＲＴ コドン ２０，３９，４１，４４，６０，６７，９８，１０２， １０３，１１８，１２２，１３５，１４２，１６２，１７３，１８１，１９０，１９６，２０２， ２１０，２１５，２２１，２４５，２７２，２７７，２９３ および ２９７で認められた。
【０１２８】
＜患者０１４３９７ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者 ０１４３９７から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−０１４３９７と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−０１４３９７を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−０１４３９７において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍） 感受性の高度の減少、並びにネビラピン （〜１００％）， デラビルジン （〜１００％） および エファビレンツ （〜７０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１２９】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−０１４３９７ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−０１４３９７において、突然変異は、コントロール配列と比較して、ＨＩＶ ＲＴ コドン ３１，１０２，１０３，１２３，１６２，１６６，１７７， ２１１，２１５，２２８，２４５，２７２ および ２７７で認められた。
【０１３０】
［実施例１０］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶ（Ｖ２４５Ｍと組み合わせた複数の他の突然変異）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者０１３４１５ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者０１３４１５から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−０１３４１５と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−０１３４１５を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−０１３４１５において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍） 感受性の高度の減少、並びにネビラピン （〜２０％）， デラビルジン （〜３０％） および エファビレンツ （〜２０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１３１】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−０１３４１５ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−０１３４１５において、突然変異は、コントロール配列と比較して、ＨＩＶ ＲＴ コドン ３５，１０２，１０３，１２２，１２３，１３５，１６２， １７７，２００，２０７，２１１，２２５，２４５，２６４，２７７ および ２９０で認められた。
【０１３２】
［実施例１１］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶ（Ｋ１０３Ｎ ＋ Ｖ２４５Ｅ ＋ Ｉ２７０Ｍ）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者１０８２９ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者１０８２９から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−０１０８２９と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−０１０８２９を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−０１１０７３において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍） 感受性の高度の減少、並びにネビラピン （〜１００％）， デラビルジン （〜１００％） および エファビレンツ （〜８０％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１３３】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−０１０８２９ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−０１０８２９において、突然変異は、コントロール配列と比較して、ＨＩＶ ＲＴ コドン ３１，３５，９０，１０２，１０３，１２２，１６２，１９６， ２１１，２１４，２１５，２２８，２４５，２７０，２７６，２７７，２９２，２９３ および ２９７で認められた。
【０１３４】
＜ＨＩＶの抗レトロウイルス薬に対する表現型感受性において、特定の突然変異の役割を確認するための部位特異的突然変異誘発＞
ＲＴＶ−０１０８２９に存在する全ての突然変異（Ｖ２４５Ｅ突然変異を除く）を含む耐性試験ベクター （ＲＴＶ０１０８２９／２４５Ｖ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−０１０８２９を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−０１０８２９／２４５Ｖにおいて、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−０１０８２９／２４５Ｖは、ネビラピン （５０５倍）， エファビレンツ （１８９倍） および デラビルジン （１８２倍）に対する感受性の高レベルの減少を提示した。ＲＴＶ−０１０８２９／２４５Ｖは、ネビラピン （〜８０％）， エファビレンツ （〜６０％） および デラビルジン （〜６０％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。ＲＴＶ−０１０８２９に存在する全ての突然変異（Ｉ２７０Ｍを除く）を含む耐性試験ベクター （ＲＴＶ−０１０８２９／２７０Ｉ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−０１０８２９を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクター　ＲＴＶ−０１０８２９／２７０Ｉにおいて、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−０１０８２９／２７０Ｉは、ネビラピン （３４１倍）， エファビレンツ （１４５倍） および デラビルジン （２４７倍）に対する感受性の高レベルの減少を提示した。ＲＴＶ−０１０８２９／２４５Ｖは、ネビラピン （〜３０％）， エファビレンツ （〜２０％） および デラビルジン （〜４０％）の存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。ＲＴＶ−０１０８２９に存在する全ての突然変異（Ｖ２４５Ｅ， Ｉ２７０Ｍ， Ｖ２７６Ｉ， Ｒ２７７Ｋ， Ｖ２９２Ｉ， Ｖ２９３Ｉ および Ｅ２９７Ｋを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−０１０８２９／２４５Ｖ−２９７Ｅ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−０１０８２９を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−０１０８２９／２４５Ｖ−２９７Ｅにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−０１０８２９／２４５Ｖ−２９７Ｅは、ネビラピン （２３３倍）， エファビレンツ （７６倍） および デラビルジン （１９８倍）に対する感受性の高レベルの減少を提示した。ＲＴＶ−０１０８２９／２４５Ｖ−２９７Ｅは、ネビラピン， エファビレンツ， もしくは デラビルジンの存在下において、如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかった。この患者サンプルにおいて、ウイルス複製の薬物依存性刺激は、突然変異Ｖ２４５Ｅ および Ｉ２７０Ｍの存在により調節される。ウイルス複製の薬物依存性刺激は、突然変異 Ｖ２４５Ｅ， Ｉ２７０Ｍ， Ｖ２７６Ｉ， Ｒ２７７Ｋ， Ｖ２９２Ｉ， Ｖ２９３Ｉ および Ｅ２９７Ｋの復帰により完全に無効にし得る。
【０１３５】
［実施例１２］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶ（Ｋ１０３Ｎ ＋ Ｉ１３５Ｔ ＋ Ｉ２７０Ｓ ）におけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる》
＜患者０１３５２２ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
患者０１３５２２から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。本患者において、過去および現行の治療投薬計画は知られていない。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、３つのサンプルの全てから、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−０１３５２２と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、ＲＴＶ−０１３５２２を、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ （ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン および アバカビル）， ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。各耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−０１３５２２において観察され、それはエファビレンツ （ ＞ ４５０倍）， ネビラピン （ ＞ ６００倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍） 感受性の高度の減少、並びにネビラピン （〜９０％）， デラビルジン （〜１１０％） および エファビレンツ （〜１００％）の存在下で高度のウイルス複製の薬物依存性刺激を示すものであった。
【０１３６】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−０１３５２２ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。ＲＴＶ−０１３５２２において、突然変異は、コントロール配列と比較してＨＩＶ ＲＴ コドン ３５，６０，６８，１０２，１０３，１３５，１６２， Ｋ１６６Ｒ， １８４，１９６，２０４，２１１，２４８，２５０，２７０，２８６，２９３ および ２９７で認められた。
【０１３７】
＜ＨＩＶの抗レトロウイルス薬に対する表現型感受性において、特定の突然変異の役割を確認するため部位特異的突然変異誘発が使用される＞
ＲＴＶ−０１０８２９に存在する全ての突然変異（Ｉ２７０Ｓを除く）を含む耐性試験ベクター （ＲＴＶ０１３５２２／２７０Ｉ） を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−０１３５２２を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−０１３５２２／２７０Ｉにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−０１３５２２／２７０Ｉは、ネビラピン （１４倍） および エファビレンツ （８倍）感受性の中等度の減少、並びにデラビルジン （４０倍）感受性の高度の減少を示した。試験した何れのＮＮＲＴＩの存在下においても、ＲＴＶ−０１３５２２／２７０Ｉは、如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかった。この患者サンプルに関して、Ｉ２７０Ｓにおける突然変異とウイルス複製の薬物依存性刺激との相関性は、非常に著しいものである。Ｉ２７０Ｓ における単一突然変異を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｉ２７０Ｓ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、野生型コントロールＲＴＶを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｖ２４１Ｓにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｉ２７０Ｓは、ネビラピン （１５倍）， エファビレンツ （４倍） および デラビルジン （１３倍） に対する感受性の低度の減少を提示した。ＲＴＶ−Ｉ２７０Ｓは、ネビラピン （〜６０％）， デラビルジン （〜６０％） および エファビレンツ （〜４０％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１３８】
［実施例１３］
《ＨＩＶの抗レトロウイルス薬に対する表現型感受性において、特定の突然変異の役割を確認するために使用された部位特異的突然変異誘発》
＜　Ｖ２４５Ｅ　＞
単一突然変異Ｖ２４５Ｅを含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｖ２４５Ｅ）を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション２４５において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｖ２４５Ｅにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｖ２４５Ｅは、ネビラピン， エファビレンツ もしくは デラビルジンに対する感受性において、如何なる減少も提示しなかった。ＲＴＶ−Ｖ２４５Ｅは、ネビラピン， エファビレンツ， もしくは デラビルジンの存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を示さなかった。
【０１３９】
＜　Ｖ２４５Ｔ　＞
単一突然変異Ｖ２４５Ｔを含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｖ２４５Ｔ） を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション２４５において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｖ２４５Ｅにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｖ２４５Ｔは、ネビラピン， エファビレンツ もしくは デラビルジンに対する感受性において、如何なる減少も提示しなかった。ＲＴＶ−Ｖ２４５Ｔは、ネビラピン， エファビレンツ， もしくは デラビルジンの存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示さなかった。
【０１４０】
＜　Ｉ１３５Ｔ　＞
単一突然変異 Ｉ１３５Ｔを含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ）を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション１３５において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔは、ネビラピン， エファビレンツ もしくは デラビルジンに対する感受性において、如何なる減少も提示しなかった。ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔは、ネビラピン， エファビレンツ， もしくは デラビルジンの存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を示さなかった。
【０１４１】
＜　Ｋ１０３Ｎ　＞
単一突然変異Ｋ１０３Ｎを含む耐性試験ベクター （ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ）を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション１０３において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎは、ネビラピン （６７倍）， エファビレンツ （２９倍） および デラビルジン （８７倍）に対する感受性の減少を提示した。ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎは、ネビラピン， エファビレンツ， もしくは デラビルジンの存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を提示しなかった。
【０１４２】
＜　Ｋ１０３Ｎ ＋ Ｉ１３５Ｔ　＞
２つの突然変異Ｋ１０３Ｎ および Ｉ１３５Ｔを含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ− Ｋ１０３Ｎ ／ Ｉ１３５Ｔ）を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション１０３ および １３５において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ／Ｉ１３５Ｔにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ／Ｉ１３５Ｔは、ネビラピン （１７１倍）， エファビレンツ （８０倍） および デラビルジン （１２１倍）に対する感受性の減少を提示した。ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ／Ｉ１３５Ｔは、ネビラピン， エファビレンツ， もしくは デラビルジンの存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を提示しなかった。
【０１４３】
＜　Ｉ１３５Ｔ ＋ Ｖ２４５Ｅ　＞
２つの突然変異Ｉ１３５Ｔ および Ｖ２４５Ｅを含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｅ）を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション１３５ および ２４５において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｅにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｅは、ネビラピン （２．５倍）， エファビレンツ （２倍） および デラビルジン （２倍）に対する感受性の軽微な減少を提示した。ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｅは、ネビラピン， エファビレンツ， もしくは デラビルジンの存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を提示しなかった。
【０１４４】
＜　Ｉ１３５Ｔ ＋ Ｖ２４５Ｔ　＞
２つの突然変異Ｉ１３５Ｔ および Ｖ２４５Ｔを含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｔ）を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション１３５ および ２４５において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｔにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｔは、ネビラピン （４倍）， エファビレンツ （２．４倍） および デラビルジン （２．５倍）に対する感受性の軽微な減少を提示した。ＲＴＶ−Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｔは、エファビレンツの存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示さず、また、ネビラピン （〜１０％） もしくは デラビルジン （〜１０％）の存在下でほんの軽微なウイルス複製の刺激を提示した。
【０１４５】
＜　Ｋ１０３Ｎ ＋ Ｉ１３５Ｔ ＋ Ｖ２４５Ｅ　＞
３つの突然変異Ｋ１０３Ｎ， Ｉ１３５Ｔ および Ｖ２４５Ｅを含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ／Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｅ）を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション１０３，１３５ および ２４５において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ／Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｅは、エファビレンツの存在下においてウイルス複製の薬物依存性刺激を示さなかったが、ネビラピン （〜１５％）および デラビルジン （〜２０％）の存在下において複製のウイルス刺激の中等度レベルを示した。
【０１４６】
＜　Ｋ１０３Ｎ ＋ Ｉ１３５Ｔ ＋ Ｖ２４５Ｔ　＞
３つの突然変異Ｋ１０３Ｎ， Ｉ１３５Ｔ および Ｖ２４５Ｔを含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ／Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｔ）を構築し、先に記載した表現型アッセイで試験した。その結果を、ポジション１０３，１３５ および ２４５において野生型であると遺伝的に定義された耐性試験ベクターを使用して決定した結果と比較した。我々は、ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ／Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｔは、ネビラピン （５９４倍）， エファビレンツ （１７４倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍）に対する感受性の高度の減少を提示した。ＲＴＶ−Ｋ１０３Ｎ／Ｉ１３５Ｔ／Ｖ２４５Ｔは、エファビレンツ （〜２５％）， ネビラピン （〜４０％） および デラビルジン （〜５０％）の存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１４７】
［実施例１４］
《耐性試験ベクターを使用して、ＨＩＶにおけるＮＮＲＴＩ薬の感受性および耐性、並びに複製の薬物依存性刺激に関連する遺伝型と表現型とを相関させる：複数の突然変異は感受性および刺激プロファイルの双方を調節できる》
＜患者９７−３０９ ＨＩＶサンプルの耐性試験ベクターの調製および表現型分析＞
２　１／２年の期間にわたる１３の別々の時点で単一患者から採取されたウイルスサンプルから、実施例１に記載のように耐性試験ベクターを構築した。この患者は、第一 （９７−３０９） および 第二 （９８−７５４）のサンプルが採取された際、約２年の期間にわたり、２つのＮＲＴＩｓ （ジドブジンおよびラミブジン）ＡＺＴ， ３ＴＣ （ＮＲＴＩｓ）， 並びにＰＲＩ （インジナビル）で、以前治療されたことがあった。前記患者は、第三サンプル（９８−１０３２）が採取された際、ＮＲＴＩ （スタブジン），　ＮＮＲＴＩ （ネビラピン）， 並びに ２つの ＰＲＩｓ （ネルフィナビル および サクイナビル）を含む新規の抗ウイルス投薬計画の投与を開始した。付加的なサンプルを、４，５ および １０週後に採取した（それぞれ、００−２−０１１６５８，００−２−０１１６５９ および ９８−１０３３）。次に前記患者は、ネビラピンの摂取を停止し、そして付加的なサンプルを１２， １６，２４ および ３６週後に採取した（それぞれ、９９−２−００８９７３，９８−７５７，９９−２−８９８０ および ９８−１０８０）。次に、前記患者は、ジドブジン， ラミブジン および インジナビルに再度療法を変えて、付加的なサンプルを５ ヶ月 （ＡＡ１２６４） および １０ ヶ月 （９９−２−００６１７４）後に採取した。ウイルス負荷測定、患者療法、および採取日（ｄａｔｅｓ ｏｆ ｄｒａｗ）は、図１４に示される。ｄ４Ｔ， ネビラピン， ネルフィナビル および サクイナビルの開始の後に、前記患者はウイルス負荷の一時的な減少、引き続くウイルス負荷の基準値への復帰を経験した（〜１， ２００，０００ コピー／ｍｌ）。投与計画からのネビラピンの除去は、ウイルス負荷の＜ ３００， ０００ コピー／ｍｌ （４倍の減少）への減少に至った。ウイルスＲＮＡ分離およびＲＴ／ＰＣＲを使用して、１２のサンプルの全てから、ＰＲ全体およびＲＴのａａ １−３１３をコードするウイルス配列を含む患者由来の切片（ＰＤＳ）を生成した。前記ＰＤＳを、ＲＴＶ−３０９， ＲＴＶ−７５４， ＲＴＶ−１０３２， ＲＴＶ−０１１６５８， ＲＴＶ−０１１６５９， ＲＴＶ−１０３３， ＲＴＶ−００８９７３， ＲＴＶ−７５７， ＲＴＶ−００８９８０， ＲＴＶ１０８０， ＲＴＶ１２６４ および ＲＴＶ−００６１７４と指定された耐性試験ベクターを生成するためインジケータ遺伝子ウイルスベクターに挿入した。次に、これらのＲＴＶｓを、一群の抗レトロウイルス薬に対する感受性のレベルを正確且つ定量的に決定するため表現型アッセイで試験した。この群の抗レトロウイルス薬は、ＮＲＴＩｓ ジドブジン， ラミブジン， スタブジン， ジダノシン， ザルシタビン， および アバカビル） ＮＮＲＴＩｓ （デラビルジン， エファビレンツ および ネビラピン）， 並びに ＰＲＩｓ （アンプレナビル， インジナビル， ネルフィナビル， リトナビル， および サクイナビル）として既知の薬剤類のメンバーを含むものであった。各耐性試験ベクタープールに対して試験した各薬のＩＣ５０が決定された。試験した全ての薬の感受性パターンを調査し、そして感受性の既知のパターンと比較した。前記ＮＮＲＴＩｓに対する感受性のパターンが、患者ＲＴＶ−１０３３， ＲＴＶ−００８９７３， ��ＴＶ−７５７， ＲＴＶ−００８９８０ および ＲＴＶ−１０８０において観察され、それはネビラピン （ ＞ ６００倍）， デラビルジン （３ から １８倍） および エファビレンツ （１６ から ３００ 倍） 感受性の減少を示すものであった。更に、ＲＴＶ−１０３３， ＲＴＶ−００８９７３， ＲＴＶ−７５７， ＲＴＶ−００８９８０ および ＲＴＶ−１０８０は、ネビラピン （４０ から ２５０％）， デラビルジン （２０ から １８０％） および エファビレンツ （３０ から １７０％）に対するウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。各ＲＴＶの感受性およびウイルス複製のパーセント刺激における実際のフォールド変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を、図１４ａに示す。
【０１４８】
＜患者ＨＩＶサンプルの遺伝型の決定＞
ＲＴＶ−３０９， ＲＴＶ−７５４， ＲＴＶ−１０３２， ＲＴＶ−０１１６５８， ＲＴＶ−０１１６５９， ＲＴＶ−１０３３， ＲＴＶ−００８９７３， ＲＴＶ−７５７， ＲＴＶ−００８９８０， ＲＴＶ１０８０， ＲＴＶ１２６４ および ＲＴＶ−００６１７４ ＤＮＡを、ＡＢＩチェーンターミネーター自動化シークエンシングで分析した。ヌクレオチド配列を野生型クレードＢ　ＨＩＶ‐１（ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ）のコンセンサス配列と比較した。コントロール配列と異なる配列の遺伝型を調査した。図１４ｂにリストしたポジションにおける突然変異を観察した。
【０１４９】
＜ＨＩＶの抗レトロウイルス薬に対する表現型感受性において、特定の突然変異の役割を確認するために部位特異的突然変異誘発が使用された＞
ＲＴＶ−１０３３は、この患者の試験された全てのサンプルの中で最も劇的なウイルス複製の薬物依存性刺激を提示した。単一クローン（ＲＴＶ−１０３３−３）は、患者由来のＲＴＶプールから採取され、該プールはＲＴＶ−１０３３プールに特徴的な突然変異並びにＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の表現型パターンを有するものであった。ＲＴＶ−１０３３−３は、逆転写酵素に存在する以下の突然変異： Ｖ３５Ｉ， Ｄ６７Ｎ， Ｔ６９Ｄ， Ｋ７０Ｒ， Ｖ１０６Ａ， Ｄ１２３Ｇ， Ｖ１８９Ｌ， Ｔ２００Ａ， Ｉ２０２Ｔ， Ｈ２０８Ｙ， Ｒ２１１Ｋ， Ｔ２１５Ｆ， Ｄ２１８Ｅ， Ｋ２１９Ｑ， Ｈ２２１Ｙ， Ｌ２２８Ｈ， Ｌ２８３Ｉ， Ｒ２８４Ｋ， Ｔ２８６Ａ， Ｖ２９３Ｉ および Ｅ２９７Ｋを有していた。ＲＴＶ−１０３３−３は、デラビルジン （２７倍）， エファビレンツ （ ＞ ４５０倍） および ネビラピン （ ＞ ６００倍）に対する感受性の劇的な減少、並びにデラビルジン （１９０％）， エファビレンツ （１８０％） および ネビラピン （２００％）の存在下で劇的なウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５０】
＜　Ｖ１０６Ａ　＞
ＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異（Ｖ１０６Ａを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ） を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖはネビラピン （９倍）感受性の中等度の減少を示し、エファビレンツ感受性においては減少を示さず、並びにデラビルジン （２０倍）感受性の高度の増加（ハイパー感受性）を提示した。ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖは、デラビルジンの存在下で如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかったが、エファビレンツ （〜２０％） および ネビラピン （〜４０％）の存在下で低レベルのウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５１】
＜　Ｆ２２７Ｌ　＞
ＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異（Ｆ２２７Ｌを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−１０３３−３／２２７Ｆ） を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−１０３３−３／２２７Ｆにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−１０３３−３／２２７Ｆは、ネビラピン （ ＞ ６００倍）， エファビレンツ （１８倍） および デラビルジン （７２倍）感受性の高度の減少を示した。ＲＴＶ−１０３３−３／２２７Ｆは、デラビルジン （〜１００％）， エファビレンツ （〜１００％） および ネビラピン （〜１２０％）の存在下において、ウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５２】
＜　Ｖ１０６ＡおよびＦ２２７Ｌ　＞
ＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異（Ｖ１０６Ａ および Ｆ２２７Ｌを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ１０３３−３／１０６Ｖ／２２７Ｆ） を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクター ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／２２７Ｆにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／２２７Ｆ は、ネビラピン （１３倍）， エファビレンツ （６倍） および デラビルジン （６倍） 感受性の中等度の減少を提示した。ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／２２７Ｆは、デラビルジン （〜８０％）， エファビレンツ （〜８０％） および ネビラピン （〜１１０％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５３】
＜　Ｖ１０６Ａ、Ｖ１８９ＬおよびＦ２２７Ｌ　＞
ＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異（Ｖ１０６Ａ， Ｖ１８９Ｌ および Ｆ２２７Ｌを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／１８９Ｖ／２２７Ｆ） を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／１８９Ｖ／２２７Ｆにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／１８９Ｖ／２２７Ｆは、ネビラピン （２．８倍）， エファビレンツ （２倍） および デラビルジン （２．７倍） 感受性の低度の減少を示した。ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／１８９Ｖ／２２７Ｆは、デラビルジン （〜３５％）， エファビレンツ （〜３０％） および ネビラピン （〜４０％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５４】
＜　Ｖ１０６Ａ、Ｆ２２７ＬおよびＴ２８６Ａ　＞
ＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異（Ｖ１０６Ａ， Ｆ２２７Ｌ および Ｔ２８６Ａを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／２２７Ｆ／２８６Ｔ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／２２７Ｆ／２８６Ｔにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／２２７Ｆ／２８６Ｔは、ネビラピン （６倍）， エファビレンツ （５倍） および デラビルジン （３倍）感受性の中等度の減少を提示した。ＲＴＶ−１０３３−３／１０６Ｖ／２２７Ｆ／２８６Ｔは、デラビルジン （〜６０％）， エファビレンツ （〜５０％） および ネビラピン （〜７０％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５５】
＜　Ｌ２８３Ｉ、Ｒ２８４ＫおよびＴ２８６Ａ　＞
ＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異（Ｌ２８３Ｉ， Ｒ２８４Ｋ および Ｔ２８６Ａを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−１０３３−３／２８３Ｌ／２８４Ｒ／２８６Ｔ） を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−１０３３−３／２８３Ｌ／２８４Ｒ／２８６Ｔにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−１０３３−３／２８３Ｌ／２８４Ｒ／２８６Ｔは、ネビラピン （ ＞ ６００倍）， エファビレンツ （８５倍） および デラビルジン （７倍）感受性の高度の減少を示した。ＲＴＶ−１０３３−３／２８３Ｌ／２８４Ｒ／２８６Ｔは、デラビルジン （〜４０％）， エファビレンツ （〜３０％） および ネビラピン （〜８０％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５６】
＜　Ｌ２８３Ｉ、Ｒ２８４Ｋ、Ｔ２８６Ａ、Ｖ２９３ＩおよびＥ２９７Ｋ　＞
ＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異（Ｌ２８３Ｉ， Ｒ２８４Ｋ， Ｔ２８６Ａ， Ｖ２９３Ｉ および Ｅ２９７Ｋを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−１０３３−３／２８３Ｌ／２８４Ｒ／２８６Ｔ／２９３Ｖ／２９７Ｅ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−１０３３−３／２８３Ｌ／２８４Ｒ／２８６Ｔ／２９３Ｖ／２９７Ｅにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ１０３３−３／２８３Ｌ／２８４Ｒ／２８６Ｔ／２９３Ｖ／２９７Ｅは、ネビラピン （１４４倍）， エファビレンツ （５倍） および デラビルジン （１６倍）感受性の高度の減少を示した。ＲＴＶ−１０３３−３／２８３Ｌ／２８４Ｒ／２８６Ｔ／２９３Ｖ／２９７Ｅは、デラビルジン， エファビレンツ もしくは ネビラピンの存在下で如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかった。
【０１５７】
＜　Ｙ１８１Ｃ　＞
Ｙ１８１Ｃに加えてＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−１０３３−３／１８１Ｃ） を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、変異したベクターＲＴＶ−１０３３−３／１８１Ｃにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−１０３３−３／１８１Ｃは、ネビラピン （ ＞ ６００倍）， エファビレンツ （ ＞ ４５０倍） および デラビルジン （ ＞ ２５０倍）感受性の高度の減少を提示した。ＲＴＶ−１０３３−３／１８１Ｃは、ネビラピンの存在下で如何なるウイルス複製の薬物依存性刺激も示さなかったが、エファビレンツ （〜１００％） および ネビラピン （〜１００％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５８】
＜　Ｍ１８４Ｖ　＞
Ｍ１８４Ｖに加えてＲＴＶ−１０３３−３に存在する全ての突然変異を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−１０３３−３／１８４Ｖ） を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−１０３３−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、変異ベクターＲＴＶ−１０３３−３／１８４Ｖにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−１０３３−３／１８４Ｖは、ネビラピン （ ＞ ６００倍）， エファビレンツ （２８倍）感受性の高度の減少、並びにデラビルジン （５倍）感受性の中等度の減少を示した。ＲＴＶ−１０３３−３／１８４Ｖは、デラビルジン （１００％）， エファビレンツ （〜８０％） および ネビラピン （〜１００％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１５９】
＜　クローン３０９−１　＞
ＲＴＶ−３０９は、患者１０３３のウイルスサンプルに由来するものであり、該患者は以前に任意のＮＮＲＴＩ阻害剤を投与されていた。ＲＴＶ−３０９は、デラビルジン および エファビレンツに対する感受性の野生型パターンを示し、並びに、ネビラピン （３倍）に対する感受性の低度の減少を示し、並びに、ＮＮＲＴＩｓの存在下ではウイルス複製の薬物依存性刺激を示さなかった。単一クローン（ＲＴＶ−３０９−３）は、患者由来のＲＴＶプールから採取され、該プールはＲＴＶ−１０３３プールに特徴的な突然変異並びにＮＮＲＴＩ感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激の表現型パターンを有するものであった。ＲＴＶ−３０９−３は、逆転写酵素に存在する以下の突然変異：Ｖ３５Ｉ， Ｄ６７Ｎ， Ｔ６９Ｄ， Ｋ７０Ｒ， Ｌ１０９Ｉ， Ｍ１８４Ｖ， Ｖ１８９Ｌ， Ｔ２００Ａ， Ｉ２０２Ｔ， Ｈ２０８Ｙ， Ｒ２１１Ｋ， Ｔ２１５Ｆ， Ｄ２１８Ｅ， Ｋ２１９Ｑ， Ｈ２２１Ｙ， Ｌ２２８Ｈ， Ｌ２８３Ｉ， Ｒ２８４Ｋ， Ｔ２８６Ａ および Ｅ２９７Ｋを有していた。ＲＴＶ−３０９−３は、デラビルジン および エファビレンツに対する感受性の野生型パターン並びにネビラピン （３倍）に対する感受性の低度の減少を示し、ＮＮＲＴＩｓの存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示さなかった。
【０１６０】
＜　Ｍ１８４Ｖ　＞
ＲＴＶ−３０９−３に存在する全ての突然変異（Ｍ１８４Ｖを除く）を含む耐性試験ベクター（ＲＴＶ−３０９３／１８４Ｍ）を構築し、先に記載した表現型アッセイを使用して試験した。その結果を、親ＲＴＶ−３０９−３を使用して決定した結果と比較した。我々は、復帰ベクターＲＴＶ−３０９−３／１８４Ｍにおける、ＮＮＲＴＩｓ， デラビルジン， ネビラピン および エファビレンツに対する表現型感受性のパターンを決定した。野生型コントロールＲＴＶと比較して、ＲＴＶ−３０９−３／１８４Ｍは、デラビルジン （４倍）， エファビレンツ （５倍） および ネビラピン （９倍）感受性の中等度の減少を示した。ＲＴＶ−３０９−３／１８４Ｍは、デラビルジン （〜５０％）， エファビレンツ （〜６０％） および ネビラピン （〜８０％）の存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激を示した。
【０１６１】
本発明は、更に非ヌクレオシドＨＩＶ−１逆転写酵素阻害剤耐性突然変異体の分離および同定するための新規ベクター、宿主細胞および組成物、並びに抗ウイルス薬スクリーニングを実行するためのかかるベクター、宿主細胞および組成物の使用に関する。また本発明は、前記突然変異体を阻害／刺激する能力における候補薬のスクリーニングに関する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：　耐性試験ベクター。
ＨＩＶ−１ゲノム（上部パネル）並びに耐性試験ベクター（下部パネル、患者由来の切片およびインジケータ遺伝子ウイルスベクターを含んでいる）の概略図。
【図２】
図２：　２細胞アッセイの概略図。
耐性試験ベクターは、インジケータ遺伝子ウイルスベクターに患者由来の切片（ＰＤＳ）をクローニングすることにより作出される。欠陥のあるＰＲおよびＲＴ配列を用いて、ルシフェラーゼ活性が機能的なＰＲおよびＲＴに依存することが示された。両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）のマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープ蛋白質または感染を可能にする他のウイルスもしくは細胞蛋白質を産生する発現ベクターと、前記耐性試験ベクターとを共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）した。患者由来の切片（ＰＤＳ）によりコードされるプロテアーゼ（ＰＲ）および逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子産物を含む偽型ウイルス粒子（Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）が産生される。次に前記粒子は収穫され、新たな細胞を感染するために使用される。薬の不存在下および広範な濃度範囲にわたる薬の存在下で前記アッセイを実行する。トランスフェクション後にプロテアーゼＰＲ阻害剤を細胞に添加する、従って該阻害剤は粒子成熟の間に存在している。対照的に、ＲＴ阻害剤はウイルス粒子感染時（もしくはその前に）に細胞に添加する。試験した異なる薬濃度において、ルシフェラーゼ量が決定され、またパーセンテージ（％）阻害が計算される。
【図３】
図３：　表現型薬感受性プロファイルの例。
ｌｏｇ１０薬濃度に対してルシフェラーゼ活性のパーセント阻害をプロットすることによりデータを分析した。このプロットを、５０％（ＩＣ５０）まで、および９５％（ＩＣ９５）までウイルス複製を阻害するのに必要な薬濃度を計算するために使用した。より高い薬濃度における阻害カーブのシフトは、減少した薬感受性（「薬剤耐性」）の証拠であると解釈される。ＮＮＲＴＩ　デラビルジン （ＤＬＶ）， ネビラピン （ＮＶＰ） およびエファビレンツ （ＥＦＶ）に対する３つの典型的なカーブが示される。薬感受性〔または「増大した耐性（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」〕の減少は、より高い薬濃度（右の方向）の薬感受性において、基準値（前治療）サンプルと比較し、または薬感受性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３ もしくは ＨＸＢ−２など）と比較した場合にシフトとして表示される。
【図４】
図４：　ウイルス複製の薬物依存性刺激を示す表現型薬感受性プロファイルの例。
ｌｏｇ１０薬濃度に対してルシフェラーゼ活性のパーセント阻害をプロットすることによりデータを分析した。このプロットを、５０％（ＩＣ５０）まで、および９５％（ＩＣ９５）までウイルス複製を阻害するのに必要な薬濃度を計算するために使用した。これらのグラフにおいて、ウイルス複製の刺激はゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害として表示される。ＮＮＲＴＩ　デラビルジン （ＤＬＶ）， ネビラピン （ＮＶＰ） およびエファビレンツ （ＥＦＶ）存在下のウイルス複製の薬物依存性刺激を示す３つの典型的なカーブが示される。患者由来の、または部位特異的突然変異体の耐性試験ベクターから得られた結果が、薬感受性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３ もしくは ＨＸＢ−２など）から得られた結果と比較される。
【図５】
図５：　ＨＩＶ　ＲＴ　コドン　ポジション２３０での突然変異を含む患者ウイルスの表（実施例３、４および５で記載）。
【図６】
図６：　３つの部位特異的突然変異体 （Ｋ２３０Ｌと組み合わせたＫ１０３Ｎ， Ｍ２３０Ｌ， および Ｋ１０３Ｎ） の減少した感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激（実施例４に記載）。
各々の部位特異的突然変異体の結果がお互いに比較され、同様に薬感受性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３， もしくは ＨＸＢ−２など）から得られた結果と比較された。これらのグラフにおいて、ウイルス複製の刺激はゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害として表示される。
【図７】
図７：　３つの部位特異的突然変異体（Ｋ２３０Ｌと組み合わせたＹ１８１Ｃ， Ｍ２３０Ｌ， および Ｙ１８１Ｃ） の減少した感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激（実施例３に記載）。
各々のＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピン）に対する各々の部位特異的突然変異体の結果がお互い比較され、同様に薬感受性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３， もしくは ＨＸＢ−２など）から得られた結果と比較された。これらのグラフにおいて、ウイルス複製の刺激はゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害として表示される。
【図８】
図８：　患者１１０７３におけるＨＩＶ ＲＴ コドン　ポジション２４１ および ２７７の復帰突然変異誘発（実施例６に記載）。
図の最上部パネルは患者サンプル（Ｖ２４１Ｓ突然変異を保持する）のグラフを示す。これらのグラフにおいて、ウイルス複製の刺激は、３つ全てのＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピン）に対してゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害として表示される。最下部パネルは、２４１Ｖ突然変異の部位特異的復帰の結果を示す。これらのグラフにおいて、３つのＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、またはネビラピン）のうちの何れにおいてもネガティブ阻害（ウイルス複製の刺激）はもはや認められなかった。
【図９】
図９：　患者０１４４５１の治療経過中の３２週を隔てた２つの時点での感受性カーブ（実施例７に記載）。
図の最上部パネルは、患者サンプル０１４４５９（０週）の感受性カーブを示す。最下部パネルは、患者サンプル０１４４５１（３２週）の感受性カーブを示し、３つ全てのＮＮＲＴＩ存在下の減少した感受性、同様にウイルス複製の薬物依存性刺激の双方を示し、この結果はコドン１０１，１０６， および １９０でのＨＩＶ　ＲＴ突然変異の出現と一致するものである。
【図１０】
図１０：　ＨＩＶ　ＲＴコドン　ポジション２４５での突然変異を含む患者ウイルスの表（実施例８， ９，１０ および １１に記載）。
【図１１】
図１１：　患者０１０８２９におけるＨＩＶ　ＲＴコドン　ポジション２４５，２７０，２７７，２９２，２９３， および ２９７の復帰突然変異誘発（実施例１１に記載）。
各々の突然変異体の結果が、薬感受性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３， もしくは ＨＸＢ−２など）から得られた結果と比較された。図の最上部パネルは、患者サンプル（コドン　ポジション２４５，２７０， ２７７，２９２，２９３， および ２９７での突然変異を保持する）のグラフを示す。これらのグラフにおいて、ウイルス複製の刺激は、３つ全てのＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピン）に対してゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害として表示される。第二のパネルは、コドン２４５での突然変異の部位特異的復帰（コドン２７０での突然変異の復帰が続く）を示す。双方の単一部位復帰突然変異体（ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ）は、ＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピン）の何れかの存在下でウイルス複製の薬物依存性刺激（ネガティブ阻害）と一致するプロファイルを保持している。最下部パネルは、コドン２４５，２７０，２７７， ２９２，２９３， および ２９７でのＨＩＶ−ＲＴ突然変異の復帰を示す。グラフの本最終パネルにおいて、ＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、もしくはネビラピン）の何れにおいてもネガティブ阻害（ウイルス複製の刺激）はもはや認められないが、この部位特異的突然変異体は減少した薬感受性（薬剤耐性）を保持している。
【図１２】
図１２：　ＨＩＶ ＲＴ 突然変異 Ｋ１０３Ｎ， １３５Ｔ， および Ｖ２４５Ｔを含む部位特異的突然変異体群における、減少した感受性およびウイルス複製の薬物依存性刺激（実施例１３に記載）。
各突然変異体の結果は、薬感受性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３， もしくは ＨＸＢ−２など）から得られた結果と比較された。各ＨＩＶ　ＲＴコドン　ポジション単独における突然変異は、薬物依存性刺激を生じなかったが、３重突然変異体は３つ全てのＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、もしくはネビラピン）に対して薬物依存性刺激を示した。これらのグラフにおいて、ウイルス複製の刺激はゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害として示される。
【図１３】
図１３：　患者１３５２２におけるＨＩＶ　ＲＴ　コドン　ポジション２７０の復帰突然変異誘発（実施例１２に記載）。
各突然変異体の結果は、薬感受性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３， もしくは ＨＸＢ−２など）から得られた結果と比較された。図の最上部パネルは、患者サンプル（ Ｉ２７０Ｓ突然変異を含む）のグラフを示す。これらのグラフにおいて、ウイルス複製の刺激は、３つ全てのＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピン）に対するゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害として示される。グラフの第二パネルは、コドン２７０での突然変異の部位特異的復帰を示す。
３つのＮＮＲＴＩ（デラビルジン、エファビレンツ、もしくはネビラピン）の何れかに対するネガティブ阻害（ウイルス複製の刺激）をもはや呈していないにもかかわらず、部位特異的突然変異体は３つ全てのＮＮＲＴＩｓに対する減少した薬感受性（薬剤耐性）を保持している。
【図１４】
図１４：　患者１０３３の１２ウイルスサンプルの臨床経過の表（実施例１４に記載）。データは、薬投薬計画、薬投薬計画の持続期間、ウイルス負荷、薬感応性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３， もしくは ＨＸＢ−２など）に対する感受性値の表現型フォールド変化（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）、およびウイルス産生の薬物依存性刺激を提示しているサンプルに対するパーセントネガティブ阻害、を含む。
【図１５】
図１５：　患者１０３３からの１２ウイルスサンプルのＨＩＶ−ＲＴアミノ酸突然変異の表（実施例１４に記載）。
【図１６】
図１６：　部位特異的突然変異誘発により決定される１０３３−３ウイルスの特定突然変異の効果（実施例１４において、議論される）。
各突然変異体の結果は、薬感受性ウイルスコントロール（ＰＮＬ４−３， もしくは ＨＸＢ−２など）から得られた結果と比較された。これらのグラフにおいて、ウイルス複製の刺激は、ゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害として示される。
【図１７】
図１７：　刺激表現型（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）におけるＭ１８４Ｖ突然変異の効果（部位特異的突然変異誘発により決定される、実施例１４に記載）。ＨＩＶ ＲＴ コドン１８４での突然変異の復帰は、ゼロ未満（即ち、ネガティブ阻害）のパーセント阻害で示されるウイルス複製の薬物依存性刺激の増大レベルを生じる。
【図１８】
図１８：　患者０１４４５１、ＮＮＲＴＩに対する減少した感受性　コドン１０１， コドン １０６ およびコドン１９０での突然変異と関連したウイルス複製の薬物依存性刺激（実施例７）。
【図１９】
図１９：　ウイルス複製の薬物依存性刺激におけるＭ１８４Ｖ突然変異の効果： ＲＴＶ−３０９。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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