(57)【要約】本発明はインターフェロン・ベータ２（「ＩＦＮ−β２」）をコードする新奇な核酸およびポリペプチド配列に関する。医薬的に許容可能な賦形剤および治療的に有効な量のヒトＩＦＮ−β２ポリペプチド、その生物学的に活性な断片、またはその生物学的に活性な誘導体を含む医薬組成物は、ヒトにおける多発性硬化症を治療することにおいて有用である。
2004505021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容可能な賦形剤および治療的に有効な量の図２に表されるヒトＩＦＮ−β２ポリペプチド、その生物学的に活性な断片、またはその生物学的に活性な誘導体を含む、哺乳類における多発性硬化症を治療することにおいて有用な医薬組成物。
【請求項２】
前記哺乳類がヒトである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬的に許容可能な賦形剤および治療的に有効な量の図２に表されるヒトＩＦＮ−β２ポリペプチド、その生物学的に活性な断片、またはその生物学的に活性な誘導体を含む、哺乳類における多発性硬化症において有用な医薬組成物を、それを必要とする哺乳類に投与する方法。
【請求項４】
前記哺乳類がヒトである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
医薬的に許容可能な賦形剤および治療的に有効な量のヒトＩＦＮ−β２ポリペプチド、その生物学的に活性な断片、またはその生物学的に活性な誘導体を含む、哺乳類における多発性硬化症を治療することにおいて有用な医薬組成物。
【請求項６】
医薬的に許容可能な賦形剤および治療的に有効な量のヒトＩＦＮ−β２ポリペプチド、その生物学的に活性な断片、またはその生物学的に活性な誘導体を含む、哺乳類における多発性硬化症において有用な医薬組成物を、それを必要とする哺乳類に投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
インターフェロンは、例えば、細胞増殖および免疫反応を含む種々の生物学的過程において重要な役割を果たす細胞間情報伝達タンパク質である。
【０００２】
本発明の説明
例えば、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、および免疫調節作用を含む無数の生物学的影響を及ぼす細胞間情報伝達ポリペプチドの部類である。インターフェロン・ベータ２（「ＩＦＮ−β２」）をコードする、新規な核酸、ポリペプチド配列、およびそれらの核酸調製物が同定されている。例えば、Ｃｉｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｔｙｒｉｎｇ，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３，２７〜８７，　１９９５を参照すること。本発明のインターフェロン・ポリペプチド、それらの断片、およびそれらの誘導体は、ＩＦＮ−β２生物活性、およびＩＦＮ−β２特定免疫原活性に限定されないがそれらを含む１以上の以下の活性を有する。
【０００３】
「ＩＦＮ−β２生物活性」は、例えば、細胞膜の変質、抗癌遺伝子調整、抗腫瘍活性、抗ウイルス活性、細胞増殖阻害または抗増殖活性、抗増殖性、リンパ球細胞毒性の増強、免疫調節活性、標的細胞分化の誘発または阻害、マクロファージ活性化、癌遺伝子の刺激に対する反応の抑制、などの機能的効果；抗体形成の減少、細胞膜成分（主要組織適合複合体、Ｆｃ受容体、β２−ミクログロブリン）の増大、細胞性免疫反応の調整、サイトカイン（例えば、インターロイキン）産生の増大、細胞傷害性Ｔ細胞効果の増大、マクロファージ効果の増大、およびナチュラルキリングの増大などの免疫学的効果；インターフェロン１型受容体、特にそのＩＦＮＡＲ２ｃ鎖への結合などのインターフェロン受容体結合活性、およびこうした受容体結合により刺激される細胞の効果；Ｊａｋ１、Ｔｙｋ２、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＣｒｋＬ、ＣｒｋＩＩ、Ｖａｖ、および他の下流エフェクター（例えば、ＭＡＰＫ）などの細胞間情報伝達分子による活性化および／または結合を意味する。例えば、Ｐｌａｔａｎｉａｓ ａｎｄ Ｆｉｓｈ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２７：１５８３〜１５９２，１９９９を参照すること。
【０００４】
用語「抗増殖性活性」とは、本発明によるＩＦＮ−β２が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘発することを意味する。これは以下の実施例において説明される。また、図８、９、および１５を参照すること。例えば、ＩＦＮ−β２は脳中の星状細胞の増殖を阻害する。この活性は、例えば、多発性硬化症を治療することにおいて有用である。なぜなら、星状細胞増殖が疾患の特徴である神経炎症を引き起こすからである。星状細胞の増殖を阻害することにより、ＩＦＮ−β２は炎症を減少させ、疾患を改善する。従って、本発明は、星状細胞の増殖を阻害し、および／または炎症を減少させるのに効果的であるＩＦＮ−β２の量を投与することを含む、多発性硬化症を治療する方法に関する。
【０００５】
「ＩＦＮ−β２−特定免疫原活性」は、例えば、ＩＦＮ−β２ ポリペプチドがＩＦＮ−β２に選択的または優先的である免疫反応、例えば、哺乳類のＩＦＮ−β２に選択的である免疫反応を導き出すことを意味する。従って、哺乳類のＩＦＮ−β２、例えば、図２中のＩＦＮ−β２から選択されるアミノ酸配列による、抗体、Ｔ−細胞、マクロファージ、Ｂ−細胞、樹状細胞などの刺激は、特定の免疫原活性である。これらの反応は日常的に測定することができる。
【０００６】
ＩＦＮ−β２は、天然源から入手可能であり、１以上の前述の生物活性を持つアミノ酸配列を有する完全な長さの哺乳類のポリペプチドである。それは、開始コドンで始まり終止コドンで終わる読取り枠を有する図２に示すような配列を有することができる。それは、自然発生正常の、自然発生突然変異体の、および単一ヌクレオチド多形態（ＳＮＰ）などを含む自然発生多形性の配列を包含する。天然源には、例えば、組織または全器官から得られるような生細胞、初代および不死化細胞株を含む培養細胞株、生検を行った組織、などが挙げられる。
【０００７】
本発明は、また、哺乳類ＩＦＮ−β２の断片に関する。断片は、好ましくは、「生物学的に活性」である。「生物学的に活性」とは、ポリペプチド断片が、生物系において、または生物系の成分により活性を保持することを意味する。生物学的活性には、前述の、例えば、ＩＦＮ−β２−生物活性およびＩＦＮ−β２−特定免疫原活性が挙げられる。断片は、化学合成、遺伝子工学、分解産物、などを含むあらゆる望ましい方法により調製することができる。ＩＦＮ−β２の生物学的に活性な断片は、タンパク質のカルボキシ−またはアミノ−末端のいずれかで除去または修正されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０００８】
好ましくは、図１２および１３における核酸およびそれらの断片は除外される。好ましくは、図１４におけるポリペプチドおよびそれらの断片は除外される。しかし、これらの配列を含有するかまたは含んでなるポリペプチド、例えば、完全な長さのＩＦＮ−β２、２以上のこれら前述の断片を有するポリペプチド、または前述の断片の一つとＩＦＮ−β２または別の源のいずれかからの追加アミノ酸配列を有するポリペプチドは除外されない。
【０００９】
本発明は、また、図２に示されるような推論されたアミノ酸配列１〜２０８を有するＩＦＮ−β２に関する。その計算された分子量は約２３，０００ダルトンであり、予測された等電点は８．１である。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される約２６，０００ダルトンの分子量を有する酸安定タンパク質である。大腸菌中に産生される非グリコシル化形態では約２０，５００ダルトンの分子量を有する。以下の実施例を参照すること。
【００１０】
図２に示されるように、それは、アミノ酸−１〜−２１からの予定シグナル配列、アミノ酸７４〜７７および８３〜８６での二つの潜在性Ｎ−グリコシル化部位、および３２、１４２および１５４でのシステイン残基を有する。ジスルフィド結合はシステイン残基３２および１４２の間に形成されると予測される。それは、アミノ酸位置７〜２４での螺旋Ａ、５５〜６９での螺旋Ｂ、８３〜９５での螺旋Ｃ、１１８〜１３４での螺旋Ｄ、および１４３〜１５８での螺旋Ｅを含む。
【００１１】
成熟ＩＦＮ−β２は図２に示されるようにアミノ酸−１〜−２１を欠いているＩＦＮ−β２を指し、１８７長のアミノ酸である。それは、また、他の公知のインターフェロン型に比べた場合Ｃ−末端での独特の１８アミノ酸延長部を有する。こうした延長部はヌクレオチドおよびアミノ酸両方のレベルでＩＦＮ−β２に対する標識として用いることができる。
【００１２】
例えば、図２に示されるようなアミノ酸配列を有する本発明のＩＦＮ−β２ポリペプチドは、膜に広がる領域、疎水性領域を含む、ポリペプチドにおける他の構造的および／または機能的領域を識別するためのあらゆる適する方法により分析することができる。例えば、ＩＦＮ−β２ポリペプチドは、例えば、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　１５７：１０５，１９８２；ＥＭＢＬ ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｄｉｃｔ；ＲｏｓｔａｎｄＳａｎｄｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１９：　５５〜７２，１９９４中に開示されている方法により分析することができる。
【００１３】
本発明のＩＦＮ−β２の他の同族体は、種々の方法により哺乳類および非哺乳類源から得ることができる。例えば、オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成（例えば、コード領域を増幅するためのプライマー−５’−ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ−３’　および５’−ＣＴＡ ＣＣＴ ＣＧＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＡＡＡ ＣＴＣ ＴＧＴ−３’）がある。大腸菌中の発現に用いられるプライマー−５’−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＡＣＴ ＡＣＣ ＴＣＧ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＡＡ−３’　および５’−ＧＣＧ ＣＧＣ ＧＣＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＡＧＡ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＡＴ−３’がある。５’および３’未翻訳のゲノム配列を含む完全長の公知である配列用プライマー−５’−ＴＴＴ ＡＧＧ ＴＧＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＡ ＡＴ−３’　および５’−ＴＡＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＴＡＧ ＡＡＴ ＡＴＡ ＴＡＡ−３’−は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，１９８９に記載されているように、同族体を選択するために用いることができる。
【００１４】
こうした同族体はＩＦＮ−β２に対して独自および類似の種々の量のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する。哺乳類生物には、例えば、ネズミ、マウス、ラット、ハムスター、モンキー、サル、豚、牛、馬、犬、猫などが挙げられる。非哺乳類生物には、例えば、脊椎動物、無脊椎動物、ゼブラ・フィッシュ、ニワトリ、ショウジョウバエ、シー・エレガンス、ゼノプス、分裂酵母、出芽酵母などの酵母、回虫、原核生物、植物、シロイヌナズナ、甲殻類、アルテミア、ウイルス、などが挙げられる。ハイブリッド形成用のオリゴヌクレオチドを選択するために、効果的な方法を用いることができる。
【００１５】
例えば、ＩＦＮ−β２特定領域は、本発明のＩＦＮ−β２を他のＩＦＮ−β２型と比較して、前者においてのみ現れる（すなわち、非保存の、またはＩＦＮ−β２に「特定の」）アミノ酸配列を選択することにより識別することができる。例えば、各種のインターフェロン型の間に保存されたおよび非保存の領域を示す図４を参照すること。非保存アミノ酸配列は選択することができ（例えば、ＫＳＬＳＰ）、縮重プローブはこうした配列に基づき設計することができる。また、Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６：３６５８〜３６６３，１９９９を参照すること。他の特定の（すなわち、非保存の）および／または保存されたアミノ酸配列は、例えば、コンピュータ・プログラムのブラスト（ＢＬＡＳＴ）セットを用いる遺伝子／タンパク質データベースを検索することにより、日常的に見出すことができる。
【００１６】
本発明は、また、ＩＦＮ−β２特定アミノ酸配列、例えば、他のインターフェロン型ではなく図２および４の特定配列中に見出される確定されたアミノ酸配列に関する。好ましいポリペプチドは、少なくとも約８個の連続アミノ酸、例えば、約９，１０，１２，１５，２０，２１，２２，２５，３０， ４０，５０などである。こうしたポリペプチドは、例えば、ＫＨＦＦＧＴＶ， ＩＩＦＱＱＲＱＶ，ＫＳＬＳＰ，ＦＲＡＮＩ，ＡＥＫＬＳＧＴ，ＣＬＦＦＶＦＳおよびＱＧＲＰＬＮＤＭＫＱＥＬＴＴＥＦＲＳＰＲおよびそれらの断片を含むことができる。ＩＦＮ−β２特異的アミノ酸配列またはモチーフは、抗原としてペプチドを産生するために有用であって、それに対して特定の免疫反応を生み出すことができる。こうした免疫化により得られる抗体は、発現標識とすることも含めて、診断または研究用の哺乳類ＩＦＮ−β２タンパク質に対する特定のプローブとして用いることができる。
【００１７】
前述のように、本発明のポリペプチドはＩＦＮ−β２用の種々のアミノ酸配列を含むことができる（例えば完全長配列、すなわち、図１に示されるような開始および終止コドンを有するもの、成熟アミノ酸配列、すなわち、そこではＩＦＮ−β２ポリペプチドが成熟ポリペプチドまたはその断片となるように処理される前駆体として産生される）。有用な断片には、例えば、前述の領域および図２および４に示されるような特定のまたは保存アミノ酸配列のあらゆるものを含むか、または本質的にそれらから成る断片が挙げられる。
【００１８】
本発明のＩＦＮ−β２ポリペプチドの断片は、特定の生物活性、例えば、抗ウイルス性、免疫調節性、抗増殖性、などを有するように選択することができる。以下を参照すること。これらのペプチドは、また、ＥＰ第４９６１６２号に記載されているように識別し調製することができる。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、また、図２に記されるアミノ酸配列に対して１００％以下のアミノ酸配列同一性を有することができる。以下の検討の目的のために、配列同一性は、図１および２に記される配列中に見出されるものと同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が比較配列（複数を含む）中の対応位置において見出されることを意味する。図１および２に記されるアミノ酸配列に対して１００％未満の配列同一性を有するポリペプチドは、相同および非相同アミノ酸置換体を含む自然発生配列からの種々の置換体を含有することができる。
【００２０】
例えば、相同アミノ酸置換体については以下を参照すること。同一および相同の残基の合計をＩＦＮ−β２ポリペプチドと比較される全体配列中の残基の総数で割ったものは配列類似％に等しい。配列同一性および類似性を計算するために、比較配列は、例えば、ファスタ（ＦＡＳＴＡ）、ブラスタ（ＢＬＡＳＴＡ）を含むあらゆる望ましい方法、アルゴリズム、コンピュータ・プログラム、などにより並べられ計算することができる。
【００２１】
図２のアミノ酸配列に対して１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドは、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、８５％、８０％、７５％、７０％、または約５３％までの低さの配列同一性を有することができる。
本発明は、また、ＩＦＮ−β２のポリペプチド・ムテイン、すなわち、天然源から得られるアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するあらゆるポリペプチドに関する（哺乳類ＩＦＮ−β２の断片は、アミノ酸数においては異なるが、アミノ酸配列においては天然ＩＦＮ−β２と異なることはない）。従って、ＩＦＮ−β２のポリペプチド・ムテインは、非天然アミノ酸を包含する、アミノ酸置換体、挿入体、および欠失体を含む。
【００２２】
本発明のＩＦＮ−β２アミノ酸配列に対するムテインは、また、遺伝子データバンク、例えば、ゲンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）、ＥＭＢＬから検索した相同性に基づき調製することができる。配列相同性検索は、コンピュータ・プログラムのブラスト（Ｂｌａｓｔ）系、スミス・ウオーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム、などに記載されているアルゴリズムを含む種々の方法を用いて達成することができる。ムテイン（複数を含む）は、ポリペプチド間で同一および／または相同であるアミノ酸を領域内に識別し並べ、次に、こうした配置に基づくアミノ酸を修飾することにより、配列中に導入することができる。
【００２３】
例えば、本発明のＩＦＮ−β２は、図４に示されるような種々の公知のインターフェロンとの配列同一性を共有する。保存アミノ酸残基におけるこれらポリペプチド間の配置は、それらの修飾が受容体結合活性などのＩＦＮ−β２の生物活性を減少させ、低減させるか、または排除すると期待されるであろう残基を識別することができる。例えば、配置が２以上の領域間に保存される同一のアミノ酸を示す場合、アミノ酸（複数を含む）の排除または置換はその生物活性に逆作用を及ぼすと期待されるであろう。
【００２４】
アミノ酸置換は、また、一つの相同アミノ酸を別のものに置き換えることによって行うことができる。相同アミノ酸は以下を含む側鎖のサイズおよび分極化の程度に基づき定義することができる：小さくて非極性：システイン、プロリン、アラニン、トレオニン；小さくて極性：セリン、グリシン、アスパラギン酸塩、アスパラギン；大きくて極性：グルタミン酸塩、グルタミン、リジン、アルギニン；中間極性：チロシン、ヒスチジン、トリプトファン；大きくて非極性：フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン。相同酸は、また、以下のように分類することができる：荷電なしの極性Ｒ基、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；酸性アミノ酸（負荷電）、アスパラギン酸およびグルタミン酸；塩基性アミノ酸（正荷電）、リジン、アルギニン、ヒスチジン。相同アミノ酸には、また、Ｄａｙｈｏｆｆ ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５，１９７８およびＡｒｇｏｓ ｉｎ ＥＭＢＯ Ｊ．，８，７７９〜７８５，１９８９により記載されているものが含まれる。
【００２５】
活性に全く影響を及ぼさないか、または野生型に比較してＩＦＮ−β２の活性を減少させるかまたは増大させるムテインを調製することができる。突然変異は、繊維芽細胞インターフェロン（ベータ−１）およびアルファ−インターフェロンなどの他のＩＦＮ−β２ｓに類似して作製することができる。例えば、ＩＦＮ−β２は、インターフェロンに一般的である特徴的な５個の螺旋束：アミノ酸位置７〜２４での螺旋束Ａ、５５〜６９での螺旋束Ｂ、８３〜９５での螺旋束Ｃ、１１８〜１３４での螺旋束Ｄ、および１４３〜１５８での螺旋束Ｅに折り畳まれる。これらの螺旋束はランダムコイルまたはループ領域により一緒に繋がれる。図３を参照すること。螺旋構造への突然変異は、ＩＦＮ−β１（繊維芽細胞）に類似して、例えば、Ｒｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：２５３８〜２５５１，２０００に記載されているように作製することができる。例えば、Ａ螺旋束の部分、ＡＢループ、およびＥ螺旋束は受容体結合に組み込まれる。また、Ｐｉｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｓｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２９４：２２３〜２３７，１９９９を参照すること。
【００２６】
本発明のＩＦＮ−β２は、繊維芽細胞インターフェロンのように、アミノ酸位置３２、１４２、および１５４において３個のシステイン残基を有する。位置３２および１４２でのシステイン残基は、繊維芽細胞インターフェロン中にジスルフィド結合を形成することが知られるシステイン残基に、配置的に類似している。繊維芽細胞インターフェロンと同様に、位置１５４でのアミノ酸は削除されるか、または、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、トレオニン、またはメチオニンなどの中性アミノ酸により置換することができる。
【００２７】
セリンおよびトレオニンはシステインに対するそれらの化学的類似性のせいで好ましい。不対システインの除去は不適当な分子内および分子間ジスルフィド結合の形成を防止することができる。例えば、米国特許第４，５８８，５８５号を参照すること。突然変異も、また、米国特許第４，９１４，０３３号および第５，５８０，７２３号に従って作製することができる。また、例えば、Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，　１２：２５７〜６６，１９９２； Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．， ９： ９７〜１１４，　１９８９；ＤｉＭａｒｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，１３：１３９，１９９３；Ｍｉｔｕｉ ｅｔ ａｌ．，　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．，５８：９３〜１３２，１９９３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：７０５〜７１５，１９９４を参照すること。
【００２８】
本発明はこうしたムテインポリペプチドをコードするムテイン核酸に関する。従って、本発明は図１のヌクレオチド配列に関係し、そこにおいて前記核酸はポリペプチドをコードし、１以上のアミノ酸位置は置換されるかまたは削除されるかまたは両方であって、且つ、核酸によりコードされるポリペプチドは組み換え的に発現される場合の細菌体からの強化された回収性、または強化された生物活性などの生物学的活性を有する。ポリペプチド・ムテインおよびその対応ヌクレオチドコード配列は、１以上の位置が相同アミノ酸により置換される場合、例えば、１、５、１０、１５、または２０での置換がある場合を除いて、図２に記されるようなアミノ酸配列を有することができる。いかに修飾が前述の活性に影響を及ぼすかは、上記、下記の方法により、および当業者が知っているであろうように測定することができる。
【００２９】
ＩＦＮ−β２活性を検定する種々の方法は公知である。例えば、有用なアッセイには、ＣＰＥ（例えば、米国特許第５，５４５，７２３号および米国特許第４，９１４，０３３号；以下の実施例）などの抗ウイルスアッセイ；受容体結合（米国特許第５，５４５，７２３号および以下の実施例）；ＳＴＡＴ活性化（例えば、以下の実施例）；ＩＦＮ−β２反応遺伝子の活性化（例えば、インターフェロン刺激反応要素（ＩＳＲＥ）は、以下の実施例に示されるように、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子に作動可能なように結合される）；Ｉ型受容体のリン酸化反応（以下の実施例）；抗増殖性（米国特許第４，９１４，０３３号、細胞株の複製を阻害するためのＩＦＮ−β２の評価能力；以下の実施例）；免疫調整（米国特許第４，９１４，０３３号、抗体依存型細胞毒性）；Ｎｏｒｏｎｈａ ｅｔ ａｌ．，　Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，４６：１４５〜１５４，１９９３、Ｔ−リンパ球の阻害およびそれらのＩＦＮ−ガンマ（「ＩＦＮ−γ」）の産生；実験的アレルギー性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）（例えば、Ｌｏｕｂｏｕｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃａｎｄ．， ８８：　９７〜９９，１９９３；Ｒｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１７４５〜１７５１，１９９３；以下の実施例）が挙げられる。
【００３０】
本発明の哺乳類ＩＦＮ−β２、断片、またはそれらの置換ポリペプチドは、また、種々の修飾を含むことができ、こうした修飾には脂質修飾、メチル化、リン酸化反応、グリコシル化、共有結合修飾（例えば、アミノ酸Ｒ基の）、アミノ酸置換、アミノ酸削除、またはアミノ酸添加が挙げられる。ポリペプチドへの修飾は、組み換え、合成、化学、など種々の方法により達成することができる。
【００３１】
本発明のポリペプチド（例えば、完全長、それらの断片、それらの突然変異）は、種々のやり方、例えば、以下に記載されるような抗体に対するイムノゲンとして、生物学的に活性な薬剤として（例えば、本発明のＩＦＮ−β２と関係する１以上の活性を有する）アッセイで用いることができる。
【００３２】
本発明のＩＦＮ−β２をコードするポリペプチド、その誘導体、またはその断片は、自然に起こらない、すなわち、自然的に発生しない配列において、１以上の構造領域、機能領域、検出可能領域、抗原領域、および／または所定の必要ポリペプチドと組合せることができる。こうした特性を含むポリペプチドは、キメラまたは融合ポリペプチドである。こうしたキメラポリペプチドは、化学、合成、擬似合成、および／または組み換え法を含む種々の方法により調製することができる。キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸は、例えば、イントロン、スプライス部位、エンハンサー、などを含有する、連続（例えば、活性を安定化させるかまたは強化するために多Ｎ−末端領域により）または分断化された読取り枠中に、種々の領域または必要ポリペプチドを含有することができる。
【００３３】
キメラ核酸は種々の方法により作製することができる。例えば、米国特許第５，４３９，８１９号を参照すること。領域または所期のポリペプチドは、信号化、増殖促進、細胞標的などの生物学的機能（例えば、小胞体または核に対する標的化などの、信号配列、標的配列）、疎水性、親水性、膜横断性などの構造的機能、受容体−リガンド機能、および／または例えば、酵素、蛍光ポリペプチド、グリーン蛍光タンパク質（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：８０２，１９９４；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：６０６，１９９６；Ｌａｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４：６１０，１９９６）などと組合せられた検出可能機能を含むあらゆる望ましい特性を保持することができる。領域は、また、例えば、免疫グロブリン重鎖、軽鎖、および／またはＦｃ領域、またはエピトープタグ配列のような安定性などを強化するための免疫グロブリンであることが可能である。
【００３４】
加えて、ポリペプチドまたはその一部は、宿主細胞中に導入される場合に選択可能な標識として用いることができる。例えば、本発明によるアミノ酸配列をコードする核酸は、枠中において、所期のコード配列に融合し、精製、選択、または標識目標のためのタグとして作用することができる。融合領域は切断部位をコードして発現、単離、精製、などを容易にすることができる。
【００３５】
本発明のＩＦＮ−β２ポリペプチドまたはその断片は、また、インターフェロンなどの他のサイトカインと組合せてキメラまたはハイブリッドＩＦＮ−β２を作製することができる。こうしたハイブリッドＩＦＮ−β２は、アルファ、オメガ、ガンマ、イプシロン、トロホブラスト、胎児性、などを含むあらゆる種類のインターフェロン間であり得る。ハイブリッド（および上記検討のムテイン）は、それらが作製された元のハイブリッドに比べて、減少したまたは限定された活性、例えば、細胞増殖調整活性、抗ウイルス活性、または免疫調節活性に限定されたものとして作製することができる。例えば、繊維芽細胞インターフェロンの大体のアミノ酸４７〜１８７、７４〜１８７、１〜７３、などを用いる繊維芽細胞とアルファ・インターフェロン間のハイブリッドについては、例えば、米国特許第４，７５８，４２８号を参照すること。
【００３６】
本発明によるポリペプチドは、本発明による発現系、例えば、生体内、生体外、無細胞、組み換え型、細胞融合系、などにおいて生産することができる。こうした系により与えられるポリペプチドの修飾には、グリコシル化、アミノ酸置換（例えば、コドン使用頻度を区別することによる）、蒸解、切断、エンドペプチダーゼまたはエクソペプチダーゼ活性、脂質およびリン酸塩などを含む化学成分の結合などのポリペプチド加工が挙げられる。
【００３７】
本発明によるポリペプチドは、天然源、通常の方法、例えば、洗剤抽出（例えば、非イオン性洗剤、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、イガペル（Ｉｇａｐｅｌ）ＣＡ−６３０）、相抽出、ｎ−ブタノール抽出、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、セファデックス、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、レクチン・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、アフィニティー・クロマトグラフィー、ＳＤＳ・ＰＡＧＥ、管理多孔性ガラス・クロマトグラフィー（ＣＰＧ）、抗体アフィニティー・クロマトグラフィー、ゲル濾過、ブルー・セファローゼ、フェニル−アガロース・クロマトグラフィー、
【００３８】
ＣＰＧおよび亜鉛−キレート・クロマトグラフィー（例えば、Ｈｅｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｌｌｉａｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７８（Ｐａｒｔ Ａ）：４４８〜４５６，１９８１）、シバクロン・ブルー・Ｆ３ＧＡ−アガロースおよびＨＰＬＣ（Ｋｅｎｎｙ　ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７８（Ｐａｒｔ Ａ）：４３５〜４４７，　１９８１）を含む、他のインターフェロンおよび他の組み換えタンパク質に適用される方法による形質転換された宿主細胞（培養基または細胞）から回収することができる。Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １１９：３９７〜４０３，１９８６；Ｄｅｍｂｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６：１７５〜１８６，１９８６；Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７８（Ｐａｒｔ Ａ）：４３３０〜４３５，１９８１；Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：７２７〜７７，１９８７も参照すること。タンパク質畳み直しステップは、成熟タンパク質の構造を完成させることにおいて、必須として用いることができる。
【００３９】
本発明は、また、本発明のＩＦＮ−β２ポリペプチド、およびそれらの断片をコードするＤＮＡｓおよびＲＮＡｓなどの核酸に関する。ＩＦＮ−β２核酸またはその断片は、天然源から得ることができるヌクレオチド配列を有する核酸である。従って、それは天然正常の、天然突然変異の、および天然多形性の対立遺伝子（例えば、ＳＮＰｓ）、などを含む。天然源には、例えば、組織および全器官から得られる生細胞、腫瘍、初代および不死細胞株を含む培養細胞株が挙げられる。
【００４０】
本発明の核酸配列は、図１に示されるような完全なコード配列、その縮退配列、およびそれらの断片を含有することができる。本発明による核酸は、また、前記および下記のあらゆるヌクレオチド配列に対して１００％相補的であるヌクレオチド配列、例えば、アンチセンスを含むことができる。
【００４１】
核酸、すなわち、本発明によるヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのポリマーは、多様な各種の供給源から得ることができる。それは、例えば、組織、細胞、または全器官から単離される、ＤＮＡまたはポリアデニル酸ｍＲＮＡなどのＲＮＡから得ることができる。核酸は直接ＤＮＡまたはＲＮＡから、またはｃ ＤＮＡライブラリから得ることができる。核酸は、望ましい遺伝子型、表現型などを有する、特定の開発段階での細胞または組織（例えば、胎児または成人の心臓細胞または組織）から得ることができる。
【００４２】
上述のＩＦＮ−β２ポリペプチドに対して記載したように、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、コード配列のみ；コード配列および追加のコード配列（例えば、リーダー、分泌、標的、酵素、蛍光または他の診断用ペプチド）、コード配列および非コード配列、例えば、５’または３’いずれかの末端での未翻訳配列、またはコード配列中に分散された配列例えばイントロンを含むことができる。
【００４３】
妨害なしにポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ヌクレオチド配列がコード配列を妨害するかまたは干渉する非コードヌクレオチドを全く持たない、例えば、イントロン（複数を含む）不在のＩＦＮ−β２用のアミノ酸コード配列を含有することを意味する。また、こうしたヌクレオチド配列は、連続したものとして説明することができる。ヒト、マウス、または他の哺乳類インターフェロン、などをコードするゲノムＤＮＡは、日常的に得ることができる。
【００４４】
本発明による核酸は、また、上述の核酸に作動可能なように結合される発現制御配列を含むことができる。用語「発現制御配列」は、それが作動可能なように結合される核酸によりコードされるポリペプチドの発現を調節する核酸配列を意味する。発現はｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで調節することができる。従って、発現制御配列にはｍＲＮＡ関連要素およびタンパク質関連要素が含まれる。こうした要素には、プロモーター、エンハンサー（ウイルス性または細胞性）、リボソーム結合配列、転写ターミネータ、などが挙げられる。
【００４５】
発現制御配列は、発現制御配列がコード配列の発現をもたらすかまたは達成するような方式に位置づけられる場合に、ヌクレオチドコード配列に作動可能なように結合される。例えば、プロモーターが５’をコード配列に作動可能なように結合する場合、コード配列の発現はプロモーターにより推進される。発現制御配列は正常遺伝子に対して異種または内生的であることができる。
【００４６】
本発明による核酸は、核酸ハイブリッド形成に基づき選択することができる。二つの一本鎖核酸調製品が一緒にハイブリッドを形成する能力は、それらのヌクレオチド配列相補性、例えば、Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、などのヌクレオチド間の塩基対合性の指標である。従って、本発明は、また、図１に記されているヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリッド化する核酸およびそれらの補体に関する。後者の配列にハイブリッド形成するヌクレオチド配列は、相補的な核酸ストランドを有するか、またはポリメラーゼ（すなわち、適切な核酸合成酵素）の存在下で複製用の鋳型として機能する。本発明は核酸の両方のストランド、例えば、センス・ストランドおよびアンチセンス・ストランドを含む。
【００４７】
ハイブリッド形成条件は、図１に記されているヌクレオチド配列と相補しあう望ましい量のヌクレオチドを有する核酸を選択するために選択することができる。こうした配列にハイブリッド形成することができる核酸は、好ましくは、例えば、配列間の約８５％、さらに好ましくは９０％、９２％、なおさらに好ましくは９５％、９７％または１００％の相補性を保持する。本発明は、特に、低度または高度の厳しさの条件下で、図１に記されているヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸配列に関する。
【００４８】
ＩＦＮ−β２配列にハイブリッド形成する核酸は種々の方法で選択することができる。例えば、ブロット（すなわち、核酸を含有するマトリクス）、チップ・アレー、および対象の核酸を含む他のマトリクスは、３０℃で一夜にわたり、ハイブリッド形成前の溶液（６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５Ｘデンハルト溶液、および５０％ホルムアミド）中でインキュベートし、次に、４２℃で一夜にわたり公知の手順に従って、ハイブリッド形成溶液（例えば、６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５０％ホルムアミド）中で検出可能オリゴヌクレオチド・プローブとハイブリッド形成することができる（以下を参照すること）。
【００４９】
ブロットは、例えば、５％未満のｂｐ不適正塩基対を許容する、すなわち、９５％以上の配列同一性を有する配列を選択する高ストリンジェント条件で洗浄する（例えば、６５℃で３０分間にわたり０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄する）ことができる。他の高ストリンジェント条件における非限定例には、６５℃で３０ｍモルＮａＣｌおよび０．５％ＳＤＳを含有する水性緩衝液中での最終洗浄が含まれる。別の高ストリンジェント条件の例には、５０℃で一夜にわたる７％ＳＤＳ、０．５ＭＮａＰＯ４、ｐＨ７、１ｍモルＥＤＴＡ中でのハイブリッド形成と、後の４２℃での１％ＳＤＳ溶液による１回以上の洗浄がある。
【００５０】
高ストリンジェント洗浄が５％未満不適正塩基対を許容することができる一方で、緩和されたまたは低ストリンジェント洗浄条件（例えば、３７℃で３０分間にわたり０．２ＸＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で２回洗浄する）は、２０％以下の不適正塩基対を許容することができる。別の低ストリンジェント条件の非限定例には、４２℃での３０ｍモルＮａＣｌおよび０．５％ＳＤＳを含有する緩衝剤中における最終洗浄が含まれる。洗浄およびハイブリッド形成は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，　１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒ ９に記載されているように実施することができる。
【００５１】
ハイブリッド形成は、また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記載されているように、プローブとその標的間に形成されるハイブリッドの融点（Ｔｍ）の計算に基づくことができる。一般に、短いオリゴヌクレオチド（１８以下のヌクレオチドを含有する）がその標的配列から融解する温度Ｔｍは、以下の式により与えられる：Ｔｍ＝（Ａ’ｓおよびＴ’ｓの数）Ｘ２℃＋（Ｃ’ｓおよびＧ’ｓの数）Ｘ４℃。より長い分子に対しては、Ｔｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０．４１（％ＧＣ）−６００／Ｎであり、式中、［Ｎａ＋］はナトリウム・イオンモル濃度であり、％ＧＣはプローブ中のＧＣ塩基対の％であり、Ｎは長さである。ハイブリッド形成はこの温度より数度下で行われ、プローブおよび標的がハイブリッドを形成し得ることを確実にすることができる。不適正塩基対は温度をなおさらに下げることにより許容することができる。
【００５２】
ストリンジェント条件は、プローブ（例えば、ＩＦＮ−β２のオリゴヌクレオチド）と標的核酸間の、例えば、少なくとも約９５％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド相補性を有する配列およびそれらの相補体を単離するために選択することができる。
【００５３】
本発明により、核酸またはポリペプチドは、図１および２に記されているヌクレオチドまたはアミノ酸配列における１以上の相違を包含することができる。ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列に対する変更または修飾は、指定されたまたはランダムな突然変異誘発を含むあらゆる利用可能な方法により達成することができる。
【００５４】
本発明によるヒトＩＦＮ−β２などの哺乳類ＩＦＮ−β２をコードする核酸は、自然発生遺伝子、例えば自然発生多形、正常または突然変異の対立遺伝子（ヌクレオチドまたはアミノ酸）、ヒト、モンキー、豚、マウス、ラット、またはウサギなどの哺乳類の自然な母集団に発見される突然変異体中に生じるヌクレオチドを含むことができる。用語「自然発生」とは、核酸が天然源、例えば、動物組織および細胞、体液、組織培養細胞、法医学試料から入手可能であることを意味する。
【００５５】
自然発生突然変異は、欠失（例えば、切断されたアミノ−またはカルボキシ−末端）、置換、反転、またはヌクレオチド配列の添加を含むことができる。これらの遺伝子は、当業者が知っているであろう方法による核酸ハイブリッド形成により検出し単離することができる。本発明の哺乳類ＩＦＮ−β２をコードするヌクレオチド配列は、例えば図１に記されているような、例えば、自然発生遺伝子、転写体、またはｃＤＮＡ中に見出されるコドンを含有することができる。例えば、望ましい宿主における発現用に、配列を最適化するために配列中のコドンを変更することは、望ましいことであり得る。
【００５６】
本発明による核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成核酸、ペプチド核酸、変性ヌクレオチド、または混合物を含むことができる。ＤＮＡは二本鎖または単一鎖であることができる。核酸を含むヌクレオチドは、所期の目的、例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈなどのヌクレアーゼに対する抵抗性、改善された生体内安定性、などに応じて、種々の公知の連鎖、例えば、エステル、スルファミン酸塩、スルファミド、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホン酸メチル、カルバメート、などを介して結合することができる。例えば、米国特許第５，３７８，８２５号を参照すること。
【００５７】
検出可能な標識（アビジン、ビオチン、放射性元素）、ハイブリッド形成、検出、または安定性を改善する部分を取り付けることなどの、核酸に対する種々の修飾はなすことができる。核酸は、また、望ましい方法により、固形物支持体、例えば、ニトロセルロース、磁性または常磁性ミクロスフェア（例えば米国特許第５，４１１，８６３号；米国特許第５，５４３，２８９号に記載されているように、例えば、強磁性、超磁性、常磁性、超常磁性の酸化鉄および多糖類を含む）、ナイロン、アガロース、ジアゾ化セルロース、ラテックス固形ミクロスフェア、ポリアクリルアミド、などに付着することができる。例えば、米国特許第５，４７０，９６７号；第５，４７６，９２５号；第５，４７８，８９３号を参照すること。
【００５８】
本発明の別の態様はオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブに関する。こうしたオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブは、例えば、試験試料中の哺乳類ＩＦＮ−β２核酸を検出し、計量し、または単離するために、またはＩＦＮ−β２同族体を識別するために用いることができる。好ましい実施形態において、核酸は、例えば、ＰＣＲ、差動表示（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）、ＤＮＡチップ（例えば、アフィメトリックス・ジーン・チップス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐｓ）；米国特許第５，１４３，８５４号、米国特許第５，４２４，１８６号；米国特許第５，８７４，２１９号；ＰＣＴ ＷＯ９２／１００９２；ＰＣＴ ＷＯ９０／１５０７０を参照すること）、および他の利用可能な方法において、オリゴヌクレオチド・プローブとして用いることができる。検出は、研究、診断、および法医学を含む多様な各種目的のために望ましくあり得る。
【００５９】
診断目的のために、試料が組織、細胞、体液、などから得られる場合、試料中の核酸配列の存在または量を識別することは望ましいことであり得る。好ましい方法において、本発明は、標的とオリゴヌクレオチド間のハイブリッド形成を達成するために効果的な条件下で試験試料中の標的核酸をオリゴヌクレオチドと接触させてハイブリッド形成を検出することを含む、核酸を検出する方法に関する。本発明によるオリゴヌクレオチドは、また、ＰＣＲ（例えば、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：５３，１９８８；米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０を参照すること）；差動表示（例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１： ３２６９ 〜 ３２７５， １９９３；米国特許第５，５９９，６７２号；ＷＯ９７／１８４５４を参照すること）；リニアＰＣＲ；または他の増幅方法などの合成核酸増幅において用いることができる。
【００６０】
検出は、他の遺伝子、例えば、情報伝達、増殖、癌、アポトーシスにかかわる遺伝子、または上記または下記のあらゆる遺伝子、など用のオリゴヌクレオチドと併用して達成することができる。オリゴヌクレオチドは、また、例えば、米国特許第５，６８３，８７７号；米国特許第５，６５６，４３０号；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：８７７９〜８７８３， １９９２に記載されているような不適正塩基対ＤＮＡ修復技術を用いて突然変異を試験するために使用することができる。
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、上述のような図１で表されるあらゆる連続ヌクレオチド配列またはそれへの補体、または配列のいかなる部分、またはそれらへの補体を含むことができる。本発明によるこれらのオリゴヌクレオチド（核酸）は、あらゆる望ましいサイズ、例えば、約１０〜２００ヌクレオチド、１２〜１００、１２〜５０、１２〜２５、１４〜１６、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、などであることができる。
【００６２】
オリゴヌクレオチドは非自然発生ヌクレオチド、例えば、イノシン、ＡＺＴ、３ＴＣ、などを有することができる。オリゴヌクレオチドは図１で表される配列に対する１００％の同一性または相補性を有することができるか、または、それは不適正塩基対またはヌクレオチド置換、例えば、１、２、３、４または５置換を有することができる。本発明により、オリゴヌクレオチドはキットを含むことができ、該キットは望ましい緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、など）、検出組成物、などを含む。オリゴヌクレオチドは、技術上知られる放射性または非放射性ラベルにより表示されるかまたは表示されないことが可能である。
【００６３】
本発明の別の態様は哺乳類ＩＦＮ−β２に対してユニークなヌクレオチド配列である。ＩＦＮ−β２に対して独特な配列とは、ＩＦＮ−β２例えば図１で表されるヌクレオチド配列において生じるが、しかし、他の核酸において特に動物の核酸においてはめったにまたはまれにしか発生せず、好ましくはヒト、ラット、マウスなどの哺乳類において生じるヌクレオチドの確定順序のことを意味する。独特なヌクレオチド配列には、アミノ酸ＫＨＦＦＧＴＶ、ＩＩＦＱＱＲＱＶ、ＫＳＬＳＰ、ＦＲＡＮＩ、ＡＥＫＬＳＧＴ、ＣＬＦＦＶＦＳ、およびＱＧＲＰＬＮＤＭＫＱＥＬＴＴＥＦＲＳＰＲ、および図１で表されるようなそれらの断片をコードする配列、またはそれらへの相補体が含まれる。
【００６４】
こうした配列は、本明細書において記載されるかまたは参考資料として包含されるあらゆる方法においてプローブとして用いることができる。センスおよびアンチセンス両方のヌクレオチド配列が包含される。本発明による独特の核酸は日常的に測定することができる。こうした独特の配列を含む核酸は、ノーザンブロットでの核酸の混合物を含む試料における例えばヒトまたはマウスＩＦＮ−β２の存在を識別するためのハイブリッド形成プローブとして用いることができる。
【００６５】
ハイブリッド形成はプローブに対して少なくとも９５％の同一性（すなわち、相補性）を有する核酸（およびコード配列を含有することができるそれらの補体）を選択するために高度の厳しい条件（上述を参照すること）下で行うことができるが、しかし厳しくない条件も用いることができる。独特のＩＦＮ−β２ヌクレオチド配列は、また、その５’または３’末端いずれかで、ＩＦＮ−β２の他部分、酵素、ＧＦＰ、などをコードする配列、発現制御配列、などを含む本特許を通して記載している種々のヌクレオチド配列に、枠中において融合することができる。
【００６６】
すでに検討したように、ハイブリッド形成は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８９に記載されているように、所期の選択性に応じて異なる条件下で行うことができる。例えば、本発明のＩＦＮ−β２を具体的に検出するために、オリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドが標的に対して１００％相補的である場合のようにオリゴヌクレオチドのみがそれにハイブリッド形成する条件下で標的核酸に対してハイブリッド形成することができる。１００％未満のヌクレオチド相補性、少なくとも約、例えば、９９％、９７％、９５％、９０％、８６．４％、８５％、７０％、６７％を有する標的核酸を選択することが必要な場合には、各種の条件を用いることができる。
【００６７】
アンチセンス核酸も本発明による核酸から調製することができ、好ましくは図１で表される配列に対するアンチセンスである。アンチセンス核酸は、ＩＦＮ−β２の発現を調節するかまたは調整する、例えばそれを阻害するためか、その発現を検出するためか、またはハイブリッド形成法用などの種々の方法において用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドは米国特許第５，５７６，２０８号と同じように用いることができる。ＩＦＮ−β２発現の調節または調整の目的のために、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは作動可能なように発現制御配列に結合することができる。
【００６８】
ＩＦＮ−β２の抑制のために、オリゴヌクレオチドはｃＤＮＡに沿って対応するセンス位置に設計することができる。例えば、Ｊ．Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＣｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ．， Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３６（１４）：１９２３〜１９３７，１９９３；Ｈｅｌｅｎｅ ａｎｄ Ｔｏｕｌｍｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，１０４９：９９〜１２５，１９９０；Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９８７；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．，Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｊｕｌ． １９９８を参照すること。
【００６９】
こうしたオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，０４０，２９６号または前述の参考資料中に開示されている種々の化学結合を用いて、耐ヌクレアーゼ性であることができる。細胞摂取を容易にするためにカチオン性リポソームによる細胞培養において約３５ｂｐの全体長を用いることができるが、しかし、生体内使用のためには、好ましくはより短いオリゴヌクレオチド、例えば、２５ヌクレオチドが投与される。
【００７０】
本発明による核酸はあらゆる望ましい方法により標識を貼ることができる。核酸は、いくつかの一般に用いられるトレーサーを列挙すると、 ３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３Ｈ、または１４Ｃなどの放射性トレーサーを用いて標識することができる。放射性標識化は、例えば、放射性標識化ヌクレオチド、ポリヌクレオチド・キナーゼ（ホスファターゼによる脱ホスホリル化によるか、またはよらない）またはリガーゼ（標識をしようとする端部に応じて）を用いる３’または５’端部での末端標識化などのあらゆる方法により行うことができる。非放射性標識化も、本発明の核酸を、免疫学的特性（抗原、ハプテン）、ある種の試薬（リガンド）に対する特定の親和性、検出可能な酵素反応が完結することを可能とする特性（酵素または共酵素、酵素基質、または酵素反応に組み込まれる他の物質）、あるいは蛍光または所期の波長での光の放射または吸収、などの特徴的な物理特性を有する残基と組み合わせて用いることができる。
【００７１】
オリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸、などを含む本発明による核酸は、ノーザンブロット、ＰＣＲ、ハイブリッド形成法、差動ディスプレイ、核酸アレー（例えば、「遺伝子チップ」）、ドットブロット、などを含む種々の技術により、全器官、組織、細胞、などにおけるＩＦＮ−β２の発現を検出するために用いることができる。こうした核酸は、乱れた発現、例えば、ＩＦＮ−β２の細胞特定のおよび／または亜細胞の変質を検出するために特に有用である。ＩＦＮ−β２のレベルは、単独で、または他の遺伝子産物、特にサイトカイン生産に組み込まれる他の遺伝子産物と組み合わされて測定することができる。
【００７２】
本発明による核酸は、所期の目的に沿って生体外および生体内の多様な各種システムにおいて発現することができる。例えば、核酸は、発現ベクター中に挿入し、所期の宿主中に導入し、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を達成するために有効な条件下で培養することができる。有効な条件には、有効な温度、ｐＨ、媒体、宿主細胞が培養される培地への添加剤（例えば、酪酸塩またはコード核酸がｄｈｆｒ遺伝子に隣接している場合メトトレキサートなどの発現を増幅するかまたは誘発する添加物）、シクロヘキシミド、細胞密度、培養皿、などを含む、宿主細胞によるポリペプチドの産生を達成するために適するあらゆる培養条件が含まれる。
【００７３】
核酸は、例えば、裸のＤＮＡ、リン酸カルシウム沈降、電気穿孔、注射、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポソームによる融合、細胞中へのその摂取を強化する薬剤との結合、ウイルス性トランスフェクションを含むあらゆる有効な方法により細胞中に導入することができる。本発明の核酸が中に導入される細胞は形質転換された宿主細胞である。核酸は染色体外であるかまたは宿主細胞の染色体（複数を含む）中に組み込むことができる。それは安定であるかまたは過渡的であることができる。
【００７４】
発現ベクターはその宿主細胞との適合性で選択される。宿主細胞には、哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＶ１、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＬＴＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、ＰＡＥ、ヒト、ヒト繊維芽細胞、ヒト原発腫瘍細胞、精巣、グリア、神経、希突起膠細胞、星状細胞、神経芽細胞腫、神経膠腫、など、Ｓｆ９（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｄａ）およびショウジョウバエなどの昆虫細胞、大腸菌などの細菌、連鎖球菌、バシラス菌、サッカロマイスなどの酵母菌、Ｓ．セレビジー、真菌性細胞、植物細胞、胚幹細胞（例えば、マウスまたはヒトなどの哺乳類）、神経幹細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心臓細胞、およびＴ−細胞が挙げられる。
【００７５】
発現制御配列は、同様に、宿主適合性および所期の目的、例えば、高複製数、高度の量、誘発、増幅、制御された発現で選択される。用いることができる他の配列には、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶからなどのエンハンサー、誘発性プロモーター、細胞型特定成分、または選択的または特定の細胞発現を可能とする配列が挙げられる。その発現を推進するために用いることができるプロモーターには、例えば、内生プロモーター、細胞情報伝達通路における他遺伝子のプロモーター、細菌宿主用のＭＭＴＶ、ＳＶ４０、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、またはＴ７プロモーター；または酵母用のアルファ因子、アルコール酸化酵素、またはＰＧＨプロモーターが挙げられる。ＲＮＡプロモーターはＴ７またはＳＰ６などのＲＮＡ転写物を作製するために用いることができる。例えば、Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．，１２（１８）：７０３５〜７０５６，１９８４；Ｄｕｎｎ ａｎｄ Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：４７７〜４３５，１９８４；米国特許第５，８９１，６３６号；Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８５：６０〜８９，１９８７を参照すること。
【００７６】
本発明の核酸またはポリペプチドは、核酸またはタンパク質電気泳動法、クロマトグラフィー、などにおけるサイズ・マーカーとして用いることができる。確定制限酵素断片は、制限酵素認識部位に対する配列を走査し、サイズを計算し、対応制限酵素の蒸解を行うことにより決定される。
【００７７】
本発明のＩＦＮ−β２ポリペプチドおよび核酸は、「単離する」ことができる。用語「単離する」とは、それがその元の環境において見出されるのではなく、本質的に、例えば、異種のＩＦＮ−β２遺伝子が中で発現される細胞の溶解物中に存在する成分から分離されて、より濃縮され、より精製された形態において存在することを意味する。
ＩＦＮ−β２が核酸導入細胞株において異種の核酸として発現される場合、本発明による核酸は、核酸が中で発現される条件下で上述のように細胞中に導入される。用語「異種の」とは、核酸が「人間の手」によって細胞株中に導入されたことを意味する。細胞株中への核酸の導入は上記で検討される。ＩＦＮ−β２核酸を発現する核酸を導入した（または形質転換された）細胞は、実施例で記載されるように溶解し溶解物としての方法で（すなわち、「単離されて」）用いることができるか、または細胞株はそのままで用いることができる。
【００７８】
一般に、用語「有効な条件」は、例えば、所期の効果が中で達成される環境を意味する。こうした環境には、例えば、緩衝剤、酸化剤、還元剤、ｐＨ、共同因子、温度、イオン濃度、細胞が用いられる場での細胞の適する年齢および／または段階（細胞周期の特定部分におけるか、または特定遺伝子が発現される特定の段階におけるような）、培養条件（基質、酸素、二酸化炭素、など）が挙げられる。
【００７９】
本発明は、また、本発明のＩＦＮ−β２を発現する細胞と、該核酸の発現を配列特定的に阻害するのに有効であるＩＦＮ−β２のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＲＮＡなどの作用物質量とを接触させることを含む、本発明のＩＦＮ−β２をコードする核酸の発現を調整、好ましくは阻害する方法に関する。
【００８０】
核酸の配列特異的阻害は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡなどのアンチセンス核酸を用いて通常に達成することができる。例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート・デオキシオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−β２ＲＮＡの特定領域まで、例えば翻訳開始部位まで設計することができ、次に、それらの発現を阻害するために有効な量でこうした遺伝子を発現する細胞に投与することができる。一般に、アンチセンス核酸は、所定の核酸のセンスまたはコードストランドに相補的である核酸であり、結果として、核酸のｍＲＮＡの転写物に対しても相補的であり、従って、それらと特定的にハイブリッドを形成することができる。好ましいアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の５’領域、特に開始コドンを含有する領域を含む。
【００８１】
安定性を強化するために、投与された核酸は、例えば、それを細胞性酵素、酸化、還元、ヌクレアーゼ、などに対して抵抗性を高めるか、またはその細胞中への摂取を増強するために修飾することができる。例えば、アクリジン挿入剤および／または疎水性尾部に結合されるホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、ホスホジエステル・オリゴヌクレオチド、ソラレン誘導体、２’−リボース修飾、ペントース糖誘導体、窒素系誘導体、などを含むあらゆる適する修飾を用いることができる。本発明において有用であり得るアンチセンス・オリゴヌクレオチド、修飾、などに関しては、例えば、米国特許第５，５７６，２０８号、第５，７４４，３６２号、第６，０４０，２９６号、および第６，０４６，３１９号を参照すること。一般に、本発明のアンチセンス核酸は、自然発生ヌクレオチド、非自然発生ヌクレオチド、および細胞の摂取および／または安定性を強化するためのそれらの組合せのモノマーを含むことができる。
【００８２】
アンチセンスは、裸の核酸として、細胞中へのその摂取を容易にする他の作用物質と共におよびこの作用物質により複合化されるかまたはカプセル化されて、細胞中に注入されるか、またはあらゆる適する送達手段により投与することができる。
【００８３】
本発明は、また、ＩＦＮ−β２生物活性が望まれるあらゆる疾病、異常、疾患、などを治療するために、ヒトＩＦＮ−β２などの本発明によるＩＦＮ−β２を用いる方法に関する。こうした方法は、１以上の以下の目的の治療を必要としている対象に本発明のＩＦＮ−β２の有効量を投与することを含む：抗癌遺伝子調整、抗腫瘍活性、抗ウイルス活性、細胞増殖阻害または抗増殖活性、抗増殖性（例えば、星状細胞増殖を阻害するために有効であるＩＦＮ−β２の量）、リンパ球の細胞毒性の強化、免疫調整活性、標的細胞分化の誘発または阻害、マクロファージ活性、癌遺伝子の反応抑制、など；抗体形成の減少、細胞膜成分の増大（主要組織適合遺伝子複合体、Ｆｃ受容体、β２−ミクログロブリン）、細胞性免疫反応の調整、サイトカイン（例えば、インターロイキン）生産の増大、細胞傷害性Ｔ細胞効果の増大、マクロファージ効果の増大、およびナチュラルキリングの増大などの免疫学的効果。ＩＦＮ−β２は、例えば、癌、自己免疫疾患、およびウイルス感染を治療するために投与することができる。例えば、本発明のＩＦＮ−β２により治療することができる種々の疾患に関してはＣｉｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｔｙｒｉｎｇ，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｂｏｔｈｅｒ．３：２７〜８７，１９９５を参照すること；特にアルファ−およびベータ−インターフェロンの使用を参照すること。
【００８４】
ＩＦＮ−β２はポリペプチドとして投与することができるか、または、それは例えば遺伝子治療における核酸として投与することができる。核酸として投与される場合、それは、発現を達成するために有効であるあらゆる形態において、例えば、リポソームまたは他の担体物質、超微粒気泡、などの中に混入された裸のＤＮＡとして、ベクター（ウイルスベクターなど、例えばアデノウイルス）として提供することができる。核酸の投与、それらの対象の中での発現、などに関するさらなる情報については上記を参照すること。
【００８５】
あらゆる癌は本発明により治療することができる：例えば、頸部上皮内癌および子宮頸癌（投与量、投与経路、処方計画などについては、例えば、ＤｅＰａｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ．，６：５２３〜５２７，１９８４を参照すること）、黒色腫および転移性黒色腫（投与量、投与経路、処方計画などについては、例えば、Ｂｅｉｔｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｕｔａｒｚｔ，４４： ３６３〜３７１，１９９４を参照すること）、ヘアリー細胞白血病、カポジ肉腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、腎細胞癌、カルチノイド腫瘍、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（他の癌に関しては、また、Ｄｏｒｒ，Ｄｒｕｇｓ，４５（２）：１７７〜２１１，１９９３を参照すること）。
【００８６】
自己免疫疾患も本発明により治療することができる：例えば、多発性硬化症（投与量、投与経路、処方計画などについては、例えば、Ｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５１：６８２〜６８９，１９９８を参照すること）、リウマチ様関節炎、など。多発性硬化症（「ＭＳ」）は、脱髄、軸索破壊および次のグリオーシスに至る血管周囲および室周囲の炎症を病理学的な特徴とする自己免疫疾患である。慢性的なＭＳの障害の顕著な特徴は、局部的な星状細胞の肥大と異常増殖の結果として形成される脱髄グリオーシス硬化巣（プラーク）である。これらの星状細胞硬化巣は正常な軸索伝導を妨害し、再髄鞘形成への物理的な障壁を現出する。従って、星状細胞増加を阻害する因子は、特に疾患の後段階において有益な治療的意味合いを持っている。従って、星状細胞を阻害するＩＦＮ−β２の能力はＭＳを治療するために特に有用である。
【００８７】
ウイルス性疾患および感染も本発明により治療することができる：例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（投与量、投与経路、処方計画などについては、例えば、Ｐｕｌｉｇｈｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，９：　１６１〜１６２，１９８８；Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｖｉｘ，６：２０３〜２１２，１９８８を参照すること）、尖圭コンジーム（投与量、投与経路、処方計画などについては、Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１：１０３８〜１０４２，１９８４を参照すること）、肝炎Ｂ、ＣおよびＤ、ＨＩＶ、など。
【００８８】
用語「投与する」とは、ＩＦＮ−β２、または他の活性剤が、標的、例えば、腫瘍、免疫系、脳損傷（例えば、多発性硬化症または他の脳炎症疾病に観察される部位）、などに送達されることを意味する。ＩＦＮ−β２は、上述のような効果を達成するために適する有効な経路により、培養中の細胞および治療しようとする損傷、疾病、または疾患を有する宿主を含むあらゆる標的（例えば、生体内、生体外、または現場での）に投与することができる：例えば、ＩＦＮ−β２調合物は直接標的部位にまたは近辺に注入することにより投与することができる。それは、また、例えば治療しようとする標的部位の位置に応じて、局所、腸溶性、非経口、静脈内、筋内、皮下、経口、鼻経由、大脳内、心室内、などによって投与することができる。ＩＦＮ−β２は細胞による摂取用の核酸としても投与することができる。核酸を投与するための方法には、上述の方法および他の従来型最新技術が含まれる。
【００８９】
ＩＦＮ−β２の有効量が標的に投与される。有効量は、所期の効果、好ましくは有益なまたは治療的効果を達成するために有用であるような量、例えば、星状細胞増殖を阻害するために有効な量である。こうした量は、例えば、変動用量を標的細胞に投与して所期の目的、例えば、免疫調整効果を生み出す抗ウイルス効果を作り出すことを達成することにおいて有効な量を測定する用量・反応実験を実施することにより、日常的に測定することができる。
【００９０】
量は、ＩＦＮ−β２が投与される環境（例えば、多発性硬化症、動物モデル、組織培養細胞、などを持つ患者）、治療しようとする細胞の部位、年齢、健康、性、および治療しようとする患者または動物の体重、などを含む種々の因子に基づき選択することができる。有用な量には、例えば、隔日に皮下に投与される１．６ＭＩＵ（国際基準ゲージによるミリオン国際単位）〜８ＭＩＵが含まれる。用語「治療する」とは、疾病、疾患、異常、などの改善をもたらすあらゆる効果を意味する。
【００９１】
ＩＦＮ−β２の有効量は、他の有効作用物質、例えば、癌、ウイルス、ＭＳ、肝炎、およびＩＦＮ−β２により治療できるあらゆる他の疾病を治療するための有効作用物質と共に投与することができる。こうした作用物質は細胞傷害性、抗ウイルス剤、化学療法剤、などであることができる。
【００９２】
本発明は、また、本発明のＩＦＮ−β２を特定的に認識する抗体に関する。ＩＦＮ−β２に特定の抗体とは、抗体がＩＦＮ−β２、例えば、図２に表される配列内の、またはこの配列を含むアミノ酸の確定配列を認識することを意味する。従って、特定の抗体は、一般に、より高い親和性により、例えば免疫ブロットまたは他の従来型免疫アッセイにより検出されるかおよび／または測定されるような異なるエピトープ（複数を含む）よりも、図２に見出されるアミノ酸配列、すなわちエピトープに結合する。
【００９３】
従って、ヒトＩＦＮ−β２のエピトープに特定的である抗体は、例えば、エピトープが欠けている試料からそれを識別するヒトＩＦＮ−β２遺伝子産物を含有する組織の試料などの試料中のエピトープの存在を検出するために有用である。有用な抗体は、ＩＦＮ−β２の独特なＣ−末端、例えば、ＱＧＲＰＬＮＤＭＫＱＥＬＴＴ　ＥＦＲＳＰＲ、またはその断片に対するものである。こうした抗体はサンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇに記載されている通りに有用であり、その通りに調合することができる。
【００９４】
抗体、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、組み換え、キメラ、ヒト化抗体は、あらゆる望ましい方法により調製することができる。組み換え免疫グロブリンライブラリー・スクリーニング（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：３８３３〜３８３７，１９８９；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２７５〜１２８１，１９８９）；リンパ球母集団の生体外刺激；Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３〜２９９，１９９１も参照すること。
【００９５】
例えば、モノクローナル抗体の生産のために、図２によるポリペプチドは、免疫反応を引き出すために有効な量において、補助剤ありまたはなしでマウス、ヤギ、またはラビットに皮下および／または腹膜内に投与することができる。抗体は、また、一本鎖またはＦａｂ断片であることができる。抗体はＩｇＭ、ＩｇＧ、亜類型、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、などであることができる。抗体および免疫反応は、また、裸のＤＮＡを投与することにより生成することができる。例えば、米国特許第５，７０３，０５５号；第５，５８９，４６６号；第５，５８０，８５９号を参照すること。
【００９６】
抗体の誘発における使用のためのインターフェロンまたはその断片は、生物活性を有することを必要としないが、しかし、それらは単独かまたは担体と組合せるかのいずれかで免疫活性を有しなければならない。ＩＦＮ−β２−特異的抗体の誘発における使用のためのペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ配列を有することが可能である。短い長さのアミノ酸、例えば５個のアミノ酸は、キーホールリンペットヘモシアニンなどの別なタンパク質または別の有用な担体のアミノ酸、および抗体生産のために用いられるキメラ分子と融合することができる。
【００９７】
抗体作製に有用なＩＦＮ−β２の領域は経験的に選択することができるか、または、例えば、ｃＤＮＡから推論されるようなＩＦＮ−β２のアミノ酸配列は、分析されて高免疫原性の領域を決定することができる。適切なエピトープを選択するための分析は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．２．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）により記載されている。
【００９８】
特定のＩＦＮ−β２抗体は、病気前の状態、およびＩＦＮ−β２の量または分布の違いを特徴とする慢性および急性の疾患の診断に有用である。ＩＦＮ−β２に対する診断試験には、ヒト（または、マウスなどを用いる場合マウスなど）体液、組織またはこうした組織の抽出物を検出するために抗体および標識を用いる方法が含まれる。抗体は中和抗体であり、ＩＦＮ−β２活性用のアッセイにおいて、例えばインターフェロン活性を中和するための対照として用いることができる。
【００９９】
本発明のポリペプチドおよび抗体は修飾ありまたはなしで用いることができる。多くの場合、ポリペプチドおよび抗体は、共有結合かまたは非共有結合かのいずれかでそれらを検出できる信号を提供する物質により結合することで標識化される。各種の標識および接合技術が知られており、科学および特許文献の両方で広く報告されてきている。適する標識には、放射性核種、酵素、基質、共同因子、阻害剤、蛍光剤、化学発光剤、および磁性粒子などが挙げられる。こうした標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【０１００】
ＩＦＮ−β２を結合する抗体および他のリガンドは、例えば、ウエスターンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、ＲＩＡ、などにおいて、動物、組織、細胞、などにおけるインターフェロン・ポリペプチドのレベルを定量化するため、それの細胞局在化および／または分布を識別するため、それをまたはそれの一部を含むポリペプチドを精製するため、それの機能を調整するために、治療、診断、および商業用研究の道具として用いることを含む種々の方法において用いることができる。本発明はこうしたアッセイ、組成物およびそれらを実施するためのキット、などに関する。本発明による抗体は、これらおよび他の方法を用いて、組織、細胞、体液、血液、尿、脳脊髄液を含む種々の試料中のＩＦＮ−β２ポリペプチドまたはその断片を検出するために用いることができる。
【０１０１】
加えて、本発明によるＩＦＮ−β２ポリペプチドまたはその誘導体に結合するリガンドは、また、例えば、合成ペプチドライブラリーまたはアプタマー（例えば、Ｐｉｔｒｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，１４３，８５４号；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０２：２５９〜２７４，１９８７；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６，１９９０；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１１０４，　１９９０；Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５を参照すること）を用いて、調製することができる。
【０１０２】
本発明は、また、例えば、米国特許第５，４３４，０５０号に開示されているような望ましい方法により調製されるＩＦＮ−β２ポリペプチドに関する。標識化ポリペプチドは、例えば、細胞中、生体外、生体内、または現場系などでのＩＦＮ−β２の動きを追跡するためにＩＦＮ−β２に結合または付着する物質を識別することなどのように、結合アッセイにおいて用いることができる。
【０１０３】
核酸、ポリペプチド、抗体、ＩＦＮ−β２、などは単離することができる。「単離する」とは、材料がその元の環境または天然において見出されない形態、例えば、成分などから分離されてさらに濃縮され、さらに精製された形態にあることを意味する。単離された核酸には、例えば完全な遺伝子、転写体、またはｃＤＮＡとして生動物中に見出される染色体ＤＮＡから分離されたＩＦＮ−β２配列を有する、例えば核酸が含まれる。
【０１０４】
この核酸はベクターの部分であるかまたは染色体中に挿入できる（特定遺伝子標的化によるかまたはその正常位置以外の位置でのランダムな取り組みによる）と共に、なおその自然の環境中に見出される形態にあるのではない形に単離することができる。本発明の核酸またはポリペプチドは、また、実質的に精製することができる。実質的に精製されるとは、核酸またはポリペプチドが分離され、他の核酸またはポリペプチドから本質的にフリーであること、すなわち、核酸またはポリペプチドが主要な活性成分であることを意味する。
【０１０５】
本発明は、また、ＩＦＮ−β２を含む形質転換動物、例えばマウスなどの非ヒト哺乳類に関する。形質転換動物は、例えば、組み換え遺伝子の１細胞胚の前核中への前核注入により人工酵母染色体を胚幹細胞中に組み込むこと、遺伝子ターゲッティング法、胚幹細胞法を含む公知の方法により調製することができる。例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；第４，８７３，１９１号；第４，８７３，３１６号；第５，０８２，７７９号；第５，３０４，４８９号；第５，１７４，９８６号；第５，１７５，３８４号；第５，１７５，３８５号；第５，２２１，７７８号；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７：７３８０〜７３８４，１９８０；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：３４３〜３４５，１９８５；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：４６５〜４９９，１９８６；Ａｓｋｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，１３：４１１５〜４１２４，１９９３；Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：５２３〜５２７，　１９９５；Ｖａｌａｎｃｉｕｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：１４０２〜１４０８，　１９９１；Ｓｔａｃｅｙ ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：１００９〜１０１６，１９９４；Ｈａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：２４３〜２４６，１９９５；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，　２１：２６１３〜２６１７，１９９３を参照すること。
【０１０６】
本発明による核酸は、マウス（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６）、豚（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３４３〜３４５，１９８５）ヒツジ（Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３４３〜３４５，１９８５）、牛、ラット、または霊長類を含むあらゆる非ヒト哺乳類中に導入することができる。例えば、Ｃｈｕｒｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５：１３〜１９，１９８７；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，　Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５：２０〜２４，１９８７；ａｎｄ ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６６２〜６８０，１９８８も参照すること。
【０１０７】
加えて、例えば、特注形質転換ラットおよびマウスの生産物は商業的に市販されているものである。これらの形質転換動物は、蛇への食物として、菌株源（すなわち、ＩＦＮ−β２またはその断片が挿入された位置）などを検出するための遺伝標識として、ＩＦＮ−β２機能を検査するための有用な動物モデルとなることができる。こうした形質転換動物は、さらに、他の導入遺伝子を含むことができる。形質転換動物はあらゆる適する方法により調製し用いることができる。
【０１０８】
本発明は、また、ＩＦＮ−β２をコードする遺伝子の発現が中で「打ち負かされて（ｋｎｏｃｋｅｄ ｏｕｔ）」しまうかまたは破壊されてしまう哺乳類細胞に関する。こうした遺伝子破壊は、例えばアンチセンスを含む有効な手段によるか、または遺伝子発現を抑圧するために有効であるヌクレオチド配列をその中に挿入することにより達成することができる。用語「遺伝子」は、その意味では、それが染色体上に存在する通りのＩＦＮ−β２コード配列を意味することに用いられると共に、そのプロモーター配列および他の調整領域を含むことができる。
【０１０９】
本発明は、特に、遺伝子の発現が中で機能的に不活性化されるかまたは破壊される１以上の細胞を含有する哺乳類に関する。機能的な不活性化または破壊は、例えば、哺乳類の単一細胞、選択された細胞、またはすべての細胞の内生ＩＦＮ−β２遺伝子によりコードされる少なくとも一部のポリペプチド発現の部分的または完全な減退を指す。用語「打ち負かされる」は遺伝子の機能的な不活性化と同意語である。
【０１１０】
一つの実施形態において、遺伝子標的戦略は、所期のヌクレオチド配列のＩＦＮ−β２遺伝子中への導入を容易にすることに用いられる。遺伝子標的戦略は、好ましくは、ヌクレオチド配列の標的核酸中への挿入を支援するために二重逆数組み換えおよび正選択標識を利用する。標的核酸は、好ましくは遺伝子、さらに好ましくはその特定の染色体座での遺伝子である。所期のヌクレオチド配列は、遺伝子が機能的に破壊される、すなわち、その発現が部分的にまたは完全に減退するといった方法で、遺伝子中に挿入される。
【０１１１】
本発明の一つの態様において、標的ベクターは選択標識をＩＦＮ−β２遺伝子の所定位置中に挿入するために用いられる。位置は選択標識挿入の際に遺伝子の機能的な崩壊を達成するように選択される。こうした目的のために、好ましい実施形態は以下を含む組み換え核酸分子である：（１）哺乳類ＩＦＮ−β２遺伝子の第一所定位置での相同組み換えを達成するために有効である５’ヌクレオチド配列であり、作動可能なように（２）に結合される、（２）それが中で存在する細胞上の第一選択性特性を与える第一選択ヌクレオチド配列の５’末端、および（３）例えば第一選択ヌクレオチド配列の３’末端に作動可能なように結合された哺乳類ＩＦＮ−β２遺伝子の第二所定位置での相同組み換えを達成するために有効である３’ヌクレオチド配列。組み換え核酸分子は、所定位置での哺乳類染色体における相同組み換えを達成するために有効である。標的ベクターの断片、例えば、要素（１）および（２）、または要素（２）および（３）を含む組み換え核酸、なども、本発明の範囲内にある。
【０１１２】
用語「組み換え」は、例えば各種源からの核酸の断片または設計された一つの源からの核酸分子を含む、例えば、人間の手により修飾された核酸分子を指す。従って、核酸分子は、例えば、それが哺乳類ＩＦＮ−β２遺伝子および選択標識遺伝子からのヌクレオチド配列を含んでいるので組み換え型である。分子は、また、それが同じ遺伝子からの配列を含有するがしかし自然には起こらないやり方で配置される、すなわち、非自然発生配置の場合、組み換え型である。
【０１１３】
「相同組み換え」は、相似の遺伝子情報を持つ核酸分子が隣り合った位置につき、ヌクレオチド・ストランドを交換する過程を指す。従って、標的核酸の所定の位置での相同組み換えを達成するために有効である組み換え核酸のヌクレオチド配列は、標的遺伝子、例えばマウスＩＦＮ−β２遺伝子の所定位置での組み換え核酸分子間のヌクレオチド・ストランドの交換を容易にするヌクレオチド配列を示す。
【０１１４】
有効なヌクレオチド配列は、一般に、ヌクレオチド塩基対合を促進し、所期の標的核酸分子（例えば、修飾しようとする遺伝子座）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。あらゆるヌクレオチド配列は、それが標的核酸分子に沿う特定の選択された位置での相同組み換えを容易にする限り用いることができる。一般に、標的ベクターと標的座間の相同性の範囲および長さに関しては、標的化効率の指数関数的依存性がある。相同組み換えに有効な配列の選択および使用は、例えば、Ｄｅｎｇ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：　３３６５〜３３７１，１９９２；Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２３：１９９〜２２５，１９８９；Ｗａｌｄｍａｎ　ａｎｄ Ｌｉｓｋａｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：５３５０〜５３５７，１９８８中に記載されている。
【０１１５】
本発明の一つの態様はＩＦＮ−β２遺伝子の発現を抑圧するかまたは機能的に破壊することである。用語「遺伝子の破壊」「遺伝子破壊」「発現を抑圧する」「遺伝子抑圧」「遺伝子の機能的な不活性化」または「機能的遺伝子不活性化」は、細胞中のその遺伝子および／またはその産物の発現を減少させるかまたは防止するやり方における遺伝子修飾を指す。遺伝子の産物の発現は、完全にまたは単に部分的に抑圧され、例えば７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超えて減少させることができる。
【０１１６】
機能的に破壊された遺伝子、例えば、機能的に破壊されたＩＦＮ−β２遺伝子には、野生型遺伝子の全コード配列より小さいものを有する不完全なポリペプチドを発現する修飾遺伝子が含まれる。こうした遺伝子は図１に示される。遺伝子は、また、翻訳不可能なメッセージ、例えばフレームシフト、減退安定性、などを作り出すようなやり方でそのｍＲＮＡ構造に影響を及ぼすことにより機能的に破壊することができる。
【０１１７】
本発明により、ＩＦＮ−β２は対応遺伝子産物の発現を破壊するために有効であるようなやり方において修飾される。従って、例えば機能的に破壊された組み換えＩＦＮ−β２遺伝子は、機能的なＩＦＮ−β２ポリペプチドを発現しないか、またはＩＦＮ−β２の野生型レベルよりも小さい、例えば７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超えて減少したレベルで機能的なＩＦＮ−β２ポリペプチドを発現する。「機能的でない」または「機能的に不活性な」ＩＦＮ−β２ポリペプチドとは、例えば、ＩＦＮ−β２が１以上のその生物活性を欠くことを意味する。遺伝子は、細胞中でのその遺伝子の発現を減退させるかまたは防止するために、あらゆる有効な位置、例えば、エンハンサー、プロモーター、調整領域、非コード配列、コード配列、イントロン、エクソン、などで修飾することができる。
【０１１８】
ＩＦＮ−β２遺伝子、例えばネズミのＩＦＮ−β２遺伝子の領域中への挿入は、相同組み換えにより達成することができる。遺伝子相同の領域および選択標識遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸分子は、ＩＦＮ−β２のプロモーターおよび／またはコード領域および／または非コード領域中に挿入され、それによって、遺伝子の発現は機能的に破壊される。次に、この打ち負かされた構造物が細胞中に挿入される場合、構造物はゲノムＤＮＡ中に組み込むことができる。従って、細胞の子孫は、遺伝子のただ一つの機能の複製を発現するのみである；遺伝子の内生ヌクレオチド配列が今挿入ヌクレオチド配列により破壊されているので、他の複製はもはや遺伝子産物を発現しないか、または減退したレベルでそれを発現する。必要ならば、機能的遺伝子は第二の類似ステップにおいて不活性化することができる。
【０１１９】
相同組み換えに有効なヌクレオチド配列は、所期の標的核酸中に挿入される予定のヌクレオチド配列、好ましくは選択標識ヌクレオチド配列または遺伝子に、作動可能なように結合することができる。
【０１２０】
組み換え核酸は、好ましくは、打ち負かそうとする内生遺伝子を含有する染色体ＤＮＡを持つ細胞中に挿入される。細胞中において、組み換え核酸分子は、打ち負かそうとする遺伝子の転写を妨げるかまたは中断するような位置で、細胞のＤＮＡとの相同組み換えにより組み込むことができる。こうした挿入は通常相同組み換えにより起こる（すなわち、内生ＤＮＡ配列に相同的または相補的である標的ベクターの領域は、標的ベクターが細胞中に挿入される場合互いにハイブリッド化する；次に、これらの領域は標的ベクターの部分が＊＊＊＊＊中に組み込まれるように組み換えすることができる）。＊＊＊＊＊は、その発現を抑圧するために遺伝子中に挿入することができる。
【０１２１】
遺伝子中の挿入ヌクレオチド配列の存在を測定することは望ましい。これは、核酸ハイブリッド形成、挿入核酸によりコードされるエピトープに結合する抗体、または挿入配列の表現型の選択によることを含む種々の方法において達成することができる。従って、こうした挿入ヌクレオチド配列は第一選択ヌクレオチド配列と呼ぶことができる。第一選択ヌクレオチド配列は、好ましくは、それが中で存在する細胞上に第一選択特性を与える。用語「選択特性」とは、例えば、細胞中に発現し、別のまたは他の特性を参照して選択することができる特性であることを意味する。
【０１２２】
選択標識遺伝子としても知られる選択ヌクレオチド配列は、それが哺乳類のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた後に検出可能および／またはアッセイ可能であるあらゆる核酸分子であることができる。選択特性は正の特性、すなわち、細胞により発現され、獲得されると共にその存在がこうした細胞の選択を可能とする特性であることができる。正の選択特性、例えば、抗生物質耐性、ウアバイン耐性（ウアバイン耐性ナトリウム／カリウムＡＴＰａｓｅタンパク質用の遺伝子）は、細胞または生物の生き残りを可能とすることができる。
【０１２３】
正の選択特性および対応選択剤の例には、例えば、ネオ（Ｎｅｏ）および／またはＧ４１８またはカノマイシン；Ｈｙｇおよびハイグロマイシン、ｈｉｓＤおよびヒスチジノール；Ｇｐｔおよびキサンチン；Ｂｌｅおよびブレオマイシン；Ｈｐｒｔおよびハイポキサンチンが挙げられる。例えば、米国特許第５，４６４，７６４号およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４：１２８８ 〜１２９２，１９８９を参照すること。
【０１２４】
標的配列中の選択遺伝子の存在は、また、選択遺伝子の産物を認識する結合リガンドを用いることにより（例えば、抗体は選択遺伝子によりコードされるポリペプチド産物を識別するために用いることができ、適切なリガンドは選択遺伝子によりコードされる受容体ポリペプチドの発現を識別するために用いることができる）、または選択遺伝子によりコードされる酵素の発現を検定することにより識別することができる。好ましくは、選択標識遺伝子は哺乳類中に自然には生じないポリペプチドをコードする。
【０１２５】
選択標識遺伝子は、それ自体のプロモーターに、または活性であるかまたはそれが中に挿入される細胞中で容易に活性化することができるあらゆる供給源からの別のプロモーターに作動可能なように結合することができる。しかし、選択標識遺伝子は、それが中に挿入される遺伝子のプロモーターを用いてそれを転写することが可能であるので、それ自体のプロモーターを結合させる必要はない。選択標識遺伝子は、例えば、リボソーム認識配列、エンハンサー配列、ポリペプチドまたはＲＮＡに安定性を与える配列、および／または遺伝子の転写を停止するためにその３’末端に結合されたポリＡ配列を含む、その発現を推進するかおよび／または支援する１以上の配列を含むことができる。
【０１２６】
正の選択標識は、正の選択標識が中で相同組み換えにより標的核酸中に組み込まれる組み換え体の選択を容易にする。本発明による遺伝子標的ベクターは、また、正しく標的化された組み換え体の選択をさらに支援する第二選択遺伝子によりコードされる第二選択特性をさらに含むことができる。負の選択標識は、中で非相同組み換えのみが起こる細胞に対する選択を可能とする。一つの好ましい実施形態において、第二選択標識遺伝子は中でそれが導入される細胞上に負の選択特性を与える。こうした負の選択特性は、それがランダムな組み込み事象と相同組み換えを区別するために用いることができるような方法で標的ベクター中に配置することができる。
【０１２７】
用語「負の選択」とは、細胞により獲得される場合、その生存可能性の損失を招く選択特性を意味する（すなわち、それは細胞に対して致死性である）。ヌクレオシド類似物、ＨＳＶｔｋ（ヘルペス・シンプレックス・ウイルス・チミジンキナーゼ）を発現する細胞に対して優先的に有害であるガンシクロビルは、それが組み込みＨＳＶｔｋ選択標識を持たない細胞を選択するので、負の選択剤として用いることができる。
【０１２８】
ＦＩＡＵ（１，２−デオキシ−２−フルオロ−α−ｄ−アラビノフランシル−５−ヨードウラシル）は、また、ＨＳＶｔｋを欠く細胞を選択するための選択剤として用いることができる。他の負の選択標識も同じように用いることができる。負の選択特性および対応チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）およびアシクロビル、ガンシクロビル、またはＦＩＡＵの例には、Ｈｐｒｔおよび６−チオグアニンまたは６−チオキサンチン；ジフテリア毒素；リシン毒素；シトシンデアミナーゼおよび５−フルオロシトシンがある。
【０１２９】
一般に、相同領域のダブルクロスオーバー置換組み換えは正の選択標識を標的核酸上の所定の位置に移すがしかし負の選択標識は移さないように、負の選択標識を遺伝子標的ベクター５’または３’上で組み換え由来の相同領域に配置する。例えば、ｔｋカセットはネズミ遺伝子の３’停止コドンから約１５０塩基対の３’末端に位置することができる。また、１より多くの負の選択特性を標的ベクター中に用いることができる。例えば、標的ベクターの５’および ３’末端での二つの負の選択ベクターの位置決めは、ランダムにベクターを組み込んだ標的細胞に反対の選択をいっそう強くする。
【０１３０】
ランダム組み込みは、時々、ランダム組み込みの前にすべてまたは部分的な負の選択標識の切除を招くベクターの再配置をもたらす。これが起こる場合、負の選択は、相同組み換えよりはむしろランダム組み込みにより標的ベクターを組み込んだ細胞を排除するために用いることはできない。一つより多くの負の選択標識の使用は、実質的に、ランダム組み込みが少なくとも一つの負の選択標識の挿入という結果を招く可能性を強くする。こうした目的のために、負の選択標識は同じかまたは異なることができる。
【０１３１】
正−負選択スキームの使用は不適正に組み込まれた標的構造物配列を有する細胞の背景を減退させる。正−負選択は一般に二つの活性選択標識の使用を含む：（１）以下のランダム組み込みまたは相同標的化を安定して発現できる正の選択標識（例えば、ネオ）、および（２）以下のランダム組み込みのみを安定して発現できる負の選択標識（例えば、ｔｋ）。正および負選択の両方を組合せることにより、正しく標的化された相同組み換え事象を有する宿主細胞は効率よく得ることができる。正−負選択スキームは、例えば、米国特許第５，４６４，７６４号；ＷＯ第９４／０６９０８号に記載されている。しかし、１以上の負の選択標識は、本発明を遂行する、例えば、ＩＦＮ−β２遺伝子が中で機能的に不活性化または破壊している形質転換動物を生産するために必要とされないことは認識される。
【０１３２】
本発明による組み換え核酸分子は、また、すべてまたは部分的なベクターを含むことができる。ベクターは、例えば複製の源を含有する宿主細胞中に自己複製することができる例えば核酸分子である。ベクターは、所期の宿主中の大量の組み換え分子を増殖させおよび／または得るための操作を行うために有用であることができる。熟練工は必要とされる目的に応じて、例えば、組み換え分子を、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞中で増殖するためにベクターを選択することができる。
【０１３３】
以下のベクターは実施例の手段により提供される：細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、ｐＢＳ、ｐＤ１０、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ΦＸ１７４、ｐＢＫ、Ｐｈａｇｅｍｉｄ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ｚ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））；Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋ＩＩ（ストラタジン）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、真核性：ＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジン）、ｐＳＶＫ３、ＰＢＰＶ、ＰＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア）。しかし、あらゆる他のベクター、例えば、プラスミド、ウイルス、またはそれらの部分は、それらが所期の宿主中で複製可能で生存可能である限り用いることができる。
【０１３４】
ベクターは、また、ゲノムが修飾される予定の宿主中でそれが複製されることを可能とする配列を含むことができる。こうしたベクターの使用は、その間に組み換えが標的化効率を増大して起こることができる相互作用期間を拡大することができる。本発明により用いることができる遺伝子標的ベクターの例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｉｔ ９．１６，ＦＩＧ．９．１６．１（ｐＮＴＫ）に記載されている。
【０１３５】
本発明の態様により、ＩＦＮ−β２遺伝子の機能は外生または異種の配列をその中に挿入することにより破壊するかまたは打ち負かすことができ、その機能を妨害することができる。例えば、外生または異種の配列は、その第一スタートコドン前のＩＦＮ−β２遺伝子領域中に挿入することができる。選択特性をコードするヌクレオチド配列は、それがＩＦＮ−β２遺伝子の内生プロモーターに作動可能なように結合されるような相同組み換えによるやり方で、ＩＦＮ−β２遺伝子中に挿入することができる。選択標識遺伝子の所期の所定位置中への組み込みに際して、選択特性の発現は内生ＩＦＮ−β２遺伝子プロモーターにより推進され、それが組み込まれた細胞中でのその検出を可能とする。
【０１３６】
選択標識遺伝子は、また、ＩＦＮ−β２遺伝子の第一スタートコドンに対する３’の下流の位置で組み込むことができる。ＩＦＮ−β２遺伝子は、融合ポリペプチドが正常の製品より活性の低い融合ポリペプチドが作製されるように、ＩＦＮ−β２ポリペプチドにより読取り枠外または読取り枠内で組み込むことができる。特性を発現する細胞のみを検出することにより、所期の位置で組み込まれた配列を含有する細胞を選択することができる。こうした選択を行う便利な方法は抗生物質に対する抵抗性を用いることである。以下の実施例において、ネオマイシン抵抗性は選択特性として用いられる。ネオマイシン毒性濃度の存在下で増殖した細胞は通常死んでしまう。相同組み換えによるネオマイシン抵抗性遺伝子の獲得は致死効果から細胞を救い、それによってそれらの選択を容易にする。
【０１３７】
ＩＦＮ−β２遺伝子は、組み込み事象により打ち負かされるかまたは機能的に破壊される。ＩＦＮ−β２コード配列の前への選択遺伝子挿入は、それをプロモーター配列から分離し、その発現を無効にする。選択遺伝子が転写終結プログラムを含有する場合、次に、ＩＦＮ−β２プロモーターを用いる遺伝子の転写はそれ以後即刻終結し、ＩＦＮ−β２コード配列の転写をもたらすことはまれにしかない。ＩＦＮ−β２遺伝子は、遺伝子の一部の特定部位欠失誘発などの置換を伴わない欠失によっても打ち負かされる。欠失領域は遺伝子の調整領域のコード領域であることができる。
【０１３８】
ＩＦＮ−β２遺伝子はあらゆる望ましい位置で修飾することができる。それは、完全なＩＦＮ−β２ポリペプチドの１以上の活性を有する不完全なＩＦＮ−β２ポリペプチドが生産されるように、修飾することができる。＊＊＊＊＊は組み換え遺伝子から除去することができる。実施例において、ネオマイシンカセットはマウスのＩＦＮ−β２遺伝子のエクソンを置換してそれを機能的に不活性にした。次に、ネオマイシンカセットは、例えば組み換え系を用いて、ＩＦＮ−β２遺伝子から除去することができる。クレ・ロックス（Ｃｒｅ−ｌｏｘ）部位特異的組み換え系は、特に、組み換え遺伝子から配列を除去するために有用である。
【０１３９】
クレ・ロックス系を利用するために、リコンビナーゼ認識部位は選択遺伝子と共に染色体中に組み込まれて、後の段階でのその除去を容易にする。リコンビナーゼ切除系の手引きに関しては、例えば、米国特許第５，６２６，１５９号、第５，５２７，６９５号、および第５，４３４，０６６号を参照すること。また、Ｏｒｂａｎ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｔｉｓｓｕｅ−ａｎｄ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６８６１〜６８６５，１９９２；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，　Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｉｔｅ−　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：　１３５１〜１３５５，１９９１；Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｃｒｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｔ ｌｏｘＰ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｐｌａｃｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７（１）：１４７〜１６１，１９８９を参照すること。
【０１４０】
核酸の他の態様のために、分子生物学の標準教科書を参照することができる。例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６；Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｈｏｗｅ，Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５を参照すること。
【０１４１】
実施例
ＩＦＮ−β２の発現および精製
精製ＩＦＮ−β２をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＩＦＮ−β１ｂと比較した。ＩＦＮ−β２はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される通りの明確な分子量２６ｋＤａを有し、一方でＩＦＮ−β１ｂは明確な分子量約２０．５ｋＤａを有する。
方法：ＰＣＲプライマー（５’−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＡＣＴ ＡＣＣ ＴＣＧ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＡＡ−３’および ５’−ＧＣＧ ＣＧＣ ＧＣＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＡＧＡ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＡＴ−３’）を、ＩＰＴＧ誘発性ｐｅｔ５ａ発現ベクター（プロメガ・コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ））中への後のライゲーション用のヒトゲノムＤＮＡ調製品から信号配列を引いたＩＦＮ−β２のコード領域を増幅するように設計した。
【０１４２】
誘発後、ＩＦＮ−β２を大腸菌封入体から単離し、ツイッタージェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１４（Ｒｕｓｓｅｌ−Ｈａｒｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１５，３１〜３７， １９９５）を用いて可溶化した。可溶化封入体からのＩＦＮ−β２の精製をイオン交換クロマトグラフィーと続くサイズ排除クロマトグラフィーを用いることにより達成することができる。ＩＦＮ−β２に対応する２６ｋＤａ帯域をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶離し、Ｎ−末端タンパク質配列化により分析した。最初の１０アミノ酸をＩＦＮ−β２に期待されるそれらと対応させた。さらに、臭化シアン蒸解を行い、いくつかの断片を生成し、これらは配列化され予定のタンパク質配列を有することが見出され、完全なタンパク質が満足に発現し精製されることを実証した。
【０１４３】
ＩＦＮ−β２によるインターフェロン依存ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ・レポーターの活性化
Ｔ９８Ｇ細胞にＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ構造物を含有するプラスミドで核酸導入を行い、構造物を発現する安定なクローンを単離した。３Ｘ１０４細胞を一夜にわたり平板培養し、精製されたＩＦＮ−β２を指示濃度で添加した。４時間後細胞をキットプロトコル（プロメガ Ｃａｔ．＃Ｅ１５０１）に記載されているようにルシフェラーゼ・アッセイキットを用いてルシフェラーゼ活性を検定した。ＩＦＮ−β２は、特に、インターフェロン依存ＩＳＲＥレポーターを活性化した。図６を参照すること。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能的な特性を示した。
【０１４４】
抗ＩＦＮ−β２マウスポリクローナル抗体によるＩＦＮ−β２のヒトＩ型インターフェロン受容体への結合の阻害
ＩＦＮ−β２の独特のＣ−末端領域（ＫＬＳＫＱＧＲＰＬＮＤＭＫＱＥＬＴＴＥＦＲ）に対応するペプチドを合成し、ＫＬＨに結合し、２ヶ月にわたる計４回の予防接種によりスイス・ウエブスター・マウスに免疫性を与えるために用いた。免疫化後、血清を集め、特定的にＩＦＮ−β２に結合する抗体を含有することを確認した。さらに、抗ＩＦＮ−β２血清は、ＩＦＮ−β２によりＩＦＮ依存ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ・レポーターの誘発を遮断した。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらと類似の機能特性を実証した。
【０１４５】
方法：
３Ｘ１０４細胞を一夜にわたり平板培養し、２０ｎｇのＩＦＮ−β２を抗ＩＦＮ−β２血清または正常マウス血清いずれかの存在下で４時間にわたり添加し、次に、ルシフェラーゼ・アッセイキットおよびプロメガ社からの標準プロトコルを用いて、誘発ルシフェラーゼの存在を検定した。図７を参照すること。
【０１４６】
ＩＦＮ−β１ｂおよびＩＦＮ−β２ｂのヒトＨＴ１０８０細胞増殖に対する影響
ＩＦＮ−β１ｂおよびＩＦＮ−β２ｂはＨＴ１０８０細胞およびＨＴ１０８０ ＩＦＮＡＲ２ｃ細胞の両方において抗増殖性効果を有する。これはアラマー・ブルーアッセイパネル（図８ＡおよびＢ）および目視検査の両方において明白であった。抗増殖性効果は、ＨＴ１０８０細胞と比べた場合、５倍の数のＩＦＮ結合部位を有するＨＴ１０８０ＩＦＮＡＲ２ｃ細胞中の増大効果により証明されているように、受容体数の増加に相関した。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を実証した。
【０１４７】
方法：
ＨＴ１０８０ ＩＦＮＡＲ２ｃ細胞は、ＩＦＮＡＲ２ｃを過剰発現するＨＴ１０８０細胞である。これらの細胞は親のＨＴ１０８０細胞よりも５倍数のＩＦＮに対する結合部位を示す。２〜５Ｘ１０４細胞／ｍｌを一夜にわたり平板培養し、ＩＦＮ−β２の１μｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌで刺激するかまたは刺激しないかのいずれかを行った。しかし、ＨＴ１０８０細胞はＩＦＮ−β２の１μｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌで刺激し、一方ＨＴ１０８０ ＩＦＮＡＲ２ｃ細胞はＩＦＮ−β２の５００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌで刺激した。標準プロトコルを用いて、細胞増殖を測定するためにアラマー・ブルー（米国特許第５，５０１，９５９号）を用い、代表分野の各時間ポイントでの写真を撮影した。インターフェロンを含有する培地を毎日取り替えた。すべての処理は三重に行った。図８を参照すること。
【０１４８】
短期間３［Ｈ］チミジン組み込みにより測定されるヒトＨＴ１０８０細胞上のＩＦＮ−β２の抗増殖性活性
３［Ｈ］チミジンの組み込みを、ＩＦＮ−β２の添加（縞カラム）またはバッファ制御（充填カラム）の４８時間後に測定した。３［Ｈ］チミジン組み込みは組み込みＣＰＭ／１０６細胞として表される。データ（図９）はｎ＝３の平均値を示し、複製間変動は１５％未満であった。ＩＦＮ−β２はチミジン組み込みを有意に、例えば、約８６％減少させた。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を立証した。
【０１４９】
方法：
細胞を２４穴細胞培養皿中で播種し（２Ｘ１０４細胞／穴）、一夜にわたり培養し、次に２４時間にわたりＩＦＮ−β２（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。次に、細胞を３［Ｈ］チミジン（［メチル−３Ｈ］チミジン、比放射能＝４０〜６０Ｃｉ／ｍモル、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）・ライフ・サイエンス）を含有する完全な培地中で培養し、２４時間後取り入れた。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、続いて１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）および１００％エタノールにより洗浄した。放射能の組み込みを決定する前に、細胞を１Ｍ水酸化カリウム中に溶解しエコルーム（Ｅｃｏｌｕｍｅ）シンチレーション流体と混合した。
【０１５０】
ＩＦＮ−β２によるＩ型ＩＦＮ受容体活性化
ＩＦＮ−β２はヒトＩ型ＩＦＮ受容体のＩＦＮＡＲ２ｃ受容体鎖のチロシンリン酸化反応を誘発した。細胞をヒトＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−β１ｂまたはＩＦＮ−β２（１５分間で１０００〜２０００相対単位／１０６細胞）により刺激しない（ｕｎｓｔｉｍ．）または刺激したかのいずれかであった。リン酸化反応はインターフェロン存在下で観察され、インターフェロン不在下では観察されなかった。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を実証した。
【０１５１】
方法：
ＩＦＮＡＲ２ｃ（５Ｘ１０７細胞）を発現するダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞を、４℃で３０分間にわたり、溶菌緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で、１％ノニデット−４０（ｖ／ｖ）（ＮＰ−４０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５％グリセロール（ｖ／ｖ）、１．０ｍＭフッ化ナトリウム、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１．０ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、０．５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５．０μｇ／ｍｌトリプシン阻害剤を含む）中に溶解し、不溶性材料を遠心分離により除去した。免疫沈降のために、ＩＦＮＡＲ２ｃ抗血清（＋）または負の対照抗血清（−）を各試料に添加し、一夜にわたり培養し、タンパク質−Ｇアガロース（ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ノベックス・ゲル）により分解した。
【０１５２】
タンパク質をジフッ化ポリビニリデン樹脂フィルター（プロ−ブロット（Ｐｒｏ−Ｂｌｏｔ））に移し、４℃で一夜にわたり遮断緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５，で０．１％ツイーン２０（ｖ／ｖ）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０ｍＭフッ化ナトリウム、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１．０ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５．０μｇ／ｍｌトリプシン阻害剤を含む）中で培養し、抗ホスホチロシン抗体（ａｂ ＰＹ９９、カリフォルニア州、サンタクルーゼのサンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））で培養し、遮断緩衝液で洗浄した。洗浄後、膜を１時間にわたりホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した特定の第二抗体（１：１００希釈）で培養し、遮断緩衝液中で３回洗浄し、化学発光検出法（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて作成した。
【０１５３】
ＩＦＮ−β２での刺激によるダウディ細胞中におけるＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２の活性化
ダウディ細胞を１５分間にわたりＩＦＮ−β１ｂまたはＩＦＮ−β２（１０００〜２０００相対単位／１０６細胞）で刺激し、溶菌緩衝液中に溶解し、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２を免疫沈降した。免疫沈降後、両方のＩＦＮ型に対してホスホチロシン特定抗体を用いて、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のチロシンリン酸化反応を検出した。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１のそれらに類似の機能特性を実証した。
【０１５４】
方法：
ダウディ細胞（１Ｘ１０７細胞）を、４℃で３０分間にわたり、溶菌緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で、１％ノニデット−４０（ｖ／ｖ）（ＮＰ−４０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５％グリセロール（ｖ／ｖ）、１．０ｍＭフッ化ナトリウム、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１．０ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、０．５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５．０μｇ／ｍｌトリプシン阻害剤を含む）中に溶解し、不溶性材料を遠心分離により除去した。免疫沈降のために、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２抗体（それぞれＳＴＡＴ１ ｐ９１およびＳＴＡＴ２（ｃ−２０）、カリフォルニア州、サンタクルーゼのサンタクルーズバイオテクノロジー）を各試料に添加し、一夜にわたり培養し、タンパク質−Ｇアガロース（ベーリンガー−マンハイム）と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ノベックス・ゲル）により分解した。
【０１５５】
タンパク質をジフッ化ポリビニリデン樹脂フィルター（プロ−ブロット）に移し、４℃で一夜にわたり遮断緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５，で０．１％ツイーン２０（ｖ／ｖ）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０ｍＭフッ化ナトリウム、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１．０ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５．０μｇ／ｍｌトリプシン阻害剤を含む）中で培養し、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ９９、カリフォルニア州、サンタクルーゼのサンタクルーズバイオテクノロジー）で培養し、遮断緩衝液で洗浄した。洗浄後、膜を１時間にわたりホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した特定の第二抗体（１：１０００希釈）で培養し、遮断緩衝液中で３回洗浄し、化学発光検出法（ピアス）を用いて作成した。
【０１５６】
ＩＦＮ−β２およびＩＦＮ−β１の抗活性
ヒトＷＩＳＨ細胞をＩＦＮ−β１ｂまたはＩＦＮ−β２のいずれかにより、次に水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）での感染により刺激した。酸化還元染料アラマーブルーを用いてウイルス性細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定した。ＩＦＮ−β１ｂに対応する抗ウイルス活性の単位をＸ軸に沿ってプロットする。ＩＦＮ−β２の特定抗ウイルス活性はｍｇ当り４．０〜８．０Ｘ１０６国際単位（「ＩＵ」）であると測定された。図１０を参照すること。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を実証した。
【０１５７】
方法：
ＷＩＳＨ細胞（３０，０００細胞／穴）を９６穴ファルコン・マイクロタイタープレート中に置き、一夜にわたり放置して付着させた。細胞をＩＦＮ−β１ｂ（第１穴で１０００ＩＵ；比活性度＝２．５Ｘ１０７ＩＵ／ｍｌ）または　ＩＦＮ−β２（第１穴で１μｇ）で刺激し、プレートを横断して６時間にわたり１：１に希釈し、続いて１８時間にわたりＶＳＶ（７Ｘ１０３プラーク形成単位／穴、（ＰＦＵｓ））を添加した。培養後、培地を除去し、１００μｌのアラマーブルー（バイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））（培地中で製造業者供給原液溶液の１：１０希釈）を各穴に添加した。３７℃で３０〜６０分間にわたる培養後、６００ｎｍでの吸収を測定することによりＣＰＥを決定した。
【０１５８】
ＩＦＮ−β２ はＨＴ１０８０細胞上のＩ型ＩＦＮ受容体への結合についてＩＦＮ−α２と競合する
１Ｘ１０６ ＨＴ１０８０細胞を、９０分間にわたり、完全細胞培養培地（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）中の１５ｎｇ／ｍｌ３２Ｐ標識化ＩＦＮ−α２（ペストカ・バイオメデイカル（Ｐｅｓｔｋａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）＃５１１００）で培養した。培養後、細胞を細胞培養培地で２回洗浄し、１％ＳＤＳ中に溶解し、シンチレーション流体で混合し、計数を行った。１５μｇ／ｍｌＩＦＮはＨＴ１０８０細胞に結合した標識化ＩＦＮ−β２の内９０％を超えて競合した。アッセイを三重に行い、標準偏差は１０％未満であった。図１１を参照すること。
【０１５９】
ＩＦＮ−β２のダウディ細胞上のＩ型ＩＦＮ受容体に対する競合結合
競合リガンド結合アッセイをＩＦＮ−α２のリン酸化形態を用いて行う。リガンドをＣｒｏｚｅ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：３３１６５〜 ３３１６８，　１９９６に記載されているようにリン酸化する（比放射能６０〜６２μＣｉ／μｇ）。結合データをＳｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１，６６０〜６７２，　１９９６に記載されているように分析する。非特定結合を１００倍過剰の非標識化ＩＦＮの存在下で測定する。各種ＩＦＮｓの競合結合を、一定量のリン酸化ＩＦＮ−α２で、増加する量の非標識化ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−β１ｂまたはＩＦＮ−β２を培養することにより測定する。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を実証する。
【０１６０】
Ｉ型ＩＦＮ受容体のＩＦＮ−β特定組み立て物
ＩＦＮ−β１ｂはＩＦＮ−α２から識別できる方法でＩ型ＩＦＮ受容体と相互作用する。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を実証する。方法：細胞（１Ｘ１０８）を、ＣＯ２インキュベータ中において３７℃で１５分間にわたり２００ＩＵ／１０６細胞の濃度でＩＦＮｓにより刺激する。処理後、細胞を４℃で遠心分離（３０００ｘｇ、３分）によりすばやく回収し、すぐに氷冷溶菌緩衝液（１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０で、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１％ＮＰ−４０（ｖ／ｖ）、１．０ｍＭオルトバナジウム酸塩、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１．０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび５μｇ／ｍｌトリプシン阻害剤を含む）中に溶解する。
【０１６１】
溶解物を４℃で遠心分離（１６，０００ｘｇ、３０分）し、上澄みを集める。細胞溶解物をＣｒｏｚｅ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：３３１６５〜 ３３１６８， １９９６に記載されているような抗ＩＦＮＡＲ１抗体、またはＩＦＮＡＲ２．２ラビットポリクローナル抗血清（１０μｌ抗血清／１０８細胞）を用いて免疫沈降し、続いてノベックス８％トリス−グリシンゲルを用いて分析する。電気泳動後、タンパク質をフッ化ポリビニリデン樹脂（ＰＶＤＦ）フィルター（プロ−ブロット）に移し、室温で一夜にわたり、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０で１５０ｍＭＮａＣｌ、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１．０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および０．１％ツイーン２０により遮断する。
【０１６２】
次に、フィルターを、室温で２〜３時間にわたりＩＦＮＡＲ１（Ｃｒｏｚｅ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：３３１６５〜 ３３１６８，１９９６に記載されているような４０Ｈ２、０．１μｇ／ｍｌ）またはＩＦＮＡＲ２（１５μｌ抗血清／１０ｍｌ遮断緩衝液）に対して方向付けされた抗体により培養し、続けて遮断緩衝液で１０分間だけ洗浄する。次に、洗浄されたフィルターを室温で２〜３時間にわたり第二抗体を共役させた対応ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で培養し、洗浄し、化学発光法（強化化学発光検出キット、ピアス）を用いて作成する。
【０１６３】
各種類のインターフェロンによる遺伝子の優先的誘導
インターフェロンは培養細胞中に重複する別個の組の遺伝子を誘発する。ダウディまたはＨＴ１０８０細胞を、１７時間にわたりヒトＩＦＮ−α２（１０００ＩＵ／１０６細胞）、ＩＦＮ−β１ｂ（１０００ＩＵ／１０６細胞）、ＩＦＮ−γ（１０００ＩＵ／１０６細胞）、またはＩＦＮ−β２（１０００ＩＵ／１０６細胞）のいずれかにより刺激し、すべての細胞ペレットを集め、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｏｌｄ ＲＴ−ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｍａｎｕａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｎ Ｐ／Ｎ ４０２８７６ Ｒｅｖ．Ａ １９９７に記載されているようにＴａｑ　Ｍａｎ（商標）分析を処理する。
【０１６４】
遺伝子発現のＲＮａｓｅ保護アッセイのために、Ｓａｎｄｈｙａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２２８７８〜２２８８４，１９９６に記載されているように細胞を刺激し、集める。ＩＦＮ−β１ｂにより優先的に誘発される遺伝子は、ＩＳＧ６〜１６の発現に対して正常化され、遺伝子はＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βにより等しく誘発される。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を実証する。
【０１６５】
ＩＦＮ−β２に応じるヒト胎児星状細胞の抗増殖性
星状細胞はＭＳ損傷の進行に寄与し、本明細書において我々はＩＦＮ−β２が生体外でヒト胎児星状細胞の増殖を阻害することを示す。この観察は、ＩＦＮ−β２が星状細胞増殖の増殖調整剤として作用し、従って、ＭＳにおける反応性グリオチック（ｇｌｉｏｔｉｃ）損傷の形成を防止することができることを示唆する。このアッセイを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を実証した。
【０１６６】
方法：
（Ａ）星状膠培養液の調製：
ヒトの胎児脳からの星状細胞濃縮培養液を１７〜２２週妊娠期間の二つの異なる胎児脳から調製した。組織を法定治療的流産に従いアドバンスト・バイオサイエンス・リソース（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ．）から入手した。髄膜除去後、脳を切開し、中身をゆっくりとピペットで取り、続いてそれらを篩にかけることにより単一の細胞懸濁液中に解離した。細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびファンギゾンを含有する抗生物質カクテルの存在下で１０％ＦＣＳを含むイスコフ培地中に再懸濁し、小グリア細胞を示差接着技術により１週間にわたり毎日除去した。
【０１６７】
次に、星状細胞を少なくとも８〜１０週間にわたり増殖させ、週に２回養分を与えた。汚染している小グリア細胞、神経細胞および希突起膠細胞の前駆細胞はこれらの長期間の培養条件を切り抜けて生きることはできない。この期間の終わりに、培養液をＧＦＡＰ、Ｏ４およびネスチン抗体で染色し、９５％を超える純粋星状細胞であることを確認した。培養液を液体Ｎ２中で凍結させてからそれらを増殖アッセイ用に用いた。
【０１６８】
（Ｂ）増殖アッセイ：
星状細胞を凍結在庫から取り出し、少なくとも二つの通路に対して上述の培地中で増殖させてからそれらを増殖アッセイ用に用いた。細胞を１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（Ｒ ＆ Ｄシステムズ）ありなしにより、２Ｘ１０４細胞／ｍｌで９６穴プレート中において平板培養した。アッセイを低血清培地（２％ＦＣＳ）中で行った。培養液をＩＦＮ−β２（１ｍｇ／ｍｌ在庫品）または指定希釈液でのバッファ制御により処理した。４日間の培養後、培養液を３Ｈ−チミジンで一夜にわたり培養し、プレートを採集前に凍結した。
【０１６９】
多発性硬化症のゲッシ動物モデルにおけるＩＦＮ−β２の活性
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は多発性硬化症用の動物モデルとして広く用いられる（Ｓｗａｎｂｏｒｇ，Ｇ．，Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏ　ｐａｔｈｏｌ．，７７，４〜１３，１９９５；Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．ａｎｄ ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｈ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１８， １〜２４，１９９６）。ＩＦＮ−β１ｂはこれらの関連ＭＳモデルにおける生体内効果を示す。これらのモデルを用いて、ＩＦＮ−β２はＩＦＮ−β１ｂのそれらに類似の機能特性を実証する。
【０１７０】
方法：
（Ａ）ＳＪＬマウスにおける受身伝達実験的アレルギー性脳脊髄炎：
動物および材料：８週齢雌ＳＪＬマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））；ＲＰＭＩ １６４０、Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを伴い、１Ｘ、０．１ミクロン濾過（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃａｔ＃２２４００〜０８９）；確定されたＦＢＳ（ハイクロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、熱不活性化、Ｃａｔ＃ＳＨ３００７０．０１）；ＭＥＭ非本質的アミノ酸溶液、１０ｍＭ、１００Ｘ（ライフ・テクノロジーズ、Ｃａｔ＃１１１４０〜０５０）；２−メルカプトエタノール、１０００Ｘ、Ｄ−ＰＢＳ中５．５Ｘ１０−２Ｍ（ライフ・テクノロジーズ、Ｃａｔ＃２１９８５〜０２３）；ペニシリン／ストレプトマイシン、ｍｌ当り１０，０００Ｕ／μｇ（バイオ−ウイッテカー（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、Ｃａｔ＃１７〜６０２Ｅ）；ハンクの平衡塩類溶液、１Ｘ、０．１ミクロン濾過（ライフ・テクノロジーズ；Ｃａｔ＃２４０２０〜１１７）；
【０１７１】
実験：
８週齢雌ＳＪＬマウスを、２００μｇのＭ．結核菌Ｈ３７Ｒａ（粉砕された）を持つ完全フロインドアジュバント（「ＣＦＡ」）中の１５０μｇプロテオリピドタンパク質（「ＰＬＰ」）を含有する、０．１ｍｌ皮下（尻尾の元と上背の間に分割する）注射により免疫化した。１１日後、軸方向、上腕および鼠径のリンパ節細胞をマウスから切開し、以下の培地（４５０ｍｌＲＰＭＩ１６４０（Ｌ−グルタミンにプラスＨＥＰＥＳを有する）に５０ｍｌ ＦＢＳ、０．４５５ｍｌ ２−メルカプトエタノール、５．０ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび５．０ｍｌ非本質的アミノ酸を添加する）中６Ｘ１０６細胞／ｍｌで培養する。最終濃度５０μｇ／ｍｌを得るために細胞にＰＬＰを添加する。細胞を３７℃、７％ＣＯ２で７２時間にわたり培養する。細胞を採集し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄する。
【０１７２】
リンパ節細胞の生死判別をトリパンブルー排除により評価する。リンパ節細胞の濃度を４Ｘ１０７細胞／ｍｌに調節する。２Ｘ１０７リンパ節細胞を、実験未使用の８週齢雌のＳＪＬマウス中にマウス当り（投与体積＝０．５ｍｌ）腹膜内的に注射する。マウスを計量し、毎日記録する。ＩＦＮ−β２およびＩＦＮ−β１ｂによる治療は必要に応じ投薬をする。臨床評価（ＥＡＥ点数／症状）は以下である：０／正常；１／のろのろ尻尾；２／直立困難；３／一つまたは両方の後肢の不完全な麻痺；４／一つまたは両方の後肢の完全な麻痺；５／動かない、瀕死の、または死亡。
【０１７３】
（Ｂ）ルイスラットにおける急性実験的アレルギー性脳脊髄炎：
動物および材料：
８週齢で免疫化された雌のルイスラット（チャールズ・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ））；脊髄ホモジェネート調製品（雄ハートレーモルモットからの、ギルロイのシモンセン・ラブズ（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｓ））：
５００〜７００グラムのモルモットをＣＯ２で安楽死させる。脊椎を切る鋭利な骨はさみを用いて脊髄を除去し、生理食塩水中で洗浄し、一度拭き取り、使用の日まで−８０℃で貯蔵する。次に、脊髄を計量し、１ｇ／ｍｌの生理食塩水で均質化し；抗原乳化液：モルモット脊髄ホモジェネートを、１ｍｇ／ｍｌマイコバクテリウム結核菌（乳鉢と乳棒により粉砕された）を有するＣＦＡ（ミシガン州、デトロイトのジフコ（Ｄｉｆｃｏ））と１：１で混合する。０．０５ｍｌを各後肢のフットパッド中に、ラット当り合計０．１ｍｌを注射する。
【０１７４】
実験：
ラットを第一日目に単一の静脈内ボーラスにより免疫化する。ラットを計量し、毎日記録する。ＩＦＮ−β２およびＩＦＮ−β１ｂによる治療は必要に応じ投薬をする。臨床評価（ＥＡＥ点数／症状）は以下である：０／正常；１／のろのろ尻尾；２／一つまたは両方の後肢の不完全な麻痺；３／一つまたは両方の後肢の完全な麻痺で、動くことはできるがしかし身体の動きを支援できない；４／後肢両方が完全な麻痺；５／後肢両方が完全な麻痺で前肢の一つまたは両方が弱いかまたは瀕死か、または死亡。
【０１７５】
これまでの説明は本発明をその最大範囲にまで利用している。前述の好ましい特定の実施形態は、従って、単に説明用として解釈されるべきであり、開示の残部は何であれどの点からも限定されるものではない。上に引用したおよび図中のすべての出願、特許および公告の全開示は、本明細書において参考としてそれらの全体を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、５’および３’配列を含むヒト・インターフェロン・ベータ２のヌクレオチド配列を示す。
【図２】
図２は、ヒト・インターフェロン・ベータ２のアミノ酸配列を示す。ＩＦＮ−β２に対する読取り枠の翻訳が示される。シグナル配列はイタリック体で示され、二つの潜在性Ｎ−グリコシル化部位およびジスルフィド結合を形成することができるシステインは下線を引かれ太字で示される。
【図３】
図３は、Ｉ型インターフェロンの３次元構造を示す。すべての三つのＩＦＮｓは、ヒト・Ｉ型ＩＦＮｓ共通の５本の螺旋束が基調である特性を共有する。加えて、ＩＦＮ−β２１ｂおよびＩＦＮ−β２は、それらの潜在性Ｎ−グルコシル化部位および予定されている二硫化結合の位置において互いに類似している。独特なＣ−末端アミノ酸配列はＩＦＮ−β２においてのみ存在する。
【図４】
図４は、ヒト・インターフェロン・ベータ２を他のインターフェロン型と比較したタンパク質配置構造である。
【図５】
図５は、ＩＦＮ−β２とヒト・Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンとの系統発生的比較である。システイン保持のパターン、潜在性Ｎ−グルコシル化部位および系統発生的分析に基づくと、ＩＦＮ−β２は他のインターフェロンのどれよりもＩＦＮ−βにより密接に関係がある。
【図６】
図６は、ヒト・インターフェロン−ベータ−２に対するＩ型ＩＦＮ依存ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを示す。
【図７】
図７は、抗ＩＦＮ−β２ポリクローナル抗体による、ＩＦＮ−β２のヒト・Ｉ型インターフェロン受容体への結合の阻害結果を示す。
【図８】
図８のＡ及びＢは、インターフェロンの細胞増殖への影響を示す。
【図９】
図９は、ヒト細胞に関するＩＦＮ−β２抗増殖性活性を示す。
【図１０】
図１０は、ヒト細胞に関するインターフェロンの抗ウイルス活性を示す。
【図１１】
図１１は、Ｉ型インターフェロン受容体への結合に対するＩＦＮ−α２およびＩＦＮ−β２間の競合を示す。
【図１２】
図１２は、ヒトＩＦＮ−β２の５’ゲノムヌクレオチド配列である。
【図１３】
図１３は、ヒトＩＦＮ−β２の５’領域をコードするヌクレオチド配列である。
【図１４】
図１４は、ヒトＩＦＮ−β２の５’ポリペプチド配列である。
【図１５】
図１５は、ＩＦＮ−β２に反応するヒト胎児星状細胞の抗増殖性を示す。（Ａ）は刺激なしでの胎児脳産物１であり、（Ｂ）はＥＧＦ刺激による胎児脳産物１である；（Ｃ）は刺激なしでの胎児脳産物２であり、（Ｄ）はＥＧＦ刺激による胎児脳産物２である。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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2004505021.tif 000074
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505021.tif 000075
【国際調査報告】
2004505021.tif 000076
2004505021.tif 000077
2004505021.tif 000078
2004505021.tif 000079