(57)【要約】本発明は、インビボでの放出が遅延した医薬を調製するためのポリカチオン性化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボでの放出が遅延した医薬の調製のためのポリカチオン性化合物の使用。
【請求項２】
該医薬がワクチンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該医薬が抗原を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
該抗原が、ウイルス病原体または細菌病原体からの抗原、真核生物病原体からの抗原、腫瘍抗原、自己免疫抗原またはそれらの混合物よりなる群から選ばれる、請求項１ないし３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
該ポリカチオン性化合物が、ポリカチオン性ペプチド、好ましくは塩基性のポリペプチド、ペプチド結合を含む有機ポリカチオン、またはそれらの混合物である、請求項１ないし４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
該ポリカチオン性化合物が、ポリリジン、ポリアルギニン、５を超える、とりわけ１０を超えるアミノ酸残基の範囲に５０％を超える塩基性アミノ酸残基を含むポリペプチド、またはそれらの混合物である、請求項１ないし５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
該ポリカチオン性化合物が、３〜７の疎水性アミノ酸のリンカーによって隔てられた少なくとも２つのＫＬＫモチーフを含む合成ペプチドである、請求項１ないし６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
該医薬が、炎症を引き起こす可能性のある化合物をさらに含む、請求項１ないし７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
該医薬が、１０分未満、好ましくは５分未満、特に１分未満の投与部位での薬理学的半減期を有する化合物をさらに含む、請求項１ないし８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
該医薬が、免疫原性の核酸分子をさらに含む、請求項１ないし９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
該医薬が、免疫原性のオリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）、とりわけＣｐＧモチーフを含むＯＤＮ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、イノシン含有ＯＤＮ（Ｉ−ＯＤＮ）、またはそれらの混合物または組み合わせをさらに含む、請求項１ないし１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
該医薬が局所的に作用する医薬である、請求項１ないし１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
該医薬がさらに活性物質を含み、該活性物質が該ポリカチオン性化合物に対する親和性を有する、請求項１ないし１２のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリカチオン性化合物の新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
製薬学的に使用したポリカチオン性化合物、たとえばポリカチオン性のアミノ酸ポリマーであるポリ−Ｌ−アルギニンおよびポリ−Ｌ−リジンは、インビトロおよびインビボで抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原を非常に効率的に負荷させる（charging）ことが示されている。これは、免疫カスケードを誘起する重要な事象であると考えられ、最終的に標的を破壊ないし中和しうる抗原特異的な免疫エフェクター細胞の誘発に導く。以前にも多くのポリカチオン性化合物が免疫細胞に対する作用を発揮することが示されている（Buschleら、Gene Ther. Mol. Biol. 1 (1998), 309-321; Buschleら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997), 3256-3261）。
【０００３】
ポリ−Ｌ−アルギニンおよびポリ−Ｌ−リジンとワクチンとしての適当な抗原との混合物の同時注射は、幾つかの動物モデルにおいて動物を腫瘍増殖から保護する。ポリカオン性化合物と抗原とからなるワクチンは、治療の非常に有効な形態であるとして当該技術分野で受け入れられている（ＷＯ９７／３０７２１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
個体に投与した多くの薬理学的物質は、しばしば速やかに生体中に分散される。薬剤の速やかな全身的分布は、通常、強力かつ有害な副作用を引き起こす。医学的効果は、医薬が注射部位に一層高い量で留まり、少量が生体全体に徐々にかつ連続的に放出される場合のほうが好ましい。
【０００５】
本発明の目的は、局所的に作用することが望まれる医薬を注射部位（貯蔵部（depot））に保持する手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、薬剤のあまりにも速やかな生体中の分布による副作用を防ぎ、または改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これら目的は、インビボ放出が遅延した医薬の調製にポリカチオン性化合物を使用することにより解決される。驚くべきことに、本発明により、ポリカチオン性化合物が、ポリカチオン性化合物なしで投与したときには個体中で速やかに分散する他の薬理学的に活性な化合物とともに投与した場合に、該活性な化合物の投与部位からの放出を遅延させる作用を示すことが見出された。ポリカチオン性化合物は活性な薬理学的化合物を貯蔵部に保持すると思われ、それにより薬理学的に活性な原理により有効な治療をするうえでしばしば望まれる医薬のインビボ放出の遅延が可能となる。
【０００７】
そのようなインビボ放出の遅延が有利である重要な分野はワクチン接種である。ワクチン接種すべき個体の免疫系に抗原が長期間にわたって提示されるなら、免疫系はそのような抗原に対する有効な免疫応答を生成する可能性が高まるであろう。一方、そのような抗原が生体中を速やかに分散してしまえば、抗原は速やかに分解および希釈され、それゆえ多くの有望な抗原について有効な免疫応答を達成することができないであろう。従って、本発明により、たとえばそのような抗原の貯蔵部を提供するためにポリカチオン性化合物が使用され、該貯蔵部は保護的な免疫を生成するためにこの抗原を免疫系に長期間にわたって連続的かつ有効に提示することを可能にする。さらに、抗原を免疫刺激性の化合物（ＣｐＧ−ＯＤＮ）と組み合わせて投与する場合に、これら免疫刺激性の化合物の貯蔵部からのゆっくりとした放出は免疫系の連続的な刺激という結果となるに違いない。
【０００８】
本発明は、組み合わせ医薬を、たとえば皮下、静脈内、鼻内、筋肉内、皮内または経皮的に投与したときに特に有利である。しかしながら、他の投与形態、たとえば非経口または局所投与もまた本発明に適している。しかしながら、貯蔵部の効果は組成物を注射またはインプラントした場合に最も有意であると思われる。
【０００９】
本発明は、インビボ放出の遅延が望まれるあらゆる医薬、たとえば、抗原、アレルゲン、医薬（サイトカイン、ケモカイン、免疫刺激性の核酸、細胞毒性の薬剤または抗血管形成剤（anti-angiogenic）または創傷の治癒に必要な化合物を含む）と関連して用いるのが好ましい。
【００１０】
本発明に使用すべき抗原は重要ではなく、好ましくはウイルスまたは細菌病原体からの抗原、真核生物病原体からの抗原、腫瘍抗原、自己免疫抗原、またはそれらの混合物よりなる群から選ばれる。特に好ましいのは、負に荷電した抗原または疎水性の抗原である。抗原のさらなる例は、不活化したウイルスまたは細菌、真菌、原生生物あるいは癌細胞などの完全に殺した生物である。抗原はまた、これら生物／組織の下部画分（subfractions）、タンパク質、または最も単純な形態でペプチドからなっていてもよい。抗原はまた、グリコシル化タンパク質またはペプチドの形態で免疫系によって認識されてよく、多糖または脂質であるかまたは含んでいてよい。短いペプチドを用いることができる、なぜなら、たとえば細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と結合した通常８〜１１アミノ酸長の短い形態の抗原を認識するからである。Ｂ細胞は約１５アミノ酸から開始して一層長いペプチドを認識する。Ｔ細胞エピソードと対照的に、Ｂ細胞抗原の三次元構造はまた抗体による認識に重要である。
【００１１】
好ましい病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型およびＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、Staphylococcus aureus、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Mycobacterium tuberculosis、Streptococcus pneumoniae、Bacillus anthracis、Vibrio cholerae、Plasmodium種（Pl. falciparum, Pl. vivaxなど）、Aspergillus種またはCandida albicansから選択される。抗原はまた癌細胞によって発現される分子（腫瘍抗原）であってもよい。抗原はまた抗原から得ることもできる。そのような抗原を得るプロセスは、病原体／癌細胞からの特定のタンパク質の精製、病原体の不活化並びにそのようなタンパク質のタンパク質加水分解的または化学的な誘導体化または安定化を含む。同様にして、腫瘍抗原（癌ワクチン）または自己免疫抗原を本発明に従ってポリカチオン性化合物とともに用いることができる。
【００１２】
本発明に従って用いるポリカチオン性化合物は、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すあらゆるポリカチオン性化合物であってよく、あるいはカチオン性リポソーム、ポリエチレンアミン、キトサン、ＤＮＡ導入に使用するポリカチオンなどの他のものであってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸、またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない（Goldmanら(1983)に記載のTuftsinを参照）。特に好ましいのは、ポリリジン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは５〜５００アミノ酸残基、とりわけ１０〜２００残基を含む。
【００１３】
これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、GanzおよびLehrer, 1999; Hancock, 1999に概説されている特性を有するポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい（AndreuおよびRivas, 1998; GanzおよびLehrer, 1999; Simmacoら、1998）。ペプチドはまた、デフェンシンのクラスに属していてよい（Ganz, 1999；GanzおよびLehrer, 1999）。そのようなペプチドの配列は、たとえば以下のインターネットアドレスの下に抗菌配列データベース（Antimicrobial Sequences Database）中に見出すことができる：
http://www.bbcm.univ.trieste. it/~tossi/pagl.html。
【００１４】
そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシンもまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を活性化（またはダウンレギュレーション）することを可能にする化合物はポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００１５】
本発明においてポリカチオン性物質として使用するのに特に好ましいのは、カテリシジン（cathelicidin）由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（Ａ１４１６／２０００、参照のため本明細書中に引用する）、とりわけ哺乳動物、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチドである。
【００１６】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはカテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質である。たとえば、マウスカテリンは、アミノ酸配列：ＮＨ2−ＲＬＡＧＬＬＲＫＧＧＥＫＩＧＥＫＬＫＫＩＧＯＫＩＫＮＦＦＱＫＬＶＰＱＰＥ−ＣＯＯＨを有するペプチドである。カテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、抗原および本発明による免疫原性ＯＤＮと組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫刺激物質を用いたまたは用いないワクチン製剤において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００１７】
本発明に従って用いることのできる他の好ましいポリカチオン性物質は、３〜７の疎水性アミノ酸のリンカーによって隔てられた少なくとも２のＫＬＫ−モチーフを含む合成ペプチドである（Ａ１７８９／２０００、参照のため本明細書中に引用する）。
上記のように、ポリカチオン性化合物は本発明に従い、個体の生体中での速やかな拡散ゆえの副作用が知られている薬剤とともに使用するのが好ましい。一般に、ポリカチオン性化合物およびゆっくりと放出する必要のある薬剤は、同じ時間に同じ部位でいっしょに投与する。本発明による組み合わせ医薬において、そのような薬剤は、たとえばポリカチオン性化合物と単に混合するか、または共有結合した医薬として提供することができる。
【００１８】
本発明に使用できる炎症を引き起こす可能性のある好ましい化合物は、免疫原性の核酸分子である。哺乳動物（およびおそらく全てではないにしても殆どの脊椎動物）の免疫系は、細菌を含む下等生物のＤＮＡを、おそらく病原体と宿主とのＤＮＡの構造上および配列使用上の差異ゆえに認識することが知られている。とりわけ、非脊椎動物に由来するＤＮＡの短いストレッチ、あるいはある種の塩基の前後関係での非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む短いオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の形態のものが標的にされる。ＣｐＧモチーフは細菌ＤＮＡでは予想された頻度で見出されるが、脊椎動物ＤＮＡでは遥かに低い頻度でしか見出されない。さらに、非脊椎動物（すなわち、細菌）のＣｐＧモチーフはメチル化されていないのに対して脊椎動物のＣｐＧ配列はメチル化されている。そのようなＣｐＧモチーフを含有するＯＤＮ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）は、単球およびＢ細胞を直接活性化することができる。その結果、ＣｐＧ−ＯＤＮによる単球およびＮＫ細胞の活性化は、Ｔｈ１型応答の誘発および細胞障害性Ｔ細胞の発生を促進する。さらに、そのような免疫原性ＯＤＮは、ワクチンアジュバントとして用いて特定の抗原に対する抗体応答を促進する（たとえば、ＥＰ０４６８５２０Ａ２、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７など）。
【００１９】
ＣｐＧ−ＯＤＮは抗原と組み合わせて動物に投与した場合に、ＣｐＧ−ＯＤＮ分子は、所望の作用を開始すべき投与部位において有効な最小濃度を達成することなく生体中を速やかに分散する。ポリカチオン性化合物は、これら分子が直ちに分散するのを抑制し、注射部位でのＣｐＧ−ＯＤＮの貯蔵部の生成を誘発すること、その結果、ＣｐＧ−ＯＤＮによって誘発される抗原特異的なインビボでの免疫応答の非常な長期化となること、を本発明の動物モデルにより示すことができた。それゆえ、このＣｐＧ−ＯＤＮモデルは、ポリカチオン性化合物の貯蔵部効果を示すうえで優れていた。ＣｐＧ−ＯＤＮを抗原と組み合わせて注射により投与すると、ＣｐＧ−ＯＤＮ分子は所望の効果の開始が望まれる投与部に有効な最小濃度をもたらすことなく生体中を速やかに分散する。ポリカチオン性化合物は、これら分子が直ちに拡散するのを抑制し、注射部位での抗原およびＣｐＧ−ＯＤＮの貯蔵部の生成を誘発すること、その結果、ＣｐＧ−ＯＤＮによって誘発される抗原特異的なインビボでの免疫応答の非常な長期化となることを示すことができた。
【００２０】
それゆえ、本発明の好ましい態様は、ポリカチオン性化合物とともに適用すべき医薬がさらに免疫原性オリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）、とりわけＣｐＧモチーフを含むＯＤＮ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、イノシン含有ＯＤＮ（Ｉ−ＯＤＮ）またはそれらの混合物または組み合わせを含むことを特徴とする。Ｉ−ＯＤＮは、たとえばオーストリア特許出願Ａ１９７３／２０００（参照のため本明細書に引用する）に記載されている。Ｉ−ＯＤＮとＣｐＧ−ＯＤＮとの混合物もまた、これら２つの原理の組み合わせ、たとえばＣｐＧモチーフを含むＩ−ＯＤＮと同様に提供できる。
【００２１】
本発明による貯蔵部効果の誘発は、もちろん、所定の投与部位で局所的に作用する必要のある薬理学的に活性な物質の場合に望ましい。それゆえ、本発明は、局所的に作用すべきであるのにこの部位から拡散や輸送プロセスによって生体中を容易に輸送および拡散されてしまう物質の場合に特に有利である。そのような物質としては、抗原、アレルゲン、サイトカイン、ケモカイン、免疫刺激性の核酸、細胞毒性の薬剤または抗血管形成剤または創傷の治癒に必要な化合物が挙げられる。
【００２２】
本発明の好ましい態様は、さもないと投与部位から速やかに拡散してしまう物質、すなわち、とりわけ投与部位に関してかなり短い薬理学的半減期を有する物質と組み合わせたポリカチオン性物質の使用に関する。それゆえ、速やかに拡散する好ましい物質は、とりわけ投与部位において１０分未満、さらに好ましくは５分未満、特に１分未満の薬理学的半減期（物質の濃度の半減）を有するものである。
【００２３】
好ましくは、貯蔵部効果を達成するためにポリカチオン性化合物とともに投与すべきそのような物質は、ポリカチオン性化合物に対してある種の親和性、すなわち、疎水性相互作用、水素架橋、静電的相互作用、極性または非極性の相互作用を示す。もちろん、貯蔵部効果は組み合わせ医薬製剤中での各成分の共有結合によっても達成されるが、薬剤とポリカチオン性化合物との非共有的相互作用が好ましい。
【００２４】
ポリカチオン性化合物およびＣｐＧ−ＯＤＮと抗原との同時投与は、ポリカチオン性化合物なしで注射したときに比べて抗原特異的な免疫応答の誘発を強力かつ相乗的に促進することが知られている（ＰＣＴ／ＥＰ０１／０００８７）。それは、排液したリンパ節から単離したＩＦＮ−γ産生細胞が多数であることに反映されている（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）。上記に記載したように、本発明に従い、抗原およびポリカチオン性化合物（一例としてポリアルギニンｐＲ６０を使用）とＣｐＧ−ＯＤＮとの混合物の１回の注射後に誘発されたこの強い局所免疫応答（第４日目／排液したリンパ節細胞）が、非常に長期間にわたって持続する全身的な免疫応答に変わることを示すことができた。本発明に従い、ＣｐＧ−ＯＤＮなどの物質がポリカチオン性化合物と複合体を形成する能力を、そのような化合物の全身的な分布およびその後の速やかな再吸収を防ぐのに用い、それによってそのような物質の特性の強力な長期化、たとえばＣｐＧ−ＯＤＮの免疫刺激特性の長期化をもたらすことができる。さらに、全身的な分布を防ぐことは、免疫刺激剤の有害な潜在的で全身的な副作用の誘発を回避する。
【００２５】
ＣｐＧ−ＯＤＮおよびポリカチオン性ペプチドを用いたこのモデルは、実施例のセクションでさらに記載および分析する。さらに、分析可能な医薬標的を提供するため、卵アルブミン由来ペプチド（ＯＶＡ257-264）をモデル化合物（モデル抗原）として用いる。
【００２６】
本発明はまた、インビボで遅延して放出する必要のある薬剤で患者を治療する方法であって、該薬剤を、該薬剤の貯蔵部効果を誘発するのに有効な量のポリカチオン性化合物とともに投与することを含む方法にも関する。
【００２７】
投与すべきポリカチオン性化合物の量は、個々の組成物の必要性および場合によりポリカチオン性ポリマーとともに投与すべき医薬に大きく依存する。ポリ−Ｌ−アルギニンおよびポリ−Ｌ−リジンの場合、ポリカチオンの好ましい量は、０.００１〜１０００μｇ／投与単位、さらに好ましくは０.１〜１０ｍｇ／投与量、とりわけ約０.１ｍｇ／２０ｇ体重（マウス）かまたはそれ以上またはヒトの等価量である。
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれら特定の態様に限られるわけではない。
【実施例】
【００２８】
本発明の実施例では、抗原とｐＲ６０およびＣｐＧ−ＯＤＮの混合物との１回の注射の後に誘発された強い局所的な免疫応答（第４日目／排液リンパ節細胞）が、最も重要なことには非常に長期間にわたって持続する全身的な免疫応答に変わることが示される（実施例１）。注射の第３７２日目（分析した最も遅い時点）でさえも、１００万の末梢血リンパ球当たり約５００の抗原特異的なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を検出することができる。この効果に対する一つの可能な説明は、ポリ−Ｌ−アルギニンとのＣｐＧ−ＯＤＮの複合体形成が、ＣｐＧ−ＯＤＮの全身的な分布およびその後のＣｐＧ−ＯＤＮの速やかな再吸収を防ぐというものである。それゆえ、このことはＣｐＧ−ＯＤＮの免疫刺激特性の強力な長期化という結果となる。
【００２９】
この仮定を調べるため、蛍光標識した化合物をいっしょにマウスの横腹に皮下注射した。この処理後の異なる時点で注射部位を標識化合物の存在について調べた。実施例２ａおよび実施例２ｂでは、ＯＶＡ257-264−ペプチド（非標識）、ポリ−Ｌ−アルギニン−ＦＩＴＣ（黄色）およびＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５（青色）を注射に用いた。ＯＶＡ257-264−ペプチドをポリ−Ｌ−アルギニン−ＦＩＴＣとともに注射した後、注射部位に貯蔵部（depot）の生成を検出することができた。ＯＶＡ257-264−ペプチドをＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５とともに注射すると、ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５の全皮膚にわたる分布という結果となった（実施例２ａ）。ＦＡＣＳ分析によって同時に決定されるように（実施例２ｂ）、ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５はまた二次リンパ性臓器（排液したリンパ節、脾臓）および非リンパ性組織（肺、肝臓、腎臓、心臓）でも検出することができる。対照的に、ＯＶＡ257-264−ペプチドおよびＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５をポリ−Ｌ−アルギニン−ＦＩＴＣとともに注射したときには、ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５はポリ−Ｌ−アルギニンによって生成される貯蔵部に限られていた（実施例２ａ）。これらマウスからのＦＡＣＳ分析（実施例２ｂ）から、ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５が注射部位での貯蔵部にポリ−Ｌ−アルギニンによって捕捉されるという事実のためにＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５は末梢では検出できないことを明らかにした。ポリ−Ｌ−アルギニン−ＦＩＴＣおよびＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５の両者がこの貯蔵部に注射後の少なくとも第９２日目まで（分析した最も遅い時点）検出することができる。この観察は、ペプチドおよびポリ−Ｌ−アルギニンとＣｐＧ−ＯＤＮとの組み合わせがペプチドおよびポリ−Ｌ−アルギニンの組み合わせに比べて貯蔵部でのはるかに一層長期間の存在に導いたことを意味している。実施例３では、ＴＲＰ−２181-188−ペプチド−ＦＩＴＣ（黄色）、ポリ−Ｌ−アルギニン−ＴＲＩＴＣ（赤色−バイオレット）、ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５（青色）を注射に用いた。ＴＲＰ−２181-188−ペプチド−ＦＩＴＣを単独かまたはＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５と組み合わせて注射したときには、該ペプチドは第４日目に注射部位で検出することができなかった。ポリ−Ｌ−アルギニン−ＴＲＩＴＣ単独の注射は、全皮膚にわたる分布という結果となった。ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５を単独かまたはＴＲＰ−２181-188−ペプチド−ＦＩＴＣと組み合わせて注射すると、ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５の全皮膚にわたる分布という結果となった。この実験はまた、ポリ−Ｌ−アルギニンを少なくとも１つのさらなる分子（ペプチドおよび／またはＣｐＧ−ＯＤＮ）とともに注射したときにポリ−Ｌ−アルギニンが貯蔵部の生成を誘発したことをも示している。
【００３０】
それゆえ、これら知見は、ポリ−Ｌ−アルギニンが、他の化合物（抗原および／または免疫刺激性ＣｐＧ−ＯＤＮ）が保持されている注射部位での貯蔵部を誘発することを意味している。ＯＶＡ257-264−ペプチド、ポリ−Ｌ−アルギニンおよびＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射の場合、この貯蔵部からのペプチドおよびＣｐＧ−ＯＤＮの両者のゆっくりとした放出は、おそらく補助細胞の持続的な活性化およびその後のＴ細胞の持続的な刺激によるものである。その結果、このことが１回の注射後に末梢で観察された多数の抗原特異的Ｔ細胞の長期間持続する存在に導くのである。
【００３１】
ＣｐＧ−ＯＤＮは、その強力な免疫刺激作用に加え、ＴＮＦ−αやＩＬ−６などの炎症促進性サイトカインの多量の全身的放出を誘発する（このことはショック症候群を誘発しうる（Sparwasser 1997, Lipford 1997））点で潜在的に有害な副作用を有することが記載されている。実施例２ａ、実施例２ｂおよび実施例３に記載するように、ＣｐＧ−ＯＤＮはポリ−Ｌ−アルギニンと組み合わせて注射した場合には全身的には存在しない。それゆえ、ポリ−Ｌ−アルギニンの同時投与がＣｐＧ−ＯＤＮによって誘発されるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の全身的な産生に影響を及ぼすか否かを調べた。両サイトカインの血清レベルを注射１時間後にＥＬＩＳＡにより決定した。実施例４は、ＯＶＡ257-264−ペプチド単独の注射もポリ−Ｌ−アルギニンと組み合わせた注射もともに血清中の有意の量のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の誘発に導くことはなかったが、一方、ＯＶＡ257-264−ペプチドをＣｐＧ−ＯＤＮと組み合わせて注射すると高濃度の両サイトカインを誘発することを示している。しかしながら、ＯＶＡ257-264−ペプチドをポリ−Ｌ−アルギニンおよびＣｐＧ−ＯＤＮとともに同時投与すると、このＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の全身的産生は完全に排除された。それゆえ、これらのデータを実施例２および実施例３に示す知見と合わせると、ポリ−Ｌ−アルギニンによって媒体された貯蔵部の生成によるＣｐＧ−ＯＤＮの局所化が、ＣｐＧ−ＯＤＮの全身分布およびその後の炎症促進性サイトカインの全身的放出を防いでいることが示される。
【００３２】
これと平行して、ポリ−Ｌ−アルギニンによるＣｐＧ−ＯＤＮの複合体形成が、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生に関してＣｐＧ−ＯＤＮによるマウス骨髄由来ＣＤ１１ｃ+樹状細胞の刺激にも直接影響を及ぼすことができるか否かを解明すべくインビトロ実験を行った。この目的のため、ＣＤ１１ｃ+樹状細胞をポリ−Ｌ−アルギニン、ＣｐＧ−ＯＤＮ、またはポリ−Ｌ−アルギニンとＣｐＧ−ＯＤＮとの組み合わせとともにインキュベートした（実施例５）。これら培養液からの上澄み液中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のレベルを決定した。ポリ−Ｌ−アルギニンとともにインキュベートした後にはＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のいずれも検出することができなかったが、一方、ＣｐＧ−ＯＤＮとともにインキュベートした後には有意の量の両サイトカインが産生される。印象的にも、ポリ−Ｌ−アルギニンの存在はこれら細胞によるＣｐＧ−ＯＤＮによって誘発されるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生を抑制した。
【００３３】
それゆえ、これら結果は、ポリ−Ｌ−アルギニンによるＣｐＧ−ＯＤＮの複合体生成が、炎症促進性サイトカインの全身的な放出のみならず局所的な放出をも抑制することを示している。その結果、ポリ−Ｌ−アルギニンのこれら有利な作用は、おそらく、ＣｐＧ−ＯＤＮによって誘発された制御されずかつ過剰な全身的および局所的な免疫応答を防ぐものである。
さらに、インビトロの実験は、ポリ−Ｌ−アルギニンがヒト樹状細胞によるポリイノシン酸−ポリシチジン酸によって誘発される炎症促進性サイトカインの産生をも抑制することを明らかにした。
【００３４】
それゆえ、これらの観察は、ポリ−Ｌ−アルギニンの一般的な抗炎症作用を示唆している。免疫原性であるが潜在的に有害な物質の投与のリスクは、おそらく、ポリ−Ｌ−アルギニンの同時投与によって最小にすることができる。そのような物質の速やかな全身分布は、全ての化合物が捕捉された貯蔵部を生成するポリ−Ｌ−アルギニンの特性によって防ぐことができる。さらに、ポリ−Ｌ−アルギニンによるこれら物質の複合体生成は、たとえば、毒性量の炎症促進性サイトカインの局所放出を抑制することができる。
【００３５】
実施例１：
卵アルブミン−ペプチド／ポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ６０）／ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせ投与は全身的かつ非常に長期間にわたって持続する強い抗原特異的な免疫応答の誘発に導く
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：ニワトリ卵アルブミンのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＯＶＡ257-264−ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）(Rotzschke, O.ら、Eur. J. Immunol. 1991 21(11): 2891-4）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００３６】
ポリＬ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：ＣｐＧモチーフ：tcc atg acg ttc ctg atg ctを含むチオホスフェート修飾オリゴジヌクレオチド：NAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００３７】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＯＶＡ257-264−ペプチド ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ ＋ ｐＲ６０
２．ＯＶＡ257-264−ペプチド ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ
３．ＯＶＡ257-264−ペプチド ＋ ｐＲ６０
【００３８】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。所定の時点で尾静脈により採血し、末梢血リンパ球（ＰＢＬＳ）をフィコール勾配を用いて単離した。ＰＢＬＳを、ワクチン接種に用いた抗原、培地（バックグラウンド）およびコンカナバリンＡ（正の対照）でエクスビボ刺激した。ＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴを記載に従って（Miyahiraら、1995）行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量をするために広く用いられている手順である。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表すスポットをカウントし、バックグラウンドスポットの数を全試料から差し引いた。ＣｏｎＡで刺激した後に多くのスポットが検出され（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な状態にあることを示していた。マウスの各実験群について図１にスポット数／１×１０6細胞を示す。
【００３９】
実施例２ａ：
ポリ−Ｌ−アルギニンは注射部位に貯蔵部の生成を誘発する
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：ニワトリ卵アルブミンのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＯＶＡ257-264−ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）(Rotzschke, O.ら、Eur. J. Immunol. 1991 21(11): 2891-4）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００４０】
ポリＬ−アルギニン６０−ＦＩＴＣ（ｐＲ６０−ＦＩＴＣ）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals。ポリ−Ｌ−アルギニンのフルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識のため、ポリ−Ｌ−アルギニンを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.９）に溶解した（１０ｍｇ／５００μｌ）。このポリ−Ｌ−アルギニン溶液に等量のＤＭＳＯ中の５倍モル過剰のＦＩＴＣ（Molecular Probes、ユージーン、オレゴン）を加えた。溶液を室温、暗所で２.５時間保持した。この混合物をＰＤ１０カラム（Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）にかけ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.９）を溶出液として用いて未反応の染料を分離した。ついで、溶液を２×５リットルのaqua dest.（ｐＨ７.４；０.１Ｍ ＨＣｌ）に対して一夜、透析した。凍結乾燥後、ポリ−Ｌ−アルギニンＦＩＴＣをaqua bidest.に１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解した。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８−Ｃｙ５：ＣｐＧモチーフ：tcc atg acg ttc ctg atg ctを含むチオホスフェート修飾、Ｃｙ５−標識オリゴジヌクレオチド：NAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００４１】
実験群（１匹のマウス／１群／指定した時点、３匹のマウス／２〜４群／指定した時点）
１．処理せず
２．ＯＶＡ257-264−ペプチド ＋ ｐＲ６０−ＦＩＴＣ
３．ＯＶＡ257-264−ペプチド ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８−Ｃｙ５
４．ＯＶＡ257-264−ペプチド ＋ ｐＲ６０−ＦＩＴＣ ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８−Ｃｙ５
第０日目にマウスの右横腹に上記化合物を含む全容量１００μｌを皮下注射した。注射後、所定の時点で被験動物を屠殺し、注射部位の写真を撮った（図２ａ）。
【００４２】
実施例２ｂ：
ポリ−Ｌ−アルギニンの同時投与はＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５の全皮膚にわたる分布を抑制する
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ポリ−Ｌ−アルギニン６０−ＦＩＴＣ（ｐＲ６０−ＦＩＴＣ）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。ポリ−Ｌ−アルギニンのフルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識のため、ポリ−Ｌ−アルギニンを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.９）に溶解した（１０ｍｇ／５００μｌ）。このポリ−Ｌ−アルギニン溶液に等量のＤＭＳＯ中の５倍モル過剰のＦＩＴＣ（Molecular Probes、ユージーン、オレゴン）を加えた。溶液を室温、暗所で２.５時間保持した。この混合物をＰＤ１０カラム（Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）にかけ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.９）を溶出液として用いて未反応の染料を分離した。ついで、溶液を２×５リットルのaqua dest.（ｐＨ７.４；０.１Ｍ ＨＣｌ）に対して一夜、透析した。凍結乾燥後、ポリ−Ｌ−アルギニンＦＩＴＣをaqua bidest.に１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解した。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８−Ｃｙ５：ＣｐＧモチーフ：tcc atg acg ttc ctg atg ctを含むチオホスフェート修飾、Ｃｙ５−標識オリゴジヌクレオチド：NAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００４３】
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８−Ｃｙ５：ＣｐＧモチーフ：tcc atg acg ttc ctg atg ctを含むチオホスフェート修飾、Ｃｙ５−標識オリゴジヌクレオチド：NAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００４４】
実験群（１匹のマウス／１群／指定した時点、３匹のマウス／２〜４群／指定した時点）
１．処理せず
２．ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８−Ｃｙ５
３．ｐＲ６０−ＦＩＴＣ ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８−Ｃｙ５
マウスの右横腹に上記化合物を含む全容量１００μｌを皮下注射した。注射１日後に被験動物を屠殺し、二次リンパ性臓器（排液リンパ節、脾臓）並びに非リンパ性組織（肺、肝臓、腎臓、心臓）からＦＡＣＳ分析を行った（図２ｂ）。
【００４５】
実施例３：
ポリ−Ｌ−アルギニンは少なくとも１つのさらなる分子と同時に注射したときに注射部位での貯蔵部の生成を誘発する
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Bloom, M. B.ら、J. Exp. Med. 1997 185, 453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識のため、ＴＲＰ−２181-188−ペプチドを１ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ７.９）に溶解した。このペプチド溶液に等量のＤＭＦ中の８倍モル過剰のＦＩＴＣ（Molecular Probes、ユージーン、オレゴン）を加えた。溶液を室温で４時間保持した。この混合物をＧ２５ゲル濾過カラム（Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）にかけ、水中の０.１％ＴＦＡを溶出液として用いて未反応の染料を分離した。ペプチド１モル当たり２モルのＦＩＴＣが導入されていた（Ｎ末端、リジンの側鎖）。投与量：１００μｇ／マウス。
【００４６】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０−ＴＲＩＴＣ（ｐＲ６０−ＴＲＩＴＣ）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。ポリ−Ｌ−アルギニンのＴＲＩＴＣ標識のため、ポリ−Ｌ−アルギニンを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.９）に溶解した（１０ｍｇ／５００μｌ）。このポリ−Ｌ−アルギニン溶液に等量のＤＭＳＯ中の５倍モル過剰のＦＩＴＣ（Molecular Probes、ユージーン、オレゴン）を加えた。溶液を室温、暗所で２.５時間保持した。この混合物をＰＤ１０カラム（Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）にかけ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.９）を溶出液として用いて未反応の染料を分離した。ついで、溶液を２×５リットルのaqua dest.（ｐＨ７.４；０.１Ｍ ＨＣｌ）に対して一夜、透析した。凍結乾燥後、ポリ−Ｌ−アルギニン−ＴＲＩＴＣをaqua bidest.に１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて溶解した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００４７】
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８−Ｃｙ５：ＣｐＧモチーフ：tcc atg acg ttc ctg atg ctを含むチオホスフェート修飾、Ｃｙ５−標識オリゴジヌクレオチド：NAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
実験群（１匹のマウス／第１群／指定した時点、３匹のマウス／２〜４群／指定した時点）
１．処理せず
２．ＴＲＰ−２181-188−ＦＩＴＣ
３．ｐＲ６０−ＴＲＩＴＣ
４．ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８−Ｃｙ５
５．ＴＲＰ−２181-188−ＦＩＴＣ ＋ ｐＲ６０−ＴＲＩＴＣ
６．ＴＲＰ−２181-188−ＦＩＴＣ ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８−Ｃｙ５
７．ｐＲ６０−ＴＲＩＴＣ ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８−Ｃｙ５
８．ＴＲＰ−２181-188−ＦＩＴＣ ＋ ｐＲ６０−ＴＲＩＴＣ ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８−Ｃｙ５
第０日目にマウスの右横腹に上記化合物を含む全容量１００μｌを皮下注射した。注射後、第４日目に被験動物を屠殺し、注射部位の写真を撮った（図３）。
【００４８】
実施例４：
ポリ−Ｌ−アルギニンの同時注射はＣｐＧ−ＯＤＮによって誘発されるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の全身的な産生をインビボで防ぐ
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：ニワトリ卵アルブミンのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＯＶＡ257-264（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）(Rotzschkeら、1991）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００４９】
ポリＬ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリＬ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：ＣｐＧモチーフ：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CTを含むチオホスフェート修飾オリゴデオキシヌクレオチド：NAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００５０】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＯＶＡ257-264
２．ｐＲ６０
３．ＣｐＧ１６６８ ＋ ＯＶＡ257-264
４．ＣｐＧ１６６８ ＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＶＡ257-264
【００５１】
マウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射１時間後、尾静脈から採血し、血清を調製した。血清中の炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の量を、サイトカイン特異的なＥＬＩＳＡにより製造業者（R&D Systems, Inc.、ミネアポリス、ミネソタ）の指示に従って決定した。
この実験は、ＯＶＡ257-264の単独またはポリ−Ｌ−アルギニンと組み合わせた注射が検出しうる量のＴＮＦ−αまたはＩＬ−６の産生を誘発しないことを示している（図４）。対照的に、ＯＶＡ257-264−ペプチドをＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８とともに注射するとＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の全身的な産生が誘発される。ペプチドおよびＣｐＧ−ＯＤＮをポリ−Ｌ−アルギニンと同時に注射したときには、ＣｐＧ−ＯＤＮによって誘発される炎症促進性サイトカインの産生は抑制された。
【００５２】
参照文献
【表１】
2004519452.tif 000002
【００５３】
【表２】
2004519452.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ポリ−Ｌ−アルギニン、ＣｐＧ−ＯＤＮおよび抗原の組み合わせ投与が、全身的かつ非常に長期間にわたって持続する強い抗原特異的な免疫応答を引き起こすことを示す。この図は、ＯＶＡ257-264−ペプチドでイクスビボで刺激した末梢血リンパ球を示す。
【００５５】
【図２ａ】ポリ−Ｌ−アルギニンが注射部位で貯蔵部の生成を誘発することを示す。この図は、ワクチン接種後の所定の時点で注射部位から撮った写真を示す。ワクチンの蛍光標識化合物を検出できる領域の周囲を白色線が囲んでいる。
【００５６】
【図２ｂ】ポリ−Ｌ−アルギニンの同時投与が、ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５の生体中の拡散を防ぐことを示す。この図は、ＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５（Ｂ）またはＣｐＧ−ＯＤＮ−Ｃｙ５およびｐＲ６０−ＦＩＴＣ（Ｃ）の注射後第１日目におけるリンパ性組織および非リンパ性組織のＦＡＣＳ分析を示す。非処理マウスを対照として用いた（Ａ）。
【００５７】
【図３】ポリ−Ｌ−アルギニンが、少なくとも１のさらなる分子と同時に注射したときに注射部位で貯蔵部の生成を誘発することを示す。この図は、ワクチン接種後第４日目に注射部位から撮った写真を示す。
【００５８】
【図４】ポリ−Ｌ−アルギニンの同時注射が、ＣｐＧ−ＯＤＮによって誘発されるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の全身的産生をインビボで防ぐことを示す。マウスの後肢に注射し、１時間後に血清を調製した。血清中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡにより決定した。
【図１】
2004519452.tif 000004
【図２ａ】
2004519452.tif 000005
【図２ｂ】
2004519452.tif 000006
【図３】
2004519452.tif 000007
【図４】
2004519452.tif 000008
【国際公開パンフレット】
2004519452.tif 000009
2004519452.tif 000010
2004519452.tif 000011
2004519452.tif 000012
2004519452.tif 000013
2004519452.tif 000014
2004519452.tif 000015
2004519452.tif 000016
2004519452.tif 000017
2004519452.tif 000018
2004519452.tif 000019
2004519452.tif 000020
2004519452.tif 000021
2004519452.tif 000022
2004519452.tif 000023
2004519452.tif 000024
2004519452.tif 000025
2004519452.tif 000026
2004519452.tif 000027
2004519452.tif 000028
2004519452.tif 000029
2004519452.tif 000030
2004519452.tif 000031
2004519452.tif 000032
2004519452.tif 000033
2004519452.tif 000034
2004519452.tif 000035
2004519452.tif 000036
2004519452.tif 000037
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004519452.tif 000038
【国際調査報告】
2004519452.tif 000039
2004519452.tif 000040
2004519452.tif 000041
2004519452.tif 000042
2004519452.tif 000043
2004519452.tif 000044