(57)【要約】記載されるのは、伝導心筋細胞富化細胞集団、並びに該集団を得るための方法および材料である。該集団を用いて、哺乳動物心筋組織に移植し、例えば生物学的ペースメーカーを提供することが可能である。やはり記載されるのは、心筋の損傷部分の収縮機能を改善するための回復性細胞心筋移植片、並びに生存心筋細胞のコーティングおよび所望により心筋細胞のためのキャリアーを含む、心臓移植に適応させた物品（例えば伝導ペースメーカーリード）である。
2004504807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多分化能細胞の分化によって得られる心筋細胞を含み、そして作業心筋細胞に比較して、伝導心筋細胞が富化された、細胞集団。
【請求項２】
前記細胞集団において、前記心筋細胞の少なくとも５０％が、伝導心筋細胞である、請求項１の細胞集団。
【請求項３】
伝導心筋細胞が、洞房結節細胞を含む、請求項１の細胞集団。
【請求項４】
伝導心筋細胞が、房室結節細胞を含む、請求項１の細胞集団。
【請求項５】
伝導心筋細胞が、洞房および房室結節細胞を含む、請求項１の細胞集団。
【請求項６】
伝導心筋細胞がまた、プルキンエ細胞も含む、請求項５の細胞集団。
【請求項７】
伝導心筋細胞が富化された細胞集団を得る方法であって：
他の細胞からの伝導心筋細胞の選択を可能にする伝導心筋細胞選択マーカーを所持するトランスジェニック多分化能細胞を提供し；
前記多分化能細胞の分化を引き起こし、前記伝導心筋細胞および他の細胞を形成し；そして
前記選択マーカーに基づいて、前記伝導心筋細胞を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項８】
前記伝導心筋細胞選択マーカーが、前記伝導心筋細胞で遺伝子の発現を引き起こすが、前記の他の細胞では引き起こさないプロモーターに融合された、陽性選択遺伝子を含む、請求項７の方法。
【請求項９】
陽性選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、そして前記選択が、前記伝導心筋細胞および他の細胞を抗生物質と接触させ、前記の他の細胞を殺すが、前記伝導心筋細胞を殺さないことを含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
プロモーターが、ｍｉｎＫプロモーターおよびコネキシン４０プロモーターからなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターがコネキシン４０プロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記プロモーターがｍｉｎＫプロモーターである、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記伝導心筋細胞選択マーカーが、前記の他の細胞で遺伝子の発現を引き起こすが、前記伝導心筋細胞では引き起こさないプロモーターに融合された、陰性選択遺伝子である心筋細胞選択マーカーを含み、そして前記選択が、前記伝導心筋細胞および他の細胞を陰性選択剤と接触させ、前記の他の細胞を殺すが、前記伝導心筋細胞を殺さないことを含む、請求項７の方法。
【請求項１４】
前記陰性選択遺伝子がＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子であり、そして前記選択が、前記伝導心筋細胞および他の細胞をガンシクロビルと接触させ、前記の他の細胞を殺すが、前記伝導心筋細胞を殺さないことを含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターがコネキシン４３プロモーターである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記伝導心筋細胞および他の心筋細胞を含む、一般的な心筋細胞集団の選択を可能にする心筋細胞選択マーカー、並びに他の心筋細胞からの前記伝導心筋細胞の選択を可能にする伝導心筋細胞選択マーカーを有する、前記多分化能細胞を提供し；
前記多分化能細胞の分化を引き起こし、心筋細胞を含む混合細胞集団を形成し；
第一に、一般的な心筋細胞選択マーカーに基づいて、前記混合集団から一般的な心筋細胞集団を選択し；そして
第二に、前記伝導心筋細胞選択マーカーに基づいて、一般的な心筋細胞集団から伝導心筋細胞集団を選択する
ことを含む、請求項１３の方法。
【請求項１７】
前記の一般的な心筋細胞選択マーカーが、心筋細胞で特異的に遺伝子の発現を引き起こす第一のプロモーターに融合された抗生物質耐性遺伝子を含み、そして前記の第一の選択が、混合細胞集団を抗生物質剤と接触させることを含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記伝導心筋細胞選択マーカーが、前記伝導心筋細胞以外の心筋細胞で遺伝子の発現を引き起こすが、前記伝導心筋細胞では引き起こさない第二のプロモーターに融合された陰性選択遺伝子であり、そして前記の第二の選択が、一般的な心筋細胞集団を陰性選択剤と接触させることを含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記陰性選択遺伝子がＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子であり、そして前記の第二の選択が、一般的な心筋細胞集団をガンシクロビルと接触させることを含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記の第二のプロモーターがコネキシン４３プロモーターである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
プロモーターに融合された選択遺伝子をコードするＤＮＡを有するトランスジェニック多分化能細胞であって、前記ＤＮＡが、作業心筋細胞に比較して、伝導心筋細胞が富化された細胞集団の選択を可能にする、前記多分化能細胞。
【請求項２２】
前記選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、そして前記プロモーターが、前記伝導細胞で特異的に遺伝子の発現を引き起こすか、または前記作業心筋細胞に比較して、前記伝導細胞で増進して引き起こす、請求項２１の細胞。
【請求項２３】
前記プロモーターがｍｉｎＫプロモーターである、請求項２２の細胞。
【請求項２４】
前記プロモーターがコネキシン４０プロモーターである、請求項２２の細胞。
【請求項２５】
前記選択遺伝子が陰性選択遺伝子であり、そして前記プロモーターが、前記作業心筋細胞で前記遺伝子の発現を引き起こすが、前記伝導心筋細胞では引き起こさない、請求項２１の細胞。
【請求項２６】
前記陰性選択遺伝子がＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子である、請求項２５の細胞。
【請求項２７】
前記プロモーターがコネキシン４３プロモーターである、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡが：
前記幹細胞から分化した、伝導および作業心筋細胞を含む、本質的に純粋な心筋細胞集団の選択を可能にする、一般的な心筋細胞選択マーカー；および
前記の本質的に純粋な心筋細胞集団からの、伝導細胞が富化された集団の選択を可能にする、伝導心筋細胞選択マーカー
を含む、請求項２１の細胞。
【請求項２９】
前記の一般的な心筋細胞選択マーカーが、心筋細胞で特異的に遺伝子の発現を引き起こす第一のプロモーターに融合された抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項２８の細胞。
【請求項３０】
前記伝導心筋細胞選択マーカーが、作業心筋細胞で遺伝子の発現を引き起こすが、伝導心筋細胞では引き起こさない第二のプロモーターに融合された陰性選択遺伝子である、請求項２９の細胞。
【請求項３１】
前記陰性選択遺伝子がＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子である、請求項３０の細胞。
【請求項３２】
前記の第二のプロモーターがコネキシン４３プロモーターである、請求項３１の細胞。
【請求項３３】
プロモーターに融合した選択遺伝子を含むＤＮＡを含む、多分化能細胞の形質転換に有用なベクターであって、前記ＤＮＡが、作業心筋細胞に比較して、伝導心筋細胞が富化された細胞集団の選択を可能にする、前記ベクター。
【請求項３４】
前記選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、そして前記プロモーターが、前記伝導心筋細胞で前記遺伝子の発現を引き起こすが、前記作業心筋細胞では引き起こさない、請求項３３のベクター。
【請求項３５】
前記プロモーターがｍｉｎＫプロモーターである、請求項３４のベクター。
【請求項３６】
前記プロモーターがコネキシン４０プロモーターである、請求項３５のベクター。
【請求項３７】
前記プロモーターがｍｉｎＫプロモーターである、請求項３４のベクター。
【請求項３８】
前記選択遺伝子が、前記作業心筋細胞で前記遺伝子の発現を引き起こすが、前記伝導心筋細胞では引き起こさないプロモーターに融合された、陰性選択遺伝子である、請求項４０のベクター。
【請求項３９】
前記陰性選択遺伝子がＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子である、請求項３８のベクター。
【請求項４０】
前記プロモーターがコネキシン４３プロモーターである、請求項３９のベクター。
【請求項４１】
哺乳動物の心臓をペーシングする方法であって：
胎児結節心筋細胞または胚性結節心筋細胞を含む細胞集団を提供し；そして
前記細胞集団を、前記哺乳動物の心筋組織に導入し、前記結節心筋細胞が前記心臓をペーシングする
ことを含む、前記方法。
【請求項４２】
前記結節心筋細胞が洞房結節細胞を含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記結節心筋細胞が房室結節細胞を含む、請求項４１の方法。
【請求項４４】
前記結節心筋細胞が、洞房および房室結節細胞を含む、請求項４１の方法。
【請求項４５】
前記細胞集団がまた、プルキンエ細胞も含む、請求項４１の方法。
【請求項４６】
哺乳動物の心筋に移植するための装置であって：
心筋へのｉｎ　ｖｉｖｏ移植に適応させた支持体；および
前記支持体上にコーティングされた生存心筋細胞
を含む、前記装置。
【請求項４７】
前記支持体が伝導リードである、請求項４６の装置。
【請求項４８】
前記伝導リード上のキャリアーマトリックス；および
前記キャリアーマトリックス中の生存心筋細胞
を含む、請求項４７の装置。
【請求項４９】
前記心筋細胞が胎児心筋細胞である、請求項４６の装置。
【請求項５０】
前記キャリアーマトリックスがゲルである、請求項４９の装置。
【請求項５１】
前記ゲルがコラーゲンゲルである、請求項５０の装置。
【請求項５２】
哺乳動物心臓の損傷心筋組織における細胞移植法であって：
哺乳動物の心筋組織に細胞を移植し、当該心筋組織は損傷を受けている；そして
前記移植が、損傷後の能動的肉芽形成および組織形成中に行われる
ことを含む、前記方法。
【請求項５３】
前記細胞が心筋細胞である、請求項５２の方法。
【請求項５４】
哺乳動物心臓の損傷心筋組織における細胞移植法であって：
哺乳動物の損傷心筋組織に細胞を移植し；そして
移植された細胞の領域を提供し、前記領域が非損傷心筋組織と接触し、そして前記損傷心筋細胞中に広がるように、前記移植が行われる
ことを含む、前記方法。
【請求項５５】
前記細胞が心筋細胞である、請求項５４の方法。
【請求項５６】
心筋細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ由来集団を含む細胞集団であって、作業心筋細胞に比較して、伝導心筋細胞が富化された、前記細胞集団。
【請求項５７】
前記細胞集団において、前記心筋細胞の少なくとも５０％が、伝導心筋細胞である、請求項５６の細胞集団。
【請求項５８】
伝導心筋細胞が洞房結節細胞を含む、請求項５６の細胞集団。
【請求項５９】
伝導心筋細胞が房室結節細胞を含む、請求項５６の細胞集団。
【請求項６０】
伝導心筋細胞が、洞房および房室結節細胞を含む、請求項５６の細胞集団。
【請求項６１】
伝導心筋細胞がまた、プルキンエ細胞も含む、請求項６０の細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、本明細書にその全体が援用される、米国仮出願第６０／１８８，５０７号、２０００年３月１０日提出の利益を請求する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、一般的に、心臓病学の分野に関し、そして特に、心筋細胞集団、並びに心筋細胞集団を得て、そして使用する方法に関する。
【０００３】
さらなる背景として、心臓の伝導系は、神経系からのシグナルと共に、他の器官から搬送される化学シグナルに反応して、心拍数を決定する。伝導系は、協調した様式で、心筋にインパルスを提供し、このインパルスは、心臓の多様な部分の協調した作用を容易にして、血液をポンピングする。この伝導系は、心筋の収縮を引き起こす、脱分極波の規則的な生成によって支持される。脱分極波の位置および頻度の協調は、心臓に、それ自体の必要性と共に、体の他の必要性に対する反応性を与えるのに不可欠である。
【０００４】
伝導系を損なう、多様な疾患または障害が知られる。したがって、心臓を「ペーシングする」概念が発展してきており、ペーシングの際には、刺激を心臓に供給し、脱分極波および付随する心臓の収縮を生成する。例えば、今日、十分な天然の心臓ペーシング機能を欠く患者において、電気機械的ペースメーカーを利用し、心臓に規則的な刺激を適用して規則的な心拍を促進することが一般的である。典型的な場合、ペースメーカーの電極を、右心室の尖部で、心筋組織中に移植し、そして残ったペースメーカー構成要素を、患者の皮膚の下、典型的には胸近傍に移植する。
【０００５】
こうした電気機械的ペースメーカーの使用は、いくつかの問題を提示してきている。例えば、こうしたペースメーカーの電池は、通常、数年後に消耗し、そしてこれが起こると、新たなパルス生成装置を移植しなければならない。さらに複雑な状況は、心臓に電極を移植する必要性から生じる可能性がある。例えば、包埋された電極の周囲に、しばしば線維症の領域が発展することが見出されてきている。この線維症は、リードと健康な心筋組織との情報交換を阻害し、そして心臓をペーシングするのに必要なシグナルの大きさを増加させる。その結果、パルス生成装置の電池が、より迅速に消耗し、そしてより頻繁に取り替えなければならなくなる。
【０００６】
電気機械的ペースメーカーを利用する際のさらなる不都合な点は、体の器官による酸素要求の変化に対して、ペースメーカーが反応性を欠くことに関連する。したがって、使用者の身体活動に関して、制限が課せられる。いくつかの運動および他の反応性ペースメーカーが開発されており、そして開発されつつあるが、この問題に対して、満足できる解決は、いまだに達成されていない。
【０００７】
電気機械的ペースメーカーの難点および欠点を考慮して、心臓病学の分野において、「生物学的ペースメーカー」を提供する概念が、ある期間、考慮されてきている。想像されるように、こうした生物学的ペースメーカーは、脱分極波を誘発して心臓をペーシングする、規則的なインパルスを提供するであろう、心臓上の生存組織の移植を伴うであろう。先行する研究において、生物学的ペースメーカーの目的を実現するため、まだいくつかの障害物を乗り越える必要がある。例えば、移植に適切で、そして有効な組織または細胞集団を、いまだ同定する必要がある。さらに、ペースメーカー移植片の長命および安定性に関連する問題に取り組む必要がある。
【０００８】
生物学的ペースメーカーの分野における研究の例として、米国特許第５，１０３，８２１号は、生物学的ペースメーカーのためのプロトコルを定式化する試みを記載する。特に、８２１号特許は、細胞が位置する右心房の心臓領域から、洞房結節細胞を採取することを提唱する。これらの細胞の除去は、少量の細胞を除去するが、右心房を穿通しない、小生検装置を含むカテーテルによって、達成される。８２１号の方法の次の工程は、採取した洞房結節細胞を培養し、より多量の細胞を生成することである。その後、移植カテーテルを用いて、心臓の右心室、特に電気機械的ペースメーカーでの経験によって、分極波を開始するのに好適であることが立証された位置である、右心室の尖部に、培養細胞を導入する。８２１号特許は、この方法が、心臓の天然ペーシングとほぼ同一に機能する生物学的ペースメーカーを患者に提供するであろうと提唱する。
【０００９】
８２１号特許に付随する困難は、経験によって、成人心筋細胞の培養は、簡単な努力では成功しないことが示されていることであり、そして実際、現在のところ、本発明の出願者は、８２１号特許に提供されるような方法の実行を可能にするであろうような、成人心筋細胞の培養に適した方法を知らない。
【００１０】
心臓の伝導系は、洞房結節細胞、房室結節細胞、およびプルキンエ細胞を含む、少なくとも３種類の細胞を伴うことが知られる。洞房結節は、主な心臓ペースメーカーであり、そして上大静脈および右心房の結合部に位置する。免疫組織化学的研究によって、洞房結節細胞は、心房筋細胞と明確に区別可能であり、各々、それ自体の特徴的な表現型を持つことが立証される。Ｐ．Ｗ．　Ｏｏｓｔｈｏｅｋら，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．７３，　Ｎｏ．３，　ｐｐ．４７６−４８１（１９９３）。房室結節は、結合組織に包埋された小さい心筋細胞で構成される。房室結節は、房室束の筋細胞と接触する、指状筋細胞で終結し、そしてプルキンエ細胞が、心筋中のプルキンエ線維のネットワークを形成し、これが作業（ｗｏｒｋｉｎｇ）心筋に興奮電流を搬送する。Ｐ．Ｗ．　Ｏｏｓｔｈｏｅｋら，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．７３，　Ｎｏ．３，　ｐｐ．４８２−４９１（１９９３）。こうした免疫組織化学的研究に加え、伝導系を含む心臓の発生の研究は、胚性幹細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化を伴ってきた。例えば、胚性幹細胞が、洞結節、心房、および心室の特性を持つ細胞に分化するのが観察されてきている。Ｖ．Ａ．　Ｍａｌｔｓｅｖら，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．７５，　Ｎｏ．２，　ｐｐ．２３３−２４４（１９９４年８月）；Ａ．Ｍ．　Ｗｏｂｕｓら，　Ａｎｎａｌｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　７５２，　ｐｐ　４６０−４６９（１９９５年３月）。
【００１１】
心臓病研究の別の領域は、心臓の収縮機能を回復するため、損傷心筋組織の診断および治療に関心を持つ。いくつかの状態が、作業心房または心室心筋細胞で構成される組織を損傷する。こうした状態には、例えば、冠状動脈遮断心筋梗塞またはそれに匹敵するものなどの虚血性異常に由来する組織壊死が含まれる。こうした損傷によって失われた収縮活性を再確立するための満足できる療法を開発する努力がなされてきているが、これらは、一般的に、存在する患者心筋細胞の非修復性特性によって妨げられてきている。
【００１２】
前述の背景に照らし、電気機械的ペースメーカーの使用を改善するか、補うか、または避ける必要性が存在する。さらに、ペーシングまたは収縮機能回復を提供するため、心筋組織を移植する改善された方法に関する必要性が存在する。これらの移植片を移植するのに有用な心筋細胞集団と共に、心臓のｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究、並びに薬理学的および毒性学的スクリーニングに関する、さらなる必要性が存在する。本発明は、これらの必要性に取り組む。
【００１３】
発明の概要
好ましい態様の１つにおいて、本発明は、心筋細胞を含み、そして作業心筋細胞に比較して、伝導心筋細胞が富化された、細胞集団を提供する。好ましくは、該集団の心筋細胞のうち、少なくとも５０％が、伝導心筋細胞、例えば洞房および／または房室結節細胞である。こうした集団は、（ｉ）他の心筋細胞からの伝導心筋細胞の選択を可能にする、伝導心筋細胞選択マーカーを含む、心筋細胞に分化する、胚性幹細胞などの多分化能細胞を提供し；（ｉｉ）多分化能細胞の分化を引き起こし；そして（ｉｉｉ）選択マーカーに基づいて、前記伝導心筋細胞を選択することを含む、本発明の方法によって、得ることが可能である。この方法において、選択マーカーは、陽性または陰性選択プロトコルを可能にしてもよく、実例となる選択マーカーには、抗生物質耐性遺伝子およびＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。これらの要素を組み合わせて、望ましい伝導心筋細胞集団が単一の選択で得られる、一工程選択プロトコルが達成可能であるし、または例えば、伝導心筋細胞および作業心筋細胞を含む、一般的な心筋細胞集団の最初の選択を可能にし、そしてまた、一般的な心筋細胞集団からの伝導心筋細胞富化集団の続く選択も可能にする、導入ＤＮＡを含む幹細胞を伴う、多工程選択プロトコルが達成可能である。
【００１４】
本発明はまた、プロモーターに融合された選択遺伝子を有するＤＮＡを含む、胚性幹細胞などのトランスジェニック多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）
（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）としても知られる）細胞であって、該ＤＮＡが、作業心筋細胞に比較して、伝導心筋細胞が富化された細胞集団の選択を可能にする、前記細胞も提供する。こうした幹細胞は、該ＤＮＡを含むベクターで、胚性幹細胞をトランスフェクションすることによって、構築可能である。こうした方法およびベクターもまた、本発明の態様を構成する。
【００１５】
本発明はまた、哺乳動物において、心臓をペーシングする方法であって、結節細胞を含む胎児心筋細胞の安定な細胞移植を、心臓で確立し、前記結節心筋細胞が該心臓をペーシングすることを含む、前記方法にも関する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、心臓病学研究に有用な動物モデルを提供する。特に、本発明は、心臓および心臓における胎児心筋細胞の安定移植片を有する非ヒト哺乳動物であって、該心筋細胞が他の心筋細胞に比較して、結節細胞が富化されている、前記哺乳動物を提供する。
【００１７】
本発明の別の側面は、哺乳動物の心筋の損傷局所部分に機能を回復する方法に関する。該方法は、局所部分に生存心筋細胞を移植することを含む。
本発明はまた、心筋組織へのｉｎ　ｖｉｖｏ移植に適応させた支持体、および該支持体上にコーティングされた生存心筋細胞を含む、装置にも関する。好ましい装置は、伝導リード、例えばペースメーカーリードである。装置はまた、縫合糸（ｓｕｔｕｒｅ）などの伸長フィラメントであってもよい。支持体は、心筋細胞で直接コーティングされてもよいし、または装置は、生存心筋細胞を所持する、支持体上にコーティングされたキャリアー、例えばゲルを含んでもよい。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明は、心筋細胞および多分化能細胞集団、並びに該細胞集団を得て、そして使用する方法を提供する。本発明はまた、関連するベクター、動物モデル、並びに心臓ペーシングおよび収縮活性回復のための移植法と共に、生存心筋細胞でコーティングされた心臓移植用の改善された物品も提供する。本発明は、それにより、慣用的な電気機械的装置の移植の際に、そしてこうした電気機械的装置を避けるかまたはその機能を補う際に、改善を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様、目的および特徴は、続く説明から明らかであろう。
好ましい態様の説明
本発明の原理の理解を促進する目的のため、ここで、その特定の態様に対する言及が行われるであろうし、そして特定の言い回しを用いて、該態様が説明されるであろう。にもかかわらず、それによって、本発明の範囲が限定されることは意図されず、本明細書に例示されるような、本発明の原理の改変、修飾およびさらなる適用が、本発明が関連する技術分野の当業者に、通常、思い浮かぶであろうように意図されることが理解されるであろう。
【００２０】
多分化能細胞および心筋細胞集団
上に開示されるように、本発明は、胎児伝導心筋細胞の富化された集団、並びに該集団を得て、そして使用するための方法および材料を特徴とする。これに関連して、本発明で利用される胎児伝導心筋細胞は、心臓において、脱分極波を確立するよう作用するペースメーカー細胞と一致する、電気生理学的特性を有するであろう。したがって、伝導心筋細胞は、一般的に、洞房（ＳＡ）結節細胞および／または房室（ＡＶ）結節細胞によって提示されるものなどの自動性（すなわち自発的収縮活性）を示すであろう。
【００２１】
伝導心筋細胞が実質的に富化された集団は、作業心房および心室心筋細胞などの、幹細胞が分化する他の心筋細胞から、伝導心筋細胞を選択するための手段を有する、遺伝子操作された多分化能細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、体細胞幹細胞、または他の多分化能細胞の分化によって、本発明の使用のために得ることが可能である。したがって、本発明の好ましい胚性幹細胞または他の多分化能細胞は、プロモーターに融合された選択マーカーをコードする、導入ＤＮＡを含み、該ＤＮＡが他の心筋細胞からの伝導心筋細胞の（陽性または陰性）選択に備えるであろう。これに関連し、当該技術分野に知られるように、陽性選択計画では、選択圧に対して、増加した生存可能性を与える選択マーカーを、選択しようとする細胞種で選択マーカーの発現を引き起こすが、除去しようとする細胞種では引き起こさないプロモーターに融合させる。したがって、例えば、本発明にしたがった、伝導心筋細胞富化集団を得るため、抗生物質または他の致死剤への耐性を与える遺伝子などの陽性選択遺伝子を、伝導心筋細胞で遺伝子の発現を引き起こすが、他の心筋細胞種では引き起こさないプロモーターに融合させる。伝導および他の心筋細胞を含む、分化した集団を、対応する選択圧、例えば抗生物質に供すると、最初の集団に比較して、生存伝導心筋細胞が富化されている、選択された集団が提供されるであろう。
【００２２】
一方、陰性選択計画では、選択圧の存在下で、細胞の生存可能性を減少させる選択遺伝子を用いる。この選択遺伝子を、選択しようとするもの以外の細胞種でその発現を引き起こすが、選択しようとする細胞では引き起こさないプロモーターに融合させる。その後、混合集団を選択圧に供し、最初の集団に比較して、選択される細胞種が富化された細胞集団を提供する。例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子が、陰性選択計画で一般的に用いられる。この遺伝子は、発現する細胞において、剤、ガンシクロビルへの感受性を与える。したがって、結節細胞心筋細胞が富化された集団を得るため、伝導心筋細胞では不活性であるが、他の心筋細胞で活性であるプロモーター、例えばコネキシン４３プロモーター（Ｏｏｓｔｈｏｅｋら，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．７３，　Ｎｏ．３，　ｐｐ．４７６−４８１（１９９３）；Ｏｏｓｔｈｏｅｋら，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．７３，　Ｎｏ．３，　ｐｐ．４８２−４９１（１９９３））に融合されたＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子などの陰性選択遺伝子を所持する胚性幹細胞または他の多分化能細胞を提供してもよい。幹細胞の分化は、伝導心筋細胞および他の心筋細胞、例えば作業心筋細胞を含む、混合集団を生じるであろう。陰性選択遺伝子、例えばＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子は、伝導心筋細胞では発現されないであろうし、したがって、該細胞は、陰性選択剤、例えばガンシクロビルに感受性でないであろう。陰性選択遺伝子は、他の心筋細胞（例えば作業心筋細胞）で発現されるだろうし、したがって、該細胞は、陰性選択剤、例えばガンシクロビルに感受性であろう。陰性選択剤の存在下で、伝導および他の心筋細胞を含む、混合心筋細胞集団をインキュベーションすると、他の心筋細胞が殺されるであろうが、伝導心筋細胞は殺されないであろう。その結果、伝導心筋細胞富化集団が得られる。
【００２３】
本発明の選択法は、少なくとも１つの選択工程が、他の心筋細胞に比較して、伝導心筋細胞の集団を富化する限り、一選択工程または多選択工程を含んでもよい。実例となる一工程選択は、選択プロトコルの状況において、伝導心筋細胞に特異的なプロモーターに融合された陽性選択遺伝子（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含む、胚性幹細胞と共に提供可能である（すなわち、プロモーターは、本質的に伝導心筋細胞においてのみ活性であり、そして選択の時点で、胚性幹細胞から分化しているいかなる他の細胞種でも活性でない）。この幹細胞を分化させ、伝導心筋細胞および他の細胞を含む集団を提供し、この集団を陽性選択圧（例えば対応する抗生物質剤）に供して他の細胞種を殺し、選択された生存伝導心筋細胞富化集団を残す。これらの目的のために使用可能な、実例となる陽性選択遺伝子には、ネオマイシンおよびハイグロマイシン耐性遺伝子が含まれる。これらの目的のための、実例となるプロモーター候補には、例えばｍｉｎＫプロモーターを含む、伝導心筋細胞に特異的であるか、または該細胞で増進されているプロモーターが含まれる。
【００２４】
実例となる多工程選択法として、幹細胞から分化する第一の集団を選択する手段、および第一の集団から第二の集団を選択する手段を有する、胚性幹細胞または他の多分化能細胞を提供してもよい。胚性幹細胞または他の多分化能細胞は、例えば、伝導および他の心筋細胞種を含む、一般的な心筋細胞集団を選択するための手段、およびその後、一般的な心筋細胞集団から伝導心筋細胞富化集団を選択するための手段を所持してもよい。例えば、多分化能細胞は、心筋細胞で活性であるが、他の細胞種で活性でないプロモーターに融合された抗生物質耐性遺伝子などの陽性選択遺伝子を所持してもよい。適切なこうしたプロモーターには、例えば、ベータ−ＭＨＣプロモーターが含まれ、そしてこうしたプロモーターを用いて、ＷＯ　９５／１４０７９（１９９５年５月２６日）に報告されるように、非常に精製された胎児心筋細胞集団を調製することが可能である。多分化能細胞はまた、伝導心筋細胞で不活性であるが、他の心筋細胞で活性であるプロモーターに融合された陰性選択遺伝子を含むよう操作してもよい。適切な陰性選択遺伝子には、例えばＨＳＶ−ＴＫ遺伝子が含まれる。これらの目的に適した候補プロモーターには、例えばコネキシン４３プロモーターが含まれる。その後、こうした幹細胞を分化させ、心筋細胞および他の細胞種を含む、最初の細胞集団を提供し、そして陽性選択圧を適用し、一般的な心筋細胞集団を選択することが可能である。その後、一般的な心筋細胞集団に陰性選択圧を適用し、伝導心筋細胞富化集団を選択することが可能である。
【００２５】
ｍｉｎＫプロモーターを用いて、結節細胞富化集団を得るのを容易にすることが可能である。ｍｉｎＫプロモーターは、心臓の伝導系に限定されるか、または少なくとも伝導系で増進される。Ｋｕｐｅｒｓｈｍｉｔら，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌ．　８４，　Ｎｏ．　２，　ｐｐ．１４６−１５２（１９９９年２月）。このプロモーターを、アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子などの選択遺伝子に融合させ、一般的に上述されるような胚性幹細胞または他の多分化能細胞の分化培養のＧ４１８選択を可能にする。クローン性非分化胚性幹細胞または他の多分化能細胞株を樹立した後、細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで分化させる。Ｇ４１８選択は、拍動細胞（すなわち心筋細胞）が観察されたら直ちに課する。伝導心筋細胞と一致するが、作業心室および心房心筋細胞と一致しない分子的および電気生理学的特性を持つ細胞の同定は、伝導心筋細胞がこのｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化法によって選択されることを確認し、そして伝導心筋細胞富化の度合いを決定するのを可能にする。例えば、伝導心筋細胞および作業心室および心房心筋細胞は、異なる活動電位プロフィールおよび／またはコネキシン発現パターンによって、互いに識別可能である。
【００２６】
結節細胞富化集団を得るためのさらなる方法において、ネオマイシン耐性遺伝子に融合されたアルファ−ＭＨＣプロモーターを含み、そしてまた、（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子に融合されたコネキシン４３プロモーターで構成される融合遺伝子を含む、胚性幹細胞などの多分化能細胞を提供する。多分化能細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化後、Ｇ４１８とインキュベーションすることによって、一般的な心筋細胞を選択する。その後、ガンシクロビルでの第二期の選択を開始する。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する細胞は、ガンシクロビルを取り込んで死ぬであろうが、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現しない細胞は生き残るであろう。コネキシン４３プロモーターは、心室および心房作業心筋細胞で活性であるため、これらの細胞は死ぬであろう。対照的に、伝導心筋細胞は、コネキシン４３を発現しないため、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現せず、そしてしたがってガンシクロビル選択で生き残るであろう。再び、選択された培養中での伝導心筋細胞富化の度合いは、分子的および電気生理学的解析を用いて、確かめることが可能である。
【００２７】
生物学的ペーシングのための細胞移植
上述のように得られた多分化能細胞由来伝導心筋細胞富化集団または胎児心筋細胞を用いて、例えば、生存哺乳動物において、生物学的ペースメーカーを生成することが可能である。一般的にいって、これは、心臓ペーシングが必要な哺乳動物（ヒト患者を含む）の心臓組織に多分化能細胞由来または胎児伝導細胞含有集団を移植し、移植された集団が心臓をペーシングすることを伴う。
【００２８】
これに関連し、右心房に位置するＳＡ結節細胞の塊は、正常に機能する心臓において、心臓のペーシングに関与する。この塊は、最初の脱分極波を生成するのに関与し、この波が究極的に心筋全体、並びに特に右心室壁および左心室壁を形成する心筋の収縮を生じる。典型的な周期において、ＳＡ結節細胞が、こうした脱分極波を開始し、この波は、波の前線が房室（ＡＶ）結節として同定される右心房中の細胞の別の小結節に到達するまで、右心房の筋肉組織を通じて伝播する。ＡＶ結節は、右心房の後部壁低部に位置し、そして左心室から右心室を分離する壁内を下方に進む。この分離壁中に伸びる、神経細胞に類似の長い線維が、ヒス束として知られる線維の束を形成し、そして分離壁の縦に沿ってＡＶ結節から伸長し、そして心室心筋のすべての部分に伸長する。
【００２９】
心臓の適切な機能は、ＳＡ結節から、右心房を通じ、そしてヒス束に沿って放射する、脱分極波に依存し、脱分極波は、ヒス束で、心臓下部の左心室および右心室の心筋を刺激し、筋肉組織の脱分極または収縮が、左心室および右心室においてポンピング作用を生じるであろう波パターンで進行するのを確実にする。
【００３０】
心臓疾患は、その結果、ＳＡ結節機能を損なわせる可能性があるか、あるいはＡＶ結節を取り囲む心房に損傷を与えるかまたは心房を中断させ、脱分極がＡＶ結節に到達しなくする可能性がある。これは、左心室および右心室への脱分極波を中断させる。他の損傷では、ヒス束またはその分枝で破断が起こり、その結果、ＳＡ結節によって生成された脱分極波が、均質でそして効率的な様式で、右心室および左心室に到達しない可能性がある。さらに他の症例では、脱分極波の完全な心臓遮断が起こる可能性がある。
【００３１】
本発明において、ペーシングに関して、心臓の機能を回復させるかまたは改善するため、ＥＳ由来または胎児伝導細胞を心臓に移植することが可能である。これを達成するため、伝導細胞を、天然ＳＡ結節またはＡＶ結節構造内、あるいは伝導系の他の場所に移植し、これらの構造の機能を補うことが可能である。あるいは、伝導細胞のペーシング移植片は、心臓の別個の領域に位置していてもよい。例えば、ペーシング移植片は、慣用的な電気機械的ペースメーカーのリードの移植に有効であることが見出された領域内に位置してもよい。例えば、これは、心臓の右心室、特に右心室の極尖部または極尖部近傍の位置を含む可能性がある。こうした位置は、電気機械的ペースメーカーで、心臓が血液をポンピングするのに有効な収縮活性を達成するため、刺激するのに有効な部位を提供することが見出されている。胎児またはＥＳ細胞由来伝導細胞移植片から、右心室および左心室の壁に沿って、均質にそして規則的な進行で放射する脱分極波を生成するように、右心室のこの位置または他の位置を選択する。移植法は、心臓の内部表面に、またはその近傍に細胞を移植するように、心臓のカテーテル処置を伴ってもよい。あるいは、細胞は、開胸法または潜在的に腹腔鏡法で、心臓の外表面に移植してもよい。特定の状況に応じて、例えばＳＡ結節を切除するかまたは別の方式で不活性化することによって、天然伝導系の機能を破壊する必要がある可能性がある。しかし、この工程は、可能な場合、避けるべきであることが想定される。
【００３２】
ヒトなどのより大きい哺乳動物では、移植片のペースメーカー活性を提供するため、細胞の何度かの注入または移植が必要である可能性がある。ヒトにおいて、予測される総移植片サイズは、約１０４から約１０７細胞またはそれ以上である。これらの確立された生存移植細胞は、１回または多数回の細胞移植によって、例えば一度に約１０８までまたはそれ以上の細胞を移植することによって、提供可能である。１つの好ましい様式において、移植は、一度に約２５０，０００までの細胞の多数回の移植（例えば注入）によって確立される。必要であれば、予備的手術後、１回またはそれ以上のさらなる手術を行って、移植片のサイズを増やし、その生物学的ペーシングまたは他の活性を最適化してもよい。
【００３３】
上述の伝導心筋細胞移植法に加え、移植心筋細胞および／または他の細胞を含む、遺伝子操作された細胞を用いて、移植の新規神経支配を促進することが可能である。特に、ペースメーカー移植片における新規神経支配は、新規神経支配を促進する増殖因子、例えば神経増殖因子（ＮＧＦ）（例えば米国特許第５，０８２，７７４号；第５，１６９，７６２号；第５，２７２，０６３号；および第５，２８８，６２２号を参照されたい）の発現をターゲッティングすることによって、達成可能である。実例となる実験において、ＮＧＦ発現カセットを骨格筋芽細胞（ＣＳＣ１２細胞）および／または線維芽細胞に導入し、安定形質転換細胞株を樹立し、そして生物学的に活性であるＮＧＦを生じる能力を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ神経突起成長アッセイで確かめる。新規神経支配の度合いを監視するため、遺伝子修飾された細胞を、成体同系宿主に移植する。移植の３週間後、動物を屠殺し、そして採取し、そして免疫組織学的解析のためプロセシングする。ｉｎ　ｓｉｔｕおよび抗ＮＧＦ免疫組織学的解析によって、ＮＧＦ融合遺伝子発現を監視する。交感および副交感ニューロンに関する免疫学的マーカーを用いると共に、組織学的検査および心臓カテコールアミン含量の測定によって、新規神経支配の度合いを評価する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、作業心臓調製を用いて、逆行性ニューロン標識実験を行い、心臓内の新生ニューロンの解剖学的起源を追跡する。すべての場合で、ＮＧＦ導入遺伝子を欠く、対応する移植片を、陰性対照として使用する。
【００３４】
このように、本発明のこのおよび同様の移植技術において、伝導心筋細胞富化集団は、それ自体、神経増殖因子などのタンパク質を搬送することが可能であるか、またはこうしたタンパク質を搬送する他の細胞と同時移植し、生物学的ペースメーカー移植片の確立および性能を最適化することが可能である。再び、免疫組織学的解析を用いて、新規神経支配の度合いを監視する。ｉｎ　ｖｉｖｏ解析のため、非浸潤技術によって、例えば１１−Ｃ−ヒドロキシエフェドリンなどの適切な画像剤を利用したＰＥＴスキャンによって、新規神経支配を監視することが可能である。こうした実験の陰性対照には、移植される細胞種（例えば筋芽細胞または線維芽細胞）を欠く移植片と共に、移植される細胞種を含むが、ＮＧＦ導入遺伝子を欠く移植片が含まれる。ひとたび、解剖学的新規神経支配の度合いが確認されたら、さらなる実験を行って、機能する神経支配の度合いを決定することが可能である。例えば、逆行性標識技術を用いて、心臓神経節へのペースメーカー移植片の連関（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を決定することが可能である。続く生理学的実験を用いて、ＡＶ結節活性が薬理学的におよび／または生理学的に遮断されている場合、ペースメーカー移植片が、自律神経制御を受けやすいことを確認することが可能である。
【００３５】
収縮性回復のための細胞移植片
本発明はまた、例えば虚血、無酸素症（ａｐｏｘｉａ）、低酸素症またはそれらに匹敵するものに由来する局所組織損傷から生じる損傷を患う心筋の領域に機能を回復するのに用いられる、細胞移植法にも関する。例えば、血餅などの冠状動脈の遮断または制限は、不適切な血液供給によって、動脈が供給する心臓の特定の領域の損傷を導く可能性がある。その結果、損傷領域は、該領域中の心筋組織の損傷または死亡を伴う可能性がある。こうした異常は、心臓の収縮機能および血液をポンピングする効率の減少を引き起こす。本発明にしたがって、こうした損傷の慣用的なフィブリン溶解性または他の療法後、心筋細胞または他の適切な細胞を用いた移植法を行って、損傷心筋領域に機能を回復することが可能である。
【００３６】
本発明の好ましい回復性移植片は、損傷心筋の領域に位置するかまたは該領域に隣接するだろうし、そして望ましくは、梗塞または他の損傷後、できる限り速やかに、活性肉芽組織形成中であるが、瘢痕形成および心筋薄化の前に、導入されるであろう。好ましい移植片は、損傷心筋に隣接する生存天然心筋に、物理的にそして電気的に連関される、心筋細胞を含むであろう。こうした連関は、例えば、移植細胞の組織化、並びに移植細胞自体の間、および移植細胞と天然心筋細胞の間の両方の新生結合複合体の形成によって、観察可能である。移植片に回復特性を提供するため、心筋細胞の何度かの移植が必要である可能性がある。これらは、例えば、各移植が約１０８までの細胞またはそれ以上を有する、細胞の１回またはそれ以上の移植によって提供可能である。好ましい方法において、移植は、約１０４から１０７細胞またはそれ以上の移植片サイズを達成するのに、一度に約２５０，０００細胞までの多数回の移植（例えば注入）によって確立される。好ましい移植において、少なくとも１回の細胞の移植は、移植細胞が、例えば心筋の損傷領域の周辺上の生存心筋組織と接触するように行われるであろう。より大きい損傷領域が関与する場合、移植される生存細胞で、損傷領域を実質的に取り囲むように、損傷領域の周辺で、細胞の多数回の注入または移植を行ってもよい。さらに、同一の手術処置または引き続く処置で行われる、続く移植において、先行する移植由来の細胞を、新規に確立された周辺として用いてもよく、そして領域に改善された機能性を提供するように、実質的に損傷心筋領域内に、または実質的に該領域全体に、生存連関心筋細胞を提供するように、移植を構築することが可能である。回復性移植のための１回または多数回の処置後、心臓の収縮機能の改善および心筋の損傷領域によって引き起こされる機能上の人為的結果（ａｒｔｉｆａｃｔ）の損失または減少に関して、患者を監視してもよい。こうした監視は、既知であり、そして虚血性または他の損傷心筋の検出および位置決定に用いられる、シグナルプロセシング方法論によって、行うことが可能である。
【００３７】
損傷心筋に機能を回復する能力は、本発明者による、ジストロフィーのイヌに対する開胸処置において、立証されている。特に、損傷心筋領域の機能回復は、ソノミクロメーター結晶の移植された対を用いた、部分長短縮の試験で観察されている（以下の実施例４を参照されたい）。ソノミクロメーター結晶間の注射によって、胎児心筋細胞の細胞移植を受けたイヌでは、続くドブタミン負荷に反応して、収縮性の５％の増加が観察された。一方、細胞移植を受けず、そしてその代わり、結晶間に生理食塩水の注射のみを受けたイヌでは、注入部分の損傷心筋の結果、該部分は、ドブタミン負荷中の収縮性の増加で反応しなかった。
【００３８】
心筋移植のための細胞界面
本発明の別の側面は、物品を修飾して心臓へのｉｎ　ｖｉｖｏ移植に適応させるための生存心筋細胞の使用に関する。例えば、１つの側面において、本発明は、例えば電気機械的ペースメーカー、除細動装置、またはそれらに匹敵するもののため、伝導リードおよび宿主心筋間の細胞界面を生成する手段を提供する。知られるように、伝統的なペースメーカーは、そのフィールドが、心室尖部の内心膜性表面の領域を刺激する、二極リードを通じた心室脱分極を活性化する。電気シグナルは、３６０℃を通じて消散するため、そしてリードおよび興奮可能心筋間に、しばしば線維症があるため、心臓脱分極を誘発するのにかなりの量のエネルギーが必要である。本発明において、伝導リードおよび興奮可能心筋間に細胞界面を構築する。特に、好ましい型で、本発明は、生存心筋細胞が浸透したキャリアーを含む伝導リードを提供する。キャリアーは、例えば、コラーゲンゲルなどのゲルであってもよい。リードは、心臓移植に知られるいかなるリードでもよく、例えば、直線状、らせん状、有棘（ｂａｒｂｅｄ）および他のリード種が含まれる。図１は、１つのこうしたリードを示す。特に、示されるのは、心臓組織への固定移植に適応させた装置１１である。装置１１は、キャリアー層１３でコーティングされた伝導リード１２を含む。キャリアー層１３は、心筋細胞の生存度を維持する、いかなる適切なキャリアー素材で形成されてもよい。好ましいキャリアーは、ゲル、例えばコラーゲンゲルであろう。キャリアー層に含まれるのは、生存心筋細胞１４である。伝導リードは、電気機械的装置１５、例えばペースメーカーのパルス生成装置に、電線１６を介して、電気的に連結される。
【００３９】
使用の際、キャリアー１３および心筋細胞を含むリード１２の先端を心筋に挿入し、生存心筋細胞１４および興奮可能心筋間の連関を容易にし、そして電気機械的装置１５を、患者に慣用的に移植する。パルス生成装置１５からのペースメーカー放電は、線維症領域を横断する必要がない（または線維症のより小さい領域しか横断する必要がない）ため、そして放電は、３６０℃の領域を通じて消散しないため、界面心筋細胞１４の刺激は、より低いエネルギー利用で達成可能である。宿主心筋の興奮は、宿主および界面心筋細胞（好ましくは胎児心筋細胞）間に形成される新生結合部複合体を通じて起動される。こうしたペースメーカーリード間の細胞界面の使用は、例えば、フィールド刺激に現在用いられる方法に比較して、心室脱分極を刺激するのに必要なエネルギーを減少させることが可能である。これは次に、現在の系の有用電池寿命を延長させることが可能である。
【００４０】
ここで図２を参照すると、示されるのは、コーティングされた生存心筋細胞２２を有する、伸長フィラメント２１、例えば縫合糸を含む、本発明の別の物品２０である。物品２０は、所望により、また、フィラメント２１への心筋細胞２２の接着を容易にする、キャリアー層２３（模型で示される）も含んでもよい；が、心筋細胞は、キャリアーがなくても表面に直接接着する、天然の傾向を有することが見出されている。物品２０は、例えば、フィラメント２１の縦に沿ってシグナルを伝達する能力を含む、心筋細胞２２の電気生理学的特性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究に有用である。これらの研究は、研究の状況において、および／または心筋細胞２２に対する毒性学的または薬理学的効果に関する剤のスクリーニングにおいて、行うことが可能であり、そして電気的シグナルを伝達する能力は、脱分極波への関与または脱分極波の開始と一致する。物品２１はまた、物品２１を心筋組織に移植して、シグナル伝達を同様に研究し、そして／または心臓における脱分極波開始の存在するパターンおよび／またはその伝播を修飾することによって、ｉｎ　ｖｉｖｏで使用可能である。例えば、物品２０は、２つの領域間にまたがるように、心筋に移植し、そしてこうして、その間にフィラメント状細胞移植片を提供することが可能である。こうした移植片はその後、２つの領域間のシグナル伝達を修飾し、例えば２つの領域間の脱分極の伝播の増進に関与して、心臓ポンピングの効率を改善するよう働く可能性がある。例えば、いくつかの状況では、例えば拡張型心筋症の治療において、ＳＡ結節領域から左心室壁にまたがるように、細胞配置フィラメントを移植してもよい。
【００４１】
本発明およびその利点のさらなる理解を促進するため、以下の特定の実施例を提供する。これらの実施例は、例であり、そして本発明を限定しないことが理解されるであろう。
【００４２】
【実施例】
実施例１
ＥＳ由来ペースメーカー細胞の選択
本実施例は、結節細胞を含む、心筋細胞下位細胞系譜が富化された細胞集団を得るための選択プロトコルを詳述する。薬剤耐性遺伝子（すなわちアミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ）に融合された心臓細胞系譜特異的プロモーター（すなわちアルファ−心臓ミオシン重鎖プロモーター）を用いて、ＥＳ細胞の分化培養において、心筋細胞の実質的に純粋な培養を選択することが可能であると示されてきている（各々本明細書に援用される、米国特許第５，６０２，３０１号およびＷＯ　９５／１４０７９を参照されたい）。分子および電気生理学的解析によって、作業心房および心室細胞、並びに伝導細胞に類似の特性を持つ細胞が、ＷＯ　９５／１４０７９に解説されるＧ４１８選択培養中に存在することが示されている。こうした分化細胞から心臓下位細胞系譜を選択するためのいくつかのプロトコルを以下に提供する。
【００４３】
Ａ．ＥＳ由来心室心筋細胞の単離
アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡの発現を駆動する、ＭＬＣ２ｖプロモーターを含む融合遺伝子を構築する。融合遺伝子はまた、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐＧＫ）−ハイグロマイシンカセットも含む。未分化ＥＳ細胞を、ＭＬＣ２ｖ−ｎｅｏ／ｐＧＫ−ハイグロ融合遺伝子でトランスフェクションする。トランスフェクション細胞は、まず、ハイグロマイシンに対する耐性によって選択し、そしてクローニングする。続いて、生じたクローン株をｉｎ　ｖｉｔｒｏで分化させ、そして心筋細胞分化が明らかになったら（すなわち拍動細胞が検出されたら直ちに）、Ｇ４１８選択に供する。生じた選択細胞の集団を、心臓および心室特異的マーカーに関して調べ、選択細胞集団における細胞系譜特異性の度合いを確かめる。調べるマーカーには、ＡＮＦ、ＭＬＣ２ａ、ＭＬＣ２ｖ、ａ−ＭＨＣ、β−ＭＨＣおよびｃＴｎＴが含まれる。心室心筋細胞と一致するが、心房および伝導心筋細胞に一致しない特性を持つ細胞、または比較的少ない心房および伝導心筋細胞の同定は、このｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化法によって、心室心筋細胞が富化された心筋細胞集団が選択可能であることを確認する。
【００４４】
Ｂ．ｍｉｎＫプロモーターを用いたＥＳ由来ペースメーカー細胞の単離
マウスｍｉｎＫ−βＧＡＬ融合遺伝子を構築する。心臓ｍｉｎＫプロモーターの細胞種特異性を確かめる慣用的方法論を用いて、この構築物でトランスジェニックマウスを生成する。ｍｉｎＫ−βＧＡＬ構築物を注入した胚から生じたマウスをスクリーニングし、トランスジェニックファウンダーを同定する。これらの動物を繁殖させ、そして胎児、新生、および成体トランスジェニック子孫において、βＧＡＬ活性パターンを監視する。これらの実験は、発現の時間的心臓特異的パターンを確認する。ｍｉｎＫ発現が伝導系に制限されるか、または該系で増進される場合、このプロモーターを、ＥＳ由来心筋細胞の選択にも用いる。再び、プロモーターをアミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子に取り込み、ＥＳ細胞分化培養のＧ４１８選択を可能にする。分子的および電気生理学的規準を用いて、伝導系選択の度合いを確認する。
【００４５】
Ｃ．二重選択計画を用いた、ＥＳ由来ペースメーカー細胞の単離
このプロトコルでは、ネオマイシン耐性遺伝子に融合されたα−ＭＨＣプロモーターで構成される導入遺伝子を用いて、心房、心室および伝導系起源の心筋細胞の混合集団を選択する。この系を二重選択計画に拡張し、非伝導系細胞を除去する。特に、作業心室および心房心筋細胞で活性であるが、結節細胞では活性でない、コネキシン４３プロモーターを用いる。コネキシン４３プロモーターおよび単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）で構成される融合遺伝子を、ＭＣＨ−ｎｅｏｒ構築物を所持するＥＳ細胞に導入する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化後、Ｇ４１８とのインキュベーションによって、心筋細胞を選択する。その後、ガンシクロビルを用いた第二周期の選択を開始する。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する細胞はガンシクロビルを取り込み、そして死ぬが、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現しない細胞は生き残る。コネキシン４３プロモーターは、心室および心房作業心筋細胞で活性であるため、これらの細胞は死ぬであろう。対照的に、結節細胞はコネキシン４３を発現せず、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現しないであろうし、そしてしたがって、ガンシクロビル選択で生き残るであろう。分子的および電気生理学的解析を行い、これらの選択された細胞培養における伝導細胞富化の度合いを確かめる。
【００４６】
Ｄ．コネキシン４０プロモーターを用いたＥＳ由来ペースメーカー細胞の単離
コネキシン４０はプルキンエ細胞で発現されるが、作業心筋細胞で発現されないことが研究によって示されてきている（Ｏｏｓｔｈｏｅｋ，　Ｐ．Ｗ．，　Ｓ．　Ｖｉｒａｇｈ，　Ｗ．Ｈ．　Ｌａｍｅｒｓ，およびＡ．Ｆ．　Ｍｏｏｒｍａｎ．　伝導系の免疫組織化学的描写ＩＩ：房室結節およびプルキンエ線維　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　７３：４８２−４９１，　１９９３；Ｏｏｓｔｈｏｅｋ，　Ｐ．Ｗ．，　Ｓ．　Ｖｉｒａｇｈ，　Ａ．Ｅ．　Ｍａｙｅｎ，　Ｍ．Ｊ．　ｖａｎ　Ｋｅｍｐｅｎ，　Ｗ．Ｈ．　ＬａｍｅｒｓおよびＡ．Ｆ．　Ｍｏｏｒｍａｎ．　伝導系の免疫組織化学的描写Ｉ：洞房結節　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　７３：４７３−４８１，　１９９３）。コネキシン４０プロモーター（Ｓｅｕｌ，　Ｋ．Ｈ．，　Ｐ．Ｎ．　ＴａｄｒｏｓおよびＥ．Ｃ．　Ｂｅｙｅｒ．　マウスコネキシン４０：遺伝子構造およびプロモーター解析　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１９９７．　Ｎｏｖ．１５．　４６：１２０−１２６，　１９９８）を利用して、ネオマイシン耐性発現カセットの発現を駆動する導入遺伝子を生成する。構築物は、ｐＧＨ−ハイグロｒベクター主鎖中に構築する。ＥＳ細胞を、コネキシン４０−ｎｅｏｒ／ｐＧＫ−ハイグロマイシン導入遺伝子でトランスフェクションする。２４時間後、細胞をハイグロマイシン選択に供する。ハイグロマイシン耐性クローンが十分に増幅されたら、分化するように培養を誘導する。拍動細胞が検出されたら直ちに（誘導８日後）、培養をＧ４１８選択に供する。
【００４７】
選択された培養を手にしたら、心筋細胞富化の度合いを確かめる。予備的実験において、Ｇ４１８選択培養をトリプシン消化し、そして個々の細胞の免疫細胞診断解析に適した密度で、コラーゲンでコーティングしたチャンバースライド上に再度蒔く。蒔いた２４時間後、心房限定プロモーターを用いた場合、細胞を筋節ミオシン心筋細胞富化に関してスクリーニングする。心筋細胞富化の度合いを確かめたら、コネキシン４０および４３特異的抗体を用いた免疫細胞診断解析を用いて、プルキンエ細胞の相対含量を確かめる。コネキシン４３および４０プローブを用いたノーザンブロット解析もまた、行う。ＭＨＣ−ｎｅｏｒまたはコネキシン４０−ｎｅｏｒ導入遺伝子いずれかを発現するＧ４１８選択心筋細胞からＲＮＡを調製する。選択プロトコルが期待されるように働くならば、コネキシン４０がコネキシン４０−ｎｅｏｒ培養における主な種類であるはずであり、そしてコネキシン４３がＭＨＣｎｅｏｒ培養における主な種類であるはずである。
【００４８】
Ｅ．心筋細胞単離に対する代替アプローチ
ニワトリ胚形成中、プルキンエ線維の発生は、作業心室心筋細胞の分化転換から生じることを示す、Ｔａｋａｓｈｉ　Ｍｉｋａｗａおよび協同研究者による最近の研究を、代替アプローチを用いて、利用可能である（Ｇｏｕｒｄｉｅ，　Ｒ．Ｇ．，　Ｙ．　Ｗｅｉ，　Ｄ．　Ｋｉｍ，　Ｓ．Ｃ．　ＫｌａｔｔおよびＴ．　Ｍｉｋａｗａ．　胚性心筋細胞のインパルス伝導プルキンエ線維へのエンドセリン誘導変換　ＰＮＡＳ　１９８８．　Ｊｕｎ．　９．　９５：６８−６８１５−６８１８，　１９９８）。これらの研究は、エンドセリン−１（ＥＴ−１、血管内皮細胞によって分泌される強力な血管収縮因子）が、この分化転換過程を促進することを立証した。したがって、ＭＨＣ−ｎｅｏｒ導入遺伝子を所持するＥＳ細胞の培養を、分化および選択プロトコル中にＥＴ−１で処理し、哺乳動物心筋細胞において、同様の分化転換過程が促進可能であるかどうか決定する。初期ネズミ胎児心筋細胞が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでプルキンエ細胞に分化転換する能力もまた、試験する。どちらの場合でも、培養をＥＴ−１に曝露する（最初の実験は、単純な用量／反応研究を必要とする）。処理後、培養からＲＮＡを調製し、そして相対作業心筋細胞対プルキンエ含量を、コネキシン４０および４３特異的プローブを用いたノーザンブロットによって、決定する。
【００４９】
実施例２
生物学的ペースメーカーを生成するための細胞移植
Ａ．生物学的ペースメーカーを生成するためのＥＳ由来伝導細胞の使用
一連の心臓移植実験は、生物学的ペースメーカーとしての細胞移植の有用性を立証する。結節細胞が富化された細胞集団を、実施例１Ｂ、１Ｃまたは１Ｄに記載されるように選択し、そして同系成体マウスの左心室に直接移植する。表面心電図記録を用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏで、実験中、心臓自動性を監視する。移植３週間後、心臓を採取し、そしてランゲンドルフ／作業心臓装置上に置く。機能する心臓は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、この装置上で３から４時間、維持可能である。ペースメーカー活性の解剖学的起源は、心外膜表面に置いたＥＣＧリードによって監視する。心臓遮断は、薬理学的に（灌流を介して）および／または外科的に（焼灼を介して）ＡＶ結節で誘導する。移植細胞が心室脱分極を作動させる能力は、心外膜ＥＣＧリードを通じて監視する。ペースメーカー活性を提供するのに最適な細胞数（伝導細胞中の常在βＧＡＬレポーターによって測定されるようなもの）および移植片の解剖学的位置を含む変数を、この系において確かめる。
【００５０】
Ｂ．生物学的ペースメーカーの新規神経支配を促進するための遺伝子操作された細胞の使用
さらなる一連の実験によって、移植片内の組換えＮＧＦの発現が新規神経支配を促進する度合いを決定する。心筋移植片を用いて、心筋に組換えタンパク質を搬送することが可能であり、そしてトランスジェニックマウスにおいて、異所性心臓ＮＧＦ発現が、過剰神経支配を導くことが知られる。ＮＧＦ発現構築物を骨格筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）に導入する。安定形質転換細胞株を樹立し、そして生物学的に活性であるＮＧＦを産生する能力を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ神経突起成長アッセイで確かめる。新規神経支配の度合いを監視するため、遺伝子修飾されたＣ２Ｃ１２細胞を、成体同系宿主に移植する。移植３週間後、動物を屠殺し、そして心臓を採取し、そして免疫組織学的解析のためにプロセシングする。ｉｎ　ｓｉｔｕおよび抗ＮＧＦ免疫組織学的解析によって、ＮＧＦ融合遺伝子発現を監視する。交感および副交感ニューロン両方に関する免疫学的マーカーを用いると共に、組織学的検査および心臓カテコールアミン含量の測定によって、新規神経支配の度合いを評価する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、作業心臓調製を用いて、逆行性ニューロン標識実験を開始して、心臓内の新生ニューロンの解剖学的起源を追跡する。すべての場合で、ＮＧＦ導入遺伝子を欠く筋芽細胞移植片を、陰性対照として使用する。
【００５１】
ＮＧＦ発現細胞を、選択されたペースメーカー細胞と同時移植する、さらなる一連の実験を行う。これらの実験は、ＮＧＦ発現が異所性移植部位内のペースメーカー細胞の神経支配を促進するレベルを決定する。再び、免疫組織解析は、新規神経支配の度合いを決定する。陰性対照は、筋芽細胞を欠く移植片と共に、ＮＧＦ導入遺伝子を欠く筋芽細胞を含む移植片が含まれる。
【００５２】
さらなる実験を開始して、機能的神経支配のレベルを決定する。これらの実験は、逆行性標識技術を利用して、ペースメーカー移植片が心臓神経節と連関する度合いを決定する。続く生理学的実験は、ペースメーカー移植片が、ＡＶ結節活性が薬理学的におよび／または生理学的に遮断されている場合、自律神経制御を受けやすい度合いを決定する。
【００５３】
実施例３
ペースメーカーリードおよび宿主心筋間の細胞界面の生成
伝統的なペースメーカーは、そのフィールドが、心室尖部の内心膜性表面の領域を刺激する、二極リードを通じた心室脱分極を活性化する。電気シグナルは、３６０°を通じて消散するため、そしてリードおよび興奮可能心筋間に、しばしば線維症があるため、心臓脱分極を誘発するのにかなりの量のエネルギーが必要である。本実験において、ペースメーカーリード電線および興奮可能心筋間で、細胞界面を構築する。これは、心筋細胞、例えば本明細書および／またはＷＯ　９５／１４０７９に記載されるように、分化ＥＳ細胞から得られる胎児心筋細胞が浸透したコラーゲンゲルプラグで終結する絶縁鉄線からなるであろう。このリードの尖端を、心筋に挿入し、心筋細胞および興奮可能心筋間の連関を容易にする。ペースメーカー放電は、線維症領域を横断する必要がない（または線維症のより小さい領域しか横断する必要がない）ため、そして放電は、３６０°の領域を通じて消散しないであろうため、界面ＥＳ由来心筋細胞の刺激は、はるかにより低いエネルギー利用で達成可能である。宿主心筋の興奮は、宿主および界面心筋細胞間に形成される新生結合部複合体を通じて起動される。
【００５４】
実施例４
回復性細胞移植
本実施例において、細胞移植を用いて、心筋の損傷領域に機能を回復することが可能であると立証される。開胸法で、麻酔したＣＸＭＤ（ジストロフィー）イヌの心筋壁上、ソノミクロメーター結晶を１．５ｃｍ離して置いた。ベースライン収縮性測定値を記録した。その後、ランゲンドルフ装置上での逆行性コラゲナーゼ灌流によって調製した雑種胎児心筋を、ソノミクロメーター結晶間の心筋に直接注入した。３週間の回復期後、ベースライン収縮性を再評価した。さらに、ドブタミン負荷（２０μｇ／ｋｇ／分および４０μｇ／ｋｇ／分）に反応した収縮性もまた、記録した。
【００５５】
血行力学的パラメーターの評価は、心臓が、示されるように、ドブタミン負荷に全体的に反応したことを示した（以下の表１を参照されたい）。
表１
【００５６】
【表１】
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【００５７】
反復測定ＡＮＯＶＡ後、スチューデント・ニューマン−クルーズ検定。
データは平均±１標準偏差として表す。
＃ｐ＜０．００１　対ベースライン
＊ｐ＜０．０１　対ドブタミン２０μｇ／ｋｇ／分
§ｐ＜０．００１　対ドブタミン２０μｇ／ｋｇ／分
収縮性に対するドブタミンの効果を測定するため、以下の式：
Δ％ＳＳ＝［（ドブタミン後ＳＳ−ドブタミン前ＳＳ）／ドブタミン前ＳＳ］ｘ１００
にしたがって、各ソノミクロメーター対に関して、部分長短縮を、ドブタミン前値に対して規準化した。
【００５８】
この研究は、対照（注入なし）、偽移植（生理食塩水大量（ｂｏｌｕｓ））および細胞移植（細胞性大量）を比較した。対照および細胞移植片群では、収縮性に約５％の増加（Δ％ＳＳとして測定されるようなもの）が観察された。対照的に、大量生理食塩水注射を受け、そしてしたがって針障害による局所損傷に供された偽手術動物において、Δ％ＳＳの増加は観察されなかった。４０μｇ／ｋｇ／分の灌流実験の場合、この相違は、統計的に有意であった。したがって、細胞移植を用いて、心筋の損傷領域に機能を回復させることが可能であると明示された。
【００５９】
実施例５
心筋細胞植え付けフィラメントの構築
胎児イヌ心筋細胞を用いた研究において、プレートの底からおよそ５ｍｍ上で、ペトリ皿に付着させた２つの金属棒の間に、縫合糸をつるした。その後、縫合糸が浸るように、胎児心筋細胞の分散細胞調製をプレートに蒔いた。その後、培養をインキュベーターに入れ、インキュベーター中で、プレートを穏やかな攪拌に供した。２４時間後、培地を交換し、そして非接着細胞を除去した。胎児心筋細胞が、縫合糸上に植え付けられたのを観察した。培養３日後、植え付け縫合糸上で、律動性収縮を観察した。図３は、これらの植え付け縫合糸の典型的なものを示す。
【００６０】
実施例６
心筋細胞植え付けフィラメントの実例となる使用
ＥＳまたは胎児由来プルキンエ細胞を入手したら、我々は「人工的プルキンエ線維」を生成するであろう。一連の実験を行い、植え付け法を最適化するであろう。これには、分化後に植え付けるタイミング、細胞濃度を変化させる影響、縫合糸素材の最適化（すなわちコラーゲンコーティング、フィブロネクチンコーティングなど）、および培養攪拌の最適化（回転対ロッキング、速度など）を試験する、いくつかの簡単な実験を含むであろう。実験終点は、植え付けが成功した縫合糸の割合の測定と共に、縫合糸上の細胞の厚みの測定からなる。縫合糸が、活動電位を伝播する能力もまた、試験する。最初のスクリーニングの試みでは、これは、単に、縫合糸に沿った細胞の収縮を監視することによって、容易に達成される。さらに、活動電位伝播の定量的監視は、電位感受性色素を用いて行う。微小電極記録もまた行う。必要な場合、細胞外電極を持つ構造物の端に、細胞を置き、そして活動電位伝播を監視する。
【００６１】
活動電位の伝播が可能な植え付け縫合糸を生成したら、マルチチャンバースライド上の隣接するチャンバーにおいて、初代心筋細胞培養間の収縮を同調させるよう設計された実験で、これらの縫合糸を用いる。この目的に向け、２つのチャンバーを分ける障壁を渡って、植え付け縫合糸を掛け、そして初代心筋細胞を各チャンバーに植え付ける。縫合糸が、培地に完全に浸ることを可能にするように、障壁（ｄａｍ）を修飾する（下げる）。細胞が接着し、そして自動性を示した後、培養の自発的速度を越える速度で、１つのチャンバーの細胞を（細胞外電極を用いて）ペーシングする。細胞外電極記録は、非ペーシングチャンバーの細胞と同時に得る。植え付け縫合糸が活動電位を伝播することが可能であれば、非ペーシングチャンバー中の細胞は、ペーシングチャンバー中のものと同一の速度で収縮するはずである。
【００６２】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでペーシングを作動するのに適した、植え付け縫合糸の生成の確立に成功したならば、植え付け縫合糸上に存在する細胞が、ｉｎ　ｖｉｖｏで生存可能であるか決定する実験につながるであろう。この目的に向け、植え付け縫合糸の短い部分を、同系成体マウス心臓表面に固定する。縫合糸の端を、心外膜表面に挿入する（３０ゲージシリンジ針で産生した小さい穴に、端を「埋める」ことによる）。縫合糸の中央領域を、心臓の心外膜表面に自由に横たわらせる。移植３週間後、心臓を除去し、そして縫合糸上の細胞の生存度を、組織学的解析によって監視する。縫合糸の存在に対するいかなる炎症性反応も、標準的組織化学（Ｈ＆Ｅ、マッソンの３色）および免疫組織像（抗マクロファージ、抗白血球など）によって監視する。
【００６３】
生存縫合糸移植物が得られたら、ペーシング適用のための使用を評価する。この目的に向け、マウス心臓の左心房および左心室間に、短い植え付け縫合糸を固定する。回復後、Ｅｌ　Ｓｈｅｒｉｆおよび協同研究者に記載されるように（先天性心臓遮断の子供の母由来の血清および免疫グロブリンＧは、ラット心臓モデルにおいて、伝導異常を誘導し、そしてＬ型カルシウムチャネルを阻害する　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　１９９８．　Ｊｕｌ．　４４：１１−１９，　１９９８）、抗ＲＨＯ抗体での処置によって、完全Ａ−Ｖ遮断を誘導する。その後、動物に挿管し、開胸し、そして心室の自発的速度より速い速度で、刺激電極を用いて、右心房をペーシングする。これらの動物における心室の同調ペーシング（しかし植え付け縫合糸を欠く対照でも、また非植え付け縫合糸を用いた対照でも見られない）は、植え付け縫合糸が左心房および左心室と電気的に連関していることを示すであろう。同様の実験はまた、イヌで行ってもよい。
【００６４】
本明細書に引用されるすべての刊行物は、当該技術分野の技術レベルを示し、そして、各々が個々に援用され、そして完全に示されるように、本明細書に援用される。
【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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