(57)【要約】本発明は、未還元および過剰還元メイタンシノイドの混合物からのメイタンシノールの製造方法に関する。メイタンシノールは細胞結合／メイタンシノイド剤複合体の調製に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ、アルミナ、ジルコニア、二酸化チタンまたは化学的に修飾したシリカ固定相の順相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりメイタンシノールを分離することによる、未還元および過剰還元されたメイタンシノイドを含む混合物からのメイタンシノールの製造方法。
【請求項２】
固定相がシリカであり、ハロゲン化炭化水素：脂肪族エステル：アルカノール移動相で溶出される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
未還元および過剰還元されたメイタンシノイドを含む混合物からのメイタンシノールの製造方法であって、５０〜７０Åの平均細孔径、０．８〜１．２ｍＬ／ｇの細孔容量、５００〜６００ｍ２／ｇの表面積、０．５ｇ／ｍＬの充填密度、１０％未満の乾燥減量、５％水性スラリーｐＨ４．０〜５．５、６０ｐｐｍ未満のナトリウム含有量、１００ｐｐｍ未満のアルミニウム含有量、８０ｐｐｍ未満の鉄含有量、８０ｐｐｍ未満のカルシウム含有量、２５ｐｐｍ未満の硫化物含有量および２５ｐｐｍ未満の塩化物含有量を有し、５０％のジクロロメタン：３９．３％の酢酸エチル：１０．７％の２−プロパノールの移動相で溶出する、角粒子多孔質アモルファスシリカゲル固定相のＨＰＬＣによりメイタンシノールを分離することを含む方法。
【請求項４】
固定相が５、１０、２０、４０、８０または１５０μｍの粒度を有する請求項３記載の方法。
【請求項５】
固定相がＳｉｌｉｃｙｃｌｅ ＩＭＰＡＱ（登録商標）である請求項３記載の方法。
【請求項６】
未還元および過剰還元されたメイタンシノイドを含む混合物からのメイタンシノールの製造方法であって、６０Åの平均細孔経、約０．９ｍＬ／ｇの細孔容量、約７００ｍ２／ｇの表面積、約０．４ｇ／ｍＬの嵩密度、１５％の水性スラリーｐＨ６．５〜７．５、０．０２％未満の鉄含有量および０．０２％未満の塩化物含有量を有し、３０％のジクロロメタン：５５％の酢酸エチル：１５％の２−プロパノールの移動相で溶出するシリカゲル固定相のＨＰＬＣによりメイタンシノールを分離することを含む方法。
【請求項７】
固定相がＭｅｒｃｋ ＬＩＣＨＲＯＳＰＨＥＲ（登録商標）Ｓｉ６０である請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法により製造されるメイタンシノール。
【請求項９】
請求項１記載の方法により製造されるメイタンシノールを、細胞結合剤メイタンシノイド複合体に変換することにより製造される細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項１０】
細胞結合剤が抗体である請求項９記載の細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項１１】
請求項３記載の方法により製造されるメイタンシノール。
【請求項１２】
請求項３記載の方法により製造されるメイタンシノールを、細胞結合剤メイタンシノイド複合体に変換することにより製造される細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項１３】
細胞結合剤が抗体である請求項１２記載の細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項１４】
請求項６記載の方法により製造されるメイタンシノール。
【請求項１５】
請求項６記載の方法により製造されるメイタンシノールを、細胞結合剤メイタンシノイド複合体に変換することにより調製される細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【請求項１６】
細胞結合剤が抗体である請求項１５記載の細胞結合剤メイタンシノイド複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は高速液体クロマトグラフィーを用いるメイタンシノールの製造方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
高細胞毒性メイタンシノイド薬剤およびそれらの治療的使用が、米国特許第５，２０８，０２０号に記載されている。これらの薬剤は、アンサマイトシン前駆体から順次調製されるメイタンシノール誘導体から調製することができる。
【０００３】
多くの関連するアンサマイトシンは、アクチノシンネマ・プレトシウム（Actinosynnema pretosium）のようなアクチノシンネマ種から、特定の培養条件下で製造することができる。アクチノシンネマ種からのアンサマイトシンの産生方法は、米国特許第４，１６２，９４０号；第４，２２８，２３９号；第４，３５６，２６５号；および第４，４５０，２３４号に記載されている。
【０００４】
メイタンシノールは、アンサマイトシンＣ−３エステルの還元的開裂により調製することができる。還元した後、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体のような化合物を生産するのにさらに誘導体化するために、反応混合物からメイタンシノールを精製する必要がある。
【０００５】
反応混合物からのメイタンシノールの一般的な精製方法は、抽出、蒸留、結晶化またはオープンカラムクロマトグラフィーを含みうる。一般的に、オープンカラムクロマトグラフィーが最も純粋な物質を与えるが、治験スケールから生産スケールに拡張することが困難である。直面する問題としては、再生不可能な試料導入、カラムヘッドの能率の変動、サイクル時間の変動、オペレーターに依存する生成物の質および収率の変動、すべてのプロセスに対する費用便益の低さが挙げられる。かくして、メイタンシノールを精製するための分取クロマトグラフィー法を、再生可能に、および拡張可能にする必要がある。
【０００６】
（発明の概要）
本発明の一の態様は、シリカ、アルミナ、ジルコニア、二酸化チタンまたは化学的に修飾したシリカ固定相の順相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりメイタンシノールを分離することによる、未還元および過剰還元されたメイタンシノイドを含む混合物からのメイタンシノールの製造方法である。
【０００７】
（図面の簡単な説明）
図１は、シリカゲル固定相でのメイタンシノールのクロマトグラフィー分離を示す。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
限定するものではないが、特許および特許出願を含む本明細書に記載されているすべての刊行物は、出典明示して本明細書に組み入れる。
【０００９】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、「高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）」なる用語は、液体移動相により移動させられる化学混合物を、成分が固定固体相の周囲、全体にわたって流れ、または向流する場合に成分の分配率が異なることを利用して、その成分に分離する方法を意味する。移動相は、１〜４００バールの圧力下で０．００１〜５０ｃｍ／ｓの流速を有する、単一成分または多成分、例えば水、有機溶媒、臨界未満または臨界超過溶媒から構成され得る。固定固体相は、球形または不規則な形である、１〜１００μｍのシリカ、アルミナ、ジルコニア、二酸化チタンまたは化学的に修飾されたシリカの粒子であり得る。
【００１０】
シリカ、アルミナ、ジルコニア、二酸化チタンまたは化学的に修飾したシリカ固定相の順相ＨＰＬＣによりメイタンシノールを分離することによる、未還元および過剰還元されたメイタンシノイドを含む混合物からのメイタンシノール（ＩＩ）の製造方法を提供する。
【００１１】
スキームＩに示すように、アンサマイトシンＰ−１（Ｉａ）、Ｐ−２（Ｉｂ）、Ｐ−３（Ｉｃ）、Ｐ−３’（Ｉｄ）、Ｐ−４（Ｉｅ）およびＰ−４’（Ｉｆ）としても知られている、メイタナシン（maytanacine）のようなＣ−３アシル側鎖を有するメイタンシノイドエステルは、還元加水分解を受け、Ｐ−０形態として知られているメイタンシノール (II)を生成する。
【００１２】
【化１】
2004526734.tif 000002
【００１３】
還元加水分解反応は、以下のように行うことができる。メイタンシノイドＣ−３エステル（Ｉａ−ｆ）を無水溶媒中に溶解し、ついで、不活性ガス雰囲気下に置き、冷却する。好ましくは、メイタンシノイドＣ−３エステルはメイタナシン（Ｉａ）またはアンサマイトシンＰ−３（Ｉｃ）である。メイタナシン（Ｉａ）は、Kupchanらの J. Org. Chem. 42, 2349-2357 (1977)に記載のように得ることができる。アンサマイトシンＰ−２、Ｐ−３、Ｐ−４およびＰ−４’の製造方法は、Hatanoら、Agric. Biol. Chem 48, 1721-1729 (1984)に記載されている。Ｐ−３’は、Tanidaら、J. Antibiot. (Tokyo) 34, 489-495 (1981)に記載されているように得ることができる。
【００１４】
別の溶媒を用いることもできるが、好ましくは、無水溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２−メトキシエチルエーテル、ジオキサンまたはジエチルエーテルである。より好ましくは、無水溶媒はテトラヒドロフランである。好ましくは、メイタンシノイドエステル１グラムあたり、２０〜３０ｍＬの、より好ましくは、２５ｍＬ／ｇ無水溶媒を用いる。別のガスを用いることもできるが、好ましくは、不活性ガスは、アルゴン、窒素またはヘリウムである。より好ましくは、不活性ガスはアルゴンである。好ましくは、溶液を、乾燥冷アセトン浴中で、約０〜−８０℃、より好ましくは、約−３０〜−５０℃、最も好ましくは、約−３５〜−４５℃の間に維持する。
【００１５】
また、還元剤も冷却し、ついで、メイタンシノイドＣ−３エステルの冷却溶液中に移す。反応物を、不活性ガス雰囲気下、低温に維持し、撹拌する。好ましくは、還元剤は、水素化トリメトキシアルミニウムリチウム（ＬｉＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化トリエトキシアルミニウムリチウム（ＬｉＡｌ（０Ｅｔ）３Ｈ）、水素化トリプロポキシアルミニウムリチウム（ＬｉＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）、水素化トリメトキシアルミニウムナトリウム（ＮａＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化トリエトキシアルミニウムナトリウム（ＮａＡｌ（ＯＥｔ）３Ｈ）または水素化トリプロポキシアルミニウムナトリウム（ＮａＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）である。より好ましくは、還元剤は、水素化トリメトキシアルミニウムリチウム（ＬｉＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）である。好ましくは、還元剤は、乾燥氷アセトン浴中で約−３０〜−４０℃に冷却する。好ましくは、冷却した還元剤は、カニューレを介して、メイタンシノイドＣ−３エステルの冷却溶液に移す。別のガスを用いることもできるが、好ましくは、不活性ガスは、アルゴン、窒素またはヘリウムである。より好ましくは、不活性ガスはアルゴンである。
【００１６】
好ましくは、還元剤は、メイタンシノイドＣ−３エステル１モルあたり、約５〜１００当量、より好ましくは、１モルあたり約７．５〜３０当量、最も好ましくは、１モルあたり約１０〜２０当量の濃度で用いられる。メイタンシノイドＣ−３エステル１モルあたり、約１００当量より多くの量の還元剤を用いることは、望ましくない副生成物を生じさせ得ることは、当業者には理解できるだろう。好ましくは、還元剤は、メイタンシノイドＣ−３エステルの冷却溶液に、約５〜４０分、より好ましくは７〜２０分、最も好ましくは８〜１２分間にわたって加える。好ましくは、反応は、不活性ガス雰囲気下、約−２５℃〜−８０℃、より好ましくは、約−２７℃〜−４５℃、最も好ましくは、約−３０℃〜−３５℃の範囲の温度を維持する。好ましくは、約３時間３０分、より好ましくは約３時間、反応物を撹拌する。
【００１７】
用いる還元剤の量、反応の間に維持される温度、還元剤を加える時間の長さおよび反応時間は、各々、他のものに依存することは、当業者には理解できるだろう。例えば、より低量の還元剤を用いる場合は、より長い反応時間が必要になる。同様に、反応を完了させるために、より低温である場合は、より過剰な量の還元剤およびより長い反応時間が必要になる。さらに、よりゆっくりとした速度で還元剤を加える場合、反応を完了させるために、より長い反応時間が必要になる。
【００１８】
反応をクエンチし、抽出し、乾燥し、濾過する。溶媒を減圧下で蒸発させて、粗メイタンシノールを得る。好ましくは、飽和塩化ナトリウム溶液、水または塩化アンモニウム溶液を添加することにより、より好ましくは、飽和塩化ナトリウム溶液を添加することにより反応をクエンチする。好ましくは、使用するメイタンシノイド１グラムあたり、約２０〜４０ｍＬの溶液を用いて、反応をクエンチする。好ましくは、酢酸エチル、ジクロロメタン、トルエン、クロロホルムまたはエーテルで、より好ましくは酢酸エチルで、反応物を抽出する。好ましくは、使用するメイタンシノイドエステル１グラムあたり、約４×８０〜４×２００ｍＬの割合で、反応物を抽出する。好ましくは、合した酢酸エチル抽出物を、硫酸ナトリウムまたは硫酸マグネシウム、より好ましくは、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過する。
【００１９】
本発明の一の具体例において、ハロゲン化炭化水素：脂肪族エステル：アルカノール移動相で溶出するシリカ固定相のＨＰＬＣにより、未還元および過剰還元メイタンシノイドから粗メイタンシノールを精製する。
【００２０】
一の好ましい具体例において、シリカ固定相は、５０〜７０Åの平均細孔径、０．８〜１．２ｍＬ／ｇの細孔容量、５００〜６００ｍ２／ｇの表面積、０．５ｇ／ｍＬの充填密度、２０５℃で２０分間の乾燥において１０％未満の乾燥減量および５％の水性スラリーｐＨ４．０〜５．５を有する多孔質アモルファスシリカゲルである。平均細孔径および細孔容量は、Ｎ２吸収により測定する。表面積は、Brunauer, Emmett and Teller（ＢＥＴ）法を用いて測定する。原子吸光またはＨＦ消化の誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）で測定されるように、ナトリウム、アルミニウム、鉄およびカルシウムは、それぞれ、６０ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満および８０ｐｐｍ未満である。水性抽出物のイオンクロマトグラフィーにより測定されるように、硫化物および塩化物は、両方とも、２５ｐｐｍ未満である。シリカ固定相の細孔径は、６０、１００または２００Åであってもよい。最も好ましくは、細孔径は６０Åである。シリカ固定相の粒度は、５、１０、２０、４０、８０または１５０μｍであってもよい。好ましくは、粒度は２０または４０μｍである。好ましいシリカ固定相は、米国特許第４，１３１，５４２号および第５，１０８，５９５号に記載のように製造することができ、または、ＩＭＰＡＱ（登録商標）シリカゲルとして、SiliCycle, Inc., Quebec, Qc, Canadaから市販されている。好ましくは、移動相は、ジクロロメタン：酢酸エチル：２−プロパノールである。５０％のジクロロメタン：３９．３％の酢酸エチル：１０．７％の２−プロパノールが特に好ましい。
【００２１】
別の好ましい具体例において、シリカ移動相は、６０Åの平均細孔径、約０．９ｍＬ／ｇの細孔容量、約７００ｍ２／ｇの表面積、約０．４ｇ／ｍＬの嵩密度、１５％の水性スラリーｐＨ６．５〜７．５、０．０２％未満の鉄含有量および０．０２％未満の塩化物含有量を有するシリカゲルである。これらの記載に対応するシリカゲルは、Ｍｅｒｃｋ ＬＩＣＨＲＯＳＰＨＥＲ（登録商標）Ｓｉ６０として、E. Merck, Darmstadt, Germanyから市販されている。好ましくは、移動相は、ジクロロメタン：酢酸エチル：２−プロパノールである。３０％のジクロロメタン：５５％の酢酸エチル：１５％の２−プロパノールが特に好ましい。
【００２２】
同じ溶出力を有するが、成分が異なる他の溶媒系が、本発明のこれらの具体例において、移動相として用いることができることは、当業者には理解できるだろう。等溶出力の溶出液は、L.R. Snyder およびJ.J. Kirklandらの、Introduction to Modern Liquid Chromatography, Wiley and Sons, New York, pp. 255-271 (1974)に記載されている。
【００２３】
どちらの具体例においても、クロマトグラフィーは、約５〜約１００バールの圧力下で、約−８０℃〜約２００℃の範囲の温度、約０．０８〜約１．６ｃｍ／ｓの線流速で行われる。好ましくは、温度は、約２０℃〜２５℃である。外界温度が特に好ましい。
【００２４】
本発明の方法は、バッチまたは連続クロマトグラフィーモードで行うことができることは、当業者には理解できるだろう。典型的な連続モードは、擬似移動床クロマトグラフィーである。Chartonら、J. Chromatogr. 702, 97-112 (1995)を参照のこと。
【００２５】
本発明の方法において有用な他の固定相は、低極性において、アルミナ、ジルコニウム、二酸化チタンおよび化学修飾シリカを含む。固定相の極性が減少すると、移動相の極性も、それに従って減少することは、当業者には理解できるだろう。アルミナ固定相は、ICN Ecochrom（Eschwege, Germany）から、ＩＣＮアルミナとして市販されている。ジルコニウム固定相は、ZirChrom Separations, Inc. (Anoka, MN)から、ＺＩＲＣＨＲＯＭ（登録商標）−相として市販されている。二酸化チタン固定相は、Sachtleben Chemie (Duisburg, Germany)から、ＳＡＣＨＴＯＰＯＲＥ（登録商標）として市販されている。化学的に修飾されたシリカ固定相は、Eka Nobel (Bohus, Sweden)からＫＲＯＭＡＳＩＬ（登録商標）として市販されている。
【００２６】
本発明の方法は、腫瘍活性化プロドラッグとして有用な、細胞結合剤／メイタンシノイド複合体を製造するために用いることができる。本発明の方法により製造されるメイタンシノールは、米国特許第５，２０８，０２０号に記載のように用いて、メイタンシノイド誘導体を含有するＮ−メチル−Ｌ−アラニンを生成することができる。ついで、細胞結合剤、好ましくは抗体に、種々のリンカー、例えば、ジスルフィド結合を介して、これらの誘導体を結合させる。
【００２７】
典型的な細胞結合剤／メイタンシノイド複合体は、以下の工程を含む方法により調製することができる：
（１）メイタンシノールをＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体とエステル化してジスルフィド含有メイタンシノイドエステルを形成すること；
（２）工程（１）により調製されたジスルフィド含有メイタンシノイドエステルを、チオール含有メイタンシノイドに還元すること；
（３）ジチオピリジル基を、細胞結合剤に誘導すること；および
（４）工程（２）により生成されたチオール含有メイタンシノイドを、工程（３）のジチオピリジル細胞結合剤に、ジスルフィド結合により結合させること。
【００２８】
本発明を、下記する、限定するものではない実施例を参照して説明する。
【００２９】
実施例１
大規模分取ＨＰＬＣによるメイタンシノールの精製
クロマトグラフィーを、ポンプ、フィードポンプおよび可変波長ＵＶ検出器を備えたＶａｒｅｘ分取ＨＰＬＣを用いて行った。１０１．６ｍｍの内径×２５０ｍｍのステンレススチールカラムに、約１ｋｇのＩＭＰＡＱ（登録商標）シリカゲル、５０〜７０Åの細孔径、０．８〜１．２ｍＬ／ｇの細孔容量、５００〜６００ｍ２／ｇの表面積、０．５ｇ／ｍＬの充填密度、２５０℃で２０分間乾燥させて１０％未満の乾燥減量、５％の水性スラリーｐＨ４．０〜５．５、６０ｐｐｍ未満のナトリウム含有量、１００ｐｐｍ未満のアルミニウム含有量、８０ｐｐｍ未満の鉄含有量、８０ｐｐｍ未満のカルシウム含有量、２５ｐｐｍ未満の硫化物含有量および２５ｐｐｍ未満の塩化物含有量ならびに１０μｍの粒度を有する、多孔性アモルファスシリカゲル固定相を充填した。このシリカゲルは、SiliCycle, Inc.から、ＩＭＰＡＱ（登録商標）６０Ａ、１０μｍ、製品番号Ｂ１００７Ｂとして、市販されている。塩化メチレン：酢酸エチル：２−プロパノール（５０：３９．３：１０．７）の移動相を、流速５００ｍＬ／分（０．１４５ｃｍ／ｓ）で用いた。２８０ｎｍで検出した。カラムを、各々の操作の前に少なくとも１０分間平衡化した。
【００３０】
アンサマイトシンＰ−３の水素化リチウムトリメトキシアルミニウム還元により調製される１０．８ｇの純粋でないメイタンシノールを、２１７ｍＬの移動相に溶解して、４９．８ｍｇ／ｍＬの濃度にした。この試料溶液を、分取カラムに送り込む前に、１０ｍｍ ＩＤ×４０ｍｍカラム（分取カラムと同じシリカで充填した）を通して１０分間再循環させた。試料溶液の分析的注入は、約１３分の保持時間であった。３グラムでの操作（Ｒｕｎ１）および２つの約４グラムでの操作（Ｒｕｎ２および３）を行った。８０ｍｌの注入剤を４グラムの操作用に作成した。
【００３１】
４．６ｍｍの内径×２５０ｍｍのカラムでのクロマトグラムを図１に示す。目的の化合物は、初期および後期の溶出不純物から良好に分離される。小さいフラクション（Ｆｒ１、１２５ｍＬ）をメイタンシノールのピーク（約１０分）の前に得、ついで、主要なフラクション（Ｆｒ２、３０００ｍＬ）および最後の小さいフラクション（Ｆｒ３、１４００ｍＬ）を得た。Ｆｒ１は純度９０．８％、Ｆｒ２は純度９９．４％およびＦｒ３は純度９９．７％を有していた。３つの操作からの第２および第３のフラクションを合し、溶媒をロータリーエバポレーションを用いて除去して残渣を得た。この残渣を２００ｍｌの酢酸エチルに再び溶解し、溶媒を再び除去した。フラスコを高減圧下で２時間ポンプで引き９．３ｇの純粋なメイタンシノールを得た。
【００３２】
初期条件下での別の操作において、純粋でないメイタンシノール（３．９ｇ）を８９ｍｌの移動相に溶解して、約４４ｍｇ／ｍｌの濃度にした。分析的注入は、保持時間約１４分であった。すべての試料が１回の注入で精製され、３．１ｇのメイタンシノールを、９９．３％の純度で得た。保持時間の相違は、カラムの充填量、固定相のバッチ間変動、移動相および温度の変動に起因し得る。
【００３３】
実施例２
ＨＰＬＣによるメイタンシノールの精製
クロマトグラフィーを、溶媒脱泡装置、第四ポンプ、自動サンプラー、カラムオーブンおよびダイオードアレー検出器を備えた、Hewlett Packard 1100 分析ＨＰＬＣ系を用いて行った。系はＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアにより制御した。粗メイタンシノールを上記したように精製し、濃度２ｇ／Ｌで移動相に溶解した。すべての実験は２５℃で行った。典型的な注入容量は、１および１００μｌであった。波長２８０ｎｍで検出した。ＨＰＬＣ用の溶媒をMallinckrodt-Bakerから購入した。
【００３４】
４．６ｍｍの内径×２５０ｍｍのステンレススチールカラムに、ＬＩＣＨＲＯＳＰＨＥＲ（登録商標）Ｓｉ６０、１０μｍのシリカ固定相（E. Merck, Darmstadt, Germany）を充填した。３０％のジクロロメタン：５５％の酢酸エチル：１５％の２−プロパノールの移動相を２ｍＬ／分の流速で用いた。アンサマイトシンＰ−３の水素化トリメトキシアルミニウム還元により調製される２００μｇの純粋なメイタンシノールを、上記した移動相に溶解した。メイタンシノールを他のすべてのピークから分離し、５分で、ついで、８．５分で溶出した。
【００３５】
本発明は、その精神または本質から逸れることなしに他の特定の形態において実効でき、したがって、引用文献は、先行文献よりもむしろ本発明の範囲に示すように付加的なクレームを形成する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、シリカゲル固定相でのメイタンシノールのクロマトグラフィー分離を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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