(57)【要約】本発明は、特にヒトに投与され、特に治療用のポリペプチドに関する。このポリペプチドは修飾されたポリペプチドであり、この修飾により、ポリペプチドをヒトに投与した際に免疫反応を誘発する傾向が低減されるという結果をもたらす。本発明は特に、インビボで使用した時に、非修飾の相当物に比べ免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるタンパク質の変異体をもたらすヒトインターフェロンアルファ、特にヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）の修飾に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）の生物活性を有し、インビボで使用した時に同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さいまたは実質的に免疫原性でない修飾された分子。
【請求項２】
本来の非修飾分子に由来する１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、および／または前記分子に由来するペプチドを結合し得る多数のＭＨＣアロタイプの低減により、前記免疫原性の喪失が達成される請求項１に記載の分子。
【請求項３】
１つのＴ細胞エピトープが除去されている請求項２に記載の分子。
【請求項４】
前記本来存在するＴ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す前記クラスＩＩのリガンドまたはペプチド配列である請求項２から４のいずれかに記載の分子。
【請求項５】
前記リガンドまたはペプチド配列が１３ｍｅｒまたは１５ｍｅｒペプチドである請求項４に記載の分子。
【請求項６】
前記ペプチド配列が、図１に記載される群から選択される請求項５に記載の分子。
【請求項７】
本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基が変更された請求項２から６のいずれかに記載の分子。
【請求項８】
１個のアミノ酸残基が変更された請求項７に記載の分子。
【請求項９】
アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換したものである請求項７または８に記載の分子。
【請求項１０】
１個または複数のアミノ酸残基の置換が図２に示すようにして行われる請求項９に記載の分子。
【請求項１１】
さらに１個または複数のアミノ酸残基の置換が図３に示すようにして行われ、前記分子に由来するペプチドを結合することができるＭＨＣアロタイプの数が低減している請求項１０に記載の分子。
【請求項１２】
１個または複数のアミノ酸の置換が図３に示されるようにして行われる請求項９に記載の分子。
【請求項１３】
アミノ酸残基の変更が、本来存在するアミノ酸残基の特定の位置における欠失によるものである請求項７または８に記載の分子。
【請求項１４】
アミノ酸残基の変更が、本来存在するアミノ酸への特定の位置におけるアミノ酸の付加によるものである請求項７または８に記載の分子。
【請求項１５】
さらに追加の変更が、前記分子の生物活性を回復するように行われる請求項７から１４のいずれかに記載の分子。
【請求項１６】
前記さらに追加の変更が、特定のアミノ酸の置換、付加または欠失である請求項１５に記載の分子。
【請求項１７】
アミノ酸の変更が、同種のタンパク質配列を参考にして行われる請求項７から１６のいずれかに記載の分子。
【請求項１８】
アミノ酸の変更が、インシリコのモデリング技術を参考にして行われる請求項７から１６のいずれかに記載の分子。
【請求項１９】
アミノ酸の変更が、ＩＮＦα２由来ペプチドまたはＩＮＦα２タンパク質によるＴ細胞の刺激または結合に関してなされる請求項７から１６のいずれかに記載の修飾された分子。
【請求項２０】
ヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）の生物活性を有し、インビボで使用した時に同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さいまたは実質的に免疫原性でない修飾された分子であって、（ｉ）本来の非修飾分子に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す前記クラスＩＩのリガンドまたはペプチド配列である１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、および／または（ｉｉ）前記分子に由来するペプチドを結合できるＭＨＣアロタイプの数の低減による１次配列内の１個または複数のアミノ酸の変更によって得ることができ、
ＩＮＦα２野生型に由来する前記１次配列における以下の連続アミノ酸残基ストリング内の１個または複数の位置でなされる変更を含む修飾された分子：
（ａ）ＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨ（Ｒ１）、
（ｂ）ＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥ（Ｒ２）、
（Ｃ）ＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹ（Ｒ３）。
【請求項２１】
前記変更が１〜９個のアミノ酸残基の置換である請求項２０に記載の分子。
【請求項２２】
前記置換が、ストリングＲ１、Ｒ２およびＲ３からの１個または複数のアミノ酸残基においてなされている請求項２１に記載の分子。
【請求項２３】
前記置換が、ストリングＲ２およびＲ３からの１個または複数のアミノ酸残基においてなされている請求項２１に記載の分子。
【請求項２４】
前記置換が、ストリングＲ３からの１個または複数のアミノ酸残基においてなされている請求項２１に記載の分子。
【請求項２５】
配列ストリングＲ１、Ｒ２またはＲ３の外部のアミノ酸残基の１個または複数の置換がさらになされている請求項１９から２４のいずれかに記載の分子。
【請求項２６】
野生型分子における位置：２４、２６、２７、３８、５５、６３、６４、６６、６７、７６、８４、８５、８９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１１９、１２２、１２３、１２６、１２８、１２９、１３０、１５３の１個または複数の位置でなされたアミノ酸残基置換を含む請求項１９から２５のいずれかに記載の分子。
【請求項２７】
野生型分子における位置：２６、２７、３８、６３、８５、８９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２３、１２６、１２８、１５３の１個または複数の位置でなされたアミノ酸残基置換を含む請求項２５に記載の分子。
【請求項２８】
前記置換が２６、２７および３８から選択される１個または複数の位置でなされている請求項２７に記載の分子。
【請求項２９】
前記置換が位置６３、８５または８９でなされている請求項２７に記載の分子。
【請求項３０】
前記置換が１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２３、１２６、１２８、１５３から選択される１個または複数の位置でなされている請求項２７に記載の分子。
【請求項３１】
前記置換が２６、２７、３８から選択される１個または複数の位置でなされ、さらに位置６３、８５または８９でなされている請求項２７に記載の分子。
【請求項３２】
前記置換が２６、２７、３８あるいは６３、８５、８９から選択される１個または複数の位置でなされ、さらに１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２３、１２６、１２８、１５３から選択される１個または複数の位置でなされている請求項２７に記載の分子。
【請求項３３】
図４に示す１個または複数の位置で前記置換がなされている請求項２６に記載の分子。
【請求項３４】
前記置換がＬ２６Ｐ、Ｆ２７Ｓ、Ｆ３８Ｅから選択される請求項２８に記載の分子。
【請求項３５】
前記置換がＩ６３Ｔ、Ｙ８５Ｓ、Ｙ８９Ｄ、Ｙ８９Ｅ、Ｙ８９Ｎから選択される請求項２９に記載の分子。
【請求項３６】
前記置換がＶ１０３Ｅ、Ｌ１１０Ｇ、Ｍ１１１Ｔ、Ｍ１１１Ｓ、Ｍ１１１Ｅ、Ｉ１１６Ｓ、Ｉ１１６Ｑ、Ｌ１１７Ｇ、Ｌ１１７Ａ、Ｙ１２２Ｅ、Ｙ１２２Ｑ、Ｆ１２３Ｈ、Ｉ１２６Ａ、Ｌ１２８Ａ、Ｌ１５３Ｓから選択される請求項３０に記載の分子。
【請求項３７】
ヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）の生物活性を有し、インビボで使用した時に同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さいまたは実質的に免疫原性でない修飾された分子であって、（ｉ）本来の非修飾分子に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す前記クラスＩＩのリガンドまたはペプチド配列である１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、および／または（ｉｉ）前記分子に由来するペプチドを結合できるＭＨＣアロタイプの数の低減による１次配列内の１個または複数のアミノ酸の変更によって得ることができ、前記置換が野生型分子ＩＮＦα２ａまたはＩＮＦα２ｂにおける以下から選択される群の少なくとも１つに対応する１個または複数の位置でなされている修飾された分子：
（ｉ）Ｉ２４Ｐ、Ｌ２６Ｐ、Ｆ２７Ｓ、Ｆ３８Ｅ、Ｖ５５Ａ、
（ｉｉ）Ｉ６３Ｔ、Ｌ６６Ａ、Ｆ６７Ｄ、Ｆ６７Ｅ、Ｗ７６Ｈ、Ｆ８４Ｄ、Ｆ８４Ｅ、Ｙ８５Ｓ、Ｙ８９Ｄ、Ｙ８９Ｅ、Ｙ８９Ｎ、
（ｉｉｉ）配列Ｒ３の内の任意の位置（Ｌ１５３Ｓを含む）。
【請求項３８】
以下の置換：
Ｖ１０３Ｅ、Ｌ１１０Ｇ、Ｌ１１０Ｓ、Ｍ１１１Ｔ、Ｍ１１１Ｓ、Ｍ１１１Ｅ、Ｉ１１６Ｓ、Ｉ１１６Ｑ、Ｌ１１７Ｇ、Ｌ１１７Ａ、Ｖ１１９Ａ、Ｙ１２２Ｑ、Ｙ１２２Ｅ、Ｙ１２２Ｈ、Ｆ１２３Ｈ、Ｉ１２６Ａ、Ｌ１２８Ａ、Ｙ１２９Ｎ、Ｌ１３０Ｇ、Ｌ１３０、Ｌ１５３Ｓ
の１個または複数が配列Ｒ３内でなされている請求項３７に記載の分子。
【請求項３９】
以下の置換：
Ｙ１２２Ｅ、Ｙ１２２Ｑ、Ｆ１２３Ｈ、Ｉ１２６Ａ、Ｌ１２８Ａ
の１個または複数がなされている請求項３８に記載の分子。
【請求項４０】
さらなる置換がなされている請求項３６から３９のいずれかに記載の分子。
【請求項４１】
以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【表１】
2004535173.tif 000015
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｙ、Ｅ、Ｑであり；
Ｘ2は、Ｆ、Ｈであり；
Ｘ3は、Ｉ、Ａであり；
Ｘ4は、Ｌ、Ａであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｙ、Ｘ2＝Ｆ、Ｘ3＝ＩかつＸ4＝Ｌは除外される）。
【請求項４２】
以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【表２】
2004535173.tif 000016
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｌ、Ｓ、Ｇであり；
Ｘ2は、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｅであり：
Ｘ3は、Ｉ、Ｓ、Ｑであり；
Ｘ4は、Ｌ、Ｇであり；
Ｘ5は、Ｙ、Ｅ、Ｑであり；
Ｘ6は、Ｆ、Ｈであり；
Ｘ7は、Ｉ、Ａであり；
Ｘ8は、Ｌ、Ａであり；
Ｘ9は、Ｌ、Ｓであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｌ、Ｘ2＝Ｍ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｌ、Ｘ5＝Ｙ、Ｘ6＝Ｆ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬかつＸ9＝Ｌは除外される）。
【請求項４３】
以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【表３】
2004535173.tif 000017
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｉ、Ｔであり；
Ｘ2は、Ｆ、Ｄ、Ａであり；
Ｘ3は、Ｌ、Ａであり；
Ｘ4は、Ｆ、Ｄ、Ｅであり；
Ｘ5は、Ｗ、Ｈであり；
Ｘ6は、Ｆ、Ｄ、Ｅであり；
Ｘ7は、Ｙ、Ｓであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｆ、Ｘ3＝Ｌ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｆ、Ｘ7＝ＹかつＸ8＝Ｙは除外される）。
【請求項４４】
以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【表４】
2004535173.tif 000018
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｉ、Ｔであり；
Ｘ2は、Ｙ、Ｓであり；
Ｘ3は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝ＹかつＸ3＝Ｙは除外される）。
【請求項４５】
以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【表５】
2004535173.tif 000019
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｌ、Ｐであり；
Ｘ2は、Ｆ、Ｓであり；
Ｘ3は、Ｆ、Ｅであり；
Ｘ4は、Ｖ、Ａであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｌ、Ｘ2＝Ｆ、Ｘ3＝ＦかつＸ4＝Ｖは除外される）。
【請求項４６】
さらなる置換がなされている請求項４１に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項４７】
請求項４３によるさらなる置換を含む請求項４６に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項４８】
請求項４４によるさらなる置換を含む請求項４６に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項４９】
請求項４５によるさらなる置換を含む請求項４７または４８に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項５０】
さらなる置換を含む請求項４２に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項５１】
請求項４３によるさらなる置換を含む請求項５０に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項５２】
請求項４４によるさらなる置換を含む請求項５０に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項５３】
請求項４５によるさらなる置換を含む請求項５１または５２に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項５４】
さらなる置換が、部分的な配列Ｒ１および／またはＲ２および／またはＲ３（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は請求項１９に特定する通り定義される）の内の１個または複数の位置でなされている請求項１に記載の修飾されたＩＮＦα２配列。
【請求項５５】
請求項１から５４のいずれかに記載の修飾されたＩＮＦα２をコードするＤＮＡ配列。
【請求項５６】
前記請求項のいずれかに定義されるＩＮＦα２の生物活性を有する修飾された分子を、場合により薬剤として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物。
【請求項５７】
以下のステップを含む、前記請求項のいずれかに定義されるＩＮＦα２の生物活性を有する修飾された分子の製造方法：
（ｉ）ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を決定すること；
（ｉｉ）インビトロもしくはインシリコ技術を用いるか、または生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
（ｉｉｉ）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合によって、あるいはペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合によって、測定したＴ細胞エピトープの活性を実質的に低減または除去するように、識別した潜在的なＴ細胞エピトープ内に１つまたは複数のアミノ酸を修飾した新規な配列変異体を設計すること；
（ｉｖ）組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、かつ前記変異体を試験することによって、所望の特性を備えた１つまたは複数の変種を識別すること；および
（ｖ）場合によってはステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すこと。
【請求項５８】
ステップ（ｉｉｉ）を、本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失により行う請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記変更を、同種のタンパク質配列および／またはインシリコモデリング技術を参考にして行う請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ｉｉ）を以下のステップ：
（ａ）既知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；（ｂ）所定の均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを前記選択領域から連続的にサンプリングすること；（ｃ）サンプリングした前記アミノ酸残基セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対する割当て値を合計することにより、サンプリングした前記各セグメントについてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および（ｄ）実質的にペプチドの治療上の有用性を低減せずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算したＭＨＣクラスＩＩ結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別する
により実行する請求項５７から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
ステップ（ｃ）を、好ましくは、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンド対立エネルギー項を含むように修飾したベーム(Bohm)スコアリング関数を用い、（１）ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；（２）前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；（３）前記第１のデータベースからモデルを選択すること；（４）前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；（５）サンプリングした各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；（６）サンプリングした各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および前記各モデルと各骨格についてステップ（１）〜（５）を繰り返すことによって実行する請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、図１、図６ａ、６ｂ、６ｃに示される群から選択される非修飾ＩＮＦα２の１次配列から作製される、１３個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド分子。
【請求項６３】
潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、請求項１９において特定されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３の部分配列のいずれかから選択される非修飾ＩＮＦα２の１次配列から作製される、１５個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド分子。
【請求項６４】
図７から選択される請求項６３に記載のペプチド分子。
【請求項６５】
請求項６２から６４において特定されるＴ細胞エピトープペプチドから選択される連続する少なくとも９個のアミノ酸残基からなるペプチド配列。
【請求項６６】
潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、非修飾ＩＮＦα２の１次配列から作製され、かつ細胞増殖の生物分析において少なくとも１．８の刺激指数を有する（ここで、前記指数は、ペプチドによる刺激を受けた後の細胞の増殖値をペプチドを受けていない対照細胞の増殖値で割った値として得られ、また、細胞増殖は、標準的方法による適当な手段によって測定される）、連続するアミノ酸残基９〜１５個からなるペプチド分子。
【請求項６７】
図６または７に示す配列からなる請求項６６に記載のペプチド分子。
【請求項６８】
請求項１９で定義されるＩＮＦα２の部分配列Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のいずれかから得られる少なくとも９個の連続するアミノ酸残基を含む請求項６６に記載のペプチド分子。
【請求項６９】
インビボで使用した際に、免疫原性は非修飾分子と比べ低減されている、または実質的に有しない、生物活性は同一であるかまたは低減したとしても許容可能な程度の低減である修飾されたＩＮＦα２分子の製造のための、請求項６２から６８のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項７０】
請求項６２から６８のいずれかにおいて特定される合成ペプチド配列、および、場合によっては薬剤として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤からなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、特にヒトに投与され、そしてとりわけ治療に使用するポリペプチドに関する。このポリペプチドは修飾されたポリペプチドであり、この修飾により、ポリペプチドがヒトに投与された際に免疫反応を誘発する傾向が低減するという結果をもたらす。本発明は特に、インビボで使用した時に、非修飾の相当物に比べて免疫原性が低い、または実質的に非免疫原性である、ＩＮＦα２タンパク質の変異体をもたらすヒトインターフェロンおよび特にヒトインターフェロンα２（ＩＮＦα２）の修飾に関する。本発明はさらに、前記非修飾タンパク質に由来するＴ細胞エピトープペプチドに関し、これにより免疫原性の低減された修飾ＩＮＦα２変異体の作製を可能にするものである。
【０００２】
（発明の背景）
治療用タンパク質に対して望ましくない免疫反応が起こるために、治療用タンパク質の有効性が制限される例が多々ある。いくつかのマウスモノクローナル抗体はヒトの多数の疾病症状において治療剤としての見込みを示すが、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応が著しく誘導するため失敗したケースもある[Schroff,R.W. et al(1985)Cancer Res.45：879-885；Shawler, D.L. et al(1985)J.Immunol.135：1530-1535]。モノクローナル抗体については、ＨＡＭＡ反応を低減させようと多数の技術が開発されている［ＷＯ  ８９／０９６２２；ＥＰ  ０２３９４００；ＥＰ  ０４３８３１０；ＷＯ  ９１／０６６６７］。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体コンストラクトにおいてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終コンストラクト中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449,456；Rebello, P.R. et al(1999)Transplantation 68：1417−1420]。
【０００３】
抗体は、治療剤として投与した際にそれに対して免疫反応が発動し得る唯一の種類のポリペプチド分子ではない。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子[Wadhwa, M. et al(1999)Clin.Cancer Res.5：1353-1361]やインターフェロンアルファ２[Russo,D. et al (1996) Bri.J.Haem.94：300-305；Stein,R. et al(1988) New Engl.Med.318：1409-1413]の治療上の使用が挙げられる。
【０００４】
免疫反応誘導の主要な要因は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上での提示を介してＴ細胞活性を刺激し得るペプチド、いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」がタンパク質内に存在することである。このような潜在的Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣ結合を確立することで測定できる。暗黙にではあるが、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合する際、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識され、少なくとも原理的には、ＴＣＲと結びつきＴ細胞応答を促進することによって、これらＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することが判明しているある種のペプチドはタンパク質配列中に保持されているものと通常理解されており、このようなペプチドは、最終タンパク質が投与される有機体内で「自己」として認識される。
【０００５】
これらのＴ細胞エピトープペプチドのある種は、細胞内でのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され得るものであり、続いてＴ−細胞の活性化を起動すべく主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されることが知られている。ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたペプチドの結果として、Ｔ細胞のこのような活性化は、次いで、例えばＢ細胞の直接の刺激による抗体応答を引き起こし、そうした抗体を産生する。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）はこのグループタンパク質で優性なアイソタイプで、本発明の主な着目点である。しかしながら、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たし、したがって本発明はこれらにも等しく適用可能である。ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲ分子は、アルファ鎖およびベータ鎖で形成され、それらのＣ末端は細胞膜を通して挿入される。各ヘテロダイマーは、９〜２０個の範囲のアミノ酸長のペプチドに結合するリガンド結合領域を有するが、結合溝に収容できるのは最高１１個のアミノ酸である。リガンド結合領域は、アルファ鎖の１〜８５個のアミノ酸およびベータ鎖の１〜９４個のアミノ酸が含まれる。ＤＱ分子は、相同的な(homologous)構造を有することが最近示されており、ＤＰ族タンパク質も非常に類似していると予想される。ヒトでは、ＤＲアイソタイプのおよそ７０種類の異なるアロタイプが知られており、ＤＱについては３０種類の異なるアロタイプが、また、ＤＰについては４７種類の異なるアロタイプが知られている。各個人は２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱおよび２個のＤＰ対立遺伝子を有する。多数のＤＲ分子の構造が解明されており、それらの構造は、ペプチドの疎水性残基（ポケット残基）と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝を指している[Brown et al Nature(1993)364：33；Stern et al(1994)Nature 368：215]。
【０００７】
クラスＩＩ分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識し病原性有機体への免疫反応を引き起こす能力に関する最大の柔軟性を保証する。リガンド結合領域には相当な量の多型が存在し、これは異なる地理的な集団および民族グループ内で区別される「ファミリー」を備えている。この多型は、ペプチド結合領域の結合特性に影響し、したがって、ＤＲ分子の異なる「ファミリー」は、幾分かは重複があるかもしれないが、異なる配列特性を備えたペプチドに対して特異性を有するであろう。この特異性は、Ｔｈ細胞エピトープの認識（クラスＩＩ  Ｔ細胞反応）を決定し、これは最終的には、Ｔｈ細胞エピトープが由来するのと同じタンパク質上に存在するＢ細胞エピトープに対する抗体反応を駆動する原因となる。したがって、個人におけるタンパク質への免疫反応は、その個人のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性によって決まるＴ細胞エピトープ認識によって重大な影響を受ける。ゆえに、世界的な人口レベルにおいてタンパク質またはペプチド内のＴ細胞エピトープを識別するためには、ＨＬＡ−ＤＲアロタイプのできるだけ多様なセット（それにより世界人口のできるだけ高い割合をカバーする）の結合特性を考慮することが望ましい。
【０００８】
本発明の対象であるタンパク質などの治療のタンパク質に対する免疫反応は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド提示経路経由で進行する。ここに外来タンパク質は、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子と連携した提示のために飲み込まれ処理される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、とりわけマクロファージおよび樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現される。Ｔ細胞表面上の同族のＴ細胞レセプターによるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の結合は、ＣＤ４分子などの他のある種のコレセプターの相互結合を伴って、Ｔ細胞内での活性化状態を引き起こすことができる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、Ｂ細胞などの他のリンパ細胞をさらに活性化して抗体を産生するか、完全な細胞性免疫反応としてＴリンパ球を活性化する。ペプチドがＡＰＣ表面における提示用の所与のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する能力は、多数の要因（最も顕著にはその１次配列）に依存する。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合溝(cleft)内でのタンパク質分解による切断およびその結合親和性の両者に影響を及ぼすことになる。ＡＰＣ表面上のＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は、特別なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が、露出したペプチド残基およびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方によって提供される決定基(determinant)を認識することができるように結合面を提示する。
【０００９】
当技術分野では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できる合成ペプチドを識別するための操作手順が存在する（例えば、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７）。そのようなペプチドは、必ずしもすべての状況下で（特にインビボでは処理経路または他の現象により）Ｔ細胞エピトープとして特に機能しないかもしれない。Ｔ細胞エピトープ識別はエピトープ除去に向けての最初のステップである。タンパク質からの潜在的なＴ細胞エピトープの識別および除去はすでに示されている。当技術分野では、通常、実験的に決定されたＴ細胞エピトープ中で認識された配列モチーフを走査する計算手段により、あるいはＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドおよび特にＤＲ結合ペプチドクラスを予想するために計算上の技術を用いることにより、Ｔ細胞エピトープの検知を可能にする方法が提供された。
【００１０】
ＷＯ９８／５２９７６とＷＯ００／３４３１７は、ポリペプチド配列がヒトのＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのサブセットに結合する可能性を識別するための計算によるスレッディング(computational threading)手法を教示する。これらの教示では、予想されたＴ細胞エピトープは、ヒト由来および非ヒト由来の治療用抗体または非抗体タンパク質の１次配列内で慎重なアミノ酸置換を用いることによって除去される。
【００１１】
合成ペプチドとの組合せで、ヒトまたは実験動物の末梢血試料から得られたＴ細胞クローンと結合し得る組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を開発する他の技術が、当技術分野で使用され[Kern, F. et al(1998)Nature Medicine 4：975-978；Kwok, W.W. et al(2001)TRENDS in Immuology 22：583-588]、さらにエピトープ識別戦略において開発されるかもしれない。
【００１２】
上記のように、およびその結果として、基本的に治療上価値があるが本来は免疫原性であるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質からＴ細胞エピトープを識別しさらに除去または少なくとも低減することが望ましいであろう。
【００１３】
これらの治療上価値のある分子のうちの１つはＩＮＦα２である。この分子は活性化されたマクロファージによって発現される重要な糖タンパク質サイトカインである。このタンパク質は抗ウイルス活性を持っており、発現細胞においてインターフェロンアルファレセプターに結合して、少なくとも２個の酵素、プロテインキナーゼとオリゴアデニル酸合成酵素の生産を刺激する。成熟ＩＮＦα２タンパク質は、１６５個のアミノ酸からなる単一のポリペプチドであり、これは１８８個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質の翻訳後プロセッシング（アミノ末端から２３アミノ酸からなるシグナル配列が開裂することによる）により生産される。ヒトＩＮＦα２の何種類かの異なるサブタイプは、１次アミノ酸配列間でわずかな違いを示すことが知られている。したがって、ＩＮＦα２ａとＩＮＦα２ｂは、成熟タンパク質鎖の位置２３で１つの残基のみが、ＩＮＦα２ａではリジン、ＩＮＦα２ｂではアルギニンと異なっている。本発明では、ＩＮＦα２ｂの配列を対象として説明するが、すべての実際的な目的のためには、ＩＮＦα２ａ配列は本発明の主題ＩＮＦα２ｂサブタイプと交換可能に考えてよいことが理解されるであろう。ＩＮＦα２（ａ，ｂ）のアミノ酸配列（１文字コードとして示す）は、以下の通りである：
【００１４】
【表１】
2004535173.tif 000002
タンパク質は広いスペクトルの抗ウイルス剤、抗増殖剤および免疫調節剤(immunomodulating agent)として相当な臨床上の重要性を有する。ＩＮＦα２の組換え、その他の調製は、ヒトにおける様々な癌およびウイルス症状の治療に使用されてきた[Sen, G.G. and Lengyel P. (1992),J. Biol. Chem. 267:5017-5020で総説されている]。しかし、多数の患者に対する非常に重要な治療上の利益にもかかわらず、ある種の患者では治療に対する抵抗性があることが文献的に示されており、抵抗の１つの重要な機構として、治療された患者の血清において検知され得る抗体を中和する作用が生じることが示されている[Quesada,J.R.et al (1985) J.Clin.Oncology 3:1522-1528;上掲Stein R.G. et al (1988);上掲Russo,D. et al (1996);Brooks M.G. et al (1989) Gut 30:1116-1122]。少なくとも同一の１次構造の分子が人体内で内生的に生産されるという事実にもかかわらず、これらの患者においては治療作用を持つインターフェロンに対して免疫反応が発動される。
【００１５】
修飾されたＩＮＦα２ａおよび使用方法は他にも提供されているが［米国特許第４，４９６，５３７号；米国特許第５，９７２，３３１号；米国特許第５，４８０，６４０号；米国特許第５，１９０，７５１号；米国特許第４，９５９，２１０号］、これらの手法はＩＮＦα２ａの商用生産における改良を対象としている。これらの教示のいずれも、タンパク質の免疫原特性に対するＴ細胞エピトープの重要性を認識するものではないし、本発明のスキームに従って特異的かつ制御されたかたちでこうした特性に直接影響を及ぼすとは考えられていなかった。
【００１６】
しかし、特性の強化されたＩＮＦα２ａ類似体には継続的な需要がある。強化が望まれている点としては、前記治療剤の発現および精製のための別スキームおよび精製の様式(modality)が含まれるが、また特に、タンパク質の生物学的特性における改良も含まれる。ヒトに投与した際のインビボ特性の改善は特に必要である。この点では、ヒトに免疫反応を引き起こす可能性が低減されているか可能性のないＩＮＦα２ａの提供が強く望まれている。
【００１７】
（発明の要約および詳細）
本発明は、潜在的なＴ細胞エピトープが除去されるかその数が低減されることによって免疫特性が修飾されたヒトインターフェロンα（特にインターフェロンα２タイプ。本発明では「ＩＮＦα２」という）の修飾形を提供する。
【００１８】
本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ結合能力により潜在的なＴ細胞エピトープであるＩＮＦα２の１次配列内に識別された配列を開示する。この開示は特に１６５アミノ酸残基からなるヒトＩＮＦα２タンパク質に関する。
【００１９】
本発明は、基本的に生物活性に影響することなく、特定のアミノ酸の置換、付加または欠失によって変更されなければならない、本発明による分子の１次配列内の特定の位置も開示する。免疫原性の喪失が生物活性の喪失と同時にのみ成される場合は、タンパク質のアミノ酸配列内のさらなる変更によって前記活性を回復することが可能である。
【００２０】
本発明は、このような修飾された分子を生産する方法をさらに開示し、とりわけ免疫原性部位を低減するか除去するために変更しなければならないＴ細胞エピトープを識別する方法を開示する。
【００２１】
本発明によるタンパク質は、対象とするヒトの体内で増加した循環時間を示すことが期待され、慢性または再発性の疾病状態（例えば、多数のＩＮＦα２を示すような場合）において特に有益であろう。本発明は、インビボで増強された特性を示すと期待されるＩＮＦα２タンパク質の修飾形を提供する。修飾されたＩＮＦα２分子は医薬組成物において使用できる。
【００２２】
要約すると、本発明は以下の対象となる事項に関する：
・ヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）の生物活性を有し、インビボで使用した時に同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さいまたは実質的に免疫原性でない修飾された分子；
・本来の非修飾分子に由来する１個または複数のＴ細胞エピトープ、好ましくは１個のＴ細胞エピトープの除去により、および／または前記分子に由来するペプチドを結合し得る多数のＭＨＣアロタイプの低減により、前記免疫原性の喪失が達成される対応する分子；
・前記本来存在するＴ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す前記クラスＩＩのリガンドまたはペプチド配列である対応する分子；
・前記リガンドまたはペプチド配列が１３ｍｅｒまたは１５ｍｅｒペプチドである対応する分子；
・前記ペプチド配列が、図１に記載される群から選択される対応する分子；
・本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基、好ましくは１個のアミノ酸残基が変更されている対応する分子；
・アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、付加または欠失、好ましくは置換したものである対応する分子；
・１個または複数のアミノ酸残基の置換が表２に示されるようにして行われ、また、場合によっては、１個または複数のアミノ酸残基の置換が表３に示されるように行われ、前記分子に由来するペプチドを結合することができるＭＨＣアロタイプの数が低減している対応する分子；
・前記分子の生物活性を回復するために、置換、追加または欠失などのさらに一層の変更が遂行された対応する分子；
・アミノ酸変更が、同種のタンパク質配列を参照して、またはインシリコモデリング技術を参照して行われている対応する修飾された分子；
・ヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）の生物活性を有し、インビボで使用した時に同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さいまたは実質的に免疫原性でない修飾された分子であって、(i)本来の非修飾分子に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す前記クラスＩＩのリガンドまたはペプチド配列である１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、および／または(ii)前記分子に由来するペプチドを結合できるＭＨＣアロタイプの数の低減による１次配列内の１個または複数のアミノ酸の変更によって得ることができ、
ＩＮＦα２野生型に由来する前記１次配列における以下の連続アミノ酸残基ストリング内の１個または複数の位置でなされる変更を含む修飾された分子：
【００２３】
【表２】
2004535173.tif 000003
；
・前記変更が１〜９個のアミノ酸残基の置換である対応する分子；
・前記置換が、ストリングＲ１、Ｒ２およびＲ３から、好ましくはＲ２およびＲ３から、より好ましくはＲ３からの１個または複数のアミノ酸残基においてなされている対応する分子；
・配列ストリングＲ１、Ｒ２またはＲ３の外部のアミノ酸残基の１個または複数の置換がさらになされている対応する分子；
・野生型分子における位置：２４、２６、２７、３８、５５、６３、６４、６６、６７、７６、８４、８５、８９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１１９、１２２、１２３、１２６、１２８、１２９、１３０、１５３の１個または複数の位置、好ましくは次の位置：２６、２７、３８、６３、８５、８９、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２３、１２６、１２８、１５３、より好ましくは１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２３、１２６、１２８、１５３の１個または複数の位置でなされたアミノ酸残基置換を含む対応する分子；
・２６、２７および３８から選択される１個または複数の位置でさらに、１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２３、１２６、１２８、１５３、または６３、８５、８９および１０３、１１０、１１１、１１６、１１７、１２２、１２３、１２６、１２８、１５３から選択される１個または複数の位置で前記置換がなされている好ましい実施形態；
・図４の中で示す１個または複数の位置で前記置換がなされている対応する分子；
・位置Ｌ２６Ｐ、Ｆ２７Ｓ、Ｆ３８Ｅおよび／またはＩ６３Ｔ、Ｙ８５Ｓ、Ｙ８９Ｄ、Ｙ８９Ｅ、Ｙ８９Ｎおよび／またはＶ１０３Ｅ、Ｌ１１０Ｇ、Ｍ１１１Ｔ、Ｍ１１１Ｓ、Ｍ１１１Ｅ、Ｉ１１６Ｓ、Ｉ１１６Ｑ、Ｌ１１７Ｇ、Ｌ１１７Ａ、Ｙ１２２Ｅ、Ｙ１２２Ｑ、Ｆ１２３Ｈ、Ｉ１２６Ａ、Ｌ１２８Ａ、Ｌ１５３Ｓで前記置換がなされている対応する分子；
・位置Ｌ２６Ｐ、Ｆ２７Ｓ、Ｆ３８Ｅおよび／またはＩ６３Ｔ、Ｙ８５Ｓ、Ｙ８９Ｄ、Ｙ８９Ｅ、Ｙ８９Ｎおよび／またはＶ１０３Ｅ、Ｌ１１０Ｇ、Ｍ１１１Ｔ、Ｍ１１１Ｓ、Ｍ１１１Ｅ、Ｉ１１６Ｓ、Ｉ１１６Ｑ、Ｌ１１７Ｇ、Ｌ１１７Ａで前記置換がなされている対応する好ましい分子；
・ヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）の生物活性を有し、インビボで使用した時に同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さいまたは実質的に免疫原性でない修飾された分子であって、(i)本来の非修飾分子に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す前記クラスＩＩのリガンドまたはペプチド配列である１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、および／または(ii)前記分子に由来するペプチドを結合できるＭＨＣアロタイプの数の低減による１次配列内の１個または複数のアミノ酸の変更によって得ることができ、前記置換が野生型分子ＩＮＦα２ａまたはＩＮＦα２ｂにおける以下から選択される群の少なくとも１つに対応する１個または複数の位置でなされている修飾された分子：
(i)Ｉ２４Ｐ、Ｌ２６Ｐ、Ｆ２７Ｓ、Ｆ３８Ｅ、Ｖ５５Ａ、
(ii)Ｉ６３Ｔ、Ｌ６６Ａ、Ｆ６７Ｄ、Ｆ６７Ｅ、Ｗ７６Ｈ、Ｆ８４Ｄ、Ｆ８４Ｅ、Ｙ８５Ｓ、Ｙ８９Ｄ、Ｙ８９Ｅ、Ｙ８９Ｎ、
(iii)配列Ｒ３の内の任意の位置；
・以下の置換の１個または複数が配列Ｒ３内でなされており、場合によってはさらに免疫性の低減につながるさらなるアミノ酸残基変更（好ましくは置換）を含む対応する分子：Ｖ１０３Ｅ、Ｌ１１０Ｇ、Ｌ１１０Ｓ、Ｍ１１１Ｔ、Ｍ１１１Ｓ、Ｍ１１１Ｅ、Ｉ１１６Ｓ、Ｉ１１６Ｑ、Ｌ１１７Ｇ、Ｌ１１７Ａ、Ｖ１１９Ａ、Ｙ１２２Ｑ、Ｙ１２２Ｅ、Ｙ１２２Ｈ、Ｆ１２３Ｈ、Ｉ１２６Ａ、Ｌ１２８Ａ、Ｙ１２９Ｎ、Ｌ１３０Ｇ、Ｌ１３０、Ｌ１５３Ｓ、好ましくはＹ１２２Ｅ、Ｙ１２２Ｑ、Ｆ１２３Ｈ、Ｉ１２６Ａ、Ｌ１２８Ａ；
・以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【００２４】
【表３】
2004535173.tif 000004
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｙ、Ｅ、Ｑであり；
Ｘ2は、Ｆ、Ｈであり；
Ｘ3は、Ｉ、Ａであり；
Ｘ4は、Ｌ、Ａであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｙ、Ｘ2＝Ｆ、Ｘ3＝ＩかつＸ4＝Ｌは除外される（この配列は野生型のＩＮＦα２に相当する））；
・以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【００２５】
【表４】
2004535173.tif 000005
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｌ、Ｓ、Ｇであり；
Ｘ2は、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｅであり：
Ｘ3は、Ｉ、Ｓ、Ｑであり；
Ｘ4は、Ｌ、Ｇであり；
Ｘ5は、Ｙ、Ｅ、Ｑであり；
Ｘ6は、Ｆ、Ｈであり；
Ｘ7は、Ｉ、Ａであり；
Ｘ8は、Ｌ、Ａであり；
Ｘ9は、Ｌ、Ｓであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｌ、Ｘ2＝Ｍ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｌ、Ｘ5＝Ｙ、Ｘ6＝Ｆ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬかつＸ9＝Ｌは除外される）；
・以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【００２６】
【表５】
2004535173.tif 000006
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｉ、Ｔであり；
Ｘ2は、Ｆ、Ｄ、Ａであり；
Ｘ3は、Ｌ、Ａであり；
Ｘ4は、Ｆ、Ｄ、Ｅであり；
Ｘ5は、Ｗ、Ｈであり；
Ｘ6は、Ｆ、Ｄ、Ｅであり；
Ｘ7は、Ｙ、Ｓであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｆ、Ｘ3＝Ｌ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｆ、Ｘ7＝ＹかつＸ8＝Ｙは除外される）；
・以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【００２７】
【表６】
2004535173.tif 000007
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｉ、Ｔであり；
Ｘ2は、Ｙ、Ｓであり；
Ｘ3は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝ＹかつＸ3＝Ｙは除外される）；
・以下の配列からなる低減された免疫原性を有する修飾されたヒトインターフェロンアルファ２（ＩＮＦα２）：
【００２８】
【表７】
2004535173.tif 000008
（ここで、Ｘ0は、Ｒ、Ｋであり；
Ｘ1は、Ｌ、Ｐであり；
Ｘ2は、Ｆ、Ｓであり；
Ｘ3は、Ｆ、Ｅであり；
Ｘ4は、Ｖ、Ａであり；
ただし、同時にＸ1＝Ｌ、Ｘ2＝Ｆ、Ｘ3＝ＦかつＸ4＝Ｖは除外される；なお、上記式中で指定された除外は、先行技術において知られているＩＮＦα２のすべての脱免疫しない変型を指し、これらをすべて含むことを指摘しておく）；
・特に特許請求の範囲に示す組合せによってさらなる置換がなされている対応する修飾されたＩＮＦα２配列；
・さらなる置換が、好ましくは、部分的な配列Ｒ１および／またはＲ２および／またはＲ３（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は上記の通り定義される）内の１個または複数の位置でなされている対応する修飾されたＩＮＦα２配列；
・上におよび以下に記載する修飾されたＩＮＦα２をコードするＤＮＡ配列；
・上に定義されるＩＮＦα２の生物活性を有する修飾された分子を、場合により薬剤として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物；
・(i)ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を決定すること；(ii)インビトロもしくはインシリコ技術を用いるか、または生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；(iii)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合によって、あるいはペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合によって、測定したＴ細胞エピトープの活性を実質的に低減または除去するように、識別した潜在的なＴ細胞エピトープ内に１つまたは複数のアミノ酸を修飾した新規な配列変異体を設計すること；(iv)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、かつ前記変異体を試験することによって、所望の特性を備えた１つまたは複数の変種を識別すること；および(v)場合によってはステップ(ii)〜(iv)を繰り返すこと；
を含む以上および以下に定義されるＩＮＦα２生物活性を有する修飾された分子を製造する方法：
・ステップ(iii)を、本来存在するＴ細胞エピトープにおいて、または同族のタンパク質配列を参照しておよび／またはインシリコモデリング技術を参照して１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失により行う対応する方法；
・ステップ(ii)を以下のステップ：(a)既知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；(b)所定の均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを前記選択領域から連続的にサンプリングすること；(c)サンプリングした前記アミノ酸残基セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対する割当て値を合計することにより、サンプリングした前記各セグメントについてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および(d)実質的にペプチドの治療上の有用性を低減せずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算したＭＨＣクラスＩＩ結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別する
により実行する対応する方法；
・ステップ(c)を、好ましくは、１２−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンド対立エネルギー項を含むように修飾したベーム(Bohm)スコアリング関数を用い、(1)ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；(2)前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；(3)前記第１のデータベースからモデルを選択すること；(4)前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；(5)サンプリングした各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；(6)サンプリングした各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および前記各モデルと各骨格についてステップ(1)〜(5)を繰り返すこと
によって実行する対応する方法；
・図１、図６ａ〜ｃに示される群から選択される、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し非修飾ＩＮＦα２の１次配列から作製される連続する１３個のアミノ酸残基からなるＴ細胞エピトープであるペプチド分子；
・Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の部分配列のいずれかから選択されるまたは図７から選択される、潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し非修飾ＩＮＦα２の１次配列から作製される連続する１５個、好ましくは少なくとも９個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド分子；
・潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、非修飾ＩＮＦα２の１次配列から作製され、かつ細胞増殖の生物分析において少なくとも１．８、好ましくは１．８〜２、より好ましくは＞２の刺激指数を有する（ここで、前記指数は、ペプチドによる刺激を受けた後の細胞の増殖値をペプチドを受けていない対照細胞の増殖値で割った値として得られ、また、細胞増殖は、実施例中により詳細に記載する標準的方法による適当な手段によって測定される）、連続するアミノ酸残基９〜１５個からなるペプチド分子；
・図６または７に示す配列のうちのいずれかからなるそのような刺激指数値を有する対応するペプチド分子；
・特許請求の範囲中で定義されるＩＮＦα２の部分配列Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のいずれかから得られる少なくとも９個の連続するアミノ酸残基を含むそのような刺激指数値を有する対応するペプチド分子；
・インビボで使用した際に、免疫原性は非修飾分子と比べ低減されている、または実質的に有しない、生物活性は同一であるかまたは低減したとしても許容可能な程度の低減である修飾されたＩＮＦα２分子の製造のための、対応するペプチドの使用；
・上記および以下にならびに図面に特定されるＩＮＦα２の生物活性を有する合成ペプチド配列、および場合によっては薬剤として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を共に含む医薬組成物。
【００２９】
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、本発明についての理解によれば、ＭＣＨクラスＩＩを結合可能で、Ｔ細胞を刺激するおよび／または（必ずしも測定可能な程度に活性化せずに）Ｔ細胞を複合体中でＭＨＣクラスＩＩに結合可能であるアミノ酸配列を意味する。
【００３０】
本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合（以下に定義される）によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる２０個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてＬ‐配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用して従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えばアミノ酸単位が１０個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば１００個以上を含み「ポリペプチド」と呼ばれる。従来、「ポリペプチド」は３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、実際上無制限である。
【００３１】
「アルファ炭素（Ｃα）」はペプチド鎖中の炭素水素（ＣＨ）部分の炭素原子である。「側鎖」はＣαへの吊り下がり（ペンダント）基であり、ペプチドの寸法と比較して著しく変動幅の広い物理的な寸法を有する、単純もしくは複雑な基または部分を含むことができる。
【００３２】
本発明は、実質的にここに示されたものと同じ１次アミノ酸配列を有する任意のＩＮＦα２分子種に適用でき、したがって、遺伝子工学的手段その他の方法によって誘導されたＩＮＦα２分子を含み、おおよそ１６５個のアミノ酸残基を含んでよい。
【００３３】
他の哺乳類由来から識別されたＩＮＦα２タンパク質は、共通して、本開示のペプチド配列の多数を有し、また、開示されたペプチド配列と実質的に同じ配列を有する多数のペプチド配列を共通に有する。したがって、このようなタンパク質配列も等しく本発明の範囲内に入る。本発明は、同種の有機体に導入された可溶性タンパク質が免疫反応を引き起こし、その可溶性タンパク質に結合する宿主抗体の進行をもたらしうるという、実際ある現実を克服することを想定している。こうした現象の中でもとりわけ顕著な例は、臨床上の使用におけるＩＮＦα２である。このタンパク質が内生的に生産されるという事実にもかかわらず、ＩＮＦα２で治療されたヒト患者の相当な割合に抗体を形成する[上掲Russo,D. et al(1996)；上掲Stein,R. et al(1988)]。本発明は、ヒトホストへの投与に際してのＩＮＦα２タンパク質の免疫反応誘発傾向を変更することにより、この問題を解決することを目的とする。本発明者らは、ここに記載した方法によって、この自己由来のタンパク質に対する免疫反応を駆動するのに決定的な役割を果たすＴ細胞エピトープを含むＩＮＦａ２分子領域を発見し、ここに開示する。
【００３４】
修飾されたＩＮＦα２をもたらす本発明の一般的な方法は、次のステップを含む：
(a)ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
(b)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
(c)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定したＴ細胞エピトープ活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内の１つまたは複数のアミノ酸を用いて新規な配列変異体を設計する。このような配列変異体は、そのような新しい潜在的なＴ細胞エピトープが、設計毎に、Ｔ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように修飾されないのであれば、配列変化によって新しい潜在的なＴ細胞エピトープの生成を回避する方法で作製される。そして、(d)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体をよく知られた組換えＤＮＡ技術によって試験する。
【００３５】
ステップ(b)による潜在的なＴ細胞エピトープの識別は従来法によって実行することができる。適当な方法はＷＯ  ９８／５９２４４；ＷＯ  ９８／５２９７６；ＷＯ  ００／３４３１７に開示されており、ＩＮＦα２から誘導されるペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子への結合性向を識別するために好適に使用できる。
【００３６】
計算によってＴ細胞エピトープを識別する別の非常に効果的な方法は、この発明によって好ましい実施形態である実施例１に記述される。
【００３７】
実際上、多数の異なるＩＮＦα２タンパク質が生産され、所望の免疫特性および機能特性に関して試験される。ＩＮＦα２断片の化学合成を含む他の操作手順も考え得るが、最も好ましくは変異体タンパク質は組換えＤＮＡ技術によって生産される。
【００３８】
１６５個のアミノ酸残基からなるヒトＩＮＦα２ａタンパク質配列についての上記スキームのステップ(b)による分析結果を図１に示す。上記スキームのステップ(c)および(d)に従い本発明の修飾された分子に関する構築および設計の結果を、図２および３に示す。
【００３９】
本発明は、１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープ活性の実質的な低減またはタンパク質からの除去をもたらす位置で少なくとも１つのアミノ酸残基を置換したＩＮＦα２類似体に関する。図１に識別された潜在的なＭＨＣクラスＩＩリガンドのうちのいずれかの特定のポイントにおいて、１または複数のアミノ酸置換を行うことで、ヒト宿主に治療剤として投与した際、低減された免疫原の可能性を有するＩＮＦα２分子をもたらすことができる。
【００４０】
アミノ酸修飾（例えば置換）が、親分子の最も免疫原性の強い領域内で行われたＩＮＦα２分子を提供することが最も好ましい。本発明者は、ヒトにおいてはＩＮＦα２分子の最も免疫原性の強い領域が、それぞれアミノ酸配列；ＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨ；ＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥおよびＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹを含む３つの領域Ｒ１、Ｒ２およびＲ３に限定されることをここに見出した。本発明の主要な好ましい実施形態は、ペプチドが結合できるＭＨＣアロタイプの結合を消失させるか、さもなければその数を低減するように、図１のＭＨＣクラスＩＩリガンドがそれに対して変更され、また、それらの全体においてまたは上記の配列要素Ｒ１、Ｒ２またはＲ３のうちのいずれかを有する最低９個のアミノ酸残基と一致(align)するＩＮＦａ２分子を含む。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態は、図４の特定の置換を含む。特に図４から得られる置換の組合せを含む修飾されたＩＮＦα２分子を提供することが好ましい。免疫原性領域Ｒ１、Ｒ２およびＲ３それぞれへの修飾を含む組合せが好ましく、Ｒ２とＲ３への修飾を含む組合せは特に好ましいが、これらが好ましいからといって、望ましいと考えられる置換の組合せを限定する意図はない。
【００４２】
Ｔ細胞エピトープの除去のためには、Ｔ細胞エピトープ活性の実質的な低減または除去を達成するために予測されるペプチド配列内の適合点でアミノ酸置換を行うことが好ましい。実際上、適合点は、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内に存在するポケットの中の１個の内部で結合するアミノ酸残基と等しいことが好ましい。
【００４３】
ペプチドのいわゆるＰ１またはＰ１アンカー位置で溝の第１のポケット内に結合するものを変更することが最も好ましい。ペプチドのＰ１アンカー残基と、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝第１ポケットとの間の結合相互作用の特性は、ペプチド全体に対する総合的な結合親和性の主な決定要素であると認められる。ペプチドのこの位置での適切な置換は、ポケット内にはより収容されにくい残基のためであり、例えばより親水性の大きな残基への置換である。ＭＨＣ結合溝内の他のポケット領域内での結合と同等な位置でのペプチド中のアミノ酸残基も考慮され、本発明の範囲に入る。
【００４４】
所与の潜在的Ｔ細胞エピトープ内の単一のアミノ酸置換が、エピトープ除去の最も好ましいルートであることが理解される。単一のエピトープ内での置換の組合せも考えられ、例えば、個別に定義されたエピトープが互いに重複する場合には特に適切になものとなり得る。さらに、所与のエピトープ内における単一のアミノ酸置換または単一のエピトープ内における置換の組合せは、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に関して「ポケットペプチド」と同等な位置でなくともペプチド配列内のどのポイントでされていてもよい。置換は、同族体構造に関してか当技術分野で知られたインシリコ技術を用いて生成する構造的方法で行われてもよいし、本発明による分子の公知の構造上の特徴に基づくものでもよい。そのような置換はすべて本発明の範囲内に入る。
【００４５】
特に、リストに挙げたペプチド内で行われた置換と組み合わせて行う場合、上に識別されたペプチド内以外のアミノ酸置換を考えてもよい。例えば、変異体分子の構造や生物活性を回復するために変更を考えることができる。そのような補償的変更およびＩＮＦα２ポリペプチドからの特定のアミノ酸残基の除去または付加を含む変更は、所望の活性で、かつ開示するペプチドのうちのいずれかの変化と組み合わせた変異体をもたらし、本発明の範囲内に入る。
【００４６】
本発明の修飾されたＩＮＦα２に関する限り、そのような修飾されたＩＮＦα２タンパク質または修飾されたＩＮＦα２タンパク質の断片を含む組成物および関連する組成物は、本発明の範囲内と考えるべきである。別の実施態様では、本発明は修飾されたＩＮＦα２実在物をコードする核酸に関する。別の実施態様では、本発明は修飾されたＩＮＦα２タンパク質を使用するヒトの治療方法に関する。
【００４７】
（図の簡単な説明）
以下の実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例は以下の図面を参照する。アミノ酸残基は、１文字コードとして示す。
【００４８】
図１  潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトＩＮＦα２ａ中のペプチド配列を示す。
【００４９】
図２  ヒトＩＮＦα２ａのＴ細胞エピトープの除去をもたらす置換を示す（ＷＴ＝野生型残基）。
【００５０】
図３  １個または複数のＭＨＣアロタイプについて潜在的Ｔ細胞エピトープの除去をもたらす追加的置換を示す。
【００５１】
図４  ヒトＩＮＦα２ａ（ＷＴ＝野生型残基、ＭＵＴ＝所望の残基）中の好ましい置換を示す。
【００５２】
図５  実施例２におけるインビトロでのＭＨＣクラスＩＩ結合分析を用いて分析されたＩＮＦα２  １３−ｍｅｒ合成ペプチド配列の表を示す。
【００５３】
図６  ＭＨＣアロタイプについてのインビトロＭＨＣペプチド結合分析の結果を示す。a)は試験したＭＨＣアロタイプの各々に対し高い結合親和性を備えたペプチドを示す(競合参照ペプチドによる阻害率０％)；b)は試験したＭＨＣアロタイプの各々に対し中程度の結合親和性を備えたペプチドを示す(競合参照ペプチドによる阻害率0〜50％)；c)は試験したＭＨＣアロタイプの各々に対し結合親和性が低いペプチドを示す(競合参照ペプチドによる阻害率50〜100％)、d)は、試験したＭＨＣアロタイプへの検知可能な結合性を有しないペプチドを示す。
【００５４】
図７  実施例３の天然の(naive)ヒトＴ細胞のインビトロ分析を使用して分析されたＩＮＦα２  １５−ｍｅｒペプチド配列の表を示す。ＩＮＦα２配列内のＮ末端ペプチド残基のペプチドＩＤ＃および位置も示す。
【００５５】
図８  ＩＮＦαペプチドによる刺激に応答する６個体からの累積的な刺激指数を示す。スクリーニングした２０個体から６個体のドナーがＩＮＦα配列から得た５１個の１５ｍｅｒペプチドの１個または複数による刺激に応答した。個々のペプチドに対する応答を３つの別個の領域にグループ化した。このうち領域３は最も免疫原性の強いペプチド＃３８および＃３９（矢印）を含んでいる。対照ペプチドＣ３２(ＤＲＢ１制限された)およびＣ４９（ＤＰ制限された）を比較のために含む。各バー内の網目掛けしてある部分は、個々のドナーからの寄与を示す。
【００５６】
図９  ＩＮＦα内の免疫原性領域を示し、天然のヒトＴ細胞を刺激できるこれらの領域に由来するペプチド配列を詳細に示したものである。
【００５７】
図１０  天然のヒトＴ細胞の増殖をインビトロで促進することができるＩＮＦαペプチドを示す表を示す。ドナーのうちの５個体に対し、主要エピトープ領域Ｒ１、Ｒ２およびＲ３由来の多重重複ペプチドに対して応答を記録する。ドナーのうちの３個体に対しては、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３からの個々の合成ペプチドに対する応答を記録する。
【００５８】
図１１  ＩＮＦαペプチドに応答するおよび応答しないドナーにおけるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の出現率を示す表である。ａ＝分子はＤＲ対立遺伝子を持ったドナーの数であり、分母はそのペプチドにインビトロでのＴ細胞増殖を示したドナーの数である(応答ドナーの総数＝６)。ｂ＝ドナー集団中の対立遺伝子の出現率。２以下の応答が記録されたペプチドは評価しなかった。試験した応答ドナーはすべてＤＲＢ１＊１４について陰性であった。ＤＲＢ１＊１４アロタイプは、試験した２０ドナー中に１．５％の出現率を有する。所与のペプチドのアロ制限(allorestriction)は、ドナー集団中の対立遺伝子の出現率、および同じ対立遺伝子を発現する応答ドナーの数によって決定される。ペプチドが任意の特定の対立遺伝子を伴う(allorestricted)場合、示されたパーセンテージは集団中での対立遺伝子に対する出現率より大きいと予想されるであろう。
【００５９】
図１２  特定のＭＨＣクラスＩＩアロタイプのための競争的結合分析における１５−ｍｅｒの合成ペプチドに対するＩＣ50値の表を示す。
【００６０】
(a)インビトロで天然のヒトＴ細胞の増殖を促進する能力を有するＩＮＦαペプチドのＤＲＢ１＊０１０１に対する相対的な結合親和性を決定するための競争ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合分析。ＩＮＦαペプチドを１０μＭビオチン化(biotinylated)インフルエンザヘマグルチニン(haemagglutinin)３０７−３１９の存在下、固定ＨＯＭ−２細胞とともにインキュベートした。最大ビオチン化ペプチド結合の５０％の阻害を引き起こす競合ペプチドの濃度をＩＣ50とした。インフルエンザ１０３−１１５を高親和性対照として含有させた。ＩＣ50≦２０μＭ＝高親和性、ＩＣ50＝２０〜１００μＭ＝中程度の親和性、ＩＣ50≧１００ｕＭ＝低親和性。
【００６１】
(b)インビトロで天然のヒトＴ細胞の増殖を促進する能力を有するＩＮＦαペプチドのＤＲＢ１＊０７０１に対する相対的な結合親和性を決定するための競争ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合分析。ＩＮＦαペプチドを１０μＭビオチン化破傷風毒素８２８−８４０の存在下、固定ＭＯＵ（ＭＡＮＮ）細胞とともにインキュベートした。最大ビオチン化ペプチド結合の５０％の阻害を引き起こす競合ペプチドの濃度をＩＣ50とした。破傷風毒素８２８−８４０を高親和性対照として含有させた。ＩＣ50≦２０μＭ＝高親和性、ＩＣ50＝２０〜１００μＭ＝中程度の親和性、ＩＣ50≧１００μＭ＝低親和性。
【００６２】
(c)インビトロで天然のヒトＴ細胞の増殖を促進する能力を有するＩＮＦαペプチドのＤＲＢ１＊０４０１に対する相対的な結合親和性を決定するための競争ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合分析。ＩＮＦαペプチドを５０ｕＭビオチン化インフルエンザヘマグルチニン３０７−３１９の存在下、固定ＷＴ−５１細胞とともにインキュベートした。最大ビオチン化ペプチド結合の５０％の阻害を引き起こす競合ペプチドの濃度をＩＣ50とした。インフルエンザ１０３−１１５を高親和性対照として含有させた。ＩＣ50≦２０μＭ＝高親和性、ＩＣ50＝２０〜１００μＭ＝中程度の親和性、ＩＣ50≧１００μＭ＝低親和性。
【００６３】
図１３  実施例７の抗増殖分析において分子に保持された活性を示すＩＮＦαの内の置換を詳述する表である（ＷＴ＝野生型の残基；＃＝残基番号；Ｍｕｔ＝施した変異）。エピトープ領域は、免疫原性エピトープ領域Ｒ１、Ｒ２またはＲ３に関しての置換の位置を示す。
【００６４】
図１４  選択された突然変異体ＩＮＦα分子の抗増殖効果の代表的なデータを示す；分析は実施例７の方法によって行った。
【００６５】
パネルa)は、免疫原性エピトープＲ１内での置換を有する分子の活性を示す。
【００６６】
パネルb)は、免疫原性エピトープＲ２内での置換を有する分子の活性を示す。
【００６７】
パネルc)は、免疫原性エピトープＲ３内での置換を有する分子の活性を示す。
【００６８】
図１５  ＩＮＦα合成ペプチドに対する個々のドナーの反応を示すパネルである。対照ペプチドＣ３２（ＤＲＢ１−制限）およびＣ４９（ＤＰ−制限）から得たデータを、比較のために含む。適当なパネル上に免疫原性領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３を示す。陽性刺激指数の閾値＝２。
【００６９】
以下の実施例において、本発明をより詳細に記載するが、これらを制限または限定として解釈してはならない。
【００７０】
（実施例１）
タンパク質やポリペプチドの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は−ＣＯＮＨ−基を含む有機化合物の任意の基である。
【００７１】
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる：
【００７２】
【化１】
2004535173.tif 000009
Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）および水素（Ｈ）原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【００７３】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると（立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である）、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φiおよびψi（ここで添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表す）はポリペプチドの２次構造を有効に規定する。角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、(Ramachandran et al. Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)、特に285−94ページ参照(これらのページは言及によって本願に組み込まれる))。
【００７４】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の位置８６でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する。Marshall, k.W.、 J.Immunol.、152：4946-4956(1994）。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸（疎水性脂肪族は以下のものである：バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）は、ポケット内に収容され得る（芳香族側鎖が優先される）。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する（例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である）。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、（全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば）Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【００７５】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
(1)予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。(2)疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる（例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる）。(3)ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント（ウィンドウ）に対する値の合計を、セグメント（ウィンドウ）の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント（ウィンドウ）の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント（ウィンドウ）について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント（ウィンドウ）内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。(4)上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。(5)予め定義した値（例えば値１）のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば、修飾することができる。本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ結合特性を修飾する可能性を有する。
【００７６】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、Ｔ細胞エピトープをより高精度で予想できる。特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のＭＨＣクラスＩＩ分子の構造に基づく少なくとも４２個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素（Ｃα）位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用において重要な位置での２０個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック(dock)のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容(dock)された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【００７７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン(Brookhaven)タンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場(Molecular Simulations Inc.、San Diego、Ca.から入手可能)と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア(Modeller, Sali a.＆ Blundell TL.、1993.J.Mol.Biol 234：779-815)によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【００７８】
本願の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法(Marshall, k.W.、et al.、Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids、1(3)：157-162)(1995)や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し（ここでもまたＭＨＣクラスＩＩ分子の比較的小さな部分集合を使用する）次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するさらに別の計算方法(Sturniolo T.、et al.、Nat.Biotech、17(6)：555-561(1999)と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は少数のＭＨＣクラスＩＩ分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスＩＩ対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスＩＩ分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【００７９】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法（これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している）と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する１１個のアミノ酸各々のＣα原子間の２乗平均平方根（ＲＭＳ）偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数（現在１３個）の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ”−αについてのＲＭＳ数値は、５０％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス５０％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表す。
【００８０】
最小のＲＭＳ偏差を有するＣα（これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の１１個の残基の位置２と等価である）を動かして、球体は３次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。
【００８１】
その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１  Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。
【００８２】
生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスＩＩ分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。
【００８３】
骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスＩＩ分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスＩＩ分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される：ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【００８４】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出さなければならないペプチドリガンドコンホメーションと組み合うＭＨＣクラスＩＩ分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜２０アミノ酸の範囲で長さが変化する（もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく）可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する：ＭＨＣクラスＩＩ分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める（上記データベースから得られる）。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスＩＩモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【００８５】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ９〜２０個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。
【００８６】
リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ”−α原子の座標を介して、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド（したがって対象タンパク質）でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。
【００８７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用（水素結合、静電気的相互作用、疎水性（親油性）相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない）を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。
【００８８】
水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素（例えばＣ＝ＮＨ−）などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは３〜７ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。
【００８９】
静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約２．８Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。
【００９０】
親油性（脂肪親和性）相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間に、それらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。
【００９１】
ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２Å〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが（約０．６Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【００９２】
１つの実施形態では、ベーム(Boehm)スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ１手法）が結合定数を評価するために使用される(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、8(3)：243-256(1994)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。別の実施形態では、スコアリング関数（ＳＣＯＲＥ２手法）が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用される(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、 12(4)：309-323(1998)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。しかし、上記の文献に記述されているベームスコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。
【００９３】
したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベームスコアリング関数を使用して評価される。修正されたベームスコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー（ΔＧbind）は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド（ΔＧo）の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与（ΔＧhb）；摂動のないイオン間相互作用（ΔＧionic）からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用（ΔＧlipo）；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する（ΔＧrot）；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー（ＥvdW）。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
（ΔＧbind）＝（ΔＧo）＋（ΔＧhbｘＮhb）＋（ΔＧionicｘＮionic）＋（ΔＧlipoｘＮlipo）＋（ΔＧrot＋Ｎrot）＋（ＥvdW）
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧo、ΔＧhb、ΔＧionic、ΔＧlipoおよびΔＧrotは、それぞれ５．４、−４．７、−４．７、−０．１７および１．４の値を与えられる定数である。
【００９４】
Ｎhbは方程式２：
Ｎhb＝Σh-bondsｆ（ΔＲ，Δα）×ｆ（Ｎneighb）×ｆpcs
によって計算される。
【００９５】
ｆ（ΔＲ，Δα）は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ（ΔＲ，Δ−α）＝ｆ１（ΔＲ）×ｆ２（Δα）
ここで、ｆ１（ΔＲ）＝１（ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合）、
または      ＝１−（ΔＲ−ＴＯＬ）／０．４（ΔＲ＜＝０．４＋ＴＯＬの場合）、
または      ＝０（ΔＲ＞０．４＋ＴＯＬの場合）。
さらに、ｆ２（Δα）＝１（Δα＜３０°の場合）
または    ＝１−（Δα−３０）／５０（Δα＜＝８０°の場合）
または    ＝０（Δα＞８０°の場合）。
【００９６】
ＴＯＬは水素結合長さ（＝０．２５Å）で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値（＝１．９Å）からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値（＝１８０°）からの偏差、
ｆ（Ｎneighb）は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ（Ｎneighb）＝（Ｎneighb／Ｎneighb,0）α（ここで、α＝０．５）
によって計算される。
【００９７】
Ｎneighbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎneighb,0＝定数２５である。
【００９８】
ｆpcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆpcs＝β（Ａpolar／ＮHB＜１０Å2の場合）、
またはｆpcs＝１（Ａpolar／ＮHB＞１０Å2の場合）
Ａpolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
ＮHBは水素結合の数であり、
βは定数＝１．２である。
【００９９】
修正されたベームスコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する（同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【０１００】
Ｎlipo項は方程式５によって計算される：
Ｎlipo＝ΣILｆ（ｒIL）
ｆ（ｒIL）はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ（ｒIL）＝１（ｒIL＜＝Ｒ１ｆ（ｒIL）＝（ｒIL−Ｒ１）／（Ｒ２−Ｒ１）でＲ２＜ｒIL＞Ｒ１の場合、
ｆ（ｒIL）＝０（ｒIL＞＝Ｒ２の場合）。
【０１０１】
ここで、Ｒ１はｒ１vdw＋ｒLvdw＋０．５および
Ｒ２＝Ｒ１＋３．０であり、
ｒ１vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒLvdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【０１０２】
Ｎrotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のｓｐ3−ｓｐ3結合およびｓｐ3−ｓｐ2結合の数である。末端ＣＨ3またはＮＨ3の回転は考慮に入れない。
【０１０３】
最後の項Ｅvdwは方程式６によって計算される：
Ｅvdw＝ε1ε2（（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）12／ｒ12−（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）6／ｒ6）。
【０１０４】
ここでε1とε2は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ1vdw＋ｒ2vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【０１０５】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε1とε2はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：０．２４５、Ｎ：０．２８３、Ｏ：０．３１６、Ｓ：０．３１６（つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について）。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：１．８５、Ｎ：１．７５、Ｏ：１．６０、Ｓ：２．００Å。
【０１０６】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである（特に本願で試みられている計算のタイプについて）。したがって、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【０１０７】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は４２個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作製することができる。
【０１０８】
本発明の予想方法は、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子に対する有する親和性が実験的に測定された多数のペプチドを含むデータセットにより較正できる。計算値を実験値と比較することによって、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予想されることがわかれば有益性の一端を決定できる。
【０１０９】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造（すなわち、アミノ酸配列）に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【０１１０】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである：ＤＯＣＫ(Kuntz et al.、 J.Mol.Biol.、 161：269-288(1982))、ＬＵＤＩ(Boehm, H.J.、 J.Comput Aided Mol.Des.、 8：623-632(1994))およびＦＬＥＸＸ(Rarey m.、 et al.、 ISMB、3：300-308(1995))。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては：ＡＭＢＥＲ(Tripos)およびＣＨＡＲｍ(Molecular Simulations Inc.)。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。
【０１１１】
洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる：Brooks, B.R., t al.、 J.Comput.Chem.、4:187-217(1983)。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Dauber-Osguthorpe et al.、 proteins4(1):31-47(1988)。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．、ｅｄ．、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ：０−３０６  ４３１３−９。
【０１１２】
以下の例は本発明をより詳細に説明するものである。
【０１１３】
（実施例２）
実施例１の方法によってＩＮＦα２の１６５アミノ酸配列をインシリコで広く分析した。５７個の１３−ｍｅｒ合成ペプチドのパネルを生成し、それらのインビトロでのヒトＭＨＣクラスＩＩ分子との結合能力を分析した。ペプチド配列を図５に示す。
【０１１４】
ＭＨＣクラスＩＩ合成ペプチド結合分析を、知られているＨＬＡ−ＤＲアロタイプのヒトリンパ芽Ｂ細胞を用いて行った。細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ビオチン化されたペプチドのみまたはビオチン化されていない競合ペプチドとともにインキュベートし、ＩＣ50値を決定した。ペプチドとのインキュベーション後、細胞を溶解し、ＭＨＣクラスＩＩ分子を抗−ＨＬＡ−ＤＲα鎖モノクローナル抗体ＬＢ３．１によって捕捉した。結合したビオチン化ペプチドをストレプトアビジンペルオキシダーゼによって検知し、結合ペプチドの量を発光によって定量的に読み取った。
【０１１５】
ビオチン化されていない試験ペプチドを、ビオチン化された競合ペプチドの存在下に固定細胞とともにインキュベートして、競争的結合分析を行った。競合ペプチドは事前に単純な（非競争的）結合分析を使用して、対象とする特定のアロタイプに対してＩＣ50値を有するように決定しておいた。ＩＣ50値は標識が付されたペプチドの５０％が結合するのを防ぐ非標識ペプチドの濃度である。ビオチン化されたペプチドの濃度は、阻害によって主として測定しているのが競合ペプチドの結合特性であることを確実にするように、各対立遺伝子について測定されたそのＥＤ50（最大応答の２分の１を与えるペプチドの濃度）の少なくとも６分の１となるように実験的に決定した。
【０１１６】
ＥＢＶで形質転換されたヒトＢリンパ芽細胞系は、ＥＣＡＣＣ(Salisbury、英国)から入手可能である。ＨＯＭ−２細胞はＤＲＢ１＊０１０１結合分析で使用した；ＷＴ５１細胞はＤＲＢ１＊０４０１結合分析で使用し、また、ＭＯＵ（ＭＡＮＮ）細胞はＤＲＢ１＊０７０１結合分析で使用した。マウスハイブリドーマＬＢ３．１は、アメリカ組織培養コレクションＡＴＣＣ(ヴァージニア州(アメリカ))から得た。増強された化学発光（ＥＣＬ）試薬は、Amersham Pharmacia(Amersham、英国)から購入した。ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンは、Life Technologies(Paisley、英国)から得た。Ｏｐｔｉｐｌａｔｅｓ（商標）は、Packard(Pangbourne、英国)から得た。ビオチン化されたペプチドは、Ｂａｂｒａｈａｍ  Ｔｅｃｈnix(Cambridge、英国)から、ビオチン化されていないペプチドはPepscan Systems(Lelystad、オランダ)から得た。Ｐｒｏｓｅｐ  ＡはMillipore(Watford、英国)から得た。ＤＡＢ、ＰＭＳＦ、ヨードアセトアミド、ベンズアミジン(benzamidine)、ロイペプチン(leupeptin)、ペプスタチン、ＰＢＳタブレット、ＤＭＳＯ、ＢＳＡ、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合剤および他のすべての化学薬品は、The Sigma Chemical Company(Poole、英国)から得た。
【０１１７】
リンパ芽細胞は、３７℃／５％ＣＯ2の湿潤大気中、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えて培養した。
【０１１８】
ＬＢ３．１ハイブリドーマ細胞は、３７℃／５％Ｃ０2の湿潤大気中、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ウシ胎児血清(FBS)、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えて培養し、培養上清からＬＢ３．１抗体を精製した。上清は０．２２μＭフィルタを用いてろ過、５０ｍｌの１ＭトリスｐＨ８．０を４５０ｍｌにつき加え、０．１Ｍバッファー溶液を作製した。次いで、バッファーを加えた上清を、４℃で３ｍｌＰＲＯＳＥＰ  Ａカラムに終夜通し、２５ｍｌＰＢＳで洗浄した。０．１Ｍクエン酸８ｍｌ（ｐＨ３．０）を用いてＬＢ３．１抗体を溶出し、各０．５ｍｌの画分を５００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に回収した。各画分のタンパク質含有量を分光光度計（Ａ２８０ｎｍ）を使用して決定した。各画分を集め、８００ｍｌＰＢＳ中、スライドＡ−Ｌｙｓｅｒ  ３．５Ｋ遮断(Pierce)を用いて透析した。ＬＢ３．１の純度を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシー染色によって調べた。
【０１１９】
各ペプチド／アロタイプの組合せについての結合分析を、１ウェル当たり２×１０6細胞を使用して、９６ウェル水平底Ｏｐｔｉｐｌａｔｅｓ（商標）中三重に行った。細胞をＲＰＭＩ−１６４０で２度洗浄し、次いで、氷上３０分間、０．５％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した後、細胞を以下のいずれかとともにインキュベートした：ビオチン化されたペプチド；ビオチン化されたペプチド＋非ビオチン化競合ペプチドまたはペプチドなし。インキュベーションは、３７℃で２４時間、ペプチド結合バッファー（１００ｍＭクエン酸塩／リン酸塩ｐＨ４．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１００μＭロイペプチン(Leupeptin)、１ｍＭヨードアセトアミド、１００μＭペプスタチンＡ、１ｍＭ  ベンズアミジン）を使用して行った。細胞を遠心分離で回収し、次いで８０μｌの上清を除去し、８０μｌ／ウェルのＮＰ４０溶解バッファー（０．５％ＮＰ４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１００μＭロイペプチン、１ｍＭヨードアセトアミド、１００μＭペプスタチンＡ、１ｍＭ  ベンズアミジン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０まで））と置き換えた。細胞を４℃で４５分インキュベートし、遠心分離によって清澄化された溶解物を得た。溶解物５０μｌ（３回分／試料）を５０μｌ  ＰＢＳ／５％ＢＳＡを含むプレコートした９６ウェルの分析用プレートの各ウェルに加えた。すべての実験でプレコーティングはその前の晩に行い、ＰＢＳで２０μｇ／ｍｌまで希釈した１００μｌ／ウェル抗クラスＩＩ抗体ＬＢ３．１により４℃において分析用プレートを事前に処理しておいた。過剰な抗体は除去し、プレートは、室温で２時間２５０μ１／ウェルＰＢＳ／５％ＢＳＡでブロック処理した。各プレートをＰＢＳ／１％  Ｔｗｅｅｎで７回洗浄し、細胞溶解物の追加の前に５０μｌのＰＢＳ／５％ＢＳＡ／０．５％  ＮＰ４０を各ウェルに加えた。
【０１２０】
溶解物を添加した後、プレートを４℃で２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで７回洗浄した。ＰＢＳ／５％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎで１：１０００に希釈した１００μｌストレプトアビジンペルオキシダーゼを各ウェルに加え、プレートを４℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで７回洗浄し、各ウェルに化学発光基質(Amersham Pharmacia)１００μｌを加えた。プレートはPerkin Elmer社MicroBeta（登録商標）TriLuxプレートリーダーを使用して読み、結果をＣＰＳで与えた。
【０１２１】
競争的分析では、ビオチン化されたペプチドの最大結合は競合ペプチドがない状態での結合力（ＣＰＳ）および次式による阻害値として定義した：
％阻害率＝１００×［（競合ペプチド不在時のＣＰＳ）−（競合ペプチド共存時のＣＰＳ）］／［競合ペプチド不在時のＣＰＳ］
最大ビオチン化ペプチド結合の５０％阻害を引き起こす競合ペプチド濃度をＩＣ50とした。
【０１２２】
図５にリストされる１３−ｍｅｒペプチドのパネル上で行った結合分析を図６ａ〜ｄに示す。図６ｄに示されるペプチドを例外として、ペプチドはすべて、試験した１個または複数のヒトＭＨＣクラスＩＩアロタイプとの結合相互作用を示す。
【０１２３】
（実施例３）
ＭＨＣ、ペプチドおよびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の間の相互作用は、Ｔ細胞認識の抗原特異性に構造的基礎を与える。Ｔ細胞増殖分析により、ペプチドのＭＨＣへの結合およびＭＨＣ／ペプチド複合体のＴＣＲによる認識を試験する。この実施例のインビトロでのＴ細胞増殖分析は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激と関係しており、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞を含んでいる。刺激はインビトロで、合成ペプチド抗原、実験によってはタンパク質抗原全体を使用して行った。刺激されたＴ細胞増殖を、3Ｈ−チミジン（3Ｈ−Ｔｈｙ）を用いて測定し、組み込んだ3Ｈ−Ｔｈｙの存在を、洗浄した固定細胞のシンチレーションカウントを使用して評価した。
【０１２４】
保存時間１２時間未満のヒト血液からの軟膜層(buffy coat)を、National Blood Service(Addenbrooks病院、Cambridge、英国)から得た。フィコールパック(Ficoll−paque)はAmersham Pharmacia Biotech(Amersham、英国)から得た。主要ヒトリンパ細胞の培養用の、血清を含まず、Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌゲントマイシン(gentomycin)および０．１％ヒト血清アルブミンを含むＡＩＭ  Ｖ培地は、Gibco-BRL(Paisley、英国)から得た。合成ペプチドは、Eurosequence (Groningen、オランダ)およびBabraham Technix(Cambridge、英国)から得た。
【０１２５】
軟膜層の温和な遠心分離により赤血球と白血球とを血漿と血小板とから分離した。最上相（血漿と血小板を含む）を除去、廃棄した。赤血球と白血球を１：１リン酸塩バッファー食塩水（ＰＢＳ）で希釈し１５ｍｌフィコールパック(Amersham Pharmacia(Amersham、英国))上で層状にした。遠心分離はメーカー推奨条件によって行い、ＰＢＭＣを血清＋ＰＢＳ／フィコールパック界面から収集した。ＰＢＭＣをＰＢＳと混合（１：１）し、遠心分離によって回収した。上清を除去、廃棄し、５０ｍｌＰＢＳ中にＰＢＭＣペレットを再懸濁させた。細胞を遠心分離によって再びペレット化し、ＰＢＳの上清を捨てた。細胞を５０ｍｌ  ＡＩＭ  Ｖ培地を使用して再懸濁し、この時点で計数しトリパンブルー(trypan blue)染料排除法を使用して生存度(viability)を評価した。細胞を遠心分離によって再び集め上清を廃棄した。細胞は、１ｍｌ当たり３×１０7の密度で低温貯蔵用に再懸濁した。貯蔵培地は加熱不活性化したＡＢヒト血清(Sigma、Poole、英国)９０％(v/v)とＤＭＳＯ(Sigma、Poole、英国)１０％(v/v)とした。細胞は制御された冷凍容器(Sigma)に移し、−７０℃で終夜置いた。使用のために必要になった時、細胞を水浴中３７℃で急速解凍し、予め温めたＡＩＭ  Ｖ培地１０ｍｌに移した。
【０１２６】
９６ウェル水平底プレート中、ＰＢＭＣを２×１０5  ＰＢＭＣ／ウェルの密度で、タンパク質とペプチド抗原で刺激した。ＰＢＭＣを３７℃で７日間インキュベートし、3Ｈ−Ｔｈｙ(Amersham-Pharmacia、Amersham、英国)でパルス処理した。この研究のために、３ａａ増分によって重複した合成ペプチド（１５ｍｅｒ）を生成した。これはＩＮＦαの全配列にわたるものである。ペプチド識別番号（ＩＤ＃）および配列を図７に示す。各ペプチドは、２０の天然ドナーから分離されたＰＢＭＣに対して個別にスクリーニングした。事前に免疫原性であると示された２種の対照ペプチド、および強力な非リコール(non−recall)抗原ＫＬＨを、各ドナー分析で使用した。
【０１２７】
この研究で使用した対照抗原は以下の通りであった：
【０１２８】
【表８】
2004535173.tif 000010
ペプチドをＤＭＳＯに溶解した（最終濃度１０ｍＭ）、これらのストック溶液は次いで、ＡＩＭ  Ｖ培地で１／５００に希釈した（最終濃度２０μＭ）。ペプチドを、１００μｌ中の最終濃度が２μＭおよび２０μＭとなるように、水平底９６ウェルプレートに加えた。解凍したＰＢＭＣの生存度(viability)をトリパンブルー染料排除法を使用して評価し、次いで細胞を２×１０6細胞／ｍｌの密度に再懸濁し、１００μｌ（２×１０5ＰＢＭＣ／ウェル）をペプチドを含む各ウェルに移した。三重ウェル培養を各ペプチド濃度で分析した。プレートを湿潤大気中３７℃５％ＣＯ2で７日間インキュベートした。細胞を１８〜２１時間、１μＣｉの3Ｈ−Ｔｈｙ／ウェルでパルス処理し、フィルタマット上に収集した。Ｗａｌｌａｃ  マイクロプレートベータトッププレートカウンター(Perkin Elmer)を使用してＣＰＭ値を測定した。結果は刺激指数として表し、以下の式を用いて決定した：
ペプチドＣＰＭを試験する増殖／非処理ウェルＣＰＭ中での増殖
この分析において刺激指数２以上を陽性刺激とした。Ｔ細胞増殖分析を使用してＩＮＦα配列にＴ細胞エピトープをマッピングした結果、３つの免疫原の領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３が識別された。これは、これらの領域の１個または複数のペプチドに応答した６ドナーにおけるＴ細胞増殖によって決定された。ＩＮＦαペプチドに応答した６ドナーのうちの４ドナーで増殖が記録されているため、領域３は潜在的な免疫優性(immunodominant)Ｔ細胞エピトープを含むと考えられる。領域１および２は、ある個体によってはＴ細胞増殖を引き起こす。応答した個体についての累積応答データを図８に示し、個別応答者についてのデータを図９にまとめて示す。個々のドナーについての刺激指数は図１５に示す。ＩＮＦαについてのおよびＲ１、Ｒ２およびＲ３を個々のペプチド／ドナー応答とともに示すエピトープデータを図１０に示す。
【０１２９】
（実施例４）
実施例３で使用したすべてのＰＢＭＣ試料について市販の試薬システム(Dynal、Wirral、英国）を使用して組織タイプを分析した。分析は、供給元の推奨するプロトコルおよび標準の付随的な試薬およびアガロース電気泳動システムに従って行った。ＤＲＢ１対立遺伝子についてのアロタイプカバー率は試験した２０ドナー中７０％であった。組織適合試験の結果を用いて特異的ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を有するＩＮＦα２ペプチド応答者の出現率を評価した。所与のペプチドのアロタイプ制限をドナー集団中の対立遺伝子の出現率、および同一の対立遺伝子を発現する応答ドナー数によって決定する。ペプチドが任意の特定の対立遺伝子と関係している場合、出現率（パーセンテージとして発現される）は集団中の対立遺伝子の出現率より大きいと予想される。こうした分析の結果を図１１に示す。一般に、少数は正確な統計検査を排除する。しかし、データは、Ｒ３として定義されたエピトープ領域のペプチドとＤＲＢ４＊０１アロタイプとの関連があり得ることを示している。
【０１３０】
（実施例５）
実施例３の生物分析を使用して識別された主要免疫原性領域に由来する配列を含む合成ペプチドを使用してＭＨＣペプチド結合分析を行った。これらの分析では、合成１５−ｍｅｒペプチドがビオチン化された競合ペプチドと競合して３個のＭＨＣアロタイプを結合する能力について試験した。実施例２に広く詳細に示す分析を行い、ペプチドを試験する競争者の６種の濃度比率から得た結合曲線からＩＣ50値を計算した。試験した各ペプチド／アロタイプの組合せに対するＩＣ50値を、図１２ａ〜１２ｃに示す。これらのデータは、インビトロの生物分析においてＴ細胞増殖を刺激し得るペプチドを示し、ＭＨＣクラスＩＩリガンド親和性が低いものでも高いものでもよい。
【０１３１】
（実施例６）
多数の修飾されたＩＮＦα２分子を従来の組換えＤＮＡ技術を使用して作製した。野生型のＩＮＦα２ｂ遺伝子はヒト胎盤のＤＮＡからクローンを作製し、対照試薬としておよび部位特異的突然変異によって修飾されたＩＮＦα２ｂ遺伝子を誘導するテンプレートの両方として遺伝子を使用した。野生型および修飾された遺伝子を真核生物の発現ベクターに挿入し、組換えＩＮＦα２タンパク質をヒト免疫グロブリン定常領域を有する融合タンパク質として発現させた。組換えタンパク質は一時的に感染したヒト胚の腎臓細胞から調製し、実施例７において詳述したように分析した。
【０１３２】
簡単に言えば、野生型のＩＮＦα２ｂ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ヒト胎盤のＤＮＡ(Sigma、Poole、英国)から増幅した。遺伝子はイントロンを含んでおらず、順方向および逆方向のプライマーを使用して容易に増幅された。これらのプライマーＯＬ１７７およびＯＬ１７８は、クローニングを促進するための制限部位を含む以下のものである：
【０１３３】
【表９】
2004535173.tif 000011
５５０ｂｐのＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、ｐＬＩＴＭＵＳ２８ベクター(NEB、UK Ltd.)中にクローニングした。多数の陽性クローンの分析により、配列はインターフェロンアルファ２ｂのそれであることが確認された。ヒト胚腎臓細胞から発現を得るために、野生型遺伝子を、ベクターｐｄ−Ｃｓに再度クローニングした[Lo et al (1998)、Protein Engineering 11：495]。ｐｄ−Ｃｓベクターは、ヒト免疫グロブリン定常領域ドメインを含む融合タンパク質の発現のためのものである。このベクターへのクローニングはＰＣＲとプライマーＯＬ２３２およびＯＬ１７８を使用して行った。これらのプライマーは酵素ＸｍａＩおよびＢａｍＨＩとともに使用するためにクローニングサイトを含む以下のものである：
【０１３４】
【表１０】
2004535173.tif 000012
５３０ｂｐのＰＣＲ産物をＸｍａＩとＢａｍＨＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して精製し、準備したｐｄ−Ｃｓ（これはＸｍａＩとＢａｍＨＩを使用してＩＮＦ（Ｌ）配列を取り除いたものである）に移した。陽性クローンを選択し、ＩＮＦα２ｂ配列を配列分析によって確認した。野生型ＩＮＦα２ｂ遺伝子を含むｐｄ−ＣｓベクターはｐＣＩＦＮ５と名付けた。
【０１３５】
修飾されたＩＮＦα２遺伝子を生成する単一または多数のコドン変異を、ｐＣＩＦＮ５をテンプレートとして使用した変異生成ＰＣＲによって行った。重複ＰＣＲを用い、インターフェロン配列の２つの変異させられた半分を組み合わせた。次いで、この断片を、上記のＸｍａＩおよびＢａｍＨＩを使用して、ｐｄ−Ｃｓ由来の発現ベクターに移すのに先立ち、配列分析のために、中間ベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター；Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）にクローニングする。
【０１３６】
変異生成は、特定の変異を起こし得る（ミスマッチ）プライマーおよびｐＣＩＦＮ５テンプレートＤＮＡとを組み合わせた個別反応において側方に位置する以下のプライマーＯＬ２３５およびＯＬ２３４を使用して行った。
【０１３７】
【表１１】
2004535173.tif 000013
拡張高信頼性ＰＣＲ試薬(Roche, GmbH)および以下のサイクルで特定される反応条件を用いて反応を行った：
９４℃／２’＋２５サイクル（９４℃／３０”、６０℃／３０”、７２℃／３０”）＋７２℃／１０”
個別の反応産物を、プライマーＯＬ２３５およびＯＬ２３４によって駆動される、上記ＰＣＲの１５サイクルを使用してＰＣＲ反応によって連結した。
【０１３８】
ＰＣＲ産物は市販のキットシステム（Qiagenゲル抽出キット）を使用して精製されたゲルであった。生成物は、Ｔ／Ａクローニングシステムを使用してベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ(Promega、英国)中にクローニングし、多数のクローンを各場合について配列決定し、所望の変異の導入が成功していることを確認した。
【０１３９】
所望のクローンを、ＢａｍＨ１とＸｍａ１で消化し、精製された産物を、準備したｐｄ−Ｃｓベクターにライゲートした。クローニングは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞(Strategene Europe)および供給元の推奨する培養条件を使用して行った。配列確認はＯＬ２６１およびＯＬ２３４を配列決定用プライマーとして使用し、すべての最終のベクター調製物上で行った。
【０１４０】
【表１２】
2004535173.tif 000014
修飾されたＩＮＦα２ヒトＩｇＦＣ融合タンパク質の発現は、発現ホストとしてＨＥＫ２９３ヒト胚腎臓細胞系を使用して達成された。トランスフェクション用のＤＮＡはすべて、供給元(Invitrogen、Paisley、英国)によって提供される高純度ＣＯＮＣＥＲＴ  ミディプレップ(midiprep)システムおよび指示を使用して調製した。ＤＮＡは使用に先立ってフィルタ滅菌し、Ａ260の測定によって定量したものである。濃度は０．５〜１．０μｇ／μｌに調節した。
【０１４１】
一時的な発現のために、ＨＥＫ２９３は、１０％ＦＣＳおよび２５０μｇ／ｍｌジェネチシン(geneticin)を補われたＤ−ＭＥＭグルタマックス(glutamax)培地(Invitrogen、Paisley、英国)を使用して成長させた。トランスフェクションに先立ち、トリプシンを用いた処理によって細胞を回収し、ＰＢＳを使用して洗浄した。細胞洗浄を２サイクル行った後、４×１０5細胞／ｍｌの密度で新鮮な培地に取り、良い細胞付着を保証するようにポリ−ｌ−リジンで前処理した多重ウェル皿に植菌する。典型的には、２×１０5細胞を４８ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートを３７℃／５％ＣＯ2で終夜インキュベートする。
【０１４２】
トランスフェクションに先立ち、各ウェル内で培地を交換し、トランスフェクション混合物を加える。トランスフェクションは、リポフェクタミン(lipofectamine)試薬および供給元(Invitrogen、Paisley、英国)によって提供される指示を使用して行った。簡単に言えば、トランスフェクション混合物は、各発現ベクターコンストラクトについて、リポフェクタミン、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ(Invitrogen、Paisley、英国)およびウェル当たり０．８μｇＤＮＡを含むように調製する。トランスフェクション混合物を細胞に加え、細胞を４〜６時間インキュベートする。培地を０．５ｍｌの新鮮な培地と交換し、細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。４８時間後、抗ＦＣ  ＥＬＩＳＡおよびダウディ(Daudi)細胞増殖分析の両分析のために試料を採った。７日後に培地を収集し、上記の分析をさらに行うため４Ｃで保存した。
【０１４３】
培地は、市販のＥＬＩＳＡシステムおよび供給元(R＆d Systems、英国)によって提供される指示を使用してＩＮＦα２の存否を分析する。いくつかの例では、ＩＮＦα融合タンパク質のヒト免疫グロブリン定常領域を検知するＥＬＩＳＡが適用された。この分析では、マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ調製物(Sigma、Poole、英国)を捕捉試薬として使用した。ＩＮＦａ−ＨｕＦｃ融合は、参照用のヒトＩｇＧ調製物(Sigma)の希釈シリーズを使用して生成された標準曲線に関して定量したものである。結合ＩＮＦα−ＦＣ融合タンパク質または参照タンパク質は、抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ複合物(Sigma)およびＳｉｇｍａ  ＯＰＤ  比色基質を使用して検知する。
【０１４４】
ＨＥＫ２９３条件培地(conditioned medium)中のＩＮＦα量を評価した後、条件培地を直接に用い、実施例７で詳述する抗増殖分析を使用して、修飾されたＩＮＦαの機能活性を試験する。
【０１４５】
（実施例７）
本発明の修飾されたインターフェロン分子を、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系Ｄａｕｄｉの成長阻害能力に関して試験した。この方法は、以前に幅広く記載されており[Mark, D.F．et al. (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5662-5666]、試験インターフェロンとともにＤａｕｄｉ細胞をインキュベートすることを含んでいる。試験分子の抗−増殖効果は、増殖細胞の存在下では色が変化する可溶性染料物質を使用して測定される。誘導された色変化を分光測光器で測定し、何らかの抗増殖効力を非処理対照および標準インターフェロン調製物で処理された細胞を用いて記録された色変化と対比して計算する。
【０１４６】
簡単に言えば、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２１３）は１００ユニット／ｍｌペニシリン／１００  ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補ったＲＰＭＩ  １６４０培地である。培地および補足物質はすべてＧｉｂｃｏ(Paisley、英国)から得た。分析の前日、細胞を密度０．９×１０6／ｍｌで新鮮な培地中に移し、翌日、１０％(v/v)のＦＢＳを含む以外は上記のものと同じ新鮮な培地に移した。細胞密度は２×１０5細胞／ｍｌに調節する。
【０１４７】
試験および対照のインターフェロン調製物は１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ中に希釈する。希釈液は９６−ウェル水平底プレートおいて１００ｕｌ／ウェル含むようにし、また、試料はすべて三重にセットアップする。典型的には倍々に希釈したシリーズを各プレートを横断するように並べる。ポジティブコントロールウェルもインターフェロン標準(NIBSC、South Mimms、英国)出発濃度を１００００ｐｇ／ｍｌとして三重分に含める。１００ｕｌ培地のみ（インターフェロンを含まない）を含む対照ウェルも含める。細胞１００ｕｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ2で７２時間インキュベートする。
【０１４８】
増殖はＡｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ試薬システムおよび供給元(Promega、Southampton、英国)の推奨するプロトコルを使用して評価する。簡単に言えば、４０μｌのＡｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ試薬システムをすべてのウェルに加え、基質を混合する。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、吸光度測定のためプレートを読み取り装置に移す。読み取りは４９０ｎｍで行う。４９０ｎｍでの平均吸光度をＹ軸に取り、加えたインターフェロン標準濃度（Ｘ軸に沿う）に対してプロットする。インターフェロン濃度は実施例６で詳述したＥＬＩＳＡ法を使用して測定する。生じた検量線を使用して各試験試料に対するＥＤ50値を決定する。
【０１４９】
多数の修飾されたＩＮＦα２分子について上記の方法によるこのような分析結果を図１４に示す。これらの結果は、ＩＮＦα２配列内にアミノ酸置換が存在しても抗増殖特性が保持されていることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】潜在的なヒトＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するヒトＩＮＦα２ａ中のペプチド配列を示す。
【図２】ヒトＩＮＦα２ａ  Ｔ細胞エピトープの除去をもたらす置換を示す（ＷＴ＝野生型残基）。
【図３】１個または複数のＭＨＣアロタイプについて潜在的Ｔ細胞エピトープの除去をもたらす追加的置換を示す。
【図４】ヒトＩＮＦα２ａ（ＷＴ＝野生型残基、ＭＵＴ＝所望の残基）中の好ましい置換を示す。
【図５】実施例２におけるインビトロでのＭＨＣクラスＩＩ結合分析を用いて分析されたＩＮＦα２  １３−ｍｅｒ合成ペプチド配列の表を示す。
【図６（ａ）】ＭＨＣアロタイプについてのインビトロＭＨＣペプチド結合分析の結果を示す。
【図６（ｂ）】ＭＨＣアロタイプについてのインビトロＭＨＣペプチド結合分析の結果を示す。
【図６（ｃ）】ＭＨＣアロタイプについてのインビトロＭＨＣペプチド結合分析の結果を示す。
【図６（ｄ）】ＭＨＣアロタイプについてのインビトロＭＨＣペプチド結合分析の結果を示す。
【図７】実施例３の天然の(naive)ヒトＴ細胞のインビトロ分析を使用して分析されたＩＮＦα２  １５−ｍｅｒペプチド配列の表を示す。
【図８】ＩＮＦαペプチドによる刺激に応答する６個体からの累積的な刺激指数を示す。
【図９】ＩＮＦα内の免疫原性領域を示し、天然のヒトＴ細胞を刺激できるこれらの領域に由来するペプチド配列を詳細に示したものである。
【図１０】天然のヒトＴ細胞の増殖をインビトロで促進することができるＩＮＦαペプチドを示す表を示す。
【図１１】ＩＮＦαペプチドに応答するおよび応答しないドナーにおけるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の出現率を示す表である。
【図１２（ａ）】特定のＭＨＣクラスＩＩアロタイプのための競争的結合分析における１５−ｍｅｒの合成ペプチドに対するＩＣ50値の表を示す。
【図１２（ｂ）】特定のＭＨＣクラスＩＩアロタイプのための競争的結合分析における１５−ｍｅｒの合成ペプチドに対するＩＣ50値の表を示す。
【図１２（ｃ）】特定のＭＨＣクラスＩＩアロタイプのための競争的結合分析における１５−ｍｅｒの合成ペプチドに対するＩＣ50値の表を示す。
【図１３】実施例７の抗増殖分析において分子に保持された活性を示すＩＮＦαの内の置換を詳述する表である（ＷＴ＝野生型の残基；＃＝残基番号；Ｍｕｔ＝施した変異）。
【図１４】選択された突然変異体ＩＮＦα分子の抗増殖効果の代表的なデータを示す。
【図１５（ａ）】ＩＮＦα合成ペプチドに対する個々のドナーの反応を示すパネルである。
【図１５（ｂ）】ＩＮＦα合成ペプチドに対する個々のドナーの反応を示すパネルである。
【図１５（ｃ）】ＩＮＦα合成ペプチドに対する個々のドナーの反応を示すパネルである。
【図１５（ｄ）】ＩＮＦα合成ペプチドに対する個々のドナーの反応を示すパネルである。
【図１５（ｅ）】ＩＮＦα合成ペプチドに対する個々のドナーの反応を示すパネルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004535173.tif 000024
【図６（ａ）】
2004535173.tif 000025
【図６（ｂ）】
2004535173.tif 000026
【図６（ｃ）】
2004535173.tif 000027
【図６（ｄ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２（ａ）】
2004535173.tif 000034
【図１２（ｂ）】
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【図１２（ｃ）】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５（ａ）】
2004535173.tif 000039
【図１５（ｂ）】
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【図１５（ｃ）】
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【図１５（ｄ）】
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【図１５（ｅ）】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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