(57)【要約】炎症性の疾病または状態の予防または治療の方法、上記方法へのＰＰＡＲデルタ活性化因子の使用、および上記治療に有用な化合物を同定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子を投与することを含む、ヒトのような哺乳類における炎症性の疾病または状態を治療する方法。
【請求項２】
炎症性の疾病または状態を治療するための医薬品の製造におけるＰＰＡＲデルタ活性化因子の使用。
【請求項３】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子がＰＰＡＲデルタアゴニストである、請求項１記載の方法または請求項２記載の使用。
【請求項４】
ＰＰＡＲデルタアゴニストが選択的アゴニストである、請求項３記載の方法または使用。
【請求項５】
選択的ＰＰＡＲデルタアゴニストがｈＰＰＡＲデルタ選択的アゴニストである、請求項４記載の方法または使用。
【請求項６】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子が一般式（Ｉ）：
【化１】
2004510750.tif 000019
で表される化合物である、請求項２記載の使用方法または請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子が、｛２−メチル−４−［４−メチル−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）チアゾール−５−イルメチルチオ］フェノキシ｝酢酸である、請求項５記載の使用または方法。
【請求項８】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子および少なくとも１つの製剤用担体を含み、ＰＰＡＲデルタアゴニストが炎症性の疾病または状態の治療に使用するために有効な量で存在する、炎症の治療に使用するための医薬製剤。
【請求項９】
化合物がＰＰＡＲデルタと直接相互作用するかどうかを決定するステップ、または化合物がＰＰＡＲデルタを活性化するかどうかを決定するステップを含む、炎症性の疾病または状態の治療に有用な化合物を同定する方法。
【請求項１０】
請求項９記載のスクリーニング法を用いて同定された化合物を投与することを含む、炎症性の疾病または状態を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は医薬品に関する。特に、本発明は、ＰＰＡＲデルタに結合し、これを活性化する化合物に関する。別の態様において、本発明は炎症性の疾病および状態を予防または治療する方法、および炎症性の疾病および状態の治療に有用な化合物を同定する方法に関する。
【０００２】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（以後ＰＰＡＲと記載する）は、リガンド活性化転写因子のステロイド／レチノイド／甲状腺ホルモン受容体ファミリーの公知のメンバーであって、とりわけ、高いマイクロモル濃度のある種のペルオキシソーム増殖因子により活性化される。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（以後ＰＰＡＲαと記載する）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（以後ＰＰＡＲγと記載する）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ（以後ＰＰＡＲδと記載する）がそれぞれＰＰＡＲのサブタイプとして同定されている。
【０００３】
一酸化窒素は可溶性グアニル酸シクラーゼ酵素の内因性刺激物質であり、多くの生物学的作用に関与している。また、過剰な一酸化窒素の生産も、多くの炎症性の疾病を含む多くの状態に関与していると考えられている。Ｌ−アルギニンからの一酸化窒素の生化学的合成は、酵素ＮＯシンターゼにより触媒される。これまでに多くのＮＯシンターゼの阻害剤、特に、内皮ＮＯシンターゼ（ｅＮＯＳ）よりも、誘導ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）またはニューロンＮＯシンターゼ（ｎＮＯＳ）のいずれかに選択性を示す阻害剤が文献に記載され、治療に用いることを提案されてきた。
【０００４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける多くの生体応答を仲介することが知られている。特異的ＴＮＦ中和抗体、可溶性ＴＮＦ受容体構築物およびＴＮＦ検出技術を用いた動物およびヒトにおける臨床および前臨床研究により、ＴＮＦが、炎症性／自己免疫性の疾病または状態を含む非常に多くの病変の仲介物質であることが示された。
【０００５】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ（以後ＰＰＡＲδと記載する）の活性化因子が、ｉＮＯＳおよびＴＮＦの生成を阻害し、それにより、炎症性の疾病または状態の予防および治療に有用であることを見いだした。
【０００６】
したがって、本発明は、炎症性の疾病または状態の治療におけるＰＰＡＲδ活性化因子の使用、およびＰＰＡＲδ活性化因子を用いて炎症性の疾病または状態を治療する方法を提供する。特に、本発明は、炎症性の疾病または状態の治療における使用に対して効力が高く、選択的なＰＰＡＲδアゴニストの使用を提供する。
【０００７】
炎症は、外傷に対する一群の血管、細胞および神経の応答である。炎症は単球、好中球および顆粒球のような炎症性細胞の組織内への移動として特徴づけられる。これは通常、内皮障壁機能の減少および組織内への水腫を伴う。疾病に関して炎症という場合、典型的には慢性の炎症を指し、これは生涯続くこともあり得る。このような慢性の炎症は病気の症状の間を通じて現れる。したがって、抗炎症治療の目的は、この慢性の炎症を軽減し、生理的過程または治癒（ｈｅａｔｉｎｇ）および組織の修復を進行させることである。
【０００８】
炎症性の疾病または状態の例には、関節の疾病または状態、特に関節炎（たとえば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、人工関節不全）、または胃腸管の疾病または状態（たとえば、潰瘍性大腸炎、クローン病、および他の炎症性の腸および胃腸の疾病、感染の結果生じる胃炎および粘膜の炎症、非ステロイド抗炎症薬により誘発された腸疾病）、肺の疾病または状態（たとえば、成人呼吸困難症候群、喘息、嚢胞性線維症、または慢性閉塞性肺疾患）、心臓の疾病または状態（たとえば、心筋炎）、神経組織の疾病または状態（たとえば、多発性硬化症）、膵臓の疾病または状態（たとえば、糖尿病に伴う炎症およびその合併症）、腎臓の疾病または状態（たとえば、糸球体腎炎）、皮膚の疾病または状態（たとえば、皮膚炎、乾癬、湿疹、じんま疹、やけど）、目の疾病または状態（たとえば、緑内障）、ならびに移植された器官の状態（たとえば、拒絶反応）、および多器官疾病（たとえば、全身性エリテマトーデス、敗血症）、およびウイルスまたは細菌感染症の炎症性後遺症、およびアテローム硬化に伴う炎症性の状態、およびそれに続く、たとえば脳または虚血性心臓病における低酸素または虚血性発作（再灌流を伴うまたは伴わない）が含まれる。
【０００９】
好ましくは、ＰＰＡＲデルタ活性化因子はＰＰＡＲδアゴニストである。本明細書において、「アゴニスト」または「活性化化合物」または「活性化因子」等は、関連ＰＰＡＲ、たとえばヒトＰＰＡＲδに対して、下に記載する結合アッセイにおいて６．０以上のｐＫｉを有し、また、たとえば、ＷＯ ００／０８００２に記載されるトランスフェクションアッセイにおいて、１０−５Ｍ以下の濃度で、指示された適当なポジティブコントロールと比較して、関連ＰＰＡＲの５０％以上の活性化を達成する化合物を意味する。より好ましくは、本発明の化合物はトランスフェクションアッセイにおいて、１０−７Ｍ以下の濃度でヒトＰＰＡＲδの５０％活性化を達成する。
【００１０】
最も好ましくは、ＰＰＡＲデルタ活性化因子は、選択的ｈＰＰＡＲδアゴニストである。本明細書において、「選択的ｈＰＰＡＲδアゴニスト」は、そのＰＰＡＲδに対するＥＣ５０が、そのＰＰＡＲλおよびＰＰＡＲαに対するＥＣ５０よりも１０倍以上低いｈＰＰＡＲδアゴニストである。このような選択的な化合物を「１０倍選択的」であると言う。ＥＣ５０は、たとえばＷＯ ００．０８００２に記載されたトランスフェクションアッセイにおいて定義され、化合物がその最大活性の５０％を達成する濃度である。最も好ましい化合物は、１００倍以上選択的なｈＰＰＡＲδアゴニストである。
【００１１】
以下にさらに特定的な本発明の態様を示す。
【００１２】
（ａ）　炎症性の疾病または状態の治療に治療薬として使用するためのＰＰＡＲデルタ活性化因子（たとえば、一般式（Ｉ）の化合物）；
（ｂ）　ＰＰＡＲデルタ活性化因子（たとえば、一般式（Ｉ）の化合物）および少なくとも１つの製剤用担体を含み、ＰＰＡＲデルタアゴニストが炎症性の疾病または状態の治療に使用するために有効な量で存在する医薬製剤；
（ｃ）　炎症性の疾病または状態を治療するための医薬品の製造におけるＰＰＡＲデルタ活性化因子（たとえば、一般式（Ｉ）の化合物）の使用；
（ｄ）　治療上有効な量のＰＰＡＲデルタ活性化因子（たとえば、一般式（Ｉ）の化合物）を哺乳類に投与することを含む、ヒトのような哺乳類における、炎症性の疾病または状態を治療する方法。
【００１３】
本明細書において、「治療」という用語は、確立されている炎症性の疾病または状態の予防および軽減を含む。ＰＰＡＲデルタ活性化因子は、化合物またはその薬学的に許容される誘導体として使用される。
【００１４】
薬学的に許容される誘導体という用語は、ＰＰＡＲデルタ活性化因子のすべての薬学的に許容される塩、溶媒和物、エステルもしくはアミド、またはそのようなエステルもしくはアミドの塩もしくは溶媒和物、または受容者に投与した際にＰＰＡＲデルタ活性化因子またはその活性な代謝産物もしくは残基を（直接または間接的に）生成することができる他の全ての化合物を意味する。
【００１５】
好ましいＰＰＡＲデルタ活性化因子は、たとえば、 ＷＯ ０１／００６０３に開示された、一般式（Ｉ）の化合物およびその薬学的に許容される塩および溶媒和物である。
【００１６】
【化２】
2004510750.tif 000002
〔式中、
Ｘは、ＣＯＯＨ（またはその加水分解性エステル）またはテトラゾール基を表し；
Ｘ１は、ＮＨ、ＮＣＨ３、Ｏ、Ｓ、結合（すなわち、存在しない）、ＣＨ２、またはＣＨを表し、ここで点線は、Ｘ１がＣＨの場合には描かれた結合が二重結合であることを示し；
Ｘ２は、ＯまたはＳを表し；
Ｒ１およびＲ２は、独立にＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３、またはハロゲンを表し；
ｎは１または２であり；
ＹおよびＺのうち一方はＮであり、他方はＳまたはＯであり；
ｙは０、１、２、３、４または５であり；
Ｒ３はそれぞれ独立に、ＣＦ３またはハロゲンを表す。〕
【００１７】
これらの化合物は、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕプロトコール（Ｏ． Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ， １９８１ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐ １）を用いてＡのような成分をアルコール（Ｂ）と結合させる一般的な方法により、またはＫ２ＣＯ３、Ｃｓ２ＣＯ３またはＮａＨのような適当な非求核塩基を用いてＡをハロゲン化アルキル（Ｃ）でアルキル化することにより、都合よく調製することができる。この合成は、Ｒで保護された酸基を用いて行うことが好ましい点に注意されたい。好ましくは、Ｒは、加水分解により脱離して一般式（Ｉ）の酸を与えるような１−６アルキルであり、または容易に加水分解される場合には、得られたエステルを投与することもできる。
【００１８】
【化３】
2004510750.tif 000003
【００１９】
たとえば、ｎが１、ＹがＳ、ＺがＮ、およびＲ３がｐ−ＣＦ３の場合、
【化４】
2004510750.tif 000004
【００２０】
タイプＡの中間体は市販されている。また、タイプＢの中間体の合成法は下に記載する通りである。
【００２１】
さらに、テトラゾール誘導体は、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕプロトコール（Ｏ． Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ， １９８１ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐ １）を用いてＤのような成分をアルコール（Ｂ）と結合させる一般的な方法により、Ｋ２ＣＯ３、Ｃｓ２ＣＯ３またはＮａＨのような適当な非求核塩基を用いてＤをハロゲン化アルキル（Ｃ）でアルキル化することにより、またはＮａＯＨのような適当な非求核塩基を用いてＥのような成分をハロゲン化アルキル（Ｃ）と結合させることにより、都合よく調製することができる。
【００２２】
【化５】
2004510750.tif 000005
【００２３】
たとえば、ｎが１、ＹがＳ、ＺがＮ、およびＲ３がｐ−ＣＦ３の場合、
【化６】
2004510750.tif 000006
【００２４】
本発明の好ましい化合物は以下の通りである：
２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸、
２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−オキサゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸、
２−｛４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸メチル、
２−｛４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸、
（Ｅ）−３−［２−メチル−４−（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メトキシ）フェニル］−２−プロペン酸
２−｛３−クロロ−４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェニル｝酢酸。
【００２５】
特に好ましいＰＰＡＲデルタアゴニストは、｛２−メチル−４−［４−メチル−２−（４−トリフルオロメチルフェニル）チアゾール−５−イルメチルチオ］フェノキシ｝酢酸およびその薬学的に許容される塩、溶媒和物、および加水分解性エステルである（下記の一般式（ＩＩ））。
【００２６】
【化７】
2004510750.tif 000007
【００２７】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子はまた、その薬学的に許容される塩または溶媒和物の形でも利用することができることは当業者に理解されるであろう。生理的に許容される塩には、薬学的に許容される無機または有機の酸または塩基から形成された従来用いられている塩、および第４アンモニウム酸付加塩が含まれる。好ましい酸性塩のより特定的な例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ギ酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、パルモ酸（ｐａｌｍｏｉｃ）、マロン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ヒドロキシナフトエ酸、ヨウ化水素酸、リンゴ酸、ｓｔｅｒｏｉｃ酸、タンニン酸等の塩が含まれる。シュウ酸のような他の酸は、それ自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩を得るための中間体として有用な塩の調製に有用であり得る。好ましい塩基性塩のより特定的な例には、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、カルシウム、亜鉛、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインの塩が含まれる。これ以後、ＰＰＡＲデルタ活性化因子という場合、化合物およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物の両方を含む。
【００２８】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子およびその薬学的に許容される誘導体は、医薬組成物の形で都合よく投与される。このような組成物は、従来の方法により１以上の生理的に許容される担体または添加剤との混合物として使用のために都合よく提供される。担体（１種または複数種の）は製剤の他の成分と共存でき、その受容者に対して有害でないと言う意味で「許容される」ものでなくてはならない。
【００２９】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子を未加工の化学物質として治療用に投与することも可能であるが、活性成分を医薬製剤として提供するのが好ましい。
【００３０】
製剤には、経口、非経口（たとえば注射またはデポ錠剤による皮下、皮内、鞘内、たとえばデポによる筋内、および静脈内を含む）、直腸および局所（皮膚、口腔および舌下を含む）投与に適したもの、または通気投与の吸入による投与に適した形が含まれるが、好ましい経路はほとんどの場合たとえば受容者の状態および障害に応じて決定される。製剤は１回服用量製剤の形で都合よく提供され、また、薬剤学の分野において周知の方法により調製することができる。全ての方法は、化合物（「活性成分」）を１以上の補助的な成分からなる担体と混合するステップを含む。一般的に、製剤は、活性成分と液体の担体または細かく分割された固体の担体またはその両方とを均一および緊密に混合した後、必要ならば、製品を所望の製剤に形作ることにより調製される。
【００３１】
経口投与に適した製剤は、それぞれがあらかじめ決定された量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤または錠剤（たとえば、特に小児への投与のための咀嚼錠）のような分離した単位として；粉末または顆粒として；水性の液体または非水性の液体中の溶液または懸濁液として；またはＯ／Ｗ型液体乳剤またはＷ／Ｏ型液体乳剤として提供される。活性成分はまたボーラス、舐剤またはペースト剤として提供されてもよい。
【００３２】
錠剤は、必要に応じて１以上の補助的な成分とともに、圧縮または成形することにより作られる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒のような流動しやすい形の活性成分を、必要に応じて他の一般的な添加剤、たとえば、結合剤（たとえば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、デンプンの漿剤、ポリビニルピロリドン）またはヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシメチルセルロース増量剤（たとえば、ラクトース、糖、微結晶セルロース、コーンスターチ、リン酸カルシウム、またはソルビトール）、滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ）、崩壊剤（たとえば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）またはラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤と混合して、適当な機械で圧縮することにより調製される。すりこみ錠剤は、不活性な液体希釈剤により湿らせた粉末の化合物の混合物を適当な機械で成型することにより製造される。錠剤は必要に応じてコーティングまたは刻印をおこない、また、含まれる活性成分が徐放または制御放出されるように製剤化してもよい。錠剤は当業者に公知の方法によりコーティングすることができる。
【００３３】
あるいは、本発明の化合物は、たとえば、水性または油性の懸濁液、溶液、乳液、シロップまたはエリキシルのような経口液体製剤に混合してもよい。さらに、これらの化合物を含む製剤は、使用前に水または他の適当なビヒクルと混合して溶解するための乾燥品として提供されてもよい。このような液体製剤は、懸濁剤、たとえば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは水素添加された食用油；乳化剤、たとえば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアラビアゴム；非水性ビヒクル（食用油を含んでもよい）、たとえば、アーモンド油、ヤシ油、油性のエステル、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；および保存剤、たとえば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸のような一般的に用いられる添加剤を含んでいてもよい。このような製剤はまた、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドのような一般的な坐剤基剤を含む坐剤として製剤化されてもよい。
【００３４】
非経口投与用の製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および想定される受容者の血液と製剤とを等張にするための溶質を含んでいてよい水性および非水性無菌注射溶液；および懸濁剤および粘稠化剤を含んでいてよい水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。
【００３５】
製剤は、１回服用量または複数回服用量用容器、たとえば、密閉されたアンプルおよびバイアルに入れて提供されてもよく、また、使用の直前に、たとえば注射用水のような無菌の液体担体を加えるのみで使用できるようになっている凍結乾燥された状態で保存されてもよい。即時調合の注射溶液および懸濁液は、上記のような種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。
【００３６】
直腸投与用の製剤は、ココアバター、硬脂肪またはポリエチレングリコールのような通常の担体を用いて坐剤として提供される。
【００３７】
口腔、たとえば頬または舌下への局所投与用の製剤には、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントのような香味を付けた基剤に入れた活性成分からなるトローチ剤、およびゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムのような基剤に入れた活性成分からなる香錠が含まれる。
【００３８】
表皮への局所投与のためには、化合物をクリーム、ゲル、軟膏またはローションとして、または経皮パッチとして製剤化してもよい。
【００３９】
化合物はまたデポ製剤として製剤化してもよい。このような長期間作用する製剤は埋め込み（たとえば、皮下または筋内に）または筋内注射により投与される。そのために、たとえば、化合物を、適当な高分子または疎水性材料（たとえば、許容される油中の乳液として）またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性の誘導体として、たとえば、難溶性の塩として製剤化することができる。
【００４０】
鼻内投与のために、本発明の化合物は、たとえば、液体スプレーとして、粉末として、または滴剤の形で用いることができる。
【００４１】
吸入による投与のために、本発明の化合物は、適当な噴射剤、たとえば、１，１，１，２−トリフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ）および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタプロパン（ＨＦＡ ２２７）、二酸化炭素または他の適当な気体を用いて、加圧容器またはネブライザーからのエーロゾルスプレーの供給の形で都合よく送達される。加圧したエーロゾルの場合には、一定量を送達するためのバルブを設けて１回用量を決定してもよい。吸入器または吹き付け器に用いるための、たとえばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、本発明の化合物およびラクトースまたはデンプンのような適当な粉末基剤の粉末混合物を含むように製剤化される。
【００４２】
上に詳細に記載した材料に加えて、製剤には、たとえば、経口投与に適した製剤は着香剤を含むというように、その製剤のタイプを考慮して当技術分野で従来使用されている他の薬剤を加えてもよい。
【００４３】
本明細書における治療に関する言及は、確立された疾病または症状の治療のみならず、予防にも範囲が及ぶことは当業者に理解されるであろう。さらに、治療における使用に必要なＰＰＡＲデルタ活性化因子の量は、治療される状態の性質および患者の年齢および状態により変化し、最終的には治療する医師または獣医の裁量に任されることが理解されるであろう。しかしながら、一般的に成人の治療に用いられる用量は典型的には１日あたり０．０２〜５０００ｍｇ、好ましくは１日あたり１〜１５００ｍｇの範囲である。所望の用量を、１回量で提供してもよく、または適当な間隔にて投与するために分割した量で、たとえば、１日２、３、４回またはそれ以上に分割したものとして提供してもよい。本発明の製剤は０．１〜９９％の活性成分を含んでいてよく、錠剤およびカプセルでは３０から９５％、液体製剤では３から５０％含むのが都合がよい。
【００４４】
本発明に使用するためのＰＰＡＲデルタ活性化因子は、１以上の他の治療薬、たとえば、痛み緩和薬、たとえば、グリシンアンタゴニスト、ナトリウムチャンネル阻害剤（たとえば、ラモトリギン）、サブスタンスＰアンタゴニスト（たとえば、ＮＫ１アンタゴニスト）、アセトアミノフェンまたはフェナセチン；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）阻害剤（たとえば、ｉＮＯＳまたはｎＮＯＳ阻害剤）；腫瘍壊死因子αの放出または作用の阻害剤；抗体治療（たとえば、モノクローナル抗体治療）；カフェインを含む刺激剤； ラニチジンのようなＨ２−アンタゴニスト；オメプラゾールのようなプロトンポンプ阻害剤；水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウムのような制酸剤；シメチコンのような整腸剤；フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドエフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、またはレボデソキシエフェドリンのようなうっ血除去薬；コデイン、ヒドロコデイン、カルミフェン、カルベタペンタン、またはデキストラメトルファンのような鎮咳薬；利尿薬；または鎮静もしくは非鎮静抗ヒスタミン薬；Ｖｉｏｘｘ（商標）またはＣｅｌｅｂｒｅｘ（商標）のようなＣＯＸ−２阻害剤および他のＮＳＡＩＤと組み合わせて使用することができる。そこで、本発明は、別の態様において、炎症の治療に、一般式（Ｉ）の化合物と他の治療薬からなる組合せを使用することを提供する。
【００４５】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子を他の治療薬と組み合わせて使用する場合、化合物は都合のよい経路により、順次または同時に投与することができる。
【００４６】
上に記載した組合せは、製剤の形で都合よく使用に供することができ、したがって、上に定義した組合せを含み、望ましくは製薬上許容される担体または添加剤をも含む製剤は本発明の別の態様である。このような組合せの個々の成分は、順次、または別々のもしくは１つの製剤として同時に、のいずれかの方法で投与される。
【００４７】
同一の製剤中で組み合わせる場合には、２つの化合物は安定で、相互に、また製剤の他の成分と適合可能でなければならないこと、および投与のために製剤化され得ることが理解されるであろう。別々に製剤化する場合には、このような化合物の製剤法として当業者に公知の方法を用いて、任意の都合のよい製剤の形で提供することができる。
【００４８】
ＰＰＡＲデルタ活性化因子を同じ疾病に対して活性を有する第２の治療薬と組み合わせて使用する場合、それぞれの化合物の用量は上記化合物を単独で用いる場合とは異なる可能性がある。適当な用量は当業者に容易に理解されるであろう。
【００４９】
本発明の発明者らは、ＰＰＡＲデルタの活性化因子である化学化合物は、炎症に関与しているｉＮＯＳおよびＴＮＦの生成の阻害剤でもあることを見いだした。新規のＰＰＡＲデルタ活性化因子の同定は、炎症の治療のためのより有効な薬物の開発につながる可能性がある。したがって、本発明はさらに、化合物がＰＰＡＲデルタと直接相互作用するかどうかを決定するステップ、または化合物がＰＰＡＲデルタを活性化するかどうかを決定するステップを含む、炎症の治療に有用な化合物を同定する方法を提供する。好ましいスクリーニング試験には、本明細書において先に論じ、またＷＯ ００ ０８００２に開示された結合およびトランスフェクションアッセイが含まれる。ＰＰＡＲデルタの好ましい対照は、たとえば、２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸であり、これは放射線標識されていると都合がよい。
【００５０】
本発明はまた、本発明の方法を用いて同定された化合物を治療上有効な量投与することを含む、被験者における炎症性の状態または疾病を治療する方法を提供する。本発明はまた、本発明のスクリーニング法により同定された化合物の、炎症性の疾病または状態を治療するための医薬品の製造における使用を提供する。
【００５１】
以下の実施例は、本発明のいくつかの特定の化合物の合成法を説明し、さらに上に記載された一般的なプロセスの特定の応用の例を示すために記載するものである。したがって、以下の実施例は本明細書に記載された発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【００５２】
実施例
実施例１
２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸の調製
中間体Ａ：
【化８】
2004510750.tif 000008
クロロスルホン酸（１５ｍＬ）を０℃に冷却した後、１０．０ｇ （０．０５Ｍ）の２−メチルフェノキシ酢酸エチルを１０分間かけて加えた。反応混合物を０〜５℃で３０分間撹拌し、浴を外してさらに２時間撹拌を続けた。反応混合物を氷に注いで白色の固体を形成させ、これを氷水で洗浄し、高度の減圧下で乾燥し、表題の化合物（１２．８４６ｇ、８６％）を得た。
【００５３】
中間体Ｂ：
【化９】
2004510750.tif 000009
ＬｉＡｌＨ４ （１．５２ｇ、４０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を０℃でよく撹拌し、４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−チアゾール−５−カルボン酸エチル（１２．６ｇ、４０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液をゆっくりと加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。０℃で水（２ｍＬ）、５Ｎ ＮａＯＨ（２ｍＬ）および水（６ｍＬ）をゆっくり加えることにより反応を止めた。沈殿を濾過し、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２およびＴＨＦにより洗浄した。溶媒の蒸発の後、黄色の固体が得られ、これをＭｅＯＨ−水から結晶化して上に記載した中間体Ｂ （９．９０ｇ、３６ｍｍｏｌ、９０％）を黄色の固体として得た。ｍｐ １２０−１２２℃。
【００５４】
中間体Ｃ：
【化１０】
2004510750.tif 000010
冷却して（０℃）、撹拌した中間体Ｂ （８．２ｇ、３０ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ （６．０７ｇ、８．３６ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２ （１２０ｍＬ）中の溶液に、ＭｅＳＯ２Ｃｌ （５．４９ｇ、３．７１ｍＬ、４８ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。２時間後に０℃でＥｔ３Ｎ （６ｍｍｏｌ）およびＭｅＳＯ２Ｃｌ （４．８ｍｍｏｌ）をさらに加えた。さらに２時間後に、ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：１）により反応が完結したことを確認した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１２０ｍＬ）により希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×２４０ｍＬ）および水（２×２４０ｍＬ）により洗浄し、乾燥、濾過し、溶媒を蒸発させて中間体Ｃ （８．０ｇ、２７ｍｍｏｌ、９０％）を黄色の固体として得た。
【００５５】
２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸：
【化１１】
2004510750.tif 000011
中間体Ａ （４．６８ｇ、１６ｍＭ）を、９．６ｇのスズ粉末と共にエタノール（２０ｍＬ）およびジオキサン／ＨＣｌ（２０ｍＬ）中で還流した。３時間後、反応混合物を氷およびＣＨ２Ｃｌ２ （２００ｍＬ）の中に注ぎ、濾過した。相を分離して水層を２×５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させて３．５ｇ （９７％）の生成物を得た。この物質は容易にジスルフィドを形成するので、直ちに使用した。これを中間体Ｃ （４．０ｇ、１４．０ｍＭ）およびＣｓ２ＣＯ３ （１０．１ｇ、３１．０ｍＭ）と共にアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶かし、１時間撹拌した後、エーテル（２００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）で希釈した。相を分離し、有機相を２×ＮａＯＨ ０．１Ｎ （５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）、濾過して、溶媒を蒸発させて粗生成物（６．５７ｇ）を得た。これをヘキサン：エーテル（１：１）中にスラリー化し、濾過して純粋な中間体Ｄ （５．０ｇ、７４％）を得た。この物質を下に記載する方法で加水分解して表題の化合物を調製した。対応するエステル（中間体Ｄ） （１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ （１０ｍＬ）（場合によっては溶解度を高めるためにＭｅＯＨを数滴加えた）中の溶液を、１Ｎ ＬｉＯＨ水溶液（２ｍＬ、２ｍｍｏｌ）で処理して、室温で１６時間撹拌した（反応が遅い場合には温度を５０℃に上げた）。溶液を１Ｎ ＨＣｌ （２ｍＬ、２ｍｍｏｌ）で中和し、有機溶媒を蒸発させて不溶性の生成物を有する水溶液を得た。不溶物が固体の場合にはこれを濾過し、乾燥して最終生成物を得た。不溶物がオイルの場合には、これをＥｔＯＡｃ （３０ｍＬ）により抽出した。有機溶液を分離し、水で洗浄し（２×３０ｍＬ）、乾燥、濾過し、溶媒を蒸発させて最終生成物を得た。
【００５６】
実施例２
２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸
中間体１
【化１２】
2004510750.tif 000012
Ｐ４Ｓ１０ （０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（１００ｍＬ）溶液にＮａＨＣＯ３ （２ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を約３０分間加熱還流した。置換ベンズアミド（１ｍｍｏｌ）を加えて反応液を９０℃で１時間撹拌した。次いで、反応液を蒸発乾固し、食塩水（１００ｍＬ）で処理し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を乾燥、濾過し、溶媒を蒸発させて最終生成物を黄色の固体として得た（５０％）。
ＭＳ ｍ／ｚ ２２３。
【００５７】
中間体２
【化１３】
2004510750.tif 000013
中間体１を２−クロロアセト酢酸エチルと反応させ（１：１ｍｍｏｌ）、混合物を一晩加熱還流した。反応液を室温に冷却して溶媒を蒸発させた。得られた固体をＥｔ２Ｏまたはヘキサンから結晶化して、表題の化合物を白っぽい固体として得た（５６％）。
ＭＡ ｍ／ｚ ３３３。
【００５８】
中間体３
【化１４】
2004510750.tif 000014
中間体２を０℃でＬｉＡｌＨ４の溶液と反応させた。反応液を撹拌しながら室温に温めた。全ての出発物質が消失した後、反応液を水（５ｍＬ）、次いで１Ｎ ＮａＯＨ （１０ｍＬ）で注意深く処理した。混合物をセライトで濾過した。濾液をＣＨ２Ｃｌ２ （３×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を乾燥、濾過し、溶媒を蒸発させて表題の化合物を白っぽい固体として得た（６３％）。
ＭＳ ｍ／ｚ ２９１。
【００５９】
中間体４
【化１５】
2004510750.tif 000015
中間体３（１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ （２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２ （１００ｍＬ）中の溶液に、塩化メタンスルホニル（１．６ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。２〜４時間後に反応が終結した。ＣＨ２Ｃｌ２ （５０ｍＬ）を加えて、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２×５０ｍＬ）、水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥、濾過した後、溶媒を蒸発させて表題の化合物を淡黄色の固体として得た（１００％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ２．４０（ｓ， ３Ｈ）、４．７０（ｓ， ２Ｈ）、７．５５−７．７５（ｍ， ３Ｈ）。
【００６０】
中間体５
【化１６】
2004510750.tif 000016
クロロスルホン酸（１５ｍＬ）を０℃に冷却した後、１０．０ｇ（０．０５Ｍ）の２−メチルフェノキシ酢酸エチルを１０分間かけて加えた。反応混合物を０〜５℃で３０分間撹拌し、浴を外してさらに２時間撹拌を続けた。反応混合物を氷に注いで、白色の固体を形成させ、これを氷水で洗浄し、高度の減圧で乾燥して、表題の化合物を得た（１２．８４６ｇ、８６％）。
【００６１】
【化１７】
2004510750.tif 000017
実施例２ａ
２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸エチル
中間体５（４．６８ｇ、１６ｍＭ）を、９．６ｇのスズ粉末と共にエタノール（２０ｍＬ）およびジオキサン／ＨＣｌ （２０ｍＬ）中で還流した。３時間後に反応混合物を氷およびＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）の中に注いで濾過した。相を分離し、水層を２×５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させて３．５ｇ （９７％）の生成物を得た。この物質は容易にジスルフィドを形成するので、直ちに使用した。これを、中間体４（４．０ｇ、１４ｍＭ）およびＣｓ２ＣＯ３ （１０．１ｇ、３１．０ｍＭ）と共にアセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解して１時間撹拌した後、エーテル（２００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）で希釈した。相を分離して、有機相を２×ＮａＯＨ ０．１Ｎ （５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させて、中間体５４である粗生成物（６．５７ｇ）を得た。この粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２（１００％）を用いてクロマトグラフィーをおこない、表題の化合物（５０％）を透明なオイルとして得た。これを静置すると固体となった。
【００６２】
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ１．２０（ｔ，３Ｈ）、２．１５（ｓ， ３Ｈ）、２．２０（ｓ， ３Ｈ）、４．０５（ｓ， ２Ｈ）、４．１５（ｑ， ２Ｈ）、４．５５（ｓ， ２Ｈ）、６．５５（ｄ， １Ｈ）、７．０５（ｄｄ， １Ｈ）、７．１５（ｄ， １Ｈ）、７．５５（ｔ， １Ｈ）、７．６５（ｍ， ２Ｈ）
ＭＳ ｍ／ｚ ５００ （Ｍ＋１）。
【００６３】
【化１８】
2004510750.tif 000018
実施例２ｂ
２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸
実施例２ａ （１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ （１０ｍＬ）溶液を、１Ｎ ＬｉＯＨの水溶液（２ｍＬ、２ｍｍｏｌ）で処理し、室温で１６時間撹拌した（反応が遅い場合には、温度を５０℃に上げた）。溶液を１Ｎ ＨＣｌ （２ｍＬ、２ｍｍｏｌ）で中和し、有機溶媒を蒸発させて、不溶性生成物を有する水溶液を得た。不溶物が固体の場合には、これを濾過して乾燥し、最終生成物を得た。不溶物がオイルの場合には、これをＥｔＯＡｃ （３０ｍＬ）で抽出した。有機溶液を分離し、水（２×３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥、濾過し、溶媒を蒸発させて最終生成物を得た。
【００６４】
粗物質をエーテルから沈殿させ、表題の化合物を黄色の泡状物として得た（８１％）。ｍｐ＜５０℃。
【００６５】
質量分析、Ｃ２１Ｈ１７Ｆ４ＮＯ３Ｓ２に対する計算値：Ｃ， ５３．５０； Ｈ， ３．６３； Ｎ， ２．９７； Ｓ， １３．６０． 計測値：Ｃ，５３．８６； Ｈ，３．６３； Ｎ， ２．８７； Ｓ， １３．８２
ＭＳ ｍ／ｚ ４７２ （Ｍ＋１）。
【００６６】
ＩＮＯＳ生検
ＰＰＡＲデルタ活性化因子の、誘導一酸化窒素シンターゼ（ＩＮＯＳ）の活性および発現を阻害する能力を、２−｛２−メチル−４［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸（これ以降、化合物Ａと呼ぶ。実施例１に記載された方法で合成された）および２−｛２−メチル−４−［（｛４−メチル−２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］フェノキシ｝酢酸（これ以降、化合物Ｂと呼ぶ。実施例２ｂに記載された方法で合成された）のような効力の高い選択的ＰＰＡＲデルタアゴニストを用いて試験した。
【００６７】
このアッセイ系において、マウスマクロファージ細胞系、Ｊ７７４におけるＩＮＯＳの発現を誘導するためにリポ多糖（ＬＰＳ）を用いた。薬理的に適切な濃度のＰＰＡＲデルタアゴニストによるＪ７７４細胞の前処理により、ＩＮＯＳ活性の阻害が見られた。このＩＮＯＳ活性の減少は、ＬＰＳ誘導ＩＮＯＳ ｍＲＮＡ発現の減少と相関があった。
【００６８】
ｉＮＯＳ活性の測定
具体的には、ＬＰＳ−誘導ＩＮＯＳ活性を以下のアッセイ条件を用いて測定した。Ｊ７７４細胞をウェルあたり３５００−５０００万細胞の密度で、黒い、底の透明な９６ウェルプレートに使用の２４時間前に播種した。細胞培養および薬物希釈は、ウシ胎児血清（１０％）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）からなる完全培地中でおこなった。Ｊ７７４細胞は、 ＬＰＳ（典型的には、１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳを用いた）の添加の前６時間および添加の後２４時間に渡って、ＰＰＡＲデルタ活性化因子ＡおよびＢ、またはビヒクルにより前処理された。ＬＰＳの添加の２４時間後に、以下の方法でＩＮＯＳ活性を測定した。細胞培養培地／薬物希釈を除去し、細胞をＤ−ＰＢＳ（ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。次いでＤ−ＰＢＳを除去し、ＤＡＦ−２ （４，５−ジアミノフルオレセイン；５ｕＭ）およびＬ−アルギニン（５００μＭ）を含むＤ−ＰＢＳと置き換えた。３７℃で３時間インキュベーションをおこなった後、それぞれのウェルの蛍光を４８５ｎｍの励起波長、５３０ｎｍの発光波長で測定した。次に、ＰＰＡＲデルタ活性化因子が存在する場合と存在しない場合におけるＬＰＳのＩＮＯＳ活性を誘導する能力を計算した。得られたデータの例を、ＬＰＳにより誘導された対照のＩＮＯＳ活性の上昇を１００％の応答として、図１に示す。
【００６９】
その結果、化合物Ａまたは化合物Ｂによる前処理は、ナノモル未満からナノモルの濃度で、Ｊ７７４細胞のＬＰＳ−誘導ＩＮＯＳ活性を著しく阻害した。
【００７０】
ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの阻害の測定
ＰＰＡＲデルタ活性化因子によるＩＮＯＳ活性の阻害に関するメカニズムをより詳細に研究した。
【００７１】
具体的には、ＰＰＡＲデルタアゴニストの、Ｊ７７４細胞におけるＬＰＳに誘導されたＩＮＯＳ ｍＲＮＡの発現を阻害する能力を試験した。Ｊ７７４細胞を、使用の２４時間前に６ウェルプレートに塗布した（１０６細胞／ウェル）。ＬＰＳを加える前に細胞をＰＰＡＲデルタ活性化因子対照培地により６時間前処理して、これをＰＰＡＲデルタ活性化因子／対照とともにさらに２４時間インキュベートした。このインキュベーション期間の終わりに、培地を吸引により除去して細胞をＤ−ＰＢＳで洗浄した。Ｄ−ＰＢＳを除去した後、市販のＲＮＡ分離キットを用いてそれぞれのサンプルから全細胞ＲＮＡを分離した。第１に、ＡＭＶ逆転写（ＲＴ）システムにより与えられる指示に従って、第１鎖ｃＤＮＡ合成をおこなった。１アリコート（１０００ｎｇ）のＲＮＡを、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （１０ｍＭ； ｐＨ８．８）、ＫＣｌ （５０ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ （０．１％）、ｄＮＴＰ （１ｍＭ）、ｒＲＮａｓｉｎ （１Ｕ／μｌ）、ＡＭＶ逆転写酵素（０．７５Ｕ／μｌ）、オリゴ（ｄＴ）１５（２５ｎｇ／μｌ）（最終濃度）を含む混合物に加えた。これをサーマルサイクラーで４２℃で３０分間、次いで９５℃で１５分間、最後に４℃でインキュベートした後、保存のために冷凍庫（−２０℃）に移した。
【００７２】
ＰＣＲの使用のために以下のプライマーセットを使用した：
マウスＩＮＯＳセンス　　　　ＣＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号１）
マウスＩＮＯＳアンチセンス　ＧＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧ（配列番号２）
マウスＧＡＰＤＨセンス　　 ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ（配列番号３）
マウスＧＡＰＤＨアンチセンス ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号４）。
【００７３】
ＰＣＲを、５μｌのＲＴ反応、ＩＮＯＳ／ＧＡＰＤＨに対するセンスおよびアンチセンスプライマー（０．４ｐｍｏｌ／μｌ）、ｄＮＴＰ （１６０μＭ）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （１０ｍＭ； ｐＨ９．０）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ （０．１％）、ＭｇＣｌ２ （２ｍＭ）、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０．０４Ｕ／μｌ） （最終濃度）を含む５０μｌ反応体積で開始した。ＰＣＲを、９５℃で６０秒の後、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒、７２℃で９０秒を２８サイクルという条件を用いて、サーマルサイクラーで実施した。７２℃で５分間の最後の伸長ステップの後、サンプルをアガロースゲル上で分析するまで、４℃に維持した。ｓｙｂｒ−グリーンで染色したゲルのデンシトメトリーによる分析を、Ｓｔｏｒｍ蛍光イメージャーシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いておこなった。
【００７４】
その結果、薬理的に適切な濃度のＰＰＡＲデルタ活性化因子により前処理されたＪ７７４細胞では、ＬＰＳ （下記のデータで１μｇ／ｍｌ）に誘導されるＩＮＯＳ ｍＲＮＡ発現の阻害が見られた。このデータを図２に示す。
【００７５】
ＴＮＦの阻害の測定
ＰＰＡＲデルタ活性化因子の、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）の発現／分泌を阻害する能力もまた試験した。その結果、ＰＰＡＲデルタ活性化因子のＬＰＳ−誘導ＴＮＦ発現を阻害する能力は、ＰＰＡＲデルタ活性化因子のＬＰＳ−誘導ＩＮＯＳ活性化に対する阻害効果と高い相関を示した。
【００７６】
具体的には、ＬＰＳ−誘導ＩＮＯＳ活性およびＴＮＦの発現を以下のアッセイ条件を用いて測定した。Ｊ７７４細胞をウェルあたり３５００−５０００万細胞の密度で、黒い、底の透明な９６ウェルプレートに播種した。細胞培養および薬物希釈は、ウシ胎児血清（１０％）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）からなる完全培地中でおこなった。Ｊ７７４細胞は、 ＬＰＳ（典型的には、１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳを用いた）の添加の前６時間および添加の後２４時間に渡って、ＰＰＡＲデルタ活性化因子またはビヒクルにより前処理された。ＬＰＳの添加の２４時間後に、以下の方法でＩＮＯＳ活性を測定した。細胞培養培地／薬物希釈を除去して、市販のＥＬＩＳＡシステムを用いた定量によりＴＮＦ濃度を測定した。細胞をＤ−ＰＢＳで洗浄した。次いでＤ−ＰＢＳを除去し、ＤＡＦ−２ （４，５−ジアミノフルオレセイン；５μＭ）およびＬ−アルギニン（５００μＭ）を含むＤ−ＰＢＳと置き換えた。次いで、ＩＮＯＳ活性を先に記載した方法で測定した。得られたデータの例を図３に示す。
【００７７】
この明細書および特許請求の範囲から構成される出願は、後の出願の優先権の基礎として用いられる可能性がある。そのような後の出願のクレームは、新規の構成または本明細書に記載された構成の組合せに関するものである可能性がある。これは製品、組成物、方法または使用法のクレームの形を取る可能性があり、また、例であって制限するものではないが１項以上の本出願のクレームを含む可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰＰＡＲデルタアゴニストのリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ｉＮＯＳ活性に対する効果を示す図である。
【図２】
ＰＰＡＲデルタアゴニストのｉＮＯＳ ｍＲＮＡのＬＰＳによる上昇に対する効果を示す図である。
【図３】
ＰＰＡＲデルタアゴニストの、ＬＰＳ−誘導ｉＮＯＳ活性化と比較したＬＰＳ−誘導ＴＮＦα発現化合物に対する効果を示す図である。
【図１】
2004510750.tif 000020
【図２】
2004510750.tif 000021
【図３】
2004510750.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004510750.tif 000023
2004510750.tif 000024
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510750.tif 000052
【国際調査報告】
2004510750.tif 000053
2004510750.tif 000054
2004510750.tif 000055
2004510750.tif 000056
2004510750.tif 000057
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