(57)【要約】本発明は、患者の癌を予防および／または処置する方法に関し、該方法は、該患者に、有効量のジフルオロメチルオルニチンの実質的にＤに富んだ鏡像異性体（Ｄ−ＤＦＭＯ）またはそのアナログを投与する工程を包含する。Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログは、約０．０５〜約２０．０ｇｍ／Ｍ２／日の用量で投与される。好ましい実施形態では、Ｄ−ＤＦＭＯは、約０．１〜約２．０ｇｍ／Ｍ２／日の用量で投与される。Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログは、癌を処置および／または予防するために、１回より多く投与され得る。実質的に精製したＤ−ＤＦＭＯおよびＤ−ＤＦＭＯアナログの組成物および処方だけでなく、投与方法もまた、記述されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の癌を予防および／または処置する方法であって、該患者に、有効量のジフルオロメチルオルニチンの実質的にＤに富んだ鏡像異性体（Ｄ−ＤＦＭＯ）またはそのアナログを投与する工程を包含する、
方法。
【請求項２】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログが、約０．０５〜約２０．０ｇｍ／Ｍ２／日の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログが、約０．１〜約２．０ｇｍ／Ｍ２／日の用量で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記投与される癌が、膀胱癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌、胃癌、血液の癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、食道癌、およびそれらの任意の組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が、結腸癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記結腸癌が、家族性腺腫様ポリープ症である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、膀胱癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記膀胱癌が、表在性膀胱癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記癌の予防および／または処置が、アポトーシスを誘発すること、細胞分裂を阻止すること、転移の可能性を抑制すること、腫瘍の負担を減らすこと、化学療法または放射線療法に対する感受性を高めること、癌細胞を殺すこと、癌細胞の成長を阻害すること、腫瘍の退行を誘発することおよびそれらの組合せから選択される機構により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログが、少なくとも２回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
固形腫瘍を切除する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログが、前記切除の前に、投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＦＭＯまたはそのアナログが、前記切除の後に、投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
投与経路が、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、経鼻投与、直腸内投与、腟内投与、局所投与、口腔内投与およびリンパ内投与から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＦＭＯまたはそのアナログが、腫瘍に直接投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログが、全身的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログが、腫瘍の局所血管系に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログが、腫瘍の局所リンパ系に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはそのアナログが、経口的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの投薬量の少なくとも６０重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの投薬量の少なくとも７０重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの投薬量の少なくとも８０重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの投薬量の少なくとも９０重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの投薬量の少なくとも９５重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの投薬量の少なくとも９７．５重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの投薬量の少なくとも９９重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの投薬量の少なくとも９９．５重量％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
薬学的に受容可能なキャリアと共にジフルオロメチルオルニチンの実質的にＤに富んだ鏡像異性体（Ｄ−ＤＦＭＯ）またはそのアナログを含有する、薬学的組成物。
【請求項２９】
患者に投与するための単位用量に処方した、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
迅速放出、時限放出、遅延放出、持続放出、経口懸濁液、錠剤、カプセル、粉末、トローチ、坐剤、リポソーム、ナノ粒子、吸入剤、点鼻液、点眼液、点耳液、灌注液、静脈内混合物、上皮液または経皮液、バッカル錠剤、シロップ、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、乳濁液、エリキシル液、圧注器、浣腸剤、うがい薬、移植片およびエアロゾルからなる群から選択される形状で処方される、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記Ｄ鏡像異性体が、全ジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの少なくとも６０重量％を構成する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記Ｄ鏡像異性体が、全ジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの少なくとも７０重量％を構成する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記Ｄ鏡像異性体が、全ジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの少なくとも８０重量％を構成する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
前記Ｄ鏡像異性体が、全ジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの少なくとも９０重量％を構成する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記Ｄ鏡像異性体が、全ジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの少なくとも９５重量％を構成する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記Ｄ鏡像異性体が、全ジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの少なくとも９７．５重量％を構成する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記Ｄ鏡像異性体が、全ジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの少なくとも９９重量％を構成する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記Ｄ鏡像異性体が、全ジフルオロメチルオルニチンまたはそのアナログの少なくとも９９．５重量％を構成する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本特許出願は、２０００年３月７日に出願された同時係属中の米国暫定特許出願第６０／１８７，４４１号および２０００年７月１日に出願された同時係属中の同時米国暫定特許出願第６０／２１５，８６６号から優先権を主張している。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般に、癌および生物学の分野に関する。さらに特定すると、本発明は、癌の治療におけるジフルオロメチルオルニチンのＤ−鏡像異性体の使用方法に関する。
【０００３】
（２．関連技術の説明）
ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）は、哺乳動物のポリアミン生合成における重要な酵素であるオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の不可逆性阻害剤である（Ｐａｓｉｃら、１９９７年）。ＤＦＭＯの２種の鏡像異性体は、それらがＯＤＣを阻害する性能が異なると報告されており、そのＬ形態は、そのＤ鏡像異性体よりも強力である（Ｄａｎｚｉｎら、１９８７年）。ポリアミンの生理学的な機能は完全には理解されていないものの、それらの細胞内濃度は、高く制御されており、正常な細胞の成長、複製、分化、分泌および修復機能には、ポリアミンが必要であることが明らかである（Ｐｅｇｇ　ａｎｄ　ＭｃＣａｎｎ．１９８２年：Ｏｋａら、１９８１年：Ｐｅｇｇ．１９８６年：Ｂａｃｈｒａｃｈ．１９７３年：Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ａｓｈｍａｎ　ａｎｄ　Ｃａｎｅｌｌａｋｉｓ．１９７９年：Ｔｈｅｔら、１９８４年：Ｌｕｃ　ａｎｄ　Ｂａｙｌｉｎ．１９８４年）。ポリアミンは、多くの腫瘍細胞において、高いレベルで見出されており（Ｐａｓｉｃら、１９９７年）、癌の発生の多段階プロセスに必須である持続細胞成長を補助している。結腸発癌の動物モデルでは、ＤＦＭＯによりＯＤＣを阻害すると、結腸の腺腫および癌腫の数および大きさが低下する（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ　ａｎｄ　Ｇｅｒｎｅｒ，１９９５年）。高いレベルのＯＤＣはまた、膀胱の移行上皮癌で報告されており、膀胱癌の患者の治療としてＤＦＭＯを使用することが報告されている（Ｍｅｓｓｉｎｇら、１９９５年）。
【０００４】
ＤＦＭＯ治療の不幸な副作用の１つには、聴覚機能の破壊がある。ポリアミンは、蝸牛で見られるが、聞き取り時のそれらの役割は、未知である（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、１９８６年）。蝸牛でのポリアミンの可能性のある役割は、疎水性環境（例えば、膜で生じるもの）と相互作用させることにあり得、それらは、無機カチオンの流動を規制し得る（Ｃａｎｅｌｌａｋｉｓら、１９７９年）。蝸牛の機能は、内リンパの独特の電解質濃度および正の分極に密接に依存している。従って、ポリアミンのレベルの変化は、蝸牛内直流電位の基礎をなす電解質の動態を変え、最終的に、蝸牛の機能に影響を与えることができる（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、１９８６年）。
【０００５】
２種類の聴器毒性（眩暈様症候群および聴力損失）が公知である（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ　ａｎｄ　Ｇｅｒｎｅｒ、１９９５年）。Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯの１日用量が増えるにつれて（０．５ｇ／ｍ２／日から３ｇ／ｍ２／日）、閾値シフトの規模および発生率が増し、この閾値シフトの開始までの時間が短くなる（Ｐａｓｉｃら、１９９７年）。正常な（３０ｄＢ未満の閾値）ベースライン聴力図のある患者は、より高い周波数レベルにおいて、異常な（３０ｄＢ以上の閾値）ベースライン聴力図の患者よりも、聴力損失が高いことを示す（Ｃｒｏｇｈａｍら、１９９１年）。両方の副作用は、薬剤を中断した後に、逆になり（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ　ａｎｄ　Ｇｅｒｎｅｒ、１９９５年）、閾値の回復は、その閾値シフトの規模または投与したＤ，Ｌ−ＤＦＭＯの用量に対する依存性を示さない（Ｐａｓｉｃら、１９９７年）。
【０００６】
聴器毒性の可能性が少ない化学療法薬の開発は、動物モデルにおける投薬量データが欠けていること、およびどの種がＤＦＭＯ聴器毒性を受けやすいか不確かなことにより、複雑になっている。最も一般的に使用されているＤＦＭＯの投与経路は、混ぜ物をした飲料水の摂取によっている。しかしながら、水の摂取（およびそれによる薬剤用量）の正確な定量化は、実行されていなかった。体重減少は、このようなＤＦＭＯ暴露の重大な結果であり（Ｍｅｙｓｋｅｎｓら、１９９５年）、その体重減少が（おそらく味のような要因により）汚染水の摂取を抑えた被験体によるのか薬剤それ自体の毒性効果によるのか明らかではない。
【０００７】
ＤＦＭＯ研究のモデルでは、矛盾するデータが得られる。モルモットでは、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、蝸牛組織におけるＯＤＣ活性を阻害し、蝸牛ポリアミンの著しい欠乏が生じる（Ｍａｒｋｓら、１９９１年）。これと共に、脳幹の聴力検査により、１％のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯを混ぜた水で処理すると、全ての列での毛細胞の損失と共に、フックおよび第一ターンにおける損傷を伴う聴力損失を生じることが分かっている。内部毛細胞は、外側毛細胞（ＯＨＣｓ）よりも速い速度で失われる（Ｓａｌｚｅｒら、１９９０年）。このモデルとしてラットを使用するとき、これらの蝸牛ポリアミンは、他の系でのポリアミン依存性プロセスを崩壊させるのに重要と考えられるレベルまでは枯渇されない。限られた用量範囲だけが研究されたものの、脳幹誘発電位で評価された聴覚閾値は、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ処理ラットでは、不変のままであった（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、１９８６年）。
【０００８】
毒性および／または他の副作用が少ない癌治療用の治療組成物およびそれらの組成物の使用方法が必要とされている。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、患者の癌を予防および／または治療する方法に関し、この方法は、この患者に、有効量のジフルオロメチルオルニチンの実質的にＤに富んだ鏡像異性体（Ｄ−ＤＦＭＯ）またはその類似物を投与する工程を包含する。Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物は、約０．０５〜約２０．０ｇｍ／Ｍ２／日の用量で投与される。好ましい実施形態では、Ｄ−ＤＦＭＯは、約０．１〜約２．０ｇｍ／Ｍ２／日の用量で投与される。Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物は、癌を治療および／または予防するために、１回より多く投与され得る。
【００１０】
癌は、膀胱癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌、胃癌、血液の癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、食道癌、およびそれらの任意の組合せであり得る。好ましい実施形態では、癌は、結腸癌であり、家族性腺腫様ポリープ症を含み得る。他の好ましい実施形態では、癌は、膀胱癌であり、表在性膀胱癌を含み得る。Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物を投与することにより患者の癌を予防および／または治療することには、固形腫瘍の切除が関与し得る。Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物は、この切除前または切除の後に、投与され得る。
【００１１】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物の投与の投与による患者の癌を予防および／または治療することは、アポトーシスを誘発すること、細胞分裂を阻止すること、転移の可能性を抑制すること、腫瘍の負担を減らすこと、化学療法または放射線療法に対する感受性を高めること、癌細胞を殺すこと、癌細胞の成長を阻止すること、腫瘍の退行を誘発することおよびそれらの組合せにより達成される。
【００１２】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物の投与は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、経鼻投与、直腸内投与、腟内投与、局所投与、口腔内投与およびリンパ内投与から選択される経路による。好ましい実施形態では、ＤＦＭＯは、腫瘍に直接投与される。Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物は、全身的に投与され得るか、腫瘍の局地脈管系に投与され得るか、またはこの腫瘍の局地リンパ系に投与され得る。さらに好ましい実施形態では、Ｄ−ＤＦＭＯは、経口的に投与される。
【００１３】
実質的に富んだとは、Ｄ鏡像異性体が、投与されるジフルオロメチルオルニチンの投薬量の少なくとも６０重量％、または少なくとも７０重量％、または少なくとも８０重量％、または少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％、または少なくとも９７．５重量％、または少なくとも９９重量％を占めることを意味する。好ましい実施形態では、このＤ鏡像異性体は、投与されるジフルオロメチルオルニチンまたはその類似物の少なくとも９９．５重量％を占める。
【００１４】
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアと共にジフルオロメチルオルニチンの実質的にＤに富んだ鏡像異性体（Ｄ−ＤＦＭＯ）またはその類似物を含有する薬学的組成物に関する。このＤ−ＤＦＭＯ薬学的組成物は、患者に投与する単位用量に処方され得る。この製薬処方は、迅速放出、時限放出、遅延放出、持続放出、経口懸濁液、錠剤、カプセル、粉末、トローチ、坐剤、リポソーム、ナノ粒子、吸入剤、点鼻液、点眼液、点耳液、灌注液、静脈内混合物、上皮液または経皮液、バッカル錠剤、シロップ、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、乳濁液、エリキシル液、圧注器、浣腸剤、うがい薬、移植片およびエアロゾルからなる群から選択される形態である。
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、この組成物中の全ＤＦＭＯまたはその類似物の少なくとも６０重量％のＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物、あるいはこの組成物中の全ＤＦＭＯの少なくとも７０重量％のＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物、あるいはこの組成物中の全ＤＦＭＯの少なくとも８０重量％のＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物、あるいはこの組成物中の全ＤＦＭＯの少なくとも９０重量％のＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物、あるいはこの組成物中の全ＤＦＭＯの少なくとも９５重量％のＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物、あるいはこの組成物中の全ＤＦＭＯの少なくとも９７．５重量％のＤ−ＤＦＭＯ、あるいはこの組成物中の全ＤＦＭＯの少なくとも９９重量％のＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物、あるいはこの組成物中の全ＤＦＭＯの少なくとも９９．５重量％のＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物を含有する。
【００１６】
（例示的な実施形態の説明）
癌を予防および／または治療する有効で毒性の少ない方法が必要とされている。現在の処置プロトコル、特に、結腸癌およびポリープのためのものには、腫瘍の切除、化学療法および放射線療法が挙げられる。本発明は、特定の癌の予後を改善する有効で安全な薬剤の開発に関する。本発明は、癌の予防および／または治療におけるジフルオロメチルオルニチンのＤ鏡像異性体（Ｄ−ＤＦＭＯ）の治療組成物および使用方法を提供する。
【００１７】
（Ｉ．ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ））
Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯはまた、エフロニチンとしても知られているが、２−（ジフロオロメチル）−ＤＬ−オルニチンの化学名称を有する。それは、オルニチン脱炭酸酵素の阻害剤であり、ポリアミン生合成経路の速度制限酵素である。ポリアミン合成のこの阻害の結果として、この化合物は、多くの有機系において、癌の形成を防止し、癌の成長を阻止し、また、腫瘍のサイズを小さくするのに有効である。それはまた、他の抗悪性腫瘍薬との相乗作用を有する。この薬剤は、腫瘍中のプレトシン合成の阻害を生じつつ、ヒトに対する０．４ｇｒ／Ｍ２／日の低い用量では、比較的に非毒性である。ラット腫瘍モデルの研究では、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯの注入により、末梢血小板数値を抑制することなく、腫瘍のプレトシンレベルが９０％低下し得ることが立証されている。
【００１８】
Ｄ−ＤＦＭＯの類似物もまた、癌の予防および／または治療用のＤ−ＤＦＭＯに代えて、使用できる。これらの類似物は、以下の形態のＤ異性体である：
【００１９】
【化１】
2004504271.tif 000002
ここで、Ｒは、Ｃ１〜４アルキル基またはＣ２〜４アルケニル基であり、それらの各々は、非置換であり得るか、またはＮＨＲ”’、塩素、フッ素、ＯＲ”’またはＳＲ”’から選択される３個までの置換基で置換され得、ここで、Ｒ”’は、水素またはＣ１〜４アルキルである；Ｒ’は、塩素および／またはフッ素から選択される３個までのハロゲン原子で置換されたＣ１〜３アルキル基である；そしてＲ”は、水素またはＣ１〜４アルキル基である。類似物には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：α−メチルオルニチン、α−エチルオルニチン、α−クロロメチルオルニチン、α−フルオロメチルオルニチン、α−ジフルオロメチルオルニチン、α−ジクロロメチルオルニチン、α−クロロフルオロメチルオルニチン、α−トリフルオロメチルオルニチン、α−トリクロロメチルオルニチン、α−ジクロロフルオロメチルオルニチン、α−クロロジフルオロメチルオルニチン、α−エチニルオルニチン、α−シアノメチルオルニチン、α−エチレニックオルニチン、α−ビニルオルニチン、α−アレニルオルニチン、α−ヒドロキシメチルオルニチン、α−メトキシメチルオルニチン、α−エチニル−δ−メチルオルニチン、α−エチニル−δ，δ−ジメチルオルニチン、δ−メチルアセチレニックオルニチン、α−メチルデヒドロオルニチン、α−エチルデヒドロオルニチン、α−クロロメチルデヒドロオルニチン、α−フルオロメチルデヒドロオルニチン、α−ジフルオロメチルデヒドロオルニチン、α−ジクロロメチルデヒドロオルニチン、α−クロロフルオロメチルデヒドロオルニチン、α−トリフルオロメチルデヒドロオルニチン、α−トリクロロメチルデヒドロオルニチン、α−ジクロロフルオロメチルデヒドロオルニチン、α−クロロジフルオロメチルデヒドロオルニチン、α−エチニル−デヒドロオルニチン、α−シアノメチルデヒドロオルニチン、α−エチレニックデヒドロオルニチン、α−ビニルデヒドロオルニチン、α−アレニルデヒドロオルニチン、α−ヒドロキシメチルデヒドロオルニチン、α−メトキシメチルデヒドロオルニチン、α−ジフルオロメチルプトレシン、α−フルオロメチルプトレシン、α−フルオロメチルデヒドロプトレシン、δ−メチル−アセチレニックプトレシン、α−エチニル−δ−メチルプトレシン、３−アミノ−３−（メチル）−２−ピペリドン、３−アミノ−３−（ヒドロキシ−メチル）−２−ピペリドン、３−アミノ−３−（フルオロメチル）−２−ピペリドン、３−アミノ−３−（クロロメチル）−２−ピペリドン、３−アミノ−３−（ジフルオロメチル）−２−ピペリドン、α−メチルリシン、α−エチルリシン、α−クロロメチルリシン、α−フルオロメチルリシン、α−ジフルオロメチルリシン、α−ジクロロメチルリシン、α−クロロメチルリシン、α−トリフルオロメチルリシン、α−トリクロロメチルリシン、α−ジクロロフルオロメチルリシン、α−クロロジフルオロメチルリシン、α−エチニルリシン、α−シアノメチルリシン、α−エチレニックリシン、α−ビニルリシン、α−アレニルリシン、α−ヒドロキシメチルリシン、α−メトキシメチルリシン、α−エチニル−δ−メチルリシン、α−エチニル−δ，δ−ジメチルリシン、δ−メチル−アセチレニックリシン、α−メチルオ���ニチンメチルエステル、α−エチルオルニチンメチルエステル、α−クロロメチルオルニチンメチルエステル、α−フルオロメチルオルニチンメチルエステル、α−ジフルオロメチルオルニチンメチルエステル、α−ジクロロメチルオルニチンメチルエステル、α−クロロフルオロメチルオルニチンメチルエステル、α−トリフルオロメチルオルニチンメチルエステル、α−トリクロロメチルオルニチンメチルエステル、α−ジクロロフルオロメチルオルニチンメチルエステル、α−クロロジフルオロメチルオルニチンメチルエステル、α−エチニルオルニチンメチルエステル、α−シアノメチルオルニチンメチルエステル、α−エチレニックオルニチンメチルエステル、α−ビニルオルニチンメチルエステル、α−アレニルオルニチンメチルエステル、α−ヒドロキシメチルオルニチンメチルエステル、α−メトキシメチルオルニチンメチルエステル、α−エチニル−δ−メチルオルニチンメチルエステル、α−エチニル−δ，δ−ジメチルオルニチンメチルエステル、δ−メチル−アセチレニックオルニチンメチルエステル、α−メチルオルニチンエチルエステル、α−エチルオルニチンエチルエステル、α−クロロメチルオルニチンエチルエステル、α−フルオロメチルオルニチンエチルエステル、α−ジフルオロメチルオルニチンエチルエステル、α−ジクロロメチルオルニチンエチルエステル、α−クロロフルオロメチルオルニチンエチルエステル、α−トリフルオロメチルオルニチンエチルエステル、α−トリクロロメチルオルニチンエチルエステル、α−ジクロロフルオロメチルオルニチンエチルエステル、α−クロロジフルオロメチルオルニチンエチルエステル、α−エチニルオルニチンエチルエステル、α−シアノメチルオルニチンエチルエステル、α−エチレニックオルニチンエチルエステル、α−ビニルオルニチンエチルエステル、α−アレニルオルニチンエチルエステル、α−ヒドロキシメチルオルニチンエチルエステル、α−メトキシメチルオルニチンエチルエステル、α−エチニル−δ−メチルオルニチンエチルエステル、α−エチニル−δ，δ−ジメチルオルニチンエチルエステル、およびα−メチル−アセチレニックオルニチンエチルエステル。１個またはそれ以上の位置で水素を重水素で置き換えた上記リストの化合物もまた、ＤＦＭＯの類似物として、考慮される。
【００２０】
Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで認められる副作用には、４ｇｒ／Ｍ２／日という高用量における聞き取りに対する影響が挙げられ、これは、それを中止したとき、解消する。聞き取りに対するこれらの影響は、０．４ｇｒ／Ｍ２／日という、さらに低用量を１年まで投与したときには、認められない（Ｍｅｙｓｋｅｎら、１９９４年）。それに加えて、眩暈（ｄｉｚｚｉｎｅｓｓ／ｖｅｒｔｉｇｏ）の症例が少数で見られ、これは、この薬剤を中止すると、解消する。高「治療」用量のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（＞１．０ｇ／ｍ２／日）を使用する研究では、主に、以前に化学療法を受けた癌患者または骨髄が感染し易い患者において、血小板減少症が報告されている。Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ療法に付随した毒性は、一般に、限られた臨床治験において、他の種類の化学療法ほどには激しくないものの、それは、用量に関連した血小板減少症を促進することが発見されている。さらに、ラットの研究から、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯを１２日間にわたって連続注入すると、対照と比べて、血小板の数値が著しく減少することが明らかとなった。他の研究から、類似の所見、すなわち、血小板減少症が連続的な静脈（ｉ．ｖ．）Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ療法の主要な毒性副作用であることが得られた。これらの発見は、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯが巨核球の骨髄前駆体のＯＤＣ活性を著しく阻害し得ることを示唆している。ＤＦＭＯは、増殖修復過程（例えば、上皮創傷の治癒）を阻害し得る。
【００２１】
Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、腫瘍プトレシン生合成を効果的に遮断できるものの、得られた抗腫瘍効果は、細胞毒性ではなく、細胞分裂停止である。例えば、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、ＭＣＡ肉腫の成長速度を遅くするが、腫瘍の退化を生じない。この発見は、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯが細胞分裂停止剤であることを明らかにした他の研究者の報告書と矛盾しない。しかしながら、研究により、ＤＦＭＯ剤には、重要な役割が存在していることが明らかとなり、これにより、ＤＦＭＯを取り込んだ組合せ化学療法レジメンをさらに開発できるようになる。
【００２２】
Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯおよびそれを良性前立腺肥大の治療に使用することは、米国特許第４，４１３，１４１号および第４，３３０，５５９号の２つの特許で記述されている。米国特許第４，４１３，１４１号は、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯを、インビトロおよびインビボの両方での強力なＯＤＣ阻害剤であるとして記述している。Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯを投与すると、これらのポリアミンが通常活発に生成されている細胞において、プトレシンおよびスペルミジンの濃度が低下する。それに加えて、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、標準腫瘍モデルで試験したとき、新生物細胞の増殖を遅くできることが分かっている。米国特許第４，３３０，５５９号は、良性前立腺肥大の治療にＤ，Ｌ−ＤＦＭＯおよびＤＦＭＯの誘導体を使用することを記述している。良性前立腺肥大は、急速な細胞増殖により特徴付けられる多くの疾患状態と同様に、ポリアミン濃度の異常な上昇を伴う。この参考文献で記述された治療は、経口的または非経口的のいずれかで、患者に投与できる。
【００２３】
Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、ＯＤＣの有効な阻害剤であるので、一部の研究者は、他の治療剤と組み合わせた接続治療（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の一部として、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯを使用しようと試みている。例えば、米国特許第４，４９９，０７２号は、このＯＤＣ阻害剤と組み合わせてインターフェロンを使用することにより、ＯＤＣ阻害剤（Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯを含めて）のポリアミン欠乏効果を改良することを記述している。それに加えて、それは、公知の細胞毒性剤（例えば、メトトレキセート）と併用して、ＯＤＣ阻害剤およびインターフェロンの両方の使用を記述している。米国特許第５，００２，８７９号は、類似の接続療法を記述しており、この療法では、ＯＤＣ阻害剤（好ましくは、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ）は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞およびインターロイキン−２と組み合わせて、使用される。
【００２４】
Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯを患者にさらに受け入れられるようにする代替的な戦略は、米国特許第４，８５９，４５２号で記述されている。Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ誘発毒性を減らすのを助けるためにアルギニンまたはオルニチンのいずれかと組み合わせて必須アミノ酸を含有するＤ，Ｌ−ＤＦＭＯの処方が記述されている。
ＩＩ．ＤＦＭＯのＤ鏡像異性体（エナンチオマー）
ＤＦＭＯに付随した毒性を少なくするための代替的な手法は、本発明で記述されている。本明細書中で記述しているように、ＤＦＭＯのＤ鏡像異性体（エナンチオマー）およびその類似物（アナログ）は、依然としてＯＤＣの阻害剤であるものの、動物モデルにおいて、毒性（聴器毒性を含めて）が低い。癌を治療するためにＤ鏡像異性体（エナンチオマー）だけでなくＤ−ＤＦＭＯの製薬組成物を使用することにより、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯの使用に付随した多くの問題が克服される。
【００２５】
Ｗａｇｎｅｒら（１９８７年）は、キラル溶離液を使った高速液体クロマトグラフィーにより、また、Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｖａｌ上のガスクロマトグラフィーにより、種々のα−置換オルニチンおよびリシン類似物（アナログ）の鏡像異性体（エナンチオマー）を分割する方法を記述している。キラル移動相としてＬ−プロリンおよび銅を使った逆相高速液体クロマトグラフィー方法は、α−置換オルニチンおよびリシン類似物（アナログ）の鏡像異性体（エナンチオマー）分割のために、記述されている。オルニチンは、使用するキラル溶離液での分離を生じないものの、種々のα−アルキル置換オルニチン、α−ハロゲノメチル置換オルニチン、α−ビニル置換オルニチンおよびα−エチニル置換オルニチン（ＤＦＭＯを含めて）に対して、優れた分割が得られる。類似の分離はまた、デヒドロオルニチンおよびリシン類似物（アナログ）についても、観察されている。キラル固定相であるＣｈｉｒａｓｉｌ　Ｖａｌ上のガスクロマトグラフィーにより、それらの対応するラクタムのモノフルオロアシル誘導体へと誘導体化した後、そのオルニチンおよびリシン類似物（アナログ）の分割が可能となる。それらのジ−Ｎ−パーフルオロアシルアルキルエステルとしてのデヒドロオルニチン類似物（アナログ）については、Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｖａｌ上のＧＣによっても、分割が得られないか、または僅かな分割しか得られない。そのキラル溶離液ＨＰＬＣ手順は、数種のオルニチン類似物（アナログ）（すなわち、α−フルオロメチルオルニチン、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）、α−クロロフルオロメチルオルニチンおよびα−フルオロメチルデヒドロオルニチン（これらは、インビトロおよびインビボにおいて、強力なオルニチン脱炭酸酵素として知られている））の半分離用（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）分割のために、容易に拡大される。
【００２６】
米国特許第５，２１７，８８６号は、二価カチオンの存在下にて、２−置換−ピペリドンを酵素Ｌ−α−Ｅ−アミノカプロラクタム加水分解酵素と反応させることに続いて、生成したＬ−ＤＦＭＯを精製することにより、（−）−４−ジフルオロメチル−オルニチン（Ｌ−ＤＦＭＯ）の製造方法を記述している。この酵素は、真菌類であるＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｕｒｅｎｔｉｉ　Ｔｏｒａｙ　２００１から得られる。
【００２７】
米国特許第４，４９６，５８８号は、２−置換オルニチンの光学異性体を合成する方法を教示している。この方法は、（−）ビナフチルリン酸でラセミ２−ピペリドンを分割する工程を包含する。このピペリドンの光学異性体の各々は、次いで、別々に加水分解されて、この２−置換オルニチンの所望の光学異性体が生じる。
【００２８】
（ＩＩＩ．ヒトの癌）
本発明はまた、癌細胞を縮小または阻害するために、個体に治療化合物を送達することに関する。標的癌細胞には、膀胱、肺、脳、前立腺、腎臓、肝臓、卵巣、乳房、皮膚、胃、食道、頭および首、精巣、結腸、子宮、リンパ系および血液の癌が挙げられる。多くの臓器の上皮癌（結腸の癌およびポリープ（これらは、活性化Ｋｉ−ｒａｓを発現する傾向にある）を含めて）は、特に重要である。また、膀胱癌（上皮膀胱癌を含めて）も、特に重要である。
【００２９】
本発明はまた、癌の発症を防止するために、前癌症状を示している個体に対して治療化合物を送達することに関する。この範疇の細胞には、ポリープおよび他の前癌性病変、前癌状態、新生物発生前状態、または癌状態へと進行する可能性がある他の異常な表現型が挙げられる。
【００３０】
（１．Ｋｒｉｓｔｅｎ−Ｒａｓ依存性癌）
Ｒａｓは、第１１染色体で見られるプロトオンコジーン産物を規定している。正常な細胞では、スイッチとして作用することにより、どこで信号を中継するのを助けるかが発見されている（Ｌｏｗｙ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ，１９９３年）。その細胞面上のレセプタが（例えば、ホルモンにより）刺激されるとき、Ｒａｓは、切り換えられて、その細胞が成長するように言う信号を伝達する。もし、この細胞表面レセプタが刺激されないなら、Ｒａｓは、活性化されず、それで、細胞成長を引き起こす経路は、開始されない。ヒトの癌の約３０％では、Ｒａｓは、永久的に切り換えられるように変異され、その細胞表面上のレセプタが活性化されているかどうかにかかわらず、その細胞が成長するように言う。細胞性ｒａｓ遺伝子（ｃ−ｒａｓ）での点変異もまた、変異体ｐ２１タンパク質を生じることができ、これは、哺乳類細胞を形質転換できる。
【００３１】
Ｒａｓは、レトロウイルス関連ＤＮＡ配列のファミリーであり、これらは、最初は、Ｈａｒｖｅｙ（Ｈ−ｒａｓ、Ｈａ−ｒａｓ、ｒａｓＨ）およびＫｒｉｓｔｅｎ（Ｋ−ｒａｓ、Ｋｉ−ｒａｓ、ｒａｓＫ）マウス肉腫ウイルスから単離された。Ｒａｓ遺伝子は、動物種の間で広く保存されており、Ｈ−ｒａｓおよびＫ−ｒａｓ遺伝子に対応する配列は、ヒト、鳥類、ネズミおよび非脊椎ゲノムで検出されている。密接に関連したＮ−ｒａｓ遺伝子は、ヒト神経芽細胞腫および肉腫細胞系で検出されている。このファミリーの全ての遺伝子は、類似のエキソン−イントロン構造を有し、各々は、ｐ２１タンパク質をコードする。
【００３２】
（２．家族性大腸腺腫症、症候群、遺伝子）
家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）は、遺伝性ポリープ症候群であり、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）癌抑制遺伝子の構造遺伝子変異の結果として起こる（Ｓｕら、１９９２年）。この常染色体優性の疾患は、発現が変動するが、何百もの大腸腺腫の進行と関連しており、これらは、最終的に、４０歳（散発性大腸癌の平均診断年齢よりも２０年早い）までに腺癌にまで進行する（Ｂｕｓｓｅｙ，１９９０年）。ＦＡＰに罹った前駆症状性個体の以前の研究では、正常な家族メンバーの対照と比較したとき、正常に見える結腸直腸バイオプシーにおいて、高いレベルのポリアミンスペルミジンおよびスペルミンならびにそれらのジアミン前駆体プトレッシンが検出された（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏら、１９９７年）。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）は、哺乳類のポリアミン合成における第一の律速酵素であるが、その活性はまた、ＦＡＰ患者からの明らかに通常の結腸粘膜バイオプシーでは、高くなる（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏら、１９９７年；Ｌｕｋ　ａｎｄ　Ｂａｙｌｉｎ，１９８４年）。これらのアミンが最適な細胞増殖に必要であるので、これらの発見は、重要である（Ｐｅｇｇ，１９８６年）。さらに、酵素活性化不可逆阻害剤ＤＦＭＯを使用したＯＤＣ活性の抑制は、発癌物質処理齧歯類における大腸での発癌を阻止する（Ｋｉｎｇｓｎｏｒｔｈら、１９８３年；Ｔｅｍｐｅｒｏら、１９８９年）。
【００３３】
Ｍｉｎ（多発性腸新生物形成）マウスは、変異ＡＰＣ／ａｐｃ遺伝子型をＦＡＰと共有しているが、ヒトＦＡＰ患者の有用な実験動物モデルとして働く（Ｌｉｐｋｉｎ，１９９７年）。Ｍｉｎマウスは、１２０日までに、胃腸管の全体にわたって、１００個より多い胃腸腺腫／腺癌を発生し得、胃腸出血し閉塞して、死亡する。
【００３４】
（３．表在性膀胱癌）
膀胱腫瘍は、顕微鏡下で現れる様式によって、いくつかの型に分類される。膀胱を冒す癌の主要な３つの型には、移行上皮癌（ＴＣＣ）、扁平上皮癌、および腺癌がある。同じ型の癌はまた、腎臓の裏層（これは、腎盂と呼ばれる）、尿管および尿道でも発生し得る。事実、膀胱癌に罹った患者がまた、腎臓の裏層、尿管および尿道でも、同じ型の癌に罹ることは珍しいことではなく、このことは、これらの患者を検査するためには、泌尿器系の完全な検査が推奨される理由となっている。
【００３５】
移行上皮癌（ＴＣＣ）は、群を抜いて、膀胱癌の最も一般的な形態である。それは、これらの癌の約９０％を占める。ＴＣＣは、膀胱を正しく並べる移行細胞の癌性の異形である。扁平上皮癌は、膀胱癌の約８％を占める。顕微鏡下では、これらの細胞は、皮膚癌に罹った細胞と非常によく似ている。大半の扁平上皮癌は、浸潤性である。腺癌は、膀胱癌の約１％〜２％を占める。これらの細胞は、腸癌の腺形成細胞と共通する点が多い。膀胱の大半の腺癌は、浸潤性である。
【００３６】
移行上皮癌、扁平上皮癌および腺癌は、全て、手術、放射線および化学療法に対して、異なって応答する。それゆえ、治療法は、異なり得る。全てのＴＣＣが同じ訳ではない；それらは、表在性であるか浸潤性であるかに従って、また、それらの形状が乳頭状か扁平かに従って、いくつかの亜型に分割される。
【００３７】
表在性ＴＣＣは、膀胱の主要筋肉層（筋肉プロプリア（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ　ｐｒｏｐｒｉａ））には広がらない。この癌は、全体的に、膀胱の内部に最も近い移行細胞層に限られ得るか、移行細胞のすぐ下の結合組織薄層（固有層）にも広がり得る。
【００３８】
浸潤性ＴＣＣは、それよりも深く広がり、膀胱の筋肉層を巻き込み、この筋肉層の外側の脂肪層に侵入し得る。
【００３９】
乳頭状ＴＣＣは、成長して、膀胱の中空中心になる。それらは、狭い柄を有し得、非常に小さいキノコのようである。一部の乳頭状ＴＣＣは、膀胱の中心に向かってのみ成長する。これらは、表在性非浸潤性乳頭状ＴＣＣと呼ばれている。他のものは、その中心に成長し、また、膀胱の筋肉層へと外向きにも成長する。これらは、浸潤性乳頭状ＴＣＣと呼ばれている。
【００４０】
扁平ＴＣＣは、膀胱の中空部分に向かっては、全く成長しない。これらの一部は、膀胱の内部または中空部分に最も近い細胞層を巻き込むにすぎない。これらは、非浸潤性扁平ＴＣＣと呼ばれている。非浸潤性扁平ＴＣＣの医学的な名称は、扁平上皮内癌（ＣＩＳ）である。一部の扁平ＴＣＣは、（この中空部分を離れて）深い層（特に、筋肉層）に侵入する。これらは、扁平浸潤性ＴＣＣと呼ばれている。
【００４１】
（ＩＶ．癌を治療する方法）
特定の局面では、本発明は、種々の悪性腫瘍の治療方法を提供する。治療方法は、個体を、Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物（アナログ）を含有する治療組成物の有効量で処理する工程を包含する。有効量は、一般に、ある疾患またはその症状の程度を検出可能かつ繰り返し改善するか、軽減するか、最小限に抑えるかまたは制限するのに十分な量として、表わされる。それよりも厳密な定義が適用され得、これには、疾患の排除、撲滅または治癒が挙げられる。
【００４２】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物（アナログ）に富んだ治療組成物で治療するのが好ましい癌の一例には、膀胱癌があり、特に、初期段階膀胱癌または表在性膀胱癌がある。初期段階膀胱癌は、殆どの場合、膀胱を切除することなしに、治療できる。治療の選択肢には、経尿道的電気切除術（ＴＵＲ）単独、またはＴＵＲに続いて、高周波療法（焼き取り）、膀胱内免疫療法または膀胱内化学療法を行うことが挙げられる。
【００４３】
部分膀胱切除は、０期の膀胱癌には、めったに行われない。この期の癌を治療するのにそれよりもめったに行われないことには、根治的膀胱切除術がある。この手術は、多くの表在性癌が存在しているときか、または表在性癌が成長し続けているときか、または他の治療を行ったにもかかわらず後に膀胱内のさらに多くの数領域で確認されたときにのみ、考慮される。
【００４４】
０期の膀胱癌に罹った人の予後は、優れている。非浸潤性乳頭状癌は、殆どの場合、適切な治療および長期的な追跡患者管理により、治癒する。これらの患者は、泌尿器系のどこかで、１個またはそれ以上の表在性癌を発現する可能性が高いものの、これらの新しい癌は、めったに、深く侵入して生命にかかわることはない。０期の癌の５年生存率は、９５％より高い。
【００４５】
０期の膀胱癌（これはまた、上皮内癌または扁平非浸潤性癌とも呼ばれている）の予後は、癌が最終的に筋肉に侵入する危険が高いために、あまり好ましくはない。その５年生存率は、約８５％である。
【００４６】
膀胱内化学療法とは、医薬品を口から投与したり静脈に注射するのではなく、膀胱に直接置くことを意味する。これらの医薬品は、膀胱に直接投与するとき、膀胱裏層の近くの癌細胞に達するが、腎臓、尿管および尿道にある癌細胞、膀胱壁に深く侵入し得る癌細胞、または他の臓器に広がった癌細胞には達しない。この理由のために、この治療は、表在性（０期）膀胱癌または最小侵入（Ｉ期）膀胱癌にのみ、使用される。この治療は、成長している癌を積極的に殺す薬剤を使用する。同じ薬剤の多くは、（口からまたは静脈へと）全身的に投与されて、さらに進行した段階の膀胱癌を治療する。チオテバ、マイトマイシンおよびドキソルビシン塩酸塩は、膀胱内化学療法に最もよく使用される薬剤である。膀胱内化学療法の主な利点の１つには、その医薬品が、身体全体には広がらないことがある。このことは、全身的な化学療法に伴って起こり得る他の臓器に対する望ましくない副作用を制限する。
【００４７】
Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物（アナログ）は、そのＤ鏡像異性体（エナンチオマー）に付随して予想される毒性が低いために、約０．０５〜約２０．０ｇｍ／Ｍ２／日の用量で、投与され得る。投与するＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物（アナログ）の好ましい用量は、約０．１〜約１５．０ｇｍ／Ｍ２／日、または約０．１〜約１２ｇｍ／Ｍ２／日、または約０．１〜約１０ｇｍ／Ｍ２／日、または約０．１〜約８ｇｍ／Ｍ２／日、または約０．１〜約６ｇｍ／Ｍ２／日、または約０．１〜約４ｇｍ／Ｍ２／日、または約０．１〜約２ｇｍ／Ｍ２／日、または約０．１〜約１ｇｍ／Ｍ２／日、または約０．１〜約０．５ｇｍ／Ｍ２／日である。
【００４８】
本発明の方法および組成物を使用して、細胞を殺すか、細胞の成長を阻止するか、転移を阻止するか、腫瘍の大きさを小さくするか、そうでなければ、腫瘍細胞の悪性表現型を逆にするか少なくするために、一般に、この治療組成物に「標的」細胞を接触させる。このことは、癌の治療に有効な他の試薬を含有する組成物と組み合わされ得る。これらの組成物は、この細胞を殺すかその増殖を阻止するのに有効な組合せ量で、供給される。この方法は、これらの細胞を、Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物（アナログ）およびこの試薬または因子と同時に接触させる工程を包含し得る。これは、この細胞を、単一の組成物または薬理学的処方（これは、両方の試薬を含有する）と接触させることにより、またはこの細胞を２種の異なる組成物または処方（ここで、一方の組成物は、Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物（アナログ）を含有し、他方は、第二の試薬を含有する）と同時に接触させることにより、達成され得る。
【００４９】
あるいは、このＤ−ＤＦＭＯ療法は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の試薬の処理の前に行うか後に行い得る。他の試薬とＤ−ＤＦＭＯまたはＤ−ＤＦＭＯ類似物（アナログ）とが別々に細胞に適用される実施形態では、一般に、各送達の時点の間で相当な時間が経過しなかったことを確認し、この試薬およびＤ−ＤＦＭＯが、依然として、この細胞に対して有利に組み合わせた効果を発揮できるようになる。このような場合では、この細胞を、互いの約１２〜２４時間以内、さらに好ましくは、互いの約６〜１２時間以内に、両方のモダリティーと接触し、約１２時間程の遅れ時間が、最も好ましい。しかしながら、ある場合には、各投与間で数日（２，３，４，５，６または７日）〜数週間（１，２，３，４，５，６，７または８週間）が経過する場合、その処理時間を著しく延長することが望まれ得る。
【００５０】
本発明の治療用Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物（アナログ）の組成物の患者への投与は、Ｄ−ＤＦＭＯまたはＤ−ＤＦＭＯ類似物（アナログ）の毒性（もしあれば）を考慮して、化学療法の投与用の一般的なプロトコルに従う。その治療サイクルは、必要に応じて、繰り返されると予想される。また、外科的な介入だけでなく、種々の標準的な療法もまた、記述した療法と組み合わせて、適用され得ると考えられる。
【００５１】
Ｄ−ＤＦＭＯ療法の臨床的な適用が考慮される場合、予定している用途に適切な製薬組成物として、その錯体を調製する必要がある。一般に、これには、ヒトまたは動物に有害であり得る任意の他の不純物だけでなく発熱物質も事実上含まない製薬組成物を調製することが必要である。また、一般に、この錯体を安定にしかつ標的細胞による錯体の取り込みを可能にするのに適切な塩および緩衝液を使用することが望まれている。
【００５２】
本発明の水性組成物は、この化合物の有効量を含有し、これは、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体に溶解または分散されている。このような組成物はまた、接種材料と呼ぶことができる。「薬学的または薬理学的に受容可能な」との語句は、必要に応じて、動物またはヒトに投与したとき、好ましくないアレルギーまたは他の有害反応を生じない分子要素および組成物を意味する。本明細書中で使用する「薬学的に受容可能なキャリア（担体）」には、任意の全ての溶媒、分散媒体、被覆（コーティング）、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質に対してこのような媒体および試薬を使用することは、当該技術分野で周知である。任意の通常の媒体または試薬がこの活性試薬と非相溶性である範囲を除いて、この治療組成物中でそれを使用することは、考慮されている。この組成物には、補助的な活性成分もまた、取り込むことができる。
【００５３】
本発明の組成物は、よく知られた製薬調製物を含有し得る。分散体はまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、また、オイル中で、調製できる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止する防腐剤を含有する。
【００５４】
治療する特定の癌に依存して、本発明の治療組成物の投与は、その標的組織がその経路を経由して利用可能である限りにおいて、任意の一般的な経路を経由する。これには、経口、経鼻、口腔内、直腸内、腟内または局所が挙げられる。局所投与は、皮膚癌の治療に特に有利である。あるいは、投与は、同所（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射または静脈内注射による。このような組成物は、通常、生理学的に受容可能なキャリア、緩衝液または他の賦形剤を含有する薬学的に受容可能な組成物として、投与される。
【００５５】
ある実施形態では、エキソビボ療法もまた、考慮される。エキソビボ療法は、患者からの標的細胞の除去を伴う。これらの細胞は、患者の体外で治療され、次いで、体内に戻される。エキソビボ療法の一例には、自己骨髄移植（ＡＢＭＴ）の変形が関係している。引き出した骨髄中には癌細胞が一部存在しているので、また、治療した患者に骨髄を戻すと、患者には癌細胞が再増殖するので、ＡＢＭＴは、何度も失敗している。しかしながら、１実施形態では、引き出した骨髄細胞は、患者の外側にある間に、その癌細胞を標的にして殺すウイルス粒子で治療できる。これらの骨髄細胞は、一旦、「パージ」されると、患者に再導入できる。
【００５６】
これらの治療は、種々の「単位用量」を含み得る。単位用量は、その投与（すなわち、適切な経路および治療レジメン）に関連した所望の応答を生じるように計算された所定量の治療組成物を含有するものとして、定義される。投与する量、および特定の経路および処方は、臨床分野の当業者の技術範囲内である。治療する被験体、特に、その被験体の状態および望ましい保護もまた、重要である。単位用量は、１回の注射として投与する必要はなく、設定時間にわたる連続注入を含み得る。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態の１つは、特定の標的癌細胞と共に、Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物の治療組成物を使用することを包含する。標的癌細胞には、肺、脳、前立腺、腎臓、肝臓、卵巣、乳房、皮膚、胃、食道、頭部および頸部、精巣、大腸、子宮、リンパ系および血液の癌が挙げられる。非小細胞肺癌は、特に重要であり、これには、扁平上皮癌、腺癌および大細胞未分化癌が挙げられる。
【００５８】
本発明によれば、腫瘍にＤ−ＤＦＭＯまたはその類似組成物を直接注射することにより、その癌を治療し得る。あるいは、この腫瘍は、任意の適切な送達ビヒクルを使用して、この組成物で注入または灌流され得る。その腫瘍に対する局所的または領域的投与もまた、考慮される。最後に、全身投与が実行され得る。適切な場合、例えば、腫瘍が切除され、その腫瘍が残留微視的疾患（ｒｅｓｉｄｕａｌ，ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ）をなくすように治療する場合、連続投与が適用され得る。注射器またはカテーテルによる送達は、好ましい。このような連続灌流は、治療開始後、約１〜２時間から、約２〜６時間まで、約６〜１２時間まで、約１２〜２４時間まで、約１〜２日まで、約１〜２週間まで、またはそれより長い期間にわたって、行われ得る。一般に、連続灌流によるこの治療組成物の用量は、１回の注射または複数回の注射により投与される用量に等しく、これは、この灌流が起こる時間にわたって、調整される。
【００５９】
４ｃｍより大きい腫瘍には、投与する容量は、約４〜１０ｍｌ（好ましくは、１０ｍｌ）であるのに対して、４ｃｍより小さい腫瘍には、約１〜３ｍｌの容量が使用される（好ましくは、３ｍｌ）。単一用量として送達される複数の注射剤は、約０．１〜約０．５ｍｌの容量を含む。これらのウイルス粒子は、有利には、この腫瘍に約１ｃｍ間隔で複数の注射剤を投与することにより、接触され得る。
【００６０】
ある実施形態では、治療する腫瘍は、少なくとも最初は、切除可能であり得る。治療用Ｄ−ＤＦＭＯまたは類似組成物で治療すると、その縁で収縮するために、または一部の特に浸潤性の部分を取り除くことにより、その腫瘍の切除可能性が高まり得る。治療に続いて、切除が可能であり得る。切除に引き続いてさらに治療することは、その腫瘍部位での微視的残留疾患をくなすのに役立つ。
【００６１】
癌治療にはまた、化学物質ベースの治療および放射線ベースの治療の両方との種々の組合せ療法が挙げられる。組合せ化学療法には、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、タクソール、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサートまたはそれらの任意の類似物または誘導体変種が挙げられる。
【００６２】
ＤＮＡ損傷を引き起こす広範囲にわたって使用されている他の因子には、γ−線、Ｘ線として一般に知られているもの、および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の有向送達が挙げられる。他の形状のＤＮＡ損傷因子（例えば、マイクロ波および紫外線照射）もまた、考慮される。これらの因子の全ては、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、および染色体の集合および維持に対して、広範囲の損傷を引き起こす。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンの毎日用量から２０００〜６０００レントゲンの単一用量までの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は、広く変わり、その同位元素の半減期、放射した放射線の強度および型、および新生物細胞により取り込みに依存している。
【００６３】
例えば、Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似組成物が「Ａ」であり、その放射性試薬または化学療法剤が「Ｂ」である場合、種々の組合せが使用され得る：
【００６４】
【数１】
2004504271.tif 000003
「接触した」および「暴露した」との用語は、細胞に適用するとき、本明細書中では、治療組成物および化学療法剤または放射線療法剤を標的細胞に送達するか標的細胞に直接並置する方法を記述するように、使用される。細胞の死滅または血行停止を達成するために、両方の試薬は、その細胞を殺すかそれを分裂させないのに有効な組合せ量で、送達される。
【００６５】
（Ｖ．製薬組成物）
本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体に溶解または分散した有効量のＤ−ＤＦＭＯまたはその類似物を含有する。「薬学的または薬理学的に受容可能な」との語句は、必要に応じて、動物またはヒトに投与したとき、好ましくないアレルギーまたは他の有害反応を生じない分子要素および組成物を意味する。
【００６６】
本明細書中で使用する「薬学的に受容可能なキャリア」には、任意の全ての溶媒、分散媒体、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質に対してこのような媒体および薬剤を使用することは、当該技術分野で周知である。任意の通常の媒体または薬剤がこの活性成分と非相溶性である範囲を除いて、この治療組成物中でそれを使用することは、考慮されている。この組成物には、補助的な活性成分もまた、取り込むことができる。ヒトに投与するためには、調製物は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ標準で要求されるような無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の標準を満たすべきである。
【００６７】
この生体材料は、望ましくない小分子量の分子を除去するために大規模に透析すべきであるか、および／または必要に応じて、所望のビヒクルにさらに容易に処方するために凍結乾燥すべきである。これらの活性化合物は、次いで、一般に、非経口投与用に処方され、例えば、静脈経路、筋肉内経路、皮下経路、病巣内経路または腹腔内経路を経由する注射用に処方される。活性成分としてヘッドピン（ｈｅａｄｐｉｎ）試薬を含有する水性組成物の調製は、本発明の開示に照らして、当業者に公知である。典型的には、このような組成物は、注射可能物質として、液状溶液または液状懸濁液のいずれかとして、調製できる；注射前に液体を添加すると溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適切な固体形状もまた、調製できる；これらの調製物はまた、乳化できる。
【００６８】
注射可能用途に適切な製薬形状には、無菌水溶液または水性分散液；ゴマ油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む処方；および無菌注射可能溶液または分散液の即席調製物用の無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、その形状は、無菌でなければならず、また、簡単に注射可能である程度まで、流動性でなければならない。それは、製造および保存条件下にて安定でなければならず、また、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。
【００６９】
遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合した水中で、調製できる。分散液もまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物ならびにオイル中にて、調製できる。通常の保存および使用条件下にて、これらの調製物は、微生物の成長を阻止する防腐剤を含有する。
【００７０】
本発明のＤ−ＤＦＭＯまたは類似物は、中性形状または塩形状で、組成物に処方できる。薬学的に受容可能な塩には、酸付加塩（これは、そのタンパク質の遊離アミノ基を使って形成される）が挙げられ、これらは、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を使って形成される。その遊離カルボキシル基を使って形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導できる。
【００７１】
このキャリアはまた、溶媒または分散媒体であり得、これは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する。その適切な流動性は、例えば、被覆（例えば、レシチン）を使用することにより、分散液の場合、必要な粒径を維持することにより、また、界面活性剤を使用することにより、維持できる。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎｓ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）により、成し遂げることができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含有させることが好ましい。これらの注射可能組成物の長期にわたる吸収は、これらの組成物中にて、吸収を遅らせる試薬（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することにより、成し遂げることができる。
【００７２】
無菌注射可能溶液は、必要に応じて、上で列挙した種々の他の成分と共に、これらの活性成分を適切な溶媒中で必要量で取り込むことにより、続いて、濾過滅菌により、調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌した活性成分を無菌ビヒクル（これは、その基本的な分散媒体と上で列挙したものに由来の必要な他の成分とを含有する）に取り込むことにより、調製される。無菌注射可能溶液の調製用の無菌粉末の場合は、好ましい調製方法には、真空乾燥法および凍結乾燥法があり、これらにより、その予め無菌濾過した溶液から、その活性成分の粉末＋任意の所望追加成分が得られる。直接注射用のさらに非常に濃縮した溶液の調製もまた、考慮され、この場合、非常に急速な浸透を生じるために、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が想定され、これらの活性薬剤の高濃度が小領域に送達される。
【００７３】
処方すると、溶液は、その投薬処方に適合した様式で、治療上有効な量で、投与される。これらの処方は、種々の投薬形状（例えば、上記の種類の注射可能溶液）で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなどもまた、使用できる。
【００７４】
水溶液で非経口投与するためには、例えば、この溶液は、もし必要なら、適切に緩衝化すべきであり、その液状希釈液は、まず、十分な生理食塩水またはグルコースで、等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に、特に適切である。これに関して、使用できる無菌水性媒体は、本発明の開示に照らして、当業者に公知である。例えば、１投薬量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解でき、１０００ｍｌの皮下注入液に添加されるか、予定注入部位に注射されるか、いずれかである。（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１５版、１０３５〜１０３８ページおよび１５７０〜１５８０ページを参照）。治療する被験体の状態に依存して、投薬量のある程度の変化が必然的に起こり得る。投与に関与している人は、いずれにしても、個々の被験体に適切な用量を決定する。
【００７５】
非経口投与（例えば、静脈内注射または筋肉内注射）に処方した化合物に加えて、他の薬学的に受容可能な形状には、例えば、経口投与用の錠剤または他の固形物；リポソーム処方物；時間放出カプセル；および現在使用されている任意の他の形状（クリームを含めて）が挙げられる。
【００７６】
また、本発明では、点鼻液またはスプレー式点鼻薬、エアロゾルまたは吸入薬を使用し得る。鼻内液は、通常、小滴またはスプレーで鼻窩に投与するように設計された水溶液である。点鼻液は、多くの点で鼻汁と類似しているように調製され、その結果、正常な繊毛作用が維持される。それゆえ、これらの水性点鼻液は、通常、等張性であり、５．５〜６．５のｐＨを維持するように、僅かに緩衝化される。それに加えて、この処方には、点眼薬で使用されるものと類似した抗菌防腐剤、および適切な薬剤安定剤（もし必要なら）が含有され得る。種々の市販の点鼻薬は、公知であり、例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤が挙げられ、喘息の予防に使用される。
【００７７】
他の投与様式に適切なさらなる処方物には、膣坐薬およびペッサリーが挙げられる。直腸ペッサリーまたは座薬もまた、使用され得る。座薬は、直腸、膣または尿道に挿入する種々の重量および形状の固形投薬形状であり、これらには、通常、薬剤が混入されている。挿入後、座薬は、軟化し、融けるか、または腔液に溶解する。一般に、座薬用の従来の結合剤およびキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得る；このような座薬は、この活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは、１％〜２％の範囲で含有する混合物から、形成され得る。
【００７８】
経口処方には、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤が挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、持続放出処方物または粉剤の形状をとる。ある種の規定実施形態では、経口製薬組成物は、不活性希釈剤または吸収できる食用キャリアを含有し、または硬質または軟質外殻ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に圧縮され得るか、または日常の食物に直接取り込まれ得る。治療用経口投与には、これらの活性化合物は、賦形剤と共に取り込まれ得、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形状で使用され得る。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。これらの組成物および調製物の割合は、もちろん、変わり得、好都合には、その単位の重量の約２％〜約７５％の間、好ましくは、２５〜６０％の間であり得る。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬量が得られるような量である。
【００７９】
これらの錠剤、トローチ、丸薬、カプセル剤などはまた、以下を含有し得る：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味剤（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油またはサクランボ香料）。この投薬単位形状は、カプセルであるとき、上記種類の物質に加えて、液状キャリアを含有し得る。種々の他の物質は、被覆として存在し得るか、そうでなければ、その投薬単位の物理的形状を変更するために、存在し得る。例えば、錠剤、丸薬またはカプセル剤は、セラック、糖またはそれらの両方で、被覆され得る。エリキシル剤のシロップは、これらの活性化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料および香料（例えば、サクランボおよびオレンジ香料）を含有し得る。
【００８０】
ある実施形態では、Ｄ−ＤＦＭＯまたはその類似物の処方および投与には、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が考慮される。リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に公知であり、また、以下で記述されている。
【００８１】
ナノカプセルは、一般に、安定で再生可能な様式で、化合物を取り込むことができる。細胞内への高分子のオーバーロードが原因の副作用を避けるために、このような超微細な粒子（約０．１μｍのサイズにした）は、インビボで分解できる重合体を使用して設計すべきである。このような要件を満たす生体分解性のポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子は、本発明での使用が考慮されており、このような粒子は、容易に製造され得る。
【００８２】
リポソームは、水性媒体に分散されたリン脂質から形成され、自然に、多層同心二重層ベシクル（これはまた、多層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれている）を形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶを超音波処理すると、小さい単層ベシクル（ＳＵＶ）が形成され、これは、２００〜５００Åの範囲の直径を有し、そのコア内に水溶液を含有する。
【００８３】
リポソーム処方物を産生する際には、以下の情報もまた、利用され得る。リン脂質は、水に分散したとき、脂質：水のモル比に依存して、リポソーム以外に種々の構造をとることができる。低い比では、このリポソームは、その好ましい構造である。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存している。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対して低い浸透性を示し得るが、高温では、それらの浸透性を著しく変える相転移を受ける。この相転移には、密に詰め込まれ規則正しく並べられた構造（これは、ゲル状態として知られている）から疎に詰め込まれ規則性が少ない構造（これは、流体状態として知られている）への変化が関係している。これは、特徴的な相転移温度で起こり、その結果、イオン、糖および薬物に対する浸透性が高くなる。
【００８４】
リポソームは、以下の４つの異なる機構によって、細胞と相互作用する：細網内皮系（例えば、マクロファージおよび好中球）の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水力または静電力、または細胞表面成分との特異的な相互作用のいずれかによる、細胞表面への吸着；細胞質へのリポソーム内容物の同時放出と共に、リポソームの脂質二重層の原形質膜へと挿入による原形質細胞膜との融合；およびリポソーム内容物の何らかの会合なしでの細胞膜または細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）膜へのリポソーム脂質の移動またはその逆。１つより多い機構が同時に作動し得るものの、そのリポソーム処方を変えると、どの機構が作動可能であるかが変化し得る。
【００８５】
（ＶＩ．実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために、含めている。これらの実施例で開示された方法は、本発明を実施する際に十分に機能するように本発明者により発見された代表的な方法に従っており、それゆえ、その実施に好ましい様式を構成すると考えることができることは、当業者に理解できるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態について多くの変更を行うことができ、それでもなお、同様または類似の結果が得られることを理解するはずである。
【００８６】
（実施例１）
（ＤＦＭＯのインビボ研究方法）
（動物および試薬）
２４匹のＬｏｎｇ　Ｅｖａｎｓ着色ラット（２５０〜２７５ｇ）は、Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し、また、３６匹の着色モルモットは、２００〜２５０ｇの初期体重で、Ｋｕｉｐｅｒ　Ｒａｂｂｉｔ　Ｒａｎｃｈ（Ｇａｒｙ，ＩＮ）から得、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｏｋｌａｈｏｍａ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｅｎｔｅｒの動物施設に収容した。被験体は、１２時間：１２時間の点灯−闇サイクル下で収容し、食物および水に自由にアクセスさせて、室温を２１℃に制御した。
【００８７】
（ラットにおけるＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ用量応答）
２４匹の動物を、各３匹の被験体の８群にランダムに配置した。処理群は、以下のとおりであった：４〜８週間にわたって、毎日（週５日）、栄養補給による０、２００、４００および６００ｍｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ。次の２群に、４匹の動物をランダムに追加した：８週間にわたって、１日２回（週５日）、栄養補給による４００および６００ｍｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ。週末には、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ（推定体重により決定した容量）は、飲料水に残した（３０ｍｌ／日／動物１匹）。体重測定は、毎日（週５日）行い、投薬の終わりに、聴覚機能の評価を実行した。
【００８８】
（モルモットにおけるＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ用量応答）
３１匹の若年の着色モルモットを、処理群にランダムに割り当てたが、これらの群には、毎日（週７日）、０．５ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）、１ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）、２ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝２）、３ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝４）および生理食塩水ビヒクル（ｎ＝５）を与えた。動物の数の変化の原因は、高い死亡率のせいであり、そのために、さらに高い暴露群へと動物を追加することを中止すると決定することになった。聴覚閾値は、投薬の４５日目で、０．５ｇ／ｋｇ／日および１ｇ／ｋｇ／日の被験体で評価したのに対して、２ｇ／ｋｇ／日の被験体は、投薬の２２日目で、評価した。それゆえ、１ｇ／ｋｇ／日および２ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯの被験体には、体重１ｋｇあたり、ほぼ同じ全Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ用量を与えた。毎日の体重測定により、注射する容量を決定した。投薬の終わりにあたり、聴覚機能の評価を行った。
【００８９】
（モルモットにおけるＤＦＭＯのラセミ体と対比した鏡像異性体）
２０匹の被験体を、処理群（ｎ＝５）にランダムに割り当てたが、これらの群には、１ｇ／ｋｇ／日のＤ−ＤＦＭＯ、１ｇ／ｋｇ／日のＬ−ＤＦＭＯ、１ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯを与えた。注射は、毎日の体重測定により決定したが、毎日、静脈内で、４５日間行った。投薬の終わりにあたり、聴覚機能の評価を行ったが、全ての動物は、試用期間を生き残った。
【００９０】
（ＣＡＰおよびＣＭの記録および分析）
この処理サイクル（最後の薬剤投薬の２４時間後）の終わりに、これらのラットを、キシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ、筋肉内注射）およびケタミン（８７ｍｇ／ｋｇ、筋肉内注射）で麻酔し、そしてモルモットを、キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、筋肉内注射）、ケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内注射）およびウレタン（１６０ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射）で麻酔した。その丸窓を、腹側外側アプローチを使用して外科的に露出させ、複合活動電位（ＣＡＰ）および蝸牛マイクロフォン電位（ＣＭ）を記録するために、外科用顕微鏡下にて、この丸窓上に、銀ワイヤ電極を注意深く置いた。参照として、頚筋には、塩化銀電極を置いた。これらのＣＡＰおよびＣＭ信号を、Ｇｒａｓｓ　Ａ．Ｃ．プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ　Ｐ１５）で増幅した。そのゲインは、１０００であった。ＣＡＰに対する帯域通過周波数は、０．１〜１．０ｋＨｚであり、ＣＭに対しては、０．１〜５０ｋＨｚであった。これらのＣＡＰ信号は、デジタルオシロスコープ（Ｎｉｃｏｌｅｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ．９０９０−ＩＩＩＡ）を使用して、観察した。これらのＣＭ信号は、ＳＲ５３０　Ｌｏｃｋ−ｉｎ増幅器（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に送信し、次いで、１μＶ　ＲＭＳ振幅を自動的に決定するために、ＰＣコンピューターに送信した。ちょうど検出可能なＣＡＰを呼び出した試験周波数の音響レベルを決定し、この値を、その周波数での閾値を概算するのに使用した。各試験周波数で１μＶ　ＲＭＳ　ＣＭで呼び出した音響周波数は、そのコンピュータープログラムにより決定し、その１μｖ　ｒｍｓ　ｃＭイソ振幅曲線（ｉｓｏ−ａｍｐｌｉｔｕｄｅ　ｃｕｒｖｅ）を評価した。各処理被験体に対する各ＣＡＰ−閾値と同じ周波数での（ビヒクルのみに暴露した被験体からの）平均対照値との間の差として、ＣＡＰ−閾値シフトを算出した。ＣＭイソ振幅曲線は、類似の様式で得た。
【００９１】
ＣＡＰおよびＣＭを誘発する純音は、ＳＲ５３０　Ｌｏｃｋ−ｉｎ増幅器（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使って発生させた。これらの信号を、プログラム化可能な減衰器により減衰し、次いで、高電圧増幅器により増幅し、そして高周波数音源（ＡＣＯ　１／２”マイクロフォン、７０１３により作製した）に送達し、スペキュラム（これは、露出した外耳道に嵌る）内に置いた。これらの音の周波数は、２、４、６、８、１２、１６、２０、２４、３０、３５および４０ｋＨｚであった。ＣＭを誘発するには、連続階調を使用した。ＣＡＰを誘発するには、トーンバーストを使用した。これらのトーンバーストの持続時間は、１０ｍｓｅｃであり、１．０ｍｓｅｃの上昇／下降時間および９．７／秒の繰り返し率であった。全試験周波数の音響レベルは、鼓膜に近くに設置したプローブマイクロフォンを使って、較正した。
【００９２】
異なる薬剤への暴露と試験周波数およびそれらの相互作用との間の全体的な有意性を評価するために、繰り返し測定ＡＮＯＶＡ（ＮＣＳＳソフトウェア）を使用した。周波数は、被験体内変数として評価し、また、処理群は、被験体間変数として評価した。ＦｉｓｈｅｒのＬｅａｓｔ　Ｓｑｕａｒｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより、ポストホック（Ｐｏｓｔ　ｈｏｃ）分析を実行した。
【００９３】
（組織構造）
コルチ器の表面調製物を、限定数の被験体で評価した。これらの動物を、ＣＡＰおよびＣＭ記録後に深く麻酔にかけつつ、断頭した。直ちに、蝸牛を除去した。その丸窓および楕円形窓の両方を開き、この蝸牛の頂部をドリルで開き、灌流を容易にした。蝸牛を、ＳＤＨ（スクシネート脱水素酵素）インキュベーション溶液（０．０５Ｍのコハク酸ナトリウム、０．０５Ｍのリン酸緩衝液および０．０５％のＴｅｔｒａＮｉｔｒｏ　Ｂｌｕｅ　Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）で灌流し、この溶液に１時間（３７℃）浸した。次いで、蝸牛を、少なくとも２日間にわたって、１０％ホルマリンで固定した。固定後、蝸牛を１０％ＥＤＴＡ溶液（エチレンジアミン四酢酸）で３日間またはそれ以上（必要に応じて）脱灰した。蝸牛の顕微解剖は、光学顕微鏡下で達成した。
【００９４】
（実施例２）
（Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理したラットにおける用量応答毒性および中毒性難聴）
ラットを２００ｍｇ／ｋｇ／日と１．２ｇ／ｋｇ／日の間の用量でＤ，Ｌ−ＤＦＭＯに暴露しても、８週間までの挿管暴露を使用したときには、何らの著しい体重変化または聴覚機能障害を生じない。図１は、全ての処理群に対して、５日間の間隔にわたって平均した体重増加（グラム）を示す。それらの対照の体重増加と比較して、２００ｍｇ／ｋｇ／日と６００ｍｇ／ｋｇ／日の間の用量では、何らの体重減少も起こらない。これらの群で使用した被験体の数は少なかったものの、２つの最も高い用量では、体重増加が低下するように思われる。これらのデータは、統計的な分析にかけると、有意判定基準を満たさなかった（Ｆ［２２，４４］＝１．５６、ｐ＝０．１０３）。
【００９５】
ＣＡＰ閾値およびＣＭ振幅に対する複数用量のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ処理の効果は、それぞれ、図２および図３で描写されている。Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、これらの基準のいずれに対しても効果がない。ＣＡＰ閾値レベルおよび１μＶ　ＲＭＳイソ振幅ＣＭ曲線は、ビヒクルで処理した対照被験体から、５ｄＢ未満だけ変化した；この規模の変化は、測定に伴う誤差の範囲内であり、生物学的な有意性はない（Ｆ［２，４］＝１．２４、ｐ＝０．３８１）。
【００９６】
（実施例３）
（Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理したモルモットにおける用量応答毒性および中毒性難聴）
ラットで観察されたデータとは対照的に、モルモットを５００ｍｇ／ｋｇ／日と３ｇ／ｋｇ／日の間の用量のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理したとき、相当な一般毒性および中毒性難聴が観察された。全ての３ｇ／ｋｇ／日被験体は、処理の最初の６日以内に死亡し、５匹の１ｇ／ｋｇ／日被験体のうちの２匹は、全６週投薬レジメンを生存しなかった。３ｇ／ｋｇ／日群を失ったので、２匹の２ｇ／ｋｇ／日被験体を追加した。２２日目までに、２ｇ／ｋｇ／日の動物は、事実上、体重増加がなく、この時点で、これらの動物の聴覚機能を評価した。図４は、聴覚機能評価を行った動物の体重増加の割合を示す。２ｇ／ｋｇ／日被験体については、体重増加は、効果的に阻止されたのに対して、１ｇ／ｋｇ／日被験体は、この投薬期間の最後の１０日間で、これらの対照から分かれるように思われる。５００ｍｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ動物は、全身毒性の明らかな徴候を示さなかった；それらの成長割合は、実際、これらの対照のものを上回った。分析により、５００ｍｇ／ｋｇ／日被験体も１ｇ／ｋｇ／日被験体もいずれも、この対照とあまり異ならないことが明らかとなった（Ｆ＜１．０）。
【００９７】
聴覚閾値の用量に依存した上昇は、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ処理モルモットで観察された。その一般的な毒性があるために、聴覚評価は、実際、５匹の５００ｍｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、３匹の１ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、２匹の２ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯおよび３匹の対照被験体（２匹の被験体は、外した；１匹は、麻酔の過剰摂取のため、また、１匹は、妊娠のためであった）。図５は、各Ｄ，Ｆ−ＤＦＭＯ用量群に対するＣＡＰ感受性の減少を示す。この薬剤を５００ｍｇ／ｋｇ／日で受けた被験体は、平均して９ｄＢのＣＡＰ閾値の上昇を示し、その減少は、周波数にわたって、比較的に平坦であった。限られた数の２ｇ／ｋｇ／日動物および１ｇ／ｋｇ／日動物は、閾値のシフトを示し、これは、高周波数の試験範囲において、最も明らかであった。この２ｇ／ｋｇ／日の群は、１４ｄＢの全周波数にわたって、平均した減少を見せたのに対して、１ｇ／ｋｇ／日被験体は、１０ｄＢの平均シフトを有していた。２０ｋＨｚと４０ｋＨｚの間の周波数だけを評価したとき、２ｇ／ｋｇ／日被験体に対する聴覚感受性の平均減少は、１ｇ／ｋｇ／日被験体に対する僅か１７ｄＢおよび５００ｍｇ／ｋｇ／日被験体に対する７．１ｄＢと比較して、３０ｄＢであった。不等なｎに対して補正した繰り返し測定ＡＮＯＶＡにより、２ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、１ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、５００ｍｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯおよび生理食塩水を受けた４つの用量群の間でのＣＡＰの著しい差を決定した（処理間、Ｆ［３，９］＝４．０６、ｐ＝０．０４４；周波数間、Ｆ［１０，１９０］＝２５．９８、ｐ＝０．００１；処理−周波数相互作用、Ｆ［３０，１９０］＝１０．８９、ｐ＝０．００１）。ポストホック分析により、３つの薬剤処理の全ては、その対照とは著しく異なっていることが明らかとなった（ｐ＜０．０５）。
【００９８】
興味深いことに、ＣＡＰ感受性の崩壊とは対照的に、これらの処理のいずれも、ＣＭ感受性に対する効果を有しなかった（図６を参照）。このＣＭは、主に、外側毛細胞、特に、蝸牛の基部にあるもの（これは、導出電極に近い）により、音響刺激に対して、発生される（図６を参照）。このＣＭは、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯの用量のいずれによっても引き起こされず、このことは、このＣＡＰで見られる効果が、ＯＨＣの機能不全に基づいて二次的に起こったものではないことを示唆している。これらの処理のいずれも、このＣＭ曲線の変化を生じず、これは、この対照からの統計的な有意性を満たした（Ｆ＜１．０）。
【００９９】
毛細胞の損傷は、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ（４５日間で１ｇ／ｋｇ／日）により引き起こされた激しいＣＡＰ閾値の上昇があるモルモットにおいて、組織学的に検査したが、ＣＭ感受性の変化はなかった。この被験体のＣＡＰ閾値損失は、対照と比べて、刺激周波数と共に上昇し、４０ｋＨｚで、５５ｄＢという最も高い上昇があった（図７Ｅ）。低い周波数に対するＣＡＰ閾値は、ＣＭによる妨害があったために、得られなかった。基底膜の表面に沿った位置は、頂点からの距離パーセントで識別され、また、音は、蝸牛の最も基礎的な部分で表わされる最も高い周波数を使って、トノトピック（ｔｏｎｏｔｏｐｉｃ）様式でコード化されるので、その生理学的なデータと関連付けることができる。内側毛細胞（ＩＨＣｓ）および外側毛細胞（ＯＨＣｓ）の両方は、この基底膜の最も先端の４０％以内で、正常なＳＤＨ（スクシネート脱水素酵素）染色を示した。例えば、図７Ａは、この基底膜の２６％で位置している毛細胞の画像である。この基底膜の残り６０％（図７Ｂ）は、毛細胞の損傷を示した。７４％（図７Ｃ）では、ＯＨＣｓおよびＩＨＣｓの損失が起こる。興味深いことに、その基部に非常に近い一部の場所（ここでは、全てのＩＨＣｓがなくなった）では、多くのＯＨＣｓは、依然として、生存している（図７Ｄ、９０％）。ＣＭ感受性が正常であること（図７Ｆ）は、その丸窓に近い基底ターンで生存しているＯＨＣｓの正常な機能を示している。
【０１００】
（実施例４）
（モルモットにおけるＬ−ＤＦＭＯおよびＤ−ＤＦＭＯの毒性および中毒性難聴）
ＤＦＭＯの鏡像異性体およびラセミ化合物を比較するデータは、図８、図９および図１０で示す。Ｄ−ＤＦＭＯは、モルモットにおいて、著しい聴覚障害を生じないのに対して、ＤＦＭＯのＬ−鏡像異性体は、このＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ処理のものを超える閾値シフトを発生することが分かった。その体重データは、これらの鏡像異性体が著しい一般毒性を生じないことを示唆している。
【０１０１】
図８は、これらの動物の成長を示す。処理した動物は、それらの対照よりもゆっくりした速度で成長するように思われたものの、全試行期間にわたるデータの統計的な分析では、著しい差は見られなかった（Ｆ［３，１６］＝０．９５、ｐ＝０．４４）。これらの鏡像異性体とラセミ化合物の間の体重増加は、互いに異なっていなかった。
【０１０２】
図９は、この鏡像異性体、ラセミ化合物および対照に対するＣＡＰ閾値シフトを示す。Ｌ−ＤＦＭＯ（黒三角）およびＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（黒四角）の両方は、２５±２ｄＢの平均閾値シフトを発生した。そのＤ−鏡像異性体（図９、黒丸）を聴覚機能について測定したとき、４０ｋＨｚでの僅かな上昇を伴って、全ての周波数にわたって、２ｄＢのＣＡＰ閾値平均シフトが見つかった。繰り返し測定ＡＮＯＶＡにより、１ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、１ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、１ｇ／ｋｇ／日のＬ−ＤＦＭＯおよび生理食塩水を受けた４つの用量群の間でのＣＡＰの著しい差を決定した（処理間、Ｆ［３，１９］＝７．４１、ｐ＝０．００２；周波数間、Ｆ［１０，１９０］＝７．９９、ｐ＜０．００１；処理−周波数相互作用、Ｆ［３０，１９０］＝２．９０、ｐ＝０．００１）。ＦｉｓｃｈｅｒのＬＳＤにかけると、Ｌ−ＤＦＭＯ（ｐ＜０．００５）およびＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｐ＜０．００５）は、全ての試験周波数にわたって、その対照とは著しく異なることが分かっているが、そのＤ−鏡像異性体は、そうではない。
【０１０３】
ＣＡＰ閾値に対する著しい効果とは対照的に、Ｌ−ＤＦＭＯは、ＣＭ感受性の変化を生じなかった（図１０、黒三角）。３５ｋＨｚおよび４０ｋＨｚでの僅かな上昇は、これらの２つの周波数で、４０ｄＢ程度に大きい損失を示す動物が原因である。Ｄ−ＤＦＭＯはまた、このＣＭを変えなかった。ＣＭに対する処理効果のいずれも、その対照から有意ではなかった（Ｆ［３，１６］＝０．９２、ｐ＝０．４５）。
【０１０４】
（論述）
酵素阻害剤で動物を処理したとき、それらの結果は、ある飽和点を備えた用量依存性曲線であると予想される。Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ化学療法の副作用としてなくすべき中毒性難聴については、この薬剤に対する中毒性難聴用量の応答を決定する必要がある。以前の研究では、この薬剤を飲料水中で投与したが、こうすると、実際の薬剤摂取量を決定することが困難となった。従って、正確な内耳神経毒性の用量応答を誘発するためには、この薬剤を直接送達する必要がある。この方法では、ラットおよびモルモットの両方を利用する。
【０１０５】
このラットモデルは、その聴力検査範囲にわたって、著しい体重減少（毒性）を生じず、また、著しい閾値シフト（内耳神経毒性）を生じなかった。これらの結果は、ラットにおいてＤ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理すると、ヒトの癌患者で以前に報告された内耳神経毒性副作用を生じないことを暗示している。Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら（１９８６年）は、飲料水中でラットを１％のＤＦＭＯで処理すると（毎日、３０ｍｌの水を飲むと仮定すると、約３００ｍｇ／ｋｇ）、正常な脳幹誘発電位を生じるだけでなく、そのポリアミンのレベルが、他の系で分裂させると考えられるレベルまで欠乏することを発見した。本発明者は、これらの動物を暴露することにより、挿管により、このデータを４倍までのさらに多い用量にまで拡張したが、依然として、聴覚閾値に対する影響は見られなかった。もし、ポリアミンのレベルが、聴覚機能において、重要な役割を果たすなら、このラットの代謝は、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯが臨界レベルまでポリアミン合成を阻害しないようにされ、従って、このラットは、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯの中毒性難聴の決定に対する信頼できるモデルとして、使用できる。
【０１０６】
対照的に、モルモットでＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ処理をすると、著しい聴覚機能不全（中毒性難聴）が発生する。この場合もやはり、以前の研究から実際の薬剤摂取量を決定することは困難であり、従って、現在の研究における全ての薬剤投与は、腹腔内投与により行われた。この研究の最初の６日間以内に、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、３ｇ／ｋｇ／日で、相当な毒性を示し、これらの動物の１００％が死にかけていた。残りの処理群は、この試行期間内では、著しい毒性（死亡または体重減少）を生じなかった。検死は、この治療過程中に死亡した１匹の動物に対して、また、この実験の最後まで生き残った被験体に対して、実行した。それらの報告は、被験体の死亡または体重増加の抑制の原因が繰り返しの注射ではなかっという結論を支持している。
【０１０７】
それらのＣＡＰ閾値からＤ，Ｌ−ＤＦＭＯは、モルモットにおいて、著しい再現可能なシフトを生じることが明らかとなった。予想していたように、試験周波数にわたる平均閾値シフトは、用量依存性である。２ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯが短時間にさらに大きな聴覚障害を発生する性能は、この治療の持続時間ではなく投与する薬剤の量が最終的に中毒性難聴を決定することを暗示している。
【０１０８】
ＣＭは、主に、蝸牛の基底ターンにある外側毛細胞により発生し、アミノグリコシドおよびシスプラチンを含有する多くの内耳神経毒性薬剤による障害を検出する感度の高い測定法であるが、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、そのＣＭイソ振幅曲線の変化を引き起こさなかった。組織構造により、極めて基底のターンにある外側毛細胞の大部分は、無傷であることが明らかとなり、このことは、ＣＭに対する効果がゼロ（ｎｕｌｌ　ｅｆｆｅｃｔ）であることを説明している。しかしながら、その基底内側毛細胞では、大部分が欠けていて、広範囲にわたる損傷が明らかとなった。蝸牛の中間部では、外側および内側毛細胞の損傷および損失の両方が明らかとなった。その頂点では、外側毛細胞も内側毛細胞もいずれも、損傷も欠損もなかった。従って、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯは、蝸牛の基底ターンに位置している毛細胞に対して、一定の選好性を有し得る。
【０１０９】
この用量応答データを作成したために、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯとその鏡像異性体との比較が可能となった。本発明者は、モルモットにおいて、再現性Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ誘発閾値を発見したので、モルモットにおいて、これらの鏡像異性体の特性付けを継続した。高い用量では死亡率が高いために、これらの鏡像異性体とラセミ化合物とを比較するために、１ｇ／ｋｇ／日を選択した。
【０１１０】
これらの鏡像異性体は、（体重増加により決定される）著しい毒性を示さなかった。Ｄ形状のＤＦＭＯは、その化合物活動電位または蝸牛マイクロフォン電位のいずれにも著しい効果を有しないことが発見された。聴覚機能の評価により、Ｌ形状のＤＦＭＯは、正常な蝸牛電位の著しい分裂を生じることが分かった。上記研究は、ＤＦＭＯの単一鏡像異性体が関与している化学療法の開発に関して、暗示を含み得る。
【０１１１】
（実施例５）
（Ｄ−、Ｌ−およびＤＬ−ジフルオロメチルオルニチンの比較。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）活性に対する効果）
（物質および方法）
組換えマウスＯＤＣをＥ　ｃｏｌｉで発現し、そして研究用に精製した。ＯＤＣの活性およびＤＦＭＯによる阻害を測定するために、微量検定法を使用する。具体的には、２０μｌの組換えマウスＯＤＣを、０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中にて、室温で、３０分間にわたって、連続希釈（０〜８０μＭのＤ−、Ｌ−またはＤ−Ｌ−ＤＦＭＯ）でプレインキュベートした。その酵素反応は、このエッペンドルフチューブ中にて、２７．５μｌのＢｒｉｊ　３５　ＯＤＣアッセイ混合物（最終濃度：４０ｍＭのＴｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、８ｍＭのＤＴＴ、０．６４ｍＭのピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）、０．８０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０４％のＢｒｉｊ　３５および０．２μＣｉ（１４Ｃ）Ｌ−オルニチン）を添加することにより、開始した。４０μｌのＣＯ２トラッピング剤（エタノールアミン／３−メトキシエタノール、２：１）を、２０ｍｌのガラス製スクレーキャップ（ｓｃｒｅ−ｃａｐ）液体シンチレーションバイアルの底部に設置し、この試料を含む開放エッペンドルフチューブを、このトラッピング剤から離して、このバイアルに設置した。このシンチレーションバイアルを、直ちに、隔壁キャップで覆い、これらのバイアルを、３７°振盪水浴中にて、１時間インキュベートした。次いで、これらのバイアルを、この水浴から取り除き、そして１００μｌの２Ｍクエン酸を、この隔壁を通って、この開放エッペンドルフチューブに加えて、このＯＤＣ反応を停止した。これらのシンチレーションバイアルを、３７°で、さらに２時間インキュベートして、この反応をクエンチした。これらのチューブを、これらのバイアルから取り除き、６ｍｌのシンチレーション液を加えた。これらのバイアルを、１分間にわたって、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＬＳ−６５００シンチレーションカウンタで数えた。このデータの最小二乗フィットにより、Ｋｉ阻害値を得た。
【０１１２】
（結果）
０．６μＭ〜８０μＭの濃度のＤ−、Ｌ−およびＤ，Ｌ−ＤＦＭＯを使用する３つの別々の研究では、そのＯＤＣ活性（Ｋｉ）を阻害する各々の有効濃度レベルを決定した。これらの有効濃度レベルは、以下のとおりである：
Ｄ−ＤＦＭＯ　　　　　２４．１μＭ
Ｌ−ＤＦＭＯ　　　　　　６．４μＭ
Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ　　　　８．１μＭ
両方の鏡像異性体は、そのラセミ混合物と同様に、阻害性であった。Ｄ−ＤＦＭＯのＫｉは、Ｌ−形状よりも４倍低く、また、この混合物よりも３倍低かった。
【０１１３】
（実施例６）
（Ｄ−、Ｌ−およびＤ，Ｌ−ＤＦＭＯによる細胞系でのアポトーシスの誘発）
Ｄ−、Ｌ−およびＤ，Ｌ−ＤＦＭＯがアポトーシスを誘発する性能を、以下の６つのヒト細胞系で検査した：ＭＣＦ−７（乳癌、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ２２）、ＬＮＣａＰ（前立腺癌、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７４０）、ＰＣ−３（前立腺癌、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５）、ＨＴ−２９（大腸癌、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ３８）、ＨＳＫ　６１２（ノルマルカラチノサイト、ＩｎＣｅｌｌ，Ｉｎｃ．から購入）および５０６ＳＭ（ノルマル大腸粘膜下間葉細胞、ＩｎＣｅｌｌ，Ｉｎｃ．から購入）。３つの形状のＤＦＭＯの各々を、２つの濃度（１μＭおよび１０μＭ）で処理した。正の対照として、アドリアマイシンおよび塩化カルシウムを使用した。Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃａｔ．＃１５８５−０４５）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色に従って、マルチウェルプレートＤＮＡ断片化を使用して、アポトーシスをアッセイした。
【０１１４】
３つの形状の全てのＤＦＭＯがアポトーシスを引き起こしたが、その癌細胞系において、細胞毒性を起こさなかった。検査した濃度では、ＤＦＭＯの形状の間では、全体的に大きな差はなかった。アポトーシスは、全てのＤＦＭＯ溶液について、正の対照であるアドリアマイシン（これは、アポトーシスだけでなく、細胞毒性でもあった）よりも明白となった。
【０１１５】
（実施例７）
（ＭＣＦ−７ヒト乳癌異種移植片モデルにおけるＤＦＭＯの鏡像異性体のインビボ評価）
ヌードマウスに、エストロゲン依存性ヒト乳癌株であるＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ２２）を移植した。この動物の飲料水に、１群あたり８匹の動物で、０．５％ｗ／ｖ溶液として、Ｄ−、Ｌ−またはＤ，Ｌ−ＤＦＭＯを随意に投与した。８匹の動物の１追加群には、３．０％溶液として、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯを投与した。この実験は、９０日目で終了させた（このとき、対照の腫瘍は、４００ｍｇの大きさに達した）。マウスを、毎週２回、計量し、腫瘍の測定は、ＤＦＭＯの投与時点（１日目）で開始して、毎週２回、カリパスにより行った。腫瘍の測定値は、式Ｌ２×Ｗ／２により、腫瘍重量（ｍｇ）に変換した。
【０１１６】
Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯを受けた群については、８匹の動物のうちの７匹は、６０．４％の平均部分腫瘍収縮に直面し、８番目の動物では、９９．２％の腫瘍成長の阻止作用があった。Ｌ−ＤＦＭＯを受けた群については、８匹の動物のうちの７匹は、５０．０％の平均部分腫瘍収縮に直面し、８番目の動物では、５．５％の腫瘍成長の阻止作用があった。Ｄ−ＤＦＭＯを受けた群については、８匹の動物のうちの４匹は、６２．６％の平均部分腫瘍収縮に直面し、８匹の動物のうちの２匹は、８４．７％の腫瘍阻止作用を有し、残りの２匹の動物は、毒性による死に直面した。対照と比較した各群の平均結果は、３．０％のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ群を含めて、図１１で示す。これらの群で見られる抗腫瘍活性の差は、有意とは考えられない。
【０１１７】
（実施例８）
（オルニチン脱炭酸酵素インビトロ活性に対するＤＦＭＯの鏡像異性体の効果）
Ｄ−、Ｌ−またはＤ，Ｌ−ＤＦＭＯがオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）を阻害する効果について、２つのインビトロ系を検査した。第一の系は、マウスＯＤＣ　ｃＤＮＡに由来の無細胞系で合成されたＯＤＣを使用した。Ｌ−ＤＦＭＯは、低い阻害剤：基質比で、Ｄ−ＤＦＭＯよりも強力なＯＤＣ阻害剤であることが分かった。このＤ異性体は、この系で、そのＬ異性体よりも１０分の１低い効力であると概算されたのに対して、ラセミＤ，Ｌ−ＤＦＭＯは、中間の効力であった。このＬ体は、（不可逆的阻害剤について予想されたように）非競合様式で作用するようであり、一方、そのＤ体は、競合様式で作用するようである。
【０１１８】
第二の系では、ＨＣＴ−１１６大腸癌誘導細胞において、内生ＯＤＣの阻害を調べた。この場合もやはり、このＬ体は、細胞内ポリアミン（ＯＤＣ活性の最終生成物）のレベルを少なくする際に、そのＤ体よりも強力であった。全ての形態のＤＦＭＯは、プトレッシン（ＯＤＣの他の最終生成物）のレベルを検出限界より低く抑えた。ポリアミンレベルは、Ｄ−ＤＦＭＯで処理した細胞内では、Ｌ−ＤＦＭＯで処理した細胞内よりも急速に回復した。
【０１１９】
（実施例９）
（Ｄ−、Ｌ−およびＤ，Ｌ−ＤＦＭＯによるＯＤＣのインビボ阻害の比較）　全身的に投与したＤ−、Ｌ−およびＤ，Ｌ−ＤＦＭＯが、マウスの皮膚にあるホルボールエステル誘発ＯＤＣを阻害する性能。（単一用量または分割用量のいずれかで）１００ｍｇで投与した全ての形態のＤＦＭＯは、ＯＤＣの活性を完全に阻害した。全形態の５ｍｇ用量を５日間にわたって毎日投与すると、ＯＤＣの活性を完全に阻害し、それらの異性体間では、差がなかった。図１２で示すように、単一用量のＤ−ＤＦＭＯ対Ｌ−ＤＦＭＯは、用量に依存して、ＯＤＣを阻害し、この場合もやはり、それらの２種の異性体間で、差はなかった。
【０１２０】
（実施例１０）
（生体液中でのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯの分析）
ラットに、単一用量のＤ−、Ｌ−およびＤ，Ｌ−ＤＦＭＯを投与し、時間の経過と共に、血漿レベルを測定した（図１３）。４００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯを投与したラットは、投与後１時間と２時間の間で、１０９μｇ／ｍｌの最大血漿レベルに達した。Ｄ−ＤＦＭＯまたはＬ−ＤＦＭＯのいずれかを２００ｍｇ／ｋｇで投与したラットは、同じ時間の経過と共に、それぞれ、１０２μｇ／ｍｌおよび４５μｇ／ｍｌに達した。Ｌ−ＤＦＭＯで見られた低い血液レベルは、この形態に対する低い生体利用能、急速な分泌、または組織またはタンパク質に対する急速な結合が原因であり得る。
【０１２１】
本明細書中で開示され請求された組成物および／または方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験なしで、行い実行できる。本発明の組成物および／または方法は、好ましい実施形態に関して記述されているものの、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中で記述された組成物および／または方法および方法の工程または工程順序に対して変更を加え得ることは、当業者に明らかとなる。さらに具体的には、化学的および生理学的に関連した試薬は、同一または類似の結果を達成しつつ、本明細書中で記述した試薬と代用し得ることが明らかである。当業者に明らかなこのような全ての代用および改良は、添付の請求の範囲で規定された本発明の精神、範囲および概念に含まれると見なされる。
【０１２２】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中で述べたものを補足する代表的な手順または他の詳細を提供する範囲内で、その内容が本明細書中で参考として援用されている。
【０１２３】
【数２】
2004504271.tif 000004
2004504271.tif 000005
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、本発明の特定の局面をさらに明示するために、含まれている。本発明は、本明細書中で提示された特定の実施形態の詳細な記述と組み合わせて、これらの図面の１つまたはそれ以上を参照して、さらによく理解できる。
【図１】５４日間にわたって毎日、栄養補給（ｇａｖａｇｅ）によって、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理したラットの体重増加。そのデータを表わすために、４つの条件を選択した。＊：対照（ｎ＝３）、白四角：２００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）、白逆三角：４００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）、白三角：６００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）、白菱形：８００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯおよび白丸：１．２ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝２）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図２Ａ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白四角：２００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図２Ｂ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白逆三角：４００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図２Ｃ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白三角：６００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図２Ｄ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白菱形：８００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図２Ｅ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白丸：１．２ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝２）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図３Ａ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットでの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白四角：２００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図３Ｂ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットでの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白逆三角：４００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図３Ｃ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットでの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白三角：６００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図３Ｄ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットでの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白菱形：８００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図３Ｅ】５４日間のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ栄養補給によって引き起こされるラットでの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図１のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白丸：１．２ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝２）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図４】４５日間にわたって毎日、腹腔内注射によって、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理したモルモットの体重増加。２ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯは、毒性があるために、早期に終了した。データは、聴覚評価を実行した動物を表しているにすぎない。＊：対照（ｎ＝３）、白四角：５００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）、白丸：１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）および白三角：２ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝２）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図５Ａ】毎日の腹腔内注射によって、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理することにより引き起こされるモルモットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図４のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白四角：５００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図５Ｂ】毎日の腹腔内注射によって、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理することにより引き起こされるモルモットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図４のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白丸：１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図５Ｃ】毎日の腹腔内注射によって、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理することにより引き起こされるモルモットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図４のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白三角：２ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝２）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図６Ａ】毎日の腹腔内注射によって、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理することにより引き起こされるモルモットでの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図４のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白四角：５００ｍｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図６Ｂ】毎日の腹腔内注射によって、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理することにより引き起こされるモルモットでの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図４のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白丸：１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝３）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図６Ｃ】毎日の腹腔内注射によって、Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯで処理することにより引き起こされるモルモットでの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図４のものと同じである。＊：対照（ｎ＝３）および白三角：２ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝２）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図７Ａ】Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ（１ｇ／ｋｇ／日で４５日間）で処理した１匹の動物における毛細胞および聴力損失。位置は、基底板の頂点からの距離（％）である。全ての光学顕微鏡写真は、同じ倍率である。２６％。
【図７Ｂ】Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ（１ｇ／ｋｇ／日で４５日間）で処理した１匹の動物における毛細胞および聴力損失。位置は、基底板の頂点からの距離（％）である。全ての光学顕微鏡写真は、同じ倍率である。６３％。
【図７Ｃ】Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ（１ｇ／ｋｇ／日で４５日間）で処理した１匹の動物における毛細胞および聴力損失。位置は、基底板の頂点からの距離（％）である。全ての光学顕微鏡写真は、同じ倍率である。７４％。
【図７Ｄ】Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ（１ｇ／ｋｇ／日で４５日間）で処理した１匹の動物における毛細胞および聴力損失。位置は、基底板の頂点からの距離（％）である。全ての光学顕微鏡写真は、同じ倍率である。９０％。
【図７Ｅ】Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ（１ｇ／ｋｇ／日で４５日間）で処理した１匹の動物における毛細胞および聴力損失。位置は、基底板の頂点からの距離（％）である。全ての光学顕微鏡写真は、同じ倍率である。１ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（黒四角）および平均対照（ｎ＝５、白四角）のＣＡＰ閾値。
【図７Ｆ】Ｄ，Ｌ−ＤＦＭＯ（１ｇ／ｋｇ／日で４５日間）で処理した１匹の動物における毛細胞および聴力損失。位置は、基底板の頂点からの距離（％）である。全ての光学顕微鏡写真は、同じ倍率である。１ｇ／ｋｇ／日のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（黒丸）および平均対照（ｎ＝５、白丸）の１μＶ　ＣＭイソ振幅曲線。
【図８】４５日間にわたって毎日、腹腔内注射によって、１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、Ｄ−ＤＦＭＯまたはＬ−ＤＦＭＯで処理したモルモットの体重増加。聴覚試験までに生き残った全ての動物。＊：対照（ｎ＝５）、白四角：１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）、白丸：１ｇ／ｋｇのＤ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）および白三角：１ｇ／ｋｇのＬ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図９】毎日、腹腔内注射によって、１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、Ｄ−ＤＦＭＯまたはＬ−ＤＦＭＯで処理したモルモットのＣＡＰ閾値上昇。動物は、図８のものと同じである。（Ａ）＊：対照（ｎ＝５）および白四角：１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）；（Ｂ）＊：対照（ｎ＝５）および白丸：１ｇ／ｋｇのＤ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）；（Ｃ）＊：対照（ｎ＝５）および白三角：１ｇ／ｋｇのＬ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図１０Ａ】毎日、腹腔内注射によって、１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、Ｄ−ＤＦＭＯまたはＬ−ＤＦＭＯで処理したモルモットの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図８のものと同じである。＊：対照（ｎ＝５）および白四角：１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図１０Ｂ】毎日、腹腔内注射によって、１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、Ｄ−ＤＦＭＯまたはＬ−ＤＦＭＯで処理したモルモットの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図８のものと同じである。＊：対照（ｎ＝５）および白丸：１ｇ／ｋｇのＤ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図１０Ｃ】毎日、腹腔内注射によって、１ｇ／ｋｇのＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ、Ｄ−ＤＦＭＯまたはＬ−ＤＦＭＯで処理したモルモットの１μＶのＲＭＳ　ＣＭイソ振幅曲線の上昇。動物は、図８のものと同じである。＊：対照（ｎ＝５）および白三角：１ｇ／ｋｇのＬ−ＤＦＭＯ（ｎ＝５）。垂直の棒は、標準誤差（ＳＥ）である。
【図１１】ヌードラットにおけるＭＣＦ−７ヒト乳癌の平均腫瘍重量。以下の濃度で、動物の飲料水中にて、Ｄ−、Ｌ−またはＤ，Ｌ−ＤＦＭＯを適宜投与した：０．０％の対照（黒丸）；０．５％のＤ−ＤＦＭＯ（白丸）；０．５％のＬ−ＤＦＭＯ（黒逆三角）；０．５％のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（白逆三角）；３．０％のＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（黒四角）。
【図１２】Ｄ−およびＬ−ＤＦＭＯ異性体の相対的阻害活性を比較するための用量応答研究。一群のメスマウスに対して、栄養補給により、経口的に、１回だけ、指示用量のＤＦＭＯを与えた。ＤＦＭＯ処理の１時間後、マウスの剃毛した背部に、０．２ｍｌアセトン中のＴＰＡ（５ｎｍｏｌ）を塗布した。１処理群あたり、３匹のマウスがあった。溶解性上皮ＯＤＣ活性は、ＴＰＡ塗布の５時間後、測定した。各値は、３匹のマウスから調製した上皮抽出物の由来のＯＤＣ活性の２回測定の平均値±Ｓ．Ｅ．である。
【図１３】４００ｍｇ／ｋｇのラセミＤ，Ｌ−ＤＦＭＯ（○）、２００ｍｇ／ｋｇのＤ−ＤＦＭＯ（白四角）または２００ｍｇのＬ−ＤＦＭＯ（白三角）を経口的に与えたラットの平均血漿レベル。
【図１】
2004504271.tif 000006
【図２Ａ】
2004504271.tif 000007
【図２Ｂ】
2004504271.tif 000008
【図２Ｃ】
2004504271.tif 000009
【図２Ｄ】
2004504271.tif 000010
【図２Ｅ】
2004504271.tif 000011
【図３Ａ】
2004504271.tif 000012
【図３Ｂ】
2004504271.tif 000013
【図３Ｃ】
2004504271.tif 000014
【図３Ｄ】
2004504271.tif 000015
【図３Ｅ】
2004504271.tif 000016
【図４】
2004504271.tif 000017
【図５Ａ】
2004504271.tif 000018
【図５Ｂ】
2004504271.tif 000019
【図５Ｃ】
2004504271.tif 000020
【図６Ａ】
2004504271.tif 000021
【図６Ｂ】
2004504271.tif 000022
【図６Ｃ】
2004504271.tif 000023
【図７Ｅ】
2004504271.tif 000024
【図７Ｆ】
2004504271.tif 000025
【図８】
2004504271.tif 000026
【図９】
2004504271.tif 000027
【図１０Ａ】
2004504271.tif 000028
【図１０Ｂ】
2004504271.tif 000029
【図１０Ｃ】
2004504271.tif 000030
【図１１】
2004504271.tif 000031
【図１２】
2004504271.tif 000032
【図１３】
2004504271.tif 000033
【国際公開パンフレット】
2004504271.tif 000034
2004504271.tif 000035
2004504271.tif 000036
2004504271.tif 000037
2004504271.tif 000038
2004504271.tif 000039
2004504271.tif 000040
2004504271.tif 000041
2004504271.tif 000042
2004504271.tif 000043
2004504271.tif 000044
2004504271.tif 000045
2004504271.tif 000046
2004504271.tif 000047
2004504271.tif 000048
2004504271.tif 000049
2004504271.tif 000050
2004504271.tif 000051
2004504271.tif 000052
2004504271.tif 000053
2004504271.tif 000054
2004504271.tif 000055
2004504271.tif 000056
2004504271.tif 000057
2004504271.tif 000058
2004504271.tif 000059
2004504271.tif 000060
2004504271.tif 000061
2004504271.tif 000062
2004504271.tif 000063
2004504271.tif 000064
2004504271.tif 000065
2004504271.tif 000066
2004504271.tif 000067
2004504271.tif 000068
2004504271.tif 000069
2004504271.tif 000070
2004504271.tif 000071
2004504271.tif 000072
2004504271.tif 000073
2004504271.tif 000074
2004504271.tif 000075
2004504271.tif 000076
2004504271.tif 000077
2004504271.tif 000078
2004504271.tif 000079
2004504271.tif 000080
2004504271.tif 000081
2004504271.tif 000082
2004504271.tif 000083
2004504271.tif 000084
2004504271.tif 000085
2004504271.tif 000086
2004504271.tif 000087
2004504271.tif 000088
2004504271.tif 000089
2004504271.tif 000090
2004504271.tif 000091
2004504271.tif 000092
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504271.tif 000093
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504271.tif 000094
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504271.tif 000095
【国際調査報告】
2004504271.tif 000096
2004504271.tif 000097
2004504271.tif 000098
2004504271.tif 000099
2004504271.tif 000100
2004504271.tif 000101
2004504271.tif 000102
2004504271.tif 000103