(57)【要約】本発明の１つの実施形態は、単一ヌクレオチド塩基によって伸長されたオリゴヌクレオチドを生成する方法である。オリゴヌクレオチドおよび伸長終止ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と混合される。その反応は、単一塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドを生成する。伸長されたオリゴヌクレオチドは、単一塩基伸長反応についてサイズ標準として使用され得る。本発明の別の実施形態は、異なる単一塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドの混合物を生成する方法である。オリゴヌクレオチド、第１伸長終止ヌクレオチド、および第２伸長終止ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と混合される。第１および第２の伸長終止ヌクレオチドは、異なるヌクレオチド塩基を含み、異なる標識で標識される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一ヌクレオチド塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドを生成する方法であって、該方法は、
オリゴヌクレオチドを伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼと混合する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
標識が前記伸長終止ヌクレオチドに結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識が蛍光色素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標識が前記オリゴヌクレオチドに結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標識が蛍光色素である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
単一ヌクレオチド塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドの混合物を生成する方法であって、該混合物は、異なる単一塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドを含み、
該方法は、オリゴヌクレオチドを第１の伸長終止ヌクレオチド、第２の伸長終止ヌクレオチド、およびターミナルトランスフェラーゼと混合する工程であって、該第１および第２の伸長終止ヌクレオチドは、異なる標識および異なるヌクレオチド塩基を含む工程、
を包含する方法。
【請求項７】
前記標識が蛍光色素である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
単一ヌクレオチド塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドを生成するためのキットであって、該キットは、伸長終止ヌクレオチド、およびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を備えるキット。
【請求項９】
前記伸長終止ヌクレオチドが標識されている、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記標識が蛍光標識である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
第１伸長終止ヌクレオチドおよび第２伸長終止ヌクレオチドを備え、第１および第２の伸長終止ヌクレオチドは、異なる標識および異なるヌクレオチド塩基を含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
４つの異なる伸長終止ヌクレオチドを含むキットであって、該４つの伸長終止ヌクレオチドのそれぞれは、異なるヌクレオチド塩基および異なる標識を有する、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記標識が蛍光色素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検出装置で単一ヌクレオチド塩基伸長反応の反応産物を同定する方法であって、該方法は、
オリゴヌクレオチドを伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼと混合することにより単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物標準を形成する工程、および、
検出装置で該単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物標準を分離し、それにより、該単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物標準を示すシグナルが創出される工程、
を包含する方法。
【請求項１５】
第２オリゴヌクレオチドを伸長終止ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と混合することにより単一塩基伸長反応産物標準を形成する工程、
前記検出装置で前記単一塩基伸長産物を分離し、それにより、該単一塩基伸長産物を示すシグナルが創出される工程、
該単一塩基伸長産物を示すシグナルと該単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物とを示すシグナルを比較する工程、
を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
単一ヌクレオチド塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドを生成する方法であって、該方法は、
伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素とオリゴヌクレオチドとを混合する工程を包含し、ここで、該混合物は、該オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能するのを可能にする鋳型を含まない方法。
【請求項１７】
単一ヌクレオチド塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドの混合を生成する方法であって、該混合物は、異なる単一塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドを含み、
該方法は、オリゴヌクレオチドを、第１伸長終止ヌクレオチド、第２伸長終止ヌクレオチド、およびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、およびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と混合する工程を包含し、ここで、該第１および第２の伸長終止ヌクレオチドは、異なる標識および異なるヌクレオチド塩基を含み、該混合物は、該オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能することを可能にする鋳型を含まない、方法。
【請求項１８】
検出装置で単一ヌクレオチド塩基伸長反応の反応産物を同定する方法であって、該方法は、
伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼを有する酵素とオリゴヌクレオチドを混合することにより、単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物標準を形成する工程であって、ここで、該混合物は、該オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能することを可能にする鋳型を含まない工程、および
検出装置で単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物標準を分離し、それにより、該単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物質標準を示すシグナルが創出される工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は分子生物学の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
核酸塩基配列の決定は、研究および診断の両方について重要である。核酸塩基配列を決定する多くの技術は、数年にわたり開発されてきた（例えば、制御された化学分解（Ｍａｘｉｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７４：５６０−５６４（１９７７））、２’３’ジデオキシ鎖終止法（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７（１９７７））。鎖終止配列決定の技術のバリエーションは、単一塩基伸長として公知であり、つまり核酸塩基配列情報が３’末端オリゴヌクレオチドプライマーに隣接する単一塩基部位のみについて必要とされるときに、「ミニ配列決定」（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が実施される。単一塩基伸長の技術は、米国特許第５，８５６，０９２号およびＳｙｖａｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８、６８４−６９２（１９９０）において記載される。単一塩基伸長技術についての問題は、単一塩基伸長産物の同定に関する困難（特に電気泳動において）である。例えば電気泳動装置により検出されるような、単一塩基伸長産物により生じるシグナルのバリエーションは、オリゴヌクレオチドプライマー間の相違により生じるシグナルのバリエーションの結果であり得る。単一塩基伸長産物に関する問題は、多重化単一塩基伸長反応において特に厄介となる。本発明者らは、単一塩基伸長反応産物の同定に関するこれらの問題を改善するための方法、組成物、キットおよびソフトウェアを提供してきた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（本発明の特定の実施形態の要約）
本発明の１つの実施形態は、単一ヌクレオチド塩基によって伸長されたオリゴヌクレオチドを生成する方法である。オリゴヌクレオチドおよび伸長終止ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と混合される。この反応は、単一塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドを生成する。伸長されたオリゴヌクレオチドは、単一塩基伸長反応について、サイズ標準として使用され得る。
【０００４】
本発明の別の実施形態は、異なる単一塩基により伸長されたオリゴヌクレオチドの混合物を生成する方法である。オリゴヌクレオチド、第１伸長終止ヌクレオチド、および第２伸長終止ヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と混合させる。第１および第２の伸長終止ヌクレオチドは、異なるヌクレオチド塩基を含み、そして異なる標識で標識される。異なる伸長終止ヌクレオチド（およびそれ故、伸長されたオリゴヌクレオチド）の同定は、取り込まれた特定の標識を参照して確認され得る。
【０００５】
本発明の別の実施形態は、検出装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７、ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００またはＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００のような自動蛍光検出電気泳動システム）における単一ヌクレオチド塩基伸長反応の反応産物を同定する方法である。オリゴヌクレオチド伸長産物は、オリゴヌクレオチドを伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素（例えば、ターミナルトランスフェラーゼ）と混合することにより生成される。この単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物は、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ミニ配列決定反応物）を用いて生成された単一塩基伸長反応の反応反応物と比較するための標準として使用され得る。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素によって生成された単一塩基オリゴヌクレオチド伸長産物は、検出装置（例えば、電気泳動装置）において、単一塩基伸長産物標準を示すシグナルを生じるように、分離され得る。このシグナルは、鋳型依存性単一塩基伸長反応産物の反応産物によって生じるシグナルと比較するための標準として使用され得る。
【０００６】
本発明の他の実施形態は、本発明の１種以上の方法を実施するためのキットである。対象のキットの実施形態としては、ターミナルトランスフェラーゼおよび１以上の伸長終止ヌクレオチドを備えるキットが挙げられる。伸長終止ヌクレオチドは、蛍光色素のような検出可能の部分を用いて標識され得る。
（定義）
本明細書で使用される場合、用語「ターミナルトランスフェラーゼ」は、有意なＤＮＡポリメラーゼ活性を保有しないが、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をいう。ＤＮＡポリメラーゼ活性に関して使用される場合、用語「有意な」は、オリゴヌクレオチドで開始された鋳型から検出可能な量の鋳型依存性ポリヌクレオチド伸長産物を生成するために十分なレベルで鋳型依存性である、ポリヌクレオチド伸長反応を行なうために、十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を意味する。ターミナルトランスフェラーゼの例として、Ｅ．ｃｏｌｉターミナルトランスフェラーゼおよび子牛胸腺ターミナルトランスフェラーゼなどが挙げられる。ターミナルトランスフェラーゼは、Ａｐｈｏｎｉｘ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐａｎｖｅｒａ、Ｓｉｇｍａ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓおよびＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのような多くの企業から市販されている。
【０００７】
本明細書で使用される場合、用語「ターミナルトランスフェラーゼ活性」は、ヌクレオチド三リン酸（伸長終止ヌクレオチドを含む）が、鋳型非依存方法にて共有結合的にオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に結合される反応の酵素的触媒をいう。従って、オリゴヌクレオチドに対して相補的な鋳型の存在または非存在に関わらず、遊離３’−ＯＨ（または機能的等価物）を有するオリゴヌクレオチド内のターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を、ヌクレオチド三リン酸と混合することによって、１以上のヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの３’プライム末端に付加される。
【０００８】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、文脈によって明確に他のように示されない限り、天然もしくは合成核酸塩基、または両方の組み合わせの重合体を広くいう。捕捉ポリヌクレオチドの骨格は、「ネイティブ」のリン酸ジエステル結合で全体的に構成され得るか、もしくは１以上のホスホロチオネート、ホスホラミダイトまたは他の改変結合のような１以上の結合を含み得る。具体的な例として、ポリヌクレオチドは、アミドインターリンケージを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。本発明と併せて使用され得る、改変された塩基および骨格のさらなる例、ならびにそれらの合成方法は、例えば、米国特許第６，００１，９８３号、Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，１９９０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ９０（４）：５４４−５８４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１（３）：１６５−１８６；Ｅｇｈｏｌｍ  ら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５−１８９７；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３１４３−３１４４、および上記の全てにおいて引用される参考文献に、見出され得る。ポリヌクレオチドを構成し得る一般的な改変核酸塩基または合成核酸塩基として、３−メチルウラシル（ｔｈｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、５，６−ジヒドロウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−トロウラシル、５−ヨードウラシル、６−ジメチルアミノプリン、６−メチルアミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノ−８−ブロモプリン、イノシン、５−メチルシトシン、７−デアザアデニンおよび７−デアザグアノシンが挙げられる。標的核酸を構成し得る改変核酸塩基または合成核酸塩基のさらなる非限定的な例は、Ｆａｓｍａｎ、ＣＲＣ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１９８５、ｐｐ．３８５−３９２；Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ’ｓ  Ｈａｎｄｂｕｎｃｈ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｔｃｓ（これらすべては、このような核酸塩基の構造、特性、および調製を記載する出版物に対する参照を与える）に見出され得る。本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、共有結合的にかまたは非共有結合的にかのいずれかで、オリゴヌクレオチドに連結されたさらなる分子（または原子）を含むオリゴヌクレオチドを含む。結合が、オリゴヌクレオチドが本発明の方法の所定の実施形態において使用されるターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素のための基質として使用されることを防がない場合、これらのさらなる分子（または原子）は、オリゴヌクレオチドの実質的にいかなる部位にも結合し得る。このようなさらなる分子の例として、米国特許第５，５１４，５４３号、同第５，７７７，０９６号、同第５，７０３，０９６号および同第５，４７０，７０５号の目的として記載されるような可動度改変化合物が挙げられる。
【０００９】
本明細書で使用される場合、用語「伸長終止ヌクレオチド」は、酵素的に組み込み可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ（糖部位が、引き続くヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの組み込みを支持しない）に対する言及をいう。典型的なターミネーターは、その核酸塩基がプリン、７−デアザ−プリン、ピリミジン、通常の核酸塩基、またはその一般的なアナログ、および糖部位がペントース（これは、ｄｄＮＴＰのようなさらなる合成を阻止する３’−置換基を含む）である。さらなる合成を阻止する置換基として、アミノ基、デオキシ基、ハロゲン基、アルコキシ基およびアリロキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なターミネーターとして、糖−リン酸エステル部分が、３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース−５−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリロキシリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’三リン酸、２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’−三リン酸、２’、３’−ジデオキシリボース−５’−三リン酸または２’，３’−ジデヒドロリボース−５’−三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
本明細書で使用される場合、用語「検出装置」は、ポリヌクレオチドのサイズ（または重量）に基づいてポリヌクレオチドを分析し得る分析装置をいう。そのような検出装置の例として、電気泳動装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７、ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３１０、ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３１００、およびＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７００のような自動ＤＮＡシークエンサーに含まれる）および質量分析器、ＨＰＬＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
検出装置に関して本明細書で使用される場合、用語「分離される（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）」は、この装置によって、ポリヌクレオチドを示す特定のシグナルを検出することをいう。装置により分離されると言われるポリヌクレオチドは、必ずしもではないが、混合物中の別のポリヌクレオチドから単離または精製され得る。
【００１２】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡポリメラーゼ」は、相補的鋳型にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの３’末端へのヌクレオチド三リン酸付加を温度依存的様式で触媒し得る能力のある酵素をいう。
【００１３】
使用されている用語「標識」は、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される反応においてオリゴヌクレオチドの３’末端へヌクレオチド（保有部分）を付加することを可能にする方法でヌクレオチドへ結合され得る検出可能な部分をいう。検出可能な部分は、この部分の存在を示す特有のシグナルを生じる。検出可能な部分の例として、蛍光色素、発色団、化学発光化合物、精製同位体などであり得る。
【００１４】
用語「単一塩基伸長反応」（または「鋳型依存性単一塩基伸長反応」とも）は、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される反応において３’位置で鋳型または単一塩基にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを伸長させることにより、ポリヌクレオチド鋳型上の特定の位置のヌクレオチド塩基の同定を決定する方法をいう。単一塩基のみによるオリゴヌクレオチドの伸長は（複数の塩基とは反対に）、１以上の伸長終止ヌクレオチドの存在下および伸長可能なヌクレオチド（例えば、２’デオキシヌクレオチド三リン酸）の非存在下において伸長を触媒することにより達成され得る。どの塩基がオリゴヌクレオチドに組み込まれたのか容易に同定するために、伸長終止ヌクレオチドは、差次的に標識され得る。従って、３’位置は、鋳型依存的様式で、単一塩基のみによって伸長される。単一塩基伸長を達成する別の方法は、単一の伸長可能のヌクレオチドを付加することにより、その結果、伸長の欠如したいずれかの伸長が検出される。単一塩基伸長反応の様々な方法の記載は、米国特許第５，８５６，０９２号およびＳｙｖａｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８、６８４−６９２（１９９０）に見出され得る。鋳型依存的様式（「鋳型依存性単一塩基伸長反応産物」いわれる）での単一塩基伸長反応において、単一塩基によって伸長されたオリゴヌクレオチドは、「単一塩基伸長反応産物」と言われる。
【００１５】
（発明の実施形態）
本発明のいくつかの実施形態は、単一ヌクレオチド塩基によって伸長されたオリゴヌクレオチドを生成するターミナルトランスフェラーゼ（およびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する他の酵素）の使用に関する。これらの伸長されたオリゴヌクレオチドは、鋳型依存性単一塩基伸長反応産物と比較するための標準として使用され得る。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素により生成される伸長されたオリゴヌクレオチドは、鋳型依存性単一塩基伸長反応の産物と同一であり得る。
【００１６】
本発明の１つの実施形態は、単一ヌクレオチド塩基により伸長された目的のオリゴヌクレオチドを生成する方法である。目的のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と混合される。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ターミナルトランスフェラーゼであり得る。伸長終止ヌクレオチドは標識されても標識されなくてもよい。１以上の伸長終止ヌクレオチドを使用する場合、異なる鎖終止ヌクレオチド上の異なるヌクレオチド塩基に対応させるため、異なる鎖終止ヌクレオチドは、差次的に標識され得、それにより、オリゴヌクレオチドに組み込まれた鎖終止ヌクレオチド上の塩基を容易に同定する方法を提供する。混合後、反応成分混合物は、所望の量の反応産物の形成を可能とするために十分な時間、インキュベートさせる。適切なインキュベーション時間は、慣用的実験を通して決定され得、選択される特定の酵素、使用される緩衝液、反応成分濃度、反応温度などのパラメーターにより変化し得る。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、単一塩基によって伸長されたオリゴヌクレオチド（このオリゴヌクレオチドは、伸長終止ヌクレオチドの付加前に標識される）を生成する方法である。標識された目的のオリゴヌクレオチドは、１以上の伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と混合される。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ターミナルトランスフェラーゼであり得る。伸長終止ヌクレオチドは、標識されても標識されなくてもよい。１以上の伸長終止ヌクレオチドを使用する場合、異なる鎖終止ヌクレオチド上の異なるヌクレオチド塩基が対応するように、異なる鎖終止ヌクレオチドは、差次的に標識され得、それにより、オリゴヌクレオチドに組み込まれた鎖終止ヌクレオチド上の塩基を容易に同定する方法を提供する。混合後、反応成分混合物は、所望の量の反応産物の形成を可能とするために十分な時間インキュベートされる。適切なインキュベーション時間は、慣用的な実験を通して決定され得、選択される特定の酵素、使用される緩衝液、反応成分濃度、反応温度などのパラメーターにより変化し得る。
【００１８】
本発明の方法により提供される伸長されたオリゴヌクレオチドは、鋳型依存性単一塩基伸長反応の反応産物と比較するための標準として使用され得る。有意義な比較は、鋳型依存性単一塩基伸長反応において生成される同じ反応産物を生成するために、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を使用することにより達成され得る。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を使用する本発明の方法の反応産物は、鋳型依存性単一ヌクレオチド塩基伸長反応の予測された反応産物と同一であるように、容易に設計され得る。例えば、反応産物の同定は、両反応において同じオリゴヌクレオチドおよび同じ鎖終止ヌクレオチドを使用することにより達成され得る。鋳型依存性単一ヌクレオチド塩基伸長反応の反応産物と実質的に同一である標準を使用するのが好ましいが、そのような同一の反応産物を使用する必要はない。
【００１９】
本発明の方法により生成される標準についての必要性の１例は、自動蛍光核酸分析器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１００）で分析される多重化鋳型依存性単一ヌクレオチド伸長反応である。多重化鋳型依存性単一ヌクレオチド伸長反応において、異なる標識された伸長終止ヌクレオチドに対する移動度変化に起因して、特定の反応産物を同定するのは困難であり得る。本発明の方法により生成される反応産物は、この問題を軽減するために使用され得る。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、複数の異なるオリゴヌクレオチドは、１以上の異なる標識された伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と混合される。この反応は、複数の異なる反応産物を生成する。異なる反応産物は、標準を生成するために使用したのと同じオリゴヌクレオチドプライマーを使用する鋳型依存性単一塩基伸長反応において生成された反応産物を同定するための標準として使用され得る。
【００２１】
単一ヌクレオチド塩基により伸長されるオリゴヌクレオチドの形成を触媒するためにターミナルトタンスフェラーゼを使用することに加え、本発明の方法は、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する他の酵素を使用し得る。多くのＤＮＡポリメラーゼは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有することが公知であり、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する本発明の実施形態において、大量の鋳型（オリゴヌクレオチドプライマーに関して規定されるような鋳型）を欠く反応混合物に非鋳型付加（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）を行なうことが所望であるが、必要でない。鋳型を削除することにより、鋳型は付加を導いた。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、単一塩基により伸長されるオリゴヌクレオチドを生成するためのキットを含む。本発明のキットを使用して生成される伸長されたオリゴヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を使用する本発明の方法に従って生成される。本発明のキットは、ターミナルトランスフェラーゼを有する酵素および伸長終止ヌクレオチドを備える。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ターミナルトランスフェラーゼであり得る。キットは、１つ以上の異なる伸長終止ヌクレオチドを備え得る。異なる伸長終止ヌクレオチドは、別個の溶液中に存在し得るか、または単一もしくは複数の溶液中に存在し得る。キットは、１つ以上の伸長終止ヌクレオチドおよびターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を含む単一の溶液をもまた備え得る。鎖伸長終止ヌクレオチドは標識され得る。
【００２３】
本発明のキットの１例は、１つのターミナルトランスフェラーゼおよび４つの異なる鎖終止ヌクレオチド（それぞれのヌクレオチドは、異なるヌクレオチド塩基（４つの標準塩基Ａ，Ｇ，ＣおよびＴ）を含み、そしてそれぞれの塩基は異なる蛍光色素で標識される）を備えるキットである。キットは、本発明の方法の便利な実施を提供するために、単独のパッケージ単位で一緒にまとめられた試薬または一連の試薬（またはそれらの機能的等価物）である。キットは、本発明の方法をしのぐ簡易性または再現性を高めるため、前もって測定された形態の試薬を提供し得る。キットは、本発明の方法を実施するための指示書を備え得る。
【００２４】
上記に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することにより、より理解され得る。実施例は、他の理由の中でもとりわけ、本発明の特定の実施例を説明するため提供され得、本発明を限定するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２５】
（ｄローダミン  ターミナルトランスフェラーゼアッセイ）
１．緩衝液１、緩衝液２およびｄローダミンミックスを氷上で完全に溶解する。
２．ボルテックスし、そして短時間遠心する。
３．氷上で反応混合物を調製する。
【００２６】
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４．反応管をサーモサイクラーに置く。
【００２７】
以下の条件で稼動させる。
【００２８】
３７℃で１５分間
７０℃で１０分間
４℃で保持
５．１μｌのエビのアルカリホスホターゼを加え、完全に混合する。
６．反応管をサーモサイクラーに置く。
【００２９】
次の条件で稼動させる。
【００３０】
３７℃で６０分間
７２℃で１５分間
４℃で保持
７．３７００ＤＮＡ分析器で分析する。
【００３１】
１）１μｌの最終産物を５μｌのホルムアミドで希釈する。
【００３２】
２）１μｌの希釈された最終産物、０．５μｌのＧＳ１２０サイズ標準および８．５μｌのホルムアミドを混合する。
【００３３】
３）次いで試料は、９６ウェルプレートの１つのウェルに移され得、ＳＮａＰｓｈｏｔ産物と共に３７００を稼動させる。
８．最終結果は、それぞれのプライマーに対し４つの有色のピーク（それぞれのピークは、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ産物と同じ（Ｎ＋１  ｄｄＮＴＰ）に対応する）を示すはずである。
（参考としての援用）
本願は、その全体が本明細書中で参照されたすべての出版物、特許、および特許出願を援用する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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