(57)【要約】有効な細胞内抗体（ＩＣＳ）の配列を含むデータベース（ＶＩＤＡデータベース）を作成するステップ、およびＫａｂａｔに従って有効な細胞内抗体の配列をアラインするステップと、特定のアミノ酸が整列された抗体の各々の位置で生じる頻度を決定することステップと、７０％から１００％の範囲内にある頻度閾値（ＬＰまたはコンセンサス閾値）を選択するステップと、特定のアミノ酸の頻度がＬＰ値よりも大きいかまたはそれに等しいアラインメントの位置を同定するステップと、該アラインメントの位置で最高頻度のアミノ酸を同定するステップとを含む細胞内抗体（ＩＣＳ）に関する少なくとも１つのコンセンサス配列を同定する方法。
2004538324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）有効な細胞内抗体（ＩＣＳ）の可変重鎖ドメインおよび／または可変軽鎖ドメインの少なくとも部分（proportion）の配列を含むデータベース（ＶＩＤＡデータベース）を作成するステップ、および有効な細胞内抗体の可変重鎖ドメインまたは可変軽鎖ドメインの配列をアラインするステップと、
ｂ）アラインされた抗体の各々の位置における特定のアミノ酸を生じる頻度を決定するステップと、
ｃ）７０％から１００％までの範囲で頻度閾値（ＬＰまたはコンセンサス閾値）を選択するステップと、
ｄ）特定のアミノ酸の頻度がＬＰ値より大きいかまたはそれに等しいアラインメントの位置を同定するステップと、
ｅ）ｄ）で定義されたアラインメントの位置において最も高頻度のアミノ酸を同定するステップと
を含む、細胞内抗体（ＩＣＳ）のための少なくとも１つのコンセンサス配列を同定する方法。
【請求項２】
ＶＩＤＡデータベースに存在する有効な細胞内抗体の可変重鎖ドメインまたは可変軽鎖ドメインの配列がＫａｂａｔに従ってアラインされている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）異なるＬＰ値に関して異なるＩＣＳを同定するステップと、
ｂ）各々の異なるＩＣＳに関して、その特定のＩＣＳとＶＩＤＡデータベースを作り上げる各々の抗体との間の同一のアミノ酸の数の頻度分布（ＶＩＤＡ分布）を構築するステップと、
ｃ）各々のＩＣＳに関して、Ｋａｂａｔデータベースを作り上げる各々の抗体とその特定のＩＣＳとの間の同一のアミノ酸の数の頻度分布（Ｋａｂａｔ分布）を構築するステップと、
ｄ）ＬＰの値に相当するＶＩＤＡ分布とＫａｂａｔ分布との間の「距離」Ｄを定義するステップと、
ｅ）各々のＬＰ値に関して、ＬＰのその値に相当するＶＩＤＡ分布とＫａｂａｔ分布との間の「距離」Ｄの値を決定するステップと、
ｆ）最適ＩＣＳを、ｄ）で定義された距離Ｄの計算値が最大であるＬＰの値に相当するＩＣＳとして同定するステップと、
を含む、細胞内抗体に関する少なくとも１つの最適コンセンサス配列（最適ＩＣＳ）を同定する方法。
【請求項４】
コンセンサス配列が、
ａ）ＶＨコンセンサス配列に関しては、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置で少なくとも以下のアミノ酸、
Ｓ−２１、Ｃ−２２、Ｓ−２５、Ｇ−２６、Ｍ−３２、Ｗ−３６、Ｐ−４１、Ｌ−４５、Ｅ−４６、Ｄ−７２、Ｑ−８１、Ｌ−８２ｃ、Ｅ−８５、Ｄ−８６、Ａ−８８、Ｙ−９０、Ｃ−９２、Ｗ−１０３、Ｇ−１０４、Ｇ−１０６、Ｔ−１０７、Ｔ−１１０、Ｖ−１１１、Ｓ−１１２
ｂ）ＶＬコンセンサス配列に関しては、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置で少なくとも以下のアミノ酸、
Ｇ−１６、Ｃ−２３、Ｗ−３５、Ｇ−５７、Ｇ−６４、Ｓ−６５、Ｓ−６７、Ｉ−７５、Ｄ−８２、Ｙ−８６、Ｃ−８８、Ｔ−１０２、Ｋ−１０３
を含む、ＶＨおよび／またはＶＬのコンセンサス配列の１つである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
コンセンサス配列が、
ａ）ヒトＶＨに関しては、本質的にはＣｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置の以下のアミノ酸、
Ｑ−１、Ｖ−２、Ｑ−３、Ｌ−４、Ｓ−７、Ｇ−８、Ｇ−９、Ｇ１０、Ｖ−１２、Ｐ−１４、Ｇ−１５、Ｓ−１７、Ｌ−１８、Ｒ−１９、Ｌ−２０、Ｓ−２１、Ｃ−２２、Ａ−２４、Ｓ−２５、Ｇ−２６、Ｆ−２７、Ｔ−２８、Ｆ−２９、Ｙ−３１ａ、Ｍ−３２、Ｗ−３６、Ｒ−３８、Ｑ−３９、Ａ−４０、Ｐ−４１、Ｇ−４２、Ｋ−４３、Ｇ−４４、Ｌ−４５、Ｅ−４６、Ｗ−４７、Ｖ−４８、Ｓ−５２、Ｇ−５４、Ｙ−５８、Ｙ−５９、Ａ−６０、Ｄ−６１、Ｓ−６２、Ｖ−６３、Ｋ−６４、Ｇ−６５、Ｒ−６６、Ｆ−６７、Ｔ−６８、Ｉ−６９、Ｓ−７０、Ｒ−７１、Ｄ−７２、Ｎ−７３、Ｓ−７４、Ｎ−７６、Ｔ−７７、Ｌ−８０、Ｑ８１、Ｍ−８２、Ｌ−８２ｃ、Ｒ−８３、Ａ−８４、Ｅ−８５、Ｄ−８６、Ｔ−８７、Ａ−８８、Ｙ−９０、Ｃ−９２、Ａ−９３、Ｗ−１０３、Ｇ−１０４、Ｇ−１０６、Ｔ−１０７、Ｌ−１０８、Ｖ−１０９、Ｔ−１１０、Ｖ−１１１、Ｓ−１１２、Ｓ−１１３；
ｂ）ヒトＶＬに関しては、本質的にはＣｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置の以下のアミノ酸、
Ｔ−５、Ｐ−８、Ｇ−１６、Ｉ−２１、Ｃ−２３、Ｗ−３５、Ｙ−３６、Ｑ−３７、Ｐ−４０、Ｇ−４１、Ｐ−４４、Ｉ−４８、Ｓ−５６、Ｇ−５７、Ｓ−６３、Ｇ−６４、Ｓ−６５、Ｓ−６７、Ｇ−６８、Ｌ−７３、Ｔ−７４、Ｉ−７５、Ｄ−８２、Ａ−８４、Ｙ−８６、Ｃ−８８、Ｔ−１０２、Ｋ−１０３；
を含む、ヒトＶＨおよび／またはＶＬに関するコンセンサス配列の１つである請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ａ）参照ＶＩＤＡデータベースの抗体の配列と抗体の配列をアラインさせるステップと、
ｂ）参照ＶＩＤＡデータベースの最適ＩＣＳ配列と抗体の配列をアラインさせるステップと、
ｃ）ＬＰ（頻度閾値）の最適値に相当するＶＩＤＡおよびＫＡＢＡＴ分布を構築するステップと、
ｄ）対応する距離Ｄを決定するステップと、
ｅ）抗体の配列とＩＣＳ参照配列との間の識別番号Ｎを決定するステップと、
ｆ）ＤとＶＩＤＡ分布の標準偏差の積とＶＩＤＡ分布の平均値との間の差を算出して、パラメーターＳintraを得るステップと、
ｇ）識別番号ＮがＳintraより大きいかまたはそれに等しい場合、抗体を細胞内抗体として同定するステップと
を含む、抗体が機能的な細胞内抗体であるかどうかを予測する方法。
【請求項７】
ａ）最適ＩＣＳ参照配列を同定するステップと、
ｂ）任意選択的に、最適ＩＣＳにより定義された位置にあるアミノ酸残基、またはこれらの残基のサブセットを、これらが最適ＩＣＳにより同定されたものであるように部位特異的突然変異により修飾するステップと
を含む、細胞内環境で機能する能力を免疫グロブリン分子に付与する方法。
【請求項８】
図１１ａおよび１１ｂに記載され、そして配列番号４１および４２で表される少なくとも１つのコンセンサス配列により記載される少なくとも１つの可変鎖を含む細胞内結合免疫グロブリン分子。
【請求項９】
各々図１１ａおよび１１ｂに記載され、そして配列番号４１および配列番号４２で表される少なくとも１つのコンセンサス配列を含む免疫グロブリン分子の、細胞内環境内におけるリガンドの選択的結合における使用。
【請求項１０】
（ａ）細胞内環境で抗原／リガンドに特異的に結合するＩＡＣＴを用いることが示されている抗体軽鎖または重鎖可変領域の配列を選択およびアラインさせるステップと、
（ｂ）アラインメントの各々の位置で最も高頻度のアミノ酸を同定するステップと
を含む細胞内抗体（ＩＣＳ）に関する少なくとも１つのコンセンサス配列を同定する方法。
【請求項１１】
（ａ）１つまたはそれ以上の抗体の可変重鎖の少なくともproportionを、図５ａで示しかつ少なくとも配列番号３で表されるコンセンサス配列と比較するステップと、
（ｂ）可変軽鎖がステップ（ａ）のコンセンサス配列と少なくとも８５％相同である１つまたはそれ以上の抗体を選択するステップと
を含む細胞内環境内で１つまたはそれ以上のその抗原／リガンドに特異的に結合できる１つまたはそれ以上の抗体を選択するための方法。
【請求項１２】
図５ａで示されかつ配列番号３で表されるコンセンサス配列と８５％の相同性を呈する可変重鎖および少なくとも１つの可変軽鎖を含む細胞内結合免疫グロブリン分子。
【請求項１３】
図５ａで示されかつ配列番号３で表されるコンセンサス配列と少なくとも８５％の同一性を呈する少なくとも１つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）および少なくとも１つの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む免疫グロブリン分子の、細胞内環境内でのリガンドの選択的結合における使用。
【請求項１４】
配列番号３で表されかつ図５ａで示されるコンセンサス配列と少なくとも８５％の同一性を示すＶＨアミノ酸配列および配列番号４１で表されかつ図１１ａで示されるコンセンサス配列により記載されるＶＨ配列からなる群から選択されるいずれかの１つまたはそれ以上の可変重鎖ドメインアミノ酸配列（ＶＨ）を用いて作製されたライブラリー。
【請求項１５】
ａ）Ｋａｂａｔデータベースから細胞内で機能的に安定なものから抗体フレームワークを選択するステップと、
ｂ）各フレームワークに関して、最適ＩＣＳにより定義された配列の位置に存在するアミノ酸を変異誘発すること、それをＩＣＳ配列のその位置にあるアミノ酸残基に変化させるステップと、
ｃ）各々のフレームワークに関して、抗体配列のＣＤＲ領域を無作為化するステップと
を含む細胞内環境内で機能することができる抗体で富化されている抗体ライブラリーを構築する方法。
【請求項１６】
ａ）最適ＩＣＳ配列との最大相同性に基づいて最初の抗体フレームワークを選択するステップと、
ｂ）限定的には各位置で、抗体フレームワークの残りの残基の全てをＫａｂａｔデータベースの抗体のその位置にあるアミノ酸に変化させる変異誘発を行うステップと、
ｃ）各々のフレームワークに関して、抗体配列のＣＤＲ領域を無作為化するステップと
を含む細胞内環境内で機能することができる抗体に富む抗体ライブラリーを構築する方法。
【請求項１７】
発現された免疫グロブリンの実質的な部分が細胞内環境内でリガンドに選択的に結合できる前記免疫グロブリン分子を生成するための請求項１６に記載のライブラリーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内環境で機能できる分子に関する。特に本発明は細胞内環境内で選択的にリガンドに結合できる免疫グロブリン分子の特徴に関する。これらの分子の使用についても記載する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内抗体すなわちイントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）が高等生物の細胞内で抗原認識に機能することが実証されている（Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ａ．およびＢｉｏｃｃａ，Ｓ．（１９９７），Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９７），Ｌａｎｄｅｓ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇにて概説されている）。この相互作用は細胞質、核でまたは分泌系で阻止に成功している細胞タンパク質の機能に影響を及ぼすことができる。この効率は植物バイオテクノロジーにおけるウイルス抵抗性に関して実証されており（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９−４７２（１９９３））、そしてＨＩＶウイルスタンパク質に（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−１５５１（１９９５）；Ｄｕａｎ，Ｌ．およびＰｏｍｅｒａｎｔｚ，Ｒ．Ｊ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４３３−５４３８（１９９４）；Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：６６７−６７３（１９９５）；Ｌｅｖｙ−Ｍｉｎｔｓ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８８２１−８８３２（１９９６））、および腫瘍遺伝子生成物に（Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．、Ｐｉｅｒａｎｄｒｅｉ−Ａｍａｌｄｉ，Ｐ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９７：４２２−４２７（１９９３）；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．、Ｐｉｅｒａｎｄｒｅｉ−Ａｍａｌｄｉ，Ｐ．、Ｃａｍｐｉｏｎｉ，Ｎ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１２：３９６−３９９（１９９４）；Ｃｏｃｈｅｔ，Ｏ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１１７０−１１７６（１９９８））結合する細胞内抗体のいくつかの適用が報告されている。強制された腫瘍遺伝子の発現はしばしば腫瘍細胞において染色体転座の後に生じるので、後者は重要な分野である（Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：１４３−１４９（１９９４））。従ってこれらのタンパク質は、細胞内抗体に結合することにより不活化され得る重要な細胞内治療標的である（Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：１９２−１９４（１９９８））。全ゲノムシークエンシングでの国際的努力により、最終的には何も解っていないタンパク質をコードする非常に多くの可能性のある遺伝子配列が生み出されるであろう。機能的ゲノム科学はこの多量のタンパク質を確認するための研究法であり、そして細胞内抗体の使用は、細胞の内部で抗体に結合することにより直接タンパク質機能をノックアウトするための、概念上は単純な研究法としてこの試みにおける重要な手段であることが保証されている。
【０００３】
従って、それを使用することにより多くのタンパク質標的に何らかの影響力を及ぼすつもりであれば、細胞で機能する抗体を誘導する単純な研究法が必要である。正常な環境では、抗体として分泌するために小胞体への免疫グロブリンの生合成が行われる。しかしながら、抗体が細胞質で発現される場合（ここでは酸化還元条件がＥＲで見出されるものとは異なる）、発現レベルの低下および抗体ドメインの半減期の制限に至るフォールディングおよび安定性の問題が生じる。これらの問題はほとんど細胞質の環境を還元するためであり（Ｈｗａｎｇ，Ｃ．、Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．およびＬｏｄｉｓｈ，Ｈ．Ｆ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１４９６−１５０２（１９９２））、これはフォールディングされたタンパク質の安定性に重要であるＶＨおよびＶＬドメインの鎖内ジスルフィド結合の形成を妨害する（Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．、Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．、Ｔａｆａｎｉ，Ｍ．、Ｐｉｅｒａｎｄｒｅｉ−Ａｍａｌｄｉ，Ｐ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１３：１１１０−１１１５（１９９５）；Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：１１７−１２７（１９９８））。しかしながら、いくつかのｓｃＦｖはこの結合の不在に耐えることが示されており（Ｐｒｏｂａ，Ｋ．、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６５：１６１−１７２（１９９７）；Ｐｒｏｂａ，Ｋ．、Ｗｏｒｎ，Ａ．、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：２４５−２５３（１９９８））、これはおそらく抗体の可変領域の特定の１次配列に依存する。本発明までに、細胞質条件に耐えるこれらの抗体について為された規則または一貫した予測は存在しなかった。さらなる問題は細胞内抗体の発現様式の設計であり、そしてＶＨおよびＶＬセグメント（すなわち抗体結合部位）がＶＨのＣ末端およびＶLのＮ末端でポリペプチドリンカーにより連結されるｓｃＦｖの使用に多くの努力が費やされている（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８））。これは細胞内発現のために最も成功する形態であるが、完全抗体から（例えばモノクローナル抗体から）ｓｃＦｖへの変換である場合、親和性の低下という欠点がある。従って全てのモノクローナル抗体をｓｃＦｖとして作製し、そして細胞において機能を維持できるわけではない。最後に、この細胞内環境において発現される場合、異なるｓｃＦｖフラグメントが明確な溶解特性または凝集性向を有している。
【０００４】
抗体の抗原結合ドメインは２つの別個の領域：重鎖可変ドメイン（ＶH）および軽鎖可変ドメイン（ＶL：これはＶkappaまたはＶlambdaのいずれかでよい）を含む。抗原結合部位自体は６個のポリペプチドループ：ＶHドメインからの３個（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）およびＶLドメインからの３個（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）により形成される。ＶHおよびＶLドメインをコードするＶ遺伝子の多様な１次レパートリーは遺伝子セグメントのコンビナトリアルな再構成により生成される。ＶH遺伝子は３個の遺伝子セグメント、ＶH、Ｄ、およびＪHの組換えにより生成される。ヒトではハロタイプに依存して、およそ５１個の機能的ＶHセグメント（ＣｏｏｋおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７（１９９５））、２５個の機能的Ｄセグメント（Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：６９（１９９７））、および６個の機能的ＪHセグメント（Ｒａｖｅｔｃｈら、Ｃｅｌｌ  ２７：５８３（１９８１））がある。ＶHセグメントはＶHドメイン（Ｈ１およびＨ２）の第１および第２抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方ＶH、Ｄ、およびＪHセグメントは組み合わされてＶHドメイン（Ｈ３）の第３抗原結合ループを形成する。ＶL遺伝子は２個の遺伝子セグメント、ＶLおよびＪLの組換えにより生成される。ヒトではハロタイプに依存して、およそ４０個の機能的ＶHセグメント（ＳｃｈａｅｂｌｅおよびＺａｃｈａｕ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３７４：１００１（１９９３））、３１個の機能的ＶLセグメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２２０（１９９６）；Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：２５０（１９９７））、５個の機能的Ｊkappaセグメント（Ｈｉｅｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６（１９８２））、および４個の機能的Ｊlambdaセグメント（ＶａｓｉｃｅｋおよびＬｅｄｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：６０９（１９９０））がある。ＶLセグメントはＶLドメイン（Ｌ１およびＬ２）の第１および第２抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方ＶLおよびＪLセグメントは組み合わされてＶLドメイン（Ｌ３）の第３抗原結合ループを形成する。この１次レパートリーから選択された抗体は少なくとも中程度の親和性でほとんど全ての抗原と結合するように十分に多様化していると考えられる。高親和性抗体は再構成された遺伝子の「親和性変異」により生成され、この場合改善された結合に基づいて免疫系により点変異が作成され、そして選択される。
【０００５】
抗体の構造および配列の分析により６個の抗原結合ループのうち５個（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）は限られた数の主鎖コンフォメーションまたは限界構造を有していることが示されている（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７（１９８９））。主鎖コンフォメーションは抗原結合ループおよび抗体フレームワークにおける特定のキー位置での（ｉ）抗原結合ループの長さ、および（ｉｉ）特定の残基、または残基の型により決定される。ループの長さおよびキー残基の分析により、大部分のヒト抗体配列によりコードされるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖コンフォメーションを予測することが可能になった（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７９（１９９２）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４６２８（１９９５）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２２０（１９９６））。Ｈ３領域は配列、長さおよび構造に関してさらにもっと多様化している（Ｄセグメントに使用による）が、ループおよび抗体フレームワークにおける特定のキー位置で、特定の残基の長さおよび存在、または残基の型に依存する短いループ鎖に関して限定数の主鎖コンフォメーションをも形成する（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００（１９９６）；Ｓｈｉｒａｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３９９：１（１９９６））。
【０００６】
最近、本発明者は細胞内環境で安定であり、正確にフォールディングされ、そしてその環境内でそのリガンドの選択的結合に関して機能的である免疫グロブリンの選択のための技術を考案した。これは国際公開公報第００／５４０５７号に記載されている。この研究法では、抗体・抗原相互作用方法でベイトとしてＤＮＡ結合ドメインに連結された抗原、およびプレイとして転写活性化ドメインに連結されたｓｃＦｖを使用した。２つの特異的相互作用が選択可能なレポーター遺伝子の転写活性化を促進する。最初のインビトロ結合ステップを実施し、このステップで免疫グロブリン分子のレパートリーへの結合に関して抗原を検定する。インビトロアッセイでそのリガンドに結合することが見出された免疫グロブリンを、次いで細胞内環境で、一般的には細胞質環境内で選択された抗原に結合するその能力に関して検定する。
【０００７】
本発明者は、インビトロで結合する有意数のこれらの免疫グロブリンがしばしばインビボでそのリガンドに特異的に結合できないことを見出した。従って、当分野では所与の抗体が細胞内環境で機能するかどうかを予測するための方法および手順に関する必要性が依然存在する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は還元性細胞内環境で細胞内抗体として機能できる安定した抗体の推定的同定、および細胞内抗体で富化されたライブラリーの設計のための方法に関する。特に本発明は、細胞内抗体ならびに、細胞内抗体で富化されたライブラリーの設計および構築のためのこれらのＩＣＳコンセンサス配列の使用を特徴とする細胞内抗体に関するコンセンサス配列（イントラボディーコンセンサス配列、ＩＣＳ）について記載する。
【０００９】
抗体のＩＣＳ配列の存在により、ＩＡＣＴまたは別の系での細胞内発現を用いる実験的選択を行う必要がなく、実験労力のかなり節減して機能的な細胞内抗体のその特性を診断できる。ＩＣＳ配列を目的の抗体の最適化ならびに細胞内抗体で富化されたライブラリーの設計および構築に用いることができる。
【００１０】
従って本発明の第１の態様は、
ａ）有効な細胞内抗体の可変重鎖ドメインおよび／または可変軽鎖ドメインの少なくとも１つの部分（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）の配列を含むデータベース（ＶＩＤＡデータベース）を作成すること、および有効な細胞内抗体の可変重鎖ドメインまたは可変軽鎖ドメインの配列をアラインさせるステップと、
ｂ）アラインされた抗体の各々の位置で特定のアミノ酸を生じる頻度を決定するステップと、
ｃ）７０％から１００％までの範囲で頻度閾値（ＬＰまたはコンセンサス閾値）を選択するステップと、
ｄ）そこでの特定のアミノ酸の頻度がＬＰ値より大きいかまたはそれに等しいアラインメントの位置を同定するステップと、
ｅ）ｄ）で定義されたアラインメントの位置において最も高頻度のアミノ酸を同定するステップと
を含む細胞内抗体（ＩＣＳ）のための少なくとも１個のコンセンサス配列を同定する方法を提供する。
【００１１】
本発明の前記の態様に従って、ＶＩＤＡデータベースに存在する有効な細胞内抗体の可変重鎖ドメインまたは可変軽鎖ドメインの配列がＫａｂａｔに従ってアラインされるのが有利である。
【００１２】
本明細書で用いる「データベース」なる用語はいずれかのデータの収集を意味する。当業者にはこのようなデータを保存できる多くの方法があることが理解されよう。適当な方法には、非限定例としては、電気形態および書面形態での保存などがある。当業者にはその他の適当なデータ保存の方法が認識されよう。
【００１３】
本発明に従って、「作成する」なる用語は製造または生成を意味する。
【００１４】
本明細書で定義するＶＩＤＡデータベースはＩＡＣＴで選択された抗体の全ての配列、特に本明細書で記載する抗ＴＡＵ抗体の配列を含有する。加えて、これは文献上に報告された、細胞内環境で１つまたはそれ以上の（複数の）抗原／リガンドに特異的に結合するこれらの抗体を含む。
【００１５】
「（アミノ酸）配列をアラインさせる」とは、配列間で同一または類似しているこれらのアミノ酸残基が明確になるように、（アミノ酸）配列を配置するかまたは列に並べることを意味する。従って本明細書で定義する「配列をアラインさせる」により２つまたはそれ以上のアミノ酸配列間の残基類似性および相違性の比較が単純および効率的になる。Ｋａｂａｔ、「免疫学的興味のあるタンパク質の配列」アメリカ保健福祉省で示されるように、当業者に公知のＫａｂａｔナンバリング系を用いて配列をアラインさせるのが有利である。
【００１６】
Ｋａｂａｔデータベース全体にわたって参照されるが、抗体配列の別のデータベースを代替としてまたはこのデータベースに加えて用いることができることを理解すべきである。
【００１７】
本明細書で用いる「頻度」なる用語はアラインされた配列の残基位置の各々で所与のアミノ酸を生じる頻度（すなわち回数）を表す。頻度％とは配列におけるいずれか特定の残基位置で同一のアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、そして比較されるその位置でのアミノ酸の全数（すなわち比較される配列の全数）のパーセンテージとして算出する。従って、例えば１０個のアミノ酸配列が比較され、そしてアミノ酸残基番号１で、１０個の残基のうち７個がアルギニンである場合、ついでその位置でのアルギニンの頻度パーセンテージは７０％である。
【００１８】
本明細書で用いる「頻度閾値」または「ＬＰ」値とは、アラインされた配列内の各アミノ酸位置に関して本明細書で定義する、選択された最低頻度％を意味する。選択された頻度閾値または（ＬＰ）値はアラインされた配列内の各々および全ての残基に関して同一であるのが有利である。「頻度閾値」の選択はその位置でのコンセンサス残基の割り当てに関して各残基位置でカットオフ点を作成する。すなわち、任意の所与の位置での１つまたはそれ以上の同一のアミノ酸の頻度％をその位置での「頻度閾値」または（ＬＰ）値と比較し、そして任意の所与の残基位置での１つまたはそれ以上の同一または類似のアミノ酸の頻度％が少なくとも選択された頻度閾値と同一である場合、次いで残基をその残基位置に関する「コンセンサス残基」に指定する。
【００１９】
当業者には、それを「コンセンサス残基」に、従ってコンセンサス配列の一部に指定するために選択された「頻度閾値」または「ＬＰ値」が高いほど、次いでいずれかの所与の残基位置で所与の残基に関して必要な「頻度％」（本明細書で定義されるように）が大きくなることは理解されよう。
【００２０】
ＶＩＤＡに含まれる抗体配列の分析により、ヒトおよびネズミの細胞内抗体で保存されるアミノ酸残基のサブセットを同定することが可能になる。この残基のサブセットをＩＣＳ（イントラボディーコンセンサス配列）と称し、そしてそれにより各種に関するＶＬ鎖のＩＣＳおよびＶＨ鎖のＩＣＳ（ヒトＩＣＳ−ＶＨ、ヒトＩＣＳ−ＶＬ、マウスＩＣＳ−ＶＨ、マウスＩＣＳ−ＶＬ）を定義することが可能になる。同一鎖に関する異なる種のＩＣＳの比較分析により共通のアミノ酸、従ってＩＣＳ−ＶＨｈｘｍ（ヒトマウス）およびＩＣＳ−ＶＬｈｘｍ、（すなわち最小）一般ＩＣＳを同定することが可能になった。明らかに、ＩＣＳはＶＩＤＡデータベースに存在する全ての抗体間の相同性の閾値に依存して異なる（絶対コンセンサス、９０％コンセンサス等）。
【００２１】
本発明はまた各々の参照群に関する最適ＩＣＳを見出す手順をも提供する。最適ＩＣＳは以下に記載する、ＶＩＤＡデータベースの抗体間の相同性の閾値を繰り返し変化させ、そして最適相同性閾値を定義するアルゴリズムで得られる。
【００２２】
従って、本発明の別の態様では、
ａ）異なるＬＰ値に関して異なるＩＣＳを同定するステップと、
ｂ）該ＩＣＳの各々に関して、その特定のＩＣＳとＶＩＤＡデータベースを作り上げる各々の抗体との間の同一のアミノ酸の数の頻度分布（ＶＩＤＡ分布）を構築するステップと、
ｃ）各々のＩＣＳに関して、その特定のＩＣＳとＫａｂａｔデータベースを作り上げる各々の抗体との間の同一のアミノ酸の数の頻度分布（Ｋａｂａｔ分布）を構築するステップと、
ｄ）ＬＰの値に相当するＶＩＤＡ分布とＫａｂａｔ分布との間の「距離」Ｄを定義するステップと、
ｅ）各々のＬＰ値に関して、ＬＰのその値に相当するＶＩＤＡ分布とＫａｂａｔ分布との間の「距離」Ｄの値を決定するステップと、
ｆ）最適ＩＣＳを、ｄ）で定義された距離Ｄの計算値が最大であるＬＰの値に相当するＩＣＳとして同定するステップと
を含む細胞内抗体に関する少なくとも１つの最適コンセンサス配列（最適ＩＣＳ）を同定する方法を提供する。
【００２３】
本発明の前記の態様に従って、本明細書に記載する１つまたはそれ以上の方法に従ってＩＣＳを作製するのが有利である。
【００２４】
ＶＩＤＡに含まれる抗体配列の分析により、ヒトおよびネズミの細胞内抗体で保存されるアミノ酸残基のサブセットを同定することが可能になる。この残基のサブセットをＩＣＳ（イントラボディーコンセンサス配列）と称し、そしてそれにより各種に関するＶＬ鎖のＩＣＳおよびＶＨ鎖のＩＣＳ（ヒトＩＣＳ−ＶＨ、ヒトＩＣＳ−ＶＬ、マウスＩＣＳ−ＶＨ、マウスＩＣＳ−ＶＬ）を定義することが可能になる。同一鎖に関する異なる種のＩＣＳの比較分析により共通のアミノ酸、従ってＩＣＳ−ＶＨｈｘｍ（ヒトマウス）およびＩＣＳ−ＶＬｈｘｍ、（すなわち最小）一般ＩＣＳを同定することが可能になった。明らかに、ＩＣＳはＶＩＤＡデータベースに存在する全ての抗体間の相同性の閾値に依存して異なり得る（完全コンセンサス、９０％コンセンサス等）。
【００２５】
各々の参照群に関する最適ＩＣＳを見出す手順に関して記載する。最適ＩＣＳは以下に記載する、ＶＩＤＡデータベースの抗体間の相同性の閾値を繰り返し変化させ、そして最適相同性閾値を定義するアルゴリズムで得られる。
【００２６】
従って、細胞内抗体は前記で定義する最適ＩＣＳを、該ＩＣＳが定義される鎖の位置で有する抗体として定義されるが、一方別の位置に関する仮説は作られておらず、強制も置かれていない。
【００２７】
ＩＣＳとＫａｂａｔコンセンサス配列との間の比較（同一群に関して）により、ＩＣＳ自体が定義される鎖のその位置で、ＩＣＳがＫａｂａｔコンセンサスに高度に相同性である（が完全に同一ではない）ことが示される。
【００２８】
機能的な細胞内抗体であるいずれかの所与の抗体の特性を予測するためにＩＣＳを用いる。特に、記載した分析により、Ｋａｂａｔデータベースに存在する抗体の約１０％のパーセンテージが細胞内抗体であると予測される。
【００２９】
機能的な細胞内抗体で大いに富化された抗体ライブラリーを構築するためにＩＣＳを用いることができる。ライブラリーはＩＣＳに基づいてｓｃＦｖフラグメントを発現するのが好ましい。
【００３０】
本発明の前記の態様に従って、ＩＣＳなる用語は「細胞内のコンセンサス配列」を意味し、そして細胞内環境内でそのリガンドに結合できる免疫グロブリン分子に関するコンセンサス配列である。本明細書で記載するＩＣＳを本発明の方法を用いて作製する。当業者には、アミノ酸残基および各ＩＣＳを含むその配列は、ＩＣＳを作製するために比較される配列の数、比較される配列の特性、および選択される頻度閾値に依存することが理解されよう。
【００３１】
本明細書で記載する「ＶＩＤＡ」とは「有効な細胞内結合抗体」を意味する。すなわち、これは機能的研究により細胞内環境内で１つまたはそれ以上のリガンドに特異的に結合することが示されている抗体を意味する。本明細書で定義するＶＩＤＡは、本発明者により細胞内環境内で機能することが示されているこれらの抗体、ならびに細胞内環境内で１つまたはそれ以上のリガンドに特異的に結合するとして文献に報告されているこれらの抗体分子を含む。
【００３２】
従って、「ＶＩＤＡデータベース」は本発明者により細胞内環境内で機能することが示されているこれらの抗体、および細胞内環境内で１つまたはそれ以上のリガンドに特異的に結合するとして文献に報告されているこれらの抗体分子の配列を含む。
【００３３】
本明細書で用いる「頻度分布」なる用語は２つまたはそれ以上の特性間の関係の提示を意味する。提示は画像による提示であるのが有利である。具体的には、特定のＩＣＳの「ＶＩＤＡ分布」は、特定のＩＣＳと本明細書で定義するＶＩＤＡデータベースを作り上げる各々の抗体との間の同一アミノ酸の数間の関係の提示を意味する。
【００３４】
同様に特定のＩＣＳの「Ｋａｂａｔ」分布なる用語は好ましくは特定のＩＣＳとＫａｂａｔデータベースを作り上げる各々の抗体との間の同一アミノ酸の数の画像による提示を意味する。
【００３５】
本明細書で定義する「Ｄ距離」とは、画像により定義された、本明細書で定義するように所与のＶＩＤＡ（有効な細胞内抗体）分布値と所与のＬＰ値（閾値）に関する所与のＫａｂａｔ分布値との間のその距離である。
【００３６】
本発明に従って、「最適ＩＣＳ」なる用語は本明細書で定義するように算出された距離Ｄが最大であるＬＰ（閾値）に相当するＩＣＳ（細胞内結合抗体コンセンサス配列）を意味する。
【００３７】
コンセンサス配列は、
ａ）ＶＨコンセンサス配列に関しては、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９１０−９１７（１９８７））に従って示された位置で少なくとも以下のアミノ酸、
Ｓ−２１、Ｃ−２２、Ｓ−２５、Ｇ−２６、Ｍ−３２、Ｗ−３６、Ｐ−４１、Ｌ−４５、Ｅ−４６、Ｄ−７２、Ｑ−８１、Ｌ−８２ｃ、Ｅ−８５、Ｄ−８６、Ａ−８８、Ｙ−９０、Ｃ−９２、Ｗ−１０３、Ｇ−１０４、Ｇ−１０６、Ｔ−１０７、Ｔ−１１０、Ｖ−１１１、Ｓ−１１２；
ｂ）ＶＬコンセンサス配列に関しては、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置で少なくとも以下のアミノ酸、
Ｇ−１６、Ｃ−２３、Ｗ−３５、Ｇ−５７、Ｇ−６４、Ｓ−６５、Ｓ−６７、Ｉ−７５、Ｄ−８２、Ｙ−８６、Ｃ−８８、Ｔ−１０２、Ｋ−１０３；
を含むＶＨおよび／またはＶＬの１つのコンセンサス配列であるのが有利である。
【００３８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、コンセンサス配列はヒトＶＨに関するものであり、そしてＣｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置で少なくとも以下のアミノ酸を本質的に含む。
Ｑ−１、Ｖ−２、Ｑ−３、Ｌ−４、Ｓ−７、Ｇ−８、Ｇ−９、Ｇ１０、Ｖ−１２、Ｐ−１４、Ｇ−１５、Ｓ−１７、Ｌ−１８、Ｒ−１９、Ｌ−２０、Ｓ−２１、Ｃ−２２、Ａ−２４、Ｓ−２５、Ｇ−２６、Ｆ−２７、Ｔ−２８、Ｆ−２９、Ｙ−３１ａ、Ｍ−３２、Ｗ−３６、Ｒ−３８、Ｑ−３９、Ａ−４０、Ｐ−４１、Ｇ−４２、Ｋ−４３、Ｇ−４４、Ｌ−４５、Ｅ−４６、Ｗ−４７、Ｖ−４８、Ｓ−５２、Ｇ−５４、Ｙ−５８、Ｙ−５９、Ａ−６０、Ｄ−６１、Ｓ−６２、Ｖ−６３、Ｋ−６４、Ｇ−６５、Ｒ−６６、Ｆ−６７、Ｔ−６８、Ｉ−６９、Ｓ−７０、Ｒ−７１、Ｄ−７２、Ｎ−７３、Ｓ−７４、Ｎ−７６、Ｔ−７７、Ｌ−８０、Ｑ８１、Ｍ−８２、Ｌ−８２ｃ、Ｒ−８３、Ａ−８４、Ｅ−８５、Ｄ−８６、Ｔ−８７、Ａ−８８、Ｙ−９０、Ｃ−９２、Ａ−９３、Ｗ−１０３、Ｇ−１０４、Ｇ−１０６、Ｔ−１０７、Ｌ−１０８、Ｖ−１０９、Ｔ−１１０、Ｖ−１１１、Ｓ−１１２、Ｓ−１１３。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、コンセンサス配列はヒトＶＬを提示し、そしてＣｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置で以下のアミノ酸を本質的に含む。
Ｔ−５、Ｐ−８、Ｇ−１６、Ｉ−２１、Ｃ−２３、Ｗ−３５、Ｙ−３６、Ｑ−３７、Ｐ−４０、Ｇ−４１、Ｐ−４４、Ｉ−４８、Ｓ−５６、Ｇ−５７、Ｓ−６３、Ｇ−６４、Ｓ−６５、Ｓ−６７、Ｇ−６８、Ｌ−７３、Ｔ−７４、Ｉ−７５、Ｄ−８２、Ａ−８４、Ｙ−８６、Ｃ−８８、Ｔ−１０２、Ｋ−１０３。
【００４０】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態では、本発明の免疫グロブリンはＣｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置で以下のアミノ酸、
Ｑ−１、Ｖ−２、Ｑ−３、Ｌ−４、Ｓ−７、Ｇ−８、Ｇ−９、Ｇ１０、Ｖ−１２、Ｐ−１４、Ｇ−１５、Ｓ−１７、Ｌ−１８、Ｒ−１９、Ｌ−２０、Ｓ−２１、Ｃ−２２、Ａ−２４、Ｓ−２５、Ｇ−２６、Ｆ−２７、Ｔ−２８、Ｆ−２９、Ｙ−３１ａ、Ｍ−３２、Ｗ−３６、Ｒ−３８、Ｑ−３９、Ａ−４０、Ｐ−４１、Ｇ−４２、Ｋ−４３、Ｇ−４４、Ｌ−４５、Ｅ−４６、Ｗ−４７、Ｖ−４８、Ｓ−５２、Ｇ−５４、Ｙ−５８、Ｙ−５９、Ａ−６０、Ｄ−６１、Ｓ−６２、Ｖ−６３、Ｋ−６４、Ｇ−６５、Ｒ−６６、Ｆ−６７、Ｔ−６８、Ｉ−６９、Ｓ−７０、Ｒ−７１、Ｄ−７２、Ｎ−７３、Ｓ−７４、Ｎ−７６、Ｔ−７７、Ｌ−８０、Ｑ８１、Ｍ−８２、Ｌ−８２ｃ、Ｒ−８３、Ａ−８４、Ｅ−８５、Ｄ−８６、Ｔ−８７、Ａ−８８、Ｙ−９０、Ｃ−９２、Ａ−９３、Ｗ−１０３、Ｇ−１０４、Ｇ−１０６、Ｔ−１０７、Ｌ−１０８、Ｖ−１０９、Ｔ−１１０、Ｖ−１１１、Ｓ−１１２、Ｓ−１１３；
を含むコンセンサス配列、およびＣｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置で以下のアミノ酸、
Ｔ−５、Ｐ−８、Ｇ−１６、Ｉ−２１、Ｃ−２３、Ｗ−３５、Ｙ−３６、Ｑ−３７、Ｐ−４０、Ｇ−４１、Ｐ−４４、Ｉ−４８、Ｓ−５６、Ｇ−５７、Ｓ−６３、Ｇ−６４、Ｓ−６５、Ｓ−６７、Ｇ−６８、Ｌ−７３、Ｔ−７４、Ｉ−７５、Ｄ−８２、Ａ−８４、Ｙ−８６、Ｃ−８８、Ｔ−１０２、Ｋ−１０３；
を含む可変軽鎖を含む。
【００４１】
別の態様では本発明は各々図１１ａおよび１１ｂに記載され、および配列番号４１および４２で表される少なくとも１つのコンセンサス配列により記載される少なくとも１つの可変鎖を含む細胞内結合免疫グロブリン分子を提供する。
【００４２】
本発明の免疫グロブリン分子は、
（ａ）重鎖に関しては、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９１０−９１７（１９８７））に従って示された位置で少なくとも以下のアミノ酸、
Ｓ−２１、Ｃ−２２、Ｓ−２５、Ｇ−２６、Ｍ−３２、Ｗ−３６、Ｐ−４１、Ｌ−４５、Ｅ−４６、Ｄ−７２、Ｑ８１、Ｌ−８２ｃ、Ｅ−８５、Ｄ−８６、Ａ−８８、Ｙ−９０、Ｃ−９２、Ｗ−１０３、Ｇ−１０４、Ｇ−１０６、Ｔ−１０７、Ｔ−１１０、Ｖ−１１１、Ｓ−１１２；および
（ｂ）軽鎖に関しては、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに従って示された位置で少なくとも以下のアミノ酸、
Ｇ−１６、Ｃ−２３、Ｗ−３５、Ｇ−５７、Ｇ−６４、Ｓ−６５、Ｓ−６７、Ｉ−７５、Ｄ−８２、Ｙ−８６、Ｃ−８８、Ｔ−１０２、Ｋ−１０３；
を含むのが有利である。
【００４３】
さらに別の態様では、本発明は各々図１１ａおよび／または１１ｂに記載され、そして配列番号４１および配列番号４２で表される少なくとも１つのコンセンサス配列を含む免疫グロブリン分子の、細胞内環境内でのリガンドの選択的結合における使用を提供する。
【００４４】
本明細書で定義する（細胞内環境内でのリガンドの）「選択的結合」なる用語は免疫グロブリンとリガンドとの間の相互作用が特異的である、すなわち、多くの分子が免疫グロブリンに提示される事象において、これらの提示された分子の１つまたはいくつかにのみ後者が結合することを意味する。免疫グロブリン・リガンド相互作用は高親和性であるのが有利である。免疫グロブリンとリガンドとの間の相互作用は非共有結合性相互作用、例えば水素結合およびファンデルワース相互作用により媒介される。概して、相互作用は免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との間の間隙で生じる。
【００４５】
さらに別の態様では、本発明は、
ａ）抗体の配列を参照ＶＩＤＡデータベースの抗体の配列とアラインさせるステップと、
ｂ）参照ＶＩＤＡデータベースの最適ＩＣＳ配列を有する抗体の配列をアラインさせるステップと、
ｃ）ＬＰ（頻度閾値）の最適値に相当するＶＩＤＡおよびＫＡＢＡＴ分布を構築するステップと、
ｄ）対応する距離Ｄを決定するステップと、
ｅ）抗体の配列とＩＣＳ参照配列との間の識別番号Ｎを決定するステップと、
ｆ）ＶＩＤＡ分布の平均値と、ＤとＶＩＤＡ分布の標準偏差との積との間の差を算出して、パラメーターＳintraを得るステップと、
ｇ）識別番号ＮがＳintraより大きいかまたはそれに等しい場合、抗体を細胞内抗体として同定するステップと
を含む、抗体が機能的な細胞内抗体であるかどうかを予測するための方法を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、
ａ）最適ＩＣＳ参照配列を同定するステップと、
ｂ）場合によっては、最適ＩＣＳにより定義された位置にあるアミノ酸残基、またはこれらの残基のサブセットを、これらが最適ＩＣＳにより同定されたものであるように部位特異的突然変異により修飾してもよいステップと
を含む、細胞内環境内で機能する能力を免疫グロブリン分子に付与する方法を提供する。
【００４７】
本発明のこの態様に従って、アラインステップを本明細書に記載するように実施するのが有利である。ＩＣＳ作製を本明細書に記載する方法を用いて実施するのが有利である。
【００４８】
本発明者はデータベースに含まれるように計画された全ての抗体に機能的結合アッセイ（すなわち酵母２ハイブリッド基盤のＩＡＣＴアッセイ）を実施することにより、およびこのような環境で抗原に特異的に結合するＩＡＣＴを用いることが見出されているこれらの抗体のみを用いることにより、次いで抗体可変ドメインに関するより完全な（複数の）コンセンサス配列を得ることができることを見出した。
【００４９】
従って、別の態様では、本発明は、
（ａ）細胞内環境内で抗原／リガンドに特異的に結合するＩＡＣＴを用いることが示されている抗体軽鎖または重鎖可変領域の配列を選択およびアラインさせるステップと、
（ｂ）アラインメントの各々の位置で最も高頻度のアミノ酸を同定するステップと
を含む細胞内抗体（ＩＣＳ）に関する少なくとも１つのコンセンサス配列を同定する方法を提供する。
【００５０】
本発明のこの態様の方法を用いて同定した（複数の）コンセンサス配列は図５ａで記載し、そして配列番号３および４で示されるものであるのが有利である。ＶＩＤＡデータベース（これは細胞内環境内でそのリガンド／抗原に結合すると文献で報告されているこれらの抗体を含み、そしてＩＡＣＴにより、そうすることが示されている必要性はない）を用いる前記で列挙した研究法を用いて同定した（複数の）コンセンサス配列は図１１ａおよび１１ｂで示され、そして配列番号４１および４２のように同定されたあまり完全ではないコンセンサス配列内に存在する全てのアミノ酸を共有する。この研究法の詳細は実施例１０の試験計画Ａに示されている。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は、
ａ）１つまたはそれ以上の抗体の可変重鎖の少なくとも一部を、少なくとも図５ａで記載され、そして配列番号３で示されるコンセンサス配列と比較するステップと、
ｂ）その可変重鎖がステップ（ａ）のコンセンサス配列と少なくとも８５％同一である１つまたはそれ以上の抗体を選択するステップと
を含む細胞内環境内で１つまたはそれ以上のその抗原／リガンドに特異的に結合できる１つまたはそれ以上の抗体を選択するための方法を提供する。
【００５２】
なおさらに別の態様では、本発明は、
ａ）１つまたはそれ以上の抗体の可変軽鎖の少なくとも一部を、少なくとも図５ａで記載され、そして配列番号４で示されるコンセンサス配列と比較するステップと、
ｂ）その可変軽鎖がステップ（ａ）のコンセンサス配列と少なくとも８５％同一である１つまたはそれ以上の抗体を選択するステップと
を含む細胞内環境内で１つまたはそれ以上のその抗原／リガンドに特異的に結合できる１つまたはそれ以上の抗体を選択するための方法を提供する。
【００５３】
本発明の前記の態様に従って、細胞内環境が哺乳動物細胞内環境であるのが有利である。さらに哺乳動物がヒトであるのが有利である。
【００５４】
選択された１つまたはそれ以上の抗体がその１つまたはそれ以上の抗原に特異的に結合するかどうかを試験するために別のインビボ結合ステップ（ｃ）を実施するのが有利である。このインビボ結合ステップを本明細書および国際公開公報第０００／５４０５７号に詳記するＩＡＣ技術を用いて実施するのが有利である。
【００５５】
本発明の上記態様に従って、免疫グロブリンは配列番号３により同定され、そして図５で示されるＶＨコンセンサス配列と少なくとも８６％の同一性を示すＶHアミノ酸配列を有するのが有利である。特に好ましい態様では、免疫グロブリン分子は少なくとも８７％の同一性を示す。免疫グロブリンは配列番号３により同定されたＶＨコンセンサス配列と少なくとも８８％の同一性、８９％の同一性、９０％の同一性、または９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８％の同一性を示すＶＨアミノ酸配列を有するのが有利である。免疫グロブリンが配列番号３により同定され、そして図５で示されるＶＨコンセンサスと少なくとも９９％の同一性を示すＶＨアミノ酸配列を有するのが最も有利である。最も好ましい実施形態では、これは配列番号３により表され、そして図５で示されるＶＨコンセンサス配列と少なくとも１００％の同一性を示す。
【００５６】
本発明の前記の態様の好ましい実施形態では、選択のために抗体の可変軽鎖および可変重鎖の両方を前述したコンセンサス配列と比較する。
【００５７】
当業者には、細胞内結合能力が決定される抗体の可変軽鎖および／または可変重鎖の、図５ａで示される１つまたはそれ以上のコンセンサス配列に対する同一性の程度が高いほど、次いで問題の抗体が細胞内環境内でそのリガンドに特異的に結合できる可能性が高くなることは理解されよう。加えてＩＡＣＴ基盤の結合ステップにより、問題の抗体が哺乳動物の細胞内環境内でそのリガンドに選択的に結合できるかどうかに関するさらなる手引きが提供される。
【００５８】
さらに別の態様では、本発明は図５ａで示され、そして配列番号３で表されるコンセンサス配列に８５％の相同性を呈する可変重鎖および少なくとも１つの可変軽鎖を含む細胞内結合免疫グロブリン分子を提供する。
【００５９】
本発明の前記の態様に従って、免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖のＶＨＩＩＩサブグループのメンバーである重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むのが有利である。
【００６０】
さらに別の態様では、本発明は図５ａで示され、そして配列番号４で表されるコンセンサス配列に８５％の相同性を呈する可変軽鎖および少なくとも１つの可変重鎖を含む細胞内結合免疫グロブリン分子を提供する。
【００６１】
さらに別の態様では、本発明は図５ａで示され、そして配列番号３で表されるコンセンサス配列と少なくとも８５％の同一性を呈する少なくとも１つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）および少なくとも１つの軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む免疫グロブリン分子の、細胞内環境内でのリガンドの選択的結合における使用を提供する。
【００６２】
本発明の前記の態様の好ましい実施形態では、その使用は、免疫グロブリン重鎖のＶＨＩＩＩサブグループのメンバーである少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む免疫グロブリン分子の、細胞内環境内でのリガンドの選択的結合における使用である。
【００６３】
本発明の前記の態様のさらに好ましい実施形態では、その使用は、細胞内環境内でのリガンドの選択的結合における、免疫グロブリン軽鎖のＶκＩサブグループのメンバーである少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（ＶL）を含む免疫グロブリン分子の使用である。
【００６４】
本発明者は細胞内抗体に関するコンセンサス配列の知識を用いて、次いで細胞内環境内で機能できる抗体分子またはそのフラグメントで富化されたライブラリーを作製できることを認識している。
【００６５】
従って別の態様では、本発明は、配列番号３で表され、そして図５ａで示されるコンセンサス配列と少なくとも８５％の同一性を示すＶＨアミノ酸配列；配列番号４１で表され、そして図１１ａで示されるコンセンサス配列により記載されるＶＨ配列；からなる群から選択されるいずれかの１つまたはそれ以上の可変重鎖ドメインアミノ酸配列（ＶＨ）を用いて作製されたライブラリーを提供する。
【００６６】
本発明の前記の態様に従って、免疫グロブリンが配列番号３により同定され、そして図５で示されるＶＨコンセンサス配列と少なくとも８６％の同一性を示すＶHアミノ酸配列を有しているのが有利である。特に好ましい実施形態では、免疫グロブリン分子は少なくとも８７％の同一性を示す。免疫グロブリンが配列番号３により同定されるＶＨコンセンサス配列と少なくとも８８％の同一性、８９％の同一性、９０％の同一性、または９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８％の同一性を示すＶＨアミノ酸配列を有するのが有利である。免疫グロブリンが配列番号３により同定され、そして図５で示されるＶＨコンセンサスと少なくとも９９％の同一性を示すＶＨアミノ酸配列を有するのが最も有利である。最も好ましい実施形態では、これは配列番号３により表され、そして図５で示されるＶＨコンセンサス配列と少なくとも１００％の同一性を示す。
【００６７】
従って、別の態様では本発明は、
ａ）Ｋａｂａｔデータベースから細胞内で機能的に安定なものから抗体フレームワークを選択するステップと、
ｂ）各フレームワークに関して、本発明による最適ＩＣＳにより定義された配列の位置に存在するアミノ酸を変異誘発すること、それをＩＣＳ配列のその位置にあるアミノ酸残基に変化させるステップと、
ｃ）各々のフレームワークに関して、抗体配列のＣＤＲ領域を無作為化するステップと
を含む、細胞内環境内で機能することができる抗体で富化されている抗体ライブラリーの構築のための方法を提供する。
【００６８】
本発明の上記の態様に従って、「細胞内で機能的に安定な」（抗体）なる用語は細胞内環境内で機能することができるその抗体、すなわち特異的抗原結合および有利には免疫応答の誘導に関して安定であるその抗体を意味する。
【００６９】
本明細書で記載する（１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を）「変異誘発する」なる用語は１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の変化を意味する。このような変化には置換、欠失、転換または挿入などがある。有利には、本明細書で記載する「変異誘発する」とは置換を含めることである。アミノ酸配列を「変異誘発する」ための方法は当業者に周知であり、そして本明細書にて記載している。
【００７０】
さらに、本発明に従って、（１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域を）「無作為化する」なる用語はアミノ酸挿入、共通のフレームワーク領域を共有する免疫グロブリン分子のレパートリーを作成するように１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域を含み、そしてライブラリー内に別の免疫グロブリン分子として同一アミノ酸構成成分を含むＣＤＲ領域を含むが、ここで少なくともこれらの残基のいくつかの同一性が個々の免疫グロブリン分子間で異なっているいくつかのまたは全てのアミノ酸残基の欠失または置換による「シャッフル」、再構成またはそうでなければ変化を意味する。当業者には、ＣＤＲ残基の無作為化により多くの異なる抗原結合特性を有する免疫グロブリン分子を含むライブラリーの作製が可能になることが理解されよう。
【００７１】
本発明の上記の態様に従って、本明細書に記載する方法に従ってＩＣＳを作製するのが好ましい。
【００７２】
さらに別の態様では、本発明は、
ａ）最適ＩＣＳ配列との相同性に基づいて抗体フレームワークを選択するステップと
ｂ）限定的には各位置で、抗体フレームワークの残りの残基の全てをＫａｂａｔデータベースの抗体のその位置にあるアミノ酸に位置させる変異誘発を行うステップと、
ｃ）各々のフレームワークに関して、抗体配列のＣＤＲ領域を無作為化するステップと
を含む細胞内環境内で機能することができる機能的な細胞内抗体で富化されている抗体ライブラリーの構築のための方法を提供する。
【００７３】
本発明の上記の態様では、本発明による最適ＩＣＳ配列との最大相同性に基づいて抗体フレームワークを選択するのが有利である。すなわち、本発明に従って作製されたＩＣＳと最大相同性を示すフレームワーク領域を選択する。
【００７４】
最後の態様では、本発明は免疫グロブリン分子を生成するために本明細書で記載するような、発現されたその分子の実質的な比率により細胞内環境内でリガンドに選択的に結合することが可能になるライブラリーの使用を提供する。
【００７５】
［定義］
本発明による免疫グロブリン分子とは標的に結合できるいずれかの部分を意味する。特に、それは２つのβシートおよび通常保存されたジスルフィド結合を含有する抗体分子の免疫グロブリンフォールディング特性を含むポリペプチドの免疫グロブリンスーパーファミリー、ファミリーのメンバーを含む。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは免疫系における広範な役割（例えば抗体、Ｔ細胞レセプター分子等）、細胞付着における関与（例えばＩＣＡＭ分子）および細胞内シグナル発生（例えばレセプター分子、例えばＰＤＧＦレセプター）を含む細胞性および非細胞性インビボ相互作用の多くの態様に関与する。本発明を標的分子に結合できる全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用できる。好ましくは、本発明は抗体またはｓｃＦｖ分子に関する。
【００７６】
本明細書で用いる抗体とは選択された標的に結合できる完全抗体または抗体のフラグメントを意味し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラなどの操作された抗体、移植片ＣＤＲおよびヒト化抗体、ならびにファージディスプレイ技術または代替技術を用いて生成された人工的に選択された抗体などが含まれる。小型のフラグメント、例えばＦｖおよびｓｃＦｖは、その小型のサイズおよびその結果生じる優れた組織分布のために、診断および治療適用のための有利な特性を有している。抗体は一本鎖抗体またはｓｃＦｖであるのが好ましい。
【００７７】
重鎖可変ドメインとは免疫グロブリン分子の抗原結合部位の部分を形成するその免疫グロブリン分子の重鎖のその部分を意味する。ＶＨＩＩＩサブグループは重鎖可変領域（ＶＨＩＩＩ）の特定のサブグループを表す。概して、このグループに入る可変鎖アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子はＫａｂａｔデータベースのＶＨＩＩＩコンセンサス配列により表すことができるＶＨアミノ酸配列を有している。
【００７８】
軽鎖可変ドメインとは免疫グロブリン分子の抗原結合部位の部分を形成するその免疫グロブリン分子の軽鎖のその部分を意味する。免疫グロブリン分子のＶΚＩサブグループは可変軽鎖の特定のサブグループを表す。概して、このグループに入る可変鎖アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子はＫａｂａｔデータベースのＶΚＩコンセンサス配列により表すことができるＶＬアミノ酸配列を有している。
【００７９】
免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域。免疫グロブリン分子の可変ドメインは免疫グロブリンフォールディングの存在を特徴とする特定の３次元コンフォメーションを有する。可変ドメインに存在する特定のアミノ酸残基はこの特徴的な免疫グロブリンドメインコア構造を維持するのに寄与する。これらの残基はフレームワーク残基として公知であり、高度に保存される傾向がある。
【００８０】
免疫グロブリン分子重鎖および軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（相補性決定領域）は特異的抗原結合に寄与するそのアミノ酸残基を表し、Ｋａｂａｔ（前掲）により定義される。ＣＤＲ残基は主に、しかし独占的ではないが、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（前掲）により定義されるような可変領域の超可変ループに含まれる。ＣＤＲおよび超可変ループは免疫グロブリンとリガンドとの相互作用に直接関与する。このループ内の残基はフレームワーク領域と比較して保存の程度が低いことが示される傾向がある。
【００８１】
細胞内とは細胞の内側を意味し、そして本発明は細胞の中で選択的にリガンド／標的に結合するその免疫グロブリンを志向する。細胞は原核または真核のいずれかの細胞、でよく、そして細菌細胞、酵母細胞および高等真核細胞からなる群から選択されるのが好ましい。最も好ましいのは酵母細胞および哺乳動物細胞である。従って本明細書で用いる「細胞内」免疫グロブリンおよび標的またはリガンドは細胞の中に存在する免疫グロブリンおよび標的／リガンドである。加えて、「細胞内」なる用語は細胞内環境に類似するかまたは擬似する環境を意味する。従って、「細胞内」とは細胞の中ではないが、インビトロである環境を意味し得る。例えば、本発明の方法を、市販により入手可能か、または天然の系から誘導できるインビトロ転写および／または翻訳系で実施することができる。
【００８２】
ＫＡＢＡＴデータベースはその特性（それが属するサブグループ、アミノ酸残基の位置、可変性）を見出すために目的の配列を試験できる抗体配列の包括的な収集である（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇら（２０００））。このデータベースは科学雑誌からの引用をも含有し、そして科学的情報のＰｕｂＭｅｄアーカイブにリンクしている。Ｋａｂａｔデータベースを用いて、アミノ酸のそれが属するサブグループにおける分布の図表を得ることが可能である。被験配列の各位置における残基の分布を得ることができ、従って可変を得ることも可能である。
【００８３】
本発明の文脈におけるＶHおよびＶL鎖のコンセンサス配列は細胞内環境でリガンドに選択的に結合できる免疫グロブリン分子に由来するＶHおよびＶL鎖のコンセンサス配列を意味する。いずれか１つの所与の位置で最も共通する残基を、細胞内で結合できるその免疫グロブリンの配列を比較する場合、その位置のコンセンサス残基として選択する。今度は各位置で全ての細胞内結合免疫グロブリンの残基を比較することによりコンセンサス配列を作製し、次いでデータを照合する。この場合、１１個の免疫グロブリンの配列を比較した。本発明の文脈では、いずれか１つの位置で５回以上残基を生じた場合だけコンセンサス残基が付与される。疑いを避けるために、ＶＨおよびＶＬコンセンサス配列はＪ領域の配列を含まない。加えて、最初の２個の残基（メチオニンおよびアラニン）はコンセンサスの部分ではない。これらはＮＣＩ１制限部位から誘導される。
【００８４】
本明細書で定義するＶＩＤＡデータベースはＩＡＣＴで選択された抗体の全ての配列、特に記載した抗ＴＡＵ抗体の配列を含有する。加えて、これは細胞内環境内で１つまたはそれ以上の抗原／リカンド／に特異的に結合すると文献に報告されているこれらの抗体を含む。本明細書で記載する「有効な細胞内抗体」とはＩＡＣＴを用いて見出されたか、または細胞内環境内で機能すると文献に報告されているこれらの抗体を意味する。「機能的」なる用語は有効なこれらの抗体がこのような環境内でその特異的抗原に選択的に結合できることを意味する。
【００８５】
「頻度閾値」または「ＬＰ」値なる用語は、本明細書でアラインされた配列内での各アミノ酸位置に関して定義される選択された最小頻度％を意味する。有利には、選択された頻度閾値または（ＬＰ）値はアラインされた配列内の各々のおよび全ての残基と同一である。「頻度閾値」の選択はその位置でのコンセンサス残基の割り当てに関する各残基位置でのカットオフ点を作成する。すなわちいずれかの所与の位置で１つまたはそれ以上の同一のアミノ酸の頻度％をその位置での「頻度閾値」または（ＬＰ）値と比較し、そしていずれかの所与の残基位置での１つまたはそれ以上の同一または類似のアミノ酸の頻度％が選択された頻度閾値と少なくとも同一である場合、次いでその残基を残基位置に関する「コンセンサス残基」に指定する。
【数１】
2004538324.tif 000003
【００８６】
選択的結合とは本発明の文脈では免疫グロブリンとリガンドとの間の相互作用が特異的である、すなわち多くの分子が免疫グロブリンに提供される事象において、後者は提供された１または数個これらの分子にのみ結合する。免疫グロブリン・リガンド相互作用には高度な親和性があるのが有利である。免疫グロブリとンリガンドとの間の相互作用は非共有結合相互作用、例えば水素結合およびファンデルワールスにより媒介される。概して、相互作用は免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の間隙で生じる。
【００８７】
レパートリーとは本発明での文脈では、結合特異性の多重度を提供するために、無作為、半無作為または１つまたはそれ以上の鋳型分子の志向された変種により核酸レベルで作製される分子のセットをいう。この場合、鋳型分子は本明細書で記載する１つまたはそれ以上のＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列である。レパートリーを作製するための方法は当分野において特徴づけされている。
【００８８】
本発明によるライブラリーとはポリペプチドまたは核酸の混合物を意味する。ライブラリーはメンバーから構成される。ライブラリーメンバー間の配列の差異はライブラリーに存在する多様性に寄与する。ライブラリーはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態をとることができるか、または核酸のライブラリーで形質転換された生物もしくは細胞、例えば細菌、ウイルス、動物または植物細胞等の形態でよい。典型的には、各個体生物または細胞はライブラリーの１つのメンバーのみを含有する。特定の適用では、各個体生物または細胞はライブラリーの２つまたはそれ以上のメンバーを含有できる。核酸は、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にするために発現ベクターに組み込まれているのが有利である。従って好ましい態様では、ライブラリーは宿主生物の集団の形態をなすことができ、各生物はその対応するポリペプチドメンバーを生成するために発現され得る核酸形態のライブラリーの単一のメンバーを含有する１つまたはそれ以上の発現ベクターのコピーを含有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８９】
［一般技術］
特記しない場合、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は（例えば細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における）当業者により共通に理解されるのと同一の意味を有する。標準的な技術は分子、遺伝学および生化学的方法（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（参照により本明細書に組み込む））ならびに化学的方法に用いられる。加えて、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州が標準的な免疫学的技術に言及する。
【００９０】
［細胞内環境でそのリガンドに結合する免疫グロブリンを選択する方法］
細胞内抗体補足技術
本発明者は細胞内環境でそのリガンドに結合する免疫グロブリンを選択するための適当な方法を記載し、そして国際公開公報第００／５４０５７号（参照により本明細書に組み込む）に詳記する。
【００９１】
概して、抗体は還元性環境、例えば細胞質において機能するように備えられていないので、インビボで抗原に結合する抗体フラグメントを入手するのは困難である（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：１１７−１２７（１９９８）；Ｐｒｏｂａ，Ｋ．、Ｇｅ，Ｌ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「チオレドキシンリダクターゼ（ＴｒｘＢ）の存在下での大腸菌の細胞質に由来する機能的な抗体一本鎖フラグメント」Ｇｅｎｅ  １５９：２０３±２０７（１９９５））。国際公開公報第００／５４０５７号に記載した細胞内抗体捕捉研究法は抗原特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントの選択および細胞内特徴づけに関する一般的試験計画から構成される。この試験計画を用いることにより、本発明者は細胞内環境内でリガンドに特異的に結合する免疫グロブリン分子を同定した。
【００９２】
国際公開公報第００／５４０５７号に記載したＩＡＣ技術は組換え細菌タンパク質を用いるインビトロｓｃＦｖファージディスプレイ・ライブラリースクリーニングの１ラウンドを含み、続いてインビトロ富化ｓｃＦｖレパートリーの酵母インビボ抗体・抗原相互作用スクリーニングで選択する（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．、Ｔｓｅ，Ｅ．、Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｈ．、Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８（１９９９））。
【００９３】
当業者には、細胞内でそのリガンドに選択的に結合する免疫グロブリン分子を選択するための別の適当な方法があることが理解されよう。
【００９４】
細胞内結合免疫グロブリン
本発明に従って用いる免疫グロブリン分子には、抗体分子の免疫グロブリンフォールディング特性を含むポリペプチドのファミリーである、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーなどがある。フォールディングは２つのβシートおよび、通常保存されたジスルフィド結合を含有する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系における広範な役割（例えば抗体、Ｔ細胞レセプター分子等）、細胞付着における関与（例えばＩＣＡＭ分子）および細胞内シグナル発生（例えばレセプター分子、例えばＰＤＧＦレセプター）を含む細胞性および非細胞性インビボ相互作用の多くの態様に関与する。本発明を標的分子に結合できる全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用できる。好ましくは、本発明は抗体、およびｓｃＦｖフラグメントに関する。
【００９５】
本発明に従って用いる免疫グロブリン分子は全て細胞内環境内でリガンドに選択的に結合できる必要な活性を有している。
【００９６】
本発明に従って免疫グロブリン分子は全て重鎖のＶＨＩＩＩサブグループのメンバーであるＶHアミノ酸配列を共有するのが有利である。これはＶＨＩＩＩサブグループに入る重鎖を有する免疫グロブリンがインビボ環境で特に高い効率を有していることを示唆している。加えて、本発明による免疫グロブリン分子がＪＨ５またはＪκ１領域に連結されたＶＨＩＩＩサブグループを有しているのがさらに有利である。
【００９７】
しかしながら本発明者は、驚くべきことに、免疫グロブリン分子は、それが良好な細胞内抗体であるために、重鎖のＶＨＩＩサブグループのメンバーである重鎖可変領域を有しているだけでは不十分であることを見出した。実際に、無作為にライブラリーから単離された、そしてインビトロでＴＡＵとの良好な結合特性を有している、ＶＨＩＩＩサブグループの抗ＴＡＵ抗体がインビボでＴＡＵと結合できない場合があることが見出されている。
【００９８】
本発明の配列間のたいていの可変性は、ＣＤＲ内に凝集されていて、分子のフレームワーク領域が免疫グロブリン分子に構造安定性を付与しており、一方ＣＤＲはリガンド結合に関与するという見解に合致する。しかしながら、これらの領域には高度な保存が存在し、これらの領域内の残基もまたインビボ環境内での結合効率に寄与するという見解に合致する。
【００９９】
本発明による免疫グロブリンは特に診断および治療適用に有用である。従って、これはエフェクタータンパク質、例えば毒素または標識を含む変化した免疫グロブリンでよい。特にインビボで免疫グロブリンの分布の撮像を可能にする標識が好ましい。このような標識は、患者の体内で容易に可視化できる放射性標識または放射線不透過性標識、例えば金属粒子でよい。さらに、これは患者から取り出した組織サンプルにおいて可視化できる蛍光標識またはその他の標識でよい。
【０１００】
組換えＤＮＡ技術を用いて、細菌または好ましくは哺乳動物細胞培養において確立された手順を用いて、本発明に従って使用するための免疫グロブリンを生成することができる。選択された細胞培養系は免疫グロブリン生成物を分泌するのが好ましい。
【０１０１】
インビトロでのハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増殖を、通例の標準的な培養培地である適当な培養培地、例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ  １６４０培地で、場合によっては哺乳動物血清、例えばウシ胎児血清または微量元素および成長維持補給剤、例えば支持細胞、例えば正常マウス腹膜滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等を補充して実施する。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、当分野で公知の適当な培養培地で、例えば細菌に関しては培地ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２ｘＹＴまたはＭ９最小培地で、ならびに酵母に関しては培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地または完全最小Ｄｒｏｐｏｕｔ培地で同様に実施する。
【０１０２】
インビトロ生成により相対的に純粋な免疫グロブリン調製物が提供され、そして一定比率で増加させて大量の望ましい免疫グロブリンを得ることが可能になる。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞培養のための技術は当分野で公知であり、そして、例えばエアリフトリアクター中もしくは連続攪拌リアクター中の均質懸濁培養、または中空糸、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上で固定もしくは捕捉された細胞培養などがある。
【０１０３】
インビボで哺乳動物細胞を増殖させることにより大量の望ましい免疫グロブリンを入手することもできる。この目的のために、望ましい免疫グロブリンを生成するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動物に注射して抗体生成腫瘍の成長を引き起こす。場合によっては、注射の前に動物を炭化水素、特に鉱物油、例えばプリスタン（テトラメチル・ペンタデカン）でプライミングする。１から３週後にこれらの哺乳動物の体液から免疫グロブリンを単離する。例えば、適当なミエローマ細胞とＢａｌｂ／ｃマウスに由来する抗体生成脾臓細胞との融合により得られたハイブリドーマ細胞、または望ましい抗体を生成するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０から誘導したトランスフェクトされた細胞を、場合によってはプリスタンで前処置してもよいＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、そして１から２週後にその動物から腹水を採取する。
【０１０４】
前記の、およびその他の技術が、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒにて論じられている（参照により本明細書に組み込む）。組換え抗体分子の調製のための技術は前記の参照文献および、例えば欧州特許第０６２３６７９号；欧州特許第０３６８６８４号および欧州特許第０４３６５９７号に記載されている（参照により本明細書に組み込む）。
【０１０５】
優先的には望ましい標的を発現する細胞の免疫蛍光染色により、免疫ブロッティングにより、酵素イムノアッセイ、例えばサンドイッチアッセイもしくはドットアッセイ、またはラジオイムノアッセイにより、望ましい免疫グロブリンに関して細胞培養上澄をスクリーニングする。
【０１０６】
免疫グロブリンの単離のために、培養上澄にまたは腹水の液体に存在するものを、例えば硫酸アンモニウムを用いる沈殿、吸湿性材料、例えばポリエチレングリコールに対する透析、選択的膜を通す濾過等により濃縮することができる。必要なおよび／または望む場合、通例的なクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースのクロマトグラフィーおよび／または（免疫）アフィニティクロマトグラフィー、例えば標的分子またはプロテインＡを伴うアフィニティクロマトグラフィーにより抗体を精製する。
【０１０７】
本発明は抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換え核酸を用いる。定義によれば、このような核酸は一本鎖核酸、該コード化核酸およびそれに対する相補的核酸からなる二本鎖核酸、またはこれらの相補的（一本鎖）核酸自体を含む。
【０１０８】
さらに、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸を、天然発生重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする確証的な配列、または本明細書に記載するその変種または誘導体を有する核酸から酵素的または化学的に合成することができる。該（複数の）修飾は、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側であるのが好ましい。
【０１０９】
［同一性／相同性］
本発明のポリペプチド配列を配列番号１から４０に示される特定の配列またはそのフラグメントに限定しないが、いずれかの供給源、例えば関連する細胞相同体、別の種に由来する相同体およびその変種または誘導体から得られた相同性配列をも含むことは理解されよう。
【０１１０】
従って、本発明は、配列番号１から配列番号４０に示されるアミノ酸配列の変種、相同体または誘導体が細胞内環境内でのリガンドに対する選択的結合に必要な活性を有している免疫グロブリン分子の１つまたはそれ以上の構成要素であれば、該配列番号１から配列番号４０に示すアミノ酸配列の変種、相同体または誘導体を包含する。
【０１１１】
本発明の文脈では、相同性配列はアミノ酸レベルで、少なくとも３０、好ましくは５０、７０、９０または１００アミノ酸にわたって、少なくとも９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一であるアミノ酸配列を含むようにする。相同性を類似性（すなわち化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮することができるが、本発明の文脈では、相同性を配列同一性に関して表現するのが好ましい。
【０１１２】
肉眼により、またはより通常的には、容易に利用できる配列比較プログラムの助けを借りて相同性比較を行うことができる。これらの市販により利用可能なコンピュータープログラムは２つまたはそれ以上の配列間の相同性％を算出することができる。
【０１１３】
近接する配列で相同性％を算出することができ、すなわち１つの配列を別の配列と共にアラインさせ、そして１つの配列の各アミノ酸を別の配列、一度に１つの残基の相当するアミノ酸と直接比較する。これを「ギャップなし」アラインメントと称する。典型的には、このようなギャップなしアラインメントを比較的短い数の残基（例えば５０個未満の近接アミノ酸）でのみ実施する。
【０１１４】
これは非常に簡単であり、そして一貫性のある方法であるが、例えば、他の同一の配列対で、１つの挿入または欠失が以下のアミノ酸残基をアラインメントから外し、従って全体的なアラインメントを実施した場合に、相同性％の大きな低下を招く可能性があることを考慮に入れていない。結果的に、たいていの配列比較方法は、不当な全体相同性スコアを不利にすることなく、可能な挿入および欠失を考慮に入れる最適アラインメントを生み出すように設計されている。これは局所的相同性を最大にしようとして配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０１１５】
しかしながら、これらのより複雑な方法では、同数の同一のアミノ酸に関してできるだけ少しのギャップを伴う（２つの比較された配列間の高い関連性を反映する）配列アラインメントが多くのギャップを伴う配列よりも高いスコアを獲得するように、アラインメントで生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を指定する。典型的にはギャップの存在に関して相対的に高いコストを課し、そして各々の後続のギャップの残基には少しのペナルティーを課す「アフィンギャップコスト」を用いる。これは最も一般的に用いられるギャップスコア系である。高いギャップペナルティーはもちろんギャップの少ない最適化アラインメントを生み出す。たいていのアラインメントプログラムによりギャップペナルティーを修飾することが可能である。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えばＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（以下を参照）を用いる場合、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップペナルティはギャップに関して−１２であり、そして各伸長に関して−４である。
【０１１６】
従って最大相同性％の算出には最初にギャップペナルティーを考慮に入れた最適アラインメントの作製が必要である。このようなアラインメントを実施するための適当なコンピュータープログラムはＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（米国ウィスコンシン大学；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７（１９８４））である。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの実例には、非限定例としてはＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９）前掲、第１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０（１９９０））および比較手段のＧＥＮＥＷＯＲＫＳスーツなどがある。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは双方共にオフラインおよびオンライン検索で利用できる（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９）前掲、７−５８から７−６０頁参照）。しかしながらＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。
【０１１７】
最終相同性％を同一性に関して測定することができるが、アラインメント過程自体は典型的には絶対的対比較に基づいていない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいて各々の対での比較にスコアを指定する、定比率の類似性スコアマトリクスを一般に用いる。一般に用いられるこのようなマトリクスの実例はＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（プログラムのＢＬＡＳＴスーツのためのデフォルトマトリクス）である。概してＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは公のデフォルト値または供給されている場合はカスタムシンボル比較表のいずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザーマニュアル参照）。ＧＣＧパッケージには公のデフォルト値を、またはその他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を用いるのが好ましい。
【０１１８】
一度ソフトウェアが最適アラインメントを作ると、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することができる。典型的にはソフトウェアが配列比較の一部としてこれを行い、そして数値による結果を作製する。
【０１１９】
細胞内環境内でリガンドに選択的に結合する能力を免疫グロブリン分子に付与する方法。
さらなる態様では、本発明は、
ａ）最適ＩＣＳ参照配列を同定するステップと、
ｂ）場合によっては、部位特異的突然変異により、最適ＩＣＳにより定義された位置にあるアミノ酸残基またはこれらの残基のサブセットを、これらが最適ＩＣＳにより同定されたものであるような方法で修飾するステップと
を含む免疫グロブリン分子に細胞内環境内で機能する能力を付与する方法を提供する。
【０１２０】
リガンド
潜在的リガンドは、細胞内に存在するポリペプチドおよびタンパク質、特に新生ポリペプチドおよびタンパク質または細胞内ポリペプチドもしくはタンパク質前駆体を含む。リガンドは変異ポリペプチドまたはタンパク質、例えば点変異、欠失および染色体転位などの遺伝子変異により作製されたポリペプチドまたはタンパク質であるのが有利である。このようなポリペプチドはしばしば腫瘍形成に関与する。実例には、スプライシングされたＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子により生成された遺伝子産物などがある。本発明をさらに全ての変異した腫瘍遺伝子産物、全ての染色体転位腫瘍遺伝子産物（特に融合タンパク質）、疾患において発現された付着タンパク質、および感染の結果として発現されるウイルスまたは細菌特異的タンパク質に適用できる。
【０１２１】
また別にリガンドはＲＮＡ分子、例えば前駆体ＲＮＡまたは遺伝子変異もしくはそれ以外のものにより作製される変異ＲＮＡ種でよい。
【０１２２】
リガンドを例えば以下に記載するような細胞に挿入することができるか、または細胞に対して内因性でよい。
【０１２３】
免疫グロブリンおよびリガンドの細胞への分配
概して免疫グロブリンを細胞に分配する。本明細書で定義するリガンドは前記したように細胞の元来の成分でよいか、または細胞に分配してもよい。
【０１２４】
免疫グロブリンおよびリガンド／標的分子を細胞内環境に導入するために、免疫グロブリンおよび／またはそのリガンドをコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのが有利である。
【０１２５】
免疫グロブリンおよび／またはリガンドをコードする核酸を発現のためにベクターに組み込むことができる。本明細書で用いるベクター（またはプラスミド）とは外来性ＤＮＡをその発現のために細胞に導入するために用いる別個のエレメントを意味する。このような賦形剤の選択および使用は十分に当業者の範囲内である。多くのベクターが利用可能であり、そして適当なベクターの選択はベクターの使用目的、ベクターに挿入する核酸の大きさ、およびベクターで形質転換される宿主細胞に依存する。各々のベクターはその機能およびそれが適合する宿主細胞に依存して種々の成分を含有する。一般にベクター成分には、非限定例としては１つまたはそれ以上の以下のものなどがある。複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終止配列およびシグナル配列。
【０１２６】
さらに一般的な操作および核酸増幅の目的で、本発明に従って免疫グロブリンおよび／または標的をコードする核酸をクローニングベクターに組み込むことができる。
【０１２７】
発現およびクローニングの双方のベクターは概して、ベクターが１つまたはそれ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含有する。典型的にはクローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡを独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自己複製配列を含む。種々の細菌、酵母およびウイルスに関してこのような配列は周知である。
【０１２８】
プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点はたいていのグラム陰性細菌に適しており、２ｍプラスミド起点は酵母に適しており、そして種々のウイルス起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳動物細胞のクローニングベクターに有用である。概して、複製成分の起点は、高レベルＤＮＡ複製にコンピテントな哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ細胞において用いるのでなければ、哺乳動物発現ベクターに必要ではない。
【０１２９】
たいていの発現ベクターはシャトルベクターであり、すなわち少なくとも１つのクラスの生物で複製できるが、発現のために別のクラスの生物にトランスフェクトされ得る。例えば、ベクターを大腸菌にクローン化し、そしてたとえベクターが宿主細胞染色体から独立して複製できなくても、次に同一のベクターを酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトする。ＤＮＡはまた宿主ゲノムへの挿入より複製することもできる。しかしながら、制限酵素消化が核酸を切断する必要があるので、ゲノムＤＮＡの回収は外因的に複製されたベクターのものよりもより複雑である。ＰＣＲによりＤＮＡを増幅することができ、そしていずれかの複製成分がなくても直接宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１３０】
発現およびクローニングベクターは選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有できるのが有利である。この遺伝子は選択培養培地で成長する形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は培養培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質およびその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキセートまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する、栄養要求欠損を補完する、または複合培地から利用できない必須栄養を供給するタンパク質をコードする。
【０１３１】
酵母に適当な選択遺伝子マーカーに関しては、マーカー遺伝子の表現型発現のために形質転換体の選択を容易にするいずれかのマーカー遺伝子を用いることができる。酵母に適したマーカーは、例えば抗生物質Ｇ４１８、ヒグロマイシンもしくはブレオマイシンに対する抵抗性を付与するものであるか、または栄養要求性酵母変異体で原栄養を提供する、例えばＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、またはＨＩＳ３遺伝子である。
【０１３２】
ベクターの複製は大腸菌で都合よく行われるので、大腸菌遺伝子マーカーおよび大腸菌複製起点を含めるのが有利である。双方共に大腸菌複製起点および抗生物質、例えばアンピシリンに対する抵抗性を付与する大腸菌遺伝子マーカーを含有する、大腸菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  c  ベクターまたはｐＵＣプラスミド、例えばｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９からこれを入手することができる。
【０１３３】
哺乳動物細胞に適した選択マーカーは望ましい核酸、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ、メソトレキセート抵抗性）、チミジンキナーゼ、またはＧ４１８もしくはヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子を発現する細胞の同定を可能にするものである。マーカーを受け入れ、そして発現している形質転換体のみが独自の生存に適合する選択圧下に哺乳動物細胞形質転換体を置く。ＤＨＦＲまたはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）マーカーの場合、選択圧が漸増する条件下で形質転換体を培養し、それにより選択遺伝子および連結された核酸の双方の増幅（その染色体組み込み部位で）を導くことにより選択圧を課すことができる。増幅は、成長に必須のタンパク質の生成に関してより強く要求される遺伝子が、望ましいタンパク質をコードし得る密接に関連する遺伝子と一緒に、組換え細胞の染色体内でタンデムに反復される過程である。望ましいタンパク質の量の増加は通常このように増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１３４】
発現およびクローニングベクターは通常宿主生物により認識されるプロモーターを含有し、そして望ましい核酸に機能的に連結されている。このようなプロモーターは誘導性または構成性でよい。プロモーターは、供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、そして単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することにより核酸に機能的に連結される。元来のプロモーター配列および多くの異種性プロモーターの双方を用いて免疫グロブリンまたは標的分子をコードする核酸の増幅および／または発現を志向することができる。「機能的に連結された」なる用語は、記載された成分がその意図される様式でそれが機能することを可能にする関係にある近位を意味する。コード化配列に「機能的に連結された」調節配列は、コード化配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるような方法でライゲートされる。
【０１３５】
原核細胞宿主とともに用いるのに適したプロモーターには、例えばβラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターなどがある。そのヌクレオチド配列は公開されており、それにより技術者がそれを望ましい核酸にライゲートさせることが可能になり、リンカーまたはアダプターを用いていずれかの必要な制限部位を供給する。細菌系で用いるためのプロモーターはまた概して核酸に機能的に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を含有する。
【０１３６】
好ましい発現ベクターは細菌内で機能できるバクテリオファージのプロモーター、例えばファゲックスまたはＴ７を含む細菌発現ベクターである。最も広く用いられている発現系の１つでは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより融合タンパク質をコードする核酸をベクターから転写することができる（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９（１９９０））。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主株では、ｐＥＴベクターと組み合わせて用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが宿主細菌のリソゲンＤＥ３から生成され、そしてその発現はＩＰＴＧ誘導ｌａｃ  ＵＶ５プロモーターの調節下にある。多くのタンパク質の過剰生成にこの系を用いて成功している。また別に、ｉｎｔファージ、例えば市販により入手可能なＣＥ６ファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）で感染させることにより、ポリメラーゼ遺伝子をラムダファージに導入することができる。その他のベクターにはラムダＰＬプロモーターを含有するベクター、例えばＰＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）、ｔｒｃプロモーターを含有するベクター、例えばｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓＴｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、スウェーデン）、またはｔａｃプロモーターを含有するベクター、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）もしくはＰＭＡＬ（ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州、米国）などがある。
【０１３７】
酵母宿主で用いるのに適したプロモーティング配列は制御され得るかまたは構成性でよく、そして高度に発現された酵母遺伝子、特にサッカロミセス・セレビジエ遺伝子から誘導されるのが好ましい。従って、ＴＲＰ１遺伝子のプロモーター、ＡＤＨＩまたはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子、ａ−もしくはα−因子をコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーターまたは解糖酵素をコードする遺伝子から誘導されるプロモーター、例えばエノラーゼのプロモーター、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、またはグルコキナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビジエＧＡＬ  ４遺伝子、Ｓ．ｐｏｍｂ  ｎｍｔ  １遺伝子またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子に由来するプロモーターを用いることができる。さらに、１つの酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）および別の酵母遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流のプロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター、例えば酵母ＰＨ０５遺伝子の（複数の）ＵＡＳ、および酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流のプロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）を用いることができる。適当な構成性ＰＨ０５プロモーターは、例えば上流の制御エレメント（ＵＡＳ）を欠いた短い酸ホスファターゼＰＨ０５プロモーター、例えばＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７３で始まりヌクレオチド−９で終わるＰＨ０５（−１７３）プロモーターエレメントである。
【０１３８】
ウイルス、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびシミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは非常に強力なプロモーター、例えばリボソームタンパク質プロモーターから、ならびに通常免疫グロブリン配列に随伴されるプロモーターから誘導されるプロモーターにより、哺乳動物宿主のベクターからの遺伝子転写を調節することができる。
【０１３９】
ベクターへのエンハンサー配列の挿入により高等真核細胞による核酸の転写を増加させることができる。エンハンサーは相対的に配向および位置独立性である。哺乳動物遺伝子に由来する多くのエンハンサー配列が公知である（例えばエラスターゼおよびグロビン）。しかしながら、典型的には真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを用いる。実例としては複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）およびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーなどがある。エンハンサーを望ましい核酸に対して５’または３’の位置でベクターにスプライシングすることができるが、プロモーターから５’の部位に位置するのが好ましい。
【０１４０】
真核細胞発現ベクターが遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）を含むことができるのが有利である。ＬＣＲは宿主細胞クロマチンに組み込まれた導入遺伝子の高レベル組み込み部位独立性発現を志向することができ、これは、ベクターの染色体組み込みが生じている永久的にトランスフェクトされた真核細胞系の文脈で遺伝子が発現される場合に特に重要である。
【０１４１】
真核細胞発現ベクターは転写の終止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列をも含有する。このような配列は通例真核性またはウイルス性ＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および３’非翻訳領域から利用できる。これらの領域は免疫グロブリンまたは標的をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【０１４２】
哺乳動物細胞における核酸の一過性発現を提供する発現ベクターが本発明の実施に特に有用である。一過性発現は通常、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、今度は高レベルの望ましい遺伝子産物を合成するように、宿主細胞で効率よく複製できる発現ベクターの使用に関与する。
【０１４３】
本発明によるベクターの構築は慣用されるライゲーション技術を用いることができる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを必要とされるプラスミドを作製するのに望ましい形態に切断し、仕立て、そして再度ライゲートする。望む場合、構築されたプラスミドの正確な配列を確認するための分析を公知の様式で実施する。発現ベクターを構築し、インビトロ転写物を調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、そして遺伝子産物発現および機能を評価するためのアッセイを実施するための適当な方法は当業者に公知である。遺伝子の存在、増幅および／または発現をサンプル中で直接、例えば慣用されるサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはインサイチューハイブリダイゼーションにより、本明細書で提供する配列に基づくことができる適当な標識プローブを用いて測定することができる。望む場合、これらの方法をどのように修飾することができるかは当業者に容易に理解されよう。
【０１４４】
マイクロインジェクションまたは小嚢、例えば細胞膜と融合できるリポソームを用いる分配により免疫グロブリンおよび／またはリガンドを直接細胞に導入することができる。ウイルス融合性ペプチドを用いて膜融合および細胞の細胞質への分配を促進させるのが有利である。
【０１４５】
［本発明のＶHおよびＶL配列を用いるライブラリーの調製］
さらに別の態様では、本発明はライブラリーを提供し、ここでライブラリーは、配列番号３で表され、図５ａで示されるコンセンサス配列と少なくとも８５％の同一性を示すＶＨアミノ酸配列、配列番号４１で表され、図１１ａで示されるコンセンサス配列により記載されるＶＨ配列；からなる群から選択されるいずれかの１つまたはそれ以上の可変重鎖ドメインアミノ酸配列（ＶＨ）を用いて作製される。
【０１４６】
これらのライブラリーは、細胞内環境内でリガンドと相互作用する能力に関して試験することができる免疫グロブリン分子またはそのフラグメントをコード、発現および／または提示することができる。本発明の本態様のライブラリーを国際公開公報第００／５４０５７号に記載される細胞内抗体捕捉法を用いて、発現された免疫グロブリン分子の結合に関して試験できるのが有利である。本発明のライブラリーは免疫グロブリン分子内に組み込まれた場合、細胞内環境内で選択的にリガンドに結合するＶHおよびＶL鎖をコードまたは発現するのが有利である。免疫グロブリンはｓｃＦｖであるのが好ましい。
【０１４７】
多様なペプチド配列が繊維状バクテリオファージの表面に表示される系（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０前出））が、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのインビトロ選択および増幅のための抗体フラグメント（およびそれをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作るのに有用であることが判明した。ＶHおよびＶL領域をコードするヌクレオチド配列を、大腸菌の細胞膜周辺腔にそれらを導くリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結し、そして結果的に得られた抗体フラグメントをバクテリオファージの表面に、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えばｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）への融合体として表示する。また別に、抗体フラグメントをラムダファージキャプシッド（ファージボディー）の外部に表示する。ファージ基盤のディスプレイ系の利点は、それが生物学的な系であるので、細菌細胞内に選択されたライブラリーのメンバーを含有するファージを成長させることにより選択されたライブラリーのメンバーを簡単に増幅できるという点である。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクターに含まれるので、シークエンシング、発現およびそれに続く遺伝子操作が比較的直接的である。
【０１４８】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびラムダファージ発現ライブラリーの構築のための方法は当分野で公知である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）前出；Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４３６３（１９９１）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４（１９９１）；Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２（１９９１）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０１３４（１９９１）；Ｈｏｏｇｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３（１９９１）；Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３６１０（１９９１）；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  １０４：１４７（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、（１９９１）前出；Ｂａｒｂａｓら、（１９９２）前出；ＨａｗｋｉｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：８６７（１９９２）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７（１９９２）；Ｌｅｒｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１３１３（１９９２）、参照により本明細書に組み込む）。
【０１４９】
代替のライブラリー選択技術はバクテリオファージラムダ発現系を含み、これをバクテリオファージプラークとして、またはリソゲンのコロニーとして、双方共に以前に記載されたように直接スクリーニングでき（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９）；ＣａｔｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７（１９９０）；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８０９５（１９９０）；Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４３２（１９９１））、そして本発明に有用である。このような発現系を用いてライブラリーの異なるメンバーを１０6までスクリーニングすることができるが、さらに多数（１０6メンバー以上）のスクリーニングにはそれほど適していない。その他のスクリーニング系は、例えばライブラリーメンバーの直接化学合成に頼る。１つの初期の方法は、例えば国際公開公報第８４／０３５６４号に記載されるピンまたはロッドのセット上でのペプチド合成に関与する。各々のビーズが個々のライブラリーメンバーであるペプチドライブラリーを形成する、ビーズ上でのペプチド合成に関与する類似の方法は米国特許第４，６３１，２１１号に記載され、そして関連する方法は国際公開公報第９２／０００９１号に記載されている。ビーズ基盤の方法の有意な改善は各ビーズを独特のアイデンティファイヤタグ、例えばオリゴヌクレオチドでタグ化して、各ライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を容易にすることに関与する。これらの改善されたビーズ基盤の方法は国際公開公報第９３／０６１２１号に記載されている。
【０１５０】
別の化学的合成方法は、アレイの別個の予め定義された位置に各々の異なるライブラリーメンバー（例えば、独特なペプチド配列）を置く様式の表面でのペプチド（またはペプチドマイメティックス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ））のアレイの合成に関与する。アレイにおけるその空間位置により各ライブラリーメンバーの同一性を決定する。予め決定された分子（例えばレセプター）および反応性ライブラリーのメンバーとの間に結合相互作用を生じるアレイにおける位置を決定し、それにより空間位置に基づく反応性ライブラリーのメンバーの配列を同定する。これらの方法は米国特許第５，１４３，８５４号；国際公開公報第９０／１５０７０号および国際公開公報第９２／１００９２号；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７（１９９１）；ＤｏｗｅｒおよびＦｏｄｏｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６：２７１（１９９１）に記載されている。
【０１５１】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製するための別の系はライブラリーメンバーのインビトロ合成のための細胞不含の酵素の機構の使用に関与する。１つの方法では、標的リガンドに対する代わりのラウンドの選択およびＰＣＲ増幅によりＲＮＡ分子を選択する（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５（１９９０）；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８（１９９０））。類似の技術を用いて予め決定されたヒト転写因子に結合するＤＮＡ配列を同定することができる（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３２０３（１９９０）；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：６３５（１９９２）；国際公開公報第９２／０５２５８号；国際公開公報第９２／１４８４３号）。類似の方法で、インビトロ翻訳を用いて大きなライブラリーを作製するための方法としてポリペプチドを合成することができる。概して安定化されたポリソーム複合体を含むこれらの方法はさらに国際公開公報第８８／０８４５３号、国際公開公報第９０／０５７８５号、国際公開公報第９０／０７００３号、国際公開公報第９１／０２０７６号、国際公開公報第９１／０５０５８号、および国際公開公報第９２／０２５３６号に記載されている。ファージ基盤でない代替のディスプレイ系、例えば国際公開公報第９５／２２６２５号および国際公開公報第９５／１１９２２号（Ａｆｆｙｍａｘ）に開示されたものはポリソームを用いて選択のためにポリペプチドを表示する。これらのおよび全ての前記の文献もまた参照により本明細書に組み込む。
【０１５２】
実際に、本明細書で記載するようにコンセンサス配列からのライブラリーの作製における主要な利点は、その生成がファージｓｃＦｖライブラリーの使用を防ぎ、そして細胞内抗体捕捉技術において使用するのに必要とされる必要なライブラリーの大きさを低減するという点である。
【０１５３】
本発明の免疫グロブリンの使用
本発明による免疫グロブリン分子、好ましくはｓｃＦｖ分子をインビボ治療および予防的適用、インビトロおよびインビボ診断適用、インビトロアッセイならびに試薬適用、機能的ゲノム適用等に用いることができる。
【０１５４】
本発明による免疫グロブリンおよび組成物の治療用および予防用の使用は前記のものを受体哺乳動物、例えばヒトに投与することに関与する。これは哺乳動物の細胞内環境への投与に関与するのが好ましい。
【０１５５】
少なくとも９０から９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンを哺乳動物に投与するのが好ましく、そして医薬的使用には、特に哺乳動物がヒトである場合、９８から９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。部分的にまたは望む場合均一になるまで一度精製すると、当業者に公知の方法を用いて、免疫グロブリン分子を診断用または治療用に（体外を含む）、またはアッセイ手順を開発および実施するのに使用することができる。
【０１５６】
本出願では、「防御」なる用語は疾患の誘発の前の保護用組成物の投与に関与する。「抑制」とは誘発事象の後であるが、疾患の臨床発現の前の組成物の投与を意味する。「処置」とは疾患の徴候が明らかになった後の保護用組成物の投与に関与する。
【０１５７】
本発明の選択された免疫グロブリン分子はインビボでタンパク質機能を撹乱させることができ、そして従って、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、および自己免疫障害（非限定例としては、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症）の防御、抑制または処置における使用、並びに移植片拒絶の防御における使用が見出される。例えば、本発明の細胞内免疫グロブリンの１つの適用は腫瘍遺伝子タンパク質、特に染色体転位に至る融合分子の撹乱における適用である。これらの分子は染色体転位を獲得した細胞の子孫にのみ生じる腫瘍特異的タンパク質であるので、特に興味深い。注目すべき実例はＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）およびある割合のＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）担持転位ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）において見出されるＢＣＲ−ＡＢＬハイブリッド融合タンパク質である（ｄｅ  Ｋｌｅｉｎ，Ａ．ら、「細胞性腫瘍遺伝子が慢性骨髄性白血病のフィラデルフィア染色体に転位する」Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７６５−７６７（１９８２）；Ｂａｒｔｒａｍ，Ｃ．Ｒ．ら、「ｃ−ａｂｌ腫瘍遺伝子の転位が慢性骨髄性白血病のフィラデルフィア染色体の存在と相関する」Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：２７７−２８０（１９８３））。
【０１５８】
本発明者は、双方共にｐ１９０とｐ２１０  ＢＣＲ−ＡＢＬとの融合タンパク質に見出されるＡＢＬのＳＨ２ドメインまたはＢＣＲタンパク質のＳＨ２結合ドメインに指向するｓｃＦｖを選択した。本発明者はインビボでＢＣＲ−ＡＢＬに結合する異なるｓｃＦｖのパネルを見出した。
【０１５９】
本発明による抗原特異的ｓｃＦｖをフィラデルフィア染色体陽性白血病における治療薬として用いることができる。ＢＣＲタンパク質のＳＨ２結合ドメインはＢＣＲ−ＡＢＬ腫瘍遺伝子タンパク質ＢＣＲｓｈ２ｂｄの形質転換特性に必要である。従って、このドメインの機能を遮断することにより、ＢＣＲ−ＡＢＬの腫瘍原性を中和することができる。加えて、ｓｃＦｖは、抗ＡＢＬ  ｓｃＦｖと組み合わせて、細胞内抗体媒介殺細胞研究法において用いられる可能性を有している（Ｅｒｉｃ  ＴｓｅおよびＴｅｒｅｎｃｅ  Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓ、「細胞内抗体カスパーゼ媒介殺細胞：癌治療における適用のための研究法」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１２２６６−１２２７１）。この研究法を用いて、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質を担持する細胞を、正常の細胞を残して特異的に死滅させることができる。
【０１６０】
本発明の選択された免疫グロブリンの有効性をスクリーニングするために用いることができる動物モデル系を、疾患に対する保護または疾患の処置において利用することができる。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の試験ための方法は当分野で公知である（Ｋｎｉｇｈｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６５３（１９７８）；Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９９：５１５（１９７８））。別の種に由来する可溶性ＡｃｈＲタンパク質で疾患を誘発することにより、重症筋無力症（ＭＧ）をＳＪＬ／Ｊ雌マウスで試験する（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：２３３（１９８８））。ＩＩ型コラーゲンの注射によりマウスの感受性株で関節炎を誘発する（Ｓｔｕａｒｔら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ／４２：２３３（１９８４））。放線菌熱ショックタンパク質の注射により感受性ラットでアジュバント関節炎が誘発されるモデルについて記載されている（Ｖａｎ  Ｅｄｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：１７１（１９８８））。記載されるようにサイログロブリンを投与することによりマウスで甲状腺炎を誘発する（Ｍａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１１５（１９８０））。インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を天然に生じるか、または例えばＫａｎａｓａｗａら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２７：１１３（１９８４）により記載されるもののようにマウスの特定の株において誘発することができる。マウスおよびラットのＥＡＥはヒトのＭＳのモデルとして提供される。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄疾患が誘発される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｉｓｃｈｅｒら編、Ｇｒｕｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｔｏｎ、ニューヨーク、１７９−２１３頁（１９８６）；ＭｃＦａｒｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７９：４７８（１９７３）；およびＳａｔｏｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１７９（１９８７）参照）。
【０１６１】
概して、本発明の選択された免疫グロブリンを薬理学的に適当な担体と一緒に精製された形態で利用し得る。典型的には、これらの担体には水性もしくはアルコール性／水性溶液、乳濁液または懸濁液などがあり、生理食塩水および／または緩衝培地を含むものもある。非経口用賦形剤には塩化ナトリウム溶液、リンガー液デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸リンガー液などがある。懸濁液中でポリペプチド複合体を維持することが必要な場合、適当な生理学的に許容されるアジュバントを増粘剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩から選択することができる。
【０１６２】
静脈内賦形剤には液体および栄養補充剤および電解質補充剤、例えばリンガー液デキストロースに基づくものなどがある。保存剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスもまた存在してよい（Ｍａｃｋ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（１９８２））。
【０１６３】
本発明の選択された免疫グロブリンを別個に投与される組成物として、または別の作用物質と組み合わせて用いることができる。これらは種々の免疫治療薬、例えばシクロスポリン、メソトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチナムおよび免疫毒素などを含むことができる。医薬用組成物は、ケモカイン、もしくはその結合タンパク質、もしくは本発明のＴ細胞と組み合わせた、またはさらには本発明による選択されたケモカイン、もしくはその結合タンパク質と組み合わせた種々細胞毒性またはその他の作用物質の「カクテル」を含むことができる。
【０１６４】
本発明による医薬用組成物の投与経路は通例当業者に公知のいずれかのものでよい。非限定例として、免疫治療などの治療用には、標準的な技術に従って本発明の選択された抗体、そのレセプターまたは結合タンパク質をいずれかの患者に投与することができる。投与は、非経口的、静脈内的、筋肉内的、腹腔内的、経皮的に、肺経路を介するなどの適当な様式によるか、または適切なことには、カテーテルを用いる直接注入によってもよい。投与量および投与頻度は患者の年齢、性別および症状、その他の薬物の併用投与、対比指標（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）および臨床医が考慮すべきその他のパラメーターに依存する。
【０１６５】
本発明の選択された免疫グロブリンを貯蔵用に凍結乾燥し、そして使用前に適当な担体で再構成することができる。公知の凍結乾燥および再構成技術を用いることができる。凍結乾燥および再構成が機能的活性損失の程度を変化させ得ること、ならびに補償するために使用レベルを上方調整すべきであることは、当業者には理解されよう。
【０１６６】
本発明のこの選択された免疫グロブリンまたはそのカクテルを含有する組成物を予防的および／または治療的処置のために投与することができる。特定の治療適用では、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻止、抑制、変調、死滅化、またはいくつかのその他の測定可能なパラメーターを達成するのに十分な量を「治療上有効量」として定義する。この投与量を達成するのに必要な量は疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般状態に依存するが、概して体重ｋｇあたり選択された免疫グロブリン０．００５から５．０ｍｇの範囲であり、より通例的に用いられるのは０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ／投与である。予防用適用には、この選択された免疫グロブリン分子またはそのカクテルを含有する組成物を類似のまたはわずかに少ない用量で投与することもできる。
【０１６７】
本発明による１つまたはそれ以上の選択された免疫グロブリン分子を含有する組成物を、哺乳動物の選択標的細胞集団の変化、不活性化、死滅化または除去を助けるために予防用および治療用設定において利用することができる。加えて、本明細書で記載したポリペプチドの選択されたレパートリーを体外でまたはインビトロで利用して、細胞の異種性収集物に由来する標的細胞集団を選択的に死滅化、消耗させるか、そうでなければ有効に除去することができる。哺乳動物の血液を体外で選択された抗体、細胞表面レセプターまたはその結合タンパク質と組み合わせることができ、それにより望ましくない細胞を死滅させるか、またはそうでなければ標準的な技術に従って哺乳動物に戻すための血液から除去する。
【０１６８】
以下の実施例において、説明のみの目的で本発明をさらに記載する。
［実施例］
試験計画（Ａ）
【実施例１】
【０１６９】
細菌性タンパク質発現および抗原の精製
ＢＣＲ抗原：細菌のＢＣＲのヒスチジンタグ化ＳＨ２結合ドメインの発現のためのプラスミド、ｐＲＳＥＴ−ＢＣＲＳＨ２ＢＤを、ＢＣＲのアミノ酸１８５−４１７をコードする配列を増幅し、そしてＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてミニｐＲＳＥＴベクター（Ｏ．Ｐｅｒｉｓｉｃより寄贈）にクローニングすることにより作製した。
【０１７０】
ＡＢＬ抗原：ヒスチジンタグ化ＡＢＬタンパク質ＳＨ２ドメイン（アミノ酸２６−３４８）（ｐＲＳＥＴ−ＡＢＬ）の細菌発現に対するプラスミドを、対応する配列のＰＣＲおよびＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてミニｐＲＳＥＴベクターにサブクローニングすることにより構築した。ＰＣＲ条件は特異的プライマー（ｐＲＳＥＴ−ＢＣＲＳＨ２ＢＤに関しては５’ｃａｇｇｇａｔｃｃｇａｇｃｇｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇａａｇ３’／５’ｃａｇｇａａｔｔｃａｔｃｇｔｔｇｇｇｃｃａｇａｔｃｔｇ３’およびｐＲＳＥＴ−ＡＢＬに関しては５’ｃａｇｇｇａｔｃｃｇａａｇｃｃｃｔｔｃａｇｃｇｇｃｃａ３’／５’ｃａｇｇａａｔｔｃｃｇａｇａｔｃｔｇａｇｔｇｇｃｃａｔ３’）および鋳型としてｐＥ１Ａ２（ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０、Ｄｒ．Ｇ．Ｇｒｏｓｖｅｌｄより寄贈）を用いて９５℃、５０℃および７２℃で各々１分間の３０サイクルであった。
【０１７１】
プラスミドを大腸菌Ｃ４１細菌に形質転換し（Ｔｓｅ，Ｅ．およびＲａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１２２６６−１２２７１（２０００））、そして指数関数的成長細菌培養物に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し（Ｏ．Ｄ．600  ０．６）、そして３０℃で４時間成長させることによりタンパク質の誘導を実施した。製造者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いてヒスチジンタグ化タンパク質を精製した。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いることにより精製されたタンパク質の濃度を決定した。
【実施例２】
【０１７２】
インビトロｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー・スクリーニングおよび特異的ｓｃＦｖ−ＶＰ１６酵母ライブラリーの調製
ＩＡＣ法に関する詳細なプロトコルは他で記載されている（Ｔｓｅ，Ｅ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｇ．およびＲａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．、ＨＫ，Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔａｗａ（２０００））。ＢＣＲタンパク質の精製されたＨｉｓタグ化ＳＨ２結合ドメインまたはＡＢＬタンパク質のＳＨ２ドメインをＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩イムノチューブ（Ｎｕｎｃ）にコートした。２×１０13ファージディスプレイｓｃＦｖ（Ｓｈｅｅｔｓ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２（１９９８））を抗原コートしたチューブと共にインキュベートし、そして結合ファージを１００ｍＭ  トリエチルアミンで溶出し、１Ｍ  トリス（ｐＨ７．４）で中和し、そしてこれを用いて大腸菌ＴＧ１細菌を感染した。形質導入された細菌をアンピシリン補充寒天プレートにプレートすることにより増幅し、そこからファージミドＤＮＡを抽出した。収集したファージミドＤＮＡをＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、そして７００−８００ｂｐ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントをゲル精製した。精製されたｓｃＦｖ（ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）ＤＮＡフラグメントをｐＶＰ１６ベクターにライゲートし、そして大腸菌ＤＨ５α細菌に形質転換した。４０のライゲーションを実施し、形質転換後におよそ１０5個の細菌コロニーが得られた。これは１次ＢＣＲ−ＳＨ２ＢＤおよびＡＢＬ−ＳＨ２特異的酵母ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ライブラリーを作製し、これをアンピシリン補充寒天プレートにプレートすることにより増幅した。細菌からＤＮＡを抽出し、そして酵母スクリーニングに使用した。
【実施例３】
【０１７３】
酵母におけるインビボ抗体−抗原相互作用スクリーニング
０．０７５％アミノ酸補充剤（Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｕｒａ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓを欠く；硫酸アデニン、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ各０．１％；Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ，Ｐｒｏ、Ｓｅｒ，およびＴｙｒ各０．０５％）を含有し、ｐＨ５．８で緩衝化したＹＡＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、および０．１％ｍｇ／ｍｌ  緩衝化したアデニン（ｐＨ５．８））または合成最小ＹＣ培地（０．１２％酵母窒素塩基、アミノ酸不含、および０．５％硫酸アンモニウム、０．１％コハク酸、０．６％ＮａＯＨ、２％グルコースおよび、要求に応じて、２％寒天）中Ｌ４０酵母（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を３０℃で３から４日間成長させた。必要な場合、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ各０．０１％および０．００５％Ｈｉｓを培地に補充した。
【０１７４】
ＢＣＲ−ＡＢＬに連結されたＬｅｘＡ（ｐＢＴＭ／Ｅ１Ａ２）に含まれるベイト抗原発現プラスミドをｐＥ１Ａ２の４ｋｂ平滑ＥａｇＩフラグメントをＢａｍＨＩ平滑ｐＢＴＭ／１１６ベクターにサブクローニングすることにより作製した。酵母インビボｓｃＦｖライブラリースクリーニングでは、酢酸リチウム形質転換プロトコル（Ｇｅｉｔｚ，Ｄ．、Ｓｔ．Ｊｅａｎ，Ａ．、Ｗｏｏｄｓ，Ｒ．Ａ．およびＳｃｈｉｅｓｔｌ，Ｒ．Ｈ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１４２５（１９９２）；Ｔｓｅ，Ｅ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｇ．およびＲａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ，Ｈ，Ｋ，Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔａｗａ（２０００））により、ｐＢＴＭ／Ｅ１Ａ２  １ｍｇおよび酵母ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ＡＤ（ここでＡＤは活性化ドメイン）ライブラリーＤＮＡ  ５００μｇをサッカロミセス・セレビジエＬ４０に同時形質転換した。プラスミドおよびヒスチジン原栄養の双方に関する栄養要求性マーカーを用いて陽性クローンを選択した。ヒスチジン独立性コロニーを採取し、ＴｒｐおよびＬｅｕを欠くＹＣ寒天プレートに再画線し、そしてフィルターアッセイによりβガル活性に関して検定した（Ｂｒｅｅｄｅｎ，Ｌ．およびＮａｓｍｙｔｈ，Ｋ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：６４３−６５０（１９８５））。単離されたｓｃＦｖを再試験するために、個々のｓｃＦｖ−ＶＰ１６ＡＤプラスミド（２００ｍｇ）をｐＢＴＭ／Ｅ１Ａ２（５００ｎｇ）と共にＬ４０酵母に同時形質転換し、そしてヒスチジン原栄養およびβガル活性を検定した。陰性「ベイト」対照として用いたｐＢＴＭ／ＡＭＣＶ（ＡＭＣＶウイルスコートタンパク質に融合したＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインを含む）は以前に記載された（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，Ｐ．、Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ，Ｅ．、Ｔｒｉｎｃａ，Ｓ．、Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｉｓ，Ｄ．、Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ａ．およびＧａｌｅｆｆｉ，Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６６：４６９−４７２（１９９３）；Ｖｉｓｃｉｎｔｉｎ，Ｍ．、Ｔｓｅ，Ｅ．、Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｈ．、Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８（１９９９））。
【実施例４】
【０１７５】
ＩＣ抗体のインビトロ特徴づけ
ｓｃＦｖは可溶性細菌細胞膜周辺腔タンパク質として発現され、これをウェスタン免疫検出のための１次抗体として用いた。ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ制限酵素消化によりｓｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントをｓｃＦｖ−ＶＰ１６ＡＤプラスミドから単離し、そしてｐＨＥＮ２ベクターにサブクローン化して（ｗｗｗ．Ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ参照）細菌細胞膜周辺腔発現のためのｐＨＥＮ２−ｓｃＦｖを作製した。ｐＨＥＮ２−ｓｃＦｖプラスミドを大腸菌ＨＢ２１５１に形質転換し、そして１ｍＭ  ＩＰＴＧを指数関数的成長細菌培地（Ｏ．Ｄ．600０．６）５０ｍｌに添加することにより、およびさらに３０℃で４時間さらに成長させることによりタンパク質の誘導を実施した。細胞をペレット化し、そして氷冷１×ＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍ  トリス−ＨＣｌ；０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５Ｍ  スクロース）４００μｌに再懸濁した。１：５  ＴＥＳ緩衝液（氷冷）６００μｌを加え、逆さまにすることにより穏やかに混合し、そして氷上に３０分置いた。遠心後、細胞膜周辺腔の可溶性ｓｃＦｖを含有する上澄を収集した。免疫検出のために細胞膜周辺腔タンパク質を１：５０の希釈で新たに使用した。９Ｅ１０抗ｍｙｃタグマウスモノクローナル抗体およびＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体を各々１：１０００および１：２５０００希釈で２次抗体として使用した。
【実施例５】
【０１７６】
哺乳動物インビボ抗体−抗原相互作用アッセイ
発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰＨＳ３により、哺乳動物発現のためのＶＰ１６転写活性化ドメインを有するｓｃＦｖインフレームのクローニングが可能になる。個々の抗ＢＣＲｓｃＦｖ  ＤＮＡフラグメントをｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰＨＳ３のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ部位にクローン化した。適当なＰＣＲ産物をｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰＨＳ３のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入することにより、ｓｃＦｖＦ８（抗ＡＭＣＶウイルスコートタンパク質）およびｓｃＦｖＲ４（抗βガラクトシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：１１７−１２７（１９９８）））のための発現プラスミドを構築した（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，Ｐ．、Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ，Ｅ．、Ｔｒｉｎｃａ，Ｓ．、Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｉｓ，Ｄ．、Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ａ．およびＧａｌｅｆｆｉ，Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６６：４６９−４７２（１９９３））。ｐＥ１Ａ２  ＲＥＦの４ｋｂのＥａｇＩフラグメントをｐＭ３のＳｍａＩ部位にサブクローニングすることにより、ＢＣＲ−ＡＢＬに連結されたＧａｌ４ＤＢＤを発現する哺乳動物ＢＣＲ−ＡＢＬ発現プラスミド（ｐＭ３−Ｅ１Ａ２）を作製した（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．、Ｂｅｌｌ，Ｂ．、Ｂｒｏａｄ，Ｐ．およびＨｏｌｌｉｓ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１８：１３７−１４１（１９９２））。対照ベイトｐＭ１−βｇａｌは以前に記載されている（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．、Ｔｓｅ，Ｅ．、Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｈ．、Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８（１９９９））。
【０１７７】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を１０％ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むα最低必須培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）中に保持した。トランスフェクションの１日前に２×１０5  ＣＨＯ細胞を６ウェルプレートの単一のウェルに播種した。リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、製造者の指示書に従う）を用いて、０．５μｇのベイトプラスミドおよびｐＥＦ−ＢＯＳ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６をＧ５−ルシフェラーゼ・レポータープラスミド０．５μｇ（ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．、Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．、ＤｅＬｕｃａ，Ｍ．、Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．およびＳｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７（１９８７））およびｐＲＬ−ＣＭＶ内部対照プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０ｎｇと一緒にＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの６０時間後に、デュアル・ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびルミノメーターを用いて、ＣＨＯ細胞抽出物に関してルシフェラーアッセイを実施した。測定したＲａｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性でトランスフェクション効率を正規化した。各トランスフェクションを２回ずつ実施した。
【実施例６】
【０１７８】
インビボ抗体−抗原相互作用スクリーニングによるＢＣＲおよびＡＢＬタンパク質に対する特異的細胞内ｓｃＦｖの単離
ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合した「ベイト」抗原の酵母発現およびＶＰ１６転写活性化ドメイン（ＡＤ）に融合したｓｃＦｖのライブラリーからなる細胞内抗体を単離するための遺伝子スクリーニング研究法（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．、Ｔｓｅ，Ｅ．、Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｈ．、Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８（１９９９））。酵母細胞内環境での抗原ベイトと特異的ｓｃＦｖとの間の相互作用により、酵母染色体レポーター遺伝子、例えばＨＩＳ３およびＬａｃＺを活性化できる複合体の形成に至る。これはｓｃＦｖをコードするＤＮＡベクターを担持する酵母の同定、および、従って単離を促進する。この研究法の限界は酵母抗体−抗原相互作用系においてスクリーニングできるｓｃＦｖ−ＶＰ１６融合クローンの数である（２−５×１０6までが都合よい）。この数字はファージ上に表示されるｓｃＦｖレパートリーの大きさよりも十分に小さい（Ｓｈｅｅｔｓ，Ｍ．Ｄ．、Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｐ．、Ｆｉｎｎｅｒｎ，Ｒ．、Ｓａｒｇｅｎｔ，Ｐ．、Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ，Ｅ．、Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．、Ｈｅｍｉｎｇｓｅｎ，Ｇ．、Ｗｏｎｇ，Ｃ．、Ｇｅｒｈａｒｔ，Ｊ．Ｃ．およびＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２（１９９８）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））。従って、酵母内でインビボでスクリーニングされるｓｃＦｖの数を制限するために、インビボ酵母抗体−抗原相互作用スクリーニングの前に、抗原として組換えタンパク質を用いてインビトロファージｓｃＦｖライブラリースクリーニングの１ラウンドを用いた。ＢＣＲおよびＡＢＬに対する抗原特異的な細胞内抗体を得るための試験計画全体のフローチャートを図１に示す。
【０１７９】
組換えタンパク質としてＢＣＲタンパク質の結合ドメインのＳＨ２（ＢＣＲ）またはＡＢＬのＳＨ２ドメイン（ＡＢＬ）のいずれかを発現させることにより、インビトロスクリーニングのためのタンパク質抗原を作製した。精製された抗原を用いてインビトロでｓｃＦｖファージディスプレイ・ライブラリー（Ｓｈｅｅｔｓ，Ｍ．Ｄ．、Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｐ．、Ｆｉｎｎｅｒｎ，Ｒ．、Ｓａｒｇｅｎｔ，Ｐ．、Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ，Ｅ．、Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．、Ｈｅｍｉｎｇｓｅｎ，Ｇ．、Ｗｏｎｇ，Ｃ．、Ｇｅｒｈａｒｔ，Ｊ．Ｃ．およびＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２（１９９８））（Ｄｒ．Ｊａｍｅｓ  Ｍａｒｋｓより寄贈）をスクリーニングした。ライブラリーはヒト由来の脾臓細胞および末梢血リンパ球から誘導し、そして最初の多様性は６．７×１０9であった。増幅されたライブラリーからの全部で２×１０13個のファージを精製されたタンパク質フラグメントでスクリーニングした。インビトロ・ファージスクリーニングの１ラウンドの後、約１０5個の抗原結合ファージを回収した（図１）。これらのサブライブラリーは抗原特異的ｓｃＦｖの富化のために複雑さが低減した。ｓｃＦｖをコードするファージミドＤＮＡを抽出し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントを酵母プレイ発現ベクターにサブクローニングしてＢＣＲおよびＡＢＬに関して各々３．２×１０5および１．３×１０5の酵母ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ＡＤライブラリーを作成した（すなわち富化されたファージサブライブラリーサイズの元来のサイズの約３倍）。サッカロミセス・セレビジエＬ４０をＢＣＲ−ＡＢＬ  ｐ１９０（ｐＢＴＭ／Ｅ１Ａ２）を発現するベイトプラスミドおよびＢＣＲまたはＡＢＬ  ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ＡＤライブラリーで同時形質転換することにより、インビボ酵母抗体−抗原相互作用スクリーニングを実施した（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８（１９９９）；Ｔｓｅ，Ｅ．、ら、Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔａｗａ（２０００））。全部でおよそ８．５×１０5個の酵母コロニーをスクリーニングし、そして１１７個の（抗ＢＣＲ）または抗ＡＢＬ酵母コロニーを選択し、そしてβガラクトシダーゼ（βガル）フィルターアッセイを用いて確認し（図１）、酵母細胞質内のｓｃＦｖとＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質との間の相互作用を示した。
【０１８０】
ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ＡＤプラスミドを酵母クローンから単離し、そしてＢｓｔＮＩ  ＤＮＡフィンガープリントパターンに従って異なる群に分類し、４５個（抗ＢＣＲ）および２４（抗ＡＢＬ）クローンを生じた。群の典型例を用いて元来の抗原ベイトでの再トランスフェクションならびにヒスチジン非依存的成長およびβガル活性化によるアッセイにおいて、ｓｃＦｖと抗原との細胞内結合を検証した。このように、βガルの活性化により１０個の抗ＢＣＲおよび１２個の抗ＡＢＬ  ｓｃＦｖを検証した。この実例を図２に表し、ここで酵母における抗ＢＣＲ  ｓｃＦｖとＢＣＲ−ＡＢＬとの相互作用を示す。ＢＣＲ−ＡＢＬに対するｓｃＦｖ結合の特異性を、酵母インビボアッセイにおけるそれらと、関連性のない抗原（植物ウイルスコートタンパク質抗原ＡＭＣＶ）との相互作用の欠如により（図２Ｂ）、およびＢＣＲ−ＡＢＬベイトに対する関連性のないｓｃＦｖ  Ｆ８の結合の欠如により（図２Ａ）さらに検証した（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，Ｐ．Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ，Ｅ．、Ｔｒｉｎｃａ，Ｓ．、Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｉｓ，Ｄ．、Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ａ．およびＧａｌｅｆｆｉ，Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６６：４６９−４７２（１９９３））。
【実施例７】
【０１８１】
細菌における抗原特異的ｓｃＦｖの発現
個々のｓｃＦｖの発現レベルを最初に細菌細胞膜周辺腔発現により試験した。捕捉されたｓｃＦｖを発現ベクター、ｐＨＥＮ２にサブクローン化し、該ベクターはインフレームでヒスチジンおよびｍｙｃエピトープタグを伴う可溶性ｓｃＦｖタンパク質の細胞膜周辺腔発現を可能にするＰｅ１Ｂリーダー配列をｓｃＦｖに対して５’で有している。細胞膜周辺腔ｓｃＦｖ抽出物を免疫検出のために抗ｍｙｃタグ抗体、９Ｅ１０を用いてウェスタンブロッティングした（図３Ａ、Ｂ）。不定レベルのタンパク質が発現される。抗ＡＢＬ  ｓｃＦｖ（図３Ａ）の最高レベルがＡ３２に関して見出され、一方例えばＡ６に関してさらに低レベルのタンパク質を検出できた。同様に、抗ＢＣＲ  ｓｃＦｖは発現における変動性を停止、Ｂ１０は最高に発現された抗体フラグメントであるが、一方Ｂ９およびＢ３３は低レベルで存在した（図３Ｂ）。これらの変動はフォールディング特性の差異を反映することができ、そしてさらに細菌におけるヒトｓｃＦｖに関するコドン優先性によるかもしれない。
【実施例８】
【０１８２】
ＩＣ抗体と抗原とのインビトロ相互作用
ＢＣＲおよびＡＢＬ抗原が膜に固定された場合、ＢＣＲとＡＢＬ抗原とを識別するためにｓｃＦｖの能力の比較により抗体特性を調査した。種々の細胞膜周辺腔ｓｃＦｖを、適合する大きさおよびレベルの細菌合成されたＢＣＲおよびＡＢＬ抗原に対する結合に関して試験した（図３Ｃ、Ｄ）。ｓｃＦｖの関連する抗原への結合は細胞膜周辺腔発現のレベルに匹敵した。抗ＡＢＬパネルでは、ｓｃＦｖＡ３２はその効率のよい発現との調和においてＡＢＬタンパク質と定量的に最高の相互作用を有し、一方Ａ６は恐らく低レベルのｓｃＦｖのために抗原を弱く検出した。ＡＢＬおよびＢＣＲ抗原の双方と交差反応すると思われるＡ２０を除いてたいていの場合、２つの抗原間のｓｃＦｖにより識別を観察したが、大きさが無傷の抗原のほぼ３０ｋＤａよりもむしろほぼ１６ｋＤａであることを鑑みて、ＢＣＲ抗原は分解された形態かもしれない。
【０１８３】
抗ＡＢＬ  ｓｃＦｖと同様に、抗ＢＣＲ  ｓｃＦｖのＢＣＲ  ＳＨ２結合ドメインタンパク質に対する結合の程度と、細胞膜周辺腔発現のレベルとの間に明確な関係があった（図３Ｄ）。同一のブロットにおけるＡＢＬタンパク質のＳＨ２ドメイン（アミノ酸２６−３４８）に対するｓｃＦｖの結合の欠如により特異性が実証された（図３Ｄ）。従って、細胞膜周辺腔ｓｃＦｖを、ＩＣＡ技術を用いて選択されたｓｃＦｖから調製する場合、たいていの抗体がインビトロおよびインビボで特異的抗原認識を呈する。
【実施例９】
【０１８４】
哺乳動物細胞における単離されたｓｃＦｖと標的抗原とのインビボ相互作用
我々のデータは、ＩＡＣ技術を用いて、インビボ抗原結合および抗原に関する特異性を示すＩＣ抗体を開発できることを示している。抗体−抗原相互作用スクリーニングを開発した我々の以前の仕事では（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．、Ｔｓｅ，Ｅ．、Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｈ．、Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８（１９９９）；Ｔｓｅ，Ｅ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｇ．およびＲａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ；Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔａｗａ（２０００））、哺乳動物レポーターアッセイを用いてＩＣ抗体の効率を評価することができることをも示した。これは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化により測定される抗ＢＣＲ  ｓｃＦｖと抗原との相互作用を試験することにより模倣された。ｓｃＦｖを哺乳動物プレイルシフェラーゼベクターにクローン化し、そしてＢＣＲ−ＡＢＬベイトをｐＭ３にクローン化した（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｉ．、Ｂｅｌｌ，Ｂ．、Ｂｒｏａｄ，Ｐ．およびＨｏｌｌｉｓ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１８：１３７−１４１（１９９２））。トランスフェクションレベルを調節するために標準Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと共に、これらをＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした。用いた標的抗原がＢＣＲ−ＡＢＬである場合、種々のレベルの活性化が観察された（図４Ａ）が、関連性のない抗原βガルを用いた場合、活性化は観察されなかった（図４Ｂ）。ｓｃＦｖ  Ｂ１０では一貫して最高の活性化レベルが見出された。ＢＣＲ−ＡＢＬベイトおよび無関係のｓｃＦｖ  Ｆ８では活性化は観察されなかった（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，Ｐ．Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ，Ｅ．、Ｔｒｉｎｃａ，Ｓ．、Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｉｓ，Ｄ．、Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ａ．およびＧａｌｅｆｆｉ，Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６６：４６９−４７２（１９９３））。
【実施例１０】
【０１８５】
選択された細胞内抗体の配列比較
ＩＡＣ技術により選択されたｓｃＦｖのパネル比較を、ヌクレオチド配列の決定および対応するアミノ酸配列への翻訳により行った（図５）。１８個のＩＣ抗体をアラインし（６個の抗ＢＣＲおよび１２個の抗ＡＢＬ）、そして重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）可変領域の双方に関してコンセンサス配列を誘導した。これらの配列データを比較した。
【０１８６】
ＩＣ抗体パネルのたいていのＶＨセグメントはＪＨ５領域に連結されたＶＨＩＩＩサブグループに入る。これはある程度ファージライブラリーにおける最初のバイアスを反映する（Ｓｈｅｅｔｓ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２（１９９８））が、無作為ｓｃＦｖ（選択されたものではないが）は別のサブグループの典型を有する（図５ＡおよびＢ並びに公開されていないＭＮＬＣ）。相補性決定領域ＣＤＲ１およびＣＤＲ２における選択されたおよび無作為の双方のｓｃＦｖに関するコンセンサスを得ることができるが、ＣＤＲ３は配列および長さが強く異なり、これは抗体結合部位におけるＣＤＲ３の公知の重要性を反映している（Ｘｕ，Ｊ．Ｌ．およびＤａｖｉｓ，Ｍ．Ｍ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００））。ＩＡＣ  ＶＨＩＩＩコンセンサスは、グルタミン酸残基よりむしろグルタミンである残基３（Ｋａｂａｔコンセンサスの残基１）を除いてフレームワークの全ての位置で、Ｋａｂａｔコンセンサス（Ｋａｂａｔ，Ｅ，Ａ．Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．およびＦｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版（１９９１）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ：米国国立衛生研究所）に対合する（図５Ａ）。ＩＣ抗体間で変化する各フレームワーク位置での残基は、個々のＶＨ遺伝子29よりもより制限されており、そしてさらにＣＤＲ１／２保存は細胞内活性と適合するこの位置での変化の容認性の限界に応じている。実際に、ＣＤＲ１の３つの残基のみが異なる抗原特異的ＩＣ抗体の同一フレームワークを伴うｓｃＦｖを単離した。従って、ＶＨＩＩＩフレームワークは細胞内発現、可溶性および機能に関して影響を受けやすく、そして非無作為ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の寄与もまた明らかである。詳細な変異誘発研究により、細胞内効率を大きく促進し得る別の変化を示すことができたが、本明細書で論じるＶＨＩＩＩコンセンサスは将来的なＩＡＣの使用のためのＣＤＲ変動性を築く少なくとも１つのバックボーンを提供する。抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ  ＩＣ抗体セットにおけるＬ鎖可変領域もまたコンセンサスの誘導、この場合ＪｋＩに連結されたＶκＩサブグループ（図５Ａ）に対する対合を可能にする。ＶＨとは異なって、３つ全てのＣＤＲ領域に関するコンセンサスを得ることができた。ＩＣ抗体  ＶＬコンセンサスとライブラリーからの無作為ｓｃＦｖから得られたものとの比較により（図５Ｂ）、後者がより大きな全体変動性を表すことを示している。ＩＣ抗体ＶκＩコンセンサスでの２者間で異なる各残基は、ＫａｂａｔデータベースによるＶκＩコンセンサスでの２者間で異なる各残基と同一であり、これはＩＣ抗体コンセンサスが保存されており、そして細胞内使用のためのｓｃＦｖ  ＶＬ配列のためのバックボーンを提供することができることを示している。
【０１８７】
試験計画（Ｂ）
【実施例１１】
【０１８８】
ＩＡＣＴ法による機能的細胞内抗体の選択
ＴＡＵ微小管に随伴されるタンパク質の欠失変異体を記載されるように（Ｆａｓｕｌｏ，Ｌ．ら（１９９６）、Ｆａｓｕｌｏ，Ｌ．ら（２０００））操作し、そしてｐＢＴＭ１１６ベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限部位にクローン化した。Ｍ１３繊維状ファージの表面に表示した抗体フラグメントの非免疫ライブラリーを抗体の選択に使用した（Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８））。ＴＡＵタンパク質の１５１−４２１フラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ベクター（ＮＥＢ）のｍａｌＥ遺伝子の下流にクローン化した。同一ベクターｐＭＡＬ−ｃ２を用いてＴＡＵ１５１−４２２タンパク質を生成した。製造者に示唆されたプロトコルに従って、記載されるように（Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｏ．Ｋ．ら（１９８２））アフィニティーカラムでタンパク質を精製した。Ｋｏｎｔｓｅｋｏｖｅ，Ｅ．ら（１９９５）に記載されるように細菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）からＴＡＵヒトタンパク質を精製した。
【０１８９】
Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ，Ｄ．（２０００）に記載されるプロトコルに従って、選択に用いた固相に予め吸収させたＴＡＵ１５１−４２１でＳｈｅｅｔｓら（１９９８）に記載された非免疫ライブラリーを検定した。選択の１および２ラウンド後、いくつかのクローンを単離し、そしてＤＮＡ増幅およびＢｓＴＮＩでの消化によるｓｃＦｖをコードする遺伝子のフィンガープリントにより特徴づけした。次いで単離されたＤＮＡをシークエンシングして得られた多様性を確認した。
【０１９０】
次いでファージミドＤＮＡを単離し、そして同一の制限酵素で予め消化したＶＰ１６ベクター（Ｖｏｊｔｅｋ，Ａ．Ｂ．ら（１９９３））のＳｆｉｌ−Ｎｏｔｌ部位で連続的にクローン化した。Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．ら（１９９９）およびＶｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．ら（２００１）に記載されるように、ｓｃＦｖ抗ＴＡＵ／ＶＰ１６  ＡＤＩおよびＡＤＩＩライブラリーをｌｅｘＡ−ＴＡＵに対して連続的に検定した。得られたクローンの９０％がヒスチジン不含培地で成長し、そしてβガル試験の後に青色になった。Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．ら（２００１）に記載される方法に従って、酵母からｓｃＦｖ抗ＴＡＵをコードする約１００個のクローンを単離し、そして前記したようにＢｓｔＮＩフィンガープリンティングおよびシークエンシングにより単離されたＤＮＡを分析した。個々のクローンをさらにＩＡＣＴによりＴＡＵに対して試験した。
【０１９１】
後者の分析の後に陽性であると判明したｓｃＦｖを、次いで可溶性形態でタンパク質を発現させる目的のためにファージミド発現ベクターにクローン化した。得られたタンパク質をアフィニティーカラムで精製し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにより、ゲル濾過で分析した。次いでｓｃＦｖを真核細胞発現ベクター、ｓｃＦｖｅｘｐｒｅｓｓおよび核ｓｃＦｖｅｘｐｒｅｓ（核におけるｓｃＦｖの発現用）で連続的にクローン化した（Ｐｅｒｓｉｃら（１９９７））。Ｆａｓｕｌｏ，Ｌ．ら（１９９６）に記載されるプロトコルにより、またはＣＨＯ細胞をトランスフェクトするために用いられるＦｕＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコルに従って、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞系を一過性にトランスフェクトした。免疫蛍光でのトランスフェクションの３０から４８時間後に細胞を分析した。
【０１９２】
Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ  Ｅｘｃｅｌ  ＩＩキットを用いて、元来のライブラリー（Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８））の１６個のｓｃＦｖおよびＩＡＣＴにより選択された２５個の抗ＴＡＵをシークエンシングした。Ｌｉ−Ｃｏｒ４０００Ｌ自動シークエンサーをＤＮＡ分析の自動シークエンシングに使用した。
【０１９３】
結果
Ｖｉｓｉｎｔｉｎら（１９９９）により開発され、そして特許出願ＰＣＴ国際公開公報第００／５４０５７号に記載された技術、ＩＡＣＴ（細胞内抗体捕捉技術）（図２）を用いて多くの異なる抗原のパネルに対する細胞内使用のための抗体を選択した。ヒトＴＡＵタンパク質に対する選択の例を本明細書にて詳細に記載する。ＴＡＵは微小管と結合するタンパク質のファミリーに属する神経タンパク質であり、そしてアルツハイマー病の病理学的マーカーである。
【０１９４】
ＩＡＣＴ法を用いて抗体を単離する目的のために、ヒトＴＡＵタンパク質の欠失変異体（Ｉｌｅ１５１−Ｓｅｒ４２２）とマルトース結合タンパク質ＭＢＰ（ＴＡＵ−ＭＢＰ）間で融合タンパク質を操作した。大腸菌で発現されたタンパク質をＮｉＮＴＡアフィニティーカラムで精製し、そして次にファージ上に発現されたヒト抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）のライブラリーのインビボ予備選択に使用した（Ｓｈｅｅｔｓ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９８））（図２、ステップ１）。このステップは、酵母の低効率の形質転換と適合し得る抗ＴＡＵ  ｓｃＦｖで富化された異種性集団を作製するのに必要であることが判明した。抗体フラグメントの非免疫ライブラリーのインビトロ予備選択の２つの連続したラウンドでＴＡＵ−ＭＢＰを使用した。予備選択の第１のサイクルおよび第２のサイクルでで富化されたライブラリーの多様性を、縮重したオリゴヌクレオチドを伴うｓｃＦｖをコードするＤＮＡの増幅の後のフィンガープリントの分析（サイクルあたり１００個のクローン）により（Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ，Ｄ．ら（２０００））、およびいくつかのｓｃＦｖのシークエンシングにより定量した。第１サイクルの後、約９０％のクローンが異なっていることを見出し、一方第２サイクルの後、１００個のうち１３個のクローンのみが異なっていることを見出した（表１）。第１および第２サイクルのいくつかのクローンを単離し、そしてＥＬＩＳＡでインビトロ検定してＴＡＵとの相互作用を検証した。第１のサイクルのこれらのクローンおよび第２のサイクルの９個はＥＬＩＳＡにおけるＴＡＵと反応することを見出した。その他の抗原に対して試験したこれらのクローン（図３ａ）（ＭＢＰおよびＢＳＡ）がＴＡＵ特異的であることを見出した。
【０１９５】
このステップの後、第１および第２サイクルの抗ＴＡＵ  ｓｃＦｖで富化されたライブラリーを酵母発現ベクター、ＶＰ１６にクローン化して転写の活性化ドメインの５’で融合された２つのライブラリーＶＰ１６（抗ＴＡＵ／ＶＰ１６ＡＤＩおよび抗ＴＡＵ／ＶＰ１６ＡＤＩＩ）を作成した。抗ＴＡＵ／ＶＰ１６ＡＤＩライブラリーは２．２ｅ１０6  ｓｃＦｖからなり、一方抗ＴＡＵ／ＶＰ１６ＡＤＩＩライブラリーは６ｅ１０4  ｓｃＦｖから形成された。
【０１９６】
抗ＴＡＵ  ｓｃＦｖをインビボで単離するために、このように作成したライブラリーをＴＡＵ（Ｉｌｅ１５１−Ｓｅｒ４２２）とｌｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメインとの間の融合タンパク質（ｌｘＡ−１５１−４２２ＴＡＵ）に対して試験した（図２、ステップ２）。これらの２つのサブライブラリーで形質転換した酵母を最初にそのヒスチジンとの原栄養に関して検定した。ヒスチジンの不在下で成長した１０5個のクローンを、ｌａｃＺ遺伝子を活性化する能力に関して連続的に検定した（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．ら（２００１））。ＨＩＳ３+およびｌａｃＺ+表現型を有することが見出されたいくつかのクローンのＤＮＡを単離し、そしてフィンガープリントにより分析し、そして次にシークエンシングした。抗ＴＡＵ／ＶＰ１６ＡＤＩライブラリーのスクリーニングにおいて、３１個の異なるクローンを単離したが、一方抗ＴＡＵ／ＶＰ１６ＡＤＩＩライブラリーのスクリーニングでは、５個が単離されただけであった。これらのクローンのうち、（抗ＴＡＵ／ＶＰ１６ＡＤＩライブラリーの）１７個および（抗ＴＡＵ／ＶＰ１６ＡＤＩＩライブラリーの）３個のみが（図３ｂ、および表１）第２のＩＡＣＴスクリーニングの後に陽性であることが確認された。これらのＩＣ抗体のＴＡＵに関する特異性を、抗ＴＡＵ  ｓｃＦｖを別の抗原で同時形質転換することにより評価した。ＩＡＣＴで選択された抗ＴＡＵは試験したいずれの抗原とも交差反応しないことが見出された。３個の抗ＴＡＵ  ｓｃＦｖをもまた大腸菌で発現され、そして細胞膜周辺腔から単離された可溶性タンパク質をＥＬＩＳＡでＴＡＵおよびＴＡＵの２個の欠失変異体に対して試験した（図３ｃ）。３個のｓｃＦｖ全てがＴＡＵおよびその欠失変異体に対してインビトロで相互作用することができた。
【０１９７】
【表１】
2004538324.tif 000004
【０１９８】
出発ライブラリーから無作為に単離された４つの抗ＴＡＵ  ｓｃＦｖをＴＡＵタンパク質に対するＩＡＣＴで、インビボで試験した。これらの抗体はＶＨＩＩＩファミリーに属する。これらのｓｃＦｖはどれもＴＡＵタンパク質とインビボで相互作用できないことが観察された。この結果は、インビボ選択がイントラボディーを得るために必要であるという事実を強調している。ＩＡＣＴで選択されそして有効な３つの抗ＴＡＵを、次いでその溶解性、凝集の傾向および安定性を検証する目的のために、生化学的技術および細胞生物学の研究により分析した（Ｗｏｒｎ，Ａ．ら（１９９９））。ゲル濾過により精製された抗体の分析により、分析した３個のｓｃＦｖがｓｃＦｖの単量体形態に相当する溶出ピークのたいていの部分で生じることが実証された（図３ｄ）。これらの３個のｓｃＦｖのアフィニティーを、競合ＥＬＩＳＡを用いて、およびＢｉａｃｏｒｅで算出し、そしてｋＤＡは１００から３５０ｎＭの範囲で変化する値を有する。インビボで異なる細胞系（ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＰＣ１２）で発現された３個のｓｃＦｖは高度に可溶性であり（図４）、ＴＡＵと結合し、そして抗体フラグメントが核局在シグナルと共に融合タンパク質として発現される場合、このタンパク質が細胞質タンパク質として発現され得るときはいつも、核においてＴＡＵを誤った場所に局在化させることができる（図５）。さらにこれらのｓｃＦｖの１つはＰＣ１２神経細胞系において内因性ＴＡＵを認識し、そしてニューロトロフィンＮＧＦ（ニューロン成長因子）により媒介される軸策成長を阻止することが見出された（Ｍｅｌｃｈｉｏｎｎａら（２００１））。
【実施例１２】
【０１９９】
ＩＡＣＴ法で単離された抗体の配列の分析
前記したｓｃＦｖのアラインメントおよび分析をＫａｂａｔデータベースに従って評価した。ＩＡＣＴで選択した抗体の全ての配列を含有するデータベースを設定した（ＶＩＤＡ、有効なイントラボディーデータベース）。ＶＩＤＡは特に前記した抗ＴＡＵ抗体の配列を含有する。さらにＶＩＤＡは文献に記載された有効な細胞内抗体の配列を含有する。抗体のアミノ酸のナンバリング（ＶＩＤＡ配列およびＫａｂａｔデータバンクの配列の双方）をＫａｂａｔスキームに従って行い（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．（１９９６）；Ｄｅｒｅｔ，Ｓ．（１９９５））、これを全ての配列とのアラインメントに互いに使用した。Ｓｅｑ  Ｔｅｓｔプログラム（Ｎａｒｔｉｎ，Ａ．（１９９６））によりアミノ酸のナンバリングを自動的に行った。抗体鎖の各位置に関する各アミノ酸の頻度を決定した。
【０２００】
「コンセンサス」（または「コンセンサス配列」）を、既定の配列セットに関して、および該配列に沿った特定の位置のサブセットに限定して、前記のサブセットの確定された位置で、最も高頻度で生じるアミノ酸が存在する配列として定義する。残りの位置ではアミノ酸は確定されない。
【０２０１】
ＶＩＤＡに存在する抗体の配列の分析を実施する目的のために、該配列を、それが由来する種（マウスまたはヒト）に従って分類し、ＶＬおよびＶＨドメインを別個に扱う。以下の４個のサブセットを同定する。
ヒトＶＨ：２４個の配列からなる
ヒトＶＬ：２４個の配列からなる
マウスＶＨ：１２個の配列からなる
マウスＶＬ：１２個の配列からなる。
【０２０２】
作製、続いて相同性セット間での比較の目的のために、細分の同一の型をＫａｂａｔデータバンクに存在する抗体の配列に適用した（細胞内発現に関しては概して試験されない）。
【０２０３】
ＶＩＤＡの各サブセットに含まれる抗体配列の分析により保存されるアミノ酸残基の群を同定することが可能になった。この残基の群をＩＣＳ（イントラボディーコンセンサス配列）と称し、そしてこれにより４個の異なるＩＣＳ（ヒトＩＣＳ−ＶＨ、ヒトＩＣＳ−ＶＬ、マウスＩＣＳ−ＶＨ、マウスＩＣＳ−ＶＬ）を定義することが可能になる。各ＶＩＤＡサブセットの抗体間の相同性の閾値に基づいて（絶対コンセンサス、９０％コンセンサス等）、異なるＩＣＳを定義することが可能である。各々の参照群に関して、いかに記載するアルゴリズムを伴う最適ＩＣＳが得られる。
【０２０４】
ＶＩＤＡ配列に基づいて、誘導により抗体の一般配列からイントラボディーの配列を（抗体の各サブセットに関して別個に）区別することを可能にする手順が工夫された。
ａ）最も高頻度のアミノ酸が見出される可能性が予め決定された閾値ＬＰ（コンセンサス閾値）を超える位置に算出を限定して、各々のＶＩＤＡサブセットのコンセンサス配列を算出する。これはイントラボディーコンセンサス配列（ＩＣＳ）を表し、そして各ＶＩＤＡサブセットに関して１つある。
ｂ）以前に同定された配列の４個のサブセットの各々に関する２つの分布を作成する。これらの分布は、その群に関係するＩＣＳコンセンサス配列に関するＶＩＤＡデータセット（緑色）のまたはＫａｂａｔデータセット（赤色）の各抗体の識別番号を表す（図１０、右側のコラム）。
ｃ）分布の各対（赤色および緑色）に関して、必要な場合、その「相対的多様性」の測定値を導入する。２つの分布間の多様性Ｄの程度の測定に関する種々の定義を用いることが可能である。我々は、問題の２つの分布の平均値の差と標準偏差の合計との間の比率の絶対値としてＤを選択することを選んだ。この比率が１よりも大きい場合、分布は異なっていると考えられる。
ｄ）ＬＰの異なる値に関して反復的に手順を繰り返し、新たな分布を決定する。４つのクラスの各々に関してＬＰの変動を伴う手順を繰り返して（例えばコンセンサス閾値ＬＰ７０％からコンセンサス閾値ＬＰ１００％まで、１−２％のステップで）、Ｄの最大値を生じるＬＰの最適値を見出すことが可能である、すなわち種々の分布対（赤色および緑色）の最高の区別が可能になる。従って、概して４個のＶＩＤＡサブセットの各々に関して異なるＬＰ値がある。
【０２０５】
従って、その配列が既にＶＩＤＡの一部を形成する所与の抗体が、イントラボディーであるか、またはないかを同定するための手順は以下のとおりである。ＶＩＤＡ分布と「適合」し、Ｋａｂａｔとは適合しない多くの部位（図１０右側のコラム）に関してＩＣＳが異なる配列はイントラボディー（細胞内結合抗体）である（２つの分布が実際に区別され得る場合）。「適合性」の作成は以下のように確立される。ＤとＶＩＤＡの標準偏差との積を加えたＶＩＤＡ分布の平均値よりも低いことが見出された場合、異なる部位の数はＶＩＤＡと適合し、そしてＫａｂａｔとは適合しない（ｂ）。実際には、既にＶＩＤＡに含まれる配列ではない配列によりＩＣＳとは異なるこれらの配列は、それとは異なり、イントラボディーであると考えられる。
【０２０６】
概して、最適ＩＣＳはＶＩＤＡデータベースの大きさに依存すると予測される。実際に種々ＶＩＤＡサブセットに含まれる配列の数の増加に伴って手順は益々精緻化される。既に我々が所有している配列に基づいて、最適ＩＣＳの収束に至るのに必要とされる配列の数を推定することは可能である。従ってこれは、得られた最適ＩＣＳが、新たな配列を加えたときに変化すべきでないように、ＶＩＤＡに存在する配列の数を推定する事柄である。新たなＶＩＤＡ配列が、現在我々が所有している配列の同一程度の変動性を保存するという仮定の上に推定を行うことができる。特に、ＶＩＤＡの一部分のみを用いてＩＣＳを算出することはいつも可能である。ＶＩＤＡはＮ配列からなると仮定する。ｍ＜Ｎ配列だけを用いてＩＣＳを算出することが可能であり、そして２項の（Ｎ、ｍ）異なる方法でこれを行うことができる。次いで各々の固定のｍに関して算出したＩＣＳ間で相同性の平均を測定することができる。この手順により、我々のものであるＶＩＤＡ配列のセットが、ＩＣＳ間の相同性の平均がｍの関数として漸近値まで飽和するのに十分大きいかどうかを理解することが可能になる。現在利用できるデータセットに関して算出されたこの推定値により、ＶＩＤＡの現在の大きさで、漸近値に遠くはないということを既に結論することが可能になった。
【０２０７】
抗体配列の分布を観察する別の方法は、偶然それを見出す可能性を評価すること、特定のアミノ酸Ａをｉの位置で見出す可能性Ｐi（Ａ）が、アミノ酸が存在する別の位置に依存せず、そしてデータバンクの位置ｉでＡを見出す頻度に基づいて決定されると仮定することからなる。所与の配列ｓに関してこの値を、
【数２】
2004538324.tif 000005
と記し、ここでＡs,iは配列ｓのｉの位置のアミノ酸である。無限の生成物を配列の全ての部位にまで広げることができるか、またはサブセットに限定することができる。
【０２０８】
結果
ＩＡＣＴ（ＶＩＤＡセット）で選択したＩＣ抗体の１７個の配列を出発ライブラリー（対照セット）から無作為に抽出した１６個のｓｃＦｖ配列と比較した。ＶＩＤＡセットの全てのＶＨドメインはサブグループＶＨ  ＩＩＩに属し（Ｄｅｒｅｔ，Ｓ．（１９９５））（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．（１９９６））、一方１３個のＶＬドメインはサブグループカッパＩに、そして４個のＶＬドメインはカッパＩＶに属する。同様に対照セットでは、多くの配列がサブグループＶＨ  ＩＩＩに属する（１個のみ異なり、ＶＨ  ＩＩに属する）。一方、ＶＬドメインでは、１０個の配列がサブグループカッパＩに属し、そして６個がラムダ（主にラムダＩＶ）に属する。対照セットの配列間の相同性の平均はＶＨドメインに関しては６９％、そしてＶＬドメインに関しては５９％である。ＶＩＤＡセット内での平均相同性（ＶＨに関しては８５％、ＶＬに関しては７７％）は対照セットよりも大きい。ＶＩＤＡセット内では、ＶＨドメインで７６個のアミノ酸（２個はＣＤＲ１に属し、２個はＣＤＲ２に属し、１個はＣＤＲ３に属する）、および４４個のＶＬドメインが保存される。保存されたアミノ酸は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの双方に関して細胞内抗体（コンセンサスＩＣＳ）に特徴的であるコンセンサス配列を定義する（図１１）。
【０２０９】
実施した最初の分析により驚くべきおよび予想外の結果が得られた。各々のＶＩＤＡおよびＫａｂａｔ配列に、Ｋａｂａｔサブセットの頻度Ｐi（Ａ）に基づいて算出したＰsを指定した（方法参照）；この点で、ＶＩＤＡ分布を対応するＫａｂａｔサブセットの分布と比較することが可能になる。比較（従って、Ｐsに関して式に存在する無限積）を配列全体まで広げた場合、２つの分布ＶＩＤＡおよびＫａｂａｔを区別することができない；実際に、ＶＩＤＡ配列は対応するＫａｂａｔサブセットで得られた値に匹敵する値を有している。しかしながら、次に驚くべきことに、比較を各々のＩＣＳの部位だけに限定すると、ＶＩＤＡ配列が全て、最も高い可能性を有するＫａｂａｔ分布のテイルに配置される（図１２）。これは、ＩＣＳにより定義された残基のサブセットがＫａｂａｔデータベースに存在する全ての抗体の十分に定義されたサブ集団を同定することを示している。これはＩＣＳが細胞内抗体であることの特性の良好なマーカーであることを示している。
【０２１０】
この結果は別の型の分析で確認された。ＶＨおよびＶＬドメインに関するＩＣＳコンセンサス配列とＫａｂａｔデータバンクから抽出されたコンセンサス配列（Ｋａｂａｔコンセンサス配列）との間の相同性の程度を測定した。表２で定義された種々のサブグループに関して比較を行った。ＶＩＤＡセットのＶＨドメインに保存された７６個のアミノ酸の２個を除いて全てが、Ｋａｂａｔデータバンクから抽出されたセット番号１の配列の類似の位置で、最大頻度で見出されたアミノ酸と合致する。さらに、２つのセット間で一致が確認されていない２つの位置は、ＶＩＤＡセットでは、Ｋａｂａｔセット番号１で最高頻度のもの（６７位置ではＶＡＬおよび７３位置ではＴＨＲ）よりも少しだけ低い頻度を表示されるアミノ酸（６７位置ではＰＨＥおよび７３位置ではＡＳＮ）により占有されている。ＩＣＳ配列のＫａｂａｔセット番号３（サブグループＶＨ  ＩＩＩ）との比較により、位置１のＧＬＮのみがＧＬＵと同様の頻度では見出されないが、その他の全ての部位での一致は完全である。一方、ＶＩＤＡセットで保存された７６個のアミノ酸のうち２７個はＫａｂａｔセット番号２（マウスＶＨ）で最高頻度のものと合致せず、これは種の相違を反映している。
【０２１１】
ＶＬドメインの配列に関しては、ＶＩＤＡセットで保存された４８個の位置のうち４７個がＫａｂａｔセット番号４（ヒトＶＬ配列から形成された）の最高頻度のアミノ酸と合致する。ＶＬドメインに関してＩＣＳ配列に属する４８個の残基のうち４個のみがＫａｂａｔセット番号５（マウス抗体のＶＬドメイン）で最高頻度のものと異なるが、４８個全てのアミノ酸はＫａｂａｔセット番号６（ヒト抗体のサブグループＶκのＶＬドメイン）で、最高頻度で見出されるものと合致する。最後に、ＩＣＳ配列の４８個のアミノ酸のうち１０個はＫａｂａｔセット番号７（ヒト抗体のサブグループＶラムダに属するＶＬドメインの配列）で、最高頻度であるものと合致しない。
【０２１２】
【表２】
2004538324.tif 000006
【０２１３】
従って、記載した分析により、帰納的には定義された位置で（すなわちＶＩＤＡセットで完全な保存が存在する位置で）ヒト抗体のＶＬおよびＶＨドメインのＫａｂａｔコンセンサス配列と合致することが見出される、各可変抗体ドメインに関する部分的コンセンサス配列ＩＣＳを定義することが可能になる。
【０２１４】
この特徴（すなわち有意であるが、完全ではなく部分的なヒトＶＬおよびＶＨドメインのアミノ酸の最高のコンセンサスの配列との相当な相同性）がＫａｂａｔデータバンクから無作為に選択された抗体の配列間でどの程度生じるかを明確にするのは興味深いことである。この目的のために、各コンセンサス配列と関連する、Ｋａｂａｔから抽出された種々のサブセットに含まれる配列の相同性の程度を分析し、分析は前記で定義したＩＣＳコンセンサス配列が定義される位置（ＶＨドメインに関しては７６、およびＶＬドメインに関しては４８、図１３参照）に限定した。この分析により、最大コンセンサスのＫａｂａｔ配列との最高の相同性が存在する領域では、配列密度が限定される、すなわちＫａｂａｔデータベースにはＫａｂａｔコンセンサス配列に非常に類似する抗体は少ししかないことが示される。（Ｋａｂａｔコンセンサス配列は仮想の配列であることを想起すべきである。）
【０２１５】
適当なサブセットに関して評価された、Ｋａｂａｔコンセンサス配列に関連するＶＩＤＡセットの配列の相同性の程度を、しかしＩＣＳにより定義された位置に関してのみ、図１３に示す（図１３のドット参照）。驚くべきことに、ＶＩＤＡセットの配列は、データベース自体に抗体が少ししかない、これらの分布の最も遠いテイルに配置される。従って、ＶＩＤＡセットの配列（細胞内抗体）はＫａｂａｔサブセットのコンセンサス配列と高度な相同性を示し、該データベースのいずれの抗体に関しても非常に稀な特徴である。サブセット番号２および番号７はこの規則に従わない。これは種の相違（この分析に用いたＶＩＤＡセットはヒト抗体から誘導した）およびＶＩＤＡセットにおけるサブグループＶκの配列の豊富さに帰することができる。
【０２１６】
ＩＡＣＴが、抗体の天然集団において稀である該抗体の選択に至ることがこの分析により確認される。分析はまた、これらの抗体を別の全てのもの（残基ＩＣＳのセット）から区別すると思われる残基のサブセットの同定に至る。さらに分析をＩＣＳにより定義されたアミノ酸位置に限定する場合、これらの細胞内抗体はＫａｂａｔコンセンサス配列と最大相同性を有する顕著な特性を有しており、この特性は本明細書で初めて機能するように定義される（図１４、右）。
【０２１７】
異なる抗原に関する細胞内抗体に由来する配列を加えた、拡張ＶＩＤＡセットに関してこの同一の分析を実施した。これらの分析によりＩＣＡＴ技術によるコンセンサス配列の捕捉の概念が確認される。
【０２１８】
ＩＡＣＴで選択した、または換言すれば、ＶＩＤＡを構成する細胞内抗体のセットを以下のファミリーに細分する（表３）。
【０２１９】
【表３】
2004538324.tif 000007
【０２２０】
２つの重要な特性を表３から推測することができる。
１）ＶＨＩＩＩファミリーはずば抜けて、最も代表的なファミリーである。明らかにこれは用いたライブラリーのバイアスを反映しているが、より一般的にはこのファミリーの抗体に関するより高度な平均的安定性を反映している（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ，Ｅ．ら（２０００））。これは、特定の免疫グロブリンが細胞内環境内で機能できる機会を最大にするために、次いでＶＨＩＩＩファミリーの免疫グロブリンを選択すべきであることを実証している。
２）しかしながら、良好な細胞内抗体であるためにＶＨＩＩＩであることは十分ではない。実際に、ライブラリーから無作為に単離され、そしてインビトロでＴＡＵとの良好な結合特性を有しているこのファミリーの抗ＴＡＵ抗体が、インビボでＴＡＵと結合できないということが以前に示されている。
【０２２１】
方法で記載したさらなる分析を拡張ＶＩＤＡセットで実施した。この分析は新たなイントラボディーを同定するために新たな手順を用いている。イントラボディーを同定するための新たな手順の結果を以下の表に表す。
【０２２２】
【表４】
2004538324.tif 000008
【０２２３】
最適ＩＣＳの同定に至り、そしてＩＣＳ自体により同定された位置に分析を限定するこの手順を最初に用いて、該ＶＩＤＡに属する各抗体を同定した。我々の所有するＶＩＤＡ配列に基づいて構築されたこの手順により、全てのＶＨ配列、および１個を除いて全てのＶＬ配列を「イントラボディー」として同定することが可能である。これは手順の最初の有効性を提供し、次いでこれはＫａｂａｔデータベースの可能性のある細胞内抗体の同定に適用された（図１５、右）。手順により種々Ｋａｂａｔサブセットの配列の約１０％になる分画が細胞内抗体（方法において定義された同定）として同定される（表４）。これらの抗体は問題の手順により同定される、良好な細胞内抗体である可能性がある。
【０２２４】
前記したようにこれらの抗体のサンプルをＩＡＣＴにより検定し、細胞内環境でのその有効な安定性を確認した。この実験的検証の結果により、良好な細胞内抗体であると予測される全ての抗体がこの実験的試験を有効に通過することが実証された。この結果により、ＩＣＳ概念および細胞内抗体を同定するためのＩＣＳに基づく手順の有効性がさらに提供される。
【０２２５】
次に、対応するサブセットの最大コンセンサスのＫａｂａｔ配列で抽出された（表４参照）ＩＣＳ配列の相同性の程度を検証した。結果を表５に示す。
【０２２６】
【表５】
2004538324.tif 000009
【０２２７】
最後に、分析をＩＣＳ位置に限定しないが、配列全体に関して、唯一最大コンセンサスのＫａｂａｔ配列に関係する相同性の程度から、ＶＩＤＡ配列を同定することも可能であるかどうかを評価した（図１５、左）。図１５は、本発明の手順が、配列全体に関してＫａｂａｔコンセンサスに関係する相同性の分析を用いて行うことができるものとより選択的に比較されることを示している。実際に、分析をＩＣＳ部位だけに限定するので（図１５、右）、配列のＶＩＤＡ分布と適合するＫａｂａｔ配列の数がより低いことが見出される。
【０２２８】
ＬＰが１００％未満である場合、イントラボディー認識手順はＶＩＤＡセットの新たな配列の挿入に関して堅調である。実際に、新たな配列の挿入は種々の位置で種々のアミノ酸を見出す可能性を１／ｎ（ここでｎはＶＩＤＡセットの配列数である）と等しい程度まで変化させるだけである。
【０２２９】
図１５、右は別の有意な態様を示している。ＶＩＤＡ集団よりも高いＫａｂａｔコンセンサスに関係する相同性を有するＫａｂａｔデータベースに有意数の配列がある。全てのアミノ酸位置が分析される場合、細胞内抗体はＫａｂａｔコンセンサスと最大類似性を有さないが（図１４、左）、これは分析がＩＣＳにより定義される部位だけに限定される場合である（図１４、右）。これから、抗体はＫａｂａｔコンセンサスに非常に類似することができ（最大相同性）、そしてしかも良好な細胞内抗体でなはいと結論付けることができる（Ｋｎａｐｐｉｋら（２０００））。
【０２３０】
良好な細胞内抗体であるために、正確な部位でＫａｂａｔコンセンサスと良好な相同性を有する必要がある。この実証に加えて、本発明はコンセンサスを算出すべきこれらの部位を同定した。
【０２３１】
結論として、本発明の記載は、
ｉ）それを実験的に検証する必要なしに、配列だけに基づいて、細胞内抗体を同定するための手段の開発；
ｉｉ）ＩＣＳが定義される抗体の分子の重要位置のセットの発見に導く、実験的に有効な細胞内抗体の配列のデータベースにおけるこの手順の使用であって、この発見もまた本発明の一部である；
ｉｉｉ）機能的細胞内抗体に非常に富むライブラリーを設計および構築するために用いることができる最適ＩＣＳ；
について記載する。
【０２３２】
前記の明細書で言及する全ての出版物、該出版物で引用された参照文献は参照により本明細書に組み込む。本発明の記載した方法および系の種々の修飾および変更は本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明白であろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明はこのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連する分野の技術者に明らかな、本発明を実施するために記載した様式の種々の修飾は以下の特許請求の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】ＩＡＣ技術を用いるＢＣＲまたはＡＢＬに対して指向する細胞内抗体の単離を表す。
Ａ．フローチャート（左）はＩＡＣ技術（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．、Ｔｓｅ，Ｅ．、Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｈ．、Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８（１９９９））に関与するステップを示す。
ステップ１：ｓｃＦｖファージディスプレイ・ライブラリーを用いてインビトロで抗原をスクリーニングした；細菌発現系を用いてこれらの実験での抗原を作製した。ステップ２：抗原に結合する全てのファージを回収し、プラスミドＤＮＡを調製し、そしてｓｃＦｖフラグメントを酵母プレイベクターｐＶＰ１６にクローン化して抗原結合に関して富化されたｓｃＦｖのサブライブラリーを作製した。ステップ３：酵母ｓｃＦｖサブライブラリーを、ベイトとしてＤＮＡ結合ドメインに融合した酵母発現抗原でスクリーニングし、ヒスチジン選択プレートで成長するコロニーを回収し、そしてβガル活性化に関して検定した。ステップ４：ヒスチジン不在下で成長し、そしてβガルを活性化するクローンを用いて、プラスミドＤＮＡおよび種々の選択された、ＢｓｔＮＩ消化でフィンガープリントされたクローンを調製してｓｃＦｖのグループを同定した。ステップ５：元来のベイトクローンを用いて各群のメンバーを続いて酵母で再試験して、純粋に抗原に結合するこれらのｓｃＦｖを同定する。これらのｓｃＦｖをさらに哺乳動物細胞において特徴づけする。
Ｂ．抗ＢＣＲ  ｓｃＦｖのＩＡＣ  Ｃ．抗ＡＢＬ  ｓｃＦｖのＩＡＣ  ＢおよびＣでは、インビトロ法（Ｓｈｅｅｔｓ，Ｍ．Ｄ．、Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｐ．、Ｆｉｎｎｅｒｎ，Ｒ．、Ｓａｒｇｅｎｔ，Ｐ．、Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ，Ｅ．、Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．、Ｈｅｍｉｎｇｓｅｎ，Ｇ．、Ｗｏｎｇ，Ｃ．、Ｇｅｒｈａｒｔ，Ｊ．Ｃ．およびＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２（１９９８）ならびにＶａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｊ．、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｋ．、Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．、Ｐｏｐｅ，Ａ．Ｒ．、Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｊ．Ｃ．、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｈｏｄｉｔｓ，Ｒ．Ａ．、Ｗｉｌｔｏｎ，Ｊ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、「ｎＭ以下の親和性を有する、大きな非免疫ファージディスプレイ・ライブラリーから単離されたヒト抗体」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９−３１４（１９９６））で用いる抗原でファージライブラリーからの２×１０13個のクローンをスクリーニングした。およそ１０5個のファージを回収し、酵母ベクターｐＶＰ１６にクローン化して抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬに関して各々３．２および１．３×１０5個のサブライブラリーを作製した。ＢＣＲ−ＡＢＬベイトを用いてほぼ８．５×１０5個の酵母をスクリーニングし、１１７個および３７個のクローンを生じた（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．、Ｔｓｅ，Ｅ．、Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｈ．、Ｒａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．およびＣａｔｔａｎｅｏ，Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１７２３−１１７２８（１９９９））。これらを配列分析により、抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ各々６および１２にさらに分割した。
【図２】酵母における抗ＢＣＲ特異的ｓｃＦｖとＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質との間の相互作用を示すβガラクトシダーゼ・フィルターアッセイを示す。
ＢＣＲ−ＡＢＬ（ｐＢＴＭ／Ｅ１Ａ２）（Ａ．）またはＡＭＣＶ植物ウイルスｐ４１コート・タンパク質（Ｂ．）に融合したいずれかのＤＮＡ結合ドメインベイトでＬ４０酵母株を形質転換した。これらの宿主株を個々のｓｃＦｖ−ＶＰ１６活性化ドメイン融合に関してコードするプラスミドで形質転換し、そしてトリプトファンおよびロイシンを欠くＶＣ培地上に画線してプラスミドに関して選択した。示したβガル・フィルターアッセイにおけるβカラクトシダーゼの活性化により、ｓｃＦｖとベイトタンパク質との相互作用をモニター観察した。Ｂ３、９、１０、２１、３３および８９は抗ＢＣＲ  ｓｃＦｖであり、そしてＦ８はＡＭＣＶ  ｐ４１タンパク質に関して特異的なｓｃＦｖである（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，Ｐ．Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ，Ｅ．、Ｔｒｉｎｃａ，Ｓ．、Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｉｓ，Ｄ．、Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ａ．およびＧａｌｅｆｆｉ，Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６６：４６９−４７２（１９９３））。ＢシリーズｓｃＦｖの相互作用はＢＣＲ−ＡＢＬベイトとのみ生じ、そしてＡＭＣＶとは生じないが、一方Ｆ８はＡＭＣＶとのみ相互作用する。
【図３】抗原に結合するフィルターによるＩＣ抗体の特徴づけを示す。ｓｃＦｖを細菌発現ベクターｐＨＥＮ２にクローン化し、そしてこれを用いてＨＢ２１５１  大腸菌を形質転換した。抗ＡＢＬ（Ａ）および抗ＢＣＲ（Ｂ）ＩＣ抗体に関してｓｃＦｖの周辺腔発現が得られた。ｓｃＦｖをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロッティングに供した。ｓｃＦｖをｃ−ｍｙｃエピトープでタグ化し、そして９Ｅ１０モノクローナル抗ｍｙｃタグ抗体および２次ＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体を用いて可視化した。（Ｃ、Ｄ）ｓｃＦｖの特異性を、フィルター結合抗原を認識するその能力を試験することによりインビトロで評価した（ＡＢＬ（Ｃ）のＳＨ２ドメインおよびＢＣＲ（Ｄ）のＳＨ２結合ドメイン）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより抗原を分離し、そしてフィルターに写し、これをｓｃＦｖ（細菌周辺腔抽出物）と共にインキュベートし、続いて検出のために９Ｅ１０およびＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体と共にインキュベートした。各ｓｃＦｖをＡＢＬ（Ａと称する）およびＢＣＲ（Ｂと称する）抗原の双方に対して試験した。
サイズマーカー位置を各パネルのＬＨＳ上に示す。
【図４】哺乳動物抗体・抗原インビボ相互作用アッセイを示す。
ＣＨＯ細胞をルシフェラーゼレポーター、抗原ベイトおよびＶＰ１６活性化ドメインに融合した抗ＢＣＲ  ｓｃＦｖでトランスフェクトした。陰性対照として無関係のｓｃＦｖ  Ｆ８を用い、そして対照ベイトはＢのβガルであった。
（Ａ）ＣＨＯ細胞を指示するようにＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部対照プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ、ベイトプラスミドｐＭ３−Ｅ１Ａ２および１つの抗ＢＣＲ  ｓｃＦｖ−ＶＰ１６発現プラスミドと一緒にホタル・ルシフェラーゼ・レポータープラスミドで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、デュアル・ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびルミノメーターを用いてルシフェラーゼレベルを検定した。各トランスフェクションからのホタル・ルシフェラーゼレベルをＲａｎｉｌｌａルシフェラーゼレベルに正規化した（トランスフェクション効率に関する内部対照）。非特異的対照としてｓｃＦｖＦ８−ＶＰ１６、無関係の抗ＡＭＣＶ  ｓｃＦｖ、発現プラスミドをｐＭ３−Ｅ１Ａ２で同時トランスフェクトし、ルシフェラーゼレポーターを加える。試験した各々のｓｃＦｖに関する相対ホタル・ルシフェラーゼレベルをｓｃＦｖＦ８のレベルを１とするヒストグラムに示した。
（Ｂ）指示するように同一のＣＨＯアッセイ系においてＢＣＲ−ＡＢＬ抗原ベイトの代わりにβガルベイト（ｐＭ−βガル）を用いて単離されたｓｃＦｖの相互作用の特異性を確認した。ｓｃＦｖＦ８に関して正規化されたホタル・ルシフェラーゼレベルを１とし、そして各ＢＣＲ特異性ｓｃＦｖに関する（Ｃ）相対ルシフェラーゼレベルをヒストグラムに示した。
【図５】誘導した細胞内ｓｃＦｖのタンパク質配列のアラインメントを示す。ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を入手し、そして誘導したタンパク質翻訳（単一文字コードで示す）をアラインした。相補性決定領域（ＣＤＲ）には影を付けている。配列番号１から４０に関するフレームワーク残基は下線を付したものである。特定の位置でのコンセンサス配列を最高頻度発生残基に関して算出したが、残基がその位置で５回以上生じた場合にのみ付与した。
Ａ．抗ＢＣＲ（Ｂ３−Ｂ８９と称する）および抗ＡＢＬ（Ａ５−Ａ３２と称する）に由来するＶＨおよびＶＬの配列。抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ  ＩＣ抗体の組み合わされたコンセンサス（Ｃｏｎ）をＫａｂａｔデータベースからのＶＨ３およびＶΚＩのサブグループコンセンサスと比較して示した。・細胞内抗体結合ＶHまたはＶLコンセンサスとの配列同一性を表す（配列番号３および配列番号４）。・アラインメントを最適化するために導入したギャップを表す。
Ｂ．選択していないファージディスプレイ・ライブラリーから無作為に得られたｓｃＦｖの配列比較。無作為に単離されたｓｃＦｖから得られたコンセンサス（ｒｃＨおよびｒｃＬ）を示す。・アラインメントを最適化するために導入したギャップを表す。・Ｘはコンセンサスを割り当てられることができなかった位置を表す。
【図６】ｓｃＦｖのジスルフィド結合を除去するためのフォールディング、安定性および耐性の概略図。
【図７】ＩＡＣＴ技術の概略図。ＩＡＣＴは二重ハイブリッド系およびファージディスプレイ技術の組み合わせである。最初に「ベイト」として用いるタンパク質に特異的である抗体フラグメントのパーセンテージを上昇させるためにファージディスプレイ技術を用いる。二重ハイブリッド系は細胞内発現の状況において抗原および関連する特異的抗体フラグメントの対を単離できるようにするために適用する。インビボで選択した後、陽性であることが解っているクローンを単離し、そしてｓｃＦｖをインビトロおよびインビボ適用に用いることができる。
【図８】ａ）インビトロ予備選択の第２サイクルの後に単離されたファージからのＥＬＩＳＡで得られた結果。抗原を１０μｇ／ｍｌの濃度でプレートに予め吸収させた。試験した９６個のうちｓｃＦｖ９個のみがＴＡＵタンパク質１５１−４２１に特異的であると判明した。結合の特異性をインビトロ予備選択で用いたＴＡＵフラグメントの精製に用いる別の抗原に対して、特にＭＢＰタンパク質に対して試験した同一のｓｃＦｖからのＥＬＩＳＡで得られたシグナルと比較した。ｂ）用いたベイト（ｌｅｘＡ−ＴＡＵ−１５１−４２２）とＩＡＣＴを用いて単離されたｓｃＦｖのパネルとの間のインビトロ相互作用。ｓｃＦｖ＃３７および＃８５と対照的に（第３および第４ライン）ｓｃＦｖ＃２、＃１４および＃５２のみがレポーター遺伝子ＨＩＳ３およびｌａｃＺ（第１、第２および第４ライン）をトランス活性化できた。相互作用対ｓｃＦｖ８＋ＡＭＣＶｐ４１を陽性対照として使用した（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，Ｍ．ら（１９９９））（第６ライン）。ｃ）大腸菌の細胞膜周辺腔から抽出したｓｃＦｖ＃２、＃１４および＃５２の可溶性分画をＥＬＩＳＡで検定した。抗原を１０μｇ／ｍｌの濃度でプレートに予め吸収させた。ＯＤ４５０でＥＬＩＳＡシグナルを測定した。ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５分析カラムを用いたｓｃＦｖ＃２、＃１４、＃５２およびｓｃＦｖαＤ１１のゲル濾過クロマトグラム。溶出容量およびマーカーとして用いたタンパク質の質量を図表に示す：卵白アルブミン（Ｏａｌｂ）（４５ｋＤａ）、ウシカルボニックアンヒドラーゼ（ＢＣＡ）（２９ｋＤａ）、ミオシン（Ｍｙｏ）（１７ｋＤａ）。単量体形態のｓｃＦｖを約１２ｍｌで流した。代表的な例としては、ｓｃＦｖαＤ１１のゲル濾過分析のクロマトグラムは、二量体または重合体の種（集合体）の溶出ピークが約１０．５ｍｌの後に溶出されることを示している。
【図９】ＩＡＣＴ（ｓｃＦｖ＃２、＃１４および＃５２）と共に単離された抗ＴＡＵおよび対照ｓｃＦｖαＤ１１の免疫蛍光顕微鏡観察。ｓｃＦｖはＣＯＳ繊維芽細胞の細胞質で発現される。細胞を抗ｍｙｃタグ抗体で処理し（Ｅｖａｎ，Ｇ．Ｉ．ら（１９８５））。続いて蛍光抗マウスモノクローナル抗体（ベクター）と共にインキュベートした。
【図１０】Ａ）二重免疫蛍光。ＣＨＯ細胞におけるｓｃＦｖ抗ＴＡＵの存在下でのＴＡＵの誤った局在化を分析した。（モノクローナル）抗ＴＡＵ７．５１抗体を用いて、そして２次抗体としてＴｅｘａｓ−ＲＥＤ（赤色染色）でコンジュゲートされた抗マウス抗体を用いてＴＡＵのマーキング（細胞質において発現される）を行った。核発現ベクターにクローン化したｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ＃２、＃１４および＃５２）およびｓｃＦｖＲ４（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．ら（１９９８））のトランスフェクションを抗ｍｙｃタグ９Ｅ１０で検出し（Ｅｖａｎ，Ｇ．Ｉ．ら（１９８５））、続いて抗マウス２次抗体（ベクター）をフルオレセイン標識した。ｓｃＦｖとＴＡＵとの同時発現を抗ＴＡＵ抗体（７．５１）、続いてＴｅｘａｓ−ＲＥＤでマークした抗マウス２次抗体を用いて（局在ＴＡＵに関して）、およびポリクローナル抗体抗ｍｙｃタグを用いて分析し、今度はフルオレセイン標識した抗ウサギにより認識させた。同時トランスフェクトされた細胞を、可変波長フィルター（Ｚｅｉｓｓフィルターセット２５）を用いて顕微鏡で可視化した。矢印は核におけるｓｃＦｖ抗ＴＡＵおよびＴＡＵの同時局在を示す。Ｂ）およびＣ）ｓｃＦｖ＃２、＃１４、＃５２および対照Ｒ４によるＣＨＯ細胞におけるＴＡＵの再標的化の影響。同時トランスフェクトされた細胞におけるＴＡＵおよびｓｃＦｖの染色パターンを、各群で観察された頻度の分析に従って４つのクラスにさらに分割した。パターン１）、２）および３）はＴＡＵおよびｓｃＦｖ間の相互作用を示している。
【図１１】ＩＡＣＴで選択された種々の抗ＴＡＵのＶＨ（Ａ）およびＶＬ（Ｂ）ドメインのアラインメント。ＣＤＲは太字である。パネル（Ａ）および（Ｂ）の一番下に、イントラボディーの特定のセットの１００％でのＩＣＳを示す。パネル（Ｃ）はヒトおよびマウスならびにヒトおよびマウス（ｈｘｍ）間で推定されるものの可変鎖に関する最適ＩＣＳを示す。ナンバリングはＣｈｏｔｈｉａに準じる。
【図１２】ヒト配列に関するＰｓの分布。Ｐｓの算出における無限積をちょうどＩＣＳで定義した位置にまで広げた。
【図１３】対応するコンセンサス配列に関連する、Ｋａｂａｔデータベースの種々のサブグループにおける配列の相同性レベルの分布。ＩＡＣＴセットの各々重鎖および軽鎖に関する保存残基７６（パートａ）および４８（パートｂ）およびｃ）に相当する位置に限定して分析した。対応するＫａｂａｔデータベースのコンセンサス配列に相同なアミノ酸残基の数を横座標に示す：ａ）黒色でヒトＶＨ（セット１、３３１９配列）、ライトグレーでマウスＶＨ（セット２、３３５３配列）、ダークグレーでヒトＶＨ３（セット３）；ｂ）黒色でヒトＶＬ（セット４、２７３１配列）、ライトグレーでマウスＶＬ（セット５、２５１８配列）；ｃ）黒色でヒトＶΚ（セット６、１３３０配列）、ダークグレーでヒトＶλ（セット７、１２６５配列）。点で終わる線は、データベースの各サブセットに関するＩＡＣＴコンセンサス配列の相同性の程度を示す。
【図１４】ＩＡＣＴ技術がどのように、セットの最大のコンセンサス配列により近い入力配列のアミノ酸の分画をもたらすフィルターとして作用するかを示す図表。
【図１５】（ｂ）ＶＩＤＡサブセットおよび各々のＫａｂａｔサブセットにおけるＩＣＳ配列との相同性の程度の分布。（ａ）ＶＩＤＡサブセットおよび各々のＫａｂａｔサブセットにおける、Ｋａｂａｔの最大コンセンサスの配列との相同性の程度の分布。横座標はＩＣＳに同等のアミノ酸の数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
2004538324.tif 000021
【図１０−２】
2004538324.tif 000022
【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
2004538324.tif 000024
【図１１ｃ】
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【図１２】
2004538324.tif 000026
【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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