(57)【要約】身体部分に薬剤を投与するシステムの性能を評価するシステム及び方法。一対の電極を、身体部分に配置させる。薬剤を身体部分に注入し、信号発生器により前記電極に電圧を加えて、前記身体部分に電気的刺激を加える。身体部分に加えた電圧及び電流を、データ取得システムを用いて測定し、これにより電気的パラメータデータを作成する。薬剤に対する免疫反応、遺伝子発現レベル、及びその他の生物反応を測定し、電気試験データと生物反応との相互関係を明らかにすることにより、システムの性能を評価する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップからなる、受容者の身体部分に薬剤を投与するためのシステムの性能評価方法において、
前記身体部分に電極を配置し、
前記身体部分に薬剤を注入し、
前記電極に連結された信号発生器を使って、前記身体部分を電気的に刺激し、前記信号発生器は、前記電極に対して少なくとも部分的に周期的な信号を供給するように作用し、
前記身体部分を電気的に刺激しながら、該身体部分に加えた電圧及び電流を測定、記録することにより、電気的パラメータデータを作成する方法。
【請求項２】
前記電極配置は、複数個の独立した導体からなることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫システム反応を測定し、
前記免疫システム反応を電気試験データに関連付けることにより、薬剤投与システムの性能を評価し得るようにして構成した、請求項１記載の方法。
【請求項４】
転換遺伝子発現レベルを測定し、
前記転換遺伝子発現レベルを前記電気試験データに関連付けることにより、薬剤投与システムの性能を評価し得るようにして構成した、請求項１記載の方法。
【請求項５】
受容者の身体部分に電気刺激治療を施す電気刺激電極装置において、
前記装置は、少なくとも一対の電極を有し、該電極のそれぞれは、導電本体及び、該導電本体の表面に塗布した部分的導電塗装を有していることを特徴とする、電気刺激電極装置。
【請求項６】
前記部分的導電塗装は、１ＫΩから１０ＭΩの範囲のインピーダンスを有していることを特徴とする、請求項５記載の電気刺激電極装置。
【請求項７】
前記部分的導電塗装は、ＰＦＡ及びＲｙｔｏｎの内、少なくとも１つから構成されることを特徴とする、請求項５記載の電気刺激電極装置。
【請求項８】
前記部分的導電塗装は、ＰＦＡ及びＲｙｔｏｎの内、少なくとも１つから構成され、導電材料は、カーボンブラック、グラファイト、金属粉の内、少なくとも１つから構成されることを特徴とする、請求項５記載の電気刺激電極装置。
【請求項９】
前記部分的導電塗装は、少なくとも部分的にはエナメルペイントであることを特徴とする、請求項５記載の電気刺激電極装置。
【請求項１０】
前記部分的導電塗装は、少なくとも部分的には、エナメルペイント及び透明な上塗り塗料であることを特徴とする、請求項５記載の電気刺激電極装置。
【請求項１１】
前記部分的導電塗装は、身体部分と接触するために位置決めされる表面の絶縁部分上において不連続であることを特徴とする、請求項５記載の電気刺激電極装置。
【請求項１２】
受容者の身体部分に電気刺激治療を施す電気刺激装置において、
前記装置は、出力を有する信号発生器を設け、
少なくとも一対の電極を、前記信号発生器の前記出力に連結させ、
前記電極の各々は、導電本体と、該導電本体の表面に塗布した部分的導電塗装を有していることを特徴とする、電気刺激装置。
【請求項１３】
前記信号発生器は、種々の形状を有する信号を時間内に発生させる任意波形信号発生器、及び定電流フィードバックモード及び定電圧フィードバックモードの内、何れかで設定した信号増幅器を有する、請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
注入針、
該針及び電極を、前記身体部分に対して適宜な位置に案内する、複数個の環状案内穴を有する針／電極ホルダを有する、請求項１２記載の装置。
【請求項１５】
少なくとも１つの電極を、前記身体部分に配置させ、前記電極は、部分的導電外表面を有しており、
前記身体部分に薬剤を注入し、
前記電極に連結した、該電極に対して少なくとも部分的に周期的な信号を与えることが出来る信号発生器を用いて、前記身体部分を電気的に刺激する、
ステップから構成される、受容者の身体部分に薬剤を投与する方法。
【請求項１６】
少なくとも２つの電極を前記身体部分に配置させ、各電極は部分的に導電する外表面を有しており、各電極に連結した、該電極に対して少なくとも部分的に周期的な信号を供給することの出来る信号発生器を用いて、前記身体部分を電気的に刺激することを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記信号発生器は、定電圧モードで機能することを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記信号発生器は、約±１００から±４００ｖｏｌｔを供給するように作用することを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記信号発生器は、周期サイクル毎に、前記身体部分に対して５−２０ミリクーロン（ｍｉｌｌｉｃｏｕｌｏｍｂ）の範囲で電荷を供給するように作用することを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
受容者の身体部分に電気刺激治療を施す電気刺激装置において、
前記装置は、出力を有する第１信号発生器を有し、
少なくとも１対の導電電極を、前記第１信号発生器の出力に連結させ、各電極は導電本体を有し、
出力を有する第２信号発生器を設け、
少なくとも１対の部分的導電電極を、前記第２信号発生器の前記出力に連結させ、各電極は、導電本体及び、該導電本体の表面に塗布した部分的導電塗装を有していることを特徴とする、電気刺激装置。
【請求項２１】
生物組織の電気刺激方法において、
少なくとも一対の電極を、電気抵抗を有する組織部分に配置させ、
前記電極に電位差を与え、
オームの法則に従って、前記電位差が、該電位差により前記組織内で生じさせる筈の電流レベルから外れるように、前記電極間の電流を制御する、生物組織電気刺激方法。
【請求項２２】
前記電流を、前記電位差が、該電位差により生じさせる筈の前記電流レベルより小さく制限することを特徴とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記電流を、不連続バリアを、前記電極の少なくとも一部と前記組織間に設けることにより、制限することを特徴とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記電極の内少なくとも１つの電極は、鋭利端部を有し、前記電流を、前記端部において不連続となっている材料により制限することを特徴とする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物組織内に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で薬剤を、電気刺激を加えながら組織投与する方法において、
哺乳動物部分に、部分的に導電する外表面、又は２セットの相補的電極からなる電極配置を適用し、
前記哺乳動物部分に薬剤を注入し、
所定の電位を有する電場を、前記電極配置間に確立して、オームの法則により流れると予測される電流よりも少ない振幅にまで、前記電場からの電流を制限し、前記確立させた電場及び電流によって、治療中に不本意な強い筋肉反射運動を起こさないようにしたことを特徴とする、方法。
【請求項２６】
前記薬剤は、核酸分子であることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸分子は、ＤＮＡプラスミド発現ベクタであることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物は、人間であることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤は、核酸分子であることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸分子は、ＤＮＡプラスミド発現ベクタであることを特徴とする、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤は、蛋白質であることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤は、有機分子であることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物組織内に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で薬剤を、電気刺激を加えながら、組織投与する方法において、
哺乳動物部分に、部分的に導電する外表面、又は２セットの相補的電極からなる電極配置を適用し、
前記哺乳動物部分に薬剤を注入し、
所定の電位を有する電場を、前記電極配置間に確立して、オームの法則により流れると予測される電流よりも少ない振幅にまで、前記電場からの電流を制限し、
前記哺乳動物部分を電気刺激しながら、該哺乳動物部分に加えた電圧及び電流を測定、記録し、これにより電気的パラメータデータを作成し、
前記確立している電場は、治療中に測定可能な不本意な筋肉反射運動を起さずに電気刺激を加えることを特徴とする、方法。
【請求項３４】
前記薬剤は、核酸分子であることを特徴とする、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸分子は、ＤＮＡプラスミド発現ベクタであることを特徴とする、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物は、人間であることを特徴とする、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
前記薬剤は、核酸分子であることを特徴とする、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸分子は、ＤＮＡプラスミド発現ベクタであることを特徴とする、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記薬剤は、蛋白質であることを特徴とする、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
前記薬剤は、有機分子であることを特徴とする、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に薬剤の注入に関連して、生体組織に電磁エネルギを与えることに関する。磁界強度及び電流条件を、これに、電気的パラメータに関してある一定の変量を与える形で設定することにより、電磁エネルギを加え、局部的に磁界及び電流パラメータを測定する装置及び方法を提供する。また、本発明は、蛋白質、小さい有機分子、若しくは小さい無機分子を含めた（但し、これに限定されるものではない）、核酸、またこれ以外の薬剤等の、薬剤を、生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）の細胞投与を向上させるため、被移植体組織に電気刺激（「電子刺激」）を与えることに関し、またこの効果を評価することに関する。
【０００２】
本発明は、被移植体組織、特に骨格筋に対する電気刺激に関連し、これは部分的絶縁電極及びこれと同様な、組織内の電流振幅を制限する構成を利用して電気刺激を与えることによる。電気刺激部位の電流は、組織をある特定の電位差で電極と直接伝導接触するように配置した場合には、組織の電気抵抗により、組織が伝導する電流より小さいものに制限すると好ましい。これは、本発明の開示による代替方法で目的を達成することが可能である。
【０００３】
本発明によって提供されるものは、伝導電極の使用に関連して起こる不随意筋運動等の、有害な効果を最小限に抑えつつ、投与を進歩させ、及び／又は、対象の転換遺伝子の発現を向上させることである。
【０００４】
数々の研究により、電気エネルギを加えると、生物膜に影響を与えることがわかっている。これによると、エネルギを十分に与えると、膜の浸透率が高まり、これにより、液剤が膜や組織を通してより簡単に拡散し、所望の効果を達成させることが可能である。一般に、この現象は、イオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、エレクトロフォレシス（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（これらをまとめて「電気刺激」或いは「電子刺激」と呼ぶ）と関連している。
【０００５】
イオントフォレシスは、一般的に、直流電流を負荷することにより、皮膚等の無傷の膜を通してイオン化物質を投与することに関する。該電流はおそらくイオンを引きずり、及び／又は組織内におけるイオンの流動性を高める。エレクトロフォレシスは、電場の影響を受けて、流体内又はゲル内でイオンが移動することに関する。エレクトロポレーションにおいては、（しばしばパルスで修正した）電場及びこれに関連した誘導電流が膜に、一般的には細胞膜に、微小な孔を形成させる。これらの孔は、一般的に、「電子孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅ）」と呼ばれ、この孔を形成する過程をエレクトロポレーションという。エレクトロポレーションの潜在的な使いみちは、薬剤、分子、イオン等の液剤、及び／又は水が、電気的に発生した孔を通して、膜の一方から他方へ容易く通過することが出来るということである。この孔は、電場を与えている間一時的に存続することが好ましい。電場を与えた後、該孔は短い時間内に閉鎖し、或いは治癒しなければならない。しかし、治癒時間は、電気刺激の振幅及び継続時間に依存し、瞬間力レベルがあまりに高かったり、刺激の継続時間が長すぎたりすることにより、組織を永久的に損傷させてしまう。該損傷は、孔が維持できないほど大きく形成されたり、又は、非常に数多く形成されたり、或いは組織を抵抗加熱することにより、またはこの両方によってもたらされる。
【０００６】
電気的に誘発された孔は、インビトロで（生体内で）簡単に観察出来る。液剤中の細胞同士は実質的にそれぞれ独立しており、これを観察することが出来る。しかし、これら孔が生成されたという仮定の下で、インビボ設定で一時的な電子孔を観察することは難しいかもしれない。多かれ少なかれ通道組織は任意の細胞を取り囲み、しばしば組織タイプに特有の定位をもつ。おそらく、導電性が不連続になると、電圧勾配及び電流密度に局部的に影響を及ぼしつつ、電磁エネルギを組織に連結する方法に影響を及ぼす。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で観察部位を取り巻く組織も、視覚による観察の妨げになっている。おそらくこういった理由から、エレクトロポレーションの模範的なインビボ研究が現在のところ、本発明の発明者には未知なのである。
【０００７】
直接関係する、効力のあるパラメータを比較的詳しく理解しないと、組織の電気刺激（「電子刺激」）を評価し、また、もしかしたら該組織の電気刺激を有用な目的に適用することは困難かもしれない。電流及び電圧が興味の対象である、第一の効力あるパラメータだと仮定してもなお、電流及び電圧の加え方は無数に存在する。ある特定な電圧や電流が望ましいと判明するかもしれないし、またある特定な電力レベルが必要かもしれない。該電圧、電流及び／又は電力は、最小値及び最大値を持つ可能性もあり、またこれ等に特定な関連性があるかもしれない。時変構成要素は不安定の場合もあるし、種々の波形を、ＤＣ（直流）から無線周波数までの周波数で試すことも出来る。時変電気刺激は、ある目的にとって有益であると判明するかもしれないし、あるいは、別の目的、例えば、パルス繰返数、衝撃周波、交流周波数等を変化させる場合に有益であるかもしれない。周波数、パルス繰返数、衝撃周波等は、連続的にも、周期的にも、指数関数的にも変化する可能性がある。周期的な波形は、直流バイアスをもっても、もたなくてもよいし、また、正弦波、鋸波や三角波、方形波、所望の衝撃周波の方形パルス、指数関数的に減衰する或いは充電するパルス等として形成することが可能である。これ等波形形状は何れも、連続的に適用してもよいし、バースト若しくはパルス列で適用してもよい。こういった異なる可能性の効果を決めたり、潜在的に有効な適用を持つ特定な組み合わせを識別したりすることは、都合が良い。
【０００８】
組織の電気刺激に関しては、接触装置及び非接触装置がある。接触装置では、目標組織部位の相対向する両側に配置した伝導電極を用いて、該目標組織部位と身体的に接触させて、信号を与える。非接触装置では、同様に、該部位の相対向する両側に配置させた電極若しくはコイルを用いて、電場或いは磁場を発生させることが可能である。接触例においては、組織は反応性要素（電気容量又はインダクタンス）をもつかもしれないし、また組織の電気伝導度は、エネルギを加えた効果により（即ち、加熱により）、ずっと変化し得るが、一般的には、組織内の電気反応はオームの法則に従っている。組織を介して伝導する電流は、電圧に比例しているが、その特定な割合は、組織抵抗による。この事実においては、固有の限定が存在する。伝導接触を仮定すると、通常、人は、電流に関して対応する効果が無い時は、独立的に、加えた電圧を制御することは出来ない。電圧及び／又は電流が組織内で増加すると、ジュール加熱が増し、痙攣性の筋収縮が起こる可能性が出てくる。非接触例では（外部的に適用した電場に限定するが）、周波数によるが、イオン流動性や振動は増加するけれども、電流は殆ど伝導しない。
【０００９】
エレクトロポレーション、イオントフォレシス、エレクトロフォレシス等は明らかになってきたが、これ等に関係するパラメータに関しては殆ど実際には理解されていない。現象を利用する試みが雑多な結果を生んだ。発展に対するはっきりとした方向性が殆ど示されなかった。これ等の現象の理解を深め、電磁気の影響下で、細胞へ薬剤投与する実験の開発に関して前進させると効果的である。最も効果的なのは、特定な薬剤を使った治療に関して、実験が考えつく程度まで、電気的、生物的面を理解することである。今日の情況に合致するように、所望の結果に到達するために電気刺激を最大限に活用する試みは、経験的にできる調整、例えば、パルスパラメータの調整に限定されてきた。経験による調整は、確かな提案とはいえない。こういった経験による調整により、電気エネルギがより高い出力レベルの場合、より広範囲に亘って孔が形成され、より低い出力レベルの場合より良い結果に到達することを論理的に仮定することが出来る。しかしながら、このことが直接的に関係するのではなく、いずれにしても、潜在的な遺伝子の組み込み、組織の損傷、患者や受容者が感じる不快感等、出力電力を増やすにあたっての障害が存在する。
【００１０】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での電気刺激を利用して薬剤を投与するシステムの性能を制御し、測定し、評価する画期的な方法が必要となってくる。この方法は、受容者を楽にすることに気をかけながら、また遺伝子の組み込み及び組織の損傷を避けながら、最適な信号を与える必要性に目をむけさせてくれる。こういったシステムでは、電圧、電流、波形、衝撃周波、拍子や繰り返し、その他の要素の有益な範囲を超えて変化するように、エネルギの加え方を変化させることが必要となる。このシステムでは、ミクロ、マクロ等の適宜なレベルで電気刺激を監視し、またこれを潜在的に制御できるようにするため、細胞からの負荷の下、電圧、電流レベルを正確に測定しなければならない。このシステムにより、サンプル情報が生成され、さもなければ、このシステムは、治療の有効性に対する、電気的パラメータの相関関係を見出す工程とうまく通じる。このような情況における治療の有効性は、ただ単に、電気パラメータを監視することではなく、治療の時間を越えて、評価すべきである。好ましくは、電気的パラメータを工夫し、試すために、このシステムを最大限に活用しなければならない。これには、膜内に孔が形成されることに付随して考えられることに敏感に反応しながら、種々の選択を試すことが含まれている。この付随的な考えは、例えば、遺伝子組込みの可能性、組織の損傷、受容者（対象）の苦痛の無い状態等を含んでいる。この技術を、特定の治療薬品を使った治療に適用させるために、即ち、種々の治療薬と関連したイオントフォレシスやエレクトロフォレシスの領域の工夫や試みを促進することにより、このシステム、及びこのシステムの設備や方法を最大限に活用すべきである。
【００１１】
ＷＯ ９８／４３７０２（Ｍａｔｈｉｅｓｅｎの１９９９，遺伝子治療６：５０８−５１４も参照）は、骨格筋を、約２５  Ｖ／ｃｍから２５０  Ｖ／ｃｍの範囲を有する、計算された電場強度内で生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で電子刺激することが開示されている。この電場強度は、２次元電圧勾配として、即ち、伝導電極間の距離（ｃｍ）で割った、伝導電極間の電位差（Ｖ）として単純に計算された。この討論においては、電極を組織に伝導的に連結することにより、任意の電圧で結果として生じた電流に関して掘り下げたものでもなければ、電圧勾配や電流密度が何故、どのようにして効果的に振り分けられたか、これ等要因が電荷移動や、おそらく該技術に影響をもつ別の考えにどのようにして影響を及ぼしたか等を掘り下げて考えたものではない。
【００１２】
ＷＯ ９９／０１１５８、ＷＯ ９９／０１１５７、ＷＯ ９９／０１１７５は、裸のＤＮＡに対する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での電子刺激を促進するために長期にわたって低電圧を使うことが開示されている。目標の組織に応じて、約１  Ｖ／ｃｍから約６００  Ｖ／ｃｍまでの電場強度や電圧勾配が開示されている。こういったことは、最小限の効果から、潜在的に有害なレベルまで比較的広範囲を含んでいる。しかしながら、より高い電圧勾配さえも提案されている。
【００１３】
Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，８１０，７６２、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，７０４，９０８、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，７０２，３５９、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，６７６，６４６、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，５４５，１３０、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，５０７，７２４、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，５０１，６６２、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，４３９，４４０、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，２７３，５２５は、エレクトロポレーション／電子刺激方法や関連する装置を開示しており、この中で、それぞれの組織内における有効な電場強度の範囲は、約２００  Ｖ／ｃｍから約２０  ＫＶ／ｃｍまでであるとしている。Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，９６８，００６、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，８６９，３２６では、更に、１００  Ｖ／ｃｍ程度の低い電場強度が一定のインビボ電子刺激処置で有効であるとしている。
【００１４】
Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉその他（１９９９、薬物投与考察 ３５：１３１−１３７）は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で電気的に影響する遺伝子投与技術の現在の様子を考察している。筆者は、腫瘍細胞に対する化学療法薬の投与で成功を収めたことを強調し、この分野における初期結果の一部を論じている。
【００１５】
Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖその他（１９９１， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０８８：１３１−１３４）は、４００  Ｖ／ｃｍから６００Ｖ／ｃｍまでの電場強度を発生させながら、皮膚の皺を電気刺激した後、２つのプラスミドＤＮＡ構成を皮下投与した。
【００１６】
Ｈｅｌｌｅｒその他（１９９６、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３８９：２２５−２２８）は、環状に配置させた電極を介して回転した高電圧パルス（１１．５  ＫＶ／ｃｍ）を発生させて、ラットの肝臓組織に２つのレポータ遺伝子を発現したプラスミドＤＮＡを投与した。
【００１７】
Ｎｉｓｈｉその他（１９９６、癌研究、５６：１０５０−１０５５）は、ラットの脳組織に、１つのリポータ遺伝子を発現したプラスミドＤＮＡを投与した。筆者は、約６００  Ｖ／ｃｍの電場強度を使った。
【００１８】
Ｚｈａｎｇその他（１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．段落２２０：６３３−６３６）は、電極間の距離をほんの約１ｍｍにして、皮膚皺に対して１２０Ｖのパルスで、マウスの皮膚に経皮的にプラスミドＤＮＡを投与した。
【００１９】
Ｍｕｒａｍａｔｓｕその他（１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．段落２２３：４５−４９）は、パルスを１０ｍＳ継続し、１００Ｖパルスで、マウスの精巣細胞に、プラスミドＤＮＡを移入したことを報告している。
【００２０】
Ｒｏｌｓその他（１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６（２）：１６８−１７１）は、電極間の距離を４．２ｍｍにして約３００から４００Ｖまでの電極を加えて、マウスの腫瘍細胞にプラスミドＤＮＡを移入したことを報告している。
【００２１】
ＡｉｈａｒａとＭｉｙａｚａｋｉ（１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６：８６７−８７０）は、電極間の距離を３−５ｍｍにして、定電圧（６０Ｖ）で、方形波パルス（５０ｍＳ継続）を与えて、マウス筋肉組織に、β−ｇａｌが生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で発現したことを報告している。
【００２２】
Ｖｉｃａｔその他（２０００、人間遺伝子治療１１：９０９−９１６）は、高電圧（９００Ｖ）、短パルス（１００μＳ）の電子刺激実験により、目標の細胞、この場合、マウスの筋肉細胞内に長期の発現があったことを示している。
【００２３】
Ｗｉｄｅｒａその他（２０００、免疫学、１６４：４６３５−４６４０）は、肝炎Ｂ表面抗原、ＤＮＡワクチンをコードしたＨＩＶｇａｇ及びｅｎｖを、マウス及びモルモットに生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で投与するために、５ｍｍ以上の間隔を有する伝導電極を使って、１００ｖｏｌｔを加えた。
【００２４】
一般的に、組織を、信号が与えられる負荷としてとらえている従来技術は、組織内に形成される電子孔に関して、電気回路の観点から厳密に調査したものではない。組織に電力を加えるということは、単に任意の電圧勾配で組織に電力を連結させるということだけではなく、別の面を持つ。この別の面とは、電圧と共に、電力消失を決定する、組織に連結した電流や、電流分布、特に局部的な電流密度を決定している、空間における連結をどのようにするか、また種々のタイミング問題を含んでいるが、これに限定されるものではない。更に、従来技術は、電流を組織に加えることにより誘発される可能性のある筋肉収縮等の、治療に付随する面に充分に注意が向けられていない。この治療に付随する面により、臨床的な観点から、治療が許容できるか、若しくは出来ないかが決められる。
【００２５】
前記した従来技術によると、遺伝子発現に関する潜在的な効果を探るために、比較的強い電圧や、これに相応じる形の実質的な電流（組織の電気抵抗に基づいて）に関して研究がなされてきた。組織が損傷する可能性があるために、組織中で適度に電力が消失するような構成をとることになる。しかしながら、骨格筋を、伝導電極を用いて低電圧を基礎として電子刺激する作業ではあっても、該工程の生物的利点は得られても、この工程に関連した不快な特徴、即ち、不本意で過酷な筋肉運動を取り除かなければならない必要性がまだ残っている。また、治療時に有効なパラメータを区別し、詳細に論じる必要性というものも残っている。これは、電気回路としての工程を、特別な方法で信号源に電気的に連結した組織、組織の量、及び／又は、電気負荷として扱われる、細胞内の平行な伝導経路を用いて分析することを含んでいる。本発明は、こういった必要性に目を向け、また該必要性を満たす、装置及び方法を提供する。
【００２６】
本発明は、１種以上の薬剤を、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で投与することを含む、電気刺激工程を構成し、また該工程を運転させ、電気治療状態及び到達した結果を記録し、直接影響するように工程の性能を評価することにより、薬剤を生物組織に投与する際の工程の性能を評価することが出来る、方法及び装置を提供する。特に、本発明は、プラスミドからなる遺伝子薬を吸収させ、これにより、患者や受容者に、免疫反応又は、別の生物的反応を引き起こさせるように、派生遺伝子産物を生成することが出来る程度まで向上させることを目的として、組織に対して電気刺激を加える際に適用することが出来る。
【００２７】
刺激測定装置に連結した一対の電極を、身体、即ち、動物（例えば、哺乳動物即ち、人間）又は植物に取り付ける。薬剤を、該身体の一部に注入する。これは、典型的には、電極領域で注射することにより行われるが、必ずしもそうでなくともよい。信号発生器により、電極に電圧を加え、所定の駆動信号を使って、身体部分を電気的に刺激させる。駆動信号は、電圧、電流、及びパルス幅、形状、負荷周期、繰返し拍子等の、タイミングの内１つ以上に関連するプリセットパラメータを持つことが出来る。信号発生器、及び／又は、信号発生器に連結した駆動増幅器は、電圧、電流、電力、タイミング等を考慮するフィードバック制御を用いて、制御される。身体部分に加えた電圧及び電流を、タイムサンプルを集めるため、データ取得システムを用いて測定する。これにより、電気的パラメータデータが生成され、記録され、格納される。薬剤に対する、遺伝子発現レベル、免疫反応又は、その他の所望の生物反応を測定する。好ましくは、電気刺激の後、時間内に、数箇所で測定する。この工程に、試験される薬剤に匹敵する標識を身体部分に注入すること、及び受容者のシステムにおいて、該標識若しくはこの産物の濃度を周期的に評価することを含んでいると、都合が良い。薬剤を、通常組織化した方法で、治療にかけられた組織を通して取り入れ（通常は、「注入する」）、局部的に組織をいっぱいにする。サンプリングにより提示された電気テストデータを、遺伝子発現データ及び／又は免疫システム反応に交差させる形で関連付けて、このシステムの性能を評価する。このようにして、異なる、潜在的に独特な特質を有する薬剤のために、最適な規則性を決めて、これを実行する。
【００２８】
発明的特徴によると、特別な電極装置を使って受容者に電気刺激治療を行うことで、電気刺激の目的をかなえることが出来る。この技術には、電流レベルを少なくとも所定の最小値に維持しつつ、受容者に加える電流レベルを制限することが含まれている。オームの法則により、所定の最低電流を起す電圧より実質的に多い電圧勾配を加えながら、通う電流を、少なくとも所定の最低値に維持すると都合が良い。これは、本発明の特許性を有する接触型電極構成においては、金属電極に誘電体を取り付けて、該誘電体により、電極が組織と直接接触しないようにすることにより、実現可能である。また、これの代替案は、電極に電気絶縁塗料を塗布することであるが、この塗布は、充分に電極を組織から電気的に絶縁させる程度であってはいけない。１の実施例では、細胞に孔を開けるために、鋭利な突端若しくは端部を有する、実質的に絶縁した（非伝導性）材料を電極に付ける。この絶縁材料は、とても薄くなり、突端又は端部直近の限られた領域において作用しなくなる傾向があるので、これにより、金属電極と組織間の接触を制限すると共に、組織を電流から完全に絶縁しないで、電流を制限することが可能である。
【００２９】
好ましい実施例では、誘電体被覆電極を用いる。一対の電極のそれぞれは、例えば、金属の、導電本体及び、該導電本体表面に塗布した部分的導電塗料から構成されている。組織と接触する電極の領域にわたって塗布された部分的導電塗料は、組織若しくは負荷と直列で、１ＫΩから１０ＫΩまでの範囲のインピーダンスを有する。この直列インピーダンスは、局部的な回路経路に沿って変化を受けやすい。効果的な塗料は、テフロンフルオロカーボン、特に、ＰＦＡ、又は、ＰＴＦＥ、キシレン、及び／又は絶縁ポリマのような別の貧弱な電気導体である。導電率を制御し、及び／又は組織との接触を、電極寸法に比して小さい領域に限定するために、このような材料の導電率を、細かいカーボンブラック、グラファイト、細かい金属粉等を多い、若しくは少ない割合で混合することにより調整することが出来る。また代替案としては、部分的導電塗料を、部分的にエナメルペイントから形成し、また選択的には、１以上の透明な塗料から形成することが出来る。
【００３０】
また、本発明は、患者又は受容者の身体部分に電気刺激治療を行うための、電気刺激装置に関する。この装置は、前述したように、１対の電極を連結した、出力を有する、信号発生器から構成される。各電極は、導電本体及び、該導電本体の表面に塗布した部分的導電塗料から構成される。塗料は、信号発生器の出力及び組織の間の回路中に存在し、これにより加えた電流を制限する。これに関連して、「部分的に導電」と「部分的に絶縁」は、実質的に同意義のものとして使う。これらの言葉は、特定の電圧に維持した金属電極と、該金属電極間の隣接する組織部位の間の連結の程度に関連して使われる。このように、実質的な苦痛、筋肉痙攣、過度なジュール加熱が無く、電気刺激効果を達成できるレベルにまで電流を制限しつつ、組織の両側に電場を与える。
【００３１】
信号発生器は、時間内に、選択した形状の信号を発生することが出来る、任意波形信号発生器と、信号増幅器から構成されていることが望ましい。増幅器の出力は、定電流フィードバック制御モード及び定電圧フィードバック制御モードのうちの何れかで構成することが好ましく、好ましい実施例では、中、若しくは、高電圧範囲において、定平均電流か定平均電圧で管理できる。特定な電力出力（電圧時間電流、即ちワット）を維持するために、出力も制御可能である。制御ドライバ増幅器の出力から直接信号を送ることが可能であり、又は、フィードバック感知信号を組織から、又は回路中の別のポイントから取るか、引き出すことが可能である。時変信号の場合においては、電流、電圧、電力、若しくは別のパラメータの所定の平均的なレベルを維持するためには、回路がフィードバック感知信号を取り除くと好ましい。好ましくは、電気的に制御することであるが、組織の温度のような、別のパラメータに部分的に基づいて制御することも可能である。
【００３２】
装置は、２つの電極間の空間に正確に薬剤を放出するために位置決めすることが出来る、注射針又はカニューレ案内用装置から構成されているか、また該装置を有していることが好ましい。針／電極ホルダには、針及び電極を、身体部分に対して、及び、電極に対して、適宜な位置に案内する、環状案内孔が複数個設けられていると好ましい。電極は、１つの配列の中に配置させることが出来る。
【００３３】
別の発明的特徴は、薬剤を受容者の身体部分に投与するための方法に関する。この方法には、（導電率の調整により、又はおそらく、電極の連続領域内に絶縁の途切れが含まれている為）完全に効果的とはいえない誘電性材料又は絶縁層を有するか、又は、部分的に導電する外表面を有する、少なくとも１つの電極と、身体部分を接触させることが含まれている。何れかの注入作用方法により、好ましくは、注射により、身体部分に薬剤を注入する。すると、該部分は、電極及び、少なくとももう１つの電気的接触部位、即ち、絶縁層に連結された電極に関連して設けられた対向電極に連結された信号発生器を使って、電気的な刺激を受ける。信号発生器は、少なくとも部分的に周期的な信号を電極に送るように作用する。信号発生器は、ピークからピークまで、約１５０ｖｏｌｔの、定電圧モードで作用することが好ましく、各サイクル中、５−２０ｍｉｌｌｉｃｏｕｌｏｍｂ  （好ましくは、５−８ｍＣ）の範囲内で電荷を供給する。間隔をおいて設けられた電極と、これ等電極間の組織（通常、電極間の線に平行に位置づけられた横紋を有する筋肉組織）は、選択的に充電したり放電したりするキャパシタを形成すると効果的である。観察出来る瞬間ピーク電流は、約１５−２０ｍＡであり、ＲＭＳ平均電流は、実質的にこれよりも少ない。イオントフォレシス、エレクトロフォレシス及び／又はエレクトロポレーション効果を得るためには、最小ＲＭＳ電流を維持させる必要があることが観察されている。効果を高めるためには、電極塗料には、誘電性材料や半導電材料を用いることが望ましい。これは、全電流を停止させる比較的良好な絶縁塗料は、折角得た有益な効果を減じてしまうか、又はなくしてしまうことがわかっているからである。
【００３４】
もう１つの発明的特徴は、身体部分に電気刺激治療を施す電気刺激装置に関し、この装置は、離れて設けた電気刺激源を有している。第１の信号発生器を、１対の導電電極に連結させ、第２の信号発生器を、１対の部分的に導電する電極に連結させる。注入針又はカニューレを、２対の電極間の空間に薬剤を放出するために位置決めすることが可能である。針／電極ホルダに、針及び電極を身体部分に対して、また電極に対して、適宜な位置に案内する、複数の環状案内孔を設けると好ましい。第１の信号発生器は、好ましくは、時間内に、選択した形状を有する信号を発生させることが出来る、任意波形信号発生器及び信号増幅器（例えば、約１５−２０ｍＡの瞬間ピーク電流を与えるために比較的低い電圧での短いパルス）である。第２の信号発生器もまた、好ましくは、時間内に、選択した形状を有する信号を発生させることが出来る、任意波形信号発生器及び信号増幅器（例えば、実質的に電流が流れない、１０秒間に１００ｖｏｌｔの低い周波数正弦波信号）である。両増幅器の出力は、それぞれ、定電流フィードバック制御モード及び定電圧フィードバック制御モードの内、何れかで構成されていることが好ましい。
【００３５】
本明細書中でいう、信号を「１対」の電極に連結するということは、少なくとも２以上の相対向する電極、又は、分離した導電経路が設けられ、これが、同一の、又は別の駆動信号を使って駆動されるような構成であれば何れも含まれる。このようにして、分離した、又は連結した陽極及び陰極の電極の配列を設けることが出来、これをそれぞれ連結することが可能であり、又、これを異なる特定の信号により駆動することが出来る。対向する対のそれぞれの電極を設け、これを差込み、さもなくば一配列中に配置させることが可能である。組織との導電的な接触を、離れた形で行ったり、或いは振り分ける形で行うために、電極を更に分けることが出来、これにより、薬剤を注入した組織の量の限界を決める電流経路を設けることが出来る。
【００３６】
本発明は、核酸分子及び他の薬剤の、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での細胞投与を進歩させるために、受容者の組織、好ましくは、骨格筋に電気刺激を与える方法を提供する。電子刺激方法とこれに関係する装置に関連して使用する核酸分子を、霊長類、人間等の哺乳動物を含めた、脊椎のある受容者にインビボで直接投与することが出来る。特別好ましい受容者は人間ではあるが、望ましい受容者は、実際、人間を除く霊長類動物等の哺乳動物である。
【００３７】
本発明の特別な実施例は、本明細書で開示したエレクトロポレーション装置及び方法を使用して、対象の核酸転換遺伝子を筋肉細胞に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で投与することに関する。この工程は、遺伝子治療適用と同様、ＤＮＡワクチン技術において有益である。注入場所部位付近で、筋肉を電子刺激すると同時に、プラスミドＤＮＡを直接注入することを本明細書が教えてくれる。より詳しく言うと、電子刺激方法は、本明細書で述べた装置、即ち、電極によって組織に励起電圧を加えることに関連して使用し、その際組織に加える電流を制限するように作用する、部分的に導電した電極セット又は、相補的な電極の複数セットに左右される。電極セットは、より導電的電極（若しくは電極領域）又は、より導電的でない電極（若しくは電極領域）内の配列の中に配置することが可能である（即ち、電極の、比較的導電的表面及び比較的断熱表面の間に散在させる）。この構成により、もし、組織に対して同一の電圧を直接、導電的に加えるとすると、オームの法則により、充分に導電した電極表面により与えられる電流密度と比較して、サンプルを介して、全電流を減らすことが可能である。（部分的導電電極を使って）組織内の電流及び、これに関連する電荷密度を減少させると、不本意な筋肉運動、ジュール加熱、また導電電極の使用に関連し起きる同じ様なこと等、電磁エネルギを加えることにより、予期される有害な副作用を最小限に抑えつつ、投与を向上させることが出来、及び／又は対象の転換遺伝子の発現が可能になる。
【００３８】
本発明は、核酸及び蛋白質配合等の、治療薬の生物学的効能及び耐性を向上させるため、動物及び人に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で電気刺激治療する際に役立つ、薬剤及びある一定の薬剤配合を試験し、これを投与するための装置及び方法を構成している。例えば、本発明によると、ある一定の遺伝子治療やＤＮＡワクチン剤が生物組織で強い免疫反応を誘発し得る有効性を高めることが出来る。これは、イオントフォレシス、エレクトロフォレシス及び／又はエレクトロポレーション効果（即ち、電気刺激）を得るために１種以上の薬剤を注入するのと実質的に同時に、電気エネルギを加え、我慢できるような治療工程にすることによる。
【００３９】
本発明は、薬剤での治療中に、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で電気刺激するために協力しなければならない幾つかの面から構成されている。これらの面には、信号の発生、信号の増幅、電極の構成や配置、薬剤の配合が含まれている。更に、本発明には別の面がある。これには、瞬間サンプル時間において加えた電流及び電圧のレベル等の、種々の治療パラメータを記録する、取得システムを使用して、高周波サンプルデータをサンプリングしたり、これらデータを収集することが含まれているが、これに限定されるものではない。以下に示す試験データは、薬剤投与中に電子刺激を加えることにより、特定の生物的効果を向上させることが出来ることを立証しており、本発明によると、この技術は更にみがきがかけられてきた。特に、導電電極、対、部分的絶縁電極、対、完全絶縁電極（反応効果は別として、実質的にゼロ電流で、また、±４００Ｖの比較的高い定制御電圧で試したことも含む）を使用して、生物学的に向上した性能が評価された。本明細書に示した発明的な電極の配置により、激しい筋肉の収縮等の、電流に関する不都合な反応を排除することが出来る程度まで電流レベルを制限して、生物学的効果を向上させる効果に到達することが出来る。
【００４０】
本発明は、ｊ＝電流密度ベクトル、σ＝導電率、Ｅ＝電場ベクトルの時、ｊ＝σＥであるミクロベクトル方式、及びＶ＝電圧、Ｉ＝電流、Ｚ＝コンプレックスインピーダンスの時、Ｖ＝ＩＺであるミクロスカラ方式の内、どちらか一方に関してオームの法則を適用することに関する。（一般的にはステンレス鋼の電極のインピーダンスは１０Ω以下であるが）導電電極よりもむしろ、ＩＫΩから１０ＭΩの範囲のインピーダンスを有する誘電性材料で一般的に被覆した、本発明による部分的絶縁電極を使うことにより、電気刺激を伴わない治療において、生物反応に関して大きな進歩をとげることが出来る。本発明及び、部分的絶縁電極又は誘電性電極を用いると、電極間の組織内を流れる、加えた電流を実質的に制限することが出来るという、大きな利点がある。これは、加えた電力レベルも同じように制限する。しかしながら、仮に最小限の電流レベルを得ることが出来れば、中位の電圧と、極端に制限した電流レベルを使えば、所望の進んだ生物反応に到達するためには、この電力レベルで十分であることがわかっている。この技術により、電流を加えることにより発生する不本意な筋肉収縮を減らし、また電流を加えることに関連した患者又は受容者の不快感を減らすことが出来る利点がある。
【００４１】
好ましい実施例では、本発明は、受容者の身体部分に薬剤を投与するためのシステムの性能を評価する方法に関する。ここでいう「薬剤」という語は、薬剤、予防接種、他の化合物や配合を含み、特に、遺伝子治療やＤＮＡワクチン接種で使用する核酸及び蛋白質配合を含んでいる。ここでいう「性能」という語は、システム効力（即ち、遺伝子治療時の望ましい免疫システム反応や遺伝子発現レベル）及び安全性、許容度、及び悪影響を含む。ここでいう「注入」という語は、単なる注射だけに限らず、他の皮下注射、経皮注射、静脈注射、経口投与、即ち、受容者の少なくとも目的の組織を満たす薬剤投与を含む。
【００４２】
一般に、筋肉組織部分等の、身体部分に隣接して電極を配置させ、該電極は、別の場所に配置させた、第２の電極に比例して電気的に駆動自在である。第２の電極は、第１の電極と同様な構成を有しており、該第１の電極とは、筋肉又は別の組織に関して反対側近くに配置されている。薬剤を身体部分に、即ち、（対称的に配置させた）電極間の空間に、直接的に又は間接的に注射し、又は別の方法で注入する。信号発生器を電極に連結させて、少なくとも部分的に周期的な信号を身体部分両側に与え、該身体部分に電気的刺激を加える。データ取得システムを使って加えた電圧及び電流を測定し、これにより、参照のために集められた電気パラメータデータが生成される。例えば、薬剤に反応して発生する産物や免疫反応の結果を周期的に分析することにより、宿主免疫反応や遺伝子表現レベルが測定される。パラメータデータ及び反応データは、種々の形態の数値分析にかけることが可能であるが、少なくとも一部のパラメータデータ及び免疫システム反応を特徴付けているデータは、相互に関係があり、それによって、このシステムの効能及び薬剤の効能を評価することが出来る。
【００４３】
図１は、本発明の実施例による、基本的な電気刺激試験回路のブロック図を示している。一般に、一定の距離だけ離れた（概略的に示した）２つの針１４、１６を有する電極を介して、信号発生器１０を、受容者１２の身体部分（組織）に連結させ、該電極は、両方の針間の反応量１８を限定している。分圧器２０は、電極の両側に平行に連結されている。１Ωの電流検知直列抵抗器２２が電極と一直線に連結されている。種々の構成及び種々の配置を有する電極は、以下に詳述するように本発明の範囲内である。
【００４４】
信号発生器１０は、好ましくは、任意波形信号発生器であり、これは、選択的な負荷周期で、及び／又は、選択的なパルス繰返し率で、一度に、若しくは、連続して、少なくとも選択可能な複数の波形の内、如何なる形状をも有する電圧信号を時間内に発生させることが出来る。本発明によると、種々の波形形状を使用することが出来る。また、種々の波形形状は、特にある薬剤にとっては適切であるかもしれない。この波形形状は、方形、正弦、放物線、鋸歯、三角形、指数関数的に増加、減少するスパイク、均一ノイズ、負のランプ、正弦掃引、対数の、又は直線の周波数の変量及び別の種々の形状を含むが、これに限定されるものではない。しかしながら、人間を除く霊長類の動物にとっては、約４００Ｈｚで連続する正弦波は、十分許容出来、また、遺伝子発現及び免疫反応を向上させる治療においては有効である。
【００４５】
信号発生器１０は、定電流（「ＣＣ」）或いは定電圧（「ＣＶ」）フィードバックで制御するよう形成したフィードバック配列を有する感度調整可能演算増幅器から構成される、信号増幅器を有している。好ましい実施例では、該制御は、数百ボルトの範囲で制御する一定高電圧（「ＣＨＶ」）モードを含んでいる。一般に、このフィードバックは、瞬間感知信号をフィルタで取り除き、これにより得た感知信号を、利得制御に適用することにより、平均定電流や平均定電圧を維持しようとする。治療した組織の電気的な特徴は、やがていくらか変化する（一般に、組織の抵抗は、治療中に減少することが観察されている）。定電流増幅器として運転している時は、平均電流が所定の値を超えて増加すると、信号発生器１０は電圧出力レベルを減少させ、これにより、電流レベルを所定値、例えば目標制御値に戻すのに役立っている。同様に、信号発生器１０は、目標平均電流を得る必要があるならば、電圧出力を増加させることが可能である。定電圧増幅器として運転している時は、信号発生器１０は、負荷（電極間の組織の抵抗）が変化したとしても、その電圧出力を維持する。このように、定電圧増幅器は、電流装荷における変化に適応するようその出力を増減させる。定電流モードでは、電極間に電気経路が無いときは（例えば、電極が組織と接触していないときは）、増幅器は限界を超えて出力電圧を増加させることが出来、定電圧モードでは、組織インピーダンスが実質的に落ちてしまうか、或いは電極が不注意にも不足してしまうと、増幅器は制限無く電流を供給しようとする。しかしながら、増幅器は、何れのフィードバックモードにおいても、出力制限をもつことが好ましく、これを一定させ、これによりフィードバック制御の範囲を制限して損害を防ぐ。
【００４６】
本発明による使用に適した（任意波形信号発生器及び演算増幅器から構成される）信号発生器は、種々の電源から入手することが可能である。これ等の例は、ＦＨＣ， Ｉｎｃ．（Ｂｏｗｄｏｉｎｈａｍ， Ｍａｉｎｅ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ （Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）等の市販用の電源、及び Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ ＲＹ−Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ等の、注文電源があり、注文電源が特に適している。
【００４７】
図１に示すように、組織１２に加えた電圧は、分圧器２０の両端に現れる。分圧器の下脚部両端の電圧Ｖａｂは、入力電圧から簡単に求めることが出来る（Ｖａｂ＝Ｖｉｎ ＊１Ｋ／（１Ｋ＋１Ｍ）又はＶａｂ  はだいたい０．００１＊Ｖｉｎ）。電圧分圧器２０は、電源電圧Ｖｉｎに対して約１０３の係数で減じられた点Ａ、Ｂ間の電圧信号を提供する。点Ａ、Ｂ間の測定電圧を、データ収集モニタやサンプリング装置に入力するために適宜定められたレベルにまで減少させることは別にして、電圧分圧器２０は、この総直列抵抗が、（入力信号周波数によるが、典型的には、２００−１０００Ωの範囲の）組織１２のインピーダンスに対してごく僅かなので、最小の回線負荷を発生させる。
【００４８】
組織１２に流れる電流は、１Ωの直列抵抗器２２両端の電圧から求めることが出来る。オームの法則Ｖ＝ＩＲにより、点Ｂ及び点Ｃ間の測定電圧は、１Ωの直列抵抗器２２に流れる電流や、組織１８に流れる電流に比例する。
【００４９】
図２は、本発明において使用するデータ取得システムを示している。データ取得システムは、コンピュータ若しくはプロセッサ及び、これに関連するデータ取得ソフトウェア５０から構成されている。オペレータの便宜を図った入力／出力装置は、キーボードとマウス５２、ディスプレイ５４、プリンタ５６等の出力装置を有する。好ましくは、高インピーダンス入力、アナログ／デジタル変換器、入力範囲を、各入力毎に所定の出力値範囲に対応するよう設定する計数制御、及びデータサンプルを集める率を決定するための（おそらく、引き起こす、若しくはイベントにより引き起こされる）１個以上のタイミング制御装置を有する、多重チャンネルデータ取得ボード５８を使用して、数値データを入力する。ＩＢＭ、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｃｏｍｐａｑ、Ｄｅｌｌ、Ｇａｔｅｗａｙ、その他当該技術において公知なものから入手可能な、典型的なＩＢＭ互換パソコン、Ａｐｐｌｅ互換機、ワークステーション等の、標準的なＰＣが、本発明によるコンピュータ、プロセッサとして使用が認められる。
【００５０】
データ取得ソフトウェアや多重チャンネルデータ取得ハードフェアは、いろいろな所から入手でき、最も典型的なものはプロセス制御データを収集する際に使用される。本発明による使用に適したモデルは、例えば、テキサス州オースティンのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できる。例えば、次の部品（多くは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能）で実行させるデータ取得システムを使って、実用的に配置させると、良好な結果を得ることが出来る。
・ＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｅシリーズ、多機能入出力データ取得（ＤＡＱ）ボード
・Ｌａｂ  Ｖｉｅｗソフトウェア／ＮＩ−ＤＡＱ、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｆｕｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（５．１バージョン）
・ＳＣＢ−６８シールド入出力コネクタブロック
・６８ピン  シールドケーブル
ＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｅ−１は、通常次の特徴を有している。
・アナログ入力、８チャンネルデファレンシャル
・１２ビット、連続接近アナログ／デジタル変換器
・１秒間で１．２５Ｍサンプル保証、１秒間に５００Ｋサンプルをハードディスクに直接ストリーム
ＤＡＱボード制御Ｌａｂ  Ｖｉｅｗソフトウェアは、好ましくは、以下の特徴を有している。
・独立計数信号の多重チャンネル記録
・５チャンネルで１秒間に１００Ｋスキャン、各チャンネル測定は１μｓｅｃで離れている
・データメモリバッファ、１，０２４，０００バイト
・スキャン／ライト＝２００Ｋ
【００５１】
図３及び図４は、本発明による針／電極ホルダ６０を示している。針／電極ホルダ６０は、一般に、プレキシグラス、ポリカーボネート等の、電気絶縁体から構成される支持物であり、薬剤注入用カニューレ又は中空針と、中空というよりはむしろ中実であり、処置領域に隣接する領域に挿入することにより埋め込まれる電極となる、組織電気刺激用の一対の針の両方を、案内し及び／又は方向付けるために使用する。針／電極ホルダ６０は、長さ約３８ｍｍ、幅約１９ｍｍ、厚さ約３．２ｍｍであると好ましく、針及び電極を、組織に対して適宜な位置に位置決めするように案内する複数の環状の案内穴により構成されている。各種の形状を有する針／電極ホルダは本発明の範囲内である。電極案内穴６２同士は、通常２ｍｍ離れて設けられており、該穴は、針／電極ホルダの面に対して約３０°で設けられている。単一の針案内穴６４は、電極案内穴６２から約３０ｍｍ離れており、該穴は、針／電極ホルダの面に対して約４０°で配置されている。
【００５２】
針／電極ホルダ６０の形状は、２、３の理由により都合が良い。針／電極ホルダ６０は、治療条件（即ち、針の位置決め、反応領域との関係等）を調整し、これら条件を堅実に再現することが出来る。本発明では、部分絶縁電極を使用することが望ましいこともわかっている。このように、細胞に薬剤を注入するための注入針を別に設けることが望ましい。
【００５３】
電極は、部分的に伝導する誘電性化合物を均一に塗布し、ステンレス鋼等の、導電物質から構成されていることが好ましい。図４に示すように、針／電極ホルダは、薬剤が反応領域（即ち、電極間の空間内に）に直接投与されるように、電極（単一の電極を６８として概略的に示す）に対して注入針６６を、適宜位置決めしている。しかしながら、電極の形状としては、注入用及び電気刺激用、両用に使用する中空の電極や、２個以上の電極を使った電極配列等が含まれるが、これに限定されるものではなく、非常に多くの電極形状が、本発明において使用が認められる。
【００５４】
図５は、（電極案内穴６２を介して）針／電極ホルダ６０に支持された一対の電極６８を示している。各電極６８は、好ましくは、中実な導電芯７０、及び部分的に導電する誘電性塗料７２を有している。中実な導電芯７０は、好ましくは、ステンレス鋼等から構成されている。許容厚みは、２７ゲージである。本発明では、各種の部分的に導電する誘電性塗料を使うことが出来る。例えば、エアブラシ（Ｔｅｓｔｏｒｓ Ｃｏｒｐ．のモデルマスタＮｏ．５０６０３）により電極に、Ｅ．Ｌ． Ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．のＮｏ．４２０−７０３、１７００−０００、ペンシルベニア州ウェストチェスタのＷｈｉｔｆｏｒｄ Ｃｏｒｐ．から入手可能なＲｙｔｏｎ、Ｗｉｔｆｏｒｄ ＸｙｌａｎのＮｏ．１３９１ １３３１皮なめし剤等の、ＰＦＡを塗布することが出来る。代替物としては、一種以上のエナメルペイント（モデルマスタＮｏ．１７０５）、選択的には、一種以上の透き通った上塗り（モデルマスタＮｏ．２７３６）がある。ＰＴＦＥ、ＰＦＡベースの部分的に導電する誘電性塗料、又は同等の化合物は、色々な所から調達が可能である。一般に、誘電体は、制限的伝導性を有するか、若しくは、金属粉、カーボンブラック、グラファイト等の導電粒子を適宜加えることにより伝導性を調整することが出来る、耐久性のある、無反応なポリマ材料から構成することが出来る。
【００５５】
部分的に導電する誘電性塗料は、電気刺激中の電圧絶縁破壊に耐えうる充分な絶縁耐力を有していることが好ましい。部分的に導電する誘電性塗料はまた、すべすべしていると好ましく（即ち、摩擦係数が低い）、これにより受容者が気楽でいられるように、電極の挿入、取り外しが簡単になっている。部分的に導電する誘電性塗料はまた、医療機器に電極被覆するものとしてＦＤＡ（米国食品薬品局）承認に適している。従って、ＰＦＡ化合物ベースの部分的に導電する誘電性塗料はまた、特に好ましい。何故なら、ＰＦＡは比較的高い絶縁耐力を有しており、多くの場合においてＦＤＡに承認されているものと考えられ、またこれは平滑であり、耐摩耗性があるからである。ＰＦＡは、一般に絶縁体であるが故に、電極に塗布する前に、カーボンブラック等の材料をＰＦＡに追加して混合することが可能である。部分的に導電する誘電性塗料は、１ＫΩから１０ＭΩの範囲のインピーダンスを有していることが好ましい。しかしながら、これより低い、またこれより高い抵抗も、即ち、特殊な形態の電流密度を得るために制限した、又は空間的に配置させた１００Ω等の低抵抗や、負荷回路のレベルでの１００ＭΩまでの高い抵抗も、本発明の範囲内である。
【００５６】
本明細書においては、電極塗料は、ある時は部分的絶縁体として、またある時は部分的導電体として出てくる。この２つの表現は、実質的に同意義である。何れの場合においても、本発明による効果は、電極が単に金属で、駆動信号を介して電極が組織と直接連結していたとしたら、オームの法則により、実質的に高い電流を生み出すことになる電圧を印加しながら、治療部位で細胞に流れる電流密度に制限を加えることが出来ることである。電圧勾配を与え、組織に電流を流すけれども、オームの法則から外れた電圧、電流関係においてこれを行うことが、本発明の特徴である。
【００５７】
実際、本発明では、本来は電荷担体を得ることが出来ない誘電性不導体又は絶縁体に、最小限の電流を維持しながら、電荷が与えられる、誘電性バリアを採用している。これには、誘電性バリアや絶縁が完全には効果的ではないことが必要である。特に、誘電体や絶縁体は、例えば、伝導が可能な、障害内の小さいギャップにより、組織を金属電極から完全に絶縁することが無い。別の選択肢としては、不導体（絶縁）ポリマ等の、通常断熱している材料を、該ポリマを硬化させる際混合した導電性粒子の割合により調整可能な抵抗で、導電するようにすることが出来る。これに適した導電性粒子は、例えば、カーボンブラック、アセチレンブラック、グラファイト、金属パウダ、金属粒子等である。
【００５８】
本発明の実施例によると、エナメル塗料である、絶縁体又は誘電性バリア材料を、治療部位に隣接する組織に孔を開けやすい、鋭利な円柱形状をした電極に塗布した。電極の電気的絶縁は、エナメル材料から予想させる絶縁に比して、あまり効果的ではなく、この絶縁により、円柱の鋭利部分を被覆しながら、十分に連続した、又は物質的に丈夫なバリアになるわけではないので、あてにならない絶縁となり、バリア効果もあてにならない。驚いたことに、完全な絶縁バリアは効果的でないのに、上述したあてにならないバリア電極が、電気刺激にとって効果的であることがわかっている。更に行った試験により、少なくとも最小限の電流、例えば、最高で、少なくとも数ミリアンペアの電流が流れているならば、組織領域両側に加えた電場により、電気刺激を効果的なものにしていることが本発明により、わかった。
【００５９】
一般的に、本発明による電気刺激を提供するために確立した電流、電圧条件は、電圧を組織サンプルの両側に加えるということである。導電電極と組織の間の、抵抗材料、誘電材料、絶縁材料によって限定された、部分的に導電する、又は、部分的に絶縁するバリアがある限り、電極の導電部分間で電圧降下する部分は、電気刺激にかけた組織の両側よりはむしろ、バリアの両側に電圧勾配を与える。しかしながら、僅かに不連続な誘電性バリアを有する電極構造により、もし電極が完全に導電的であったとしたらオームの法則によりなる電流密度にはならずに、組織の絶縁部分に大きな電圧勾配をもたらし得る。要するに、本発明の特徴によると、治療する組織の抵抗を考えて、オームの法則に適合しない電圧、電流条件の下で電気刺激を加えることである。特に、組織に供給する電流を、電気刺激中、より導電的に組織に連結した同一の電圧降下によって生まれる電流よりも少なく制限する。
【００６０】
データ取得システムは、電気刺激工程の全体的な時間経過中に、電気的パラメータ及び電気的条件を、１秒間に１００Ｋを超える速度で記録し、書類を作成するように作用する。このシステムは、（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＰＣＩ−６１１  ｂｅｌを使用した場合）データを、１秒間に５Ｍサンプルまでの率で、平行して４チャンネルまでハードディスクにストリームすることが出来る。データ取得システムは、これとは別の特定なデータ率での求めに応じることが出来る。
【００６１】
電極を、好ましくは筋肉繊維に平行に、細胞内に挿入させる。一般に、針／電極ホルダ６０を使って、薬剤を組織内に注入する。予め選択しておいた時間間隔で、所望の波形を用いて電極に電圧を加える。
【００６２】
本発明による別の特徴によると、差し入れた電極、又は、別の構成を有する、対又は、グループとなる対向電極を複数個設け、これを別々の信号により駆動させ、又は、組織と電極、又は、組織と電極領域間を連結することにより得られる特定の振幅で、電流と同時に起きる効果により、組織を治療するといった、異なる導電特徴を有するように構成することが出来る。例えば、第１信号発生器を、一対の導電電極に連結させ、第２信号発生器を、一対の部分的導電電極に連結させることが出来る。注入針又はカニューレを、２対の電極間の空間に薬剤を放出させるために位置決めすることが出来る。針／電極ホルダには、身体の部分に対して、また、電極に対して、針及び電極を適宜な位置に案内する環状案内穴を複数個設けることが好ましい。第１信号発生器は、遅れずに選択した形状の信号を発生させる任意形状信号発生器、及び信号増幅器（例えば、約１５−２０ｍＡの瞬間ピーク電流を供給する、比較的低い電圧での短いパルス）であることが好ましい。第２信号発生器は、遅れずに選択した形状の信号を発生させる任意形状信号発生器、及び信号増幅器（例えば、電位差はあるが、実質的に電流の流れが無い、１０秒間に１００ｖｏｌｔの、低周波数正弦波）である。両増幅出力は、定電流フィードバック制御モード及び定電圧フィードバック制御モードの内、何れかで形成されていることが好ましい。
【００６３】
非常に多くの試運転が行われてきた。この試運転では、受容者の身体部分を、時変信号で電気的に刺激し、身体部分に電気刺激を加えながら、該身体部分に供給した電圧及び電流を、上記開示したデータ取得システムを使って、測定し、記録した。その後の試運転に際しては、パラメータが広範囲に亘って変化した。全ての場合において、遺伝子発現、及び／又は免疫反応が強くなったのを測定し、薬剤投与の効力がはっきりした。
【００６４】
不本意な筋収縮は、電気刺激の結果としてある一定の範囲内で起こる有害な副作用として知られている。一般に、同一の振幅では、比較的低い周波数信号（例えば、４００Ｈｚ正弦波）よりも、比較的高い周波数信号（例えば、５０ＫＨｚ正弦波）のほうが筋収縮が少ないことが測定されている。
【００６５】
方形、正弦、三角形、指数関数的に増加、減少するスパイク、均一ノイズ、負のランプ、正弦掃引（これに限定されるものではないが）等を含む、種々の波形形状が試されてきたし、またこれ等が本発明による使用に受け入れられるものであると考えられてきた。
【００６６】
また、図１４に示すように、非導電塗料を塗布した電極を用いて実行した電気刺激は、試した薬剤に対する生物学的反応に関して進歩がみられないことが測定されている。比較的純粋なＰＦＡの非導電塗料で塗布した電極は、すぐれた絶縁耐力特性、摩擦抵抗、平滑潤滑性等を有していた。しかしながら、予期していたことではあるが、完全絶縁電極は、データ取得システムによって記録されたように、電気刺激中に測定可能な電流を生むことはなかった。試した薬剤に対する生物学的反応に関して進歩を望むならば、少なくともある程度の電流の流れや、ある程度の電荷移動が必要となることが、本発明によってわかってきた。また、不本意な筋収縮が増加するのは、特に、比較的低い周波数信号で、電流を増加させることと関連性があるが、電流を、所定の最小平均電流を僅かに上まるように制限することにより、不都合な収縮を起こさずに生物学的効果を発揮させることが出来ることがわかっている。
【００６７】
筋肉収縮が電極間の組織内で起こる限り、電極同士を近接して設けるならば、受け入れる収縮を減らすことが出来る。例えば、電極間の距離を、該電極を配置した筋肉の長さに比して小さく保つことが出来る。このようにして、電極間のスペースを８ｍｍから４ｍｍに減らし、他の条件を同じにすると、マウスの筋肉組織における収縮範囲を狭めることが出来る。
【００６８】
このようにして、非常に多くの試運転から集めたあらゆるデータの相互関係を明らかにするにあたって、漏出性がある、誘電性の部分的導電塗料で塗布した、導電本体を有する電極は、多くの有害な副作用を減らしながら、生物学的反応の観点から進歩がみられることを出願人は確認した。各々が、部分的導電塗料から形成された、漏出性のある誘電体を有する、一対の電極を、上記開示した針／電極ホルダを使って、組織に配置させた。薬剤を反応領域に注入した。信号発生器を、ピークからピークまでで約２００ｖｏｌｔの定電圧モードに設定した。使用した信号形状は、１０列１０００ｐｕｌｓｅを有する方形波であり、各パルスは２００μ秒でピーク時で１００ｖｏｌｔ、２００μ秒及び休止時６００μ秒で−１００ｖｏｌｔ有している。
【００６９】
図６は、対象の電気刺激から集めた電気試験データを示す、データ取得システムからの治療後分析の例示的なディスプレイを示している。一般に、瞬間電流は、２０ｍＡより少なく、また（定電圧制御モードで）電流増幅は、各パルス列中で落ち込みがちだった。それ故、不本意な筋肉収縮による受容者の不快感は最小限になった。こういった状況で、組織は、１回の治療当り、５−２０ｍｉｌｌｉｃｏｕｌｏｍｂの範囲で全電荷を受ける。しかしながら、この電荷は、急激に振り分けられ、電極間の間隔約１ｃｍ当り３３０ｖｏｌｔ（３ｍｍちょっとで１００ｖｏｌｔ）のわずかな電圧勾配を有する電場の存在下で、局部的に組織密度が変化を受けやすい。
【００７０】
［発明の効果］
本発明を用いると、種々の利点が与えられる。網羅的ではないが、このリストを以下に示す。本発明は、最低でも、生物組織と接触している電極の両側に加えた電場（電圧）、及び電流を含む、関連する電気的パラメータを全時間経過に亘って、特定な時期を十分に分析しながら、正確に測定し、記録することが可能な診断ツールを提供している。関連する電気信号を測定し、記録すると、電気的に刺激した動物対象記録を量的に分析することが出来、（ａ）電場／電圧（エレクトロポレーション）、（ｂ）駆動電流（イオントフォレシス）、（ｃ）他の現象、の作用メカニズムを決定し、これを最大限に活用することが出来、グループ内の患者から患者までに対等な治療を確立し、これを確実にすることが出来、信号発生器、電気信号、電極配置を最適化するために、信号発生器により負荷をかけた生物組織を理解することが出来、（ｅ）より多くの量の細胞を扱うために、工程を率に応じて変化させることが出来（例えば、人間関連の投与量は、０．５−１．０ｍｌの注入）、生物組織の電気的特徴（導電性／インピーダンス、誘導抵抗／磁気抵抗、周波数応答等）を更に理解することが出来、電気信号パラメータの、生物的な効力、不本意な筋肉収縮等の、非電気的変数に対する相関関係を研究することが出来、「等価回路」の開発及び、人間治療に概念的に拡大するための、動物型組織のコンピュータ模擬実験の開発を容易にすることが出来、不本意な筋肉収縮に関する量的な測定の範囲を広げることが出来、電気刺激治療（及び、反対の反応を示す場合の適宜な分析）の、正確かつ完全な記録を文書化することが出来る。
【００７１】
観察した不本意な筋肉収縮は、加えた電流や、加えた総合電荷が増すにつれて多くなるということが、追加的に、またきわどいところで観察された。また、電気刺激治療にとって明らかに許容できることは、電流の振幅や総合的な集積電荷に単調的に関連しているように見受けられる。従って、本発明は、電流や総合電荷を多くかけるという、否定的な面を最小限に抑える努力を行いつつ、向上した生物反応を達成する手引きを教えている。
【００７２】
本発明はまた、核酸分子や他の薬剤の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での投与を向上させるために、骨格筋細胞及び受容者の別の組織を電子刺激治療するための進んだ方法に関する。電子刺激にかける別の受容者組織は、心筋、皮下細胞、皮膚細胞、腫瘍細胞、肺細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、眼球細胞等を含んでいるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
ワクチン治療、又は遺伝子治療の受容者に導入される表現可能なＤＮＡの量は、ＤＮＡ構成で使用する転写プロモータ、及び翻訳プロモータの強度に依存し、また、表現した遺伝子産物のそれぞれの免疫原性や治療に役立つ値に依存する。合成ＤＮＡワクチンや遺伝子治療表現カセットは、この技術分野では公知であり、転換遺伝子を最適に表現するのを助けるために、種々の形態で提供されている。ＤＮＡワクチンは、効果的な免疫予防であり、又、抗体及び／又は細胞媒介免疫を中和することにより、ウイルス性の、又は、細菌性の感染に対して効果的な治療として介入することが出来る。一般に、予防用、又は治療用（ワクチン投与又は遺伝子治療）にとって免疫学的に有効な投与量は、約１μｇから１０ｍｇであり、約１ｍｇから５ｍｇのプラスミドＤＮＡを、本明細書に記述した電子刺激に関連して、人間の筋肉細胞に直接投与すると好ましい。骨格筋に直接注入する際、針、又は無針噴射注射によるのが好ましい投与経路ではあるが、本明細書で述べた電子刺激方法に従った別の経路は、皮下注射／電子刺激、皮内挿入／電子刺激等を含むが、これに限定するものではない。電子刺激しながら、皮膚及び腹膜組織内へ投与する際の感触に関しても考えなければならない。
【００７４】
本発明のもう１つの実施例は、ＤＮＡワクチン技術等を適用するため、又は遺伝子治療を適用するため、目的の遺伝子を発現するＤＮＡ分子を骨格筋に投与するための方法を利用することに関する。この点に関する発明は、１セットの部分導電電極若しくは２セットの相補的な電極を利用して、注入箇所付近で筋肉を電子刺激しながら、核酸を骨格筋に直接注入することに関する。利用する電極の型を考慮に入れて、これら電極の両側に電圧かけて電場を発生させると、体積電流密度は、対向する電極と組織を直接導電接触させるとオームの法則により得ることが出来る電流密度より少なくなるという、電圧／電流関係が発生する。特に、加えた電圧と、組織の抵抗に等しい電極電流間の関係に代わり、直列抵抗を散在させることにより、また、好ましくは、不連続な、抵抗性の、誘電性の、又は絶縁しているバリアを使って、組織との接触点を減らすことにより、絶縁箇所で接触させ、最大の電流密度を発生させることにより、より低い電流にすることが出来る。このようにして、電圧と関連付けて電流を加えると、おそらくは、電流密度を、治療箇所における組織の容量に比して比較的小さい割合である絶縁経路に実質的に制限することにより、不本意な筋肉運動を実質的に最小限に抑え、又は完全に排除しながら、受容者の組織に対するＤＮＡ表現プラスミドの投与を向上させ、及び／又はこの発現を高めることが出来る。これ等の不本意な筋肉運動は、組織容量が、電圧勾配及び電流密度に支配される導電電極（例えば、ステンレス鋼）を用いて、組織の両側に電圧駆動電流をかけることに関連がある。電流及び加えた総電荷を減少させると、電子刺激を加えない場合に比して、受容者に対する薬剤投与を進歩させると共に、不本意な筋肉収縮を最小限に抑え、又はこれを完全になくすことが出来る。本明細書で開示した電気刺激処置により、高い電圧をかけることと関連して発生することがわかっている、不本意な著しい筋肉反射運動等の、有害な副作用を発生させずに、人間、若しくは人間を含まない霊長類等の、哺乳動物の受容者（これらを含むが、これに限定されるものではない。）に対する生物的反応を向上させ、またこれ等受容者に対する薬剤の細胞移入を向上させることが出来る。
【００７５】
高いインピーダンスを有する誘電性塗料により電流は高くならないけれども、電場が電極間を貫通するような、本発明による部分的導電電極を使う際には、電極の２つの極性間に置かれた電位の量を調整するためには、信号増幅器は、定電圧（ＣＶ）フィードバック構成であると都合がよい。本発明による装置及び方法を使用して、本明細書に記載した、部分的に絶縁する、又は２セットの相補的電極を使うことにより、電気刺激を加えない治療に比して、生物反応に関してかなりの進歩を遂げることが可能である。更に、（部分的に絶縁する、又は２セットの相補的な電極を利用した）本発明は、治療処置中に、受容者に加える電流を減少させ、これにより、不本意な筋肉収縮、及びこれに関連した痛みを減らす意義深い利点をもっている。本明細書を考慮すると、多数の電極配列を、１箇所の投与箇所近くで、或いは、おそらく多数の投与箇所で利用することが出来る。
【００７６】
図３に示すように、ある特定の実施例では、針及び電極を、目的の組織に対してうまく位置決めさせるために、プレキシグラスの針／電極ホルダを使用している。図３に示すような、針及び電極の挿入角及び電極間の距離は、さほど重要ではない。図７には、別の実施例による針／電極ホルダが示されており、該針／電極ホルダは、細長い電極を摺動自在に保持する複数の孔及び、電極が突出する長さを調整する止めねじを有する、ポリカーボネイト等の絶縁材ブロックから実質的に構成されており、特にマウスにおける治療に適用されている。約１ｍｍから約４ｍｍの範囲で間隔を開けて設けた電極を使って開発したデータでは、電極間の距離は、１ｍｍの何分の１から約１０ｍｍの範囲でよい。
【００７７】
注入や針注射による薬剤投与の後に、電気刺激がなされる限り、また、その間に、薬剤が治療した組織内で効果的な濃度を保っている限り、電気刺激を加えることに関連した薬剤の注入時間は過度に重要なものではない。薬剤を注入する前に電子刺激治療を行うと、生物反応に関する望ましい向上が望めず、組織内にもはや薬剤が存在しないならば、治療による薬剤の利益は明らかに享受できないということがわかっている。
【００７８】
「例」部分に示すように、本発明による中心点は、非オーム電場の存在下、組織内で比較的中位の電流が流れるように、部分絶縁電極若しくは、２セットの相補電極を介して定電圧を加えることが出来るということである。この電流の減少は、治療時間中、組織の両側に運んだ総合電荷が比較的低いことと関連する。これにより、上記した不本意な筋肉反射運動がかなり減少し、若しくは、無くなり、引き続いて、臨床的な設定に関してこの方法がとても興味をそそるようになる。ここで述べた高速度データ取得システムは、加えた電圧及び電流の測定のデジタル記録を作成し、これにより、特定の治療中に運んだ総合電荷等の、治療変数を計算することが出来る。「例」欄に示すように、本発明による方法によると、目標の筋肉細胞への移入を向上させながら、総合電荷を約５−３０倍減少させることが出来、ＤＮＡプラスミド発現構成を投与する場合には、電子刺激を伴わない注入に比して、転換遺伝子発現レベルをかなり増加させることが出来る。
【００７９】
本明細書を検討すると、電気信号、増幅器モード、電極、注入配合の選択は、数々の公知の方法で相互に関連付けることが出来るのは明らかである。これ等の考察は、以下のものを含んでいるが、これに限定されるわけではない。
（１）どんな導電回路を用いても、一般的にオームの法則に従わなければならない。また、１ＭＨＺ以下の準静的ドメインにおける電位には、ポワソンの方程式に従わなければならない。しかしながら、一般的に電極の水準、またより小さいスケールでは、別々の電極表面領域、別々の組織構造等に関しては、これらの関係の効果を考える必要がある。
（２）電気信号は、周波数、振幅、スペクトル崩壊（例えば、フーリエのパワースペクトル）、形状、拍子等によって特徴づけられる。これらにおける変数及び変形は、物理学の法則に従わなければならない。
（３）同じ目的のために、電場Ｅは、確立した電位差Ｖに寸法的に比例して釣合いがとれており、電位を隔てている距離Ｄに反比例して釣合いがとれている。それ故、電圧及び距離両方の変化若しくは差を、他の幾何学的面の変化若しくは差も含めて、評価しなければならない。組織を、電極間の抵抗としての機能と考える限り、電気エネルギを加えることにより、またジュール加熱により、組織及び／又は、組織と電極間の連結部分の導電性を時間を越えて変化させることが出来ることを認識する必要がある。
（４）電流Ｉは、電荷の時間変化率（即ち、電荷の最初の時間微分）であるので、治療中の時間変化を評価する必要がある。
（５）電流密度ｊは、電流が及んだ断面領域Ａで除した総電流Ｉである。しかしながら、電流が及ぶ受容者組織は、空間的に物理的特性が全方向に等しいわけでもなければ、均質でもない（例えば、骨格筋繊維は一軸方向に走っている）ので、電流が組織に流れる空間的範囲や領域だけでなく、電極の種類や、該電極に対する、治療中の受容者組織の内、肉眼で見ることが出来る構造及び、顕微鏡によらなければ見えない微細構造の位置に関する要素も考慮に入れなければならない。
（６）ワンショット充電装置／エネルギ散逸装置（例えば、コイル又はキャパシタ）等の種々の特定な駆動要素、一瞬、電圧又は電流と連結するスイッチング要素、及び他の公知技術から、電子装置を設計することが可能であり、該電子装置は、関連装置又はフィードバック構成により管理可能であるが、ここで述べた特定な実施例は、例を限定するものではない。
【００８０】
演算増幅器は、電子刺激に適した電気信号を生成する例示的な装置であり、これを簡単にフィードバック制御構造に連結して、電圧、電流、又は他の測定単位（例えば、ワット数）に基づく駆動増幅器の出力の制御を維持することが出来る。それ故、相補的な２セットの電極では、相補的な導電電極セットと共に使う場合には、定電流（ＣＣ）構成が都合が良いけれども、部分的、又は完全絶縁電極では、定電圧（ＣＶ）フィードバック構成を第一に使用することが奨励される。
（７）ここで述べた導電電極材は、実質的に無視することが出来る内部抵抗を有する低抵抗金属であると考えられる。しかしながら、ステンレス鋼がむしろ良く、ステンレス鋼の種々の配合により、材料の導電性／抵抗性が電荷注入を変化、変更させることが出来る。
（８）誘電性塗料を塗った（部分的、又は完全絶縁）電極の特性を説明しなければならない。本発明によると、例えば、絶縁耐力、誘電率、微孔性、潤滑性は重要な要素である。
（９）注入配合に含まれる（アルミニウム塩等の）アジュバントは、治療中の組織の空間インピーダンスを変更させることが出来る。
【００８１】
前述した討論及び、後述する「例」の記述からすると、これらパラメータを一般的に調整、適用することが可能であり、これは、この技術における当業者にとって明らかであり、本発明の範囲内である。
【００８２】
本発明の重要な面によると、部分的に絶縁した１セットの電極又は、２セット以上の相補的電極により、組織及び治療領域の両側に電圧をかけ、これにより電場存在下、電流を組織に対して加える。しかしながら、この関係は、厳密的には、組織抵抗に基づいて組織内に電流を引き起こしている電極に対する電圧の関係ではない。任意の時間における電流は、治療中に変化する可能性があるが、開示した電子刺激方法では、組織体積０．０９ｃｍ３中で、およそ２０ｍＡ以下の瞬間電流密度を加えている。記述した「例」においては、治療体積は、約０．３×０．３×１．０ｃｍ３であり、これで不本意な筋肉反射運動を減少できるか、又は完全になくすことが出来ることがわかっている。しかしながら、求めるべき生物向上効果に達するためには、導電した電極表面の少なくとも一部から生じる電流密度で十分だった。
【００８３】
また、本発明による重要な面は、電子刺激を、マイクロ秒（μＳ）から約１時間まで変動させて、時間経過中行うことが出来る。組織に対して加える電流を減らし、不本意な筋肉反射運動を減らし、又はなくしたことにより、本発明による方法により、（運動選手の１筋肉当り２０分かかる、筋肉組織に対する超音波治療に類似した）長期の電子刺激処置が可能であると予想される。
【００８４】
筋肉組織に対する電気刺激の間中、有効な波形であればどんなものでも適用することが出来、これにより、薬剤の移入を増やすことが出来る。例えば、交流を加えるものは、単極式の、又は２極式の正弦波、また、三角波形、方形波形、指数関数的上昇−減少波形、均一ノイズ、負ランプ、対数シヌソイド掃引等の、非シヌソイド波形が含まれているが、これに限定されるものではない。
【００８５】
１種以上の薬剤を投与するために、開示した装置及び方法を利用することが出来る。この１種以上の薬剤は、核酸分子、蛋白質、抗体、（組換え型のウイルス、不活性化ウイルス、減衰ウイルス等の）ウイルス粒子、ウイルス似粒子（ＶＬＰ）、ポリマ、（ＰＬＧＡミクロスフェア、アジュバント特性を示すカチオン脂質［ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ等の］）、配合核酸、受け入れ可能な薬剤プロファイルを有する小有機分子、小無機分子を含むが、これに限定されるものではない。薬剤は、また、レシチンリポソーム、ＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３／２４６４０参照）と、本技術で公知の、他のリポソーム等の、リポソームと関連している。薬剤、特にＤＮＡプラスミド発現ベクタを、アジュバント、又は、本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドワクチンの免疫原性を増加させるアジュバントと配合することが出来る。これらアジュバントは、本技術では種々のものが公知であり、ＤＮＡワクチンに関して使用する際に入手可能である。このアジュバントは、ＤＮＡを被覆した金ビーズを使った粒子ボンバード、ＤＮＡワクチンの無針噴射注射、シトキン、ケモキン、コスティミュレートリ（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子を発現するプラスミドＤＮＡと、ＤＮＡワクチンの共同投与、カチオン脂質と、又は、サポニン等の実験用のアジュバントとＤＮＡの配合、単ホスホリル脂質Ａ、ＯＰＴＩＶＡＸポリマ、又は、ＤＮＡワクチンの免疫原性を増加させる他の化合物であるが、これに限定されるものではない。本発明のＤＮＡベクタワクチンに使用する別のアジュバントとしては、アルミニウム燐酸塩ベースのアジュバントが、約０．９のＰＯ４／Ａｌモル率を有する、アルミニウム燐酸塩ベースアジュバントの１種以上の形状がある。無機質ベースのアジュバントは、カルシウム燐酸塩の１種以上の形状から生成することが出来る。ミネラルベースのアジュバントは、適宜な細胞免疫反応に有害な影響を与えずに、ＤＮＡ予防接種に対する体液性の反応を増加させる際に効果的である。これ等の、ＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するミネラルベースの化合物は、関連するものとしてここに入れた、ＰＣＴ国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２４１４、 ＰＣＴ国際公開Ｎｏ．ＷＯ ９８／３５５６２に開示されている。このようなアルミニウム燐酸塩アジュバントとしては、Ａｄｊｕｐｈｏｓが登録商標として存在する。別のアルミニウムベースアジュバントは、（登録商標Ａｌｌｈｙｄｒｏｇｅｌ等の）アルミニウム水酸化物が含まれている。
【００８６】
興味の対象となるどんな核酸も、本方法の候補となり、この核酸は、筋肉細胞の移入に敏感に反応する、閉円環状、または線状プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ破片等の、ＤＮＡを含むが、これに限定されるものではない。加えて、ＲＮＡ分子の投与も、本発明の範囲内に含まれる。本明細書に例示したように、特に役に立つ適用は、ＤＮＡプラスミド発現ベクタを骨格筋細胞に、今までよりも向上させる形で投与、移入することに関する。電気刺激により骨格筋細胞内で移入効果が高まると、必然的に対象の抗原の発現が高まる。このように、本発明は、ＤＮＡワクチンの投与と関連した形で免疫反応を向上させることが出来ると共に、種々の遺伝子治療を仮定した病気及び障害を改善させることが出来る。
【００８７】
本明細書で開示したＤＮＡプラスミドベクタは、本技術では公知である。本明細書で述べたＶ１Ｊｎｓベクタは、改良型の方法を例示するために使用されるが、比較可能なＤＮＡ発現ベクタや、ここで述べた他のベクタは、本発明を実行するために利用することが出来ることは、本技術の当業者にとって明らかなことである。ワクチンベクタＶ１、Ｖ１Ｊ、Ｖ１Ｊｎｅｏ、Ｖ１Ｊｎｓ、Ｖ１Ｒの準備に関しては、参照のためにここに入れた、ＷＯ９４／２１７９７（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２７５１）に記述されている。加えて、ｔＰＡリーダシーケンス（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（これに限定させるものではないが）等の適宜なリーダシーケンスからなる、ＤＮＡプラスミドベクタを利用すると役に立つ。上記ベクタバックボーンからなる、ＤＮＡプラスミド発現ベクタの例は、ＷＯ９７／３１１１５（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４）に記述されており、これには、人間等の目標受容者に発現させるため最適化した活用コドンの効果も示されている。ＷＯ９７／３１１１５の明細書も参照のため入れた。
【００８８】
予防治療や健康維持に役立つ治療に基づいて分析できるウイルス性、細菌性の攻撃の例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザ、結核、ヒト乳頭腫ウイルス、肝炎Ａ、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ等を含むが、これに限定されるものではない。本明細書に記載した要素を利用して、癌等の非感染性疾患、自己免疫疾患、及び種々のアレルギ用の予防治療又は健康維持に役立つ治療を提供することは、本発明の範囲内である。腫瘍、感染性の病原体に対して予防接種が可能である。何故ならば、ＣＤ８  ＣＴＬ反応は両方の異常生物学的処置において重要であるからである。本発明による構成要素及び方法によって、どんなＤＮＡワクチン配合も投与出来、また、これを家畜に適用する際にも有益である。家畜への適用は、狂犬病、ジステンパー、脚部、口腔部疾患、炭素菌、ウシ亜科動物単純疱疹、ウシ亜科動物の結核等を含んでいるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
好ましいＤＮＡワクチンは、ＨＩＶベースワクチンであり、これには、（ｐ５５又はｐ１７、ｐ２４、ｐ９、ｐ６等のその一部、又は、その更なるエピトープ）ｇａｇ、 （プロテアーゼ、逆転写酵素活性、ＲＮａｓｅ活性、及び／又はインテグラーゼ活性、又はその一部等の、全コード領域、及びある特定の活性をコードする領域等の、）ｐｏｌ、（ｇｐ１６０、ｇｐ４１及び／又はその一部等の）ｅｎｖ、の３つの構造遺伝子、ｎｅｆ、Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ及び／又はＶｐｘ又はその一部等の、ＨＩＶ寄生（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）遺伝子、ｔａｔ、ｒｅｖ又はその一部等の、ＨＩＶ転写活性遺伝子を含む、種々のＨＩＶ遺伝子のコード領域の全部又は一部を現す、抗原を発現するＨＩＶ  ＤＮＡワクチンが含まれているが、これに限定するものではない。ある特定なＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス１型）ベースのＤＮＡワクチン構成は、ｐ５５ギャグ抗原をコードするヌクレオチド配列に融合したＶ１Ｊｎｓバックボーンからなっており、ここでは、開いた読み枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）内のコドンは、人間における発現に最適だった。この構成は、Ｖ１Ｊｎｓ−ＦＬｇａｇと呼ばれる。コドンは、人間に発現させるために最適な、ＨＩＶ−１ｐ５５ギャグをコードするＶ１Ｊｎｓ−ＦＬｇａｇのための開いた読み枠に関しては、ＷＯ ９８／３４６４０  （ＰＣＴ国際出願 Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２２９３）に示されている。開始メチオニン（ＡＴＧコドン）は、ヌクレオチド１０−１２に代表され、「ＴＡＡ」終止コドンは、代表的なＨＩＶ−１ｐ５５ギャグ抗原のヌクレオチド１５１０−１５１２から始まる。ギャグ遺伝子の発現を高めるための人工遺伝子部分は、同一の翻訳配列を有するが、「アミノ酸配列データから演算した合成オリゴヌクレオチド試験：その理論的、応用的考察」という表題のＪ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．第１８３巻、ｐｐ１−１２（１９８５）からの研究記事のＲ． Ｌａｔｈｅによって定義されたように、別のコドンを使用する、配列に転換された。ＨＩＶギャグ遺伝子部位の発現を高めるための以下に示す方法は、この遺伝子を哺乳動物の細胞内で効率よく発現することが出来ないのは、転写構成物の全ての結果である、というわれわれの仮説に基づいていた。このように、同一の蛋白質配列をコードする別のコドンを使うと、ギャグを発現させる際の制約を取り除くことが出来る。使用した特別なコドン入れ替え方法は以下の通りである。（１）開いた読み枠を適宜にするため、コドンの場所を特定し、（２）人間の遺伝子による使用頻度を観察するために野生型コドンを比較し、（３）コドンが最も一般的に使われているものでない時には、これを、人間の細胞内で高く発現する最適なコドンに置き換え、（４）全遺伝子部位が置き換わるまで、この処置を繰り返し、（５）このコドンの置き換えにより発生した望ましくない配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロン除去認識部位の偶然の産物、不必要な制限酵素部位等）のために、新しい遺伝子配列を検査して、これ等の配列を除去するコドンを置換し、（６）人工遺伝子部位を組み立て、発現が向上しているかを試験する。
【００９０】
これ等の方法は、発現させるためにコドンを最適に使用することからなる遺伝子を生成するＨＩＶギャグ用の、次に述べる人工遺伝子配列を生成するために使った。上記処置は、ＤＮＡワクチン用のコドン最適遺伝子を設計するための本方法の概要を提供するものであるが、この処置にちょっとした変更を加え、又は配列に関してちょっとした変更を加えることにより、同様なワクチン効力を得ることが出来るか、又は、遺伝子発現が向上することは、当業者は理解している。
【００９１】
次に挙げる例は、本発明を説明するためのものであるが、これに限定されるわけではない。
【００９２】
例１
遺伝子発現に関する、定電圧、低電流での電子刺激の効果
材料−Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５（ストレイン、ペニシリン、ストレプトマイシン、超純粋ＣｓＣｌを、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）から入手し、カナマイシン、フェトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｍ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。分泌アルカリ性燐酸塩遺伝子をＴｒｏｐｉｘ（Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）から購入し、標準的な処置の後、Ｖ１ＪｎＳ中にクローンとして発生させた。
【００９３】
プラスミドの準備−ＳｅＡＰプラスミドを発現しているＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞に、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを追加して、ＬＢ中で極限状態まで増大させる。プラスミドを、標準ＣｓＣｌ方法により精製し、更に使用するまで、５ｍｇ／ｍＬより高い濃度でサリン中で溶解度を高めた。これら準備したものを、使用のために希釈するまで、−２０ｄｅｇ Ｃで凍結させて保存した。作業濃度（ＨＰ８４５３ダイオード配列分光光度計で測定したように、Ａ＿２８０により立証された量）まで希釈した、標準的なサリン又はＰＢＳ中で、ＤＮＡを最小限調剤し、一晩中保存するならば４ｄｅｇ Ｃで、同じ日に使用するならば、室温で保存した。
【００９４】
動物プロトコル−雌のＴａｃｏｎｉｃ  ｂａｌｂ／ｃマウス（生後４−８週間）に、ケタミン／キシラジン（１００／８  ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。右側にＩＰを注入し、左側腹部筋肉を剃った。麻酔の深さは、ＩＰ投与後、数分間足指をつまんで計った。動物が眠っている間に、２８Ｇインシュリンで、注射器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ ＃３２９４３φ）を満たした。各動物は、表１、２に示すプラスミド濃度で、Ｖ１Ｊｎｓ−ＳｅＡＰを１×５０μｌ受けた（０．２ｍｇ／ｍｌ）。プラスミドＤＮＡを、剃った腹部筋肉に注入した。注射針を膝頭の丁度上に差し入れ、これを、臀部に向けて、腹部筋肉に沿って縦方向に約１．０ｃｍだけ打ち込んだ。一般的には、注射器を直ぐに外した後、２個の針電極を、図７に示す針／電極ホルダの助けを借りて、電極間の間隔をＤ＝３ｍｍにして、筋肉繊維と平行な腹部筋肉グループの外端に、皮膚を介して挿入した。必要であれば、鋭利な針を使用して、電極が通過できるように、皮膚に孔を開けた。
【表１】
2004532654.tif 000002
【表２】
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【００９５】
このようにして、２個の平行な電極間に、注入剤の泡が取り巻いた。以下に示すように、電子刺激を加えた。一般的に、投与後９日間で血を取り、マイクロテナー（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）チューブを使って血清を分離した。血清は、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移し、分析するまで凍らせた。５ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒの血清を、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｐｈｏｓｐｈａｌｉｇｈｔ化学ルミネセンス分析キット（＃ＢＰ３００）を使い、ＳｅＡＰレベルで分析し、Ｄｙｎｅｘ  ＭＬＸ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使って、示数をとった。
【００９６】
電極−使い捨て同軸導電電極を、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｉｖ．（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ） から入手し、Ｍｅｄｅｌｅｃ ２７Ｇ針は＃Ｎ５３１５５であった。針ホルダ及びケーブル（＃Ｎ２１００１）を入手し、増幅器出力信号を、各同軸針の外側の電極に取り付けたＤＩＮコネクタ上のピン４間に加えた。
【００９７】
オーダーメードの部分絶縁電極を、同じＯｘｆｏｒｄ Ｍｅｄｅｌｅｃの同軸導電電極（２６Ｇ， ０．４６ｍｍ （φ イエローハブ）から、規格に従って作成した。電極には、メーカーの指示に従って薄めた赤いエナメルペイント（Ｔｅｓｔｏｒ’ｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍａｓｔｅｒ ＃１７０５）を、エアブラシ（Ｔｅｓｔｏｒ’ｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍａｓｔｅｒ ＃５０６０３）を用いてスプレー塗布し、室温で２、３日乾燥させた。その後、これに、再びエアブラシを用いて、透明仕上げ塗りを塗布した（Ｔｅｓｔｏｒ’ｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍａｓｔｅｒ ＃２７３６）、少なくとももう２時間ほど乾燥させた。数々の失敗経験から、針先端の曲げ半径を調整することが重要だとかわった。小さい曲げ半径を有する鋭すぎる針は、塗料で表面を塗布するのが大変難しい。それ故、６００グリットのサンドペーパーで先端をこするか、又は、より大きい曲げ半径でこれを製造すると、うまく塗布することが出来ると考えられている。
【００９８】
あるいはまた、ステンレス鋼の単極針（＃ＰＲＯ−３７ＵＳ）をＴｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ｓｔｏｒｅ （Ｂｕｃｋｌｅｙ， ＷＡ）から購入し、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏａｔｉｎｇｓ （Ｓｔｏｃｋｔｏｎ， ＣＡ）で、ｄｕ Ｐｏｎｔ （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）のＰＦＡ（＃４２０−７０３， １７０００００）又は、Ｗｈｉｔｆｏｒｄ （Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）のキシラン（製造番号１３９１， １３３１ ｔａｎ）を塗布した。他の模範塗料は、Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ｓｔｏｒｅの専売のＰＴＦＥ塗料及び、Ｈｙｄｒｏｍｅｒ Ｉｎｃ． （Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）のポリウレタン塗料だった。
【００９９】
電子刺激及び高速度データ取得システム―外付けのカスタムビルトの電力増幅器を有する、パーソナルコンピュータベースシステムで、信号を発生させ、これを記録した。信号発生器は、Ｄｅｌｌ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ＸＰＳ Ｔ６００ （Ｓ／Ｎ Ｗ−１６９１６）パソコンのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ （Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ） ＮＩ−５４１１任意波形発生カードであった。波形は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｗａｖｅｆｏｒｍ Ｅｄｉｔｏｒにより設計し、１秒間に１０Ｍサンプルの割合で、デジタルバイナリファイルとして保存した。ＡＲＢカード上の周辺メモリにロードし、５０ｏｈｍ出力で終えるために、これらバイナリファイルを呼び出す、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｏｒ 又はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｎｏｔｅｐａｄにおいて、テキストベースのシーケンスファイルを構築した。出力信号は、直ぐに分配され、一方を、データ取得ボード上の入力チャンネルに接続し、もう一方は、増幅器のＤＣ入力に接続した。
【０１００】
Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｒａｈｗａｙ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｍｏｄｅｌ １９９８０６６４、Ｓ／Ｎ： Ａ＝ＩＲＢＭ）で、特別注文の増幅器を組み立て、主に、ＡＰＥＸ Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ）ＰＡ−８５モノリシック演算増幅器から構成した。増幅器は、表１に示すように、定電流（ＣＣ）フィードバックモード又は定電圧（ＣＶ）フィードバックモードの何れかで作動させた。図１に概略的に示すように、筋肉組織両側の、Ｉ−Ｖ電流、電圧モニタ信号を、増幅器の電圧感知、電流感知絶縁出力から直接連結させた。何れかの理由で電気刺激治療を中止させる際の予防措置として、安全連動装置ペダルを装着した。高圧（ＡＰＥＸ）増幅器を、所望するならば、±４００Ｖ提供できるように連結させた。
【０１０１】
高速データ取得システムを、同一のＤｅｌｌ パソコンのＡＲＢカードの隣に装着した、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｅ−１ Ｅ−ｓｅｒｉｅｓ 多機能多重入力データ取得ボードから構成した。記録用の電気信号を、ＳＣＢ−６８ブレークアウトボックスに入力し、ＲＦノイズを減少させるために接地アルミニウムホイルシェルで覆った。３つの入力チャンネル（ＡＲＢ出力、加えた電圧、加えた電流）からのデジタル化した１２ビットの測定を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｄａｔａ Ｌｏｇｇｅｒ．ｖｉ ｅｘａｍｐｌｅ ｖｉｒｔｒｕａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｄｅの修正版を使って、１００ ｋＳａｍ／ｓｅｃ又は、 ２５０ ｋＳａｍ／ｓｅｃで、ハードディスクにストリームした。この場合、２枚のＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓカードを、名前をＮＩ ＡＲＢ／ＤＡＱ ｖｌ．ｘという、書面の注文申請書により、ＬａｂＶＩＥＷ ソフトウフェア環境内で一緒に管理した。時折、刺激監視箱（ＲＹ−Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＃１９９９０５９４）を電極に、直列に接続した。尤も、このような箱を使用するのは好ましくは無いことである。
【０１０２】
電子刺激治療―グループ１は、ＤＮＡ注入後、電子刺激を受けず、グループ２は、定電流（ＣＣ、Ｉ＝±５０ｍＡ）で、ステンレス鋼の導電電極を介して電子刺激を受けた。グループ２の動物は、列と列の間に１／２の休止周期を置く形で、Ｎ＝１０列の、ｆ＝１ｋＨｚの２極方形波パルス（各極性で２００μｓｅｃ、休止時に６００μｓｅｃ）を受けた。グループ３の動物は、上記したように、部分的に絶縁する塗料付電極を介して電子刺激を受けた。筋肉組織に定電圧（Ｖ＝１００Ｖ）をかけ、グループ３の動物は全て、列と列の間に１／２の休止周期を置く形で、Ｎ＝１０列の、ｆ＝１ｋＨｚの２極方形波パルス（各極性で２００μｓｅｃ、休止時に６００μｓｅｃ）を受けた。
【０１０３】
電子刺激分析―１動物１治療当り、１０Ｍｂ以上の生バイナリデータファイルを、多重チャンネル記録に適合するように、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｄａｔａ Ｒｅａｄｅｒ．ｖｉの直接変更を使って、検査、分析した。従って、１０分の１のデータを取って、他のＬａｂ  ＶＩＥＷソフトウェアに書き込み、治療処置の間に測定した瞬間電圧レベル及び瞬間電流レベルの柱状グラフを作成した。
【０１０４】
図９Ａ及び９Ｂは、投与後４日（Ａ）、及び投与後１１日のｂａｌｂ／ｃ マウスの血清ＳｅＡＰレベルを示している。図９Ａは、導電電極又は部分的絶縁電極の何れかを用いた電子刺激に続く４日間の、マウスにおけるＳｅＡＰ発現に関する重要で、比較可能な向上を示している。設定された完全なデータ及び他のパラメータは、表１に示す（４日と１１日）。
【０１０５】
ステンレス鋼の導電電極で電気刺激処置を受けた動物（グループ２）は、好ましくない不本意な筋肉収縮をかなり経験したことが、一貫して観察された。この収縮は、治療を受けた筋肉だけでなく、隣接する筋肉群にまで及んだ。それ故、Ｎ＝１０列を与えると、１０周期にわたって不本意な筋肉収縮が観察でき、これは、信号を与えた時間に正確に対応していた。更に、加えた電流が増加するほど、筋肉収縮が激しさを増していることがはっきりと観察できた。このように、ＣＣモードで、１００ｍＡの信号を加えた導電電極では、他の条件は同じにして５０ｍＡを加えたときに比べて、かなり強く筋肉収縮してしまう。
【０１０６】
全く思いもよらないことではあるが、導電電極を使用した場合と比較して、部分的に絶縁する電極を使用すると、観察できた不本意な筋肉収縮が劇的に減少した（グループ３）。一般的には、治療中の腹部筋肉にだけ、間欠的な震えや痙攣が観察されただけだった。治療を１０秒行うと、３、４回の震えや痙攣が観察された。
【０１０７】
このように、本発明による部分的絶縁電極により、筋肉収縮が減少し、それ故許容性が高まると同時に、生物反応も向上した（図９Ａ−Ｂ）。
【０１０８】
図１０Ａ及び１０Ｂは、Ｎ＝１０列の、ｆ＝１ＫＨｚの２極方形波（各極性で２００μＳ、休止時に６００μＳ）を与える形で、増幅器を約＋５０ｍＡ及び−５０ｍＡの定電流（ＣＣ）モードにして、ステンレス鋼の導電電極により電子刺激を受けた、動物１７５０の代表的な電気刺激部分を示すための、電気刺激治療処置（ボルトで加えた電圧及びミリアンペアで与えた電流の両方）中に取得した生のバイナリデータの時系列グラフを示している。図１０Ａに示す４秒窓の時間には、加えた列の内、２列が含まれており、電流、電圧に関する大きな変化全体を見ることが出来、図１０Ｂに示す６ミリ秒の窓の時間には、６つの単位細胞パルスが含まれており、組織に加えた個々の波形パルスを調べることが出来る。
【０１０９】
図１１Ａ−Ｄは、動物１７５０に対する治療中に記録した、生バイナリデータファイルを分析した、瞬間電圧、瞬間電流の柱状グラフを示している。図１１Ａ、１１Ｂは、巨視的な図であり、図１１Ｃ及び１１Ｄは、全体的なグラフを見る際、見えない部分を明らかにするために、各グラフの中心部を拡大したものである。１０秒間の治療中、総絶対電流は、Ｉｔｏｔ＝２０ｍＡで、加えた総電荷は、約２００ｍＣだった。
【０１１０】
図１２Ａ及び１２Ｂは、動物１６６１に対する電子刺激の代表部分を示すための、電気刺激治療処置（ボルトで加えた電圧と、ミリアンペアで加えた電流両方）中に得た生のバイナリデータの時系列グラフを示している。このマウスは、同一のＮ＝１０列、ｆ＝１ＫＨｚの二極方形波（各極性２００μＳ、休止時６００μＳ）を利用して、約＋１００Ｖと−１００Ｖの振幅で、定電圧（ＣＶ）モードにし、エナメル塗料及び仕上げ塗料を塗布した部分的に絶縁する電極を介して電子刺激治療を受けた。図１２Ａに示す４秒窓の時間には、加えた１０列の内、２列が含まれており、電流、電圧に関する大きな変化全体を見ることが出来、図１２Ｂに示す６ミリ秒窓には、６つの単位細胞パルスが含まれており、組織に加えた個々の波形パルスを調べることが出来る。
【０１１１】
図１３Ａ−Ｄは、動物１６６１に対する治療処置の間に記録した、生のバイナリデータファイルを分析した、瞬間電圧、電流の柱状グラフを示している。図１３Ａ、１３Ｂは、巨視的な図であり、図１３Ｃ、１３Ｄは、全体的なグラフを見る際、見えない部分を明らかにするために、各グラフの中心部を拡大したものである。加えた総絶対電流（電荷）は、Ｉｔｏｔ＝０．８ｍＡだった（１０秒間の治療中、Ｑｔはだいたい８ｍＣ）。
【０１１２】
図１４は、注入後８日の、ｂａｌｂ／ｃマウスにおける血清ＳｅＡＰレベルを示しており、これは、（ｉ）電子刺激を加えていない、（ｉｉ）ステンレス鋼の導電電極を用いて電子刺激を加えた、（ｉｉｉ）完全絶縁したＰＦＡを塗布した電極を用いて電子刺激を加えたものである。
【０１１３】
例２
マウスにおける血清ＳｅＡＰレベルに関する、導電電極及び完全絶縁電極の効果
表２に示すように、ステンレス鋼の導電電極（グループ２）及び（ＰＴＡを塗布した）完全絶縁誘電性電極（Ｎ＝１０列の方形パルス、グループ３）を用いて、例１と同様の電子刺激条件で、Ｖ１Ｊｎｓ−ＳｅＡＰプラスミドＤＮＡ（１０μｇ）をｂａｌｂ／ｃマウスに与えた。
【０１１４】
完全絶縁電極を使うことに限定すると、治療中に、筋肉収縮、筋肉の震え又は痙攣は観察されなかった。有効な信号が加えられていることが確認できるような特徴は、治療に関して見ることは出来なかった。その代わりに、電圧が加えられたかどうか、また、明らかなことではあるが、電流が加えられていないことを確認するには、データ取得システムに頼る必要があった。
【０１１５】
図１４は、更に、完全絶縁電極（グループ３）の血清ＳｅＡＰレベルは、電子刺激を全く加えなかった場合と区別がつかなかった（即ち、グループ１と比べて）ことを示している。対称的に、ステンレス鋼の電極（ＣＣ、Ｉ＝±５０ｍＡ、Ｎ＝１０列、ｆ＝１ｋＨｚ二極方形波パルス、各極性で２００μｓｅｃ、休止時に６００μｓｅｃ）は強い反応を示した（グループ２）。
【０１１６】
この処置を、完全絶縁ＰＦＡ電極を使って、４００Ｖで繰り返した。生物反応は向上しなかった。
【０１１７】
本明細書を通して述べたように、これらの結果は、完全に絶縁した誘導性電極（即ち、治療中の、周辺騒音がある中、基準電流又は基準電荷以下を与える）は、ＤＮＡプラスミド発現ベクタの細胞投与を向上させるものではないことを示している。その代わり、例１に示すように、電極は、少なくとも部分的に電流を導電しなければならない。たとえ、核酸分子の細胞内への移入を向上させ、不本意な筋肉反射運動を減少させるために、従来のステンレス鋼の電極により、オームの法則を満足させる電流よりも少なくした場合でもそういえるのである。
【０１１８】
本発明は、前述した例やその変形に関連して開示したが、更なる変更は、この技術における当業者にとって明らかである。本発明は、特に記述した変更に限定するものではなく、従って、排他的権利を主張する本発明の範囲を評価するために、好ましい例として前述したものよりはむしろ、添付したクレームを参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
図面には、本発明による、好ましい例示実施例が示されている。本発明は、例として開示した実施例に限定されず、添付した特許請求の範囲内で変更が可能であるものとする。図においては、
図１は、本発明による、基本的な電気刺激試験回路のブロック図である。
図２は、本発明による、データ取得システムのブロック図である。
図３は、本発明による、針／電極ホルダの平面図である。
図４は、本発明による、針／電極ホルダの側断面図である。
図５は、本発明による、針／電極ホルダに支持された、中実の導電中心と、部分的に導電する誘電性塗料をそれぞれ有する、一対の電極の断面図である。
図６は、中実の導電中心と、部分的に導電する誘電性塗料をそれぞれ有する、一対の電極を使用して電気刺激を加えた際集めた電気試験データを示す、本発明による、データ取得システムからの例示のディスプレイである。
図７は、本発明による、別の電極ホルダの断面図である。
図８は、本発明のシステムを機能的に説明したブロック図であり、作用、即ち刺激及び反応、即ち測定部分に細分化されている。
図９Ａ、９Ｂは、注入後４日（Ａ）、注入後１１日（Ｂ）の、ｂａｌｂ／ｃマウスの血清ＳｅＡＰレベルを示しており、それぞれ、（ｉ）電気刺激を加えない、（ｉｉ）ステンレス鋼の導電電極で電気刺激を加える、（ｉｉｉ）部分的絶縁電極で電気刺激を加えたものである。データは、個々のマウスを（＊）及びグループの平均を（○）で表している。この平均には、標準的な中間値誤差が含まれている。
図１０Ａ及び１０Ｂは、動物１７５０の代表的な電気刺激部分を示すための、電気刺激治療処置（ボルトで加えた電圧及びミリアンペアで与えた電流の両方）中に取得した生のバイナリデータの時系列グラフを示している。このマウスは、Ｎ＝１０列の、ｆ＝１ＫＨｚの２極方形波（各極性で２００μＳ、休止時に６００μＳ）を与える形で、増幅器を約＋５０ｍＡ及び−５０ｍＡの定電流（ＣＣ）モードにして、ステンレス鋼の導電電極により電子刺激を受けた。図１０Ａに示す４秒窓の時間には、加えた１０列の内、２列が含まれており、電流、電圧に関する大きな変化全体を見ることが出来、図１０Ｂに示す６ミリ秒の窓には、６つの単位細胞パルスが含まれており、組織に加えた個々の波形パルスを調べることが出来る。
図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄは、動物１７５０に対する治療中に記録した、生バイナリデータファイルを分析した、瞬間電圧、瞬間電流の柱状グラフを示している。図１１Ａ、１１Ｂは、巨視的な図であり、図１１Ｃ及び１１Ｄは、全体的なグラフを見る際、見えない部分を明らかにするために、各グラフの中心部を拡大したものである。１０秒間の治療中、総絶対電流は、Ｉｔｏｔ＝２０ｍＡほどで、加えた総電荷は、約２００ｍＣだった。
図１２Ａ及び１２Ｂは、動物１６６１に対する電子刺激の代表部分を示すための、電気刺激治療処置（ボルトで加えた電圧と、ミリアンペアで加えた電流両方）中に得た生のバイナリデータの時系列グラフを示している。このマウスは、同一のＮ＝１０列、ｆ＝１ＫＨｚの二極方形波（各極性２００μＳ、休止時６００μＳ）を利用して、増幅器を約＋１００Ｖと−１００Ｖの定電圧（ＣＶ）モードにし、エナメル塗料及び仕上げ塗料を塗布した部分的に絶縁する電極を介して電子刺激治療を受けた。図１２Ａに示す４秒窓の時間には、加えた１０列の内、２列が含まれており、電流、電圧に関する大きな変化全体を見ることが出来、図１２Ｂに示す６ミリ秒窓には、６つの単位細胞パルスが含まれており、組織に加えた個々の波形パルスを調べることが出来る。
図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄは、動物１６６１に対する治療処置の間に記録した、生のバイナリデータファイルを分析した、瞬間電圧、電流の柱状グラフを示している。図１３Ａ、１３Ｂは、巨視的な図であり、図１３Ｃ、１３Ｄは、全体的なグラフを見る際、見えない部分を明らかにするために、各グラフの中心部を拡大したものである。加えた総絶対電流（電荷）は、１０秒間の治療でＩｔｏｔ＝０．８ｍＡほどだった（Ｑｔｏｔはだいたい８ｍＣ）。
図１４は、注入後８日の、ｂａｌｂ／ｃマウスにおける血清ＳｅＡＰレベルを示しており、これは、（ｉ）電子刺激を加えていない、（ｉｉ）ステンレス鋼の導電電極を用いて電子刺激を加えた、（ｉｉｉ）完全絶縁したＰＦＡを塗布した電極を用いて方形パルスを与え、電子刺激を加えたものである。データは、個々のマウスを（＊）、及びグループの平均を（○）で表している。この平均には、標準的な中間値（ＳＥＭ）誤差が含まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ−Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｄ】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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