(57)【要約】本発明は抗体を使用して血清及び糞便で胃及び膵臓疾患を検出する方法に関する。
2004524522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵癌、慢性膵炎、胃病及び炎症性腸疾患からなるグループから選ばれたヒト又は動物の身体の疾病の検出方法において、身体の血清又は糞便から得られ、この中に存在するＳＬＰＩ（分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤）、その断片又は複合体を免疫学的手段と接触させることによって検出する方法。
【請求項２】
免疫学的手段と接触させる前に、糞便を均質化する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫学的手段が抗ＳＬＰＩ抗体、特に標識抗体、その断片又は複合体である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＳＬＰＩ−抗体反応をＥＬＩＳＡ検定によって検出する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
胃病が胃炎又は潰瘍に起因する請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
炎症性腸疾患がクローン病又は潰瘍性大腸炎である請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
身体の血清又は糞便中のＳＬＰＩ−抗体反応のほかにエラスターゼ１濃度も検出する請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複合体がＳＬＰＩ−エラスターゼ１複合体である請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＬＰＩの断片がアミノ酸残基１から５４を有するＳＬＰＩのＮ末端領域である請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＬＰＩの断片がアミノ酸残基５５から１０７を有するＳＬＰＩのＣ末端領域である請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
膵癌、慢性膵炎、胃病及び炎症性腸疾患からなるグループから選ばれたヒト又は動物の身体の疾病をヒト又は動物の身体の糞便又は血清で検出するための抗ＳＬＰＩ断片又は抗ＳＬＰＩ複合体抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は膵臓及び胃腸疾患の検出方法、特に膵癌、慢性膵炎、胃病及び炎症性腸疾患の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓疾患、例えば膵癌又は慢性膵炎は胃腸疾患、例えば胃病又は炎症性腸疾患と同じくヒト及び動物の身体の重大な脅威である。この種の疾病の早期のなるべく特異的な診断は、効果的な治療のために不可欠である。これまで胃腸管のほとんどすべての疾患は、標準的方法として試料採取による侵襲的方法（内視鏡法、大腸鏡法、ＥＲＣＰ［内視鏡的膵胆管造影法］等）に造影法（ソノグラフ法、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影等）を援用して診断した。この診察の前段階で幾つかの実験室的方法が、特定の内臓例えば膵臓の不全について解明することができる日常的方法として確立されている。ところがこれら実験室的方法はたいてい費用がかかり、多くの場合新鮮な材料（胃液、膵液、十二指腸液等）で短時間の内に実施しなければならない。さもなければ試料の酵素組成により特異的因子の検出がもはやできないことが多いからである（このことはとりわけ酵素基質反応に当てはまる）。患者の血清で特定のパラメータを決定する場合、この値はしばしば希望通りに確実なものでなく（大きな個人内及び個人間変動）、極めて低い感受性を示す。
【０００３】
また幾つかの少数の疾患（慢性膵炎、胃のヘリコバクターピロリ感染症、腸内細菌異常等）で最近、呼吸試験（例えば13Ｃ−尿素呼吸試験、Ｈ2−グルコース呼吸試験、13Ｃ−トリグリセリド呼吸試験等）を確立することができたが、かなり高価な設備（例えば質量分析計）を備えねばならず、例えば高価な13Ｃ−標識に制約されて費用をこれ以上引き下げることができないので、その実施はこれまで少数のセンターでしかできない。
従ってこれらの方法は適当な予備スクリーニング・プログラムへの採用に適さないことが多い。
【０００４】
患者の糞便で特定の疾患を検出することができる診断テストは、これまでごく少数しかない。例えば腸癌のスクリーニング法としての糞便中の潜血の検出のための潜血試験、慢性膵炎の診断のための糞便中の膵臓エラスターゼの検出及び胃のヘリコバクターピロリ感染の検出のために最近開発されたヘリコバクターピロリ糞便試験がこれに数えられる。最後の２つの試験では抗体技術により検出が行われる。
【０００５】
膵臓エラスターゼの試験に関しては、この試験は重い膵臓外分泌不全の診断のための有用な方法であるが、しかし中度ないし軽度の機能障害は検出が比較的不良であることが認められる。
【０００６】
悪性の疑いのある膵臓病変の確実な非侵襲的鑑別方法は依然として存在しない。膵癌の非侵襲的診断のための候補として、とりわけ特定の遺伝子突然変異を検出するマーカーが検討されている（Ｋ−Ｒａｓ、ｐ１６、ｐ５３）。個々の遺伝子は癌発生の時間的経過の中で様々に活動するから、異なる確率で癌腫の発生に関連する。
【０００７】
例えばＫ−Ｒａｓ突然変異はすでに前癌段階、即ち癌種の「発生」の段階で検出されるが、腫瘍抑制遺伝子ｐ１６及びｐ５３は癌種が存在すると不活性化される。ところが癌種の発生に早期に関与する遺伝子は、腫瘍発生の前段階即ち「前癌」状態や腫瘍のない慢性膵炎患者でも検出されることがあり、それが予測力を制限するという欠点がある。このためこれらの種々の腫瘍マーカー又は膵癌に対するその他の特異的マーカーの組合わせを得ようとする。
【０００８】
ＣＡ１９−９、即ち患者の血清で経過マーカー及び再発指標として決定される腫瘍マーカーの、経過パラメータとして利用される検出にも同じことが当てはまる。研究が示すところによれば、７人中ちょうど５人の慢性膵炎患者でＣＡ１９−９の血清値が増加しており、膵癌の手術を行った後、血清のＣＡ１９−９レベルの正常化が現われたのは１０−２９％の場合に過ぎない。
【０００９】
これまでＰＣＲ法による市販のＫ−Ｒａｓ検出キットが提供されているが（Ｅｌｕｃ−ｉｇｅｎｅ  Ｋ−Ｒａｓ７；Ｚｅｎｅｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、この技術は時間がかかり、高価であり、検出に偽陰性の又は偽陽性の影響を及ぼす恐れのある環境からのＤＮＡ汚染を回避するために、すべての分子生物学的方法のように研究材料及び試験方法の実施を極めて入念に（無菌で）取扱うことが必要である。
【００１０】
膵癌の診断のための別のマーカーとして、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）の検出が有効である。この酵素はもっぱら膵臓で前駆体（「プロ酵素」）プロカルボキシペプチダーゼＡ（ＰＣＰＡ）として形成される。プロペプチドの分解によって、酵素は活性カルボキシペプチダーゼに変えられる。
【００１１】
膵臓腫瘍患者の血清でＰＣＰＡの増加が検出される。また健全な膵臓のカルボキシペプチダーゼＡは他の膵臓酵素（エラスターゼ、アミラーゼ等）と比較して分泌が少ない（酵素分泌の割合は約５％）。従って膵臓の病的変異（膵炎、膵癌）は検出限界以下の酵素の低下及び／又は「未成熟」プロ酵素（ＰＣＰＡ）の増加をもたらすと予想される。もう一つの利点は、カルボキシペプチダーゼＡが無傷で腸通過に耐え、糞便中で定量されることである。
【００１２】
体液又は糞便中のＣＰＡ又はＰＣＰＡの決定のための市販の検出キットはまだない。
【００１３】
全体として、多くの胃腸疾患の慢性的異変の確実な非侵襲的診断は依然として存在しないことが確認される。
【００１４】
慢性炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎では最初の症状の発現から診断に至るまでに一般に大変長い期間が経過し、それが多くの場合治療の実施を非常に難しくし、不可能にさえする。クローン病と潰瘍性大腸炎は、現在十分な診断法も治療法もない病因不明な慢性炎症性腸疾患（ＣＥＤ）である。クローン病又は潰瘍性大腸炎の診断のために現在行われる方法は、炎症パラメータの確定並びに体液及び糞便の微生物学的及び血清学的検査である。場合によってはソノグラフ的及び内視鏡的検査法がこれに加わる。さらに放射性同位元素、例えば111インジウム、99テクネチウムを使用し、それに関連して白血球をこれらの同位元素で標識して検出する方法が開発された。この方法はクローン病及び潰瘍性大腸炎に対して高い感受性と特異性を有するが、技術的に複雑であり、高価であり、患者にとって厄介である。特定の患者群、例えば幼児や妊婦にはこの診断法を行うことができない。
【００１５】
そこで抗体検定に基づき特定の病像の特異的検出をすでに早期に行うことができる比較的温和な方法が開発された。例えば米国特許公報第５，４５５，１６０号は胃腸管の腫瘍疾患並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎の診断方法を記載する。この刊行物は抗カルプロテクチン抗体の使用、特に患者の糞便中のカルプロテクチンの定量のための酵素免疫検定の使用を開示する。その場合カルプロテクチン量の増加は前記の疾病を示唆する。
【００１６】
ドイツ国特許第４１０７７６５号明細書は体液及び糞便のいずれとも反応する高特異的膵臓エラスターゼ１−抗体を得る方法を記載する。この方法により得られる抗体は糞便による慢性及び急性膵炎の診断に適している。
【００１７】
Ｓｉ−Ｔａｈａｒ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１８（２０００），１０６１−１０７１）により、ＳＬＰＩ（分泌性白血球プロテイナーゼ阻害剤）即ちプロテアーゼ阻害機能を有する１１．７ｋＤａの大きさのタンパク質は腸への有害な影響、例えば微生物感染に対する有力な治療薬であることが知られている。
【００１８】
国際公開公報ＷＯ９４／０６４５４によりＨＩＶ感染に対する予防薬としてのＳＬＰＩの使用が知られている。国際特許出願ＷＯ９９／１７８００には粉末状ＳＬＰＩの薬剤としての使用が記載されている。そこで特に説明されている粉末状の投薬形態は、吸入療法によるＳＬＰＩの使用に利用される。米国特許第５，６３３，２２７号により喘息又はアレルギー性鼻炎の治療のためのＳＬＰＩの使用が明らかである。日本国特許第０７１０３９７７号明細書によりＳＬＰＩ又はＳＬＰＩ−エラスターゼ複合体のための免疫学的サンドイッチ型検定が明らかである。その場合アミノ酸残基１から５４及び５５から１０７を有するＳＬＰＩ断片が認識される。上記の系により呼吸道の疾患を検出できることが説明される。また日本国特許第０３２７９８６２号明細書により抗体に基づくＳＬＰＩ検定法が明らかである。
【００１９】
ＳＬＰＩについては、このタンパク質がキモトリプシン形プロテアーゼ（例えば膵臓エラスターゼ）及びトリプシン形プロテアーゼに対して阻害活性を有することが知られている。前者の活性については、これがＳＬＰＩのＣ末端領域に、後者の活性はＮ末端領域に属することが知られている。米国特許第５，８５１，９８３号明細書はこの認識に基づき調製された短縮及び融合タンパク質並びにこのタンパク質の製薬上の応用の可能性を記載する。最後に国際公開公報ＷＯ９６／０８２７５は別のＳＬＰＩ断片及びトリプターゼの阻害のためのこの断片の使用を開示する。
【発明の開示】
【００２０】
そこで本発明の根底にある技術問題は、膵臓及び胃腸疾患、特に膵癌、慢性膵炎、胃病及び炎症性腸疾患に対する、簡単に実施され、温和で安価な、かつ迅速に実施される検出方法を提供することである。
【００２１】
本発明はヒト又は動物の身体の血清又は糞便を採取し、免疫学的手段と接触させることによってＳＬＰＩ（分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤）、その断片又は複合体を検出し、特に血清又は糞便中のＳＬＰＩ、その断片又は複合体の濃度を決定して行う、膵癌、慢性膵炎、胃病及び炎症性腸疾患からなるグループから選ばれるヒト又は動物の身体の疾病の検出方法を提供することによってこの問題を解決する。本発明に基づき意外なことに免疫学的手段、特にモノクローナル又はポリクローナル抗体を使用して、ＳＬＰＩ、その断片又は複合体の有無、特に現存するＳＬＰＩの濃度を、健康な対象者と比較して決定することにより、ヒト又は動物の身体の血清又は糞便で上記の疾病の検出が可能であることを示すことができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
慢性膵炎又は膵癌を罹患する患者は、本発明に基づき糞便にＳＬＰＩが健康な者に比して特に高い濃度で現われることによって診断される。健康なヒト又は動物の身体の糞便はＳＬＰＩが極めて少ないか又はまったくない。本発明に基づき患者の糞便で慢性膵炎又は膵癌を決定できるだけでなく、さらに疾患の度合もＳＬＰＩ濃度決定によって定量することができる。糞便中のＳＬＰＩ濃度は糞便中に存在するエラスターゼ１濃度と相関することを示すことができた。特に慢性膵炎患者の糞便中のＳＬＰＩ濃度はエラスターゼ１濃度と、また健康な対照者のＳＬＰＩ濃度はこの対照者のエラスターゼ１濃度と相関することを示すことができた。同じことが膵癌患者のＳＬＰＩ濃度にも当てはまる。従ってこのＳＬＰＩ濃度は同じくこの患者のエラスターゼ１濃度と相関する。
【００２３】
本発明はとりわけＳＬＰＩが腸内で決して直ちに分解されないことを示すことができたという点で、意外である。むしろ慢性膵炎及び膵癌患者では糞便中のＳＬＰＩを検出することができる。
【００２４】
そこで本発明は特にヒト又は動物の身体の糞便中のＳＬＰＩの検出による膵臓疾患の免疫学的検出方法に関する。
【００２５】
さらに本発明に基づき胃病、例えば胃炎又は潰瘍のない健康な対照者の血清中のＳＬＰＩ濃度は、このような疾病を持つ患者より小さいことを示すことができた。そこで本発明に基づき膵臓及び胃腸疾患の免疫学的検出のための本方法を胃病の診断にも利用することができる。その場合正常な健康な対照者に比して高い血清中ＳＬＰＩ濃度が検出される。そこで本発明はまた特にヒト又は動物の身体の血清中のＳＬＰＩの検出による胃腸疾患の免疫学的検出方法に関する。
【００２６】
本発明に関連して「免疫学的手段」の概念は、抗原、特にＳＬＰＩ、ＳＬＰＩ含有複合体、例えば異価又は同価の組成のタンパク質−タンパク質複合体もしくはＳＬＰＩ断片の検出のための抗体の使用を意味する。以下で本発明に関連してＳＬＰＩの概念は、例えばＳＬＰＩ−エラスターゼ１複合体のような他のタンパク質との複合体又はＳＬＰＩの断片、例えばＣ又はＮ末端断片をも意味する。このような断片は例えばアミノ酸残基１から５４（Ｎ末端断片）又は５５から１０７（Ｃ末端断片）を有する。上記の位置データについては、米国特許第５，８５１，９８３号及びそこに配列番号４で示された番号表示を参照されたい。米国特許第５，８５１，９８３号及び国際公開公報ＷＯ９６／０８２７５に開示されたＳＬＰＩ断片に関する開示内容は、ここに本発明の開示内容に完全に包含されており、そこに挙げられた断片と本発明方法の組合わせに対して保護が請求されることを明確にしている。
【００２７】
本発明に関連して抗体の概念は、特異的にＳＬＰＩ、ＳＬＰＩ含有複合体例えばＳＬＰＩ−エラスターゼ１複合体又はＳＬＰＩ断片を認識し、結合する限り、モノクローナル抗体もポリクローナル抗体も意味する。好ましい実施形態では抗体又はその断片は他の抗原を結合しない。もちろん抗体又は断片は修飾することができ、例えば他の分子又はその部分例えば色素標識、放射性標識、測定可能な反応を開始する酵素、例えばホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、酵素基質、蛍光物質、化学発光物質、細胞毒素、スペーサー、支持物質等とコンジュゲート、会合もしくは共有又は非共有結合することができる。標識、コンジュゲート又は未修飾抗体は可溶の形もしくは例えば支持体マトリクス又は小球に固定化した形をとることができる。例えば酵素で標識した抗体を第２の酵素増幅系で使用することができる。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では免疫学的手段の使用とは、試料即ち血清又は糞便、特に均質化した糞便を、特異的に抗原即ちＳＬＰＩを認識する少なくとも１つの抗体を含む免疫学的試薬と接触させることを意味する。
【００２９】
そこで発明はヒト又は動物の身体の糞便又は血清中のＳＬＰＩの定性的及び／又は定量的決定のための抗ＳＬＰＩ抗体の使用に関する。こうして本発明に基づき抗ＳＬＰＩ抗体を使用して血清で胃腸疾患を、また糞便で膵癌又は慢性膵炎を特異的に検出することが可能である。
【００３０】
免疫学的手段を使用する本発明方法はサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ、間接的又は競合的ＥＬＩＳＡとして実施することが好ましい。その場合ＨＴＰ法（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｕｔ）を使用することが特に好ましい。
【００３１】
本発明に基づくサンドイッチ型ＥＬＩＳＡに関連して、異なるＳＬＰＩエピトープに、また代替として同じＳＬＰＩエピトープに向けられた少なくとも２つの異なるモノクローナル抗体が必要である。少なくとも２つの抗体は均質又は不均質系に溶解し及び／又は支持体に固定されている。
【００３２】
本発明に基づき免疫学的手段を３つの異なる抗体の系として構成することももちろん可能であり、その場合抗体の１つは不均質相にあり、他の２つの抗体は可溶である。２つの可溶の抗体の１つは標識を有し、他の抗体は標識なしである。この実施形態では可溶の抗体は標識無しの抗体に向けられている。
【００３３】
本発明に基づき免疫学的手段を使用して行われる方法は、特に好ましい実施形態では血清又は好ましくは均質化し、場合によっては希釈した糞便を、ＳＬＰＩに対して特異的な少なくとも２つの抗体とともにインキュベートすることが必要である。好ましい実施形態では２つの抗体の１つは固相に結合されている。これは常法で行われる。別の抗体は可溶の形であることが好ましく、好ましい実施形態では標識を有する。本発明に基づき別の抗体を使用する場合は、好ましい実施形態ではそのうちの１つだけが標識を有する。
【００３４】
本発明の一実施形態では非特異的にＳＬＰＩと結合し得る抗体、又は特に好ましくは特異的にＳＬＰＩと結合し得る抗体が固相に結合される。固相に結合されたこの抗体は続いて血清又は糞便とともに、場合によっては洗浄処理の後に第２の抗体とともにインキュベートする。第２の抗体は特異的にＳＬＰＩと結合することができ、可溶の形であって標識を有する。固相に結合された抗体が非特異的にＳＬＰＩと結合し得る抗体であるならば、固相にはＳＬＰＩだけでなく他の抗原も結合する。ところが特異的にＳＬＰＩと結合する第２の抗体は、特異的にＳＬＰＩ又はＳＬＰＩと第１の抗体の複合体とだけ反応するから、ＳＬＰＩ分子だけが特異的に標識付き抗体を有し、こうして固相と液相の分離の後に定量することができる。
【００３５】
このようにして本発明に基づき例えばサンドイッチ型ＥＬＩＳＡに関連して、標識なしのＳＬＰＩ特異的な第１の抗体を例えば担体に結合し、試験溶液又は懸濁液を加えることができる。その際試験溶液又は懸濁液中にあるＳＬＰＩは第１の抗体に結合される。続いて第２の標識付き抗ＳＬＰＩ抗体を加える。この抗体はＳＬＰＩ又はＳＬＰＩと第１の抗体の複合体と特異的に反応する。第２の抗体に標識することによって、標準液を使用してＳＬＰＩ量を決定することができる。
【００３６】
ＳＬＰＩに特異的に結合する第１の抗体を固相に固定すれば、固相にＳＬＰＩだけが特異的に結合される。第２の可溶の抗体とともにインキュベートすると、この第２の抗体もＳＬＰＩと反応する。固相と液相を分離した後、第２の抗体に標識することによってＳＬＰＩの正確な定量を行うことができる。
【００３７】
発明の特に好ましい実施形態ではＳＬＰＩに特異的又は非特異的に結合する第１の抗体でマイクロタイタープレートを被覆し、続いて血清又は糞便を被覆されたマイクロタイタープレートと接触させ、未結合の成分を洗い流した後、標識付きの、例えばビオチン標識付きの第２の抗ＳＬＰＩ抗体をマイクロタイタープレートに加え、第２の抗体がＳＬＰＩに結合し得る条件でマイクロタイタープレートをインキュベートする。続いて固相と液相を分離し、標識を直接検出するか、又は酵素で標識した第２の抗体を使用して基質を加え、基質の変化を定量的に決定する。そこでビオチンで標識した第２の抗体を次のインキュベーションでペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とストレプトアビジンのコンジュゲートと反応させることができる。ペルオキシダーゼは基質ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチオアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩）を酸化することができる。酸化したＡＢＴＳを続いて測光法で決定することができる。
【００３８】
本発明の特に好ましい実施形態では第１の抗体が常法のようにＥＬＩＳＡイムノプレ−トのくぼみの底をなすのではなく、支持体マトリクス例えば不織構造、織構造又は膜構造に直接組み込むことによってマトリクスに結合される。好ましいマトリクスは中空線維膜又は細孔を有する平面膜である。発明の有利な実施形態ではこの平面膜にイオン交換基を設けることもできる。
【００３９】
ポリクローナル抗体は、分離し完全に精製したＳＬＰＩ又はその断片で動物を免疫感作し、周知のようにポリクローナル抗体を含む抗血清を得ることによって作られる。モノクローナル抗体は周知の方法で作られる。本発明に基づき使用される抗ＳＬＰＩ抗体は市販の抗体であってもよい。
【００４０】
本発明に基づき検出可能な胃病は胃炎又は潰瘍症状である。本発明に基づき検出可能な炎症性疾患は例えばヘリコバクターピロリ感染に原因し、もしくはクローン病又は潰瘍性大腸炎症状である。
【００４１】
本発明の特に好ましい実施形態では患者の血清又は糞便でＳＬＰＩを検出するときに、同時にエラスターゼ１濃度も検出する。ヒトの膵臓エラスターゼ１は腸通過に無傷で耐え、糞便でタンパク質として定量することができる。糞便中のエラスターゼ１濃度は膵臓外分泌機能を反映する。糞便グラム当りエラスターゼ２００μｇ以上の値は正常な膵臓外分泌機能を指示し、糞便グラム当りエラスターゼ２００μｇ以下の値は膵臓外分泌不全を指示する。急性膵炎の場合、急性炎症段階でエラスターゼ１が血清に放出されるから、血清中のエラスターゼの定量によってこの疾病の診断又は解明が可能である。従って血清中の高いエラスターゼ１濃度は膵炎を示唆する。
【００４２】
発明のその他の有利な実施形態は従属請求項で明らかである。
【００４３】
以下の実施例と当該の図に基づき発明を詳述する。
【実施例】
【００４４】
実施例１
慢性膵炎患者の糞便中のＳＬＰＩの検出
慢性膵炎のない患者４２人、膵癌患者６人及び慢性膵炎患者１９人からそれぞれ１００ｍｇの糞便を採取し、秤量し、抽出用緩衝液（リン酸塩緩衝食塩溶液、ｐＨ７．２、洗浄剤及びアジ化トリウム）で抽出し、希釈した。
【００４５】
糞便試料懸濁液を室温で試験管振とう装置により何回も激しく混合することによって抽出を行う。完全な抽出を保証するために、糞便をよく均質化しなければならない。少なくとも５分間の抽出の後に最後にもう１回混合する。粒子の沈降の後に糞便試料抽出物を次のように希釈する。
【００４６】
ＳＬＰＩの測定のために１：１００の希釈率で、またエラスターゼ１の比較測定のために１：５００の希釈率で試料抽出物の希釈を行った。
【００４７】
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ、ドイツ国ヴィースバーデン）のＳＬＰＩ−ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｌｉｎｅ(R)、カタログ番号ＤＰ１００，６／９９）でＳＬＰＩ濃度を決定した。
【００４８】
このＥＬＩＳＡは９６個のくぼみを具備し、マウスの抗ヒトＳＬＰＩモノクローナル抗体で被覆したポリスチレン・マイクロタイタープレートを使用する。抽出物をピペットでくぼみに移した後、ＳＬＰＩは固定化したモノクローナル抗体により結合される。未結合の物質を洗い流した後、酵素と結合された、ヒトＳＬＰＩに対して特異的なポリクローナル抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した抗ヒトＳＬＰＩポリクローナル抗体）をくぼみに入れる。未結合の抗体−酵素試薬を洗い流した後、基質溶液をくぼみに入れ、結合したＳＬＰＩの尺度として発色を測定する。
膵臓エラスターゼ１の濃度をＳＣＨｅＢｏ−Ｔｅｃｈ(R)社のエラスターゼ１−ＥＬＩＳＡ（ドイツ国ギーセン、カタログ番号０７、２０００年４月、ＥＰ０５４７０５９Ｂ１）により決定した。
【００４９】
図１及び２に示す下記の結果が生じた。
【００５０】
図１は慢性膵炎のない患者群、膵癌患者群及び慢性膵炎患者群について作図した患者の糞便中のＳＬＰＩ濃度（糞便グラム当りピコグラムＳＬＰＩ）を示す。対照群の成員は糞便中にＳＬＰＩがまったく又は僅かしかないが、慢性膵炎及び膵癌の２つの患者群は糞便中のＳＬＰＩ濃度がはるかに高いことがはっきり示される。
【００５１】
図２は同じ患者群で行ったエラスターゼ１の濃度測定を示す。健康な対照群は明らかに２００μｇ／糞便ｇを超えるエラスターゼ含量を有するが、慢性膵炎及び膵癌の２つの患者群は糞便中のエラスターゼ１濃度が著しく減少している。
【００５２】
実施例２
実施例２ａ
胃病がある又はない患者の血清中のＳＬＰＩの検出
胃の所見が正常な患者（ｏＢ）１７人と胃又は小腸の潰瘍（胃潰瘍及び十二指腸潰瘍）の患者３３人からそれぞれ５ｍｌの血液を採取し、室温で３０００ｒｐｍにより１０分間遠心分離して血清を得た。
ＳＬＰＩの測定のために希釈率１：１００で血清試料の希釈を行なった。
【００５３】
血清中のＳＬＰＩ濃度をＲ＆Ｄ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ、ドイツ国ウィースバーデン）のＳＬＰＩ−ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ(R)、カタログ番号ＤＰ１００，６／９９）により決定した。ＥＬＩＳＡは実施例１で説明したように行った。
【００５４】
図３は対照群と患者のＳＬＰＩ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【００５５】
結果：
患者群は対照群と比較して著しく高いＳＬＰＩ濃度を示した。
【００５６】
実施例２ｂ
胃の所見が正常な患者（対照）１７人、慢性胃炎患者１６人及び潰瘍病患者１８人からそれぞれ５ｍｌの血液を採取し、室温で３０００ｒｐｍにより１０分間遠心分離して血清を得た。
【００５７】
ＳＬＰＩの測定のために希釈率１：１００で血清試料の希釈を行った。
【００５８】
血清中のＳＬＰＩ濃度をＲ＆Ｄ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ、ドイツ国ウィースバーデン）のＳＬＰＩ−ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ(R)、カタログ番号ＤＰ１００，６／９９）により決定した。
【００５９】
ＥＬＩＳＡは実施例１で説明したように行った。
【００６０】
慢性胃炎患者も潰瘍病（胃潰瘍又は十二指腸潰瘍）の患者も血清中のＳＬＰＩ濃度が著しく高かった。
【００６１】
図４は胃の所見が正常な患者、慢性胃炎患者及び潰瘍病（Ｕｌｃｕｓ）患者の血清中のＳＬＰＩ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。図がはっきり示すように、健康な対照群は慢性胃炎及び潰瘍病の患者群よりはるかに小さなＳＬＰＩ濃度を有する。
結果：
ＳＬＰＩ血清濃度は胃腸病のマーカーとしても適している。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】糞便中のＳＬＰＩ濃度のヒストグラムを示す。
【図２】糞便中のエラスターゼ１濃度のヒストグラムを示す。
【図３】血清中のＳＬＰＩ濃度のヒストグラムを示す。
【図４】血清中のＳＬＰＩ濃度のヒストグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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