(57)【要約】マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）用の新規な脱塩サンプル支持プレートが開示されている。この支持プレートにはサンプル提示面があり、サンプル提示面には１以上の吸着層の受け入れ面があり、吸着層によって受け入れ面上に選択された分子が保持される。また、従来のＭＡＬＤＩ−ＭＳおよび自動ＭＡＬＤＩ−ＭＳに対して、本発明のサンプル支持プレートを作製し、使用する方法についても開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル提示面を備えたマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）用の脱塩サンプル支持プレートであって、前記サンプル提示面には１以上の吸着層の受け入れ面があり、この吸着層によって、選択された分子が受け入れ面上に保持される、前記脱塩サンプル支持プレート。
【請求項２】
前記吸着層が、選択された分子を吸着層に保持するのに十分な吸着性を有する、請求項１に記載のサンプル支持プレート。
【請求項３】
前記吸着層が、塩を吸着層から除去するために水溶液で洗浄される、請求項１に記載のサンプル支持プレート。
【請求項４】
吸着層に保持される前記選択された分子が、分析対象、マトリックス、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載のサンプル支持プレート。
【請求項５】
吸着層が、高分子フィルムである、請求項２に記載のサンプル支持プレート。
【請求項６】
前記高分子フィルムが、モノマー、ポリマー、またはこれらの組み合わせ、ポロゲン、および開始剤を混合することによって調製される、請求項５に記載のサンプル支持プレート。
【請求項７】
前記高分子フィルムが、モノマー、ポリマー、またはこれらの組み合わせ、および開始剤を混合することによって調製される、請求項５に記載のサンプル支持プレート。
【請求項８】
前記ポリマーが、ポリスチレンおよびポリビニルピロリジノンからなる群より選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記モノマーが、モノビニルモノマー、ポリビニルモノマー、およびモノビニルモノマーとポリビニルモノマーとの混合物からなる群より選択される、請求項６または７に記載のサンプル支持プレート。
【請求項１０】
前記モノビニルモノマーが、スチレン、Ｎ−ビニルピロリドン、メタクリレート、ビニルアセテート、グリシジル・メタクリレート、およびこれらのいかなる組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載のサンプル支持プレート。
【請求項１１】
前記モノビニルモノマーが、Ｎ−ビニルピロリドンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリビニルモノマーが、ジビニルベンゼン、エチレンジメタクリレート、ビス−アクリルアミド、ジビニルピリジン、エチレンジメタクリレート、ヒドロキシアルキレンジメタクリレート、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載のサンプル支持プレート。
【請求項１３】
前記ポリビニルモノマーが、ジビニルベンゼンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記モノビニルモノマーとポリビニルモノマーとの混合物が、ジビニルベンゼンとＮ−ビニルピロリドンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポロゲンが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル、アルコール、ケトン、エーテル、およびこれらのいかなる組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載のサンプル支持プレート。
【請求項１６】
前記開始剤が、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、過酸化二硫酸、バゾ（Vazo）52、バゾ64、バゾ67、バゾ88、V70、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６または７に記載のサンプル支持プレート。
【請求項１７】
前記受け入れ面が、正確に定められた位置にある、請求項１に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプル支持プレート。
【請求項１８】
前記受け入れ面の正確に定められた位置が、自動分析を容易にするものである、請求項１７に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプル支持プレート。
【請求項１９】
受け入れ面のグリッドがサンプル提示面上に形成されている、複数の受け入れ面を備えた請求項１７または１８に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプル支持プレート。
【請求項２０】
前記グリッドが、９６の受け入れ面を有する、請求項１９に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプル支持プレート。
【請求項２１】
前記複数の受け入れ面が、ハイスループット分析を容易にするものである、請求項１９に記載のＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプル支持プレート。
【請求項２２】
請求項１に記載のサンプル支持プレートを準備し；
サンプルを受け入れ面に添加し；
サンプル中の選択された分子を吸着剤層に保持させ；および
塩および他の不純物を洗浄するために受け入れ面に溶媒を添加して、受け入れ面に添加したサンプルを脱塩することを含む、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用のサンプルを調製するための、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）用のサンプル調製方法。
【請求項２３】
サンプルを受け入れ面に添加する前に、前記サンプル支持プレートを極性有機溶媒で処理する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記極性有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、および水／有機溶媒の混合物からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記極性有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記吸着層が、吸着層から塩を除去するために水溶液で洗浄される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルが、分析対象、マトリックス材料、１以上の塩、および１以上の溶媒を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記溶媒が、水性である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプルが、マトリックス材料の溶液を含有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、マトリックス材料を含有しない、請求項２２のサンプル支持プレートの作製方法。
【請求項３１】
前記マトリックス材料が、吸着層が水溶液で洗浄された後に添加される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
サンプル提示面を備えたサンプル支持プレートを準備し；
前記サンプル提示面に１以上の吸着層の受け入れ面（ここで、吸着層によって、選択された分子が受け入れ面上に保持される）を作製することを含む、請求項１に記載のサンプル支持プレートの作製方法。
【請求項３３】
サンプル提示面を備えたサンプル支持プレート上に、１以上の吸着層の受け入れ面（ここで、吸着層によって、選択された分子が受け入れ面上に保持される）を作製することを含む請求項１に記載のサンプル支持プレートの作製方法。
【請求項３４】
前記吸着層が、高分子フィルムを含んでなる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
モノマー、ポリマー、またはこれらの組み合わせ、ポロゲン、および開始剤を混合し；
ターゲットスポットをこの混合物でコーティングし；
重合反応を開始させ、高分子フィルムを形成させ；および
未反応のモノマー、ポロゲン、および開始剤を除去するために、高分子フィルムを洗浄することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
モノマー、ポリマー、またはこれらの組み合わせ、および開始剤を混合し；
ターゲットスポットをこの混合物でコーティングし；
重合反応を開始させて、高分子フィルムを形成させ；および
未反応のモノマー、ポロゲン、および開始剤を除去するために、高分子フィルムを洗浄することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記高分子フィルムを極性有機溶媒で処理することをさらに含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記極性有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、および水／有機溶媒混合物からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記極性有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリマーが、ポリスチレンおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記モノマーが、モノビニルモノマー、ポリビニルモノマー、およびモノビニルモノマーとポリビニルモノマーとの混合物からなる群より選択される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記モノビニルモノマーが、スチレン、Ｎ−ビニルピロリドン、メタクリレート、ビニルアセテート、グリシジル・メタクリレート、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記モノビニルモノマーが、Ｎ−ビニルピロリドンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリビニルモノマーが、ジビニルベンゼン、エチレンジメタクリレート、ビス−アクリルアミド、ジビニルピリジン、エチレンジメタクリレート、ヒドロキシアルキレンジメタクリレート、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリビニルモノマーが、ジビニルベンゼンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記モノビニルモノマーとポリビニルモノマーとの混合物が、ジビニルベンゼンとＮ−ビニルピロリドンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポロゲンが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル、アルコール、ケトン、エーテル、およびこれらのいかなる組み合わせからなる群より選択される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記開始剤が、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、過酸化二硫酸、バゾ（Vazo）52、バゾ64、バゾ67、バゾ88、V70、およびこれらのいかなる組み合わせからなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
サンプル提示面を備えたサンプル支持プレート（前記サンプル支持プレートには１以上の吸着層の受け入れ面があり、吸着層によって、選択された分子が受け入れ面上に保持される）を準備し；
分析対象を含有するサンプルを、吸着層の受け入れ面へ添加し；
サンプル中の分析対象を吸着層に保持させ；
吸着層から塩を除去するため吸着層を水溶液で洗浄して、サンプルを脱塩し；および
吸着層に保持された前記脱塩された分析対象にＭＡＬＤＩ−ＭＳを行うことを含む、分析対象にマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を行う方法。
【請求項５０】
前記サンプル提示面に１以上のサンプルターゲットスポットがあり、当該ターゲットスポットには吸着層がある、請求項１、２２、３２、３３、または４９のいずれか１項に記載のサンプル支持プレートまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の背景）
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）によるイオン化質量分析（ＭＳ）は、大きな分子（例えば、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA等の生体高分子）の分析に有用なツールである。この分析の感度と自動分析の速度が、ＭＡＬＤＩプレート上のサンプル調製とサンプル純度に大きく依存することは、広く知られている。ＭＡＬＤＩ質量分析用のサンプル調製に関する多くの問題点が、ブルカー社（Bruker）の英国特許出願公開第GB2332273A号にまとめられている。特に、塩は、付加体を形成するため、マススペクトルの結果に大きな影響を及ぼすことがある。
【０００２】
塩を除去する従来の方法の１つは、逆相吸着剤（C18-シリカやジビニルベンゼンを主体とするポリマーなど）を利用するものである。例えば、かかる吸着剤が充填されている充填相へ分析対象の混合物を通すと、分析対象は充填材料に吸着される一方、塩は充填材料に保持されない。次いで、適当な溶媒によって、吸着された分析対象を吸着剤から溶離させる。このような応用例として、数種の市販品が出回っている。
【０００３】
しかし、これらの製品はすべて、サンプルをＭＡＬＤＩプレートへ添加する前に、いくつかの精密な工程が必要である。こういった付加的な工程によって、サンプルの大きなロス（損失）やサンプルの潜在的なコンタミネーションが生じてしまう。さらに、必要な溶離液の量が比較的多いため、通常、サンプル調製工程にてサンプルを希釈する。ＭＡＬＤＩのレーザーは、添加したサンプルの全面積の数パーセントのみに照射されるため、添加した希釈サンプルのほんの一部分だけが脱離・検出される。これが、感度悪化の原因である。
【０００４】
従来のＭＡＬＤＩプレート上へのサンプル添加に関する他の問題は、プレート上でのサンプルの乾燥に関する。サンプルの乾燥に際して、ターゲットである分析対象は場所により様々に濃縮される。その結果、分析に適した分析対象をターゲット中においてレーザーで探さなければならず、各サンプルの分析時間が長くなってしまう。例えば、清浄な金属製サンプル支持プレートに添加したサンプルとマトリックスの溶液の液滴が金属表面上で乾燥すると、マトリックスの小結晶からなるサンプルスポットが、既に湿っている部分に広がる。一般に、湿った部分では均一にコーティングされない。水溶液中では、マトリックスの小結晶の大部分が、金属プレート上の濡れた部分の縁から徐々に生成し始め、濡れた部分の中心へ向かって結晶成長する。そのため、分析対象の分子が不均一に分散し、サンプルスポットの中心に結晶が存在しないか、サンプルスポットの中心が（高濃度のアルカリ塩が他にも存在するため）ＭＡＬＤＩのイオン化に実際に用いることのできない細かな小結晶によってコーティングされてしまうことが多い。こういった結晶には、通常、高濃度の塩が存在するため、ＭＡＬＤＩイオン化に十分なものではない。さらに、ＭＡＬＤＩのイオン化収率と質量分析能が、サンプルスポット中の位置によって変動してしまう。サンプルスポット上で、分析対象のイオン収率と質量分析能とが良好な好ましい位置を見出すことは、しばしば大変な作業である。このため、ＭＡＬＤＩ質量分析におけるサンプルのハイスループット（高速大量処理）化の発展が困難となっている。
【０００５】
英国特許出願GB 2332273A には、ＭＡＬＤＩプレート上の表面特性（親水性または疎水性）修飾を利用した疎水性パッチ（patches）（「アンカー」）を有する、テフロンのような疎水性皮膜でコーティングされたＭＡＬＤＩ プレートが記載されている。サンプルの液滴がこのアンカー上に滴下されると、溶媒の蒸発につれてこの液滴は小さくなり、アンカーのある位置において中心方向に向かう。これによって、分析対象が小さなスポットに濃縮され、質量分析の感度が、サンプル液滴を乾燥させる上述した従来のサンプル調製法と比較して、１０〜１００倍に向上した。このサンプルスポットは、迅速・自動化されたＭＡＬＤＩ−ＭＳを容易にするよう、適切なグリッドにて配置することができる。このようにコーティングされたプレートは、ブルカー・ダルトニクス社よりアンカーチップ（AnchorChip（商標））として市販されている。しかし、このプレートは、分析対象の分析を妨害する塩を除去するための洗浄工程の間、分析対象分子を保持することができない。
【０００６】
米国特許第6,020,208号および第6,124,137号には、ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートのデザインが記載されており、この場合、ターゲットスポットのサンプル提示面が、分析対象を特異的または非特異的にサンプル提示面上に捕捉する親和性分子で修飾されている。これによれば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の効率と感度が従来法に比べ改善されたと報告されている。分析に用いなかった分子をさらに処理して、サンプル提示面上で分析することもできる。
【０００７】
公開されたPCT出願第WO98/59360号、第WO98/59361号、第WO98/59362号、およびこれらに対応する欧州特許出願第EP00990256号、第EP00990257号、および第EP00990258号には、選択性のある様々な条件によって、選択された分子を様々な吸着剤上に保持するためのプレート、および未透過（retentate）クロマトグラフィー法が記載されている。選択された分子を分析するための、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける最高の親和条件が選択されている。
【０００８】
米国特許第5,480,526号には、キャピラリー電気泳動法によって、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析をするサンプルを分析前に脱塩することが記載されている。
米国特許第6,104,028号には、マトリックスの改良により、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの感度と分解能とを向上させることが記載されている。
【０００９】
米国特許第5,260,571号、第5,281,538号、第5,308,978号には、サンプルを添加する前に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプルプレートのターゲットスポットへマトリックスを層状に配置することにより、検出感度と分解能を向上させることが記載されている。これにより、乾燥後、サンプルとマトリックス材料との密な混合物ができる。同様に、米国特許第5,595,636号には、サンプルを添加する前に、ラッカー状の薄い平滑性のある膜を使用して、分析対象分子を脱離しやすくすることが記載されている。
【００１０】
米国特許第5,770,860号、第5,770,272号、および第5,705,813号には、質量分析に関して使用する装置を改良したことが記載されている。特に、米国特許第5,770,272号には、噴霧スプレーによって、ＭＡＬＤＩマトリックス材料の均一な連続膜をＭＡＬＤＩターゲット状に形成することが記載されている。米国特許第5,705,813号には、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる質量分析前のサンプル操作について、統一された液体の取扱法が記載されている。米国特許第5,770,860号には、多数のピペット装置によってマイクロタイタープレートから同時に多数のサンプルを移動させ、質量分析機へサンプル支持台を挿入する方法が開示されている。この方法によると、挿入を繰り返すことにより、サンプルプレート上に高密度のサンプルが生成される。
【００１１】
しかし、適当な溶媒（例えば、水）を使用して塩を除去することによって、未修飾の表面上でも分析対象とマトリックスとを保持しつつ、ＭＡＬＤＩプレート上でサンプルを直接脱塩でき、それによって、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの検出感度と分解能とを向上させつつサンプル処理工程の数を減らすことができるような、ＭＡＬＤＩ−ＭＳのサンプル調製についての技術的進歩が望まれている。サンプルスポットを小さくすることによって、サンプルを特定の部分に濃縮し、サンプル位置を探す手間がなくすことができる。
（発明の概要）
本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用の脱塩サンプル支持プレートに関する。本発明により、本発明のサンプル支持プレートの簡便な作製法と使用法が提供される。また、本発明により、サンプルの調製法および分析法が提供される。さらに、本発明のサンプルの調製法と分析法によれば、適切な溶媒（例えば、水）を用いて塩を洗浄することによって、未修飾の表面上に分析対象とマトリックスとを保持しつつ、ＭＡＬＤＩプレート上で直接脱塩することができ、それによって、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの検出感度と分解能とを向上させつつ、サンプル処理の工程数を減らすことができる。サンプルスポットを小さくすることにより、サンプルを特定の部分へ集中させることができ、それによって、サンプル位置を探す必要がなくなる。
【００１２】
したがって、１つの観点からは、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）に使用する脱塩サンプル支持プレートである。本発明のＭＡＬＤＩプレートにはサンプル提示面があり、サンプル提示面には１以上の吸着層の受け入れ面がある。この吸着層によって、選択された分子が受け入れ面に保持される。
【００１３】
他の観点からは、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用サンプルの調製方法である。上記のサンプル支持プレートを準備し、サンプルが受け入れ面へ添加される。サンプル中の選択された分子が吸着層に保持される。溶媒を受け入れ面に添加して塩や他の不純物を洗浄し、それによって、ターゲットスポットに添加したサンプルを脱塩し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用のサンプルが調製される。
【００１４】
さらに他の観点からは、本発明は、上記のサンプル支持プレートの作製法である。サンプル提示面と１以上の吸着層の受け入れ面とを備えたサンプル支持プレートが準備される。この吸着層により、受け入れ面上に選択された分子が保持される。
【００１５】
関連した観点からは、本発明は、上記のサンプル支持プレートの作製法である。この方法は、サンプル提示面を備えたサンプル支持プレート上に、１以上の吸着層の受け入れ面を形成させることを含む。この吸着層によって、選択された分子が受け入れ面上に保持される。
【００１６】
他の観点からは、本発明は、上記の脱塩用サンプルプレートを用いて、分析対象にマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を行う方法である。この方法には、サンプル提示面を備えたサンプル支持プレート（サンプル提示面には１以上の吸着層の受け入れ面があり、吸着層によって、選択された分子が受け入れ面に保持される）を準備し；分析対象を含有するサンプルを吸着層の受け入れ面に添加し、サンプル中の分析対象を吸着層に保持させ；吸着層を水溶液で洗浄して吸着層から塩を除去し、それによってサンプルを脱塩し；吸着層に保持されている脱塩された分析対象にＭＡＬＤＩ−ＭＳを行うことが含まれる。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用の脱塩サンプル支持プレートに関する。本発明によって、本発明のサンプル支持プレートの簡便な作製法および使用法が提供される。また、本発明によって、サンプルの調製法および分析法が提供される。さらに、本発明のサンプルの調製法および分析法によれば、適当な溶媒（例えば、水）を用いて塩を洗浄することによって、未修飾表面上に分析対象とマトリックスとを保持しつつＭＡＬＤＩプレート上でサンプルを直接脱塩することができ、それによって、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの検出感度と分解能とを向上させつつサンプルの操作回数を減らすことが可能である。サンプルスポットを小さくすることにより、サンプルをある部分に集中させることができ、それによってサンプルの位置を探す必要がなくなる。
（定義）
本発明をさらに詳細に説明する前に、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる一定の用語について、便宜上、ここにまとめる。
【００１７】
本明細書で用いられる「サンプル支持プレート」または「サンプルプレート」という用語は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析をするためにサンプルを置く装置をいう。本発明のサンプル支持プレートを作製するために、従来のＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプル支持プレートを十分な吸着性を有する材料でコーティングして、受け入れ面上（例えば、ターゲットスポット上）に吸着層を設けることができる。
【００１８】
本明細書で用いられる「ターゲットスポット」という用語は、ある具体的なサンプルやサンプルの混合物を分析するための、サンプル支持プレート上の指定された部分をいう。
本明細書で用いられる「吸着層」または「十分な吸着」という用語は、選択された分子（例えば、分析対象）を誘導化したり化学修飾することなく、選択された分子を保持することができるいかなる材料（例えば、高分子フィルムまたは高分子コーティング）を指す。この吸着層は、選択された分子（例えば、分析対象）を他の分子（例えば、塩）から選択的に吸着できるため、洗浄手順を適切に選択することによって吸着層から望ましくない分子種を除去することができる。吸着層に添加された分子が膜に吸収されたり、膜に浸透しないように、この吸着層は実質的に多孔性でなくてもよい。また、本発明の十分に多孔性の吸着層を用いて表面積を増大させ、それによって、保持されている選択された分子を濃縮し、分析感度を向上させることができる。
【００１９】
本明細書で用いられる「塩」という用語は、付加体の形成により、分析対象の質量分析（の質）に悪影響を与えるすべての塩（アルカリ塩を含む）をいう。
本明細書で用いられる「分析対象」という用語は、分析される単独の分子、または分析される複数の分子をいう。
【００２０】
本明細書で用いられる「マトリックス材料」という用語は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳでの使用に適したすべての材料（例えば、１以上の、光吸収性である酸性のいくつかの小さな化学物質（例えば、ニコチン酸またはシナピン酸））をいう。ターゲットスポット上で乾燥し、マトリックス結晶に包含された分析対象分子が（レーザー照射によって）固相結晶から気層または蒸気層へ十分に脱離・イオン化され、分子イオンとして飛び出させられるよう、マトリックス材料を分析対象と溶液中で混合する。マトリックス材料を何倍も過剰量にすると、結晶形成しやすくなり、分析対象を捕捉しやすくなる。
【００２１】
本明細書で用いられる「選択された分子」という用語は、分析のために保持される分子（例えば、分析対象、マトリックス材料、または分析対象とマトリックス材料との組み合わせ）をいう。選択された分子は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を改善するための本発明の方法によって除去される他の分子（例えば、塩）とは異なる。
【００２２】
本明細書で用いられる「水溶液」または「水性溶媒」という用語は、水、および成分として水を含む液体をいう。この用語には、他の成分（例えば、溶液中に溶解している有機化合物または無機化合物）および水と混和性のある有機溶媒または無機溶媒を含む溶液も含まれると解される。例えば、水とメタノールとの混合物は水溶液と考えられる。
【００２３】
本明細書で用いられる「受け入れ面」という用語は、吸着層が付加されるサンプル提示面の１部分をいう。吸着層は、何ら修飾（例えば、物理的修飾または化学的修飾による処理）されることなく、受け入れ面に付加される。
【００２４】
本明細書で用いられる「選択基準」という用語は、吸着層が吸着層に添加された分子を逆相分離する性質（例えば、疎水性）をいう。
（発明の実施態様の説明）
１つの実施態様において、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）用の脱塩サンプル支持プレートである。本発明のＭＡＬＤＩプレートにはサンプル提示面があり、このサンプル提示面には１以上のサンプル受け入れ面がある。この吸着層は、選択された分子を受け入れ面上に保持する。本発明は、また、サンプル支持プレートの作製方法、サンプルの調製方法、および分析方法に関する。
【００２５】
吸着層は、選択された分子を吸着層に保持できるよう、十分に吸着性を有する。本発明の他の実施態様において、吸着層表面に保持される選択された分子は、分析対象、マトリックス、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましい実施態様において、吸着層は高分子フィルムである。
【００２６】
本発明の１つの実施態様において、ターゲットスポットは、自動分析を容易にするように正確に定められた位置に受け入れ面を有する。他の実施態様において、本発明のＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプルプレートには複数の受け入れ面とそれに近接する受け入れ面があり、サンプル受け入れ面上に受け入れ面のグリッドが形成されている。この複数の受け入れ面によって、ハイスループット分析が容易になる。好ましい実施態様において、このグリッドには９６の受け入れ面が含まれる。
【００２７】
他の観点からは、本発明は、上記のＭＡＬＤＩ−ＭＳサンプル支持プレートの作製方法である。サンプル提示面を備えたサンプル支持プレートが提供される。本発明のサンプル支持プレートを作製するために、ほぼすべての材料を使用できる。しかし、使用する材料は、サンプル調製に使用する試薬と望ましくない反応を生じてはならず、MALDI-MSにおける通常の条件において分解しないものでなければならない。適した材料としては、プラスチック（例えば、ポリオレフィン、特に、ポリエチレン、およびポリプロピレン、PVC、およびポリスチレン）、ガラス、および金属（例えば、ステンレス鋼）が挙げられる。好ましい実施態様において、サンプル支持プレートの作製に用いる材料は、導電性を有する。
【００２８】
１つの実施態様において、サンプル提示面は、１以上の吸着層の受け入れ面を有する。吸着層の受け入れ面は、吸着層溶液をプレートのサンプル提示面上へ添加することによって、作製される。１つの実施態様において、吸着層は、ピペッターを用いて面上に「スポット（spot）」される。他の実施態様においては、ソレノイド駆動弁（solenoid actuated valves）または圧電性蒸着（piezoelectric deposition）によってスポットされる。他の実施態様においては、当業者に公知の技術を用いて、ピン（pin）によってスポットされる。
【００２９】
好ましい実施態様において、吸着材料によって、サンプル中の分子の逆相分離が容易になる。これによって、選択された分子（例えば、分析対象）は吸着層への非特異的結合によって保持される一方、他の分子（例えば、塩）は保持されず、除去することができる。例えば、吸着層は、疎水性で、同時に水で濡らすことができる性質であってよい。
【００３０】
好ましい実施態様において、吸着層には高分子フィルムが含まれる。高分子フィルムは、モノマー、ポリマー、またはこれらの組み合わせ、ポロゲン（porogen：細孔形成剤）、および開始剤を混合して、作製される。また、他の態様では、高分子フィルムは、モノマーポリマー、またはこれらの組み合わせ、および開始剤を混合して、作製される。ある具体的な態様では、このポリマーは、ポリスチレンとポリビニルピロリジノンから選択される。
【００３１】
１つの実施態様において、モノマーは、モノビニルモノマー、ポリビニルモノマー、またはモノビニルモノマーとポリビニルモノマーとの混合物である。使用することのできるモノビニルモノマーとしては、例えば、スチレン、Ｎ−ビニルピロリジノン、メタクリレート、ビニルアセテート、グリシジル・メタクリレート、およびこれらのいかなる組み合わせが挙げられる。１つの実施態様において、モノビニルモノマーは、Ｎ−ビニルピロリジノンである。
【００３２】
用いることのできるポリビニルモノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、エチレンジメタクリレート、ビス−アクリルアミド、ジビニルピリジン、エチレンジメタクリレート、ヒドロキシアルキレンジメタクリレート、またはこれらのいかなる組み合わせが挙げられる。１つの実施態様おいて、ポリビニルモノマーは、ジビニルベンゼンである。他の実施態様において、モノビニルモノマーとポリビニルモノマーとの混合物は、ジビニルベンゼンとＮ−ビニルピロリジノンである。
【００３３】
好適なポロゲンとしては、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル、アルコール、ケトン、エーテル、またはこれらのいかなる組み合わせが挙げられる。同様に、好適な開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、過酸化二硫酸、バゾ（Vazo）52、バゾ64、バゾ67、バゾ88、V70、またはこれらのすべての組み合わせが挙げられる。
【００３４】
本発明の具体的な実施態様において、本発明のサンプル支持プレートは、モノマー、ポリマー、またはこれらの組み合わせ、ポロゲン、および開始剤を混合し；この混合物でサンプル支持プレートの受け入れ面を（例えば、ピペットによって）コーティングし；重合反応を開始させて高分子フィルムを形成させ；および、高分子フィルムを洗浄して、未反応のモノマー、ポロゲン、および開始剤を除去することによって、作製される。また、ポロゲンを使用しない以外は上述の方法と同様にして、この方法を行うこともできる。
【００３５】
１つの実施態様において、本発明のコーティングされたサンプルプレートを、サンプルを添加する前に有機溶媒（特には、極性有機溶媒）で処理する。極性有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、または水／有機溶媒混合物が挙げられる。
【００３６】
他の観点からは、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用サンプルの調製方法である。上述の本発明のサンプル支持プレートが提供され、ターゲットスポット上の受け入れ面にサンプルが添加される。サンプル中の選択された分子が、吸着層に保持される。これによって、ターゲットスポットの受け入れ面に添加されたサンプルが効果的に脱塩される。１つの実施態様において、吸着層が水溶液で洗浄されて、吸着層から塩が除去される。
【００３７】
上述のように、１つの実施態様において、本発明のコーティングされたサンプル支持プレートは、サンプル添加前に有機溶媒（特には、極性有機溶媒）で処理される。比較的表面積の小さい高分子材料（例えば、高分子フィルム中に含まれるモノビニルモノマーが少ないことによる）は、有機溶媒での前処理が必要になることがある。かかる処理により、吸着層の表面が十分に濡れ、それによって、吸着層表面に選択させた分子を保持することが促進される。
【００３８】
１つの実施態様において、サンプルには、分析対象、マトリックス材料、１以上の塩、および１以上の溶媒が含まれる。具体的な態様において、この溶媒は水性である。１つの実施態様において、サンプルは、マトリックス材料の溶液を含む。他の態様において、サンプルは、マトリックス材料を含まない。さらに他の態様において、マトリックス材料は、吸着層が水溶液で洗浄された後に添加される。
【００３９】
他の観点からは、本発明は、上述した本発明のサンプル支持プレートを使用して、分析対象に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を行う方法である。この方法は、上述のサンプル支持プレートを提供し、分析対象を含むサンプルを吸着層の受け入れ面へ添加し；サンプル中の分析対象を吸着層に保持させ；吸着層を水溶液で洗浄して吸着層から塩を除去することによって、サンプルを脱塩し；および吸着層に保持されている脱塩された分析対象にＭＡＬＤＩ−ＭＳを行うことを含む。
【００４０】
本発明の１つの実施態様において、サンプル提示面には１以上のサンプルターゲットスポットがあり、ターゲットスポットには吸着層がある。
（実施例）
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、これは本発明を限定するものではない。
（実施例１）
ポリマーがスポットされたプレート（polymer spotted plates）の作製と初期評価
ジビニルベンゼン9.75g、Ｎ−ビニルピロリドン5.25g、V70（開始剤）0.3gからなるモノマー溶液を準備した。ピペッターを用いて、従来の金属製ＭＡＬＤＩプレートの受け入れ面にモノマー溶液でスポットを作製した。その結果、このプレート上には、十分にモノマー溶液でコーティングされたスポットの列（A〜D列とする）と、少量のモノマー溶液のスポットの列（E〜H列とする）とが含まれる。このプレートを約６０℃のオーブンで一晩加熱し、重合反応を開始させ、プレート上の各スポットに非多孔質高分子コーティングを形成させた。
【００４１】
このプレートは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートのターゲットスポット上に付加された非多孔質フィルムを有する。このプレートを、塩化メチレン中で超音波処理した後に、メタノール中で超音波処理することにより、簡便に洗浄した。次いで、以下の方法により、このプレートを分析するために処理した。
１．高分子コーティングの処理
・１μLの100％アセトニトリルで高分子コーティングを洗浄する。
【００４２】
・１μLの80％アセトニトリルで高分子コーティングを洗浄する。
・アセトニトリルを除去し、２μLの0.1％トリフルオロ酢酸で洗浄する。
２．サンプルの結合
・0.1％トリフルオロ酢酸を除去する。
【００４３】
・0.1％トリフルオロ酢酸中に、２μLのサンプルを入れる。
・溶媒を気化させて乾燥させる。
３．サンプルの洗浄
・２μLの0.1％トリフルオロ酢酸をターゲット上に添加する。
【００４４】
・４分間インキュベートする。
・洗浄液を除去する。
・これを繰り返す。
４．マトリックス材料の添加
・0.5μLのαシアノ5mg/mL（アセトニトリル25％、エタノール25％、トリフルオロ酢酸0.05％）を添加する。
【００４５】
・気化させて乾燥させる。
バックグラウンドの混入（コンタミネーション）を測定するため、上述のプレートを、サンプルなしの従来型ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートと比較した。次いで、コーティングした受け入れ面上におけるＭＡＬＤＩ−ＭＳによるペプチドのイオン化能を試験するため、サンプル（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）トリプシン消化物）を高分子コーティングしていないコントロールサンプルと比較分析した。次いで、サンプル（トリプシン消化物）を載せた高分子コーティングしたＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートを、水で２回洗浄し、洗浄しなかったサンプルの結果と比較した。上述のような比較的直径の大きい高分子コーティングを有するＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートを作製し、結果を比較した。
【００４６】
４つの図の内、図１には、以下のような上記の比較実験の結果を示す。
１．高分子コーティングによって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに顕著なバックグラウンドが発生することはなかった。
２．ＢＳＡが、高分子コーティングからイオン化された。
３．ＢＳＡはコーティングに結合し、洗浄工程中も保持された。
４．SN比（signal to noise ratio）は、直径の小さいコーティングがされたプレートで改善される。
（実施例２）
種々のコーティング組成物のＭＡＬＤＩ−ＭＳプレート上への調製
いくつかのコーティング組成物を、ポリスチレン（分子量280,000、アルドリッチ18242-7、ロット130 15902CI）、ポリビニルピロリジノン（分子量360,000、シグマP-5288、ロット38H0092）、および１−メチル−２−ピロリジノン（アルドリッチ44377-8、ロットP1 00850 MI）を用いて調製し、以下の方法で、ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレート上にスポットを作製した。
１．Ａ１〜Ａ１２のスポットを、ポリマー溶液（20mlのガラスバイアル中の、１gのポリスチレンと15mlの１−メチルー２−ピロリジノンとの混合物）で作製した。
２．Ｂ１〜Ｂ１２のスポットを、ポリマー溶液（20mlのガラスバイアル中の、0.9gのポリスチレン、0.1gのポリビニルピロリジノン、および15mlの１−メチル−２−ピロリジノンの混合物）で作製した。
３．Ｃ１〜Ｃ１２のスポットを、ポリマー溶液（20mlガラスバイアル中の、0.8gのポリスチレン、0.2gのポリビニルピロリジノン、および15mlの１−メチル−２−ピロリジノンの混合物）で作製した。
４．Ｄ１〜Ｄ１２のスポットを、ポリマー溶液（20mlガラスバイアル中の、0.7gのポリスチレン、0.3gのポリビニルピロリジノン、および15mlの１−メチル−２−ピロリジノン）で作製した。
５．Ｅ１〜Ｅ１２のスポットを、ポリマー溶液（20mlガラスバイアル中の、0.6gのポリスチレン、0.4gのポリビニルピロリジノン、および15mlの１−メチル−２−ピロリジノン）で作製した。
６．Ｆ１〜Ｆ１２のスポットを、ポリマー溶液（20mlガラスバイアル中の、0.5gのポリスチレン、0.5gのポリビニルピロリジノン、および15mlの１−メチル−２−ピロリジノン）で作製した。
【００４７】
このプレートを約60℃のオーブンに１時間入れ、次いで、10秒間アセトニトリルの超音波バスに入れ、最後にメタノールで洗浄した。
（実施例３）
ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートの第２の作製法
１−メチル−２−ピロリジノンを除去し、加熱して高分子フィルムのスポットを形成させた後に、ポリマー溶液をスポットして、４つのＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートを作製した。この方法は、プレート上での重合開始が一定でないことによるプレート作製に関する問題点を改善し、バックグラウンドのノイズおよび感度の問題を検討するためのものである。以下の方法によりプレートを作製し、実施例２で作製したプレートと比較した。
１．ポリスチレン（平均分子量2,802,000）とポリビニルピロリジノン（平均分子量360,000）とを１−メチル−２−ピロリジノン中へ溶解させた。
２．ポリマー溶液によりＭＡＬＤＩプレート上にスポットを作製した。
３．プレートをオーブンに入れ、１−メチル−２−ピロリジノンを除去し、高分子フィルムを作製した。
【００４８】
ＭＡＬＤＩプレート上にスポットしたポリマー溶液は、ポリマー溶液Ａおよびポリマー溶液Ｂとした。ポリマー溶液Ａは、1.6gのポリスチレン（平均分子量280,000）、0.4gのポリビニルピロリジノン（平均分子量360,000）と15mlの１−メチル−２−ピロリジノンとの混合物である。ポリマー溶液Ｂは、1.0gのポリスチレン（平均分子量280,000）、1.0gのポリビニルピロリジノン（平均分子量360,000）、および15mlの１−メチル−２−ピロリジノンの混合物である。
【００４９】
２つのプレートに、約0.05μＬのポリマー溶液Ａでスポットを作製し、他の２つのプレートには、0.05μＬのポリマー溶液Ｂでスポットを作製した。
（参照による本明細書への導入）
すべての特許、公開された特許出願、および本明細書で引用した他の文献についての全内容を、参照により本明細書に含めるものとする。
（均等物）
当業者は、本明細書に具体的に記載されている本発明の具体的な実施態様に対する多くの均等物を、通常の実験（routine experimentation）以上のことをすることなく、認識し、確認することができるだろう。このような均等物も、本特許請求の範囲に含まれると考える。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本発明の高分子コーティングされたブランクのサンプルプレートと、本発明の高分子コーティングされていないブランクのサンプルプレートとを、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって比較分析したものである。
【図２】図２は、高分子コーティングしたサンプルプレートと高分子コーティングしていないサンプルプレート上のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）トリプシン消化物を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって比較分析したものである。
【図３】図３は、図２に示した高分子コーティングしたプレートを水で２回洗浄する前と後のサンプルプレートを、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって比較分析したものである。
【図４】図４は、上述のように、ＢＳＡトリプシン消化物を添加した後に洗浄したサンプルプレートにおいて、高分子コーティングの直径が小さいものと大きいものを、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって比較分析したものである。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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