(57)【要約】本発明は、概して、実質的に精製されたMANFおよびMANFをコードする実質的に精製された核酸を特徴とする。また本発明は、MANFと薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物、神経変性疾患の処置方法、細胞移植中または細胞移植後のドーパミン作動性ニューロンの生存率を改善する方法、移植用ニューロンの生産方法、およびMANFの生物活性を調整または模倣する化合物を同定する方法も特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に精製されたMANFポリペプチド。
【請求項２】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項１の実質的に精製されたMANFポリペプチド。
【請求項３】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項２の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項４】
MANFポリペプチドをコードする実質的に精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項５の実質的に精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項５の実質的に精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
（i）実質的に精製されたMANFポリペプチドと（ii）中枢神経系への投与に薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項８】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項７の医薬組成物。
【請求項９】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項８の医薬組成物。
【請求項１０】
さらに神経細胞を含む請求項７の医薬組成物。
【請求項１１】
前記神経細胞がニューロン、神経幹細胞、またはニューロン前駆細胞である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
ドーパミン作動性ニューロンの生存率を増加させる方法であって、前記ドーパミン作動性ニューロンを生存促進量の本質的に精製されたMANFポリペプチドと接触させる工程を含む方法。
【請求項１３】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7からなる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
移植用のドーパミン作動性ニューロンを成長させる方法であって、前記ニューロンまたはその前駆細胞を生存促進量の実質的に精製されたMANFポリペプチドと共に培養する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7からなる、請求項１６の方法。
【請求項１８】
神経系の疾患または障害を持つ患者を処置する方法であって、前記患者にドーパミン作動性ニューロン生存促進量の実質的に精製されたMANFポリペプチドを投与する工程を含む方法。
【請求項１９】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7からなる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
哺乳動物におけるドーパミン作動性ニューロンの細胞死を防止する方法であって、前記哺乳動物にドーパミン作動性ニューロン生存促進量の実質的に精製されたMANFポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7からなる、請求項２２の方法。
【請求項２４】
哺乳動物の神経系に細胞を移植する方法であって、(i）前記哺乳動物の神経系に細胞を移植すること、および（ii）前記細胞移植の4時間前から前記細胞移植の4時間後までの時間枠に、ドーパミン作動性ニューロン生存促進量のMANFポリペプチドを、前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物がヒトである請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7からなる、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記時間枠が前記細胞移植の2時間前から前記細胞移植の2時間後までである、請求項２４の方法。
【請求項２９】
哺乳動物の神経系に細胞を移植する方法であって、
（a）前記細胞をインビトロでMANFポリペプチドと接触させる工程、および
（b）前記細胞を前記哺乳動物の神経系に移植する工程
を含む方法。
【請求項３０】
工程（a）および工程（b）が互いに4時間以内に行われる、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物がヒトである請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記MANFポリペプチドが本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項２９の方法。
【請求項３３】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7からなる、請求項３２の方法。
【請求項３４】
本質的に配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなるMANFポリペプチドをコードする発現ベクター。
【請求項３５】
前記MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなる、請求項３４の発現ベクター。
【請求項３６】
前記ベクターがアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項３４の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の説明
本願は、参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国仮特許出願第60/277,516号（2001年3月20日出願）に基づく利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明はニューロンの生存率を増加させるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
末梢神経系および中枢神経系（それぞれPNSおよびCNS）におけるニューロンの成長、生存および分化は、部分的に、標的由来神経栄養因子、パラクリン神経栄養因子およびオートクリン神経栄養因子に依存している。逆に、神経栄養因子の欠如は、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症（ALSまたはルーゲーリッグ病）などの神経変性疾患の病因に関与すると考えられている。ニューロン細胞培養では、星状膠細胞との共培養によって、または星状膠細胞から調製された条件培地（CM）を供給することによって、神経栄養支持がなされている。中脳腹側起源の星状膠細胞は、CNSの他の領域（例えば新線条体や大脳皮質）に由来する星状膠細胞と比較して、中脳腹側ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する効力がはるかに大きい。インビトロ培養開始後21日（21daysinvitro（DIV））以降の長期中脳培養物では、星状膠細胞単層の増殖と時を同じくして、ドーパミン作動性ニューロンの割合が20％から60％に増加する。これに対して、星状膠細胞の増殖が阻害される条件下では、ドーパミン作動性ニューロンは5DIVまでに培養物からほとんど排除されるが、GABA作動性ニューロンは排除されない。これらの結果は、近接するドーパミン作動性ニューロンの生存および発育にとって相同器官由来の（homotypically-derived）星状膠細胞が重要であることを示し、中脳星状膠細胞が中脳ドーパミン作動性ニューロンにとって生理的パラクリン神経栄養因子の供給源であるらしいことを示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
星状膠細胞がニューロンの生存を促進する分子を分泌することは繰り返し証明されており、そのために、神経変性疾患処置用治療薬の探索では星状膠細胞に焦点があてられてきた。多くの研究室が星状膠細胞由来の神経栄養因子を単離しようと試みたが、大きな技術上の問題によって阻まれてきた。すなわち、血清は初代培養星状膠細胞の最適な成長にとって不可欠な培地成分であるが、後で条件培地中に分泌された因子を精製する際に、血清の存在はじゃまになるのである。
【０００５】
したがって、新しい神経栄養因子を同定し精製する必要があり、またタンパク質単離技術に適合する条件培地を製造するための新しい方法を見いだす必要もある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、先に、腹側中脳細胞株1（ventral mesencephalic cell line-1：VMCL-1）と呼ぶ自発的に不死化した1型星状膠細胞様細胞株を単離した。American Type Culture Collection（ATCC；バージニア州マナッサス）に寄託されたこの細胞株（ATCC受託番号：PTA-2479；寄託日：2000年9月18日）は中脳腹側に由来し、初代1型星状膠細胞の特徴を保っているが、無血清培地中で活発に成長する。これらの細胞から調製されたCMは、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存率を少なくとも3倍は増加させると共にそれらの発育も促進する1つまたは複数のニューロン生存因子を含有する。
【０００７】
本発明者らは、多段階精製法を用いて、VMCL-1 CMのドーパミン作動性ニューロン生存促進活性と同時精製されるタンパク質として、アルギニンリッチタンパク質（ARP）を同定した。このタンパク質および活性は5段階の精製工程を経て同時精製されたので、本発明者らは、このタンパク質が所望のドーパミン作動性ニューロン生存促進活性を持つVMCL-1 CM中の因子の一つであると判断する。
【０００８】
また本発明者らは、ARPがこれまで認識されていなかった分泌型として産生されることも見いだした。本発明者らはこの分泌型をMANF（matureastrocyte-derivedneurotrophicfactor＝成熟星状膠細胞由来神経栄養因子）と呼んでいる。図1および配列番号3に示すように、MANFはARPタンパク質のN末端アルギニンリッチ部分を欠いている。配列を検討した結果から、本発明者らは、この分泌型が、これまで同定されていなかったARPのスプライス変異体（ARPβまたはプロMANF）（これは配列番号2に示す配列を持つ）の切断によって生成すると考えている。MANFおよびプロMANFならびに生物学的に活性なその類似体、誘導体および断片を総称して「MANFポリペプチド」という。
【０００９】
したがって、第1の側面として、本発明は、実質的に精製されたMANFポリペプチドを特徴とする。一態様として、MANFポリペプチドは配列番号2、3、4、5、6または7のアミノ酸配列を持つ。もう一つの態様として、MANFポリペプチドは、配列番号2、3、4、5、6または7のアミノ酸配列に対して1つまた複数の保存的アミノ酸置換を含むか、またはこれらのアミノ酸配列の一つを持つタンパク質と、その他の点では実質的に同一である。
【００１０】
第2の側面として、本発明は、MANFポリペプチドをコードする実質的に精製されたポリヌクレオチドを特徴とする。上述のように、MANFポリペプチドは配列番号2、3、4、5、6または7のアミノ酸配列を持つか、またはこれらのアミノ酸配列に対して1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含みうる。一態様として、本ポリヌクレオチドは配列番号2、3、4、5、6または7のアミノ酸配列を持つタンパク質と実質的に同一なタンパク質をコードする。もう一つの態様として、本ポリヌクレオチドは配列番号9または10の配列からなる。
【００１１】
第3の側面として、本発明は、第2の側面のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを特徴とする。本発現ベクターは、例えばアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであることができる。ある特定態様では、前記ポリヌクレオチドが、神経細胞における上記ポリヌクレオチドの発現を可能にする調節配列に作動可能に連結される。
【００１２】
第4の側面として、本発明は、（i）実質的に精製されたMANFポリペプチドと（ii）中枢神経系への投与に薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
【００１３】
第5の側面として、本発明は、（i）実質的に精製されたMANFポリペプチド、（ii）薬学的に許容できる担体、および（ii）神経細胞を含む医薬組成物を特徴とする。神経細胞は、例えばニューロン、神経幹細胞、またはニューロン前駆細胞であることができる。
【００１４】
第6の側面として、本発明は、ドーパミン作動性ニューロンの生存率を増加させる方法であって、ドーパミン作動性ニューロンを生存促進量の実質的に精製されたMANFポリペプチドと接触させる工程を含む方法を特徴とする。
【００１５】
第7の側面として、本発明は、移植用のドーパミン作動性ニューロンを成長させる方法を特徴とする。この方法は、ニューロンまたはその前駆細胞を生存促進量の実質的に精製されたMANFポリペプチドと共に培養する工程を含む。一態様として、MANFポリペプチドは薬学的に許容できる賦形剤と共に投与される。
【００１６】
第8の側面として、本発明は、神経系の疾患または障害を持つ患者を処置する方法を特徴とする。本方法は、ドーパミン作動性ニューロン生存促進量の実質的に精製されたMANFポリペプチドを、前記患者に投与する工程を含む。
【００１７】
第9の側面として、本発明は、哺乳動物におけるドーパミン作動性ニューロンの細胞死を防止する方法を特徴とする。この方法は、ドーパミン作動性ニューロン生存促進量の実質的に精製されたMANFポリペプチドを、前記哺乳動物に投与する工程を含む。
【００１８】
第10の側面として、本発明は、ヒトなどの哺乳動物の神経系に細胞を移植する方法であって、（i）前記哺乳動物の神経系に細胞を移植すること、および（ii）前記細胞移植の2〜4時間前から前記胞移植の2〜4時間後までの時間枠に、ドーパミン作動性ニューロン生存促進量のMANFポリペプチドを、前記哺乳動物に投与することを含む方法を特徴とする。
【００１９】
第11の側面として、本発明は、ヒトなどの哺乳動物の神経系に細胞を移植するもう一つの方法を特徴とする。この方法は、（a）前記細胞をMANFポリペプチドと接触させる工程、および（b）工程（a）の細胞を前記哺乳動物の神経系に移植する工程を含む。工程（a）および工程（b）は互いに4時間以内に行われることが望ましい。
【００２０】
第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、または第11の側面の特定態様では、MANFポリペプチドが配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなるか、または本質的に配列番号2、3、4、5、6または7からなる。
【００２１】
本明細書で証明するように、ドーパミン作動性ニューロンは、MANFポリペプチドの存在下では、その大部分が死なない。パーキンソン病患者では中脳のドーパミン作動性ニューロンが死ぬ。したがって本発明はパーキンソン病の処置方法を提供する。また、ドーパミン作動性ニューロンの消失が存在するか予想される神経系の障害または疾患の処置におけるMANFポリペプチドの使用も、本発明に包含される。
【００２２】
MANFがドーパミン作動性ニューロンの生存に関与するという発見により、さまざまな診断試験およびドーパミン作動性ニューロン生存促進薬を同定するためのアッセイに、MANFを使用することができる。MANF発現は、ある人が神経変性障害の危険にさらされているかどうかを決定するための診断手段としても役立つだろう。この診断プロセスは、患者の応答（例えばある化合物または薬物を投与した時の効力または有害副作用の強弱）の予測を含む、患者の遺伝子型に応じた薬物処置のテーラーメード化（tailoring）（薬理ゲノミクスという）につながりうる。
【００２３】
MANFポリペプチドに対する抗体は、治療薬としても診断薬としても使用することができる。抗体は、B細胞を含む生物系、例えばマウスなどの動物を、MANFポリペプチドで免疫学的に攻撃してB細胞による抗MANFの産生を刺激した後、その抗体をその生物系から単離することによって製造される。そのような抗体は、試料を抗体と接触させた後、試料中のMANFポリペプチドの目安として免疫複合体を測定することによって、血清などの生物学的試料中のMANFポリペプチドを測定するために使用することができる。MANFに対する抗体は、MANF生物活性を調整するための治療薬として使用することもできる。
【００２４】
したがって、もう一つの側面として、本発明は、MANFポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体を特徴とする。
【００２５】
さらにもう一つの側面として、本発明は、MANFによるドーパミン作動性ニューロン生存促進活性を、候補化合物が調整するかどうかを決定する方法であって、（a）MANFポリペプチドを用意すること、（b）MANFポリペプチドを候補化合物と接触させること、および（c）MANF生物活性を測定することを含み、前記化合物と接触させていないMANFポリペプチドの生物活性と比較したMANF生物活性の変化によって、当該候補化合物がMANF生物活性を調整することが示される方法を特徴とする。前記MANFポリペプチドは細胞内にあってもよいし、無細胞アッセイ系内にあってもよい。
【００２６】
もう1つの側面として、本発明は、候補化合物が神経変性を減少させるのに役立つかどうかを決定する方法であって、（a）MANFポリペプチドを用意する工程、（b）前記ポリペプチドを候補化合物と接触させる工程、および（c）MANFポリペプチドの結合を測定する工程を含み、MANFポリペプチドの結合によって、当該候補化合物が神経変性を低下させるのに役立つことが示される方法を特徴とする。
【００２７】
上記本発明スクリーニング方法の特定態様では、細胞が動物中にあり、MANFポリペプチドは配列番号2、3、4、5、6または7の配列からなるか、または本質的に配列番号2、3、4、5、6または7からなる。
【００２８】
本発明は、MANF生物活性を増強または模倣する因子を同定するためのスクリーニング方法も特徴とする。これらの増強因子スクリーニング方法では、MANFの発現量、安定性または生物活性を増加させる候補化合物の能力を、標準的技術を使って調べる。MANFに結合する候補化合物は、増強剤として作用する可能性がある。ミメティック（例えばMANF受容体を結合する化合物）は、MANFポリペプチドの不在下で作用する能力を持つ化合物である。
【００２９】
ポリペプチド（例えばMANFポリペプチド）が、そのポリペプチドに本来付随している成分から分離されていることを、「実質的に精製された」という用語によって表す。典型的には、あるポリペプチドが少なくとも60重量％であって、そのポリペプチドに本来付随しているタンパク質および天然有機分子を含まない場合、そのポリペプチドは実質的に精製されているという。ポリペプチドの純度は好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％である。実質的に精製されたポリペプチドは、例えば天然供給源（神経細胞など）からの抽出、そのポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、またはそのタンパク質の化学合成などによって得ることができる。純度は、任意の適切な方法によって、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析などによって測定することができる。
【００３０】
あるポリペプチドが、その自然状態で当該ポリペプチドに付随している夾雑物から、分離されている場合、そのポリペプチドは本来付随している成分を実質的に含まないという。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、またはそのポリペプチドの本来の起源である細胞とは異なる細胞系で産生されたポリペプチドは、そのポリペプチドに本来付随している成分を実質的に含まないだろう。したがって、実質的に精製されたポリペプチドには、本来なら真核生物中に存在するが大腸菌または他の原核生物中で合成されたポリペプチドが包含される。
【００３１】
2個を超えるアミノ酸の鎖を、糖鎖付加またはリン酸化などの翻訳後修飾とは無関係に、「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語によって表す。
【００３２】
本発明の一部であるMANFポリペプチドは、ドーパミン作動性ニューロン生存促進活性（「MANF生物活性」）を持ち、ヒトMANF（配列番号2、3または4）をコードするcDNAに高いストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によってコードされているポリペプチドであるか、またはヒトMANFと実質的に同一である。この定義には、プロMANFポリペプチド（例えばヒトプロMANF；配列番号2）、合成ヒトMANF（配列番号4）、MANF生物活性を持つと予想されるヒトMANFのペプチドドメイン（例えばLRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREA（配列番号11）、RGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICEL（配列番号12）およびKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKY（配列番号13））、ならびにマウス（例えば配列番号5、6および7）、ウシ（図11A、配列番号14）およびブタ（図11B、配列番号15）などの種から得られるMANFポリペプチド相当物が包含される。アルギニンリッチなアミノ末端（例えば配列番号1のアミノ酸1〜55）を含むARPタンパク質は、MANFポリペプチドの定義からは、特に除外される。したがってヒトARP（配列番号1）はMANFポリペプチドであるとはみなされない。
【００３３】
本発明の一部であるポリヌクレオチドは、上に定義したMANFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。代表的ポリヌクレオチドは、例えば配列番号9および配列番号10の配列によって表される。
【００３４】
基準とするアミノ酸配列または核酸配列に対して少なくとも5％、好ましくは90％、より好ましくは95％、最も好ましくは97％の一致度を示すポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、「実質的に同一」という用語によって表す。ポリペプチドの場合、比較する配列の長さは、一般的には少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸、より好ましくは少なくとも25アミノ酸、最も好ましくは35アミノ酸であるだろう。ポリヌクレオチドの場合、比較する配列の長さは、一般的には少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチド、最も好ましくは110ヌクレオチドであるだろう。
【００３５】
配列一致度は、通例、配列解析ソフトウェアを使って、そのソフトウェアに指定されているデフォルトパラメーターで測定される（例えばウィスコンシン州53705マディソン、ユニバーシティー・アベニュー1710番、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、ジェネティックス・コンピュータ・グループの配列解析ソフトウェアパッケージ）。このソフトウェアプログラムは、さまざまな置換、欠失および他の改変にホモロジーの程度を割り当てることによって、類似する配列同士を照合する。保存的置換には、通例、以下のグループ内での置換が包含される：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００３６】
2×SSC中、40℃で行われる少なくとも40ヌクレオチド長のDNAプローブとのハイブリダイゼーションを、「高ストリンジェンシー条件」という用語によって表す。高ストリンジェンシー条件の他の定義については、参照により本明細書に組み込まれるF.Ausubelら「Current Protocols in Molecular Biology」の6.3.1-6.3.6頁（John Wiley & Sons, ニューヨーク州ニューヨーク, 1994）を参照されたい。
【００３７】
標準的な細胞生存率アッセイで、ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する（または逆にドーパミン作動性ニューロンの死を防止する）活性を持つ分子を、「化合物」または「因子」という用語によって表す。
【００３８】
本発明のポリペプチドを含むポリペプチドの集合物（collection）を、「組成物」という用語によって表す。
【００３９】
処置される哺乳動物にとって生理的に許容できると同時に、それと一緒に投与されるポリペプチドの治療特性を変化させない賦形剤、担体または希釈剤を、「薬学的に許容できる賦形剤」という用語によって表す。薬学的に許容できる担体の代表的な一例は生理食塩溶液である。他の生理的に許容できる担体およびそれらの製剤も当業者には知られており、例えばA.R. Gennaro AR編「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」第20版（2000, Lippencott Williams & Wilkins）などに記載されている。
【００４０】
ある化合物の存在が、ドーパミン作動性ニューロン生存率アッセイ（例えば本明細書に記載するアッセイ）において、ドーパミン作動性ニューロンの生存率を、当該化合物の不在下でのドーパミン作動性ニューロンの生存率と比較して、少なくとも2倍は増加させることを、「ドーパミン作動性ニューロン生存促進活性」を持つ化合物という用語によって表す。ドーパミン作動性ニューロンの生存率の増加は、少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも4倍、最も好ましくは少なくとも5倍であることができる。このアッセイはインビトロアッセイであってもよいし、インビボアッセイであってもよい。
【００４１】
本発明は、ニューロンの細胞死を防止するための新しい方法および試薬を提供する。また本発明は、異常なニューロン細胞死を一因とする神経疾患または神経障害を処置するための医薬組成物も提供する。
【００４２】
本発明の他の特徴および利点は、以下に述べる本発明の好ましい態様の説明から明らかになるだろう。
【００４３】
以前、本発明者らは、結果としてドーパミン作動性ニューロンの分化および生存を促進する因子を、中脳由来のある細胞株（「VMCL-1」と呼ぶ）が分泌することを発見した。この細胞株は無血清培地中で活発に成長する。さらに、これらの細胞から調製したCMは、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存率を少なくとも3倍は増加させると共にそれらの発育も促進する1つまたは複数のドーパミン作動性ニューロン生存因子を含有する。
【００４４】
本発明者らはVMCL-1細胞株からあるタンパク質を精製し、それがARPであることを確認した。本発明者らはこのタンパク質を以下のように精製した。体積3LのVMCL-1条件培地を調製し、これを逐次、5段階のカラムクロマトグラフィーにかけた。各精製工程で、各カラム画分の生物活性を、上述のバイオアッセイで調べた。ドーパミン作動性ニューロンの生存に対する各画分の効果を5日間にわたって24時間おきに見積もり、1〜10の尺度で評価した。5番目の精製工程後に、生物活性画分および隣接する不活性画分をSDS-PAGEで分析した。SDS-PAGE分析の結果、活性画分のレーンには、20kDa領域に特徴的なタンパク質バンドが見いだされた。その「活性」バンドを切り出してトリプシン消化にかけ、質量分析を用いた解析によって、バックグラウンドを上回る各ペプチドの分子量および配列を決定した。次の2つのペプチド配列が同定された：DVTFSPATIE（配列番号6）およびQIDLSTVDL（配列番号7）。データベースの検索により、ヒトアルギニンリッチタンパク質およびそのマウスオルソログとの一致が確認された。マウスEST配列がコードする予想タンパク質は予想ヒトタンパク質と約95％一致している。ラットESTデータベースの検索により、2つの配列が見いだされが、そのうちの1つ（dbEST Id：4408547；EST名：EST348489）はヒトおよびマウスタンパク質に対してアミノ酸レベルで有意なホモロジーを持っていた。完全長ラット配列はGenBankデータベースにはなかった。また本発明者らは、GenBankに登録されているヒトARPの配列が正しくないことも見いだした。正しい配列を配列番号1に記載する。
【００４５】
本発明者らは、アルギニンリッチなアミノ末端がカルボキシ末端から分離されてヒトプロMANF（配列番号2）が生成するような形で、ヒトARPが切断されることを見いだした。切断されたカルボキシ末端断片はシグナルペプチドを含むので、ヒトMANF（配列番号3）は細胞から分泌されることになる。
【００４６】
分泌型MANFと非分泌型MANF（総称してMANFポリペプチドという）はどちらも神経栄養活性を持ち、パーキンソン病などの神経変性疾患の処置およびヒトへの移植中または移植後のドーパミン作動性ニューロンの生存率の改善に、神経栄養因子として役立つ。MANFポリペプチドは、移植用ニューロンのインビトロ生産を改善するためにも使用することができる。もう一つの用途として、MANFポリペプチドは、MANFのドーパミン作動性ニューロン生存促進活性を調整または模倣する化合物の同定にも使用することができる。MANFポリペプチドは、MANF受容体を同定するためにも使用することができる。これらの用途をそれぞれ以下に詳しく説明する。
【００４７】
MANF生物活性を調整する分子の同定
ドーパミン作動性ニューロンの生存のMANFによる調節に対する候補分子の効果は、例えばMANF特異抗体を使ったウェスタンブロット法または免疫沈降などの標準的なタンパク質検出技術を使って、翻訳レベルで測定することができる。
【００４８】
MANFのレベルを調整する化合物は精製または実質的に精製されていてもよいし、化合物の混合物（例えば細胞から得られる抽出物または上清）の一成分であってもよい（Ausubelらの前掲書）。化合物の混合物をアッセイする場合は、細胞に添加する化合物プールの部分集合（例えばHPLCまたはFPLCなどの標準的精製技術によって得られるもの）を次第に小さくしていって、単一の化合物または最小数の有効化合物がMANF発現量を調整することが証明されるまで、MANF発現量を測定する。
【００４９】
MANFによるドーパミン作動性ニューロンの生存を調整する能力に関して、化合物を直接スクリーニングすることもできる。このアプローチでは、候補化合物が存在する場合のドーパミン作動性ニューロンの生存量を、その候補化合物が存在しない場合のドーパミン作動性ニューロンの生存量と、等価な条件下で比較する。この場合も、候補化合物のプールからスクリーニングを開始して、そこから1つまたは複数の有用な調整因子化合物を段階的に単離することができる。生存促進活性は任意の標準的アッセイによって測定することができる。
【００５０】
MANFの活性を調整する化合物を検出するもう一つの方法は、MANFと物理的に相互作用する化合物に関するスクリーニングを行うことである。これらの化合物は、当技術分野で知られる相互作用トラップ（interaction trap）発現システムを応用することによって、検出することができる。これらのシステムは転写活性化アッセイを利用してタンパク質相互作用を検出するもので、Gyurisら（Cell 75:791-803, 1993）およびFieldら（Nature 340:245-246, 1989）の論文に概説されている。別法として、MANFまたは生物学的に活性なその断片を、125I Bolton-Hunter試薬（Boltonら, Biochem. J. 133:529, 1973）で標識することもできる。マルチウェルプレートのウェルに前もって配置しておいた候補分子を、標識MANFと共にインキュベートし、次に洗浄する。標識MANF複合体を含むウェルをすべてアッセイする。さまざまな濃度のMANFを使って得たデータを利用して、MANFと候補分子との数、親和性および会合に関する値を計算することができる。
【００５１】
MANFドーパミン作動性ニューロン生存促進活性の調整因子として機能する化合物または分子としては、ペプチド分子および非ペプチド分子、例えば細胞抽出物中、哺乳動物血清中、または哺乳動物細胞を培養した後の成長培地中に存在するものなどを挙げることができる。
【００５２】
ニューロン細胞の生存率が増加するような形でMANF発現またはMANFによる生物活性を調整する分子は本発明では有用であると考えられる。例えば、そのような分子は、以下に述べるように治療薬などとして使用することができる。
【００５３】
治療法
MANFがドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する神経栄養因子として発見されたことから、MANFはパーキンソン病などの神経変性疾患の治療的処置に利用することができる。
【００５４】
ニューロン死を防止する目的でMANFポリペプチドを細胞に添加するには、そのタンパク質を発現させることができる培養細胞系から十分量の組換えMANFポリペプチドを得ることが好ましい。好ましいMANFポリペプチドはヒトMANFであるが、他の動物（例えばブタ、ラット、マウス、イヌ、ヒヒ、ウシなど）に由来するMANFポリペプチドも使用することができる。次に、患部組織へのタンパク質の送達は、適切なパッケージングシステムまたは投与システムを使って達成することができる。別法として、小分子類似体を使用し、それを投与することによって、MANFアゴニストとして作用させ、そうすることで望ましい生理的効果を生じさせてもよい。
【００５５】
遺伝子治療はもう一つの潜在的治療アプローチである。この場合は、MANFポリペプチドをコードする遺伝子（またはMANFセンスRNAをコードするポリヌクレオチド）の正常なコピーを細胞中に導入して、MANFポリペプチドをうまく産生させる。遺伝子は、細胞に取り込まれることができ、しかも有効なドーパミン作動性ニューロン生存促進活性をもたらすのに十分なタンパク質をコードすることができるような形で、細胞に送達されなければならない。
【００５６】
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルスベクター、または神経細胞に対して適切な向性を持つ他のウイルスベクターを、治療用MANFコンストラクトの遺伝子導入送達システムとして使用することができる。この目的に役立つベクターは一般に数多く知られている（Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990；Friedman, Science 244:1275-1281, 1989；EglitisおよびAnderson, BioTechniques 6:608-614, 1988；TolstoshevおよびAnderson, Curr. Opin. Biotech. 1:55-61, 1990；Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991；Cornettaら, Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 36:311-322, 1987；Anderson, Science 226:401-409, 1984；Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991；Millerら, Biotech. 7:980-990, 1989；Le Gal La Salleら, Science 259: 988-990, 1993；ならびにJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995）。レトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、既に臨床的にも使用されている（Rosenbergら, N. Engl. J. Med. 323:370, 1990；Andersonら, 米国特許第5,399,346号）。望ましい細胞への治療用DNAの導入には、非ウイルス的アプローチも使用することができる。例えば、リポフェクション（Felgnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987；Onoら, Neurosci. Lett. 117:259, 1990；Brighamら, Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989；Staubingerら, Meth. Enzymol. 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド-ポリリジンコンジュゲーション（Wuら, J. Biol. Chem. 263:14621, 1988；Wuら, J. Biol. Chem. 264:16985, 1989）、またはそれほど好ましくはないが、手術条件下でのマイクロインジェクション（Wolffら, Science 247:1465, 1990）などによって、MANFをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することができる。
【００５７】
遺伝子導入は、インビトロでの感染を必要とする非ウイルス手段を使って達成することもできるだろう。これにはリン酸カルシウム、DEAEデキストラン、エレクトロポレーションおよびプロトプラスト融合が含まれるだろう。細胞へのDNAの送達にはリポソームも有益である可能性があるだろう。これらの方法を利用することはできるが、これらの多くは効率が低い。
【００５８】
本明細書に記載するコンストラクトでは、MANFまたはプロMANF cDNA発現を、任意の適切なプロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、またはメタロチオネインプロモーターなど）から指示することができ、任意の適切な哺乳類調節要素によって調節することができる。例えば、所望により、神経細胞での遺伝子発現を優先的に指示することが知られているエンハンサーを使って、MANFポリペプチド発現を指示することができる。使用するエンハンサーとしては、例えばその発現が組織特異的または細胞特異的であると特徴づけられるエンハンサーなどを挙げることができるだろう。
【００５９】
細胞内での安定性および半減期が増加するようにRNA分子を修飾してもよい。考えられる修飾としては、例えば分子の5'および/または3'末端への隣接配列の付加、または分子の主鎖にリン酸ジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2'O-メチルを使用することなどが挙げられる。この発想は、イノシン、キューオシン、およびワイブトシンなどの異常塩基、ならびにアセチル型、メチル型、チオ型、その他同様に修飾された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンであって内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないものなどの包含により、これらの分子のすべてに拡張することができる。
【００６０】
本発明に包含されるもう一つの治療アプローチでは、組換えMANFポリペプチドを、細胞の消失が起こる可能性がある部位または細胞の消失が実際に起こっている部位に（例えば注射などによって）直接投与するか、または（例えば従来からある任意の組換えタンパク質投与技術などによって）全身投与する。
【００６１】
本発明のもう一つの態様は、上述した治療効果のいずれかを得る目的で、薬学的に許容できる担体と組み合わせて、医薬組成物を投与することに関する。そのような医薬組成物は、AMNFポリペプチド、MANFポリペプチドに対する抗体、および/またはMANFポリペプチドのミメティックおよびアゴニストからなることができる。本組成物は、単独で投与してもよいし、少なくとも1つの他の薬剤、例えば安定化化合物などと組み合わせて投与してもよく、任意の滅菌生体適合性医薬担体、例えば食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などに入れて投与することができる。本組成物は、単独で、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて、患者に投与することができる。
【００６２】
一例として、処置対象には、細胞を移植する部位にMANFポリペプチドを投与する。MANFポリペプチドの投与は、細胞の移植前、移植中または移植後に行うことができる。これら2つの工程は、好ましくは、互いに約4時間以内に行われる。所望により、MANFポリペプチドは、細胞移植前および/または細胞移植後に、さまざまな間隔で、処置対象に繰り返し投与することができる。MANFポリペプチドのこの保護的投与は、細胞移植後、何ヶ月も、さらには何年も経ってから行ってもよい。
【００６３】
MANFポリペプチドは、ヒトまたは他の哺乳動物に投与する他にも、移植前の任意の時点で、生産中のニューロンの生存を改善する目的で、培養に使用することもできる。一例として、移植しようとする細胞を、生存促進量のMANFポリペプチドをも含んでいる医薬担体に懸濁する。MANFポリペプチドは、工程初期に（例えばニューロンが最初の分化を起こしつつあるときに）培養物に投与することもできる。ニューロンは初代ドーパミン作動性ニューロンである必要はないと理解される。幹細胞またはニューロンを生成させることができる他の任意の細胞からインビトロまたはインビボで分化するニューロン（例えばドーパミン作動性ニューロン）を、その生産および維持に際して、MANFポリペプチドの存在下で培養することができる。
【００６４】
非経口製剤は流動性の溶液または懸濁液の形態をとることができる。また、経口投与の場合、製剤は錠剤またはカプセル剤の形態をとることができ、鼻腔内製剤の場合は、散剤、点鼻薬またはエアロゾルの形態をとることができる。
【００６５】
当技術分野で周知の製剤方法については、例えばA.R. Gennaro AR編「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」第20版（2000, Lippencott Williams & Wilkins）などを参照されたい。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤として、滅菌水または滅菌食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物油、または水素化ナフタレン類などを含むことができる。また、生体適合性生分解性ラクチドポリマーまたはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーを使って、本因子の放出を制御することもできる。本因子に役立つ可能性がある他の非経口送達システムには、エチレン-酢酸ビルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋込型注入システム、およびリポソームなどがある。吸入用製剤は、賦形剤として、例えば乳糖を含むことができる。また、吸入用製剤は例えばポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸などを含む水溶液であってもよいし、点鼻薬の形態で投与される油性溶液であってもよく、鼻腔内に投与されるゲルの形態もとりうる。
【００６６】
本因子は単独の活性剤として使用することもできるし、他の活性成分、例えば神経疾患でのドーパミン作動性ニューロンの生存を容易にすることができる他の成長因子、またはペプチダーゼ阻害剤もしくはプロテアーゼ阻害剤などと組み合わせて使用することもできる。
【００６７】
本発明の製剤中の本因子の濃度は、投薬量および投与経路を含むいくつかの問題に依存して変動するだろう。
【００６８】
一般論として、非経口投与の場合、本発明の因子は、約0.1〜10％（w/v）のポリペプチドを含む水性生理緩衝溶液として投与することができる。一般的用量範囲は約1mg/kg〜約1g/kg体重/日である。好ましい用量範囲は約0.01mg/kg〜100mg/kg体重/日である。好ましい投薬量は、おそらく、対処しようとする病態生理学的状態のタイプおよび進行度、患者の全体的健康状態、製剤の組成、および投与経路に依存するだろう。
【００６９】
ヒトMANFは本明細書に記載する方法での使用に好ましいが、MANFはラット、マウスおよびウシを含む数多くの種で同定されている。標準的な方法で他の動物からも容易にMANFを同定できることは、当業者には理解されるだろう。ドーパミン作動性ニューロン生存促進活性を持ち、ヒトARPをコードするcDNAにハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質は、いずれも本発明の一部であるとみなされる。
【００７０】
以下の実施例は本発明を例示するためのものである。以下の実施例は決して本発明を限定しようとするものではない。
【００７１】
実施例１
VMCL-1細胞の作出および解析
VMCL-1細胞株は以下のように作出した。約2〜3％が神経膠芽細胞であるラットE14中脳細胞を、10％（v/v）ウシ胎仔血清を含む培地で12時間インキュベートした後、分裂促進因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含む無血清培地で増殖させた。15DIVを超えてから、増殖している神経膠様細胞の島がいくつか観察された。単離および継代培養後に、それらの細胞（本明細書ではVMCL-1細胞という）は、無血清成長培地でも血清含有成長培地でも迅速に増殖した。続いて行った免疫細胞化学分析により、これらは2つの星状膠細胞マーカー、GFAPおよびビメンチンに関して陽性に染色され、A2B5、O4、GalCおよびMAP2を含む希突起神経膠系統またはニューロン系統のマーカーについては陰性に染色されることがわかった。本発明者らはVMCL-1細胞株をATCCに寄託している（受託番号PTA-2479；寄託日：2000年9月18日）。
【００７２】
VMCL-1から調製した無血清CMは、培養E14中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存率の増加および分化を引き起こした。これらの作用は、初代中脳1型星状膠細胞から得られるCMが発揮する作用と似ている。中脳領域特異的遺伝子（例えばwnt-1、en-1、en-2、pax-2、pax-5およびpax-8など）の発現は、VMCL-1細胞と、E14中脳腹側由来の初代1型星状膠細胞との間で類似していた。どちらの細胞でもwnt-1は強く発現されるが、en-1はそれほど強くは発現されず、これらが中脳由来であることから期待される発現パターンが裏付けられた。染色体解析により、細胞の70％が異数体であり、そのうちの50％は四倍体であることがわかった。増殖能の明白な低下は24回を超える継代培養後にも観察されなかった。この細胞株の性質は不死化1型星状膠細胞の性質と一致している。
【００７３】
VMCL-1細胞は明らかに非ニューロン的な神経膠様の形態を持つが、培養1型星状膠細胞に特有の大きくて扁平な形状は持っていない。免疫細胞化学分析により、これらはGFAPおよびビメンチンに関して陽性に染色され、MAP2、A2B5およびO4に関して陰性に染色されることが明らかになった。したがってこれらは希突起膠細胞系統の細胞ではなかった。A2B5に対する反応が陰性であったことと、その形態上の特徴から判断すると、これらは2型星状膠細胞でもなかった。免疫細胞化学的証拠が支持する分類は1型星状膠細胞という分類であるが、上述のようにこれらの細胞は培養初代1型星状膠細胞の古典的な形態学的特徴を持っていない。
【００７４】
実施例２
培養E14ドーパミン作動性ニューロンに対するVMCL-1 CMの作用
VMCL-1を、培養E14中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存および発育に影響を及ぼすその能力について、0、5、20および50％（v/v）で調べた。培養物を10％ウシ胎仔血清（FBS）で12時間プライミングした後、無血清成長培地中で生育させ、7DIV後にそれらを染色し、解析した。ドーパミン作動性ニューロンの生存率の増加に対するCMの用量依存的作用が観察された。CMは生存率を5倍増加させた。これに対して、非ドーパミン作動性ニューロンの生存率には有意な増加が認められなかった。この推定上の因子の生物学的作用の特徴は、GDNFの供給源であるB49神経膠腫細胞株から得られるCMとは著しく相違している（Linら, Science 260:1130-1132）。
【００７５】
実施例３
VMCL-1細胞の遺伝子発現解析
VMCL-1細胞株と初代培養星状膠細胞との類似性をさらに調べるために、中脳領域に特有な6種類のマーカー遺伝子の発現を測定した。wnt-1、en-1、en-2、pax-2、pax-5およびpax-8の解析により、E13神経組織では発現しているがE14神経組織では発現していなかったpax-2を除いて、すべての遺伝子がE13中脳腹側神経組織でもE14中脳腹側神経組織でも発現していることが明らかになった。初代星状膠細胞とVMCL-1細胞はどちらも、E13およびE14中脳腹側神経組織と同等レベルのwnt-1を発現させた。en-1の発現は初代星状膠細胞とVMCL-1細胞とでは同じ程度であったが、E13およびE14中脳腹側組織における発現と比べると低レベルだった。これに対して、en-2、pax-5およびpax-8は、初代星状膠細胞でもVMCL-1でも発現していなかった。pax-2はE13中脳腹側では発現しているがE14中脳腹側では発現せず、初代星状膠細胞では発現しているがVMCL-1では発現していなかった。
【００７６】
実施例４
VMCL-1細胞の染色体解析
34個の細胞で染色体数を数えた。これらのうち9細胞は、ラットの二倍数である42だった。異数体である25細胞のうち、12/25すなわち48％は四倍体領域にあった。高二倍体細胞（染色体数43〜48）と低二倍体細胞（染色体数39〜41）はそれぞれ母集団の20％を占め、12％の細胞は構造変化を起こした染色体を持っていた。
【００７７】
VMCL-1 CMは培養ドーパミン作動性ニューロンの生存率を増加させる選択的作用を持つことから、この細胞株が産生する分子には、臨床的用途が考えられる。50％（v/v）の濃度でVMCL-1 CMに毒性がないことは、活性な推定神経栄養因子が有毒でないことを示している。VMCL-1 CMが発揮する作用は、中脳初代1型星状膠細胞から調製されるCMとほとんど全く同じである（Takeshimaら, J. Neurosci. 14: 4769-4779, 1994）。VMCL-1由来の推定因子がドーパミン作動性ニューロンに対して示す高度の特異性は、ニューロン全般の生存率が有意に増加せず、ドーパミン作動性ニューロンの生存率が5倍増加したという観察結果からはっきり示されている（図1）。本発明者らは初代1型星状膠細胞がGDNF mRNAを発現させることを証明したが、ウェスタンブロットでは50pgの感度でCM中にGDNFは検出されなかった。さらに本発明者らは、本実験条件下では、至適濃度のGDNFによるドーパミン作動性ニューロンの生存率の増加が、決して2倍を超えないことも明らかにした。これらの観察結果は、それだけで、VMCL-1 CMの神経栄養作用を担う因子がGDNFでないことを示している。
【００７８】
実施例５
1型星状膠細胞条件培地の製造
E16 1型星状膠細胞CM（10L）を濾過し、0.2M NaClを含む20mM Tris-HCl（Mallinckrodt Chemical Co., ケンタッキー州パリス）pH 7.6で前もって平衡化しておいたHeparin-Sepharose CL-6Bカラム（ベッド体積80mL）にかけた。平衡化緩衝液で洗浄した後、結合しているタンパク質を、20mM Tris-HCl（pH7.6）中、0.2M−2M NaClの直線的勾配（総液量400mL、流速100mL/時）を使って、カラムから溶出させた。Pharmacia LKBフランクションコレクターを使って各画分を分取し、280nmで吸光度を測定した（Sargent-Welch PU 8600 UV/VIS分光光度計）。各画分から1mLずつ採取し、4つずつプール（合計体積4mL）して、Centricon-10（登録商標）膜濃縮器（Millipore, マサチューセッツ州ベッドフォード）で脱塩した。試料を合成培地で1：4に希釈し、ドーパミン作動活性についてバイオアッセイした。活性画分をプール（合計体積80mL）した後、50mMギ酸アンモニウム（pH7.4）で前もって平衡化しておいたG-75 Sephadex（登録商標）カラム（70×2.5cm, Pharmacia Biotechnology Ltd., 英国ケンブリッジ）にかけた。タンパク質を同じ緩衝液（流速75mL/時）で分離し、280nmで吸光度を測定した。各画分から1mLを採取し、4つずつプール（合計体積4mL）して、凍結乾燥によって濃縮し、体積1mLの蒸留水に復元した。次に、試料を合成培地で1：4に希釈して、ドーパミン作動性バイオアッセイを行った。神経栄養活性を持つものを個別の画分としてさらにバイオアッセイした。
【００７９】
VMCL-1 CMの重要な特徴は、これが、培養中に存在するGABA作動性、セロトニン作動性および他のニューロン表現型と比較して、主にドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することである。この特異性はGDNFにも当てはまる。しかし、詳細な試験の結果、VMCL-1由来の化合物はGDNFではないことが証明された。
【００８０】
実施例６
ドーパミン作動性ニューロン生存促進活性を持つタンパク質の単離および精製
精製プロトコールを以下のように実行した。使用した塩はすべて最高純度のものとし、Sigma Chemical Co.から入手した。緩衝液はすべて新たに調製し、0.2μMフィルターを通して濾過した（Millipore製のGP Express真空駆動システム）。
【００８１】
第1ステップ：Heparin-Sepharoseカラムクロマトグラフィー（4℃）
3リットルのVMCL-1条件培地を、室温の等体積の20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）で希釈し、5K PREP/SCALE-TFF 2.5ft2カートリッジ（Millipore）で濾過して、体積550mLまで濃縮した。2×5mL HiTrap Heparinカラム（Pharmacia Biotech）を使って10mLのHeparin-Sepharoseカラムを組み立て、少なくとも100mLの10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）（緩衝液A）で前もって平衡化しておいたものに、濃縮物を負荷した。負荷が完了した後、カラムを100mLの緩衝液Aで洗浄した。合計10個の画分を緩衝液B（緩衝液A＋1M塩化ナトリウム）で約3mLずつ分取した。分析用に300μLの試料を採取した。
【００８２】
第2ステップ：Superose 12カラムクロマトグラフィー（4℃）
第1ステップで得たすべての画分をプールした後、Centricon Plus-20濃縮器（5,000MWCO, Millipore）を使って4.5mLまで濃縮した。Superose 12媒質（Prep Grade, Sigma Chemical Co.）を詰めた16×600mmのゲル濾過カラムを、少なくとも300mLのGF緩衝液（0.6M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2））で前もって平衡化しておいたものに、前記濃縮物を負荷した。各2mLの画分を分取し、活性について分析した。活性タンパク質は、84mlのGF緩衝液がカラムを通過した後の15mLに溶出し、タンパク質標品（Bio-Rad）で得たカラム較正データによれば、これは約20〜30kDa溶出領域に相当した。
【００８３】
第3ステップ：セラミックヒドロキシカラムクロマトグラフィー（室温；FPLCシステム）
20〜30kDa溶出領域に相当する第2ステップで得た活性画分をプールし、Centricon Plus-20濃縮器（5,000MWCO）を使って7.5mLに濃縮し、2Lの10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）（緩衝液A）に対して4℃で一晩透析し、緩衝液Aで平衡化した1mLのプレパックセラミックヒドロキシアパタイト（Type I、Bio-Rad）カラムに（Superloopを通して）負荷した。過剰の非結合タンパク質（通過画分）を緩衝液Aでカラムから洗い流した後、1.0M NaClを含む緩衝液Aの直接的勾配を0％から100％までかけた。各1mLの画分を分取し、活性について分析した。活性タンパク質は0.4M〜0.8MのNaCl濃度に相当する勾配領域内に幅広いピークとして溶出した。
【００８４】
第4ステップ：陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（室温：FPLCシステム）
幅広いピークに相当する画分をプール（合計体積＝15mL）し、Centricon Plus-20（5,000MWCO）を使って6mLまで濃縮し、2Lの20mM Tris HCl緩衝液（pH7.5）（緩衝液A）に対して4℃で一晩透析し、1mLの陰イオン交換FPLCカラム（Uno, Bio-Rad）に（Superloopを通して）負荷し、緩衝液Aで平衡化した。過剰の非結合タンパク質を緩衝液Aでカラムから洗い流した後、0−100％ 1M NaClの直線的勾配（緩衝液A中）をかけた。各1mLの画分を分取し、活性について分析した。活性タンパク質は通過画分（すなわち非結合タンパク質画分）に見いだされた。
【００８５】
第5ステップ：BioSil 125カラムクロマトグラフィー（室温：HPLCシステム）
第4ステップで得た活性タンパク質画分（合計体積7mL）を、Centricon Plus-20濃縮器（5,000MWCO）で体積がゼロ近く（約1μL）になるまで濃縮し、0.6mLの10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）に復元した。復元した物質（70μL、分析実験）を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）（GF緩衝液）で平衡化したBioSil 125 HPLCゲル濾過カラム（Bio-Rad）に負荷した。クロマトグラフィーはHP1100シリーズHPLCシステム（Hewlett-Packard）を使って行った。溶出液を120μLずつ分取し、活性およびタンパク質含量（SDS-PAGE）について分析した。活性は、カラムから溶出した主要280nm吸光度ピークに伴う画分中に見いだされた。SDS-PAGE分析によれば、これは45kDaタンパク質に相当した。それにもかかわらず、45kDaタンパク質ピークの副画分には活性が認められなかったことから、活性は、45kDaタンパク質と同時溶出するが、12％SDS-PAGE銀染色ゲルでは検出することができないはるかに低濃度の別のタンパク質の存在によるのかもしれないことが示された。そこで、第5ステップで得た残りの濃縮物を、Centricon-3濃縮器（Millipore）で、体積が80μLになるまでさらに濃縮し、60μLを上述の分析実験と同じ条件でカラムに負荷し、分離した。各120μLの溶出画分から8μLを採取し、SDS-PAGE（12％ゲル）と銀染色との組み合わせによって分析した。この分析により、活性画分には、さらに2つのタンパク質（約18kDaと約20kDaの分子量を持つ）が関係し、それらは主要45kDaタンパク質と同時溶出することがわかった。活性画分を1Lの酢酸アンモニウム緩衝液（pH8.0）に対して透析（4℃）し、それらを合わせて2つの活性プールP1およびP2とした。この際、P-1は20kDaタンパク質と45kDaタンパク質とを含み、P-2は18kDaタンパク質と45kDaタンパク質を含むようにした。各プールをSpeedVac真空濃縮器（Savant）で乾燥し、15μLの0.1M酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.9）に個別に復元した。各試料の一部を採取して、活性についてアッセイした。また、各1μLを12％SDS-PAGE分析にかけた後、銀染色を行った。
【００８６】
上述の分析の結果から、P-1は所望の生存促進活性を含み、P-2は所望の生存促進活性を含まないことが、明確に示された。次のステップとして、P-1とP-2の両方をSeppdVacで乾燥し、新たに調製した10μLのSDS-PAGE還元試料緩衝液（Bio-Rad）に（それぞれ）復元し、沸騰水浴で1分間インキュベートし、12％SDS-PAGEゲルに負荷した。電気泳動が完了した後、ゲルをメタノール/酢酸/水溶液（50：10：40）中、室温で40分間固定し、ナノピュア水で3回洗浄し、GelCodeブルー染色試薬（Pierce）を使って室温で一晩染色した。染色が完了した後、GelCode溶液をナノピュア水でゲルから洗い流し、45kDaタンパク質（P-1とP-2の両方）および20kDaタンパク質（P-1のみ）に相当する可視タンパク質バンドをかみそりの刃でゲルから切り出した。対応するバンドを含む各ゲル切片を、インゲル消化の時まで、1.5mLの微量遠心管に入れておいた。
【００８７】
実施例７
nESI-MS/MSによるインゲル消化断片の解析
コロイド状のクーマシーブルー染料を除去するために、タンパク質ゲルバンドを、30％アセトニトリル（水溶液）中、室温で、100mM重炭酸アンモニウムと共に、1時間インキュベートした。染料が完全に除去されるまで、脱色溶液を何回か交換した。次に、ゲル片を脱イオン水（約200μL）で覆い、10分間振とうした。ゲル片をアセトニトリル中で脱水し、過剰の液体を除去した後、遠心エバポレーターで完全に乾燥させた。ゲルバンドを再水和し、200ngの修飾トリプシン（Promega, ウィスコンシン州マディソン）を含む50mM重炭酸アンモニウム（pH8.3）20μLで再水和した。ゲル片を50mM重炭酸アンモニウム（pH8.3）（約50μL）で覆い、37℃で一晩インキュベートした。次に、消化溶液をきれいなエッペンドルフ管に移し、ゲル片を50〜100μLの5％酢酸（水溶液）中で30分間超音波処理した。抽出溶液を消化溶液と合わせ、遠心エバポレーターで蒸発乾固した。
【００８８】
インゲル消化抽出物をまず、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOFMS）により、Voyager Elite STR MALDI-TOFMS装置（Applied Biosystems Inc., マサチューセッツ州フレーミングハム）を使って分析した。抽出物を5μLの50％アセトニトリル、1％酢酸に溶解した。ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとして使用し、正イオンリフレクトロンモードでスペクトルを取得した。この分析には各試料のおよそ5分の1を使用した。これらのスペクトルから消化抽出物中のペプチドの質量が得られ、次に、それを使って社内非冗長タンパク質配列データベースを検索した。これはペプチドマスフィンガープリンティングと呼ばれる方法である。残りの試料はナノエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（nESI-MS/MS）によるペプチド配列決定分析に使用した。抽出物をまずC18 ZipTips（Millipore）で脱塩し、75％メタノール（水溶液）、0.1％酢酸（5μL）に再溶解した。試料のおよそ半分をナノエレクトロスプレーガラスキャピラリー（Micromass）に負荷した。nESI-MS/MS分析はQ-Star四重極飛行時間ハイブリッド質量分析（PE SCIEX, オンタリオ州コンコード）を使って行った。MS/MS分析はすべて正イオンモードで行った。衝突ガスは窒素とし、衝突エネルギーは40〜60eVとした。MS/MSスペクトルは通例、2分間にわたって毎秒取得した。そのMS/MSスペクトルを利用し、部分配列タグを使って社内非冗長タンパク質配列データベースを検索した（すなわち、データベースの検索にはペプチド質量および数個のフラグメントイオンだけを使った）。この手順でタンパク質が同定されない場合は、2つ以上のペプチドのアミノ酸配列をMS/MSスペクトルから可能な限り完全に決定した。これらの配列を使って、NCBIのタンパク質、ヌクレオチドおよびEST配列データベースでBLAST検索を行った。
【００８９】
実施例８
ARPの分泌型であるMANFの同定
ARPがVMCL-1 CMに観察された神経栄養活性の少なくとも一部を担う因子であるためには、タンパク質が細胞から放出されなければならない。しかし、ARPの予想アミノ末端は塩基性の電荷を持ち、これは細胞核への残留に有利と考えられる性質である。それでもなお本発明者らは、分泌型も存在するのだろうという仮説を立てた。
【００９０】
本発明者らの仮説の裏付けは、酵母シグナル配列トラップ技術を使ってcDNAライブラリーをスクリーニングしている時にキイロショウジョウバエ（Drosophilamelanogaster）にARP様タンパク質をコードするcDNAを同定したGooらの刊行物（Molecules and Cells 9:564-568, 1999）に見つかった。このcDNAがコードする推定ARP様タンパク質はアルギニンリッチなアミノ末端を欠いている。本発明者らは、SingalPプログラムを使って、ショウジョウバエARP様タンパク質のシグナルペプチド（残基1〜22）およびアラニン22とロイシン23の間のシグナルペプチダーゼ切断部位を同定した。これもショウジョウバエARP様タンパク質が分泌される証拠になる。
【００９１】
本発明者らは、ヒトARPとショウジョウバエARP様タンパク質との整列に基づいて、ヒトARPがシグナル配列およびシグナルペプチダーゼ切断部位を持つだろうと推測した。そこで本発明者らは、SignalPプログラムを使って、アルギニンリッチなアミノ末端（アミノ酸1〜55）を欠くヒトARPを解析した。このポリペプチドをプロMANFと呼ぶことにする。この例では、56位のメチオニンが開始コドンである。SignalPプログラムにより、配列番号2の残基1〜21からなるシグナルペプチドと、アラニン21とロイシン22の間の切断部位が予測された。これはショウジョウバエARP様タンパク質の解析結果と一致する。予想される切断されたヒトMANFタンパク質を図2および配列番号3に記載する。このMANFポリペプチドと他の代表的MANFポリペプチドを図2および3に示す。代表的MANFポリヌクレオチドを図4に示す。
【００９２】
本発明者らは、本発明者らが行ったショウジョウバエARP様タンパク質（GenBankアクセッション番号AF132912_1）とヒトARPの解析を根拠の一つとして、翻訳はヒトARPの1位のメチオニンからでも56位のメチオニンからでも始まることができると予測する。後者の場合、シグナルペプチド含有タンパク質（プロMANF）は、MANFの形で細胞から分泌されることが可能であり、細胞外で神経栄養因子として作用する。しかし、本発明者らがMANFの存在を発見したことにより、アルギニンリッチなアミノ末端領域を含むARPの細胞内での機能が排除されるわけではない。
【００９３】
実施例９
大腸菌で発現させたMANFの生物活性
ヒトMANF（配列番号3）をコードするポリヌクレオチドを含むpTriExを使って、大腸菌細菌細胞で組換えタンパク質発現を行った。350mLの細菌細胞培養物から合計4mgの精製組換えMANFを得た。これがMANFであることは質量分析シークエンシングによって確認した。このタンパク質をそのDAニューロン保護能力について調べた。図5に示すように、大腸菌で発現させたMANFはVMCL-1条件培地と同程度にDAニューロンを細胞死から保護する能力を持っていた。
【００９４】
実施例１０
HEK293細胞で発現させた真核MANFの用量反応
20％のドーパミン作動性ニューロンを含むドーパミン作動性細胞培養アッセイシステムを使って、ドーパミン作動性ニューロンの生存に対するヒトMANF（純度99％、HEK293細胞中で産生したもの）の用量相関を調べた。E14妊娠ラットをCO2ナルコーシスによって屠殺した。胴を70％EtOHに浸漬し、開腹術を行い、子宮嚢を摘出し、20mLの冷HBSS（pH7.4）を含む50mL管に移した。次に、15mLの冷HBSSを入れた10cmペトリ皿に各子宮嚢を移した。胎児を完全な形で摘出し、各脳を完全な形で単離して、15mLの冷HBSSを入れた新しい10cmペトリ皿に移した。中脳腹内側（VM）を中脳屈の蓋部分で解剖して、充填密度1.0×105細胞/mm3の1.0mm3組織片を得た。そのVM組織を10mLの冷PCM10が入っている15mL管に移した。プールしたVM組織をPCM10（2mMグルタミン、5mg/mLインスリン、5mg/mLトランスフェリン、5mg/mL亜セレン酸ナトリウムを含むDMEM/F12；20nMプロゲステロン、30nMチロキシン、および10％ウシ胎仔血清）で洗浄（3回）した後、無血清培地（PCM0；ウシ胎仔血清を含まない点以外はPCM10と同じ）で1回洗浄し、パパイン（10U/mL）を含む2.0mlのPCM0中、37℃で15分間消化した。次に、プロテアーゼ活性を失活させるために、組織をPCM10（5mL×3）ですすいだ。500μLにセットしたP-1000を使って、2.0mLのPCM0中で粉砕を行った。終点は組織塊の痕跡がない乳状懸濁液である。分散した細胞を遠心分離（1,000rpm、2分、4℃）し、計数した後、PCM10に6.25×105細胞/mLの密度で再懸濁した。この段階で細胞生存率を試験したところ、通常は＞95％だった。
【００９５】
これらの細胞を、25μLのマイクロアイランド（MI）小滴（1.56×104細胞/MI）として、ポリ-D-リジンをコートした8穴チャンバースライドにプレーティングした。25μLのMI小滴は12.5mm2の面積を占める。したがってMIの平準最終平均細胞密度は1.25×105細胞/cm2である。MIの中心部での平均細胞密度は約2.0×105/cm2であり、MIの周縁部では＜1.0×104まで減少する。MIを、湿度100％の5％CO2中、37℃で45分間インキュベートして、細胞をコート表面に付着させた。付着後に、375μLのPCM10を各ウェルに加え、細胞を4時間、血清でプライミングした。プライミングの終了時にPCM10を100％吸引して、無血清PCM0に置き換えた。
【００９６】
MANFは以下のように製造した。ヒトプロMANF（配列番号2）をpTriEx発現ベクターにクローニングした。組換えタンパク質発現はHEK293細胞で行った。シグナル配列を欠く精製組換えMANF 20μgを、800mLのHEK293細胞条件培地から得た。これがMANFであることは質量分析シークエンシング解析によって確認した。
【００９７】
第1、第3および第5日に、表示した量のMANFで培養物を処理した。Vector ABC法または間接免疫蛍光法を使って、培養物をDIV6またはDIV7に固定し、染色した。
【００９８】
DIV3には早くも、試験したさまざまな濃度のMANFの間に有意な相違があった（ANOVA, P＜0.001）（図6）。Tukeyの分析方法を用いた一対比較は、250および500pg/mlならびに1.0および10ng/nLのMANFが対照とは有意に異なることを示した（P＜0.05）。
【００９９】
実施例１１
BDNF、GDNFおよびMANF間の効力の順序
図7に示すように、BDNF、GDNFおよびMANFを3つの等価な用量で試験したところ、効力の順序はMANF＞GDNF＞BDNFだった。これは、低濃度側の2つのMANF濃度が、低用量のBDNFまたはGDNFよりも、DAニューロンに対して選択的であることを示している。最も高い用量では、効力の順序はGDNF＞MANF＞BDNFだった。概してBDNFは、DAニューロンを最も強力に、しかし最も低い特異性で保護する傾向を示した。低濃度では、MANFはDAニューロンを最も選択的に保護する傾向を示した。
【０１００】
実施例１２
活性であると予想されるMANFのドメイン
本発明者らはMANF生物活性を持つ（すなわちDAニューロンを細胞死から保護する）と予想されるペプチドをMANFから3つ同定した。これらのヒトペプチドは、LRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREA（配列番号11）、RGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKIC EKLKKKDSQICEL（配列番号12）、およびKYDKQIDLS TVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKY（配列番号13）である。これに相当するペプチドは標準的な配列整列プログラムを使って容易に同定することができる。マウス、ウシおよびブタのMANF配列を本明細書に記載する。これらのペプチドは、本明細書に記載する治療方法のいずれにも利用することができ、明らかに「MANFポリペプチド」であるとみなされる。
【０１０１】
実施例１３
MANFに対する応答性の選択性
他の脳領域に由来するニューロンを保護するMANFの能力を調べた。ラット小脳顆粒ニューロン、神経節感覚ニューロン、または交感神経ノルアドレナリン作動性ニューロンの保護は観察されなかった。同様に、MANFがDAニューロンに対して明白な保護を示す腹側中脳培養物でも、GABA作動性ニューロンおよびセロトニン作動性ニューロンに対する活性はないようだった。上述の結果とは対照的に、MANFは培養後根神経節細胞のサブセットに対して保護的だった。後根神経節は少なくとも3つのニューロン亜集団からなっている。NGF、BDNFおよびNT-3は、いずれもニューロトロフィン神経栄養因子ファミリーのメンバーであり、それぞれこれらのニューロンの異なるサブセットに作用する。したがって、後根神経節ニューロンのこのサブセットに対するMANFの作用は、神経栄養因子の一般的な神経保護特性と一致している。
【０１０２】
実施例１４
MANFポリクローナル抗体の製造
ポリクローナル抗体を以下のように製造した。Hisタグ付きの完全長MANFを大腸菌に産生させた。ウサギ1羽につき1回あたり200μgの精製MANFタンパク質を6回抗原注射した（1、21、35、49、63および70日目にそれぞれ1回）。84日目に血清を集めた（血清100mL/1羽）。
【０１０３】
ウェスタンブロット解析を使ってMANF-pAbの活性を調べた。MANF-pAb活性の一次試験には比較的多量のMANF（720ng）を使用したところ、1：12,800の希釈率でも活性を保っていた（図8、レーン9）。次の試験では、MANFの希釈率を5,000に固定し、MANFの量を1,000から15.6ngまで変化させた。最低量のMANF（15.6ng）が容易に検出された（図9、レーン9）。BDNFおよびGDNFとの交差反応性に関する試験では、MANFの量（32ng）の3倍でも、MANF-pAbはBDNFおよびGDNFのどちらとも交差反応しないことが、試験結果によって示された（図10A〜10C）。
【０１０４】
上述の結果は以下の方法を使って得られた。
【０１０５】
中脳培養
初代中脳細胞培養は、定時妊娠（timed-pregnant）Sprague-Dawleyラット（Taconic Farms；ニューヨーク州ジャーマンタウン）から、先に記述されているように調製した（Shimodaら, Brain Res. 586: 319-323, 1992；Takeshimaら, J. Neurosci. 14:4769-4779, 1994；Takeshimaら, Neuroscience. 60: 809-823, 1994；Takeshimaら, J. Neurosci. Meth. 67:27-41, 1996）。解剖した組織を集め、実験の目的に応じて、酸素化した冷たい（4℃）HBSSまたは10％ウシ胎仔血清（Biofluids Laboratories, メリーランド州ロックビル）を含む培地にプールした。妊娠14日目（すなわちE14）に、妊娠ラットをCO2へのばく露によって屠殺し、腹部を70％EtOHで洗浄し、開腹術を行い、胎仔を集め、Ca2+もMg2+も含まない冷ダルベッコリン酸緩衝食塩水（DPBS）（pH7.4）にプールした。次に、完全な形の脳を摘出し、間脳と中脳の間で切断し、中脳蓋の内側に切り込みを入れて、外側に広げた。中脳ドーパミン作動性領域を含む腹内側の1.0mm3組織塊を単離した。切り出した組織塊を冷たい（4℃）酸素化培地にプールした。その組織を前もって消化せずに粉砕した。あるいは、10U/mLのパパイン（Sigma Chemical Co.）を含むL-15成長培地で細胞を37℃で15分間インキュベートし、培地で洗浄し（2mL×3）、針と注射器だけを使って粉砕した。分散した細胞を1.5mLエッペンドルフ管（1.0mL/管）に移し、約600gで2分間遠心分離した。これより速い速度で長時間遠心分離を行うと、培養物が砕片で汚染され、その結果、細胞の成長が最適でなくなる。培地を注意深く吸引し、細胞を新しい培地に再懸濁し、血球計数器で計数した。開腹術からプレーティングまでのすべての操作を2時間以内に完了した。ある典型的な実験では、胎仔10〜15匹の同腹仔から1.0×105細胞/胎仔または1.0×106〜1.5×106細胞/同腹仔を得た。
【０１０６】
中脳マイクロアイランド培養
中脳マイクロアイランド培養物を作製するために、細胞を上述のように調製し、5.0×105/mLの最終密度で再懸濁した。その懸濁液の小滴25μL（1.25×104細胞）を、ポリ-D-リジン（50μg/mL）をコートした8穴チャンバースライド上に、100μLピペットを使ってプレーティングした。小滴の面積は約12.5mm2で、最終平均細胞密度は1.0×105/cm2だった。小滴を均一に分散させ、尾を引かないようにピペットチップを垂直に引き抜いた。マイクロアイランド培養が占める面積は培養中一定のままだった。培養物を湿度100％の5％CO2中、37℃で30分間インキュベートして細胞を接着させた後、375μLの成長培地を各ウェルに加えた。最初の12時間後に培地を交換し、その後は1日おきに培地の約半分を交換した。
【０１０７】
細胞生存性アッセイ
二色蛍光細胞生存性アッセイキット（Live/Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kits, 型番L-3224, Molecular Probes, Inc., オレゴン州ユージーン）を利用して、プレーティング前および培養中の生細胞と死細胞を同定した。生細胞と死細胞はそれぞれ緑色および赤色の蛍光を発して、生存性の指標を2つ与える。エチジウムホモ二量体およびカルセイン-AMをDPBSで希釈して、最終濃度をそれぞれ3.8μMおよび2.0μMにした。細胞生存性の評価をプレーティング前に行った。細胞浮遊液をガラススライド上で同体積の染料（通例20μL）と共に、暗湿潤箱中、室温で15分間インキュベートし、カバーガラスをした後、FITC用光学部品を使って蛍光顕微鏡で調べた。プレーティング直前の細胞生存率は約95％だった。
【０１０８】
培養培地
使用した無血清培地は同体積のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）とハムF-12（Gibco, ニューヨーク州グランドアイランド；320-1320J）、1.0mg/mLウシアルブミンフラクションV（Sigma Chemical Co.；A-4161）、0.1μg/mLアポトランスフェリン（Sigma；T-7786）、5μg/mLインスリン（Sigma；I-1882）、30nM L-チロキシン（Sigma；T-0397）、20nMプロゲステロン（Sigma；P-6149）、30nM亜セレン酸ナトリウム（Sigma；S-5261）、4.5mMグルタミン（Gibco, 320-5039AF）、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（Gibco；P-100-1-91）からなった。
【０１０９】
VMCL-1細胞株からの条件培地の製造
VMCL-1細胞株から条件培地を製造するために、15cm非コート培養皿で、1.0％のFBSを含む20mLの成長培地に、2.0×106個の細胞をプレーティングした。80％コンフルエントになった時点で、培地を吸引し、細胞を無血清培地で1回洗浄した。アルブミンを含まない無血清N2培地20mLを加え、条件づけを48時間続けた。通常、この期間中に細胞は100％コンフルエントまで増殖した。培地を吸引し、50mL管にプールし、遠心分離（15,000rpmで20分間）した後、1.0Lプラスチックビンにプールした。通常は、CMの各バッチのうち5mLを0.22μmフィルターで滅菌濾過し、5mLずつ−70℃で保存し、それを使って神経栄養効力を決定した後、多量のCM貯蔵分と一緒にプールした。所望により、当業者に知られている標準的な工業的細胞培養技術を使って、VMCL-1 CMを大量に製造することができる。
【０１１０】
1型星状膠細胞の条件培地の製造
1型星状膠細胞は以下のように調製した。E16ラット胎仔脳幹を冷DPBS中で解剖し、中脳領域を星状膠細胞培養培地（DMEM/ハムF-12（1：1）、15％FBS、4.0mMグルタミン、30nM亜セレン酸ナトリウム、ペニシリン、およびストレプトマイシン）に移した。注射器に装着した18ゲージ針を使って2mLの新しい培地中で細胞を粉砕することにより、細胞を分散させた。細胞を遠心分離器に入れて2,000rpmで5分間遠心分離し、培地に再懸濁し、再び粉砕した。最後に得た細胞ペレットを、1×106細胞/75cm2フラスコの密度で、15mLの培地に分散させ、プレーティングした。細胞を5％二酸化炭素および95％空気の雰囲気下に37℃で24時間インキュベートし、付着していない細胞を吸引によって除去した。細胞をさらに9日間培養した後、混入した細胞タイプをすべて除去するために、フラスコを16時間激しく振とうした。星状膠細胞単層をDPBSで3回洗浄し、トリプシン処理し、再びプレーティング（1×106細胞/フラスコ）した。この時点で、細胞のごく一部を8穴チャンバースライド（Nunc Inc., イリノイ州ネーパービル）にプレーティングし、これらの姉妹培養物をフラスコ培養物について説明するように処理した。コンフルエントに達したら、培地を、7.5％FBSを含む培地で置き換え、細胞を48時間インキュベートした。次の交換時には、合成無血清培地（DMEM/ハムF-12（1：1）、4.0mMグルタミン、30nM亜セレン酸ナトリウム、100U/mlペニシリンおよび100U/mLストレプトマイシン）を加え、細胞をさらに48時間にインキュベートした。培地を置換し、5日後に、条件培地を収集し、タンパク質分解を阻害するためにロイペプチン（10mM：Bachem, カリフォルニア州トランス）およびフッ化4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニル塩酸塩（1.0mM：ICN Biochemicals, オハイオ州オローラ）と混合した。収集時に、培養物の表現型を評価するために、チャンバースライド上で培養した星状膠細胞単層を免疫染色した。
【０１１１】
VMCL-1細胞の培養
VMCL-1を培養し、VMCL-1 CMを調製するために、15cm非コート培養皿で、まずは10％FBSを含む20mLの成長培地に、2.0×106個の細胞をプレーティングした。80％コンフルエントになった時点で、培地を吸引し、細胞を無血清培地で1回洗浄した。通常は、アルブミンを含まない20mLの無血清培地を加え、条件付けを48時間続けた。条件培地を収集する用途には、N2培地は特に適していることが判明した。通常、この48時間中に、細胞は100％コンフルエントまで増殖した。培地を吸引し、50mL管にプールし、遠心分離（15,000rpmで20分間）した後、1.0Lプラスチックビンにプールした。CMの各バッチのうち5mLを0.22μmフィルターで滅菌濾過し、0.5mLずつ−70℃で保存し、それを使って神経栄養効力を決定した後、多量のCM貯蔵分と一緒にプールした。VMCL-1細胞株は現在までに50回を超えて継代されている。
【０１１２】
免疫組織化学
MAP2およびTH免疫細胞化学分析のために、培養物を冷DPBSで洗浄し（250μL×2）、PBS中の4％ホルムアルデヒドで10分間固定し、1％CH3COOH/95％EtOHを使って−20℃で5分間透過処理した後、PBSで洗浄した（250μL×3）。非特異的結合をPBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA-PBS）で15分間ブロックした。抗TH抗体（50μL）（Boehringer-Mannheim, インディアナ州インディアナポリス）または抗MAP2抗体（Boehringer-Mannheim）を各ウェルに適用し、スライドを暗湿潤箱に入れて室温で2時間インキュベートした。対照染色は抗TH抗体と同じ希釈率のマウス血清を使って行った。PBSで洗浄（250μL×2）した後、抗マウスIg-FITC（50μL）を適用し、スライドをさらに1時間インキュベートした。PBS（250μL×2）で洗浄した後、過剰の液体を吸引し、チャンバーの壁を取り外し、VectaShieldマウント剤（Vector Laboratories, カリフォルニア州バーリンゲーム）を1滴適用した後、カバーガラスをのせ、それをマニキュア液で封入した。一部の実験では、THの同定にビオチン化二次抗体を使用し、ビオチン化ペルオキシダーゼアビジン複合体を使って、ニッケル増強ジアミノベンジジン（DAB）反応生成物を発色させた（ABCキット；Vector Laboratories）。
【０１１３】
グリア線維酸性タンパク質（GFAP, Boehringer-Mannheim, #814369）の場合は、固定および透過処理を、5％CH3COOH/95％C2H5OHを使って−20℃にて1段階で行った。それ以降の手順はTHの可視化に使用した手順と同じとした。A2B5およびO4の場合は、培養物を冷DPBS（250μL×2）で洗浄し、1％BSA-PBSで10分間ブロックした。A2B5抗体（50μL）を各ウェルに適用し、1時間インキュベートした。DPBS（250μ×2）で洗浄した後、二次抗体として抗IgM-FITCを30分間適用した。次に、細胞をDPBS（250μL×2）で洗浄した。細胞核を対比染色するために、細胞を10mM重炭酸ナトリウム中0.5μg/mLの核酸染料H33258（Hoechst, ミズーリ州カンザスシティ）と共に、室温で15分間インキュベートした後、PBSで10分間の洗浄を2回行った。最後に冷DPBS（250μL×2）で洗浄した後、細胞を上述のようにマウントした。
【０１１４】
RT-PCR解析
ラットE13またはE14中脳腹側組織、または1×109個の星状膠細胞、または1×109個のVMCL-1細胞から、RNA-STAT試薬（TelTest, メリーランド大学, メリーランド州バルチモア）を使って、全RNAを抽出した。第1鎖cDNAをRNAから作製し、ポリメラーゼ連鎖反応により、製造者の方法を使って増幅した。
【０１１５】
反応生成物を2％アガロースゲル電気泳動によって分割して、サイズおよび断片の相対的存在量を決定した。cDNAの負荷量が等しいことを確認するために、β-アクチンおよびGAPDHに関するPCR結果を対照として含めた。
【０１１６】
染色体解析
2.5％FBS、D-グルコース（2.5g/L）および1：100に希釈したITSサプリメントを含むDMEM/F-12 1：1培地で、細胞を生育させた。24時間後に、分裂中期の継代培養物をコルヒチン（10μg/mL）で停止させた。細胞をトリプシン処理し、低浸透圧ショック（75mM KCl）にかけた。次に、MeOH/CH3COOH（3：1）を3回交換して細胞を固定し、風乾した。次に4％ギムザ液を使って細胞を染色し、顕微鏡で調べた。
【０１１７】
寄託物
本出願人は、細胞株VMCL-1を封入した少なくとも25本のバイアルを、米国20110バージニア州マナッサスのAmerican Type Culure Collectionに寄託した（ATCC受託番号PTA-2479）。これらの細胞は2000年9月18日にATCCに寄託された。このVMCL-1の寄託物は、30年間、または最新の請求の後5年間、または本特許の有効期間のうちいずれか最長の期間、公的寄託機関であるATCC寄託機関で保管され、この期間中に生存可能でなくなった場合には再寄託されるだろう。また、本出願人は、試料の生存に関する表示の提出を含めて、37C.F.R§§1.801-1.809の要件をすべて満たしている。本出願人は、ATCCからの寄託物の入手可能性に対して制限を設けていない。ただし、生物材料の移送またはその商業的運搬に対して法が課す制限を撤回する権限は、本出願人にはない。本出願人は、本特許に基づいて付与される権利のいかなる侵害も放置しない。
【０１１８】
他の態様
上記明細書に挙げた刊行物および特許はすべて参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載した本発明の方法およびシステムのさまざまな変更態様は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかだろう。具体的な好ましい態様に関して本発明を説明したが、本発明はそのような具体的態様に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者にとって自明な上記本発明実施形態のさまざまな変更態様は、本発明の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】VMCL-1細胞培養物から得られるさまざまな量の条件培地がチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞（上図）およびMAP2陽性細胞（下図）の生存に及ぼす効果を示す図。
【０１２０】
【図２】ヒトARP（配列番号1）、ヒトプロMANF（配列番号2）、ヒトMANF（配列番号3）およびシグナル配列を欠く合成ヒトMANF（配列番号4）を示す図。
【０１２１】
【図３】マウスプロMANF（配列番号5）、マウスMANF（配列番号6）、およびシグナル配列を欠く合成マウスMANF（配列番号7）を示す図。
【０１２２】
【図４】ヒトARP（配列番号8）、ヒトプロMANF（配列番号9）およびヒトMANF（配列番号10）をコードするポリヌクレオチドの配列を示す図。
【０１２３】
【図５】チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞（上図）およびMAP2陽性細胞（下図）の生存に対する、大腸菌中で発現させたMANFの生物活性を示す図。各レーンは以下の通りである：A1−PCM0対照；A2−VMCL-1 CM（25％）；B1−MANF（10pg/mL）；B2−MANF（50pg/mL）；B3−MANF（100pg/mL）；B4−MANF（250pg/mL）；B5−MANF（500pg/mL）；B6−MANF（1ng/mL）；B7−MANF（5ng/mL）；B8−MANF（10ng/mL）；B9−MANF（50ng/mL）；B10−MANF（100ng/mL）。
【０１２４】
【図６】HEK293細胞から発現、分泌させたMANFに関する用量反応曲線を示す図。各レーンは以下の通りである：A−対照；B1−PCM0対照；B2−緩衝液対照；C1−MANF（100pg/mL）；C2−MANF（250pg/mL）；C3−MANF（500pg/mL）；C4−MANF（1ng/mL）；C5−MANF（10ng/mL）；C6−MANF（25ng/mL）；C7−MANF（50pg/mL）。DIV1でデータを収集したAを除いて、データはすべてDIV3で収集した。
【０１２５】
【図７】BDNF、GDNFおよびMANFの効力の順序を示す図。
【０１２６】
【図８】MANF（720ng）のウェスタンブロットにおけるMANFポリクローナル抗体活性を示す図。
【０１２７】
【図９】MANFのウェスタンブロットにおけるMANFポリクローナル抗体検出の感度を示す図。わずか15.6ngのMANFでも検出可能だった。
【０１２８】
【図１０】MANFポリクローナル抗体がBDNFまたはGDNFと交差反応しなかったことを示す一連の図。（A）ウェスタンブロット、（B）銀染色、（C）クーマシーブルー染色。
【０１２９】
【図１１】ウシ（図11A）およびブタ（図11B）プロMANFの配列を示す図。シグナルペプチドを太字で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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