(57)【要約】胚性細胞集団の分化の経路をマッピングする方法であって、細胞を外因子に曝露すること及び特定の細胞タイプ又は細胞系譜に特徴的な遺伝子発現産物を測定することを含む方法について記載する。ヒト胚性細胞の分化を方向付けることは、解離胚様体を１種又は複数の外因子に曝露し特定の細胞について培養液を富化することに基づく。分化細胞は、ヒトにおける病状を治療するために使用することができる。分化経路を決定し外因子の分化におけるそれらの有用性をスクリーニングするためのキットを提供する。
2004504834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性細胞集団の分化の経路をマッピングする方法であって、
（ｉ）（ａ）一組の遺伝子発現産物（ここで、その一組の中の各遺伝子発現産物は、分化を受けた細胞タイプの特性を示し、複数個の分化細胞タイプがその組の中に示されている）及び（ｂ）外因子のライブラリーからの外因子を選択すること、
（ｉｉ）細胞集団に外因子を働かせること、
（ｉｉｉ）その一組の中の遺伝子発現産物を決定することにより、未分化細胞の分化経路に対する外因子の効果を特徴付けること、及び
（ｉｖ）分化の経路をマッピングすることを含む方法。
【請求項２】
前記一組の遺伝子発現産物が、中胚葉、外胚葉及び内肺葉から選択される組織で発現する少なくとも１種類の遺伝子発現産物を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
前記一組の遺伝子発現産物が、外胚葉で発現する少なくとも１種類の遺伝子発現産物、中胚葉で発現する少なくとも１種類の遺伝子発現産物、及び内肺葉で発現する少なくとも１種類の遺伝子発現産物を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
外胚葉で発現する少なくとも１種類の遺伝子発現産物に、ＮＦ−Ｈ、ケラチン及び副腎ＤβＨからなる群のいずれかが含まれる、請求の範囲第２項又は３項に記載の方法。
【請求項５】
中胚葉で発現する少なくとも１種類の遺伝子発現産物に、エノラーゼ、レニン、ＣＭＰ、カリクレイン、ＷＴ１、ｃＡＣＴ、δ−グロブリン及びβ−グロブリンからなる群のいずれかが含まれる、請求の範囲第２項又は３項に記載の方法。
【請求項６】
内胚葉で発現する少なくとも１種類の遺伝子発現産物に、アルブミン、α１ＡＴ、アミラーゼ、ＰＤＸ−１、インスリン及びαＦＰからなる群のいずれかが含まれる、請求の範囲第２項又は３項に記載の方法。
【請求項７】
外因子が、インターロイキン、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ１、アクチビン−Ａ、ＢＭＰ−４、ＨＧＦ、ＥＧＦ、βＮＧＦ及びレチノイン酸からなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】
ヒト胚性細胞の分化を特定の細胞タイプに方向づける方法であって、
ａ．胚性幹細胞集団が胚様体を形成することを可能にすること、
ｂ．胚様体を解離させ、少なくとも１種類の外因子の存在下で有効な期間、胚性細胞を分化させること、及び
ｃ．ヒト胚性細胞の定方向分化を引き起こし特定の細胞タイプを形成することを含む方法。
【請求項９】
胚様体が浮遊培養中で形成する、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
胚様体が単層培養物である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１１】
外因子が成長因子である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１２】
外因子がインターロイキンである、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１３】
外因子が神経成長因子である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１４】
外因子がレチノイン酸である、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１５】
分化細胞がニューロン細胞タイプである、請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１６】
分化細胞がニューロン突起を有する、請求の範囲第１５項に記載の方法。
【請求項１７】
胚性細胞がヒト胚性細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞の変性又は細胞の機能不全に伴う状態に罹った対象を治療する方法であって、
ａ．解離胚性細胞を入手すること、
ｂ．細胞を外因子で処理すること、
ｃ．細胞を分化させること、及び
ｄ．有効量の分化細胞を対象中に移植してその状態を治療することを含む方法。
【請求項１９】
前記状態が、心筋の変性している心臓状態である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞を、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＲＡ、ＨＧＦ及びＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１種類の外因子で処理する、請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２１】
前記状態が、腎臓組織の変性している腎臓状態である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞をＮＧＦで処理する、請求の範囲第２１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記状態が、皮膚組織の変性している皮膚状態である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞をＢＭＰ−４で処理する、請求の範囲第２３項に記載の方法。
【請求項２５】
前記状態が、肝臓組織の変性している肝臓状態である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞をＮＧＦで処理する、請求の範囲第２５項に記載の方法。
【請求項２７】
前記状態が、脳組織の変性している脳状態である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞をＮＧＦ又はＲＡの少なくとも１種類で処理する、請求の範囲第２７項に記載の方法。
【請求項２９】
前記状態が、ニューロンの変性している脊髄損傷である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞をＮＧＦ又はＲＡの少なくとも１種類で処理する、請求の範囲第２９項に記載の方法。
【請求項３１】
前記状態が貧血又は免疫不全症である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞をＮＧＦ又はインターロイキンの少なくとも１種類で処理する、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項３３】
前記状態が、副腎組織の変性している副腎状態である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞をＲＡで処理する、請求の範囲第３３項に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象がヒト対象である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が哺乳動物である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項３７】
選択された細胞タイプが、脳細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、ミュラー管細胞、心細胞、血液細胞、皮膚細胞及び副腎細胞のいずれであってもよい、請求の範囲第１８項に記載の方法。
【請求項３８】
分化経路を決定するためのキットであって、
（ａ）アッセイフォーマット内にパネルを形成する複数組の細胞特異的マーカーを含み、アッセイフォーマットには細胞特異的マーカーを検出するための試薬が含まれ、細胞特異的マーカーには、胚の外胚葉、中胚葉及び内胚葉の各特性を示す第一組のマーカー、及び体内組織の特性を示す第二組のマーカーが含まれ、第二組には２種類以上のマーカーが含まれ、さらに
（ｂ）細胞特異的マーカーに結合した試薬を検出するための手段を含むキット。
【請求項３９】
試薬がＤＮＡプライマー及び抗体から選択される、請求の範囲第３８項に記載のキット。
【請求項４０】
細胞特異的マーカーに結合した試薬を検出する手段が、ゲルをベースとする系、免疫検出アッセイ及び固体化学アッセイから選択される、請求の範囲第３８項に記載のキット。
【請求項４１】
外因子をスクリーニングし、その外因子がヒト胚性細胞集団内で定方向分化を引き起こすことができるか否かを判定するための方法であって、
（ａ）ヒト胚性細胞集団を外生成長因子に曝すこと、
（ｂ）受容体の発現を測定すること（その受容体は、特定の分化細胞集団の特徴を示すタイプである）、及び
（ｃ）外因子が、特定の細胞集団の分化を促進するか、正常レベルで分化を維持するか、又は分化を低下させるか否かを決定することを含む方法。
【請求項４２】
細胞タイプの分化を決定するマーカーのパネルであって、複数個の外胚葉特異的タンパク質、複数個の中胚葉特異的タンパク質及び複数個の内胚葉特異的タンパク質の遺伝子発現を特異的に検出するための一組の試薬を含むパネル。
【請求項４３】
外胚葉特異的タンパク質が、ニューロフィラメントタンパク質、ケラチン及び副腎ドーパミンβヒドロキシラーゼからなる群から選択されるタンパク質をさらに含む、請求の範囲第４０項に記載のパネル。
【請求項４４】
中胚葉特異的タンパク質が、エノラーゼ、ＣＭＰ、レニン、カリクレイン、ＷＴＩ、ｃＡＣＴ、βグロビン、δグロビン及びｃアクチンからなる群から選択されるタンパク質をさらに含む、請求の範囲第４０項に記載のパネル。
【請求項４５】
内胚葉特異的タンパク質が、アミラーゼ、α−ＦＰ、ＰＤＸ−１及びインスリンからなる群から選択されるタンパク質をさらに含む、請求の範囲第４０項に記載のパネル。
【請求項４６】
試薬がＤＮＡプライマーである、請求の範囲第４０項に記載のパネル。
【請求項４７】
試薬が抗体である、請求の範囲第４０項に記載のパネル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、胚性幹細胞の定方向分化のための方法及びキットならびにｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるそれらの使用法に関する。
【０００２】
（背景技術）
従来技術の中では、胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞期胚の内部細胞塊に由来し、正常核型を維持しながら培養液中で無制限に増殖することができる未分化多分化能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞として説明されている。胚盤胞由来の幹細胞は、重篤な複合免疫不全マウスの筋肉又は精巣中に注入されると奇形腫を形成する。マウス胚性幹細胞は、様々な細胞タイプへ自然に分化することができる凝集塊又は胚様体をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて形成することが報告されている。胚盤胞由来の幹細胞とは対照的に、胚様体由来の細胞はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて移植されても奇形腫を形成しないようである。（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、（１９８７）ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ｐｐ．７１−１１２；Ｔｈｏｍｓｏｎ他（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ２８２、ｐｐ．１１４５−１１４７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ他（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ１８、ｐｐ．３９９−４０４）。
【０００３】
ヒト胚性幹細胞は、体外受精によって生じるヒト胚から回収されてきたが、ヒト以外の霊長類及びヒトからの胚様体の形成には問題が多かった。マウスとは対照的に、霊長類、より具体的には普通のマーモセット（Ｔｈｏｍｓｏｎ、（１９９６）Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．５５、ｐｐ．２５４−２５９、ＵＳＰ５，８４３，７８０）及びアカゲザル（Ｔｈｏｍｓｏｎ、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９２、ｐｐ．７８４４−７８４８）からの肺様体の形成は、一貫性がなく非同時性であることが分かった。さらに、アカゲザル胚性幹細胞の分化は無秩序であり、胞構造は形成しなかった。さらに、ヒト胚性幹細胞は、自発的かつ無統制に分化するため、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてどのような細胞タイプが形成するのかを実験者が判断できないことが分かった（Ｔｈｏｍｓｏｎ、他、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２８２、ｐｐ．１１４５−１１４７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ、他、（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｖｏｌ．１９、ｐｐ．３９９−４０４；Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ、他、（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、Ｖｏｌ．６、ｐｐ．８８−９５）。
【０００４】
望ましい系統の前駆体及び分化細胞の均一な集団を提供するために、ヒト胚性幹細胞の分化を操作するための技法を開発することは、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける医学的使用法及びｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるアッセイにとって望ましい。
【０００５】
マウスを研究することから哺乳動物における発生について多くの有用な教訓を学ぶことができるが、発生のすべてが動物すべてにおいて同一というわけではない。従って、様々な哺乳動物における経路を分析及び比較するための手段を手に入れ、それらの手段を、ヒトを含む哺乳動物からの胚性幹細胞の単離、保存及び培養を可能にし、細胞の変性に伴う疾患状態を直す方法と組み合わせることが望ましい。
【０００６】
特に、ヒト胚性幹細胞は、多くのヒト病変における移植のための細胞供給源として、及び生医学工学における部品ならびにヒト発達の初期に関する手掛かりを提供する際の部品としてとりわけ有用と思われる。
【０００７】
（発明の概要）
本発明の第一の実施形態では、胚性細胞集団の分化の経路をマッピングする方法であって、（ｉ）（ａ）一組の遺伝子発現産物（ここで、その組の中の各遺伝子発現産物は、分化を受けた細胞タイプの特性を示し、複数個の分化細胞タイプがその組の中に示されている）及び（ｂ）外因子のライブラリーからの外因子を選択すること、（ｉｉ）細胞集団に外因子を働かせること、（ｉｉｉ）組の中の遺伝子発現産物を決定することにより、未分化細胞の分化経路に対する外因子の効果を特徴付けること、及び（ｉｖ）分化の経路をマッピングすることを含む方法を提供する。
【０００８】
上記によれば、遺伝子発現産物には、中胚葉、外胚葉及び／又は内胚葉で発現する少なくとも１種類の遺伝子発現産物が含まれ、外胚葉で発現する発現産物は、例えばニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）、ケラチン又は副腎ドーパミンβヒドロキシラーゼ（ＤβＨ）、であり、中胚葉で発現する発現産物には、エノラーゼ、レニン、軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）、カリクレイン（ｋａｌｉｋｒｅｉｎ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴＩ）、心筋アクチン（ｃＡＣＴ）、δ−グロブリン又はβ−グロブリンのいずれかが含まれ、内胚葉で発現する発現産物には、アルブミン、α１−アンチトリプシン（α１ＡＴ）、アミラーゼ、膵及び十二指腸ホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ−１）、インスリン及びα−フェトプロテイン（αＦＰ）が含まれる。
【０００９】
上記によれば、外因子の例には、インターロイキン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦβ１）、アクチビン−Ａ、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、β神経成長因子（ＮＧＦ）及びレチノイン酸（ＲＡ）が含まれる。
【００１０】
本発明の別の実施形態では、ヒト胚性細胞の分化を特定の細胞タイプに方向づける方法であって、（ａ）胚性幹細胞の集団が胚様体を形成することを可能にするステップと、（ｂ）胚様体を解離させ、少なくとも１種類の外因子の存在下で効果のある時間、胚性細胞を分化させるステップと、（ｃ）ヒト胚性細胞の定方向分化を引き起こし特定の細胞タイプを形成するステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
上記方法によれば、胚様体は浮遊培養液中に形成することができる。胚性細胞は、基体上に単層を形成することがある。外因子は、成長因子、例えばインターロイキン、神経成長因子、又はレチノイン酸でよい。分化細胞は、ニューロン細胞タイプであり、さらにニューロン突起を有することがある。本実施形態のすべてで胚性細胞はヒトであってもよい。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、細胞の変性又は細胞の機能不全に伴う状態に苦しむ対象を治療する方法であって、（ａ）解離胚性細胞を入手すること、（ｂ）細胞を外因子で処理すること、（ｃ）細胞を分化させること、及び（ｄ）有効量の分化細胞を対象中に移植して状態を治療することを含む方法を提供する。
【００１３】
上記によれば、状態は、心筋が変性している心臓状態であってもよい。細胞は、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＲＡ、ＨＧＦ及びＥＧＦからなる群から選択される外因子で処理し、有効量の分化細胞は心臓を目標とすることができる。状態は、腎臓組織が変性している腎臓状態であってもよく、細胞は、ＮＧＦで処理し、有効量の分化細胞は腎臓を目標とすることができる。状態は、皮膚組織が変性している皮膚状態であってもよく、細胞は、ＢＭＰ−４で処理し、有効量の分化細胞は皮膚を目標とすることができる。状態は、肝臓が変性している肝臓状態であってもよく、細胞は、ＮＧＦで処理し、有効量の分化細胞は肝臓を目標とすることができる。状態は、脳組織が変性している脳状態であってもよく、細胞は、ＮＧＦ又はＲＡの少なくとも１種類で処理し、有効量の分化細胞は脳を目標とすることができる。状態は、ニューロンが変性している脊髄損傷であってもよく、細胞は、ＮＧＦ又はＲＡの少なくとも１種類で処理し、有効量の分化細胞は肝臓を目標とすることができる。状態は、貧血又は免疫不全であってもよく、細胞は、ＮＧＦ又はインターロイキンの少なくとも１種類で処理し、有効量の分化細胞は血液を目標とすることができる。状態は、副腎組織が変性している副腎状態であってもよく、細胞は、ＲＡで処理し、有効量の分化細胞は副腎組織を目標とすることができる。
【００１４】
上記によれば、対象は、ヒト対象を含む哺乳動物であってもよい。分化細胞タイプは、脳細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、ミュラー管細胞、心細胞、血液細胞、皮膚細胞及び副腎細胞のいずれであってもよい。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、分化経路を決定するためのキットであって、アッセイフォーマット内にパネルを形成する複数組の細胞特異的マーカーを含み、アッセイフォーマットには細胞特異的マーカーを検出するための試薬が含まれ、細胞特異的マーカーには、胚の外胚葉、中胚葉及び内胚葉の各特性を示す第一組のマーカー、及び体内組織の特性を示す第二組のマーカーが含まれ、第二組には２種類以上のマーカーが含まれ、さらに細胞特異的マーカーに結合した試薬を検出するための手段を含むキットを提供する。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、外因子をスクリーニングし、その外因子がヒト胚性細胞集団内で定方向分化を引き起こすことができるか否かを判定するための方法であって、（ａ）ヒト胚性細胞集団を外生成長因子に曝すこと、（ｂ）受容体の発現を測定すること（受容体は、特定の分化細胞集団の特徴を示すタイプである）、及び（ｃ）外因子が分化を促進し、正常レベルで分化を維持し、又は特定の細胞集団の分化を低下させるか否かを決定することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、細胞タイプの分化を判定するマーカーのパネルであって、複数個の外胚葉特異的タンパク質、複数個の中胚葉特異的タンパク質及び複数個の内胚葉特異的タンパク質の遺伝子発現を特異的に検出するための一組の試薬を含むパネルを提供する。
【００１８】
上記によれば、外胚葉特異的タンパク質には、例えばニューロフィラメントタンパク質、ケラチン及び副腎ドーパミンβヒドロキシラーゼが含まれ、中胚葉特異的タンパク質には、エノラーゼ、ＣＭＰ、レニン、カリクレイン、ＷＴＩ、ｃＡＣＴ、βグロビン、δグロビン及びｃアクチンが含まれ、内胚葉特異的タンパク質には、アミラーゼ、α−ＦＰ、ＰＤＸ−１及びインスリンが含まれる。試薬にはＤＮＡプライマー又は抗体が含まれる。
【００１９】
本発明の前述の特徴は、添付の図面を参照し、以下の詳細な説明を参照することにより、より簡単に理解されるであろう。
【００２０】
（具体的実施形態の詳細な説明）
定義。本説明及び添付の特許請求の範囲で使用する以下の用語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、指示された意味を有するものとする。
【００２１】
本明細書及び特許請求の範囲における用語「分化」は、細胞で起こり、それらの細胞に、ある特化された機能を獲得させ、他の特化された機能単位に変化する能力を失わせる変化として定義される。分化が可能な細胞は、全能性、多分化能性又は多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞のいずれであってもよい。分化は、成熟細胞としては部分的又は完全のどちらであってもよい。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲で用いる用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞期胚の内部細胞塊に由来する多分化能性細胞タイプを指す。本明細書及び特許請求の範囲で用いる用語「胚性細胞」には、胚性幹細胞、胚様体（ＥＢ）及び通常は多分化能性である分化胚性細胞（ＤＥ）が含まれるが、多能性である部分的に分化した細胞が含まれてもよい。
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲における用語「外因子」は、細胞集団の媒体に存在した場合に、細胞の生物学的特性に影響を及ぼす因子として定義される。用語外因子には、分泌型因子又は合成剤又は隣接細胞の表面上の受容体又はそれらのいずれかの阻害剤が含まれる。これらの因子は、蛋白質、炭水化物もしくは脂質又はそれらの混合物であってもよく、さらにペプチド、非ペプチドホルモン、小さな有機分子、及び化学ライブラリーの生成物又は天然に存在する供給源であってもよい新規な治療剤又は治療分子候補が含まれる。外因子は、単一型の分子又は２個以上の分子の混合物であってもよい。外因子は、細胞媒体中に添加される前に精製してもよく、又は粗製調製物であってもよい。外因子の例には、成長因子、ホルモン、抗体などの分泌型生体分子ならびに塩又はイオンが含まれる。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲における用語「対象」は、すべての生物として定義され、より具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【００２５】
本明細書及び特許請求の範囲における用語「遺伝子発現産物」は、転写ＲＮＡ又は翻訳後に修飾されたタンパク質を含むタンパク質のいずれかと定義される。
【００２６】
用語「ア（ａ）」又は「アン（ａｎ）」又は「ザ（ｔｈｅ）」は、「１種又は複数の」を意味することを意図している。
【００２７】
本発明の実施形態は、外因子をスクリーニングして、胚性幹細胞の成熟細胞の前駆体又は成熟細胞自体への定方向分化を引き起こすことができる外因子を決定する方法を提供する。このスクリーニング方法は、単一の外因子又は外因子の組み合わせを用い、特定の細胞タイプに関して細胞集団を富化する方法に関する情報を提供する。この方法は、一部の外因子は、特定の経路に関して阻害活性を有するが、他の因子は、特定の経路に向かって分化を活発に刺激することを示した。この後者の範疇には、阻害活性を有する因子の阻害剤が含まれる。他の因子は分化に対する効果を持たない。この方法を図１から４に例示する。本発明の他の実施形態は、外因子の存在下における胚性細胞の分化によって生じる細胞タイプの指標として、細胞特異的マーカーの遺伝子発現を利用する。
【００２８】
本発明の他の実施形態には、分化を方向付け、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて用いるための極めて均質な細胞集団を産生することが分かった外因子を選択することが含まれる。例えば、発明者他は、対照の分化胚性細胞に比べて、成長因子で処理した培養液はより均質であり、培養液の半分までが１種又は２種の細胞タイプを含むことを見いだした。図３に例示するように、遺伝子発現産物のパネルを構築し、外因子の存在下における胚性細胞の定方向分化を判定した。この手法を用い、発明者他は、部分的分化及び分化細胞タイプの増加の特徴を明らかにし、分化細胞の所定の選択を誘導するのに適している外因子の包括的プロフィールを提供することができる。胚性細胞からニューロンを得るための定方向分化経路を実施例３に記載する。
【００２９】
前述の方法は、ヒト胚性細胞を含む哺乳動物の胚性幹細胞に適用することができる。従来技術の参考文献は、成長因子の添加又は転写因子の導入のどちらかにより特定の細胞に関して富化されたマウス細胞の異種集団を報告している。（Ｇｏｒｄｏｎ他ＵＳＰ５，９１４，２６８；Ｗｉｌｅｓ、他、（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．１１１、ｐｐ．２５９−２６７；Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ、他、（１９９３）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、Ｖｏｌ．２１、ｐｐ．７７４−７７８；Ｓｌａｇｅｒ、他、（１９９３）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．１４、ｐｐ．２１２−２２４；Ｂａｉｎ他、（１９９５）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１６８、ｐｐ．３４２−３５７；Ｂｒｕｓｔｌｅ、他、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２８５、ｐｐ．７５４−７５６；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｒａｍｏｓ、他、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．８９、ｐｐ．９１７１−９１７５；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ−Ｄｕｓｈｎｉｋ、他、（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１７、ｐｐ．３８１７−３８２２）。それに続く異種集団からの細胞タイプの選別及び選択を行い、選択細胞に関してさらに富化した。（Ｋｌｕｇ、他、（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、Ｖｏｌ．９８、ｐｐ．２１６−２２４；Ｋｏｌｏｓｓｏｖ、他、（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４３、ｐｐ．２０４５−２０５６；Ｌｉ、他、（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８、Ｖｏｌ．１４３、ｐｐ．２０４５−２０５６；Ｌｅｅ他、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１８、ｐｐ．６７５−６７８）。凝集させてＥＢを形成させたマウスＥＳ細胞は、成獣マウスの脳及び脊髄に神経を分布することができる成熟ニューロンに分化することができた。（Ｂａｉｎ他、（１９９５）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１６８、ｐｐ．３４２−３５７；Ｗｏｂｕｓ他、（１９９８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、Ｖｏｌ．４７、ｐｐ．９６５−９７３；Ｄｅａｃｏｎ他、（１９９８）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、Ｖｏｌ．１４９、ｐｐ．２８−４１；Ｌｅｅ他、（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ｖｏｌ．１８、ｐｐ．６７５−６７９及びＭｃＤｏｎａｌｄ他、（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、Ｖｏｌ．５、ｐｐ．１４１０−１４１２）。これらの研究はいずれも、複数の細胞タイプへの分化に対する様々な外因子の効果についての幅広い分析は行っていない。
【００３０】
好ましい実施形態では、発明者他は、胚性細胞からヒト分化細胞を得るための新規な手法を提供し、特定の外因子を用い、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて複数の細胞タイプ（例えば、ヒト細胞タイプ）の混合物を富化する方法を確立した。培養における無制限な増殖に関する胚性幹細胞の特性を利用し、発明者他は、胚性幹細胞、特にヒト胚性細胞の分化を操作し、対象に移植するための細胞供給源を提供する手段について記載する。発明者他は、外因子による解離胚様体の処理が、明確な小細胞、筋肉様シンシチウム（ｓｙｎｃｉｔｉｕｍｓ）、ニューロン様細胞、線維芽細胞様細胞、大円形細胞又は他の間充織もしくは上皮細胞などの別個の形態を有する細胞集団を生み出すことができることを見いだした。これらの様々な形態は、因子による処理の結果として特定のプログラムが開始されることを示唆している。
【００３１】
ヒト胚性幹細胞の分化を誘導するために実施例１に記載するプロトコルは、細胞間に複雑なシグナル伝達を生じさせる凝集ステップ（原腸形成プロセスとやや似ている）及びＥＢとして５日後の、従って外生成長因子に曝露することのできる解離ステップで構成された。５日齢ＥＢの時期には、未分化ＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−４の発現からはっきり分かるように、細胞は最後までは分化しておらず、成長因子に対する様々な受容体を発現する。
【００３２】
実施例では、発明者他は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるヒト胚性幹細胞の定方向分化に関して８種類の成長因子（ｂＦＧＦ、ＴＧＦベータ１，アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ＨＧＦ、ＥＧＦ、βＮＧＦ及びレチノイン酸）の使用法について記載する。外因子の他の例には、インターロイキン、ハリネズミタンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、ｗｎｔ及びｉｎｔならびにこれまで述べていないＦＧＦファミリーの他のメンバーが含まれる。分化ヒト細胞が外因子に対する細胞特異的受容体を発現する場合には、胚性幹細胞に対する因子の効果を、分化経路の活性化の結果として発現する細胞特異的受容体の増加量を測定することによってモニターすることができる。さらに、分化が、様々な上皮又は間充織形態と相関することがある。本明細書に記載するように、分化の様々なステージで胚性細胞を分析するためのパネルの開発は、ルーチンに分化を方向付けるのに有用な手段を提供している。
【００３３】
従って、実施例１及び２では、すべての胚葉及び１１種の異なる組織をカバーする２４種の細胞特異的分子マーカーの発現によって細胞の分化をアッセイした。記載の成長因子は、限定することを意図していない。様々な成長因子によって誘導された系統特異的分化を図４に要約する。各成長因子は独自の効果を有しているが、発明者他は、ヒト胚性幹細胞の分化に対するそれらの効果に基づいて因子を３種類のカテゴリーに分類することができる（図４）。第一のグループ（ＴＧＦβ１及びアクチビン−Ａ）は、内胚葉及び外胚葉細胞への細胞の分化を阻害するようであるが、特定の中胚葉細胞への分化を可能にする。中胚葉細胞のうち、これらの因子は、背側中胚葉における軟骨細胞、中間中胚葉における腎臓及びミュラー管細胞及び外側中胚葉における血液形成への分化を阻害する。
【００３４】
第二のグループには、外胚葉ならびに中胚葉細胞への分化を可能にする、又は誘導する因子が含まれる（ＲＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ−４及びＥＧＦ）。しかしながら、これらの因子は、どの細胞が阻害され、正常レベルで産生され、又は促進されるかによって変化する。例えば、図４に示すように、ＲＡは、軟骨細胞、中間中胚葉によって産生される細胞、及びヒト胚性幹細胞における血液形成を阻害する。対照的に、ＢＭＰ−４は、軟骨細胞及び血液形成分化を低下させ、調べた他のすべての中胚葉細胞の分化を阻害するが、皮膚細胞の形成を可能にするようである。ＥＧＦは、心臓、及び皮膚の分化を刺激するようであり、正常レベルの筋肉を可能にするが、腎臓、血液及び脳を形成する細胞の形成を阻害する。ＦＧＦは、心臓の細胞の形成を刺激するに過ぎず、正常レベルの筋肉皮膚及び脳の形成を可能にし、腎臓の細胞の分化を阻害する。
【００３５】
成長因子の第三のグループ（ＮＧＦ及びＨＧＦ）は、内胚葉を含む３種類すべての胚性細胞系譜への分化を可能にする。例えば、ＮＧＦは、胚性細胞の分化を、肝臓組織（肝細胞）、膵臓（島細胞）、脳（ニューロン）、腎臓及びミュラー管細胞の形成へと方向付けることが分かった。それほどではないにせよ、ＮＧＦは、心臓及び血液の産生を刺激し、筋肉及び骨（軟骨細胞）の分化をダウンレギュレートするようである。しかしながら、ＮＧＦの存在下では、皮膚細胞への分化は完全に阻害される。このパターンはＨＧＦと同一ではない。ＨＧＦをヒト胚性細胞に添加した場合には、正常レベルで皮膚細胞が誘導される。しかしながら、ＨＧＦの存在下では、腎臓細胞の分化は完全に阻害され、肝臓、膵臓、脳、軟骨細胞及び血液の形成は著しく阻害される。
【００３６】
図４に示す結果は、定方向分化に対する強力で新しい手法を表している。胚性幹細胞及び／又は分化胚性細胞を因子に曝露し、特定の情報をもたらす遺伝子発現産物を、各外胚葉、中胚葉及び内胚葉組織及びそれらの分化対応物について分化胚性細胞中で分析するこの手法を用い、どの外因子も分析することができる。上述の組織の分化を評価することへの新規な手法の利点は、分化に関して単一外因子の複雑な関係を明らかにし、さらに操作できることである。
【００３７】
例えば、分化胚性（ＤＥ）細胞培養液における特定の分化を、形態の変化としてまず検出することができる。外因子との１０日間の培養の後、ＤＥ細胞はさらに均質となり、外因子で処理しない対照に比べてより多くの部分が特定の細胞タイプを示した。発明者他は、異なる細胞タイプに対して選択されたマーカーの組を用いて遺伝子発現を測定することにより、これらの細胞の分化を分析した。発明者他は、細胞地図タンパク質（ｃｅｌｌ　ｍａｐｐｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の実質的な公文書を利用した。様々なタイプの成熟した異常及び正常細胞に特徴的なタンパク質マーカーの数は極めて多く、定方向分化により得られる細胞を分析するために好都合な出発点を提供する。成熟細胞を特徴付ける遺伝子発現産物は十分明らかになっているが、これは、未分化胚性細胞が成熟細胞に分化する間に起きる中間的細胞タイプの場合とは違う。図５に記載したマーカーは、胚性細胞集団に対する外因子の効果を同定するために一組のマーカーを選択することができる遺伝子発現産物の例を提供する。このリストは、包括的でないことを意図している。これまで述べていないＴ細胞受容体、α−グロビン、ソマトスタチン、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及びグルカゴンなどのＧ−タンパク質結合受容体などの他のマーカーも使用することができる。
【００３８】
中間細胞系統用のマーカーの組は、反復プロセスにおいて大きさが増加するグループから選択することができる。例えば、特定の外因子は、本発明の実施形態による特定のマーカーによって認識される特定のタイプの未成熟細胞への胚性細胞の分化を刺激することが見いだされている。次いで、２Ｄタンパク質ブロットなどの当技術分野における標準プロトコルを用いることにより、タンパク質含量についてそれらの細胞を分析して同定することができるが、遺伝子発現は、完全な成熟細胞によって異なる。中間もしくは成熟細胞又は両方に見いだされるそれらの遺伝子発現産物は、これに続く外因子の胚性細胞に対する効果を測定するためのマーカーとしての役割を果たすことができる。この手法は、従来技術の方法によって以前は認識されなかった新規前駆細胞の単離及び特徴付けを可能にする。
【００３９】
発明者他は、３種すべての胚葉及び二次胚葉からの２４種類の組織特異的マーカーのパネルを用いる上記の手法を例示した。これら２４種類の組織特異的マーカーを用い、培養における胚性幹細胞について、８種類の異なる成長因子を分析した。これらの細胞はヒトであったが、この方法の実施形態は、いかなる供給源からの胚性幹細胞にも適用することができる。発明者他は、アッセイフォーマットにおいてマーカーのパネルを利用し、アッセイフォーマットは、ＲＴ−ＰＣＲ及び特定のプライマーに依存する標準的かつ定量的なゲルベースの技法を利用した（実施例１−２及び図１−３を参照）。当技術分野で知られている他のアッセイフォーマットを用いて分化の経路をマッピングすることができ、高感度抗体をベースとする技法が含まれる。高感度抗体技法には、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸収（ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ａｂｓｏｒｐ−ｔｉｏｎ）（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光抗体技法が含まれる。他の検出手段には、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成方法、及びプローブ又はプライマーをアレイ内の固体基体に取り付ける固体化学分析が含まれる。ＤＮＡアレイは、多数のサンプルを迅速に分析することを可能にする。従って、分化胚性細胞における複数の組織の分化状態に対する特定の成長因子の効果を判定することができる。
【００４０】
特定の組織に関係する遺伝子の発現を同定することに加え、分化している細胞の変化している形態を調べることによって分化を追跡することができる。例えば、特定の分化を誘導する能力は、外因子の存在下で所定の時間培養された分化胚性細胞培養における形態変化としてまず明らかとなった（図１Ａ）。外因子との培養後、分化胚性細胞はさらに均質となり、因子で処理しない対照に比べてより多くの部分が特定の細胞タイプを示した。これらの細胞の分化は遺伝子発現試験によっても追跡し、発明者他は、３種すべての胚葉及び二次胚葉からの組織特異的マーカーの転写を分析した。実施例２に示すように、２４種類の遺伝子のうち１６種類がヒトＤＥ細胞中で発現し、１１種類の異なる組織を示した（図３）。
【００４１】
多くのマーカーの組を分析することにより、発明者他は、特定の細胞タイプに分化を方向付けることができる因子を特定することができる。図４は、実施例で試験した８種類の成長因子はどれも、ヒト胚性幹細胞の完全に均一かつ単一の分化を方向付けなかったが、分化細胞タイプの数は、様々な因子について実質的に異なることを示している。上記実施例では、個々の成長因子から観察される分化は、試験した大部分の成長因子が特定の細胞タイプの分化を阻害し、この阻害効果は誘導効果よりもより顕著であることを示している。従って、特定の分化は、フォリスタチン及びノギンなどの成長因子阻害剤を用い、ヒト胚性幹細胞の分化中に産生されるであろう内生成長因子を相殺することによっても達成できる。
【００４２】
要約すれば、特定の外因子は、特定の経路に沿って細胞の分化を主に阻害し、副次的経路において細胞の分化をもたらす。特定の組織は、そのような外因子の作用を抑制又は妨害することによって生じることがある。他の外因子は、胚性幹細胞の分化を直接刺激することもあるが、他の因子は、発生中のある時点における胚性幹細胞の増殖及び発達に対してほとんど又は全く効果を持たないことがある。特定の順序で複数の因子を用いて最適な分化結果を得ることができ、選択方法を組み合わせて、完全に定方向の細胞分化を行うための手段を提供する。
【００４３】
本発明の実施形態は、特定の細胞系列に沿って部分的又は完全に分化された細胞を得る方法を提供する。これらの方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏの双方における使用法を有する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける分化経路の産物である細胞のｉｎ　ｖｉｖｏにおける使用法は、本明細書に記載の方法による処理された幹細胞に由来する軟骨細胞を用いるｉｎ　ｖｉｖｏにおける骨損傷の修復が対象となるであろう。さらに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける分化細胞を用い、損傷器官、例えば脊髄のためのニューロン細胞を修復することができる。
【００４４】
発明者他は、特定の成長因子の存在下でヒト胚性細胞からニューロンを形成できることを示した。これらのニューロン培養液は成熟して様々な複雑度を有するニューロン突起を形成する。前述のように、ＲＡとβＮＧＦが共にヒト胚性細胞から発生するニューロン細胞の数を増加させることを立証することに加え、発明者他は、ＲＡが成熟ニューロンの産生を促進し、これらのニューロンがドーパミン又はセロトニン受容体を発現し、ニューロン突起の複雑な叢を形成することを立証する。ＲＡのみが副腎マーカーの発現を誘導し、ＮＧＦは誘導せず、ＮＧＦは内胚葉マーカーの発現を誘導したがＲＡは誘導しない。
【００４５】
成長因子による培養液中のニューロンの富化は、細胞選択のプロセスを介して（成長又は生存率の向上のどちらかにより）、又は分化誘導の結果として生じることがある。発明者他のニューロンに分化した胚性細胞についての産物は、例えば、ヒトにおいて中枢神経系における変性又は外傷で失われたニューロンの置き換えに使用するために、培養で多量のニューロンを得るための方法を提供する。この例は、移植療法及び他の使用法のために無制限の細胞供給源を作製する際の発明者他の手法の有用性を際だたせることに役立っている。このことは、今日まで移植療法に利用できる主なヒト細胞供給源である胎児組織を得ることの困難さを軽減することができる（Ｐｅｓｃｈａｎｓｋｉ、（１９９５）Ｎｅｕｒｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．６８、ｐｐ．２７３−２８５）。
【００４６】
細胞療法の場合には、細胞を対象に直接添加し、有害な病状に対処することができる。例えば、ニューロンのタイプである分化胚性細胞を、パーキンソン病、多発性硬化症又は脊髄損傷を治療するため、対象に直接投与することができる。分化胚性細胞を用い、ルーゲーリグ病、糖尿病又は他の自己免疫状態を直接治療することができる。実際、分化胚性細胞を用い、人体における器官又は組織に対する疾患又は損傷を直接治療することができる。あるいは、当技術分野で知られている生体適合性の三次元又は二次元無機又は有機マトリクスを細胞に播種することにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて人工組織中に細胞を組み込み、移植の前にマトリクス内で細胞を増殖及び分化させることができる。成獣マウス胸腺支質が播種される生体適合性マトリクスの例は、Ｐｌｚｎａｎｓｋｙ他、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１８、ｐｐ．７２９−７３４に示されている。
【００４７】
特定の細胞系列に沿って部分的又は完全に分化された細胞を提供するための方法についての他の使用法には、薬物毒性アッセイのための試薬を作製することなどのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける使用法が含まれる。腎臓細胞、肝臓細胞、脳細胞、心臓平滑筋、軟骨細胞、膵臓細胞、ニューロン細胞、血液細胞などの分化細胞の培養液に薬物を添加することにより、前臨床試験における動物の使用を回避することが可能である。さらに、部分的分化細胞への薬物の添加は、胚の発生に対する薬物の影響に関する有用な情報を提供することができる。分化の途中にある細胞の単離及び特徴付けは、健康及び疾患の関連において発生における細胞の遺伝子型及び表現型を理解するために有用な情報資源を提供する。
【００４８】
（発明を実施するための最良の形態）
（１）分化ヒト胚性幹細胞における遺伝子発現産物の測定
細胞培養：ヒト胚性幹細胞は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上で培養し、次いでゼラチンでコーティングしたプレートに移し、さらに培養して培養液中のマウス細胞の数を減少させた。胚様体（ＥＢ）への分化は、ペトリ皿に移すことによって開始し、胚様体は浮遊したままにした。５日後、ＥＢを解離させ、単層として細胞を培養し、分化胚性（ＤＥ）細胞を形成させる。このプロトコルは、凝集塊としてのヒト胚性幹細胞の初期分化及び細胞を外生成長因子に曝露することができる単層としての続く分化を可能にする。８種類の異なる成長因子：ＮＧＦ、ｂＦＧＦ、アクチビン−Ａ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＢＭＰ４及びレチノイン酸（ＲＡ）の存在下で１０日間、ＤＥ細胞を培養した（図１Ａ）。
【００４９】
ヒトＥＳ細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ他、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２８６、ｐｐ．１１４５−１１４７に記載のように入手した。体外受精（ＩＶＦ）により生じた卵割期ヒト胚は、必要な承認プロセスを経て入手した。胚を胚盤胞期まで培養し、内部細胞塊を単離した。ＥＳ細胞株を胚から単離し、６ヶ月の培養期間を通して正常核型を維持し、複製上の危機を受けることなく数ヶ月にわたって連続的に継代されたと思われる細胞株を選択した。この細胞は、８０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ−ＥＳ細胞用に最適化されたダルベッコの改良イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ−血清非含有処方（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％非必須アミノ酸原液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１０３単位／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）及び４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中、マウス胚線維芽細胞上で培養した場合に、均質な未分化形態を有していた。ゼラチン（０．１％、Ｍｅｒｃｋ）を用い、組織培養プレートを覆った。
【００５０】
ＥＢの形成を誘導するため、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．１％／１ｍＭ）を用いてＥＳ細胞をプラスチック製のペトリ皿に移し、凝集させてプレートへの付着を防いだ。白血病抑制因子（ＬＩＦ）及びｂＦＧＦを欠く以外は同一の培地でヒトＥＢを培養した。ＥＢを５日間培養し、次いで解離させ、５０μｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）でコーティングした組織培養プレート上で培養した。単一又はグループで用いる以下のヒト組み換え成長因子の存在下で細胞を培養した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｓｗｏｂｏｄａ、他、（１９９９）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．５３、ｐｐ．１２０５−１２１１。）−１０ｎｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）。トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）（Ｓｗｏｂｏｄａ他）−２ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）。アクチビン−Ａ（Ｓｌａｇｅｒ他、（１９９３）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．１４、ｐｐ．２１２−２２４）−２０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）。骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）Ｓｌａｇｅｒ他、及びＢａｉｎ他、（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、Ｖｏｌ．２２３、ｐｐ．６９１−６９４　１４）−１０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）。肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／細胞分散因子（Ｄｏｅｔｓｃｈ他、（１９９９）Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ．９７、ｐｐ．７０３−７１６）−２０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）。上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｄｏｅｔｓｃｈ他）−１００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）。β神経成長因子（ＮＧＦ）（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ他、（１９９９）Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ．９６、ｐｐ．２５−３４）−１００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）。レチノイン酸（ＲＡ）（Ｄｅａｃｏｎ、他、（１９９８）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｖｏｌ．１４９、ｐｐ．２８−４１；Ｐｅｓｃｈａｎｓｋｉ、他、（１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．６８、ｐｐ．２７３−２８５）−１μｍ（Ｓｉｇｍａ）。これらの条件の下で、分化胚性（ＤＥ）細胞をさらに１０日間培養した。調べた成長因子はすべて、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）血清置換には存在せず、胚性細胞を培養した。
【００５１】
この実施例では、ヒトＥＳ細胞凝集塊の初期分化が生じ、細胞が単層を形成した後も続いた。好ましい実施形態では、単層を外因子に曝露した。図１Ａは、成長因子を利用する一プロトコルを示す。
【００５２】
実施例２でより詳細に述べるように、外因子の添加と相関する受容体の存在は、因子を培養液に添加した段階のＤＥ細胞（５日齢ＥＢ）中で判断できると思われる。例えば、ヒト胚性幹細胞、５日齢ＥＢ及び１０日齢ＤＥ細胞からＲＮＡを単離し、レチノイン酸アルファ型受容体（ＲＡＲ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子Ｉ型受容体（ＦＧＦＲＩ）、アクチビンＩＩＢ型受容体（ＡＣＴＲＩＩＢ）、トランスフォーミング成長因子ＩＩ型受容体（ＴＧＦＲＩＩ）、肝細胞成長因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、及び骨形成タンパク質４ＩＩ型受容体（ＢＭＰ４ＲＩＩ）に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって分析することができる。対照として、８量体結合タンパク質４（Ｏｃｔ−４）、未分化細胞のマーカー、及びＧ３ＰＤ（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）、ハウスキーピング遺伝子のマーカーもモニターした。
【００５３】
ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成及び免疫組織化学：ＥＢ又はそれらの培養誘導体を４％パラホルムアルデヒド中で固定した。ｉｎ−ｓｉｔｕ実験では、ＮＦ−Ｌ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）（ＣＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＣＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＣ）の５０量体２’−Ｏ−メチル５’−ビオチン化ｃＤＮＡのハイブリッド形成を追跡した。次いで、蛍光発生基質を用い、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼによりプローブを検出した（Ｇｒｉｆｍａｎ、他、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９５、ｐｐ．１３９３５−１３９４０）。免疫組織化学については、ＥＢをパラフィン中に包埋して１０μＭで切片とするか、プレート上で直接染色した。一次抗体としてマウスモノクローナル抗ＮＦ−Ｈを用い、Ｃｙ３結合ヤギ抗マウスＩｇＧで検出した。
【００５４】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：Ａｔｌａｓ（商標）Ｐｕｒｅ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、全ＲＮＡを抽出した。ＰＣＲ　Ｋｉｔ用のＡｄｖａｎｔａｇｅ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、全ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成した。ヒト遺伝子に対して選択的なＤＮＡプライマーと共に、ｃＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅にかけた。各遺伝子について、ＤＮＡプライマーを様々なエクソンから誘導し、ＰＣＲ産物が特異的ｍＲＮＡ種を示しゲノムＤＮＡを示さないことを保証した。ＰＣＲは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ａｄｖａｎｔａｑ＋（商標）ＲＴ−ＰＣＲキット及び６８℃の２段階サイクルを用いて行った。
【００５５】
プライマーは以下の遺伝子について合成した。ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）、アストロサイトに豊富なリンタンパク質（ＰＥＡ−１５）、ケラチン、ドーパミンβ水酸化酵素（ＤβＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、エノラーゼ、ミオシン軽鎖ポリペプチド２（ミオシン）、軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）、レニン、カリクレイン、ウィルムス腫瘍１（ＷＴＩ）、β−グロビン（β−Ｇｌｏｂ）、δ−グロビン（δ−Ｇｌｏｂ）、心アクチン（ｃＡＣＴ）、アルブミン、α１アンチトリプシン（α１ＡＴ）、リパーゼ、アミラーゼ、ＰＤＸ−１、インスリン、グルカゴン、界面活性剤、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、α−フェトプロテイン（αＦＰ）、レチノイン酸アルファ型受容体（ＲＡＲ）、肝細胞成長因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子Ｉ型受容体（ＦＧＦＲＩ）、トランスフォーミング成長因子ＩＩ型受容体（ＴＧＦＲＩＩ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アクチビンＩＩＢ型受容体（ＡＣＴＲＩＩＢ）、骨形成タンパク質４ＩＩ型受容体（ＢＭＰ４ＲＩＩ）、８量体結合タンパク質４（Ｏｃｔ−４）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）、β−アクチン。プライマーの詳細な説明及びそれらの予想産物を図５に示す。参照により組み込む。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｓ．ｈｕｊｉ．ａｃ．ｉｌ／〜ｎｉｓｓｉｍｂ／ｆａｃｔｏｒｓ　ｅｓ／ｐｒｉｍｅｒｓ．ｈｔｍｌ−ｅｎｔｅを参照されたい。
【００５６】
（２）未分化細胞に対する外生成長因子の効果を測定することによる分化経路のマッピング
８種類の標的受容体がすべて５日齢のＥＢで発現し、大部分はＥＳ及びＤＥ細胞で発現した（図２）。特に、受容体のうち４種類（ＴＧＦＲＩＩ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＢＭＰ４ＲＩＩ）は、ヒトＥＳ細胞において極めて低レベルで発現し、それらの発現は、培養及びさらなる分化後に増加する。理論により制限されるとは思わないが、発明者他は、低レベルの発現が胚性細胞培養における部分的分化に起因すると考えている。
【００５７】
成長因子受容体が５日齢のＥＢで発現したことから、発明者他は、対応するリガンドの分化に対する効果を調べることができた。プラスチック上の数日間の培養及び成長因子への連続曝露後、細胞は様々な形態を獲得した（図１Ｂ）。成長因子がないと、細胞は多くの異なるタイプのコロニーへ自然と分化したが、成長因子の添加は、シンシチウム形成筋細胞及びニューロン細胞などのより成熟した細胞形態を生み出した。対照ＤＥ細胞に比べ、成長因子処理の培養液はより均質であり、培養液の半分までが１種又は２種の細胞を含んでいた。例えば、ＨＧＦで処理した培養液には明確な核を有する小細胞の大きな集団が（図１Ｂ−Ｉ）、アクチビン−Ａで処理した細胞には筋肉様シンシチウムが（図１Ｂ−ＩＩＩ）、ＲＡで処理した培養液にはニューロン様細胞が（図１Ｂ−ＩＶ）、ｂＦＧＦで処理した培養液には線維芽細胞様細胞が（図１Ｂ−Ｖ）、ＢＭＰ−４で処理した培養液には大きな円形細胞が（図１Ｂ−ＶＩ）見いだされた。これらの様々な細胞形態は、成長因子処理の結果として特異的プログラムが開始することを立証している。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲを用い２４種類の細胞特異的遺伝子のパネルの発現を測定することにより、成長因子によって誘導される分化をさらに調べた。ＲＮＡは、ＥＳ細胞、２０日齢ＥＢ、１０日齢ＤＥ細胞、及びＲＡ、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ、アクチビン−Ａ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及びＢＭＰ４で処理のいずれかで処理したＤＥ細胞から単離した。相補ＤＮＡを様々なサンプルから作成し、これらの遺伝子に特異的なプライマーによって転写物を増幅させた。各遺伝子について、２種類のＤＮＡプライマーを様々なエクソンから誘導し、ＰＣＲ産物が特異的ｍＲＮＡ種を示しゲノムＤＮＡを示さないことを保証した。さらに、プライマーからの正しい増幅産物を、様々なヒト成人又は胚性組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＭＴＣ（商標）Ｐａｎｅｌｓ）からのｃＤＮＡを増幅することにより確認した（結果は示さない）。２４種類の細胞特異的マーカーのうち、１６種類が処理ＤＥ細胞で発現した。大部分の転写物は対照ＤＥ細胞でも発現し（図３Ａを参照）、外生成長因子を必要とせずに多くの異なる細胞タイプがＥＳ細胞から発生することを示した。さらに、ヒト胚性細胞培養液はいくつかの細胞特異的遺伝子を発現し、培養液における部分的な自然発生分化が存在することを示した。
【００５９】
異なる処理における特異的マーカーの発現パターンを対照ＤＥ細胞の発現パターンと比較すると、いくつかの結論を引き出すことができる。いくつかのマーカーは、特定の成長因子が存在する場合にのみ発現し、例えば、副腎マーカーのドーパミンβ水酸化酵素（ＤβＨ）は、細胞をレチノイン酸で処理した場合にのみ発現し、泌尿生殖マーカーのＷＴ−１は、ＮＧＦ又はＨＧＦのどちらかを添加した場合に発現する（図３Ａ）。対照的に、筋肉特異的エノラーゼは、ＢＭＰ−４曝露後を除くすべての条件下で発現する（図３Ａ）。一部の成長因子、例えばＮＧＦは、３種類すべての胚葉からの細胞を示す様々な転写物の発現を誘導するが、他の因子、すなわちＴＧＦβ１は、比較的少ない特異的転写物の産生をもたらす。
【００６０】
各成長因子誘導実験は少なくとも３回繰り返した。ＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、結果の略図を図３Ｂに示す。遺伝子発現の誘導又は抑制を色分けし、成長因子の細胞特異的発現の全般的な誘導又は抑制に基づいて成長因子を順序付けた。すなわち、試験した因子の最も多種類の細胞特異的遺伝子発現を誘導する因子（ＮＧＦ）を左側に、多くの細胞タイプの分化を抑制又は方向付けることができない因子（ＢＭＰ−４、アクチビン−Ａ及びＴＧＦβ１）を右側にする。
【００６１】
（３）ニューロン分化のためのＥＢからの誘導細胞の特徴付け
細胞培養：ヒトＥＳ細胞を培養し、実施例１に記載のようにＥＢを作成した。凝集の開始から４日後、成長因子を与えた。レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）：１０−７Ｍ（Ｂａｉｎ他（１９９５）又は１０−６Ｍ（Ｂａｉｎ他、１９９６）；ＴＧＦβ１（Ｓｉｇｍａ）：２ｎｇ／ｍｌ（Ｓｌａｇｅｒ他、（１９９３）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．１４、ｐｐ．２１２−２２４。）；βＮＧＦ（Ｎｅｗ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｓｒａｅｌ）：１００ｎｇ／ｍｌ（Ｗｏｂｕｓ他、１９８８）。２１日後、５μｇ／ｃｍ２のコラーゲン処理プレート上でＥＢを培養し、全ＥＢ又は単一細胞のどちらかでトリプシン／ＥＤＴＡにより解離させた。培養液は、それぞれさらに１週間又は２日間保存した。
【００６２】
ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成及び免疫組織化学は実施例１．ＲＴ−ＰＣＲ分析に従って行った。全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、実施例１に従ってＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ、セロトニン受容体２Ａ及び５Ａ（それぞれ５ＨＴ２Ａ、５ＨＴ５Ａ）及びドーパミン受容体Ｄ１（ＤＲＤ１）用のプライマーはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ドーパ脱炭酸酵素（ＤＤＣ）用のプライマーは、（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）ＴＣＴＧＴＧＣＣＴＣＴＴＡＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＧＧ及び（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）ＡＴＣＡＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＣとした。結果を図６〜８に示す。
【００６３】
まず、未成熟と完全分化ニューロンの双方によって発現されるニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）ＲＮＡに対するｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成により分化をアッセイした（Ｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｅｎ、他、（１９８７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、Ｖｏｌ．７、ｐｐ．３４８９−３５０４）。発明者他は、βＮＧＦ及び高濃度のＲＡが、培養液中のニューロン細胞の比率を対照の２１％からそれぞれ３９％及び５２％に増加させることを見いだした。低濃度のＲＡ（１０−６Ｍの代わりに１０−７Ｍ）は、ＮＧＦと類似した効果を生み出したが、ＴＧＦβ１処理ではニューロン分化に対する効果は観察されなかった（図６）。
【００６４】
免疫染色は、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）タンパク質を示し、成熟ニューロン（Ｃａｒｄｅｎ他）、成熟ＥＢの切片（図７Ａ）中にのみ見いだされた。ＥＢを培養した場合には、これらのニューロンは様々な複雑度の繊維状「回路網」（図７Ｂ）を形成し、ＮＦ−Ｈについて陽性に染色された（図７Ｃ）。ＲＡによる処理と続く培養は、未処理のＥＢにおける５４％に比べ、ＮＦ−Ｈ陽性ニューロンを含むＥＢ数を７６％まで増加させた。さらに、ＲＡ処理ＥＢは、より複雑な回路網形態へと劇的な移動を示し（図７Ｄ）、細胞の分化状況に対する成長因子のプラス効果が示唆された。
【００６５】
ヒトＥＳ細胞から得られた神経細胞の特徴をさらに明らかにするため、発明者他は、ＲＡで処理したＥＢ及び陰性対照としてのＥＳ細胞におけるドーパミン受容体（ＤＲＤ１）及び２種類のセロトニン受容体（５ＨＴ２Ａ及び５ＨＴ５Ａ）の発現についてアッセイした（図８）。これらの受容体はＲＡ処理後のＥＢで検出されたが、未処理のＥＳ細胞では検出されなかった。ドーパミン及びセロトニン受容体が発現しなかったことから、培養液中のニューロンがそれらの神経伝達物質リガンドも合成するか否かを決定することは興味深かった。この可能性に呼応して、発明者他は、セロトニンとドーパミンの両者の合成における重要な酵素であるドーパ脱炭酸酵素（ＤＤＣ）の発現を観察した（Ｓｗｏｂｏｄａ他、（１９９９）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．５３、ｐｐ．１２０５−１２１１）（図８）。
【００６６】
上記で引用したすべての参考文献を参照により本明細書に組み込む。前述した本発明の特定の実施形態は、本発明の範囲を制限することを意図しておらず、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
培養におけるヒト胚性幹細胞の分化誘導を示す。（Ａ）分化プロトコルの略図。（Ｂ）分化誘導前後の胚性幹細胞の様々な形態：Ｉ：フィーダー上の胚性幹細胞のコロニー。ＩＩ−ＩＶ：それぞれＨＧＦ、アクチビン−Ａ、ＲＡ、ｂＦＧＦ、又はＢＭＰ−４の存在下に培養した分化細胞は分化細胞のサイズと比較してコロニー中の胚性細胞のサイズが小さいことを示している。スケールバー、１００μｍ。
【図２】
ヒト胚性幹細胞における様々な成長因子に対する受容体の発現を示す。ＥＳ細胞、５日齢の胚様体（ＥＢ）及び分化胚性（ＤＥ）細胞からのＲＮＡサンプルを、特異的受容体についてＲＴ−ＰＣＲにより分析した。対照として、５日齢のＥＢのＲＮＡを前もってｃＤＮＡ（−ＲＴ）を作製することなく分析した。
【図３】
（Ａ）様々な成長因子で処理したヒトＥＳ細胞における細胞特異的遺伝子の発現の分析を示す。様々な成長因子で処理したＥＳ、２０日齢のＥＢ及びＤＥ細胞からのＲＮＡを、１７種類の細胞特異的遺伝子及び２種類のハウスキーピング遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲにより分析した。遺伝子は、それらの胚葉によって分類した。（Ｂ）遺伝子発現に対する成長因子の効果の略図。１３種類の遺伝子の発現に対するＮＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＲＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＴＧＦβ１又はアクチビン−Ａの効果に関する３つの実験からの結果を示す。結果は色分けし、オレンジ色は対照（成長因子なし）と類似した発現を示し、赤色は少なくとも２倍の誘導を示し、黄色は２分の１以下の阻害を示し、緑色は発現が検出できないことを示す。
【図４】
ヒト胚性細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける分化に対する様々な成長因子の効果を示す。濃い矢印及び大きなフォントは、指示された組織に特異的な遺伝子に関して、対照（成長因子なし）に比べて誘導されたことを示す。破線の矢印は発現の低下を示す。細胞特異的転写物の消失は、対応する組織の記号を削除することによって象徴的に示されている。
【図５】
図５Ａ及び図５Ｂは、細胞の定方向分化を測定するためにパネル中で用いる遺伝子発現産物をコードする遺伝子の例を示す。図５Ｃ及び図５Ｄは、各配列の対応するＳＥＱ　ＩＤ番号を示す。
【図６】
レチノイン酸及びβＮＧＦがニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）ｍＲＮＡの発現を誘導することを示す。解離ＥＢに由来する細胞のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成分析はＮＦ−Ｌの発現を示している。ＲＡ−（低（１０−７Ｍ）又は高（１０−６Ｍ）濃度）、ＴＧＦβ１、及びβＮＧＦ処理培養を示す。スケールバー＝１００μｍ。棒グラフは、各処理後にＮＦ−Ｌ　ＲＮＡを発現する細胞の割合を示す。各条件のアッセイは３回繰り返し（５０〜１５０個の細胞）、標準誤差のバーをグラフ中に示す。
【図７】
レチノイン酸がヒトＥＢからのニューロン突起の形成を促進することを示す。（Ａ）ニューロン細胞体（二重の矢印）及び複雑な基部突起（ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ）（矢印）が、抗ＮＦ−Ｈ抗体で染色したＥＢを介して切片中に認められる。Ｈｏｅｃｓｈｔ染色（青色）は、インタクトな核と分裂した核を共に示す。（Ｂ）コラーゲン上で培養されたインタクトなＥＢから形成されたニューロン様突起の叢。（Ｃ）コラーゲン上で培養された２０日齢のＥＢをＮＦ−Ｈについての免疫染色は、様々な複雑度を有するニューロン突起の叢が生じることを示す。（Ｄ）様々な複雑度の回路網を示すＥＢの比率に対するＲＡの効果を要約する棒グラフ。各条件は、培養液中で全ＥＢを数える（２０〜４０個）ことによりアッセイし、実験を２回繰り返して類似の結果を得た。スケールバー＝１００μｍ。
【図８】
レチノイン酸がニューロン特異的遺伝子の発現を誘導することを示す。ＲＡ（ＥＢ＋ＲＡ）の存在下で、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞及び２１日齢ＥＢにおけるドーパミン受容体Ｄ１（ＤＲＤ１）、セロトニン受容体２Ａ及び５Ａ（５ＨＴ２Ａ及び５ＨＴ５Ａ）、ドーパ脱炭酸酵素（ＤＤＣ）及びハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。逆転写されていないＲＮＡサンプルを陰性対照として用い、ＤＮＡ汚染（−ＲＴ）がないことを保証した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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