(57)【要約】【課題】肝臓を標的とする医薬的に活性な化合物及びその製造方法を提供する。【解決手段】肝臓を標的とする活性な化合物は一般式（Ｉ）：【化１】2004504359.tif 000016（式中、Ａはα−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、Ｂはα−Ｈ基又はβ−Ｈ基を表わし、Ｃは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、或いはＢ及びＣは一緒になって二重結合を形成し、Ｄは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、Ｅは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、−Ｇ−は側鎖部分を表わし、−ＮＨ−Ｊは、（ｉ）アミノ基を含む活性化合物の残基であって、前記−ＮＨ−基が前記活性化合物の前記アミノ基により供与される残基、及び（ｉｉ）アミノ基が付加された活性化合物の残基であって、前記−ＮＨ−基が前記付加されたアミノ基により供与される残基から選択され、Ｘ及びＹの各々は独立して単結合、−（ＣＨ２ ）ｚ −（式中、ｚは１ないし８である。）基、−Ｏ−基又は−Ｓ−基を表わし、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、そしてｐは０又は１であるが、但し、−ＮＨ−Ｊが（ｉ）を表わす場合、ｍは１である。）で表わされる化合物である。このような化合物の製造方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2004504359.tif 000013
（式中、
Ａはα−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、
Ｂはα−Ｈ基又はβ−Ｈ基を表わし、
Ｃは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、或いはＢ及びＣは一緒になって二重結合を形成し、Ｄは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、
Ｅは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、
−Ｇ−は側鎖部分を表わし、
−ＮＨ−Ｊは、
（ｉ）アミノ基を含む活性化合物の残基であって、前記−ＮＨ−基が前記活性化合物の前記アミノ基により供与される残基、及び
（ｉｉ）アミノ基が付加された活性化合物の残基であって、前記−ＮＨ−基が前記付加されたアミノ基により供与される残基
から選択され、
Ｘ及びＹの各々は独立して単結合、−（ＣＨ２ ）ｚ −（式中、ｚは１ないし　　８である。）基、−Ｏ−基又は−Ｓ−基を表わし、
ｎは０又は１であり、
ｍは０又は１であり、そして
ｐは０又は１であるが、但し、
−ＮＨ−Ｊが（ｉ）を表わす場合、ｍは１である。）で表わされる肝臓を標的とする活性な化合物。
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）中、−ＮＨ−Ｊが、アミノ基を含む活性化合物の残基であって、前記−ＮＨ−基が前記活性化合物の前記アミノ基により供与される残基であり、且つｍが１である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記一般式（Ｉ）中、−ＮＨ−Ｊが、アミノ基が付加された活性化合物の残基であって、且つ前記−ＮＨ−基が前記付加されたアミノ基により供与される請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記一般式（Ｉ）中、−Ｇ−が−（ＣＨ２ ）ｑ −（式中、ｑは１ないし８である。）基、−Ｏ−基又は−Ｓ−基を表わす請求項１ないし３の何れか一項記載の化合物。
【請求項５】
前記一般式（Ｉ）中、−Ｇ−が−（ＣＨ２ ）ｑ −（式中、ｑは１ないし５である。）基を表わす請求項４記載の化合物。
【請求項６】
前記一般式（Ｉ）中、ｑが３ないし５である請求項５記載の化合物。
【請求項７】
前記一般式（Ｉ）中、ｑが４である請求項５記載の化合物。
【請求項８】
前記一般式（Ｉ）中、Ｘ及びＹの各々が独立して単結合又は−（ＣＨ２ ）ｚ −基を表わす請求項１ないし７の何れか一項記載の化合物。
【請求項９】
前記一般式（Ｉ）中、Ｘ及びＹの各々が独立して単結合又は−（ＣＨ２ ）ｚ −（式中、ｚは１ないし５である。）基を表わす請求項９記載の化合物。
【請求項１０】
前記一般式（Ｉ）中、ｐが１であり、−Ｇ−が−Ｏ−基、−Ｓ−基又は−（ＣＨ２ ）ｑ −（式中、ｑは３ないし５である。）基を表わし、且つＹが単結合を表わす請求項１，２又は３記載の化合物。
【請求項１１】
前記一般式（Ｉ）中、−ＮＨ−Ｊが、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、メソトレキセート、タモキシフェン、マイトマイシンＣ、フルオロウラシル、サイトアラビン、チオグアニン、アシクロビル、ガンシクロビル、アムフォテリシン、プリマキン、ウルソデオキシコリルリジルシステイン、ウルソデオキシコリルリジルシステイン酸、ウルソデオキシコリルリジルメチオニン、ウルソデオキシコリルリジル−グルタチオン（還元型）、ウルソデオキシコリルリジルメチオニンスルホン、アメソプテリン、アラビノシル−シトシン、Ｌ−システイン酸、システイン、Ｌ−システインスルフィン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチオニン、メチオニンスルホン、メチオニンスルホキシド、Ｌ−グルタチオン、Ｓ−アデノシル−ホモシステイン、Ｓ−アデノシル−メチオニン、８−アミノキノリン、チロロン（２，７−ビス［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］−９Ｈ−フルオレン−９−オン）、チロロン二塩酸のようなチロロン類似化合物、３，６−ビス［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−９Ｈ−キサンテン−９−オン二塩酸、２，７−ビス［ジメチルアミノアセチル］−９Ｈ−キサンテン二塩酸水和物、２，８−ビス［ジメチルアミノアセチル］−ジベンゾチオフェン二塩酸水和物及び２，８−ビス［ジメチルアミノアセチル］−ジベンゾフラン二塩酸水和物、メルファラン（４−（ビス［２−クロロエチル］アミノ）−Ｌ−フェニルアラニン、ペプチド、プロテイン及びヌクレオチドからなる群から選択された医薬として活性な化合物に基づいている請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
前記医薬として活性な化合物がドキソルビシン及びタモキシフェンから選択される請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、ヒオコール酸、α−，β−又はω−ムリコール酸、ノル−胆汁酸、リソコール酸、３β−ヒドロキシコーレノン酸、ウルソデオキシコール酸及びアロコール酸（５α−コーラン−２４−オイック酸）からなる群から選択されたステロイド部分を含む請求項１ないし１２の何れか一項記載の化合物。
【請求項１４】
前記ステロイド部分がコール酸、デオキシコール酸、リソコール酸、ウルソデオキシコール酸及びヒオコール酸から選択される請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
一般式（ＩＩＩ ）：
【化２】
2004504359.tif 000014
（式中、Ｇ及びＪは請求項１において定義されたものと同じ意味を表わす。）で表わされる化合物。
【請求項１６】
前記一般式（ＩＩＩ ）中、残基−ＮＨ−Ｊがドキソルビシンに基づいている請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
前記一般式（ＩＩＩ ）中、Ｇが請求項４ないし７の何れか一項において定義されたものと同じ意味を表わす請求項１５又は１６記載の化合物。
【請求項１８】
一般式（ＩＩ）：
【化３】
2004504359.tif 000015
（式中、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，ｎ，ｍ及びｐは請求項１において定義されたものと同じ意味を表わす。）で表わされる化合物をアミノ基を有する活性化合物と反応させ、前記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物のカルボキシル基と前記活性化合物のアミノ基との間にアミド結合を形成する工程を含む、請求項１において定義されたものと同じ意味を表わす一般式（Ｉ）で表わされる化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は医薬として活性な化合物、そして更に特別には、肝臓を標的とする医薬として活性な化合物に関するものである。
【０００２】
クレーマー，ダブリュー（Ｋｒａｍｅｒ Ｗ）他は１９９２年のジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），第２８７巻，第１８５９８〜１８６０４頁で、そしてＥＰ−Ｂ−０４１７７２５は、とりわけ、ステロイド環の３α−ＯＨ位で胆汁酸に結合し、胆汁酸のカルボキシル基と３α−ヒドロキシル基との間にエステル結合を形成するためのモデル薬としてのクロラムブチルを開示している。
【０００３】
同様に、ＥＰ−Ａ−０２３２７８８及びＵＳ４７９３９４９は、Ｎ−ハロアルキルカルバモイル基がステロイド環の３−ＯＨ位に結合している抗癌剤を開示している。
【０００４】
マーリン（Ｍａｒｉｎ） 他は１９９８年のインターナショナル　ジャーナル　オブ　キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ），７８号，第３４６〜３５２頁で、そしてマシアス（Ｍａｃｉａｓ）他は１９９８年のジャーナル　オブ　リピド　リサーチ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．），３９号，第１７９２〜１７９８頁で、グリココール酸のグリシン部分のカルボキシル基を介してグリココール酸に結合し、その結果、シスプラチン中の塩素原子の一つが失われたシスプラチンの合成を報告している。シスプラチン中の二つの塩素原子は、それらがＤＮＡと二官能性付加物を形成するので、薬効の点で非常に重要である。
【０００５】
マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ） 他は、１９９２年のニューヨーク，「アナルス　オブ　ザ　ニューヨーク　アカデミー　オブ　サイエンス（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ） 」，第６６０巻，第３０６〜３０９頁，ＸＰ００２１６２２５５で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的利用能を改良するための、アミノ結合体を使用するオリゴヌクレオチドＤＮＡホスホジエステル，ホスホジエステルＲＮＡ模造物及びホスホロチオエートに対するコール酸の結合を開示している。このように本発明においては、結合体と医薬的に活性な部分との間にはアミド結合が存在しない。
【０００６】
ステフェン（Ｓｔｅｐｈｅｎ） 他は、１９９２年のバイオケミカル　ファルマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．），４３号，第１９６９〜１９７４頁で、薬剤−胆汁酸錯体の合成を報告している。甲状腺ホルモンＬ−Ｔ３ は、コール酸のＣ２５カルボキシル基とＬ−トリヨードチロニンのアラニン側鎖のα−アミノ基との間のアミド結合を介して胆汁酸に結合していた。前記薬剤と前記胆汁酸との結合は、前記薬剤の薬効に関して重要であると考えられる前記薬剤のアミノ基の損失を生じさせる。
【０００７】
シー．オー．ミルズ（Ｃ．Ｏ．Ｍｉｌｌｓ） 他は、１９９１年の「ビオシミカ　エト　ビオフィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ） 」，第１１５号，第１５１〜１５６頁（ＷＯ９９／０７３２５参照）で、リジン分子のα−アミノ基を含むアミド結合によりリジル基がコリル基に結合しており、そしてフルオレセイン基がイソチオシアネート基を介してリジン分子のε−アミノ基に結合しているコリル−リジル−フルオレセインに基づく蛍光胆汁酸塩を開示している。シー．オー．ミルズ（Ｃ．Ｏ．Ｍｉｌｌｓ） 他（上記に同じ）は、胆汁産生及び肝抽出の際のコリル−リジル−フルオレセインと天然胆汁酸コリルグリシンとの間の同一性を記載しており、そして前記両化合物は同様の方法で取り扱われることを示唆している。シー．オー．ミルズ（Ｃ．Ｏ．Ｍｉｌｌｓ） 他による結論の一つは、より多い胆汁排出及び遊離フルオレセインに対するコリル−リジル−フルオレセインの肝抽出は、胆汁塩との結合が肝臓への標的化合物の有効な道筋であり得ると示唆することであるが、この点に関して特に教示されていない。
【０００８】
エム．ジェイ．モント（Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅ） 他は、１９９９年の「ジャーナル　オブ　ヘパトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ） 」，第３１号，第５２１〜５２８頁で、肝臓癌に対して細胞増殖抑制剤を運搬するための分子としての胆汁酸の使用を開示しており、そしてグリココール酸のカルボキシレート基にシスプラチンを結合させシス−ジアミンクロロコリルグリシネートプラチナ（ＩＩ）を製造することにより得られる抗癌性化合物を記載している。
【０００９】
肝臓を標的とする医薬的に活性な化合物であって、肝臓を標的とする部分と前記化合物の医薬的に活性な部分との間に、前記医薬的に活性な部分の有効性に悪影響を及ぼすこと無く強い結合が存在し、それにより、肝臓細胞の細胞内器官を標的とすることが可能な化合物を提供することが本発明の対象である。
【００１０】
本発明に従って、一般式（Ｉ）：
【化４】
2004504359.tif 000002
（式中、
Ａはα−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、
Ｂはα−Ｈ基又はβ−Ｈ基を表わし、
Ｃは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、或いはＢ及びＣは一緒になって二重結合を形成し、Ｄは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、
Ｅは−Ｈ基、α−ＯＨ基又はβ−ＯＨ基を表わし、
−Ｇ−は側鎖部分を表わし、
−ＮＨ−Ｊは、
（ｉ）アミノ基を含む活性化合物の残基であって、前記−ＮＨ−基が前記活性化合物の前記アミノ基により供与される残基、及び
（ｉｉ）アミノ基が付加された活性化合物の残基であって、前記−ＮＨ−基が前記付加されたアミノ基により供与される残基
から選択され、
Ｘ及びＹの各々は独立して単結合、−（ＣＨ２ ）ｚ −（式中、ｚは１ないし８である。）基、−Ｏ−基又は−Ｓ−基を表わし、
ｎは０又は１であり、
ｍは０又は１であり、そして
ｐは０又は１であるが、但し、
−ＮＨ−Ｊが（ｉ）を表わす場合、ｍは１である。）で表わされる肝臓を標的とする活性な化合物が提供される。
【００１１】
前記分子の残部に対するアミド結合は強いので、それはインヴィボにて開裂しない。この事は、前記医薬からインヴィボにて容易に開裂される胆汁酸に基づく前記医薬のための送達ビークルを提供することに基づく先の提案からの相当な逸脱を示す。従って、本発明は、医薬的に活性な化合物に結合したアミノ基（又は、−ＮＨ−Ｊの−ＮＨ−基を提供し得る他の基）の手段に関するものである。
【００１２】
医薬的に活性な化合物がそれ自体、−ＮＨ−Ｊの−ＮＨ−基を提供するアミノ基を含む場合（例えば、ドキソルビシンにおける場合）、基本的にｍは１であり、その結果、所望の基−（Ｇ）ｐ −を介して前記分子の残部に結合しているアミノ基は、前記医薬的に活性な化合物の結合した（且つそれ故、非官能性）アミノ基の機能を提供する。この場合、Ｇ及びＹは、得られた物の側鎖のＮＨ２ 基が−ＮＨ−Ｊの−ＮＨ−基に対して物理的に近隣にあり得、それにより、結合していない医薬的に活性な化合物に通常存在する結合していないアミノ基の効果を模倣するように選択されることが好ましい。
【００１３】
一つの−ＮＨ−基も有しない医薬的に活性な化合物の場合、このような基は分子中の好ましい位置に付加される。−ＮＨ−基が、医薬的に活性な化合物（例えば、タモキシフェン）に付加したアミノ基により提供される場合、従って、側鎖アミノ基が存在する必要はなく、それ故、この場合、ｍは０であってよい。この後の場合、前記医薬的に活性な化合物はそれ自体アミノ基を含み得るか又は含み得ないが、しかしアミノ基を含む場合、前記化合物と前記胆汁酸部分との間の結合には関与しないので、アミノ基は必要とされる機能を実施するために利用可能である。
【００１４】
残基−ＮＨ−Ｊは、抗生物質，利尿剤，ペプチド，抗ウィルス剤，抗癌剤，肝臓治療剤，抗高血圧剤，レニン阻害剤，プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤，インターフェロン誘導剤，ＤＮＡアンチセンス／センス及びリボザイムから選択されたどのような医薬的に活性な化合物に基づくものであってもよい。二者択一的に、−ＮＨ−Ｊは、ペプチド，プロテイン又はヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）に基づいてもよい。
【００１５】
例えば、−ＮＨ−Ｊは、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトキサントロン、メソトレキセート、タモキシフェン、マイトマイシンＣ、フルオロウラシル、サイトアラビン、チオグアニン、アシクロビル、ガンシクロビル、アムフォテリシン、プリマキン、ウルソデオキシコリルリジルシステイン、ウルソデオキシコリルリジル　システイン酸、ウルソデオキシコリルリジル　メチオニン、ウルソデオキシコリルリジル−グルタチオン（還元型）、ウルソデオキシコリルリジル　メチオニンスルホン、アメソプテリン、アラビノシル−シトシン、Ｌ−システイン酸、システイン、Ｌ−システインスルフィン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチオニン、メチオニンスルホン、メチオニンスルホキシド、Ｌ−グルタチオン、Ｓ−アデノシル−ホモシステイン、Ｓ−アデノシル−メチオニン、８−アミノキノリン、チロロン（２，７−ビス［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］−９Ｈ−フルオレン−９−オン）；チロロン二塩酸のようなチロロン類似化合物、３，６−ビス［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−９Ｈ−キサンテン−９−オン二塩酸、２，７−ビス［ジメチルアミノアセチル］−９Ｈ−キサンテン二塩酸水和物、２，８−ビス［ジメチルアミノアセチル］−ジベンゾチオフェン二塩酸水和物及び２，８−ビス［ジメチルアミノアセチル］−ジベンゾフラン二塩酸水和物、並びにメルファラン（４−（ビス［２−クロロエチル］アミノ）−Ｌ−フェニルアラニンに基づいてよい。
【００１６】
従って、本発明の化合物は主に、肝臓に対して都合良く標的化された活性化合物の肝臓への送達に関するものである。これらは以下のように分類され得る。
【００１７】
１．肝臓治療剤を標的とするための化合物。
２．胆汁分泌欠損症を治療するための薬剤を標的とするための化合物。
３．それ自身の機能の点では治療剤でない保護剤（例えば、放射性保護剤）を標的とするための化合物。
４．他のプロドラッグの局部的活性化のための酵素設計を標的とするための化合物（例えば、標的化された酵素により肝臓内で局部的に活性化された内部プロドラッグを投与することによる）。この事は、薬剤は胆汁酸部分に結合していないので、前記薬剤は急速に除去され得ないという潜在的な利益を有する。
５．肝臓内で効果的に代謝され通常利用可能な活性体を形成する薬剤を標的とするための化合物。
【００１８】
側鎖部分の場合、−Ｇ−は−（ＣＨ２ ）ｑ −（式中、ｑは１ないし８、好ましくは１ないし５、更に好ましくは３ないし５、そして最も好ましくは４である。）基を表わし得、或いはそれは−Ｏ−基又は−Ｓ−基を表わし得る。肝臓を標的とする胆汁酸部分に医薬的に活性な化合物を結合させている部分に側鎖アミノ基が存在する場合（即ち、ｍ＝１の場合）、部分−Ｇ−は通常、存在するのみである（即ち、ｐ＝１の場合）。ｐ＝１で且つ−Ｇ−が−Ｏ−基、−Ｓ−基又は−（ＣＨ２ ）ｑ −（この場合、ｑは３ないし５である。）基を表わす場合、Ｙは単結合を表わすことが好ましい。
【００１９】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物中のステロイド部分は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、ヒオコール酸、α−，β−又はω−ムリコール酸、ノル−胆汁酸、リソコール酸、３β−ヒドロキシコーレノン酸、ウルソデオキシコール酸、アロコール酸（５α−コーラン−２４−オイック酸）などに基づいてよい。
【００２０】
結合されたコール酸は比較的親水性であり、それ故、細胞内器官により積極的に取り込まれない。従って、それは急速な肝細胞移送を有する。他方、結合されたデオキシコール酸はコール酸より親水性に乏しく且つ一層細胞に浸入し、それ故、比較的遅い肝細胞移送を有する。それはアポトーシス様の性質を有し、そして胆管細胞（肝細胞）により捕捉される。それ故、抗癌剤に結合されている場合、デオキシコール酸は胆管癌（肝臓細胞癌）に対して標的化され得る。
【００２１】
結合されたリソコール酸は最も疎水性な胆汁塩であり、それ故、最も細胞浸入性である。それは細胞核により捕捉され、それ故、薬剤に結合された場合、前記細胞核に対して前記薬剤を標的化し得る。
【００２２】
結合されたウルソデオキシコール酸は強い親水性であり、それ故、細胞浸入性に乏しい。その肝細胞移送は、コール酸及びリソコール酸の肝細胞移送に対して中程度である。ウルソデオキシコーレートは抗胆汁分泌特性を有するので、抗胆汁分泌特性を有する薬剤に結合された場合、相乗的又は付加的機作により、それは前記薬剤の抗胆汁分泌能を向上させ得る。
【００２３】
更に本発明に従って、一般式（ＩＩ）：
【化５】
2004504359.tif 000003
（式中、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，ｎ，ｍ及びｐは上記において定義されたものと同じ意味を表わす。）で表わされる化合物をアミノ基を有する活性化合物と反応させ、前記一般式（ＩＩ）で表わされる化合物のカルボキシル基と前記医薬的に活性な化合物のアミノ基との間にアミド結合を形成する工程を含む、上記において定義されたものと同じ意味を表わす一般式（Ｉ）で表わされる化合物の製造方法を提供する。
【００２４】
本発明の好ましい化合物は一般式（ＩＩＩ ）：
【化６】
2004504359.tif 000004
（式中、Ｇ及びＪは上記において定義されたものと同じ意味を表わす。）で表わされる化合物である。
【００２５】
本発明をここで更に詳細に述べる。
【００２６】
実施例１
コリル−リジル−ドキソルビシン（ＶＩＩＩ）の合成
全反応スキーム
【化７】
2004504359.tif 000005
【化８】
2004504359.tif 000006
【００２７】
工程１−コリル−リジン−Ｎ−ε−ＦＭＯＣ （Ｖ）の製造
無水アセトン（１０ｃｍ３ ）及びトリエチルアミン（５００μＬ，３．５９ｍｍｏｌ）を化合物（ＩＶ），コール酸（１．４６ｇ，３．５７３ｍｍｏｌ）に−５℃で撹拌しながら反応容器中で２０分間添加し、その後−５℃ないし−１０℃の温度を保持しながら、イソブチルクロロカーボネート（０．５３４ｍＬ，１．３ｇ，４．５６ｍｍｏｌ）を液滴添加した。添加２０分後、１５℃で更に３０分間、この反応物を激しく撹拌した。水（８ｃｍ３ ，８ｇ）中の水酸化ナトリウム（０．１５３ｇ，３．８２５ｍｍｏｌ）を、Ｎ−ε−ＦＭＯＣ −Ｌ−リジン（３．５６８ｍｍｏｌ，１．３１４ｇ）に２５ｍＬコニカルフラスコ中で添加した。混合を開始し、そして透明溶液が形成されるまで（約２０分間）継続した。この溶液を上記コール酸混合物に急速に添加し、その後、最初＋４℃で１０分間激しく撹拌し、更に室温で更に５０分間撹拌した。
【００２８】
１ＭＨＣｌ（４．４３ｃｍ３ ）をこの反応混合物に添加して、最終ｐＨを約２とした。この酸性化した溶液を次いで、酢酸エチルを用いて（３×５０ｍＬ）分離ロート中で抽出した。混合した酢酸エチル抽出物を濾過し、次いで蒸留水（ｐＨ２）を用いて洗浄し、次いで硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、その後、ロータリーエバポレーター中で４０℃で蒸発乾燥させ、化合物（Ｖ），コリル−リジン−Ｎ−ε−ＦＭＯＣ を白色固体として得た。純度９０％，収率９７％。更なる精製はＴＬＣによった。
【００２９】
工程２−化合物（ＶＩＩＩ）への転換
化合物（ＶＩ），ドキソルビシン塩酸（２４ｍｇ，４０μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６μＬ，４０μｍｏｌ）を、３００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁した。２００μＬのＤＭＦに溶解した化合物（Ｖ），コリル−リジン−Ｎ−ε−ＦＭＯＣ （３４ｍｇ，４０μｍｏｌ）を添加した。０ないし２℃に冷却後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６ｍｇ，４０μｍｏｌ）を添加し、その後、１００μＬのＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド（８ｍｇ，４０μｍｏｌ）を添加した。この混合物を３０分間０℃で撹拌し、次いで１８時間室温（２１℃）で暗所にて撹拌した。形成された前記ＤＭＦ溶液を１００μＬの希釈酢酸溶液（１０ｍＬの蒸留水中１ｍＬの氷酢酸）を用いて酸性化した。この反応混合物を遠心し、 次いで上澄み液を捕集した。ジエチルエーテルを添加してガム状沈澱物を生成させ、その後、２００μＬのメタノールを添加し、次いで真空下で濃縮した。更に２００μＬのメタノールを添加し、そしてジイソプロピルエーテルを液滴添加することにより、化合物（ＶＩＩ ），コリル−リジル（ＦＭＯＣ ）ドキソルビシンをメタノール溶液から沈殿させた。コリル−リジル（ＦＭＯＣ ）ドキソルビシンをジエチルエーテルを用いて３回洗浄し、次いで真空下で２０分間徹底的に乾燥させた。コリル−リジル（ＦＭＯＣ ）ドキソルビシンを収率９８％、ＴＬＣにより純度９６％で製造した。
【００３０】
コリル−リジル（ＦＭＯＣ ）ドキソルビシンの穏やかな開裂を５％ピペリジン（２００μＬ）を使用して行ない、次いで１０分間室温で保温した。この反応を２０μＬの０．５ＭＨＣｌの添加により停止させ、その後、ジイソプロピルエーテルを添加することにより、化合物（ＶＩＩＩ），コリル−リジル−ドキソルビシンを収率９６％以上、ＴＬＣにより純度９４％以上で製造した。
【００３１】
化合物（ＶＩＩＩ）は質量分析計により決定された１０６２．５の分子量（化合物（ＶＩＩＩ）の質量並びにそのナトリウム付加物（分子量＝１０８４．５），炭素−１３同位体（分子量＝１０８５．４）及び炭素−１４同位体（分子量＝１０８６．４）の質量を示すマススペクトルである図１参照）を有する。化合物（ＶＩＩＩ）は、この時点では水、メタノール及びエタノールに可溶性であり、そしてエトキシエタンのような非極性溶媒に不溶性である。
【００３２】
インヴィトロ毒性試験
上記のように合成されたコリル−リジル−ドキソルビシン（ＶＩＩＩ）は、アポトーシス及びネクローシスの半定量的な測定を可能にする自然位置での末端標識法を用いて遊離ドキソルビシン及び遊離コーレート（コール酸塩）と比較して細胞毒性試験を実施した。
【００３３】
２４ウェル（穴）プレート中のＨｅｐＧ２細胞（コブラ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を使用した。ドキソルビシン、コーレート又はコリルーリジル　ードキソルビシン（０．８６μモルまでの様々な濃度で）は三重反復で添加され、そして４時間培養された。細胞はウェル・プレートからトリプシンで剥離し、細胞遠心して収穫して、そして冷凍保存された。
【００３４】
細胞の生存能を測定する為に、一部分を３０分間室温に迄暖め、アセトンで１０分間固定し、そしてそれからワックスが細胞の周囲に注がれた。
【００３５】
自然位置で末端標識された（ＩＳＥＬ）された陽性混合物は、緩衝液（１ｍＬ）、ｄＡＴＰ（１μＬ）、ｄＣＴＰ（１μＬ）、ｄＧＴＰ（１μＬ）、Ｄｉｇ１１　ｄＵＴＰ（１μＬ）及びクレノウＤＮＡポリマレーゼ（４μＬ）を含有して作られ、並びに自然位置で末端標識された、緩衝液（１ｍＬ）、ｄＡＴＰ（１μＬ）、ｄＣＴＰ（１μＬ）、ｄＧＴＰ（１μＬ）、Ｄｉｇ１１、２ｄＵＴＰ及び水（４μＬ）からなる陰性混合物も又作成された。各細胞遠心物及びカバースリップに６０μＬのＩＳＥＬ陽性混合物又は陰性混合物が添加された。これらはその後３７℃の水槽に１時間浮遊された。その後カバースリップを取り除き、そして蒸留水で３回、５分間づつ洗浄し、その後ｐＨ７．５のＴＢＳで５分間洗浄した。ＴＢＳで１：２００に希釈された抗ジゴシキゲン・アルカリフォスファターゼを添加し、そして室温で１時間保温し、それから引き続いてｐＨ７．５のＴＢＳで２．５分間洗浄し、その後にｐＨ８．２のＴＢＳで更に２．５分間洗浄した。基質混合物はナフトール燐酸（１０ｍｇ）、Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）、トリスｐＨ８．２（４９）、ＩＭレバマソール（１Ｍ　Ｌｅｖａｍａｓｏｌｅ）（５０μＬ）及び堅牢青（Ｆａｓｔ ｂｌｕｅ ）（５０ｍｇ）を含有するように作られた。
【００３６】
基質混合物は各々の細胞遠心物に添加され、そして１５分間発色させ、引き続いて蒸留水で洗浄し、そしてそれから検鏡板に固定した。
【００３７】
得られた結果を下の表１並びに付随する表２に纏めた。
【表１】
2004504359.tif 000007
表１から明かなように、化合物（ＶＩＩＩ）は０．０６ないし０．８６μＭの範囲の濃度では遊離ドキソルビシンの毒性と同様の毒性を示した。
【００３８】
インヴィボ胆管排出試験
コリル−リジル−ドキソルビシン（ＶＩＩＩ）、遊離ドキソルビシン及び遊離コーレートも又、下に記載したように胆管排出試験を実施した。
【００３９】
全ての動物実験は実験動物の維持及び使用に関するその地域の施設ガイドラインに従って実施した。１４Ｃ−ドキソルビシン（１４Ｃ―Ｄｏｘ）並びに１４Ｃ−コリル−リジル−ドキソルビシン（１４Ｃ−ＣｐｄＶＩＩＩ）の胆管排出をウイスター・ラットを使用して測定した。体重２５０ないし３００ｇのラットはペントバルビタールの腹腔投与により麻酔した（腹腔投与５０ｍｇ／ｋｇの体重）。開腹手術をし、共通胆管の上半分部分でポーテックス（Ｐｏｒｔｅｘ）ポリテン・チューブによりカニューレ（長さ２０ｃｍ、内径＝０．２９ｍｍ、外径＝６１ｍｍ、イギリス国，ロンドン所在のエイ．アール．ホーウェル（Ａ．Ｒ．Ｈｏｒｗｅｌｌ） 社製）を挿入した。動物の体温は直腸プローブによりモニターし、そして常温調節器により３７．５±０．５℃に維持した。実験動物（ｎ＝６）はその後右頚静脈を通じて生理食塩水に溶解した濃縮槐状の１４Ｃ―Ｄｏｘ（３００μＬ当たり１ｍｇ）又は１４Ｃ−ＣｐｄＶＩＩＩ（３００μＬ当たり２ｍｇ）を注射した。６０分間にわたり１０分毎に胆汁のアリコット（部分標本）を採取した。６０分後に心臓、肝臓、血液及び尿を、それらの１４Ｃ―Ｄｏｘ又は１４Ｃ−ＣｐｄＶＩＩＩの含有量の放射活性分析のために採取した。全ての胆汁のアリコットは基礎胆汁のバックグランドに対してシンチレーション・カウンターでその放射活性を分析した。
【００４０】
得られた結果は投与線量の放射活性の百分率として表現し、そして下記の表２及び３ａに纏めてある。
【表２】
2004504359.tif 000008
【表３】
2004504359.tif 000009
結果は付随する表３ａ及び表３ｂにも又纏めてある。
【００４１】
上記からも明かなように、化合物（ＶＩＩＩ）は遊離ドキソルビシンに比較して、急速に肝／胆系に移送されている。
【００４２】
更なる試験が、ウイスター・ラットの心臓、肝臓、尿及び血液に関して、試験された化合物の百分率を評価する為に実施された。結果は表３ｂと付随する表４に纏めてある。
【表４】
2004504359.tif 000010
【００４３】
表３ａ及び表３ｂから明かなように、投与後６０分の時点の後には、化合物（ＶＩＩＩ）は効果的に肝臓標的に達しており、それに反して遊離ドキソルビシンはその大部分が血液及び心臓にあり、殆ど肝臓には見つからない。
【００４４】
実施例２
実施例１の工程を繰り返すが、Ｎ−ε−ＦＭＯＣ −Ｌ−リジンの代わりに３．５６８ｍｍｏｌ（０．８７９ｇ）のＮ−ε−ｔＢＯＣ−Ｌ−リジンを使用して工程１にてコリル−リジン−Ｎ−ε−ｔＢＯＣを合成し、それを使用してその後工程２でコリル−リジル（ｔＢＯＣ）ドキソルビシンを合成し、実施例１の工程２に記載されている５％ピペリジンの代わりに酢酸エチル中の３ＭのＨＣｌを使って開裂して化合物（ＶＩＩＩ）が合成される。
【００４５】
実施例３
コール酸の代わりに等量のデオキシコール酸を使用して実施例２又は３と同様にして式（ＩＸ）の化合物を合成する。
【化９】
2004504359.tif 000011
【００４６】
実施例４
コール酸の代わりに等量のリソコール酸を使用して実施例１又は２と同様にして式（Ｘ）の化合物を合成する。
【化１０】
2004504359.tif 000012
【００４７】
実施例５
ドキソルビシン塩酸塩（２４ｍｇ、４０μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６μＬ、４０μｍｏｌ）を３００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁した。ウルソデオキシコリル−リジル−ＦＭＯＣ （３４ｍｇ，４０μＬ）を添加した。０ないし２℃に冷却した後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（８ｍｇ，４０μｍｏｌ）を添加し、引き続いて１００μＬ中のジシクロヘキシルカルボジイミド（８ｍｇ，４０μｍｏｌ）を添加した。混合物を暗所において０℃で３０分間、そして引き続いて室温（２１℃）で１８時間攪拌した。反応の終了時点で、混合物を濾過し、そして濾液にメタノール（４００μＬ）を添加した後に、ウルソデオキシコリル−リジル−ドキソルビシン−ＦＭＯＣ （ＵＣＬＤＦＭＯＣ ）を沈殿させるためにジイソプロピルエーテルを添加した。沈殿物をジイソプロピルエーテルで３回洗浄し、そしてその後にクロロホルム（１ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテルから沈殿して９０ないし９６％の収量で、９１ないし９４％の純度範囲でＵＣＬＤＦＭＯＣ を得た。
【００４８】
６ｍｇのＵＣＬＤＦＭＯＣ の穏やかな開裂を、室温にて５．５分間攪拌しながら２００μＬのＤＭＦ中のピペリジン（５μＬ）（即ち２．５％Ｖ／Ｖピペリジン）にて行い、ウルソデオキシコリル−リジル−ドキソルビシン（収率８９ないし９２％で純度９０ないし９２％）を得た。
【００４９】
実施例６
ウルソデオキシコリル−リジル−ＦＭＯＣ （３０．６ｍｇ，４０μＬ）の代わりに、デオキシコリル−リジル−ＦＭＯＣ （３０．６ｍｇ，４０μＬ）を使用して実施例５と同様にしてデオキシコリル−リジル−ドキソルビシン（収率８９ないし９２％で純度９０ないし９２％）を得た。
【００５０】
実施例７
ウルソデオキシコリル−リジル−ＦＭＯＣ （３０．６ｍｇ，４０μＬ）の代わりに、ハイヨコリル−リジル−ＦＭＯＣ （３４ｍｇ，４０μＬ）を使用して実施例５と同様にしてハイヨコリル−リジル−ドキソルビシン（収率８９ないし９２％で純度９０ないし９２％）を得た。
【００５１】
実施例８
ウルソデオキシコリル−リジル−ＦＭＯＣ （３０．６ｍｇ，４０μＬ）の代わりに、リソコリル−リジル−ＦＭＯＣ （３０ｍｇ，４０μＬ）を使用して実施例５と同様にしてリソコリル−リジル−ドキソルビシン（収率８９ないし９２％で純度９０ないし９２％）を得た。
【００５２】
実施例９
無水条件でＮ，Ｎ―ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はテトラメチレンスルホン（８ｍＬ）中の１０ｍｍｏｌ（３．７２ｇ）タモキシフェン（１−（ｐ−β―ヂメチルアミノエトキシフェニル）−トランス−１，２−ジフェニルブテ−１−エン）を、６ｍＬのＤＭＦ又はテトラメチレンスルホン中の０．４ｇのニトロニウムテトラフルオロ硼酸塩の溶液を攪拌しながら温度が１５℃と２５℃の間に維持されるように添加する。添加が終了した後にも、攪拌は３０分間２０℃と３５℃の間で継続する。反応混合物をその後注意深く冷水５ｍＬに注入する。有機層を分離し、水で２度洗浄し、そして塩化カルシウム上で乾燥する。過剰な芳香族基質を減圧下で溜去して硝酸塩タモキシフェンを得る。
【００５３】
硝酸塩タモキシフェンはその後酸（Ｈ３ Ｏ＋ ）中で塩化第一錫（ＳｎＣｌ２ ）と反応させ、次いで水酸化ナトリウムを添加してタモキシフェナミン（収率９２％）を得る。得られたタモキシフェナミンは、ドキソルビシンとコリル−リジン−ｔＢＯＣとの連結に関して上記実施例１又は２に記載されたと同様にして、コリル−リジン−Ｎ−ε−ＦＭＯＣ 又はコリル−リジン−Ｎ−ε−ｔＢＯＣと反応させる。５％ピペリジンを使用した穏やかな開裂はコリルリジルタモキシフェンを得、更にスルホン化して水中に溶解するコリルリジルタモキシフェンを得る。
【００５４】
比較例
コリルリジルＣＢＺＤオキソルビシン（ＣＬ（ＣＢＺ）−Ｄｏｘ）の合成
ドキソルビシン塩酸塩（４８ｍｇ，８０μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１２μＬ，８０μｍｏｌ）を６００μＬのＮ，Ｎ―ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁した。０．４ｍＬＤＭＦに溶解されたコリルリジン−Ｎ−ε−ＣＢＺ（６４ｍｇ，８０μｍｏｌ）を添加した。０ないし２℃に冷却した後、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１２ｍｇ，８０μｍｏｌ）を添加し、その後に０．２ｍＬＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド（１６ｍｇ，８０μｍｏｌ）を添加した。混合物を暗所で３０分間０℃で攪拌し、そしてその後室温（２１℃）で１８時間攪拌した。形成されたＤＭＦ溶液を２００μＬの希釈酢酸により酸性化した。遠心分離の後、上澄みを集め、そしてＣＬ（ＣＢＺ）−Ｄｏｘを酢酸エチルの添加により沈殿した。沈殿物を乾燥して９２％の収率でＣＬ（ＣＢＺ）−Ｄｏｘを得た。
【００５５】
細胞毒性試験
図５を参照すると、ラットの肝細胞のモノレイヤー細胞をクロム−５１（１．４８×１０５ Ｂｑ（４μＣｉ））と一緒に１８時間培養し、その後０．０１２ＭのＣＬ（ＣＢＺ）及びＣＬ（ＣＢＺ）−Ｄｏｘと培養した。上澄み液及び細胞の活性を測定した。クロム−５１の漏れが総活性（培養液＋細胞）の百分率として表される。値は平均＋／−標準偏差ＳＤである［ｎ＝５］。＊ ＝Ｐ＜０．００１ＣＬ（ＣＢＺ）／ＣＬ（ＣＢＺ）−Ｄｏｘ及びコントロール（クロム−５１との培養の後には何も添加しない）。
【００５６】
コントロール（３７．６１＋／−１．５６％）、ＣＬ（ＣＢＺ）−Ｄｏｘ（３６．４５＋／−３．７７％）及びＣＬ（ＣＢＺ）（４９．０１＋／−２．５７％）の間には統計的に有意な差は観察されなかった。これはコリル−リジル部分との結合において、アミド基を形成するのに使われたドキソルビシンのアミノ基を置換するために遊離アミノを供給する事が大切である事を意味する。
【００５７】
追加細胞毒性試験
コリル−リジル−ドキソルビシン（ＶＩＩＩ）は１２のヒト癌細胞株（巨細胞型肺癌細胞株Ｈ４６０、乳癌細胞株ＭＣＦ７、子宮癌細胞株ＵＸＦ　１１３８Ｌ、及び巨細胞型肺癌細胞株ＬＸＦＬ　５２９Ｌを含む）にてインヴィトロでの抗増殖活性を試験し、遊離ドキソルビシン及びコール酸をコントロールとして比較した。９６ウェル・プレートのウエル当たり５ないし２０，０００細胞を藩種した。２４時間後に化合物類が各々３ｎＭないし３０μＭ（コリル−リジル−ドキソルビシン及びコール酸）及び０．３ｎＭないし３μＭ（ドキソルビシン）の容量範囲で添加された。試験化合物との継続的な４日間の暴露の後に、細胞内ＤＮＡ含量を細胞数と一致する蛍光シグナルを出すプロピジウムヨージドを用いて決定した。
【００５８】
コリル−リジル−ドキソルビシンはドキソルビシンと同様な潜在活性を持っている事が判明した。コリル−リジル−ドキソルビシンの平均ＩＣ７０は、遊離ドキソルビシンの０．７μＭに比べて１．３μＭであった。コリル−リジル−ドキソルビシン及び遊離ドキソルビシンは細胞毒性において異なったパターンを示したが、これらの化合物の癌選択性は殆ど同じであった。コリル−リジル−ドキソルビシンに最も感受性の高い細胞株は、巨細胞型肺癌細胞株Ｈ４６０、乳癌細胞株ＭＣＦ７、子宮癌細胞株ＵＸＦ　１１３８Ｌ、及び巨細胞型肺癌細胞株ＬＸＦＬ　５２９Ｌであった。遊離コール酸はインヴィトロでは抗癌活性を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、化合物（ＶＩＩＩ）の質量並びにそのナトリウム付加物（分子量＝１０８４．５），炭素−１３同位体（分子量＝１０８５．４）及び炭素−１４同位体（分子量＝１０８６．４）の質量を示すマススペクトルを表わす図である。
【図２】図２は、各化合物の濃度（横軸）と死滅細胞％（縦軸）との関係を示す図である。
【図３ａ】図３ａは、各化合物における時間（横軸）と投与％（縦軸）との関係を示す図である。
【図３ｂ】図３ｂは、各化合物における時間（横軸）と投与％（縦軸）との関係を示す別の図である。
【図４】図４は、肝臓，心臓，尿及び血液における６０分時点での投与％を示す図である。
【図５】図５は、各試料におけるクロム−５１放出％を示す図である。
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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