(57)【要約】植物細胞核ゲノムへの目的ＤＮＡの選択的組込みをもたらす方法であって、（ｉ）植物細胞内で自律性の複製能を有する増幅ベクター又はその前駆体であって、該ベクターが、（ａ）植物細胞内で機能する複製起点をコードするＤＮＡ配列と、（ｂ）ベクターと宿主核ＤＮＡとの間の部位特異的かつ／又は相同的な組換えに必要なＤＮＡ配列と、（ｃ）任意に、さらなる目的ＤＮＡとを含むものを、植物細胞に供給する工程と、（ｉｉ）任意に、ベクターの増幅及び／又は細胞間移動及び／又は部位特異的かつ／又は相同的な組換えを促進する条件を与える工程と、（ｉｉｉ）植物核ＤＮＡにおける予定の部位で組換えを受けた細胞を選択する工程と、を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞の核ゲノム中に目的とするＤＮＡの選択的な組込みをもたらす方法において、
（ｉ）植物細胞内で自律性の複製能を有する、増幅ベクター又はその前駆体であって、該ベクターが、
（ａ）植物細胞内で機能する複製起点をコードするＤＮＡ配列（１個又は複数）と、
（ｂ）ベクターと宿主の核ＤＮＡとの間の部位特異的かつ／又は相同的な組換えに必要なＤＮＡ配列（１個又は複数）と、
（ｃ）任意に、さらに目的とするＤＮＡと
を含むものを、植物細胞に供給する工程と、
（ｉｉ）任意に、ベクターの増幅及び／又は細胞間移動及び／又は部位特異的かつ／又は相同的な組換えを促進する条件を与える工程と、
（ｉｉｉ）植物の核ＤＮＡ中における予定部位で組換えを受けた細胞を選択する工程と
を含む方法。
【請求項２】
植物細胞の核ゲノム中に目的とするＤＮＡの選択的組込みをもたらす方法であって、
（ｉ）植物細胞ゲノム中に組み込んだ際、部位特異的かつ／又は相同的な組換えのための標的部位をもたらす配列を含む第１のＤＮＡで、植物細胞をトランスフェクション又は形質転換する工程と、
（ｉｉ）その核ゲノム中に部位特異的かつ／又は相同的な組換えのための該標的部位を含む細胞を選択する工程と、
（ｉｉｉ）該標的部位の組換えのための領域と目的とする第１の配列を含む第２のＤＮＡで、該選択された細胞を、トランスフェクション又は形質転換する工程と、
（ｉｖ）任意に、組換えのための酵素を供給する工程と、
（ｖ）標的部位に組み込まれた、第２のＤＮＡからの目的配列を含む細胞を選択する工程とを含み、
これらの工程により、植物細胞内で自律性の複製能を有し、植物細胞内で機能する複製起点をコードするＤＮＡ配列（１個又は複数）を含む増幅ベクター又はその前駆体により、該第１又は該第２のＤＮＡの少なくとも１つが伝達される方法。
【請求項３】
植物細胞内の前記増幅ベクターの複製が、一過性である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅ベクターが、相同的組換えに必要なＤＮＡ（１個又は複数）を含む請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
植物細胞への増幅ベクター又はその前駆体の前記供給、或いは前記トランスフェクション又は形質転換が、アグロバクテリウム媒介伝達により行われる請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
植物細胞への増幅ベクター又はその前駆体の前記供給、或いは前記トランスフェクション又は形質転換が、ウイルスによる直接トランスフェクションにより行われる請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
植物細胞への増幅ベクター又はその前駆体の前記供給、或いは前記トランスフェクション又は形質転換が、非生物学的伝達により行われる請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
植物細胞への増幅ベクター又はその前駆体の前記供給、或いは前記トランスフェクション又は形質転換が、植物の核ＤＮＡ中に予め組み込まれたベクター又はプロベクターＤＮＡの変換で、自律的に複製するプラスミドを形成することにより行われる請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅ベクターが、２つの複製起点を有するその前駆体から放出される請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅ベクターが、ＤＮＡウイルス由来のベクターである請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅ベクターが、ＲＮＡウイルス由来ベクターのＤＮＡコピー又は複製中間体である請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅ベクターが、レトロトランスポゾン起源である請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅ベクターが、逆転写、宿主感染力、細胞間及び／又は全身性の移動、宿主染色体への組込み、ウイルス粒子構築、宿主による発現抑制の制御、宿主の生理機能の制御のための機能を含む、他のウイルス機能をさらに有する請求項１０から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
植物細胞内で機能する前記複製起点が、植物の核ゲノムに由来する請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
植物細胞内で機能する前記複製起点が、リボソームＤＮＡの遺伝子間スペーサー領域に由来する請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
植物細胞内で機能する前記複製起点が、合成物である請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複製起点が、植物ウイルスに由来する請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記相同的又は部位特異的な組換えが、片側性である請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記相同的又は部位特異的な組換えが、両側性である請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記部位特異的組換えが、部位特異的組換え酵素、制限酵素、インテグラーゼ、リゾルベースの群から選択される組換え酵素により促進又は助長される請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記相同的組換えが、ＲｅｃＡ様タンパク質、ＨＯタイプの希少切断エンドヌクレアーゼ、Ｉ−Ｓｃｅｌエンドヌクレアーゼの群から選択される組換え酵素により促進又は助長される請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅ベクターが、組換えのプロセスにおいて構築される請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のＤＮＡが、工程（ｉｉ）の選択のための選択マーカーを含む請求項２から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のＤＮＡが、目的とする第２の配列をさらに含む請求項２から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１及び前記第２のＤＮＡの組換えが、機能的な配列を設置する請求項２から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１及び前記第２のＤＮＡのそれぞれが、前記組換えの結果として選択マーカーを形成する、選択マーカー断片をさらに含む請求項２から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２のＤＮＡが、増幅ベクター又はその前駆体により伝達される請求項２から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｉ）及び（ｉｉ）で植物に導入された配列の機能が、工程（ｉｉｉ）から（ｖ）までに破壊される請求項２から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
非相同的組換えに関与する遺伝子の発現が阻害又は抑制される請求項１から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
組換えの最終結果が、位置指定突然変異である請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から３０の何れか一項の方法を、１回又は複数回実施することにより得られる、又は得られえる植物細胞、種子及び植物体。
【請求項３２】
請求項２の工程（ｉ）及び（ｉｉ）の方法を、任意に、請求項２３から２８の何れか一項の方法に関連して、１回又は複数回実施することにより得られる、又は得られえる植物細胞、種子及び植物体。
【請求項３３】
請求項１から３０の何れか一項に記載の方法を実施するためのベクター又はプロベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクター又はプロベクターを含むアグロバクテリウム細胞。
【請求項３５】
請求項３３に記載のベクター又はプロベクターを含むパッケージされたウイルス粒子。
【請求項３６】
（ｉ）請求項３２に記載の植物細胞、種子及び植物体、並びに
（ｉｉ）請求項３３に記載のベクター又はプロベクター及び／又は請求項３４に記載のアグロバクテリウム細胞及び／又は請求項３５に記載のウイルス粒子
を、構成部材として含むキット。
【請求項３７】
請求項２の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を実施するためのベクター又はプロベクター、並びに請求項２の工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を実施するためのベクターを、構成部材として含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の遺伝的修飾に関する。特に、本発明は、植物細胞核ゲノムへＤＮＡを部位選択的に組込む方法に関する。本発明はさらに、そのような方法に用いるベクター並びにそれにより生産される植物細胞、種子及び植物体に関する。また、本発明の方法を実施するための複数の構成部材からなるキット（a Kits-of-parts）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物分子遺伝学及び植物機能ゲノム学の分野における現在の研究レベルでは、植物形質転換は、植物の改良にとってますます重要なツールとなっていると思われる。現在の形質転換の手順においては多くの制限があるが、現在用いられている技術の最も重要な欠点の一つとしては、標的遺伝子の宿主ゲノムへの不規則な挿入をもたらし、次いで非制御的な伝達と予測不能なレベルの導入遺伝子の発現をきたすことがある。その結果、既存の方法で、望ましいレベル又はパターンの発現を有する形質転換植物を見出すには、数世代にわたり産生され分析される、多数の独立した形質転換植物を必要とする。
同一部位へ後から形質転換することは不可能なので、そのような非選択的な形質転換のためのベクターは、必然的に全発現単位を含まなければならず、そのため、そのプロセスにおいては遺伝子工学的性能が限定される。ゲノムにおける特定部位でのＤＮＡの効率的なターゲティングを行なうためのプロトコールを開発する試みとして、多種のアプローチが検討されている。これらの検討成果は以下のとおりである。
（ｉ）組換え／修復に関与するいくつかの酵素を過剰発現させることにより、相同的組換え（内因性細胞性組換え機構に依拠する）の方法を改善する試み
（ｉｉ）非特異的な組換えに寄与する酵素を抑制的に制御することにより、非選択的な組換えを低減する試み
（ｉｉｉ）微生物起源の異種組換え酵素の使用、
（ｉｖ）植物における選択的なＤＮＡ修飾のためのキメラ形成の開発
【０００３】
以下に、これら検討成果について簡単に説明する。
【０００４】
相同的組換えは、細菌及び酵母において容易に起こり、遺伝子置換実験に用いられている。最近では、哺乳類（マンソアら（Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３３６巻、３４８〜３３６ページ、トーマスら（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８６年、Ｃｅｌｌ、第４４巻、４１９〜４２８ページ、トーマスら（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８７年、Ｃｅｌｌ、第５１巻、５０３〜５１２ページ）及びコケＰｈｙｓｃｏｍｙｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ（シェファー及びジリド（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ＆  Ｚｒｙｄ、１９９７年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第１１巻、１１９５〜１２０６ページ）における、遺伝子置換ツールとして開発された相同的組換え技術がある。しかしながら、相同的組換えは植物では非効率的である。相同的組換えによる選択的ＤＮＡ修飾は、標的部位と相同性の領域を共有する線状ＤＮＡ分子を細胞に導入することによって達成される。相同的組換えは、ＤＮＡ断片の末端における２本鎖損傷により誘発された修復メカニズムの結果として起こる。また、残念ながら、多くの生物及び／又は細胞型で、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）と呼ばれる競合的修復メカニズムが、非常に高頻度で起こるため、選択的に所望の部位選択的な組換えを起こすことが困難である（ハーバー（Ｈａｂｅｒ）、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１２巻、２８６〜２９２ページ、ハーバー（Ｈａｂｅｒ）、２０００年、ＴＩＧ、第１６巻、２５９〜２６４ページ、メンギステ及びパスズコウスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）、１９９９年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第３８０巻、７４９〜７５８ページ）。高等植物では、相同的組換えによる選択的な形質転換の成功例についての報告は、極僅かにすぎず、その成功例のすべてにおいて、非選択的組換えに対して選択的組換えを生じる効率は、１０−３〜１０−５の範囲であった（パスズコウスキーら（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、ＥＭＢＯ  Ｊ．第７巻、４０２１〜４０２６ページ、リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、第２巻、４１５〜４２５ページ、ミアオ及びラム（Ｍｉａｏ  ＆  Ｌａｍ）、１９９５年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第７巻、３５９〜３６５ページ、オフリンガら（Ｏｆｆｒｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年、ＥＭＢＯ  Ｊ．第９巻、３０７７〜３０８４ページ、ケムピンら（Ｋｅｍｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、第３８９巻、８０２〜８０３ページ）。これは、スクリーニングに、非常に多数の植物が必要であり、時間と費用の面で非常に無駄が多いこととを意味する。そして、このようなスクリーニングは、多くの場合に無益な努力となるであろう。
【０００５】
相同的組換えの頻度を増加させる試みがなされている。２本鎖損傷修復に関与するいくつかの酵素を過剰発現させたものがあり、例えば、タバコにおける大腸菌ＲｅｃＡタンパク質（レイスら（Ｒｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９３巻、３０９４〜３０９８ページ）又は大腸菌ＲｕｖＣタンパク質（シャレフら（Ｓｈａｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９６巻、７３９８〜４０２ページ）の過剰発現が試みられている。しかし、これは、染色体内相同的組換えの増加（約１０倍の）引起こすものにすぎず、遺伝子選択性（ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を増加するものではなかった（レイスら（Ｒｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９７巻、３３５８〜３３６３ページ）。相同的組換えを増加させる他のアプローチを用いるものとしては、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ（チウラジら（Ｃｈｉｕｒａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、第８巻、２０５７〜２０６６ページ、ルーングら（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９４巻、６８５１〜６８５６ページ）又は酵母Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ（プチタら（Ｐｕｃｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．第９３巻、５０５５〜５０６０ページ）のような希少切断性のエンドヌクレアーゼ（ｒａｒｅ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて、ゲノムの遺伝子工学処理部位で２本鎖損傷を誘発するものがある。Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼを用いて２×１０−３〜１８×１０−３の標的部位選択率が得られた。この方法は、選択性が改善されてはいるが、依然として非効率的なものである。さらに、この選択的組換えの多くは、望ましくない突然変異を含んでいたり、損傷した部位の１の末端のみでの相同的組換えにより発生するものであった。因みに、興味深い最近の刊行物において、相同染色体間の有糸分裂組換えを３桁のレベルで増加することを示されている高効率組換え性のタバコ突然変異体が記載されている。しかし、この刊行物は、関与遺伝子をまだ特定しておらず（ゴルブノバら（Ｇｏｒｂｕｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第２４巻、６０１〜６１１ページ）、選択的組換えに関係するものではない。
【０００６】
他のアプローチとしては、相同的組換え／非相同的組換えの比を増加させるために、非相同的末端結合に関与する酵素（例えば、Ｋｕ７０）の活性を低下させること（米国特許第６，１８０，８５０号）からなるものがある。しかし、このアプローチは、到底、実用的なものと言えるものでなかった。
【０００７】
最近、キメラ形成と呼ばれるアプローチが開発されているが、このアプローチは、標的遺伝子に単一ヌクレオチド突然変異を導入するためにＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いることからなる。このアプローチは、哺乳類細胞においては非常に効率がよく（ユーンら（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３巻、２０７１〜２０７６ページ、クレンら（Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９６巻、１０３４９〜１０３５４ページ、バートレットら（Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．第１８巻、６１５〜６２２ページ）、成功率は４０％を超えている。残念なことに、効率は植物でははるかに低く（ズーら（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９６巻、８７６８〜８７７３ページ、ビーサムら（Ｂｅｅｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９６巻、８７７４〜８７７８ページ、ズーら（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第１８巻、５５５〜５５８ページ、国際出願第９９２５８５３号）、１０−５〜１０−７の頻度に達するにすぎない。植物系において、キメラ形成アプローチを用いるさらなる重大な欠点としては、当該アプローチが、単一ヌクレオチドの突然変異の導入に制限されるとともに、導入された突然変異が選択可能な表現型をもたらす特定の場合に限定されることである。
【０００８】
他のアプローチとしては、微生物起源の異種部位特異性の組換え酵素を用いるものがある。これらの組換え酵素を用いる場合、標的とされるＤＮＡ配列だけでなく、標的部位についても、それらの各々の側に特異的組換え部位を含めなければならない。現在までのところ、このアプローチは、著しく制限された条件によるため、ほとんど実際的な有用性をもたらすものではない。そのような系の例としては、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ−Ｌｏｘ系（オースチンら（Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８１年、Ｃｅｌｌ、第２５巻、７２９〜７３６ページ）、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦｌｐ−Ｆｒｔ系（ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８２年、Ｃｅｌｌ、第２９巻、２２７〜２３４ページ）、ザイゴサカロミセスロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）のＲ−ＲＳ系（アラキら（Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１８２巻、１９１〜２０３ページ）及びストレプトミセスファージＰｈｉＣ３１のインテグラーゼ（ソープ及びスミス（Ｔｈｏｒｐｅ  ＆  Ｓｍｉｔｈ）、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９５巻、５５０５〜５５１０ページ、グロスら（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９７巻、５９９５〜６０００ページ）などがある。野生型Ｌｏｘ部位（ＬｏｘＰ部位）は、８ｂｐ非対称コア配列の両側に隣接する１３ｂｐ逆方向反復配列からなっている。コア領域の非対称性は、当該部位に方向性を与える。ＬｏｘＰ部位間の組換えは、ＬｏｘＰ部位の位置と配向によって、欠失、挿入又は転位をもたらし得る可逆反応である。植物では、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系が、欠失（ベイレイら（Ｂａｙｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１８巻、３５３〜３６１ページ）、逆位（メドベリーら（Ｍｅｄｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．第２３巻、４８５〜４９０ページ）、転位（キンら（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９１巻、１７０６〜１７１０ページ、バーグンストら（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、第１０９巻、２８７〜２９７ページ）、植物染色体への環状ＤＮＡの挿入（アルバートら（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第７巻、６４９〜６５９ページ）、染色体アームの種間転座（ヘザーら（Ｈｅａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第２３巻、７１５〜７２２ページ）及び形質転換後の選択遺伝子の除去（デール及びオウ（Ｄａｌｅ  ＆  Ｏｗ）、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８８巻、１０５５８〜６２ページ、ズオら（Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１９巻、１５７〜１６１ページ）をもたらすために使用された。選択的形質転換にＣｒｅ−Ｌｏｘ系（又は同様な組換え系）を用いる際に遭遇する問題の一つとしては、ＤＮＡの挿入に引き続き、その除去が起こり得ることである。実際、ＤＮＡの挿入は２��子反応であるのに対し、除去は単一分子での部位の組換えを要するものであるため、除去は挿入よりもはるかに高い効率で起こる。この問題に対処するために、一過性にＣｒｅを発現させたり、挿入によってＣｒｅコード配列を置換してその配列を不活性化したり、突然変異部位を使用したりする、多くのアプローチが考案されている（アルバートら（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第７巻、６４９〜６５９ページ、バーグンストら（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第３８巻、３９３〜４０６ページ、米国特許第６，１８７，９９４号）。ストレプトミセスファージＰｈｉＣ３１インテグラーゼのような、一部の部位特異的組換え酵素は、組換えが不可逆的に生じるため（逆反応は異なる酵素により行われる）、理論的には同じ問題を生じないはずである（ソープ及びスミス（Ｔｈｏｒｐｅ  ＆  Ｓｍｉｔｈ）、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９５巻、５５０５〜５５１０ページ、しかし、それらは動物に限定される）が、植物細胞におけるこの組換え系の使用はまだ確認されていない。部位特異的組換え系を実際に魅力のないものとする他の欠点が存在するからである。即ち、第１に、受容体（レシピエント）のゲノムにおけるランディング又はドッキング部位を設計する必要があるが、その設計は、現在、植物ゲノムへの組換え部位の不規則な挿入により行われており、このような設計は、部位特異的組込みのほとんどの利点を失わせてしまう。第２に、望ましい組換え頻度は、依然として、特に経済的に重要な農作物において非常に低く、その結果、その使用はタバコ及びシロイヌナズナに限定されている。植物細胞における組換え酵素の発現は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ又はＦｌｐ−ｆｒｔのような一般的に用いらる系で回避することができない問題である、毒性の問題を生じる。
【０００９】
国際出願第９９／２５８５５号及び対応媒介米国特許第６，３００，５４５号は、植物細胞において高コピー数のウイルスレプリコンを得るために、部位特異的組換えを媒介とする除去により、アグロバクテリウム伝達Ｔ−ＤＮＡのウイルスレプリコンを動態化する方法を開示している。前記の高コピー数は、部位特異的な組換えを用いて植物染色体へ目的ＤＮＡを部位選択的に組込む上で有用であると推測される。しかし、この開示は、この推測について、どのようにして試験するかについての情報が含まれておらず、この開示に示される実施例は、部位選択的組込みに関連するものでない。さらに、この実施例は、細胞に部位選択的な組込みを受ける細胞を提示するものではなく、感染細胞の腐朽を示唆する若葉の基部における黄色の斑及び縞の発生といったウイルス感染の徴候を示す植物を提示するものにすぎない。したがって、これらの文献の教示は、ウイルスベクターによって細胞破壊を生じる細胞の感染に限定されている。これら文献の教示は、単に、成功裡の部位選択的な組込みを選択させることのみであり、核ゲノムへの組込みが起こったか否かについての判断を可能とするものではない。これは、その文献が部位選択的形質転換細胞を回収するための選択方法の開示を含んでいないという事実により強調される。核ゲノムに部位特異的に取り込まれた目的の前記ＤＮＡを含むトランスジェニック子孫細胞の選択及び回収は、これらの参考文献の教示によっては全く不可能である。さらに、国際出願第９９／２５８５５号及び米国特許第６，３００，５４５号は、この問題について言及していない。さらに、これらの文献は、相同的組換えについて言及していない。さらに、この方法は、アグロバクテリウムを介してのレプリコン伝達に限定されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の課題は、実用的な用途において十分に効率的な、植物の選択的な形質転換方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる課題は、組込み結果の回収、即ち、植物核ＤＮＡにおいて組換えを受けた細胞の選択を可能にする、植物細胞核ゲノムへ目的とするＤＮＡを選択的に組込む方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる課題は、相同的組換えにより植物細胞核ゲノムへ目的とするＤＮＡを選択的に組込む方法を提供することである。
【００１３】
したがって、本発明のさらなる課題は、アグロバクテリウムを媒介とする方法とは無関係の伝達方法による、植物細胞核ゲノムへ目的とするＤＮＡを選択的に組込む方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の課題は、植物細胞核ゲノムへの目的ＤＮＡの選択的組込みをもたらす方法において、
（ｉ）植物細胞内で自律性の複製能を有する増幅ベクター又はその前駆体であって、該ベクターが、
（ａ）植物細胞内で機能する複製起点をコードするＤＮＡ配列と、
（ｂ）増幅ベクターと宿主核ＤＮＡとの間の部位特異的かつ／又は相同的な組換えに必要なＤＮＡ配列と、
（ｃ）任意に、さらなる目的ＤＮＡと
を含むものを、植物細胞に供給する工程と、
（ｉｉ）任意に、ベクターの増幅及び／又は細胞間移動及び／又は部位特異的かつ／又は相同的な組換えを促進する条件を与える工程と、
（ｉｉｉ）植物核ＤＮＡの予定の部位で組換えを受けた細胞を選択する工程とを含む方法、により解決される。
【００１５】
さらに、植物細胞核ゲノムへの目的ＤＮＡの選択的組込みをもたらす方法において、
（ｉ）植物細胞ゲノムに組み込んだ際、部位特異的かつ／又は相同的な組換えのための標的部位を供与する配列を含む第１のＤＮＡで、植物細胞をトランスフェクション又は形質転換する工程と、
（ｉｉ）その核ゲノム中に、部位特異的かつ／又は相同的な組換えのための該標的部位を含む細胞を選択する工程と、
（ｉｉｉ）該標的部位を有する組換えのための領域および第１の目的配列を含む第２のＤＮＡで、該選択された細胞を、トランスフェクション又は形質転換する工程と、
（ｉｖ）任意に、組換えのための酵素を供給する工程と、
（ｖ）標的部位に組み込まれた第２のＤＮＡから、目的配列を含む細胞を選択する工程とを含み、
これらの工程により、植物細胞内で自律性の複製能があり、植物細胞内で機能する複製起点をコードするＤＮＡ配列を含む増幅ベクター又はその前駆体で、該第１のＤＮＡ又は該第２のＤＮＡの少なくとも１つを伝達する方法が提供される。
【００１６】
さらに、本発明は、これらの方法を実施することにより得られる又は得られうる植物細胞、種子及び植物体、並びにこれらの方法を実施するためのベクター（増幅ベクター）又はプロベクター（前駆体）を提供する。さらに、本発明は、当該ベクター又はプロベクターを含む、アグロバクテリウム細胞及びパッケージされたウイルス粒子を提供する。
【００１７】
最後に、本発明は、
（ｉ）特に、上記５工程のプロセスの工程（ｉ）及び（ｉｉ）によって得られる植物細胞、種子及び植物体と、
（ｉｉ）本発明によるベクター又はプロベクター、並びに／或いは前記アグロバクテリウム細胞及び／又はパッケージされたウイルス粒子と
を構成部材として含むキットを提供する。
【００１８】
また更に、上記５工程プロセスの（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を実施するためのベクター又はプロベクターと、当該プロセスの（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の工程を実施するためのベクターとを構成部材として含む、キットを提供する。
【００１９】
驚くべきことに、植物細胞の部位選択的形質転換の効率が、増幅ベクターによる部位特異的かつ／又は相同的な組換えのためのＤＮＡ配列を供給させることにより著しく改善できることが見い出された。この改善の正確な理由は、今のところ明らかではないが、標的配列のコピー数の増加に起因すると思われる。非増幅性ベクターを用いる場合と対照的に、増幅ベクターを用いることにより部位選択的挿入の顕著な増加を実証する実施例を提示している。より一層驚くべきことは、このコピー数の増加が、同時に、核ゲノムへの標的とする配列の非選択的又は不規則な挿入の頻度を増加させないことである。その結果、不規則な挿入の頻度に対する選択的な挿入の頻度の比は、本発明による方法により著しく増加する。非常に重要なことは、選択的形質転換が、もはや植物バイオテクノロジーにおける常用の方法になるほどのレベルの効率を達成していることである。
【００２０】
しかし、増幅ベクターの高コピー数は、疾患症状、細胞分裂の妨害、最終的には感染細胞の死滅をもたらすので、増幅ベクターの複製は、組込みの選択を困難又は不可能にする。その結果、核ゲノムに組み込まれた目的ＤＮＡを含む子孫細胞を得ることができない。したがって、発明者らは、次の難題に直面した。すなわち、一方で、効率的な部位選択的な組込みは、ベクターの複製を必要とし、他方で、当該複製は、植物核ＤＮＡにおける組換えを受けた細胞の選択を妨げる、という難題である。
【００２１】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、この難題を解決する方法を突きとめた。好ましくは、本発明の方法は、前記増幅ベクターで形質転換又はトランスフェクションした細胞内の前記増幅ベクターの複製が一過性となるように設計される。一過性の複製とは、一時的な複製、すなわち、前記細胞内の相同的及び／又は部位特異的な組換え、並びに核ゲノムへの前記目的ＤＮＡの組込みを達成又は検出するのに必要限度の期間継続する複製を意味する。増幅ベクターの一過性の複製は、選択可能な子孫細胞を生ずるように前記細胞の分裂能を妨害しないことが望ましい。好ましい増幅ベクターは、子孫細胞内で消滅するものである。後述で、本発明による子孫細胞の選択の成功を実証する実施例を示す。
【００２２】
増幅ベクターの一過性の複製は、いくつかの方法により達成することができる。１つの可能性は、ポリメラーゼが消失するときに複製が停止するような、増幅ベクターの一時的な複製に関与する核酸ポリメラーゼ（レプリカーゼ）を供給することである。これは、レプリカーゼ遺伝子を非複製ベクターで植物細胞に供給することによって行うことができる（実施例６を参照）。好ましくは、当該非複製ベクターを維持するために用いる選択圧力を、この目的のために軽減する。さらに、複製は、組換えの結果として（実施例１３を参照）、例えばレプリカーゼ遺伝子を非発現性とすることにより、停止又は減少させることができる。
【００２３】
本発明はさらに、植物細胞ゲノムへの目的ＤＮＡの選択的組込みをもたらす方法において、
（ｉ）植物細胞内で自律性の複製能を有する増幅ベクター又はその前駆体であって、該ベクターが、
（ａ）植物細胞内で機能する複製起点をコードするＤＮＡ配列と、
（ｂ）該増幅ベクターと宿主核ＤＮＡとの間の相同的組換えに必要なＤＮＡ配列と、
（ｃ）任意に、さらなる目的ＤＮＡと
を含むものを、植物細胞に供給する工程と、
（ｉｉ）任意に、ベクターの増幅及び／又は細胞間移動及び／又は部位特異的かつ／又は相同的な組換えを促進する条件を与える工程と、
（ｉｉｉ）植物核ＤＮＡの予定部位で組換えを受けた細胞を選択する工程と
を含む方法を提供する。
【００２４】
植物細胞内で増幅するために、本発明において使用する増幅ベクターは、植物細胞内で機能する複製起点を有さなければならない。複製起点は、植物核ゲノム由来、例えば、リボソームＤＮＡ遺伝子間スペーサー領域由来であってよい。或いは、複製起点は、非植物起源又は合成のものであってもよい。好ましくは、複製起点は、植物ウイルス由来、最も好ましくはＤＮＡウイルス由来のものである。複製起点は、細胞内で複製酵素（ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ）により認識されるならば、細胞内で機能する。複製酵素は、複製起点と同じ起源のものであることが好ましい。複製酵素が形質転換される植物種に由来する場合、前記細胞に外来複製酵素を供給する必要はない。ベクター増幅を促進するためには、特に前記複製起点が前記植物細胞と異なる起源に由来する場合、複製酵素を供給してもよい。この酵素は、増幅ベクター上、別のベクター上にコードさせることができ、或いは植物核ゲノムに組み込むことができる。
【００２５】
増幅ベクターは、植物ウイルス由来のベクターであってよく、増幅ベクターは、ＲＮＡウイルスから得ることができる。この場合、増幅ベクターは、好ましくはＲＮＡウイルス由来ベクターのＤＮＡコピー又は複製中間体である。但し、ベクターは、ＤＮＡウイルスから得ることが好ましい。ベクターは、そのようなウイルスの少なくとも１つの機能的な要素を含む場合、ＲＮＡ又はＤＮＡウイルス由来であると考えることができる。好ましくは、そのような機能的な要素は、そのウイルスの複製酵素（ポリメラーゼ）により認識される複製起点である。
【００２６】
ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）は、本発明を実施するという目的に特によく適している。増幅ベクターは、更に、宿主感染、植物全体に広がるための細胞間及び／又は全身性の移動、並びに選択的形質転換の頻度のさらなる増加のためのウイルス機能をコードする他の配列を有することが好ましい。増幅ベクターは、宿主染色体への組込み、ウイルス粒子構築、宿主による遺伝子発現抑制の制御及び／又は宿主の生理機能の制御のような機能をもたらすためのさらなる配列を有していてよい。或いは、そのような追加のウイルス機能は追加のベクターに備えさせてもよい。追加のベクターは複製ベクターであってもよい。追加のベクターは、追加のウイルス機能が一過性のみに発現するような非複製ベクターであることが好ましい。これにより、植物の疾患症状を低減することができる。さらに、増幅ベクターは、レトロトランスポゾン起源のものであってよい。
【００２７】
増幅ベクターはさらに、目的ＤＮＡ配列、例えば、有用な形質を与えるため、突然変異誘発を行う等のために発現させる遺伝子を含んでいてよい。
【００２８】
前記部位特異的又は相同的な組換えは、増幅ベクターと宿主核ＤＮＡとの間で起こる。前記宿主核ＤＮＡは、宿主の核染色体に属していてもよく、或いはエピソーム核ＤＮＡに属していてもよい。当該組換えは、増幅ベクターと宿主の核染色体上のＤＮＡとの間で起こることが好ましい。
【００２９】
部位特異的又は相同的な組換えを促進するために、部位特異的組換え酵素、制限酵素又はインテグラーゼのような適切な組換え酵素を、追加のベクター又は前記植物に予め組み込んだ遺伝子から供給することができる。そのような追加のベクターは、増幅ベクターとともに同時に形質転換させるか、又は別個に形質転換させることができる。組換え酵素の発現は構成性又は誘導性であってよい。組換え酵素は、例えば、非複製ベクターから一過性のみに発現させることが好ましい。組換え酵素が核ゲノムの標的遺伝子座に存在する場合、その機能は、組換えの結果として破壊することができる。
【００３０】
相同的組換えの場合、組換え酵素は外部から供給してはならず、この過程は内因性組換えに依拠させる。しかし、その効率は、相同的組換えを促進するための組換え酵素をさらに供給することによりさらに増加させることができる。そのような酵素は、前記植物の酵素、異種酵素又は工学的に処理した酵素であってよい。
【００３１】
相同的組換えを、植物の核ゲノムへの目的ＤＮＡの選択的組み込みのために用いる場合、望ましい組換えのために選択される適切な選択手段が存在する限り、核ゲノムにおけるあらゆる部位を標的とすることができる。選択は、抗生物質又は阻害剤耐性をもたらす突然変異を導入若しくは耐性マーカー遺伝子を供給することにより、達成することができる。より多くのゲノム配列が知られるようになるにつれて、相同的組換えにより望ましい部位を標的とすることがより広く適用できるようになる。
【００３２】
選択的相同的組換えの好ましい実施形態は、植物核ゲノムの遺伝子における位置指定突然変異誘発である。この目的のために、増幅ベクターは、標的部位の相同配列が隣接する望ましい突然変異を含んでいてよい。
【００３３】
部位特異的組換えを、植物の核ゲノムへの目的ＤＮＡの選択的組み込みに用いる場合、上記５工程のプロセスによって、部位特異的組換え酵素で認識可能な標的部位を、植物に予め導入することが好ましい。上記５工程のプロセスは、２つの段階からなり、第１の段階（工程（ｉ）及び（ｉｉ））においては、部位特異的組換えのため予め設計された標的部位を有するトランスジェニック植物が生産される。標的部位は核ゲノムに安定に組み込まれていることが好ましい。５工程の工程（ｉ）における前記第１のＤＮＡのトランスフェクション又は形質転換は、非選択的であってよい。ゲノムの多種の遺伝子座に導入された標的部位を有する多くのトランスジェニック植物が生産される可能性がある。次いで、望ましい位置に標的部位を有するトランスジェニック植物系を、第２の段階（工程（ｉｉｉ）及び（ｖ））の工程を実施するために選択することができる。次いで、第２の段階における目的ＤＮＡの組込みを、進めることができる。この方法によれば、安定なトランスジェニック植物系を最初の工程で生産することができる。そのような各トランスジェニック植物系は、第２の段階により様々な目的のために用いることができ、この方法を高度に汎用性のあるものとする。少なくとも１つの前記第１又は第２のＤＮＡは、増幅ベクターにより伝達される。少なくとも前記第２のＤＮＡが増幅ベクターにより伝達されることが好ましい。
【００３４】
前記第１及び第２のＤＮＡは、目的配列を含んでいてよい。そのような目的配列は、選択可能マーカー及び／又は例えば、植物に有用な形質を与えるために発現させる遺伝子であってよい。組換えは機能的な配列を安定させることが好ましい。機能な配列を安定させる例としては、発現させるＤＮＡをプロモーターの制御下に置くことである。それにより、プロモーターは、前記第１又は第２のＤＮＡにより供給され、発現させるＤＮＡがそれぞれ前記第１又は第２のＤＮＡにより供給される。さらに、コード配列の２つの断片の組合せのような遺伝子の機能的な発現に必要な他の機能は、前記組換えにより組み合わせることができる。前記組換えは、遺伝子の機能を破壊するため、又は、標的部位の配列を除去するためにも用いることができる。
【００３５】
前記植物細胞に前記増幅ベクター（例えば、レプリコン）又はその前駆体（プレレプリコン又はプロベクター）を供給することができる。前記植物細胞に前記前駆体を供給する場合、植物細胞内で前記増幅ベクターへと処理される前駆体を適用する必要がある。増幅ベクターは、例えば、組換えにより前駆体から摘出することができる。しかし、増幅ベクターを前駆体から摘出する場合、摘出は、増幅ベクターの複製放出を可能にするために、前駆体に２つの複製起点を供給することで達成することが好ましい。
【００３６】
前駆体からの増幅ベクターの摘出は、アグロバクテリウムにより伝達されるＴｉプラスミドから増幅ベクターを摘出するためにアグロバクテリウムの形質転換と組み合わせて行うことが好ましい。さらに、増幅ベクターは、組換えにより２つ又はそれ以上の前駆体から植物細胞内で構築させることができる。
【００３７】
前記植物細胞に前記増幅ベクター又はその前駆体をいくつかの方法により供給することができる。好ましい方法は、アグロバクテリウム媒介伝達、直接ウイルストランスフェクション及び非生物学的伝達（例えば、粒子ボンバードメント）である。直接ウイルストランスフェクションにおいては、感染性ウイルス材料を植物組織に直接適用する。直接ウイルストランスフェクションは、ウイルスＤＮＡをアグロバクテリウムを用いて間接的に伝達するアグロインフェクション（Ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）と区別すべきである。アグロバクテリウム媒介伝達においては、Ｔｉプラスミドが増幅ベクターの前駆体として伝達され、それが植物細胞内で処理されて、前記増幅ベクターを発生する。直接ウイルストランスフェクション及び非生物学的伝達法が好ましい。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、植物における選択的形質転換の効率を増加させるための増幅ベクターの使用を記述する。ＤＮＡが伝達された細胞でパッセンジャーＤＮＡ（目的ＤＮＡ）を増幅する植物細胞内での複製能を有するベクターは、特異的組換えの頻度を著しく増加することが示されている。さらに、用いるベクターがウイルスゲノム由来であり、細胞間又は長距離（全身性）の移動のような他のウイルスの能力を保持している場合、標的とされるパッセンジャーＤＮＡは、それを複製もする隣接細胞及び生物体全体に輸送させることができる。得られる選択的組換え効果がさらに増幅する。我々は、植物の内因性組換え機構又は異種の部位特異的組換えシステムを用いて、天然の又は予め設計した標的部位における複製ベクターによる相同的組換え頻度の増加が得られることを見い出した。
【００３９】
移入ＤＮＡを内因性組換え機構又は異種の部位特異的組換え酵素を用いて組み換えする必要があるかどうかにかかわりなく、組換えは、理論的には移入ＤＮＡ分子と標的部位との物理的相互作用を伴う。したがって、それは移入ＤＮＡと標的ＤＮＡの相対的濃度に依存するであろう（ウイルソンら（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９１巻、１７７〜１８１ページ）。組換え反応（２分子反応である）は摘出反応よりもはるかに低速度で起こり、挿入事象を回収するために洗練された戦略（上述）を用いなければならないので、Ｃｒｅのような組換え酵素を用いる場合、これは特に重要である。種々のアプローチが既に企てられ、また、企てることができる（図１を参照）。部位特異的組換えの効率を改善する我々のアプローチは、相同的組換えに関与する酵素の濃度を増加させ、又は増加させずに、複製ベクターを用いて標的とするＤＮＡを増幅することからなっている。任意には、非相同的組換えに関与するタンパク質の発現をさらに抑制してもよい。増幅ベクターは、本明細書において、それらが伝達される細胞内でパッセンジャーＤＮＡを複製することが示されている。ウイルス由来のアンプリコン（レプリコン）を用いる場合、感染が隣接細胞に広がり、選択的挿入の効率がさらに改善する。予期しない結果は、選択的形質転換の顕著な増加である。非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）と呼ばれる競合的修復メカニズムもまた、経済的に重要なすべての作物を含むほとんどの高等植物種において高頻度で生じるので、このアプローチの成功は驚くべきものであった。ＮＨＥＪは、望ましくない反応の強いバックグラウンドで薄められ、又は隠される所望の部位選択的組換えを、従来技術において、選択することが困難である理由の１つである。
【００４０】
本発明による選択的形質転換は、植物の遺伝子工学を、非常に精密、制御的、かつ効率的な技術とする。本発明は、広く適用可能であり、遺伝子導入持続期間、遺伝子活性化に対する制御の欠如、遺伝子サイレシング、ベクター設計の制限、現在の遺伝子操作過程の１工程特性、系統変換持続期間及び関連する連鎖障害（ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｒａｇ）等を含む植物遺伝子工学における現在の多くの問題を解決することができる。我々の知る限りでは、植物における選択的形質転換における増幅ベクターの使用に関する従来技術は存在しない。
【００４１】
植物ウイルスアンプリコンを用いたベクター
ジェミニウイルスは、双晶二十面体で、環状の１本鎖ＤＮＡゲノムを特徴とする植物感染性ウイルスの大規模かつ多様な科のメンバーである（総説については以下を参照のこと。ティンマーマンズら（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４５巻、７９〜１１３ページ、ムリニネアウクスら（Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年、ウイルソンティーエムエー、デイビーズジェーダブリュ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｔ．Ｍ．Ａ．、Ｄａｖｉｅｓ  Ｊ．Ｗ．）（編）ウイルスに関する遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）、シーアールシープレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）［フロリダ州ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）所在］、１８７〜２１５ページ、パルマー及びリビキ（Ｐａｌｍｅｒ  ＆  Ｒｙｂｉｃｋｉ）、１９９７年、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１２９巻、１１５〜１３０ページ）。
ジェミニウイルスは、一般的に以下の２つのサブグループに分類することができる（いくつかの非定型ジェミニウイルスを除く）：
（ｉ）単一構成要素のゲノムを有し、単子葉植物に感染し、ヨコバイにより伝達されるモノパーティトジェミニウイルス、及び
（ｉｉ）そのゲノムが２つの環状ゲノムから構成され、双子葉植物に感染し、コナジラミにより伝達されるジパーティトジェミニウイルス。
モノパーティトジェミニウイルスのいくつかの例としては、トウモロコシ条斑ウイルス（ＭＳＶ）、コムギ矮小ウイルス（ＷＤＶ）、ジギタリア条斑ウイルス（ＤＳＶ）及びススキカリヤス条斑ウイルス（ＭｉＳＶ）などがある。ジパーティトジェミニウイルスの例としては、トマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）、ダイズゴールデンモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）及びアフリカタピオカモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）及びイチビモザイクウイルス（ＡｂＭＶ）などがある。
【００４２】
ジェミニウイルスは、ｓｓＤＮＡを含む大腸菌ファージ（例えば、ＰｈｉＸ１７４）により使用される機構と同様のローリングサークル機構を用いてそれらのゲノムを複製する（サウンダーズら（Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．第１９巻、２３２５〜２３３０ページ、ステンガーら（Ｓｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８８巻、８０２９〜８０３３ページ）。この様式の複製は、複製中間体としての２本鎖ＤＮＡゲノムの生成を生じる。これらの２本鎖ＤＮＡゲノムは、本質的に高コピー植物プラスミドとして挙動し、感染細胞の核当たり最大３００００コピーの極めて高いコピー数で存在することができる（カネフスキーら（Ｋａｎｅｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第２巻、４５７〜４６３ページ、ティンマーマンズら（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２０巻、４０４７〜４０５４ページ）。これらの特性と集合的にはジェミニウイルスが非常に広い宿主範囲を有するという事実とは、主として導入遺伝子の発現レベルを高めるため、或いはジェミニウイルス疾患に対する抵抗戦略を開発するために、植物用の複製ベクターとしてのジェミニウイルスの開発に関する多くの研究を刺激した。植物における遺伝子発現を増大させるための（米国特許第５９８１２３６号、国際出願第０２０５５７Ａ２号、米国特許第６１１０４６６号、米国特許第６１４７２７８号、米国特許第６０７７９９２号）、植物疾患抵抗戦略を開発するための（いくつかの例は米国特許第６１１８０４８号、国際出願第９７３９１１０Ａ１号、米国特許第６１３３５０５号、米国特許第６０８７１６２号）又は植物におけるゲノム発現を抑制するための（国際出願第９９５０４２９Ａ１号）複製ジェミニウイルスベクターの使用を記述しているいくつかの特許が出されている。
【００４３】
単子葉植物のゲノムの転位及び形質転換を達成するために、ジェミニウイルスベクターとトランスポゾンとの併用の試みを記載したいくつかの刊行物が存在する（ラウフスら（Ｌａｕｆｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻、７７５２〜７７５６ページ、シェン及びホーン（Ｓｈｅｎ  ＆  Ｈｏｈｎ）、１９９２年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第２巻、３５〜４２ページ、スギモトら（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第５巻、８６３〜８７１ページ）。１つの刊行物は、形質転換の頻度を増加させるための増幅ベクターとしてのジェミニウイルスの使用を報告している（スギモトら（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．第５巻、８６３〜８７１ページ）。この研究は、染色体ＤＮＡに導入されたＤＮＡ分子のＰエレメントの転位に基づくショウジョウバエ形質転換法により触発された。著者らは、独立したジェミニウイルスミスカンサス条斑ウイルス（ＭｉＳＶ）ベクターにおけるＤｓエレメント及びＡｃトランスポザーゼをクローンし、イネプロトプラストをこれらのベクターで同時ボンバードした。除去後、低頻度の再挿入（１０−５程度）により、５つの染色体挿入が回収された。対照非複製ベクターには転位は検出できなかったことから、転位の頻度が低いため、再挿入を回収するためには複製が必要であったことがわかる。このアプローチは、得られる形質転換の非選択性によって、我々の発明と区別される。
【００４４】
本発明は増幅ベクターとしてレプリコンを使用することが好ましい（レプリコンは環状ＤＮＡを自由に複製する。その使用は多くの刊行物に記載されている。総説については以下を参照のこと。ティマーマンズら（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４５巻、７９〜１１３ページ、ムリニネアウクスら（Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年、ウイルソンティーエムエー、デイビーズジェーダブリュ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｔ．Ｍ．Ａ．、Ｄａｖｉｅｓ  Ｊ．Ｗ．）（編）ウイルスに関する遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）、シーアールシープレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）［フロリダ州ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）所在］、１８７〜２１５ページ、パルマー及びリビキ（Ｐａｌｍｅｒ  ＆  Ｒｙｂｉｃｋｉ）、１９９７年、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１２９巻、１１５〜１３０ページ）。レプリコンは、ジェミニウイルス複製起点と好ましくは目的ＤＮＡとを含む。複製は、レプリコン自体、同時形質転換した複製又は非複製プラスミドに存在し得るジェミニウイルスレプリカーゼにより媒介され、或いは、染色体に組み込まれ安定に形質転換された発現カセットから発現させてもよい。レプリコンは、プレレプリコンの形で細菌中でクローンすることができる。
レプリコンは、次の２つのアプローチのいずれか１つによりプレレプリコンから放出させることができる：
（ｉ）プラスミドベクターからレプリコンＤＮＡを放出する酵素でプレレプリコンを消化すること、或いは
（ｉｉ）２単位長以上のゲノムを含むプレレプリコンを使用すること。
第１のアプローチでは、摘出されたＤＮＡは、内因性リガーゼを用いて細胞に導入された後に再環化する（ビサロら（Ｂｉｓａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８３年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．第１１巻、７３８７〜９６ページ）。第２のアプローチでは、環状レプリコンが、重複配列における相同的分子内組換えにより、又は複製放出機構（２つの複製起点がプレレプリコンに存在することを条件とする）により、プレレプリコンから放出される（ステンジャーら（Ｓｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８８巻、８０２９〜８０３３ページ、ロジャーズら（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、Ｃｅｌｌ、第４５巻、５９３〜６００ページ）。プレレプリコンは、その連続体にレプリコンを含んでおり、レプリコン形成は、前記プレレプリコンの隣接配列から当該連続体を放出する過程である。レプリコンは、植物宿主内でベクター前駆体又はプロベクターから形成させることができる。ベクター前駆体又はプロベクターは、植物宿主中での処理により、当該宿主中で異種核酸配列を増幅し、発現することができるベクターを形成する核酸配列である。当該処理は、不連続ベクター部分から連続体の形成を含む。
【００４５】
レプリコンは、アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、粒子伝達又は他のＤＮＡ伝達技術などの様々なメカニズムにより植物細胞に導入することができる。或いは、レプリコンは、染色体に組み込まれたプレレプリコンから放出させることができる。これらの構成体内のプレレプリコンは、複製放出機構によるレプリコンの放出を促進するために２つの複製起点を含む。レプリコンの放出と複製は、レプリカーゼの発現により制御される。したがって、細胞の生存に対するレプリコンの複製の有害な影響の可能性を最小限にするために、誘導性の又は組織特異的なプロモーターを用いて発現のタイミングを制御することができることは有用であろう。
【００４６】
ジェミニウイルス系増幅ベクターは本発明の実施に好ましいが、植物細胞中で増幅できる他のベクターも本発明に使用してよい。
【００４７】
ＲＮＡ及びＤＮＡを含むウイルスは、複製ベクターの構成に用いることができると思われる。異なるウイルスの例を以下の一覧に示す。
【００４８】
（ＤＮＡウイルス）
環状ｄｓＤＮＡウイルス：科：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ、代表種：ツユクサ黄色斑紋ウイルス、属：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：カリフラワーモザイクウイルス、「ＳｂＣＭＶ様ウイルス」、代表種：ダイズ退縁斑紋ウイルス、属：「ＣｓＶＭＶ様ウイルス」、代表種：キャッサバ葉脈ウイルス、属：「ＲＴＢＶ様ウイルス」、代表種：イネツングロ病ウイルス、属：「ペチュニア葉脈透化ウイルス」、代表種：ペチュニア葉脈ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス；
【００４９】
環状ｓｓＤＮＡウイルス：科：ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、属：Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ（ジェミニウイルスサブグループＩ）、代表種：トウモロコシ条斑ウイルス、属：Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ（ジェミニウイルスサブグループＩＩ）、代表種：ビートカーリートップウイルス、属：Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ（ジェミニウイルスサブグループＩＩＩ）、代表種：マメゴールデンモザイクウイルス；
【００５０】
（ＲＮＡウイルス）
ｓｓＲＮＡウイルス：科：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：アルファルファマメゴールデンモザイクウイルス、属：ｌｌａｒｖｉｒｕｓ、代表種：タバコ条斑ウイルス、属：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：スズメノチャヒキモザイクウイルス、属：Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：キュウリモザイクウイルス；
科：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、代表種：ビート黄化ウイルス、属：Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ、代表種：レタス感染黄化ウイルス、科：Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：ササゲモザイクウイルス、属：Ｆａｂａｖｉｒｕｓ、代表種：ソラマメウイルトウイルス１、属：Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ、代表種：タバコ輪点ウイルス；
科：Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ、代表種：ジャガイモウイルスＹ、属：Ｒｙｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：ライグラスモザイクウイルス、属：Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：オオムギ黄化モザイクウイルス；
科：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓ、代表種：パースニップ斑紋ウイルス、属：Ｗａｉｋａｖｉｒｕｓ、代表種：イネわい化ウイルス、科：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：カーネーション斑紋ウイルス、属：Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ、代表種：カーネーション輪点ウイルス、属：Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：トウモロコシ退縁斑紋ウイルス、属：Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ、代表種：タバコえそウイルス、属：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ、代表種：トマトブッシースタントウイルス、属未指定のｓｓＲＮＡウイルス、属：Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ、代表種：リンゴステムグルービングウイルス；
属：Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ、代表種：カーネーション潜在ウイルス、属：Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：カーネーション隆起成長モザイクウイルス、属：Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ、代表種：土壌コムギモザイクウイルス、属：Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ、代表種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：Ｉｄａｅｏｖｉｒｕｓ、代表種：ラズベリーブッシー萎縮ウイルス；
属：Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ、代表種：オオムギ黄萎ウイルス、属：Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ、代表種：トウモロコシｒａｙａｄｏ  ｆｉｎｏウイルス、属：Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ、代表種：ジャガイモウイルスＸ、属：Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：インゲンマメ南部モザイクウイルス、属：Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ、代表種：イネ縞葉枯ウイルス、属：Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：タバコモザイクウイルス、属：Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ、代表種：タバコ茎えそウイルス、属：Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ、代表種：リンゴクロロティックリーフスポットウイルス病、属：Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：カブラ黄化モザイクウイルス、属：Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ、代表種：ニンジン斑紋ウイルス；
【００５１】
ネガティブｓｓＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス、科：ラブドウイルス、属：Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、代表種：レタスｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｙｅｌｌｏｗウイルス、属：Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、代表種：ジャガイモ黄化えそウイルス；
ネガティブｓｓＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス、属：Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ、代表種：トマト黄化えそウイルス；
【００５２】
ｄｓＲＮＡウイルス：科：Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ、代表種：シロクローバ潜伏ウイルス１、属：Ｂｅｔａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ、代表種：シロクローバ潜伏ウイルス２、科：Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｕｊｉｖｉｒｕｓ、代表種：Ｆｕｊｉ  ｄｉｓｅａｓｅウイルス、属：Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ、代表種：創傷腫瘍ウイルス、属：Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ、代表種：イネラツギドスタントウイルス；
【００５３】
未指定ウイルス：ゲノムｓｓＤＮＡ：種：バナナｂｕｎｃｈｙ  ｔｏｐウイルス、種：ココナツｆｏｌｉａｒ  ｄｅｃａｙウイルス、種：ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ  ｃｌｏｖｅｒ  ｓｔｕｎｔウイルス；
【００５４】
ゲノム：ｄｓＤＮＡ、種：キュウリ葉脈黄化ウイルス、ゲノム：ｄｓＲＮＡ、種：タバコｓｔｕｎｔウイルス；
【００５５】
ゲノム：ｓｓＲＮＡ、種：ニンニクウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ブドウのつる斑紋ウイルス、種：トウモロコシ白線モザイクウイルス、種：オリーブ潜在ウイルス２、種：ウルミアメロンウイルス、種：ゼラニウム輪紋ウイルス；
【００５６】
衛星及びウイロイド：衛星：ｓｓＲＮＡ衛星ウイルス：サブグループ２衛星ウイルス、代表種：タバコえそ衛星；
【００５７】
衛星ＲＮＡ、サブグループ２Ｂ型ｍＲＮＡ衛星、サブグループ３Ｃ型線状ＲＮＡ衛星、サブグループ４Ｄ型環状ＲＮＡ衛星；
ウイロイド、代表種：ジャガイモ紡錘型塊萎ウイロイド。
【００５８】
主として、植物ウイルス起源のベクターは、植物において自律性の複製能を有するプラスミドとして用いられるが、非ウイルスエレメントを用いてそのようなプラスミドを設計するのに必要な原理は知られている。例えば、植物細胞の多くの推定複製起点が記載されている（バルラーニら（Ｂｅｒｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１１巻、１６１〜１６２ページ、ヘルナンデスら（Ｈｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１０巻、４１３〜４２２ページ、バルラーニら（Ｂｅｒｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１１巻、１７３〜１８２ページ、エクダールら（Ｅｃｋｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１２巻、５０７〜５１６ページ）。高等植物のゲノム由来の自律複製配列（ＡＲＳエレメント）は、酵母及び高等動物のＡＲＳエレメントと共通の構造及び配列における特徴を有することが示されている（エクダールら（Ｅｃｋｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１２巻、５０７〜５１６ページ）。植物ＡＲＳエレメントは、サッカロミセスセレビシエにおけるプラスミドに自律複製能を与えることができる。酵母におけるプラスミドの自律複製を促進することができるトウモロコシ核ＤＮＡ配列の研究で、それら配列は、トウモロコシゲノム内で高度に繰り返されている配列の２つのファミリーを示した。それらの配列は、特徴的なゲノムハイブッド形成パターンを有する。典型的には、ゲノム断片の各１２〜１５ｋｂ上にＡＲＳ相同配列の１つのコピーのみが存在する（バルラーニら（Ｂｅｒｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１１巻、１６１〜１６２ページ）。植物複製起点のレプリコンにおける他の起源は、植物における異種遺伝子の増幅と発現を刺激できる植物リボソームＤＮＡスペーサーエレメントである（ボリスジュクら（Ｂｏｒｉｓｊｕｋ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．第１８巻、１３０３〜１３０６ページ）。
【００５９】
したがって、本発明において使用を意図している増幅ベクターは、必ずしも植物ウイルス由来のものとは限らない。同様に、植物ＤＮＡウイルスは、選択的ＤＮＡ形質転換に特に有用であると思われる増幅ベクターを設計する容易な方法を提供するが、植物ＲＮＡウイルス又は非植物ウイルスのエレメントから完全又は部分的に構成されたベクターも可能である。植物ウイルスに基づくベクターの利点は明らかである。そのようなベクターは、増幅のほかに、細胞間及び長距離での移動のような別の有用な機能を提供する可能性がある。さらに、そのようなベクターは、感染した植物からウイルスを根絶する既知の方法を用いて、後で植物細胞から容易に除去し得る場合が多い。
【００６０】
本発明において、レプリコンは、宿主細胞の核内で所望の標的配列のコピー数を増加させるために用いることが望ましい。本発明の１の実施形態において、標的部位を含む組換えは、レプリコンに設けられた特異的組換え部位と標的部位に設けられた特異的組換え部位との介在によって起こる。他の実施形態において、組換えは、レプリコンにより運ばれる配列と宿主ゲノムにおける相同の配列との間の相同的組換えの結果として起こる。ベクターの詳細とこれらのベクターの使用については、次に記述する。
【００６１】
異種組換え系からの組換え部位を含むレプリコン
適切な組換え酵素／組換え部位系としては、とりわけバクテリオファージＰ１のＣｒｅ−Ｌｏｘ系（オースチンら（Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８１年、Ｃｅｌｌ、第２５巻、７２９〜７３６ページ）、サッカロミセスセレビシエのＦｌｐ−Ｆｒｔ系（ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８２年、Ｃｅｌｌ、第２９巻、２２７〜２３４ページ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉのＲ−Ｒｓ系（アラキら（Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１８２巻、１９１〜２０３ページ）、ストレプトミセスファージＰｈｉＣ３１（ソープ及びスミス（Ｔｈｏｒｐｅ  ＆  Ｓｍｉｔｈ）、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９５巻、５５０５〜５５１０ページ、グロスら（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９７巻、５９９５〜６０００ページ）及びリゾルベースなどがある。レプリコンには１つ又は２つの組換え部位が存在する。１つの組換え部位が存在する場合、組換えはジェミニウイルス配列を含む標的部位で、レプリコン全体の組込みがもたらされる（片側組換え）。したがって、標的とするＤＮＡの両側に隣接する２つの組換え部位を用いることが好ましい（両側組換え）。組換え酵素の発現時に、標的遺伝子座で２つの部位を適合部位と組換えることにより、標的遺伝子座における組換え部位間にあるＤＮＡ配列の、レプリコン上の目的ＤＮＡ配列による置換が引き起こされる。例えば、標的とするＤＮＡ断片にプロモーターでない選択マーカーと標的部位にプロモーターを含めることにより、選択的組換えに対する選択を容易に行うことができる。次いで、組換えは、標的部位におけるプロモーターの制御のもとで選択マーカー遺伝子を置くことにより、当該選択マーカー遺伝子の活性化をもたらし、その結果、機能的なマーカーが確立される。プロモーターなしで選択マーカーが標的部位に存在し、プロモーターがレプリコン上に存在する逆の戦略も可能である。
【００６２】
２つの組換え部位がレプリコン上に存在する場合、これらの部位は互いに組換えないことが有利である。その理由は、これによりレプリコンの複製時に目的配列が欠失する可能性があるためである。互いに組み換えることができない組換え部位の対が、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ及びＦｌｐ／Ｆｒｔ系について記載されている。異種特異的部位と呼ばれるそのような部位は、中央コア領域に突然変異を含んでいる。これらの部位は、野生型レベルでそれらと同じ部位と組み換えることができるが、異なる異種特異的部位と組み換えることはできない（ベスケ及びサウア（Ｂｅｔｈｋｅ  ＆  Ｓａｕｅｒ）、１９９７年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻、２８２８〜２８３４ページ、実施例２も参照）。Ｐｈｉｃ３１インテグラーゼのようないくつかの系の組み換え部位は、同一部位と組み換えることはできないが、異なる適合部位とのみ組み換えることができる。例えば、Ｐｈｉｃ３１インテグラーゼの存在下では、ａｔｔＰ部位はａｔｔＢ部位と組み換えられ、ａｔｔＬとａｔｔＲを生ずる。ａｔｔＰ又はａｔｔＢ部位は、レプリコンで用いることができ、一方、適合部位はゲノム上の標的部位に置くことができる。
【００６３】
植物核ゲノムにおける標的部位は、天然に存在する（標的とされる内在遺伝子、異種部位特異的組換え酵素、制限酵素等により認識される配列）か、又は予め設計して既存の技術を用いて植物ゲノムに導入する。植物細胞にそのような部位を伝達するために、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによる植物細胞へのベクターの直接導入（米国特許第０５１００７９２号、欧州特許第００４４４８８２Ｂ１号、欧州特許第００４３４６１６Ｂ１号）、エレクトロポレーション（欧州特許第００５６４５９５Ｂ１号、欧州特許第００２９０３９５Ｂ１号、国際出願第０８７０６６１４Ａ１号）又はプロトプラストのＰＥＧ媒介処理）などの種々の方法を用いることができる。これらの３つの方法は、非生物学的伝達法としてまとめることができる。アグロバクテリウム媒介植物形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許第４，９４０，８３８号、米国特許第５，４６４，７６３号）もベクターの伝達の有効な方法である。原則として、マイクロインジェクションのような他の植物形質転換法も用いることができる（国際出願第０９２０９６９６号、国際出願第０９４００５８３Ａ１号、欧州特許第１７５９６６Ｂ１号）。植物形質転換法の選択は、形質転換する植物種の種類に依存する。例えば、単子葉植物の形質転換についてはマイクロプロジェクタイルボンバードメントが好ましく、双子葉植物についてはアグロバクテリウム媒介形質転換が一般的に良好な結果が得られる。同じ方法を、増幅ベクターによる植物細胞のトランスフェクション又は形質転換、或いは植物細胞へのＤＮＡの前記供給に用いることができる。さらに、このようなことは、ウイルストランスフェクションにより、或いは、自律的に複製するプラスミドを形成するために植物核ＤＮＡにあらかじめ組み込んだベクター又はプロベクターを用いて達成することができる。
【００６４】
適切な異種組換え酵素は、レプリコン、同時形質転換した複製若しくは非複製プラスミド、又は染色体標的部位から発現させることができる。その発現は、構成性、組織特異性又は誘導性とすることができる。種々の可能性について、後述する実施例において示す。
【００６５】
ジパーティトジェミニウイルスは、２つのゲノム構成要素であるＤＮＡＡとＤＮＡＢとを有している。Ｂゲノムは、その産物が両ゲノム構成要素の細胞間及び全身性の移動のために必要とされる２つの遺伝子をコードする（ブローら（Ｂｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第６９巻、５０３〜５１４ページ、キンら（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７２巻、９２４７〜９２５６ページ）。一例としては、２つのオープンリーディングフレームであるＢＬ１及びＢＲ１をコードするＢＧＭＶのＤＮＡＢゲノムがある。Ｂゲノム上にコードされている遺伝子の発現は、レプリコンを細胞間及び全身において移動させることを可能とする。両遺伝子は、野生型Ｂゲノムを放出する構成体を、同時に形質転換することにより供給される。また、Ｂ遺伝子は、非複製プラスミドで供給することもできる。この方法において、Ｂゲノムの遺伝子は、細胞から非複製プラスミドが消失するまで一過性に発現させることができる。これは、Ｂゲノムの遺伝子、特にＢＬ１の発現が、ジェミニウイルス感染植物の疾患症状の原因であるので、有利である（パスカルら（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、第５巻、７９５〜８０７ページ）。Ｂゲノムによりコードされた遺伝子の一過性の発現は、ＴＧＭＶのＤＮＡＡゲノムの全身移動に十分である（ジェフェリーら（Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２２３巻、２０８〜２１８ページ）。
【００６６】
内因性配列と相同性を有する配列を運ぶレプリコン
内因性配列と相同であるＤＮＡ配列を含むレプリコンの複製により、相同的標的配列との組換えが増加する。相同的組換えは、ＤＮＡの２本鎖損傷又はニックにより開始することが好ましい。ジェミニウイルスＤＮＡは、超コイル２本鎖環状、開環及び線状のＤＮＡなどの種々の形態で細胞内に存在する（サウンダーら（Ｓａｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１９巻、２３２５〜２３３０ページ）。開環ＤＮＡにおけるニック及び線状ＤＮＡにおける２本鎖損傷は、相同的組換えを誘発する。更に組換えを増大させるためには、レプリコンに酵母ＨＯ又はＩＳｃｅ−ｌエンドヌクレアーゼのような希少切断酵素のための１つ又は２つの制限酵素部位を置くことで、複製ＤＮＡにおける２本鎖損傷の形成を誘発することも可能である。エンドヌクレアーゼは、同時形質転換した複製又は非複製プラスミド、或いは染色体に安定に組み込まれた発現カセットから発現させることができる。その発現は、構成性、組織特異性又は誘導性とすることができる。
【００６７】
本発明で用いるベクターは、プロベクターであってよい。プロベクターとは、例えば、イントロンスプライシングなどの植物核酸処理機構により、本発明によるベクターを植物細胞内で発生させる元のベクターである。
【００６８】
実施例
以下の実施例は、特に、増殖ベクターの複製による、高頻度の部位選択的な組込みの検出について示す。さらには、好ましくは一過性に複製する増殖ベクターを使用する、子孫細胞の選択及び形質転換体の回収についての成功例を示す。
【実施例１】
【００６９】
この実施例は、ＢＧＭＶ  ＤＮＡＡ及びＤＮＡＢゲノムの複製クローンのクローニングを報告する（図２）。
【００７０】
ＧＦＰを含むＤＮＡＡゲノム複製ベクターのクローニング
ｐＵＣ１９  ＤＮＡを、プライマーｄｎａａｐｒ７（ａａｃ  ｔｇｃ  ａｇｔ  ｃｔａ  ｇａｃ  ｔｇｇ  ｃｃｇ  ｔｃｇ  ｔｔｔ  ｔａｃ  ａａｃ）及びｄｎａａｐｒ８（ａａｃ  ｔｇｃ  ａｇａ  ａｃａ  ａｔｔ  ｇｃｔ  ｃｇａ  ｇｇｃ  ｇｔａ  ａｔｃ  ａｔｇ  ｇｔｃ  ａ）を用いて増幅し、増幅された断片をＰｓｔ１で消化し、再連結した。得られたプラスミドｐＩＣ１１４４は、ｐＵＣ１９に類似しているが、ポリリンカーがＸｈｏ１、Ｍｆｅｌ及びＰｓｔ１で置換されていた。ＤＮＡは、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）から入手したマメゴールデンモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）分離株ＤＳＭＺ  ＰＶ−００９４で感染させたインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）組織から抽出した。ＢＧＭＶ共通領域（ＣＲ、ＢＧＭＶ複製起点を含む）を含むゲノムの断片を、プライマーｄｎａａｐｒ３（ｇｇｇ  ａａｔ  ｔｃａ  ｃｔａ  ｇｔａ  ａａｇ  ａｔｃ  ｔｇｃ  ｃｇｔ  ｃｇａ  ｃｔｔ  ｇｇａ  ａｔｔ  ｇ）及びｄｎａａｐｒ４（ｃａａ  ｔｇｃ  ａｔｃ  ａｔｇ  ｇｃｇ  ｃａｔ  ｃａｃ  ｇｃｔ  ｔａｇ  ｇ）を用いてＰＣＲにより増幅し、Ｍｆｅｌ及びＰｓｔｌで消化したｐＩＣ１１４４中でＥｃｏＲＩ−Ｎｓｉｌ断片としてクローン化して、プラスミドｐＩＣ１１５６を得た。ｐＩＣ１１５６中のＢＧＭＶ挿入断片を配列決定した。他の２つのＢＧＭＶ  ＤＮＡＡゲノム断片をＢＧＭＶ感染インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＤＮＡからプライマー対ｄｎａａｐｒ９（ａａｇ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ａａｇ  ｇａｔ  ｃｃｔ  ｃｔｇ  ｇａｃ  ｔｔａ  ｃａｃ  ｇｔｇ  ｇａａ  ｔｇｇ）／ｄｎａａｐｒ１３（ｃｇｃ  ｔｃｇ  ａｇｇ  ｃｃｇ  ｔｃｇ  ａｃｔ  ｔｇｇ  ａａｔ  ｔｇｔ  ｃ）及びｄｎａａｐｒ５（ｇａａ  ｇａｔ  ｃｔｇ  ｃａａ  ｇａｇ  ｇａｇ  ｇｔｃ  ａｇｃ  ａ）／ｄｎａａｐｒ１０（ａａｇ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ａｔｃ  ｔａｔ  ｔｔｃ  ｔａｔ  ｇａｔ  ｔｃｇ  ａｔａ  ａｃｃ）で増幅した。これらの断片の合計は、コートタンパク質を含まない完全なＢＧＭＶゲノムに等しい。これらの断片を、（それぞれ）Ｘｈｏ１／Ｐｓｔ１及びＰｓｔ１／ＢｇＩＩＩで消化し、Ｘｈｏ１及びＢｇＩＩＩで消化したｐＩＣ１１５６中で３元連結反応によりクローン化した。得られたプラスミドは、重複するＢＧＭＶ  ＤＮＡＡ共通領域が両側に隣接する、コートタンパク質遺伝子を含まない１つの完全なＢＧＭＶ  ＤＮＡＡゲノムを含んでいる。３クローン、すなわちｐＩＣ１６６３、１６６４及び１６６７を試験に備えて保存した。ＢａｍＨＩ及びＰｓｔｌを含む多クローニング部位はコートタンパク質遺伝子を置換している。
【００７１】
ＧＦＰ（ＳＧＦＰは合成ＧＦＰを表す）コード配列を、ｐＩＣ０１１（Ｈｂｔプロモーター−合成ＧＦＰコード配列−ｐＵＣ１８におけるＮｏｓターミネーター）からのＢａｍＨＩ−Ｐｓｔｌ断片として、ｐＩＣ１６６３、ｐＩＣ１６６４及びｐＩＣ１６６７のＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ１部位においてクローン化して、プラスミドｐＩＣ１６９３、ｐＩＣ１６９４及びｐＩＣ１６９７を得た（補足図１）。ＧＦＰはコートタンパク質プロモーターの制御下に置かれている。
【００７２】
レプリカーゼのために突然変異させたＤＮＡＡゲノムクローンを、ＡＬ１  ＯＲＦに存在するＢｇＩＩＩを破壊して構築した。ｐＩＣ１６９３、ｐＩＣ１６９４及びｐＩＣ１６９７に２つのＢｇＩＩＩ部位が存在するので、第２のＢｇＩＩＩ部位を欠いた中間構成体を構築した（ｐＩＣ２６９０）。この構成体は、ｐＩＣ１６９４からの断片をプライマーｄｎａａｐｒ１６（ａａｇ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｔｔｃ  ｔａｔ  ｇａｔ  ｔｃｇ  ａｔａ  ａｃｃ）及びｄｎａａｐｒ５（ｇａａ  ｇａｔ  ｃｔｇ  ｃａａ  ｇａｇ  ｇａｇ  ｇｔｃ  ａｇｃ  ａ）を用いてＰＣＲにより増幅して構築し、増幅産物からのＰｓｔ１−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｈｉｎｄ３及びＰｓｔｌで消化したｐＩＣ１６９４においてクローン化した。次いで、ｐＩＣ２６９０をＢｇＩ２で消化し、末端をｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで満たし、再連結して、プラスミドｐＩＣ２７０５を得た（補足図３）。
【００７３】
ＤＮＡＢゲノムのクローニング
完全なＤＮＡＢゲノムを、ＢＧＭＶ感染インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＤＮＡから、プライマーｄｎａｂｐｒ２（ｃｇｇ  ｃａｔ  ｇｃａ  ｔｇｃ  ａｔｔ  ｔｇｇ  ａｇｇ  ａｔｔ  ｔｇｃ  ｔａａ  ｃｔｇ）及びｄｎａｂｐｒ３（ｃｇｇ  ａｔｇ  ｃａｔ  ｔｃａ  ａｔｔ  ａｔｇ  ｔａｇ  ａｇｔ  ｃａｃ  ａｃａ  ｇ）を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅された断片を、ｐｒｏｍｅｇａからのｐＧＥＭＴでクローン化した。Ｎｓｉｌによるクローンの消化により、完全な線状ＤＮＡＢゲノムが放出された。１２のクローンを採集し、挿入部を含む９クローン（ｐＩＣ１９１１〜ｐＩＣ１９１９（補足図２））を機能性に関する試験に備えて保存した。
【００７４】
ＤＮＡＡ及びＤＮＡＢクローンの機能性の試験
ＧＦＰの機能性（機能コートタンパク質プロモーター及び機能コード配列）を試験するために、ｐＩＣ１６９３、ｐＩＣ１６９４及びｐＩＣ１６９７を、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０００／ＨＥ（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ））を用いて、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の切除した葉にボンバードした。翌日、両種の葉において３つの構成体すべてについてＧＦＰ発現表皮細胞が検出された。
【００７５】
ＤＮＡＡ及びＤＮＡＢクローンの複製及び移動を試験するために、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の切除した葉に、ｐＩＣ１６９３、ｐＩＣ１６９４及びｐＩＣ１６９７を、対に組合せてｐＩＣ１９１１〜ｐＩＣ１９１９（Ｎｓｉｌで消化したもの）とともにボンバードした。すべての組合せにより数百のＧＦＰ発現細胞を生じさせた。２つのプラスミドの組合せ１６９４／１９１４及び１６９７／１９１９について、ＧＦＰの発現が、主として葉脈中のＧＦＰ発現細胞のいくつかについて、隣接細胞に広がっている。
【００７６】
植物全体におけるＤＮＡＡ及びＤＮＡＢの機能性を試験するために、ｐＩＣ１６９４／１９１４及びｐＩＣ１６９７／１９１９の組合せを、発芽中のマメの小根にボンバードした（図２）。実生を土壌に戻し、１０日後に最初の２つの葉におけるＧＦＰ発現について評点をつけた。大多数の幼植物が最初の２つの葉のいくつかの葉脈に蛍光を示した。最初の２つの葉からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡＡプローブを用いてサザンブロッティングにより分析した。植物にＤＮＡＡ及びＤＮＡＢクローンを接種したとき、１本鎖、超コイル２本鎖及び開環２本鎖の形態が検出されたが、植物にＤＮＡＡクローンのみを接種したときには検出されなかった。ＧＦＰタンパク質もＧＦＰ抗体を用いてウエスタンサザンブロッティングにより検出された。
【実施例２】
【００７７】
この実施例では、標的同時形質転換非複製プラスミドを用いるプラスミドの複製が、組換えの頻度を増加できることを示す。この実施例では、組換えがＣｒｅ組換え酵素により媒介され、供与体及び受容体プラスミドに存在するＩｏｘＰ及びＬｏｘＭ部位で起こる（図３）。
【００７８】
プラスミドの説明
ｐＩＣ１６６７からのＰＣＲ断片を、ｄｎａａｐｒ１３（ｃｇｃ  ｔｃｇ  ａｇｇ  ｃｃｇ  ｔｃｇ  ａｃｔ  ｔｇｇ  ａａｔ  ｔｇｔ  ｃ）及びｄｎａａｐｒ１５（ｃｃｃ  ａｔｇ  ｃａｔ  ｃｔａ  ｇａｇ  ｔｔａ  ａｃｇ  ｇｃｃ  ｇｇｃ  ｃｃａ  ａａｔ  ａｔｃ  ｔａａ  ｃｇｔ  ｔｃｔ  ｃａｃ  ａｔｇ）を用いて増幅し、Ｘｈｏｌ及びＰｓｔｌで消化したｐＩＣ１６６７におけるＸｈｏｌ−Ｎｓｉｌ断片としてクローンした。得られたプラスミドｐＩＣ１９５１は、ｐＩＣ１６６７と類似しているが、コートタンパク質遺伝子プロモーターを欠いている。
【００７９】
プラスミドｐＩＣ５５１は、（ｉ）Ｘｂａｌ及びＨｉｎｄ３で消化したｐＵＣ１１９についてプライマーａｄｌｏｘ１（ｇｔｔ  ｃｔａ  ｇａｔ  ｇｔｔ  ａａｃ  ｇｇｃ  ｇｃｇ  ｃｃｇ  ｇｃｇ  ｔａａ  ｔｃａ  ｔｇｇ  ｔｃａ）、ａｄｌｏｘ２（ａａｃ  ｃａｔ  ｇｇａ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｇｇｃ  ｃｇｇ  ｃｃｃ  ｔｇｇ  ｃｃｇ  ｔｃｇ  ｔｔｔ  ｔａｃ  ａａｃ）、ａｄｌｏｘ３（ｃｇｇ  ｇａｔ  ｃｃｔ  ｇａｇ  ｃｔｃ  ｔａｔ  ａａｃ  ｔｔｃ  ｇｔａ  ｔａａ  ｔｇｔ  ａｔｇ  ｃｔａ  ｔａｃ  ｇａａ  ｇｔｔ  ｇｔｔ  ｃｔａ  ｇａｔ  ｇｔｔ  ａａｃ  ｇｇ）及びａｄｌｏｘ４（ｃｇｇ  ｇａｔ  ｃｃｃ  ｔｇｃ  ａｇａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ａｔｃ  ｔａｔ  ａｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｇ  ａａａ  ａａｃ  ａａｃ  ｃａｔ  ｇｇａ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｇｇ）を用いてＰＣＲを実施し、（ｉｉ）ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、（ｉｉｉ）消化した断片を再連結して得た。ｐＩＣ５５１はｐＵＣ１１９と類似しているが、ポリリンカーＡｓｃＩ−ＨｐａＩ−ＸｂａＩ−ＩｏｘＡ−ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ−ＬｏｘＭ−ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＦｓｅＩを有している。ＬｏｘＡ（ａｃａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔ）及びＬｏｘＭ（ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｃｔａｔ  ａｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｇ）は、修飾されたＬｏｘＰ部位である。ＬｏｘＡは、ＬｏｘＰと逆方向反復配列の１つにおける１ヌクレオチドが異なっており、野生型レベルでＬｏｘＰと組み換えることができる。ＬｏｘＭは、中央スペーサー領域に２つの突然変異を有し、ＬｏｘＰ又はＬｏｘＡと組み換えることができないが、他の異種特異的部位の場合と同様に、それ自体と自由に組み換えることができる（ベスケ及びサワー（Ｂｅｔｈｋｅ  ＆  Ｓａｕｅｒ）、１９９７年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻、２８２８〜２８３４ページ）。
【００８０】
ＧＦＰコード配列を含むｐＩＣ０１１のＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ１断片をｐＩＣ５５１のＢａｍＨＩ及びＰｓｔ１部位においてクローン化して、プラスミドｐＩＣ２０５１を得た（補足図４）。反対方向のＬｏｘＡ及びＬｏｘＭ部位が隣接したＧＦＰ  ＯＲＦを含むＦｓｅｌ／Ｘｂａ１断片をｐＩＣ２０５１からｐＩＣ１９５１のＸｂａ１及びＦｓｅｌ部位にサブクローンして、プラスミドｐＩＣ２１２１を得た（補足図５）。ｐＩＣ２１２１は、コートタンパク質遺伝子を置換している２つの異種特異的部位の間にあるプロモーターのないＧＦＰコード配列を含む。
【００８１】
ｐＩＣ１２６２は、ｐＩＣ０４の０．９ｋｂ  ＥｃＩ１３６ＩＩ−Ｐｓｔ１シロイナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチン２プロモーター（プラスミドベクターにおいてクローン化したアクチン２プロモーター断片）を、ｐＩＣ０８のＨｉｎｄ３平滑部位及びＰｓｔ１部位（ｐＵＣ１９における３５Ｓプロモーター−ＬｏｘＰ−Ｃｒｅ−Ｎｏｓターミネーター）に、クローニングして構築した。ｐＩＣ１３２１は、ｐＩＣ１２６２のＮｏｓターミネーターを、Ｏｃｓターミネーターがその後にあるＬｏｘＭ（ＬｏｘＰ部位に対して反対方向の）部位を含むＤＮＡ断片で置換して構築した。
ｐＩＣ１３２１（補足図６）は、ｐＵＣ１９に次の挿入断片を含んでいる：
シロイナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチン２プロモーターＬｏｘＰ−Ｃｒｅ  Ｏｒｆ−ＬｏｘＭ−Ｏｃｓターミネーター。
【００８２】
複製プラスミドと非複製プラスミド標的部位との組換え（図３）
ｐＩＣ２１２１を、ｐＩＣ１３２１と、野生型タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）の葉及びインゲンのマメの細胞の懸濁液培養に、同時にボンバードした。対照として、ｐＩＣ２０５１をｐＩＣ１３２１と同じ植物組織に同時のボンバードした。３日後に、ｐＩＣ２１２１挿入断片の複製により、ｐＩＣ１３２１との組換えが増加し、Ｃｒｅ  ＯＲＦとＧＦＰコード配列とが交換された。シロイナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチン２プロモーターへのＧＦＰの融合により、ＧＦＰの発現がもたらされた。非複製プラスミドｐＩＣ２０５１を用いた対照実験では、ＧＦＰ発現細胞は検出されなかった（図３）。
【実施例３】
【００８３】
この実施例では、我々は、標的とされる挿入部を含むプラスミドの複製において、植物染色体に安定に挿入された標的部位を用いると、組換え頻度を増加させ得ることを示す。組換えは、Ｃｒｅにより媒介され、複製プラスミドと標的部位の両方に存在するＩｏｘＰ及びＬｏｘＭ部位で起こり、Ｃｒｅは同時形質転換プラスミドに伝達される（図４）。
【００８４】
プラスミドの説明
ＸｈｏＩ及びＳａｃＩが隣接するＬｏｘＰ部位を含むアダプター（プライマーａｄｌｏｘ１５［ｔｃｇ  ａｇａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｃａ  ｔａｃ  ａｔｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ａｇｃ  ｔ］及びａｄｌｏｘ１６［ａｔａ  ａｃｔ  ｔｃｇ  ｔａｔ  ａａｔ  ｇｔａ  ｔｇｃ  ｔａｔ  ａｃｇ  ａａｇ  ｔｔａ  ｔｃ］を用いて構築した）を、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩで消化したｐＩＣ０１でクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣ２７４５は、ｐＵＣ１１８におけるＤＮＡ断片（３５Ｓプロモーター−ＬｏｘＰ−Ｇｕｓ−Ｏｃｓターミネーター）を含んでいる。ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位が隣接するＬｏｘＭ部位（反対方向の）を含むアダプター（プライマーａｄｌｏｘ１７［ｇａｔ  ｃａｔ  ａａｃ  ｔｔｃ  ｇｔａ  ｔａａ  ｔｃｔ  ａｔａ  ｃｔａ  ｔａｃ  ｇａａ  ｇｔｔ  ａｔｔ］及びａｄｌｏｘ１８［ｃｔａ  ｇａａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｃｇｔ  ａｔａ  ｇｔａ  ｔａｇ  ａｔｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ］を用いて構築した）を、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化したｐＩＣ２７４５においてクローン化して、プラスミドｐＩＣ２７５５を得た。ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ３断片を、ｐＩＣ２７５５から、バイナリーベクターｐＩＣＢＶ１（アイコンジェネティックス（Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）で開発された。他のバイナリーベクターもこのクローニングに同様に適していると思われる）のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ３部位にサブクローンした。得られたプラスミドｐＩＣ２７６４（補足図７）は、バイナリーベクターにおける挿入断片（３５Ｓプロモーター−ＬｏｘＰ−Ｇｕｓ−ＬｏｘＭ−Ｏｃｓターミネーター）を含んでいる。
【００８５】
Ｃｒｅ  ＯＲＦは、ｐＩＣ０８からプライマーｃｒｅｒｅｃｏｍｂ１（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ  ＣＣＡＡＴＴＴＡＣＴ  ＧＡＣＣＴ）及びｃｒｅｒｅｃｏｍｂ２（ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣ  ＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣ）を用いてＰＣＲにより増幅し、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ平滑断片としてｐＩＣ０１１のＰｓｔＩ平滑及びＮｃｏＩ部位においてクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣ２７２１（補足図８）は、Ｈｂｔプロモーター（トウモロコシＣ４ＰＰＤＫ遺伝子の基礎プロモーターに融合された３５Ｓエンハンサーを含むキメラプロモーター、シェーン（Ｓｈｅｅｎ）、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９５年、第１２巻、３４９７ページを参照）の制御下にあるＣｒｅ  ＯＲＦを含む。
【００８６】
複製プラスミドと染色体標的部位との組換えの増加
構成体ｐＩＣ２７６４を、アグロバクテリウムの株ＧＶ３１０１にエレクトロポレーションにより導入し、形質転換した細菌をタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の形質転換に用いた。３０の形質転換したタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を、Ｘ−ｇｌｕｃ溶液で染色して（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、１９８７年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、第５巻、３８７〜４０５ページ）、高レベルのＧｕｓ発現を有する植物を選択した。Ｇｕｓを発現した植物を、プラスミドｐＩＣ２７２１とｐＩＣ２１２１との混合物でボンバードした。植物細胞への伝達後に、ＧＦＰを含むＤＮＡＡゲノムがｐＩＣ２１２１から放出され、複製すると予想される。Ｃｒｅにより媒介された組換えにより、染色体上の標的遺伝子座でＧｕｓコード配列のＧＦＰコード配列による交換が引き起こされ、ＧＦＰが３５Ｓプロモーターの制御下に置かれた。対照実験では、ｐＩＣ２０５１（非複製で、プロモーターを含まないＧＦＰ構成体）を、Ｇｕｓを発現したトランスジェニックタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物に同時にボンバードした。ｐＩＣ２１２１をｐＩＣ２７２１と同時にボンバードしたとき、対照実験におけるよりも多くのＧＦＰ発現細胞が検出された。
【００８７】
ｐＩＣ２７６４は、アイコンジェネティックス（Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）により開発されたインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）細胞懸濁液培養系においても形質転換された。安定に形質転換したクローンをＸ−Ｇｌｕｃで染色して、高レベルのＧｕｓ活性を有する系を選択した。Ｇｕｓを高レベルで発現した２つのクローンの細胞を増幅し、プラスミドｐＩＣ２１２１とｐＩＣ２７２１との混合物又はプラスミドｐＩＣ２０５１とｐＩＣ２７２１との混合物でボンバードした。ｐＩＣ２１２１をｐＩＣ２７２１とともに同時にボンバードしてから１週間後に、対照実験と比較して多くのＧＦＰ陽性細胞が認められた。
【実施例４】
【００８８】
この実施例において、我々は、実施例３で述べたように、部位選択的な組換えが安定に形質転換されたマメ細胞の生産をもたらし得ることを示す。この実施例では、ＢＡＲ遺伝子（図５）をＧＦＰで置換するが、ターゲティング戦略は実施例３と同じである。
【００８９】
プラスミドの説明と実験
ｐＩＣ２１０３は、ｐＩＣ５５１のＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位におけるｐＩＣ０１２（ｐＵＣ１１８におけるＮｏｓプロモーター−Ｂａｒコード配列−Ｏｃｓターミネーター）のＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をクローニングして構築した。反対方向の２つの異種特異的Ｌｏｘ部位が隣接するＢＡＲコード配列を含むｐＩＣ２１０３  ＦｓｅＩ−ＸｂａＩ断片を、ｐＩＣ１９５１のＦｓｅＩ−ＸｂａＩ部位にサブクローンして、プラスミドｐＩＣ２５７４（補足図９）を得た。ｐＩＣ２５７４は、コートタンパク質遺伝子を置換している２つの異種特異的部位の間にクローンされたプロモーターのないＢＡＲコード配列を含む。
【００９０】
ｐＩＣ２５７４をＢｇＩ２で消化し、再連結した。得られたクローンｐＩＣ２９４８（補足図１０）は、ＡＩ１（レプリカーゼ）、ＡＩ２及びＡＩ３  ＯＲＦｓの欠損を有している。
【００９１】
上述の２つのインゲンマメ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）トランスジェニック系（ｐＩＣ２７６４で安定に形質転換した）の細胞を、プラスミドｐＩＣ２５７４とｐＩＣ２７２１の混合物又はプラスミドｐＩＣ２９４８とｐＩＣ２７２１の混合物でボンバードした。形質転換したクローンをホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を含むプレート上で選択した。形質転換したクローンをＰＣＲにより分析して、部位特異的組換えにより生産されたことを確認した。ｐＩＣ２５７４を用いた場合、非複製対照ｐＩＣ２９４８を用いた場合よりも多くのＰＰＴ耐性クローンが得られた。
【実施例５】
【００９２】
この実施例では、戦略は実施例４と同様である。しかし、ここではＣｒｅを含む非複製プラスミドにレプリカーゼが存在する（図６）。このアプローチの利点は、レプリコンの複製が一過性であり、レプリカーゼを運ぶ非複製プラスミドが消失するときに停止する。利点は、形質転換した細胞が複製プラスミドを含まず、より健康で、トランスジェニック植物をより容易に発生させることができることである。
【００９３】
プラスミドの説明と実験
ＡＩ１（レプリカーゼ）、ＡＩ２及びＡＩ３  ＯＲＦｓを含む断片を、プラスミドｐＩＣ１６６４からプライマーＡＩ１ｘｈｏ１（ｔｃｔ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｔｔａ  ｃａａ  ａｔａ  ｔｇｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃｔｃ  ａａａ  ｇ）及びＡＩ１ｘｂａ１（ｇｃｔ  ｃｔａ  ｇａｇ  ｇａｔ  ｃｔａ  ｔｔｔ  ｃｔａ  ｔｇａ  ｔｔｃ  ｇａｔ  ａａｃ  ｃ）を用いて増幅した。増幅された断片を、ｐＩＣ０１（ｐＵＣ１１８における３５Ｓプロモーター−Ｇｕｓコード配列−Ｏｃｓターミネーター）のＸｈｏ１及びＸｂａ１部位におけるＸｈｏ１  Ｘｂａ１断片としてクローンした。得られたプラスミドｐＩＣ２８２１は、３５Ｓプロモーターの制御下のＢＧＭＶレプリカーゼを含む。
【００９４】
アダプター（ｅｃｏｐｓｔ１、ｅｃｏｐｓｔ２）を、ｐＩＣ２７２１のＥｃｏＲＩ部位においてクローン化した。得られたクローンｐＩＣ２９５５は、Ｍｆｅ１及びＰｓｔ１部位により置換されたＥｃｏＲＩ部位を有する。ｐＩＣ２８２１の２つの断片（ＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片及びＮｃｏＩ−Ｐｓｔ１断片）を、Ｍｆｅ１及びＰｓｔ１で消化したｐＩＣ２９５５中に３元連結反応でクローンした。得られたプラスミドｐＩＣ２９６６（補足図１１）は、３５Ｓプロモーターから発現されるＢＧＭＶ複製配列及びＨｂｔプロモーターの制御下にあるＣｒｅコード配列を含む。
【００９５】
上述の２つのインゲンマメ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）トランスジェニック系（ｐＩＣ２７６４で安定に形質転換した）の細胞を、プラスミドｐＩＣ２９４８とｐＩＣ２９６６との混合物又はプラスミドｐＩＣ２９４８とｐＩＣ２７２１との混合物でボンバードした。形質転換したクローンを、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を含むプレート上で選択した。形質転換したクローンを、ＰＣＲにより分析して、部位特異的組換えにより生産されたことを確認した。ｐＩＣ２９４８を複製した場合、ｐＩＣ２９４８をｐＩＣ２７２１と同時形質転換した非複製対照よりも多くのＰＰＴ耐性クローンが得られた（ｐＩＣ２９６６上での複製のため）。
【実施例６】
【００９６】
この実施例では、ＧＦＰを運ぶ複製クローンを、複製Ｃｒｅ発現クローン及びＢＧＭＶ  ＤＮＡＢゲノムとともに同時にボンバードする（図７）。３クローンすべてが複製することができ、Ｂゲノムが存在するため、３クローンすべてが、複製する隣接細胞に移動することができる。その結果、部位特異的組換えが起こる細胞数が増加することになる。
【００９７】
プラスミドの説明と実験
Ｃｒｅ  ＯＦＲをｐＩＣ９０３（ＰｒｏｍｅｇａからのｐＧｅｍ−Ｔにおいてクローン化したＣｒｅ  ＯＦＲ）からＳａｃＩ平滑Ｐｓｔ１断片として摘出し、ｐＩＣ１６６４のＢａｍＨＩ平滑部位及びＰｓｔ１部位においてクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣ２７３６（補足図１２）は、ＤＮＡＡ複製ベクターにおけるＢＧＭＶコートタンパク質の制御下にあるＣｒｅコード配列を含んでいる。
【００９８】
ｐＩＣ２１２１を、ｐＩＣ２７３６及びｐＩＣ１９１４（Ｎｓｉ１消化）とともに、ｐＩＣ２７６４で形質転換したトランスジェニックタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物の葉において、同時にボンバードした。対照実験では、ｐＩＣ２０５１をｐＩＣ２７２１と同時にボンバードした。ボンバードメントの１週間後に、実験において対照よりも多くのＧＦＰ発現細胞が検出された。
【実施例７】
【００９９】
この実験は、実施例６で述べたものと類似しているが、隣接細胞を複製し、隣接細胞に移動させるＢゲノムクローンの無能化の点で異なっている（図８）。Ｂゲノムクローンは、一過性に発現し、暫時の後に消失する。ＢＬ１遺伝子の発現がジェミニウイルス感染植物の疾患症状の大部分の原因であることが示されている（パスカルら（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、第５巻、７９５〜８０７ページ）ので、Ｂクローンを除去することが有利である。Ｂゲノムの遺伝子の一過性の発現は、ＴＧＭＶのＤＮＡＡゲノムの全身移動に十分であることも示された（ジェフリーら（Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２２３巻、２０８〜２１８ページ）。
【０１００】
プラスミドの説明と実験
シロイナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチン２プロモーターを含むｐＩＣ０４のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片を、ｐＩＣ０２（ｐＵＣ１１８における３５Ｓプロモーター−Ｇｕｓコード配列−Ｏｃｓターミネーター）のＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ部位においてクローン化したところ、プラスミドｐＩＣ２７７９が得られた。ＢＧＭＶ  ＢＬ１  Ｏｒｆを含むＰＣＲ断片を、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＤＮＡ（ＢＧＭＶ感染葉組織から抽出）から、プライマーＢＩ１Ｘｈｏ１（ｇｃｃ  ｔｃｇ  ａｇｃ  ｔｔａ  ａａｔ  ｇｇａ  ｔｔｃ  ｔｃａ  ｇｔｔ  ａｇｃ）及びＢＩ１ｂａｍ（ｃｇｇ  ｇａｔ  ｃｃｔ  ｔａｔ  ｔｔｃ  ａａａ  ｇａｃ  ｔｔｔ  ｇｇｔ  ｔｇａ  ｇ）を用いて増幅した。この断片を、ｐＩＣ０１に、Ｘｈｏ１−ＢａｍＨＩ断片としてクローン化して、プラスミド２７８１を得た。ＢＧＭＶ  ＢＲ１  ＯＲＦを含むＰＣＲ断片を、ｐＩＣ１９１４  ＤＮＡから、プライマーＢｒ１ｎｓｉ１（ｃｇａ  ｔｇｃ  ａｔｃ  ａｃａ  ｃｇａ  ａｔｔ  ａａｔ  ａａｔ  ｇｔａ  ｔｇｃ  ｇｔｃ）及びＢｒ１ｂａｍ（ｃｇｇ  ｇａｔ  ｃｃｔ  ｔａｔ  ｃｃａ  ａｃａ  ｔａａ  ｔｃａ  ａｇａ  ｔｃａ  ａａｔ  ｇ）を用いて増幅した。この断片を、ｐＩＣ２７７９に、Ｎｓｉ１−ＢａｍＨＩ断片としてクローン化して、プラスミド２７９２を得た。２つのｐＩＣ２７８１断片（ＥｃｏＲＩ平滑−ＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ３）を、Ｐｓｔ１（平滑）及びＨｉｎｄ３で消化したｐＩＣ２７９２に、３元連結反応でクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣ２８０７（補足図１３）は、（それぞれ）ｐＵＣ１１８におけるシロイナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチン２プロモーター及び３５Ｓプロモーターの制御下にあるＢＲ１及びＢＬ１  ＯＲＦｓを含む。
【０１０１】
ｐＩＣ２７６４で形質転換したトランスジェニックタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物の葉において、ｐＩＣ２１２１を、ｐＩＣ２８０７及びｐＩＣ２７３６とともに同時にボンバードした。対照実験では、ｐＩＣ２０５１をｐＩＣ２７２１と同時にボンバードした。ボンバードメントの１週間後に、実験において対照よりも多くのＧＦＰ発現細胞が検出された。
【実施例８】
【０１０２】
この実施例は、実施例６と類似しているが、ここでは、組換え酵素を、複製クローンから伝達させる代わりに標的部位から発現させる（図９）。その利点は、複製クローンが移動するすべての細胞においてＣｒｅが既に発現していることである。さらに、標的部位における組換えがＣｒｅを置換し、そのさらなる発現が妨げられる。
【０１０３】
プラスミドの説明と実験
ｐＩＣ１３２１のアクチン２プロモーター−ＬｏｘＰ−Ｃｒｅ  Ｏｒｆ−Ｎｏｓターミネーター断片を、Ｎｏｔ１平滑−ＳａｃＩ断片として、バイナリーベクターｐＢＩＮ１９のＳｍａＩ及びＳａｃＩ部位にサブクローンして、構成体ｐＩＣ１５９３を得た（補足図１４）。
【０１０４】
ＬｏｘＰ−Ｇｕｓ−Ｏｃｓターミネーター−ＬｏｘＰ断片を、プラスミドｐＩＣ０２から、プライマーＬｏｘＰｇｕｓ（ｇｇｃ  ａｔｃ  ｇａｔ  ａｔａ  ａｃｔ  ｔｃｇ  ｔａｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｃａｔ  ｔａｔ  ａｃｇ  ａａｇ  ｔｔａ  ｔａｃ  ａａｔ  ｇｇｇ  ｔｃａ  ｇｔｃ  ｃｃｔ  ｔａｔ  ｇ）及びＬｏｘＰｏｃｓ（ｇｃｃ  ｃａｔ  ｇｇａ  ｔａａ  ｃｔｔ  ｇｃｔ  ａｔａ  ａｔｇ  ｔａｔ  ｇｃｔ  ａｔａ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｔａｔ  ｇｔｃ  ａａｇ  ｇｔｔ  ｔｇａ  ｃｃｔ  ｇｃａ  ｃ）を用いて増幅した。増幅された断片を、ＣＩａＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＩＣ５９１（ＣＩａＩで置換されたＢａｍＨＩを有するｐＩＣ０１１）においてクローン化し、ＣＩａＩ及びＮｃｏＩで消化した。得られたプラスミドｐＩＣ２５５３は、プロモーターとＧＦＰのコード配列との間に挿入されたＬｏｘＰ部位が隣接するＧｕｓ遺伝子を含む。
【０１０５】
ｐＩＣ１５９３を、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム株ＡｇＩ１に導入し、形質転換したアグロバクテリウムを用いて、トランスジェニックタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を形質転換した。１０の形質転換体から抽出したＤＮＡを用いて、導入遺伝子の存在についてＰＣＲにより試験した。カナマイシン形質転換マーカー又はＣｒｅ遺伝子のプライマーを用いてＰＣＲを実施したとき、すべての植物が陽性であることが認められた。トランスジェニック植物におけるＣｒｅ組換え酵素の機能性を試験するために、２５の形質転換体の１枚の葉を、プラスミドｐＩＣ２５５３でボンバードした。Ｃｒｅの存在下で、ｐＩＣ２５５３のＬｏｘＰ部位の組換え酵素が、ＧＦＰ遺伝子の発現をもたらした。Ｃｒｅを発現することが認められた植物の葉を、ｐＩＣ２１２１とｐＩＣ１９１４の混合物でボンバードした（Ｎｓｉ１消化）。対照実験では、同じトランスジェニック植物の葉をｐＩＣ２０５１とｐＩＣ１９１４との混合物でボンバードした（Ｎｓｉ１消化）。実験において対照よりも多くのＧＦＰ発現細胞が検出された。
【実施例９】
【０１０６】
この実施例は、ゲノム内の標的配列と相同のＤＮＡ配列を含むプラスミドの複製がこの標的配列との相同的組換えをもたらし得ることを示す（図１０）。
【０１０７】
プラスミドの説明と実験
インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＬＳ遺伝子の断片を、ゲノムＤＮＡから、縮重プライマーａｌｓｄｐｒ１（ｃｇｇ  ｇａｔ  ｃｃｃ  ａｇｇ  ｔｇｇ  ｎｇｃ  ｗｔｃ  ｍａｔ  ｇｇａ  ｇａｔ）及びａｌｓｄｐｒ２（ｃｇｇ  ａｇｃ  ｔｃｇ  ｃａｔ  ａｃａ  ｃａｇ  ｔｈｃ  ｃｒｔ  ｇｃａ  ｔ）を用いて増幅し、直接配列決定を行った。配列情報を用いて、プロリン（トウモロコシＡＨＡＳ１０８のＰｒｏ−１６５に相当する［リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、ＥＭＢＯ  Ｊ．第７巻、１２４１〜１２４８ページ］）と重複する２つのプライマー（ａｌｓｐｒ３：  ｃｇａ  ｃａｇ  ｃｇｔ  ｃｇｃ  ｃｃｔ  ｃｇｔ  ｔｇｃ  ｃａｔ  ｃ及びａｌｓｐｒ４：  ｇａｔ  ｇｇｃ  ａａｃ  ｇａｇ  ｇｇｃ  ｇａｃ  ｇｃｔ  ｇｔｃ  ｇ）を設計した。ａｌｓｐｒ３とａｌｓｐｒ４は、このプロリンをアラニンに変えるヌクレオチド置換を含む。ＰＣＲを用いて、プロリンがアラニンに突然変異したＡＨＡＳ  ＤＮＡを、マメゲノムＤＮＡから、プライマーａｌｓｄｐｒ１、ａｌｓｄｐｒ２、ａｌｓｐｒ３及びａｌｓｐｒ４を用いて増幅した。このＤＮＡを、ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＩＣ２１７１においてクローン化して、プラスミドｐＩＣ２８３４を得た（補足図１５）。
【０１０８】
非複製プラスミドの対照として、ｐＩＣ２８３４のＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１９にサブクローンして、プラスミド２８５７を得た（補足図１６）。
【０１０９】
マメ細胞懸濁培養を、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）葉組織から調製した。それぞれ約１０６個の細胞を含む６０枚の培地を、プラスミドｐＩＣ２８３４でボンバードした。陰性対照として、６０枚の培地をプラスミドｐＩＣ２８５７でボンバードし、別の４０枚の培地はボンバードせずに、同じ条件で生育させた。形質転換した細胞を、２０ｐｐｂのクロロスルホン（Ｇｌｅａｎ、工業用、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ））を含む固形培地上で、平板培養した。ボンバードメントの４〜６週間後に確認される推定の事象を、５０ｐｐｂのクロロスルホンを含む新しい培地上で選択した。耐性クローンをＰＣＲ増幅により分析し、配列決定した。対照よりも実験（複製クローンｐＩＣ２８３４を用いた）において、予想された変化（標的コドンにおけるプロリンからアラニンへの）に起因した多くの耐性クローンが認められた。
【実施例１０】
【０１１０】
この実施例は、複製ジェミニウイルスクローンをアグロバクテリウムの浸潤により伝達できることを示す。
【０１１１】
プラスミドの説明と実験
ｐＩＣ１６９４のＸｈｏ１−Ｎａｒ１断片を、ｐＩＣＢＶ１１に、サブクローンして、ｐＩＣ１６９４のプロレプリコン部分を含むバイナリーベクターを構築した。得られたクローンｐＩＣＨ４３００（図１１）は、重複するＣＲｓ間に、ＢＧＭＶコートタンパク質プロモーターの制御下にあるＧＦＰ遺伝子とＡＩ１／２／３遺伝子とを含む。ｐＩＣ４３００を、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１で形質転換した。アグロバクテリウム細胞を、１００μＭアセトシリンゴンを含むＬＢ中で一夜生育させた。翌日、細菌をペレットとし、１０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び１００μＭアセトシリンゴンを含む溶液に、０．８のＯＤで再懸濁した。再懸濁したアグロバクテリウム細胞を、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に浸潤させた。接種２日後から２週間を超える時点まで、強いＧＦＰ蛍光が浸潤した領域に認められた。ジェミニウイルスレプリコンが形成されていることを確認するために、接種の３日後に浸潤領域からゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロットにより分析した。未消化のＤＮＡをＧＦＰプローブで分析したところ、ニックを有する開環ＤＮＡと超コイルＤＮＡが存在することが示されたが、ＢａｍＨＩにより線状化されたＤＮＡは１つの移動断片をもたらした。線状化ＤＮＡのシグナルと既知の濃度のプラスミドのシグナルとの比較により、レプリコンが細胞当たり１５〜３００００コピー存在すると推定された。
【実施例１１】
【０１１２】
この実施例では、レプリカーゼを欠くジェミニウイルスクローンが、輸送中にレプリカーゼを供給した場合、効率よく複製することを示す。
【０１１３】
プラスミドの説明
ｐＩＣＨ４３００から、ｃｒｐｒ６（ｃｇｃ  ａａｔ  ｔｇｃ  ｔｃｇ  ａｇｃ  ｔｔｔ  ｇａｇ  ｇｔｇ  ｇｔｇ  ｇｃａ  ｔａｔ  ｔｔｇ）及びｇｆｐｐｒ１（ｃｇｃｔｇａａｃｔｔｇｔｇｇｃｃｇｔｔｃａｃ）を用いて増幅したＰＣＲ産物を、Ｘｈｏ１  ＢａｍＨＩ断片として、ｐＩＣＨ４３００のＸｈｏ１  ＢａｍＨＩ部位においてクローン化した。得られたクローンｐＩＣＨ５１８４は、ｐＩＣＨ４３００と類似しているが、ｐＩＣＨ５１８４におけるプロレプリコン領域の外側にあるＡＬ１の断片を欠いている。レプリカーゼを欠くＧＦＰプロレプリコンは、ｐＩＣＨ４３００からｃｒｐｒ９（ｃｇｇ  ｔｃａ  ｔｇａ  ｔｔｃ  ｔｃａ  ａｇｃ  ａｃａ  ｇｔａ  ｔｇｇ  ｃａｔ  ａｔｔ  ｔｇｔ  ａａａ  ｔａｔ  ｇｃｇ  ａｇｔ  ｇｔｃ）及びｃｒｐｒ８（ｇｃ  ｔｃｔ  ａｇａ  ｇａｃ  ａｃｇ  ｔｇｇ  ａｇｇ  ｃｇｔ  ａｃｇ  ｇ）を用いて増幅したＰＣＲ産物を、ｐＩＣＨ５１８４のＢｓｐＨＩ及びＸｂａ１部位においてクローン化して構築した。プラスミドｐＩＣＨ５１７０（図１１）は、ｐＩＣＨ２８２１のＸｈｏ１  Ｘｂａ１断片（ＡＩ１／２／３  Ｏｒｆｓ）を、ｐＩＣＢＶ１６（アイコンジェネティックス（Ｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）バイナリーベクター、Ｋａｎ選択）においてクローン化して構築した。ＡＩ１／２／３  Ｏｒｆｓは、ｐＩＣＨ５１７０における３５Ｓプロモーターの制御下にある。ｐＩＣＨ４３００から、プライマーｃｒｐｒ８（ｇｃ  ｔｃｔ  ａｇａ  ｇａｃ  ａｃｇ  ｔｇｇ  ａｇｇ  ｃｇｔ  ａｃｇ  ｇ）及びｃｒｐｒ９（ｃｇｇ  ｔｃａ  ｔｇａ  ｔｔｃ  ｔｃａ  ａｇｃ  ａｃａ  ｇｔａ  ｔｇｇ  ｃａｔ  ａｔｔ  ｔｇｔ  ａａａ  ｔａｔ  ｇｃｇ  ａｇｔ  ｇｔｃ）を用いて増幅したＰＣＲ産物を、ｐＩＣＨ４３００のＢｓｐＨＩ  Ｘｂａ１断片としてクローンした。得られたプラスミドｐＩＣＨ５２０３（図１１）は、ｐＩＣＨ４３００と類似しているが、ＡＩ１／２／３  Ｏｒｆｓを欠いている。ｐＩＣＨ４６９９は、ｐＩＣＨ４３００と類似しているが、ＧＦＰコード配列が、アンチセンス配向でＬｏｘＡ−Ｇｕｓコード配列−ｎｏｓターミネーター−ＬｏｘＭを含む配列により置換されていた。
【０１１４】
実験
ｐＩＣＨ５２０３、ｐＩＣＨ４６９９及びｐＩＣＨ５１７０を、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換した。上記のように、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に浸潤させた。ｐＩＣＨ５２０３を単独、ｐＩＣＨ４６９９又はｐＩＣＨ５１７０とともに浸潤させ、ｐＩＣＨ４３００を陽性対照として浸潤させた。４日後に浸潤領域からゲノムＤＮＡを抽出し、共通領域プローブを用いて、サザンブロッティングにより分析した。ｐＩＣＨ５２０３を単独で浸潤させたとき、複製は検出されなかった（図１１、レーン１〜３）。ｐＩＣＨ５２０３レプリコンは、高レベル（図１１、レーン４〜６、断片ｂ）で、ｐＩＣＨ４６９９（構成的に複製する、増幅断片（ａ）を図１１に示す）とともに同時に浸潤させた組織中で増幅した。それはまた、複製しないｐＩＣＨ５１７０とともに同時に浸潤させたときも効率よく複製した（図１１、レーン７〜９）が、ｐＩＣＨ４３００を単独で浸潤させたとき（レーン１０〜１２）よりも低レベルであった（約５倍低い）。
【実施例１２】
【０１１５】
この実施例では、組換えはストレプトミセスファージＰｈｉＣ３１インテグラーゼ系に依拠し、組換えはＡｔｔＰ部位とＡｔｔＢ部位との間に起こる。部位選択的形質転換は、アグロバクテリウム形質転換を用いて実施するが、他の伝達手段によっても実施できると思われる。
【０１１６】
プラスミドの説明
ｐＩＣＨ６２７２（図１２）は、ｐＩＣＢＶ１０（選択のためのＮｏｓプロモーター−Ｎｐｔｌｌコード配列−Ｎｏｓターミネーターを含むアイコンジェネティックス（Ｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）バイナリーベクター）においてクローン化され、３４Ｓプロモーター−ＡｔｔＢ部位−Ｇｕｓコード配列−Ｏｃｓターミネーター−ＡｔｔＢ部位（逆方向）−ＧＦＰコード配列−Ｎｏｓターミネーターからなっている。３４Ｓプロモーターは、ｐＩＣＰ１１５９（３４Ｓプロモーター−多クローニング部位−マンノピンシンターゼターミネーターを含むクロラムフェニコールプラスミド）から、Ｘｂａ  ＢｇＩ２断片としてクローンした。Ｇｕｓコード配列−Ｏｃｓターミネーター配列ブロックは、ｐＩＣ０１からのＳａｃ１  Ｐｓｔ１として現れる。ＧＦＰコード配列−Ｎｏｓターミネーターは、Ｐｓｔ１部位を欠失したｐＩＣ０１１由来クローンに由来する。ＡｔｔＢ組換え部位（ｃｃｇｃｇｇｔｇｃｇｇｇｔｇｃｃａｇｇｇｃｇｔｇｃｃｃｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃｃｇｇｇｃｇｃｇｔａｃｔｃｃａｃ）は、インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）から発注されるオリゴヌクレオチドから合成した。
【０１１７】
ｐＩＣＨ７５５５（図１２）は、ｐＩＣＢＶ１０にクローンされた、シロイヌナズナアクチン２プロモーター−ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ−Ｎｏｓターミネーター−ＢＧＭＶ共通領域−ＡｔｔＰ部位−Ｂａｒコード配列−Ｏｃｓターミネーター−３５Ｓプロモーター−逆方向のＡｔｔＰ部位−ＢＧＭＶ共通領域からなっている。共通領域はｐＩＣ１６９４に、Ｂａｒ−ＯｃｓターミネーターはｐＩＣ０１２に、３５ＳプロモーターはｐＩＣ０１に、アクチン２−ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ−ＮｏｓターミネーターはｐＩＣＰ１０１０に由来する。ＡｔｔＰ組換え部位（ｇｔａｇｔｇｃｃｃｃａａｃｔｇｇｇｇｔａａｃｃｔｔｔｇａｇｔｔｃｔｃｔｃａｇｔｔｇｇｇｇｇｃｇｔａ）を、インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）から発注されるオリゴヌクレオチドから合成した。
【０１１８】
実験
プラスミドｐＩＣＨ６２７２は、アグロバクテリウム形質転換によりタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃａｍ）において安定に形質転換された。トランスジェニック植物は、Ｘ−Ｇｌｕｃで葉組織を染色して、Ｇｕｓ発現について検査した。部位選択的形質転換に用いるために、Ｇｕｓを発現した２つの形質転換体を選択した。レプリコン上のＡｔｔＰ部位（ｐＩＣＨ７５５５に由来）における、標的部位におけるＡｔｔＢ部位（ｐＩＣＨ６２７２に由来）との組換えは、プロモーターのないＢＡＲ遺伝子（レプリコンに由来）を３４Ｓプロモーターの制御下に置き、それにより、形質転換細胞にＰＴＴ耐性を付与すべきである。両形質転換体のリーフディスクにプラスミドｐＩＣＨ７５５５を運ぶアグロバクテリアを接種するか、或いはｐＩＣＨ７５５５及びｐＩＣＨ５１７０を含むアグロバクテリウム培養の混合物を接種した。ＰｈｉＣ３１インタグラーゼの存在下では、レプリコン上の２つのＡｔｔＰ部位の部位特異的組換えが標的遺伝子座における２つのＡｔｔＢ部位のいずれか１つにおいて起こり得る。構成体ｐＩＣＨ７５５５又はｐＩＣＨ７５５５由来のレプリコンの第１のＡｔｔＰ部位が標的遺伝子座における第１のＡｔｔＢ部位と組み換えるとき、ｐＩＣＨ７５５５又はレプリコンのプロモーターのないＢａｒ遺伝子は標的部位における３４Ｓプロモーターの制御下に置かれている。形質転換細胞の選択は、ＰＰＴ含有培地上で行った。標的とする遺伝子が一過性に複製したとき（ｐＩＣＨ７５５５及びｐＩＣＨ５１７０の一過性の発現）複製しなかったとき（ｐＩＣＨ７５５５単独）よりも多くの組換え体が得られた。形質転換細胞をＰＣＲ及びサザンブロッティングにより分析して、部位選択的形質転換細胞であることを確認した。
【実施例１３】
【０１１９】
この実施例では、標的部位及び標的とする遺伝子（プロレプリコン上に存在）を最初に別の植物体内で形質転換する。標的とする遺伝子の伝達は、ハイブリッド形成により実現する。
【０１２０】
プラスミドの説明
ｐＩＣＨ６３１３（図１２）は、ｐＩＣＨ６２７２から得られる。ＢｇＩ２  ＳｐｅＩ断片を、ｐＩＣＨ６３０３（バイナリーベクターにおける内部リボソーム入口部位に連結されたＡＩ１／２／３）  Ｏｒｆｓ）から、ｐＩＣＨ６２７２のＸｂａ１  ＢａｍＨＩ部位にサブクローンした。得られたプラスミドは、３４Ｓプロモーターの制御下にあるＧｕｓ及びＡＩ１／２／３を含む。ｐＩＣＨ６０４０（図１２）は、ｐＵＣ１１８における３５Ｓプロモーター−ＡｔｔＢ部位−Ｂａｒコード配列−ＯｃｓターミネーターＡｔｔＰ部位−ＧＦＰコード配列−Ｎｏｓターミネーターからなっている。３５Ｓプロモーター配列はｐＩＣ０１に、Ｂａｒ−ＯｃｓターミネーターはｐＩＣ０１２に、ＧＦＰ−ＮｏｓターミネーターはｐＩＣ０１１に由来する。ｐＩＣＨ６０４０は、トランスジェニック植物におけるＰｈｉＣ３１の発現を確認するために試験構成体としてデザインした。すなわち、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼの発現により、ＡｔｔＢとＡｔｔＰとの分子内組換えが３５ＳプロモーターへのＧＦＰコード配列の融合及びＧＦＰの発現をもたらす。
【０１２１】
実験
ｐＩＣＨ７５５５、ｐＩＣＨ６３１３及びｐＩＣＨ６２７２を、アグロバクテリウム形質転換を用いてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に安定に形質転換させた。Ｇｕｓを発現したｐＩＣＨ６３１３を、ｐＩＣＨ７５５５形質転換体との交雑に用いるために選択した。これらの形質転換体は、ＩＲＥＳによりＧｕｓに連結されるとき、ＢＧＭＶレプリカーゼも発現すると予想される。ｐＩＣＨ７５５５形質転換体を、ＰＣＲにより、プロレプリコンの存在について確認し、試験構成体ｐＩＣＨ６０４０による葉組織のボンバードメントにより、ＰｈｉＣ３１の活性について確認した。ｐＩＣＨ６３１３形質転換体を、雌としてｐＩＣＨ７５５５形質転換体と交雑させた。Ｆ１植物では、ｐＩＣＨ６３１３からのＡＩ１／２／３遺伝子の発現が、ｐＩＣＨ７５５５導入遺伝子からのレプリコンの形成をもたらす。レプリコン分子と標的部位との組換えが３４ＳプロモーターへのＢＡＲ遺伝子の融合をもたらす。同時に、Ｇｕｓコード配列−ＩＲＥＳ−ＡＩ１／２／３  ＯｒｆｓのＢａｒコード配列−Ｏｃｓターミネーター−３５Ｓプロモーターによる置換が、レプリコンの複製の停止をもたらす。対照交雑（複製なし）では、ｐＩＣＨ６２７２形質転換体を、雌としてｐＩＣＨ７５５５形質転換体と交雑させた。両タイプの交雑のＦ１植物を選択せずに生育させ、Ｆ２実生についてＢａｓｔａ選択を適用した。ｐＩＣＨ６３１３との交雑によって、ｐＩＣＨ６２７２との交雑よりも多くのＢａｓｔａ耐性植物が得られた。Ｂａｓｔａ耐性植物をＰＣＲ及びサザンブロッティング分析により検査して、標的部位組換え事象により得られたことを確認した。
【実施例１４】
【０１２２】
この実施例では、部位選択的ＤＮＡ組換えの成功を検出するためのアッセイとして、ＲＮＡウイルスプロベクター系を用いる。プロベクター系の別の断片上のＬｏｘＰ部位における組換えが、増幅の能力のある機能的ウイルス転写物に転写されるＤＮＡ分子をもたらす。このアッセイを用いて、ＤＮＡ配列の複製が非複製標的配列との部位特異的組換えの率を増加させることを示す。
【０１２３】
プラスミドの説明
ｐＩＣＨ４３７１は、ＴＶＣＶ  ＲＮＡウイルスに基づく５’プロベクターからなっている。ｐＩＣＨ４３７１は、バイナリーベクターにおけるシロイヌナズナアクチン２プロモーター−ＴＶＣＶポリメラーゼ−移動タンパク質の切断型−ＬｏｘＰ部位−Ｎｏｓターミネーターを含む。ｐＩＣＨ４４６１は、３’末端プロベクターからなる。それは、バイナリーベクター中にＬｏｘＰ部位−ＧＦＰコード配列−ウイルス３’ＮＴＲ−Ｎｏｓターミネーターを含んでいる。ｐＩＣＨ７３１１は、ｐＩＣＨ４４６１のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片（３’プロベクター断片を含む）を、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩで消化したｐＩＣＨ６９７０（バイナリーベクターにおける２ＢＧＭＶ共通領域間のＬｏｘＡ−Ｂａｒコード配列−ＬｏｘＭ）においてクローン化して得た。ｐＩＣＨ７３１１は、バイナリーベクターにおける２ＢＧＭＶ共通領域間のＬｏｘＰ−ＧＦＰコード配列−ＴＶＣＶ３’ＮＴＲ−Ｎｏｓターミネーターからなっている（図１３）。ｐＩＣＨ１７５４は、ｐＩＣＢＶ１０においてクローンされたシロイヌナズナアクチン２プロモーター−ＬｏｘＰ−ｃｒｅコード配列−ＬｏｘＭ−Ｏｃｓターミネーターからなっている。ｐＩＣ１７５４は、ここではｃｒｅ組換え酵素を供給するために用いる。
【０１２４】
実験
ｐＩＣＨ４３７１、ｐＩＣＨ７３１１、ｐＩＣＨ５１７０及びｐＩＣＨ１７５４を、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換させた。ｐＩＣＨ４３７１を、タバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉において、ｐＩＣＨ７３１１、ｐＩＣＨ１７５４とともに同時浸潤させた。この際、ｐＩＣＨ５１７０（ＢＧＭＶレプリカーゼ）を同時浸潤に用いた場合と、用いない場合とで行なった。ｐＩＣＨ５１７０の浸潤により、ｐＩＣＨ５１７０を用いない場合よりも多くのＧＦＰ区域が得られ（図１３）、３’末端プロベクターの増幅によって、部位特異的組換えの増加をもたらすことが示唆される。陰性対照として、ｐＩＣＨ７３１１をｐＩＣＨ５１７０とともに、又は単独で浸潤させた。いずれの場合にもＧＦＰ発現は検出されず、ＧＦＰは３’プロベクタークローンのみからは発現しないことがわかる。また、ｐＩＣＨ４３７１を、ｐＩＣＨ４４６１及びｐＩＣＨ１７５４とともに浸潤させた。ｐＩＣＨ４３７１を、ｐＩＣＨ７３１１及びｐＩＣＨ１７５４と同時浸潤させた場合と同じ数の組換えが認められた（示さず）。
【実施例１５】
【０１２５】
この実施例では、非複製相同配列を用いるＤＮＡ配列の複製が相同的組換え率を増加させることを示す。非機能性ＲＮＡプロレプリコンを機能性に突然変異させることにより、増幅及びＧＦＰ発現葉細胞区域をもたらす、組換え事象が検出された。
【０１２６】
プラスミドの説明
プラスミドｐＩＣＨ７４７７（図１４）は、ｐＩＣＨ４３５１の３つの断片、すなわちＫｐｎＩ  ＳｐｈＩ平滑断片、ＳｐｈＩ平滑Ｘｈｏ１断片及びＸｈｏ１  Ｋｐｎ１断片を連結させて構築した。得られたクローンｐＩＣＨ７４７７は、Ｓｐｈ１部位で、ＴＶＣＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｄｒｐ）Ｏｒｆにフレームシフトを含み、したがって、非機能性プロレプリコンクローンである。ＴＶＣＶ  Ｒｄｒｐ  Ｏｒｆの非突然変異断片を、ｐＩＣＨ４３５１から、プライマーｒｄｒｐｐｒ３（ｔｔｔ  ｃｃａｔｇｇ  ａｔｔ  ａｃｃ  ｃｔｇ  ｔｔａ  ｔｃｃ  ｃｔａ  ａａｇ  ｇｃａ  ｔｃｔ  ｃｇｔ  ｃｇｃ  ｇｔｔ  ｔａｃ）及びｒｄｒｐｐｒ４（ｔｔｔ  ｃｔｇｃａｇ  ｇａａ  ａｔｇ  ａａａ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ｇａａ  ａｃａ  ａｇ）を用いてＰＣＲ増幅し、ｐＩＣＨ７４２３におけるＮｃｏ１  Ｐｓｔ１断片としてクローンした（ｐＩＣＨ７４２３は、コートタンパク質プロモーター領域からＨｉｎｄ３  Ｎｃｏ１が除去されたｐＩＣＨ１６９４の誘導体である）。得られたクローンｐＩＣＨ７４８０（図１４）は、ジェミニウイルスプロレプリコンにおけるＩ−ＳｃｅＩ制限部位が片側に隣接するＴＶＣＶの非突然変異断片を含む。ｐＩＣＨ７４８０のＮｃｏ１  Ｐｓｔ１断片を、ｐＩＣＨ６９７０のＮｃｏ１及びＰｓｔ１部位にサブクローンした。得られたクローンｐＩＣＨ７４９９（図１３）は、ｐＩＣＨ７４８０と類似しているが、レプリカーゼを欠いているため、自律的に複製することができない。しかし、レプリカーゼをトランスに供給されるとき、複製することができる。
【０１２７】
実験
プラスミドｐＩＣＨ４３５１は、ＲＮＡウイルスＴＶＣＶに基づくＧＦＰを運ぶプロレプリコンである。ｐＩＣＨ７４７７においては、ＴＶＣＶのＯＲＦにおけるフレームシフトのためレプリコンを生産することができない。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物に、プラスミドｐＩＣＨ７４８０を含むアグロバクテリウムを浸潤させた。非複製対照として、別の植物にｐＩＣＨ７４９９を、アグロバクテリウムを介して浸潤させた。１日後に、両植物にｐＩＣＨ７４７７及びｐＩＣＨ７５００（３５Ｓプロモーター−Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ−Ｎｏｓターミネーター）を浸潤させた。ｐＩＣＨ７５００の発現は、Ｉ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼとＩ−ＳｃｅＩ制限部位におけるジェミニウイルスレプリコンの切断をもたらす。線状化断片のＴＶＣＶ  Ｏｒｆの突然変異部分との相同的組換えは、機能性ＴＶＣＶプロレプリコンの再生をもたらす。ｐＩＣＨ７４８０を用いた方がｐＩＣＨ７４９９よりも多くのＧＦＰ発現区域が形成された。
【０１２８】
この実験の変形形態において、ジェミニウイルスレプリコンのレプリカーゼをトランスで一過性に発現させる。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物に、ｐＩＣＨ７４８０を単独で、又はｐＩＣＨ７４８０とｐＩＣＨ５１７０を浸潤させた。１日後に、すべての植物にｐＩＣＨ７４７７及びｐＩＣＨ７５００を浸潤させた。ｐＩＣＨ５１７０を接種した植物において、ｐＩＣＨ７４８０単独を接種した植物よりも多くのＧＦＰ発現区域が得られた。
【０１２９】
他の実験において、ｐＩＣＨ７４７７を安定にタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に形質転換させた。形質転換体に、ｐＩＣＨ７４８０又はｐＩＣＨ７４９９を浸潤させた。１日後に、同じ領域にｐＩＣＨ７５００を浸潤させることにより、Ｉ−ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼが伝達された。ｐＩＣＨ７４８０を浸潤させた植物において、ｐＩＣＨ７４９９を浸潤させた植物よりも多くのＧＦＰ発現区域が得られた。
【０１３０】
他の実験において、ｐＩＣＨ７４７７トランスジェニック植物にｐＩＣＨ７４９９を単独又はｐＩＣＨ５１７０とともに浸潤させた。１日後に、同じ領域にｐＩＣＨ７５００を浸潤させることにより、制限エンドヌクレアーゼが伝達された。ｐＩＣＨ５１７０を浸潤させた植物において、ｐＩＣＨ７４９９を浸潤させた植物よりも多くのＧＦＰ発現区域が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】植物細胞内の標的部位又は相同的組換えの頻度を増加させるための多くの可能な方法のうちの６つ（Ａ〜Ｆ）を示す図である。Ｘは、ドナー分子又は目的配列である。Ｙは、アクセプター又は標的部位である。Ｚは、部位選択的又は相同的な組換えの頻度である。Ｗは、非相同的又は不規則な組込みの頻度である。大きい文字は、分子（Ｘ、酵素）、標的部位（Ｙ）の数／濃度の増加及び組換え事象（Ｚ、Ｗ）の頻度の増加を意味する。
【図２】ジェミニウイルスに基づくベクターの複製能力を試験するために設計された実験のスキームを示す図である。
【図３】一過性の発現実験において、複製及び非複製ベクターを用いて部位特異的組換えの効率を比較するためのスキームを示す図である。
【図４】目的のドナー配列（ＧＦＰ）を含む複製及び非複製ベクターを用いてトランスジェニック植物細胞内の部位特異的組換えの効率を比較するためのスキームを示す図である。部位特異的Ｃｒｅ組換え酵素は、非複製ベクターから一過性に供給される。
【図５】目的のドナー配列（ＢＡＲ）を含む複製及び非複製ベクターを用いてトランスジェニック植物細胞内の部位特異的組換えの効率を比較するためのスキームを示す図である。部位特異的Ｃｒｅ組換え酵素は、非複製ベクターから一過性に供給される。
【図６】目的のドナー配列（ＢＡＲ）を含む複製及び非複製ベクターを用いてトランスジェニック植物細胞内の部位特異的組換えの効率を比較するためのスキームを示す図である。部位特異的Ｃｒｅ組換え酵素は、非複製ベクターからレプリカーゼとともに一過性に供給される。
【図７】目的のドナー配列（ＧＦＰ）を含む、細胞間移動能を有する（複製及びＢＧＭＶ  Ｂゲノムの移動に起因）複製ベクター及び非複製ベクターを用いてトランスジェニック植物細胞内の部位特異的組換えの効率を比較するためのスキームを示す図である。部位特異的Ｃｒｅ組換え酵素は、複製又は非複製ベクターから一過性に供給される。
【図８】目的のドナー配列（ＧＦＰ）を含む、細胞間移動能を有する（しかしＢＧＭＶ  Ｂゲノムは移動することができない）複製ベクター及び非複製ベクターを用いてトランスジェニック植物細胞内の部位特異的組換え事象の効率を比較するためのスキームを示す図である。部位特異的Ｃｒｅ組換え酵素は、複製又は非複製ベクターから一過性に供給される。
【図９】目的のドナー配列（ＧＦＰ）を含む、細胞間移動能を保持している（複製及びＢＧＭＶ  Ｂゲノムの移動に起因）複製ベクター及び非複製ベクターを用いてトランスジェニック植物細胞内の部位特異的組換え事象の効率を比較するためのスキームを示す図である。部位特異的Ｃｒｅ組換え酵素は、トランスジェニック植物細胞により発現され、部位特異的組換えの結果としてスイッチオフされる。
【図１０】ジェミニウイルスに基づく複製ベクターを用いた相同的組換えによる位置指定突然変異誘発の実験のスキームを示す図である。
【図１１】トランスで供給されたレプリカーゼによるレプリコンの増幅を実証するために構成されたＴ−ＤＮＡに基づく構成体ｐＩＣＨ５２０３、ｐＩＣＨ４３００、ｐＩＣＨ４６９９及びｐＩＣＨ５１７０を示し、サザンブロット分析の結果を示す図である。
【図１２】Ｃ３１インテグラーゼ系を用いた部位特異的組込みのために設計されたＴ−ＤＮＡに基づく構成体ｐＩＣＨ６２７２、ｐＩＣＨ６３１３、ｐＩＣＨ７５５５、ｐＩＣＨ５１７０及びｐＩＣＨ６０４０を示す図である。
【図１３】ジェミニウイルス媒介３’末端プロベクター増幅を用いた５’及び３’プロベクター間の部位特異的組換えの増加を実証するために用いた構成体ｐＩＣＨ４３７１、ｐＩＣＨ４４６１、ｐＩＣＨ７３１１、ｐＩＣＨ５１７０及びｐＩＣＨ１７４５を示す図である。また、部位特異的組換えの増加を示す浸潤性Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉の写真を示す。
【図１４】組換え事象の検出系としてのプロベクターエレメントを用いた相同的組換えのために設計されたＴ−ＤＮＡに基づく構成体ｐＩＣＨ７４７７、ｐＩＣＨ７４８０、ｐＩＣＨ７４９９、ｐＩＣＨ５１７０及びｐＩＣＨ７５００を示す図である。
【図１５】補足図１は、実施例で用いたベクターを示す。
【図１６】補足図２は、実施例で用いたベクターを示す。
【図１７】補足図３は、実施例で用いたベクターを示す。
【図１８】補足図４は、実施例で用いたベクターを示す。
【図１９】補足図５は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２０】補足図６は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２１】補足図７は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２２】補足図８は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２３】補足図９は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２４】補足図１０は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２５】補足図１１は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２６】補足図１２は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２７】補足図１３は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２８】補足図１４は、実施例で用いたベクターを示す。
【図２９】補足図１５は、実施例で用いたベクターを示す。
【図３０】補足図１６は、実施例で用いたベクターを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月18日(2003.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞の核ゲノム中に目的とするＤＮＡの選択的な組込みをもたらす方法において、
（ｉ）植物細胞内で自律性の複製能を有する、増幅ベクター又はその前駆体であって、該ベクターが、
（ａ）植物細胞内で機能する複製起点をコードするＤＮＡ配列（１個又は複数）と、
（ｂ）ベクターと宿主の核ＤＮＡとの間の部位特異的かつ／又は相同的な組換えに必要なＤＮＡ配列（１個又は複数）と、
（ｃ）任意に、さらに目的とするＤＮＡと
を含むものを、植物細胞に供給する工程と、
（ｉｉ）任意に、ベクターの増幅及び／又は細胞間移動及び／又は部位特異的かつ／又は相同的な組換えを促進する条件を与える工程と、
（ｉｉｉ）植物の核ＤＮＡ中における予定部位で組換えを受けた細胞を選択する工程とを含み、
該（ｉ）の工程により、該植物細胞内の該増幅ベクターの複製を、一過性とする方法。
【請求項２】
植物細胞の核ゲノム中に目的とするＤＮＡの選択的組込みをもたらす方法であって、
（ｉ）植物細胞ゲノム中に組み込んだ際、部位特異的かつ／又は相同的な組換えのための標的部位をもたらす配列を含む第１のＤＮＡで、植物細胞をトランスフェクション又は形質転換する工程と、
（ｉｉ）その核ゲノム中に部位特異的かつ／又は相同的な組換えのための該標的部位を含む細胞を選択する工程と、
（ｉｉｉ）該標的部位の組換えのための領域と目的とする第１の配列を含む第２のＤＮＡで、該選択された細胞を、トランスフェクション又は形質転換する工程と、
（ｉｖ）任意に、組換えのための酵素を供給する工程と、
（ｖ）標的部位に組み込まれた、第２のＤＮＡからの目的配列を含む細胞を選択する工程とを含み、
これより、植物細胞内で自律性の複製能を有し、植物細胞内で機能する複製起点をコードするＤＮＡ配列（１個又は複数）を含む増幅ベクター又はその前駆体で、該第１又は該第２のＤＮＡの少なくとも１つを伝達し、
該植物細胞内の該増幅ベクターの複製を、一過性とする方法。
【請求項３】
前記増幅ベクターが、相同的組換えに必要なＤＮＡ（１個又は複数）を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
植物細胞への増幅ベクター又はその前駆体の前記供給、或いは前記トランスフェクション又は形質転換が、アグロバクテリウム媒介伝達により行われる請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
植物細胞への増幅ベクター又はその前駆体の前記供給、或いは前記トランスフェクション又は形質転換が、ウイルスによる直接トランスフェクションにより行われる請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
植物細胞への増幅ベクター又はその前駆体の前記供給、或いは前記トランスフェクション又は形質転換が、非生物学的伝達により行われる請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
植物細胞への増幅ベクター又はその前駆体の前記供給、或いは前記トランスフェクション又は形質転換が、植物の核ＤＮＡ中に予め組み込まれたベクター又はプロベクターＤＮＡの変換で、自律的に複製するプラスミドを形成することにより行われる請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅ベクターが、２つの複製起点を有するその前駆体から放出される請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅ベクターが、ＤＮＡウイルス由来のベクターである請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅ベクターが、ＲＮＡウイルス由来ベクターのＤＮＡコピー又は複製中間体である請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅ベクターが、レトロトランスポゾン起源である請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅ベクターが、逆転写、宿主感染力、細胞間及び／又は全身性の移動、宿主染色体への組込み、ウイルス粒子構築、宿主による発現抑制の制御、宿主の生理機能の制御のための機能を含む、他のウイルス機能をさらに有する請求項９から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
植物細胞内で機能する前記複製起点が、植物の核ゲノムに由来する請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
植物細胞内で機能する前記複製起点が、リボソームＤＮＡの遺伝子間スペーサー領域に由来する請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
植物細胞内で機能する前記複製起点が、合成物である請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複製起点が、植物ウイルスに由来する請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記相同的又は部位特異的な組換えが、片側性である請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記相同的又は部位特異的な組換えが、両側性である請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記部位特異的組換えが、部位特異的組換え酵素、制限酵素、インテグラーゼ、リゾルベースの群から選択される組換え酵素により促進又は助長される請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記相同的組換えが、ＲｅｃＡ様タンパク質、ＨＯタイプの希少切断エンドヌクレアーゼ、Ｉ−Ｓｃｅｌエンドヌクレアーゼの群から選択される組換え酵素により促進又は助長される請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅ベクターが、組換えのプロセスにおいて構築される請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のＤＮＡが、工程（ｉｉ）の選択のための選択マーカーを含む請求項２から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のＤＮＡが、目的とする第２の配列をさらに含む請求項２から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１及び前記第２のＤＮＡの組換えが、機能的な配列を設置する請求項２から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１及び前記第２のＤＮＡのそれぞれが、前記組換えの結果として選択マーカーを形成する、選択マーカー断片をさらに含む請求項２から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のＤＮＡが、増幅ベクター又はその前駆体により伝達される請求項２から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｉ）及び（ｉｉ）で植物に導入された配列の機能が、工程（ｉｉｉ）から（ｖ）までに破壊される請求項２から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
非相同的組換えに関与する遺伝子の発現が阻害又は抑制される請求項１から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
組換えの最終結果が、位置指定突然変異である請求項１から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１から２９の何れか一項の方法を、１回又は複数回実施することにより得られる、又は得られえる植物細胞、種子及び植物体。
【請求項３１】
請求項２の工程（ｉ）及び（ｉｉ）の方法を、任意に、請求項２２から２７の何れか一項の方法に関連して、１回又は複数回実施することにより得られる、又は得られえる植物細胞、種子及び植物体。
【請求項３２】
請求項１から２９の何れか一項に記載の方法を実施するためのベクター又はプロベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載のベクター又はプロベクターを含むアグロバクテリウム細胞。
【請求項３４】
請求項３２に記載のベクター又はプロベクターを含むパッケージされたウイルス粒子。
【請求項３５】
（ｉ）請求項３１に記載の植物細胞、種子及び植物体、並びに
（ｉｉ）請求項３２に記載のベクター又はプロベクター及び／又は請求項３３に記載のアグロバクテリウム細胞及び／又は請求項３４に記載のウイルス粒子
を、構成部材として含むキット。
【請求項３６】
請求項２の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を実施するためのベクター又はプロベクター、並びに請求項２の工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を実施するためのベクターを、構成部材として含むキット。
【国際調査報告】
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