(57)【要約】本発明は、女性産児調節における、そして子宮内膜症の治療および診断のためのフィブリン−１ポリペプチドおよびフィブリン−１核酸の製薬的使用に関する。
2004504275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性構成成分として、以下の：
ａ．フィブリン−１核酸、
ｂ．フィブリン−１核酸を含有するベクター、
ｃ．フィブリン−１核酸を含有する細胞、
ｄ．フィブリン−１−アンチセンス核酸、
ｅ．フィブリン−１ポリペプチド、または
ｆ．フィブリン−１ポリペプチドに対する抗体
を含有することを特徴とする製剤組成物。
【請求項２】
子宮内膜症の治療または予防のための請求項１記載の製剤組成物の使用。
【請求項３】
子宮内膜症の診断のための請求項１記載の製剤組成物の使用。
【請求項４】
遺伝子療法のための作用物質としての請求項１記載の製剤組成物の使用。
【請求項５】
女性不妊症の治療のための請求項１記載の製剤組成物の使用。
【請求項６】
女性産児調節のための請求項１記載の製剤組成物の使用。
【請求項７】
子宮受容性の検出のための請求項１記載の製剤組成物の使用。
【請求項８】
子宮受容性の検出方法であって、フィブリン−１ポリペプチドの量および／またはフィブリン−１核酸の量が請求項１記載の組成物の助けにより測定される方法。
【請求項９】
フィブリン−１ポリペプチドのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの同定のための請求項１記載の製剤組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、フィブリン−１ポリペプチドおよびフィブリン−１核酸の製薬的使用に関する。
【０００２】
子宮内膜症は最も一般的な婦人科学的疾患の１つであり、生殖年齢の全女性の約５〜１０％が罹患している（Ｓｉｌｌｅｍ， Ｍ． １９９８； Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ（商標） ２３， Ｓｕｐｐｌ． １， １−２８）。疼痛および多数のその他の症状のほかに、多数の子宮内膜症患者は不妊であり、大部分のＩＶＦ患者（ＩＶＦ＝体外受精）が子宮内膜症に罹っている（Ａｄａｍｓｏｎ， Ｇ．Ｄ． １９９７； Ｓｅｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｂｉｏｌ． １５， ２６３−２７１）。集中的研究にもかかわらず、不妊の理由は不明である（Ｒｙａｎ， Ｉ．Ｐ．； Ｔａｙｌｏｒ， Ｒ．Ｎ． １９９７； Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｓｕｒｖ． ５２， ３６５−３７１； Ｈａｎｅｙ， Ａ．Ｆ． １９９７； Ｒｅｐｒｏｄ． Ｍｅｄ． Ｒｅｖ． ６， １４５−１６１）。
【０００３】
子宮内膜症と不妊との間の未解決の関係のほかに、子宮内膜症の病因も不明である。いくつかの理論が存在する（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ， Ｐ．Ｊ．Ｑ．， １９９６； Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． １１， Ｓｕｐｐｌ． ３， ５３−６５）が、しかしいずれも立証されていない。多数の過程が、例えば炎症のような疾患の発症および／または存続に重要な役割を演じ得る。文献では、炎症媒介物質が有意変動濃度で子宮内膜症を有する女性の腹腔内液中に存在する、という多数の引用が認められる（Ｖｉｎａｔｉｅｒ， Ｄ．； Ｄｕｆｏｕｒ， Ｐ．； Ｏｏｓｔｅｒｌｙｎｃｋ， Ｄ． １９９６； Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｕｐｄａｔｅ ２， ３７１−３８４）。さらに、多くの場合、腫瘍から類似の方法で既知であるように、新脈管形成増大が観察される。
【０００４】
実際、高濃度の新脈管形成性増殖因子が子宮内膜症を有する女性の腹腔内液中に見出された（Ｔａｙｌｏｒ， Ｒ．Ｎ． ｅｔ ａｌ． １９９７； Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２８， １９４−２０７）。腫瘍との別の類似は、子宮内膜症細胞が侵襲性であり、このことが、細胞の表面に位置し、そして細胞−細胞接着のために重要であるタンパク質の損失に関与し得るという事実にある（Ｓｔａｒｚｉｎｓｋｉ−Ｐｏｗｉｔｚ， Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｕｐｄａｔｅ ４， ７２４−７２９）。近年、子宮内膜症の発症における遺伝的素因に対応する出版物の数が増大しつつあった（Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｓ．， １９９７； Ｓｅｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｂｉｏｌ． １５， ３０９−３１８）。したがって腫瘍抑制分子およびファミリークラスターの損失が記載された。
【０００５】
子宮内膜症の最新治療は、エストロゲン除去の概念に基づいており、因果療法は利用可能でない。腹腔鏡検査または開腹術中に子宮内膜症病巣が除去されるかまたは閉塞される侵襲性介入により、一般に低エストロゲン症の誘発によって、検出され得ない残存する子宮内膜症病巣の増殖の少なくとも部分的抑制を生じる薬剤的処置が連携される（Ｓｉｌｌｅｍ， Ｍ． １９９８； Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ（商標） ２３， Ｓｕｐｐｌ． １， １−２８）。
【０００６】
用いられる投薬の例は、（ｉ）テストステロン誘導体であるダナゾール（これは極高用量（４００〜８００ ｍｇ／日）で、そのアンドロゲン女性偽半陰陽に基づいて投与され、多数の副作用を生じる）、（ｉｉ）ゲスタゲン（これは卵巣エストロゲン合成を抑制し、そして高率の破綻出血を生じる）、ならびに（ｉｉｉ）ＧｎＲＨ−アゴニスト（これは卵巣エストロゲン合成の抑制を生じ、そして閉経期症状および骨減少を生じ得る）である。
【０００７】
３つの物質群はすべて子宮内膜症の初期治療に有効であることが立証されているが、しかし全シリーズの副作用を有し、現在まで、高再発率の低減に寄与し得なかった。
したがって因果療法を目指す新規の治療方法の必要性が存在する。
したがって問題は、子宮内膜症の像に関連する遺伝子を同定することである。
この問題は、子宮内膜症関連遺伝子としてのフィブリン−１遺伝子の同定により本発明によって達成される。
【０００８】
フィブリン−１遺伝子と子宮内膜症の疾患の像との関連は、種々の患者群の比較により同定された。ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）示差表示法を用いて、３つの臨床群の子宮内膜からのｍＲＮＡが互いに比較された：
１．ＬＨ＋４日：黄体形成ホルモン（ＬＨ）を振り出すことによる排卵誘発後４日目、子宮内膜はまだ胚を受容しない。この群は、卵管閉塞または男性不妊のためにＩＶＦプログラムに参加した、そして正常子宮内膜を有する患者から成っていた。
【０００９】
２．ＬＨ＋８日：この時点で、「着床窓」が開けられ、子宮内膜は受容性である。「着床窓」の開放により、遺伝子の発現または抑制が予測され、それらのタンパク質産物は胚の転移増殖において不可欠な役割を演じる。これらの遺伝子は、群１に関するサブトラクション分析により同定される。この群は、１．で記載されたような患者から成る。
３．ＬＨ＋８日＋子宮内膜症：この時点で、健常女性における着床窓は開放している。しかしながらこの群の患者は未知の理由のために不妊であって、そして子宮内膜症に罹患していた。この群では、したがって群２との比較に際して別の遺伝子調節パターンが予測された。
【００１０】
着床窓という用語は、子宮内腔に到達する胚が任意の時点で転移増殖できず、むしろ月経周期の平均分泌期におけるある期間にのみ転移増殖し得る現象を説明する。この期間が、着床窓と呼ばれる（Ｌｅｓｓｅｙ， Ｂ．Ａ． １９９８； Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ．， １３ Ｓｕｐｐ． ３， ２４７−２５８； Ｔａｂｉｂｚａｄｅｈ， Ｓ． １９９８； Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｕｐｄａｔｅ， ４， ４６５−４７１）。
フィブリン−１のｍＲＮＡは、健常女性（群２）における開放着床窓の時期に漸増されるが、一方、子宮内膜症女性（群３）では、周期の同一時点で漸増は測定され得ない（図２および３）。
【００１１】
フィブリン−１はフィブリン−１Ａ〜１Ｄと呼ばれる４つの異なる形態になり、そしてフィブリン−１遺伝子の異なるスプライス変異体を現すタンパク質である。フィブリン−１Ａは、最短形態である。フィブリン−１Ｂ、−Ｃおよび−Ｄは各々、付加的なしかし異なるＣ−末端ドメインを有する。ＤＮＡ−およびタンパク質配列は既知である（図４〜１１および以後の参考文献：ＷＯ９１／０２７５５、Ａｒｇｒａｖｅｓ， Ｗ．Ｓ．ｅｔ ａｌ． １９９０； Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１１， ３１５５−３１６４， Ｔｒａｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． １９９６； １５， ４７９−４９３）。フィブリン−１は、細胞外マトリックスの一構成成分として既知である。それは細胞接着過程に関与し、フィブロネクチン受容体と結合する。ＷＯ９１／０２７５５は診断的および治療的使用を記述するが、しかしその使用が実行される適応症は何かについての参考文献はない。子宮内膜症の出現との関連は新規である。
【００１２】
本発明は、活性構成成分として：
ａ．フィブリン−１核酸、
ｂ．フィブリン−１核酸を含有するベクター、
ｃ．フィブリン−１核酸を含有する細胞、
ｄ．フィブリン−１−アンチセンス核酸、
ｅ．フィブリン−１ポリペプチド、または
ｆ．フィブリン−１ポリペプチドに対する抗体
を含有する製剤組成物に関する。
【００１３】
フィブリン−１核酸は、フィブリン−１の４つのスプライス変異体すべてのＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡのいずれもを、またはその一部分を含む。ＤＮＡおよびタンパク質配列は、図４〜１１に図示されている。フィブリン−１核酸は、好ましくはＤＮＡである。フィブリン−１Ｃおよび−１Ｄスプライス変異体が好ましく、そしてフィブリン−１Ｄスプライス変異体が特に好ましい。ヒト配列が好ましい。
【００１４】
ベクターは、原核生物または真核生物ベクターであり得る。ベクターの例は、ｐＰＲＯ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＣ１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＢＡＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＭＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。フィブリン−１核酸は、当業者に既知の方法を用いてこれらのベクター中に挿入され得る。フィブリン−１核酸は、好ましくは、発現シグナル、例えばプロモーターおよびエンハンサーによりベクターに連結される。
【００１５】
細胞としては、例えば大腸菌、酵母、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｆ９、ＣＯＳ、ＣＶ−１またはＢＨＫが用いられ得る。一般的に用いられる方法により、細胞は、フィブリン−１核酸を含有するベクターで形質転換され得る。
フィブリン−１−アンチセンス核酸は、フィブリン−１ ｍＲＮＡと相補的であるＤＮＡおよび／またはＲＮＡである。それは全相補配列または部分的配列を含み得る。
【００１６】
フィブリン−１ポリペプチドは、４つのスプライス変異体すべての全配列ならびに一部分と定義される。好ましいのは、フィブリン−１Ｃおよび−Ｄスプライス変異体のポリペプチドであり、特に好ましいのはフィブリン−１Ｄスプライス変異体のポリペプチドである。
フィブリン−１ポリペプチドに対する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。それは全フィブリン−１ポリペプチドに対してまたはその断片に対して向けられ得る。このような抗体の生成は、試験動物の免疫感作により標準的方法にしたがって実行される。
【００１７】
本発明の製剤組成物は、一般的に用いられる固体または液体ビヒクルまたは希釈剤を、ならびに当業者に既知である方法で適切な投与量による投与の所望の型に対応する一般的に用いられる製薬的または技術的アジュバントを用いて生成される。錠剤は、例えば活性成分を既知のアジュバント、例えば不活性希釈剤、例えばデキストロース、糖、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドン、炸薬、例えばコーンスターチまたはアルギン酸、結合剤、例えばデンプンまたはゼラチン、滑剤、例えばカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレートまたはポリビニルアセテートと混合することにより生成され得る。活性成分を含有するカプセルは、例えば、不活性ビヒクル、例えばラクトースまたはソルビトールと混合し、ゼラチンカプセル中に封入される活性成分により生成され得る。
【００１８】
本発明の製剤組成物は、適切な溶液中で、例えば生理学的一般塩溶液中でも用いられ得る。
非経口投与のためには、特に油状溶液、例えばゴマ油、ヒマシ油および綿実油中の溶液が適切である。溶解性を増大するために、可溶化剤、例えばベンジルベンゾエートまたはベンジルアルコールが付加され得る。
【００１９】
本発明の製剤組成物は、子宮内膜症の治療または予防のために用いられ得る。これは、遺伝子療法の使用により起こり得る。この場合、フィブリン−１核酸を含有するベクターが設計され、投与される。例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはＳＶ４０由来のベクターである。遺伝子療法は、Ｇｏｍｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ等（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ （１９９９） ３５， ８６７−８８５）により記載されたようなプロトコールにしたがって実行され得る。投与は、局所的に、即ち子宮に直接的に、あるいは全身的に、即ち循環を介して投与され得る。これは、子宮内膜におけるフィブリン−１ポリペプチドの発現増大を生じる。その結果、フィブリンの生物学的機能は回復される。子宮内膜症の治療および予防のための別の可能性は、生物学的に活性である完全タンパク質またはその一部分としてのフィブリン−１ポリペプチドの投与である。フィブリン−１ポリペプチドは、組換え的方法で生成され得る。
【００２０】
さらに本発明は、子宮内膜症の診断のための本発明の製剤組成物の使用に関する。この点では、子宮内膜症が予測される女性から、血液または子宮内膜試料が取り出される。これらの試料中で、フィブリン−１ポリペプチドの量は免疫試験により確定され得る。この点で、フィブリン−１ポリペプチドに対するまたはその断片に対する抗体が産生され、次に後者はＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）において、ＲＩＡ（放射免疫検定）において、または免疫組織化学において用いられて、フィブリン−１ポリペプチドの量を確定する。
【００２１】
代替物として、子宮内膜試料からのＲＮＡが精製され、そしてフィブリン−１ｍＲＮＡがノーザンブロット、ＰＣＲまたはチップ−ハイブリダイゼーションにより測定される。チップ−ハイブリダイゼーションでは、フィブリン−１核酸または断片は、特定の核酸チップ上に存在する。フィブリン−１核酸の量は、フィブリン−１−アンチセンスＲＮＡを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによっても確定され得る。この場合、アンチセンス−ＲＮＡはジゴキシゲニン、３２Ｐまたは３３Ｐにより標識され得る。
【００２２】
本発明の製剤組成物は、女性不妊症の治療のためにも用いられ得る。この点で、彼らの不妊のために治療を望む患者から血液または子宮内膜試料が取り出され、そしてフィブリン−１の量が前期のように確定される。不妊がフィブリン−１発現の障害に関連する場合、受胎能は、着床窓の時点でのフィブリン−１の量を増大することにより増大され得る。フィブリン−１の量の増大は、遺伝子療法により、またはフィブリン−１ポリペプチドの投与により子宮内膜症の治療におけると同様に達成され得る。フィブリン−１の量の増大は、成功率、即ち妊娠率を上げるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ授精の方法において特に望ましい。
【００２３】
本発明の別の目的は、女性産児調節のための本発明の製剤組成物の使用である。多数の子宮内膜症患者は、不妊症である。子宮内膜症では、フィブリン−１の調節は崩壊される、ということを本発明は示す。この作用は、妊娠することを望まない健常女性において人工的に下向き調整されるフィブリン−１により逆にも用いられ得る。これは、フィブリン−１遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡの使用により、あるいはフィブリン−１ポリペプチドにたいして向けられ、そしてフィブリン−１の生物学的機能を抑制する抗体の使用により実行され得る。抗体は、例えば子宮内に投与され得るし、そしてフィブリン−１の遮断による上首尾の検出を、したがって胚の着床を妨げ得る。
ラットを用いた試験も、着床におけるフィブリン−１の重要な役割を示す。ここで、フィブリン−１の発現が交尾後に不変のままであることが示された（図１５参照）。
【００２４】
本発明は、子宮受容性を検出するための本発明の製剤組成物の使用にも関する。子宮受容性は、前着床胚が子宮の子宮内膜中に着床されるようになり得る確率を指す。子宮受容性は、開放着床窓の時点で最大である。本発明は開放着床窓の時点でフィブリン−１発現が漸増されるため、フィブリン−１ｍＲＮＡまたはフィブリン−１ポリペプチドの量を測定することにより、高子宮受容性の時点を確定され得る。測定は、ノーザンブロット、ＰＣＲまたはチップ−ハイブリダイゼーションにより、あるいは免疫試験により、子宮内膜症の診断において上記と同様に実行される。
【００２５】
子宮受容性の確定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ授精において特に重要である。ここで、正しい時期に授精卵母細胞を投与することが重要である。さらに本発明は、子宮受容性の検出のための方法であって、それによりフィブリン−１ポリペプチドの量および／またはフィブリン−１核酸の量が本発明の製剤組成物の助けにより確定される方法に関する。先ず、血液または子宮内膜試料が女性から取り出され、次にフィブリン−１ｍＲＮＡまたはフィブリン−１ポリペプチドの量が確定される。
【００２６】
本発明は、フィブリン−１ポリペプチドのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを同定するための本発明の製剤組成物の使用にも関する。アゴニストおよびアンタゴニストは、フィブリン−１ポリペプチドと結合することにより、あるいはその生理学的結合相手とのその結合におけるフィブリン−１ポリペプチドとの競合により、フィブリン−１ポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼす物質である。このようなアゴニストまたはアンタゴニストは、低分子物質あるいは他のペプチドまたはタンパク質、例えば抗体であり得る。
【００２７】
このようなアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために、フィブリン−１ポリペプチドを発現する細胞が、考え得るアゴニストまたはアンタゴニストで処置され、そして細胞分化（Ｇａｅｔｊｅ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． １９９５； Ｌａｎｃｅｔ ３４６， １４６３−１４６４）およびその他の細胞特性が分析される。フィブリン−１アンタゴニストは、例えば産児制御のために用いられ得る。フィブリン−１アゴニストは、高フィブリン−１活性が望まれる場合はいつでも用いられ得る。これは、例えば子宮内膜症および不妊症の治療における場合である。ここで、フィブリン−１アゴニストが、フィブリン−１核酸またはフィブリン−１ポリペプチドの代わりに付加され得る。
【００２８】
実施例
実施例で用いられる分子生物学的方法、例えばＲＮＡの単離、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡのシーケンシング、ＲＮＡアーゼ保護、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、既知の教科書に、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． １９８９； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されたように実施した。遺伝子発現のサブトラクション分析のための方法は、例えばＬｉａｎｇ， Ｐ． ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ． １９９５； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７， ２７４−２８０に記載されている。
【００２９】
実施例１．ｄｄＰＣＲ法による着床窓中に調節される遺伝子転写物の単離
３つの群：ＬＨ＋４／妊娠可能、ＬＨ＋８／妊娠可能およびＨＬ＋８／子宮内膜症に属する患者の子宮内膜から、ＲＮＡを単離した。センスプライマーＡＰ−１〜ＡＰ−５およびアンチセンスプライマーＴ１２ＭＡを、α−［３５Ｓ］ｄＡＴＰの存在下での増幅のために用いた。生成物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、比較した。全体的に、少なくとも２つの別個の試験において異なる発現パターンを有する２４のストリップをさらにプロセシングした。ゲルからの単離後、３つのＤＮＡ断片をＰＣＲにより再度増幅し（ＧｅｎｅＡｍｐＴＭキット、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）、アガロースゲル上で精製して、ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭＡｍｐＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｒｆｌ位置でサブクローニングした。次にプラスミド−ＤＮＡを大量に産生し、挿入物のサイズを立証して、配列を決定した。次に生物情報的方法を実施して、既知の配列との相同性を検出した。
【００３０】
実施例２．「ＲＮＡアーゼ保護」法による結果の確証
実施例１で単離したクローンから、アンチセンスＲＮＡプローブを生成した。この目的のために、Ｔ７またはＴ３プロモーターを用いて、挿入物の配向の一関数として用いた。ＲＮＡアーゼによる一本鎖ＲＮＡの消化後、残留二本鎖ＲＮＡ分子をポリアクリルアミドゲル上で単離して、オートラジオグラフィーにより可視化した。３群間で発現パターンを比較し、ｄｄＰＣＲ法の結果とも比較した。フィブリン−１Ｄをコードしたクローンは、もっとも有益な発現パターンを示した（図１〜３）。
【００３１】
実施例３．ヒトフィブリン−１Ｄの組織分布（ノーザンブロット）
ヒトフィブリン−１ＤのＣ末端コード領域の増幅のために、以下のプライマーを用いた：５’−ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１２）およ５’−ＧＡＡＣＣＡＧＴＡＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＡＧ−３’（配列番号１３）。「鋳型」として、ヒト肝臓ｃＤＮＡ（ＱＵＩＣＫ−ＣｌｏｎｅＴＭ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。標準条件により、ＰＣＲ増幅を実行した。ｐＣＲ−ＴｏｐｏＴＭプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でサブクローニング後、挿入物をシーケンシングし、そしてフィブリン−１Ｄのすでに発表済みの配列との１００％一致が見出された（Ａｒｇｒａｖｅｓ， Ｓ．， １９９６， Ａｃｃｅｓｓ Ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０１２４４）。
【００３２】
フィブリン−１Ｄ挿入物のγ−［３２Ｐ］ｄＣＴＰの存在下で、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ（商標）ＩＩ無作為プライマーキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の助けにより、特異的プローブを得た。このプローブを、多組織ノーザン「ヒト筋肉ＭＴＮ」および「ヒト組織ＭＴＮ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のハイブリダイゼーションのために緊縮条件下で用いた。洗浄フィルターをオートラジオグラフィーにより分析した。アンチセンスプローブをヒトシクロフィリンＡから生成し（Ｈａｅｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８７， ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ９４７−９５０）、緊縮条件下での制御ハイブリダイゼーションに用いた。結果は、フィブリン−１Ｄが多数のしかしすべてではない組織中で発現されることを示す。高発現は、子宮で観察され得る（図１２）。
【００３３】
実施例４．ラットフィブリン−１Ｄの３‘末端の単離
ヒト配列由来の以下のプライマーを合成した：５’−ＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧＴＣ−３’（配列番号１４）および５’−ＧＡＡＣＣＡＧＴＡＣＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＡ−３’（配列番号１５）。「鋳型」として、ラット脳からのｃＤＮＡ（ＱＵＩＣＫ−ＣｌｏｎｅＴＭ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。標準条件下で、ＰＣＲ増幅を実行した。ｐＣＲ−ＴｏｐｏＴＭプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でサブクローニング後、ＤＮＡ挿入物をシーケンシングした（図１３）。誘導化タンパク質配列は、ヒトフィブリン−１Ｄの配列との８７．５％同一性を示した。ラット配列とヒト配列との間の差を強調する（図１３）。
【００３４】
実施例５．雌周期中および交尾後１〜５日目のラットフィブリンの発現
半定量的ＰＣＲにより、発現を分析した。この目的のために、以下のプライマーを用いた：
フィブリン−１：
センス５’−ＡＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＣＴＧ−３’（配列番号１６）、
アンチセンス５’−ＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１７）。
フィブリン−１Ｃ：
センス５’−ＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１８）、
アンチセンス５’−ＡＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号１９）。
【００３５】
フィブリン−１Ｄ：
センス５’−ＣＧＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２０）、
アンチセンス５’−ＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣ−３’（配列番号２１）。
対照においては、シクロフィリンＡに対する特異的プライマーを用いた：
センスプライマー５’−ＴＧＡＣＴＴＧＣＧＧＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号２２）、
アンチセンスプライマー５’−ＡＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’（配列番号２３）。
【００３６】
全体的ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ， ＵＳＡ）を用いて、子宮組織から総ＲＮＡを抽出した。ＰｒｏＳＴＡＲ一次鎖ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した。Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ， ＵＳＡ）を用いて、ＰＣＲ分析を実施した。反応条件を以下に示す：最初に９４℃で５分；次に９４℃で２０秒、６０℃で２０秒および７２℃で４０秒を３２回（フィブリン−１）または２５回（シクロフィリンＡ）、最後に７２℃で１０分。
【００３７】
図１４の結果は、ラットフィブリン−１の周期依存性発現を示す。フィブリン−１の発現は、１Ｃも１Ｄアイソフォームも、発情間期中は弱く、その後増大して、発情後期中に最大に達する。
発情前期、発情期、発情後期および発情間期という用語は、Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｍ．Ｅ． Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｔ． Ｉｎ： Ｋｎｏｂｉｌ， Ｅ．， Ｎｅｉｌｌ， Ｊ．Ｄ．（Ｅｄｓ．） Ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ２， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ １９９４， ６１３−６５８に説明されている。
図１５は、交尾後のフィブリン−１の発現が依然として変更されないことを示す。最大量は交尾後３日目に測定された。ここでも、１Ｃおよび１Ｄアイソフォームはフィブリン−１と同様のパターンを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、調節化ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。これをｄｄＰＣＲ法により同定し、フィブリン−１Ｄの３‘末端と同時発生するよう作製した。
【図２】
図２は、ＬＨ＋８／妊娠可能群におけるヒトフィブリン−１Ｄ遺伝子の増大の「ＲＮＡアーゼ保護」法による検出を示す。図１に示したクローンにより放射能活性アンチセンスＲＮＡ−プローブを生成し、３つの群：ＬＨ＋４／妊娠可能（初期分泌性）、ＬＨ＋８／妊娠可能（中期分泌性）、およびＬＨ＋８／子宮内膜症（中期分泌性および子宮内膜症）からのＲＮＡとハイブリダイズさせた。アンチセンス−アクチンプローブを内部対照として生成した。非ハイブリダイズ化一本鎖ＲＮＡの消化後、反応生成物をポリアクリルアミドゲル上で分離して、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【図３】
図３は、図２の結果（ＲＮＡアーゼ保護法）の定量化を示す。二本鎖フィブリン−１ＤおよびアクチンＲＮＡのストリップを「走査」して、測定量をアクチンの量に対して基準化した。
【図４】
図４は、ヒトフィブリン−１Ａに関するＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。
【図５】
図５は、ヒトフィブリン−１Ａに関するタンパク質配列（配列番号３）を示す。
【図６】
図６は、ヒトフィブリン−１Ｂに関するＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。
【図７】
図７は、ヒトフィブリン−１Ｂに関するタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【図８】
図８は、ヒトフィブリン−１Ｃに関するＤＮＡ配列（配列番号６）を示す。
【図９】
図９は、ヒトフィブリン−１Ｃに関するタンパク質配列（配列番号７）を示す。
【図１０】
図１０は、ヒトフィブリン−１Ｄに関するＤＮＡ配列（配列番号８）を示す。
【図１１】
図１１は、ヒトフィブリン−１Ｄに関するタンパク質配列（配列番号９）を示す。
【図１２】
図１２は、ノーザンブロットにおけるヒトフィブリン−１Ｄの組織分布を示す。フィブリン−１Ｄ特異性部分により放射能活性ＤＮＡプローブを生成し、ヒト「多組織ノーザン」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とハイブリダイズさせた。シクロフィリンＡの発現パターンを内部対照として確定した。
【図１３】
図１３は、ラットフィブリン−１Ｄタンパク質（ヒトフィブリン−１Ｄのアミノ酸５７６〜６９６に対応する）のＣ末端をコードするＤＮＡ配列（配列番号１０）および誘導化タンパク質配列を示す。
【図１４】
図１４は、雌周期の種々の日数からの子宮組織中のラットフィブリン−１ｍＲＮＡの発現を示す。すべてのフィブリン−１形態を検出するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、あるいはフィブリン−１Ｃまたはフィブリン−１Ｄアイソフォームに対する特異的プライマーをＰＣＲ増幅のために用いた。シクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）特異的プライマーを対照実験に用いた。「鋳型」として、発情間期（Ｄ）、発情前期（Ｐ）、発情期（Ｏ）または発情後期（Ｍ）からのラット子宮組織からの一次鎖ｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、次に臭化エチジウムで着色した。ＧｅｌＤｏｃ２０００装置（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いてストリップの強度を定量化した。
【図１５】
図１５は、交尾後種々の日数からの子宮組織中のラットフィブリン−１ｍＲＮＡの発現を示す。すべてのフィブリン−１形態を検出するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、あるいはフィブリン−１Ｃまたはフィブリン−１Ｄアイソフォームに対する特異的プライマーをＰＣＲ増幅のために用いた。シクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）特異的プライマーを対照実験に用いた。「鋳型」として、交尾後（ｐ．ｃ．）１〜５日目のラット子宮組織からの一次鎖ｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、次に臭化エチジウムで着色した。ＧｅｌＤｏｃ２０００装置を用いてストリップの強度を定量化した。
【図２】
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【図３】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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