(57)【要約】本発明は、試料中のプロテアーゼ感受性ＰｒＰＳｃ配座異性体およびプロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃ配座異性体の両方の濃度を同定するためのアッセイを提供する。好ましい態様において、本アッセイは、試料中の全ＰｒＰＳｃ濃度を決定する段階、プロテアーゼ感受性ＰｒＰＳｃ（ｓＰｒＰＳｃ）配座異性体を選択的に加水分解するプロテアーゼでＰｒＰＳｃ画分を処理する段階、および、試料中のｓＰｒＰＳｃ濃度を定量する段階を含む。血液などの簡単に入手可能な生体試料中のＰｒＰＳｃは主にｓＰｒＰＳｃであるので、ｓＰｒＰＳｃを検出することができるとプリオンの早期検出が可能となる。また、ｓＰｒＰＳｃとｒＰｒＰＳｃの比によって、感染試料中の特定のプリオン株を同定することも可能になる。2004529314.tif 000003
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のプリオン株を決定する方法であり、以下の段階を含む方法：
試料中の全ＰｒＰＳｃ、処理感受性ＰｒＰＳｃ、および処理耐性ＰｒＰＳｃの相対量を決定する段階；
該相対量と既知プリオン株の相対量を比較する段階であり、ここで、相対量がプリオン株を示唆する段階。
【請求項２】
試料が動物から抽出され、既知プリオン株が、Ｄｒｏｗｓｙ、１３９Ｈ、Ｈｙｐｅｒ、Ｍｅ７、ＭＴ−Ｃ５、ＲＭＬ、およびＳｃ２３７からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料中の全ＰｒＰＳｃ、処理感受性ＰｒＰＳｃ、および処理耐性ＰｒＰＳｃの相対量が以下の段階によって決定される、請求項１記載の方法：
単位量の試料中の疾患関連高次構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）タンパク質の全量を決定する段階；
感受性型の疾患関連高次構造を加水分解するのに十分な条件下で、単位量の試料を処理する段階；
試料を処理した後に単位量の試料中に残っている処理耐性疾患関連高次構造タンパク質の量を決定する段階；
単位量の試料中の感受性型タンパク質の量を求めるために、疾患関連高次構造タンパク質の決定された全量から処理耐性タンパク質の決定された量を差し引く段階；
比が疾患関連高次構造タンパク質の株を示唆する、処理感受性疾患関連高次構造の量と処理耐性疾患関連高次構造の量の比を計算する段階。
【請求項４】
単位試料中の疾患関連高次構造タンパク質の株を決定する方法であり、以下の段階を含む方法：
単位量の試料中の疾患関連高次構造タンパク質の全量を決定する段階；
試料中の感受性型の疾患関連高次構造を加水分解するのに十分な条件下で、試料を処理する段階；
試料を処理した後に試料中に残っている処理耐性疾患関連高次構造タンパク質の量を決定する段階；
試料中の感受性型のタンパク質の量を求めるために、疾患関連高次構造タンパク質の決定された全量から処理耐性タンパク質の決定された量を差し引く段階；
比が疾患関連高次構造タンパク質の株を示唆する、処理感受性疾患関連高次構造の量と処理耐性疾患関連高次構造の量の比を計算する段階。
【請求項５】
試料が動物由来であり、処理が、試料中のタンパク質の実質的に全ての感受性高次構造を加水分解するのに十分な条件下で試料をプロテアーゼ処理する段階を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
タンパク質がＰｒＰタンパク質であり、疾患関連高次構造タンパク質がＰｒＰＳｃであり、処理耐性高次構造がＰｒＰ２７−３０を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
疾患関連高次構造タンパク質の全量および処理非感受性タンパク質の量が、５桁またはそれ以上の範囲にわたってタンパク質濃度を検出することができる方法を用いて決定される、請求項４記載の方法。
【請求項８】
疾患高次構造タンパク質の全量が処理前に単離される、請求項４記載の方法。
【請求項９】
流動可能な（ｆｌｏｗａｂｌｅ）液体状態の試料と、疾患関連高次構造タンパク質に選択的に結合する複合体形成剤（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ａｇｅｎｔ）からなる固形基質を接触させること；および
試料中の疾患関連高次構造タンパク質が複合体形成剤に結合する時間の間、試料と基質を接触したままにすること
によって、疾患高次構造タンパク質が単離される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質がＰｒＰタンパク質であり、疾患関連高次構造がＰｒＰＳｃであり、かつ複合体形成剤が、ヘテロポリ酸またはその塩、ペプチド、および抗体からなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
複合体形成剤がリンタングステン酸の金属塩であり、試料がウシから抽出される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
複合体形成剤が未変性ＰｒＰＳｃに選択的に結合する抗体であり、試料がヒトから抽出される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
試料中のＰｒＰＳｃ株を同定する方法であり、以下の段階を含む方法：
単位試料中のＰｒＰＳｃの全量を決定する段階；
エピトープが感受性型ＰｒＰＳｃを結合剤により検出可能にする、試料中の感受性型ＰｒＰＳｃのエピトープを曝露するのに十分な条件下で試料を処理する段階；
エピトープに選択的に結合する結合剤を試料と接触させる段階、および結合剤に結合した感受性型ＰｒＰＳｃの量から、感受性型ＰｒＰＳｃの量を決定する段階；ならびに
（ａ）ＰｒＰＳｃの全量、（ｂ）感受性ＰｒＰＳｃの量、および（ｃ）耐性ＰｒＰＳｃの量のいずれかとの間の比を計算し、それによりＰｒＰＳｃ株を決定する段階。
【請求項１４】
プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
結合剤が、曝露されたエピトープに結合する検出可能に標識された抗体である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
抗体が３Ｆ４である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
試料がヒト血清およびヒト全血からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
処理感受性型ＰｒＰＳｃが１×１０３粒子／ｍｌ以下の濃度で試料中に存在する、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
試料中のプリオン株を決定する方法であり、以下の段階を含む方法：
単位量の試料中のプリオンの全量を単離する段階；
感受性型プリオンを加水分解するのに十分な条件下で、試料を処理する段階；
処理感受性の疾患関連高次構造の量を決定する段階；
処理耐性の疾患関連高次構造の量を決定する段階；および
比が特定のプリオン株を示唆する、処理感受性の疾患関連高次構造の量と処理耐性の疾患関連高次構造の量の比を計算する段階。
【請求項２０】
既知プリオン株の標準比を計算された比と比較することによってプリオン株が決定される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
既知のＰｒＰＳｃ株が、Ｄｒｏｗｓｙ、１３９Ｈ、Ｈｙｐｅｒ、Ｍｅ７、ＭＴ−Ｃ５、ＲＭＬ、およびＳｃ２３７からなる群より選択される株である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
処理耐性高次構造がＰｒＰ２７−３０を含み、処理がプロテアーゼＫによる処理を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
プリオン関連疾患を有する被験者の予後を決定する方法であり、以下の段階を含む方法：
試料中の全ＰｒＰＳｃ、処理感受性ＰｒＰＳｃ、および処理耐性ＰｒＰＳｃの相対量を決定する段階；ならびに
該相対量と既知プリオン株の相対量を比較する段階であり、ここで、相対量がプリオン関連疾患の潜伏期間および病理を示唆する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、血液または組織などの試料中の病原性タンパク質（例えば、プリオン）の株を決定する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
プリオンは、ヒトおよび動物において中枢神経系海綿状脳症を引き起こす感染性病原体である。プリオンは、細菌、ウイルス、およびウイロイドとは異なる。プリオンタンパク質の感染には核酸成分が必要でないということが、現在、最も有力な仮説である。さらに、ある種の動物（例えば、ヒト）に感染するプリオンは、その種とは遺伝学的に異なる別の種（例えば、マウス）に感染しない。
【０００３】
プリオンおよびプリオンが引き起こす疾患の研究における大きな一歩は、プリオンタンパク質（「ＰｒＰ」）と呼ばれるタンパク質の発見および精製であった（Ｂｏｌｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１８：１３０９−１１（１９８２）；Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：６９４２−５０（１９８２）；ＭｃＫｉｎｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ３５：５７−６２（１９８３））。その後、完全なプリオンタンパク質コード遺伝子のクローニング、配列決定、およびトランスジェニック動物における発現がなされた。ＰｒＰＣは単コピーの宿主遺伝子によってコードされ（Ｂａｓｌｅｒら、Ｃｅｌｌ ４６：４１７−２８（１９８６））、通常、ニューロンの外表面に見出される。翻訳後プロセス間に、ＰｒＰＳｃは正常な細胞性ＰｒＰアイソフォーム（ＰｒＰＣ）から形成され、プリオン病は、ＰｒＰＣがＰｒＰＳｃと呼ばれる変異アイソフォームに変換することで起こる。ＰｒＰＳｃは、動物およびヒトの伝染性神経変性疾患の伝染および病理発生の両方に必要である。
【０００４】
プルシナー（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ），Ｓ．Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１５１５−１５２２（１９９１）を参照されたい。最も一般的な動物のプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクレイピー、シカおよびオオシカの慢性消耗病、ならびにウシのウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）である（Ｗｉｌｅｓｍｉｔｈ，Ｊ．およびＷｅｌｌｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２１−３８（１９９１））。４つのヒトプリオン病が特定されている：（１）クールー、（２）クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病（ＣＪＤ）、（３）ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）病（ＧＳＳ）、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７：９４３−９６０（１９７７）；Ｍｅｄｏｒｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：４４４−４４９（１９９２））。当初、散発性疾患、遺伝性疾患、および感染性疾患としてのヒトプリオン病の発表が難問を投げかけたが、これは後にＰｒＰの細胞遺伝性起源によって説明された。
【０００５】
プリオンの変化は異なる疾患表現型を引き起こし、しばしば、株と呼ばれる。それぞれのプリオン株は、潜伏期間の長さ、ＰｒＰＳｃ蓄積のトポロジー（ｔｏｐｏｌｏｇｙ）、および異常病変の分布により現れる特有のプリオン病表現型を生じる（ＦｒａｓｅｒおよびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、１９６８；ＦｒａｓｅｒおよびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、１９７３；Ｂｒｕｃｅ、ＭｃＢｒｉｄｅら、１９８９；Ｔａｒａｂｏｕｌｏｓ、Ｊｅｎｄｒｏｓｋａら、１９９２；ＤｅＡｒｍｏｎｄ、Ｙａｎｇら、１９９３；Ｓｃｏｔｔ、Ｇｒｏｔｈら、１９９７）。株は高度の忠実度で複製し、このことは、この現象の原因となり得る機構を必要とする。ＰｒＰＳｃは複数の高次構造で存在する可能性があるという理由で株を説明することができると仮定したが、裏づけとなる証拠は当初なかった（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、１９９１；Ｃｏｈｅｎ、Ｐａｎら、１９９４）。その後に、異なる研究方針（一方は、ハムスターでの継代によるミンクからのプリオン株の単離に関する研究（ＢｅｓｓｅｎおよびＭａｒｓｈ、１９９４）、他方は、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスへの遺伝性ヒトプリオン病の継代に関する研究（Ｔｅｌｌｉｎｇ、Ｐａｒｃｈｉら、１９９６））によって、プリオン株の特性はＰｒＰＳｃの高次構造に暗号化されているという議論に集束した。
【０００６】
生物製剤中のＰｒＰＳｃの検出は、プリオン病が伝染性であるため極めて重要である。医原性ＣＪＤは、死体の脳下垂体に由来するヒト成長ホルモンならびに硬膜移植片によって引き起こされた（Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ ３４０：２４−２７（１９９２））。さらに、ニューギニア高地のフォア（Ｆｏｒｅ）族および近隣の部族を何十年にもわたって荒廃させたクールーは、食人儀式間の感染によって蔓延したと考えられている（Ａｌｐｅｒｓ，Ｍ．Ｐ．、「神経系の遅い伝染性疾患（Ｓｌｏｗ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）」第１巻、Ｓ．Ｂ．ＰｒｕｓｉｎｅｒおよびＷ，Ｊ，Ｈａｄｌｏｗ編（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ｐｐ．６６−９０（１９７９））。ヒト脳下垂体由来ＨＧＨで処置された非常に多くの若い成人がＣＪＤを発症している（Ｋｏｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：７３１−７３３（１９８５）；Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ ３４０：２４−２７（１９９２）；Ｆｒａｄｋｉｎら、ＪＡＭＡ ２６５、８８０−８８４（１９９１）；Ｂｕｃｈａｎａｎら、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ、３０２：８２４−８２８（１９９１））。さらに、フランスでは何百人もの子供が、ＣＪＤを発症するリスクのある死体抽出成長ホルモンで処置されている（Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０、１９９３、１０頁を参照のこと）。脳下垂体から調製されたＨＧＨがプリオンに汚染されていたことは、疑わしいＨＧＨロットを接種した６６ヵ月後にプリオン病がサルに伝染したことによって裏付けられている（Ｇｉｂｂｓ，Ｊｒ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２８：３５８−３５９（１９９３））。
【０００７】
プリオン病に伴う長い潜伏期間のため、ＨＧＨで処置された世界中の数千人の人々における医原性ＣＪＤの全ては数十年間明らかにならないと考えられる。医原性ＣＪＤはまた、汚染されたヒト脳下垂体由来生殖腺刺激ホルモンで処置された４人の不妊女性（Ｈｅａｌｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７：５１７−５１８（１９９３）；Ｃｏｃｈｉｕｓら、Ａｕｓｔ．Ｎ．Ｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０：５９２−５９３（１９９０）；Ｃｏｃｈｉｕｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ５５：１０９４−１０９５（１９９２））ならびに硬膜移植片を受けた少なくとも１１人の患者（Ｎｉｓｂｅｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２６１：１１１８（１９８９）；Ｔｈａｄａｎｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６９：７６６−７６９（１９８８）；Ｗｉｌｌｉｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ５４：９４０（１９９１）；Ｂｒｏｗｎら、Ｌａｎｃｅｔ ３４０：２４−２７（１９９２））において発症していると考えられる。これらの医原性ＣＪＤ症例により、プリオンに汚染されている可能性のある医薬品および生物製剤をスクリーニングする必要性が強調されている。
【０００８】
ウシプリオンが新規変異型クロイツフェルト−ヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）を発症した人間に伝染した可能性により、生物製剤中のプリオンを検出する重要性が高まっている（Ｇ．Ｃｈａｚｏｔら、Ｌａｎｃｅｔ ３４７：１１８１（１９９６）；Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌら、Ｌａｎｃｅｔ ３４７：９２１−９２５（１９９６））。初期の研究によって、スクレイピー感染性を失うことなくＰｒＰＳｃのＮ末端を切断することができ（Ｓ．Ｂ．Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：６９４２−６９５０（１９８２）；Ｓ．Ｂ．Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ３８：１２７−１３４（１９８４））、相応して、ＰｒＰＳｃのＮ末端が切り取られているものは依然としてＰｒＰＳｃへの変換を可能にすることが明らかになった（Ｍ．Ｒｏｇｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３１８２−３１８６（１９９３））。ウシからヒトへｎｖＣＪＤが伝染できることがインビボ試験によって確かめられている。これにより、記録に残されている「種の壁」がこの新たな株と関係があるという励ましとなる推測を、米国立科学アカデミー紀要の１２月２０日号が揺るがしていることが示唆されている（Ｍ．Ｒ．Ｓｃｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５１３７−１５１４２（１９９９））。
【０００９】
１９９９年４月６日に公布された米国特許第５，８９１，６４１号に開示されるように、試料中の変形タンパク質を検出する方法が開発されている。このような方法は大変な価値があり得るが、病原性タンパク質の異なる型の存在およびこれらの異なる型の相対量を検出する方法を認めていない。本発明は、これを提供する。
【００１０】
発明の概要
本発明は、プリオンなどの病原性タンパク質の異なる型を同定するアッセイを提供する。例えば、このアッセイは、試料中のプロテアーゼ感受性ＰｒＰＳｃ配座異性体およびプロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃ配座異性体の両方の濃度を特定することができる。好ましい態様において、このアッセイは、１）試料中の全ＰｒＰＳｃ濃度を決定する段階；２）ＰｒＰＳｃ画分を、プロテアーゼ感受性ＰｒＰＳｃ（ｓＰｒＰＳｃ）配座異性体を選択的に加水分解するプロテアーゼで処理する段階；および３）試料中のｓＰｒＰＳｃ濃度を定量する段階を含む。血液などの簡単に入手できる生体試料中のＰｒＰＳｃは主にｓＰｒＰＳｃであり、プロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃ（すなわちｒＰｒＰＳｃ）ではないので、ｓＰｒＰＳｃを検出することができるとプリオンを早期に検出することができる。これらのアッセイは、プロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃ（ｒＰｒＰＳｃ）配座異性体がプリオン感染の典型的な症状に関連する濃度まで蓄積する前に、試料におけるプリオン感染を特定することができる。従って、本発明は、ヒト生物製剤および食品などの製品中のこれらの感染因子を早期に検出する改善された方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法はまた、異なるプリオン分離株（「株」）を区別する能力を有し、従って、感染試料中の特定のプリオン株を同定することができる。ｒＰｒＰＳｃとｓＰｒＰＳｃの比は、プリオン感染中に特定の各株について比較的一定に保たれる。ｒＰｒＰＳｃ濃度を決定し、ｒＰｒＰＳｃ濃度とｓＰｒＰＳｃ濃度の比を計算することによって、これらの２種類のＰｒＰＳｃ配座異性体のインビボ濃度の比に基づいて特定のプリオン株を同定することができる。
【００１２】
本発明の１つの態様において、例えば、試料を、ＰｒＰＳｃに選択的に結合する（すなわち、ｒＰｒＰＳｃおよびｓＰｒＰＳｃの両方に選択的に結合する）複合体形成剤に曝露することによって、ＰｒＰＳｃ全画分が処理前に単離される。
【００１３】
特定の態様において、ＰｒＰＳｃ配座異性体は、プロテイナーゼＫ限定消化、その後の、ｒＰｒＰＳｃまたはｓＰｒＰＳｃを認識するが、その両方を認識しない抗体による同定を用いて同定される。例えば、限定タンパク質分解後のＰｒＰＳｃ濃度とＰｒＰＣ濃度を比較することによって、試料中の全ＰｒＰＳｃ濃度が測定される。次いで、試料の第２のアリコートを完全消化し（すなわち、ＰｒＰＣを除去し、ｓＰｒＰＳｃの高次構造を緩める）、ｒＰｒＰＳｃ量を測定する。次いで、全ＰｒＰＳｃ濃度からｒＰｒＰＳｃ濃度を差し引くことによって、試料中のｓＰｒＰＳｃ量を決定することができる。
【００１４】
本発明の１つの態様は、以下の段階を含む、試料中のプリオン株を決定する方法である：
試料中の全ＰｒＰＳｃ、処理感受性ＰｒＰＳｃ、および処理耐性ＰｒＰＳｃの相対量を決定する段階；
最も一致するものを見つめるために相対量と既知プリオン株の相対量を比較し、それにより、プリオン株を決定する段階。
【００１５】
試料が動物から抽出され、既知プリオン株は、Ｄｒｏｗｓｙ、１３９Ｈ、Ｈｙｐｅｒ、Ｍｅ７、ＭＴ−Ｃ５、ＲＭＬ、およびＳｃ２３７からなる群より選択される、前記方法を実施することができる。
【００１６】
前記方法は、試料中の全ＰｒＰＳｃ、処理感受性ＰｒＰＳｃ、および処理耐性ＰｒＰＳｃの相対量が以下の段階によって決定される手順を含む、様々な手順を用いて実施することができる：
単位量の試料中の疾患関連高次構造タンパク質の全量を決定する段階；
感受性型の疾患関連高次構造を加水分解するのに十分な条件下で、単位量の試料を処理する段階；
試料を処理した後に単位量の試料中に残っている処理耐性疾患関連高次構造タンパク質の量を決定する段階；
単位量の試料中の感受性型タンパク質の量を求めるために、疾患関連高次構造タンパク質の決定された全量から処理耐性タンパク質の決定された量を差し引く段階；
比が疾患関連高次構造タンパク質の株を示唆する、処理感受性疾患関連高次構造の量と処理耐性疾患関連高次構造の量の比を計算する段階。
【００１７】
本発明の別の態様は、以下の段階を含む、単位試料中の疾患関連高次構造タンパク質の株を決定する方法である：
単位量の試料中の疾患関連高次構造タンパク質の全量を決定する段階；
試料中の感受性型の疾患関連高次構造を加水分解するのに十分な条件下で、試料を処理する段階；
試料を処理した後に試料中に残っている処理耐性疾患関連高次構造タンパク質の量を決定する段階；
試料中の感受性型タンパク質の量を求めるために、疾患関連高次構造タンパク質の決定された全量から処理耐性タンパク質の決定された量を差し引く段階；
比が疾患関連高次構造タンパク質の株を示唆する、処理感受性疾患関連高次構造の量と処理耐性疾患関連高次構造の量の比を計算する段階。特定の態様において、試料は動物に由来し、処理は、試料中のタンパク質の実質的に全ての感受性高次構造を加水分解するのに十分な条件下で、試料をプロテアーゼ処理することを含む。別の特定の態様において、タンパク質はＰｒＰタンパク質であり、疾患関連高次構造タンパク質はＰｒＰＳｃであり、処理耐性高次構造はＰｒＰ２７−３０を含む。別の特定の態様において、疾患関連高次構造タンパク質の全量および処理非感受性タンパク質の量は、５桁またはそれ以上の範囲にわたってタンパク質濃度を検出することができる方法を用いて決定される。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、以下の段階を含む、試料中のＰｒＰＳｃ株を同定する方法である：
単位試料中のＰｒＰＳｃの全量を決定する段階；
エピトープが感受性型ＰｒＰＳｃを結合剤により検出可能にする、試料中の感受性型ＰｒＰＳｃのエピトープを曝露するのに十分な条件下で、試料（例えば、１×１０３粒子／ｍｌ以下のＰｒＰＳｃを含むホモジナイズされたウシ脳またはヒト血液）を処理（例えば、プロテイナーゼＫ処理）する段階；
試料と、エピトープに選択的に結合する結合剤（例えば、３Ｆ４などの抗体）を接触させ、結合剤に結合した感受性型ＰｒＰＳｃの量から、感受性型ＰｒＰＳｃの量を決定する段階；ならびに
（ａ）ＰｒＰＳｃの全量、（ｂ）感受性ＰｒＰＳｃの量、および（ｃ）耐性ＰｒＰＳｃの量のいずれかとの比を計算し、それによりＰｒＰＳｃ株を決定する段階。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、以下の段階を含む、試料中のプリオン株を決定する方法である：
単位量の試料中のプリオンの全量を単離する段階；
感受性型プリオンを加水分解するのに十分な条件下で、試料を処理（例えば、プロテイナーゼＫ処理）する段階；
処理感受性の疾患関連高次構造の量を決定する段階；
処理耐性の疾患関連高次構造（例えば、ＰｒＰ２７−３０）の量を決定する段階；および
比が特定のプリオン株を示唆し、プリオン株は、計算された比と既知プリオン株（例えば、Ｄｒｏｗｓｙ、１３９Ｈ、Ｈｙｐｅｒ、Ｍｅ７、ＭＴ−Ｃ５、ＲＭＬ、およびＳｃ２３７からなる群より選択される株）の標準比を比較することによって決定することができる、処理感受性の疾患関連高次構造の量と処理耐性の疾患関連高次構造の量の比を計算する段階。
【００２０】
さらに別の態様において、以下の段階を含む、プリオン関連疾患を有する被験者の予後を決定する方法が提供される：
試料中の全ＰｒＰＳｃ、処理感受性ＰｒＰＳｃ、および処理耐性ＰｒＰＳｃの相対量を決定する段階；ならびに
該相対量と既知プリオン株の相対量を比較する段階であり、ここで、相対量がプリオン関連疾患の潜伏期間および病理を示唆する段階。
【００２１】
本発明の目的は、ヒト、霊長類、サル、ハムスター、マウス、ブタ、ウシ、ヒツジ、シカ、オオシカ、ネコ、イヌ、およびニワトリの組織から得られた、またはそれらに由来する変更可能な試料材料中のプリオン感染に特異的な診断アッセイを提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、プリオン感染についての株特異的な診断アッセイおよび／または予後アッセイを提供することである。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、プロテイナーゼＫ耐性型ＰｒＰＳｃが表現型的に検出可能な量でまだ存在しない、症状を示す前の段階でＰｒＰＳｃを同定することである。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、ｒＰｒＰＳｃ濃度が検出可能な濃度より少ないか、全く蓄積していない可能性がある組織におけるプリオン感染についての疾患特異的診断アッセイを提供することである。このような試料の例は、プリオンに感染した全血から単離された血清および白血球（ＷＢＣ）である。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、感染動物から採取された試料中のｓＰｒＰＳｃとｒＰｒＰＳｃの比を決定することによって、プリオン感染動物におけるプリオン株を特異的に区別するための迅速なアッセイを提供することである。
【００２６】
本方法の１つの利点は、迅速で、信頼性が高く、比較的わずかな試薬または機器しか必要としないことである。
【００２７】
このアッセイの重要な特徴は、迅速で、費用対効果が大きく、大量の試料をスクリーニングする能力を有する高流入設計である。
【００２８】
本発明のこれらのおよびその他の目的、利点、および特徴は、以下でより完全に説明される方法についての詳細を読むことにより、当業者に明らかになると考えられる。
【００２９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の方法および試薬の説明の前に、本発明は、説明される特定のプロトコールおよび材料に限定されず、当然変更されうることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は特定の態様だけを説明する目的で用いられ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本発明を限定すると意図されないことも理解されるべきである。
【００３０】
値の範囲が定められている場合、その範囲の上限と下限との間の、間のそれぞれの値（特に文脈によって明確に規定されない限り下限の単位の１／１０まで）も詳細に開示されることが理解される。記載された任意の値または記載された範囲内の間の値と、他の記載された任意の値または記載された範囲内の間の値との間の、それぞれの狭い範囲が本発明に含まれる。これらの狭い範囲の上限および下限は、独立して、この範囲に含まれても、含まれなくてもよく、各範囲（ここで、限界のいずれかが狭い範囲に含まれるか、限界のいずれも狭い範囲に含まれないか、または両限界が狭い範囲に含まれる）もまた、記載された範囲において明確に限定して排除される任意の限界に応じて本発明に含まれる。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、含まれる限界のいずれかまたは両方を排除する範囲も本発明に含まれる。
【００３１】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書で説明されるものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料が今から説明される。方法および／または材料を開示および説明するために、本明細書に記載の全ての刊行物が参照として本明細書に組み入れられ、方法および／または材料に関連して刊行物が引用されている。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「１つの」「ある」、および「その」とは、特に文脈によって明確に規定されていない限り複数の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「１つの試料」への言及は複数のこのような試料を含み、「特定の複合体形成剤」への言及は１つまたは複数の複合体形成剤および当業者に周知のその等価物などへの言及を含む。
【００３３】
本明細書で議論される刊行物は、単に、本願の出願日前の刊行物を開示するために示される。本明細書には、先行発明に基づいて本発明がこのような刊行物に先行する権利がないと認められると解釈されるものは何もない。さらに、示された公開日は実際の公開日とは異なる場合があり、実際の公開日を別個に確認する必要がある場合がある。
【００３４】
定義
「複合体形成剤」という用語は、タンパク質の圧縮した高次構造（例えば、ＰｒＰＳｃ）および／またはタンパク質の緩んだ高次構造（例えば、ＰｒＰＣ）と選択的に結合または複合体化する任意の物質を指すために本明細書で用いられる。この複合体形成剤はペプチドまたは抗体などの生物学的分子（例えば、ＰｒＰＳｃに対して選択的な抗体）でもよく、化学薬品（例えば、リンタングステン酸（ＰＴＡ））でもよい（化学薬品は、塩（例えば、リンタングステン酸ナトリウム）の形で添加されてもよい）。複合体形成剤は単独で用いられてもよく、組み合わせて用いられてもよい。例えば、生物学的複合体形成剤は化学複合体形成剤と共に用いられてもよい（例えば、ペプチドおよび化学薬品の使用）。別の例では、同じクラスの２種類の複合体形成剤（例えば、リンタングステン酸（およびその塩）ならびにトリクロロ酢酸の混合物）を一緒に使用することができる。形成される複合体は、ＰｒＰＳｃ複合体と残りの組成物を分離するためのいくつかの手段（例えば、表面への複合体形成剤の固定化）をもたらしうる。好ましい複合体形成剤はＰｒＰＣに結合するより容易にＰｒＰＳｃに結合し、特に好ましい薬剤は高度の親和性でＰｒＰＳｃに結合し、有意なレベルでＰｒＰＣに結合しない。客観的に、好ましい結合剤は、ＰｒＰＣに結合する結合親和性の２倍以上、好ましくは、ＰｒＰＣに結合する結合親和性の５倍以上でＰｒＰＳｃに結合する。
【００３５】
本明細書で使用する「タンパク質」という用語は任意のアミノ酸配列を含むことが意図され、糖タンパク質などの修飾配列を含む。この用語は、天然のタンパク質およびペプチドならびに組換えまたは合成により合成されたタンパク質およびペプチドを含む。本発明に関連して用いられる「タンパク質」という用語は、少なくとも２種類の異なる高次構造で生じる天然のタンパク質をカバーすることが特に意図され、ここで、両高次構造は、同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有するが、３種類以上の異なる３次元構造を有する。タンパク質の高次構造には、疾患状態に関連しない少なくとも１種類の高次構造および疾患状態に関連する（すなわち、病原性の）少なくとも２種類の高次構造が含まれる。本開示に関して用いられるタンパク質の特定のおよび好ましい例は、ＰｒＰＣ型と呼ばれる非疾患型およびＰｒＰＳｃと呼ばれる疾患関連型を含むＰｒＰタンパク質であり、ＰｒＰＳｃは、少なくとも１種類のプロテアーゼ感受性型（ｓＰｒＰＳｃ）および少なくとも１種類のプロテアーゼ耐性高次構造（ｒＰｒＰＳｃ）で存在する。プリオンタンパク質すなわちＰｒＰタンパク質のＰｒＰＳｃ型は感染性および病原性であるが、他の疾患高次構造タンパク質は病原性であるが、感染性でない。本明細書で使用する「病原性」という用語は、タンパク質が実際に疾患を引き起こすことを意味してもよく、単に、タンパク質が疾患に関連し、従って、疾患が存在する時に存在することを意味してもよい。従って、本開示に関して用いられる病原性タンパク質は、必ずしも、疾患の特異的な原因因子であるタンパク質であるとは限らない。
【００３６】
「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」などの用語は本明細書で同義に用いられ、ヒトおよび動物において疾患（海綿状脳症）を引き起こすことが知られている感染粒子型のＰｒＰＳｃと、適切な条件下でＰｒＰＳｃ感染型に変換される非感染型のＰｒＰＣの両方を意味するものとする。
【００３７】
「プリオン」、「プリオンタンパク質」、および「ＰｒＰＳｃタンパク質」などの用語は、ＰｒＰＳｃ感染性型ＰｒＰを指すために本明細書で同義に用いられ、「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」と「感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」という言葉の短縮形である。粒子は、これに限定されるわけではないが、主としてＰｒＰ遺伝子によりコードされるＰｒＰＳｃ分子からなる。プリオンは一般的にＰｒＰＳｃ二量体である。プリオンは、細菌、ウイルス、およびウイロイドとは異なる。既知のプリオンは動物に感染して、ヒツジおよびヤギの伝染性神経系変性疾患であるスクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）すなわち「狂牛病」、ならびにネコのネコ海綿状脳症を引き起こす。ヒトに罹患することが知られている４つのプリオン病は、（１）クールー、（２）クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、（３）ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）、および（４）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）である。本明細書で使用する「プリオン」とは、使用される任意の動物、特にヒトおよび家畜において、これらの疾患または他の疾患の全てまたはいずれかを引き起こす全ての型のプリオンを含む。
【００３８】
「ＰｒＰ遺伝子」という用語は、既知の多型および病原性変異を含むタンパク質を発現する遺伝物質を述べるために本明細書で用いられる。「ＰｒＰ遺伝子」という用語は、一般的に、任意の型のＰｒＰタンパク質をコードする任意の種の任意の遺伝子を意味する。一般に知られているいくつかのＰｒＰ配列が、このような配列を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる、ガブリエル（Ｇａｂｒｉｅｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９０９７−９１０１（１９９２）ならびに米国特許第５，５６５，１８６号；同第５，７６３，７４０号；同第５，７９２，９０１号；および国際公開公報第９７／０４８１４号に記載されている。ＰｒＰ遺伝子は、本明細書で述べられる「宿主」および「試験」動物を含む任意の動物ならびにその任意および全ての多型および変異に由来してよく、この用語は、まだ発見されていない他のこのようなＰｒＰ遺伝子を含むことが理解される。このような遺伝子により発現されるタンパク質は、ＰｒＰＣ（非疾患）型またはＰｒＰＳｃ（疾患）型のいずれをもとることができる。
【００３９】
「抗体」という用語は、抗原に結合することができる免疫グロブリンタンパク質を意味する。本明細書で使用する抗体は、抗体全体ならびに関心対象のエピトープ、抗原、または抗原断片に結合することができる任意の抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ）’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含むことが意図される。本発明のアッセイに好ましい抗体は、関心対象のタンパク質（例えば、ＰｒＰタンパク質、特に、ＰｒＰＳｃタンパク質またはＰｒＰＳｃ二量体）に対して免疫反応性または免疫特異的であり、従って、特異的かつ選択的に結合する。未変性の非疾患型と疾患型の両方に対して（例えば、未変性ＰｒＰＣおよび未変性ＰｒＰＳｃの両方に対して）免疫反応性および免疫特異的な抗体を使用してもよい。ＰｒＰＣに対する抗体は、好ましくは免疫特異的である（例えば、関連物質と実質的に交差反応しない）。本発明と共に使用することができるいくつかの特異的抗体が、抗体を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる、公開された国際公開公報第９７／１０５０５号において開示されている。この公開されたＰＣＲ出願は、これも参照として本明細書に組み入れられる、１９９８年１２月８日に公布された米国特許第５，８４６，５３３号に対応する。「抗体」という用語は全種類の抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびファージディスプレイ法を用いて作成された抗体）を含む。本発明の特に好ましい抗体は、未変性ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃの両方に対して比較的高度の親和性を有する抗体であり、ＰｒＰＳｃに対してより大きな結合親和性を有する抗体が好ましい。本発明の抗体は、本明細書で定義された「複合体形成剤」である。
【００４０】
ＰｒＰＣに結合する抗体は、１９８６年１０月８日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ ２０８５２）に寄託され、１９８９年２月２１日に公布された米国特許第４，８０６，６２７号（これは、ＰｒＰＣに選択的に結合するが、未変性型（すなわち、プロテアーゼ処理されていない）ＰｒＰＳｃには結合しない抗体を開示するために参照として組み入れられる）において開示および説明されるハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣ ＨＢ９２２２によって産生されるモノクローナル抗体２６３Ｋ ３Ｆ４である。
【００４１】
「精製された抗体」とは、天然で結合している他のタンパク質、炭水化物、および脂質を十分に含まない抗体を意味する。このような抗体は、ＰｒＰＳｃタンパク質（またはその抗原断片）に「優先的に結合」し、他の抗原的に関連しない分子を実質的に認識せず、結合しない。本発明の精製された抗体は、好ましくは、特定の種に対して免疫反応性かつ免疫特異的であり、より好ましくは、未変性ＰｒＰＳｃに対して免疫特異的である。
【００４２】
タンパク質（例えば、ＰｒＰタンパク質）の「抗原断片」とは、抗体に結合することができる、このようなタンパク質の一部を意味する。
【００４３】
「特異的に結合する」とは、特定のポリペプチド（例えば、タンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）のエピトープ）に対する抗体の高アビディティおよび／または高親和性結合を意味する。好ましくは、この特定のポリペプチド上のエピトープへの抗体の結合は、他の任意のエピトープ（特に、関心対象の特定のポリペプチドと同じ試料に関連する分子または同じ試料中の分子に存在し得るエピトープ）への同じ抗体の結合より強い（例えば、結合条件を調節することによって、抗体が、ほとんど、所望のタンパク質のエピトープ部位またはエピトープ断片（例えば、ＰｒＰＳｃのエピトープ断片）にだけ結合するように、タンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）のエピトープ断片により強く結合する）。
【００４４】
「検出可能に標識された抗体」、「検出可能に標識された抗ＰｒＰ」、または「検出可能に標識された抗ＰｒＰ断片」とは、取り付けられた検出可能な標識を有する抗体（または結合特異性を保持している抗体断片）を意味する。検出可能な標識は、通常、化学結合によって取り付けられるが、標識がポリペプチドの場合、もう一つの選択肢として遺伝子工学的技法によって取り付けることができる。検出可能に標識されたタンパク質を作成する方法は当技術分野において周知である。検出可能な標識は当技術分野において周知であるが、通常、放射性同位体、蛍光体、常磁性標識、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）を発するか、もしくは標識を基質に曝露した後に検出可能なシグナルを発する他の部分もしくは化合物である。様々な検出可能な標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識する方法、および標識抗体を使用する方法が当技術分野において周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと）。ユーロピウムが特に好ましい標識である。
【００４５】
本明細書で用いられる略語としては以下が挙げられる。
ＣＮＳ：中枢神経系
ＢＳＥ：ウシ海綿状脳症
ＣＪＤ：クロイツフェルト−ヤコブ病
ＦＦＩ：致死性家族性不眠症
ＧｄｎＨＣｌ：塩酸グアニジン
ＧＳＳ：ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病
Ｈｕ：ヒト
ＨｕＰｒＰ：ヒトプリオンタンパク質
Ｍｏ：マウス
ＭｏＰｒＰ：マウスプリオンタンパク質
ＳＨａ：シリアンハムスター
ＳＨａＰｒＰ：シリアンハムスタープリオンタンパク質
ＰｒＰＳｃ：プリオンタンパク質のスクレイピーアイソフォーム
ＰｒＰＣ：プリオンタンパク質の細胞に含まれる一般的な正常アイソフォーム
ＰｒＰＣＪＤ：ＰｒＰタンパク質のＣＪＤアイソフォーム
ＦＶＢ：ＦＶＢマウスの卵は比較的大きく、外因性ＤＮＡのマイクロインジェクションを比較的よく受け入れるために、トランスジェニックマウス作成によく用いられる標準的なマウス近交系
ｓＰｒＰＳｃ： ＰｒＰＳｃのプロテイナーゼＫ感受性画分
ｔＰｒＰＳｃ：プロテイナーゼＫ処理前の全ＰｒＰＳｃ
ｒＰｒＰＳｃ：プロテイナーゼＫ処理後に測定され、初めに記載されたＰｒＰ２７−３０と同一のＰｒＰＳｃタンパク質のプロテイナーゼＫ耐性画分
［ＤＲＣ］−疾患関連高次構造タンパク質の濃度
ＰＴＡ−リンタングステン酸
ＮａＰＴＡ−リンタングステン酸ナトリウム
ＴＣＡ−トリクロロ酢酸
ＡＣ−アフィニティクロマトグラフィー
【００４６】
本発明の一般的な局面
本発明は、試料中の特定のＰｒＰＳｃアイソフォームであるｓＰｒＰＳｃの早期検出が可能な非常に感度の高い高次構造依存性イムノアッセイ（ＣＤＩ）を提供する。このアッセイはまた、試料中のプロテアーゼ感受性ＰｒＰＳｃ配座異性体とプロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃ配座異性体を区別し、それぞれの濃度を定量し、それにより、特定の試料中の一方の型と他方の型の比を定量することができる。本発明の方法は、ＰｒＰのＰｒＰＳｃアイソフォームが、少なくとも１種類のプロテアーゼ感受性高次構造（一般的に、ｓＰｒＰＳｃと呼ばれる）および少なくとも１種類のプロテアーゼ耐性高次構造（一般的に、ｒＰｒＰＳｃと呼ばれる）で存在するという発見から生じている。
【００４７】
ｓＰｒＰＳｃ濃度およびｒＰｒＰＳｃ濃度を試料から直接決定することができるが、特定の態様において、本発明のイムノアッセイは、１）試料中の全ＰｒＰＳｃを単離する段階、２）このＰｒＰＳｃ画分の一部をプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）に曝露する段階、および３）試料中のＰｒＰＳｃのプロテアーゼ耐性型およびプロテアーゼ感受性型の濃度を決定する段階を特徴とする。プロテアーゼの活性は、限られた時間、ｓＰｒＰＳｃとｒＰｒＰＳｃを区別することが可能な条件下でＰｒＰＳｃ画分を用いて制御される。この高次構造依存性イムノアッセイは、かなりの数のＰｒＰＳｃ分子の二次構造および三次構造を区別することが可能な迅速なツールをもたらす。プロテアーゼ感受性型（すなわち、ｓＰｒＰＳｃ）ＰｒＰＳｃの同定によって、被験者にプロテアーゼ耐性型が蓄積する前に（すなわち、被験者が症状を示す前の間に）、試料中の感染性プリオンを検出することが可能になる。これにより、例えば、症状を示す前の感染動物において、または外見上健常な人において、プリオンを早期に同定することが可能になる。
【００４８】
本発明の方法はまた、それぞれの株がｒＰｒＰＳｃとｓＰｒＰＳｃの特有の比を示すので、特定のＰｒＰＳｃ株を同定するのに使用することもできる。このアッセイによって、インビボで増殖しているＰｒＰＳｃ配座異性体に基づいてプリオン株を区別することが可能になる。特定の理論に制限されるわけではないが、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ感受性高次構造は、特定のプリオン株によって異なることがあるように思われる。例えば、８つの異なる株が少なくとも８つの異なるプロテアーゼ感受性ＰｒＰＳｃ高次構造を有することが証明されている。実際に、限定プロテアーゼ消化およびＧｄｎＨＣｌ変性研究によって明らかにされたように、それぞれの株は、ある範囲の高次構造からなると考えられている。これらの発見は、タンパク質の一次構造が１つだけの三次構造を決定するという最近まで確信されていた考えと対照をなす（Ａｎｆｉｎｓｅｎ、１９７３）。
【００４９】
プリオン感染の症状を示す前の段階を通じてｓＰｒＰＳｃ画分はｒＰｒＰＳｃ画分と共に蓄積し、これらの２つの型はそれぞれの株において一定の比で存在する。しかしながら、この比は株間で異なり、これは、接種後のｓＰｒＰＳｃタンパク質の異なる高次構造の蓄積およびクリアランスの差を反映している。それぞれの株は特有の疾患特性（例えば、潜伏期間の平均長さ、ＰｒＰＳｃ蓄積の配置、および特定のプリオン株によって生じる病変の分布）と関連するので、被験者における特定のプリオン株の同定は被験者の予後を決定するのに役立つ可能性がある。ある特定の株が存在することによって感染原因が示唆されることもある（例えば、プリオン株の同定は、個体の感染源を追跡するのに、または汚染製品における潜在的なプリオン源を特定するのに役立ちうる）。
【００５０】
現在、プリオンを検出するためのアッセイは開発中であるが、まだ商品化はされていない。さらに、このようなアッセイの費用、利便性、または（大きな規模での）精度はまだ分からない。従って、ヒト血漿などの物質がプリオンを含有するという疑いが持たれる場合、破棄される。英国がヒト血漿供給品を破棄していたことを示す、Ｔｈｅ Ｗａｌｌ Ｓｔｒｅｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９８年１１月２５日、１頁、「英国は全献血の一部を狂牛病の恐れのために破棄する（Ｍａｄ Ｃｏｗ Ｆｅａｒｓ Ｌｅａｄｓ Ｕ．Ｋ． ｔｏ Ｄｅｓｔｒｏｙ Ｐａｒｔｓ ｏｆ ａｌｌ Ｄｏｎａｔｅｄ Ｂｌｏｏｄ）」という題名の記事を参照されたい。この劇的な措置は、（１）プリオンがヒト血漿に存在する可能性がある、（２）プリオン病が死に至るものであり、現在のところ治療することができない、（３）市販のプリオン検査が現在のところ存在しない、および（４）試料からプリオンを除去する市販の方法が現在のところ存在しないという理由でなされた。本発明は、疾患サイクルの初期段階で試料中のプリオンを同定する方法および特定のプリオン株を確かめる手段（これにより感染個体に至るまで製品を追跡することが可能になりうる）を含む。さらに、このアッセイは、血清および全血などの、ｒＰｒＰＳｃを含まないが、ｓＰｒＰＳｃ濃度を有する試料中のプリオンを同定することができる。
【００５１】
疾患の進行および／または起こり得る伝染を避けるために、生物学的液体、特に、被験者に導入されるべき生物学的液体（例えば、血液製剤）に存在する全てのＰｒＰＳｃを同定することが重要である。本発明は、（１）生物製剤および食品などの製品が感染性プリオンを含まないことを確認する（すなわち、製品が「プリオン非含有」であることを確認する）ために製品を試験すること、ならびに／または（２）感染の原因となるプリオン株を決定するために試料中の特定のプリオン株を同定することに関して有用である。少なくとも２つの理由で株を知ることが重要である。第１に、異なる化合物によって異なる株を治療することができる。従って、株を同定することは株特異的治療に向けての第一段階である。第２に、株を知ることによって、供給源に至るまで株を追跡し、それにより感染源を決定することが可能である。感染源を知ることは、同定された感染源からの感染のさらなる蔓延を阻止する計画の立案に向けての第一段階である。
【００５２】
一般的な手順
プリオンタンパク質の病原性型を同定するために、および／またはプリオン株を決定するために、本発明を用いて任意の種類の試料を処理することができる。本発明は、圧縮した型および緩んだ型を有する任意のタンパク質の同定に適用することができる。この場合、圧縮した型は、プロテアーゼ感受性配座異性体（例えば、構造中間体）およびプロテアーゼ耐性配座異性体の両方に存在する。本発明は、ＰｒＰタンパク質の病原性形態の同定について詳細に説明され、特に、試料中のｓＰｒＰＳｃ濃度の区別について説明される。
【００５３】
本発明のアッセイの第一段階は、単位試料中の疾患関連タンパク質の全量（または濃度）を決定することである。例えば、これは、単位からｔＰｒＰＳｃを単離し、物理的に測定することによって、または単位中のｔＰｒＰＳｃ濃度を直接決定することによって（例えば、単位をＰｒＰＳｃに特異的な抗体で処理することによって）行うことができる（米国特許第５，８９１，６４１号；同第６，２１４，５６５号；および同第５，８４６，５３３号を参照のこと）。
【００５４】
アッセイの第二段階は、単位試料を処理して、単位試料中のｓＰｒＰＳｃ濃度および／またはｒＰｒＰＳｃ濃度を区別することである。１つの例示的な態様において、ｓＰｒＰＳｃ濃度は、単位試料処理後にｒＰｒＰＳｃ濃度を測定し、単位試料中のｔＰｒＰＳｃ濃度からｒＰｒＰＳｃ濃度を差し引くことによって決定することができる。例えば、加水分解処理に対して耐性の疾患関連タンパク質配座異性体を除く試料中の全てのまたは実質的に全てのタンパク質を破壊または加水分解するように、最初の試料の単位または単離された全疾患関連タンパク質を溶解処理する。このような例において、試料の処理は、（１）試料中に存在する全てのまたは実質的に全ての非ＰｒＰタンパク質を加水分解するために；（２）存在する全てのまたは実質的に全てのＰｒＰＣを加水分解するために；（３）存在するプロテアーゼ感受性ＰｒＰＳｃを加水分解するために；および（４）存在するプロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃの６５個のＮ末端アミノ酸を加水分解し、それにより、加水分解されないＰｒＰ２７−３０のみを残すために行われる。次いで、このプロテアーゼ耐性タンパク質の量（または濃度）を決定し、疾患関連タンパク質の全量（全ＰｒＰＳｃ）から差し引いて、プロテアーゼ感受性疾患関連タンパク質（例えば、ｓＰｒＰＳｃ）の濃度を求める。
【００５５】
溶解処理として、極端なｐＨ（例えば、２以下または１２以上）、強力に還元または酸化する化合物への曝露などの化学的方法を挙げることができる。溶解処理はまた温度を用いて行うこともできる。例えば、ＰｒＰタンパク質の加水分解は、８０℃以上から１３２℃まで１日間〜３日間加熱することによって達成することができる。ｐＨを１２または１３まで上げることによって、著しく時間を短縮し、温度を下げることができる。所望の結果を得るために、時間、温度、ｐＨ、および化合物（例えば、プロテアーゼ）の組み合わせを調節することができる。様々な好ましい態様において、酵素とタンパク質の比は１：５〜１：５００で変化してもよく、ｐＨは６．５〜８．５で変化してもよく、温度は２２℃〜３７℃で変化してもよい。
【００５６】
または、ｓＰｒＰＳｃをアンフォールディングするように単位試料を処理することができ、アンフォールディングされたｓＰｒＰＳｃを選択的に認識するが、ｒＰｒＰＳｃを認識しない結合剤を用いて、ｓＰｒＰＳｃ濃度を直接決定することができる。例えば、化学的方法によって、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ感受性ｓＰｒＰＳｃ配座異性体がアンフォールディングされ、抗体が（処理されたｒＰｒＰＳｃでは利用できない）エピトープに接近することができる。処理化合物の濃度ならびに時間および温度は、処理されるタンパク質および得ようとする最終結果によって異なる。
【００５７】
この処理は、直接、試料に対して、または単離されたｓＰｒＰＳｃに対して用いることができる。単位試料が単離ＰｒＰＳｃを含む場合、ｒＰｒＰＳｃでは利用できないｓＰｒＰＳｃのエピトープを選択的に認識する結合剤によって、ｓＰｒＰＳｃ濃度を直接測定することができる。単位試料がＰｒＰＣも含み、結合剤がＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣの両方にあるエピトープを認識する場合（例えば、３Ｆ４）、処理により、ＰｒＰＣが加水分解されるがｓＰｒＰＳｃが加水分解されてはならず（例えば、限定タンパク質分解）、またはＰｒＰＣ濃度は処理前に決定されなければならない。後者の場合、処理された単位試料への結合レベルはｓＰｒＰＳｃ濃度に対応した量で増加する。
【００５８】
さらに、ｓＰｒＰＳｃとｒＰｒＰＳｃを区別するのに物理的方法を使用することができる。本発明の方法に含まれることが意図される技法として、ｓＰｒＰＳｃとｒＰｒＰＳｃの沈降の差に基づく濾過、超遠心分離、クロマトグラフィー法、およびｓＰｒＰＳｃとｒＰｒＰＳｃの重合の差に基づく方法が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００５９】
複合体形成剤を用いた試料からのｔＰｒＰＳｃの単離
本発明の特定の態様において、プリオンは、ｒＰｒＰＳｃとｓＰｒＰＳｃを区別する処理の前に試料から単離される。例えば、プリオンは、試料を、ＰｒＰＳｃに選択的に結合し、試料からＰｒＰＳｃを取り出すことができる複合体形成剤に曝露することによって生体試料から単離することができる。ＰｒＰＳｃの単離は、固定化複合体形成剤との複合体形成（すなわち、固定化複合体形成剤を含むアフィニティカラム、膜、フィルター、またはビーズへの試料の曝露）によるものでもよい。複合体形成剤は、アッセイでのさらなる使用のために試料からＰｒＰＳｃを効果的に取り出す（米国特許第５，９７７，３２４号を参照のこと）。
【００６０】
処理されるべき生体試料は、室温（１５℃〜３０℃）で流動可能な液体でなければならない。この溶液のｐＨは約６．４〜８．４、好ましくは７．４であるべきであり、過剰のマグネシウムまたはカルシウムを含んではいけない。
【００６１】
試料は、固体表面に固定化された複合体形成剤、またはプリオンと結合した複合体形成剤を試料から分離することができるように設けられた複合体形成剤に曝露される。複合体形成剤は、試料中に存在するタンパク質の任意の圧縮した形態（一般的に、病原性形態）と優先的にまたはそれだけと複合体を形成するか、またはどうにかして結合し、従って、試料が固定化複合体形成剤に曝露されると、試料中に存在する任意のＰｒＰＳｃを固体表面に効果的に固定化する。
【００６２】
１つの態様において、化学薬品（例えば、ヘテロポリ酸（例えば、ＰＴＡ））または好ましくはその金属塩（ＮａＰＴＡ））が、膜フィルター、磁気ビーズなどの固体表面に固定化される。試料は、試料中の実質的に全てのＰｒＰＳｃがＰＴＡと複合体を形成するのに十分な時間にわたって複合体形成剤に供される。例えば、試料は、約１時間〜１６時間にわたって約３０℃〜４５℃（好ましくは、３７℃）でインキュベートすることができる。複合体形成剤はＰｒＰＳｃと複合体を形成する。重要なことは、形成された複合体を、いくつかの手段（例えば、濾過、磁場の使用、沈降など）によって試料の残りから分離できることである。
【００６３】
複合体形成剤
本発明において複合体形成剤として有用な化合物として、抗体、酵素、ペプチド、化学種、結合分子などが挙げられる。これらの複合体形成剤は、生物学的溶液からプリオンを結合および単離できるように用いられる。このような複合体形成剤は、当業者に明らかなように、全血、血漿および血小板などの血液成分、ならびに他の生物学的液体において使用することができる（米国特許第６，２２１，６１４号を参照のこと）。
【００６４】
化学薬品
本発明の１つの態様において、生物学的材料からプリオンを取り出す化合物は、ＰｒＰＳｃを沈殿させる化学薬品である。本発明における複合体形成剤として使用する化学薬品の１つの好ましいクラスは、ヘテロポリ酸およびその塩である。ヘテロポリ酸は、少なくとも１つの中心元素および少なくとも１つの配位元素を有するオキソアニオンの完全にまたは部分的にプロトン化した形態である。ヘテロポリ酸はケギン構造を有してもよく、ドーソン構造を有してもよい。
【００６５】
ヘテロポリ酸の特定のクラスは、ヘテロポリモリブデン酸塩のプロトン化形態である。これらのアニオンは、１つまたは複数の中心原子の周りに２〜１８個の６価モリブデン原子を含む。これらのヘテロポリモリブデン酸塩の中心原子として約３６の異なる元素が特定されている。これらのアニオンは全て高度に酸素化されている。ヘテロポリモリブデン酸塩の例として、［ＰＭｏ１２Ｏ４０］３、［Ａｓ２Ｍｏ１８Ｏ６２］６、および［ＴｅＭｏ６Ｏ２４］６（式中、中心原子は、それぞれ、Ｐ５＋、Ａｓ５＋、およびＴｅ６＋である）が挙げられる。ヘテロポリモリブデン酸塩のより詳細な議論は、「キルクオマー化学技術百科辞典（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、第３版、１５、６８８−６８９（１９８１）に示されている。
【００６６】
ヘテロポリモリブデン酸塩のプロトン化形態に似た別のクラスのヘテロポリ酸は、ヘテロポリタングステン酸塩のプロトン化形態である。ヘテロポリタングステン酸塩において、配位元素はモリブデンではなくタングステンである。米国特許第４，３７６，２１９号（この全開示は本明細書に参照として明確に組み入れられる）は、様々なヘテロポリ酸の調製について述べている。これらのヘテロポリ酸の中心元素は、Ｐ、Ｓｉ、Ｂ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｍｎ、Ｆ、Ｖ、Ｃｅ、およびＴｈからなる群より選択することができる。これらのヘテロポリ酸の配位元素としてＭｏおよび／またはＷが挙げられる。任意の配位元素として、Ｖ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、およびＦｅが挙げられる。配位元素数と中心元素数の比は２．５〜１２、好ましくは９〜１２でよい。米国特許第４，３７６，２１９号に例示される特定のヘテロポリ酸として、リンタングステン酸、ケイタングステン酸、１０−タングスト−２−バナドリン酸、６−タングスト−６−モリブドリン酸、リンモリブデン酸、ケイモリブデン酸、ゲルマノタングステン酸、タングストフッ酸、および１８−タングスト−２−リン酸、ならびにこれらの酸の全てまたは任意の塩（例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、およびＣａ塩などの金属塩）が挙げられる。本発明において使用するための特定のヘテロポリ酸は、リンタングステン酸（すなわち、Ｈ３ＰＷ１２Ｏ４０）およびその金属塩（特に、Ｎａ塩）である。このような複合体形成剤はＰｒＰＳｃに効果的に結合する。
【００６７】
このような化学薬品は、単独で、組み合わせて、または緩衝液および不活性結合化学薬品などの他の非生物活性化学薬品と共に使用することができる。本発明のヘテロポリ酸（例えば、ＰＴＡ）は、好ましくは、金属塩の形で用いられるが、これに限定されるわけではない。金属塩として、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどが挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００６８】
本発明の支持体材料と組み合わされるヘテロポリ酸またはその塩の量は、生物学的液体からＰｒＰＳｃを有意に取り出すのに十分な量で、好ましくは、検出不可能な濃度または少なくとも非感染濃度までＰｒＰＳｃを取り出すのに十分な量で存在すべきである。ヘテロポリ酸と支持体材料の重量比は、例えば、約１：２０〜約１：１でもよい。ヘテロポリ酸を十分に分散させ、それによってヘテロポリ酸の有効表面積を増大させる任意のやり方で、ヘテロポリ酸と支持体材料を組み合わせることができる。これらの成分を組み合わせる好ましい技法は、支持体材料へのヘテロポリ酸の含浸による技法である。ヘテロポリ酸はまた、イオン交換法によって支持体材料と組み合わせることもできる。含浸法は、支持体材料の多孔領域にヘテロポリ酸水溶液を吸収させ、その後に、乾燥させて水を除去し、支えられたヘテロポリ酸を残すことを伴ってもよい。本開示を読めば当業者に明らかなように、ヘテロポリ酸またはその塩を固定化する他の方法を、これらの複合体形成剤を固定化するのに使用することができる。
【００６９】
生物因子
別の態様において、複合体形成剤は、ＰｒＰＳｃに選択的に結合するタンパク質、ペプチド、または他の生物学的部分である。
【００７０】
１つの態様において、複合体形成剤は、プリオンに選択的に結合するように設計されたペプチドまたは他の低分子である。好ましくは、ペプチドまたは低分子は、ＰｒＰＳｃに優先的に結合するように設計されている。「優先的に結合する」とは、ペプチドが生物学的溶液中の他のタンパク質よりもＰｒＰＳｃに結合する可能性が、少なくとも２０倍以上、より好ましくは５０倍以上、より好ましくは１００倍以上、さらにより好ましくは１０００倍以上高くなるように設計されることを意味する。生物学的液体は一般的に未変性形態のＰｒＰＳｃを含むので、本発明のペプチドは、好ましくは、変性した形態ではなくＰｒＰＳｃの未変性形態に結合するように設計されている。ペプチドは、当業者によって予想されるように、結合しやすいＰｒＰＳｃ領域に対するペプチドを設計することによって、ＰｒＰＳｃへの結合を最大限にするように設計することができる。ＰｒＰＳｃに結合する有用な抗体は、抗体および抗体を作成する方法を開示および説明するために本明細書に参照として組み入れられる、１９９８年１２月８日に公布された米国特許第５，８４６，５３３号で開示および説明されている。ＰｒＰＳｃに結合するこれらの抗体の一部は、支持体表面に結合し、本発明において使用することができるペプチドである。
【００７１】
本発明の複合体形成剤はまた、プリオンに対して選択的な抗体でもよい。この抗体は、別の成分（例えば、高密度金属）に直接固定化されてもよく、結合されてもよい。この抗体はＰｒＰＳｃに結合することができる（例えば、米国特許第５，８４６，５３３号において開示された抗体）。
【００７２】
一般的に、スクレイピー感染は免疫応答を生じさせず、宿主生物は、同じ種に由来するＰｒＰＳｃに対して寛容である。ＰｒＰＣまたはＰｒＰＳｃに結合する抗体が米国特許第５，８４６，５３３号に開示されている。最初に試料中のＰｒＰＳｃを単離するために、ＰｒＰＣに結合するが、ＰｒＰＳｃに結合しない任意の抗体を使用することができ、当業者は、このような抗体を周知の手順を用いて作成することができる。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号のファージディスプレイ抗体ライブラリーを作成する方法を参照されたい。だが、ポリクローナル抗ＰｒＰ抗体が、ウサギにおいて、蟻酸またはＳＤＳで変性された多量のＳＨａＰｒＰ２７−３０による免疫化後に惹起されている（Ｂｅｎｄｈｅｉｍ、Ｂａｒｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：４１８−４２１（１９８４）；Ｂｏｄｅ、Ｐｏｃｃｈｉａｒｉら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６６：２４７１−２４７８（１９８５）；Ｓａｆａｒ、Ｃｅｒｏｎｉら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４０：５１３−５１７（１９９０））。同様に、ＰｒＰ２７−３０に対する少数の抗ＰｒＰモノクローナル抗体がマウスにおいて作成されている（ＢａｒｒｙおよびＰｒｕｓｉｎｅｒ、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５４：５１８−５２１（１９８６）；Ｋａｓｃｓａｋ、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６１：３６８８−３６９３（１９８７））。これらの抗体は蟻酸またはＳＤＳで変性されたＰｒＰ２７−３０に対して作成され、ＳＨａおよびヒトの両方に由来する未変性ＰｒＰＣおよび処理または変性されたＰｒＰＳｃを等しく十分に認識することができるが、ＭｏＰｒＰに結合しない。驚くほどのことではないが、これらの抗体のエピトープは、ＳＨａＰｒＰとＭｏＰｒＰとのアミノ酸の違いを含む配列領域に位置していた（Ｒｏｇｅｒｓ、Ｙｅｈｉｅｌｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３１８２−３１８６（１９９３））。
【００７３】
前記で引用された刊行物に記載された種類の多くの抗体がＰｒＰＣおよび処理または変性されたＰｒＰＳｃに結合するが、未変性ＰｒＰＳｃに結合しない理由は、完全に明らかになっていない。特定の理論に制限されるわけではないが、タンパク質がＰｒＰＣ高次構造にある時に曝露されているエピトープが、ＰｒＰＳｃ立体配置（この場合、タンパク質はかなり不溶性であり、より密に折り畳まれている）では曝露されていないか、または部分的に隠されているので、このようなことが起こりうると考えられている。
【００７４】
本発明の目的のために、結合が起こらないということを示すことは、平衡定数すなわち親和定数Ｋａが１０６ｌ／モル以下であることを意味する。さらに、結合は、Ｋａが１０７ｌ／モル以上、好ましくは１０８ｌ／モル以上である時に存在すると認められる。１０７ｌ／モル以上の結合親和性は、（１）単一のモノクローナル抗体（すなわち、多数の１種類の抗体）、（２）複数の異なるモノクローナル抗体（例えば、多数の、各５種類の異なるモノクローナル抗体）、または（３）多数のポリクローナル抗体に起因しうる。（１）〜（３）の組み合わせを用いることも可能である。選択される好ましい抗体は、ＰｒＰＳｃの未変性高次構造への結合と比較して、タンパク質の処理または変性されたＰｒＰＳｃ形態に少なくとも４倍強く結合する。結合親和性の４倍の差は、前記の（１）〜（３）に従って、いくつかの異なる抗体を用いることで達成することができ、混合物中でのこれらの抗体のいくつかは、それ自体では、４倍未満の差を有する場合がある。
【００７５】
様々な異なる方法を１つまたは複数の異なる抗体と共に使用することができる。当業者は、抗体を既知の標識で標識し、現在利用可能なロボット工学、サンドイッチアッセイ、電子検出器、フローサイトメトリーなどと共に使用できることを理解すると考えられる。さらに、抗体は、直接、または抗抗体などの他の媒介を介して、より密度の高い成分に結合することができる。
【００７６】
精製方法
本発明の複合体形成剤を、生物学的物質からプリオンを効果的に単離するために様々な精製手順において使用することができる。本発明において使用するための多数の方法が以下でまとめられている。
【００７７】
アフィニティクロマトグラフィー
アフィニティクロマトグラフィー（ＡＣ）はタンパク質と固定化リガンドとの相互作用に依存している。ＡＣは、ある程度、クロマトグラフィー支持体に取り付けられたリガンドの相互作用に基づいている。マトリクスにカップリングした疎水性リガンドは、本明細書ではＡＣ支持体、ＡＣゲル、またはＡＣカラムと様々に呼ばれる。タンパク質とＡＣ支持体との相互作用の強さは、タンパク質上の非極性表面と極性表面の割合の関数だけでなく、非極性表面の分布によるものであることもさらに理解される。
【００７８】
ＡＣカラムの調製において多数のマトリクスを使用することができる。このようなマトリクスは、好ましくはビーズであり、より好ましくは球状ビーズであり、これらは本発明の複合体形成剤の支持体表面として働く。マトリクスのために提案される材料として、好ましくは、多孔性球体の形をした、アガロース、架橋デキストラン、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル、ポリアクリルアミド、セルロース、およびその誘導体または組み合わせが挙げられる。酢酸セルロースが、生物学的液体浄化用の装置（例えば、体外血液浄化装置）において首尾よく以前に用いられている。ポリウレタンが特に血液と適合性がある。シリカおよびその誘導体もまた、ヘテロポリ酸と使用する支持体材料として特に有用である。参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，４７５，１７８号および同第５，３６６，９４５号を参照されたい。
【００７９】
本発明の方法における使用に好ましい材料は、天然の親水性ポリマーであるアガロースである。９０％〜９６％の多孔度を有するビーズゲルが、アガロースの割合を変えることで形成される。ゲルの分子量は、５００，０００（１０％アガロースの場合）から２０，０００，０００（４％アガロースの場合）の範囲内である。直径２０ミクロン〜２００ミクロンの粒子が市販されている。アガロースビーズの機械強度は、Ｊ．ポラス（Ｐｏｒａｔｈ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ ６０、１６７（１９７１）の方法を用いて、アガロースの割合を増加させるか、またはビーズとエピクロロヒドリンまたは２，３−ジブロモプロパノールを架橋することによって高めることができる。これによって、相応して最大作業圧力を高めることができる（アガロースの５０％の増加は最大作業圧力の２倍〜４倍の増大につながる）。
【００８０】
適切なカップリング方法を決定する基準とは、支持体からの複合体形成剤の漏れを最小限にすること、化合物の熱安定性を維持すること、および最適量の複合体形成剤を保持することである。この技法はまた、支持体材料の劣化も、インビボで血液成分に結合する支持体上の反応基の生成も引き起こしてはいけない。複合体形成剤はまた、ある期間にわたってその活性を保持しなければならない。
【００８１】
アフィニティクロマトグラフィーカップリング法の最適化において考慮しなければならないさらなる要因は、粒子および／もしくはカラム内でのカップリング剤の分布の程度；ｐＨ；温度；カラムを通る生体試料の流速；結合した複合体形成剤のサイズ；ならびに／または特定の支持体の直径および孔径である。これらの条件のそれぞれを、当業者に周知なように、特定の手順、生体試料、および複合体形成剤に合わせて最適化することができる。
【００８２】
濾過方法
生体試料からプリオンを取り出すのに使用することができる別の方法は、膜による濾過を伴う。膜は、生物学的液体に面する側に、またはより好ましくは生物学的液体に面しない側に、膜に直接結合したプリオン複合体形成剤を有してもよい。または、複合体形成剤は、生物学的物質の大きな成分（例えば、血球）に接触しない膜裏側の領域に仕切られてもよい。後者の例では、複合体形成剤は、膜裏側の不溶性マトリクスに結合してもよい。本発明において使用するための膜は、平面の形でもよく、１つもしくはそれ以上の中空糸の形でもよく、および／または平らな箔の形でもよい。参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第４，３６１，４８４号を参照されたい。
【００８３】
膜に適した材料として、再生セルロース、酢酸セルロース、不織アクリルコポリマー、ポリサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリアクリロニトリル、ポリアミドなどが挙げられる。生物学的に活性な材料は、生物学的液体に面しない膜側の孔内および／または表面上に固定化される。これにより、血球などの成分が活性材料と接触しない。膜の孔は、通常、０．０１ミクロン〜０．８ミクロン、好ましくは、０．１５ミクロン〜０．４５ミクロンのオーダーの大きさである。ポリマー支持体は意図された使用条件下で安定でなければならず（すなわち、血液によって化学的または酵素的に分解されてはいけない）、支持体および固定化された複合体形成剤は血液と適合性がなければならず、支持体は、１５０ｍｌ／分〜２５０ｍｌ／分の臨床流速で、優れた流動性および低い圧縮性を有するべきである。
【００８４】
細孔膜の前記の構造（すなわち、プリオン複合体形成剤の非対称固定化）によって、生物学的液体は、あり得る残った有害な残留物を除去するために、後で濾過される必要がない。これにより、物質の除去と同様に分離も一段階および同じ段階で行うことができる。
【００８５】
細孔半透膜は、生物学的液体用の入口および出口を有する１つの包装および同じ包装の中に束ねられた、および封入された繊維１本１本の形でもよい。繊維の先端は、包装内で本質的に平行している繊維１本１本を保持するために適切な接着剤によって接着される。繊維または繊維の束の一端は入口と連絡した状態で設けられるのに対して、反対端は出口と連絡した状態で設けられる。
【００８６】
生物学的物質は、入口を通って包装の中に入り、繊維の長軸方向の空隙を通り、出口を通って包装から出る。包装を通過する間に、浸透画分のみが、プリオン複合体形成物質と接触するために各方向に繊維壁を通って交互路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｐａｔｈ）に流入するように、液体は圧力変化にさらされる。圧力変化を実現する手段はまた、繊維１本１本および繊維の束それぞれの間の空間と連絡した拡張チャンバ（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）からなってもよい。液体が繊維壁を通過することによって濾過が自動的に達成されるので、あり得る有害な残留物を除去するために生物学的物質を後で濾過する必要は全くない。
【００８７】
圧力変化は、−２００ｍｍＨｇ〜＋２００ｍｍＨｇ、好ましくは−１００ｍｍＨｇ〜＋１００ｍｍＨｇで変化しうる。血液の拡散距離が長ければ長いほど（例えば、プリオン複合体形成剤が膜の裏側で不溶性マトリクスに結合している場合）、所望の分離効果を達成するのに必要とされる圧力変化補償が大きくなる。それに対応して、圧力変化の振動数は、約０．０５Ｈｚから約１０Ｈｚまで、好ましくは０．５Ｈｚ〜１Ｈｚまで変化してもよい。処理ユニットを通過した後、生物学的物質（例えば、全血）は、直接、患者に再度入れられてもよく、将来使用するために保存されてもよい。処理された血液は丸ごと保存されてもよく、様々な成分（例えば、血漿、血小板、赤血球など）に分けて保存されてもよい。または、血液は、プリオンを除去する前に、その成分に分離されてもよい。
【００８８】
複合体形成剤が抗体である場合、抗体と、中空糸膜の外側多孔側の壁との間隔をあけるために分子スペーサーセグメント形成手段を有することが望ましいことが多い。この一般的な配置は、抗原の分子量が大きい（例えば、分子量１００，０００ダルトン以上）場合に好ましい。例えば、抗体と膜表面とのスペーサーまたは「ハンドル（ｈａｎｄｌｅ）」として６炭素または８炭素のメチレン基が便利である。抗原がアルブミンに容易に吸収されるか、またはフィルター膜表面材料よりアルブミンと容易に化学反応する場合、スペーサー分子はアルブミンなどのタンパク質でもよい。膜の外面は、通常、非対称型（時として、異方性型と呼ばれる）限外濾過膜の有効フィルター膜である内膜と比較して比較的孔の多い材料と考えられる。従って、例えば、膜の外側多孔側を、食塩水に溶解した１７％ヒトアルブミン溶液で処理してもよい。アルブミンは、膜構造の多孔区画（すなわち、膜の障壁層の下にある区画）内の表面を被覆し、その後、タンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ抗体）溶液をアルブミンに付着させることができる。（希釈グルタルアルデヒド溶液または他のこのような穏やかな架橋誘導剤を用いるように）タンパク質をある程度、架橋することが望ましいことが多い。これは、この物質を膜表面の適当な位置に固定するのに役立つ。
【００８９】
血液から病原因子を除去することができるカートリッジを作成するアプローチの１つは、血液病原因子に対して十分な透過性を有する繊維膜を備えた体外循環装置である。この血液病原因子は、膜を通って、繊維外空間に隔離された固定化可溶性抗体に移される。これは、ＰｒＰＳｃ抗体と、膜の濾過側を通過して、生体試料の残りに入ることのできないＰｒＰＳｃとの高分子量重合結合体の形成を伴う（すなわち、生体試料の残りに細胞が保持される）。
【００９０】
可溶性の固定化複合体形成剤を形成するために、免疫反応性複合体形成剤の分子量は、繊維の外側多孔性部分から、浄化されるべき血液に拡散しないサイズまで大きくすることができる。これは、複合体形成剤と高分子量水溶性物質（例えば、シリカゲルもしくはデキストラン）を化学反応させることによって、または免疫反応性複合体形成剤を重合することによって行うことができる。このような、高分子によって運ばれる抗体の使用は、物質移動および結合速度論に及ぼす分極効果の割合が大きくなるために、高率の抗原吸収に有利である。
【００９１】
または、膜は、機械的に、互いにほぼ同一であるが、化学的に、異なる材料でできている場合がある２枚の膜半分からなってもよい。この場合、生物学的物質と面しない膜半分だけがプリオン複合体形成剤に結合することができるのであれば十分である。例えば、膜半分は互いに隣接して設けられてもよく、ここで、ＰｒＰＳｃ複合体形成剤は、好ましくは、生物学的物質に面しない膜半分の孔内および両面に結合している。
【００９２】
複合体形成剤（例えば、ＮａＰＴＡまたは抗ＰｒＰＳｃ抗体）をまた、生物学的物質に面する表面が接触試薬を含まないように膜に固定化することもできる。これは、血球と試薬との接触を避け、それにより、発熱物質および／またはアナフィラキシー反応を避けるためである。従って、これは、膜の一方の面に（ならびに孔内に）プリオン複合体形成剤が固定化される非対称固定化の一形態である。膜の孔内に固定化する利点とは、巨視的表面と比較して有効微視的表面を何倍（＞１０００）にもすることができることである。複合体形成剤は生物学的物質に面しない膜部分に固定化されるので、生物学的物質はその物質と接触しない。従って、結果として、生物学的物質を後で別個に濾過する必要は全くない。
【００９３】
または、プリオン複合体形成剤は、膜裏側の不溶性マトリクスに結合されてもよい。処理過程はほぼ同じままであるが、必要な拡散距離が約１０倍長いので、膜を通る実流量（ｒｅａｌ ｆｌｏｗ）をいくらか多く設計する必要がありうる。
【００９４】
プリオン複合体形成剤が孔内に固定化されるかどうか、または膜裏側の不溶性マトリクスに固定化されるかどうかにかかわらず、固定化手順は、好ましくは、プリオンと複合体形成剤の複合体が結合および固定化されたままになるように行われる（すなわち、複合体は単離後に血液中に存在しない）。一般的に、共有結合が最良の固定化である。使用される共有結合の種類は、膜材料の選択および複合体形成剤の性質によって決まる。
【００９５】
プリオンが固定化された後、複合体形成剤および／または結合表面からプリオンを取り出すことができる。これは、（１）変性物理的条件（例えば、ｐＨ２もしくはｐＨ１２）；（２）カオトロピック塩（例えば、塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）もしくは尿素）；（３）タンパク質のαヘリックス高次構造を促進する溶媒（例えば、フッ素化アルコール）によって、またはこのような方法の組み合わせによって一番うまく行われる。または、プリオンは結合表面に固定化されたままにされ、ｒＰｒＰＳｃとＰｒＰＳｃを区別するためにマトリクスそれ自体の上でさらに処理することができる。
【００９６】
実施例
本発明は、本発明の特定の態様を参照して説明されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更が可能であり、等価物で置換できることが当業者に理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、１つまたは複数のプロセス段階を本発明の目的、精神、および範囲に合うように、多くの変更を加えることができる。全てのこのような変更は添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【００９７】
実施例Ｉ
プロテイナーゼＫ感受性ＰｒＰＳｃの同定
本発明のアッセイを用いて、隠された３Ｆ４エピトープを有するプロテイナーゼＫ感受性ＰｒＰＳｃ分子（ｓＰｒＰＳｃ）を、異なるプリオン株に感染したハムスターの脳ホモジネートにおいて同定した。タンパク質分解に対して感受性であるｓＰｒＰＳｃ画分をプロテイナーゼＫ限定消化に供し、シリアンハムスターにおいて継代された８つのプリオン株のそれぞれについて、この画分と全ＰｒＰＳｃからのプロテアーゼ耐性ＰｒＰ２７−３０画分を比較することによってｓＰｒＰＳｃを評価した。ｓＰｒＰＳｃの一定の割合は、疾患末期における個々の各プリオン株の独特のパラメータであった。ｓＰｒＰＳｃ画分を潜伏期間の関数としてプロットした時、優れた相関係数で直線的な関係が見られた。本発明者らは、ｓＰｒＰＳｃが、細胞プロテアーゼによって最も容易に除去されるＰｒＰＳｃ分子を示している可能性があると仮定した。ＰｒＰタンパク質の異なる高次構造的アイソフォームの特性を表１にまとめる。
【００９８】
【表１】プリオンタンパク質の高次構造的アイソフォーム
2004529314.tif 000002
【００９９】
実施例２
プリオン株の同定
本発明のアッセイは、ｓＰｒＰＳｃの定量によってプリオン株の分類を可能にする。まず最初に、異なる生物学的特性を有するプリオン株の対を区別するために、プロテアーゼ耐性ＰｒＰＳｃ断片（ＰｒＰ２７−３０）のサイズを用いた。ＰｒＰＣおよびＰｒＰＳｃは同じ共有結合構造を有するので、ＰｒＰＳｃ配座異性体のタンパク質分解に対する防御の差は、ＰｒＰＳｃの三次構造の変化を反映している可能性が高い。しかしながら、Ｄｙプリオン株に由来するＰｒＰＳｃのタンパク質分解に対する耐性の減少は、同様の潜伏期間を有する数種類のスクレイピー株がこのプロテアーゼ耐性減少を示さなかったので、長期の潜伏期間と相関しなかった。ほとんどのプリオン株は同様のタンパク質分解耐性を示したので、多くの異なる株に由来するＰｒＰＳｃの高次構造を厳密に調べるために、より感度の高い技法が開発された。
【０１００】
以下のハムスター適合スクレイピー分離株：Ｄｒｏｗｓｙ（Ｄｙ）、１３９Ｈ、Ｈｙｐｅｒ（Ｈｙ）、Ｍｅ７、ＭＴ−Ｃ５、およびＳｃ２３７の脳内注射によって、シリアンハムスターを感染させた。動物を疾患末期で安楽死させ、直ぐに脳を凍結し、−７０℃で保存した。脳を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＰｏｗｅｒＧｅｎホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に３×３０秒間押し付けることで氷上でホモジナイズした。得られた１０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを、卓上型遠心分離器で５００ｇで５分間、回転させた。上清を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した４％サルコシルと１：１で混合した。各試料を２つのアリコートに分けた：（ａ）未処理；および（ｂ）５０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ＰＫ）で２時間、３７℃で処理。
【０１０１】
反応物を０．５ｍＭ ＰＭＳＦならびにアプロチニンおよびロイペプチン（各２μｇ／ｍｌ）でブロッキングした後、各試料を２つのアリコートに再度分けた：（１）未処理（未変性と呼ぶ）；（２）最終濃度４ＭのＧｄｎＨＣｌと混合し、８０℃〜１００℃で５分間加熱（変性と呼ぶ）。両試料をＨ２Ｏで２０倍に希釈し、アリコートを、ＰＢＳに溶解した０．２％グルタルアルデヒドで１時間活性化されたポリスチレンプレートにロードした。５℃で一晩インキュベートしたプレートを、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および６％ソルビトール（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）でブロッキングした。次の段階で、プレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ｐＨ７．８）で３回洗浄し、ユーロピウム標識モノクローナル抗体３Ｆ４と２時間インキュベートした。ユーロピウム標識供給業者（Ｗａｌｌａｃ社、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）により供給された増強溶液でさらに７回の洗浄段階後にプレートを現像し、ＤＥＬＦＩＡ １２３４フルオロメーター（Ｗａｌｌａｃ社、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）でシグナルをカウントした。記載されたように（Ｓａｆｅｒ、Ｗｉｌｌｅら、１９９８）、ＰｒＰＳｃ含有量を計算した。
【０１０２】
アッセイにより明らかにされたように、各ハムスター適合プリオン株のＰｒＰＳｃは異なるタンパク質分解感受性を示す。データの点および棒は、各プリオン株に感染した３つの異なる脳から得られた平均±ＳＥＭを示す（図１）。この感受性の差は、各株の全ＰｒＰ濃度ならびにｒＰｒＰＳｃとｓＰｒＰＳｃ比が異なることも示している。
【０１０３】
実施例３
脳ホモジネートにおけるｓＰｒＰＳｃの早期検出
ｓＰｒＰＳｃを検出することができるこのアッセイはまた、Ｓｃ２３７プリオンが脳内に接種されたシリアンハムスターの脳におけるｓＰｒＰＳｃの早期検出にも有効であった。まず最初に、脳ホモジネートのプロテイナーゼＫ処理アリコートまたは未処理アリコートをリンタングステン酸ナトリウムで沈殿させ、実施例２に記載のように、プロテイナーゼＫ処理前後のペレット中のＰｒＰＳｃ濃度を求めた。
【０１０４】
Ｓｃ２３７プリオンが脳内に接種されたシリアンハムスターの脳におけるｓＰｒＰＳｃの蓄積は、ｒＰｒＰＳｃの蓄積より前に起こる。図２に示すように、早くも感染から２０日後にｓＰｒＰＳｃを検出することができたが、ｒＰｒＰＳｃ濃度はこの時点では非常に低かった。見たところ、ｓＰｒＰＳｃ画分はＳｃ２３７プリオン感染の症状を示す前の段階を通じてｒＰｒＰＳｃと共に蓄積し、全ＰｒＰＳｃのうちのｓＰｒＰＳｃの割合はほとんど変化しなかった。さらに、異なるプリオン株に感染したハムスターにおけるＣＤＩデータは、ｓＰｒＰＳｃ対ｒＰｒＰＳｃの割合がプリオン複製の一定かつ株特異的な量的特性であるという考えを裏付けている。データの点および棒は、Ｓｃ２３７プリオンに感染した３つの異なる脳からＣＤＩにより得られた平均±ＳＥＭを示す。
【０１０５】
全ＰｒＰＳｃの割合として表すと、ｓＰｒＰＳｃは、接種後２０日〜８０日の期間で全ＰｒＰＳｃの大幅な割合を占めて存在する（図３）。これらの結果は、脳内接種材料の大部分が恐らく主としてｒＰｒＰＳｃであり、接種後数日以内に急速に除去されることを証明している。データの点および棒は、Ｓｃ２３７プリオンに感染した３つの異なる脳から得られた平均±ＳＥＭを示す。
【０１０６】
実施例４
生物学的液体におけるｓＰｒＰＳｃの同定
本発明のアッセイはまた、プリオンに感染した白血球（ＷＢＣ）および血清に存在するＰｒＰＳｃがプロテイナーゼＫ感受性（ｓＰｒＰＳｃ）であることを示すのに用いられた。プロテイナーゼＫ（ＰＫ）処理前後にＣＤＩによって、年齢が一致している対照（ｃ）またはＳｃ２３７感染動物（Ｓｃ）からの個々の血液画分をアッセイした。
【０１０７】
正常（ｃ）またはＳｃ２３７プリオン感染シリアンハムスター（Ｓｃ）から得られた全血を３．８％（ｗ／ｖ）緩衝化クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）と混合し（１：９）、血漿を得るために１１００ｒｐｍで回転させた。次いで、細胞要素を、パーコール勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって異なる画分に分離した。血清を得るために、正常（ｃ）またはスクレイピー感染シリアンハムスター（Ｓｃ）から得られたシリアンハムスター血液をホウケイ酸ガラス管の中で凝固させた。血清を、５００ｇでの遠心分離によって血餅から分離した。２％サルコシルを添加した後、それぞれの血液画分を２つのアリコートに分けた：（ａ）未処理；および（ｂ）２５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ＰＫ）で３７℃で１時間処理。０．３％〜１．２％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸ナトリウムおよび３５ｍＭ〜５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加した後、全試料を３７℃で一晩インキュベートし、１４，０００ｇで回転させた。ペレットを再懸濁し、実施例２に記載のように未変性アリコートおよび変性アリコートに分けた。まず最初に、各アリコートを、Ｒ１抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートし、ユーロピウム標識３Ｆ４モノクローナル抗体を用いて現像した。７回の洗浄段階の後、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｐａｃｋａｒｄ社）時間分解蛍光分光法を用いて、シグナルを評価した。
【０１０８】
各試料の変性（ＴＲＦＤ）アリコートおよび未変性（ＴＲＦＮ）アリコートからのシグナルの比として、結果を表した（図４）。血漿および血小板では、ｓＰｒＰＳｃはｒＰｒＰＳｃとほぼ同じ濃度で存在するのに対して、白血球および血清では、ｓＰｒＰＳｃはＰｒＰＳｃの最も優勢な画分であり、その濃度は血漿または血小板において見られる濃度より非常に高かった。２より大きなＣＤＩ比の値は、ＰｒＰＳｃが検出可能に存在することを示している。
【０１０９】
本発明は、本発明の特定の態様を参照して説明されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更が可能であり、等価物で置換できることが当業者に理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、１つまたは複数のプロセス段階を本発明の目的、精神、および範囲に合うように、多くの変更を加えることができる。全てのこのような変更は添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】プロテイナーゼＫ（ＰＫ）感受性ＰｒＰＳｃ配座異性体の定量によるプリオン株の分類を示すグラフである。
【図２】Ｓｃ２３７プリオンが脳内接種されたシリアンハムスター脳中のｓＰｒＰＳｃの検出を示すグラフである。
【図３】Ｓｃ２３７プリオンが脳内接種されたシリアンハムスター脳中のｓＰｒＰＳｃ蓄積がｒＰｒＰＳｃ蓄積より前に起こることを示すグラフである。
【図４】Ｓｃ２３７プリオン感染シリアンハムスターの血清およびＷＢＣにおけるｓＰｒＰＳｃの検出を示すグラフである。
【図１】
2004529314.tif 000004
【図２】
2004529314.tif 000005
【図３】
2004529314.tif 000006
【図４】
2004529314.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004529314.tif 000008
2004529314.tif 000009
2004529314.tif 000010
2004529314.tif 000011
2004529314.tif 000012
2004529314.tif 000013
2004529314.tif 000014
2004529314.tif 000015
2004529314.tif 000016
2004529314.tif 000017
2004529314.tif 000018
2004529314.tif 000019
2004529314.tif 000020
2004529314.tif 000021
2004529314.tif 000022
2004529314.tif 000023
2004529314.tif 000024
2004529314.tif 000025
2004529314.tif 000026
2004529314.tif 000027
2004529314.tif 000028
2004529314.tif 000029
2004529314.tif 000030
2004529314.tif 000031
2004529314.tif 000032
2004529314.tif 000033
2004529314.tif 000034
2004529314.tif 000035
2004529314.tif 000036
2004529314.tif 000037
2004529314.tif 000038
2004529314.tif 000039
2004529314.tif 000040
2004529314.tif 000041
2004529314.tif 000042
2004529314.tif 000043
2004529314.tif 000044
2004529314.tif 000045
2004529314.tif 000046
2004529314.tif 000047
2004529314.tif 000048
2004529314.tif 000049
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529314.tif 000050
【国際調査報告】
2004529314.tif 000051
2004529314.tif 000052
2004529314.tif 000053