(57)【要約】ここに癌又は他の疾患の診断及び治療のために使用されることのできる方法及び組成物が記載される。また、ここにケモカイン受容体の調節剤を同定するために使用されることのできる方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において癌細胞を検出する方法であって、上記患者からの生物学的サンプルをケモカイン受容体ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
請求項1に記載の上記方法であって、上記ケモカイン受容体がCXCR4であり、上記生物学的サンプルが卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、頭部及び頚部癌の細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、結腸直腸癌細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、又は頚部癌細胞の検出のために設計される、前記方法。
【請求項３】
上記ケモカイン受容体がCCR2であり、上記生物学的サンプルがグリア芽細胞腫癌細胞の検出のために設計される、請求項1に記載の上記方法。
【請求項４】
上記ケモカイン受容体がCCR1であり、上記生物学的細胞がグリア芽細胞腫癌細胞、又は膵臓癌細胞の検出のために設計される、請求項1に記載の上記方法。
【請求項５】
上記ケモカイン受容体がCCR4であり、上記生物学的サンプルが卵巣癌細胞、頭部及び頚部の癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、グリア芽細胞腫癌細胞、又は結腸直腸癌細胞の検出のために設計される、請求項1に記載の上記方法。
【請求項６】
上記ケモカイン受容体がCCR5であり、上記生物学的細胞が前立腺癌細胞、頭部及び頚部の癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、結腸直腸癌細胞、膵臓癌細胞、又は卵巣癌細胞の検出のために設計される、請求項1に記載の上記方法。
【請求項７】
上記ケモカイン受容体がCCR7であり、上記生物学的細胞が腎臓癌細胞、膵臓癌細胞、又は胃癌細胞の検出のために設計される、請求項1に記載の上記方法。
【請求項８】
上記ケモカイン受容体がCCR8であり、上記生物学的細胞がグリア芽細胞腫癌細胞又は前立腺癌細胞の検出のために設計される、請求項1に記載の上記方法。
【請求項９】
上記ケモカイン受容体がCX3CR1であり、上記生物学的細胞がグリア芽細胞腫癌細胞又は膵臓癌細胞の検出のために設計される、請求項1に記載の上記方法。
【請求項１０】
上記ケモカイン受容体がCXCR3であり、上記生物学的細胞がグリア芽細胞腫癌細胞の検出のために設計される、請求項1に記載の上記方法。
【請求項１１】
上記ケモカイン受容体がCXCR6であり、上記生物学的細胞が肺癌細胞、膀胱癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、又は結腸直腸癌細胞である、請求項1に記載の上記方法。
【請求項１２】
上記患者が癌を治療するために治療的措置を行っている、請求項1に記載の上記方法。
【請求項１３】
上記患者が癌の可能性のある、請求項1に記載の上記方法。
【請求項１４】
患者からの生物学的サンプルにおいて癌細胞を検出する方法であって、上記生物学的サンプルを抗ーケモカイン受容体抗体又はケモカインと接触させることを含む、前記方法。
【請求項１５】
上記ケモカイン受容体がCXCR4であり、上記生物学的サンプルが卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、頭部及び頚部の癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、結腸直腸癌細胞、急性リンパ芽球性白血病細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、又は頚部癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項１６】
上記ケモカイン受容体がCCR2であり、上記生物学的サンプルがグリア芽細胞腫癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項１７】
上記ケモカイン受容体がCCR1であり、上記生物学的サンプルがグリア芽細胞腫癌細胞、又は膵臓癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項１８】
上記ケモカイン受容体がCCR4であり、上記生物学的サンプルが卵巣癌細胞、頭部及び頚部の癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、グリア芽細胞腫癌細胞、又は結腸直腸癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項１９】
上記ケモカイン受容体がCCR5であり、上記生物学的サンプルが前立腺癌細胞、頭部及び頚部の癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、又は卵巣癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項２０】
上記ケモカイン受容体がCCR７であり、上記生物学的サンプルが腎臓癌細胞、膵臓癌細胞、又は胃癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項２１】
上記ケモカイン受容体がCCR8であり、上記生物学的サンプルがグリア芽細胞腫癌細胞、又は前立腺癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項２２】
上記ケモカイン受容体がCX3CR1であり、上記生物学的サンプルがグリア芽細胞腫癌細胞又は膵臓癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項２３】
上記ケモカイン受容体がCXCR3であり、上記生物学的サンプルがグリア芽細胞腫癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項２４】
上記ケモカイン受容体がCXCR6であり、上記生物学的サンプルが肺癌細胞、膀胱癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、又は結腸直腸癌細胞の検出のために設計される、請求項14に記載の上記方法。
【請求項２５】
上記患者が癌の治療のために治療的措置を行っている、請求項14に記載の上記方法。
【請求項２６】
上記患者が癌を有する可能性のある、請求項14に記載の上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌及び他の疾患に関連したケモカイン受容体の同定に関する。本発明はまた、疾患の診断及び治療におけるケモカイン受容体のアゴニスト及びアンタゴニストの使用を提供する。本発明はさらに、ケモカイン受容体と関連した疾患を抑制する作用物質及び／又は標的の同定及び使用のための方法に関する。
【０００２】
関連する出願への相互参照
本出願は、それぞれが参考文献として本明細書中に援用されている、以下の：2001年10月23日に出願された、米国特許出願第60/336,849号；2001年3月16日に出願された、米国特許出願第60/276,797号；2001年2月28日に出願された、米国特許出願第60/272,330号；に関連する。
【背景技術】
【０００３】
ケモカインは、白血球の遊走及び活性化を誘導する低分子量サイトカインのファミリーを構成する（Baggiolini M., et al. Annu. Rev. Immunol. 15: 675-705(1997)を参照のこと）。30を超えるヒトケモカインが記載された。それらは、異なる白血球タイプ（好中球、単球、好酸球、好塩基球、リンパ球、樹状細胞等）に対する特異性、及びケモカインが合成される細胞及び組織のタイプにおいて多様である。これらの分子は、白血球の経内皮の遊走に加わることに加えて、T細胞活性化のための情報伝達カスケードの同時刺激を誘導する７の膜貫通のＧタンパク結合受容体のリガンドである（Oppenheim et al. Ann. Rev. Immunol. 9:617-648(1991),Premback et al. Nat. Med. 2:1174-1178(1996) ）。
【０００４】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、及びCXCR4を含む、12を超える異なるヒトケモカイン受容体が知られている。上記ケモカインは、CC及びCXCと呼ばれる２の主要なサブファミリーに分割される。CC及びCXCケモカインは、システイン−システイン又はシステイン−X−システイン、ここでXは典型的には別のL−アミノ酸である、のいずれかで始まるN末端アミノ酸配列において相互に相違する。ケモカイン受容体の他のクラスは、CX3CR1に代表される。これらの受容体はシステイン−X3−システインモチーフを有する。上記ファミリーはまた、それらの受容体へのそれらの結合様式においても異なる。例えば、CCケモカインはCC受容体に結合し、CXC受容体に結合しない、そして、逆もまた同様である。
【０００５】
ケモカインのその受容体への結合は、典型的には走化作用のような細胞の生物学的応答がそれに続く、細胞質のカルシウム濃度の一過性の上昇のような細胞内シグナル応答を誘導する。異なるケモカインは、造血細胞によって発現される特異的な7−膜貫通受容体を活性化することにより、造血細胞の異なる集団の輸送を制御する。
【０００６】
いくつかのケモカイン受容体はまた、細胞内へのウィルスの侵入を容易にするためにそれらがHIV及び細胞のCD4受容体と相互作用するように、HIVの補助受容体として働く。特別には、他の多くのケモカイン及びオーファン受容体もまたHIV-1の潜在的な受容体として同定されているにもかかわらず、CXCR4及びCCR5は主要な補助受容体であることが見出された。これらの受容体のアンタゴニストに基づいた治療的アプローチが開発され、そのうちのいくつかは最近治験中である（Murakami and Yamamoto Int J Hemotol 72:412-7(2000)を参照のこと）。加えて、CXCR4の発現は骨肉腫及び膵臓癌と関連していた（Paoletti et al. Int J Oncol; 18:11-6(2001)及びKoshiba et al. Clin Cancer Res. 6:3530-5(2000)を参照のこと）。
【０００７】
他のケモカイン受容体−リガンドの対形成が報告されており、持続的に完全なものに近づいている。Zlotnik and Yoshie "Chemokines: a new classification system and their role in immunity "Immunity 12:121-27(2000)を参照のこと。
【０００８】
本分野における進歩にもかかわらず、癌及び他の疾患の診断及び治療において有用な新しい標的分子の同定は継続的に必要とされている。本発明は、これらの要求に取り組むものである。
【０００９】
発明の要約
本発明は、患者における癌のような異常増殖性の疾患の検出方法を提供する。上記方法は、患者からの生物学的サンプルを、本発明のケモカイン受容体ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させることを含む。替わりに、上記方法は、上記患者からの生物学的サンプルを、本発明のケモカイン受容体に特異的に結合する抗体と接触させることを含むことができる。本発明の上記方法は、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、頭部及び頚部の癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、結腸直腸癌細胞、急性リンパ球性白血病細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、又は頚部癌細胞の検出のためのCXCR4の検出に使用され得る。上記方法は、グリア芽細胞腫細胞の検出のためのCCR2の検出に使用され得る。上記方法は、グリア芽細胞腫細胞及び膵臓癌細胞の検出のためのCCR1の検出に使用され得る。上記方法は、卵巣癌細胞、頭部及び頚部の癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、又は結腸直腸癌細胞の検出のためのCCR4の検出に使用され得る。上記方法は、前立腺癌細胞、頭部及び頚部の癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、子宮癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、及び卵巣癌細胞の検出のためのCCR5の検出に使用され得る。上記方法は、腎臓癌細胞、膵臓癌細胞、及び胃癌細胞の検出のためのCCR7の検出に使用され得る。上記方法は、前立腺癌細胞の検出のためのCCR8の検出に使用され得る。上記方法はグリア芽細胞腫細胞及び膵臓癌細胞の検出のためのCX3CR1の検出に使用され得る。上記方法は、CXCR6の検出に使用されることができ、そして上記生物学的サンプルは肺癌細胞、膀胱癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、及び結腸直腸癌細胞の検出のために設計される。
【００１０】
上記方法は、癌を治療するために治療的措置を行っている患者をモニターするのに使用されることができる。替わりに、上記方法は、癌を有する可能性のある患者において疾患を検出するのに使用されることができる。
【００１１】
本発明の上記方法はまた、他の異常増殖性の疾患に対して使用され得る。例えば、上記方法は、良性の前立腺肥大（BPH）と関連する細胞のような良性腫瘍及び／又は前癌性細胞の検出に使用され得る。これらの方法において、CCR5及びCCR8の検出は特に有用である。替わりに、上記方法は、血管新生又は関節リューマチと関連したもののような他の細胞タイプの検出に使用され得る。CXCR4の検出は特にこれらの目的に有用である。
【００１２】
発明の詳細な説明
上で概説された対象に従って、本発明は、転移性の癌、良性腫瘍、前癌性細胞、並びに関節リューマチ及び血管新生を含む癌のような疾患の診断及び治療のための方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的に一定の癌におけるケモカイン受容体の増加した発現の同定に基づく。特別には、卵巣癌、膀胱癌、結腸直腸癌、肺癌、頭部及び頚部癌、腎臓癌、胃癌、子宮癌、急性リンパ球性白血病、及び頚部癌におけるCXCR4；、頭部及び頚部癌、腎臓癌、胃癌、子宮癌、結腸直腸癌、及び卵巣癌におけるCCR4；グリア芽細胞腫におけるCCR1および／又はCCR2;前立腺癌、頭部及び頚部癌、腎臓癌、胃癌、子宮癌、大腸癌、及び卵巣癌におけるCCR5；腎臓癌及び胃癌におけるCCR7；前立腺癌におけるCCR8；そして肺癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌及び結腸直腸癌におけるCXCR6である。CXCR4の増加した発現は関節リューマチ及び血管新生においてもまた、確認された。この進捗に基づいて、本発明はこれらの疾患の診断及び治療のための新しい方法及び組成物、並びに癌及び他の疾患を緩和する組成物のスクリーニング方法を提供する。癌におけるケモカイン受容体の重要性は、ケモカイン受容体及び腫瘍細胞自体の輸送の機能により、転移性の細胞が特別な部位に向かう輸送干渉という構成要素、及び生存度と新しい部位で成長するための能力を増大するために転移部位において共存する必要のある伴細胞という構成要素の両方を含むことができる。これらの”付属の”細胞は、転移過程における決定的な成長ステージ中の環境において転移性の細胞がコロニーを形成し、生存することを可能とする決定的な機能を提供するのに働くことができる。
【００１３】
CXCR4に対する自然のリガンドは間質細胞由来の因子（SDF1）である。SDF1アルファ及び１ベータはインタークライン（intercrine）CXCサブファミリーに属する小さなケモカインである。SDF1アルファ及びSDF1ベータをコードするヒトDNA配列が単離され、特徴づけられた。上記SDF1アルファ及びSDF1ベータ遺伝子は、それぞれ89及び93アミノ酸のタンパクをコードする（Shirozu et al., Genomics 28:495-500(1995),Genbankカタログ番号L36033及びL36034も参照のこと）。したがって、これらのタンパクからの配列はまた、細胞中のCXCR4活性を調節するのに使用され得る。
【００１４】
Ter-1（UniGene hs.113222、及びGenBankカタログ番号D49919、U45983、U62556、Z79782、Y08456、及びNM 005201）とも呼ばれるCCR8の自然のリガンドは、I-309（UniGene hs.72918、及びGenBankカタログ番号NM 002981、NP 002972、M57506）及びCCL1（GenBankカタログ番号M57506及びM57502）を含む。
【００１５】
STRL33及びBonzo(UniGene hs. 34526及びGenBankカタログ番号U73531、U73529、AF007545)とも呼ばれるCXCR6の自然のリガンドは、CXCL6(GenBankカタログ番号 NM022059)を含む。
【００１６】
CCR5(UniGene hs.54443、及びGenbankカタログ番号AF031237、XM0303397、NM000579)の自然のリガンドは、RANTES、CCL5(AF043341)；MIP-1アルファ、LD78アルファ、CCL3(M23452)、及びMIP-1ベータ、CCL4(M23502)を含む。
【００１７】
CCR4(UniGene hs.184926、及びGenBankカタログ番号X85740、NM 005508、AB023888、AB023889、AB023890、AB023891、AB023892)の自然のリガンドは、MDC(UniGene hs.97203、及びGenBankカタログ番号NM 002990、NP 002981)及びTARC(UniGene hs.66742、及びGenBankカタログ番号D43767、NM 002987、NP 002978)である。
【００１８】
CCR1(UG hs.301921及びGenBankカタログ番号L10918、D10925、L09230、NM 001295)の自然のリガンドは、RANTES、MIP-1a、MCP-1(UniGene hs.303649、及びGenBankカタログ番号NM 002982、NP 002973)である。
【００１９】
CCR2(UniGene hs.302043、及びGenBankカタログ番号AF014958、U97123、AF015524、AJ344142、AF015525、NM 003965、NM000647)の自然のリガンドは、MCP-1,MCP-3(UniGene hs.251526、及びGenBankカタログ番号NM 006277、NP 006264、X72309)及びMCP-4(UniGene hs.11383、及びGenBankカタログ番号NM 005408、NP 005399、U59808)である。
【００２０】
CCR7(UniGene hs.1652、及びGenBankカタログ番号L08176、L31581、NM 001838及びXM049959)の自然のリガンドはEBI1リガンドである、ELCである。
【００２１】
CX3CR1(UniGene hs.198252、及びGenBankカタログ番号U20350、U28934、NM 001337、XM 047502)の自然のリガンドは、フラクタルカイン(UniGene hs.80420、及びGenBankカタログ番号NM 002996、NP 2987)である。
【００２２】
CXCR3(UniGene hs.198252、及びGenbBankカタログ番号NM 001504、NP 001495、U32674、Z79783)の自然のリガンドは、I-TAC(UniGene hs.103982、及びGenBankカタログ番号NM 005409、 NP 005400、AF30514、U66096、Y15220),IP-10(UniGene hs.2248、及びGenBankカタログ番号NM 001565、NP 001556、X02530)及びMIG(UniGene hs.77367、及びGenBankカタログ番号NM 002416、NP 002407、X72755)である。
【００２３】
本明細書中のすべてのUniGeneクラスター識別番号（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene/)及びカタログ番号は、GenBank配列データベースのためのものでありカタログ番号の配列は、特別に参考文献として本明細書中に援用されている。GenBankは、当業者に知られており、例えば、Benson, DA, et al., Nucleic Acids Research 26:1-7(1998)及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照のこと。配列はまた、他のデータベース、例えば、European Molecular Biology Laboratory(EMBL)及びDNA Database of Japan(DDBJ)において入手可能である。
【００２４】
表１は、ケモカイン受容体、その受容体の発現に関連した表示、及び上記受容体の自然のリガンドの一覧表を表す。Zlotnik and Yoshie Immunity 12:121-27(2000)を参照のこと。
【００２５】
【表１】
2004535157.tif 000002
【００２６】
定義
”CXCR4ポリヌクレオチド”及び”CXCR4ポリペプチド”という用語は、以下の：（１）Unigene hs.89414、及びGenBankカタログ番号AF025375、L08176、L31581、NM 001838に対して約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％より高いヌクレオチド配列の同一性、或いは好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000、又はこれを超えるヌクレオチドの領域にわたるヌクレオチドの同一性を有する、（2）例えば、これらのカタログに示されたアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生されたポリクローナル抗体である、抗体に結合する、（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、これらのカタログ中の配列の核酸配列、又はそれらの相補的な配列に特異的にハイブリダイズする；又は（４）上で示されたアミノ酸配列に対して、約60％、65％、70％、75％、85％、90％、好ましくは、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、若しくは99％、又はそれを超えるアミノ酸配列の同一性、或いは好ましくは少なくとも約25、50、100、200、350、又はより大きなアミノ酸の領域にわたるアミノ酸配列の同一性を有する、核酸及びポリペプチドの多型性の変異形、対立遺伝子、突然変異体、並びに種間相同体を指す。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、典型的には、霊長類、例えばヒト；げっ歯類、例えばラット、マウス、ハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、又は他の哺乳類を含む哺乳類に由来するものであるが、それらに限定されない。”CXCR4ポリペプチド”及び”CXCR4ポリヌクレオチド”は、自然発生的又は、組換えのいずれかである。上記用語法は、他の受容体及びそれらの配列、例えば、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、CX3CR1、及びCXCR6に関して同様に使用される。例えば、上に示されたGenBankカタログを参照のこと。
【００２７】
”完全な長さの”ケモカイン受容体タンパク又は核酸は、１又はそれを超える自然発生的な、野生型の受容体ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に通常含まれるすべての要素を含む、受容体ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、或いはそれらの変異形を意味する。上記”完全な長さ”は、オルタナティブ・スプライシングを含む、翻訳後プロセシング又はスプライシングの多様なステージの前、又は後であることができる。
【００２８】
本明細書中で使用される”生物学的サンプル”は、例えばケモカイン受容体タンパク、ポリヌクレオチド、又は転写物の核酸又はポリペプチドを含む生物学的組織又は体液のサンプルである。そのようなサンプルは、霊長類、例えば人類、又はげっ歯類、例えばマウス、及びラット、から単離された組織を含むが、それらに限定されない。生物学的サンプルはまた、生検及び剖検のサンプルのような組織の切片、及び血液、血漿、血清、唾液、大便、涙、粘液、毛、皮膚、などのような組織学的な目的で採取される凍結された切片を含むことができる。生物学的サンプルはまた、患者の組織に由来する移植片及び初代及び／又は形質転換された培養細胞も含む。生物学的サンプルは、典型的には、真核生物、最も好ましくは霊長類、例えば、チンパンジー又はヒト；ウシ；イヌ；ネコ；げっ歯類、例えばモルモット、ラット、マウス；ウサギのような哺乳類；又は鳥類；爬虫類；或いは魚類から得られる。本発明においては、上記生物学的サンプルは、典型的には卵巣の、肺の、結腸直腸の、頭部及び頚部の、腎臓の、胃の、子宮の、血液細胞の、脳の、前立腺の、又は乳房の組織サンプルであるが、他の体液又はサンプルもまた、それらの組織の１における癌の診断に役立つ。
【００２９】
サンプルが上記標的器官から採取された場合、上記サンプルは、特別な癌細胞”の検出のために設計”される（例えば、肺癌細胞の検出のための肺のサンプル）。加えて、上記サンプルは、上記原発腫瘍からの転移性の細胞を含む可能性のある器官又は組織から採取されることができる。そのような２次的部位は、リンパ節又は転移を含む可能性のある他の組織を含むことができる。当業者は、上記２次的部位が、最も通常的にはいずれかの特別な癌への転移と関連していることを理解するだろう。
【００３０】
”生物学的サンプルの提供”は、本発明中に記載された方法において使用するための生物学的サンプルを得ることを意味する。最も頻繁には、これは細胞のサンプルを動物から取り出すことにより行われるが、先に単離された細胞（別の人によって、別の時に、及び／又は別の目的のために単離された）を使用すること、又は本発明をin vivo で実施することによっても達成され得る。治療又は結果の履歴のある記録的な組織は、部分的に有用であるだろう。
【００３１】
２又はそれを超える核酸又はポリペプチド配列の関係において”同一の”又は”同一性”パーセントという用語は同一又は以下に記載される規定値パラメーターでのBLAST 又は BLAST2.0配列比較アルゴリズムを用いて測定されたものと同一の、又はこれと同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドを特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウィンドウ又は選択された領域に対する最大の一致を得るために比較され、そして整列化された場合、特定の領域に対して約60％、好ましくは70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又はより高い同一性）で有する２又はそれを超える配列又は部分配列を指す。そのような配列はその後”実質的に同一”と称される。この定義はまた、テスト配列の相補的配列を意味し、又はこれに適用される。上記定義はまた、置換されたものと同様に欠失及び／又は付加を有する配列を含む。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムはギャップ等を説明することができる。好ましくは、少なくとも約25のアミノ酸又はヌクレオチドの長さの領域、又はより好ましくは50-100のアミノ酸又はヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在する。
【００３２】
配列比較のために、典型的には１の配列が、テスト配列がそれに対して比較される対照配列をつとめる。配列比較アルゴリズムを用いた場合、テスト及び対照配列はコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列の組み合わせが設計され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが選定される。好ましくは、規定値プログラムパラメーターが使用可能、又は替わりのパラメーターが選択可能である。上記配列比較アルゴリズムはその後、上記プログラムパラメーターに基づいて対照配列に比較したテスト配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００３３】
本明細書中で使用される”比較ウインドウ”は、20〜600、普通は約50〜約200、より普通には約100〜約150からなる群から選ばれた近接する位置の数のいずれか１の区域を示し、そこにおいてある配列が近接する位置にある同数の対照配列に対して、上記2の配列が最適に整列化された後に、比較されるものである。比較のための配列の整列化の方法は、本分野において周知である。比較のための配列の最適な整列化は、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981),の局所的ホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)のホモロジー整列化アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)の類似性の研究方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTAin the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,Madison, WI)によって、又はマニュアル整列化及び可視的検査によって行われ得る（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausbel et al., eds. 1995 補遺)を参照のこと）。
【００３４】
配列の同一性及び配列の類似性のパーセントを決定するために好適なアルゴリズムの好ましい例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402(1997)及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)中に記載されているBLAST及びBLAST2.0である。BLAST及びBLAST2.0は、本明細書中に記載されたパラメーターとともに、本発明の核酸及びタンパクの配列の同一性のパーセントを決定するために使用される。BLAST分析を実施するためのソフトウエアは、National Cancer for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとともに整列化した場合にいずれかの陽性の値の閾値スコアTに一致又は条件を満たす、問題の配列中のWという長さの短いワードを同定することにより最初に高スコアの配列対（high scoring pairs(HSPs))を同定することを含む。Tは、近接したワードスコアの閾値を意味する（Altschul et al., supra)。これらの最初の近接したワードヒットは、それらを含むより長いHSPsを見出すための探索を開始するためのもとになる。上記ワードヒットは、累積的な整列スコアが増加するかぎり、各配列に沿って両方向に拡張される。累積的なスコアは、核酸配列のためにはパラメーターＭ（一致した残基対への報酬スコア；常に１より大きい）とＮ（一致しない残基へのペナルティースコア；常に１未満）を用いて計算される。アミノ酸配列のためには、累積的なスコアを計算するためにスコアリング用の行列が使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は以下の：上記累積的な整列スコアがその最高到達値からＸという量だけ低下した；上記累積的な整列スコアが、１又はそれを超える陰性のスコアの残基の整列の蓄積によって、ゼロまたはそれ未満まで低下する、又は、いずれかの配列の終点に到達した、場合に停止する。上記BLASTアルゴリズムパラメーターW，T，及びXは、上記整列の感度及び速さを決定する。BLASTNプログラム（核酸配列のための）は、11というワード長（W)、10という期待値(E), M=5、N=-4及び両鎖の比較を規定値として使用する。アミノ酸配列のためには、上記BLASTPプログラムは規定値として3というワード長(W)、10という期待値(E)、そして、上記のスコアリング用の行列BLOSUM62（Henikoff & Henikoff, Proc. Natul. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)を参照のこと）は、50という整列(B)、10という期待値(E)、M=5、N=-4及び両鎖の比較を使用する。
【００３５】
上記BLASTアルゴリズムはまた、２の配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin & Altshul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993)を参照のこと）。上記BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の１の測定値は、最小の合計確率（P(N)）であり、これは、２のヌクレオチド又はアミノ酸配列の一致が偶然に起こる確率を示す。例えば、テストされる核酸の対照の核酸に対する比較における最小の合計確率が約0.2より小さい、より好ましくは約0.01より小さい、そして最も好ましくは約0.001より小さい場合に上記核酸は対照配列に類似すると考えられる。
【００３６】
２の核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという表示は、以下に記載されるように、最初の核酸が第２の核酸によってコードされたポリペプチドに対して産生された抗体と交差反応性を有することである。したがって、典型的には、ポリペプチドは、それと第２のポリペプチドとが保存的な置換のみにおいて相違する場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２の核酸配列が実質的に同一であるとの他の表示は、以下に記載されるように、上記２の分子又はそれらに相補的なものがストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズすることである。２の核酸配列が実質的に同一である、とのなお別の表示は、上記配列を増幅するために同一のプライマーが使用され得ることである。
【００３７】
”宿主細胞”は、発現ベクターを含み、上記発現ベクターの複製及び発現を支持する自然発生的な細胞又は形質転換された細胞である。宿主細胞は、培養細胞、移植片、in vivoの細胞等であることができる。宿主細胞は、E. coliのような原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類のような真核細胞、或いは、CHO、HeLaなどのような哺乳動物の細胞であることができる（例えば、The American Type Culture Collection catalog 又は web site, www.atcc.orgを参照のこと）。
【００３８】
”単離された”、”精製された”又は”生物学的に純粋”という用語は、通常はその自然の状態でそれに付随することが見出された成分から実質的又は本質的に遊離した物質を意味する。純度及び均一性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような分析化学の技術を用いて決定される。調製物中に存在する卓越種であるタンパク又は核酸は、実質的に精製される。特別には、単離された核酸は、上記遺伝子に隣接し上記遺伝子によってコードされたタンパク以外のタンパクをコードする、オープンリーディングフレームから分離される。いくつかの実施態様における”精製された”という用語は、核酸又はタンパクが電気泳動ゲル中で本質的に1のバンドを生じさせることを表す。好ましくは、それは上記核酸又はタンパクが少なくとも85％純粋であること、より好ましくは、少なくとも95％純粋であること、そして最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。他の実施態様における”精製する”又は”精製”は、精製されるために上記組成物から少なくとも１の不純物を除去することを意味する。この意味で、精製は、上記精製された化合物が100％純粋であることを必要としない。
【００３９】
”ポリペプチド”、”ペプチド”及び”タンパク”という用語は、本明細書においてアミノ酸残基のポリマーを示すように交換可能に使用される。上記用語は、自然発生的なアミノ酸ポリマー及び非自然発生的なアミノ酸ポリマーと同様に、１またはそれを超えるアミノ酸残基が、対応する自然発生的なアミノ酸残基の合成の化学的擬態であるアミノ酸コポリマーに適用される。
【００４０】
”アミノ酸”という用語は、自然発生的な及び合成のアミノ酸、並びにアミノ酸アナログ及び自然発生的なアミノ酸に類似した方法で機能するアミノ酸の擬態を指す。後に修飾を受けるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γーカルボキシグルタメート、及びO−ホスホセリン、と同様に自然発生的なアミノ酸は遺伝暗号でコードされるアミノ酸である。アミノ酸アナログは、自然発生的なアミノ酸、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基と同じ基礎的な化学構造を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、に結合するアルファ炭素を指す。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）、又は修飾されたペプチドの主鎖を有するが、しかし、自然発生的なアミノ酸と同一の基礎的な化学構造を保持する。アミノ酸の擬態は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生的なアミノ酸に類似した方法で機能する化学的物質を指す。
【００４１】
本明細書中で、アミノ酸はそれらの通常知られた３文字のシンボル又はIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される１文字のシンボルによって表されることができる。同様にヌクレオチドはそれらの通常認められた１文字の暗号によって表されることができる。
【００４２】
”保存的に修飾された変異形”はアミノ酸及び核酸の配列の両方に適用される。特別な核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異形は同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、或いは上記核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、基本的に同一の配列を表す。遺伝的暗号の縮退によって、多くの機能的に同一の核酸がいずれかの所定のタンパクをコードする。例えば、GCA、GCC、GCG又はGCUのコドンはすべてアミノ酸、アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが特定される各位置では上記の対応するコドンのいずれかによって、上記コドンはコードされるペプチドを変更することなく変更されることができる。そのような核酸の変異形は、保存的に修飾された変異形の１の種である”サイレント変異形”である。本明細書中のポリペプチドをコードする各核酸はまた、上記核酸の可能性のある各サイレント変異形をも表す。当業者は、核酸の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUG、及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く）は機能的に同一の分子を得るように修飾され得ることを理解するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異形は、発現産物については記載された各配列に含まれるが、しかし、実際のプローブ配列に関してはそうではない。
【００４３】
アミノ酸配列については、コードされた配列中の単一のアミノ酸、又はアミノ酸の小パーセンテージを変更、付加、又は除去する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク配列への各置換、欠失、又は付加が”保存的に修飾された変異形”であり、上記変更がアミノ酸の化学的に類似するアミノ酸による置換という結果になることを当業者は理解するだろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的な置換の表は、本分野において周知である。そのような保存的に修飾された変異形は本発明の多型性の変異形、種間相同体、及び対立遺伝子にさらに加えられるものであり、これらを排除するものではない。
【００４４】
以下の８の群：１）アラニン(A)、グリシン(G)；２）アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；３）アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；４）アルギニン(R)、リジン(K)；５）イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；６）フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；７）セリン(S)、トレオニン(T)；及び８）システイン(C)、メチオニン(M)はそれぞれお互いに保存的な代替物であるアミノ酸を含む（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照のこと）。
【００４５】
組織化の多様なレベルによってポリペプチド構造のような高分子構造が記述されうる。この組織化の一般的な検討については、例えば、Alberts et al., Molecular Biology of the Cell(3rd ed., 1994)及びCantor & Schimmel, Biophysical Chemistry Part I:The Conformation of Biological Macromolecules(1980)を参照のこと。”１次構造”は、特定のペプチドのアミノ酸配列を表す。”２次構造”は、局所的に規定されたポリペプチド内の３次元構造を指す。これらの構造はドメインとして通常知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトなユニットを形成するポリペプチドの部分であり、典型的には、25〜約500アミノ酸の長さである。典型的なドメインはβシート及びαーへリックスの広がりのような、より組織化されない部分から作られる。”３次構造”は、ポリペプチドモノマーの完全な３次元構造を指す。”４次構造”は、通常は独立した３次元ユニットの非共有結合による会合により形成される３次元構造を指す。異方性の項はまた、エネルギー項として知られている。
【００４６】
本明細書中で使用される”核酸”若しくは”オリゴヌクレオチド”又は”ポリヌクレオチド”或いは、文法的な同義語は、共有結合で共に連結された少なくとも２のヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には約5、6、7、8、9、10、12、15、15、25、30、40、50又はそれを超えるヌクレオチドの長さから約100ヌクレオチドの長さに至る。核酸及びポリヌクレオチドはいずれかの長さのポリマーである。いくつかの場合には核酸アナログは例えば、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はO-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analoges: A Practical Approach, Oxford University Pressを参照のこと）；並びにペプチドの核酸主鎖及び結合を含む主鎖を変更するものに含まれるにもかかわらず、本発明の核酸は、一般的にはホスホジエステル結合を含むであろう。他のアナログ核酸は以下の：陽性の主鎖；米国特許第5,235,033号及び同第5,034,506号並びにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580 Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds.に記載されたものを含む、非イオン性の主鎖及びに非リボース主鎖を有するものを含む。１又はそれを超える炭素環の糖を含む核酸はまた、核酸の１の定義内に含まれる。リボース-リン酸主鎖の修飾は多様な理由、例えば、生理学的環境中のそのような分子の安定性と半減期を増加させるため、によって、又はバイオチップ上のプローブとして行われる。自然発生的な核酸の混合物とアナログの混合物は作成され得る；替わりに、異なる核酸アナログの混合物及び自然発生的な核酸及びアナログの混合物も作成されることができる。
【００４７】
特別には、ペプチドの核酸アナログを含むペプチド核酸（PNA）が好ましい。これらの主鎖は、自然発生的な核酸の高度に荷電したホスホジエステル主鎖とは対照的に、中性の条件下で実質的に非イオン性である。第一に、上記PNA主鎖は、亢進したハイブリダイゼーション動力学を示す。PNAは、完全に適合した塩基対と比較して、不適当な組み合わせの塩基対について、より大きな融点（Tm）の変化を有する。DNA及びRNAは、典型的には内部の不適合あたりTmの2〜4℃の低下を示す。非イオン性のPNA主鎖では、上記低下は7〜9℃に近い。同様に、それらの非イオン性の性質によって、これらの主鎖に結合した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に比較的感受性が低い。加えて、PNAは、細胞内酵素によって分解されず、したがってより安定であり得る。
【００４８】
上記核酸は、特定されたとおりに１本鎖又は２本鎖であることができ、或いは２本鎖の又は１本鎖の配列両方の部分を含むことができる。当業者に理解されるであろうとおり、１本鎖の記述はまた、相補鎖の配列を定義する；したがって、本明細書中に記載された配列はまた、上記配列の相補鎖を提供する。上記核酸は、ゲノムの及びcDNAの両方のDNA、RNA、又はハイブリッドであることができ、ここで上記核酸は、デオキシリボー及びリボーヌクレオチドの組み合わせ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、等を含む塩基の組み合わせを含むことができる。”転写物”は典型的には自然発生的なRNA、例えばmRNA前駆体、hnRNA、又はmRNA、を指す。本明細書中に用いられる通り、”ヌクレオシド”という用語は、ヌクレオチド及びヌクレオシド並びにヌクレオチドアナログ、そしてアミノ修飾されたヌクレオシドのような修飾ヌクレオシドを含む。加えて、”ヌクレオシド”は非自然発生的なアナログ構造を含む。したがって例えば、それぞれが塩基を含むペプチド核酸の上記個別のユニットは、本明細書中でヌクレオシドと表される。
【００４９】
”標識”又は”検出可能な部分”は、分光学的な、光化学的な、生化学的な、免疫化学的な、化学的な、又は他の物理学的な手段によって検出可能な組成物である。有用な標識は、例えば、32P、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、通常ELISAで使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は、例えばペプチド中へ放射線標識を取り込むことによって検出可能とされ得る、又は上記ペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用される得るハプテン及びタンパクを含む。
【００５０】
”エフェクター”又は”エフェクター部分”或いは”エフェクター成分”はリンカー又は化学結合を介して共有結合で、或いはイオン性の、ファン・デル・ワールス力の、静電気の、又は水素結合を介して抗体に非共有結合で結合（又は連結、或いは接合）する分子である。”エフェクター”は、例えば放射性化合物、蛍光化合物、酵素又は基質、エピトープタグのようなタグを含む検出部分を含む多様な分子：毒素；化学療法剤；リパーゼ；抗生物質；又は”強い”例えばベータ放射線を放射する放射性同位体であることができる。
【００５１】
”標識核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド”は、上記プローブの存在が上記プローブに結合した標識の存在を検出することにより検出されることができるように、リンカー又は化学結合を介した共有結合、又はイオン性の、ファン・デル・ワールス力の、静電気の、又は水素結合を介した非共有結合のいずれかで標識に結合するものである。替わりに、例えば、ビオチン、ストレプトアビジンのような結合パートナーの対の１が他方に結合する場合、高親和性相互作用を用いた方法が同じ結果を達成することができる。
【００５２】
本明細書中で使用されるように、”核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド”は、１又はそれを超えるタイプの化学結合を通して、通常は相補的な塩基対形成を通して、通常は水素結合形成を通じて相補的配列の標的核酸に結合し得る核酸と定義される。本明細書中で使用されるとおり、プローブは、自然の（すなわち、A、G、C、又はT）又は修飾された塩基（7-デアザグアノシン、イノシン、等）を含むことができる。加えて、プローブ中の上記塩基は、ハイブリダイゼーションを妨害しない限りは、ホスホジエステル結合以外の結合で結合されることができる。したがって、例えばプローブは、成分の塩基がホスホジエステル結合よりもペプチド結合で結合されるペプチド核酸であることができる。当業者は、プローブが、ハイブリダイゼーション条件の厳密性次第で上記プローブとの完全な相補性を欠く標的配列に結合できることを理解するだろう。上記プローブは好ましくは、アイソトープ、発色団、ルミフォア、色原体によるように直接的に標識され、又はストレプトアビジン複合体が後で結合することのできるビオチンによるように間接的に標識される。上記プローブの存否のアッセイによって、選択された配列又は亜配列の存否を検出することができる。
【００５３】
例えば細胞、又は核酸、タンパク、或いはベクターに関して使用される場合、”組換え”という用語は、上記細胞、核酸、タンパク若しくはベクターが異種核酸若しくはタンパクの導入、又は本来の核酸又はタンパクの変更によって修飾されたこと、或いは上記細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は上記細胞の本来の（非組換えの）形態中には見出されない遺伝子を発現する、又はそうでなければ異常発現される本来の遺伝子を発現するか若しくは全く発現しない。
本明細書中の”組換え核酸”という用語は、核酸、一般的には例えば、最初はポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを用いた核酸の操作によってin vitroで形成された自然には見出されない形態の核酸を意味する。したがって、単離された核酸であって線状の形態のもの、又は正常には連結されないDNA分子をin vitro で連結することによって形成された発現ベクターの両方が本発明の目的のためには組換えであるとみなされる。いったん組換え核酸が作製され、宿主細胞又は生物体に再導入された場合、それは非組換え的に複製される、すなわちin vitro の操作よりも宿主細胞のin vivo の細胞機構を用いて；しかし、そのような核酸はいったん組換え的に産生されると、その後非組換え的に複製されても本発明の目的のためにはなお組換えであるとみなされる。同様に、”組換えタンパク”は組換え技術を用いて、すなわち上記のとおり組換え核酸の発現を通して作製された、タンパクである。
【００５４】
”異種の”という用語は、核酸の部分に関して使用された場合、上記核酸が自然には相互に同一の関係で見出されない２又はそれを超える亜配列を含むことを示す。例えば、上記核酸は典型的には組替え的に産生され、新しい機能を有する核酸となるように配置された無関係の遺伝子からの２又はそれを超える配列、例えば１の供給源からのプロモーターと別の供給源からのコード領域、を有する。同様に、異種のタンパクは上記タンパクが自然には相互に同一の関係で見出されない２又はそれを超える亜配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク）。
【００５５】
”プロモーター”は、核酸の転写を支配する一連の核酸制御配列である。本明細書中で使用されるように、プロモーターは、ポリメラーゼIIタイプのプロモーターであるTATA要素のように転写開始部位の近傍に必須の核酸配列を含む。プロモーターはまた、場合により、遠位のエンハンサー又はリプレッサー要素を含み、これは転写開始部位から数千塩基対もの位置にあることができる。”構成的な”プロモーターは、ほとんどの環境的かつ発生的な条件下で活性のあるプロモーターである。”誘導的な”プロモーターは、環境的な又は発生的に制御された条件下で活性のあるプロモーターである。”作動可能に連結された”という用語は、（プロモーター、又は転写因子結合部位の配列のような）核酸発現制御配列と第２の核酸配列との間の機能的結合を指し、ここで発現制御配列が上記第２の配列に対応する核酸の転写を支配する。
【００５６】
”発現ベクター”は、宿主細胞中の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を有する組換え的に又は合成的に作り出された核酸構築物である。上記発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸フラグメントであり得る。典型的には、上記発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されるように転写される核酸を含む。
【００５７】
”に選択的に（特異的に）ハイブリダイズする”という句は、その配列が複合的な混合物（例えば、細胞の総DNA又はRNA、或いは総ライブラリーDNA又はRNA）中に存在する場合、ストリンジェントな条件下での分子の特別なヌクレオチド配列のみへの結合、２重鎖形成、又はハイブリダイズを指す。
【００５８】
”ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”という句は、そこでは、プローブが典型的には核酸の複合的な混合物中でその標的亜配列にハイブリダイズし、他の配列にはハイブリダイズしないであろう条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であって、違う環境においては異なるであろう。より長い配列は、高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指導は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)中に見出される。一般的には、定義されたイオン強度のｐHにおいて、ストリンジェントな条件は、特定の配列の融点（Tm)よりも5〜10℃低くなるように選ばれる。上記Tmは、標的に相補的なプローブの50％が上記標的配列に平衡状態で（標的配列が過剰に存在するために、Tmで、プローブの50％が平衡状態で占有される。）ハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐH、及び核酸濃度において）である。ストリンジェントな条件とは、ｐH7.0〜8.3において塩濃度がナトリウムイオン約1.0M未満、典型的には、ナトリウムイオン濃度約0.01〜1.0M（又は他の塩）であり、温度は少なくとも短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）については少なくとも約30℃、及び、長いプローブ（例えば、50ヌクレオチドよりも多い）については少なくとも、約60℃であるものであろう。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションのためには、陽性のシグナルは少なくともバックグラウンドハイブリダイゼーションの２倍、好ましくは10倍である。具体的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の：50％ホルムアミド、5ｘSSC、及び1％SDS、42℃でインキュベート、又は5ｘSSC、1％SDS、65℃でインキュベートし、0.2ｘSSC及び0.1％SDS中で65℃で洗浄する、であることができる。PCRのためには、アニーリング温度が約32℃及び48℃の間でプライマー長によって変化することができるにもかかわらず、約36℃の温度が低ストリンジェントな増幅には典型的である。高ストリンジェントなPCR増幅のためには、高ストリンジェントなアニーリング温度がプライマー長及びその特異性によって約50℃〜約65℃の範囲にわたることができるのにもかかわらず、約62℃の温度が典型的である。高ストリンジェント及び低ストリンジェントな増幅の両方のための典型的なサイクル条件は、30秒〜2分の90℃〜95℃の変性相、30秒〜2分続くアニーリング相、及び約72℃の伸長相が1〜2分、を含む。低ストリンジェント及び高ストリンジェントな増幅反応のためのプロトコールとガイドラインが、例えばInnis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. 中で提供される。
【００５９】
ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸であっても、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、実質的に同一である。これは、例えば遺伝暗号によって許容される最大のコドンの縮退によって核酸のコピーが作り出される場合に起こる。そのような場合には、核酸は典型的には中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。具体的な”中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”は、40％ホルムアミド、1M  NaCl、1％SDSの緩衝液中、37℃でのハイブリダイゼーション、及び1ｘSSC中、45℃における洗浄を含む。陽性のハイブリダイゼーションは、少なくともバックグラウンドの2倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーション及び洗浄条件が類似したストリンジェントな条件を提供するのに利用され得ることを容易に認識するだろう。ハイブリダイゼーションのパラメーターの決定のための付加的なガイドラインが、多くの参考文献、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, ed, Ausbel, et al、中に提供される。
【００６０】
例えば、CXCR4ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の”阻害剤”、”活性化剤”、及び”調節剤”はCXCR4ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のin vitro 及び in vivoのアッセイを用いて同定された、活性化する、阻害する、又は調節する分子又は化合物を指すために用いられる。阻害剤は、CXCR4タンパクに例えば結合し、部分的又は全体的に活性を遮断し、活性化を減少、阻止、遅延させ、不活性化し、減感し、又はCXCR４タンパクの活性又は発現をダウンレギュレートする化合物、例えばアンタゴニストである。”活性化剤”は、CXCR4タンパク活性を増加、開放、活性化、促進、活性化の亢進、増感し、これに作用し、又はアップレギュレートする化合物である。阻害剤、活性化剤、又は調節剤はまた、自然発生的な及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、リガンド同族体、抗体、化学的低分子などと同様に、タンパクの遺伝的に修飾された異形、例えば活性の変化した異形、を含む。阻害剤及び活性化剤のそのようなアッセイは、上記のように例えばCXCR４タンパクにin vitroで、細胞中で、又は細胞膜で、推定上の調節化合物を適用し、そして活性に対する機能的効果を決定することを含む。CXCR4の活性化剤及び阻害剤はまた、癌細胞をテスト化合物とともにインキュベートし、1又はそれを超える癌タンパク、例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、又はそれを超える癌タンパクの発現の増加又は減少を決定することによって同定され得る。
【００６１】
潜在的な活性化剤、阻害剤、又は調節剤で処理されたケモカイン受容体タンパクを含むアッセイサンプルは阻害剤、活性化剤、又は調節剤を含まないコントロールサンプルに対して、阻害の程度を調べるために、比較される。コントロールサンプル（阻害剤で処理していない）には100％の相対的なタンパク活性値を与えた。ポリペプチドの阻害は、上記コントロールに対する活性値が約80％、好ましくは50％、より好ましくは25〜0％である場合に達成される。受容体ポリペプチドの活性化は、上記コントロール（活性化剤で処理していない）に対する活性値が110％、より好ましくは150％、より好ましくは200〜500％（すなわち、コントロールに対して2〜5倍高い）、さらに好ましくは1000〜3000％高い場合に達成される。
【００６２】
”細胞成長の変化”は、病巣の形成、足場非依存性、半固体又は軟寒天での成長、接触阻害及び成長の密度限界の変化、成長因子又は血清要求の減少、細胞形態の変化、不死化の獲得又は喪失、腫瘍特異的なマーカーの獲得又は喪失、好適な宿主動物に注射した場合の腫瘍形成又は抑制能、及び／又は上記細胞の不死化のようなin vitro 又は in vivoにおけるいずれの細胞の成長及び増殖特性の変化をも指す。例えば、Freshney，Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241(3rd ed. 1994)を参照のこと。
【００６３】
”腫瘍細胞”は、腫瘍中の前癌性の、癌性の、及び正常細胞を指す。
【００６４】
”癌細胞”、”形質転換された”細胞又は組織培養中の”形質転換”は、新しい遺伝物質の取り込みを含むことが必須でない、自発性の又は誘導された表現形の変化を指す。形質転換が形質転換を引き起こすウイルスによる感染及び新しいゲノムのDNAの取り込み、又は外来のDNAの取り込みから生じ得るのにもかかわらず、それはまた、自発的に又は内在性の遺伝子を突然変異させるところの続く発癌物質への露出により生じる。形質転換は、細胞の不死化、異常な成長制御、及び／又は悪性化のような表現形の変化と結びついている（Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique(3rd ed. 1994)を参照のこと）。
【００６５】
”抗体”は、特異的に抗原に結合しそして認識するイムノグロブリン遺伝子又はそのフラグメントからのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識されたイムノグロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域の遺伝子をミリアッドイムノグロブリンの可変領域の遺伝子と同様に含む。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、これらは、今度はそれぞれイムノグロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEを定義する。典型的には、抗体の上記抗原結合領域は、結合の特異性及び親和性において最も決定的なものであるだろう。
【００６６】
典型的なイムノグロブリン（抗体）構造の単位は4量体を含む。各4量体は2の同一のポリペプチド鎖の対を含み、各対は１の“軽い”（約25ｋD）及び１の“重い”（約50〜70kD）ポリペプチド鎖を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識を担う100〜110又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶL）及び可変重鎖（ＶH）は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。
【００６７】
抗体は、例えば完全なイムノグロブリンとして、又は多様なぺプチダーゼで消化することによって作り出される多くのよく特徴づけられたフラグメントとして存在する。したがって、例えばペプシンは、抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化し、F（ab）‘2、それ自身ジスルフィド結合でVH-CH１に結合した軽鎖であるFabのダイマー、を産生する。上記F（ab）’2は、それによって上記F（ab）’2ダイマーをFab’モノマーに変換する、ヒンジ領域でジスルフィド結合を分解する穏やかな条件下で還元されることができる。上記Fab’モノマーは、本来はヒンジ領域の部分を有するFabである（Fundamental Immunology (Paul Ed., 3d ed. 1993)を参照のこと）。多様な抗体フラグメントが完全な抗体の消化物として定義される一方、当業者はそのようなフラグメントが化学的に又は組換えDNA方法のいずれかによってde novo 合成されることができることを理解するだろう。したがって、本明細書中で使用されるとおり、抗体という用語はまた、抗体フラグメントであって、抗体全体の修飾によって産生されるもの、或いは組換えDNA方法を用いたde novo 合成によるもの、（例えば、1本鎖Fv）又はファージディスプレイライブラリーを用いて同定されるもの（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990)）のいずれかを含む。
【００６８】
抗体の調製のためには、例えば、組換えの、モノクローナルの、又はポリクローナルの抗体の本分野で知られた多くの技術が使用され得る（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497(1975））；Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983);Cole et al., pp.77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985);Coligan, Current Protocols in Immunology(1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1998); 及び Goding, Monoclonal Anribodies: Principles and Practice(2nd ed. 1986)を参照のこと）。1本鎖抗体の作製のための技術（米国特許第4,946,778号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体の作製に適合させられ得る。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物のような他の生物体は、選ばれた抗原に特異的に結合する抗体及び異側性のFabフラグメントを同定するのに使用され得る（例えば、MacCafferty et al., Nature 348:552-554(1990);Marks et al., Biotechnology 10:779-783(1992)を参照のこと）。
【００６９】
“キメラ抗体”は抗体分子であって、その中で（ａ）定常領域、又はその部分が抗原結合部位（可変領域）が異なる又は変更されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域、又はキメラ抗体に新しい性質を与える全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等に連結される；又は（ｂ）可変領域、又はその部分が、変更、置換、或いは異なる又は変更された抗原特異性を有する可変領域に交換された、抗体である。
【００７０】
受容体及びリガンドの配列の同定
以下の検討は、CXCR4遺伝子及びタンパク、並びに対応するリガンドの疾患の診断及び治療における使用に焦点をあてる。当業者は、この検討が本明細書中で開示される他のケモカイン受容体及びそれらのリガンド（例えば、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、CX3CR1、及びCXCR6）に適合することを認識するだろう。１の側面において、例えばCXCR4遺伝子及び他の遺伝子の発現レベルは、発現プロフィールを提供するために、診断情報が必要とされる異なる患者サンプル中で決定される。特定のサンプルの発現プロフィールは、本質的には上記サンプルの状態の”フィンガープリント”であり；2の状態が類似的に発現されたいずれかの特定の遺伝子を有する一方、多くの遺伝子の評価は同時に、細胞の状態に特有の遺伝子発現プロフィールの作成を可能とする。すなわち、正常の組織が癌性の又は転移性の癌性組織から識別されることができ、又は転移性の癌性組織が生存中の癌患者からの組織と比較され得る。既知の異なる癌の状態における組織の発現プロフィールを比較することによって、これらの各状態においてどの遺伝子が重要であるか（アップー、及びダウンーレギュレーションの両方を含む）、についての情報が得られる。
【００７１】
癌組織対非癌組織におけるCXCR4配列及び他の配列の同定は、この情報の何通りもの使用を可能とする。例えば、特定の治療措置が評価されることができ、特定の患者において化学療法剤が癌を、したがって腫瘍の成長又は再発をダウンレギュレートするのか、が評価されることができる。同様に、患者サンプルを既知の発現プロフィールと比較することによって、診断及び治療の結果が得られ、確認されることができる。転移性の組織もまた、組織中の癌の段階を判定するために分析され得る。さらには、これらの遺伝子発現プロフィール（又は個別の遺伝子）は、特別の発現プロフィールを擬態又は変更する観点で候補薬物のスクリーニングを可能とし、例えば、スクリーニングは癌の発現プロフィールを抑制する薬物のために行われ得る。これは、後でこれらのスクリーニングにおいて使用され得る重要な癌遺伝子のセットを含むバイオチップを作製することにより行われることができる。これらの方法はまた、タンパクに基づいて行われ得る；すなわち、CXCR４のタンパク発現レベルは治療目的又は候補薬物をふるいわけるために評価され得る。加えて、CXCR4核酸配列は、アンチセンス核酸の投与、又は治療的薬剤として投与されるCXCR4タンパク（それらの抗体及びそれらの他の修飾因子を含む）を含む遺伝子治療目的のために投与され得る。
【００７２】
受容体及びリガンドの核酸の使用
本発明の受容体及びリガンドをコードする核酸はいくつかの方法で使用される。例えば、以下に概説されるように、CXCR4配列を含む核酸プローブは、病気の検出のためのスクリーニング及び診断方法中で使用されるために作製され、バイオチップ（他の癌特異的な核酸と共に）に付着される。替わりに、上記CXCR4及びSDF1核酸は、例えば遺伝子治療、ワクチン、及び／又はアンチセンスの適用のために使用され得る。替わりに、CXCR4又はSDF1ポリペプチドのコード領域を含む上記CXCR4及びSDF1核酸は、ポリペプチドの発現のため、再度のスクリーニング目的のため、又は患者への投与のための発現ベクターに挿入されることができる。
【００７３】
好ましい実施態様において、例えば、CXCR4又はSDF1である、受容体又はリガンドの核酸に特異的にハイブリダイズする核酸プローブが作成される。バイオチップに付着されたCXCR4核酸プローブは、標的配列及び本発明のプローブのハイブリダイゼーションが起こるように、CXCR4核酸、すなわち標的配列（例えばサンドイッチアッセイ中では、上記サンプルの標的配列又は他のプローブ配列のいずれか）、に対して実質的に相補的となるように設計される。以下に概説されるように、この相補性は完全である必要はなく；標的配列及び本発明の１本鎖核酸の間のハイブリダイゼーションを妨害するであろう多くの塩基対の間違いがあることができる。しかしながら、突然変異の数が非常に多いために、最低のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてさえハイブリダイゼーションが起こらない場合、上記配列は相補的な標的配列ではない。したがって、本明細書中の”実質的に相補的”によって、本明細書中で概説するとおり、正常な反応条件下、特別には高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするために上記プローブが十分に標的配列に相補的であることが意味される。
【００７４】
核酸プローブは一般的には１本鎖であり、しかし部分的に１本鎖で部分的に２本鎖であり得る。プローブの鎖の性質はターゲット配列の構造、組成、及び性質によって決定される。一般的には、核酸プローブは約8〜約100塩基の長さ、好ましくは約10〜約80塩基、特別に好ましくは約30〜約50塩基である。すなわち、一般的には遺伝子全体は使用されない。いくつかの実施態様において、数百塩基ものもっと長い核酸が使用され得る。
【００７５】
好ましい実施態様において、重複するプローブ又は標的配列の異なるセクションに対するプローブのいずれかと共に1配列あたり1を超えるプローブが使用される。すなわち、2、3、4、又はそれを超えるプローブ、好ましくは3、が特定の標的に対して重複するように作るために使用される。上記プローブは重複（すなわち、いくつかの共通する配列を有する）することができ、又は離れていることができる。いくつかの場合、PCRプライマーはより高い感度のためのシグナルの増幅のために使用されることができる。
【００７６】
当業者に理解されるであろうとおり、核酸は広く多様なやり方で固相支持体に付着、又は固定され得る。本明細書中の”固定された”及び文法的同義語によって、以下に概説するとおり、核酸プローブ及び固相支持体間の会合又は結合が結合、洗浄、分析、及び除去の条件下で十分に安定であることが意味される。上記結合は典型的には共有結合又は非共有結合であり得る。本明細書中の”非共有結合”及び文法的同等語によって、1又はそれを超える静電気の、親水性の、及び疎水性の相互作用が意味される。ストレプトアビジンのような分子の支持体への共有結合的な付着及びビオチン標識されたプローブのストレプトアビジンへの非共有結合は非共有結合に含まれる。本明細書中の”共有結合”及び文法的同等語によって、支持体及びプローブである2の部分はシグマ結合、パイ結合、及び配位結合を含む少なくとも1の結合によって付着されていることが意味される。共有結合は上記プローブ及び上記固相支持体間で直接的に形成されることができ、或いは架橋結合剤又は固相支持体若しくはプローブのいずれか又は両方の分子上の特異的な反応基の包接によって形成されることができる。固定化はまた、共有結合及び非共有結合の組み合わせを含むことができる。
【００７７】
一般的には、プローブは当業者が理解するであろうとおり、広く多様な方法でバイオチップに付着される。本明細書中で記載するとおり、上記核酸は続くバイオチップへの付着を伴う最初の合成によって、又は上記バイオチップ上で直接的に合成され得る。
【００７８】
バイオチップは、好適な固体基質を含む。本明細書中の”基質”又は”固相支持体”又は他の文法的同義語によって、核酸プローブの付着又は会合に適した、離れた個別の部位を含むように修飾されることができ、少なくとも1の検出方法で調べることが可能な物質が意味される。当業者によって理解されるであろうとおり、可能な基質の数は非常に大きく、そしてガラス及び修飾された又は機能化されたガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、及びスチレン並びに他の物質のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンJ、等）、ポリサッカライド、ナイロン又はニトロセルロース、レジン、シリカ又はシリカプラスチック、等を含むがこれらに限定されない。一般的には、上記基質は明らかに蛍光ではなく、視覚的な検出を可能とする。好ましい基質は、再使用可能な低蛍光プラスチックバイオチップ、と題された1999年3月15日に出願された米国特許出願番号第09/270,214号、本明細書中に参考文献としてそっくりそのまま援用されている、中に記載されている。
【００７９】
一般的には基質は、基質の他の立体配置が同様に使用されるであろうことが当業者に理解されるであろうにもかかわらず、平面である。例えば、上記プローブは、サンプル体積を最小化するためのフロースルーサンプル分析のために管の内部表面に置かれることができる。同様に、上記基質は、特別なプラスチックで作られた閉鎖細胞フォームを含むフレキシブルフォームのようにフレキシブルであることができる。
【００８０】
好ましい実施態様中で、バイオチップ及びプローブの表面は、これら2の続く付着のための化学官能基で誘導体化されることができる。したがって、例えば、バイオチップは、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基及びチオール基を含むが、しかしこれらに限定されない化学官能基、特別に好ましくはアミノ基で誘導体化される。これらの官能基を用いることにより、上記プローブはプローブ上の官能基を用いて付着され得る。例えば、アミノ基を含む核酸は、例えば、当業者に知られているとおり、架橋剤を用いることによって；例えば、周知のとおり、同種のー又は異種のー2の機能を持つ架橋剤を用いることによってアミノ基を含む表面に付着されることができる（1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200)。加えて、いくつかの場合には、アルキル基のような追加の架橋剤（置換された及びヘテロアルキル基を含む）が使用されることができる。
【００８１】
この実施態様において、オリゴヌクレオチドは当業者に知られているとおりに合成され、その後、固相支持体の表面に付着される。当業者に理解されるであろうとおり、5’又は3’末端のいずれかが固相支持体に付着されることができ、又は付着は内部のヌクレオチドを介する。
【００８２】
他の実施態様においては、固相支持体への固定化は、非常に強力であるが非共有的であることができる。例えば、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドが作成されることができ、それはストレプトアビジンで共有結合的にコートされた表面に結合し、結果的に付着する。
【００８３】
替わりに、上記オリゴヌクレオチドは、当業者に知られているとおりに上記表面上で合成されることができる。例えば、光重合化合物を利用した光活性化技術が使用される。好ましい実施態様において、上記核酸は、PCT国際出願公開第95/25116号；同第95/35505号；米国特許第5,700,637号及び同第5,445,934号；及びそのすべてが参考文献として明白に援用されている中の記載された参考文献；これらの付着方法が基礎となったAffimetrix GeneChip(商標）技術に記載されたような周知のフォトリトグラフ技術を利用してin situ で合成され得る。
【００８４】
受容体及びリガンド、例えばCXCR4及びSDF1配列、の発現レベルを測定するためにしばしば増幅に基づいたアッセイが実施される。これらのアッセイは典型的には、逆転写と共に実施される。そのようなアッセイにおいては、増幅反応において核酸配列が鋳型として作用する（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法、又はPCR）。定量的な増幅において、増幅産物の量は、もとのサンプル中の鋳型の量に比例する。適切なコントロールに対する比較はCXCR4 RNAの量の測定を提供する。定量的な増幅方法は当業者に周知である。定量的なPCRのための詳細なプロトコールは、例えば、Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (1990)中に提供される。
【００８５】
いくつかの実施態様においては、TaqManに基づいたアッセイが発現を測定するために使用される。Taq Manに基づいたアッセイは5’蛍光色素及び3’クエンチング剤を含む蛍光性のオリゴヌクレオチドプローブを使用する。上記プローブはPCR産物にハイブリダイズするが、それ自身は3’末端のブロッキング剤によって伸長されない。上記PCR産物が続くサイクル中で増幅される場合、ポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性、例えばAmpliTaq、は上記TaqMan プローブの開裂を引き起こす。この開裂は、5’蛍光色素と3’クエンチング剤を分離し、それによって、増幅法の機能として蛍光の増加という結果となる（例えば、Perkin-Elmerによって提供される文献、例えば、www2.Perkin-elmer.comを参照のこと）。他の好適な増幅法は、リガーゼ連鎖反応法（LCR）（Wu & Wallace, Genomics 4:560(1989), Landegren et al., Science 241:1077(1988),及びBarringer et al., Gene 89:117(1990)を参照のこと）、転写増幅（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173(1989)）、自己持続的な配列の複製（Guatelli et al.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874(1990)を参照のこと）、ドットPCR、及びリンカーアダプターPCR等を含むがこれらに限定されない。
【００８６】
核酸からの受容体又はリガンドポリペプチドの発現
好ましい実施態様において、受容体及びリガンド、例えばCXCR4及び／又はSDF1、の核酸は以下に記載されるように、その後スクリーニングアッセイにおいて使用され得るポリペプチドを発現する多様な発現ベクターを作製するのに使用される。発現ベクター及び組換えDNA技術は当業者に周知であり（例えば、Ausubel, supra, and Gene Expression Systems(Fernandez & Hoeffler, eds, 1999)を参照のこと）、タンパクを発現させるために使用される。上記発現ベクターは自己複製する染色体外ベクター、又は宿主ゲノム中に組み込まれるベクターのいずれかであることができる。一般的には、これらの発現ベクターは、CXCR4タンパクをコードする核酸に作動可能であるように連結された転写、又は翻訳の調節核酸を含む。”コントロール配列”という用語は、特定の宿主生物体において作動可能なように連結された、コード配列の発現に使用されるDNA配列を意味する。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル；及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００８７】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合、”作動可能なように連結”される。例えば、シグナルペプチド又は分泌リーダーのDNAは、それがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパクとして発現される場合にはポリペプチドのDNAに作動可能なように連結される；プロモーター又はエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響する場合には作動可能なようにコード配列に連結される；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置する場合にはコード配列に作動可能なように連結される。一般的には、”作動可能なように連結された”とは、連結されているDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接し、かつ読み取り枠中にある。しかしながら、エンハンサーは、近接している必要がない。連結は、典型的には便利な制限部位での核酸連結によって達成される。そのような部位がない場合、慣用方法に従って合成のオリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。転写及び翻訳の調節核酸は、一般的には上記タンパクの発現に使用される宿主細胞に適しているだろう。多数のタイプの適切な発現ベクター、及び好適な調節配列が多様な宿主細胞についてこの分野において知られている。
【００８８】
一般的には、転写及び翻訳の調節配列はプロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列並びにエンハンサー又はアクチベーター配列を含むことができるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、調節配列はプロモーター及び転写開始及び停止配列を含む。
【００８９】
プロモーター配列は構成的又は誘導的プロモーターのいずれかをコードする。上記プロモーターは自然発生的なプロモーター又はハイブリッドプロモーターのいずれかであることができる。1を超えるプロモーターの要素を合わせたハイブリッドプロモーターはまた、本分野において知られており、本発明中で有用である。
【００９０】
加えて、発現ベクターは付加的な要素を含むことができる。例えば、発現ベクターは2の複製システムを有することができ、したがって2の生物体中に、例えば発現のために哺乳動物又は昆虫の細胞中に、そしてクローニングと増幅のために原核細胞中に維持されることが可能である。さらには、組み込まれる発現ベクターについては、上記発現ベクターは少なくとも1の宿主細胞ゲノムと同種の配列、そして好ましくは発現構築物に隣接する2の同種の配列を含む。組み込まれるベクターは、上記ベクターの封入のための適切な同種の配列を選択することによって宿主細胞中の特異的な位置に方向づけられる。
組み込まれるベクターのための構築物は、本分野において周知である（例えば、Fernandez & Hoeffler, supra)。
【００９１】
加えて、好ましい実施態様においては、上記発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を可能とするために選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は本分野において周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。
【００９２】
本発明の受容体又はリガンド、例えばCXCR4及びSDF1、のタンパクは、タンパクをコードする核酸を含むベクターの発現によって形質転換された宿主細胞を、上記タンパクの発現を誘導又は引き起こすための適切な条件下で培養することによって産生される。タンパクの発現に適切な条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選択によって異なり、当業者によって日常の実験法又は最適化を通して容易に確認されるだろう。例えば、発現ベクター中での構成的プロモーターの使用は、誘導的プロモーターの使用が誘導のための適切な成長条件を必要とする一方、宿主細胞の成長及び増殖の最適化を必要とするだろう。加えて、いくつかの実施態様においては、収集のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞の発現において使用されるバキュロウイルスシステムは溶菌ウイルスであり、そしてしたがって収集時期の選択が産物の収率に対して決定的であり得る。
【００９３】
適切な宿主細胞は、酵母、細菌、古細菌、カビ、並びに昆虫及び哺乳動物を含む動物細胞を含む。特に興味深いのは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） 及び他の酵母、E.コリ（E. coli）, バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）, Sf9細胞, C129細胞, 293細胞, パンカビ属（Neurospora）, BHK, CHO, COS, HeLa細胞, HUVEC(human umbilical vein endothelial cells), THP1（マクロファージ細胞株）及び多様な他のヒト細胞及び細胞株である。
【００９４】
好ましい実施態様においては、上記受容体及びリガンドのタンパク、例えばCXCR4及びSDF1は、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物の発現システムはまた、本分野において知られており、逆転写ウイルス及びアデノウイルスシステムを含む。哺乳動物のプロモーターとしての特別な使用は、哺乳動物のウイルス遺伝子からのプロモーターである、なぜなら、上記ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現し、広い宿主の範囲を持つためである。実施例は、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びCMVプロモーター（例えば、Fernandez & Hoeffler, supraを参照のこと）。典型的には、転写の終了及び哺乳動物細胞により認識されるポリアデニレーション配列は、翻訳停止コドンの3’側に位置する制御領域及びしたがってプロモーター要素と一緒にコード配列に隣接する。転写ターミネーター及びポリアデニレーションシグナルの例は、SV40に由来するものを含む。
【００９５】
外来性の核酸を宿主哺乳動物に導入する方法は、他の宿主と同様に本分野で知られており、使用される宿主細胞によって異なる。技術は、デキストランにより仲介される形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンにより仲介される形質移入、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、及び核内へのDNAの直接マイクロインジェクションを含む。
【００９６】
好ましい実施態様において、CXCR4又はSDF1ポリペプチドは細菌システム中で発現される。細菌の発現システムは、本分野で周知である。バクテリオファージからのプロモーターもまた、使用され、本分野において知られている。加えて、合成プロモーター、及びハイブリッドプロモーターもまた有用であり、例えば上記tacプロモーターはtrp及びlacプロモーター配列のハイブリッドである。さらには、細菌プロモーターが細菌のRNAポリメラーゼに結合することができ転写を開始する能力を有する、非細菌由来の自然発生的なプロモーターを含み得る。機能するプロモーター配列に加えて、効果的なリボソーム結合部位が望ましい。発現ベクターはまた、細菌中のCXCR4タンパクの分泌に備えるシグナルペプチド配列を含むことができる。上記タンパクは、成長培地中へ（グラム陽性細菌）、又は細胞の内膜及び外膜との間に位置する細胞膜周辺腔中へ（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。細菌の発現ベクターはまた、形質転換された細菌菌株の選択に備えるための選択可能なマーカー遺伝子を含む。好適な選択遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンのような薬剤に対して耐性のある細菌を与える遺伝子を含む。選択可能なマーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシンの生物合成経路中にあるような生物合成的な遺伝子を含む。これらの成分は、発現ベクター中に集められる。細菌のための発現ベクターは本分野において周知であり、そして中でもバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）, E.コリ（E. coli）, ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）, 及び ストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）, を含む（例えば、Fernandez & Hoeffler, supra）。細菌の発現ベクターは塩化カルシウム処理、エレクトロポーレーションなどのような本分野において周知の技術を用いて細菌宿主細胞に形質転換される。
【００９７】
1の実施態様において、タンパクは昆虫細胞中で産生される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター及び特別にはバキュロウイルスに基づいた発現ベクターは本分野において周知である。
【００９８】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは酵母細胞中で産生される。酵母の発現システムは、本分野において周知であり、そしてサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、及びC.マルトーサ（C. maltosa）、ハンセニュラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、及びK.ラクチス（K. lactis）、ピキア・ギラリモンディ（Pichia guillerimondii）、及びP.パストリス（P. pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）、及びヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）のための発現ベクターを含む。
【００９９】
受容体又はリガンドのポリペプチドはまた、本分野において周知の技術を用いた融合タンパクとして作られることもできる。したがって、例えば、モノクローナル抗体の作製のためには、所望のエピトープが小さい場合、上記ポリペプチドは抗原を形成するために担体タンパクに融合されることができる。替わりに上記タンパクは発現を増加させるため、又は他の理由で、融合タンパクとして作成されることができる。
【０１００】
好ましい実施態様において、受容体又はリガンド、例えばCXCR4又はSDF1、のポリペプチドは、発現後精製又は単離される。上記ポリペプチドは、サンプル中にどんな他の成分が存在するかによって、当業者に知られた多様な方法で単離または精製されることができる。標準的な精製方法は、電気泳動的、分子的、免疫的、そしてイオン交換、疎水性、アフィニティー、並びに逆相HPLCのクロマトグラフィー及びクロマトフォーカシングを含むクロマトグラフィー技術を含む。例えば、上記タンパクは、標準的な抗CXCR4又は抗SDF1タンパク抗体カラムを用いて精製されることができる。タンパク濃度に関連して限外濾過及びダイアフィルトレーション技術もまた有用である。好適な精製技術の一般的なガイダンスについては、Scopes, Protein Purificaion(1982)を参照のこと。必要な精製の程度は、タンパクの使用に依存するであろう。いくつかの場合には、精製は不必要であろう。
【０１０１】
いったん発現され、そして必要に応じて精製されると、上記タンパク及び核酸は多くの適用において有用である。それらは、免疫的選択試薬として、ワクチン試薬として、スクリーニング試薬として使用されることができる。
【０１０２】
受容体の変異形、例えばCXCR4、のポリペプチド
1の実施態様において、受容体又はリガンド、例えばCXCR4又はSDF1、のポリペプチドは野生型の配列に比較して誘導体又は変異タンパクである。すなわち、以下においてより十分に概説されるとおり、上記誘導体ペプチドはしばしば少なくとも1のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を含み、特別にはアミノ酸の置換が好ましい。アミノ酸の置換、挿入、又は欠失は上記ペプチド内のいかなる残基においても生ずることができる。
【０１０３】
本発明のポリペプチドの1の実施態様には、アミノ酸配列の変異形も含まれる。これらの変異形は、典型的には以下の3のクラス：置換的、挿入的、又は欠失的変異形の1以上に区分される。これらの変異形は通常は、上記変異形をコードするDNAを生成するために、カセット又はPCR突然変異誘発又は本分野において知られた他の技術を用いて上記タンパクをコードするDNA中のヌクレオチドの部位特異的な突然変異、その後、組換え細胞培養中で上記DNAを発現させることによって調製される。しかしながら、約100〜150までの残基を有する変異形タンパクフラグメントは確立された技術を用いたin vitro の合成によって調製されることができる。アミノ酸配列の変異形は、それらを自然発生的な対立形質の又は種間のタンパクアミノ酸配列の変動から隔てる特徴である、所定の変化の性質によって特徴づけられる。上記変異形は、以下においてより十分に概説されるであろう変更された特徴を有する変異形もまた選ばれ得るにもかかわらず、典型的には自然発生的なアナログと同質の生物学的活性を示す。
【０１０４】
アミノ酸配列の異形を導入する部位又は領域が先に決定されている一方、突然変異自体は先に決定されている必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の実施を最適化するために、ランダムな突然変異誘発が標的コドン又は領域及び所望の活性の最適な組み合わせのためにスクリーニングされる発現された受容体、例えばCXCR4、の変異形においておこなわれることができる。既知の配列を有するDNAの所定の部位における置換突然変異をおこす技術は、周知であり、例えばM13プライマー突然変異誘発及びPCR突然変異誘発である。突然変異体のスクリーニングは、例えばCXCR4タンパク活性のアッセイを用いて行われる。
【０１０５】
アミノ酸置換は典型的には1の残基についてであり；挿入はかなり大きな挿入が許容され得るにもかかわらず、普通は約1〜20残基程度である。欠失は、いくつかの場合には欠失はもっと大きくあることができるにもかかわらず、約1〜約20残基の範囲である。
【０１０６】
置換、欠失、挿入、又はそれらの組み合わせは最終的な誘導体に到達するために使用されることができる。一般的には、これらの変化は分子の変更を最小にするために数少ないアミノ酸において行われる。しかしながら、ある環境においてはより大きな変化が許容され得る。受容体タンパク、例えばCXCR4、の特徴の小さな変化が望まれる場合には、置換は一般的には定義の項において提供された置換チャートにしたがって行われる。
【０１０７】
変異形は、変異形もまた必要に応じて受容体タンパクの特徴を変更するために選ばれるにもかかわらず、典型的には自然発生的なアナログと同質の生物学的活性を示し、同一の免疫応答を誘発するであろう。替わりに、変異形は、受容体タンパクの生物学的活性が変更されるように設計されることができる。例えば、グリコシル化部位は変更又は除去されることができる。
【０１０８】
共有結合性の受容体ポリペプチドの修飾は本発明の範囲に含まれる。共有結合性の修飾の1のタイプは、受容体ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、受容体ポリペプチドのN-又はC-末端の残基或いは選ばれた側鎖の残基と反応することの可能な有機的誘導体化剤と反応させることを含む。2機能性の試剤による誘導体化が有用であり、例えば、以下により十分に記載されるとおり、抗-受容体ポリペプチド抗体の精製又はスクリーニングアッセイの方法において使用するための、水に不溶の支持基質又は表面への受容体ポリペプチドの架橋のための試剤である。通常使用される架橋剤は、例えば、1,1-ビス（ジアゾアセチル）-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシサクシニミドエステル、例えば４−アジドサリシリックアシッドのエステル、3,3’-ジチオビス（サクシニミジルプロピオネート）のようなジサクシニミジルエステルを含む同種の2機能性のイミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド-1,8-オクタンのような2機能性のマレイミド及びメチル-3-（（ｐ−アジドフェニル）ジチオ）プロピオイミデートのような試剤を含む。
【０１０９】
他の修飾は、対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基それぞれの脱アミノ化、プロリン及びリジンの水酸化、セリル、トレオニル、又はチロシル残基水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のγ-アミノ基のメチル化（Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, pp. 79-86(1983)）、N−末端アミンのアセチル化、及びいずれかのC−末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１１０】
本発明の範囲の受容体ポリペプチドの誘導された共有結合性の修飾の他のタイプは、ポリペプチドの本来のグリコシル化様式の変更を含む。“本来のグリコシル化様式の変更”は、本明細書中の目的のためには、本来の受容体ポリペプチド配列中に見出される１又はそれを超える炭水化物部分を除去すること、及び／又は本来の受容体ポリペプチド配列中には存在しない１又はそれを超えるグリコシル化部位を付加することを意味することを意図する。グリコシル化様式は多くの方法で変更され得る。例えば、受容体配列を発現するための異なる細胞タイプの使用は、異なるグリコシル化様式に帰する。
【０１１１】
受容体ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加もまた、そのアミノ酸配列の変更によって達成されることができる。上記変更は、例えば、１又はそれを超えるセリン又はスレオニン残基の本来の受容体ポリペプチドの配列へ（O-連結グリコシル化部位へ）の付加によって、またはそれによる置換で達成されることができる。上記受容体のアミノ酸配列は、場合によりDNA レベルにおける変化を通して、特別には所望のアミノ酸へ翻訳されるであろうコドンが産生されるようにあらかじめ選択された塩基において受容体ポリペプチドをコードするDNAを突然変異させることによって、変更されることができる。
【０１１２】
受容体ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、ポリペプチドへの化学的又は酵素的なグリコシドの結合である。そのような方法は、本分野において、例えば、PCT出願公開第WO87/05330号、及びAplin & Wriston, CRC Crit.Rev. Biochem., pp. 259-306(1981)中に記載される。
【０１１３】
受容体ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に又は酵素的に或いはグリコシル化の標的として働くアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異による置換によって達成されることができる。化学的脱グリコシル化技術は本分野において知られており、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987)によって、及びEdge et al., Anal. Biochem. 118:131(1981)によって記載される。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350(1987)によって記載されるように、多様な内在性の及び外来のグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【０１１４】
受容体の共有結合性の修飾の他のタイプは、受容体ポリペプチドを多様な非タンパク性のポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン、に米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192号及び同第4,179,337号に述べられているやり方で連結することを含む。
【０１１５】
受容体ポリペプチドはまた、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した受容体ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾されることができる。１の実施態様において、そのようなキメラ分子は、例えば抗―タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとCXCR4ポリペプチドの融合を含む。上記エピトープタグは一般的にはCXCR4ポリペプチドのアミノ−又はカルボキシル−末端に置かれる。CXCR4ポリペプチドのそのようなエピトープでタグされた形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出され得る。また、エピトープタグの供給は、抗―タグ抗体又はエピトープタグに結合する他のタイプのアフィニティー基質を用いたアフィニティー精製による容易なCXCR4ポリペプチドの精製を可能とする。替わりの実施態様において、上記キメラ分子は、CXCR4ポリペプチドとイムノグロブリン又はイムノグロブリンの特別な領域との融合を含むことができる。上記キメラ分子の２価の形態については、そのような融合はIgG分子のFc領域とのものであることができる。
【０１１６】
多様なタグポリペプチド及びそれらの各抗体が本分野において周知である。例として、ポリーヒスチジン（ポリーhis）又はポリーヒスチジンーグリシン（ポリーhis-gly）タグ；His６及び金属キレートタグ、fluHAタグポリペプチド及びその抗体12CA5（Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165）(1988));c-myc タグ及びその8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体（Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616(1985)）;及び単純ヘルペスウイルス糖タンパクD（gD）及びその抗体（Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553(1990)を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグーペプチド（Flag-peptide）(Hopp et al., BioTechinology 6：1204-1210(1988))；KT3エピトープペプチド（Martin et al., Science 255:192-194(1992)）;チューブリンエピトープペプチド（Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166(1991)）；及びT7遺伝子10タンパクペプチドタグ（Lutz−Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397(1990)）を含む。
【０１１７】
さらにCXCR4タンパクの実施態様に含まれるのは、他のケモカイン受容体タンパク及び他の生物体からのケモカイン受容体タンパクであって、以下に概説するとおり、クローン化され、発現されるものである。したがって、ヒト又は他の生物体からの他の関連するタンパクを発見するためにプローブ又は変性したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマー配列が使用されることができる。当業者に理解されるであろうとおり、特別に有用なプローブ及び／又はPCRプライマー配列はCXCR4核酸配列の特有の領域を含む。本分野において一般的に知られているとおり、好ましいPCRプライマーは約15〜約35ヌクレオチドの長さ、好ましくは約20〜約30、そして必要に応じてイノシンを含むことができる。PCR反応のための条件は本分野において周知である（例えば、Innis, PCR Protocols, supra）。
【０１１８】
受容体又はリガンドタンパクに対する抗体
好ましい実施態様において、上記受容体又はリガンドタンパクが抗体の産生のために、例えば免疫療法又は免疫診断のために、使用される場合、上記受容体又はリガンドタンパクは、少なくとも１のエピトープ又は抗原決定基を完全な長さのタンパクと共通に有していなければならない。本明細書中の“エピトープ”又は“抗原決定基”によって典型的にはMHCの種類に応じて抗体又はT−細胞受容体を産生及び／又はこれに結合するタンパクの部分が意味される。したがって、もっとも多くの場合、より小さいタンパクに対して作製された抗体は完全な長さのタンパク、特別には連続的なエピトープに結合することができるであろう。好ましい実施態様において、上記エピトープは特有のものである；すなわち、特有のエピトープに対して産生された抗体が示す交差反応性がわずかであるか、又は無い。
【０１１９】
ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に知られている（例えば、Coligan, supra;及びHarlow & Lane, supra）。ポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤及び所望によりアジュバントの１又はそれより多い注射により哺乳動物中で作製することができる。典型的には、上記免疫化剤及び／又はアジュバントは、哺乳動物に複数回の皮下又は腹腔内注射によって注射されるであろう。上記免疫化剤は、核酸によってコードされたタンパク又はそれらのフラグメント或いはそれらの融合タンパクを含むことができる。免疫化剤を、免疫化される哺乳動物において免疫原性のあることが知られているタンパクに接合することは有用であることができる。そのような免疫原性のタンパクの例は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシシログロブリン、及びソイビーントリプシンインヒビターを含むが、これらに限定されない。採用されることのできるアジュバントの例は、フロインドの完全アジュバントを及びMPL-TDMアジュバント（モノホスホリルリピッドA、合成トレハロースジコリノミコレート）を含む。免疫化のプロトコールは過度の実験なしに当業者によって選択されることができる。
【０１２０】
替わりに、上記抗体はモノクローナル抗体であることができる。モノクローナル抗体はKohler & Milstein, Nature 256:495(1975)によって記載されたようなハイブリドーマ方法を用いて調製されることができる。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物が、典型的には免疫化剤に対して特異的に結合する抗体を産生、又は産生することのできるリンパ球を誘導するための免疫化剤で免疫化される。替わりに、リンパ球は、in vitro で免疫化されることができる。上記免疫化剤は典型的には本発明の核酸によってコードされるタンパク又はそれらのフラグメント、或いはそれらの融合タンパクを含むであろう。一般的には、ヒト由来の細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（“PBLｓ”）のいずれか、又は非ヒトである哺乳動物由来の細胞が望ましい場合には、ブタの細胞又はリンパ節細胞が使用される。上記リンパ球は、その後ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールのような好適な融合剤を用いて不死化された細胞株と融合される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(1986)）。不死化された細胞株は、通常は形質転換された哺乳動物細胞、特別にはげっ歯類、ウシ、及びヒト由来のメラノーマ細胞である。通常は、ラット又はマウスメラノーマ細胞株が採用される。上記ハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合の、不死化された細胞の成長又は生存を阻害する１又はそれを超える物質を含む好適な培養培地中で培養されることができる。例えば、上記親細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT又はHPRT）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（“HAT培地”）、それらの物質がHGPRT−欠乏細胞の成長を妨害する。
【０１２１】
１の実施態様において、上記抗体は２方向に特異的な抗体である。２方向に特異的な抗体はモノクローナルな、好ましくは少なくとも２の異なる抗原に対する結合特異性を有する、又は同一の抗原上の２のエピトープに対する結合特異性を有するヒト、又はヒト化された抗体である。１の実施態様において、結合特異性のうちの１はCXCR4に対してであり、他方はいずれかの他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク又は受容体或いは受容体サブユニット、好ましくは腫瘍特異的なもの、に対してである。替わりに、テトラマータイプの技術は多価の試薬を作り出すことができる。
【０１２２】
好ましい実施態様において、例えばCXCR4又はSDF1タンパクに対する抗体は、以下に記載されるとおり、CXCR4タンパクの生物学的機能を減少又は排除することができる。すなわち、抗―CXCR4タンパク抗体（ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルのいずれか）のCXCR4発現組織（又はCXCR4を含む細胞）への添加は上記タンパクの発現と関連した癌を減少又は排除することができる。一般的には、少なくとも活性の25％の減少が好ましく、少なくとも約50％が特別に好ましく、そして約95〜100％の減少が格別に好ましい。
【０１２３】
好ましい実施態様において、CXCR4又はSDF1タンパクに対する抗体はヒト化された抗体である（例えば、Xenerex Biosciences, Medarex, Inc., Abgenix, Inc., Protein Design Labs, Inc.）。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体は、イムノグロブリン、イムノグロブリン鎖、又は非ヒトイムノグロブリンに由来する最小の配列を含む（Fv、Fab、Fab’、F(ab')2又は抗体の他の抗原結合性の亜配列のような）それらのフラグメントのキメラ分子である。ヒト化された抗体は、そこにおいて受容者の相補的な抗原決定領域（CDR）からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギのような非ヒトの種のCDR（供与者の抗体）からの残基に置き換えられるヒトイムノグロブリン(受容者の抗体)を含むことができる。いくつかの場合には、ヒトイムノグロブリンのFvフレームワーク領域の残基が対応する非ヒトの残基に置き換えられる。ヒト化された抗体はまた、受容者の抗体にも、導入されたCDR又はフレームワーク領域にも見出されない残基を含む。一般的には、ヒト化された抗体は、少なくとも１であり、典型的には２である可変ドメインのすべてを実質的に含み、そこにおいては、非ヒトイムノグロブリンのCDRに対応するすべて又は実質的にすべてのCDR領域が、そしてすべて又は実質的にすべてのフレームワーク領域（FR）がヒトイムノグロブリンのコンセンサス配列のそれらと同一である。上記ヒト化された抗体は最適にはまた、少なくともイムノグロブリン定常領域（Fc）の部分、典型的にはヒトイムノグロブリンの定常領域の部分、をも含むであろう（Jones et al., Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988)及びPresta, Curr, Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)）。
【０１２４】
非ヒト抗体をヒト化する方法は本分野において周知である。一般的には、ヒト化された抗体は非ヒトである供給源から導入された１又はそれを超えるアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば輸入残基と呼ばれ、典型的には輸入可変ドメインから得られる。ヒト化は本質的にはWinter 及びその協力者たちの方法（Jones et al., Nature 321:522-525(1986);Reichmann et al., Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988)）に従って、げっ歯類のCDRs又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって実施され得る。したがって、そのようなヒト化された抗体はキメラ抗体であり、（米国特許第4,816,567号）そこにおいては実質的に完全なヒト可変ドメインよりも少ない部分が非ヒトの種からの対応する配列によって置換されている。実際、ヒト化された抗体は典型的にはいくつかのCDR残基および多分いくつかのFR残基がげっ歯類の抗体中の類似の部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１２５】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー（Hoogenboom & Winter, J. Mol.Biol. 227:381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581(1991)）を含む、本分野において知られた多様な技術を用いて産生されることができる。Cole et al.及びBoerner et al.の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために使用可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Thdrapy, p.77(1985)及びBoerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95(1991)）。同様に、ヒト抗体はヒトイムノグロブリン遺伝子座を、例えば内因性のイムノグロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化された、例えばマウスであるトランスジェニック動物中に導入することによって作成され得る。挑戦の結果、ヒト抗体産生が観察され、それは遺伝子の再配列、会合、及び抗体レパートリーを含むすべての面でヒトにおいて見られたものと非常に類似している。このアプローチは例えば、米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号及び以下の科学的出版物：Markes et al., Bio/Tecnology 10:779-783(1992);Lonberg et al., Nature 368:856-859(1994);Morrison, Nature 368:812-13(1994);Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996);Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93(1995)中に記載されている。
【０１２６】
免疫療法によって適切な受容体又はリガンド、例えばCXCR4又はSDF1、のタンパクに対して作製された抗体による癌（卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、頭部及び頚部癌、腎臓癌、胃癌、子宮癌、グリア芽細胞腫、前立腺癌、又は乳癌）の治療が意味される。本明細書中で用いられるとおり、免疫療法は受動的又は能動的であることができる。本明細書中で定義されるとおり、受動的免疫療法は受容者（患者）への受動的な抗体の移入である。能動的な免疫化は、受容者（患者）における抗体及び／又はT細胞応答の誘導である。免疫応答の誘導はそれに対して抗体が作製された抗原を受容者に与えた結果である。当業者に理解されるとおり、抗原はそれに対して抗体が作製されたポリペプチドを受容者に注射することによって、又は抗原を発現することのできる核酸と受容者を接触させることによって抗原が与えられ、そして、抗原の発現のための条件下で免疫応答へ導く。
【０１２７】
理論的には結合することはないが、治療に使用される抗―受容体抗体は、受容体タンパクの細胞外ドメインに結合しそして循環するケモカインリガンドのような他のタンパクに結合することを妨害する。上記抗体は細胞膜貫通受容体タンパクのダウンレギュレーションを引き起こすことができる。当業者によって理解されるであろうとおり、上記抗体は、受容体タンパクの細胞外ドメインへのタンパク結合の競合的、非競合的、又は不競合的阻害剤であることができる。上記抗体はまた、受容体タンパクのアンタゴニストである。さらに、上記抗体は細胞膜貫通受容体の活性化を防害する。１の側面において、上記抗体が受容体タンパクへの他の分子の結合を妨害する場合、上記抗体は受容体機能、例えばシグナリングの活性化、を妨害する。
【０１２８】
上記抗体はまた、上記細胞を細胞毒性剤に対して標的化、又は増感させるために使用されることができ、上記細胞毒性剤はTNF-α、TNF-β、IL-1、INF-γ、IL-2、又は５FU、ビンブラスチン、アクチノマイシンD、シスプラチン、メトトレキセート、などを含む化学療法剤を含むがこれらに限定されない。いくつかの場合には、上記抗体は細胞膜貫通タンパクと複合体を形成した場合に血清成分を活性化し、それによって細胞毒性又は抗原依存性の細胞毒性（ADCC）を仲介するサブタイプに属する。したがって、受容体は患者に細胞膜貫通受容体タンパクに対する抗体を投与することによって処理される。抗体の標識化は、補助毒素を活性化し、毒素の必要量を局在化し、又はそうでなければ局所的に細胞を除去することができる。
【０１２９】
他の好ましい実施態様においては、上記抗体はエフェクター部分に接合される。上記エフェクター部分は放射性標識、又は蛍光標識のような標識化部分を含むいずれかの数の分子、或いは治療的部分であることができる。１の側面において、上記治療的部分は受容体タンパクの活性を調節する低分子である。
【０１３０】
好ましい実施態様において、上記治療的部分はまた、細胞毒性因子であり得る。この方法において、上記細胞毒性因子を受容体、例えばCXCR4組織又は細胞、を標的とさせることは傷害を受けた細胞の数を減少させ、それによってCXCR4に関連した症状を軽減する結果となる。細胞毒性因子は多数かつ多様で、細胞毒性のある薬物、又は毒素或いはそのような毒素のフラグメントを含むが、それらに限定されない。好適な毒素及びそれらの対応するフラグメントはジフテリアA鎖、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン（curcin）、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、サポリン等を含む。細胞毒性因子はまた、放射性同位体を受容体タンパクに対して作製した抗体に接合させることによって、又は放射性核種を抗体に共有結合で付着されたキレート剤に結合させることによって作った放射化学物質を含む。治療的部分をもって細胞膜貫通受容体タンパクを標的とさせることは、受容体が傷害をうけた範囲の中の治療的部分の局所的濃度を増加させるのに働くだけでなく、また上記治療的部分と関連するかも知れない有害な副作用を減少させることにも働く。
【０１３１】
本発明のCXCR4又はSDF1抗体は特異的にCXCR4又はSDF1タンパクに結合する。本明細書中の”特異的に結合”によって上記抗体が上記タンパクに少なくとも約0.1ｍMのKd、より普通には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM又はそれより良好、最も好ましくは少なくとも約0.01μM又はそれより良好なKdで結合することが意味される。結合の選択性もまた、重要である。CXCR4及びSDF1の例は、本明細書中に記載されるとおり、受容体とリガンドの適合及び特異的な癌との相関の適例である。
【０１３２】
診断的及び治療的な適用のための受容体配列の検出
１の側面において、受容体、例えばCXCR4、の遺伝子の発現レベルが癌細胞の検出のために決定される。評価は遺伝子転写物、又はタンパクレベルにおいてであることができる。遺伝子発現量は遺伝子転写物のDNA又はRNA同等物に対する核酸プローブを用いてモニターされることができ、又は替わりに最終の遺伝子産物自体（タンパク）が、例えばCXCR4タンパクに対する抗体、及び標準的なイムノアッセイ（ELISAｓ等）、又はマススペクトロスコピーアッセイ、2次元ゲル電気泳動等を含む他の技術によってモニターされることができる。CXCR4遺伝子に対応するタンパク、すなわち癌表現型において重要であるとされたタンパク、は診断試験において評価され得る。
【０１３３】
好ましい実施態様において、遺伝子発現のモニタリングが同時に多数の遺伝子について実施される。複数のタンパク発現のモニタリングも同様に実施され得る。同様にこれらのアッセイは個体を基礎として同様に実施されることができる。
【０１３４】
１の実施態様において、CXCR4核酸プローブが、本明細書中において概説されるとおり、特定の細胞中のCXCR4配列の検出及び定量のためにバイオチップに付着される。PCR技術はより高い感受性を与えるために使用され得る。同様に、他の受容体が検出され得る。
【０１３５】
好ましい実施態様において、受容体タンパク、例えばCXCR4、をコードする核酸が検出される。CXCR4をコードするDNA又はRNAが検出されることができるにもかかわらず、特別に興味深いのは、CXCR4タンパクをコードするmRNAが検出される方法である。mRNAを検出するためのプローブは、上記mRNAに相補的であり、これとハイブリダイズするヌクレオチド／デオキシヌクレオチドプローブであることができ、オリゴヌクレオチド、cDNA又はRNAを含むが、これらに限定されない。プローブはまた、本明細書中で定義されるとおり、検出可能な標識を含まなければならない。1の方法において、mRNAは核酸をナイロン膜のような固相支持体に固定化し、上記プローブを上記サンプルとハイブリダイズさせた後に検出される。非特異的に結合したプローブを洗浄によって除去した後、上記標識を検出する。他の方法においては、mRNAの検出はin situ で実施される。この方法においては、透過化処理された細胞又は組織サンプルが検出可能に標識された核酸プローブと、標的mRNAと上記プローブがハイブリダイズするのを可能とする十分な時間、接触させられる。非特異的に結合したプローブを除去するための洗浄に続いて、上記標識が検出される。例えば、CXCR4タンパクをコードするmRNAに相補的なジゴキシゲニン標識されたリボプローブ（RNAプローブ）は、ジゴキシゲニンを抗ージゴキシゲニン2次抗体と結合させることによって検出され、ニトロブルーテトラゾリウム及び5-ブロモ-4-クロロ-３-インドイルホスフェートで現像される。
【０１３６】
他の好ましい方法においては、受容体タンパク、例えばCXCR4、に対する抗体は、in situ 画像診断技術、例えば組織学において（例えばMethods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993))、使用される。この方法において、細胞はCXCR4タンパクの1から多数の抗体に接触させられる。非特異的な抗体結合の除去のための洗浄に続いて、抗体の存在が検出される。1の実施態様において、抗体は検出可能な標識を含む2次抗体とともにインキュベートされることによって検出される。他の方法においては、CXCR4タンパクに対する1次抗体は検出可能な標識、例えば基質に作用し得る酵素マーカー、を含む。他の好ましい実施態様においては、複数の1次抗体のそれぞれが異なる、そして検出可能な標識を含む。この方法は、複数のCXCR4タンパクの同時スクリーニングに特別に使用される。当業者によって理解されるであろうとおり、多くの他の組織学的画像診断技術もまた、本発明によって提供される。
【０１３７】
好ましい実施態様において、上記標識は異なる波長の発光を検出し、識別する能力を有する蛍光光度計中で検出される。加えて、蛍光で活性化されたセルソーター（FACS)がこの方法中で使用され得る。
【０１３８】
他の好ましい実施態様において、抗体は血液、血清、血漿、便、及び他のサンプルからの癌細胞の存在の診断に使用される。したがって、そのようなサンプルは、受容体タンパク、例えばCXCR4、の存在について探索され、テストされるサンプルとして有用である。抗体は先に記載された、ELISA、イムノブロッティング（ウェスタンブロッティング）、免疫沈降法、BIACORE技術等を含むイムノアッセイ技術によってCXCR4タンパクを検出するために使用され得る。逆に、抗体の存在は内因性のCXCR4タンパクに対する免疫応答を示唆することができる。
【０１３９】
好ましい実施態様において、標識された受容体核酸プローブの組織の配列への in situ ハイブリダイゼーションが行われた。例えば、転移性の癌組織及び／又は正常組織を含む組織サンプルの配列が作成される。その後、in situ ハイブリダイゼーション（例えば、Ausubel, supraを参照のこと）が実施される。個体と標準との間でフィンガープリントの比較をした場合、熟練者は発見に基づいて、診断、予後、又は予想を作成することができる。診断を示す遺伝子が予後を示す遺伝子と異なることができ、細胞の状態の分子的プロフィール作成が応答的又は無反応の状態の区別に導き得ること、又は結果を予想し得ることがさらに理解されるだろう。
【０１４０】
好ましい実施態様において、上記受容体のタンパク、抗体、核酸、修飾タンパク、及び受容体配列を含む細胞が予後のアッセイにおいて使用される。上記のように、癌と相関した遺伝子発現プロフィールが長期の予後に関して作成され得る。再び、好ましい遺伝子を用いてこれはタンパク、又は遺伝子レベルのいずれかにおいて行われることができる。上記のように、組織又は患者における受容体配列の検出及び定量のために、受容体プローブがバイオチップに付着される。上記アッセイは診断のために上で概説されたとおりに進行する。PCR法はより感受性が高く、正確な定量を提供することができる。
【０１４１】
治療的化合物のアッセイ
好ましい実施態様において、指定された受容体又はそのリガンドが、受容体の活性又は発現に機能的影響を有する化合物を同定するための薬物スクリーニングアッセイにおいて使用される。”機能的影響”という句は、受容体タンパクの活性を調節する化合物をテストするためのアッセイに関して、上記タンパク又は核酸の間接的又は直接的な影響、例えば、機能的、物理的、又は化学的影響、の下にある、癌、又は転移を減少させる能力のようなパラメーターを決定することを含む。上で記したとおり、ケモカイン受容体タンパクはGタンパクに結合した受容体である。Gタンパクに結合した受容体の活性化のためのアッセイは本分野において周知である。そのようなアッセイはリガンドの結合（例えば、放射性リガンドの結合によって）、セカンドメッセンジャー（例えば、cAMP、cGMP、IP3、DAG、又はCa2+）、イオン流動、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベル等を測定するアッセイを含む。加えて、癌と関連した表現型への結合の影響が測定されることができ、そのようなアッセイは軟寒天上の細胞成長；足場依存性；成長の接触阻害及び密度限定；細胞増殖；細胞形質転換；成長因子又は血清依存性；腫瘍特異的マーカーレベル又はヌードマウスにおける腫瘍成長を含む。加えて、転移性の表現型を測定するアッセイはマトリゲル及び他の合成の又は自然のマトリックス中への侵入；転移を行っている細胞中のmRNA及びタンパクの発現、及び他の転移性の癌細胞の特徴のためのアッセイを含む。他のアッセイは、例えばKoshiba et al., Clin. Cancer Res. 6:3530-5(2000)中に記載された、細胞遊走のためのアッセイ、又は例えばPaoletti Int J Oncol; 18:11-6(2001)中に記載された、マトリックス分解酵素の発現のためのアッセイを含む。”機能的影響”はin vitro、in vivo、及びex vivoの活性を含む。
【０１４２】
”機能的影響の決定”によって、間接的又は直接的に受容体タンパク配列の影響、例えば、機能的、物理的、及び化学的影響、の下にあるパラメーターを増加、又は減少させる化合物をアッセイすることが意味される。そのような機能的影響は、当業者に知られた多くの手段、例えば、タンパクの分光学的特徴（例えば、蛍光、吸収、反射指数）、水力学的（例えば、形状）、クロマトグラフィーの、又は溶解性の特質の変化、誘導的なマーカー又は受容体タンパクの転写における活性化の測定；結合活性の測定又は結合アッセイ、例えば抗体又は他のリガンドへの結合、及び細胞増殖の測定によって測定され得る。
【０１４３】
受容体又はリガンドタンパク、抗体、核酸、修飾タンパク及びそのような配列を含む細胞はまた、”遺伝子発現プロフィール”又はポリペプチドの発現プロフィールに対する候補薬物の効果を評価することによってアッセイされ得る。好ましい実施態様において、上記発現プロフィールは、候補薬物で処理した後の遺伝子の発現プロフィールのモニタリングを可能とするためにハイスループットのスクリーニング技術と結びついている（例えば、Zlokarnik, et al., Science 279:84-8(1998); Heid, Genome Res 6:986-94, 1996)）。
【０１４４】
”テスト化合物”又は”候補薬物”又は”調節剤”又は本明細書中で使用される文法的な同義語は、癌の表現型又は癌に関連した配列、例えば核酸又はタンパク配列、を直接的又は間接的に変更する能力についてテストされる、いずれかの分子、例えばタンパク、オリゴペプチド、有機的低分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド等、を表す。好ましい実施態様において、周知のアッセイにおいて測定されるように、調節剤は受容体の発現又は活性を変更する。
【０１４５】
ある実施態様において、潜在的な調節剤の組み合わせのライブラリー（コンビナトリアルライブラリー）が受容体ポリペプチドへの結合能力、又はその活性を調節する能力についてスクリーニングされるであろう。慣用的には、有用な性質を有する新しい化学的実体は、何らかの望ましい性質又は活性、例えば阻害活性、を有する化学的化合物（”リード化合物”と呼ばれる）の同定、リード化合物の変異形の生成、及びそれらの変異形化合物の性質及び活性の評価によって作り出される。しばしば、ハイスループットスクリーニング（HTS）方法がそのような分析のために採用される。
【０１４６】
1の好ましい実施態様において、ハイスループットスクリーニング方法は多数の潜在的な治療的化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供することを含む。そのような”コンビナトリアルケミカルライブラリー”はその後、望ましい特徴的活性を示すライブラリー構成物（特定の化学種又はサブクラス）を同定するための1又はそれを超えるアッセイにおいてスクリーニングされる。そのようにして同定された化合物は慣用の”リード化合物”として働くことができ、又はそれら自身が潜在的な又は実際の治療薬として使用されることができる。
【０１４７】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬のような多くの化学的”ブロック形成”を組み合わせることにより、化学的合成又は生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化学的化合物の集合である。例えば、ポリペプチド（例えば突然変異タンパク質）ライブラリーのような直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリーは、アミノ酸と呼ばれる化学的ブロック形成の一組を所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）についてあらゆる可能な方法で組み合わせることによって形成される。数百万もの化学的化合物が化学的ブロック形成のそのような組み合わせの混合を通じて合成され得る（Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9):1233-1251(1994)）。
【０１４８】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの準備及びスクリーニングは当業者に周知である。そのようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493(1991)、Houghton et al., Nature, 354:84-88(1991)、ペプトイド（PCT出願公開第WO 91/19735号を参照のこと）、コードされたペプチド（PCT出願公開第WO93/20242号）、ランダムなバイオーオリゴマー（PCT出願公開第WO91/00091号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチドのようなダイバーソマー（diversomer）（Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913(1993)）、ビニロガスポリペプチド（Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. USA 90:6909-6913(1993)）、ベータ-D-グルコースの足場を有する非ペプチドペプチド擬態（Hirschmann et al., J Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218(1992)）、小化合物ライブラリーの有機合成類似物（Chen et al., J. Amer. Chem.Soc. 116:2661(1994)）、オリゴカーバメート（Cho, et al., Science 261:1303(1993)）、及び／又はペプチジルホスホネート（Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658(1994)）を含むが、これらに限定されない。一般的には、Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385(1994)、核酸ライブラリー（例えば、Strategene, Corp.を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3):309-314(1996)及びPCT/US96/10287を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liagng et al., Science 274:1520-1522(1996)、及び米国特許第5,593,853号を参照のこと）、及び小有機化合物ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum, C&EN, Jan 18, page33(1993);イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノン及びメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号及び同第5,519,134号；モルフォリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,228,514号及び同様のものを参照のこと）を参照のこと。
【０１４９】
コンビナトリアルライブラリーの作成のための装置は商業的に入手可能である（例えば、357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照のこと）。
【０１５０】
多くの周知の自動化されたシステムが液相化学のために開発された。これらのシステムは、Takeda Chemical Industries, LTD.(Osaka,Japan)によって開発された自動化された合成装置及びロボットアームを利用した多くの自動化されたシステム（Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass,; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.）であって、化学者によって実施される手動の合成操作を模倣するもののような自動化されたワークステーションを含む。上記の装置のいずれもが本発明とともに使用されるのに好適である。これらの装置の性質及びそれらが本明細書中で検討するとおりに操作できるようにする変更の実施（仮にあれば）は、関連する分野の当業者にとって明らかであろう。加えて、多くのコンビナトリアルライブラリー自身が商業的に入手可能である（例えばComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St, Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等を参照のこと）。
【０１５１】
調節剤を同定するアッセイはハイスループットスクリーニングに適用可能である。好ましいアッセイは、例えば受容体タンパクへのケモカインの結合の促進又は阻害の検出を含む。特定の核酸又はタンパク産物の存在、不存在、定量、又は他の性質のためのハイスループットアッセイは当業者に周知である。同様に、結合アッセイ及びレポーター遺伝子アッセイは、同様に周知である。したがって、例えば、米国特許第5,559,410号はタンパクの高スループットスクリーニングアッセイを開示し、米国特許第5,585,639号は核酸の結合（すなわち、配列中の）の高スループットスクリーニングアッセイを開示し、並びに米国特許第5,576,220号及び同第5,541,061号は、リガンド／抗体結合のスクリーニングのハイスループットな方法を開示する。
【０１５２】
加えて、ハイスループットスクリーニングシステムは商業的に入手可能である（例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA;Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA,等を参照のこと）。これらのシステムは典型的にはすべてのサンプル及び試薬のピペッティング、液体の予製、時間の決められたインキュベーション、及び上記アッセイに適切な検出器におけるマイクロプレートの最終的な読み取りを含むすべての手順を自動化する。これらの適合可能なシステムは、高度の柔軟性及び個別適応性と同様にハイスループット及び迅速な始動を提供する。そのようなシステムの製造者は多様な高スループットシステムのための詳細な手順を提供する。したがって、例えば、Zymark Corp.は遺伝子の転写、リガンドの結合などの変更を検出するためのスクリーニングシステムを記載した技術報告を提供する。
【０１５３】
１の実施態様において、調節剤はタンパク、しばしば自然発生的なタンパク又は自然発生的なタンパクのフラグメントである。したがって、例えばタンパクを含む細胞抽出液、又はタンパク性の細胞抽出液の無作為な又は方向づけられた消化物が使用されることができる。この方法によってタンパクライブラリーが本発明のスクリーニングのために作成されることができる。この実施態様において特に好ましいのは、細菌、カビ、ウイルス、及び哺乳動物のタンパクのライブラリーであり、哺乳動物のタンパクが好ましく、そしてヒトのタンパクが特別に好ましい。特に有用なテスト化合物は、例えば酵素の基質又はリガンド及び受容体である標的が属するタンパクのクラスに対して方向づけられているであろう。
【０１５４】
好ましい実施態様において、調節剤は約5〜約30アミノ酸のペプチドであり、好ましくは約5〜約20アミノ酸、そして特に好ましくは約7〜約15のアミノ酸のペプチドである。上記ペプチドは上で概説したように自然発生的なタンパク、ランダムペプチド、又は“偏向させられた”ランダムペプチドである。本明細書中の“無作為化された”または文法的な同義語によって、各核酸及びペプチドが本質的にそれぞれ無作為の核酸及びアミノ酸から成ることが意味される。これらのランダムペプチド（以下で検討するように、又は核酸）が化学的に合成されることから、それらはいずれかの核酸又はアミノ酸をいずれかの位置に取り込むことができる。合成過程は、配列の長さにわたって可能な組み合わせのすべて又はほとんどの形成を可能とし、したがって無作為化された生物活性のある候補タンパク性作用物質のライブラリーを形成し、無作為化されたタンパク又は核酸を作り出すために設計され得る。
【０１５５】
1の実施態様において、上記ライブラリーは完全に無作為化され、どの位置にも配列の優先性も又は定常性もない。好ましい実施態様において、上記ライブラリーは偏向されている。すなわち、配列中のいくつかの位置は定常に保たれるか、又は限られた数の可能性から選ばれる。例えば、好ましい実施態様においては、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は定義された、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏向された（大小のいずれか）残基のクラス内で、核酸結合ドメインの生成のため、架橋形成のためのシステイン、SH-3ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシン、又はヒスチジン生成など、或いはプリン生成などのために無作為化される。
【０１５６】
一般的にタンパクについて上で記載したとおり、核酸調節剤は自然発生的な核酸、無作為の核酸、又は”偏向された”無作為の核酸であることができる。例えば、原核生物の、又真核生物のゲノムの消化物は上でタンパクについて概説したように使用されることができる。
【０１５７】
好ましい実施態様において、候補化合物は有機化学的部分であって、その広く多様なものが文献において利用可能である。
【０１５８】
候補作用物質が添加され、細胞がある時間インキュベートされた後、標的配列を含むサンプルが分析のためにバイオチップに添加される。必要な場合には、標的配列は既知の技術を用いて調製される。例えば、上記サンプルは既知の溶解緩衝液、エレクトロポーレーションなどを用いて細胞を溶解するために処理され、精製及び／又はPCRのような増幅を適宜実施することを伴う。例えば、核酸に共有結合で付着する標識を伴うin vitroでの転写が実施される。一般的には、核酸はビオチン-FITC又はPE、或いはcy3又はcy5で標識される。
【０１５９】
好ましい実施態様において、標的配列は標的配列のプローブへの特異的結合を検出する手段を提供するために、例えば蛍光、ケミルミネッセント、化学的又は放射性シグナルで標識される。標識はまた、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であることができ、適切な基質を与えると検出可能な産物を産生する。替わりに、標識は、酵素に結合するが、酵素によって触媒されず変化を受けない、酵素阻害剤のような標識された化合物又は低分子であり得る。標識はまた、エピトープタグ又はストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンのような部分又は化合物であり得る。例えばビオチンを例にとると、ストレプトアビジンが上記のように標識され、それによって結合した標的配列のための検出可能なシグナルを提供する。非結合標識ストレプトアビジンは典型的には分析の前に除去される。
【０１６０】
当業者に理解されるであろうとおり、これらのアッセイは直接的ハイブリダイゼーションアッセイであることができるか、又は”サンドイッチアッセイ”を含むことができ、それらは米国特許第5,681,702号、同第5,597,909号、同第5,545,730号、同第5,594,117号、同第5,591,584号、同第5,571,670号、同第5,580,731号、同第5,571,670号、同第5,591,584号、同第5,624,802号、同第5,635,352号、同第5,594,118号、同第5,359,100号、同第5,124,246号、及び同第5,681,697号において一般的に概説されている多数のプローブの使用を含み、これらはすべて本明細書中に参考文献として援用されている。この実施態様において、一般的に標的配列は上で概説したとおりに調製され、その後ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とする条件下で、複数の核酸プローブを含むバイオチップに添加される。
【０１６１】
本発明においては、上で概説されたように高度の、中程度の、及び低度のストリンジェントな条件下で多様なハイブリダイゼーション条件が使用されることができる。アッセイは一般的には標的の存在する場合にのみ標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とする、ストリンジェントな条件下で行われる。ストリンジェント性は、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピックな塩濃度のpH、有機溶剤濃度などを含むが、これらに限定されない熱力学的変数であるステップパラメーターを変更することによってコントロール可能である。
【０１６２】
これらのパラメーターはまた、一般的に米国特許第5,681,697号中で概説されるように、非特異的結合をコントロールするために使用され得る。したがって、非特異的結合を減少させるために、より高度にストリンジェントな条件下で一定のステップを実施することがのぞましい。
【０１６３】
本明細書において概説された反応は多様な方法で達成されることができる。以下に概説される好ましい実施態様で、反応構成物は同時に、又は順次に異なる順序で添加されることができる。加えて、反応は多様な他の試薬を含むことができる。これらは、最適のハイブリダイゼーション及び検出を容易にし、及び／又は非特異的な又はバックグラウンドの相互作用を減少させる塩、緩衝液、例えばアルブミンである中性タンパク、界面活性剤などを含む。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのような、他の方法でアッセイの効率を高める試薬はまた、サンプル調製方法及び標的の純度次第で適切に使用されることができる。
【０１６４】
アッセイデータは遺伝子発現プロフィールを形成し、発現レベル及び各遺伝子の状態間での発現レベルの変化を定量するために分析される。
【０１６５】
癌表現型の調節剤を同定するためにスクリーニングが実施される。1の実施態様において、特定の発現プロフィールを誘導し、又は抑制することができ、したがって好ましくは関連する表現型を作り出す調節剤を同定するためにスクリーニングが実施される。例えば診断的適用のための他の実施態様においては、特異的に発現される特定の状態で重要な遺伝子が同定され、各遺伝子の発現を変化させる調節剤を同定するためにスクリーニングが実施され得る。別の実施態様においては、特異的に発現される遺伝子の発現産物の生物学的機能を変化させる調節剤を同定するためにスクリーニングが実施される。特定の状態における遺伝子の重要性を同定した上で再度、遺伝子産物に結合及び／又はその生物学的活性を調節する作用物質を同定するためにスクリーニングが実施される。
【０１６６】
加えて、候補作用物質に応答して誘導される遺伝子のためにスクリーニングが行われ得る。癌発現パターンを抑制し、正常の発現パターンに導く能力又は単一の癌遺伝子発現プロフィールを正常組織からの遺伝子の発現を擬態するように調節する能力に基づいて調節剤を同定後、上記のようなスクリーニングが上記作用物質に応答して特異的に調節される遺伝子を同定するために実施され得る。正常組織及び作用物質で処理された癌組織との間の発現プロフィールの比較は正常組織又は癌組織で発現されず、作用物質で処理された組織で発現する遺伝子を明らかにする。これらの作用物質特異的な配列は本明細書中で癌遺伝子又はタンパクについて記載された方法によって同定され、使用されることができる。特別には、これらの配列及びそれらがコードするタンパクは作用物質で処理された細胞のマーキング及び同定において使用される。加えて、抗体が作用物質によって誘導されたタンパクに対して作成され、処理された癌組織サンプルの新規な治療を目指して使用されることができる。
【０１６７】
したがって、1の実施態様において、テスト化合物に関連した癌発現プロフィールを有する癌細胞集団に投与される。本明細書中の”投与”又は”接触”によって、候補作用物質が、取り込み及び細胞内作用によって又は細胞表面における作用によって、上記作用物質が細胞に作用することを可能とするようなやり方で、細胞に添加されることが意味される。いくつかの実施態様において、タンパク性の候補作用物質（すなわち、ペプチド）をコードする核酸がアデノウイルス構築物又はレトロウイルス構築物のようなウイルス構築物中に入れられ、例えばPCT/US97/01019に記載のペプチド作用物質の発現が達成されるように細胞に加えられることができる。制御可能な遺伝子治療もまた、使用され得る。
【０１６８】
いったん、テスト化合物が細胞に投与されると、所望により細胞は洗浄され、ある時間好ましい生理学的条件の下でインキュベートされることができる。本明細書中で概説されるとおり、上記細胞は、その後収集され、新しい遺伝子発現プロフィールが作られる。
【０１６９】
したがって、例えば癌の発現型を調節、例えば誘導又は抑制する作用物質について癌組織がスクリーニングされることができる。遺伝子の発現プロフィールのすくなくとも1の、好ましくは多数の変化が、上記作用物質が受容体活性に影響することを示す。癌の表現型のそのような特徴を明らかにすることにより、発現型を変化させる新しい薬剤のスクリーニングが発明される。このアプローチでは、上記標的薬物は既知である必要はなく、本来の発現スクリーニングプラットフォーム中に表されている必要もなく、また標的タンパクの転写物レベルも変化する必要がない。
【０１７０】
調節活性を有する化合物を同定するアッセイはin vitro で実施され得る。例えば、受容体ポリペプチドは最初に潜在的な調節剤に接触させられ、例えば0.5〜48時間の好適な時間の間インキュベートされる。1の実施態様において、上記受容体ポリペプチドレベルは、in vitro においてタンパク又はmRNAのレベルを測定することにより決定される。タンパクのレベルは受容体ポリペプチド又はそれらのフラグメントに選択的に結合する抗体によってウエスタンブロッティング、ELISAなどのようなイムノアッセイを用いて測定される。mRNAの測定のためには、例えばPCR、LCRを用いた増幅、又は例えばノーザンハイブリダイゼーションである、ハイブリダイゼーションアッセイを用いた増幅、RNAse保護、ドットブロッティング、が好ましい。本明細書中に記載されるとおり、タンパク又はmRNAのレベルは、例えば、蛍光性に又は放射性に標識された核酸、放射性に又は酵素的に標識された抗体等の直接的又は間接的に標識された検出剤を用いて検出される。
【０１７１】
替わりに、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク、CAT、又はβ-galのようなレポーター遺伝子に作動可能に連結された受容体タンパクプロモーターを用いてレポーター遺伝子システムが発明され得る。レポーター構築物は典型的には、細胞中に移入される。潜在的な調節剤による処理の後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、又は活性の量が当業者に知られた標準的な技術に従って測定される。
【０１７２】
好ましい実施態様において、結合アッセイが行われる。一般的に、精製された又は単離された遺伝子産物が使用される；すなわち、1又はそれを超える異なるように発現された核酸の遺伝子産物が作成される。例えば、抗体がタンパク遺伝子産物に対して作成され、存在するタンパクの量を決定するために標準的なイムノアッセイが行われる。替わりに、受容体タンパクを含む細胞が上記アッセイにおいて使用され得る。
【０１７３】
したがって、好ましい実施態様において、上記方法は例えばCXCR4である受容体タンパクと候補化合物を結合させ、タンパクに対する上記化合物の結合を定量する。好ましい実施態様においては、他の哺乳動物タンパクも使用できるにもかかわらず、例えば、ヒトの疾患の動物モデルの開発のためにヒトCXCR4タンパクを利用する。本明細書中で概説したとおり、いくつかの実施態様においては、CXCR4タンパクの変異形又は誘導体が使用されることができる。
【０１７４】
一般的には、本明細書中の方法の好ましい実施態様において、受容体タンパク又は候補作用物質は、単離されたサンプルを受容する領域を有する（例えば、マイクロタイタープレート、アレイ）不溶性の支持体に非散在性に結合する。上記不溶性の支持体は、そこへ結合することのできる可溶性の物質と容易に分離することができるいかなる組成物でつくることもでき、その他の方法ですべてのスクリーニング方法全体に適合することができる。そのような支持体の表面は固体、又は多孔質であることができ、いかなる便利な形状であることもできる。好適な不溶性の支持体の例はマイクロタイタープレート、アレイ、膜、及びビーズを含む。これらは典型的にはガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、ポリサッカライド、ナイロン、又はニトロセルロース、テフロン（商標）などで作られる。マイクロタイタープレート及びアレイは特に便利である、なぜなら、少量の試薬及びサンプルを用いて多数のアッセイが同時に行われるからである。組成物の特定の結合様式はそれが試薬と本発明のすべての方法に適合し、組成物の活性を維持し、非散在性である限り重大なものではない。結合の好ましい方法は（タンパクが支持体に結合した場合、リガンド結合部位又は活性化順序を立体的にブロックしない）抗体の使用、”接着性の”又はイオン性の支持体への直接的結合、化学的架橋形成、表面上でのタンパク又は作用物質の合成などを含む。タンパク又は作用物質の結合に続いて、過剰の非結合物質は洗浄によって除去される。サンプルを受容する領域はその後ウシ血清アルブミン（BSA)、カゼイン又は他の無害なタンパク又は他の成分とインキュベートすることを通じてブロックされることができる。
【０１７５】
好ましい実施態様において、受容体タンパクが支持体に結合し、テスト化合物がアッセイに添加される。替わりに、候補作用物質が支持体に結合し、受容体タンパクが添加される。新規な結合剤は特異的な抗体、化学ライブラリーのスクリーニング中で同定された非天然の結合物質、ペプチドアナログ、などを含む。特別に興味深いのは、ヒト細胞に対して低い毒性を有するスクリーニングアッセイのための作用物質である。この目的のために、標識されたin vitro のタンパク−タンパク結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク結合のためのイムノアッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などを含む広く多様なアッセイが使用されることができる。
【０１７６】
テスト調節化合物の受容体タンパクへの結合の測定は多くの方法で行われることができる。好ましい実施態様において、上記化合物は標識され、そして例えば、受容体タンパクのすべて又は部分を固相支持体に付着させ、標識された（例えば、蛍光標識）候補作用物質を添加し、過剰の試薬を洗浄して除き、そして固相支持体上に標識が存在するか否かを決定することによって、結合が、直接的に測定される。多様なブロッキング及び洗浄のステップが適宜、利用されることができる。
【０１７７】
いくつかの実施態様において、成分のうちのただ１つが標識される、例えばタンパク（又はタンパク性の候補化合物）が標識され得る。変わりに、１を超える成分が異なる標識、例えば、タンパクのための125I及び化合物のための蛍光団、で標識され得る。近接試薬、例えば、クエンチング剤又はエネルギー転移試薬、もまた有用である。
【０１７８】
１の実施態様において、テスト化合物の結合が競合結合アッセイによって測定される。競合物質は、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどのような標的分子（例えばCXCR4タンパク）に結合することが知られている結合部分である。ある環境下では、上記結合部分が上記化合物に取って代わり、上記化合物と上記結合部分間の競合結合があることができる。１の実施態様において、上記テスト化合物は標識される。上記化合物又は競合物質のいずれか或いは両方が、もしあれば結合を可能とする十分な時間の間、最初にタンパクに添加される。インキュベーションは最適の活性を容易にする温度、典型的には4及び40℃の間、で実施される。インキュベーション時間は典型的には、例えば速いハイスループットなスクリーニングを容易にするために、最適化される。典型的には、0.1及び1時間の間が十分であろう。過剰の試薬は一般的には、除去され、洗い流される。第2の成分がその後添加され、結合を表すために標識された成分の存否がその後調べられる。
【０１７９】
好ましい実施態様において、競合物質が最初に添加され、続いてテスト化合物が添加される。競合物質の置換がテスト化合物が受容体タンパクに結合し、したがって受容体タンパクに結合することができ、潜在的に受容体タンパクの活性を調節し得ることを示唆する。この実施態様において、いずれの成分も標識され得る。したがって、例えば仮に競合物質が標識された場合、洗浄溶液中の標識の存在が作用物質による置換を表す。替わりに、仮にテスト化合物が標識された場合、支持体上の標識の存在が置換を表す。
【０１８０】
替わりの実施態様において、上記テスト化合物は最初に添加されインキュベート及び洗浄され、競合物質がそれに続く。競合物質の結合のないことが、テスト化合物が高い親和性をもって受容体タンパクに結合することを表すことができる。したがって、仮にテスト化合物が標識された場合、競合物質の結合がないことと結びついた支持体上の標識の存在がテスト化合物が受容体タンパクに結合しうることを表すことができる。
【０１８１】
好ましい実施態様において、上記方法は受容体タンパクの活性を調節することのできる作用物質を同定するための特異的なスクリーニングを含む。この実施態様において、上記方法は受容体タンパクと競合物質を最初のサンプル中で結合させることを含む。第２のサンプルはテスト化合物、受容体タンパク、及び競合物質を含む。競合物質の結合は両方のサンプルについて測定され、そして２のサンプルの間の結合の変化又は相違は受容体タンパクに結合することができ、潜在的にその活性を調節することのできる作用物質の存在を示す。すなわち、第2のサンプル中の競合物質の結合が最初のサンプルに比較して異なる場合、上記作用物質は受容体タンパクに結合することができる。
【０１８２】
替わりに、特異的なスクリーニングは本来の受容体タンパクに結合するが、修飾された受容体タンパクには結合できない候補薬物を同定するために使用される。CXCR4タンパクの構造がモデルとされ、その部位と相互作用する作用物質を合成するための推理的ドラッグデザインにおいて使用される。受容体タンパクの活性に影響する候補薬物はまた、上記タンパクの活性を促進又は低下させる能力について薬物をスクリーニングすることによっても同定される。
【０１８３】
陽性コントロール及び陰性コントロールがアッセイ中で使用されることができる。好ましくは、コントロール及びサンプルは統計的に有意な結果を得るために少なくとも3連で実施される。すべてのサンプルのインキュベーションはタンパクへの作用物質の結合に十分な時間、行われる。インキュベーションにつづいてサンプルは非特異的に結合した物質を洗浄によって除かれ、結合した一般的には標識された作用物質の量が決定される。例えば、放射性標識が採用された場合、結合した化合物の量を測定するためにサンプルはシンチレーションカウンター中で計測されることができる。
【０１８４】
多様な他の試薬が上記スクリーニングアッセイに含まれることができる。これらは最適なタンパク−タンパク結合を容易にし、及び／又は非特異的な若しくはバックグラウンドの相互反応を減少させるために使用されることのできる塩、中性タンパク、例えばアルブミン、界面活性剤などの試薬を含む。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を亢進させる試薬もまた、使用されることができる。成分の混合物は必要な結合を提供する順番で添加されることができる。
【０１８５】
好ましい実施態様において、本発明は受容体タンパクの活性を調節することのできる化合物のスクリーニングのための方法を提供する。上記方法は上で明らかにされたとおり、受容体タンパクを含む細胞にテスト化合物を添加することを含む。好ましい細胞のタイプはほとんどすべての細胞を含む。上記細胞は受容体タンパクをコードする組換え核酸を含む。好ましい実施態様において、候補作用物質のライブラリーは複数の細胞でテストされる。
【０１８６】
１の側面において、上記アッセイは、その前または後における例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、化学療法剤を含む薬理学的物質、放射線照射、抗がん剤、又は他の細胞（すなわち、細胞―細胞接触）である生理学的シグナルへの露出の存在下または非存在下において評価される。他の実施例においては、測定は細胞サイクル過程の異なる段階で行われる。
【０１８７】
この方法においては、受容体作用物質を調節する化合物が同定される。薬理活性を有すする化合物は受容体タンパクの活性を促進又は阻害することができる。いったん同定されると、化合物の決定的な構造的特徴を同定するために類似する構造が評価される。
【０１８８】
１の実施態様において、受容体を発現する細胞の分裂を阻害する方法が提供される。上記方法は受容体阻害剤の投与を含む。別の実施態様においては、CXCR4を阻害する方法が提供される。上記方法は、CXCR4阻害剤の投与を含む。さらなる実施態様においては、癌を有する細胞又は個体を治療する方法が提供される。上記方法は、CXCR4阻害剤の投与を含む。
【０１８９】
１の実施態様において、CXCR4阻害剤は上で検討されたとおり、抗体である。別の実施態様においては、CXCR4阻害剤はアンチセンス分子である。
【０１９０】
以下に記載される多様な細胞成長、増殖、及び転移のアッセイは、当業者に知られている。
【０１９１】
＜細胞懸濁液中の軟寒天上の成長又はコロニー形成＞
正常細胞は付着し、成長するために固体の培養基を必要とする。細胞が形質転換されると、細胞はこの表現型を失い、上記培養基から離れて成長する。例えば、形質転換された細胞は、撹拌された懸濁培養液、又は例えば半固体の寒天又は軟寒天のような半固体の培地に懸濁された状態で成長し得る。腫瘍抑制遺伝子で形質移入された場合、形質転換された細胞は、正常な表現型を再発生し、付着し、成長するための固体の培養基を必要とする。懸濁液アッセイにおける軟寒天上の成長又はコロニー形成は、宿主細胞中で発現された場合、異常な細胞増殖及び形質転換を阻害する受容体配列の調節剤を同定するために使用されることができる。治療的な化合物は、宿主細胞の撹拌された懸濁培養液中で又は半固体又はソフトな半固体培地中に懸濁された状態で成長する能力を低下又は喪失させるであろう。
【０１９２】
懸濁液アッセイにおける軟寒天上の成長又はコロニー形成の技術は本明細書に参考文献として援用されているFreshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed., 1994)に記載されている。また、本明細書中に参考文献として援用されているGarkavtsev et al. (1996), supraの方法の部分も参照のこと。
【０１９３】
＜成長の接触阻害及び密度制限＞
正常細胞は典型的にはそれらが他の細胞に接触するまで平面的にそして組織化されたパターンでペトリ皿中で成長する。細胞がお互いに接触すると、それらは接触阻害を受け、成長を中止する。しかしながら、細胞が形質転換されると、細胞は接触阻害を受けず、非組織化された細胞増殖巣中で高密度になるまで成長を続ける。したがって、形質転換された細胞は正常細胞よりも高い飽和密度まで成長する。これは、正常な周囲の細胞の通常のパターンの中で細胞増殖巣中の細胞の方向性を失った単一層又は球状化された細胞の形成によって形態学的に検出されることができる。替わりに、飽和密度における（H3）−チミジンの標識率が成長の密度制限を測定するために使用され得る。Freshny (1994), supraを参照のこと。腫瘍抑制遺伝子で形質移入された場合、形質転換された細胞は正常の表現型を再発生し、接触阻害を受け、より低密度で成長するであろう。
【０１９４】
このアッセイにおいて、飽和密度における（H3）−チミジンの標識率は成長の密度制限を測定する好ましい方法である。形質転換された宿主細胞は受容体配列で形質移入され、非制限的な培地条件で飽和密度において24時間成長させられる。 （H3）−チミジンで標識された細胞のパーセンテージがオートラジオグラフィーによって測定される。Freshny (1994), supraを参照のこと。
【０１９５】
＜成長因子又は血清依存性＞
形質転換された細胞はそれらの正常の相対物よりも低い血清依存性を有する（例えば、Temin, J. Natl. Cancer Inst. 37:167-175(1966);Eagle et al.,J.Exp.Med.131:836-879(1970);Freshney, supraを参照のこと）。これは、形質転換された細胞によって放出された多様な成長因子に部分的に依存する。形質転換された宿主細胞の成長因子又は血清依存性はコントロールのそれを比較されることができる。
【０１９６】
＜腫瘍特異的なマーカーレベル＞
腫瘍細胞はそれらの正常の相対物よりも増加した量のある因子（以後、本明細書中で“腫瘍特異的マーカー”という）を放出する。例えば、ヒト神経膠腫は正常の脳細胞よりも高いレベルのプラスミノーゲン活性化因子（PA）を放出する（例えば、Gullino, Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth. in Biological Responses in Cancer, pp.178-184(Mihich(ed.)1985)を参照のこと）。同様に、腫瘍血管新生因子（TAF）は腫瘍細胞からそれらの正常の相対物よりも高いレベルで放出される。例えば、Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem. Cancer Biol.(1992)を参照のこと。
【０１９７】
これらの因子の放出を測定する多様な技術がFreshney(1994), supra中に記載されている。Unkless et al., J. Biol. Chem. 249:4295-4305(1974); Strickland & Beers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702(1976); Whur et al., Br. J. Cancer 42:305-312(1980); Gullino, Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth. in Biological Responses in Cancer, pp.178-184(Mihich(ed.)1985; Freshney Anicancer Res. 5:111-130(1985)も参照のこと。
【０１９８】
＜マトリゲルへの侵襲性＞
マトリゲル又は他の細胞外マトリックス成分への侵襲性の程度は受容体配列を調節する化合物を同定するアッセイとして使用され得る。腫瘍細胞はマトリゲル又は他の細胞外マトリックス中への細胞の侵襲性と悪性度の間に高い相関関係を示す。このアッセイにおいて腫瘍形成性の細胞が典型的には宿主細胞として使用される。これらの宿主細胞中の腫瘍抑制遺伝子は宿主細胞の侵襲性を減少させるであろう。
【０１９９】
Freshney (1994), supraに記載の技術が使用され得る。すなわち、宿主細胞の侵襲性のレベルがマトリゲル又は他の細胞外マトリックス成分でコートされたフィルターを用いて測定され得る。ゲル中への透過、又はそれを通ってフィルターの反対側への透過は侵襲性であるとみなされ、細胞数および移動距離によって、或いは細胞を125Iであらかじめ標識し、フィルターの反対側の又は皿の底の放射活性を計測することによって組織学的に評価される。例えば、Freshney (1994), supraを参照のこと。
【０２００】
＜in vivoにおける腫瘍の成長＞
CXCR4配列の細胞成長に対する効果はトランスジェニック又は免疫抑制マウスにおいてテストされることができる。受容体遺伝子が分断された又は受容体遺伝子が挿入されたノックアウトトランスジェニックマウスが作成されることができる。ノックアウトトランスジェニックマウスはマーカー遺伝子又は他の異種遺伝子をマウスゲノムの内在性の受容体遺伝子部位に相同組換えを介して挿入することによって作製されることができる。そのようなマウスはまた、内在性の受容体遺伝子を上記受容体遺伝子の突然変異体で置換させること又は内在性の受容体遺伝子を例えば発癌物質への露出によって突然変異させることによって作製されることができる。
【０２０１】
DNA構築物が胚幹細胞の核中へ導入される。新しく作られた遺伝的病変を含む細胞は宿主マウスの胚に注入され、それは受容者である雌に再移植される。これらの胚のいくつかは部分的に突然変異細胞株に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発育する。したがって、キメラマウスを繁殖させることによって、導入された遺伝的病変を有する新しいマウスの系統を得ることができる（例えば、Capecchi et al., Science 244:1288(1989)を参照のこと）。キメラの標的マウスは以下の：Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory(1988) and Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C.,(1987)に従って得ることができる。
【０２０２】
替わりに、多様な免疫的に抑制された又は免疫的に欠陥のある宿主動物が使用され得る。例えば、遺伝的に胸腺欠損の”ヌード”マウス（例えば、Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:921(1974)を参照のこと）、SCIDマウス、胸腺除去されたマウス、又は放射線照射されたマウス（例えば、Bradley et al., Br. J. Cancer 38:263(1978);Selby et al., Br. J. Cancer 41:52(1980)を参照のこと）を宿主として使用可能である。同質遺伝的な宿主に注入された移植可能な腫瘍細胞（典型的には約106細胞）は、高い比率の場合において侵襲性の腫瘍を産生する一方、類似の起源の正常細胞はそうではない。侵襲性の腫瘍を生じさせた宿主中にCXCR4配列を発現する細胞が皮下注射される。好適な長さの時間後、好ましくは4-8週間後、腫瘍の成長が測定され（例えば、体積、又はその2の最大の寸法によって）、コントロールに対して比較される。統計的に有意に減少した（例えば、スチューデントのT検定を使用して）腫瘍は、成長を阻害されたと表される。
【０２０３】
＜関節リューマチ＞
この疾患の多くの動物モデルが知られている。マウスにおける自然型IIのコラーゲンに対する免疫応答がヒトRAに似た多くの組織学的及び病理学的特徴を有する関節炎のための実験モデルを確立するために使用された。マウスにおけるコラーゲンにより誘導された関節炎（CIA）に対する感受性がH-2I領域、特別にはI-A亜領域中に位置付けられた。Huse, et al., Fed. Proc. 43:1820(1984)。
【０２０４】
感受性のある系統、DBA-1、からのマウスは、本明細書中に参考文献として援用されているWooley and Luthra, J. Immunol. 134:2366(1985)に記載の技術を用いて、そのマウスを自然型IIのコラーゲンで処理することによってCIAを生じさせられた。
【０２０５】
他のモデルでは、ラットのアジュバント関節炎がヒト関節炎の実験モデルであり、細菌性の抗原によって引き起こされた自己免疫性関節炎のプロトタイプである。Holoschitz, et al., Prospects of Immunology (CRC Press)(1986);Pearson Arthritis Rheum. 7:80 (1964)を参照のこと。同じクローン細胞の研究に基づいて、アジュバント（MT）；疾患における標的自己抗原に対して反応性のあるT細胞クローンによるその伝播性によって証明されるように、細胞が仲介する免疫応答の結果としての疾患は軟骨のプロテオグリカン分子の一部に現れる。
【０２０６】
ラットのアジュバント疾患は、数箇所の蓄積部位、好ましくは皮内に或いは足へ又は尾の付け根に与えられたフロイントのアジュバント（結核菌の死菌又はその化学的断片、ミネラルオイル、及び乳化剤）の単回注射によって作られる。アジュバントは他の抗原の非存在下で与えられる。
【０２０７】
疾患の症状への複合的な治療の効果をモニターする。これらの症状は組織病理学的であり、滑膜の裏打ち細胞の増殖を伴う急性及び亜急性の滑膜炎、圧倒的な関節組織に特有の単核の浸潤、結合組織パンヌスによる骨及び関節の軟骨の浸潤、及び特別には罹患した関節に近接する骨膜の骨新形成を含む。重篤な又は慢性である場合、繊維性又は骨の強直症のような破壊的な変化が起こる。これらの組織病理学的な症状はコントロール動物においてフロイントのアジュバントに対する感作後約12日で表れると予想される。
【０２０８】
疾患のポリヌクレオチド調節剤
＜アンチセンスポリヌクレオチド＞
ある実施態様において、アンチセンスポリヌクレオチド、すなわちコードしているmRNA核酸配列、例えば、受容体タンパクmRNA又はその亜配列、に相補的で好ましくは特異的にそれにハイブリダイズすることのできる核酸、の使用によって受容体タンパクの活性はダウンレギュレートされ、又は完全に阻害される。アンチセンスポリヌクレオチドのmRNAへの結合はmRNAの翻訳及び／又は安定性を低下させる。
【０２０９】
本発明に関して、アンチセンスポリヌクレオチドは自然発生的なヌクレオチド、又は自然発生的なサブユニット又はそれらの近い同族体から形成された合成種を含むことができる。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、糖部分又は糖間の結合を変化させることができる。これらの典型例は本分野の使用が知られたホスホロチオエート及び他の含硫種である。アナログはそれらが受容体タンパクのmRNAとハイブリダイズするのに効果的に機能する限りは本発明に含まれる。例えば、Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc., Natick, MAを参照のこと。
【０２１０】
そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは組換え手段を用いて容易に合成されることができ、またはin vitroで合成されることができる。そのような合成のための設備はApplied Biosystemsを含むいくつかの販売者によって販売されている。ホスホロチオエート及びアルキル化された誘導体のような他のオリゴヌクレオチドの調製はまた、当業者に周知である。
【０２１１】
本明細書中で使用されるアンチセンス分子はアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。センスオリゴヌクレオチドは、例えばアンチセンス鎖に結合することによって転写をブロックするために採用されることができる。アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドは、受容体分子の標的mRNA（センス）またはDNA(アンチセンス）配列に結合できる１本鎖核酸配列（RNAまたはDNAのいずれか）である。本発明のアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは一般的に少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14〜30ヌクレオチドのフラグメントを含む。所定のタンパクをコードするcDNA配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る技能は、例えばStein & Cohen Cancer Res. 48:2659(1988)及びvan der Krol et al.(BioTechniques 6:958(1988)を参照のこと。
【０２１２】
＜リボザイム＞
アンチセンスポリヌクレオチドに加えてリボザイムが受容体ヌクレオチド配列を標的とし、そして転写を阻害するために使用され得る。リボザイムは他のRNA分子を触媒的に切断するRNA分子である。I群リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、RNaseP、及びオクスヘッドリボザイムを含む異なる種類のリボザイム（異なるリボザイムの性質の一般的な総説のために、例えばCastanotto et al., Adv. in Pharmacology 25: 289-317(1994)を参照のこと）が記載されている。
【０２１３】
ヘアピンリボザイムの一般的な特性は、例えばHampel et al., Nucl. Acids Res. 18:299-304(1990);ヨーロッパ特許出願公開第0360257号；米国特許第5,254,678号中に記載されている。調製方法は当業者に周知である（例えば、PCT出願公開第WO94/26877号；Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6340-6344(1993); Yamada et al., Human Gene Therapy 1:39-45 (1994); Leavitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:699-703(1995); Leavitt et al., Human Gene Therapy 5:1151-120(1994);及びYamada et al., Virology 205:121-126(1994)を参照のこと）。
【０２１４】
受容体のポリヌクレオチド調節剤はPCT出願公開第WO91/04753号に記載のとおり、リガンド結合分子との接合の形成によって標的ヌクレオチド配列を含む細胞中へ導入されることができる。好適なリガンド結合分子は細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドを含むがこれらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の接合は実質的にはリガンド結合分子のその対応する分子又は受容体への結合能を阻害せず、又は細胞中へのセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその接合態の侵入をブロックしない。替わりに、受容体のポリヌクレオチド調節剤が、例えばPCT出願公開第WO90／10448号に記載されたようにポリヌクレオチドー脂質複合体の形成によって、ターゲット核酸配列を含む細胞中へ導入されることができる。アンチセンス分子又はモデルにおけるノックアウト及びノックインモデルの使用はまた、治療方法に加えて、上で検討したスクリーニングアッセイ中で使用されることができる。
【０２１５】
したがって、１の実施態様において、細胞中又は生物体中の受容体の調節方法が提供される。１の実施態様において、上記方法は細胞に、内在性の受容体タンパクの生物学的活性を低下又は消失させる抗−受容体抗体を投与することを含む。
【０２１６】
１の実施態様において、本発明の受容体タンパクはそれらの受容体タンパクに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体を産生するために使用されることができる。同様に、上記受容体タンパクは標準的な技術を用いてアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合されることができる。これらのカラムはその後、生産、診断、又は治療的目的のために有用な受容体抗体を精製するために使用されることができる。好ましい実施態様において、上記抗体は特定の受容体タンパクに特有のエピトープに対して産生される、すなわち、上記抗体は他のタンパクに対してわずかの交差反応性を示すか、又は示さない。上記受容体抗体は標準的なアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合され、受容体タンパクを精製するために使用される。上記抗体はまた、上で概説したとおり、受容体タンパクに特異的に結合することから、ブロッキングポリペプチドとして使用されることができる。
【０２１７】
医薬組成物及びワクチン組成物の投与
1の実施態様において、治療的に効果的な用量の受容体又はリガンドタンパク或いはその調節剤が、卵巣癌、肺癌、直腸結腸癌、膀胱癌、頭部及び頚部の癌、腎臓癌、胃癌、子宮癌、急性リンパ芽球性白血病、頚部癌、グリア芽細胞種、前立腺癌、又は乳癌のような癌の治療のため、或いは血管新生の予防のために患者に投与される。上記のとおり、CXCR4組成物は同様に関節リューマチの治療に使用され得る。関節リューマチ（RA）は滑液中に見出されるタンパクへの免疫応答の結果として生じる慢性の炎症性疾患である。
【０２１８】
本明細書中の”治療的に有効な用量”によって、投与されるものに対して効果を生じる用量が意味される。正確な用量は治療の目的に依存し、そして既知の技術（例えば、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery;Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992), Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692,0824716981; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); 及び Pickar, Dosage Calculations (1999)）を用いて当業者によって確認可能であろう。本分野において知られているとおり、タンパク分解、全身的対局所的デリバリー、及び新しいプロテアーゼ合成速度、並びに年齢、体重、全体的な健康、性別、投与時期、薬物相互作用、及び症状の重症度のための調節が必要であり、それは当業者による日常の実験による確認が可能であろう。
【０２１９】
本発明の目的のための”患者”はヒトおよび他の動物、特別には哺乳動物を含む。したがって、上記方法はヒトの治療及び獣医学的適用の両方を含む。好ましい実施態様において、上記患者は哺乳動物、好ましくは霊長類、そして最も好ましい実施態様においては患者はヒトである。
【０２２０】
本発明の受容体タンパク及びそれらの調節剤の投与は経口の、皮下の、静脈内の、鼻腔内の、経皮的な、腹腔内の、筋肉内の、肺内の、膣内の、直腸内の、又は眼内の方法を含む、上で検討した多様な方法で行われることができるが、それらに限定されない。
【０２２１】
受容体の活性は低分子アンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、シグナリングの受容体特異的な阻害、リガンド変異形又は同族体、及び受容体発現レベルの転写コントロールのような当業者に知られた多くの方法によって特異的に阻害されることができる。
【０２２２】
最も広く知られたCXCE4及び他のケモカイン受容体のアンタゴニストは脂肪族の又は芳香族の結合で結合された2のシクラム（1,4,8,11-テトラアザシクロ-テトラデカン）単位から成る化学的化合物の群であるビシクラムである（Donzella et al. Nat. Med 4:72-77(1998);Schols et al. Antiviral Res 35:147-156(1997)）。プロトタイプのビシクラム、AMD3100、の多くの誘導体がこれらの化合物のCXCR4アンタゴニスト活性を最適化するために合成された（Bridger et al. J Med Chem 42:3971-81(1999)）。
【０２２３】
アメリカカブトガニの血液細胞中に発見された抗菌ペプチドであるポリフェムシンの切断されたペプチドアナログは、特異的なCXCR4アンタゴニストであると同定された。ビシクラムのように、これらの化合物は低分子量の化合物である。しかしながら、それらは異なる構造を有し、ビシクラム耐性のHIV菌株に対して活性がある（Tamamura et al. Biochem Biophys Res Commun 253:877-82(1998); Xu et al. AIDS Res Hum Retroviruses 15:419-27(1999);Tamamura et al. Bioorg Med Chem Lett 10:2633-7(2000); Tamamura et al. Bioorg Med Chem Lett 11:359-362(2001)）。関連する分子は他の受容体の有用なアンタゴニスト又はアゴニストであるだろう。
【０２２４】
CXCR4の他のアンタゴニストは、アルギニン残基だけが存在するノナペプチドであるALX40-4C（Doranz et al. J Exp Med 186:1395-400(1997)）; ポリカチオン性のペプトイドであるCGP64222（Hamy et al. Proc Natl Acad Sci USA 94:3548-3553(1997);Daelemans et al. Mol Pharmacol 57:116-124(2000)）、及びNaya et al. （米国特許第6,140,338号）及びAtsma et al. (PCT出願公開第WO0056729号)に記載の化合物である。
【０２２５】
自然発生的なCXCR4リガンドに由来するペプチドアンタゴニストもまた知られている。ケモカインSDF-1（基質細胞由来の因子ー１）のN末端ペプチドのあるアナログはCXCR4アンタゴニストである（Loetscher et al. J Biol Chem 273:22279-22283(1998)）。加えて、Staudinger らは他のCXCR4リガンドであるHIV-1エンベロープタンパクgp120、がSDF-1の効果に効果的に拮抗することを示した（Biochem Biophys Res Commun. 280:1003-1007）。リガンドの変異形又は同族体はアンタゴニスト又はアゴニストとして働く。
【０２２６】
CXCR4活性はまた、アゴニストの結合を阻害するよりもむしろ受容体自体を妨害することによって調節され得る。Tarasova らはCXCR4の膜貫通ドメインに由来するペプチドの発現が、0.2μMもの低濃度で受容体シグナリング及びHIV複製を阻害することを示した（J Biol Chem 274:34911-34915(1999)）。受容体活性を減少させる他の方法は、特異的に染色体のDNA及び／又はRNAにハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド（Takeshi et al. EP1050583）並びにCXCR4mRNAに対して方向づけられたハンマーヘッドリボザイムのDNAをコードしているベクターのリポソーム組成物のような当業者に知られた多くの方法を用いて発現レベルを低下させることである（Eagles et al. PCT出願公開第WO/9936518号）。同様のストラテジーが他の受容体に適用可能なはずである。
【０２２７】
本発明の医薬組成物は患者に投与するために好適な形態の受容体タンパク又は調節剤を含む。好ましい実施態様において、医薬組成物は薬剤として許容可能な塩として存在するような水に溶解可能な形態であり、それは酸及び塩基の両方の付加塩を含むこと意味する。”医薬として許容可能な付加塩”とは、遊離の塩基の生物学的な有効性を保持し、生物学的又は他の意味で望ましくないものでなく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、オキサロ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタン硫酸、エタン硫酸、p-トルエン硫酸、サリチル酸等のような有機酸とともに形成される塩を示す。”薬剤として許容可能な塩基付加塩”は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などのような無機塩基に由来するものを含む。特別に好ましいのはアンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、及びマグネシウムの塩である。薬剤として許容可能な無毒の有機塩に由来する塩は1級、2級及び3級アミン、自然発生的な置換アミンを含む置換アミン、環状アミン及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、並びにエタノールアミンのような基礎的なイオン交換樹脂の塩を含む。
【０２２８】
医薬組成物はまた、１又はそれを超える以下の：血清アルブミンのようなキャリアータンパク；緩衝液；微晶質セルロース、ラクトース、コーンスターチ又は他のスターチのようなフィルター；結合剤；甘味料及び他の香料；着色剤；及びポリエチレングリコールを含むことができる。
【０２２９】
医薬組成物は投与方法に依存して多様な用量単位で投与されることができる。例えば、経口投与に好適な用量単位は、粉末、錠剤、ピル、カプセル、及びロゼンジを含むがこれらに限定されない。経口投与された場合、受容体タンパク調節剤（例えば、抗体、アンチセンス構築物、リボザイム、低有機分子など）は消化から保護されなくてはならない。これは典型的には、上記分子を酸又は酵素的加水分解に対して耐性を与える組成物と混合するか、又は上記分子をリポソーム又は保護バリアのような適切な耐性のある担体中に包むことによって達成される。作用物質を消化から保護する手段は本分野において周知である。
【０２３０】
投与のための組成物は、通常は薬剤として許容可能な担体、好ましくは水性の担体、に溶解される受容体タンパク調節剤を含む。例えば、緩衝生理食塩水等の多様な水性の担体が使用され得る。これらの溶液は滅菌され、一般的には望ましくない物質を含まない。これらの組成物は慣用の周知の滅菌技術によって滅菌されることができる。上記組成物はpHを調節する緩衝剤、毒性調節剤等のような生理学的条件に近似させるために必要とされる薬剤として許容可能な補助剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等、を含むことができる。これらの製剤中の活性のある作用物質の濃度は、選択された特定の投与方法及び患者の必要に従って広く多様であることができ、そして主として液体の容量、粘度、体重などに基づく（例えば、Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980)及びGoodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics(Hardman et al., eds., 1996)）。
【０２３１】
したがって、静脈内投与のための典型的な医薬組成物は患者１日あたり約0.1〜10mgであるだろう。特に薬物が血流中でなく、体腔、又は器官の内腔中へのように奥まった部位に投与される場合、患者１日あたり0.1〜100mgの用量が使用されることができる。非経口的に投与可能な組成物の実際の調製方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science 及び Goodman and Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, supraのように当業者に知られているか又は明らかであろう。
【０２３２】
受容体タンパクの調節剤を含む組成物は治療的又は予防的処置のために投与され得る。治療的な適用において組成物は、疾患（例えば、癌）に罹った患者に回復に十分な量又は少なくとも疾患及びその合併症を部分的に停止させる量で投与される。これを達成するのに適切な量は”治療的に有効な用量”と定義される。この使用のための有効量は疾患の重篤度及び患者の全体的な健康状態に依存するであろう。必要とされ、患者が耐えられる用量及び頻度で単回又は複数回の組成物の投与が行われる。いずれの場合にも、上記組成物は患者を効果的に治療するために十分な量の本発明の作用物質を提供しなければならない。哺乳動物の癌の発生を防ぎ、又は遅らせることのできる調節剤の量は”予防的に有効な用量”と称される。予防的処置のために必要とされる特定の用量は上記哺乳動物の医学的状態及び病歴、予防される特定の癌、並びに年齢、体重、性別、投予経路、有効性などの他の因子に依存するであろう。そのような予防的処置は、例えば癌の再発を予防すべき以前癌に罹った哺乳動物において、又は癌の発生の顕著な可能性が疑われる哺乳動物において使用されることができる。
【０２３３】
この受容体タンパク調節化合物が単独で或いは付加的な調節化合物と、又は他の治療的薬剤、例えば抗癌剤若しくは抗癌治療、と併用して投与され得ることは理解されるであろう。
【０２３４】
多くの実施態様において、1又はそれを超える核酸、例えばアンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムのような核酸配列を含むポリヌクレオチド、がin vivo 又はin vitro において細胞中に導入されるであろう。本発明はin vitro（細胞を除く）、ex vivo又はin vivo(細胞又は生物体に基づく)の組換え発現システムを用いた受容体ポリペプチド及び核酸の発現に有用な方法、試薬、ベクター、及び細胞を提供する。
【０２３５】
タンパク又は核酸の発現のために宿主細胞中へ核酸を導入するために用いられる特別な方法は適用に特異的なものである。宿主細胞中へ外来の核酸配列を導入するための多くの方法が使用されることができる。これらはリン酸カルシウムによる形質移入、スフェロプラスト、エレクトロポーレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、及び宿主細胞中へクローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNA又は他の外来の遺伝的物質を導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む（例えば、Berger & Kimmel, Guide to Moleculer Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 (Berger), Ausbel et al., eds., Current Protocols（1999年中の補遺）及びSambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Mannual(2nd ed., Vol. 1-3, 1989)を参照のこと）。
【０２３６】
好ましい実施態様において、受容体タンパク及び調節剤は治療的薬剤と同様に投与され、そして上で概説したように製剤されることができる。同様に、受容体遺伝子（完全な長さの配列及び部分的な配列の両方、又は受容体をコードする領域の制御配列）は遺伝子治療の適用において投与されることができる。当業者によって理解されるであろうとおり、これらの受容体遺伝子は遺伝子治療（すなわち、ゲノム中への取り込み）として又はアンチセンスの組成物としてのいずれかでアンチセンスの適用を含む。
【０２３７】
受容体ポリペプチド及びポリヌクレオチドはまた、HTL、CTL及び抗体応答を刺激するワクチン組成物として投与され得る。そのようなワクチン組成物は、例えば脂肪付加されたペプチド（例えば、Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341(1995)を参照のこと）、ポリ（DL-ラクチド−コ−グリコシド）（”PLG”）ミクロスフィア中に封入されたペプチド組成物（例えば、Eldridge, et al., Molec, Immunol. 28:287-294(1991); Alonso et al., Vaccine 12:299-306(1994); Jones et al., Vaccine 13:674-681(1995)を参照のこと）、免疫刺激複合体中に含まれるペプチド組成物（ISCOMS）（例えば、Takahashi et al., Nature 344:873-875(1990); Hu et al., Clin Exp Immunol. 113:235-243(1998)を参照のこと）、複数抗原ペプチドシステム（MAPs）（例えば、Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413(1988); Tam, J. Immumol. Methods 196:17-32(1996)）、多価のペプチドとして製剤されたペプチド、バリスティックデリバリーシステム中で使用されるペプチド、典型的に結晶化されたペプチド、ウイルスのデリバリーベクター（Perkus, et al., 以下の：Concepts in vaccine development(Kaufmann ed., p.379,1996); Chakrabarti, et al., Nature 320:535(1986); Hu et al., Nature 320:537(1986); Kieny, et al., AIDS Bio/Technology 4:790(1986); Top et al., J. Infect. Dis. 124:148(1971);Chanda et al., Virology 175:535(1990)中において）、ウイルス又は合成由来の粒子（例えば、Kofler et al., J. Immunol. Methods. 192:25(1996); Eldridge et al., Sem. Hematol. 30:16(1993); Falo et al., Nature Med. 7:649(1995)を参照のこと）、アジュバント（Warren et al., Annu. Rev. Immunol. 4:369(1986); Gupta et al., Vaccine 11:293(1993)）、リポソーム（Reddy et al., J. Immunol. 148:1585(1992); Rock Immunol. Today 17:131(1996)）、又は裸の若しくは粒子に吸着されたcDNA（Ulmer, et al., Science 259:1745(1993); Robinson et al., Vaccine 11:957(1993); Shiver et al., 以下の:Concepts in vaccine development (Kaufmann, ed., p.423, 1996);Cease & Berzofsky, Annu. Rev. Immunol. 12:923(1994)及びEldridge et al., Sem. Hematol. 30:16(1993)中において）、を含むことができる。受容体を介するターゲティングとしても知られている、Avant Immunotherapiutics, Inc. (Needham, Massachusetts)製品のような毒素を標的とするデリバリー技術もまた、使用されることができる。
【０２３８】
ワクチン組成物はしばしばアジュバントを含む。多くのアジュバントが水酸化アルミニウム又はミネラルオイルのような、抗原を急速な代謝から保護するように設計された物質、及びリピッドA、ボルテデラ・パータッシス（Bortadella pertussis）又はミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）由来のタンパクのような免疫応答の刺激剤を含む。あるアジュバントは、例えばフロイントの不完全アジュバント及び完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, MI）；メルクアジュバント65（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）；AS-2（SmithKline Beecham, Philadelphia, PA）；水酸化アルミニウムゲル（alum）又はリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄、又は亜鉛の塩；アクリル化チロシンの不溶性の懸濁液；アクリル化された糖；陽イオン性にまたは陰イオン性に誘導体化されたポリサッカライド；ポリホスファゼン（polyphosphazenes）；生物的分解可能なミクロスフィア；モノホスホリルリピッドA及びクイルAのように、商業的に入手可能である。GM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12などのサイトカインは成長因子のようにアジュバントとして使用されることができる。
【０２３９】
ワクチンは、DNA又はRNAが1又はそれを超えるポリペプチド又はそのフラグメントをコードしている核酸組成物として患者に投与されることができる。このアプローチは、例えば、Wolff et al., Science 247:1465(1990)並びに米国特許第5,580,859号；同第5,589,466号；同第5,804,566号；同第5,739,118号；同第5,736,524号；同第5,679,647号；PCT出願公開第WO/98/04720号に記載され、より詳細には以下に記載される。DNAに基づいたデリバリー技術の例は”裸のDNA”、容易化された（ブビバカイン、ポリマー、ペプチドを介した）デリバリー、陽イオン性の脂質複合体、及び粒子を介した（”遺伝子銃”）又は圧力を介したデリバリー（例えば、米国特許第5,922,687号）を含む。
【０２４０】
治療的又は予防的な免疫化の目的のために、本発明のペプチドはウイルス又は細菌ベクターによって発現されることができる。発現ベクターの例はワクシニア又は伝染性上皮腫のような減弱されたウイルス宿主を含む。このアプローチは例えば受容体ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入の後、組換えワクシニアウイルスは免疫原性のペプチドを発現し、それによって免疫応答を引き出す。ワクシニアベクター及び免疫化プロトコールにおいて有用な方法は例えば、米国特許第4,722,848号中に記載される。他のベクターはBCG（Bacille Calmette Guerin）である。BCGベクターはStover et al., Nature 351:456-460(1991)中に記載されている、例えば、アデノ又はアデノ関連のウイルスベクター、レトロウイルスベクター、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）ベクター、無毒化された炭素菌ベクター等である、治療的投与又は免疫化のために有用な広く多様な他のベクターが本明細書の記載から当業者に明らかとなるであろう（例えば、Shata et al., Mol Med Today 6:66-71(2000); Shedlock et al., J Leukoc Biol 68:793-806(2000); Hipp et al., In Vivo 14:571-85(2000)を参照のこと）。
【０２４１】
DNAワクチンとして遺伝子を用いる方法は周知であり、制御可能なプロモーター、又は組織特異的なプロモーターの管理下で標的とされた患者の受容体中における発現のために、受容体遺伝子又は受容体遺伝子の部分を配置することを含む。DNAワクチンに使用される受容体遺伝子は完全な長さの受容体タンパクをコードすることができるが、しかしより好ましくは上記タンパクに由来するペプチドを含む受容体の部分をコードする。1の実施態様において、患者は受容体遺伝子に由来する複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫化される。例えば、受容体遺伝子又は受容体タンパクのサブフラグメントをコードする配列が発現ベクター中に導入され、ＭＨＣクラスＩの関係におけるそれらの免役原性及び細胞毒性のあるT細胞応答を引き起こす能力についてテストされる。この方法は、細胞内エピトープを含む抗原を提示する細胞に対する細胞毒性のあるT細胞応答の発生に備える。
【０２４２】
好ましい実施態様において、DNAワクチンはDNAワクチンとともにアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。そのようなアジュバント分子はDNAワクチンによってコードされた受容体ポリペプチドに対する免疫原性の応答を増加させるサイトカインを含む。付加的な又は代替のアジュバントが入手可能である。
【０２４３】
他の好ましい実施態様においては、受容体遺伝子は癌の動物モデルを作り出すことに使用される。癌の動物モデルは、受容体調節剤のスクリーニングに使用される。例えば、受容体タンパクを過剰発現するトランスジェニック動物が作出されることができる。所望の発現レベルに依存して、多様な強さのプロモーターがトランス遺伝子を発現するために採用されることができる。また、組み込まれたトランス遺伝子のコピー数が決定され、トランス遺伝子の発現レベルの決定のために比較されることができる。そのような方法で作出された動物は癌の動物モデルとして使用され、そしてさらに受容体に関連した癌の調節剤のスクリーニングにおいて有用である。
【０２４４】
診断の及び／又は予後の適用における使用のためのキット
上で示唆された診断の、研究の、及び治療の適用における使用のために、キットも本発明によって提供される。診断の、及び研究の適用において、そのようなキットは以下の：アッセイ試薬、緩衝液、受容体の核酸又は抗体、ハイブリダイゼーションプローブ及び／又はプライマー、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、優性のネガティブ受容体ポリペプチド又はポリヌクレオチド、受容体の低分子阻害剤等のいずれか又はすべてを含むことができる。治療的な製品は、滅菌生理食塩水又は他の薬剤として許容可能なエマルジョン及び懸濁基剤を含むことができる。加えて、上記キットは本発明の方法を実行するための指示を含む指導的材料（すなわち、プロトコール）を含むことができる。指導的材料が典型的には書かれた又は印刷された材料であるが、そのようなものには限定されない。そのような指導を蓄積し、それを消費者に伝達することのできるいかなる媒体も本発明によって考慮される。そのような媒体は、電気的蓄積媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えば、CD ROM）等を含むがこれらに限定されない。そのような媒体はそのような指導的材料を提供するインターネットサイトへのアドレを含むことができる。
【０２４５】
本発明はまた、特定の受容体の調節剤のスクリーニングのためのキットをも備える。そのようなキットは容易に入手できる材料及び試薬から調製することができる。例えば、CXCR4を対象とするそのようなキットは、1又はそれを超える以下の材料：CXCR4ポリペプチド又はポリヌクレオチド、反応チューブ、及びCXCR4活性をテストするための指導書、をを含むことができる。場合により、上記キットは生物学的に活性のあるCXCR4タンパクを含む。キットの予定される使用者及び使用者の特別なニーズに依存して、広く多様なキット及び構成要素が本発明に従って調製されることができる。診断は典型的には複数の遺伝子産物の評価を含むであろう。遺伝子は病歴の又は結果のデータ中に同定されることのできる疾患の重要なパラメーターとの相関に基づいて選択されるであろう。
【０２４６】
上記の実施例が本発明の真の範囲を限定することに貢献するのではなく、むしろ例示的な目的のために示されていることは理解される。すべての出版物、一連のカタログ番号、及び本明細書中に記された特許出願は、各個別の出版物、又は特許出願が特別に及び個々に参考文献として援用されることを意図されたかのように、本明細書中に参考文献として援用されている。
【国際公開パンフレット】
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