(57)【要約】本発明は、とりわけ、グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ酵素であって、野生型酵素と比較して、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、そして第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異されて、ＥＰＳＰＳタンパク質配列が改変され、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬであるように、野生型酵素における保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に突然変異が導入されている、前記酵素を提供する。本発明はまた、こうしたＥＰＳＰＳ酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換した素材から再生したグリホサート抵抗性植物、並びにグリホサートまたは農業的に許容しうる誘導体を田畑に起用することによって、こうした植物およびグリホサート感受性雑草を含んでなる田畑で、雑草を選択的に調節する方法も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＥＰＳＰＳと比較してタンパク質配列が改変されたグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ酵素であって、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、そして第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異され、該突然変異が野生型酵素における保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に導入されて、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬとなっており、該酵素が配列Ｋ（Ａ／Ｖ）ＡＫＲＡＶＶＶＧＣＧＧＫＦＰＶＥを含まず、
該酵素が安定であり、そして以下の配列モチーフ（ｉ）から（ｖｉｉｉ）［Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、Ｚ、Ｚ１およびＺ２は、明記されるもの以外のいかなるアミノ酸でもよい］の少なくとも１つを所持することで特徴付けられる、前記グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ酵素：
（ｉ）ＡＬＬＭＺＡＰＬＡ、ＺはＳまたはＴでない；
（ｉｉ）ＥＩＥＩＺＤＫＬ、ＺはＶでない；
（ｉｉｉ）ＦＧ（Ｖ／Ｉ）（Ｋ／Ｓ）ＺＥＨ、ＺはＶでない；
（ｉｖ）ＡＬ（Ｋ／Ｒ）ＺＬＧＬ、ＺはＲでない；
（ｖ）ＧＬＸＶＥＺ１ＤＸＺ２ＸＸＸＡ（Ｉ／Ｖ）Ｖ、Ｚ１はＴでなく、そして／またはＺ２はＥでない；
（ｖｉ）ＩＴＰＰＺ１Ｋ（Ｌ／Ｖ）（Ｋ／Ｎ）Ｚ２、Ｚ１はＫでなく、そして／またはＺ２はＴでない；
（ｖｉｉ）ＴＩＺ（Ｄ／Ｎ）ＰＧＣＴ、ＺはＮまたはＬでない；
（ｖｉｉｉ）（Ｄ／Ｎ）ＹＦＸＶＬＸＺＸＸ（Ｋ／Ｒ）Ｈ、ＺはＲでない。
【請求項２】
モチーフ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）の少なくとも２つを含んでなる、請求項１記載の酵素。
【請求項３】
モチーフ（ｉ）において、ＺがＡであり；モチーフ（ｉｉ）において、ＺがＩであり；モチーフ（ｉｉｉ）において、ＺがＡであり；モチーフ（ｉｖ）において、ＺがＫ、ＴまたはＡであり；モチーフ（ｖ）において、Ｚ１がＲまたはＡ、あるいはより好ましくないがＤまたはＥであり、そしてＺ２が好ましくはＶまたはＡ、あるいはより好ましくないがＴであり；配列モチーフ（ｖｉ）において、Ｚ１がＥまたはＡであり、そしてＺ２がＰ、ＩまたはＶであり；モチーフ（ｖｉｉ）において、ＺがＲまたはＫであり；そしてモチーフ（ｖｉｉｉ）において、ＺがＴまたはＳ、あるいはより好ましくないがＱである、請求項１または２のいずれかに記載の酵素。
【請求項４】
（ｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）
（ｉｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅ；
（ｉｉｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）；
（ｉｖ）（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）；
（ｖ）（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅ；
（ｖｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅ；
（ｖｉｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）
からなる群より選択される、１以上の配列を含んでなる、請求項１記載の酵素。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＥＰＳＰＳをコードする領域を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４または５に示す配列を有する、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４または５内に位置するイントロンを構成するポリヌクレオチドで植物ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得ることが可能な、ＥＰＳＰＳをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の構成要素：
（ｉ）エンハンサーが得られる配列の転写開始点より上流の促進領域であって、そしてエンハンサーが内在性に含まれる配列においても、または構築物の一部として異種性に存在する際も、エンハンサー自体がプロモーターとして機能しない、少なくとも１つの転写エンハンサー；
（ｉｉ）ダイズＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーター；
（ｉｉｉ）ダイズＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードする、ダイズゲノム配列；
（ｉｖ）ダイズＥＰＳＰＳをコードするゲノム配列；
（ｖ）転写ターミネーター；
［ここで、ダイズＥＰＳＰＳコード配列は野生型配列と比較して改変され、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異され、該突然変異が野生型酵素における保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に導入されて、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬＴＡＡＶとなっている］
を転写の５’から３’方向に含んでなる、請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
以下の構成要素：
（ｉ）エンハンサーが得られる配列の転写開始点より上流の促進領域であって、エンハンサーが内在性に含まれる配列においても、または構築物の一部として異種性に存在する際も、エンハンサー自体がプロモーターとして機能しない、少なくとも１つの転写エンハンサー；
（ｉｉ）セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーター；
（ｉｉｉ）セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードする、セイヨウアブラナゲノム配列；
（ｉｖ）セイヨウアブラナＥＰＳＰＳをコードするゲノム配列；
（ｖ）転写ターミネーター；
［ここで、セイヨウアブラナＥＰＳＰＳコード配列は、野生型配列と比較して改変され、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異され、該突然変異が野生型酵素における保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に導入されて、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬＴＡＡＶとなっている］
を転写の５’から３’方向に含んでなる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
植物の制御可能プロモーターの発現調節下にある、葉緑体輸送ペプチド／ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＣＴＰ／ＰＰＳ）または葉緑体輸送ペプチド／ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＣＴＰ／ＰＰＤＫ）をコードする配列をさらに含んでなる、請求項５〜９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ＣＴＰおよびＰＰＤＫコード配列が、互いに関して、非異種性である、請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記促進領域が、その３’端が、エンハンサーが得られる配列の直近の転写開始点の少なくとも４０ヌクレオチド上流である配列を構成する、請求項５〜１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
促進領域が、その３’端が、前記直近の開始点の少なくとも６０ヌクレオチド上流である領域を構成する、請求項１２記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記促進領域が、その３’端が、エンハンサーが得られる配列のＴＡＴＡコンセンサスの最初のヌクレオチドより少なくとも１０ヌクレオチド上流である配列を構成する、請求項１２記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ポリヌクレオチド中でタンデムに存在する第一および第二の転写エンハンサーを含んでなる、請求項５〜１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
エンハンサーまたは第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域中のイントロンの最初のヌクレオチドの約１００から約１０００ヌクレオチド上流の間にある、請求項５〜１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
エンハンサーまたは第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域中のイントロンの最初のヌクレオチドの約１５０から約１０００ヌクレオチド上流の間にある、請求項５〜１６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
エンハンサーまたは第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域中のイントロンの最初のヌクレオチドの約３００から約９５０ヌクレオチド上流の間にある、請求項５〜１７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
エンハンサーまたは第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域中のイントロンの最初のヌクレオチドの約７７０から約７９０ヌクレオチド上流の間にある、請求項５〜１８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
エンハンサーまたは第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域中のイントロンの最初のヌクレオチドの約３００から約３８０ヌクレオチド上流の間にある、請求項５〜１９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
エンハンサーのまたは第一のエンハンサー３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域中のイントロンの最初のヌクレオチドの約３２０から約３５０ヌクレオチド上流の間にある、請求項５〜１８および２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーター上流の領域が、ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始点より上流の配列由来の、少なくとも１つのエンハンサーを含んでなる、請求項５〜２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
ＥＰＳＰＳコード配列由来のプロモーター上流の領域が、アクチン、ｒｏｌＤＦｄ、Ｓ−アデノシルホモシステイナーゼ、ヒストン、チューブリン、ポリユビキチンおよびプラストシアスニン（ｐｌａｓｔｏｃｙａｓｎｉｎ）遺伝子、並びにＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶ３５Ｓ遺伝子のものからなる群より選択されるプロモーターの転写開始点より上流の配列由来の、少なくとも１つのエンハンサーを含んでなる、請求項５〜２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターのいずれかの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびアクチン遺伝子の転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を、５’から３’方向に含んでなる第二のエンハンサーを含んでなる、請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびｒｏｌＤｆｄ遺伝子の転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を、５’から３’方向に含んでなる第二のエンハンサーを含んでなる、請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびヒストン遺伝子の転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を、５’から３’方向に含んでなる第二のエンハンサーを含んでなる、請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびチューブリン遺伝子の転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第二のエンハンサーを、５’から３’方向に含んでなる、請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ＦＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第二のエンハンサーを、５’から３’方向に含んでなる、請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
ダイズＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドの翻訳開始点を構成するコドンの５’のヌクレオチドが、コザックの好ましい配列である、請求項５〜２８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰをコードするゲノム配列の５’に、相対的に高発現される遺伝子由来の５’非翻訳リーダー配列が位置する、請求項８〜２９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記の高発現される遺伝子が、グルカナーゼ、カルコンシンターゼおよびルビスコをコードするものからなる群より選択される、請求項３０記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
ＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードするゲノム配列の５’である非翻訳領域内に位置する、ウイルス由来翻訳エンハンサーまたは非ウイルス翻訳エンハンサーを含んでなる、請求項８〜３１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性、のうちの少なくとも１つをそれを含有する植物素材に与えることが可能なタンパク質をコードする領域をさらに含んでなる、請求項５〜３２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
除草剤がグリホサート以外である、請求項３３記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
除草剤がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＧＯ）阻害剤、特にブテフェニシルであり、そして対応する抵抗性タンパク質が、ＰＰＧＯまたはその阻害剤抵抗性変異体である、請求項３４記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
昆虫抵抗性付与領域が、Ｂｔ由来の結晶毒素（分泌Ｂｔ毒素を含む）；プロテアーゼ阻害剤、レクチン、キセンホラブドゥス／フォトラブドゥス毒素をコードし；真菌抵抗性付与領域が、既知のＡＦＰ、デフェンシン、キチナーゼ、グルカナーゼ、Ａｖｒ−Ｃｆ９をコードするものからなる群より選択され；細菌抵抗性付与領域が、セクロピンおよびテキプレシン並びにそれらの類似体をコードするものからなる群より選択され；ウイルス抵抗性領域が、ウイルスコートタンパク質、移動タンパク質、ウイルスレプリカーゼをコードする遺伝子、並びにウイルス抵抗性を提供することが知られるアンチセンスおよびリボザイム配列からなる群より選択され；ストレス、塩、および干ばつ抵抗性付与領域が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびペルオキシダーゼをコードするもの、既知のＣＢＦ１制御配列を構成する配列、並びにトレハロースの集積を提供することが知られる遺伝子からなる群より選択される、請求項３３〜３５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
昆虫抵抗性付与領域が、ｃｒｙＩＡｃ、ｃｒｙＩＡｂ、ｃｒｙ３Ａ、ｃｒｙ１ＢＣ、Ｖｉｐ１Ａ、Ｖｉｐ１Ｂ、Ｖｉｐ３Ａ、Ｖｉｐ３Ｂ、システインプロテアーゼ阻害剤、およびユキノハナレクチンをコードするものからなる群より選択される、請求項３６記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれかに記載のポリヌクレオチドであって、ｍＲＮＡ不安定性モチーフおよび／または望ましくないスプライシング領域が除去され、あるいは作物に好まれるコドンが用いられるように改変され、こうして改変されたポリヌクレオチドの植物における発現により、非改変ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域の、これらが内在性である生物における発現により得られるものと、実質的に類似の活性／機能を有する、実質的に類似のタンパク質を生じる、前記ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
改変ポリヌクレオチドと、前記植物に内在的に含有されて実質的に同一のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間の同一性の度合いが、改変配列と内在性配列の間の共抑制を妨げるようなものである、請求項３８記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記度合いが約７０％未満である、請求項３９記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項４２】
請求項５〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、または請求項４１のベクターで形質転換されている、植物素材。
【請求項４３】
請求項５〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、または請求項４１のベクターで形質転換されており、そして、それを含有する植物素材に、以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性、のうちの少なくとも１つを与えることが可能なタンパク質をコードする領域を含んでなるポリヌクレオチドで、さらに形質転換されている、またはされる、植物素材。
【請求項４４】
請求項４２または４３のいずれかに記載の素材から再生されている、形態学的に正常な稔性の全植物、それらの子孫、種子および部分。
【請求項４５】
請求項５〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドで形質転換された素材から再生されている植物と、葉緑体中で上昇したレベルのホスホエノールピルビン酸を提供することが可能なタンパク質をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドで形質転換された素材の再生から生じる植物を交雑することから生じる、形態学的に正常な稔性の全植物。
【請求項４６】
前記の可能なタンパク質が、ＣＴＰおよびＰＰＳの融合体、またはＣＴＰおよびＰＰＤＫの融合体である、請求項４５記載の植物。
【請求項４７】
請求項５−４０のいずれか１つのポリヌクレオチドを含んでなり、そして請求項５−４０のいずれか１つのポリヌクレオチドまたは請求項４１のベクターで形質転換された素材から再生されている植物と、ＣＴＰ／ＰＰＳまたはＣＴＰＰＰＤＫをコードする領域、および／またはタンパク質をコードする領域であって以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性、のうちの少なくとも１つをそれを含有する植物素材に与えることが可能なものを含んでなるポリヌクレオチドで形質転換されている植物を交雑することから生じる、形態学的に正常な稔性の全植物、生じた植物の子孫、その種子および部分。
【請求項４８】
穀物、果実および野菜、例えば、カノラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、飼料ビート、セイヨウナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ、ダイズ種、サトウキビ、エンドウ、農場マメ、ポプラ、ブドウ、柑橘類、ムラサキウマゴヤシ、ライムギ、オーツムギ、芝生および飼い葉、アマおよびアブラナ、並びに、すでに特に言及されていない限り、ナッツ産生植物からなる群より選択される、請求項４４〜４７のいずれか１つに記載の植物、それらの子孫、種子および部分。
【請求項４９】
請求項４４〜４８のいずれか１つに記載のダイズ、カノラ、アブラナ、ワタ、テンサイ、ヒマワリ、エンドウ、ジャガイモおよび飼料ビート。
【請求項５０】
雑草および請求項４４〜４９のいずれか１つに記載の植物または子孫を含んでなる田畑で、雑草を選択的に調節する方法であって、該植物に実質的に影響を与えることなく、雑草を調節するのに十分な量のグリホサート型除草剤を該田畑に適用することを含んでなる、前記方法。
【請求項５１】
グリホサート除草剤の適用前または後のいずれかにおいて、次のものの１つ又はそれ以上を、該田畑に適用することをさらに含んでなる、請求項５０記載の方法：除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺細菌剤および抗ウイルス剤。
【請求項５２】
グリホサート除草剤に実質的に耐性または実質的に抵抗性である植物を産生する、以下の工程を工程を含んでなる方法：
（ｉ）植物素材を、請求項５〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたは請求項４１に記載のベクターで形質転換する工程；
（ｉｉ）こうして形質転換された素材を選択する工程；そして
（ｉｉｉ）こうして選択された素材を、形態学的に正常な稔性の全植物に再生する工程。
【請求項５３】
形質転換が素材へのポリヌクレオチドの以下の手段による導入を伴う、請求項５２記載の方法：
（ｉ）ポリヌクレオチドでコーティングされた粒子での素材への微粒子銃；または（ｉｉ）ポリヌクレオチドを含んでなる溶液でコーティングされた炭化ケイ素ファイバー上での素材の突き刺し；または（ｉｉｉ）アグロバクテリウムへのポリヌクレオチドまたはベクターの導入、そしてこうして形質転換されたアグロバクテリウムと植物素材の共培養、これにより該植物素材は形質転換され、続いて再生される。
【請求項５４】
形質転換された素材がグリホサートに対する抵抗性により選択される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
グリホサート除草剤に実質的に耐性または実質的に抵抗性である、植物組織および／または形態学的に正常な稔性の全植物の産生における、請求項５〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、または請求項４１に記載のベクターの使用。
【請求項５６】
除草剤の候補物のハイスループットｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのための除草剤標的の産生における、請求項５〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、または請求項４１に記載のベクターの使用。
【請求項５７】
目的の遺伝子を発現するよう形質転換された生物学的素材を選択する方法であって、形質転換素材が、請求項５〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、または請求項４１に記載のベクターを含んでなり、そして選択が、形質転換素材をグリホサートまたはその塩に曝露し、そして生存素材を選択することを含んでなる、前記方法。
【請求項５８】
生物学的素材が植物起源である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
植物が双子葉植物である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
双子葉植物が、ダイズ、ワタ、テンサイ、セイヨウアブラナ、ハクサイまたはキャベツからなる群より選択される、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
外来のＤＮＡを含有する稔性形質転換植物を再生するための、以下の工程を含む方法：
（ａ）形質転換しようとする前記植物から再生可能組織を産生する工程；
（ｂ）前記再生可能組織を前記の外来のＤＮＡで形質転換する工程、ここで前記の外来のＤＮＡは選択可能ＤＮＡ配列を含んでなり、前記配列は、選択装置として再生可能組織中で機能する；
（ｃ）工程（ｂ）後、約１日から約６０日の間に、工程（ｂ）由来の前記再生可能組織を、前記組織から苗条を産生することが可能な培地中に置く工程、ここで前記培地は、前記選択可能ＤＮＡ配列を含有する再生可能組織を選択するのに用いられる化合物をさらに含有し、形質転換再生組織の同定または選択を可能にする；
（ｄ）工程（ｃ）の選択された組織から少なくとも１つの苗条が形成された後、前記苗条を、前記苗条から根を産生し小植物を産生することが可能な第二の培地に移す工程、ここで第二の培地は、所望により、前記化合物を含有してもよい；そして
（ｅ）前記小植物を稔性トランスジェニック植物に成長させる工程、ここで、外来のＤＮＡは、メンデル方式で子孫植物に伝達される、
前記方法において、工程（ｂ）および工程（ｃ）の間に、形質転換素材をカルス誘導培地上に置く、所望による工程があってもよく、外来のＤＮＡは、請求項５から４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドであり、または外来のＤＮＡに含まれる選択可能ＤＮＡ配列は、該ポリヌクレオチドを含んでなり、そして前記化合物はグリホサートまたはその塩であることを特徴とする。
【請求項６２】
植物が、ダイズ、ワタ、テンサイ、セイヨウアブラナ、ハクサイまたはキャベツからなる群より選択される双子葉植物である、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記再生可能組織が、胚発生カルス、体細胞胚、未成熟胚などからなる群より選択される、請求項６１または６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
請求項１〜４のいずれか１つに記載の酵素、または請求項５〜４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドにコードされるもの、あるいは請求項５〜４１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたはベクターを検出する手段を含んでなる、診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術、そして特に、非トランスジェニック様植物と比較した際、除草剤に対する実質的な抵抗性または実質的な耐性を示すトランスジェニック植物の産生に関する。本発明はまた、とりわけ、前記トランスジェニック植物の産生に用いられ、または前記トランスジェニック植物により産生されるヌクレオチド配列（およびその発現産物）にも関する。
【０００２】
除草剤にさらされた際、実質的に該除草剤に「耐性」である植物は、同様にさらされた非耐性様植物に提供されるものに比較した際、右にシフトした用量／反応曲線を提供する。こうした用量／反応曲線は、ｘ軸にプロットされた「用量」およびｙ軸にプロットされた「殺割合」、「除草効果」などを有する。耐性植物は、典型的には、既定の除草効果を生じるため、非耐性様植物の少なくとも２倍多い除草剤を必要とするであろう。除草剤に実質的に「抵抗性」である植物は、作物を商業的な目的で成長させようとする田畑で、雑草を殺すのに、農業界で典型的に使用される濃度および割合の除草剤にさらされた際、あるとしても、わずかしか、壊死、溶解、白化または他の病変を示さない。
【０００３】
Ｎ−ホスホノメチルグリシン（およびその多様な塩）が傑出した例である、作用部位として５−エノールピルビルシキミ酸リン酸シンセターゼ（５−ｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖｙｌ ｓｈｉｋｉｍａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：以後「ＥＰＳＰＳ」）を有する除草剤（以後「グリホサート」）に、植物が実質的に抵抗性または実質的に耐性であることが、特に好ましい。
【０００４】
除草剤は、除草剤適用の通常の技術にしたがい、該除草剤に抵抗性を与えられている作物を含んでなる田畑に、発生前または後いずれかに適用してもよい。本発明は、とりわけ、こうした除草剤耐性または抵抗性植物の産生に有用なヌクレオチド配列を提供する。
【０００５】
本発明により、野生型ＥＰＳＰＳと比較してタンパク質配列が改変されているグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ酵素、すなわち第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異されており、当該突然変異が野生型酵素における保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に導入されて、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬとなっているものであって、該酵素が配列Ｋ（Ａ／Ｖ）ＡＫＲＡＶＶＶＧＣＧＧＫＦＰＶＥを含まず、その特徴として該酵素は安定であり、そして以下の配列モチーフ（ｉ）から（ｖｉｉｉ）：
（ｉ）ＡＬＬＭＺＡＰＬＡ、ＺはＳまたはＴでない；
（ｉｉ）ＥＩＥＩＺＤＫＬ、ＺはＶでない；
（ｉｉｉ）ＦＧ（Ｖ／Ｉ）（Ｋ／Ｓ）ＺＥＨ、ＺはＶでない；
（ｉｖ）ＡＬ（Ｋ／Ｒ）ＺＬＧＬ、ＺはＲでない；
（ｖ）ＧＬＸＶＥＺ１ＤＸＺ２ＸＸＸＡ（Ｉ／Ｖ）Ｖ、Ｚ１はＴでなく、そして／またはＺ２はＥでない；
（ｖｉ）ＩＴＰＰＺ１Ｋ（Ｌ／Ｖ）（Ｋ／Ｎ）Ｚ２、Ｚ１はＫでなく、そして／またはＺ２はＴでない；
（ｖｉｉ）ＴＩＺ（Ｄ／Ｎ）ＰＧＣＴ、ＺはＮまたはＬでない；
（ｖｉｉｉ）（Ｄ／Ｎ）ＹＦＸＶＬＸＺＸＸ（Ｋ／Ｒ）Ｈ、ＺはＲでない
［Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、そしてＺ、Ｚ１およびＺ２は、明記されるもの以外のいかなるアミノ酸でもよい］
のうちの少なくとも１つを有する、前記グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ酵素を提供する。
【０００６】
酵素の好ましい態様は、モチーフ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）の少なくとも２つを含んでなる。本発明の酵素の特定の態様において、モチーフ（ｉ）において、ＺがＡであり；モチーフ（ｉｉ）において、ＺがＩであり；モチーフ（ｉｉｉ）において、ＺがＡであり；モチーフ（ｉｖ）において、ＺがＫ、ＴまたはＡであり；モチーフ（ｖ）において、Ｚ１がＲまたはＡ、あるいはより好ましくないがＤまたはＥであり、そしてＺ２が好ましくはＶまたはＡ、あるいはより好ましくないがＴであり；配列モチーフ（ｖｉ）において、Ｚ１がＥまたはＡであり、そしてＺ２がＰ、ＩまたはＶであり；モチーフ（ｖｉｉ）において、ＺがＲまたはＫであり；そしてモチーフ（ｖｉｉｉ）において、ＺがＴまたはＳ、あるいはより好ましくないがＱである。前記酵素の特に好ましい態様は：
（ｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）
（ｉｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅ；
（ｉｉｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）；
（ｉｖ）（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）；
（ｖ）（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅ；
（ｖｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅ；
（ｖｉｉ）（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）
からなる群より選択される、１以上の配列を含んでなる。
【０００７】
本発明はまた、本発明の酵素をコードする領域を含んでなる、単離ポリヌクレオチド、特に、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４または５に示す配列、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４または５内に位置するイントロンを、植物ゲノムライブラリーに含まれるポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって得られる配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチドも包含する。本発明はまた、葉緑体輸送ペプチドおよび該ペプチドの３’のグリホサート抵抗性双子葉植物５−エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする領域を含んでなる単離ポリヌクレオチドであって、前記領域が、植物の制御可能（ｏｐｅｒａｂｌｅ）プロモーターの発現調節下にあり、但し、前記プロモーターが、前記領域に関し異種性でなく、そして葉緑体輸送ペプチドが、前記シンターゼに関し異種性でない、前記単離ポリヌクレオチドも含む。
【０００８】
「異種性」により、異なる供給源由来であることを意味し、そして対応して、「非異種性」は、同一供給源由来であることを意味する−が、これは、生物または組織レベルよりむしろ、遺伝子レベルである。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）ＥＰＳＰＳコード配列に関し、プロモーターがウイルスに由来し、そして該プロモーターがその発現を調節する配列が植物に由来する限り、明らかに異種性である。しかし、用語「異種性」は、本発明では、さらに狭い意味を有する。例えば、本発明に関するように、「異種性」は、ペチュニアＥＰＳＰＳコード配列が、例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現を調節するもの以外のやはりペチュニア由来のプロモーターに関して、「異種性」である。この意味では、ペチュニアＥＰＳＰＳ遺伝子に由来し、その後、同様にペチュニア由来のＥＰＳＰＳコード配列の発現の調節に用いられるペチュニアプロモーターは、前記コード配列に関し「非異種性」である。しかし、「非異種性」は、プロモーターおよびコード配列が、必ずしも１つおよび同一の（オリジナルまたは子孫）ポリヌクレオチドから得られなければならないことを意味しない。輸送ペプチドに関しても同様である。例えば、ヒマワリ由来のルビスコ葉緑体輸送ペプチドは、同様にヒマワリ（同一植物、組織または細胞）由来のＥＰＳＰＳ遺伝子のコード配列に関し、「異種性」である。ヒマワリ由来のルビスコ輸送ペプチドコード配列は、やはりヒマワリ由来のルビスコ酵素コード配列に関し、両配列の起源が、異なる細胞、組織またはヒマワリ植物に存在していてもよい、異なるポリヌクレオチドである場合でも、「非異種性」である。
【０００９】
前記ポリヌクレオチドの最も特に好ましい型は、転写の５’から３’方向に、以下の構成要素：（１）：
（ｉ）エンハンサーが得られる配列の転写開始点より上流であり、そしてエンハンサーが内在性に含まれる配列においても、または構築物の一部として異種性に存在する際も、エンハンサー自体がプロモーターとして機能しない促進領域（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）である、少なくとも１つの転写エンハンサー；
（ｉｉ）ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）ＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーター；
（ｉｉｉ）ダイズＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードする、ダイズゲノム配列；
（ｉｖ）ダイズＥＰＳＰＳをコードするゲノム配列；
（ｖ）転写ターミネーター；
［ここで、ダイズＥＰＳＰＳコード配列は、野生型配列と比較して改変され、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、そして第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異されており、当該突然変異が野生型酵素における保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に導入されて、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬＴＡＡＶとなっている］；あるいは（２）：
（ｉ）エンハンサーが得られる配列の転写開始点より上流であり、そしてエンハンサーが内在性に含まれる配列においても、または構築物の一部として異種性に存在する際も、エンハンサー自体がプロモーターとして機能しない促進領域である、少なくとも１つの転写エンハンサー；
（ｉｉ）セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｉｃｃａ  ｎａｐｕｓ）ＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーター；
（ｉｉｉ）セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードする、セイヨウアブラナゲノム配列；
（ｉｖ）セイヨウアブラナＥＰＳＰＳをコードするゲノム配列；
（ｖ）転写ターミネーター；
［ここで、セイヨウアブラナＥＰＳＰＳコード配列は、野生型配列と比較して改変され、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、そして第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異されており、当該突然変異が野生型酵素における保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に導入されて、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬＴＡＡＶとなっている］
のいずれかを含んでなる構築物を含む。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチド、特に直前の先行する段落に開示される２つは、植物の制御可能プロモーターの発現調節下にある、葉緑体輸送ペプチド／ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＣＴＰ／ＰＰＳ）または葉緑体輸送ペプチド／ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＣＴＰ／ＰＰＤＫ）をコードする配列をさらに含んでなることが可能である。ＰＰＤＫタンパク質配列が、植物において、その自己輸送ペプチドを介して、葉緑体に向けられ、そしてしたがって、直前の先行する文のポリヌクレオチドが、こうした非異種性の組み合わせをコードすることが特に好ましい。ＰＰＤＫコード配列は、単子葉または双子葉植物いずれに由来してもよいし、そしてこうしたコードされるタンパク質は、所望により、低温不安定性でない。「低温不安定性でない」によって、該酵素が、Ｕｓａｍｉら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２７，  ９６９−９８０に言及されるのと類似の実験条件下、０セ氏温度で５分間インキュベーションした際、その活性の少なくとも５０％を維持することを意味する。こうした「低温安定性」酵素は、Ｆ．ビデンティス（Ｆ．  ｂｉｄｅｎｔｉｓ）から単離された同様の酵素より、少なくとも２倍安定である。ＰＰＳまたはＰＰＤＫ酵素は、グリホサートの作用部位であり、そしてＥＰＳＰＳ酵素を含有する葉緑体において、上昇したレベルのＰＥＰを提供する。
【００１１】
ポリヌクレオチドの促進領域は、好ましくは、その３’端が、エンハンサーが得られる配列の直近の転写開始点の少なくとも４０ヌクレオチド上流である配列を構成する。ポリヌクレオチドのさらなる態様において、促進領域は、その３’端が、前記直近の開始点の少なくとも６０ヌクレオチド上流である領域を構成し、そしてポリヌクレオチドのさらなる態様において、前記促進領域は、その３’端が、エンハンサーが得られる配列のＴＡＴＡコンセンサスの最初のヌクレオチドより少なくとも１０ヌクレオチド上流である配列を構成する。
【００１２】
本発明にしたがったポリヌクレオチドは、２以上の転写エンハンサーを含んでなることが可能であり、ポリヌクレオチドの特定の態様において、エンハンサーは、タンデムに存在することが可能である。
【００１３】
本発明のポリヌクレオチドにおいて、エンハンサーまたは第一のエンハンサー（１より多く存在する場合）の３’端は、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、あるいは５’非翻訳領域中のイントロンまたは他の非翻訳リーダー配列の最初のヌクレオチド（該領域がイントロンまたは他の非翻訳配列を含有する場合）の約１００から約１０００ヌクレオチド上流の間にあることが可能である。ポリヌクレオチドのより好ましい態様において、エンハンサーの３’端、または第一のエンハンサーは、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、あるいは５’非翻訳領域中のイントロンまたは他の非翻訳リーダー配列の最初のヌクレオチドの約１５０から約１０００ヌクレオチド上流の間にあり、そしてさらにより好ましい態様において、エンハンサーの３’端、または第一のエンハンサーは、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、あるいは５’非翻訳領域中のイントロンまたは他の非翻訳リーダー配列の最初のヌクレオチドの約３００から約９５０ヌクレオチド上流の間にあることが可能である。さらにより好ましい態様において、エンハンサーの３’端、または第一のエンハンサーは、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、あるいは５’非翻訳領域中のイントロンまたは他の非翻訳リーダー配列の最初のヌクレオチドの約７７０から約７９０ヌクレオチド上流の間に位置することが可能である。
【００１４】
別の本発明のポリヌクレオチドにおいて、エンハンサーの３’端、または第一のエンハンサーは、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、あるいは５’非翻訳領域中のイントロンまたは他の非翻訳リーダー配列の最初のヌクレオチドの約３００から約３８０ヌクレオチド上流の間に位置することが可能であり、そしてこの別のポリヌクレオチドの好ましい態様において、エンハンサーの３’端、または第一のエンハンサーは、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、あるいは５’非翻訳領域中のイントロンまたは他の非翻訳リーダー配列の最初のヌクレオチドの約３２０から約３５０ヌクレオチド上流の間に位置する。
【００１５】
本発明にしたがったポリヌクレオチドにおいて、ＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーター上流の領域は、アクチン、ｒｏｌＤＦｄ、Ｓ−アデノシルホモシステイナーゼ、ヒストン、チューブリン、ポリユビキチンおよびプラストシアニン遺伝子、並びにＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶ３５Ｓ遺伝子のものからなる群より選択されるプロモーターの転写開始点より上流の配列由来の、少なくとも１つのエンハンサーを含んでなることが可能である。
【００１６】
したがって、本発明のポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびアクチン遺伝子の転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第二のエンハンサーを含んでなることが可能である。
【００１７】
あるいは、該ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびｒｏｌＤｆｄ遺伝子の転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第二のエンハンサーを含んでなることが可能である。
【００１８】
あるいは、該ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびヒストン遺伝子の転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第二のエンハンサーを含んでなることが可能である。
【００１９】
あるいは、該ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびチューブリン遺伝子の転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第二のエンハンサーを含んでなることが可能である。
【００２０】
あるいは、該ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、ＦＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第二のエンハンサーを含んでなることが可能である。
【００２１】
あるいは、該ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第一のエンハンサー、およびＦＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始点より上流の配列由来の転写促進領域を含んでなる第二のエンハンサーを含んでなることが可能である。
【００２２】
ポリヌクレオチドに存在する多様なエンハンサーの同一性および近位に関わらず、ＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドの翻訳開始を構成するコドンの５’のヌクレオチドが、コザックの好ましい配列であることが可能である。これが意味することは、当業者に公知であり、そして以下の実施例からさらに明らかとなるであろう。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドの特に好ましい態様は、ＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードする配列の上流に、グルカナーゼ、カルコンシンターゼおよびルビスコ遺伝子などの、比較的高発現される遺伝子由来の非翻訳５’リーダー配列をコードする配列を含んでなる。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードするゲノム配列の５’である非翻訳領域内に位置する、ウイルス由来翻訳エンハンサーを含んでなることも可能である。当業者は、こうした適切な翻訳エンハンサー−例えばＴＭＶ由来のオメガおよびオメガプライム配列、およびタバコ腐食ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）由来のもの−の同一性、並びにどのようにして、タンパク質発現増加の望ましい結果を得るように、こうした翻訳エンハンサーをポリヌクレオチド内に導入することが可能であるかを知っている。
【００２５】
本発明にしたがったポリヌクレオチドは、それを含有する植物素材（ｍａｔｅｒｉａｌ）に、少なくとも１つの以下の農学的に望ましい形質（ｔｒａｉｔ）：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性を与えることが可能なタンパク質をコードする領域をさらに含んでなることが可能である。こうしたポリヌクレオチドは、ＥＰＳＰＳ以外の除草剤抵抗性付与遺伝子、例えばグリホサート酸化−還元酵素（ＧＯＸ）を意図する一方、抵抗性付与遺伝子が、以下のタンパク質をコードする群より選択される可能性がある場合、除草剤はグリホサート以外であってもよい：フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チトクロムＰ４５０、アセチル−ＣＯＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）、アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素（ＰＰＯ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、ポリアミン輸送タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ブロモキシニルニトリラーゼ、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）から入手可能なｔｆｄＡ遺伝子の産物、および前記タンパク質の既知の突然変異誘発または他の改変変異体。ポリヌクレオチドが、多数の除草剤抵抗性を提供する場合、こうした除草剤は、ジニトロアニリン除草剤、トリアゾロ−ピリミジン類、ウラシル、フェニル尿素、トリケトン、イソキサゾール、アセトアニリド、オキサジアゾール、トリアジノン、スルホンアニリド、アミド、アニリド、イソキサフルトール、フルロクロリドン、ノルフルラゾン、およびトリアゾリノン型除草剤からなる群より選択可能であり、そして出現後除草剤は、グリホサートおよびその塩、グルフォシネート、アシュラム、ベンタゾン、ビアラホス、ブロマシル、セトキシジムまたは別のシクロヘキサンジオン、ジカンバ、ホサミン、フルポキサム、プロピオン酸フェノキシ、キザロホップまたは別のアリールオキシ−フェノキシプロパノエート、ピクロラム、フルオロメトロン、アトラジンまたは別のトリアジン、メトリブジン、クロリムロン、クロロスルフロン、フルメトシュラム、ハロスルフロン、スルホメトロン、イマザキン、イマゼタピル、イソキサベン、イマザモックス、メトシュラム、ピリトロバク、リムスルフロン、ベンスルフロン、ニコスルフロン、フォメサフェン、フルログリコフェン、ＫＩＨ９２０１、ＥＴ７５１、カルフェントラゾン、メソトリオン、スルコトリオン、パラコート、ジクワット、ブロモキシニルおよびフェノキサプロップからなる群より選択可能である。
【００２６】
本発明にしたがったポリヌクレオチドの特定の態様は、グリホサート、および対応する抵抗性タンパク質がＰＰＧＯまたはその阻害剤抵抗性変異体である、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＧＯ）阻害剤、特にブテフェニシル（ｂｕｔｅｆｅｎｉｃｉｌ）両方に対する抵抗性を提供する。こうした除草剤抵抗性を与える組み合わせをコードする、特に好ましい構築物は、ＰＰＧＯ阻害剤抵抗性ＰＰＧＯ酵素コード配列と組み合わせ、ＰＰＤＫまたはＰＰＳをコードする配列と組み合わせて、本発明のＥＰＳＰＳコード配列を含んでなり−こうした配列は−望ましい場合−自己輸送ペプチドによって、葉緑体に向けられ、そしてタンパク質コード配列が、細菌起源のものと対照的に、植物のものである場合、非異種性プロモーターの発現調節下にある。
【００２７】
ポリヌクレオチドが殺虫タンパク質をコードする配列を含んでなる場合、これらのタンパク質は、分泌Ｂｔ毒素を含むＢｔ由来の結晶毒素；プロテアーゼ阻害剤、レクチン、キセンホラブドゥス（Ｘｅｎｈｏｒａｂｄｕｓ）／フォトラブドゥス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）毒素からなる群より選択可能である。真菌抵抗性付与遺伝子は、既知のＡＦＰ、デフェンシン、キチナーゼ、グルカナーゼ、およびＡｖｒ−Ｃｆ９をコードするものからなる群より選択可能である。特に好ましい殺虫タンパク質は、ｃｒｙＩＡｃ、ｃｒｙＩＡｂ、ｃｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ１Ａ、Ｖｉｐ１Ｂ、Ｖｉｐ３Ａ、Ｖｉｐ３Ｂ、システインプロテアーゼ阻害剤、およびユキノハナ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）レクチンである。ポリヌクレオチドが細菌抵抗性付与遺伝子を含んでなる場合、これらは、セクロピンおよびテキプレシン（ｔｅｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）並びにそれらの類似体をコードするものからなる群より選択可能である。ウイルス抵抗性付与遺伝子は、ウイルスコートタンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ウイルスレプリカーゼをコードするもの、並びにウイルス抵抗性を提供することが知られるアンチセンスおよびリボザイム配列からなる群より選択可能であり；一方、ストレス、塩、および干ばつ抵抗性付与遺伝子は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびペルオキシダーゼをコードするもの、既知のＣＢＦ１制御配列を構成する配列、並びにトレハロースの集積を提供することが知られる遺伝子からなる群より選択可能である。
【００２８】
本発明にしたがったポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ不安定性モチーフおよび／または望ましくないスプライシング領域を除去し、あるいは作物に好まれるコドンを用い、植物において、こうして改変されたポリヌクレオチドの発現が、非改変ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域が内在性である生物における非改変ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域の発現により得られるのと、実質的に類似の活性／機能を有する、実質的に類似のタンパク質を生じるように改変し、含まれるタンパク質コード配列の発現を促進してもよい。改変ポリヌクレオチドおよび前記植物に内在的に含有され、そして実質的に同一のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間の同一性の度合いは、改変および内在性配列の間の共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を妨げるものであってもよい。この場合、配列間の同一性の度合いは、好ましくは、約７０％未満であるべきである。
【００２９】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる、生物学的または形質転換ベクターを含む。したがって、「ベクター」により、とりわけ、以下の１つ：プラスミド、ウイルス、コスミド、あるいはポリヌクレオチドを含有するよう形質転換されたまたはトランスフェクションされた細菌を意味する。
【００３０】
本発明は、前記ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換されている植物素材と共に、それを含有する植物素材に、少なくとも１つの以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性を与えることが可能なタンパク質をコードする領域を含んでなるポリヌクレオチドで、さらに形質転換されている、またはされる、こうした形質転換植物素材をさらに含む。
【００３１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された素材から再生されている植物、および葉緑体において、上昇したレベルのホスホエノールピルビン酸を提供可能なタンパク質である、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＰＰＳ）またはピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）などのタンパク質をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドで形質転換した素材の再生から生じる植物を交雑することから生じる、形態学的に正常な稔性の全植物をさらに含む。こうしたタンパク質は、適切な輸送ペプチドによって−ＰＰＤＫ酵素の場合、好ましくは自己ペプチドによって−、葉緑体に向けられる。
【００３２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有し、そして本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された素材から再生されている植物、並びにＣＴＰ／ＰＰＳまたはＣＴＰ／ＰＰＤＫをコードする領域、および／またはそれを含有する植物素材に、少なくとも１つの以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性を与えることが可能なタンパク質をコードする領域を含んでなるポリヌクレオチドで形質転換されている植物の交雑から生じる、形態学的に正常な稔性の全植物をさらに含む。本発明はまた、生じた植物の子孫、種子および部分も含む。
【００３３】
本発明の植物は、穀物（ｆｉｅｌｄ  ｃｒｏｐｓ）、果実および野菜、例えば、カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、テンサイ（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ）、ワタ（ｃｏｔｔｏｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）、イネ（ｒｉｃｅ）、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）、飼料ビート（ｍａｎｇｅｌ  ｗｏｒｚｅｌ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、マンゴー（ｍａｎｇｏ）、モモ（ｐｅａｃｈ）、リンゴ（ａｐｐｌｅ）、セイヨウナシ（ｐｅａｒ）、イチゴ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ）、バナナ（ｂａｎａｎａ）、メロン（ｍｅｌｏｎ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、ニンジン（ｃａｒｒｏｔ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、キャベツ（ｃａｂｂａｇｅ）、タマネギ（ｏｎｉｏｎ）、ダイズ種（ｓｏｙａ  ｓｐｐ）、サトウキビ（ｓｕｇａｒ  ｃａｎｅ）、エンドウ（ｐｅａ）、農場マメ（ｆｉｅｌｄ  ｂｅａｎｓ）、ポプラ（ｐｏｐｕｌａｒ）、ブドウ（ｇｒａｐｅ）、柑橘類、ムラサキウマゴヤシ（ａｌｆａｌｆａ）、ライムギ（ｒｙｅ）、オーツムギ（ｏａｔ）、芝生（ｔｕｒｆ）および飼い葉（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓｅｓ）、アマ（ｆｌａｘ）およびアブラナ（ｏｉｌｓｅｅｄ  ｒａｐｅ）、並びに、すでに特に言及されていない限り、ナッツ産生植物、その子孫、種子、および部分からなる群より選択可能である。
【００３４】
特に好ましいこうした植物には、ダイズ、カノラ、アブラナ（ｂｒａｓｓｉｃａ）、ワタ、テンサイ、ヒマワリ、エンドウ、ジャガイモおよび飼料ビートが含まれる。
【００３５】
本発明はさらに、雑草および本発明の植物またはその除草剤抵抗性子孫を含んでなる田畑で、雑草を選択的に調節する方法であって、該植物に実質的に影響を与えることなく、雑草を調節するのに十分な量のグリホサート型除草剤を該田畑に適用することを含んでなる、前記方法を含んでなる。この方法にしたがって、グリホサート除草剤の適用前または後いずれかに、１以上の除草剤、殺虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）、殺真菌剤、殺線虫剤、殺細菌剤および抗ウイルス剤を、該田畑（そしてしたがって、該田畑に含有される植物）に適用することが可能である。
【００３６】
本発明は、グリホサート除草剤に実質的に耐性または実質的に抵抗性である植物を産生する方法であって：
（ｉ）植物素材を、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換し；
（ｉｉ）こうして形質転換された素材を選択し；そして
（ｉｉｉ）こうして選択された素材を、形態学的に正常な稔性の全植物に再生する
工程を含んでなる、前記方法をさらに提供する。
【００３７】
形質転換はいかなる既知の手段によってもよいが、特に：（ｉ）ポリヌクレオチドでコーティングされた粒子での素材の微粒子銃；（ｉｉ）ポリヌクレオチドを含んでなる溶液でコーティングされた炭化ケイ素ファイバー上での素材の突き刺し（ｉｍｐａｌｅｍｅｎｔ）；または（ｉｉｉ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）へのポリヌクレオチドまたはベクターの導入およびこうして形質転換されたアグロバクテリウムと植物素材の共培養、該植物素材はこれにより形質転換され、そして続いて再生される、による、素材へのポリヌクレオチドへの導入を伴うことが可能である。特定の植物種に関して、日常的な改変を要する可能性がある、植物形質転換、選択および再生技術は、当業者に公知である。こうして形質転換された植物素材は、グリホサートに対する抵抗性によって選択可能である。
【００３８】
本発明は、グリホサート除草剤に実質的に耐性または実質的に抵抗性である、植物組織および／または形態学的に正常な稔性の全植物の産生における、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの使用をさらに提供する。
【００３９】
本発明は、目的の遺伝子を発現するよう形質転換された生物学的素材を選択する方法であって、形質転換素材が、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含んでなり、そして選択が、形質転換素材をグリホサートまたはその塩に曝露し、そして生存素材を選択することを含んでなる、前記方法をさらに含む。前記素材は、植物起源であることが可能であり、そして特に、ダイズ、テンサイ、ワタおよびアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）からなる群より選択される、双子葉植物由来であることが可能である。
【００４０】
本発明は、外来の（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡを含有する稔性形質転換植物を再生するための方法であって：
（ａ）形質転換しようとする前記植物から再生可能組織を産生し；
（ｂ）前記再生可能組織を前記の外来のＤＮＡで形質転換し、ここで前記の外来のＤＮＡは選択可能ＤＮＡ配列を含んでなり、前記配列は、選択装置として再生可能組織中で機能する；
（ｃ）工程（ｂ）後、約１日から約６０日の間に、工程（ｂ）由来の前記再生可能組織を、前記組織から苗条（ｓｈｏｏｔ）を産生することが可能な培地中に置き、ここで前記培地は、前記選択可能ＤＮＡ配列を含有する再生可能組織を選択するのに用いられる化合物をさらに含有し、形質転換再生組織の同定または選択を可能にすることが可能である；
（ｄ）工程（ｃ）の選択された組織から少なくとも１つの苗条が形成された後、前記苗条を、前記苗条から根を産生し、小植物（ｐｌａｎｔｌｅｔ）を産生することが可能な第二の培地に移し、ここで第二の培地は、所望により、前記化合物を含有する；そして
（ｅ）前記小植物を稔性トランスジェニック植物に成長させる、ここで、外来のＤＮＡは、メンデル方式で子孫植物に伝達され、外来のＤＮＡが、本発明にしたがったポリヌクレオチドであり、または外来のＤＮＡにより含まれる選択可能ＤＮＡ配列が、該ポリヌクレオチドを含んでなり、そして前記化合物がグリホサートまたはその塩である、ことで特徴付けられる、
工程を含んでなる、前記方法をさらに含む。植物は、上述のような双子葉類であることが可能であり−より好ましくは、ダイズ、カノラ、アブラナ（ｂｒａｓｓｉｃａ）、ワタ、テンサイ、ヒマワリ、エンドウ、ジャガイモおよび飼料ビートより選択されることが可能であり、そして前記再生可能組織は、胚発生カルス、体細胞胚、未成熟胚などからなることが可能である。
【００４１】
本発明はまた、本発明の酵素またはポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドにコードされる酵素を検出する、そしてしたがってこれらを含有する組織または試料を同定するのに適した手段を含んでなる、診断キットも含む。ポリヌクレオチドは−本出願に開示される酵素コード配列から容易に得ることが可能なプライマーに基づいて−当業者に知られるように、ＰＣＲ増幅によって、検出可能である。酵素自体は、例えば、酵素が含有する抗原性領域を、診断的に識別するため、酵素に対して作成された抗体の使用によって、検出可能である。
【００４２】
本発明は、関連する図および配列表と組み合わせて、以下の説明からさらに明らかとなるであろう。
【００４３】
配列のうち：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１は、セイヨウアブラナゲノムＤＮＡを示す。
【００４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２は、Ｂｎ  ＥＰＳＰＳ５（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３は、Ｂｎ  ＥＰＳＰＳ３（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４は、ＢｎＦ１（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５は、ＢｎＦ２      （ＰＣＲプライマー）を示す。
【００４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６は、ＢｎＦ３      （ＰＣＲプライマー）を示す。
【００４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７は、ＢｎＦ４      （ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８は、ＢｎＦ５      （ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９は、ＢｎＦ６      （ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０は、ＢｎＦ７（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１は、ＢｎＦ８（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２は、ＢｎＦ９（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３は、ＢｎＦ１０（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４は、ＢｎＦ１１（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５は、ＢｎＦ１２（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６は、ＢｎＸｈｏ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７は、ＢｎＭＵＴＢｏｔ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００６０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８は、ＢｎＭＵＴＴｏｐ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００６１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９は、ＢｎＮｄｅ（ＰＲＣプライマー）を示す。
【００６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０は、ＢｎＲＢＳＥＰ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００６３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１は、Ｂｒａｓｒ  １２（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２は、Ｂｒａｓｒ  １１（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３は、Ｂｎａｐｕｓ開始ｒｅｖを示す。
【００６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４は、ゲノムウォーカー１を示す。
【００６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５は、ゲノムウォーカー２を示す。
【００６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６は、ＣａＭＶ３４３（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００６９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７は、ＣａＭＶ４６Ｃ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００７０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８は、ＢｎＧＵＳＸＭａ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９は、ＦＭＶエンハンサーを示す。
【００７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０は、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサーを示す。
【００７３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１は、ダイズゲノムＥＰＳＰＳ配列クローン１／１４を示す。
【００７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２は、ダイズゲノムＥＰＳＰＳ配列クローン１／１２を示す。
【００７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３は、ＥＰＳＰＳ  １０逆方向（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４は、ＥＰＳＰＳ  ４順方向（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５は、二重突然変異を含有する、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１を示す。
【００７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６は、二重突然変異を含有する、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２を示す。
【００７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７は、ＦＭＶ３５Ｓ９０エンハンサーを示す。
【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８は、ＦＭＶ３５Ｓ４６エンハンサーを示す。
【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９は、Ｇｍ  Ｔｅｒｍ  Ｂａｍ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００８２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０は、Ｇｍ  Ｔｅｒｍ  Ｅｃｏ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００８３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１は、ＢｎＭＵＴ２ＰＳＴ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２は、ＢｎＭＵＴＫＰＮ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００８５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３は、ＧｍＲｕｂＰａｃ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００８６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４は、ＧｍＲｕｂｂｏｔ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００８７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５は、ＧｍＲｕｂｔｏｐ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６は、ＧｍＲｕｂＫｐｎ（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００８９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７は、ＺＭＰＰＤＫ１（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００９０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８は、ＺＭＰＰＤＫ２（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９は、ＥＣＰＰＳ１（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０は、ＥＣＰＰＳ２（ＰＣＲプライマー）を示す。
【００９３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１−６５は、本発明の安定なＥＰＳＰＳタンパク質に存在するモチーフを示す。
【００９４】
【実施例】
本発明の安定なグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳシンターゼをクローニングし、発現し、そして性質決定するのに有用な方法を本明細書に記載する。
【００９５】
本発明の安定なグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳは、適切な緩衝液中、３７℃で少なくとも４時間インキュベーションした後にも安定である（その触媒活性を＞〜８０％保持する）ことを特徴とする。以下に例示するように、酵素安定性実験は、実質的に精製された、部分的に精製された、またはクルードな酵素抽出物調製（例えば、後者は、グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳを発現するよう操作したトランスジェニック植物の抽出物として、または同様に、グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳをコードする導入遺伝子を発現するよう操作した微生物の抽出物として、容易に得られる）を用いて、適切に実行可能である。理想的には、グリホサート抵抗性酵素は、精製された形において、そしてその後、より実際的な植物中に似た条件下で試験するために、未精製植物抽出物中に、混入しなおした（ｓｐｉｋｅｄ  ｂａｃｋ）精製タンパク質として、両方で、安定性に関して試験する。こうした抽出物において、グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳによる酵素活性は、ある範囲のグリホサート濃度に渡って活性を試験することによって、バックグラウンド感受性内在性ＥＰＳＰＳから容易に識別可能である。グリホサートの識別濃度で（例えば、０．１ｍＭ  ＰＥＰの存在下での０．１ｍＭグリホサート）、実質的にすべての測定活性は、抵抗性酵素から生じるであろう。
【００９６】
実施例１  安定なグリホサート抵抗性ＥＰＳＰシンターゼの同定法
グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳの安定性を試験するため、酵素の試験溶液（ｐＨ〜７．０−７．５の緩衝液中、そして精製または部分的精製型で、以下に記載するように調製）を４−５時間、３７℃に加熱する。その後、加熱酵素のグリホサート抵抗性活性を、ａ）同様に調製したが、氷温で維持した試料およびｂ）同様であるが新たに調製した試料の活性と比較する。
【００９７】
本発明の安定なグリホサート抵抗性酵素は、以下に記載するようにアッセイした際、適切な対照に比較して、３７℃で５時間のインキュベーション後、元来のグリホサート抵抗性触媒活性を、失うとしても少ししか失わない（＜２０％、好ましくは＜１５％、そしてより好ましくは＜１０％）という事実によって、特徴付けられる。好ましくは、安定性実験は、実質的に純粋な酵素を用いて行うが、未精製調製を用いても、または純粋なタンパク質を未精製抽出物に混入しなおした際も、通常は、非常に類似の結果が得られるであろう。アッセイおよび酵素抽出物の調製に適切に用いられる方法は、以下にさらに詳細に記載する。グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳの安定性は、様々な他の本質的に同等の方法で（例えば、わずかにより高い温度で、より短い時間、またはより低い温度で、より長い期間、例えば２５℃で３日間、酵素を加熱することによって）、適切に評価可能である。
【００９８】
実施例２  ＥＰＳＰＳ活性のアッセイ法および動力学的定数の決定
アッセイは、一般的に、Ｋ＋イオンを陽イオン性対イオンの主要な種とし、Ｐａｄｇｅｔｔｅら、１９８７（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，  ２５８（２）５６４−５７３）の放射化学法にしたがい、行う。２５℃でｐＨ７．０の５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ＫＯＨ）中の総体積５０μｌのアッセイは、示されるように、１０％グリセロール、および５ｍＭ  ＤＴＴ、多様な基質としての（動力学的測定のため）あるいは１００または２５０μＭで固定された１４Ｃ  ＰＥＰおよび０．７５または２ｍＭのシキミ酸３リン酸（Ｋ＋塩）を含有するＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．０中に適切に希釈された精製酵素または植物抽出物（以下を参照されたい）を含有する。所望により、未精製植物抽出物のアッセイでは、アッセイはまた、５ｍＭ  ＫＦおよび／または０．１ｍＭモリブデン酸アンモニウムも含有する。アッセイは、１４Ｃ  ホスホエノールピルビン酸（シクロヘキシルアンモニウム＋塩）の添加で開始し、そして２−１０分後（２分が好ましい）、１部分の１Ｍ酢酸および９部分のエタノールの溶液５０μｌの添加で停止する。停止後、２０μｌを、シンクロパック（ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）ＡＸ１００（２５ｃｍｘ４．６ｍｍ）カラム上に装填し、そして移動相が３５分間に渡り０．５ｍｌ／分で流れる、０．２８Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．５を用いたアイソクラチック溶出を用い、クロマトグラフィーする。これらの条件下では、ＰＥＰおよびＥＰＳＰの保持時間は、個々のカラムに応じて、それぞれ、〜１９および２５分である。ＣＰ５２５ＴＲシンチレーションカウンターを、ＡＸ１００カラムの末端につなぐ。０．５ｍｌフローセルを取り付け、そしてシンチレーション物の流速（Ｕｌｔｉｍａ  Ｆｌｏ  ＡＰ）を１ｍｌ／分に設定する。ＰＥＰおよびＥＰＳＰの相対ピーク面積を統合し、標識ＰＥＰのＥＰＳＰへの変換の割合を決定する。見かけのＫｍおよびＶｍａｘ値は、Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．のＧｒａｆｉｔ３．０９ｂを用いた単純加重で双曲線に適合する最小二乗により決定する。Ｋｍ値は、一般的に、Ｋｍ／２−１０Ｋｍの範囲の８−９の多様な基質濃度および３つ組点を用い、確認する。特に明記される場合を除き、データ点は、基質のＥＰＳＰへの変換が＜３０％である解析にのみ含まれる。
【００９９】
シキミ酸−３−Ｐｉ（Ｓ３Ｐ）は以下のように調製する。０．０５Ｍシキミ酸、０．０６６５Ｍ  ＡＴＰ（Ｎａ塩）、１０ｍＭ  ＫＦ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０５Ｍ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含有する０．３Ｍ  ＴＡＰＳ、ｐＨ８．５の７ｍｌに、７５μｌの７７単位（μｍｏｌ  分−１）ｍｌ−１溶液のシキミ酸キナーゼを添加する。室温で２４時間置いた後、９５℃に簡単に加熱することにより、反応を停止する。反応溶液を、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ９中で５０倍に希釈し、そして０−０．３４Ｍ  ＬｉＣｌ２勾配を用い、Ｄｏｗｅｘ  １  Ｘ  ８−４００上での陰イオン交換により、クロマトグラフィーする。Ｓ３Ｐ分画を合わせ、凍結乾燥し、そしてその後、７ｍｌの再蒸留Ｈ２Ｏに再溶解する。その後、２８ｍｌの０．１Ｍ  Ｂａ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）２および１８９ｍｌの無水エタノールを添加する。本溶液を４℃で一晩攪拌する。三−バリウムＳ３Ｐの生じた沈殿物を収集し、そして３０ｍｌの６７％エタノール中で洗浄する。その後、洗浄沈殿物を、〜３０ｍｌの再蒸留Ｈ２Ｏに溶解する。必要に応じ、Ｋ２ＳＯ４を添加することにより、Ｓ３ＰのＫ＋塩が産生される。過剰な硫酸の添加を最小限にするよう、非常に注意する。ＢａＳＯ４沈殿物を除去し、そしてＳ３Ｐの必要な塩を含有する上清を凍結乾燥する。各塩を重量測定し、そしてプロトンＮＭＲにより解析する。こうして調製されたＳ３Ｐ調製は、プロトンＮＭＲによると、＞９０％純粋であり、そしてその重量および３１Ｐ  ＮＭＲの統合によると、硫酸カリウムの少量の残渣しか含有しない。
【０１００】
実施例３．  ＥＰＳＰＳアッセイに適した植物素材抽出物の調製
カルスまたは小植物素材（０．５−１．０ｇ）を、液体窒素で冷却した乳鉢および乳棒で、細かい凍結粉末にすり砕く。この粉末を、等体積の適切な冷却抽出緩衝液（例えば、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＤＴＴ、１．７ｍＭ「ペファブロック（ｐｅｆａｂｌｏｃ）」（セリンプロテアーゼ阻害剤）、１．５ｍＭ  ロイペプチン、１．５ｍＭ  ペプスタチンＡ、１０％ｖ／ｖグリセロールおよび１％ポリビニルピロリドンを含有する、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩衝液）に取り、再懸濁し、混合し、そして冷却遠心分離装置中で遠心分離し、破片を落とす。上清を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５の冷却ＰＤ１０カラムで、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＤＴＴおよび１０％ｖ／ｖグリセロールを含有する、ｐＨ７．５の２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩衝液に交換する。タンパク質は、ウシ血清アルブミンを用いて規準化したブラッドフォード法により、概算する。抽出物の一部を液体窒素で凍結し；一部は直ちにアッセイする。
【０１０１】
実施例４．  未精製植物素材において、ＥＰＳＰＳ活性をアッセイし、そしてグリホサートに抵抗性である総量の比率を識別する方法
植物抽出物のＥＰＳＰＳアッセイは、０．１ｍＭ  Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの非存在下または存在下いずれかで、０．１ｍＭ  １４Ｃ−ＰＥＰおよび０．７５ｍＭシキミ酸−３−Ｐｉを用い、上述のように行う。これらのアッセイ条件下で、本発明のＥＰＳＰＳの抵抗型は、＜８．５％阻害されると概算され、一方、感受性ｗ／ｔ型は、本質的に完全に阻害される（＞９８％）。したがって、グリホサートの存在下で観察される活性レベル（Ａ）は、導入遺伝子発現由来の抵抗性酵素のレベルの〜９２％に相当するとみなされ、一方、感受性ｗ／ｔ  ＥＰＳＰＳのレベルは、グリホサートの非存在下に観察されるＥＰＳＰＳ活性の総レベルからＡｘ〜１．０８を引いたものとみなされる。本発明の突然変異酵素のＶｍａｘは、ｗ／ｔ酵素のＶｍａｘの約３分の１でしかないと概算されるため（そしてｗ／ｔおよび突然変異型両方のＰＥＰのＫｍ値は、約２０μＭまたはそれ未満であると概算されるため）、内在性ｗ／ｔＥＰＳＰＳの発現レベルに比較した突然変異酵素ポリペプチドの発現レベルは、その相対観察活性の比に基づいて計算された比より、約３倍高いとみなされる。ＥＰＳＰＳポリペプチド発現の総レベル（突然変異体＋ｗ／ｔ）もまた、ウェスタンブロッティングを用いて概算する。
【０１０２】
実施例５．  大腸菌において、成熟セイヨウアブラナＥＰＳＰＳをコードするｗ／ｔ  ｃＤＮＡのクローニングおよび発現
セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ  ｃＤＮＡは、製造者によって供給される推奨にしたがい、ＢＲＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴを用いて、温室栽培セイヨウアブラナ植物から単離したＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅する。ＰＣＲは、製造者によって供給される推奨にしたがい、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｆｕターボポリメラーゼを用いて行う。既知のヌクレオチド配列（ＥＭＢＬ寄託番号Ｘ５１４７５）に基づいて、適切に設計したオリゴヌクレオチドプライマーを、増幅反応および逆転写工程に用いる。ＰＣＲ産物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯキットを用いて、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩにクローニングする。挿入物の配列は、配列決定によって確かめ、そして開始Ｍｅｔの存在を除いて、予測されるオープンリーディングフレームが、予測される成熟葉緑体セイヨウアブラナＥＰＳＰＳタンパク質のものに対応することを確認する。クローニングし、そして確認したＥＰＳＰＳ配列は、当該技術分野に知られるような、適切な制限酵素を用いて切除し、そして精製断片を、同様に消化したｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。組換えクローンは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに供給される大腸菌のコドン最適化ＲＰ株、ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入する。ＥＰＳＰＳタンパク質は、発酵培地（１００μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＬＢ）に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した後、この株で発現される。正しい予測された分子量を持つ組換えタンパク質は、（ｉ）細胞抽出物のＳＤＳゲルのクーマシー染色および空のｐＥＴ２４ａベクターで形質転換した同様の大腸菌細胞抽出物のクーマシー染色ゲルの並べた比較に基づいて、そしてｉｉ）先に精製された植物ＥＰＳＰＳタンパク質に対して作成したポリクローナル抗体を用いたウェスタン解析によって、同定する。
【０１０３】
実施例６．  グリホサート抵抗性突然変異体セイヨウアブラナＥＰＳＰＳの大腸菌におけるクローニングおよび発現
生じる反応産物が、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、そして第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異され、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬＴＡＡＶであるように、野生型酵素における保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に突然変異が導入されている、改変ＥＰＳＰＳタンパク質をコードするような、特定の変化を導入するように設計したプライマー対を用いた２つのさらなるＰＣＲのテンプレートとして、ｐＣＲＢｌｕｎｔ中のセイヨウアブラナＥＰＳＰＳ  ｃＤＮＡを用いる。セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ遺伝子の配列が知られており、そしてこの突然変異誘発を達成するプライマーを設計する方法は、当該技術分野に公知である。
【０１０４】
生じたＰＣＲ産物は、ゲル精製し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯキットを用いて、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩにクローニングする。挿入物のＤＮＡ配列およびその予測されるオープンリーディングフレームが、予測される成熟葉緑体セイヨウアブラナＥＰＳＰＳタンパク質のものに対応し（開始Ｍｅｔの存在を除く）、そしてまた望ましい変化（ＥＰＳＰＳ配列中の特定の位でのＴからＩおよびＰからＳの特定の突然変異）がコードされることを確認する。こうしてクローニングし、そして確認したセイヨウアブラナＥＰＳＰＳ配列は、適切な制限酵素を用いて切除し、そして精製断片を、同様に消化したｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。組換えクローンは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに供給される大腸菌のコドン最適化ＲＰ株、ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入する。ＥＰＳＰＳタンパク質は、発酵培地（１００μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＬＢ）に１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した後、この株で発現される。正しい予測された分子量を持つ組換えタンパク質は、ｉ）細胞抽出物のＳＤＳゲルのクーマシー染色および空のｐＥＴ２４ａベクターで形質転換した同様の大腸菌細胞抽出物のクーマシー染色ゲルの並べた比較に基づいて、そしてｉｉ）先に精製された植物ＥＰＳＰＳタンパク質に対して作成したポリクローナル抗体を用いたウェスタン解析によって、同定する。セイヨウアブラナＥＰＳＰＳのこの突然変異型は、本明細書に記載するように精製し、そして性質決定する。
【０１０５】
実施例７．  突然変異体セイヨウアブラナＥＰＳＰＳの精製および性質決定
成熟突然変異体セイヨウアブラナＥＰＳＰＳタンパク質は、〜４℃で以下のように精製する。２５ｇの細胞湿重量を、５ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２０％ｖ／ｖグリセロールを含有する、ｐＨ７．５の０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩衝液５０ｍｌ中で洗浄する。低速遠心分離後、細胞ペレットを、同一であるが２ｍＭの「ペファブロック」セリンプロテアーゼ阻害剤もまた含有する緩衝液５０ｍｌに再懸濁する。細胞は、ガラスホモジナイザーを用い、均質に懸濁し、そしてその後、Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｕｄｂｒｏｏｋｅ  Ｒｄ，  Ｗａｒｗｉｃｋ，  Ｕ．Ｋ．）Ｂａｓｉｃ  Ｚ細胞破壊装置を用い、１００００ｐｓｉで破壊する。未精製抽出物を〜３０，０００ｇで１時間遠心分離し、そしてペレットを廃棄する。硫酸プロタミン（サルミン）を、最終濃度０．２％まで添加し、混合し、そして溶液を３０分間放置する。沈殿素材を、〜３０，０００ｇで３０分間の遠心分離により除去する。アリスター（Ａｒｉｓｔａｒ）等級の硫酸アンモニウムを、飽和４０％の最終濃度まで添加し、３０分間攪拌し、そしてその後、〜２７，０００ｇで３０分間遠心分離する。ペレットを細胞破壊に用いたのと同一の緩衝液〜１０ｍｌ中に再懸濁し、さらに硫酸アンモニウムを添加し、溶液を飽和〜７０％にし、溶液を３０分間攪拌し、そして再び遠心分離し、ペレットを得て、これを、Ｓ２００緩衝液（１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２０％ｖ／ｖグリセロールを含有する１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．８））〜１５ｍｌに再懸濁する。これをろ過（０．４５ミクロン）し、Ｓ２００緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を含有するＫ２６／６０カラムに装填し、そしてクロマトグラフィーする。ＥＰＳＰＳ酵素活性に基づき検出したＥＰＳＰＳ含有分画を合わせ、そしてＳ２００緩衝液で平衡化したＨＰ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２０  ｍｌを含有するｘｋ１６カラム上に装填する。カラムをＳ２００緩衝液で洗浄し、そしてその後、同一緩衝液中の０．０Ｍから０．２Ｍ  ＫＣｌで展開させた直線勾配内で、ＥＰＳＰＳを溶出させる。ＥＰＳＰＳは、塩濃度およそ０．１Ｍ以下に対応する単一ピーク内に溶出する。ＥＰＳＰＳ酵素活性に基づき検出したＥＰＳＰＳ含有分画を合わせ、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５緩衝液（２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０％ｖ／ｖグリセロールを含有する、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５））で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５のＨｉＬｏａｄ  ｘｋ２６／６０カラム上に装填する。酵素活性に基づき同定したＥＰＳＰＳ含有分画を合わせ、そして同じＳｕｐｅｒｄｅｘ７５緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱの１ｍｌカラム上に装填する。カラムを出発緩衝液で洗浄し、そしてＥＰＳＰＳは、０．０および０．２Ｍ  ＫＣｌの間で展開させる１５ｍｌ直線勾配の過程で、単一ピークとして溶出する。ＥＰＳＰＳは、精製の本工程で、ほぼ（＞９０％）純粋で得られる。所望により、ＥＰＳＰＳを、１．０Ｍ（アリスター）硫酸アンモニウムを含有するＳｕｐｅｒｄｅｘ７５緩衝液に交換し、そして同一緩衝液で平衡化したフェニルセファロースの１０ｍｌカラム上に装填することにより、さらに精製する。ＥＰＳＰＳは、１．��および０．０Ｍ硫酸アンモニウムの間で展開させた減少硫酸アンモニウム直線勾配の過程中、初期に、単一ピークとして溶出する。
【０１０６】
これらのまたは同様の方法によって得られ、そして２ｍＭシキミ酸−３−Ｐｉの存在下で上述のようにアッセイした、セイヨウアブラナＥＰＳＰＳの精製突然変異体型は、〜５μｍｏｌ／分／ｍｇの見かけのＶｍａｘ、およびＰＥＰに関する〜２５μＭのＫｍを有する。４０μＭ  ＰＥＰでは、グリホサートのカリウム塩に対するＩＣ５０値は、〜０．６ｍＭである。突然変異体ＥＰＳＰＳのグリホサートカリウムの概算されるＫｉ値は、〜０．４５ｍＭである。
【０１０７】
実施例８．  セイヨウアブラナＥＰＳＰＳをコードするゲノムＤＮＡのクローニング
ＥＰＳＰＳをコードするセイヨウアブラナゲノムＤＮＡ断片（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）が、当該技術分野に知られる（ＧａｓｓｅｒおよびＫｌｅｅ、１９９０）。ＰＣＲプライマーＢｎＥＰＳＰＳ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）およびＢｎＥＰＳＰＳ３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）を用いて、セイヨウアブラナ変種ウェスター（Ｗｅｓｔａｒ）から単離したゲノムＤＮＡから、ＥＰＳＰＳ遺伝子を増幅する。
【０１０８】
Ｐｆｕポリメラーゼを用いて、以下の条件でＰＣＲを行う：
９４℃５分間
９４℃１分間
５５℃３０秒間
７２℃１２分間。
【０１０９】
生じた３．８ｋｂ産物は、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−Ｔｏｐｏにクローニングし、そして以下のプライマー：Ｍ１３順方向、Ｍ１３逆方向（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢｎＦ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）、ＢｎＦ２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、ＢｎＦ３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）、ＢｎＦ４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）、ＢｎＦ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）、ＢｎＦ６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）、ＢｎＦ７（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）、ＢｎＦ８（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）、ＢｎＦ９（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）、ＢｎＦ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）、ＢｎＦ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）およびＢｎＦ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）を用いて配列決定する。
【０１１０】
実施例９．  ＢｎＥＰＳＰＳをコードするゲノムＤＮＡへの突然変異の導入
望ましいＴｈｒ−ＩｌｅおよびＰｒｏ−Ｓｅｒ突然変異は、望ましいアミノ酸変化を導入するために、コドン変化を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって、セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ遺伝子に導入する。プライマーＢｎＸｈｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）およびＢｎＭＵＴＢｏｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）を用いて、ウェスターゲノムＤＮＡからＥＰＳＰＳの望ましい領域を増幅する。同様に、プライマーＢｎＭｕｔＴｏｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）およびＢｎＮｄｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）を用いて、ウェスターゲノムＤＮＡからさらなる領域を増幅する。各ＰＣＲ産物１μｌを混合し、そして重複する相補配列をアニーリングさせる。その後、プライマーＢｎＸｈｏおよびＢｎＮｄｅを用いたＰＣＲによって、産物を連結する。生じたＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定して、二重突然変異の包含に関して確認する。ＢｎＥＰＳＰＳクローン中のＸｈｏ１／Ｎｄｅ１断片を切除し、そして二重突然変異体を含有するクローニングしたＸｈｏ１／Ｎｄｅ１断片と置き換える。
【０１１１】
実施例１０．  突然変異体セイヨウアブラナＥＰＳＰＳをコードする遺伝子の上流に、ルビスコリーダー配列を有する、植物における突然変異体セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ発現のための構築物
タバコのルビスコリーダーは、ＰＣＲによって構築物に導入する。プライマーＢｎＲＢＳＥＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）およびＢｒａｓｒ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）を用いて、Ｐｆｕ−Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用い、テンプレートとしての野生型セイヨウアブラナゲノムＤＮＡ  ５０ｎｇから、産物を増幅する。生じたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４ブラントＴＯＰＯにクローニングし、そしてＮｏｔ１（ベクター由来）およびＸｈｏ１で切除可能であるように配置される、制限消化によって、同定する。その後、ルビスコリーダーは、Ｎｏｔ１／Ｘｈｏ１として、突然変異ＢｎＥＰＳＰＳクローンに導入する。
【０１１２】
実施例１１．  ゲノムウォーキングによる、セイヨウアブラナＥＰＳＰＳプロモーター（植物におけるＥＰＳＰＳ発現に有用なもの）の同定
植物遺伝子いずれかの上流または下流配列の増加した長さは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈに供給され、そして指示されるような、ゲノムウォーキングキットを用いて、得ることが可能である。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２および２３（Ｂｒａｓ  ｒ１１およびＢｎａｐｕｓ開始ｒｅｖ）に示すプライマーを用い、ゲノムウォーキカーキットに付随するプロトコルに記載される方法にしたがって、セイヨウアブラナゲノムＤＮＡを用い、セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ遺伝子の上流配列を得る。
【０１１３】
Ｂｒａｓ  ｒ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）のプライマーは、ゲノムウォーカーキットに供給されるＡＰ１プライマーと組み合わせて用い、そしてＢｎａｐｕｓ開始ｒｅｖプライマーは、ゲノムウォーカーキットに供給されるＡＰ２プライマーと共に用いる。産物は、製造者の指示にしたがって、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを用いて、ｐＣＲ−ＴＯＰＯにクローニングする。ＰｈａｒｍａｃｉａのＲｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  Ｂｅａｄｓを用い、Ｍ１３順方向および逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲを行い、どのクローンが正しいサイズの挿入物を含有するかを確かめる。これらのクローンのいくつかを用いて、ＤＮＡ調製を作成し、そしてその後、これらのＤＮＡを用いて、挿入物のヌクレオチド配列を決定する。
【０１１４】
第二の組のプライマー（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４および２５）は、以下に示すように、さらなるウォークに用いる：
ゲノムウォーカー１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４）、ＡＰ１プライマーと共に  ゲノムウォーカー２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）、ＡＰ２プライマーと共に。
【０１１５】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈのプロトコルに推奨されるものに加え、さらなるゲノム消化を行う。これらの消化には、ＡｌｕＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩおよびＲｓａＩが含まれる。その後、これらの消化したＤＮＡを、ゲノムウォーキングキットに付随するプロトコルに記載されるように行った他の消化と同一に処理する。これは、正しく、そして長いＰＣＲ産物を得る機会を増加させるために行う。再び、ＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがって、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを用いて、ｐＣＲ−ＴＯＰＯにクローニングし、そして正しいサイズの挿入物を含有する各クローン産物から得たランダムなクローンに対して、配列決定を行う。挿入物の配列を決定する。セイヨウアブラナＥＰＳＰＳの翻訳開始部位から上流の、公表配列と隣接する、およそ１ｋｂの配列を得る。
【０１１６】
実施例１２．  植物における突然変異体セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ発現のための構築物
３５Ｓエンハンサーは、プライマー、ＣａＭＶ３４３およびＣａＭＶ４６Ｃ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６および２７）を用いたＰＣＲによって、ベクターｐＭＪＢ１（図１）から増幅する。
【０１１７】
ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングし、そして配列決定する。先の実施例に記載するように得た、望ましいプロモーターは、Ｓｐｈ１部位およびＢｎＧＵＳＸｍａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８）を含有する５’プライマーを用いて、セイヨウアブラナ・ウェスターゲノムＤＮＡから増幅する。
【０１１８】
ＰＣＲ産物を直接Ｓｐｈ１およびＸｍａ１で消化し、そしてＳｐｈ１／Ｘｍａ１として３５Ｓエンハンサーを含有するｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｓｐｈ１での部分消化物）に連結する。その後、ＢｎＥＰＳＰＳプロモーターに融合させたＣａＭＶ３５ＳエンハンサーをＮｏｔ１（ベクター由来）およびＸｍａ１を用いて、ｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔから切除し、そしてタバコルビスコリーダーおよび突然変異セイヨウアブラナＥＰＳＰＳ遺伝子を含有するＰＣＲ４Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングする。ＦＭＶエンハンサー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９）またはＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０）を化学的に合成し、そしてベクターｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯにサブクローニングする。ＦＭＶエンハンサーは、Ｎｏｔ１／Ｓａｃ１としてＰＣＲ４−Ｂｌｕｎｔから切除し、そしてＮｏｔ１／Ｓａｃ１として、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー／セイヨウアブラナプロモーター／ルビスコリーダー／セイヨウアブラナＥＰＳＰＳに連結する。最終構築物を図２に示す。全発現カセットは、ＥｃｏＲ１を用いて切除し、そして植物形質転換に適したベクターに連結することが可能である。
【０１１９】
実施例１３．  植物形質転換および再生
発現カセットは、ＥｃｏＲ１を用いて、ｐＦＣＢｎＥＰＳＰＳベクターから切除し、そして例えば、ユニークなＥｃｏＲ１制限部位で、バイナリーベクターｐＢｉｎ１９に連結する。望ましい発現カセットを含有するバイナリーベクターは、Ｈｏｌｓｔｅｒｓら、１９７８に提供される形質転換凍結融解法を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４に形質転換する。タバコ形質転換および全植物再生は、Ｄｒａｐｅｒら（Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉ．  Ｐｕｂ．  １９８９）のプロトコルにしたがって、ニコチアナ・タバクム変種サムスン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｖａｒ．  Ｓａｍｓｕｎ）を用いて行う。形質転換事象は、カナマイシンを含有するＭＳ培地上で選択する。あるいは、ｐＦＣＢｎＥＰＳＰＳ、またはダイズ由来のグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ遺伝子を発現することによって、植物において、グリホサート抵抗性を搬送可能な他の構築物は、ダイズに関して記載されるように、アグロバクテリウム仲介技術を用いることなく、植物に直接導入可能である。
【０１２０】
構築物は、微粒子銃型アプローチ（例えばＳａｎｔａｒｅｍ  ＥＲ，  Ｆｉｎｅｒ，  Ｊ．Ｊ（１９９９）“半固形培地上に維持した増殖性胚形成組織を用いた、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉｌ）の形質転換”  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｐｌａｎｔ  ３５，  ４５１−４５５；ＵＳＰ−５，５０３，９９８、ＵＳＰ  ５８３０７２８）を用いるか、またはアグロバクテリウムでの感染を介するか（例えばＵＳＰ−５，０２４，９４４、ＵＳＰ−５，９５９，１７９）、いずれかで、再生可能胚形成ダイズ組織に形質転換する。再生可能胚形成ダイズ組織は、例えば、未成熟胚の子葉または他の適切な組織から得る。
【０１２１】
増殖性胚形成組織は、例えば、半固形培地上で維持することが可能である。こうした組織は、例えば、以下の方法で得る。長さ３−４ｍｍの未成熟接合子胚を、例えば、花形成２−３週間後のダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉｌ）のさやから単離する。さやは、「後ろから光をあてる（ｂａｃｋｌｉｇｈｔｉｎｇ）」ことによって、正しい長さおよび成熟度の胚が存在していることを確認可能である。その後、さやを滅菌する。未成熟胚を除去し、そして各々から軸を単離する。その後、未成熟胚を、Ｂ５ビタミン、３％スクロースおよび４０ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを含有する、ｐＨ７．０の‘Ｄ４０−Ｌｉｔｅ’半固形（０．２％ゲルライト）ＭＳ塩培地に３−４週間蒔く。胚増殖のため、その後、素材は、Ｂ５ビタミン、３％スクロース、２０ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄおよび０．２％ゲルライトを含有する、ｐＨ５．７の‘Ｄ２０’ＭＳ塩培地に移す。明るい緑の球状増殖性胚を含む素材を選択し、そして２−３週間ごとに継代培養する。
【０１２２】
照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）のため、組織の２０−２５の塊／プレートを選択し（照射前に４−５日間、継代培養）、そしてＤ２０培地を含有するプレート中央に配置する。無菌フード下で、１５分間、カバーを取ることによって、組織を１５分間乾燥させる。ＤＮＡ構築物中でコーティングした金粒子（例えば、上記参考文献に記載される方法を用いてコーティングしたもの）を、商業的に入手可能な多数の銃のいずれか１つを用いて、Ｄ２０培地上の組織に、２回照射する。さらなる例として、ＰＤＳ１０００粒子銃を用いる。粒子は、Ｋｌｅｉｎら，  １９８７，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２７，  ７０−７３に記載されるのと類似の方式で、調製し、そしてＤＮＡでコーティングすることが可能である。あるいは、例えば、微量遠心分離試験管中の６０ｍｇの金またはタングステン粒子（〜１．０μｍ）を、ＨＰＬＣ等級エタノールで反復して洗浄し、そしてその後、滅菌水で反復して洗浄する。粒子を１ｍｌの滅菌水に再懸濁し、そして微量遠心分離試験管中、５０μｌのアリコットに分配する。金粒子は４℃で、タングステン粒子は−２０℃で保管する。３ｍｇのＤＮＡを（解凍した）粒子の各アリコットに添加し、そして試験管を最速でボルテックスする。ほぼ連続ボルテックスに維持しながら、５０μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ２および２０μｌの０．１Ｍスペルミジンを添加する。さらに１０分間ボルテックスした後、試料をエッペンドルフ微量遠心分離装置中で５秒間遠心分離し、上清を抜き取り、そしてＨＰＬＣ等級エタノールを連続して添加して、粒子を洗浄する。粒子を６０μｌのエタノールに完全に再懸濁し、そしてその後、ＰＤＳ１０００粒子銃に用いる、各マクロキャリアーの表面上に１０μｌアリコットに分配する。ＰＤＳ１０００粒子銃の構成要素は、７０％エタノール中の液浸および風乾によって表面滅菌する。〜２．５ｃｍディスク内に配置した組織を含む、上述のように調製した標的プレートを、停止スクリーンから６ｃｍに置く。その後、適切に選択した破裂ディスクを照射に用いる。
【０１２３】
照射１週間後、すべての組織塊を、０．０５および５ｍＭの間の適切な選択濃度のグリホサートを含有する、ｐＨ５．７に緩衝した、Ｄ２０培地上に移す。さらに３−４週間後、すべての組織を、この濃度範囲内の増加した濃度のグリホサートを含有する新鮮なＤ２０培地に移す。さらに３−４週間後、生存組織を選択し、そしてグリホサートを含有する同様のＤ２０培地中で、３−４週間ごとに継代培養する。あるいは、グリホサート以外のいくつかの他の選択可能マーカーもまた存在する場合、選択は適切なように行うことが可能である（例えば増加する濃度のハイグロマイシンを用いる）。増殖部分をこうして維持し、そして十分な組織が得られたら、ＰＣＲによって解析して、望ましいＤＮＡに関してトランスジェニックであることを確認可能である。
【０１２４】
胚を発生させ、そして成熟させるため、組織塊を、Ｂ５ビタミン、６％マルトースおよび０．２％ゲルライトを含有する、ｐＨ５．７のＭＳ塩を含んでなるＭ６培地上に置く。６−９の塊を、２３℃で背の高いプレートに入れる。３−４週間後、胚が伸長し、そして分離して、そしてＭ６培地上の別の周期のインキュベーションに移すことが可能になる。４−６週間後、胚はクリーム色であり、そして乾燥の準備ができている。９つのこうしたクリーム色の胚を、乾燥したペトリ皿に入れ、パラフィルムで封印し、そして棚に２−３日間置く。胚は、幾分弛緩しており、そして「パリパリカリカリ（ｃｒｉｓｐｙ−ｃｒｕｎｃｈｙ）」していないはずである。
【０１２５】
乾燥胚は、ＯＭＳ（増殖制御因子不含ＭＳ培地）上に蒔くことによって、発芽させることが可能である。通常、１週間以内に起こる発芽後、植物をより大きい箱に移し、そして十分な根および苗条が形成されたら、そこから土に移す。真菌混入を防止するため、蒸留水で根からＯＭＳを洗浄することが望ましい。植物は、高湿度下で維持し、そして成長させ、そしてまず、２４時間明期下に置く。植物は、２４時間明期下で、高さ約２フィートまで成長させ、そしてその後、１６時間明期体制にシフトすることを通じて、花を咲かせ、そしてさやを形成するのを促進する。種子を収集し、そして通常の植物育種法を用いて、子孫を成長させ、交雑し、そして戻し交雑して、導入遺伝子を望ましい植物背景に移動させる。植物は、ＰＣＲ、サザン、ウェスタン、ＥＬＩＳＡおよび酵素アッセイ技術による解析を含む、通常の分子生物学法を用いて、導入遺伝子の存在および発現に関して、ルーチンで解析する。
【０１２６】
実施例１４．  安定なグリホサート抵抗性ＥＰＳＰｓをコードする遺伝子を得る方法
本発明の１つの態様において、大腸菌における発現に適したグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ遺伝子であって、例えば、本明細書に記載する、コード配列において、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位が突然変異され、そして第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異され、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬであるように、野生型酵素における以下の保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に突然変異が導入されている、前記遺伝子を構築する。
【０１２７】
本発明の安定なグリホサート抵抗性ＥＰＳＰシンターゼおよびこれらをコードする遺伝子は、その後、ランダムまたは部分的ランダム突然変異誘発法によって（例えば化学薬品またはＵＶ突然変異誘発を用いて）、非校正ＤＮＡポリメラーゼを用いることによって（例えばＸＬ１レッドなどの株において）、またはいくつかの「指示進化」アプローチのいずれか１つを用いることによって（例えばＫｕｃｈｎｅｒおよびＡｒｎｏｌｄ，  １９９７，  ＴＩＢＴＥＣＨ，  １５，  ５２３−５３０に概説されるように、またはＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ＰＮＡＳ，  ９１，  １０７４７−１０７５１に記載されるように）、広範囲の変異体を生成して、そして安定であり、そしてグリホサート抵抗性であり続けるＥＰＳＰＳを発現している遺伝子を選択することによって得られる。適切な選択手段は、例えば、突然変異遺伝子を、上昇した温度（例えば３７−４２℃）で、大腸菌のＡｒｏＡ株において、（例えば弱い恒常的プロモーターから）発現させ、そして最小培地（所望によりまた、グリホサートも含有する）中で最も増殖可能な形質転換体を選択することを含む。あるいは、培地が、選択的濃度のグリホサートを含有することを条件として、非ａｒｏＡ宿主株（好ましくは例えばｒｅｃＡ）が使用可能である。当業者は、突然変異誘発および選択の多くの方法が、本発明の範囲内で使用可能であることを認識するであろう。
【０１２８】
実施例１５．安定なグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳおよびそれらをコードする遺伝子
セイヨウアブラナＥＰＳＰＳの安定な二重突然変異体が、本発明の一例である。当業者は、本発明のこうしたＥＰＳＰＳおよびそれらをコードする遺伝子の他の例が、上述のものと同一または類似の方法を用いて、クローニング、単離および性質決定可能であることを認識するであろう。
【０１２９】
本発明のＥＰＳＰＳおよびＥＰＳＰＳ遺伝子配列において、第一の位のコード配列は、第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように突然変異され、そして第二の位は、第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように突然変異され、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬであるように、野生型酵素における以下の保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に突然変異が導入されている。
【０１３０】
本発明のＥＰＳＰＳタンパク質配列は、配列Ｋ（Ａ／Ｖ）ＡＫＲＡＶＶＶＧＣＧＧＫＦＰＶＥを有する領域を含まない点で、さらに特徴付けられる。
【０１３１】
本発明のＥＰＳＰＳタンパク質配列は、以下の（ｉ）→（ｖｉｉｉ）に列挙するアミノ酸配列モチーフの少なくとも１つを含んでなる点で、さらに特徴付けられる。
（ｉ）ＡＬＬＭＺＡＰＬＡ、ＺはＳまたはＴでない
（ｉｉ）ＥＩＥＩＺＤＫＬ、ＺはＶでない
（ｉｉｉ）ＦＧ（Ｖ／Ｉ）（Ｋ／Ｓ）ＺＥＨ、ＺはＶでない
（ｉｖ）ＡＬ（Ｋ／Ｒ）ＺＬＧＬ、ＺはＲでない
（ｖ）ＧＬＸＶＥＺ１ＤＸＺ２ＸＸＸＡ（Ｉ／Ｖ）Ｖ、Ｚ１はＴでなく、そして／またはＺ２はＥでない
（ｖｉ）ＩＴＰＰＺ１Ｋ（Ｌ／Ｖ）（Ｋ／Ｎ）Ｚ２、Ｚ１はＫでなく、そして／またはＺ２はＴでない
（ｖｉｉ）ＴＩＺ（Ｄ／Ｎ）ＰＧＣＴ、ＺはＮまたはＬでない
（ｖｉｉｉ）（Ｄ／Ｎ）ＹＦＸＶＬＸＺＸＸ（Ｋ／Ｒ）Ｈ、ＺはＲでない
ここで、Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、そしてＺ、Ｚ１およびＺ２は、示されるもの以外のいかなるアミノ酸でもよい。
【０１３２】
さらに、本発明のＥＰＳＰＳ遺伝子およびタンパク質に関して、タンパク質配列が、モチーフｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｖ）およびｖｉ）の少なくとも１つ、好ましくは少なくともこれらの２つを含んでなることが好ましい。
【０１３３】
さらに、アミノ酸配列モチーフｉ）において、Ｚは好ましくはＡであり、配列モチーフｉｉ）において、Ｚは好ましくはＩであり、配列モチーフｉｉｉ）において、Ｚは好ましくはＡであり、配列モチーフｉｖ）において、Ｚは好ましくはＫ、ＴまたはＡであり、配列モチーフｖ）において、Ｚ１は好ましくはＲまたはＡであり、そしてより好ましくないがＤまたはＥであり、一方、Ｚ２は好ましくはＶまたはＡであり、そしてより好ましくないがＴであり、配列モチーフｖｉ）において、Ｚ１は好ましくはＥまたはＡであり、一方、Ｚ２は好ましくはＰ、ＩまたはＶであり、配列モチーフｖｉｉ）において、Ｚは好ましくはＲまたはＫであり、そして配列モチーフｖｉｉｉ）において、Ｚは好ましくはＴまたはＳであり、そしてより好ましくないがＱである。
【０１３４】
さらに、本発明のいくつかのＥＰＳＰＳタンパク質配列は、これらが、以下の配列：
（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）または
（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅまたは
（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）または
（Ｉ／Ｖ）ＶＶＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）または
（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅまたは
（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧ（Ｉ／Ｌ／Ｑ）ＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）Ｅまたは
（Ｉ／Ｖ）ＶＥＧＣＧＧＫＦＰ（Ｖ／Ａ／Ｔ）（Ｓ／Ｇ）
の少なくとも１つを含んでなる点で特徴付けられる。
【０１３５】
さらに、本発明のＥＰＳＰＳ配列は、好ましくは、双子葉植物由来である。
【０１３６】
実施例１６．  ダイズ由来の安定なグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ
本発明の好ましい例は、ダイズ由来であり（例えばＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３および３４のＥＰＳＰＳ遺伝子を参照されたい）、そしてその後、実施例１５にしたがって所望により改変して、安定なグリホサート抵抗性ＥＰＳＰシンターゼを生じる、ＥＰＳＰＳタンパク質配列およびこれらをコードするＤＮＡ配列である。
【０１３７】
特に好ましいのは、ダイズ由来のＥＰＳＰシンターゼ遺伝子であって：
（ａ）第一の位の残基がＴｈｒでなくＩｌｅであるように第一の位のコード配列が突然変異され、そして第二の位の残基がＰｒｏでなくＳｅｒであるように第二の位が突然変異され、改変配列がＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬであるように、野生型酵素における以下の保存領域ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬを含んでなるＥＰＳＰＳ配列に突然変異が導入されており、
そして
（ｂ）該ＤＮＡコード配列は、コードされるタンパク質が、アミノ酸配列モチーフｉｉ）、ｉｉｉ）、ｖ）およびｖｉｉｉ）の少なくとも１つそして好ましくは２以上を含んでなるように、実施例１５にしたがって、さらに改変可能である。
【０１３８】
実施例１７  ＥＰＳＰＳをコードするダイズ部分長ｃＤＮＡのクローニング
ダイズＲＮＡは、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬに記載されるようにＴｒｉＺｏｌＴＭ試薬、および縮重プライマーＥＰＳＰＳ１０逆方向（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５）と共に、製造者に提供されるプロトコルを用い、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて合成した第一鎖ｃＤＮＡを用い、単離する。ＰＣＲは、テンプレートとして、逆転写したダイズ第一鎖ｃＤＮＡ産物、並びにプライマー、ＥＰＳＰＳ４順方向（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４）およびＥＰＳＰＳ１０逆方向（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３）を用いて、製造者に供給されるプロトコルにしたがって、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＴＭに供給される、すぐ使用できる（ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｇｏ）ＰＣＲビーズを用いて行う。
【０１３９】
以下のＰＣＲ条件を用いる：
１．９４℃３分間、１周期
２．９４℃４５秒間
５０℃３０秒間
７２℃１分間、２５周期
３．７２℃１０分間、１周期。
【０１４０】
およそ１ｋｂの得られた産物は、製造者の推奨にしたがい、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ２．１にクローニングする。コロニーをランダムに選び取り、そしてＱＩＡｐｒｅｐミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたプラスミド調製を介して、さらなる実験のために選択し、その後、ＥｃｏＲＩで消化して、これらのクローン中の挿入物のサイズを示す。期待される１ｋｂの挿入物を含有するクローンを増殖させる。選択したクローンのポリヌクレオチド配列は、ＡＢＩ３７７自動化配列決定装置を用いて決定する。データベース検索は、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）を用いて行い、そしてこれによって、配列決定したクローンの大部分が、既知の植物ＥＰＳＰＳ配列に高い相同性を示す、部分長ｃＤＮＡを含有することが示される。
【０１４１】
実施例１８  ダイズＥＰＳＰＳをコードするゲノムポリヌクレオチド配列の単離
ラムダＦｉｘＩＩ中に構築されたダイズゲノムライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入し、そして１，０００，０００クローンを、供給者のプロトコルにしたがって蒔く。Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋フィルターを用いて、ライブラリープレートからリフトを作成し、そしてこれらを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａに供給されるプロトコルおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）にしたがって、プロセシングした。膜へのＤＮＡのＵＶクロスリンクは、ＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行う。ダイズＥＰＳＰＳ  ｃＤＮＡプローブは、ダイズＥＰＳＰＳ部分長ｃＤＮＡ配列を含有するクローンを、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてアガロースゲル電気泳動によって、１ｋｂ産物を精製することによって、調製する。プローブは、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ  ＤＮＡ標識キット（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、３２Ｐ  ｄＣＴＰで標識する。Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ緩衝液（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）中で、フィルターをプレハイブリダイズし、そしてハイブリダイズする。洗浄は、０．１ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳを用いて、６５℃で行う。その後、フィルターをサランラップでくるみ、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載されるように、増感スクリーンを含有するカセット中で、フィルムに曝露する。
【０１４２】
ハイブリダイズしたプラークをＳＭ緩衝液に摘み取り、より低い密度で再度蒔き、そしてさらに２回の精製周期を通じて、再スクリーニングする。ファージＤＮＡは、当該技術分野に公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて、プラーク純粋ファージストックから回収する。回収したファージＤＮＡをＮｏｔ１で消化し、そしてゲノムＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングする。生じたベクターを、ＴＯＰ１０大腸菌に形質転換する。生じたクローンは、製造者に提供されるプロトコルを用いて、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＥＢ）を用い、配列決定する。簡潔には、十分なバッチの９６ＧＰＳ事象を選択し、そしてＱｉａｇｅｎＴＭ  Ｂｉｏｒｏｂｏｔを用いて、ＤＮＡを調製する。ＡＢＩ３７７自動化配列決定装置を用いて、ＮＥＢに供給されるようなＧＰＳ−ＳおよびＧＰＳ−Ｎプライマーで、ＤＮＡを配列決定した。Ｓｅｑｍａｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ）を用いて、配列データを解析する。ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子は、Ｂｌａｓｔアルゴリズムを用いて、既知のＥＰＳＰＳに対する相同性によって、同定する。既知のＥＰＳＰＳに高い相同性を示す、２つのコンティグ含有配列の配列をＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８に示し、そしてそれぞれ、ＧｍＥＰＳＰＳ１／１４およびＧｍＥＰＳＰＳ１２と名づける。これらの遺伝子の図式的表示を図３および図４に提供する。
【０１４３】
当業者は、ダイズに存在する他のＥＰＳＰＳ遺伝子がある可能性があり、そしてこれらは、本実施例に記載するのと同様の方法論を用いて単離し、そしてヌクレオチド配列決定することが可能であると、理解するであろう。
【０１４４】
実施例１９  ダイズＥＰＳＰＳ遺伝子を宿する植物形質転換ベクターの産生
２つのエンハンサーの組み合わせ、ＦＭＶ３５Ｓ９０（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７）およびＦＭＶ３５Ｓ４６（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８）は、化学的に合成し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐａｃ１を用いて、ベクターｐＴＣＶ１００１（図５）にサブクローニングする。ダイズＥＰＳＰＳターミネーター、およびコード配列の小さい領域は、テンプレートとしてクローンＧｍＥＰＳＰＳ１／１４を用いて、プライマーＧｍＴｅｒｍＢａｍ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９）およびＧｍＴｅｒｍＥｃｏ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０）を用いたＰＣＲによって得る。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングし、配列決定し、そしてＰｓｔ１およびＥｃｏＲ１を用いて切除し、そしてＦＭＶ／ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサーを含有するｐＴＣＶ１００１ベクターに連結する。最後に、どちらかのＧｍＥＰＳＰＳ１／１４中のダイズＥＰＳＰＳ遺伝子の大部分を含有する、Ｐａｃ１：ＢａｍＨ１  ＤＮＡ断片を切除し、そしてエンハンサーおよびターミネーター両方を含んでなるｐＴＣＶ１００１ベクターにクローニングする。
【０１４５】
実施例２０  ＥＰＥＰＳ遺伝子への突然変異の導入
グリホサートに対する耐性を増加させるのに必要な、望ましいＴｈｒからＩｌｅおよびＰｒｏからＳｅｒへの突然変異は、以下の方式で構築物に挿入する。望ましいアミノ酸突然変異を生じるヌクレオチド変異を含有する、プライマーＢｎＭＵＴ２ＰＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１）は、テンプレートとしてのＧｍＥＰＳＰＳ１／１４と共にｐｆｕ−ＴＵＲＢＯポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたＰＣＲにおいて、プライマーＢｎＭＵＴＫＰＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２）と組み合わせて用いる。ここで望ましい突然変異を含有するＰＣＲ産物をｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングし、そして配列決定する。その後、これをＫｐｎ１Ｐｓｔ１として切除し、そしてＷＴ配列を含有するｐＴＣＶ１００１中の構築物において、対応する断片を置き換えるのに用いる。最終ベクターは、ｐＴＣＶＧＭＥＰＳＰＳ（図６）と称する。
【０１４６】
実施例２１  ５’ＵＴＬの導入
リブロース二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ）またはタバコグルカナーゼ由来の小サブユニットなどの、さらなる５’ＵＴＬを、ＰＣＲによって、構築物に挿入することが可能である。さらに、ＡＵＧ翻訳開始コドンを取り巻く背景を最適化して、コンセンサスコザック配列ＡＣＣＡＵＧＧを生じる。ＳＳＵルビスコリーダーに関して、プライマーＧｍＲｕｂＰａｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３）およびＧｍＲｕｂｂｏｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４）を用いて、ダイズＥＰＳＰＳ遺伝子の５’ＵＴＬにダイズルビスコ５’ＵＴＬを導入する。その後、ＧｍＲｕｂＴｏｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５）およびＧｍＲｕｂＫｐｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６）を用いて、ダイズＥＰＳＰＳ遺伝子の第一のエクソンにダイズルビスコ５’ＵＴＬを導入する。その後、プライマーＧｍＲｕｂＰａｃおよびＧｍＲｕｂＫｐｎを用いたＰＣＲによって、２つのＰＣＲ産物を連結し、そして生じた産物を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングし、そして配列決定する。ＰＣＲ産物の信頼性を確認したら、Ｐａｃ１：Ｋｐｎ１としてＰＣＲ４ベクターから切除し、そしてベクターｐＴＣＶＧＭＥＰＳＰＳ中のＰａｃ１／Ｋｐｎ１制限断片を置き換えるのに用いる。
【０１４７】
これらの実施例は、植物において、グリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ酵素を産生可能なコード配列中に、特定の突然変異を含有するダイズＥＰＳＰＳ遺伝子に融合させた２つのエンハンサーを含んでなるＤＮＡ配列の構築を概略する。当業者は、エンハンサーをプロモーターおよび転写開始部位上流の多様な距離に導入して、植物細胞において、二重突然変異体ＥＰＳＰＳダイズ遺伝子の転写速度および／または量を増進するよう作用させることが可能であると理解するであろう。距離は、各個々の遺伝子に関して、経験的に決定しなければならない可能性がある。これは、エンハンサーを二重突然変異体ＥＰＳＰＳダイズ遺伝子の転写開始点から異なる距離で融合させた、いくつかの構築物を作成し、そしてこれらの構築物を植物素材に導入し、そして選択した濃度のグリホサートに対する抵抗性に関して、素材をアッセイすることを伴う。当業者はまた、エンハンサーの選択は、ＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶエンハンサーに制限されるのでなく、とりわけ、アクチン遺伝子、ユビキチン遺伝子、マンノピン、ノパリンおよびオクトピンシンターゼ遺伝子、コメリナイエローウイルス（ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｉｒｕｓ）、およびジャガイモウイルスＹおよびＸコートタンパク質などの植物で発現される他の植物ウイルス由来の遺伝子由来のエンハンサーを含む、植物で高発現する遺伝子いずれか由来のエンハンサーも含んでもよいことも理解するであろう。５’ＵＴＲの選択は、ダイズ小サブユニットルビスコに限定されなくてもよく、そして他の遺伝子由来のリーダーが使用可能である。
【０１４８】
実施例２２  植物形質転換および再生
発現カセットは、Ｘｍａ１を用いてｐＴＣＶＧＭＥＰＳＰＳベクターから切除し、そしてユニークなＸｍａ１制限部位で、バイナリーベクターｐＢｉｎ１９に連結する。望ましい発現カセットを含有するバイナリーベクターは、Ｈｏｌｓｔｅｒｓら、１９７８に提供される形質転換凍結融解法を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４に形質転換する。タバコ形質転換および全植物再生は、Ｄｒａｐｅｒら（Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉ．  Ｐｕｂ．  １９８９）のプロトコルにしたがって、ニコチアナ・タバクム変種サムスンを用いて行う。形質転換事象は、カナマイシンを含有するＭＳ培地上で選択する。
【０１４９】
あるいは、ＰＴＣＧＭＥＰＳＰＳ、またはダイズ由来のグリホサート抵抗性ＥＰＳＰＳ遺伝子を発現することによって、植物において、グリホサート抵抗性を搬送可能な他の構築物は、ダイズに関して、以下：Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．（１９９０），  ７９（１），  ２１０−１２；ＵＳＰ−５，９６８，８３０；ＷＯ−００４２２０７；およびＵＳＰ−５，９５９，１７９を含むいくつかの参考文献に記載されるように、そして実施例１３に記載するように、アグロバクテリウム仲介技術を用いることなく、植物に直接導入可能である。
【０１５０】
実施例２３  トランスジェニック植物の解析
形質転換体のＰＣＲ解析
葉試料を形質転換株から採取し、そして既知の方法にしたがってＤＮＡを抽出した。導入遺伝子内の特定の領域に対してオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、試験した植物素材におけるその検出を可能にする。
【０１５１】
ＲＮＡ解析
導入遺伝子をコードするｍＲＮＡの存在は、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを用いて、植物内で検出する。総ＲＮＡは、Ｔｒｉ試薬および製造者（ＳｉｇｍａＴＭ）に提供されるプロトコルを用いて、葉組織から抽出する。ブロットは、存在する方法を用いて調製し、そして放射標識ダイズＥＰＳＰＳ  ｃＤＮＡを用いて探査する（ｐｒｏｂｅｄ）。
【０１５２】
タンパク質解析
トランスジェニック植物中の組換えタンパク質の存在は、標準的プロトコルを用い、組換えダイズＥＰＳＰＳに対して作成した抗体と共に、ウェスタンブロッティング法を用いて決定する。
【０１５３】
酵素アッセイ
抵抗性ＥＰＳＰＳ活性は、１４Ｃ放射標識基質およびＨＰＬＣによる産物検出を用いて、植物中で検出する。
【０１５４】
除草剤耐性試験
組織培養後、トランスジェニック植物は、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ植木鉢配合土第３番を含有する５インチ植木鉢に移す。植物は、温室内で順応させ（およそ２週間）、そしてトラックスプレー装置を用いて、空中組織に、多様な濃度で適用したグリホサートを処方する。グリホサートに抵抗性であるものを同定する、形質転換植物の視覚的評価は、適用２１日後に行う。
【０１５５】
実施例２４  プラスチドを標的とするピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）またはホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＰＰＳ）構築物の導入
自己輸送ペプチド配列を含有する、トウモロコシ由来のＰＰＤＫをコードするｃＤＮＡ（ＥＭＢＬ寄託番号Ｊ０３９０１）は、プライマーＺＭＰＰＤＫ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７）およびＺＭＰＰＤＫ２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８）を用いて、トウモロコシ組織からＲＴ−ＰＣＲによって増幅する。ＲＴ−ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯにクローニングし、そして配列決定して信頼性を確認する。トウモロコシＰＰＤＫ遺伝子は、Ｎｃｏ１／Ｋｐｎ１断片としてｐＣＲ２．１ベクターから切除し、そして同様に消化したｐＭＪＢ１（図１）に連結する。その後、植物発現カセットを、さらなる植物形質転換前に、ｐＴＣＶＧＭＥＰＳＰＳカセット（図６）にサブクローニングする。フラベリア・ブラウニー（Ｆｌａｖｅｒｉａ  ｂｒｏｗｎｉｉ）由来の低温安定性ＰＰＤＫをコードするもの（ＥＭＢＬ寄託番号ＡＡＱ９４６４５）またはイネ由来のものなどの、他のＰＰＤＫ遺伝子は、同様の戦略を用いて操作可能である。同様に、大腸菌においてＰＰＳをコードする遺伝子（ＥＭＢＬ寄託番号Ｘ５９３８１）は、オリゴＥＣＰＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９）およびＥＣＰＰＳ２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０）を用いて、ＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ産物は、植物の制御可能プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなど）、葉緑体輸送シグナル配列（ルビスコの小サブユニット由来のものなど）、およびターミネーター（ＮＯＳなど）を含有する、植物発現カセットにクローニングする。
【０１５６】
配列表
【０１５７】
【化１】
2004528808.tif 000002
【０１５８】
【化２】
2004528808.tif 000003
【０１５９】
【化３】
2004528808.tif 000004
【０１６０】
【化４】
2004528808.tif 000005
【０１６１】
【化５】
2004528808.tif 000006
【０１６２】
【化６】
2004528808.tif 000007
【０１６３】
【化７】
2004528808.tif 000008
【０１６４】
【化８】
2004528808.tif 000009
【０１６５】
【化９】
2004528808.tif 000010
【０１６６】
【化１０】
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【０１６７】
【化１１】
2004528808.tif 000012
【０１６８】
【化１２】
2004528808.tif 000013
【０１６９】
【化１３】
2004528808.tif 000014
【０１７０】
【化１４】
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【０１７１】
【化１５】
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【０１７２】
【化１６】
2004528808.tif 000017
【０１７３】
【化１７】
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【０１７４】
【化１８】
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【０１７５】
【化１９】
2004528808.tif 000020
【０１７６】
【化２０】
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【０１７７】
【化２１】
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【０１７８】
【化２２】
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【０１７９】
【化２３】
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【０１８０】
【化２４】
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【０１８１】
【化２５】
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【０１８２】
【化２６】
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【０１８３】
【化２７】
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【０１８４】
【化２８】
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【０１８５】
【化２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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