(57)【要約】ピノレン酸及び／またはその誘導体を含む組成物の外用塗布によって老化肌、敏感肌、乾燥肌、しわ肌及び／または光損傷肌を治療する化粧方法。本発明はまたこのような化粧的治療に適した組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）有効量のピノレン酸と、
（ｂ）皮膚科学的に許容されるビヒクルと、
から成る外用組成物。
【請求項２】
ピノレン酸が外用組成物中に外用組成物の０．１−５重量％のレベルで存在することを特徴とする請求項１に記載の外用組成物。
【請求項３】
ピノレン酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することから成る、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供する化粧方法。
【請求項４】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供する外用組成物におけるピノレン酸及び／またはその誘導体の使用。
【請求項５】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える外用組成物を製造するためのピノレン酸及び／またはその誘導体の使用。
【請求項６】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善に使用するためのピノレン酸及び／またはその誘導体。
【請求項７】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善に使用するための、（ｉ）有効量のピノレン酸及び／またはその誘導体と、（ｉｉ）化粧的及び／または皮膚科学的に許容されるビヒクルと、から成る外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、皮膚の状態及び外観を改善する化粧方法、並びに、皮膚の状態及び外観を改善する外用組成物を製造するためのピノレン酸の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
皮膚は、皮膚科学的な異常、苛酷な環境（風、エアコンディショニング、セントラルヒーティング）、または、正常な老化の進行（加齢老化）などによって衰える。皮膚が日光を浴びると皮膚の老化が加速される（光老化）。皮膚の外観及び状態を改善する化粧組成物及び化粧方法に対する要望は近年になって著しく増大した。
【０００３】
消費者は、小じわ、深いしわ、たるみ、色素沈着過剰及び老人斑のような皮膚の加齢老化及び光老化の目に見える徴候を治療したりまたはその出現を延期させる“老化防止用”化粧品を益々求めるようになっている。
【０００４】
消費者が老化防止に加えて別の有益な効果を化粧品に求めることも少なくはない。また、“敏感肌”という概念は、敏感肌、乾燥肌及び／または剥落肌の外観及び状態を改善し、赤焼け肌および／または刺激肌を鎮静する化粧品に対する消費者の要望を喚起した。しみ、吹出物、汚点などを治療する化粧品も消費者の要望の対象になっている。
【０００５】
全身治療用の化粧用配合物にピノレン酸のような脂肪酸を使用することは公知である。例えば、松果油（ピノレン酸含有）が抗炎症作用を有し得ることは（例えばＷＯ９８／４３５１３から）公知であり、この物質は爪やすりの使用によって感染症が生じることを防ぐ目的で爪やすりをコートするために使用されている。
【０００６】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする課題）
我々はここに意外にも、明らかにされていなかったピノレン酸の別の特性を発見し、皮膚に外用塗布する化粧組成物中でこれらの特性はこれまで明らかにされていなかったスキンケア効果を与えるために有効であることを知見した。
【０００７】
我々はいまや、小じわ、深いしわ、たるみ、色素沈着過剰及び老人斑のような加齢老化または光老化に起因する正常な皮膚状態の有効な治療及び予防がピノレン酸またはその誘導体を含む化粧組成物を皮膚に塗布することによって得られることを知見した。我々はまた、化粧組成物中にピノレン酸を使用すると、老化防止に加えて、敏感肌及び／または刺激肌の鎮静、皮膚の弾力的回復力の改善、皮膚の乾燥／剥落の抑制、皮膚の増殖過剰の抑制のような別の有益な効果が有利に得られることを知見した。
【０００８】
（課題を解決するための手段）
従って、本発明の第一の目的は、有効量のピノレン酸を含んでおりヒトの皮膚に塗布される外用組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的によれば、ピノレン酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することから成る、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える化粧方法が提供される。
【００１０】
本発明はまた、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える外用組成物中のピノレン酸及び／またはその誘導体の使用を包含する。
【００１１】
従って、本発明による方法及びピノレン酸の使用は、肌の弾力性を改善して肌の滑らかさ及びしなやかさを向上させ、しわ及び老化肌の出現を抑制または延期し、皮膚の色を改善するという老化防止効果を与える。皮膚の外観、きめ及び状態の全般的な改善、特に輝き、透明さに関する改善が達成され、全体的に若々しい外観が得られる。本発明の方法及び使用はまた、敏感肌及び／または刺激肌の軽減及び鎮静に有益である。従って本発明方法は広い範囲のスキンケア効果を有利に提供する。
【００１２】
本文中に使用された“治療する”という用語は、しわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または刺激肌のような上述の皮膚状態の出現を抑制、延期及び／または予防すること、皮膚の質を全般的に強化すること、また、ひふのしわを減らし、皮膚の柔軟性、緻密さ、滑らかさ、しなやかさ及び弾力性を増すことによって皮膚の外観及びきめを改善することをその範囲内に包含する。本発明による化粧方法及びピノレン酸及びその誘導体の使用は、しわ、老化、光損傷、乾燥及び刺激の状態が既に生じている皮膚の治療に有効であり、あるいは、正常な老化／光老化過程による上記のような劣化性変化を予防または抑制するために若年者の治療にも有効であろう。
【００１３】
ピノレン酸は５、９及び１２位に３つの二重結合を有している不飽和長鎖（Ｃ１８）脂肪酸である。ピノレン酸は例えば松果油中に約２５％のレベルで見出されるであろう。
【００１４】
本発明はまた、ピノレン酸部分を含む遊離酸の誘導体を包含する。好ましい誘導体としては、エステル（例えば、レチニルエステル、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えば、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩、アンモニウム塩）のような酸のカルボキシル基の置換によって得られた誘導体、及び／または、アルファヒドロキシ及び／またはベータヒドロキシ誘導体のようなＣ１８炭素鎖の置換によって得られた誘導体がある。
【００１５】
トリグリセリドエステル誘導体の場合、グリセロール主鎖のピノレン酸置換基の全ての位置異性体が包含される。トリグリセリドは少なくとも１つのピノレン酸部分を含有していなければならない。例えば、グリセロール主鎖の３つのエステル化可能な位置のうちで、１位または２位がピノレン酸でエステル化され、３位が別の脂質でエステル化されていてもよく、あるいは、グリセロール主鎖の１位及び３位がＰＡによってエステル化され、２位が別の脂質によってエステル化されていてもよい。
【００１６】
従って、ピノレン酸トリグリセリドに富む油も本発明に使用されるのに適しているであろう。
【００１７】
本明細書で“ピノレン酸”という用語を使用するとき、この用語が常にピノレン酸部分を含む誘導体も含意することを理解されたい。“ピノレン酸部分”という用語はピノレン酸誘導体の（１つまたは複数の）ピノレン酸脂肪アシル部分を意味する。
【００１８】
本発明に有効成分として使用されるピノレン酸は外用組成物中に有効量で存在する。通常は有効成分の全量が組成物の０．０００１重量％−５０重量％の量で存在する。より好ましい量は０．０１重量％−１０重量％であり、最小コストで最大効果をあげるための最も好ましい量は０．１重量％−５重量％である。
【００１９】
本発明に使用される組成物はまた、有効成分となるピノレン酸またはその誘導体の希釈剤、分散剤または担体として作用するための皮膚科学的／化粧的に許容されるビヒクルを含有する。ビヒクルは、水、液体もしくは固体の皮膚緩和剤、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末、噴射剤などのようなスキンケア製品に常用の物質を含み得る。
【００２０】
ビヒクルは通常は組成物の５重量％−９９．９重量％、好ましくは２５重量％−８０重量％を形成するであろう。また、別の化粧品アジュバントが存在しない場合には組成物のバランスを形成するであろう。
【００２１】
有効成分であるピノレン酸以外の皮膚に有益な別の特別な有効成分、例えば、日光遮断剤、別の皮膚美白剤、日焼け剤も含有され得る。ビヒクルは更に、香料、乳白剤、保存料、色素及びバッファも含有し得る。
【００２２】
本発明方法に使用される外用組成物を調製するために、スキンケア製品の常用の調製方法を使用し得る。一般には皮膚科学的に許容される担体に有効成分を慣用の方法で添合する。有効成分を先ず、組成物に添合すべき水または別の溶媒または液体の一部分に適宜溶解または分散させる。好ましい組成物は水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンである。
【００２３】
組成物は、クリーム、ジェルまたはローションなどのような慣用のスキンケア製品の形態でよい。組成物はまた、いわゆる“ウォッシュ−オフ”製品、例えば浴用もしくはシャワー用のジェルでもよく、これらは場合によっては、すすぎ中に有効成分が皮膚に付着することを促進するデリバリー系を含有している。最も好ましくは、製品が“リーブ−オン”製品、即ち、皮膚に塗布されるが塗布直後のすすぎ段階の予定が不要な製品である。
【００２４】
組成物は従来同様に、ジャー、びん、チューブ、ロールボールなどのような適当な容器に適当な方法で包装できる。
【００２５】
本発明の方法は、治療を必要とする皮膚に毎日１回または数回行えばよい。皮膚の外観の改善は、皮膚の状態、本発明方法に使用した有効成分の濃度、組成物の使用量及び組成物の塗布頻度などに依存して通常は３−６カ月後に目に見えて明らかになる。一般に、少量の組成物、例えば０．１−５ｍｌの組成物を適当な容器またはアプリケーターから皮膚に塗布し、手、指または適当なデバイスを使用して皮膚に塗り拡げたり及び／または擦り込んだりする。組成物が“リーブ−オン”製品として処方されたかまたは“リンス−オフ”製品として処方されたかに従って、場合によっては後のすすぎ段階が必要である。
【００２６】
本発明をいっそう容易に理解できるように、以下の実施例を単なる代表として示す。
【００２７】
添付図面を参照しながら以下の実施例によって本発明を説明する。
【００２８】
図１及び図２は、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの正の調節に対するピノレン酸の効果を示す。
図３及び図４は、線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ｓＩＣＡＭ−１レベル及び線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ＰＧＥ２レベルに対するピノレン酸の効果をそれぞれ示す。
図５は、角質化エンベロープ形成に対するピノレン酸の効果を示す。
図６は、ケラチノサイト分化に対するピノレン酸の効果を示す。
【００２９】
（実施例）
以下の実施例はピノレン酸の老化防止効果を証明する。
【００３０】
プロコラーゲンＩ及びデコリンの正の調節をｉｎ  ｖｉｖｏで惹起するためにピノレン酸の外用による治療を使用できることは我々の同時係属出願Ｎｏ．９９９０８９５６．８から公知である。
【００３１】
このため、該出願中の“比較目的のレチノイン酸の外用による治療後のｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚中のプロコラーゲンＩ及びデコリンの正の調節の同定”という見出しの付いた文節はその全部が参照によって本発明に含まれるものとする。
【００３２】
実施例１
ヒトの皮膚線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成を測定する手順
皮膚線維芽細胞ならし培地の調製
ヒト包皮の継代２（Ｐ２）の一次線維芽細胞を１２ウェルのプレートに１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、５％炭酸ガス及び４％酸素の雰囲気下、１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間維持した。この時間の経過後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いで新しい無血清ＤＭＥＭ中で更に６０時間インキュベートした。次に線維芽細胞単層を無血清ＤＭＥＭで再度洗浄した。被験試薬及びビヒクル対照を最終用量０．４ｍｌ／ウェルの新しい無血清ＤＭＥＭ中の細胞に３重複で加えて更に２４時間インキュベートした。この線維芽細胞ならし培地を直ちに分析するかまたは後で分析するように液体窒素中で瞬間凍結し−７０℃で保存した。次に細胞をカウントし、引き続いてドットブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【００３３】
皮膚線維芽細胞ならし培地中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンタンパク質のドットブロットアッセイ
（対照として）ビヒクルまたは被験試薬で処理した皮膚線維芽細胞から得られたならし培地のサンプルに２０ｍＭのジチオトレイトール（１：１０に希釈した２００ｍＭの予製液）と０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（１：１００に希釈した１０％の予製液）を補充し、十分に混合し、次いで７５℃で２分間インキュベートした。１７５ｃｍ２容のフラスコに１０，０００細胞／ｃｍ２で播種した線維芽細胞から得られた純粋な線維芽細胞ならし培地を系列希釈することによってアッセイ標準を調製し、上述のように無血清ＤＭＥＭ中に維持した。
【００３４】
次にＢｉｏ−Ｒａｄの９６−ウェルＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を製造業者の指示通りに使用して予め湿らせたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜シートにアッセイサンプルを３重複で塗布した。ウェルあたり約２００μｌの培地を塗布した。重力によって培地を膜濾過（３０分間）した後、膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗液を重力によって膜濾過した（２×１５分間）。次にＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホルドに接続し、３回目及び最終回のＰＢＳ洗浄を吸引下で行った。装置を分解し、膜を取り出し、必要に応じて速やかに裁断してからブロッキングバッファに入れて４℃で一夜維持した。
【００３５】
デコリン分析用に調製した膜はＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）トゥィーン２０でブロックし、プロコラーゲン−Ｉ分析用に調製した膜はＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳／０．０５％トゥィーン２０でブロックした。翌日、１：１０，０００に希釈したヒトプロコラーゲン−Ｉに対する第一抗体（ＭＡＢ１９１２；ラットモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはヒトデコリンに対する第一抗体（ウサギポリクローナル；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）で膜を室温で２時間プローブした。その後、膜をＴＢＳ／０．０５％トゥィーン２０で洗浄し（３×５分間）、次いで必要に応じて１：１，０００に希釈した１２５Ｉ−コンジュゲート抗ラットまたは抗ウサギＦ（ａｂ′）２フラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に室温で１時間インキュベートした。
【００３６】
上記の処理後、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎストリップをＴＢＳ／トゥィーン２０で再度洗浄（３×５分間）した後、室温で風乾した。乾燥した膜をセロファンに包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ蓄積リン光スクリーンに１６−１８時間露光した。この時間の経過後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用し、露光されたスクリーンをりん光イメージング装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＳＦ）によって走査した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ中の定量ツールを使用するコンピューター支援画像解析によってドット強度を評価し、細胞数に標準化し、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの合成に対する種々の被験試薬の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位に対する相対値として決定した。
【００３７】
以下の表１は、ヒトの皮膚線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成に対するピノレン酸の効果とピノレン酸の塗布量とを示す。結果を正規化するために、被験物質の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位に対する相対値として決定した。図１及び図２はもっと多いデータ点で得られた結果を示すグラフである。
【００３８】
比較のために、レチノイン酸を使用して試験し、ヒトの皮膚線維芽細胞中のデコリン合成に対するレチノイン酸の効果を評価した。試験に使用した試薬の濃度は細胞の生存率に全く影響しなかった。
【００３９】
【表１】
2004523488.tif 000002
【００４０】
表１の結果は、ピノレン酸が対照に比べてヒトの皮膚線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの双方の合成について有意に正の調節を行うことを示す。
【００４１】
皮膚のデコリンレベルは皮膚の状態及び外観の改善に関係する。しわの消去及び光損傷肌の皮膚修復のような皮膚に有益な多くの効果に関係があるコラーゲンが皮膚に調節されて正しく沈着するためには皮膚のデコリンレベルの上昇が重要である。
【００４２】
実施例２
この実施例では皮膚線維芽細胞の炎症反応の軽減に対するピノレン酸の効果を測定する。
【００４３】
線維芽細胞ＰＧＥ２及びＩＣＡＭアッセイ
ヒトの皮膚線維芽細胞による細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）及びＰＥＧ２の産生は炎症刺激物質ＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）によって誘発され得る。ＰＭＡは細胞内で酸化ストレス及び炎症反応を誘発する外部ストレス物質を代表する。ｉｎ  ｖｉｖｏ炎症モデルの作製にこのモデルを使用する。
【００４４】
ヒト包皮の継代２（Ｐ２）の一次線維芽細胞を３５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、５％炭酸ガスの雰囲気下、１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間維持した。ジメチルスルホキシド（エタノール、最終濃度１％）中の新しい細胞培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清を補充）にピノレン酸を３重複で添加し、更に２４時間インキュベートした。１０ｎＭのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）を培地に添加し、細胞を更に２４時間インキュベートした。対照は被験化合物もＰＭＡも全く含有していなかった。この線維芽細胞／培地を直ちに以下に記載のように分析するかまたは後で分析するために液体窒素中で瞬間凍結し−７０℃で保存した。次に細胞をカウントし、引き続いてドットブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【００４５】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）アッセイ：培養プレートを静かに振盪した後で各５０μｌ量の培養培地をＰＧＥ２アッセイのために採取した。培地中のＰＧＥ２レベルをＢｉｏｔｒａｋ  ＰＧＥ２イムノアッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）によって測定した。アッセイは、限定量の固定されたＰＧＥ２特異的抗体に対するサンプル中の非標識ＰＧＥ２と一定量の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＰＧＥ２との競合に基づく。サンプル中の非標識ＰＧＥ２の濃度は、同時に得られた標準曲線に従って決定する。
【００４６】
ＩＣＡＭ−１アッセイ：培地を廃棄し、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞に、１５０μｌの０．１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を３分間添加して細胞膜からＩＣＡＭを抽出した。抽出物をエッペンドルフ遠心管に移して１，０００ｇで２分間遠心して細胞破片を除去した。１００μｌ量の上清をＩＣＡＭアッセイに使用した。可溶性ＩＣＡＭ−１を市販の酵素免疫検定用（ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で評価した。サンプル中のＩＣＡＭ−１の濃度を平行処理標準曲線に基づいて決定した。
【００４７】
ＰＧＥ２及びＩＣＡＭのアッセイから得られた結果を以下の表２に要約し、図３及び図４のグラフに示す。
【００４８】
【表２】
2004523488.tif 000003
＊エンザイムイムノアッセイによって検出可能な最大レベル
【００４９】
上記結果は、ＰＭＡ（ホルボールミリスチルアセテート）のような炎症刺激物質で刺激された細胞がプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生によって測定される炎症反応の増加を生じたことを示す。ピノレン酸はたとえ０．１μｍのレベルであっても、ＰＧＥ２産生によって測定される炎症反応を劇的に減少させる。従って結果は、ピノレン酸が優れた抗炎症活性を有することを証明する。
【００５０】
上記の結果はまた、ＰＭＡで刺激された細胞はＩＣＡＭ産生量の増加を生じることを示す。ピノレン酸は、もう１つの炎症マーカーである細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）の産生量を減少させる。従ってこれらの結果もまた、ピノレン酸が優れた抗炎症作用を有することを証明する。
【００５１】
実施例３
ヒト包皮の継代３（Ｐ３）のケラチノサイトをダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ），０．０３ｍＭカルシウム中、９６ウェルプレートに４，０００細胞／ウェルで播種した。処理前に細胞を３日間増殖させた。処理ビヒクルはＤＭＳＯであった。４日間の処理後、細胞を採取し、１００μｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで細胞を１％のトリトンＸ１００、５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、０．０２ｍＭのロイペプチン、０．０２ｍＭのペプスタチンで抽出した。次にＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓを使用し、６０μｌ／ウェルの抽出物でＤＮＡ濃度（ｎｇ／ウェル）を検定した。
【００５２】
次に細胞を２００μｌのＰＢＳ、次いで１００μｌの２％のＳＤＳで洗浄し、２０ｍＭのＤＴＴを各ウェルに添加した。次に、プレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートシーラー（ＩＣＮ）でシールし、気密給湿環境（即ち、給湿紙で裏張りした密閉サンドイッチボックス）中で６０℃で一夜インキュベートした。次に、Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用し、抽出物をＰＶＤＦ転移膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で重力濾過した。次に膜を蒸留水で洗浄した後、銀染色した（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎキット）。次に、染色したドットブロット膜をＰｈｏｒｅｔｉｘアレイソフトウェア（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して分析した。
【００５３】
結果
結果を以下の表３に示し、図５及び図６にグラフで表す。
【００５４】
【表３】
2004523488.tif 000004
＊０に対する相対値。ＤＮＡ値の場合はＰ＜０．００１。
【００５５】
結果は、０．１−２０μＭのピノレン酸の塗布に応じて角質化エンベロープの産生がどの程度増加したか及びＤＮＡレベルがどのように低下したかを示す。これは、ケラチノサイト分化の増進を示す指標であり、ピノレン酸がｉｎ  ｓｉｔｕの皮膚関門形成及び弾力的回復力を改善し、水の経皮的損失とケラチノサイト増殖とを抑制することを示唆する。
【００５６】
実施例４
以下の配合表は本発明の方法及び使用に適した水中油型クリームである。指定したパーセンテージは組成物の重量％である。
【００５７】
【表４】
2004523488.tif 000005
＊Ｂｒｉｊ  ５６はセチルアルコールＰＯＥ（１０）
＊＊Ａｌｆｏｌ  １６ＲＤはセチルアルコール
【００５８】
実施例５
以下の配合表は本発明のエマルジョンクリームである。
【００５９】
【表５】
2004523488.tif 000006
【００６０】
上記の実施例４及び５の外用組成物はいずれも、老化または光老化によって衰えた皮膚に塗布されたときにはしわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または刺激肌の外観を改善するため、若年者の皮膚に塗布されたときには上記のような劣化性変化の予防または延期を助長するために有効な化粧的治療効果を提供する。組成物は慣用の方法で加工できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの正の調節に対するピノレン酸の効果を示す。
【図２】
デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの正の調節に対するピノレン酸の効果を示す。
【図３】
線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ｓＩＣＡＭ−１レベルに対するピノレン酸の効果を示す。
【図４】
線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ＰＧＥ２レベルに対するピノレン酸の効果を示す。
【図５】
角質化エンベロープ形成に対するピノレン酸の効果を示す。
【図６】
ケラチノサイト分化に対するピノレン酸の効果を示す。
【図１】
2004523488.tif 000007
【図２】
2004523488.tif 000008
【図３】
2004523488.tif 000009
【図４】
2004523488.tif 000010
【図５】
2004523488.tif 000011
【図６】
2004523488.tif 000012
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月30日(2002.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）組成物の０．１−５重量％のピノレン酸と、
（ｂ）皮膚科学的に許容されるビヒクルと、
から成る外用組成物。
【請求項２】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える外用組成物を製造するためのピノレン酸及び／またはその誘導体の使用であって、ピノレン酸が組成物の０．１−５重量％の量で使用される該使用。
【請求項３】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善に使用するための、（ｉ）組成物の０．１−５重量％のピノレン酸及び／またはその誘導体と、（ｉｉ）化粧的及び／または皮膚科学的に許容されるビヒクルと、から成る外用組成物。
【国際調査報告】
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