(57)【要約】本発明は、カチオン重合体および核酸よりなる複合体、核酸を細胞および有機体内に転移させるためのこのタイプの複合体の使用、薬剤としての該複合体の使用、並びに該複合体を製造するために使用できる新規な重合体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中に可溶性または可分散性であり且つ疎水性置換基を有する線状カチオン重合体と少なくとも１種の核酸とを含んでなる複合体。
【請求項２】
重合体がポリアミンであることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
ポリアミンがポリエチレンイミンであることを特徴とする、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
置換基が重合体上に側鎖としてまたは末端に配置されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
置換基がアルキル鎖、アシル鎖またはステロイド類似置換基、およびイソシアナート上へのもしくはα，β−不飽和カルボニル化合物上への主重合体鎖の窒素官能基の添加により導入されうる疎水性置換基であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
重合体が下記の一般式：
【化１】
2004510829.tif 000014
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１は水素、メチルまたはエチルを示し、そして
Ｒ２は炭素数１〜２３のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ３およびＲ４（末端基）は、互いに独立して、水素および炭素数１〜２４のアルキルを示すか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ５（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
重合体が下記の一般式：
【化２】
2004510829.tif 000015
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１は水素、メチルまたはエチルを示し、そして
Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ３およびＲ４（末端基）は、互いに独立して、水素および炭素数１〜２４のアシルを示すか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ５（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
重合体が下記の一般式：
【化３】
2004510829.tif 000016
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は水素またはヒドロキシルを示し、
そしてここで
Ｒ４およびＲ５（末端基）は、互いに独立して、水素または胆汁酸を示すか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ６（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
重合体が下記の一般式：
【化４】
2004510829.tif 000017
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１はＯＲ４またはＮＲ４Ｒ５を示し、
ここで
Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、水素または炭素数１〜２４のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ２およびＲ３（末端基）は互いに独立して主重合体鎖中の窒素原子上の置換基に相当するか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ６（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
重合体が下記の一般式：
【化５】
2004510829.tif 000018
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１は炭素数１〜２４のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ２およびＲ３（末端基）は互いに独立して主重合体鎖中の窒素原子上の置換基に相当するか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ４（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項１１】
重合体が２２０ ０００ｇ／モルより低い平均分子量を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の複合体。
【請求項１２】
重合体が２０００〜１００ ０００ｇ／モルの平均分子量を有することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の複合体。
【請求項１３】
重合体が細胞−特異的リガンドに結合されていることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の複合体。
【請求項１４】
核酸がプラスミドであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の複合体。
【請求項１５】
核酸が薬理学的に活性な物質をコードするヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の複合体。
【請求項１６】
核酸が抗原、アレルゲンまたは免疫調節蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の複合体。
【請求項１７】
核酸／重合体充填比が１：０．１〜１：１０の間、特に１：２〜１：１０の間、であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体。
【請求項１８】
水溶液中に存在する適量の重合体を適量の核酸溶液と混合することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の複合体の製造方法。
【請求項１９】
混合物を次に乾燥することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
薬剤としての使用のための請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体および別の添加剤を含有する組成物。
【請求項２２】
核酸を細胞内に導入するための請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体を含有する細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の細胞および別の添加剤を含有する組成物。
【請求項２５】
遺伝子療法用の薬剤を製造するための請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２６】
予防接種用の薬剤を製造するための請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２７】
アレルギーの場合における寛容誘導用の薬剤を製造するための請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２８】
一般式
【化６】
2004510829.tif 000019
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１は水素、メチルまたはエチルを示し、そして
Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ３およびＲ４（末端基）は、互いに独立して、水素および炭素数１〜２４のアシルを示すか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ５（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
の重合体。
【請求項２９】
一般式
【化７】
2004510829.tif 000020
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は水素またはヒドロキシルを示し、
そしてここで
Ｒ４およびＲ５（末端基）は、互いに独立して、水素または胆汁酸を示すか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ６（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
の重合体。
【請求項３０】
一般式
【化８】
2004510829.tif 000021
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１はＯＲ４またはＮＲ４Ｒ５を示し、
ここで
Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、水素または炭素数１〜２４のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ２およびＲ３（末端基）は互いに独立して主重合体鎖中の窒素原子上の置換基に相当するか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ６（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
の重合体。
【請求項３１】
一般式
【化９】
2004510829.tif 000022
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１は炭素数１〜２４のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ２およびＲ３（末端基）は互いに独立して主重合体鎖中の窒素原子上の置換基に相当するか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ４（末端基）は停止反応に依存する置換基であり、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１であり、ここで単位ｍおよびｎは重合体内に無作為に分布されている］
の重合体。
【請求項３２】
それが２２０ ０００ｇ／モルより低い平均分子量を有することを特徴とする、請求項２８〜３１のいずれかに記載の重合体。
【請求項３３】
それが２０００〜１００ ０００ｇ／モルの平均分子量を有することを特徴とする、請求項３２に記載の重合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、カチオン重合体および核酸の複合体、核酸を細胞内に導入するためのそのような複合体の使用、並びに薬剤としての複合体の使用に関する。本発明はまた、複合体を製造するために使用できる新規な重合体にも関する。
【０００２】
核酸類（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のインビボでの人間における治療使用において持続的な成功を収めることは現在まで可能でなかった。この理由は多分、必要な遺伝子情報の限定された発現であり、それは遺伝子転移または発現させようとする核酸の入手性の不適切な効率により引き起こされる。重要な役割を演ずる別の理由は、使用する輸送またはベクター系統の不適切な安定性および不適切な生相容性である。
【０００３】
遺伝子療法または免疫感作用の核酸の経口的または経鼻的投与の可能性は特に魅力的である（Ｐａｇｅ ＆ Ｃｕｄｍｏｒｅ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００１， ６， ９２−１０１）。この場合、核酸をヌクレアーゼによる分解から保護することが必須である。予防接種の場合には、粘膜の免疫学的保護に関与するＭＡＬＴ（粘膜関連リンパ系組織）の刺激を確実にするためには特に粘膜の露出が非経口的投与には好ましい。例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）またはＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）の如き病原体によるこの領域における感染の予防が非常に重要である。
【０００４】
例えばレトロウイルスまたはアデノウイルスの如きウイルスベクターは炎症性または免疫原過程を誘導する危険性を伴う（Ｍｃ Ｃｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９５， ６， １５３５−１５６０； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９６， １， ４３３−４４２）。
【０００５】
代替法として非ウイルス性の合成輸送系統に関する研究が行われたが、それらは所望する性質をこれまでに示していない。特に脂質と、適宜、他の混合された細胞−特異的リガンドとの混合物に基づく系統は生物物理学的には困難を伴ってまたは不適切にしか同定することができず、且つ貯蔵および投与に関して力学的な構造変化過程の危険性を伴う。特に、薬剤としての使用のための必須条件としての投与の安全性はこの場合には存在しない。
【０００６】
従って合成カチオン重合体に基づく複合体が、それらの構造的特徴が再現可能に形成することができ且つ明瞭に同定することができる限り、好ましい（Ｍ．Ｃ． Ｇａｒｎｅｔｔ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １９９９， １６， １４７−２０７）。
【０００７】
複合体を製造するための合成カチオン重合体の製造に関して記載された多くの方法は、重合体の分枝鎖度およびそれらの微細構造に関して確定されない生成物をもたらす。さらに、トランスフェクション用に使用される多くの重合体は非常に広い分子量分布によってのみ特徴づけられるかまたはそれらの平均分子量によってのみ記載されている。
【０００８】
三次元的な分枝鎖構造を有するカチオン重合体であるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は核酸の複合化および縮合用に特に適する（Ｗ．Ｔ． Ｇｏｄｂｅｙ， Ｊ． ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９９， ６０， １４９−１６０）。多くの一連のインビトロ実験で核酸の細胞内への導入に関する適合性を示すことが可能であり、そしてＭＷ２０００ｇ／モルの範囲内の低い分子量を有する重合体（ＬＭＷ−ＰＥＩ、ＬＭＷ：低分子量）は高い活性を特に示す（ＥＰ−Ａ ０ ９０５ ２５４）。分枝鎖重合体の不確定な構造はその欠点とみなされるはずである。
【０００９】
対照的に、確定された分子量を有する線状ポリエチレンイミンを製造することができそしてインビトロおよびインビボ遺伝子転移用の多くの用途で使用されてきた（ＷＯ ９６／０２６５５）。線状ポリエチレンイミン類のトランスフェクション効率を改良するための研究は二つの方針をもたらした（Ｍ．Ｃ． Ｇａｒｎｅｔｔ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １９９９， １６， １４７−２０７）。
１）一方では親水性置換基を導入することによりＤＮＡ／重合体複合体の水中溶解度を増加させることが可能であり、そして他方では蛋白質との相互作用に関して不活性である複合体を製造することが可能であった。さらに、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンイミンのブロック共重合体も記載されていた。
２）細胞−特異的リガンド、普通は親水性炭化水素またはペプチド構造、を導入することによりターゲティング効果を得ることが可能であった。
【００１０】
複合化した核酸の細胞内への転移の効率は多くの要素に、特に複合体と細胞膜との間の相互作用、細胞タイプの性質、複合体の寸法および複合体の成分間の充填比に、依存する。複合体と細胞膜との間の相互作用並びに細胞内への吸収に関してはほとんど知られていない。
【００１１】
分枝鎖状の未置換ポリエチレンイミン類と５０モル％までのヘキシルまたはドデシルアルキル鎖での置換度による置換されたポリエチレンイミン類との比較に基づき、ポリエチレンイミン類と疎水性置換基およびアニオン性燐脂質よりなるモデル膜との間の増加した相互作用を示すことが可能であった（Ｄ．Ａ． Ｔｉｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９８５， １８， ３３８−３４２）。
【００１２】
核酸の複合化用の疎水性官能基を有するポリエチレンイミン類の使用はアルキル−置換された系統に関してのみ記載されていた（ＷＯ ９９／４３７５２）。ポリアクリレート類を基にしたカチオン重合体に関しては疎水性単量体単位がトランスフェクション効率を高めることを示すことも可能であった（Ｍ． Ｋｕｒｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０００， ６８， １−８）。２５モル％のステアリル単位を有する疎水化されたポリ−Ｌ−リシンに関してはこれらの重合体と組み合わされた核酸と脂肪蛋白質との三成分複合体が筋肉細胞内のトランスフェクション効率における増加をもたらすことを示すことが可能であった（Ｋ．−Ｓ． Ｋｉｍ， Ｊ． ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９７， ４７， ５１−５９）。ＥＰ−Ａ ０ ９８７ ０２９は、場合により線状および分枝鎖状アルキル鎖をまたはそうでなければアリール基を有していてもよいポリアリルアミン類を記載している。
【００１３】
長鎖アルキル基を有する疎水化されたポリエチレンイミン類は、例えば、エステル分解における触媒系としての第四級の完全にアルキル化されそしてその結果として高度に荷電された構造の形態でこれまでに使用されていた。さらに、アシル化された構造も酵素の安定化用に使用されていた（ＵＳ ４９５０５９６）。
【００１４】
本発明は、水中に可溶性または可分散性であり且つ疎水性置換基を有する線状カチオン重合体及び少なくとも１種の核酸を含んでなる複合体に関する。
【００１５】
重合体は好ましくはポリアミドそして特に好ましくはポリエチレンイミンである。
【００１６】
疎水性置換基は重合体上に側鎖としてまたは末端に配置されうる。置換度（主重合体鎖内の官能化されたＮ原子の百分率含有量）は好ましくは０．０１〜１０％の間である。
【００１７】
特に適する疎水性置換基はアルキル鎖、アシル鎖またはステロイド類似置換基である。アシル鎖が疎水性置換基として特に適する。イソシアナート上へのまたはα，β−不飽和カルボニル化合物上への主重合体鎖の窒素官能基の添加により導入されうる疎水性置換基も適する。
【００１８】
複合体生成用に好ましく使用できる重合体は下記の一般式：
【００１９】
【化１０】
2004510829.tif 000002
【００２０】
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１は水素、メチルまたはエチルを示し、そして
Ｒ２は炭素数１〜２３のアルキル、好ましくは炭素数１２〜２３のアルキル、特に好ましくは炭素数１７のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ３およびＲ４（末端基）は、互いに独立して、水素および炭素数１〜２４のアルキル、好ましくは炭素数１３〜２４のアルキル、特に好ましくは炭素数１８のアルキルを示すか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ５（末端基）は停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、ここでＲ基は末端基Ｒ３およびＲ４に相当することができ、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内、好ましくは２５０〜２２５０の範囲内、特に好ましくは５００〜２０５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１、好ましくは０．０１＜ａ＜０．０５、そして特に好ましくはａ＝０．０３である］
を有する。
【００２１】
この場合、単位ｍおよびｎはブロック化された構造でないが重合体内に無作為に分布されている
複合体生成用に好ましく使用できる別の重合体は下記の一般式：
【００２２】
【化１１】
2004510829.tif 000003
【００２３】
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１は水素、メチルまたはエチルを示し、そして
Ｒ２は炭素数１〜２２のアルキル、好ましくは炭素数１１〜２２のアルキル、特に好ましくは炭素数１６のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ３およびＲ４（末端基）は、互いに独立して、水素または炭素数１〜２４のアシル、好ましくは炭素数１３〜２４のアシル、特に好ましくは炭素数１８のアシルを示すか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ５（末端基）は停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、ここでＲ基は末端基Ｒ３およびＲ４に相当することができ、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内、好ましくは２５０〜２２５０の範囲内、特に好ましくは５００〜２０５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１、好ましくは０．０１＜ａ＜０．０５、そして特に好ましくはａ＝０．０３である］
を有する。
【００２４】
この場合、単位ｍおよびｎはブロック化された構造でないが重合体内に無作為に分布されている
この重合体は新規であり、そしてそういうわけで本発明はそれにも関する。
【００２５】
複合体生成用に使用することができる別の重合体は下記の一般式：
【００２６】
【化１２】
2004510829.tif 000004
【００２７】
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は水素またはヒドロキシルを示し、
そしてここで
Ｒ４およびＲ５（末端基）は、互いに独立して、水素または胆汁酸を示すか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ６（末端基）は停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、ここでＲ基は末端基Ｒ３およびＲ４に相当することができ、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内、好ましくは２５０〜２２５０の範囲内、特に好ましくは５００〜２０５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１、好ましくは０．０１＜ａ＜０．０５、そして特に好ましくはａ＝０．０３である］
を有する。
【００２８】
この場合、単位ｍおよびｎはブロック化された構造でないが重合体内に無作為に分布されている
この重合体は新規であり、そしてそういうわけで本発明はそれにも関する。さらに、基本的なステロイド骨格に関する全ての立体異性体も包含される。特に、置換基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はαおよびβ立体配置の両方に配置されうる。５位置における置換基も同様にαおよびβ立体配置に存在しうる（Ｒｏｅｍｐｐ−Ｃｈｅｍｉｅ−Ｌｅｘｉｋｏｎ， ９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， １９９２ に従う命名法）。
【００２９】
複合体生成用に好ましく使用することができる別の重合体は下記の一般式：
【００３０】
【化１３】
2004510829.tif 000005
【００３１】
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１はＯＲ４またはＮＲ４Ｒ５を示し、
ここで
Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、水素または炭素数１〜２４のアルキル、好ましくは炭素数１３〜２４のアルキル、特に好ましくは炭素数１８のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ２およびＲ３（末端基）は互いに独立して主重合体鎖中の窒素原子上の置換基に相当するか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ６（末端基）は停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、ここでＲ基は末端基Ｒ２およびＲ３に相当することができ、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内、好ましくは２５０〜２２５０の範囲内、特に好ましくは５００〜２０５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１、好ましくは０．０１＜ａ＜０．０５、そして特に好ましくはａ＝０．０３である］
を有する。
【００３２】
この場合、単位ｍおよびｎはブロック化された構造でないが重合体内に無作為に分布されている
この重合体は新規であり、そしてそういうわけで本発明はそれにも関する。
【００３３】
複合体生成用に好ましく使用することができる別の重合体は下記の一般式：
【００３４】
【化１４】
2004510829.tif 000006
【００３５】
［式中、各個別［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ］単位中で、
Ｒ１は炭素数１〜２４のアルキル、好ましくは炭素数１３〜２４のアルキル、特に好ましくは炭素数１８のアルキルを示し、
そしてここで
Ｒ２およびＲ３（末端基）は互いに独立して主重合体鎖中の窒素原子上の置換基に相当するか、或いは開始剤に依存する構造を有し、
ここで
Ｒ４（末端基）は停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、ここでＲ基は末端基Ｒ２およびＲ３に相当することができ、
そしてここで平均重合度Ｐ＝（ｍ＋ｎ）は４５〜５２５０の範囲内、好ましくは２５０〜２２５０の範囲内、特に好ましくは５００〜２０５０の範囲内であり、そしてｎ＝ａ×Ｐであり、０．００１＜ａ＜０．１、好ましくは０．０１＜ａ＜０．０５、そして特に好ましくはａ＝０．０３である］
を有する。
【００３６】
この場合、単位ｍおよびｎはブロック化された構造でないが重合体内に無作為に分布されている
この重合体は新規であり、そしてそういうわけで本発明はそれにも関する。
【００３７】
重合体は好ましくは２２０ ０００ｇ／モルより低い平均分子量、特に好ましくは２０００〜１００ ０００ｇ／モルの間の平均分子量、非常に特に好ましくは２０ ０００〜１００ ０００ｇ／モルの間の平均分子量を有する。
【００３８】
疎水性基は重合体−類似反応（ｐｏｌｙｍｅｒ−ａｎａｌｏｇｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）において、例えばハロアルカン類を用いるアルキル化、塩化カルボニル類を用いるアシル化、反応性エステル類を用いるアシル化、α，β−不飽和カルボニル化合物（カルボン酸類、カルボキサミド類、カルボン酸エステル類）上へのミハエル付加によりまたはイソシアナート上の付加により、挿入される。これらは文献に開示されている反応タイプである（Ｊ． Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９２）。
【００３９】
線状ポリエチレンイミン類は、例えば、カチオン性開始剤を用いる２−エチルオキサゾリンのカチオン性開環重合により、好ましくは Ｂ．Ｌ． Ｒｉｖａｓ ｅｔ ａｌ． （Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌ． １９９２， ２８， ３−８） により、製造される。この方法で得られたポリ（エチルオキサゾリン）類は、濃塩酸および水の混合物、好ましくは濃塩酸および水の１：１混合物、を用いる処理により、プロパン酸を除去しながら線状ポリエチレンイミン類に定量的に転化される。反応温度は好ましくは８０〜１００℃の間、特に好ましくは１００℃、である。反応時間は好ましくは１２〜３０時間の間、特に好ましくは２４時間、である。生成物は好ましくはエタノールからの数回の再結晶化により精製される。
【００４０】
上記の方法で２０００〜２２０ ０００ｇ／モルの所望する分子量範囲内の線状ポリエチレンイミン類を製造することが可能である。
【００４１】
アルキル基、例えば、Ｃ１８アルキル基、は例えば適当な線状ポリエチレンイミンの無水エタノール中５％強度溶液を４０〜７５℃の、好ましくは６０℃の、反応温度において塩化オクタデシルと反応させることにより導入される。塩化アルキルの計量添加量は所望する置換度に正確に依存する（０．１〜１０％）。反応時間は好ましくは１０〜２４時間の間、特に好ましくは１７時間、である。
【００４２】
アシル基、例えば、Ｃ１８アシル基、は例えば適当な線状ポリエチレンイミンの無水エタノール中５％強度溶液を４０〜６０℃の、好ましくは５０℃の、反応温度において塩化オクタデシルと反応させることにより導入される。酸塩化物の計量添加量は所望する置換度に正確に依存する（０．０１〜１０％）。反応時間は好ましくは１０〜２４時間の間、特に好ましくは２０時間、である。
【００４３】
アシル基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いるカルボン酸誘導体の活性化を伴う反応性エステル方法によっても製造することができる。この方法は好ましくは胆汁酸を用いるポリエチレンイミンの官能化の場合に使用される。この目的のためには、例えば、胆汁酸誘導体である以下では置換基としてＣＤＣと略するケノデオキシコール酸（３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸）を溶媒としてのジメトキシエタン中でジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させる。反応は室温で起き、そして反応時間は１６時間である。この方法で製造された反応性エステルを適当な線状ポリエチレンイミンの無水エタノール中５％強度溶液と反応させる。反応性エステルの計量添加量は所望する置換度に正確に依存する（０．０１〜１０％）。反応温度は２０〜６０℃の間、好ましくは５０℃、である。反応時間は好ましくは１０〜２４時間の間、特に好ましくは２０時間、である。
【００４４】
反応性エステル方法による例えばケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）のオリゴアミン類、例えば、スペルミンまたはペンタエチレンヘキサミン、中への導入は文献に記載されている（Ｓ． Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９８， ３０， ６１−７１．）。本発明に従う胆汁酸−置換された重合体は疎水性置換基を有し、Ｓ． Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ． により記載された ”ｃａｔｉｏｎｉｃ ｆａｃｉａｌ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ” と同様にしてヒドロキシル基の数により疎水化度を調節することが可能である。
【００４５】
本発明に従う複合体を製造するためには高度に精製された試料が好ましく使用される。この目的のためには、疎水性線状ポリエチレンイミン類を０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ７の水中に溶解させ、そしてセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）上でのカラムクロマトグラフィーおよびその後の凍結乾燥により精製した。重合体を次に水中にまたは、好ましくは簡単な超音波処理しながら生理的食塩水中に再溶解させ、そしてｐＨ７に調節した。複合体を製造するためには、ポリエチレンイミン溶液の濃度は好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍｌの間、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ、である。
【００４６】
例えば１Ｈ−ＮＭＲ分光法、ＦＴ−ＩＲ分光法およびゼータ電位測定の如き標準的方法を用いることによりカチオン重合体を同定することが可能である。
【００４７】
複合体生成用に使用される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡである。核酸はオリゴヌクレオチドまたは核酸構築物である。核酸は好ましくは１個もしくはそれ以上の遺伝子を含んでなる。核酸は特に好ましくはプラスミドである。
【００４８】
核酸は、薬理学的に活性な物質もしくはその前駆体をコードするかおよび／または酵素をコードするヌクレオチドは配列を含んでなることができる。
【００４９】
核酸は、病原体の抗原をコードするヌクレオチド配列を含んでなることができる。病原体およびそれに属する関連抗原、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）および糖蛋白質Ｄ；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＧａｇ、Ｎｅｆ、Ｐｏｌ；Ｃ型肝炎ウイルスおよびＮＳ３；炭疽および致死因子、リーシュマニアおよびｌｍＳＴＩ１およびＴＳＡ；結核菌およびＭｔｂ８．４である。免疫応答がそれに対して存在するような抗原をコードするいずれの適当な核酸でも使用することが原則的には可能である。抗原をコードする別種の核酸類を必要に応じて組み合わせるべきである。
【００５０】
核酸は、アレルゲンをコードするヌクレオチド配列を含んでなることができる。アレルゲンの例はｆ２（イエホコリダニ）、Ｂｅｔｖ１（カンバ花粉）、Ａｒａｈ２（ピーナッツ）、Ｈｅｖｂ５（ラテックス）である。人間または動物でアレルギー反応を引き起こす抗原をコードするいずれの適当な核酸でも使用することが原則的には可能である。アレルゲンをコードする別種の核酸類を必要に応じて組み合わせるべきである。
【００５１】
核酸は、免疫調節蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んでなることができる。免疫調節蛋白質の例はサイトカイン類（例えばＩＬ−４、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＴＮＦα）、ケモキン類（例えばＭＣＰ−１、ＭＩＰ１α、ＲＡＮＴＥＳ）、補助刺激剤（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ）または他のもの（例えば熱衝撃蛋白質）である。ＤＮＡ配列中のＣｐＧモチーフも免疫調節性質を示す。
【００５２】
核酸は、適宜、抗原／アレルゲンおよび免疫調節蛋白質の融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んでなることができる。
【００５３】
核酸は好ましくは、特異的に、例えばウイルス−特異的に（換言すると、例えば、ウイルス−感染細胞中でのみ）、（標的）細胞−特異的に、代謝特異的に、細胞サイクル−特異的に、成長−特異的にまたはそうでなければ非特異的に発現する特定の遺伝子をもたらす配列を含んでなることもできる。
【００５４】
最も簡単な場合には、核酸は所望する蛋白質、および特異的なプロモーター配列および、適宜、他の調節配列をコードする遺伝子を含んでなる。遺伝子の発現を促進および／または延長させるために、例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー配列を存在させることが可能である。そのようなプロモーターおよび／またはエンハンサー配列は、例えば、Ｄｉｏｎ， ＴｉＢＴｅｃｈ １９９３， １１， １６７ で論評されている。その例は、ラウス肉腫ウイルスおよびレトロウイルスのＬＴＲ配列、ＣＭＶウイルスのプロモーター領域およびエンハンサー領域、ＩＴＲ配列並びに／またはＡＡＶウイルスのプロモーター配列ｐ５、ｐ１９およびｐ４０、アデノウイルスのＩＴＲおよび／またはプロモーター配列、ワクシニア遺伝子のＩＴＲおよび／またはプロモーター配列、ヘルペスウイルスのＩＴＲおよび／またはプロモーター配列、パルボウイルスのプロモーター配列並びにパピローマウイルスのプロモーター配列（上流調節領域）である。
【００５５】
本発明に従う複合体は、それに対して特異的リガンドが結合される重合体を含んでなることができる。そのような細胞−特異的リガンドは、例えば、それらが標的細胞、好ましくは動物または人間標的細胞、の外膜に結合するように設計することができる。本発明に従うリガンド−含有複合体は、核酸の標的細胞−特異的転移用に使用することができる。標的細胞は、例えば、内皮細胞、筋肉細胞、大食細胞、リンパ球、グリア細胞、血液形成細胞、腫瘍細胞、例えば白血病細胞、ウイルス感染細胞、気管支内皮細胞または肝細胞、例えば肝臓洞様毛細血管細胞でありうる。内皮細胞と特異的に結合するリガンドは、例えば、内皮細胞に特異的なモノクローナル抗体もしくはその断片、マンノース−末端糖蛋白質、糖脂質もしくは多糖類、サイトカイン類、成長因子、接着分子、または特に好ましい態様では、内皮細胞向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有するウイルスのエンベロープからの糖蛋白質よりなる群から選択することができる。平滑筋細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、アクチンに特異的なモノクローナル抗体またはその断片、細胞膜受容体および成長因子または、特に好ましい態様では、平滑筋細胞向性を有するウイルスのエンベロープからの糖蛋白質を含んでなる群から選択することができる。大食細胞および／またはリンパ球に特異的に結合するリガンドは、例えば、大食細胞および／またはリンパ球上の膜抗原に特異的なモノクローナル抗体、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリン類または大食細胞および／またはリンパ球上の膜抗原に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体のＦｃ断片、サイトカイン類、成長因子、マンノース−末端ペプチド類、蛋白質、脂質もしくは多糖類、または特に好ましい態様では、ウイルスのエンベロープからの糖蛋白質、特にヌクレオチド位置８７２中に突然変異を有するインフルエンザＣウイルスからのＨＥＦ蛋白質または触媒性３回対称軸であるセリン−７１、ヒスチジン−３６８または−３６９およびアスパラギン酸−２６１を含有するインフルエンザＣウイルスのＨＥＦ分解生成物を含んでなる群から選択することができる。グリア細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、グリア細胞の膜構造に特異的に結合する抗体および抗体断片、接着分子、マンノース−末端ペプチド類、蛋白質、脂質もしくは多糖類、成長因子、または特に好ましい態様では、グリア細胞向性を有するウイルスのエンベロープからの糖蛋白質を含んでなる群から選択することができる。血液形成細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、幹細胞因子の受容体に特異的な抗体または抗体断片、ＩＬ−１（特に受容体タイプＩまたはＩＩ）、ＩＬ−３（特に受容体タイプαもしくはβ）、ＩＬ−６またはＧＭ−ＣＳＦ、および無傷の免疫グロブリン類またはこの特異性を有するＦｃ断片、および成長因子、例えばＳＣＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６もしくはＧＭ−ＣＳＦおよび関連受容体に結合するその断片を含んでなる群から選択することができる。白血病細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、白血病細胞上の膜構造に特異的に結合する抗体、抗体断片、免疫グロブリン類またはＦｃ断片、例えばＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＡＭＡＬ、シ��ロシル−Ｌｅ、ＣＤ５、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２３、Ｍ３８、ＩＬ−２受容体、Ｔ−細胞受容体、ＣＡＬＬＡまたはＣＤ１９、および成長因子もしくはそれから誘導される断片またはレチノイド類を含んでなる群から選択することができる。ウイルス感染細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、ウイルスによる感染後に感染細胞の細胞膜上で発現するウイルス抗原に特異的な抗体、抗体断片、無傷の免疫グロブリン類またはＦｃ断片を含んでなる群から選択することができる。気管支内皮細胞、肝臓洞様毛細血管細胞または肝細胞に特異的に結合しうるリガンドは、例えば、トランスフェリン、アシアロ糖蛋白質、例えばアシアロオロソムコイド、ネオ糖蛋白質またはガラクトース、インシュリン、マンノース−末端ペプチド類、蛋白質、脂質または多糖類、無傷の免疫グロブリン類または標的細胞に特異的に結合するＦｃ断片、および特に好ましい態様では、標的細胞に特異的に結合するウイルスのエンベロープからの糖蛋白質を含んでなる群から選択することができる。リガンドのさらに詳細な例は、例えば、ＥＰ−Ａ ０ ７９０ ３１２およびＥＰ−Ａ ０ ８４６ ７７２に開示されている。
【００５６】
本発明はさらに本発明に従う複合体の使用にも関する。例えば、複合体は核酸を細胞または標的細胞内に導入するために（トランスフェクション）、薬剤を製造するためにおよび／または遺伝子療法において、そして予防および治療的な予防接種並びにアレルギーの場合における寛容誘導用に使用することができる。本発明は好ましくは、非ウイルス性またはウイルス性核酸構築物を細胞内に導入するための本発明に従う複合体の使用並びに疾病の予防または治療の目的でのこの（トランスフェクトされた）細胞の患者への投与に関し、細胞は例えば内皮細胞、リンパ球、大食細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋肉細胞または内皮細胞であることが可能であり、そしてこの細胞を皮膚に局部的に適用するかまたは皮下、筋肉内、創傷に、体腔に、器官にもしくは血管に注射することが可能である。別の好ましい態様では、本発明は疾病の予防または治療のための本発明に従う複合体の使用に関し、本発明に従う複合体を従来方法で、好ましくは経口的に、非経口的にまたは局部的に投与することが可能である。本発明に従う複合体は例えば経舌的に、鼻内に、皮膚に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、直腸に、創傷に、体腔に、身体開口部に、器官にまたは血管に与えるかまたは注射することができる。適宜本発明に従う複合体を別の添加剤（佐薬、麻酔薬など）と組み合わせることも価値があるであろう。
【００５７】
患者への導入前の核酸の本発明に従う複合化の１つの利点は、抗−ＤＮＡ抗体の生成がそれによって難しくなることに基づく。対照として実験動物内に導入される裸のＤＮＡは狼瘡−傾向があるマウスにおいて自己免疫抗体の生成における増加および自己−抗体分泌Ｂ細胞の数の３倍増加をもたらした（Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ： ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｓｓｕｅｓ， ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ： Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｅｄ． Ｅ． Ｒａｚ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
【００５８】
本発明はさらに、本発明に従う複合体がトランスフェクトされた細胞または標的細胞と共にインキュベートされた細胞の製造方法にも関する。トランスフェクションは好ましくはインビトロで行われる。本発明はさらに、本発明に従う複合体を含有するトランスフェクトされた細胞または標的細胞にも関する。本発明はさらに、薬剤としてのまたは薬剤を製造するためのおよび／または遺伝子療法のために、トランスフェクトされた細胞の使用にも関する。
【００５９】
本発明はさらに、本発明に従う複合体を含有する薬剤またはそれを用いてトランスフェクトされた細胞にも関する。
【００６０】
本発明はまた、本発明に従う複合体が他の添加剤と混合されている薬剤を製造する方法にも関する。
【００６１】
本発明はまた、細胞−特異的リガンドに対する本発明に従う重合体の結合、およびこの核酸を細胞内に導入するためまたは疾病の予防もしくは治療のために複合体を哺乳動物に投与するためのウイルス性もしくは非ウイルス性核酸との複合体中の結合用生成物の使用にも関する。細胞−特異的リガンドの製造および結合の可能性はこれまでに特許出願ＥＰ−Ａ ０ ７９０ ３１２およびＤＥ−Ａ １９６ ４９ ６４５に詳細に記載されていた。これらの特許出願を参照すること。
【００６２】
本発明に従う、適宜細胞−特異的リガンドに結合されている重合体とウイルス性もしくは非ウイルス性核酸構築物との複合体は遺伝子療法用の遺伝子転移物質である。好ましい態様では、これらの複合体は患者に対して外部からまたは内部から、局部的に、体腔に、器官に、血液流に、呼吸管に、胃腸管に、尿生殖器管に、または経口的に、鼻内に、筋肉内にもしくは皮下に投与される。
【００６３】
本発明はまた、核酸構築物が本発明に従う複合体により導入された、特に酵母または哺乳動物からの、細胞にも関する。特に好ましい態様では、核酸構築物は本発明に従う複合体により細胞系統に導入され、それは次に選択された遺伝子の発現のためのトランスフェクション後に使用することができる。これらの細胞は従って患者用の薬剤を与えるために使用することができる。
【００６４】
本発明はさらに、疾病の処置または予防のための薬剤を製造するために核酸が本発明に従う複合体により導入されている哺乳動物細胞の使用にも関する。例えば、内皮細胞を血液から得、インビトロで本発明に従う複合体で処置しそして患者に例えば静脈内注射することができる。別の可能性は、例えば、樹状細胞（抗原−提示細胞）を血液から得、インビトロで本発明に従う複合体で処置しそして患者に注射して予防または治療免疫応答を誘発させることである。インビトロでトランスフェクトされたそのような細胞は患者に対して本発明に従う複合体と組み合わせて投与することもできる。この組み合わせは、各場合とも同時にまたは異なる時点で、同一または異なる部位に投与される細胞および複合体を含んでなる。
【００６５】
本発明に従う重合体は核酸と、２種の出発物質を混合することにより、複合化される。混合比は、負に荷電された核酸と正に荷電された重合体との間の所望する充填比により決められる。ゼータ電位測定から、疎水性官能基を有する線状ポリエチレンイミン類（Ｈ−ＬＰＥＩ）の場合にはｐＨ７におけるプロトン化度は約５０％であることを確定することが可能であった。ＤＮＡ／重合体充填比は１：０．１〜１：１０の間で変動しうる。好ましい充填比は１：２〜１：１０の間である。１：５〜１：１０の充填比では、１００μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度において懸濁または沈澱が起きうる。沈澱が生成した場合には、それらを投与前に再懸濁または再分散させることができる。
【００６６】
本発明に従う複合体は好ましくはＨ−ＬＰＥＩ溶液を適当な核酸溶液に加えることにより製造される。濃度は特に好ましくは１：１容量混合物が製造されるように調節される。
【００６７】
充填比を同定するために複合体をアガロースゲル電気泳動により試験することができる。複合体のＤＮＡ縮合および寸法に関する情報を得るために、選択された複合体を走査力顕微鏡により試験することができる。
【００６８】
特に、重合体鎖と結合された疎水性基が。減じられた水中溶解度にもかかわらず、特に良好な結果を示し且つ規定された縮合複合体を生成することは驚異的である。疎水性改質された重合体は界面活性剤または乳化剤のように作用し、従って核酸との粒状複合体を生成しえないことが必然的に予期されていた。疎水性置換基が核酸／重合体複合体の表面特性を決め、それはその結果として細胞膜との増加した相互作用および増加したトランスフェクション効率をもたらすことも予期されていた。
実施例
一般的記述
以下でＨ−ＬＰＥＩと略する疎水性の線状ポリエチレンイミン類は核酸を細胞内に導入するためのベクターとしての効率に関してそしてその生相容性において線状の未置換ポリエチレンイミン類（ＬＰＥＩ）より顕著に優れていることが驚くべきことに見いだされた。マウスに関する実験では、ヒト因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）蛋白質をコードするＨ−ＬＰＥＩおよびＤＮＡプラスミドを含有する核酸複合体を各場合とも同一分子量の線状の未置換ポリエチレンイミン類と比べて試験した。蛋白質発現はＨ−ＬＰＥＩ複合体の場合にのみ検出可能であった。同様に、裸のＤＮＡを用いるトランスフェクション実験は常に陰性であった。
【００６９】
ＦＶＩＩＩ遺伝子療法に関する研究では、好ましくはＣ１８側鎖を有する、アシル化されたポリエチレンイミン類が特に有効であることが証明された。アシル化度は０．１〜１０％の間、好ましくは１〜５％の間、そして特に好ましくは３％である。平均分子量は好ましくは２０ ０００〜１００ ０００ｇ／モルの範囲内である。
【００７０】
さらに、好ましくはＣＤＣ置換基を有する、特に胆汁酸置換基を有する、線状ポリエチレンイミン類が有効であると同定された。アシル化度は０．１〜１０％の間、好ましくは１〜５％の間、そして特に好ましくは３％である。分子量は好ましくは２０ ０００〜１００ ０００ｇ／モルの範囲内である。
【００７１】
同時に、インビボ試験中に有毒反応は観察されなかった。
【００７２】
インビボ実験中のＦＶＩＩＩ蛋白質発現の分析および測定並びに対応する処方は以下の実施例に詳細に記載されている。
実施例１
線状ポリエチレンイミン類（ＬＰＥＩ）の合成：
２−エチルオキサゾリンのポリ（エチルオキサゾリン）へのカチオン開環重合（Ｂ．Ｌ． Ｒｉｖａｓ， Ｓ．Ｉ． Ａｎａｎｉａｓ， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌ． １９９２， ２８， ３−８ と同様）およびその後のプロパン酸の除去による酸性加水分解により、線状ポリエチレン類を合成した。ある種の前駆重合体（ポリ（エチルオキサゾリン類））は市販もされている（シグマ−アルドリッヒ・ヘミーＧｍｂＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）、ドイツ）。前駆重合体はゲル透過クロマトグラフィー、１Ｈ−ＮＭＲおよびＦＴ−ＩＲにより同定された。
【００７３】
例えば、２４．７ｇのポリ（エチルオキサゾリン）（ＭＷ ２００ ０００ｇ／モル）を４０ｍｌの水および４０ｍｌの濃塩酸の混合物中で１００℃において反応させることにより定量的な加水分解が可能であった。２４時間後に生成した大量の沈澱を２５０ｍｌの水を加えることにより溶解させた。２０℃に冷却した後に、２０％強度ＮａＯＨを加えることにより生成物をｐＨ１１に調節しそして沈澱させた。沈澱を吸引濾過しそして洗浄し（洗浄水、ｐＨ７）そして次に高真空下で五酸化燐上で乾燥した。粗製生成物を次にエタノールから再結晶化させた（収量９．５ｇ／８８％）。セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム）上でのポリエチレンイミンの飽和水溶液（ｐＨ７）からの溶離剤としてのミリポル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）水を用いるカラムクロマトグラフィーおよびその後の凍結乾燥により、高純度バッチ（ミリグラム量）が得られた。
【００７４】
線状ポリエチレンイミン類は１Ｈ−ＮＭＲおよびＦＴ−ＩＲにより同定され、それにより定量的な加水分解を確認することが可能であった。
実施例２
８７ ０００ｇ／モルのＭＷを有するＬＰＥＩ中への３モル％のＣ１８アルキル基の導入を例とした疎水性官能基を有する線状ポリエチレンイミン類（Ｈ−ＬＰＥＩ）の合成
この目的のために、０．５ｇのＬＰＥＩを１０ｍｌのエタノール中に６０℃においてアルゴン下で溶解させ、そして、０．１１ｇ（０．１３ｍｌ）の塩化オクタデシルのゆっくりした添加後に、１７時間にわたり撹拌した。２０ｍｌの水を２０℃において加えることにより反応生成物を沈澱させそして濾別し、水（洗浄水ｐＨ７）で洗浄しそして高真空下で五酸化燐上で乾燥した（収量０．４８ｇ／９６％）。セファデックスＧ２５（ファーマシア使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム）上でのポリエチレンイミンの飽和水溶液（ｐＨ７）からの溶離剤としてのミリポル水を用いるカラムクロマトグラフィーおよびその後の凍結乾燥により、高純度バッチ（ミリグラム量）が得られた。
【００７５】
アルキル化された線状ポリエチレンイミン類は１Ｈ−ＮＭＲおよびＦＴ−ＩＲにより同定され、それにより所望するアルキル化度を確認することが可能であった。
実施例３
８７ ０００ｇ／モルのＭＷを有するＬＰＥＩ中への３モル％のＣ１８アシル基の導入を例とした疎水性官能基を有する線状ポリエチレンイミン類（Ｈ−ＬＰＥＩ）の合成
この目的のために、０．５ｇのＬＰＥＩを１０ｍｌのエタノール中に５０℃においてアルゴン下で溶解させ、そして、０．１１ｇ（０．１２ｍｌ）の塩化オクタデシルのゆっくりした添加後に、２０時間にわたり撹拌した。反応混合物を濾過しそして次に真空中で量的に濃縮した。残渣を４ｍｌの熱いエタノール中に溶解させそして８ｍｌの２０℃の水を加えることにより生成物を沈澱させた。濾過および水（洗浄水ｐＨ７）を用いる洗浄後に、高真空下で五酸化燐上で乾燥した（収量０．３８ｇ／７６％）。セファデックスＧ２５（ファーマシア使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム）上でのポリエチレンイミンの飽和水溶液（ｐＨ７）からの溶離剤としてのミリポル水を用いるカラムクロマトグラフィーおよびその後の凍結乾燥により、高純度バッチ（ミリグラム量）が得られた。
【００７６】
アシル化された線状ポリエチレンイミン類は１Ｈ−ＮＭＲおよびＦＴ−ＩＲにより同定され、それにより所望するアシル化度を確認することが可能であった。
実施例４
８７ ０００ｇ／モルのＭＷを有するＬＰＥＩ中への３モル％のケノデオキシコール酸基（３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸）の導入を例とした疎水性官能基を有する線状ポリエチレンイミン類（Ｈ−ＬＰＥＩ）の合成
ケノデオキシコール酸（シグマ−アルドリッヒ・ヘミーＧｍｂＨ）をこの目的のためにＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応性エステル化合物に転化させた。１ｇのケノデオキシコール酸および０．３２ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを５ｍｌのジメトキシエタン中に溶解させそして０−５℃において０．６３ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させた。反応混合物を１６時間にわたり撹拌し、沈澱を濾別し、そして濾液を真空中で濃縮した。反応性エステルを高真空下で乾燥し（安定なフォーム）そして１Ｈ−ＮＭＲにより同定した。さらなる精製なしに、１７９ｍｇのケノデオキシコール酸反応性エステルを０．５ｇのＬＰＥＩの１０ｍｌのエタノール中溶液に室温においてアルゴン下で加えた。反応混合物を次に５０℃において２０時間にわたり撹拌した。室温に冷却した後に、２５ｍｌの水を加えることにより生成物を沈澱させた。残渣を濾別し、水（洗浄水ｐＨ７）で洗浄しそして高真空下で五酸化燐上で乾燥した（収量０．４１ｇ／８２％）。セファデックスＧ２５（ファーマシア使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム）上でのポリエチレンイミンの飽和水溶液（ｐＨ７）からの溶離剤としてのミリポル水を用いるカラムクロマトグラフィーおよびその後の凍結乾燥により、高純度バッチ（ミリグラム量）が得られた。
【００７７】
反応性エステル方法によりアシル−官能化された線状ポリエチレンイミン類は１Ｈ−ＮＭＲおよびＦＴ−ＩＲにより同定され、それにより所望するアシル化度を確認することが可能であった。
実施例５
ゼータ電位測定：
線状ポリエチレンイミン類および疎水性官能基を有するポリエチレンイミン類の水溶液中での生理的ｐＨにおける電荷およびプロトン化度を確定するためにゼータ電位測定を行った。平均分子量とは無関係にそして重合体タイプとは無関係に、ｐＨ７における平均プロトン化度は５０％であることが見いだされ、換言すると窒素原子の約５０％が水溶液中でｐＨ７においてプロトン化された形態である。
実施例６
ポリヌクレオチド／重合体複合体の製造：
目的は、種々のポリヌクレオチド／重合体充填比（１：０．１〜１：１０）および２５０μｇ／ｍｌの一定のポリヌクレオチド濃度を有するＦＶＩＩＩプラスミドｐＣＹ２の複合化を例としてポリヌクレオチド／重合体複合体を製造することであった。充填比および対応する濃度は実施例５に示されたゼータ電位測定に基づき計算することができる。
【００７８】
プラスミドｐＣＹ２は文献に記載されている（Ｃ．Ｒ． Ｉｌｌ， Ｃ．Ｑ． Ｙａｎｇ， Ｓ．Ｍ． Ｂｕｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ， Ｊ．Ｎ． Ｇｏｎｚａｌｅｓ， Ｄ．Ｓ． Ｂｕｒｎｓ， Ｒ．Ｍ． Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ ａｎｄ Ｐ． Ｓｃｕｄｅｒｉ， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ １９９７， ８（２）， ２３−３０）。ｐＣＹ２は９１６４ｂｐ長さでありそしてチロイドホルモン結合グロブリンプロモーター、アルファ−１マイクログロブリン／ビクニンエンハンサーの２つのコピー、およびヒトＢ領域−欠失ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現を調節するウサギベータ−グロブリン遺伝子イントロンの５′−領域を含有する。プラスミドはアンピリシン抗生物質耐性遺伝子、複製のＣｏｌＥ１源およびポリＡ部位も含有する。
【００７９】
水中およびｐＨ７の生理的食塩水中の両方で０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する全てのポリエチレンイミン類（ＬＰＥＩ、Ｈ−ＬＰＥＩ）の貯蔵溶液を製造した。これは、２５ｍｇのＬＰＥＩまたはＨ−ＬＰＥＩを３０ｍｌの水または生理的食塩水中に加熱および簡単な超音波処理をしながら溶解させ、０．１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ７に調節しそして５０ｍｌの最終量にすることにより、行われた。貯蔵溶液を濾過（０．２μｍ）により殺菌しそして長時間にわたり２０℃で貯蔵することができる。順次希釈物（それぞれ１ｍｌ、表１）を貯蔵溶液から製造しそして５００μｇ／ｍｌの濃度のポリヌクレオチド溶液と１：１容量比で反応させて、規定された電荷および２５０μｇ／ｍｌのポリヌクレオチド濃度を有するポリヌクレオチド複合体を生じた（表２）。標準的実験では、３００μｌの量のポリヌクレオチド／ＬＰＥＩまたはポリヌクレオチド／Ｈ−ＬＰＥＩ溶液がしばしば選択された。高いポリエチレンイミン含有量を有する複合体では沈澱が起きることがあり、そして特定の用途前に再懸濁または再分散させることができる。
【００８０】
重合体溶液をポリヌクレオチド溶液中に室温において殺菌条件下でピペット添加しそして次にボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）中で混合した。室温における４時間の培養時間後に、ポリヌクレオチド／重合体複合体を４℃において貯蔵すると、複合体は数週間にわたり貯蔵安定性であった。動物実験用には複合体溶液を必要に応じて希釈することができる。
【００８１】
【表１】
2004510829.tif 000007
【００８２】
【表２】
2004510829.tif 000008
【００８３】
実施例７
ゲル電気泳動によるポリヌクレオチド／重合体複合体の同定
ポリヌクレオチド／重合体複合体の重合体および電荷置換の複合化性能をアガロースゲル電気泳動により試験した。ゲルをそれぞれ０．４ｇのアガロースおよび４０ｍｌのトリスアセテート緩衝液（０．０４Ｍ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡでｐＨ８．３）から製造した（厚さ、約０．６ｃｍ）。４μｌのポリヌクレオチド／重合体複合体（ｃ＝２５０μｇ／ｍｌ）、９．５μｌの水（ミリポル）および１．５μｌの停止混合物よりなる試料をボルテックス中で混合しそしてゲルポケット中に定量的に移した。ゲル電気泳動は普通は１００〜１５０ｍＡの電流（１１０Ｖ）で起きる。比較用に、ＤＮＡマーカー（ペクラブ（ＰｅｑＬａｂ）、１ｋｂラダー（Ｌａｄｄｅｒ））および裸の（複合化されていない）ポリヌクレオチドもそれぞれのゲル電気泳動実験で分析した。
【００８４】
臭化エチジウムの水溶液中でのゲルの現像および２５４ｎｍにおける照射後に、ＤＮＡ帯の位置が見えた。ＦＶＩＩＩプラスミドの場合、プラスミドのスーパーコイル化形態および円形態に相当しておりそして陽極の方向に泳動する２つの帯が見える。ＬＰＥＩおよびＨ−ＬＰＥＩは臭化エチジウムでは検出できなかった。複合体中の重合体含有量における増加は、充填点におけるプラスミドの部分的であるがまだ不完全な遅延をもたらす。１：１より高いポリヌクレオチド／重合体充填比を有する複合体はもはや検出できず、換言すると、ＤＮＡ中への臭化エチジウムのインターカレーションはもはや可能でなかった。凝集したＤＮＡは１：１の充填比より上では重合体でカプセル化された粒子の形態であった。ゲル電気泳動の結果は試験した線状ポリエチレンイミン類のタイプ（分子量、置換）に依存していない。計算された充填比（実施例５参照）はゲル電気泳動により確認することができる。
実施例８
走査力顕微鏡検査法（ＡＦＭ）によるポリヌクレオチド／重合体複合体の同定
水溶液中で製造された選択されたポリヌクレオチド／重合体複合体をＡＦＭ（デジタル・インストルメンツ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により同定した。この目的のために、複合体の溶液を水で０．５〜１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、そして１〜５μｌの間の希釈された溶液を珪素基質上にピペットで添加した。水の蒸発（約５分間）後に、試料をＡＦＭ中で分析した。１：０．１５のポリヌクレオチド／重合体比より上では、ＤＮＡ縮合および粒子生成があることを示すことが可能であり、粒子の寸法は１００〜２００ｎｍの範囲内であった。
実施例９
疎水性官能基を有するポリエチレンイミン類（Ｈ−ＬＰＥＩ）を用いるインビボトランスフェクション実験：
ポリヌクレオチド／重合体複合体をＦＶＩＩＩをコードするプラスミドｐＣＹ２を用いて製造した。
【００８５】
使用したマウスは、生後５−６週間のそれぞれ約２０ｇのＣ５７Ｂ１／６雌マウスであった。マウスは米国のシモンセン・ラブス・インコーポレーテッド（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ）から購入した。
【００８６】
実験では、５匹のマウス／群を使用し、そして２００μｌ／動物で尾の静脈を介して５０μｇのプラスミドＤＮＡ単独または５０μｇのプラスミドＤＮＡ＋重合体のいずれかを注射した。ＤＮＡ／重合体充填比は１：０．５であった。その後の実験では、１０匹のマウスｇ並びにＤＮＡ：重合体／ＬＰＥＩおよび重合体／Ｈ−ＬＰＥＩの異なる充填比をそれぞれ使用した。動物を注射から２４時間後に眼窩後方で出血させた。
【００８７】
これらの動物からの血漿試料を改変ＦＶＩＩＩ活性検定を用いて評価した。血漿を最初にネズミモノクローナル抗体Ｃ７Ｆ７でコーテイングされた９６−ウェル検定板への添加前にホスフェート緩衝食塩水で１：４に希釈した。Ｃ７Ｆ７抗体はヒトＦＶＩＩＩの軽鎖に関して特異的でありそしてネズミＦＶＩＩＩと反応しない。３７℃における２時間のインキュベーション後に、板を０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）を含有するＰＢＳで２回洗浄した。引き続き、コーテスト・キット（Ｃｏａｔｅｓｔ ｋｉｔ）の製造業者（スウェーデンのダイアファーマ・インコーポレーテッド（Ｄｉａｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．））により規定された試薬及び評価条件を使用した。検定の最終段階は４０５／４５０ｎｍで行われる光学濃度読み取りであった。全てのＦＶＩＩＩ水準を、組み換えヒトＦＶＩＩＩを希釈されたマウス血漿に加えることにより作製された標準曲線から外挿した（表３に示された目盛り付け）。
【００８８】
結果を表４および５に示す。
ＦＶＩＩＩ活性検定（Ｃ７Ｆ７改変コーテスト）：
試薬および緩衝液：
コーテイング緩衝液：シグマＰ−３８１３、ｐＨ７．４または０．１Ｍ炭酸水素緩衝液ｐＨ９．２；
阻止緩衝液：１×コーテスト緩衝溶液＋０．８％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０；
洗浄緩衝液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０ｐＨ７．２使用前フィルター；
インキュベーション緩衝液：ツイーン２０なしの阻止緩衝液；
コーテストＶＩＩＩ：Ｃ／４検定キット：クロモジェニクス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）ＡＢ、＃８２−１９−１８−６３／２
工程：
１． ９６−ウェルのイミュロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）板を５μｇ／ｍｌのＣ７Ｆ７でコーテイング緩衝液（１００μｌ／ウェル）中で一晩にわたり４℃においてコーテイングする。
２． ３回洗浄し、阻止緩衝液（１００μｌ／ウェル）を加え、少なくとも１時間にわたり３７℃でインキュベートする。
３． ３回洗浄し、阻止緩衝液（１００μｌ／ウェル）中に希釈された試料を加え、１−２時間にわたり３７℃でインキュベートする。
４． ３回洗浄し、インキュベーション緩衝液（２５μｌ／ウェル）を加え、引き続きコーテスト試薬（キット：５０μｌ／ウェルの混合されたＦＩＸａ、ＦＸ＋燐脂質）を加え、キットの混合指示に従い、５分間にわたり３７℃でインキュベートし、次に５０μｌの基質Ｓ−２２２を各ウェルに加え、そして５分間にわたり３７℃で、または低い範囲値に関しては１０分間にわたりそれよりインキュベートする（段階４はシェーカーが付いた加熱されたブロック中で行うこともできる）。
５． ２％クエン酸（５０μｌ／ウェル）を用いて反応を停止させる。
６． ４０５−４５０ｎｍにおいてＯ．Ｄ．を測定する。
実施例１０
比較実験（表５ａ、ｂ）：
裸のＦＶＩＩＩプラスミドｐＣＹ２を用いるインビボ比較実験は常に陰性であり、換言すると蛋白質発現は検出できなかった。３種の分子量分布（ＭＷ２２ ０００、８７ ０００、２１７ ０００ｇ／モル）および例えば１：０．５のプラスミド／ＬＰＥＩ充填比を有する未置換の線状ポリエチレンイミン類（ＬＰＥＩ）に基づくプラスミド／重合体複合体を用いる比較実験（２００μｌのＩＶ注射、ＤＮＡに基づきｃ＝２５０μｇ／ｍｌ）では、蛋白質発現を検出することは同様に不可能であった。
【００８９】
【表３】
2004510829.tif 000009
【００９０】
【表４】
2004510829.tif 000010
【００９１】
【表５】
2004510829.tif 000011
【００９２】
【表６】
2004510829.tif 000012
【００９３】
【表７】
2004510829.tif 000013
【００９４】
実施例１１
ｐＨが変更した場合のポリヌクレオチド／重合体複合体の性能を試験するためそして細胞のエンドソーム−リソソーム区画の効果を刺激するために、アガロースゲル電気泳動試験を種々の緩衝液系統でそして変動するｐＨ条件下で行った。部分的放出に当たるｐＨ８．３（ＴＡＥ緩衝液）からｐＨ５．９（ＭＥＳ緩衝液）への変化で複合化度が減少することを示すことが可能であった。
【国際公開パンフレット】
2004510829.tif 000023
2004510829.tif 000024
2004510829.tif 000025
2004510829.tif 000026
2004510829.tif 000027
2004510829.tif 000028
2004510829.tif 000029
2004510829.tif 000030
2004510829.tif 000031
2004510829.tif 000032
2004510829.tif 000033
2004510829.tif 000034
2004510829.tif 000035
2004510829.tif 000036
2004510829.tif 000037
2004510829.tif 000038
2004510829.tif 000039
2004510829.tif 000040
2004510829.tif 000041
2004510829.tif 000042
2004510829.tif 000043
2004510829.tif 000044
2004510829.tif 000045
2004510829.tif 000046
2004510829.tif 000047
2004510829.tif 000048
2004510829.tif 000049
2004510829.tif 000050
2004510829.tif 000051
2004510829.tif 000052
2004510829.tif 000053
2004510829.tif 000054
2004510829.tif 000055
2004510829.tif 000056
2004510829.tif 000057
2004510829.tif 000058
2004510829.tif 000059
2004510829.tif 000060
2004510829.tif 000061
2004510829.tif 000062
2004510829.tif 000063
2004510829.tif 000064
2004510829.tif 000065
2004510829.tif 000066
2004510829.tif 000067
2004510829.tif 000068
2004510829.tif 000069
2004510829.tif 000070
2004510829.tif 000071
2004510829.tif 000072
2004510829.tif 000073
【国際調査報告】
2004510829.tif 000074
2004510829.tif 000075
2004510829.tif 000076
2004510829.tif 000077
2004510829.tif 000078
2004510829.tif 000079