(57)【要約】オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化を企図した部位で、化学的に結合する官能基によって基体に結合された化学種を提供する部位を含む基体によって構成された固体の支持体であって、前記化学種が、アルキル鎖によって支持体に結合されたジオール基を有することを特徴とする固体の支持体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化を企図した部位で、化学的に結合する官能基によって基体に結合された化学種を提供する部位を含む基体によって構成された固体の支持体であって、前記化学種が、アルキル鎖によって支持体に結合されたジオール基を有することを特徴とする固体の支持体。
【請求項２】
前記基体が、ガラス、ケイ素、及びプラスチックの中から選択される材料であることを特徴とする請求項１に記載の固体の支持体。
【請求項３】
前記支持体に化学種を結合するための化学的官能基が、シラン官能基であることを特徴とする請求項１または２に記載の固体の支持体。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化のために活性化された部位で、化学的に結合する官能基によって基体に結合された化学種を提供する部位を含む基体によって構成され、前記化学種が前記プローブの固定化を企図したアルデヒド基を含む固体の支持体であって、前記アルデヒド基が、アルキル鎖によって保持されたジオールの酸化によって得られる基であることを特徴とする固体の支持体。
【請求項５】
前記基体が、ガラス、ケイ素、及びプラスチックの中から選択される材料であることを特徴とする請求項４に記載の固体の支持体。
【請求項６】
前記支持体に化学種を結合するための化学的官能基が、シラン官能基であることを特徴とする請求項４または５に記載の固体の支持体。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞が、支持体のアルデヒド官能基と、プローブによって保持されたアミン官能基との間の共有結合によって活性部位に固定化されている、請求項４から６のいずれか一項に記載の固体を支持体を含むことを特徴とするバイオチップ。
【請求項８】
以下の工程：
−  基体の表面を洗浄する工程；
−  清浄化表面に、化学的に結合する官能基によって基体に結合された、プローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化を可能にするアルデヒド官能基を形成することを企図した前駆体を含む化学種を配置することによって、前記部位を規定する工程；
を含む、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞を固定化することを企図した部位を有する固体の支持体の製造方法であって、前記前駆体がエポキシド官能基であり、ジオール基を与えるように処理され、前記エポキシド前駆体が、アルキル鎖の末端で配置されることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記ジオール基を与えるための処理が、エポキシドの酸加水分解であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
前記洗浄工程が、ガラス、ケイ素、及びプラスチックの中から選択される材料の基体の表面を洗浄することからなることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基体に対する化学種の結合のための化学的官能基が、シラン官能基であることを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
さらにアルデヒドを得るために隣接したジオールを酸化することからなる工程を含むことを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程：
−  請求項１２に記載の方法によって、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化を企図した部位を有する固体の支持体を製造する工程；
−  前記固体の支持体のアルデヒド官能基と、５’または３’位置で前記プローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞によって保持されたアミン官能基との間の供給結合によって、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞を固定化する工程；
からなることを特徴とするバイオチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に生物学的チップの生産のためのプローブの固定化方法に関する。本発明は、固体の支持体へ共有結合によってグラフトされたオリゴヌクレオチドを有するバイオチップの製造を可能にする。
【０００２】
【従来の技術】
バイオチップは、固体の支持体への直接的なオリゴヌクレオチドの平行的な合成によって生産されても良い。この場合、この方法の制限は、複数の合成されたプローブを結合する点に存在する。実際、合成の後に精製をすることは可能ではない。これは、ｎの企図された長さについて長さ（ｎ−１）マーの切り詰められた配列の支持体上の存在を導く。この方法は、６から２０マーの間の長さを有するプローブの高密度チップ（１０００プローブを超えるもの）について適している。この場合に考慮される応用は、一塩基多型（ＳＮＰ）の配列決定とスクリーニングである。
【０００３】
別の途は、プローブの固定化である。この場合、プローブは事前に合成され、それ故精製可能である。二つのタイプのオリゴヌクレオチドプローブの固定化が利用可能である。精製されたプローブは、吸着によって、またはプローブと支持体の間の特異的反応を介したグラフト化によってのいずれかで、支持体に固定化されて良い。
【０００４】
負に荷電されたプローブのホスホジエステル骨格と、正の荷電を有する変性された支持体の間で成立した静電的なタイプの結合が、プローブの固定化において非共有結合的な態様で存在するため、支持体へのプローブの吸着は受動的な現象である。このタイプの固定化は、７０から数百マーの間を長さを含むプローブで適合的である。
【０００５】
これとは対照的に、特異的な反応によるプローブのグラフト化の場合では、プローブに結合された官能基と、支持体上に導入された官能基の間の反応性及び特異性のために、この現象は能動的であると言える。この固定化の態様は、沈着したプローブと使用される支持体の間でその後共有タイプの結合を成立させる。これは、６から５０−６０マーの間の長さを含むプローブで適合的である。
【０００６】
オリゴヌクレオチドプローブの固定化は、プローブと支持体の結合された化学的官能基のペアを使用する。この化学的官能基のペアの概念は、求核性物質と求電子性物質の間の反応性に基づく。
【０００７】
かくして、いくつかの官能化の可能性、つまりいくつかのプローブ及び支持体上の化学的官能基の導入の可能性が存在する。故に求核性プローブが求電子性支持体で使用されても良く、求電子性プローブが求核性支持体で使用されても良く、求核性プローブが求二電子性セグメントの存在下であるが、同様な求核性支持体で使用されて良く、求電子性プローブが求二核性セグメントの存在下で、同様な求電子性支持体で使用されても良い。
【０００８】
アミン官能基によって求核性にされたプローブが、最も広く使用されている。この官能基は実際に安定であり、非常に市場で入手可能である。
【０００９】
二つの相補的な一本鎖ＤＮＡの間の対形成生産物であるハイブリドンに対応する蛍光スポットを得るためには、各種の工程が必要である。
【００１０】
プローブの固定化を有するバイオチップのための官能化支持体を得ることは、三つの主たる工程を必要とする：
−  反応性の部位を提示する前の、支持体表面の洗浄工程；
−  この表面のシラン化工程；
−  前記部位の活性化工程。
これらの工程の後、三つの他の工程が引き続き、それは蛍光シグナルの獲得を導くであろう：
−  前記部位でのプローブの固定化工程；
−  前記プローブのハイブリダイゼーション工程；
−  読み取り工程。
【００１１】
後に化学的官能基が形成される支持体上へのアンカー部位の導入のために、二つの途が主に区別される。これらの部位は、求核性または求電子性のいずれかである。それらはシラン化工程の間で導入される。
【００１２】
例として、図１は、シランによって支持体に結合されたアミン官能基によって構成された求核性部位を示す。
【００１３】
バイオチップとして現在利用可能な支持体は、アルデヒド官能基の導入により求電子性部位を有する。それらは、アミン官能基により求核性とされたプローブを結合を可能にする。
【００１４】
図３は、ジアルデヒドセグメントに結合したアミン官能基から開始する、支持体上にアルデヒド官能基を得るための模式図を示す。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
アルデヒド官能基を提示し、現在知られているバイオチップ支持体は、以下の欠点を有する。
【００１６】
それらは、プローブ結合部位の最終密度を減少するカップリング中間体を必要とする（図３参照）。
【００１７】
アルデヒド形態は比較的低安定性を有するため、それらの貯蔵は問題を提示する。実際に、前記支持体は、それらを含む箱を開封した後に迅速に使用しなければならないことが観察されている。
【００１８】
支持体上の初期のＮＨ２基（図３参照）は、非特異的化合物の吸着を嗜好するＮＨ３＋に変換されても良い。前記バイオチップのバックグランドノイズは、結果として増大する。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
従来技術の欠点に対する解決策を提供するために、本発明によれば、ジオールを介してエポキシドの変換により、アルデヒド官能基（プローブの固定化を許容する）を得ることが提案されている。
【００２０】
本発明の第一の主題は、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化を企図した部位で、化学的に結合する官能基によって基体に結合された化学種を提供する部位を含む基体によって構成された固体の支持体であって、前記化学種が、アルキル鎖によって支持体に結合されたジオール基を有することを特徴とする固体の支持体からなる。
【００２１】
図２は、アルキル鎖の末端で配置されたシラン基によって支持体に結合されたエポキシド官能基によって構成された求電子性部位を示す。前記アルキル鎖は、酸素から離れている。
【００２２】
そのような支持体は、ジオール形態がアルデヒド形態より安定であるため、問題なく６ヶ月間貯蔵可能であるという利点を有する。
【００２３】
前記基体は、ガラス、ケイ素、及びプラスチックの中から選択される材料からなって良い。
【００２４】
支持体に化学種を結合するための化学的官能基は、好ましくはシラン官能基である。
【００２５】
本発明の第二の主題は、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化のための活性部位で、化学的に結合する官能基によって基体に結合された化学種を提供する部位を含む基体によって構成され、前記化学種が前記プローブの固定化を企図したアルデヒド基を含む固体の支持体であって、前記アルデヒド基が、アルキル鎖によって保持されたジオールの酸化によって得られる基であることを特徴とする固体の支持体からなる。アルキル鎖は、酸化工程の前に、ジオール官能基と支持体上の結合基の間の結合中の酸素の存在を避ける。
【００２６】
前記基体は、結合層で覆われたまたは覆われない、ガラス、ケイ素、及びプラスチックの中から選択された材料からなって良い。
【００２７】
支持体に前記化学種を結合する化学的官能基は、好ましくはシラン官能基である。
【００２８】
本発明の第三の主題は、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞が、支持体のアルデヒド官能基と、プローブによって保持されたアミン官能基との間の共有結合によって活性部位に固定化されている、前述の活性部位を含む基体によって構成された固体の支持体を含むバイオチップからなる。
【００２９】
本発明の第四の主題は、以下の工程：
−  基体の表面を洗浄する工程；
−  清浄化表面に、化学的に結合する官能基によって基体に結合された、プローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化を可能にするアルデヒド官能基を形成することを企図した前駆体を含む化学種を配置することによって、前記部位を規定する工程；
を含む、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞を固定化することを企図した部位を有する固体の支持体の製造方法であって、前記前駆体がエポキシド官能基であり、ジオール基を与えるように処理され、前記エポキシド前駆体が、アルキル鎖の末端で配置されることを特徴とする方法からなる。
【００３０】
ジオール基を与えるための処理は、有利にはエポキシドの酸加水分解である。
【００３１】
洗浄工程は、ガラス、ケイ素、及びプラスチックの中から選択される材料の基体の表面を洗浄することからなって良い。
【００３２】
基体に対する化学種の結合のための化学的官能基は、好ましくはシラン官能基である。
【００３３】
前記方法はさらに、アルデヒドを得るためにジオールを酸化することからなる工程を含んでも良い。
【００３４】
本発明の第五の主題は、以下の工程：
−  前述の方法によって、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞の固定化を企図した部位を有する固体の支持体を製造する工程；
−  前記固体の支持体のアルデヒド官能基と、５’または３’位置で前記プローブによって保持されたアミン（またはオキシアミン）官能基との間の供給結合によって、オリゴヌクレオチドプローブ、タンパク質、またはリガンドを有する生物学的細胞を固定化する工程；
を含む、バイオチップの製造方法からなる。
【００３５】
例示として示され制限的なものではない以下の記載を読むことで、且つ添付された図面から、本発明は十分に理解され、さらなる利点及び詳細が明らかとなるであろう。
【００３６】
【発明の実施の形態】
図４は、本発明によって、エポキシド官能基をジオールに加水分解し、次いでアルデヒドに酸化することから得られる、固体の支持体でアルデヒド官能基を得る模式図である。使用されるエポキシドは、例えばトリエトキシシラングリシドオキシプロピルエポキシドである。
【００３７】
しかしながら本発明の発明者は、洗浄、シラン化、活性化、及びハイブリダイゼーションの各工程の後に、支持体上のハイブリダイゼーションスポットの蛍光の結果が、あまり顕在化されていないことを観察した。市販品のシート及びアミン化シートで実施された平行な操作が、より優れたシグナル強度を与えたため、これはハイブリダイゼーション工程のためではない。
【００３８】
それ故本発明者は、洗浄化工程またはシラン化工程（それらはｉｎ ｓｉｔｕ合成の場合に有効である）ではなく、むしろ活性化工程、つまりエポキシド官能基をアルデヒドに変換する間、より正確にはシランの隣接したジオールをアルデヒドに酸化する工程について疑問を生じた。
【００３９】
図５は、隣接した位置でのジオール官能基を示す模式図である。
【００４０】
前記基を有するアルキル鎖上の酸素ではなくエポキシドで、酸化が生じるべきであることが引き続く。
【００４１】
図６は、ジオールとの過ヨウ素酸ナトリウム錯体形成のメカニズムを示す模式図である。
【００４２】
それらの仮説を確認するために、本発明者は、アルキル鎖（この鎖に酸素は存在しない）によって結合したエポキシド官能基を有するシランを使用した。
【００４３】
図７は、本発明の方法によってシラン化された基体の官能化を示す模式図である。
【００４４】
反応順列の各種の工程の後、黒いバックグランド上の飽和した蛍光スポットが得られ、本発明者の仮説を確認した。
【００４５】
本発明は、従来技術、とりわけ現在市場で入手可能なアルデヒドタイプの基体に対していくつかの利点を有する。
【００４６】
本発明は、プローブ結合部位の最終密度を減少するいずれのカップリング中間体も使用しない。得られる蛍光シグナルは、本発明の場合でより大きい。同等な実験条件の下で、１０倍が観察される。
【００４７】
前述のように、本発明は、特に安定であるジオール形態で固体の支持体を貯蔵可能である。
【００４８】
本発明はまた、静電的相互作用を可能にする基が存在しないため、バイオチップのバックグランドノイズを最小化可能である。
【００４９】
本発明に係る支持体の調製は、例えばｉｎ ｓｉｔｕ合成と行ったバイオチップの他の操作方法で実施できる。
【００５０】
例として、ジオールを生じるエポキシドを開裂した後に、本発明に係るシランを、固体の支持体上のオリゴヌクレオチドのｉｎ ｓｉｔｕ合成に作用させて使用する。Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９タイプの自動合成器でガラスビーズ上でのオリゴヌクレオチドの合成に現在使用されているホスホロアミダイト化学式を使用した。使用される合成プロトコールは、文献Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ （Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９８５年１０月， ２８頁）１に記載されている。それは、カップリング、アセチル化、酸化、及び脱トリチル化の各工程を含み、これらの工程は、ホスホルアミダイトヌクレオチドによって有される塩基（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）によって決定される配列を有するオリゴヌクレオドの合成を可能にするように繰り返される。
【００５１】
第一のカップリング工程は、２’−デオキシ−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホルホルアミダイトと、支持体のジオールとの間で生じる。以下のカップリングが、各種の塩基を有するヌクレオチドの間で生じる。２０マーの配列が完成した：３’ ＴＴＴＴＴ ＡＴＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＡＡ ＴＡＧ Ｃｙ３ ５’。Ｃｙ３蛍光ラベルは、前述のホルホルアミダイト化学式を使用して、合成の最後で導入された。
【００５２】
５５０ｎｍでの励起の後にＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ８０エピ蛍光顕微鏡で測定された蛍光シグナルは、アルカリ鎖に酸素を含むシランの場合で得られたものより４から５倍の倍率まで大きく増大した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、前述されたように、シランによって支持体に結合されたアミン官能基によって構成された求核性部位を示す。
【図２】図２は、前述されたように、シランによって支持体に結合されたエポキシド官能基によって構成された求電子性部位を示す。
【図３】図３は、前述されたように、従来技術によって、固体の支持体上にアルデヒド官能基を得る模式図を示す。
【図４】図４は、本発明によって、固体の支持体上にアルデヒド官能基を得る模式図を示す。
【図５】図５は、隣接した位置でのジオール官能基を示す模式図である。
【図６】図６が、ジオールとの過ヨウ素酸ナトリウム錯体形成のメカニズムを示す模式図である。
【図７】図７は、本発明の方法によってシラン化された基体の官能化を示す模式図である。
【図４】
2004519663.tif 000002
【図７】
2004519663.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2004519663.tif 000004
2004519663.tif 000005
2004519663.tif 000006
2004519663.tif 000007
2004519663.tif 000008
2004519663.tif 000009
2004519663.tif 000010
2004519663.tif 000011
2004519663.tif 000012
2004519663.tif 000013
2004519663.tif 000014
2004519663.tif 000015
2004519663.tif 000016
2004519663.tif 000017
2004519663.tif 000018
2004519663.tif 000019
2004519663.tif 000020
2004519663.tif 000021
2004519663.tif 000022
2004519663.tif 000023
2004519663.tif 000024
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004519663.tif 000025
【国際調査報告】
2004519663.tif 000026
2004519663.tif 000027
2004519663.tif 000028
2004519663.tif 000029
2004519663.tif 000030
2004519663.tif 000031
2004519663.tif 000032
2004519663.tif 000033