(57)【要約】式Ｉ：（ＡＸＸＤＸＸＸ）ｎ　　　Ｉ［式中、ＡはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたはそれらの誘導体であり；ＤはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌまたはそれらの誘導体であり；各Ｘは天然コイルドコイルタンパク質のエピトープのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基またはそれらの誘導体であり；各（ＡＸＸＤＸＸＸ）リピート中のＸ残基は、Ｘ残基のセットを形成し；ｎは１以上である］の合成ペプチド。
2004503565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
（ＡＸＸＤＸＸＸ）ｎ　　　Ｉ
［式中、
ＡはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたはそれらの誘導体であり；
ＤはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌまたはそれらの誘導体であり；
各Ｘは天然コイルドコイルタンパク質のエピトープのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基またはそれらの誘導体であり；
各（ＡＸＸＤＸＸＸ）リピート中のＸ残基は、Ｘ残基のセットを形成し；
ｎは１以上である］
の合成ペプチド。
【請求項２】
各（ＡＸＸＤＸＸＸ）リピートにおいて、ＡがＩｌｅであり、ＤがＬｅｕである、請求項１記載のペプチド
【請求項３】
ｎが約３から６である、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
前記Ｘ残基が、天然タンパク質のコイルドコイル領域において溶媒にさらされるアミノ酸である、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
前記Ｘ残基のセットのそれぞれが、単一のタンパク質の同じエピトープから得られる、請求項１記載のペプチド。
【請求項６】
異なるＸ残基の少なくとも二つのセットを含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項７】
前記異なるセットのそれぞれが、同じタンパク質の異なるエピトープ、及び異なるタンパク質から得られるエピトープからなる群から独立に選択される、請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドのＣ−末端及び／またはＮ−末端で付加的なアミノ酸をさらに含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項９】
前記付加的なアミノ酸残基が、ペプチドのＮ−末端でのＣＮｌｅＧである、請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｘ残基のセットが、天然コイルドコイルタンパク質の溶媒にさらされる残基のコンセンサス配列に対応する、請求項１記載のペプチド。
【請求項１１】
前記コイルドコイルタンパク質が、肺炎球菌表面タンパク質Ａ、肺炎球菌表面タンパク質Ｃ、及び肺炎球菌アドヘシンＡからなる群から選択される、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
ＥＥＬＸ１Ｘ２ＫＩＤＥＬＤＸ３ＥＩＡＸ４ＬＥＫＸ５（配列番号５）、及びＥＥＬＸ１Ｘ２ＫＩＤＥＬＤ（配列番号５の１−１１）［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５はいずれかのアミノ酸である］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１記載のペプチド。
【請求項１３】
式中、
Ｘ１がＳ、Ｑ、Ｎ、またはＤであり；
Ｘ２がＤ、Ｎ、またはＫであり；
Ｘ３がＡ、またはＮであり；
Ｘ４がＫ、Ｅ、またはＤであり；及び
Ｘ５がＮ、Ｄ、またはＥである；
請求項１２記載のペプチド。
【請求項１４】
式Ｉ：
（ＡＸＸＤＸＸＸ）ｎ　　　Ｉ
［式中、
ＡはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたはそれらの誘導体であり；
ＤはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌまたはそれらの誘導体であり；
各Ｘは天然コイルドコイルタンパク質のエピトープのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基またはそれらの誘導体であり、但し少なくとも一つのＸが、荷電したアミノ酸と、反対の荷電の別のアミノ酸残基との間で塩架橋を形成するような態様で、荷電したアミノ酸残基で置換されて、その塩架橋がペプチドのコイルドコイル構造の推定を容易にすることを除く；
各（ＡＸＸＤＸＸＸ）リピート中のＸ残基は、Ｘ残基のセットを形成し；
ｎは１以上である］
の合成ペプチド。
【請求項１５】
荷電したアミノ酸が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される、請求項１４記載のペプチド。
【請求項１６】
ａ）コイルドコイルタンパク質のエピトープを選択する工程；
ｂ）前記エピトープのどのアミノ酸残基が溶媒にさらされるかを測定する工程；及び
ｃ）式ＩのＸ位置に前記溶媒にさらされるアミノ酸残基を挿入する工程；
を含む、式Ｉのペプチドの製造方法。
【請求項１７】
前記コイルドコイルタンパク質が細菌タンパク質である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記エピトープの選択工程が、コンピューターアルゴリズムを使用して実施される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
エピトープアミノ酸の一つのセットが使用される、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記セットのそれぞれが、同じタンパク質の異なるエピトープ、及び異なるタンパク質から得られるエピトープからなる群から独立に選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも一つの式Ｉのペプチドを含む、動物において免疫応答を刺激するのに有用な組成物。
【請求項２２】
前記式Ｉのペプチドが、キャリアータンパク質に接合されている、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
さらにアジュバントを含む、請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも二つの異なるＸ残基のセットを含む、請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
前記異なるセットのそれぞれが、同じタンパク質の異なるエピトープ、及び異なるタンパク質から得られるエピトープからなる群から独立に選択される、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
微生物の一つより多くの株及び／または種に対する免疫応答を刺激するのに有用である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２７】
動物に式Ｉのペプチドを投与することを含む、動物において免疫応答を引き出す方法。
【請求項２８】
式Ｉのペプチドを認識する抗体。
【請求項２９】
式Ｉのペプチドが、細菌タンパク質から得られる溶媒にさらされるアミノ酸を含む、請求項２８記載の抗体。
【請求項３０】
微生物の一つより多くの株及び／または種に結合する、請求項２８記載の抗体。
【請求項３１】
ポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項２８記載の抗体。
【請求項３２】
請求項２８記載の抗体を含む製薬組成物。
【請求項３３】
製薬学的に許容可能な賦形剤またはキャリアーをさらに含む、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
免疫応答を刺激するために、動物に式Ｉのペプチドを投与することによって生産される抗体。
【請求項３５】
式Ｉのペプチドを含む、ワクチンとして有用な組成物。
【請求項３６】
一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが、式Ｉのペプチドにおいて使用される、請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
エピトープアミノ酸のセットが、微生物の異なる株及び／または種から得られる、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
一つより多くの微生物の株及び／または種に対する交差保護を提供する、請求項３５記載の組成物。
【請求項３９】
一つより多くの微生物の株及び／または種に対する交差保護を提供する、請求項３６記載の組成物。
【請求項４０】
一つより多くの微生物の株及び／または種に対する交差保護を提供する、請求項３７記載の組成物。
【請求項４１】
製薬学的に許容可能な賦形剤またはキャリアーをさらに含む、請求項３５記載の組成物。
【請求項４２】
細菌感染の疑いのある哺乳動物に式Ｉのペプチドを投与することを含む、細菌感染を防止する方法。
【請求項４３】
一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが式Ｉのペプチドにおいて使用され、前記エピトープアミノ酸のセットが微生物の異なる株及び／または種から得られる、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
いくつかの微生物の株及び／または種による感染を防止するのに有用である、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
いくつかの微生物の株及び／または種による感染を防止するのに有用である、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
細菌感染の疑いのある、または細菌感染に罹患している動物において細菌感染を治療または防止する方法であって、動物に対して式Ｉのペプチドを投与することによって生産される細菌タンパク質に対する有効量の抗体を、前記動物に投与することを含む方法。
【請求項４７】
前記動物において感染の症状を防止する、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
いくつかの微生物の株及び／または種による感染を治療または防止するのに有用である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
ａ）特定の微生物から得られるエピトープを含む式Ｉのペプチドに対する抗体と、サンプルを接触させる工程；及び
ｂ）前記抗体が前記サンプルの構成成分に結合するかを測定する工程；
を含む、サンプル中の特定の微生物の存在を測定する方法。
【請求項５０】
前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
細菌感染の原因となる剤を決定するために使用される、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
サンプル中のいくつかの微生物の株及び／または種の存在を同時に検出するために使用される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
サンプル中のいくつかの微生物の株及び／または種の存在を同時に検出するために使用される、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
サンプル中のいくつかの微生物の株及び／または種の存在を同時に検出するために使用される、請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
生物学的サンプル中の細菌タンパク質に対する抗体の存在を測定する方法であって、
ａ）前記細菌タンパク質から得られる少なくとも一つのエピトープを含む式Ｉのペプチドと、前記生物学的サンプルを接触させる工程；及び
ｂ）前記生物学的サンプル中の抗体が、前記ペプチドに結合するかを測定する工程；
を含む方法。
【請求項５６】
特定の微生物に対して動物をさらす前に測定するために使用される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
付加的アミノ酸が、ラクタム架橋の形成を通じてペプチドを安定化する、請求項８記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
関連出願
本出願は、２０００年６月１４日に出願された米国仮出願第６０／２１１，８９２号、及び２０００年６月２３日に出願された第６０／２１３，３８７号の利益を享受する。これらの仮出願のそれぞれの完全な内容が、全体として参考としてここに取り込まれる。
【０００２】
本発明は、天然に存在する微生物及び非微生物タンパク質抗原から由来する合成ペプチドを含む、構造特異的ペプチドを生産するためのコイルドコイル構造的骨格の使用に関する。前記合成ペプチドの構造は、天然のタンパク質のコイルドコイル領域から由来するエピトープがスプライスされた、７つ揃いのリピート単位の構造を利用する。生成したペプチドはより安定なコイルドコイル構造を有し、それ故ヘリックス構造におけるエピトープの提示を改良する。
【０００３】
【参考文献】
2004503565.tif 000003
2004503565.tif 000004
2004503565.tif 000005
2004503565.tif 000006
【０００４】
上述の文献、特許、及び特許出願の全ては、各個々の文献、特許出願、または特許の開示が、特定的に且つ個々的に全体として参考として取り込まれるように示されたのと同じ程度に、全体として参考としてここに取り込まれる。
【０００５】
【従来の技術】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、肺炎、骨髄炎、及び菌血症のような生命を脅かす侵襲性の疾患を引き起こす重要な病原体である。米国では毎年１００万以上のケースの肺炎球菌性肺炎が診断されており、これらの感染の０．７％が致死的であると見積もられている（Ｌａｎｃｅｒ， １９８５）。発展途上国では、４００万の死者がＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染での肺炎によるものであり、死者の７０％を数えると見積もられている（ＷＨＯ， １９９５）。Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはまた、中耳炎及び静脈洞炎のようなあまりひどくない疾患を引き起こし、それらはその罹患率のため、ヘルスケアシステムの有意な重荷となっている。肺炎球菌感染症と関連する高い罹患率と致死率は、その生物が複数の抗生物質に対する耐性を獲得する速度によって悪化している（Ｓｐｉｋａ等， １９９１； Ｂａｑｕｅｒｏ等， １９９１）。かくして、肺炎球菌感染症に対する有効な治療のためのまだ見ぬ必要性が存在する。
【０００６】
ヒトにおける肺炎球菌感染症の予防のために利用されている現在のワクチンは、精製された莢膜ポリサッカリドに基づく。莢膜ポリサッカリドワクチンのデザインは、９０の異なる莢膜タイプが存在し、莢膜によって引き出される保護はタイプ特異的であるという事実により複雑である（Ｈｅｎｒｉｃｈｓｏｎ， １９９５）。これらの問題は、特定の莢膜が他種よりもヒトの疾患とより一般的に関連しているという事実によって幾分緩和されており、それは最終的に、現在２３価のワクチンにおける莢膜の封入を導いている（Ｒｏｂｂｉｎｓ等， １９８３）。しかしながら、莢膜ポリサッカリドは、複数の繰り返し単位を有するほとんどのポリマー状化合物と同様に、免疫応答及びＩｇＧへのサブクラススイッチングの刺激について非効率的である（Ｂｅｕｖｅｒｙ等， １９８２）。驚くべきことではないが、このワクチンは、成人における致死的肺炎球菌性菌血症の予防においてわずか６０％のみ有効であり（Ｓｈａｐｉｒｏ等， １９９１）、２歳以下の子供では十分な抗体応答を引き出すことができない（Ｃｏｗａｎ等， １９７８）。子供における微弱な免疫原性の問題は、このポリサッカリドをジフテリア及び破傷風菌トキソイドのようなタンパク質キャリアに接合することによって解決しようとしている（Ｓｈｅｌｌｙ等， １９９７）。最近の臨床試験では、７価の接合物ワクチンが、子供において免疫原性であり、侵襲性の肺炎球菌感染症に対して保護を引き出すことが示された。
【０００７】
しかしながら、臨床上の重要な感染が、子供の場合とは異なる莢膜タイプによって引き起こされるため、成人については別個のワクチンが必要とされるであろう。発展途上国における適用範囲は、肺炎球菌株の地理的なバリエーションのため、５２％程度の低さであると予測される。さらに、接合物ワクチンは、発展途上国にはあまりに高価であると理解される。かくして、肺炎球菌性ワクチンの開発に対する代替的なアプローチに対する早急な必要性が存在する。
【０００８】
ポリサッカリドワクチンと関連する欠点は、肺炎球菌性タンパク質抗原に基づくワクチンの開発の可能性における興味を引きつけている。考慮される肺炎球菌性タンパク質は、毒素、ニューモリシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）、オートリシン（ａｕｔｏｌｙｓｉｎ）、及び表面タンパク質を含む。今日までワクチンとして使用されている表面タンパク質は、肺炎球菌表面アドヘシンＡ（ＰｓａＡ）、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、及び肺炎球菌表面タンパク質Ｃ（ＰｓｐＣ）を含む。これらの表面タンパク質は図１に示される。
【０００９】
ニューモリシンは、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの実質上全ての臨床上の単離物によって生産されるチオールサイトリシン（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ）である。マウスを、明礬に吸着されたニューモリシンの遺伝学的に操作されたトキソイドバージョン（ニューモリソイド）で免疫化した場合、生存割合及び非生存者の死の速度（生存時間）は、コントロールのものより有意に大きかった。しかしながら、保護の度合いにおける有意な差異が、各種の株の間で記載された（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等， １９９４）。ニューモリソイドは、肺炎球菌莢膜ポリサッカリドのためのキャリアータンパク質として現在調査されている（Ｍｉｃｈｏｎ等， １９９８）。一般的に、破傷風菌トキソイド接合物と比較すると、莢膜ポリサッカリドをニューモリシンの接合物として処方した場合、莢膜ポリサッカリドに対するより高い応答が観察された。オートリシンでの免疫化もまた、敗血症モデルにおいて保護的であることが示されている（Ｃａｎｖｉｎ等， １９９５）。しかしながら、オートリシンに対する抗体は、ニューモリシンのオートリシン依存的放出を妨げるため、その効果を一部しか発揮しないようである。
【００１０】
今日まで調査された全てのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ単離物は、リポタンパク質肺炎球菌表面アドヘシン（ＰｓａＡ）を発現する。ＰｓａＡは３７ｋＤａの分子量であり、遺伝学的に保存されていると考慮される。ＰｓａＡの機能は、Ｚｎ結合膜輸送タンパク質の機能である（Ｌａｗｒｅｎｃｅ等， １９９８）。最近の研究では、天然ＰｓａＡでのマウスの免疫化が、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの毒性株でのチャレンジからマウスを保護する抗ＰｓａＡ抗体を生産することが示されている（Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎ等， １９９６； Ｄｅ等， １９９９）。マウス保菌モデルでは、ＰｓａＡが、保菌に対する保護を引き出す最も最適な肺炎球菌表面抗原の一つであることが示されている。しかしながらＰｓａＡは、ネズミ敗血症モデルまたはネズミ肺感染症モデルにおける保護の誘導では、ＰｓｐＡほど有効ではない（Ｂｒｉｌｅｓ等， ２０００）。
【００１１】
肺炎球菌表面タンパク質Ａは、今日まで研究されているＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの全ての株で見出されており、完全な毒性のために必要とされる（Ｃｒａｉｎ等， １９９０）。ＰｓｐＡは、６７から９９ｋＤａの範囲の株依存的な分子量を有する一方、全てのタンパク質が、４の別個のドメインからなる：Ｎ末端の非常に荷電したドメイン、プロリンリッチドメイン、１０の非常に保存された２０アミノ酸リピートを含むリピートドメイン、及び短い疎水性ドメイン（図２）。リピート領域は、コリン残基に対する非共有結合によって、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞表面に対するこのタンパク質の結合に関与する。
【００１２】
Ｒｘ１株のＰｓｐＡのアミノ酸配列は、配列番号１としてここに含まれる。このＰｓｐＡのＮ末端の配列分析（残基１−３０３）は、この配列がコイルドコイル構造を採用することを示した。コイルドコイル構造は、左巻きのスーパーツイストを有する互いに巻き付いた二つの両親媒性αヘリックスからなる（図３）。コイルドコイルは７つ揃いの繰り返し（ａｂｃｄｅｆｇ）によって特徴付けされ、そこではａとｄの位置が、典型的に疎水性アミノ酸によって占められる。これらの残基は、この構造の安定性に関与する疎水性表面を形成するように整列する。
【００１３】
ＰｓｐＡのＮ末端配列は、配列中に散在する３個のプロリンを含み、それらは連続するコイルドコイル中に小さな裂け目を形成すると解される。このタンパク質の流体力学的特徴、及びコンピューターモデリングから、ＰｓｐＡが、３個のプロリン領域の一つでそれ自体にホールディングし直すことによってコイルドコイルを形成することが提案されている。コイルドコイル領域は、細胞壁から広がって、おそらく莢膜の外側に突出していると解される。
【００１４】
ＰｓｐＡの正確な機能は未知である。それは、血液からの肺炎球菌のクリアランスを遅延することが示されている（ＭｃＤａｎｉｅｌ等， １９８７）。毒性に対するＰｓｐＡの主要な効果は、相補的な固定を妨げることであろうと解されている。さらに、コイルドコイル領域の非常に陽性に荷電した性質が、陰性に荷電した莢膜と相互作用するであろうと解されている。この相互作用は、莢膜の構造を安定化するであろう。
【００１５】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ＰｓｐＡと同様なドメイン構造を有するが、より大きいコイルドコイル領域を有し、全体のサイズがより大きいＰｓｐＣと称される別の表面タンパク質を有する（図２）。ヘリックスドメインのＮ末端１５０アミノ酸は、非常に可変的なサイズと配列を有する。この超可変領域に隣接して、１０１から２０５アミノ酸の長さの各種のサイズの、二つの繰り返し配列が存在する。最も大きいＰｓｐＣタンパク質では、ＰｓｐＡにおいて見出されるコイルドコイル領域のＣ末端部分と相同なヘリックス領域が存在する。ＰｓｐＣタンパク質とＰｓｐＡタンパク質の比較が、図２に示されている。現在では、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのほとんどの株が、ＰｓｐＡとＰｓｐＣの両者を生産するという証拠が存在する（Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗａｌｔｅｒ等， １９９９； Ｃｒａｉｎ等， １９９６）。ＰｓｐＣの正確な機能は未知であるが、ＰｓｐＡと類似する態様で機能すると解されている。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コイルドコイルタンパク質の特徴的な７つ揃いの繰り返し（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎ（ここでａとｄの位置は典型的に疎水性アミノ酸によって占められる）が、天然タンパク質のコイルドコイル領域または潜在的なコイルドコイル領域から由来するエピトープを、安定なコイルドコイル構造に固定し、天然タンパク質に基づく新規な合成ペプチドを形成するためのテンプレートとして使用できるという、予期せぬ発見に関する。そのようなペプチドは、免疫化のために使用されても良い。天然コイルドコイルタンパク質の対応する部分から得られるアミノ酸残基は、溶媒にさらされるｂ、ｃ、ｅ、ｆ及びｇ位置にスプライスされる一方、疎水性アミノ酸（特にＩｌｅ及びＬｅｕ）がａ及びｄ位置を占める。生成した新規なペプチドは、水溶液中で安定なコイルドコイル構造を維持し、天然タンパク質の特徴である免疫原性エピトープを提供する。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の一つの特徴点は、下式（式Ｉ）：
（ＡＸＸＤＸＸＸ）ｎ　　　Ｉ　　　　（配列番号１５）
［式中、ＡはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたはそれらの誘導体であり、ＤはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌまたはそれらの誘導体であり、各Ｘは、天然のコイルドコイルタンパク質のエピトープのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基またはそれらの誘導体であり、Ｘ残基のセットを形成し、ｎは１以上の整数である］
の合成ペプチドを提供する。好ましくは、各（ＡＸＸＤＸＸＸ）リピートのセットにおいて、ＡはＩｌｅであり、ＤはＬｅｕである。ｎについての好ましい値は、２から１００である。好ましい実施態様では、ｎは２から１０であり、最も好ましくは約３から６である。
【００１８】
好ましいＸ残基のセットは、天然タンパク質のコイルドコイル領域において溶媒にさらされるアミノ酸である。各Ｘアミノ酸残基のセットは、独立に選択され及び／または組み合わされて良い。言い換えると、それらは、同じタンパク質の同じエピトープ、同じタンパク質の異なるエピトープ、異なるタンパク質のエピトープ等から由来しても良い。
【００１９】
前記ペプチドはさらに、ペプチドのＮ末端で、アミノ酸残基ＣＮｌｅＧ−のような付加的アミノ酸を含んで良い。前記ペプチドはまた、Ｃ末端で付加的アミノ酸を含んでも良い。付加的アミノ酸は、コイルドコイルを形成する傾向を有する配列で並んでも並ばなくても良く、各末端での付加的アミノ酸の数は、好ましくは１００未満である。各末端での付加的アミノ酸の数は、より好ましくは５０未満、さらにより好ましくは３０未満、またさらにより好ましくは２０未満、最も好ましくは１０未満である。
【００２０】
本発明は、天然状態においてコイルドコイル構造として存在する、微生物タンパク質に関する新規な合成ペプチドの作製のために特に使用されて良い。特に、微生物表面タンパク質、とりわけＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ表面タンパク質Ａ及びＣのエピトープから得られるアミノ酸残基が、新規なペプチドにおいて使用されて良い。多くの微生物表面タンパク質が同様な構造を有し、長い自立したコイルドコイルとして存在する。
【００２１】
Ｘ残基は、天然のコイルドコイルタンパク質、例えばＰｓｐＡ及びＰｓｐＣのコンセンサス配列から由来しても良い。ＰｓｐＡの好ましいコンセンサス配列は、ＥＥＬＸ１Ｘ２ＫＩＤＥＬＤＸ３ＥＩＡＸ４ＬＥＫＸ５（配列番号５）である。好ましくは、Ｘ１はＳ、Ｑ、ＮまたはＤであり；Ｘ２はＤ、ＮまたはＫであり；Ｘ３はＡまたはＮであり；Ｘ４はＫ、ＥまたはＤであり；Ｘ５はＮ、ＤまたはＥである。
【００２２】
コイルドコイル構造の安定性を増大するために、ｅ及びｇ位置のアミノ酸残基は、興味あるエピトープの一部でなければ、荷電したアミノ酸（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓ）で任意に置換されて良い。この置換は、一方のペプチド鎖中のｅ位置及び「相補的鎖」中のｇ’位置が、例えばＡｓｐとＬｙｓといった反対の荷電のアミノ酸によって占められるように実施されるべきである。同様に、一方の鎖のｇ位置及び相補的鎖のｅ’位置は、反対の荷電の残基によって置換され得る。例えば、図３の鎖１と鎖２は「相補的鎖」である。図３に示されるように、鎖１のｅ位置及び鎖２のｇ’位置が整列する。それ故、反対の荷電を有するアミノ酸残基が、これらの二つの位置を占める場合、それらはその側鎖の間で塩架橋を形成し、それはコイルドコイル構造の安定性を増大する。
【００２３】
これらの残基は、塩架橋が同じ鎖において３または４残基離れている二つの残基の間で形成できるように、荷電したアミノ酸によって置換されても良い。別法として、荷電したアミノ酸は、安定化した鎖において反対の荷電の残基と相互作用することによって、コイルドコイル構造を安定化しても良い。
【００２４】
別の特徴点では、本発明は、コイルドコイルから由来する抗原性エピトープを選択する工程、アミノ酸残基が溶媒にさらされるかを測定する工程、及び式ＩのＸ位置中に前記溶媒にさらされるアミノ酸残基を挿入する工程を含む、式Ｉのペプチドの製造方法を提供する。特にエピトープの選択は、コンピューターアルゴリズムを使用して実施して良い。同じタンパク質または異なるタンパク質から由来する一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが使用されて良い。さらにエピトープアミノ酸のセットは、微生物コイルドコイルタンパク質のエピトープが使用される場合、微生物の異なる株及び／または種から得られても良い。
【００２５】
さらなる特徴点では、本発明は、式Ｉのペプチドを含む、動物における免疫応答を刺激するのに有用な組成物を提供する。一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが式Ｉのペプチドにおいて使用され、このエピトープアミノ酸のセットが微生物の異なる株及び／または種から得られる場合、前記組成物は、一つより多くの微生物の株及び／または種に対する免疫応答を刺激するのに有用である。前記動物は、鳥類、哺乳類（ヒトを含む）、または免疫応答が可能ないずれの動物でも良い。
【００２６】
式Ｉのペプチドの投与によって生産される抗体もまた、本発明の特徴点として提供される。そのような抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでも良い。そのような抗体を含む製薬組成物もまた提供される。一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが式Ｉのペプチドにおいて使用され、このエピトープアミノ酸のセットが微生物の異なる株及び／または種から得られる場合、前記抗体は、一つより多くの微生物の株及び／または種に結合するであろう。
【００２７】
またさらなる特徴点では、本発明は、式Ｉのペプチドを含む、ワクチンとして有用な組成物を提供する。一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが式Ｉのペプチドにおいて使用され、このエピトープアミノ酸のセットが微生物の異なる株及び／または種から得られる場合、前記組成物は、一つより多くの微生物の株及び／または種に対する交差保護を提供するのに有用である。
【００２８】
またさらなる特徴点では、本発明は、微生物感染に感受性な哺乳動物に式Ｉのペプチドを投与することを含む、微生物感染の予防方法を提供する。一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが式Ｉのペプチドにおいて使用され、このエピトープアミノ酸のセットが微生物の異なる株及び／または種から得られる場合、前記組成物は、微生物のいくつかの株及び／または種による感染の予防に有用である。
【００２９】
またさらなる特徴点では、本発明は、細菌感染の疑いのあるまたは細菌感染に罹患している動物における細菌感染の治療または予防方法を提供し、この方法は、細菌タンパク質に対する有効量の抗体を前記動物に投与することを含み、ここで前記抗体は、動物に式Ｉのペプチドを投与することによって生産される。特にそのような投与は、前記動物において受動免疫化を提供するため、及び／または前記動物における感染の症状を予防若しくは減弱するために使用されて良い。一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが式Ｉのペプチドにおいて使用され、このエピトープアミノ酸のセットが微生物の異なる株及び／または種から得られる場合、前記方法は、いくつかの微生物の株及び／または種による感染を治療または予防するであろう。
【００３０】
またさらなる特徴点では、本発明は、特定の微生物から得られるエピトープを含む式Ｉのペプチドに対する抗体とサンプルを接触させる工程、及び前記抗体が前記サンプルの構成成分に結合するかを測定する工程を含む、サンプル中の特定の微生物の存在の測定方法を提供する。前記サンプルは、生物学的サンプルでも良い。前記方法は、微生物感染の原因となる剤を測定するために使用されても良い。一つより多くのエピトープアミノ酸のセットが式Ｉのペプチドにおいて使用され、このエピトープアミノ酸のセットが微生物の異なる株及び／または種から得られる場合、前記方法は、サンプル中のいくつかの微生物の株及び／または種の存在を同時に検出するために使用されて良い。
【００３１】
またさらなる特徴点では、本発明は、異なるタンパク質から得られるエピトープを有する式Ｉのペプチドを動物に投与することを含む、動物の免疫系にさらすための複数のエピトープの生産方法を提供する。好ましい実施態様では、前記ペプチドエピトープは、単一の微生物の、または微生物の異なる株及び／または種から得られる異なるタンパク質から得られる。
【００３２】
またさらなる特徴点では、本発明は、微生物タンパク質から得られる少なくとも一つのエピトープを含む式Ｉのペプチドと生物学的サンプルを接触させる工程、及びペプチドに対する生物学的サンプル中の抗体の結合を測定する工程とを含む、生物学的サンプル中の微生物タンパク質に対する抗体の存在の測定方法を提供する。前記方法は、動物が微生物に対してさらされているかを測定するために使用されても良い。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明は、天然に存在するタンパク質抗原から由来する合成ペプチドを含む、構造特異的ペプチドを生産するためのコイルドコイル構造骨格の使用に関する。合成ペプチドの構造は、天然コイルドコイルタンパク質のエピトープをスプライスした、７つ揃いの繰り返し単位の骨格を利用する。
【００３４】
特に前記合成ペプチドは、微生物タンパク質、特に表面タンパク質に基づき、それらは肺炎球菌表面タンパク質Ａ及びＣのようなコイルドコイル形態で天然に存在する。合成ペプチドは免疫原性であり、動物において免疫応答を引き出すために使用できる。従ってそれらは、ワクチンとして、または天然に存在するタンパク質を認識する抗体生産または細胞介在性免疫を刺激するために有用である。
【００３５】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本出願で使用される用語は、他に示すところがなければ以下のように定義される。
【００３６】
定義
「天然タンパク質」は、天然に存在するタンパク質である。
【００３７】
「コイルドコイルタンパク質」は、少なくとも一部としてコイルドコイルを形成するタンパク質である。コイルドコイルタンパク質は、コイルドコイルに加えて他の形態的構造を有しても良い。用語、コイルドコイルタンパク質に包含されるものは、コイルドコイル構造を想定されることが示されているタンパク質、及びコンピューターアルゴリズムを使用することによってコイルドコイルを形成すると予測されるタンパク質である。
【００３８】
「微生物タンパク質」は、細菌、古細菌、真菌、ウイルス、原生動物、藻類、粘菌、またはプリオンのような微生物から由来するタンパク質である。
【００３９】
ここで使用される「ペプチド」は、ペプチドまたはタンパク質である。言い換えると、本願において言及されるペプチドは、いずれかの数のアミノ酸を含んで良い。
【００４０】
「式Ｉのペプチド」は、式Ｉからなる断片である合成断片を含むペプチドである。
【００４１】
「エピトープ」は、抗原決定基であるタンパク質またはペプチドの一部である。
【００４２】
アミノ酸の「誘導体」は、天然に存在しないアミノ酸残基または化学的に変性されたアミノ酸である。アミノ酸誘導体は、血清または組織におけるペプチドの半減期を増大するため、またはペプチドの抗原性を増大するために使用されて良い。
【００４３】
天然に存在しないアミノ酸は、Ｄ−アイソマー、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、アミノイソ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、及び２−チエニルアラニンに制限されなくて良い。
【００４４】
化学的に改変されたアミノ酸は、側鎖修飾を有するアミノ酸である。例えば、リジンのアミノ基は、アルデヒド、引き続きＮａＢＨ４での還元でのアルキル化；メチルアセトイミダートでのアミド化；無水酢酸でのアシル化；シアナートでのカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）でのトリニトロベンジル化；無水コハク酸と無水テトラドロフタル酸でのアシル化；及びプリドキサル−５’−ホスファート、引き続きＮａＢＨ４での還元でのピリドキシル化によって改変されても良い。
【００４５】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサル及びグリオキサルのような試薬での複素環縮合産物の形成によって改変されても良い。
【００４６】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレア形成を経たカルボジイミド活性化、引き続き例えば対応するアミンへの誘導体化によって改変されても良い。
【００４７】
スルフィドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセタミドでのカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物と混合したジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換化マレイミドとの反応；４−クロロメルクリベンゾアート、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、フェニルメルクリクロリド、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、及び他のメルクリアールを使用するメルクリアール誘導体の形成；またはアルカリｐＨでのシアナートでのカルバモイル化によって改変されても良い。
【００４８】
トリプトファン残基は、例えばＮ−ブロモスクシンイミドでの酸化、または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルフェニルハライドでのインドール環のアルキル化によって改変されても良い。チロシン残基は、テトラニトロメタンでのニトロ化によって改変され、３−ニトロチロシン誘導体を形成しても良い。
【００４９】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の改変は、ヨード酢酸誘導体またはジエチルピロカルボナートでのアルキル化によって達成されても良い。
【００５０】
「ペプチド」は、天然に存在するアミノ酸またはアミノ酸誘導体を含むペプチドであっても良い。ペプチドはまた、ペプチドの異なる部分の間で架橋を含んでも良い。例えばコイルドコイル構造は、しばしば二本鎖または三本鎖からなる。コイルドコイルの異なる鎖はジスルフィド結合によって結合していることが好ましく、それはコイルドコイル構造を安定化する。より好ましくは、ペプチドは３または４残基離れて位置するリジンとグルタミン酸の側鎖の間でラクタム架橋を含む（Ｈｏｕｓｔｏｎ等， １９９６）。これらのラクタム架橋は、好ましくはペプチドのＮ−及びＣ−末端で取り込まれ、エピトープが展示されている配列の領域には取り込まれない。
【００５１】
「溶媒にさらされる」または「溶媒接近可能な」アミノ酸残基は、タンパク質またはペプチドが溶液中に存在する場合、溶媒にさらされるタンパク質またはペプチドのアミノ酸残基である。溶液は好ましくは水溶液であり、より好ましくは血液、リンパ液、または穏やかなバッファーのような生理学的に適合可能な溶液である。特に、「溶媒にさらされる」アミノ酸残基は、コイルドコイルを形成するまたは形成すると予測される天然エピトープのｂ、ｃ、ｅ、ｆまたはｇ位置での残基を指す。
【００５２】
穏やかなバッファーは、リン酸緩衝生理食塩水である。本願で使用される「穏やかなバッファー」は、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ， ｐＨ７．０である。
【００５３】
「抗体」は、特異的な抗原と反応し、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭといった構造の特性に基づく５個の別個のクラスの一つに属するタンパク質分子である、
【００５４】
「免疫応答」は、興味ある組成物またはワクチンに対する細胞性及び／または抗体介在性免疫応答の宿主における発達である。そのような応答は、以下の一つ以上の生産からなっても良い：興味ある組成物またはワクチンに含まれる抗原に特異的に向けられた、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／または細胞障害性Ｔ細胞。
【００５５】
「ワクチン」は、病原体による感染を部分的または完全に予防する免疫応答を動物において引き出すことができる分子である。
【００５６】
免疫応答と「引き出す」または「刺激する」とは、免疫原に対して免疫系をさらすことによって免疫応答を引き起こすことである。
【００５７】
「免疫原」は、動物において免疫応答を引き出すことができる分子である。
【００５８】
「細菌感染の予防」は、細菌感染の発達を完全にまたは部分的に予防することである。
【００５９】
「微生物感染の治療」は、細菌感染の開始の後、細菌感染の症状を完全にまたは部分的に減少することである。
【００６０】
「サンプル」は、物質、材料、または集団の等量部分または代表的部分である。例えばサンプルは、水、汚水、オイル、砂、血液、生物学的組織、尿、または排泄物のサンプルであって良い。
【００６１】
「生物学的サンプル」は、動物、植物、または微生物のような生物学的主体から回収されるサンプルである。
【００６２】
「有効量」は、企図される目的を達成するのに十分な量である。例えばワクチンの有効量は、標的の疾患と接触することから受容者を保護する、または疾患と関連する医学的状態を予防または減弱するための、ワクチンの受容者における免疫応答を引き出すのに十分なワクチンの量である。
【００６３】
合成コイルドコイルペプチド
ＰｓｐＡは、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの各種の株の中で非常に可変的であることが以前に示されている。ＰｓｐＡに対して生産されたモノクローナル抗体を使用するマッピング研究は、主な交差反応性エピトープが、コイルドコイルドメインの最後の１００アミノ酸で見出されることを示す（配列番号１の１９２−２７０残基）（ＭｃＤａｎｉｅｌ等， １９９４）。この領域の配列に基づいて、ＰｓｐＡタンパク質を３つのファミリーを含む６のグレードにグループ分けすることが可能である。動物の研究では、ＰｓｐＡでの免疫化が、同じＰｓｐＡファミリーにおける他の株に交差反応性である免疫応答を引き出すだけでなく、この交差反応性がファミリーの間で拡張されることを示している（Ｂｒｉｌｅｓ等， １９９９； ＭｃＤａｎｉｅｌ等， １９９１； Ｔａｒｔ等， １９９６）。さらに、精製ＰｓｐＣ断片での免疫化が、敗血症に対して保護的であり、ＰｓｐＡと交差反応する抗体を生産する（Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗａｌｔｅｒ等， １９９９）。交差保護の結果は、ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣに対するコイルドコイルドメインの間のバリエーションにも関わらず、保存されたエピトープが存在するに違いないことを示唆する。
【００６４】
ＰｓｐＡに対する免疫が保護的であろうという第一の証拠は、ＰｓｐＡ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）が胎児敗血症からマウスを保護するという発見であった。その後、Ｒｘ１株から得たＰｓｐＡに対するＩｇＧまたはＩｇＭモノクローナル抗体での受動保護が、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＷＵ２株のＬＤ５０の１０５倍でのｉｐまたはｉｖでチャレンジに引き続く死からマウスを保護することが示された（Ｂｒｉｌｅｓ等， １９８９）。このＭＡｂｓは、相補性介在性の機構によってチャレンジされたマウスの血液から肺炎球菌をクリアランスすることが示された。活性な免疫化の研究は、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株から得たＰｓｐＡの２７ｋＤａ断片（配列番号１の１−２４５残基）を利用し、それはそのタンパク質のヘリックスドメインのほとんどを含む。ＦＣＡアジュバントと組み合わせた５μｇのこの断片でのＣＢＡ／Ｎマウスの免疫化、引き続きＰＢＳ中のブースター量での免疫化は、ＷＵ２株の３００ｃｆｕ（ＬＤ５０の３０倍）のｉｖチャレンジから保護した（Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎ等， １９９１）。ほとんどの最近の研究では、マウスが１から５μｇのアジュバントなしの１−３０３残基を含む断片を受け取る場合、それはより悪性のＡ６６．１株の４８０ｃｆｕでのｉｖチャレンジに引き続き胎児感染に対して保護を引き出した（Ｂｒｉｌｅｓ等， １９９８）。免疫化されたマウスまたはウサギから得た免疫血清でのマウスにおける受動保護の研究は、チャレンジ株のＬＤ５０の１０から１００倍のチャレンジ量から胎児敗血症に対して保護できる。
【００６５】
ＰｓｐＡが数多くの血清学的タイプに分割できる一方、それは非常に交差反応性タンパク質であることが示されている。Ｒｘ１株から得たＰｓｐＡのヘリックス部分で免疫化された一匹のウサギから得た血清は、ウエスタンブロットにおいて全ての肺炎球菌から得たＰｓｐＡを認識できる。ＣＢＡ／ＮマウスをＤ３０、ＷＵ２及びＢＧ９７３９の各株から得たＰｓｐＡでの免疫化に引き続き１４の異なるＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株（〜２００×ＬＤ５０量）でチャレンジした場合、各ＰｓｐＡは、ほとんどのチャレンジ株に対して交差保護を示した。Ｒｘ１株から得たＰｓｐＡのヘリックスドメイン（配列番号１の１−３１４残基）が、ヒトボランティアにおける安全性と免疫原性について最近評価された（Ｎａｂｏｒｓ等， ２０００）。水酸化アルミニウムに吸着された５から１２５ｍｇのこの断片で患者を免疫化した場合、Ｒｘ１断片に対する高レベルの循環抗体が引き出され、並びに異種ＰｓｐＡ分子に対する抗体も引き出された。
【００６６】
Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株から得たＰｓｐＡ配列を、Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｉｎｃから得たＰｅｐｔｏｏｌｓプログラムを使用して分析した。Ｐｅｐｔｏｏｌｓ構造予測アルゴリズムは、４の予測されるアルゴリズムから得た結果に基づいて、コンセンサス予測と組み合わされた周知のタンパク質ホールディングモチーフを同定することに基づく。Ｐｅｐｔｏｏｌｓプログラムはまた、ＰｓｐＡのＮ末端部分に対する３００アミノ酸に亘る非常にヘリックス状の領域を予測する。Ｐｅｐｔｏｏｌｓプログラムはまた、各種の配列の親水性、溶媒接近可能性、柔軟性、及びターンの傾向を測定することによって、そのタンパク質の部位が抗原性であるかを予測することが可能であり、さらに周知のＢ細胞エピトープのデーターベースに対する配列をマッチする。Ｐｅｐｔｏｏｌｓは、添付資料１に示されたコイルドコイルドメインにおける数多くの潜在的なＢ細胞エピトープを同定した。
【００６７】
ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣ（またはコイルドコイルとして存在する他のタンパク質）のコイルドコイルへのホールディングは、溶媒接近可能である特定の残基と、溶媒接近不可能である疎水性コアを形成する特定の残基を引き起こす。溶媒接近可能なアミノ酸は、７つ揃いのリピートのｂ、ｃ、ｅ、ｆ及びｇ位置で位置し、一方でアミノ酸ａとｄは埋め込まれる。かくして溶媒接近可能な位置での残基は、例えば抗体生産といった免疫応答を介在するのに関与しているに違いない。コイルドコイル領域によって形成されるエピトープは、ａおよびｄ残基がさらされていないため不連続であるに違いない。かくして、これらのタンパク質から得られるエピトープは、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ及びｇの溶媒接近可能な位置から由来するに違いない。
【００６８】
我々は、コイルドコイルタンパク質の疎水性コアの安定性が、７つ揃いのリピートのａ位置のＩｌｅ残基とｄ位置のＬｅｕ残基の取り込みによって最大化されていることを発見した。従って本発明は、式Ｉ：
（ＡＸＸＤＸＸＸ）ｎ　　　　　（配列番号１５）
［式中、
ＡはＩｌｅまたはその誘導体であり；
ＤはＬｅｕまたはその誘導体であり；
各Ｘは天然コイルドコイルタンパク質のエピトープのアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基またはその誘導体であり；
各（ＡＸＸＤＸＸＸ）リピート中のＸ残基は、Ｘ残基のセットを形成し；
ｎは１以上である］
を含む合成ペプチドを提供する。
【００６９】
好ましい実施態様は、ａ位置でＩｌｅ、ｄ位置でＬｅｕを有する一方、本発明においては、ａまたはａ位置でＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕを含むペプチドも企図される。かくして、ａ位置でのアミノ酸はＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕであっても良く、ｄ位置でのアミノ酸は独立にＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕであっても良い。
【００７０】
ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣのコイルド領域は非常に長いが、合成コイルドコイル形成配列はより短くても良い。もしラクタム架橋が含まれるのであれば、合成コイルドコイルは１４残基程度の短さであって良い（Ｈｏｕｓｔｏｎ等， １９９６）。ラクタム架橋の不存在下では、我々は２１アミノ酸を含むヘリックスペプチドが安定であることを見出した。さらに、分子内ジスルフィド結合による個々のヘリックス同士の結合は、これらの構造をさらに安定化する。小さなコイルドコイルは、ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣのような天然コイルドコイルタンパク質から得られるエピトープをスプライスする骨格として機能する。潜在的な骨格は以下の配列を有する：
ＣｎｌｅＧ−（ＩＸＸＬＸＸＸ）ｎ　　　　（配列番号１６）
［式中、Ｎｌｅは非分枝側鎖を含むロイシンのアイソマーであるノルロイシンである］。ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣのような天然コイルドコイルタンパク質からエピトープを形成する残基（残基ｂ、ｃ、ｅ、ｆ及びｇ）は、Ｘ位置内に挿入されるであろう。残基エピトープは、Ｐｅｐｔｏｏｌｓのようなアルゴリズム及びバイオインフォマティックスプログラムを使用して決定できる可能性がある。エピトープは、Ｂｉａｃｏｒｅ装置上の天然タンパク質に対して生産されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の分析によってマップできる。Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの各種の株から得られるもののような異なる天然タンパク質から得られるエピトープは、新規な配列を生産するために共にスプライスできる。ペプチドは、当該技術分野で確立されたペプチド合成法によって合成されても良く、または興味あるペプチド配列をコードする発現ベクターを構築し、ペプチドを発現するために使用できる。この骨格中のＩ及びＬ残基は独立に、Ｉ、ＬまたはＶから選択されるアミノ酸によって置換されても良い。
【００７１】
本発明におけるｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇ位置でのアミノ酸は、興味ある特定のタンパク質の天然コイルドコイルから得られる溶媒にさらされるアミノ酸である。それ故、本発明はＷＯ ０１／０００１０とは別個であり、コイルドコイルテンプレートにおける非コイルドコイルタンパク質から得られる溶媒にさらされるアミノ酸を展示するように配向する。その結果、非コイルドコイルエピトープは、コイルドコイル構造に変換され、コイルドコイル構造に対して生産された抗体は、元々の非コイルドコイルエピトープを認識しないであろう。対照的に、本発明の式Ｉに従って生産されたペプチドは、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇ位置で、コイルドコイルタンパク質のｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇ位置から得られるアミノ酸を含む。生成したペプチドは、より免疫原性である一方で、特異性に関して元となるエピトープと同じ免疫応答を引き出すであろう。
【００７２】
本発明はまた、一つのペプチドを別のものに埋め込むことに向けられたＷＯ ９６／１１９４４とは別個である。略記すると、ＷＯ ９６／１１９４４は、興味あるペプチドと同じ構造を形成するような強い特性を有するアミノ酸とペプチドを隣接させ、それによってペプチドの構造を安定化することによって、ペプチドの免疫原性を増大することができることを開示する。例えば、コイルドコイルを形成するペプチドを、ＧＣＮ４のアミノ酸配列中に埋め込むことができ、それは比較的安定なコイルドコイルを形成する。生成したキメラペプチドは、αヘリックス誘導溶媒トリフルオロエタノール中に溶解した場合、高いヘリックス含量を有するが、水性条件下でのヘリックス含量は低い。本発明は他方で、別のアミノ酸配列中にペプチド断片を埋め込むものではない。代わりにペプチドのａ及びｄ位置でのアミノ酸は、特異的に選択され、コイルドコイル構造の安定性を増大するために適切な場合置換され、生成したペプチドは水溶液中でさえ典型的にヘリックス状である。
【００７３】
以下の実施例は、本発明の基本的特徴を説明する。前述のように、Ｒｘ１ ＰｓｐＡタンパク質から得たコイルドコイルドメインのＣ末端は、数多くの交差保護性エピトープを含むことが示されている。Ｂｉｏｔｏｏｌｓソフトウェアは、コイルドコイル免疫原の構築を説明するために使用されるであろう１５３−１７０残基と１８１−１９８残基を含む数多くのそのようなエピトープを同定した（実施例１）。これらのエピトープのａ及びｄ位置は太字で強調され、溶媒接近可能なアミノ酸はイタリックで記載される。これらの位置は、テンプレートのａ位置でＩｌｅ、ｄ位置でＬｅｕによって置換されている。潜在的なエピトープから得られる溶媒にさらされる残基を単純にスプライスし、この骨格にそれらを取り込むことによって、免疫原性である独特のポリペプチド配列を作成可能である。実施例１に記載されたコイルドコイルは、約７，０００Ｄａの分子量を有し、それ自体免疫応答を引き出すのに十分な長さであろう。代わりにこれらの分子は、破傷風菌トキソイドまたはＫＬＨのようなキャリアータンパク質に結合することができ、または当業者に周知の方法を使用してリポソームに結合できる。
【００７４】
例えばこのタンパク質から得られるｃ残基が、式Ｉにおけるｃ残基に対応しなければならないように、残基をフェーズにおいて維持しなければならないことが強調されなければならない。二つの隣接する配列のそれぞれから得られる残基が、スプライスの間で生じるいずれかのギャップを埋めるために使用できる。コイルドコイルは二つのαヘリックスからなるために、二つのヘリックス鎖は異なる配列を有することができ、かくして分子全体におけるエピトープの数を増大する。各種のクレードから得られる数多くのエピトープの取り込みを通じて、コイルドコイルペプチドは各種のクレードの間で交差反応するであろう。
【００７５】
一定の疎水性コアを維持し、溶媒にさらされる残基のみにおいてスプライスし、及び各種のタンパク質から得られるエピトープを混合することによって、独特の配列が生産される。かくして、式Ｉのペプチドは、一方の７つ揃いのリピートにおいてＰｓｐＡのｂ、ｃ、ｅ、ｆ及びｇ位置から得られるアミノ酸を有し、もう一方のリピートにおいてＰｓｐＣから得られるそれらを有しても良い。このペプチドがワクチンとして使用される場合、ＰｓｐＡとＰｓｐＣの両者に対する免疫が誘導され、それによってＳ． Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する二重の保護が提供される。
【００７６】
特筆すべきアプローチは、表面タンパク質（ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣのような）と表面アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）の両者から得られるアミノ酸を含むことである。アドヘシンタンパク質は、鼻咽腔領域におけるＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの病原性に関与し、一方で表面タンパク質は、全身性の症状に関与する。ＰｓａＡは鼻咽腔保菌を予防するために有効なワクチンであり、一方でＰｓｐＡは全身性の感染のためのより最適なワクチンの候補である（Ｂｒｉｌｅｓ等， ２０００）。それ故ＰｓａＡ及びＰｓｐＡから得られるエピトープを含むペプチドは、最近による鼻咽腔感染及び全身性の感染の両者に対する防御を提供するであろう。これは、式Ｉのペプチドの一方の７つ揃いのリピート内に、ＰｓａＡのαヘリックス領域から得られる溶媒にさらされるアミノ酸と、同じペプチドの他方の７つ揃いのリピート内に、ＰｓｐＡのαヘリックスから得られる溶媒にさらされるアミノ酸とをスプライスすることによって達成できる。同様に、ＰｓｐＣエピトープとＰｓａＡエピトープの両者を含むハイブリッドペプチドが調製できる。
【００７７】
別法として、式Ｉのペプチドは、微生物の異なる株、または異なる微生物から得られるタンパク質の溶媒にさらされるアミノ酸を含んでも良く、生成したワクチンは、使用される全ての株または微生物に対して有効であることができる。同様に、コンセンサス配列は、異なる株から得られる特定のタンパク質について推定され、全てのこれらの株に対するワクチンとして使用されても良い（実施例３参照）。
【００７８】
ペプチドのヘリックス安定性を改良するために、式Ｉの７つ揃いのリピートのｅ及びｇ位置は、グルタミン酸とリジンとを含んでも良い。これらの残基は、一方の鎖のｅと他方の鎖のｇ’との間で塩架橋を形成し、並びに一方の鎖のｇと他方の鎖のｅ’の間でも塩架橋を形成する。これらの塩架橋は、コイルドコイル構造を安定化するのにさらに寄与する。個々のαヘリックスを安定化するため、リジン残基とグルタミン酸残基は、３−４残基離れた位置に導入でき、その側鎖の間の鎖間塩架橋の形成を容易にできる。アラニンまたはアミノイソ酪酸のような高いヘリックス特性を有するアミノ酸を含むことによって、コイルドコイルの安定性を増大できる。
【００７９】
別法として、エピトープを含まない安定化した鎖が使用されても良い。安定化した鎖の唯一の目的は、エピトープを含む鎖のヘリックス含量を増大することである。安定化した鎖は、エピトープ含有鎖のヘリックス構造の形成をサポートし安定化する非常に安定なヘリックスを形成可能である。好ましくはエピトープは、ｅ及びｇ位置でリジン及び／またはグルタミン酸を有し、安定化した鎖は、ｅ’またはｇ’位置で反対の荷電を有するアミノ酸を提供でき、鎖間塩架橋を形成する。安定化した鎖の例は以下の通りである：
ＣＮｌｅＧＧＧ（ＥＩＥＡＬＫＫ）５　　　　　（配列番号２）
【００８０】
これらのペプチドの構造的及び立体構造的完全性は、円２色性（ＣＤ）スペクトロスコピーによって容易に測定できる。本発明において有用なペプチドは、水溶液中でヘリックスの特徴を有する（実施例２及び３参照）。それ故天然のエピトープは、生理学的環境において正確に存在できる。対照的に、以前に報告された合成コイルドコイルタンパク質は、水溶液中でヘリックスを形成しない（ＷＯ ９６／１１９４４）。本発明において有用なペプチドは、ＣＤスペクトロスコピーによって測定して、穏やかなバッファー中で少なくとも２０％のヘリックス含量を有する。ヘリックス含量は、穏やかなバッファー中で好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％である。
【００８１】
ペプチドの安定性は、熱変性アッセイ、または塩化グアニジン変性アッセイのような化学的変性アッセイによって測定されても良い。そのようなアッセイは、当業者に周知である。ペプチドの安定性は、阻害ＥＬＩＳＡによって間接的に評価されても良く、そこでは抗原と抗体の間の相互作用を阻害するペプチドの能力が、抗体に対して抗原と競合するために必要な構造を仮定した場合に、ペプチドがどのくらい安定であるかの指標として機能する。
【００８２】
他の細菌コイルドコイルタンパク質から得られるエピトープもまた、本発明において使用されて良い。特に、コイルドコイル構造を含む細菌表面タンパク質から得られるエピトープが使用されて良い。本発明において有用なタンパク質を有する微生物の例は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、特にその仮定的タンパク質ＨＩ０５００；ライム病スピロヘータ、即ちＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、特にその表面リポタンパク質Ｐ２７；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、特にその仮定的タンパク質ｐｐＩＢ；大腸菌、特にその保存的ＹｉｇＮタンパク質；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、特にＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、及びその推定ペリプラズムタンパク質；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、特にそのタンパク質ＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種、特にＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びその仮定的タンパク質ＥＯ７；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種ｍと国仮定的タンパク質ＣＴ８２５；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、特にその仮定的タンパク質ＰＦＢ０１４５０、及び成熟寄生虫感染赤血球表面抗原；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍｓ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ウイルス；真菌等を制限することなく含む。
【００８３】
さらに、細菌起源から由来しない他のコイルドコイルタンパク質が同じ態様で使用されて良い。例えば、治療目的のためタンパク質に対する抗体を生産すること、またはこのタンパク質の機能を研究することは一般的である。しかしながら、全ての興味あるタンパク質が十分に免疫原性であるわけでなく、天然タンパク質の特定のコイルドコイル領域に対して特異的に向けられた抗体を生産することは困難であろう。本発明は、例えタンパク質がどんな起源、機能、または細胞内局在を有するかに関わらず、いずれのコイルドコイルタンパク質に対しても抗体調製を最適化するために使用されて良い。さらに本発明はまた、抗体を生産するために使用されるペプチド中の興味ある領域のみを含むことによって、特定のコイルドコイル領域に対して向けられた抗体の生産を可能にする。
【００８４】
非細菌性のコイルドコイルタンパク質の例は、エストロゲンレセプター結合断片関連遺伝子９（Ｎａｋａｓｈｉｍａ等， １９９９）、白血病関連タンパク質５（Ｋａｐａｎａｄｚｅ等， １９９８）、ブドウ膜自己抗原（Ｙａｍａｄａ等， ２００１）、アンギオポエチン前駆体（Ｄａｖｉｓ等， １９９６）、ＮＦ−カッパＢ必須モジュレーター（Ｌｉ等， １９９９）、腫瘍感受性遺伝子１０１タンパク質（Ｌｉ等， １９９７）、細胞トリカルシノーマ抗原１（Ｃｈａｎｇ等， １９９４）、ＴＡＣＣ１（Ｓｔｉｌｌ， １９９９）、及びＴＰＲ（Ｍｉｒａｎｄａ等， １９９４）を制限することなく含む。
【００８５】
ここに挙げられた細菌及び非細菌タンパク質に加えて、当業者は、当該技術分野の確立された方法に従って、他のコイルドコイルタンパク質を同定できる。例えば、もしタンパク質のアミノ酸配列が入手可能であれば、ＭｕｌｔｉｃｏｉｌまたはＰｅｐｔｏｏｌのような各種のコンピューターアルゴリズムが、そのタンパク質がコイルドコイルを形成するかどうか予測するために使用できる。実質的に精製されたタンパク質については、ＣＤスペクトロスコピーが、ここに記載された実際の構造を測定するために使用できる。
【００８６】
組成物
式Ｉのコイルドコイルペプチドを含む組成物は、少なくとも二つの目的のため動物において免疫応答を引き出すために使用できる。組成物が動物における免疫応答を引き出すことによってワクチンとして機能する場合、生成した抗体またはＴ細胞介在性免疫は、同じエピトープを含むその後の攻撃から動物を保護できる（能動免疫）。別法として、組成物は、研究ツールとして使用できる、または同じエピトープを含む後の攻撃から第二の動物を保護するために第二の動物に投与できる抗体を生産するために使用できる（受動免疫）。
【００８７】
引き出された免疫応答を増幅するために、式Ｉのペプチド、特により小さいペプチド（例えば）１から４の７つ揃いのリピートを含むもの）をキャリアータンパク質に接合することが好ましいであろう。
【００８８】
さらに、式Ｉのコイルドコイルペプチドまたはキャリアータンパク質とのそれらの接合体は、アジュバントが免疫保護化抗体力化または細胞介在性免疫応答を増大するため、免疫応答を引き出すためのアジュバントとさらに混合されても良い。そのようなアジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミド、Ａｄｊｕｖａｘ （Ａｌｐｈａ−Ｂｅｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｉｎｊｅｃｔ Ａｌｕｍ （Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ＬｉｐｉｄＡ （Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＭＰＬ＋ＴＤＭ （Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｔｉｔｅｒｍａｘ （ＣｙｔＲｘ）、ＱＳ２１、ＣｐＧ配列（Ｓｉｎｇｈ等， １９９９）、毒素、トキソイド、グリコプロテイン、リピド、グリコリピド、細菌細胞壁、サブユニット（細菌またはウイルス）、炭水化物分子（モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−、オリゴ−、及びポリサッカリド）、各種のリポソーム製剤またはサポニンを制限することなく含む。各種のアジュバントの組み合わせは、免疫原製剤を調製するために抗原と共に使用されて良い。
【００８９】
組成物は、脈管内、腹腔内、筋肉内、皮膚内、皮下、経口、鼻腔、または吸入を含む各種の輸送方法によって投与されて良い。組成物はさらに、製薬学的に許容可能な賦形剤及び／またはキャリアーを含んで良い。そのような組成物は、霊長類、齧歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、ブタ、イヌ、及びトリ種のような、免疫応答を開始可能ないずれかの動物を免疫化するのに有用である。家畜動物と野生動物の両者が免疫化されて良い。組成物の正確な製剤は、特定のペプチドまたはペプチド−キャリアー接合物、免疫化される種、及び投与の経路に依存するであろう。
【００９０】
コイルドコイルタンパク質に対して生産された抗体は、製薬組成物中に含ませることができ、動物に投与できる。製薬組成物は典型的に、製薬学的に許容可能なキャリアーを含み、製薬学的に許容可能な賦形剤を含んでも良い。製薬組成物は、脈管内、腹腔内、筋肉内、皮膚内、皮下、経口、鼻腔で投与でき、またはエアゾール吸入によっても投与できる。好ましくは製薬組成物は、脈管内、筋肉内、鼻腔、またはエアゾール吸入によって投与される。
【００９１】
本発明によって、抗体、特にモノクローナル抗体もまた包含され、それは式Ｉのペプチドに対して生産された抗体から由来する。特に、ハイブリドーマは式Ｉのペプチドを使用して生産でき、組換え誘導体抗体は、周知の遺伝学的操作法に従ってこれらのハイブリドーマを使用して生産できる（レビューとして、Ｗｉｎｔｅｒ等， １９９１参照）。例えば、モノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡ断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる。ＰＣＲプライマーは、重鎖または軽鎖の定常領域に相補的であるオリゴヌクレオチドであることができ、ＰＣＲテンプレートは、ハイブリドーマから調製される全ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであることができる。別法として、ｃＤＮＡライブラリーが、ハイブリドーマから調製でき、特定のハイブリドーマによって生産される重鎖または軽鎖のクローンを得るために、イムノグロブリン重鎖または軽鎖の定常領域に対応するプローブでスクリーニングできる。
【００９２】
次に、可変領域に対するＤＮＡ断片は、発現ベクター内に挿入でき、選択された定常領域のｃＤＮＡ配列とフレーム中で融合される。定常領域は、ヒト化抗体を生産するためにヒト定常配列、ヤギ抗体を生産するためにヤギ定常配列、式Ｉのペプチドを認識するＩｇＥを生産するためにＩｇＥ定常配列等であることができる。かくして、同じ抗原認識能力を有するが、異なる定常領域を有する抗体が生産できる。特に興味があるのはヒト化抗体であり、それはヒト化定常領域に対する非所望の免疫応答を引き出すことなく、ヒトにおいて同系の抗原と関連する疾患に対する治療薬として使用できる。
【００９３】
抗体をヒト化するため、またはヒト抗体を生産するための、当該技術分野で周知の他の方法が同様に利用でき、Ａｂｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．によって開発された異種マウス法（米国特許第６，０７５，１８１号；第６，１５０，５８４号）、並びにＢｉｏｖａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ．、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．、ＩｍｍＧｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｄａｒｅｘ， Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｌａｎ、Ｅｏｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ、またはＵｒｏＧｅｎｓｙｓ Ｉｎｃ．によって開発された方法を制限することなく含む。同様に、コイルドコイルペプチド抗原に対するヒト抗体分泌細胞をスクリーニングするための当該技術分野で周知の他の方法が利用できる。
【００９４】
コイルドコイルペプチドまたはコイルドコイルペプチドに対する抗体のいずれかを含む組成物のための処方は、投与経路、投与される動物のサイズと種類、及び投与の目的のような因子に依存して変化するであろう。本発明における使用のための適切な処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。
【００９５】
以下の実施例は、本発明を説明するために与えられ、本発明の範囲を制限するいずれの目的でも構成されるものではない。
【００９６】
【実施例】
以下の実施例では、以下の略語は以下の意味を有する。定義されていない略語は、一般的に受け入れられている意味を有する。
℃　　　　＝摂氏
ｈｒ　　　＝時
ｍｉｎ　　＝分
μＭ　　　＝マイクロモーラー
ｍＭ　　　＝ミリモーラー
Ｍ　　　　＝モーラー
ｍｌ　　　＝ミリリットル
μｌ　　　＝マイクロリットル
ｍｇ　　　＝ミリグラム
μｍ　　　＝マイクログラム
ｒｐｍ　　＝分当たりの回転
ＩＤ　　　＝内径
ＴＦＥ　　＝トリフルオロエタノール
ＥＤＴ　　＝エタンジオール
ＴＦＡ　　＝トリフルオロ酢酸
ＰＢＳ　　＝リン酸緩衝生理食塩水
β−ＭＥ　＝β−メルカプトエタノール
ＤＭＳＯ　＝ジメチルスルホキシド
Ｎｌｅ　　＝ノルロイシン
ＥＬＩＳＡ＝酵素免疫検定法
ＨＲＰ　　＝セイヨウワサビペルオキシダーゼ
ＴＤ　　　＝胸腺依存性
ＴＴ　　　＝破傷風菌トキソイド
ＫＬＨ　　＝キーホールリンペットヘモシアニン
ＢＳＡ　　＝ウシ血清アルブミン
【００９７】
本願を通じた使用されるアミノ酸の一文字コード及び三文字コードは、以下に記載される：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン
Ｗ＝Ｔｒｙ＝トリプトファン
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
【００９８】
物質と方法
ペプチド合成と精製
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４３１ Ａペプチド合成器でｔ−Ｂｏｃ化学により、ペプチド類似体を調製した。ペプチド樹脂（７００ｍｇ）を、０−４℃で１時間、１０％アニゾールと２．５％ ＥＤＴを含む１０ｍＬのＨＦで切断した。ＨＦの除去の後、ペプチド／樹脂をシンターガラス漏斗に移し、ジエチルエーテル（２×５０ｍＬ）、引き続き氷冷酢酸（２×５０ｍＬ）で洗浄した。次いで酢酸溶液を凍結乾燥した。粗ペプチドを、０．０５％ ＴＦＡと３ｍＬ酢酸を含む１５ｍＬの水に採取した。攪拌とソニケーションの後、混合物を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を回収し、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２μｍシリンジフィルターを通じて濾過した。この溶液を、３ｍＬ／分の流速で５ｍＬ注入ループを通じてＺｏｒｂａｘ ＲＸ−Ｃ８ （２２．１ｍｍ ＩＤ×２５０ｍｍ、５μｍの粒径）に乗せた。溶媒Ａが水中に０．０５％ ＴＦＡであり、溶媒Ｂがアセトニトリル中に０．０５％ ＴＦＡである、０．１％Ｂ／分の直線状ＡＢ勾配を稼働することによって、精製を実施した。
【００９９】
リンカーとシステイン残基を取り込ませ、コイルドコイルの鎖をジスルフィド結合によって共に結合させた。ジスルフィド架橋化コイルドコイルを、１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３， ｐＨ８．５中の〜１０ｍｇ／ｍＬのペプチドの室温での一晩の空気酸化によって形成した。全てのペプチドを、分析的ＨＰＬＣとエレクトロスプレーマススペクトロメトリーによって特徴付けし、タンパク質濃度並びにアミノ酸組成を、アミノ酸分析によって測定した。前述の従来の固相化学によって、ペプチドのＮ末端に結合した光反応性試薬ベンゾイル安息香酸を生産するキャリアータンパク質破傷風菌トキソイドにペプチドを結合した。この光アフィニティープローブは、ｔ−Ｂｏｃ化学の条件下で安定である。ノルロイシン残基をペプチドのリンカー領域に取り込ませ、アミノ酸分析によってキャリアータンパク質に結合したペプチドの定量を可能にした。１００ｍｍのＮＨ４ＨＣＯ３， ｐＨ８．３バッファー中に溶解した１０ｍｇの破傷風菌トキソイドに対して６ｍｇのペプチドを加え、溶液を３５０ｎｍの波長で１時間照射した。いずれの非反応性ペプチドをも除去し、溶液を１５ｍＬの透析カセットに移し、４Ｌの２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， ｐＨ７．０バッファーで透析した。この透析物のＨＰＬＣ分析を、照射溶液中に存在する非反応性ペプチドの量を測定するために使用した。残余のペプチドがＨＰＬＣクロマトグラムにおける曲線の下の全部の領域の１％未満である場合、透析は完成したと判断された。
【０１００】
ＣＤスペクトロスコピー
円２色性（ＣＤ）スペクトロスコピーを、Ｊａｓｃｏ ＤＰ−５００Ｎデータプロセッサーを装備したＪａｓｃｏ Ｊ−５００Ｃスペクトロポラリメーター（Ｊａｓｃｏ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して実施した。ジスルフィド結合化ペプチドの〜５００ｍＭのストック溶液の１０倍の希釈物を、０．０２ｃｍの溶融シリカセルに乗せ、１９０から２５０ｎｍで楕円率をスキャンした。各ジスルフィド架橋化類似体を、穏やかな条件（５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．０）で且つ同じバッファー中の５０％ＴＦＥの存在下でＣＤスペクトロスコピーによって分析した。ラウダ水浴（モデルＲＭＳ、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｒｅｘｄａｌｅ， Ｏｎｔ．）を使用して、セルの温度を制御した。ＣＤスペクトルは、２５０から１９０ｎｍの０．１ｍｍ間隔でのデーターの回収によって得られた４のスキャンの平均であった。
【０１０１】
ＨＰＬＣ
分析的ＨＰＬＣを、ダイオードアレー検出器を備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣで実施した。分析は、Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ８カラム（４．５ｍｍ ＩＤ×１５０、３．５μｍ粒径）で実施した。移動相は、Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む脱イオン精製水（１８ＭΩ／ｃｍ）、及びＢ：０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード，９９．９９％）であった。ＨＰＬＣ操作条件は以下に挙げられる：
流速　　　　　　　 １ｍＬ／時
注入容量　　　　　 ２０ｍＬ
検出波長　　　　　 ２１５ｎｍ
勾配２．５％Ｂ／分
全稼働時間　　　　 ２０分
挿入開始時　　　　 ５分
最小領域（挿入）　 ２５０００
【０１０２】
実施例１：合成肺炎球菌免疫原の構築
この実施例は、合成免疫原内に、ＰｓｐＡのコイルドコイル構造のｂ、ｃ、ｅ、ｆまたはｇ位置でのアミノ酸座菌をスプライスする方法を説明する。Ｂｉｏｔｏｏｌｓソフトウェアーは、１５３−１７０残基と１８１−１９８残基とを含むＰｓｐＡ中の多くのコイルドコイルモチーフを同定した。以下に示されるように、これらのモチーフのａ及びｄ位置は太字で表され、溶媒接近可能なアミノ酸はイタリックである。明確化のためスペースが７つ揃いのリピートの間で挿入されている
ＬＥＥＡＥＫＫ ＡＴＥＡＫＱＫ ＶＤＡ　　　　　　配列番号１の１５３−１６８残基
ＡＥＬＥＮＱ ＶＨＲＬＥＱＥ ＬＫＥＩＤＥＳ　　　　配列番号１の１８１−１９８残基
【０１０３】
溶媒にさらされる残基は、ａ及びｄ位置のそれぞれでイソロイシン及びロイシンでコイルドコイルテンプレート内に取り込まれる。
2004503565.tif 000007
【０１０４】
このペプチドを、物質と方法に記載されているように合成する。ａ及びｄ位置でイソロイシン及びロイシンの代わりに天然の配列を含むコントロールペプチドも合成する：
ＣＮｌｅＧ ＬＥＥＡＥＫＫ ＡＴＥＡＫＱＫ ＶＤＡＬＥＮＱ ＶＨＲＬＥＱＥ ＬＫＥＩＤＥＳ
（天然コントロール；配列番号４）
【０１０５】
ペプチドのＣＤプロフィールとヘリックス安定性を、物質と方法に記載されているように測定する。その結果は、試験ペプチドが、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の不存在下で穏やかなバッファー（５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ ＫＣＬ， ｐＨ７．０）中でさえヘリックス形態で存在することを示す。対照的に、天然のコントロールは、ヘリックス構造を形成するためのＴＦＥの存在を必要とする。同様に、試験ペプチドは、熱変性実験で試験すると天然コントロールよりずっと安定である
【０１０６】
実施例２：合成肺炎球菌ＰｓｐＡペプチド
合成ペプチドを、３種の異なる肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ｐｓｐＡ）から得たエピトープに基づいて調製した。３種のＰｓｐＡタンパク質及びそれらの莢膜血清型は以下の通りである：
ＰｓｐＡ株　　　　　　莢膜血清型
ＢＧ ８７４６　　　　　　　２３Ｆ
ＥＦ５６６８　　　　　　　 ４
ＢＧ８０９０　　　　　　　 １９Ｆ
【０１０７】
これらのタンパク質を、肺炎球菌感染におけるこれらの血清型の罹患率のため選択した（Ｋａｌｉｎ， １９９８）。図４に示されるＢ細胞エピトープを、バイオインフォマティックスソフトウェアーＰｅｐｔｏｏｌｓ（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ， Ａｌｂｅｒｔａ）を使用して同定した。３種のエピトープを、コイルドコイルリピートが記録上維持されるように共にスプライスした。リンカー及びシステイン残基を取り込ませ、コイルドコイルの鎖がジスルフィド結合によって共に結合するようにさせた。
【０１０８】
ペプチドのＣＤスペクトルが図５に示される。穏やかなバッファー（５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ ＫＣｌ， ｐＨ７．０）において、ペプチドはランダムコイルとアルファヘリックスの混在した構造を採用する。５０％トリフルオロエタノール（ＴＦＥ、これはアルファヘリックスにホールディングする特性を有するペプチド中のヘリックス構造を誘導する）の存在下で、ペプチドは高度にヘリックス状の構造を採用する。穏やかなバッファー中のヘリックス含量は、５０％ＴＨＦ中のものの１７％であり、ペプチドがＴＦＥを含まない生理学的に適合可能な溶液中でヘリックスを形成することを示す。それ故このペプチドは、生理学的条件下で免疫応答を引き出すために使用されて良い。
【０１０９】
実施例３：コンセンサスコイルドコイル配列の生産
今日まで、各種の株から得た肺炎球菌表面タンパク質Ａの４０分部分的及び完全配列が、各種の配列データベースに放出されている。これらのタンパク質は、リーダー配列、コイルドコイルドメイン、プロリンドメイン、及びコリン結合ドメインからなる共通の構造を共有する。プログラムＭｕｌｔｉＣｏｉｌ（Ｗｏｌｆ等， １９９７）によるＰｓｐＡ配列の分析は、コイルドコイル領域がプロリン残基を含む部分によって破壊されていることを示す。ソフトウェアーＢｉｏｔｏｌｌｓを使用した複数の配列分析は、印刷された配列が２４．１％から９７％まで相同性が変化することを示す。しかしながら、これらのタンパク質のヘリックスドメインの特定の領域は顕著に相同であり、これらの保存された領域がペプチドの機能に重要であることを示唆する。
【０１１０】
コンセンサス配列（図６）を、抗原活性を有することが示された保存領域から推定した。完全な及び部分的なＰｓｐＡ配列を、バイオインフォマティックスソフトウェアーＰｅｐｔｏｏｌｓ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ， Ｅｄｍｏｎｔｏｎ， Ａｌｂｅｒｔａ）中のＮａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＰｕｂＭｅｄウェブサイトからダウンロードした。全部で４０の完全な及び部分的配列をソフトウェアーのアライメントモジュールに移し、コンセンサスの域値を６５％にセットした。コンセンサスの域値は、並べられた配列の群中の最小の残基複数性を規定する。要するに、コンセンサス域値は、不十分なマッチを排除するために機能し、配列内の保存残基を強調する。これは、視覚的観察により相同性の容易な同定を可能にする。
【０１１１】
コイルドコイル領域の最後の１００アミノ酸は、この領域が交差反応性エピトープを有することが以前に示されているため、配列相同性の焦点であった。図６は、この領域内で見出される残基に対する配列アライメントを説明する。特にこのアライメントは、ＥＥＬＸ１Ｘ２ＫＩＤＥＬＤＸ３ＥＩＡＸ４ＬＥＫＸ５（配列番号５）のコンセンサス配列を生じ、個々では推定のａ及びｄ位置が、それぞれイソロイシン及びロイシンであるように選択された。好ましくは、Ｘ１がＳ、Ｑ、Ｎ、またはＤであり；Ｘ２がＤ、Ｎ、またはＫであり；Ｘ３がＡ、またはＮであり；Ｘ４がＫ、Ｅ、またはＤであり；及びＸ５がＮ、Ｄ、またはＥである。
【０１１２】
このコンセンサス領域の第一の部分を含む配列、ＥＥＬＳＤＫＩＤＥＬＤ（配列番号６）を、抗原性研究のために選択した。Ｓｅｒ及びＡｓｐ残基は、これらの残基がアライメントされた配列の大多数で存在するため、この配列に含まれた。
【０１１３】
ＥＥＬＳＤＫＩＤＥＬＤ（配列番号６）を含む合成ペプチドを、本発明の式Ｉに従って製造した。かくして、式Ｉに係る前記配列のＮ末端でイソロイシンが挿入され、ペプチドの長さを増大するために隣接配列が加えられた。このペプチドの完全な配列、ＣＶＸ０２７０は以下の通りであり、コンセンサス配列から得られる残基は太字で強調されている：
アセチル−ＣＮｌｅＧＥＩＥＡＬＫＫＫＩＥＥＬＳＤＫＩＤＥＬＥＫＥＩＫ−アミド　　（配列番号７）
【０１１４】
ＣＤスペクトルを、穏やかな条件（５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ ＫＣｌ， ｐＨ７．０）の下で５０％ＴＦＥを含む水溶液中で実施した。２０℃での穏やかな条件の下でペプチドＣＶＸ０２７０のＣＤスペクトルが図７に示される。ＣＤスペクトルは、２２２ｎｍ及び２０９ｎｍで最小値、２００ｎｍ以下で高いポジティブ楕円率を有するヘリックスペプチドの典型である。典型的に、２２２ｎｍでのモル楕円率（［θ］２２２）は、ペプチド中のヘリックス含量を測定するために使用されている。ペプチドＣＶＸ０２７０については、これは−２９８００の値に対応し、このペプチドが有意にα−ヘリックスであることを示す。理論的には、２７残基のペプチドについての［θ］２２２の値は−３３９００である（Ｃｈｅｎ等， １９７４）。それ故ペプチドＣＶＸ０２７０は８８％ヘリックス状である。リンカー領域（Ｃｙｓ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ）はヘリックスではないようにデザインされ、それ故［θ］２２２シグナルを減少することに注意すべきである。２２２と２０８でのモル楕円率の比（［θ］２２２／［θ］２０８）は１．０２より大きく、コイルドコイルについて以前に観察されたものと相同であり（Ｈｏｄｇｅｓ等， １９８８； Ｌａｕ等， １９８４； Ｚｈｏｕ等， １９９２）、［θ］２０８が［θ］２２２より大きい非相互作用性αヘリックスとは明らかに異なる。５０％ＴＦＥの存在下では、ヘリックス含量は１０１％にわずかに増加した。このデータは、ペプチドＣＶＸ０２７０が高度にヘリックス状であり、水溶液の下でコイルドコイル構造で主に見出されることを示す。
【０１１５】
ＣＶＸ０２７０の安定性を測定するために、熱変性実験を実施した。図８は、温度の関数として［θ］２２２をモニターすることによって得られた変性曲線を示す。この研究は、ペプチドＣＶＸ０２７０が７５℃で元々のヘリックスの７７％を示すペプチドで非常に安定であることを示す。前記の結果は、ａ位置でイソロイシン及びｄ位置でロイシン残基を有するコイルドコイル形成配列が、別のタンパク質配列から得られたヘリックスエピトープを与えるのに十分に安定であることを示す。
【０１１６】
実施例４：コイルドコイルタンパク質の免疫原性
実施例３に記載されたペプチド「Ｓｔｒｅｐ」（配列番号７）を、物質と方法に記載されたタンパク質キャリアー破傷風菌トキソイド（（ＴＴ）に結合した。このペプチドの免疫原性を以下のように測定した。
【０１１７】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（６−８週齢、メス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、Ｓｔｒｅｐ−破傷風菌トキソイド（２０、１０または５μｇ）及び非接合破傷風菌トキソイドと共に腹腔内注射（１００μＬトータル、５０％ Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ２％アジュバント、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、カタログ番号ＳＦ２０００−２５０）によって、０日目（１°一次免疫化）、７日目（２°二次免疫化）、２８日目（３°三次免疫化）、及び４２日目（追加免疫）に免疫化した。これらの抗原を０．９％ ＮａＣｌ中に各種の量で希釈し、０．９％ ＮａＣｌで注射されたマウスをネガティブコントロールとして使用した。マウスを、６、１４、３５、及び４９日目に１°、２°、３°及び追加免疫に引き続き採血し、抗体力価（直接的ＥＬＩＳＡ）及び抗体アイソタイプ応答（アイソタイピングＥＬＩＳＡ）についてのアッセイ、抗体特性（阻害ＥＬＩＳＡ）の測定、並びに免疫保護化抗体応答（殺菌アッセイ／オプソニン化アッセイ）の測定のために血清を回収した。
【０１１８】
典型的に免疫化スケジュールは表１に示される。当該技術分野で周知の各種の他の免疫化スケジュール及びアジュバント処方もまた有効であろう。脈管内、筋肉内、皮膚内、皮下、経口、鼻腔、エアゾール吸入経路を含む各種の輸送法もまた有効であろう。
【０１１９】
表１：Ｉ．Ｐ．で免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス−Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ免疫化スケジュール
【表１】
2004503565.tif 000008
研究群：
（１０Ａ．ＢＹマウス／群）
１．Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ（２０μｇ／マウス）＋アジュバント
２．Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ（１０μｇ／マウス）＋アジュバント
３．Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ（５μｇ／マウス）＋アジュバント
４．破傷風菌トキソイド（２０μｇ／マウス）＋アジュバント
５．ＰＢＳ（Ａｌｕｍなし）
【０１２０】
Ａ．コイルドコイル抗原接合物によって引き出される抗体レベルの測定
抗体レベルを測定するために基本的な方法は、以下の直接的ＥＬＩＳＡプロトコールによる：
１．０．０５Ｍ炭酸−二炭酸バッファー（ｐＨ９．６、１００μＬ／ウェル）中の１．０μｇ／ｍＬ（ウェル当たり０．１μｇ）の抗原でのＥＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ）の被覆。
２．４℃で一晩のプレートのインキュベーション。
３．翌日、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）での３回のプレートの洗浄。ベンチトップ上でプレートをたたくことによる過剰な液体の除去。
４．ウェル当たり１００μＬブロッキングバッファー（ＰＢＳ／２％ＢＳＡ）でのプレートのブロック。３７℃で１時間のプレートのインキュベーション。
５．洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で５回のプレートの洗浄。ベンチトップ上でプレートをたたくことによる過剰な液体の除去。
６．希釈バッファー（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ）で適切に希釈されたウェル当たり１００μＬの試験抗体の添加。３７℃で６０分のプレートのインキュベーション。
７．洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回のプレートの洗浄。ベンチトップ上でプレートをたたくことによる過剰な液体の除去。
８．１：５０００の濃度への希釈バッファー（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ）中におけるＨＲＰ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）の希釈。ウェル当たり１００μＬの添加と３７℃で６０分のインキュベーション。
９．洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回のプレートの洗浄。ベンチトップ上でプレートをたたくことによる過剰な液体の除去。
１０．ＨＲＰ基質の調製
０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー中に溶解された０．０３％過酸化水素（３０％）と１ｍＭ ＡＢＴＳ（クエン酸ナトリウム（１．４８ｇ）は５００ｍＬ蒸留水にクエン酸ナトリウムを溶解する。クエン酸は７５０ｍＬ蒸留水にクエン酸を溶解する。ｐＨ４．２を得るようにクエン酸ナトリウム溶液にクエン酸溶液を注ぐ）。各ウェルに１００μＬの添加、及び３０分暗所で発色。
１１．３０分４０５ｎｍでのＥＬＩＳＡプレートリーダーでの吸光度の読み取り。
【０１２１】
Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ接合物（２０μｇ、１０μｇ及び５μｇ）に対して抗血清で得られた平均のＯ．Ｄ．のＥＬＩＳＡの読み取りが表２に示される。全ての３の投与量濃度（２０μｇ、１０μｇ及び５μｇ）でのＳｔｒｅｐ−ＴＴ接合物が、Ｓｔｒｅｐ（ＥＩＥＡＬＫＫＫＩＥＥＬＳＤＫＩＤＥＬＥＫＥＩＫ）ハプテンに対して有意な抗体力価を引き出した。非接合破傷風菌トキソイドがコイルドコイルＳｔｒｅｐ抗原に対していずれか抗体または交差反応性の抗体をも引き出さないため、これらの抗体は抗原特異性である。
【０１２２】
表２．コイルドコイルＳｔｒｅｐ抗原に対するマウス血清抗体のＥＬＩＳＡの結果
【表２】
2004503565.tif 000009
＊マウスは、Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ＋アジュバント、ＴＴ＋アジュバント、またはＰＢＳで０、７、２８及び４２日目に腹腔内で注射された。血清は４９日目に回収された。
【０１２３】
Ｂ．コイルドコイル抗原接合物によって引き出される抗体アイソタイプレベルの測定
抗体アイソタイプレベルを測定するために基本的な方法は、コイルドコイル抗原接合物によって引き出されるＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡアイソタイプを提供するために以下の通りである：
１．０．０５Ｍ炭酸−二炭酸バッファー（ｐＨ９．６、１００μＬ／ウェル）中の１．０μｇ／ｍＬ（ウェル当たり０．１μｇ）の抗原でのＥＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ）の被覆。
２．４℃で一晩のプレートのインキュベーション。
３．翌日、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回のプレートの洗浄。ベンチトップ上でプレートをたたくことによる過剰な液体の除去。
４．ウェル当たり１００μＬブロッキングバッファー（ＰＢＳ／２％ＢＳＡ）でのプレートのブロック。３７℃で１時間のプレートのインキュベーション。
５．洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で５回のプレートの洗浄。ベンチトップ上でプレートをたたくことによる過剰な液体の除去。
６．操作バッファー（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ）中の１：２５０希釈マウス血清の調製。適切なウェル内への１００μＬ／ウェルの添加。３７℃で１時間のプレートのインキュベーション。
７．洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回のプレートの洗浄。ベンチトップ上でプレートをたたくことによる過剰な液体の除去。
８．ＨＲＰ−ラベル化検出抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．）の希釈。
適切なウェル内への１００μＬ／ウェルの添加。３７℃で１時間のプレートのインキュベーション。
９．洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回のプレートの洗浄。ベンチトップ上でプレートをたたくことによる過剰な液体の除去。
１０．ＨＲＰ基質の調製
０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー中に溶解された０．０３％過酸化水素（３０％）と１ｍＭ ＡＢＴＳ（クエン酸ナトリウム（１．４８ｇ）は５００ｍＬ蒸留水にクエン酸ナトリウムを溶解する。クエン酸は７５０ｍＬ蒸留水にクエン酸を溶解する。ｐＨ４．２を得るようにクエン酸ナトリウム溶液にクエン酸溶液を注ぐ）。各ウェルに１００μＬの添加、及び３０分暗所で発色。
１１．３０分４０５ｎｍでのＥＬＩＳＡプレートリーダーでの吸光度の読み取り。
【０１２４】
Ｓｔｒｅｐ−ＴＴコイルドコイル抗原に対するＩｇＧ抗体アイソタイプ応答は表３に示される。これらの結果は、二次免疫化の後Ｓｔｒｅｐコイルドコイル抗原に対する有意なＩｇＧ１抗体レベルの存在を示す。ＩｇＧ１からＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３への有意なＩｇＧアイソタイプへのスイッチが、追加免疫注射の後観察された（２９日目の採血）。コイルドコイルＳｔｒｅｐ抗原に対する観察されたＩｇＧ抗体の成熟は、ＴＤ応答の典型例である。
【０１２５】
表３．コイルドコイルＳｔｒｅｐ抗原に対するマウス血清抗体のアイソタイピングＥＬＩＳＡ
【表３】
2004503565.tif 000010
2004503565.tif 000011
【０１２６】
Ｃ．コイルドコイル抗原接合物または遊離ペプチドでの組成物中の抗体結合の測定
抗血清の特異性を、コイルコイル構造を有するまたは有さないペプチドを使用して、阻害ＥＬＩＳＡによってさらに調査した。この阻害ＥＬＩＳＡについてのプロトコールは以下の通りである：
１．炭酸−二炭酸バッファー中の１．０μｇ／ｍＬ（ウェル当たり０．１μｇ）へのコーティング抗原の希釈。ガラスチューブの使用。
２．プレートの各ウェルに１００μＬのコーティング抗原の添加。４℃で一晩のプレートの貯蔵。
３．ウェルの攪拌と、キムワイプ上で逆さまにして除去。ウェル当たり〜２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）（ｖ／ｖ）で３回のプレートの洗浄。
４．ウェル当たり２００μＬのブロッキングバッファーの添加（ＰＢＳ／２％ＢＳＡ）（ｖ／ｖ）。３７℃で６０分のプレートのインキュベーション。
５．ウェルの攪拌と、キムワイプ上で逆さまにして除去。ウェル当たり〜２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）（ｖ／ｖ）で５回のプレートの洗浄。
６．希釈バッファー（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ）（ｖ／ｖ）で適切に希釈された、５０μＬの選択された競合的接合物または遊離ペプチドの添加。（注意：競合的ペプチドは５０μＬ中で２倍の濃度を有する）
７．希釈バッファー（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ）（ｖ／ｖ）で適切に希釈された、ウェル当たり５０μＬの試験抗体の添加。（注意：試験抗体は５０μＬ中で２倍の濃度を有する）各ウェルの最終容量は１００μＬであった。
８．ＥＬＩＳＡシェイカーでゆっくり攪拌しながら３７℃で６０分のプレートのインキュベーション。
９．ウェルの攪拌と、キムワイプ上で逆さまにして除去。ウェル当たり〜２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）（ｖ／ｖ）で３回のプレートの洗浄。１：５０００の濃度に、希釈バッファー（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ）（ｖ／ｖ）中へのペルオキシダーゼ接合抗マウスＩｇＧの希釈。ウェル当たり１００μＬの添加と、３７℃で６０分のインキュベーション。
１０．ウェルの攪拌と、キムワイプ上で逆さまにして除去。ウェル当たり〜２００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）（ｖ／ｖ）で３回のプレートの洗浄。
１１．ＨＲＰ基質の調製
０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー中に溶解された０．０３％過酸化水素（３０％）と１ｍＭ ＡＢＴＳ（クエン酸ナトリウム（１．４８ｇ）は５００ｍＬ蒸留水にクエン酸ナトリウムを溶解する。クエン酸は７５０ｍＬ蒸留水にクエン酸を溶解する。ｐＨ４．２を得るようにクエン酸ナトリウム溶液にクエン酸溶液を注ぐ）。各ウェルに１００μＬの添加、及び３０分暗所で発色。
１２．３０分４０５ｎｍでのＥＬＩＳＡプレートリーダーでの吸光度の読み取り。
【０１２７】
この阻害アッセイで使用されるＳｔｒｅｐ＃１、＃２及び＃３遊離ペプチドの配列は以下の通りである：
2004503565.tif 000012
【０１２８】
ラクタム架橋を形成する残基は、太字で強調されている。ラクタムは、グルタミン酸残基のカルボン酸側鎖をリジン残基のアミノ基側鎖と反応させることによって形成される。これらのラクタムは、それらが４残基離れて配置され、且つリジンの方向にグルタミン酸が配向されている場合、αヘリックスとコイルドコイルを安定化する。
【０１２９】
エピトープはイタリックの文字で強調されている。全ての３種の配列から、エピトープがリジン残基（Ｌ）が引き続く二つのグルタミン酸残基（ＥＥ）で開始することが分かる。一本鎖ペプチドの場合、ロイシン残基が、ラクタム架橋の一部であるグルタミン酸（Ｅ）残基によって置換されている。エピトープは、コイルドコイルにおいてＳＫＤとイソロイシン（Ｉ）残基が引き続いて連続し、一本鎖ペプチドにおいてラクタム架橋に含まれるリジン残基が引き続く。エピトープの最後の二つの残基はＤＥである。
【０１３０】
表４は、３種の異なるＳｔｒｅｐペプチド、Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ免疫原、ＴＴ、及びＢＳＡを使用する抗Ｓｔｒｅｐ血清の阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｓｔｒｅｐ＃３ペプチド（免疫原として使用されるペプチド）は有意な阻害を示し、Ｓｔｒｅｐ＃２（直鎖状ペプチド、低ヘリックス含量を有する）は阻害を示さなかった。それ故、免疫原Ｓｔｒｅｐ−ＴＴは構造的（または３次元）エピトープ構造を認識する抗体を引き出すと解されていた。Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ免疫原は、直鎖状エピトープに対して抗体を引き出さなかった。それ故これらの結果は、コイルドコイル抗原が構造的エピトープを認識する抗体を引き出すことを示唆する。阻害はまたＳｔｒｅｐ＃１ペプチドでも観察され、そのペプチドはコイルドコイル抗原に対してさらなる安定性を加えるラクタム架橋を含む。
【０１３１】
表４：各種のＳｔｒｅｐ抗原インヒビターを使用する抗Ｓｔｒｅｐ（１：２５，０００の希釈、４９日目）の阻害ＥＬＩＳＡ
【表４】
2004503565.tif 000013
2004503565.tif 000014
Ｓｔｒｅｐ＃１＝コイルドコイル＋ラクタム架橋
Ｓｔｒｅｐ＃２＝直鎖状配列
Ｓｔｒｅｐ＃３＝配列番号７
【０１３２】
Ｄ．コイルドコイル抗原接合物によって引き出される免疫保護化抗体を測定するための殺菌アッセイとオプソニン化アッセイ
使用される基本的な殺菌アッセイとオプソニン化アッセイは以下の通りである：
殺菌アッセイ
１．各種のカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から調達される所望のグラム陽性細菌でのアガープレートのストリーク。３７℃で一晩のインキュベーション。
２．翌日、単離されたコロニーの取得と、滅菌試験チューブへの１．０ｍｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ（ＴＨＢ）＋Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＹＥ）中のイノキュレート。３７℃で一晩のインキュベーション。
３．翌日、４２０ｎｍの波長でのイノキュレートされた細菌のＯ．Ｄ．の測定。ブランクとしてＴＨＦ＋ＹＥ培地の使用。
４．滅菌平底９６穴ウェルプレートに対して、各ウェルに滅菌した２．５ｍｍのガラスビーズの添加。
５．各ウェルに対して、５μＬの細菌、及び１０μＬの試験されるマウス血清の添加。３７℃で１時間のインキュベーション。注意：工程５と６は三重に実施される。
６．１時間のインキュベーション後、ＴＨＢ＋ＹＥ中に無菌的に、１：２０希釈した外因性補足物（Ｌｏｗ ＴｏｘモルモットＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）の調製。５０μＬの添加。３７℃で１時間のインキュベーション。
７．補足インキュベーションの後、５０μＬの等量物をガラススプレッダーを使用してアガープレートに配置。
８．プラスチックバッグに全てのアガープレートをラップ、３７℃で一晩のインキュベーション。
９．翌日、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）のカウント。
【０１３３】
オプソニン化アッセイ
１．各種のカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から調達される所望のグラム陽性細菌でのアガープレートのストリーク。３７℃で一晩のインキュベーション。
２．翌日、単離されたコロニーの取得と、滅菌試験チューブへの１．０ｍｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ（ＴＨＢ）＋Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＹＥ）中のイノキュレート。３７℃で一晩のインキュベーション。
３．翌日、１００Ｕ／ｍｌの滅菌ヘパリンの調製。
４．各マウス（５−１０）の尾の静脈内に１００μＬの滅菌ヘパリンの静脈内注射。１０分後、滅菌チューブ内にマウスの心臓採血。
５．４２０ｎｍの波長でのイノキュレートされた細菌のＯ．Ｄ．の測定。ブランクとしてＴＨＦ＋ＹＥ培地の使用。
６．滅菌平底９６穴ウェルプレートに対して、各ウェルに滅菌した２．５ｍｍのガラスビーズの添加。
７．各ウェルに対して、５０μＬのヘパリン処理血液、１０μＬの試験されるマウス血清、５μＬの細菌の添加。３７℃で１時間のインキュベーション。注意：この工程は三重に実施される。
８．１時間のインキュベーション後、蒸留水中に無菌的に、１：２０希釈した外因性補足物（Ｌｏｗ ＴｏｘモルモットＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）の調製。５０μＬの添加。３７℃で１時間のシェイカーでのインキュベーション（遅い動き）。
９．１時間後、１００μＬの等量物をガラススプレッダーを使用してアガープレートに配置。
１０．プラスチックバッグに全てのアガープレートをラップ、３７℃で一晩のインキュベーション。
１１．翌日、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）のカウント。
【０１３４】
Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ接合物（２０、１０、５μｇの投与量）で免疫化されたマウスから得た血清は、オプソニン化アッセイによって測定すると免疫保護的であることが見出された。Ｓｔｒｅｐ−ＴＴに対する抗血清は、代表的なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型（１，３及び５）のコロニー形成ユニットの減少を示した。破傷風菌トキソイドまたはＰＢＳで注射されたマウスから得た血清では、ほとんどまたは全くコロニー形成ユニットの減少が観察されなかった。Ｓｔｒｅｐ−ＴＴ接合物は、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコイルドコイル抗原に対する免疫保護化抗体を引き出した。
【０１３５】
表５：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型（１，３及び５）を使用するＳｔｒｅｐ−ＴＴに対する抗血清のオプソニン化の結果
【表５】
2004503565.tif 000015
【０１３６】
添付資料１
Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１株から得られるＰｓｐＡタンパク質の免疫原性領域の分析。免疫原性領域は、配列の株の星印によって示される。
【表６】
2004503565.tif 000016
2004503565.tif 000017
2004503565.tif 000018
2004503565.tif 000019
2004503565.tif 000020
2004503565.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、微生物表面に存在するいくつかの抗原を表す、肺炎球菌表面の仮想図である。ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣから得られるコイルドコイル領域は、細胞壁から離れて突出していると解される。
【図２】図２は、ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣ分子の模式図であり、それらのホモロジー領域を強調している。各タンパク質は、コイルドコイルドメイン、プロリンリッチ領域、コリン結合領域、及び疎水性テールの４個のドメインからなる。高い配列ホモロジーが、ＰｓｐＡ及びＰｓｐＣの間のコイルドコイルドメインの領域２の部分に存在する。
【図３】図３は、二つのペプチド鎖からなるコイルドコイル構造の断面図を示す。鎖１における７つ揃いのリピートの７の位置は、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びｇで表される一方、鎖２における７つ揃いのリピートの７の位置は、ａ’、ｂ’、ｃ’、ｄ’、ｅ’、ｆ’及びｇ’で表される。白い矢印は、ａとａ’、及びｄとｄ’のそれぞれの間の疎水性相互作用を示す。
【図４】図４は、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのいくつかの臨床的に関連する株のエピトープを、コイルドコイルテンプレートに組み合わせ、免疫原性ペプチドを作製する工程を示す。
【図５】図５は、ＴＦＥの存在下及び不存在下での、図４のペプチドのＣＤスペクトルを示す。
【図６】図６は、非常に保存されたＰｓｐＡの領域を示す。式Ｉを有することを確認するように選択されたコンセンサス配列も知られている。
【図７】図７は、ペプチドＣＶＸ０２７０のＣＤスペクトルを示し、それは図６に示されたコンセンサス配列の一部を含む。
【図８】図８は、ペプチドＣＶＸ０２７０の熱変性プロフィールを示す。
【図１】
2004503565.tif 000022
【図２】
2004503565.tif 000023
【図３】
2004503565.tif 000024
【図４】
2004503565.tif 000025
【図５】
2004503565.tif 000026
【図６】
2004503565.tif 000027
【図７】
2004503565.tif 000028
【図８】
2004503565.tif 000029
【国際公開パンフレット】
2004503565.tif 000030
2004503565.tif 000031
2004503565.tif 000032
2004503565.tif 000033
2004503565.tif 000034
2004503565.tif 000035
2004503565.tif 000036
2004503565.tif 000037
2004503565.tif 000038
2004503565.tif 000039
2004503565.tif 000040
2004503565.tif 000041
2004503565.tif 000042
2004503565.tif 000043
2004503565.tif 000044
2004503565.tif 000045
2004503565.tif 000046
2004503565.tif 000047
2004503565.tif 000048
2004503565.tif 000049
2004503565.tif 000050
2004503565.tif 000051
2004503565.tif 000052
2004503565.tif 000053
2004503565.tif 000054
2004503565.tif 000055
2004503565.tif 000056
2004503565.tif 000057
2004503565.tif 000058
2004503565.tif 000059
2004503565.tif 000060
2004503565.tif 000061
2004503565.tif 000062
2004503565.tif 000063
2004503565.tif 000064
2004503565.tif 000065
2004503565.tif 000066
2004503565.tif 000067
2004503565.tif 000068
2004503565.tif 000069
2004503565.tif 000070
2004503565.tif 000071
2004503565.tif 000072
2004503565.tif 000073
2004503565.tif 000074
2004503565.tif 000075
2004503565.tif 000076
2004503565.tif 000077
2004503565.tif 000078
2004503565.tif 000079
2004503565.tif 000080
2004503565.tif 000081
2004503565.tif 000082
2004503565.tif 000083
2004503565.tif 000084
2004503565.tif 000085
2004503565.tif 000086
2004503565.tif 000087
2004503565.tif 000088
2004503565.tif 000089
2004503565.tif 000090
2004503565.tif 000091
2004503565.tif 000092
2004503565.tif 000093
2004503565.tif 000094
2004503565.tif 000095
2004503565.tif 000096
2004503565.tif 000097
2004503565.tif 000098
2004503565.tif 000099
2004503565.tif 000100
2004503565.tif 000101
2004503565.tif 000102
2004503565.tif 000103
2004503565.tif 000104
2004503565.tif 000105
2004503565.tif 000106
2004503565.tif 000107
2004503565.tif 000108
2004503565.tif 000109
2004503565.tif 000110
2004503565.tif 000111
2004503565.tif 000112
2004503565.tif 000113
2004503565.tif 000114
2004503565.tif 000115
2004503565.tif 000116
2004503565.tif 000117
2004503565.tif 000118
2004503565.tif 000119
2004503565.tif 000120
2004503565.tif 000121
2004503565.tif 000122
2004503565.tif 000123
2004503565.tif 000124
2004503565.tif 000125
2004503565.tif 000126
2004503565.tif 000127
2004503565.tif 000128
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503565.tif 000129
【国際調査報告】
2004503565.tif 000130
2004503565.tif 000131
2004503565.tif 000132
2004503565.tif 000133