(57)【要約】ａ）酸化可能な基質及び酸素ドナーに加えて、固体で分割された相中に酵素的触媒試薬を含む水性反応バスを形成し、遊離状態で、前記試薬は、前記バス中に分配され、後者は運転状態にセットされて良いこと；ｂ）水性反応バスを、固体で分割された相中の酵素的触媒試薬で富化された分画と、前記触媒試薬が存在せず、処理剤が得られる分画に分離すること；を特徴とする、少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を含む、少なくとも一つの酵素的触媒試薬；水性相中で酸化可能であり、酸素ドナーの作用によって、前記酵素的触媒試薬による触媒作用により酸化されることが可能であり、それによって遊離状態で酸素化化学種を生産可能である少なくとも一つの基質；前記酸素ドナー；を接触させることによる、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体、例えば液体、状態で処理剤を酵素的に生産する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）酸化可能な基質及び酸素ドナーに加えて、固体で分割された相中に酵素的触媒試薬を含む水性反応バスを形成し、遊離状態で、前記試薬は、前記バス中に分配され、後者は運転状態にセットされて良いこと；
ｂ）水性反応バスを、固体で分割された相中の酵素的触媒試薬で富化された分画と、前記触媒試薬が存在せず、処理剤が得られる分画に分離すること；
を特徴とする、
−  少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を含む、少なくとも一つの酵素的触媒試薬；
−  水性相中で酸化可能であり、酸素ドナーの作用によって、前記酵素的触媒試薬による触媒作用により酸化されることが可能であり、それによって遊離状態で酸素化化学種を生産可能である少なくとも一つの基質；
−  前記酸素ドナー；
を接触させることによる、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体、例えば液体、状態で処理剤を酵素的に生産する方法。
【請求項２】
前記酵素的触媒試薬が、固体で分割された相中で、反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素的触媒試薬が、液体状態で、反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化可能な基質が、適切な場合水性相中で、水性反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酸素ドナーが、適切な場合水性相中で、反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素的触媒試薬が、反応バスから放出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
連続的または不連続的に実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素的触媒試薬が、固相で、反応バス中で、エマルションの形態に懸濁され、適切な場合、乳化剤が前記バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
酵素的触媒試薬に対して不活性である固体粒子の凝集物が水性反応バス中に形成され、前記凝集物が、触媒試薬を遊離状態で含みまたは取り込み、前記凝集物は、水性反応バス内に配置され、それによって、前記バスは、工程（ｂ）の間で、凝集物が富化した分画と、凝集物が存在せず、処理剤が得られる分画に分離されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
凝集物が綿状沈殿物であり、綿状沈殿形成剤、例えばアニオン性またはカチオン性綿状沈殿形成剤が、反応バスに導入されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
凝集物が凝固物であり、凝固剤が反応バスに導入されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
凝固剤と綿状沈殿形成剤が反応バスに導入されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
増粘剤が反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
増粘剤が、クレー、カオリン、シリカ、またはシリカートから選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記触媒試薬が、少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を発現している微生物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ｐＨ調節剤がバスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
過酸化水素を生産する予備的酵素システムの形態で酸素ドナーがバスに導入され、前記酵素的触媒試薬が、ペルオキシダーゼタイプの酵素に加えて、オキシドレダクターゼタイプの酵素を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素的触媒試薬がペルオキシダーゼから選択されることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記酸化可能な基質が、ナトリウムチオシアナート（ＮＡＳＣＮ）またはカリウムチオシアナート（ＫＳＣＮ）、ナトリウムビスルフィト（ＮａＨＳＯ３）、ナトリウムヒドロスルフィト（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）、ナトリウムメタビスルフィト（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、ナトリウムニトリト（ＮａＮＯ２）またはカリウムニトリト（ＫＮＯ２）、ナトリウムヒポクロリド（ＮａＯＣｌ）、及びカリウムヨージド（ＫＩ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸素ドナーが過酸化水素であることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
水性相中に酵素的触媒試薬及び凝集剤を含むことを特徴とする、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体状態での処理剤の酵素的生産のための試薬の群。
【請求項２３】
水性相中に酵素的触媒試薬及び綿状沈殿形成剤を含むことを特徴とする、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体状態での処理剤の酵素的生産のための試薬の群。
【請求項２４】
水性相中に酵素的触媒試薬及び凝固剤を含むことを特徴とする、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体状態での処理剤の酵素的生産のための試薬の群。
【請求項２５】
酵素的触媒試薬及び増粘剤を含むことを特徴とする、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体状態での処理剤の酵素的生産のための試薬の群。
【請求項２６】
前記酵素的触媒試薬がペルオキシダーゼから選択されることを特徴とする、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の試薬の群。
【請求項２７】
前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項２６に記載の試薬の群。
【請求項２８】
少なくとも一つの安定な酸素化化学種を遊離状態で含む、流体、例えば液体、状態の処理剤。
【請求項２９】
前記安定な酸素化化学種が、ヒポチオシアナートイオン（ＯＳＣＮ−）であることを特徴とする、請求項２８に記載の処理剤。
【請求項３０】
前記酸素化化学種が、１０時間より長く安定であることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の処理剤。
【請求項３１】
３または４の区画を含み、その２または３が連続的に攪拌されており、
−  第一は、酵素的触媒試薬、及び任意に凝固剤と増粘剤を受けるように企図され；それは高速で攪拌され；
−  第二は任意に綿状沈殿形成剤を受け取り、任意にｐＨ調節剤を受け取り；それは低速で攪拌され；
−  第三は、酸化可能な基質並びに酸素ドナーを供給され、所望の酵素反応の部位であり、これもゆっくりと攪拌され；
−  第四の区画では、水性反応バスが、固体及び分割された相において酵素的触媒試薬で富化されている分画と、前記触媒試薬を含まず、処理剤が得られる区画に分離され、前記分画を分離するための手段を含む；
ことを特徴とするリアクター。
【請求項３２】
前記分画を分離するための手段が、デカンテーション、浮選、遠心分離、濾過、及び／またはサイクロン分離から選択されることを特徴とする、請求項３１に記載のリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体状態において、酸素化化学種と酸化物質の濃縮した連続的フローを生産し、それによって、例えば、水を含む各種の食物性製品、及び産業上の物質の脱汚染化及び滅菌のために、並びに食物性製品、医薬品、及び化粧品の調製のために使用できる溶液を入手可能であることに関する。
【背景技術】
【０００２】
この目的のために、オキシドレダクターゼのような天然の抗菌酵素システム、例えばラクトペルオキシダーゼシステムの使用が知られており、数多くの応用が記載されている。
【０００３】
この酵素システムの特性は、特に"The lactoperoxidase system chemistry and biological significance" (1985) Marcel Dekker, Inc, New York, Chap. 8, pp 143-178で研究されている。
略記すると、このラクトペルオキシダーゼ／チオシアナート／過酸化水素抗菌システムは、以下の３種の成分を含む：
−  酵素：ラクトペルオキシダーゼ；
−  酸化可能物質：チオシアナートイオン（ＳＣＮ−）；
−  酸素ドナー：過酸化水素。
【０００４】
このシステムでは、液体媒体において、ラクトペルオキシダーゼが、チオシアナート酸化反応を触媒する。
【０００５】
有意な量の過酸化水素の存在下で、正確なｐＨ条件の下で、酸化反応は、より酸化される酸素酸誘導体へと継続する。
【０００６】
非制限的な態様では、得られる酸素化化学種は、それ自体または混合物として、ヒポチオシアナートイオンＯＳＣＮ−、Ｏ２ＳＣＮ−、及びＯ３ＳＣＮ−イオン、スーパーオキシドＯ２−、及びトリオキシドＯ３−イオン、ヒドロキシルイオンＯＨ−、酸化硝酸ＮＯ、三酸化二窒素Ｎ２Ｏ３、二酸化窒素ＮＯ２、ペルオキシニトリトＯＮＯ２、ヒドロキシペルオキシニトリトＯＮＨＯ２、二酸化硫黄ＳＯ２、三酸化硫黄ＳＯ３、亜硫酸ＨＳＯ３、及び次亜塩素酸ＨＯＣｌである。
【０００７】
上述の酸素化化学種は、特に細菌、例えばPseudomonae属、Enterobacteriaceae属、例えばE. coli、Salmonella属、Listeria属、またはCampylobacter属、スポア形態、及び原生動物、ウイルス、酵母、または真菌のような数多くの微生物に関して、静菌効果及び殺菌効果を有することが知られている。
【０００８】
得られた酸素化化学種、特にＯＳＣＮ−、Ｏ２ＳＣＮ−、及びＯ３ＳＣＮ−のような酸化チオシアナートイオンの作用の結果として、それらは細胞膜の成分と相互作用可能であり、化学的汚染源を酸化可能であるため、この抗菌システムはまた、脱汚染のためにも使用できる。
【０００９】
過酸化水素供給基質−それらは過酸化水素自体であっても良く、または例えば過酸化金属、若しくは過酸化水素を生産する補充的酵素システムであっても良く、この補充的酵素システムは、例えば酸化可能基質と酸素と共なるオキシドレダクターゼ、例えば水性媒体中のグルコース／グルコースオキシダーゼシステムである−の存在下で、完全なシステムを使用することが可能であり、略記すると、そのような抗菌システムの反応特性は、以下の３の工程を含む：
−  過酸化水素供給源による、過酸化水素の生産；
−  チオシアナート酸化反応；
−  得られた酸素化化学種の作用による脱汚染。
数多くの応用が記載されている。
【００１０】
例えば、ＷＯ−Ａ−８７０７８３８は、後の使用に鑑みて、乾燥形態で、ラクトペルオキシダーゼ、チオシアナート、及び天然の酸素ドナーを含む抗菌組成物の実装方法を記載している。
【００１１】
ＵＳ−Ｃ−５４０３４５０は、酸化されることが可能であり、水中の汚染源として存在する物質を変換する目的で、オキシドレダクターゼが固定化されているユニットの使用を開示している。
【００１２】
ＪＰ５８１５２４８６は、例えば繰り返しの使用のためのポリマー粒子に対する酵素の固定化を教示している。
【００１３】
リアクター壁またはフィルム、ビーズ、若しくはかなりの比表面積を含む他の支持体に対する酵素または酵素システムの固定化のためのシステムもまた知られている。
【００１４】
【特許文献１】
ＷＯ−Ａ−８７０７８３８
【特許文献２】
ＵＳ−Ｃ−５４０３４５０
【特許文献３】
ＪＰ５８１５２４８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、これらの使用のいずれもが、以下の理由により、それらが内包している酵素の過度の消費のため、満足には至っていない：
−  処理される製品の粉砕化による使用に関与し、それ故酵素の量は、処理される製品の面積と体積に比例するという例えば乾燥形態でのそれらの実装；
−  あるいは、固定化酵素の低い反応収率；
−  あるいは、生成される酸素化化学種の迅速な崩壊。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の方法は、流体、例えば液体、状態において、高い収率を有し、実質的な耐久性を示す少なくとも一つの安定な酸素化化学種を遊離状態において含む処理剤を生産することができることによって、前述の全ての欠点を解消可能である。
【００１７】
本発明は、以下のもの：
ａ）酸化可能な基質及び酸素ドナーに加えて、固体で分割された相中に酵素的触媒試薬を含む水性反応バスを形成し、遊離状態で、前記試薬は、前記バス中に分配され、後者は運転状態にセットされて良いこと；
ｂ）水性反応バスを、固体で分割された相中の酵素的触媒試薬で富化された分画と、前記触媒試薬が存在せず、処理剤が得られる分画に分離すること；
を特徴とする、
−  少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を含む、少なくとも一つの酵素的触媒試薬；
−  水性相中で酸化可能であり、酸素ドナーの作用によって、前記酵素的触媒試薬による触媒作用により酸化されることが可能であり、それによって遊離状態で酸素化化学種を生産可能である少なくとも一つの基質；
−  前記酸素ドナー；
を接触させることによる、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体、例えば液体、状態で処理剤を酵素的に生産する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
酸素ドナーは好ましくは、過酸化水素のような過酸化物である。
【００１９】
遊離状態における酸素化化学種は、生成した溶液のｐＨで、遊離状態において、前記酸素化化学種の存在に向かう解離反応の平衡を解離定数が置換するイオン状態にある化学種であると解される。
【００２０】
本発明は、以下の変形例を提供できる：
−  おそらく水性相に存在する酸化可能な基質が、水性反応バスに導入される；
−  固体で分割された相の状態、または液体状態で存在する酵素的触媒試薬が、反応バスに導入される；
−  酵素的触媒試薬が、反応バスから放出される；
−  この方法が、連続的または不連続的に実施される；
−  酵素的触媒試薬に対して不活性である固体粒子の凝集物が水性反応バス中に形成され、前記凝集物が、触媒試薬を遊離状態で含みまたは取り込み、前記凝集物は、水性反応バス内に配置され、それによって、前記バスは、工程（ｂ）の間で、凝集物が富化した分画と、凝集物が存在せず、処理剤が得られる分画に分離される；
−  凝集物が綿状沈殿物であり、綿状沈殿形成剤、例えばアニオン性またはカチオン性綿状沈殿形成剤が、反応バスに導入される；
−  凝集物が凝固物であり、凝固剤が反応バスに導入される；
−  増粘剤がバスに導入される；
−  固体状態の酵素的触媒試薬が、反応バス中でエマルション形態に懸濁され、適切な場合、乳化剤が前記バスに導入される；
−  触媒試薬が、少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を発現している微生物を含む；
−  ｐＨ調節剤がバスに導入される；
−  過酸化水素を生産する予備的酵素システムの形態で酸素ドナーがバスに導入され、酵素的触媒試薬が、ペルオキシダーゼタイプの酵素に加えて、オキシドレダクターゼタイプの酵素を含む。
【００２１】
凝集物は、固体及び分割された相中に酵素的触媒試薬を維持することが可能であるが、遊離状態で、凝固剤、綿状沈殿形成剤、または乳化剤の添加によって、増粘剤の存在化または不存在下で、反応媒体中で、反応の最後で前記反応媒体からそれらを単離し、それらをリサイクルすることが可能であるいずれかの製剤であると解される。
【００２２】
遊離状態は、触媒試薬と前記凝集試薬の間でイオン結合または共有結合を形成せずに、凝集物における懸濁物の状態を意味すると解される。
【００２３】
一つの実施変形例では、凝集物は綿状沈殿物である。
【００２４】
綿状沈殿物は、酵素または酵素システムに対して化学的に不活性で、酵素を固定化することなくそれを含む粒子のいずれかの凝集物を意味するように解され、前記凝集物は、凝固の後または予備的凝固無しで、ｐＨ調節剤を取り込みまたは取り込まずに、カチオン性またはアニオン性綿状沈殿形成剤を添加することによって得ることができる。
【００２５】
使用される綿状沈殿形成剤は、ポリマー状イオン性またはカチオン性綿状沈殿形成剤、例えばポリサッカリド、アニオン性へテロポリサッカリドまたはポリアクリルアミドから選択される、
【００２６】
有利には、綿状沈殿形成剤は、反応媒体のｌ当たり０．１ １０−６から１０ｇまでの割合で、反応媒体中に添加される。
【００２７】
一つの実施変形例では、凝集物は凝固物である。
【００２８】
凝固物は、酵素または酵素システムに対して不活性であり、酵素を固定化することなくそれを含む粒子のいずれかの凝集物を意味するように解され、前記凝集物は、前述のような凝固剤を添加することによって得ることができる。
【００２９】
有利には、凝固剤は、反応媒体のｌ当たり０．１ １０−６から１０ｇまでの割合で、反応媒体中に添加される。
【００３０】
前記凝集物は、凝固剤及び綿状沈殿形成剤の連続的な添加によって形成できる；この方法では、凝固工程は沈殿形成工程に先行する。
【００３１】
沈殿形成工程が凝固工程によって先行される場合、後者は、例えばアルミニウムまたは鉄の塩、例えば硫酸アルミニウム、塩化アルミニウム、アルミン酸ナトリウム、アルミニウムポリヒドロキシクロリド、アルミニウムポリヒドロキシスルファート、アルミニウムポリヒドロキシクロロスルファート、塩基性アルミニウムポリクロロスルファート、アルミニウムポリヒドロキシクロロシリカート、アルミニウムフルオロスルファート、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、フェリッククロロスルファート、ソーダ、またはジメチルジアリルアンモニウムクロリドのホモポリマーから選択される凝固剤を導入することによって作用される。
【００３２】
本発明はまた、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含み、さらに水性相に酵素的触媒試薬と凝集剤、及び／または水性相に綿状沈殿形成剤、及び／または水性相に凝固剤を含む、流体状態で処理剤を酵素的に生産するための試薬の群に関する。
【００３３】
一つの実施態様では、使用が所望される凝集剤のタイプと化学的に適合可能である有機または無機増粘剤が、混合物に添加される。
【００３４】
前記実施変形例によれば、この増粘剤は、酵素的触媒試薬を導入するのと同時に、または水性反応バスが形成された後に導入される。
【００３５】
この増粘剤は、クレー、カオリン、シリカ、またはシリカート、あるいは酵素の富化を促進するいずれかの他の適合可能な無機試薬から選択される。
【００３６】
有利には増粘剤は、反応媒体のｌ当たり０．１から１００ｇの範囲の割合で、反応媒体に添加される。
【００３７】
本発明はまた、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含み、少なくとも一つの酵素的触媒試薬と増粘剤とを含む、流体状態における処理剤の酵素的生産のための無水形態の試薬の群に関する。
【００３８】
有利には、前記無水形態の試薬の群は、０．００５から１０％の酵素的触媒試薬と、９０から９９．９９５％の増粘剤を含み、例えば２ｃｍ３の実用体積を有するリアクター当たり、５ｇから４００ｇの乾燥形態のラクトペルオキシダーゼと、１０００ｇから５０００ｇのクレーを含む。
【００３９】
前記試薬の群は、実用体積のｌ当たり０．２から１０ｇの速度でリアクターにそれを導入することによって使用される。
【００４０】
別の実施態様では、乳化剤が混合物に添加される。
【００４１】
エマルションは、酵素を固定化することなくそれを含み、脂肪またはダイズレシチンまたは炭化水素のような乳化剤を添加することによって得ることができるいずれかの懸濁液を意味するように解される。
【００４２】
特定の実施態様では、凝集物分散媒体のｐＨは、無機または有機の酸または塩基から選択されるであろうｐＨ調節剤を添加することによって安定化または調節できる。
【００４３】
酵素的触媒試薬は、遊離した、化学的に単離された、またはそれら自体で会合した酵素であり、前記酵素は、単離された微生物、植物若しくは動物起源の細胞、または多細菌叢から得られる。それらは特に、ペルオキシダーゼ、及び酵素を生産し、または酵素活性を生成するいずれかの天然の、選択された、または遺伝学的に変性された微生物である。
【００４４】
本発明で使用できるペルオキシダーゼは、植物起源のペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、またはダイズペルオキシダーゼ、あるいは穀物ＮＡＤＰＨニトラートオキシドレダクターゼ、または動物若しくはヒト起源のペルオキシダーゼ、例えば唾液ペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、及び好酸球ペルオキシダーゼを含む。
【００４５】
これらのペルオキシダーゼは、母乳または唾液のような天然物質から抽出及び／または単離でき、あるいは当業者に周知である天然または化学的方法を使用して生産できる。これらのペルオキシダーゼはまた、組換え法によっても生産でき、これらの後者は当業者に周知である。
【００４６】
酵素的触媒試薬は好ましくは、ペルオキシダーゼから選択される。
【００４７】
好ましい実施態様では、ペルオキシダーゼはラクトペルオキシダーゼである。
【００４８】
有利には、前記酵素は、反応媒体のｌ当たり０．０２から１０ｇの範囲の割合で、反応媒体に添加される。
【００４９】
酸化可能な基質は、負に荷電したハロゲン及びそれらの誘導体、並びに負に荷電したシュードハロゲン及びそれらの誘導体からなる群から選択される。この場合、負に荷電したハロゲンは、元素の周期表の第ＶＩＩ族に属するアニオンの形態の特定の化学元素を指し、それらは例えばブロミド、Ｂｒ−、クロリド、Ｃｌ−、またはヨージド、Ｉ−である。
【００５０】
シュードハロゲンは例えば、チオシアナートイオン、ビスルフィトイオン、ヒドロスルフィトイオン、メタビスルフィトイオン、ニトリト、及び／またはヒポクロリトイオンからなる群から選択される。
【００５１】
酸化可能な基質は、好みによって、使用されるペルオキシダーゼに従って、ナトリウムチオシアナート（ＮＡＳＣＮ）またはカリウムチオシアナート（ＫＳＣＮ）、ナトリウムビスルフィト（ＮａＨＳＯ３）、ナトリウムヒドロスルフィト（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）、ナトリウムメタビスルフィト（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、ナトリウムニトリト（ＮａＮＯ２）またはカリウムニトリト（ＫＮＯ２）、ナトリウムヒポクロリド（ＮａＯＣｌ）、及びカリウムヨージド（ＫＩ）から選択されるであろう。
【００５２】
例えば、ペルオキシダーゼが以下のものである場合、以下の酸化可能な基質が使用されるであろう：
−  唾液ペルオキシダーゼである場合、チオシアナートイオンまたはヨージドイオン及び／またはそれらの混合物のいずれか；
−  ラクトペルオキシダーゼである場合、チオシアナートイオンまたはヨージドイオン及び／またはそれらの混合物のいずれか；
−  ミエロペルオキシダーゼである場合、チオシアナートイオンまたはヨージドイオンまたはクロリドイオン及び／またはそれらの混合物のいずれか；
−  セイヨウワサビペルオキシダーゼである場合、クロリドイオンまたはヨージドイオン及び／またはそれらの混合物のいずれか；
−  植物起源のペルオキシダーゼである場合、チオシアナートイオンまたはブロミドイオンまたはクロリドイオン及び／またはそれらの混合物のいずれか。
【００５３】
過酸化物、例えば過酸化酸素の存在下で、これらの酵素システムの作用は、特にヒポチオシアナートイオンまたはヒポハライドイオンの生産を引き起こす。
【００５４】
有利には、組み合わせた酵素基質は、反応媒体のリットル当たり０．０５ｍＭから１５ｍＭの範囲の割合で反応媒体に添加される。
【００５５】
本発明に係る酸素ドナーは、過酸化水素、またはいずれかの無機過酸化物、例えば金属過酸化物、例えば過酸化マグネシウムまたは過酸化ナトリウム、有機過酸化物、例えば過酸化ベンジルまたは過酸化尿素であることができるが、過酢酸、過マンガン酸カリウム、及びパーカルボナートであることもできる。一般的な態様では、過酸化水素を生産可能であるいずれかの化学化合物が使用できる。
【００５６】
有利には、酸素ドナーは、反応媒体のリットル当たり０．０５ｍＭから１５ｍＭの範囲の割合で、反応媒体に添加される。
【００５７】
酸素ドナーが、過酸化酸素を生産する予備的酵素システムの形態で存在する場合、それは酸化可能な基質及び酵素、例えばオキシドレダクターゼタイプの酵素を含み、この酵素はこの基質に特異的である。かくして、使用される酵素システムがオキシドレダクターゼである場合、単独でまたはこの基質と組み合わせた酸化可能な基質は、グルコース、ラクトース、またはキサンチンのような基質から単離され、過酸化水素を生産する工程に作用するために媒体に添加される。
【００５８】
以下の酵素システムが、例示として挙げられるであろう：グルコースオキシダーゼ／グルコース、ガラクトースオキシダーゼ／ガラクトース、ウラートオキシダーゼ／ウラート、コリンオキシダーゼ／コリン、グリシンオキシダーゼ／グリシン、グルタマートオキシダーゼ／グルタマート、及びアルコールオキシダーゼ／アルコール。
【００５９】
酸素と水の存在下で、これらの酵素システムは、過酸化水素を生産可能であり、それは本発明に係る方法の酵素システムにおける酸素ドナーとして使用されるであろう。
【００６０】
別法として、この酸素ドナーは、微生物、例えばStreptococcus属及び／またはLactobacillus属から選択でき、それらは過酸化水素を生産できる。
【００６１】
使用されるペルオキシダーゼ及び／またはオキシドレダクターゼとしては、例示として以下のものが挙げられる：
−  植物起源の酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ(E.C. No. 1.11.1.7)、またはダイズペルオキシダーゼ、または穀物ＮＡＤＰＨニトラートオキシドレダクターゼ(E.C. No. 1.6.6.1)；
−  真菌起源の酵素、例えばグルコースオキシダーゼ(E.C. No. 1.1.3.4)、カタラーゼ(E.C. No. 1.11.1.6)、ベータガラクトシダーゼ(E.C. No. 3.2.1.23)、及びAspergillusＮＡＤＰＨニトラートオキシドレダクターゼ(E.C. No. 1.6.6.2)；
−  細菌起源の酵素、例えばEnterococcusＮＡＤＨペルオキシダーゼ(E.C. No. 11.1.1)、VibrioＮＡＤＰＨオキシドレダクターゼ(E.C. No. 1.6.99.3)、Colibacillusニトラートレダクターゼ(E.C. No. 1.9.6.1)、Pediococcus乳酸ジスムターゼオキシダーゼ(E.C. No. 1.1.3.2)、Collibacillusスーパーオキシドジスムターゼ(E.C. No. 1.15.1.1)、Arthromycesペルオキシダーゼ(E.C. No. 1.11.1.1)、及びColibacillusベータガラクトシダーゼ(E.C. No. 3.2.1.23)；
−  動物起源の酵素、例えば母乳キサンチンオキシダーゼ(E.C. No. 1.1.3.22)、母乳ラクトペルオキシダーゼ(E.C. No. 1.11.1.7)、白血球ミエロペルオキシダーゼ(E.C. No. 1.11.1.7)、神経組織酸化窒素シンセターゼ(E.C. No. 1.14.13.39)、赤血球スーパーオキシドジスムターゼ(E.C. No. 1.15.1.1)、及び肝細胞スルフィトオキシダーゼ(E.C. No. 1.8.3.1)。
【００６２】
本発明に係る方法の工程ｂ）、つまり水性反応バスを、固体及び分割された相中の酵素的触媒試薬で富化した分画と、前記触媒試薬を含まず、前記処理剤が得られる分画とに分離する工程の実施は、凝集物またはエマルションを分離し回収することによって操作される。使用される手段として例示的には、エマルションの場合には、デカンテーション、浮選、及び遠心分離、並びに綿状沈殿物または凝固物の場合には、沈降分離、縦方向または横方向の濾過、または遠心分離、及び／またはサイクロン分離のような、古典的に使用される手段である。
【００６３】
本発明に係る方法は、流体、例えば液体、状態において処理剤を得ることを可能にし、前記試薬は、遊離状態で、少なくとも一つの安定な酸素化化学種を含む。
【００６４】
とりわけ、安定な酸素化化学種は、ヒポチオシアナートイオン（ＯＳＣＮ−）である。
【００６５】
本発明はまた、流体、例えば液体、状態における処理剤に関し、前記試薬は、１０時間より長く安定である少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む。
【００６６】
本発明はとりわけ、１０時間より長く安定である少なくともヒポチオシアナートを遊離状態で含む、流体、例えば液体状態における処理剤に関する。
【００６７】
本発明に係る方法は、大量の本発明に係る処理剤溶液を生産することが可能であり、前記溶液は、物質、機械、器具、織物、容器、及びパイプワーク、及び農産業の敷地、及び植物、または病院及びケアセンターを清浄化、洗浄、及び消毒するために使用できる殺生物特性を有する。本発明の方法はまた、ヒト及び／または動物の健康のために企図される化粧品及び医薬品、並びに食物性製品の製剤化のために企図される溶液を調製可能である。
【００６８】
本発明の方法は、食物製品、例えば果物、野菜、及び葉、並びに動物製品の表面を脱汚染化するための洗浄溶液の生産を可能にする。
【００６９】
これらの殺生物性溶液は、浸液、スプレー、注射、またはネブライゼーションの手段によって使用することができるであろう。
【００７０】
製品混合物の構成成分、例えば脱水または濃縮に引き続く果汁の再構成のための水として、これらの溶液を使用することも可能であろう。
【００７１】
本発明の方法は、ヒトまたは動物の消費のための飲料、または温水スプリング水、水泳用プール水、または浴用水のために水を生産することを企図した水の滅菌及び純水化が可能であろう。
【００７２】
本発明に係る方法はまた、汚水、水性廃棄物、または産業排水を処理することが可能であり、実際に、気体性廃棄物を液体に循環させることによってそれらを処理することが可能である。
【００７３】
化学的汚染源、例えば硝酸鉛またはリン酸塩は、有機汚染源であるためかくして酸化される；オキシドレダクターゼの流速及び濃度に依存して、分解を完全または部分的にすることが可能であろう。
【００７４】
少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を含む、少なくとも一つの酵素的触媒試薬、酸素ドナー、及び前記酵素的触媒試薬によって酸化可能である基質を接触させ、それによって遊離状態で前記酸素化化学種を生成することによる、少なくともヒトｐつの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体、例えば液体、状態における処理剤の酵素的生産方法の操作は、リアクター（図１）において実施され、前記リアクターは、部分的または完全に閉じることができ、金属または合成物質で形成され、ローディング装置（１）、及びオーバーフロー、及び／または仕切りをサイフォンの形態で備えており、一つの区画から次の区画（２）へ通過させることができる。
【００７５】
本発明に係るリアクターは、３または４の区画からなり、そのうちの２または３は連続的に攪拌されている：
−  第一（３）は、酵素的触媒試薬、及び任意に凝固剤と増粘剤を受けるように企図される；それは高速で攪拌される；
−  第二（４）は任意に綿状沈殿形成剤を受け取り、任意にｐＨ調節剤を受け取る；それは低速で攪拌される；
−  第三は、酸化可能な基質並びに酸素ドナーを供給され、所望の酵素反応の部位であり、これもゆっくりと攪拌される；
−  第四の区画では、水性反応バスが、固体及び分割された相において酵素的触媒試薬で富化されている分画と、前記触媒試薬を含まず、処理剤が層状堆積器で得られる区画に分離され、前記層状堆積器は、低い供給点（６）、排出口に連結され、水流の真下に配置されたオーバーフロー（７）、及び堆積化固体物質（９）を動的に抽出するための低い点を含み、前記固体物質を放出し（１０）、またはそれをリサイクルのために回収する（１１）。
【００７６】
実施変形例では、本発明に係る方法、つまり少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体、例えば液体、状態での処理剤の酵素的生産方法は、少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を含む、少なくとも一つの酵素的触媒試薬、酸素ドナー、及び前記酵素的触媒試薬により酸化可能である酸化可能な基質を接触させ、それによって、リアクター（図２）において遊離状態で前記酸素化可能な化学種を生成し、前記リアクターは、部分的または完全に閉じることができ、金属または合成物質から形成され、一つの区画から別の区画へ通過ｋなおうなおーバーフローのローディング装置（１）を備え、３の区画を含む区画化タンクからなり、３の区画の最初の二つは連続的に攪拌されている：
−  第一は、酵素的触媒試薬と乳化剤が導入され、迅速に攪拌され；
−  第二は、酸化可能な基質が供給され、所望の酵素反応の部位であり、低速で攪拌され；
−  第三の区画は回収バット（５）であり、遊離状態の少なくとも一つの酸素化化学種と残余の物質を含む溶液のエマルションを、合着器、浮遊器、遠心分離器（６）、フィルター、またはサイクロンであって良い分離ユニットに向けて連続的に汲み出すことが可能である。
【００７７】
本発明に係る方法を、０．２から０．５ｍＭのＨ２Ｏ２及び０．４から１ｍＭのＫＳＣＮの存在下で、綿状沈殿物の形態で、ラクトペルオキシダーゼを使用することによって、溶液中の酸素化化学種の溶液の生産に適用することは、０．０５から０．３５ｍＭの酸素化化学種を含む水溶液を生ずる。
【００７８】
連続的スプレー及び１０℃でのバスによって、レタスを洗浄して脱汚染化するために使用される場合、この溶液は、１０分のオーダーの接触時間で、秘書離婚トロールレタスと比較して、Pseudomonas細菌（１０５ｃｆｕ／ｍｌ）を有意に減少し（平均して２から５ｌｏｇ）、Listeria細菌（１０５ｃｆｕ／ｍｌ）を１から２ｌｏｇまで有意に減少するように、細菌汚染の割合を減少できる。
【実施例】
【００７９】
図２に記載されたもののようなリアクターに、１０ｇ／ｌのクレー及び０．５５ｍｌの凝固剤と同時に、０．２５ｇ／ｌのラクトペルオキシダーゼを導入し、以下の表１に示されるように各種の量のＫＳＣＮ及びＨ２Ｏ２を導入し、その後攪拌して反応区画に通過させる。
【００８０】
【表１】
2004528040.tif 000002
【００８１】
反応に引き続き、サンプルを取りだして、酵素活性と生成した遊離化学種の濃度を測定する。
【００８２】
ヒポチオシアナートイオン（ＯＳＣＮ−）は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）分子のスルフィドリル基と反応することができ、前記分子は過剰量のホウ化水素ナトリウムの存在下で事前に減少されている。
【００８３】
この減少した分子は、４１２ｎｍの波長で光を吸収する。
【００８４】
ヒポチオシアナートイオン（ＯＳＣＮ−）がスルフィドリル基を酸化する場合、４１２ｎｍでの吸光度は、サンプル中に存在するイオンの量に比例して減少し、それによってそれらを定量できる。
【００８５】
チオシアナートイオン（ＳＣＮ−）は、酸性媒体中のＦｅＣｌ３と反応でき、存在するチオシアナートの量に比例し、４５０ｎｍの波長で光化学的に測定できる量の着色化産物を形成する。
【００８６】
サンプル中に存在するチオシアナートの量を測定するために、較正範囲を生産することが必要である。
【００８７】
【表２】
2004528040.tif 000003
【００８８】
リアクター中の初期の酵素活性は、アッセイナンバー４でチェックされる。これは５０μｌの凝固剤を使用して実施され、以下の式に従う：
ΔＯＤ４０５ｎｍ／１０秒＝１．０２３
酵素活性Ｉは、発色基質、即ち２，２’−アジノ−ビスまたはＡＢＴＳを使用して４０５ｎｍで比色測定された。
ラクトペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下でＡＢＴＳの酸化を触媒する。酸化ＡＢＴＳ分子は、４０５ｎｍで吸収する特性を有し、それによって４０５ｎｍで連続的に測定される吸光度によって、時間の単位当たりの生産される酸化ＡＢＴＳの量（Beer-Lambertの法則に従ってＯＤ４０５ｎｍに比例する）に追従することによって、酵素溶液の活性を測定することが可能である。
【００８９】
溶液の安定性のモニター
前述の方法は、リアクターに残存する溶液中のヒポチオシアナートイオン、即ちＯＳＣＮ−の濃度の変化をモニターするために使用され、得られたその結果が図３及び４に示されており、それは１日（図４）及び４日（図３）の期間に亘るリアクターに残存する水中の、ヒポチオシアナートイオン、ＯＳＣＮ−の濃度変化についての曲線を表す。
【００９０】
得られた結果は、ＯＳＣＮ−の濃度は、１０時間後に６００ｍＭから５００ｍＭに変化し、その濃度は２０時間後に５０％までしか下降しないことを示す（図４参照）。
【００９１】
４日間の期間では、得られた曲線は、８０時間後に、初期濃度の１６％に等しいヒポチオシアナートイオン、ＯＳＣＮ−の残余濃度を示す（図３参照）。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の方法を実施するための一つの実施態様のリアクターの模式図である。
【図２】本発明の方法を実施するための一つの実施態様のリアクターの模式図である。
【図３】４日の期間に亘るリアクターに残存する水中の、ヒポチオシアナートイオン、ＯＳＣＮ−の濃度変化についての曲線。
【図４】１日の期間に亘るリアクターに残存する水中の、ヒポチオシアナートイオン、ＯＳＣＮ−の濃度変化についての曲線。
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年9月1日(2003.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）酸化可能な基質及び酸素ドナーに加えて、固体で分割された相中に酵素的触媒試薬を含む水性反応バスを形成し、遊離状態で、前記試薬は、前記バス中に分配され、後者は運転状態にセットされて良いこと；
ｂ）水性反応バスを、固体で分割された相中の酵素的触媒試薬で富化された分画と、前記触媒試薬が存在せず、処理剤が得られる分画に分離すること；
を特徴とする、
−  少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を含む、少なくとも一つの酵素的触媒試薬；
−  水性相中で酸化可能であり、酸素ドナーの作用によって、前記酵素的触媒試薬による触媒作用により酸化されることが可能であり、それによって遊離状態で酸素化化学種を生産可能である少なくとも一つの基質；
−  前記酸素ドナー；
を接触させることによる、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体、例えば液体、状態で処理剤を酵素的に生産する方法。
【請求項２】
前記酵素的触媒試薬が、固体で分割された相中で、反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素的触媒試薬が、液体状態で、反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化可能な基質が、適切な場合水性相中で、水性反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酸素ドナーが、適切な場合水性相中で、反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素的触媒試薬が、反応バスから放出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
連続的または不連続的に実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素的触媒試薬が、固相で、反応バス中で、エマルションの形態に懸濁され、適切な場合、乳化剤が前記バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
酵素的触媒試薬に対して不活性である固体粒子の凝集物が水性反応バス中に形成され、前記凝集物が、触媒試薬を遊離状態で含みまたは取り込み、前記凝集物は、水性反応バス内に配置され、それによって、前記バスは、工程（ｂ）の間で、凝集物が富化した分画と、凝集物が存在せず、処理剤が得られる分画に分離されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
凝集物が綿状沈殿物であり、綿状沈殿形成剤、例えばアニオン性またはカチオン性綿状沈殿形成剤が、反応バスに導入されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
凝集物が凝固物であり、凝固剤が反応バスに導入されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
凝固剤と綿状沈殿形成剤が反応バスに導入されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
増粘剤が反応バスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
増粘剤が、クレー、カオリン、シリカ、またはシリカートから選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記触媒試薬が、少なくとも一つのペルオキシダーゼタイプの酵素を発現している微生物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ｐＨ調節剤がバスに導入されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
過酸化水素を生産する予備的酵素システムの形態で酸素ドナーがバスに導入され、前記酵素的触媒試薬が、ペルオキシダーゼタイプの酵素に加えて、オキシドレダクターゼタイプの酵素を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素的触媒試薬がペルオキシダーゼから選択されることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記酸化可能な基質が、ナトリウムチオシアナート（ＮＡＳＣＮ）またはカリウムチオシアナート（ＫＳＣＮ）、ナトリウムビスルフィト（ＮａＨＳＯ３）、ナトリウムヒドロスルフィト（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）、ナトリウムメタビスルフィト（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、ナトリウムニトリト（ＮａＮＯ２）またはカリウムニトリト（ＫＮＯ２）、ナトリウムヒポクロリド（ＮａＯＣｌ）、及びカリウムヨージド（ＫＩ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸素ドナーが過酸化水素であることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
水性相中に酵素的触媒試薬及び凝集剤を含むことを特徴とする、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体状態での処理剤の酵素的生産のための試薬の群。
【請求項２３】
水性相中に酵素的触媒試薬及び綿状沈殿形成剤を含むことを特徴とする、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体状態での処理剤の酵素的生産のための試薬の群。
【請求項２４】
水性相中に酵素的触媒試薬及び凝固剤を含むことを特徴とする、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体状態での処理剤の酵素的生産のための試薬の群。
【請求項２５】
酵素的触媒試薬及び増粘剤を含むことを特徴とする、少なくとも一つの酸素化化学種を遊離状態で含む、流体状態での処理剤の酵素的生産のための試薬の群。
【請求項２６】
前記酵素的触媒試薬がペルオキシダーゼから選択されることを特徴とする、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の試薬の群。
【請求項２７】
前記ペルオキシダーゼがラクトペルオキシダーゼであることを特徴とする、請求項２６に記載の試薬の群。
【請求項２８】
１０時間より長く安定状態にある、酸素化化学種として、少なくともヒポチオシアナートイオン（ＯＳＣＮ−）を遊離状態で含む、流体、例えば液体、状態の処理剤。
【請求項２９】
３または４の区画を含み、その２または３が連続的に攪拌されており、：
−  第一は、酵素的触媒試薬、及び任意に凝固剤と増粘剤を受けるように企図され；それは高速で攪拌され；
−  第二は任意に綿状沈殿形成剤を受け取り、任意にｐＨ調節剤を受け取り；それは低速で攪拌され；
−  第三は、酸化可能な基質並びに酸素ドナーを供給され、所望の酵素反応の部位であり、これもゆっくりと攪拌され；
−  第四の区画では、水性反応バスが、固体及び分割された相において酵素的触媒試薬で富化されている分画と、前記触媒試薬を含まず、処理剤が得られる区画に分離され、前記分画を分離するための手段を含む；
ことを特徴とするリアクターの、請求項２８に記載の処理剤の生産のための使用。
【請求項３０】
前記分画を分離するための手段が、デカンテーション、浮選、遠心分離、濾過、及び／またはサイクロン分離から選択されることを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【国際調査報告】
2004528040.tif 000027
2004528040.tif 000028
2004528040.tif 000029
2004528040.tif 000030
2004528040.tif 000031
2004528040.tif 000032