(57)【要約】肺における粘液の過剰分泌が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）アンタゴニストの投与により阻害される。ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、ＥＧＦ受容体と結合し阻止する有機低分子、抗体、又は抗体の一部の形態でありうる。ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、好ましくは、肺気道における杯細胞の形成を阻害するために十分な量で、注射により投与される。それにより、気道粘液産生をもたらす杯細胞の脱顆粒が阻害される。杯細胞増殖を阻害する候補薬剤をスクリーニングするためのアッセイ法も、提供される。
2004503599.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療に有効な量の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）アンタゴニストを、気道杯細胞過形成による気道粘液過剰分泌に罹患した患者へ投与することを含む、個体の気道における杯細胞過形成を低下させる方法。
【請求項２】
ＥＧＦ−ＲアンタゴニストがＥＧＦ−Ｒに選択的なキナーゼ阻害剤である、請求項１の方法。
【請求項３】
アンタゴニストがＢＩＢＸ１５２２である、請求項２の方法。
【請求項４】
アンタゴニストが抗体である、請求項１の方法。
【請求項５】
抗体が上皮増殖因子（ＥＧＦ）と特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項４の方法。
【請求項６】
抗体が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）と特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項４の方法。
【請求項７】
アンタゴニストが膜貫通型ＥＧＦ−Ｒリガンドの放出を阻害するものである、請求項１の方法。
【請求項８】
アンタゴニストが膜貫通型ＥＧＦ−Ｒリガンドの放出を媒介するメタロプロテイナーゼの選択的阻害剤である、請求項７の方法。
【請求項９】
アンタゴニストが杯細胞産生を誘導するＧタンパク質共役型受容体アンタゴニストである、請求項８の方法。
【請求項１０】
アンタゴニストがＥＧＦ−Ｒのトランスリン酸化を阻害するものである、請求項１の方法。
【請求項１１】
アンタゴニストが抗酸化剤である、請求項８の方法。
【請求項１２】
アンタゴニストが注射により投与される、請求項１の方法。
【請求項１３】
アンタゴニストが、通常の生理食塩溶液の形態で担体と共に静脈内に投与される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
アンタゴニストが吸入により投与される、請求項１の方法。
【請求項１５】
アンタゴニストがリポソーム送達により投与される、請求項１の方法。
【請求項１６】
リポソームが立体的に安定化され静脈内に投与される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
気道における杯細胞過形成を低下させるのに十分な用量の、治療に有効な量の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）アンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む、気道における杯細胞過形成を低下させるための薬学的製剤。
【請求項１８】
ＥＧＦ−ＲアンタゴニストがＥＧＦ−Ｒに選択的なキナーゼ阻害剤である、請求項１７の製剤。
【請求項１９】
ＥＧＦ−ＲアンタゴニストがＥＧＦ−Ｒのトランスリン酸化を阻害するものである、請求項１８の製剤。
【請求項２０】
アンタゴニストが抗酸化剤である、請求項１９の製剤。
【請求項２１】
アンタゴニストが抗体である、請求項１７の製剤。
【請求項２２】
抗体が上皮増殖因子（ＥＧＦ）と特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項２１の製剤。
【請求項２３】
抗体が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）と特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項２１の製剤。
【請求項２４】
アンタゴニストが膜貫通型ＥＧＦ−Ｒリガンドの放出を阻害するものである、請求項１７の製剤。
【請求項２５】
アンタゴニストが膜貫通型ＥＧＦ−Ｒリガンドの放出を媒介するメタロプロテイナーゼの選択的阻害剤である、請求項２４の製剤。
【請求項２６】
治療に有効な量の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）アンタゴニストを、鼻ポリープに罹患した患者へ投与することを含む、鼻ポリープを治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府の権利
米国政府は、国立衛生研究所プログラムにより授与された助成金ＨＬ−２４１３６のため、本願における一定の権利を有しうる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的には肺治療の領域に関する。より具体的には、本発明は、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストの投与による、肺及び気道における粘液の過剰分泌の阻害に関する。さらに、本発明は、肺における粘液の過剰分泌を阻害することができる候補薬剤の開発又は査定のための方法にも関する。
【０００３】
発明の背景
呼吸系の誘導気道においては、粘液線毛系が、吸入された粒子又は感染体を肺の気道の外へ移動させるための第一の防御メカニズムとして機能している。さらに、気道の体液中に存在する物質が、粒子の毒性を制限し、感染体を不活化するように機能する。咳の物理的メカニズムは、気道から粘液を排斥するように機能する（例えば、「呼吸系医療の基礎（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃａｒｅ）」，Ｐｉｅｒｓｏｎ及びＫａｃｍａｒｅｋ編（１９９２）Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，「内科のハリソンの原理（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，Ｆａｕｃｉら編（１９９７）第１４版，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
【０００４】
粘液線毛系は、線毛上皮細胞、上皮杯細胞、並びに粘膜下腺中に位置している漿液細胞及び粘液細胞からなる。線毛は、上皮を介した塩化物の能動輸送及び水の受動的な移動により気道の内腔へ分泌された水性層（線毛周囲液）により囲まれている。線毛は、この水性層の上に浮遊している粘液と接触し、一方向の推進運動により粘液を声門へと移動させる（Ｐｉｅｒｓｏｎ及びＫａｃｍａｒｅｋ（前記）及びＦａｕｃｉら（前記）を参照のこと）。粘液は、上皮杯細胞及び粘膜下腺細胞により産生され、脱顆粒後に気道の内腔へと分泌される。
【０００５】
粘液は、一般的に、吸入された粒子又は感染体のクリアランスを促すが、気道における粘液の過剰分泌は、進行性の気道閉塞を引き起こす場合がある。末梢気道においては、咳は分泌物の清掃に有効でない。さらに、多くの杯細胞を含有している小気道は、その小さい寸法のため、粘液による気道栓塞を特に起こしやすい。気道過剰分泌は、相当数の個体に影響を与えており、慢性気管支炎、急性喘息、嚢胞性繊維症、及び気管支拡張のような多様な肺疾患において見られる。
【０００６】
粘液の過剰分泌は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する患者における主要な症状であり、その状態（即ち、慢性的な咳及び痰の産生）を決定する。この状態は、単独で、１千４百万人の米国人に影響を与えており、進行性の疾病及び死亡を引き起こす場合がある。喘息は、米国人口の少なくとも４％に影響を与え、年間少なくとも２０００例の死亡の原因となっていると推定されている（Ｐｉｅｒｓｏｎ及びＫｕｃｍａｒｅｋ（前記））。急性喘息の発作中には、気管支壁が膨張し、粘液の量が増加し、気管支平滑筋が収縮し、それにより気道の狭窄が引き起こされる。急性喘息における過剰分泌の結果として、拡張的な粘液栓塞が、罹患率及び死亡率の主要な原因となりうる。
【０００７】
過剰分泌は、世界で最も一般的な致命的な遺伝病の一つである嚢胞性繊維症にも関与していることが示されている。嚢胞性繊維症は、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによる膜塩化物イオンチャネルの活性化に対して気道粘液細胞が非応答性になる常染色体劣性疾患である（Ｐｉｅｒｓｏｎ及びＫａｃｍａｒｅｋ（前記）、及びＦａｕｃｉら（前記））。嚢胞性繊維症に罹患した個体の肺においては、その後の電解質の不均衡により、気道粘液の水和レベルが減少し、それにより粘液が高度に粘稠となる。過剰分泌は、嚢胞性繊維症を有する個体の気道を閉塞し、さらに肺機能を損なわせる。
【０００８】
過剰分泌を含むその他の疾患には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が含まれる。ＣＯＰＤの病原においては、酸化ストレスが重要な役割を果たしている。酸素フリーラジカルを生成させるタバコ煙が、病原に強く関与していることが示されている。ＣＯＰＤにおいては炎症部位に好中球が観察されることが多く、興味深いことに、酸素フリーラジカルは、活性化の間に好中球により放出されることが知られている。
【０００９】
様々な肺疾患を有する患者に補助換気を提供するため、機械的な挿管が必要となることが多い。チューブを、口腔咽頭部から導入し、気管内に設置する。気管内チューブの周囲の空気の漏出を防止するため、気管下方においてチューブの周囲にバルーンを膨張させるが、それは、上皮を剥離させ杯細胞化生を引き起こす場合がある。上皮の創傷は、大量の粘液分泌を引き起こしうる修復過程へと至る。患者におけるそのような長期的な気管内挿管は、過剰分泌による有害な効果に至る場合もある。
【００１０】
過剰分泌性肺疾患を有する患者の肺においては、高レベルの粘液の結果として、粘液のクリアランスが減少する。細菌、例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のような病原体が、しばしば粘液内にコロニーを確立し、高頻度で肺感染を引き起こす。
【００１１】
気道過剰分泌に罹患した個体を治療するための古典的な療法には、抗生物質療法、気管支拡張剤（例えば、メチルキサンチン類、強力なβ２アドレナリン刺激特性を有する交感神経作用薬、抗コリン作用薬）、主に喘息における全身投与又は吸入によるコルチコステロイドの使用、去痰薬、例えばグアイフェネシンの経口投与による粘液の液化、及び「粘液溶解」剤、例えば水、高張生理食塩水のエアロゾル送達が含まれる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ（前記）を参照）。嚢胞性繊維症のためのより最近の療法は、ＤＮＡを多く含む粘液又は痰を標的とするＤＮＡｓｅの投与である（Ｓｈａｋら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．（ＵＳＡ）８７：９１８８−９１９２；Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｒ．Ｃ．ら（１９９１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：８１２）。さらに、打診法、振とう法、及びドレナージからなる胸部物理療法も、粘稠な粘液のクリアランスを促すために使用されている。肺移植は重篤な肺障害を有する者のための最終的な選択となりうる。従って、粘液分泌を標的とする、より効率的な、又は代替的な療法が必要である。特に、気道における粘液分泌物の形成を減少させるであろう特別な療法が必要とされている。
【００１２】
関連文献
癌細胞の増殖を阻止するためのＥＧＦ阻害剤の使用は、レビツキ（Ｌｅｖｉｔｓｋｉ）（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６（１）：１−１３；ポウィス（Ｐｏｗｉｓ）（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６２：５７−９５；コンダパカ（Ｋｏｎｄａｐａｋａ）とレディー（Ｒｅｄｄｙ）（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１１７：５３−５８に概説されている。
【００１３】
発明の概要
気道における粘液の過剰分泌は、多数の異なる肺疾患の有害な症状である。分泌は、杯細胞の脱顆粒により引き起こされ、杯細胞の増殖は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）の刺激により促進される。本発明は、治療的な量のＥＧＦアンタゴニスト、好ましくはキナーゼ阻害剤を投与することにより、肺過剰分泌を治療する。アンタゴニストは、ＥＧＦ又はその受容体のいずれかと結合する、低分子、抗体、又は抗体の一部の形態でありうる。本発明のもう一つの面において、粘液の過剰分泌を阻害する候補薬剤の治療的可能性を予測するインビトロ及びインビボの方法が提供される。
【００１４】
本発明の第一の目的は、肺における粘液の過剰分泌を含む疾患を治療する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、粘液の過剰分泌を引き起こす疾患の治療において有用な製剤を提供することである。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの目的は、（ｉ）杯細胞増殖のインビトロ・モデルを、ＥＧＦ又はその機能的等価物と接触させる工程、（ｉｉ）続いて、インビトロ・モデルを候補薬剤と接触させる工程、及び（ｉｉｉ）杯細胞増殖を査定し、その際、杯細胞増殖の阻害をその候補薬剤の治療的可能性の指標とする工程を含む、粘液の過剰分泌を阻害する候補薬剤のスクリーニングのためのインビトロ・アッセイ法を提供することである。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、（ｉ）例えば腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）で、ＥＧＦ−Ｒを誘導することにより、過剰分泌性肺疾患の動物モデルを作出すること、（ｉｉ）ムチン産生杯細胞が産生されるよう、リガンド、例えばトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）又はＥＧＦで、誘導されたＥＧＦ−Ｒを刺激すること、（ｉｉｉ）候補薬剤で処理すること、及び（ｉｖ）杯細胞増殖又は粘液分泌を査定し、その際、杯細胞増殖又は粘液分泌の阻害を候補薬剤の治療的可能性の指標とすることを含む、粘液の過剰分泌を阻害する候補薬剤のスクリーニングのためのインビボ・アッセイ法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、粘液の過剰分泌を阻害するＥＧＦ−Ｒアンタゴニストのスクリーニングのためのインビトロ・アッセイ法及びインビボ・アッセイ法を提供することである。
【００１９】
本発明の利点は、肺気道における過剰な粘液形成を防止するための手段を提供する点である。
【００２０】
本発明の特徴は、ある範囲の異なる型のアンタゴニストが、ＥＧＦ及び／又はＴＧＦ−αの効果、並びにそれらのＥＧＦ−Ｒとの相互作用を阻止するために使用されうるという点である。
【００２１】
本発明の一つの面は、哺乳動物患者、好ましくはヒト患者の気道における粘液分泌物の形成を減少させるためのＥＧＦアンタゴニストの製剤である。
【００２２】
本発明のもう一つの目的は、哺乳動物患者、好ましくはヒト患者の気道における粘液分泌を減少させるためのＥＧＦアンタゴニストの肺内送達の方法である。
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、気道における過剰な粘液分泌物形成を症状として有する、ある範囲の異なる疾患を治療するための方法を提供することである。これらの疾患には、これらに限定はされないが、慢性気管支炎、急性喘息、嚢胞性繊維症、気管支拡張、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性刺激又は機械的剥離のような上皮の傷害に起因する過剰分泌、及び鼻の過剰分泌が含まれる。
【００２４】
本発明のこれら及びその他の目的、利点、及び特徴は、より完全に以下に記載される治療法、並びにインビトロ及びインビボのアッセイ法の詳細を参照することにより、当業者に明らかとなろう。
【００２５】
好ましい態様の詳細な説明
治療的な量のＥＧＦアンタゴニスト、好ましくはキナーゼ阻害剤を投与することによる、気道粘液過剰分泌の治療のための組成物及び方法が提供される。アンタゴニストは、ＥＧＦ又はその受容体のいずれかと結合する、低分子、抗体、又は抗体の一部の形態でありうる。気道過剰分泌性疾患、例えば慢性気管支炎、気管支拡張、嚢胞性繊維症、急性喘息、ＣＯＰＤ等においては、気道におけるムチン合成が増加し、粘液過剰分泌が起こる。分泌された粘液は、気道の閉塞を引き起こし、この効果は、これらの疾患における死亡を引き起こす。
【００２６】
気道傷害及び炎症のいくつかの原因が、気道上皮細胞における上皮増殖因子受容体の発現を誘導することが、本明細書において示される。ＥＧＦ−Ｒ誘導の後、その後のリガンド依存性及び非リガンド依存性の両方のメカニズムによるＥＧＦ−Ｒの刺激により、遺伝子発現レベル及びタンパク質レベルの両方においてムチン産生が引き起こされる。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの選択的阻害剤が、このムチンの遺伝子及びタンパク質の発現を阻止することが証明される。
【００２７】
本発明を制限するものではないが、杯細胞産生の展開の順序はＥＧＦ−Ｒの発現に基づくことが示唆される。ＴＮＦαによる刺激により、非顆粒形成分泌細胞の強いＥＧＦ−Ｒ染色が誘導され、それに続くＥＧＦ−Ｒリガンドによる活性化により、進行的に細胞質内の粘液糖質複合体に関する染色が引き起こされ、そして細胞は「前杯」細胞となり、次いで「杯」細胞となる。データは、ＥＧＦ−Ｒ活性化が、選択的な細胞分化を促進し、増殖は促進しないことを示唆している。杯細胞は、ＥＧＦ−Ｒを発現している非顆粒形成分泌細胞に由来しており、ＥＧＦ−Ｒリガンドにより刺激されてムチンを産生すると考えられる。
【００２８】
ＥＧＦ−Ｒは、サイトカインによる刺激に加え、その他のシグナル伝達メディエータによっても刺激されうる。例えば、長期にわたる喫煙は、杯細胞の過形成を含む、末梢気道における進行性の病理学的変化と関連している。炎症誘発性サイトカインにより活性化された好中球及びタバコ煙は、非リガンド依存性のＥＧＦ−Ｒの活性化を介して、ヒト気管支上皮細胞におけるムチン合成を引き起こすことが示され、このことは、動員された好中球及びタバコ煙が、気道におけるムチン産生細胞の異常な誘導を引き起こす上皮細胞分化の制御因子であることを意味している。ＩＬ−８、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン、ＴＮＦ−α、タバコ煙、又はＨ２Ｏ２を含む多様な刺激により活性化された好中球は、上皮細胞におけるムチン発現を上方制御するが、その合成はＥＧＦ−Ｒ阻害剤により阻害される。好中球は、ＥＧＦ−Ｒリガンド、ＥＧＦ、及びＴＧＦαを産生することもできる。さらに、上皮細胞はＥＧＦ−Ｒリガンドの起源である。
【００２９】
気道上皮に対する機械的損傷も、過剰分泌を引き起こし、粘液栓塞の原因となりうる。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの阻害剤は、気管内挿管後の粘液過剰分泌を防止するよう機能する。
【００３０】
上皮の傷害は、軽度の喘息の場合ですら、喘息を有する患者の研究における一般的な所見であり、傷害は臨床的症状の悪化と増加的に関係している。アレルギー応答により生じた上皮傷害は、ＥＧＦ−Ｒ活性化を誘導し、それが異常な杯細胞産生を引き起こす。ＥＧＦ−Ｒは、上皮傷害、例えば喘息において起こる「気道リモデリング」、修復、及び創傷閉鎖に関与していることが示されている。機械的な上皮傷害及び喘息における上皮損傷は、上皮分泌細胞の異常増殖を引き起こす、類似したＥＧＦ−Ｒカスケードを含んでいる可能性がある。
【００３１】
過剰分泌は、鼻の炎症性疾患の重要な徴候でもある。好中球依存性メカニズムを利用して杯細胞脱顆粒を誘導することにより鼻杯細胞を「攻撃」した場合、ＥＧＦ−Ｒ及びムチンの発現が強く上方制御される。これらの現象は杯細胞の再顆粒形成と関連していた。好中球浸潤の刺激のような炎症により、杯細胞の脱顆粒及びムチン分泌が引き起こされると、ＥＧＦ−Ｒの上方制御及び活性化により、気道上皮にムチンが再供給される。
【００３２】
本発明の治療法及び製剤を記載する前に、本発明が、記載された特定の方法及び製剤に限定されず、当然、様々に変化しうることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書において使用された用語は、特定の態様を記載することのみを目的とするものであり、本発明を制限するものではないことも理解されたい。
【００３３】
特記しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法及び材料と類似した、又は等価な任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試行において使用されうるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。本明細書において言及された全ての出発物は、引用された出版物と共に、方法及び／又は材料を開示し記載するために、参照として本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本明細書に記された出版物は、本願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書の記載は、先行特許のため本発明がそのような出版物に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供された出版物の日付は、実際の公開日と異なっている可能性があり、公開日は独立に確認される必要がある可能性がある。
【００３５】
定義
「上皮増殖因子」又は「ＥＧＦ」とは、上皮細胞に対する分裂促進活性を特徴とする生物学的活性を有するタンパク質又はその一部を意味する（例えば、Ｃｏｈｅｎ（１９８６）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６（１２）：１０１７；Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ．，「増殖因子と癌（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１１４６−１１５３）。その例は、例えばアーディア（Ｕｒｄｅａ）ら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：７４６１−７４６５により記載されているようなヒト上皮増殖因子である。
【００３６】
本発明の目的のため特に重要であるのは、杯細胞に対するＥＧＦの分裂促進活性である。ＥＧＦにより誘発される生物学的応答に関してＥＧＦの機能的等価物であるタンパク質又はその一部も、この定義に包含されるものとする。
【００３７】
「上皮増殖因子受容体」又は「ＥＧＦ−Ｒ」とは、ＥＧＦタンパク質又はその一部と結合することができるタンパク質又はその一部を意味する。その例は、ヒト上皮増殖因子受容体である（Ｕｌｌｒｉｃｈら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：４１８−４２５参照；ゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００５２２８）。好ましくは、ＥＧＦリガンドの結合により、ＥＧＦ−Ｒが活性化される（例えば、細胞内分裂促進シグナル伝達の活性化、ＥＧＦ−Ｒの自己リン酸化が引き起こされる）。当業者であれば、ＥＧＦに加え、その他のリガンドが、ＥＧＦ−Ｒと結合し、ＥＧＦ−Ｒを活性化しうることを認識するであろう。そのようなリガンドの例には、これらに限定はされないが、ＴＧＦ−α、ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、及びニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）（ヘルグリン（ｈｅｒｇｕｌｉｎ）としても知られる）（ＳｔｒａｗｎとＳｈａｗｖｅｒ（１９９８）Ｅｘｐ．−Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）５５３−５７３及び「タンパク質キナーゼ因子ブック：タンパク質チロシンキナーゼ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ）」（１９９５）Ｈａｒｄｉｅｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ）が含まれる。
【００３８】
「ＥＧＦ−Ｒアンタゴニスト」とは、ＥＧＦ−Ｒの効果、特に杯細胞増殖又は杯細胞による粘液過剰分泌に対するＥＧＦ−Ｒの効果を、直接的又は間接的に阻害することができる任意の薬剤を意味する。ＥＧＦ−Ｒは、それぞれ自己リン酸化又はトランスリン酸化のいずれかを引き起こす、リガンド依存性メカニズム及び非リガンド依存性メカニズムによって活性化されうる。着目しているＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、これらのメカニズムのいずれか又は両方を阻害しうる。例えば、ＴＮＦ−αとＥＧＦ−Ｒとの結合により、リガンド依存性リン酸化が引き起こされるが、それは、ＥＧＦ−Ｒと結合し、それによりＥＧＦ受容体を活性するであろうＥＧＦとリガンドとの相互作用を防止する抗体により阻止されうる。そのような抗体の例は、ゴールドステイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）ら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１３１１−１３１８；ロリマー（Ｌｏｒｉｍｅｒ）ら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：８５９−８６４；シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）とウェルズ（Ｗｅｌｓ）（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４：８５３−８６２に記載されている。低分子チロシンキナーゼ阻害剤も、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストとして有効である。
【００３９】
又は、酸素フリーラジカルのような化合物が、ＥＧＦ−Ｒのトランスリン酸化を刺激し、非リガンド依存性の受容体の活性化を引き起こすことが示されている。トランスリン酸化によりＥＧＦ−Ｒを活性化するその他の手段には、紫外線及び浸透圧、エンドセリン−１、リゾホスファチジン酸、及びトロンビンによるＧタンパク質共役型受容体の刺激、ｍ１ムスカリン性アセチルコリン受容体、並びにヒト成長ホルモンが含まれる。この非リガンド依存性メカニズムのアンタゴニストには、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＤＭＳＯ、ＤＭＴＵ、アスコルビン酸等のような抗酸化剤が含まれる。酸化ストレスを介した非リガンド依存性のＥＧＦＲの活性化は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）ｐ４４／４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ４４／４２ｍａｐｋ）の活性化をもたらし、ムチン合成をもたらす。このＭＥＫ活性化は、選択的ＭＥＫ阻害剤ＰＤ９８０５９、及び抗酸化剤によって阻害される。従って、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」という用語には、ＭＥＫ阻害剤及び抗酸化剤も包含される。
【００４０】
さらに、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達経路は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の刺激によって活性化されうる。ＧＰＣＲとの相互作用によるヘテロ三量体Ｇタンパク質のリガンドによる活性化は、膜貫通型メタロプロテイナーゼの細胞外活性を誘導する細胞内シグナルをもたらす。これは、膜貫通型増殖因子前駆体の細胞外プロセシング、及び、直接的に、又はプロテオグリカン・マトリックスを介してＥＧＦＲの外部ドメインと相互作用し、細胞内シグナルを活性化する成熟因子の放出をもたらす。プレンゼル（Ｐｒｅｎｚｅｌ）ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４０２：８８４−８８８。従って、ＥＧＦＲは、膜貫通型メタロプロテイナーゼ（ＭＰ）の作用による膜結合型ＥＧＦＲリガンドの放出によって活性化されうる。従って、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」という用語には、これに限定はされないが、特異的メタロプロテイナーゼ阻害剤を含む、この過程の阻害剤がさらに包含される。
【００４１】
ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、ＥＧＦ産生又はＥＧＦ−Ｒ産生を刺激する因子と結合し、それによりＥＧＦによる杯細胞増殖の促進を阻害する抗体（即ち、ＥＧＦ−Ｒをリン酸化するリン酸化カスケードの阻害剤）であってもよい。例えば、ＴＧＦａ−シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素４０の融合タンパク質が、アーティーガ（Ａｒｔｅａｇａ）ら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：４７０３−４７０９により記載されている。
【００４２】
好ましい態様において、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、ＥＧＦ−Ｒのチロシンキナーゼ活性の阻害剤、特に他のチロシンキナーゼと比較してＥＧＦ−Ｒに選択的な作用を有する低分子阻害剤であり、好ましい低分子は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける天然のＥＧＦ受容体を阻止し、１ｋＤ未満の分子量を有する。
【００４３】
ＥＧＦ及びＥＧＦ−Ｒの阻害剤には、これらに限定はされないが、キナゾリン類、例えばＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリン、もしくはＣＰ−３５８，７７４、ピリドピリミジン類、ピリミドピリミジン類、ピロロピリミジン類、例えばＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１、及びＣＧＰ６２７０６、並びにピラゾロピリミジン類（ＳｈａｗｎとＳｈａｗｖｅｒ（前記））、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン類（Ｔｒａｘｌｅｒら，（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３９：２２８５−２２９２）、クルクミン（ジフェルロイルメタン（ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌ ｍｅｔｈａｎｅ））（Ｌａｘｍｉｎ ａｒａｙａｎａら，（１９９５），Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ １６：１７４１−１７４５）、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタリミド（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：８１３−８２１、Ｄｉｎｎｅｙら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：１６１−１６８）、ニトロチオフェン部分を含有しているチルホスチン類（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎｓ）（Ｂｒｕｎｔｏｎら（１９９６）Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １１：２６５−２９５）、プロテインキナーゼ阻害剤ＺＤ−１８３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＣＰ−３５８７７４（Ｐｆｉｚｅｒ，ｉｎｃ．）、ＰＤ−０１８３８０５（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、もしくは国際公開公報９９／０９０１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）、国際公開公報９８／４３９６０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）、国際公開公報９７／３８９８３（Ｗａｒｅｎｅｒ Ｌａｂｅｒｔ）、国際公開公報９９／０６３７８（Ｗａｒｅｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）、国際公開公報９９／０６３９６（Ｗａｒｅｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）、国際公開公報９６／３０３４７（Ｐｆｉｚｅｒ，ｉｎｃ．）、国際公開公報９６／３３９７８（Ｚｅｎｅｃａ）、国際公開公報９６／３３９７７（Ｚｅｎｅｃａ）、及び国際公開公報９６／３３９８０（Ｚｅｎｅｃａ）（これらは全て参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているようなもの、又はアンチセンス分子が含まれる。
【００４４】
治療法に関して本明細書において使用されるような、ＥＧＦＲアンタゴニストの「治療に有効な量」とは、ＥＧＦＲ活性化と関連したパラメータの阻害において有効なアンタゴニストの量である。
【００４５】
「ＥＧＦＲ活性化と関連したパラメータの阻害」とは、粘液細胞過形成；杯細胞の増殖；上皮気道細胞の杯細胞への分化；杯細胞の脱顆粒；又は杯細胞による粘液の過剰分泌の低下、減少、中和、軽減、又は防止を意味する。
【００４６】
「治療」、「治療すること」等の用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを一般的に意味するために本明細書において使用される。その効果は、疾患もしくはその症状の完全もしくは部分的な防止に関する予防的なものであってもよいし、かつ／又は疾患及び／もしくは疾患に起因する有害な効果の部分的もしくは完全な治癒に関する治療的なものであってもよい。「治療」とは、本明細書において使用されるように、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、
（ａ）疾患又は症状の素因を有するが、未だその疾患を有するとは診断されていない対象において、疾患又は症状の発生を防止すること、
（ｂ）疾患又は症状を阻害すること、即ちその進展を抑止すること、又は
（ｃ）疾患又は症状を緩解させること、即ち疾患又は症状の後退を引き起こすこと
を含む。本発明は、肺又は気道の疾患を有する患者の治療に関し、特に、患者の粘液の過剰分泌の治療、即ち粘液の過剰分泌の防止、阻害、又は緩解に関する。症状の治療に関して、本発明は、気道における粘液又は痰の減少、病理学的生物による感染の阻害、咳の緩和、及び気道栓塞による低酸素症の防止に関する。
【００４７】
より具体的には、「治療」とは、粘液の過剰分泌を含む肺疾患に罹患した患者に対する、治療的に検出可能な有益な効果を提供することを意味するものとする。
【００４８】
さらに具体的には、「治療」とは、抗体、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤、及びアンチセンス分子；抗酸化剤；これに限定はされないが、ＭＥＫの阻害剤を含む、ＥＧＦＲカスケード中の任意の因子の阻害剤；メタロプロテイナーゼ阻害剤；Ｇタンパク質共役型受容体阻害剤等のようなＥＧＦアンタゴニスト及び／又はＥＧＦ−Ｒアンタゴニストからなる群より選択される化合物による粘液の過剰分泌の防止、緩和、及び／又は阻害を意味するものとする。別の治療は、気道におけるＥＧＦ−Ｒ発現を防止し、それにより初期の段階で経路を阻止することを含みうる。例えば、ＴＮＦαとその受容体との結合を阻止する試薬は、ＥＧＦ−Ｒの上方制御を防止しうる。
【００４９】
治療には、粘液の過剰分泌により引き起こされ、かつ／又は粘液の過剰分泌に関係している病原体による感染の防止又は阻害が含まれる。
【００５０】
「抗体」とは、抗原と結合することができる免疫グロブリン・タンパク質を意味する。抗体とは、本明細書において使用されるように、着目している抗原又は抗原性断片と結合することができる抗体断片、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂを含むことを意味する。好ましくは、抗体と抗原との結合は、ＥＧＦ又はＥＧＦ−Ｒの活性を阻害する。
【００５１】
「ヒト化抗体」という用語は、ＣＤＲが非ヒト起源に由来しており、Ｉｇ分子又はその断片の残りの部分がヒト抗体に由来しており、好ましくはヒト抗体をコードする核酸配列から作製されている、完全な抗体分子、即ち２つの完全な軽鎖及び２つの完全な重鎖からなる抗体、並びに抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖのみからなる抗体を記載するために、本明細書において使用される。
【００５２】
「ヒト抗体」及び「ヒト化抗体」という用語は、抗体分子の全部分がヒト抗体をコードする核酸配列に由来している抗体を記載するために、本明細書において使用される。そのようなヒト抗体は、ヒト患者において免疫応答をほとんど又は全く誘発しないため、抗体療法における使用にとって最も望ましい。
【００５３】
「キメラ抗体」という用語は、「ヒト化抗体」という用語の定義において既に記載されたような抗体分子及び抗体断片を記載するために、本明細書において使用される。「キメラ抗体」という用語は、ヒト化抗体を包含する。キメラ抗体は、第一の哺乳動物種に由来する重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列の一つの部分と、第二の異なる哺乳動物種に由来する重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列のもう一つの部分とを少なくとも有する。好ましくは、可変領域が非ヒト哺乳動物種に由来し、定常領域がヒト種に由来する。特に、キメラ抗体は、好ましくは、可変領域をコードする非ヒト哺乳動物由来のヌクレオチド配列と、抗体の定常領域をコードするヒト由来のヌクレオチド配列とから作製される。
【００５４】
「特異的に結合する」とは、抗体と特異的ポリペプチドとの高アビディティかつ／又は高親和性の結合を意味する。抗体と特異的ポリペプチド上のエピトープとの結合は、同抗体と、他の任意のエピトープ、特に着目している特異的ポリペプチドと関連した分子又は同一試料の中に存在しうるエピトープとの結合よりも強い。着目しているポリペプチドと特異的に結合する抗体は、他のポリペプチドと、弱いが検出可能なレベル、例えば着目しているポリペプチドに対して示された結合の１０％以下のレベルで結合することができてもよい。そのような弱い結合、又はバックグラウンド結合は、例えば適切な対照を使用することにより、着目している化合物又はポリペプチドとの特異的抗体の結合と容易に区別することが可能である。
【００５５】
「検出可能に標識された抗体」、「検出可能に標識された抗ＥＧＦ」、又は「検出可能に標識された抗ＥＧＦ断片」とは、検出可能標識が付着している抗体（又は結合特異性を保持している抗体断片）を意味する。検出可能標識は、通常、化学的結合により付着しているが、又は、標識がポリペプチドである場合には、遺伝子組み換え技術により付着していてもよい。検出可能に標識されたタンパク質の作製のための方法は、当技術分野において周知である。検出可能標識は、当技術分野において既知の多様なそのような標識から選択されうるが、通常は、放射性同位体、フルオロフォア、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、又は検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）を放出するか、もしくは標識のその基質への曝露後に検出可能なシグナルを放出するその他の部分もしくは化合物である。様々な検出可能標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、及び抗原を検出するため標識された抗体を使用するための方法が、当技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編（「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと）。
【００５６】
治療法
本発明は、治療的な量のＥＧＦ−Ｒアンタゴニストを投与することにより、肺過剰分泌を治療する方法を提供する。一般に、その方法は、治療に有効な量のＥＧＦＲアンタゴニストを、気道粘液過剰分泌に罹患した個体へ投与することを含む。いくつかの態様において、本発明は、粘液産生杯細胞による個体の気道における粘液過剰分泌を治療する方法を提供する。他の態様において、本発明は、個体の気道における杯細胞過形成を低下させるための方法を提供する。粘液の過剰分泌又は病理学的レベルの粘液の蓄積を特徴とする任意の疾患、特に任意の肺疾患が、本明細書に記載の方法により治療されうる。この方法により治療されうる肺過剰分泌性疾患の例には、これらに限定はされないが、慢性気管支炎のような慢性閉塞性肺疾患、喘息のような炎症性疾患、気管支拡張、肺繊維症、ＣＯＰＤ、鼻過剰分泌の疾患、例えば鼻アレルギー、鼻ポリープ、及びその他の過剰分泌性疾患が含まれる。嚢胞性繊維症のような遺伝病、カルタゲナー症候群、α１−アンチトリプシン欠損、家族性非嚢胞性繊維症、気道の粘液濃縮化も、同様に含まれるものとする。
【００５７】
ＥＧＦ又はＥＧＦ−Ｒを直接的に標的とするアンタゴニストが好ましい。しかし、当業者であれば、例えばＴＧＦ−αアンタゴニスト；マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）ｐ４４／４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ４４／４２ｍａｐｋ）；抗酸化剤；メタロプロテイナーゼ阻害剤；ＭＡＰキナーゼの阻害剤；膜結合型ＥＧＦＲリガンドの放出を媒介するメタロプロテイナーゼの阻害剤；Ｇタンパク質共役型受容体の阻害剤等のように、ＥＧＦ−Ｒによる杯細胞増殖の促進を引き起こす生物学的カスケードに関与する任意の因子又は細胞が、阻害の標的となりうることを認識するであろう。理論に拘束されないが、カスケードは、炎症反応中、肥満細胞又は好中球のような細胞がＴＮＦ−αを放出し、次いでＴＮＦ−αがＥＧＦ−Ｒ発現を促進したときに開始する。次に、例えばそのリガンドＥＧＦによるＥＧＦ−Ｒの刺激により、杯細胞増殖が誘発される。このように、ＴＮＦ−α経路のようなカスケードに関与している任意の細胞又は因子が、アンタゴニスト活性の標的となりうる。
【００５８】
治療法において投与されるＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、任意の形態でありうる。例えば、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、ＥＧＦ、ＴＧＦα、又はＥＧＦ−Ｒと結合する、低分子（即ち、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、チロシンキナーゼ阻害剤等）、抗体、又は抗体の一部の形態でありうる。好ましいＥＧＦＲアンタゴニストは、選択的、即ち同一型の他の因子よりも大きい程度に標的因子を阻害するものである。選択性は、例えば阻害剤が炎症が生じている気道へ優先的に送達されるような、製剤化及び薬物送達の方法によって増強されうる。
【００５９】
低分子ＥＧＦ−Ｒアンタゴニスト
チロシンキナーゼ阻害剤
ＥＧＦ受容体に作用し、ＥＧＦ−Ｒに選択的なチロシンキナーゼ阻害剤は、当技術分野において既知であり、本発明の方法において使用されうる。その例は、既に記載されており、ＢＩＢＸ１５２２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｉｎｃ．，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙより）、ＣＧＰ５９３２６Ｂ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、チルホスチンＡＧ１４７８（Ｄａｕｂら（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６７０３２−７０４４）；４−アミノキナゾリンＥＧＦ−Ｒ阻害剤（米国特許第５，７６０，０４１号に記載）、ニトリル化合物及びモノニトリル化合物を含む、ナフタレン、インダン、もしくはベンゾキサジンであってもよい置換されたスチレン化合物（米国特許第５，２１７，９９９号に記載）、米国特許第５，７７３，４７６号に開示された阻害剤、ジャガイモ・カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＰＣＩ）、３個のジスルフィド架橋を有する３９アミノ酸プロテアーゼ阻害剤（Ｂｌａｎｃｏ−Ａｐａｒｉｃｉｏら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３（２０）：１２３７０−１２３７７）、ボンベシン・アンタゴニストＲＣ−３０９５（Ｓｚｅｐｅｓｈａｚｉら（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９４：１０９１３−１０９１８）等を含む。その他のチロシンキナーゼ阻害剤には、キナゾリン類、例えばＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリン、もしくはＣＰ−３５８，７７４、ピリドピリミジン類、ピリミドピリミジン類、ピロロピリミジン類、例えばＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１、及びＣＧＰ６２７０６、並びにピラゾロピリミジン類（ＳｈａｗｎとＳｈａｗｖｅｒ（前記））、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン類（Ｔｒａｘｌｅｒら，（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３９：２２８５−２２９２）、クルクミン（Ｋｏｒｕｔｌａら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２２４：５９７−６００）；（Ｌａｘｍｉｎ ａｒａｙａｎａ（１９９５），Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ １６：１７４１−１７４５）等が含まれる。
【００６０】
好ましいチロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦ受容体に選択的なもの、即ち、ＥＧＦ−Ｒが、チロシンキナーゼ活性を有するその他の細胞表面受容体よりも大きな程度で阻害されるようなものである。選択性は、例えば炎症が生じている気道へ阻害剤が優先的に送達されるような、製剤化及び薬物送達の方法により増強される。
【００６１】
非リガンド依存性ＥＧＦＲ活性化の阻害剤
非リガンド依存性メカニズムのアンタゴニストには、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＤＭＳＯ、ＤＭＴＵ、アスコルビン酸等のような抗酸化剤が含まれる。酸化ストレスを介した非リガンド依存性のＥＧＦＲ活性化は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）ｐ４４／４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ４４／４２ｍａｐｋ）の活性化をもたらし、ムチン合成をもたらす。タケヤマ（Ｔａｋｅｙａｍａ）ら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１５４６−１５５２。このＭＥＫ活性化は、選択的ＭＥＫ阻害剤ＰＤ９８０５９、及び抗酸化剤によって阻害される。従って、ＭＥＫ阻害剤及び抗酸化剤は、本発明の治療法において使用されうる。本発明の治療法において使用されうるＭＥＫ阻害剤には、これらに限定はされないが、ＰＤ９８０５９；Ｕ０１２６；並びに国際公開公報９９／０１４２１；国際公開公報９９／０１４２６；国際公開公報９８／３７８８１；国際公開公報９７／４５４１２；及び米国特許第５，５２５，６２５号に記載されたＭＥＫ阻害剤を含む、当技術分野において既知の任意のＭＥＫ阻害剤が含まれる。本発明の方法において使用されうるＥＧＦＲカスケードのその他の阻害剤には、これに限定はされないが、ＳＢ２０３５８０を含む、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの阻害剤が含まれる。
【００６２】
メタロプロテイナーゼ阻害剤
メタロプロテイナーゼ阻害剤、特に、これに限定はされないが、バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）（ＢＢ−９４）（Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ−Ｐｒａｇａら（１９９７）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １５：６１−７５）を含む膜貫通型ＥＧＦＲリガンド前駆体の細胞外プロセシングに関与しているメタロプロテイナーゼの阻害剤、及び、これらに限定はされないが、Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ−Ｐｒａｇａら（１９９７）；Ｂｒｏｗｎ（１９９９）ＡＰＭＩＳ １０７：１７４−１８０に記載されているもの；並びに例えば国際公開公報２０００１７１６２；米国特許第６，０３７，３６１号；国際公開公報２００００９４８５；国際公開公報２００００６５６１；及び国際公開公報２００００６５６０に記載されているものが、本発明の治療法において使用されうる。ある阻害剤が、膜貫通型ＥＧＦＲリガンド前駆体を放出させるメタロプロテイナーゼを阻害することにより、ＥＧＦＲの活性化の阻害において有効であるか否かは、当業者によって容易に決定されうる。一つの非制限的な例として、メタロプロテイナーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で、細胞を、これらに限定はされないが、ＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）、カルバコール、トロンビン、ボンベシン、及びエンドセリンを含むＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の刺激剤；ＥＧＦ；ホルボールエステル（例えば、テトラデカノイル−ホルボール−１３−アセタート、ＴＰＡ）；又はイオノマイシンと接触させ、Ｐｒｅｎｚｅｌら（１９９９）（前記）又は実施例のセクションに記載されたようにしてＥＧＦＲのトランス活性化を測定することができる。又は、メタロプロテイナーゼ、特にバチマスタット感受性メタロプロテイナーゼの酵素アッセイ法を実施することができる。当業者は、メタロプロテイナーゼの特異的又は選択的な阻害剤に加え、これらに限定はされないが、ＧＰＣＲの阻害剤（例えば、アンタゴニスト）、特に杯細胞産生を誘導するアンタゴニストを含む、このカスケード中の任意の因子の阻害が、本発明の治療法において使用されうることを容易に認識するであろう。
【００６３】
投薬量
全身投与のための典型的な投薬量は、１回の投与につき対象の体重１ｋｇ当たり０．１μｇから１００ミリグラムの範囲である。当業者であれば、用量レベルが、特定の化合物、症状の重度、及び対象の副作用への感受性の関数として変動しうることを容易に認識するであろう。化合物によって効力は異なる。特定の化合物の好ましい投薬量は、多様な手段によって当業者により容易に決定されうる。好ましい手段は、例えば本明細書に記載のインビトロ及びインビボの試験を用いて、特定の化合物の生理学的効力を測定することである。
【００６４】
ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストとしての抗体
ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストとしての抗体は、特に重要である（例えば、Ｖｉｌｏｒｉａら，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５１：１５２３）。ＥＧＦ又はＥＧＦ−Ｒに対する抗体は、マウス、齧歯類、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等を含む異種の免疫適格性哺乳動物宿主を、ＥＧＦもしくはＥＧＦ−Ｒ又はそれらの一部で免疫感作することにより作製される。好ましくは、ヒトのＥＧＦもしくはＥＧＦ−Ｒ又はそれらの一部が、免疫原として使用される。特定の宿主の選択は、主に都合による。免疫原が、宿主動物の皮下、筋肉内、腹腔内、血管内等に注射されうる免疫感作は、従来の技術に従い実施される。通常、１日おきに腹腔内に約１．０〜約１０ｍｇ／ｋｇのＥＧＦ又はＥＧＦ−Ｒが、免疫原として使用されるであろう。注射は、アジュバント、例えば完全もしくは不完全フロイント・アジュバント、スペコール（ｓｐｅｃｏｌ）、ミョウバン等を用いてもよいし、又は用いなくてもよい。免疫感作スケジュールの完了後、ＥＧＦ又はＥＧＦ−Ｒに特異的なポリクローナル抗血清を提供するため、従来の方式に従い、抗血清を収集することができる。
【００６５】
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれか、好ましくはモノクローナル抗体が、免疫感作された動物から作製される。ポリクローナル抗血清は、免疫感作スケジュールの完了後、動物から、従来の方法に従い、血清から収集されうる。モノクローナル抗体の作製のためには、リンパ球を適切なリンパ組織、例えば脾臓、流入領域リンパ節等から収集し、適切な融合パートナー、通常は骨髄腫系と融合させ、特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。着目している抗原特異性に関するハイブリドーマのクローンのスクリーニングを、従来の方法に従い実施する。
【００６６】
特に重要であるのは、ＥＧＦとＥＧＦ−Ｒとの結合を阻害するためＥＧＦ−Ｒ又はＥＧＦと結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、例えばＥＧＦ−Ｒの細胞外ドメインと特異的に結合し、それによりＥＧＦの結合を防止する抗体である。そのような抗体は、前記の従来の方法論により作成することができ、又は市販もされている。ＥＧＦアンタゴニストとして機能するであろう抗体の例には、これらに限定はされないが、中和抗ＥＧＦ−Ｒモノクローナル抗体Ｃ２２５（Ｋａｗａｍｏｔｏら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０：１３３７−１３４１；Ｐｅｔｉｔら（１９９７）Ｊ．Ｐａｔｈ．１５１：１５２３−１５３、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹが製造）及び抗ＥＧＦ−Ｒモノクローナル抗体ＥＭＤ５５９００（Ｍａｂ４２５とも呼ばれる）（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。
【００６７】
本発明の抗体は、通常の多量体構造ではなく、単鎖として作製されてもよい。単鎖抗体は、Ｊｏｓｔら（１９９４）Ｊ．Ｂ．Ｃ．２６９：２６２６７−７３等に記載されている。重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、グリシン及び／又はセリンを含む小さい中性アミノ酸を少なくとも約４個コードするスペーサーとライゲートさせる。この融合体によりコードされるタンパク質は、元の抗体の特異性及び親和性を保持している機能的な可変領域の組み立てを可能にする。
【００６８】
抗体をヒト化する方法は、当分野において既知である。ヒト化抗体は、トランスジェニック・ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産物でありうる（例えば、国際公開公報９０／１００７７及び国際公開公報９０／０４０３を参照のこと）。又は、着目している抗体は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ・ドメイン、及び／又はフレームワークの残基を、対応するヒト配列と置換するため、組み換えＤＮＡ技術により操作されうる（国際公開公報９２／０２１９０を参照のこと）。
【００６９】
キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ ｃＤＮＡの使用も、当技術分野において既知である（Ｌｉｕら（１９８７）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８４：８４３９及び（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１）。抗体を産生するハイブリドーマ又はその他の細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを作製するために使用する。着目しているｃＤＮＡを、特異的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応により増幅することができる（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号）。又は、ライブラリーを作成し、着目している配列を単離するためスクリーニングする。次いで、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ヒト定常領域配列と融合させる。ヒト定常領域遺伝子の配列は、カバット（Ｋａｂａｔ）ら（１９９１）「免疫学対象のタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２に見出すことができる。ヒトＣ領域遺伝子は、既知のクローンから容易に入手可能である。次いで、従来の方法によりキメラ・ヒト化抗体を発現させる。
【００７０】
Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦａｂのような抗体断片は、例えばプロテアーゼ又は化学的分解による、完全なタンパク質の分解により調製されうる。又は、短縮された遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列の後ろに、短縮された分子を生成させるための翻訳終止コドンが続いたものを含む。
【００７１】
過剰分泌粘液性疾患を有する個体は、最初、例えば吸入により、１日に２回患者の体重１キログラム当たり約２０ミリグラム（ｍｇ）から約４００ｍｇの範囲の量のＥＧＦ−Ｒアンタゴニストを投与されうる。
【００７２】
ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストとしてのアンチセンス分子
もう一つの態様において、本発明の治療剤は、ＥＧＦ又はＥＧＦ−Ｒをコードするヒト配列に特異的なアンチセンス分子である。投与される治療剤は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、特に天然型核酸からの化学的修飾を有する合成オリゴヌクレオチド、又はＲＮＡのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物でありうる。アンチセンス配列は、標的のＥＧＦ遺伝子又はＥＧＦ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡと相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する（例えば、Ｎｙｃｅら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５；７２０を参照のこと）。アンチセンス分子は、ＲＮＡｓｅＨの活性化又は立体障害を介して、翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を減少させることにより遺伝子発現を阻害する。一つのアンチセンス分子を投与してもよいし、又はアンチセンス分子の組み合わせを投与してもよく、組み合わせは、単一の標的遺伝子に由来する複数の異なる配列を含んでいてもよいし、もしくはいくつかの異なる遺伝子に相補的な配列を含んでいてもよい。
【００７３】
好ましい標的遺伝子は、ＥＧＦ−Ｒ又はＥＧＦである。遺伝子配列は、公共のデータベースから入手可能である（ヒト上皮増殖因子、ゲンバンクアクセッション番号Ｋ０１１６６；上皮増殖因子受容体の前駆体のヒトｍＲＮＡ、ゲンバンクアクセッション番号Ｘ００５８８）。一般的に、アンチセンス配列は、動物宿主と同一の起源種を有するであろう。
【００７４】
アンチセンス分子は、標的細胞に導入され発現される適切なベクターに含まれた標的遺伝子配列の全部又は一部の発現により作製されうる。転写開始は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として産生されるよう方向付けられるであろう。アンチセンスＲＮＡは内因性センス鎖ｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより標的遺伝子の発現を阻止する。天然型の転写開始領域、又は外因性の転写開始領域が、使用されうる。プロモーターが、インビトロの組み換え法により、又は配列の染色体への相同的取り込みの結果として、導入されうる。β−アクチン・プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及び後期プロモーター、ヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ等を含む、筋細胞において活性を有する多くの強力なプロモーターが、当技術分野において既知である。
【００７５】
転写ベクターは、一般的に、核酸配列の挿入を提供するための、プロモーター配列の近傍に位置する便利な制限部位を有する。転写開始領域と、標的遺伝子又はその断片と、転写終結領域とを含む転写カセットが調製されうる。転写カセットは、通常少なくとも約１日にわたり、さらに通常は少なくとも約数日にわたり一時的又は安定的に細胞内に維持されうる多様なベクター、例えばプラスミド、レトロウイルス、例えばレンチウイルス、アデノウイルス等に導入されうる。
【００７６】
又は、好ましい態様において、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、一般的に約７から５００ヌクレオチド、通常約１２から５０ヌクレオチド、さらに通常は約２０から３５ヌクレオチドであろうが、長さは、阻害の効率、交差反応性の欠如を含む特異性等により支配される。約７から８塩基長の短いオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の強力かつ選択的な阻害剤となりうることが見出されている（Ｗａｇｎｅｒら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４０−８４４を参照のこと）。
【００７７】
内因性センス鎖ｍＲＮＡ配列の１個またはそれ以上の特異的領域が、アンチセンス配列が相補的となるよう選択される。ｍＲＮＡの５’領域はアンチセンス阻害に対して特に感受性が高いことが示されている。しかし、最近の証拠により、ｍＲＮＡの二次構造の分析が、部位の阻害への到達可能性において重要であることが示されている。オリゴヌクレオチドの特異的配列の選択には、インビトロ又は動物モデルにおける標的遺伝子の発現の阻害に関して、いくつかの候補配列をアッセイする、経験的な方法を使用することができる。ｍＲＮＡ配列のいくつかの領域がアンチセンス相補のため選択された、配列の組み合わせを使用することもできる。
【００７８】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法により化学的に合成されうる（Ｗａｇｎｅｒら（１９９３）（前記）及びＭｉｌｌｉｇａｎら（前記）を参照のこと）。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内安定性及び結合親和性を増加させるため、天然型のホスホジエステル構造から化学的に修飾されたものである。骨格、糖、又はヘテロ環式塩基の化学を改変する、そのような修飾は、文献に多数記載されている。
【００７９】
オリゴヌクレオチドは、細胞による分子の取り込みを増強するターゲティング部分をさらに含みうる。ターゲティング部分とは、特異的結合分子、例えば肺上皮細胞、特にＥＧＦ−Ｒを含有している上皮細胞の表面上に存在する分子を認識する抗体又はその断片である。
【００８０】
二重特異的抗体、キメラ抗体、及び単鎖抗体が、当技術分野において既知である。適当に調製された非ヒト抗体は、様々な方法でヒト化されうる。オリゴヌクレオチドとターゲティング部分との連結には、オリゴヌクレオチド骨格の化学に応じて、任意の従来の方法、例えばジスルフィド結合、アミド結合、又はチオエステル結合を使用することができる。好ましくは、連結は、オリゴヌクレオチドを遊離させるため、細胞内で分解されるであろう。
【００８１】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼから防御し、細胞膜を介した輸送を改善するため、疎水性残基、例えばコレステロールと結合していてもよい。又は、ポリ−Ｌ−リジン又はその他のポリアミンとの結合によっても、細胞への送達が増強されうる。行うことができるさらなる修飾は、標的ｍＲＮＡへのインターカレーションを起こし、得られたハイブリッドを安定化することができる、アクリジンのようなインターカレーション成分の添加である。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、細胞内でアンチセンス−ｍＲＮＡ複合体を崩壊させるであろう（１個以上の）酵素、例えばＲＮａｓｅ−Ｈと組み合わせてトランスフェクトされうる。アンチセンス−ｍＲＮＡ二重鎖を優先的に崩壊又は解離させうる任意のタンパク質又は酵素も、同様に有用でありうる。
【００８２】
アンチセンス阻害剤の代替物として、触媒性核酸化合物、例えばリボザイム、アンチセンス結合体等が、遺伝子発現を阻害するために使用されうる。リボザイムはインビトロで合成され、患者へ投与されてもよいし、又は標的細胞内でリボザイムが合成されるよう発現ベクター上にコードされてもよい（例えば、国際特許出願国際公開公報９５２３２２５、及びＢｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：４４３４−４２を参照のこと）。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、国際公開公報９５０６７６４に記載されている。ｍＲＮＡ加水分解を媒介することができるアンチセンス・オリゴヌクレオチドと金属複合体、例えばテルピリジルＣｕ（ＩＩ）（ｔｅｒｐｙｒｉｄｙｌＣｕ（ＩＩ））との結合体は、バシュキン（Ｂａｓｈｋｉｎ）ら（１９９５）Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５４：４３−５６に記載されている。
【００８３】
薬学的製剤
ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、溶液で、又はリポソーム懸濁液のようなその他の任意の薬理学的に適当な投与形態で提供されうる。適切な抗体又はその他の形態の抗ＥＧＦが、そのような材料の投与のための通例の様式で、投与のため製剤化されうる。典型的な製剤は、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに提供されているものである。投与経路は、投与すべき化合物、治療を受ける患者及び疾患の状態に基づき選択されるであろう。粘液の過剰分泌が存在する場合、化合物は、疾患の重度に応じて異なる経路を介して投与されうる。例えば、緊急の状況は、ｉ．ｖ．投与を必要とするかもしれず、急性であるが生命に関わらない状況では、経口治療が可能であり、慢性治療はエアロゾルにより投与されうる。
【００８４】
鼻及び気道の疾患における治療的使用のためには、局所的送達が好ましい。吸入又はエアロゾル注入による送達は、全身投与により吸収される濃度と比較して高レベルの薬物濃度を提供する。又は、ＥＧＦアンタゴニストは、筋肉内注射、静脈内（ＩＶ）注射、皮下注射、又は腹腔内注射を含む注射により投与されてもよく、最も好ましくはＩＶ注射及び局所注射により投与される。しかしながら、坐剤、皮膚貼付剤として、又は鼻腔内に適用されうる、経粘膜製剤又は経皮製剤のような、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストが全身循環系に侵入することを許容するための手段が利用可能であれば、その他の投与様式も使用されうる。ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストを血流へ、又は局所的に肺へ移行させる任意の適当な製剤が、正しく使用されうる。
【００８５】
注射の場合、適当な製剤には、一般的に、安定剤もしくはその他の微量成分を場合により含んでいてもよい、生理食塩水、ハンクス溶液、又はその他の緩衝液を使用した水性の溶液又は懸濁液が含まれる。リポソーム調製物及びその他の微小乳濁液の形態を使用することもできる。ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、凍結乾燥形態で供給され、投与のため再生させられてもよい。経粘膜投与及び経皮投与は、一般的に、胆汁、塩、フシジン酸及びその類似体、様々な界面活性剤等のような粘膜又は皮膚の関門の通過を促す薬剤を含む。ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストが消化管において不活化されないようにするため、適当な腸溶性コーティングが製剤化されるのであれば、経口投与も可能である。
【００８６】
製剤の性質は、ある程度、選択されたＥＧＦ−Ｒアンタゴニストの性質に依存するであろう。適当な製剤は、当業者に周知の既知の技術及び製剤化の原理を使用して調製される。特定の薬学的組成物中に含まれるＥＧＦ−Ｒアンタゴニストの割合（％）も、製剤の性質に依存するであろう。抗体であるＥＧＦ−Ｒアンタゴニストの割合（％）は、典型的には、約１重量％から約８５重量％までの広い範囲で変動するであろう。
【００８７】
細胞による核酸の取り込みを増強するための多くの送達法が、当分野において既知である。有用な送達系には、センダイウイルス−リポソーム送達系（ＲａｐａｐｏｒｔとＳｈａｉ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１２４−１５１３１）、陽イオン性リポソーム、ポリマー性送達ゲル又はマトリックス、多孔性バルーン・カテーテル（Ｓｈｉら（１９９４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９０：９５５−９５１及びＳｈｉら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：４０８−４１４に開示されているようなもの）、レトロウイルス発現ベクター等が含まれる。
【００８８】
送達媒体としてのリポソームの使用は、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストと共に使用するための一つの重要な方法である。リポソームは、標的部位の細胞と融合し、内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームの細胞との接触は、単離、結合剤等のような接触を維持するための様々な手段を使用して、融合のために十分な時間、維持される。リポソームは、センダイウイルス又はインフルエンザウイルス等のような膜の融合を媒介する精製されたタンパク質又はペプチドを用いて調製されうる。脂質は、ホスファチジルコリンのような陽イオン性脂質を含む既知のリポソーム形成脂質の任意の有用な組み合わせでありうる。残りの脂質は、通常、コレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のような中性脂質であろう。リポソームを調製するには、カトー（Ｋａｔｏ）ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３３６１に記載された手法を使用することができる。
【００８９】
好ましい態様において、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、立体的に安定化された「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」リポソーム、例えばＰＥＧ化リポソーム内に封入される。そのようなリポソームは、ｉ．ｖ．注射された場合、長期にわたり循環系に滞留する。気道の炎症中には、後毛細管細静脈ギャップ・ジャンクションが開口し、液体蓄積を可能にし、分子、例えば補体、キニノーゲンが組織へ侵入し炎症カスケードを開始させることを許容する。そのような炎症は、リポソーム及びその内容物が、炎症を起こした組織に選択的に沈積することを可能にする（Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １５：４５５−４６０）。
【００９０】
ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストは、吸入経路用の薬学的送達系により、罹患した患者へ投与されうる。化合物は、吸入による投与に適した形態に製剤化されうる。薬学的送達系は、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストの気管支粘膜への局所投与による呼吸器療法に適した系である。本発明は、容器からのＥＧＦ−Ｒアンタゴニストの押し出しを圧縮ガスの力に依存している系を使用することができる。エアロゾル又は加圧パッケージが、この目的のため使用されうる。
【００９１】
本明細書において使用されるように、「エアロゾル」という用語は、加圧されたプロペラント・ガスにより治療適用部位へと運搬される極めて微細な液体又は固体の粒子をさすものとして、従来の意味で使用される。薬学的エアロゾルを本発明において使用する場合、エアロゾルは、液体担体とプロペラントとの混合物の中に溶解、懸濁、又は乳濁させられうる治療的に活性な化合物を含有する。エアロゾルは、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、又は半固体の調製物の形態でありうる。本発明において使用されるエアロゾルは、患者の気道を介した、微細な固体粒子として、又は液体ミストとしての投与を目的とするものである。当業者に既知の様々な型のプロペラントが使用されうる。適当なプロペラントの例には、これらに限定はされないが、炭化水素又はその他の適当なガスが含まれる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、定量（ｍｅｔｅｒｅｄ ａｍｏｕｎｔ）を送達するための値を提供することにより決定されうる。
【００９２】
ガス中に実質的に均一なサイズの極めて微細な液体粒子を生成させる装置である噴霧器を用いて、本発明を実施してもよい。好ましくは、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストを含有している液体が、飛沫として分散させられる。小飛沫は、噴霧器の排出チューブから気流により運搬されうる。得られたミストは、患者の気道へと進入する。
【００９３】
滑沢剤、担体、又はプロペラントを含む、又は含まない、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニスト又はその類似体を含有している粉末組成物を、療法が必要な哺乳動物へ投与することができる。本発明のこの態様は、吸入により粉末薬学的組成物を投与するための従来の器具を用いて実施されうる。例えば、化合物と、ラクトース又はデンプンのような適当な粉末基剤との粉末混合物を、例えばカプセルもしくはカートリッジ、例えばゼラチン、又はブリスターパック中に単位投薬形態で提示することができ、粉末はそれらから吸入器の補助により投与されうる。
【００９４】
過剰分泌性肺疾患を治療するため、組み合わせ療法が使用されうる。特に、粘液線毛クリアランスを促すための気管支拡張剤、コルチコステロイド、去痰剤、粘液溶解剤等のような過剰分泌の緩和のための従来の治療と、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストを組み合わせることができる。
【００９５】
患者の状態によっては、注射（例えば、静脈内）又は吸入により本発明の製剤を送達することが好ましい場合がある。肺に多量の粘液を有する患者は、一般的に、最初は吸入により治療され得ない。これは、肺へのエアロゾル化製剤の吸入が特に有効でない程に、患者の肺が閉塞しているという事実のためである。しかしながら、注射による治療の後、又は長期的な維持のため、又は患者の肺が重度に閉塞していない状況では、吸入による投与が好ましい。比較的少ない用量が、最も治療が必要な特定の細胞へ局所的に送達されうるため、吸入による投与は好ましい。比較的少ない用量を送達することにより、任意の有害な副作用が排除されるか、又は実質的に減少する。最も治療が必要な細胞へ直接的に送達することにより、より迅速に治療の効果が実現するであろう。
【００９６】
本発明に関して使用されうるいくつかの異なる型の吸入方法論が存在する。本発明のアンタゴニストは、基本的に３つの異なる型の吸入用製剤へと製剤化されうる。第一に、本発明のアンタゴニストは、低沸点プロペラントを用いて製剤化されうる。そのような製剤は、一般的に、従来の定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）により投与されうる。しかし、米国特許第５，４０４，８７１号及び第５，５４２，４１０号に記されたような、患者の呼気量及び流速を測定する技術を利用することにより、反復可能な投薬を得る能力が増加するよう、従来のＭＤＩを修飾してもよい。
【００９７】
又は、本発明のアンタゴニストは、水性溶液又はエタノール性溶液の中に製剤化され、従来の噴霧器により送達されうる。しかし、より好ましくは、そのような溶液製剤は、米国特許第５，４９７，７６３号、第５，５４４，６４６号、第５，７１８，２２２号、及び第５，６６０，１６６号に開示されたような器具及び系を使用してエアロゾル化される。
【００９８】
最後に、本発明のアンタゴニスト化合物は、乾燥粉末製剤へと製剤化されうる。そのような製剤は、粉末のエアロゾル・ミストを作出した後、乾燥粉末製剤を単純に吸入することにより投与されうる。そのような方法を実施するための技術は、１９９８年７月７日に発行された米国特許第５，７７５，３２０号及び１９９８年４月２１日に発行された米国特許第５，７４０，７９４号に記載されている。
【００９９】
前掲の各特許に関して、本出願人らは、これらの特許が肺内薬物送達における他の出発物を引用していること、及び本発明のアンタゴニストの送達に関して使用されうる特定の方法論、器具、及び製剤に関してそのような出版物が参照されうることを指摘する。さらに、各特許は、本発明のアンタゴニスト製剤の製剤化、器具、パッケージング、及び送達方法論を開示する目的のため、参照として完全に本明細書に組み込まれる。
【０１００】
スクリーニング・アッセイ法
候補薬物
スクリーニング・アッセイ法は、ＥＧＦアンタゴニストである生理活性候補薬剤を同定するため使用されうる。特に重要であるのは、ヒト細胞に対して低い毒性を有する薬剤に関するスクリーニング・アッセイ法である。標識インビトロ・タンパク質−タンパク質結合アッセイ法、電気泳動移動度シフト・アッセイ法、酵素活性アッセイ法、タンパク質結合に関するイムノアッセイ法等を含む、極めて多様なアッセイ法が、この目的のため使用されうる。精製されたＥＧＦタンパク質又はＥＧＦ−Ｒタンパク質を使用して三次元結晶構造を決定し、それを、分子間相互作用、トランスポーター機能等のモデリングに使用することもできる。
【０１０１】
本明細書において使用されるように、「薬剤」という用語は、これらに限定はされないが、ＥＧＦ又はＥＧＦＲ受容体の機能の直接的な改変又は阻害；ＥＧＦＲカスケード中の任意の因子の改変又は阻害；ＥＧＦＲの活性化に関与している任意の因子の改変又は阻害；膜結合型ＥＧＦＲリガンドの放出に関与している任意の因子の改変又は阻害を含む、ＥＧＦ又はＥＧＦ−Ｒの生理学的機能の、直接的又は間接的な改変又は阻害の能力を有する任意の分子、例えばタンパク質又は医薬品を記述するものである。一般的に、様々な濃度に対するディファレンシャルな応答を得るため、異なる薬剤濃度を用いて複数のアッセイ混合物が並行に実行される。典型的には、これらの濃度のうちの一つは、陰性対照として、即ちゼロ濃度又は検出レベル未満で使用される。
【０１０２】
候補薬剤には、多数の化学的クラスが包含されるが、典型的には、それらは有機分子であり、好ましくは５０ダルトン超、約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機又は無機の化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的にはアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を少なくとも１個含み、好ましくは化学的官能基のうちの少なくとも２個を含む。候補薬剤は、しばしば、前記の官能基のうちの１個またはそれ以上で置換された、環式炭素もしくはヘテロ環式構造、及び／又は芳香族もしくは多重芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的類似体、又は組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。
【０１０３】
候補薬剤は、合成化合物又は天然化合物のライブラリーを含む極めて多様な起源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、極めて多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び特異的合成のための多数の手段が利用可能である。又は、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、入手可能であるか、又は容易に作製される。さらに、天然の又は合成により作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的手段、物理学的手段、及び生化学的手段により容易に修飾され、コンビナトリアル・ライブラリーを作製するため使用されうる。構造的類似体を作製するため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような特異的又はランダムな化学的修飾を、既知の薬理学的薬剤に施すことができる。
【０１０４】
スクリーニング・アッセイ法が結合アッセイ法である場合、検出可能シグナルを直接的又は間接的に提供することができる標識と、１個またはそれ以上の分子を結合させることができる。様々な標識には、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子等が含まれる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン等のような対が含まれる。特異的結合メンバーのため、通常、相補的なメンバーが、検出を提供する分子で既知の手法に従い標識されるであろう。
【０１０５】
その他の多様な試薬が、スクリーニング・アッセイ法に含まれうる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を促し、かつ／又は非特異的なもしくはバックグラウンドの相互作用を減少させるため使用される、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のようなアッセイ法の効率を改善する試薬が使用されうる。成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で添加されうる。インキュベーションは、任意の適当な温度、典型的には４〜４０℃で実施される。インキュベーション時間は、活性が最適となるよう選択されるが、迅速なハイ・スループット・スクリーニングが促されるよう最適化されてもよい。典型的には、０．１〜１時間が十分であろう。
【０１０６】
所望の薬理学的活性を有する化合物は、本明細書に記載の製剤として、過剰分泌性疾患の治療のため、生理学的に許容される担体に含まれて、宿主へ投与されうる。導入の様式に応じて、化合物は、本明細書に記載の多様な方式で製剤化されうる。製剤中の治療的活性を有する化合物の濃度は、約０．１〜１００重量％で変動しうる。
【０１０７】
投薬計画
適切な投薬レベルも、治療を受ける対象の性質、治療を受ける過剰分泌性状態の特定の性質及びその重度、活性要素として使用されるＥＦＧＲアンタゴニストの性質、投与の形式、製剤、及び実務者の判断を含む多数の要因に応じて変動するであろう。例えば、抗ＥＧＦ又は抗ＥＧＦ−Ｒのような抗体自体を注射可能製剤として投与する場合、投薬量は、１回の投薬につき２０〜約４０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であろう。数日にわたる反復投与が必要である場合もあるし、又は静脈内手段による投与は連続的なものであってもよい。慢性状態の場合、投与は必要に応じて比較的長期にわたり継続されうる。
【０１０８】
投薬計画の効率は、患者における改善された肺機能を査定することにより決定されるであろう。この査定には、痰の粘弾性の測定、痰の努力呼気肺活量及び最大中期呼気流量（ｍａｘｉｍａｌ ｍｉｄｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）の改善を含む肺機能の改善が含まれうる。前述の治療計画は、抗生物質、ＤＮＡｓｅＩ、又は過剰分泌性肺疾患の治療のためのその他の現行の療法のような補助療法と併せて与えられうる。抗生物質が患者の療法の一部として共投与される場合、粘液又は痰の粘性の減少、及び粘液又は痰の肺クリアランスの増加を示す、細菌増殖の減少による治療の効率を査定するため、療法後の細菌定量が含まれうる。
【０１０９】
肺機能試験及び肺過剰分泌性疾患の臨床的進展の診断試験は、当業者に既知である。標準的な肺機能試験には、気道抵抗（ＡＲ）；努力肺活量（ＦＶＣ）；１秒間努力呼気肺活量（ＦＥＶ（１））；努力中期呼気量（ｆｏｒｃｅｄ ｍｉｄｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ ｆｌｏｗ）；及び最大呼気流速（ＰＥＦＲ）が含まれる。その他の肺機能試験には、血液ガス分析；薬物療法に対する応答；チャレンジ・アンド・エクササイズ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ａｎｄ ｅｘｅｒｃｉｓｅ）試験；呼吸筋強度の測定；繊維光学的（ｆｉｂｒｏ−ｏｐｔｉｃ）気道検査等が含まれる。粘液の特性を研究するためのいくつかの基本的な手法には、例えば磁気マイクロレオメーターを使用したレオロジー、粘液滴と表面との間の接触角を測定することにより接着表面と接着系との引力を特徴決定するための粘着力が含まれる。線毛による粘液輸送は、従来の技術、及び直接的な測定、即ちインサイチューの粘液クリアランスを使用して研究されうる。経上皮電位差、肺上皮のイオン輸送系の活性の正味の結果は、適切な微小電極を使用して測定されうる。定量的な形態学的方法が、上皮表面状態を特徴決定するために使用されうる。
【０１１０】
治療を受ける患者は、ヒトのような霊長類であってもよいし、又は記載された症状を示すその他の任意の動物であってもよい。本発明の方法はヒト患者の治療に特に適合しているが、本発明が獣医実務にも適用可能であることが理解されよう。
【０１１１】
インビトロ・スクリーニング・アッセイ法
本発明のもう一つの態様において、候補薬剤の杯細胞増殖阻害の治療的可能性を査定するため、即ちそのような薬剤がＥＧＦアンタゴニストとしての活性を有するか否かを査定するため、インビトロ・アッセイ法が使用される。一般的に、そのようなアッセイ法は、（ｉ）杯細胞増殖のインビトロ・モデルを、ＥＧＦ又はその機能的等価物と接触させる工程；（ｉｉ）続いて、インビトロ・モデルを候補薬剤と接触させる工程；及び（ｉｉｉ）杯細胞増殖を査定し、その際、杯細胞増殖の阻害を候補薬剤の治療的可能性の指標とする工程を含む。
【０１１２】
アッセイ法は、好ましくは、２つの対照を用いて実施される。ここで、第二の細胞群はいずれの化合物とも接触させず、第三の細胞群はＥＧＦとは接触させるが、候補薬剤とは接触させない。次いで、ＥＧＦ及び候補薬剤の細胞への効果の程度を決定するため、比較を行う。
【０１１３】
任意の杯細胞増殖のインビトロ・モデルが使用されうる。例えば、ガズマン（Ｇｕｚｍａｎ）ら（１９９５）２１７：４１２−４１９に記載のようにして、ラット気管細胞を単離し培養物中で維持することができる。簡単に説明すると、ラット気管細胞をコラーゲン・ゲルでコーティングされた半透膜上に播き、まず培地中で液内培養し、続いて気体／液体界面で維持する。インビトロ細胞の例には、初代ヒト気管支細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏより入手可能）；ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８４８）；及びＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５５）が含まれる。
【０１１４】
インビトロ培養物をＥＧＦ及び候補薬剤と接触させる。査定すべき終点及び候補薬剤の性質に応じて、ＥＧＦの添加の前に、同時に、又は後に、候補薬剤を培養物と接触させることができる。培養細胞を、対照と比した杯細胞増殖の阻害に関して査定する。
【０１１５】
多様な分子マーカー又は生化学的マーカーが、杯細胞増殖を査定するため使用されうる。使用されうる分子マーカー又は生化学的マーカーの例には、これらに限定はされないが、杯細胞に特徴的な遺伝子発現又はタンパク質発現が含まれる。いくつかのムチン遺伝子、例えばＭＵＣ５Ｂ（Ｄｅｓｓｅｙｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１６８−３１７８）は気道に発現しており、その遺伝子産物は粘液中に高度に見られる。ムチン遺伝子の発現は、粘液の産生を決定するための適当なマーカーを提供する。
【０１１６】
ムチン遺伝子発現は、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ムチン遺伝子プロモーターの調査、又はインサイチュー分析のような従来の技術により査定されうる。又は、ムチン・タンパク質が、検出可能に標識された抗体を使用して、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、免疫化学等のような従来の方法により査定される。アルシアン青／ＰＡＳ染色を使用したムチンの染色（Ｌｏｕら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５７：１９２７−１９３４）のような形態学的基準も、培養物中の杯細胞の存在又は欠如を決定するため使用されうる。ムチンに対する抗体は、ＥＬＩＳＡ法を使用して調査されうる。リガンド、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−αによるＥＧＦ−Ｒの刺激は、特定のＥＧＦ受容体キナーゼのリン酸化を誘導し、杯細胞産生を引き起こすため、ＥＧＦ−Ｒリン酸化は杯細胞誘導の反映として測定されうる（Ｄｏｎａｔｏ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２０４７４−２０４８１）。
【０１１７】
肺細胞増殖に関連した分子マーカー又は生化学的マーカーの減少は、アンタゴニストの治療的可能性の指標となる。
【０１１８】
インビボ・モデル
本発明のさらにもう一つの態様において、候補薬剤の杯細胞増殖阻害の治療的可能性を査定するため、インビボ動物モデルが使用される。一般的に、アッセイ法は、（ｉ）ＥＧＦ−Ｒ発現を誘導することにより過剰分泌性肺疾患の動物モデルを作出する工程；（ｉｉ）ムチン産生杯細胞を作製するため、誘導されたＥＧＦ−Ｒを刺激する工程；（ｉｉｉ）候補薬剤で処理する工程；及び（ｉｖ）杯細胞増殖又は粘液分泌を査定し、その際、肺細胞増殖又は粘液分泌の阻害を候補薬剤の治療的可能性の指標とする工程を含む。
【０１１９】
任意の過剰分泌性肺疾患のインビボ・モデルが使用されうる。例えば、テマン（Ｔｅｍａｎｎ）ら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１−４７８に記載され、本明細書に提供された実施例で示されているような喘息マウス・モデル。又は、タケヤマ（Ｔａｋｅｙａｍａ）ら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．に記載されたようなラット・モデルが使用されうる。その他の使用されうる動物モデルの例には、これらに限定はされないが、モルモット（杯細胞を構成的に発現する種）及びラットが含まれる。
【０１２０】
動物モデルの肺組織又は気管組織は、インビトロ・モデルに関して記載されたのと同様の分子マーカー及び生化学的マーカーにより査定されうる。杯細胞増殖の減少は、ＥＧＦ−Ｒアンタゴニストの治療的可能性の指標となる。
【０１２１】
以下の実施例は、当業者に本発明の作成法及び使用法の完全な開示及び説明を提供するために記載され、本発明者らが本発明であると見なすものの範囲を制限するためのものではないし、下記の実験が全て又は唯一の実施された実験であることを表すためのものでもない。使用された数字（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証するよう努力したが、いくつかの実験の誤差及び偏差は考えられる。特記しない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
【０１２２】
実験例
実施例１
ＥＧＦ系は気道におけるムチン産生を制御する
杯細胞の過形成は、様々な気道の過剰分泌性疾患において起こるが、基本的なメカニズムが不明であるために、有効な療法が存在しない。健康な気道には杯細胞はほとんど存在しないが、過剰分泌性気道疾患においては杯細胞の過形成が起こる。ヒト気管支（ＮＣＩ−Ｈ２９２）細胞系を研究した。これらの細胞は、ＥＧＦ−Ｒを構成的に発現しており、ＥＧＦ−Ｒ遺伝子発現は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）によりさらに刺激された。ＥＧＦ−Ｒリガンドはムチンの合成を増加させ、この効果はＴＮＦαとの共インキュベーションにより増加した。
【０１２３】
病原体除去ラットの気道上皮細胞は、ＥＧＦ−Ｒタンパク質をほとんど発現していなかったが、ＴＮＦα（２００ｎｇ）の気管内注入により、基底細胞、前杯細胞、及び杯細胞においてＥＧＦ−Ｒが誘導され、線毛細胞においては誘導されず、ＴＮＦα、ＥＧＦ、又はＴＧＦα単独では杯細胞産生が誘導されなかった。しかし、ＴＮＦαの後にＥＧＦ−Ｒリガンドを注入すると、杯細胞及び前杯細胞の数が増加し、アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色（粘液糖質複合体を反映する）及びムチンＭＵＣ５遺伝子発現が著しく増加した。感作されたラットにおいて、オボアルブミンは、気道上皮における杯細胞産生及びＥＧＦ−Ｒ発現を引き起こした。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、ＴＮＦαの後にＥＧＦ−Ｒリガンドで刺激されたラット、及びラット喘息モデルにおいては、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２）での前処理により、気道における杯細胞産生が防止された。これらの所見より、気道の過剰分泌性疾患におけるＥＧＦ−Ｒカスケードの阻害剤の役割が証明される。
【０１２４】
方法
インビトロ研究
細胞培養
ヒト肺粘膜性類表皮癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、加湿５％ＣＯ２水ジャケット付きインキュベーター内で、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地の中で増殖させた。コンフルエントになった時点で、ＥＧＦ（組換えヒトＥＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＴＧＦα（組換えヒトＴＧＦα、２５ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ＴＮＦα（組換えヒトＴＮＦα、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）＋ＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）、又はＴＧＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）＋ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に、１２時間、２４時間、又は４８時間、細胞をインキュベートした。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２（１０μｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｉｎｃ．，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙより譲り受けた）を用いた阻害実験においては、増殖因子を添加する３０分前に、ＢＩＢＸ１５２２で細胞を前処理した。インキュベーション後、Ｔ−７５フラスコ中で増殖させた細胞を、全ＲＮＡ抽出又はタンパク質抽出のため使用し、８チャンバー・スライドを、ムチンを可視化するためのアルシアン青／ＰＡＳ染色のため使用した。
【０１２５】
ウェスタン・ブロッティング
Ｔ−７５フラスコ中で増殖させた細胞を、溶解させ、１％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ、１％ジオキシコール酸ナトリウム、及びＰＭＳＦ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳで剥離した。総タンパク質量は、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により推定した。細胞溶解物をトリシン試料緩衝液及び２％βＭＥと共に９５℃に加熱した。８％アクリルアミド・ゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質を分離した。得られたゲルを転写緩衝液（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、２０容量％メタノール、ｐＨ８．３）中で平衡化した。次いで、タンパク質を電気泳動によりニトロセルロース膜に転写した。次いで、５％無脂肪スキムミルクを含む０．０５％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有ＰＢＳの中で、膜を１時間インキュベートした。次いで、膜をモノクローナル・マウス抗ＥＧＦ−Ｒ抗体（１：１００）と共に４℃で一晩インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法（ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。ＥＧＦ−Ｒの陽性対照として、Ａ４３１細胞由来の細胞溶解物を使用した（２０）。
【０１２６】
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦ−Ｒの免疫細胞化学的局在部位決定
８チャンバー・スライド上で増殖させた細胞を、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定した。ＥＧＦ−Ｒに関して染色するため、０．０５％ツィーン２０、２％正常ヤギ血清、及び２ｍＭレバミゾールを含有するＰＢＳを、抗体の希釈剤として使用した。切片を、ＥＧＦ−Ｒに対するマウス・モノクローナル抗体（１：２５０）と共に４℃で一晩インキュベートし、次いで過剰の一次抗体を除去するためＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を、１：２００希釈のビオチン化ウマ抗マウス免疫グロブリン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法（ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。
【０１２７】
プローブ
ＥＧＦ−Ｒ ｍＲＮＡ発現は、直鎖化されたｐＴＲＩ−ＥＧＦ−Ｒ−ヒト・プローブ・テンプレート（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して決定した。このプローブは、エキソン１２〜１４に相当するヒトＥＧＦ−Ｒ遺伝子の３６０ｂｐのｃＤＮＡ断片を含有している。ＭＵＣ５遺伝子発現は、ヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の２９８ｂｐのｃＤＮＡ断片を含有するヒトＭＵＣ５ＡＣプローブ（Ｃａｒｏｌ Ｂａｓｂａｕｍ博士より譲り受けた）を使用して決定した。
【０１２８】
ノーザン・ブロッティング
各条件で、トリ・リージェント（Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｔｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を使用して、Ｔ−７５組織培養フラスコ中で増殖させたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞から、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を１％アガロース／ホルムアルデヒド・ゲル上で電気泳動させ、キャピラリー・ブロッティングによりナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）へ転写した。プローブは、ランダム・プライムドＤＮＡ標識キット（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して３２Ｐで標識した。ブロットに、４２℃で４時間プレハイブリダイゼーションを施し、次いで４２℃で１６時間、３２Ｐ標識特異的ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は、２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、１％ポリビニル−ピロリドン、１％フィコール、及び０．５％ピロリン酸ナトリウムを含有していた。ハイブリダイゼーション後、膜を、室温で３０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで２回洗浄し、続いて５０℃で３０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで２回洗浄し、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで１回濯いだ。膜をＸ線フィルムへ感光させた。
【０１２９】
インビボ研究
実験的動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究に関する委員会（ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）により承認された。体重２３０〜２５０ｇの特定病原体除去雄Ｆ３４４フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラット（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）を、温度調節された（２１℃）部屋で維持し、標準的な実験用飼料及び水を自由に摂取させた。
【０１３０】
健康ラット
メトヘキシタール・ナトリウム（Ｂｒｅｖｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ、５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）でラットに麻酔をかけ、自発呼吸をさせた。ＴＮＦαが気道においてＥＧＦ−Ｒを上方制御するか否かを決定するため、ＴＮＦα（２００ｎｇ、１００μｌ）を気管内に注入し、２４時間後に動物を安楽死させた。ＥＧＦ又はＴＧＦαが気道上皮において杯細胞を誘導するか否かを調査するため、ＥＧＦ（６００ｎｇ、１００μｌ）又はＴＧＦα（ラット合成ＴＧＦα、２５０ｎｇ、１００μｌ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）を、単独で、又はＴＮＦα（２００ｎｇ、１００μｌ）注入の２４時間後に、気管内に注入し、４８時間後に動物を安楽死させた。各研究において、無菌のＰＢＳ（１００μｌ）を対照として気管内に注入した。ムチン産生がＥＧＦ−Ｒの活性化を介して起こるか否かを確認するため、本発明者らは、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２（阻害剤を使用した研究から、癌増殖を防止すると推定された用量）の効果を調査した。ラットを、ＴＧＦαの注入の１時間前及び２４時間後に、ＢＩＢＸ１５２２（３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、又は３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で前処理した。ＴＧＦαの注入の４８時間後、調査のため気管及び肺を摘出した。
【０１３１】
感作されたラット
感作
０日目及び１０日目に、１００ｍｇの水酸化アルミニウムと複合体化されたオボアルブミン（１０ｍｇ、等級Ｖ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む無菌生理食塩水０．５ｍｌの腹腔内注射により、ラットを感作した。次いで、ラットを１０日間休息させた。２０日目に、オボアルブミンを気管内に直接送達し、気管内注入により、３回（２０日目、２２日目、及び２４日目）、０．１％オボアルブミンを含む生理食塩水１００μｌで動物をチャレンジした。チャレンジを受けていないラット（２０日目）又は３回目のチャレンジから４８時間後のラット（２６日目）を安楽死させた。この手法により、杯細胞化生が誘導された。杯細胞の過形成を阻止するため、感作されたラットをＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２で前処理した。オボアルブミン・チャレンジの日（２０日目、２２日目、及び２４日目）、感作されたラットをＢＩＢＸ１５２２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、接種の１時間前）で前処理し、次いでオボアルブミンと共にＢＩＢＸ１５２２も気管内に注入した（ＢＩＢＸ１５２２、１０−５Ｍ、１００μｌ）。ラットを安楽死させる前日まで、２４時間毎にＢＩＢＸ１５２２をｉ．ｐ．注射した。動物を安楽死させた後、３回目のチャレンジから４８時間後に気管を摘出した。
【０１３２】
組織の調製
麻酔中の予め選択された時点で、１２０ｍｍＨｇの圧力で、１％パラホルムアルデヒドを含むＤＥＰＣ処理ＰＢＳを、全身循環系に灌流した。次いで、気管を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に２４時間置いた。固定後、気管及び肺を、細胞分析のためＪＢ−４＋モノマー溶液Ａに包埋するか、又は免疫組織化学及びインサイチュー・ハイブリダイゼーションのためＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋した。包埋組織を、横断切片（厚さ４ｍｍ）として切断し、スライド上に置いた。
【０１３３】
細胞分析
油浸対物レンズ（倍率１０００倍）を用いて、２ｍｍの基底層上の上皮細胞核を計数することにより、上皮細胞の総数を計数した。分析された上皮の各領域下の基底層の直線的な長さは、基底膜のディジタル化された画像の輪郭をトレースすることにより決定された。刺激の注入後、「発達中の」杯細胞が形成される。これらの細胞は、アルシアン青／ＰＡＳ陽性顆粒を有するが、顆粒のサイズは小さく、細胞質顆粒の数は少ない。本発明者らは、これらの「発達中の」杯細胞を、細胞が成熟杯細胞になる前の段階である、「前杯細胞」と名付けた。杯細胞は、細長い立方体形、杯形〜低い円柱形であり、核と内腔表面との間の細胞質の大部分を、大量のアルシアン青／ＰＡＳ染色顆粒が占めている。前杯細胞は、比較的小さい粘液染色面積（基底膜から内腔表面までの上皮の高さの１／３未満）を有するか、又は低密度の弱くアルシアン青／ＰＡＳ染色される小さな顆粒を有する細胞と定義される。線毛細胞は、周縁部に線毛があること、細胞質が弱く染色されること、及び核が大きく丸いことにより認識される。非顆粒形成（ｎｏｎ−ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ）分泌細胞は、円柱形であり、内腔から基底層にまで拡がっている。細胞質は薄桃色に染色され、数個の小さいＰＡＳ陽性アルシアン青陰性顆粒が細胞質に観察される。基底細胞は、基底膜の直ぐ上に位置するが、気道内腔にまでは及ばない、大きな核を有する小さい平板状の細胞である。
【０１３４】
杯細胞産生の定量
杯細胞産生は、他に記載されている半自動イメージング・システム（Ｗｅｂｅｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：２９４−２９７）を使用して、粘膜表面上皮上のアルシアン青／ＰＡＳ染色粘液物質の体積密度により決定した。本発明者らは、アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色面積及び総上皮面積を測定し、アルシアン青−ＰＡＳにより染色された面積の総面積に対する割合（％）としてデータを表した。分析は、パブリック・ドメインＮＩＨイメージ（Ｉｍａｇｅ）プログラム（米国国立衛生研究所で開発され、インターネットを介してｚｉｐｐｙ．ｎｉｍｈ．ｇｏｖからアノニマスＦＴＰで、又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ，ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ ＰＢ９５−５００１９５ＧＥＩからフロッッピーディスクで入手可能である）を用いて実施した。
【０１３５】
ラット上皮におけるＥＧＦ−Ｒの免疫組織化学的局在部位決定
ＥＧＦ−Ｒの局在部位は、ラット気管の凍結切片において、ＥＧＦ−Ｒに対する抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた免疫組織化学的染色を使用して調査した。１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳによる灌流の後、組織を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳの中に１時間置き、次いで凍結保護のため３０％ショ糖中に一晩取り出した。気管をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋し、凍結させた。凍結切片（５μｍ）を切断し、ガラス・スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上に置いた。免疫染色はインビトロ研究と同様にして実施した。
【０１３６】
プローブの調製
ラットＭＵＣ５のｃＤＮＡは、キャロル バスマウム（Ｃａｒｏｌ Ｂａｓｂａｕｍ）博士より譲り受けた。ラットＭＵＣ５の３２０ｂｐのｃＤＮＡ断片を、転写ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＸｂａ／ｈｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。インサイチュー・ハイブリダイゼーション用のＲＮＡプローブを調製するため、このラットＭＵＣ５ ｃＤＮＡ断片を含有している組換えプラスミドを直鎖化し、アンチセンス・プローブ又はセンス・プローブを得るため、それぞれＴ７又はＴ３ポリメラーゼを用いてインビトロ転写した。インサイチュー・ハイブリダイゼーション用のプローブは、［３５Ｓ］ＵＴＰの存在下で作製した。転写後、ｃＤＮＡ鋳型をＤＮａｓｅで消化し、放射標識ＲＮＡをセファデックスＧ−２５クイックスピン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ）（商標）カラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）により精製し、エタノール／酢酸アンモニウム溶液中で沈殿させた。使用前、ＲＮＡプローブを７０％エタノールで洗浄し、１０ｍＭ ＤＴＴで希釈した。
【０１３７】
インサイチュー・ハイブリダイゼーション
凍結切片（５μｍ）を切断し、正の電荷を有するガラス・スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）の上に置いた。センス・プローブ及びアンチセンス・プローブを用いたハイブリダイゼーションのため、近位で切断された切片を使用した。代替的な切片を、アルシアン青／ＰＡＳ染色のため使用した。標本を４％パラホルムアルデヒドで再固定し、０．５×ＳＳＣ中で再水和させ、次いで無水酢酸を含むトリエタノールアミンの中でアセチル化した。ハイブリダイゼーションは、２５００〜３０００ｃｐｍ／μｌのアンチセンス・プローブ又はセンス・プローブを含む５０％脱イオン化ホルムアミド、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、２０ｍＭジチオスレイトール、１０％デキストラン硫酸、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、及び０．５ｍｇ／ｍｌの超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて、５５℃で一晩実施した。ハイブリダイゼーション後の処理は、室温における２×ＳＳＣ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノールでの洗浄、室温における３０分間のＲＮａｓｅ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）とのインキュベーション、さらに５５℃における２時間の０．１×ＳＳＣ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノールでの洗浄、次いで室温における０．５×ＳＳＣでの洗浄からなっていた。標本を脱水和させ、空気乾燥させ、オートラジオグラフィーのため、コダックＮＢＴヌクレア・トラック・エマルジョン（Ｋｏｄａｋ ＮＢＴ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｃｋ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）でカバーした。４℃における７〜２１日間の感光後、スライドを現像し、固定し、ヘマトキシリンで対比染色した（２１）。
【０１３８】
統計
全てのデータが、平均±ＳＥＭで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、一元配置分散分析を使用した。分散分析において統計的有意性が同定された場合には、多重比較のためシェフェのＦ検定を使用した。帰無仮説の確率が０．０５未満である場合に、統計的有意差ありと見なした。
【０１３９】
結果
ＴＮＦαはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦ−Ｒの産生を刺激する
第一に、本発明者らは、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞がＥＧＦ−Ｒを構成的に発現しているか否かを決定した。イムノブロットのウェスタン分析により、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞のコンフルエント培養物中のＥＧＦ−Ｒタンパク質の存在が同定された（図１Ａ、右）。コンフルエントになった後、細胞を調査した。溶解物を８％アクリルアミドゲル上で電気泳動させ、抗ＥＧＦ−Ｒ抗体でブロットした。マーカー・タンパク質の分子量は右側に報告されている。ＥＧＦ−Ｒの陽性対照は、ＥＧＦ−Ｒを構成的に発現している（Ｗｅｂｅｒら（前記））Ａ４３１細胞に由来するタンパク質であった（図１Ａ、左）。抗ＥＧＦ−Ｒ抗体を用いた免疫細胞化学的研究により、陽性染色が明らかとなり、それは分裂中の細胞において最も著しかった（図１Ｂ、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の培養物における抗ＥＧＦ−Ｒ抗体を用いた免疫細胞化学的分析）。コンフルエンス時、陽性染色が観察され、それは分裂中の細胞において最も強かった（矢印、右側）。一次抗体の非存在下では、染色は存在しなかった（左側）。ノーザン・ブロッティングにより、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）がＥＧＦ−Ｒ遺伝子発現を上方制御することが示され、その効果は１２時間後に存在し、２４時間後に増加した（図１Ｃ、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦ−Ｒのノーザン分析）。分析は、１２時間又は２４時間、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートされたコンフルエント培養物から抽出された全ＲＮＡに対して実施した。ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロース・ゲル上で電気泳動させ、ナイロン膜へ転写し、３２Ｐ−標識ＥＧＦ−Ｒ ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、膜を洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。
【０１４０】
ＥＧＦ−ＲリガンドはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における粘液糖質複合体の発現及びＭＵＣ５遺伝子発現を刺激する
ＥＧＦ−ＲはＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において構成的に発現されているため、本発明者らは、ＥＧＦ−Ｒリガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦα）の、粘液糖質複合体の産生を誘導する能力を査定した（図２、上カラム、ムチン糖タンパク質の同定のためのＮＣＩ−Ｈ２９２細胞のアルシアン青／ＰＡＳ染色）。上カラム＝阻害剤の非存在下での細胞のインキュベーション；下カラム＝ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２（１０μｇ／ｍｌ）の存在下でのインキュベーション。細胞を単独でインキュベートした場合には（対照）、いくつかのＰＡＳ陽性染色が観察され（矢印、上カラム）；ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）単独とのインキュベーションは染色に影響を与えず；ＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）又はＴＧＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）とのインキュベーションはＰＡＳ陽性染色を増加させ（矢印）、ＴＮＦα＋ＴＧＦαとのインキュベーションは染色を著しく増加させた（矢印、上カラム）。
【０１４１】
いくつかの対照細胞は染色を示し；ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）単独とのインキュベーションは染色に影響を与えず；ＥＧＦ又はＴＧＦα（それぞれ２５ｎｇ／ｍｌ）のいずれかとのインキュベーションはＰＡＳ陽性染色を増加させ（矢印）；ＴＮＦα＋ＴＧＦαとのインキュベーションは、いずれかのリガンド単独の場合よりもはるかに多く染色を増加させた。このように、ＥＧＦ−Ｒリガンドは、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において粘液糖質複合体を誘導する。
【０１４２】
ＭＵＣ５遺伝子発現を調査するため、ノーザン・ブロッティングを実施した（図３）。全ＲＮＡ（１０μｇ）を細胞から抽出し、ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で電気泳動させ、ナイロン膜へ転写し、３２Ｐ標識ＭＵＣ５ ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、膜を洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。ＭＵＣ５遺伝子発現に関して、１２時間（上カラム）又は２４時間（下カラム）の、培地単独（Ｃ）、ＥＧＦもしくはＴＧＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）、又はＴＮＦαとＥＧＦもしくはＴＧＦαのいずれかとの組み合わせを用いた培養物を得た。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２；１０μｇ／ｍｌ；下カラム）とのプレインキュベーション後、ＴＮＦαとＥＧＦ又はＴＧＦａのいずれかとを用いた培養物も得た。阻害剤は、ＭＵＣ５遺伝子発現を防止した。
【０１４３】
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、対照状態において、ある程度の発現を示し（図３、左下カラム）；細胞をＥＧＦ又はＴＧＦαと共にインキュベートした場合、ＭＵＣ５遺伝子発現は１２時間後にはほとんど認められなかったが、２４時間後には明確に発現した。ＴＮＦαは、単独では、ＭＵＣ５遺伝子発現に影響を与えなかったが、ＥＧＦ−Ｒリガンドと共にインキュベートされた細胞へＴＮＦαを添加した場合には、ＭＵＣ５遺伝子発現は、ＥＧＦ−Ｒリガンド単独によって引き起こされたレベルよりも著しく高く増加した（図３）。
【０１４４】
ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２）はＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における粘液糖質複合体の発現及びＭＵＣ５遺伝子発現を防止する
ＥＧＦ−Ｒ受容体の活性化がＭＵＣ５遺伝子発現を誘導するという仮説を検証するため、細胞をＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２と共にインキュベートした。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞をＢＩＢＸ１５２２（１０μｇ／ｍｌ）で前処理した場合、対照状態におけるＰＡＳ陽性染色が阻害され、ＥＧＦ−Ｒリガンドにより起こる染色の増加が著しく阻害された（図２、下カラム）。ノーザン分析において、ＴＮＦαとＥＧＦ又はＴＧＦαとの組み合わせにより著しく増加したＭＵＣ５遺伝子発現は、ＢＩＢＸ１５２２とのプレインキュベーションにより完全に阻害された（図３、下カラム）。これらの結果は、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるムチン遺伝子及び粘液糖タンパク質の誘導に、ＥＧＦ−Ｒの活性化が関与していることを示している。
【０１４５】
ＴＮＦαはラットにおけるＥＧＦ−Ｒ産生を刺激する
（構成的には気道上皮杯細胞をほとんど有しない）病原体除去ラットを、まずＴＮＦαの役割に関して研究した。対照状態において、気管上皮はＥＧＦ−Ｒ陽性細胞をほとんど含有していなかった（図４Ａ、左）。しかしながら、ＴＮＦα（２００ｎｇ）の気管内注入により、気管上皮の様々な細胞型においてＥＧＦ−Ｒタンパク質が誘導された（図４Ａ、右）。ＥＧＦ−Ｒ陽性染色は、杯細胞（Ｇ）、前杯細胞（Ｐ−Ｇ）、非顆粒形成分泌細胞（Ｓ）、及び基底細胞（Ｂａ）に存在したが、線毛細胞には存在しなかった。このように、ＴＮＦαは、ＥＧＦ−Ｒタンパク質産生を誘導する。
【０１４６】
ラットにおける粘液糖質複合体の産生及びＭＵＣ５遺伝子発現におけるＥＧＦ−Ｒリガンドの役割
対照状態において、気管上皮は杯細胞及び前杯細胞をほとんど含有していなかった。ＥＧＦ−Ｒリガンド、ＥＧＦ（６００ｎｇ；示していない）又はＴＧＦα（２５０ｎｇ；表１）単独の気管内注入は、上皮における粘液糖質複合体の産生に対する影響を有していなかった。しかしながら、まずＴＮＦα（２００ｎｇ）を与え、続いて２４時間以内にＥＧＦ又はＴＧＦαを与え（表１）、４８時間後に動物を安楽死させた場合には、アルシアン青／ＰＡＳ染色が著しく増加し、杯細胞及び前杯細胞の数が著しく増加したが、細胞の総数又は線毛細胞数は変化しなかった（表１）。ＭＵＣ５遺伝子に関するインサイチュー・ハイブリダイゼーションにより、対照動物においては発現が示されなかった。ＴＮＦαに続いてＥＧＦ又はＴＧＦαを気管内に注入した場合には、ＭＵＣ５の発現が上皮において可視となった。このように、ＥＧＦ−Ｒの誘導又はＥＧＦ−Ｒリガンドによる刺激は、単独では、杯細胞化生又は粘液糖質複合体の産生を誘導するのに不十分であった。しかしながら、ＴＮＦαによるＥＧＦ−Ｒの誘導後には、ＥＧＦ−Ｒリガンドの注入により杯細胞化生が著しく刺激された。
【０１４７】
【表１】気管上皮における細胞分析
2004503599.tif 000003
ラットにおける気管上皮細胞に対するメディエータ及びオボアルブミン感作の効果。細胞は「方法」に記載のようにして分析された。各群５匹のラット。特徴決定は、（粘液糖質複合体を染色する）アルシアン青（ＡＢ）／ＰＡＳ染色により補助された。細胞の計数に加え、総上皮面積のうちＡＢ／ＰＡＳ染色面積が占める割合（％）を計算した。対照気道、及びＴＧＦα（２５０ｎｇ）単独で刺激された気道は、杯細胞及び前杯細胞をほとんど含有しておらず；ＡＢ／ＰＡＳによる染色はほとんど存在しなかった。ＴＮＦα（２００ｎｇ）に続いてＴＧＦαで刺激することにより、杯細胞及び前杯細胞の数が増加し、ＡＢ／ＰＡＳ染色細胞が占める面積が増加した。腹腔内（ｉｐ）のオボアルブミン（ＯＶＡ）によるラットの感作は、細胞分布又はＡＢ／ＰＡＳ染色に対する効果を有していなかったが、ＯＶＡをｉｐで与えた後、ＯＶＡを気管内（ｉｔ）に注入した場合には、杯細胞及び前杯細胞、並びにＡＢ／ＰＡＳ染色が占める面積の割合（％）の著しい増加が見られた。
【０１４８】
ラットにおけるオボアルブミン感作はＥＧＦ−Ｒ及び杯細胞産生を誘導する
急性喘息による死亡は、気道の粘液閉塞によることが報告されているため、病原体除去ラットにおいて喘息のモデルを作製した。０日目及び１０日目にオボアルブミン（１０ｍｇ、ｉｐ）を注射しても、杯細胞過形成は刺激されなかった（表１）。しかしながら、これに続いて、２０日目、２２日目、及び２４日目にオボアルブミン（１００μｌ中０．１％）を３回気管内（ｉ．ｔ．）注入し、２６日目に動物を安楽死させた場合には、杯細胞及び前杯細胞が著しく増加し；線毛細胞及び基底細胞の数は不変であった（表１、右側）。抗ＥＧＦ−Ｒ抗体を用いた免疫組織化学的研究は、対照気管において染色を示さなかった。ｉ．ｐ．及びｉ．ｔ．の両方で感作された動物は、ＡＢ／ＰＡＳで陽性染色された細胞（図４Ｂ、右）において選択的にＥＧＦ−Ｒ染色を示した（図４Ｂ、左）。オボアルブミン（０．１％、１００ｍｌ）の３回の気管内注入の後、杯細胞及び前杯細胞においてＥＧＦ−Ｒ免疫反応性が強く発現され（左下）、同一細胞がアルシアン青／ＰＡＳで陽性染色された（右下）。このように、オボアルブミン喘息モデルは、ＥＧＦ−Ｒを産生する細胞において杯細胞増殖を示した。
【０１４９】
ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２）は、ラットにおけるＴＮＦα＋ＥＧＦ−Ｒリガンドの注入及びオボアルブミン感作により誘導される杯細胞産生を防止する
ＢＩＢＸ１５２２は、培養細胞におけるムチン産生を防止したため、この阻害剤の効果を、病原体除去ラットにおいて調査した。ＴＮＦαに続いてＥＧＦ−ＲリガンドＴＧＦαを気管内注入することにより増加したアルシアン青／ＰＡＳ染色は、ＢＩＢＸ１５２２（３〜３０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ；図５Ａ）による前処理により用量依存的に阻害された。（ＥＧＦ−Ｒを誘導するための）ＴＮＦαに続いてＥＧＦ−ＲリガンドＴＧＦαを気管内注入することにより、著しい杯細胞化生が引き起こされた。
【０１５０】
オボアルブミンで感作されたラットにおいては、ＢＩＢＸ１５２２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）での前処理により、杯細胞の産生が完全に阻害された（アルシアン青／ＰＡＳ染色により評価；図５Ｂ）。ｉ．ｐ．でのみオボアルブミンを与えられた動物は、気管支上皮におけるＡＢ／ＰＡＳ陽性染色をほとんど示さなかった。まずｉ．ｐ．でＯＶＡ感作され、続いてＯＶＡを３回気管内（ｉ．ｔ．）注入された動物は、ＡＢ／ＰＡＳ陽性染色の顕著な増加を示した。
【０１５１】
これらの研究は、ＥＧＦ−Ｒが、ＥＧＦ−Ｒリガンドにより刺激された場合、インビトロ及びインビボで杯細胞産生を誘導すること、その効果が、ＥＧＦ−Ｒの活性化によるものであり、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤により阻止されたことを示している。オボアルブミン喘息モデルにおいても、阻害剤は杯細胞産生の防止において有効であった。
【０１５２】
杯細胞誘導のメカニズムの記載に加え、当結果は、ＥＧＦ−Ｒの発現に基づく杯細胞産生の展開に関する、可能性のある順序を示唆している。ＴＮＦαによる刺激により非顆粒形成分泌細胞の強い染色が誘導され；それに続くＥＧＦ−Ｒリガンドによる活性化により、進行的に細胞質内の粘液糖質複合体の染色が引き起こされ、細胞が「前杯細胞」となり、次いで「杯」細胞となった。ＴＮＦαの注入に続くＥＧＦ−Ｒリガンドの注入により、上皮細胞の総数は改変されることなく杯細胞産生が誘導され、このことから、ＥＧＦ−Ｒ活性化により選択的な細胞分化（増殖ではない）が促進されたことが示唆される。その所見から、杯細胞が、ＥＧＦ−Ｒを発現する非顆粒形成分泌細胞に由来しており、ＥＧＦ−Ｒリガンドにより刺激されてムチンを産生することが示唆される。
【０１５３】
急性喘息で死亡した患者において、杯細胞過形成及び粘液栓塞は重要な所見である。マウス喘息モデルにおいては、気道の感作が、オボアルブミンの反復注入の後に起こり、顕著な気道杯細胞の過形成を引き起こした。本発明者らは、対照気道上皮には発現していないＥＧＦ−Ｒが、感作された動物においては発現していることを示している。染色された細胞は前杯細胞及び杯細胞であり、このことから、ＥＧＦ−Ｒが杯細胞産生に関与していることが示唆される。ＥＧＦ−Ｒ受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２）による前処理により、気道杯細胞産生が防止されたが、このことは、実験的喘息における杯細胞産生におけるＥＧＦ−Ｒ活性化の役割を確証している。
【０１５４】
当結果は、杯細胞過形成にＥＧＦ−Ｒ経路が関与していることを示している。オゾン、二酸化硫黄、ウイルス、リポ多糖、血小板活性化因子、及びインターロイキン−４のような様々な刺激が、ムチンの産生及び分泌を上方制御することが、以前の研究から示されている。本発明は、これらの炎症刺激とＥＧＦ−Ｒ系との関係を評価するためのメカニズムを提供する。
【０１５５】
喘息は、本発明の治療戦略の一例として使用されている。正常ヒト気道上皮は、杯細胞１個に対し３〜１０個という比率の線毛細胞を有する。喘息において、杯細胞の数は線毛細胞と等しいか、又はそれよりも多く；喘息発作重積状態で死亡する患者においては、喘息以外の呼吸器疾患で死亡する患者における数と比較して、杯細胞が占める面積の割合（％）が３０倍増加している。杯細胞の産生の阻害は、この過剰分泌の起源を排除するはずである。杯細胞の生活環は不明であるため、治療による杯細胞過形成の消散の経過は正確には予測することができない。さらなるアレルゲンへの曝露が存在しない場合、以前に感作されたマウスにおける杯細胞過形成は、その他のアレルギー性炎症の兆候と共に５０日以内に消散した。ＥＧＦ−Ｒ活性化の阻害は、杯細胞の寿命によっては、はるかに迅速に杯細胞過形成を阻害する可能性がある。最近、高度に選択的なＡＴＰ競合性チロシンキナーゼ阻害剤が報告された。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦ−Ｒ発現と関連した悪性疾患の治療のための評価を受けている途中である。
【０１５６】
過剰分泌は、多くの慢性炎症性気道疾患における主要な兆候である。現在、これらの疾患の症状を緩解させ、進行を停止させるための有効な療法は存在しない。当所見は、ＥＧＦ−Ｒ活性化を阻害することにより杯細胞産生が防止されるという、療法のためのメカニズム及び戦略を提供する。ＥＧＦ−Ｒ活性化の阻害剤が、過剰分泌性気道疾患における療法として提唱される。
【０１５７】
実施例２
杯細胞の産生における酸化ストレスの役割
ヒトにおいて、長期にわたる喫煙は、杯細胞過形成を含む末梢気道における進行性の病理学的変化と関連していることが示唆されている。同様に、動物における実験的な喫煙モデルは、気道における杯細胞過形成を引き起こすことが示されている。しかしながら、タバコ煙がムチン合成を誘導するメカニズムは不明である。以下のデータは、炎症誘発性サイトカインにより活性化された好中球及びタバコ煙が、非リガンド依存性のＥＧＦ−Ｒの活性化を介して、ヒト気管支上皮細胞におけるＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こすことを証明する。これらの結果は、動員された好中球及びタバコ煙が、気道におけるムチン産生細胞の異常な誘導を引き起こしうる、上皮細胞分化の制御因子であることを暗示する。
【０１５８】
方法
好中球の単離
健康なヒト・ドナーから得られた末梢血よりヒト好中球を精製した。好中球の単離は、フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配分離、デキストラン沈降、及び赤血球の低張溶解の標準的な技術により実施した。細胞は、通常、トリパンブルー色素排除によると９５％超が生存していた。内毒素混入を防止するため、全ての溶液を、０．１μｍフィルターに通した。
【０１５９】
細胞培養
ヒト肺粘膜性類表皮癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、加湿５％ＣＯ２水ジャケット付きインキュベーター内で、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及びヘペス（２５ｍＭ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地の中で増殖させた。６穴培養プレート又は８チャンバー・スライドのいずれかを、細胞を培養するために使用した。コンフルエントになった時点で、細胞を、好中球単独（１０６細胞／ｍｌ）、ＴＮＦα単独（組換えヒトＴＮＦα、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＩＬ−８単独（組換えヒトＩＬ−８、１０−８Ｍ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ｆＭＬＰ単独（１０−８Ｍ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＴＮＦα＋好中球、ＩＬ−８＋好中球、ｆＭＬＰ＋好中球、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、２００μＭ）、タバコ煙溶液、又はＴＧＦα（組換えヒトＴＧＦα、０．１〜２５ｎｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、新鮮な培地単独と共にインキュベートした。予め選択された時点で実験を終了させた（ｍＲＮＡについては６時間及び１２時間；タンパク質については２４時間）。対照として、同じ時間、培地単独と共に細胞をインキュベートした。好中球を用いた別の研究においては、ＴＮＦαがＭＵＣ５ＡＣ合成に対して最も強い効果を有していたため、ＴＮＦαを刺激として選択した。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートされた好中球と共に１時間インキュベートし、次いで上清（例えば、好中球から放出された分子）の混入を回避するため無菌ＰＢＳで洗浄するか、又はＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を上清のみと共にインキュベートした。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤を用いた阻害研究においては、刺激を添加する３０分前に、ＢＩＢＸ１５２２（１０μｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｉｎｃ．，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙより譲り受けた）又はチルホスチンＡＧ１４７８（１０μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を前処理した。血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼの選択的阻害剤（チルホスチンＡＧ１２９５、１００μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、及びチルホスチンの陰性対照（チルホスチンＡ１、１００μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の効果も調査した。ＥＧＦ−Ｒリガンドに対する阻止抗体を用いた阻害研究においては、上清を抗ＴＧＦα抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）又は抗ＥＧＦ抗体で３０分間前処理し、次いでＮＣＩ−Ｈ２９２細胞へ添加した。酸素フリーラジカルの役割は、酸素フリーラジカルのスカベンジャーＤＭＳＯ（１％、Ｓｉｇｍａ）、１，３−ジメチル−２−チオ尿素（ＤＭＴＵ、５０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、又はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、３００Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を使用して調査した。
【０１６０】
タバコ煙溶液の調製
研究用タバコ（コード２Ｒ１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎのため作製された）を研究に使用した。タバコ煙溶液は、以前に記載されたようにして調製された（Ｄｕｓｓｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：９００−９０６）。簡単に説明すると、１分当たり１回の速度でタバコ煙をポリプロピレン製シリンジ（３５ｍｌ）に吸引し（１０回）、５０ｍＭヘペス緩衝液を含有する２０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０へと徐々に通した。次いで、煙溶液をｐＨ７．４に滴定し、調製直後に使用した。
【０１６１】
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における粘液糖質複合体及びＭＵＣ５ＡＣタンパク質の可視化
実験の最後に、８チャンバー・スライドで増殖させた細胞を、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、次いで粘液糖質複合体を可視化するためアルシアン青／過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色するか、又はＭＵＣ５ＡＣの免疫細胞化学のため使用した。ＭＵＣ５ＡＣの免疫細胞化学のため、０．０５％ツィーン２０、２％正常ヤギ血清、及びレバミゾール（２ｍＭ）を含有するＰＢＳを、抗体の希釈剤として使用した。細胞をＭＵＣ５ＡＣに対するマウスｍＡｂ（クローン４５Ｍ１、１：２００、Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）と共に室温で１時間インキュベートし、次いで過剰の一次抗体を除去するためＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を１：２００希釈のビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。
【０１６２】
ヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子に関するインサイチュー・ハイブリダイゼーション
ヒトＭＵＣ５ＡＣの２９８ｂｐのｃＤＮＡ断片を、ＴＡクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に挿入した。ＲＮＡプローブの調製及びインサイチュー・ハイブリダイゼーションは、前記と同様にして実施した。
【０１６３】
ＭＵＣ５ＡＣタンパク質のイムノアッセイ法
前記と同様にしてＭＵＣ５ＡＣタンパク質を測定した。簡単に説明すると、複数の希釈率の細胞溶解物をＰＢＳを用いて調製し、各試料５０μｌを９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で重炭酸−炭酸緩衝液（５０μｌ）と共に４０℃で乾燥するまでインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２％ＢＳＡ（第Ｖ画分、Ｓｉｇｍａ）で室温で１時間ブロッキングした。プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．０５％ツィーン２０を含有するＰＢＳで希釈されたマウス・モノクローナルＭＵＣ５ＡＣ抗体（１：１００）５０μｌと共にインキュベートした。１時間後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ結合体（１：１０，０００、Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに分配した。１時間後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。発色反応をＴＭＢペルオキシダーゼ溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて起こさせ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１６４】
ＴＧＦαタンパク質の定量的分析
市販のＥＬＩＳＡキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して、製造業者の指示に従い、ＴＧＦαタンパク質を測定した。好中球＋ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）の１時間のインキュベーションの後、採取された上清を、１％トライトン Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、及びいくつかのプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する溶解緩衝液ＰＢＳと混合し、次いでＴＧＦαを測定するために使用した。
【０１６５】
ＥＧＦ−Ｒタンパク質の免疫沈降及びチロシン・リン酸化に関するイムノブロッティング
細胞を無血清培地で２４時間培養し、次いでＴＧＦα、Ｈ２Ｏ２、又は活性化された好中球の上清で１５分間刺激した。刺激後、細胞を溶解させ、回転式振とう器中で４℃で３０分間インキュベートした。不溶性材料を除去するため、細胞溶解物を１４，０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離した。等量のタンパク質を含有する上清の一部を、抗ＥＧＦ受容体抗体（ポリクローナル、Ａｂ４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及び２０μｌのプロテインＡ−アガロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて４℃で２時間免疫沈降させた。沈降物を０．５ｍｌの溶解緩衝液で３回洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液に懸濁させ、５分間加熱した。タンパク質を８．０％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。得られたゲルを転写緩衝液（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、２０容量％メタノール、ｐＨ８．３）中で平衡化した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜（０．２２μｍ）へ電気泳動により転写し、５％無脂肪スキムミルクを含む０．０５％ツィーン２０含有ＰＢＳで一晩ブロッキングし、次いでモノクローナル抗ホスホチロシン抗体（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共に１時間インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法のための標準的なプロトコル（ＡＢＣ ｋｉｔ， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従い、結合した抗体を可視化した。
【０１６６】
統計
全てのデータが、平均±ＳＥＭで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、一元配置分散分析を使用した。分散分析において統計的有意性が同定された場合には、多重比較のため、シェフェのＦ検定を使用した。帰無仮説の確率が０．０５未満である場合、統計的有意差ありと見なした。
【０１６７】
結果
活性化された好中球はムチンＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こす
好中球＋好中球を活性化する刺激（ＩＬ−８、ｆＭＬＰ、ＴＮＦα）を、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞と共に１時間インキュベートした場合、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成は２４時間以内に有意に増加したが、未刺激好中球（１０６／ｍｌ）、ＩＬ−８単独、又はｆＭＬＰ単独は、ＭＵＣ５ＡＣ合成に対する効果を示さず；ＴＮＦα単独とのインキュベーションは小さな非有意なＭＵＣ５ＡＣ合成の増加を引き起こした。好中球をＴＮＦαと共に１時間プレインキュベートし、次いで好中球とそれらの上清を分離した場合、それに続き上清をＮＣＩ−Ｈ２９２細胞と共に１時間インキュベートすることにより、１２時間以内にＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現が上方制御され、アルシアン青／ＰＡＳ及びＭＵＣ５ＡＣタンパク質に対する抗体の両方による染色が２４時間以内に刺激され；休止期ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現をほとんど示さず、アルシアン青／ＰＡＳ及びＭＵＣ５ＡＣタンパク質の両方の染色を小さく断片的に示した。上清により誘導されたＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成は、対照より有意に増加しており、インキュベーション後に上清から分離された好中球には効果がなかった。活性化された好中球は、ＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こす活性を有する産物を迅速に分泌するということが結論付けられた。
【０１６８】
ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤は活性化された好中球の上清により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成を防止する
ＥＧＦ−ＲリガンドはＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの活性化を介してＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こすことが知られているため、活性化された好中球の上清により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成におけるＥＧＦ−Ｒ活性化の役割を調査した。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を選択的ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２、ＡＧ１４７８）で前処理することにより、活性化された好中球の上清により通常は誘導されるＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成が防止された。選択的な血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＡＧ１２９５）及びチルホスチンの陰性対照（Ａ１）には効果がなかった。これらの結果は、活性化された好中球の上清により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成に、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの活性化が関与していることを示している。
【０１６９】
ＭＵＣ５ＡＣ合成における活性化された好中球の上清に分泌されるＥＧＦ−Ｒリガンドの役割
ＥＧＦ−ＲチロシンキナーゼがＥＧＦ−Ｒリガンド（ＥＧＦ及びＴＧＦα）に対し依存性であるか否かを決定するため、本発明者らは、活性化された好中球の上清を、ＥＧＦ−Ｒリガンドに対する中和抗体と共にプレインキュベートした。上清を抗ＴＧＦα抗体又は抗ＥＧＦ抗体で前処理することにより、活性化された好中球の上清により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成は阻害されなかった。さらに、上清中にＴＧＦαは検出されなかった。従って、活性化された好中球の上清により引き起こされるＥＧＦ−Ｒチロシンのリン酸化は、ＥＧＦ−ＲリガンドＥＧＦ及びＴＧＦαとは無関係のメカニズムにより誘導された。
【０１７０】
タバコ煙及び酸素フリーラジカルはＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こす
タバコ煙及び酸素フリーラジカルＨ２Ｏ２は、ＴＧＦαと同様に、１２時間以内にＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現を上方制御した。同様に、全ての刺激がＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成及び粘液糖質複合体産生を２４時間以内に増加させ、この効果は用量依存的に起こった。Ｈ２Ｏ２に応答して起こる最大のＭＵＣ５ＡＣ合成は、ＴＧＦαに対する応答よりも有意に少なかった。ＡＧ１４７８による前処理により、全ての刺激により誘導されるＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成の増加が防止され、このことから、刺激が、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの活性化によりムチン合成を引き起こすことが示された。活性化された好中球の上清、タバコ煙、及びＨ２Ｏ２によるＭＵＣ５ＡＣ合成は、フリーラジカル・スカベンジャー（ＤＭＳＯ及びＤＭＴＵ）及びＳＯＤによる前処理により有意に阻害されたが、ＴＧＦαによるＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成はＤＭＳＯ又はＳＯＤによる影響を受けなかった。
【０１７１】
活性化された好中球の上清及びＨ２Ｏ２によるＥＧＦ−Ｒのチロシン・リン酸化の誘導
ＥＧＦ−Ｒタンパク質の分布は、無血清培地で培養された対照、及び全ての刺激条件（活性化された好中球の上清、タバコ煙、Ｈ２Ｏ２、又はＴＧＦα）で類似していた。全タンパク質チロシン・リン酸化は、活性化された好中球の上清、タバコ煙、Ｈ２Ｏ２、又はＴＧＦαを添加してから１５分以内に起こり；無血清培地で培養された対照は効果を示さなかった。ＴＧＦαにより誘導される全タンパク質チロシン・リン酸化は、活性化された好中球の上清、タバコ煙、又はＨ２Ｏ２の効果よりも大きかった。ＥＧＦ−Ｒがリン酸化されたか否かを決定するため、抗ＥＧＦ−Ｒ抗体による免疫沈降を実施した。活性化された好中球の上清、タバコ煙の可溶性産物、及びＨ２Ｏ２は全て、ＥＧＦ−Ｒ特異的なチロシン・リン酸化を１５分以内に誘導し、その効果はＴＧＦαにより引き起こされた効果と類似していた。ＡＧ１４７８によるＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の前処理により、全ての刺激によるＥＧＦ−Ｒチロシン・リン酸化が阻害された。ＤＭＳＯは、上清、タバコ煙、及びＨ２Ｏ２により誘導されるＥＧＦ−Ｒチロシン・リン酸化を阻害したが、ＤＭＳＯは、ＴＧＦαにより誘導されるＥＧＦ−Ｒチロシン・リン酸化に対する効果は有していなかった。
【０１７２】
上記の結果は、好中球が、ＩＬ−８、ｆＭＬＰ、又はＴＮＦαにより活性化されたとき、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるムチンＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こすことを示している。さらに、好中球とＴＮＦαとのインキュベーションの１時間後に収集された上清は、ＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こし、その効果は選択的ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤により阻害された。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの阻害により、活性化された好中球の上清により引き起こされるＭＵＣ５ＡＣ合成は完全に阻止され；非ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤である、選択的な血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＡＧ１２９５）及びチルホスチンの陰性対照（Ａ１）には効果がなく、このことは、ＥＧＦ−Ｒチロシン・リン酸化が、活性化された好中球の上清により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成のシグナル伝達経路であることを暗示している。
【０１７３】
活性化された好中球の上清がＥＧＦ−Ｒチロシン・リン酸化を誘導するメカニズムをさらに分析するため、リガンド依存性及び非リガンド依存性両方のＥＧＦ−Ｒ経路を調査した。第一に、活性化された好中球の上清の中のＴＧＦαを測定し、上清が測定可能な量のＴＧＦαを含有していないことを見出した。以前の報告より、好中球が低濃度（２．５ｐｇ／１０６細胞）のＴＧＦαのみを含有していることが示されている。活性化された好中球の上清のＭＵＣ５ＡＣ合成に対する効果は、好中球中に見出されるＴＧＦαの量よりも４００倍多い１ｎｇのＴＧＦαの効果と同等の強さであった。第二に、本発明者らは、ＥＧＦ−Ｒリガンドの中和抗体を用いた阻止研究を実施した。ＥＧＦ及びＴＧＦαに対する中和抗体による前処理により、活性化された好中球の上清により引き起こされるＭＵＣ５ＡＣ合成は阻害され得なかった。これらの結果より、好中球の上清により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成が、好中球によるＥＧＦ−Ｒリガンド（ＴＧＦα及びＥＧＦ）の分泌によるのではないことが示唆される。次に、本発明者らは、非リガンド依存性経路を調査した。酸素フリーラジカルは活性化中の好中球により放出され、様々な細胞におけるＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼのトランス活性化を引き起こすことが知られているため、本発明者らは、活性化された好中球による酸素フリーラジカルの放出が、ＥＧＦ−Ｒチロシン・リン酸化を引き起こし、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こすのだという仮説を立てた。フリーラジカルのスカベンジャー（ＤＭＳＯ及びＤＭＴＵ）及びＳＯＤにより、活性化された好中球の上清によるＭＵＣ５ＡＣ合成が阻害された。ＴＮＦαは、懸濁液中の好中球において酸化的破裂を引き起こし、その最大応答は１時間以内に起こることが報告されているが；本発明の結果は、同様の経過を示した。
【０１７４】
Ｈ２Ｏ２は、酸化的破裂において好中球から放出される主要産物であるが、当研究において、外因性Ｈ２Ｏ２は、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こした。しかしながら、ＭＵＣ５ＡＣ合成におけるＨ２Ｏ２に対する最大応答は、ＴＧＦαに対する応答のわずか半分であった。当研究における重要な所見は、タバコ煙が単独でＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こしたという事実である。これは、タバコ煙が直接的な刺激及び好中球の動員により引き起こされる間接的な刺激の両方により、インビボでＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こしうることを示唆している。ＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こすタバコ煙中の正確な分子は、未だ不明である。タバコ煙は、複数の産物（例えば、ニコチン、タール、アクロレイン、及び酸化剤）を含有していることが示されている。本発明者らの実験において、ＤＭＳＯ及びＳＯＤはタバコ煙により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成を部分的に阻害した。従って、酸化ストレスは、この応答を起こさせる一つのメカニズムであるかもしれない。タバコ煙により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成が、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤により完全に阻止されたという事実は、ＥＧＦ−Ｒ活性化が、タバコ煙により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成において主要な役割を果たしていることを示している。
【０１７５】
気道疾患において、好中球性の気道炎症は一般的な特徴であり、好中球はサイトカイン及びタバコ煙により動員され活性化される。当研究は、動員された好中球及びタバコ煙が、気道におけるムチン産生細胞の誘導を引き起こす上皮細胞分化の制御因子としても作用することを示している。最も重要なこととして、ＥＧＦ−Ｒ活性化の阻害は、過剰分泌性気道疾患における療法として有用であろう。
【０１７６】
実施例３
気道上皮の創傷は杯細胞化生を引き起こす
気道に注入されたアガロース・プラグは、気管支を閉塞させることなく気管支内に慢性的に留まり、そして残留したプラグは、炎症を引き起こし、杯細胞化生をもたらすであろうという仮説を立てた。アガロース・プラグは、アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色及びムチンＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現により示されるような、炎症細胞の局所的な動員と関連した顕著な局所的な杯細胞産生を誘導することが示される。この結果は、プラグにより誘導される杯細胞化生にＥＧＦ−Ｒ活性化が関与していることを示している。
【０１７７】
方法
動物
実験動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究に関する委員会により承認された。特定病原体除去雄Ｆ３４４ラット（体重２３０〜２５０ｇ；Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂ．，Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）を使用した。ラットは、環境的に調節された層流フードを有する病原体除去バイオクリーン（ＢｉｏＣｌｅａｎ）ケージに収容し、無菌の飼料及び水を自由に摂取させた。
【０１７８】
薬物
以下の供給元からの薬物を使用した。シクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、メトヘキシタールナトリウム（Ｂｒｅｖｉｔａｌ、Ｊｏｎｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ペントバルビタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂ．，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）；ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの選択的阻害剤ＢＩＢＸ１５２２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｉｎｃ．，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙより譲り受けた）は、２ｍｌのポリエチレングリコール４００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌ、及び３ｍｌの２％マンニトール水溶液（ｐＨ７．０）に溶解させた。ＮＰＣ１５６６９（白血球運動の阻害剤）は、Ｓｃｉｏｓ Ｎｏｖａ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡより譲り受けた。
【０１７９】
アガロース・プラグ
アガロース・プラグ（直径０．７〜０．８ｍｍ）は、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％アガロースＩＩ型中ＥＥＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて作成された。組織内のアガロース・プラグを可視化するため、５０℃でアガロースを融解させた後、３％の懸濁モナストラル・ブルー（Ｍｏｎａｓｔｒａｌ ｂｌｕｅ）Ｂ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した。
【０１８０】
実験プロトコル
病原体除去ラットは、通常、気道に杯細胞をほとんど有していないため、本発明者らは、病原体除去ラットを研究した。メトヘキシタール・ナトリウム（Ｂｒｅｖｉｔａｌ、２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で動物に麻酔をかけた。正中頸部切開により気管を無菌的に露出させ、切開された気管に通されたポリエチレン・チューブ（ＰＥ９０、内直径０．８６ｍｍ、外直径１．２７ｍｍ、Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＹ）と接続された２０ゲージのアンジオカス（Ａｎｇｉｏｃａｔｈ）（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎｄｙ，ＵＴ）を介して、アガロース・プラグを気管支内に注入した。右気管支に選択的に注入されるよう、ポリエチレン・チューブを３０°の角度で湾曲させた。注入後、切開部を縫合により閉鎖した。
【０１８１】
アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に対するＥＧＦ−Ｒの役割を評価するため、アガロース・プラグの注入の１時間前に、動物をＢＩＢＸ１５２２（８０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で処理し、毎日繰り返した（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、１日２回）。アガロース・プラグの注入から２４時間後、４８時間後、又は７２時間後に動物を安楽死させた。
【０１８２】
アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生におけるＴＮＦαの役割を評価するため、動物をＴＮＦα中和抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で処理した。最初の処理（０．２ｍｌ生理食塩水中１００μｌ、ｉ．ｐ．）はアガロース・プラグの注入の１時間前に与え、毎日ｉ．ｐ．注射を繰り返した。さらに、皮下に移植された浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ ２ＭＬ１，Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を介して、ＴＮＦα中和抗体を点滴注入した（１０μｌ／ｈ）。
【０１８３】
アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に対する好中球の効果を研究するため、ラットを、シクロホスファミド（骨髄白血球の阻害剤）又はシクロホスファミド＋ＮＰＣ１５６６９の組み合わせで前処理した。シクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）をアガロース・プラグ注入の５日前に与え、シクロホスファミド（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の第二の注射をプラグ注入の１日前に与えた。ＮＰＣ１５６６９を用いた研究においては、薬物（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）をアガロース・プラグ注入の１時間前に注射し、次いで以後３日間毎日注射した。
【０１８４】
全ての薬物（ＢＩＢＸ１５２２、ＴＮＦα中和抗体、シクロホスファミド、及びＮＰＣ１５６６９）を、アガロース・プラグ注入の１時間前にｉ．ｐ．で与え、３日間毎日投薬を繰り返した。
【０１８５】
組織の調製
アガロース・プラグ注入後の様々な時点で、ペントバルビタール・ナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）でラットに麻酔をかけ、全身循環系に１２０ｍｍＨｇの圧力で１％パラホルムアルデヒドを含むジエチルピロカルボネート（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理ＰＢＳを灌流した。右肺を摘出し、右尾状葉を組織学に使用した。凍結切片については、組織を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に１時間置き、次いで凍結保護のための３０％ショ糖中に一晩移した。組織をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋した。メタクリレート切片については、組織を４％パラホルムアルデヒド中に２４時間置き、次いで段階的な濃度のエタノールで脱水和させ、メタクリレートＪＢ−４（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）に包埋した。組織切片（厚さ４μｍ）を、アルシアン青／ＰＡＳで染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１８６】
気管支上皮の形態計測的分析
以前に発表された方法に従い、半自動画像分析システムを使用して、上皮内の粘液糖質複合体のアルシアン青／ＰＡＳ染色面積の割合（％）を決定した。上皮の面積及び上皮内のアルシアン青／ＰＡＳ染色粘液糖質複合体の面積を、手動で画定し、ＮＩＨイメージ・プログラム（米国国立衛生研究所で開発され、インターネットからアノニマスＦＴＰで、又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ，ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ ＰＢ９５−５００１９５ＧＥＩからフロッッピーディスクで入手可能である）を使用して分析した。総上皮面積のうちアルシアン青／ＰＡＳ染色が占める割合（％）としてデータを表した。粘液分泌を半定量的に評価するため、全長に対する比率として、陽性染色された長さを計算することにより、アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色が占める上皮表面の長さの割合（％）を決定した。全上皮長に対する剥皮上皮の長さの比率を計算することにより、剥皮上皮の割合（％）を決定した。
【０１８７】
メタクリレート切片における細胞型の同定及び細胞分析
油浸対物レンズ（倍率１０００倍）を用いて２ｍｍの基底層上の上皮細胞核を計数することにより、上皮細胞の総数を計数した。分析された上皮の各領域の下の基底層の直線的な長さは、基底層のディジタル化された画像の輪郭をトレースすることにより決定した。上皮細胞は、以前に記載されたようにして同定した。簡単に説明すると、基底細胞は、基底膜の直ぐ上に位置するが、気道内腔にまでは及ばない、大きな核を有する小さな平板状の細胞として同定された。細胞質は、暗く染色され、アルシアン青又はＰＡＳ陽性顆粒は存在しなかった。線毛細胞は、周縁部に線毛を有すること、細胞質が弱く染色されること、及び核が大きく丸いことにより認識された。非顆粒形成分泌細胞は、円柱形であり、気管支内腔から基底層にまで拡がっていた。アガロース・プラグの気管支内注入後、「発達中の」杯細胞（前杯細胞）が形成された。これらの細胞は、アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色を示し、顆粒は小さく、細胞には顆粒が充満しておらず；小さな粘液染色面積（基底膜から内腔表面までの上皮の高さの１／３未満）を含有しているか、又は低密度の弱くアルシアン青／ＰＡＳ染色される小さな顆粒を含有していた。未決定の型の細胞とは、妥当な分類のために十分な細胞質の特徴を欠いた細胞プロフィールと定義された。
【０１８８】
ＥＧＦ−Ｒの免疫組織化学的局在部位決定
ＥＧＦ−Ｒに対するモノクローナル・マウス抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した免疫組織化学的局在部位決定によりＥＧＦ−Ｒの存在を決定した。先に調製された４μｍの凍結切片を、４％パラホルムアルデヒドで後固定し、０．３％Ｈ２Ｏ２／メタノールで処理した。組織をＥＧＦ−Ｒ抗体（１：２５０希釈）と共にインキュベートした。３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色された抗原−抗体複合体を可視化するため、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（１：２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用し、続いてストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用した。陰性対照スライドは、一次抗体又は二次抗体のいずれかを省略し、ＰＢＳと交換して、インキュベートした。
【０１８９】
インサイチュー・ハイブリダイゼーション
キャロル バスマウム（Ｃａｒｏｌ Ｂａｓｂａｕｍ）博士より譲り受けたラットＭＵＣ５ＡＣの３２０ｂｐのｃＤＮＡ断片を含有するプラスミドから、［３５Ｓ］標識リボプローブを作製した。切片に、［３５Ｓ］標識ＲＮＡプローブ（２，５００〜３，０００ｃｐｍ／μｌハイブリダイゼーション緩衝液）をハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅＡ処理を含む高ストリンジェンシー条件下で洗浄した。７〜２１日間のオートラジオグラフィー後、写真感光乳剤を現像し、スライドをヘマトキシリンで染色した。
【０１９０】
気道上皮内の好中球の計数
気管支への好中球流入の評価を、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドで好中球を染色することにより実施し、好中球の数を、気道内腔及び上皮において計数し；結果を基底層長１ｍｍ当たりの染色された細胞の数として表した。
【０１９１】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）
各動物群における種類別細胞数を査定するため、肺を各３ｍｌの無菌ＰＢＳで５回洗浄し、洗浄液をプールし、容量を測定した。１，０００ｒｐｍで１０分間、洗浄液をスピンすることによりＢＡＬ中の細胞を収集した。次いで、ＢＡＬ液中の細胞数を決定するため、血球計を用いて、１０マイクロリットルの細胞懸濁液を計数した。ディフ−クイック（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ，ＩＬ）で染色されたサイトスピン調製物に対して、種類別細胞計数を実施した。種類別細胞計数は、各サイトスピン・スライド上に少なくとも２００個の細胞をサンプリングすることにより得られた。
【０１９２】
統計分析
データは、平均±ＳＥＭで表されている。統計分析のため、適宜、二元配置又は一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、続いてスチューデントｔ検定を使用した。０．０５未満の確率を、統計的有意差と見なした。
【０１９３】
結果
気道上皮構造に対する効果：杯細胞化生
アガロース・プラグが気道上皮の構造に影響を与えるか否かを決定するため、アガロース・プラグを５匹の病原体除去ラットの右気管支内に注入した。対照動物においては、気管支上皮はほとんど杯細胞を含有していなかった。しかしながら、アガロース・プラグの局所注入後、アルシアン青／ＰＡＳ染色により、杯細胞面積の時間依存的な増加が示され、それは注入から２４時間後に早くも検出可能となり、７２時間後に最大となった。２４時間後に、アガロース・プラグは前杯細胞及び杯細胞の数を有意に増加させ、４８時間後には、より多くの成熟杯細胞が見出された（表１）。７２時間後、アガロース・プラグは杯細胞の数を増加させたが（Ｐ＜０．０１）；基底細胞及び線毛細胞の数は変化しなかった（Ｐ＞０．０５）。注入から７２時間後の基底膜１ｍｍ当たりの上皮細胞の総数は、有意ではなかったが、わずかに増加し（Ｐ＞０．０５、表１）；上皮の高さ（上皮の基底膜から内腔表面までを測定）は、対照気道における１６．０±１．２μｍから、プラグ注入から７２時間後には３８．１±９．１μｍへと増加した（ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）。
【０１９４】
対照動物の気道内腔には、アルシアン青／ＰＡＳ染色が存在しなかった。しかしながら、アガロース・プラグと隣接した内腔には陽性染色が観察され、粘液糖質複合体の分泌が起こっていることが示された。アガロース・プラグを有する気道においては、染色は時間依存的に増加した。プラグと隣接した気道におけるアルシアン青／ＰＡＳ陽性染色が占める上皮の全長に対する割合（％）は、対照動物における０．１±０．１％から、２４時間後には４．７±１．４％、４８時間後には１３．３±０．７％、７２時間後には１９．１±０．７％へと増加した（ｎ＝５）。さらに、アガロース・プラグは、プラグを有する気管支の上皮を、２４時間後には１３．５±２．３％、４８時間後には６．９±２．４％、７２時間後には５．１±１．５％剥皮した（ｎ＝５）。
【０１９５】
ムチン遺伝子発現に対するアガロース・プラグの効果
対照ラットの気管支には、ＭＵＣ５ＡＣのアンチセンス・プローブにより検出可能なシグナルは存在しなかった（１群当たりｎ＝４）。アガロース・プラグが注入された気管支においては、ＭＵＣ５ＡＣのシグナルが２４時間から７２時間にかけて時間依存的に増加した（ｎ＝４）。ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現は、アルシアン青／ＰＡＳで陽性染色された細胞に優先的に見出された。他の細胞型（例えば、平滑筋、結合組織）には、シグナルが検出されなかった。ＭＵＣ５ＡＣセンス・プローブを用いて調査された切片は、発現を示さなかった。
【０１９６】
気道上皮におけるＥＧＦ−Ｒ発現に対するアガロース・プラグの効果
対照動物において、ＥＧＦ−Ｒに対する抗体を用いた免疫染色は、上皮における低密度の染色を示した。しかしながら、アガロース・プラグの注入後、アガロース・プラグと隣接した上皮は、アルシアン青／ＰＡＳで陽性染色された細胞におけるＥＧＦ−Ｒ陽性染色を示した。ＥＧＦ−Ｒに関する染色パターンは、ＭＵＣ５ＡＣ及びＡＢ／ＰＡＳに関する染色と平行していた。前杯細胞、杯細胞、及び非顆粒形成分泌細胞は、ＥＧＦ−Ｒに関して免疫陽性であった。線毛細胞は免疫反応性を示さなかった。アガロース・プラグにより閉塞されていない気道においては、上皮はＥＧＦ−Ｒに関する染色をほとんど示さず、対照動物における染色と類似しているようであった。
【０１９７】
杯細胞化生及びムチン遺伝子発現に対するＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤の効果
本研究において、アガロース・プラグの注入は、ムチンを産生する細胞におけるＥＧＦ−Ｒの発現を引き起こした。ＥＧＦ−Ｒは、チロシンキナーゼ受容体クラスのメンバーである。従って、ＥＧＦ−Ｒリガンド（ＥＧＦ又はＴＧＦα）がＥＧＦ−Ｒと結合すると、特異的なＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼが活性化される。従って、ＥＧＦ−Ｒ活性化が、アガロース・プラグの注入後のＭＵＣ５ＡＣ遺伝子及び粘液糖質複合体の発現を誘導するという仮説を検証するため、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２）をラットに腹腔内注射した。ＢＩＢＸ１５２２は、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にアガロース・プラグにより誘導される上皮のアルシアン青／ＰＡＳ染色面積を顕著に阻害した。プラグ注入から７２時間後、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現も完全に阻害された。
【０１９８】
杯細胞化生及びＥＧＦ−Ｒタンパク質発現に対するＴＮＦα中和抗体の効果
本発明者らは、アガロース・プラグにより引き起こされる炎症において、ＴＮＦαが放出されるという仮説を立てた。従って、本発明者らは、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に対する、ＴＮＦα中和抗体によるラットの前処理の効果を調査した。ＴＮＦα中和抗体で前処理された動物においては（ｎ＝５）、アガロース・プラグは、ＥＧＦ−Ｒタンパク質発現も、アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色（杯）細胞の産生も、もはや刺激しなかった。
【０１９９】
アガロース・プラグによる炎症細胞動員
アガロース・プラグが上皮傷害及び炎症細胞浸潤を引き起こすことが認められた。様々な炎症細胞が、ＴＮＦα及びＥＧＦ−Ｒリガンドの両方を産生しうる。ＥＧＦ−Ｒ及びそのリガンドの両方が、杯細胞化生へと至るＥＧＦ−Ｒカスケードに関与している。本発明者らは、アガロース・プラグにより誘導される効果における白血球及びマクロファージの役割を、二通りに評価した。第一に、本発明者らは、気管支肺胞洗浄において細胞を調査した。対照ラットにおいては、回収された細胞は主にマクロファージであった（ｎ＝５；図４、対照）。アガロース・プラグの注入後、マクロファージの数は増加し（Ｐ＜０．０５）、有意な数の好中球（Ｐ＜０．０１）が洗浄液中に出現した。リンパ球の数は不変であった。
【０２００】
組織切片内の浸潤細胞も評価した。アガロース・プラグを有しない気道には、ほとんど好中球が含まれていなかったが、プラグを含有する気道は、上皮にも内腔にも好中球の存在を示した。対照気道、並びにプラグ注入から２４時間後、４８時間後、及び７２時間後において、気道内腔の好中球の数は、それぞれ、基底層１ｍｍ当たり０．２±０．２、４２．４±７．１、４０．７±７．７、及び２０．１±７．２であった（Ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。さらに、対照、並びにプラグ注入から２４時間後、４８時間後、及び７２時間後において、気道上皮の好中球の数は、それぞれ、基底層１ｍｍ当たり１．３±０．４、１５．６±２．６、１４．９±１．４、及び１４．８±２．６であった（Ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。
【０２０１】
好中球動員、杯細胞化生、及びＥＧＦ−Ｒタンパク質発現に対するシクロホスファミドの効果
シクロホスファミドで処理されたラットにおいては、血中好中球が枯渇し（シクロホスファミド後の静脈血中の好中球数は１．８±０．５％、ｎ＝５）、プラグにより誘導されるＢＡＬへの好中球動員が阻害された。気道内腔（基底層１ｍｍ当たり２．６±０．３）及び上皮（０．８±０．２／ｍｍ）における好中球の数も、２４時間後に有意に減少した。シクロホスファミドは、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生及びＥＧＦ−Ｒタンパク質発現も阻害した。ロイメジン（ｌｅｕｍｅｄｉｎ）、ＮＰＣ１５６６９をシクロホスファミドに添加した場合の、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生の阻害は、シクロホスファミド単独の効果と類似していた。これらの結果は、プラグにより誘導される杯細胞化生に好中球が関与していることを示している。
【０２０２】
考察
当研究において、本発明者らは、対照状態においては杯細胞をほとんど有していない病原体除去ラットの気道における、杯細胞化生に対するアガロース・プラグ注入の効果を調査した。対照動物の気管支及びアガロース・プラグを含まない気管支（対照肺）における上皮細胞は、アルシアン青／ＰＡＳにより均一に陰性に染色された。アガロース・プラグの注入により、注入されたプラグと隣接した気管支上皮の杯細胞面積の明確な時間依存的な増加が引き起こされ、それは注入後２４時間以内に検出可能となり、約７２時間後に最大となった。プラグを有する気道と隣接した気道も、アルシアン青／ＰＡＳで陽性に染色された。総細胞数、並びに基底細胞及び線毛細胞の数は変化しなかったが、杯細胞の数は増加し、非顆粒形成分泌細胞の数はアガロース・プラグ注入後に時間依存的に減少した（表２）。これらの結果より、杯細胞化生が非顆粒形成分泌細胞の杯細胞への変換の結果であったことが示唆される。
【０２０３】
【表２】病原体除去ラットにおける気管支上皮細胞の分布に対するアガロース・プラグの効果＊
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細胞は「方法」に記載のようにして分析した。各群ｎ＝５。特徴決定は、（粘液糖質複合体を染色する）アルシアン青／ＰＡＳ染色により補助された。対照気道は、前杯細胞及び杯細胞をほとんど含有していなかった。アガロース・プラグの注入後、対照動物と比較して、前杯細胞及び杯細胞の数は時間依存的（２４時間後、４８時間後、７２時間後）に増加し、非顆粒形成分泌細胞の数は減少した。
＊ データは、基底層１ｍｍ当たりの細胞数の平均±ＳＥである。
‡ 対照と比較してＰ＜０．０５。
§ 対照と比較してＰ＜０．０１。
‖ 細胞が分類のための十分な細胞質の特徴を欠いている。
【０２０４】
ラット気道杯細胞は、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子を発現することが報告されている。本研究においては、対照気管支は、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子を発現していなかったが、アルシアン青／ＰＡＳで陽性に染色された、プラグにより閉塞した気道又は栓と隣接した気道は、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子を発現しており、このことから、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子がアガロース・プラグにより誘導される粘液産生に関与していることが示唆された。これらの結果は、アガロース・プラグが、ラット気道中の選択された細胞において、ムチン遺伝子の発現及び粘液糖質複合体の産生を誘導することを示している。
【０２０５】
アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生のメカニズムを調査した。ＥＧＦ−Ｒは、病原体除去ラットの気道上皮に通常は発現していないが、ＴＮＦαにより誘導される。上皮にＥＧＦ−Ｒが存在する場合、ＥＧＦ−Ｒリガンド（ＥＧＦ又はＴＧＦα）の注入により、ムチン遺伝子及びタンパク質発現の増加が引き起こされる。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの選択的阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２）により、これらの応答が完全に阻害され、このことから、杯細胞化生にＥＧＦ−Ｒシグナル伝達が関与していることが示された。アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に対するＢＩＢＸ１５２２の効果を決定した。ＢＩＢＸ１５２２は、アガロース・プラグにより誘導される粘液糖質複合体の産生及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現を阻害した。これらの結果は、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生にＥＧＦ−Ｒカスケードが関与していることを示している。
【０２０６】
ＥＧＦ−Ｒカスケードがアガロース・プラグによる杯細胞化生を引き起こすメカニズムを研究した。第一に、本発明者らは、気管支上皮におけるＥＧＦ−Ｒタンパク質の発現を研究した。対照気道はＥＧＦ−Ｒに関して均一に陰性に染色されたが、アガロース・プラグを含有する気道は、選択的な時間依存的なＥＧＦ−Ｒに関する陽性染色を示した。陽性染色された細胞には、非顆粒形成分泌細胞、前杯細胞、及び杯細胞が含まれていた。このように、アガロース・プラグはＥＧＦ−Ｒタンパク質発現を誘導した。ＴＮＦαに対する中和抗体で前処理されたラットは、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生を示さず、このことから、アガロース・プラグにより誘導されるＥＧＦ−Ｒ発現にＴＮＦαが関与していることが示された。
【０２０７】
白血球産生を選択的に抑制する薬物であるシクロホスファミドは、アガロース・プラグ注入後の気道洗浄液及び気道上皮への好中球動員を防止し、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生も防止した。マクロファージもアガロース・プラグの導入の後に増加したが、マクロファージ動員はシクロホスファミドにより阻害されなかった。これらの結果は、アガロース・プラグにより誘導される杯細胞化生に好中球が関与していることを示している。シクロホスファミドによりアガロース・プラグ後のＥＧＦ−Ｒタンパク質発現も減少したという事実は、好中球が、少なくとも部分的に、この炎症状態におけるＥＧＦ−Ｒ発現に寄与していることを示唆している。
【０２０８】
好中球も、ＥＧＦ−Ｒリガンド、ＥＧＦ及びＴＧＦαを産生しうる。さらに、上皮細胞はＥＧＦ−Ｒリガンドの起源であり、アガロース・プラグと隣接した上皮の著しい剥皮が存在した。従って、上皮は、ＴＮＦα及びＥＧＦ−Ｒリガンド両方の重要な潜在的な起源でありうる。
【０２０９】
アガロース・プラグの有効な刺激は、呼吸中のプラグの移動と、それに続く上皮の剥皮と関連していると、合理的に推測できる。気道上皮に対する機械的な損傷は、過剰分泌を引き起こすことが報告されている。これらの以前の研究は、気道上皮に対する機械的外傷が過剰分泌に至るという仮説の信用性を高める。口蓋気管内挿管は、ウマにおいて多量の粘液分泌をもたらすことが報告されている。患者における慢性的な挿管は、粘液過剰分泌を引き起こし、粘液栓塞の原因となりうる。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの阻害剤は、気管内挿管後の粘液過剰分泌を防止するために役立つかもしれない。
【０２１０】
上皮の傷害は、中程度の喘息の場合ですら、喘息患者の研究における共通の所見であり、傷害は臨床的な症状の悪化と増加的に関係している。アレルギー応答により生じた上皮の傷害は、異常な杯細胞産生をもたらすＥＧＦ−Ｒ活性化を誘導しうる。上記データは、特に杯細胞化生を含む異なる応答に、ＥＧＦ−Ｒ活性化が関与していることを示している。機械的な上皮傷害及び喘息における上皮損傷には、上皮分泌細胞の異常な増殖をもたらす類似の（ＥＧＦ−Ｒ）カスケードが関与している可能性がある。これは、致命的な急性喘息例において起こる過剰分泌に関するメカニズムを提供する。
【０２１１】
実施例４
ＥＧＦ受容体による杯細胞の再顆粒形成
ラット鼻気道上皮における杯細胞の脱顆粒が、ｆＭＬＰの鼻腔内吸入により誘導された。ｆＭＬＰ（１０−７Ｍ）の鼻腔内吸入から４時間後に、鼻中隔上皮において有意な脱顆粒が誘導された。杯細胞の再顆粒形成は、吸入の４８時間後までに起こった。対照の状態において、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質は杯細胞に発現していたが、ＥＧＦ−Ｒタンパク質は発現していなかった。ＥＧＦ−Ｒ及びＭＵＣ５ＡＣムチンの遺伝子及びタンパク質は、いずれも、対照上皮には存在しないが、吸入から４８時間後には有意に発現していた。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２による前処理により、ｆＭＬＰにより誘導される杯細胞脱顆粒の後のムチンＭＵＣ５ＡＣの遺伝子及びタンパク質の発現が阻害された。これらの結果は、ＥＧＦ−Ｒの発現及び活性化が、ラット鼻上皮における杯細胞の再顆粒形成に関与していることを示している。
【０２１２】
方法
動物
実験動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究に関する委員会により承認された。特定病原体除去雄Ｆ３４４ラット（体重２００〜２３０ｇ；Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂ．，Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）を使用した。動物は、環境的に調節された層流フードを有する病原体除去バイオクリーン・ケージに収容し、無菌の飼料及び水を自由に摂取させた。
【０２１３】
鼻組織の調製
吸入後の様々な時点において、ペントバルビタール・ナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）でラットに麻酔をかけた。動物の心臓を露出させ、先端が鋭利でない針を左心室の心尖から上行大動脈へ挿入し、全身循環系に１％パラホルムアルデヒドを灌流した。右心房における切開により、固定液の出口を提供した。眼、下顎、皮膚、及び筋系を除去し、頭部を大容量の同固定液に２４時間浸漬した。固定後、頭部をサージパス（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）（Ｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｒ ＩＩ，Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＩＬ）で４〜５日間脱灰し、リン酸緩衝生理食塩水で濯いだ。鼻腔を鼻口蓋の切歯乳頭のレベルで横に切片化した。前方組織塊を、グリコールメタクリレート（ＪＢ４ Ｐｌｕｓ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）又は凍結切片のためのＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）に包埋した。グリコールメタクリレート包埋された塊の腹側表面から厚さ５μｍの切片を切断し、酸性及び中性の糖質複合体を証明するためアルシアン青（ｐＨ２．５）／過ヨウ素酸−シッフ（ＡＢ／ＰＡＳ）で染色するか、又は上皮へ遊走した白血球を可視化するため３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色した。凍結包埋された塊の腹側表面から厚さ５μｍの切片を切断し、ＡＢ／ＰＡＳで染色するか、又はＥＧＦ−Ｒ及びＭＵＣ５ＡＣの免疫染色のため使用した。
【０２１４】
鼻上皮における好中球の計数
４００倍という倍率で、３，３’−ジアミノベンジジンで染色された上皮層の高倍率視野において好中球を計数した。鼻中隔上皮内（基底膜から細胞先端部まで）の好中球の数を、基底層長１単位当たりの核プロフィールの数を計数することにより決定した。
【０２１５】
杯細胞の脱顆粒及び再顆粒形成の定量
杯細胞の脱顆粒及び再顆粒形成を査定するため、本発明者らは、以前に発表された方法に従い、半自動イメージング・システムを使用して、粘膜表面上皮上のアルシアン青／ＰＡＳ染色粘液物質の体積密度を測定した。本発明者らは、ビデオ・カメラ・コントロール・ユニット（ＤＸＣ７５５０ＭＤ；Ｓｏｎｙ Ｃｏｒｐ．ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，ＮＪ）と接続されたアキシオプラン（Ａｘｉｏｐｌａｎ）顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、染色されたスライドを調査した。ＩＭＡＸＸビデオ・システム（ＰＤＩ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を使用して、４００倍の位相差レンズを用いて鼻上皮の像を高倍率視野で記録した。表層上皮分泌細胞の細胞内ムチンは、様々なサイズの楕円形の紫色顆粒として出現した。本発明者らは、アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色面積及び総上皮面積を測定し、総面積に対するアルシアン青／ＰＡＳ面積の割合（％）としてデータを表した。分析は、パブリック・ドメインＮＩＨイメージ・プログラムを使用して、マッキントッシュ９５００／１２０コンピュータ（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）上で実施した。
【０２１６】
ＥＧＦ−Ｒタンパク質及びＭＵＣ５ＡＣタンパク質の免疫局在部位決定
パラホルムアルデヒドで固定された鼻組織からの組織切片を、内因性の過酸化物を阻止するため、３％Ｈ２Ｏ２／メタノールで処理し、１：１００希釈のＥＧＦ−Ｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又はＭＵＣ５ＡＣ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）に対するマウス・モノクローナル抗体と共に１時間インキュベートした。免疫反応性のＥＧＦ−Ｒ又はＭＵＣ５ＡＣを、色素原として３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを使用して、ベクタステイン・エリート（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ）ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で可視化した。対照には、一次抗体又は二次抗体のＰＢＳとの置換が含まれていた。
【０２１７】
方法
本発明者らは、通常、鼻中隔上皮に多くの杯細胞を有しない病原体除去ラットを研究した。杯細胞脱顆粒及び好中球の鼻粘膜上皮への遊走に対するエアロゾル化ｆＭＬＰの効果を決定するため、ペントバルビタール・ナトリウム（６５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で動物に麻酔をかけ、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ；１０−５Ｍ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む発熱性物質を含まない生理食塩水を、５分間エアロゾルにより鼻腔内に与えた。エアロゾル曝露は、０．３ｍｌ／分の速度でエアロゾル・ミストを発生する超音波噴霧器（ＰｕｌｍｏＳｏｎｉｃ，ＤｅＶｉｂｉｓｓ Ｃｏ．，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＰＡ）を用いて、動物を換気することにより達成された。同様にして、対照動物には、生理食塩水エアロゾル単独を鼻腔内に与えた。
【０２１８】
ｆＭＬＰエアロゾルの吸入後の鼻杯細胞の再顆粒形成を研究するため、ｆＭＬＰの鼻腔内送達から４８時間後にラットを安楽死させた。
【０２１９】
杯細胞再顆粒形成に対するＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ活性化の効果を評価するため、ｆＭＬＰの吸入の３０分前に、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２、１５ｍｇ／ｋｇ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｉｎｃ．，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙより譲り受けた）で動物を腹腔内で前処理し、１日２回繰り返した。
【０２２０】
統計
全てのデータが、平均±ＳＥＭとして表されている。各実験群について、一元配置ＡＮＯＶＡ又はスチューデントｔ検定を使用した。０．０５未満の確率を、統計的有意差と見なした。
【０２２１】
結果
鼻上皮構造に対するｆＭＬＰによる杯細胞脱顆粒の効果　対照状態において、鼻中隔上皮は、ＡＢ／ＰＡＳ染色杯細胞の有意な面積を含有していたが、内腔表面は染色されなかった。ムチンＭＵＣ５ＡＣタンパク質に関する免疫染色は、ＡＢ／ＰＡＳ染色の範囲と一致していたが、インサイチュー・ハイブリダイゼーションでは、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現がほとんど又は全く示されなかった。ＥＧＦ−Ｒタンパク質に関する免疫組織化学的染色は、陰性であった。これらの結果は、対照ラット鼻上皮が、ムチン遺伝子を発現することなく、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質を含有している完全な杯細胞を含有していることを示している。内腔の染色の欠如は、ムチンの脱顆粒（分泌）が存在しなかったことを示唆している。
【０２２２】
未刺激のラット鼻上皮は、ムチン・タンパク質を含有する「安定な」非脱顆粒杯細胞を含有している、という仮説を立てた。好中球化学誘引物質（例えば、ｆＭＬＰ）は、好中球を気道上皮へ動員し、そこで好中球がエラスターゼ依存的な過程を介してＧＣ脱顆粒を引き起こすことが示されている。ＧＣ脱顆粒の効果を調査するため、好中球化学誘引物質ｆＭＬＰ（１０−７Ｍ）のエアロゾルを５分間鼻腔内に送達した。ｆＭＬＰの４時間後に安楽死させたラットにおいて、ＡＢ／ＰＡＳ染色面積及びＭＵＣ５ＡＣ陽性免疫染色面積は著しく減少しており、鼻上皮への好中球動員が起こっていた。ＡＢ／ＰＡＳ染色は鼻気道内腔表面において顕著であり、このことから、ＧＣ脱顆粒が起こったことが確認された。しかしながら、ｆＭＬＰの４時間後、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現は不変であった。
【０２２３】
ｆＭＬＰの４８時間後に安楽死させたラットにおいては、ＥＧＦ−Ｒ抗体による免疫組織化学的染色により、前杯細胞及び杯細胞においてＥＧＦ−Ｒが陽性に染色され、ＡＢ／ＰＡＳ染色及びＭＵＣ５ＡＣ免疫陽性染色の面積は、対照状態において存在するレベルに戻り、このことから、鼻ＧＣの再顆粒形成が起こったことが示された。この時点で、好中球動員はもはや存在せず；ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現はＧＣが占める範囲において可視であり、このことから、ＧＣ再顆粒形成がムチン遺伝子発現の増加と関連していることが示された。
【０２２４】
杯細胞再顆粒形成におけるＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ・リン酸化の役割
以前のラットにおける研究より、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）の活性化が、ムチンの遺伝子及びタンパク質の発現に至ることが報告された。ＥＧＦ−Ｒ活性化が、ｆＭＬＰ後のラット鼻ＧＣ再顆粒形成において役割を果たしているという仮説を検証するため、ラットを選択的ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２で前処理した（ｎ＝５）。ｆＭＬＰのエアロゾル化は、鼻上皮への好中球動員及びＧＣ脱顆粒を引き起こしたが、４８時間後、ＡＢ／ＰＡＳ染色及びＭＵＣ５ＡＣ免疫陽性染色の面積は減少したままであった。これらの結果は、ｆＭＬＰによる脱顆粒の後の鼻ＧＣムチン合成に、ＥＧＦ−Ｒ活性化が関与していることを示している。
【０２２５】
当研究において、本発明者らは、ラット鼻上皮におけるムチン産生の制御を調査した。対照上皮は、有意な数の杯細胞を含有しており、これらの細胞にはＭＵＣ５ＡＣタンパク質が存在した。しかしながら、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現は存在しなかった。ＭＵＣ５ＡＣムチン発現は、他の気道上皮細胞において、ＥＧＦ−Ｒの発現及びそれらの活性化を介して起こることが報告されている。対照ラット鼻上皮細胞には、ＥＧＦ−Ｒの遺伝子又はタンパク質の発現が見出されなかった。ＡＢ／ＰＡＳ染色又はＭＵＣ５ＡＣタンパク質は内腔に存在せず、このことから、有意な杯細胞脱顆粒（分泌）は起こっていなかったことが示唆された。ＥＧＦ−Ｒは、「安定な」杯細胞においては下方制御されており、さらなるムチン合成を防止しているのかもしれない。従って、本発明者らは、杯細胞脱顆粒を誘導することにより鼻杯細胞を「攻撃」し、それに続く気道上皮構造の変化を調査した。
【０２２６】
好中球化学誘引物質は、好中球と杯細胞との密接な接触を含む、好中球エラスターゼにより媒介される、モルモット及びヒトの気道における好中球依存性の杯細胞脱顆粒を引き起こす。鼻中隔に通常存在している杯細胞の脱顆粒を誘導するため、化学誘引物質ｆＭＬＰを鼻腔内に吸入させた。ｆＭＬＰにより鼻上皮に好中球が動員され、続いて杯細胞の脱顆粒が起こった。アルシアン青／ＰＡＳ染色範囲は顕著に減少した。
【０２２７】
次に、本発明者らは、ｆＭＬＰにより誘導されるＧＣ脱顆粒の後の、鼻上皮における後続現象を調査した。ｆＭＬＰの４時間後、鼻ＧＣの最大の脱顆粒が起こり、ＥＧＦ−Ｒ及びＭＵＣ５ＡＣの発現は存在しないままであった。しかしながら、ｆＭＬＰの４８時間後、ＥＧＦ−Ｒは前杯細胞及び杯細胞において強く発現していた。ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現は、今や、上皮において強く発現しており、これらの現象は杯細胞の再顆粒形成（ＡＢ／ＰＡＳ及びＭＵＣ５ＡＣの染色の増加）と関連していた。実際、ｆＭＬＰの４８時間後には、杯細胞面積が対照状態と類似する程度にまで、再顆粒形成が起こった。これらの所見は、ＧＣ脱顆粒が、ＥＧＦ−Ｒの発現及び活性化に至り、それによりムチンＭＵＣ５ＡＣ発現が誘導されることを示唆している。
【０２２８】
ＧＣ再顆粒形成におけるＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ活性化の役割を調査するため、本発明者らは、選択的ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２で動物を前処理した。ＢＩＢＸ１５２２で前処理された動物において、ｆＭＬＰは依然としてＧＣ脱顆粒を引き起こした。しかしながら、ＢＩＢＸ１５２２による前処理は、ＧＣの再顆粒形成及びＭＵＣ５ＡＣタンパク質の発現を防止した。これらの結果は、ＧＣ脱顆粒後のムチンの再増殖にＥＧＦ−Ｒ活性化が関与していることを示している。病原体除去ラットにおいては、杯細胞は「不活型」（即ち、脱顆粒しない）であり、ＥＧＦ−Ｒが下方制御されている。炎症（例えば、好中球浸潤の刺激）がＧＣ脱顆粒及びムチン分泌を引き起こすと、ＥＧＦ−Ｒの上方制御及び活性化が気道上皮にムチンを再供給する。本所見は、選択的ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤が、鼻疾患における過剰分泌の防止において有用である可能性を示唆している。
【０２２９】
実施例５
ヒト気管支におけるＥＧＦ−Ｒと杯細胞産生との関係
正常ヒト気道及び喘息気道におけるＥＧＦ−Ｒ発現を査定した。ＥＧＦ−Ｒ及びＭＵＣ５ＡＣ（杯細胞ムチンのマーカーとして）の両方に関するインサイチュー・ハイブリダイゼーション及び免疫組織化学的分析を実施した。
【０２３０】
方法
対象
１１人の健康対象及び１２人の喘息対象に由来する試料を分析した。以下の表３に要約されるように、肺活量測定、吸入メタコリンに対する気道の反応性、及び皮膚試験反応性によって、対象を特徴決定した。ＦＥＶ１：１秒間努力呼気肺活量；ＦＥＶ１ ＰＣ２０：基線ＦＥＶ１の２０％の減少を引き起こすために必要なメタコリンの吸入誘発濃度。
【０２３１】
【表３】
2004503599.tif 000005
【０２３２】
健康対象は、気道閉塞又は再発性鼻炎の臨床歴を有しておらず、正常な肺機能検査結果を有していた。彼らは、皮膚アレルギーも有していなかった。喘息対象は、喘息に関する臨床的診断基準（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８７）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３６：２２５−２４４）を満たし、吸入メタコリンに対する過敏性を示した。研究への参加前６週間以内に吸入又は経口でコルチコステロイドを摂取した対象はいなかった。喘息対象は、症状のコントロールのためにβ−アゴニストを断続的に使用していた。当時もしくは過去の喫煙歴、過去５年以内の気管内挿管歴、過去６週以内の気道感染、又は重度の心疾患もしくは神経学的疾患を有する者は、対象の中にいなかった。
【０２３３】
気管支鏡は、口から導入し、右主気管支幹へと進めた。スパイク付き（ｓｐｉｋｅｄ）窓付き（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｅｄ）の生検用鉗子を使用して、上葉、中葉の分岐部、及び下葉の上方セグメントから生検試料を得た。生検標本を、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、次いで凍結保護のため３０％ショ糖中に一晩置いた。標本を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物又はグリコールメタクリレート（ＧＭＡ）樹脂（Ｐａｒｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｅ， Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ， ＵＫ）に包埋し、厚さ３μｍの切片として切断した。全ての切片を、アルシアン青／ＰＡＳで染色し（杯細胞の可視化のため）、ヘマトキシリンで対比染色した（総細胞数の計数のため）。アルシアン青（１％）は、酢酸（３％）で希釈し、最終ｐＨは２．５であった。
【０２３４】
ＥＧＦＲ及びＭＵＣ５ＡＣのインサイチュー・ハイブリダイゼーション
インサイチュー・ハイブリダイゼーションは、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の３５０ｂｐのｃＤＮＡ断片を含有しているヒトＥＧＦＲプローブ（ｐＴＲＩ−ＥＧＦ−Ｒ−ヒト・プローブ・テンプレート、Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）及びヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の２９８ｂｐのｃＤＮＡ断片を含有しているヒトＭＵＣ５ＡＣプローブを使用して実施した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を、ＥＧＦＲ断片のサブクローニングのために使用した。ハイブリダイゼーションは記載されたようにして実施した（Ｌｏｕら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５７：１９２７−１９３４）。簡単に説明すると、凍結切片（４μｍ）を切断し、正の電荷を有するガラス・スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）の上に置いた。近位で切断された切片を、センス・プローブ及びアンチセンス・プローブを用いたハイブリダイゼーションに使用した。標本を、４％パラホルムアルデヒドで再固定し、０．５×ＳＳＣ中で再水和させ、次いでトリエタノールアミン及び無水酢酸の中でアセチル化した。ハイブリダイゼーションは、アンチセンス・プローブ又はセンス・プローブ２５００〜３００ｃｐｍ／μｌを含む５０％脱イオン化ホルムアミド、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、２０ｍＭジチオスレイトール、１０％デキストラン硫酸、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、及び０．５ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて、５８℃で、一晩、実施した。ハイブリダイゼーション後の処理は、２×ＳＳＣ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールでの室温での洗浄、室温での３０分間のＲＮａｓｅ溶液（２０μｇ／ｍｌ）とのインキュベーション、さらに５５℃で２時間の０．１×ＳＳＣ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールでの洗浄、次いで室温で２０分間の０．５×ＳＳＣでの洗浄からなっていた。標本を、脱水和させ、空気乾燥させ、オートラジオグラフィーのためコダックＮＢＴヌクレア・トラック・エマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）でカバーした。４℃で７〜２１日間の感光の後、スライドを現像し、固定し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０２３５】
ＥＧＦＲ及びＭＵＣ５ＡＣの免疫組織化学的分析
免疫組織化学は、ＧＭＡ包埋切片を使用して実施した。切片を、４％パラホルムアルデヒドで５分間再固定した。０．０５％ツィーン２０、２％正常ヤギ血清、及びレバミゾール（２ｍＭ）を含有しているＰＢＳを、抗体の希釈剤として使用した。ＥＧＦＲに対するマウス・モノクローナル抗体（１：４０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、又はＭＵＣ５ＡＣに対するマウス・モノクローナル抗体（クローン４５Ｍ１、１：１００、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）と共に室温で一晩、切片をインキュベートし、次いで過剰の一次抗体を除去するためＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１：２００希釈のビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に室温で２時間、切片をインキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法の標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。全ての免疫組織化学的染色に、一次抗体に曝さない対照切片、同一アイソタイプの無関係の抗体に置換するか、又は１０倍過剰の免疫感作ペプチドと共に抗体をプレインキュベートする切片が含まれていた。ＥＧＦＲの免疫染色には、染色パターンを確認し、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸残基１００５〜１０１６に相当するＥＧＦＲペプチド抗原（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用したクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）を実施するため、ＥＧＦＲに対するウサギ・ポリクローナル抗体（１：１００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）も使用した。抗ＥＧＦＲ抗体については、ＥＧＦＲ過剰発現Ａ４３１細胞系から調製された細胞溶解物と共に抗体をプレインキュベートすることにより、対照実験が実施された。
【０２３６】
形態計測的分析
抗ＥＧＦＲ Ａｂ又は抗ＭＵＣ５ＡＣ Ａｂで染色された生検切片から、４００倍の倍率で、気道上皮の画像を６個捕捉した。他に記載されている半自動イメージング・システム（Ｔａｋｅｙａｍａら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｌ２９４−Ｌ３０２）を使用して、上皮粘膜表面上のＭＵＣ５ＡＣ免疫反応性の体積密度により、杯細胞面積を査定した。本発明者らは、陽性染色面積及び総上皮面積を測定し、陽性染色面積の割合（％）としてデータを表した。分析は、パブリック・ドメインＮＩＨ ＩＭＡＧＥプログラム（米国国立衛生研究所で開発され、ｚｉｐｐｙ．ｎｉｍｈ．ｇｏｖからアノニマスＦＴＰにより、又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ，ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ ＰＢ９５−５００１９５ＧＥＩからフロッッピーディスクで入手可能である）を用いて実施した。ＥＧＦＲ免疫反応性は、ステレオロジー・ツールボックス（Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｙ Ｔｏｏｌｂｏｘ）（バージョン１．１、Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｘ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）により分析した。気道上皮内のＥＧＦＲ陽性細胞の数は、点及び線からなるサイクロイドを使用して、点計数により決定した。点計数は、対象のアイデンティティ及び疾患カテゴリを承知していない研究者が実施した。
【０２３７】
統計分析
統計は、スタット・ビュー（ＳｔａｔＶｉｅｗ）４．０１（Ａｂａｃｕｓ ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して実施した。全てのデータが、平均±ＳＥＭで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、マン・ホイトニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定を使用し；変数間の相関を決定するため、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ）の線形回帰分析及び一元配置分散分析を使用した。帰無仮説の確率が０．０５未満である場合に、統計的有意差ありと見なした。
【０２３８】
結果
ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ
全ての喘息対象において、インサイチュー・ハイブリダイゼーションは、気道上皮におけるＥＧＦＲ ｍＲＮＡの発現を示したが、健康対象はＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現をほとんど示さなかった。ＥＧＦＲセンス・プローブは均一に陰性であった。
【０２３９】
ＥＧＦＲタンパク質
ＥＧＦＲ陽性細胞の総上皮細胞に対する割合（％）は、健康対象より喘息対象において大きかった（Ｐ＜０．０５、図６、左カラム）。健康対象において、ＥＧＦＲ免疫反応性は、稀であり、ほぼ完全に杯細胞に限定されていた。喘息対象においては、ＥＧＦＲ免疫反応性は多様であり、ＥＧＦＲ免疫反応性が杯細胞にのみ観察される対象、及び内腔にも観察される対象がいた。ＥＧＦＲ免疫反応性が主に基底細胞に局在している対象もいた。基底細胞におけるＥＧＦＲ免疫反応性の割合（％）は、健康対象よりも喘息対象の方が大きく；杯細胞においては、喘息対象よりも健康対象の方がＥＧＦＲ免疫反応性の割合（％）が大きかった（図６）。粘液線が生検中に観察される場合もあった。腺中の粘液細胞はＥＧＦＲ免疫反応性を示したが、漿液細胞は示さなかった。線毛細胞は、喘息対象においても健康対象においてもＥＧＦＲ免疫反応性を示さなかった。一次抗体に曝さなかった切片、又は同一アイソタイプの無関係の抗体に置換した切片は陰性であり、過剰のＥＧＦＲタンパク質の抗体への予備吸着により、ＥＧＦＲ免疫反応性は消失した。
【０２４０】
杯細胞及び基底細胞におけるＥＧＦＲ免疫反応性の結果を、表４に要約する。
【０２４１】
【表４】
2004503599.tif 000006
【０２４２】
ＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡ
喘息対象においては、杯細胞の分布と類似した断片的なパターンで気道上皮にＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡが発現していた。健康対象由来の上皮は、杯細胞の分布域に位置しているＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡの弱い発現のみを示した。ＭＵＣ５ＡＣセンス・プローブは均一に陰性であった。
【０２４３】
ＭＵＣ５ＡＣとＥＧＦＲとの共局在
ＥＧＦＲ免疫反応性が杯細胞に観察された場合、ＭＵＣ５ＡＣ及びＥＧＦＲの免疫反応性は、アルシアン青／ＰＡＳで染色された杯細胞に共局在していた。
【０２４４】
ＥＧＦＲ免疫反応性のＭＵＣ５ＡＣとの相関
気道上皮細胞のＥＧＦＲ免疫反応性は、全ての対象において、気道上皮におけるＭＵＣ５ＡＣ陽性染色面積との有意な正の相関を示した（ｎ＝２３、ｒ＝０．７２５、Ｐ＜０．０００１）（図７）。
【０２４５】
実施例６
ＩＬ−１３はＥＧＦＲを刺激し好中球を活性化することにより粘液産生を誘導する
病原体除去ラットにおいて、ＩＬ−１３を注入することにより、ＩＬ−１３により誘導される粘液産生に対するＥＧＦＲ活性化の役割を調査し、ＩＬ−１３により誘導される杯細胞（ＧＣ）増殖に対するＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果を調査した。
【０２４６】
方法
動物
体重２２０〜２４０ｇの特定病原体除去雄Ｆ３４４フィッシャー・ラットを、シモンセン・ラボラトリーズ（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）より購入した。動物は、病原体除去室に収容し、実験用餌で維持し、飼料及び水を自由に摂取させた。カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究に関する委員会は、全ての手法を承認した。各群５匹の動物を研究した。
【０２４７】
ＩＬ−１３により誘導されるＧＣ化生に対するＥＧＦＲ活性化の選択的阻害剤の効果
まず、ラットにおいてインビボ研究を実施したところ、ＩＬ−１３がラット気管上皮においてＧＣ化生を誘導することが示された。ペントバルビタール［ネンブタール・ナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ）、５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉｐ）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ］で動物に麻酔をかけ、自発呼吸をさせた。媒体（リン酸緩衝生理食塩溶液；ＰＢＳ）又はＩＬ−１３を、口から２０ゲージのアンジオカス・カテーテル（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎｄｙ，ＵＴ）により気管支内に注入しながら、高輝度照明器（ＦｉｂｅｒＬｉｔｅ；Ｄｏｌａｎ Ｊｅｎｎｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）を使用して喉頭範囲を可視化した。ＩＬ−１３の注入から４８時間後、竜骨組織を調査した。様々な濃度のＩＬ−１３（組換えマウスＩＬ−１３；５ｎｇ／匹、５０ｎｇ／匹、１００ｎｇ／匹、及び５００ｎｇ／匹、Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む２００μｌのＰＢＳを、気管内に注入した。無菌ＰＢＳ（２００μｌ）を、対照として気管内に注入した。
【０２４８】
ＩＬ−１３により誘導されるＧＣ化生と、ＥＧＦＲ活性化との関係の調査のため、ＩＬ−１３注入の１日前、及び翌日に、選択的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２；１〜３０ｍｇ／ｋｇ／日、ｉｐ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で動物を処理した。ＩＬ−１３の注入から４８時間後、動物を安楽死させた。
【０２４９】
ＩＬ−１３により誘導される杯細胞化生における白血球動員の役割
予備研究において、本発明者らは、ＩＬ−１３が気道への白血球動員を引き起こすことを認めた。本発明者らは、白血球動員が、ＩＬ−１３によって誘導される上皮からの化学誘引物質の放出によって起こり、この動員が、ＧＣ化生へと至るＩＬ−１３により誘導されるＥＧＦＲカスケードに関与しているとの仮説を立てた。動物群を、ＩＬ−１３（５００ｎｇ）の注入から４時間後、８時間後、１６時間後、２４時間後、及び４８時間後に安楽死させ、気道組織内の白血球を計数した。
【０２５０】
ＩＬ−１３により誘導されるＧＣ化生における白血球の役割の評価のため、骨髄内の白血球の阻害剤［シクロホスファミド（１７）；Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］、又はインターロイキン−８に対する阻止抗体（ＩＬ−８Ａｂ；ウサギ抗ヒトＩＬ−８抗体；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）でラットを前処理した。ＩＬ−１３（５００ｎｇ）の単一用量の注入の５日前にシクロホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を与え、ＩＬ−１３注入の１日前に２回目のシクロホスファミド注射（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を与えた。もう一つの研究系列において、本発明者らは、ＩＬ−１３と共にＩＬ−８ Ａｂ（１０μｇ／匹）を注入し、抗ヒトＩＬ−８阻止抗体の注入を、１２時間間隔で、動物が安楽死するまで繰り返した。
【０２５１】
組織の調製
致死量のペントバルビタール［ネンブタール・ナトリウム、２００ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ］で動物を安楽死させ、全身循環系に、１％パラホルムアルデヒドを含むジエチルピロカルボネート（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）（ＤＥＰＣ、Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理したＰＢＳを、左心室から灌流した。凍結切片については、竜骨組織を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に一晩置き、次いで凍結保護のため３０％ショ糖中に置いた。組織をオプティマル・カッティング・テンパラチャー（ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＯＣＴ、Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）化合物に包埋した。プラスチック切片又はパラフィン切片については、組織を４％パラホルムアルデヒド中に一晩置き、エタノールで脱水和させ、ＪＢ−４プラス・モノマー溶液Ａ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）又はパラフィンに包埋した。包埋組織を厚さ４μｍの横断切片として切断し、ガラス・スライド上に置いた。
【０２５２】
ＧＣ化生の定量
全ての研究において、一定のサンプリングを得るため、竜骨を調査した。本発明者らは、ＡＢ／ＰＡＳ陽性面積及び総上皮面積を測定し、総上皮面積に対するＡＢ／ＰＡＳ面積の割合（％）として結果を表した。分析は、パブリック・ドメインＮＩＨ ＩＭＡＧＥプログラム（米国国立衛生研究所で開発され、ｚｉｐｐｙ．ｎｉｍｈ．ｇｏｖからアノニマスＦＴＰにより、又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ，ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ ＰＢ９５−５００１９５ＧＥＩからフロッッピーディスクで入手可能である）を用いて実施した。
【０２５３】
ラット竜骨上皮におけるＭＵＣ５ＡＣ、ＥＧＦＲタンパク質、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−８に関する免疫組織化学的染色
０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールにより内因性ペルオキシダーゼを阻止した後、０．０５％ツィーン２０及び２％正常ヤギ血清を含有しているリン酸緩衝溶液を、抗体の希釈剤として使用した。ＥＧＦＲに対するマウスｍＡｂ（１：２５０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＵＣ５ＡＣに対するマウスｍＡｂ（クローン４５Ｍ１、１：５００、Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、又はＴＮＦ−αに対するウサギ抗体（１：１０００、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と共に４℃で一晩、切片をインキュベートし、過剰の一次抗体を除去するためＰＢＳで洗浄した。ＩＬ−８様物質の免疫組織化学的局在部位決定のため、本発明者らは、マウス抗ヒトＩＬ−８抗体（１：２０；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を使用した。次いで、１：２００希釈のビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に室温で１時間、切片をインキュベートした。アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。ＭＵＣ５ＡＣタンパク質の測定にも、上皮におけるＧＣ化生の定量的測定のために使用したのと同一の方法を使用した。
【０２５４】
気道組織における白血球の評価
ＩＬ−１３（５００ｎｇ）の注入から４時間後、８時間後、１６時間後、２４時間後、及び４８時間後、動物を安楽死させ、気道組織内の白血球を計数した。好中球の動員を評価するため、本発明者らは、好中球のための３，３’−ジアミノベンジジンで切片を染色し、次いでトルイジンブルーで対比染色した。ペルオキシダーゼ陽性の青色細胞質の細胞として見られる好中球を、胸骨内の上皮（基底膜から細胞先端部まで）の６個の連続する高倍率視野で計数した。好塩基球の動員を評価するため、本発明者らは、ルナ（Ｌｕｎａ）試薬で切片を染色した。
【０２５５】
ヒト好中球の単離及び走化性
健康ドナーから得られた末梢血よりヒト好中球を精製した。好中球単離は、フィコール・ハイパック勾配分離、デキストラン沈降、及び赤血球の低張溶解の標準的な技術により実施した。細胞は、通常、トリパンブルー色素排除によると９５％超が生存していた。内毒素の混入を防止するため、全ての溶液を０．１μｍフィルターに通した。走化活性は、リーディング・フロント（ｌｅａｄｉｎｇ ｆｒｏｎｔ）技術を利用して、４８穴マイクロケモスタシス・チャンバー（４８−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｃｈａｍｂｅｒ）（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ）において査定した。遊走は、３７℃で２５分後のニトロセルロース・フィルター（孔径３μｍ）を介した好中球の正味の移動（μｍ）として測定した。ＩＬ−１３（１０−１０、１０−９、５×１０−９Ｍ；組換えヒトＩＬ−１３；Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の効果は、移動距離として表され、ＲＰＭＩ１６４０と共にインキュベートされた好中球のランダムな遊走と比較される。
【０２５６】
データ分析
全てのデータが、平均±ＳＥＭで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて統計分析を実施した。ＡＮＯＶＡにおいて統計的有意性が同定された場合には、多重比較のためシェフェのＦ検定を使用した。０．０５未満の確率を、統計的有意差ありと見なした。
【０２５７】
結果
杯細胞化生に対するインターロイキン−１３の効果
ＩＬ−１３がムチン産生を誘導することを確認するため、ＩＬ−１３（５ｎｇ／匹、５０ｎｇ／匹、１００ｎｇ／匹、及び５００ｎｇ／匹）を気管内に注入し、４８時間後に組織を調査した。対照ラットにおいて、気道上皮は、散在するＡＢ／ＰＡＳ染色及びＭＵＣ５ＡＣ染色のみを含有していた（図８）。ＩＬ−１３は、用量依存的にＡＢ／ＰＡＳ染色及びＭＵＣ５ＡＣ染色を増加させた（図８）。これらの結果は、ＩＬ−１３が、ラット気道上皮において、ＧＣ化生及びＭＵＣ５ＡＣムチン産生を誘導することを暗示している。
【０２５８】
ＩＬ−１３により誘導される杯細胞化生に対するＥＧＦＲ活性化の選択的阻害剤の効果
ＩＬ−１３により誘導されるＧＣ化生と、ＥＧＦＲ活性化との関係を調査するため、選択的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２；１〜３０ｍｇ／ｋｇ／日）で前処理した。対照ラットは、気道上皮にＥＧＦＲ発現をほとんど示さなかったが、ＩＬ−１３注入によりＥＧＦＲ発現が増加した。選択的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２による前処理によって、ＩＬ−１３により誘導されるＡＢ／ＰＡＳ染色及びＭＵＣ５ＡＣ染色は、用量依存的に、かつ完全に防止された（図９）。これらの所見は、ＩＬ−１３により誘導されるムチン産生にＥＧＦＲ活性化が関与していることを示している。
【０２５９】
ラット気道組織におけるＴＮＦαの発現
本発明者らは、ＴＮＦα発現に対するＩＬ−１３注入の効果を調査した。対照ラットにおいて、ＴＮＦα抗体による染色は最小であった。ＩＬ−１３注入によって、主に浸潤好中球において、ＴＮＦα発現が誘導された。シクロホスファミドによる前処理によって、ＩＬ−１３により誘導されるＴＮＦα発現は防止された。
【０２６０】
白血球動員及びムチン産生に対するＩＬ−１３の効果
対照ラットの気道上皮はほとんど白血球を含有していなかったが、気道へのＩＬ−１３注入により、時間依存的な白血球動員が引き起こされ（図１０Ａ）、それはおよそ８時間後に開始し、２４時間以内に最大となった。骨髄内の白血球を抑制する薬物シクロホスファミドによる前処理により、気道への白血球動員は阻害され（図１０Ａ）、ＩＬ−１３により誘導されるムチン産生が防止された（図１０Ｂ）。
【０２６１】
インビトロの好中球走化性に対するＩＬ−１３の効果を調査するため、本発明者らは、ヒト好中球を用いて研究した。ＩＬ−１３は、用量依存的に好中球の移動を減少させ、５×１０−９Ｍという濃度で、対照値の５０．６±３．４％への減少を引き起こした。
【０２６２】
ＩＬ−１３は好中球走化性を引き起こさなかったため、本発明者らは、ＩＬ−１３が、上皮において好中球化学誘引物質の産生を刺激するとの仮説を立てた。対照動物において、気道上皮はＩＬ−８様化学遊走物質に関して染色されなかったが、ＩＬ−１３注入により、抗ヒトＩＬ−８抗体による陽性染色がもたらされた。ＩＬ−８阻止抗体による前処理により、ＩＬ−１３により誘導される白血球動員及びムチン産生は阻害された（図１０）。これらの所見は、ＩＬ−１３が、気道上皮のＩＬ−８様化学誘引物質を誘導し、それが好中球動員を引き起こすことを示している。
【０２６３】
実施例７
ＥＧＦＲの活性化はタバコ煙により誘導されるムチン産生を促進する
実施例２に記載のように、炎症誘発性サイトカインにより活性化された好中球及びタバコ煙は、リガンド依存性のＥＧＦＲの活性化を介して、インビトロでヒト気管支上皮細胞におけるムチンＭＵＣ５ＡＣ合成を引き起こす。この現象を、ラット及びヒトにおいて実施されたインビボ研究によりさらに調査した。
【０２６４】
方法
インビトロ研究
タバコ煙溶液の調製
タバコ煙溶液は、実施例２に記載のようにして調製した。
【０２６５】
細胞培養
ヒト肺粘膜性類表皮癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、加湿５％ＣＯ２水ジャケット付きインキュベーター内で、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及びヘペス（２５ｍＭ）を含有しているＲＰＭＩ１６４０培地の中で増殖させた。６穴培養プレート又は８チャンバー・スライドのいずれかを、細胞を培養するために使用した。コンフルエントになった時点で、細胞をタバコ煙溶液と共に１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、新鮮な培地単独と共にインキュベートした。予め選択された時点で実験を終了させた（ｍＲＮＡについては６時間及び１２時間；タンパク質については２４時間）。対照として、同じ時間、培地単独と共に細胞をインキュベートした。ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤を用いた阻害研究においては、タバコ煙溶液を送達する３０分前に、ＢＩＢＸ１５２２（１０μｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａ ＫＧ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙより譲り受けた）又はチルホスチンＡＧ１４７８（１０μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を前処理した。血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼの選択的阻害剤（チルホスチンＡＧ１２９５、１００μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、及びチルホスチンの陰性対照（チルホスチンＡ１、１００μＭ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の効果も調査した。活性酸素の役割は、酸素フリーラジカルのスカベンジャーＤＭＳＯ（１％、Ｓｉｇｍａ）又はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、３００Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を使用して調査した。
【０２６６】
活性化されたＥＧＦＲに関するイムノブロッティング
細胞を無血清培地で２４時間培養し、次いでタバコ煙溶液又はＴＧＦαで１５分間刺激した。刺激後、溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％トライトン−Ｘ１００、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ ＰＭＳＦ、並びに各１０μｇ／ｍｌのロイペプチン及びアプロチニン）により細胞を溶解させ、４℃で３０分間インキュベートした。不溶性材料を除去するため、細胞溶解物を１４，０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離した。等量のタンパク質を含有する上清の一部を、ＳＤＳ試料緩衝液に懸濁させ、５分間加熱した。タンパク質を４〜１５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。得られたゲルを転写緩衝液（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、２０容量％メタノール、ｐＨ８．３）中で平衡化した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜へ電気泳動により転写し、それを、５％無脂肪スキムミルクを含む０．０５％ツィーン２０含有ＰＢＳと共に１時間インキュベートし、次いで抗ホスホ特異的ＥＧＦＲ ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共に一晩インキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法（ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）のための標準的なプロトコルに従い、結合したＡｂを可視化した。
【０２６７】
ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ及びＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡのインサイチュー・ハイブリダイゼーション
インサイチュー・ハイブリダイゼーションは、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の３５０ｂｐのｃＤＮＡ断片を含有しているヒトＥＧＦＲプローブ（ｐＴＲＩ−ＥＧＦ−Ｒ−ヒト・プローブ・テンプレート、Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）及びヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の２９８ｂｐのｃＤＮＡ断片を含有しているヒトＭＵＣ５ＡＣプローブを使用して実施した。３５０ｂｐのｃＤＮＡヒトＥＧＦＲを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクターのＫｐｎＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位へサブクローニングした。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを、ヒトＥＧＦＲのアンチセンス・プローブ及びセンス・プローブを作製するために使用した。ハイブリダイゼーションは、以前に記載されたようにして実施した（Ｌｏｕら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５７：１９２７−１９３４）。簡単に説明すると、８チャンバー・スライド上で増殖させた細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．５×ＳＳＣ中で再水和させ、次いでトリエタノールアミン及び無水酢酸の中でアセチル化した。ハイブリダイゼーションは、アンチセンス・プローブ又はセンス・プローブ２５００〜４０００ｃｐｍ／μｌを含む５０％脱イオン化ホルムアミド、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、２０ｍＭジチオスレイトール、１０％デキストラン硫酸、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、及び０．５ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて、５８℃で、一晩、実施した。ハイブリダイゼーション後の処理は、２×ＳＳＣ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールでの室温での洗浄、室温での３０分間のＲＮａｓｅ溶液（２０μｇ／ｍｌ）とのインキュベーション、さらに５５℃で２時間の０．１×ＳＳＣ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールでの洗浄、次いで室温で２０分間の０．５×ＳＳＣでの洗浄からなっていた。標本を、脱水和させ、空気乾燥させ、オートラジオグラフィーのためコダックＮＢＴヌクレア・トラック・エマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）でカバーした。４℃で７〜２１日間の感光の後、スライドを現像し、固定し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０２６８】
ＭＵＣ５ＡＣタンパク質のイムノアッセイ法
以前に記載されたようにして、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質を測定した（Ｔａｋｅｙａｍａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：３０８１−３０８６）。簡単に説明すると、複数の希釈率の細胞溶解物をＰＢＳを用いて調製し、各試料５０μｌを９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）内で重炭酸−炭酸緩衝液（５０μｌ）と共に４０℃で乾燥するまでインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２％ウシ血清アルブミン第Ｖ画分（Ｓｉｇｍａ）で室温で１時間ブロッキングした。プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．０５％ツィーン２０を含有するＰＢＳで希釈されたＭＵＣ５ＡＣ ｍＡｂ（１：１００）５０μｌと共にインキュベートした。１時間後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ複合体（１：１０，０００）を各ウェルに分配した。１時間後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。発色反応を３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて起こさせ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０２６９】
インビボ研究
薬物
ＢＩＢＸ１５２２（３ｍｇ又は９ｍｇ）を、２５％（ｗ／ｖ）ソルトール（ｓｏｌｕｔｏｌ）を含有するクロロホルム０．６ｍｌに溶解させた。この溶液を乾燥するまで蒸発させた。残さをメタノール０．３ｍｌに再溶解させ、再び乾燥するまで蒸発させた。このストック調製物を４℃で５日間保存した。気管内注入のための溶液は、最終濃度がそれぞれ０．１％及び０．３％となるよう、予め加温された３ｍｌの生理食塩水（４０℃）にストック調製物を溶解させることにより、当日、新鮮に調製した。
【０２７０】
タバコ煙曝露による杯細胞化生の誘導
体重２５０〜３００ｇの雄スプレーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットを研究に使用した。動物は温度及び湿度がコントロールされた部屋に収容し、水及び標準的な実験用飼料を自由に摂取させた。動物を、煙処理しない対照群、又は煙曝露する対照群及び処理群へとランダムに振り分けた。煙処理群のラットは、ラットに適合したチャンバーを有する煙処理装置を使用して、５日間、１日に８回、定期的に、ノンフィルター（ｎｏｎ−ｆｉｌｔｅｒ）タバコ（ニコチン１．２ｍｇ、濃縮物１２ｍｇ）に曝した。
【０２７１】
タバコ煙により誘導される杯細胞化生のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２による阻害
杯細胞化生及び粘液産生に対するＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の効果を評価するため、タバコ煙曝露の１時間前に、媒体又は１ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇの用量のＢＩＢＸ１５２２で、１日１回、動物を気管内処理した。媒体又はＢＩＢＸ１５２２による動物の処理は、１日目に開始し、タバコ煙曝露中５日間継続した。１ｍｌ／ｋｇの容量の気管内注入を、イソフルラン麻酔下で実施した。
【０２７２】
ＲＮＡの単離及び定量
最後のタバコ煙曝露から８時間後、ペントバルビタール・ナトリウムで動物を安楽死させた。気管及び右主気管支幹を摘出し、製造業者の指示に従いキアゲンＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙ）キットを使用して全ＲＮＡ単離のため加工した。ＲＮＡ定量には、リアルタイムＰＣＲ技術（Ｔａｑｍａｎ−ＰＣＲ，ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を利用した。この技術は、他に詳細に記載されている（Ｆｉｎｋら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：１３２９−１３３３）。簡単に説明すると、ＰＣＲサイクル中、５’蛍光標識ヌクレオチドが、タックポリメラーゼ（ＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ）のエキソヌクレアーゼ活性によりプローブから放出され；蛍光の放出がレーザーにより検出され、ＰＣＲサイクルが進行するにつれ、バックグラウンドを超えて増加する蛍光が測定され記録される。シグナルが内部参照シグナルに対し規準化され、参照シグナルとの差が標準偏差の１０倍を超える閾値サイクル（Ｃｔ）をソフトウェアが設定する。Ｃｔ値が、入力標的数の定量のため使用される。
【０２７３】
ラットＭＵＣ５ＡＣ用のプライマー及びプローブは、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）より提供されたプライマーエクスプレス（ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ）（商標）１．０プログラムを使用して設計した。以下の配列を、ラットＭＵＣ５ＡＣの定量のため使用した。順方向プライマー
2004503599.tif 000007
逆方向プライマー
2004503599.tif 000008
及びＦＡＭレポーター色素標識ハイブリダイゼーション・プローブ
2004503599.tif 000009
【０２７４】
リボソームＲＮＡ用のプライマー及びプローブは、バイオシステムズ ドイツランド ＧｍｂＨ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）［ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＶＩＣ（商標）プローブ）、米国特許第４３０８３２９号］。ＲＴ−ＰＣＲ及びタックマン（ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲは、製造業者の指示に従い（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキット、Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐ／Ｎ ４０２８７７ Ｒｅｖ．Ａ，１９９６）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲコア・リージェント（Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）（Ｐａｒｔ Ｎｏ． Ｎ８０８−０２３６）；順方向プライマー５０ｎＭ、逆方向プライマー３００ｎＭ、プローブ１００ｎＭ、酢酸マンガン２．５ｍＭ；全ＲＮＡおよそ５〜１０ｎｇ；酵素、反応緩衝液、及びヌクレオチドを使用したワンステップＲＴ−ＰＣＲで実施した。サイクル：１０’５０℃；３０’６０℃；５’９５℃；４０×２０”９４℃、１’５９℃。ｍＲＮＡ発現を定量するため、標的遺伝子を、まず、内部標準としてのリボソームＲＮＡに対し規準化した。次いで、標準対照組織と比較したＭＵＣ５ＡＣの相対量としてデータを表した。
【０２７５】
組織の調製及び杯細胞産生の定量
肺を切除し、７％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。左主気管支幹を、免疫組織化学染色のため使用した。胚切片を、主な肺内気道全長が含まれるよう切断し、総上皮面積、及び細胞内粘液糖複合体に関し染色される面積を評価するため、それぞれヘマトキシリン及びエオシン、又はアルシアン青／ＰＡＳで連続的に染色した。杯細胞産生は、画像分析システム（ＳＩＳ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して上皮粘膜表面上のアルシアン青／ＰＡＳ染色粘液糖複合体の体積密度により決定した。アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色面積及び総上皮面積を、２ｍｍの長さの基底層において測定した。総面積に対するアルシアン青／ＰＡＳ染色面積の割合（％）として、データを表した。
【０２７６】
ヒトにおける研究
対象
ヒト研究のプロトコルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のヒト研究に関する委員会（ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）により承認された。ＣＯＰＤの臨床的診断基準（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８７）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３６：２２５−２４３）を満たした対象４人のヒト気管支上皮の試料を、手術時に得た。過去５年以内の気管内挿管歴、及び重度の心疾患もしくは神経学的疾患の経歴はなかった。
【０２７７】
組織の調製
外科標本を４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、次いで凍結保護のため３０％ショ糖中に一晩置いた。標本をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物に包埋し、厚さ４μｍの切片として切断した。
【０２７８】
ＥＧＦＲの免疫組織化学的分析
免疫組織化学は、凍結切片を使用して実施した。切片を４％パラホルムアルデヒドで５分間再固定した。０．０５％ツィーン２０、２％正常ヤギ血清、及びレバミゾール（２ｍＭ）を含有しているＰＢＳを、抗体の希釈剤として使用した。ＥＧＦＲに対するマウス・モノクローナル抗体（１：２００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に室温で２時間、切片をインキュベートし、次いで過剰の一次抗体を除去するためＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１：２００希釈のビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に室温で１時間、切片をインキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。全ての免疫組織化学染色に、一次抗体に曝さない対照切片、同一アイソタイプの無関係の抗体に置換するか、又は１０倍過剰の免疫感作ペプチドと共に抗体をプレインキュベートする切片が含まれていた。染色パターンを確認し、ヒトＥＧＦＲのアミノ酸残基１００５〜１０１６に相当するＥＧＦＲペプチド抗原（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用したクエンチングを実施するため、ＥＧＦＲに対するウサギ・ポリクローナル抗体（１：１００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）も使用した。
【０２７９】
統計
全てのデータが、平均±ＳＥＭで表されている。群間の統計的有意差を決定するため、一元配置分散分析を使用した。分散分析において統計的有意性が同定された場合には、多重比較のためシェフェのＦ検定を使用した。帰無仮説の確率が０．０５未満である場合、統計的有意差ありと見なした。
【０２８０】
結果
Ａ．　ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるインビトロ研究
タバコ煙はＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現を上方制御する
対照条件において、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡを構成的な発現していた。細胞へのタバコ煙溶液の添加により、６時間以内にＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現が上方制御され、その効果は１２時間後に増加した。ＴＮＦａ（対照として使用）も、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現を増加させた。ＥＧＦＲのセンス・プローブは、発現を示さなかった。
【０２８１】
タバコ煙はＥＧＦＲチロシン・リン酸化を活性化する
本発明者らは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性化に対するタバコ煙溶液の効果を調査した。陽性対照として、本発明者らは、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦＲ特異的チロシン・リン酸化を増加させるＥＧＦＲリガンド、ＴＧＦαを使用した（図１１）。同様に、タバコ煙溶液は、ＥＧＦＲ特異的チロシン・リン酸化を増加させたが、その程度は低かった（図１１）。ＢＩＢＸ１５２２によるＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の前処理により、タバコ煙溶液及びＴＧＦαにより誘導されるＥＧＦＲチロシン・リン酸化が阻害された（図１１）。
【０２８２】
タバコ煙はＭＵＣ５ＡＣ発現を増加させる
休止期ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、１２時間後、ＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡの発現をほとんど示さなかった。細胞へのタバコ煙溶液の添加により、６時間以内にＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡ発現が上方制御され、その効果は１２時間後に増加した。ＴＮＦα（対照として使用）も、ＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡ発現を増加させた。ＭＵＣ５ＡＣのセンス・プローブは、発現を示さなかった。同様に、タバコ煙は、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成を２４時間以内に増加させ、その効果は用量依存的に起こった（図１２）。
【０２８３】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤はＮＣＩＨ２９２細胞におけるＭＵＣ５ＡＣの遺伝子及びタンパク質の発現を防止する
タバコ煙によって誘導されるＭＵＣ５ＡＣの遺伝子及びタンパク質の発現が、ＥＧＦＲの活性化により起こったのか否かを試験するため、細胞を様々なチロシンキナーゼ阻害剤と共にインキュベートした。選択的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２、ＡＧ１４７８）による細胞の前処理は、タバコ煙溶液によって誘導されるＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡ発現及びＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成を防止した（図１２）。血小板由来増殖因子の選択的チロシンキナーゼ阻害剤（ＡＧ１２９５）及びチルホスフィンの陰性対照（ＡＩ）には効果がなかった（図１２）。さらに、タバコ煙によって誘導されるＭＵＣ５ＡＣ合成は、フリーラジカル・スカベンジャー（ＤＭＳＯ）による前処理、及びＳＯＤによって有意に阻害された。これらの結果は、ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼの活性化が、ＮＣＩＨ２９２細胞におけるＭＵＣ５ＡＣの遺伝子及びタンパク質の発現を誘導すること、タバコ煙によって誘導されるＭＵＣ５ＡＣ産生に、タバコ煙によって誘導される酸化ストレスが、少なくとも一部は関与していることを示している。
【０２８４】
Ｂ．　ラットにおけるインビボ研究
タバコ煙は病原体除去ラットにおける杯細胞産生を増加させる
対照動物において、気道上皮はほとんど杯細胞を含有していなかった（図１３）。タバコ煙の吸入（１日８本５日間）によって、アルシアン青／ＰＡＳ染色は著しく増加した（図１３）。タバコ煙の吸入によって、ＭＵＣ５ＡＣムチン遺伝子発現も増加した（図１４）。
【０２８５】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２）は病原体除去ラットにおけるタバコ煙によって誘導される杯細胞産生を防止する
タバコ煙処理中、ラットをＢＩＢＸ１５２２で処理した場合、アルシアン青／ＰＡＳ染色の増加が、用量依存的かつ完全に阻害された（図１３）。ＢＩＢＸ１５２２により、タバコ煙によって誘導されるＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現の発現も防止された（図１４）。
【０２８６】
Ｃ．　ＣＯＰＤを有する患者におけるヒト研究
ＣＯＰＤを有する患者においてＥＧＦＲ免疫反応性は気道杯細胞及び粘膜下腺に位置している
ＥＧＦＲ免疫反応性は、アルシアン青／ＰＡＳ染色が陽性であった杯細胞及び粘液腺に観察され、ＥＧＦＲ染色は、気道内腔にも観察された。一次抗体に曝していない切片、又は同一アイソタイプの無関係の抗体に置換した切片は陰性であり、過剰のＥＧＦＲタンパク質による抗体の予備吸着により、ＥＧＦＲ免疫反応性は消滅した。
【０２８７】
実施例８
鼻ポリープにおけるＥＧＦＲ発現と杯細胞化生との関係
鼻ポリポーシスは、罹患した個体の福祉及び生活の質に影響を与える、一般的な慢性炎症性上気道疾患である。ＥＧＦＲがヒト鼻ポリープにおける粘液過剰分泌及び粘液細胞過形成に関与している可能性を、調査した。鼻ポリープ上皮及び下鼻甲介の正常鼻上皮において、ＭＵＣ５ＡＣの遺伝子及びタンパク質の発現を、調査した。インサイチュー・ハイブリダイゼーション及び免疫化学的染色を使用して、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現、並びにそれらと粘液細胞過形成との関係を分析した。さらに、鼻ポリープにおける、ＥＧＦＲ発現におけるＴＮＦ−αの存在及び位置、並びに好中球の存在を調査した。
【０２８８】
方法
材料
外科的手技を受けている患者から鼻標本を得た。篩骨蜂巣開放術中にポリープが摘出された患者において８個の鼻ポリープが採取され、いびき患者における鼻甲介切除中に除去された下鼻甲介から６個の鼻生検試料が得られた（対照群）。鼻組織試料を直ちにホルムアルデヒドで固定し、形態学的研究のためパラフィン包埋した。鼻ポリポーシスを有する患者は、いずれも、嚢胞性繊維症又は原発性線毛機能不全（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｉｌｉａｒｙ ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ）を有していなかった。対象には、手術の１ヶ月前にポリポーシスの療法（即ち、グルココルチコイド及び抗生物質）を中止するよう要請した。全ての患者からインフォームド・コンセントが得られ、アンリ・モンドール病院（Ｈｏｐｉｔａｌ Ｈｅｎｒｉ Ｍｏｎｄｏｒ）（ＣＣＰＰＲＢ，Ｃｒｅｔｅｉｌ，Ｆｒａｎｃｅ）の倫理委員会（Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）より承認が得られた。
【０２８９】
標準的な形態学的評価
５μｍのパラフィン切片を得、脱パラフィン処理し、組織学的研究のためのディフ・クイック・ステイン・セット（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ Ｓｔａｉｎ Ｓｅｔ）（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、及び粘液糖質複合体のためのアルシアン青（ＡＢ）／ＰＡＳで染色した。
【０２９０】
鼻標本におけるＭＵＣ５ＡＣ及びＥＧＦＲの免疫組織化学的局在部位決定
先に調製された５μｍのパラフィン切片を脱パラフィン処理し、再水和させ、４％パラホルムアルデヒドで後固定し、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメチルアルコールで処理した。０．０５％ツィーン２０、２％正常ヤギ血清を含有しているＰＢＳを、抗体の希釈剤として使用した。ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体（１：２００希釈）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）又はＭＵＣ５ＡＣに対するモノクローナル抗体（１：５００希釈）（クローン４５Ｍ１、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）と共に室温で２時間、組織切片をインキュベートした。次いで、ビオチン化ウマ抗マウス抗体（１：２５０希釈）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に室温で１時間、切片をインキュベートした。アビジン−ビオチン−アルカリホスファターゼ複合体法（Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のための標準的なプロトコルに従い、結合した抗体を可視化した。組織切片をヘマトキシリンで対比染色した。ポリープ及び下鼻甲介からの鼻粘膜の組織調製は、同時に実施した。一次抗体の省略を、陰性対照として使用した。
【０２９１】
ＡＢ／ＰＡＳ、ＭＵＣ５ＡＣ、及びＥＧＦＲに関して染色された面積の定量
ＡＢ／ＰＡＳ染色、並びにＭＵＣ５ＡＣ及びＥＧＦＲの免疫反応性の定量は、他に記載されているような半自動イメージング・システム（Ｌｏｕら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５７：１９２７−１９３４）を使用して査定した。鼻標本の上皮の画像は、４００倍の位相差レンズを用いて１０個の高倍率視野から記録した。本発明者らは、ＡＢ／ＰＡＳ、ＭＵＣ５ＡＣ、及びＥＧＦＲに関して染色された面積、並びに総上皮面積を測定し、ＡＢ／ＰＡＳ、ＭＵＣ５ＡＣに対する抗体、又はＥＧＦＲに対する抗体により染色された面積の、総面積に対する割合（％）としてデータを表した。分析は、パブリック・ドメインＮＩＨイメージプログラム（米国国立衛生研究所で開発され、ｚｉｐｐｙ．ｎｉｍｈ．ｇｏｖからアノニマスＦＴＰにより、又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ，ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ ＰＢ９５−５００１９５ＧＥＩからフロッッピーディスクで入手可能である）を用いて実施した。
【０２９２】
まず、ＡＢ／ＰＡＳ及びＭＵＣ５ＡＣに関して染色された面積（％）を調査し、対照上皮とポリープ上皮とを比較した。対照標本においては、上皮が均一に偽重層しており、試料採取は簡単であった。しかしながら、鼻ポリープの表面上皮は、様々な形態学的サブタイプを示した。（ａ）正常な偽重層上皮（線毛細胞、杯細胞、及び基底細胞の単層から構成）；（ｂ）線毛細胞、基底細胞、及び杯細胞からなる過形成上皮（３個超の細胞層、基底細胞、粘液細胞のいずれか、又は両方を含有）；（ｃ）扁平上皮化生は当標本中には観察されなかった。試料採取では、その不均一性を考慮しなければならない。まず、各ポリープにおける偽重層上皮及び過形成上皮の面積を決定するため、染色されたスライドを低倍率で調査した。標本によって大きな差違が存在し：平均すると、偽重層上皮は、完全ポリープ上皮の２５％（範囲１４〜５６％）を占め、過形成上皮は７５％（範囲４４〜１００％）を占めていた。ポリープ中の染色面積（％）を調査するため、本発明者らは、各ポリープ中の偽重層上皮及び過形成上皮の割合（％）と比例する代表的な区域（１０個の高倍率視野）の画像を得た。
【０２９３】
偽重層上皮の区域よりも過形成上皮の区域の方が、杯細胞の濃度が高いことが見出されたため、本発明者らは、２つの区域におけるＥＧＦＲタンパク質発現を比較した。これらの研究において、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質に関して染色された２つの型の上皮、及びＥＧＦＲタンパク質に関して染色された隣接切片の１０個の高倍率視野の画像を得、面積を比較した。ポリープ標本の半分のみがＥＧＦＲを発現していたため、本発明者らは、隣接する染色標本の１０個の高倍率視野を調査して、ポリープにおけるＥＧＦＲ染色とＭＵＣ５ＡＣ染色との関係を決定した。
【０２９４】
鼻組織におけるＥＧＦＲ遺伝子及びＭＵＣ５ＡＣ遺伝子の発現
ＥＧＦＲ遺伝子発現を、３５Ｓ標識リボプローブを使用したインサイチュー・ハイブリダイゼーションにより査定した。３５０ｂｐ断片をｐＴＲＩ−ＥＧＦＲヒト・テンプレート（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）より単離し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＫｐｎＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位へとサブクローニングした。インサイチュー・ハイブリダイゼーション用のＲＮＡプローブを調製するため、このヒトＥＧＦＲ ｃＤＮＡ断片を含有している組換えプラスミドを直鎖化し、アンチセンス・プローブ及びセンス・プローブを得るため、Ｔ７又はＴ３ポリメラーゼによりインビトロ転写した。インサイチュー・ハイブリダイゼーション用のプローブは、硫黄３５−ウリジン三リン酸（［３５Ｓ］ＵＴＰ）の存在下で作製した。ＭＵＣ５ＡＣについては、ヒトを含有しているプラスミドからリポプローブを作製した。プローブ単離及びインサイチュー・ハイブリダイゼーションは、以前に記載されたようにして実施した（Ｌｏｕら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５７：１９２７−１９３４）。
【０２９５】
鼻ポリープにおけるＴＮＦ−αの免疫組織化学的局在部位決定
本発明者らは、ＴＮＦ−αに対するポリクローナル・ウサギ抗ヒト抗体（１：１０００希釈）（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりポリープ標本を染色した。ＴＮＦ−αタンパク質の定量は、以前に記載されたようにして（Ｆｉｎｏｔｔｏら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：２２７８−２２８９）、１０個の連続する高倍率視野（４００倍）（５個は上皮下区域、５個は間質区域）を調査することにより実施した。報告された値は、１視野当たりの陽性細胞として表されている。これらの条件下で、１個の視野は０．２５ｍｍ２の面積を表す。
【０２９６】
好中球に関する免疫組織化学的染色
本発明者らは、組織標本中の好中球を同定するため、２個の抗体を使用した。好中球エラスターゼはヒト好中球の主要な成分であるため、本発明者らは、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）に対するモノクローナル・マウス抗体（１：５０００希釈）（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用した。さらに、好中球エラスターゼは、好中球以外の細胞に比較的少ない量で存在している可能性があるため、本発明者らは、好中球細胞表面上に存在する低親和性Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩ）と結合し、好中球（ＣＤ−１６＋）を好塩基球（ＣＤ−１６−）と区別することが以前に示されているＣＤ−１６に対するモノクローナル抗体（１：５００希釈）（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）（１０）も使用した。ＭＵＣ５ＡＣとＥＧＦＲ染色の説明の段落を参照のこと。
【０２９７】
動員された好中球は、杯細胞に対する２つの効果を有する。第一に、好中球エラスターゼは気道杯細胞の強力な分泌促進物質である（Ｔａｋｅｙａｍａら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｌ２９４−Ｌ３０２）。第二に、杯細胞脱顆粒は、ＥＧＦＲ発現を引き起こし（Ｌｅｅら （２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ）、好中球はＥＧＦＲ活性化を引き起こす（Ｔａｋｅｙａｍａら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１５４６−１５５２）。従って、本発明者らは、鼻ポリープの上皮において好中球エラスターゼ及びＣＤ１６に関して染色された細胞を計数し、ＥＧＦＲ陽性標本とＥＧＦＲ陰性標本とを比較した。各標本について、１０個の連続する高倍率視野（４００倍）を得、陽性染色細胞を計数した。結果は、陽性染色細胞数／視野として表されている。これらの条件下で、１個の視野は０．２５ｍｍ２の面積を表す。
【０２９８】
統計分析
ＡＢ−ＰＡＳ、ＭＵＣ５ＡＣ、及びＥＧＦＲに関して染色された面積、並びにＴＮＦ−α、ＨＮＥ、及びＣＤ１６に関して染色された細胞の測定から得られたデータは、ノンパラメトリックなマン・ホイトニーのＵ検定を使用して比較した。帰無仮説の確率が０．０５未満である場合、統計的有意差ありと見なした。
【０２９９】
結果
正常鼻上皮及びポリープ鼻上皮における粘液糖質複合体及びムチンＭＵＣ５ＡＣ
ＡＢ／ＰＡＳによる染色、及びムチンＭＵＣ５ＡＣに関する免疫染色は、正常鼻上皮及びポリープ鼻上皮の両方において陽性であった。ＡＢ／ＰＡＳ染色及びＭＵＣ５ＡＣ染色が占める上皮の面積は、対照対象においても、ポリープを有する対象においても、相互に異なっていなかった（それぞれ、Ｐ＝０．９１及びＰ＝０．１０）（図１５）。しかしながら、平均染色面積（％）は対照上皮よりもポリープの方が有意に大きかった（各比較、Ｐ＜０．０１）。
【０３００】
鼻上皮におけるＥＧＦＲ免疫反応性及び遺伝子発現
（ａ）ＥＧＦＲ免疫反応性
４人の対照においては、ＡＢ／ＰＡＳ染色及びＭＵＣ５ＡＣ染色が低密度であった正常上皮において、ＥＧＦＲ免疫反応性は弱く、いくつかの杯細胞及び無脱顆粒分泌細胞に局在しており；他の２人の対象においては、組織はＥＧＦＲ抗体で染色されなかった。これらの２つの標本においても、ＡＢ／ＰＡＳ染色及びＭＵＣ５ＡＣ染色は低密度であった。
【０３０１】
ポリープにおいては、８個の標本のうち４個が、ＥＧＦＲ抗体で陽性に染色され；残りの４個のポリープはＥＧＦＲ抗体で染色されなかった。４個のＥＧＦＲ陽性染色ポリープの上皮においては、ＥＧＦＲ陽性染色の平均面積（％）が、ＥＧＦＲ染色を有していた４人の対照対象の上皮よりも大きかった（４４．０７±５．９５％対１９．５５±１．４４％；Ｐ＝０．０２）。対照上皮（前記参照）とは対照的に、ポリープにおいては、ＥＧＦＲ染色が、はるかに強く、基底細胞に集中しており；いくつかの非顆粒形成分泌細胞及び杯細胞も陽性に染色された。線毛細胞は、対照においてもポリープにおいても染色されなかった。
【０３０２】
（ｂ）ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ
ＥＧＦＲ免疫反応性を示した４人の対照対象の上皮は、インサイチュー・ハイブリダイゼーションにより証明されるようにＥＧＦＲ遺伝子発現も示した。これらの標本において、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡのシグナルは弱く、上皮の基底区域に位置していた。ＥＧＦＲ染色が存在しなかった２個の対照標本においては、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡも存在しなかった。ポリープにおいては、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡに関するインサイチュー・ハイブリダイゼーションによって、基底上皮においてＥＧＦＲ免疫反応性が陽性であった４個の標本において、上皮の基底区域における強い発現が示された。ＥＧＦＲ免疫反応性を示さなかった４個のポリープには、ＥＧＦＲ遺伝子発現がほとんど存在せず；これらの標本において、シグナルは上皮の基底部分には位置しておらず、非顆粒形成分泌細胞と見られるいくつかの細長い細胞に主として見られた。センス・プローブは、ポリープにおいても対照においてもシグナルを示さなかった。
【０３０３】
鼻標本におけるＴＮＦ−α免疫局在部位決定
ＴＮＦ−αはインビトロのヒト上皮細胞系、及びインビボのラット気管上皮においてＥＧＦＲ発現を誘導するため、本発明者らは、ＴＮＦ−αに対するポリクローナル抗体で鼻標本を染色した。対照標本にはＴＮＦ−α免疫反応性が存在しなかったが、ポリープ標本は全てＴＮＦ−α免疫反応性を示した。しかしながら、ＥＧＦＲ陽性染色ポリープは、非ＥＧＦＲ染色ポリープよりも多くのＴＮＦ−α染色細胞を含有していた（１９．５５±１．１３対９．０２±．４１個／視野；Ｐ＝０．０２、ｎ＝４）。染色は、上皮下層及び深部間質層の炎症細胞に集中していた。形態学的形状に基づき、これらの細胞の大部分が、特徴的な２分葉核を有する好塩基球であった。しかしながら、いくつかの単核細胞及び好中球も陽性に染色された。１個の標本は、上皮、主に基底細胞にＴＮＦ−α免疫反応性を発現した。
【０３０４】
ＥＧＦＲ発現とムチンＭＵＣ５ＡＣとの関係
（ａ）ポリープにおける偽重層上皮と過形成上皮との比較
対照標本において、上皮は均一に偽重層していた。しかしながら、ポリープにおいては、表面上皮が偽重層上皮と過形成上皮とから構成されていた。過形成上皮の区域は、偽重層区域よりも有意に大きい、ＡＢ／ＰＡＳ及びＭＵＣ５ＡＣに関して陽性染色される上皮面積（％）を含有していることが見出したため、本発明者らは、ＥＧＦＲが、過形成上皮の区域において偽重層上皮の区域よりも強く発現しているとの仮説を立てた。本発明者らは、ＥＧＦＲ陽性ポリープの上皮において、偽重層上皮（図１６Ｂ）よりも大きいＭＵＣ５ＡＣ染色面積を含有していた過形成上皮（図１６Ａ）が、大きいＥＧＦＲ陽性染色面積も含有していることを見出した。
【０３０５】
（ｂ）ＥＧＦＲ陽性とムチンＭＵＣ５ＡＣの遺伝子及びタンパク質の発現との関係
ＥＧＦＲ活性化は、気道上皮においてムチン発現を引き起こすことが示されているため、本発明者らは、上皮におけるＥＧＦＲ陽性とムチン発現との関係を調査した。まず、これらの研究は、ＥＧＦＲを発現している標本が、ムチンＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現も示すことを示した。次に、本発明者らは、上皮におけるＥＧＦＲ陽性と、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質染色との関係を調査した。驚くべきことに、ＥＧＦＲで染色された群は、ＥＧＦＲ免疫反応性を有していないポリープ群よりも低いＭＵＣ５ＡＣ染色面積を有していた（図１７Ａ）。しかしながら、ＥＧＦＲ陽性染色ポリープにおいて、杯細胞は比較的小さく、内腔に大きいＭＵＣ５ＡＣ染色面積が存在し、このことから、活発な杯細胞脱顆粒が示されたが、ＥＧＦＲ免疫反応性を示さなかったポリープにおいては、杯細胞は比較的大きく、内腔にＭＵＣ５ＡＣ染色の最小の証拠を示した。
【０３０６】
ポリープ上皮における好中球浸潤
好中球エラスターゼは杯細胞脱顆粒に関与していることが示されているため、ＥＧＦＲが、杯細胞脱顆粒が起こった組織に、より強く発現しているという仮説を査定するため、本発明者らは、エラスターゼ及びＣＤ１６に対する抗体により標本を染色することにより、ポリープ標本における好中球の位置を調査した。本発明者らは、上皮内の好中球の数が、ＥＧＦＲに関して染色されなかった標本と比較して、ＥＧＦＲ陽性標本において増加していることを見出した（図１７Ｂ）。
【０３０７】
本発明の特定の態様を参照して本発明を説明してきたが、本発明の本旨及び範囲から逸脱することなく様々な変化を作成し、等価物を置換することが可能であることを、当業者は理解されたい。さらに、特定の情況、材料、物質の組成、過程、（１個またはそれ以上の）工程を適合化するため、本発明の目的、本旨、及び範囲に対して多くの修飾を行うことが可能である。そのような修飾は全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞及びＡ４３１細胞におけるＥＧＦ−Ｒのウェスタンブロットである。図１Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の培養物における抗ＥＧＦ−Ｒ抗体を用いた免疫細胞化学的分析である。図１Ｃは、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＥＧＦ−Ｒのノーザン分析である。
【図２】ムチン糖タンパク質の同定のためのＮＣＩ−Ｈ２９２細胞のアルシアン青／ＰＡＳ染色。
【図３】ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＭＵＣ５遺伝子発現に関するノーザン分析。
【図４】病原体除去ラットにおける抗ＥＧＦ−Ｒ抗体を用いたＥＧＦ−Ｒの免疫組織化学的分析。図４Ａ、ＴＮＦ−αで処理されたラット。図４Ｂ、オボアルブミンで感作されたラット。
【図５】杯細胞の産生に対するＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤（ＢＩＢＸ１５２２）の効果を示すグラフ（アルシアン青／ＰＡＳ陽性染色細胞が占める気道上皮の染色された面積の％として表されている）である。
【図６】健康気道上皮細胞及び喘息気道上皮細胞におけるＥＧＦＲ免疫反応性の組織分布を示す棒グラフである。
【図７】気道上皮におけるＥＧＦＲ免疫反応性とＭＵＣ５ＡＣ産生との相関を示すグラフである。
【図８】ラット気道におけるアルシアン青（ＡＢ）／ＰＡＳ染色の面積（％）に対するＩＬ−１３注入の用量依存的な効果を示すグラフであり（図８Ａ）、ラット気道におけるＭＵＣ５ＡＣタンパク質発現の面積（％）に対するＩＬ−１３注入の用量依存的な効果を示すグラフである（図８Ｂ）。
【図９】ラットにおける、選択的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２による、ＩＬ−１３により誘導されるアルシアン青／ＰＡＳによる粘液糖質複合体の染色の用量依存的な阻害を示すグラフであり（図９Ａ）、ラットにおける、選択的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＢＩＢＸ１５２２による、ＩＬ−１３により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ染色の用量依存的な阻害を示すグラフである（図９Ｂ）。
【図１０】ラット気道上皮における白血球動員に対するＩＬ−１３注入の効果を示すグラフであり（図１０Ａ）、ラット気道上皮におけるアルシアン青（ＡＢ）／ＰＡＳ染色に対するＩＬ−１３注入の効果を示すグラフである（図１０Ｂ）。
【図１１】タバコ煙及びＴＧＦαにより誘導されるＥＧＦＲのチロシン・リン酸化を示すオートラジオグラフである。結果は、３つの異なる実験の代表である。バー＝１７０ｋＤ。
【図１２】タバコ煙溶液のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞とのインキュベーションの効果、並びにタバコ煙により誘導されるＭＵＣ５ＡＣタンパク質合成に対する、チロシンキナーゼ阻害剤及び抗酸化剤の効果を示す棒グラフである。
【図１３】病原体除去ラットにおける、気道上皮のアルシアン青／ＰＡＳ染色面積の割合（％）に対するタバコ煙吸入の効果、及びタバコ煙により誘導されるアルシアン青／ＰＡＳ応答に対するＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果を示す棒グラフである。
【図１４】病原体除去ラットにおける、気管気管支組織におけるＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡ発現に対するタバコ煙吸入の効果、及びタバコ煙により誘導されるＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡ発現に対するＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の効果を示す棒グラフである。
【図１５】対照上皮（白カラム）及び鼻ポリープ上皮（黒カラム）における上皮のＡＢ／ＰＡＳ染色面積及びＭＵＣ５ＡＣ染色面積の割合（％）を示すグラフである。値は、ＡＢ／ＰＡＳ染色細胞及びＭＵＣ５ＡＣ染色細胞が占める面積（％）の平均±ＳＥＭとして表されている。
【図１６】ポリープ内の偽重層上皮及び過形成上皮におけるＭＵＣ５ＡＣ染色面積及びＥＧＦＲ染色面積の比較を示すグラフである。値は、染色面積（％）の平均±ＳＥＭとして表されている。
【図１７】ＥＧＦＲ陽性ポリープ及びＥＧＦＲ陰性ポリープにおける杯細胞脱顆粒を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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