(57)【要約】本発明は、ＢｔＩもしくはＢｔＩＩプロモーターまたはＢｔＩおよびＢｔＩＩプロモーターの組合わせ、少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列、およびバチルス・スフェリカス（「Ｂｓ」）二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質に対して少なくとも８０％の配列一致率を持ちかつ天然４１．９ｋＤタンパク質の毒性の少なくとも５０％を持つポリペプチドをコードする配列を含む核酸配列に関する。この配列は、所望により、さらに、Ｂｓ二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質に対して少なくとも８０％の配列一致率を持ちかつＢｓ　４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする。この核酸配列をバチルス・チュリンゲンシス（「Ｂｔ」）細胞またはＢｓ細胞中で発現させると、Ｂｓ二成分毒素の産生量が、非形質転換Ｂｓ細胞と比較して、少なくとも１０倍になる。本発明は、核酸配列、発現ベクター、宿主細胞、および本発明の核酸配列で細菌を形質転換することによってその殺虫細菌の毒性を増加させる方法を提供する。さらに本発明は、Ｂｔ亜種イスラエレンシス（「Ｂｔｉ」）のＣｙｔ１Ａａ１タンパク質がＢｓ抵抗性蚊の幼虫におけるＢｓ二成分毒素に対する抵抗性を逆転させるという発見に関する。本発明は、Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質を発現させるＢｓ細胞、およびＣｙｔ１Ａａ１タンパク質をＢｓ二成分毒素と同時適用することによってＢｓ二成分毒素に対する抵抗性を低下させる方法を提供する。
2004505643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）プロモーター、
（ｂ）細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチド、
（ｃ）リボソーム結合部位、および
（ｄ）バチルス・スフェリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）二成分毒素の４１．９ｋＤ毒素タンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列、
を上記の順に含む核酸配列。
【請求項２】
前記第１ポリペプチドが配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ、請求項１の核酸配列。
【請求項３】
前記第１ポリペプチドが配列番号９の配列を持つ、請求項１の核酸配列。
【請求項４】
さらに要素（ｄ）の配列が、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能する第２ポリペプチドをコードする、請求項１の核酸配列。
【請求項５】
前記第２ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項４の核酸配列。
【請求項６】
前記第２ポリペプチドが配列番号８の配列を持つ、請求項４の核酸配列。
【請求項７】
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の前記６以上の連続ヌクレオチドが９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である、請求項１の核酸配列。
【請求項８】
前記９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列が、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される、請求項７の核酸配列。
【請求項９】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターがｃｒｙプロモーターである、請求項１の核酸。
【請求項１０】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターがｃｒｙ１プロモーターである、請求項１の核酸。
【請求項１１】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターが、ｃｒｙ１Ａａ１、ｃｒｙ１Ａａ２、ｃｒｙ１Ａａ３、ｃｒｙ１Ａａ４、ｃｒｙ１Ａａ５、ｃｒｙ１Ａａ６、ｃｒｙ１Ｂａ１、ｃｒｙ１Ｂａ２、ｃｒｙ１Ｃａ１、ｃｒｙ１Ｃａ２、ｃｒｙ１Ｃａ３、ｃｒｙ１Ｃａ４、ｃｒｙ１Ｃａ５、ｃｒｙ１Ｃａ６、ｃｒｙ１Ｃａ７、ｃｒｙ１Ｆａ１、ｃｒｙ１Ｆａ２、ｃｙｔ１Ａａ１、ｃｙｔ１Ａａ２、ｃｙｔ１Ａａ３、およびｃｙｔ１Ａａ４からなる群より選択される、請求項１の核酸。
【請求項１２】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターがｃｙｔ１Ａａ１プロモーターである、請求項１１の核酸。
【請求項１３】
ＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとを持ち、該ＢｔＩプロモーターと該ＢｔＩＩプロモーターとがオーバーラップしている、請求項１の核酸。
【請求項１４】
請求項１の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項２の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項３の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項４の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項５の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１９】
請求項６の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項７の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項８の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項９〜１３のいずれかの核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１４の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１５の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１６の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１７の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１８の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１９の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２０〜２２のいずれかの発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
さらにｃｒｙ１１Ａ　２０ｋＤタンパク質を含む請求項２３の宿主細胞。
【請求項３１】
さらにｃｒｙ１１Ａ　２０ｋＤタンパク質を含む請求項２９の宿主細胞。
【請求項３２】
細胞がバチルス・チュリンゲンシス細胞である、請求項２３の宿主細胞。
【請求項３３】
細胞がバチルス・チュリンゲンシス細胞である、請求項２４の宿主細胞。
【請求項３４】
細胞がバチルス・チュリンゲンシス細胞である、請求項２５の宿主細胞。
【請求項３５】
細胞がバチルス・チュリンゲンシス細胞である、請求項２６の宿主細胞。
【請求項３６】
細胞がバチルス・チュリンゲンシス細胞である、請求項２７の宿主細胞。
【請求項３７】
細胞がバチルス・チュリンゲンシス細胞である、請求項２８〜２９のいずれかの宿主細胞。
【請求項３８】
シグマ因子Ａタンパク質を結合するバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列。
【請求項３９】
宿主細菌細胞におけるバチルス・スフェリカス二成分毒素の産生量を増加させる方法であって、
（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列で、宿主細胞を形質転換すること、および
（ｂ）前記核酸配列を宿主細胞中で発現させること
を含み、前記核酸配列の発現により、バチルス・スフェリカス二成分毒素の産生量が、前記核酸配列で形質転換されていない野生型バチルス・スフェリカス細胞におけるバチルス・スフェリカス二成分毒素の産生量と比較して増加する方法。
【請求項４０】
前記第１ポリペプチドが配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記第１ポリペプチドが配列番号９の配列を持つ、請求項３９の方法。
【請求項４２】
さらに前記第１ポリペプチドをコードする配列が、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能する第２ポリペプチドをもコードする、請求項３９の方法。
【請求項４３】
前記第２ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記第２ポリペプチドが配列番号８の配列を持つ、請求項４２の方法。
【請求項４５】
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の前記６以上の連続ヌクレオチドが９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である、請求項３９の方法。
【請求項４６】
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列が、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される、請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記宿主細胞がバチルス・チュリンゲンシス細胞である、請求項３９の方法。
【請求項４８】
前記宿主細胞がバチルス・スフェリカス細胞である、請求項３９の方法。
【請求項４９】
前記宿主細菌細胞がさらにｃｒｙ１１Ａ遺伝子の２０ｋＤ産物を発現させる、請求項３９の方法。
【請求項５０】
遺伝子組換え細菌を作出する方法であって、
（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、
少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列、
リボソーム結合部位、および
バチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列
を上記の順に含む核酸配列で、遺伝子組換え細菌を形質転換する工程、および
（ｂ）宿主細胞中で前記核酸配列を発現させる工程
を含む方法。
【請求項５１】
前記第１ポリペプチドが配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記第１ポリペプチドが配列番号９の配列を持つ、請求項５０の方法。
【請求項５３】
さらに前記第１ポリペプチドをコードする配列が、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする配列をも含む、請求項５０の方法。
【請求項５４】
前記第２ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項５３の方法。
【請求項５５】
前記第２ポリペプチドが配列番号８の配列を持つ、請求項５３の方法。
【請求項５６】
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の前記６以上の連続ヌクレオチドが９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である、請求項５０の方法。
【請求項５７】
前記細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列が、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される、請求項５０の方法。
【請求項５８】
遺伝子組換え細菌が、バチルス・チュリンゲンシス、バチルス・スフェリカス、およびＢｔｉまたはＢｓ以外のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の種からなる群より選択される、請求項５０の方法。
【請求項５９】
蚊の幼虫に対するバチルス・チュリンゲンシス細菌の毒性を増加させる方法であって、
（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチド、
リボソーム結合部位、および
バチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列
を上記の順に含む核酸配列で、前記細菌を形質転換する工程、および
（ｂ）細菌中で前記核酸配列を発現させる工程
を含み、前記核酸配列の発現により、前記幼虫に対する前記細菌の毒性が、前記核酸配列で形質転換されていない野生型バチルス・スフェリカス細胞よりも強くなる方法。
【請求項６０】
前記細菌がさらにｃｒｙ１１Ａ遺伝子の２０ｋＤ産物を含む、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記第１ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項５９の方法。
【請求項６２】
前記第１ポリペプチドが配列番号９の配列を持つ、請求項５９の方法。
【請求項６３】
さらに前記第１ポリペプチドをコードする配列が、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする配列をも含む、請求項５９の方法。
【請求項６４】
前記第２ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記第２ポリペプチドが配列番号８を持つ、請求項６３の方法。
【請求項６６】
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の前記６以上の連続ヌクレオチドが９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である、請求項５９の方法。
【請求項６７】
前記９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列が、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される、請求項６６の方法。
【請求項６８】
ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列を含むバチルス・スフェリカスの遺伝子組換え細胞。
【請求項６９】
前記第１ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７０】
前記第１ポリペプチドが配列番号９の配列を持つ、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７１】
さらに前記第１ポリペプチドをコードする配列が、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする配列をも含む、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７２】
前記第２ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７３】
前記第２ポリペプチドが配列番号８を持つ、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７４】
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の前記６以上の連続ヌクレオチドが９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７５】
前記９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列が、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される、請求項４２の遺伝子組換え細胞。
【請求項７６】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターがｃｒｙプロモーターである、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７７】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターが、ｃｒｙ１Ａａ１、ｃｒｙ１Ａａ２、ｃｒｙ１Ａａ３、ｃｒｙ１Ａａ４、ｃｒｙ１Ａａ５、ｃｒｙ１Ａａ６、ｃｒｙ１Ｂａ１、ｃｒｙ１Ｂａ２、ｃｒｙ１Ｃａ１、ｃｒｙ１Ｃａ２、ｃｒｙ１Ｃａ３、ｃｒｙ１Ｃａ４、ｃｒｙ１Ｃａ５、ｃｒｙ１Ｃａ６、ｃｒｙ１Ｃａ７、ｃｒｙ１Ｆａ１、ｃｒｙ１Ｆａ２、ｃｙｔ１Ａａ１、ｃｙｔ１Ａａ２、ｃｙｔ１Ａａ３、およびｃｙｔ１Ａａ４からなる群より選択される、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７８】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターがｃｙｔ１Ａａ１プロモーターである、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項７９】
前記細胞がさらにｃｒｙ１１Ａオペロンの２０ｋＤ産物を発現させる、請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【請求項８０】
バチルス・スフェリカス細胞の毒性を増加させる方法であって、
（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列で、前記細胞を形質転換すること、および
（ｂ）宿主細菌中で前記核酸配列を発現させること
を含み、前記核酸配列の発現により、前記細菌の毒性が、前記核酸配列で形質転換されていない野生型バチルス・スフェリカス細胞と比較して増加する方法。
【請求項８１】
前記第１ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項８０の方法。
【請求項８２】
前記第１ポリペプチドが配列番号９の配列を持つ、請求項８０の方法。
【請求項８３】
さらに前記第１ポリペプチドをコードする配列が、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする配列をも含む、請求項８０の方法。
【請求項８４】
前記第２ポリペプチドが配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す、請求項８０の方法。
【請求項８５】
前記第２ポリペプチドが配列番号８を持つ、請求項８０の方法。
【請求項８６】
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の前記６以上の連続ヌクレオチドが９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である、請求項８０の方法。
【請求項８７】
前記９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列が、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される、請求項８０の方法。
【請求項８８】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターがｃｒｙプロモーターである、請求項８０の方法。
【請求項８９】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターが、ｃｒｙ１Ａａ１、ｃｒｙ１Ａａ２、ｃｒｙ１Ａａ３、ｃｒｙ１Ａａ４、ｃｒｙ１Ａａ５、ｃｒｙ１Ａａ６、ｃｒｙ１Ｂａ１、ｃｒｙ１Ｂａ２、ｃｒｙ１Ｃａ１、ｃｒｙ１Ｃａ２、ｃｒｙ１Ｃａ３、ｃｒｙ１Ｃａ４、ｃｒｙ１Ｃａ５、ｃｒｙ１Ｃａ６、ｃｒｙ１Ｃａ７、ｃｒｙ１Ｆａ１、ｃｒｙ１Ｆａ２、ｃｙｔ１Ａａ１、ｃｙｔ１Ａａ２、ｃｙｔ１Ａａ３、およびｃｙｔ１Ａａ４からなる群より選択される、請求項８０の方法。
【請求項９０】
バチルス・チュリンゲンシスプロモーターがｃｙｔ１Ａａ１プロモーターである、請求項８９の方法。
【請求項９１】
バチルス・スフェリカス二成分毒素に対する抵抗性を低下させる方法であって、バチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）（「Ｂｔｉ」）Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質を、前記二成分毒素を発現させるバチルス・スフェリカス細胞中で発現させることを含む方法。
【請求項９２】
バチルス・スフェリカス二成分毒素に対する抵抗性を低下させる方法であって、前記二成分毒素を発現させるバチルス・チュリンゲンシス細胞中でＢｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質を発現させることを含む方法。
【請求項９３】
バチルス・スフェリカス二成分毒素に対する抵抗性を低下させる方法であって、Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質を前記二成分毒素と共に適用することを含む方法。
【請求項９４】
前記Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質が溶解凍結乾燥Ｂｔｉ細胞の粉末の形をしている、請求項９３の方法。
【請求項９５】
前記Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質が精製タンパク質である、請求項９３の方法。
【請求項９６】
前記Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質が、約１：２〜約１：５０のＣｙｔ１Ａａ１タンパク質対Ｂｓ比で適用される、請求項９３の方法。
【請求項９７】
前記Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質が、約１：１０のＣｙｔ１Ａａ１タンパク質対Ｂｓ比で適用される、請求項９６の方法。
【請求項９８】
少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列をさらに含む請求項１〜３８の核酸。
【請求項９９】
少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列をさらに含む、請求項３９、５０、５９または８０のいずれかの方法。
【請求項１００】
少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列をさらに含む請求項６８の遺伝子組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は２０００年８月１４日に出願された米国特許出願第０９／６３９，５７６号に基づく優先権を主張し、前記特許出願の内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
（連邦政府の資金提供を受けた研究および開発においてなされた発明に対する権利に関する陳述）
該当なし。
【０００３】
（発明の背景）
医学および新薬の進歩にも関わらず、マラリア、フィラリア症、デング熱およびウイルス性脳炎は今なお重大なヒトの疾患であり、これらの疾患を風土病とする地域に住む人々は世界中で２０億人と見積もられている（「世界保健レポート（Ｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｒｅｐｏｒｔ）１９９９年版」，世界保健機関，スイス・ジェノバ（１９９９））。これらの疾患の病原体は蚊によって伝達されるので、疫病管理方法は広スペクトル化学殺虫剤による蚊個体群の減少に大きく依存してきた。しかし、蚊個体群に殺虫剤抵抗性が発生するため、化学殺虫剤の使用は多くの国で徐々に削減されつつある。さらに、環境に対する影響、特に標的でない益虫ならびに食品および上水道の汚染を介した脊椎動物に対する影響が懸念されるので、多くの政府はこれらの化学製品の使用を制限している。
【０００４】
これらの問題があることから、世界保健機関は、細菌型殺虫剤の登録および使用に関する基準を策定して、化学製品から細菌型殺虫剤への転換を促進している（公衆衛生用細菌型殺幼虫剤の基準仕様（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｌａｒｖｉｃｉｄｅｓ　ｆｏｒ　ｐｕｂｌｉｃ　ｈｅａｌｔｈ　ｕｓｅ），ＷＨＯ文書ＷＨＯ／ＣＤＳ／ＣＰＣ／ＷＨＯＰＥＳ／９９．２，世界保健機関，スイス・ジェノバ（１９９９））。細菌に基づく製品の一部は蚊幼虫の防除用である。なかでも、Ｖｅｃｔｏｂａｃ（登録商標）およびＴｅｋｎａｒ（登録商標）は、最も広く使用されている２製品であり、これらはどちらもバチルス・チュリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）亜種イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）に基づいている。また、バチルス・スフェリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に基づく新製品Ｖｅｃｔｏｌｅｘ（登録商標）も、フィラリア症およびウイルス性疾患の蚊媒介体の防除用として、最近、販売されるようになった。これらの製品は商業的にはまずまずの成功を収めているが、多くの化学農薬と比較するとコストが高く効率も低いことが、多くの開発途上国における使用規模の拡大を妨げている。さらに、インド、ブラジルおよびフランスではイエカ（Ｃｕｌｅｘ）属の蚊の野外個体群でバチルス・スフェリカスに対する抵抗性が既に報告されているので、長期有用性に関する懸念も生じている（Ｓｉｎｅｇｒｅら「南仏におけるバチルス・スフェリカスに対するアカイエカ抵抗性の初めての野外出現」（Ｆｉｒｓｔ　ｆｉｅｌｄ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｕｌｅｘ　ｐｉｐｉｅｎｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ｉｎ　ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｆｒａｎｃｅ）」媒介動物生態学会（Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｅｃｏｌｏｇｙ），第７回ヨーロッパ集会，１９９４年９月５−８日，スペイン・バルセロナ；Ｒａｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｍｏｓｑ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｓｓｏｃ．１１：　１−５（１９９５）；Ｓｉｌｖａ−Ｆｉｌｈａら，Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｔ　８８：５２５−５３０（１９９５））。
【０００５】
これらの細菌の殺虫特性は、主として、芽胞形成時に産生される殺虫性タンパク質によっている。バチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシス（Ｂｔｉ）におけるキータンパク質がＣｙｔ１Ａ（２７ｋＤａ）、Ｃｒｙ１１Ａ（７２ｋＤａ）、Ｃｒｙ４Ａ（１２８ｋＤａ）およびＣｒｙ４Ｂ（１３４ｋＤａ）であるのに対して、バチルス・スフェリカス（Ｂｓ）は、単一の二成分毒素のそれぞれ毒素ドメインおよび結合ドメインとして働く４１ｋＤａおよび５２ｋＤａタンパク質を産生する（ｄｅ　ＢａｒｊａｃおよびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｄ．Ｊ．編「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ　ａｎｄ　Ｂｌａｃｋｆｌｉｅｓ」（ラトガーズ大学印刷部，ニュージャージー州ブランズウィック）の１１−４４頁に掲載されているＦｅｄｅｒｉｃｉらの論文（１９９０）；Ｂａｕｍａｎｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ　Ｒｅｖ．５５：４２５−４３６（１９９１））。
【０００６】
Ｂｔｉ毒素とＢｓ毒素とが生化学的にも毒物学的にも相違することから、これらの毒素を組み合わせて単一の細菌に導入すれば、改良された細菌を構築することが可能かもしれないと考えられた。このアプローチを使って所望の毒性を持つ遺伝子組換え細菌を作出する試みは、この十年間に数多く行なわれた。例えばいくつかのグループがＢｔｉ毒素遺伝子をＢｓに導入している。例えばＢａｒら，Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈｏｌ．５７：１４９−１５８（１９９１）ではＢｔｉ内毒素遺伝子がＢｓ２３６２にクローニングされたが、組換え生物の生物学的活性はＢｔｉの生物学的活性よりも低いことが明らかになった。Ｐｏｎｃｅｔら，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．１１７：９１−９６（１９９４）ではＢｔｉのｃｒｙ４Ｂおよびｃｒｙ１１Ａ遺伝子がＢｓ２２９７に導入され、Ｐｏｎｃｅｔら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４４１３−４４２０（１９９７）では同じ株にｃｒｙ１１Ａ遺伝子が相同組換えによって導入された。Ｔｈｉｅｒｙら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３９１０−３９１６（１９９８）では、Ｂｔ　ｃｙｔ１Ａｂ１遺伝子がＢｓに導入されたが、ｃｙｔ１Ａｂ１遺伝子の発現レベルはおそらく低すぎて毒性に有意な影響はないと報告されている。Ｓｅｒｖａｎｔら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３０２１−３０２６（１９９９）ではＣｒｙ１１ＡおよびＣｒｙ１１Ｂａ　Ｂｔ毒素が生体内組換えによってＢｓ２２９７に導入され、それによって宿主域を拡大しうることが明らかになった。。Ｂｏｕｒｇｕｉｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３４０−３４４（１９９０）では、ＢｔｉにＢｓ毒素が導入されたが、蚊幼虫に対して毒素間の相乗的または相加的効果は見いだされなかった。Ｂｓの利点とＢｔの利点とを他の方法で組み合わせる試みも商業的に有用という証拠は得られていないようである。例えば、単にＢｓの培養とＢｔの培養とを生育し、次にこれらの２生物を混合しただけでは有効でない。なぜなら、得られる混合物のうち、２生物の芽胞によって占められる割合が、毒素の重量に比して大きくなりすぎて、十分な毒性が得られないと考えられるからである。
【０００７】
新しいバイオ農薬の商業的開発は、一つにはＥＰＡの規則によって包括的な試験が要求されることもあって、多大の費用を要し、マージンは例えば医薬品に比べると低い。この十年間に報告された組換え生物はいずれも、現在市販されているＢｔｉ株またはＢｓ株と比べて、蚊防除における商業的使用に向けた開発に見合うほど十分な改善を示してはいないようである。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、Ｂｓ二成分毒素の高レベル発現を、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細胞、とりわけＢｓ細胞およびＢｔ細胞中で達成するためのヌクレオチド配列、発現ベクター、宿主細胞および方法を提供する。
【０００９】
特に本発明は、ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）プロモーター、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチド、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤ毒素タンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列を提供する。より好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、最も好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９の配列を持つ。第１ポリペプチドをコードする配列はさらに、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能する第２ポリペプチドをコードする配列を含むことができる。好ましい態様では第２ポリペプチドは配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、最も好ましい態様では配列番号８の配列を持つ。一部の態様では、前記核酸はさらに、少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列を含む。特に好ましい態様では、少なくとも６ヌクレオチドのそれら２つの配列は、どちらも９マー細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、とりわけ好ましい態様では、それらＳＴＡＢ−ＳＤ配列は３０〜４０ヌクレオチド離れている。
【００１０】
細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチドは、９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤの６、７または８連続ヌクレオチドであることができる。好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチドは９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である。一部の好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される。バチルス・チュリンゲンシスプロモーターはｃｒｙプロモーターであり、特にｃｒｙ１プロモーターであることができる。さらに、バチルス・チュリンゲンシスプロモーターは、ｃｒｙ１Ａａ１、ｃｒｙ１Ａａ２、ｃｒｙ１Ａａ３、ｃｒｙ１Ａａ４、ｃｒｙ１Ａａ５、ｃｒｙ１Ａａ６、ｃｒｙ１Ｂａ１、ｃｒｙ１Ｂａ２、ｃｒｙ１Ｃａ１、ｃｒｙ１Ｃａ２、ｃｒｙ１Ｃａ３、ｃｒｙ１Ｃａ４、ｃｒｙ１Ｃａ５、ｃｒｙ１Ｃａ６、ｃｒｙ１Ｃａ７、ｃｒｙ１Ｆａ１、ｃｒｙ１Ｆａ２、ｃｙｔ１Ａａ１、ｃｙｔ１Ａａ２、ｃｙｔ１Ａａ３、またはｃｙｔ１Ａａ４であることができる。一部の好ましい態様では、前記バチルス・チュリンゲンシスプロモーターはｃｙｔ１Ａａ１プロモーターである。前記核酸はＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの両方を含むことができ、それら２つのプロモーターはオーバーラップしていてもよい。
【００１１】
さらに本発明は上記の核酸を含む発現ベクターおよびその発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。宿主細胞はさらにＢｔｉ　ｃｒｙ１１Ａオペロンがコードする２０ｋＤタンパク質を含むことができる。好ましい態様では、宿主細胞はバチルス・チュリンゲンシス細胞またはバチルス・スフェリカス細胞である。
【００１２】
さらに本発明は、シグマ因子Ａタンパク質を結合するバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチド、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤ毒素タンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列も提供する。より好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、最も好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９の配列を持つ。第１ポリペプチドをコードする配列はさらに、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能する第２ポリペプチドをコードする配列を含むことができる。好ましい態様では第２ポリペプチドは配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、最も好ましい態様では配列番号８の配列を持つ。細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチドは、９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤの６、７または８連続ヌクレオチドであることができる。好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチドは９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である。一部の好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される。一部の態様では、前記核酸はさらに、少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列を含む。特に好ましい態様では、それら２つの配列はどちらも９マー細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、とりわけ好ましい態様では、それらＳＴＡＢ−ＳＤ配列は３０〜４０ヌクレオチド離れている。
【００１３】
さらに本発明は、宿主細菌細胞におけるバチルス・スフェリカス二成分毒素の産生量を増加させる方法であって、（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチド、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列で、宿主細胞を形質転換すること、および（ｂ）前記核酸配列を宿主細胞中で発現させることを含み、前記核酸配列の発現により、バチルス・スフェリカス二成分毒素の産生量が、前記核酸配列で形質転換されていない野生型バチルス・スフェリカス細胞におけるバチルス・スフェリカス二成分毒素の産生量と比較して増加する方法を提供する。好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す。特に好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９の配列を持つ。一部の態様では、第１ポリペプチドをコードする配列はさらに、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能する第２ポリペプチドをコードする。好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、特に好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８の配列を持つ。一部の態様では、前記核酸はさらに少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列を含む。特に好ましい態様では、それら２つの配列はどちらも９マー細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、とりわけ好ましい態様では、それらＳＴＡＢ−ＳＤ配列は３０〜４０ヌクレオチド離れている。
【００１４】
好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチドは９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である。特に好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される。好ましくは、宿主細胞はバチルス・チュリンゲンシス細胞またはバチルス・スフェリカス細胞である。好ましい態様では、宿主細菌細胞はさらにｃｒｙ１１Ａ遺伝子の２０ｋＤ産物を発現させる。
【００１５】
もう一群の態様として、本発明は、遺伝子組換え細菌を作出する方法であって、（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチド、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列で、遺伝子組換え細菌を形質転換する工程、および（ｂ）宿主細胞中で前記核酸配列を発現させる工程を含む方法を提供する。好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、特に好ましい態様では、配列番号９の配列を持つ。第１ポリペプチドをコードする配列はさらに、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする配列を含むことができる。好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、特に好ましい態様では、配列番号８の配列を持つ。一部の態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチドは９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列である。より好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される。一部の態様では、前記核酸はさらに少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列を含む。特に好ましい態様では、それら２つの配列はどちらも９マー細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、とりわけ好ましい態様では、それらＳＴＡＢ−ＳＤ配列は３０〜４０ヌクレオチド離れている。好ましい態様では、遺伝子組換え細菌は、バチルス・チュリンゲンシス、バチルス・スフェリカス、およびＢｔｉまたはＢｓ以外のバチルス属のメンバーからなる群より選択される。
【００１６】
さらにもう一群の態様として、本発明は、蚊の幼虫に対するバチルス・チュリンゲンシス細菌の毒性を増加させる方法であって、（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチド、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列で、前記細菌を形質転換する工程、および（ｂ）細菌中で前記核酸配列を発現させる工程を含み、前記核酸配列の発現により、前記幼虫に対する前記細菌の毒性が、前記核酸配列で形質転換されていない野生型バチルス・スフェリカス細胞よりも強くなる方法を提供する。好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示す。特に好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９の配列を持つ。一部の態様では、前記核酸はさらに少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列を含む。特に好ましい態様では、それら２つの配列はどちらも９マー細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、とりわけ好ましい態様では、それらＳＴＡＢ−ＳＤ配列は３０〜４０ヌクレオチド離れている。
【００１７】
好ましい態様では、第１ポリペプチドをコードする配列はさらに、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする配列を含む。より好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、特に好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８の配列を持つ。さらに、好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の前記６以上の連続ヌクレオチドは９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、特に好ましい態様では、その９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される。とりわけ好ましい態様では、細菌はさらにｃｒｙ１１Ａ遺伝子の２０ｋＤ産物を含む。
【００１８】
さらにもう一群の態様として、本発明は、ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチド、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列を含むバチルス・スフェリカスの遺伝子組換え細胞を提供する。好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号９に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、特に好ましい態様では、配列番号９の配列を持つ。一部の態様では、前記核酸はさらに少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列を含む。特に好ましい態様では、それら２つの少なくとも６ヌクレオチド配列はどちらも９マー細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、とりわけ好ましい態様では、それらＳＴＡＢ−ＳＤ配列は３０〜４０ヌクレオチド離れている。
【００１９】
好ましい態様では、第１ポリペプチドをコードする配列はさらに、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする配列を含む。より好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、特に好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８の配列を持つ。一部の態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチドは９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、好ましい態様では、その９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される。一部の好ましい態様では、バチルス・チュリンゲンシスプロモーターはｃｒｙプロモーターである。より好ましい態様では、バチルス・チュリンゲンシスプロモーターは、ｃｒｙ１Ａａ１、ｃｒｙ１Ａａ２、ｃｒｙ１Ａａ３、ｃｒｙ１Ａａ４、ｃｒｙ１Ａａ５、ｃｒｙ１Ａａ６、ｃｒｙ１Ｂａ１、ｃｒｙ１Ｂａ２、ｃｒｙ１Ｃａ１、ｃｒｙ１Ｃａ２、ｃｒｙ１Ｃａ３、ｃｒｙ１Ｃａ４、ｃｒｙ１Ｃａ５、ｃｒｙ１Ｃａ６、ｃｒｙ１Ｃａ７、ｃｒｙ１Ｆａ１、ｃｒｙ１Ｆａ２、ｃｙｔ１Ａａ１、ｃｙｔ１Ａａ２、ｃｙｔ１Ａａ３、およびｃｙｔ１Ａａ４からなる群より選択され、特に好ましい態様では、ｃｙｔ１Ａａ１プロモーターである。特に好ましい態様では、細胞はさらにｃｒｙ１１Ａオペロンの２０ｋＤ産物を発現させる。
【００２０】
さらに本発明は、バチルス・スフェリカス細胞の毒性を増加させる方法であって、（ａ）ＢｔＩプロモーター、ＢｔＩＩプロモーター、およびＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターとの組合わせからなる群より選択されるバチルス・チュリンゲンシスプロモーター、少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列、リボソーム結合部位、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素の４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の毒性の少なくとも５０％に相当する毒性を持つ第１ポリペプチドをコードする配列を上記の順に含む核酸配列で、前記細胞を形質転換すること、および（ｂ）宿主細菌中で前記核酸配列を発現させることを含み、前記核酸配列の発現により、前記細菌の毒性が、前記核酸配列で形質転換されていない野生型バチルス・スフェリカス細胞と比較して増加する方法を提供する。好ましい態様では、第１ポリペプチドは配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、特に好ましい態様では、配列番号９の配列を持つ。好ましい態様では、前記第１ポリペプチドをコードする配列はさらに、バチルス・スフェリカス二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列一致率を示しかつ配列番号９の４１．９ｋＤ毒素タンパク質の結合ドメインとして機能することができる第２ポリペプチドをコードする配列を含む。より好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８に対して少なくとも９０％の配列一致率を示し、特に好ましい態様では、第２ポリペプチドは配列番号８の配列を持つ。一部の態様では、前記核酸はさらに少なくとも６連続ヌクレオチドを含む細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の第２配列を含む。特に好ましい態様では、それら２つの少なくとも６ヌクレオチド配列はどちらも９マー細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、とりわけ好ましい態様では、それらＳＴＡＢ−ＳＤ配列は３０〜４０ヌクレオチド離れている。
【００２１】
好ましい態様では、細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６以上の連続ヌクレオチドは９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列であり、特に好ましい態様では、その９ヌクレオチド細菌ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号５）、およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号６）からなる群より選択される。本方法の好ましい態様では、バチルス・チュリンゲンシスプロモーターはｃｒｙプロモーターである。より好ましい方法では、バチルス・チュリンゲンシスプロモーターは、ｃｒｙ１Ａａ１、ｃｒｙ１Ａａ２、ｃｒｙ１Ａａ３、ｃｒｙ１Ａａ４、ｃｒｙ１Ａａ５、ｃｒｙ１Ａａ６、ｃｒｙ１Ｂａ１、ｃｒｙ１Ｂａ２、ｃｒｙ１Ｃａ１、ｃｒｙ１Ｃａ２、ｃｒｙ１Ｃａ３、ｃｒｙ１Ｃａ４、ｃｒｙ１Ｃａ５、ｃｒｙ１Ｃａ６、ｃｒｙ１Ｃａ７、ｃｒｙ１Ｆａ１、ｃｒｙ１Ｆａ２、ｃｙｔ１Ａａ１、ｃｙｔ１Ａａ２、ｃｙｔ１Ａａ３、およびｃｙｔ１Ａａ４からなる群より選択される。最も好ましい方法では、バチルス・チュリンゲンシスプロモーターはｃｙｔ１Ａａ１プロモーターである。
【００２２】
さらにもう一群の態様として、本発明は、バチルス・スフェリカス二成分毒素に対する抵抗性を低下させる方法であって、バチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシス（「Ｂｔｉ」）Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質を、前記二成分毒素を発現させるバチルス・スフェリカス細胞中で発現させることを含む方法を提供する。
【００２３】
また本発明は、バチルス・スフェリカス二成分毒素に対する抵抗性を低下させる方法であって、前記二成分毒素を発現させるバチルス・チュリンゲンシス細胞中でＢｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質を発現させることを含む方法、およびバチルス・スフェリカス二成分毒素に対する抵抗性を低下させる方法であって、Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質を前記二成分毒素と共に適用することを含む方法も提供する。Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質は溶解凍結乾燥Ｂｔｉ細胞の粉末の形をとることができ、また、精製タンパク質であってもよい。Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質は、約１：２〜約１：５０から選択されるＣｙｔ１Ａａ１タンパク質対Ｂｓ比で適用することができる。好ましくはＢｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質を約１：１０のＣｙｔ１Ａａ１タンパク質対Ｂｓ比で適用する。
【００２４】
（詳細な説明）
Ｉ．序論
本発明は、遺伝子組換え細菌細胞中でバチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）（「Ｂｓ」）の二成分毒素を高レベルに合成させるための核酸配列、ベクター、宿主細胞および方法を提供する。Ｂｓ毒素は極めて強力であるが、野生型Ｂｓ細胞は低レベルのＢｓ毒素しか産生しない。これは、Ｂｓ毒素が単一の毒素に過ぎないこと（これに対し、例えばＢｔは毒素の複合体を産生する）と相まって、昆虫がこの毒素に対する抵抗性を迅速に発生させることを可能にする。細胞あたりの毒素産生量を増加させると、その結果生じるバイオ農薬製剤の殺傷力は増加し、そのバイオ農薬を摂取する幼虫が生き残る可能性は低下する。さらに、細胞あたりの毒素量の増加は、細菌毒素発酵生産プロセスの効率を著しく増加させ、昆虫防除を達成するために適用しなければならない細菌製品の量を低下させる。したがって本発明は、製造および使用コストを著しく低下させ、有効ではあるが環境に対する有害性が高くなりがちな化学農薬に対するバイオ農薬の競争力を増加させる。
【００２５】
本発明の核酸は、Ｂｔ遺伝子由来の強力なプロモーターとリボソーム結合部位との間にＳＴＡＢ−ＳＤ核酸配列を挿入し、そのコンストラクトをＢｓ毒素の結合タンパク質もしくは毒素タンパク質またはその両方をコードする核酸配列と組み合わせることによって作製される異種配列である。好ましい態様では両方のタンパク質が存在する。驚いたことに、強力なＢｔプロモーターをＳＴＡＢ−ＳＤ核酸配列と連結すると、Ｂｓ毒素の産生量が、非改変（野生型）バチルス・スフェリカスの標準株が産生するタンパク質量の少なくとも１０倍、通常は１５〜２０倍に、劇的に増加する。そしてまた、Ｂｓ二成分毒素の存在は、遺伝子組換え細胞の毒性を驚くほど増加させる。例えば、イエカ属の蚊の幼虫に対する遺伝子組換え細胞の毒性は、非遺伝子組換え細胞と比較して１０倍以上増加する。
【００２６】
所望により、遺伝子組換え細胞はさらにｃｒｙ１１Ａオペロンの２０ｋＤシャペロン様産物を含む。驚いたことに、このタンパク質の存在は上記核酸配列からのＢｓタンパク質の合成をさらに５０％〜１００％増加させるので、Ｂｓ毒素の産生量はＢｓの標準株による産生量のおよそ２０〜３０倍に増加することになる。
【００２７】
新しい農薬には規制当局の承認を得る費用などがかかるので、投資を正当なものとするには、細菌細胞の毒性が目的とする生物に対して少なくとも約５倍は増加していることが一般に望ましい。Ｂｓ中およびバチルス・チュリンゲンシス（「Ｂｔ」）中でＢｓ毒素を産生させようと過去十年以上にわたって他の研究者らが行なってきた努力によって増加した毒素産生量は２、３または４倍であり、商業的製造または野外使用を目指すには低すぎた。したがって、本発明により、Ｂｓ毒素の産生量を、Ｂｓの標準株中で産生される量の少なくとも１０倍、より一般的には１５倍、２０倍、２５倍、さらには３０倍にも増加させうることは、有意義かつ驚くべき技術的進歩である。同じく驚いたことに、ヒト疾患の重要な媒介体であるイエカ属の蚊に対する試験では、本発明の核酸で形質転換されたＢｔ細胞の毒性には少なくとも１０倍の改善が認められ、他の属の蚊に対する当該細胞の毒性が低下することもなかった。
【００２８】
Ｂｔなどのバイオ農薬はバイオリアクターで商業生産される。本発明により、ＢｔまたはＢｓなどの細菌細胞の毒性を増加させることができるということは、単位培養培地あたりの毒素生産量が増加するので、培養量を小さくすることができ、培養培地に使用される原料も相応に減らすことができるということを意味する。したがって本発明はバイオ農薬の製造コストを低下させることになり、これは、化学農薬の代わりにバイオ農薬を使用することが経済的になるような状況を増やすだろう。さらに本発明により、通常は毒性を持たない細菌種、特に昆虫の幼虫に対して通常は毒性を持たない細菌種に、Ｂｓ毒素に基づく毒性を付与することもできるようになる。これら他の細菌種の特定環境における残留性などといった属性は、これまでバイオ農薬として役立ってきたＢｔおよびＢｓの属性とはおそらく異なるので、本発明は、現在利用可能なものとは異なる範囲の属性を持つバイオ農薬も提供する。それにより、本発明は、害虫の駆除に際して公衆衛生当局者および農学者がとりうる選択肢の範囲を拡大する。
【００２９】
高レベルのＢｓ毒素を産生する能力は、Ｂｔ亜種、例えば蚊およびブユ幼虫などの双翅目害虫の防除に有用な亜種イスラエレンシス（Ｂｔのこの株を以下「Ｂｔｉ」という）、オオタバコガ幼虫（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｉａ）、イラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）およびヨトウムシ（ｆａｌｌ　ａｒｍｙ　ｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などを含む毛虫害虫の防除に広く有用な亜種クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）、例えばコロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）およびポプラハムシ（ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ　ｌｅａｆ　ｂｅｅｔｌｅ）（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌａ　ｓｃｒｉｐｔａ）などの鞘翅目害虫に対して活性な亜種モリソニ（ｍｏｒｒｉｓｏｎｉ）、ならびに亜種テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）および亜種アイザワイ（ａｉｚａｗａｉ）の毒性を増加させるのに、とりわけ役立つ。
【００３０】
さらに本発明はバイオ農薬の宿主域の拡大を可能にする（すなわち本発明はバイオ農薬が毒性を発揮する対象生物の範囲を拡大する）。Ｂｓ毒素は主にイエカ属およびハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）属の幼虫に対して毒性を示し、一方、Ｂｔｉはイエカ属およびヤブカ（Ａｅｄｅｓ）属に対してより活性である。したがって、Ｂｔｉ細胞中で高レベルのＢｓ毒素を発現させると、イエカ属に対する毒性が増加するだけでなく、その細胞はハマダラカ属にもより有効な薬剤になる。ハマダラカ属はマラリアの主要媒介体であるので、この宿主域の増加だけでも、本発明は公衆衛生にとって大きな戦力になる。
【００３１】
さらに本発明は、ＢｔｉのＣｙｔ１Ａａ１（「Ｃｙｔ１Ａ」とも呼ばれる）タンパク質が、Ｂｓ毒性に対して高い抵抗性を持つ蚊に対するＢｓの毒性を、回復させることができるという発見に関する。他のグループにより、Ｂｓに対する抵抗性の機序は昆虫中腸における受容体への結合の喪失であることが、先に明らかにされている。理論に縛られることは望まないが、Ｃｙｔ１Ａａ１は中腸微絨毛膜へのＢｓ毒素の挿入を可能にして、毒性を回復させるようであるう。
【００３２】
市販のバイオ農薬製剤に使用されるバチルス・スフェリカス２３６２株に対して少なくとも３０，０００倍の抵抗性を持つネッタイイエカ（Ｃｕｌｅｘ　ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）個体群を使った研究で、Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１をバチルス・スフェリカスと併用したところ、抵抗性は完全に抑制された。先に、バチルス・チュリンゲンシス亜種メデリン（ｍｅｄｅｌｌｉｎ）（「Ｂｔｍ」）由来の異なるＣｙｔタンパク質Ｃｙｔ１Ａｂによって、抵抗性の抑制が多少は起こることが示されている（Ｔｈｉｅｒｙら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３９１０−３９１６（１９９８））。しかし驚いたことに、Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａによる抵抗性の抑制は、Ｂｔｍ　Ｃｙｔ１Ａｂを使って達成された抑制より数倍大きい。さらに、Ｂｓ２３６２は商業的に使用されている株であり、しかも標的蚊個体群が既にかなりの抵抗性を発生させている株なので、この株に対する抵抗性を抑制することはとりわけ重要である。したがって、Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質がＢｓ２３６２に対する毒性を回復させるという発見により、バイオ農薬としてのＢｓの継続使用を妨げてきた大きな課題の解決策が提供される。
【００３３】
この発見は、Ｂｓ毒素を産生する細菌細胞、例えばＢｓ細胞、またはＢｓ毒素を産生するように組換え的に改変されたＢｔ細胞などでＢｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１を産生させることによって、利用することができる。Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａ１を発現させるように組換え的に改変されたＢｓ細胞中でＢｓ毒素が産生される場合は、さらに、ｃｒｙ１１Ａオペロンがコードする２０ｋＤシャペロン様タンパク質を発現させるように細胞を形質転換することが好ましい。ｃｙｔ１Ａａ１の配列はＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号Ｘ０３１８２として入手することができ、Ｗａａｌｗｉｊｋら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：８２０７−８２１７（１９８５）によって公表されている。ｃｒｙ１１Ａオペロンとそこにコードされている２０ｋＤタンパク質については後述する。
【００３４】
もう一つの選択肢として、Ｂｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａタンパク質またはＣｙｔ１Ａａを産生するＢｔｉ細胞（またはＢｔｉ　Ｃｙｔ１Ａａを産生するように組換え的に改変された他のバチルス属の細胞）を、Ｂｓから製造された細胞、顆粒または粉末に加えて、その顆粒が本来なら抵抗性である生物に対して毒性を持つようにすることもできる。
【００３５】
下記の実施例に示すように、Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質は比較的わずかな量でも、抵抗性を劇的に抑制することができ、または抵抗性を排除することさえできる。好ましい態様として、Ｃｙｔ１Ａａ１タンパク質は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９または１：１０から選択される比で、Ｂｓ混合物に加えることができ、比較的少ない添加物量で抵抗性の顕著な逆転が起こるので１：１０が最も好ましい。また、例えば比率を下げると抵抗性の抑制にある程度の低下が起こるかも知れないことを理解した上で、ＣｙｔＡａ１タンパク質を添加するコストを下げることが望まれる場合などには、さらに高い比、例えば１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、または１：７０なども使用することができる。実施例５に記載のアッセイを使って特定の比を試験することにより、その特定の比が抵抗性の逆転を所望する程度にもたらすかどうかを判別することができる。１：１００に満たないＣｙｔ１Ａａ１対Ｂｓ比は好ましくない。
【００３６】
Ｃｙｔ１Ａａタンパク質は精製顆粒として添加することができるが、通常はＣｙｔ１Ａａ産生Ｂｔｉ細胞の形でＣｙｔ１Ａａを添加する方が容易である。Ｂｓと混合する前にＢｔｉ細胞を溶解し凍結乾燥して粉末にしておくと便利である。好ましい態様では、Ｂｓは２３６２株である。
【００３７】
本発明者らの結果によれば、Ｂｔｉに由来する他のＣｙｔ１タンパク質も、同じように作用して、Ｂｓ二成分毒素に対する抵抗性を逆転させるだろう。
【００３８】
一般にＢｓ細胞とＢｔ細胞とが一緒には適用されないことは当業者に知られている。理論に縛られることは望まないが、これは、それぞれの種によって産生される芽胞の重量が毒素と比較して大きくなり、標的幼虫が摂取できる毒素の有効量を減少させることが懸念されるためだろう。しかし、抵抗性の抑制を達成するために添加する必要があるＢｔｉの量はあまり大きくないので、この懸念材料は取り除かれる。実施例に記載する研究は、Ｂｔｉ細胞をＢｓと混合しても十分な毒性が得られることを示している。
【００３９】
Ｂｔはバイオ農薬として約２０年間商業的に使用され、Ｂｓは約５年間商業的に使用されてきた。野外におけるＢｔｉおよびＢｓの使用は、例えばＨ．ｄｅ　ＢａｒｊａｃおよびＤ．Ｊ．Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ編「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ　ａｎｄ　Ｂｌａｃｋｆｌｉｅｓ」ラトガーズ大学印刷部（ニュージャージー州ブランズウィック、１９９０）のＭｕｌｌａ，Ｍ．Ｓ．「蚊に対するバチルス・チュリンゲンシス・イスラエレンシスの活性、野外効力および使用（Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｆｉｅｌｄ　ｅｆｆｉｃａｃｙ，ａｎｄ　ｕｓｅ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ）」ｐ．１３４−１６０およびＹａｐ，Ｈ．−Ｈ．「蚊防除用バチルス・スフェリカスの野外試験（Ｆｉｅｌｄ　ｔｒｉａｌｓ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ｆｏｒ　ｍｏｓｑｕｉｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ）」ｐ．３０７−３２０などに概説されている。したがって、大量のＢｔおよびＢｓ生物を培養すること、これらの生物からバイオ農薬を製剤すること、およびその製剤を野外で適用することは、当業者にはよく知られている。本明細書に記載する組換え生物および方法は、当技術分野で知られるＢｔおよびＢｓ細胞からバイオ農薬を製剤する方法のいずれにも使用することができる。
【００４０】
本発明の組換えＢｓ細胞は、Ｂｓバイオ農薬が現在使用されている方法のいずれにも使用することができるが、現在商業的に使用されている株と比較した場合の毒性の増加に見合った低い適用率で適用することができる。例えば、組換えＢｓが現行株の１０倍の毒性を持つとすると、現在使用されている物質量の１０分の１の適用で同じ殺傷力を得ることができる。さらに、Ｃｙｔ１Ａａ１を発現させる遺伝子組換え細胞は、野生型Ｂｓ二成分毒素に対して抵抗性になっている蚊個体群に対して使用することができる。
【００４１】
Ｂｓ二成分毒素を産生する本発明の組換えＢｔ細胞は、一般にＢｔによって防除される生物の防除に使用することができると共に、ハマダラカ属に対して使用することもできる。組換えＢｓに関して上で述べたように、高レベルのＢｓ毒素を発現させる組換えＢｔは、現在商業的に使用されている株と比較した場合の毒性の増加に見合った低い適用率で適用することができる。したがって、本発明により、物質の使用量を減らすことができる。ＢｔまたはＢｓの量を減らすと、培養する必要があるＢｔまたはＢｓの量が減ることになるので、同量の殺傷力を製造するために必要な原料が減少し、したがって、与えられた面積を処置するのに十分な物質を製造するための純費用が減少する。
【００４２】
以下の項では本明細書で使用する用語を定義する。次に、ＢｔおよびＢｓ細菌ならびにそれらの毒素、本発明での使用に適したＢｔプロモーター、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列、本発明の核酸配列の構築、および２０ｋＤシャペロン様タンパク質、ならびに本発明の核酸、ベクター、宿主細胞および細菌の製造および使用について述べる。
【００４３】
ＩＩ．定義
別段の定義をしない限り、本明細書で使用する技術用語およ科学用語は全て、本発明の属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を持つ。本発明で使用する用語の多くは、その一般的定義を、以下の文献に見いだすことができる：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら「Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（第２版、１９９４）、Ｗａｌｋｅｒ編「Ｔｈｅ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９８８）、ＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ「Ｔｈｅ　Ｈａｒｐｅｒ　Ｃｏｌｌｉｎｓ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９１）。本発明を実施または試験するにあたって、本明細書に記載する方法および物質と類似するまたは等価な方法および物質はいずれも使用することができるが、好ましい方法および物質を説明する。本明細書において下記の用語は、別段の明示がない限り、それぞれに与えられた意味を持つ。
【００４４】
「バチルス・チュリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）」、「Ｂ・チュリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）」および「Ｂｔ」は、芽胞形成時に結晶性封入体を産生する能力を持つことを特徴とするグラム陽性土壌細菌を表す。封入体には殺虫性内毒素が含まれている。封入体は、プラスミド上の遺伝子によってコードされる殺虫性タンパク質（「結晶性タンパク質」という場合もある）を含む。この細菌は、高温で培養することにより、プラスミドを「除去」して、結晶性タンパク質を産生しない細胞にすることができる。そのような細菌を「非結晶（ａｃｒｙｓｔａｌｌｉｆｅｒｏｕｓ）」細胞または「結晶陰性（ｃｒｙｓｔａｌ　ｍｉｎｕｓ）」細胞という。
【００４５】
「バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）」または「Ｂｓ」は、同様にある種の昆虫にとって有毒なタンパク質のパラ胞子結晶を産生するグラム陽性土壌細菌を表す。
【００４６】
「二成分毒素（ｂｉｎａｒｙ　ｔｏｘｉｎ）」はＢｓが産生する毒素を表す。この毒素は２つのタンパク質から構成され、そのうちの一方は結合部分として働き、他方は毒素として働く。これら２つのタンパク質は溶液中で会合して機能的毒素を形成することができる。これらのタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Ｂａｕｍａｎｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２０４５−２０５０（１９８８）に報告されている。５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）は結合ドメインとして機能し、４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）は毒素ドメインとして機能する。本明細書でこれらのタンパク質のどちらかに言及する場合は、天然の変異体、および（ａ）４１．９ｋＤ毒素タンパク質の場合はタンパク質の毒性が、または（ｂ）５１．４ｋＤ結合タンパク質の場合は毒素タンパク質の結合を可能にする当該タンパク質の能力が、５０％を超える減少を起こしていないような合成変異体を包含するものとする。具体的には、例えばグルタミン酸によるアスパラギン酸の置換またはその逆などといった保存的置換が施されている合成変異体が考えられる。
【００４７】
「Ｃｒｙ」および「Ｃｙｔ」は、バチルス・チュリンゲンシスが産生する２つのタンパク質ファミリーのメンバーを表す。最近、当技術分野では、種々のＣｒｙタンパク質をローマ数字（当該タンパク質が毒性を示す生物の見かけの範囲を表そうとしたもの）で記載する方法から、アラビア数字で記載する方法に命名法が変更され、Ｃｙｔタンパク質も名称が見直された。約１３０のＣｒｙおよびＣｙｔタンパク質について旧名称および現行名称の命名法を対比した包括的一覧表が、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３（１９９８）に記載されている。
【００４８】
現在「Ｃｙｔ１Ａａ１」と呼ばれているタンパク質は、以前は「ＣｙｔＡ」または「Ｃｙｔ１Ａ」と呼ばれることがあった。本明細書でＣｙｔＡまたはＣｙｔ１Ａという場合はＣｙｔ１Ａａ１を表す。
【００４９】
当技術分野における標準的な用法に従って、本明細書における「Ｃｒｙ」または「Ｃｙｔ」という用語の使用はタンパク質を表し、イタリック体の用語「ｃｒｙ」または「ｃｙｔ」は遺伝子を表す。
【００５０】
「プロモーター」は、関連ポリヌクレオチドの転写を指示する一連の核酸制御配列、例えばバチルス・チュリンゲンシス由来のｃｒｙ１Ａｃ１プロモーターであり、異種ポリヌクレオチドであっても固有のポリヌクレオチドであってもよい。プロモーターは、転写開始部位近くの核酸配列、例えばポリメラーゼ結合部位などを含む。プロモーターは、所望により、転写開始部位から数千塩基対もの距離に位置する場合もある遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含む。
【００５１】
「シグマ因子」は、ＤＮＡ中の特定配列を認識することが知られているタンパク質であって、ＲＮＡポリメラーゼによるそのＤＮＡの転写の開始を促進するタンパク質複合体の一部を形成するタンパク質を表す。当技術分野では知られているように、シグマ因子タンパク質の配列は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での研究によって決定された。バチルス属の他の種で同じ機能を果たすタンパク質は枯草菌のシグマ因子に対して約８０〜９５％の配列相同性を持つ。したがって、Ｂｔにおいて枯草菌のシグマ因子と同じ役割を果たす因子は、枯草菌の典型タンパク質の配列とはわずかに異なる配列を持つ。本明細書で使用する「シグマ因子」という用語は、Ｂｔにおいて枯草菌のシグマ因子と同じ機能を果たし、枯草菌のシグマ因子タンパク質に対して約８０〜９５％またはそれ以上の配列相同性を持つタンパク質を表す。これらのタンパク質は枯草菌タンパク質に対応するが、その配列は必ずしも枯草菌タンパク質と同一ではないことを強調するために、本明細書では、これらを「シグマ様」因子またはタンパク質と呼ぶ場合もある。
【００５２】
「ＢｔＩプロモーター」はシグマ因子Ｅによって認識されるプロモーターを表す。「ＢｔＩＩプロモーター」はシグマ因子Ｋによって認識されるプロモーターを表す。
【００５３】
「強力なＢｔＩまたはＢｔＩＩプロモーター」は、あるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結して、Ｂｔ細胞中で発現させた場合に、細胞の乾燥重量の少なくとも５％、より好ましくは１０％、最も好ましくは１５％以上を占めるタンパク質をもたらすプロモーターを表す。
【００５４】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、リン酸ジエステル結合、関連する天然構造変異体およびその合成非天然類似体によって連結されたヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然構造変異体、およびその合成非天然類似体）から構成されるポリマーを表す。したがって、この用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオチド間の結合に非天然合成類似体が含まれるヌクレオチドポリマーを包含する。文脈上必要であれば、ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表した場合に、これが「Ｔ」を「Ｕ」で置き換えたＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も包含することは理解されるだろう。
【００５５】
「組換え」は、インビトロで合成されたまたは他の方法で操作されたポリヌクレオチド（「組換えポリヌクレオチド」）と、組換えポリヌクレオチドを使ってそれらのポリヌクレオチドがコードする遺伝子産物を細胞内または他の生物学的系内で産生させる方法とを表す。例えばクローン化ポリヌクレオチドを適当な発現ベクター、例えば細菌プラスミドなどに挿入し、そのプラスミドを使って適当な宿主細胞を形質転換することができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を「遺伝子組換え宿主細胞」または「遺伝子組換え細菌」という。次に、遺伝子組換え宿主細胞内で遺伝子を発現させて、例えば「組換えタンパク質」を産生させる。組換えポリヌクレオチドは非コード機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）を果たしてもよい。
【００５６】
「異種ポリヌクレオチド配列」または「異種核酸」は、もう一つのポリヌクレオチドに、それら２つのポリヌクレオチド配列が自然界にある場合と同じ関係では配置されていないような形で、機能的に関係しているポリヌクレオチド、例えばプロモーター配列を表す相対語である。異種ポリヌクレオチド配列としては、例えば、異種核酸に作動可能に連結されたプロモーター、および遺伝子組換え宿主細胞に導入するための異種ベクターに挿入された固有のプロモーターを含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。異種ポリヌクレオチド配列は、形質転換技術によって宿主細胞に導入されるので、「外因性」であると見なされる。しかし異種ポリヌクレオチドは、外部供給源に由来してもよいし、同じ供給源に由来してもよい。異種ポリヌクレオチド配列の改変は、例えばポリヌクレオチドを制限酵素で処理して、調節要素に作動可能に連結することができるポリヌクレオチド配列を生成させることなどによって行なうことができる。改変は部位特異的突然変異誘発法などの技術によって行なうこともできる。
【００５７】
「内因性に発現」という用語は、宿主細胞中で天然に発現される、宿主細胞にとって固有のポリヌクレオチドを表す。
【００５８】
「発現カセット」は、宿主細胞における遺伝子の転写を可能にする一連のポリヌクレオチド要素を表す。通例、発現カセットはプロモーターおよび転写される異種または固有のポリヌクレオチド配列を含む。発現カセットは、例えば転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサー要素などをさらに含んでもよい。
【００５９】
「作動可能に連結」という用語は、一方の部分の活性（例えば転写を調節する能力）が他方の部分に対する作用（例えば配列の転写）をもたらすような２つの部分間の機能的関係を表す。したがって、あるポリヌクレオチド発現制御配列（例えばプロモーターまたは他の転写調節配列）と第２のポリヌクレオチド配列（例えば固有のまたは異種のポリヌクレオチド）とが機能的に連結されていて、発現制御配列がポリヌクレオチドの転写を指示する場合、ポリヌクレオチドは「プロモーターに作動可能に連結」されている。
【００６０】
「殺虫性内毒素」は、結晶性タンパク質とも呼ばれるＣｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１ＣおよびＢｓ二成分毒素などの殺虫活性を示す内毒素タンパク質をコードする遺伝子のファミリーを表す（ＨｏｆｔｅおよびＷｈｉｔｅｌｅｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３：２４２−２５５（１９８９）参照）。そのような殺虫性内毒素はバチルス・チュリンゲンシスによって産生され、昆虫、特に昆虫の幼虫にとって有毒である。
【００６１】
殺虫性内毒素の「殺虫有効量」は、植物、土壌または他の「位置」、例えば部位もしくは場所に適用したときに殺虫活性を与える単位用量である。
【００６２】
「ｃｒｙ１１Ａオペロン２０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子」（２０ｋＤａタンパク質遺伝子）は、約２０ｋＤａのタンパク質をコードするｃｒｙ１１Ａオペロン中の遺伝子を表す（Ｆｒｕｔｏｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｙｓ．ａｎｄ　Ｅｃｏｌ．１９：５９９−６０９（１９９１）に記載されているもの；ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についてはＦｒｕｔｏｓらの文献の図４を参照されたい）。
【００６３】
「産生量を増加させる」とは、第１のタンパク質、例えばｃｒｙ１１Ａオペロン２０ｋＤａタンパク質などの、宿主細胞における第２のタンパク質、例えば殺虫性内毒素などの正味の量を増加させる活性を表す。
【００６４】
「発現させるのに適格な」とは、内因性および／または外因性ポリヌクレオチドの発現にとって十分な細胞環境を提供する宿主細胞を表す。
【００６５】
２以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、「同一」または「一致」率という用語は、下記の配列比較アルゴリズムの一つを使用するかまたは目視検査による評価で最大限一致するように比較し整列した場合に、同じである２以上の配列または部分配列、または同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの百分率が指定した値である２以上の配列または部分配列を表す。
【００６６】
２つの核酸またはポリペプチドに関して、「実質的に同一」という表現は、下記の配列比較アルゴリズムの一つを使用するかまたは目視検査による評価で最大限一致するように比較し整列した場合に、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基一致率を示す２以上の配列または部分配列を表す。
【００６７】
配列を比較するには、通例、ある配列を基準配列とし、試験配列をその基準配列と比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験配列および基準配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定したプログラムパラメーターに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列一致率を計算する。
【００６８】
比較のための配列の最適な整列は、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジー整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ウィスコンシン州マディソン、サイエンス・ドライブ５７５）のウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって行なうことができる（概要については、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の合弁事業（１９９５年増補版）（以下「Ａｕｓｕｂｅｌ」）を参照されたい）。
【００６９】
配列一致率および配列類似率の決定に適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｅｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により、公的に利用することができる。このアルゴリズムでは、まず、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させた時にある正の値を持つ限界スコアＴに一致するかスコアＴを満足する問い合せ配列中の長さＷの短い文字列を同定することによって、高スコア配列ペア（ｈｉｇｈ　ｓｃｏｒｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｐａｉｒ：ＨＳＰ）が決定される。Ｔは近傍文字列スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ　ｗｏｒｄ　ｓｃｏｒｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前掲）。ヒットしたこれらの初期近傍文字列を元にして、それらを含む、より長いＨＳＰを見つけるための検索を開始する。次に、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、ヒットした文字列を各配列に沿って両側に延長する。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアはパラメーターＭ（一致する残基対に対する報奨（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ（一致しない残基対に対する禁則（ｐｅｎａｌｔｙ）スコア；常に＜０）を使って計算される。アミノ酸配列の場合は、スコア行列を使って累積スコアを計算する。ヒットした文字列の各方向への延長は、累積アラインメントスコアが最大達成値より量Ｘだけ低下した時に中止する。累積スコアは１または複数の負スコア残基の並びが蓄積するために０以下になるか、または各配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトとして、文字列の長さ（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ：Ｗ）１１、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ：Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較が使用される。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、文字列の長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列が使用される（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５（１９８９）参照）。
【００７０】
配列一致率の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行なう（例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴによって得られる類似性の尺度の一つは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標となる最低和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ　ｓｕｍ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と基準核酸との比較における最低和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であるなら、その核酸は基準配列に類似しているとみなされる。
【００７１】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらにもう一つの指標は、後述するように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。したがって、例えばあるポリペプチドともう一つのポリペプチドとの相違点が保存的置換だけである場合、それら２つのポリペプチドは、通例、実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることのもう一つの指標は、後述するように、２つの分子がストリンジェントな条件で互いにハイブリダイズすることである。
【００７２】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という用語は、ある核酸配列がその相補鎖にはハイブリダイズするが、他の配列にはほとんどハイブリダイズしないような条件を表す。核酸ハイブリダイゼーションに関してストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境パラメーターが異なると変化する。長い配列ほど高温で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳細な指針はＴｉｊｓｓｅｎ「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｂｅｓ」パートＩの第２章「ハイブリダイゼーションの原理の概観および核酸プローブアッセイの戦略（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅ　ａｓｓａｙｓ）」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク（１９９３）に記載されている（このＴｉｊｓｓｅｎの文献は全文、参照により本明細書に組み込まれる）。極めてストリンジェントな条件は、特定プローブのＴＭ点に等しくなるように選択される。これに対し、ストリンジェンシーが低下した条件は、核酸配列が不完全に一致した配列に結合するような条件である。ストリンジェンシーは、温度、塩濃度、ホルムアミドもしくはＤＭＳＯなどの有機化合物の存在、またはこれらの全てによって制御することができる。これらのパラメーターの変更による影響は当技術分野ではよく知られている。例えば、ホルムアミド濃度の変化がＴｍに及ぼす影響は、次の等式にまとめられる：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇＮａ＋）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／オリゴ長）−０．６３（％ホルムアミド）。ＴＭＡＣによるＴｍの低下および塩濃度の変更による影響もよく知られている。温度の変更は、便利で、制御が容易で、可逆性があることから、一般に好ましいストリンジェンシー制御手段である。
【００７３】
「保存的置換」は、ポリペプチドにおける、あるアミノ酸の、機能的に類似するアミノ酸による置換を表す。以下の６群はそれぞれに、互いに保存的置換であるアミノ酸を含んでいる：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ「ＰＲＯＴＥＩＮＳ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク（１９８４）も参照されたい。
【００７４】
ＩＩＩ．ＢｔｉおよびＢｓ毒素
ＢｔｉおよびＢｓは、芽胞形成時にタンパク質結晶性封入体を産生する好気性グラム陽性有芽胞土壌生物である。Ｂｔ亜種の結晶は、広範囲にわたる多様な鱗翅目、鞘翅目および双翅目の種の幼虫に対して毒性を示す。序論では、その防除に様々なＢｔ亜種が現在使用されている昆虫の一部を挙げた。Ｂｔは使用されている全バイオ農薬の約９０％を占める（ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６０２７−６０３３（１９９５））。
【００７５】
ｃｒｙ遺伝子およびｃｙｔ遺伝子は、Ｂｔが産生する様々な殺虫性タンパク質をコードしている。これらの遺伝子は数多く同定され配列決定されており、当技術分野ではよく知られている。例えばＣｒｉｃｋｍｏｒｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３（１９９８）（このＣｒｉｃｋｍｏｒｅらの文献は全文、参照により本明細書に組み込まれる）には、１２０個を超える同定されたＢｔ　ｃｒｙ遺伝子および９個のＢｔ　ｃｙｔ遺伝子の配列について、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を記した表が記載されている。
【００７６】
その名称から予想されるように、Ｂｓの二成分毒素は、それぞれ５１．４ｋＤと４１．９ｋＤの２つのタンパク質から構成されている。これらのタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は１０年以上前から知られており、Ｂａｕｍａｎｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２０４５−２０５０（１９８８）に報告されている。５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）は結合ドメインとして機能し、４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）は毒素ドメインとして機能するので、最大限の毒素機能を発揮するには、通常は等モル量の両タンパク質が存在すべきである。これは、両タンパク質が同時にほぼ同じ量で発現されるように、本発明のプロモーター−ＳＴＡＢ−ＳＤコンストラクトの下流に、両方のタンパク質をコードする核酸配列を置くことによって、都合よく達成することができる。２つのＢｓ毒素タンパク質のうち一方だけの核酸配列を本発明のプロモーター−ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の制御下に置く場合は、２つのタンパク質が等モル量またはほぼ等モル量に産生されるように、他方のＢｓ毒素タンパク質をコードする配列を類似するプロモーターコンストラクトの転写制御下に置くことが望ましい。
【００７７】
定型的な遺伝子操作技術を使って配列番号８および９の配列を改変し、なおかつＢｓ毒素と同じように機能するタンパク質を得ることができることは、当業者には理解されるだろう。例えば、Ｂｓ二成分毒素タンパク質（配列番号９）の配列にアミノ酸の保存的置換を施して、高い配列一致度を持ち天然タンパク質の毒性の少なくとも一部を保っているタンパク質またはポリペプチドを得ることができる。また、同様の改変をＢｓ二成分毒素結合ドメイン（配列番号８）に施して、それでもなお、そのタンパク質が毒素タンパク質の結合タンパク質として機能できるようにすることもできる。好ましくは、そのようなタンパク質またはポリペプチドは、天然Ｂｓ　４１．９ｋＤまたは５１．４ｋＤタンパク質に対して少なくとも約７５％の一致率、より好ましくは配列番号８または配列番号９に対して８０％、さらに好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の一致率を持つ。天然Ｂｓ毒素の代わりを務める特定ポリペプチドの機能は、本明細書で説明する当技術分野で知られるアッセイによって、容易に試験することができる。天然４１．９ｋＤ毒素タンパク質（配列番号９）の代わりを務めるポリペプチドは天然Ｂｓ毒素の毒性の少なくとも５０％、より好ましくは天然Ｂｓ毒素の毒性の６０％、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を持っていることが好ましい。Ｂｓ二成分毒素の天然５１．４ｋＤ結合タンパク質（配列番号８）の代わりを務めるポリペプチドは、当該結合タンパク質に対する昆虫受容体に結合できることが好ましい。そのような結合は、例えば免疫組織化学（定性的）または刷子縁膜結合アッセイ（「刷子縁膜小胞結合アッセイ」とも呼ばれるこれらのアッセイにより、相対的結合能力の定量的評価が得られる）などによって決定することができる。そのようなアッセイは当技術分野ではよく知られている。
【００７８】
驚いたことに、本発明者らは、Ｂｔ由来のＣｙｔ１Ａタンパク質が、Ｂｓ二成分毒素の結合タンパク質の受容体を失っている幼虫に対する上記毒素の毒性を、回復させることができることを見いだした。したがって、所望により、Ｂｓ二成分毒素の４１．９ｋＤ毒素タンパク質を発現させる細胞において、５１．４ｋＤ結合ドメインタンパク質の一部または全部の代わりに、Ｃｙｔ１Ａタンパク質を同時発現させることができ、それらのタンパク質は、その細胞またはその細胞から製造されたバイオ農薬を摂取した標的幼虫に対して毒性を示すだろう。したがって例えば、Ｂｓ　４１．９ｋＤタンパク質の量とおおむね類似する量を発現させるプロモーターと共にＣｙｔ１Ａタンパク質をコードする核酸配列を導入することによって、ＢｔｉなどのＢｔ細胞を形質転換することができる。あるいは、Ｃｙｔ１Ａタンパク質とＢｓ二成分毒素とを個別に製造し、それらを混合して、Ｂｓ毒素抵抗性の蚊をその毒素に対して感受性にすることもできる。この使用法の変形として、Ｃｙｔ１Ａタンパク質を４１．９ｋＤ　Ｂｓ毒素タンパク質（例えば組換え発現させたもの）に添加して、その混合物を、Ｂｓ毒素に抵抗性を示す蚊個体群に対して使用することができる。５１．４ｋＤ結合ドメインタンパク質の作用機序とは作用機序が異なりうるので、完全な毒作用を達成するために、５１．４ｋＤ　Ｂｓ結合タンパク質の場合にそうであるほどには、Ｃｙｔ１Ａタンパク質の量を、毒素タンパク質の量とぴったり一致させる必要はないようである。
【００７９】
ＩＶ．Ｂｔプロモーター
本発明では、Ｂｔ　ｃｒｙまたはｃｙｔ遺伝子由来のプロモーターを使ってＢｓ毒素を発現させる。これらの遺伝子は、Ｂｔが産生する種々の殺虫性タンパク質をコードする。上述したように、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｖ．，６２：８０７−８１３（１９９８）の表１に、１２０個のＢｔ　ｃｒｙ遺伝子および９個のＢｔ　ｃｙｔ遺伝子の配列に関して、名称およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の便利な表が記載されている。これらの各遺伝子について上記の表に記載されているコード領域の開始コドンの前にある５’配列がプロモーター領域を含むことは、当業者には理解されるだろう。
【００８０】
当業者には知られているように、ＣｒｙおよびＣｙｔタンパク質の遺伝子転写は、シグマ因子と呼ばれるタンパク質が結合する配列の存在によって、時間的に調節される。シグマ因子は他のタンパク質を動員し、それが複合体を形成して、ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの転写を開始させる。ｃｒｙまたはｃｙｔ遺伝子のプロモーターは一般に、そこに結合するシグマ因子に基づいて、３つのカテゴリー、すなわちシグマＥプロモーター、シグマＫプロモーターおよびシグマＡプロモーターに分類される。
【００８１】
シグマＥプロモーターはＢｔＩプロモーターとも呼ばれ、シグマＫプロモーターはＢｔＩＩプロモーターとも呼ばれる（本明細書におけるプロモーターの説明では、「シグマＥ」および「ＢｔＩ」という用語を可換的に使用し、同様に「シグマＫ」および「ＢｔＩＩ」という用語も可換的に使用する）。多くのｃｒｙ遺伝子は芽胞形成時に活性であって、一般にＢｔＩまたはＢｔＩＩプロモーターによって駆動され、芽胞形成時にＢｔＩプロモーターが活性である時期はＢｔＩＩプロモーターより早い。概要については、ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６０２７−６０３２（１９９５）（以下「ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ　１９９５」）を参照されたい。ほとんどのｃｒｙ遺伝子を認識するシグマ因子が知られている。例えばＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ　１９９５参照。例えば、ｃｒｙ４ＡおよびＢは、ＢｔＩプロモーターによって認識される。
【００８２】
多くのｃｒｙ遺伝子は２つのプロモーター、すなわち１つのＢｔＩと１つのＢｔＩＩを持っている。これらの二重プロモーターの組合わせは、芽胞形成過程における遺伝子の発現期間を延長する働きをする。２つのプロモーターはオーバーラップする場合もある。非芽胞形成依存的ｃｒｙ遺伝子は、さらに別のシグマ因子、すなわちシグマＡによって認識されるさらに別のプロモーターセットを持つ。例えばＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ　１９９５を参照されたい。
【００８３】
本発明の核酸配列および方法には、任意の強力なＢｔＩまたはＢｔＩＩプロモーターを使用することができる。二重ＢｔＩおよびＢｔＩＩプロモーター、特にオーバーラップしたＢｔＩおよびＢｔＩＩプロモーターは、タンパク質発現の強力なプロモーターになる傾向があり、本発明の核酸を構築するためのプロモーターの好ましい形態である。二重プロモーターを持つ以下のグループに属する遺伝子のメンバーはとりわけ好ましい：ｃｒｙ１Ａ、ｃｒｙ１Ｂ、ｃｒｙ１１Ａ、およびｃｙｔ１Ａａ。
【００８４】
本発明では、非結晶Ｂｔｉ細胞の乾燥重量の少なくとも５％、より好ましくは１０％、最も好ましくは１５％以上を占めるまでＣｙｔ１Ａａ１タンパク質を発現させることができるＢｔＩまたはＢｔＩＩプロモーターは、いずれも強力なプロモーターであるとみなされ、本発明の目的に適したＢｔＩまたはＢｔＩＩプロモーターである。二重ＢｔＩおよびＢｔＩＩプロモーターまたはプロモーター領域は好ましい。
【００８５】
好ましい態様では、ＢｔＩまたはＢｔＩＩプロモーターはｃｒｙ１プロモーターまたはｃｙｔ１Ａａ１（Ｃｙｔ１Ａとも呼ばれる）プロモーターである。ｃｒｙ１プロモーターは系統学的に近い関係にあり配列一致度も高いので（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３（１９９８）参照）、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅらの文献でｃｒｙ１遺伝子と呼ばれている遺伝子のプロモーターはいずれも、Ｂｓ二成分毒素を高レベルに発現させることができると考えられる。特に好ましい態様は、ｃｒｙ１Ａａ１（かつてはｃｒｙ１Ａ（ａ）と呼ばれていた）、ｃｒｙ１Ｂａ１（かつてはｃｒｙ１Ｂと呼ばれていた）、ｃｒｙ１Ｃａ１（かつてはｃｒｙ１Ｃと呼ばれていた）、ｃｒｙ１Ｆａ１（かつてはｃｒｙ１Ｆと呼ばれていた）である。これらの各遺伝子には他にも近縁遺伝子があることに注意すべきである。例えばｃｒｙ１Ｆａ１はｃｒｙ１Ｆａ２と近縁関係にある。同じ大文字および同じ小文字で指定される上記ｃｒｙ１遺伝子群の他のメンバーは、その遺伝子群の最初に挙げた遺伝子とほぼ同等に好ましいと考えられる（すなわちｃｒｙ１Ｆａ２はｃｒｙ１Ｆａ１とほぼ同等に好ましい）。
【００８６】
もう一つの特に好ましい態様として、プロモーターはｃｙｔ１Ａａ１由来のプロモーターであることができる。このプロモーターは、ＢｔＩプロモーターとＢｔＩＩプロモーターの両方を含み、それゆえに二重プロモーターと呼ばれることもある。プロモーター領域に２つのプロモーターが含まれているので、この遺伝子のプロモーター領域は「ｃｙｔ１Ａプロモーター群」とも呼ばれる。系統学的解析および配列一致度によれば、他のｃｙｔ１Ａａ遺伝子のプロモーターも、本発明の組成物および方法に使用できる十分に強いＢｔＩもしくはＢｔＩＩプロモーターまたは複合ＢｔＩおよびＢｔＩＩプロモーターである。
【００８７】
非芽胞形成依存性ｃｒｙ遺伝子プロモーターはシグマＡプロモーターであり、条件を変更しなければ、一般的には満足できるプロモーターではない。非芽胞形成型のＢｔは当然ながら代謝資源を芽胞産生に転用することがなく、芽胞形成型よりも長期間にわたって毒素を蓄積することができる。ゆえに、非芽胞形成型では、シグマＡプロモーターを使って高レベルの毒素を蓄積させることができる。したがって、ＢｔＩおよびＢｔＩＩプロモーターは、ＢｔおよびＢｓを含むバチルスでの使用に好ましい。非芽胞形成型のバチルスでは、シグマＡプロモーターを使用することができる。
【００８８】
Ｖ．ＳＴＡＢ−ＳＤ配列
バチルス・チュリンゲンシスの結晶性タンパク質ｍＲＮＡは芽胞形成時に１０分の平均半減期を持つ。これに対して、他のｍＲＮＡの平均半減期は１〜２分である。この長い半減期は、芽胞形成細胞の乾燥重量の２０〜３０％にも達しうる結晶性タンパク質の極めて高い産生量の一因だろう。
【００８９】
これらのタンパク質の長い半減期は、その遺伝子の２つの非翻訳領域に関係している。第１に、５’非翻訳領域には、翻訳開始には関与しないがｍＲＮＡの安定性の決定因子である配列が、通常はプロモーターとコード領域との間に見いだされる。この配列はシャイン・ダルガーノ（「ＳＤ」）様コンセンサス配列である。第２に、ｃｒｙ１Ａａなどのｃｒｙ遺伝子の３’末端断片は、ｍＲＮＡ転写物の半減期を２〜３倍増加させる（ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：６３３−６４３（１９９６）（以下「Ａｇａｉｓｓｅ　１９９６」））。
【００９０】
５’ＳＤ様配列はタンパク質産生の安定化に関与するようである。したがって、これは「ＳＴＡＢ−ＳＤ」配列と名付けられている（Ａｇａｉｓｓｅ　１９９６）。Ａｇａｉｓｓｅ　１９９６では、ＳＴＡＢ−ＳＤは１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端との相互作用に関与することが示唆され、相補性を失わせると予想されるＳＴＡＢ−ＳＤ配列の突然変異は付与される安定性に影響を及ぼすことが見いだされた。興味深いことに、当時ｃｒｙＩＩＩＡと呼ばれていたタンパク質（現在はｃｒｙ３Ａと呼ばれている）のＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、枯草菌１６Ｓ　ｒＲＮＡの３’末端との相互作用と推定される作用を示した。理論に縛られることは望まないが、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列のポリプリン（ＧおよびＡ）ヌクレオチドは、リボソームの１６Ｓ　ｒＲＮＡの３’末端のピリミジンヌクレオチドの相補的配列と塩基対を形成するらしく、この塩基対形成がｍＲＮＡの５’末端への５’エンドリボヌクレアーゼの接近を阻害し、メッセージの半減期を増加させ、よってコードされているタンパク質の産生量を増加させるようである。したがって、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は特定の細菌種に特異的なものではなく、他のバチルス属および他の属の細菌のＳＴＡＢ−ＳＤ配列を使って、ビー・チューリギエンシスおよびバチルス・スフェリカスにおけるタンパク質の産生を安定化することができると思われる。
【００９１】
Ａｇａｉｓｓｅ　１９９６では、データベースが再検討され、例えばＢｔ由来の４つのｃｒｙ遺伝子、ビー・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）のｃｗｐ遺伝子座、およびリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のｉｎＩＡＢ遺伝子座などの５’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）に、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列と推定される配列が数多く同定された。これらのＳＴＡＢ−ＳＤ配列はいずれも、強力なバチルスプロモーターとリボソーム結合部位との間に置けば、バチルス中で高レベルのＢｓ毒素を産生させるために使用することができる。同定されたＳＴＡＢ−ＳＤ配列は互いにかなり高い相同性を持っている。
【００９２】
好ましい態様では、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（ｃｒｙ３Ａ配列、配列番号１）、ＧＡＡＧＧＧＧＧＧ（ｃｒｙ３Ｂ配列、配列番号２）、ＧＡＧＧＧＧＧＧＧ（ｃｒｙ３Ｂ２配列、配列番号３）、ＧＡＡＡＧＧＧＧＧ（ｃｒｙ３Ｄ配列、配列番号４）、ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（ビー・ブレビスのｃｗｐ、配列番号５）およびＧＡＡＡＧＧＧＧＴ（エル・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のｉｎｌＡＢ、配列番号６）からなる群より選択される。ｃｒｙ３Ａ、ｃｒｙ３Ｂ、ｃｒｙ３Ｂ２およびｃｒｙ３Ｄ配列は特に好ましい。ｃｒｙ３Ａは最も好ましい態様である。所望により、２以上のＳＴＡＢ−ＳＤ配列をタンデムに使用することができる。複数のＳＴＡＢ−ＳＤ配列を使用する場合は、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列が複数の３０Ｓリボソームサブユニットと相互作用できるように、配列は約３０〜４０ヌクレオチド離れていることが好ましい。リボソームサブユニットのさしわたしは約３０ヌクレオチドである。使用する多重ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の数は、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列と枯草菌１６ＳｒＲＮＡ３’の３’末端との相互作用を妨害するほど多くてはならない。存在するＳＴＡＢ−ＳＤ配列が多すぎるかどうかは、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の数が一つ少ないコンストラクトと比較したタンパク質産生量の減少に注目することによって決定することができる。１〜２つのＳＴＡＢ−ＳＤ配列が最も好ましい。同様に、２つのＳＴＡＢ−ＳＤ配列の間には適宜任意の距離（通例、３〜３００ヌクレオチド）を置くことができるが、分離の効果は、分離距離が３３〜４０ヌクレオチドである類似のコンストラクトとの比較で、調べようとする分離距離を持つコンストラクトによるタンパク質の産生量を決定することによって調べることができる。
【００９３】
上記ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の一つと高い配列一致度を持ちＳＴＡＢ−ＳＤ配列として機能することができる他の配列は、本発明の核酸および方法に使用することができる。この配列は上記ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の一つに対して少なくとも８５％の配列一致率を示すべきであり、タンパク質産生量を向上させるように機能すべきである。好ましい形態として、この配列は少なくとも約９０％の配列一致率を示し、より好ましくは約９５％以上の配列一致率を示す。さらに、Ａｇａｉｓｓｅ　１９９６には、安定性に有害な影響を及ぼしうる推定ＳＴＡＢ−ＳＤ配列への改変に関する指針が記載されいている。一般に、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列と枯草菌１６ＳｒＲＮＡ３’の３’末端との相互作用を消滅させるようなヌクレオチドの変化は、タンパク質産生量を減少させると思われ、好ましくない。
【００９４】
驚いたことに、タンパク質産生量を増加させるには、完全なＳＴＡＢ−ＳＤ配列を使用する必要はないこともわかった。ＳＴＡＢ−ＳＤ配列のうち、わずか６連続ヌクレオチドでも、安定性を向上させる機能を果たすことができる。完全な９ヌクレオチドＳＴＡＢ−ＳＤ配列ほど強力にはタンパク質の産生を安定化しないものの、この６マー（ある数のヌクレオチドまたはアミノ酸からなる配列は、当技術分野では、その数および接尾語「マー」で呼ぶことができる）なしでタンパク質を産生させるよりは良い結果が得られる。したがって、所望により、これらのＳＴＡＢ−ＳＢ部分配列の一つを完全ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の代わりに使用することができる。しかし、長い配列ほど１６Ｓ　ｒＲＮＡリボソームサブユニットの対応するピリミジン配列に強く結合するので、より好ましくはＳＴＡＢ−ＳＤ配列の７連続ヌクレオチドを使用し、さらに好ましくはＳＴＡＢ−ＳＤ配列の８連続ヌクレオチドを使用する。完全長９ヌクレオチドＳＴＡＢ−ＳＤ配列を使用することが最も好ましい。これらのコンストラクトのうちの２つ、例えば２つの６マーをタンデムに使用することによって、より良い結果を得ることもできる。本明細書の他の項での説明が容易なように、「ＳＴＡＢ−ＳＤ配列」という用語は、文脈上別段の必要がない限り、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の６、７または８連続ヌクレオチド部分配列を包含するものとする。
【００９５】
推定される核酸配列または既知のＳＴＡＢ−ＳＤ配列への所望の改変は、いずれも、Ａｇａｉｓｓｅ　１９９６に記載のアッセイおよびその他の方法に従ってガラクトシダーゼコード配列を含むプラスミドにその配列を入れるか、または下記実施例に記載する方法でＳＴＡＢ−ＳＤ配列を検討中の配列で置き換え、その結果得られるタンパク質産生量を、本明細書に記載のＳＴＡＢ−ＳＤ配列を使ったコンストラクトからの同じタンパク質の産生量と比較することによって、ＳＴＡＢ−ＳＤタンパク質としてのその機能について、便利に試験することができる。クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー解析による測定で、Ｂｓ二成分毒素の産生量を野生型Ｂｓ細胞の８倍未満に減少させる配列は、あまり好ましくない。
【００９６】
ＶＩ．本発明の核酸配列の構築
当技術分野ではプロモーターの構築に関してかなりの情報が明らかになっている。これに関連して、以下の説明を行なうことにより、強力なＢｔプロモーターのシグマ因子結合部位とリボソーム結合部位との間にＳＴＡＢ−ＳＤ配列を最適に設置するために当業者が必要とするかもしれない具体的情報を提供する。
【００９７】
図１は核酸配列の典型的な構築例を示している。この態様では、ｃｙｔ１Ａプロモーターはヌクレオチド１〜５３７を含む（ｃｙｔ１Ａ遺伝子は２つのプロモーター、すなわち一つはＢｔＩプロモーター、もう一つはＢｔＩＩプロモーターを含むので、この遺伝子のプロモーター領域を当技術分野では「ｃｙｔ１Ａプロモーター群」と呼ぶ場合もある）。シグマＥ様因子およびシグマＫ様因子の結合部位をそれぞれ適当な領域の上に置いた「Ｓｉｇｍａ　Ｅ」および「Ｓｉｇｍａ　Ｋ」という表示で示し、「−３５」および「−１０」という数字ならびに下線付きの配列は特異的結合部位を表す。ヌクレオチド７２６〜７３０およびヌクレオチド２２４６〜２２４９の「ＲＢＳ」という文字を付した下線付きのヌクレオチドはリボソーム結合部位を表す。
【００９８】
５３８〜６５９の下線付きヌクレオチドは、ｃｒｙ３Ａプロモーターからクローニングした配列を表す。この配列は９ヌクレオチドＳＴＡＢ−ＳＤ配列を導入するためにクローニングしたものであるが、９ヌクレオチド配列をクローニングする方が相対的に難しいので、それより長いｃｒｙ３Ａプロモーター由来の配列を使用した。６６０位から始まる配列は、コード領域の上流にある二成分毒素の配列の一部であり、その後にコード領域が続いている（Ｂａｕｍａｎｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２０４５−２０５０（１９８８）に公表されているとおり））。「＋１」と記した位置の開始コドンの上流にあるこの部分は、単に、好都合な制限部位が存在するという理由だけで選択した。これより短いまたは長い部分を使用することもでき、実際、所望により、二成分毒素遺伝子の全プロモーター領域を使用することもできる。しかし一般的には、操作が容易であるという理由だけでなく、偶然に存在するかもしれないリプレッサー配列などが偶発的に含まれてしまうのを避けるためにも、短い配列を使用する方が好ましい。さらに、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の後ろに異なる配列を使用する場合は、リボソーム結合部位をＳＴＡＢ−ＳＤ配列と開始コドンの間に置くべきである。好ましくは、リボソーム結合部位を、開始コドンの約６〜約１０ヌクレオチド上流に置く。５１．４ｋＤおよび４１．９ｋＤ　Ｂｓ二成分毒素タンパク質の開始部位および停止部位も図示してある。
【００９９】
この典型例の要素のつなげ合わせ方は、大きく変更しても、なおＢｓ二成分毒素の高レベル産生に有効に働く配列を得ることができる。この配列では、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列をクローニングするために、ｃｒｙ３Ａ配列由来のおよそ１２１ヌクレオチドを使用した。これは単にクローニングが容易だから行なったに過ぎず、９ヌクレオチドＳＴＡＢ−ＳＤ配列（または前項で説明したように、その６、７または８連続ヌクレオチド部分配列）だけを導入することもできる。しかしクローニングの容易さを考えて、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列を包含する約２０〜約１３０ヌクレオチド長の配列を使用することが、通常は好ましい。ＳＴＡＢ−ＳＤ配列そのものはシグマ因子結合部位の約１０塩基下流からＲＢＳ配列の直前までのどこにおいてもよく、一方、ＲＢＳ配列は、開始コドンの約６〜約１０塩基上流に位置するべきである。すなわち、プロモーターのＲＢＳが削除される場合は別のＲＢＳ、例えばＢｓ二成分毒素由来のＲＢＳを開始コドンの約６〜約１０塩基上流に置くべきであるということを理解した上で、シグマ因子結合部位の下流に位置するプロモーターの全部または一部を削除することができる。上述のように、図１に示す配列では、６６０位以降の配列は天然Ｂｓ二成分毒素遺伝子に由来する。どの特定配列でも、実施例１０に記載のアッセイで、その配列を用いることにより、それが毒素産生に対して有害な影響または有利な影響を持つかどうかを決定するための試験を、容易に行なうことができる。
【０１００】
ＶＩＩ．２０ｋＤシャペロン様タンパク質
本発明の方法では、Ｂｓ二成分毒素の産生量を増加させるために、既知タンパク質（Ｆｒｕｔｏｓら，前掲；ＶｉｓｉｃｋおよびＷｈｉｔｅｌｙ，前掲）をコードする２０ｋＤａタンパク質遺伝子をコードする遺伝子で、宿主細胞を形質転換する。この２０ｋＤａタンパク質遺伝子は、例えばバチルス・チュリンゲンシスの２つの亜種から単離し、配列決定することができる（Ｆｒｕｔｏｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｙｓｔ．ａｎｄ　Ｅｃｏｌ．１９：５９９−６０９（１９９１））。２０ｋＤａタンパク質遺伝子で形質転換された細胞で、２０ｋＤａタンパク質の発現レベルが特徴付けられている。当業者は、本明細書および国際特許出願公開番号ＷＯ９７／３９６２３に記載の方法および配列情報を使って２０ｋＤａタンパク質を単離し、それを使って、宿主細胞を形質転換するための組換え発現ベクターを構築することができる。
【０１０１】
２０ｋＤタンパク質遺伝子で形質転換される宿主細胞は、Ｂｓ二成分毒素を発現させるのに適格な宿主細胞であるべきである。それらの細胞はＢｓ二成分毒素を発現させるものであってもよいし、それらの細胞を外因性二成分毒素発現ベクターで形質転換してもよい。上述のように、Ｂｓ二成分毒素の両タンパク質の配列は知られている。当業者は、この配列情報を本明細書に記載の方法と共に利用することにより、２０ｋＤタンパク質をコードする遺伝子で宿主細胞、例えばＢｓ細胞を形質転換するための組換えベクターを構築することができる。好都合なことに、２０ｋＤタンパク質の遺伝子は、高レベルのＢｓ毒素を発現させるための核酸配列と同じプラスミド上に置くことができる。
【０１０２】
ＶＩＩＩ．核酸配列およびベクター
宿主細胞を形質転換するための組換え発現ベクターは、まず、本明細書に記載する構成ポリヌクレオチド配列を単離することによって製造される。次に、それらのポリヌクレオチド配列、例えば上述のプロモーターによって駆動されるＢｓ二成分毒素をコードする配列を連結して、宿主細胞の形質転換に適した組換え発現ベクターを作製する。組換えポリヌクレオチドの単離および製造方法は当業者にはよく知られている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」第２版（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９５）には、多くのクローニング課題によって当業者を導くのに十分な情報が記載されている。
【０１０３】
特定のポリヌクレオチドを得るための好ましい一方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーを、ｍＲＮＡまたはＤＮＡテンプレート上でのポリメラーゼ伸長またはライゲーションと組み合わせて使用する。そのような方法、例えばＲＴ、ＰＣＲまたはＬＣＲでは、所望のヌクレオチド配列が増幅される（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号参照）。制限エンドヌクレアーゼ部位をプライマー中に組み込むことができる。増幅されたポリヌクレオチドを精製し、連結して、発現カセットを形成させる。天然遺伝子配列には、インビトロ突然変異誘発法および適当な突然変異が組み込まれるように設計されたプライマーを使ったＰＣＲなどの技術によって、変異を導入することができる。もう一つの好ましいポリヌクレオチド配列単離方法では、既知の制限エンドヌクレアーゼ部位を使って、プラスミドから核酸断片を単離する。当業者は、既知の遺伝子配列に基づくプライマーを使って、興味ある遺伝子を単離することもできる。
【０１０４】
選択した単離ポリヌクレオチド配列、例えば上述のプロモーター配列によって駆動されるＢｓ二成分毒素を、「発現ベクター」、「クローニングベクター」または「ベクター」（これらの用語は通常、選択した宿主細胞中で複製することができるプラスミドまたは他の核酸分子を表す）に挿入する。発現ベクターは自律的に複製することができるか、または宿主細胞のゲノム中に挿入されることによって複製することができる。多くの場合、２以上の宿主細胞中で使用できること、例えばクローニングおよび構築用の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と発現用のバチルス・チュリンゲンシスとで使用できることが、ベクターにとって望ましい。ベクターの追加要素としては、例えば、所望のポリヌクレオチド配列で形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にするテトラサイクリン耐性またはハイグロマイシン耐性などの選択マーカーを挙げることができる（例えば米国特許第４，７０４，３６２号参照）。細胞への遺伝情報の輸送に使用されるベクターも特に重要なわけではない。宿主細胞における組換えタンパク質の発現に使用される適当なベクターはどれでも使用することができる。好ましいベクターはｐＨＴ３１０１であり、これは大腸菌−バチルス・チュリンゲンシスシャトルベクターである（Ｌｅｒｅｃｌｕｓら，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２１１−２１８（１９８９））。
【０１０５】
発現ベクターは通例、選択したポリヌクレオチドの宿主細胞における発現に必要な要素を全て含む発現カセットを持つ。典型的発現カセットは、選択したポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。Ｂｓ二成分毒素の発現を指示するために使用されるプロモーターは上述のとおりであり、Ｂｓ二成分毒素タンパク質の一方または両方をコードする配列に作動可能に連結される。異種転写開始部位からプロモーターまでの距離は、好ましくは、そのプロモーターが自然環境にある場合の転写開始部位から距離とほぼ同じ距離にする。しかし、当業者には知られているように、この距離を多少変化させてもプロモーター機能の損失は起こらない。ｃｒｙ１１Ａオペロンがコードする２０ｋＤタンパク質の発現には、標準的発現カセットに典型的に使用されているもの、例えばβ−ガラクトシダーゼプロモーターなどを含めて、異種遺伝子を宿主細胞で発現させるのに適した他のプロモーターを使用することができる。本発明の一態様では、２０ｋＤタンパク質遺伝子をｃｒｙＩＡｃ遺伝子のＢｔＩおよびＢｔＩＩプロモーター（「ｃｒｙＩＡｃプロモーター」）に作動可能に連結して、プロモーターに作動可能に連結した異種核酸を生成させる。ｃｒｙＩＡｃプロモーターは、芽胞形成を誘導する生育条件で高度に活性である。
【０１０６】
ＩＸ．タンパク質の発現
組換え発現ベクターを構築し単離した後、それを使って、Ｂｓ二成分毒素を発現させるための宿主細胞を形質転換することができる。タンパク質発現用の宿主細胞に遺伝物質を導入するために使用する具体的手法は特に重要なわけではない。外来ポリヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための周知の手法はいずれも使用することができる。宿主細胞のタイプによって異なる形質転換法には、エレクトロポレーシス；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を利用するトランスフェクション；パーティクルガン法；リポフェクション；感染（ベクターが感染性物質である場合）、および他の方法がある（概要については前掲のＳａｍｂｒｏｏｋらの文献およびＡｕｓｕｂｅｌらの文献を参照されたい）。一部の態様では、Ｐｏｎｃｅｔら，Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４４１３−４４２０（１９９７）に記載されているように、相同組換えによって宿主細胞を形質転換することができる。バチルス・チュリンゲンシスの好ましい形質転換法は、Ｗｕら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：９６５−９７２（１９９４）に記載されているエレクトロポレーションである。
【０１０７】
Ｂｓ二成分毒素遺伝子で形質転換するための宿主としては、タンパク質を発現させるのに適格な任意の適切な宿主細菌細胞、特にバチルス属のメンバーが挙げられる。特に好ましい態様では、それらの細胞はＢｓまたはＢｔ細胞である。Ｂｓ二成分毒素で形質転換された宿主は、殺虫剤として有用な遺伝子組換え細菌である。バチルス・チュリンゲンシスの好ましい亜種には、例えばバチルス・チュリンゲンシス亜種クルスタキ、バチルス・チュリンゲンシス亜種アイザワイ、バチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシス、およびバチルス・チュリンゲンシス亜種テネブリオニスなどがある。好ましい株はＢｔｉ　ＩＰＳ８２である。
【０１０８】
宿主細胞をＢｓ二成分毒素遺伝子で形質転換した後、その宿主細胞を毒素の発現に適した条件下で培養する。通例、芽胞形成および殺虫性内毒素遺伝子の発現が促進されるような条件下で、宿主を生育する。当業者に知られている標準的培地で接種物を発酵させることにより、必要な任意の量の宿主細胞を調製することができる。培地は、例えば一般的には、窒素源およびグルコースなどの炭水化物源を含むだろう。適切な培養条件としては、１５〜４５℃の範囲の温度、好ましくは３０℃の温度と、ほぼ中性のｐＨが挙げられる。培養はバッチ式に、通例３〜５日間行なうと好都合だろう。
【０１０９】
当技術分野では種々のＢｔおよびＢｓ細胞用成長培地が知られている。一部の好ましい態様では、実施例で説明するように、濃度２５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含む栄養寒天（ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはペプトン化ミルク（１％ペプトン化ミルク［ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ］、１％デキストロース、０．２％酵母エキス、１．２１６ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．０７２ｍＭ　ＦｅＳＯ４、０．１３９ｍＭ　ＺｎＳＯ４、０．１１８ｍＭ　ＭｎＳＯ４）で、宿主細胞保存培養から得た接種物を生育する。
【０１１０】
Ｂｓ二成分毒素の産生量の増加は、Ｂｓ二成分毒素遺伝子を発現させるのに適格な宿主細胞をその遺伝子で形質転換し、その細胞を適当な条件下で生育した後に観察される。Ｂｓ二成分毒素の産生量の増加は、当業者に知られる標準的方法によって観察することができる。例えば、殺虫性内毒素のパラ胞子封入体を精製したり（ＷｕおよびＦｅｄｅｒｉｃｉ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：６９７−７０２（１９９５）（以下「ＷｕおよびＦｅｄｅｒｉｃｉ　１９９５」）参照）、溶解した培養物から遠心分離によって収集したり、顕微鏡で調べたり（前掲のＷｕおよびＦｅｄｅｒｉｃｉ　１９９５）することができる。遠心分離によって収集されたパラ胞子封入体または精製されたパラ胞子封入体は、当技術分野で知られている標準的な方法、例えばクロマトグラフィー、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、ウェスタン解析、またはゲル電気泳動などを使って分離することができる（前掲のＷｕおよびＦｅｄｅｒｉｃｉ　１９９５ならびに前掲のＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい）。タンパク質の量は、例えば染色したバンドの幅および強度、デンシトメトリー、生物活性および蛍光などの適当な手段によって定量することができる。非形質転換状態でＢｓ二成分毒素を合成しないことが知られているＢｔ細胞または他の細胞の形質転換体の場合は、Ｂｓ二成分毒素の産生量は全て本発明の方法による増加分に相当する考えられる。Ｂｓ細胞を本発明の核酸で形質転換した場合は、形質転換細胞によって産生される正味の毒素量を、類似する非形質転換細胞と比較することができる。正味の毒素量とは、パラ胞子体または結晶中のＢｓ二成分毒素の量を表す。対照宿主はその他の点では形質転換宿主と遺伝的に同一であり、比較培地で生育する。増加はＢｓ二成分毒素産生量の統計的に有意な増加である。好ましい態様では、溶解した培養物から遠心分離によってパラ胞子体を単離し、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによってそのパラ胞子体を調べる。
【０１１１】
（実施例）
実施例１：Ｂｔｉプロモーター、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列および毒素のコード配列を使ってＢｔｉ中で産生されるＢｓ二成分毒素の発現レベル
プラスミドｐＨＴ３１０１に入れたｃｙｔ１ＡプロモーターおよびＳＴＡＢ−ＳＤ配列を使って、バチルス・スフェリカス２３６２二成分毒素遺伝子を、バチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシス（Ｂｔｉ）の非結晶株（４Ｑ７）に導入した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で得たゲルのデンシトメトリー走査によって評価したところ、このコンストラクトにより、同じ培地で生育した親（野生型）バチルス・スフェリカス株で得られる産生量と比較して単位培養培地あたり１５倍以上と思われる二成分毒素の産生が起こった。
【０１１２】
【表１】
2004505643.tif 000003
実施例２：Ｂｓ二成分毒素を発現させるように操作された無毒性Ｂｔｉの毒性　Ｂｓ　２３６２二成分毒素を産生するように形質転換した非結晶性４Ｑ７　Ｂｔｉ株の毒性をネッタイイエカの４齢幼虫（「Ｌ４」）で試験し、同じ培地で生育した野生型Ｂｓ　２３６２株と比較した（Ｂｔｉ　４Ｑ７株は常態ではＢｓまたはＢｔｉ毒素を産生しない）。ＬＣ５０は試験時に試料中に存在する幼虫の５０％を殺すのに必要な毒素量である。
【０１１３】
下記表２に示すように、イエカ属の蚊の４齢幼虫の５０％を殺すのに必要な野生型Ｂｓ２３６２の量（「ＬＣ５０」）は１５．０ｎｇ／ｍｌだった。本発明の核酸によってＢｓ毒素を発現させるように形質転換された４Ｑ７　Ｂｔｉ株は１．４のＬＣ５０、すなわち無改変Ｂｓより約１０倍優れた毒性を持っていた。
【０１１４】
実施例３：Ｂｓ二成分毒素を発現させるように操作されたＢｔｉの毒性
Ｂｓ２３６２二成分毒素を産生させる実施例１に記載のプラスミドでバチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシスを形質転換すると、親株（ＢｓまたはＢｔｉ）のどちらと比較しても、イエカ属に対して毒性が少なくとも１０倍増加した。
【０１１５】
Ｂｔｉ　ＩＰＳ８２は市販のバイオ農薬として使用されているＢｔｉの株である。表２からわかるように、イエカ属の蚊の４齢幼虫（「Ｌ４」）の５０％を殺すのに必要なこの株の量（「ＬＣ５０」）は１９．５ｎｇ／ｍｌだった。野生型Ｂｓ　２３６２株は１５ｎｇ／ｍｌのＬＣ５０を持っていた。本発明の核酸によってＢｓ毒素を発現させるように形質転換されたＢｔｉ　ＩＰＳ８２株は１．５のＬＣ５０、すなわち無改変Ｂｓより約１３倍優れた毒性を持っていた。
【０１１６】
【表２】
2004505643.tif 000004
実施例４：実施例１〜３で使用した材料および方法
Ａ．細菌株、遺伝子、プラスミドおよび形質転換
バチルス・スフェリカス２３６２株はＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（イリノイ州ノースシカゴ）の厚意によって提供された粉末調製品から得た。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）−バチルス・チュリンゲンシスシャトル発現ベクター　ｐＨＴ３１０３（Ｌｅｒｅｃｌｕｓら，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５１：２１１−７（１９８９））を利用して、大腸菌ＤＨ５α中でプラスミドコンストラクト（ｐＰＨＳＰ−１）を作製および増幅した。そのｐＰＨＳＰ−１コンストラクトを、オハイオ州立大学のバチルス保存センター（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）（オハイオ州コロンバス）から入手したバチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシスの非結晶株４Ｑ７中、またはバチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシスＩＰＳ８２（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で発現させた。ｃｙｔ１Ａプロモーター群およびＳＴＡＢ−ＳＤ配列（ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０：６３３−６４３（１９９６））を持つ６６０ｂｐ断片を含む改変ｐＨＴ３１０１系ベクター（ｐＳＴＡＢ−ＳＤ）は、以前に記載されている（Ｐａｒｋら，ＦＥＭＳ　Ｍｃｉｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ　１８１：３１９−３２７（１９９９））。プラスミドはＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ．）を使って精製した。バチルス株はＰａｒｋら，Ａｐｐ　Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　６４：３９３２−３９３８（１９９８）に記載のエレクトロポレーションによって形質転換した。
【０１１７】
Ｂ．バチルス・スフェリカス殺昆虫性タンパク質をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅
アルカリ溶解法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を使ってバチルス・スフェリカス２３６２から粗製プラスミド調製物を調製した。Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ＋）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）とプライマーＢＳＰ−１（５’ａａｃｔｇｃａｇＣＴＴＧＴＣＡＡＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＴＴＡＡＡＧＧＴＡＡＣＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号１０））およびＢＳＰ−２（５’−ａａｃｔｇｃａｇＣＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＧＡＧＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１１））（Ｇｅｎｏｓｙｓ）とを用いるＰＣＲによって、バチルス・スフェリカスの５４．１ｋＤａタンパク質および４１．９ｋＤａ殺昆虫性タンパク質をコードする遺伝子（Ｂａｕｍａｎｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２０４５−２０５０（１９８８）、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｍ２０３９０）を得た。３．４ｋｂｐ　ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し、ｐＨＴ３１０１の同じ部位にクローニグして、ｐＨＢＳを得た。ｐＨＢＳ中の３．０ｋｂｐ　ＨｐａＩ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＳＴＡＢ−ＳＤの平滑末端化したＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位にクローニングして、ｐＰＨＳＰ−１を得た。
【０１１８】
Ｃ．細菌株の生育
バチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシス４Ｑ７／ｐＰＨＳＰ−１株およびバチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシスＩＰＳ８２／ｐＰＨＳＰ−１株は、濃度２５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含む栄養寒天（ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはペプトン化ミルク（１％ペプトン化ミルク［ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ］、１％デキストロース、０．２％酵母エキス、１．２１６ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．０７２ｍＭ　ＦｅＳＯ４、０．１３９ｍＭ　ＺｎＳＯ４、０．１１８ｍＭ　ＭｎＳＯ４）で生育した。昆虫バイオアッセイ用には、２８℃、２５０ｒｐｍ／分に設定した振盪培養器にて、エリスロマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含む２５ｍｌのペプトン化ミルク中で、バチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシスＩＰＳ８２／ｐＰＨＳＰ−１を６日間生育し、溶解した（６日間で細胞の＞９８％が芽胞を形成した）。芽胞および結晶を４℃、６，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって収集した。得られたペレットを水で２回洗浄し、真空槽で乾燥した。
【０１１９】
Ｄ．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ペプトン化ミルク中で６日間生育した後、溶解した培養物１ｍｌを収集し、１０，０００×ｇで５分間遠心分離した。培地を捨て、１５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）および１５０の２×サンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）を加えた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）で分画した。
【０１２０】
Ｅ．バイオアッセイ
バイオアッセイでは、４齢初期幼虫２０匹の群を、２３７ｍｌプラスチックカップに入れた１００ｍｌの脱イオン水中で、ある範囲の濃度の凍結乾燥芽胞／結晶粉末にばく露した。７〜９種類の粉末濃度について、５日に分けて反復試験した。
【０１２１】
Ｆ．顕微鏡検査
Ｚｅｉｓｓ　Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ＩＩＩを用いる光学顕微鏡検査法により、１００倍油浸対物レンズを使って、芽胞形成培養物をモニターした。透過電子顕微鏡検査には、ペプトン化ミルク培養物から芽胞形成細胞を溶解直前に収集し、３％リン酸緩衝化グルタルアルデヒドおよび０．２５％ショ糖中で２時間固定し、１％ＯｓＯ４中で後固定し、エタノール−プロピレンオキシドで脱水し、エポン−アラルダイト（Ｅｐｏｎ−Ａｒａｌｄｉｔｅ）に包埋した（ＩｂａｒｒａおよびＦｅｄｅｒｉｃｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６５：５２７−５３３（１９８６））。加速電圧７５ｋＶの日立６００電子顕微鏡で芽胞形成細胞の超薄切片を調べ、撮影した。
【０１２２】
実施例５：Ｃｙｔ１Ａタンパク質は、Ｂｓ毒素に高い抵抗性を示す蚊に、Ｂｓ毒素に対する感受性を回復させる
Ａ．材料および方法
細菌株および毒素
この研究で使用した毒素調製品は、バチルス・スフェリカス２３６２およびＣｙｔ１Ａａだけを産生するバチルス・チュリンゲンシス亜種イスラエレンシスの組換え株の溶解した培養物の凍結粉末である（ＷｕおよびＦｅｄｅｒｉｃｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５２７６−５２８０（１９９３））。これらの粉末には、芽胞および結晶（すなわちパラ胞子体）が、細胞片および凍結乾燥によって生じた培地固形分と共に含まれていた。試験した具体的粉末は以下のとおりである：（１）バチルス・スフェリカス２３６２、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（イリノイ州ノースシカゴ）から野生型の工業用粉末として入手したもの、（２）Ｃｙｔ１Ａａ、上記ＢＴＩの組換え株、および（３）ＢＴＩ　４Ｑ７、内毒素を何も産生しないこの亜種の非結晶株。この株はオハイオ州立大学バチルス保存センター（オハイオ州コロンバス）から入手し、対照の一つとして使用した。精製Ｃｙｔ１Ａ結晶の凍結乾燥粉末（ＷｕおよびＦｅｄｅｒｉｃｉ，前掲）も使用した。
【０１２３】
毒素粉末の製造および貯蔵
種々の毒素を産生する細菌株を、先に記載されているように、固体培地または液体培地で生育した（Ｗｉｒｔｈら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ，９４：１０５３６−１０５４０（１９９７）、Ｐａｒｋら，Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３９３２−３９３８（１９９８））。芽胞形成細胞を蒸留水で洗浄し、沈降させ、得られたペレットを凍結乾燥した。蚊の選択およびバイオアッセイを行なうために、粉末の懸濁原液を蒸留水中に調製し、約２５個のガラスビーズを使ってホモジナイズした。原液は毎月調製し、１０倍段階希釈液は毎週調製した。不用時は全ての原液および希釈液を−２０℃で凍結しておいた。
【０１２４】
蚊株
ネッタイイエカ（Ｃｘ．ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）の２つの株、すなわちバチルス・スフェリカス２３６２に抵抗性の株であるＢＳ−Ｒと、無選択非抵抗性株であるＳｙｎ−Ｐとを使用した。ＢＳ−Ｒは１９９２年以来バチルス・スフェリカス２３６２で選択されてきた株であり、感受性参考株Ｓｙｎ−Ｐの５０％を殺す濃度の１４９，０００倍の高濃度である１０００μｇ／ｍｌへの４８時間のばく露に、常に生残する。Ｓｙｎ−Ｐは、南カリフォルニアの３つの異なる地理的区域から１９９５年に収集された幼虫個体群に由来するネッタイイエカの「合成」個体群である。このコロニーはバチルス・スフェリカスにばく露することなく実験室で維持されてきた。
【０１２５】
選択およびバイオアッセイ法
上述のように、ＢＳ−Ｒ株は１９９２年以来、バチルス・スフェリカス２３６２による選択圧の下で維持されてきた。選択は、ほうろう引きの金属皿で、４齢初期幼虫約１，０００匹の群を、約１Ｌの脱イオン水中、濃度範囲１００〜１２０μｇ／ｍｌのバチルス・スフェリカスに４８〜９６時間ばく露することからなった。選択下における幼虫の平均死亡率は１選択あたり１０％未満であり、生残した幼虫を使ってコロニーを継続させた。
【０１２６】
バイオアッセイでは、４齢初期幼虫２０匹の群を、２３７ｍｌプラスチックカップに入れた１００ｍｌの脱イオン水中で、ある範囲の濃度の凍結乾燥芽胞／結晶粉末にばく露した。４８時間後に２〜９８％の死亡率をもたらす７〜９種類の粉末濃度について、５日に分けて反復試験した。異なる組合わせのＣｙｔ１Ａとバチルス・スフェリカス２３６２とを試験したバイオアッセイでは、細菌株の凍結乾燥粉末の重量に基づいて、これらの毒素を様々な比率にした。
【０１２７】
精製Ｃｙｔ１Ａ結晶の量には限りがあったので、この粉末を使ったバイオアッセイでは、１０ｍｌの脱イオン水に入れた４齢初期幼虫１０匹を、３０ｍｌプラスチックカップで使用し、２〜３日に分けて反復試験した。バチルス・スフェリカス２３６２工業用粉末とＣｙｔ１Ａ精製結晶とを１０：１の比（１０部のバチルス・スフェリカス２３６２：１部のＣｙｔ１結晶）で混合するバイオアッセイは、バチルス・スフェリカス２３６２およびＣｙｔ１の凍結乾燥粉末の重量に基づいて行なった。
【０１２８】
ＰＣ用プログラムを使って全データをプロビット法にかけた。信頼限界がオーバーラップする用量反応値は有意差があるとはみなさなかった。抵抗性比はＢＳ−Ｒ株に関する各致死濃度値をＳｙｎ−Ｐ株の値で割ることによって計算した。数字１を含む信頼限界を持つ抵抗性比は有意であるとはみなさなかった。
【０１２９】
相乗作用の評価
Ｔａｂａｓｈｎｉｋ，Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｅｎｔｏｍｏｌ　５８：３３４３−３３４６（１９９２）の方法を使って、バチルス・スフェリカス２３６２とＣｙｔ１Ａの間の相乗的相互作用を評価した。Ｃｙｔ１Ａとバチルス・スフェリカス２３６２の様々な混合物について、これらの毒素の個々の値の加重調和平均から理論致死濃度値を計算した。バチルス・スフェリカス２３６２粉末は試験したどの濃度でもＢＳ−Ｒ株に対して毒性を持たなかったので、この株については、Ｃｙｔ１Ａとバチルス・スフェリカス２３６２の組合わせの理論毒性を、Ｃｙｔ１Ａ単独の毒性および比率に基づいて計算した。理論致死濃度値と実測された致死濃度値との比と定義される相乗作用指数（ＳＦ）を、バチルス・スフェリカス２３６２とＣｙｔ１Ａ株との組合わせおよびバチルス・スフェリカス２３６２と精製Ｃｙｔ１Ａ結晶との組合わせについて決定した。比が１より大きかった場合は、毒性が個々の相加的毒性から予想される値を超えたので、毒素相互作用は相乗的であると見なした。比が１より小さかった場合、相互作用は拮抗的であるとみなし、比が１であれば、値は相加的であったことになる。
【０１３０】
Ｂ．結果
標準的条件下で抵抗性蚊株および感受性蚊株に対する毒素ベースライン値を決定するためのバイオアッセイでは、１０００μｇ／ｍｌのバチルス・スフェリカス２３６２にネッタイイエカのＢＳ−Ｒ株をばく露しても死亡は起こらなかった。これは感受性株Ｓｙｎ−Ｐで得られるＬＣ５０（０．００６７μｇ／ｍｌ）よりも１４９，０００倍高い濃度だった。水１００ｍｌに２０匹の幼虫ではなく１０ｍｌの水に１カップあたり１０匹の幼虫を使ってバイオアッセイを行なったところ、ＢＳ−Ｒでは死亡が起こらなかったが、Ｓｙｎ−Ｐに対するＢＳ　２３６２の毒性は低下した（ＬＣ５０，０．０３２μｇ／ｍｌ）。幼虫密度を増加させると、低密度で観察される死亡率と同レベルの死亡率を誘導するのに必要なＢｔｉ毒素の量が低下することは、以前に明らかにされている（Ａｌｙら，１９８８）。小バイオアッセイ系を使って見積もったＢＳ−ＲおよびＳｙｎ−Ｐの感受性の相違は３１，０００倍だった。
【０１３１】
Ｃｙｔ１Ａ細菌株は、標準バイオアッセイ系で、Ｓｙｎ−Ｐ（ＬＣ５０，１１．７μｇ／ｍｌ）よりもＢＳ−Ｒ株（ＬＣ５０，３２．５μｇ／ｍｌ）に対してわずかに低い毒性を示した。しかし、小バイオアッセイ系でＣｙｔ１Ａ結晶を使って行なった試験では、ＢＳ−ＲとＳｙｎ−Ｐの間に感受性の相違は認められなかった（ＬＣ５０，約２０μｇ／ｍｌ）。
【０１３２】
バチルス・スフェリカス２３６２調製品にＣｙｔ１Ａを添加したところ、ＢＳ−Ｒ抵抗性ネッタイイエカ株に対するその毒性の大部分が回復した。バチルス・スフェリカス２３６２とＣｙｔ１Ａの比を１０：１にすると、抵抗性蚊株にも感受性蚊株にも高い毒性を示した。この組合わせの毒性レベルはＳｙｎ−Ｐを対象とする場合の方がＢＳ−Ｒを対象とする場合より高く、ＬＣ９５値はそれぞれ０．４４２および３６．６μｇ／ｍｌ、ＢＳ−Ｒの抵抗性比（ＬＣ５０）は８２．９だった。５：１の比はＳｙｎ−ＰおよびＢＳ−Ｒに対してさらに毒性が強く、ＬＣ９５レベルでの抵抗性比は３４．４倍に低下した。３：１のバチルス・スフェリカス２３６２：Ｃｙｔ１Ａ比でも、この混合物はＢＳ−Ｒ（ＬＣ５０，１．９９μｇ）に対して有意に増加した毒性を示し、抵抗性比はＬＣ９５レベルで１５．４倍に低下した。比を１：１にした場合のＢＳ−Ｒに対する毒性は、比が３：１の場合と有意に異ならなかった。総合すると、バチルス・スフェリカス２３６２対Ｃｙｔ１Ａの比率が増加するにつれて、抵抗性蚊株と感受性蚊株のどちらに対する毒性も増加した。しかし、ＬＣ９５値でのＢＳ−Ｒの抵抗性比は、Ｃｙｔ１Ａを主成分とする１：３、１：５および１：１０の比では、有意でないレベルまで低下した。
【０１３３】
これらの組合わせについてＳＦを計算したところ、Ｃｙｔ１Ａとバチルス・スフェリカス２３６２の間には、ＢＳ−Ｒ株に対して有意な相乗作用が見いだされたが、Ｓｙｎ−Ｐに対する有意な相乗作用は認めなかった。ＳＦ値はＢＳ−Ｒに関してＬＣ９５レベルで１０〜１３７の範囲にあった。最も高レベルの相乗作用は、Ｃｙｔ１Ａが最低の比率で存在する組合わせ（１０：１、５：１、３：１）に観察された。これらの組合わせは、１：１０、１：５および１：３の比では、ＬＣ９５レベルでＳｙｎ−Ｐに対して拮抗的であり、１：１、３：１、５：１、および１０：１の比（すなわちバチルス・スフェリカスが主成分になった場合）では相加的または弱く相乗的だった。
【０１３４】
バチルス・スフェリカス２３６２を精製Ｃｙｔ１Ａ結晶と１０：１の比で混合してバイオアッセイを行なったところ、この組合わせはＢＳ−Ｒ（ＬＣ９５，４．９６μｇ／ｍｌ）にもＳｙｎ−Ｐ（ＬＣ９５，２．３７μｇ／ｍｌ）にも強い毒性を示すことがわかった。この混合物に対する感受性はＢＳ−Ｒ株の方がわずかに低いが、毒性値に有意差はなかった。重要なことに、この組合わせの場合、ＢＳ−Ｒ株に抵抗性は検出されず、２７８という高いＳＦ値を持っていた。
【０１３５】
Ｃ．考察
Ｃｙｔ１ＡをＢＳ　２３６２と併用すると、ネッタイイエカの高抵抗性株に対する後者の毒性が回復した。さらに、本発明者らは、亜致死濃度のＣｙｔ１Ａ結晶を使って毒性を完全に回復させて、ＢＳ−Ｒ蚊株におけるバチルス・スフェリカスに対する抵抗性を抑制することもできた。抵抗性蚊個体群に対して高レベルの活性が観察されたのとは対照的に、これらと同じ混合物を使っても、非抵抗性参考株Ｓｙｎ−Ｐに対する活性は、ほとんどまたは全く増加しなかった。
【０１３６】
抵抗性蚊に対する高い毒性を低濃度でバチルス・スフェリカス２３６２に回復させるというＣｙｔ１Ａの能力はイエカ個体群の防除にとって実用的な意味があり、その作用様式に対する洞察を与える。バチルス・スフェリカスに基づく細菌殺幼虫剤はいくつかの国で使用されており、ネッタイイエカの野外個体群における抵抗性は既にフランス、ブラジルおよびインドで報告されている。本発明者らの研究結果は、Ｃｙｔ１Ａをわずか１：１０の比でバチルス・スフェリカス幼虫に添加すれば、ネッタイイエカの高抵抗性個体群に対してさえ、毒性の大部分が回復することを示している。したがってＣｙｔ１Ａは実用的なバチルス・スフェリカス抵抗性管理ツールになる。さらにまた、少量のＣｙｔ１Ａをバチルス・スフェリカス調製品に添加すると、蚊個体群において、まだ発生していない抵抗性を遅らせることもできる。
【０１３７】
バチルス・チュリンゲンシス亜種メデリン由来の異なるＣｙｔタンパク質Ｃｙｔ１Ａｂが、大きな毒素結晶を産生するバチルス・スフェリカスの殺蚊性株２２９７に対するアカイエカ（Ｃｘ．ｐｉｐｉｅｎｓ）の抵抗性を抑制できることは、他のグループによって明らかにされている（Ｔｈｉｅｒｙら，１９９８）。しかし、バチルス・スフェリカス２２９７に対する抵抗性のＣｙｔ１Ａｂによる抑制は、バチルス・スフェリカスに対する抵抗性のＣｙｔ１Ａによる抑制よりも有効性がはるかに低かった。バチルス・スフェリカス２２９７に対する抵抗性を抑制するＣｙｔ１Ａｂの能力が低いのは、アカイエカに対するこのＣｙｔ毒素の毒性がＣｙｔ１Ａと比較して５分の１しかないことによるのかもしれない（Ｔｈｉｅｒｙら，Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　６３：４６８−４７３（１９９７））。
【０１３８】
Ｃｙｔ１Ａがバチルス・スフェリカス２３６２の毒性を回復させる正確な方法はわからない。しかし、本発明者らのネッタイイエカＢＳ−Ｒ株における抵抗性の機序およびＣｙｔ１Ａの結合特性に関するこれまでの研究から、Ｃｙｔ１Ａは微絨毛膜への毒素の結合および挿入を助けることが示唆される。本発明者らのネッタイイエカの抵抗性株は、バチルス・スフェリカス２３６２毒素に対する機能的な受容体を持たないので、毒素は中腸微絨毛膜に結合することができない。Ｃｙｔ１Ａの研究により、Ｃｙｔ１Ａは脂質部分への結合によって膜を混乱させること、またＣｙｔ１ＡはＣｒｙ毒素へも結合することが明らかになっている。さらに、ＢＴＩ　Ｃｒｙ毒素の存在下で、Ｃｙｔ１Ａは蚊幼虫の胃盲嚢および後部中腸の細胞の微絨毛に結合する。これらの知見からバチルス・スフェリカス毒性を回復させる機序がいくつか示唆される。Ｃｙｔ１Ａおよびバチルス・スフェリカス毒素は溶解後に一つに結合し、次いでＣｙｔ１Ａの親油性ゆえに複合体として膜に挿入されるのかもしれない。もう一つの可能性として、まずＣｙｔ１Ａが膜に結合した後、バチルス・スフェリカス毒素がＣｙｔ１Ａに結合し、膜に挿入されるのかもしれない。さらには、Ｃｙｔ１Ａが膜に浸透して、バチルス・スフェリカス毒素が本来の標的に接近できるようにする損傷を引き起こすのかもしれない。
【０１３９】
本発明者らがＣｙｔ１Ａとバチルス・スフェリカス２３６２の組合わせで得た相乗作用も、Ｃｙｔ１Ａが他のタンパク質毒素の蚊微絨毛膜への結合、とりわけ、効率よく結合しない微絨毛膜への結合を助けることによって毒性を増加させることを示すもう一つの証拠になる。先の研究で、本発明者らは、Ｃｙｔ１Ａが、バチルス・チュリンゲンシスの殺蚊性株由来のＣｒｙ４およびＣｒｙ１１毒素と、抵抗性蚊に対して相乗作用することを明らかにした。しかし、非抵抗性蚊における相乗作用は、ＢＴＩのＣｒｙ４およびＣｒｙ１１Ａ毒素でのみ観察され、Ｃｒｙ１１Ａよりはるかに毒性の高いバチルス・チュリンゲンシス亜種エガセサン（ｊｅｇａｔｈｅｓａｎ）由来のＣｒｙ１１Ｂ毒素では観察されなかった。本研究でも同様の相同作用パターンが観察され、Ｃｙｔ１Ａは抵抗性ＢＳ−Ｒ株に対してバチルス・スフェリカス２３６２の毒性と相乗作用するが、感受性Ｓｙｎ−Ｐ株に対しては相乗作用しなかった。これらの結果が上述した先の研究で得られた結果と共に意味するところは、高い毒性または高い結合親和性を持つＣｒｙ１１Ｂまたはバチルス・スフェリカス２３６２二成分毒素などの毒素にとって、Ｃｙｔ１Ａによる結合の補助は、ほとんどまたは全く価値がないということである。しかし、抵抗性によって毒素受容体が改変されまたは失われている場合は、微絨毛膜に結合し微絨毛膜を混乱させるというＣｙｔ１Ａの能力が、膜に進入して毒性を発揮するというこれらの毒素の能力を回復させる。Ｃｙｔ１Ａとバチルス・スフェリカス毒素はどちらも蚊中腸管内腔で溶解するので、これらは管腔および微絨毛膜表面での溶解後直ちに会合するのかもしれない。これらの結果が意味するところは、Ｃｙｔ１Ａが、そしてもしかすると他のＣｙｔタンパク質も、非Ｃｙｔタンパク質毒素の殺虫スペクトルを他の昆虫種まで拡大しうるということである。
【０１４０】
【表３】
2004505643.tif 000005
ＳＦ＝相乗作用指数
ａ括弧内の比は、バチルス・スフェリカス工業用粉末とＣｙｔ１Ａ芽胞／結晶粉末の相対比（ＢＳ：ＣｙｔＡ）を表す。比は全て各粉末の重量に基づく。
【０１４１】
実施例６：６マー・ポリプリン配列およびタンデムＳＴＡＢ−ＳＤ配列の使用　完全長ＳＴＡＢ−ＳＤ配列より短いポリプリン配列がタンパク質産生量を増加させる能力を調べた。ＳＴＡＢ−ＳＤ配列に関する上記の項で述べたように、遺伝子の非翻訳部分にあるＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、ｍＲＮＡを５’エンドリボヌクレアーゼの作用から保護することによって、その遺伝子がコードするタンパク質の産生量を増加させると考えられる。さらに、ＳＴＡＢ−ＳＤ配列を特徴づけるのに役立つポリプリン配列は、１６Ｓ　ｒＲＮＡの３’末端にあるポリピリミジン配列と塩基対を形成すると考えられる。
【０１４２】
ｃｒｙ３Ａの完全長９マーＳＴＡＢ−ＳＤ配列ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号１）から出発して、２つの６マー部分配列、すなわちＡＧＧＡＧＧ（配列番号１２。ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の最後の６ヌクレオチドからなる。これは「ポリプリン配列Ｉ（ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｉ）」の略でＰＰＳ−Ｉと名付けた）およびＧＡＡＡＧＧ（配列番号１３。ＳＴＡＢ−ＳＤ配列の最初の６ヌクレオチドからなる。これはＰＰＳ−ＩＩＩと名付けた）を作製した。各ＰＰＳを、ｃｙｔ１Ａ遺伝子のＢｔプロモーターと共にコンストラクトに入れ、５’安定化因子としての各ＰＰＳの効率を、リポーターとしてｃｒｙ３Ａタンパク質を用いて決定した。二重ＳＴＡＢ−ＳＤ配列も試験した。
【０１４３】
ＰＰＳ−Ｉ、ＰＰＳ−ＩＩＩ、一部のプリンをピリミジンに変化させるポリプリン配列の改変がタンパク質産生に及ぼす効果、複数のＳＴＡＢ−ＳＤ配列があることの効果、複数のＳＴＡＢ−ＳＤ配列の間隔を様々な距離に設定した場合の効果を調べるために、一連のコンストラクトを作製した。他の全ての成分（すなわち上流領域、ＵＴＲ領域、ステム−ループ構造、およびコード領域）は全てのコンストラクトで同じとした。
【０１４４】
ｐＣＩ−１０はＢｔＩプロモーターだけを含み、ポリプリン配列も他の安定化配列も含まない。ｐＣＩ−２０はＢｔＩプロモーターおよびＰＰＳ−Ｉを含む。ｐＣＩ−２１では、ＰＰＳ−Ｉが５’−ＡＧＧＡＧＧ−３’から５’−ＡＴＴＡＴＴ−３’という配列に改変されているので、もはやポリプリン配列を含まない。ｐＣＩ−３０では、６マーが天然ＳＴＡＢ−ＳＤ配列に戻るように、ＰＰＳ−Ｉの３上流ヌクレオチドが５’−ＴＴＴ−３’から５’−ＧＡＡ−３’に改変されている。したがって、ｐＣＩ−２０中のＰＰＳ−Ｉ（５’−ＴＴＴＡＧＧＡＧＧ−３’）はｐＣＩ−３０ではＳＴＡＢ−ＳＤ（５’−ＧＡＡＡＧＧＡＧＧ−３’）に変化している。ｐＣＩＩＩ−１０は二重Ｂｔプロモーターを含むがＰＰＳ配列は含まず、ｐＣＩＩＩ−２０は二重ＢｔプロモーターとＰＰＳ−ＩＩＩとを含む。ｐＣＩ−５０は８ヌクレオチド離れた２つのＳＴＡＢ−ＳＤ配列を含む。ｐＣＩ−６０も２つのＳＴＡＢ−ＳＤ配列を含むが、このコンストラクトでは、それらは３３ヌクレオチド離れている。
【０１４５】
試験したコンストラクトの一部のＣｒｙ３Ａタンパク質の相対的産生量を以下に記載する。
【０１４６】
ｐＣＩ−１０（ＢｔＩプロモーター）：１０％
ｐＣＩ−２０（ＢｔＩプロモーター＋ＰＰＳ−Ｉ）：１００％（基準として使用）
ｐＣＩ−２１（ＢｔＩプロモーター＋ポリプリン配列を持たないＰＰＳ−Ｉ）：７％
ｐＣＩＩＩ−１０（二重Ｂｔプロモーター、ＰＰＳなし）：１４％
ｐＣＩＩＩ−２０（二重Ｂｔプロモーター＋ＰＰＳ−ＩＩＩ）：３７％
ｐＣＩ−３０（ＢｔＩプロモーター＋ＳＴＡＢ−ＳＤ）：１６２％
ｐＣＩ−５０（ＢｔＩプロモーター＋８ヌクレオチド離れた二重ＳＴＡＢ−ＳＤ）：１９８％
ｐＣＩ−６０（ＢｔＩプロモーター＋３３ヌクレオチド離れた二重ＳＴＡＢ−ＳＤ）：３３４％。
【０１４７】
ＰＰＳ−ＩとＰＰＳ−ＩＩＩ（９マーＳＴＡＢ−ＳＤ配列の最初の６ヌクレオチドおよび同じ配列の最後の６ヌクレオチドである連続６マー）は、これらの配列を含まないコンストラクトよりも多くのタンパク質発現をもたらした。完全長ＳＴＡＢ−ＳＤ配列は著しく優れた結果を与えた。また、二重ＳＴＡＢ−ＳＤ配列はどちらもさらに高レベルのタンパク質産生をもたらし、３３ヌクレオチド離した二重ＳＴＡＢ−ＳＤ配列では、単一のＳＴＡＢ−ＳＤ配列を持つコンストラクトのタンパク質産生量のほぼ２倍になった。理論に縛られることは望まないが、ｐＣＩ−５０コンストラクトとｐＣＩ−６０コンストラクトが示す発現量が異なるのは、３０Ｓリボソームサブユニットのさしわたしが約３０ヌクレオチドであるという事実によるのかもしれない。そのため、約３０ヌクレオチド以上離れたＳＴＡＢ−ＳＤ配列は、２つの３０Ｓサブユニットと同時に相互作用することができるのかもしれない。
【０１４８】
本明細書で引用した刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願について参照により本明細書に組み込まれる旨を個別に明示した場合と同様に、全て参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１４９】
明解に理解されるように実例を挙げて本発明をいくらか詳細に説明したが、本願特許請求の範囲の精神から逸脱することなく一定の改変および変更を加えうることは、本発明の教示するところに照らして当業者には明らかだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂｓ二成分毒素をプラスミドにクローニングするために使用した断片のヌクレオチド配列（配列番号７）およびそこにコードされているアミノ酸配列を表す。「ＳＩＧＭＡ　Ｅ」および「ＳＩＧＭＡ　Ｋ」はそれぞれシグマ因子ＥおよびＫの結合部位を表す。ヌクレオチド５３７とヌクレオチド６６０の間の下線付き配列は、下線部分中に大文字かつ「ＳＴＡＢ−ＳＤ」という上付き文字で示すＳＴＡＢ−ＳＤ配列を導入するためにＰＣＲによって配列中にクローニングされた部分を表す。Ｂｓ二成分毒素の５１．４ｋＤタンパク質（配列番号８）および４１．９ｋＤタンパク質（配列番号９）の開始コドンおよび停止コドンを、アミノ酸配列の下に記す。「ＲＢＳ」という記号を付けたヌクレオチド７２５とヌクレオチド７３０の間およびヌクレオチド２２４５とヌクレオチド２２５０の間の下線部分はリボゾーム結合部位を表す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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