(57)【要約】宿主の核転写要素及び翻訳要素を転写的及び翻訳的制御下にあって対象のコード配列を発現することができるトランスジェニック植物又は植物細胞の作製方法であって、（ａ）前記対象のコード配列に操作可能に結合し、その転写に必要な宿主植物又は植物細胞の転写機能を開始する上流要素、（ｂ）前記対象のコード配列に操作可能に結合した宿主植物又は植物細胞の翻訳機能を開始する上流要素、を欠いた前記対象のコード配列を含むベクターを宿主植物又は植物細胞の核ゲノムに導入し、その後前記対象のコード配列を発現する植物細胞又は植物を選択することによる方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用な形質を発現することができるトランスジェニック植物又は植物細胞を作製する方法において、
（ａ）前記対象のコード配列に操作可能に結合し、その転写に必要な宿主植物又は植物細胞で機能する上流転写開始要素、
（ｂ）宿主植物又は植物細胞で機能し、前記対象のコード配列に操作可能に結合した上流翻訳開始要素、
を欠いた前記対象のコード配列を含むベクターを前記トランスジェニック植物又は植物細胞用の宿主植物又は植物細胞の核ゲノムに導入し、その後前記対象のコード配列を発現する植物細胞又は植物を選択することによって、宿主の核転写要素及び翻訳要素の転写的及び翻訳的制御下で対象のコード配列を発現する方法。
【請求項２】
前記ベクターが、前記対象のコード配列の上流及び／又は下流にスプライシング供与体及び／又は受容体部位（類）をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ベクターが、前記対象のコード配列の下流に１個又は複数のシストロンをさらに含み、前記シストロンは前記対象のコード配列に結合している請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象のコード配列の下流の前記１個又は複数のシストロンの少なくとも１個が、前記対象のコード配列の下流の転写及び／又は翻訳要素（類）に操作可能に結合している請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、前記対象のコード配列又は前記シストロン（類）に操作可能に結合したシグナルペプチドを標的とするためにコードされた１個又は複数の配列をさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、前記対象のコード配列又は前記シストロン（類）に隣接して、又は内部に蛋白質分解部位をコードする１個又は複数の配列をさらに含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象のコード配列又は前記シストロン（類）に隣接した、又は内部にある蛋白質分解による切断部位をコードする前記配列が自触媒的である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記トランスジェニック植物又は植物細胞が、発現した融合蛋白質を切断するために必要な部位特異的プロテアーゼをもたらすために遺伝子的に改変されているか、又はトランスフェクトされている請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターが、前記対象のコード配列又は前記シストロン（類）に操作可能に結合した１個又は複数の転写エンハンサーをさらに含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが、前記対象のコード配列又は前記シストロン（類）に操作可能に結合した１個又は複数の翻訳エンハンサーをさらに含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、部位特異的リコンビナーゼによって認識される１個又は複数の組換え部位をさらに含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ハイブリッドメッセンジャーＲＮＡが、前記トランスジェニック植物又は植物細胞の核ＤＮＡから得られたＲＮＡ及び前記対象のコード配列から得られたＲＮＡを含んで生成される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハイブリッドメッセンジャーＲＮＡが複数の異種ポリペプチド配列をコードする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリッドメッセンジャーＲＮＡが、前記トランスジェニック植物又は植物細胞に存在するメッセンジャーＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記ハイブリッドメッセンジャーＲＮＡの翻訳によって融合蛋白質が誘導される請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合蛋白質が複数の異種ポリペプチド配列を含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記対象のコード配列が植物由来である請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターが、植物由来のみの機能的要素を含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象のコード配列が、宿主植物又は植物細胞で機能し、前記対象のコード配列に操作可能に結合した転写終結要素を含まない請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象のコード配列の発現がポリペプチド形成を引き起こす請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象のコード配列の発現がＲＮＡ形成を引き起こす請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法を使用して得られたＲＮＡ。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法を使用して得られた蛋白質又はポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法によって得られた植物細胞、植物及びそれらの子孫。
【請求項２５】
遺伝子操作のための、請求項２４記載の植物細胞又は植物の使用。
【請求項２６】
前記遺伝子操作が標的化形質転換を含む請求項２５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック植物を作製するための方法及びベクター並びにそれによって得られる植物及び植物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
安定して遺伝する所望の導入遺伝子の発現パターンの実現は、今なお植物生物工学分野の主要な問題の１つである。導入遺伝子をベクター内に完全に独立した転写単位の一部として導入し、導入遺伝子を植物特異的な異種又は同種のプロモーター及び転写終結配列の転写制御下におくことが標準的な方法である（たとえば、米国特許第０５５９１６０５号、米国特許第０５９７７４４１号、ＷＯ００５３７６２Ａ２、米国特許第０５３５２６０５号などを参照のこと）。しかし、ゲノムＤＮＡに組み込まれた後、外来ＤＮＡは植物ゲノムＤＮＡに無作為に挿入されるので、このような転写ベクターからの遺伝子発現は多くの様々な宿主因子によって影響を受けるようになる。これらの因子は、導入遺伝子の発現を不安定で、予測不可能にし、子孫では導入遺伝子のサイレンシングを誘導することが多い（Ｍａｔｚｋｅ  ＆  Ｍａｔｚｋｅ、２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、４３、４０１〜４１５、Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９、２２７〜２３２、Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ他、１９９８、Ｐｌａｎｔ．Ｊ．、１６、６５１〜６５９）。転写遺伝子サイレンシング（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ＴＧＳ）及び転写後遺伝子サイレンシング（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ＰＴＧＳ）を含めた植物における導入遺伝子のサイレンシングについては十分詳細に調べられている。最近の発見によって、ＴＧＳではメチル化とクロマチン構造の間には密接な関係があり、ＰＴＧＳではＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとヌクレアーゼの関与があることがわかった（Ｍｅｙｅｒ、Ｐ．、２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４３、２２１〜２３４、Ｄｉｎｇ、Ｓ．Ｗ．、２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１、１５２〜１５６、Ｉｙｅｒ他、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０００、４３、３２３〜３４６）。たとえば、ＴＧＳでは、導入遺伝子のプロモーターは導入遺伝子の安定な発現に都合の悪いクロマチン構造を有する多くの組み込み部位でしばしばメチル化を受ける可能性がある。その結果、既存の方法を実施するためには、多くの独立したトランスジェニック植物を作製して、所望する安定発現パターンを備えたものを発見するために数世代分析することが必要である。さらに、世代を通して安定した導入遺伝子発現パターンを示すような植物であっても、ストレス又は病原体の攻撃などの天然に生じる状態の下でその後サイレントになる可能性がある。転写単位に隣接する足場蛋白質接着領域（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の使用（Ａｌｌｅｎ、Ｇ．Ｃ．、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、８、８９９〜９１３、Ｃｌａｐｈａｍ、Ｄ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．、４６、６５５〜６６２、Ａｌｌｅｎ、Ｇ．Ｃ．、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、５、６０３〜６１３）など発現制御の改善を目指した現在の取り組みでは、いわゆる「部位有効な変更」の依存性を減少させることによって導入遺伝子発現の独立性及び安定性を潜在的に高めることが可能である（Ｍａｔｚｋｅ  ＆  Ｍａｔｚｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．、１、１４２〜１４８、Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９、２２７〜２３２、ＷＯ９８４４１３９Ａ１、ＷＯ００６７５７Ａ１、ＥＰ１００５５６０Ａ１、ＡＵ０００１８３３１Ａ１）。しかし、これらには導入遺伝子の発現パターンが必要で、植物設計において現在直面している問題を部分的に解決するにすぎない。遺伝子サイレンシングは、植物に感染するウイルスによって植物の防御機構として誘発されうる（Ｒａｔｃｌｉｆｆ他、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６、１５５８〜１５６０、Ａｌ−Ｋａｆｆ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９、２１１３〜２１１５）。非トランスジェニック植物では、このようなサイレンシングは病原体に対するものであるが、トランスジェニック植物では、特に導入遺伝子が病原体と相同性があるとき、導入遺伝子もサイレンシングされる可能性がある。これは、特に転写ベクターの設計に多くの異なるウイルス起原の要素を使用する場合、問題である。トランスジェニック植物にＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）を感染させるとＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーター制御下でＢＡＲ遺伝子をサイレンシングされる可能性があることを示したＡｌ−Ｋａｆｆ及びその同僚等による最近の発表が実例である（Ａｌ−Ｋａｆｆ他、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１８、９９５〜９９９）。今まで環境中に放出され商業的に培養されたトランスジェニック植物は全て、転写促進シグナルとして３５Ｓプロモーターを使用して操作されたことは記載する価値があることである。
【０００３】
ここ数年、一連のシス制御要素が著しく増加してきており、現在では導入遺伝子を精巧に空間的及び時間的に制御するための手段が含まれる。これらには、様々なプロモーター及び転写終結部位並びに翻訳制御要素／遺伝子発現のエンハンサーなどのいくつかの転写要素が含まれる。一般的に、翻訳エンハンサーは、細胞性トランス作用因子と共にｍＲＮＡの翻訳を促進するシス作用性要素として定義することができる。真核細胞における翻訳は一般的に、キャップされたｍＲＮＡの５’末端からのリボソームによるスキャニングによって開始される。しかし、翻訳の開始はまた、キャップ構造から独立した機構によって行われることが可能である。この場合、リボソームはリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）要素によって翻訳開始コドンに向かう。最初ピコルナウイルスで発見された（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＆  Ｋａｍｉｎｓｋｉ、１９９５、ＲＮＡ、１、９８５〜１０００）これらの要素はまた、他のウイルスｍＲＮＡ及び真核細胞ｍＲＮＡで確認された。ＩＲＥＳは他の細胞性トランス作用性因子と一緒にｍＲＮＡの内部開始コドンでリボソーム複合体の組み立てを促進するシス作用性要素である。ＩＲＥＳ要素のこの特徴は、動物細胞又は昆虫細胞の多シストロン性転写単位から２個以上の蛋白質を発現させるためのベクターで利用された。現在では、これらは第１の遺伝子がキャップ依存性の方法で翻訳され、第２の遺伝子がＩＲＥＳ要素制御下にある動物系用のバイシストロン性発現ベクターで広く使用されている（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ  ＆  Ｓｍｉｔｈ、１９９５、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、４、１７９〜１８４、Ｍａｒｔｉｎｅｓ−Ｓａｌａｓ、１９９９、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９、４５８〜４６４）。通常、ＩＲＥＳ制御下での遺伝子発現濃度は著しく異なり、第１遺伝子のキャップ依存性発現と比較して６〜１００％の範囲内である（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ他、２０００、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１、３７６〜３８２）。これらの発見には、ＩＲＥＳの使用に関して、たとえば、どの遺伝子をバイシストロン性ベクターにおいて第１の遺伝子として使用するかを決定するために重要な意味がある。発現ベクターにＩＲＥＳが存在すると、通常条件下のみならずキャップ依存性翻訳が阻害された条件下においても選択的な翻訳がもたらされる。これは、通常トランス作用性因子を必要としないので、通常ストレス条件下（ウイルス感染、熱ショック、増殖停止など）で起こる（Ｊｏｈａｎｎｅｓ  ＆  Ｓａｒｎｏｗ、１９９８、ＲＮＡ、４、１５００〜１５１３、Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  ＆  Ｇｉｎｇｒａｓ、１９９８、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０、２６８〜２７５）。
【０００４】
翻訳をベースとしたベクターは、近年動物細胞系を使用して研究する研究者達の注目を浴びている。マウスにおいてｃｒｅリコンビナーゼの組織特異的発現を行うためにＩＲＥＳ−Ｃｒｅリコンビナーゼカセットを使用することを記載した報告がある（Ｍｉｃｈａｅｌ他、１９９９、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．、８５、３５〜４７）。この研究では、新規ＩＲＥＳ−Ｃｒｅカセットを発達初期に発現する蛋白質チロシンキナーゼのＥｐｈ受容体をコードするＥｐｈＡ２遺伝子のエキソン配列に導入した。この研究は、宿主ＤＮＡの転写制御に依拠して動物細胞において組織特異的発現用翻訳ベクターを使用することを最初に示したので、特に興味深い。ＩＲＥＳ要素の他の重要な適用は、挿入突然変異用のベクターにおける使用である。このようなベクターでは、リポーター遺伝子又は選択マーカー遺伝子はＩＲＥＳ要素の制御下にあり、転写活性遺伝子の転写領域内に挿入された場合のみ発現することができる（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｈ他、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３９２、６０８〜６１１、Ａｒａｋｉ他、１９９９、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、４５、７３７〜７５０）。しかし、動物系におけるＩＲＥＳの応用は発展してきたにもかかわらず、これらの系のＩＲＥＳ要素は植物細胞では機能しないのである。さらに、植物細胞における部位特異的又は相同的組換えは、極めて希で、実用的ではないので、植物細胞では同様の取り組みは検討されなかった。
【０００５】
植物特異的ＩＲＥＳ要素に関するデータは非常に少ない。しかし、近年植物でも活性のあるいくつかのＩＲＥＳがｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ  ｃｒＴＭＶ（ＴＭＶウイルスが感染した十字花植物）で発見され（Ｉｖａｎｏｖ他、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２、３２〜４３、Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ他、１９９９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６３、１３９〜１５４、ＷＯ９８／５４３４２）、他の植物ウイルスにおいてＩＲＥＳの翻訳制御が示されている（Ｈｅｆｆｅｒｏｎ他、１９９７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８、３０５１〜３０５９、Ｎｉｅｐｅｌ  ＆  Ｇａｌｌｉｅ、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３、９０８０〜９０８８）。ＩＲＥＳ技術は、トランスジェニック植物及び現存するベクターの代わりとなる便利な植物ウイルスベクターで使用できる可能性が大いに秘められている。今日までに、安定した核変換のための唯一知られている植物ＩＲＥＳ要素の適用は、バイシストロン構築物において対象の遺伝子を発現するためのＩＲＥＳの使用と関連している（ＷＯ９８／５４３４２）。問題の構築物には、５’から３’方向へ、転写プロモーター、前記転写プロモーターに結合した第１遺伝子、第１遺伝子の３’に位置するＩＲＥＳ要素及びＩＲＥＳ要素の３’に位置する第２遺伝子が含まれ、すなわち、まだ一連の転写制御要素が完全に含まれている。最近、我々は国際特許出願（ＰＣＴ／ＥＰ０１／１４４２１）において、転写制御要素のないＩＲＥＳをベースとした翻訳ベクターの使用について記載した。驚いたことに、陰性対照として使用した、転写制御要素及び翻訳制御要素のないベクターはまだ、たとえばトランスジェニック植物の創出などの実用に十分高い変換頻度を生じ、内在性蛋白質との翻訳融合物としての対象の形質を発現することを発見した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ゲノムの中に組み込まれた対象のコード配列を安定して発現でき、導入遺伝子サイレンシングをほとんど起こさないトランスジェニック植物又は植物細胞を作製するための新規方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、宿主の核転写要素及び翻訳要素の転写的及び翻訳的制御下で対象のコード配列を発現することができるトランスジェニック植物又は植物細胞の作製方法であって、
（ａ）前記対象のコード配列に操作可能に結合し、その転写に必要な宿主植物又は植物細胞で機能する上流転写開始要素、
（ｂ）宿主植物又は植物細胞で機能し、前記対象のコード配列に操作可能に結合した上流翻訳開始要素を欠いた前記対象のコード配列を含むベクターを前記トランスジェニック植物又は植物細胞用の宿主植物又は植物細胞の核ゲノムに導入し、その後前記対象のコード配列を発現する植物細胞又は植物を選択することによる方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、有用な形質を発現できるトランスジェニック植物又は植物細胞を作製する方法において、宿主の核転写要素及び翻訳要素の転写的及び翻訳的制御下で対象のコード配列を発現することができるトランスジェニック植物又は植物細胞の作製方法であって、
（ａ）前記対象のコード配列に操作可能に結合し、その転写に必要な宿主植物又は植物細胞で機能する上流転写開始要素、
（ｂ）宿主植物又は植物細胞で機能し、前記対象のコード配列に操作可能に結合した上流翻訳開始要素を欠いた前記対象のコード配列を含むベクターを前記トランスジェニック植物又は植物細胞用の宿主植物又は植物細胞の核ゲノムに導入し、その後前記対象のコード配列を発現する植物細胞又は植物を選択することによる方法を提供する。
【０００９】
翻訳ベクターを使用した実験中に、植物又は植物細胞の新規遺伝的形質転換方法を発見した。操作可能に結合し、宿主植物又は植物細胞で機能する機能的転写又は翻訳開始要素（機能的要素（ａ）及び（ｂ））がない対象のコード配列を有するベクターを使用することに基づく。コード配列は操作可能に結合した翻訳又は転写機能要素を有してもよく、有さなくても良い。翻訳停止シグナル（停止コドン）を有することが好ましい。これらのベクターは「翻訳融合ベクター」と呼ばれる。転写ベクター、ＩＲＥＳをベースとした翻訳ベクター及び翻訳融合ベクターを比較すると非常に驚くべき結果が明らかになった。形質転換実験で最初陰性対照として指定された翻訳融合ベクターによる形質転換細胞の数はＩＲＥＳをベースとした翻訳ベクターで得られるもののほんの２〜１０分の１であった。この翻訳効率は、十分実際的に有用な限界内である。たとえば、翻訳融合ベクターｐｌＣ１４５１（図３）によっていくつかのＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ形質転換細胞が生じ、ＩＲＥＳをベースとした翻訳ベクターｐｌＣ１３０１と比較したところほんの２分の１であった（図２）。翻訳ベクターは、対象のコード配列の上流にＩＲＥＳ様翻訳開始要素を含み、宿主植物の転写機構に依拠している。
【００１０】
図３は、本発明による翻訳融合ベクターの最も単純な形態の例を示した図である。これには対象のコード配列が含まれ、操作可能に結合した機能的転写及び翻訳開始要素がない。このベクターは任意選択で転写終結因子（図３の３５Ｓ終結因子）を有することが可能である。このような翻訳融合ベクターを使用した本発明の方法の一実施形態を図１Ａに示す。形質転換によって宿主植物の転写活性遺伝子のコーディング部分（エキソン）へのベクターの組み込みが引き起こされる。転写に際して、前記トランスジェニック植物又は植物細胞の核ＤＮＡから得られたＲＮＡ及び対象の前記コード配列から得られたＲＮＡを含むハイブリッドｍＲＮＡ、すなわちハイブリッドｍＲＮＡが形成される。ＲＮＡがプロセシング（すなわち、イントロンスプライシング、キャッピング、ポリアデニル化）された後、翻訳によってＮ末端部分として天然の宿主蛋白質の一部及びＣ末端部分として対象のコード配列の遺伝子産物を有する融合蛋白質が生じる。前記対象のコード配列後の翻訳停止は翻訳停止シグナルによることが好ましい。
【００１１】
図１Ｂは、ベクターが機能的要素（ａ）及び（ｂ）がない対象のコード配列（導入遺伝子１）及びそれらに結合した及びそれらの下流の他のシストロンを含むより複雑な一般的実施形態を示した図である。この場合、対象のコード配列（導入遺伝子１）は導入遺伝子１の後で転写を終結する機能的転写終結要素を有さないことが好ましい。前記他のシストロン（類）は、前記対象のコード配列の下流及び前記他のシストロンの上流にあるプロモーター又はＩＲＥＳ要素様の転写及び／又は、翻訳要素に操作可能に結合することが可能である。さらに、前記他のシストロン（類）は、それらの下流に転写終結シグナルを有することが好ましい。前記シストロン（類）はＩＲＥＳ要素（類）の翻訳制御下にあることが好ましい。図１Ｂに示した場合では、転写翻訳によって対象のコード配列の遺伝子産物を含む融合蛋白質が生じる。他のシストロン（導入遺伝子２）はＩＲＥＳ要素の制御下で翻訳される。
【００１２】
翻訳融合ベクターがコード配列又はシストロンとしてのみ前記対象のコード配列を含有する場合、前記コード配列は形質転換細胞を選択するための選択的マーカーをコードすることが好ましい。ベクターが前記コード配列の下流に１個又は複数の他のシストロンを含有する場合、前記シストロンの１個は選択的マーカーをコードすることが可能である。
【００１３】
他の好ましい実施形態では、翻訳融合ベクター中の（好ましくは選択的マーカーをコードする）対象のコード配列には、部位特異的リコンビナーゼによって認識可能なＤＮＡ配列が後に続く（図１Ｃ）。本発明の方法で得られた形質転換細胞は次に、第２の形質転換で対象の遺伝子を組み込むために使用することが可能である。前記対象の遺伝子は、好ましくはＩＲＥＳ要素の翻訳制御下にあることが可能である。ＩＲＥＳ要素は、翻訳融合ベクターにおいて部位特異的リコンビナーゼによって認識可能な前記配列の上流に設けることができる。公知の、及び所望する、又は適切な発現パターンを有する形質転換細胞を前記第２の変換のために選択することが可能である。あるいは、形質転換細胞の選択的マーカー遺伝子は、翻訳融合ベクターの部位特異的組換え用の部位を使用して対象の遺伝子と交換することが可能である（たとえば、図４に示したものを参照のこと）。したがって、本発明の方法によって作製したトランスジェニック植物又は植物細胞は、他の遺伝子操作、特に部位特異的組換えを使用した標的化形質転換のために使用することができる。
【００１４】
翻訳融合ベクターがさらに前記対象のコード配列の下流にシストロンを含有する場合、形質転換マーカーはベクター中の第１シストロンとして使用することが好ましい。この好ましい方法はＩＲＥＳをベースとした翻訳ベクターの利点を全て備えているが、さらに形質転換細胞が回復する機会が増大する可能性がある。このような翻訳融合をベースとした発現を直接選択することによってまた、他の有用な形質、たとえば、限定はしないが、除草剤耐性を直接選択することが可能になる。
【００１５】
本発明の方法のためのベクターは、たとえば「インフレーム」融合の機会を増大させ、したがって形質転換効率を著しく増大させるために、スプライシング部位を取り込ませることによって容易に改善することができる。
【００１６】
一般的に、本発明の方法は前記トランスジェニック植物又は植物細胞の核ＤＮＡから得られたＲＮＡ及び前記対象のコード配列から得られたＲＮＡを含むハイブリッドメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形成を引き起こす。一般的な実施形態では、前記ハイブリッドｍＲＮＡは融合蛋白質をコードする。前記ハイブリッドｍＲＮＡはまた、たとえば前記ベクターがさらに前記対象のコード配列の下流の複数シストロンの１個を含有するとき、複数の異種ポリペプチド配列をコードすることが可能である。他の実施形態では、たとえば機能的ゲノム分析のために、前記植物又は植物細胞に天然にあるｍＲＮＡの発現を抑制するために、前記ハイブリッドｍＲＮＡは前記植物又は植物細胞に天然にある前記ｍＲＮＡに少なくとも部分的に相補的（アンチセンス）な配列を含有する。ハイブリッドｍＲＮＡに翻訳融合ベクターを容易に含めるために、前記ベクターの形質をコードする配列の前にスプライシング受容部位を設けることができる（図６及び図７）。
【００１７】
植物レポーターＧＵＳ（Ｋｅｒｔｌｕｎｄｉｔ他、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、５２１２〜５２１６）、ＧＦＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ他、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、６２８６〜６２９０）及び形質転換選択マーカーＮＰＴＩＩ（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ他、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６、２７２９〜２７３４）、ＡＰＨ（３’）ＩＩ（Ｋｏｎｃｚ他、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８４６７〜８４７１）、ＢＡＲ（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ他、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０２、３３〜３７）をコードするものを含めた多くの蛋白質が（翻訳的）融合蛋白質として活性を保持できることが知られている。しかし、この発見は適用が限られており、たとえば植物における遺伝子の捕捉（Ｋｏｎｃｚ他、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８４６７〜８４７１、Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ他、１９９５、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、９、１７９７〜１８１０）又は蛋白質局在／発現パターンの研究以外には適用できない。前述した場合全てにおいて、数種類の転写及び／又は翻訳終結シグナルを有するベクターを使用した。ここで、我々は遺伝子をコードした内在蛋白質との翻訳融合産物として形質転換した植物細胞を直接選択するために、形質転換マーカーを効率よく使用できることを初めて示す。
【００１８】
さらに、本発明の方法のためのベクターは、前記対象のコード配列又はそれらの下流にある前記シストロンの隣又は内部にある蛋白質切断部位をコードする１種又は複数の配列を含むことが可能である。これによって、最初に発現した融合蛋白質から切断された前記対象のコード配列によってコードされる蛋白質を得ることが可能になる。前記蛋白質切断部位では自己触媒的で融合蛋白質の自己切断が可能である。あるいは、発現した融合蛋白質の切断には、部位特異的プロテアーゼを必要としてよい。このようなプロテアーゼは、前記植物又は植物細胞にとって天然であってよい。あるいは、植物又は植物細胞は融合蛋白質を切断する異種部位特異的プロテアーゼをもたらすために、遺伝的に変更又はトランスフェクトされてよい。
【００１９】
本発明の方法は、トランスジェニック植物、好ましくはトランスジェニック作物植物を作製するために使用することが可能である。これらの植物は、有用な形質を発現することが好ましい。前記形質は、少なくとも部分的に前記対象のコード配列の発現の結果であり、（たとえば、アンチセンス技術のために）ＲＮＡ分子、たとえば、リボソームＲＮＡ、運搬ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡをもたらすことが可能である。前記形質は、前記コード配列の発現の結果でポリペプチド又は蛋白質をもたらすことが好ましい。さらに、前記形質は前記対象のコード配列及び１種又は複数の他のシストロンの発現の結果であることが可能である。
【００２０】
本発明の方法は、作製されたトランスジェニック植物又は植物細胞が最小限数の異種要素を含有しており、導入遺伝子発現をより安定にし、導入遺伝子サイレンシングを起こりにくくするという利点を有している。前記方法のためのベクターで使用した配列又は要素は植物由来であって、作製したトランスジェニック植物及び植物細胞の外来配列の含有率がさらに減少することが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
植物を安定して形質転換するベクターの構築については数多くの著者が報告している（概論としては、Ｈａｎｓｅｎ  ＆  Ｗｒｉｇｈｔ、１９９９、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、２２６〜２３１、Ｇｅｌｖｉｎ、Ｓ．Ｂ．、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９、２２７〜２３２を参照のこと）。これら全ての構築物の基本的成分は同一である。５’から３’の方向へ、植物特異的プロモーター、対象の遺伝子の構造部分及び転写終結因子から成る完全に機能的な転写単位が植物細胞に導入され、対象の遺伝子の発現を実現するために安定してゲノムに組み込まなければならない。
【００２２】
安定した植物の核形質転換細胞を得るために異なる技術を開発した。我々の発明は、植物細胞にいかなる機能的転写も翻訳開始要素もないコード配列を導入すると、おそらく形質転換した植物細胞での対象の導入遺伝子からｍＲＮＡを形成させることができる植物宿主の転写／翻訳機構の結果として、対象のコード配列を発現する形質転換細胞が比較的高頻度で生じるという驚くべき発見に基づいている。提案した方法は、ベクター内のプロモーター又はＩＲＥＳ要素に制御可能には結合していない対象のコード配列を有する前記ベクターを使用するが、宿主ゲノムのコーディング部分への挿入に際して、植物でコードされている内在蛋白質との翻訳融合物が形成される。
【００２３】
本発明の方法で使用したベクターは、内在植物遺伝子の転写領域に組み込まれた後、キメラｍＲＮＡとなり、その後対象の融合蛋白質に翻訳される（図１）。我々の知る限りでは、従来技術では安定した核植物形質転換細胞を創出するためのこの様な取り組みはない。非常に驚くべきことに、ほとんどの植物ゲノムでは転写活性ＤＮＡの割合が少なければ、本発明で説明した翻訳融合ベクターを使用した形質転換実験によって対象の遺伝子を発現する数多くの形質転換細胞が生じる。
【００２４】
本発明では、導入遺伝子を確実に発現するための当面の課題に取り組む。本発明の方法を使用して宿主ゲノムに組み込まれた導入遺伝子は、宿主内在遺伝子の転写制御要素の全て又はほとんどを含む転写／翻訳機構に依拠しており、したがって異種制御ＤＮＡ要素によって通常引き起こされる導入遺伝子のサイレンシングが最小限に抑えられる。
【００２５】
導入遺伝子を輸送するためのベクターは、多くの様々な方法で構築することができる。最も簡単な変種は、対象の遺伝子のコード配列又はその一部（基本翻訳融合ベクター−図１Ａ）及び所望するならば転写及び翻訳停止シグナルから成る。他の変種では、対象のコード配列の後にＩＲＥＳ又はプロモーター要素を組み込み、他のシストロンの転写及び／又は翻訳を行う。高度な翻訳融合ベクター変種は、部位特異的組換えのための配列を含むことが可能で、（概論としては、Ｃｏｒｍａｎ  ＆  Ｂｕｌｌｏｃｋ、２０００、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１、４５５〜４６０を参照のこと）現存する導入遺伝子を置換するか、又は宿主ＤＮＡの転写領域に対象の他の遺伝子を組み入れることが可能である（図１Ｃ）。バクテリオファージ及び酵母の部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び植物でのＤＮＡ操作に広く使用されている。本発明で使用するためのリコンビナーゼ−組換え部位の例には、以下のもの、ｃｒｅリコンビナーゼ−ＬｏｘＰ組換え部位、ＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ組換え部位、Ｒリコンビナーゼ−ＲＳ組換え部位、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ−ａｔｔＰ／ａｔｔＢ組換え部位などが含まれる。
【００２６】
翻訳ベクターへのスプライシング部位の導入を使用して、加工した転写物への導入遺伝子取り込みの可能性を増大させることができる。
【００２７】
ベクターはさらに、対象の前記コード配列又は追加した前記シストロン（類）の上流にシグナルペプチドをターゲティングするための配列コーディングを含むことが可能である。このようなシグナルペプチドの好ましい例には、色素体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、核ターゲティングシグナルペプチド、液胞ターゲティングペプチド、及び分泌シグナルペプチドが含まれる。
【００２８】
対象のコード配列に隣接して蛋白質分解部位を含むベクターでは、融合蛋白質の切断が生じ、このような蛋白質切断を可能にする条件が整えば、対象の蛋白質が純粋な形態で放出される。
【００２９】
植物細胞に翻訳ベクターを輸送するために、微粒子銃、エレクトロポレーション又はプロトプラスとのＰＥＧを用いた処理によって植物細胞に前記ベクターを直接導入することを含めた様々な方法を使用することができる。アグロバクテリウムを用いた植物形質転換はまた、翻訳ベクターを輸送する有効な方法である。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及びＮｉｃｏｔｉａｎａにおいてＴ−ＤＮＡ右境界配列に密接に結合したプロモーターのないＡＰＨ（３’）ＩＩレポーター遺伝子でＴ−ＤＮＡ挿入による突然変異誘発を行うことによって、全挿入物の少なくとも３０％において転写及び翻訳遺伝子融合物が誘導されることが示された（Ｋｏｎｃｚ他、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８６、８４６７〜８４７１）。
【００３０】
前述の取り組みは全て、挿入を行った内在遺伝子の発現制御下に対象の配列を置く系を設計するためのものである。その結果、対象の配列の適切な発現濃度が得られる。その他の多くの場合では、変更した導入遺伝子発現パターンが好ましいかもしれない。これらの場合では、翻訳融合ベクターは導入遺伝子の発現パターンを調節することができるエンハンサーなどの転写活性要素を備えることができる。エンハンサー配列は、数千塩基対も離れたところに位置するプロモーターの強度に影響を及ぼすことができることが知られている（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｊ．、２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０、Ｒ２４１〜Ｒ２４４）。このような取り組みの可能性はＴ−ＤＮＡに位置する３５Ｓエンハンサー要素が内在遺伝子の発現パターンを変更するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるアクティベーションタギング（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔａｇｇｉｎｇ）による実験（Ｗｅｉｇｅｌ他、２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２２、１００３〜１０１３）、及び前述のエンハンサートラップトランスポゾンタギングにおいて示された。後者の例では、内在遺伝子のエンハンサーがレポーター導入遺伝子の発現パターンを決定した。この取り組みは、たとえば植物形質転換の初期段階において、又は導入遺伝子発現パターンの変更が形質転換後に必要なときに有用であろう。
【００３１】
発現パターンはまた、翻訳エンハンサーを使用することによって変更することが可能である。エンハンサー配列は、適用の必要性に応じて配列特異的組換え系（挿入、置換又は除去）によって容易に操作することが可能である。しかし、エンハンサーは転写又は翻訳の開始因子として機能できない。
【００３２】
我々は、翻訳融合蛋白質として機能的な植物の選択的マーカー遺伝子に基づいた一連の構築物を好ましく構築することに取り組んだ。このようなマーカー遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼによって認識される組換え部位が前又は後ろにあることが可能で、したがって他の形質転換段階を使用することによって優位な部位に対象の遺伝子を組み入れることが可能である。任意選択で、マーカー遺伝子は、ＩＲＥＳ又はプロモーターの制御下で他の導入遺伝子（シストロン）が後に続くことが可能である。これらの構築物は、対象のコード配列の前の５’末端から直線化した後で、植物細胞形質転換に直接使用することができるか、又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用したＤＮＡ移動用のＴ−ＤＮＡにクローニングすることができる。
【００３３】
さらに他の構築物群は、独立型の融合産物として所望する形質を発現することを目的とする。これらの実験では、対象のコード配列は選択上の利点、たとえば、限定はしないが、除草剤耐性を付与しなければならない。我々の例は翻訳融合ベクターに基づき、酵素の機能的部分を含有する融合蛋白質を有することによって、除草剤バスタに耐性を示す植物を作製する。
【００３４】
この取り組みはまた、対象の配列がアンチセンス配列で、転写によって一部が内在性遺伝子をサイレンシングするように設計されたアンチセンスであるハイブリッドＲＮＡの生成が引き起こされる場合に使用することができる。
【００３５】
対照として使用した他の構築物類は、ＩＲＥＳ制御下でプロモーターのない選択遺伝子（陽性翻訳ベクター）を含有するか、又は単子葉及び／又は双子葉細胞（陽性対照又は転写ベクター）において機能する構成プロモーターの制御下で選択的遺伝子を含有することが可能である。適切な技術、たとえばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが有するＴｉプラスミドベクター（米国特許第５５９１６１６号、米国特許第４９４０８３８号、米国特許第５４６４７６３号）、粒子銃又は微粒子銃（米国特許第０５１００７９２号、欧州特許第００４４４８８２Ｂ１号、欧州特許第００４３４６１６Ｂ１号）を使用して植物細胞にＤＮＡを形質転換した。原則として、他の植物形質転換方法、たとえば、限定はしないが、マイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６、ＷＯ０９４００５８３Ａ１、欧州特許第１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポレーション（欧州特許第００５６４５９５Ｂ１号、欧州特許第００２９０３９５Ｂ１号、ＷＯ０８７０６６１４Ａ１）を使用することができた。
【００３６】
形質転換方法は、形質転換する植物種に左右される。我々の例には、代表的な単子葉（たとえば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）及び双子葉（たとえば、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｏｒｉｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｕｓ）植物種の形質転換効率に関するデータが含まれており、したがって、我々の取り組みは種ゲノム内の転写領域の密度が異なる様々な系統発生起原の植物種においても可能性があることが示される。
【００３７】
ベクター内のトランスジェニックコード配列は対象の遺伝子の一部のみを表し、この遺伝子は次にその後の部位特異的又は相同組換えの結果として機能的な長さに再構築される。
【実施例１】
【００３８】
ＩＲＥＳを含有した翻訳融合ベクターの構築
一連のＩＲＥＳを用いた発現ベクターは、標準的分子生物学技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用して構築した。ベクターｐｌＣ１３０１（図２）は、プラスミドｐｌＣ５０１（ｐＵＣ１２０のｐ３５Ｓ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳＭＰ．７５ＣＲ−ＢＡＲ−３５Ｓターミネーター）をＨｉｎｄＩＩＩで消化して、大きなゲル精製断片を再連結することによって作製した。ＩＲＥＳＭＰ．７５ＣＲ配列は、十字花科（ＣＲ）に感染するトバモウイルスの移動蛋白質（ＭＰ）のサブゲノムＲＮＡの５’非翻訳リーダー配列の３’末端７５塩基を表す。
【００３９】
プロモーターのないＢＡＲ遺伝子を含有する構築物は、ｐ３５Ｓ：ＢＡＲ−３’３５Ｓを含有するプラスミド（ｐｌＣ１３１１、図示せず）から３５Ｓプロモーターを削除することによって作製した。プラスミドｐｌＣ１３１１をＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩで消化して、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端にした。大きな制限断片をゲル精製して、再連結してｐｌＣ１４５１（プロモーターのないＢＡＲ−３５Ｓターミネーター、図３参照）を作製した。
【００４０】
ベクターｐｌＣ−ＢＧ（図５）を以下の通りに作製した。ＢＡＲ遺伝子の３’末端を鋳型としてプラスミドｐｌＣ０２６及び２種類のＢＡＲ遺伝子特異的プライマー（前向きプライマー：５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｃｇｔｇｔａｃｇｔｃｔｃｃｃ−３’及び逆向きプライマー：５’−ｃｃａｔｇｇｃｇａｔｃｔｃｇｇｔｇａｃｇｇｇｃ  ａｇｇａｃ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した。これらのプライマーと共に、ＳａｌＩをこのＰＣＲ断片の５’末端に、及びＮｃｏＩ部位を３’末端に導入した。最終的なＢＡＲ／ＧＦＰ−融合構築物をクローニングするために、このＳａｌＩ／ＮｃｏＩで消化し、ゲル精製したＰＣＲ産物をゲル精製した構築物ｐｌＣ０１１（ＨＢＴプロモーター、ＧＦＰ−ＮＯＳ終結因子）の小さなＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ断片に連結し、ゲル精製した構築物ｐｌＣ１４５１の大きな断片をＳａｌＩ及びＰｓｔＩで消化した。この構築物（ｐｌＣ  ＢＧ）では、ｂａｒ遺伝子はＧＦＰ遺伝子の５’末端の枠に融合されている。蛋白質レベルでは、ＢＡＲ−ＧＦＰ−融合蛋白質はＢＡＲ蛋白質部分がＧＦＰ蛋白質から１個のアミノ酸（Ａｌａ）によって分離しているこの構築物から、ＢＡＲ−ＧＦＰ−融合蛋白質は発現することができる。この構築物の増幅部分を配列決定して配列を確かめた。
【００４１】
形質転換実験で使用するために、全てのベクターをＳａｃＩ（ｐｌＣ１４５１、ｐｌＣ  ＢＧ）又はＨｉｎｄＩＩＩ（ｐｌＣ０５２、ｐｌＣ１３０１）制限酵素で消化して直線化し、未消化ベクターから分離するためにゲル精製した。
【実施例２】
【００４２】
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓのＰＥＧを使用したプロトプラスト形質転換
プロトプラストの単離
Ｂｒａｓｓｉｃａのプロトプラストの単離は既に記載された方法に基づいた（Ｇｌｉｍｅｌｉｕｓ  Ｋ．、１９８４、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、６１、  ３８〜４４、Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  ＆  Ｇｌｉｍｅｌｉｕｓ、１９８６、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、４３、１５５〜１６２及びＳｕｎｄｂｅｒｇ他、１９８７、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、７５、９６〜１０４）。
【００４３】
０．３％ゲルライトを含む１／２ＭＳ培地を含有する９０ｍｍペトリ皿で滅菌した種子（付録参照のこと）を発芽させた。この種子を互いに少し離して列に並べた。このペトリ皿を密封して、４５°の角度に傾斜させ、暗所において２８℃で６日間維持した。胚軸を鋭利なカミソリの刃で１〜３ｍｍの長さの断片に切断した。材料の組織解離を避けるために刃をしばしば交換した。胚軸片をＴＶＬ溶液（付録参照のこと）に入れ、細胞の原形質を溶解した。この物質を室温で１〜３時間処理した。この前処理によって無傷のプロトプラストの収率が著しく高まった。原形質溶解前溶液を酵素溶液８〜１０ｍｌと交換した（付録参照のこと）。酵素溶液で物質全体を覆うが、過剰に使用しないようにする。この物質を暗所で２０〜２５℃で少なくとも１５時間インキュベートした。このペトリ皿を非常にゆっくり回転する回転攪拌機に入れた。プロトプラスト及び細胞破片の混合物を７０ｍｍメッシュサイズのフィルターで濾過した。このペトリ皿をＷ５溶液５〜１０ｍｌで洗浄し（Ｍｅｎｃｚｅｌ他、１９８１、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、５９、１９１〜１９５）（また、付録を参照のこと）、再度濾過して、懸濁物の残りと一緒にした。プロトプラスト懸濁物を４０ｍｌの滅菌ファルコン試験管に移し、プロトプラストを１２０ｇで７分間遠心してペレットにした。上清を除去して、プロトプラストのペレットをスクロース０．５Ｍに再懸濁した。懸濁物を１０ｍｌ滅菌遠心管に入れ（試験管当たり８ｍｌ）、Ｗ５溶液２ｍｌを添加した。１９０ｇで１０分間遠心後、無傷のプロトプラストをパスツールピペットで界面相から収集した。これらを新しい遠心管に移し、ＣａＣｌ２を入れたマンニトール０．５Ｍに再懸濁して、１２０ｇで５分間ペレットにした。
【００４４】
ＰＥＧ処理
プロトプラストを形質転換緩衝液（付録参照のこと）に再懸濁した。プロトプラスト濃度は、血球計算板を使用して測定し、次に１〜１．５×１０６プロトプラスト／ｍｌに調節した。この懸濁物の液滴１００μｌを傾斜した６ｃｍのペトリ皿の下端に置き、２、３分そのままにしてプロトプラストを沈降させた。次に、プロトプラストをＤＮＡ溶液（Ｑｉａｇｅｎ精製、濃度１ｍｇ／ｍｌでＴＥに溶解）５０〜１００μｌとゆっくり混合した。次に、ＰＥＧ溶液２００μｌ（付録参照のこと）をプロトプラスト／ＤＮＡ混合物に滴加した。１５〜３０分後、ペトリ皿がほとんど満たされるまで（約６ｍｌ）、形質転換緩衝液（又はＷ５溶液）を少量（１滴ずつ）添加した。懸濁物を１〜５時間そのままにして沈降させた。その後、プロトプラストを遠心管に移し、Ｗ５溶液に再懸濁して、１２０ｇで５〜７分間ペレットにした。
【００４５】
プロトプラストの培養及び形質転換細胞の選択
プロトプラストを培地８ｐＭ（Ｋａｏ  ＆  Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ、１９７５、Ｐｌａｎｔａ、１２６、１０５〜１１０、付録を又参照すること）に移し、２５℃で低い光密度で、２．５ｃｍのペトリ皿には０．５ｍｌ、５ｃｍのペトリ皿には１．５ｍｌの培地を入れてインキュベートした。プロトプラスト密度は、２．５×１０４プロトプラスト／ｍｌであった。いかなるホルモンも含まない新鮮な８ｐＭ培地３倍量をプロトプラスト第１分割の直後に添加した。細胞を高い光強度で、１日当たり１６時間インキュベートした。
【００４６】
１０〜１４日後、スクロース０．１Ｍ、アガロース０．１３％、ＰＰＴ５〜１５ｍｇ／Ｌを含み、ホルモン濃度は８ｐＭ培地よりの４分の１であるＫ３培地（Ｎａｇｙ  ＆  Ｍａｌｉｇａ、１９７６、Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．、７８、４５３〜４５５）に細胞を移した。新鮮培地へ容易に移すために、注意深く薄層に広げることによって細胞を滅菌した濾紙の上部に置いた。この細胞を高い光強度で、１日当たり１６時間維持した。細胞コロニーの大きさが直径約０．５ｃｍに達した後、細胞を分化培地Ｋ３の入ったペトリ皿に移した。
【実施例３】
【００４７】
微粒子銃によるＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍの形質転換
植物細胞培養
懸濁したＴ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ  Ｌ．細胞系をＭＳ２培地（ＭＳ塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３〜４９７）、チアミンＨＣｌ  ０．５ｍｇ／Ｌ、イノシット  １００ｍｇ／Ｌ、スクロース  ３０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ−トリプトン  ２００ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ  ２ｍｇ／Ｌ）を入れた２５０ｍｌフラスコを回転振盪機に置いて１６０ｒｐｍで２５℃で増殖させ、毎週継代した。継体後４日目に、細胞をスクロース  ０．５Ｍを含むゲルライト凝固（４ｇ／Ｌ）ＭＳ２上に置いた滅菌した５０ｍｍ濾紙ディスクに広げた。
【００４８】
微粒子銃
微粒子銃は、バイオリスティックＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実施した。マクロキャリア発射点から停止スクリーンまでの距離は１５ｍｍで、停止スクリーンから標的組織までの距離は６０ｍｍで、細胞に９００〜１１００ｐｓｉで発射した。ラプチャーディスクとマクロキャリアの発射点までの距離は１２ｍｍであった。４時間の浸透圧前処理の後、細胞に発射した。
【００４９】
元のＢｉｏ−Ｒａｄの方法（Ｓａｎｆｏｒｄ他、１９９３、：「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ｒ．Ｗｕ著、２１７、４８３〜５０９）に従ってＤＮＡ−金コーティングを以下の通りに実施した。５０％グリセロールに溶かした金粉末（０．６、１．０ｍｍ）２５μｌを０．２ｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ５μｌ、ＣａＣｌ２（２．５Ｍ）２５μｌ及び０．１Ｍスペルミジン１０μｌと混合した。この混合物を２分間激しく攪拌し、その後室温で３０分間インキュベートして、遠心して（２０００ｒｐｍ、１分）、７０％及び９９．５％エタノールで洗浄した。最後に、ペレットを９９．５％エタノール３０μｌに再懸濁した（６μｌ／１回）。
【００５０】
新しいＤＮＡ−金コーティング方法（ＰＥＧ／Ｍｇ）は、以下の通りに実施した。エッペンドルフ管の中で金懸濁液（５０％グリセロールに６０ｍｇ／ｍｌで溶かす）２５μｌをプラスミドＤＮＡ５μｌと混合し、その後ＭｇＣｌ２１．０Ｍに溶かした４０％ＰＥＧ３０μｌを補給した。この混合物を２分間激しく攪拌し、その後混合しないで室温で３０分間インキュベートした。遠心（２０００ｒｐｍ、１分）後、ペレットを７０％エタノール１ｍｌで２回、９９．５％エタノール１ｍｌで１回洗浄し、最終的に９９．５％エタノール３０μｌに分散させた。エタノールに溶かしたＤＮＡ−金懸濁液（６μｌ）をマクロキャリアディスクに添加し、５〜１０分間乾燥させた。
【００５１】
プラスミドＤＮＡ調製
プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂに形質転換し、ＬＢ培地でマキシプレップを増殖させ、ＤＮＡをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キットを使用して精製した。
【００５２】
選択
安定した形質転換の実験のために、処理した細胞を含んだフィルターを適切なフィルター殺菌選択的薬剤（ハイグロマイシン（Ｄｕｃｈｅｆａ）１５０ｍｇ／Ｌ、ビアラホスＢ（Ｄｕｃｈｅｆａ）１０ｍｇ／Ｌを含む固形ＭＳ２培地に移した。このプレートを暗所で２６℃でインキュベートした。
【実施例４】
【００５３】
微粒子銃によるＯｒｙｃｈｏｐｈｒａｑｍｕｓ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓの形質転換
懸濁培養物の調製
Ｏ．ｖｉｏｌａｃｅｕｓ植物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＭＳ培地、０．３％ゲルライト（あるいは、１／２ＭＳ、２％スクロース及び０．８％寒天）で２４℃で昼１６時間／夜８時間の光周期で３〜４週間増殖させた。（大きさに応じて）４から６枚の葉を小片に切断し、カルス誘導培地（ＣＩＭ）（付録参照）３０ｍｌの入ったマジェンタボックスに移した。この物質を薄暗がり（又は暗所で）２４℃で激しく攪拌しながら４〜５週間維持した。この期間中に、新鮮なＣＩＭ培地を添加してマジェンタボックス内の植物組織が液体に覆われるようにした。マジェンタボックスの壁に付着した細胞は、箱を転位させたり、振盪したりすることによって培地中に遊離させた。
【００５４】
微粒子銃用植物組織の調製
細胞懸濁液の一部を注意深くペトリ皿のＣＩＭ固形培地によって支持された滅菌濾紙に添加した。植物物質の入ったペトリ皿を暗所で５〜７日間維持した。方法を実施する４時間前に、細胞を含んだ濾紙を１０％スクロースを含んだ新鮮なＣＩＭに移動させた。実施例３で説明したように微粒子銃を実施した。微粒子銃を実施して１４時間後、この物質を３％スクロースの入ったＣＩＭに移して、暗所で維持した。
【００５５】
形質転換細胞の選択
微粒子銃を実施して２から４日後、細胞を含んだ濾紙を適切な選択薬剤（１０〜１５μｇ／ｍｌＰＰＴ）を補給したＣＩＭを入れたプレートに移した。７日毎に、この物質を新鮮な選択培地に移した。このプレートを暗所で維持し、約６週間後にプレートの物質を適切な選択薬剤（１０〜１５μｇ／ｍｌＰＰＴ）を補給した形態形成誘導培地（ＭＩＭ）（付録参照）を入れたペトリ皿に移した。このプレートを強い光強度で、日長１６時間でインキュベートした。
【実施例５】
【００５６】
プロモーターのないｌｏｘＰ−ＨＰＴ遺伝子を有するＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍの形質転換
構築物ｐｌＣ０５２（図４）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して直線化し、ゲル精製して未消化物質を分離し、前述のように微粒子銃のために使用した（実施例３参照のこと）。直線化したベクターはｐＵＣ１９ポリリンカー（５７ｂｐ）及びそれに続くＨＰＴ遺伝子の５’末端のｌｏｘＰ部位を含む。一般的に、約１００ｂｐがＨＰＴ遺伝子の翻訳開始コドンの５’末端に位置する。３４枚のプレートを形質転換し、ハイグロマイシン含有培地（実施例３）で１．５カ月選択した後、３個のハイグロマイシン耐性コロニーが回収された。ＰＣＲによって回収された組み込み部位の配列は、３個の形質転換細胞いずれも別々であることが確かめられた。
【実施例６】
【００５７】
Ｔ−ＤＮＡに基づいた翻訳融合ベクター
この実施例の目的は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いた翻訳ベクターの植物細胞への輸送を示すことである。
【００５８】
現存する翻訳融合ベクターのさらなる改善は、異なるベクター要素をバイナリーベクターｐｌＣＢＶ１０（図８を参照のこと）にサブクローニングして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いた双子葉植物の形質転換を可能にすることによって実現した。いずれのバイナリーベクターとも標準的分子生物学的技術を使用して構築した（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ベクターｐｌＣＨ３７８１（図６を参照のこと）を構築するために、構築物ｐｌＣＨ３６５１（ＢＡＲ遺伝子／ターミネーター／エンハンサー要素）のプロモーターのない発現カセットをｐｌＣＢＶ１０のポリリンカーにＸｂａｌ／ＥｃｏＲＩ断片及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片としてスリーフラグメントライゲーションによってサブクローニングした。構築物ｐｌＣＨ３８３１は、エンハンサー要素（ＴＡＴＡボックスのないアクチン２−プロモーター、図７参照）のないベクターｐｌＣＨ３８７１と同様の翻訳融合ベクターを表す。このエンハンサー要素を除去するために、構築物ｐｌＣＨ３７８１をＥｃｏＲＩで消化して、連結した。ｐｌＣＨ３７８１及びｐｌＣＨ３８３１のいずれの構築物ともＢＡＲ遺伝子の前に、容易にＢＡＲコード配列を処理した内在遺伝子転写物に取り込ませ、正確な翻訳融合産物を形成するために、２個のスプライシング受容部位（ＳＡ）を含有する。
【００５９】
翻訳ベクターと転写ベクターの効率を比較するために、ＮＯＳプロモーターの制御下でＮＰＴＩＩ遺伝子をまたｐｌＣＨ３７８１及びｐｌＣＨ３８３１に取り込ませた。ｐｌＣＨ３７８１及びｐｌＣＨ３８３１のＴ−ＤＮＡは、Ｂｅｎｔ他によって記載された様に（１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、１８５６〜１８６０）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌ−０）植物に導入された。真空浸潤して３週間後に種子を収穫し、２群に等分した。１群は滅菌してカナマイシン５０ｍｇＬ−１を含有するＧＭ＋１％グルコース培地（Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５５３６〜５５４０）で形質転換細胞をスクリーニングした。もう一方の群は、土壌中で発芽させ、ホスフィノスリシン溶液（５０μｇ／ｍｌ）を数回噴霧した。それぞれのスクリーニング実験の形質転換細胞の数を計数した。転写ベクターで得られた形質転換細胞の数に対する翻訳ベクターで得られた数（ｐｐｔＲ：ＫｍＲ）の割合は、使用した構築物に応じておよそ１：１５〜１：２５の範囲であった。
【００６０】
本明細書で説明した構築物は全てまた、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いたリーフディスク（Ｈｏｒｓｈ他、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９〜１２３１）及びＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒ）胚軸（Ｒａｄｋｅ他、１９８８、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、７５、６８５〜６９４）の形質転換のために使用した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのゲノムの大きさはＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ及びタバコとそれぞれ１０〜２０倍異なり、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの転写領域はタバコ及びＢｒａｓｓｉｃａと比較して高密度であるにもかかわらず、翻訳融合ベクターで得られたＢｒａｓｓｉｃａ及びタバコの形質転換細胞の頻度は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの頻度に匹敵していた（転写ベクターと比較して１５〜２５倍低い）。
【００６１】
（付録）
種子の滅菌
種子を少なくとも２時間１％ＰＰＭ溶液に浸漬する（一晩が好ましい）。種子を７０％ＥｔＯＨで１分間洗浄して、その後回転振盪機上に置いた２５０ｍｌフラスコに入れた０．０１％ＳＤＳ又はＴｗｅｅｎ２０）を含む１０％塩素溶液で滅菌する。この種子を滅菌水０．５Ｌで洗浄する。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
【表２】
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【００６４】
【表３】
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【００６５】
【表４】
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【００６６】
【表５】
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【００６７】
ホルモン溶液は、濾過滅菌して、高圧滅菌した培地に添加した。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】多くの可能な翻訳融合ベクター変種のうち１種類を示した図である。
対象のコード配列（導入遺伝子）を有する翻訳融合ベクターの最も簡単な変種である。
【図１Ｂ】多くの可能な翻訳融合ベクター変種のうち１種類を示した図である。
このベクターはＩＲＥＳ要素によって第１の導入遺伝子から分離された第２導入遺伝子を含有する。
【図１Ｃ】多くの可能な翻訳融合ベクター変種のうち１種類を示した図である。
このベクターはＩＲＥＳ及び部位特異的リコンビナーゼによって認識される組換え部位（ＲＳ）を含有する。
【図２】ＩＲＥＳＭＰ．７５ＣＲ、ＢＡＲ及び３５Ｓ終結因子を含有する翻訳ベクターｐｌＣ１３０１を示した図である。
【図３】プロモーターのないＢＡＲ遺伝子及び３５Ｓ終結因子を含有するベクターｐｌＣ１４５１を示した図である。
【図４】ｌｏｘＰ部位、ＨＰＴ遺伝子及びｎｏｓ終結因子を含有するベクターｐｌＣ０５２を示した図である。
【図５】ＢＡＲ−ＧＦＰ翻訳融合物を含有するベクターｐｌＣ−ＢＧを示した図である。
【図６】プロモーターのないＢＡＲ遺伝子の前に３個のスプライシング受容体部位（３×ＳＡ）を含有するバイナリーベクターｐｌＣＨ３７８１を示した図である。
【図７】プロモーターのないＢＡＲ遺伝子の前に３個のスプライシング受容体部位（３×ＳＡ）を含有するバイナリーベクターｐｌＣＨ３８３１を示した図である。
【図８】バイナリーベクターｐｌＣＢＶ１０を示した図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月5日(2003.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
有用な形質を発現することができるトランスジェニック植物又は植物細胞を作製する方法であって、
（ａ）前記対象のコード配列に操作可能に結合し、その転写に必要な宿主植物又は植物細胞で機能する上流転写開始要素、
（ｂ）宿主植物又は植物細胞で機能し、前記対象のコード配列に操作可能に結合した上流翻訳開始要素、
を欠いた前記対象のコード配列を含むベクターを前記トランスジェニック植物又は植物細胞用の宿主植物又は植物細胞の核ゲノムに導入し、その後前記対象のコード配列を発現する植物細胞又は植物を選択することによって、宿主の核転写要素及び翻訳要素の転写的及び翻訳的制御下で対象のコード配列を発現することを含む、
上記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２５】
宿主の核転写要素及び翻訳要素の転写的及び翻訳的制御下で選択マーカー遺伝子のコード配列を核ゲノム中に含有し、
前記コード配列は、
（ａ）前記対象のコード配列に操作可能に結合し、その転写に必要な宿主植物又は植物細胞で機能する上流転写開始要素、
（ｂ）宿主植物又は植物細胞で機能し、前記対象のコード配列に操作可能に結合した上流翻訳開始要素、
を欠いている、
請求項２４記載の植物細胞、植物及びそれらの子孫。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２６】
請求項２４又は２５に記載の植物細胞又は植物の、前記植物細胞又は植物の標的化形質転換のための使用。
【国際調査報告】
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