(57)【要約】Ｒ１〜Ｒ３が明細書中の記載と同意義である式（Ｉ）：【化１】2004523541.tif 000010で示される治療的に活性なピラゾール誘導体、その製造方法、治療における、特に形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）の過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防におけるその使用、およびかかる治療において用いるための医薬組成物に関する。
2004523541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004523541.tif 000006
［式中、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−４アルキルまたはＣＨ２ＣＯＮＲ４Ｒ５から選択され；
ｎは０、１、２、３、４または５から選択される整数であり；
Ｒ２は同じであっても異なっていてもよく、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択され；
Ｒ３はＨ、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択され；
Ｒ４はＨまたはＣ１−４アルキルであり、Ｒ５はＣ１−４アルキルである］
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１がＨまたはＣ１−４アルキルである請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項３】
ｎが０、１または２であり、Ｒ２がナフチリジン環のＣ（２）、Ｃ（３）またはＣ（４）位に位置し、ハロ、−ＣＮ、−ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択される請求項１または請求項２記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項４】
ｎが０である請求項３記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項５】
Ｒ３がピリジン環のＣ（３）またはＣ（６）位に位置し、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択される上記請求項いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項６】
Ｒ３がＨまたはＣ１−４アルキルである請求項５記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項７】
２−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−［１，５］ナフチリジン；および
２−［３−（６−メチルピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−［１，５］ナフチリジン；
から選択される請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物およびその塩ならびに溶媒和物。
【請求項８】
少なくとも１つの請求項１〜７いずれか１項に記載の式（Ｉ）で示される化合物を、医薬上許容される希釈剤または担体と一緒に含んでなる医薬組成物。
【請求項９】
医薬として用いるための請求項１〜７いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項１０】
ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付け有れる障害の治療および／または予防のための医薬の製造における請求項１〜７いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物の使用。
【請求項１１】
ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害を患っているヒトまたは動物対象の治療方法であって、該ヒトまたは動物対象に、有効量の請求項１〜７いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
式（Ｉ）：
【化２】
2004523541.tif 000007
［式中、
Ｒ１はＨであり；ｎは０、１、２、３、４または５から選択される整数であり；Ｒ２は同じであっても異なっていてもよく、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択され；Ｒ３はＨ、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択される］
で示される化合物の製造方法であって：
（ａ）式（Ｅ）：
【化３】
2004523541.tif 000008
［式中、Ｒ３は上記と同意義である］
で示されるケトンに、酢酸、ついで、ジメチルホルムアミドを添加すること；および
（ｂ）ヒドラジンモノヒドリド、ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏを得られた反応混合物に連続して添加すること；
を含む方法。
【請求項１３】
式（Ｉ）：
【化４】
2004523541.tif 000009
［式中、
Ｒ１はＣ１−４アルキルまたはＣＨ２ＣＯＮＲ４Ｒ５であり、ここに、Ｒ４はＨまたはＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ５はＣ１−４アルキルであり；ｎは０、１、２、３、４または５から選択される整数であり；Ｒ２は同じであっても異なっていてもよく、ハロ、−ＣＮ、−ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択され；Ｒ３Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択される］
で示される化合物の調製方法であって、
Ｒ１がＨである式（Ｉ）で示される化合物を、適当な塩基の存在下でＮ−アルキル化することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規ピラゾール誘導体、その製造法、治療、特に、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）の過剰発現により特徴付けられる障害の治療および予防におけるその使用に関する。
【０００２】
ＴＧＦ−βは、アクチビン／インヒビン、骨形成蛋白（ＢＭＰ）およびＴＧＦ−βを含むＴＧＦ−βスーパーファミリーに属している多機能サイトカインである。ＴＧＦ−βの３つのイソフォーム（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）が哺乳類において同定されており、これらの各々は、異なる染色体の別個の遺伝子によりコードされる（D.A. Lawrence, Eur. Cytokine. Netw., 1996, 7(3), 363）。ＴＧＦ−βは、細胞周期を調節し、増殖応答を制御し、または細胞接着、移動および細胞間伝達を媒介する細胞外マトリックス蛋白に関係している、遺伝子の発現を最終的に誘発する細胞内シグナリング経路を開始させる。ＴＧＦ−βは、細胞増殖および分化、細胞外マトリックス形成、造血および免疫調節のモジュレーションを含む多面的効果を有する（RobertsおよびSpoon, Handbook of Experimental Pharmacology, 1990, 95, 419-458）。
【０００３】
種々の細胞表面蛋白および受容体は、活性ＴＧＦ−βリガンドがその受容体に結合することにより開始されるシグナルを変換することが知られている。ＴＧＦ−βシグナリング経路が開始されることにより、ＴＧＦ−βリガンドはＩＩ型膜受容体の細胞外ドメインに結合する（Massague, Ann. Rev. Biochem., 1998, 67, 753.）。ついで、結合ＩＩ型受容体は、Ｉ型（Ａｌｋ５）受容体を、多重結合膜複合体に補充し、ついで、活性ＩＩ型受容体キナーゼは、Ｉ型受容体キナーゼをリン酸化し、活性化する。Ｉ型受容体キナーゼの機能は、受容体結合共転写因子、Ｓｍａｄ−２またはＳｍａｄ−３をリン酸化することであり、その結果これは細胞質中に放出され、Ｓｍａｄ−４に結合する。ＰＡＩ−１遺伝子は、上記した細胞経路の結果として、ＴＧＦ−βにより活性化される。
【０００４】
ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療および／または予防に対する一のアプローチは、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することである。例えば、優勢ネガティブＴＧＦ−βＩＩ型受容体の過剰発現によるＴＧＦ−βＩＩ型受容体の阻害は、ラットモデルにおいて、肝臓線維症および機能不全を防止すること（Proc. Natl. Acad. Sci, 1999, 96(5), 2345)）および確定した肝臓線維症の進行を防止すること（Hepatology, 2000, 32, 247）が知られている。
【０００５】
ＴＧＦ−βの病的過剰発現は、重症の病原性症状の進行を最終的に誘発する多くの望ましくない効果に関連していることが知られている（G.C. Blobeら、N. Engl. J. Med., 2000, 1350）。特に、ＴＧＦ−βの病的過剰発現は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰な蓄積、細胞増殖および免疫抑制を引き起こし得る。ＥＣＭの過剰蓄積は、線維症、例えば腫瘍線維症、放射線誘発線維症、肝臓、腎臓、肺、腸、心臓、膵臓、腹膜または他の臓器の線維症を誘発することが知られている。線維症は、肝硬変、特発性肺線維症、球体硬化症および肥厚性瘢痕を誘発し得る。
多くの他の病状は、ＴＧＦ−βにより制御される遺伝子の発現の変化に付随することが知られており、これらは癌の進行、骨機能異常および炎症性障害を含む。
【０００６】
ＴＧＦ−β細胞内経路を阻害することができる化合物の開発は、上記した症状の予防および／または治療に効果がある望ましい手段と思われる。ＴＧＦ−β細胞内経路および／またはＴＧＦ−βの発現を阻害することができる化合物は、線維症の症状の進行を誘発する徴候の障害の治療において用いることができる。例えば、本発明の化合物は、種々の肝臓関連症状、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、アルコール誘発肝炎、ヘモクロマトーシスおよび原発性胆汁性肝硬変症に関連する線維症の治療において有用であり得る。
【０００７】
本発明の化合物はピラゾール誘導体である。他のピラゾール化合物は、以前に、別の医薬用途において用いることが記載されている。ＰＣＴ特許出願、ＷＯ９６／０３３８５，ＷＯ９８／５２９３７、ＷＯ９８／５２９４０、ＷＯ９８／５２９４１およびＷＯ００／３１０６３（Searle & Co）には、一連の置換ピラゾール化合物およびｐ３８キナーゼ介在障害の治療におけるその使用が開示されている。特に、記載されている化合物は、炎症、炎症性腸疾患、多発性硬化症および喘息において有用である。欧州特許出願０８４６６８７（Lilly & Co）には、脂肪酸のｓＰＬＡ２介在放出の阻害に有用な新規な置換ピラゾールが記載されている。かかる化合物は、敗血性ショックのような症状の治療に有用である。ＥＰ０８４６６８６（Pfizer Ltd）には、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の両方の阻害剤として作用する一連の縮合ピラゾール誘導体が開示されている。かかる化合物は、ＩＬ−１およびＴＮＦ介在疾患、例えば、慢性炎症性疾患、特定の自己免疫疾患および敗血症誘発臓器傷害の治療に有用である。上記した特許出願は本発明のピラゾール化合物を記載しているものではない。
【０００８】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ００／１２９４７（Scios Inc.）には、キナーゼｐ３８−αおよび／またはＴＧＦ−βの活性の増大に付随する種々の障害を治療するための一連のキナゾリン誘導体の使用が記載されている。これに記載されている化合物は、両方の蛋白の活性を阻害することが示されており、したがって、ｐ３８−αおよびＴＧＦ−βの両方に対する活性の増大が必要とされる症状の治療に特に有用である。
【０００９】
この度、以下に記載するある種の置換ピラゾール化合物が、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防に有用であることを見出した。特に、本発明の化合物は、Ｉ型ＴＧＦ−β（Ａｌｋ５）受容体レベルで作用するＴＧＦ−β阻害剤である。
【００１０】
本発明の一の態様により、式（Ｉ）：
【化１】
2004523541.tif 000003
［式中、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−４アルキルまたはＣＨ２ＣＯＮＲ４Ｒ５から選択され、ここに、Ｒ４はＨまたはＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ５はＣ１−４アルキルから選択され；
ｎは０、１、２、３、４または５から選択される整数であり；
Ｒ２は同じであっても異なっていてもよく、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択され；
Ｒ３はＨ、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択される］
で示される化合物およびその塩ならびにその溶媒和物（以後、「本発明の化合物」という）を提供する。
【００１１】
また、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される塩を範囲に含む。式（Ｉ）で示される化合物の適当な医薬上許容される塩は、酸塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびテトラアルキルアンモニウム塩等、または適当な酸、例えば酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸およびコハク酸のような有機カルボン酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、メタンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸のような有機スルホン酸、および塩酸、硫酸、リン酸およびスルファミン酸等のような無機酸とのモノもしくはジ塩基塩を含む。
また、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物の溶媒和物、例えば水和物にも関する。
【００１２】
Ｒ１がＨである式（Ｉ）で示される化合物は、互変異性体で存在し得る。別個の互変異性体およびそれらの混合物は本発明の範囲内に含まれる。
好ましくは、Ｒ１はＨまたはＣ１−４アルキルであり、より好ましくは、Ｒ１はＨである。
【００１３】
好ましくは、ｎは０、１または２であり、Ｒ２はナフチリジン環のＣ（２）、Ｃ（３）またはＣ（４）位に位置し、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択される。最も好ましくは、ｎは０である。
好ましくは、Ｒ３はピリジン環のＣ（３）またはＣ（６）位に位置し、Ｈ、ハロ（例えばフルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択される。最も好ましいＲ３はＨＨまたはＣ１−４アルキルである。別に、Ｒ３はＨである。
【００１４】
本発明は、上記したような好ましい基の組合せを有する化合物を含むことは理解できるだろう。
【００１５】
ＴＧＦ−βの過剰発現に特徴付けられる障害の治療または予防において有用な薬剤として特に対象となる式（Ｉ）で示される化合物は：
２−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−［１，５］−ナフチリジン；および
２−［３−（６−メチルピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−［１，５］−ナフチリジン；
およびその塩ならびに溶媒和物である。
【００１６】
式（Ｉ）で示される化合物およびその塩ならびに溶媒和物は、後に記載する方法により調製することができ、これは本発明のさらなる一の態様を構成する。本発明のさらなる態様において、式（Ｅ）で示される中間体化合物の製造方法を提供する。
式（Ｉ）で示される化合物は、有利には、下記スキーム１の一般方法に従って調製できる。
【００１７】
【化２】
2004523541.tif 000004
【００１８】
【化３】
2004523541.tif 000005
【００１９】
略語表
ＡｃＯＨ  酢酸
ＤＭＦ・ＤＭＡ  ジメチルホルムアミド・ジメチルアセタール
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＫＨＭＤＳ  カリウムビス（トリメチルシリル）アミド
ＭｅＣＮ  アセトニトリル
THF  テトラヒドロフラン
【００２０】
本発明のさらなる態様において、以下の一般方法（スキーム２）：
（ｉ）ハロゲン化アルキル、Ｒ１Ｘ（ここに、Ｒ１は上記と同意義である）のような適当なＮ−アルキル化剤を、炭酸カリウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような適当な塩基の存在下、好ましくは、０〜７５℃の温度の範囲で、より好ましくは、２０〜６０℃の温度の範囲、最も好ましくは室温で、ＤＭＦまたはＭｅＣＮのような適当な溶媒の存在下で添加し、ついで、いずれの得られた異性体混合物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより分離すること、
に従って、Ｒ１がＣ１−４アルキルまたはＣＨ２ＣＯＮＲ４Ｒ５から選択され、ここに、Ｒ４およびＲ５が上記と同意義である式（Ｉ）で示される化合物は、上記した工程（ｖｉｉ）から得られる式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物のＮ−アルキル化により調製することができる。
【００２１】
上記スキーム２の（ｖｉｉｉ）に記載のＮ−アルキル化により、式（Ｉ）で示される化合物の構造異性体が形成されることは理解できるだろう。かかる異性体は、上記したＲ１がＨである式（Ｉ）で示される化合物の互変異性体のＮ−アルキル化により得られる。個々の異性体およびそれらの混合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００２２】
６−メチル−３−アミノピリジン（Ｃ）は当該分野で公知の方法、例えば、A.W. Hofmann, Ber. Dtsch. Ges., 1881, 14, 2725に記載の方法に従って調製することができる。
２−メチル−１，５−ナフチリジン（Ｄ）は当該分野で公知の方法、例えば、Chem. Pharm. Bull., 1971, 19(9), 1857に従って調製することができる。
【００２３】
上記した工程（ｉｉ）に記載したようなモノ置換ピリジルエステル、Ｒ３（Ｃ５Ｈ３Ｎ）ＣＯ２Ｅｔ（ここに、Ｒ３は上記と同意義である）は当該分野で公知の方法と類似の方法で調製することができる。例えば、Ｒ３がＣ（６）−ＯＭｅである場合、Fingerら、J. Org. Chem., 1962, 27, 3965；Ｒ３がＣ（３）−ＯＭｅである場合、Dejardinら、Bull. Chim. Soc. Fr., 1979, 289；Ｒ３がＣ（５）−Ｂｒである場合、ChambersおよびMarfat, Synth. Commun., 1997, 27(3), 515；およびＲ３がＣ（４）−ＣＮである場合、HeinischおよびLotsch, Heterocycles, 1987, 26(3), 731。
【００２４】
工程（ｖ）に記載したようなN-アルキル化反応は、当該分野で公知の方法（例えば、R. Fusco, Pyrazoles, Chapter 4, p.71, The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A. Weissberger (ed), Vol. 22, Intersciences, New York, 1967およびElguero, Pyrazoles and their Benzo derivatives, p.222, Comprehensive Heterocycles Chemistry, A.R. Katrisky, C.W. ReesおよびK.T. Potts (eds), Vol. 5, Pergamon Press, Oxford, 1984）と類似の方法に従って行うことができる。
【００２５】
本発明の化合物がＴＧＦ−β１型（Ａｌｋ５）受容体を阻害することによりＳｍａｄ−２またはＳｍａｄ−３蛋白のリン酸化を阻害することが見出された。
したがって、本発明の化合物は、本明細書に記載のアッセイにおいて試験され、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療および予防において可能性ある治療的有用性があることが見出された。
かくして、ヒトまたは獣医学において、特に、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防において、医薬として用いるための式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００２６】
本明細書において言及する治療は、予防ならびに確定した症状の治療を範囲に含むことは理解できるだろう。さらに、本明細書で言及するＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防は、線維症、特に肝臓および腎臓の線維症、癌の進行、骨機能異常および炎症性障害および瘢痕化のようなＴＧＦ−β関連疾患の治療または予防を含む。
本発明に従って治療され得る他の病的症状は、上記した序文で論じられている。本発明の化合物は、特に、線維症およびそれに関連する症状の治療に適している。
【００２７】
本発明の化合物は、肝臓疾患に対する例えば抗ウイルス剤のような他の治療剤、または腎臓疾患に対するＡＣＥ阻害剤またはアンギオテンシン受容体アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。
【００２８】
本発明の他の態様により、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害、特に線維症の治療および／または予防のための医薬の製造における式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の使用を提供する。
【００２９】
さらなる態様において、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害、特に線維症を患っているヒトまたは動物の治療方法であって、該ヒトまたは動物対象に、有効量の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを特徴とする方法を提供する。
【００３０】
本発明の化合物はいずれかの慣用的な方法で投与するために処方されてもよく、したがって、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を、１つまたはそれ以上の医薬上許容される希釈剤または担体と混合して含む、治療において用いるための医薬組成物も範囲に含む。
本発明は成分を混合して含む該医薬組成物の製造方法を提供する。
例えば、本発明の化合物は、経口、舌下、非経口、局所および直腸投与で処方することができる。
【００３１】
経口投与用の錠剤およびカプセルは、慣用的な賦形剤、例えば結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、でんぷんの粘漿剤またはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、ラクトース、微結晶セルロース、糖、とうもろこしでんぷん、リン酸カルシウムまたはソルビトール；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；崩壊剤、例えば、ポテトスターチ、クロスカルメロースナトリウムまたはスターチグリコール酸ナトリウム；または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含んでいてもよい。経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、乳液、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、または、使用前に水または他の適当なビヒクルで復元する乾燥生成物として調製することができる。かかる液体製剤は、慣用的な添加剤、例えば懸濁化剤、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用油；乳濁化剤、例えば、レシチン、ソルビタンモノオレアートまたはアカシア；非水性ビヒクル（食用油を含んでいてもよい）、例えば、アーモンド油、ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；または保存剤、例えば、メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸を含んでいてもよい。また、製剤は、必要に応じて、緩衝塩、フレーバー、着色剤および／または甘味剤（例えば、マンニトール）を含んでいてもよい。
【００３２】
舌下投与に関しては、組成物は、慣用的な方法で、錠剤またはロゼンジの形態にすることができる。
また、化合物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセライドのような慣用的な坐剤基剤を含有する坐剤として処方することもできる。
【００３３】
また、本発明の化合物は、ボーラス注射または持続性注射による非経口投与用に処方することができ、例えば、アンプル、バイアル、少量の注射または予備充填シリンジのような単位剤形、または、付加的な保存剤と一緒に複数回投与容器に調製することができる。組成物は、水性または非水性ビヒクル中の溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態であってもよく、処方剤、例えば、酸化防止剤、緩衝剤、抗菌剤および／または毒性調節剤を含んでいてもよい。別法として、活性成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば滅菌発熱物質不含水で復元するための粉末の形態であってもよい。乾燥固体製剤は、滅菌粉末を、無菌状態で、別個の滅菌容器に充填することにより、または、滅菌溶液を、無菌状態で各々の容器に充填し、凍結乾燥することにより調製することができる。
【００３４】
本発明で用いる局所投与は、吸入による投与を含む。局所投与用の製剤の種々の型の例としては、軟膏、クリーム、ローション、粉末、ペッサリー、スプレー、エアロゾル、吸入で用いるためのカプセルもしくはカートリッジまたは滴剤（例えば、目または鼻の滴剤）が挙げられる。
【００３５】
例えば、軟膏およびクリームは、適当な増粘剤および／またはゲル化剤および／または溶媒を添加した水性または油性基剤と一緒に処方できる。かくして、かかる基剤は、例えば、水および／または液体パラフィンまたはラッカセイ油もしくはヒマシ油のような植物油のような油またはポリエチレングリコールのような溶媒を含む。用いることができる増粘剤は、ソフトパラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、微結晶ワックスおよびベースワックスを含む。
【００３６】
ローションは、水性または油性基剤と一緒に処方することができ、一般的には、１つまたはそれ以上の乳濁化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤または増粘剤も含むだろう。
外用粉末は、いずれの適当な粉末基剤、例えば、タルク、ラクトースまたはスターチの補助を用いて形成することができる。滴剤は、１つまたはそれ以上の分散剤、溶解剤または懸濁化剤も含む、水性または非水性基剤と一緒に処方することができる。
【００３７】
スプレー組成物は、例えば、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いることで、加圧パックから供給される水溶液もしくは懸濁液またはエアロゾルとして処方することができる。
吸入で用いるためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、本発明の化合物および適当な粉末基剤、例えばラクトースまたはでんぷんの粉末混合物を含んで処方することができる。
【００３８】
本発明の化合物は、有利には、例えば、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ、適当には、体重１ｋｇ当たり０．０５〜２５ｍｇの量で、１日１回またはそれ以上の回数で、経口投与することができる。もちろん的確な投与量は、患者の年齢および症状、選択される特定の投与経路に依存し、完全に投与する主治医の判断による。
【００３９】
以下の実施例は本発明を説明するものであって限定するものではない。
【００４０】
中間体
中間体１：２−メチル−［１，５］ナフチリジン
濃硫酸（１４ｍｌ）、ｍ−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（１１．３０ｇ）、ホウ酸（１．５５ｇ、０．０３９ｍｏｌ）および硫酸鉄五水和物（０．９０ｇ、３．２３ｍｍｏｌ）の混合物を室温で撹拌した。グリセロール（８．０ｍｌ）、ついで、３−アミノ−６−メチル−ピリジン（２．７９ｇ、０．０２５ｍｏｌ）および水（１４ｍｌ）を加えた。得られた混合物を１３５℃に１８時間撹拌しながら加熱した。反応混合物を室温に冷却し、４Ｎの水酸化ナトリウムを用いて塩基性化し、得られた混合物を酢酸エチル（×４）を用いて抽出した。抽出物を合し、ついで、シリカゲル（２０ｍｌ）上に予備吸収させ、ついで、Ｂｉｏｔａｇｅクロマトグラフィー（９０ｇのシリカゲルカートリッジを使用）に付して、酢酸エチル（ニート）で抽出した。適当なフラクションを合し、ついで、蒸発させて、標題化合物（２．０１ｇ、５５％）を淡褐色結晶性固体として得た。
ＬＣ−ＭＳ  ｍ／ｚ１４５＝ＭＨ＋
【００４１】
中間体２：２−［１，５］ナフチリジン−２−イル−１−ピリジン−２−イル−エタノン
無水ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の２−メチル−［１，５］ナフチリジン、（０．５０ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）およびピコリン酸エチル（０．５２ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）の撹拌し、冷却（−７８℃）した溶液に、ヘキサメチルジメチルシルアジドカリウム（トルエン中０．５Ｍ溶液）（１３．９ｍｌ、６．９４ｍｍｏｌ）を１０分にわたって滴下した。この混合物を７８℃で１時間撹拌し、ついで、室温で２０時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム（１００ｍｌ）溶液を反応混合物に撹拌しながら加え、得られた混合物を酢酸エチルおよび水間で分配した。水相を分離し、酢酸エチル（×３）で抽出した。抽出物および有機相を合し、水で洗浄し、最終的に乾燥し、蒸発させて、標題化合物（０．８６ｇ）を橙黄色固体として得た。
［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ２５０（ＭＨ＋）
【００４２】
中間体３：１−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−２−［１，５］ナフチリジン−２−イル−エタノン
２−メチル−［１，５］ナフチリジン（４．３４ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）およびメチル−６−メチルピコリネート（１．１当量、５ｇ、３３．１１ｍｍｏｌ）は中間体２に記載のようにカップリングして、標題化合物を橙色固体（６ｇ）として得た。
［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ２６４（ＭＨ＋）
【００４３】
実施例
実施例１：２−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン
無水ＤＭＦ（６ｍｌ）中の２−［１，５］ナフチリジン−２−イル−１−ピリジン−２−イル−エタノン、（０．３９ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、酢酸（０．３２ｍｌ、５．６１ｍｍｏｌ）、ついで、ジメチルホルムアミド／ジメチルアセトアミド（ＤＭＦ／ＤＭＡ）（０．６２ｍｌ、４．６８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で１時間撹拌し、ついで、ヒドラジン水和物（１．７０ｍｌ、３５．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を５０℃に２時間加熱し、ついで、室温に冷却した。反応物を水および酢酸エチル間で分配し、ついで、水相を分離し、酢酸エチル（×８）で抽出した。抽出物および有機相を合し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、蒸発させて粗物質を赤褐色のガムとして得た。このガムをアセトニトリルから結晶化して、標題化合物（０．３１ｇ、７３％）を淡黄色の固体として得た。
［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ２７４（ＭＨ＋）
1H NMR: (DMSO-d6): δ 13.6 (1H, V.br.s, NH), 8.92 (1H, dd, CH), 8.58 (1H, br.s, CH), 8.33-8.25 (3H, br.m, 3 X CH), 7.95-7.80 (3H, 2 X m, 3 X CH), 7.74 (1H, dd, CH), 7.40 (1H, m, CH)
【００４４】
実施例２：２−［３−（６−メチル−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−［１，５］−ナフチリジン
中間体３（５．６６ｇ、２１．５２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＡ（３．８５ｇ、３２．２８ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（７．５４ｇ、１５０ｍｍｏｌ）と反応させて、ペンタン中にトリチュレートした後、標題化合物を黄色固体（２．０６ｇ）として得た。
融点：１９３℃
ＨＲＭＳ  Ｃ１７Ｈ１３Ｎ５としての計算値：（Ｍ＋Ｈ）＋２８８．１２４９、実測値：２８８．１２２８
ある程度のスペクトル線幅の広がりは、異なる互変異性体の存在および／または分子内の束縛回転（複数でも可）が原因であり、これらの型のピラゾール化合物の1HNMRスペクトルに固有のものであることは理解できるだろう。
【００４５】
生物学的データ
実施例１および２の化合物を、インビトロで、下記の生物学的アッセイ１を用いて、試験した。試験した両方の化合物は、アッセイ１において、約０．０５μＭのＩＣ５０を有した。
【００４６】
アッセイ
アッセイ１
ＴＧＦ−βシグナリングを阻害するための本発明の化合物の可能性は、例えば、以下のインビトロアッセイを用いて示すことができる。
アッセイは、ルシフェラーゼ（ホタル）受容体遺伝子に結合したＰＡＩ−１プロモーター（強力なＴＧＦ−β応答プロモーター）で安定にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞において行った。化合物をＴＧＦ−βに曝した細胞におけるルシフェラーゼ活性を阻害する能力で選択した。加えて、ＴＧＦ−β応答プロモーターにより操作されず、毒性対照として用いられる第２のルシフェラーゼ（レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ））遺伝子で細胞をトランスフェクトした。
（９６ウェル）マイクロプレートを、マルチドロップ装置を用いて、２００μｌの血清含有培地中、ウェルあたり３５０００細胞の濃度で、安定なトランスフェクト細胞系で播種する。これらのプレートを細胞インキュベータ中に置く。
１８〜２４時間後（２日目）、細胞インキュベーション処理を開始する。細胞をＴＧＦ−βおよび５０ｎＭ〜１０μＭ（１％のＤＭＳＯの最終濃度）の範囲の濃度で、候補化合物と一緒にインキュベートする。試験に用いたＴＧＦ−β（ｒｈＴＧＦβ−１）の最終濃度は１ｎｇ／ｍＬである。細胞を、ＴＧＦ−βを添加する１５〜３０分前に候補化合物と共にインキュベートする。試験反応の最終値は１５０μｌである。各々のウェルは１つだけの候補化合物を含み、そのＰＡＩ−１プロモーターに対する効果を測定する。
カラム１１および１２は対照として用いる。カラム１１は８ウェルを含み、細胞をＴＧＦ−βの存在下、候補化合物無しでインキュベートする。カラム１１を、（阻害活性を定量するための）試験ウェルで測定した値と比較できる、「参考ＴＧＦ−β誘発ホタルルシフェラーゼ値」を測定するために用いる。ウェルＡ１２〜Ｄ１２において、細胞をＴＧＦ−β不含培地で増殖させる。これらの状況で得られたホタルルシフェラーゼ値は、「基礎ホタルルシフェラーゼ活性」の代表的なものである。ウェルＥ１２〜Ｈ１２において、細胞を、ＴＧＦ−βおよび５００μＭのＣＰＯ（シクロペンテノン、Ｓｉｇｍａ）、細胞毒性化合物の存在下でインキュベートする。減少したホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性（カラム１１において得られたものの約５０％）により、毒性を明らかにする。
１２〜１８時間後（３日目)、ルシフェラーゼ定量化処理を開始する。以下の反応をDual Luciferaseアッセイキット（Promega）から得た試薬を用いて行う。細胞を洗浄し、10μｌの受動溶解緩衝液（passive lysis buffer）（Promega）で溶解させる。撹拌（１５〜３０分）に続いて、プレートのルシフェラーゼ活性を、デュアルインジェクター照度計（BMG lumistar）で読み取る。このために、５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬および５０μｌの「Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ」緩衝液を、順次、両方のルシフェラーゼの活性を定量するために注入する。測定で得られたデータを、適当なソフトウェアを用いて、処理し、分析する。ウェルＡ１１〜Ｈ１１（カラム１１、ＴＧＦ−β 単独）で得られた平均ルシフェラーゼ活性値を１００％とみなし、ウェルＡ１２〜Ｄ１２（培地のみ中の細胞）で得られた値を基底レベル（０％）とする。試験した各々の化合物に関して、濃度応答曲線を、図解して測定できるＩＣ５０値で構成する。
【００４７】
アッセイ２
キナーゼＡｌｋ５受容体を阻害するための本発明の化合物の可能性は、例えば、以下のインビトロアッセイを用いて示すことができる。
Ａｌｋ５のキナーゼドメインを、バキュロウイルス／Ｓｆ９細胞系において、クローン化し、発現させた。蛋白（アミノ酸１６２〜５０３）を、Ｃ末端で６−Ｈｉｓタグ化した。Ｎｉ２＋カラムを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した後、自己リン酸化を試験した。酵素を５０ｍＭ、ｐＨ７．４のトリス；１００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのＭｇＣｌ２；５ｍＭのＭｎＣｌ２；１０ｍＭのＤＴＴを含有する培地中でインキュベートした。酵素を化合物（試験において最終的に０．１％のＤＭＳＯ）で、３７℃で１０分間プレインキュベートした。反応を３μＭのＡＴＰ（０．５μＣｉガンマ−３３Ｐ−ＡＴＰ）を添加することにより開始させた。３７℃で１５分後、反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．９、２．５％のグリセロール、１％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプトエタノール）を添加することにより停止させた。試料を５分間９５℃で煮沸し、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動を行った。乾燥ゲルを、一晩、リン酸スクリーンに曝露した。Ａｌｋ５自動リン酸化をＳＴＯＲＭ（Molecular Dynamics）を用いて定量した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004523541.tif 000031
【国際調査報告】
2004523541.tif 000032
2004523541.tif 000033
2004523541.tif 000034