(57)【要約】白血病による死の危険にさらされていない偶蹄目の動物、好ましくはウシの血漿又はあらかじめ決定された血漿成分を含んで成る、腫瘍の処置及び追加治療のための医薬調製物。あらかじめ決定された画分は、白血病を有するウシから採取した無脂質画分と健康なウシから採取した無脂質画分との間で、電気泳動によって検出可能な差異を構成する材料ボバイン４０及び／又はボバイン３００である。必要な画分の分離方法において、最初の血液は、凝血剤によって任意に処理され、そして粒子がそれから分離され、血漿画分が第一有機溶媒によって処理され、続いて細かい粒子から構成された界面活性剤材料がそれらに加えられ、液体が混合され、そして粒子に結合した無脂質画分が遠心によって液体成分から分離され、そして分離した画分が再び溶液にされる。
2004504353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血病によって死の危険にさらされなかった偶蹄目の動物の血漿又は既に決定されている血漿成分を含んで成ることを特徴とする、医薬調製物。
【請求項２】
偶蹄目の動物がウシであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬調製物。
【請求項３】
あらかじめ決定された成分が血漿の無脂質画分であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬調製物。
【請求項４】
全体に結合するために必要な量を有する界面活性剤と結合している、請求項３に記載の医薬調製物。
【請求項５】
腫瘍の処置及び／又は診断のための医薬調製物であって、白血病を有するウシから採取した無脂質画分と健康なウシから採取した無脂質画分との間で、電気泳動によって検出可能な差異を構成する、材料ボバイン４０及びボバイン３００のいずれかを含んで成ることを特徴とする医薬調製物。
【請求項６】
動物及び／又はヒトの血液の無脂質画分の調製方法であって、抗凝血剤で最初の血液を任意に処理し、そしてそれらから微粒子を分離する段階を含んで成り、第一有機溶媒で血漿画分を処理し、細かい粒子から構成される界面活性剤材料をそれらに添加し、その液体を混合し、続いて遠心によって液体成分から前記粒子に結合した無脂質画分を分離し、そして分離した画分を繰り返し溶液にする段階を特徴とする方法。
【請求項７】
前記画分を繰り返し溶液にする段階を実施するために第二有機溶媒を用いて、溶液を混合し、そして遠心によって液体成分から前記粒子に結合した無脂質画分を分離し、そして分離した画分を二回溶液にすることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
分離した画分を二回溶液にする前記段階で生理学的な溶液を用いることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
分離した画分を二回溶液にする前記段階で、前記無脂質画分のための溶媒である液体を用い、続いて遠心を繰り返すことによって液体画分から前記界面活性剤粒子を除去することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤材料の前記粒子が２００〜４００ｎｍのサイズを有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤材料の重量が前記血漿画分の０．５重量％であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤材料がカオリンであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一有機溶媒の重量が前記血漿画分の量と実質的に等しいことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二有機溶媒の重量が前記第一有機溶媒の重量と等しいことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一有機溶媒がアルコールであり、そして前記第二有機溶媒がアルコールとトルエンの等量混合物であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍の処置及び追加治療のための請求項１に記載の医薬調製物の使用。
【請求項１７】
原発腫瘍後の二次性腫瘍の形成を予防するための請求項１に記載の医薬調製物の使用。
【請求項１８】
Ｓ１８０肉腫、Ｃ２６結腸ガン、ＭＸＴ乳ガン及び急性リンパ性白血病のいずれかを処置するための請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、主に腫瘍の処置及び診断のための医薬調製物、並びに血漿の無脂質画分を分離するための方法に関する。
【０００２】
公表国際特許出願ＷＯ ００／４０２５６は、急性白血病に苦しむ患者から得られた血漿の腫瘍阻害作用に関する。当該出願においては、多数の実験が記載されており、この中で使用された調製物は、特定の型の腫瘍との関連において、コントロール群と比較して２０％の向上をもたらしている。この向上は、有意として言及されているものの下限に近いものである。
【０００３】
急性白血病の血液から作られた医薬調製物の利用は、ドナーとして使用され得る対象者が少ないこと、及びヒトの血液の使用に関連した厳密な倫理上及び法律上の検討すべき問題の存在によって限定されている。この分野において世界中でなされる腫瘍処置の優れた有意性及び研究の限界は、治療又は診断のいずれかにおける見通しとして明らかなあらゆる新規な解析方法を通じて判断される。
【０００４】
上文で引用した特許出願は、急性白血病に苦しむ患者の血液が、一般的な抗腫瘍効果を有する正確に限定されていない成分を含んで成る可能性を示した。
【０００５】
本発明の目的は、腫瘍の治療及び診断のために使用され得る新規医薬調製物を提供することであり、これには、腫瘍との戦いにおける役割を有する血漿の有効な分離のための目的を含んでおり、そして更なる目的として、その様な血液のドナーの適当な群を見出すことがある。
【０００６】
最初の段階におけるその目的を達成するために、更に有効な洗浄方法が考案されており、ここでは、有効成分が血漿の無脂質画分にあると仮定された。血漿の無脂質成分の分離は、血漿画分が第一有機溶媒で処理され、続いて非常に細かい粒子から成る界面活性剤が添加され、そして次に当該粒子に結合した無脂質画分の激しく混合したものが、遠心によって液体成分から分離され、この分離された画分が再び溶液にされる場合に好ましい方法で実施され得る。
【０００７】
洗浄は、溶解段階と分離段階が第二の有機溶媒を用いることによって繰り返され、続いて遠心が繰り返される場合により有効である。
【０００８】
界面活性剤の量は血漿の量に関して約０．５％であり、そしてその粒子サイズは約２００〜４００ｎｍの間である。好ましい材料は、例えばカオリン（ｂｏｌｕｓ ａｌｂａ）、活性炭又はメトセルである。
【０００９】
遠心は、好ましくは１５０００ｇの加速で行う。溶解は、有機溶媒の適用後、溶液が断続的な遠心によって上昇した温度でより長期間安定な場合に実現しやすい。
【００１０】
無脂質成分からの界面活性剤粒子の分離は、不可欠なものではなく、そして２回目の分離の後、当該粒子は、それらに結合した無脂質成分と一緒に、例えば生理溶液にされうる。
【００１１】
更なる精製方法に従い、無脂質成分は若干量の界面活性剤と一緒に溶液にされ、そして更に遠心することによって固体成分が分離され得る。
【００１２】
この方法で分離され、そして急性白血病を有するドナーから得られた無脂質産物は、上文で引用した特許出願に記載の産物よりも有意に有効であることが証明されていたので、前記目的の主要な観点が検討され、すなわちその様な抗腫瘍成分が急性白血病においてのみ見られるか否か、又はそれが腫瘍から治癒した対象者の血液中にも存在するか否か、が検討された。
【００１３】
その様な成分が腫瘍から治癒した対象者の血液に存在し、そしてこの存在が血漿の無脂質部分において起こることは認識されてきた。上述の洗浄方法を適用することによって、マウスのＳ １８０肉腫の場合において、腫瘍から治癒したドナーから得られた調製物を用いる場合、生存時間が実質的により長く、そしてその効果が腫瘍の型に依存しないようであり、そして異なる腫瘍から治癒したドナーから得られた血漿混合物から得られた無脂質画分が同様に有効な腫瘍阻害作用を持つことが実験的に証明されている。
【００１４】
腫瘍から治癒したドナーの数は、急性白血病を有する対象者の数よりも実質的に多く、そして彼らから得ることができる血液の量はほとんど制限されないが、広範な医療上の使用は、上文で言及したモラル及び法律上の限界に起因して予期され得ない。
【００１５】
基本的な目的を解決する更なるアプローチが、更に進歩的な発見へと導いた。この発見に至った経緯は、動物における腫瘍の自然な治癒の研究による。偶蹄目の動物の場合、レトロウイルスによって引き起こされる腫瘍の病気がむしろ特異的である。ある種において、この病気は腫瘍において現れ、そして感染した動物は死亡し、一方、他の種、主にウシ（キャトル）では、この病気は腫瘍において又はその動物の通常の健康状態における任意な病気において発現しない。当該感染は、血液中の抗体ＧＰ５１の存在によって検出されうる。
【００１６】
家畜（ウシ）は白血病に苦しむ個体から隔離しなければならないことは獣医学の最近の一般的な考えである。この考えは、表題「ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｒｅｅｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｏｃｋ」の、１９９２年のＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓの第四版において公表された見解によって立証されており、そしてこの見解は、ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅによってなされた。白血病の感染範囲はほぼ５０％であることが明らかとなった。更なる刊行物として、同一の雑誌の１９９７年の発行番号第９号は、白血病からの家畜の隔離の重大性を協調しているＴｅｌｋｅｓ， Ｌａｊｏｓ博士の論文「Ｆｒｅｅｉｎｇ ｃａｔｔｌｅ ｆｒｏｍ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｉｎ Ｈｕｎｇａｒｙ」を含んで成る。感染の範囲はより多くの農場で高いことが明らかとなっており、そして第二の論文の際には、感染範囲は約１７％であった。
【００１７】
前記発見の本質は、成功裡に、且つ症状なく白血病と戦った動物の血液、更に詳細にはそれらの血液の血漿の無脂質画分が、ヒトのドナーの血液で行われた実験において有効であることが証明された成分を含んで成ることに存する。この発見は、この仮定をいくつかの側面から確認した多くの実験に続き、そして腫瘍に対する戦いが開始されてから想像もつかなかったほど有効な腫瘍阻害作用の存在についての証拠を提供した。
【００１８】
当該作用の存在は更に、白血病に苦しんでいない動物から得られた同様の血液成分がその様な作用を有していなかったという発見によって確認された。
【００１９】
ヒト及び動物のドナーから得られた無脂質血漿の電気泳動試験によって、２つの範囲の分子量の同様の画分の存在が確認され、そしてこれらの画分は健康なドナーから得られた血漿には存在していなかった。「ボバイン（ｂｏｖｉｎ）４０」と以降言及される約４００００の分子量を有する第一画分及び「ボバイン（ｂｏｖｉｎ）３００」と以降言及される、３０００００〜３５００００の範囲にある分子量を有する第二画分が、腫瘍阻害作用について重要であるはずである。
【００２０】
本発明に従う解決法の知見においては、白血病を有する個体からの家畜の隔離の必要性についての全般的な修正が賢明なようである。
【００２１】
本発明に従い同定されたボバイン４０及びボバイン３００の画分は優れた腫瘍阻害作用を持ち、そして同時にそれらが存在しないことの検出は腫瘍の診断を確立するのを補助する。
【００２２】
本発明は実施例に関連して記載され、これは添付図面及び実験に引用される。
【００２３】
本発明に従う解決法の異なる詳細は、行われた実験の異なる段階の順序において知ることができる。重大さの順番に関係なく、実験に使用した材料の調製方法についての記載が必要とされる。
【００２４】
出発材料として使用した血液から、無脂質血漿成分が多段階の分離法を介して得られる。好ましい分離段階は以下の通りである。
【００２５】
出発血液が採集された後すぐ、それを抗凝血剤、好ましくはヘパリンで処理する。
【００２６】
微粒子の分離は、好ましくは４℃の温度で且つ５０００ｇの加速（ｇは標準重力の加速を意味する）の遠心によって実施される。遠心が、血液を採取された後すぐに行われない場合、凝固剤によって処理した血液は低温、好ましくは遠心の温度で多くて４８時間保存されうる。遠心の期間は、少なくとも約１０分である。更なる処理のために、上層の液体が使用される。このようにして得られた血漿は、−２０℃の温度にまで冷却されることがあり、そして異なるドナーから同様に得られた血漿と混合されることもある。更なる処理は、より高い血漿の質が必要な場合に行うことがある。本明細書に記載の実施例において、任意な特定のドナーから得られた血漿が異なるドナーから得られたものと混合され、そしてそれらに由来する何らかの差異が別々に報告される。
【００２７】
液体成分の除去の第一段階として、血漿が同量の第一有機溶媒、例えば９６％の純度のアルコールによって希釈され、そしてその様にして得られた溶液は混合される。
【００２８】
第二段階において、界面活性材料（剤）が０．５重量％の量で溶液に添加される。この界面活性材料の役割は、血漿の無脂質成分をそれらの表面上に結合させることである。界面活性剤は、カオリン、活性炭又はメトセルであってもよく、そしてそれらの平均粒子サイズは好ましくは２００〜４００ｎｍの間にある。記載した実施例の場合では、界面活性材料はカオリンである。
【００２９】
この血漿混合物は、室温で６時間の物理的干渉（混合）によって懸濁状態で永続的に保持され、続いて、５℃の温度で、それは１０〜１２時間インキュベートされる。インキュベーション期間、液体は３０分おきに一度、それぞれ短時間混合された。
【００３０】
インキュベーションに続いて、混合物を混合によって再懸濁し、そして懸濁物を４〜５℃の温度で１５０００ｇの加速で１０分間遠心した。
【００３１】
遠心したものから、界面活性剤粒子が結合した更に固体の成分が以降の工程のために分離され、そして液相は廃棄した。第二有機溶媒が、第一有機溶媒の重量と同量分離相に添加され、これは、例示的な場合においてアルコールとトルエンの５０重量％−５０重量％混合物であった。その様にして得られた混合物の処理は、第一溶媒の後の処理と同一であった。この工程の間、血漿混合物は、室温で６時間の物理的干渉（混合）によって懸濁状態で永続的に保持され、続いて、５℃の温度で、それは５〜１２時間インキュベートされた。インキュベーション期間、液体は１時間おきに一度、それぞれ短時間混合された。
【００３２】
インキュベーションに続いて、混合物を混合によって再懸濁し、そして懸濁物を５℃の温度で１５０００ｇの加速で１０分間遠心した。
【００３３】
遠心したものから、界面活性剤粒子が結合した固体成分が以降の工程のために分離され、そして液相は廃棄した。
【００３４】
固体成分は薄層を形成するために広げられ、続いてあらゆる残りの有機溶媒が減圧下に２時間据えられた除湿器内で除去された。
【００３５】
続いて、最初の血漿の重量と同量の生理食塩水が、分離した沈殿物に添加され、そしてこの材料は混合によって再懸濁された。この様にして得られた血漿調製物は、界面活性剤材料、カオリンの頭文字を意味する文字「ｂ」を用いて以下の明細書の部分において標識される。
【００３６】
第二の相対的に更に精製された別の血漿調製物を得る場合、界面活性剤材料は、組織に優しい洗剤を、血漿調製物を溶解し得る混合物「ｂ」に添加する方法で除去された。例示的な場合において、この洗剤は０．０１重量％のラウリル硫酸ナトリウムであった。適当な懸濁液を得るために、洗剤が一緒に添加された材料は、連続的に混合しながら６時間室温でインキュベートされ、続いて冷蔵庫内で８〜１２時間保存された。インキュベーションの間に沈殿物を形成した材料を再懸濁し、続いて冷却状態でそれを１５０００ｇに加速して遠心した。沈殿物を廃棄し、そして上層の液体は有用な材料を含んでおり、これは材料「ｂ」との識別のために、且つこの材料がより純度が高い（ｆｉｎｅｒ）ことを表すために、文字「ｆ」を用いて以下の明細書の部分において標識される。
【００３７】
マウスを用いて行われる実験を容易にするために、両方の型の生成物がそれぞれ１ｍｌの用量で与えられ、それらは続いて標識され、そして冷凍状態で保存された。
【００３８】
それらの調製物の生成物及び環境はともに滅菌されたものであり、それ故に当該材料は無菌であり、そして非経口適用が可能である。
【００３９】
１．Ｓ １８０肉腫の移植による実験
これら全ての実験は、２５ｇの平均重体重を有する同一の型の雌のＢＤＦ１マウスで実施された。実験される動物及びポジティブコントロール動物は共に、Ｓ １８０肉腫が皮下から移植された。動物の型に関しての実験の環境、移植された肉腫の型及び移植方法は、上文で引用した国際特許出願に記載のものと同一とした。各実験群は少なくとも５匹のマウスを含んでおり、そしてデータは関連する群におけるマウスの平均に関して報告した。マウスは、適当な群の数に従い識別され、そしてそれらは固有の数を有した。
【００４０】
実験１
急性白血病に苦しむ患者の血液から、「ｂ」型の血漿調製物を調製し、そして実験群において、各マウスは、１日おきに計８回０．１ｍｌそれらを皮下から受けた。
【００４１】
ポジティブコントロール群において、平均寿命は１９．６日であり、そして実験群においては、それは２３．５日であった。これは２０％の増大であり、有意な向上であるとみなされうる。同一の型の腫瘍との関連で、上文で引用した国際特許出願においては、最良の調製物が生存において５％の増大をもたらすという、有意な閾値よりもはるかに低いものであった。無脂質血漿成分の適当な分離は、それ故に非常に不可欠なのものである。
【００４２】
実験２
この実験は、６個の独立した実験結果を含んで成り、そしてそれは、血漿の無脂質成分に含まれると思われる、腫瘍に対して有効な材料が腫瘍から治癒した対象者の血液にも存在するという仮定に基づいている。腫瘍が発見されてから少なくとも１０年、そして多くて２７年間生存しており、それ故に治癒したとみなされうるその様な人々がドナーとして選択された。診断されたドナーの腫瘍の型は、順番に咽頭ガン、結腸ガン、乳ガン、リンパ性白血病、精巣及び前立腺の腫瘍並びに肺腫瘍であった。
【００４３】
血漿調製物「ｂ」型は、６人のドナー全ての場合に作成され、そしてマウスの各群をそれらで処置した。コントロール群の平均寿命は再び１９．６日であったが、処置群の平均は２５．５〜２７．３の間で変化し、それ故に処置群間でごくわずかな差異があった。その様な生存は、コントロール群と比較して３０％〜４０％の向上を構成し、これは非常に有意である。
【００４４】
更なる実験として、「ｂ」型の血漿産物が、微粒子の除去後に６人のドナー全てから得た血漿の等しい混合物から作成された。この産物は、コントロール群と比較して３８％の生存の増大を示した。
【００４５】
これらの実験は、このように、腫瘍から治癒した対象者の無脂質血漿成分が有効な腫瘍阻害材料を含むという仮定を確認した。更に、その様な材料の存在が実際の腫瘍の型に依存せず（少なくとも試験した腫瘍の型の場合）、それ故に混合物が等しく有効であることも証明された。
【００４６】
実験３
血液試験によりウシの白血病の存在が確認されたウシ（ビーフ）がドナーとして選択された。その様なドナーの血液から、「ｂ」及び「ｆ」型の血漿産物が作成された。同様に、血漿産物の両方の型が、血液が白血病の存在を示さなかったウシの血液から調製された。
【００４７】
試験は複数の変形版で行われ、変化するものとして、第一のパラメーターは１日おきに適用した処置の回数であり、第二のパラメーターは０．１〜０．１５ｍｌの間で変化した用量であり、そして第三のパラメーターは当該産物、すなわち「ｂ」又は「ｆ」型の純度であった。これらのパラメーターの試験の好ましい範囲が、実際の実験の前のパイロット実験によって決定されたのは、それぞれの最適値が用量と処置の回数に関して見出されたためである。
【００４８】
白血病を有するウシの血液から得た産物は、ドナーの利用可能性に関して、そして倫理上及又はモラルの検討材料に関して制限がないため、大規模な適用可能性の基準を満たす。生存データは、ヒトの血液から得た他の方法による好ましいデータを実質的に超えている。これは、これらの実験結果の詳細な説明の理由である。
【００４９】
実験の間、動物の平均体重、平均生存時間が試験され、更に当該試験のあらかじめ決定した時期に、１ｍｌの試験血液試料が各群のそれぞれのマウスから採取さされ、そして当該試料中における多数の腫瘍マーカーの存在が試験された。血液試料が採取されたマウスは、それらがその様な血液の量で生存し得ないために、以下の実験から除かれた。
【００５０】
生存時間に関する結果は、２つの主な群に分けられることがあり、すなわち処置は「ｂ」又は「ｆ」型の産物で実施される。白血病を有するウシに由来する起源は、略語「Ｂｂｏ」によって表され、それ故に第一の主な群の処置は材料Ｂｂｏ−ｂで実施され、そして第二の主な群のものは材料Ｂｂｏ−ｆで実施された。
【００５１】
日にちは腫瘍の移植の日から数えた。それぞれの曲線を、少なくとも５匹のマウスを含む群の平均に関して図１〜７に示した。
【００５２】
図１及び２は、材料Ｂｂｏ−ｆで処置した群の生存のダイアグラムを示す。ポジティブコントロール群のマウスは、正常な給餌とは別に、移植後の処置をなんらう受けず、処置群のマウスは、限定量を有する材料Ｂｂｏ−ｆによって１日おきに処置された。図１に示した群での各処置において、用量は０．１５ｍｍであった。２つの処置群は、互いに処置の回数が異なる。第一群においては８回の処置が適用され、一方第一の群においては処置の回数が１０回であり、その後、当該マウスは鎖卵成る処置をなんら受けなかった。１０回の処置を受けた群の場合、処置の終了後、すなわち、第２０日目の後、死亡率が突然増大したことが見られた。この突然の増大は、８回の処置を受けた群でも見ることができるが、増大が後で且つより緩やかな傾きで起こることは興味深い。１９．６日を有する、コントロール群と比較した平均生存時間は、８回の処置を受けた群では２４，８日であり、一方１０回の処置を受けた群では２３．２日である。
【００５３】
図２に示したそれぞれの群において、処置は二日おきに１０回行った。用量に差異がある。第一群のマウスは各処置において０．１５ｍｌの用量を受け、一方第二群は０．１ｍｌの用量で処置された。用量が減少した場合、差異は非常に明らかである。生存時間は３０日に増大し、これはポジティブコントロール動物群と比較して１５３％の向上を構成する。
【００５４】
材料Ｂｂｏ−ｂを用いた処置の結果を図の２つの群に示す。図３〜５の場合において、変化するパラメーターは用量である。図３に示した場合、処置は６回行い、そして生存時間が使用した用量にほとんど依存せず、そして低用量が若干好ましいことが見てとれる。しかしながら、生存時間は、平均生存時間が３７日であり、これがポジティブコントロールと比較してほぼ１８９％の向上であるため、材料Ｂｂｏ−ｆと比較して実質的に良かった。用量に由来する生存時間の依存性は、図４を考慮する場合に更に明らかとなる。ここでは、処置の回数は８回であった。０．１５ｍｌの用量の効果のもとで、生存時間は、６回の処置で得られた値と比較して減少し、そしてこのことは単に過量の結果であると思われる。反対に、０．１ｍｌの用量は、平均生存時間が実質的に増大し、そして５９日目までにダイアグラムが５０％の値にまだ達していなかったので８回の処置に最適であると思われる。このことによって、生存は３００％以上に増大し、これは著しく望ましい図である。
【００５５】
図５は、１０回の処置を受けたマウスの場合における平均生存時間を示す。ここで、０．１５ｍｌの用量が驚くべき事であるのは、この群において、生存が突然減少するが、同様の処置を受けた初期の群では平均がより良いためである。マウスの数が少ないために、１又は２匹のマウスの多少好ましい挙動から違いが生じていると思われる。突然死の割合は、３３日目の後に０．１ｍｌの用量の場合に増大し、これも過量の結果であると思われる。
【００５６】
図６及び７において、変化するパラメーターは処置の回数である。２つの図面の比較は、０．１ｍｌの用量による８回の処置の適用が最適であることを示す。図７由来の結果は、用量が多い場合に、向上が処置の回数の減少につれて増大することを記載しており、これはまた、用量が多すぎたことを示している。
【００５７】
腫瘍の治癒及び動物の平均体重
処置された群の動物の状況で経験した向上は、平均生存時間に基づくだけでは認識され得ない。出発時の体重が２５ｇの動物において、６〜８ｇの重量、すなわち動物の全重量のほぼ三分の一の大きな腫瘍が形成される。材料Ｂｂｏ−ｂ由来の０．１ｍｌの用量で周期の終わりまでに８回処置された動物において、よく認識されている処置が腫瘍の状態において行われ、肉腫が開かれ、そしてつぶれやすい材料が廃棄された。この材料は、死んだ腫瘍細胞を包含していた。当該動物の「こぶ」が消え、そして彼らは体重が増え始めた。
【００５８】
図８は、共に８回の処置を受けた群Ｂｂｏ−ｂ及びＢｂｏ−ｆ並びにポジティブコントロール群に関する、最初の１９日における動物の平均体重の値を示す。当該ダイアグラムは、特に材料Ｂｂｏ−ｂでの処置の場合において、上述した状態の報告と良好に相関している。当該ダイアグラムの欠点は、それが別々に腫瘍の量を示さないことにある。我々は腫瘍の重量について正確な値を得ることができず、それ故に全体重は腫瘍の重量も含む。処置した群において、最初の低下、続いて再生する増大が典型的であり、ポジティブコントロール群においては、重量は上下しながら増大し、これは主に腫瘍の増大によって引き起こされる。
【００５９】
上文の実験のうちの、最良のものとして現れたものは、白血病を有していない健康なウシから得た材料を用いて繰り返された。当該結果は、ポジティブコントロール群において得られたものと有意に異なることはなく、そしてこのことは、白血病を有するウシの血液から得られた材料のみが有効であることを確認した。
【００６０】
酵素腫瘍マーカーの試験結果
悪性の過程を伴う代謝の変化の試験のために、臨床実験において幅広く決定される複数の酵素腫瘍マーカーがあり、そしてこれらの方法の中でも、型の数が決定され、これは慣習的な試験のために使用されうる。当該方法を選択する際、悪性の過程が複雑な生化学的障害を伴い、そしてしばしばそれによって維持されることを考慮した。従って、これらの考慮により、核酸の代謝（血清アルカリ性（塩基性）及び酸性デオキシリボヌクレアーゼ活性、５’−ヌクレオチダーゼ活性）；ポリアミン代謝（アルギナーゼ活性）；肝ミトコンドリアの機能（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性）；糖新生（ホスホヘキソースイソメラーゼ活性）；骨関連過程の同定（骨特異的アルカリホスファターゼ活性）のアッセイを実施するために必要であると思われる。列記した酵素の活性における変化は、悪性の過程を伴い、そして維持する代謝の変化及び適用した治療の結果に続く。
【００６１】
実験の間、血液試料は、腫瘍の移植から８日目、１５日目そして１９日目にマウスから採取された。データを表１に要約する。当該データは、全て別々に実験した、それぞれの５匹のマウスの平均に関する。
【００６２】
表の中の幾つかのカラムの意味
β−Ｇｌｙｃ：非特異的ホスファターゼ、β−グリセロホスフェート；この値は、腫瘍マーカーとして解釈され得るように、他のホスファターゼの値のものから引かれるべきである；
Ａｌｋ．Ｆ：アルカリホスファターゼ
５’−ＴＭＰ：５’−チミジン−５−モノホスフェート
ＰＤＥ：ホスホジエステラーゼ
ＳＤＮａｚ：酸性デオキシリボヌクレアーゼ（酸性ＤＮＡアーゼ）
Σ．５’−ＮＤ：全ての５’−ヌクレオチダーゼの合計の値
【表１】
2004504353.tif 000003
【００６３】
当該表において、３つの異なる群が見られる。最後の群は腫瘍を移植されていないマウスを有するコントロールに関連し、そしてこの群のマウス５１−５５は８日目に試験され、マウス５６−６０は１５日目に試験され、そしてマウス１０６−１１０は１９日目に試験された。
【００６４】
中段の群は、ポジティブコントロールに関連し、マウス１５１−１５５は８日目に試験され、マウス１０１−１０５は１５日目、そしてマウス４１−５０は１９日目に試験された。
【００６５】
最初の群は、２つの亜群に分けられ、１つは材料Ｂｂｏ−ｂによる処置を受けた、数字の２で始まるもの、そしてもう１つは材料Ｂｂｏ−ｆによる処置を受けた、数字の３で始まるものである。当該亜群Ｂｂｏ−ｂにおいて、マウス２７１−２７５の試験は８日目に、マウス２７６−２８０は１５日目に、マウス２７１−２７５は１９日目に、そして最後にマウス２４６−２５０の試験は、実質的な生存に関して随分遅い、４５日目に行った。
【００６６】
第二の亜群における、材料Ｂｂｏ−ｆで処置したマウスの、試験日に従う分布：３９６−４００：８日目；３９１−３９５：１５日目；３８５−３９０：１９日目。
【００６７】
結果を図９においてカラムダイアグラムの形態で要約する。この中で、横軸上に例示したマウスの群は縦軸上のデータと互いに関連しており、ここで、カラムの高さはデータの合計を表している。横軸において、マウスの群は別々に例示され、そして各群において、左から右の順番で試料データの順番が増大する。
【００６８】
３つの左側のカラムは、コントロール群と関連し、中央の３つのカラムはポジティブコントロール群と関連し、そして７つの右側のカラムのうちの最初の３つのカラムは亜群Ｂｂｏ−ｆに属し、そして残りの４つのカラムは亜群Ｂｂｏ−ｂに属する。
【００６９】
コントロール群において、データは自然に時間につれて変化せず、それらの変動は自然の範囲内である。ポジティブコントロール群の場合、全ての成分が極端に高く、そして瀕死の時期（最後のカラム）までに、それらは更に増大する。
【００７０】
反対に、両方で処置した亜群において、最初の値は既にポジティブコントロール群のデータよりも小さく、そしてそれらは更に時間につれて減少する。材料Ｂｂｏ−ｂは、好ましい生存データに従い、材料Ｂｂｏ−ｆによる処置よりも実質的により良いで結果を示した。減少は、１９日目の後も続き、そして実験の終了までに、データはコントロール群の標準的な値に近づく。
【００７１】
実験４
これまでの実験の間に得られた好ましい結果に基づき、無脂質血漿のどの成分が前記作用に原因があるかを試験した。我々は健康な人の血液、急性白血病の対象者由来の血液、腫瘍から治癒した対象者由来の血液、更には白血病のウシ及び白血病ではないウシから採取した血液を所持していたので、調製型「ｂ」が列記した各血液から作成され、そしてそれらは個別の電気泳動試験にかけられた。当該試験のために、出発材料が、使用されるポリアクリルアミドゲルの表面上に持ち込まれ、そして電気泳動処置の効果のもと、当該材料の成分がそれらの分子量の順番に従い分離された。
【００７２】
腫瘍処置の観点から効果的でないことが証明された血液、すなわち正常なヒト血液及び白血病でないウシから採取された血液から得られた画分は、腫瘍処置の観点から効果的である血液の型から得られた画分と比較された。最も明らかな差異は、白血病を有するウシから採取された血液の画分において見られ、そしてそれは分子量約４００００の画分、更には分子量３０００００〜３５００００の画分の存在下にあった。これらの２つの画分は、共に試料の８〜１２重量％を表した。腫瘍が治癒したドナーから採取された血液調製物の画分は、これらの成分をいずれも包含していたが、分子量４００００付近の画分の存在は亜更に明らかであり、そして画分の量は実質的に少なく、約２〜３％であった。急性白血病の血液から得られた調製物の画分の中でも、分子量４００００の成分がごくわずかに存在しており、他の画分は検出されなかった。
【００７３】
前記の２つの画分を同定する目的で、約４００００の分子量を有するものは「ボバイン４０」と言及され、そして３０００００〜３５００００の他の画分は「ボバイン３００」と表される。本明細書に記載の方法はこれらの２つの画分の間違いのない同定にとって十分である。これらの画分の構造の同定は現在行われている。示された結果の知識において、材料ボバイン４０及びボバイン３００の存在が示した作用にとって重要であることは、十分な根拠により述べることができる。
【００７４】
ＩＩ． Ｃ２６結腸直腸腫瘍の移植による実験
当該実験は、第一世代の内部交配（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｂｒｅｄ）したＢａｌｂ／ｃ雌性マウスを用いて実施した。
【００７５】
マウスの原産地はＴＮＯ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｒｉｆｋｓｗｉｊｋ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）であり、繁殖地はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｇａｒｙ）のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙであった。
【００７６】
動物の飼育環境は、ｍａｃｒｏｌｏｎ材料のケージ、２０〜２２℃の温度、相対湿度４５〜５５％、１２時間周期で変化する昼夜の維持、であった。給餌は、オートクレーブで滅菌されうる標準的な品質のマウスの餌（型：Ａｌｔｒｏｍｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で行い、寝具は経木から作成した。繁殖の衛生レベルは、既述のＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）条件に従った。動物の世話及び飼育は、「Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ」におけるヘルシンキ宣言に従い行った。
【００７７】
Ｃｏｌｏｎ−２６結腸腺ガンはＳＲＩ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， Ａｌａｂａｍａ， Ｕ．Ｓ．Ａ）から購入した。移植方法：維持した腫瘍由来の２０ｍｇの小片が、皮下から肩胛骨間の領域に移植された。
【００７８】
実験の間、動物を１０匹のマウスの群に分け、ポジティブコントロール群の動物は移植後に何ら処置を受けなかった。処置群においては、処置は前述のＢｂｏ−ｂ材料を用いて行った。この材料は、当該実験の文書化の間にＡＢＢ−７とも称された。実験シリーズＩを介して得られた経験が利用され、そして当該処置は、１〜９日目の間、合計８回、１日に１回同時に適用された。各群における差異は処置の方法及び適用した実験材料の量にあった。
【００７９】
生存データを図１０に要約する。ポジティブコントロール群の場合、１００％の生存時間は１９日であった。最初の群において、処置は０．１ｍｌの用量で腹腔内（ＩｐＩ）で実施し、第二群においては、適用方法は、用量が０．１５ｍｌであったことを除き同一であり、そして口を経口（ｐｅｒ ｏｓ）材料の適用も試験された。ここで、適当な用量の供給装置が、動物の胃に直接材料を運ぶために使用された。第一の経口（ｐｏ１）群においては、用量は０．２ｍｌの材料であり、そして第二の経口（ｐｏ２）群においては用量は０．３ｍｌであった。更なる群として、当該材料を０．１ｍｌの材料を用いて皮下（皮膚の下）から適用した、ｓｃも処置された。生存データは、１０匹のマウスの群の平均を示す。図面から、処置群のそれぞれにおいて実質的な向上が起こり、最も有効な２つの処置が０．１ｍｌの材料を用いるｉｐ適用及び０．２ｍｌの材料を用いるｐｏ処置であったことが見て取れる。
【００８０】
当該実験は、１０匹のマウスの更なる群において繰り返され、そして腫瘍の重量を測定するために、腫瘍は、動物が瀕死（すなわち死の直前）状態に達した場合に摘出され、そして腫瘍の重量が測定された。
【００８１】
図１１は、これらの実験結果を示す。カラムの上方に、関連する水準レベルの値を示し、これは、全ての場合において０．０５未満であり、すなわち当該データは非常に信頼性がある。
【００８２】
同様に処置した１０匹のマウスの更なる群において、５’−ヌクレオチダーゼ活性が、腫瘍移植から８日目、１６日目に、並びに実験シリーズＩの場合には瀕死状態において採集した試料上で決定された。これらのデータを図１２に示す。当該活性は、開始時の低い値から、１６日目までには最高のものへと増大し、瀕死状態に達した後は、当該活性はポジティブコントロール群で得られた値から実質的に低下した。
【００８３】
ＩＩＩ． ＭＸＴ乳ガンを移植する実験
実験ＩＩに記載の条件を維持しながら、記載されている起源の雌性のＢＤＦ１マウスが、ＭＸＴ乳ガンの場合における、材料Ｂｂｏ−ｂを用いる処置の効果を試験するために使用された。移植される腫瘍細胞の出所はＭＡＳＯＮ Ｒｅｓ． Ｉｎｓｔ． ＵＳＡである。維持された腫瘍由来の１ｍｍ３の体積の小片を肩胛骨間の領域に皮下から移植した。
【００８４】
当該動物から、１０匹のマウスの群が実験ＩＩの場合に形成され、そして各群において、それぞれが等しく処置された。材料Ｂｂｏ−ｂを用いる処置は、実験ＩＩの場合のように、すなわち８日間の間毎日１回同時に実施された。ポジティブコントロールの場合、平均生存時間は２４日であった。図１３は、異なる処置群の場合の生存時間を示す。多くの処置群が同一の方法で処置され、例えば０．１５ｍｌの用量の群ｉｐ１及びｉｐ２は腹腔内から同じように処置され、あるいは群ｐｏ２及びｐｏ３は経口から０．３ｍｌの用量で処置された。この腫瘍の型において、生存時間の増大は約４０％であり、これは経口処置の場合において最大であった。
【００８５】
腫瘍の重量の試験は、実験ＩＩで記載したような瀕死状態の動物で実施され、そしてその結果を図１４及び１５に要約する。横軸に示した数は特定の群におけるマウスの連番に関連し、それらに特別な意味はない。カラムダイアグラムに示した縦の項は関連する群における偏差に関する。腫瘍の重量の減少は、経口から適用した処置でも、ここでは最も有意であった。
【００８６】
実験動物上で実施した５’−ヌクレオチダーゼの試験は、処置した群における実質的な低下を示し、その様な試験の完全な実験データの解析は、現時点ではまだ完了しておらず、それ故にそれらは表の形に要約することができない。
【００８７】
ＩＶ．急性Ｌ１２１０リンパ性白血病の移植による実験
材料Ｂｂｏ−ｂの作用は、急性Ｌ１２１０リンパ性白血病の場合において試験された。１０匹のマウスの群は、実験ＩＩ及びＩＩＩに関連して記載したように飼育された雌性のＢＤＦ１マウスから形成された。急性Ｌ１２１０リンパ性白血病が維持されたＤＢＡ／２マウスの腹水及び生理食塩水から、１０６個の細胞を含んで成る０．１ｍｌの液体が作成された。その液体から、０．１ｍｌが腹腔内から各実験マウスへと注射され、そして処置群においては、当該処置は、実験ＩＩ及びＩＩＩの様に８日間、１日に一回実施された。
【００８８】
図１６は、生存データを示す。ポジティブコントロール群における平均生存時間は９．９日であった。図１６においては、どの様に材料が適用されたかに依存して生存時間における非常に実質的な差異があることが見て取れる。腹腔内及び皮下の適用に応じて、生存時間は１７０％であり、そしてこれらに対して、０．２ｍｌの用量の経口適用は３２０％の生存時間をもたらしたが、この処置群においては、個体の動物間の差異が大きく、そしてそれらのいくつかは完全に治癒していた。この腫瘍の型において、相対的な腫瘍の重量を決定する方法がなく、そして腹腔で回収された腹水は、腸間膜に存在する腫瘍と一緒に、絶対的な腫瘍の重量を構成した。図１７は、瀕死の群においてその様に決定された絶対的な腫瘍の大きさの測定された重量を示す。３０日目に生存していた動物もこれらの群に属していた。図１７においては、処置した群のうちの３つにおいて測定可能な腫瘍の重量が見られなかったことが見て取れる。
【００８９】
図１８は、５日目及び８日目及び瀕死状態における５’−ヌクレオチダーゼ活性の変化を示す。当該ダイアグラムからは、実質的な向上が処置した群の全てにおいて起こること、そして幾つかの処置群において、標準的な値が得られてことが見て取れる。
【００９０】
複数の異なる日に実験Ｉ〜ＩＶに参加したマウスの更なる群において、組織学的な試験が実施された。当該試験には、１７の異なる臓器の組織学的解析を含めた。その様な組織学的試験に基づき、試験した腫瘍型のいずれにおいても転移は形成されていなかったと述べることができる。しかしながら、ポジティブコントロール群の場合においては、はっきりと認識可能な転移活性が見られた。これらは、以下の様に個々の腫瘍の型：リンパ腺及び肝臓におけるＳ１８０肉腫の場合；肝臓及び腸間膜のリンパ腺におけるＣ２６の場合；肝臓におけるＭＸＴ腫瘍の場合；骨髄におけるＬ１２１０の場合においても検出された。
【００９１】
上文の実験結果は、経験した有意な向上が、今回試験しなかった腫瘍の型においても起こることを有望なものする。それらの顕著な有意性により、全ての型の腫瘍を網羅する実験が必要であろう。それにも関わらず、上文の実験は、主要な効果の存在を支持するのに十分広いものであった。
【００９２】
本発明に従う解決方法は、腫瘍の処置のためだけでなく、追加治療のため、そして転移の形成を予防するために効果的に使用され得る。
【００９３】
前記作用に重要であるが、少なくとも画分ボバイン４０以外の２つの別々の画分が腫瘍を有する対象者の血液中に存在するという事実により、これらの画分の試験は腫瘍の診断に使用され得る。
【００９４】
本発明に従う調製物を用いて、そしてその診断的な可能性を用いて得られた結果は、腫瘍の効果的な処置及び診断に関する希望をもたらす。白血病を有するウシのストックは世界中に十分存在し、これにより大規模な製造が可能となる。更に、材料ボバイン４０及びボバイン３００の製造のための合成方法を見つけるための可能性が存在しているのは、これらの材料の徹底的な試験が予想通りにその様な製造をもたらしうるためである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０．１５ｍｌのＢｂｏ−ｆ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図２】図２は、Ｂｂｏ−ｆ材料を用いる１０回の処置の生存のダイアグラムである。
【図３】図３は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる６回の処置の生存のダイアグラムである。
【図４】図４は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる８回の処置の生存のダイアグラムである。
【図５】図５は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる１０回の処置の生存のダイアグラムである。
【図６】図６は、０．１ｍｌのＢｂｏ−ｂ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図７】図７は、０．１５ｍｌのＢｂｏ−ｂ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図８】図８は、１９日目までの動物の体重を示す。
【図９】図９は、酵素試験の結果を要約している一連のカラムダイアグラムである。
【図１０】図１０は、結腸直腸腫瘍Ｃ２６の移植後の処置の生存データを示す。
【図１１】図１１は、図１０の処置における相対的な腫瘍の重量を示す。
【図１２】図１２は、図１０の処置の場合における５’ヌクレオチダーゼの値を示す。
【図１３】図１３は、ＭＸＴ乳ガンを処置する場合に見られる生存のダイアグラムを示す。
【図１４】図１４は、図１３の処置の場合の相対的な腫瘍の重量を例示する。
【図１５】図１５は、処置の次なる型の場合における図１４版である。
【図１６】図１６は、Ｌ１２１０リンパ性白血病を処置する場合に見られる生存のダイアグラムを示す。
【図１７】図１７は、図１６の処置において得られた絶対的な腫瘍の重量を示す。
【図１８】図１８は、図１６の処置の場合における５’ヌクレオチダーゼの値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月2日(2002.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【書類名】明細書
【発明の名称】腫瘍の処置のための医薬調製物及び血漿の無脂質画分の調製方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】白血病によって死の危険にさらされず、且つ白血病を有している偶蹄目の動物の無脂質画分の成分を含んで成ることを特徴とする、医薬調製物。
【請求項２】偶蹄目の動物がウシであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬調製物。
【請求項３】腫瘍の処置のための医薬調製物であって、白血病を有するウシから採取した血漿の無脂質画分と健康なウシから採取した血漿の無脂質画分との間で、電気泳動により検出可能な差異を構成する材料を含んで成ることを特徴とする医薬調製物。
【請求項４】抗凝血剤で最初の血液を任意に処理し、そしてそれらから微粒子を分離する段階を含んで成り、第一有機溶媒で血漿画分を処理し、細かい粒子から構成される界面活性剤材料をそれらに添加し、その液体を混合し、続いて遠心によって液体成分から前記粒子に結合した無脂質画分を分離し、そして分離した画分を繰り返し溶液にする段階を特徴とする、請求項１に記載の血漿の無脂質画分の調製方法。
【請求項５】前記画分を繰り返し溶液にする段階を実施するための第二有機溶媒を用いて、溶液を混合し、そして遠心によって液体成分から前記粒子に結合した無脂質画分を分離し、そして分離した画分を二回溶液にすることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】分離した画分を二回溶液にする前記段階で生理学的な溶液を用いることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】分離した画分を二回溶液にする前記段階で、前記無脂質画分のための溶媒である液体を用い、続いて遠心を繰り返すことによって液体画分から前記界面活性剤粒子を除去することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】界面活性剤材料の前記粒子が２００〜４００ｎｍのサイズを有することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】前記界面活性剤材料の重量が前記血漿画分の０．５重量％であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】前記界面活性剤材料がカオリンであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】前記第一有機溶媒の重量が前記血漿画分の量と実質的に等しいことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】前記第二有機溶媒の重量が前記第一有機溶媒の重量と等しいことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】前記第一有機溶媒がアルコールであり、そして前記第二有機溶媒がアルコールとトルエンの等量混合物であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】腫瘍の処置及び追加治療のための請求項１に記載の医薬調製物の使用。
【請求項１５】原発腫瘍後の二次性腫瘍の形成を予防するための請求項１に記載の医薬調製物の使用。
【請求項１６】Ｓ１８０肉腫、Ｃ２６結腸ガン、ＭＸＴ乳ガン及び急性リンパ性白血病のいずれかを処置するための請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、主に腫瘍の処置のための医薬調製物及び血漿の無脂質画分を分離するための方法に関する。
【０００２】
公表国際特許出願ＷＯ ００／４０２５６は、急性白血病に苦しむ患者から得られた血漿の腫瘍阻害作用に関する。当該出願においては、多数の実験が記載されており、この中で使用された調製物は、特定の型の腫瘍との関連において、コントロール群と比較して２０％の向上をもたらしている。この向上は、有意として言及されているものの下限に近いものである。
【０００３】
急性白血病の血液から作られた医薬調製物の利用は、ドナーとして使用され得る対象者が少ないこと、及びヒトの血液の使用に関連した厳密な倫理上及び法律上の検討すべき問題の存在によって限定されている。この分野において世界中でなされる腫瘍処置の優れた有意性及び研究の限界は、治療又は診断のいずれかにおける見通しとして明らかなあらゆる新規な解析方法を通じて判断される。
【０００４】
上文で引用した特許出願は、急性白血病に苦しむ患者の血液が、一般的な抗腫瘍効果を有する正確に限定されていない成分を含んで成る可能性を示した。
【０００５】
本発明の目的は、腫瘍の治療及び診断のために使用され得る新規医薬調製物を提供することであり、これには、腫瘍との戦いにおける役割を有する血漿の有効な分離のための目的を含んでおり、そして更なる目的として、その様な血液のドナーの適当な群を見出すことがある。
【０００６】
最初の段階におけるその目的を達成するために、更に有効な洗浄方法が考案されており、ここでは、有効成分が血漿の無脂質画分にあると仮定された。血漿の無脂質成分の分離は、血漿画分が第一有機溶媒で処理され、続いて非常に細かい粒子から成る界面活性剤が添加され、そして次に当該粒子に結合した無脂質画分の激しく混合したものが、遠心によって液体成分から分離され、この分離された画分が再び溶液にされる場合に好ましい方法で実施され得る。
【０００７】
洗浄は、溶解段階と分離段階が第二の有機溶媒を用いることによって繰り返され、続いて遠心が繰り返される場合により有効である。
【０００８】
界面活性剤の量は血漿の量に関して約０．５％であり、そしてその粒子サイズは約２００〜４００ｎｍの間である。好ましい材料は、例えばカオリン（ｂｏｌｕｓ ａｌｂａ）、活性炭又はメトセルである。
【０００９】
遠心は、好ましくは１５０００ｇの加速で行う。溶解は、有機溶媒の適用後、溶液が断続的な遠心によって上昇した温度でより長期間安定な場合に実現しやすい。
【００１０】
無脂質成分からの界面活性剤粒子の分離は、不可欠なものではなく、そして２回目の分離の後、当該粒子は、それらに結合した無脂質成分と一緒に、例えば生理溶液にされうる。
【００１１】
更なる精製方法に従い、無脂質成分は若干量の界面活性剤と一緒に溶液にされ、そして更に遠心することによって固体成分が分離され得る。
【００１２】
この方法で分離され、そして急性白血病を有するドナーから得られた無脂質産物は、上文で引用した特許出願に記載の産物よりも有意に有効であることが証明されていたので、前記目的の主要な観点が検討され、すなわちその様な抗腫瘍成分が急性白血病においてのみ見られるか否か、又はそれが腫瘍から治癒した対象者の血液中にも存在するか否か、が検討された。
【００１３】
腫瘍から治癒したドナーの数は、急性白血病を有する対象者の数よりも実質的に多く、そして彼らから得ることができる血液の量はほとんど制限されないが、広範な医療上の使用は、上文で言及したモラル及び法律上の限界に起因して予期され得ない。
【００１４】
基本的な目的を解決する更なるアプローチが、更に進歩的な発見へと導いた。この発見に至った経緯は、動物における腫瘍の自然な治癒の研究による。偶蹄目の動物の場合、レトロウイルスによって引き起こされる腫瘍の病気がむしろ特異的である。ある種において、この病気は腫瘍において現れ、そして感染した動物は死亡し、一方、他の種、主にウシ（キャトル）では、この病気は腫瘍において又はその動物の通常の健康状態における任意な病気において発現しない。当該感染は、血液中の抗体ＧＰ５１の存在によって検出されうる。
【００１５】
家畜（ウシ）は白血病に苦しむ個体から隔離しなければならないことは獣医学の最近の一般的な考えである。この考えは、表題「ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｒｅｅｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｏｃｋ」の、１９９２年のＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓの第四版において公表された見解によって立証されており、そしてこの見解は、ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅによってなされた。白血病の感染範囲はほぼ５０％であることが明らかとなった。更なる刊行物として、同一の雑誌の１９９７年の発行番号第９号は、白血病からの家畜の隔離の重大性を協調しているＴｅｌｋｅｓ， Ｌａｊｏｓ博士の論文「Ｆｒｅｅｉｎｇ ｃａｔｔｌｅ ｆｒｏｍ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｉｎ Ｈｕｎｇａｒｙ」を含んで成る。感染の範囲はより多くの農場で高いことが明らかとなっており、そして第二の論文の際には、感染範囲は約１７％であった。
【００１６】
前記発見の本質は、成功裡に、且つ症状なく白血病と戦った動物の血液、更に詳細にはそれらの血液の血漿の無脂質画分が、ヒトのドナーの血液で行われた実験において有効であることが証明された成分を含んで成ることに存する。この発見は、この仮定をいくつかの側面から確認した多くの実験に続き、そして腫瘍に対する戦いが開始されてから想像もつかなかったほど有効な腫瘍阻害作用の存在についての証拠を提供した。
【００１７】
当該作用の存在は更に、白血病に苦しんでいない動物から得られた同様の血液成分がその様な作用を有していなかったという発見によって確認された。
【００１８】
ヒト及び動物のドナーから得られた無脂質血漿の電気泳動試験によって、２つの範囲の分子量の同様の画分の存在が確認され、そしてこれらの画分は健康なドナーから得られた血漿には存在していなかった。「ボバイン（ｂｏｖｉｎ）４０」と以降言及される約４００００の分子量を有する第一画分及び「ボバイン（ｂｏｖｉｎ）３００」と以降言及される、３０００００〜３５００００の範囲にある分子量を有する第二画分が、腫瘍阻害作用について重要であるはずである。
【００１９】
本発明に従う解決法の知見においては、白血病を有する個体からの家畜の隔離の必要性についての全般的な修正が賢明なようである。
【００２０】
本発明に従い同定されたボバイン４０及びボバイン３００の画分は優れた腫瘍阻害作用を持ち、そして同時にそれらが存在しないことの検出は腫瘍の診断を確立するのを補助する。
【００２１】
本発明は実施例に関連して記載され、これは添付図面及び実験に引用される。
【００２２】
本発明に従う解決法の異なる詳細は、行われた実験の異なる段階の順序において知ることができる。重大さの順番に関係なく、実験に使用した材料の調製方法についての記載が必要とされる。
【００２３】
出発材料として使用した血液から、無脂質血漿成分が多段階の分離法を介して得られる。好ましい分離段階は以下の通りである。
【００２４】
出発血液が採集された後すぐ、それを抗凝血剤、好ましくはヘパリンで処理する。
【００２５】
微粒子の分離は、好ましくは４℃の温度で且つ５０００ｇの加速（ｇは標準重力の加速を意味する）の遠心によって実施される。遠心が、血液を採取された後すぐに行われない場合、凝固剤によって処理した血液は低温、好ましくは遠心の温度で多くて４８時間保存されうる。遠心の期間は、少なくとも約１０分である。更なる処理のために、上層の液体が使用される。このようにして得られた血漿は、−２０℃の温度にまで冷却されることがあり、そして異なるドナーから同様に得られた血漿と混合されることもある。更なる処理は、より高い血漿の質が必要な場合に行うことがある。本明細書に記載の実施例において、任意な特定のドナーから得られた血漿が異なるドナーから得られたものと混合され、そしてそれらに由来する何らかの差異が別々に報告される。
【００２６】
液体成分の除去の第一段階として、血漿が同量の第一有機溶媒、例えば９６％の純度のアルコールによって希釈され、そしてその様にして得られた溶液は混合される。
【００２７】
第二段階において、界面活性材料（剤）が０．５重量％の量で溶液に添加される。この界面活性材料の役割は、血漿の無脂質成分をそれらの表面上に結合させることである。界面活性剤は、カオリン、活性炭又はメトセルであってもよく、そしてそれらの平均粒子サイズは好ましくは２００〜４００ｎｍの間にある。記載した実施例の場合では、界面活性材料はカオリンである。
【００２８】
この血漿混合物は、室温で６時間の物理的干渉（混合）によって懸濁状態で永続的に保持され、続いて、５℃の温度で、それは１０〜１２時間インキュベートされる。インキュベーション期間、液体は３０分おきに一度、それぞれ短時間混合された。
【００２９】
インキュベーションに続いて、混合物を混合によって再懸濁し、そして懸濁物を４〜５℃の温度で１５０００ｇの加速で１０分間遠心した。
【００３０】
遠心したものから、界面活性剤粒子が結合した更に固体の成分が以降の工程のために分離され、そして液相は廃棄した。第二有機溶媒が、第一有機溶媒の重量と同量分離相に添加され、これは、例示的な場合においてアルコールとトルエンの５０重量％−５０重量％混合物であった。その様にして得られた混合物の処理は、第一溶媒の後の処理と同一であった。この工程の間、血漿混合物は、室温で６時間の物理的干渉（混合）によって懸濁状態で永続的に保持され、続いて、５℃の温度で、それは５〜１２時間インキュベートされた。インキュベーション期間、液体は１時間おきに一度、それぞれ短時間混合された。
【００３１】
インキュベーションに続いて、混合物を混合によって再懸濁し、そして懸濁物を５℃の温度で１５０００ｇの加速で１０分間遠心した。
【００３２】
遠心したものから、界面活性剤粒子が結合した固体成分が以降の工程のために分離され、そして液相は廃棄した。
【００３３】
固体成分は薄層を形成するために広げられ、続いてあらゆる残りの有機溶媒が減圧下に２時間据えられた除湿器内で除去された。
【００３４】
続いて、最初の血漿の重量と同量の生理食塩水が、分離した沈殿物に添加され、そしてこの材料は混合によって再懸濁された。この様にして得られた血漿調製物は、界面活性剤材料、カオリンの頭文字を意味する文字「ｂ」を用いて以下の明細書の部分において標識される。
【００３５】
第二の相対的に更に精製された別の血漿調製物を得る場合、界面活性剤材料は、組織に優しい洗剤を、血漿調製物を溶解し得る混合物「ｂ」に添加する方法で除去された。例示的な場合において、この洗剤は０．０１重量％のラウリル硫酸ナトリウムであった。適当な懸濁液を得るために、洗剤が一緒に添加された材料は、連続的に混合しながら６時間室温でインキュベートされ、続いて冷蔵庫内で８〜１２時間保存された。インキュベーションの間に沈殿物を形成した材料を再懸濁し、続いて冷却状態でそれを１５０００ｇに加速して遠心した。沈殿物を廃棄し、そして上層の液体は有用な材料を含んでおり、これは材料「ｂ」との識別のために、且つこの材料がより純度が高い（ｆｉｎｅｒ）ことを表すために、文字「ｆ」を用いて以下の明細書の部分において標識される。
【００３６】
マウスを用いて行われる実験を容易にするために、両方の型の生成物がそれぞれ１ｍｌの用量で与えられ、それらは続いて標識され、そして冷凍状態で保存された。
【００３７】
それらの調製物の生成物及び環境はともに滅菌されたものであり、それ故に当該材料は無菌であり、そして非経口適用が可能である。
【００３８】
１．Ｓ １８０肉腫の移植による実験
これら全ての実験は、２５ｇの平均重体重を有する同一の型の雌のＢＤＦ１マウスで実施された。実験される動物及びポジティブコントロール動物は共に、Ｓ １８０肉腫が皮下から移植された。動物の型に関しての実験の環境、移植された肉腫の型及び移植方法は、上文で引用した国際特許出願に記載のものと同一とした。各実験群は少なくとも５匹のマウスを含んでおり、そしてデータは関連する群におけるマウスの平均に関して報告した。マウスは、適当な群の数に従い識別され、そしてそれらは固有の数を有した。
【００３９】
実験１
急性白血病に苦しむ患者の血液から、「ｂ」型の血漿調製物を調製し、そして実験群において、各マウスは、１日おきに計８回０．１ｍｌそれらを皮下から受けた。
【００４０】
ポジティブコントロール群において、平均寿命は１９．６日であり、そして実験群においては、それは２３．５日であった。これは２０％の増大であり、有意な向上であるとみなされうる。同一の型の腫瘍との関連で、上文で引用した国際特許出願においては、最良の調製物が生存において５％の増大をもたらすという、有意な閾値よりもはるかに低いものであった。無脂質血漿成分の適当な分離は、それ故に非常に不可欠なのものである。
【００４１】
実験２
この実験は、６個の独立した実験結果を含んで成り、そしてそれは、血漿の無脂質成分に含まれると思われる、腫瘍に対して有効な材料が腫瘍から治癒した対象者の血液にも存在するという仮定に基づいている。腫瘍が発見されてから少なくとも１０年、そして多くて２７年間生存しており、それ故に治癒したとみなされうるその様な人々がドナーとして選択された。診断されたドナーの腫瘍の型は、順番に咽頭ガン、結腸ガン、乳ガン、リンパ性白血病、精巣及び前立腺の腫瘍並びに肺腫瘍であった。
【００４２】
血漿調製物「ｂ」型は、６人のドナー全ての場合に作成され、そしてマウスの各群をそれらで処置した。コントロール群の平均寿命は再び１９．６日であったが、処置群の平均は２５．５〜２７．３の間で変化し、それ故に処置群間でごくわずかな差異があった。その様な生存は、コントロール群と比較して３０％〜４０％の向上を構成し、これは非常に有意である。
【００４３】
更なる実験として、「ｂ」型の血漿産物が、微粒子の除去後に６人のドナー全てから得た血漿の等しい混合物から作成された。この産物は、コントロール群と比較して３８％の生存の増大を示した。
【００４４】
これらの実験は、このように、腫瘍から治癒した対象者の無脂質血漿成分が有効な腫瘍阻害材料を含むという仮定を確認した。更に、その様な材料の存在が実際の腫瘍の型に依存せず（少なくとも試験した腫瘍の型の場合）、それ故に混合物が等しく有効であることも証明された。
【００４５】
実験３
血液試験によりウシの白血病の存在が確認されたウシ（ビーフ）がドナーとして選択された。その様なドナーの血液から、「ｂ」及び「ｆ」型の血漿産物が作成された。同様に、血漿産物の両方の型が、血液が白血病の存在を示さなかったウシの血液から調製された。
【００４６】
試験は複数の変形版で行われ、変化するものとして、第一のパラメーターは１日おきに適用した処置の回数であり、第二のパラメーターは０．１〜０．１５ｍｌの間で変化した用量であり、そして第三のパラメーターは当該産物、すなわち「ｂ」又は「ｆ」型の純度であった。これらのパラメーターの試験の好ましい範囲が、実際の実験の前のパイロット実験によって決定されたのは、それぞれの最適値が用量と処置の回数に関して見出されたためである。
【００４７】
白血病を有するウシの血液から得た産物は、ドナーの利用可能性に関して、そして倫理上及又はモラルの検討材料に関して制限がないため、大規模な適用可能性の基準を満たす。生存データは、ヒトの血液から得た他の方法による好ましいデータを実質的に超えている。これは、これらの実験結果の詳細な説明の理由である。
【００４８】
実験の間、動物の平均体重、平均生存時間が試験され、更に当該試験のあらかじめ決定した時期に、１ｍｌの試験血液試料が各群のそれぞれのマウスから採取さされ、そして当該試料中における多数の腫瘍マーカーの存在が試験された。血液試料が採取されたマウスは、それらがその様な血液の量で生存し得ないために、以下の実験から除かれた。
【００４９】
生存時間に関する結果は、２つの主な群に分けられることがあり、すなわち処置は「ｂ」又は「ｆ」型の産物で実施される。白血病を有するウシに由来する起源は、略語「Ｂｂｏ」によって表され、それ故に第一の主な群の処置は材料Ｂｂｏ−ｂで実施され、そして第二の主な群のものは材料Ｂｂｏ−ｆで実施された。
【００５０】
日にちは腫瘍の移植の日から数えた。それぞれの曲線を、少なくとも５匹のマウスを含む群の平均に関して図１〜７に示した。
【００５１】
図１及び２は、材料Ｂｂｏ−ｆで処置した群の生存のダイアグラムを示す。ポジティブコントロール群のマウスは、正常な給餌とは別に、移植後の処置をなんらう受けず、処置群のマウスは、限定量を有する材料Ｂｂｏ−ｆによって１日おきに処置された。図１に示した群での各処置において、用量は０．１５ｍｍであった。２つの処置群は、互いに処置の回数が異なる。第一群においては８回の処置が適用され、一方第一の群においては処置の回数が１０回であり、その後、当該マウスは鎖卵成る処置をなんら受けなかった。１０回の処置を受けた群の場合、処置の終了後、すなわち、第２０日目の後、死亡率が突然増大したことが見られた。この突然の増大は、８回の処置を受けた群でも見ることができるが、増大が後で且つより緩やかな傾きで起こることは興味深い。１９．６日を有する、コントロール群と比較した平均生存時間は、８回の処置を受けた群では２４，８日であり、一方１０回の処置を受けた群では２３．２日である。
【００５２】
図２に示したそれぞれの群において、処置は二日おきに１０回行った。用量に差異がある。第一群のマウスは各処置において０．１５ｍｌの用量を受け、一方第二群は０．１ｍｌの用量で処置された。用量が減少した場合、差異は非常に明らかである。生存時間は３０日に増大し、これはポジティブコントロール動物群と比較して１５３％の向上を構成する。
【００５３】
材料Ｂｂｏ−ｂを用いた処置の結果を図の２つの群に示す。図３〜５の場合において、変化するパラメーターは用量である。図３に示した場合、処置は６回行い、そして生存時間が使用した用量にほとんど依存せず、そして低用量が若干好ましいことが見てとれる。しかしながら、生存時間は、平均生存時間が３７日であり、これがポジティブコントロールと比較してほぼ１８９％の向上であるため、材料Ｂｂｏ−ｆと比較して実質的に良かった。用量に由来する生存時間の依存性は、図４を考慮する場合に更に明らかとなる。ここでは、処置の回数は８回であった。０．１５ｍｌの用量の効果のもとで、生存時間は、６回の処置で得られた値と比較して減少し、そしてこのことは単に過量の結果であると思われる。反対に、０．１ｍｌの用量は、平均生存時間が実質的に増大し、そして５９日目までにダイアグラムが５０％の値にまだ達していなかったので８回の処置に最適であると思われる。このことによって、生存は３００％以上に増大し、これは著しく望ましい図である。
【００５４】
図５は、１０回の処置を受けたマウスの場合における平均生存時間を示す。ここで、０．１５ｍｌの用量が驚くべき事であるのは、この群において、生存が突然減少するが、同様の処置を受けた初期の群では平均がより良いためである。マウスの数が少ないために、１又は２匹のマウスの多少好ましい挙動から違いが生じていると思われる。突然死の割合は、３３日目の後に０．１ｍｌの用量の場合に増大し、これも過量の結果であると思われる。
【００５５】
図６及び７において、変化するパラメーターは処置の回数である。２つの図面の比較は、０．１ｍｌの用量による８回の処置の適用が最適であることを示す。図７由来の結果は、用量が多い場合に、向上が処置の回数の減少につれて増大することを記載しており、これはまた、用量が多すぎたことを示している。
【００５６】
腫瘍の治癒及び動物の平均体重
処置された群の動物の状況で経験した向上は、平均生存時間に基づくだけでは認識され得ない。出発時の体重が２５ｇの動物において、６〜８ｇの重量、すなわち動物の全重量のほぼ三分の一の大きな腫瘍が形成される。材料Ｂｂｏ−ｂ由来の０．１ｍｌの用量で周期の終わりまでに８回処置された動物において、よく認識されている処置が腫瘍の状態において行われ、肉腫が開かれ、そしてつぶれやすい材料が廃棄された。この材料は、死んだ腫瘍細胞を包含していた。当該動物の「こぶ」が消え、そして彼らは体重が増え始めた。
【００５７】
図８は、共に８回の処置を受けた群Ｂｂｏ−ｂ及びＢｂｏ−ｆ並びにポジティブコントロール群に関する、最初の１９日における動物の平均体重の値を示す。当該ダイアグラムは、特に材料Ｂｂｏ−ｂでの処置の場合において、上述した状態の報告と良好に相関している。当該ダイアグラムの欠点は、それが別々に腫瘍の量を示さないことにある。我々は腫瘍の重量について正確な値を得ることができず、それ故に全体重は腫瘍の重量も含む。処置した群において、最初の低下、続いて再生する増大が典型的であり、ポジティブコントロール群においては、重量は上下しながら増大し、これは主に腫瘍の増大によって引き起こされる。
【００５８】
上文の実験のうちの、最良のものとして現れたものは、白血病を有していない健康なウシから得た材料を用いて繰り返された。当該結果は、ポジティブコントロール群において得られたものと有意に異なることはなく、そしてこのことは、白血病を有するウシの血液から得られた材料のみが有効であることを確認した。
【００５９】
酵素腫瘍マーカーの試験結果
悪性の過程を伴う代謝の変化の試験のために、臨床実験において幅広く決定される複数の酵素腫瘍マーカーがあり、そしてこれらの方法の中でも、型の数が決定され、これは慣習的な試験のために使用されうる。当該方法を選択する際、悪性の過程が複雑な生化学的障害を伴い、そしてしばしばそれによって維持されることを考慮した。従って、これらの考慮により、核酸の代謝（血清アルカリ性（塩基性）及び酸性デオキシリボヌクレアーゼ活性、５’−ヌクレオチダーゼ活性）；ポリアミン代謝（アルギナーゼ活性）；肝ミトコンドリアの機能（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性）；糖新生（ホスホヘキソースイソメラーゼ活性）；骨関連過程の同定（骨特異的アルカリホスファターゼ活性）のアッセイを実施するために必要であると思われる。列記した酵素の活性における変化は、悪性の過程を伴い、そして維持する代謝の変化及び適用した治療の結果に続く。
【００６０】
実験の間、血液試料は、腫瘍の移植から８日目、１５日目そして１９日目にマウスから採取された。データを表１に要約する。当該データは、全て別々に実験した、それぞれの５匹のマウスの平均に関する。
【００６１】
表の中の幾つかのカラムの意味
β−Ｇｌｙｃ：非特異的ホスファターゼ、β−グリセロホスフェート；この値は、腫瘍マーカーとして解釈され得るように、他のホスファターゼの値のものから引かれるべきである；
Ａｌｋ．Ｆ：アルカリホスファターゼ
５’−ＴＭＰ：５’−チミジン−５−モノホスフェート
ＰＤＥ：ホスホジエステラーゼ
ＳＤＮａｚ：酸性デオキシリボヌクレアーゼ（酸性ＤＮＡアーゼ）
Σ．５’−ＮＤ：全ての５’−ヌクレオチダーゼの合計の値
【表１】
2004504353.tif 000044
【００６２】
当該表において、３つの異なる群が見られる。最後の群は腫瘍を移植されていないマウスを有するコントロールに関連し、そしてこの群のマウス５１−５５は８日目に試験され、マウス５６−６０は１５日目に試験され、そしてマウス１０６−１１０は１９日目に試験された。
【００６３】
中段の群は、ポジティブコントロールに関連し、マウス１５１−１５５は８日目に試験され、マウス１０１−１０５は１５日目、そしてマウス４１−５０は１９日目に試験された。
【００６４】
最初の群は、２つの亜群に分けられ、１つは材料Ｂｂｏ−ｂによる処置を受けた、数字の２で始まるもの、そしてもう１つは材料Ｂｂｏ−ｆによる処置を受けた、数字の３で始まるものである。当該亜群Ｂｂｏ−ｂにおいて、マウス２７１−２７５の試験は８日目に、マウス２７６−２８０は１５日目に、マウス２７１−２７５は１９日目に、そして最後にマウス２４６−２５０の試験は、実質的な生存に関して随分遅い、４５日目に行った。
【００６５】
第二の亜群における、材料Ｂｂｏ−ｆで処置したマウスの、試験日に従う分布：３９６−４００：８日目；３９１−３９５：１５日目；３８５−３９０：１９日目。
【００６６】
結果を図９においてカラムダイアグラムの形態で要約する。この中で、横軸上に例示したマウスの群は縦軸上のデータと互いに関連しており、ここで、カラムの高さはデータの合計を表している。横軸において、マウスの群は別々に例示され、そして各群において、左から右の順番で試料データの順番が増大する。
【００６７】
３つの左側のカラムは、コントロール群と関連し、中央の３つのカラムはポジティブコントロール群と関連し、そして７つの右側のカラムのうちの最初の３つのカラムは亜群Ｂｂｏ−ｆに属し、そして残りの４つのカラムは亜群Ｂｂｏ−ｂに属する。
【００６８】
コントロール群において、データは自然に時間につれて変化せず、それらの変動は自然の範囲内である。ポジティブコントロール群の場合、全ての成分が極端に高く、そして瀕死の時期（最後のカラム）までに、それらは更に増大する。
【００６９】
反対に、両方で処置した亜群において、最初の値は既にポジティブコントロール群のデータよりも小さく、そしてそれらは更に時間につれて減少する。材料Ｂｂｏ−ｂは、好ましい生存データに従い、材料Ｂｂｏ−ｆによる処置よりも実質的により良いで結果を示した。減少は、１９日目の後も続き、そして実験の終了までに、データはコントロール群の標準的な値に近づく。
【００７０】
実験４
これまでの実験の間に得られた好ましい結果に基づき、無脂質血漿のどの成分が前記作用に原因があるかを試験した。我々は健康な人の血液、急性白血病の対象者由来の血液、腫瘍から治癒した対象者由来の血液、更には白血病のウシ及び白血病ではないウシから採取した血液を所持していたので、調製型「ｂ」が列記した各血液から作成され、そしてそれらは個別の電気泳動試験にかけられた。当該試験のために、出発材料が、使用されるポリアクリルアミドゲルの表面上に持ち込まれ、そして電気泳動処置の効果のもと、当該材料の成分がそれらの分子量の順番に従い分離された。
【００７１】
腫瘍処置の観点から効果的でないことが証明された血液、すなわち正常なヒト血液及び白血病でないウシから採取された血液から得られた画分は、腫瘍処置の観点から効果的である血液の型から得られた画分と比較された。最も明らかな差異は、白血病を有するウシから採取された血液の画分において見られ、そしてそれは分子量約４００００の画分、更には分子量３０００００〜３５００００の画分の存在下にあった。これらの２つの画分は、共に試料の８〜１２重量％を表した。腫瘍が治癒したドナーから採取された血液調製物の画分は、これらの成分をいずれも包含していたが、分子量４００００付近の画分の存在は亜更に明らかであり、そして画分の量は実質的に少なく、約２〜３％であった。急性白血病の血液から得られた調製物の画分の中でも、分子量４００００の成分がごくわずかに存在しており、他の画分は検出されなかった。
【００７２】
前記の２つの画分を同定する目的で、約４００００の分子量を有するものは「ボバイン４０」と言及され、そして３０００００〜３５００００の他の画分は「ボバイン３００」と表される。本明細書に記載の方法はこれらの２つの画分の間違いのない同定にとって十分である。これらの画分の構造の同定は現在行われている。示された結果の知識において、材料ボバイン４０及びボバイン３００の存在が示した作用にとって重要であることは、十分な根拠により述べることができる。
【００７３】
ＩＩ． Ｃ２６結腸直腸腫瘍の移植による実験
当該実験は、第一世代の内部交配（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｂｒｅｄ）したＢａｌｂ／ｃ雌性マウスを用いて実施した。
【００７４】
マウスの原産地はＴＮＯ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｒｉｆｋｓｗｉｊｋ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）であり、繁殖地はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｇａｒｙ）のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙであった。
【００７５】
動物の飼育環境は、ｍａｃｒｏｌｏｎ材料のケージ、２０〜２２℃の温度、相対湿度４５〜５５％、１２時間周期で変化する昼夜の維持、であった。給餌は、オートクレーブで滅菌されうる標準的な品質のマウスの餌（型：Ａｌｔｒｏｍｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で行い、寝具は経木から作成した。繁殖の衛生レベルは、既述のＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）条件に従った。動物の世話及び飼育は、「Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ」におけるヘルシンキ宣言に従い行った。
【００７６】
Ｃｏｌｏｎ−２６結腸腺ガンはＳＲＩ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， Ａｌａｂａｍａ， Ｕ．Ｓ．Ａ）から購入した。移植方法：維持した腫瘍由来の２０ｍｇの小片が、皮下から肩胛骨間の領域に移植された。
【００７７】
実験の間、動物を１０匹のマウスの群に分け、ポジティブコントロール群の動物は移植後に何ら処置を受けなかった。処置群においては、処置は前述のＢｂｏ−ｂ材料を用いて行った。この材料は、当該実験の文書化の間にＡＢＢ−７とも称された。実験シリーズＩを介して得られた経験が利用され、そして当該処置は、１〜９日目の間、合計８回、１日に１回同時に適用された。各群における差異は処置の方法及び適用した実験材料の量にあった。
【００７８】
生存データを図１０に要約する。ポジティブコントロール群の場合、１００％の生存時間は１９日であった。最初の群において、処置は０．１ｍｌの用量で腹腔内（ＩｐＩ）で実施し、第二群においては、適用方法は、用量が０．１５ｍｌであったことを除き同一であり、そして口を経口（ｐｅｒ ｏｓ）材料の適用も試験された。ここで、適当な用量の供給装置が、動物の胃に直接材料を運ぶために使用された。第一の経口（ｐｏ１）群においては、用量は０．２ｍｌの材料であり、そして第二の経口（ｐｏ２）群においては用量は０．３ｍｌであった。更なる群として、当該材料を０．１ｍｌの材料を用いて皮下（皮膚の下）から適用した、ｓｃも処置された。生存データは、１０匹のマウスの群の平均を示す。図面から、処置群のそれぞれにおいて実質的な向上が起こり、最も有効な２つの処置が０．１ｍｌの材料を用いるｉｐ適用及び０．２ｍｌの材料を用いるｐｏ処置であったことが見て取れる。
【００７９】
当該実験は、１０匹のマウスの更なる群において繰り返され、そして腫瘍の重量を測定するために、腫瘍は、動物が瀕死（すなわち死の直前）状態に達した場合に摘出され、そして腫瘍の重量が測定された。
【００８０】
図１１は、これらの実験結果を示す。カラムの上方に、関連する水準レベルの値を示し、これは、全ての場合において０．０５未満であり、すなわち当該データは非常に信頼性がある。
【００８１】
同様に処置した１０匹のマウスの更なる群において、５’−ヌクレオチダーゼ活性が、腫瘍移植から８日目、１６日目に、並びに実験シリーズＩの場合には瀕死状態において採集した試料上で決定された。これらのデータを図１２に示す。当該活性は、開始時の低い値から、１６日目までには最高のものへと増大し、瀕死状態に達した後は、当該活性はポジティブコントロール群で得られた値から実質的に低下した。
【００８２】
ＩＩＩ． ＭＸＴ乳ガンを移植する実験
実験ＩＩに記載の条件を維持しながら、記載されている起源の雌性のＢＤＦ１マウスが、ＭＸＴ乳ガンの場合における、材料Ｂｂｏ−ｂを用いる処置の効果を試験するために使用された。移植される腫瘍細胞の出所はＭＡＳＯＮ Ｒｅｓ． Ｉｎｓｔ． ＵＳＡである。維持された腫瘍由来の１ｍｍ３の体積の小片を肩胛骨間の領域に皮下から移植した。
【００８３】
当該動物から、１０匹のマウスの群が実験ＩＩの場合に形成され、そして各群において、それぞれが等しく処置された。材料Ｂｂｏ−ｂを用いる処置は、実験ＩＩの場合のように、すなわち８日間の間毎日１回同時に実施された。ポジティブコントロールの場合、平均生存時間は２４日であった。図１３は、異なる処置群の場合の生存時間を示す。多くの処置群が同一の方法で処置され、例えば０．１５ｍｌの用量の群ｉｐ１及びｉｐ２は腹腔内から同じように処置され、あるいは群ｐｏ２及びｐｏ３は経口から０．３ｍｌの用量で処置された。この腫瘍の型において、生存時間の増大は約４０％であり、これは経口処置の場合において最大であった。
【００８４】
腫瘍の重量の試験は、実験ＩＩで記載したような瀕死状態の動物で実施され、そしてその結果を図１４及び１５に要約する。横軸に示した数は特定の群におけるマウスの連番に関連し、それらに特別な意味はない。カラムダイアグラムに示した縦の項は関連する群における偏差に関する。腫瘍の重量の減少は、経口から適用した処置でも、ここでは最も有意であった。
【００８５】
実験動物上で実施した５’−ヌクレオチダーゼの試験は、処置した群における実質的な低下を示し、その様な試験の完全な実験データの解析は、現時点ではまだ完了しておらず、それ故にそれらは表の形に要約することができない。
【００８６】
ＩＶ．急性Ｌ１２１０リンパ性白血病の移植による実験
材料Ｂｂｏ−ｂの作用は、急性Ｌ１２１０リンパ性白血病の場合において試験された。１０匹のマウスの群は、実験ＩＩ及びＩＩＩに関連して記載したように飼育された雌性のＢＤＦ１マウスから形成された。急性Ｌ１２１０リンパ性白血病が維持されたＤＢＡ／２マウスの腹水及び生理食塩水から、１０６個の細胞を含んで成る０．１ｍｌの液体が作成された。その液体から、０．１ｍｌが腹腔内から各実験マウスへと注射され、そして処置群においては、当該処置は、実験ＩＩ及びＩＩＩの様に８日間、１日に一回実施された。
【００８７】
図１６は、生存データを示す。ポジティブコントロール群における平均生存時間は９．９日であった。図１６においては、どの様に材料が適用されたかに依存して生存時間における非常に実質的な差異があることが見て取れる。腹腔内及び皮下の適用に応じて、生存時間は１７０％であり、そしてこれらに対して、０．２ｍｌの用量の経口適用は３２０％の生存時間をもたらしたが、この処置群においては、個体の動物間の差異が大きく、そしてそれらのいくつかは完全に治癒していた。この腫瘍の型において、相対的な腫瘍の重量を決定する方法がなく、そして腹腔で回収された腹水は、腸間膜に存在する腫瘍と一緒に、絶対的な腫瘍の重量を構成した。図１７は、瀕死の群においてその様に決定された絶対的な腫瘍の大きさの測定された重量を示す。３０日目に生存していた動物もこれらの群に属していた。図１７においては、処置した群のうちの３つにおいて測定可能な腫瘍の重量が見られなかったことが見て取れる。
【００８８】
図１８は、５日目及び８日目及び瀕死状態における５’−ヌクレオチダーゼ活性の変化を示す。当該ダイアグラムからは、実質的な向上が処置した群の全てにおいて起こること、そして幾つかの処置群において、標準的な値が得られてことが見て取れる。
【００８９】
複数の異なる日に実験Ｉ〜ＩＶに参加したマウスの更なる群において、組織学的な試験が実施された。当該試験には、１７の異なる臓器の組織学的解析を含めた。その様な組織学的試験に基づき、試験した腫瘍型のいずれにおいても転移は形成されていなかったと述べることができる。しかしながら、ポジティブコントロール群の場合においては、はっきりと認識可能な転移活性が見られた。これらは、以下の様に個々の腫瘍の型：リンパ腺及び肝臓におけるＳ１８０肉腫の場合；肝臓及び腸間膜のリンパ腺におけるＣ２６の場合；肝臓におけるＭＸＴ腫瘍の場合；骨髄におけるＬ１２１０の場合においても検出された。
【００９０】
上文の実験結果は、経験した有意な向上が、今回試験しなかった腫瘍の型においても起こることを有望なものする。それらの顕著な有意性により、全ての型の腫瘍を網羅する実験が必要であろう。それにも関わらず、上文の実験は、主要な効果の存在を支持するのに十分広いものであった。
【００９１】
本発明に従う解決方法は、腫瘍の処置のためだけでなく、追加治療のため、そして転移の形成を予防するために効果的に使用され得る。
【００９２】
前記作用に重要であるが、少なくとも画分ボバイン４０以外の２つの別々の画分が腫瘍を有する対象者の血液中に存在するという事実により、これらの画分の試験は腫瘍の診断に使用され得る。
【００９３】
本発明に従う調製物を用いて、そしてその診断的な可能性を用いて得られた結果は、腫瘍の効果的な処置及び診断に関する希望をもたらす。白血病を有するウシのストックは世界中に十分存在し、これにより大規模な製造が可能となる。更に、材料ボバイン４０及びボバイン３００の製造のための合成方法を見つけるための可能性が存在しているのは、これらの材料の徹底的な試験が予想通りにその様な製造をもたらしうるためである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０．１５ｍｌのＢｂｏ−ｆ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図２】図２は、Ｂｂｏ−ｆ材料を用いる１０回の処置の生存のダイアグラムである。
【図３】図３は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる６回の処置の生存のダイアグラムである。
【図４】図４は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる８回の処置の生存のダイアグラムである。
【図５】図５は、Ｂｂｏ−ｂ材料を用いる１０回の処置の生存のダイアグラムである。
【図６】図６は、０．１ｍｌのＢｂｏ−ｂ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図７】図７は、０．１５ｍｌのＢｂｏ−ｂ材料を用いる処置の生存のダイアグラムである。
【図８】図８は、１９日目までの動物の体重を示す。
【図９】図９は、酵素試験の結果を要約している一連のカラムダイアグラムである。
【図１０】図１０は、結腸直腸腫瘍Ｃ２６の移植後の処置の生存データを示す。
【図１１】図１１は、図１０の処置における相対的な腫瘍の重量を示す。
【図１２】図１２は、図１０の処置の場合における５’ヌクレオチダーゼの値を示す。
【図１３】図１３は、ＭＸＴ乳ガンを処置する場合に見られる生存のダイアグラムを示す。
【図１４】図１４は、図１３の処置の場合の相対的な腫瘍の重量を例示する。
【図１５】図１５は、処置の次なる型の場合における図１４版である。
【図１６】図１６は、Ｌ１２１０リンパ性白血病を処置する場合に見られる生存のダイアグラムを示す。
【図１７】図１７は、図１６の処置において得られた絶対的な腫瘍の重量を示す。
【図１８】図１８は、図１６の処置の場合における５’ヌクレオチダーゼの値を示す。
【国際調査報告】
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