(57)【要約】本発明はセロトニン受容体細胞内シグナル伝達経路におけるＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化をモジュレートする方法及び組成物を提供する。本発明は、細胞又は組織におけるタンパク質ホスファターゼ−１（ＰＰ−１）、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）、及び／又はタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の活性をモジュレートする方法及び組成物を提供する。本発明は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路疾患（例えば鬱病）の治療方法を提供する。本発明は、ドーパミン関連疾患の治療方法を提供する。本発明は、このような治療に使用するための、セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子である、ＤＡＲＰＰ−３２、カゼインキナーゼ１、サイクリン依存性キナーゼ５、ＡＭＰＡ受容体、タンパク質ホスファターゼ−１、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ、及び／又はタンパク質ホスファターゼ２Ａの活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。本発明はまた、このような治療に使用するための、ＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化をモジュレートする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする方法であって、該細胞又は組織とセロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物の有効量とを接触させることを含み、ここで該細胞又は組織と化合物との接触がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションをもたらす上記方法。
【請求項２】
ＣＫ１をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＫ１がＣＫ１α、ＣＫ１γ、ＣＫ１δ又はＣＫ１εである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃｄｋ５活性をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＡＭＰＡ受容体活性をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＰ−１活性をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＰ２Ｃ活性をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃａイソ型である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｂイソ型である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｇイソ型である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＰ２Ｂ活性をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＰ２Ａ活性をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子がＣＫ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子がＡＭＰＡ受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子がＰＰ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子がＰＰ２Ｃである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃａイソ型である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｂイソ型である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｇイソ型である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子がＰＰ２Ｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子がＰＰ２Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物がセロトニン受容体アゴニストであり、細胞又は組織と上記アゴニストとの接触がＣＫ１の活性を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物がセロトニン受容体アゴニストであり、細胞又は組織と上記アゴニストとの接触がＰＰ２Ａの活性を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物がセロトニン受容体アンタゴニストであり、細胞又は組織と上記アンタゴニストとの接触がＣＫ１の活性を低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物がセロトニン受容体アンタゴニストであり、細胞又は組織と上記アンタゴニストとの接触がＰＰ２Ａの活性を低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
目的の細胞又は組織におけるＣＫ１の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）上記細胞又は組織におけるＣＫ１活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｃ）上記細胞又は組織におけるＣＫ１活性の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＣＫ１活性の第１レベルと第２レベルとの差がセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路におけるＣＫ１活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項２７】
目的の細胞又は組織におけるＣｄｋ５の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）上記細胞又は組織におけるＣｄｋ５活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｃ）上記細胞又は組織におけるＣｄｋ５活性の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＣｄｋ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路におけるＣｄｋ５活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項２８】
目的の細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｃ）上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルと第２レベルとの差がセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路におけるＡＭＰＡ受容体活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項２９】
目的の細胞又は組織におけるＰＰ−１の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）上記細胞又は組織におけるＰＰ−１活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｃ）上記細胞又は組織におけるＰＰ−１活性の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＰＰ−１活性の第１レベルと第２レベルとの差がセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路におけるＰＰ−１活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項３０】
目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）上記細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃ活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｃ）上記細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃ活性の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＰＰ２Ｃ活性の第１レベルと第２レベルとの差がセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路におけるＰＰ２Ｃ活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項３１】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃａイソ型である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｂイソ型である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｇイソ型である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）上記細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂ活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｃ）上記細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂ活性の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＰＰ２Ｂ活性の第１レベルと第２レベルとの差がセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路におけるＰＰ２Ｂ活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項３５】
目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）上記細胞又は組織におけるＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｃ）上記細胞又は組織におけるＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差がセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路におけるＰＰ２Ａ活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項３６】
目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｃ）上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルをそれぞれ測定するステップ、
を含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項３７】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃａイソ型である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｂイソ型である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｇイソ型である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
目的の細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化をモジュレートする化合物を同定する方法であって
（ａ）目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ、
（ｂ）上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の第１レベルを測定するステップ、
（ｃ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、
（ｄ）上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルをそれぞれ測定するステップ、及び
（ｅ）上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差、並びにＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の第１レベルと第２レベルとの差が、上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化をモジュレートする上記試験化合物の能力を示すものである上記方法。
【請求項４１】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃａイソ型である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｂイソ型である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｇイソ型である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化を調節する方法であって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションが上記細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の改変をもたらすものである上記方法。
【請求項４５】
上記細胞がニューロンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃａイソ型である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｂイソ型である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｇイソ型である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
ＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の増大又は低減を特徴とする障害を治療する方法であって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含む上記方法。
【請求項５０】
治療を必要とする患者において５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害を治療する方法であって、Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を増大する薬剤を該患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＣＫ１活性を増大するものである上記方法。
【請求項５１】
治療を必要とする患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療において使用するための薬剤の同定方法であって、
（ａ）候補薬剤とＣＫ１及びＳｅｒ１３７脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２とを接触させるステップ、及び
（ｂ）Ｓｅｒ１３７脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の量を検出するステップ、
を含み、ここで上記候補薬剤の存在下にてＳｅｒ１３７脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の増大が検出される場合に該薬剤を同定するものである上記方法。
【請求項５２】
治療を必要とする患者において５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害を治療する方法であって、Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を低減する薬剤を該患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＣｄｋ５活性を低減するものである上記方法。
【請求項５３】
治療を必要とする患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療において使用するための薬剤の同定方法であって、
（ａ）候補薬剤とＣｄｋ５及びＴｈｒ７５脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２とを接触させるステップ、及び
（ｂ）Ｔｈｒ７５脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の量を検出するステップ、
を含み、ここで上記候補薬剤の存在下にてＴｈｒ７５脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定するものである上記方法。
【請求項５４】
治療を必要とする患者において５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害を治療する方法であって、Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を低減する薬剤を該患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＰＰ−１活性を低減するものである上記方法。
【請求項５５】
治療を必要とする患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療において使用するための薬剤の同定方法であって、
（ａ）候補薬剤とＰＰ−１及びＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２とを接触させるステップ、及び
（ｂ）Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップ、
を含み、ここで上記候補薬剤の存在下にてＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定するものである上記方法。
【請求項５６】
治療を必要とする患者において５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害を治療する方法であって、Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を低減する薬剤を該患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＰＰ２Ｃ活性を低減するものである上記方法。
【請求項５７】
治療を必要とする患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療において使用するための薬剤の同定方法であって、
（ａ）候補薬剤とＰＰ２Ｃ及びＳｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２とを接触させるステップ、及び
（ｂ）Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップ、
を含み、ここで上記候補薬剤の存在下にてＳｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定するものである上記方法。
【請求項５８】
治療を必要とする患者において５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害を治療する方法であって、Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を阻害する薬剤を該患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＰＰ２Ｂ活性を低減するものである上記方法。
【請求項５９】
治療を必要とする患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療において使用するための薬剤の同定方法であって、
（ａ）候補薬剤とＰＰ２Ｂ及びＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２とを接触させるステップ、及び
（ｂ）Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップ、
を含み、ここで上記候補薬剤の存在下にてＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定するものである上記方法。
【請求項６０】
治療を必要とする患者において５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害を治療する方法であって、Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を増大する薬剤を該患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＰＰ２Ａ活性を増大するものである上記方法。
【請求項６１】
治療を必要とする患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療において使用するための薬剤の同定方法であって、
（ａ）候補薬剤とＰＰ２Ａ及びＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２とを接触させるステップ、及び
（ｂ）Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップ、
を含み、ここで上記候補薬剤の存在下にてＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の増大が検出される場合に該薬剤を同定するものである上記方法。
【請求項６２】
細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化を調節する方法であって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含み、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションが上記細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の改変をもたらすものである上記方法。
【請求項６３】
上記細胞がニューロンである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃａイソ型である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｂイソ型である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
ＰＰ２ＣがＰＰ２Ｃｇイソ型である、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立精神保険研究所（National Institute of Mental Health）より授与された認可番号ＭＨ−４０８９９及びＤＡ１００４４の政府支援によりなされたものである。米国政府は本発明にある一定の権利を有する。
【０００２】
関係出願
本願は、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、２００１年８月１０日に出願された米国仮出願第６０／３１１，６４１号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の優先権を主張する。
【０００３】
１．技術分野
本発明はセロトニン受容体細胞内シグナル伝達におけるＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化をモジュレートする方法及び組成物に関する。本発明は、細胞又は組織におけるＤＡＲＰＰ−３２、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）、サイクリン依存性キナーゼ５（Ｃｄｋ５）、ＡＭＰＡ受容体、タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ−１）、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）、及び／又はタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の活性をモジュレートする方法及び組成物に関する。本発明は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路疾患（例えば鬱病）の治療方法に関する。本発明はまた、ドーパミン関連疾患の治療方法に関する。本発明は、このような治療に使用するための、セロトニン受容体細胞内シグナル伝達分子である、ＤＡＲＰＰ−３２、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）、サイクリン依存性キナーゼ５（Ｃｄｋ５）、ＡＭＰＡ受容体、タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ−１）、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）、及び／又はタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の活性をモジュレートする薬剤を同定する方法に関する。本発明はまた、このような治療に使用するための、ＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存性活性化をモジュレートする方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
鬱病は、最も衰弱性の精神疾患であるが、鬱病を治療するための薬理学的方法はまだほとんどない。セロトニン及びノルアドレナリン再取込み運搬物質を阻害する三環系抗鬱薬、並びにモノアミン神経伝達物質の主要な代謝酵素を阻害するモノアミンオキシダーゼインヒビターが５０年以上も利用されている。長年にわたり利用されている別の治療方法は、電気痙攣療法である。より最近では、選択的セロトニン再取込みインヒビターが開発されている。それにもかかわらず、現在の治療は最善のものではなく、完全な回復を示すのは全患者のほんの約５０％であり、より多くの患者（８０％以下）は部分的な応答を示す（Nestlerら、2002; Neuron 34,13-25）。従って、鬱病の治療のための新規な方法が緊急に必要とされている。
【０００５】
脳内のセロトニン作動性経路は、気分の調節に重要であることが十分解明され、脳細胞内のセロトニンの枯渇が行動抑制の発生と関連している（Cooperら、1991. The Biochemical Basis of Neuropharmacology, 6th Edition. Oxford university Press: New York, p. 338-366）。結果として、薬理学的研究は、鬱病治療の手法としてセロトニン様機能を改変する化合物の開発に焦点が当てられている。セロトニン（５−ＨＴ又は５ＨＴとしても知られる）は、神経組織に作用し、特異的受容体の作用を介してその応答を誘発する。シナプス前ニューロンから放出されたセロトニンは、シナプス後のニューロンにおける特異的受容体に作用する。鬱病のための現在の治療計画の大部分は、シナプス間隙におけるセロトニンレベルを改変する薬剤を使用することにより、セロトニン作動性神経伝達をモジュレートすることを含む。
【０００６】
１５種のセロトニン受容体が哺乳動物のＣＮＳ組織において同定され、クローニングされ、薬理学的に特性決定されている（Barnesら、1999, Neuropharmacology 38, 1083-1152）。これらは、７種のサブクラス（５−ＨＴ１Ａ−Ｆ、５−ＨＴ２Ａ−Ｃ、５−ＨＴ３Ａ−Ｂ、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５、５−ＨＴ６及び５−ＨＴ７受容体）に分類される。これらは、イオンチャネル型である５−ＨＴ３受容体を除き、全て代謝型受容体である。これらのセロトニン受容体は、以下の二次メッセンジャー系を介して作用する：５−ＨＴ１−クラス受容体、並びに５−ＨＴ５Ａ及びＢ受容体はｃＡＭＰ形成を低減させる；５−ＨＴ２−クラス受容体は、イノシトール三リン酸及びジアシルグリセロール形成を増大させる；５−ＨＴ３受容体はＮａ＋及びＣａ２＋流入を増大させる；５−ＨＴ４、５−ＨＴ６及び５−ＨＴ７受容体は、ｃＡＭＰ形成を増大させる。従って、セロトニンは多数の二次メッセンジャー系を活性化することができ、結果として、大部分の抗鬱薬の作用が非特異的となる。
【０００７】
現在までのところ、現在使用されている抗鬱薬よりも良好な治療プロフィールを示す、セロトニン受容体のいずれかに作用する特異的なアゴニスト又はアンタゴニストはない。このことは、その効果を達成するためには多数のセロトニン受容体における活性の改変が抗鬱薬には必要であり、また抗鬱特性は、シナプス後のニューロン内における複数の神経伝達物質が媒介する細胞内シグナル伝達カスケードの一体化（統合）により達成されることを示している。
【０００８】
従って、三環系抗鬱薬、選択的セロトニン再取込みインヒビター及び／又はモノアミンオキシダーゼインヒビターの抗鬱効力には、多数のセロトニン受容体の効果を一体化（統合）するタンパク質が関与している。そのようなタンパク質の１つであるＤＡＲＰＰ−３２（ドーパミン−及びｃＡＭＰ−調節ホスホタンパク質、分子量３２，０００）は、脳内におけるドーパミン及びｃＡＭＰの主要標的として発見されている（Walaasら、1983. Nature 301: 69-71）。ＤＡＲＰＰ−３２は、ドーパミン作動性ニューロンの２つの主要な投射領域、すなわち前前頭皮質及び線条体に豊富に存在する。前前頭皮質及び線条体は、中程度から高度なセロトニン様神経支配を受け（Steinbusch, 1981, Neuroscience 6,557-618）、これは、この領域におけるドーパミンレベルの低減時にさらに増大する（Rozasら、1998, Neurosci. Lett. 245,151-154）。いくつかのセロトニン受容体、最も顕著なものとして５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｅ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、及び５−ＨＴ６は線条体において発現される（Barnesら、1999, Neuropharmacology 38, 1083-1152）。
【０００９】
過去数年にわたり、ＤＡＲＰＰ−３２が、ドーパミンの生化学的、電気物理学的、転写的及び行動的作用において必須の役割を果たしていることが解明されている（Greengard, P.ら、1999. Neuron 23:435-447）。ドーパミンは、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のＤ１受容体媒介活性化を介してＤＡＲＰＰ−３２をＴｈｒ３４でリン酸化し、それによりＤＡＲＰＰ−３２をタンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ−１）の強力なインヒビターに変換する（Walaasら、1983. Nature 301: 69-71；Hemmingsら、1984. Nature 310: 503-505）。ホスホ−ＤＡＲＰＰ−３２はＰＰ２Ｂ（カルシニュリンとも称する）により脱リン酸化される。別のキナーゼ及びホスファターゼがＤＡＲＰＰ−３２を別の部位でリン酸化し、その機能を調節することも示されている。
【００１０】
カゼインキナーゼＩ（ＣＫ１）は、単離されかつ特性決定された最初のセリン／トレオニンプロテインキナーゼの１つであった（Gross, S.D.及びR.A. Anderson. 1998. Cell Signal 10:699-671）。これは細胞の核及び細胞質中に見出すことができる遍在性酵素であって、細胞骨格又は細胞膜と結合している。中枢神経系（ＣＮＳ）において、ＣＫ１は概日リズム（Camacho, F.ら2001. FEBS Lett. 489:159-165）及び細胞内輸送（Murakami, A.ら 1999. J. Biol. Chem. 274:3804-3810；Panek, H.R.ら 1997.EMBO J. 16:4194-4204；Wang, X.ら 1996. Mol. Cell. Biol. 16: 5375-5385）を調節する役割を果たすようである。新線条体（neostriatum）において、ＣＫ１はＤＡＲＰＰ−３２をＳｅｒ１３７においてリン酸化することが見出されている（Desdouits, F.ら 1995. J. Biol. Chem. 270:8772-8778）。Ｓｅｒ１３７のリン酸化は、ホスホ−Ｔｈｒ３４のＰＰ２Ｂにより脱リン酸化される能力に影響を与える（Desdouits, F.ら 1995. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92:2682-2685；Desdouits, F.ら 1998. Biochem.J. 330:211-216）。ＰＰ２Ｃはまた、この複合体に関与し、ＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ３４におけるリン酸化状態の調節に関与している。なぜなら、ＰＰ２ＣはＤＡＲＰＰ−３２のＳｅｒ１３７部位でのリン酸化を低減させるためである（Desdouitsら 1998. Biochem.J. 330:211-216）。
【００１１】
ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ及びＣＫ１に加えて、サイクリン依存性キナーゼ５（ｃｄｋ５）及びＰＰ２ＡもＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化状態の調節に関与している。Ｃｄｋ５は元来、ｐ３４ｃｄｃ２プロテインキナーゼの同族体と同定された。その後の研究は、Ｃｄｃ２と異なり、Ｃｄｋ５キナーゼ活性は分裂中の細胞に検出されないことを示した。代わりに、Ｃｄｋ５の活性型は分化したニューロンにのみ存在し、ここでｐ３５と呼ばれるニューロン特異的３５ｋＤａ調節サブユニットと会合する。Ｃｄｋ５／ｐ３５は発生中及び成熟神経系において様々な役割を果たす。最近の研究は、Ｃｄｋ５の誤調節をアルツハイマー病と結び付けている（Kusakawa, G.ら 2000. J. Biol. Chem. 275:17166-17172；Lee, M. S.ら 2000. Nature 405:360-364；Nath, R.ら 2000. Biochem. Biophys. Res. Commun. 274:16-21；Patrick, G. N.ら 1999. Nature 402:615-622）。これらの研究において、カルパインの作用によるｐ３５のｐ２５への変換は、活性化の延長及びＣｄｋ５の局在化の改変を引起す。順に、Ｃｄｋ５／ｐ２５はタウ・タンパク質を高リン酸化し、細胞骨格構造を破壊し、そして一次ニューロンのアポトーシスを促進しうる。
【００１２】
最近の研究は、Ｃｄｋ５がＤＡＲＰＰ−３２をＴｈｒ７５にてリン酸化することも示している（Nishi, A.ら 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:12840-12845；Bibb, J. A.ら 1999. Nature 402:669-671）。Ｔｈｒ７５でリン酸化されたＤＡＲＰＰ−３２はＰＫＡのインヒビターである（Bibbら 1999. Nature 402:669-671）。Ｃｄｋ５によるＴｈｒ７５におけるＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化は、ＰＫＡを阻害することにより、ＰＫＡによるＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ３４のリン酸化に対する影響を低減し、ＤＡＲＰＰ−３２／ＰＰ１カスケードに重要な調節上の役割を果たす（Bibb, J. A.ら 1999. Nature 402: 669-671）。ホスホ−Ｔｈｒ７５はＰＰ２Ａにより脱リン酸化される。この有用な証拠は、ドーパミンが、ＰＫＡを活性化することによりＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ７５におけるリン酸化を低減させ、それがまたＰＰ２Ａを活性化させて、ＤＡＲＰＰ−３２／ＰＰ１シグナル伝達カスケードの効力を増大させることを示している（Nishiら、2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12840-12845）。
【００１３】
別の研究は、ＤＡＲＰＰ−３２の総レベルと、特定の抗鬱性化合物の薬理学的活性と結び付けている（Guitart, X.及びE. J. Nestler. 1992. J. Neurochem. 59: 1164-1167）。これらの研究者は、ラットにおけるリチウム、イミプラミン及びトラニルシプロミンの長時間投与は、前頭皮質におけるＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性のレベルを有意に増大させるが、ハロペリドール、モルヒネ及びコカインの投与はＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性に対して作用しなかった。リチウムは双極性障害の治療に用いられるが、イミプラミン及びトラニルシプロミンは抗鬱薬である。イミプラミンはノルエピネフリンの再取込みを阻害することにより作用し、トラニルシプロミンはモノアミンオキシダーゼインヒビターである。
【００１４】
上記受容体に特異的なアゴニスト及びアンタゴニストについて、またこれらのアゴニスト及びアンタゴニストによりその後セロトニン作動性機能がどのようにモジュレートされるかについて研究がなされているが、セロトニン活性と関連する種々の細胞内シグナル伝達経路について、又はセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の機能に関連する疾患を治療するために用い得る薬剤についてはほとんど解明されていない。従って、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の機能に関連する疾患を治療するために用い得る新規な薬剤を開発するために利用することが可能な新規な薬物アッセイが緊急に必要とされている。
【００１５】
２．１．タンパク質ホスファターゼ−２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）
ＰＰ２Ｃは大きなＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼファミリーに属する。しかしながら、このファミリーでは非常に例外的なメンバーである。ＰＰ２Ｃはこのファミリーに属する他のホスファターゼ（例えばＰＰ−１、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）又はカルシニュリン（ＰＰ２Ｂ））とは有意な相同性を有しない。これらのホスファターゼの大部分とは異なり、ＰＰ２Ｃは単一のポリペプチド鎖を含み、既知のＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼインヒビター、例えばオカダ酸（Bialojan及びTakai, 1988, Biochem. J. 256,283-290）、カリキュリン（Hishiyaら、1999, J. Biol. Chem. 274,26705-26712）、又はミクロシスチン（MacKintoshら、1990, FEBS Lett. 264, 187-192）のいずれに対しても感受性を示さない。従って、ＰＰ２Ｃは他のＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼとは別のサブファミリーに分類されている（Price及びMumby, 1999, Curr. Opin. Neurobiol. 9,336-342）。
【００１６】
過去１０年において、ホスファターゼのＰＰ２Ｃサブファミリーは、種々の組織からクローニングされ、そしてα、β、γ、δ及びＮＥＲＰＰと称される多数のイソ型の発見のために多様化した（Tamuraら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1796-1800；Wenkら、1992, FEBS Lett. 297,135-138；Marleyら、1998, FEBS Lett. 431,121-124；Travis及びWelsh, 1997, FEBS Lett. 412,415-419；Tongら、1998, J. Biol. Chem. 273,35282-35290；Labesら、1998, Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 41, 917-923）。これらのイソ型は、一次アミノ酸配列、金属依存性及び局在位置において有意に異なるものであるが、これらは全て２〜３の共通する性質を有する。イソ型は全て、リン酸及び金属結合に必要な複数の保存ドメインを有する（Dasら、1996, EMBO J. 15,6798-6809）。δを除く全てのイソ型の酵素活性にはＭｇ２＋又はＭｎ２＋イオンの存在が必須であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現される場合には完全にＭｎ２＋依存性である（Tongら、1998, J. Biol. Chem. 273,35282-35290）。
【００１７】
ＰＰ２Ｃ活性を調節する正確な機構はまだ同定されていないが、ＰＰ２Ｃが細胞周期の進行（Chengら、1999, Trends Biochem. Sci. 22,245-251）、ストレスシグナル伝達経路（Takekawaら、1998, EMBO J. 17, 4744-4752；Takekawaら、2000, EMBO J. 19,6517-6526；Hanadaら、2001, J. Biol. Chem. 276,5753-5759）及びアクチン細胞骨格の形成（Hishiyaら、1999, J. Biol. Chem. 274,26705-26712）において機能することは明らかである。ＰＰ２Ｃの過剰発現によって顕著な形態学的変化が生じ、その結果、最終的にはアポトーシスが起こる（Tongら、1998, J. Biol. Chem. 273, 35282-35290）。
【００１８】
ＰＰ２Ｃは脳において広範囲に発現されるので、シナプス活性の調節に重要な役割を果たす可能性がある。しかしながら現在までにＰＰ２Ｃのニューロン基質についてはほんのわずかしか特性決定されていない。ＰＰ２Ｃの可能性ある基質の１つは、自己リン酸化部位でＰＰ２Ｃにより脱リン酸化されるｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣＡＭＫ  ＩＩ）である（Fukunagaら、1993, J. Biol. Chem. 268,133-137；Strackら、1997, J. Biol. Chem. 272, 13467-13470）。ＰＰ２Ｃの他のニューロン基質はＤＡＲＰＰ３２である。このタンパク質は線条体黒質のニューロンに非常に多量に存在し（推定濃度５０μＭ）、複数のセリン／トレオニンリン酸化部位を有する（Greengard, 2001, Science 294,1024-1030）。これは、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によりＴｈｒ３４でリン酸化されると、ＰＰ−１の強力なインヒビターとなる（Hemmingsら、1984, Nature 310,503-505）。Ｔｈｒ７５がリン酸化された場合には、ＤＡＲＰＰ３２はＰＫＡの強力なインヒビターに変化する（Bibbら、1999, Nature 402,669-671）。従って、ＤＡＲＰＰ３２は、そのＴｈｒ３４及びＴｈｒ７５のリン酸化部位に応じてキナーゼ／ホスファターゼインヒビターの２つの役割を果たす。代謝型グルタミン酸受容体の刺激は、ＤＡＲＰＰ３２のＳｅｒ１３７残基をリン酸化するカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）を活性化する（Liuら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,11062-11068）。Ｓｅｒ１３７のリン酸化は、カルシニュリン（ＰＰ２Ｂ）によるＴｈｒ３４の脱リン酸化を阻害する（Desdouitsら、1998, Biochem. J. 330, 211-216）。ラットの肝臓から単離されたＰＰ２ＣはＳｅｒ１３７を脱リン酸化し、それにより間接的にＰＰ−１の活性に影響を及ぼす（Desdouitsら、1998, Biochem. J. 330,211-216）。
【００１９】
驚くべきことに、第１メッセンジャー及び他のシグナル伝達事象によるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ又はＰＰ２Ａの調節に関してはほとんど知られていない。それ故に、当技術分野において、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達分子であるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ又はＰＰ２Ａの調節に関係する疾患又は障害を治療するのに利用しうる新規の組成物又は医薬を開発するために使用可能な新しいスクリーニング方法を提供する必要性がある。さらに、少なくとも部分的に、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ又はＰＰ２Ａにより調節される細胞内シグナル伝達経路の異常又は調節障害による疾患又は障害の治療を開発する必要がある。本発明はそのような方法及び組成物を提供する。
【００２０】
本特許出願の第２節、又はあらゆる他の節におけるあらゆる参考文献の引用又は確認は、そのような参考文献が本発明に先行する技術として利用しうることを容認するとみなすものではない。
【発明の開示】
【００２１】
３．発明の概要
本発明は、目的の細胞又は組織におけるカゼインキナーゼ１（「ＣＫＩ」又は「ＣＫ１」）、サイクリン依存性キナーゼ５（「Ｃｄｋ５」、「ｃｄｋ５」又は「ＣＤＫ５」）、タンパク質ホスファターゼ１（「ＰＰ−１」）、ＡＭＰＡ受容体（「ＡＭＰＡ」）、タンパク質ホスファターゼ−２Ｃ（「ＰＰ２Ｃ」）、タンパク質ホスファターゼ−２Ｂ（「ＰＰ２Ｂ」）、又はタンパク質ホスファターゼ−２Ａ（「ＰＰ２Ａ」）活性をモジュレートする方法であって、目的の細胞又は組織をセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物の有効量と接触させることを含み、ここで上記細胞又は組織と上記化合物との接触が、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションをもたらす上記方法を提供する。
【００２２】
本発明は、ＡＭＰＡ受容体の活性を調節する方法であって、本発明の化合物、例えば、本発明の方法により同定された化合物の有効量を（例えば、個人、患者又は動物に）投与することを含み、ここで上記化合物がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートし、そしてＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションが、ニューロンにおけるＡＭＰＡ受容体の活性の改変をもたらす上記方法を提供する。特定の実施形態においては、上記ＡＭＰＡ受容体は興奮細胞、例えばニューロンにおけるものである。他の実施形態においては、上記方法は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートするために５−ＨＴＲアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含み、それによりＡＭＰＡ受容体の活性を改変する。
【００２３】
本発明は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする薬剤、医薬又は化合物を同定する、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供する。そのような方法は、単独で又は互いに組み合わせて使用することができる。一実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ；上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ；及び上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【００２４】
他の実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ；目的の細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルを測定するステップ；上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ；上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップ；ならびに上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差ならびにＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルと第２レベルとの差がＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【００２５】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｔｈｒ３４−リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２又はＳｅｒ１３７−リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を増大させる、あるいはＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を低減させる薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤はセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路分子の活性を増大させる上記方法を提供する。
【００２６】
本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによりセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートしうる薬剤を同定するｉｎ ｖｉｖｏの方法も提供する。そのような方法は、単独で又は本明細書に開示したｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｓｉｔｕの方法と一緒に使用することができる。１つのそのような方法は、薬剤の非ヒト哺乳動物への投与を含むものである。次いでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性化の量（及び／又は速度）を測定する。活性化の量（及び／又は速度）が薬剤の不在下と比較して、薬剤の存在下で増大するか又は低減するときに、該薬剤はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによりセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートすることができると同定される。好ましい実施形態においては、非ヒト哺乳動物はげっ歯類である。さらに好ましい実施形態においては、げっ歯類はマウスである。
【００２７】
本発明はまた、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を改善する可能性のある及び／又はそれらの治療に使用しうる薬剤を選択する目的で、候補薬剤（又は医薬若しくは化合物）をスクリーニングする方法も提供する。
【００２８】
本発明はまた、薬剤（又は医薬若しくは化合物）を同定する方法、例えば、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療法に使用することができる医薬の医薬スクリーニングアッセイを提供する。特定の実施形態においては、上記方法は、Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２、Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２、又はＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化（又は脱リン酸化）の量の増大（又は低減）を検出することを含む。
【００２９】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を改変する薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤が、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートするものである上記方法を提供する。
【００３０】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＣｄｋ５及びＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｔｈｒ７５脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＴｈｒ７５脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【００３１】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を低減する薬剤を上記患者に投与することを含み、該薬剤がＰＰ−１活性を低減するものである上記方法を提供する。
【００３２】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＰＰ−１及びＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【００３３】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を低減する薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＰＰ２Ｃ活性を低減するものである上記方法を提供する。
【００３４】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＰＰ２Ｃ及びＳｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＳｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【００３５】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を阻害する薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤が、ＰＰ２Ｂ活性を低減するものである上記方法を提供する。
【００３６】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＰＰ２Ｂ及びＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【００３７】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を増大する薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤が、ＰＰ２Ａ活性を低減するものである上記方法を提供する。
【００３８】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＰＰ２Ａ及びＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の増大が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【００３９】
別の実施形態においては、本発明は、細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化を調節する方法であって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションが、細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の改変をもたらすものである上記方法を提供する。
【００４０】
本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする組成物を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートし、それにより５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を改善することが可能な薬剤を開発するための合理的薬物設計を実施する方法を提供する。
【００４２】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるカゼインキナーゼ１の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるカゼインキナーゼ１活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるカゼインキナーゼ１活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、カゼインキナーゼ１活性の第１レベルと第２レベルとの差がカゼインキナーゼ１活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、カゼインキナーゼ１活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００４３】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、サイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、サイクリン依存性キナーゼ５活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００４４】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルと第２レベルとの差がＡＭＰＡ受容体活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＡＭＰＡ受容体活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００４５】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＰＰ−１の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＰＰ−１活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＰＰ−１活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＰＰ−１活性の第１レベルと第２レベルとの差がＰＰ−１活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＰＰ−１活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００４６】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃ活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＰＰ２Ｃ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＰＰ２Ｃ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＰＰ２Ｃ活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００４７】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂ活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＰＰ２Ｂ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＰＰ２Ｂ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＰＰ２Ｂ活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００４８】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＰＰ２Ａ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＰＰ２Ａ活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００４９】
本発明はまた、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療のための診断方法及び治療方法、例えば限定されるものではないが、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療における本発明の組成物又は化合物の使用、を提供する。
【００５０】
一態様において、本発明は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路のモジュレーションを特徴とするニューロンの状態を治療する方法であって、その治療が必要な被験者に対し、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする本発明の化合物の有効量を投与し、それにより、５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路のモジュレーションによってＡＭＰＡ受容体活性及び／若しくはＤＡ細胞内シグナル伝達経路の活性を増大又は低減させることを含む上記方法を提供する。
【００５１】
特定の実施形態において、５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路は、（ｉ）Ｔｈｒ−３４のＰＫＡリン酸化のｃＡＭＰ活性化を増大させる５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化、（ｉｉ）Ｔｈｒ−７５のタンパク質ホスファターゼ−２Ａ（ＰＰ−２Ａ）の脱リン酸化のＰＫＡ活性化のｃＡＭＰ活性化を増大させる５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化、並びに／又は（ｉｉｉ）ＰＬＣの活性化を増大させ、それがまたＳｅｒ−１３７のＣＫ１依存的リン酸化のカルシウム活性化を増大させる５−ＨＴ２受容体の活性化を含む。
【００５２】
従って、これらの相互作用に影響を及ぼす本発明の方法により同定される化合物はいずれも、５−ＨＴＲ関連障害の治療用処置の基礎として機能する可能性があり、従って、上記相互作用に関与するタンパク質は全て本明細書に記載のアッセイに用いることができる。
【００５３】
本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートするために本発明の化合物の有効量を投与することによる、個体（例えば患者）又は動物被験体の５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療方法を提供する。一実施形態において、薬剤は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性を促進又は増大させる。別の実施形態において、薬剤は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性を阻害又は低減させる。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明は、治療を必要とする患者における５−ＨＴ関連障害の治療方法であって、ＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ３４、Ｔｈｒ７５及び／又はＳｅｒ１３７におけるリン酸化をモジュレートする薬剤を該患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートするものである上記方法を提供する。特定の実施形態では、薬剤は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａへの結合によりその活性をモジュレートする。
【００５５】
本発明は、５−ＨＴＲ関連、ＣＫ１関連、Ｃｄｋ５関連、ＡＭＰＡ受容体関連、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害、疾患、及び／又は状態の症状を示す患者又は被験者において、上記症状を改善しうる本発明の薬剤（又は医薬若しくは化合物）を投与する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の症状を示す患者又は被験者において、上記症状を改善しうる、本明細書に開示する方法により同定された薬剤を投与する方法を提供する。他の実施形態においては、５−ＨＴＲ活性のアゴニストを、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療に用い得る。また別の実施形態においては、５−ＨＴＲ活性のアンタゴニストを、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療に用い得る。
【００５６】
本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする組成物を提供する。また本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによりＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする組成物を提供する。本発明は、本明細書に開示する本発明の薬剤（又は医薬若しくは化合物）の医薬組成物も提供する。本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性を調節する、並びに５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を診断又は治療するための医薬組成物を包含する。特定の実施形態においては、正常な機能の低下が上述した疾患又は障害（例えば鬱病）の表現型の発現をもたらしうるものであるため、セロトニン受容体（５−ＨＴＲ）シグナル伝達経路の活性化、又はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの増大（例えば下流の活性化）によって、かかる疾患（例えば鬱病）の症状を示す個体における症状の改善が促進される。
【００５７】
本発明はまた、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路をモジュレートすることによりドーパミン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートする組成物を提供する。また本発明は、本明細書に開示する本発明の薬剤（又は医薬若しくは化合物）の医薬組成物を提供する。本発明は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路をモジュレートすることによりドーパミン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートするための、及びＤＡ関連障害の診断又は治療のための医薬組成物を包含する。特定の実施形態においては、正常なドーパミン様機能の低減によってＤＡ関連障害（例えばパーキンソン病）の表現型の発現がもたらされうるため、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路を介した又はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレートによるＤＡＲＰＰ−３２の活性化により、ドーパミン作動性神経伝達とは独立したＤＡ関連障害の症状を示す個体における症状の改善を促進しうる。従って本発明において、セロトニン作動性神経伝達又はセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性を増強する薬剤、あるいはＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする薬剤は、ドーパミンとは独立して改善効果を発揮するものであり、ＤＡ関連障害の治療に用い得る。
【００５８】
３．１．定義
本明細書に使用される用語「モジュレート（modulate）」又は「モジュレーション（modulation）」はその通常の意味を有し、用語「増強する（enhance）」、「阻害する（inhibit）」及び「模倣する（mimic）」の意味を包含する。活性の「モジュレーション」は、活性の増大又は低減であってもよい。
【００５９】
本明細書に使用される用語「アゴニスト」は直接的又は間接的に、受容体を介して又は受容体に作用して薬理学的効果を生じるいずれかの化合物であり、一方、「アンタゴニスト」は受容体の刺激を遮断してその薬理学的効果を生じる任意の化合物である。
【００６０】
本明細書に使用される用語、モジュレートする化合物（modulatory compound）の「有効量」は、本明細書に開示したような分析方法を利用する研究から得たデータに基づいて当業者が決定することができる量である。上記データは、限定されるものでないが、以下の第５．６．節に考察したＩＣ５０測定から得た結果を含んでもよい。
【００６１】
本明細書に使用される用語「セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路」は、「セロトニン作動性細胞内シグナル伝達カスケード」、「セロトニン作動性シグナル伝達カスケード」、「５−ＨＴ受容体細胞内シグナル伝達経路」、「５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路」又は類似の略語と互換的に用いられる。
【００６２】
本明細書に使用される用語「ＤＡＲＰＰ−３２」は、「ドーパミン及びサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）調節性リンタンパク質（Dopamine-and cAMP-Regulated PhosphoProtein）」及び「ＤＡＲＰＰ３２」と互換的に用いられ、新線条体（neostriatum）の中間サイズ有刺ニューロン（medium-sized spiny neurons）が選択的に濃縮された３２キロダルトンの細胞質ゾルタンパク質である。ヒト、マウス、ラット及びウシＤＡＲＰＰ−３２アミノ酸配列は、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Ｂｉｂｂらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号に開示されている（それぞれ配列番号１〜４を参照のこと）。
【００６３】
本明細書に使用される用語「Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２」は、「Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ３２」、「ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２」、「トレオニン（Threonine）−７５  ＤＡＲＰＰ−３２」及び「トレオニン（threonine）−７５  ＤＡＲＰＰ−３２」ならびに類似の略語と互換的に用いられ、Breneら（J. Neurosci. 14: 985-998 (1994)）により開示されてＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ３０１２９．１を有するＤＡＲＰＰ−３２のアミノ酸配列中の７５番目のアミノ酸残基を示し、これは、本明細書に開示したように、Ｃｄｋ５によりリン酸化しうるトレオニン残基である。
【００６４】
本明細書に使用される用語「ホスホ−Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２」又は以上開示した類似の略語はＴｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化型を示す。
【００６５】
本明細書に使用される用語「Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２」は、「Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ３２」、「ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２」、「トレオニン（Threonine）−３４  ＤＡＲＰＰ−３２」、及び「トレオニン（threonine）−３４  ＤＡＲＰＰ−３２」ならびに類似の略語と互換的に用いられ、Breneら（J. Neurosci. 14: 985-998 (1994)）により開示されて受託番号ＡＡＢ３０１２９．１を有するＤＡＲＰＰ−３２のアミノ酸配列中の３４番目のアミノ酸残基を示し、これは、本明細書に開示したように、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）によりリン酸化しうるトレオニン残基である。
【００６６】
本明細書に使用される用語「ホスホ−Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２」又は以上に開示した類似の略語はＴｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化型を示す。
【００６７】
本明細書に使用される用語「Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２」は、「Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ３２」、「ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２」、「セリン−１３７  ＤＡＲＰＰ−３２」、及び「セリン−１３７  ＤＡＲＰＰ−３２」ならびに類似の略語と互換的に用いられ、Breneら（J. Neurosci. 14: 985-998 (1994)）により開示されて受託番号ＡＡＢ３０１２９．１を有するＤＡＲＰＰ−３２のアミノ酸配列中の１３７番目のアミノ酸残基を示し、これは、本明細書に開示したように、ＣＫ１によりリン酸化されうるセリン残基である。
【００６８】
本明細書に使用される用語「ホスホ−Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２」又は以上に開示した類似の略語はＳｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化型を示す。
【００６９】
本明細書に使用される用語「ＣＫ１」、「カゼインキナーゼＩ」又は「ＣＫＩ」は、「カゼインキナーゼ１」と互換的に用いられる。ＣＫ１はセリン／トレオニンプロテインキナーゼのメンバーである。ＣＫ１は、限定されるものでないが、少なくとも７種の別の遺伝子によりコードされた多重イソ型からなるＣＫ１（ＣＫＩ）ファミリー（ＣＫ１α、β、γｉ、γ２、γ３、δ、ε；Desdouits, F.ら 1995. J. Biol. Chem. 270:8772-8778；Grossら, 1998, Cell Signal 10(10):699-711；Vielhaberら, 2001, IUBMB Life 51(2), 73-8）のメンバーを含む。
【００７０】
本明細書に使用される「ＣＫ１の類似体」は「ＣＫ１の同族体」と互換的に用いられ、ＣＫ１のようにＤＡＲＰＰ−３２をＳｅｒ１３７においてリン酸化するプロテインキナーゼである。
【００７１】
本明細書に使用される用語「ＤＡＲＰＰ−３２のＣＫ１リン酸化可能な断片」は、脱リン酸化型のときに、ＣＫ１によりリン酸化することができるセリン残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２のタンパク質断片である。配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＤＡＲＰＰ−３２については、上記セリン残基は好ましくはＳｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２である。このような断片は約５〜１００個、好ましくは１０〜５０個の残基を有してもよい。例えば、特定の実施形態においては、ペプチド断片はＳｅｒ１３７を含む配列番号１由来の５個の連続アミノ酸を含んでなる。このタイプの他の実施形態においては、ペプチド断片はＳｅｒ１３７を含む配列番号１由来の７個の連続アミノ酸を含んでなる。別の実施形態においては、ペプチド断片はＳｅｒ１３７を含む配列番号１由来の１０〜２５個の連続アミノ酸を含んでなる。全てのペプチド断片は融合ペプチド又は融合タンパク質の部分であってもよい。ＣＫ１リン酸化可能なＤＡＲＰＰ−３２の断片は、当技術分野で公知の方法により、例えばホスホ−Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質のさらに大きい断片から若しくは全長ホスホ−Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質からリン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断し脱リン酸化することにより調製してもよい。このように、これらの断片は、以下に記載した標準ペプチド合成法により合成するか、又は組換えＤＮＡ技術を介して若しくは古典的タンパク分解法により作製することができる。
【００７２】
本明細書に使用される用語「ＣＤＫ５」、「Ｃｄｋ５」又は「ｃｄｋ５」は、ニューロンサイクリン依存性様タンパク質（Ｎｃｌｋ）及びタウプロテインキナーゼＩＩ（ＴＰＫＩＩ）としても知られる「サイクリン依存性キナーゼ５」と互換的に用いられる。Ｃｄｋ５はサイクリン依存性キナーゼのメンバーであるが、例外的にＣｄｋ５はサイクリンよりもニューロンサイクリン依存性様キナーゼ５関連タンパク質（Ｎｃｋ５ａ）（neuronal cyclin-dependent-like kinase 5 associated protein）と呼ばれる非サイクリン補助因子を使用する。用語「Ｃｄｋ５」をキナーゼ反応の記載に用いるとき、その活性型、すなわち、「Ｃｄｋ５／Ｎｃｋ５ａ複合体」（本明細書に以下に記載した）は実触媒因子及び／又はＣｄｋ５の触媒活性の少なくとも１０％を保持するＣｄｋ５の断片であってもよいと理解すべきである。
【００７３】
本明細書に使用される用語「Ｃｄｋ５の類似体」は、「Ｃｄｋ５の同族体」と互換的に用いられ、Ｃｄｋ５のようにＤＡＲＰＰ−３２をトレオニン−７５でリン酸化し、しかしトレオニン−３４でリン酸化しない。そのような類似体の１つはｃｄｋ１である。
【００７４】
本明細書に使用される用語「Ｎｃｋ５ａ」は、「ニューロンサイクリン依存性様キナーゼ５関連タンパク質（neuronal cyclin-dependent-like kinase 5 associated protein）」と互換的に用いられ、Ｃｄｋ５の非サイクリン補助因子である。脳には少なくとも２つのＮｃｋ５ａのイソ型（ｐ３５及びｐ３９）があり、これらはタンパク分解性断片（すなわち、それぞれｐ２５及びｐ２９）としても存在する。
【００７５】
本明細書に使用される用語「Ｃｄｋ５／Ｎｃｋ５ａ複合体」は、Ｃｄｋ５とＮｃｋ５ａの間に形成された複合体を表し、Ｃｄｋ５キナーゼの活性型である。
【００７６】
本明細書に使用される「ＤＡＲＰＰ−３２のＣｄｋ５リン酸化可能断片」は、脱リン酸化型であるときにＣｄｋ５によりリン酸化することができるトレオニン残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２のタンパク質断片である。配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＤＡＲＰＰ−３２については、上記トレオニン残基は好ましくはＴｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２である。このような断片は約５〜１００個、好ましくは１０〜５０個の残基を有してもよい。例えば、特定の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ７５を含む配列番号１由来の５個の連続アミノ酸を含んでなる。このタイプの他の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ７５を含む配列番号１由来の７個の連続アミノ酸を含んでなる。別の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ７５を含む配列番号１由来の１０〜２５個の連続アミノ酸を含んでなる。全てのペプチド断片は融合ペプチド又は融合タンパク質の部分であってもよい。Ｃｄｋ５リン酸化可能なＤＡＲＰＰ−３２の断片は、当技術分野で公知の方法により、例えば脱リン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断しリン酸化することによるか、又はホスホ−Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質のさらに大きい断片から若しくは全長ホスホ−Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質からリン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断することにより調製してもよい。このように、これらの断片は、以下に記載した標準ペプチド合成法により合成するか、又は組換えＤＮＡ技術を介して若しくは古典的タンパク分解法により作製することができる。
【００７７】
本明細書に使用される「ＤＡＲＰＰ−３２のＰＰ２Ｃ脱リン酸化可能断片」は、リン酸化型であるときにＰＰ２Ｃにより脱リン酸化することができるセリン残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２のタンパク質断片である。配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＤＡＲＰＰ−３２については、上記セリン残基は好ましくはＳｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２である。このような断片は約５〜１００個、好ましくは１０〜５０個の残基を有してもよい。例えば、特定の実施形態においては、ペプチド断片はＳｅｒ１３７を含む配列番号１由来の５個の連続アミノ酸を含んでなる。このタイプの他の実施形態においては、ペプチド断片はＳｅｒ１３７を含む配列番号１由来の７個の連続アミノ酸を含んでなる。別の実施形態においては、ペプチド断片はＳｅｒ１３７を含む配列番号１由来の１０〜２５個の連続アミノ酸を含んでなる。全てのペプチド断片は融合ペプチド又は融合タンパク質の部分であってもよい。ＰＰ２Ｃ脱リン酸化可能なＤＡＲＰＰ−３２の断片は、当技術分野で公知の方法により、例えば脱リン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断しリン酸化することによるか、又はホスホ−Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質のさらに大きい断片から若しくは全長ホスホ−Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質からリン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断することにより調製してもよい。このように、これらの断片は、以下に記載した標準ペプチド合成法により合成するか、又は組換えＤＮＡ技術を介して若しくは古典的タンパク分解法により作製することができる。
【００７８】
本明細書に使用される「ＤＡＲＰＰ−３２のＰＰ２Ｂ脱リン酸化可能断片」は、リン酸化型であるときにＰＰ２Ｂにより脱リン酸化することができるトレオニン残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２のタンパク質断片である。配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＤＡＲＰＰ−３２については、上記トレオニン残基は好ましくはＴｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２である。このような断片は約５〜１００個、好ましくは１０〜５０個の残基を有してもよい。例えば、特定の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ３４を含む配列番号１由来の５個の連続アミノ酸を含んでなる。このタイプの他の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ３４を含む配列番号１由来の７個の連続アミノ酸を含んでなる。別の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ３４を含む配列番号１由来の１０〜２５個の連続アミノ酸を含んでなる。全てのペプチド断片は融合ペプチド又は融合タンパク質の部分であってもよい。ＰＰ２Ｂ脱リン酸化可能なＤＡＲＰＰ−３２の断片は、当技術分野で公知の方法により、例えば脱リン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断しリン酸化することによるか、又はホスホ−Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質のさらに大きい断片から若しくは全長ホスホ−Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質からリン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断することにより調製してもよい。このように、これらの断片は、以下に記載した標準ペプチド合成法により合成するか、又は組換えＤＮＡ技術を介して若しくは古典的タンパク分解法により作製することができる。
【００７９】
本明細書に使用される「ＤＡＲＰＰ−３２のＰＰ２Ａ脱リン酸化可能断片」は、リン酸化型であるときにＰＰ２Ａにより脱リン酸化することができるトレオニン残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２のタンパク質断片である。配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＤＡＲＰＰ−３２については、上記トレオニン残基は好ましくはＴｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２である。このような断片は約５〜１００個、好ましくは１０〜５０個の残基を有してもよい。例えば、特定の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ７５を含む配列番号１由来の５個の連続アミノ酸を含んでなる。このタイプの他の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ７５を含む配列番号１由来の７個の連続アミノ酸を含んでなる。別の実施形態においては、ペプチド断片はＴｈｒ７５を含む配列番号１由来の１０〜２５個の連続アミノ酸を含んでなる。全てのペプチド断片は融合ペプチド又は融合タンパク質の部分であってもよい。ＰＰ２Ａ脱リン酸化可能なＤＡＲＰＰ−３２の断片は、当技術分野で公知の方法により、例えば脱リン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断しリン酸化することによるか、又はホスホ−Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質のさらに大きい断片から若しくは全長ホスホ−Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質からリン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断することにより調製してもよい。このように、これらの断片は、以下に記載した標準ペプチド合成法により合成するか、又は組換えＤＮＡ技術を介して若しくは古典的タンパク分解法により作製することができる。
【００８０】
本明細書に使用される場合、キナーゼ反応における、本明細書において上述したＤＡＲＰＰ−３２又はＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化可能断片のリン酸化の量及び／又は速度が「有意に変化した」というのは、ＤＡＲＰＰ−３２又はＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化可能断片のリン酸化の量及び／又は速度が対照反応と比較して少なくとも約１０〜２５％だけ増大又は低減したときである。好ましくは、候補モジュレーターの存在下で観察される目的の分子（例えばＣＫ１又はＣｄｋ５）によるＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の速度の有意な変化は、ある点で該反応のミカエリス定数（例えば、Ｖｍａｘ又はＫｉｎ）と相関がある。例えば、インヒビターの場合、ＫＩを決定してもよい。このように、ある特定の実施形態においては、反応混合物中の様々な濃度のモジュレーターを研究して、候補モジュレーターのモジュレーターとしての同定を可能にすることが好ましい。
【００８１】
本明細書に使用される場合、ホスファターゼ反応における、本明細書において上述したＤＡＲＰＰ−３２又はＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能断片の脱リン酸化の量及び／又は速度が「有意に変化した」というのは、ＤＡＲＰＰ−３２又はＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能断片の脱リン酸化の量及び／又は速度が対照反応と比較して少なくとも約１０〜２５％だけ増大又は低減したときである。好ましくは、候補モジュレーターの存在下で観察される目的の分子（例えばＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ又はＰＰ２Ａ）によるＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の速度の有意な変化は、ある点で該反応のミカエリス定数（例えば、Ｖｍａｘ又はＫｉｎ）と相関がある。例えば、インヒビターの場合、ＫＩを決定してもよい。このように、ある特定の実施形態においては、反応混合物中の様々な濃度のモジュレーターを研究して、候補モジュレーターのモジュレーターとしての同定を可能にすることが好ましい。
【００８２】
本明細書に使用される用語「５−ＨＴＲ関連障害」は、用語「セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路障害」、「５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路障害」、「５−ＨＴＲ障害」、「５−ＨＴＲ症状」、「５−ＨＴＲ機能障害」、「５−ＨＴＲ関連機能障害」、「５−ＨＴＲ関連疾患」、「５−ＨＴＲ関連症状」、「５−ＨＴＲシグナル伝達経路の調節障害」、「５−ＨＴＲシグナル伝達経路調節障害」、又はその類似の略語と互換的に用いられる。５−ＨＴＲ関連障害としては、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌が挙げられる。５−ＨＴＲ関連障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織若しくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）におけるセロトニン受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常若しくは調節障害に関わる疾患（例えば鬱病）又は症状（例えばコカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。５−ＨＴＲ関連障害はまた、限定されるものでないが、５−ＨＴＲ関連障害の症候群も含む。特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、ＤＡＲＰＰ−３２の１以上の特異的トレオニン及び／又はセリン残基のリン酸化及び／又は脱リン酸化の刺激及び／又は阻害に関わる調節異常の対応する治療による、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化及び／又は脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【００８３】
本明細書に使用される用語「ＣＫ１関連障害」は、「ＣＫ１障害」、「ＣＫ１症状」、「ＣＫ１機能障害」、「ＣＫ１関連機能障害」、「ＣＫ１関連疾患」、「ＣＫ１関連症状」、「ＣＫ１機能の調節障害」、又は「ＣＫ１機能調節障害」と互換的に用いられる。ＣＫ１関連障害としては、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌が挙げられる。ＣＫ１関連障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織若しくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）におけるセロトニン受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常若しくは調節障害に関わる疾患（例えば鬱病）又は症状（例えばコカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。ＣＫ１関連障害はまた、限定されるものでないが、ＣＫ１関連障害の症候群も含む。特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、ＤＡＲＰＰ−３２の１以上の特異的トレオニン及び／又はセリン残基のリン酸化及び／又は脱リン酸化の刺激及び／又は阻害に関わる調節異常の対応する治療による、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化及び／又は脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【００８４】
本明細書に使用される用語「Ｃｄｋ５関連障害」は、「Ｃｄｋ５障害」、「Ｃｄｋ５症状」、「Ｃｄｋ５機能障害」、「Ｃｄｋ５関連機能障害」、「Ｃｄｋ５関連疾患」、「Ｃｄｋ５関連症状」、「Ｃｄｋ５機能の調節障害」、又は「Ｃｄｋ５機能調節障害」と互換的に用いられる。Ｃｄｋ５関連障害としては、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌が挙げられる。Ｃｄｋ５関連障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織若しくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）におけるセロトニン受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常若しくは調節障害に関わる疾患（例えば鬱病）又は症状（例えばコカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。Ｃｄｋ５関連障害はまた、限定されるものでないが、Ｃｄｋ５関連障害の症候群も含む。特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、ＤＡＲＰＰ−３２の１以上の特異的トレオニン及び／又はセリン残基のリン酸化及び／又は脱リン酸化の刺激及び／又は阻害に関わる調節異常の対応する治療による、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化及び／又は脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【００８５】
本明細書に使用される用語「ＡＭＰＡ受容体関連障害」は、「ＡＭＰＡ受容体障害」、「ＡＭＰＡ受容体症状」、「ＡＭＰＡ受容体機能障害」、「ＡＭＰＡ受容体関連機能障害」、「ＡＭＰＡ受容体関連疾患」、「ＡＭＰＡ受容体関連症状」、「ＡＭＰＡ受容体機能の調節障害」、又は「ＡＭＰＡ受容体機能調節障害」と互換的に用いられる。ＡＭＰＡ受容体関連障害としては、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌が挙げられる。ＡＭＰＡ受容体関連障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織若しくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）におけるセロトニン受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常若しくは調節障害に関わる疾患（例えば鬱病）又は症状（例えばコカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。ＡＭＰＡ受容体関連障害はまた、限定されるものでないが、ＡＭＰＡ受容体関連障害の症候群も含む。特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、ＤＡＲＰＰ−３２の１以上の特異的トレオニン及び／又はセリン残基のリン酸化及び／又は脱リン酸化の刺激及び／又は阻害に関わる調節異常の対応する治療による、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化及び／又は脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【００８６】
本明細書に使用される用語「ＰＰ−１関連障害」は、「ＰＰ−１障害」、「ＰＰ−１症状」、「ＰＰ−１機能障害」、「ＰＰ−１関連機能障害」、「ＰＰ−１関連疾患」、「ＰＰ−１関連症状」、「ＰＰ−１機能の調節障害」、又は「ＰＰ−１機能調節障害」と互換的に用いられる。ＰＰ−１関連障害としては、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌が挙げられる。ＰＰ−１関連障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織若しくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）におけるセロトニン受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常若しくは調節障害に関わる疾患（例えば鬱病）又は症状（例えばコカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。ＰＰ−１関連障害はまた、限定されるものでないが、ＰＰ−１関連障害の症候群も含む。特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、ＤＡＲＰＰ−３２の１以上の特異的トレオニン及び／又はセリン残基のリン酸化及び／又は脱リン酸化の刺激及び／又は阻害に関わる調節異常の対応する治療による、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化及び／又は脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【００８７】
本明細書に使用される用語「ＰＰ２Ｃ関連障害」は、「ＰＰ２Ｃ障害」、「ＰＰ２Ｃ症状」、「ＰＰ２Ｃ機能障害」、「ＰＰ２Ｃ関連機能障害」、「ＰＰ２Ｃ関連疾患」、「ＰＰ２Ｃ関連症状」、「ＰＰ２Ｃ機能の調節障害」、又は「ＰＰ２Ｃ機能調節障害」と互換的に用いられる。ＰＰ２Ｃ関連障害としては、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌が挙げられる。ＰＰ２Ｃ関連障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織若しくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）におけるセロトニン受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常若しくは調節障害に関わる疾患（例えば鬱病）又は症状（例えばコカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。ＰＰ２Ｃ関連障害はまた、限定されるものでないが、ＰＰ２Ｃ関連障害の症候群も含む。特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、ＤＡＲＰＰ−３２の１以上の特異的トレオニン及び／又はセリン残基のリン酸化及び／又は脱リン酸化の刺激及び／又は阻害に関わる調節異常の対応する治療による、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化及び／又は脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【００８８】
本明細書に使用される用語「ＰＰ２Ｂ関連障害」は、「ＰＰ２Ｂ障害」、「ＰＰ２Ｂ症状」、「ＰＰ２Ｂ機能障害」、「ＰＰ２Ｂ関連機能障害」、「ＰＰ２Ｂ関連疾患」、「ＰＰ２Ｂ関連症状」、「ＰＰ２Ｂ機能の調節障害」、又は「ＰＰ２Ｂ機能調節障害」と互換的に用いられる。ＰＰ２Ｂ関連障害としては、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌が挙げられる。ＰＰ２Ｂ関連障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織若しくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）におけるセロトニン受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常若しくは調節障害に関わる疾患（例えば鬱病）又は症状（例えばコカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。ＰＰ２Ｂ関連障害はまた、限定されるものでないが、ＰＰ２Ｂ関連障害の症候群も含む。特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、ＤＡＲＰＰ−３２の１以上の特異的トレオニン及び／又はセリン残基のリン酸化及び／又は脱リン酸化の刺激及び／又は阻害に関わる調節異常の対応する治療による、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化及び／又は脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【００８９】
本明細書に使用される用語「ＰＰ２Ａ関連障害」は、「ＰＰ２Ａ障害」、「ＰＰ２Ａ症状」、「ＰＰ２Ａ機能障害」、「ＰＰ２Ａ関連機能障害」、「ＰＰ２Ａ関連疾患」、「ＰＰ２Ａ関連症状」、「ＰＰ２Ａ機能の調節障害」、又は「ＰＰ２Ａ機能調節障害」と互換的に用いられる。ＰＰ２Ａ関連障害としては、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌が挙げられる。ＰＰ２Ａ関連障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織若しくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）におけるセロトニン受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常若しくは調節障害に関わる疾患（例えば鬱病）又は症状（例えばコカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。ＰＰ２Ａ関連障害はまた、限定されるものでないが、ＰＰ２Ａ関連障害の症候群も含む。特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、ＤＡＲＰＰ−３２の１以上の特異的トレオニン及び／又はセリン残基のリン酸化及び／又は脱リン酸化の刺激及び／又は阻害に関わる調節異常の対応する治療による、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化及び／又は脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【００９０】
本明細書に使用される用語「ＤＡ関連障害」は、「ドーパミン関連障害」、「ＤＡ障害」、「ドーパミン作動性障害」、又はその類似の略語と互換的に用いられる。ＤＡ関連障害としては、限定されるものでないが、統合失調症、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、ツレット症候群、レッシュ−ナイハン病、疼痛、ジストマ症、及び薬物乱用が挙げられる。
【００９１】
本明細書に使用される用語「小有機分子」は、３キロダルトン未満、好ましくは１．５キロダルトン未満の分子量を有する有機化合物（又は無機化合物（例えば、金属）と錯体を形成した有機化合物）である。小有機分子は血液−脳関門を通過しうることが好ましい。
【００９２】
本明細書に使用される用語「約」は１０〜１５％以内、好ましくは５〜１０％以内を意味する。例えば、約６０個のアミノ酸残基を含有するアミノ酸配列は５１〜６９アミノ酸残基、さらに好ましくは５７〜６３アミノ酸残基を含有してもよい。
【００９３】
４．図面の説明
図１（Ａ〜Ｆ）は、新線条体の切片におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のセロトニンによる調節である。新線条体における、ＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ３４（Ａ及びＤ）、Ｔｈｒ７５（Ｂ及びＥ）、並びにＳｅｒ１３７（Ｃ及びＦ）でのリン酸化のセロトニンによる調節の時間経過（Ａ〜Ｃ）及び用量応答研究（Ｄ〜Ｆ）である。（Ａ〜Ｃ）セロトニンを１００μＭで使用した。（Ｄ、Ｆ）切片を、ホスホ−Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２の研究については２分間、ホスホ−Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２の研究については１０分間インキュベートした。データは、平均（±ＳＥ）（ｎ＝６−１０）を表す。対照と比較して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；一方向ＡＮＯＶＡとその後ダネット検定を行った。詳細については第６節参照。
【００９４】
図２は、ＰＣＡ及び５−ＨＴＰによるｉｎ ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。マウスに、生理食塩水、ＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ）、又は５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉｐ）注射した。１５分後に焦点電波照射によりマウスを死滅させた。データは、グループ毎５〜１０匹のマウスについて平均±ＳＥを表す。生理食塩水処置マウスと比較して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；一方向ＡＮＯＶＡとその後ダネット検定を行った。詳細については第６節参照。
【００９５】
図３（Ａ〜Ｃ）は、野生型（ＷＴ）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウスにおけるＰＣＡ及び５−ＨＴＰによるｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡ発現の調節を示す。（Ａ）野生型（ＷＴ）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウスにおける生理食塩水、ＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ）又は５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）による処置の２０分後のｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡの発現を示す暗視野オートラジオグラム（倍率×５）。（Ｂ及びＣ）ヒストグラムは、それぞれの処置後の線条体の脳室周辺領域（Ａ）、及び帯状皮質（Ｃ）におけるｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡの発現の量を示す。野生型（ＷＴ）、黒棒；ＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯ、白棒。データは、グループ毎５〜８匹のマウスについて平均±ＳＥを表す。生理食塩水処置マウスと比較して、＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；同じ処置を行ったＷＴマウスと比較して、＃、Ｐ＜０．０５；＃＃、Ｐ＜０．０１；一方向ＡＮＯＶＡとその後ダネット検定を行った。詳細については第６節参照。
【００９６】
図４は、野生型（ＷＴ）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウスにおけるＰＣＡ及び５−ＨＴＰによる処置に対する行動応答を示す。野生型（ＷＴ）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウスにおける総移動（上）及び常同行為（下）に対するＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ；左）及び５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ；右）の影響。データは、グループ毎６〜１０匹のマウスについて平均±ＳＥを表す。生理食塩水処置マウスと比較して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；同じ処置を行ったＷＴマウスと比較して、＃＃＃、Ｐ＜０．００１；＃＃、Ｐ＜０．０１；＃、Ｐ＜０．０５；二方向ＡＮＯＶＡとその後ダネット検定を行った。詳細については第６節参照。
【００９７】
図５は、セロトニン作動性神経伝達の増強がＴｈｒ３４、Ｔｈｒ７５、及びＳｅｒ１３７におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節するモデル集合経路を示す。５−ＨＴ４又は５−ＨＴ６受容体の活性化は、連続的にｃＡＭＰレベル、ＰＫＡの活性及びＴｈｒ３４のリン酸化を増強する。活性化ＰＫＡはまたタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ−２Ａ）をリン酸化及び活性化し（Nishiら、2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,12840-12845）、Ｃｄｋ５部位、Ｔｈｒ７５の脱リン酸化を生じ（Bibbら、1999, Nature (London) 402,66671）、ＰＫＡの阻害を除去し（Bibbら、1999, Nature (London) 402,669-671）、そしてＴｈｒ３４のリン酸化を増大させる。５−ＨＴ２受容体はＰＬＣを活性化し、カゼインキナーゼ−１（ＣＫ１）活性（２００１年６月１８日出願の米国特許仮出願第６０／２９８，９７８号、参照によりその全文を本明細書に組み入れる）、Ｓｅｒ１３７のリン酸化、及びタンパク質ホスファターゼ−２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）によるＴｈｒ３４の脱リン酸化の阻害（Desdouitsら、1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,2682-2685）を増大させる。これらのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの種々の作用は相乗作用であり、それぞれがＴｈｒ３４のリン酸化状態の増大、及びＰＰ−１の阻害の増大をもたらす（Hemmingsら、1984, Nature (London) 310,503-505）。実線は活性化を示し、破線は阻害を示す。詳細については第６節参照。
【００９８】
図６は、フルオキセチンでの短時間処置によるｉｎ ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。データは、生理食塩水又はフルオキセチン（５、１０又は２０ｍｇ／ｋｇ）で処置し、注射の１５分に死滅させたマウスについて示す。ホスホ−Ｔｈｒ−３４  ＤＡＲＰＰ−３２（■）及びホスホ−Ｔｈｒ−７５  ＤＡＲＰＰ−３２（黒三角）の量を、海馬（左パネル）、前前頭皮質（中央パネル）、及び線条体（右パネル）で定量し、ホスホ−Ｓｅｒ−１３７  ＤＡＲＰＰ−３２（○）の量を線条体で定量した。データは、グループ毎６〜１０匹のマウスについて平均±ＳＥを表す。生理食塩水処置マウスと比較して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；一方向ＡＮＯＶＡとその後ダネット検定を行った。詳細については第７節参照。
【００９９】
図７は、フルオキセチンでの長時間処置によるｉｎ ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。データは、生理食塩水（上）又はフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ；下）で１９日間処置し、その後フルオキセチン（生理食塩水中、０、５又は１０ｍｇ／ｋｇ）を負荷し、注射の１５分に死滅させたマウスについて示す。ホスホ−Ｔｈｒ−３４  ＤＡＲＰＰ−３２（■、□）、ホスホ−Ｔｈｒ−７５  ＤＡＲＰＰ−３２（黒三角、△）、及びホスホ−Ｓｅｒ−１３７  ＤＡＲＰＰ−３２（●、○）の量を定量し、総ＤＡＲＰＰ−３２に対して正規化した（本文参照）。データは、グループ毎４〜８匹のマウスについて平均±ＳＥを表す。生理食塩水／生理食塩水処置マウスと比較して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；フルオキセチン／生理食塩水処置マウスと比較して、+、Ｐ＜０．０５；++、Ｐ＜０．０１；生理食塩水／フルオキセチン処置マウスと比較して、＃、Ｐ＜０．０５；一方向ＡＮＯＶＡとその後ダネット検定を行った。詳細については第７節参照。
【０１００】
図８は、生理食塩水又はフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ）での１９日間にわたる長時間処置後のＤＡＲＰＰ−３２  ｍＲＮＡ及びインヒビター−１のレベルを示す。暗視野顕微鏡写真のための暴露時間は７日間、又は線条体ＤＡＲＰＰ−３２  ｍＲＮＡの場合には２日間とした。ＤＡＲＰＰ−３２  ｍＲＮＡ（左）及びインヒビター−１ｍＲＮＡ（右）の量は、海馬（上）、前前頭皮質（中央）及び線条体（下）における密度測定により定量した。データは、グループ毎４〜６匹のマウスについて平均±ＳＥを表す。生理食塩水処置マウスと比較して、＊、Ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定を行った。詳細については第７節参照。
【０１０１】
図９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセロトニン（１００μＭ）によるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。切片の抽出物におけるホスホ−Ｔｈｒ−３４  ＤＡＲＰＰ−３２（上）及びホスホ−Ｔｈｒ−７５  ＤＡＲＰＰ−３２（下）の量は、密度測定により定量した。データは、３〜１０回の実験について平均±ＳＥを表す。対照と比較して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；スチューデントのｔ検定を行った。詳細については第７節参照。
【０１０２】
図１０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセロトニン（１００μＭ）によるＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体のリン酸化の調節を示す。野生型マウス（黒棒）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウス（白棒）由来の切片の抽出物におけるホスホ−Ｓｅｒ−８３１  ＧｌｕＲ１（左）及びホスホ−Ｓｅｒ−８４５  ＧｌｕＲ１（右）の量は、密度測定による定量した。データは、３〜１０回の実験について平均±ＳＥを表す。対照と比較して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；野生型におけるセロトニンと比較して、＃、Ｐ＜０．０５；＃＃、Ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ検定を行った。詳細については第７節参照。
【０１０３】
図１１は、抗鬱効力についての尾部懸垂試験における、フルオキセチン媒介静止へのＤＡＲＰＰ−３２の関与を示す図である。野生型（ＷＴ）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウスに、試験の３０分前にフルオキセチン（５又は１０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。試験は、５分間にわたって行い、その間の静止時間を記録した。データは、グループ毎６〜１０匹のマウスについて平均±ＳＥを表す。生理食塩水を用いた場合と比較して、＃、Ｐ＜０．０５；＃＃、Ｐ＜０．０１；ＤＡＲＰＰ−３２  ＷＴマウスにおいてフルオキセチンを用いた場合と比較して、＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００１；二方向ＡＮＯＶＡとその後ダンカン検定を行った。ＷＴ、野生型；ＫＯ、ノックアウト。詳細については第７節参照。
【０１０４】
図１２は、ラット線条体由来のＰＰ２Ｃイソ型のＰＣＲ増幅を示す図である。ＰＰ２Ｃａ（レーン１）、ｂ（レーン２）、ｇ（レーン３）及びｄ（レーン４）を、ラット線条体ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、１％アガロースゲル上で分析した。ＮＥＲＰＰ（レーン５）及びＰＰ２Ｂ（レーン６）をそれぞれ陰性対照及び陽性対照として用いた。ＤＮＡ断片をゲルから単離し、ｐＥＴ２８ａ発現ベクターにクローニングした。レーン０は基準である。詳細については第８節参照。
【０１０５】
図１３（Ａ〜Ｂ）は、ラット線条体からクローニングしたＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ、及びｄイソ型のアミノ酸配列の比較を示す。配列は、非線条体イソ型であるＮＥＲＰＰ（Labesら、1998, Mol. Cell. Neurosci. 12,29-47）と共にアライメントしている。
（Ａ）ラットＰＰ２Ｃイソ型のマルチプルタンパク質アライメント。同一残基を黒背景に対する白文字で示した。保存残基は灰色背景に対する黒文字で示した。星印は金属イオンと結合する残基を示し、三角は基質のリン酸部分と相互作用するアルギニン残基を示す（Dasら、1996, EMBO J. 15,6798-6809）。
（Ｂ）種々のＰＰ２Ｃイソ型における相対類似度の概要を示す。各タンパク質の左側の数字は、その各タンパク質とＰＰ２Ｃａとのアミノ酸同一性（％）を示す。各個々の矢印と一緒に示される数字は、任意の２つのタンパク質間のアミノ酸同一性（％）を表す。ＰＰ２Ｃイソ型間の同一性％は、ＣｌｕｓｔａｌＷ法を用いて計算した。詳細については第８節参照。
【０１０６】
図１４（Ａ〜Ｄ）は、ラット脳におけるＰＰ２Ｃイソ型のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。示すようにＰＰ２Ｃａ（α，Ａ）、ｂ（β，Ｂ）、ｇ（γ、Ｃ）及びｄ（δ，Ｄ）のためのアンチセンスプローブ（ＡＳ）又はセンスプローブ（Ｓ）と共にラット脳の水平断面切片をインキュベートした。矢印はＰＰ２Ｃイソ型ｍＲＮＡの顕著な発現を示す脳領域（Ｓｔｒ：線条体；Ｈｉｐｐ：海馬；Ｃｅｒｅ：小脳；Ｃｏｒ：皮質；Ｔｈａｌ Ａｎｔ：視床の前面；Ｔｈａｌ ＰＶＮ：視床下部の室傍核）を示す。詳細については第８節参照。
【０１０７】
図１５は、ＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄのＤＮＡを担持するｐＥＴ２８ａベクターで形質転換された細菌（大腸菌）細胞からの組換えＰＰ２Ｃイソ型の精製を示す。タンパク質発現はＩＰＴＧで誘導し、Ｈｉｓタグを付した組換えＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄをＮｉ−ＮＴＡ−アガロースクロマトグラフィーを用いて精製した。アリコート（約１ｍｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。ＰＰ２Ｃａ（α）、ＰＰ２Ｃｂ（β）、ＰＰ２Ｃｇ（γ）、ＰＰ２Ｃｄ（δ）。詳細については第８節参照。
【０１０８】
図１６は、ＰＰ２Ｃイソ型によるホスホ−Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を示す。ＣＫ１によりＳｅｒ１３７でリン酸化されたＤＡＲＰＰ−３２をＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄイソ型と共に所定の種々の時間にわたりインキュベートした。アッセイは１０ｍＭ Ｍｎ２＋の存在下にて３７℃にて行った。詳細については第８節参照。
【０１０９】
図１７（Ａ〜Ｃ）は、ＰＰ２Ｃイソ型の活性に対する金属イオンの影響を示す。ＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｇを、種々の濃度のＭｇ２＋（黒丸）又はＭｎ２＋（黒四角）の不在下又は存在下にて基質として［３２Ｐ］ホスホ−Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ３２を用いて３７℃にてアッセイした。ＰＰ２Ｃａ（α）、ＰＰ２Ｃｂ（β）、ＰＰ２Ｃｇ（γ）。詳細については第８節参照。
【０１１０】
図１８（Ａ〜Ｃ）は、ＰＰ２Ｃイソ型によるホスホ−Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ３２の脱リン酸化の反応速度分析を示す。ＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｇを、２０ｍＭ Ｍｎ２＋の存在下にて基質として［３２Ｐ］ホスホ−Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ３２を用いて３７℃にてアッセイした。示すように０．１２５〜２０ｍＭの種々の濃度を用いた。３回の独立した実験から得たデータを分析し、ラインウィーバー・バーク法を用いてプロットした。ＰＰ２Ｃａ（α）、ＰＰ２Ｃｂ（β）、ＰＰ２Ｃｇ（γ）。詳細については第８節参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１１】
５．発明の詳細な説明
本発明は、セロトニンがＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ３４部位及びＳｅｒ１３７部位におけるリン酸化を増大させ、Ｔｈｒ７５におけるリン酸化を低減するという、本発明者の一部にとって驚くべき発見に基づくものである。本発明によれば、セロトニンはＤＡＲＰＰ−３２リン酸化をモジュレートする他の物質（例えば、ＣＫ１アクチベーター、ｃｄｋ５インヒビター、ＰＰ−１インヒビター、ＰＰ２Ｃインヒビター、ＰＰ２Ｂインヒビター又はＰＰ２Ａアクチベーターなど）の活性を模倣するものであるため、またセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路は鬱病の病因に関係するため、本発明の方法においては、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達分子、例えば限定するものではないが、ＣＫ１（例：ＣＫ１α、ＣＫ１β、ＣＫ１γｉ、ＣＫ１γ２、ＣＫ１γ３、ＣＫ１δ、ＣＫ１ε）、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ（限定するものではないが、ＰＰ２Ｃａ、ＰＰ２Ｃｂ及びＰＰ２Ｃｇなど）、ＰＰ２Ｂ、及び／又はＰＰ２Ａの活性を改変する化合物は抗鬱活性を有する。
【０１１２】
セロトニン（５−ＨＴ）自体、及びセロトニン作動性神経伝達を増強する薬剤は細胞表面受容体に対し作用する。本発明においては、５−ＨＴ２、５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路を介してＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を媒介する。本発明においては、セロトニンは、５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体への結合を介して、ｃＡＭＰの生成、及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化を増大する。続いてＰＫＡはＤＡＲＰＰ−３２をＴｈｒ３４でリン酸化する。このリン酸化事象は、ＤＡＲＰＰ−３２をタンパク質ホスファターゼ−１（ＰＰ−１）のインヒビターに変換する。ＰＫＡはまたＰＰ２Ａを活性化し、これが続いてＤＡＲＰＰ−３２をＴｈｒ７５で脱リン酸化する。この部位におけるリン酸化状態は、通常はＣｄｋ５により比較的高レベルに維持され、そのようにすることでＤＡＲＰＰ−３２がＰＫＡのインヒビターとなっている。従って、本発明においては、セロトニンが、ＰＫＡ／ＰＰ２Ａ細胞内シグナル伝達経路、及びＴｈｒ７５−ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を活性化することによって、ＰＫＡの構成的阻害を低減する。このセロトニンの作用は、ＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ３４におけるＰＫＡ媒介調節に関して正のフィードバックループとして機能する。さらに本発明においては、リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２によるＰＰ−１の阻害が、ＡＭＰＡ（ＡＭＰＡ；α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体のＧｌｕＲ１サブユニットのホスホ−Ｓｅｒ８４５のＰＰ−１媒介脱リン酸化を阻害する。続いてこれが、ＧｌｕＲ１サブユニットのＳｅｒ８４５のリン酸化を増大させ、ＡＭＰＡ受容体を活性化する。
【０１１３】
本発明においては、セロトニンは、５−ＨＴ２受容体を介して、ＰＬＣ生成を増大させ、ＣＫ−１を活性化する。ＣＫ−１は次にＤＡＲＰＰ−３２をＳｅｒ１３７でリン酸化する。このリン酸化事象は、ＤＡＲＰＰ−３２をＰＰ２Ｂ（すなわちカルシニュリン）のインヒビターに変換する。ＰＰ２ＢはＤＡＲＰＰ−３２をＴｈｒ３４で脱リン酸化するため、セロトニンが媒介するＤＡＲＰＰ−３２のＳｅｒ１３７におけるリン酸化の増大は、Ｔｈｒ３４−ＤＡＲＰＰ−３２におけるセロトニン／ＰＫＡ媒介リン酸化と、その後のＰＰ−１の阻害を増強する。さらに本発明においては、Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化状態は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路を介したＰＰ２Ｃのモジュレーションによりモジュレートしうる。一実施形態において、Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化は、その活性の低減により、例えばＰＰ２Ｃの阻害を増大する。
【０１１４】
本発明は、目的の細胞又は組織におけるカゼインキナーゼ１（「ＣＫ１」又は「ＣＫＩ」）、サイクリン依存性キナーゼ５（「Ｃｄｋ５」、「ｃｄｋ５」又は「ＣＤＫ５」）、タンパク質ホスファターゼ１（「ＰＰ−１」）、ＡＭＰＡ受容体（「ＡＭＰＡ」）、タンパク質ホスファターゼ−２Ｃ（「ＰＰ２Ｃ」）、タンパク質ホスファターゼ−２Ｂ（「ＰＰ２Ｂ」）、又はタンパク質ホスファターゼ−２Ａ（「ＰＰ２Ａ」）活性をモジュレートする方法であって、目的の細胞又は組織をセロトニン受容体（５−ＨＴＲ）細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物の有効量と接触させることを含み、ここで上記細胞又は組織と上記化合物との接触が、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションをもたらす上記方法を提供する。
【０１１５】
本発明は、ＡＭＰＡ受容体の活性を調節する方法であって、本発明の化合物、例えば、本発明の方法により同定された化合物の有効量を（例えば、個人、患者又は動物に）投与することを含み、ここで上記化合物がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートし、そしてＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションが、ニューロンにおけるＡＭＰＡ受容体の活性の改変をもたらす上記方法を提供する。特定の実施形態においては、上記ＡＭＰＡ受容体は興奮細胞、例えばニューロンにおけるものである。他の実施形態においては、上記方法は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートするために５−ＨＴＲアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含み、それによりＡＭＰＡ受容体の活性を改変する。
【０１１６】
本発明は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする薬剤、医薬又は化合物を同定する、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を提供する。そのような方法は、単独で又は互いに組み合わせて使用することができる。一実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ；上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ；及び上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【０１１７】
他の実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ；目的の細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルを測定するステップ；上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ；上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップ；ならびに上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差ならびにＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルと第２レベルとの差がＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【０１１８】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｔｈｒ３４−リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２又はＳｅｒ１３７−リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を増大させる、あるいはＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を低減させる薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤はセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路分子の活性を増大させる上記方法を提供する。
【０１１９】
本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによりセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートしうる薬剤を同定するｉｎ ｖｉｖｏの方法も提供する。そのような方法は、単独で又は本明細書に開示したｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｓｉｔｕの方法と一緒に使用することができる。１つのそのような方法は、薬剤の非ヒト哺乳動物への投与を含むものである。次いでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性化の量（及び／又は速度）を測定する。活性化の量（及び／又は速度）が薬剤の不在下と比較して、薬剤の存在下で増大するか又は低減するときに、該薬剤はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによりセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートすることができると同定される。好ましい実施形態においては、非ヒト哺乳動物はげっ歯類である。さらに好ましい実施形態においては、げっ歯類はマウスである。
【０１２０】
本発明はまた、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を改善する可能性のある及び／又はそれらの治療に使用しうる薬剤を選択する目的で、候補薬剤（又は医薬若しくは化合物）をスクリーニングする方法も提供する。
【０１２１】
本発明はまた、薬剤（又は医薬若しくは化合物）を同定する方法、例えば、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療法に使用することができる医薬の医薬スクリーニングアッセイを提供する。特定の実施形態においては、上記方法は、Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２、Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２、又はＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化（又は脱リン酸化）の量の増大（又は低減）を検出することを含む。
【０１２２】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を改変する薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤が、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートするものである上記方法を提供する。
【０１２３】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＣｄｋ５及びＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｔｈｒ７５脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＴｈｒ７５脱リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【０１２４】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を低減する薬剤を上記患者に投与することを含み、該薬剤がＰＰ−１活性を低減するものである上記方法を提供する。
【０１２５】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＰＰ−１及びＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【０１２６】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を低減する薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＰＰ２Ｃ活性を低減するものである上記方法を提供する。
【０１２７】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＰＰ２Ｃ及びＳｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｓｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＳｅｒ１３７リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【０１２８】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を阻害する薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤が、ＰＰ２Ｂ活性を低減するものである上記方法を提供する。
【０１２９】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＰＰ２Ｂ及びＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｔｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＴｈｒ３４リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の低減が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【０１３０】
別の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害をその治療が必要な患者において治療する方法であって、Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を増大する薬剤を上記患者に投与することを含み、ここで該薬剤が、ＰＰ２Ａ活性を低減するものである上記方法を提供する。
【０１３１】
別の実施形態においては、本発明は、治療が必要な患者における５−ＨＴ関連障害又はＤＡ関連障害の治療に使用するための薬剤を同定する方法であって、（ａ）候補薬剤をＰＰ２Ａ及びＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２と接触させるステップ、並びに（ｂ）Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の量を検出するステップを含み、ここで候補薬剤の存在下にてＴｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化の増大が検出される場合に該薬剤を同定する上記方法を提供する。
【０１３２】
別の実施形態においては、本発明は、細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化を調節する方法であって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションが、細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の改変をもたらすものである上記方法を提供する。
【０１３３】
本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする組成物を提供する。
【０１３４】
本発明はさらに、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートし、それにより５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を改善することが可能な薬剤を開発するための合理的薬物設計を実施する方法を提供する。
【０１３５】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるカゼインキナーゼ１の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるカゼインキナーゼ１活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるカゼインキナーゼ１活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、カゼインキナーゼ１活性の第１レベルと第２レベルとの差がカゼインキナーゼ１活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、カゼインキナーゼ１活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【０１３６】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、サイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、サイクリン依存性キナーゼ５活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【０１３７】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルと第２レベルとの差がＡＭＰＡ受容体活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＡＭＰＡ受容体活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【０１３８】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＰＰ−１の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＰＰ−１活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＰＰ−１活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＰＰ−１活性の第１レベルと第２レベルとの差がＰＰ−１活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＰＰ−１活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【０１３９】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃ活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ｃ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＰＰ２Ｃ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＰＰ２Ｃ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＰＰ２Ｃ活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【０１４０】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂ活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ｂ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＰＰ２Ｂ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＰＰ２Ｂ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＰＰ２Ｂ活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【０１４１】
一実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ、（ｂ）該細胞又は組織と試験化合物とを接触させるステップ、並びに（ｃ）該細胞又は組織におけるＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここで、ＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＰＰ２Ａ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、ＰＰ２Ａ活性のモジュレーションは５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【０１４２】
本発明はまた、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療のための診断方法及び治療方法、例えば限定されるものではないが、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療における本発明の組成物又は化合物の使用、を提供する。
【０１４３】
一態様において、本発明は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路のモジュレーションを特徴とするニューロンの状態を治療する方法であって、その治療が必要な被験者に対し、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする本発明の化合物の有効量を投与し、それにより、５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路のモジュレーションによってＡＭＰＡ受容体活性及び／若しくはＤＡ細胞内シグナル伝達経路の活性を増大又は低減させることを含む上記方法を提供する。
【０１４４】
特定の実施形態において、５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路は、（ｉ）Ｔｈｒ−３４のＰＫＡリン酸化のｃＡＭＰ活性化を増大させる５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化、（ｉｉ）Ｔｈｒ−７５のタンパク質ホスファターゼ−２Ａ（ＰＰ−２Ａ）の脱リン酸化のＰＫＡ活性化のｃＡＭＰ活性化を増大させる５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化、並びに／又は（ｉｉｉ）ＰＬＣの活性化を増大させ、それがまたＳｅｒ−１３７のＣＫ１依存的リン酸化のカルシウム活性化を増大させる５−ＨＴ２受容体の活性化を含む。
【０１４５】
従って、これらの相互作用に影響を及ぼす本発明の方法により同定される化合物はいずれも、５−ＨＴＲ関連障害の治療用処置の基礎として機能する可能性があり、従って、上記相互作用に関与するタンパク質は全て本明細書に記載のアッセイに用いることができる。
【０１４６】
本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートするために本発明の化合物の有効量を投与することによる、個体（例えば患者）又は動物被験体の５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療方法を提供する。一実施形態において、薬剤は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性を促進又は増大させる。別の実施形態において、薬剤は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性を阻害又は低減させる。
【０１４７】
特定の実施形態において、本発明は、治療を必要とする患者における５−ＨＴ関連障害の治療方法であって、ＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ３４、Ｔｈｒ７５及び／又はＳｅｒ１３７におけるリン酸化をモジュレートする薬剤を該患者に投与することを含み、ここで該薬剤がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートするものである上記方法を提供する。特定の実施形態では、薬剤は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａへの結合によりその活性をモジュレートする。
【０１４８】
本発明は、５−ＨＴＲ関連、ＣＫ１関連、Ｃｄｋ５関連、ＡＭＰＡ受容体関連、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害、疾患、及び／又は状態の症状を示す患者又は被験者において、上記症状を改善しうる本発明の薬剤（又は医薬若しくは化合物）を投与する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の症状を示す患者又は被験者において、上記症状を改善しうる、本明細書に開示する方法により同定された薬剤を投与する方法を提供する。他の実施形態においては、５−ＨＴＲ活性のアゴニストを、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療に用い得る。また別の実施形態においては、５−ＨＴＲ活性のアンタゴニストを、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療に用い得る。
【０１４９】
本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする組成物を提供する。また本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによりＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする組成物を提供する。本発明は、本明細書に開示する本発明の薬剤（又は医薬若しくは化合物）の医薬組成物も提供する。本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性を調節する、並びに５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を診断又は治療するための医薬組成物を包含する。特定の実施形態においては、正常な機能の低下が上述した疾患又は障害（例えば鬱病）の表現型の発現をもたらしうるものであるため、セロトニン受容体（５−ＨＴＲ）シグナル伝達経路の活性化、又はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの増大（例えば下流の活性化）によって、かかる疾患（例えば鬱病）の症状を示す個体における症状の改善が促進される。
【０１５０】
本発明はまた、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路をモジュレートすることによりドーパミン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートする組成物を提供する。また本発明は、本明細書に開示する本発明の薬剤（又は医薬若しくは化合物）の医薬組成物を提供する。本発明は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路をモジュレートすることによりドーパミン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートするための、及びＤＡ関連障害の診断又は治療のための医薬組成物を包含する。特定の実施形態においては、正常なドーパミン様機能の低減によってＤＡ関連障害（例えばパーキンソン病）の表現型の発現がもたらされうるため、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路を介した又はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレートによるＤＡＲＰＰ−３２の活性化により、ドーパミン作動性神経伝達とは独立したＤＡ関連障害の症状を示す個体における症状の改善を促進しうる。従って本発明において、セロトニン作動性神経伝達又はセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性を増強する薬剤、あるいはＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする薬剤は、ドーパミンとは独立して改善効果を発揮するものであり、ＤＡ関連障害の治療に用い得る。
【０１５１】
開示を明確にするために、限定するものではなく、本発明の詳細な説明を以下の小節に区分する。
【０１５２】
５．１．ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする方法
本発明は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする方法であって、目的の細胞又は組織を、セロトニン受容体（５−ＨＴＲ）細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物の有効量と接触させることを含み、上記細胞又は組織と上記化合物との接触がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションをもたらす上記方法を提供する。細胞又は組織としては、限定されるものでないが：興奮性細胞、例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン、又は介在ニューロン；グリア細胞；ニューロン又はグリア細胞の一次培養物；ニューロン又はグリア細胞系に由来する細胞；分離した細胞；全細胞；透過処理した細胞；細胞抽出物又は精製された酵素調製物；及び組織又は器官、例えば、脳、脳切片、脊髄、脊髄切片、中枢神経系、末梢神経系、又は神経が挙げられる。特定の実施形態においては、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性は増大する。他の特定の実施形態においては、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性は低減する。
【０１５３】
一実施形態においては、本発明は、セロトニン受容体（５ＨＴＲ）の活性のモジュレーションによって、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）、サイクリン依存性キナーゼ５（Ｃｄｋ５）、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）、タンパク質ホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）、及び／又はタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の活性をモジュレートする方法を提供する。好ましい実施形態においては、セロトニン受容体は５−ＨＴ２、５−ＨＴ４、又は５−ＨＴ６セロトニン受容体である。
【０１５４】
他の実施形態においては、本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによりＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする方法を提供する。
【０１５５】
一実施形態においては、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏでモジュレートする方法を提供する。他の実施形態においては、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をｉｎ ｖｉｖｏでモジュレートする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの適用は、限定されるものでないが、動物個体、組織切片、破砕した細胞調製物、無傷の細胞、及び単離しかつ精製した細胞調製物における活性のモジュレーションを含む。
【０１５６】
本発明によれば、本発明の化合物は５−ＨＴＲアゴニスト又はアンタゴニストでありうる。しかしながら、他の実施形態においては、本発明の化合物は、セロトニン受容体のレベルと異なる５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路のレベルで作用する化合物であってもよい。その結果、本発明はまた、ある特定の実施形態においては、セロトニン受容体のレベルと異なる５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路のレベルで作用する化合物についてスクリーニングすることにより同定した組成物を含みうる。当業者であれば、本発明の方法でＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートすることができると一旦同定されれば、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性が関与する可能性のある症状を治療する目的で、上記化合物を治療薬として用いて、細胞（例えばニューロン）におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートすることを理解するであろう。そのような症状は、限定されるものでないが、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を含む。
【０１５７】
本発明は、ＡＭＰＡ受容体の活性を調節する方法であって、化合物、例えば、本発明の方法により同定した化合物の有効量を、（例えば、個人、患者又は動物に）投与することを含み、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションにより細胞におけるＡＭＰＡ受容体の活性が改変される上記方法を提供する。一実施形態においては、上記ＡＭＰＡ受容体は興奮性細胞、例えばニューロンにおけるものである。他の実施形態においては、上記方法は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性を増大しそれによりＡＭＰＡ受容体の活性を改変する目的での５−ＨＴＲアゴニストの投与を含む。
【０１５８】
いずれの特定の理論により束縛されるのを欲しないが、本発明の一態様においては、アゴニスト（例えば５−ＨＴＰ、ＰＣＡ又はフルオキセチン）による５−ＨＴ２、５−ＨＴ４又は５−ＨＴ６受容体の活性化は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路によるＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を媒介する。本発明においては、セロトニンは、５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体への結合を介して、ｃＡＭＰの生成、及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化を増大する。続いてＰＫＡはＤＡＲＰＰ−３２をＴｈｒ３４でリン酸化する。このリン酸化事象は、ＤＡＲＰＰ−３２をタンパク質ホスファターゼ−１（ＰＰ−１）のインヒビターに変換する。ＰＫＡはまたＰＰ２Ａを活性化し、これが続いてＤＡＲＰＰ−３２をＴｈｒ７５で脱リン酸化する。この部位におけるリン酸化状態は、通常はＣｄｋ５により比較的高レベルに維持され、そのようにすることでＤＡＲＰＰ−３２がＰＫＡのインヒビターとなっている。従って、本発明においては、セロトニンが、ＰＫＡ／ＰＰ２Ａ細胞内シグナル伝達経路、及びＴｈｒ７５−ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を活性化することによって、ＰＫＡの構成的阻害を低減する。このセロトニンの作用は、ＤＡＲＰＰ−３２のＴｈｒ３４におけるＰＫＡ媒介調節に関して正のフィードバックループとして機能する。さらに本発明においては、リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２によるＰＰ−１の阻害が、ＡＭＰＡ（ＡＭＰＡ；α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体のＧｌｕＲ１サブユニットのホスホ−Ｓｅｒ８４５のＰＰ−１媒介脱リン酸化を阻害する。続いてこれが、ＧｌｕＲ１サブユニットのＳｅｒ８４５のリン酸化を増大させ、ＡＭＰＡ受容体を活性化する。
【０１５９】
本発明においては、セロトニンは、５−ＨＴ２受容体を介して、ＰＬＣ生成を増大させ、ＣＫ−１を活性化する。ＣＫ−１は次にＤＡＲＰＰ−３２をＳｅｒ１３７でリン酸化する。このリン酸化事象は、ＤＡＲＰＰ−３２をＰＰ２Ｂ（すなわちカルシニュリン）のインヒビターに変換する。ＰＰ２ＢはＤＡＲＰＰ−３２をＴｈｒ３４で脱リン酸化するため、セロトニンが媒介するＤＡＲＰＰ−３２のＳｅｒ１３７におけるリン酸化の増大は、Ｔｈｒ３４−ＤＡＲＰＰ−３２におけるセロトニン／ＰＫＡ媒介リン酸化と、その後のＰＰ−１の阻害を増強する。さらに本発明においては、Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化状態は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路を介したＰＰ２Ｃのモジュレーションによりモジュレートしうる。
【０１６０】
いずれの特定の理論により束縛されるのを欲しないが、本発明の他の態様においては、アゴニスト（例えば５−ＨＴＰ、ＰＣＡ又はフルオキセチン）による５−ＨＴ４受容体の活性化は、Ｔｈｒ−３４のＰＫＡリン酸化のｃＡＭＰ活性化を増大させ、Ｔｈｒ−７５のＰＰ−２Ａ脱リン酸化のＰＫＡ活性化のｃＡＭＰ活性化を増大させる。
【０１６１】
いずれの特定の理論により束縛されるのを欲しないが、本発明の他の態様においては、アゴニスト（例えば５−ＨＴＰ、ＰＣＡ又はフルオキセチン）による５−ＨＴ６受容体の活性化は、Ｔｈｒ−３４のＰＫＡリン酸化のｃＡＭＰ活性化を増大させ、Ｔｈｒ−７５のＰＰ−２Ａ脱リン酸化のＰＫＡ活性化のｃＡＭＰ活性化を増大させる。
【０１６２】
いずれの特定の理論により束縛されるのを欲しないが、本発明の他の態様においては、アゴニスト（例えば５−ＨＴＰ、ＰＣＡ又はフルオキセチン）による５−ＨＴ２受容体の活性化は、ＰＬＣの活性化を増大させ、それが続いて、Ｓｅｒ−１３７のＣＫ１依存的リン酸化のカルシウム活性化を増大させる。
【０１６３】
５．２．ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法
本発明は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする薬剤（又は医薬若しくは化合物）を同定する方法を提供する。一実施形態においては、本発明は、セロトニン受容体の活性のモジュレーションによって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。特定の実施形態においては、薬剤は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａへの結合により活性をモジュレートする。
【０１６４】
本発明においては、細胞又は組織としては、限定されるものでないが、興奮性細胞、例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン、又は介在ニューロン；グリア細胞；ニューロン若しくはグリア細胞の一次培養物；ニューロン若しくはグリア細胞系統に由来する細胞；分離した細胞；全細胞；透過処理した細胞；細胞抽出物若しくは精製酵素調製物；及び組織若しくは器官、例えば、脳、脳切片、脊髄、脊髄切片、中枢神経系、末梢神経系、若しくは神経が挙げられる。
【０１６５】
別の実施形態においては、本発明は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路のモジュレーションによって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする薬剤の同定方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによってセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性をモジュレートする薬剤の同定方法を提供する。特定の実施形態において、薬剤は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａへの結合により活性をモジュレートする。
【０１６６】
本発明の特定の実施形態において、セロトニン（５ＨＴ）受容体は、５−ＨＴ２、５−ＨＴ４及び／又は５−ＨＴ６受容体である。
【０１６７】
別の実施形態において、本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによってＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする薬剤の同定方法を提供する。
【０１６８】
特定の実施形態において、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性は、それぞれＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの発現を包含する。
【０１６９】
当技術分野の通常の技術者であれば明白に理解しうるように、５−ＨＴ受容体、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートしうる薬剤、医薬若しくは化合物を同定するための、本明細書に開示したいずれかの及び／又は全ての実施形態は、本明細書に開示した合理的医薬設計を組込む方法を含めて、これらを組み合わせてさらなる医薬スクリーニング及びアッセイを形成することができ、これらは全て本発明が意図するものである。
【０１７０】
一実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ；上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ；及び上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【０１７１】
他の実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ；目的の細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルを測定するステップ；上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ；上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップ；ならびに上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差ならびにＡＭＰＡ受容体活性の第１レベルと第２レベルとの差がＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【０１７２】
他の実施形態においては、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、（ａ）目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ：（ｂ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ；及び（ｃ）上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルを測定するステップを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、そしてＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションがセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路及び／又は５−ＨＴ受容体の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【０１７３】
好ましい実施形態において、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の活性は、５−ＨＴ２、５−ＨＴ４又は５−ＨＴ６受容体の活性のモジュレーションにより調節される。
【０１７４】
他の実施形態においては、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ、上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のレベルを測定するステップを含み、ここで上記レベルと試験化合物に接触させてない比較しうる細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の標準又は基線レベルとの差がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示し、そしてＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションがセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路及び／又は５−ＨＴ受容体の活性モジュレーションにより調節されることを特徴とする上記方法を提供する。
【０１７５】
別の実施形態において、本発明は、目的の細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
（ａ）目的の細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルを測定するステップ；
（ｂ）上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の第１レベルを測定するステップ；
（ｃ）上記細胞又は組織を試験化合物と接触させるステップ；
（ｄ）上記細胞又は組織におけるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第２レベルをそれぞれ測定するステップ；及び
（ｅ）上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の第２レベルを測定するステップ、
を含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の第１レベルと第２レベルとの差、並びにＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の第１レベルと第２レベルとの差が、上記細胞又は組織におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化をモジュレートする上記試験化合物の能力を示す上記方法を提供する。
【０１７６】
別の実施形態において、本発明は、細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化を調節する方法であって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２の活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含み、ここでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の活性のモジュレーションにより、上記細胞におけるＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の変化がもたらされる上記方法を提供する。
【０１７７】
別の実施形態において、本発明は、ＡＭＰＡ受容体のリン酸化依存的活性化の増大又は低減を特徴とする疾患を治療する方法であって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含む上記方法を提供する。
【０１７８】
別の実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおける抗鬱活性を生じうる化合物を同定する方法を提供する。該方法は、試験化合物による細胞又は組織の処理前と後の両方のＤＡＲＰＰ−３２リン酸化レベルパターンの決定に基づく。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける適用としては、限定するものではないが、限定されるものでないが、動物個体、組織切片、破砕した細胞調製物、無傷の細胞（細胞系及び一次培養物を含む）、及び単離しかつ精製した細胞調製物における活性のモジュレーションを含む。その結果、本発明はまた、上記方法により同定した組成物を含む。当業者であれば、セロトニン活性を有する既知の抗鬱性化合物と類似したＤＡＲＰＰ−３２リン酸化レベルパターンの改変を生じうると一旦同定されれば、鬱病並びにセロトニン系が関与する他の症状を治療する目的で、上記化合物を用いうることを理解するであろう。そのような症状は、限定されるものでないが、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を含む。本発明においては、同定された化合物は、本明細書に提示される試験などの試験から得られるデータに基づいて当業者により決定されうる有効投与量又は有効量として投与しうる。そのようなデータとしては、限定されるものではないが、ＩＣ５０測定から得られる結果である。
【０１７９】
本発明はまた、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を改善する可能性のある及び／又はその治療に使用しうる薬剤を選択するための薬剤（又は医薬若しくは化合物）をスクリーニングする方法も提供する。
【０１８０】
本発明はまた、薬剤を同定する方法、例えば、５−ＨＴＲ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を治療するための治療法に使用しうる医薬スクリーニングアッセイも提供する。
【０１８１】
本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートすることができる薬剤を同定するｉｎ ｖｉｖｏの方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示したように、単独で又はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｓｉｔｕの方法と一緒に使用することができる。１つのこのような方法は、薬剤の非ヒト哺乳動物への投与を含むものである。次いでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性化の量（及び／又は速度）を測定する。活性化の量（及び／又は速度）が、薬剤の不在下と比較して薬剤の存在下で増大するか又は低減するときに、上記薬剤はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートすることができると同定される。好ましい実施形態においては、非ヒト哺乳動物はげっ歯類である。さらに好ましい実施形態においては、げっ歯類はマウスである。
【０１８２】
他の実施形態においては、薬剤を５−ＨＴＲアゴニストと一緒に投与する。次いでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションの量（及び／又は速度）を測定する。５−ＨＴＲアゴニストの投与は薬剤の不在下でＣＫ１、ＰＰ２Ａ及びＡＭＰＡ受容体活性の増大、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及びＰＰ２Ａ活性の低減をもたらすと考えられるため、活性化の量（及び／又は速度）が薬剤の不在下と比較して薬剤の存在下で有意に増大又は低減する場合には、その薬剤をＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレート可能なものと同定する。
【０１８３】
他の実施形態において、薬剤は５−ＨＴＲアンタゴニストと共に投与する。続いて、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ、及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーションの量（及び／又は速度）を測定する。薬剤の不在下における５−ＨＴＲアンタゴニストの投与はＣＫ１、ＰＰ２Ａ及びＡＭＰＡ受容体活性の増大、Ｃｄｋ５、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及びＰＰ２Ａ活性の増大をもたらすと考えられるため、活性化の量（及び／又は速度）が、薬剤の不在下と比較して相対的に薬剤の存在下において有意に増大又は低減する場合には、その薬剤をＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレート可能なものと同定する。
【０１８４】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける方法はさらに非ヒト哺乳動物に対する薬剤の投与を含んでもよい。そのような動物モデルは第５．５節に記載されている。
【０１８５】
特定の実施形態においては、動物モデルはホモ接合性ノックアウトマウスである（それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、１９９８年７月７日発行のFienbergらによる米国特許第５，７７７，１９５号；２０００年１月１１日発行のNishiらによる米国特許第６，０１３，６２１号；及びFienbergら, 1998, Science 281:838-842を参照）。一実施形態においては、ホモ接合性ＤＡＲＰＰ−３２ノックアウトマウスを追加の試験又はアッセイに用いて、候補薬剤がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートすることを立証するか又は確認してもよい。特定の実施形態においては、Nishiら（２０００年１月１１日発行の米国特許第６，０１３，６２１号）が記載した方法によって立証を実施することができる。そのような薬剤がＤＡＲＰＰ−３２リン酸化によるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートすると同定されるときは、ＤＡＲＰＰ３２ノックアウトマウスにおける薬剤の存在又は投与は、薬剤の不在又は非投与と比較してＡＭＰＡ受容体の活性化の量（及び／又は速度）を有意に増大又は低減しないに違いない。
【０１８６】
ある特定の実施形態においては、様々な構造骨格（例えば、プリン）に基づく化合物のコンビナトリアルライブラリー、ならびに無関係な天然化合物を候補医薬として試験することができる。このタイプの好ましい実施形態においては、本明細書に開示した自動ロボット技術を用いるハイスループット技術を利用してアッセイを実施する。ポジティブな結果（「ヒット」）は、対照反応物（候補医薬をアッセイに含有しない）と比較して、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性の低減又は増大を表す。
【０１８７】
いったん候補医薬が選択されると、その候補医薬の構造変異体を試験することができる。これらの化合物を詮索し、膜透過性、効果の特異性、及び毒性などのパラメーターを修飾してもよい。次にこの２次スクリーニングで選択した（例えば、最も強力な）化合物をｉｎ ｓｉｔｕ及び動物モデル（第５．５節を参照）で評価して、選択した化合物がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性を改変するかどうか並びに／あるいは最小限の副作用で予想の行動改変を誘導するかどうかを確認してもよい。そのような行動異常は、限定されるものでないが、例えばマウスへの医薬投与の乱用が歩行運動活性の増大をもたらす、運動活性の試験を含みうる（例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるKostenら, J. Pharmacol., Exp. Ther. 269:137-144 (1994)；Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）；及び／又は選択した医薬の自己投与若しくは前パルス抑制（例えば、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる１９９８年、７月７日発行の米国特許第５，７７７，１９５号を参照）。次いでこれらの試験の後に臨床研究におけるヒトによる試験を実施することができる。あるいは、ある特定の実施形態においては、臨床研究におけるヒトの試験を、動物試験なしに実施することができる。ＣＫ１又はＣｄｋ５と異なる標的に影響を与える化合物も、以下に例示した代わりの標的を用いて同様にスクリーニングすることができる。
【０１８８】
あるいは、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーター（例えば、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａのアクチベーター又はインヒビター）を、例えば、組換えバクテリオファージにより作製した無作為ペプチドライブラリー（例えば、Scott及びSmith, Science 249:386-390 (1990)；Cwirlaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990)；Devlinら, Science 249:404-406 (1990)を参照）又は化学ライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。この「ファージ法」を用いて非常に大きなライブラリー（１０６−１０８種の化学物質）を構築することができる。第２の手法は化学的方法の利用であり、その例はGeysen法（Geysenら, Molecular Immunology 23:709-715 (1986)；Geysen ら J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)）及びFodorらの方法（Science 251:767-773 (1991)）である。Furkaら（第14回生化学国際会議（14th international Congress of Biochemistry）, Volume 5, Abstract FR:013 (1988)；Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991)）、Houghton（米国特許第４，６３１，２１１号、１９８６年１２月発行）及びRutterら（米国特許第５，０１０，１７５号、１９９１年４月２３日発行）は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のモジュレーターとして試験することができるペプチドの混合物を作る方法を開示する。
【０１８９】
他の態様においては、合成ライブラリー（それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるNeedelsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4 (1993)；Ohlmeyerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993)；Lamら, 国際特許公開ＷＯ９２／００２５２；Kocisら, 国際特許公開９４／２８０２８）などを本発明によるＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性化のモジュレーターをスクリーニングするために利用することができる。いったん候補モジュレーターが同定されると、化学類似物を、市販される（例えば、Chembridge Corporation, San Diego, CA又はEvotec OAI, Abingdon, UKから）化学品のライブラリーから選択するかあるいは新規に合成することができる。有望な薬剤（医薬）を標準アッセイにかけて、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性化の活性に対するその効果を試験することができる。次いでＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性化の活性をモジュレートする医薬を選択する。
【０１９０】
本発明はまた、５−ＨＴＲ（例えば、５−ＨＴ２Ｒ、５−ＨＴ４Ｒ又は５−ＨＴ６Ｒ）、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａとｉｎ ｖｉｖｏで結合して阻害又は活性化する小分子、その類似体のスクリーニング、ならびにＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの天然のモジュレーターのスクリーニングも意図する。あるいは、天然産物ライブラリーを本発明のアッセイを利用して５−ＨＴＲ、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする分子をスクリーニングすることができる。
【０１９１】
ある特定のアッセイにおいては、標的、例えば、５−ＨＴＲ、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａを固体支持体に付着させることができる。そのような標的を固体支持体上に配置する方法は当技術分野では周知であり、ビオチンを標的に結合しかつアビジンを固体支持体に結合するものなどを含む。固体支持体を洗浄して未反応種を除去することができる。標識した候補モジュレーター（例えば、インヒビター）の溶液を固体支持体と接触させることができる。固体支持体を再び洗浄して、支持体と結合しない候補モジュレーターを除去する。固体支持体とともに残って標的と結合した標識した候補モジュレーターの量を定量することができる。あるいは、又はさらに、例えば、標識した候補モジュレーターと標的との間の解離定数を定量することができる。標的又は候補モジュレーターに対する適当な標識は本明細書に開示されている。
【０１９２】
本発明の他の態様においては、候補モジュレーターは、ＰＫＡによるＴｈｒ３２  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化又はそのＰＰ２Ｂによる脱リン酸化、Ｃｄｋ５によるＴｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化又はそのＰＰ２Ａによる脱リン酸化、あるいはＣＫ１によるＳｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化又はそのＰＬＣによる活性化又はそのＰＰ２Ｃによる脱リン酸化をモジュレートする能力について、独立して、又は本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２、Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２若しくはＳｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２、又はＴｈｒ３４、ＴＨｒ７５若しくはＳｅｒ１３７残基を含むそれらの断片のリン酸化の量及び／又は速度を定量する。そのようなアッセイは、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号に開示されている。
【０１９３】
本発明の別の態様において、ＣＫ１の候補モジュレーターは、Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化又はセリン−１３７を含有するＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化可能な断片をモジュレートする能力について、独立して、又は本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化、又はセリン１３７残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化可能な断片の量及び／又は速度を、上述したアッセイにより測定する。
【０１９４】
本発明の別の態様において、Ｃｄｋ５の候補モジュレーターは、Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化又はトレオニン−７５を含有するＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化可能な断片（すなわち、Ｃｄｋ５−Ｎｃｋ５ａ複合体）をモジュレートする能力について、独立して、又は本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化、又はトレオニン−７５残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化可能な断片の量及び／又は速度を、上述したアッセイにより測定する。
【０１９５】
本発明の別の態様において、ＡＭＰＡ受容体の候補モジュレーターは、Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化又はトレオニン−３４を含有するＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化可能な断片をモジュレートする能力について、独立して、又は本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化、又はトレオニン−３４残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化可能な断片の量及び／又は速度を、上述したアッセイにより測定する。別の実施形態においては、Yanら（1999, Nature Neurosci. 3: 13-17）の方法を用いてＡＭＰＡ受容体活性についてアッセイすることができる。
【０１９６】
本発明の別の態様において、ＰＰ−１の候補モジュレーターは、Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化又はトレオニン−３４を含有するＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能な断片をモジュレートする能力について、独立して、又は本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化、又はトレオニン−３４残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能な断片の量及び／又は速度を、上述したアッセイにより測定する。
【０１９７】
本発明の別の態様において、ＰＰ２Ｃの候補モジュレーターは、Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化又はセリン−１３７を含有するＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能な断片をモジュレートする能力について、独立して、又は本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Ｓｅｒ１３７  ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化、又はセリン−１３７残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能な断片の量及び／又は速度を、上述したアッセイ又は第８節に開示したアッセイにより測定する。
【０１９８】
本発明の別の態様において、ＰＰ２Ｂの候補モジュレーターは、Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化又はトレオニン−３４を含有するＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能な断片をモジュレートする能力について、独立して、又は本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Ｔｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化、又はトレオニン−３４残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能な断片の量及び／又は速度を、上述したアッセイにより測定する。
【０１９９】
本発明の別の態様において、ＰＰ２Ａの候補モジュレーターは、Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化又はトレオニン−７５を含有するＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能な断片をモジュレートする能力について、独立して、又は本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化、又はトレオニン−７５残基を含有するＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化可能な断片の量及び／又は速度を、上述したアッセイにより測定する。
【０２００】
このようにして、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化を阻害するか又は刺激するモジュレーターを次に選択する。特定の実施形態においては、候補モジュレーターのセロトニン作動性細胞内シグナル伝達分子、例えばＣＫ１（例えば、ＣＫ１α、ＣＫ１β、ＣＫ１γｉ、ＣＫ１γ２、ＣＫ１γ３、ＣＫ１δ、ＣＫ１ε）、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ（限定するものではないが、例えばＰＰ２Ｃａ、ＰＰ２Ｃｂ及びＰＰ２Ｃｇ）、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの触媒活性に対する効果を定量する。次いで候補モジュレーターをホスホ−Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２によるＰＫＡ阻害の生理学的結果に対する効果について試験することができる。このために、電位依存性Ｃａ２＋電流（ＰＫＡにより調節されることが知られる）を、解離した線条体ニューロンのパッチ−クランプ記録を用いて分析することができる。そのような方法は、本明細書に参照によりその全文が組み入れられるBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号に開示されている。
【０２０１】
他の実施形態においては、候補モジュレーターを、線条体組織切片に加えることができる（第６節及び第７節に開示のように）。組織サンプルを様々な濃度の候補モジュレーターを用いて処理し、次いでサンプルをＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性について分析することができる。ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性の候補モジュレーターは、例えば無傷のニューロンに対してｉｎ ｓｉｔｕで、急いで調製した新線条体切片を試薬を含有するクレブス重炭酸塩バッファー溶液中でインキュベートする処理により、試験することができる。これらの化合物の効果は、最適濃度とインキュベーション時間を実験的に規定することにより試験することができる。
【０２０２】
他の実施形態においては、動物モデル（第５．５節を参照）を用いて、５−ＨＴＲ関連症状に対する候補薬剤の効果を確かめることができる。次いで、５−ＨＴＲ関連症状を改善する候補モジュレーターを選択することができる。例えば、動物の歩行運動行動応答を薬剤の存在及び不在下で測定することができる。特定の実施形態においては、動物（例えばマウス）の歩行運動は、第６節に開示するような運動観察において測定することができる。特定の実施形態では、げっ歯類の尾部懸垂試験（第７節に開示する）を実験動物として用いて、抗鬱効力を予測することができる。
【０２０３】
動物モデルで候補治療薬（例えば、候補薬、候補モジュレーターなど）を試験する方法は当技術分野では周知である。このようにして、候補治療薬を用いて動物個体を治療することができる。候補モジュレーターを、様々な方法により投与することができ、それらの方法としては、提案される用途によって、局所、経口、皮下、又は腹腔内（腹腔内注射など）が挙げられる。最適の用量は実験的に規定しうる。動物は、例えば焦点マイクロ波ビーム照射により犠牲にすることができる。
【０２０４】
特定の実施形態においては、線条体組織のホモジネートを免疫ブロット分析にかける。利用しうる別の手法は、この疾患の動物モデルにおける５−ＨＴＲ関連病理学的症候を軽減する上での、これらの化合物の潜在的効果を評価する。例えば、ヒト疾患の病因となるハンチントン病（ＨＤ）遺伝子型を異所的に発現する動物は、ＨＤ患者と類似の神経病理学的症候群を表す。そのようなモデルを利用して、いずれの候補治療薬の効能を評価することもできる（第５．５節を参照）。一般的に、少なくとも２グループの動物をアッセイに利用し、少なくとも１グループは候補モジュレーターなしで投与用ビヒクルを投与する対照グループである。
【０２０５】
５．２．１．キナーゼ及びホスファターゼのための酵素アッセイ
本発明の方法によれば、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａのインヒビターを、単離した酵素の直接アッセイにより同定することができる。キナーゼ（例えば、ＣＫ１又はＣｄｋ５）の活性は、当業者に公知の様々な方法によりモニターすることができ、それらの方法としては、例えば次に開示された方法が挙げられる：Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド結合及びキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88；Baderら (2001, Journal of Biomolecular Screening 6 (4):255-64)；Liu, F., X.H. Ma,ら (2001), 「代謝共役型グルタミン酸受容体によるサイクリン依存性キナーゼ５及びカゼイン キナーゼ１の調節（Regulation of cyclin-dependent kinase 5 and casein kinase 1 by metabotropic glutamate receptors）」, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (20):11062-8；Evans, D.B., K.B. Rankら (2002).「96ウエルフォーマットを用いるヒトのタウタンパク質キナーゼII/Cdk5のインヒビターを研究するためのシンチレーション近接アッセイ（A scintillation proximity assay for studying inhibitors of human tau protein kinase II/Cdk5 using a 96-well format）」, Journal of Biochemical & Biophysical Methods 50 (2-3):151-61。
【０２０６】
そのような方法を用いて、目的のキナーゼを含有するサンプルを、適当な条件のもとで、放射性ＡＴＰ及びリン酸化部位を提供する適当な組成の合成ペプチド基質に曝す。次いで新しくペプチドと結合した放射性リン酸塩を測定する。基質ペプチドと共有結合したビオチンなどの化学部分を付加することにより、ストレプトアビジンをコーティングしたビーズと基質ペプチドとの結合が可能になる。ビーズに結合したペプチドを単離し、関連する放射能を測定するか、又は、好ましくはシンチレーション近接アッセイに適したビーズを用いることにより、基質ペプチドに関連する放射能を直接測定することができる。
【０２０７】
タンパク質ホスファターゼ（例えばＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ又はＰＰ２Ａ）の活性は、当業者に公知の種々の方法、例えばCohenら（1988, Protein phosphatase-1 and protein phosphatase-2A from rabbit skeletal muscle, Methods Enzymol 159: 390-408）又はStewart及びCohen（1988, Protein phosphatase-2B from rabbit skeletal muscle: a Ca2+-dependent, calmodulin-stimulated enzyme, Methods Enzymol 159: 409-16）に記載の方法によりモニターすることができる。
【０２０８】
ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａのモジュレーターはまた、ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化、すなわち、Ｓｅｒｌ３７  ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化（ＣＫ１）、Ｔｈｒ７５  ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化（Ｃｄｋ５）又はＴｈｒ３４  ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化（ＰＫＡ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ１）のモジュレーターについてスクリーニングすることにより同定することができる。このような方法は、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号に開示されている。
【０２０９】
ペプチド基質のリン酸化はまた、リン酸特異的抗体の直接結合を経由して又は競合体リンペプチドからのリン酸特異的抗体の置換を測定することにより検出することができる（例えば、Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体−リガンド結合及びキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88を参照）。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は蛍光偏光（ＦＰ）などの蛍光法を特異的リンペプチド抗体複合体を検出するために利用することができる。これらの方法が有する利点は、結合した種の単離によらないで、むしろ溶液中の特異的結合によって起こる蛍光の変化に依る「均一系の」検出を使用することである。リン酸特異的抗体を作る方法は当技術分野で周知である。
【０２１０】
一実施形態においては、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号に開示された方法（それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられる）を利用して、Ｔｈｒ３４−リン酸化、Ｔｈｒ７５−リン酸化又はＳｅｒｌ３７−リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２に特異性を有するリン酸化状態特異的抗体を作製する。
【０２１１】
蛍光共鳴エネルギー移動、又はＦＲＥＴは、均一系アッセイに広く利用されていて、巨大分子の特異的結合を検出することができる。ＦＲＥＴは、励起された「ドナー」蛍光分子（蛍光体）がそのエネルギーを光として発光するよりむしろ近接する「アクセプター」蛍光体に移動する能力に依存する。従って、基質標的との結合によって２つの蛍光体が一緒の空間に運ばれると、正常なドナー波長で発光される蛍光が低下しアクセプター蛍光体により発光される蛍光が増加する。ドナー蛍光の減少又はアクセプター蛍光の増加を利用して結合事象を測定することができる。
【０２１２】
一実施形態においては、Baderらが開示した方法（2001, 「時間分解蛍光共鳴エネルギー移動に基づくハイスループットスクリーニングのためのcGMP依存性プロテインキナーゼアッセイ（A cGMP-dependent protein kinase assay for high throughput screening based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer）」, Journal of Biomolecular Screening 6 (4):255-64）を利用してキナーゼ活性を定量する。Baderらは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）に基づくハイスループットスクリーニング用のｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼアッセイを開示している。目的のキナーゼを含有するサンプルを、ＡＴＰ、及びＣｄｋ５特異的リン酸化部位とアミノ末端ビオチン部分とをもつ合成ペプチド基質に曝した。リン酸化ペプチドをアロフィコシアニン標識したストレプトアビジン、リンペプチド特異的抗体、及びユーロピウム−キレート標識した二次抗体を用いて検出した。ストレプトアビジンとリン酸特異的抗体がリン酸化基質分子に同時結合すると、アロフィコシアニン蛍光体「アクセプター」が二次抗体上のユーロピウムキレート「ドナー」の十分近くまで運ばれるので、蛍光共鳴エネルギー移動が起こって６１５ｎｍにおけるユーロピウム放射の減少及び６６５ｎｍ波長におけるアロフィコシアニン放射の増加として測定可能となる。ユーロピウム−アロフィコシアニンのドナー−アクセプター対が通常利用されるのは、励起ユーロピウムの蛍光寿命が長い利点を生かして、従ってシグナルが「時間分解（time-resolved）」されるからである。
【０２１３】
クマリンとフルオレセインイソチオシアネートなどの他の蛍光体の対を利用することができる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関わるこのような分子の対をＦＲＥＴ対と呼ぶ。エネルギー伝達が起こるためには、ドナーとアクセプター分子が典型的に近い近位（７０〜１００Åまで（Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211:353-388；Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246:300-334））になければならない。エネルギー伝達の効率はドナー分子とアクセプター分子との間の距離が大きくなると急速に低下する。ＦＲＥＴに通常使用される分子としては、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、及び５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられる。蛍光体がドナーであるか又はアクセプターであるかは、その励起及び発光スペクトル、ならびに対となる蛍光体により規定する。例えば、ＦＡＭは４８８ｎｍの波長の光により最も効率的に励起されて、５００〜６５０ｎｍでかつ発光最高５２５ｎｍのスペクトルをもつ光を発光する。ＦＡＭは、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸ（これらは全て５１４ｎｍの励起最高波長をもつ）と共に使用するのに適したドナー蛍光体である。
【０２１４】
蛍光偏光測定値を使ってまた、プロテインキナーゼ又はホスファターゼの活性を測定することもできる（例えば、Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド結合及びキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88；Turekら, 2001, Anal. Biochem. 299:45-53を参照）。大きな特異的抗体が小さい蛍光性リンペプチドと結合すると、その回転速度（tumbling rate）を遅くして蛍光偏光シグナルを増加する。従って、蛍光偏光は結合した蛍光性リンペプチドの量に比例する。このアッセイを競合モードで利用することができ、固定した濃度の蛍光性ペプチド及び抗体を生物サンプルに加えて非蛍光性リンタンパク質又はリンペプチドの存在をシグナルの低減として記録する。このアッセイはまた、直接結合モードで利用することもでき、リン酸添加（キナーゼにより）又は除去（ホスファターゼにより）により抗体結合、従って偏光シグナルをモジュレートする。特定の実施形態においては、蛍光偏光アッセイをTurekら（2001, Anal. Biochem. 299:45-53）の方法を用いて実施し、産物特異的な抗リン酸化ペプチド特異的（例えば、抗リン酸セリン）抗体を使用する。
【０２１５】
特定の実施形態においては、Ｃｄｋ５のモジュレーター（例えば、インヒビター）は、ベクターによる発現後の細菌から精製した組換えＣｄｋ５を用いて、Ｃｄｋ５を含有する細胞溶解物を用いて、又は脳組織溶解物を用いて、酵素アッセイを経由して同定することができる（例えば、Leostら, 2000, Eur. J. Biochem. 267:5983-5994を参照）。他の実施形態においては、Ｃｄｋ５のモジュレーターは、バキュロウイルスを使う発現後の昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）から精製した組換えＣｄｋ５を用いて同定することができる。このようなアッセイにおいては、酵素又は溶解物を３０℃にてペプチド基質ビオチン−ＤＡＲＰＰ−３２（アミノ酸残基６７−８２）（約１μＭ）とともに、適当なバッファー（５００μＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール）中で最終反応容積４０−６０μｌにてインキュベートする。反応は等容積の停止バッファー（３０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を加えることにより停止する。
【０２１６】
リン酸化ペプチドの検出については、停止した反応物のアリコート（２０−３０μｌ）を、三連で３８４ウエル黒色マルチウエルプレートに加え、次いで、適当なバッファー（０．１％ＢＳＡを含むリン酸バッファー生理食塩水、ｐＨ７．４）中にウサギポリクローナル抗リン酸ｔｈｒ７５−ＤＡＲＰＰ−３２抗体（１ｎＭ）、ユーロピウム標識した抗ウサギＩｇＧ（１ｎＭ）、及びストレプトアビジン−アロフィコシアニンコンジュゲート（２ｕｇ／ｍｌ）を含有する抗体混合液の２容積を加えた。２０℃にて１−２４時間インキュベーションの後に、Applied Biosystems社サイトフルオア（Cytofluor）を用いて励起した後、５０μｓから開始して２００μｓの期間にわたり蛍光を測定する（励起フィルター波長３４０ｎＭ；発光フィルター波長６６０ｎＭ）。マウスモノクローナル抗リン酸ｔｈｒ７５−ＤＡＲＰＰ−３２抗体、ユーロピウム標識した抗マウスＩｇＧなどの他の抗体組合わせは本発明により意図されていて、比較しうる結果を与えうると予測される。
【０２１７】
ＣＫ１のインヒビターは、単離したＣＫ１、ＣＫ１を含有する細胞溶解物、又は脳組織溶解物を用いて、同様な酵素アッセイを経由して同定することができる。このアッセイにおいては、酵素又は溶解物を、３０℃にて、ペプチド基質ビオチン−ＤＡＲＰＰ−３２（アミノ酸残基１３２−１４６）（ほぼ１μＭ）とともに、適当なバッファー（５００μＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール）中で、最終反応容積４０−６０μｌにてインキュベートする。反応は等容積の停止バッファー（３０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を加えることにより停止する。
【０２１８】
リン酸化ペプチドの検出については、停止した反応物のアリコート（２０−３０μｌ）を、三連で３８４ウエル黒色マルチウエルプレートに加え、次いで、適当なバッファー（０．１％ＢＳＡを含むリン酸バッファー生理食塩水、ｐＨ７．４）中に抗リン酸ｓｅｒｌ３７−ＤＡＲＰＰ−３２抗体（１ｎＭ）、ユーロピウム標識した抗マウスＩｇＧ（１ｎＭ）、及びストレプトアビジン−アロフィコシアニンコンジュゲート（２ｕｇ／ｍｌ）を含有する抗体混合液の２容積を加えた。２０℃にて１−２４時間のインキュベーションの後に、Applied Biosystems社サイトフルオア（Cytofluor）を用いて励起した後、５０μｓから開始して２００μｓの期間にわたり蛍光を測定する（励起フィルター波長３４０ｎＭ；発光フィルター波長６６０ｎＭ）。ウサギポリクローナル抗リン酸ｔｈｒ７５−ＤＡＲＰＰ−３２抗体、ユーロピウム標識した抗ウサギＩｇＧなどの他の抗体組合わせは本発明により意図されていて、比較しうる結果を与えうると予測される。
【０２１９】
上に開示したアッセイの一形態においては、組換え酵素、組織から単離された酵素、又は組織若しくは細胞溶解物を、プロリン指定リン酸化部位を提供するビオチン−ペプチド基質とともに３０℃にてインキュベートする。ラット及びマウスＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化部位と同一である、ヒトＤＡＲＰＰ−３２のアミノ酸残基６７−８２、ＫＲＰＮＰＣＡＹＴＰＰＳＬＫＡＶ（配列番号５）はこのような基質を提供する。
【０２２０】
上に開示したアッセイの他の形態においては、組換え酵素、組織から単離された酵素、又は組織若しくは細胞溶解物を、カゼインキナーゼリン酸化部位を提供するビオチン−ペプチド基質とともに３０℃にてインキュベートする。ラット及びマウスＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化部位と同一である、ヒトＤＡＲＰＰ−３２のアミノ酸残基１３３−１４３、ＥＥＥＤＳＱＡＥＶＬＫ（配列番号６）はこのような基質を提供する。
【０２２１】
５−ＨＴＲリガンドに応答する細胞内キナーゼ活性のモジュレーションは、当業者に公知の様々な方法によりモニターすることができる。その細胞表面上５−ＨＴＲを提示する培養細胞をアゴニスト又はアンタゴニストとともにインキュベートし、界面活性剤溶解により遊離される細胞内キナーゼとそれらの活性を上記のリン酸化の蛍光検出により又は放射性同位体トレーサー法により測定することができる。放射性同位体トレーサー法は、例えば、Liu, F., X. H. Ma,ら (2001), 「代謝共役型グルタミン酸受容体によるサイクリン依存性キナーゼ５及びカゼインキナーゼ１の調節（Regulation of cyclin-dependent kinase 5 and casein kinase 1 by metabotropic glutamate receptors）」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (20):11062-8；Evans, D.B., K.B. Rankら (2002), 「96ウエルフォーマットを用いるヒトのタウタンパク質キナーゼII/Cdk5のインヒビターを研究するためのシンチレーション近接アッセイ（A scintillation proximity assay for studying inhibitors of human tau protein kinase II/Cdk5 using a 96-well format）」, J. Biochem. Biophys. Meth. 50 (2-3):151-61；及びMcDonaldら, 1999, 「Raf/MEK/ERKキナーゼカスケードのシンチレーション近位アッセイ：ハイスループットスクリーニング及び選択的酵素インヒビターの同定（A scintillation proximity assay for Raf/MEK/ERK kinase cascade: High-throughput screening and identification of selective enzyme inhibitors）」, Anal. Biochem. 268:318-329の開示のように利用してもよい。
【０２２２】
他の実施形態においては、細胞に基づくリン酸化のアッセイを利用する。特定の実施形態においては、タンパク質リン酸化に基づくシグナル伝達をｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、単一生存細胞で、蛍光指示薬を使って、Satoら（2002, 「単一生存細胞のタンパク質リン酸化をイメージングするための蛍光指示薬（Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells）」, Nature Biotechnology 20(3):287-94）に開示されたような方法を用いて可視化する。そのようなセンサーは、フレキシブルリンカーにより分離された２つの蛍光タンパク質分子からなる。リンカーペプチドはリン酸化部位及びリンタンパク質認識エレメントを含有する。リンカーのリン酸化は、コンフォメーションの変化を生じて２つの蛍光タンパク質を密接した近位に運び、ＦＲＥＴを発生させてその系の蛍光出力を変える。
【０２２３】
５．３．セロトニン受容体シグナル伝達経路によりＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物
本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする組成物であって、限定されるものでないが、以下に開示する次の薬剤、医薬、化合物又は小分子を含む上記組成物も提供する。本発明はまた、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性のモジュレーションによってＡＭＰＡ受容体の活性をモジュレートする組成物であって、限定されるものでないが、以下に開示する次の薬剤、医薬、化合物又は小分子を含む上記組成物も提供する。本発明はまた、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害障害の治療方法に使用する組成物であって、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートし、限定されるものでないが、以下に開示する次の薬剤、医薬、化合物又は小分子を含む上記組成物も提供する。ある特定の実施形態においては、上記組成物は５−ＨＴＲシグナル伝達経路を介して活性をモジュレートする。一実施形態においては、上記５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路は、（ｉ）Ｔｈｒ−３４のＰＫＡリン酸化のｃＡＭＰ活性化を増大させる５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化、（ｉｉ）Ｔｈｒ−７５のタンパク質ホスファターゼ−２Ａ（ＰＰ−２Ａ）の脱リン酸化のＰＫＡ活性化のｃＡＭＰ活性化を増大させる５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化、並びに／又は（ｉｉｉ）ＰＬＣの活性化を増大させ、それがまたＳｅｒ−１３７のＣＫ１依存的リン酸化のカルシウム活性化を増大させる５−ＨＴ２受容体の活性化を含む。
【０２２４】
５−ＨＴＲアゴニストとしては、限定するものではないが、５−ＨＴＰ、ＰＣＡ、セロトニン再取込みインヒビター（ＳＳＲＩ）、例えばフルオキセチン（アドフェン、デプロキシン、フルクチン（Fluctin）、フルクチン（Fluctine）、フルダック、フルフラン、フルニル、フルオザック、フルオキセレン、フルオキシル、フルオキセロン、フルチン、フルキシル、フォンテックス、ローバン、マーグリラン、オキセチン、プロデップ、プロザック、プロザック２０、ロベキセティナ、セロニル）、フルボキサミン（ファボキシル）、フルボキサミン（デュミロックス（Dumirox）、デュミィロックス（Dumyrox）、ファベリン、ファヴォキシル、フェバリン、フロキシフラル、ルボックス、マヴェラル）、クロバザム（フリシウム）、アルプラゾラム（フロンタール）、及びパロキセチン（パキシル）が挙げられる。
【０２２５】
混合５−ＨＴＲアゴニスト／アンタゴニストとしては、限定するものではないが、ブスピロン、ミアンセリン、トラゾドン（デシレル）、及びミルタゼピン（レメロン）が挙げられる。
【０２２６】
５−ＨＴＲアンタゴニストとしては、限定するものではないが、リスペリドン、クロザピン、オランザピン、クエチアピン、ケタンセリン及びリタンセリンが挙げられる。
【０２２７】
５−ＨＴ細胞内シグナル伝達経路のモジュレーターとしては、限定するものではないが、ＭＡＯインヒビター、例えばトラニルシプロアミン（PARNATE（登録商標））、モクロベミド、及びフェネルジン（NARDIL（登録商標））が挙げられる。
【０２２８】
５−ＨＴ細胞内シグナル伝達経路の他のモジュレーターとしては、限定するものではないが、三環系抗鬱薬、例えばイミプラミン（FRONIL（登録商標））、クロミプラミン（ANAFRANIL（登録商標））及びトリミプラミン（SURMONTIL（登録商標））が挙げられる。
【０２２９】
５−ＨＴ細胞内シグナル伝達経路の他のモジュレーターとしては、限定するものではないが、ペルフェナジン、ブプロピオン（WELLBUTRIN（登録商標））、ベンラタキシン（EFFEXOR（登録商標））及びレボキセチンが挙げられる。
【０２３０】
５−ＨＴ細胞内シグナル伝達経路の別のモジュレーターとしては、限定するものではないが、ＣＫ１インヒビター、例えば、ＣＫ１−７（ＣＫ１−７）及びＣｄｋ５インヒビター、例えばブチロラクトンが挙げられる。
【０２３１】
５−ＨＴ細胞内シグナル伝達経路の別のモジュレーターとしては、限定するものではないが、ＰＬＣインヒビター（例えばＵ７３１２２）、Ｃａ２＋キレート剤（例えばＢＡＰＴＡ／ＡＭ）が挙げられる。
【０２３２】
５−ＨＴ細胞内シグナル伝達経路の別のモジュレーターとしては、限定するものではないが、カルシニュリン（ＰＰ２Ｂ）インヒビター、例えばシクロスポリンＡ、シペルメトリン３−（２，２−ジクロロエテニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸シアノ（３−フェノキシフェニル）メチルエーテル、タクロリムス（ＦＫ５０６、Prograf）、デルタメトリン及びＩＳＡＴＸ２４７（Isotechnika）が挙げられる。
【０２３３】
ある特定の５−ＨＴＲアゴニスト又はアンタゴニストがアゴニストとアンタゴニストの両方の特性を有しうることは、当業者には明らかであろう。以上に掲げた化合物は機構の理論により限定されるものでなく、それらの分類と無関係に本発明に利用することができる。
【０２３４】
本発明はまた、５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路のモジュレーターとして活性を有する新しい化合物であって、限定されるものでないが、５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達を刺激又は阻害する能力をもついずれの化合物も含みかつ、限定されるものでないが、細胞内に送達することができる低分子量有機分子を含む上記化合物を設計する方法も包含する。
【０２３５】
本発明はさらに、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートしそれにより５−ＨＴＲシグナル伝達経路に関係する障害を改善することができる医薬を開発するための、合理的な医薬設計を実施する方法を提供する。そのような合理的な医薬設計は、５−ＨＴＲのアゴニスト若しくはアンタゴニスト、又はセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路のモジュレーターとして同定されている化合物を出発点に用いて実施することができる。他の実施形態においては、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａのアゴニスト又はアンタゴニストとして同定されている化合物を出発点に用いてもよい。従って、本発明はさらに特異的なインヒビターを同定することを可能にするスクリーニング及びアッセイを提供する。そのような合理的医薬設計の方法は当技術分野で周知である。特定の実施形態においては、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号に開示された合理的な医薬設計法を用いる。
【０２３６】
実際に、候補モジュレーターをＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、又はＡＵＴＯＤＯＣＫ（Dunbrackら, Folding & Design 2:27-42 (1997)）などのドッキングプログラムを用いるコンピューターモデルを利用して試験し、例えば５−ＨＴＲシグナル伝達経路の候補モジュレーターを同定することができる。次いでこれらのモジュレーターをＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性に対する効果について試験することができる。この方法は、候補モジュレーターの形状及び化学構造が如何にうまく５−ＨＴＲ、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａと結合しうるかを確かめるための、候補モジュレーターの５−ＨＴＲ、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ複合体とのコンピューターフィッティングを含みうる（Buggら, 1993, Scientific American (Dec.) 269 (6):92-98；Westら, TIPS, 16:67-74 (1995)）。コンピュータープログラムはまた、サブユニットのモジュレーター／インヒビターとの引力、反力、及び立体障害を評価するために使用することもできる。一般的に、フィットが強いほど、立体障害は低くかつ引力は大きく、より強力な候補モジュレーターである、というのは、これらの特性はより強い結合定数と一致するからである。さらに、候補医薬の設計における特異性が高いほど、その医薬は他のタンパク質と相互作用しない可能性が高い。これにより、他のタンパク質との望ましくない相互作用による潜在的副作用が最小限に抑えられる。最初に、５−ＨＴＲと結合することが知られている化合物（例えば、５−ＨＴＰ）又はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａに結合することが知られている化合物をコンピューターモデルプログラムにより、１以上の有望な候補類似体を同定するまでシステム的に改変する。さらに、選択した類似体のシステム的改変物を次いでコンピューターモデルプログラムにより、１以上の候補類似体を同定するまでシステム的に改変する。そのような解析は、当業者に周知であり、例えば、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの開発に効果的で
あることが知られている（例えば、Lamら, Science 263:380-384 (1994)；Wlodawerら, Ann. Rev. Biochem. 62:543-585 (1993)；Appelt, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48 (1993)；Erickson, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128 (1993)を参照）。あるいは、候補モジュレーターを、最初に、例えば、上に開示した組換えバクテリオファージにより作製した無作為ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。この方法で選択したペプチドを次いで上に開示したコンピューターモデルプログラムによりシステム的に改変し、上に開示した構造的類似体と同様に処理する。
【０２３７】
いったん候補モジュレーターが同定されると、市販される化学品のライブラリー（例えば、Chembridge Corporation, San Diego, CA又はEvotec OAI, Abingdon, UK）から選択することができる。あるいは、候補モジュレーターを新規に合成してもよい。候補ペプチドモジュレーターは、タンパク質合成技術により、例えば、ペプチド合成機又は当技術分野で周知のタンパク質／ペプチド合成の他の方法の使用により合成することができる。一実施形態においては、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号（本明細書に参照によりその全文が組み入れられる）に開示されたタンパク質／ペプチド合成の方法を利用する。１又は比較的小グループの特定化合物の新規合成が医薬設計の分野では妥当である。
【０２３８】
候補薬剤、候補薬剤の標的（例えば、５−ＨＴＲ、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ）又はＤＡＲＰＰ−３２（３２Ｐ−Ｔｈｒ７５リン酸化ＤＡＲＰＰ−３２など）のいずれに標識を付けてもよい。適当な標識としては、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼ）、蛍光団（若干の蛍光団を挙げると、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離又はキレート化ランタニド系列の塩、特にＥｕ３＋）、発色団、放射性同位体、キレート剤、染料、コロイド状金、ラテックス粒子、リガンド（例えば、ビオチン）、化学発光剤、磁気ビーズ又は磁気共鳴イメージング標識が挙げられる。対照マーカーを用いるときは、受容体と対照マーカーに対して同じ又は異なる標識を用いてもよい。
【０２３９】
同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５ｌＣｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３ｌＩ、及びｌ８６Ｒｅなどの放射性標識を用いるときは、当技術分野で公知のカウント方法を利用することができる。
【０２４０】
標識が酵素である実施形態においては、検出は当技術分野で公知の現在利用されている比色、分光分析、蛍光分光分析、電流測定又はガス分析技術により実施することができる。
【０２４１】
直接標識は、本発明の方法によって利用しうる標識の一例である。直接標識は、自然の状態において、肉眼（例えば、複合又は解剖光学顕微鏡を通しての目視観察により）、又は光学フィルターの助けをかりて及び／又は刺激、例えば蛍光を増強する紫外光を適用して、容易に見ることができる実体である。本発明の方法によって利用しうる着色標識の例としては、金属ゾル粒子、例えば、Leuvering（米国特許第４，３１３，７３４号）が開示したような金ゾル粒子；Gribnauら（米国特許第４，３７３，９３２号）及びMayら（ＷＯ８８／０８５３４）が開示したような染料ゾル粒子；Mayら（ＷＯ８８／０８５３４）、Snyder（ＥＰ−Ａ ０２８０ ５５９及び０ ２８１ ３２７）が開示したような染色ラテックス；又はCampbellら（米国特許第４，７０３，０１７号）が開示したようなリポソーム中に封入された染料が挙げられる。
【０２４２】
他の直接標識は、放射性ヌクレオチド、発光部分、又は蛍光部分を含み、限定されるものでないが、例えば、緑色蛍光タンパク質の改変／融合キメラを含む（それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、１９９７年４月２９日発行の米国特許第５，６２５，０４８号、及び１９９７年７月２４日公開のＷＯ９７／２６３３３に開示）。
【０２４３】
これらの直接標識デバイスに加えて、酵素を含む間接標識も本発明によって利用することができる。様々なタイプの酵素結合イムノアッセイ、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、又はウレアーゼを用いる酵素結合イムノアッセイが当技術分野で周知である。これらならびにその他の類似のアッセイが当技術分野で周知であり、例えば、Engvall（1980,「酵素イムノアッセイELISA及びEMIT（Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT）」, Methods in Enzymotogy, 70:419-439）及び米国特許第４，８５７，４５３号に開示されている。
【０２４４】
ある特定の実施形態においては、タンパク質を代謝標識により標識することができる。代謝標識の標識付けは、［３５Ｓ］−メチオニン又は［３２Ｐ］−オルトリン酸などの代謝標識を補充した培地の存在下でタンパク質を発現する細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中に起こる。［３５Ｓ］−メチオニンによる代謝（又は生合成）標識に加えて、本発明はさらに、［１４Ｃ］−アミノ酸及び［３Ｈ］−アミノ酸による（不安定でない位置に置換したトリチウムによる）標識を意図する（例えば、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で１９９９年１０月１５日出願の米国特許出願第０９／４１９，３７９号、及びBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で２０００年１０月１３日出願の米国特許出願第０９／６８７，９５９号を参照）。
【０２４５】
５．４．診断及び治療法
本明細書に開示したように、本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性又は発現をモジュレートする薬剤、医薬、化合物及び組成物を提供する。
【０２４６】
本発明はまた、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を治療するための診断及び治療の方法であって、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の治療における、限定されるものでないが、上記組成物又は化合物の使用を含む上記方法も提供する。
【０２４７】
一態様においては、本発明は、ＡＭＰＡ受容体活性の増大又は低減を特徴とする神経症状を治療する方法であって、本発明による化合物の有効量を投与してＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートし、その結果、５−ＨＴＲシグナル伝達経路のモジュレーションによってＡＭＰＡ受容体のリン酸化状態及び／又は活性を増大又は低減させることを含む上記方法を提供する。一実施形態においては、上記化合物を本明細書に開示した方法により同定する。
【０２４８】
さらに、本発明は、個人（例えば、患者）又は動物被験体における、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートする本発明の化合物の有効量を投与することにより治療する方法を提供する。一実施形態においては、上記薬剤はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性を促進しかつ増大する。他の実施形態においては、上記薬剤はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性を阻害し又は低減する。好ましい実施形態においては、上記薬剤は、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路によって活性を促進（すなわち増大）又は阻害（すなわち低減）するものである。
【０２４９】
特定の実施形態においては、本発明の方法を利用して、個人において、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌に特徴的な症候及び／又は病状に関連する、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を治療する。
【０２５０】
好ましくは、上記の治療方法で投与される薬剤、化合物又は組成物は十分な量が十分な速度で脳血液関門を通過することができて、障害、従って症状又は疾患の治療を可能にする。そのような一実施形態においては、薬剤を静脈中に投与する。他の実施形態においては、薬剤を経口投与する。さらに好ましくは、薬剤は担体なしで脳血液関門を通過することができる（投与の方法及び経路については、第５．６節を参照）。
【０２５１】
５．５．疾患又は障害のモデル
本発明の方法によれば、限定されるものでないが、鬱病、情動障害、躁鬱病、強迫神経障害、摂食障害、嘔吐、パニック障害、不安障害、偏頭痛、ミクローナス、月経前症候群（ＰＭＳ）、心的外傷後ストレス症候群、カルチノイド症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠又は概日リズム障害（例えば、不眠症）、性的障害、ストレス障害、統合失調症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、神経変性障害、薬物乱用、疼痛、及び癌を含む、セロトニン受容体シグナル伝達経路に関連する疾患又は障害のための動物モデルをアッセイに利用して、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートする化合物又は５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の症候群を改善する化合物をスクリーニングすることができる。
【０２５２】
一実施形態においては、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又は、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害のための動物モデルを本発明の方法によるスクリーニングアッセイに利用する。そのような動物は、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシなどであってもよく、好ましくは非ヒト哺乳動物である。
【０２５３】
一実施形態においては、トランスジェニックマウスをアルツハイマー病に対する動物モデルとして利用する（例えば、Lewisら (2000, Aug.), 「突然変異（P301L）タウタンパク質を発現するマウスにおける神経細線維もつれ、筋萎縮及び進行性運動障害（Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein）」, Nature Genetics 25(4):402-5、2000, Nat. Genet. 26(1):127に誤り；Lewisら 2001, 「突然変異タウ及びAPPを発現するトランスジェニックマウスにおける神経細線維変性の増加（Enhanced neurofibrillary degeneration in transgenic mice expressing mutant tau and APP）」, Science 293 (5534):1487-91；Gotzら, 2001, 「無β42原繊維により誘導される、P301lタウのトランスジェニックマウスにおける神経細線維もつれの形成（Formation of neurofibrillary tangles in P301l tau transgenic mice induced by Abeta 42 fibrils）」, Science 293 (5534):1491-5を参照）。Lewisら（2000, 「突然変異（P301L）タウタンパク質を発現するマウスにおける神経細線維もつれ、筋萎縮及び進行性運動障害（Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein）」, Nature Genetics 25(4):402-5、2000, Nat. Genet. 26(1):127に誤り）は、ヒトＰ３０１Ｌタウタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを開示する。このマウス株由来の動物は、年齢に依存して過リン酸化タウ及び進行性運動障害を含有するアルツハイマー様の神経細線維もつれを発生する。ＣＫ１活性化、又はその後のＣｄｋ５活性化のモジュレーターの、神経細線維もつれ及び神経機能障害の発生に対する効果をこのモデル系において研究した。５−ＨＴＲ又はＤＡ受容体シグナル伝達経路モジュレーターの、無β４２に刺激された神経細線維もつれの形成に対する効果もこのモデル系において研究した。この場合、無β４２は、Ｐ３０１ｌタウ発現マウスとヒトＡＰＰ発現マウスとの遺伝的交雑（例えば、Lewisら 2001, 「突然変異タウ及びAPPを発現するトランスジェニックマウスにおける神経細線維変性の増加（Enhanced neurofibrillary degeneration in transgenic mice expressing mutant tau and APP）」, Science 293 (5534):1487-91）により、又はタウ発現マウスの脳中への無β42の直接注射（例えば、Gotzら, 2001, 「無β42原繊維により誘導される、P301lタウのトランスジェニックマウスにおける神経細線維もつれの形成（Formation of neurofibrillary tangles in P301l tau transgenic mice induced by Abeta 42 fibrils）」, Science 293 (5534):1491-5）により補給することができる。そのようなモデル動物系を利用して、それらの５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路に対する効果によりアルツハイマー病の治療に有用である化合物をスクリーニングすることができる。
【０２５４】
他の実施形態においては、卒中のラットモデルを利用する。Brintら（1988, J. Cerebr. Blood Flow & Metab. 8:474-485）は、限局性脳虚血のラットモデルを開示している。De Vryら（2001, Eur. J. Pharmacol. 428:203-214）は、ラット急性硬膜下血腫モデル、及び５−ＨＴＲアンタゴニストであるＢＡＹ３６−７６２０の神経保護よび行動効果を研究するために用いたラット中大脳動脈閉塞モデルを開示している。Baoら（2001, Brain Res. 922:173-179）は、グループＩ  ５−ＨＴＲ受容体アゴニスト及びアンタゴニストを試験した限局性脳虚血のラットモデルを開示している。Tanakaら（2002, Brain Research 924:98-108）は中大脳動脈閉塞による卒中の測定方法を開示している。そのようなモデル動物系を利用して、それらの５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路に対する効果により卒中の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０２５５】
他の実施形態においては、統合失調症のラットモデルを利用する（Sipesら, 1995, 「ラットにおける前パルス抑制の8-OH-DPAT破壊：作用部位の(+)WAY 100、135及び局在による逆転（8-OH-DPAT disruption of prepulse inhibition in rats: reversal with (+) WAY 100,135 and localization of site of action）」, Psychopharmacology (Berl) 117(1):41-8；Caoら, 2002, Brain Research 937:32-40）。そのようなモデル動物系を利用して、それらの５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路に対する効果により統合失調症の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０２５６】
他の実施形態においては、注意欠陥障害（ＡＤＤ）又は注意欠陥過活動障害（ＡＤＨＤ）のラットモデルを利用する（例えば、Hansenら, 1999, 「欠陥注意過活動障害の動物モデルにおけるアルコール応答性、過反応性及び運動不穏（Alcohol responsiveness, hyperreactivity and motor restlessness in an animal model for attention-deficit hyperactivity disorder）」, Psychopharmacology 146:1-9；Russell, 2002, Behavioral Brain Res. 130: 191-196を参照）。Russellは、例えば、ＡＤＨＤの遺伝モデルである自然発症の高血圧ラットモデルを開示している。そのようなモデル動物系を利用して、それらの５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路に対する効果によりＡＤＨＤの治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０２５７】
他の実施形態においては、疼痛のマウスモデルを利用する（例えば、O'Callaghanら, 1975, 「改変ホットプレート方法による麻薬性アンタゴニストの麻酔活性の定量（Quantification of the analgesic activity of narcotic antagonists by a modified hot-plate procedure）」, J. Pharmacol Exp Ther 192:497-505；Guarnaら, 2002, J. Neurochem. 80:271-277；Menendezら, 2002, 「片側ホットプレート試験：マウスの中枢及び末梢痛覚過敏を検出するための簡単で感受性のある方法（Unilateral hot plate test: a simple and sensitive method for detecting central and peripheral hyperalgesia in mice）」, J. Neurosci. Methods 113: 91-97）。Guarnaらは、急性熱侵害受容に対するマウスモデルを開示している。Menendezらは、中枢及び末梢痛覚過敏に対するマウスモデルを開示している。そのようなモデル動物系を利用して、それらの５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路に対する効果により疼痛の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０２５８】
他の実施形態においては、依存症（例えば、コカイン依存症）のラットモデルを利用する（Caine及びKoob, 1995, 「ラットにおいて、ドーパミン作動薬7-OH-DPATの前処理は、様々なスケジュールのもとでのコカイン自己投与用量-効果関数を左へシフトする（Pretreatment with the dopamine agonist 7-OH-DPAT shifts the cocaine self-administration dose-effect function to the left under different schedules in the rat）」, Behav. Pharmacol 6:333-347；Orsiniら, 2002, Brain Research 925:133-140）。そのようなモデル動物系を利用して、それらの５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路に対する効果により薬物乱用の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０２５９】
他の実施形態においては、パーキンソン病のマウスモデルを利用する（Uhlら, 1985, Lancet 1: 956-57; Mokry, 1995, 「パーキンソン病の研究に用いる実験モデルと行動試験（Experimental models and behavioral tests used in the study of Parkinson's Disease）」, Physiol. Res. 44:143-50.；Du, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:14669-14674）。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果によりパーキンソン病の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。別の実施形態においては、パーキンソン病のラットモデルを使用する。特定の実施形態においては、標準的な方法により６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン、ドーパミン作用性神経毒素）をラットに注射する。６−ＯＨＤＡは、ドーパミン作動性ニューロンにより選択的に取り込まれて、ニューロンを死滅させる。かかる６−ＯＨＤＡ損傷動物はパーキンソン病の動物モデルと考えられる（第６節参照）。
【０２６０】
他の実施形態においては、癲癇の動物又は組織モデルを利用する（例えば、Paschoaら, 1997, 「実験癲癇のキンドリング及び皮質刺激モデルにおける発作パターン（Seizure patterns in kindling and cortical stimulation models of experimental epilepsy）」, Brain Res. 770:221-227；Kokaia, 1995, Exper. Neurol. 133:215-224；Merlin, 1999, J. Neurophysiol. 82:1078-1081；Merlin, 2001, J. Neurophysiol. 87:621-625を参照）。Kokaia（1995, Exper. Neurol. 133:215-224）は癲癇のマウスモデルを開示している。Merlin（1999, J. Neurophysiol. 82:1078-1081；2001, J. Neurophysiol. 87: 621-625）は癲癇のモルモット海馬切片モデルを開示している。そのような動物モデル又は組織系を利用して、それらの５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路に対する効果により癲癇の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０２６１】
他の実施形態においては、癌、腫瘍形成、又は発癌のげっ歯類動物（例えば、マウス）モデルを利用する。このようなげっ歯類モデルは当業者に周知である（例えば、Satoら, 1997, 「SCIDマウスにおける、LNCaP細胞の前立腺内接種を利用する転移性アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌モデル（A metastatic and androgen-sensitive human prostate cancer model using intraprostatic inoculation of LNCaP cells in SCID mice）」, Cancer Res. 15: 1584-1589を参照）。例えば、ある特定の実施形態においては、腫瘍を胸腺欠損裸マウスの皮下で増殖してもよい（例えば、Singhら, 2002, Cancer Res. 62:3063-3069を参照）。そのようなモデル動物系を利用して、それらの５−ＨＴＲ細胞内シグナル伝達経路に対する効果により癌又は腫瘍の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０２６２】
別の実施形態において、げっ歯類の尾部懸垂試験（第７節に記載する）は、抗鬱薬としての効力を予測するための実験モデルとして使用しうる。
【０２６３】
特定の実施形態においては、動物モデルはホモ接合性ＤＡＲＰＰ−３２ノックアウトマウスである（例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、１９９８年７月７日発行のFienbergらによる米国特許第５，７７７，１９５号；２０００年１月１１日発行のNishiらによる米国特許第６，０１３，６２１号；及びFienbergら, 1998, Science 281:838-842を参照）。一実施形態においては、候補薬がＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性をモジュレートすることを実証又は確証するさらなる試験又はアッセイに、ホモ接合性ＤＡＲＰＰ−３２ノックアウトマウスを利用することができる。特定の実施形態においては、実証はNishiら（２０００年１月１１日発行の米国特許第６，０１３，６２１号）が記載した方法によって実施してもよい。そのような薬剤がＤＡＲＰＰ−３２リン酸化によってＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性をモジュレートすると確認された場合、ＤＡＲＰＰ３２ノックアウトマウスにおける上記薬剤の存在又は投与は、薬剤の非存在又は非投与と比較して、ＡＭＰＡ受容体活性化の量（及び／又は速度）を有意に増大又は低減することはないに違いない。
【０２６４】
５．６．医薬組成物
本発明は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性を調節するための医薬組成物、並びに５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を診断又は治療するための医薬組成物を包含する。正常機能が喪失すると、上に掲げた疾患又は障害が発生するので、セロトニン受容体（５−ＨＴＲ）シグナル伝達経路の活性化、又はＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性の増大（例えば、下流活性化）はそのような障害を示す個体における症候の改善を促進する。
【０２６５】
あるいは、ある特定の５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の症候群は、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａ活性のレベルを低減することにより、及び／又はセロトニン受容体シグナル伝達経路の活性をダウンレギュレーションすることにより（例えば、下流シグナル伝達事象を標的とすることにより）改善することができる。様々な手法を以下に考察する。
【０２６６】
特定の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴＲ関連障害の症候を示す患者又は被験者の上記症候を改善することができる薬剤（第５．４節を参照）を投与する方法を提供する。
【０２６７】
特定の実施形態においては、本発明は、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の症候を示す患者又は被験者の上記症候を改善することができる薬剤（第５．４節を参照）を投与する方法を提供する。
【０２６８】
特定の実施形態においては、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を治療するために、本明細書に開示した５−ＨＴＲ活性のアゴニストを使用することができる。他の実施形態においては、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害を治療するために、本明細書に開示した５−ＨＴＲ活性のアンタゴニストを使用することができる。その化合物が５−ＨＴＲに対する絶対的特異性を示すことは必要でない。例えば、５−ＨＴＲと他の受容体の両方に作用する化合物を使用してもよく；そのような化合物を神経系への送達が最適化されるように投与して、５−ＨＴＲ関連障害、ＤＡ関連障害、ＣＫ１関連障害、Ｃｄｋ５関連障害、ＡＭＰＡ受容体関連障害、又はＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／若しくはＰＰ２Ａ関連障害の改善を達成してもよい。
【０２６９】
５．６．１．医薬製剤
本発明は、本明細書に以上開示した本発明の薬剤、医薬又は化合物の医薬組成物を提供する。薬剤、医薬又は化合物又はそれらの生理学的に許容される塩又は溶媒和化合物を、注射用に、又は経口、局所、経鼻、吸入、吹送（口又は鼻を経て）、バッカル、非経口、直腸投与若しくはその他の投与剤形用に製剤化することができる。本発明は、本発明の薬剤の有効量を製薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、賦形剤及び／又は担体と一緒に含有する医薬組成物を提供する。そのような組成物としては、様々なバッファー内容物（例えば、トリス−塩酸、酢酸、リン酸）、ｐＨ及びイオン強度の希釈物；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、抗酸化剤（アスコルビン酸、メタ亜硫酸水素塩）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えば、ラクトース、マニトール）などの添加剤が挙げられる。
【０２７０】
組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物又はリポソーム中に組み込んでもよい。ヒアルロン酸を利用してもよい。生体適合性のある吸収性ポリマーを、脂肪酸ポリエステル、共重合体及びブレンドからなる群から選択してもよく、それらとしては、限定されるものでないが、乳酸エステルのホモポリマー及び共重合体（Ｄ−、Ｌ−、乳酸及びＤ−、Ｌ−及びメソ乳酸エステルを含む）、グリコール酸エステル（グリコール酸を含む）、ε−カプロラクタム、ｐ−ジオキサノン（米国特許第４，０５２，９８８号に開示された１，４−ジオキサン−２−オン）、ｐ−ジオキサノンのアルキル置換誘導体（すなわち、米国特許第５，７０３，２００号に開示された６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オン）、トリエチレンカーボネート（１，３−ジオキサン−２−オン）、１，３−ジオキサンのアルキル置換誘導体（米国特許第５，４１２，０６８号に開示された）、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、ヒドロキシ酪酸塩、ヒドロキシ吉草酸塩、１，４−ジオキセパン−２−オン（米国特許第４，０５２，９８８号に開示された及びその二量体、１，５，８，１２−テトラオキサシクロテトラデカン−７，１４ジオン）、１，５−ジオキセパン−２−オン、及びそれらのポリマーブレンドが挙げられる。
【０２７１】
そのような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えうる。例えば、「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第18版（1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042）、1435-1712頁を参照。上記組成物を液体剤形で、又は凍結乾燥剤形として乾燥粉末で製造してもよい。
【０２７２】
本発明で使用が意図されるのは、一般的に、「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第18版（1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042）、第８９章に開示された経口固体剤形である。固体投与剤形としては、錠剤、カプセル剤、ピル剤、トローチ剤又はロゼンジ剤、カシェ剤又はペレット剤が挙げられる。また、リポソーム又はプロテイノイド封入を利用して本発明の組成物を製剤することもできる（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報じられるプロテノイドミクロスフェアのように）。リポソーム封入を利用してもよく、リポソームは様々なポリマーを用いて誘導体化しうる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療用の可能な固体投与剤形の説明は、Marshall, K（「現代の医薬品（Modern Pharmaceutics）」, G. S. Banker及びC. T. Rhodes編, 第10章, (1979)）により与えられている。一般的に、製剤は、薬剤と不活性成分（生物学的活性物質の胃環境に対する保護及び腸における放出を可能にする）を含みうる。
【０２７３】
十分な胃耐性を保証するために、少なくともｐＨ５．０まで不透過性のコーティングが有用である。腸溶コーティングとして利用される、より普通の不活性成分の例は、酢酸トリメリト酸セルロース（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリ酢酸フタル酸ビニル（ＰＶＡＰ）、ユードラジット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）Ｌ３０Ｄ、アクアテリック（Ａｑｕａｔｅｒｉｃ）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ユードラジットＬ、ユードラジットＳ、及びシェラック（Ｓｈｅｌｌａｃ）である。これらのコーティングは混合フィルムとして使用してもよい。
【０２７４】
コーティング又はコーティングの混合物はまた、胃に対する保護を意図しない錠剤に対して使用することもできる。これは、糖コーティング又は錠を嚥下しやすくするコーティングを含む。カプセルは、乾燥治療薬、すなわち粉末を送達するためのハードシェル（ゼラチンなど）から作製されてもよいし；液剤形用に、ソフトゼラチンシェルを用いてもよい。カシェ剤のシェル材料は厚いデンプン又はその他の食用紙であってもよい。丸薬、ロゼンジ錠、成型錠又は粉薬錠剤に対しては、湿式造粒技術を利用することができる。
【０２７５】
治療薬を、顆粒又はペレットの形態の細かい多微粒子の製剤に含有してもよい。カプセル投与用物質の製剤はまた、粉末、軽く圧縮したプラグ又はさらに錠剤であってもよい。治療薬はまた圧縮により製造することもできる。
【０２７６】
着色剤及び香料を全て含んでもよい。例えば、上記タンパク質（又は誘導体）を（リポソーム又はミクロスフェア封入によるなどして）製剤し、次いでさらに着色剤及び香料を含有する冷蔵飲料などの食用品中に含ませてもよい。
【０２７７】
治療薬の容積を不活性物質又は増量剤を用いて希釈又は増量してもよい。これらの希釈剤又は増量剤としては、炭水化物、特にマニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース（例えば、微結晶セルロース）、スクロース、水素リン酸カルシウムで修飾したデキストラン及びデンプンが挙げられる。ある特定の無機塩も増量剤として利用することができ、それらとしては、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムが挙げられる。いくつかの市販される希釈剤として、ファースト・フロ（Fast-Flo）、エムデックス（Emdex）、STA-Rx 1500、エンコンプレス（Emcompress）及びアビセル（Avicell）がある。
【０２７８】
治療薬の製剤において崩壊剤を固体投与剤形中に含ませてもよい。崩壊剤として利用される物質は、限定されるものでないが、デンプン（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプンに基づく商業用崩壊剤、エクスプロタブ（Explotab））が挙げられる。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト（Amberlite）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジ皮、酸性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベントナイトは全て使用することができる。崩壊剤の他の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末ガムを崩壊剤として及び結合剤として使用してもよく、それらは、寒天、カラヤ（Karaya）又はトラガカントなどの粉末ガムを含みうる。アルギン酸とそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【０２７９】
治療薬を一緒に保持して硬質錠を作るために結合剤を用いてもよく、それらとしては、アカシア、トラガカント、デンプン（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン）及びゼラチンなどの天然産物由来の物質が挙げられる。その他としては、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方とも、アルコール溶液中で治療薬を造粒するのに使うことができる。
【０２８０】
減摩剤（anti-frictional agent）を治療薬を剤形中に含ませて、製剤過程中の固着を防止してもよい。潤滑剤を治療薬とダイ壁の間の層として用いてもよく、これらとしては、ステアリン酸とそのマグネシウム及びカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液パラフィン、植物油及びワックス、タルクならびにシリカが挙げられる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カルボワックス（Carbowax）４０００及び６０００などの可溶潤滑剤を利用してもよい。
【０２８１】
製剤中の医薬の流動特性を改善して圧縮中の分散を助けることができる滑剤を加えてもよい。滑剤としては、デンプン、タルク、焼成シリカ及び水和シリコアルミン酸塩（silicoaluminate）が挙げられる。
【０２８２】
治療薬の水環境中への溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として加えてもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤を含んでもよい。陽イオン界面活性剤を利用してもよく、ベンズアルコニウムクロリド又はベンズエトニウムクロリドを含んでもよい。界面活性剤として製剤中に含んでもよい潜在的非イオン界面活性剤としては、ラウロマクロゴル（lauromacrogol）４００、ポリオキシル（polyoxyl）４０ステアリン酸塩、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は上記タンパク質又は誘導体の製剤中に、単独で又は様々な比率の混合物として存在してもよい。
【０２８３】
薬剤の取込みを潜在的に増強する添加物は、例えば、脂肪酸のオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
【０２８４】
徐放経口製剤が望ましいであろう。薬剤を、拡散又は浸出機構により放出させる不活性基剤、例えばガム中に組込むことができる。分解の遅い基剤を製剤中に組込んでもよい。数種の腸溶コーティングも徐放効果を有する。
【０２８５】
本発明の治療薬の他の徐放剤形は、オロス（Oros）治療薬システム（Alza Corp.）に基づく方法による、すなわち、医薬を半透過膜中に封入し、水が進入して浸透圧効果により１つの小さい隙間を通して医薬を押し出すようにする。
【０２８６】
その他のコーティングを製剤に用いてもよい。それらには、コーティングパンで適用できる様々な糖類を含む。治療薬はまたフィルムコーティングを施した錠であってもよく、この場合使用する材料は２グループに区分される。第１グループは非腸溶性材料であり、それらとしては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ-エチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルセルロース、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、カルボキシ-メチルセルロースナトリウム、プロビドン（providone）及びポリエチレングリコールが挙げられる。第２グループは腸溶性材料からなり、通常はフタル酸のエステルである。
【０２８７】
材料の混合物を利用して、最適なフィルムコーティングを提供してもよい。フィルムコーティングは、パンコーターで又は流動層で又は圧縮コーティングにより実施することができる。
【０２８８】
経口投与用の液製剤は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁液の剤形をとってもよいし、又は使用前に水又は適当なビヒクルを用いて構成する乾燥製品として提供してもよい。そのような液製剤は通常の手段により、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコール又は分留した植物油）；及び保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸のメチル又はプロピルエステル)などの製薬上許容される添加剤を用いて調製することができる。上記製剤はまた、バッファー塩、香料、着色及び甘味剤を、適当に含有してもよい。
【０２８９】
薬剤の経鼻送達も意図している。経鼻送達により、治療製品の鼻への投与直後に上記タンパク質の血液流への通過が可能になり、該製品を肺内に沈積させる必要がない。経鼻送達用製剤は、デキストラン又はシクロデキストランによる製剤を含む。
【０２９０】
吸入による投与用には、本発明による使用する化合物を、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当なガスを用いて、加圧パック又は噴霧器からエーロゾルスプレー散布の剤形で送達するのが好都合である。加圧エーロゾルの場合、投与単位は測った量を送達するバルブを設けて測定することができる。吸入器又は吹送器に用いるために、上記化合物とラクトース又はデンプンなどの適当な粉末基剤との粉末混合物を含有する、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを製剤してもよい。
【０２９１】
上記化合物は、注射による、例えばボーラス注射又は連続輸液による非経口投与用に製剤することができる。注射用製剤は、単位投与剤形で、例えばアンプル中で、又は多回投与容器中に保存剤を加えて提供してもよい。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳化液などの剤形をとってもよく、懸濁、安定化及び／又は分散剤などの製剤用薬剤を含有してもよい。あるいは、活性成分は粉末剤形であって、使用前に、適当なビヒクル、例えば発熱物質を含有しない無菌水を用いて構成してもよい。
【０２９２】
上記化合物はまた、座剤又は保持浣腸、例えば、ココアバター又は他のグリコシドなどの通常の座剤用基剤を含有する直腸用組成物に製剤することもできる。
【０２９３】
従来開示された製剤に加えて、上記化合物はまた、デポ製剤として製剤することもできる。そのような長期間作用する製剤は、移植（例えば、皮下又は筋内に）により又は筋内注射により投与することができる。従って、例えば、上記化合物を、適当なポリマー又は疎水性材料（例えば、許容しうる油の乳化液として）又はイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤することができる。
【０２９４】
上記組成物は、所望であれば、活性成分を含有するパックで又は１回以上の単位投与剤形を含む調剤デバイスで提供することができる。パックは、例えばブリスターパックのような金属又はプラスチックホイルであってもよい。パック又は調剤デバイスに投与のための指示書を添付してもよい。
【０２９５】
５．６．２．投与量の決定
上記のような化合物の毒性及び治療上の有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための細胞培養又は実験動物における標準の医薬的方法により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することはできるが、そのような化合物は罹患組織の部位を標的として非感染細胞に対する潜在的損傷を最小化し、それにより副作用が減少する送達系を設計するように注意しなければならない。
【０２９６】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得たデータを、ヒトに用いる投与量の範囲の製剤に利用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含んで毒性が少しか又は全く無い範囲の循環濃度にある。投与量はこの範囲内で、使用する投与剤形及び利用する投与径路に依存して変わってもよい。本発明の方法に使用するいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから評価することができる。動物モデルにおいては、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症候群の最高抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように製剤することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィにより測定することができる。
【０２９７】
５．６．３．投与経路
本発明の治療用組成物の成分は、非経口、局所、又は経粘膜、例えば、経口、経鼻、又は経直腸、又は経皮で導入することができる。好ましくは、投与は非経口、例えば、静脈注射を経由し、又は、限定されるものでないが、細動脈内、筋内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内投与である。好ましい実施形態においては、本発明の治療用組成物の成分は経口又は非経口で導入する。
【０２９８】
本発明の好ましい実施形態においては、薬剤（又は医薬若しくは化合物）は脳血液関門を通過し、さらに好ましくは容易に通過することができて、例えば、経口、非経口又は静脈投与が可能である。あるいは、脳血液関門を通過し又は輸送できるように薬剤を修飾するか又は改変することができる。分子が脳血液関門を通過するための当技術分野で公知の多数の方法を利用することができ、限定されるものでないが、分子の疎水性を増加する方法；分子を、脳血液関門の受容体を標的として移動する担体との又はドコサヘキサン酸との複合体として導入する方法などがある。
【０２９９】
他の実施形態においては、頭蓋に小孔を明けて薬剤を投与する標準の方法により、本発明の薬剤を投与する。
【０３００】
他の実施形態においては、分子を頭蓋内に又は、さらに好ましくは、脳室内に投与することができる。他の実施形態においては、脳血液関門の浸透圧破壊（osmotic disruption）を利用して薬剤の脳への送達を実施することができる（Nilaverら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9829-9833 (1995)）。さらに他の実施形態においては、薬剤を、脳血液関門を標的とするリポソームに入れて投与することができる。リポソームに入った医薬の投与は公知である（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatら、「感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy of infectious Disease and Cancer）」, Lopez-Berestein及びFidler (編), Liss, New York, pp.317-327及びpp.353-365 (1989)を参照）。このような方法は全て本発明に包含される。
【０３０１】
分子の脳血液関門通過能力について複数の予測が行われているが、これらの予測はせいぜい推測でしかない。脳中への化合物の進入の速度と程度は一般的に、主に分配係数、イオン化定数、及び分子サイズにより決定されると考えられる。普遍的に適用しうる脳貫入モデルとしての単一の分配溶媒系は現れていないが、オクタノール-水系が特に注目されていて、Hanschと共同研究者は、この系において約１００の分配係数が中枢神経系（ＣＮＳ）中への進入に最適であると示唆している（Glave and Hansch, J. Pharm. Sci. 61:589 (1972)；Hanschら, J. Pharm. Sci. 76:663 (1987)）。実際上、オクタノール−水分配系は化合物の脳血液関門通過能力の定性的示唆を与えるだけである。例えば、公知のヒスタミンＨ２受容体アンタゴニストの間で比較すると、それらの脳貫入とオクタノール−水分配の間には単純な関係がないことを示唆する（Youngら, J. Med. Chem. 31:656(1988)）。オクタノール−水分配のほかに、他の因子が脳血液関門を通過する傾向に影響を及ぼす。ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニストの脳血液関門通過能力を比較すると、化合物の全水素結合能力の低下とともに脳貫入が増加しうることを示唆する（Youngら, J. Med. Chem. 31:656 (1988)）。本明細書に参照によりその全文が組み入れられるBegleyら（J. Neurochem. 55:1221-1230 (1990)）は、シクロスポリンＡの脳血液関門通過能力を開示している。Begleyらが用いた方法論は、次の通りである：
（１）次式：
ＢＵＩ＝［（脳３Ｈ／脳１４Ｃ）／（注入した３Ｈ／注入した１４Ｃ）］×１００
［式中、１４Ｃ基準化合物は１４Ｃブタノール又は類似溶媒である］を用いるトリチウム標識薬剤化合物の脳取込み指数（ＢＵＩ）の測定；
（２）脳灌流研究；
（３）静脈内ボーラス注射研究；及び
（４）培養脳大脳毛細管内皮を用いる研究。
【０３０２】
他の実施形態においては、治療化合物を小胞、特にリポソームに入れて送達してもよい（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatら, 「感染性疾患及び癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy of infectious Disease and Cancer）」, Lopez-Berestein及びFidler (編), Liss,New York, pp.317-327及びpp.353-365 (1989)を参照）。その全身副作用を軽減するために、これは薬剤を導入する好ましい方法であろう。
【０３０３】
他の実施形態においては、治療薬を徐放系で送達することができる。例えば、薬剤を静脈内輸液、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、又は他の投与モードを用いて投与してもよい。一実施形態においては、ポンプを利用してもよい（Langer, 前掲, Sefton, CRC Crit. Ref.Biomed. Eng. 14:201 (1987)；Buchwaldら, Surgery 88:507 (1980)；Saudekら, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)を参照）。他の実施形態においては、ポリマー材料を利用してもよい（「徐放の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」, Langer及びWise (編), CRC Press: Boca Raton, Florida (1974)；「制御した医薬生物利用可能性、医薬設計及び性能（Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）」, Smolen及びBall (eds.), Wiley: New York (1984)；Ranger及びPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)を参照；またLevyら, Science 228:190 (1985)；Duringら, Ann. Neurol. 25:351 (1989)；Howardら, J Neurosurg. 71:105 (1989)も参照）。さらに他の実施形態においては、徐放系を治療標的、すなわち、脳の近位に配置して全身用量のほんの僅かしか必要でないようにすることができる（例えば、Goodson, 「徐放の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」, 前掲, vol.2, pp.115-138 (1984)を参照）。他の徐放系は、Langer（Science 249:1527-1533 (1990)）の総説に考察されている。
【実施例】
【０３０４】
次の実施例は説明するために提供するものであり、限定するためではない。
【０３０５】
６．実施例１：前脳におけるセロトニン作動性神経伝達を媒介するＤＡＲＰＰ−３２
本実施例は、セロトニンが、神経細胞におけるセロトニンのシグナル伝達経路として神経組織においてＤＡＲＰＰ−３２と相互作用することを実証し、さらにセロトニン活性と関連する症状（例えば鬱病）を治療するための治療の標的を開示する。
【０３０６】
６．１．材料及び方法
６．１．１．線条体脳切片の調製及び処理
当業者には公知の方法（Nishi, Aら、1997. J. Neurosci. 17: 8147-8155）で、雄のＣ５７／ＢＬ６マウス（６〜８週令）から新線条体切片を調製した。簡単に説明すると、記載されているように（Nishi, Aら、1997. J. Neurosci. 17: 8147-8155）、新線条体（背側線条体）、側座核（腹側線条体）、及び前前頭皮質からの切片（３００μｍ）を成体の雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスから調製した。これらの切片をクレブスバッファー（１１８ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ２ＳＯ４、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１１．７ｍＭグルコース、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２）において、一定の酸素転添加（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）しながら３０℃で６０分間プレインキュベートしたが、その際３０分後にバッファーを取り替えた。終神経へのセロトニンの再取込みを防止するため、セロトニンを用いる２分前に、セロトニン再取込みインヒビターであるフルオキセチン（１０μＭ）で切片を前処理した。その後、セロトニン、並びに各実験で記載されているその他の薬剤で切片を処理した。薬剤処理の後、バッファーを除去し、切片をドライアイス上で急速凍結し、免疫ブロッティングの実施まで−８０℃で保存した。
【０３０７】
６．１．２．動物個体実験
ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するパラ−クロロアンフェタミン（ＰＣＡ）及び５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）の影響を調べる実験では、成体の雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、生理食塩水、ＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ）、又は５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、注射から１５分後、小動物用電波（Muromachi Kikai、東京）を用いて、焦点電波照射（４．５〜５ｋＷを１．４秒）により死なせた。５−ＨＴＰを用いた前記及びその他すべての実験において、５−ＨＴＰの前にカルビドパ（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。脳を速やかに除去し、線条体及び前頭皮質を切除して、アッセイで用いるまで８０℃で保存した。
【０３０８】
６．１．３．免疫ブロッティング
１％ＳＤＳ及び５０ｍＭ ＮａＦを含有する高温均質化バッファーにおいて、凍結切片を超音波破砕し、サンプルを１０分沸騰させた。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加し、サンプルを５分沸騰させた。サンプル（約１２０μｇの全タンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）により分離してから、ニトロセルロースに移した。ほとんどの実験では、免疫ブロットは、最初に、抗ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２、抗ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２、又は抗ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２抗体で検出した。ブロットを再びストリッピングし、抗全ＤＡＲＰＰ−３２抗体で検出した。抗体結合はＥＣＬ免疫ブロッティング検出系を用いて調べた。オートラジオグラフィーにより化学発光を検出し、ＮＩＨイメージ１．５２ソフトウエアを用いて、スキャニングしたイメージの分析によりバンドを定量した。１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）前処理マウスを用いた実験ではまた、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体（Chemicon）を用いて、免疫ブロッティングを実施した。タンパク質リン酸化に対するデータを対照のパーセンテージとして表わす。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション野生型（ＷＴ）マウス及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウス（７）に生理食塩水、ＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ）、又は５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを腹腔内注射し、注射から２０分後断頭により死なせた。ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験を前記のようにして実施した。
【０３０９】
６．１．４．自発運動測定
ＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスの自発運動を水平及び鉛直方向センサーの両方を備えた運動モニター（４３×４４×４５ｃｍ）（Opto-Varimex, Columbus Instruments, コロンバス、オハイオ州）で測定した。実験日の２４日前に１時間かけてマウスを箱に順化させた。実験当日、マウスをその箱に２０分（馴化期間）置いてから薬剤を投与した。生理食塩水、ＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ）、又は５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ；５０ｍｇ／ｋｇのカルビドパ腹腔内投与から３０分後）を腹腔内注射し、自発運動を５０分測定した。いくつかの実験では、生理食塩水、ＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ）、又は５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）投与の１０分前に、成体の雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスをクロザピン（０．３ｍｇ／ｋｇ）で前処理した。オートトラックシステム（Columbus Instruments）を用いることにより自発運動パラメーター（移動距離及び常同運動）を定量した。
【０３１０】
６．２．結果
マウス脳（Ｃ５７／ＢＬ６系統）から調製した新線条体切片を用いた。切片を表１に示すように、セロトニン作動性活性をモジュレートする様々な化合物で処理してから、リン酸化状態特異的抗体を用いて、３つの部位（Ｓｅｒ１３７、Ｔｈｒ３４及びＴｈｒ７５）におけるＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化に対する上記薬剤の影響を評価した。Ｓｅｒ１３７及びＴｈｒ３４のリン酸化実験の場合にはインキュベーション時間は２分であるが、Ｔｈｒ７５の場合にはインキュベーション時間は１０分とした。これら実験で用いた対照化合物には、公知のシグナル伝達インヒビター、並びにＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に影響を与えることがすでに証明されているドーパミンアゴニスト及びアンタゴニストが含まれた（Nishiら、2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12840-12845）。
【０３１１】
６．２．１．脳切片におけるＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化のセロトニンによる調節
表１及び図１に示した結果から、セロトニンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの線条体切片の処理によって、Ｔｈｒ３４及びＳｅｒ１３７でのＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化が有意に増大するのに対し、Ｔｈｒ７５でのリン酸化は低減することがわかる。
【表１】
2004538323.tif 000002
2004538323.tif 000003
2004538323.tif 000004
2004538323.tif 000005
【０３１２】
ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化に対するセロトニンの時間経過及び用量応答作用を図１に示す。
【０３１３】
新線条体（背側線条体）、側座核（腹側線条体）、及び前前頭皮質から切片を調製した。新線条体切片での時間経過実験から、セロトニン（１００μＭ）が、３つのリン酸化部位すべてでＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の急速な増大を引き起こし（図１Ａ〜Ｃ）、中でもＴｈｒ３４での作用が最も顕著であることがわかった。Ｔｈｒ３４及びＳｅｒ１３７でのＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の状態は、１０分以内に基底レベルに戻り（図１Ａ〜Ｃ）、そのままの状態が３０分続いた（示していない）。対照的に、Ｔｈｒ７５におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化は、わずかに、しかし有意な増大に続いて、同部位でのリン酸化状態に顕著な低減が起こった。どの時点にもＤＡＲＰＰ−３２の合計レベルに変化はみられなかった。これらのデータに基づき、続くすべての実験では、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２の実験については２分、ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２の実験の場合には１０分切片をインキュベートした。Ｔｈｒ３４でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節するのに必要なセロトニンの濃度は、Ｔｈｒ７５及びＳｅｒ１３７より低かった（図１Ｄ〜Ｆ）。Ｔｈｒ３４、Ｔｈｒ７５、及びＳｅｒ１３７でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用を示すＥＣ５０値はそれぞれ１３．５Ｍ、２９．６Ｍ及び３７．６Ｍであった。側座核から調製した切片を用いて、セロトニン（１００μＭ）を用いた２分のインキュベーションにより、Ｔｈｒ３４（３０７±２５％、ｎ＝１２）及びＳｅｒ１３７（１４３±７％、ｎ＝１２）でのリン酸化が増大し、セロトニンを用いた１０分のインキュベーションにより、Ｔｈｒ７５（７５±６％、ｎ＝１２）が低減した。前前頭皮質からの切片において実施した実験から、セロトニンを用いた２分のインキュベーションにより、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２（１８５±１５％、ｎ＝６）が増大し、セロトニンを用いた１０分のインキュベーションにより、ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２（８５±３％、ｎ＝６）が低減した。前前頭皮質ではシグナルが低いために、この領域ではホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２のレベルを正確にアッセイすることができなかった。従って、セロトニンによるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節は、３つの脳領域のすべてにおいて類似していた。側座核よりも新線条体から多くの切片を回収できるため、続くほとんどの実験では、新線条体から調製した切片を用いた。
【０３１４】
ＰＫＡのアクチベーター、すなわち、Ｔｈｒ３４のリン酸化を高める化合物（例えばロリプラム）が、抗鬱活性を有することは知られている。ロリプラムはｃＡＭＰホスホジエステラーゼ４型のインヒビターであり、ｃＡＭＰ及びＰＫＡ活性の細胞内レベルを高める。複数の臨床試験により、ロリプラムが鬱病患者において抗鬱効力を有することが証明されている（Horowski及びSastre-Y-Hernandez. 1985. Curr. Ther. Res. 38: 23-29；Bobonら、1988. Eur. Arch. Psychiatry Neurol. Sci. 238: 2-6；Fleischhackerら、1992. Neuropsychobiology 26: 59-64）。しかし、線条体切片に関するデータから、セロトニンがＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節する能力に基づいて、ＣＫ１及びＰＰ２Ａのアクチベーター、又はｃｄｋ５、ＰＰ２Ｂ若しくはＰＰ２Ｃのインヒビターが抗鬱薬としての特性を有しうることが初めて明らかにされた。
【０３１５】
６．２．２．新線条体及び皮質切片におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対する５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）の作用
数種のセロトニン受容体、特に、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ２ＡＣ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、及び５−ＨＴ６は線条体全域で発現する。ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のセロトニン媒介調節に関与するセロトニン受容体の同一性（identity）を、選択性アゴニスト及びアンタゴニストの使用により決定した。新線条体切片において様々なセロトニンアゴニストを用いて得られた結果を表１に示す。２−［１−（４−ピペロニル）ピペラジニル］ベンゾチアゾール（ＰＰＢ、５−ＨＴ４受容体アゴニスト）と２−エチル−５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン（ＥＭＤＴ、５−ＨＴ６受容体アゴニスト、Eli Lilly & Co.）は単独又は一緒に、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２でセロトニンの作用を定量的に模倣したが、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２ではそうではなかった。ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２でのＰＰＢ及びＥＭＤＴの作用を示すＥＣ５０値はそれぞれ２７．３Ｍ及び２０．５Ｍ、ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２ではそれぞれ４５．５Ｍ及び２７．４Ｍであった。加えて、５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体でのアゴニストとして高い親和性を有する５−メトキシトリプタミン（１００μＭ）は、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２を増大し（２６１±３１％、ｎ＝１２）、ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２を低減した（７６±７％、ｎ＝１２）。反対に、ＤＯＩ［（±）−２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミンヒドロクロリド；（±）−１−（２，５ジメトキシ−４−ヨードフェニル）−２−アミノプロパン］、すなわち５−ＨＴ２Ａ／アゴニストは、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２でセロトニンの作用を模倣したが、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２ではそうではなかった。ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２でのＤＯＩのＥＣ５０値は１８．２μＭであった。５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニストであるアンピルトリン（恐らくｃＡＭＰを低減することによる）と、５−ＨＴ３アゴニストであるＳＲ５７２２７Ａ（恐らくＣａ２＋を増大することによる）は、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２を低減したが、ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２には有意な影響を与えなかった。前前頭皮質から調製した切片を用いて、５−ＨＴ４受容体アゴニストであるＰＰＢ、又は５−ＨＴ６受容体アゴニストであるＥＭＤＴを用いた２分のインキュベーションにより、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２が増大した（それぞれ、２０３±１５％、ｎ＝６、並びに１８５±１９％、ｎ＝６）が、ＰＰＢ又はＥＭＤＴを用いた１０分のインキュベーションでは、ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２が低減した（それぞれ、８４±４％、ｎ＝６、並びに８０±７％、ｎ＝６）。
【０３１６】
６．２．３．新線条体切片におけるセロトニン媒介ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対する５−ＨＴ受容体アンタゴニストの作用
選択的セロトニン受容体アンタゴニストを用いて得られた結果（表１）は、アゴニストを用いて得られた結果と一致していた。従って、ＳＤＺ２０５，５５７、すなわち５−ＨＴ４受容体アンタゴニストと、Ｒｏ０４−６７９０、すなわち５−ＨＴ６受容体アンタゴニストは、単独で又は一緒に、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２でセロトニンの作用を低減させたが、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２ではそうでなかった。反対に、ケタンセリン、すなわち５−ＨＴ２Ａ／Ｃ受容体アンタゴニストは、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用を低減させたが、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２又はホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２ではそうでなかった。５−ＨＴ２及び５−ＨＴ６受容体に対して特に高い親和性を有する、多重受容体アンタゴニストであるクロザピン（１７）は、試験したすべての部位で、ＤＡＲＰＰ−３２のセロトニン媒介リン酸化を有意に妨害した。これらを一緒に考え合わせると、セロトニン受容体アゴニスト及びアンタゴニストを用いて得られた結果は、ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用が、５−ＨＴ２、５−ＨＴ４、及び５−ＨＴ６受容体の活性化に起因しうることを示している。
【０３１７】
６．２．４．新線条体切片におけるセロトニン媒介ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するシグナル伝達モジュレーターの作用
ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用がＤＡＲＰＰ−３２含有ニューロンに対する直接作用によって媒介されるか否かを調べるために、テトロドトキシン（ＴＴＸ）で切片を前処理した。ＴＴＸは、電位型ナトリウムチャネルを遮断することにより活動電位依存性シナプス伝達を阻害する。ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用はＴＴＸに影響されなかったが、これは直接作用を示している（表１）。５−ＨＴ２及び５−ＨＴ４、５−ＨＴ６受容体が使用する主なシグナル伝達経路はそれぞれ、ホスホリパーゼＣ及びＰＫＡの活性化を含む。これらシグナル伝達経路のセロトニンの作用に対する寄与を調べるために、線条体切片をＵ−７３１２２、すなわち選択性ホスホリパーゼＣインヒビター、又はＲｐ−ｃＡＭＰＳ、すなわち選択性ＰＫＡインヒビターのいずれかで前処理した後、セロトニンを使用した。表１に示すように、Ｕ−７３１２２は、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２に対するセロトニンの作用を遮断したが、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２又はホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２に対してはそうでなかった。反対に、Ｒｐ−ｃＡＭＰＳは、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２に対するセロトニンの作用を阻害したが、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２に対してはそうでなかった。
【０３１８】
６．２．５．ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節におけるセロトニン−ドーパミン相互作用の特性決定
ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用がドーパミン作動性シグナル伝達経路のモジュレーションによって媒介されるか否かを決定するために、数種の実験を実施した（表１）。セロトニンと、ＳＫＦ８２９５８、すなわちＤ１受容体選択的アゴニストは、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２を増大し、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２を低減する上で、相加的作用を有した。セロトニンと、キンピロール、すなわちＤ２受容体選択的アゴニストは、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２に対するアゴニスト的作用と、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２でのリン酸化を増大する上での相加的作用を有した。ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用は、Ｄ１受容体ＫＯマウス（未発表の結果）からの切片、又はドーパミン作用性神経毒素であるＭＰＴＰで前処理したマウスからの切片において有意に変化した（表１）。これは、ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用がドーパミン放出の調節によって媒介されなかったことを示している。
【０３１９】
６．２．６．ＰＣＡ及び５−ＨＴＰによるｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節
セロトニン放出物質であるＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ）、セロトニン前駆物質である５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）、又はフルオキセチン（０、５、１０又は２０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに腹腔内（ｉｐ）注射した。注射から１５分後、小動物用電波（Muromachi Kikai、東京、日本）を用いた焦点電波照射（４．５〜５ｋＷを１．４秒）によりマウスを死なせた。脳を速やかに取り出し、線条体、皮質及び海馬を切除して、Ｔｈｒ３４、Ｓｅｒ１３７、Ｔｈｒ７５及びＳｅｒ１０２でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のレベル測定まで、−８０℃で保存した。結果を表２及び図２に示す。ビヒクル対照、５−ＨＴＰ＋カルビドパ及びＰＣＡを用いた実験では、線条体の組織サンプルだけからデータを得た。フルオキセチンを用いた実験では、個別に切除した線条体、皮質及び海馬の組織サンプルからデータを得た。
【０３２０】
表２及び図２に示した結果から、線条体において、ＰＣＡ及び５−ＨＴＰがＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の変化の共通パターン、すなわち、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２での増大、並びにホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２での低減を引き起こすことがわかる。さらに、前前頭皮質では、ＰＣＡ及び５−ＨＴＰによりホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２が増大した（それぞれ１４７±４．８％、ｎ＝５マウス、及び１４４±８．３％、ｎ＝５マウス）が、ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２は低減した（それぞれ７９±３．８％、ｎ＝５マウス、及び７４±８．０％、ｎ＝５マウス）。従って、セロトニンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で同じような量でＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節する。
【表２】
2004538323.tif 000006
2004538323.tif 000007
【０３２１】
これらのｉｎ  ｖｉｖｏデータにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた結果が確認された。セロトニンは、Ｔｈｒ３４及びＳｅｒ１３７でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を増大したが、Ｔｈｒ７５でのリン酸化を低減した。セロトニン前駆体だけ（５−ＨＴＰ）を用いた場合、セロトニン放出物質（ＰＣＡ）を用いた場合、並びにセロトニン再取込みインヒビター（フルオキセチン）を用いた場合に作用が認められた。
【０３２２】
６．２．７．ＤＡＲＰＰ−３２によるＡＭＰＡ受容体のＧｌｕＲ１サブユニットのホスホ−ＳＥＲ８４５活性化の調節
セロトニンの活性におけるＤＡＲＰＰ−３２の関与を評価するために、ＤＡＲＰＰ−３２を欠失したマウス（ＤＡＲＰＰ−３２ノックアウト（ＫＯ）マウス）を用いた。１セットの実験では、正常マウス（ＤＡＲＰＰ−３２野生型）及びＤＡＲＰＰ−３２ノックアウトマウスから線条体切片を調製し、セロトニンと一緒に５分インキュベートした。次に、ＡＭＰＡ（ＡＭＰＡ、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体のＧｌｕＲ１サブユニットのホスホ−Ｓｅｒ８４５のレベルを決定するための実験を実施した。この部位（ＰＫＡによりリン酸化され、ＰＰ−１により脱リン酸化される）でのリン酸化状態は、ＡＭＰＡ電流をモジュレートすることがすでにわかっている（Rocheら、1996. Neuron 16: 1179-1188；Snyderら、2000. J. Neuroscience 20:4480-4488）。表３に示したように、セロトニンは、ＤＡＲＰＰ−３２野生型マウスにおいてホスホ−Ｓｅｒ８４５−ＧｌｕＲ１の有意な誘導を引き起こしたが、ノックアウトマウスでは起こさなかった。これらのデータは、ＤＡＲＰＰ−３２によりモジュレートされたセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路（すなわち、セロトニン／ＤＡＲＰＰ−３２／ＰＰ−１シグナル伝達カスケード）が、ＡＭＰＡ受容体のホスホ−Ｓｅｒ８４５−ＧｌｕＲ１サブユニットのセロトニン媒介調節に重要であることを示している。
【表３】
2004538323.tif 000008
【０３２３】
６．２．８．ＰＣＡ及び５−ＨＴＰによるｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡ発現の調節におけるＤＡＲＰＰ−３２の関与
遺伝子転写に対するＰＣＡ及び５−ＨＴＰの作用を媒介する上でのＤＡＲＰＰ−３２の関連性を評価するために、ＤＡＲＰＰ−３２野生型及びノックアウトマウスに、ＰＣＡ、５−ＨＴＰ、又はフルオキセチンを全身注射し、ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡ発現に対する作用を調べた。
【０３２４】
注射から２０分後、動物を断頭により死なせ、その脳を−８０℃で凍結した。次に、冠状断面切片で作製してから、ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡに対するプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験のために処理した。ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡの発現は、ニューロンの生化学的活性のマーカーとして広く用いられている。ＰＣＡ（４ｍｇ／ｋｇ）及び５−ＨＴＰ（５０ｍｇ／ｋｇ＋カルビドパ５０ｍｇ／ｋｇ）によるセロトニン作用系の操作により、ＤＡＲＰＰ−３２野生型マウスにおける複数の脳領域（前前頭皮質及び線状体を含む）でのｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡ発現が増大した。同じ処理により、ＤＡＲＰＰ−３２ノックアウトマウスにおけるｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡの誘導に有意な低下が起こった（表４を参照）。図３に示すように、ＰＣＡ及び５−ＨＴＰの両方が、ＷＴマウスの線条体及び脳皮質全体でｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡの強度の発現を誘導した。この作用を線条体の脳室周囲領域（図３Ｂ）及び帯状束皮質（図３Ｃ）で定量したところ、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスで強度に低減していた。
【表４】
2004538323.tif 000009
【０３２５】
６．２．９．６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）損傷試験
セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路及びＤＡＲＰＰ−３２の活性化がパーキンソン病の治療における用途を有することを証明するさらに別の実験を実施した。これらの実験では、標準的方法に従い、ラットに６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン；ドーパミン作用性神経毒素）を片側（すなわち、一方の半球に）注射した。６−ＯＨＤＡはドーパミン作動性ニューロンにより選択的に取り込まれ、ニューロンを死滅させる。このような６−ＯＨＤＡ損傷動物は、パーキンソン病の動物モデルと考えられる。６−ＯＨＤＡ損傷動物を死なせてから、非損傷（すなわち、「正常」）半球及び６−ＯＨＤＡ損傷（すなわち、「ドーパミンを欠失（枯渇）した」）半球から、前記のように線条体切片を調製し、前記の方法に従って線条体切片実験に用いた。５−ＨＴ又は生理食塩水（対照）を前記の方法に従って投与した。５−ＨＴの投与により、両方の半球で、Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化における同様の増大が起こることがわかった。これらの実験から、５−ＨＴは、増大したドーパミン作動性神経伝達とは概して独立の機構によりＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を活性化すると解釈される。従って、セロトニン作動性神経伝達を増大し、かつ刺激性の薬剤は、ドーパミンとは独立した抗パーキンソン作用を発揮し、パーキンソン病の治療に用いることだできる。
【表５】
2004538323.tif 000010
【０３２６】
６．２．１０．ＰＣＡ及び５−ＨＴＰの行動に関する作用におけるＤＡＲＰＰ−３２の関与
セロトニンの放出の増大により発揮される行動に関する作用を媒介する上でのＤＡＲＰＰ−３２の役割を調べるために、自発運動及び常同行動に対するＰＣＡ及び５−ＨＴＰの作用をＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスにおいて試験した。ＰＣＡは５−ＨＴＰと同様に、ＷＴマウスにおいて自発運動及び常同行動の両方で急激な増大を引き起こした（図４）。これらの行動パラメーターの両方に対する作用は、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスでは消失した。ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスのＰＣＡ及び５−ＨＴＰに対する応答性の低減は、これらのマウスが機能亢進となる能力の喪失によって説明することはできない。薬剤の投与を受けたことがない動物を新しい環境（試験ケージにより表示される）に暴露する実験では、ＷＴ（６．１３３±２９３ｃｍ／２０分）マウスとＤＡＲＰＰ−３２ＫＯ（６．２６８±４１８ｃｍ／２０分）マウスの間に自発運動スコアに差は認められなかった。
【０３２７】
６．３．論考
本実施例は、ＤＡＲＰＰ−３２活性が、マウスにおけるセロトニン作動性応答に関与することを証明し、ＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用データと、セロトニン系の生物学的機能との重要な関連を示している。本実施例はまた、増大したセロトニン作動性神経伝達により誘導される行動及び生化学的作用が、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスでは低減することも示している。本実施例はさらに、セロトニンの作用をｉｎ  ｖｉｖｏで媒介する上でのＤＡＲＰＰ−３２の重要な役割を示している。
【０３２８】
セロトニンは、脳切片におけるＴｈｒ３４（ＰＫＡ部位）及びＳｅｒ１３７（ＣＫ−１部位）でのＤＡＲＰＰ−３２のリン酸化の増大と、Ｔｈｒ７５（Ｃｄｋ５部位）でのリン酸化の低減を引き起こした。選択的セロトニン受容体アゴニスト及びアンタゴニスト、並びにその他の薬理学的試薬（例えば、ＴＴＸ、Ｕ−７３１２２及びＲｐｃＡＭＰなど）を使用することにより、本発明者らは根元的なシグナル伝達経路を解明することができた。Ｔｈｒ３４及びＴｈｒ７５でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節する上でのセロトニンの作用は、５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化により媒介されたのに対し、Ｓｅｒ１３７での調節は５−ＨＴ２受容体により媒介された。これら３つの経路は相乗作用機構によりＰＰ−１を阻害すると考えられる（図５）ため、これらの経路は、セロトニン、並びにセロトニン伝達を増大する化合物がそれらの作用を生み出すモデルを提供する。後者の化合物には、ＰＣＡ及び５−ＨＴＰ以外に、選択的セロトニン再取込みインヒビターであるフルオキセチン（広く用いられている抗鬱薬）が含まれる。増大したセロトニン作動性神経伝達により誘導されるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のパターンは、増大したドーパミン作動性神経伝達により誘導されるものと非常に類似している（１３）。しかし、ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のセロトニン媒介調節は、ドーパミン作動性神経伝達の改変とは概して独立している（表１）。
【０３２９】
多数の精神活性化合物は、セロトニン作用及びドーパミン作用系の両方に直接作用する。例えば、コカインは、シナプスからのドーパミン及びセロトニン両方の再取込みを阻害する。近年、部位選択試験（place preference test）におけるコカインの強化特性は、ドーパミン輸送物質ＫＯマウス又はセロトニン輸送物質ＫＯマウスにおいて依然として影響を受けないが、両方の輸送物質を欠失したマウスでは重度の損傷を受ける（１９）。これらのデータは、コカインの特定の生化学的作用がドーパミン又はセロトニンのいずれかによって媒介される可能性があることを意味している。この実施例から、ＤＡＲＰＰ−３２経路を介したシグナル伝達が恐らくこの重複性の原因であることがわかる。この観察結果を支持するように、二重輸送物質ＫＯマウスの部位選択試験におけるコカインの強化特性に対する応答性の低減がＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスにより模倣されることがわかっている（２０）。
【０３３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するセロトニンの作用が生理学関連性を有することは本明細書ですでに開示した実験で証明される。これらの実験は、マウスにＰＣＡ又は５−ＨＴＰを注射し、線条体及び前前頭皮質におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対する作用を試験した。いずれの処理によっても、セロトニンに対する応答に関して切片で観察されたものと極めて類似したＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のパターン、すなわち、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２及びホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２での増大、並びにホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２での低減が起こった。ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対する５−ＨＴＰの作用は、ドーパミン作動性終神経において産生される異所性放出セロトニンに主に起因すると考えることもできた。しかし、セロトニン作動性終神経に選択的に作用するＰＣＡも、用いた用量で、線条体及び前前頭皮質におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に顕著な作用を有したという事実は、これらの領域でのセロトニンの放出増大がＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節することを示している。ＤＡＲＰＰ−３２が行動に対するセロトニンの作用を媒介するという結論は、５−ＨＴ２及び５−ＨＴ６受容体によって応答を阻害する用量である０．３ｍｇ／ｋｇのクロザピンが、ＰＣＡ及び５−ＨＴＰの運動作用を阻止することを示す実験により支持される。ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で生化学的作用及び行動に対するセロトニンの作用におけるＤＡＲＰＰ−３２の関与を強く示す証拠は、ＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスにおけるＰＣＡ及び５−ＨＴＰの作用を試験した実験から得られた。ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡの誘導は、ＰＣＡ又は５−ＨＴＰで処理したＷＴマウスにおける線条体及び大脳皮質全体を通じて認められた。ＰＣＡ及び５−ＨＴＰの両方がｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡ発現を誘導する能力は、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスでは著しく減弱した。ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡの転写がＰＰ−１により負の調節を受けることはよく知られている（２１）。ＰＣＡ及び５−ＨＴＰ媒介ｃ−ｆｏｓ誘導におけるＤＡＲＰＰ−３２の関与は、少なくとも部分的に、それがＰＰ−１を阻害する能力によるものである。
【０３３１】
以前の研究では、運動及び診査行動の調節にはセロトニンが関連しているとされていた（２３）。セロトニンを欠失させると、ラットにおいて探索（exploration）の長期低下が起こる（２４）のに対し、側座核にセロトニンを局所投与すると、ラットに運動の増大が起こる（２５）。セロトニンの放出を増強する薬剤（例えば、ＰＣＡ、５−ＨＴＰ、及び３，４−メチレンジオキシメタムフェタミン（「エクスタシー（Ecstasy）」）が自発運動を高めることは一般に認められている（２３、２６）。ＰＣＡ及び５−ＨＴＰの作用におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の機能的関連性をさらに詳しく調べるために、これら薬剤が自発運動及び常同行動に及ぼす作用をＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスで試験した。予想していたように、ＰＣＡ及び５−ＨＴＰの両方がＷＴマウスにおける自発運動及び常同行動を増強した。これら応答は両者共に、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスでは大幅に低減した。
【０３３２】
以上のデータを考え合わせると、ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化が中枢神経系組織におけるセロトン作動性機能、並びにセロトン作動性誘導抗鬱薬活性に関連していることがわかる。これらのデータは、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａの活性と、抗鬱薬活性及び神経機能の調節に関与する生物学的に重要な過程との関連を示すものである。さらに、上記データは、鬱病の治療のための治療戦略によりターゲッティングするためのシグナル伝達分子に関する情報を提供するものである。従って、鬱病の治療において治療を目的としてターゲッティングされるシグナル伝達分子としては、限定するものではないが、ＣＫ１、Ｃｄｋ５、ＡＭＰＡ受容体、ＰＰ−１、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ２Ｂ及び／又はＰＰ２Ａを挙げることができる。
【０３３３】
６．４．参照文献
2004538323.tif 000011
2004538323.tif 000012
2004538323.tif 000013
【０３３４】
７．実施例２：フルオキセチンの生化学的作用及び行動に対する作用における線条体及び線条体外ＤＡＲＰＰ−３２の関与
本実施例は、前前頭皮質、海馬及び線条体における複数の部位でのＤＡＲＰＰ−３２のレベル及びリン酸化状態に対するフルオキセチンの短時間及び長時間投与の影響を開示する。ＤＡＲＰＰ−３２ノックアウト（ＫＯ）マウスを用いることにより、フルオキセチンの有益な作用の媒介、並びにＡＭＰＡ（ＡＭＰＡ：α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−4−イソキサゾールプロピオン酸）受容体リン酸化の調節におけるＤＡＲＰＰ−３２の関与を調べた。抗鬱薬効果を推定するための実験モデルとして尾部懸垂試験を用いた。
【０３３５】
７．１．材料及び方法
７．１．１．動物個体実験
フルオキセチンの短時間作用を調べる実験では、成体の雄Ｃ５７／Ｂ１６マウスに生理食塩水又はフルオキセチン（５、１０若しくは２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉｐ）注射し、注射から１５分後に小動物用電波（Muromachi Kikai、東京、日本）を用いて、焦点電波照射（４．５〜５ｋＷを１．４秒）により死なせた。フルオキセチンの長時間作用を調べる実験では、成体の雄Ｃ５７／Ｂ１６の野生型マウス（ＷＴ）又はＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウス（１６）に生理食塩水又はフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ）を１９日間腹腔内（ｉｐ）注射してから、生理食塩水又はフルオキセチン（５又は１０ｍｇ／ｋｇ）を負荷し、注射から１５分後に死なせた。すべての実験において、海馬、前前頭皮質、及び線条体を速やかに切開して取り出し、アッセイの実施まで−８０℃で保存した。
【０３３６】
７．１．２．海馬、前前頭皮質及び線条体からの切片の調製及び処理
記載されている（１７）ように、成体の雄Ｃ５７／Ｂ１６のＷＴ又はＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスから切片（３００−ｍ）を調製した。一定の酸素添加（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）の下で３０℃にてクレブスバッファー中で切片を６０分間前インキュベートした。その際、３０分後にバッファーを取り替えた。セロトニンを用いるすべての実験で、切片を２分フルオキセチン（１０Ｍ）で前処理してから、セロトニン（１００Ｍ）をさらに２分間（ホスホ−Ｔｈｒ−３４及びホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２の場合）又は１０分間（ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２並びにホスホ−Ｓｅｒ−８３１及びホスホ−Ｓｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１の場合）添加した。どの試験条件下でもフルオキセチン単独ではＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に影響を与えなかった。薬剤処理後、バッファーを除去し、切片をドライアイス上で急速凍結し、免疫ブロッティングの実施まで−８０℃で保存した。
【０３３７】
７．１．３．免疫ブロッティング
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験からの凍結組織サンプルを１％ＳＤＳ中で超音波破砕し、１０分間沸騰させた。ホモジネートの小さなアリコートをビシンコニン酸タンパク質アッセイ方法（Pierce）によるタンパク質決定のために保持した。記載されている（１７）ように１０％アクリルアミドゲルを用いて、等量のタンパク質を処理した。免疫ブロッティングは、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２（１８）、ホスホ−Ｔｈｒ７５ ＤＡＲＰＰ−３２（９）、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２（１９）、ホスホ−Ｓｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１（Upstate Biotechnology、レークプラシッド、ＮＹ）、ホスホ−Ｓｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１（Upstate Biotechnology）に対してはリン酸化状態特異的な抗体、又は全ＤＡＲＰＰ−３２（２０）及び全ＧｌｕＲ１（Upstate Biotechnology）に対してはリン酸化状態特異的ではない抗体を用いて実施した。抗体結合は、増強した化学発光（ＥＣＬ；Amersham Pharmacia）により検出し、National Institutes of HealthのＩＭＡＧＥ１．６１ソフトウエアを用いて、デンシトメトリーにより定量した。タンパク質リン酸化に関するデータは、対照のパーセンテージとして表す。
【０３３８】
７．１．４．ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスに生理食塩水又はフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ）を１９日間腹腔内（ｉｐ）注射し、最後の注射から２０分後に断頭により死なせた。脳を速やかに切開して取り出し、−８０℃で凍結した。凍結切片（１２μｍ）を調製し、ＤＡＲＰＰ−３２の全長クローンと対応するｃＤＮＡからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製した［α−３５Ｓ］ＵＴＰ標識リボプローブ、又は記載されている（２１）インヒビター−１とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、上記切片をバイオマックスＭＲフィルム（Kodak）に２１４日暴露し、マイクロコンピューターイメージングデバイスシステム（Microcomputer Imaging Device system）（M4、Imaging Research、セントキャサリンズ、ON、カナダ）で分析した。
【０３３９】
７．１．５．尾部懸垂試験
尾部懸垂試験を実施する３０分前に生理食塩水又はフルオキセチン（５又は１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに腹腔内（ｉｐ）注射した。床から８０ｃｍ上方の地点で、マウスの尾の先端から１ｃｍのところを粘着テープでプラットフォームの縁に固定することにより、マウスを尾から懸垂させた。この試験を５分間実施し、その間、ＰＯＲＳＯＬＴ（Infallible Software、Rockville、ＭＤ）プログラムにより、静止持続時間を記録した。マウスは、それらが受動的に吊り下がり、動いていないとき、静止しているとみなした（１４）。
【０３４０】
７．２．結果
７．２．１．フルオキセチンでの短時間処置によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節
生理食塩水又はフルオキセチン（５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに腹腔内（ｉｐ）注射し、１５分後に焦点電波照射により死なせた。表６に示す結果から、フルオキセチンは、海馬、前前頭皮質、及び線条体において、Ｔｈｒ３４、すなわちＰＫＡ部位でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の増大、並びに、Ｔｈｒ−７５、すなわちサイクリン依存性キナーゼ５（Ｃｄｋ５）部位でのリン酸化の低減を引き起こしたことがわかる（図６）。線条体外領域における低シグナルのために、Ｓｅｒ−１３７、すなわちカゼインキナーゼ−１部位でのリン酸化のレベルは、線条体でしか正確にアッセイすることができなかった。この領域では、フルオキセチンは、Ｓｅｒ−１３７でのリン酸化を増大した。
【０３４１】
７．２．２．フルオキセチンでの長時間処置によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節
フルオキセチンの抗鬱作用は、発現するのに典型的には２、３週間を要する。フルオキセチンの長時間処置によるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化への作用を調べるために、１９日間毎日１回生理食塩水又はフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処理してから、５又は１０ｍｇ／ｋｇの生理食塩水又はフルオキセチンの一回の腹腔内（ｉｐ）注射で負荷し、注射から１５分後に死なせた。生理食塩水で長時間処理し、かつフルオキセチンで負荷したマウスは、短時間投与応答実験で得られた結果（図６）と類似したＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のパターン（図７上方）を示した。
【０３４２】
フルオキセチンで長時間処置したマウスでは、海馬及び前前頭皮質で総ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質の増大がみられたが、線条体ではみられなかった（第７．２．３節、「フルオキセチンでの長時間処置によるＤＡＲＰＰ−３２ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの調節」を参照）。ＤＡＲＰＰ−３２の総レベルのこのような変化を正規化した後、生理食塩水で長時間処理し、かつ生理食塩水を負荷したマウスと、フルオキセチンで長時間処理し、かつ生理食塩水を負荷したマウスとの間では、Ｔｈｒ−３４、Ｔｈｒ−７５、又はＳｅｒ−１３７でリン酸化されたＤＡＲＰＰ−３２の割合に差はなかった。フルオキセチンによる負荷は、生理食塩水で長時間処置したマウスで認められたもの（図７上方）と同じような程度で、フルオキセチンで長時間処置したマウスでも、Ｔｈｒ３４でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化が増大し、Ｔｈｒ−７５でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化が低減した（図７下方）。対照的に、１０ｍｇ／ｋｇのフルオキセチンによる負荷が線条体におけるＳｅｒ−１３７でのリン酸化を増大する能力（図７下方）は、フルオキセチンで長時間処置したマウスでは消失した。
【０３４３】
７．２．３．フルオキセチンでの長時間処置によるＤＡＲＰＰ−３２ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの調節
フルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ）で長時間処置したマウスは、生理食塩水で長時間処置したマウスと比較して、前前頭皮質（１２３．３％）及び海馬（１２１．４％）では総ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質のレベルが上昇したが、線条体（１０２．４％）では上昇しなかった。ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質の総レベルの変化は、ＤＡＲＰＰ−３２の極めて近縁の相同体であるインヒビター−１タンパク質の総レベルの変化（上記三領域について、それぞれ、１０２．２％、９８．３％及び９７．３％）と近似していなかった。海馬及び前前頭皮質におけるＤＡＲＰＰ−３２タンパク質レベルに対する長時間フルオキセチンの作用が転写レベルで起こったか否かを決定するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験を実施して、ＤＡＲＰＰ−３２ ｍＲＮＡレベルに対する生理食塩水又はフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）の長時間投与（１９日間毎日１回）の影響を調べた。図８に示すように、フルオキセチンでの長時間処置により、海馬及び前前頭皮質ではＤＡＲＰＰ−３２ ｍＲＮＡ発現が増大したが、線条体では増大しなかった（図８左側）。フルオキセチンでの長時間処理は、試験した領域のいずれにおいても、インヒビター−１ｍＲＮＡ発現に影響を与えなかった（図８右側）。
【０３４４】
７．２．４．切片におけるセロトニンによるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節
ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するフルオキセチンの影響が、ＤＡＲＰＰ−３２含有ニューロンに対するセロトニンの作用に起因するものか否かを調べるために、切片をセロトニン（１００Ｍ）と一緒にインキュベートした。図９に示す結果から、セロトニンは海馬、前前頭皮質及び線条体から調製した切片（図９）において、Ｔｈｒ−３４でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を増大し（図９上方）、Ｔｈｒ−７５でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を低減した（図９下方）ことがわかる。セロトニンはまた、線条体におけるＳｅｒ−１３７でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化も増大した（第６節を参照）。
【０３４５】
７．２．５．ＷＴマウス及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスから調製した切片におけるセロトニンによるＡＭＰＡ受容体リン酸化の調節
ＤＡＲＰＰ−３２はＡＭＰＡ受容体のリン酸化を調節し、線条体ニューロンにおけるＡＭＰＡ電流（current）を増大する（１２、１３）。さらに、ＡＭＰＡ受容体の正のアロステリックモジュレーターは、鬱病の動物モデルに有益な効果をもたらす（１４、１５）。従って、本発明者らはＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスを用いて、ＡＭＰＡ受容体の機能特性に影響を与えることが知られる２つの別々のリン酸化部位（すなわち、ＰＫＣ／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）部位であるＳｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１と、ＰＫＡ部位であるＳｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１）でＡＭＰＡ受容体のＧｌｕＲ１サブユニットのリン酸化状態をセロトニンが調節することができるか否かについて調べた。図１０に示した結果から、セロトニン（１００μＭ）が、ＷＴマウスの海馬、前頭皮質及び線条体から調製した切片において、Ｓｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１及びＳｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１でのリン酸化を増大したことがわかる。ＷＴマウスにおいてＳｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１で増大されたリン酸化は、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスから調製した切片では有意に低減し（図１０）、これは、ＤＡＲＰＰ−３２／ＰＰ−１細胞内シグナル伝達経路がこの部位でのＧｌｕＲ１リン酸化のセロトニン媒介調節に関与していることを示している。ＷＴマウスにおけるＳｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１で増大されたリン酸化は、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスから調製した線条体切片では有意に低減したが、海馬又は皮質切片ではそうではなかった（図１０）。上記線条体のデータは、ＤＡＲＰＰ−３２／ＰＰ−１細胞内シグナル伝達経路がＳｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１でのリン酸化のセロトニン媒介調節に関与している可能性があることを示している。
【０３４６】
７．２．６．ＷＴマウス及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスにおける生理食塩水又はフルオキセチンでの長時間処置によるＡＭＰＡ受容体リン酸化の調節
生理食塩水で長時間処置し、フルオキセチンを負荷しておいたＷＴマウスは、試験した３つの脳領域すべてにおいてＳｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１及びＳｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１でリン酸化の増大を示した（表６）。
【表６】
2004538323.tif 000014
2004538323.tif 000015
【０３４７】
データは、生理食塩水又はフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ）で１９日間処理した後、生理食塩水又はフルオキセチン（５又は１０ｍｇ／ｋｇ）を負荷し、注射から１５分後に死なせたＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯ（Ｄ３２ＫＯ）マウスにおける、ホスホＳｅｒ−８３１−ＧｌｕＲ１及びホスホＳｅｒ−８４５−ＧｌｕＲ１について示す。データは、１グループ当たり４〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを示す。＊は、生理食塩水／生理食塩水処理マウスと比較してＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１をそれぞれ示し；§は、フルオキセチン／生理食塩水処理ＷＴマウスと比較してＰ＜０．０５、§§はＰ＜０．０１を示し；†は、生理食塩水／フルオキセチン処理ＷＴマウスと比較してＰ＜０．０５を示し；＃は、対応するＷＴマウスと比較してＰ＜０．０５を示す。一方向ＡＮＯＶＡの後ダンネット試験を実施した。
【０３４８】
フルオキセチンで長時間処理してから、フルオキセチンを負荷したＷＴマウスは、フルオキセチンで長時間処理してから、生理食塩水を負荷したＷＴマウスと比べて、３つの脳領域すべてにおいてＳｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１でのリン酸化のレベルが高かった。対照的に、フルオキセチンによる負荷がＳｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１でのリン酸化を増大する能力は、フルオキセチンで長時間処理したＷＴマウスでは消失した。本発明者らはまた、ＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスにおける、ＡＭＰＡ受容体のフルオキセチン誘導リン酸化を比較することにより、フルオキセチンの作用を媒介する上でのＤＡＲＰＰ−３２の関与の可能性を評価した。フルオキセチン（５及び１０ｍｇ／ｋｇ）がＳｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１でリン酸化を増大する効力は、ＷＴマウスと比べて、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスにおいて、マウスが生理食塩水又はフルオキセチンによる長時間処理を受けたか否かに関わらず、有意に低かった（表６）。ホスホＳｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１でのフルオキセチン媒介増大は、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスからの海馬では有意に低かったが、皮質又は線条体では低くなかった（表６、海馬）。
【０３４９】
７．２．７．抗鬱薬効力に関する尾部懸垂試験でフルオキセチンにより媒介される静止におけるＤＡＲＰＰ−３２の関与
実験動物を逃げられない有害な状況にさらす、学習性無力感（learned helplessness）モデル（例えば、尾部懸垂試験）は、抗鬱薬効力を推定するのに有用である。これらの試験中、マウスは、動揺と静止の時期を交互に示す（２３）。これらの試験において各種の抗鬱薬での短時間処理により、静止が低下することは十分に証明されている。特に、セロトニンを選択的に阻害する薬剤（例えば、フルオキセチン）は、尾部懸垂試験において常に効力があるようだ。尾部懸垂試験におけるフルオキセチン媒介抗鬱薬様作用におけるＤＡＲＰＰ−３２の関与の可能性を評価するために、試験の３０分前に生理食塩水又はフルオキセチン（５又は１０ｍｇ／ｋｇ）をＷＴ及びＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスに注射した。フルオキセチンはＷＴマウスにおける静止を低下させた（図１１）。この作用は、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスでは強度に低減した（図１１）。試験した用量のフルオキセチンにより運動が有意に影響されたわけではないため、活性の非特異的増大が、ＷＴマウスにおけるフルオキセチンの正の作用によるものということはできなかった。
【０３５０】
７．３．論考
本実施例は、フルオキセチンが多数の部位でＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節し、ＤＡＲＰＰ−３２がフルオキセチンの生化学的作用及び行動に関する作用を媒介することを証明するものである。機能的神経画像化試験から、鬱病の個体の前前頭皮質、海馬、扁桃及び線条体には改変された活性があり、それが少なくとも部分的に抗鬱薬療法により逆転可能である（２）ことがわかった。さらに、実験動物へのフルオキセチン及びその他の抗鬱薬の投与後のｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路での順応が、形態学的及び電気生理学的変化と共に、前前頭皮質、海馬、扁桃及び線条体について記載されている（１、２）。これらの領域は、中程度から高度のセロトニン作動性神経支配を受け（２５）、ＤＡＲＰＰ−３２を含んでいる（６）。本発明の実験では、フルオキセチンがＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節する能力を皮質、海馬、及び線条体において評価した。
【０３５１】
本発明の実験では、動物個体へのフルオキセチンの短時間投与又は切片へのセロトニンの適用により、Ｔｈｒ−３４でのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化が増大し、Ｔｈｒ−７５でのリン酸化が低減し、Ｓｅｒ−１３７でのリン酸化が増大することがわかった。前述の実施例（第６節）により、セロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路の以下のカスケードがこれら３つの作用の原因であることが明らかにされた：（ｉ）５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化がＴｈｒ−３４のＰＫＡリン酸化のｃＡＭＰ活性化を増大し；（ｉｉ）５−ＨＴ４及び５−ＨＴ６受容体の活性化がＴｈｒ−７５のタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ−２Ａ）脱リン酸化のＰＫＡ活性化のｃＡＭＰ活性化を増大し；（ｉｉｉ）５−ＨＴ２受容体の活性化がＰＬＣの活性化を増大し、これによりＳｅｒ−１３７のＣＫ１依存的リン酸化のカルシウム活性化も増大した。前記実施例で述べたように、これら３つのリン酸化部位での変化は相乗的に作用し、各々がＰＰ−１の阻害に寄与している。さらに、これら３つのカスケードによって、Ｔｈｒ−３４及びＴｈｒ−７５で（しかし、Ｓｅｒ−１３７では調節しない）ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節するフルオキセチンの能力が、この化合物で長時間処理したマウスでは保存されるという観察結果が得られたと考えられる。従って、長時間のフルオキセチン処理の後、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路を介したセロトニン媒介の応答は持続する（１、２７）が、ＰＬＣ経路を介した応答は低減する（２７、２８）ことが証明される。
【０３５２】
フルオキセチンによる長時間の処理により、前前頭皮質及び海馬におけるＤＡＲＰＰ−３２タンパク質及びｍＲＮＡの総レベルに有意な上昇が起こったが、線条体には起こらなかった。これらのデータは、三環系抗鬱薬であるイミプラミン、又は気分安定薬であるリチウムによる長時間の処理により、ラットの前頭皮質における総ＤＡＲＰＰ−３２タンパク質のレベルが高まるという以前の観察結果（３１）を広げるものである。前頭皮質及び海馬におけるＤＡＲＰＰ−３２レベルの調節の基礎となる作用機構は、依然として決定されていない。しかし、フルオキセチンを含む数種の抗鬱薬による長時間の処理によって、実験動物の前頭皮質及び海馬におけるＢＤＮＦのレベルが高まる（３２）こと、並びにＤＡＲＰＰ−３２ ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルはＢＤＮＦ ＫＯマウスで有意に低下する（３３）ことが明らかにされているため、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が関与していると考えられる。
【０３５３】
特定の理論に拘束されるものではないが、これらのデータは、ホスホ−Ｔｈｒ３４ ＤＡＲＰＰ−３２が、複数のイオンチャネル及びイオンチャネル型受容体（例えば、ＡＭＰＡ受容体）のリン酸化状態及び効力を増大する（１０、１１）ことを示している。海馬（３５）又は線条体（１２）ニューロンにおけるＰＫＡの活性化により、ＡＭＰＡ受容体電流及びＡＭＰＡ受容体媒介シナプス可塑性が増強する。ホモマーの（homomeric）ＧｌｕＲ１チャネルが運搬するピーク電流のＰＫＡ媒介増大のためには、Ｓｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１でのＰＫＡによるリン酸化が必要である（３６）。また、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）又はタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化により、海馬ニューロンにおけるＡＭＰＡ電流の増大もたらした後、Ｓｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１のリン酸化によりＡＭＰＡ受容体を調節することもできる。
【０３５４】
ＡＭＰＡ受容体機能の２つのアロステリック増強剤であるＬＹ３９２０９８及びＬＹ４０４１８７は、２種類の「学習性無力感」試験、すなわち、強制水泳試験及び尾部懸垂試験において強力な抗鬱薬用作用を有することが知られている（１４、１５）。これらの知見に基づき、本発明者らはＡＭＰＡ受容体リン酸化に対するフルオキセチンの作用を調べた。フルオキセチンの短時間投与により、前頭皮質、海馬及び線条体におけるＳｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１及びＳｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１両方のリン酸化が増大した。Ｓｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１でのフルオキセチン媒介調節は、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスで強度にかつ一貫して減弱した。フルオキセチンの長時間投与後、フルオキセチンによる負荷が、ＤＡＲＰＰ−３２依存的に、Ｓｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１でリン酸化を誘導する能力は保存された。対照的に、Ｓｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１でのフルオキセチン媒介リン酸化は、生理食塩水で長時間処理したマウスだけに認められ、フルオキセチンで長時間処理したマウスには認められなかった。その結果、Ｓｅｒ−８４５ ＧｌｕＲ１及びＳｅｒ−８３１ ＧｌｕＲ１のリン酸化状態の比が高くなった。このような変化は、改変されたシナプス可塑性（３８）と関連し、フルオキセチンの抗鬱薬作用の開始遅延に関連する順応応答の基礎となっていると考えられる。
【０３５５】
ＤＡＲＰＰ−３２リン酸化に対するフルオキセチンの生化学的作用の行動との関連性を評価するために、尾部懸垂試験におけるフルオキセチンの作用をＷＴおよびＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスで評価した。この試験は、その高度の推定有効性のために、臨床的に有効な抗鬱薬を検出するのに最も一般的に用いられている方法である（２３、２４）。フルオキセチンを含む数種の選択的セロトニン再取込みインヒビターはこの試験での静止を低下させる。確かに、本発明の実験では、フルオキセチンはＷＴマウスにおける静止を低下させた。フルオキセチンはＷＴマウスでの運動に影響を与えなかったことから、非特異的活性化がこの作用の原因であると考えられない。興味深いことに、尾部懸垂試験におけるフルオキセチンの作用は、ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスにおいて有意に低減した。ＤＡＲＰＰ−３２ＫＯマウスにおける尾部懸垂試験でのフルオキセチン誘導の静止時間低減の抑制は、ＤＡＲＰＰ−３２がフルオキセチンの抗鬱薬作用に参加することを顕著に示している。結論として、以上のデータから、フルオキセチンがＤＡＲＰＰ−３２及びＡＭＰＡ受容体のリン酸化状態を調節すること、ＤＡＲＰＰ−３２が、ＡＭＰＡ受容体リン酸化に関する、及び尾部懸垂試験におけるフルオキセチンの作用を媒介するのに関与していること、並びにＡＭＰＡ受容体増強剤がこの行動試験で抗鬱薬を模倣することがわかり、これらのことは、ＡＭＰＡ受容体リン酸化及びコンダクタンスのＤＡＲＰＰ−３２誘導による増大に関与するシグナル伝達経路が、フルオキセチンの抗鬱薬作用を媒介する上で重要な役割を果たしている可能性を示唆している。
【０３５６】
７．４．参照文献
2004538323.tif 000016
2004538323.tif 000017
2004538323.tif 000018
【０３５７】
８．実施例３：ラット脳由来のタンパク質ホスファターゼＰＰ２Ｃイソ型の特性決定
タンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）は、脳において発現される主要なＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼである。この実施例は、線条体由来のＰＰ２Ｃのアルファ（「ａ」又は「α」）、ベータ（「ｂ」又は「β」）、ガンマ（「ｇ」又は「γ」）及びデルタ（「ｄ」又は「δ」）イソ型のクローニングの例を示す。組換えＰＰ２Ｃイソ型は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させ、脳におけるそれらの分布、イオン特異性、及びＤＡＲＰＰ−３２のホスホ−Ｓｅｒ１３７残基に対するホスファターゼ活性を比較した。これらのデータから、イソ型のうち３つが、脳におけるドーパミン及びグルタミン酸調節シグナル伝達に関与すること、並びにＰＰ２Ｃａ及びｇが皮質、海馬、小脳及び線条体において高度に発現されるた優勢なイソ型であるのに対し、ＰＰ２Ｃｂ及びｄイソ型は大脳皮質及び線条体において低から中程度の発現を示した。組換えＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｇイソ型は、Ｋｍ値がそれぞれ１３、２５及び７ｍＭで、Ｓｅｒ１３７でのＤＡＲＰＰ−３２を脱リン酸化した。対照的に、ＰＰ２ＣｄはＤＡＲＰＰ−３２を脱リン酸化しなかった。
【０３５８】
８．１．材料及び方法
８．１．１．材料
ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）をSigmaから取得した。ＣＫ１は、New England BioLabsから取得した。すでに記載されている（Desdouitsら、1998）ように、組換えＤＡＲＰＰ−３２を精製し、［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１モル／モルの化学量論）を用いたＣＫ１によりＳｅｒ１３７でｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化した。
【０３５９】
８．１．２．組換えＰＰ２Ｃイソ型のクローニング及び発現
ＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄイソ型、ＰＰ２Ｂ、並びに軸索伸長調節タンパク質ホスファターゼ（ＮＥＲＰＰ）の全長ｃＤＮＡを以下のプライマーを用いて、ラット線条体のオリゴ−ｄＴ−及びランダムプライミングしたｃＤＮＡの混合物であるライブラリー（Dr. Zhen Yan、SUNY Buffaloからの寄贈）からＰｆｕポリメラーゼを用いて増幅した：
ＰＰ２Ｃａフォワード：5’-GCGTCGACGATGGGAGCATTTTTAGACAAG-3’（配列番号７）
ＰＰ２Ｃａリバース：5’-TATTCATGCGGCCGCTTACCACATATCATCAGTTG -3’（配列番号８）
ＰＰ２Ｃｂフォワード：5’-GCGTCGTCGACGATGGGTGCATTTTTGGATAA-3’（配列番号９）
ＰＰ２Ｃｂリバース：5’-TATTCATGCGGCCGCTTATAAGGCTACCAATGAGTC -3’（配列番号１０）
ＰＰ２Ｃｇフォワード：5’-ACGCGTCGACAAATGGGTGCCTACCTCTCTCAGCC-3’（配列番号１１）
ＰＰ２Ｃｇリバース：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTGCTAGTCCCGCTTGGCCTTCTT-3’（配列番号１2）
ＰＰ２Ｃｄフォワード：5’-GCGTCGACGATGGACCTATTCGGGGACTTG-3’（配列番号１３）
ＰＰ２Ｃｄリバース：5’-TATTCATGCGGCCGCGTGTCCTATCCTCACCACC-3’（配列番号１４）
ＰＰ２Ｂフォワード：5’-GCGTCGACGATGGCCGCCCCGGAGCCGGC-3’（配列番号１５）
ＰＰ２Ｂリバース：5’-TATTCATGCGGCCGCTCACTTGTTCCTGATGACCTC-3’（配列番号１６）
ＮＥＲＰＰフォワード：5’-GCGTCGACGATGGGGAAGAGCACACACAATGAAG-3’（配列番号１７）
ＮＥＲＰＰリバース：5’-TATTCATGCGGCCGCTCATGACAGCTTGTTTCCATGTAT-3’（配列番号１８）。
【０３６０】
増幅のためのプロトコルは、９４℃で１分の変性、５５℃で１分のアニーリング、及び７２℃で１分の伸長を２サイクルに続いて、９４℃で１分の変性、６０℃で１分のアニーリング、及び７２℃で１分の伸長を２５サイクル実施することを含むものであった。得られたＰＣＲ断片を１％アガロースゲルで分離した。１２００〜１６００ｂｐの予想されたサイズのＤＮＡバンドをゲルから抽出し、ｐＥＴ２８ａ発現ベクター（Novagene）のＮｏｔＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングした。少なくとも２つの独立に産生されたクローンの直接配列決定により、クローニングしたｃＤＮＡヌクレオチド配列を確認した。
【０３６１】
得られたＤＮＡ構築物で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換してから、１ＬのＬＢ培地（３００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含む）において３７℃で増殖させた。ＯＤ６００が０．５において、１ｍＭイソプロピルｂ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりタンパク質発現を誘導し、培養物を４時間インキュベートした。遠心分離により細胞を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及びＥＤＴＡ非含有プロテアーゼインヒビターカクテル（Hoffman-La Roche）を含む１０ｍｌの氷冷溶解バッファー中に再懸濁させた。フレンチプレスを用いて細胞を溶解させ、細胞残屑を３０，０００ｇで４０分の遠心分離により除去した。上清を２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロース（Qiagen）と共に４℃で３０分インキュベートした。４００ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファーを用いて組換えタンパク質を溶離させ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析し、−８０℃で保存した。
【０３６２】
８．１．３．ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
様々なＰＰ２Ｃ遺伝子の断片、すなわちＰＰ２Ｃａ（４５２ｂｐ）Ｎ−末端断片；ＨｉｎｄＩＩＩ部位から開始するＰＰ２Ｃｂ及びＰＰ２Ｃｇ（３１０ｂｐ）Ｃ−末端断片；ＰＰ２Ｃｄ（３００ｂｐ）Ｎ−末端断片に対応する、ｃＤＮＡクローンからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により３５Ｓ−標識ｃＲＮＡプローブを調製した。転写反応は、５０ｎｇの線状化プラスミド、３５Ｓ−ＵＴＰ（＞１０００Ｃｉ／ｍモル、NEN Life Science）と、記載されている（LeMoineら、1995）ようにＳＰ６又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いて実施した。アルカリ加水分解により、約２５０ｂｐのｃＲＮＡ断片を取得した後、３５Ｓ標識プローブをＧ５０−Ｓｅｐｈａｄｅｘで精製し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）（０．１容量）／無水エタノール（２．５容量）を用いて沈降させた。
【０３６３】
すでに記載されている（LeMoineら、1995）ようにラットからの脳切片にハイブリダイズさせた。凍結切片を４％パラホルムアルデヒド中で室温にて５分間後固定（post-fix）し、４×標準クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で２回すすいでから、０．１Ｍトリエタノールアミン／４×ＳＳＣ（ｐＨ８．０）中の０．２５％無水酢酸に室温で１０分放置した。脱水した後、５０μｌのハイブリダイゼーション溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、１×デンハルト溶液、２５０μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１００ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ、０．１％チオ硫酸ナトリウム）中の１０６ｃｐｍの３５Ｓ標識ｃＲＮＡプローブと、切片を５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。２０分のＲＮＡｓｅＡ処理（２０μｇ／ｍｌ）の後、室温にて２×ＳＳＣで２回５分、１×ＳＳＣで５分、０．５×ＳＳＣで５分、切片を洗浄し、６５℃にて０．１×ＳＳＣで２回３０分すすいだ後、脱水した（後者のＳＳＣ洗浄液は、１ｍＭ ＤＴＴを含んだ）。切片をＸ線フィルム（Kodak BIOMAX）に６日間露出した。
【０３６４】
８．１．４．ホスファターゼアッセイ
基質としてｐＮＰＰを用いるＰＰ２Ｃイソ型の活性をすでに記載されているように評価した（Brumelら、1997）。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２又は２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び０．１２５〜２０ｍＭ基質を含む反応混合物（０．１ｍｌ）を３７℃で１０分酵素と一緒にインキュベートした。反応を１ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨの添加により停止させ、ｐ−ニトロフェノール放出の初期速度を４０５ｎｍでの分光測光法により決定した（１８，０００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を用いた）。
【０３６５】
３２Ｐ−ＤＡＲＰＰ（Ｓｅｒ１３７でリン酸化）を用いたＰＰ２Ｃイソ型の活性を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１％ＢＳＡ、及び０．５〜２０ｍＭ基質を含む反応混合物（合計容量４０ｍｌ）において３７℃でアッセイした。２００ｍｌの５０％三塩化酢酸の添加により反応を停止させた。次に、サンプルを氷上で３０分インキュベートし、４℃及び１０，０００ｇで１０分遠心分離させた。上清中に回収した放射能をシンチレーションカウンター（Beckman）でチェレンコフ計数により測定した。
【０３６６】
動力学的パラメーター（Ｋｍ及びＶｍａｘ）をラインウィーバー・バークプロットから決定した。
【０３６７】
８．２．結果
８．２．１．ラット線条体において発現させたＰＰ２Ｃイソ型のクローニング及び配列分析
ＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄイソ型の全オープンリーディングフレームに対応するＰＣＲ断片をラット線条体オリゴ−ｄＴ／ランダムプライミングした逆転写ｃＤＮＡライブラリーから増幅した（図１２）。陽性対照として全長カルシニュリン（ＰＰ２Ｂ）ｃＤＮＡも同じ鋳型から増幅した。陰性対照として、本発明者らは、ＮＥＲＰＰ、すなわち、脳特異的ＰＰ２Ｃ類似体のＤＮＡを単離することができなかったが、これは、明らかに線条体では発現しない（Labesら、1998）。各ＰＰ２Ｃイソ型について少なくとも２つのｃＤＮＡを独立にクローニングし、配列決定した。クローンの推定アミノ酸配列を図１３Ａに示す（ＧｅｎＢａｎｋに提出されたＰＰ２Ｃｇ配列、登録番号：ＡＦ５２５６８７）。これらの配列は、それぞれ、腎臓からのＰＰ２Ｃａ（Tamuraら、1989）、肝臓からのＰＰ２Ｃｂ（Marleyら、1998）、骨格筋からのＰＰ２Ｃｇ（Travis及びWelsh、1997）、及び視床下部からのＰＰ２Ｃｄ（Tongら、1998）のすでに公表されているｃＤＮＡと少なくとも９９％同一であった。本発明の実験で得られたＤＮＡ配列におけるわずかな差異は、ゲノムの多型に起因すると思われる。線条体ＰＰ２Ｃイソ型のアミノ酸配列の比較により、ａ及びｂイソ型は最も近縁であった（７５％の同一性）が、ＰＰ３Ｃｇ、ＰＰ２Ｃｄ、及びＮＥＲＰＰは、ＰＰ２Ｃａに対して（それぞれ３０、２３及び２０％）、並びに互いに対して同一性が比較的低いことが明らかになった（図１３Ｂ）。異なるイソ型同士の同一性が低いにもかかわらず、金属リン酸結合に関与する残基（Dasら、1996）は保存されている。
【０３６８】
８．２．２．ラット脳におけるＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄのｍＲＮＡの発現
脳全域にわたってＰＰ２Ｃａ ｍＲＮＡの広範囲かつ一般に高度の発現がみられる（図１４）。特に、非常に高レベルが、すべての海馬下位領域（ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３）及び歯状回、小脳の顆粒細胞層、並びに大脳皮質の層２及び３に認められた。また、高レベルのＰＰ２Ｃａ ｍＲＮＡが、ほとんどの視床及び視床下核、中隔核、並びに線条体（すなわち、尾状−被殻及び側座核）において、大脳皮質の１、４及び６層で認められた。
【０３６９】
中レベルのＰＰ２Ｃｂ ｍＲＮＡが海馬のＣＡ３及び歯状回下位領域、並びに小脳における顆粒細胞層に認められた。それ以外に、ＰＰ２Ｃｂ ｍＲＮＡの低くはあるが特定レベルの発現が大脳皮質、線条体及び視床に検出可能であった。ＰＰ２Ｃｇ ｍＲＮＡもまた広範囲に発現し、前頭皮質でのレベルが最も高かった。線条体及び海馬において中程度のレベルが認められた。
【０３７０】
ＰＰ２Ｃｄ ｍＲＮＡのレベルはほとんどの脳領域で低から中レベルであることがわかった。視床の室周囲核及び小脳の顆粒細胞ではより高レベルのＰＰ２Ｃｄ ｍＲＮＡが認められた。海馬の下位領域（ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３及び歯状回）、並びに大脳皮質のすべての層に中程度のレベルが認められた。低いが、特定のシグナルが線条体で検出された。
【０３７１】
以上を考え合わせると、上記結果から、ＰＰ２Ｃａ及びｇ ｍＲＮＡは脳において最も豊富に存在するが、ＰＰ２Ｃｂ及びｄ ｍＲＮＡは中から低レベルで発現することがわかる。
【０３７２】
８．２．３．組換えＰＰ２Ｃイソ型の特性決定
酵素活性をさらに詳しく特性決定するために、ｈｉｓタグを付したＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄイソ型を大腸菌において発現させ、各々が約９０％の均一性に達するまでＮｉ−ＮＴＡ−アガロース上で精製した（図１５）。組換えＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｄは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約４５ｋＤａの見かけ分子質量で泳動したが、これはそれぞれ４２、４３及び４４ｋＤａの推定分子質量に相当する。対照的に、組換えＰＰ２Ｃｇは、８０ｋＤａの分子質量で泳動したが、これは５９ｋＤａの推定サイズより有意に高い。これは、タンパク質の極めて高い酸性の性質によって起こると考えられ、これがＳＤＳ結合に影響を与える（アスパラギン酸及びグルタミン酸がＰＰ２Ｃｇに中の全アミノ酸の２５％以上を占める）（図１３Ａ；Travis及びWelsh、1997を参照）。
【０３７３】
複数の以前の研究から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＰ２Ｃ活性が、二価金属カチオンの性質に依存することが明らかにされている（Pato及びKerc、1991；Fjeld及びDenu、1999）。Ｍｇ２＋及びＭｎ２＋の両方が、組換えＰＰ２Ｃａを活性化することがわかっている（Cohen、1997；Fjeld及びDenu、1999）。別の研究では、組換えＰＰ２Ｃｄ活性がＭｇ２＋だけの添加に厳密に依存することが認められた（Tongら、1998）。初めに、組換えＰＰ２Ｃイソ型のホスファターゼ活性を基質としてｐＮＰＰを用いてアッセイした。二価金属カチオンの非存在下では、ＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｇについて非常に低いレベルの活性が測定され、２０ｍＭ Ｍｇ２＋又はＭｎ２＋の添加により酵素活性が刺激された。対照的に、ＰＰ２ＣｄはＭｎ２＋の存在下でしか触媒活性を呈示しなかった。
【０３７４】
一般に、ＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｇは、ｐＮＰＰに関して類似したＫＭ値を示し、基質の脱リン酸に関するＶｍａｘ値だけが異なっていた（表７）。Ｖｍａｘ値は、２０ｍＭ Ｍｇ２＋と比較して２０ｍＭ Ｍｎ２＋の存在下で５０〜１００倍高かった。同様に、それらの触媒効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、Ｍｇ２＋と比較して２０ｍＭ Ｍｎ２＋の存在下で２〜３桁高かった。ＰＰ２Ｃｇの顕著な特徴は、Ｍｎ２＋の存在下で認められる高いＫｍであった。ＰＰ２Ｃｄは、主としてｐＮＰＰのＫｍがはるかに高いために、最も効率の低い酵素であった。
【表７】
2004538323.tif 000019
【０３７５】
表７の説明。基質としてｐＮＰＰを用いてアッセイしたＰＰ２Ｃイソ型の酵素活性。基質としてｐＮＰＰを用いて、４０５ｎｍでの吸光度の変化によりホスファターゼ活性を測定した。データのラインウィーバー・バークプロットからＫｍ及びＶｍａｘ値を算出した。
【０３７６】
８．２．４．ＰＰ２Ｃイソ型のホスホ−ＤＡＲＰＰ−３２特異性
本発明者らの以前の研究から、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）によりＳｅｒ１３７でリン酸化されたＤＡＲＰＰ−３２がＰＰ２Ｃ様活性の生理学的基質であることがわかっている（Desdouitsら、1998）。ＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄは線条体において発現する。従って、本発明者らは、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２に対するＰＰ２Ｃイソ型の活性を比較した。ＰＰ２Ｃｄは、ホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２を脱リン酸しなかったが、ＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｇは、類似した脱リン酸初期速度を示した（図１６）。
【０３７７】
次に、本発明者らは、基質としてホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２を用いてＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｇの金属依存性を分析した（図１７）。０〜３０ｍＭの濃度範囲内で、ＰＰ２Ｃの３つのイソ型すべてが、Ｍｇ２＋の存在下と比較して、Ｍｎ２＋の存在下では１．２〜４倍高い効率でホスホ−Ｓｅｒ１３７ ＤＡＲＰＰ−３２を脱リン酸した。ＰＰＣ２ａはＭｎ２＋又はＭｇ２＋に対して最も感受性が高く、最大活性は４〜５ｍＭ二価カチオンで観察された。ＰＰ２Ｃｂ及びｇは最大活性のためにさらに高い濃度（１０〜２０ｍＭ Ｍｎ２＋又はＭｇ２＋）を要した。非常に高い濃度（５０ｍＭまでのＭｎ２＋又はＭｇ２＋）によって、ホスファターゼ活性は低下した。
【０３７８】
本発明者らは、基質としてホスホ−Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ−３２を用いてＰＰ２Ｃａ、ｂ及びｇ活性の動力学的パラメーターを比較した（図１８）。３つのイソ型すべてが７〜２５ｍＭの類似したＫｍ値、並びに０．３〜１．０ｍｍｏｌ／分／ｍｇの類似したＶｍａｘ値を示し、そのうちＰＰ２Ｃｇが最も高い触媒効率を示した（表８）。
【表８】
2004538323.tif 000020
【０３７９】
表８の説明。基質として［３２Ｐ］ホスホ−Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ−３２を用いてアッセイしたＰＰ２Ｃイソ型の酵素活性。３２Ｐの放出によりホスファターゼ活性を測定し、データのラインウィーバー・バークプロットからＫｍ及びＶｍａｘ値を算出した。
【０３８０】
８．３．論考
本発明者らは、線条体において発現し、かつ、線条体に非常に豊富なＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸に関与する、最も多様なニューロンのＰＰ２Ｃイソ型のいくつかをクローニングし、特性決定した。ＤＡＲＰＰ３２リン酸の状態はまた、ＰＰ１及びＰＫＡ両方の活性にも影響を与え、ドーパミン作動性及びセロトニン作動性神経伝達において重要な役割を果たす（Greengard、2001）。また、ＤＡＲＰＰ３２ Ｓｅｒ１３７はＣＫ１によりリン酸化され、ＣＫ１は、代謝型グルタミン酸受容体により活性化されることから、ＰＰ２Ｃは脳におけるグルタミン酸作動性シグナル伝達の調節にも関与する（Liuら、2001）。従って、ＤＡＲＰＰ３２ Ｓｅｒ１３７残基の脱リン酸における個々のＰＰ２Ｃイソ型の役割を評価するのに重要である。
【０３８１】
以前の研究から、ＰＰ２ＣｍＲＮＡは、尾状被殻中にわずかな発現がみられるだけで、脳での発現は比較的低いレベルであることが明らかになっている（Abeら、1992）。対照的に、本発明者らのデータは、ＰＰ２Ｃα及びγｍＲＮＡの両方が皮質、小脳及び線条体で非常に豊富であることを明確に示している。また、ＰＰ２Ｃβ及びδｍＲＮＡは、脳全域（線条体を含む）にわたってこれよりはるかに低いレベルで発現する。
【０３８２】
特異的インヒビター及びイソ型特異的抗体の欠如が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ両方でのＰＰ２Ｃの試験における不十分な進行の原因であると考えられる。これまで、ＰＰ２Ｃ特異性が、オカダ酸処理に対する相対的耐性及び二価イオン（例えば、Ｍｇ２＋又はＭｎ２＋）への依存により確認されている。どの金属イオンがｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＰ２Ｃ触媒部位でのホスファターゼ反応を触媒するかは依然としてわかっていないため、ＰＰ２Ｃイソ型への金属依存性は特に興味深い。
【０３８３】
本発明者らのデータから、Ｍｇ２＋をＭｎ２＋で置換することにより、反応のＫｍに有意な影響を与えずに、α及びβイソ型の両方についてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｐＮＰＰ加水分解のＶｍａｘが約５０倍高くなることが明らかにされた。対照的に、ＰＰ２Ｃγは、Ｍｇ２＋をＭｎ２＋で置換すると、Ｋｍは２４倍低く、Ｖｍａｘは１５倍高くなる。これらのデータから、ＰＰ２ＣファミリーはＭｎ２＋により直接調節することが可能であることがわかる。
【０３８４】
ＰＰ２Ｃα、β及びγによるＤＡＲＰＰ３２脱リン酸化の動力学的パラメーターの類似性は、３つのＰＰ２Ｃイソ型すべてがＤＡＲＰＰ３２のＳｅｒ１３７残基を脱リン酸化する能力があることを示す。特定の理論に拘束されるものではいが、ＰＰ２Ｃαは、線条体において最も豊富に存在することから、このイソ型は、ドーパミン作動性及びセロトニン作動性細胞内シグナル伝達経路においてＰＰ２Ｃイソ型の最も大きな役割を果たしている可能性がある。
【０３８５】
７．５．参考文献
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2004538323.tif 000023
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【０３８６】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態により範囲を限定されるものでない。実際、当業者であれば以上の説明から、本明細書に記載されたことに加えて本発明のさらなる改変が明らかであろう。そのような改変は添付した特許請求の範囲内に入ると意図するものである。
【０３８７】
本明細書に引用した全ての参考文献は、それぞれの個々の出版物、特許又は特許出願が特定してかつ個々に、参照によりその全文があらゆる目的で組み入れられると示されたのと同じ程度で、本明細書に参照によりその全文があらゆる目的で組み入れられる。
【０３８８】
いずれの公開文献の引用も出願日に先立つ開示であるが、本発明が先行する発明によるこのような公開文献に先んずる権利が与えられないことを容認するとみなしてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０３８９】
【図１ａ】新線条体の切片におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のセロトニンによる調節を示す。
【図１ｂ】新線条体の切片におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化のセロトニンによる調節を示す。
【図２】ＰＣＡ及び５−ＨＴＰによるｉｎ ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。
【図３ａ】野生型（ＷＴ）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウスにおけるＰＣＡ及び５−ＨＴＰによるｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡ発現の調節を示す。
【図３ｂ】野生型（ＷＴ）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウスにおけるＰＣＡ及び５−ＨＴＰによるｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡ発現の調節を示す。
【図４】野生型（ＷＴ）及びＤＡＲＰＰ−３２  ＫＯマウスにおけるＰＣＡ及び５−ＨＴＰによる処置に対する行動応答を示す。
【図５】セロトニン作動性神経伝達の増強がＴｈｒ３４、Ｔｈｒ７５、及びＳｅｒ１３７におけるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化を調節するモデル集合経路を示す。
【図６】フルオキセチンでの短時間処置によるｉｎ ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。
【図７ａ】フルオキセチンでの長時間処置によるｉｎ ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。
【図７ｂ】フルオキセチンでの長時間処置によるｉｎ ｖｉｖｏでのＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。
【図８】生理食塩水又はフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ）での１９日間にわたる長時間処置後のＤＡＲＰＰ−３２  ｍＲＮＡ及びインヒビター−１のレベルを示す。
【図９ａ】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセロトニン（１００μＭ）によるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。
【図９ｂ】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセロトニン（１００μＭ）によるＤＡＲＰＰ−３２リン酸化の調節を示す。
【図１０】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのセロトニン（１００μＭ）によるＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体のリン酸化の調節を示す。
【図１１】抗鬱効力についての尾部懸垂試験における、フルオキセチン媒介静止へのＤＡＲＰＰ−３２の関与を示す。
【図１２】ラット線条体由来のＰＰ２Ｃイソ型のＰＣＲ増幅を示す。
【図１３ａ】ラット線条体からクローニングしたＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ、及びｄイソ型のアミノ酸配列の比較を示す。
【図１３ｂ】ラット線条体からクローニングしたＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ、及びｄイソ型のアミノ酸配列の比較を示す。
【図１３ｃ】ラット線条体からクローニングしたＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ、及びｄイソ型のアミノ酸配列の比較を示す。
【図１３ｄ】種々のＰＰ２Ｃイソ型における相対類似度の概要を示す。
【図１４】ラット脳におけるＰＰ２Ｃイソ型のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。
【図１５】ＰＰ２Ｃａ、ｂ、ｇ及びｄのＤＮＡを担持するｐＥＴ２８ａベクターで形質転換された大腸菌からの組換えＰＰ２Ｃイソ型の精製を示す。
【図１６】ＰＰ２Ｃイソ型によるホスホ−Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ−３２の脱リン酸化を示す。
【図１７ａ】ＰＰ２Ｃイソ型の活性に対する金属イオンの影響を示す。
【図１７ｂ】ＰＰ２Ｃイソ型の活性に対する金属イオンの影響を示す。
【図１８】ＰＰ２Ｃイソ型によるホスホ−Ｓｅｒ１３７−ＤＡＲＰＰ３２の脱リン酸化の反応速度分析を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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2004538323.tif 000215
2004538323.tif 000216
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004538323.tif 000217
【国際調査報告】
2004538323.tif 000218
2004538323.tif 000219
2004538323.tif 000220
2004538323.tif 000221
2004538323.tif 000222