(57)【要約】本発明は、ヒトパピローマウイルス感染およびそれに付随する徴候および疾患の治療および予防にて有用な方法および組成物に関する。さらには、本発明はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）アミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが高度に発現された哺乳動物遺伝子のものと類似しているポリヌクレオチド配列に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）アミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが高度に発現された哺乳動物遺伝子のものと類似しているポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが高度に発現されたヒト遺伝子のものと類似しているところの、請求項１記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが高度に発現されたイー・コリ遺伝子のものとも類似しているところの、請求項１または請求項２記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
ＤＮＡ配列である、請求項１ないし３のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
頚部癌、良性皮膚疣贅または陰部疣贅と関連するＨＰＶタイプまたはサブタイプのＨＰＶポリペプチドをエンコードする前記請求項のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
１−４、６、７、１０、１１、１６、１８、２６−２９、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８型のうちの一つのＨＰＶポリペプチドをエンコードする、請求項５記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
特に頚部癌または陰部疣贅と関連するＨＰＶタイプまたはサブタイプのＨＰＶポリペプチドをエンコードする、請求項６記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
６、１１、１６、１８、３３または４５型の内の一つのＨＰＶポリペプチド、あるいは１またはそれ以上の６、１１、１６、１８、３３または４５型ＨＰＶウイルスの２またはそれ以上のポリペプチドの融合物をエンコードする、請求項７記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
ＨＰＶ１１、６ａまたは６ｂから選択されるＨＰＶタイプまたはサブタイプのＨＰＶポリペプチドをエンコードする、請求項８記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
生物学的機能が低下した変異ＨＰＶポリペプチドをエンコードする、前記請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
１またはそれ以上の点突然変異を含み、それにより１またはそれ以上のポリペプチドの天然の生物学的機能が不活化される、変異ＨＰＶをエンコードする、請求項１０記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
エンコードされたＨＰＶポリペプチドがＨＰＶ初期遺伝子産物の全体または一部を含むところの、前記請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
エンコードされたＨＰＶポリペプチドが、Ｅ１またはＥ２の全体または一部、あるいはＥ１またはＥ１の全体または一部ともう一つ別のＨＰＶポリペプチドとの融合物を含むところの、請求項１２記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
０．３より大きいが、１より小さい高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用係数を有する前記請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
０．４より大きいが、１より小さい高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用係数を有する請求項１４記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
０．５より大きいが、１より小さい高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用係数を有する請求項１５記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１７】
０．６より大きい高度に発現されたイー・コリ遺伝子のコドン使用係数を有する前記請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
図５に示すポリヌクレオチド配列、またはそのコドン使用パターンを維持するフラグメントまたは類似体。
【請求項１９】
図６に示すポリヌクレオチド配列、またはそのコドン使用パターンを維持するフラグメントまたは類似体。
【請求項２０】
宿主細胞によるポリヌクレオチド配列の発現をさせることができる対照配列に操作可能に結合した前記請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２１】
細菌、昆虫または哺乳動物細胞においてポリヌクレオチド配列の発現の指令能を有する、請求項２０記載の発現ベクター。
【請求項２２】
ｐ７３１３ＰＬｃである請求項２０または請求項２１記載の発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２０〜２２のいずれか一つに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
細菌、哺乳動物または昆虫細胞である、請求項２３または請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２０〜２２のいずれか一つに記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項２８】
ＤＮＡでコートされた複数の粒子、好ましくは金粒子を含む、請求項２６または請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】
医薬上許容される賦形剤およびＤＮＡベクターを含む、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３０】
さらにアジュバントを含む請求項２６〜２９のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項３１】
アジュバントがポリヌクレオチドによりエンコードされるＨＰＶポリペプチドとの融合物としてエンコードされる、請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ＨＰＶ感染の治療または予防における請求項１〜１９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項３３】
ＨＰＶ感染の治療または予防における請求項２０〜２２のいずれか一つに記載のベクターの使用。
【請求項３４】
ＨＰＶ感染の治療または予防における請求項２６〜３１のいずれか一つに記載のワクチン組成物の使用。
【請求項３５】
ＨＰＶ感染症が、ＨＰＶ６、１１、１６または１８型の感染症であるところの、請求項３２〜３４のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３６】
請求項１〜１９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、請求項２０〜２２のいずれか一つに記載のベクターまたは請求項２６〜３１のいずれか一つに記載の医薬組成物の、皮膚疣贅、陰部疣贅、有意性が未確認の異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、頚部異形成、子宮頚管上皮内新生腫瘍（ＣＩＮ）または頚部癌の治療または予防における使用。
【請求項３７】
有効量の請求項１〜１９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、請求項２０〜２２のいずれか一つに記載のベクターまたは請求項２６または３１のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与することを含む、ＨＰＶ感染症またはそれに付随する任意の症状または疾患を治療または予防する方法。
【請求項３８】
請求項２６〜３０のいずれか一つに記載の医薬組成物をプライム・ブースト投与計画にて請求項１〜１９のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターまたは非ウイルスベースの系とともに投与することを含む、ＨＰＶ感染症またはこれに付随する任意の症状または疾患を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はヒトパピローマウイルス感染症およびこれに付随する症状および疾患の治療および予防において有用な方法および組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
パピローマウイルス感染症は、ヒツジ、イヌ、ウサギ、サル、ウシおよびヒトを含む様々な種において観察されている。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は８０種以上に分類されている（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １９９９ １６：２０３−２１１）。新種は、Ｌ１遺伝子がすでに同定された種からのＬ１配列と９０％未満の同一性を示すものとして定義され、一方、サブタイプは９０％から９８％の間のＬ１配列同一性を示し、変種は９８％より大きな配列同一性を示す（プロトタイプ（親）型に対して）。パピローマウイルスは一般に上皮に感染するが、異なるＨＰＶ種は異なる疾患を引き起こす。例えば、１−４、７、１０および２６〜２９型は良性皮膚疣贅を引き起こし、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８型は頚部癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ）に関連し、タイプ６および１１型は陰部疣贅（生殖管の非悪性コンジローマ）に関与する。
【０００３】
陰部疣贅の大部分（＞９０％）はＨＰＶ遺伝子型６および１１を含む。ＨＰＶ−６が単一の感染症において同定される最も優勢な遺伝子型であり、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１の両方が時折同じ病変にて発生する場合がある。疣贅は一般に感染した個体において複数の部位において生じ、パートナーがコンジローマ（陰部疣贅）にかかっている患者の６０％以上に病変が発現し、平均的潜伏期間は３ヶ月である。いくつかの治療オプションが現在利用可能である。しかしながら、これらは摘出または剥離および／または局所ゲルおよびクリームの使用によるものである。これらは痛みがないわけではなく、頻繁に病院で診察を受ける必要があり、効果は非常に多様である。疾患の再発は、この疾患の有効な管理にとって重大な問題である。
【０００４】
陰部疣贅は自然に退縮し、細胞性免疫が疣贅の退縮の原因となる一次事象と思われる。高自発的退縮率は宿主細胞性免疫が疾患を散らすことができ、免疫療法介入を陰部疣贅の治療または予防のオプションとすることができることを示す。疾患管理の目的は、痛みがなく、最低限の診察しか必要とせず、高い疾患消散率を有し、再発を減少させる／最小限に抑えるウイルス特異性療法である。
ＨＰＶは組織培養において増殖させることが困難であることが示されており、旧来の生または減毒ウイルスワクチンはない。ＨＰＶワクチンの開発も、ヒトウイルスを研究できる適当な動物モデルがないことにより遅れている。これは、ウイルスが高度に種特異性であり、従って、ワクチンを最初にヒトにおいて試す前に安全性試験のために必要とされる免疫適格動物がヒトパピローマウイルスに感染する可能性がないためである。
【０００５】
パピローマウイルスは、Ｅ１〜Ｅ７、Ｌ１およびＬ２で表される「初期（ｅａｒｌｙ）」および「後期（ｌａｔｅ）」遺伝子をエンコードするＤＮＡゲノムを有する。初期遺伝子配列は、ウイルスＤＮＡ複製および転写、宿主免疫の回避、および正常な宿主細胞周期および他のプロセスの変更に関連する機能を有することが示されている。例えば、Ｅ１蛋白は、ＡＴＰ−依存性ＤＮＡヘリカーゼであり、ウイルスＤＮＡ複製プロセスの開始に関与し、一方、Ｅ２はウイルス遺伝子発現およびＤＮＡ複製の両方を制御する調節蛋白である。そのＥ１および複製のウイルス起源の両方を結合できることにより、Ｅ２は起点でＥ１の局所濃度を生じさせ、かくしてウイルスＤＮＡ複製の開始を刺激する。Ｅ４蛋白は、十分には規定されていない多くの機能を有するようであるが、これらのうちには宿主細胞骨格との結合があり、一方、Ｅ５はエンドソームの酸性化を遅らせ、その結果、細胞表面でのＥＧＦレセプターの発現が増大し、Ｅ６およびＥ７はいずれもそれぞれ細胞蛋白ｐ５３およびｐＲＢと結合することが知られている。Ｅ６およびＥ７蛋白は、頚部癌と関連するＨＰＶタイプを形成することが知られており、腫瘍遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）とよばれる。Ｌ１およびＬ２は２つのウイルス構造（カプシド）蛋白をエンコードする。
【０００６】
歴史的に、ワクチンは病原体による感染症を予防する一方法と見なされ、免疫系に前もって病原体を認識させ、万一感染が起こった場合にこれを中和する。ワクチンは、病原体から得られる１またはそれ以上の抗原、通常、全生物（死滅または弱毒化形態のいずれか）、あるいは生物から選択された抗原ペプチドを含む。免疫系が抗原に暴露された場合に、個体の一生の間その免疫学的「記憶」を保持する細胞が生じる。その後の同じ抗原への暴露（例えば、病原体による感染に際して）は特定の免疫応答を刺激し、この結果、感染性物質が除去または不活化される。
【０００７】
免疫応答に対して２つの手段：すなわち、体液性（抗体）応答および細胞媒介応答がある。細胞（ウイルスおよびある種の細菌）内で複製する病原体から由来の蛋白抗原は、その後、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）分子に関連した感染した細胞表面上で示される短鎖ペプチドを放出する、感染した宿主細胞内で処理される。このＭＣＨＩおよびペプチドに関連する複合体を抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させると、Ｔ細胞は活性化され、細胞毒性活性を獲得する。これらの細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は感染した宿主細胞を溶解させることができ、従って感染病原体の複製および蔓延を制限する。免疫応答のもう一つの重要な手段は、ＣＤ４＋Ｔ細胞により制御される。病原体由来の抗原は細胞外環境中に放出される際に、分化抗原提示細胞（ＡＰＣ）により取り込まれ、ＭＨＣＩＩ分子と関連してこれらの細胞の表面上で提示される。この複合体における抗原の認識はＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激して、他のＴ細胞のエフェクターメカニズムを調節する可溶ファクター（サイトカイン）を分泌させる。抗体はＢ細胞により産生される。抗原を分泌された抗体と結合させることにより、病原体の感染性が中和され、Ｂ細胞の表面上の膜結合抗体と抗原との結合がＢ細胞の分化を刺激し、したがってＢ細胞応答を増幅する。一般に、抗体および細胞性免疫応答（ＣＤ８＋およびＣＤ４＋）の両方が病原体による感染を制御するために必要とされる。
【０００８】
免疫系は、病原体に感染した後でさえも、病原体の不活化または除去により感染を制御または消散させるために利用できると考えられる。かかる免疫療法（「治療用」ワクチンまたは免疫治療薬ともいう）は理論的には細胞性応答が有効であることを必要とするが、体液性および細胞性免疫応答は両方とも惹起することができる。
マウスにリン酸カルシウム沈殿ＤＮＡを接種すると、該ＤＮＡによりエンコードされるペプチドが発現されることが示されている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ， Ｎ ａｎｄ Ｒｅｓｈａｆ， Ｌ． ＰＮＡＳ ８３ ９５５１−９５５５）。その後、沈殿されなかったプラスミドＤＮＡをマウスに筋肉内注射すると、筋肉細胞中にそのＤＮＡが取り込まれ、エンコードされた蛋白が発現されることが示された。ＤＮＡの発現の結果、自然感染におけるように、エンコードされた病原体蛋白が宿主細胞内で産生されるので、このメカニズムは、免疫療法または治療的ワクチン接種に必要とされる細胞性免疫応答を刺激することができ、従ってＤＮＡベースの薬剤を予防用ワクチンまたは免疫療法として適用できる。ＤＮＡワクチンはＷＯ９０／１１０９２（Ｖｉｃａｌ， Ｉｎｃ．）において記載されている。
【０００９】
ＤＮＡ予防接種は、筋肉内注射以外の手段により送達することができる。例えば、皮膚中への送達は、免疫メカニズムが、感染に対して障壁である組織、例えば、皮膚および粘膜中において高度に活性であるという事実を利用する。皮膚中への送達は注射、ジェットインジェクター（液体を皮膚または筋肉を含む基底組織中に圧力下で押し込む）またはパーティクルボンバードメント（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（上皮を透過するために十分な密度の粒子上にＤＮＡをコートすることができる）により行うことができる（米国特許第５３７１０１５）。例えば、ヌクレオチド配列を、金ビーズ上にコートされたプラスミド中に組み入れることができ、これをその後、高圧下で、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４：３７−４２ （１９９６）に記載されているようにして表皮中に投与する。これらの粒子を皮膚中に発射することにより、表皮細胞および表皮ランゲルハンス細胞の両方が直接感染する。ランゲルハンス細胞はＤＮＡを取り込み、エンコードされたペプチドを発現し、これらを細胞表面ＭＨＣ蛋白上に提示するために処理する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。トランスフェクトされたランゲルハンス細胞はリンパ節に移動し、ここで提示された抗原フラグメントをリンパ細胞に与え、免疫応答を惹起する。粒子により媒介される皮膚中への送達による免疫応答を誘発するためには非常に少量のＤＮＡ（１μｇ未満、０．５μｇ未満であることが多い）しか必要でなく、これは直接筋肉内注射後に免疫応答を生じるために必要であることが知られているＤＮＡの量（ミリグラム）とは対照的である。
【００１０】
トランスフェクトされた哺乳動物細胞、例えば、ＨｅＬａ、２９３、またはＣＨＯ細胞におけるＨＰＶ蛋白の発現および検出はしばしば困難であることが判明し、従って、蛋白の検出可能な発現または純粋な蛋白の量を必要とする生化学的および免疫学的研究については、イー・コリ、バクロウイルスまたは酵母蛋白発現系が用いられることが多い。これらの系において、蛋白の収量は機能分析および精製ならびにその後の生化学的および免疫学的研究を実施可能にするために適当である。しかしながら、直接蛋白検出法（例えば、ウェスタンブロッティング）は典型的にはＣＭＶまたはＳＶ４０などの強力なプロモーターを有するベクターを使用する場合でさえもトランスフェクトされた哺乳動物細胞においてＥ１蛋白発現を検出できない。哺乳動物細胞においてＥ１蛋白発現を増大させるために設計された方法は、Ｅ１遺伝子の５’フランキング配列をクローニングすること（Ｒｅｍｍら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９９ ７３， ３０６２−３０７０）およびトランスフェクション後のトランスフェクトされたＥ１プラスミドベクターの増幅（Ｚｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ １９９８ ７２， ３４３６−３４４１）を含む。インプットベクタープラスミドのトランスフェクション後の複製による増幅は、細胞におけるＥ１遺伝子コピー数を増大させるネット効果を有し、従って、蛋白レベルを増大させ、蛋白の検出を促進する（ウェスタンブロッティングによる）。Ｅ１蛋白発現および検出は哺乳動物細胞において問題であるので、ウサギ網状赤血球系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３５Ｓ標識されたメチオニンを用いてインビトロ転写−翻訳により蛋白の発現を検出するものもいた（Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９ ２５６， ３３０−３３９；Ｓａｆａｒｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５ ２１１， ３８５−３９６）。しかしながら、これは無細胞系であり、ファージＴ７からのＲＮＡポリメラーゼの結合配列を含む修飾されたプロモーターの使用を必要とする。
【００１１】
Ｅ１蛋白発現はさらに、ＤＮＡ複製のＨＰＶ起点を含むプラスミドのインビトロＤＮＡ複製の検出により間接的に検出されている。プラスミドを含むこの複製起点の検出は、Ｅ１（およびＥ２）蛋白発現の代理の働きをする（Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９ ２５６， ３３０−３３９；Ｌｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９３ ６７， ７１３１−７１３９およびＤｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９２ ６６， ５９４９−５９５８）。Ｅ１およびＥ２は両方ともＨＰＶ起点の複製に必要とされ、従って哺乳動物細胞を、Ｅ１およびＥ２遺伝子の両方をエンコードするプラスミド、およびＤＮＡ複製のＨＰＶ起点を有する第三のプラスミドでトランスフェクションすると、標準的蛋白検出法（ウェスタンブロッティング）により検出できない場合でも、Ｅ１蛋白（およびＥ２蛋白）の発現ができたならば、起点を有するプラスミドの複製だけが得られるであろう。
【００１２】
ＤＮＡコードは４つの文字（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を有し、生物の遺伝子においてエンコードされる蛋白のアミノ酸を表す３文字「コドン」を表すためにこれらを用いる。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直線状配列をこれらの遺伝子によりエンコードされる蛋白におけるアミノ酸の直線状配列中に翻訳する。コードは高度に変性し、６１個のコドンが２０種の天然のアミノ酸をコードし、３個のコドンが「停止」シグナルを表す。従って、ほとんどのアミノ酸は１以上のコドンによりコードされ、実際、いくつかは４以上の異なるコドンによりコードされる。
所定のアミノ酸をコードするために１以上のコドンが利用可能である場合、生物のコドン使用パターンは高度に非ランダムであることが観察されている。異なる種はそのコドン選択において異なる傾向を示し、さらに、コドンの利用は単一の種において高レベルおよび低レベルで発現される遺伝子間で著しく異なる。この傾向はウイルス、植物、細菌および哺乳動物細胞において異なり、いくつかの種は他よりもランダムコドン選択から大きく離れた偏りを示す。例えば、ヒトおよび他の哺乳動物は、ある細菌またはウイルスほど強く偏向していない。これらの理由から、イー・コリにおいて発現される哺乳動物遺伝子または哺乳動物細胞において発現されるウイルス遺伝子は、有効な発現のコドンが不適当に分布している可能性が高い。しかしながら、イー・コリ発現に適したコドン使用パターンを有する遺伝子は、ヒトにおいても有効に発現される可能性が高い。ヘテロローガスなＤＮＡ配列において、発現が起こる宿主においてほとんど観察されないコドンのクラスターが存在することは、該宿主における低いヘテロローガスな発現の前兆となる。
【００１３】
コドンを宿主において稀なものから宿主に好ましいものへ変更すること（「コドン最適化」）によりヘテロローガスな発現レベルが向上されるいくつかの例がある。例えば、ＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は哺乳動物コドン使用パターンに関して最適化され、これは哺乳動物（Ｃｏｓ−１）細胞培養において野生型ＨＰＶ配列よりも増大した発現レベルを提供することが示されている（Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９９９． ７３， ４９７２−４９８２）。この研究において、哺乳動物（使用率＞２）におけるよりもＢＰＶにおいて２倍以上の頻度で起こる全てのＢＰＶコドン、および使用率が１．５より大きいほとんどのコドンは、優先的に用いられる哺乳動物コドンにより保存的に置換された。ＷＯ９７／３１１１５、ＷＯ９７／４８３７０およびＷＯ９８／３４６４０（Ｍｅｒｃｋ ＆Ｃｏ．， Ｉｎｃ．）において、ＨＩＶ遺伝子またはそのセグメントのコドン最適化の結果、コドン最適化配列が、そのために最適化される宿主哺乳動物においてＤＮＡワクチンとして用いられる場合に、蛋白発現が増大し、免疫原性が向上されることが示されている。この研究において、配列は、各ウイルスコドンは意図される宿主の最適コドンと保存的に置換されるので、完全に最適化コドン（これが望ましくない制限サイト、イントロンスプライスサイトなどを導入する場合を除く）からなる。
【００１４】
第一の態様に従って、本発明はＨＰＶアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列を提供し、該ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは高度に発現された哺乳動物遺伝子のものと類似している。好ましくは、ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。望ましくは、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは高度に発現されたヒト遺伝子のものと類似している。理想的には、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは、高度に発現されたイー・コリ遺伝子のものとも類似している。ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列、例えば二本鎖ＤＮＡ配列である。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、頚部癌、良性皮膚疣贅または陰部疣贅に関連するＨＰＶタイプまたはサブタイプ、例えば、１−４、６、７、１０、１１、１６、１８、２６−２９、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８型、好ましくは６、１１、１６、１８、３３または４５型（特に頚部癌および陰部疣贅と関連する）、最も好ましくはＨＰＶ１１、６ａまたは６ｂのＨＰＶポリペプチドをエンコードする。
【００１５】
従って、一緒になってＨＰＶアミノ酸配列をエンコードする複数のコドンを含む合成遺伝子が提供され、アミノ酸配列をエンコードするために用いられる可能なコドンの選択は、合成遺伝子におけるコドン使用の頻度がパピローマウイルス遺伝子のものよりも高度に発現された哺乳動物遺伝子のものと密接に類似するように、最適哺乳動物コドン使用と類似するように変更されている。好ましくは、コドン使用パターンは高度に発現されたヒト遺伝子と実質的に同じである。
ある例において、エンコードされたアミノ酸配列は野生型ＨＰＶアミノ酸配列である。別の例において、エンコードされたアミノ酸配列は、ポリペプチドの１以上の天然の生物学的機能を減少または不活化するために十分なアミノ酸の変化、例えば、アミノ酸点突然変異を有する野生型配列を含む変異ＨＰＶアミノ酸配列である。変異アミノ酸配列は、望ましくは野生型ポリペプチドの免疫原性を保持する。
【００１６】
エンコードされたＨＰＶポリペプチドは、初期遺伝子産物、例えば、Ｅ１、Ｅ２またはＥ７、またはそのフラグメント、類似体または融合物を含んでもよいし、あるいは後期遺伝子産物、例えば、Ｌ１またはＬ２、あるいはそのフラグメント、類似体または融合物であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、２以上のＨＰＶ初期遺伝子産物、ＨＰＶ初期遺伝子産物およびＨＰＶ後期遺伝子産物間、または２以上のＨＰＶ後期遺伝子産物間、１以上のＨＰＶ遺伝子産物のフラグメント間、またはＨＰＶ遺伝子産物（またはそのフラグメント）およびＨＰＶ以外の供給源由来のポリペプチド、例えば、アジュバントまたは標的化ペプチド、あるいはポリペプチド、例えば、ＨＢＶコアペプチドの間の融合物をエンコードする。融合は、同一または異なるウイルスタイプまたはサブタイプ由来のＨＰＶ遺伝子産物間であってもよい。かかる融合物は望ましくは融合ポリペプチド成分の免疫原性を保持する。好ましくは、エンコードされたＨＰＶポリペプチドは初期遺伝子産物の全体または一部を含み、最も好ましくは、Ｅ１またはＥ２を含む。一例において、ポリヌクレオチド配列は、図１において示すＨＰＶ６ｂの野生型Ｅ１ポリペプチド、あるいはそのフラグメントまたは類似体をエンコードする。もう一つの例において、ポリヌクレオチド配列は：図２に示す変異ＨＰＶ６ｂＥ１アミノ酸配列；ＨＰＶ１１または６ａまたは６ｂの野生型Ｅ２アミノ酸配列（図３）；図４ｂの変異ＨＰＶ６ｂＥ２アミノ酸配列；および図４ａの変異ＨＰＶ１１Ｅ２配列またはそのフラグメント、類似体または融合物（エンコードされたポリペプチドが免疫原性を保持するもの）の１以上をエンコードすることができる。
【００１７】
本発明に従って、ポリヌクレオチドのコドン使用パターンは、好ましくは標的生物の高度に発現された遺伝子において０．２未満のＲＳＣＵ値を有するコドンを排除する。相対的同義コドン使用（ＲＳＣＵ）値は、アミノ酸のすべてのコドンが等しく頻繁に用いられる場合に予想される数で観察されるコドン数を割ったものである。本発明のポリヌクレオチドは、高度に発現されたヒト遺伝子について一般に０．３以上、好ましくは０．４以上、最も好ましくは０．５以上であるが、１未満のコドン使用係数（以下に定義）を有する。望ましくは、ポリヌクレオチドは高度に発現されたイー・コリ遺伝子について０．５以上、好ましくは０．６以上、最も好ましくは０．７以上のコドン使用係数を有する。
【００１８】
一例において、本発明は、図５または図６に示すポリヌクレオチド配列、またはそのコドン使用パターンを保持するそのフラグメントまたは類似体を提供する。さらにもう一つの例において、本発明は図５または図６において示す配列と相補的なポリヌクレオチド配列を提供する。
本発明の第二の態様に従って、本発明の第一の態様のポリヌクレオチド配列の発現を含み、発現を行うことができ、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが高度に発現された哺乳動物遺伝子、好ましくは高度に発現されたヒト遺伝子のものと類似したＨＰＶアミノ酸配列をエンコードする発現ベクターが提供される。ベクターは細菌、昆虫または哺乳動物細胞、特にヒト細胞において、ヘテロローガスなＤＮＡの発現を行うのに適している。一例において、発現ベクターはｐ７３１３ＰＬｃである（図７）。
【００１９】
本発明の第三の態様に従って、本発明の第一の態様のポリヌクレオチド配列、または第二の態様の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、細菌、例えば、イー・コリ、哺乳動物、例えば、ヒトであってもよいし、あるいは昆虫細胞であってもよい。本発明のベクターを含む哺乳動物細胞は、インビトロでトランスフェクトされた培養細胞であってもよいし、あるいは哺乳動物にベクターを投与することによりインビボでトランスフェクトすることもできる。
第四の態様において、本発明は、本発明の第一の態様のポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、該組成物は本発明の第二の態様のＤＮＡベクターを含む。好ましい態様において、組成物は、ＨＰＶアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列をエンコードするベクターを含むＤＮＡでコートされた複数の粒子、好ましくは金粒子を含み、該ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは、高度に発現された哺乳動物遺伝子、特にヒト遺伝子のものと類似している。もう一つの例において、組成物は医薬的に許容される賦形剤および本発明の第二の態様のＤＮＡベクターを含む。組成物はまたアジュバントを含んでもよい。
【００２０】
さらにもう一つの態様において、本発明は、高度に発現された哺乳動物遺伝子のものと類似し、野生型ＨＰＶアミノ酸配列をエンコードするコドン使用パターンを有する配列またはポリペプチドの１以上の天然の機能を不活化するために十分なアミノ酸変化を有する野生型配列を含む変異ＨＰＶアミノ酸配列を産生するために、野生型ＨＰＶヌクレオチド配列のコドン使用パターンを変更する工程、またはポリヌクレオチド配列を合成する工程を含む、医薬組成物の製造法を提供する。
さらに、第一の態様のポリヌクレオチド、または本発明の第二の態様のベクターの、ＨＰＶ感染症、好ましくは頚部癌、良性皮膚疣贅または陰部疣贅、例えば、１〜４、６、７、１０、１１、１６、１８、２６〜２９、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８型に関連するＨＰＶタイプまたはサブタイプによる感染症の治療または予防における使用も提供される。ある態様において、本発明は、特に頚部癌および陰部疣贅に関連する６、１１、１６、１８、３３または４５型、最も好ましくはＨＰＶ１１、６ａまたは６ｂのＨＰＶ感染症の治療または予防における、第一の態様のポリヌクレオチド、または本発明の第二の態様のベクターの使用を提供する。本発明はさらに、第一の態様のポリヌクレオチド、本発明の第二の態様のベクターまたは本発明の第四の態様の医薬組成物の、皮膚疣贅、陰部疣贅、有意性が未確認の異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、頚部異形成、子宮頚管上皮内新生腫瘍（ＣＩＮ）または頚部癌の治療または予防における使用を提供する。従って、本発明はさらに、１〜４、６、７、１０、１１、１６、１８、２６〜２９、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８型の１以上のＨＰＶ感染症、またはこれに付随する任意の症状または疾患の治療または予防用医薬の製造における、第一の態様のポリヌクレオチド、または本発明の第二の態様のベクターの使用も提供する。
【００２１】
本発明はまた、有効量の本発明の第一の態様のポリヌクレオチド、第二の態様のベクターまたは本発明の第四の態様の医薬組成物を投与することを含む、ＨＰＶ感染症、特にＨＰＶ１〜４、６、７、１０、１１、１６、１８、２６〜２９、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８型の１以上による感染症、またはこれに付随する任意の症状または疾患を治療または予防する方法も提供する。医薬組成物の投与は、１またはそれ以上の個別の投与、例えば、「プライム・ブースト（ｐｒｉｍｅ　ｂｏｏｓｔ）」治療ワクチンレジメの形態をとることができる。ある場合においては、「一次（ｐｒｉｍｅ）」予防接種は、本発明のポリヌクレオチド、好ましくはプラスミド由来のベクター中に組み入れられたものの粒子媒介ＤＮＡ送達および同じポリヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターの投与による「ブースト」によってもよい。
【００２２】
本明細書および特許請求の範囲全体において、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」なる用語及びその変化である「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」なる言葉は、包括的に理解されるべきである。すなわち、これらの用語は、状況が許容する場合には、具体的に明記されていない他のものまたは数値も含むことを意図する。
「類似体」なる用語は、本発明のもう一つのポリヌクレオチドと同じアミノ酸配列をエンコードするが、同じコドン使用パターンを保持しながら、例えば同じコドン使用パターンまたは他のポリヌクレオチドの０．１以内、好ましくは０．０５以内のコドン使用係数を有しながら、遺伝子コードの重複により異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００２３】
「コドン使用パターン（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　ｐａｔｔｅｒｎ）」なる用語は、検討しているヌクレオチド配列、遺伝子または遺伝子のクラス（例えば、高度に発現された哺乳動物遺伝子）におけるすべてのコドンの平均的出現頻度を意味する。ヒトを含む哺乳動物のコドン使用パターンは、文献において見出すことができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６， ２４：２１４−２１５参照）。
本発明のポリヌクレオチドにおいて、コドン使用パターンはヒトパピローマウイルスに典型的なものから標的生物、例えばイー・コリまたは哺乳動物、特にヒトに偏向したコドンをより密接に表すものへ変更される。「コドン使用係数（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）」は、所定のポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが標的種のものとどれほどよく類似しているかを示す尺度である。コドン出現頻度は、多くの種の高度に発現された遺伝子について文献から得ることができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６， ２４：２１４−２１５参照）。それぞれ６１のコドンについてのコドン出現頻度（選択されたクラスの遺伝子の１０００コドンについての発生数として表される）は、それぞれ２０の天然のアミノ酸について標準化され、従って各アミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンの値を１とし、それほど一般的でないコドンについての頻度を０から１の間になるように評価する。従って、６１コドンのそれぞれに標的種の高度に発現された遺伝子について１またはそれ以下の値が割り当てられる。該種の高度に発現された遺伝子に関連して、特定のポリヌクレオチドについてのコドン使用係数を計算するために、特定のポリヌクレオチドのそれぞれのコドンについての評価された値を記録し、これらの値のすべての幾何平均を得る（これらの値の自然対数の合計をコドンの合計数で割り、真数をとる）。係数は０から１の間の値を有し、係数が高いほど、ポリヌクレオチドにおいてより多くのコドンが頻繁に用いられる。ポリヌクレオチド配列がコドン使用係数１を有するならば、コドンのすべては標的種の高度に発現された遺伝子について「最も頻度の高い」コドンである。
【００２４】
さらに短いポリヌクレオチドは本発明の範囲内に含まれる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＰＶ蛋白のフラグメントをエンコードすることができる。少なくとも８、例えば、８〜１０のアミノ酸または２０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０または２００までのアミノ酸の長さのフラグメントをエンコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが高度に発現された哺乳動物遺伝子のものと類似したコドン使用パターンを有し、エンコードされたオリゴまたはポリペプチドがＨＰＶ抗原性を示す限り、本発明の範囲内にあると考えられる。特に、排他的ではないが、本発明のこの態様は、ポリヌクレオチドが完全ＨＰＶ蛋白配列のフラグメントをエンコードし、該蛋白の１またはそれ以上の独立した蛋白を表す場合を包含する。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドはイー・コリおよび哺乳動物細胞において、同じアミノ酸配列をエンコードする対応する野生型配列よりも高い発現を示す。いずれかの理論により拘束されることを望むものではないが、これは少なくとも２つの理由のためと考えられる。まず、宿主細胞のものに近いコドン使用パターンを有すると、配列は細胞翻訳機構によりさらに容易に処理される。第二に、３０％までのヌクレオチド配列（またはそれ以上）が野生型配列と異なる場合、転写または翻訳を妨害する部位（例えば、蛋白結合部位）は除去または変更される。
【００２６】
いくつかの例において、本発明のポリヌクレオチドはイー・コリおよび哺乳動物（例えば、ヒト）遺伝子と類似したコドン使用パターンを示す。これは、配列が哺乳動物の予防接種およびイー・コリ細胞を用いたインビトロで有意な量の抗原蛋白の生成（例えば、哺乳動物またはヒト組織における発現のレベルを判断するためにイムノアッセイなどの分析において用いるために）において用いられる場合に特に有利である。
前記のように、本発明は本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。かかる発現ベクターは分子生物学の分野において日常的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素、例えば、蛋白を発現させるために必要で、正しい方向に配置されたポリアデニル化シグナルの使用を含む。他の適当なベクターは当業者には明らかである。この点に関するさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）参照。
【００２７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチド、またはベクターにおいて本発明において使用されるポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコーディング配列の発現が可能な調節配列と操作可能に結合している。すなわち、ベクターは発現ベクターである。「操作可能に結合」なる用語は、記載された成分がその意図される方法で機能するような関係にあるところの、並列関係をいう。コーディング配列と「操作可能に結合」した調節配列、例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるような位置にある。
ベクターは、例えば、プラスミド、人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ）、ウイルスまたは複製の起点、所望によりポリヌクレオチドの発現のプロモーターまたは所望によりプロモーターのレギュレーターを備えたファージベクターであってもよい。ベクターは１以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドまたは真菌ベクターの耐性遺伝子の場合にはアンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子を含んでもよい。ベクターは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの産生についてはインビトロで用いることができ、あるいは例えばベクターによりエンコードされる蛋白の産生については、例えば哺乳動物宿主細胞などの宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために用いることができる。ベクターは、インビボで、例えば、ＤＮＡ予防接種または遺伝子療法において用いることもできる。
【００２８】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現がデザインされる宿主細胞と適合性であるように選択することができる。例えば、哺乳動物プロモーターはカドミウムなどの重金属に反応して誘発することができる金属結合蛋白プロモーター、およびβ−アクチンプロモーターを含む。ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）も用いることができる。これらのプロモーターはすべて十分に記載され、当該分野において容易に入手可能である。
適当なウイルスベクターの例としては、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアまたはアルファ−ウイルスベクターならびにレンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含むレトロウイルスが挙げられる。これらのウイルスを用いた遺伝子移入技術は当業者に公知である。例えば、レトロウイルスベクターを用いて、本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に安定して組み込むことができるが、かかる組換えは好ましくない。対照的に複製欠損アデノウイルスベクターはエピソームのままであり、従って一次的な発現を許容する。例えばサブユニットワクチンとしてまたはイムノアッセイにおいて用いられる、本発明のポリヌクレオチドによりエンコードされるＨＰＶ蛋白を産生するために、昆虫細胞（例えばバクロウイルスベクター）、ヒト細胞または細菌において発現を行うことができるベクターを用いることができる。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、エンコードされた蛋白の発現により産生において有用であり、該発現はインビトロ、インビボまたはエクスビボにおいて起こり得る。ヌクレオチドは従って、収率を増大させるために組換え蛋白合成に関与するか、またはＤＮＡ予防接種技術において用いられる治療薬としての用途を有する。本発明のポリヌクレオチドがインビトロまたはエクスビボでのエンコードされた蛋白の産生において用いられる場合、細胞、例えば細胞培養におけるものは、発現されるポリヌクレオチドを含むように修飾される。かかる細胞は、一時、または好ましくは安定な哺乳動物細胞系を含む。本発明のポリペプチドをエンコードするベクターの挿入により修飾される細胞の具体例としては、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３およびＣＯＳ細胞が挙げられる。好ましくは、選択される細胞系は安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化および細胞表面発現を許容するものである。発現は、形質転換された卵母細胞において達成することができる。ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドから、トランスジェニックなヒト以外の動物、例えば、マウスの細胞において発現することができる。本発明のポリヌクレオチドからポリペプチドを発現するトランスジェニックなヒト以外の動物は本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドが例えばＤＮＡ予防接種において治療薬として有用である場合、核酸が予防接種される哺乳動物、例えばヒトに投与されるであろう。核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、好ましくはＤＮＡはベクター、例えば前記のようなものの形態において提供され、これは哺乳動物の細胞において発現することができる。ポリヌクレオチドは任意の利用可能な技術により投与することができる。例えば、核酸を注射により、好ましくは皮内、皮下または筋肉内により導入することができる。別法として、核酸は核酸送達装置、例えば、粒子媒介ＤＮＡデリバリー（ＰＭＤＤ）を用いて皮膚中に直接送達することができる。この方法において、不活性粒子（例えば、金ビーズ）は核酸でコートされ、例えば発射装置から高圧下での発射により、これらが受容体の表面（例えば、皮膚）を透過できるために十分な速度で加速される。（本発明の核酸分子でコートされた粒子は、かかる粒子をロードされた送達装置と同様に、本発明の範囲に含まれる）。組成物は望ましくは、０．５〜５μｍ、好ましくは約２μｍの平均直径を有する金粒子を含む。好ましい例において、コートされた金ビーズは、カートリッジとしての働きをするために管中に装填され、各カートリッジは、０．１〜５μｇ、好ましくは約０．５μｇＤＮＡ／カートリッジでコートされた０．１〜１ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇの金を含む。
【００３１】
ネイクドポリヌクレオチドまたはベクターを患者に導入する適当な技術は、適当なビヒクルを用いた局所適用を包含する。核酸は皮膚、または粘膜表面に、例えば、鼻内、経口、膣内または直腸内投与により局所投与することができる。ネイクドポリヌクレオチドまたはベクターは医薬的に許容される賦形剤、例えばリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）と一緒に存在することができる。ＤＮＡ吸収は、ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）などの促進剤の使用により、別々にまたはＤＮＡ処方に含めるかのいずれかによりさらに促進することができる。核酸を受容者に直接投与する他の方法は、超音波、電気刺激、電気穿孔法および米国特許第５６９７９０１号に記載されているミクロシーディング（ｍｉｃｒｏｓｅｅｄｉｎｇ）を包含する。
核酸構築物の吸収は、いくつかの公知技術、例えば、トランスフェクション剤の使用を含むものにより向上させることができる。これらの試薬の例としては、カチオン試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランおよびリポフェクタント、例えば、リポフェクタムおよびトランスフェクタムが挙げられる。投与される核酸の量は変更することができる。典型的には、核酸は１ｐｇ〜１ｍｇの範囲の量において投与され、好ましくは粒子媒介遺伝子送達については１ｐｇ〜１０μｇの核酸および他の経路については１０μｇ〜１ｍｇである。
【００３２】
本発明の核酸配列はまた、遺伝子療法において有用な特別の送達ベクターにより投与することもできる。遺伝子療法は、例えば、Ｖｅｒｍｅら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７， ３８９：２３９−２４２により記載されている。ウイルスおよび非ウイルスベクター系の両方を用いることができる。ウイルスベースの系としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、カナリア痘ウイルスおよびワクシニアウイルスに基づく系が挙げられる。非ウイルスベースの系としては、核酸の直接投与、微小球封入技術（ポリ（ラクチド−コ−グリコシド）およびリポソームベースの系が挙げられる。ウイルスおよび非ウイルス送達系は、初回接種後にブースター注射をすることが望ましい場合に、プラスミドなどの非ウイルスベクターを用いて、例えば、初期「プライム」ＤＮＡ予防接種と、それに続くウイルスベクターまたは非ウイルスベースのシステムを用いた１以上の「ブースト」接種を組み合わせることができる。
【００３３】
本発明の核酸配列はさらに、形質転換された細胞により投与することもできる。かかる細胞は、対象から収穫された細胞を包含する。本発明のネイクドポリヌクレオチドまたはベクターはインビトロでかかる細胞中に導入することができ、形質転換された細胞を後に対象に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドはホモローガスな組換え事象により、細胞中にすでに存在している核酸中に組み入れることができる。形質転換された細胞は、望ましいならば、インビトロで成長させ、結果として得られる細胞の１以上を本発明において用いることができる。細胞は、患者の適当な部位に公知の外科手術または顕微手術技術（移植、顕微注射など）により提供することができる。
適当な細胞としては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球および有効なＡＰＣにするために処理できる他の細胞が挙げられる。かかる細胞は、抗原を提示する能力を増大させるため、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を向上させるため、抗腫瘍、例えば、抗頚部癌効果を有するため、および／または免疫学的に受容体と適合性（すなわち、適当したＨＬＡハプロタイプ）とするために遺伝子的に修飾することができる。ＡＰＣは一般に、腫瘍および腫瘍周辺組織を含む様々な生物学的液体および器官の任意のものから単離することができ、オートローガス、同種、同系または異種細胞であってもよい。
【００３４】
本発明のある好ましい例は、樹状細胞またはその原種を、インビトロで形質転換し、患者に戻すか、または例えば、粒子媒介ＤＮＡ送達によりワクチンにおいて送達されるヌクレオチドのインビボ標的としてのいずれかで、抗原提示細胞として用いる。樹状細胞は、非常に有効なＡＰＣであり（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５１， １９９８）、予防的または治療的抗腫瘍免疫を惹起するための生理学的アジュバントとして有効であることが証明されている（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ５０：５０７−５２９， １９９９参照）。一般に、樹状細胞はその典型的な形状（自然位で星状、インビトロで見ることができる顕著な細胞質突起（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、処理し、提示するその能力およびそのナイーブＴ細胞応答を活性化する能力に基づいて同定することができる。樹状細胞は、もちろんインビボまたはエクスビボで樹状細胞上に通常見られない特定の細胞表面レセプターまたはリガンド、例えば、本発明の構築物においてエンコードされる抗原を発現するために処理することができ、かかる修飾された樹状細胞は本発明に含まれる。樹状細胞の代替物として、分泌されたベシクル抗原をロードされた樹状細胞（エクソゾームと呼ばれる）をワクチン内において用いることができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４：５９４−６００， １９９８参照）。
【００３５】
樹状細胞および原種は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織−浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血または任意の他の適当な組織または液体から得ることができる。例えば、樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦなどのサイトカインの組み合わせを末梢血から収穫した単球の培養物に添加することによりエクスビボで分化させることができる。別法として、末梢血、臍帯血または骨髄から収穫されたＣＤ３４陽性細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦ、ＣＤ４０リガンド、リポ多糖ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンド（プロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞の生成において重要なサイトカイン）および／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘発する他の成分の組み合わせの培地に添加することにより樹状細胞に分化させることができる。　ＡＰＳは、本発明において予想されるように、一般に抗原ＨＰＶアミノ酸配列、例えばコドン最適化ポリヌクレオチドをエンコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトすることができる。かかるトランスフェクションは、エクスビボで起こり、かかるトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンを次に本明細書に記載するような治療目的で用いることができる。別法として、樹状突起または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルを患者に投与することができ、その結果インビボで起こるトランスフェクションが起こる。樹状細胞のインビボおよびエクスビボトランスフェクションは、例えば一般に当該分野において公知の任意の方法、例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載されている方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６−４６０， １９９７により記載されている粒子媒介法を用いて行うことができる。
【００３６】
ワクチンおよび医薬組成物は、密封されたアンプルまたはバイアルなどの単一または多剤容器に入れて提供することができる。かかる容器は、好ましくは使用まで処方の無菌状態を保つために密封される。一般に、処方は油状または水性ビヒクル中懸濁液、溶液または乳液として貯蔵することができる。別法として、ワクチンまたは医薬組成物は、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態において貯蔵することができる。粒子媒介送達による投与を意図されるヌクレオチド配列を含むワクチンは、圧縮気体送達装置を用いて使用に適したカートリッジとして提供することができ、この場合において、カートリッジは中空管からなり、その内部表面はワクチンヌクレオチドを有する粒子で、所望により他の医薬的に許容される成分の存在下でコートされる。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、アジュバント化合物、またはＤＮＡによりエンコードされる蛋白により誘発される免疫応答を調節または増大させる働きをする他の物質を含んでもよい。これらは、抗原と別に、または抗原との融合物としてのいずれかとしてＤＮＡによりエンコードすることができるか、または処方の非ＤＮＡ要素として含めることができる。本発明の処方中に含めることができるアジュバントタイプの物質の例としては、ユビキチン、リソソーム関連膜蛋白（ＬＡＭＰ）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、ｆｌｔ３−リガンドおよび他のサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γおよびＧＭＣＳＦが挙げられる。
他の適当なアジュバントは商業的に入手可能であり、例えば、フロインドの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）；
イミクイモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（３Ｍ， Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ）；レスイミクイモド（Ｒｅｓｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（３Ｍ， Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ）；メルクアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， Ｒａｈｗａｙ， ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ）；アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンまたはアニオン誘導化多糖類；ポリホスファゼン；生物分解性微小球；モノホスホリルリピッドＡおよびｑｕｉｌＡである。サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７または−１２もアジュバントとして用いることができる。
【００３８】
本発明の処方において、アジュバント組成物が主にＴｈ１タイプの免疫応答を誘発することが好ましい。従って、アジュバントは主にＴｈ２から主にＴｈ１タイプ応答へＤＮＡ−エンコードされた抗原に応答して生じる免疫応答を調節する働きをする。高レベルのＴｈ１−タイプサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−、ＴＮＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘発に有利である傾向にある。応答が主にＴｈ−１タイプである好ましい例において、Ｔｈ１−タイプサイトカインのレベルはＴｈ２−タイプのサイトカインのレベルよりも増大する。これらのサイトカインのレベルは、標準的分析法を用いて容易に評価することができる。一連のサイトカインの概要については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：１４５−１７３， １９８９を参照のこと。
【００３９】
従って、主にＴｈ１−タイプ応答を惹起するのに用いられる適当なアジュバントしては、例えば、モノホスホリルリピッドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピッドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）のアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。主にＴＨ１タイプ免疫応答を誘発する他の公知アジュバントは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドはＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないことを特徴とする。かかるオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５に記載されている。免疫刺激ＤＮＡ配列も、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２， １９９６により記載されている。ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドは同じまたは異なるポリヌクレオチド構築物においてパピローマ抗原から別々にエンコードすることができるか、または例えばこれとの融合物として直接隣接していてもよい。別法として、ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドは別々に、すなわち、エンコードされた抗原を含む組成物の一部としてではなく、投与することができる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは単独または他のアジュバントとの組み合わせにおいて用いることができる。例えば、向上されたシステムは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドおよびサポニン誘導体の組み合わせ、特にＷＯ００／０９１５９およびＷＯ００／６２８００に記載されているようなＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせを含む。好ましくは、該処方はさらに水中油エマルジョンおよび／またはトコフェノールを含む。
【００４０】
もう一つの好ましいアジュバントはサポニン、好ましくはＱＳ２１であり（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）、これは単独または他のアジュバントとの組み合わせにおいて用いることができる。例えば、向上された系は、モノホスホリルリピッドＡとサポニン誘導体の組み合わせ、例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されているようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されているようなＱＳ２１がコレステロールで消されている反応原性が低い組成物を含む。他の好ましい処方は、水中油エマルジョンおよびトコフェノールを含む。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよび水中油エマルジョン中トコフェロールを含む有効なアジュバント処方はＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
他の好ましいアジュバントとしては、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ， Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、デトックス（Ｄｅｔｏｘ）（Ｒｉｂｉ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰｓ）が挙げられる。
【００４１】
他の好ましいアジュバントは、一般式（Ｉ）：
式（Ｉ）：　ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
（式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである）のアジュバント分子を含む。
本発明の一例は、一般式（Ｉ）（式中、ｎは１〜５０の間であり、好ましくは４〜２４であり、最も好ましくは９である；Ｒ成分はＣ１−５０、好ましくはＣ４−Ｃ２０アルキルであり、最も好ましくはＣ１２アルキルであり、Ａは結合である）のポリオキシエチレンエーテルを含む処方を含む。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲であり、好ましくは０．１〜１０％であり、最も好ましくは０．１〜１％の範囲である。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、次の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンエーテル、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルは、メルクインデックス（第１２版：収録７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。前記一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルは、所望により、もう一つ別のアジュバントと組み合わせることができる。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは係属中の英国特許出願番号ＧＢ９８２０９５６．２に記載されているようなＣｐＧとの組み合わせである。
【００４２】
ワクチンがアジュバントを含む場合、ワクチン処方は、２回に分けて投与することができる。例えば、抗原をエンコードするヌクレオチド構築物を含有する処方の一部をまず、例えば皮下または筋肉内注射により投与するか、または皮内粒子媒介送達により投与することができ、その後、アジュバントを含む処方を続いて直ちにまたはワクチン分野において熟練した医師には明らかである適当な間隔をおいて投与することができる。これらの状況下で、アジュバントは、抗原性処方と同じ経路によるか、または別の経路により投与することができる。他の例において、処方のアジュバント部分は、抗原性部分の前に投与される。一例において、アジュバントは、粒子媒介送達の前または後にいずれかに、抗原をエンコードするヌクレオチド配列の粒子媒介送達の部位で皮膚に適用される局所処方として投与される。
【００４３】
次の実施例は、添付の図面を参照して本発明をさらに説明するものである。図１は、ジンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）から得たＨＰＶ１１、６ａおよび６ｂ型からのＥ１の野生型アミノ酸配列のプロトタイプを示す。
図２は、図１からのＨＰＶ６ｂＥ１のプロトタイプ野生型アミノ酸配列（６ｂ〜ｅ１）を、生物学的活性を除去するために点突然変異を含むＨＰＶ６ｂＥ１アミノ酸配列（６ｎ〜ｅ１ｍｕｔ）とならべて示す。
図３は、ジンバンクから得たＨＰＶ１１、６ａおよび６ｂ型からのＥ２のプロトタイプ野生型アミノ酸配列を示す。
図４ａは、図３からのＨＰＶ１１Ｅ２のプロトタイプ野生型アミノ酸配列（Ｈｐｖ−１１ｅ２−ｗｔ）を、生物学的活性を除去するために点突然変異を含むＨＰＶ１１Ｅ２アミノ酸配列（Ｈｐｖ−１１ｅ２−ｍｕｔ）および図６のヌクレオチド配列によりエンコードされるアミノ酸配列（Ｈｐｖ−１１ｅ２−ｃｏｍｕｔ）と並べて示す。
図４ｂは、図３からのＨＰＶ６ｂＥ２のプロトタイプ野生型アミノ酸配列（Ｈｐｖ−６ｂｅ２−ｗｔ）を、生物学的活性を除去するために点突然変異を含むＨＰＶ６ｂＥ２アミノ酸配列（Ｈｐｖ−６ｂｅ２−ｍｕｔ）と並べて示す。
図５は、図２からのＨＰＶ６ｂＥ１の変異アミノ酸配列をエンコードする、高度に発現されたヒト遺伝子のものと類似したコドン使用パターンを有するヌクレオチド配列を示す。
図６は、図４からのＨＰＶ１１Ｅ２の変異アミノ酸配列をエンコードする、高度に発現されたヒト遺伝子のものと類似したコドン使用パターンを有するヌクレオチド配列を示す。
図７は、ＤＮＡベクターｐ７３１３−ＰＬｃを示す。
図８は、アクリルアミドゲル上にかけ、発現されたＥ１蛋白と結合する抗体を示すために染色された実施例４からの細胞溶解物サンプルを示す。
図９は、本発明のポリヌクレオチドでマウスを免疫化した後の抗原攻撃に対する細胞応答を示す（実施例６）。
図１０は、アクリルアミドゲル上にかけ、発現されたＥ２蛋白と結合する蛋白を示すために染色された実施例７からの細胞溶解物サンプルを示す。
【００４４】
実施例１−ＨＰＶ６ｂＥ１のコドン最適化
ジンバンクから得たＨＰＶ６ｂＥ１の野生型プロトタイプアミノ酸配列を図１に示す（下の配列）。この図は、１１、６ａおよび６ｂ型のＨＰＶウイルスプロトタイプ配列間のこの蛋白の高レベルの相同性を示す。同様に、図３は、ＨＰＶ１１、６ａおよび６ｂのＥ２蛋白の野生型プロトタイプアミノ酸配列を示す。ＨＰＶ６ｂ配列を用いた免疫療法（治療的ワクチン）は、交差反応して、３つのウイルスタイプすべてに対して予防的または治療的免疫応答を提供することが予想される。
ＨＰＶ６ｂＥ１配列のコドン使用を、高度に発現されたヒトおよびイー・コリ遺伝子と比較し、両種について低いコドン使用係数が見出された。生物は所定のアミノ酸についてその最も好ましいコドンを独占的に使用するものではないため、各アミノ酸残基について最も豊富なコドンを使用しただけでは、ひずんだコドン使用パターンが得られる。従って、高度に発現されたイー・コリおよびヒト遺伝子において自然に見出されるものに近いコドン出現頻度を有する合成遺伝子を得るために、コドンは統計的方法を用いて決めた。
【００４５】
合成遺伝子におけるコドンは、Ｃａｌｃｇｅｎｅ（Ｒ．Ｓ． Ｈａｌｅ ａｎｄ Ｇ Ｔｈｏｍｐｓｏｎにより作成）とよばれるＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃプログラムを用いて決められる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１２ ｐｐ．１８５−１８８（１９８８））。もとの配列における各アミノ酸残基について、コドンは、高度に発現されたイー・コリにおいてこれが出現する可能性に基づいて決めた。マイクロソフトウインドウズ３．１で動作するプログラムの詳細はその作者から入手できる。プログラムはコドンを合成遺伝子に割り当てるために統計的方法を利用するので、結果として得られるコドンはすべてが標的生物において最も頻繁に用いられるわけではない。むしろ、標的生物の頻繁に用いられるコドンおよびあまり用いられないコドンの割合は、正しい割合においてコドンを割り当てることにより合成配列において反映される。しかしながら、特定のコドンを配列中の特定の位置に割り当てる厳重な規則がないので、これを実行するたびにプログラムは異なる合成遺伝子を生じるが、それぞれは同じコドン使用パターンを有し、それぞれが同じアミノ酸配列をエンコードする。プログラムを所定のアミノ酸配列および所定の標的生物について数回実行するならば、いくつかの異なるヌクレオチド配列が生じ、これは制限部位の数、種類および位置、イントロンスプライスシグナルなどが異なり、そのいくつかは望ましいものではない。当業者らはこれらの特徴に基づいてポリペプチドの発現において用いられる適当な配列を選択することができる。
【００４６】
さらに、コドンは統計に基づいてランダムに決められるので、標的生物において比較的まれに用いられる２以上のコドンがきわめて接近して密集する可能性がある（おそらくはありそうもないが）。かかるクラスターは翻訳の機構を混乱させ、その結果、発現率が特に低くなり、従って最適化された遺伝子におけるコドンを選択するためのアルゴリズムは、任意のまれなコドンクラスターが偶然選択されることを防止するために高度に発現された遺伝子について０．２未満のＲＳＣＵ値を有するコドンを排除した。残存するコドンの分布を次に高度に発現されたイー・コリ遺伝子についての頻度に従って配分して、イー・コリ遺伝子のもの（係数＝０．８５）および高度に発現されたヒト遺伝子のもの（係数＝０．５０）と類似した合成遺伝子内の全体的な分布を得る。高度に発現されたヒト遺伝子のコドン出現頻度パターンに従ってコドンを配分するために、稀なコドンの排除を任意にするＳｙｎｇｅｎｅ（Ｐｅｔｅｒ Ｅｒｔｌ、未公開）（Ｃｏｌｃｇｅｎｅプログラムの最新版）を用いる以外は、ＨＰＶ１１Ｅ２のコドン最適化ヌクレオチド配列を得るための同様のプロセスを用いた。Ｅ１についてのコドン割り当てと異なり、稀なコドンは除外されない。同時に、以下に記載するように、Ｋ１１１Ａアミノ酸変化をエンコードするためにオリゴヌクレオチドの一つについて変更を行った。
【００４７】
コドン最適化Ｅ１およびＥ２遺伝子中に変異を導入して、Ｅ１（Ｋ８３Ｇ、Ｒ８４ＧおよびＧ４８３Ｄ）およびＥ２（Ｋ１１１Ａ）アミノ酸配列において点突然変異を生じさせた。変異した遺伝子のアミノ酸配列を図２（ＨＰＶ６ｂＥ１）および４（ＨＰＶ６ｂＥ２およびＨＰＶ１１Ｅ２）において示す（野生型プロトタイプ配列と並べる）。ＨＰＶ６ｂＥ１のコドン最適化および変異ヌクレオチド配列を図５に示す。ＨＰＶ６ｂＥ２のコドン最適化および変異ヌクレオチド配列を図６に示す。図４において、コドン最適化および変異ＨＰＶ１１Ｅ２遺伝子の発現により得られるポリペプチドのアミノ酸配列も、プロトタイプ野生型および変異野生型アミノ酸配列と並べて示して、ヌクレオチド配列のコドン最適化がエンコードされるアミノ酸配列（変異野生型配列と同一）を変更しないことを示す。
【００４８】
実施例２−コドン最適化ＨＰＶ６ｂＥ１ポリヌクレオチド配列の構築
遺伝子設計：
前記の最適化ソフトウェアを用いて、重複４０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを最適化配列から計算した。制限部位を含む末端オリゴヌクレオチドは６０ｍｅｒであった。オリゴヌクレオチドはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄから入手した（５０ナノモル濃度、脱保護および非リン酸化）。
オリゴヌクレオチドアセンブリ：
各オリゴヌクレオチドを二重蒸留水中に溶解させて最終濃度１００マイクロモル（μＭ）にし、すべての９６オリゴヌクレオチドの同じ混合物を調製した（１００μＭ）。合成は、Ｒｏｃｈｅ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒから得たＰｗｏポリメラーゼ（カタログ番号１６４４９５５）を用いて次のようにしてセットアップした。
二重蒸留水　　　　　　８６μｌ
Ｐｗｏ１０Ｘ緩衝液　　１０μｌ
ｄＮＴＰミックス　　　　１μｌ（１００ｍＭｄＮＴＰの同等の混合物）
オリゴミックス　　　１μｌ（１００μＭｏｌｉｇｏの同等の混合物）
Ｐｗｏポリメラーゼ　　　２μｌ
前記反応ミックスについて次の条件を用いてＴｒｉｏ Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った：
１．４０℃　２分
２．７２℃　１０秒
３．９４℃　１５秒
４．４０℃　３０秒
５．７２℃　２０秒＋２秒／サイクル
６．４℃　∞
サイクルを工程３から５の間で２５回繰り返した。
２５サイクル完了後、１０μｌのアリコートを各試験管から除去し、０．８％トリスアセテート（ＴＡＥ）アガロースゲル上に付し、長波ＵＶ光下で観察した。合成されたＥ１　ＤＮＡの予想されるサイズは約２ｋｂである。
【００４９】
遺伝子回収：
合成遺伝子を、合成ｏｌｉｇｏのＮ末端上にＮｏｔ１制限部位およびＣ末端合成オリゴにＢａｍＨ１部位を含む２つの末端オリゴを用いてポリメラーゼを用いてＰＣＲにより回収した。
二重蒸留水　　　　　　６５μｌ
Ｐｗｏ１０Ｘ緩衝液　　１０μｌ
ｄＮＴＰミックス　　　　１μｌ（１００ｍＭｄＮＴＰの同等の混合物）
アセンブリミックス　　２０μｌ（前回のＰＣＲから入手）
Ｎ末端ｏｌｉｇｏ　　　　１μｌ（１００μＭ）
Ｃ末端ｏｌｉｇｏ　　　　１μｌ（１００μＭ）
Ｐｗｏポリメラーゼ　　　２μｌ
１．９４℃　４５秒
２．７２℃　２分＋１分／５００ｂｐ
３．７２℃　１０分
４．４℃　∞
サイクルを工程２と１の間で２５回繰り返した。
ＤＮＡを合計５０μｌのキット溶出緩衝液中に再懸濁させる前に、ＰＣＲ産物を次にＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８１０４）を用いて精製した。１０μｌのアリコートをＮｏｔ１およびＢａｍＨ１制限酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｉｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ， ３ Ｆｏｕｎｔａｉｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｉｎｃｈｉｎｎａｎ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ， Ｐａｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ）で３７℃で２時間消化した。この消化物を０．８％ＴＡＥアガロースゲル上でゲル精製し、２ｋｂＤＮＡ産物を切除し、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８７０４）を用いて抽出した。最終消化精製ＤＮＡフラグメントを合計５０μｌのキット溶出緩衝液中に溶出させた。
【００５０】
このＰＣＲフラグメントをベクターｐ７３１３ＰＬｃ（図７）（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．， さらなる詳細は以下を参照）中にクローンし、能力ＪＭ１０９細胞（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｐ９７５１）中に形質転換した。選択されたクローンからのプラスミドＤＮＡはＮｃｏ１−ＢａｍＨ１およびＮｃｏ１−ＥｃｏＲＩでの消化によりチェックされた制限酵素であった。２ｋｂフラグメント挿入物を有する５の正しいクローンを選択し、挿入ＤＮＡを配列化させた。３つの点突然変異だけを含む挿入物を有する１つのクローンをさらに使用するために選択した。３つの点突然変異を他のクローンからのホモローガスな小フラグメントでのライゲーションスワップにより補正した。
補正されたクローンを制限酵素消化により再チェックし、挿入ＤＮＡを完全に配列化させた。このクローンをｐ６ｂＥ１ｃ／ｏと称する。同時に、比較発現および免疫化の研究のために野生型ＨＰＶ−６ｂ（ＥＭＢＯ Ｊ． ２（１２）２３１４−２３１８ １９８３）およびＨＰＶ−１１（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５１， １２４−１３０ １９８６）のゲノムクローンからＰＣＲ増幅し、代表的フラグメントをＮｏｔ１−ＢａｍＨ１消化ベクターｐ７３１３ＰＬｃ中にクローンした。これらのクローンをそれぞれｐ６ｂＥ１ｗ／ｔおよびｐ１１Ｅ１ｗ／ｔと称する。
クローンｐ６ｂＥ１ｃ／ｏおよびｐ６ｂＥ１ｗ／ｔにおけるＥ１遺伝子をさらに変異させて、アミノ酸変化Ｋ８３Ｇ、Ｋ８４ＧおよびＧ４３８Ｄを導入した。必要な変異を導入するために設計されたヌクレオチド置換を有する配列化させた適合３’および５’オリゴヌクレオチドプライマーをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位指向性変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５１８）において記載されている方法により他のキット試薬とのＰＣＲ反応において用いた。変異ｐ６ｂＥ１ｃ／ｏおよびｐ６ｂＥ１ｗ／ｔクローンはそれぞれｐ６ｂＥ１ｃ／ｏ　ｍｕｔおよびｐ６ｂＥ１ｗ／ｔ　ｍｕｔと表した。
【００５１】
実施例３−コドン最適化ＨＰＶ１１Ｅ２ポリヌクレオチド配列の構築
Ｅ２コドン最適化遺伝子の設計、アセンブリおよび回収はＥ１についてすでに記載したとおりであるが、重複オリゴヌクレオチドは長さが４０ではなく６０ヌクレオチドであり、１８ｎｔの重複を有する。Ｅ１法におけるのと異なり、２個の適当な野生型配列オリゴヌクレオチドを２個の６０ｍｅｒオリゴヌクレオチド（Ｋ１１１Ａ変化を生じるために必要なヌクレオチド置換を含む）と置換することにより、Ｋ１１１Ａアミノ酸変異を含むクローンがコドン最適化Ｅ２遺伝子クローンと同時に生じた。の細胞毒性効果は複製老化のバイオマーカーと相関しない。
プラスミドｐ７３１３−ＰＬｃの組成
ｐＵＣ１９のＥａｍ１１０５Ｉ−Ｐｓｔ１フラグメントを含むベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｔｄ．， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｂｕｃｋｓ， ＨＰ７ ９ＮＡ）を、カナマイシン耐性遺伝子と、それに続く両フラグメントの平滑末端を含むｐＵＣ４ＫのＥｃｏＲＩフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて置換することにより、プラスミドを構築した。ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１プロモーター／エンハンサー、イントロンＡはＨａｒｒｉｅｔ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手したプラスミドＪＷ４３０３由来であり、Ｘｈｏｌ−Ｓａｌ１フラグメントとしてｐＵＣ１９のＳａｌ１サイト中に挿入し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを組み入れる。プロモーターからの５’ＳａｌＩ−Ｂａｎｌフラグメントの欠失は、ベクターにおいて用いられる最小のプロモーターを生じた（ＷＯ００／２３５９２−Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．）。ＨＢＶ表面抗原３’ＵＴＲは、ベクターｐＡＭ６中、Ｂ型肝炎ウイルス、血清型ａｄｗ由来であった（Ｍｏｒｉａｒｔｙ ら、．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８， ２６０６−２６１０， １９８１）。ｐＡＭ６（ｐＢＲ３２２ベースのベクター）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（カタログ番号ＡＴＣＣ４５０２０）から入手した。３’ＵＴＲは１．４ｋｂＢａｍＨＩフラグメントとしてポリアデニル化シグナルに対して５’に挿入し、ＢａｍＨＩサイトを除去するための挿入のために平滑末端にした。一連の工程において（ＢｇｌＩＩでの消化、クレノウポリメラーゼ処理、ＢｓｔＸＩでの消化、ＮｃｏＩでの消化、オーバーハングを除去するための緑豆ヌクレアーゼでの処理およびＢｓｔＸＩでのさらなる処理を含む）、ＨＢＶ　Ｓ遺伝子およびｂＧＨｐＡシグナルの３’未翻訳エンハンサー領域とｂＧＨｐＡシグナル間に修飾を行って、Ｘ遺伝子プロモーターおよびｂＧＨｐＡシグナル間の５コドン以上のすべてのオープンリーディングフレームを除去する。この結果、Ｘ蛋白（９アミノ酸）およびＸ遺伝開始コドンの翻訳可能な部分をエンコードする配列が欠失する。しかしながら、この領域はＣＭＶプロモーターからのＨＢｓＡｇの発現を向上させることが判明しているので、Ｘ遺伝子の弱いエンハンサー／プロモーター領域は保持されていた。ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをウサギベータグロブリンポリアデニル化シグナルと置換した。Ｓ抗原の５’非コーディングおよびコーディング配列を切除し、オリゴヌクレオチドリンカーと置換して、プラスミドｐ７３１３−ＰＬを産生することが示されている複数のクローニング部位を得た。
【化１】
2004504057.tif 000002
Ｄａｖｉｄ Ｈｏｄｇｅｓｏｎ（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）からプラスミドｐＤＡＨ２１２からのサブクローンからＣｏｌＥ１ｃｅｒ配列を得、プライマーを用いてＰＣＲにより増幅して、ＥｃｏＲＩ制限部位を配列の両端に配置した。ｃｅｒ配列を次にｐ７３１３−ＰＬのＥｃｏＲＩ制限部位中に挿入して、プラスミドｐ７３１３−ＰＬｃを得た（図７）。増幅されたｃｅｒの配列をジンバンクエントリーＭ１１４１１に対して立証した。
【００５２】
実施例４−哺乳動物２９３Ｔ細胞におけるＥ１の発現
哺乳動物２９３Ｔ細胞を６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ　Ｃｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， １０ Ｔｈｅ ＶａｌｌｅｙＣｅｎｔｒｅ， Ｇｏｒｄｏｎ Ｒｏａｄ， Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ， Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）組織培養皿につき２×１０５細胞の最終濃度で、一夜３７℃、５％ＣＯ２中で対数期で増殖させた。次のトランスフェクションミックスを調製し、２５分間合成した：
１６μｌの滅菌二重蒸留水中２μｇのプラスミドＤＮＡ（ベクター、ｐ６ｂＥ１ｃ／ｏ、ｐ６ｂＥ１ｗ／ｔ）
＋
ＯＰＴＩ−ｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ）　　　８μｌ
リポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）　　　　　　　　　　　　　６μｌ
【００５３】
各細胞単層を注意深くＯＰＴＩ−ｍｅｍで２回洗浄した。８００μｌのＯＰＴＩ−ｍｅｍを各ウェルに添加した。２００μｌのＯＰＴＩ−ｍｅｍを各トランスフェクションミックスに添加し、混合し、静かに細胞単層に添加した。プレートを５時間３７℃で５％ＣＯ２中インキュベートし、その後、トランスフェクションミックスおよびＯＰＴＩ−ｍｅｍを捨てた。細胞単層を静かに細胞成長培地で２回洗浄し、最終的にトランスフェクトされた細胞を、１０％ウシ胎仔血清および２９．２ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンを含むダルベッコの修飾イーグル培地中、３７℃で５％ＣＯ２中２４時間インキュベートした。細胞をマイクロチューブ中に掻き落とし、ＰＢＳで２回洗浄し、スピンダウンし、細胞ペレットをＳＤＳ　Ｐａｇｅ　Ｌａｅｍｍｌｉ色素中に再懸濁させた。細胞ペレットを沸騰させ、１０％ＳＤＳ　Ｐａｇｅゲル上にロードし、１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ緩衝液中電気泳動にかけた。電気泳動後、ゲルをニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にブロットし、ウェスタンブロットした。ニトロセルロース膜を、ＰＢＳ中５％Ｍａｒｖｅｌ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｅｖｅｒａｇｅｓ， Ｋｎｉｇｈｔｏｎ， Ａｄｂａｓｔｏｎ， Ｓｔａｆｆｏｒｄ， ＵＫ）で３０分間室温でブロックし、ＰＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。ウサギにおいてＨＰＶ６ｂＥ１のＣ末端蛋白配列（蛋白配列：ＣＳＳＳＬＤＩＱＤＳＥＤＥＥＤＧＳＮＳＱＡＦＲ）に対して生じさせたポリクローナル抗体を、ＰＢＳ中５％Ｍａｒｖｅｌ中に希釈し、ニトロセルロース膜に添加した。これを室温で１時間静かに撹拌しながらインキュベートした。希釈された抗体を除去し、膜をＰＢＳ中および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。二次接合体、ブタ抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＤＡＫＯ）をＰＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中１：２００００に希釈した。これを洗浄された膜に添加し、静かに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。膜を次にＰＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でよく洗浄した。化学発光ＨＲＰキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、膜上に移された蛋白を検出した。
【００５４】
結果：
Ｅ１の翻訳された蛋白の予想されるサイズは６８ｋＤａ−７２ｋＤａである。結果（図８）は、コドン最適化ＨＰＶ６ｂＥ１（レーン４）を含むｐ７３１３−ＰＬｃにより発現される正確な蛋白のサイズを示す。野生型Ｅ１を含むベクターはレーン３にあり、これは、野生型ヌクレオチド配列からのヒト細胞においてＥ１の検出可能な発現がないことを示す。同様に、レーン２（エンプティーベクター）およびレーン１（未トランスフェクト細胞）においてＥ１は検出されない。レーン１〜４の約６０ｋＤバンドは抗Ｅ１抗体と交差反応する未同定細胞蛋白である。バンドはレーン全体にわたってほぼ一定の強度のものであり、これはサンプルのローディングが一貫していることを示す。
【００５５】
実施例５−ＨＰＶ　Ｅ１およびＨＰＶ　Ｅ２蛋白を発現する組換えワクシニアウイルスの構築
ＨＰＶ−６ｂＥ１蛋白を発現するワクシニアウイルスがＧｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ， Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ， ＵＫで生じた。ＨＰＶ−１１Ｅ１およびＨＰＶ−１１Ｅ２を発現するワクシニアウイルスは、Ｊｅｆｆ Ｅｎｇｌｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＵＳから贈られた。
簡単に言うと、ｐ６ｂＥ１ｗ／ｔからのＥ１遺伝子を、ワクシニアウイルスベクターｐＴＭ３中にクローンし、次に制限酵素チェックし、ＤＮＡ配列化された組換えベクターをトランスフェクトされたＨＴｋ−細胞に対して用いた。組換えワクシニアウイルスを単離し、プラーク精製した。Ｅ１蛋白発現を、任意の細胞のＨＰＶ−６ｂＥ１を発現する組換えウイルスおよびバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する第二のワクシニアウイルス（ｖＴＦ７−３）の両方での感染後、ペプチド抗血清を用いてウェスタンブロッティングによりチェックした。細胞のワクシニアウイルスｖＦＴ７−３での同時感染も、ＨＰＶ−１１Ｅ１およびＥ２組換えワクシニアウイルスからＥ１およびＥ２蛋白の直接発現を行うために必要である。ワクシニアウイルスＷＲ株を負の対照実験において用いた。ベクターｐＴＭ３およびウイルスｖＴＦ７−３はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳから得た。
【００５６】
実施例６−免疫学−ＨＰＶ抗原に対する細胞応答の検出
すべての試薬は特に記載がなければＧｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｅｌｙ， ＳｃｏｔｌａｎｄまたはＳｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， Ｄｏｒｓｅｔから入手した。
Ａ．免疫化プロトコル
メスＣ５７ＢＬ／６マウスを１．０〜２．０μｇＤＮＡ（ｐ６ｂＥ１ｃ／ｏ、ｐ６ｂＥ１ｗ／ｔ，ｐ６ｂＥ１ｃ／ｏ、ｐ６ｂＥ１ｗ／ｔ　ｍｕｔまたはエンプティープラスミドｐ７３１３ＰＬｃのいずれか）でＰＭＤＤにより免疫化し、１４日後に同じ用量で追加抗原投与した。頚部を脱臼させることにより動物を屠殺し、ＨＰＶ抗原に対する細胞応答を調べるために脾臓を摘出した。
Ｂ．脾臓細胞の単一細胞懸濁液の調製
脾臓を磨りガラススライド（ＢＤＨ）間で「つぶし」、赤血球を溶解させ（１５５ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ　ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）、細胞を完全ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。（１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールで補足したＲＰＭＩ−１６４０培地）。
【００５７】
Ｃ．ＭＣ５７標的細胞の感染
ＨＰＶ抗原由来の免疫優性エピトープは従って規定されていないままで、インビトロでの抗原特異性応答の検出は、全蛋白をエンコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた標的細胞内で生じた全抗原の自然のプロセッシングによる。ＭＣ５７細胞（Ｋｂ陽性）を、５の感染の多重度を用いて１時間３７℃でＨＰＶ−６ｂＥ１、ＨＰＶ−１１Ｅ２またはＨＰＶ−１１Ｅ１を発現する組換えワクシニアウイルスで感染させた。過剰のウイルスを洗浄して除去し、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ， Ｇｅｎｅｖａ）を含む完全ＲＰＭＩ中に細胞を再懸濁させた。
【００５８】
Ｄ．ＥＬＩＳＰＯＴ
実験群から入手した４×１０ｅ５脾臓細胞を添加する前に、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（９６ウェル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＩＰ Ｓ ４５ １ ０）をラット抗マウスＩＦＮガンマ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ １８１８１Ｄ）でＰＢＳ中１５μｇ／ｍｌで一夜（４℃）でコートした。１×１０ｅ４組換えワクシニア感染ＭＣ５７細胞の添加により抗原を提示した。野生型ワクシニアＷＲ株を負の対照として用いた。分析を一夜３７℃（５％ＣＯ２）でインキュベートした。
分析の２日に、ビオチニル化ラット抗マウスＩＦＮガンマ（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ １８１１２Ｄ）を１μｇ／ｍｌで用い、続いてストレプトアビジンアルカリホスファターゼ接合体（ＴＣＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡ １００８）をＰＢＳ中１／１０００の希釈度で用いて、スポット形成細胞を検出した。アルカリホスファターゼ基質キット（Ｂｉｏｒａｄ １７０−６４３２）を用いてこれを可視化し、イメージ分析により定量化した。結果を図９に示す。
【００５９】
図９からわかるように、ワクシニアベクター（ｖａｃｃ．Ｅ１（１１）またはｖａｃｃ．Ｅ１（６ｂ））中のＥ１で攻撃された場合に、ＨＰＶ−６ｂコドン最適化Ｅ１配列をエンコードするプラスミドで予防接種された３匹のマウスすべてから強力な細胞応答が見られた。これらのマウスが野生型ワクシニア（ｖａｃｃ．ＷＴ）、またはＨＰＶ−１１Ｅ２（ｖａｃｃ．Ｅ２（１１））を発現するワクシニアで攻撃された場合に応答は見られない。対照的に、野生型Ｅ１配列をエンコードするプラスミドでのマウスの予防接種の結果、Ｔ細胞応答は得られない。これらのマウスからの脾臓細胞は、Ｅ１遺伝子を有するワクシニアによる攻撃に対しても、任意の他の攻撃に対しても反応しない（データは省略）。Ｅ１遺伝子の変異は、マウスにおける細胞応答を変更しない。さらに、ｐ６ｂＥ１ｃ／ｏおよびｐ６ｂＥ１ｃ／ｏ　ｍｕｔで免疫化されたマウスはＨＰＶ−１１から得られるＥ１蛋白を発現するワクシニアウイルスで感染した標的細胞に対して強力な細胞性免疫応答を生じたので、ＨＰＶ−６ｂＥ１およびＨＰＶ−１１Ｅ１間に高レベルの免疫原性交差反応性が存在することを仮定することができる。空のｐ７３１３−ＰＬｃベクターで予防接種されたマウスは任意の攻撃に対して応答を示さない。
【００６０】
実施例７−哺乳動物２９３Ｔ細胞におけるＨＰＶ６ｂＥ２の発現
２４ウェルプレート中２９３％細胞単層（８０％コンフルエント）を、標準的プロトコル（前記実施例４参照）に従ってトランスフェクションにより２．５μｌのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１μｇの各プラスミド（ｐ６ｂｗ／ｔ、ｐ６ｂｃ／ｏ、ｐ６ｂｗ／ｔ　ｍｕｔ、ｐ６ｂｃ／ｏ　ｍｕｔ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を収穫し、リン酸塩緩衝塩溶液中リンスし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＶ−６ｂＮ−末端アミノ酸配列ＭＥＡＩＡＫＲＬＤＡＣＱＥＱＬＬＥＬＹＥＥＣ（図１０）に対して生じさせた抗Ｅ２ペプチド抗血清（＃１１００）を用いてウェスタンブロットにより調べた。
結果
結果は、トラック３（コドン最適化Ｅ２）およびトラック５（コドン最適化および変異Ｅ２）において予想されるサイズ（４０ｋｄ〜４５ｋＤ）の主蛋白バンドを示す。同じサイズの副バンドもトラック４に出現し、変異野生型Ｅ２プラスミドからの非常に低レベルの発現を示すが、トラック１（負の対照）、またはトラック２（野生型Ｅ２蛋白）においては出現しない。〜２５ｋｄの交差反応蛋白バンドがすべてのトラックにおいて出現し、このことは蛋白溶解物の等しいローディングを示す。Ｅ２の変異はコドン最適化により著しく向上されるＥ２蛋白発現を損なわないようである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ジンバンクから得たＨＰＶ１１、６ａおよび６ｂ型からのＥ１の野生型アミノ酸配列のプロトタイプを示す。
【図２】図１からのＨＰＶ６ｂＥ１のプロトタイプ野生型アミノ酸配列（６ｂ−ｅ１）を、生物学的活性を除去するために点突然変異を含むＨＰＶ６ｂＥ１アミノ酸配列（６ｎ−ｅ１ｍｕｔ）とならべて示す。
【図３】ジンバンクから得たＨＰＶ１１、６ａおよび６ｂ型からのＥ２のプロトタイプ野生型アミノ酸配列を示す。
【図４ａ】図３からのＨＰＶ１１Ｅ２のプロトタイプ野生型アミノ酸配列（Ｈｐｖ−１１ｅ２−ｗｔ）を、生物学的活性を除去するために点突然変異を含むＨＰＶ１１Ｅ２アミノ酸配列（Ｈｐｖ−１１ｅ２−ｍｕｔ）および図６のヌクレオチド配列によりエンコードされるアミノ酸配列（Ｈｐｖ−１１ｅ２−ｃｏｍｕｔ）と並べて示す。
【図４ｂ】図３からのＨＰＶ６ｂＥ２のプロトタイプ野生型アミノ酸配列（Ｈｐｖ−６ｂｅ２−ｗｔ）を、生物学的活性を除去するために点突然変異を含むＨＰＶ６ｂＥ２アミノ酸配列（Ｈｐｖ−６ｂｅ２−ｍｕｔ）と並べて示す。
【図５】図２からのＨＰＶ６ｂＥ１の変異アミノ酸配列をエンコードする、高度に発現されたヒト遺伝子のものと類似したコドン使用パターンを有するヌクレオチド配列を示す。
【図６】図４からのＨＰＶ１１Ｅ２の変異アミノ酸配列をエンコードする、高度に発現されたヒト遺伝子のものと類似したコドン使用パターンを有するヌクレオチド配列を示す。
【図７】ＤＮＡベクターｐ７３１３−ＰＬｃを示す。
【図８】アクリルアミドゲル上にかけ、発現されたＥ１蛋白と結合する抗体を示すために染色された実施例４からの細胞溶解物サンプルを示す。
【図９】本発明のポリヌクレオチドでマウスを免疫化した後の抗原攻撃に対する細胞応答を示す（実施例６）。
【図１０】アクリルアミドゲル上にかけ、発現されたＥ２蛋白と結合する蛋白を示すために染色された実施例７からの細胞溶解物サンプルを示す。
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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