(57)【要約】各々が配列番号１及び配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含む新規に同定された２つの酵素、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ−２が開示されている。開示された酵素の各々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｒｋ及びｐ３８  ＭＡＰＫによってリン酸化され活性化されるセリン／トレオニンシグナル伝達キナーゼである。また、組換え核酸分子を含む細胞、そのアンチセンス構築物、開示されたタンパク質の各々に特異的な抗体が開示されており、また、新規な核酸分子及びそれらの遺伝子産物を含むキットのような新規な核酸分子及びそれらの遺伝子産物の使用方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのマイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化するプロテインキナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）ヒトのＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードしており配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）ヒトのＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードしており配列番号１で表されるヌクレオチド配列の相補配列に高緊縮条件下でハイブリダイズし、配列がＤＮＡであるときは完全相補性であり、ＲＮＡであるときはヒト細胞の天然型ｍＲＮＡに一致するようなヌクレオチド配列、
（ｃ）前項（ａ）または（ｂ）の配列をコードするヒトＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドに縮重するヌクレオチド配列、及び、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその対応フラグメント、
から成るグループから選択されることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項２】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのスプライス変異体をコードするコーディング領域を含み、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼが配列番号１で表されるヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項３】
単離核酸分子がｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子が配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記単離核酸分子が配列番号１で表されるヌクレオチド配列の相補配列に緊縮性洗浄条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする単離核酸分子。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分子によってコードされた実質的に純粋なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ。
【請求項８】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする単離核酸配列のスプライス変異体であるヌクレオチド配列によってコードされた実質的に純粋なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ。
【請求項９】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列によってコードされた実質的に純粋なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ。
【請求項１０】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列の相補配列に緊縮性洗浄条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされた実質的に純粋なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ。
【請求項１１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸分子によってトランスフェクトまたは形質転換された細胞であって、細胞が細菌細胞、哺乳類細胞または両生類卵母細胞であり、核酸分子が細胞に異種性であることを特徴とする適当な宿主細胞。
【請求項１３】
生物サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２メッセンジャーＲＮＡの検出方法であって、
（ａ）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを発現すると推測される適当な宿主細胞に請求項１に記載の核酸分子を複合体の形成に有利な条件下で導入する段階と、
（ｂ）前記複合体の存在を前記サンプル中の前記ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの存在を示す指標として検出する段階と
から成る方法。
【請求項１４】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＤＮＡ配列の同定方法であって、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーを標識プローブでプローブする段階と、プローブに対して有意な相同度を有している配列をライブラリーから回収する段階とから成り、プローブが請求項１に記載のヌクレオチド配列から成ることを特徴とする方法。
【請求項１５】
（ａ）請求項１に記載の核酸分子を真核細胞に導入する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の細胞中の第二メッセンジャー活性を検出する段階とから成り、前記活性は導入された核酸分子によってコードされたポリペプチドによって仲介されることを特徴とするサンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの同定方法。
【請求項１６】
ヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの活性を調節する被験化合物を同定するバイオアッセイであって、該バイオアッセイが、
（ａ）被験化合物の非存在下でＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＤＮＡで形質転換された真核細胞の第二メッセンジャー活性を測定し、これによって第一測定値を得る段階と、
（ｂ）被験化合物の存在下でＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＤＮＡで形質転換された真核細胞の第二メッセンジャー活性を測定し、これによって第二測定値を得る段階と、
（ｃ）第一測定値と第二測定値とを比較し、第一測定値と第二測定値との違いを生じた化合物をＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの活性を調節する被験化合物として同定する段階とから成り、真核細胞が機能性ヒト副甲状腺ホルモン−２ポリペプチドを発現することを特徴とするバイオアッセイ。
【請求項１７】
ＭＡＰＫＡＰ−２に仲介される疾病状態に対する被験化合物の治療有効性をモニターする方法であって、
（ｉ）機能不全のＭＡＰＫＡＰ−２仲介疾病状態にあると推測される患者から被験化合物を投与する前に投与前サンプルを採取する段階と、
（ｉｉ）投与前サンプル中のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡでコードされたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの発現レベルまたは活性を検出して第一測定値を得る段階と、
（ｉｉｉ）投与後サンプル中のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡでコードされたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの発現レベルまたは活性を検出して第二測定値を得る段階と、
（ｉｖ）第一測定値と第二測定値とのＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの発現レベルまたは活性を比較する段階と、
（ｖ）上記に応じて患者に対する化合物の投与を変更する段階とから成る方法。
【請求項１８】
機能不全のシグナル伝達ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼによって示される疾病状態の退縮、進行または発症を判定する方法であって、方法が、（ｉ）前記疾病状態に罹っていると推測される被験者のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを含有するサンプルを、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含む核酸ハイブリダイゼーションプローブに、該ハイブリダイゼーションブとｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとの結合に有利な条件下で接触させて両者間に複合体を形成させる段階と、（ｉｉ）前記被験者が前記疾病状態を発症する危険があることを示す指標として前記複合体を検出する段階とから成ることを特徴とする方法。
【請求項１９】
機能不全のシグナル伝達ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを特徴とする病的障害の退縮、進行または発症を判定する方法であって、障害を生じた患者のサンプルを、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有する単離核酸分子の遺伝子産物に特異的な検出可能プローブに、プローブ／遺伝子産物複合体の形成に有利な条件下で接触させる段階から成り、前記複合体の存在が患者の病的障害の退縮、進行または発症を示す指標となることを特徴とする方法。
【請求項２０】
プローブが抗体であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が放射性ラベルまたは酵素によって標識されていることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
炎症インヒビターとして使用するための被験化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）配列番号１とヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするヌクレオチド配列とから成るグループから選択され配列番号１で表されるヌクレオチド配列の相補配列に高緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに被験化合物を接触させる段階と、
（ｂ）接触したＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼタンパク質のＨｓｐ−２７に結合する能力またはＨｓｐ−２７をリン酸化する能力を試験する段階とから成り、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼによるＨｓｐ−２７のリン酸化を阻害するかまたはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼタンパク質とＨｓｐ−２７との結合を阻害する被験化合物が炎症治療薬の候補となることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項７に記載のポリペプチドを医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組合せて含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２４】
請求項７のポリペプチドの異常レベルを生じ易い被験者の体内でこのような異常レベルを修正する薬剤の効力をモニターする方法であって、有効量の薬剤を被験者に投与する段階と、投与後の被験者の体内のポリペプチドのレベルを測定する段階とから成り、ポリペプチドレベルが正常レベルに近付くように変化することが薬剤の効力の指標となることを特徴とする方法。
【請求項２５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列番号２の全長の少なくとも８０％の一致を有しているポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む単離核酸分子であって、８０％一致は、配列番号２に許容されるアミノ酸変異を定義し、該アミノ酸変異は式：
Ｎａ＝Ｘａ−（ＸａＹ）
〔式中、Ｎａはアミノ酸変異の最大数、Ｘａは配列番号２に含まれるアミノ酸の総数、Ｙは０．８０の値を表し、ＸａとＹとの非整数積はこの積をＸａから減算する前に最も近い整数になるよう端数を切り捨てる〕で表される等式によって決定及び計算されることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項２６】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを活性化する（１つまたは複数の）リガンドの同定方法であって、方法が、
（ｉ）転写調節要素に機能的に連結されたリポーター遺伝子とＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする外因性遺伝子とを含有している宿主細胞を用い、転写調節要素が活性化されると（１つまたは複数の）リポーター遺伝子の発現が誘発されるようにして、内因性ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼが欠失した宿主細胞をＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性を活性化すると推測される候補化合物に接触させる段階と、
（ｉｉ）（１つまたは複数の）リポーター遺伝子の誘発をモニターする段階と、
（ｉｉｉ）ポリペプチドを活性化する（１つまたは複数の）リガンドを同定する段階とから成る方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の核酸分子の遺伝子産物に特異的な抗体。
【請求項２８】
異種性タンパク質を発現するように設計されたヒト以外の組換え細胞系であって、細胞系が配列番号２で表されるＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを誘導的に発現する請求項１に記載の異種性核酸分子によって形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を含むことを特徴とするヒト以外の組換え細胞系。
【請求項２９】
宿主細胞中で核酸分子の発現をコントロールする調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３０】
結合相手を含有すると推測されるサンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの結合相手の検出方法であって、
（ｉ）サンプルと配列番号２のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとをＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼが結合相手に有利に結合する条件下で接触させる段階と、
（ｉｉ）結合相手に対するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの結合を検出することによってサンプル中の結合相手の存在を判定する段階とから成る方法。
【請求項３１】
配列番号２のアミノ酸配列から成るキナーゼポリペプチドの結合活性またはキナーゼ活性を調節する化合物の同定方法であって、方法が、
（ａ）ポリペプチドを発現する細胞と被験化合物とをポリペプチドの結合活性またはキナーゼ活性の調節に適した条件下で接触させる段階と、
（ｂ）被験化合物によるポリペプチドの結合活性またはキナーゼ活性の調節を検出する段階とから成る方法。
【請求項３２】
前記薬剤がＭＡＰＫＡＰ−２活性を阻害することを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬剤がＭＡＰＫＡＰ−２活性を刺激することを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
薬剤がＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
薬剤がＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の転写またはＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡの翻訳を調節することによってＭＡＰＫＡＰ−２の発現を調節することを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
薬剤がＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子のコーディング鎖にアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳類のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの内因性シグナル伝達活性を調節する方法であって、ＭＡＰＫＡＰ−２を発現し得る細胞を請求項３１の化合物に接触させることから成る方法。
【請求項３８】
ポリペプチドの活性の前記調節がポリペプチドに対する被験化合物の直接結合によって検出されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記直接結合が細胞を溶解させ免疫沈降を行うことによって測定されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記直接結合が酵母ツーハイブリッドアッセイによって測定されることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドの活性の前記調節がＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性アッセイの使用によって検出されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性アッセイがＭＡＰＫＡＰ−２基質のリン酸化に基づくことを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドの天然に生じる対立遺伝子変異体の結合活性またキナーゼ活性を調節する化合物の同定方法であって、対立遺伝子変異体が、４５℃の６×ＳＳＣ中で配列番号１から成る核酸分子の相補配列にハイブリダイズし、次いで５０−６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄した核酸分子によってコードされており、方法が、
（ａ）対立遺伝子変異体を発現する細胞と被験化合物とを対立遺伝子変異体の結合活性またはキナーゼ活性の調節に適した条件下で接触させる段階と、
（ｂ）被験化合物による対立遺伝子変異体の結合活性またキナーゼ活性の調節を検出する段階とから成る方法。
【請求項４４】
配列番号２によって表されるアミノ酸配列、または、配列番号２に少なくとも８０％一致し、配列番号２との違いが末端アミノ酸残基の１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、及び／または末端アミノ酸残基の欠失に限られた変異配列を含み、変異配列のＨｓｐ−２７リン酸化能力が実質的に減少していないことを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項４５】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸の異常な発現または活性を特徴とする障害を有する患者の治療方法であって、ＭＡＰＫＡＰ−２調節剤である薬剤を患者に投与することから成る方法。
【請求項４６】
ＭＡＰＫＡＰ−２調節剤がＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＭＡＰＫＡＰ−２調節剤がＭＡＰＫＡＰ−２核酸分子であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
ＭＡＰＫＡＰ−２調節剤がペプチド、ペプチド模擬体またはその他の小分子であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質または核酸の異常な発現を特徴とする障害が免疫関連障害であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
セリン含有基質のリン酸化方法であって、
（ａ）有効濃度のＡＴＰと配列番号１に少なくとも８４％の相同度を有しておりＨｓｐ−２７をリン酸化する酵素とを基質と共にインキュベートする段階と、
（ｂ）基質のリン酸化量を測定する段階とから成る方法。
【請求項５１】
更に、酵素と酵素のアンタゴニスト候補またはアゴニスト候補との混合物を形成する段階と、基質のリン酸化量に対する前記アンタゴニスト候補またはアゴニスト候補の効果を測定する段階とから成る請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫＡＰ−２）の活性を調節する試薬の同定方法であって、方法が、
（ａ）セリン、トレオニン及びチロシンキナーゼ活性を有しているＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを含有する被験サンプルと試薬とを入手する段階と、
（ｂ）被験サンプルをＭＡＰＫＡＰ−２基質及び標識リン酸塩と共に基質のリン酸化に十分な条件下でインキュベートする段階と、
（ｃ）基質内への標識リン酸塩の取り込み率を測定し、この取り込み率をＭＡＰＫＡＰ−２活性の測定値とする段階と、
（ｄ）ＭＡＰＫＡＰ−２活性に対する試薬の効果を対照に比較する段階とから成り、前記ＭＡＰＫＡＰ−２活性の変化がＭＡＰＫＡＰ−２活性を調節できる試薬の存在を示す指標となることを特徴とする方法。
【請求項５３】
前記ＭＡＰＫＡＰ−２基質がＨｓｐ−２５、Ｈｓｐ−２７及びＡＬＴ２の１つまたは複数であることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記調節がＭＡＰＫＡＰ−２活性の阻害であることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムから成るグループから選択されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
試薬が腫瘍壊死因子及びインターロイキン−１から成るグループから選択されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
ＭＡＰＫＡＰ−２合成を調節する試薬の同定方法であって、方法が、
（ａ）セリン、トレオニン及びチロシンキナーゼ活性を有しているＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを含有する被験サンプルを準備する段階と、
（ｂ）被験サンプルを試薬の存在下でインキュベートする段階と、
（ｃ）サンプル中に存在するタンパク質をゲル電気泳動によって画分する段階と、
（ｄ）タンパク質を膜に転移させる段階と、
（ｅ）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに特異的な標識抗体によってタンパク質をプローブし、ＭＡＰＫＡＰ−２合成のレベルを検出抗体量によって測定する段階と、
（ｆ）ＭＡＰＫＡＰ−２合成に対する試薬の効果を対照に比較する段階とから成り、ＭＡＰＫＡＰ−２合成の変化がＭＡＰＫＡＰ−２合成を調節し得る試薬の存在を示す指標となることを特徴とする方法。
【請求項５８】
ＭＡＰＫＡＰ−２発現を調節する試薬の同定方法であって、
（ａ）ＭＡＰＫＡＰ−２ポリヌクレオチドが発現されている被験サンプルを準備する段階と、
（ｂ）被験サンプルを試薬の存在下でインキュベートする段階と、
（ｃ）被験サンプルからポリアデニル化ＲＮＡを単離する段階と、
（ｄ）ポリアデニル化ＲＮＡをＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに特異的なポリヌクレオチドプローブと共にインキュベートする段階と、
（ｅ）ポリアデニル化ＲＮＡにハイブリダイズしたプローブの量を測定し、ＭＡＰＫＡＰ−２の発現レベルをＲＮＡにハイブリダイズしたＭＡＰＫＡＰ−２プローブの量に直接関係付ける段階と、
（ｆ）ＭＡＰＫＡＰ−２発現に対する試薬の効果を対照に比較する段階とから成り、ＭＡＰＫＡＰ−２発現の変化がＭＡＰＫＡＰ−２発現を調節し得る試薬の存在を示す指標となることを特徴とする方法。
【請求項５９】
試薬が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体から成るグループから選択されることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
試薬が、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムから成るグループから選択されることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化するプロテインキナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ）の検出に役立つキットであって、前記キットが、バッファと、セリン、トレオニン及びチロシンキナーゼ活性を有するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに特異的に結合する標識抗体とを含んでおり、試験すべきサンプルがバッファ及び抗体に混合されることを特徴とするキット。
【請求項６２】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化するプロテインキナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ）をコードしている核酸の検出に役立つキットであって、前記キットが、バッファと、ＭＡＰＫＡＰ−２をコードする核酸配列またはその相補配列に緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも約２０個のヌクレオチドから成る核酸分子と、その使用説明書とを含むことを特徴とするキット。
【請求項６３】
ヒトのマイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化するプロテインキナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、
（ａ）ヒトのＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードしており配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）ヒトのＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードしており配列番号３で表されるヌクレオチド配列の相補配列に高緊縮条件下でハイブリダイズし、配列がＤＮＡであるときは完全相補性であり、ＲＮＡであるときはヒト細胞の天然型ｍＲＮＡに一致するようなヌクレオチド配列、
（ｃ）前項（ａ）または（ｂ）の配列をコードするヒトＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドに縮重するヌクレオチド配列、及び、
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその対応フラグメント、
から成るグループから選択されることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項６４】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのスプライス変異体をコードするコーディング領域を含み、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼが配列番号３で表されるヌクレオチド配列によってコードされていることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項６５】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする単離核酸分子。
【請求項６６】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする単離核酸分子のスプライス変異体であるヌクレオチド配列によってコードされた実質的に純粋なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ。
【請求項６７】
請求項６２に記載の核酸分子によってトランスフェクトまたは形質転換された細胞であって、細胞が細菌細胞、哺乳類細胞または両生類卵母細胞であり、核酸分子が細胞に異種性であることを特徴とする適当な宿主細胞。
【請求項６８】
請求項６３に記載の核酸分子によってコードされた実質的に純粋なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ。
【請求項６９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に少なくとも８０％の一致を有しているヌクレオチドを含む単離核酸配列であって、配列番号１の全長にＮａまでの核酸変異を含み、Ｎａはこのような変異の最大数を表し、式：
Ｎａ＝Ｘａ−（ＸａＹ）
〔式中の、Ｘａは配列番号１に含まれるヌクレオチドの総数、Ｙは０．８０の値を表し、ＸａとＹとの非整数積はこの積をＸａから減算する前に最も近い整数になるように端数を切り捨てる。〕によって計算され、前記ポリペプチドがＭＡＰＫＡＰ−２活性を有していることを特徴とする単離核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内シグナル伝達セリン／トレオニンキナーゼをコードする新規に同定された核酸分子、このポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、及び、新規なポリペプチドに対して誘発された抗体に関する。本発明は更に、新規なポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、例えば、細胞内のシグナル伝達の調節方法、ＭＡＰＫＡＰ−２仲介障害の治療プロトコルの設計における本文中に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの利用方法を提案する。また、開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを不可欠な要素とするシグナル伝達経路の機能不全によってまたは機能不全のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼによって発症する医学的障害を有する哺乳類を治療するための治療用組成物を提供しそれらの使用を提案する。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖の調節は、細胞環境を“感知”し、環境変化に関する入力シグナルを細胞に供給すべく作用する細胞表面受容体の種々のファミリーによって精密に統制される複雑なシグナル伝達経路アレイに仲介されている。これらのシグナル伝達経路は、タンパク質合成、分泌、代謝及び遺伝子発現の変化に導く細胞増殖のすべての重大な段階を調節する。これらのシグナルは、細胞表面膜に局在する特異的受容体分子に結合し該受容体分子を活性化する増殖因子、ホルモン、サイトカイン及びペプチドの形態を有している。活性化された受容体は次に細胞内シグナル伝達経路を起動し、最終的には、遺伝子発現、タンパク質分泌、細胞周期進行及び細胞分化に影響する多様な細胞応答を生じさせる。細胞内部のシグナル伝達経路は一般に、相互に情報を交換するタンパク質の連鎖によって形成され、連鎖中の各タンパク質成分は上流のアクチベーターからシグナルを取り込んで下流の種々のターゲットまたはエフェクタータンパク質に転送する。
【０００３】
タンパク質の可逆的リン酸化はシグナル伝達の中心的な特徴である。多くの細胞プロセスがリン酸化／脱リン酸メカニズムによってある程度調節されることは当業界で公知である。実際、多くのプロテインキナーゼ“カスケード”が認識されており、このようなカスケードでは、一連のプロテインキナーゼがリン酸化し互いを順次に調節して、最終的には、代謝酵素、転写因子、細胞骨格タンパク質、細胞周期レギュレーター、翻訳コントロールタンパク質、イオンチャンネル及びその他のプロテインキナーゼのような基幹的な調節分子を差別的にリン酸化する。このように、プロテインキナーゼ及びホスファターゼは細胞調節において主要な役割を果たす。
【０００４】
典型的な哺乳類細胞では１０，０００の活性タンパク質のうちの１，０００以上がリン酸化されていると推定される。活性化を駆動する高エネルギーリン酸塩は一般に、プロテインキナーゼによってアデノシン三リン酸分子（ＡＴＰ）から特定のタンパク質に転移され、タンパク質ホスファターゼによって該タンパク質から除去される。リン酸化は細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、増殖因子及び分化因子など）、細胞周期のチェックポイント及び環境的または栄養的ストレスに応答して生じ、分子スイッチの起動にほぼ類似している。スイッチが起動されると、適当なプロテインキナーゼが代謝酵素、調節タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャンネルもしくはポンプまたは転写因子を活性化する。
【０００５】
プロテインキナーゼは、他のタンパク質をリン酸化したり及び／またはそれ自体がリン酸化する（自己リン酸化）酵素である。基質に関しては、真核細胞のシグナル伝達に関与するプロテインキナーゼは、それらの利用基質に基づいて主要な３グループ、即ち、タンパク質−チロシン特異的キナーゼ（チロシン残基の基質をリン酸化する）、タンパク質−セリン／トレオニン特異的キナーゼ（セリン及び／またはトレオニン残基の基質をリン酸化する）及びデュアル特異性キナーゼ（チロシン、セリン及び／またはトレオニン残基の基質をリン酸化する）に大別される。今日までに１００をはるかに上回る数のプロテインキナーゼが同定されている。プロテインキナーゼの概要に関しては、Ｋｅｍｐ，Ｂ．Ｅ．（ｅｄ．）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９０）及びＨａｎｋｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４２−５２（１９８８）を参照するとよい。
【０００６】
プロテインキナーゼが細胞調節において基幹的な役割を果たすことが判明したので、プロテインキナーゼの欠陥が多くの疾病状態及び病気の容態に関与することは意外ではない。例えば、多くのガン細胞中ではＥＧＦもしくはＰＤＧＦのような細胞性チロシンキナーゼの過剰発現、または、構成的に活性の形態（ガン遺伝子）を産生するチロシンキナーゼの突然変異が生じる。Ｄｒｕｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：５６１−５６（１９９６）参照。タンパク質チロシンキナーゼはまた、炎症シグナルに関与する。欠陥Ｔｈｒ／Ｓｅｒキナーゼ遺伝子は筋硬直性ジストロフィー、ガン、アルツハイマー病のような複数の疾病に関与することが証明された。Ｓａｎｐｅｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１２：３４１−６（１９９５）；Ｓｐｅｒｂｅｒら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１９７：１４９−１５３（１９９５）；Ｇｒａｍｍａｓら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  １６：５６３−５６９（１９９５）；Ｇｏｖｏｎｉら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７７：３３２−３３７（１９９６）。キナーゼは更に、アンギオテンシンＩＩ及び造血サイトカイン受容体のシグナル伝達にも関与していた。Ｂ．Ｂｅｒｋら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８０：５，ｐｐ．６０７−１６（１９９７）；Ｒ．Ｍｕｆｓｏｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１１：１  ｐｐ．３７−４４（１９９７）。
【０００７】
セリン／トレオニンプロテインキナーゼのファミリーに属するマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ／ＭＡＰＫ）が、増殖因子、マイトジェン及びプロテインチロシンキナーゼを受容体とする分化因子のような様々な細胞外アゴニストの細胞内作用の仲介に中心的な役割を果たしていることが最近になって証明された（Ｃｏｂｂら，１９９１；Ｓｔｕｒｇｉｌ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９１）。
【０００８】
過去数年にわたるデータは、ＭＡＰキナーゼがプロテインキナーゼ及びプロテインホスファターゼの双方を介するシグナル伝達を促進し、様々な多くの病的生理状態を生み出す生物作用を起動する原因となることを示唆していた。このような状態としては、機能不全の白血球、Ｔ−リンパ球によって発症する状態、急性及び慢性の炎症疾患、例えば、リューマチ様関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、ゼンソク及びアレルギー反応がある。
【０００９】
ほぼ全ての細胞表面受容体がシグナル伝達中に１つまたは複数のＭＡＰプロテインキナーゼ“カスケード”を使用する。受容体のタンパク質チロシンキナーゼ、非受容体のタンパク質チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体及びヘテロトライマー形Ｇプロテイン結合受容体のような種々の受容体からのシグナルはすべてＭＡＰＫの活性化を生じさせると報告されていた。
【００１０】
ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化は様々な多くの刺激に対する細胞応答の初期イベントとして生じる。ＭＡＰキナーゼの活性化メカニズムは集中的に研究され、受容体のチロシンキナーゼのリガンド誘発活性化によって開始され一連のプロテインキナーゼの逐次活性化を生じさせる保存されたシグナル伝達カスケードが判明した。ＭＡＰキナーゼ経路に集まるシグナルの多様性はこのカスケードが無数の目的に役立つことを示しており、その活性化の結果は細胞の情況に依存するであろう。
【００１１】
ＭＡＰキナーゼは、配列Ｔｈｒ−−Ｘ−−Ｔｙｒをもつデュアルリン酸化モチーフにおいて、それ自体が“デュアル特異性”酵素であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）によってリン酸化されることによって活性化される（Ａｈｎら，１９９１；Ｇｏｍｅｚ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９９１；Ｎａｋｉｅｌｎｙら，１９９２ａ，ｂ）。デュアル特異性キナーゼはタンパク質中のチロシン残基及びセリン／トレオニン残基の双方をリン酸化し得る。活性化されたＭＡＰＫは核に転位し、核でｃ−Ｍｙｃ、Ｃ／ＥＢＰβ、ｐ６２ＴＣＦ／Ｅｌｋ−１、ＡＴＦ−２及びｃ−Ｊｕｎのような様々の転写因子を直接的にリン酸化し活性化し得る。Ｇｒｕｎｉｃｋｅ，Ｈａｎｓ  Ｈ．，Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９５）。
【００１２】
哺乳類のＭＡＰキナーゼには、細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ，ＥＲＫ）、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びＣＳＢＰ／ｐ３８／ＲＫ／Ｍｐｋ２キナーゼがある（Ｃｏｂｂら）。これらのサブグループは、ＭＡＰキナーゼ活性化に必要なトリペプチドデュアルリン酸化モチーフの配列：Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（ＥＲＫ）、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＪＮＫ）及びＴｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｐ３８）によって識別される。最も特性決定の進んだ経路は細胞外−シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化する経路である。ｃＪｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ３８ＭＡＰＫを活性化するシグナル伝達経路についてはそれほど理解は進んでいない。Ｄａｖｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：４７０−４７３（１９９４）参照。各経路は、ＭＡＰキナーゼまたはＥＲＫ、ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）及びＭＥＫキナーゼ（ＭＥＫＫ）から成るＭＡＰキナーゼモジュールを含む。
【００１３】
公知の全てのシグナル伝達経路はＭＡＰキナーゼをリン酸化及び活性化するために２つのデュアル特異性プロテインキナーゼＭＥＫ１及びＭＥＫ２を使用すると考えられている。ＭＡＰキナーゼの基質としては、リン酸化によって活性化されて遺伝子発現を誘発する別のプロテインキナーゼ及び複数の転写因子がある。
【００１４】
ＪＮＫ及びｐ３８キナーゼはプロ炎症性サイトカインＴＮＦ−α及びインターロイキン−１に応答して、また、熱ショック、紫外線、リポ多糖類及びタンパク質合成インヒビターのような細胞性ストレスによって活性化される。Ｂ．Ｄｅｒｉｊａｒｄら，Ｃｅｌｌ，７６，ｐｐ．１０２５−３７（１９９４）；Ｌ．Ｓｈａｐｉｒｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２，ｐｐ．１２２３０−４（１９９５）参照。ＭＡＰＫキナーゼ、特にｐ３８経路の活性化の結果として転写因子及び開始因子がリン酸化され、細胞分裂、アポトーシス、培養細胞の浸潤性及び炎症応答に影響を及ぼす。
【００１５】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、ＭＡＰ−キナーゼ活性化プロテインキナーゼＭＡＰＫＡＰ−２及びＭＡＰＫＡＰ３、ＭＡＰ−キナーゼ相互作用性キナーゼＭＮＫ１及びＭＮＫ２、並びに、ｐ３８−調節／活性化プロテインキナーゼＰＲＡＫ及びＭＳＫ１のような多くのプロテインキナーゼを活性化する。更に、ＡＴＦ２（活性化転写因子２）、ＣＨＯＰ／ＧＡＤＤ１５３及びＭＥＦ２（筋細胞エンハンサー因子２）のような転写因子が同時にリン酸化される。ｐ３８ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達のターゲットが核であることが最近になって判明した。
【００１６】
上記と極めて対照的に、ＥＲＫキナーゼはマイトジェン及び増殖因子によって活性化される。Ｄ．Ｂｏｋｅｍｅｙｅｒら，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４９，ｐｐ．１１８７−９８（１９９６）。ＥＲＫカスケードは１つまたは複数のＲａｆファミリーキナーゼによって開始され、これらのキナーゼがＭＡＰキナーゼキナーゼ１（ＭＫＫ１）及びＭＫＫ２をリン酸化及び活性化し、その結果としてＭＫＫがＭＡＰキナーゼ細胞外シグナル調節キナーゼ１（Ｅｒｋ１）及びＥｒｋ２をリン酸化及び活性化し得る（Ｄａｖｉｓ，１９９３；Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９５）。Ｅｒｋが次に、表皮増殖因子受容体、サイトゾルホスホリパーゼＡ２、リボソームＳ６キナーゼＩＩ（Ｒｓｋ）、Ｅｌｋ−１（三重複合体因子）、ｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｍｙｃのような細胞質及び核の双方の基質をリン酸化する（Ｓｔｕｒｇｉｌｌら，１９８８；Ｐｕｌｖｅｒｅｒら，１９９１；Ｇｉｌｌｅら，１９９５）。ＥＲＫカスケードの活性化によって生じる最終結果は細胞増殖または分化に導く最初期遺伝子転写の誘発である。活性化されたＭＡＰキナーゼは核に転位し転写因子をリン酸化すると報告されている。
【００１７】
ＭＡＰキナーゼの基質としては、Ｓ６キナーゼ−ｒｓｋ１及びｒｓｋ２（ｐ９０ｒｓｋ）及びＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰ−２）がある。後者はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ−２の頭字語である。
【００１８】
ＭＡＰＫＡＰ−２はマイトジェン活性化プロテインＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）のｐ４２及びｐ４４のアイソフォームによって活性化される酵素として骨格筋中で初めて同定された（Ｓｔｏｋｏｅら，１９９２ａ）。ＭＡＰＫＡＰ−２は、基質特異性、インヒビターＨ７に対する不感受性及びアミノ酸配列によって、同じくｐ４２／ｐ４４ＭＡＰＫによって活性化されるリボソームプロテインＳ６キナーゼ（ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１）のＲＳＫファミリーから識別される（Ｓｔｏｋｏｅら，１９９２ａ，１９９３）。ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２の触媒ドメインは、複数のカルモジュリン依存性プロテインキナーゼを含むプロテインキナーゼ系統樹の１分枝及びＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２のＣ末端キナーゼドメインに極めて類似している（３５％−４０％一致）（Ｓｔｏｋｏｅら，１９９３，Ｅｎｇｅｌら，１９９３）。該ドメインの前にプロリンに富むＮ末端ドメインが存在し、また、共通前駆体ｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングによって異なる２つのＣ末端配列が形成され得ると報告されている。これらのアイソフォームの１つは、推定される核局在シグナルＫＫ（Ｘ）１０ＫＲＲＫＫを含んでいる（Ｓｔｏｋｏｅら，１９９３；Ｚｕら，１９９４）。ＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡ転写物は試験したどの哺乳類組織にも同様の濃度で存在している（Ｓｔｏｋｏｅら，１９９３；Ｚｕら，１９９４）。
【００１９】
ＭＡＰＫＡＰ−２の基質としては、グリコーゲンシンターゼ、スモール熱ショックタンパク質Ｈｓｐ−２５及びＨｓｐ−２７、ＡＴＦ２及びＣＲＥＢがある（Ｓｔｏｋｏｅら，１９９２ｂ；Ｆｒｅｓｈｅｎｙら，１９９４；Ｔａｎら，１９９６）。最も特性決定されたＭＡＰＫＡＰ−２の基質はＨｓｐ２７である。
【００２０】
ＭＡＰＫＡＰ−２は、細胞をインターロイキン−１もしくは腫瘍壊死因子で刺激するかまたは細胞ストレスに曝したときに活性化される（Ｒｏｕｓｅら，１９９４）。ＭＡＰＫＡＰ−２はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｒｋｓによってリン酸化及び活性化される。しかしながら細胞中ではＭＡＰＫＡＰ−２はｐ３８ＭＡＰＫによって支配的に調節されている。炎症応答中には、ＴＮＦ−α及びＩＬ−βがｐ３８を活性化し、これはＴＮＦ及びＩＬ−１の産生増加を起動する。ＴＮＦ及びＩＬ−１は次に炎症応答を増幅する。このプロセスは敗血症ショック及びアテローム性動脈硬化巣の形成に１つの役割を果たすと考えられている。
【００２１】
最近の文献を考察すると、ｐ３８キナーゼ及びＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ経路が化学的、機械的及びプロ炎症性襲撃に対する細胞の応答における中心成分であるという考え方がほぼ定説になっている。
【００２２】
例えば、ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８経路がＩＬ−２産生に強いつながりをもつ明らかな証拠が示された。ＩＬ−２遺伝子の転写及びＴ−細胞増殖に導く十分なＴ−リンパ球活性化にはｐ３８の活性化が必要であることは明白に確認された。従って、選択的キナーゼ阻害によるシグナル伝達プロセスの遮断がＩＬ−２産生及びＴ−リンパ球増殖を抑制すると予測され、これらは、リューマチ様関節炎、クローン病及び炎症性腸疾患を非限定例とする慢性炎症疾患の治療に有効であろう。
【００２３】
本文に記載のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ（配列番号２）は、プロ炎症性遺伝子産物の活性化に導くストレス関連刺激に対する細胞応答を伝達すると考えられている。サイトカインのような炎症メディエイタの有害作用が独創的な抗炎症療法の開発に新しい道を開く。ＭＡＰＫ及びＭＡＰＫＡＰ−２は、ストレスに対する細胞応答を仲介するシグナル伝達イベントで中心的な役割を果たすので、これらの不活性化またはこれらに対する拮抗作用は応答を減衰させるために極めて重要である。
【００２４】
従って、ＭＡＰＫＡＰ−２も含めたＭＡＰＫ類は、リューマチ様関節炎（ＲＡ）、クローン病、炎症性腸疾患、骨関節炎（ＯＡ）及び多発性硬化症（ＭＳ）に限定される訳ではないが、これらを含む自己免疫疾患の病理に極めて重要な役割を果たしていると予測される。
【００２５】
従って、本文に記載の新規なヒトのセリン／トレオニンシグナル伝達キナーゼ（配列番号２）及び該キナーゼをコードする核酸配列、例えば配列番号１は、機能不全のＴリンパ球を非限定例とする機能不全の白血球をコントロールするため、リューマチ様関節炎（ＲＡ）、クローン病、炎症性腸疾患、骨関節炎（ＯＡ）及び自己免疫疾患を治療するため、急性及び慢性の炎症並びに機能不全の天然型ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼによって発症する別の疾病を研究、診断及び治療するために診断用及び治療用に使用できる特異的ターゲットとして有意な潜在能力を有している。
【００２６】
実際、本文に記載のヒトＭＡＰＫＡＰ−２シグナル伝達セリン／トレオニンキナーゼをモジュレーターとして使用する潜在的な診断用及び治療用の用途は容易に明らかになるであろう。治療的な介入を特に必要とする疾病の共通分野の非限定例は、機能不全の白血球、Ｔ細胞活性化によって発症する病態生理的障害、急性及び慢性の炎症性疾患、例えば、リューマチ様関節炎（ＲＡ）、クローン病、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、骨関節炎、移植拒絶、マクロファージ調節、アテローム性動脈硬化症、線維芽細胞調節、病的線維症、喘息、アレルギー反応、アテローム、骨関節炎、敗血症、神経変性及び関連疾患などである。
【００２７】
特異的サイトゾル経路に組み込まれる（１つまたは複数の）特異的シグナル伝達ポリペプチドを調節または不活性化する化合物は一般に、下流の生理的応答を調節または減衰させる有意な潜在能力を有しているであろう。従って、本文中に記載のような天然型または組換えヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの活性を調節する化合物をスクリーニングできることは、治療薬の開発にとって最も重要である。従って、出願人らは、ターゲットに基づく薬物設計プログラムに役立つようなヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをクローニングすることを試みた。
【００２８】
出願人らはここに、本文に記載の新規なヒトセリン／トレオニンシグナル伝達キナーゼの発現クローニングによる単離を報告する。出願人らは、新規なキナーゼをコードする新しく発見された単離核酸分子はＰＫＡＰ−２キナーゼが関与する欠陥シグナル伝達経路に付随する種々の障害を治療するために有効な治療薬候補の開発を可能にすると信じている。
【００２９】
本発明の新規なキナーゼは公知のＭＡＰＫＡＰ−２に比べて１つまたは複数の塩基に接触するアミノ酸残基が異なっている配列を有しているか、または、公知のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの配列とは異なっており従って公知の配列から識別できるヌクレオチド塩基配列を有している。
【００３０】
(発明の開示)
本発明は新規に同定された酵素ＭＡＰＫＡＰ−２を開示する。この酵素は、特にＥｒｋｓ及びｐ３８  ＭＡＰＫによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化及び活性化されるセリン／トレオニンシグナル伝達キナーゼである。
【００３１】
より特定的には本発明は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸分子、組換え核酸分子、組換え核酸分子を含有する細胞、アンチセンスＭＡＰＫＡＰ−２核酸構築物、このようなタンパク質に対して誘発された抗体、該抗体を含有するハイブリドーマ、ＭＡＰＫＡＰ−２核酸を検出する核酸プローブ、サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２核酸またはポリペプチドの検出方法、核酸プローブまたは抗体を含むキット、ＭＡＰＫＡＰ−２またはそのフラグメントに結合し得る化合物の（１つまたは複数の）検出方法、ＭＡＰＫＡＰ−２活性のアゴニストまたはアンタゴニストの検出方法、哺乳類の体内でＭＡＰＫＡＰ−２関連活性を刺激または抑制する方法、哺乳類体内の（１つまたは複数の）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの正常に比べて過多または過少の発現に付随する病的状態を開示ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストによって治療する方法、ＭＡＰＫＡＰ−２アゴニストまたはアンタゴニストを含む医薬組成物に関する。
【００３２】
キナーゼをコードする単離核酸分子は好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
本発明の別の目的は、配列番号１で表される核酸配列と緊縮条件下でハイブリダイズし得る核酸分子を含み、該核酸分子が発現ベクターに作動可能に連結されている組換え分子を提供することである。
【００３４】
配列番号１で表される配列を含むポリペプチドの相補配列を含む（１つまたは複数の）アンチセンス分子も提供される。より特定的には本発明の目的は、配列番号１の核酸コーディング領域の転写／翻訳を調節する能力を有しているアンチセンス分子に及ぶ。
【００３５】
ヒトのＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの生物活性を調節する化合物を同定する方法も提供される。
【００３６】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体も提供される。
【００３７】
本発明は更に、組換え宿主細胞内で本発明のシグナル伝達キナーゼを発現させる発現ベクターを目的とする。該ベクターは、実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有しているキナーゼまたはその薬理学的及び／または生物学的に活性のもしくは生物学的に有効な誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。
【００３８】
本発明は更に、配列番号１に由来のアンチセンス核酸配列を含む生物学的に有効な核酸分子を発現させる発現ベクターを目的とする。該核酸分子は、本発明のシグナル伝達ポリペプチドの核酸コーディング領域の転写／翻訳を調節する能力を有している。
【００３９】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードしている上述のＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはプラスミドを含有するに組換え細胞も本発明で提供される。
【００４０】
実際、本発明の１つの目的は、シグナル伝達ポリペプチドを発現させる発現ベクターを含有する宿主細胞を提供することである。該ベクターは実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有しているシグナル伝達ポリペプチドまたはその薬理学的及び／または生物学的に活性のもしくは生物学的に有効な誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。
【００４１】
本発明のまた別の目的は、本文に開示されたポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすべく十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブに及ぶ。本発明の核酸プローブによって遺伝子工学業界の平均的な当業者は任意の種から同様のポリペプチドを同定及びクローニングすることができ、これによって本発明の配列の用途を拡大し得る。
【００４２】
本発明はまた、配列番号１に由来の単離及び精製された核酸分子を目的とする。核酸分子は、実質的に配列番号２で表される生物学的に有効なドミナントネガティブ突然変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの生物活性及び／または薬理活性を調節する能力を有している。
【００４３】
新しく開示された種類のタンパク質セリン／トレオニンキナーゼは、細胞の表面の受容体から開始されたシグナルを調節することができ、その調節能力はこの種類のキナーゼによるＭＡＰＫ−依存性経路の活性化に依存している。本文で開示されたポリペプチドは配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸分子と緊縮条件下でハイブリダイズし得る核酸配列によってコードされたアミノ酸配列の少なくとも一部分を含んでいる。
【００４４】
本発明の別の目的は、実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを提供することである。生物学的に活性のそのフラグメントも包含される。
【００４５】
本発明の別の目的は、シグナル伝達経路のシグナル伝達ポリペプチド、特に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの活性と特異的に相互作用し該活性を調節する潜在的に薬理学的有効性をもつ化合物のスクリーニング及び定量的キャラクタリゼーションを行う（１つまたは複数の）アッセイを提供することである。
【００４６】
本発明は更に、シグナル伝達分子の生物活性及び／または薬理活性を調節する化合物の同定方法であって、
（ａ）シグナル伝達活性を調節すると推測される候補化合物と配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとを組合せる段階と、
（ｂ）ポリペプチドの生物活性及び／または薬理活性に対する候補化合物のモジュレーター効果を測定する段階とから成る方法を提供する。
【００４７】
本発明は更に、シグナル伝達分子の生物活性及び／または薬理活性を調節する化合物の同定方法であって、
（ａ）シグナル伝達活性のモジュレーター候補化合物と配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する宿主細胞とを組合せる段階と、
（ｂ）ポリペプチドに付随する生物活性及び／または薬理活性に対する候補化合物のモジュレーター効果を測定する段階とから成る方法を提供する。このような測定は、ポリペプチドのレベルまたは活性の変化を検出する段階を含む。
【００４８】
本発明はまた、上記方法のいずれか１つによって同定された化合物を目的とする。該化合物は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの生物活性及び／または薬理活性、即ちキナーゼ活性を調節する。
【００４９】
更に本発明は、上記方法のいずれか１つによって同定された化合物を含み、該化合物がＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの生物活性及び／または薬理活性を調節するような医薬組成物を目的とする。
【００５０】
機能不全のシグナル伝達経路によって発症する疾病状態の（１つまたは複数の）治療方法も提供される。１つのこのような方法は、化合物がＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの生物活性及び／または薬理活性を調節することが上記方法のいずれか１つによって同定された化合物を有効量で投与するか、または、実質的に配列番号２で表される生物学的に有効なドミナントネガティブ突然変異体またはその機能性誘導体を有効量で投与することから成る。
【００５１】
代替的な実施態様は、欠陥シグナル伝達分子によって仲介される病態生理状態の治療を要する患者の治療方法に及ぶ。該方法は、配列番号１に由来の生物学的に有効なアンチセンス核酸分子を有効量で投与するか、または、実質的に配列番号２で表される生物学的に有効なドミナントネガティブ突然変異体またはその機能性誘導体をコードする核酸を有効量で投与することから成る。
【００５２】
本発明の更に別の目的によれば、実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むシグナル伝達ポリペプチドに特異的な抗体、実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド配列を同定するための診断用組成物が提供される。
【００５３】
本発明はまた、配列番号１に由来のＰＣＲプライマー、及び、実質的に配列番号１で表される核酸分子の作製方法を目的とする。
【００５４】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを含有するプラスミドも提供される。
【００５５】
本発明の別の特徴によれば、組換え技術によって本発明のシグナル伝達キナーゼを産生させる方法が提供される。該方法は、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸配列を含有している原核性及び／または真核性の形質転換宿主細胞を（１つまたは複数の）キナーゼポリペプチドの発現を促進する条件下で培養する段階と、次いで（１つまたは複数の）ポリペプチドを回収する段階とから成る。
【００５６】
別の目的によれば、本発明は、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの発現レベルを調節し、これによって本文に開示された新規なキナーゼに直接または間接に関係付けられる障害を治癒的及び／または予防的に治療する手段を提供する。
【００５７】
また、医薬的に許容される担体中に、（ａ）本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、（ｂ）免疫学的に活性または生物学的に活性のそのフラグメント、または、（ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）に親和性を有している抗体を含む治療用組成物も本発明に包含される。これらの治療用組成物は、発現もしくは活性の異常（低下または遍在）レベルまたは実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有している欠陥シグナル伝達ポリペプチドを特徴とする種々の障害の治療手段を提供する。
【００５８】
本発明のシグナル伝達キナーゼが得られたことに基づいて、天然型または組換えＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと（１つまたは複数の）その結合相手、即ち、いずれもＭＡＰＫＡＰ−２をリン酸化することが公知のＥＲＫまたはｐ３８のような上流キナーゼ、または、活性化ＭＡＰＫＡＰ−２によってリン酸化されるＨｓｐ−２７もしくはＨｓｐ−２５のような下流のターゲット基質との相互作用を刺激または阻害するアゴニストまたはアンタゴニストを同定し得る。実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有しているＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを発現する細胞の代謝及び反応性はアゴニストまたはアンタゴニストによってコントロールされ、これによって問題の疾病を軽減しまたはいくつかの場合には予防する手段を提供する。
【００５９】
上記に従って、ＭＡＰＫＡＰ−２に結合しＭＡＰＫＡＰ−２を活性化するか（アゴニスト）または活性化を阻害する（アンタゴニスト）化合物のスクリーニング方法が提供される。実際、様々な潜在的アゴニストまたはアンタゴニストによって本文に開示されたキナーゼを試験すると、キナーゼの機能及び活性に関する追加の情報が提供されるであろう。このような情報から、本文に開示されたシグナル伝達キナーゼと極めて特異的に相互作用し得る化合物の同定に到達し得る。このような特異性は医学的用途で極めて価値が高いことが判明している。このようなアッセイは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに結合しこれによってキナーゼとその結合相手との相互作用をブロックまたは阻害する化合物を同定するように設計し得る。別のアッセイは、ＭＡＰＫＡＰ−２に仲介される細胞内経路を刺激し得る化合物を同定するように設計できる。
【００６０】
本文に開示されたヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのアゴニストまたはアンタゴニストの検出方法は、ＭＡＰＫＡＰ−２を産生する細胞を１つの化合物の存在下でインキュベートする段階と、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの活性レベルの変化を検出する段階とから成る。
【００６１】
本発明の別の目的は、ＭＡＰＫＡＰ−２関連キナーゼ活性を変化させるに十分な量のＭＡＰＫＡＰ−２アゴニストまたはアンタゴニストと医薬的に許容される希釈剤、担体もしくは賦形剤とから成る医薬組成物に及ぶ。
【００６２】
本発明のまた別の目的によれば、新規な本発明ポリペプチドをコードする核酸配列中の突然変異に関係した疾病を検出するため、及び、コードされたポリペプチドのレベル変化を検出するための診断用アッセイが提供される。
【００６３】
また、本文に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを様々な潜在的アゴニストまたはアンタゴニストで試験すると、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの機能及び活性に関する追加情報が提供され、天然型ＭＡＰＫＡＰ−２との極めて特異的な相互作用またはその結合相手との相互作用を生じ得る化合物の同定及び設計に到達し得る。
【００６４】
本文に開示された新規な核酸、これらの核酸によってコードされているポリペプチド、本発明で提供されるベクター及び細胞は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、該キナーゼに対する抗体、及び、該抗体に対する抗体を産生し得る。これによって、その存在が本発明ポリペプチドだけの分析を妨害し得る他の多くの夾雑タンパク質を実質的に含有しない合成または組換えキナーゼポリペプチドタンパク質の製造手段が提供される。新規なＭＡＰＫＡＰ−２を利用できれば、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに対する薬物の効果を観察することができ、これによって本文に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはその天然型及びその対応結合相手に特異的な薬物の初期ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを１つの試験系で行うことが可能になる。
【００６５】
更に、欠陥シグナル伝達経路、特に実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する（１つまたは複数の）欠陥シグナル伝達ポリペプチドが担当する欠陥シグナル伝達経路によって仲介される疾病を検出するための診断用アッセイも提供される。
【００６６】
また、本発明の特異的抗体を入手できれば、ＭＡＰＫＡＰ−キナーゼ及びその対応リガンド（例えば、正常ｖｓ疾患脳組織）の分布及び発現密度をモニターするために免疫組織化学の技術を応用することが可能になる。このような抗体はまた、診断及び治療の用途に使用できよう。この抗体は好ましくは、ポリペプチドの生物活性（即ち、アデニル酸シクラーゼ活性化）を中和し得る。
【００６７】
従って、本発明のキナーゼと共に免疫複合体を形成し得る抗体の精製調製物も含めたこのような抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）は、ポリペプチドまたはそのフラグメントを抗原として使用することによって産生させ得る。
【００６８】
その結果として、本発明の１つの目的は、細胞内シグナルで調節された実質的に純粋なキナーゼを提供することである。該タンパク質は配列番号２で表されるアミノ酸配列を有しているヒトキナーゼポリペプチドに選択的に結合し得る抗体を使用して単離される。
【００６９】
本発明の別の目的は、ＭＡＰＫ依存性経路の少なくとも１つの酵素によってリン酸化されるポリペプチドに選択的に結合し得る単離抗体に関する。該抗体は、実質的に純粋な本発明のタンパク質を有効量で動物に投与する段階とタンパク質に選択的に結合し得る抗体を回収する段階とを含む方法によって得ることができる。
【００７０】
本発明のまた別の目的によれば、本発明のシグナル伝達キナーゼまたは（１つまたは複数の）このようなキナーゼをコードする核酸分子をＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの作製、キナーゼアッセイなどのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ目的に利用する方法が提供される。
【００７１】
更に、薬剤開発及び種々の疾病状態の治癒的治療に関しては、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするポリヌクレオチドを入手できれば、このような遺伝子中で幾つかの疾病状態の発症に相関関係を有し得る改変（たとえば変異）を同定することが可能になる。更に、このような突然変異を合成ＤＮＡ配列に特異的に導入し、次いでその効果を判定するために該合成ＤＮＡを実験動物またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系に導入することによってこのような疾病状態の動物モデルの作製が可能になる。
【００７２】
これらの目的及びその他の目的の少なくとも幾つかは本文に開示された種々の実施態様において取り扱う。本発明のその他の特徴及び利点は明細書及び特許請求の範囲を更に読み込むことによって当業者に明らかになるであろう。
【００７３】
本文及び特許請求の範囲に使用された不定冠詞及び定冠詞を付けて単数形で表された用語は、複数形を含まないことが文脈から明らかでないときは複数形を含意する。従って、例えば、“１つの宿主細胞”という表現は複数のこのような宿主細胞を含意する。また“抗体”という表現は１つまたは複数の抗体及び当業者に公知のその等価物を含意する。その他に関しても同様である。
【００７４】
以下の（１つまたは複数の）定義及び（１つまたは複数の）記載は、末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２をコードする（１つまたは複数の）ポリヌクレオチド及びコードされた（１つまたは複数の）タンパク質（それぞれ配列番号１及び２）を対象としているが、これらの定義及び記載が全長クローン（配列番号３及び４）にも同様に通用することは理解されよう。
【００７５】
異なる定義がない限り、本文中で使用したすべての技術的及び科学的用語は本発明が属する分野の平均的な当業者が普通に理解する意味と同義である。本文中に記載の方法及び材料と同様または等価の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することはできるが、好ましい方法、装置及び材料を以下に記載する。
【００７６】
刊行物に報告されている本発明に使用できるような手順、ベクターなどを記載し開示する目的で本文に引用したすべての刊行物は参照によって本発明に含まれるものとする。本発明は先行発明に基づいたこのような開示に先行する権利がないことを認めたと解釈できる表現は本文中に全く存在しない。
【００７７】
以下の記載中、組換えＤＮＡ技術の分野で使用される多くの用語が多く使用されている。これらの用語に与えるべき範囲も含めて、明細書及び特許請求の範囲がより明白にかつ確実に理解できるように、これらの用語を以下に定義する。
【００７８】
“遺伝子”という用語は、そのヌクレオチド配列がポリペプチド分子をコードしている核酸分子を意味する。遺伝子は割り込みのないヌクレオチド配列でもよく、または、イントロン、プロモーター領域、スプライシング部位及び反復配列のような介在セグメントを含んでいてもよい。遺伝子はＲＮＡでもよくまたはＤＮＡでもよい。好ましい遺伝子は、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする遺伝子である。
【００７９】
本発明の明細書及び特許請求の範囲でＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾語として“単離された”及び／または“精製された”という用語が使用されているとき、このように呼ばれるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質がヒトの手によってこのような形態で製造され、従ってそれらの天然のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞環境から離れていることを意味する。このヒトによる介入の結果として、本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド及びタンパク質は、天然に生じるときのＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド及びタンパク質には使用できないような本文中に記載の方法で使用できる。
【００８０】
同様に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾語として本文中に使用された“組換え”という用語は、このように呼ばれるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質が人間の力、例えば、クローニング、組換え発現などによって作製されたことを意味する。従って、例えば本文中で使用された組換えタンパク質という用語は、人間の力によって宿主に加えられたＤＮＡを発現する組換え宿主によって産生されたタンパク質を意味する。
【００８１】
本文中で使用された“挿入”または“付加”という用語はそれぞれ、天然に生じる分子に比較して１つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基が付加されるようなアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化を意味する。
【００８２】
本文中で使用された“置換”という用語は、１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドがそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドによって置換されることを意味する。
【００８３】
“シグナル伝達障害”という用語は、シグナル伝達経路の異常に関連する疾患または状態を意味する。このような異常は、欠陥ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの存在、または、その天然型の上流プロテインキナーゼ即ち哺乳類ＥＲＫもしくはｐ３８による不適正なリン酸化、または、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの低レベル発現もしくは遍在レベル発現の結果として生じ得る。あるいは、活性化ＥＲＫもしくはｐ３８が内因性ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと有効に相互作用せず、そのためシグナル伝達経路に異常が生じることもある。また、それらの間の相互作用、または、ＭＡＰＫＡＰ−２とその天然型結合相手のいずれかとの間の相互作用のレベルが正常であっても、相互作用がシグナル伝達経路障害を有効に治療できないこともある。
【００８４】
“障害”という用語は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはこのようなキナーゼをコードする核酸で治療することによって好転する任意の状態を意味する。この用語は、問題の障害に対する哺乳類の疾病素質のような病理的条件も含めた慢性及び急性の障害または疾病を含意する。障害の非限定例は、心血管系障害、神経系障害及び疼痛知覚障害などである。
【００８５】
“異常”または“異常な”という用語は、このような疾病または状態に罹っていない生物で観察されるレベルとは統計的に異なるレベルを意味しており、シグナルの過剰な量、強度もしくは持続時間またはシグナルの不十分な量、強度もしくは持続時間を特徴とする。シグナル伝達異常は、細胞の機能、生存率または分化状態の異常として現れる。また異常な相互作用レベルは正常レベルよりも高いことも低いこともあり、生物の正常な性能または機能を損なうであろう。
【００８６】
“シグナル伝達経路”という用語は、細胞外タンパク質受容体から細胞膜を介して細胞質に与えられるメッセージの伝達に関与する一連のイベントを意味する。シグナルは最終的に細胞に特定の機能を実行させ、例えばコントロール不能な増殖を生じさせ、これによってガンを引き起こす。シグナル伝達経路の種々のメカニズム（Ｆｒｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２：１７８５−１７９７，１９９３）は、所与のシグナルの量または強度を測定し得る方法を提供する。シグナル伝達経路の異常に関連する特定の疾病次第では、種々の症状を検出し得る。当業者は本文中に記載された様々な別の疾病に付随する症状を認識できる。更に、幾つかのアダプター分子は膜に向かう第二のシグナル伝達タンパク質を補充するので、種々のタンパク質及び複合体の濃度及び局在性もシグナル伝達の１つの測定手段となる。更に、円二色性及び蛍光試験を使用してシグナルの伝達に関与するコンホメーション変化を観察し得る。
【００８７】
本文中で使用された“アゴニスト”という用語は、ＭＡＰＫＡＰ−２生物活性を模倣するかまたは正の調節を行う（例えば増強または補充する）薬剤を意味する。ＭＡＰＫＡＰ−２アゴニストは野生型ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質または野生型ＭＡＰＫＡＰ−２の少なくとも１つの生物活性をもつその誘導体でよい。ＭＡＰＫＡＰ−２治療薬はまた、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の発現の正の調節を行うかまたはＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質の少なくとも１つの生物活性を増加させる化合物でもよい。アゴニストはまた、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと別の分子、例えばその基質との相互作用を増加させる化合物でもよい。あるいは、“アゴニスト”が、ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質に結合したときにＭＡＰＫＡＰ−２の効果を増加させるかまたは効果の持続期間を延長させる分子を指してもよい。
【００８８】
本文中で使用された“アンタゴニスト”という用語は、少なくとも１つのＭＡＰＫＡＰ−２生物活性の負の調節を行う（例えば抑制または阻害する）薬剤を意味する。ＭＡＰＫＡＰ−２アンタゴニストは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと別の分子、例えば下流のターゲット分子との相互作用を阻害または抑制する化合物でもよい。従って、好ましいアンタゴニストは、ＭＡＰＫＡＰ−２がその上流キナーゼ、例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２を活性化するＭＡＰＫ酵素またはＭＡＰＫＡＰ−２によって活性化される下流ターゲット基質に結合することを阻害または抑制する化合物である。アンタゴニストはまた、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の発現の負の調節を行うかまたはＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質の存在量を減少させる化合物でもよい。ＭＡＰＫＡＰ−２アンタゴニストはドミナントネガティブ形態のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２転写因子によって調節されるが転写を調節できない遺伝子の上流領域と相互作用し得るＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの形態でもよい。ＭＡＰＫＡＰ−２アンタゴニストはまた、ドミナントネガティブ形態のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ＭＡＰＫＡＰ−２アンチセンス核酸、または、ＭＡＰＫＡＰ−２  ＲＮＡと特異的に相互作用し得るリボザイムであってもよい。また別のＭＡＰＫＡＰ−２アンタゴニストはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに結合しその作用を阻害する分子である。このような分子にはペプチド、抗体及び小分子がある。
【００８９】
本文中で使用された“ドミナントネガティブ突然変異体”という用語は、対応する野生型天然形態に対して配列中の少なくとも１つの位置に関する変化、好ましくは天然型ペプチド中の生物活性及び／または薬理活性に必要な活性部位のアミノ酸残基位置を変化させる位置に変化が生じ、これによって突然変異ペプチドをコードするようになった核酸コーディング領域配列を意味する。本文中で使用されたドミナントネガティブ突然変異体はまた、突然変異ペプチドに対しても同様の意味で使用し得る。
【００９０】
従って、“ドミナントネガティブ突然変異タンパク質”という用語は、正常なシグナル伝達経路を妨害する突然変異タンパク質を意味する。ドミナントネガティブ突然変異タンパク質は、該当ドメイン（例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはＮＢＰ）を含んでいるが、例えば同じタンパク質の第二ドメインの結合を妨害することによって適正なシグナル伝達を妨害する突然変異を有している。ドミナントネガティブタンパク質の一例はＭｉｌｌａｕｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｆｅｂ．１０，１９９４に記載されている。記載された薬剤は好ましくは、実質的に配列番号２で表される配列を有しているシグナル伝達キナーゼとＮＢＰとの相互作用をブロックまたは促進するペプチドである。ペプチドは組換えペプチドでも精製ペプチドでもよく、または、医薬的に許容される担体もしくは希釈剤中に配置されてもよい。
【００９１】
本文中に使用された“調節”という用語は、実質的に配列番号２で表される配列を有しているシグナル伝達分子の生物活性及び／または薬理活性を増進または阻害する能力、または、本発明核酸の核酸コーディング領域の機能的特性を増進または阻害する能力を意味する。本文中で使用された“調節する”という用語はまた、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの生物活性の変化または変質を意味する。
【００９２】
調節は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのタンパク質活性の増加もしくは減少でもよく、結合特性の変化、または、生物的、機能的もしくは免疫的特性の何らかの別の変化でもよい。
【００９３】
アンチセンス核酸分子及びドミナントネガティブ突然変異核酸コーディング領域及びドミナントネガティブ突然変異ペプチドに関して本文中で使用された“生物学的に有効な”という用語は、本発明の新規なシグナル伝達タンパク質キナーゼの生物活性及び／または薬理活性及び／または本発明の新規なシグナル伝達タンパク質キナーゼの核酸コーディング領域の転写／翻訳を調節するこれらの分子の能力を意味する。
【００９４】
本文に開示された新規な核酸分子またはポリペプチドについて本文中で使用された“機能性誘導体”という用語は、本文中に定義したような機能的な生物活性及び／または薬理活性を有しており配列番号１または配列番号２に由来する統一体、例えば、末端欠損形態、欠失を有する形態、機能性フラグメント、置換を有する形態、挿入もしくは延長末端を有する形態、または、生物学的に有効なドミナントネガティブ突然変異体、または、生物学的に有効なアンチセンス分子を意味する。
【００９５】
本文中で使用された“直接投与”という用語は、本発明の実施態様及び／または機能性誘導体（例えば配列番号１または２）を含む核酸分子、ペプチドまたは化合物の直接投与を意味する。直接投与の非限定例は遺伝子治療である。
【００９６】
本文中で使用された“抗体”という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖及びヒト化した抗体、並びに、Ｆａｂもしくはその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物を含むＦａｂフラグメントを包含する。
【００９７】
本文中で使用された“許容される担体”という用語は、リン酸塩緩衝生理食塩水、水、水中油型もしくは油中水型エマルジョン、様々な種類の湿潤剤のような標準的医薬担体のいずれをも包含する。
【００９８】
本発明の核酸、オリゴヌクレオチド（アンチセンスを含む）、これらを含有するベクター、形質転換宿主細胞、ポリペプチド及びその組合せ、並びに、本発明の抗体は、化合物が本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得るか否かについて判定するための化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに使用できる。
【００９９】
従って、（１つまたは複数の）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼポリペプチドに結合する化合物の同定方法も本発明によって考察される。本発明の（１つまたは複数の）キナーゼは競合的結合アッセイに使用できる。このようなアッセイは、どの化合物が本発明の（１つまたは複数の）キナーゼに結合できるか否かを判定するための多くの化合物の高速スクリーニングに適している。、結合することが判明した化合物については、このような化合物が本発明の（１つまたは複数の）キナーゼポリペプチドのモジュレーター、アゴニストまたアンタゴニストのいずれの作用を行うかを判断するために引き続いてより詳細なアッセイを行うことができる。
【０１００】
当業者には理解されるであろうが、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのキナーゼ活性を調節する化合物を同定するアッセイ方法では一般に対照との比較が必要である。１つの種類の“対照”は、“対照”細胞または培養物を化合物に接触させないこと以外は、化合物に接触させる被験細胞または被験培養物と実質的に同じ処理を受ける細胞または細胞培養物を意味する。例えば、電圧クランプ電気生理的手順を使用する方法では、細胞を浸漬させる外部溶液を変えるだけで同じ細胞を化合物の存在下または非存在下で試験できる。別の種類の“対照”細胞または培養物は、“対照”細胞または培養物が本発明のポリペプチドを発現しないこと以外は、形質転換細胞に等しい細胞または培養物でもよい。従って、化合物に対する形質転換細胞の応答を同じ反応条件下の同じ化合物に対する“対照”細胞または培養物の応答（または応答の欠如）に比較する。
【０１０１】
本発明のまた別の実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの活性化を、上述のバイオアッセイによって同定された少なくとも１つの有効量の化合物（アゴニストまたはアンタゴニスト）にキナーゼを接触させることによって調節できる。
【０１０２】
本発明の別の実施態様によれば、異常なシグナル伝達を特徴とする疾病状態を診断する方法が提供される。例えば、機能不全のシグナル伝達を特徴とする病的障害に罹っている患者からサンプルを採取し、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に実質的に相同のヌクレオチド配列を有している核酸プローブに接触させる。サンプル中に存在する何らかの相補ｍＲＮＡに対するプローブの結合を測定し、患者体内のこのような病的障害の退縮、進行または発症の指標とする。
【０１０３】
あるいは、本発明の核酸分子の遺伝子産物に特異的な検出可能プローブに患者のサンプルを、プローブ／遺伝子産物複合体の形成に有利な条件下で接触させることもできる。複合体の存在が患者体内の病的障害の退縮、進行または発症の指標となる。
【０１０４】
本発明の別の実施態様によれば、適当な包装材料中に少なくとも１つの本発明の核酸を含む好ましくはキット形態の診断用システムが提供される。診断用核酸は本文中に記載のキナーゼコーディング核酸に由来する。例えば１つの実施態様では診断用核酸が配列番号１に由来する。本文に開示した診断用システムは、ゲノムＤＮＡまたは被転写核酸（例えばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）中でＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸の有無を検定するアッセイに有用である。
【０１０５】
適当な診断用システムは少なくとも１つのアッセイに十分な量の少なくとも１つの本発明の核酸を含むか、または好ましくは２つ以上の発明の核酸を個別に包装された（１つまたは複数の）化学試薬として含む。典型的には、包装された試薬の使用説明書も添付されている。本発明の核酸プローブ及び／またはプライマーを本文に記載の本発明方法を実施するための適当なバッファ及び溶液と組合せたキット形態に組込むことは当業者には容易であろう。
【０１０６】
本文中に使用された“プロテインキナーゼ”という用語は、それ自体のリン酸化状態または別のタンパク質もしくはポリペプチドのリン酸化状態を調節し得るタンパク質またはポリペプチドを含意する。プロテインキナーゼは、セリン／トレオニン残基、チロシン残基、または、デュアル特異性キナーゼのようにセリン／トレオニン残基とチロシン残基との双方に特異性（即ち、リン酸化特異性）を有し得る。
【０１０７】
本文中で使用された“マイトジェン活性化プロテインキナーゼ”または“ＭＡＰＫ”という用語は、別のタンパク質をリン酸化及び活性化するという特徴的な活性を有しているプロテインキナーゼを意味しており、その非限定例は、ＭＡＰＫＡＰ−２である。ＭＡＰＫの例は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ及びＥＲＫである。これらは一般にデュアル特異性キナーゼである。
【０１０８】
“治療”という用語は、治癒的治療と予防的または防止的措置との双方を意味する。治療を要する者という用語は、既に障害を生じている者及び障害が生じ易い者または障害を予防する必要がある者の双方を意味する。
【０１０９】
“スクリーニング”という用語は、生物について１つの特性の有無を検査することを意味する。そのプロセスは、シグナル伝達レベル及び組換えもしくは天然産生のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとその天然の結合相手（ＮＢＰ）／基質との間の相互作用レベルのような種々の特性の測定または検出を含む。
【０１１０】
“ＮＢＰ”という用語は、ポリペプチドに天然に会合するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの天然の結合相手を意味する。特定の天然結合相手の構造（一次、二次または三次）はＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと天然の結合相手との間の特定タイプの相互作用に影響を及ぼすであろう。例えば、天然の結合相手がＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに相補的なアミノ酸配列を含むとき、可能な相互作用は共有結合であろう。同様に、別の構造的特徴は対応する別の相互作用を可能にするであろう。相互作用は特定の残基に限定されないが、具体的にはホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニン残基が関与するであろう。広範囲の配列がＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと相互作用できる。当業界で公知の技術を使用してＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの複数の天然結合相手を同定し得る。ＮＢＰはまた、天然及び合成のＭＡＰＫＡＰ−２基質を包含する。本発明のまた別の目的は、シグナル伝達経路の異常を特徴とする疾病または状態を有する生物の治療方法を提供することである。
【０１１１】
好ましい実施態様では、診断または治療される疾病または状態が上述のような疾病または状態であり、薬剤は、遺伝子治療または後述する等価の別の方法によって提供されるドミナントネガティブ突然変異タンパク質であり、薬剤は治療的に有効であり、後述するようなＥＣ５０またはＩＣ５０を有している。
【０１１２】
１００μＭ以下のＥＣ５０またはＩＣ５０が好ましく、５０μＭ以下がより好ましく、２０μＭ以下が最も好ましい。このような低いＥＣ５０またはＩＣ５０の利点は、低濃度の分子を治療または診断のためにｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用できることである。このような低いＥＣ５０またはＩＣ５０をもつ分子の発見によって、同様の力価及び有効性を有している追加の分子を設計及び合成することが可能になった。更に、筋肉細胞では分子が１００μＭ以下のＥＣ５０またはＩＣ５０を有し得る。
【０１１３】
“治療有効量”という用語は、治療的に適正な効果を有している医薬組成物の量を意味する。治療的に適正な効果は、患者の疾病もしくは状態の１つまたは複数の症状をある程度まで軽減するか、または、疾病もしくは状態に付随するかもしくは原因となる１つまたは複数の生理的もしくは生化学的パラメーターを部分的もしくは全面的に正常に戻す。一般に、治療有効量は、ＥＣ５０またはＩＣ５０、患者の年齢と体格、患者に付随する疾病次第で分子が約１ナノモルと１μモルとの間である。
【０１１４】
本発明はまた、細胞中のＭＡＰＫ依存性経路の活性を調節し得る治療用化合物を包含する。該化合物は、（ａ）細胞を推定調節分子に接触させる段階と、（ｂ）ＭＡＰＫ依存性経路の少なくとも１つの構成要素に特異的な少なくとも１つの基質の活性化またはリン酸化を測定することによって細胞中のＭＡＰＫ依存性経路の活性を調節するという推定調節化合物の能力を測定する段階とから成るプロセスによって同定される、基質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有しているヒトキナーゼポリペプチドである。これらの構成要素としてはＥＲＫまたはｐ３８があり、これらは双方ともＭＡＰＫ経路の構成要素でありＭＡＰＫＡＰ−２をリン酸化することが知られている。
【０１１５】
本発明の代替的実施態様は、機能不全のＭＡＰＫＡＰ−２仲介シグナル伝達経路によって発症する疾病の治療方法を提供する。該方法は、ＭＡＰＫ依存性経路の活性を低減し得る分子、活性化細胞外シグナル調節キナーゼによってリン酸化されるポリペプチドの活性を低減し得る分子及びそれらの組合せのような少なくとも１つの調節分子を含む治療用化合物を有効量で患者に投与することから成り、この場合の有効量は、疾病に関与する有害な細胞を消滅させる量を意味する。
【０１１６】
また別の目的として本発明によって提供されるスクリーニングアッセイは、その生殖細胞及び体細胞が本文に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはその天然基質を活性化させるに十分なタンパク質の選択部分をコードするヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック哺乳動物に関する。例えば本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする配列をヒト以外の哺乳類の胚に導入し得る複数の手段が存在し、このような手段の幾つかは例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０−１４６８−１４７４（１９８８）及びＷｅｓｔｐｈａｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１８１−１９６（１９８９）に記載されている。これらの文献は参照によって本発明に含まれるものとする。この場合、動物細胞が受容体を発現し、従って、選択されたアゴニストまたはアンタゴニストを試験するためまたはスクリーニングするための便利なモデルとして使用し得る。
【０１１７】
Ｉ．ＭＡＰＫＡＰ−２をコードするポリペプチドを含むＤＮＡ構築物；ＤＮＡ構築物を含有するベクター、宿主細胞、発現、など
新規なヒトシグナル伝達キナーゼ−ＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子がここに提供される。より特定的には、ＭＡＰＫＡＰ−２をコードする単離ｃＤＮＡ及び組換えメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が記載されている。単離核酸分子のスプライス変異体も記載されている。典型的には、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２がスプライス変異体として生じるのでないならば、ＭＡＰＫＡＰ−２をコードしているポリヌクレオチドは本文中に記載されたＭＡＰＫＡＰ−２コーディングＤＮＡに実質的な配列相同性（即ち、約９０％を上回る相同性）を有しているであろう。スプライス変異体をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡは、全体配列としてはここで提供されるＤＮＡまたはＲＮＡに９０％未満の相同性であるかもしれないが、このようなスプライス変異体は開示されたＤＮＡにほぼ１００％相同性の領域を含むであろう。
【０１１８】
“核酸”または“核酸分子”という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び適当な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを意味する。この用語はまた、ヌクレオチド類似体から作製され記載の実施態様に応用できるようなＲＮＡまたはＤＮＡの類似体、一本鎖（センスまたはアンチセンス）及び二重鎖のポリヌクレオチドを等価物として包含する。ＤＮＡは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡ、例えば、本文中に開示された新規なキナーゼをコードする遺伝子でもよい。
【０１１９】
異なる指定がない限り、“ヌクレオチド”という用語は、糖部分（ペントース）とリン酸塩基と窒素含有複素環塩基とから成るＤＮＡまたはＲＮＡのモノマーユニットを定義する。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に結合されており、塩基と糖との組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドがペントースの３′位または５′位に結合したリン酸塩基を含有するとき、これをヌクレオチドと呼ぶ。作動可能に連結されたヌクレオチドの配列を本文中で典型的には“塩基配列”または“ヌクレオチド配列”及び文法的に等価の名称で呼び、本文中では左から右に向かう方向が慣用の５′−末端から３′−末端の方向に対応する式によって表す。
【０１２０】
本文中に提示した“ヌクレオチド配列”の各々は、デオキシリボヌクレオチド（略号Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ）の配列として表される。しかしながら、核酸分子の“ヌクレオチド配列”という用語は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては、デオキシリボヌクレオチドの配列を意味しており、ＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては、対応するリボヌクレオチドの配列（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）を意味する。この場合、特定のデオキシリボヌクレオチド中のチミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）の各々がリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）で置換されている。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略号を使用して表された配列番号１の配列を有するＲＮＡ分子という用語は、配列番号１のデオキシリボヌクレオチドＡ、ＧまたはＣの各々が対応するリボヌクレオチドＡ、ＧまたはＣによって置換され、デオキシリボヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵによって置換された配列を有するＲＮＡ分子を含意すると理解されたい。
【０１２１】
“本発明のポリヌクレオチド”または“核酸”という用語は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、または、本文中に開示されたヌクレオチド配列に高緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの配列を含有するＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【０１２２】
本文中で使用された“スプライス変異体”という用語は、ゲノムＤＮＡの（１つまたは複数の）一次転写物のディファレンシャルプロセシングによって産生され、２種以上のｍＲＮＡを産生させる（１つまたは複数の）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼコーディング核酸の変異体を意味する。ディファレンシャルプロセシングされた一次転写物に由来のｃＤＮＡは、アミノ酸完全一致領域と別のアミノ酸配列をもつ領域とを有するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするであろう。従って、同じゲノム配列が多数の近縁ｍＲＮＡ及びタンパク質の産生に導く。得られるｍＲＮＡ及びタンパク質の双方を本文中で“スプライス変異体”と呼ぶ。
【０１２３】
本文中で使用された“対立遺伝子”または“対立遺伝子配列”または“対立遺伝子形態”という用語は、同じ機能のタンパク質をコードする遺伝子であるが同じ遺伝子の別の形態に比べて異なるヌクレオチド配列を含む代替的遺伝子形態を意味する。
【０１２４】
対立遺伝子は核酸配列中の少なくとも１つの突然変異の結果として生じ、その構造または機能が変化したかまたは不変化の変形ｍＲＮＡまたはポリペプチドを生じる。所与の天然または組換え遺伝子は、０、１または多数の対立遺伝子形態を有し得る。対立遺伝子を生じさせる大抵の突然変異的変化の原因は一般に、ヌクレオチドの自然的な欠失、付加または置換である。これらの種類の変化が所与の配列中に単独で生じてもよくまたは組合せて１回または複数回生じてもよい。
【０１２５】
本文中で使用された“対立遺伝子多型”または“対立遺伝子変異体”という用語は、１つの遺伝子の内部のヌクレオチド配列の変異を意味しており、この場合、普遍的集団中の別々の個体が遺伝子の別々の変異体を発現するであろう。
【０１２６】
本文中の“から本質的に構成される”という表現は、開示された配列を包含することを意味しており、自然的に生じるかまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的もしくは遺伝的な修飾の結果であるかにかかわりなく、開示された（１つまたは複数の）ヌクレオチド配列の対立遺伝子変異を含意する。このような変異体の各々が本文中に開示された対応するＭＡＰＫＡＰ−２のヌクレオチド配列と本質的に同じヌクレオチド配列を有することは理解されよう。
【０１２７】
核酸分子またヌクレオチド配列の“フラグメント”は、全長よりも短く、配列番号１のヌクレオチド配列に緊縮ハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし得る最小の長さを少なくとも含む核酸の一部分である。このようなフラグメントの長さは好ましくは１５−１７ヌクレオチドまたはそれ以上である。
【０１２８】
“変異”核酸分子という用語は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする天然型ヌクレオチド配列中に小変化、即ち、天然型配列の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、付加及び／または置換という変化を含み、好ましくは天然型核酸分子の生物活性を実質的に維持しているポリヌクレオチド配列を意味する。変異核酸分子は例えば、標準ＤＮＡ突然変異誘発技術または変異ＤＮＡ分子もしくはその一部分の化学的合成によって作製し得る。一般的に、基準のヌクレオチド配列と変異体とのヌクレオチド配列とが全体的にはほぼ相似であり多くの領域で一致しているような変異に限定される。
【０１２９】
変異ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の変化がサイレントでもよい。即ち、変化がポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸を変化させない。変化がこの種のサイレント変化に限定されている場合、変異体は基準と同じアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするであろう。
【０１３０】
あるいは、変化が“保存性”でもよい。保存性変異は、基準ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変えるようなヌクレオチド配列の変化である。このようなヌクレオチド変化の結果として、基準配列によってコードされたポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び末端欠損が生じるであろう。従って、保存性変異は、核酸配列によってコードされたポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基の保存性変化を生じさせるような遺伝子のタンパク質コーディング領域の変化である。
【０１３１】
好ましい核酸分子の変異形態は、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする天然型遺伝子と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチド配列相似を有しているのが好ましい。
【０１３２】
“プライマー”または“（１つまたは複数の）核酸重合プライマー”という用語は、４つの異なるヌクレオチド三リン酸と重合剤（即ち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）との存在下に適当なバッファ中で適当な温度という条件で核酸鎖に相補的なプライマー延長産物の合成を開始するとき、ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの正確な長さは多くの要因に左右されるが、典型的には１５−２０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と共に十分に安定な複合体を形成するためにはより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズすべく十分に相補性でなければならない。所望の場合にはプライマーを標識できる。
【０１３３】
本文中に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのスプライス変異体の所在を検出するために当業界で公知の核酸増幅技術を使用できる。これは、不一致の（１つまたは複数の）配列を包囲するＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドをヒトＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅させるプライマーとして使用することによって行われる。増幅産物のサイズ及び配列の決定から、スプライス変異体の存在が明らかになる。更に、ヒトゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションによって単離すると、イントロンによって隔てられた多数のエキソンを含有するＤＮＡが生じ、これは本文中に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする転写物の種々のスプライス変異体に対応している。核酸操作技術は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７，定期的に更新）に概説されている。核酸の化学合成方法は例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２，１９８１及びＭａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１に検討されている。核酸の化学合成は例えば市販の全自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーで行うことができる。
【０１３４】
本文中で使用された核酸“プローブ”は、配列番号１で表される配列中の連続１４個以上の塩基と同じであるかまたは該塩基に相補的である少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも５０個の連続塩基を含むヌクレオチド配列を有している一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの類似体である。更に、配列番号１に対応する完全配列の完全ｃＤＮＡコーディング領域もプローブとして使用し得る。
【０１３５】
現在好ましいとされているプローブに基づくスクリーニング条件は、約３７℃の温度、約２０％のホルムアミド濃度、約５×の標準生理食塩水型クエン酸塩（ＳＳＣ；２０×ＳＳＣは３Ｍの塩化ナトリウム、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０を含有している）である。このような条件で完全な相同性を要せずにプローブ配列にかなりの程度の相似性を有している配列を同定し得る。
【０１３６】
“ハイブリダイゼーション”は、染色体ＤＮＡ中で天然に生じる結合と同様に核酸の相補鎖（即ち、センス：アンチセンス鎖またはプローブ：ターゲットＤＮＡ）が水素結合を介して互いに結合することを意味する。所与のプローブをターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせるために使用される緊縮性レベルは当業者が容易に変更できる。
【０１３７】
本文中で使用された“緊縮ハイブリダイゼーション条件”という表現は、ポリ核酸ハイブリッドが安定する条件を表す。当業者には明らかであろうが、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）によって表される。Ｔｍは式：
８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ
によって概算できる。式中のｌはハイブリッドのヌクレオチド長さである。Ｔｍは配列相同度が１％減少する毎に１℃−１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定度はナトリウムイオン濃度及び温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応を低緊縮条件下で行い、次いで、もっと高い種々の緊縮性で複数回の洗浄を行う。ハイブリダイゼーション緊縮性という用語はこのような洗浄条件に関係がある。
【０１３８】
本文中で使用された“中程度に緊縮性のハイブリダイゼーション”という表現は、ターゲットＤＮＡをターゲットＤＮＡに約６０％一致、好ましくは約７５％一致、より好ましくは約８５％一致する相補的核酸に結合させ得る条件を表す。ターゲットＤＮＡに約９０％以上一致する相補的核酸が特に好ましい。好ましい中程度に緊縮性の条件は、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃のハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、６５℃の洗浄に等価の条件である。
【０１３９】
“高緊縮ハイブリダイゼーション”という表現は、０．０１８ＭのＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列だけがハイブリダイゼーションできる条件を表す（即ち、ハイブリッドが０．０１８ＭのＮａＣｌ中、６５℃で安定でないときは、このハイブリッドは本文中で考察するような高緊縮条件下で安定でない）。高緊縮条件は例えば、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でハイブリダイゼーションし、次いで０．１×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄することによって与えることができる。
【０１４０】
“低緊縮ハイブリダイゼーション”という表現は、１０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃のハイブリダイゼーション、次いで１×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、５０℃の洗浄に等価の条件を表す。
【０１４１】
Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及びＳＳＰＥ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照）は別の適当なハイブリダイゼーションバッファと同様に当業界で公知である。例えば、ＳＳＰＥはｐＨ７．４のリン酸塩緩衝された０．１８ＭのＮａＣｌである。ＳＳＰＥは例えば、１７５．３ｇのＮａＣｌ、２７．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４及び７．４ｇのＥＤＴＡを８００ｍｌの水に溶解し、ｐＨを７．４に調整し、次いで１リットルになるまで水を加えることによって２０×の予製液として調製できる。Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３：６４１参照）は例えば、５ｇのフィコール（Ｔｙｐｅ４００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＮＣ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｎ．Ｊ．）、５ｇのポリビニルピロリドン及び５ｇのウシ血清アルブミン（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）を混合し、次に５００ｍｌまで水を加え、濾過して粒状物を除去することによって５０×の予製液として調製できる。
【０１４２】
本文中に開示された新規なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする好ましい核酸は、中程度に緊縮性、好ましくは高緊縮性の条件下で、配列番号１で表される核酸配列の実質的に全部の配列またはかなりの部分（即ち、典型的には少なくとも１５−３０ヌクレオチド）にハイブリダイズする。
【０１４３】
好ましくは、プローブに少なくとも７０％の相同度を有している配列を同定できプローブにもっと低い相同度を有している配列から識別するようなハイブリダイゼーション条件を選択する。その結果として、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有している核酸が得られる。
【０１４４】
このように、核酸プローブは種々の用途に役立つ。他方で核酸プローブは、本発明による核酸分子を増幅させるＰＣＲプライマーとして使用し得る。また、例えばｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはノーザンブロットハイブリダイゼーションによってターゲット組織中で本発明分子の発現を検出する有効なツールとなり得る。
【０１４５】
本発明のプローブは後述するように当業界で公知の方法で標識し、種々の診断用キットに使用してもよい。
【０１４６】
“ラベル”という用語は、化合物または組成物に特異的に結合して該化合物または組成物の検出を容易にするような化合物または組成物を意味する。この用語は、標識された化合物または組成物にそれらが別の分子に特異的に結合できるような特性を与えることも含意する。“標識された”という用語は、化合物または組成物が典型的には共有結合によって特異的に結合したことを表すが、化合物または組成物をラベルで標識するために非共有結合的相互作用も使用できる。従って、ラベルは直接検出可能ラベル、即ち、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）または蛍光もしくは燐光分子（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド燐光）でもよく、または、ラベルが間接に、即ち、酵素活性（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）もしくは別の分子（ストレプトアビジン、ビオチン、抗原、エピトープまたは抗体）への結合能力によって検出されてもよい。ラベルの取り込みは種々の手段で行われる。即ち、ポリメラーゼ仲介プライマー延長反応において放射性標識したかもしくはビオチニル化したヌクレオチドを使用してもよく、または、組換え発現もしくは合成手段を介してエピトープにタグ付けしてもよく、または、抗体に結合させてもよい。
【０１４７】
ラベルは直接付着させてもよく、または、立体障害を少なくするために種々の長さのスペーサーアームを介して付着させてもよい。多様な種類の標識試薬のいずれかを本発明の目的に使用し得る。例えば、１つまたは複数の標識ヌクレオシド三リン酸、プライマー、リンカーまたはプローブを使用できる。免疫蛍光分析技術に関する記載は、ＤｅＬｕｃａ，“Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ収載，Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ｐｐ．１８９−２３１（１９８２）に見出される。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０１４８】
また、ラベルという用語が“タグ”を含意してもよい。タグは、標識分子に特異的に結合できる。例えば、ビオチンをタグとして使用し、タグに結合するアビジニル化またはストレプトアビジニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用し、次いで、ＨＲＰの存在を検出するために発色性基質（例えば、テトラメチルベンズアミン）を使用し得る。同様にして、タグがエピトープまたは抗原（例えば、ジゴキシゲニン）であり、タグに結合させるために酵素標識、蛍光標識または放射性標識した抗体を使用できる。
【０１４９】
核酸配列の定義において、実質的に相似のアミノ酸配列をコードし得るすべての対象核酸配列は、実質的に相似であると考えるかまたは基準核酸配列、即ち、本文中に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのコーディング配列（配列番号１）に実質的に等しいヌクレオチド配列を含むと考える。
【０１５０】
実際、“実質的に同じ配列”という用語は、２つのタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが中程度に緊縮性の条件下でハイブリダイズし、同じアミノ酸配列を有するかまたはそれらの構造もしくは機能を変化させない配列変化を有しているタンパク質をコードしていることを意味する。
【０１５１】
ヌクレオチド配列“相似性”は、２つのポリヌクレオチド配列が（適正なヌクレオチド挿入または欠失を伴って）最適に位置合せされたときそれらの配列の対応する位置に等しいヌクレオチド塩基をどの程度有するかを表す判断基準である。配列相似性またはパーセント相似性は、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム，バージョン６．０のような配列解析ソフトウェアを使用して配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）によって設計されたようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の位置合せ方法を利用する。
【０１５２】
本文中で使用された“実質的に等しいヌクレオチド配列”という用語は、少なくとも約９０％の一致を有することを意味しており、実質的に等しいアミノ酸配列は９５％を上回るアミノ酸一致を有している。しかしながら、スプライス変異体として生じたので上記レベル未満の相同度を有しているかまたは保存性アミノ酸置換（または縮重コドンの置換）によって修飾されているタンパク質（及びこのようなタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ）が本発明の範囲内に包含されることは理解されよう。
【０１５３】
本文中で使用された“実質的に表されたような”または“表された”という用語もまた、変化を有してはいるが実質的に同じ生化学的または薬理学的機能を実質的に同じ方法で果たす本文中に定義されたような機能誘導タンパク質及び機能誘導核酸を意味する。しかしながら、本文中で使用された“実質的に表されたような”という表現は、生物学的に有効なドミナントネガティブ突然変異体をも包含し、本文中に定義された生物学的に有効なアンチセンス分子をも含意する。
【０１５４】
本発明はまた、配列番号１で示される核酸とは異なるが同じ表現型を有している核酸を包含する。表現型的に相似の核酸を“機能的に等価の核酸”と呼ぶこともある。
【０１５５】
本文中で使用された“機能的に等価の核酸”または“機能性誘導体”という表現は、偶発的な僅かな配列変異を有することを特徴とし本文中に開示された核酸配列と実質的に同様に機能して（１つまたは複数の）同じタンパク質を産生する核酸配列を意味する。
【０１５６】
機能的に等価の配列は、本文中に開示され特許請求の範囲に記載された核酸及びアミノ酸組成物と実質的に同じ組成物を産生するために実質的に同様に機能するであろう。
【０１５７】
特に、機能的に等価のＤＮＡは、本文中に開示されたタンパク質（配列番号２）と同じタンパク質をコードしているか、または、１つの非極性残基が別の非極性残基で置換されているかもしくは１つの荷電残基が同様の荷電残基で置換されているような保存性アミノ酸変異を有しているタンパク質をコードしている。これらの変化は、タンパク質の三次構造を実質的に変化させない変化であると当業者に認められている変化を包含する。
【０１５８】
特に、機能的に等価の核酸は、本文中に開示されたポリペプチドと同じポリペプチド、または、保存性アミノ酸変異を有しているポリペプチド、または、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドに実質的に相似のポリペプチドをコードしている。
【０１５９】
本発明の１つの実施態様において、本文中に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするｃＤＮＡは配列番号１で表される配列と実質的に同じヌクレオチド配列を含む。本発明のタンパク質をコードする好ましいｃＤＮＡ分子は配列番号１で表される配列と実質的に同じヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
本発明の別の実施態様は、配列番号２で表される配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする基準ヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有している（１つまたは複数の）核酸を考察する。
【０１６１】
更に、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードしているが遺伝コードの縮重性のため上述のハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸に必ずしもハイブリダイズしないような核酸が提供される。本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする好ましい核酸は、配列番号２で表される配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドから構成される。
【０１６２】
本文中で使用された“縮重”という用語は、配列番号１に比べて少なくとも１つのヌクレオチドが違っているが配列番号２で表されるアミノ酸と同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。例えば、トリプレット“ＵＣＵ”、“ＵＣＣ”、“ＵＣＡ”及び“ＵＣＧ”で表される４つのコドンはすべてアミノ酸セリンをコードしているので、これらは互いに縮重である。
【０１６３】
本文中で使用された“発現”という用語は、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写されペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを表す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来するとき、適切な真核性宿主細胞または生物が選択されるならば、発現はｍＲＮＡのスプライシングを包含するであろう。
【０１６４】
本文中で使用された“発現ベクター”という用語は、宿主細胞への核酸領域の転写を指令する核酸ベクター構築物を意味する。発現ベクターの非限定例はプラスミド、レトロウイルスベクター、ウイルス及び合成ベクターである。
【０１６５】
本文中で使用された“形質転換された宿主細胞”という用語は、本発明の核酸分子または機能性誘導体が組み込まれた細胞を意味する。
【０１６６】
本発明の核酸は当業界で公知の様々な方法、例えば、配列番号１の種々の領域から得られたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅などのような本文中に記載された方法によって作製できる。
【０１６７】
配列番号１に含まれているヌクレオチドに等しいかまたは十分に等しいポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとしてまたは核酸増幅（ＰＣＲ）反応のプライマーとして、本発明のポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するため、並びに、配列番号１に高い配列相似性を有している別の遺伝子（ヒト以外の種のホモローグ及びオーソローグをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するために使用され得る。典型的にこれらのヌクレオチド配列は、基準配列に７０％一致、好ましくは８０％一致、より好ましくは９０％一致、最も好ましくは９５％一致の配列である。プローブまたはプライマーは一般に、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドから成り、５０ヌクレオチド以上でもよい。特に好ましいプローブは３０−５０ヌクレオチドであろう。
【０１６８】
本発明のポリヌクレオチドに由来の核酸プローブがこの目的に特に有用であろう。核酸の例は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは単離ゲノムＤＮＡである。このような核酸の非限定例は、配列番号で表される配列と実質的に同じヌクレオチド配列をもつ核酸、または、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする核酸である。プローブは一般に少なくとも１５のヌクレオチドを含むであろう。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３０個のヌクレオチドを含み、５０ヌクレオチド以上でもよい。特に好ましいプローブは３０−５０ヌクレオチドの範囲であろう。プローブは本文に開示されたポリヌクレオチドのスプライス変異体を単離するために使用し得る。
【０１６９】
このように、ポリペプチドをコードする核酸を単離する１つの手段は、腎臓、肝臓、骨格筋、白血球、白血病ＭＯＬＴ４及びリンパ球ＤＮＡのような種々のソースのヒトの組織及びｃＤＮＡを本発明の配列によってプローブし、次いで使用プローブに対して有意レベルの配列相同性を有している配列を選択することである。一般には、哺乳類ライブラリーをスクリーニングした後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって陽性クローンを同定し、同定したクローンを制限酵素マッピング及び／またはＤＮＡ配列解析によって特性決定し、次いで、本発明に示した配列に比較検討し、それらが完全ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＤＮＡを含むか否かを確認する。選択されたクローンが不完全な場合、オーバーラップクローンを得るためにこのクローンを使用して同じライブラリーを再度スクリーニングするかまたは別のライブラリーをスクリーニングするとよい。所望ならば、完全ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするオーバーラップクローンが得られるまで陽性クローンでライブラリーを再スクリーニングすることができる。ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーであるとき、オーバーラップクローンは読み取り枠を含むであろう。ライブラリーがゲノムであるとき、オーバーラップクローンはエキソンとイントロンとを含むであろう。双方の場合に、ＤＮＡ及び本発明に示したコードされたタンパク質に比較することによって完全クローンを同定し得る。
【０１７０】
好ましい緊縮ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡから成る溶液中、４２℃で一夜インキュベーションする段階、次いで、０．１×ＳＳＣ中、約６５℃でフィルターを洗浄する段階から成る。従って本発明はまた、適当なライブラリーを緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の配列またはそのフラグメントを有する標識プローブでスクリーニングすることによって得られるポリヌクレオチドを包含する。
【０１７１】
多くの場合に、単離ｃＤＮＡ配列が不完全であること、即ち、本発明のヒトのポリペプチドをコードする領域がｃＤＮＡの５′端で短く切られていることを当業者は理解されるであろう。これは、逆転写酵素が本来的に低い“プロセシング適性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）”（重合反応中に鋳型との付着を維持し得る酵素の能力の判断基準）をもつ酵素なので、第一鎖のｃＤＮＡの合成中にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成できないからである。
【０１７２】
全長ｃＤＮＡを得るためまたは短いｃＤＮＡを延長するために使用可能ないくつかの方法が当業者に公知であり、例えば、Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）の方法がある（例えば、Ｆｒｏｈａｍｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，８９９８−９００２，１９８８参照）。Ｍａｒａｔｈｏｎ．ＴＭ．法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に代表されるような上記方法の新しい修正方法ではより長いｃＤＮＡの捜索がはるかに容易になった。Ｍａｒａｔｈｏｎ．ＴＭ．法では、選択組織から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、各末端に“アダプター”配列を結合させる。次に、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーとアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーとの組合せを使用して核酸増幅（ＰＣＲ）を行って、ｃＤＮＡの“欠失”５′端を増幅する。次に“入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）”プライマー、即ち、増幅産物内にアニールするように設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列の以後の３′にアニールするアダプター特異的プライマーと既知の遺伝子配列の以後の５′にアニールする遺伝子特異的プライマー）を使用してＰＣＲ反応を繰り返す。次にこの反応の産物をＤＮＡ配列決定によって解析し、全長ｃＤＮＡを構築した。全長ｃＤＮＡを構築するためには、上記反応産物を既存のｃＤＮＡに直接接合することによって完全配列を与えるか、または、５′プライマーの設計に関する新しい配列情報を使用して独立の全長ＰＣＲを行う。
【０１７３】
このようにして同定された本発明のＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列は、このような核酸が当業者に公知の様々なタンパク質発現系に取り込まれるときにはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの産生に使用できる。更に、このような核酸分子またはそのフラグメントを検出容易な置換基で標識し、所与のサンプル中の本発明のコーディング遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の存在及び／または量を検定するアッセイでハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。本文中に記載の核酸分子及びそのフラグメントはまた、本文中に記載の本発明のタンパク質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応でプライマー及び／または鋳型として使用できる。
【０１７４】
ヒト以外の種に由来するホモローグ及びオーソローグも含めた本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするポリヌクレオチドは、適当なライブラリーを緊縮ハイブリダイゼーション条件下で配列番号１またはそのフラグメントの配列を有する標識プローブでスクリーニングする段階と、全長ｃＤＮＡ及びポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを単離する段階とから成る方法によって得ることができる。このようなハイブリダイゼーション技術は当業者に公知である。
【０１７５】
“一致”は公知の方法によって容易に計算できる。公知方法の非限定例は、以下の文献（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載された方法である。一致を判定する方法は、被験配列間で最大の整合度（マッチ）が与えられるように設計する。更に、一致を判定する方法は公的に利用可能なコンピュータープログラムにコード化されている。２つの配列間の一致を判定するコンピュータープログラム法の非限定例は、ＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮＣＢＩ及びその他のソースから公的に利用できる（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも一致の判定に使用できる。
【０１７６】
ポリヌクレオチド比較用パラメーターとしては以下のパラメーターがある：
（１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３
“ギャップ”プログラムはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓから入手可能。これらは核酸比較用デフォールトパラメーターである。
【０１７７】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する“一致”の好ましい意味はそれぞれ以下の（１）及び（２）で説明される。
【０１７８】
（１）ポリヌクレオチドの実施態様は更に、配列番号１で表される基準配列に少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の一致を有するポリヌクレオチド配列から成る単離ポリヌクレオチドを含む。この場合、ポリヌクレオチド配列は配列番号１で表される基準配列に一致してもよく、または、基準配列に対して整数個のヌクレオチド変異を含んでいてもよく、この変異は少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換（トランジション及びトランスバージョンを含む）または挿入から成るグループから選択されており、これらの変異は基準ヌクレオチド配列の５′もしくは３′末端位置で生じるかまたはこれらの末端位置間の任意の位置で基準配列中のヌクレオチド間に個々に散在したり基準配列内に１つまたは複数の連続グループとして散在しており、ヌクレオチド変異の数は、一致パーセントを１００で除算した整数を配列番号１のヌクレオチドの総数に乗算し、この積を配列番号１のヌクレオチドの総数から減算することによって算出される。即ち、式：
Ｎｎ＝Ｘｎ−（ＸｎＹ）
で算出され、
式中の、Ｎｎはヌクレオチド変異の数、Ｘｎは配列番号１のヌクレオチドの総数、Ｙは５０％ならば０．５０、６０％ならば０．６０、７０％ならば０．７０、８０％ならば０．８０、８５％ならば０．８５、９０％ならば０．９０、９５％ならば０．９５、９７％ならば０．９７、１００％ならば１．００であり、乗算演算子を表す記号である。ＸｎとＹとの積が整数でないときは、Ｘｎから減算する前に最も近い整数になるよう端数を切り捨てる。
配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変異は、このコーディング配列中にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じさせ、これによって、このような変異後のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを変異させる。
【０１７９】
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする相補的ＤＮＡクローンは、与えられたＤＮＡから調製し得る。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラリーのような天然ソースから得ることもでき、または、市販されている公知技術を使用して合成することもできる。
【０１８０】
実際には、本発明のポリヌクレオチドは、標準クローニング及びスクリーニングを使用し、天然型ＭＡＰＫＡＰ−２またはその天然型結合相手を発現しているかまたは発現すると推測される細胞中のｍＲＮＡに由来のｃＤＮＡライブラリーから、発現配列タグ（ＥＳＴ）解析を使用して得ることができる（Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：１６５１−１６５６；Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，（１９９２）３５５：６３２−６３４；Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７７Ｓｕｐｐ：３−１７４）。
【０１８１】
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２をコードするヌクレオチド配列は配列番号１で表されたコーディング配列に全長にわたって一致してもよく、または、配列番号２のポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列の縮重形態でもよく、または、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に高い一致度を有していてもよい。
【０１８２】
本発明の新規なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする代表的な核酸分子は多くの特徴を有している。例えば、
（ｉ）核酸分子が配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードしているか、または、
（ｉｉ）中程度の緊縮条件下で（ｉ）のＤＮＡにハイブリダイズする核酸分子であるか、または、
（ｉｉｉ）上記の（ａ）または（ｂ）に縮重のＤＮＡであり、このＤＮＡが生物学的に活性のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードしているか、または、
（ｉｖ）配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に少なくとも７５．９％の一致を有しているヌクレオチド配列であるか、または、
（ｖ）その対応するフラグメントであるか、または、
（ｖｉ）配列番号１に含まれているヌクレオチド配列に十分な一致を有するヌクレオチド配列またはその対立遺伝子変異体、そのスプライス変異体及び／またはそれらの相補配列である。
【０１８３】
好ましくは、（１つまたは複数の）本発明の核酸分子、即ち配列番号１は、ヒトのＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするヌクレオチド配列に少なくとも８０％一致するか、配列番号１で表されるコーディングヌクレオチド配列に少なくとも８５％一致するか、または、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に少なくとも９０％一致するような高い一致度のヌクレオチド配列を含有する。
【０１８４】
特に好ましい本発明の実施態様としては、実質的に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有している本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするポリヌクレオチド及びその変異体がある。
【０１８５】
別の好ましい実施態様は、配列番号２のＭＡＰＫＡＰ−２のアミノ酸配列中に複数、例えば５−１０、１−５、１−３、１−２または１個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を何らかの組合せで含むＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドである。
【０１８６】
別の好ましい本発明の実施態様は、配列番号２て表されるアミノ酸配列を有するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするポリヌクレオチドに全長で少なくとも８０％一致するポリヌクレオチド、及び、このようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。これについては、このようなポリヌクレオチドに全長で少なくとも８０％一致するポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも９０％一致するポリヌクレオチドがとりわけ好ましい。更に、少なくとも９７％一致するポリヌクレオチドが極めて好ましく、少なくとも９８−９９％一致するポリヌクレオチドはいっそう好ましく、少なくとも９９％一致するポリヌクレオチドが最も好ましい。
【０１８７】
本発明は更に、本文中に上述した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これについては、本発明はとりわけ、緊縮条件下で本文中に上述したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本文中に使用された“緊縮条件”という用語は、配列間に少なくとも９５％の一致度、好ましくは少なくとも９７％の一致度が存在するときにのみ生じるハイブリダイゼーションを意味する。
【０１８８】
別の実施態様においては、本発明は、５′から３′の方向に、宿主細胞中で転写を開始させる有効なプロモーター、及び、（１つまたは複数の）上述の本発明の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【０１８９】
本発明はまた、１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び、組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。
【０１９０】
本発明のＤＮＡ構築物に由来のＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を産生させるために無細胞翻訳系も使用できる。
【０１９１】
クローン化ＤＮＡを適当な発現ベクターに取り込ませ、プラスミドベクター、または、各々が１つまたは複数の異なる遺伝子をコードしているプラスミドベクターの組合せ、または、直鎖ＤＮＡによって真核細胞のトランスフェクションを行い、トランスフェクトされた細胞を当業界で公知の方法で選択する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）。本発明の核酸構築物を含む発現ベクターを宿主細胞に導入（形質導入）して形質導入された組換え細胞（即ち、組換えヘテロロガス核酸を含有する細胞）を作製する適当な手段は当業界で公知である（概要に関しては、例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２参照、これらの各々はその記載内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする）。
【０１９２】
代表的な形質導入方法は例えば、ウイルスベクターを使用する感染（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号及び第４，６５０，７６４号参照）、リン酸カルシウムトランスフェクション（米国特許第４，３９９，２１６号及び第４，６３４，６６５号）、硫酸デキストラントランスフェクション、電気穿孔、リポフェクション（例えば、米国特許第４，３９４，４４８号及び第４，６１９，７９４号参照）、サイトフェクション、粒子ビーズボンバードメント、などである。ヘテロロガス核酸は場合によっては、染色体外（即ち、エピソーム）維持が可能な配列を含んでもよく、または、ヘテロロガス核酸が宿主のゲノムに組み込まれるドナー核酸でもよい。次に、組換え細胞を、（１つまたは複数の）ＤＮＡによってコードされたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼが発現する条件下で培養する。好ましい細胞は、哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ及びＬｔｋ−細胞）、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのようなメチル親和性酵母細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌）、などである。
【０１９３】
本発明を行うために使用される発現ベクターは、クローン化ＤＮＡの転写を指令し得るプロモーターと転写ターミネーターとを含むであろう。
【０１９４】
発現ベクターは更に、当該コーディング配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，前出）、アデノウイルス５  Ｅ１Ｂ領域に由来のポリアデニル化シグナル及びヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：３７１９−３７３０，１９８１）がある。発現ベクターは、プロモーター部位とＲＮＳスプライス部位との間に位置する非コーディング性のウイルスリーダー配列、例えば、アデノウイルス２の３分節系リーダーを含んでいてもよい。好ましいベクターはまた、ＳＶ４０エンハンサー及びマウスμエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｃｅｌｌ  ３３：７１７−７１８，１９８３）のようなエンハンサー配列を含み得る。発現ベクターはまた、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする配列を含み得る。
【０１９５】
適当な発現ベクターは当業界で公知であり、例えば、このようなＤＮＡの発現を調節し得るプロモーター領域のような調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡを発現し得るベクターがある。従って、発現ベクターという用語は、プラスミド、ファージ、組換えウイルスのような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を包含し、あるいはその他にも、適当な宿主細胞に導入されたときに挿入されたＤＮＡを発現させるベクターを包含する。適当な発現ベクターは当業者に公知であり、真核細胞及び／または原核細胞中で複製可能なベクター、及び、エピソームに維持されるベクター、または、宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターがある。
【０１９６】
原核細胞である大腸菌を形質転換させる代表的な発現ベクターは、ｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，米国特許第４，９５２，４９６号参照）、例えば、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーターと大腸菌のｌａｃ誘導オペレーターとｌａｃリプレッサー遺伝子とを含むｐＥＴ１１ａ、及び、Ｔ７プロモーターとＴ７ターミネーターと大腸菌のｏｍｐＴ分泌シグナルとを含むｐＥＴ１２ａ−ｃである。別のこのようなベクターは、ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２であり（Ｄｕｆｆａｕｄら，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：４９２−５０７，１９８７参照）、これは、ｌｐｐプロモーターとｌａｃＵＶ５プロモーターオペレーターとｏｍｐＡ分泌シグナルとｌａｃリプレッサー遺伝子とを含んでいる。
【０１９７】
代表的な真核細胞発現ベクターは、ｐＳＶ−２ｇｐｔ系（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１０８−１１４）；Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ系（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２：１６１−１７０）のような真核細胞カセット、及び、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：８１０−８１５）によって記載された発現クローニングベクターである。これらのプラスミドベクターの各々は、該当する本発明のキメラタンパク質の発現を促進し得る。
【０１９８】
また、細胞内で機能性の転写領域と、本文に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに対応するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列と、適当な宿主細胞内で機能性の転写終結領域とを含む（１つまたは複数の）核酸分子が提供される。
【０１９９】
多くの様々な転写及び翻訳の調節配列を宿主の性質に依存して使用し得る。転写及び翻訳の調節シグナルは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、サルウイルス、などのようなウイルスソースに由来し得る。このようなソースでは調節シグナルが高レベル発現を有している特定の遺伝子配列に付随する。あるいは、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどのような哺乳類発現産物からのプロモーターを使用してもよい。遺伝子配列の発現を調節できるような抑制または活性化を行う転写開始調節シグナルを選択してもよい。温度を変更することによって発現を抑制または開始できるような温度感受性の調節シグナルを使用するかまたは化学物質（例えば代謝産物）の調節作用を受ける調節シグナルが有利である。
【０２００】
従って、１つの実施態様は、本文中に開示された本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを組換え的に発現する形質転換宿主細胞を提供する。
【０２０１】
本文中では、細胞が遺伝子操作によって正常には産生しないかまたは正常にはもっと低いレベルで産生するタンパク質を産生できるようになったとき、細胞が“所望のペプチドを発現するように変異された”という。当業者は、ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成配列を真核細胞または原核細胞に導入し発現させる手順を容易に応用し得る。
【０２０２】
ＤＮＡのような核酸分子は、転写及び翻訳の調節情報を含むヌクレオチド配列を含むとき、ポリペプチドを“発現することが可能な”と言われる。また、このような配列はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に“作動可能に連結された”と言われる。作動可能な連鎖は、調節ＤＮＡ配列と発現させたいＤＮＡ配列とが遺伝子配列を発現できるように連結された連鎖を意味する。遺伝子配列の発現に必要な調節配列の詳細な種類は生物毎に異なるであろうが、一般に原核細胞中では、プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指令する）と、ＲＮＡに転写されたときに合成開始のシグナルを与えるＤＮＡ配列との双方を含むプロモーター領域を含む。このような領域は通常は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、などのような転写及び翻訳の開始に関与する５′−非コーディング配列を含むであろう。
【０２０３】
所望ならば、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子をコードする配列の３′の非コーディング領域が上述の方法によって得られる。この領域は、終結及びポリアデニル化のような転写終結調節配列として保持される。従って、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＤＮＡ配列に本来的に隣接している３′領域を保持することによって転写終結シグナルが提供される。発現宿主細胞中で転写終結シグナルが十分に機能性でないときは、宿主細胞中で機能性の３′領域が代替し得る。
【０２０４】
２つのＤＮＡ配列（例えばプロモーター領域配列とＭＡＰＫＡＰ−２コーディング配列）は、２つのＤＮＡ配列間の連鎖が、（１）フレームシフト突然変異を導入させない、（２）ＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子配列の転写を指令するプロモーター領域配列の能力を妨害しない、または、（３）プロモーター領域配列によって転写されるＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子配列の能力を妨害しない連鎖であるときは、“作動可能に連結された”と言われる。従って、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を行うことができるならば、プロモーター領域はＤＮＡに作動可能に連結されている。
【０２０５】
対照配列、発現ベクター、形質転換方法、などの選択は、遺伝子を発現させるために使用される宿主細胞の種類に依存する。本文中で使用された“細胞”、“細胞系”及び“細胞培養物”という用語は互換的に使用されており、いずれの呼称もそれらの後代を含意する。
【０２０６】
“形質転換体”または“形質転換細胞”という用語は、初代被験細胞及び転移回数にかかわりなく該細胞に由来する培養物を意味する。また、計画的なまたは偶発的な突然変異が原因ですべての後代のＤＮＡが正確に等しい内容ではないことも理解されよう。しかしながら、定義したように、突然変異した後代は出発形質転換細胞と同じ機能性を有している。
【０２０７】
本発明のヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのコーディング遺伝子を発現させるためには、適正宿主によって認識される転写及び翻訳のシグナルが必要である。本発明は、原核細胞または真核細胞のいずれかにおけるＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼコーディング遺伝子（またはその機能性誘導体）の発現を包含する。
【０２０８】
本発明の発現系に使用し得る宿主細胞は、本発明の新規なヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの発現に使用されるのに適している限り、厳密に制約されない。適当な宿主はしばしば真核細胞である。
【０２０９】
本発明の実施に使用し得る適当な宿主細胞の代表例は、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のような細菌細胞；酵母細胞及びコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞のような菌類細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２及びヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）のＳｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３及びＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；及び、植物細胞である。
【０２１０】
酵母種（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，ｓｐｐ．、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）または糸状菌類（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）のような菌類細胞は本発明の範囲内で宿主細胞として使用できる。本発明で使用し得る適当な酵母ベクターは、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：１０３５−１０３９，１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら，Ｇｅｎｅ  ８：１２１−１３３，１９７９）、ＰＯＴベクター（Ｋａｗａｓａｋｉら，米国特許第４，９３１，３７３号、該特許は参照によって本発明に含まれるものとする）、ｐＪＤＢ２４９及びｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４−１０８，１９７８）及びそれらの誘導体である。このようなベクターは一般に選択可能マーカーを含み、該マーカーは、優性表現型を示す任意数の遺伝子で１つでよく、該優性表現型に基づいて形質転換体を選択できるような表現型アッセイが存在する。好ましい選択可能マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完し、抗生物質耐性を与えるか、または、細胞に特定炭素源を利用させるようなマーカーであり、例えば、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈら，前出）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ  ８：１７，１９７９）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌら，前出）またはＰＯＴ１（Ｋａｗａｓａｋｉら，前出）がある。別の適当な選択可能マーカーは、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を与えるＣＡＴ遺伝子である。
【０２１１】
プロモーターを取り込む酵母遺伝子配列発現系シリーズのいずれかを利用でき、酵母をグルコースに富む培地中で増殖させるときに有効に発現された解糖酵素をコードする遺伝子配列から終結エレメントが大量に産生される。既知の解糖遺伝子配列も極めて効率的な転写コントロールシグナルを供給できる。
【０２１２】
酵母は転写後ペプチド修飾もできるという重要な利点を有している。強力プロモーター配列と高コピー数プラスミドとを利用する多くの組換えＤＮＡ戦略が存在し、酵母中で所望のタンパク質を産生するために利用できる。酵母は、クローン化された哺乳類遺伝子配列産物の上でリーダー配列を認識し、リーダー配列を含むペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌する。哺乳類宿主に関しては、複数の可能なベクター系をＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの発現に利用し得る。
【０２１３】
様々な高等真核細胞が本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞として役立つが、すべての細胞系が受容体を細胞の第二メッセンジャー系に機能的に結合させることができるとは言えない。ＢＨＫ、ＣＨＯ、Ｙ１（Ｓｈａｐｉｒｏら，ＴＩＰＳ  Ｓｕｐｐｌ．４３−４６（１９８９））、ＮＧ１０８−１５（Ｄａｗｓｏｎら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｄ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２，ｐａｇｅｓ８９−１１４（１９８９））、Ｎ１Ｅ−１１５（Ｌｉｌｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：５３０７−５３１３（１９８６））、ＰＣ１２及びＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）のような培養哺乳類細胞が好ましい。好ましいＢＨＫ細胞系はｔｋ−−ｔｓ１３  ＢＨＫ細胞系（Ｗａｅｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｓｅｒｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：１１０６−１１１０（１９８２））及びＢＨＫ５７０細胞系（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．に登録番号ＣＲＬ  １０３１４で寄託）である。ｔｋ−−ＢＨＫ細胞系はＡＴＣＣから登録番号ＣＲＬ１６３２で入手できる。
【０２１４】
原核細胞宿主は一般に、組換えタンパク質の産生を極めて効率的にかつ簡便に行うことができ、従って、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのコーディング遺伝子を発現させる好ましい発現系の１種である。
【０２１５】
多くの場合、原核細胞は大腸菌の種々の菌株によって代表される。しかしながら、別の細菌株のような別の微生物菌株も使用できる。原核細胞系では、宿主に適合性の種に由来する複製部位とコントロール配列とを含むプラスミドベクターを使用するとよい。適当なプラスミドベクターの例は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ−１１８、ｐＵＣ１１９などである。適当なファージまたはバクテリオファージベクターはγｇｔ１０、γｇｔ１１などである。適当なウイルスベクターはｐＭＡＭ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣなどである。好ましくは本発明の選択されたベクターは選択された宿主細胞中で複製能力を有している。
【０２１６】
認知されている原核細胞宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａなどのような細菌がある。しかしながらこのような条件下でペプチドはグリコシル化しないであろう。原核細胞宿主は発現プラスミド中のレプリコン及びコントロール配列に適合性でなければならない。
【０２１７】
原核細胞中でＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ（またはその機能性誘導体）を発現させるためには、ＭＡＰＫＡＰ−２をコードするヌクレオチド配列を機能性原核細胞プロモーターに作動可能に連結する必要がある。このようなプロモーターは構成性でもよいが、より好ましくは調節可能（即ち、誘導可能または脱抑制可能（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ））である。構成プロモーター及び誘導プロモーターの例は当業者に公知である。原核性プロモーターはＣｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６（１９８６）；及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４））に概説されている。原核細胞中の適正発現にはまた、遺伝子配列のコーディング配列の上流にリボソーム結合部位が存在することが必要である。このようなリボソーム結合部位は、例えば、Ｇｏｌｄら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０４（１９８１）に開示されている。
【０２１８】
本文中で使用された“プロモーター”という用語は、該プロモーターに作動可能に連結されている選択されたＤＮＡ配列の発現を調節し、該選択されたＤＮＡ配列を細胞中で発現させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列を意味する。この用語は“組織特異的”プロモーター、即ち、選択されたＤＮＡ配列を特定細胞（例えば特定組織の細胞）中でのみ発現させるプロモーターを含意する。この用語はまた、選択されたＤＮＡの発現を主として１つの組織中で調節するが別の組織中でも発現を生じさせるいわゆる“漏出”プロモーターも包含する。この用語はまた、組織非特異的プロモーター、及び、構成的に発現するかまたは誘導性である（即ち発現レベルをコントロールできる）プロモーターも含意する。
【０２１９】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸分子及び作動可能に連結されたプロモーターを非複製性ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子としてレシピエント原核細胞または真核細胞に導入する。非複製性分子は直鎖状分子でもよいが好ましくは共有結合した閉環状分子である。このような分子は自立複製ができないので、遺伝子の発現は導入された配列の一過性発現を介して生じる。あるいは、導入されたＤＮＡ配列を宿主染色体に組み込むことによって恒久的発現を生じさせてもよい。
【０２２０】
１つの実施態様では、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体に組み込むことができるベクターを使用する。導入されたＤＮＡがそれらの染色体に安定に組み込まれた細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞を選択できる１つまたは複数のマーカーを導入することによっても選択できる。該マーカーは栄養要求性宿主に対して原栄養性、生物致死剤耐性例えば抗生物質または重金属例えば銅などに対する耐性を与える。選択可能マーカー遺伝子配列は発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結されてもよく、または、コトランスフェクションによって同じ細胞に導入されてもよい。一本鎖の結合用タンパク質ｍＲＮＡの最適合成には追加のエレメントも必要であろう。これらのエレメントとしては、スプライスシグナル、転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルがある。このようなエレメントを取り込んだｃＤＮＡ発現ベクターとしては、Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３）によって記載されたベクターがある。
【０２２１】
好ましい実施態様においては、導入された核酸分子がレシピエント宿主中で自立複製し得るプラスミドまたウイルスベクターに取り込まれるであろう。多様な種類のベクターのいずれかをこの目的に使用し得る。特定プラスミドまたはウイルスベクターの選択における重要な要因は、ベクターを含むレシピエント細胞をベクターを含まないレシピエント細胞から容易に識別して選択できるか、特定宿主中で望ましいベクターのコピー数が得られるか、及び、異なる種の宿主細胞間でベクターを“シャトル”できるのが望ましいか、などである。
【０２２２】
好ましい原核性ベクターは、大腸菌中で複製できるプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、πＶＸのようなプラスミドである。このようなプラスミドは例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋによって開示されている（ｃｆ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９））。ＢａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしてはｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などがある。このようなプラスミドはＧｒｙｃｚａｎによって開示されている（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｔｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），ｐｐ．３０７−３２９）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドはｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３（１９８７））、及び、φＣ３１のようなＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージである。（Ｃｈａｔｅｒら，：Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ  Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ（１９８６），ｐｐ．４５−５４）。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドはＪｏｈｎら（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６））及びＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９７８））に概説されている。
【０２２３】
上記に指摘したように、真核細胞宿主中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの発現には真核細胞調節領域の使用が必要である。このような領域は一般に、ＲＮＡ合成の開始を指令するために十分なプロモーター領域を含むであろう。好ましい真核細胞プロモーターは例えば、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０（１９８１））；酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））である。
【０２２４】
広く知られているように、真核細胞ｍＲＮＡの翻訳は第一メチオニンをコードするコドンで開始される。このため、真核細胞プロモーターとＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ（またはその機能性誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連鎖がメチオニンをコードし得る介在コドン（即ちＡＵＧ）を全く含まないことを確保するのが好ましい。このようなコドンが存在すると、融合タンパク質が形成されるか（ＡＵＧコドンがＭＡＰＫＡＰ−２コーディング配列と同じ読み枠に存在するとき）、または、フレームシフト突然変異（ＡＵＧコドンがＭＡＰＫＡＰ−２コーディング配列と同じ読み枠に存在しないとき）が生じる。
【０２２５】
好ましい真核細胞プラスミドとしては例えば、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロンサークルなど、またはそれらの誘導体がある。これらのプラスミドは当業界で公知である（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ｍｉａｍｉ  Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４（１９８２）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐ．４４５−４７０（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ  ２８：２０３−２０４（１９８２）；Ｂｏｌｌｏｎら，Ｊ．Ｃｔｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．５６３−６０８（１９８０）。
【０２２６】
（１つまたは複数の）構築物を含有する発現用のベクターまたは核酸分子を調製した後、（１つまたは複数の）ＤＮＡ構築物を、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、などのような種々の適当な手段のいずれかによって適当な宿主細胞に導入し得る。ベクターの導入後、レシピエント細胞を、ベクター含有細胞の増殖を選択する選択培地で増殖させる。（１つまたは複数の）クローン化遺伝子の発現の結果、本文に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは生物学的に活性のそのフラグメントが産生される。これは、形質転換させただけの細胞中で行われてもよく、または、（例えば、神経芽細胞腫などにブロモデオキシウラシルを投与することによって）これらの細胞の分化を誘発した後で行われてもよい。
【０２２７】
本発明のペプチドを形成するために様々なインキュベーション条件を使用できる。最も好ましい条件は生理的条件の模擬条件である。
【０２２８】
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの調製手段の一例は、当業界で公知の方法を使用して細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（即ち、卵母細胞）または哺乳類細胞のような適当な宿主細胞中でＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸を発現させ、発現されたポリペプチドを同じく公知の方法を使用して回収することである。
【０２２９】
ノーザンブロットまたはスロットブロット分析のような方法を使用して、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのコーディングＤＮＡまたはＲＮＡを含有するトランスフェクト細胞を選択できる。また、トランスフェクト細胞を分析してＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを発現する細胞を同定できる。分析は例えば、機能性受容体を伴う公知のスクリーニングアッセイのいずれかを使用し、得られた値を対照である非トランスフェクト細胞に比較し、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに応答する細胞膜電流を電気生理学的にモニターするなどによって行うことができる。（１つまたは複数の）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはそのフラグメント／部分をコードする核酸を含む発現ベクターによって形質転換させた細胞から直接的に単離できる。
【０２３０】
核酸分子は細胞に安定に取り込まれてもよく、または、当業界で公知の方法で一過性に導入されてもよい。安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするヌクレオチド配列を選択可能マーカー遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性、など）と共に含む発現ベクターを細胞にトランスフェクトし、マーカー遺伝子を発現する細胞選択条件下でトランスフェクト細胞を増殖させることによって作製するとよい。一過性トランスフェクタントを作製するために、トランスフェクション効率をモニターするリポーター遺伝子（例えば、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を哺乳類細胞にトランスフェクトする。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＤＮＡの正確な量及び比率は実験的に決定し、特定の細胞及びアッセイ条件に最適化する。一過性トランスフェクションでは、トランスフェクタントが典型的には選択条件下で増殖しないこと、及び、通常はトランスフェクション後数日以内に分析されることを理由として、典型的には選択可能マーカー遺伝子を使用しない。
【０２３１】
クローン化ＤＮＡが組み込まれた細胞を同定するために、通常は選択可能マーカーを当該遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞に導入する。培養した哺乳類細胞に使用し得る好ましい選択可能マーカーとしては、ネオマイン、ヒグロマイシン及びメソトレキセートのような薬物に耐性を与える遺伝子がある。選択可能マーカーは増幅できる選択可能マーカーでもよい。好ましい増幅できる選択可能マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子及びネオマイン耐性遺伝子である。選択可能マーカーに関してはＴｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ、これは参照によって本発明に含まれるものとする）によって概説されている。選択可能マーカーは平均的な当業者のレベルで十分に選択できる。
【０２３２】
選択可能マーカーは独立のプラスミドによって当該遺伝子と同時に細胞に導入されてもよく、または、同じプラスミドによって導入されてもよい。同じプラスミドによる場合、選択可能マーカーと当該遺伝子とは異なるプロモーターのコントロール下に維持されてもよくまたは同じプロモーターのコントロール下に維持されてもよい。後者の編制は二シストロンメッセージ（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｍｅｓｓａｇｅ）を生じる。この種の構築物は当業界で公知である（例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，米国特許第４，７１３，３３９号）。また、細胞に導入される混合物に“キャリアーＤＮＡ”として知られる追加のＤＮＡを加えるのが有利であろう。
【０２３３】
特に好ましい特徴によれば、ヘテロロガスＤＮＡを含有する真核細胞はこのようなＤＮＡを発現し、組換えＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを形成する。より好ましい特徴によれば、組換えＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性は、非トランスフェクト宿主細胞には存在しない種類の活性なので容易に検出できる。
【０２３４】
ヘテロロガスＤＮＡはエピソームエレメントとして細胞中に維持されてもよく、または、細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。得られた組換え細胞を次に培養するかまたはこのような培養物もしくはその継代培養物から継代培養（哺乳類の場合は継代）し得る。組換え細胞をトランスフェクション、インジェクション及び培養する方法は当業者に公知である。また、（１つまたは複数の）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを、当業者に公知のタンパク質精製方法を使用して精製し得る。例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのアフィニティ精製には、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに特異的に結合する抗体またはその他のリガンドを使用するとよい。
【０２３５】
本文中で使用された“ヘテロロガスまたは外来ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ”という表現は互換的に使用されており、それらが存在する細胞のゲノムの一部として天然に発生しないＤＮＡもしくはＲＮＡまたはゲノム中で天然に生じる場所とは異なる１つまたは複数の場所に見いだされるＤＮＡもしくはＲＮＡを意味する。典型的には、ヘテロロガス又は外来ＤＮＡ及びＲＮＡは、宿主細胞に内因性でなく、細胞に人工的に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを表す。ヘテロロガスＤＮＡの例としては本文中に開示されたＤＮＡがある。
【０２３６】
別の実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってｍＲＮＡが産生され得る。このｍＲＮＡを次にアフリカツメガエルの卵母細胞に注入すると、そこでＲＮＡがＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの合成を指令する。あるいは、本発明のコーディングＤＮＡを卵母細胞に直接的に注入して機能性ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを発現させてもよい。トランスフェクトした哺乳類細胞または注入された卵母細胞を次に本発明で提供される薬物スクリーニング方法に使用し得る。
【０２３７】
あるいは、本発明のＤＮＡ配列をＲＮＡに転写し、該ＲＮＡを次に両生類細胞にトランスフェクトしてタンパク質に翻訳させることもできる。適当な両生類細胞としてはアフリカツメガエル卵母細胞がある。
【０２３８】
ＩＩ．実質的に純粋なＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチド
本発明はまた、ＭＡＰＫＡＰ−２と命名された実質的に純粋なシグナル伝達キナーゼポリペプチドを提供する。このポリペプチドはヒト起原である。このポリペプチドは適当な任意の方法で作製できる。本発明のポリペプチドは、組換えによって産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、または、これらの方法の併用によって産生されたポリペプチドを包含する。
【０２３９】
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼは配列番号２で表される配列によって定義されるポリペプチド（特に、成熟ポリペプチド）、及び、配列番号２のポリペプチドまたは対応部分に少なくとも８０％の一致、より好ましくは配列番号２に少なくとも８５％の一致、更に好ましくは少なくとも９０％の一致、もっと好ましくは少なくとも９５％の一致を有するポリペプチドを包含する。
【０２４０】
“ＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチド”、“ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質”、“本発明のポリペプチド”、“ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ”という用語はすべて互換的に使用されており、配列番号２で示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むキナーゼポリペプチドとそのホモローグを包含し、アゴニスト及びアンタゴニストポリペプチドを含む。
【０２４１】
“ポリペプチド”または“ペプチド”または“タンパク質”という用語は、アミノ酸残基の重合体及びその変異体と合成類似体とを意味しており、本文中で互換的に使用されている。従って、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が合成の非天然アミノ酸、例えば対応する天然アミノ酸の化学的類似体から成るようなアミノ酸重合体、及び、天然に発生するアミノ酸重合体にも使用される。本発明のポリペプチドとしては、実質的に配列番号２で表される配列を有しているポリペプチド即ちＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼが好ましい。
【０２４２】
“アミノ酸”は、重合してタンパク質を形成するサブユニットであり、タンパク質中に普遍的に見出される２０種類のアミノ酸が存在する。アミノ酸の一般式はＨ２Ｎ−−ＣＨＲ−ＣＯＯＨであり、式中のＲ基は水素原子（アミノ酸グリシン中）から複合環（アミノ酸トリプトファン中）までのいかなる基でもよい。
【０２４３】
“タンパク質”という用語は、ペプチド結合によって互いに接合された５−５０個またはそれ以上のアミノ酸から形成された化合物を意味する。
【０２４４】
“リポーター”分子は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に会合し、それらの存在を確認し、それらを定量し得る放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質または色原性物質である。
【０２４５】
“一致”は当業界で公知のように、それぞれ２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列について、配列比較によって決定された配列間の関係である。当業界では“一致”という用語はまた、それぞれポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列について、このような配列の鎖の適合度（マッチ）によって決定された配列近縁度を意味する。
【０２４６】
本発明のポリペプチドＭＡＰＫＡＰ−２（配列番号２）に関する“一致”または“相同”という用語は、候補配列と配列番号２とを位置合せし必要ならば相同パーセントが最大になるようにギャップを導入した後で候補配列中に存在する配列番号２の残基に等しいアミノ酸残基のパーセンテージであると定義される。保存性置換は配列一致部分とは考えない。Ｎ−またはＣ−末端の延長、欠失、挿入が一致または相同の程度を下げるとは全く考えられない。
【０２４７】
ポリペプチド配列比較用パラメーターとしては以下のパラメーターがある：
（１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）比較マトリックス：ＢＬＯＳＳＵＭ６２，Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
これらのパラメーターに役立つプログラムは“ギャップ”プログラムとしてＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓから公的に入手可能である。上記のパラメーターはペプチド比較用デフォールトパラメーターである（エンドギャップに対してペナルティ無し）。
【０２４８】
ポリペプチドの実施態様は更に、配列番号２の基準ポリペプチドに少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の一致を有するポリペプチドから成る単離ポリペプチドを含む。この場合、ポリペプチド配列は配列番号２の基準配列に等しくてもよく、または、基準配列に比べて整数個のアミノ酸変異を含んでいてもよく、この変異は少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存性及び非保存性の置換を含む）または挿入から成るグループから選択されており、これらの変異は基準ポリペプチド配列のアミノ−もしくはカルボキシ−末端位置で生じるかまたはこれらの末端位置間の任意の位置で基準配列中のアミノ酸間に個々に散在したり基準配列内に１つまたは複数の連続グループとして散在しており、アミノ酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に一致パーセントを１００で除算した整数を乗算し、得られた積を配列番号２のアミノ酸の総数から減算することによって算出される。即ち、式：
Ｎａ＝Ｘａ−（ＸａＹ）
で算出され、
式中の、Ｎａはアミノ酸変異の数、Ｘａは配列番号２のアミノ酸の総数、Ｙは５０％ならば０．５０、６０％ならば０．６０、７０％ならば０．７０、８０％ならば０．８０、８５％ならば０．８５、９０％ならば０．９０、９５％ならば０．９５、９７％ならば０．９７、１００％ならば１．００であり、乗算演算子を表す記号である。ＸａとＹとの積が整数でないときは、Ｘａから減算する前に最も近い整数になるよう端数を切り捨てる。
【０２４９】
本文中で使用された本発明のポリペプチドの“変異体”という用語は、本発明のポリペプチドの配列に比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入及び／または欠失をもつアミノ酸配列を有しているポリペプチドを意味する。一般に差異は、基準配列（本発明のポリペプチド）と変異体とが全体的に極めて類似しており、多くの領域で一致するという程度の限定された差異である。このような変異体は一般に生物学的に活性であり、該当ポリペプチドに対する配列一致は必然的に１００％未満である。
【０２５０】
好ましい実施態様では、生物学的に活性の変異体が本発明のポリペプチドに少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも約８５％、いっそう好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列一致を有している。アミノ酸置換は好ましくは単一アミノ酸残基の置換である。
【０２５１】
本発明のポリペプチド（基準タンパク質）の“フラグメント”という用語は、野生型即ち基準タンパク質の完全アミノ酸配列の一部分を含むタンパク質分子を表すことを意味する。
【０２５２】
本発明の好ましいポリペプチド及びポリヌクレオチドは、特にそれらにホモロガスなポリペプチド及びポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／特性を有していると予測される。更に、本発明の好ましいポリペプチド及びポリヌクレオチドは少なくとも１つのＭＡＰＫＡＰ−２近縁活性を有している。
【０２５３】
本文中で使用された本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ（配列番号２）の活性という表現は、本発明の特徴的な活性を意味する。このような活性は典型的には１つまたは複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によって測定され、多くの場合に本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ活性に対応する。このような活性は例えば、第二メッセンジャー活性を測定するアッセイまたはリン酸化アッセイのような当業者に公知の任意の方法によって測定し得る。
【０２５４】
本発明のポリペプチド及び生物学的に活性のそれらのフラグメント及びそれらの機能的等価物はまた化学合成によって製造できる。例えば、製造業者によって提案された化学作用を使用するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａまたは４３１Ａの全自動ペプチドシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を使用して合成ポリペプチドを製造し得る。
【０２５５】
本発明はまた、許容される担体と共に、単離及び精製された本発明のポリペプチド、その活性フラグメント、精製された成熟タンパク質、その活性フラグメントのいずれかが単独でまたは互いに組合せて含まれている組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は組換えによって得られてもよく、化学合成されてもよく、または、天然ソースから精製されてもよい。
【０２５６】
本発明のポリペプチドは“成熟”タンパク質の形態でもよく、または、融合タンパク質のようなもっと大きいタンパク質の一部であってもよい。多数のヒスチジン残基のような精製を助ける配列または組換え産生中の安定性に有利な追加の配列を含ませるのがしばしば有利である。
【０２５７】
本発明の組換えＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当業界で公知のプロセスによって作製できる。従って、別の特徴によれば、本発明は、１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを含む発現系、このような発現系で遺伝子操作された宿主細胞、及び、組換え技術による本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの産生に関する。本発明のＤＮＡ構築物に由来のＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を産生させるために無細胞翻訳系も使用できる。
【０２５８】
また、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの生物学的に活性のフラグメントまたは変異体も包含される。フラグメントは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有している上記ポリペプチドのアミノ酸配列に部分的には全く同じであるが全体としては同じでないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。生物学的に活性のフラグメントは、成熟または天然型ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに付随するキナーゼ活性を、類似の活性または改善された活性または望ましくない活性の低減も含めて仲介するフラグメントである。活性は、天然基質のリン酸化だけでなく合成基質のリン酸化も含む。
【０２５９】
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼによって活性化（リン酸化）される有効な基質の一部を以下の表に示す。
公知のＨｓｐ−２７（熱ショックタンパク質−２７）の完全タンパク質配列。
２）Ｈｓｐ−２７に基づくペプチド
ａ）ＬＣＢ−ＹＳＲＡＬＳＲＱＬ−ＮＨ２
ｂ）ＬＣＢ−ＬＬＲＧＰＳＷＤＰＦＲ−ＮＨ２
ｃ）ＬＣＢ−ＲＡＬＳＲＱＬＳＳＧＶ−ＮＨ２
Ｈｓｐ−２５
グリコーゲンシンターゼに基づくペプチド
ａ）ＬＣＢ−ＫＫＬＮＲＴＬＳＶＡ−ＮＨ２
４）ＣＲＥＢに基づくペプチド
ａ）ＬＣＢ−ＫＲＲＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ
ここに、ＬＣＢ＝長鎖ビオチン、及び、ＮＨ２＝遊離アミン。
本発明で提供される配列に基づいて、公知の方法を使用して追加の基質を同定及び設計できる。
【０２６０】
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドと同様に、フラグメントは“独立”フラグメントでもよく、または、もっと大きいポリペプチド内部に含まれて一部または一領域を形成してもよく、最も好ましくは単一連続領域として含まれていてもよい。
【０２６１】
好ましいフラグメントは例えば、開示されたＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有しているが、アミノ末端を含む連続残基シリーズまたはカルボキシ末端を含む連続残基シリーズ、または、一方がアミノ末端を含み他方がカルボキシ末端を含む２つの連続残基シリーズが欠失している末端欠損ポリペプチドである。
【０２６２】
好ましくは、これらのポリペプチドのすべてが、本文中に開示されたポリペプチドの生物活性をそのキナーゼ活性も含めて保持している。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも８０％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、該ポリペプチドのフラグメントであって配列番号２の対応フラグメントに少なくとも８５％一致するフラグメントを包含する。
【０２６３】
上記に定義した配列及びフラグメントの変異体もこのグループに包含される。好ましい変異体は、保存性アミノ酸置換によって、即ち、１つの残基が類似特性をもつ別の残基で置換されることによって基準配列から変異した変異体である。このような置換の典型としては、それぞれ、Ａｌａ，Ｖａｌ，ＬｅｕとＩｌｅ、ＳｅｒとＴｈｒ、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕ、ＡｓｎとＧｉｎ、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、または、芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間で生じる置換がある。数個、５−１０個、１−５個または１−２個のアミノ酸が何らかの組合せで置換、欠失または付加された変異体が特に好ましい。
【０２６４】
ＩＩＩ．ペプチド核酸即ち“ＰＮＡ”
また別の実施態様では、本発明の核酸分子は、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸塩主鎖で修飾され得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸塩主鎖はペプチド核酸を産生するように修飾され得る（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３参照）。本文中で使用された“ペプチド核酸”または“ＰＮＡ”という用語は、デオキシリボースリン酸塩主鎖がプソイドペプチド主鎖で置換され４つの天然ヌクレオ塩基だけが保持されている核酸模擬体、例えば、ＤＮＡ模擬体を意味する。ＰＮＡの中性主鎖は低イオン強度条件下でＤＮＡ及びＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを許容することが判明していた。ＰＮＡオリゴマーの合成はＨｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４６７０−６７５に記載されているような標準固相ペプチド合成プロトコルを使用して行うことができる。
【０２６５】
新規なＭＡＰＫＡＰ−２コーディング核酸分子のＰＮＳは治療及び診断の用途に使用できる。例えば、転写もしくは翻訳の中断を誘発したりまたは複製を阻害することによって遺伝子発現の配列特異的調節を生じさせるアンチセンス薬剤またはアンチジーン薬剤としてＰＮＡを使用できる。本発明の核酸分子のＰＮＡはまた、遺伝子内部の単一塩基対の突然変異を（例えばＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピングによって）分析するために使用でき、別の酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）前出）と併用するときは“人工制限酵素”として使用でき、または、ＤＮＡの配列決定用もしくはハイブリダイゼーション用のプローブもしくはプライマーとして使用できる（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ前出）。
【０２６６】
別の実施態様においては、本発明のＰＮＡが、（例えばそれらの安定性または細胞による取り込みを増進するために）、親油性もしくは別のヘルパー基をＰＮＡに付着させることによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成することによって、または、リポソームもしくは当業界で公知の別の薬物デリバリー技術を使用することによって修飾され得る。例えば、本発明の核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、ＰＮＡとＤＮＡとの有利な特性を併せて有するように作製できる。
【０２６７】
このようなキメラでは、ＤＮＡ認識酵素（例えばＲＮＡアーゼＨ及びＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用でき、ＰＮＡ部分は高い結合親和性及び特異性を与える。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合数及び配向に基づいて選択された適正長さのリンカーを使用して結合できる（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）前出及びＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら，（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載された手順で行うことができる。例えば、標準ホスホラミダイト結合法を使用して固体支持体の上でＤＮＡ鎖を合成し、修飾したヌクレオシド類似体、例えば、５′−（４−メトキシトリチル）アミノ−５′−デオキシ−チミジンホスホラミダイト、をＰＮＡとＤＮＡの５′末端との中間に使用できる（Ｍａｇ，Ｍ．ら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次に、ＰＮＡモノマーを段階的に結合させて５′ＰＮＡセグメントと３′ＤＮＡセグメントとをもつキメラ分子を作製する（Ｆｉｎｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）前出）。あるいは、５′ＤＮＡセグメントと３′ＰＮＡセグメントとを有するキメラ分子を合成してもよい（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
【０２６８】
別の実施態様では、オリゴヌクレオチドが、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体をｉｎ  ｖｉｖｏでターゲッティングするため）、または、細胞膜透過促進剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８８／０９８１０参照）、または、血液脳関門通過促進剤（例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／１０１３４参照）のような別の付加基を含んでいてもよい。更に、オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションに起動される開裂剤（例えば、Ｋｒｏｌら，（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６）またはインターカレート剤（例えばＺｏｎ，（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９）で修飾されてもよい。このために、オリゴヌクレオチドを別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションに起動される架橋剤、輸送剤、または、ハイブリダイゼーションに起動される開裂剤）にコンジュゲートしてもよい。
【０２６９】
ＩＶ．組成物
本発明はまた、シグナル伝達経路にＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼが含まれているとき、該シグナル伝達経路の異常を軽減する方法を提供する。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼが関与する個々の成分の活性及び／またはレベルの調節を含む障害、例えば、細胞増殖障害、造血細胞障害、並びに、炎症及びリューマチ様関節炎のような免疫系の障害を治療する組成物及び方法、また、このような治療薬の同定方法が本発明の範囲に包含される。更に、このような障害の予知方法及び予知用組成物も記載されている。
【０２７０】
このような障害の治療方法及び治療用組成物に関しては、このような方法及び組成物の非限定例は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとＭＡＰＫＡＰ−２ターゲットまたは天然結合相手（ＮＢＰ）との間の相互作用を抑制または阻害し得る薬剤を含む。これらは、ＭＡＰＫＡＰ−２をリン酸化する（１つまたは複数の）上流キナーゼも包含する。あるいは、ＮＢＰがＭＡＰＫＡＰ−２基質、例えばＨｓｐ−２５などでもよい。ＭＡＰＫＡＰ−２の天然型または組換えポリペプチドとその結合相手との間の相互作用の活性及び／またはレベルを調節し得る薬剤はチロシンホスファターゼの脱リン酸活性を阻害または抑制する薬剤を包含する。このような薬剤はまた、活性化ＭＡＰＫＡＰ−２のリン酸化活性を増進または刺激し、従って、天然基質例えばＨｓｐ−２５または人工基質との相互作用をもたらす薬剤を包含する。
【０２７１】
このような薬剤の同定方法も記載されている。これらの方法は例えば、複合体（例えばＭＡＰＫＡＰ−２：ＮＢＰ複合体）の成分間の相互作用を破壊または阻害または促進し得る薬剤を同定するアッセイを包含し、また、このような複合体を破壊及び／または阻害及び／または促進し得る薬剤を合理的に設計する範例及び戦略を包含する。
【０２７２】
ＭＡＰＫＡＰ−２：ＮＢＰ複合体が関与する障害は、例えば、このような複合体の存在が正常なシグナル伝達イベントの異常な阻害を生じさせることが原因で発症する。このような症例では、複合体の破壊によって正常なシグナル伝達イベントが回復するであろう。更に、異常な複合体は、変異した亜細胞性アダプタータンパク質の局在化を惹起し、その結果として例えば機能不全の細胞イベントが生じる。この症例では、複合体の阻害によって正常な細胞構造が回復されて維持され得る。また、複合体の破壊を惹起する１つまたは複数の薬剤は複合体の別の潜在的な成分間の相互作用の破壊を惹起し得る。
【０２７３】
上述の抗体は、１つの複合体またはそのエピトープを特異的に認識するように作製されてもよく、または、複合体の成分のいずれかに存在するエピトープ、特に成分が複合体から離れて独立に存在するときには抗体によって認識されないようなエピトープを特異的に認識する抗体であってもよい。このような抗体は例えば、生物サンプル中の複合体の検出に使用されてもよく、あるいは、複合体形成の阻害方法として、従って障害の発症を阻害するために使用されてもよい。一般に、ＭＡＰＫＡＰ−２に対する抗体に関する上述の技術は複合体（ＭＡＰＫＡＰ−２：ＮＢＰ）に対する抗体に対しても使用でき、その逆も可能である。
【０２７４】
Ｖ．抗−ＭＡＰＫＡＰ−２抗体及びその使用
本発明の別の目的は抗体に関する。例えば、（１つまたは複数の）本発明のポリペプチド、そのフラグメントまたはｃＤＮＡ配列に基づくその類似体に由来の免疫原を使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清、または、モノクローナル抗体を、標準プロトコルによって作製できる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）参照）。これらの抗体はまた、（１つまたは複数の）ハイブリドーマを作製するため、医薬組成物を同定するため、及び、ＤＮＡ／タンパク質相互作用を研究するために使用できる。
【０２７５】
“免疫特異的”という用語は、抗体が本発明のポリペプチドに対して従来技術の別の近縁ポリペプチドに対するよりも大きい親和性を有していることを意味する。
【０２７６】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これらの抗体のフラグメント、及び、ヒト化形態を包含する。
【０２７７】
例えば、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）に記載されているような当業界で公知の方法によって産生させ得る。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。本発明のポリペプチドはこのような抗体を産生させるときに免疫原として使用できる。あるいは、合成ペプチドを（市販のシンセサイザーを使用して）作製し、免疫原として使用することもできる。アミノ酸配列が対応ポリペプチドの疎水性ドメインをコードするかまたは親水性ドメインをコードするかを判断するためにこれらのアミノ酸配列を当業界で公知の方法によって分析できる。キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフトまたは二機能性の抗体のような変形抗体も当業界で公知の方法によって生産できる。このような抗体はまた、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，前出に記載されたハイブリドーマ、化学合成または組換え方法によって産生させ得る。抗ペプチド抗体及び抗融合タンパク質抗体も使用できる。（例えば、Ｂａｈｏｕｔｈら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２：３３８（１９９１）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）参照、これらは参照によって本発明に含まれるものとする）。
【０２７８】
ポリクローナル抗体は、複合体またはその抗原機能性誘導体のような抗原によって免疫感作された動物の血清から得られた抗体分子の不均一集団である。
【０２７９】
１つの特定抗原に対する抗体の実質的に均一な集団であるモノクローナル抗体は培養中の連続細胞系によって抗体分子を産生させる任意の技術によって得ることができる。これらの技術の非限定例は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）及び米国特許第４，３７６，１１０号のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２，１９８３；Ｃｏｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０，１９８３）、及び、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５，ｐｐ．７７−９６）である。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びその任意のサブクラスを包含する任意の免疫グロブリンクラスのものでよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養し得る。この方法は高い抗体価のｍＡｂをｉｎ  ｖｉｖｏで産生できるので、現在の好ましい生産方法である。
【０２８０】
ポリクローナル抗体を産生させるために、ウサギ、マウス、ラットなどを非限定例とする種々の宿主動物を複合体の注射によって免疫する。免疫応答を増進するために、宿主の種に従って種々のアジュバントを使用し得る。アジュバントの非限定例は、フロインド（完全及び不完全）アジュバント、リゾレシチンのようなミネラルゲル、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有効なヒトアジュバントである。
【０２８１】
抗体を産生することが判明している動物（マウス、ウサギなど）は選択されたポリペプチドによって免疫感作できる。免疫感作方法は当業界で公知である。このような方法としては、ポリペプチドの皮下または腹腔内注射がある。免疫感作に使用するポリペプチドの量を免疫感作する動物の種類、ポリペプチドの抗原性及び注射部位に基づいて変更することは当業者に理解されよう。
【０２８２】
ペプチド抗原性を増強するためにポリペプチドを修飾してもよく、または、アジュバントに入れて投与してもよい。ポリペプチドの免疫原性を増強する方法は当業界で公知である。このような手順は、抗原とヘテロロガスタンパク質（例えば、グロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）との結合、または、免疫感作中のアジュバントの混在を含む。モノクローナル抗体については、免疫動物の脾細胞を摘出し、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４骨髄腫細胞のような骨髄腫細胞に融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞にする。
【０２８３】
モノクローナル抗体を製造するために、連続細胞系培養物によって産生される抗体を供給する任意の技術を使用し得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）がある。抗体の活性フラグメントは“抗体”の定義に包含される。
【０２８４】
慣用の技術によって新規なＭＡＰＫＡＰ−２抗原に対するヒトモノクローナル抗体を作製することは容易ではないので、ヒト以外の抗体の抗原結合領域例えばＦ（ａｂ′）２または超可変領域を組換えＤＮＡ技術によってヒトの定常領域（Ｆｃ）または骨格領域に移して実質的にヒトの分子を作製するのが望ましい。このような方法は当業界で広く知られており、例えば、米国特許第４，８１６，３９７号、欧州特許公開１７３，４９４及び２３９，４００に記載されている。これらの文献は参照によって本発明に含まれるものとする。あるいは、参照によって該文献に含まれるＨｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に概説された汎用プロトコルに従って、ヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングし次いで所望の特異性の抗体（または結合フラグメント）をコードする配列をクローニングし増幅することによって、ヒトのポリペプチドに特異的に結合するヒトのモノクローナル抗体またはその部分をコードするＤＮＡ配列を単離してもよい。
【０２８５】
抗体フラグメントもまた本発明の範囲内に包含される。これらは公知の技術によって作製し得る。例えば、このようなフラグメントの非限定例は、抗体分子のペプシン消化によって産生できるＦ（ａｂ′）２フラグメント、及び、Ｆ（ａｂ′）２フラグメントのジスルフィドブリッドを還元することによって作製し得るＦａｂフラグメントである。あるいは、ＰＴＫ／アダプター複合体に対する所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定できるようにＦａｂ発現ライブラリーを構築してもよい（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）。
【０２８６】
フラグメントはまた、一本鎖抗体、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、及び、上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。一本鎖抗体の産生技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体の産生にも応用できる。あるいは、一本鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｈｏｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８；及びＷａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６，１９８９）を複合体特異的一本鎖抗体の産生に応用できる。一本鎖抗体は、アミノ酸ブリッジを介してＦｃ領域のＨ鎖フラグメントとＬ鎖フラグメントとを連結して一本鎖ポリペプチドとすることによって形成される。
【０２８７】
“ヒト化抗体”もまたキメラ抗体として本発明の範囲に包含される。“ヒト化抗体”の作製技術は公知であり、当業者の技術の範囲内である。本発明の抗体のヒト化形態は、キメラ化またはＣＤＲグラフト化のような当業界で公知の手順を使用して作製し得る。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス、または、別の哺乳類を含む別の生物を使用し得る。抗体は好ましくは、免疫原性を最小にするために“実質的にヒトの”であり、実質的に純粋な形態である。“実質的にヒトの”という用語は、一般には少なくとも約７０％のヒト抗体配列、好ましくは少なくとも約８０％のヒト抗体配列、最も好ましくはヒト体内の免疫原性を最小にするために少なくとも約９０−９５％またはそれ以上のヒト抗体配列を含有することを意味する。
【０２８８】
適正な抗原特異性をもつマウス抗体分子から得られた遺伝子を適正な生物活性をもつヒトの抗体分子と共にスプライシングすることによって“キメラ抗体”を産生するように開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ，３１４；４５２−４５４，１９８５）を使用できる。キメラ抗体は、ネズミのｍＡｂに由来の可変領域とヒトの免疫グロブリン定常領域とを有する分子のように異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【０２８９】
別の実施態様において、本発明はサンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを検出する方法に関する。方法は、（ａ）サンプルを免疫複合体が形成される条件下で上述の抗体に接触させる段階と、（ｂ）ポリペプチドに結合した上記抗体の存在を検出する段階とから成る。より詳細には、方法が、被験サンプルを１つまたは複数の本発明の抗体と共にインキュベートする段階と、抗体が被験サンプルに結合したか否かを検定する段階とを含む。サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２レベルが正常レベルに比べて変化しているとき、この変化は筋疾患を示す指標となる。抗体を被験サンプルと共にインキュベートする条件は固定されていない。インキュベーション条件は、アッセイに使用されるフォーマット、使用される検出方法、並びに、アッセイに使用される抗体の種類及び特性に依存する。、常用の免疫アッセイフォーマット（例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ、拡散に基づくオクタロニー法、または、ロケット免疫蛍光アッセイなど）のいずれかを本発明の抗体が使用できるように容易に修正できることは当業者に理解されよう。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，“Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋら，“Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌａ．Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に見出すことができる。
【０２９０】
本発明の免疫アッセイの被験サンプルは、細胞、細胞のタンパク質抽出物もしくは膜抽出物、または、血液、血清、血漿もしくは尿のような生物体液を包含する。上述の方法に使用される被験サンプルは、アッセイフォーマット、検出方法及びアッセイサンプルとして使用される組織、細胞もしくは抽出物の種類に基づいて変更される。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物の調製方法は当業界で公知であり、使用システムに合うサンプルが得られるように容易に修正できる。
【０２９１】
別の実施態様では、本発明は上述のモノクローナル抗体またはその結合性フラグメントを産生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは、特定のモノクローナル抗体を分泌し得る不死化した細胞系である。一般に、モノクローナル抗体及びハイブリドーマの製造方法は当業界で公知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１（１９８０））。
【０２９２】
当業界で公知の多数の方法のいずれか１つを使用して所望の特徴をもつ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定できる。これらの方法は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット分析またはラジオイムノアッセイによるハイブリドーマのスクリーニングを含む（Ｌｕｔｚら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４（１９８８））。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、当業界で公知の手順を使用してクラス及びサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，前出（１９８４））。ポリクローナル抗体については、上述の手順の１つを使用して、抗体含有抗血清を免疫動物から単離し、所望の特異性をもつ抗体の存在についてスクリーニングする。
【０２９３】
代替的な実施態様では、上述の抗体を検出可能に標識することが考察される。例えば、検出可能なマーカーを直接または間接に抗体に付着させる。有用なマーカーは例えば、放射性同位体、アフィニティラベル（例えば、ビオチン、アビジン、など）、酵素ラベル（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、など）、蛍光ラベル（ＦＩＴＣまたはローダミンなど）、常磁性原子などである。このような標識を行う手順は当業界で公知であり、例えば、Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７９）；Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌら，Ｉｍｍｕｎｏｔ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６）を参照し得る。本発明の標識抗体は、特異的ペプチドを発現する細胞または組織を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｓｉｔｕアッセイで使用できる。
【０２９４】
従って、本文中では、細胞の表面で新規なポリペプチドの存在を検出する方法を考察する。１つのアッセイフォーマットでは、標識抗体、好ましくは、ｈＭＡＰＫＡＰ−２を高レベル発現することが判明している体組織と反応するモノクローナル抗体を使用し、抗体に対する特異的結合を測定することによって本発明のポリペプチドを同定及び／または定量する。このアッセイは典型的には免疫複合体の形成に導く条件下で行う。非標識の第一抗体を第一抗体に反応性のラベルと組合せて使用して受容体を検出できる。例えば、第一抗体を特異的に検出できるようにした標識第二抗体によって第一抗体を間接的に検出してもよい。あるいは、、抗−ＭＡＰＫＡＰ−２抗体を上述のように直接的に標識できる。放射性核種、粒子（例えば、金、フェリチン、磁気粒子、赤血球）、フルオロホア、化学発光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特にハプテン）などのような多くの様々なラベルを使用し得る。
【０２９５】
本発明の別の実施態様では、上述の抗体を固体支持体に固定する。このような固体支持体の例は、ポリカーボネートのようなプラスチック、アガロース及びセファロースのような複合糖質、ポリアクリルアミドのようなアクリル樹脂、ラテックスビーズである。このような固体支持体に抗体を結合する技術は当業界で公知である（Ｗｅｉｒら，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０（１９８６）；Ｊａｃｏｂｙら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４））。本発明の固定化抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ並びにイムノクロマトグラフに使用できる。
【０２９６】
本発明のポリペプチドの“（１つまたは複数の）免疫活性フラグメント”も本発明に包含される。このようなフラグメントは、ターゲット免疫系（例えばネズミまたはウサギ）中でＭＡＰＫＡＰ−２特異的抗体を誘発し得るか、または、本発明のポリペプチド特異的抗体への結合に関して天然型ＭＡＰＫＡＰ−２と競合し得、従って、生物サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの存在を検出するイムノアッセイに有用なタンパク質である。このような免疫活性フラグメントの最小サイズは典型的には８−１１個の連続アミノ酸から成る。
【０２９７】
更に、合理的に設計された抗ペプチドペプチドを産生すべく特異的ペプチド配列に結合し得るペプチドを作製するために、当業者は、現在入手可能な手順、並びに、抗体に関して上記に開示された技術、方法及びキットを容易に修正し得る。例えば、Ｈｕｒｂｙｏ，“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８９−３０７（１９９２）及びＫａｓｐｃｚａｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：９２３０−８（１９８９）参照。
【０２９８】
抗ペプチドペプチドは多くの方法のいずれか１つによって作製し得る。補足的に説明すると、抗ペプチドペプチドは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ配列中に見出される塩基性アミノ酸残基を酸性残基で置換し、疎水性及び非電荷の極性基は維持することによって産生できる。例えば、リシン、アルギニン及び／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換し、グルタミン酸残基をリシン、アルギニンまたはヒスチジンで置換する。
【０２９９】
このような抗体はまた、本発明のポリペプチドのイムノアフィニティまたはアフィニティクロマトグラフィーに使用できる。このように産生される抗体はまた、特に、哺乳類、好ましくはヒトの組織のような身体サンプル中に存在する（１つまたは複数の）本発明のポリペプチドのレベルを検出する診断方法及びシステムに使用できる。このようなポリペプチドの検出に関しては、抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージング方法に使用できる。
【０３００】
サンプル中の本発明のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出に有用な免疫手順は、検出可能な抗体を使用するイムノアッセイを包含する。このようなイムノアッセイは例えば、競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、などを包含する。これらは例えば米国特許第４，６４２，２８５号、第４，３７６，１１０号、第４，０１６，０４３号、第３，８７９，２６２号、第３，８５２，１５７号、第３，８５０，７５２号、第３，８３９，１５３号、第３，７９１，９３２号、及び、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に概説されている。これらの文献は参照によって本発明に含まれるものとする。またＰａｎｄｅｘマイクロ蛍光アッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイ及び免疫組織化学染色手順も包含される。これらも当業界で公知である。
【０３０１】
従って、抗ＭＡＰＫＡＰ−２抗体（例えばモノクローナル抗体）は、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準技術によって天然ＭＡＰＫＡＰ−２を単離するために使用できる。抗ＭＡＰＫＡＰ−２抗体は細胞から得られた天然ＭＡＰＫＡＰ−２の精製、及び、宿主細胞中で発現された組換え産生ＭＡＰＫＡＰ−２の精製を促進する。更に、抗ＭＡＰＫＡＰ−２抗体は、ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質の量及び発現パターンを評価するために（例えば、細胞溶解液または細胞上清中の）ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質を検出するために使用できる。抗ＭＡＰＫＡＰ−２抗体は、例えば所与の治療計画の効果を判定するための臨床試験手順の一部として、組織中のタンパク質レベルをモニターするために診断用に使用できる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合（即ち、物理的に連結）させることによって促進され得る。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質及び放射性物質である。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼである。適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンである。適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンである。発光物質の例は、ルミノールである。生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンである。適当な放射性物質の例は、１２５Ｉ，１３１Ｉ，３５Ｓまたは３Ｈである。
【０３０２】
サンプル中のポリペプチドの検出に抗体を使用できる平均的な当業者に公知の様々なアッセイフォーマットが存在する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照。例えば、抗体がサンプルのポリペプチドに結合しサンプルからポリペプチドを除去するように抗体を固体支持体に固定化し得る。次に、検出可能なリポーター基を有しており抗体／ペプチド複合体に結合する第二抗体を使用して結合ポリペプチドを検出し得る。あるいは、競合アッセイを使用してもよい。競合アッセイでは、固定化抗体に結合するポリペプチドをリポーター基で標識し、抗体とサンプルとのインキュベーション後に固定化抗体に結合させる。サンプルの成分による標識ポリペプチドと抗体との結合阻害の程度がサンプル中のポリペプチドのレベルを表す指標となる。これらの方法で使用し得る適当なリポーター基の非限定例は、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシターゼ）、基質、補因子、インヒビター、染料、放射性核種、発光基、蛍光基及びビオチンである。
【０３０３】
本発明の別の実施態様においては、上述のような検出方法を行うために必要なすべての試薬を含有するキットが提供される。キットは、（ｉ）上述の抗体を収容している第一の容器手段と、（ｉｉ）該抗体の結合相手とラベルとから成るコンジュゲートを収容している第二の容器手段とから成る。
【０３０４】
代替実施態様では、キットが更に、１つまたは複数の以下の成分を収容している１つまたは複数の別の容器を含む：洗浄用試薬、及び、結合抗体の存在を検出し得る試薬。検出用試薬の非限定例は、標識第二抗体であるか、あるいは、第一抗体が標識されているときは、標識抗体と反応し得るクロモホア試薬、酵素試薬、抗体結合試薬である。核酸プローブキットに関して上述したような区画化キットでもよい。
【０３０５】
本発明に記載された抗体を当業界に公知の既成のキットフォーマットの１つに容易に組み込めることは当業者に容易に理解されよう。
【０３０６】
ＶＩ．本発明の使用及び方法
本発明の（１つまたは複数の）ポリペプチド（キナーゼポリペプチド）は哺乳類宿主に遍在性であると仮定され、多くの病態も含めた多くの生物機能の一因である。従って、一方では本発明ポリペプチドを刺激する化合物または薬物、他方では本発明ポリペプチドの機能を阻害し得る化合物または薬物を見出すことが望ましい。
【０３０７】
より特定的には、本文中に記載した核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモローグ及び抗体は以下の方法の１つまたは複数に使用できる：（ａ）スクリーニングアッセイ；（ｂ）予測医学、即ち、診断アッセイ、予知アッセイ、モニター用臨床試験；及び、（ｃ）治療方法、即ち、治癒及び予防。
【０３０８】
本発明の核酸は例えば、本発明のポリペプチドを発現させるため、ＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子中の遺伝子変異を検出するため、及び、ＭＡＰＫＡＰ−２活性を調節するために後述するように使用できる。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼもしくはその天然基質の過少発現もしくは過剰発現またはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ特異的インヒビターもしくはアゴニストの産生を特徴とする障害を治療するために使用できる。また、本発明のポリペプチドは、天然産生ＭＡＰＫＡＰ−２基質をスクリーニングするため、ＭＡＰＫＡＰ−２活性を調節する治療薬もしくは化合物をスクリーニングするため、または、野生型ＭＡＰＫＡＰ−２に比較して活性低下もしくは活性異常を示すＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを産生させるために使用し得る。更に、抗ＭＡＰＫＡＰ−２抗体は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの検出及び単離、ＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドの造影及び体内利用効率の調節、並びに、ＭＡＰＫＡＰ−２活性の調節に有用であろう。“ＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドまたはキナーゼ”という用語が好ましくは、実質的に配列番号２で表される配列を有するポリペプチドであることを理解されたい。
【０３０９】
Ａ．スクリーニングアッセイ
本文中に記載されたシグナル伝達キナーゼ、即ち、本発明のポリペプチドまたはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、その免疫原性フラグメントもしくはオリゴペプチドは、様々な薬物スクリーニング技術のいずれかで治療用化合物をスクリーニングするために使用できる。このような試験で使用されるフラグメントは溶液中に遊離していてもよく、固体支持体に固着されていてもよく、細胞表面に支持されてもよく、または、細胞内に局在してもよい。
【０３１０】
細胞ベースのアッセイ
細胞ベースのアッセイは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに結合するか、例えばＭＡＰＫＡＰ−２発現もしくはＭＡＰＫＡＰ−２活性を刺激もしくは阻害する効果を有しているか、または、例えばＭＡＰＫＡＰ−２基質の発現もしくは活性を刺激もしくは阻害する効果を有しているモジュレーターを同定するため、即ち、モジュレーターの候補となるかもしくはモジュレーターとして試験される化合物もしくは薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模擬体、小分子またはその他の薬物）を同定するために使用できる。
【０３１１】
本文中で使用された本発明のポリペプチドの“活性を調節する”化合物またはシグナルという表現は、化合物またはシグナルの存在下で本発明のポリペプチドが化合物またはシグナルの非存在下とは異なる活性を示すように本発明のポリペプチドの活性を変更する化合物またはシグナルを表す。より特定的には、このような化合物またはシグナルはアゴニスト及びアンタゴニストである。このような活性は一般に、本文中に記載した慣用のアッセイを使用して検出される。
【０３１２】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当業界で例えばＤｅＷｉｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９（１９９３）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８（１９９４）に見出される。
【０３１３】
化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２）、または、ビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９１））、チップ（Ｆｏｄｏｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９（１９９２））またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０））に与えられる。
【０３１４】
従って、組換えまたは天然のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、並びに、本発明のポリペプチドの機能をｉｎ  ｖｉｖｏで調節する化合物のスクリーニング方法は本発明の範囲内に包含される。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質または非タンパク質性有機分子である。化合物は、新規なシグナル伝達キナーゼポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはその機能を増進または減退させることによって調節し得る。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはポリペプチドの機能を調節する化合物は様々なアッセイによって検出し得る。
【０３１５】
アッセイは、発現または機能の変化の有無を判定する簡単な“イエス／ノー”アッセイでもよい。被験サンプルの発現または機能を標準サンプルの発現または機能のレベルに比較することによってアッセイを定量的にしてもよい。
【０３１６】
従って、本発明の実施態様として、シグナル伝達キナーゼポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法を期待し得る。該方法は、シグナル伝達キナーゼ活性のモジュレーターであると推測される候補化合物を、実質的に配列番号２で表される配列を有するシグナル伝達キナーゼに組合せる段階と、キナーゼ活性に対するモジュレーター候補化合物の効果、すなわち、Ｈｓｐ−２７のようなＭＡＰＫＡＰ−２基質をリン酸化するＭＡＰＫＡＰ−２の能力を測定する段階とから成る。
【０３１７】
従って、１つの目的によれば、本発明は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性を調節する試薬の同定方法であって、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを被験試薬と共にインキュベートする段階と、ＭＡＰＫＡＰ−２基質をリン酸化するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの能力に対する被験試薬の効果を測定する段階とから成る方法を提供する。
【０３１８】
あるいは、シグナル伝達キナーゼの活性を調節する化合物の同定方法が、シグナル伝達キナーゼ活性のモジュレーター候補化合物と実質的に配列番号２で表される配列を有するシグナル伝達キナーゼ分子を発現する宿主細胞とを組合せる段階と、キナーゼ活性に対するモジュレーター候補化合物の効果を測定する段階とから成る。キナーゼのインヒビターに関する好ましい細胞アッセイはほぼ２種類、即ち、（１）キナーゼ活性の直接測定、及び、（２）シグナル伝達カスケードの下流イベントの測定、に大別される。これらの方法は、内因性キナーゼまたは過剰発現した組換えキナーゼを使用できる。従って、ＭＡＰＫＡＰ−２シグナル伝達経路の活性化は、３２Ｐ取り込み速度の定量によって測定されるような、基質例えばＨｓｐ−２７のリン酸化速度によるＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性の測定を含み得る。Ｈｓｐ−２７または別の適当なＭＡＰＫＡＰ−２基質は宿主細胞によって同時に発現されてもよく、または代替的には、基質が外部から添加されてもよい。
【０３１９】
本文中で使用された“ＭＡＰＫＡＰ−２基質”という用語は、ＭＡＰＫＡＰ−２基質、例えば、Ｈｓｐ−２７、Ｈｓｐ−２５のような天然基質を意味してもよく、当業者に公知の人工基質を意味してもよい。
【０３２０】
“ＭＡＰＫＡＰ−２活性の調節”という用語は、阻害効果または刺激効果を包含する。本発明は、ＭＡＰＫＡＰ−２活性を阻害する試薬のスクリーニングに特に有用である。このような試薬は、ＭＡＰＫＡＰ−２に仲介される障害、例えば、炎症及び酸化性損傷の治療または予防に有効である。
【０３２１】
ポリペプチド変異体及び本文中で検討したその他の薬剤を評価するために使用されるＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼアッセイは、Ｈｓｐ−２７または別のＭＡＰＫＡＰ−２基質をリン酸化し、これによってＭＡＰＫＡＰ−２を活性にする（即ち、Ｈｓｐ−２７のような基質をｉｎ  ｖｉｖｏリン酸化し得る）化合物の能力を評価する任意のアッセイを包含する。このような方法に使用し得るＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼは、内因性タンパク質またはその変異体でもよく、精製タンパク質または組換えタンパク質でもよく、平均的な当業者に明らかな様々な技術のいずれかを使用して製造し得る。
【０３２２】
例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２をコードするｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び平均的な当業者に公知の方法を使用して適当なヒトｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅によってクローニングし得る。ＭＡＰＫＡＰ−２は、公表された配列に基づくプライマーを使用してクローニングし得る（Ｄｅｒｉｊａｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：６８２−６８５，１９９５）。ＭＡＰＫＡＰ−２  ｃＤＮＡを次に細菌性発現ベクターにクローニングし、標準技術を使用して大腸菌のような細菌中でタンパク質を産生させるとよい。細菌性発現ベクターは、組換えタンパク質がＮ−末端またはＣ−末端にエピトープを含むようにグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼタンパク質（ＧＳＴ）のようなエピトープをコードするＤＮＡを含んでいてもよいが、必ずしも含んでいなくてもよい。
【０３２３】
ＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子／基質をリン酸化するＭＡＰＫＡＰ−２の能力は例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイによって測定できる。簡単に説明すると、ＭＡＰＫＡＰ−２基質分子、例えば免疫沈降したＭＡＰＫＡＰ−２基質分子（例えば、Ｈｓｐ−２７）を、このような分子を発現している細胞系から採取し、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ及び放射性ＡＴＰ例えば［．δ３２Ｐ］ＡＴＰと共に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＡＴＰを含有する適当なバッファ中、３０℃で６０分間インキュベートできる。一般には、約５０ｎｇ−１μｇのポリペプチド及び５０ｎｇの組換えＭＡＰＫＡＰ−２を２−７ｃｐｍ／ｆｍｏｌ［．χ３２Ｐ］ＡＴＰと共に使用すれば十分である。インキュベーション後、免疫沈降したＭＡＰＫＡＰ−２基質分子を還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、膜例えばＰＶＤＦ膜に移し、オートラジオグラフにかける。オートラジオグラフ上に検出可能バンドが出現するとき、これは、ＭＡＰＫＡＰ−２基質、即ち、Ｈｓｐ−２７がリン酸化されたことを示す指標となる。
【０３２４】
ＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット基質への［３２Ｐ］リン酸塩の取り込みは、ホスファーイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用する技術のような平均的な当業者に公知の技術を使用して定量し得る。ポリペプチド変異体の基質特異性を評価するためには、Ｈｓｐ−２７に代えて別のＭＡＰＫＡＰ−２基質を使用する以外は上述とほぼ同様にしてキナーゼアッセイを行うとよい。
【０３２５】
また、ＭＡＰＫＡＰ−２基質のどの残基がリン酸化されたかを判定するためにリン酸化基質のホスホアミノ酸解析を行うことができる。簡単に説明すると、放射性リン酸化タンパク質バンドをＳＤＳゲルから切り出し、部分的酸加水分解処理する。次に生成物を表面的（ｏｎｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ）電気泳動によって分離し、例えば、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）で解析し、ニンヒドリン染色したホスホアミノ酸標準に比較する。
【０３２６】
キナーゼの細胞活性を測定するためのソースは、標準プロテアーゼインヒビターの存在下で１−３回の冷凍−解凍サイクルを行って調製した全細胞溶解液でよい。あるいは、標準タンパク質精製法によってキナーゼを部分的または完全に精製してもよい。最後に、本文中に記載したＣ末端調節ドメインに特異的な抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィーによってまたはやはり本文中に記載した組換えキナーゼに組み込んだエピトープタグに特異的なリガンドによってキナーゼを精製し得る。次に、キナーゼ調製物を従来技術に記載の活性アッセイにかける。
【０３２７】
ＭＡＰＫＡＰ−２がリン酸化によって活性化されるか否かを判断するために、エピトープタグを添付したかまたは不添付のＭＡＰＫＡＰ−２の基質、例えばＨｓｐ−２７を使用して、結合ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行うこともできる。代替バッファを使用でき、このようなバッファの組成はキナーゼ活性の有意な変化を伴うことなく変更できることに注目されたい。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化し、様々な公知技術のいずれかを使用して定量する。このようなアッセイを使用すると、活性化ＭＡＰＫＡＰ−２はバックグラウンドを少なくとも５％上回るレベルでＨｓｐ−２７をリン酸化し得るであろう。
【０３２８】
ＭＡＰＫＡＰ−２基質リン酸化の特異性は、Ｈｓｐ−２７の活性化測定によって試験できるだけでなく、ＭＡＰＫＡＰ−２リン酸化部位の欠失した突然変異Ｈｓｐ−２７を代わりに使用することによって試験できる。対照値に比べた基質のリン酸化の変化は、ＭＡＰＫＡＰ−２シグナル伝達経路の変化、及び、被験者の体内でＭＡＰＫＡＰ−２仲介障害の危険性が増大していることを示す指標となる。
【０３２９】
本発明の１つの実施態様は、イムノキナーゼアッセイを使用するサンプル中の活性ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの検出に関する。簡単に説明すると、標準技術を使用してＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの非反復配列に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を誘発する。細胞抽出物のような被験サンプルを抗ＭＡＰＫＡＰ−２抗体と共にインキュベートしてＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを免疫沈降させ、免疫沈降した物質を次に基質（例えばＨｓｐ−２７）と共に、基質リン酸化に適した条件下でインキュベートする。基質リン酸化のレベルは一般に、本文中に記載したような様々なアッセイのいずれかを使用して測定できる。
【０３３０】
シグナル伝達キナーゼの生物活性を調節する化合物の同定方法も好ましい。該方法は、シグナル伝達キナーゼ活性のモジュレーター候補化合物と実質的に配列番号２で表される配列をもつシグナル伝達キナーゼとを組合せる段階と、合成、機能または活性のような生物活性に対するモジュレーター候補化合物の効果を測定する段階とから成る。
【０３３１】
１つの実施態様では、スクリーニングアッセイは、ＭＡＰＫＡＰ−２プロモーターに作動可能に連結されたリポーター遺伝子がトランスフェクトされた細胞を被験化合物に接触させる段階と、リポーター遺伝子の発現レベルを測定する段階とから成る。リポーター遺伝子は例えば、色、蛍光、発光、細胞生存率、細胞栄養要求の軽減、細胞増殖及び薬物耐性のような検出可能シグナルを生じさせる遺伝子産物をコードし得る。例えばリポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼから成るグループから選択される遺伝子産物をコードし得る。
【０３３２】
シグナル伝達キナーゼの薬理活性を調節する化合物の同定方法も好ましい。方法は、シグナル伝達キナーゼ活性のモジュレーター候補化合物と実質的に配列番号２で表される配列を有するシグナル伝達キナーゼとを組合せる段階と、薬理活性に対する候補化合物の効果を測定する段階とから成る。
【０３３３】
サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性の検出に加えて、サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２のレベルを検出する方法も提供される。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはポリヌクレオチドのレベルは一般に、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合する試薬を使用して測定され得る。
【０３３４】
代表的な細胞ベースのアッセイは、ＭＡＰＫＡＰ−２の活性を調節する被験化合物の能力の測定に基づく。この場合、ＭＡＰＫＡＰ−２の活性を調節する被験化合物の能力を測定する段階は、例えば、実質的に配列番号２で表される配列を有するシグナル伝達キナーゼ分子が被験化合物または試薬に結合または相互作用する能力を測定することによって行う。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを検出するための試薬は典型的には抗体であり、抗体は本文中に記載の手順で調製し得る。
【０３３５】
１つの好ましい実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子に結合または相互作用するＭＡＰＫＡＰ−２の能力の測定は、ターゲット分子の活性を測定することによって行う。例えば、ターゲット分子（基質）の活性は、ターゲットの細胞性第二メッセンジャー（例えば、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３、など）の誘発を検出するか、ターゲット及び適当な基質の触媒／酵素活性を検出するか、リポーター遺伝子（検出可能マーカー、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結されたターゲット応答性調節エレメントから成る）の誘発を検出するか、または、ターゲットに調節された細胞応答を検出することによって測定できる。
【０３３６】
一般に、実質的に配列番号２で表される配列のシグナル伝達分子の生物活性及び／または薬理活性を調節するための、本文中に記載され、考察され、引用された方法に従って同定される化合物は本発明の特に好ましい実施態様である。
【０３３７】
別の実施態様は、シグナル伝達キナーゼポリペプチドまたはそのフラグメントに対する特異的結合アフィニティに基づいて複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。方法は、
（ｉ）複数の化合物を準備する段階と、
（ｉｉ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントと複数の化合物の各々とを、適当な条件下で結合し得るに十分な時間組合せる段階と、
（ｉｉｉ）複数の化合物の各々に対するキナーゼポリペプチドまたはそのフラグメントの結合を検出し、これによってシグナル伝達キナーゼポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定する段階と、から成る。
【０３３８】
本発明のまた別の実施態様は、ＭＡＰＫＡＰ−２活性のアゴニストまたはアンタゴニストの検出方法を提供する。方法は、実質的に配列番号２で表される配列を有するポリペプチドを発現する細胞を化合物の存在下でインキュベートする段階と、ポリペプチド活性レベルの変化を検出する段階とから成る。このようにして同定された化合物は、化合物の存在の指標となる活性変化を生じさせるであろう。好ましい実施態様では、化合物が複合混合物、例えば、血清、体液または細胞抽出物中に存在する。化合物が同定された後、当業界で公知の技術を使用して化合物を単離できる。
【０３３９】
好ましい実施態様では、方法が、（ａ）（ｉ）実質的に配列番号２で表される配列を有するポリペプチドと、（ｉｉ）ＭＡＰＫＡＰ−２結合相手／基質と、（ｉｉｉ）被験化合物とを含む反応混合物を形成する段階と、（ｂ）ポリペプチドと結合相手との間の相互作用を検出する段階から成る。被験化合物の非存在下に比べた被験化合物の存在下のポリペプチドと結合相手との間の相互作用の統計的に有意な変化（相乗または阻害）は、被験化合物がＭＡＰＫＡＰ−２生物活性の潜在的なアゴニスト（模擬体または相乗剤）またはアンタゴニスト（インヒビター）であることを示す指標となる。反応混合物は、無細胞タンパク質調製物、例えば、再構成タンパク質混合物または細胞溶解液でもよく、または、ＭＡＰＫＡＰ−２結合相手を組換え的に発現するヘテロロガス核酸を含む組換え細胞でもよい。
【０３４０】
好ましい実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２とＭＡＰＫＡＰ−２結合相手との間の相互作用を検出する段階は競合結合アッセイである。別の好ましい実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチド及びＭＡＰＫＡＰ−２結合相手の少なくとも一方が検出可能ラベルを含み、ＭＡＰＫＡＰ−２とＭＡＰＫＡＰ−２結合相手との間の相互作用は複合体中のラベルを検出することによって定量される。検出可能ラベルは例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子である。別の実施態様では、複合体をイムノアッセイによって検出する。
【０３４１】
別の実施態様においては、本発明は哺乳類のＭＡＰＫＡＰ−２付随活性を作動させる（刺激する）かまたは該活性に拮抗する方法を提供する。方法は、実質的に配列番号で表される配列を有するアゴニストまたはアンタゴニストを、作動または拮抗の効果を生じさせるに十分な量で該哺乳類に投与する段階から成る。
【０３４２】
本発明の好ましい実施態様は、配列番号２のような本文中に記載のヒトシグナル伝達ポリペプチドによって仲介される状態の治療を要する患者の治療方法である。方法は、本発明で考察される方法で実質的に配列番号２で表される配列を使用して薬理学的ターゲットとして同定されたヒトシグナル伝達調節化合物を有効量で投与する段階から成る。
【０３４３】
好ましい実施態様では、本発明は、リューマチ様関節炎のような哺乳類の炎症関連疾患をＭＡＰＫＡＰ−２活性のアゴニストまたはアンタゴニストで治療する方法に関する。方法は、ＭＡＰＫＡＰ−２付随機能を作動させるかまたは該機能に拮抗するために十分な量のアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳類に投与する段階から成る。
【０３４４】
無細胞アッセイ
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはその結合相手または基質と相互作用し得る化合物を同定し、これによってポリペプチドまたは結合相手の活性を修飾するために無細胞アッセイも使用できる。このような化合物は、ポリペプチドの活性に対して効果を有し得る。無細胞アッセイはまた、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとその天然の結合相手／ターゲット分子／基質、即ちＨｓｐ−２７との間の相互作用を調節する化合物を同定するために使用できるであろう。
【０３４５】
代表的な無細胞スクリーニングアッセイは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼポリペプチドまたはその機能性フラグメントと被験化合物または被験化合物のライブラリーとを両者間の複合体の形成に有利な条件下で接触させる段階と、複合体の形成を検出する段階とを含む。検出目的でポリペプチドを特定マーカーで標識し、被験化合物または被験化合物のライブラリーを異なるマーカーで標識できる。被験化合物とＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはそのフラグメントのような結合相手との相互作用は、インキュベーション段階及び洗浄段階後の２つのラベルのレベルを測定することによって検出できる。洗浄段階後の２つのラベルの存在が相互作用を示す指標となる。
【０３４６】
別の実施態様では、アッセイが、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼポリペプチドまたはその生物活性部分とＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに結合する既知の化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成させる段階と、アッセイ混合物を被験化合物に接触させる段階と、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと相互作用する被験化合物の能力を測定する段階とを含み、ポリペプチドと相互作用する被験化合物の能力を測定する段階は、被験化合物が既知化合物に比べてＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼポリペプチドまたはその生物活性部分に優先的に結合するという能力の測定から成る。
【０３４７】
代替的な無細胞アッセイでは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼポリペプチドまたはその生物活性部分を被験化合物に接触させ、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはその生物活性部分の活性を調節（刺激または阻害）する被験化合物の能力を測定する。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの活性を調節する被験化合物の能力の測定は例えば、上述のような直接結合測定方法の１つによってＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子（基質）に結合するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの能力を測定することによって行うことができる。
【０３４８】
ＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子に結合するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼポリペプチドの能力の測定はまた、リアルタイムの生体分子相互作用分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ））のような技術を使用して行うことができる。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５（１９９１）。本文中で使用された“ＢＩＡ”という用語は、いずれの相互作用体（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）も標識することなくリアルタイムの生体特異的相互作用を研究する技術である。表面プラスモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ））の光学的現象を生物分子間のリアルタイム反応の指標として使用できる。
【０３４９】
いずれの相互作用体も標識することなくＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとそのターゲット分子との間の相互作用を調節する化合物の能力を測定する代替的実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２とそのターゲット分子との相互作用を検出するためにマイクロ生理機能測定計（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）の使用が提案される。マイクロ生理機能測定計はＭＡＰＫＡＰ−２及びそのターゲット分子のいずれをも標識することなく相互作用を検出するために役立つ。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ｏ，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２。本文中で使用された“マイクロ生理機能測定計”（例えば細胞センサ）という用語は、光アドレス可能な電位差測定センサ（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ（ＬＡＰＳ））を使用して細胞がその周囲環境を酸性化する速度を測定する分析用計器である。この酸性化速度の変化を化合物と結合相手との間の相互作用の指標として使用できる。
【０３５０】
上述のような本発明のアッセイ方法の２つ以上の実施態様においては、複合体化した形態のタンパク質が複合体化しない形態のタンパク質から容易に分離できまたアッセイの全自動化に適応するようにＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはそのターゲット分子を固定化するのが望ましい。被験化合物とＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとの結合、または、候補化合物の存在下及び非存在下のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとターゲット分子との相互作用は、反応体の収容に適した任意の容器で行わせることができる。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、微量遠心管である。１つの実施態様では、一方または双方のタンパク質をマトリックスに結合させ得るドメインを付加する融合タンパク質を供給し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＭＡＰＫＡＰ−２融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ターゲット融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させ、次いで、被験化合物と合せるかまたは被験化合物及び非吸着ターゲットタンパク質もしくはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと合せて、複合体の形成に導く条件下（例えば、生理的条件の塩及びｐＨ）で混合物をインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去し、またビーズの場合には固定化マトリックスも除去し、例えば上述の手順で複合体を直接または間接に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ結合活性のレベルを標準技術を使用して測定することもできる。
【０３５１】
タンパク質をマトリックスに固定化する別の技術も本発明のスクリーニングアッセイに使用できる。例えば、ビオチンとストレプトアビジンとのコンジュゲーションを利用してＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子を固定化できる。ビオチニル化ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはターゲット分子は、当業界で公知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンをコートした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に固定化する。
【０３５２】
あるいは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはターゲット分子に反応性であるがＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとターゲット分子との結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化し、未結合のターゲットまたはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを抗体コンジュゲーションによってウェルに捕獲させてもよい。このような複合体検出方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体に関して上述した方法以外にも、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはターゲット分子に反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、並びに、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはターゲット分子に付随する酵素活性の検出を利用するエンザイムリンクトアッセイがある。
【０３５３】
本発明の範囲内に包含されるこのような方法の１つは、シグナル伝達経路障害を調節する被験薬剤の能力を同定する方法である。方法は、少なくとも１つの薬剤とＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼとを該薬剤が該タンパク質に結合し得る十分な時間接触させる段階と、未結合の薬剤を除去する段階と、タンパク質に結合した化合物の存在を測定し、これによってＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ複合体が関与する障害を調節する被験薬剤の能力を同定する段階とから成る。
【０３５４】
代替的な実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの活性を調節する被験化合物の能力の測定が、ＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子（例えばＭＡＰＫＡＰ−２仲介シグナル伝達経路成分、例えばＨｓｐ−２７）の活性を更に調節するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの能力を測定することによって行われる。例えば、適正ターゲットに対するエフェクター分子の活性を測定するか、または、適正ターゲットに対するエフェクターの結合を上述のように測定できる。
【０３５５】
また別の実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２発現のモジュレーターが、細胞を候補化合物に接触させ、細胞内のＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法によって同定される。候補化合物の存在下のＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下のＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルに比較する。次に、比較に基づいて候補化合物をＭＡＰＫＡＰ−２発現のモジュレーターとして同定する。例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が候補化合物の存在下では非存在下よりも大きい（統計的に有意に大きい）とき、候補化合物はＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質（アゴニスト）であると同定される。あるいは、ＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が候補化合物の存在下で非存在下よりも小さい（統計的に有意に小さい）とき、候補化合物はＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の阻害物質（アンタゴニスト）であると同定される。細胞内のＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、本文中に記載のＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはポリペプチドの検出方法によって測定できる。
【０３５６】
本発明のまた別の特徴によれば、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼはツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイで、ＭＡＰＫＡＰ−２に結合するかまたは相互作用し（“ＭＡＰＫＡＰ−２−結合タンパク質”または“ＭＡＰＫＡＰ−２−ｂｐ”）ＭＡＰＫＡＰ−２活性に関与する別のタンパク質を同定するための“おとり（ｂａｉｔ）タンパク質”として使用できる（例えば、米国特許第５，２３８，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら，Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２（１９９３）；及びＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００参照）。このようなＭＡＰＫＡＰ−２結合タンパク質は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは例えばＭＡＰＫＡＰ−２仲介シグナル伝達経路の下流エレメントのようなＭＡＰＫＡＰ−２ターゲットによるシグナルの伝播に関与するらしいと考えられる。あるいは、このようなＭＡＰＫＡＰ−２結合タンパク質が、ＭＡＰＫＡＰ−２阻害物質であるらしいとも考えられる。
【０３５７】
ツーハイブリッドシステムは、多くの転写因子がモジュール性であることに基づく。転写因子は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとから構成されている。簡単に説明すると、アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物中では、ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質をコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合している。別の構築物中では、ＤＮＡ配列のライブラリーに由来し未同定のタンパク質（“獲物”または“サンプル”）をコードする１つのＤＮＡ配列が既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合している。“おとり”タンパク質及び“獲物”タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用してＭＡＰＫＡＰ−２依存性複合体を形成することができるならば、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとが極めて近接する。この近接によって転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されているリポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。リポーター遺伝子の発現を検出でき、機能性転写因子を含有する細胞コロニーを単離でき、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用できる。
【０３５８】
従って、本文中に記載のようにして同定した薬剤を適当な動物モデルに更に使用することも本発明の範囲内に包含される。例えば、本文中に記載のようにして同定された薬剤（例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２調節剤、アンチセンスＭＡＰＫＡＰ−２核酸分子、ＭＡＰＫＡＰ−２特異的抗体またはＭＡＰＫＡＰ−２結合相手）は、このような薬剤による治療の効力、毒性または副作用を測定するために動物モデルに使用し得る。
【０３５９】
あるいは、本文中に記載のようにして同定された薬剤をこのような薬剤の作用メカニズムを判定するために動物モデルに使用できる。更に、本発明は、上述のようなスクリーニングアッセイによって同定された新規な薬剤を本文中に記載のような治療に使用することに関する。
【０３６０】
Ｂ．検出アッセイ
本文中で同定されたｃＤＮＡ配列（及び対応する完全遺伝子配列）の部分またはフラグメントは、ポリヌクレオチド試薬として多くの用途に使用できる。例えば、これらの配列は、（ｉ）サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２をコードするヌクレオチド配列を検出するため、（ｉｉ）染色体上でそれぞれの遺伝子をマップし、これによって遺伝病に関連する遺伝子領域の所在を検出するため、（ｉｉｉ）少量の生物サンプルから個体を同定する（組織タイピング）ために使用できる。これらの用途は以下の項目に記載されている。遺伝子産物も本文中に記載のように使用できる。
【０３６１】
（ｉ）サンプル中の検出
実質的に配列番号２で表される配列を有するポリペプチドをコードする核酸を検出するために、核酸プローブまたはＰＣＲプライマーを使用する標準ハイブリダイゼーション及び／またはＰＣＲ技術を使用するとよい。適当なプローブ及びプライマーは本文中に提供されＭＡＰＫＡＰ−２  ｃＤＮＡ配列に基づいて平均的な当業者によって設計され得る。
【０３６２】
従って、ＭＡＰＫＡＰ−２の発現レベルの測定はノーザンブロット分析によって行うことができる。ポリアデニル化［ポリ（Ａ）＋］ｍＲＮＡを被験サンプルから単離する。ｍＲＮＡを電気泳動によって分画し、膜に転移させる。膜を標識ＭＡＰＫＡＰ−２  ｃＤＮＡによってプローブする。別の実施態様では、発現されたｍＲＮＡに応用した定量的ＰＣＲによってＭＡＰＫＡＰ−２発現を測定する。
【０３６３】
別の実施態様では、被験試薬とＭＡＰＫＡＰ−２ポリヌクレオチド発現ベクターをトランスフェクトした細胞とを一緒にインキュベートし、ＭＡＰＫＡＰ−２転写に対する被験試薬の効果を上述のようにノーザンブロット分析によって測定する。
【０３６４】
別の実施態様では、被験サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２の発現レベルを測定することによってＭＡＰＫＡＰ−２シグナル伝達経路の活性化を測定する。特定実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２の発現レベルをウェスタンブロット分析によって測定する。サンプル中に存在するタンパク質をゲル電気泳動によって分画し、膜に転移させ、ＭＡＰＫＡＰ−２に対する標識抗体でプローブする。
【０３６５】
ＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子に結合または相互作用するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの能力の測定は、直接結合の測定によって行う。ＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子に結合または相互作用するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの能力の測定を行うために、例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを放射性同位体または酵素ラベルに結合すると、複合体中の標識ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを検出することによってＭＡＰＫＡＰ−２ターゲット分子に対するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの結合を測定できる。例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２分子、特にＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈによって直接または間接に標識し、放射性同位体を放射線放出の直接カウンティングまたはシンチレーションカウンティングによって検出する。
【０３６６】
あるいは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ分子を、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼによって酵素標識し、適当な基質から生成物への変換を測定することによって酵素ラベルを検出してもよい。
【０３６７】
（ｉｉ）染色体マッピング
本発明の核酸分子は染色体の同定にも有効であろう。（１つまたは複数の）配列は個々のヒト染色体の特定位置に特異的にターゲットされ、該位置とハイブリダイズする。本発明に従って染色体に適正配列をマッピングすることは、配列と遺伝子関連疾患との相関関係を知るための重要な第一歩である。配列を正確な染色体位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的位置と遺伝子地図データとの相関関係がわかる。（このようなデータは例えば、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手し得るＶ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎに見出される）。次に、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を、例えばＥｇｅｌａｎｄ，Ｊら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７（１９８７）に記載された連鎖分析（物理的に隣接の遺伝子の同時遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））によって同定できる。病気に罹った個体と罹っていない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の違いも決定できる。１つの突然変異が罹患個体の幾つかまたは全部に観察されるが正常個体には全く観察されないとき、該突然変異が疾病の原因因子である可能性が大きい。
【０３６８】
例えば、１つの配列（または該配列の一部分）を単離したとき、この単離配列は染色体上の遺伝子の位置をマップするために使用できる。このプロセスは染色体マッピングと呼ばれる。従って、本文中に記載されたＭＡＰＫＡＰ−２をコードする（１つまたは複数の）ヌクレオチド配列（配列番号１）の部分またはフラグメントは染色体上のＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子の位置をマップするために使用できる。
【０３６９】
一例として、ＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子は、本文中に開示したＭＡＰＫＡＰ−２ヌクレオチド配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５−２５塩基対の長さ）を調製することによって染色体にマップできる。ＭＡＰＫＡＰ−２配列のコンピューター解析は、ゲノムＤＮＡ中の２個以上のエキソンにまたがるため増幅プロセスを複雑にするということのないプライマーを予測するために使用できる。その後、これらのプライマーを個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用できる。ＭＡＰＫＡＰ−２配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドだけが増幅フラグメントを生じるであろう。
【０３７０】
体細胞ハイブリッドは、種々の哺乳類（例えばヒト及びマウスの細胞）に由来の体細胞を融合させることによって調製する。ヒト及びマウスの細胞のハイブリッドは増殖及び分裂に伴って、ヒト染色体を無作為順序で次第に失うがマウス染色体は保持する。特定酵素が欠失しているのでマウス細胞は増殖できないがヒト細胞は増殖できる培地を使用することによって、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が保持されるであろう。種々の培地を使用することによってハイブリッド細胞系のパネルを作製し得る。パネル中の各細胞は単一のヒト染色体または少数のヒト染色体とマウス染色体の全セットとを含み、個々の染色体を特定のヒト染色体に容易にマッピングできるであろう（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ  Ｐ．ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４）。
【０３７１】
また、転位及び欠失のあるヒト染色体を使用することによってヒト染色体のフラグメントだけを含有する体細胞ハイブリッドも作製できる。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定の配列を特定の染色体に対応させる迅速な手順である。１個のサーマルサイクラーを使用して１日あたり３つ以上の配列を対応させることができる。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにＭＡＰＫＡＰ−２ヌクレオチド配列を使用し、特定染色体に由来のフラグメントのパネルによって詳細な位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行うことができる。別のマッピング戦略としては、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆａｎ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６２２３−２７（１９９０）に記載）、標識され流動選別（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｉｎｇ）された染色体によるプレスクリーニング、及び、染色体へのハイブリダイゼーションによる予備選択がある。
【０３７２】
中期染色体分布（ｓｐｒｅａｄ）に対するＤＮＡ配列の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は更に、正確な染色体位置を１段階で与えるために使用できる。染色体分布は紡錘体を破壊するコルセミドのような化学物質によって中期の分裂が阻止された細胞を使用して作製できる。
【０３７３】
染色体はトリプシンで簡単に処理でき、次いでギムザ染色できる。各染色体上に明暗バンドのパターンが現われ、それによって染色体を個々に同定できる。ＦＩＳＨ技術では５００または６００塩基という短いＤＮＡ配列を使用できる。しかしながら、１，０００塩基よりも大きいクローンのほうが非反復染色体位置に十分なシグナル強度で結合し易いので、検出が容易である。妥当な時間内に好結果が得られるクローンの長さは好ましくは１，０００塩基、より好ましくは２，０００塩基で十分であろう。この技術の概要に関しては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照されたい。
【０３７４】
単一染色体または該染色体上の単一部位をマークするために染色体マッピング用試薬を個々に使用でき、または、多数部位及び／または多数染色体をマークするために試薬パネルを使用できる。実際には、マッピング目的には遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬が好ましい。コーディング配列は遺伝子ファミリー中に保存され易い配列であり、従って染色体マッピング中のクロスハイブリダイゼーションの機会が多い。
【０３７５】
更に、ＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子に関連する疾病に罹患した個体と罹患していない個体との間のＤＮＡ配列の違いを決定し得る。１つの突然変異が罹患個体の幾つかまたは全部で観察されるが非罹患個体では観察されないならば、該突然変異が該疾病の原因因子である可能性が高いと推測してもよい。罹患した個体と非罹患の個体との比較は一般に、染色体分布から観察できるかまたはＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを使用して検出できる欠失または転位のような構造変化染色体中で探す段階を含む。最終的には、複数の個体から得られた遺伝子の完全な配列決定を行って、突然変異の存在を確認したり突然変異を多型性から識別したりすることができる。
【０３７６】
（ｉｉｉ）組織タイピング
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２配列はまた微量生物サンプルから個体を同定するために使用できる。例えば米軍は個人の身元確認に制限断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ））を使用することを考察している。この技術では、個人のゲノムＤＮＡを１つまたは複数の制限酵素によって消化し、サザンブロットでプローブして身元確認用の非反復バンドを生じさせる。この方法では、消失したり切り離されたりまたは奪われたりするので確実な身元確認が難しい現行の“Ｄｏｇ  Ｔａｇｓ”の欠点が解消される。本発明の配列はＲＦＬＰに対する追加のＤＮＡマーカーとして役立つ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載）。
【０３７７】
更に、本発明の配列は、個人のゲノムの選択された部分の実際のＤＮＡ配列を１塩基ずつ決定する代替的技術を提供するために使用できる。即ち、本文中に記載されたＭＡＰＫＡＰ−２ヌクレオチド配列は、該配列の５′端及び３′端から２つのＰＣＲプライマーを調製するために使用できる。次にこれらのプライマーを使用して個人のＤＮＡを増幅し、引き続いて該ＤＮＡを配列決定することができる。
【０３７８】
この方法で作製した個人に対応するＤＮＡ配列のパネルはその人だけの身元確認手段を提供する。対立遺伝子が異なるので各人が有しているこのようなＤＮＡ配列のセットは一つしかないからである。本発明の配列は、個人及び組織からこのような身元確認用配列を得るために使用できる。本発明のＭＡＰＫＡＰ−２ヌクレオチド配列はヒトゲノムの部分を一つだけ表す。
【０３７９】
これらの配列のコーディング領域ではある程度までの対立遺伝子変異が生じ、非コーディング領域ではもっと高い程度の対立遺伝子変異が生じる。一人の人間で対立遺伝子変異は５００塩基毎にほぼ一回の頻度で生じると推測される。本文中に記載の配列の各々は、身元確認の目的で個人のＤＮＡを比較するための標準としてある程度まで使用できる。何故なら、非コーディング領域に生じる多型の数が多いほど個人の識別に必要な配列の数が少ないからである。
本文中に記載のＭＡＰＫＡＰ−２ヌクレオチド配列から得られた試薬パネルを個人のその人だけの身元確認用データベースの作製に使用するならば、後でその人の組織を同定するためにも同じ試薬を使用できる。その人だけの身元確認用データベースを使用すると、極めて少ない組織サンプルから生死にかかわりなく個人の身元確認を確実に行うことができる。
【０３８０】
本文中に記載のＭＡＰＫＡＰ−２ヌクレオチド配列は更に、脳組織のような特定組織の同定に例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術で使用できる標識プローブまたは標識可能プローブのようなポリヌクレオチド試薬を提供するために使用できる。
【０３８１】
同様にして、上記に引用したプローブまたはＭＡＰＫＡＰ−２プライマーはまた、組織培養物を汚染に基づいてスクリーニングする（即ち、培養物中の異なるタイプの細胞の混合物の存在をふるいにかける）ために使用できる。
【０３８２】
Ｃ．予測医薬
本発明はまた予測医学に関する。個体を予防的に治療するために予知（予測）目的で使用される診断用アッセイ、予知アッセイ、及び、臨床試験のモニタリングなどは少なくとも部分的には、新規なＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の同定、及び、該遺伝子でコードされたＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの被験者体内における発現レベル及び／または機能に影響を及ぼすような遺伝子及び関連経路の遺伝子中の変化に基づく。
【０３８３】
機能不全に関連するヒトＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子の突然変異形態は、ヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの過少発現，過剰発現または変質発現の結果として生じる疾病の診断または疾病に対する感受性の診断を強化または確定するための診断用ツールを提供するであろう。ＭＡＰＫＡＰ−２のコーディング遺伝子に突然変異を含む個体はＤＮＡレベルで様々な技術によって検出し得る。
【０３８４】
本文中に記載の診断用アッセイを使用して得られた情報は（単独でまたは同じ疾病の一因となる別の遺伝欠陥に関する情報と共に）、被験者が炎症関連障害の発症の原因となるかまたは一因となる遺伝子欠陥（例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の欠陥またはＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の発現を調節する遺伝子の欠陥）を有することを予知、診断または確認するために役立つ。予知情報に基づいて医師は個体のＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の異常発現を特徴とする病理状態の発症を予防または延期するために有効な養生法（例えば食事及び運動）または治療プロトコルを推薦できる。
【０３８５】
更に、個体に（１つまたは複数の）ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子またはタンパク質の欠陥または欠損を生じさせる１つまたは複数の特定の変異に関する情報（ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子プロフィル）は、単独でまたは炎症関連障害の一因となる別の遺伝子欠陥に関する情報と共に、個体の遺伝子プロフィルに合わせて個別の療法を設計するという“薬理遺伝子学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）”の目標に到達し得る。例えば、医師は個体のＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子プロフィルに基づいて、（１）潜んでいるＭＡＰＫＡＰ−２関連障害に対する薬物をいっそう効果的に処方でき、また、（２）特定個体に対する特定薬物の適正用量をより賢明に決定し得る。
【０３８６】
例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼタンパク質の発現レベルは、単独でまたは同じ疾患の一因となることが判っている別の遺伝子の発現レベルと共に、多くの患者で疾病の様々な時期に測定でき、該疾病の転写または発現プロフィルを作成し得る。個々の患者の発現パターンを次に該疾病の発現プロフィルに比較して、患者に投与すべき適正な薬物及びその用量を決定し得る。
【０３８７】
ＭＡＰＫＡＰ−２または疾病の遺伝子プロフィルに基づいて最も高い臨床効果を示すと予想される集団をターゲットすることができれば、（１）市場実績がよくない市販薬物の地位回復、（２）安全性及び薬効が患者サブグループ特異的であるという制約の結果として臨床開発が中断されている薬物候補の救済、及び、（３）薬物候補及びもっと最適な薬物の標識のいっそう速くかつ廉価な開発（例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２をマーカーとして使用することは最適な有効用量を知るために役立つ）が可能になる。
【０３８８】
従って、本発明の１つの目的は、生物サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）に関してＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ及び／または核酸の発現並びにＭＡＰＫＡＰ−２の活性を測定し、これによって個体が疾病もしくは障害に罹患しているかまたはＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現もしくは活性に関連する疾患を発症する危険があるか否かについて判定する診断アッセイに関する。
【０３８９】
本発明は更に、個体がＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、核酸の発現または活性に関連する障害を発症する危険があるか否かを判定する予知（または予測）アッセイを提供する。例えば、生物サンプル中でＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の突然変異を検定できる。このようなアッセイは予知または予測目的で使用され、これによってＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、核酸の発現または活性を特徴とするまたは関連する障害の発症よりも前に個体を予防的に治療することができる。本発明の別の目的は、臨床試験中のＭＡＰＫＡＰ−２の発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響のモニタリングに関する。
【０３９０】
上記及びその他の薬剤を以下の項でより詳細に説明する。
【０３９１】
（ｉ）診断用アッセイ
本発明は、被験者が、免疫関連の炎症性障害を発症させるようなＭＡＰＫＡＰ−２の異常活性、例えばＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質の異常レベルまたは異常生物活性に関連する疾病、状態または障害を発症しているか（診断）または発症の危険があるか（予測）を判定する手段を提供する。
【０３９２】
従って、本発明の１つの目的は、被験者が免疫関連障害を発症しているかまたは発症し易いことを判定する方法を提供する。方法は、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子またはタンパク質のレベル、ＭＡＰＫＡＰ−２の生物活性のレベル及び／またはＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子中の突然変異もしくは特定の多型変異体の存在を測定する段階からなる。
【０３９３】
１つの実施態様では、方法は、被験者がＭＡＰＫＡＰ−２の異常なｍＲＮＡ及び／またはタンパク質レベルを示すか否かを、ノーザンブロット分析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学などによって判定する段階を含む。
【０３９４】
該方法によれば、被験者から細胞を採取し、ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質またはｍＲＮＡレベルを測定し、健康な被験者のＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質またはｍＲＮＡレベルに比較する。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはｍＲＮＡの異常レベルはＭＡＰＫＡＰ−２の異常活性を示す指標となり得る。
【０３９５】
別の実施態様では、方法が、ＭＡＰＫＡＰ−２の少なくとも１つの活性を測定する段階を含む。例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の発現の調節を例えば本文中に記載の手順で測定する。得られた結果と健康な被験者のＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質に対して行った同様の分析の結果との比較は、被験者がＭＡＰＫＡＰ−２の異常活性を示すか否かに関する指標となる。
【０３９６】
本発明の別の実施態様は、生物サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸の有無を検出するために、被験者から生物サンプルを採取する段階と、生物サンプルをＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物または薬剤に接触させて、生物サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸の存在を検出する段階から成る方法を提供する。好ましくは、ＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するために使用される薬剤は、サンプル中に存在し得るＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る標識核酸プローブである。核酸プローブは例えば、配列番号１の核酸のようなヒトＭＡＰＫＡＰ−２核酸、または、好ましくはサンプル中に存在すると推測されるＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに緊縮条件下で特異的にハイブリダイズすべく十分な長さのその一部分でよい。本発明の診断用アッセイに使用し得る別の適当なプローブは本文中に記載されている。
【０３９７】
あるいは、薬剤が配列番号１の遺伝子産物、即ち、ヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼに特異的な抗体のような標識ラベルでもよい。抗体はポリクローナルでもよいが、より好ましくはモノクローナルである。完全形の抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２）を使用できる。前述のように、プローブまたは抗体に関する“標識された”という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合させる（即ち、物理的に連結する）ことによって行うプローブまたは抗体の直接標識、並びに、直接標識されている別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含する。
【０３９８】
間接標識の例は、蛍光標識第二抗体を使用する第一抗体の検出、及び、蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようなビオチンによるＤＮＡの末端標識を包含する。
【０３９９】
“生物サンプル”という用語は、被験者から単離された組織、細胞及び生物流体並びに被験者の体内に存在する組織、細胞及び流体を包含する。即ち、本発明の検出方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの生物サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するために使用できる。ＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡを検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術としてはノーザンハイブリダイゼーション及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションがある。サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはそのフラグメントの有無を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術としては、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光がある。また、ＭＡＰＫＡＰ−２ゲノムＤＮＡを検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術としては、サザンハイブリダイゼーションがある。
【０４００】
従って、本発明の１つの実施態様は、サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２の存在を検出する方法であって、（ａ）該サンプルを上述の核酸プローブにハイブリダイゼーションが生じる条件下で接触させる段階と、（ｂ）該核酸分子に結合した該プローブの存在を検出する段階とから成る方法に関する。当業者は上述のような当業者に公知の技術に従って核酸プローブを選択し得る。被験サンプルの非限定例はヒト組織のＲＮＡサンプルである。
【０４０１】
別の実施態様では、方法が更に、対照被験者から対照生物サンプルを採取する段階と、対照サンプルをＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡが生物サンプル中で検出されるように接触させる段階と、対照サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と被験サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在とを比較する段階とを含む。
【０４０２】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを検出するｉｎ  ｖｉｖｏ技術は、被験者体内に標識抗ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ特異的抗体を導入する段階を含む。例えば、被験者の体内でその存在及び位置を標準造影技術によって検出できる放射性マーカーで抗体を標識できる。
【０４０３】
生物サンプル中のヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの有無を検出するキットも提供される。例えば、キットは生物サンプル体内のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはｍＲＮＡを検出し得る標識化合物または薬剤、サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２の量を測定する手段、及び、サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２の量を標準に比較する手段とを含み得る。化合物または薬剤は適当な容器に包装できる。キットは更に、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸を検出するためのキットの使用説明書を含む。
【０４０４】
（ｉｉ）予知アッセイ
本文中に記載の予知方法は更に、ＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現または活性に関連する疾病または障害を発症しているかまたは発症の危険がある患者を同定するために利用できる。例えば、前述の診断用アッセイまたは後述するアッセイのような本文中に記載のアッセイは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、核酸の発現または活性に関連する障害を発症しているかまたは発症の危険がある患者を同定するために利用できる。
【０４０５】
その結果として、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの異常な発現または活性に関連する疾病または障害の同定方法が提供される。方法は、被験者から被験サンプルを採取し、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する段階から成り、サンプル中にＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸が存在するとき、被験者がＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現または活性に関連する疾病または障害を発症しているかまたは発症の危険があると診断する。
【０４０６】
本文中で使用された“被験サンプル”という用語は、該当被験者から採取した生物サンプルを意味する。例えば、被験サンプルは生物体液（例えば、血清）、細胞サンプルまたは組織である。
【０４０７】
更に、本文中に記載の予知アッセイはまた、ＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現または活性に関連する疾病または障害を治療するために１つの薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、またはその他の薬剤候補）を患者に投与できるか否かを判断するために使用できる。
【０４０８】
上記に従って、ＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現または活性に関連する障害に対して１つの薬剤で患者を効果的に治療できるか否かを判断する方法が提供される。方法は、ＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現または活性に関連する病的状態が発症する危険があると推測される被験者から被験サンプルを採取し、次いでＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸の発現また活性を検出する段階を含み、多量のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸の発現または活性が検出されたときは患者であると診断し、このような患者に対しては、ＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現または活性に関連する疾病の治療薬を投与できる。
【０４０９】
上述したような本発明の方法はまた、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子中の遺伝子変化を検出し、遺伝子変化が生じた被験者にＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子に関連する疾病の危険があるか否かを判断するために使用できる。好ましい実施態様ではこの方法は、被験者の細胞サンプル中で、ＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドをコードする遺伝子の完全性またはＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子のミス発現に影響を与える変化の少なくとも１つを特徴とする遺伝子変化の有無を検出する段階を含む。
【０４１０】
このような遺伝子変化は、（１）ＭＡＰＫＡＰ−２のコーディング遺伝子からの１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、（２）ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子に対する１つまたは複数のヌクレオチドの付加、（３）ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、（４）ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の染色体転位、（５）ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変化、（６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の異常修飾、（７）ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（８）ＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドの非野生型レベル、（９）ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の対立遺伝子の消滅、及び、（１０）ＭＡＰＫＡＰ−２ポリペプチドの不適正な翻訳後修飾、の少なくとも１つの存在を確認することによって検出できる。
【０４１１】
その他のＭＡＰＫＡＰ−２関連疾病またはその異常発現に付随する病的状態は、患者から採取したサンプルからＭＡＰＫＡＰ−２発現の異常な減少または増加レベルを判断する方法によって診断できる。発現の減少または増加は、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロット法及びその他のハイブリダイゼーション方法のような当業界で公知のポリヌクレオチド定量方法のいずれかを使用してＲＮＡレベルで測定できる。宿主から採取したサンプル中の実質的に配列番号２で表される配列を有するポリペプチドのレベルを測定するために使用できるアッセイ技術は当業者に公知である。このようなアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡアッセイがある。
【０４１２】
代表的な実施態様では、変化の検出が、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号参照）、あるいは、結合連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４参照）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者の反応はＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の点突然変異の検出に特に有効である（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２参照）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する段階と、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは双方）を単離する段階と、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子（存在するならば）のハイブリダイゼーション及び増幅が生じるような条件下でＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーに核酸サンプルを接触させる段階と、増幅産物の有無を検出するかまたは増幅産物のサイズを検出し、その長さを対照サンプルに比較する段階とを含み得る。ＰＣＲ及び／またはＬＣＲは予備増幅段階として、本文中に記載の突然変異検出に使用される技術のいずれかと共に使用されるのが望ましい。
【０４１３】
代替的な増幅方法は、自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または、その他の任意の核酸増幅方法、次いで当業者に公知の技術を使用する増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは特に、核酸分子が極めて少ない数で存在する場合にこのような核酸分子を検出するために有効である。
【０４１４】
サンプル細胞中のＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の突然変異はまた制限酵素開裂パターンの変化によって同定できる。例えば、サンプル及び対照のＤＮＡを単離し、（場合によっては）増幅し、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによって消化し、フラグメント長サイズをゲル電気泳動によって測定し比較する。サンプル及び対照のＤＮＡ間のフラグメント長サイズの違いは、サンプルＤＮＡ中の突然変異を示す指標となる。更に、リボザイム開裂部位の発達または消滅によって特異的突然変異の存在数を算定するために配列特異的リボザイムを使用できる（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号参照）。
【０４１５】
別の実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子中の遺伝子突然変異は、サンプル及び対照の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを数百また数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定できる（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｉ，Ｍ．Ｊ．ら，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３−７５９）。
【０４１６】
例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２の遺伝子突然変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら，前出、に記載のような発光ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイ中で同定できる。簡単に説明すると、第一のハイブリダイゼーションプローブアレイを使用してサンプル及び対照中のＤＮＡの長い鎖部分を走査し、順次にオーバーラップするプローブの直線状アレイによって配列間の塩基変化を同定する。この段階で点突然変異を同定し得る。この段階後の第二のハイブリダイゼーションアレイでは、検出されたすべての変異または突然変異に相補的なもっと小さい専用プローブアレイを用いて特異的突然変異を特性決定できる。突然変異アレイの各々は、一方が野生型遺伝子に相補的であり他方が突然変異遺伝子に相補的である平行プローブセットから構成される。
【０４１７】
また別の実施態様では、当業界で公知の様々な配列決定反応のいずれかを使用してＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子を直接的に配列決定し、サンプルＭＡＰＫＡＰ−２の配列と対応する野生型（対照）配列とを比較することによって突然変異を検出できる。配列決定反応の例は、Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０（１９７７）またはＳａｎｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３（１９７７）によって開発された技術に基づく反応である。また、診断用アッセイ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８，（１９９５））を行うときには、質量分析法による配列決定のような様々な全自動配列決定手順のいずれかを利用できると考えられる（例えば、ＰＣＴ国際公開Ｎｏ．ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら，Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；及びＧｒｉｆｆｉｎら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９（１９９３）参照）。
【０４１８】
ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子中の突然変異を検出する別の方法は、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖中のミスマッチ塩基を検出するために開裂剤からの保護を使用する方法である（Ｍｙｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２，（１９９５））。一般に、“ミスマッチ開裂”の技術では、先ず、野生型ＭＡＰＫＡＰ−２配列を含有する（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡと組織サンプルから得られた突然変異体の可能性があるＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されたヘテロ二本鎖を準備する。二重鎖にした二本鎖を、対照鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチが原因で二本鎖中に存在するような一本鎖領域を開裂する試薬によって処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をＲＮアーゼで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理すると、ミスマッチ領域を酵素消化できる。別の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するためにＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムとピペリジンとによって処理できる。ミスマッチ領域の消化後、得られた物質を次に変性用ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分離して突然変異部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２）参照。好ましい実施態様では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識できる。
【０４１９】
更に別の実施態様では、ミスマッチ開裂反応で、所定の系における二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１つまたは複数のタンパク質（いわゆる“ＤＮＡミスマッチ修復酵素”）を使用し、細胞のサンプルから得られたＭＡＰＫＡＰ−２  ｃＤＮＡ中の点突然変異を検出しマッピングする。例えば、大腸菌のｍｕｔ  Ｙ酵素はＧ／ＡミスマッチでＡを開裂し、ＨｅＬａ細胞のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを開裂する（Ｈｓｕら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７−１６６２（１９９４））。代表的な実施態様によれば、ＭＡＰＫＡＰ−２配列、例えば野生型ＭＡＰＫＡＰ−２配列に基づくプローブを（１つまたは複数の）被験細胞から得られたｃＤＮＡまたは別のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。二本鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、開裂産物があれば、これを電気泳動プロトコルなどによって検出できる。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号参照。
【０４２０】
別の実施態様では、電気泳動移動度の変化を使用してＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子中の突然変異を同定してもよい。
【０４２１】
別の方法は、突然変異核酸と野生型核酸との電気泳動移動度の差異を検出するために一本鎖コンホメーション多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＳＣＰ））を使用する（Ｏｒｉｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８６：２７６６（１９８９），Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））。サンプル及び対照のＭＡＰＫＡＰ−２核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させ、次いで再生させる。一本鎖核酸の二次構造は配列に応じて違っており、生じた電気泳動移動度の変化からたった１つの塩基変化であっても検出できる。ＤＮＡフラグメントを標識プローブによって標識または検出してもよい。アッセイの感度は、（ＤＮＡでなく）ＲＮＡを使用することによって強化される。ＲＮＡのほうが配列変化に対する二次構造の感度が高いからである。好ましい実施態様では、本発明の方法が、二重鎖ヘテロ二本鎖分子を電気泳動移動度の変化に基づいて分離するヘテロ二本鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５（１９９１））。
【０４２２】
また別の実施態様では、変性用勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ））を使用して、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中の突然変異フラグメントまたは野生型フラグメントの移動を検定する（Ｍｙｅｒｓら，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）。分析方法としてＤＧＧＥを使用するとき、例えば約４０ｂｐのＧＣに富む高融点ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することによってＤＮＡが完全には変性しないことを確保するためにＤＮＡを修飾する。別の実施態様では、対照ＤＮＡとサンプルＤＮＡとの移動度の差異を同定するために変性用勾配に代えて温度勾配を使用する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｓｎｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３（１９８７）），米国特許ＵＳ６，１４６，８４１。
【０４２３】
点突然変異を検出する別の技術の非限定例は、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または、選択的プライマー延長である。例えば、既知の突然変異が中央に配置されたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次に、完全なマッチが見出されたときだけハイブリダイゼーションできるような条件下でターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせる（Ｓａｉｋｉら，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドはＰＣＲ増幅したターゲットＤＮＡにハイブリダイズするか、または、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に結合し標識されたターゲットＤＮＡにハイブリダイズするときは複数の異なる突然変異にハイブリダイズする。
【０４２４】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅テクノロジーを本発明と共に使用してもよい。特異的増幅用プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、該当突然変異を、（増幅が差別的ハイブリダイゼーションに依存するように）分子の中央に含んでもよく（Ｇｉｂｂｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＲＥｓ．１７：２４３７−２４４８（１９８９））、または、１つのプライマーの３′末端に含んでもよい。後者の場合には、適正条件下でミスマッチがポリメラーゼ延長を防止または抑制できる。Ｐｒｏｓｓｎｅｒら，Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８（１９９３）参照。更に、開裂に基づく検出が可能になるように突然変異の領域に新しい制限部位を導入することが望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１（１９９２））。幾つかの実施態様ではまた、増幅用にＴａｑリガーゼを使用して増幅を行ってもよい。Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９（１９９１）参照。このような場合、５′配列の３′末端に完全なマッチが存在するときにだけ結合が生じるので、増幅の有無を探索することによって特異的部位の既知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
【０４２５】
本文中に記載の方法は例えば、本文中に記載された少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予めパッケージされた診断用キットを利用することによって行うことができる。このようなキットは、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子が関与する疾病または疾患の症状または家族履歴を示す患者を診断するための臨床診断手順で簡便に使用できる。
【０４２６】
更に、本文中に記載の予知アッセイにはＭＡＰＫＡＰ−２が発現している任意の細胞型または組織を利用し得る。
【０４２７】
（ｉｉｉ）アンチセンス分子／遺伝子治療
アンチセンス分子
過剰発現及び／または過剰活性のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸の発現または活性の細胞レベル及び／または活性を低下させる薬剤は様々な治療計画に使用できるであろう。ＭＡＰＫＡＰ−２の細胞レベル及び／または活性を低下させる技術の非限定例は、アンチセンスまたはリボザイム法、及び／または、遺伝子療法であり、これらの各々は当業界で公知である。
【０４２８】
本文中では、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するために配列番号２のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするｍＲＮＡのどこかの部分に特異的に結合し得るヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドが本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするｃＤＮＡの配列のどこかの部分に特異的に結合し得る配列を有していてもよい。
【０４２９】
本発明の別の実施態様では、本文中で提供される配列番号１のｃＤＮＡ配列が、アンチセンス構築物を使用して内因性遺伝子をノックアウトすることによって、細胞中、特に造血系に由来の細胞中の新規なヒトシグナル伝達キナーゼの生理的な適性を研究するために使用され得る。
【０４３０】
提案されたアンチセンス試薬をデリバリーする幾つかの方法としては、（１）リポソームによる封入、（２）レトロウイルスベクターによる形質導入、（３）殆どの核タンパク質に見出される核ターゲッティング部位を利用する核区画への局在化、（４）細胞にｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションし次いでトランスフェクト細胞の再移植または投与、及び、（５）ＤＮＡ運搬系の利用、がある。
【０４３１】
従って、ＭＡＰＫＡＰ−２をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害すべく機能するアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びリボザイムのようなオリゴヌクレオチドが本発明の範囲に包含される。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は、ターゲットとなるｍＲＮＡに結合しタンパク質への翻訳を妨げることによってｍＲＮＡの翻訳を直接的に阻止すべく作用する。アンチセンスＤＮＡに関しては、翻訳開始部位、例えば、該当するヌクレオチド配列の−１０から＋１０までの領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０４３２】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒し得る酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用メカニズムには、相補的ターゲットＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的相互作用、次いでエンドヌクレアーゼによる開裂が含まれる。本発明の範囲内で、タンパク質複合体成分をコードするＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ開裂を特異的にかつ効率的に触媒するハンマーヘッド型またはその他のモチーフのリボザイム分子が設計される。
【０４３３】
最初に、潜在的なＲＮＡターゲットの内部の特異的リボザイム開裂部位を同定するために、ターゲット分子を以下の配列、即ち、ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含むリボザイム開裂部位について走査する。同定後、開裂部位を含むターゲット遺伝子の領域に対応する１５−２０ヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適正にする二次構造のような予測した構造的特徴について評価する。また、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用し、ターゲット候補と相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション容易性を試験することによってターゲット候補の適性を評価してもよい。Ｄｒａｐｅｒ，ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９参照。
【０４３４】
本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子とリボザイムとの双方は当業界で公知の任意のＲＮＡ分子合成方法によって調製し得る。Ｄｒａｐｅｒ、前出参照。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。これらの方法には、例えば、固相ホスホアミダイト化学合成のような当業界で公知のオリゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成技術がある。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を作製してもよい。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込んでいる多様な種類のベクターに組み込むことができる。あるいは、使用されるプロモーター次第ではアンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を細胞系に安定に導入することもできる。
【０４３５】
細胞内安定性を増加させかつ半減期を延長させる手段としてＤＮＡ分子に様々な修飾を導入し得る。可能な修飾の非限定例としては、分子の５′及び／または３′末端にリボ−またはデオキシ−ヌクレオチドのフランキング配列を付加する修飾、または、オリゴデオキシリボヌクレオチド主鎖内部でホスホジエステラーゼ連鎖でなくホスホロチオエートまたは２′Ｏ−メチルを使用する修飾がある。
【０４３６】
本発明の実施には、１２−２１ヌクレオチドのオリゴマー、特に１２−１８ヌクレオチドのオリゴマーが最も好ましい。オリゴ類は原則として、転写物の翻訳阻害に有効であり、本文中に記載の効果を誘発し得る。開始コドン部位またはその近傍の部位でｍＲＮＡを阻止することによって翻訳が最も有効に阻害される。従って、ヒトのキナーゼｍＲＮＡ転写物の５′末端領域に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。この領域ではハイブリダイゼーションを妨害するような二次構造及び三次構造が最も少ない。更に、３′方向で開始部位からあまりにも遠い配列は、“読み過し”現象が生じてリボソームがアンチセンス／センス二本鎖をほどいてメッセージが翻訳され得ると考えられるのでｍＲＮＡ転写物のハイブリダイゼーション効率が落ちる。ヒトのシグナル伝達キナーゼｍＲＮＡのどこかの部分に相補的またはハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは治療に使用することを考察できる。
【０４３７】
１９９７年６月１７日に付与された米国特許第５，６３９，５９５号、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，は、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示すオリゴヌクレオチド配列の同定方法を教示している。既知のポリヌクレオチドに由来のランダムオリゴヌクレオチドを含有する発現ベクターを細胞に形質転換／トランスフェクトする。次に、細胞についてオリゴヌクレオチドの所望の活性から生じた表現型を検定する。所望の表現型をもつ細胞を同定した後、所望の活性を有しているオリゴヌクレオチドの配列を同定できる。ベクターを回収することによって、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び挿入された核酸材料を含む領域の配列決定によって同定を完了し得る。
【０４３８】
記載されたポリヌクレオチド配列をコードする新規なシグナル伝達キナーゼポリペプチドに相補的なヌクレオチド配列をアンチセンス療法用に合成できる。これらのアンチセンス分子はＤＮＡでもよく、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定な誘導体でもよく、ＲＮＡでもよく、２′−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体でもよく、または別のオリゴヌクレオチド模擬体でもよい。１９９７年７月２９日に付与された米国特許第５，６５２，３５５号，Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ、及び、１９９７年７月２９日に付与された米国特許第５，６５２，３５６号，Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓは、生理的に安定なアンチセンス分子の合成及び効果を記載しており、これらの特許は参照によって本発明に含まれるものとする。シグナル伝達キナーゼアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム封入またはアンチセンス配列を担うベクターからの発現、などによって細胞に導入できる。アンチセンス療法は、シグナル伝達キナーゼ活性の抑制が効果的である疾病の治療に特に役立つであろう。
【０４３９】
遺伝子療法
本文中に記載のシグナル伝達キナーゼは遺伝子療法によって患者に投与し得る。更に、本発明のポリペプチドはこのようにしてターゲット器官の細胞にデリバリーし得る。逆に、ターゲット器官の細胞中のポリペプチド発現を抑制するためにはシグナル伝達キナーゼアンチセンス遺伝子療法を使用し得る。Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）参照。Ｍｉｌｌｅｒによれば、技術はヒトの遺伝子療法の実用化が望めるような顕著な初期結果が得られるまで進歩した。
【０４４０】
最も簡単な形態では、微量のＤＮＡをマイクロインジェクションの方法によって細胞の核に注入するだけで遺伝子導入を行うことができる。Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＭＲ，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−８８（１９８０）。組換え遺伝子がいったん細胞に導入されると、細胞は組換え遺伝子の転写及び翻訳の正常なメカニズムを認識でき、遺伝子産物が発現されるであろう。
【０４４１】
ＤＮＡをもっと多数の細胞に導入する別の方法も試験された。これらの方法には、ＤＮＡをＣａＰＯ４で沈降させピノサイトーシスによって細胞に取り込ませるトランスフェクション（Ｃｈｅｎ  Ｃ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ  Ｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２（１９８７）；細胞に大きい電圧パルスを作用させて膜に開孔を設ける電気穿孔（（Ｃｈｕ  Ｇ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：１３１１−２６（１９８７））；ターゲット細胞と融合する脂肪親和性小胞にＤＮＡをパッケージするリポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ＰＬ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７（１９８７））；及び小さい入射粒子に結合したＤＮＡを使用する粒子衝撃（Ｙａｎｇ  ＮＳ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８−７２（１９９０）、がある。ＤＮＡを細胞に導入する別の方法は化学的に修飾されたタンパク質にＤＮＡを結合する方法である。
【０４４２】
また、アデノウイルスタンパク質がエンドソームを不安定化し細胞によるＤＮＡの取り込みを増進し得ることも証明された。ＤＮＡ複合体を含有する溶液にアデノウイルスを混合するか、または、タンパク質架橋剤を使用してアデノウイルスに共有結合したポリリシンにＤＮＡを結合させると、組換え遺伝子の取り込み及び発現が実質的に改善される。Ｃｕｒｉｅｌ  ＤＴら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，６：２４７−５２（１９９２）。
【０４４３】
本文中で使用された““遺伝子導入”という用語は、外来核酸分子を細胞に導入するプロセスを意味する。遺伝子導入を行う一般的な目的は、遺伝子によってコードされた特定産物を発現可能にすることである。産物は、タンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、酵素活性ＲＮＡなどである。遺伝子導入は培養細胞中で行うこともでき、または、動物体内への直接投与によって行うこともできる。一般的に遺伝子導入は、非特異的相互作用または受容体介在相互作用によって核酸をターゲット細胞に接触させ、膜経由でまたはエンドサイトーシスによって核酸を細胞に取り込み、形質膜またはエンドソームから細胞質内に核酸を放出するプロセスを含む。発現は更に、細胞の核内に核酸を移動させ適正な転写用核因子に結合させることを必要とする。
【０４４４】
本文中に使用された“遺伝子療法”という用語は、遺伝子導入の１つの形態であり、本文中で使用された遺伝子導入の定義に包含され、より特定的にはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子導入を意味する。細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子導入し次いで患者に移植してもよく、または、核酸または核酸−タンパク質複合体を患者に直接的に投与して遺伝子導入を行ってもよい。
【０４４５】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼのコーディング領域は、レシピエント宿主細胞の感染によってキナーゼポリペプチドＤＮＡの導入に介在するウイルスベクターに結合できる。適当なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどがある。例えば、１９９７年４月２９日に付与された米国特許第５，６２４，８２０号，Ｅｐｉｓｏｍａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、参照。本発明の核酸コーディング領域を有効な真核細胞発現ベクターに組み込ませ、この発現ベクターを遺伝子治療される体細胞に直接的に投与または導入する（また、コーディング領域好ましくはｍＲＮＡ転写物を含む核酸フラグメントを体細胞に直接投与するかまたは導入してもよい）。例えば、１９９６年１２月３１日に付与された米国特許第５，５８９，４６６号参照。このような核酸及びベクターはエピソームとして維持されてもよく、または、遺伝子融合シグナルと真核細胞の適正な転写及び翻訳のシグナル、即ち、実効的に配置された転写開始部位の５′のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、遺伝子融合のＡＴＧ翻訳開始コドン、（１つまたは複数の）終結コドン、及び、コーディング領域の３′に実効的に配置された転写物ポリアデニル化シグナルを含むプロウイルスまたはその一部分として宿主染色体ＤＮＡに取り込まれてもよい。
【０４４６】
あるいは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、リガンド−ＤＮＡコンジュゲートまたはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡコンジュゲートを使用するターゲット化ＤＮＡの受容体介在性導入、リポフェクション膜融合または直接マイクロインジェクションのような非ウイルス技術によって遺伝子治療用細胞に導入してもよい。これらの手順及びその変形は、当業界で確立した方法に従って、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのヒトのシグナル伝達キナーゼポリペプチドによる遺伝子治療（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５，１９９１及びＷｉｌｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１７９−２２２，１９９２参照）、並びに、本文中に開示されたＭＡＰＫＡＰ−２核酸配列を導入するように修飾し、動物に再移植できるｅｘ  ｖｉｖｏの方法に適している。。
【０４４７】
ＭＡＰＫＡＰ−２核酸配列を細胞にデリバリーするために、裸のＤＮＡの直接摂取（例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０））、例えば肝のアシアロ糖タンパク質受容体によって取り込まれるアシアロオロソムコイドに結合したＤＮＡを使用する受容体介在ＤＮＡ取り込み（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）、及び、リポソーム介在デリバリー（Ｋａｎｅｄａら，Ｅｘｐｔ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１７３：５６−６９（１９８７）及びＫａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５−３７８（１９８９））のような別の非ウイルス技術を使用できる。これらの物理的方法の多くは、互いに組合せてもよく、または、ウイルス技術に組合せてもよい。例えば、受容体介在ＤＮＡ取り込みはアデノウイルスと共に使用することによって増進される（Ｃｕｒｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０−８８５４（１９９１））。
【０４４８】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸はまた、増殖する細胞の支持体を提供する埋め込みデバイス経由で投与し得る。従って、細胞は埋め込みデバイス中に維持され、本発明の有効な治療薬を供給する。
【０４４９】
代表的な１つの実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２コーディング配列（配列番号１）を含む発現ベクターを細胞に挿入し、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、次いで多数の細胞を患者体内に注入する。別の好ましい実施態様では、好ましいプロモーター（例えば強いプロモーター）を含むＤＮＡセグメントを、内因性ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子を含む細胞に、プロモーターセグメントが内因性ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の発現を増進させるように導入する（例えば、プロモーターセグメントを細胞に、該セグメントが内因性ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子に直結するように導入する）。
【０４５０】
ターゲット細胞集団（例えば、免疫系の細胞）は、このような細胞の活性を調節するためにＭＡＰＫＡＰ−２の変異形態を導入することによって修飾し得る。
【０４５１】
別の好ましい実施態様では、遺伝子置換の方法が示されている。本文中で使用された“遺伝子置換”という用語は、動物体内でｉｎ  ｖｉｖｏで発現されることができこれによって動物体内に欠如または欠失している内因性遺伝子の機能を提供または増強する核酸配列を供給することを意味する。
【０４５２】
ＰＣＲ診断
核酸配列、そのオリゴヌクレオチド、フラグメント、部分またはアンチセンス分子は、新規なヒトシグナル伝達キナーゼ分子の発現レベルを検出するための体液または生検組織の診断アッセイに使用できる。例えば、配列番号１で表されるｃＤＮＡ配列から設計された配列または配列番号２に含まれている配列は患者体内のｍＲＮＡ転写物の存在を検出するため、または、治療中の転写物の調節をモニターするために使用できる。
【０４５３】
ターゲット核酸配列を増幅するためまたは後でハイブリダイゼーションアッセイによって分析するための１つの方法はポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）またはＰＣＲ技術として知られている。ＰＣＲ技術は、互いから離れて存在し、例えば本文中に配列番号１で表される遺伝子配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、疑わしいサンプル中で本発明の配列を検出するように応用できる。プライマーは二重鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの対応する鎖に相補的であり、典型的には約５０−４５０ヌクレオチド以上（通常は２０００ヌクレオチド以下）離れている。この方法は、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで、ターゲットＤＮＡの変性とプライマー結合とＤＮＡポリメラーゼによる延長とのサイクルを反復してプライマー間隔に基づいて予測された長さのＤＮＡフラグメントを得るという段階を含む。ターゲット配列の増幅度は、実行するサイクル回数によってコントロールされ、理論的には簡単な式２ｎによって算出され、式中のｎはサイクル回数を表す。例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＰＣＲ  Ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｙ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｒｍ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．；ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．；１９９７年５月１３日に付与された米国特許第５，６２９，１５８号，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ参照。
【０４５４】
臨床試験中の効果のモニタリング
ＭＡＰＫＡＰ−２または疾病の遺伝子プロフイルに基づいて最も高い臨床効果を示すと予測された集団をターゲットできれば、（１）市場実績のよくない市販薬物の復権、（２）安全性または有効性が患者サブグループに特異的であるという制約を示した結果として臨床開発が断念されていた薬物候補の救済、及び、（３）薬物候補のもっと迅速でもっと廉価な開発及びもっと最適な薬物標識（例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２をマーカーとして使用することは最適な有効用量を知るために役立つので）、が可能になる。
【０４５５】
ＭＡＰＫＡＰ−２治療薬による個体の治療は、ＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質のレベルまたは活性、ＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡのレベル、及び／またはＭＡＰＫＡＰ−２の転写レベルのようなＭＡＰＫＡＰ−２の特性値を測定することによってモニターできる。この測定値は、治療が有効であるか、または、治療の調節もしくは最適化が必要であるかを示す指標となるであろう。従って、ＭＡＰＫＡＰ−２は臨床試験中の薬物の効力に関するマーカーとして使用できる。
【０４５６】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物または化合物）の影響をモニターすることも本発明によって考察され、基本薬物のスクリーニングだけでなく、臨床試験にも応用できる。例えば、上述のようなスクリーニングアッセイによってＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子発現及びタンパク質レベルの増加またはＭＡＰＫＡＰ−２活性の正の調節が測定される薬剤の有効性は、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子発現及びポリペプチドレベルの低下またはＭＡＰＫＡＰ−２の負の調節を示す被験者の臨床試験でモニターできる。あるいは、スクリーニングアッセイによってＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子発現及びポリペプチドレベルの低下またはＭＡＰＫＡＰ−２活性の負の調節が測定される薬剤の有効性は、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子発現及びポリペプチドレベルの増加またはＭＡＰＫＡＰ−２活性の正の調節を示す被験者の臨床試験でモニターできる。このような臨床試験で、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子及び好ましくは障害に関与したその他の遺伝子の発現または活性を特定細胞の表現型の“リードアウト”またはマーカーとして使用できる。
【０４５７】
例えば非限定的に説明すると、（例えば、本文中に記載のようなスクリーニングアッセイで同定された）ＭＡＰＫＡＰ−２活性を調節する薬剤（例えば化合物、薬物または小分子）で治療することによって調節されるＭＡＰＫＡＰ−２のような遺伝子を細胞中で同定できる。従って、ＭＡＰＫＡＰ−２関連障害に対する薬剤の効果を例えば臨床試験で検査するためには、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＭＡＰＫＡＰ−２及びＭＡＰＫＡＰ−２関連障害に関与する別の遺伝子のそれぞれの発現レベルを分析する。遺伝子発現のレベル（例えば、遺伝子発現パターン）を本文中に記載のようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは、本文中に記載の方法の１つでポリペプチドの産生量を測定することによって、あるいは、ＭＡＰＫＡＰ−２もしくは別の遺伝子の活性レベルを測定することによって定量できる。このようにして、遺伝子発現パターンが薬剤に対する細胞の生理的応答を表すマーカーとして役立つ。従って、この応答状態を、薬剤による個体の治療開始前及び治療中の種々の時点で測定するとよい。
【０４５８】
好ましい実施態様では、本発明は薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子またはその他の本文中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬物候補）による患者の治療の有効性をモニターする方法を提供する。方法は、（ｉ）薬剤投与前の患者から投与前サンプルを採取する段階と、（ｉｉ）投与前サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する段階と、（ｉｉｉ）患者から１つまたは複数の投与後サンプルを採取する段階と、（ｉｖ）投与後サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する段階と、（ｖ）投与前サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを１つまたは複数の投与後サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルに比較する段階と、（ｖｉ）これに応じて患者に対する薬剤の投与を変更する段階とから成る。
【０４５９】
例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２の発現または活性を検出レベルよりも高いレベルに上げたいとき、即ち、薬剤の有効性を増加させたいときには薬剤の投与量を増加するのが望ましい。あるいは、ＭＡＰＫＡＰ−２の発現または活性を検出レベルよりも低いレベルに下げたいとき、即ち、薬剤の有効性を減少させたいときには薬剤の投与量を減少するのが望ましい。このような実施態様によれば、観察可能な表現型応答が存在しないときであってもＭＡＰＫＡＰ−２の発現または活性が薬剤の有効性を示す指標として使用され得る。
【０４６０】
また、有害かもしれない遺伝子の発現をＭＡＰＫＡＰ−２治療薬が増加も減少もさせないことを検証するために、ＭＡＰＫＡＰ−２の投与前及び投与後に患者の細胞を採取してＭＡＰＫＡＰ−２以外の遺伝子の発現レベルを検出することもできる。これは例えば転写プロファイリングの方法を使用することによって行うことができる。従って、ＭＡＰＫＡＰ−２治療薬にｉｎ  ｖｉｖｏで接触させた細胞に由来のｍＲＮＡ及びＭＡＰＫＡＰ−２治療薬に接触させなかった同種細胞に由来のｍＲＮＡを逆転写し、多数の遺伝子に由来のＤＮＡを含むチップにハイブリダイズさせ、これによってＭＡＰＫＡＰ−２治療薬で処理した細胞中の遺伝子発現と未治療の細胞中の遺伝子発現とを比較する。例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２治療薬が個体の体内で原ガン遺伝子の発現を開始させるならば、この特定のＭＡＰＫＡＰ−２治療薬の使用は望ましくないと考えられる。
【０４６１】
繰り返すためには、生物組織を時間の経過に伴って繰り返し検定し、所望のパラメーター、例えばＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはｍＲＮＡまたはＤＮＡのレベルを時間の経過に伴って記録し、治療計画の有効性を評価するかまたは治療プロトコルの有効性を判定する。
【０４６２】
本発明の１つの実施態様は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの異常発現を特徴とする状態を軽減するように設計された治療計画の経過を追跡する方法に関する。方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド、（ｉｉ）上記配列の縮重配列によってコードされたポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、から成るグループから選択されたパラメーターのレベルを測定するために患者のサンプルをアッセイにかける段階と、
（ｂ）前項（ａ）で選択されたパラメーターのレベルを第二時点で検定する段階と、
（ｃ）第二時点のレベルを（ａ）で測定したパラメーターのレベルに比較し、該治療計画の効果を判定する段階と、
から成る。
【０４６３】
機能不全性シグナル伝達を特徴とする病的障害の退縮、進行または発症を判定する方法は、このような障害のある患者から採取したサンプルを配列番号１の配列に実質的に相同のヌクレオチド配列をもつ相補的核酸ハイブリダイゼーションプローブと共にインキュベートする段階と、該サンプル中に相補的ｍＲＮＡが存在するならば該相補的ｍＲＮＡと該プローブとの結合を測定して、患者体内の病的障害の退縮、進行または発症の判定手段とする段階から成る。
【０４６４】
機能不全性シグナル伝達を特徴とする病的障害の退縮、進行または発症を判定する方法は、このような障害のある患者から採取したサンプルを、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有する単離核酸分子の遺伝子産物に特異的な検出可能プローブに、プローブ／遺伝子産物複合体の形成に有利な条件下で接触させる段階から成り、この複合体の存在が患者体内の病的障害の退縮、進行または発症の指標となる。
【０４６５】
Ｃ．治療方法
本発明はまた、ＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現また活性に関連する障害の危険がある（または罹患し易い）かまたは障害のある被験者の予防的及び治癒的な治療方法を提供する。予防的及び治癒的な治療方法に関しては、このような治療は薬理遺伝子学の分野から得られた知識に基づいて個別に作成または修正され得る。
【０４６６】
本文中で使用された“薬理遺伝子学”という用語は、遺伝子配列決定、統計的遺伝学、遺伝子発現分析のような遺伝学のテクノロジーを臨床開発中または市販の薬物に応用することを意味する。より特定的にはこの用語は、患者の遺伝子が薬物に対するそれぞれの応答（例えば、患者の“薬物応答表現型”または“薬物応答遺伝子型”）をどのように決定するかに関する研究を意味する。
【０４６７】
上記に従って、本発明の（１つまたは複数の）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはＭＡＰＫＡＰ−２モジュレーターによる個体の予防的または治癒的な治療を該個体の薬物応答遺伝子型に合せて作成する方法が提供される。薬理遺伝子学に基づいて臨床医または医師は、予防的または治癒的な治療の対象を該治療によって最も効果が得られる患者に限定し、薬物関連の有害副作用が生じる患者の治療は避けるようにすることができる。
【０４６８】
（ｉ）予防的方法
１つの特徴によれば、本発明は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ（配列番号２）またはＭＡＰＫＡＰ−２発現もしくは少なくとも１つのＭＡＰＫＡＰ−２活性を調節する薬剤を被験者に投与することによって被験者の体内で異常なＭＡＰＫＡＰ−２発現または活性に関連する疾病または状態を予防する方法を提供する。ＭＡＰＫＡＰ−２の異常な発現または活性によって生じるかまたはこれらがその一因となる疾病に罹る危険のある被験者は、例えば、本文中に記載した診断用アッセイまたは予知アッセイのいずれか１つまたはその組合せによって同定できる。予防薬の投与はＭＡＰＫＡＰ−２異常の特徴的症状の出現よりも前に、疾病もしくは障害を予防するかあるいはその進行を遅らせるために投与できる。ＭＡＰＫＡＰ−２異常のタイプ次第で、被験者を治療するために、例えばＭＡＰＫＡＰ−２、ＭＡＰＫＡＰ−２アゴニストまたはＭＡＰＫＡＰ−２アンタゴニストとなる薬剤を使用できる。適切な薬剤は本文中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定できる。
【０４６９】
（ｉｉ）治癒的方法
本発明の別の特徴は、治癒目的でＭＡＰＫＡＰ−２の発現または活性を調節する方法に属する。その結果として、代表的な実施態様は、ＭＡＰＫＡＰ−２に細胞を接触させるか、または、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの細胞関連活性の１つまたは複数の活性を調節する薬剤に細胞を接触させる段階を含む調節方法を教示している。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性を調節する薬剤は、核酸またはポリペプチド、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの天然ターゲット分子（例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２リン酸化基質−Ｈｓｐ−２７または別の天然型基質）、ＭＡＰＫＡＰ−２抗体、ＭＡＰＫＡＰ−２のアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＭＡＰＫＡＰ−２のアゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド模擬体、または、別の小分子のような本文中に記載の物質でよい。
【０４７０】
代表的な実施態様は、１つまたは複数のＭＡＰＫＡＰ−２活性を刺激する薬剤に関する。このような刺激性薬剤の例は、活性ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、及び、細胞に導入された実質的に配列番号２で表される配列を有するＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸分子である。
【０４７１】
別の実施態様では薬剤が１つまたは複数のＭＡＰＫＡＰ−２活性を阻害する。
【０４７２】
このような阻害薬剤の例は、アンチセンスＭＡＰＫＡＰ−２核酸分子、抗−ＭＡＰＫＡＰ−２抗体及びＭＡＰＫＡＰ−２インヒビターである。これらの調節方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば細胞を薬剤と共に培養することによって）行ってもよく、あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば薬剤を被験者に投与することによって）行ってもよい。従って本発明は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾病または障害に苦しむ個体の治療方法を提供する。
【０４７３】
本発明の代表的な方法は、ＭＡＰＫＡＰ−２の発現もしくは活性を調節する（例えば正の調節または負の調節を行う）薬剤（例えば、本文中に記載されたスクリーニングアッセイによって同定された薬剤）または薬剤の組合せを投与する段階を含む。別の実施態様では、方法が、ＭＡＰＫＡＰ−２の発現または活性の低下または異常を補償するための治療としてＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは核酸分子を投与する段階を含む。
【０４７４】
ＭＡＰＫＡＰ−２が異常に負に調節されている状態及び／またはＭＡＰＫＡＰ−２の活性増加が有益な効果を有すると考えられる状態ではＭＡＰＫＡＰ−２活性の刺激が望ましい。例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２が負に調節されている状態及び／またはＭＡＰＫＡＰ−２の活性増加が有益な効果を有すると考えられる状態ではＭＡＰＫＡＰ−２活性の刺激が望ましい。同様に、ＭＡＰＫＡＰ−２が異常に正に調節されている状態及び／またはＭＡＰＫＡＰ−２の活性減少が有益な効果を有すると考えられる状態ではＭＡＰＫＡＰ−２活性の阻害が望ましい。
【０４７５】
（ｉｉｉ）薬理遺伝子学
薬理遺伝子学は、病人の薬物素因の変質及び異常作用に起因する臨床的に有意な遺伝性の薬物応答変化を取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６）及びＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７）参照。一般に、薬理遺伝子条件は２つのタイプに分類される。１つは身体に対する薬剤の作用の仕方を変化させる単一要因（薬剤作用変化）として伝達される遺伝条件であり、いま１つは薬剤に対する身体の作用の仕方を変化させる単一要因（薬剤代謝変化）として伝達される遺伝条件である。これらの薬理遺伝子条件は希有な遺伝欠陥として生じるかまたは天然多型として生じる。
【０４７６】
個体の体内のＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子またはタンパク質の欠陥または欠失を生じさせる１つまたは複数の特定の変化（ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子プロフィル）に関して得られた情報を、単独で使用するかまたは同じ疾病の一因となる別の遺伝欠陥に関する情報と共に使用すると、個体の遺伝子プロフィルに基づいて特定の疾病に対する治療方法を個別に計画できる。これが“薬理遺伝子学”の到達目標である。
【０４７７】
例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の特異的対立遺伝子をもつ被験者は、特定の疾病の症状を表すことも表さないこともあり、また、特定の疾病を発症し易い体質であったりする。更に、彼等が症状を表す患者であるときは、ある種の薬物、例えば特異的ＭＡＰＫＡＰ−２治療薬に応答することもあり、または、該薬物には応答しないが別の薬物には応答を示すこともある。従って、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子及び／またはタンパク質の欠陥及び／または欠失が原因または一因となる疾病または状態の症状を示す患者集団からＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子プロフィル（例えば、リューマチ様関節炎の発症に関連するＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の変化の分類）を作成し、個体のＭＡＰＫＡＰ−２プロフィルを集団のプロフィルに比較すると、特定の患者または患者集団（即ち、同じ遺伝子変化を有する患者群）に対して安全で有効であると予測される薬剤の選択または設計が可能である。
【０４７８】
例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の欠陥または欠失が原因または一因となる疾病に罹った患者集団でＭＡＰＫＡＰ−２プロフィル、例えばＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の一致を判定することによってＭＡＰＫＡＰ−２集団プロフィルを作成し得る。場合によっては更にＭＡＰＫＡＰ−２集団プロフィルに、様々な方法のいずれかを使用して得られたＭＡＰＫＡＰ−２治療薬に対する集団の応答に関する情報を加えることもできる。様々な方法としては、（１）ＭＡＰＫＡＰ−２関連疾患に付随する症状の重篤度、（２）ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の発現レベル、（３）ＭＡＰＫＡＰ−２  ｍＲＮＡのレベル、及び／または、（４）ＭＡＰＫＡＰ−２のタンパク質レベル、をモニタリングする方法、（ｉｉｉ）そのＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子またはＭＡＰＫＡＰ−２経路遺伝子中に存在する１つまたは複数の特定の遺伝子変化に基づいて集団を分割または分類する方法がある。ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子集団プロフィルはまた場合によっては、特定の変化を生じた患者が特定の治療薬に応答したかまたは応答しなかったかを示す指標となり得る。従ってこの情報または集団プロフィルは、個体のＭＡＰＫＡＰ−２プロフィルに基づいて個体が特定の薬物に応答することを予測するために役立つ。好ましい実施態様では、ＭＡＰＫＡＰ−２プロフィルが転写または発現レベルのプロフィルであり、段階（ｉ）はＭＡＰＫＡＰ−２タンパク質の発現レベルを単独でまたは同じ疾病の一因となることが判っている別の遺伝子の発現レベルと共に測定する段階から成る。多くの患者で疾病の様々な時期にＭＡＰＫＡＰ−２プロフィルを測定できる。
【０４７９】
薬理遺伝子学的研究はまた、トランスジェニック動物を使用して行うことができる。例えば、本文中に記載したようなＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の特異的対立遺伝子変異体を含むトランスジェニックマウスを作製し得る。これらのマウスは例えば、野生型ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子をヒトＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子の対立遺伝子で置換することによって作製できる。次に特異的ＭＡＰＫＡＰ−２治療薬に対するこれらのマウスの応答を測定し得る。
【０４８０】
薬物応答を予測させる遺伝子を同定するための“全ゲノム対応（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）”として知られた１つの薬理遺伝子学的な方法は主として、既知の遺伝子関連マーカーから成るヒトゲノムの高分解能マップ（例えば、各々が２つの変異体をもつヒトゲノムの６０，０００−１００，０００の多型または可変部位から成る“バイ−アレリック”遺伝子マーカーマップ）に依存する。このような高分解能遺伝子マップをフェーズＩＩ／ＩＩＩの薬物治験に参加した統計的有意数の患者の各人のゲノムのマップに比較すると、特定の薬物について観察された応答または副作用に関連したマーカーを同定し得る。
【０４８１】
あるいは、ヒトのゲノム中の数千万の既知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の組合せからこのような高分解能マーカーを作成することもできる。本文中で使用した“ＳＮＰ”という用語は、ＤＮＡ鎖中の単一ヌクレオチド塩基に生じ易い変化である。例えば、ＳＮＰはＤＮＡの１０００塩基あたりに１回生じ得る。ＳＮＰは疾病のプロセスに関与することもあろうが、大半は疾病関連性でない。このようなＳＮＰの発生に基づく遺伝子マップが与えられると、個体はそれぞれのゲノム中のＳＮＰの特定パターンに依存する遺伝子グループに分類できる。このようにして、遺伝的に類似の個体グループに合わせた治療計画を、このような遺伝的に類似の個体に共通の形質を考慮に入れて作成できる。
【０４８２】
あるいは、薬物応答を予測させる遺伝子を同定するために“候補遺伝子法（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ）”と呼ばれる方法を利用できる。この方法によれば、薬物ターゲットをコードする遺伝子（例えば本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ）がわかっている場合、該遺伝子に生じ易いあるすべての変異体は集団中でかなり容易に同定でき、該遺伝子の１つの変形が特定の薬物応答に関連するか否かを別の変形に比べて判断できる。
【０４８３】
代表的な実施態様として、薬物代謝酵素の活性は薬物作用の強度及び持続の主要決定要因である。薬物代謝酵素（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ−２（ＮＡＴ  ２）及びシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見によって、安全な標準用量の薬物の摂取後に期待された薬物効果が得られない患者や過剰な薬物応答及び重篤な毒性を示す患者が何故生じるかという理由を説明できるようになった。これらの多型は集団中で２つの表現型、エキステンシブメタボライザー（ＥＭ）及びプアーメタボライザー（ＰＭ）として発現される。異なる集団ではＰＭの発生率が異なっている。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は極めて多型性であり、ＰＭ中で幾つかの突然変異が同定されたが、これらの突然変異はすべて機能性ＣＹＰ２Ｄ６の欠如に導く。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９のプアーメタボライザーは標準用量で摂取されても過剰な薬物応答及び副作用を高頻度で生じる。代謝産物が有効治療部分である場合、ＰＭは治療応答を全く示さない。これは、ＣＹＰ２Ｄ６によって形成されるその代謝産物モルヒネによって介在されるコデインの解熱効果に関して証明される。別の極端は標準用量に応答しないいわゆる超高速メタボライザーである。最近では、超高速代謝の分子基盤がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ることが同定された。
【０４８４】
また、薬剤応答を予測させる遺伝子を同定するために“遺伝子発現プロファイリング”と呼ばれる方法を使用できる。薬物（例えば、本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼモジュレーター）を投与した動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路が起動されたか否かを示す指標となる。
【０４８５】
上記の薬理遺伝子学的方法の２つ以上から得られた情報を使用して、個体の予防的または治癒的な治療を行うための適正薬用量及び治療計画を決定できる。上記から収集した知識を薬用量決定または薬物選択に使用すると、副反応や治療の失敗を避けることができ、従って、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたは本文中に記載の代表的スクリーニングアッセイの１つによって同定されモジュレーターのようなＭＡＰＫＡＰ−２モジュレーターで患者を治療するときの治癒効率または予防効率を増進し得る。
【０４８６】
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、並びに、本文中に上述したスクリーニングアッセイによって同定されたＭＡＰＫＡＰ−２活性（例えば、ＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子発現）に対して刺激作用または阻害作用を有する本発明の薬剤またはモジュレーターは、異常なＭＡＰＫＡＰ−２活性に付随する障害（例えばうっ血性心不全のような心血管障害）を（予防的または治癒的に）治療するために個体に投与できる。このような治療に関連した薬理遺伝子学（即ち、個体の遺伝子型と該個体の外来化合物または薬物に対する応答）も考察できる。治療薬の代謝の違いが薬理活性薬物の用量と血中濃度との関係を変化させることによって重篤な毒性または治療不全に導く。従って、医師または臨床医は、ＭＡＰＫＡＰ−２分子またはＭＡＰＫＡＰ−２モジュレーターを投与すべきか否かを決定するため及びＭＡＰＫＡＰ−２分子またはＭＡＰＫＡＰ−２モジュレーターによる治療における薬用量及び／または治療計画を作成するために、適切な薬理遺伝子学的研究で得られた知識を応用できる。
【０４８７】
ＶＩ．ジンクフィンガー含有タンパク質
遺伝子の発現を支配する一次メカニズムが配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質スイッチを含むという範例は１９６７−Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２１４，３２３−４（１９６７）に提示された。ＤＮＡ結合タンパク質の多様な構造ファミリーが記載された。
【０４８８】
いずれか１つの遺伝子の選択的発現は主として、タンパク質転写因子と、大抵は実際のコーディング領域の近傍または上流に位置する遺伝子のコントロール領域に存在する特徴的ヌクレオチド配列との相互作用によって行われる。一連のこのような因子または調節タンパク質の結合はＲＮＡポリメラーゼ及び全遺伝子に共通の転写機構の別の成分を活性化させる分子スイッチとして作用する。このような転写因子の特定の組合せが供給されると、遺伝子は確実に正しい場所及び正しい時期にスイッチされる。従って、転写調節は主としてタンパク質がＤＮＡ及びＲＮＡに配列特異的に結合することによって行われる。
【０４８９】
ＤＮＡの配列特異的認識に関与する既知のタンパク質モチーフのうちで、ジンクフィンガータンパク質は独特のモジュール性を有している。今日まで２００を越える数のタンパク質がジンクフィンガードメインを有することが判明し、これらのタンパクの多くは転写因子である。ＤＮＡ及びＲＮＡ結合転写因子ＴＦＩＩＩＡ中で最初に同定されたＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーモチーフ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，ＭｃＬａｃｈｌａｎ，Ａ．Ｄ．＆  Ｋｌｕｇ，Ａ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  ４，１６０９−１４（１９８５）は恐らく、配列特異的タンパク質を構築するための理想的な構造スカフォールドである。ジンクフィンガーは、主としてＤＮＡ塩基対の特異的配列即ち “はしご形” ＤＮＡの“横桟”に結合することによって転写因子をそれらのターゲット遺伝子に接続する。実際、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーモチーフは真核細胞中で最も頻用される核酸結合モチーフを構成している。
【０４９０】
これらのモチーフは特異的ＤＮＡ配列を認識しこれに結合するもっと大きいタンパク質ドメインを構築するためのモジュール式積み上げブロックとして使用できる。ジンクフィンガーとＤＮＡとの相互作用の詳細なモデルが提示されている（Ｂｅｒｇ．１９８８；及びＣｈｕｒｃｈｉｌｌら，１９９０）。また、ＲＮＡに結合するジンクフィンガータンパク質も報告されている−Ｃｌｅｍｅｎｓｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：５３０，（１９９３）。
【０４９１】
重要なことに、設計されたジンクフィンガーペプチドを使用する遺伝子発現のコントロールがガン遺伝子マウス細胞系の特異的阻害によって及び発現プラスミド中の遺伝子をスイッチオンすることによって証明された。これらの実験は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが所与のＤＮＡ配列を認識するように新たに（ｄｅ  ｎｏｖｏ）設計され得ることを証明した。互いに連結した５個から６個の個別のジンクフィンガーがヒトゲノム中の微量アドレスを構成すべく十分に長い１５−１８ｂｐの長さのＤＮＡ配列認識することは理解されよう。設計されたＤＮＡ結合ドメイン、例えば、無機能（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）ドメインに官能基を付加することによってターゲット遺伝子の発現の正または負の調節を行う新しい転写因子を作製し得る。可能な用途としては、ガン遺伝子発現の退縮、及び、ウイルス感染の複製サイクルの破壊が考えられる。Ｋｌｕｇ．Ａ，Ｊ．Ｍｏｌ．２９３（２）：２１５−８（１９９９）。
【０４９２】
米国特許第６，１４０，４６６号は、細胞ヌクレオチド配列に結合し細胞ヌクレオチド配列の機能を調節する新しいジンクフィンガーモジュールの設計方法を教示している。提案された新規な変異体はＤＮＡまたはＲＮＡに結合し、プロモーターからの転写または構造遺伝子の被転写領域内部からの転写を増進または抑制し得る。細胞ヌクレオチド配列は細胞中で天然に生じる配列であってもよく、または、細胞中のウイルス由来のヌクレオチド配列であってもよい。米国特許第５，７８９，５３８ｂ号も参照。
【０４９３】
その結果として、本文中に開示された新規なヌクレオチド配列は、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするヘテロロガスＤＮＡで細胞を形質転換する必要なしに細胞系から内因性ＭＡＰＫＡＰ−２を発現させるために使用できる新しいジンクフィンガー含有タンパク質を設計するために使用できる。提案された新しいジンクフィンガータンパク質は本文中に開示されたポリヌクレオチド配列に特異的であるかまたはその相補的配列であり、これは実質的に配列番号２のポリペプチドをコードしている。得られたタンパク質は次に、ＭＡＰＫＡＰ−２関連障害を治療するために使用できる。
【０４９４】
ＶＩＩ．医薬製剤及び投与形態
新規なヒトキナーゼコーディングＤＮＡ、ヒトキナーゼコーディングＲＮＡ、アンチセンス配列または実質的に配列番号２で表される配列を有するヒトキナーゼ、またはヒトのキナーゼ活性を有するかまたはその活性を調節する変異体または類似体を含む医薬有用組成物は、公知の方法に従って、例えば、医薬的に許容される担体との混合によって製剤化できる。このような担体の例及び製剤化方法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に見出される。効果的な投与に適した医薬的に許容される組成物を形成するためには、このような組成物が有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはモジュレーターを含有するであろう。
【０４９５】
治療有効用量という用語は、組成物がヒトのシグナル伝達キナーゼポリペプチド関連障害を治療または診断するために十分な量で個体に投与されることを意味する。有効量は、個体の状態、体重、性別及び年齢のような様々な要因に従って変更し得る。その他の要因としては、投与形態がある。有効であるが無毒な量の所望化合物をシグナル伝達キナーゼ調節剤として使用できる。
【０４９６】
本文中に開示された方法に従って同定された化合物は、潜在的な毒性が最小になるようにしながらシグナル伝達キナーゼまたはその活性を最適に調節するように定型の試験によって決定した適正用量で単独使用し得る。更に、別の薬剤の同時投与または順次投与も望ましい。
【０４９７】
このような化合物の毒性及び治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％までの致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％の治療有効量）を測定するための医薬用標準手順によって細胞培養物または実験動物中で測定できる。毒性作用と治療効果との用量比が治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きい治療係数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータはヒトに使用できる薬用量の範囲を処方するために使用できる。このような化合物の薬用量は好ましくは、毒性を殆どまたは全く示さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。薬用量は使用される剤形及び使用される投与経路に応じてこの範囲内で変更し得る。
【０４９８】
正確な処方、投与経路及び薬用量は、個々の医師が患者の状態を考慮して選択し得る。例えば、Ｆｉｎｇｌら，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１  ｐ．１参照。主治医は、毒性または器官の機能不全があればいつどのように投与を終了、中断または調節するかを知る必要があることに留意されたい。逆に、（毒性を除外した）臨床応答が適正でないときに治療をもっと高いレベルに調節することも主治医は知る必要がある。問題の障害を管理するために投与される用量の値は、治療すべき状態の重篤度及び投与経路に伴って変更されるであろう。状態の重篤度は例えば、標準予知評価方法にによって評価され得る。更に、用量及び恐らく投薬頻度はまた、患者各人の年齢、体重及び応答に従って変更されるであろう。上述のプログラムと同等のプログラムを獣医薬にも使用し得る。薬用量は、不要な交差反応、過敏反応などのような好ましくない副作用を生じるほど多い量であってはならない。
【０４９９】
一般に、薬用量は患者の年齢、状態、性別及び疾病の程度、もしあれば逆効果の徴候（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）、並びに、各医師によって調整されるべき別の同様の変数に伴って変更されるであろう。薬用量の範囲は、０．００１ｍｇ／ｋｇ−５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ−１．０ｍｇ／ｋｇの本発明のアゴニストまたはアンタゴニストが１日あたり１回または複数回で１日または数日間投与されるような範囲である。
【０５００】
経口投与のためには、治療される患者に対する薬用量を症状に応じて調節するために、組成物を好ましくは０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０及び５０．０ミリグラムの有効成分を含有する刻み目付きまたは刻み目のない錠剤の形態で提供する。有効量の薬物を普通には１日あたり体重１ｋｇに対して約０．０００１ｍｇ／ｋｇ−約１００ｍｇ／ｋｇの薬用量レベルで供給する。より特定的にはこの範囲は１日あたり体重１ｋｇに対して約０．００１ｍｇ／ｋｇ−約１０ｍｇ／ｋｇである。もっと特定的には範囲は約０．０５ｍｇ／ｋｇ−約１ｍｇ／ｋｇである。勿論、薬用量レベルは特定化合物の効力に従って変更される。いくつかの化合物は別の化合物よりも効力が大きい。更に、薬用量レベルは化合物の生体内利用効率に従って変更されるであろう。化合物の生体内利用効率及び効力が大きいほど、経口デリバリーを非限定例とする任意のデリバリー経路で投与される化合物の必要量が少ない。ヒトのシグナル伝達キナーゼモジュレーターの薬用量は、併用されると所望の効果を発揮するように調整される。他方では、これらの種々の薬剤の薬用量を独立に最適化し、いずれかの薬剤を単独で使用したときよりも病状が軽減される相乗的結果を達成するように併用してもよい。当業者は、ヌクレオチドに対してはタンパク質またはそれらのインヒビターとは異なる処方を使用するであろう。また、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのデリバリーは特定の細胞及び状態に特異的であろう。
【０５０１】
例えば、細胞培養物中で測定されたＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲（即ち、ポリペプチド複合体の最大破壊の半値、または、複合体成分の細胞レベル及び／または活性の最大阻害の半値が得られる被験化合物濃度）が得られるような用量を動物モデルで処方し得る。このような情報を使用して、ヒトに有効な用量をいっそう正確に決定できる。血漿中のレベルは例えばＨＰＬＣによって測定し得る。
【０５０２】
医薬組成物は、皮下、外用、経口及び筋肉内のような様々な経路によって個体に提供され得る。医薬組成物の投与は経口的または非経口的に行われる。非経口デリバリーの方法には、外用、動脈内（組織に直接）、筋肉内、皮下、髄内、鞘内、心室内、静脈内、腹腔内、または、鼻腔内投与がある。本発明はまた、本発明の新規な治療方法に使用するための適当な外用、経口、全身性及び非経口医薬製剤を提供することを目的とする。シグナル伝達キナーゼの調節に使用するための有効成分として本発明に従って同定された化合物を含有する組成物は慣用の投与ビヒクルに入れた多様な治療用剤形で投与できる。例えば、化合物は、錠剤、カプセル剤（いずれも適時放出剤及び持続放出剤を含む）、丸剤、散剤、粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ及びエマルジョンのような経口剤形または注射によって投与できる。同様に、化合物はまた静脈内（濃縮塊及び注入）、腹腔内、皮下、閉鎖を伴うかもしくは伴わない外用、または、筋肉内形態で投与してもよい。すべての形態が製薬業界の当業者に公知である。
【０５０３】
注射の場合、本発明の薬剤は水溶液、好ましくはハンク溶液、リンゲル液または生理的食塩水バッファのような生理的に適合性のバッファ中で製剤化し得る。経粘膜投与のためには、障壁透過に適した浸透剤を製剤中に使用し得る。このような浸透剤は当業界で普遍的に知られている。本発明を実施するために本文中に開示された化合物を全身性投与に適した剤形に製剤化するための医薬的に許容される担体の使用は本発明に包含される。担体及び適当な実用の製造手順を選択することによって、本発明の組成物、より特定的には溶液として製剤化された組成物を例えば静注によって非経口投与し得る。化合物は当業界で公知の医薬的に許容される担体を使用して経口投与に適した剤形に容易に製剤化できる。このような担体は本発明の化合物を錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などのような治療される患者が経口摂取できる形態に製剤化し得る。
【０５０４】
細胞内投与を目的とする薬剤は平均的な当業者に公知の技術を使用して投与され得る。例えば、このような薬剤をリポソームに封入し、次いで上述のように投与し得る。リポソームは水性内部を含む球形の脂質二重層である。リポソーム形成時点で水溶液中に存在する全部の分子が水性内部に取り込まれる。リポソームの内容物は外部の微小環境から保護され、また、リポソームが細胞膜に融合するので細胞の細胞質に効率的にデリバリーされる。更に、疎水性であるので、小さい有機分子を直接的に細胞内に投与してもよい。
【０５０５】
これらの医薬組成物は有効成分に加えて、活性化合物を医薬として使用できる調製物に加工することを容易にする賦形剤及び補助剤から成る医薬的に許容される適当な担体を含有し得る。経口投与すべく製剤化された調製物は錠剤、カプセル剤または溶液の形態でよい。本発明の医薬組成物はそれ自体公知の方法、例えば、慣用の混合、溶解、造粒、浮遊、乳化、封入、捕獲または凍結乾燥プロセスを使用して製造し得る。
【０５０６】
非経口投与される医薬製剤としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液がある。更に、活性化合物の懸濁液は油性の注射用懸濁液として適宜調製し得る。適当な親水性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、または、エチルオレエートもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームである。注射用水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。場合によっては懸濁液がまた、安定剤、または、高度に濃縮された溶液を調製できるように化合物の溶解度を増加させる物質を含有し得る。
【０５０７】
経口使用される医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤に組合せ、場合によっては得られた混合物を粉砕し必要ならば適当な補助剤を添加した後で錠剤または糖衣錠コアを得るように顆粒の混合物を加工することによって得られる。適当な賦形剤はより特定的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類のような充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／または、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物である。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムのような崩壊剤を添加し得る。
【０５０８】
キット
本発明は更に、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ及びその付随キナーゼ活性を検出するキットを提供する。このようなキットは、ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼもしくはポリヌクレオチドのレベルを検出するように設計されてもよく、または、直接キナーゼアッセイもしくは結合キナーゼアッセイでＨｓｐ−２７のような天然基質もしくは人工基質のリン酸化を検出してもよい。このアッセイでは、ＭＡＰＫＡＰ−２のリン酸化レベル及び／またはキナーゼ活性を測定し得る。
【０５０９】
（１つまたは複数の）ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ及びそれらの付随キナーゼ活性は、真核細胞、細菌、ウイルス、これらの生物から調製された抽出物、生存する生物体内で見出される流体のような様々なサンプルのいずれかで検出され得る。一般に、本発明のキットは、アッセイで使用すべき試薬またはバッファのような要素を収容した１つまたは複数の容器を含む。
【０５１０】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼまたはポリヌクレオチドのレベルを検出するキットは典型的には、ＭＡＲＫファミリー及び／またはＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つに結合する試薬を含む。ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードする核酸を検出するための試薬は核酸プローブでもよくまたはＰＣＲプライマーでもよい。好ましい実施態様では、キットが更に、１つまたは複数の以下の試薬を収容した別の容器を含む：洗浄用試薬、及び、結合した核酸プローブの存在を検出し得る試薬。検出用試薬の非限定例は、放射性標識プローブ、酵素標識プローブ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、アフィニティ標識プローブ（ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン）である。
【０５１１】
ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼを検出するための試薬は典型的には抗体である。サンプル中のＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの存在を検出するために有用なキットは、上述の試薬が内部に配置された少なくとも１つの容器手段を含む。キットはまた、試薬の直接的または間接的な検出に適したリポーター基を含む（即ち、リポーター基は試薬に共有結合してもよく、または、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンまたはレクチンのようなそれ自体が試薬に結合し得る第二分子に結合してもよい）。適当なリポーター基の非限定例は、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、染料、放射性核種、発光基、蛍光基及びビオチンである。このようなリポーター基は、平均的な当業者に公知の標準方法を使用してサンプル成分に試薬を直接的または間接的に結合させるために使用し得る。
【０５１２】
より詳細には、区画型キットという用語は個別の容器に試薬を収容した任意のキットを含意する。このような容器は小さいガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックストリップもしくは紙ストリップである。このような容器によって、サンプルと試薬とが交差汚染しないようにして試薬を１つの区画から別の区画に効率的に移すことができ、また、各容器の薬剤または溶液を１つの区画から別の区画に定量的に添加し得る。このような容器としては、被験サンプルを受容する容器、アッセイに使用されるプローブまたはプライマーを収容している容器、洗浄用試薬（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水、トリス−バッファ、など）を収容している容器、ハイブリダイズプローブ、結合抗体、増幅産物などを検出するために使用される試薬を収容している容器、などがある。ＭＡＰＫＡＰ−２に対する抗体、好ましくは、モノクローナル抗体のような単一特異的抗体またはＮＢＰの組成物を、抗−抗体、ラベルなどのような追加試薬と別々にもしくは一緒に通常は凍結乾燥形態で容器に収容しているキットも提供され得る。
【０５１３】
Ｈｓｐ−２７のリン酸化の測定に基づいてＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性を検出するキットは一般に、Ｈｓｐ−２７またはその等価物を適当なバッファと組合せて含む。Ｈｓｐ−２７活性の検出に基づいてＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼ活性を検出するキットは一般に、ＭＡＰＫＡＰ−２をＨｓｐ−２７のような適当なＭＡＰＫＡＰ−２基質と組合せて含む。場合によっては、キットが更に、基質と組合せる前にＭＡＰＫＡＰ−２を精製し、活性化するための適当なバッファ及び／または材料を含む。このようなキットは、上述のように行われる直接または結合キナーゼアッセイに使用され得る。
【０５１４】
従って、別の特徴によれば、本発明は、本発明のポリペプチドに対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、結合相手、基質、酵素などを同定するため、または、個別形態もしくは複合体形態のこのようなポリペプチドの産生を抑制または増進する化合物を同定するためのスクリーニングキットに関する。キットは、
（ａ）本発明のポリペプチドと、
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞と、
（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜と、
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体とから成り、本発明のポリペプチドは配列番号２で表される。
【０５１５】
このようなキットにおいて（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が本質的な成分を構成することは理解されよう。
【０５１６】
本発明に記載された核酸プローブを当業界で公知の慣用のキットフォーマットの１つに容易に組込めることは当業者に明らかであろう。
【０５１７】
本発明を以下の非限定実施例によって更に説明する。本願に引用したすべての参考文献、特許及び公開特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【実施例１】
【０５１８】
Ｉ．本発明のｃＤＮＡポリヌクレオチド配列のクローニング
（ｉ）全長ＭＡＰＫＡＰ−２をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号３）：
ヌクレオチド１−１２００にわたる全長ＭＡＰＫＡＰ−２  ｃＤＮＡは３つのＥＳＴクローンの結合によって作製した。これらのＥＳＴクローンは：３４３５６３（ｇｂ：ｗ６９４３２）；６１０３０７（ｇｂ：ａａ１７１５１９）；及びＡＩ４７８８９０であった。３４２５６３断片と６１０３０７断片との組合せを表すＤＮＡ断片をｐＴｈｉｏＨｉｓベクターにサブクローニングし、以下のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅した：５′ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ３′（配列番号５）；及び５′ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ３′（配列番号６）。ＰＣＲ条件は、１０％（０．５Ｍ）ＧＣ  Ｍｅｌｔバッファ及びＰｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を利用するＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＡｄｖａｎｔａｇｅＲＴＭ−ＧＣ  ２ＰＣＲキットによって推奨されている条件であった。このＤＮＡフラグメントはサブクローニング用の３′ＮＯＴ  Ｉ制限部位を含んでいた（フラグメント１）。ＡＩ４７８８９０  ＥＳＴ  ＤＮＡ断片は上記と同じ条件を利用し、以下の２つのオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅した：５′ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＣＣ  ＡＴＧ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ３′（配列番号７）；及び５′ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ３′（配列番号８）。このフラグメントは、サブクローニング用の５′ＢＡＭ  ＨＩ部位を含んでいた（フラグメント２）。高速ライゲーションキット法（Ｒｏｃｈｅ）を使用して個々のＥＳＴフラグメントをＴＯＰＯ  ＴＡベクターに結合した。Ｑｉａｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してクローンをミニプレップ精製した。フラグメント１はＡＦＬ  ＩＩＩ及びＮＯＴ  Ｉで制限消化し、フラグメント２はＡＦＬ  ＩＩＩ及びＢＡＭ  ＨＩで制限消化してＤＮＡフラグメントをＴＡベクターから単離した。制限したインサートをＱｉａｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製した。インサートをＢＡＭ  ＨＩ及びＮＯＴ  Ｉで制限しておいたｐＧＥＸ  ５Ｘ−１にＲｏｃｈｅ高速ライゲーション法を使用してライゲーションした。化学的にコンピテントな大腸菌１−ｓｈｏｔ  ＴＯＰＯ  １０細胞を形質転換し、得られたクローンを上述のようにミニプレップ精製した。クローンを制限消化物によって点検して、１２００ｂｐのＭＡＰＫＡＰ−２  ＤＮＡフラグメントの遊離を確認し、更にＡＢＩ  ３９３  ＸＬにおいてＴａｑ  ＦＳ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた全自動配列決定によって確認した。上記の１２００ｂｐのＭＡＰＫＡＰ−２フラグメントのＤＮＡ配列を配列番号３で表し、その推定アミノ酸配列を配列番号４で表す。全長ＭＡＰＫＡＰ−２コーディング遺伝子に対応するｃＤＮＡ配列は少なくとも以下の点で従来技術のＭＡＰＫＡＰ−２遺伝子とは違っている。
【０５１９】
全長クローン（配列番号３）と従来技術のクローン（登録番号Ｘ７５３４６のクローン）のＤＮＡ配列比較から、それぞれのＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸に以下の違いがあることが判明した：Ｄ１１７Ｈ；Ｌ２４７Ｗ；及びＶ２４８Ｓ。ＭＡＰＫＡＰ−２の９個のＥＳＴ  ＤＮＡフラグメントを位置合せするとこれらの変化がすべてのＥＳＴで保存され、また、マウス、ハムスター、ウサギ及びショウジョウバエのような別の種でも保存されていることが判明した。
【０５２０】
本発明の全長クローンは、従来技術のクローンには存在しない４つの追加アミノ酸をＮ末端にコードしていた。
【０５２１】
（ｉｉ）末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）：
末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２は、上述の全長ＭＡＰＫＡＰ−２  ｃＤＮＡを鋳型として使用し以下のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅した：５′ＣＡＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＣ  ３′（配列番号９）；及び５′ＴＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴ  ３′（配列番号１０）。ＰＣＲ条件は、１０％（０．５Ｍ）ＧＣ  Ｍｅｌｔバッファ及びＰｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を利用するＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＡｄｖａｎｔａｇｅＲＴＭ−ＧＣ  ２ＰＣＲキットによって推奨されている条件であった。インサートをＢＡＭ  ＨＩ及びＮＯＴ  Ｉで制限しておいたｐＧＥＸ  ５Ｘ−１にＲｏｃｈｅ高速ライゲーション法を使用して結合した。化学的にコンピテントな大腸菌１−ｓｈｏｔ  ＴＯＰＯ  １０細胞を形質転換し、得られたクローンを上述のようにミニプレップ精製した。クローンを制限消化物によって点検して、１１８８ｂｐの末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２  ＤＮＡフラグメントの遊離を確認し、更にＡＢＩ  ３９３  ＸＬにおいてＴａｑ  ＦＳ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた全自動配列決定によって確認した。
【０５２２】
末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２コーディングクローン（配列番号１）と従来技術のクローン（登録番号Ｘ７５３４６のクローン）とのＤＮＡ配列比較から、それぞれのＤＮＡ配列のアミノ酸に以下の違いがあることが判明した：Ｄ１１７Ｈ；Ｌ２４７Ｗ；及びＶ２４８Ｓ。ＭＡＰＫＡＰ−２の９個のＥＳＴ  ＤＮＡフラグメントを位置合せするとこれらの変化がすべてのＥＳＴで保存され、または、マウス、ハムスター、ウサギ及びショウジョウバエのような別の種でも保存されていることが判明した。
【０５２３】
Ｓｆ−９／バキュロウイルス中の全長ＭＡＰＫＡＰ−２クローンの発現
ＭＡＰＫＡＰ−２をｐＡｃＧ３Ｘ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にサブクローニングし、Ｓｆ−９／バキュロウイルス中で以下の条件下でＧＳＴ−融合として発現させた：４．４ｍＬのＭＡＰＫＡＰ−２ウイルス保存液（力価８．５×１０７ｐｆｕ／ｍＬ）を添加することによって４００ｍＬの１．５×１０６Ｓｆ−９細胞／ｍＬをｍｏｉ＝１で感染させた。細胞を２６℃で４８時間増殖させ、２ｍＭのＮａ３ＶＯ４及び５０ｎｇ／ｍＬのＯｋａｄａｉｃ  Ａｃｉｄの存在下で４２℃で３０分間の熱ショックを与えて活性化した。１５００ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞を収集した。細胞ペレットを−２０℃で凍結し、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＮａ３ＶＯ４、５０ｎｇ／ｍＬのＯｋａｄａｉｃ  Ａｃｉｄ及びＳｉｇｍａプロテアーゼカクテル中に溶解させた。上清をグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させることによってタンパク質を精製した。カラムを５カラム容のカラムバッファで洗浄し、２０ｍＭのグルタチオン（Ｓｉｇｍａ）を加えたカラムバッファで溶出させた。精製及び溶出用のカラムバッファは５０ｍＭのトリス  ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロールから成る。
【０５２４】
Ｓｆ−９／バキュロウイルス中の末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２クローンの発現
末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２をｐＡｃＧ３Ｘ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にサブクローニングし、Ｓｆ−９／バキュロウイルス中で以下の条件下でＧＳＴ−融合として発現させた：２．６ｍＬの末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２ウイルス保存液（力価１．５×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）を添加することによって４００ｍＬの１．５×１０６Ｓｆ−９細胞／ｍＬをｍｏｉ＝１で感染させた。細胞を２６℃で４８時間増殖させ、２ｍＭのＮａ３ＶＯ４及び５０ｎｇ／ｍＬのＯｋａｄａｉｃ  Ａｃｉｄの存在下で４２℃で３０分間の熱ショックを与えて活性化した。１５００ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞を収集した。細胞ペレットを−２０℃で凍結し、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＮａ３ＶＯ４、５０ｎｇ／ｍＬのＯｋａｄａｉｃ  Ａｃｉｄ及びＳｉｇｍａプロテアーゼカクテル中に溶解させた。上清をグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させることによってタンパク質を精製した。カラムを５カラム容のカラムバッファで洗浄し、２０ｍＭのグルタチオン（Ｓｉｇｍａ）を加えたカラムバッファで溶出させた。精製及び溶出用のカラムバッファは５０ｍＭのトリス  ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロールから成る。
【実施例２】
【０５２５】
哺乳類細胞発現
本発明のポリペプチドはまた、ヒト胚性腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞または接着性ｄｈｆｒＣＨＯ細胞中で発現できる。最大のタンパク質発現を得るために、典型的には５′及び３′の全部の非翻訳領域（ＵＴＲ）をｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入する前にタンパク質ｃＤＮＡから除去する。その後、リポフェクチンによって個々の受容体ｃＤＮＡを細胞にトランスフェクトし、適正量（約４００ｍｇ／ｍｌ）のＧ４１８の存在下で選択する。
【０５２６】
適当な選択期間、即ち、約３週間の経過後、個々のクローンを採取し、膨張させて更に分析する。ベクター単独をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞を陰性対照とする。個々の受容体を安定に発現する細胞系を単離するために、典型的には約２４−３６クローンを選択し、ノーザンブロット分析によって分析する。受容体ｍＲＮＡは一般に、分析したＧ４１８抵抗性クローンの約５０％に検出される。
【実施例３】
【０５２７】
アフリカツメガエル卵母細胞中の機能アッセイ
本発明のＭＡＰＫＡＰ−２  ｃＤＮＡをコードする直鎖化プラスミド鋳型からのキャップ付きＲＮＡ転写物はＲＮＡポリメラーゼを使用し標準手順に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌで水に懸濁させる。雌のカエル成体から卵巣葉を摘出し、卵胞を除去した第５期の卵母細胞を採取し、ＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）をマイクロインジェクション装置を使用して５０ｎｌの丸塊として注入する。
【０５２８】
次に２電極電圧クランプを使用してアゴニスト接触に応答した個々のアフリカツメガエル卵母細胞の電流を測定する。室温でＣａ２＋非含有のＢａｒｔｈの培地中で記録する。アフリカツメガエル系は公知のリガンド及びリガンドを活性化する組織／細胞抽出物をスクリーニングするために使用できる。
【実施例４】
【０５２９】
マイクロフィジオメトリックアッセイ
様々な二次メッセンジャー系の活性化によって細胞から少量の酸が押し出される。形成される酸は主として、細胞内シグナル伝達プロセスを刺激するために必要な代謝活性の増加の結果である。細胞周囲の媒体のｐＨ変化は極めて小さいがＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲマイクロフィジオメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．）によって検出可能である。ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは本発明のＧ−プロテイン結合受容体のような細胞内シグナル伝達経路を利用するエネルギーに結合している受容体の活性化を検出できる。
【０５３０】
添付図面を参照しながら本発明の好ましい実施態様について記載したが、本発明がこれらの詳細な実施態様に限定されないこと、当業者は特許請求の範囲に定義された本発明の範囲及び要旨を逸脱することなく記載の実施態様に様々な変更及び修正を加えてもよいことが理解されよう。
【０５３１】
(配列の説明)
配列番号１は１１９１ヌクレオチド塩基から成る本発明の新規な末端欠損ＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【０５３２】
配列番号２は配列番号１の遺伝子産物の推定アミノ酸配列である。
【０５３３】
配列番号３は１２００ヌクレオチド塩基から成る本発明の新規な全長ヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【０５３４】
配列番号４は配列番号３の遺伝子産物のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【０５３５】
【図１】ｔｄｎａＭＡＰＫＡＰ−２と命名された１１９１ヌクレオチド塩基の長さをもつ本発明の末端欠損ヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするヌクレオチド配列を表す。
【図２】ｔａａＭＡＰＫＡＰ-２と命名された３９６アミノ酸の本発明の末端欠損ヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼの推定アミノ酸配列を表す。
【図３】ｆｌｄｎａＭＡＰＫＡＰ−２と命名された１２０３ヌクレオチド塩基の長さをもつ本発明の全長ヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼをコードするヌクレオチド配列を表す。
【図４】ｆｌａａＭＡＰＫＡＰ−２と命名された４００アミノ酸の本発明の全長ヒトＭＡＰＫＡＰ−２キナーゼクローンの推定アミノ酸配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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