(57)【要約】本発明は、補酵素Ａ利用酵素（ＣｏＡＥＮ）と、ＣｏＡＥＮを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ＣｏＡＥＮの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５）、並びにそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する実質的に精製された変異体。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
【請求項５】
ストリンジェントな条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドの検出法であって、
（ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプル内の少なくとも一つの核酸とハイブリダイズさせて、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプル内の前記ポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーションの前に前記ポリヌクレオチドの増幅過程をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の検出法。
【請求項９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９のポリヌクレオチドと少なくと７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
【請求項１１】
請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
ポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を培養する過程と、
（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
好適な医療用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む医薬品組成物。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された抗体。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
【請求項１８】
請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
【請求項１９】
ＣｏＡＥＮの発現または活性の低下に関連する疾患の治療または予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過程を含む、ＣｏＡＥＮの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防する方法。
【請求項２０】
ＣｏＡＥＮの発現または活性の増大に関連する疾患の治療または予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する過程を含む、ＣｏＡＥＮの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、補酵素Ａ利用酵素の核酸配列およびアミノ酸配列、並びにこれらの配列を用いた腫瘍疾患、免疫異常症、神経障害、小胞輸送障害、及び筋疾患の診断、治療並びに予防に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多くの細胞生合成の中間代謝プロセスは、炭素原子含有基質（炭素基質）の分子間の移動を含む。そのような反応の例としては、トリカルボン酸回路、脂肪酸及び長鎖リン脂質の合成、アルコール及びアルデヒドの合成、中間代謝物の合成、及びアミノ酸分解経路に関与する反応が含まれる。これらの反応のいくつかは、通常、ＡＴＰのＡＤＰの変換或いはＡＴＰのＡＭＰとピロリン酸塩への変換のどちらかによって得られるエネルギーを必要とする。
【０００３】
多くの場合、炭素基質は、少なくとも２つの炭素原子を含む小さな分子から得られる。炭素基質は、細胞内の炭素基質キャリア分子として働くより大きな分子と共有結合する場合が多い。上記の生合成メカニズムに於いて、キャリア分子とは補酵素Ａの事である。補酵素Ａ（ＣｏＡ）は、ヌクレオチドＡＤＰの誘導体と構造的関連を持ち、ホスホジエステルのアデノシン３’，５’−二リン酸のαリン酸基への結合によって、連結した４’−ホスホパンテテインからなる。４’−ホスホパンテテインの末端チオール基は、炭素基質結合形成の部位として働く。細胞に於ける生合成及び中間代謝の間に、ＣｏＡをキャリア分子として利用する主な炭素基質は、アセチル、スクシニル、プロピオニル成分であり、それらすべてはアシル基の一例である。その他の炭素基質は、脂肪酸酸化中間体として作用するエノイル脂質、及びアセチル−ＣｏＡフラックス制御因子／ミトコンドリアアシル基転移タンパク質として働くカルニチンを含む。アシル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡはそれぞれ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ及びアセチル−ＣｏＡシンセターゼにより細胞中で合成される。
【０００４】
脂肪酸の活性化は、アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性の少なくとも３つの形態で仲介される。その形態とはすなわち、１）酢酸塩及び多数のその他の低分子量カルボン酸を活性化し、筋ミトコンドリア及びその他の組織の細胞質ゾル中に見られるアセチル−ＣｏＡシンセターゼ、２）（主に食物より得られる）４から１１の炭素原子を含む脂肪酸を活性化し、肝臓ミトコンドリア中にのみ存在するアシル−ＣｏＡシンセターゼ、３）６から２０の炭素原子を含む長鎖脂肪酸に特異的であり、ミクロソーム及びミトコンドリアに見られるアシル−ＣｏＡシンセターゼの３つである。アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性に関連するタンパク質は、細菌、酵母、植物、マウス、及びヒト等の多くから同定された。アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによる酵素のリン酸化によって調整されうる。
【０００５】
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びホスファチジン酸（ＰＡ）は、細胞内のシグナル伝達及び脂質の生合成に関与するリン脂質である。１−アシルｓｎ−グリセロール−３−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５１）としても知られるＬＰＡアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）は、アシルドナーとしてアシル−ＣｏＡを利用するＬＰＡのＰＡへの変換を触媒する。この酵素は、ミクロソーム及び原形質膜に見られ、インターロイキン１に応答してリン酸化されることで調整されうる。ＬＰＡは膜リン脂質代謝における中間体として役割を果たし、活性化血小板によっても生成される。Ｗｅｓｔ， Ｊ（１９９７， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６：６９１−７０１）らは、ＬＰＡＡＴ−α及びＬＰＡＡＴ−βの二つのタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを同定した。これらＬＰＡＡＴ−αとＬＰＡＡＴ−βとは、微生物若しくは植物のＬＰＡＡＴ配列との広範囲な配列類似性を有する。ＬＰＡＡＴ−α−ｍＲＮＡはすべての組織で検出されるが、骨格筋に於いて最も発現し、ＬＰＡＡＴ−βは、主に心臓及び肝臓組織で発現する。哺乳類細胞における二つのｃＤＮＡの過剰発現によって、無細胞抽出液でのＬＰＡＡＴ活性が増大することがｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで分かった。このアッセイで、蛍光標識したＬＰＡのＰＡへの変換を測定した。このＬＰＡＡＴ活性の増大は、インターロイキン１βの刺激を受けた細胞における、腫瘍壊死因子α及びインターロイキン６の転写及び合成の促進と相関性を有し、ＬＰＡＡＴの過剰発現がサイトカインによる細胞内のシグナル応答を増幅させ得ると示唆する（Ｗｅｓｔ，＿前出）。
【０００６】
分離実験に於いて、ＣＯＳ７細胞中で産生される組み替えタンパク質は、ホスホグリセロールアクセプターとしてのＬＰＡ、及びアシルドナーとしてのアラキドニル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｙｌ）補酵素Ａを優先するＬＰＡＡＴ活性を示した。ノーザンブロット法は、ｍＲＮＡが脳小領域パネルを含むほとんどの人間組織で発現されることを立証した。発現は、肝臓及び膵臓に於いて最高の値を、胎盤に於いて最小の値を取った（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ， Ｃ （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２０２９９−２０３０５）。ＬＰＡもまた、星状細胞によるグルタメート及びグルコースの取り込み障害、及び血管収縮を引き起こすことによって神経変性過程の病態生理学に関与しうる。加えて、ＬＰＡは、Ｒａｓ及びＲａｆ／マイトジェン活性プロテインキナーゼ経路の活性化、ホスホリパーゼＣ及びＤの刺激、アデニリルサイクルの阻害、及びアクチン細胞骨格再構築を伴う局所接着タンパク質のリン酸化によって、腫瘍細胞の成長及び侵入の強力なプロモーターである。（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ， 前出）
細菌、酵母、及び植物のＬＰＡＡＴのその他のヒト相同体は、ヒトＵ９３７細胞に見られる。ノーザンブロット法によって、免疫細胞及び上皮細胞に於いて高いレベルの発現が示された。ｃＤＮＡ末端の急速な増幅によって、差次的に発現するスプライスバリアントが明らかになった。（Ｓｔａｍｐｓ， Ａ．Ｃ． （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２６：４５５−４６１）
新規の補酵素Ａ利用酵素及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見により、腫瘍疾患、免疫異常症、神経障害、小胞輸送障害、及び筋疾患の診断及び治療、予防に有用な新規の組成物を提供して当分野のニーズを満たすことができる。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＣｏＡＥＮ」、個別には「ＣｏＡＥＮ−１」、「ＣｏＡＥＮ−２」、「ＣｏＡＥＮ−３」、「ＣｏＡＥＮ−４」、及び「ＣｏＡＥＮ−５」と呼ばれる実質的に精製されたポリペプチドである補酵素Ａ利用酵素を提供する。本発明の一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５からなる一群から選択されたアミノ酸配列の保存されたアミノ酸が１つ以上置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【０００８】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。
【０００９】
更に、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列の相補体を、少なくとも１つのサンプルのポリヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレオチドの存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。
【００１１】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明は更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に含まれる。
【００１３】
本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの発現に好適な条件の下、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からそのポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に提供する。
【００１５】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポリペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＣｏＡＥＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防方法であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に効果的な量投与することを含む、治療または予防方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＣｏＡＥＮの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防方法であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを患者に効果的な量投与することを含む、治療または予防方法を提供する。
【００１８】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。
【００１９】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００２０】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【００２１】
定義
用語「ＣｏＡＥＮ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＣｏＡＥＮのアミノ酸配列を指す。
【００２２】
用語「アゴニスト」は、ＣｏＡＥＮの生物学的活性を強化したり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、ＣｏＡＥＮに直接相互作用するか、或いはＣｏＡＥＮが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＣｏＡＥＮの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００２３】
用語「アレル変異配列」は、ＣｏＡＥＮをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。ある遺伝子は、自然発生型のアレル変異配列が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。
【００２４】
ＣｏＡＥＮをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＣｏＡＥＮと同じポリペプチド或いはＣｏＡＥＮの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＣｏＡＥＮと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＣｏＡＥＮの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれ得る。
【００２５】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子である場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００２６】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって行われる。
【００２７】
用語「アンタゴニスト」は、ＣｏＡＥＮの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、ＣｏＡＥＮに直接相互作用するか、或いはＣｏＡＥＮが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＣｏＡＥＮの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００２８】
用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２、及びそれらの断片、Ｆｖ断片などの無傷の分子を指す。ＣｏＡＥＮポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて産生可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から、或いは化学的に合成可能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００２９】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００３０】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖に相補的な核酸配列を含む任意の組成物を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞によって作られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖、「プラス（＋）」という表現はセンス鎖を指す。
【００３１】
用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」は、天然或いは組換え体のＣｏＡＥＮ、合成のＣｏＡＥＮまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００３２】
用語「相補的」及び「相補性」は、ポリヌクレオチド同士が塩基対を形成して自然に結合することを指す。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−Ｔ３’」が相補的な配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合する部分的な場合、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合もあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である。
【００３３】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。ＣｏＡＥＮ若しくはＣｏＡＥＮの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡなど）を含む水溶液に展開され得る。
【００３４】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにシークエンシングされた核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）を用いて５’及び／または３’の方向に延長されてシークエンシングされた核酸配列、或いはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）などのフラグメントの構築のためのコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のインサイト社クローン、及び場合によっては、１つ以上のパブリックのドメインＥＳＴの重複によって構築された核酸配列を指す。延長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配列もある。
【００３５】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。
2004510401.tif 000002
一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、ａ）置換された領域のポリペプチドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、ｂ）置換された部位の分子の電荷または疎水性、及び／または、ｃ）側鎖の大半が維持される。
【００３６】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００３７】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって修飾されたポリペプチドのことである。
【００３８】
用語「断片」は、ＣｏＡＥＮまたはＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或いは、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【００３９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０のある断片は、例えば、同じゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００４０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０のある断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５のある断片は、特異的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５を同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５のある断片は、特異的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００４１】
用語「類似性」は相補性の程度を表す。これには、部分的類似性と完全な類似性とがある。用語「同一性」を「類似性」とも言える。同一の配列と標的の核酸とのハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に阻止される部分的に相補的な配列は、「実質的に類似」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの阻止は、緩いストリンジェントな条件の下、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に類似の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、緩いストリンジェントな条件の下、完全に類似（同一）の配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これは、緩いストリンジェントな条件の下では非特異的な結合が許容されるということではなく、緩いストリンジェントな条件では、２つの配列の互いへの結合が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならい。部分的な相補性ともいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。
【００４２】
ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」又は「％の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比較を行うことができる。
【００４３】
ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。このプログラムはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列の対の「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００４４】
別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）などから入手できるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ） （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）によって得られる。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒｉｌ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｎを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【００４５】
高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードが縮重するため、類似のアミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に同じタンパク質をコードする多数の核酸配列を作ることができる。
【００４６】
ポリペプチド配列に用いられる用語「同一性のパーセント」又は「同一性の％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）が保存される。
【００４７】
ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ バージョン３．１２ｅ配列アラインメントプログラム（上記）に組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いる対方式のポリぺプチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、及び「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００４８】
別法では、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒｉｌ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペプチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【００４９】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得り、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体である。
【００５０】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００５１】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件の下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配列が高い同一性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件の下で、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性即ちストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の決定において特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過程は、目的のストリンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【００５２】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、洗浄過程を行う温度で部分的に表すことができる。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低く選択される。このＴｍは、（所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーションの条件は、周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他による， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版の１−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ； 特に２巻の９章に記載されている。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェントなハイブリダイゼーションでは、約０．２×ＳＳＣ及び約１％のＳＤＳの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。ＳＳＣの濃度は、約０．１％のＳＤＳが存在の下、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲である。通常は、遮断剤を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。
【００５４】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。
【００５５】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００５６】
「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴をもつ。
【００５７】
用語「マイクロアレイ」は、基板上に配列されたそれぞれ異なったポリヌクレオチドの配列を指す。
【００５８】
マイクロアレイの文脈に用いられる用語「要素」或いは「アレイ要素」は、基板の表面に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。
【００５９】
用語「変調」は、ＣｏＡＥＮの活性の変化を指す。例えば、変調によって、ＣｏＡＥＮのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【００６０】
用語「核酸」或いは「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖であって、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、任意のＤＮＡ様物質、及びＲＮＡ様物質を指す。
【００６１】
「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般に、機能的に結合したＤＮＡ配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードする領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【００６２】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組成物が溶解性となる。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る。
【００６３】
「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＣｏＡＥＮやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレオチドにアニーリングした後、あるＤＮＡポリメラーゼ酵素によって、標的のＤＮＡ一本鎖に沿って延長される。プライマーの組は、例えば、ＰＣＲ法における核酸配列の増幅（及び同定）に用いることができる。
【００６４】
本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及びプライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【００６５】
プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．他による、１９８９年、名称「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版の１−３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）、またはＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他による、１９８７年、名称「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）、並びに Ｉｎｎｉｓ他による、１９９０年、名称「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ．）を参照されたい。ＰＣＲ用のプライマーの組は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ （Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用いて、ある既知の配列から引き出すことができる。
【００６６】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのＰＣＲ用のプライマーの対の選択、及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌクレオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用である。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈ Ｗｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ ＴＸより入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｏｐｅ）におけるプライマーの設計に有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ１より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂａｒａｙ）」を入力できる。また、Ｐｒｉｍｅｒ３は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように変更することもできる）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（ＵＫ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ より入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片は、例えば、ＰＣＲ法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイ要素、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。
【００６７】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化学合成によって作られる場合も多いが、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ に記載されたような遺伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【００６８】
別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワクチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニアウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【００６９】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＣｏＡＥＮをコードする核酸若しくはその断片、ＣｏＡＥＮ自体を含むと推定されるサンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在する又は基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。
【００７０】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【００７１】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものを指す。
【００７２】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【００７３】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板には、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこにポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【００７４】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【００７５】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｎによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一性が極めて高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの択一的スプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば、或る集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、病態、病態の特徴を表し得る。
【００７６】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｐによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このようなポリペプチドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。
【００７７】
（発明）
本発明は、新規のヒト補酵素Ａ利用酵素（ＣｏＡＥＮ）及びＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、腫瘍疾患、免疫異常症、神経障害、小胞輸送障害、及び筋疾患の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の使用に関する。
【００７８】
表１は、ＣｏＡＥＮをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたインサイト社クローンを示す。列１及び列２はそれぞれ、ポリペプチド及びポリヌクレオチドのＳＥＱ ＩＤ ＮＯを示す。列３は、各ＣｏＡＥＮをコードする核酸が同定されたＩｎｃｙｔｅクローンのクローンＩＤを示し、列４は、それらのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリを示す。列５は、Ｉｎｃｙｔｅクローン及びそれらに対応するｃＤＮＡライブラリを示す。ｃＤＮＡライブラリが示されていないインサイト社クローンは、プールされたｃＤＮＡライブラリに由来する。列５のクローンは、各ＣｏＡＥＮのコンセンサスヌクレオチド配列の構築に用いられ、ハイブリダイゼーション技術における断片として有用である。
【００７９】
表２の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示し、列１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ、列２は各ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数、列３は潜在リン酸化部位、列４は潜在グリコシル化部位、列５はシグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列及びモチーフを有するアミノ酸残基、列６は各タンパク質の識別、列７は分析方法及び場合によってはその分析方法が利用できる検索可能なデータベースを示す。列７の分析方法は、配列相同性及びタンパク質モチーフから各ポリペプチドを特徴付けるために用いることが可能である。
【００８０】
表３の列は、組織特異性と、ＣｏＡＥＮをコードするヌクレオチド配列に関連した疾患または異常症、症状とを示している。表３の列１は、ヌクレオチドの配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）を示している。列２は、ＣｏＡＥＮを発現する組織カテゴリー、及びＣｏＡＥＮを発現する全組織におけるその割合を示す。列３は、ＣｏＡＥＮを発現する組織に関連する疾患若しくは異常症、症状、並びにＣｏＡＥＮを発現する全組織におけるそれらの割合を示す。列４は、各ｃＤＮＡライブラリをサブクローニングするために用いたベクターを示す。
【００８１】
ＣｏＡＥＮをコードする核酸配列の以下に示す断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０の同定、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するハイブリダイゼーション若しくは増幅の技術において、これらの断片は有用である。コード化されたポリペプチド配列は、例えば、抗体の作製に有用である。有用な断片には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のヌクレオチドの約５１５から６０７までの断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のヌクレオチドの約１２２９から１２６４までの断片及び約１６１９から１６４２までの断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチドの約１２５８から１４３７までの断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチドの約１１９１から１２２９までの断片と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチドの約７７から１３９までの断片とが含まれる。
【００８２】
表４の列は、ＣｏＡＥＮをコードするｃＤＮＡのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリの作製に用いられた組織の説明を示す。列１は、ヌクレオチドのＳＥＱ ＩＤ ＮＯを示し、列２はそれらのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリを示し、列３は列２のｃＤＮＡライブラリに対応する組織の由来及び詳細を示す。
【００８３】
本発明はまた、ＣｏＡＥＮの変異体を含む。好適なＣｏＡＥＮの変異体は、ＣｏＡＥＮアミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％ものアミノ酸配列同一性を有し、ＣｏＡＥＮの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも１つを有する。
【００８４】
本発明はまた、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例では、本発明は、ＣｏＡＥＮをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０からなる一群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
本発明はまた、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも約７０％、より好適には少なくとも約８５％、最も好適には少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異配列は、ＣｏＡＥＮの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも一つを有するアミノ酸配列をコードし得る。
【００８６】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＣｏＡＥＮをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み合わせは、自然発生のＣｏＡＥＮのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【００８７】
ＣｏＡＥＮをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択されたストリンジェントな条件の下で、自然発生のＣｏＡＥＮのヌクレオチドとハイブリダイズ可能なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドンの使用を有するＣｏＡＥＮ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＣｏＡＥＮ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【００８８】
本発明はまた、ＣｏＡＥＮ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＣｏＡＥＮまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００８９】
更に本発明には、種々のストリンジェント条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７； ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１．を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【００９０】
当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。好ましくは、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３或いは３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７； Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３．を参照）。
【００９１】
当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＣｏＡＥＮをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要素などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ ２：３１８−３２２を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．等（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：８１８６を参照）。キャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む（例えば、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。（例えば、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ． 他 （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０を参照）。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、ＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計される。
【００９２】
完全な長さのｃＤＮＡのスクリーニングの際は、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５’領域を有する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【００９３】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能である。出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ及びＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。
【００９４】
本発明の別の実施例では、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にＣｏＡＥＮ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＣｏＡＥＮのクローン化及び発現に利用可能である。
【００９５】
種々の目的でＣｏＡＥＮをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等が可能である。
【００９６】
別の実施例によれば、ＣｏＡＥＮをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．等（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＣｏＡＥＮ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実行可能である（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．等（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４を参照）。また、合成の自動化は例えばＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成し得る。更にＣｏＡＥＮのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプチドを作ることが可能である。
【００９７】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ． 及び Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１を参照）を用いて実質的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシークエンシングにより確認することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ． Ｔ． （１９８３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照）。
【００９８】
生物学的に活性なＣｏＡＥＮを発現させるために、ＣｏＡＥＮをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含む。これらの要素には、ベクター及びＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＣｏＡＥＮをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＣｏＡＥＮをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０１−１８−１６２．を参照）。
【００９９】
当業者に周知の方法を用いて、ＣｏＡＥＮをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる。（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章及び１３章１−４章を参照）。
【０１００】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＣｏＡＥＮをコードする配列の保持及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１０１】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＣｏＡＥＮをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９．を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＣｏＡＥＮが必要な場合は、ＣｏＡＥＮの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【０１０２】
ＣｏＡＥＮの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ．； 及びＢｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． 他 （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−７９４： Ｓｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． 他 （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１−１８１−１８４．を参照）
植物系もＣｏＡＥＮの発現に使用可能である。ＣｏＡＥＮをコードする配列の転写は、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。（例えば、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ ＮＹ， ｐｐ．１９１−１９６を参照）。
【０１０３】
哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＣｏＡＥＮをコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞にＣｏＡＥＮを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用いることが可能である。
【０１０４】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているものより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０１０５】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＣｏＡＥＮの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＣｏＡＥＮをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１０６】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能である。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれｔｋ−又はａｐｒ−細胞において使用される。（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（ｃＣｏＡＥＮｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対する耐性を与える（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−３５７０； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。さらに選択に利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤが文献に記載されている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．他（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−７９１を参照）。
【０１０７】
マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＣｏＡＥＮをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＣｏＡＥＮをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＣｏＡＥＮをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１０８】
一般に、ＣｏＡＥＮをコードする核酸配列を含み、ＣｏＡＥＮを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＣｏＡＥＮの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ＣｏＡＥＮ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。（例えば、 Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他．（１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ； Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ＮＹ； 及びＰｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９０） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【０１１０】
種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＣｏＡＥＮをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。
【０１１１】
ＣｏＡＥＮをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換された細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用されるその配列及び／またはそのベクターによる。ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＣｏＡＥＮの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１１２】
更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の「ｐｒｅｐｒｏ」または「ｐｒｏ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０１１３】
本発明の別の実施例では、ＣｏＡＥＮをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＣｏＡＥＮタンパク質が、ＣｏＡＥＮの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、ＣｏＡＥＮをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＣｏＡＥＮが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ． （１９９５、前出 ｃｈ １０）．に記載されている。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【０１１４】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＣｏＡＥＮの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、３５Ｓメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１１５】
ＣｏＡＥＮの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合成によって作製され得る（例えば、前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ｐｐ． ５５−６０．を参照）。タンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行うことが可能である。ＣｏＡＥＮの種々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。
【０１１６】
（治療）
ＣｏＡＥＮのある領域と補酵素Ａ利用酵素のある領域との間に、例えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、ＣｏＡＥＮの発現は、癌、免疫応答、炎症、及び発達、並びに脳及び筋組織と密接な関係がある。従って、ＣｏＡＥＮは、腫瘍疾患、免疫異常症、神経障害、小胞輸送障害、及び筋疾患においてある役割を果たすと考えられる。ＣｏＡＥＮの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＣｏＡＥＮの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＣｏＡＥＮの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＣｏＡＥＮの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１１７】
従って、一実施例において、ＣｏＡＥＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＣｏＡＥＮまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、免疫異常症が含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また、神経障害も含まれ、その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病が含まれ、また、小胞輸送障害も含まれ、その中には嚢胞性線維症、グルコース‐ガラクトース吸収不全症候群、高コレステロール血症、糖尿病、尿崩症、高／低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病と、潰瘍性大腸炎や胃潰瘍、十二指腸潰瘍を含む胃腸疾患と、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む小胞輸送障害に関連した別の症状と、枯草熱や喘息、じんま疹を含むアレルギーと、自己免疫性溶血性貧血、増殖性糸球体腎炎、炎���性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、リウマチ様変形性関節症、硬皮、チェディアック‐東症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、トキシックショック症候群、外傷性組織損傷、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、蠕虫感染、原虫感染が含まれ、また、筋疾患も含まれ、その中には、心筋症、心筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型偽肥大性筋ジストロフィ、筋緊張性ジストロフィ、中心コア病、ネマリンミオパシーラネマリン筋障害、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパチー、感染性節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー（ｅｔｈａｎｏｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、口峡炎、アナフィラキシー、不整脈、喘息、心血管ショック、クッシング病、高血圧症、低血糖症、心筋梗塞、脳症、てんかん、カーンズ‐セイヤ症候群、乳酸アシドーシス、ミオクローヌス疾患、眼筋麻痺が含まれる。筋疾患は、筋肉の正常な動作の阻害または変化と定義され、限定するものではないが、血管、胃腸管、心臓、子宮、膀胱、及び骨格筋が含まれる。
【０１１８】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＣｏＡＥＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＣｏＡＥＮまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１１９】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＣｏＡＥＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＣｏＡＥＮを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０１２０】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＣｏＡＥＮの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＣｏＡＥＮの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１２１】
更なる実施例では、ＣｏＡＥＮの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＣｏＡＥＮのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した発生障害、免疫異常症、及び細胞増殖異常症、並びに腫瘍疾患が含まれる。限定するものではないが、腫瘍疾患の例には、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌などがあり、詳しくは副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。一実施態様では、ＣｏＡＥＮと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＣｏＡＥＮを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０１２２】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＣｏＡＥＮの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０１２３】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０１２４】
ＣｏＡＥＮのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたＣｏＡＥＮを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＣｏＡＥＮと特異的に結合するものを同定が可能である。ＣｏＡＥＮの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０１２５】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＣｏＡＥＮまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【０１２６】
ＣｏＡＥＮに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５のアミノ酸からなり、一般的には約１０以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子の全アミノ酸配列も含む。ＣｏＡＥＮアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１２７】
ＣｏＡＥＮに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 等． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 等． （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１−８−４２； Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 等． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 等． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０を参照）。
【０１２８】
更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１−４８５１−４８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．等． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＣｏＡＥＮ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混合によって生成することもできる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１１１２０−３を参照）。
【０１２９】
抗体は、リンパ球集団の中のｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘発することによって、または免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生することもできる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ３８３３−３８３７； Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０１３０】
ＣｏＡＥＮに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）に断片と、Ｆ（ａｂ’）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 等． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２７５−１２８１を参照）。
【０１３１】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＣｏＡＥＮとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性ＣｏＡＥＮエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０１３２】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＣｏＡＥＮ抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＣｏＡＥＮ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったものである。多数のＣｏＡＥＮエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール抗体試薬の測定値Ｋａは、ＣｏＡＥＮ抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＣｏＡＥＮエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＣｏＡＥＮ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＣｏＡＥＮが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１３３】
ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、ある下流の適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクロナール抗体試薬は一般に、ＣｏＡＥＮ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。（例えば、Ｃａｔｔｙ， 前出， 及びＣｏｌｉｇａｎ 他、前出を参照）。
【０１３４】
本発明の別の実施例では、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態では、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を阻止するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって、相補的分子または断片は、ＣｏＡＥＮの活性の調節、または遺伝子機能の調節のために使用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＣｏＡＥＮをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０１３５】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてＣｏＡＥＮをコードポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができる（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ 他、及び前出のＡｕｓｕｂｅｌ 他によるものを参照）。
【０１３６】
ＣｏＡＥＮをコードする遺伝子は、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド又はその断片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はアンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み入れられない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損なわれるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに長く持続し得る。
【０１３７】
上記した通り、遺伝子の発現は、ＣｏＡＥＮをコードする遺伝子の制御５’または調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ、ＰＮＡ）を設計することによって調節することができる。例えば開始部位から約−１０から約＋１０までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いることが可能である。同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重式ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． 等． （１９９４） Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ． 及び Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計できる。
【０１３８】
酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。例えば、ＣｏＡＥＮをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１３９】
任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテストすることによって評価することが可能である。
【０１４０】
本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用いて、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホスホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＣｏＡＥＮをコードするＤＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０１４１】
ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くすることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく、イノシン、キュエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、及びワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）などの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大することができる。
【０１４２】
ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏでの使用に等しく適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療の場合、患者から採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すためにクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−６６：を参照）。
【０１４３】
上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０１４４】
本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物は、ＣｏＡＥＮ、ＣｏＡＥＮに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はＣｏＡＥＮのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０１４５】
本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することもできる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０１４６】
活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術については、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ＰＡ）に記載されている。
【０１４７】
経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体により、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。
【０１４８】
経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或いは糖衣錠コア（ｄｒａｇｅｅ ｃｏｒｅｓ）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が加えられる。
【０１４９】
糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。このような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル（ｃａｒｂｏｐｏｌ ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤または糖衣錠に加えられる。
【０１５０】
経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィット型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルには、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含まれる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或いは懸濁され得る。
【０１５１】
非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リンガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソームなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。
【０１５２】
局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。
【０１５３】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣化、溶離（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥処理を用いて製造され得る。
【０１５４】
医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の薬剤の形態には、１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、及び２％〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることができる。
【０１５５】
医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の薬としてラベルが貼られる。ＣｏＡＥＮの投与のため、このようなラベルには、量、頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。
【０１５６】
本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な服用量を決めることができる。
【０１５７】
どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができる。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定することができる。
【０１５８】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＣｏＡＥＮ又はその断片、ＣｏＡＥＮの抗体、ＣｏＡＥＮのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ５０（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはＬＤ５０（服用に対して集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０と示すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０１５９】
正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるため或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮されるものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与され得る。
【０１６０】
通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇまでの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０１６１】
（診断）
別の実施例では、ＣｏＡＥＮに特異的に結合する抗体が、ＣｏＡＥＮの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＣｏＡＥＮやＣｏＡＥＮのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。ＣｏＡＥＮの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＣｏＡＥＮを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。
【０１６２】
ＣｏＡＥＮを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＣｏＡＥＮの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＣｏＡＥＮの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＣｏＡＥＮに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体形成の量は、測光法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）などの種々の方法で定量され得る。被験者のＣｏＡＥＮの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパラメーターとなる。
【０１６３】
別の実施例によれば、ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＣｏＡＥＮを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＣｏＡＥＮの不在、存在、及び過度の発現を調べ、治療中のＣｏＡＥＮレベルの制御を監視する。
【０１６４】
ある実施形態では、ＣｏＡＥＮまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＣｏＡＥＮをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがＣｏＡＥＮをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０１６５】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＣｏＡＥＮをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０の配列、或いはＣｏＡＥＮ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０１６６】
ＣｏＡＥＮをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＣｏＡＥＮ及びＣｏＡＥＮ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。
【０１６７】
ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＣｏＡＥＮの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、腫瘍疾患が含まれ、その中には、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌などがあり、詳しくは副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれ、また、免疫異常症も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また、神経障害も含まれ、その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病が含まれ、また、小胞輸送障害も含まれ、その中には嚢胞性線維症、グルコース‐ガラクトース吸収不全症候群、高コレステロール血症、糖尿病、尿崩症、高／低血糖症、グレーブ���病、甲状腺腫、クッシング病と、潰瘍性大腸炎や胃潰瘍、十二指腸潰瘍を含む胃腸疾患と、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む小胞輸送障害に関連した別の症状と、枯草熱や喘息、じんま疹を含むアレルギーと、自己免疫性溶血性貧血、増殖性糸球体腎炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、リウマチ様変形性関節症、硬皮、チェディアック‐東症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、トキシックショック症候群、外傷性組織損傷、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、蠕虫感染、原虫感染が含まれ、また、筋疾患も含まれ、その中には、心筋症、心筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型偽肥大性筋ジストロフィ、筋緊張性ジストロフィ、中心コア病、ネマリンミオパシーラネマリン筋障害、中心核ミオパシー、脂質ミオパシー、ミトコンドリアミオパチー、感染性節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒性ミオパシー、エタノールミオパシー（ｅｔｈａｎｏｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、口峡炎、アナフィラキシー、不整脈、喘息、心血管ショック、クッシング病、高血圧症、低血糖症、心筋梗塞、脳症、てんかん、カーンズ‐セイヤ症候群、乳酸アシドーシス、ミオクローヌス疾患、眼筋麻痺が含まれる。ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＣｏＡＥＮの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。
【０１６８】
特定の形態において、ＣｏＡＥＮをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＣｏＡＥＮをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＣｏＡＥＮをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特定の治療効果を推定することが可能である。
【０１６９】
ＣｏＡＥＮの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あるいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＣｏＡＥＮをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０１７０】
疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いることができる。
【０１７１】
癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる。
【０１７２】
ＣｏＡＥＮをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、酵素を用いた生成、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得る。オリゴマーは、好ましくはＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェントな条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いることが可能である。
【０１７３】
ＣｏＡＥＮの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．等（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．等（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６を参照）。多数のサンプルの定量速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速な高スループット型のアッセイを用いることで加速された。
【０１７４】
別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監視し、遺伝子の変異、突然変異及び多型を識別する。この情報は、遺伝子機能の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び開発に有用である。
【０１７５】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他 （１９９５） 米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他 （１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； 及び Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号を参照）
本発明の別の実施例ではまた、ＣｏＡＥＮをコードする核酸配列を用いて、自然発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， １．３． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ５−８７−１３４， 及びＴｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）
ｉｎ ｓｉｔ蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他による（１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， 前出， ｐｐ． ９６５−９６８．を参照）。遺伝子マップデータの例は、種々の科学誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のワールドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体マップ上のＣｏＡＥＮをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを検出することもある。
【０１７６】
染色体標本のｉｎ ｓｉｔハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張することもできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマーカーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表す（例えば、Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他による（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。
【０１７７】
本発明の別の実施例では、ＣｏＡＥＮ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細胞内に存在する。ＣｏＡＥＮとテストされる薬剤との複合体を結合することによる形成は計測されることもある。
【０１７８】
薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，他による（１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４を参照）。この方法では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基板の上に合成される。試験用化合物は、ＣｏＡＥＮ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたＣｏＡＥＮが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたＣｏＡＥＮはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０１７９】
別の実施例では、ＣｏＡＥＮと結合可能な中和抗体がＣｏＡＥＮと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＣｏＡＥＮと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０１８０】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＣｏＡＥＮをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０１８１】
当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する好適な特定の実施例は、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０１８２】
前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願［１９９８年１１月３日に提出した代理人整理番号ＰＦ−０６２２Ｐ］に言及することをもって本明細書の一部とする。
【０１８３】
（実施例）
１　ｃＤＮＡライブラリの作製
ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入、或いは表４に列記した組織から単離した。ある組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した。一方では、別の組織をホモジナイズし、フェノール、或いはグアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液を含むＴＲＩＺＯＬ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶液を塩化セシウム遠心するか、またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶液からＲＮＡを沈殿させた。
【０１８４】
ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ． Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてポリ（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。別法では、ＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【０１８５】
ある場合には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社が対応するｃＤＮＡライブラリを作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて当分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリを作製した。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７，前出，ユニット５．１−６．６を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１つの制限酵素或いは複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ １０００または ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ（３００〜１０００ｂｐ）を選択した。ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐｌＮＣＹ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを結合させた。この組換えプラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ， ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦ、ＳＯＬＲ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５αまたはＤＨ １０Ｂ、ＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ １０Ｂを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。
【０１８６】
２　ｃＤＮＡクローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）或いは細胞溶解を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏ切除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、ＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの内の少なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１８７】
別法では、高スループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した。（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理してから３８４−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１８８】
３　シークエンシング及び分析
ｃＤＮＡのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒまたはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ） 液体転移システムとの組み合わせなどの高スループット装置で行った。ｃＤＮＡのシークエンシング反応の準備には、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の試薬、またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）などのＡＢＩシークエンシングキットに含まれる試薬を用いた。ｃＤＮＡのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、当分野で周知のその他の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列の読み枠は、標準的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７， 前出， ｕｎｉｔ ７．７）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した方法で配列を延長した。
【０１８９】
ｃＤＮＡのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。表５は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文献、閾値パラメーターの概要を示す。表５の列１は用いたツール及びプログラム、アルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の一部とした引用文献、列４の記載部分は２つの配列の一致度の評価に用いたスコア及び確率値、他のパラメータを示す（確率値が高ければ高いほど配列間の相同性が高くなる）。配列の解析には、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア （ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いた。
【０１９０】
ポリヌクレオチド配列の確証は、ＢＬＡＳＴ及び動的計画法、ジヌクレオチド最近接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースやＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰＦＡＭなどのデータベースから選択した配列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Ｐｈｒｅｄ及びＰｈｒａｐ、Ｃｏｎｓｅｄに基づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳに基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリーンした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（上記）及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰｒｏｓｉｔｅなどのデータベース、またはＰＦＡＭなどのＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ （ＨＭＭ）に基づいたタンパク質ファミリーデータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。ＨＭＭは、確率を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する（例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照）。
【０１９１】
完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。
【０１９２】
４　ノーザン分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出， ７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． 他、前出， ４章及び１６章を参照）。
【０１９３】
ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索の基準は、
（％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００
として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。
【０１９４】
ノーザン分析の結果は、ＣｏＡＥＮをコードする転写物が発生したライブラリの分布割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライブラリの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリーには、癌、炎症／外傷、細胞増殖、神経、貯留（ｐｏｏｌｅｄ）が含まれる。カテゴリー別に、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のライブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合（パーセント）と各疾患で発現する割合を表３に示した。
【０１９５】
５　ＣｏＡＥＮをコードするポリヌクレオチドの延長
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５’の延長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の延長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを延長した。
【０１９６】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いてこの配列を延長した。２段階以上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。
【０１９７】
当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）用いて９６ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【０１９８】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を延長することに成功したかを決定する。
【０１９９】
延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて延長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２００】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１−１５， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてシークエンシングした。
【０２０１】
同様に上述の手順で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０のヌクレオチド配列を利用し、この延長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′調節配列を得た。
【０２０２】
６　個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１０から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの［γ‐３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超精細排除デキストランビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１或いはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０２０３】
各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブラン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に転写する。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーションパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して比較する。
【０２０４】
７　マイクロアレイ
化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を合成することが可能である（例えば、上記Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒを参照）。ドットブロット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的なアレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べることが可能である。
【０２０５】
完全長のｃＤＮＡ、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）、或いはそれらの断片が、マイクロアレイの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ、ＥＳＴ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから任意に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。ｃＤＮＡは、例えばＵＶ交差結合（ＵＶ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）を利用してスライドに固定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる（例えば、 Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０； 及び Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ． 他． （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５を参照）。蛍光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼーションするために用いる。上記した方法でこの基質を分析する。
【０２０６】
８　相補的ポリヌクレオチド
ＣｏＡＥＮをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発生のＣｏＡＥＮの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣｏＡＥＮのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＣｏＡＥＮをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０２０７】
９　ＣｏＡＥＮの発現
ＣｏＡＥＮの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＣｏＡＥＮが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節要素に関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＣｏＡＥＮを発現する。真核細胞でのＣｏＡＥＮの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＣｏＡＥＮをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７； Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．を参照）。
【０２０８】
殆どの発現系では、ＣｏＡＥＮが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６キロダルトンの酵素ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＣｏＡＥＮからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５，前出， ｃｈ １０， １６）に記載されている。これらの方法で精製したＣｏＡＥＮを直接用いて以下のアッセイを行うことができる。
【０２０９】
１０　ＣｏＡＥＮ活性の実証
ＣｏＡＥＮの活性は、Ｂｒｅｍｅｒ， Ｊ． （１９８１， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６５：６２８−６３１）による方法に従って、［Ｈ３］標識パルミトイルカルニチンを生成する、マロニルＣｏＡから［Ｈ３］標識カルニチンへのマロニル基の移動を測定することで決定される。ミトコンドリアは本分野で周知の方法を用いて、哺乳動物組織より調整される。ミトコンドリアの試料（３５−４０μｇ）は、７５ ｍＭ ＫＣＩ、５０ｍＭ マニトール、２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ ７．３）、２ｍＭ ＮａＣＮ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ ｍＭ ジチオスレイトール、及び１％ ウシ血清アルブミン（脂肪酸を実質的に含まない）を含むインキュベーション混合物中に於いて、３０°Ｃで３分間、様々な濃度のＣｏＡＥＮ及びマロニルＣｏＡ（０−１μＭ）でプレインキュベートされる。このインキュベートに引き続き、Ｌ−［メチル−３Ｈ］ カルニチン０．１μＣｉが、２００μＭの最終的なＬ−カルニチン濃度を得るために加え、インキュベーションが更に６分間続ける。１００μｌの１０Ｎ ＨＣｌが加えて反応を停止する。［Ｈ３］パルミトイルカルニチンがブタノールで抽出され、スタンダード液体シンチレーション法を用いてカウントされる。回収された［Ｈ３］パルミトイルカルニチンの量は、試料中のＣｏＡＥＮの量に比例している。
【０２１０】
別法では、ＣｏＡＥＮの活性は、ＡｇｕａｄｏやＣａｍｐｂｅｌｌらの方法（１９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：４０９６−４１０５）により決定される。ＣｏＡＥＮの活性は、放出ＣｏＡのチオール基の５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）との反応を測定することで決定され、それは分光光度計で４１３ｎｍにおける吸収の増加として確認できる。ＣＯＳ７のような適切な哺乳類細胞株は、ＣｏＡＥＮを含むベクターに一過性に形質移入される。ＣｏＡＥＮの一過性に発現するように細胞培養の培地で適切な時間インキュベートした後、細胞は採取され、本分野中でよく知られた方法を用いてホモジナイズされる。次に、細胞ホモジェネートは緩衝基質でインキュベートされる。典型的なインキュベーション混合物は、ｐＨ ７．４の１００ｍＭ トリＨＣｌ、１ ｍＭ ＤＴＮＢ、５０ μＭ ＬＰＡ （ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−グリセロール ３−リン酸塩）、１０−４５ μＭ アシル−ＣｏＡ、細胞ホモジェネートの５０−１５０ μｇで構成され、合計で１ｍｌである。ＤＴＮＢは、ｐＨ７．０の０．１ Ｍ カリウムリン酸塩バッファに０．０１Ｍ溶液として加えられる。反応は、２分間に渡りその他の全ての成分で試料をプレインキュベートした後に、アシル−ＣｏＡを加えることで開始される。１３６００ユニットのモル吸収は、放出されたＣｏＡとＤＴＮＢとの結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を計算することに用いられる。４１３ｎｍに見られる吸収の増加は、試料に於けるＣｏＡＥＮの量に比例する。
【０２１１】
１１　機能的アッセイ
ＣｏＡＥＮの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＣｏＡＥＮをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。このようなベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）及びｐＣＲ ３．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．による （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記載されている。
【０２１２】
遺伝子発現におけるＣｏＡＥＮの影響は、ＣｏＡＥＮをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＣｏＡＥＮ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２１３】
１２　ＣｏＡＥＮに特異的な抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８１６−３０８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＣｏＡＥＮを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０２１４】
別法では、ＣｏＡＥＮアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０２１５】
通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのペプチドシンセサイザＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＣｏＡＥＮ活性を検査するには、ペプチドまたはＣｏＡＥＮを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０２１６】
１３　特異的抗体を用いる自然発生ＣｏＡＥＮの精製
自然発生ＣｏＡＥＮ或いは組換えＣｏＡＥＮを、ＣｏＡＥＮに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＣｏＡＥＮ抗体とを共有結合させることにより構築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。
【０２１７】
ＣｏＡＥＮを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＣｏＡＥＮを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＣｏＡＥＮとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＣｏＡＥＮを回収する。
【０２１８】
１４　ＣｏＡＥＮと相互作用する分子の同定
ＣｏＡＥＮ又は生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ．及びＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９を参照）で標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＣｏＡＥＮと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＣｏＡＥＮ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＣｏＡＥＮ濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とＣｏＡＥＮとの関連、親和性、数について数値を計算する。
【０２１９】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれる。
【０２２０】
（表の簡単な説明）
表１は、ＣｏＡＥＮをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）、クローン識別番号、ｃＤＮＡライブラリ、及びｃＤＮＡ断片を示す。
【０２２１】
表２は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、並びにＣｏＡＥＮの解析に用いた方法、アルゴリズム、及び検索可能なデータベースを示す。
【０２２２】
表３は、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症及び症状と、各ＤＮＡがクローニングされたベクターとを示す。
【０２２３】
表４は、ＣｏＡＥＮをコードするｃＤＮＡクローンを単離したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織を示す。
【０２２４】
表５は、ＣｏＡＥＮの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並びにその説明、引用文献、閾値パラメーターを示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510401.tif 000081
【国際調査報告】
2004510401.tif 000082
2004510401.tif 000083
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