(57)【要約】本発明は、根の成長を刺激、および／または側根もしくは不定根の形成を促進、および／または根の屈地性を変化させる方法に関連し、この方法は、植物または植物の一部において植物サイトカイニンオキシダーゼを発現させる工程、あるいは植物または植物の一部におけるサイトカイニンの活性レベルを減ずる別のタンパク質を発現させる工程を包含する。本発明はまた、新規の植物サイトカイニンオキシダーゼタンパク質、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質をコードする核酸配列に関連し、ならびにこの配列を含むベクター、宿主細胞、トランスジェニック細胞およびトランスジェニック植物に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
根の成長を刺激するため、または側根もしくは不定根の形成を促進するか、または根の屈地性を変化させるための、植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸または植物もしくは植物の一部におけるサイトカイニン活性レベルを減じるタンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項２】
根の成長を刺激するか、または側根もしくは不定根の形成を促進するため、または根の屈地性を変化させる方法であって、該方法は、以下：
（ａ）配列番号２７、１、３、５、７、９、１１、２５、２６、２８〜３１、３３もしくは３４またはこれらの相補体のいずれかにおいて提供されるＤＮＡ配列を含む核酸、
（ｂ）配列番号２７、１、３、５、７、９、１１、２５、２６、２８〜３１、３３もしくは３４またはこれらの相補体のいずれかに対応するＲＮＡ配列を含む核酸、
（ｃ）配列番号２７、１、３、５、７、９、１１、２５、２６、２８〜３１、３３もしくは３４またはこれらの相補体のいずれかに特異的にハイブリダイズする核酸、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、３２もしくは３５またはこれらの相補体のいずれかにおいて提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
（ｅ）該核酸がＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＴがＵで置換されたＲＮＡであることで特徴付けられる、（ａ）〜（ｄ）のいずれかにおいて規定される核酸、
（ｆ）遺伝暗号の結果として、配列番号２７、１、３、５、７、９、１１、２５、２６、２８〜３１、３３もしくは３４のいずれかにおいて提供される核酸に縮重している核酸、または（ａ）〜（ｅ）のいずれかにおいて規定される核酸に縮重している核酸、
（ｇ）生物間におけるコドン使用頻度の差異に起因して、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは３５のいずれかにおいて提供されるタンパク質をコードする核酸から分岐している核酸、または（ａ）〜（ｅ）のいずれかにおいて規定される核酸から分岐している核酸、
（ｈ）対立遺伝子間の差異に起因して分岐している、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは３５において提供されるタンパク質をコードする核酸、または（ａ）〜（ｅ）において規定される核酸、
（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または３５のいずれかにおいて提供されるタンパク質をコードする核酸、
（ｊ）サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する（ａ）〜（ｉ）のいずれかにおいて規定される核酸の機能性フラグメント、ならびに
（ｋ）植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸、
からなる群から選択される植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸を発現させる工程を包含するか、または植物もしくは植物の一部におけるサイトカイニン活性レベルを減ずるタンパク質をコードする核酸を、好ましくは根において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項３】
サイトカイニンオキシダーゼ活性を有する新規の植物性タンパク質をコードする単離された核酸であって、該核酸は、以下：
（ａ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４またはこれらの相補体のいずれかにおいて提供されるＤＮＡ配列を含む核酸、
（ｂ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４またはこれらの相補体のいずれかに対応するＲＮＡ配列を含む核酸、
（ｃ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４またはこれらの相補体のいずれかにおいて提供される核酸に特異的にハイブリダイズする核酸、
（ｄ）配列番号３２において提供されるポリペプチドを含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸であって、配列番号４において提供されるアミノ酸配列に少なくとも７０％類似する核酸、
（ｅ）配列番号６において提供されるアミノ酸配列に少なくとも４７％類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｆ）配列番号１０または３５において提供されるアミノ酸配列に少なくとも４７％類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｇ）配列番号４、６、１０、３２または３５のいずれかにおいて提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
（ｈ）遺伝暗号の結果として、配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３３または３４のいずれかにおいて提供される核酸に縮重している核酸、または（ａ）〜（ｇ）のいずれかにおいて規定される核酸に縮重している核酸、
（ｉ）生物間におけるコドン使用頻度の差異に起因して、配列番号４、６、１０または３５のいずれかにおいて提供されるタンパク質をコードする核酸から分岐している核酸、または（ａ）〜（ｇ）のいずれかにおいて規定される核酸から分岐している核酸、
（ｊ）対立遺伝子間の差異に起因して分岐している、配列番号４、６、１０または３５において提供されるタンパク質をコードする核酸、または（ａ）〜（ｇ）において規定される核酸、
（ｋ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４のいずれかにおいて提供される核酸によってコードされる、サイトカイニンオキシダーゼの免疫学的に活性なフラグメントをコードする核酸、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸の、免疫学的に活性なフラグメントをコードする核酸、
（ｌ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３または３４のいずれかにおいて提供される核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの機能フラグメントか、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかにおいて規定される核酸の機能フラグメントをコードする核酸であって、ここで該フラグメントがサイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する核酸、ならびに
（ｍ）配列番号４、６、１０または３５において規定されるタンパク質をコードする核酸、
からなる群から選択され、ただし該核酸は、以下のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＣ００５９１７、ＡＢ０２４０３５およびＡＣ０２３７５４のいずれにおいても寄託されていない核酸である、単離された核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の単離された核酸であって、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ、またはＴがＵで置換されたＲＮＡである、核酸。
【請求項５】
請求項３または４に記載の核酸に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子。
【請求項６】
請求項３または４に記載の核酸を特異的に増幅する、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子。
【請求項７】
請求項３または４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターであって、該ベクターは発現ベクターであり、ここで前記核酸が１つ以上のコントロール配列に作動可能に連結し、原核宿主細胞および／または真核宿主細胞において該核酸の発現を可能にする、ベクター。
【請求項９】
請求項３もしくは４に記載の核酸、または請求項７もしくは８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、請求項３もしくは４に記載の核酸またはこれらのホモログもしく誘導体、またはこれらの免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能フラグメントによりコード可能である、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリペプチドであって、配列番号４、６、１０もしくは３５のいずれか、またはこれらのホモログもしくは誘導体、またはこれらの免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能フラグメントにおいて提供される、アミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のポリペプチドを産生する方法であって、請求項９または１０に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドが発現可能な条件下で培養して、該産生されたポリペプチドを培地から回収する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載のポリペプチドもしくはこれらの特異的エピトープを特異的に認識する、抗体。
【請求項１５】
トランスジェニック植物、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物組織を産生する方法であって、発現可能な構成の請求項３もしくは４に記載の核酸、または請求項７もしくは８に記載のベクターを、該植物、該植物細胞または該植物組織に導入する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
改変植物、改変植物細胞または改変植物組織を産生する方法であって、請求項１１もしくは１２に記載のポリペプチドを該植物の細胞、組織または器官に直接導入する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１１または１２に記載のポリペプチドの発現に影響を与える方法であって、請求項３もしくは４に記載の、１つ以上のコントロール配列に作動可能に連結した核酸、または請求項７もしくは８に記載のベクターを、植物細胞のゲノム中に安定に導入する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項３または４に記載の核酸を含むトランスジェニック植物細胞であって、ここで該核酸が、請求項１６もしくは１７に記載の方法で得られる植物細胞もしくはトランスジェニック植物細胞において、該核酸を転写および／または発現させる、調節エレメントに作動可能に連結する、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２０】
請求項１８に記載のトランスジェニック植物細胞であって、ここで請求項３または４に記載の核酸が該植物細胞のゲノム中に安定に組みこまれる、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の植物細胞を含む、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物組織。
【請求項２２】
請求項２１に記載の植物の収穫可能部分。
【請求項２３】
請求項２２に記載の植物の収穫可能部分であって、種子、葉、果実、茎培養物、根茎、根、塊茎および鱗茎からなる群から選択される、植物の収穫可能部分。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれかに記載の植物または植物の一部に由来する、子孫。
【請求項２５】
根の成長を刺激する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２で規定される核酸を発現させる工程、あるいは植物もしくは植物の一部中のサイトカイニンの活性レベルを減ずる別のタンパク質を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
側根もしくは不定根の形成を促進する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２に規定される核酸を発現させる工程、あるいは植物もしくは植物の一部中のサイトカイニンの活性レベルを減ずる別のタンパク質を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項２７】
根の屈地性を変化させる方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２に規定される核酸の発現を変化させる工程、あるいは植物もしくは植物の一部中のサイトカイニンの活性レベルを減ずる別のタンパク質を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項２８】
収量を増大させる、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
請求項２５〜２８のいずれかに記載の方法であって、ここで前記核酸の発現が、強力な構成プロモーターの制御下で生じる、方法。
【請求項３０】
請求項２５〜２８のいずれかに記載の方法であって、ここで前記核酸の発現が、優先的に根において発現されるプロモーターの制御下で生じる、方法。
【請求項３１】
請求項１１または１２に記載のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得する方法であって、請求項１１もしくは１２に記載のポリペプチドを用いるスクリーニングアッセイを包含する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、ツーハイブリッドスクリーニングアッセイの工程を包含し、ここで請求項１１または１２に記載のポリペプチドをベイトとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをプレイとして用いる、方法。
【請求項３３】
請求項１１または１２に記載のポリペプチドと請求項３１または３２に記載の方法によって得られ得る相互作用パートナータンパク質との間の相互作用を調節する方法。
【請求項３４】
請求項１１または１２に記載のポリペプチドと相互作用する化合物を同定および獲得する方法であって、以下：
ａ）ツーハイブリッドシステムを提供する工程であって、ここで請求項１１もしくは１２に記載のポリペプチド、および請求項３１もしくは３２に記載の方法によって得られ得る相互作用パートナータンパク質が発現される、工程
ｂ）該化合物を、ａ）において規定されるように発現させたポリペプチドにより形成される複合体と相互作用させる工程、および
ｃ）該化合物の、ａ）において規定されるように発現させたポリペプチドにより形成される複合体との相互作用の測定を実施する工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項１１または１２に記載のポリペプチドに特異的に結合する化合物もしくは該化合物の混合物を同定する方法であって、以下：
ａ）請求項１１または１２に記載のポリペプチドを、該化合物もしくは該化合物の混合物とを、複合体が形成されるのに適した条件下で合わせる工程、および
ｂ）複合体形成を検出する工程であって、ここで該複合体の存在により、該ポリペプチドに特異的に結合する化合物もしくは混合物を同定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
請求項３１〜３５のいずれかに記載の方法であって、ここで前記化合物または混合物が請求項１１または１２に記載のポリペプチドの活性を阻害して、化学物質の合理的設計に使用され得る、方法。
【請求項３７】
請求項３１〜３５のいずれかに記載の方法により、植物成長制御因子または除草剤として同定される、化合物または混合物の、使用。
【請求項３８】
植物成長制御因子または除草剤の生産方法であって、請求項３１〜３５のいずれかに記載の方法の工程、および該工程から得られる化合物を適切な形態に処方し、農業または植物細胞もしくは植物組織培養に提供する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
成長を促進する化学物質もしくは除草剤の設計またはスクリーニングの方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２に規定される核酸または請求項７もしくは８に記載のベクターを使用する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
収量増加のための、請求項３もしくは４に記載の核酸分子または請求項２に規定される核酸、請求項７もしくは８に記載のベクター、請求項１１もしくは１２に記載のポリペプチドの、使用。
【請求項４１】
根の成長を刺激するための、請求項３もしくは４に記載の核酸分子または請求項２に規定される核酸、請求項７もしくは８に記載のベクター、請求項１１もしくは１２に記載のポリペプチドの、使用。
【請求項４２】
側根もしくは不定根の形成を促進するための、請求項３もしくは４に記載の核酸分子または請求項２に規定される核酸、請求項７もしくは８に記載のベクター、請求項１１もしくは１２に記載のポリペプチドの、使用。
【請求項４３】
根の屈地性を変化させるための、請求項３もしくは４に記載の核酸分子または請求項２に規定される核酸、請求項７もしくは８に記載のベクター、請求項１１もしくは１２に記載のポリペプチドの、使用。
【請求項４４】
請求項３〜６のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸分子、請求項７もしくは８に記載のベクター、請求項１１もしくは１２に記載のポリペプチド、または請求項１４に記載の抗体を含む、診断用組成物。
【請求項４５】
根の分裂組織の大きさを増大する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、植物もしくは植物の一部、好ましくは根において発現させる工程、あるいは植物もしくは植物の一部、好ましくは根におけるサイトカイニンの活性レベルを減ずるタンパク質をコードする核酸を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４６】
根の大きさを増大する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、植物もしくは植物の一部、好ましくは根において発現させる工程、あるいは植物もしくは植物の一部、好ましくは根におけるサイトカイニンの活性レベルを減ずるタンパク質をコードする別の核酸を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４７】
苗条の分裂組織の大きさを増大する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸の発現を、好ましくは苗条においてダウンレギュレートさせる工程を包含する、方法。
【請求項４８】
葉の枯死を遅延する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸の発現を、葉において、好ましくは枯死しつつある葉においてダウンレギュレートさせる工程を包含する、方法。
【請求項４９】
葉の枯死を変化させる方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、枯死しつつある葉において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５０】
葉の厚みを増大する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、植物もしくは植物の一部において発現させる工程、あるいは植物もしくは植物の一部におけるサイトカイニンの活性レベルを減ずるタンパク質をコードする核酸を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５１】
導管の大きさを減ずる方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、植物もしくは植物の一部において発現させる工程、あるいは植物もしくは植物の一部におけるサイトカイニンの活性レベルを減ずるタンパク質をコードする核酸を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５２】
導管の大きさを増大する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸の、植物もしくは植物の一部における発現をダウンレギュレートする工程を包含する、方法。
【請求項５３】
単為結実を増大する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、植物もしくは植物の一部、好ましくは胎座、胚珠およびこれらに由来する組織において発現させる工程、あるいは植物もしくは植物の一部、好ましくは胎座、胚珠およびこれらに由来する組織におけるサイトカイニンの活性レベルを減ずるタンパク質をコードする核酸を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５４】
苗の木立能力を改善する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、苗部分、好ましくは苗の根において発現させる工程、あるいは苗部分、好ましくは苗の根におけるサイトカイニンの活性レベルを減ずるタンパク質をコードする核酸を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５５】
枝分かれを増大する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、植物もしくは植物の一部において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５６】
倒伏耐性を改善する方法であって、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸を、植物もしくは植物の一部、好ましくは茎または腋芽において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５７】
トランスジェニック台木の使用であって、該トランスジェニック台木を若枝を用いて接木して、該台木における植物サイトカイニンオキシダーゼの発現に起因して促進された、根の成長を特徴とする得られた植物もしくは樹木を生じるように、根に関する特徴を改善するための、使用。
【請求項５８】
請求項５７に記載の使用であって、ここで前記植物サイトカイニンオキシダーゼが、請求項３もしくは４に記載の核酸または請求項２において規定される核酸によってコードされる、使用。
【請求項５９】
トランスジェニック植物であって、請求項５７または５８に記載の植物サイトカイニンオキシダーゼを発現するトランスジェニック台木を含み、そしてさらに若枝を含む、トランスジェニック植物。
【請求項６０】
請求項５９に記載の植物の収穫可能な部分。
【請求項６１】
根の成長および発生を刺激する方法であって、トランスジェニック植物細胞または、トランスジェニック植物組織培養物における植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、ここで前記核酸が、請求項３に記載の核酸または請求項２において規定される核酸のうち少なくとも１つである、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、１つ以上の発育プロセスおよび／または環境適合プロセス（根の成長および／または不定根の形成、および／または側根の形成、および／または根の屈地性、および／または苗条の成長、および／または頂芽優性、および／または枝分かれ、および／または時間感覚、および／または開花時期、および／または花芽形成、および／または種子発育、および／または種子生成の開始または刺激または増大の改変を含むがこれらに限定されない）のような、植物の形態学的、生化学的および生理学的な特性または特徴を改変するための方法に関し、この方法は、植物中の特にサイトカイニンオキシダーゼにおいて、細胞特異的プロモーター配列、組織特異的プロモーター配列、または器官特異的プロモーター配列のような調節可能なプロモーター配列の制御下で、サイトカイニン分解制御タンパク質を作動可能に発現する工程を包含する。好ましくは、本発明によって改変される特徴は、サイトカイニン媒介性および／またはオーキシン媒介性の特徴である。本発明は、本発明の方法を実行するために有用な遺伝子構築物、ならびにこれらの他の同質遺伝子的な対応物と比較して変更された形態学的および／または生化学的および／または生理学的な特性を有する生成されたトランスジェニック植物まで拡張する。
【０００２】
（発明の背景）
根は、高等植物の重要な器官である。その主要な機能は、土壌中での植物の固着、ならびに水および栄養分（Ｎ養分、鉱物など）の取り込みである。従って、根の成長は、特に栄養分限定の条件下において、地上の器官の成長および生成に直接的または間接的に影響を与える。根はまた、防御化合物および植物ホルモンのような二次植物産物の生成に関連している。
【０００３】
根はまた、多数の重要な主要生産物における貯蔵器官である。砂糖大根は、欧州における糖の生産のための最も重要な植物である（２億６０００万ｔ／年；世界の生産の３８％）。マニオカ（キャッサバ）、ヤムおよび甘薯（サツマイモ）は、重要なデンプン生産物である（およそ１億５０００万ｔ／各年）。これらのデンプン含有量は、ジャガイモの２倍ほど高くあり得る。根はまた、多数の野菜（例えば、ニンジン、ダイコン）、薬草（例えば、ショウガ、ククマ（ｋｕｋｕｍａ））および医療植物（例えば、ニンジン）において、消費のための関連する器官である。さらに、根において見出される二次植物生産物のいくつかは、化学産業および製薬産業にとって経済的に重要である。例はヤムであり、これは、ステロイドホルモンの合成のための基本分子を含む。別の例は、シコニンであり、これは、毛状根培養におけるＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの根によって生成される。シコニンは、その抗炎症、抗腫瘍および創傷治癒の特性のために使用される。
【０００４】
さらに、作物の改善された根の成長はまた、水接近性および水取り込みを増加させることによって、雑草との競合を強化し、そして乾燥した領域における成長を改善する。
【０００５】
改善された根の成長はまた、バイオレメディエーションおよび土壌侵食の予防／阻止のような生態学的な目的に関連する。
【０００６】
根の構築は、地面におけるその形質を評価することが困難であるために、伝統的育種を介してほとんど調査されないままの領域である。従って、生物工学は、この形質の改善に有意な影響を与え得る。なぜなら、これは、地面における大規模なスクリーニングに依存していないためである。むしろ、生物工学的なアプローチは、植物の特定の特徴を決定する分子成分の基本的な理解を必要とする。今日、この知識は、断片的のみの知識であり、そして結果として、生物工学は、この領域において大きな進歩を実現し得るには程遠い。
【０００７】
根の成長の十分に確立された調節因子は、オーキシンである。成長する植物へのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）の適用は、側根の発達および側根の伸長を刺激する（Ｔｏｒｒｅｙ，Ａｍ  Ｊ  Ｂｏｔ  ３７：２５７−２６４，１９５０；Ｂｌａｋｅｌｙら、Ｂｏｔ  Ｇａｚ  １４３：３４１−３５２，１９８２；ＭｕｄａｙおよびＨａｗｏｒｔｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１９３−２０３，１９９４）。いろいろな濃度のＩＡＡに曝露された根は、側根の数の増加が始まった（Ｋｅｒｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２２：９２５−９３２，２０００）。さらに、特定の濃度の外因性オーキシンに応答して側根を生成する根が、より高い濃度のＩＡＡに引き続いて曝露される場合、多数の過剰な側根が、既存の根の間に間隔をあけて形成される（Ｋｅｒｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２２：９２５−９３２，２０００）。逆に、オーキシン輸送インヒビター（ＮＰＡを含む）を含む寒天上での根の成長は、側根の数を減少させる（ＭｕｄａｙおよびＨａｗｏｒｔｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１９３−２０３，１９９４）。
【０００８】
増加したレベルの内因性ＩＡＡを含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体が単離されている（Ｂｏｅｒｊａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１４０５−１４１，１９９５；Ｃｅｌｅｎｚａら、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ  ９：２１３１−２１４２，１９９５；Ｋｉｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：２０２３−２０３７，１９９５；Ｌｅｈｍａｎら、Ｃｅｌｌ  ８５：１８３−１９４，１９９６）。これらは、現在、第２染色体上に位置する単一の遺伝子座の対立遺伝子であることが知られている。これらの変異体の菌は、過剰の不定根および側根を有する。このことは、外部オーキシン適用の上記効果に従う。
【０００９】
不定根および側根の形成に対するオーキシンの刺激効果は、トランスジェニック植物におけるオーキシンの過剰生産が、根の成長を増加させるための有効な手法であることを示唆する。しかし、このことが、改善された特徴を有する商業的製品を生じるか否かはまた疑問である。不定根および側根の形成に対するその刺激効果は別として、オーキシン過剰生産は、例えば、葉数の減少、異常な葉の形態（狭く曲がった葉）、中断された花序、増加した頂芽優性、茎上の不定根の形成（これらの多くは、農学的視点から望ましくない）のような他の影響を引き起こす（Ｋｌｅｅら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ  １：８６−９６，１９８７；Ｋａｒｅｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５：２２５−２３６，１９９０）。従って、増加したオーキシン合成に頼るアプローチの主要な問題は、主にオーキシンの効果を根に限定する、封じ込めの問題である。この封じ込めの問題は、組織特異的プロモーターを使用することによって克服されないようである：オーキシンは、植物中で輸送され、そしてこれらの作用は、合成の部位に結果的に限定されない。別の問題は、オーキシンが常に全部の根の生物量を増やすか否かである。寒天成長植物については、濃度を次第に増加させることは、側根形成を刺激したが、同時にこれらの根の成長を阻害したことが見出されている（Ｋｅｒｋら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２２：９２５−９３２，２０００）。オーキシン効果の封じ込めおよび根の成長の維持に関連する上記問題は、特許請求の範囲の実施形態によって解決される。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物に関連する。この遺伝子は、調節プロモーターの制御下で発現される。このプロモーターは、内因性の組織特異的または環境特異的な因子によって調節され得るか、あるいは、特定の化学物質の適用によって誘導され得る。
【００１１】
本発明はまた、遺伝子構築物を含む細胞または植物に関する。
【００１２】
本発明はまた、根または根の特定の組織もしくは細胞型に特異的であるプロモーターの制御下でのサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現により、根の構造および生物量を改変するための方法に関する。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
オーキシン生合成の増加に関連する上記問題を回避するために、代替的なアプローチに従うことを決定した。本発明者らは、オーキシンの生物学的アンタゴニストの下方制御が、オーキシンレベルの増加と比較して、根の成長に対する同様の効果またははるかに優れた効果を誘起し得ると考えた。ホルモンの作用および相互作用は極度に複雑であるが、本発明者らは、サイトカイニンが、根の成長に関連してオーキシンアンタゴニストとして機能し得ると仮定した。植物組織培養に関するホルモン研究により、オーキシン対サイトカイニンの比が、これらのホルモンの各々の絶対レベルよりも器官形成についてより重要であることが示され、このことは、確かに、これらのホルモンが、少なくとも特定の生物学的プロセスにおいて、アンタゴニストとして機能することを示す。さらに、側根形成は、サイトカイニンの外部適用によって阻害される。興味深いことに、根の伸長はまた、サイトカイニン処理によって負に影響され、このことにより、サイトカイニンが、根の枝分かれおよび根の成長の両方を制御することが示唆される。
【００１４】
まとめて、現在の文献データによると、サイトカイニンのレベルを増加することは、根の成長に負に影響するが、このプロセスの基礎となる機構は、理解されていないことが示される。植物におけるサイトカイニン合成の部位は、根の先端および苗条の若い組織である。内因性サイトカイニンの濃度は、ｎＭ範囲である。しかし、この定量は困難であるので、かなり大きい組織量が抽出される必要があり、そして実際の局所的濃度は知られていない。サイトカイニンの細胞下区画化もまた知られていない。遊離塩基およびリボシドは、細胞質および核に局在するが、グリコシドは液胞に局在すると一般に考えられている。また、わずかに異なる化学構造を有する異なるサイトカイニンが存在する。結果として、外因性サイトカイニンの効果が、全サイトカイニン濃度の上昇に起因するか、またはむしろ、レセプター、トランスロケーター、トランスポーター、酵素改変についての植物固有のサイトカイニンの他の形態（これらは、構造、細胞局在または細胞下局在のいずれかにおいて異なる）からの競合に起因するかは、知られていない。
【００１５】
根のサイトカイニンのレベルが、根の成長に最適なレベルを本当に超えるという仮説を試験するために、サイトカイニンオキシダーゼ（これは、サイトカイニン代謝酵素である）をコードする新規な遺伝子を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＡｔＣＫＸと命名される）からクローニングし、そして引き続き、トランスジェニックのタバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、強力な構成性プロモーター下で発現させた。ＡｔＣＫＸ  ｍＲＮＡの発現および増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示す形質転換体はまた、増大した根の形成および成長を明らかにした。苗条の成長に対する負の影響もまた観察された。後者は、これらの植物におけるサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の構成的発現に従い、このことは、一般的な植物成長特性のためのサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の限定された発現の重要性を示す。サイトカイニンオキシダーゼ活性の封じ込めは、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは器官特異的プロモーターを使用して達成され得る。なぜなら、サイトカイニン分解は、ＣＫＸタンパク質を発現する組織または細胞に限定されるプロセスであるためであり、これは、上に説明したように、ホルモン合成に頼るアプローチと対照的である。
【００１６】
苗条の成長に対するサイトカイニンオキシダーゼ発現の観察された負の影響は、サイトカイニンオキシダーゼが、成長促進化学物質の設計または成長促進化学物質のスクリーニングのための興味深い標的であることを実証する。このような化学物質は、サイトカイニンオキシダーゼ活性を阻害するはずであり、好ましくは、根に輸送されないはずであり、そして、土壌中で迅速に分解されるはずであり、その結果、これらの化学物質の適用は、根の成長を阻害しない。サイトカイニンはまた、葉の老化を遅らせ、これは、正の効果が光合成組織の成長および維持の両方を含むことを意味する。さらに、サイトカイニンが老化を遅らせ、葉の緑化（クロロフィル含有量）を増大し、そして苗条の頂芽優性を減少するという観察により、植物の地上部におけるＣＫＸ活性を抑制することに基づく手法（アンチセンス、リボザイム、および同時抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）技術のような）が、遅れた老化、強化された葉の緑化および増加した枝分かれを生じ得ることが示される。
【００１７】
同様に、根の成長に対するサイトカイニンオキシダーゼ発現の観察された正の効果は、サイトカイニンオキシダーゼが、除草剤の設計またはスクリーニングのための興味深い標的であることを実証する。このような除草剤は、サイトカイニンオキシダーゼ活性を阻害するはずであり、好ましくは苗条に輸送されないはずであり、そして土壌を介して根に与えられ得る溶媒中で可溶性でありそして比較的安定であるはずである。
【００１８】
植物の発達および構造に対するサイトカイニンオキシダーゼ過剰発現のこれらの効果は今まで知られておらず、結果として、本発明およびその実施形態は、想定され得ない。
【００１９】
苗条成長に対する観察された負の影響は、サイトカイニンオキシダーゼの操作がまた、矮化表現型を得るために使用され得ることを実証する。矮化表現型は、例えば、穀物および果樹のような商業的作物において特に有用である。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態は、植物の成長および構造、そして特に根の成長および構造に対するサイトカイニンオキシダーゼの正の効果に関する。サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子ファミリーは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける少なくとも６つのメンバーを含み（以下の実施例を参照のこと）、そして本発明者らは、トランスジェニック植物においてこれらの遺伝子のいくつかを用いて達成された効果において、定量的差異が存在することを示した。多数の緑色植物（Ｈａｒｅおよびｖａｎ  Ｓｔａｄｅｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ９１：１２８−１３６，１９９４；ＪｏｎｅｓおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇ  ２３：１２３−１３４，１９９７）ならびに他の生物（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＭｏｋおよびＭｏｋ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１３９〜１５４頁、１９９４）におけるサイトカイニンオキシダーゼ活性の存在についての証拠を考慮すると、記載されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓサイトカイニンオキシダーゼの機能的ホモログは、他の生物から単離され得ることが予想される。従って、サイトカイニンオキシダーゼの配列（本発明において機能的である）は、本明細書中に記載される配列と同一である必要はない。本発明は、一般に、穀物および単子葉作物について特に有用であり、そして例えば、コムギまたはトウモロコシ由来のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子もまた同様に使用され得る（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９９；ＲｉｎａｌｄｉおよびＣｏｍａｎｄｉｎｉ，１９９９）。サイトカイニンオキシダーゼ活性または任意の他のサイトカイニン代謝活性を有する他の遺伝子（Ｚａｚｉｍａｌｏｖａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｈｏｏｙｋａａｓ，Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｌｉｂｂｅｎｇａ（編）、Ｅｌｉｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４１−１６０頁、１９９７を参照のこと）もまた、本発明の目的のために使用され得る。同様に、内因性サイトカイニン代謝活性を増加するタンパク質をコードする遺伝子もまた、本発明の目的のために使用され得る。原則として、類似の表現型がまた、サイトカイニンのシグナル伝達経路に関与するレセプターまたはタンパク質のようなサイトカイニンの下流で機能する遺伝子と干渉することによって、得られ得る。
【００２１】
本発明の目的のために、用語「根の成長」は、単子葉植物および双子葉植物の両方において、その発育の異なる段階において根系を構成する異なる部分の成長の全ての局面を含むことが理解されるべきである。根の増大された成長は、一次根、側根、不定根など（これら全ては、本発明の範囲内である）を含むその部分の１つ以上の強化された成長に由来し得ることが理解されるべきである。
【００２２】
第１の実施形態に従って、本発明は、植物サイトカイニンオキシダーゼの発現を含むか、または植物もしくは植物の一部分における活性なサイトカイニンのレベルを減少する別のタンパク質の発現を含む、根の成長を刺激するためそして／または側根および／もしくは不定根の形成を増大するため、そして／または根の屈地性を変更するための方法に関する。
【００２３】
本発明の文脈中において、用語「発現」および／または「過剰発現」は、交換可能に使用され、そして両方が、植物において活性なサイトカイニンのレベルを減少させる、植物サイトカイニンオキシダーゼまたは任意の他のタンパク質の「増大されそして／または異所性の発現」に関することが理解されるべきである。これにより、植物サイトカイニンオキシダーゼの増大された発現、ならびに植物サイトカイニンオキシダーゼまたは上記の他のタンパク質の「新規の（ｄｅ  ｎｏｖｏ）」発現が意味されることが明らかであるはずである。あるいは、上記の他のタンパク質は、植物サイトカイニンオキシダーゼのサイトカイニン代謝活性を増大する。
【００２４】
本発明の文脈中において、表現「側根および／または不定根」は、「側根および不定根」を意味し得るが、「側根または不定根」もまた意味し得ることがさらに理解されるべきである。この増大は、側根の形成または不定根の形成、ならびに（必ずしも必要ではないが）両方の型の非一次根の形成において、存在し得る。
【００２５】
さらなる実施形態に従って、本発明は、植物または植物の一部分における、植物サイトカイニンオキシダーゼの発現を含むか、または活性なサイトカイニンのレベルを減少する別のタンパク質の発現を含む、根の成長を刺激するため、そして／または側根もしくは不定根の形成を増大するため、そして／または根の屈地性を変更するため、そして／または収量を増加するため、そして／または初期成長力を強化するため、そして／または根／苗条比を改変するため、そして／または倒伏に対する耐性を改善するため、そして／または干ばつ耐性を増加するため、そして／または外植体のインビトロ増殖を促進するための方法に関する。
【００２６】
好ましい実施形態に従って、本発明は、サイトカイニンオキシダーゼ、好ましくは本発明に従うサイトカイニンオキシダーゼ、または植物または植物の一部分（好ましくは根）における活性なサイトカイニンのレベルを減少させる別のタンパク質の過剰発現によって根の重量の増加を生じる、根の成長を刺激するための方法に関する。
【００２７】
増殖促進配列の過剰発現に起因する根のバイオマスのより高い産生は、その収率に対する直接的な影響、および根細胞またはトランスジェニック根細胞もしくはこのトランスジェニック根細胞の細胞培養物によって産生される化合物の産物への間接的な影響を有する。根の培養物において産生される目的の化合物の１つの例としては、シコニンがあり、この収率は、この方法によって有利に向上され得る。
【００２８】
より特定の実施形態に従って、本発明は、根の増殖を刺激するための方法、あるいは側方根および外来性根の形成を促進するための方法、あるいは以下：
（ａ）配列番号２７、１、３、５、７、９、１１、２５、２６、２８〜３１、３３もしくは３４のいずれかに規定されるＤＮＡ配列、またはその相補鎖を含む核酸、
（ｂ）配列番号２７、１、３、５、７、９、１１、２５、２６、２８〜３１、３３もしくは３４のいずれかに対応するＲＮＡ配列、またはその相補鎖を含む核酸、
（ｃ）配列番号２７、１、３、５、７、９、１１、２５、２６、２８〜３１、３３もしくは３４のいずれか、またはその相補鎖に特異的にハイブリダイズする核酸、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、３２もしくは３５のいずれかに規定されるアミノ酸配列、またはその相補鎖を含むタンパク質をコードする核酸、（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに規定される核酸であって、この核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくはＲＮＡであり、ここで、ＴがＵで置換されること、に特徴付けられる、核酸
（ｆ）配列番号２７、１、３、５、７、９、１１、２５、２６、２８〜３１、３３もしくは３４のいずれかに規定される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重された核酸、または（ａ）〜（ｅ）のいずれかに規定される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重された核酸、
（ｇ）配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは３５のいずれかに規定されるタンパク質をコードする核酸とは、生物体間のコドン使用頻度における差異に起因して異なる核酸、または（ａ）〜（ｅ）のいずれかに規定される核酸とは、生物体間のコドン使用頻度における差異に起因して異なる核酸、
（ｈ）配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは３５に規定されるタンパク質をコードする核酸または（ａ）〜（ｅ）に規定される核酸とは、対立遺伝子間の差異に起因して異なる、核酸、
（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは３５のいずれかに規定されるタンパク質をコードする核酸、
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかに規定される核酸の機能的フラグメントであって、このフラグメントがサイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、フラグメント、および
（ｋ）植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸、
からなる群より選択される、植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸を植物中で発現させる工程を包含するか、または活性サイトカイニンのレベルを低減させるタンパク質をコードする核酸を植物（好ましくは、根）で発現する工程を包含する、向地性を変更するための方法、に関する。
【００２９】
本発明において、新規Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸は単離され、そして本発明者らは驚くべきことに、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部におけるサイトカイニンオキシダーゼの発現が、上記の根に関連する特性を生じることを、初めて示し得た。好ましくは、サイトカイニンオキシダーゼの発現は、好ましくは、根特異的プロモーターの制御下で根において生じるべきである。このような根特異的プロモーターの１つの例は、配列番号３６に提示される。
【００３０】
実施例の節においていくつかの新規ＡｔＣＫＸ遺伝子およびタンパク質によって本発明が支持されるが、実施例の節に記載されるように、植物における類似の効果を得るために他の植物（好ましくは、この他の植物の根）から単離されかつ他の植物において発現される他のサイトカイニンオキシダーゼの使用に、本発明の概念がまた関することは、明確であるべきである。
【００３１】
従って、本発明は、植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸の使用、あるいは根の増殖を刺激するためまたは側方根もしくは外来性根の形成を促進するためまたは根の向地性を変更するために、植物もしくは植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを低減させるタンパク質をコードする核酸の使用、にさらに一般的に関する。用いられる好ましいサイトカイニンオキシダーゼは、上記のようなサイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸によってコードされ、そして本願明細書の後述に規定されるような本発明の新規核酸によってコードされる。
【００３２】
本発明は、以下：
（ａ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４のいずれかに規定されるＤＮＡ配列、またはその相補鎖を含む核酸、
（ｂ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４のいずれかに対応するＲＮＡ配列、またはその相補鎖を含む核酸、
（ｃ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４のいずれかに規定される核酸に特異的にハイブリダイズする核酸、またはその相補鎖
（ｄ）配列番号３２に規定されるポリペプチドを含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸であって、そしてこの核酸が、配列番号４に規定されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％類似、好ましくは少なくとも７５％、８０％もしくは８５％、より好ましくは９０％もしくは９５％、最も好ましくは９９％類似する、核酸、
（ｅ）配列番号６に規定されるアミノ酸配列に対して、少なくとも３５％類似、好ましくは３７％、４０％、４５％、４７％もしくは５０％類似、より好ましくは、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％類似、最も好ましくは８５％、９０％もしくは９５％類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｆ）配列番号１０または配列番号３５に規定されるアミノ酸配列に対して、少なくとも３５％類似、好ましくは３７％、４０％、４５％、４７％もしくは５０％類似、より好ましくは５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％類似、最も好ましくは８５％、９０％もしくは９５％類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｇ）配列番号４、６、１０、３２もしくは３５のいずれかに規定されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
（ｈ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３３もしくは３４のいずれかに規定される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重された核酸、または（ａ）〜（ｇ）のいずれかに規定される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重された核酸
（ｉ）配列番号４、６、１０もしくは３５のいずれかに規定されるタンパク質をコードする核酸とは、生物体間のコドン使用頻度における差異に起因して異なる核酸、または、（ａ）〜（ｇ）のいずれかに規定される核酸とは、生物体間のコドン使用頻度における差異に起因して異なる核酸、
（ｊ）配列番号４、６、１０もしくは３５に規定されるタンパク質をコードする核酸または（ａ）〜（ｇ）のいずれかに規定される核酸とは、対立遺伝子間の差異に起因して異なる核酸、
（ｋ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４のいずれかに規定される核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの免疫学的に活性なフラグメント、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかに規定される核酸の免疫学的に活性なフラグメント、をコードする核酸、
（ｌ）配列番号２９、３、５、９、２６、２７、３１、３３もしくは３４のいずれかに規定される核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの機能的フラグメント、または（ａ）〜（ｊ）のいずれかに規定される核酸の機能的フラグメント、をコードする核酸であって、ここで、このフラグメントがサイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、核酸、ならびに
（ｍ）配列番号４、６、１０もしくは３５に規定されるタンパク質をコードする核酸であって、但し、この核酸が以下のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＣ００５９１７、ＡＢ０２４０３５、およびＡＣ０２３７５４のいずれかの下に寄託される核酸ではない、核酸、
からなる群より選択されるサイトカイニンオキシダーゼの活性を有する新規植物タンパク質をコードする単離された核酸に関する。
【００３３】
本発明はまた、本発明の単離された核酸に関し、この核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ、またはＲＮＡであって、ここで、ＴがＵで置換される。
【００３４】
本発明はまた、本発明の核酸と特異的にハイブリダイズするかまたは本発明の核酸を特異的に増幅する、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子に関する。
【００３５】
別の実施形態に従って、本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターに関する。好ましい実施形態において、このベクターは、発現ベクターであり、ここで、この核酸は、原核生物宿主細胞および／または真核生物宿主細胞においてこの配列の発現を可能にする制御配列の１つ以上と作動可能に連結される。
【００３６】
単子葉植物における本発明のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現のために、このｃＤＮＡ配列に対応する核酸配列が、単子葉植物においてイントロンのスプライシングの誤りをさけるために用いられることは、理解されるはずである。単子葉植物において発現される好ましいｃＤＮＡ配列は、配列番号２５〜３０および３４のいずれかに示される核酸を有する。
【００３７】
本発明はまた、本発明の核酸分子またはベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞を含む群から選択される。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、本発明の核酸によってコード可能な単離されたポリペプチド、またはその相同体もしくは誘導体、またはその免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能的フラグメントに関する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、３２および３５のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはその相同体もしくはその誘導体、またはその免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能的フラグメントを含む。さらにより好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２もしくは３５に規定されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその相同体もしくは誘導体、またはその免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能的フラグメントに関する。好ましいその機能的フラグメントは、これらのシグナルペプチドを欠くこれらのフラグメントである。
【００３９】
なお別の実施形態に従って、本発明は、本発明のポリペプチドを産生するための方法に関し、この方法は、このポリペプチド発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程および産生された培養物由来のポリペプチドを回収する工程を包含する。
【００４０】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体またはその特異的エピトープに関する。
【００４１】
本発明は、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物組織の産生のための方法にさらに関し、この方法は、この植物、植物細胞、植物組織または植物器官に発現可能な形式でかまたは本発明のベクターで、本発明の核酸分子を導入する工程を包含する。
【００４２】
本発明はまた、変更された植物、植物細胞または植物組織の産生のための方法に関し、この方法は、この植物の細胞、組織または器官への、本発明のポリペプチドの直接的導入を包含する。
【００４３】
別の実施形態に従って、本発明は、本発明のポリペプチドの発現をもたらすための方法に関し、この方法は、植物細胞のゲノムへの、１つ以上の制御配列に作動可能に連結した本発明の核酸分子または本発明のベクターの安定な導入を包含する。本発明は、この植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する上記のような方法にさらに関する。
【００４４】
本発明はまた、本発明の核酸配列を含むトランスジェニック植物細胞に関し、この配列は、植物細胞においてこの核酸の転写および／または発現を可能にする調節エレメントに作動可能に連結され、上記で説明されたような方法によって獲得可能である。
【００４５】
別の好ましい実施形態に従って、本発明は、本明細書において上記のようなトランスジェニック植物細胞に関し、ここで、本発明の核酸は、この植物細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。
【００４６】
本発明は、本明細書中に記載されるような植物細胞を含む、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物組織に関し、そしてこれはまた、このトランスジェニック植物の収穫可能な部分（好ましくは、種子、葉、果実、幹培養物、根茎、根、塊茎、根茎および球根からなる群より選択される）に関する。本発明はまた、このトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部のいずれか由来の子孫に関する。
【００４７】
別の実施形態に従って、本発明は、根の増殖を刺激するための方法に関し、この方法は、本発明の核酸の発現を包含するかまたは植物もしくは植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを低減させる別のタンパク質の発現を包含する。
【００４８】
植物細胞培養物または植物組織培養物は、特有の培地（液体または固体のいずれか）において増殖される植物細胞または植物組織の人工的に生成された培養物であり、この培養物は、増殖および／または特定の化合物の産生のために必要な要件を全て、これらの植物細胞または植物組織に提供する。植物細胞培養物および／または植物組織培養物は、わずかな例として、植物の迅速な増殖のためおよびトランスジェニック植物の産生のために用いられ得る。
【００４９】
根の形成は、この培養物のいくつかの外植片についてまたはこの培養物におけるいくつかの条件下で困難であり得る、そしてこの培養された植物細胞または植物組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現は、根の形成を促進するために用いられ得る。植物細胞培養物および／または植物組織培養物はまた、価値のある化合物の工業生産に用いられ得る。可能性のある生産化合物は、医薬品、農薬、顔料、化粧品、香水、食品添加物などである。このような産物の例としては、シコニンがあり、これは、植物Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの根によって産生される。植物組織培養物の例としては、毛状根培養物があり、これは、人工的に産生される毛状根の塊である。Ｌ．ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎの根は、大量に収集するのが困難であり、毛状根培養物を調製することによって、最終産物のシコニンが、通常生じるよりも早い速度で工業的に調製され得る。本明細書中に開示されるように、サイトカイニンオキシダーゼの発現は、根の増殖および発達を促進し、それ故、この植物細胞培養物および植物組織培養物の手順において有利に用いられ得る。従って、本発明の別の実施形態に従って、方法は、根の増殖および発達を刺激するために提供され、この方法は、植物サイトカイニンオキシダーゼ（好ましくは、本発明のサイトカイニンオキシダーゼ）をコードする核酸の、このトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物細胞培養物またはトランスジェニック植物組織培養物における発現を包含する。
【００５０】
本発明は、側方根または外来性根の形成を促進するための方法にさらに関し、この方法は、植物もしくは植物の一部における本発明の核酸の発現を包含するか、または植物もしくは植物の一部における活性なサイトカイニンのレベルを低減させる別のタンパク質の発現を包含する。
【００５１】
本発明はまた、根の向地性を変更するための方法に関し、この方法は、植物もしくは植物の一部における本発明の核酸の発現を変更する工程を包含するかまたは植物もしくは植物に一部における活性なサイトカイニンのレベルを低減させる別のタンパク質の発現を変更する工程を包含する。
【００５２】
本発明はまた、初期の成長力を増強するための方法、および／または根／苗条の比を変更するための方法、および／または倒伏への耐性を増強させるための方法、および／または渇水許容度を増加させるための方法、および／または外植片のインビトロでの増殖を促進するための方法に関し、この方法は、植物もしくは植物の一部における本発明の核酸の発現を包含するか、または植物もしくは植物の一部における活性なサイトカイニンのレベルを低減させる別のタンパク質の発現を包含する。
【００５３】
本発明は、根のサイズまたは根分裂組織のサイズを増大させるための方法にさらに関し、この方法は、植物もしくは植物の一部（好ましくは、根）における本発明の核酸の発現を包含するか、または植物もしくは植物の一部（好ましくは、根）における活性なサイトカイニンのレベルを低減させる別のタンパク質の発現を包含する。
【００５４】
なお別の実施形態に従って、本発明は、苗条の分裂組織のサイズを増大させるための方法に関し、この方法は、好ましくは苗条における本発明の核酸の発現のダウンレギュレーションを包含する。
【００５５】
好ましい実施形態に従って、本発明は葉の老化を遅延させる方法に関連し、この方法は、葉（好ましくは、老化した葉）における本発明のサイトカイニンオキシダーゼのいずれかの発現のダウンレギュレーションを包含する。また、本発明は、葉の老化を変更するための方法に関し、この方法は、老化葉におけるサイトカイニンオキシダーゼのうちの１つの発現を包含する。
【００５６】
本発明はまた、葉の厚みを増加させるための方法に関し、この方法は、植物または植物の一部（好ましくは、葉）における本発明の核酸の発現を包含するか、または植物または植物の一部（好ましくは、葉）における活性なサイトカイニンのレベルを低減させる別のタンパク質の発現を包含する。
【００５７】
本発明はまた、導管のサイズを縮小させるための方法に関し、この方法は、植物もしくは植物の一部（好ましくは、導管）における本発明の核酸の発現を包含するか、または植物もしくは植物の一部（好ましくは、導管）における活性なサイトカイニンのレベルを低減する別のタンパク質の発現を包含する。
【００５８】
本発明は、導管のサイズを増大させるための方法にさらに関し、この方法は、植物または植物の一部における本発明の核酸の発現のダウンレギュレーションを包含する。
【００５９】
別の実施形態に従って、本発明は、実生の木立能力（ｓｔａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）を改善するための方法に関し、この方法は、実生における本発明の核酸の発現を包含するかまたは実生における活性なサイトカイニンのレベルを低減させる別のタンパク質の発現を包含する。
【００６０】
さらに、本発明は、上記のような方法のいずれかに関し、この方法は、収率の増加をもたらす。
【００６１】
本発明は、本発明の方法のいずれかにさらに関し、ここで、この核酸のこの発現は、強力な構造プロモーターの制御下で生じる。好ましい実施形態において、本発明は、本発明のいずれかの方法に関し、ここで、この核酸のこの発現は、根において優先的に発現されるプロモーターの制御下で生じる。表５において、根特異的プロモーターの非網羅的な一覧が挙げられる。本発明の方法に用いられる好ましいプロモーターは、棍棒状の根の相同プロモーターであり、このプロモーターは、配列番号３６に規定される配列を有する。
【００６２】
なお別の実施形態に従って、本発明は、細胞運命を変更するための方法、および／または植物の発生を変更するための方法、および／または植物の形態を変更するための方法、および／または植物の生化学を変更するための方法、および／または植物の生理学を変更するための方法、および／または細胞周期の進行速度を変更するための方法に関し、この方法は、本発明の核酸の、植物の特定の細胞、組織または器官における発現の変更を含む。
【００６３】
本発明はまた、増殖の増加、ならびに／または収率の増加、ならびに／または植物細胞、組織および／もしくは器官の老化の変更、ならびに／または植物における側方器官の形成の頻度の増加、を獲得するための方法に関し、この方法は、本発明の核酸の異所性の発現を包含する。
【００６４】
本発明はまた、有害な増殖条件下および／またはストレス下において細胞における細胞分裂活性を促進かつ延長するための方法に関し、この方法は、本発明の核酸配列のエピトープ性発現を包含する。
【００６５】
なお別の実施形態に従って、本発明は、本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得する方法に関し、この方法は、スクリーニングアッセイを包含し、ここで、本発明のポリペプチドが用いられる。
【００６６】
より好ましい実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得するための方法に関し、この方法は、ツーハイブリッドスクリーニングアッセイを包含し、ここで、誘因物質として本発明のポリペプチドを使用し、そして捕捉物質としてｃＤＮＡライブラリーが、用いられる。
【００６７】
本発明は、本発明のポリペプチドと、上記のような方法によって獲得された相互作用するタンパク質パートナーとの間の相互作用を調節するための方法にさらに関する。
【００６８】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドと相互作用する化合物を同定および獲得するための方法に関し、この方法は、以下：
ａ）ツーハイブリッド系を提供する工程であって、ここで、本発明のポリペプチドおよび相互作用タンパク質パートナーが上記のような方法によって獲得可能である工程、
ｂ）この化合物が、ａ）に規定される発現ポリペプチドによって形成された複合体と相互作用する工程、および、
ｃ）この化合物と、このポリペプチドまたはａ）に規定される発現ポリペプチドによって形成された複合体との相互作用の（リアルタイム）測定を実施する工程、を包含する。
【００６９】
本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定するための方法にさらに関し、この方法は、以下：
ａ）複合体の形成させるのに適切な条件下で、本発明のポリペプチドを、この化合物または化合物の混合物と合させる工程、および
ｂ）複合体の形成を検出する工程であって、ここで、複合体の存在がこのポリペプチドに特異的に結合する化合物または混合物を同定する、工程、を包含する。
【００７０】
本発明はまた、上記化合物または混合物が本発明のポリペプチドの活性を阻害し、そして化学物質の合理的設計のために使用され得る、上記方法に関する。
【００７１】
別の実施形態によれば、本発明は、上記のような方法によって同定される化合物または混合物の、植物生長の調節因子または除草剤としての使用に関する。
【００７２】
本発明はまた、植物生長の調節因子または除草剤組成物の生成のために方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：上記方法の化合物スクリーニング工程、およびこれらの工程から得られた化合物を、農産物または植物の細胞または組織の培養物への適用のための適切な形態に処方する工程。
【００７３】
本発明はまた、植物または植物部分（好ましくは、茎または腋芽）における、本発明の核酸の発現を包含する、分枝を増加させるための方法に関する。
【００７４】
本発明はまた、植物または植物部分（好ましくは、茎または腋芽）における、本発明の核酸の発現を包含する、倒れ抵抗性（ｌｏｄｇｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を改善するための方法に関する。
【００７５】
本発明はまた、本発明の核酸または本発明のベクターの使用を包含する、生長促進化学物質または除草剤を設計するため、またはスクリーニングするための方法に関する。
【００７６】
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの、生産量を増加させるための使用に関する。
【００７７】
本発明はまた、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの、根の生長を刺激するための使用に関する。
【００７８】
本発明はまた、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの、側根または不定根の形成を増強するための使用に関する。
【００７９】
本発明はまた、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの、根の屈地性を変更するための使用に関する。
【００８０】
本発明はさらに、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のポリペプチドの、早期強勢を増強するため、および／または根／苗条比を改変するため、および／または倒れに対する抵抗性を改善するため、および／または旱魃耐性を増加させるため、および／または外植片のインビトロ増殖を促進するための使用に関する。
【００８１】
本発明はまた、本発明の核酸分子、本発明の組換えベクターまたは本発明のポリペプチドの、植物の発生を改変するため、および／または植物の形態を改変するため、および／または植物の生化学を変更するため、および／または植物の生理学を変更するための使用に関する。
【００８２】
なお別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明のポリペプチド、または本発明の抗体を含む、診断組成物に関する。
【００８３】
本発明の別の実施形態は、トランスジェニック台木の使用に関し、このトランスジェニック台木は、接ぎ穂の移植手順におけるサイトカイニンオキシダーゼの発現に起因して、根の生長および発生が増強されており、農業的または園芸的特性が改善された植物または樹木を生じる。この接ぎ穂は、トランスジェニックであっても非トランスジェニックであってもよい。この実施形態によって予測される具体的な特徴は、根の組織によって与えられる特徴であり、そして土壌における植物／樹木の改善された固定、および／または改善された水の取り込み（この結果、例えば、旱魃耐性が改善される）、および／または土壌からの改善された栄養の取り込み、および／または植物全体にわたる有機物質の改善された移送、および／または土壌への物質（例えば、植物シデロフォアなど）の増強された分泌、および／または改善された呼吸、および／または改善された病気抵抗性、および／または改善された生産量が挙げられる。移植のためにＡｒＣＫＸで形質転換された台木を使用することの利点は、これらの増強された根の組織に加えて、本明細書中に開示されるような、移植の際の葉の老衰の遅延である（図１２Ａを参照のこと）。この特定の実施形態のために好ましい植物または樹木は、それら自体の根では十分には生長せず、そして耕作された設定で移植される植物または樹木が挙げられ、例えば、ブドウ、柑橘類、アンズ、アーモンド、プラム、モモ、リンゴ、ナシ、サクラ、クルミ、イチジク、ハシバミ、およびビワの、産業上有益な品種である。
【００８４】
上記のように、オーキシンおよびサイトカイニンは、特定の生物学的プロセスにおいて、アンタゴニストとして作用する。たとえば、サイトカイニン／オーキシン比は、根および苗条の産生を調節し、高濃度のオーキシンが、組織化された根を生じ、そして高濃度のサイトカイニンが、苗条の産生を生じる。本発明において開示されるように、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるサイトカイニンオキシダーゼの発現は、増強したオーキシン効果に一致して、増強された根の発生を生じる。オーキシンはまた、果実の発生に関与する。オーキシンでの雌花部分の処理は、いくつかの植物種において、単偽結実果実の発生を生じる。単偽結実果実の発生は、雌生殖器におけるオーキシンの生合成の増加によって、いくつかの園芸作物植物において、遺伝子操作された（ＷＯ０１０５９８５）。
【００８５】
従って、別の局面によれば、本発明は、植物における単偽結実形質を誘導するための方法に関し、この方法は、植物または植物の部分（好ましくは、胎座、胚珠およびこれらに由来する組織のような、雌生殖器）において、１種以上のサイトカイニンオキシダーゼ、または活性サイトカイニンのレベルを低下させる別のタンパク質の発現をダウンレギュレートする工程からなる。Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓまたはそのホモログ（胎座および胚珠において高い発現特異性を与えるもの）の１つに由来するＤｅｆＨ９プロモーター領域は、この目的で使用され得る。
【００８６】
（定義および実施形態の詳細）
当業者は、本明細書中に記載される本発明が、具体的に記載されるもの以外の改変および変更に供されることを理解する。本明細書中に記載される本発明は、このような改変および変更の全てを含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において個々にかまたは包括的に言及または指示されるような工程、特徴、組成物および化合物の全て、ならびにこれらの工程または特徴のいずれかまたは大部分のいずれかおよび全ての組み合わせを包含する。
【００８７】
本発明は、任意の植物（特に、単子葉植物および双子葉植物）に適用可能であり、これらとしては、とりわけ、以下が挙げられる：
【００８８】
【表１】
2004535753.tif 000002
2004535753.tif 000003
アマランス、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、カノラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、チリメンキャベツ、亜麻、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、麦わら、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、および茶を含む列挙からなる群より選択される、飼葉もしくは飼料のマメ科植物、装飾用植物、食品作物、樹木もしくは低木、または上に具体的に名称を列挙した任意の植物の種子、あるいは上記種のいずれかの組織、細胞または器官の培養物。
【００８９】
本明細書を通じて、文脈がそうではないことを要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびにその変形（例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、言及される整数または工程あるいは複数の整数または工程の群の包含の意味を含むが、他の整数または工程、あるいは複数の整数または工程の群のいずれの排除の意味も含まないことが、理解される。
【００９０】
本明細書中において使用される場合、用語「に由来する」とは、特定の整数または複数の整数の群が、特定の種から派生しているが、必ずしもその特定の源から直接的に得られたとは限らないことを示すと解釈されるべきである。
【００９１】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、または「オリゴペプチド」とは、本明細書中において使用される場合、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸をいう。この用語はまた、ジスルフィド結合形成、システイン化、酸化、グルタチオン化、メチル化、アセチル化、ファルネシル化、ビオチン化、ステアロイル化、ホルミル化、リポ酸付加、リン酸化、硫酸化、ユビキチン化、ミリストイル化、パルミトイル化、ゲラニルゲラニル化、環化（例えば、ピログルタミン酸形成）、酸化、脱アミノ化、脱水、グリコシル化（例えば、ペントース、ヘキソースアミン、Ｎ−アセチルヘキソースアミン、デオキシヘキソース、ヘキソース、シアル酸など）、およびアシル化のような公知のアミノ酸改変、ならびに天然には存在しないアミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基およびＤ−アミノ酸残基を含む。
【００９２】
本発明のタンパク質の「ホモログ」は、そのタンパク質に対する、その１以上の機能的特性の変更を伴わずに（特に、得られる物の活性を減少させずに）、それがホモログであるタンパク質に関連して、アミノ酸置換、欠失および／または付加を含む、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素である。例えば、このタンパク質のホモログは、そのタンパク質の生物活性なアミノ酸配列改変体からなる。このようなホモログを産生するために、そのタンパク質に存在するアミノ酸は、類似の特性（例えば、疎水性、親水性、疎水性モーメント、抗原性、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成または破壊する特性など）を有する、他のアミノ酸によって置換され得る。アミノ酸の物理的特性および化学的特性の概説を、表１に提供する。
【００９３】
本発明のタンパク質の置換改変体は、そのタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる残基が代わりに挿入された改変体である。アミノ酸置換は、代表的には、単一の残基の置換であるが、そのポリペプチドに配置される機能的拘束に依存して、クラスター化され得る；挿入は、通常、約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであり、そして欠失は、約１〜２０残基の範囲にある。好ましくは、アミノ酸置換は、上記のもののような、保存的アミノ酸置換を含む。
【００９４】
【表２】
2004535753.tif 000004
本発明のタンパク質の挿入アミノ酸配列改変体は、１以上のアミノ酸残基が、そのタンパク質の所定の部位に導入されている改変体である。挿入は、単一のアミノ酸または複数のアミノ酸の、アミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合ならびに配列内挿入を含み得る。一般に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合よりも小さく、約１〜１０残基のオーダーである。アミノ末端融合タンパク質またはペプチドあるいはカルボキシ末端融合タンパク質またはペプチドの例としては、転写活性化因子の結合ドメインまたは活性化ドメイン（ツーハイブリッドシステムにおいて使用されるような）、ファージコートタンパク質、（ヒスチジン）６−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｔａｇ・１００エピトープ（ＥＥＴＡＲＦＱＰＧＹＲＳ）、ｃ−ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ（ＤＹＫＤＤＤＫ）、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、プロテインＣエピトープ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ）およびＶＳＶエピトープ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）が挙げられる。
【００９５】
本発明のタンパク質の欠失改変体は、そのタンパク質のアミノ酸配列からの１以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。
【００９６】
本発明のタンパク質のアミノ酸改変体は、当該分野で周知のペプチド合成技術（例えば、固相ペプチド合成など）を使用してか、または組換えＤＮＡ操作によって、容易に作製され得る。置換改変体、挿入改変体または欠失改変体として表れる改変体タンパク質を産生するためのＤＮＡ配列の操作は、当該分野で周知である。例えば、既知の配列を有するＤＮＡにおける所定の部位での置換変異体を作製するための技術（例えば、Ｍ１３変異誘発、Ｔ７−Ｇｅｎインビトロ変異誘発キット（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰＣＲ媒介部位特異的変異誘発または他の部位特異的変異誘発プロトコルによる）は、当業者に周知である。
【００９７】
本発明において、ＤＮＡ配列間および／またはタンパク質間の「同一性」および／または「類似性」の百分率は、ＤＮＡｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムのような当該分野において公知のコンピュータプログラムを、Ｃｌｕｓｔａｌ法と組み合わせて使用して、算出される。
【００９８】
本発明のタンパク質の「誘導体」は、そのポリペプチドの少なくとも約５個の連続するアミノ酸残基を含むが、そのタンパク質の生物学的活性を保持する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素である。「誘導体」は、そのポリペプチドの天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較して、さらなる天然に存在するアミノ酸残基、改変されたアミノ酸残基、グリコシル化されたアミノ酸残基、アシル化されたアミノ酸残基または天然には存在しないアミノ酸残基をさらに含み得る。あるいは、またはさらに、誘導体は、そのポリペプチドの天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較して、１以上の非アミノ酸置換（例えば、そのアミノ酸配列に共有結合または非共有結合された、レポーター分子または他のリガンド（例えば、アミノ酸の検出を容易にするためにアミノ酸に結合されたレポーター分子など））を含み得る。
【００９９】
「免疫学的に活性」とは、ある分子またはその特定のフラグメント（例えば、特異的エピトープまたはハプテン）が、抗体によって認識される（すなわち、抗体に結合する）ことを意味する。特異的エピトープは、例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９９６）に記載されるようなペプチド走査技術を使用して、決定され得る（Ｇｅｈｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｒｏｄｄａ，Ｓ．Ｊ．およびＭａｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９８６）Ａ  ｐｒｉｏｒｉ  ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｈｉｃｈ  ｍｉｍｉｃｓ  ａ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，７０９−７１５）。
【０１００】
用語「配列のフラグメント」または「配列の部分」とは、言及される本来の配列の短縮配列を意味する。短縮配列（核酸またはタンパク質の配列）は、長さが広範に変動し得る；最小のサイズは、言及される本来の配列に少なくとも匹敵する機能および／または活性を配列に提供するために十分なサイズの配列（例えば、機能的フラグメント）であるが、最大のサイズは重要ではない。いくつかの適用において、最大サイズは、通常、本来の配列の所望の活性および／または機能を提供するために必要とされるものよりもさほど大きくない。代表的に、短縮されたアミノ酸は、約５〜約６０アミノ酸長の範囲である。しかし、より代表的には、この配列は、最大約５０アミノ酸長であり、好ましくは、最大約６０アミノ酸である。少なくとも約１０、１２または１５アミノ酸、最大約２０または２５アミノ酸までの配列を選択することが、通常望ましい。
【０１０１】
機能的フラグメントはまた、本発明によるタンパク質に特異的なエピトープを含むフラグメントを含み得る。好ましい機能的フラグメントは、例えば、少なくとも５アミノ酸、１０アミノ酸、２５アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸、または２００アミノ酸の長さを有する。
【０１０２】
従って、機能的フラグメントはまた、免疫学的に活性なフラグメントまたはそうでないフラグメントであり得ることが、理解されるべきである。
【０１０３】
本発明の状況下で、上記に定義されたような、サイトカイニンオキシダーゼのホモログ、誘導体ならびに／あるいは免疫学的に活性なフラグメントおよび／または機能的なフラグメントが、具体化される。本発明における使用のために意図される、特に好ましいサイトカイニンオキシダーゼタンパク質のホモログ、誘導体ならびに／あるいは免疫学的に活性なフラグメントおよび／または機能的なフラグメントは、植物、より具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに由来し、さらにより具体的には、これらのサイトカイニンオキシダーゼは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸであるか、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて発現され得る。本発明は、ＡｔＣＫＸタンパク質の機能的なホモログまたは誘導体および／あるいは免疫学的に活性なフラグメントの使用を明確に意図し、そして、これらのＡｔＣＫＸタンパク質のうちの１つをコードするヌクレオチド配列の使用についての適用に限定されない。
【０１０４】
任意のこれらのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびそれらのフラグメントは、生物学的系（例えば、細胞培養物）において産生され得る。あるいは、任意のこれらのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびそれらのフラグメントは、例えば、固相ペプチド合成によって、化学的に製造され得る。これらのタンパク質またはそのフラグメントは、例えば、ツーハイブリッドアッセイの場合にあるように、融合タンパク質の部分であり得、このようなアッセイは、例えば、本発明に従うサイトカイニンオキシダーゼと相互作用するタンパク質の同定を可能にする。
【０１０５】
これらのタンパク質またはそのフラグメントは、例えば、本発明のサイトカイニンオキシダーゼと本発明の方法によって得られた相互作用タンパク質パートナーとの間の相互作用を調節するために、さらに有用である。化学合成されたペプチドは、例えば、抗血清および／または抗体の産生のための抗原の供給源として、特に有用である。
【０１０６】
「抗体」としては、モノクローナル、ポリクローナル、合成または重鎖ラクダ抗体、ならびに抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメント）が挙げられる。モノクローナル抗体は、例えば、ＬｉｄｄｌｅおよびＣｒｙｅｒ（１９９１）に記載の技術によって調製され得、この技術は、免疫した動物由来の脾臓細胞に対するマウス骨髄腫細胞の融合を包含する。さらに、分子またはそのフラグメントに対する抗体またはそのフラグメントは、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）に記載の方法を使用して得られ得る。小さいペプチド（例えば、本発明のタンパク質のフラグメント）に対する抗体の場合、これらのペプチドは、一般に、動物の免疫前にキャリアタンパク質に結合される。このようなタンパク質キャリアとしては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよび破傷風トキソイドが挙げられる。キャリアタンパク質は、動物の免疫応答を増強し、そしてＴ細胞レセプター結合部位に対するエピトープを提供する。用語「抗体」とは、抗体の誘導体（例えば、標識抗体）をさらに含む。抗体標識としては、アルカリホスファターゼ、ＰＫＨ２、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ６７、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３、ビオチン、アガロース、ペルオキシダーゼおよび金粒子（ｇｏｌｄ  ｓｐｈｅｒｅ）が挙げられる。タンパク質に対する抗体に依存する分子生物学におけるツールとしては、タンパク質ゲルブロット分析、遺伝子同定を可能にする発現ライブラリーのスクリーニング、タンパク質定量法（ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡを含む）、タンパク質の免疫アフィニティー精製、タンパク質の免疫沈降（例えば、実施例６を参照のこと）、および免疫学的局在決定が挙げられる。抗体および特にペプチド抗体の他の用途としては、タンパク質分解性プロセシングの研究（Ｌｏｆｆｌｅｒら、１９９４、Ｗｏｕｌｆｅら、１９９４）、タンパク質活性部位の決定（Ｌｅｒｎｅｒ  １９８２）、前駆体および翻訳後プロセシングの研究（ＢａｒｏｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ  １９８２、Ｌｅｒｎｅｒら、１９８１、Ｓｅｍｉｅｒら、１９８２）、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインの同定（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９８２）、および遺伝子発現におけるエキソン使用頻度の研究（Ｔａｍｕｒａら、１９９１）が挙げられる。
【０１０７】
上記に定義されたような、サイトカイニンオキシダーゼまたはそのホモログ、誘導体もしくはフラグメントを特異的に認識する抗体が、本発明において具体化される。好ましいサイトカイニンオキシダーゼは、植物サイトカイニンオキシダーゼ、より具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ（ＡｔＣＫＸ）のうちの１つである。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「核酸分子」とは、任意の長さのポリマー形態にあるヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、あるいは両方の組み合わせ）をいう。これらの用語には、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡがさらに含まれる。これらの用語にはまた、公知のヌクレオチド改変（例えば、メチル化、環化および「キャップ（ｃａｐ）」、ならびにアナログ（例えば、イノシン）による天然に存在する１以上のヌクレオチドの置換）も含まれる。ヌクレオチドの改変としては、以下の付加が挙げられる：アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー（ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ）、コレステロール、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｄａｂｃｙｌ、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、Ｅｄａｎｓ、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、ホスフェートソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ（登録商標）、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）。ポリヌクレオチド骨格改変としては、メチルホスホネート、２’−ＯＭｅ−メチルホスホネートＲＮＡ、ホスホロチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｒａｔｅ）、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅＲＮＡが挙げられる。塩基改変としては、以下が挙げられる：２−アミノ−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’ｄＡ（コルジセピン）、７−デアザ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、無塩基（ａｂａｓｉｃ）部位（ｄＳｐａｃｅｒ）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−ｌ−ｄＣ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、変換可能な（ｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅ）ｄＡ、変換可能なｄＣ、変換可能なｄＧ、変換可能なｄＴ、変換可能なｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄｌ、Ｏ６−フェニル−ｄｌ、４−メチル−インドール、２’−デオキシネブラリン（ｄｅｏｘｙｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３−ニトロピロール、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、Ｏ４−Ｍｅ−ｄＴ、Ｏ４−トリアゾールｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−ｌ−ｄＵ、Ｏ４−トリアゾールｄＵ。これらの用語には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（骨格が糖ではなくＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から��る偽ペプチドである、ＤＮＡアナログ）も包含される。ＰＮＡは、ＤＮＡの挙動を模倣し、そして相補的な核酸鎖に結合する。ＰＮＡの中性骨格は、通常達成されるよりも、より強い結合およびより高い特異性を生じる。さらに、ＰＮＡの独特な化学的、物理学的および生物学的特性は、強力な生体分子ツール、アンチセンス薬剤および抗遺伝子薬剤、分子プローブおよびバイオセンサーを生成するために使用されている。
【０１０９】
本発明はまた、本発明に従う核酸の少なくとも約１５個連続するヌクレオチド、および好ましくは、１５〜５０ヌクレオチドの核酸配列を有利に提供する。これらの配列は、上記に定義されるような本発明の配列に特異的にハイブリダイズするためのプローブ、あるいは、上記に定義されるような本発明の配列の特異的な増幅または複製を開始するためのプライマーなどとして、有利に使用され得る。このような核酸配列は、当該分野で周知の技術（例えば、組換え手段または合成手段）に従って生成され得る。これらはまた、本発明に従う核酸の存在を検出するための診断キットなどにおいて使用され得る。これらの試験は、一般に、ハイブリダイズする条件下でプローブをサンプルと接触させる工程、およびそのサンプル中のプローブと任意の核酸との間の任意の二重鎖形成または三重鎖形成の存在を検出する工程を包含する。
【０１１０】
有利には、本発明に従う核酸配列は、例えば、ＰＣＲクローニングの機構を使用するような、組換え手段または合成手段を使用して生成され得る。ＰＣＲクローニングの機構は、一般に、プライマーの対（これらは、クローニングされることが所望される遺伝子の領域に対する、約１５〜５０ヌクレオチドであり得る）を作製する工程、これらのプライマーを細胞由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと接触させる工程、その所望の領域の増幅を生じる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、その増幅された領域またはフラグメントを単離する工程、および増幅されたＤＮＡを回収する工程、を包含する。一般に、本明細書中に規定される技術は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９）に記載される。
【０１１１】
「コード配列」または「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、適切な制御配列または調節配列の制御下に配置された場合（すなわち、これらのコード配列またはＯＲＦが発現形式で存在する場合）に、ｍＲＮＡに転写され得、そして／または、ポリペプチドに翻訳され得る、ヌクレオチド配列として定義される。コード配列またはＯＲＦに、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳終止コドンが結合される。コード配列またはＯＲＦとしては、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列、合成的に製造されたヌクレオチド配列、またはゲノムＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。コード配列またはＯＲＦは、介在核酸配列によって中断され得る。
【０１１２】
本質的に同じタンパク質をコードするが異なる供給源から単離される遺伝子およびコード配列は、実質的に異なる核酸配列から構成され得る。逆に、実質的に異なる核酸配列は、本質的に同じタンパク質の発現をもたらすように設計され得る。これらの核酸配列は、例えば、所定の遺伝子の異なる対立遺伝子の存在、遺伝コードの縮重、またはコドン使用頻度の差異の結果である。従って、表２に示されるように、メチオニンおよびトリプトファンのようなアミノ酸は、１つのコドンによってコードされるが、アルギニン、ロイシンおよびセリンのような他のアミノ酸は、各々、最大６つまでの異なるコドンから翻訳され得る。好ましいコドン使用頻度における差異を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（細菌）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、Ｍ．ｓａｔｉｖａ（２つの双子葉植物）およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（単子葉植物）について表３に示す。１つの例を挙げると、コドンＧＧＣ（グリシンについて）は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおいて最も頻繁に使用される（３６．２％）コドンであり、Ｏ．ｓａｔｉｖａにおいて２番目に最も頻繁に使用されるコドンであるが、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａおよびＭ．ｓａｔｉｖａにおいては、はるかに低い頻度でしか使用されていない（それぞれ、９％および８．４％）。グリシンをコードする４つの可能なコドン（表２を参照のこと）のうち、このＧＧＣコドンは、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＯ．ｓａｔｉｖａにおいて最も好ましく使用される。しかし、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて、これは、ＧＧＡ（およびＧＧＵ）コドンであり、Ｍ．ｓａｔｉｖａにおいては、これは、ＧＧＵ（およびＧＧＡ）コドンである。
【０１１３】
本発明において定義されるＤＮＡ配列は、介在配列によって中断され得る。「介在配列」とは、本発明のＤＮＡ配列を含むコード配列を破壊するか、または本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列の発現形式を破壊する、任意の核酸配列を意味する。介在配列の除去は、このコード配列または発現可能な形式を回復する。介在配列の例としては、イントロンおよび移動可能なＤＮＡ配列（例えば、トランスポゾン）が挙げられる。「移動可能なＤＮＡ配列」とは、組換え事象の結果として移動され得る任意のＤＮＡ配列を意味する。
【０１１４】
（表２．遺伝コードの縮重性）
【０１１５】
【表３】
2004535753.tif 000005
（表３．１０００コドン当たりの頻度として表した異なる生物における示されるコドンの使用頻度（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ））
【０１１６】
【表４】
2004535753.tif 000006
2004535753.tif 000007
「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同な相補的ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは、全体的に溶液中（すなわち、両方の相補的な核酸が溶液中にある）で生じ得る。このようなプロセスに依存する分子生物学におけるツールとしては、ＰＣＲ、サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ配列決定が挙げられる。ハイブリダイゼーションプロセスはまた、マトリクス（例えば、磁気ビーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズまたは任意の他の樹脂）に固定された一方の相補的な核酸と生じ得る。このようなプロセスに依存する分子生物学におけるツールとしては、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡの単離が挙げられる。ハイブリダイゼーションプロセスはさらに、固体支持体（例えば、ニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレン）に固定されたか、または、例えば、フォトリソグラフィーによって、例えば、シリカガラス支持体に固定された一方の相補的な核酸と生じ得る（後者は、核酸アレイまたはマイクロアレイとして、あるいは核酸チップとして公知である）。このようなプロセスに依存する分子生物学におけるツールとしては、ＲＮＡおよびＤＮＡのゲルブロット分析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。ハイブリダイゼーションが生じるのを可能にするために、核酸分子は、一般に、熱的または化学的（例えば、ＮａＯＨによって）に変性され、二本鎖を２つの一本鎖に融解するか、そして／または、一本鎖核酸からヘアピンまたは他の二次構造を排除する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度およびハイブリダイゼーション緩衝液組成のような条件によって影響される。ハイブリダイゼーションについての高ストリンジェンシー条件は、高温、および／または、低塩濃度（塩としては、ＮａＣｌおよびクエン酸三Ｎａが挙げられる）、および／または、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの含有、および／または、ハイブリダイゼーション緩衝液中のＳＤＳ（界面活性剤）のような化合物濃度の低下、および／または、ハイブリダイゼーション緩衝液からのデキストラン硫酸またはポリエチレングリコール（分子集合を促進する）のような化合物の排除、を含む。従来のハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるが、当業者は、多くの異なるハイブリダイゼーション条件が、核酸配列の既知もしくは予測される相同性および／または長さの関数で設計され得ることを認識する。十分に低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、上記に定義される本発明のＤＮＡ配列に対して異種の核酸を単離するために、特に好ましい。この異種性に寄与する要素としては、上記に議論したような、対立性、遺伝コードの縮重、および好ましいコドン使用頻度における差異が挙げられる。
【０１１７】
明らかに、本発明は、上記に定義されるような、サイトカイニンオキシダーゼ、そのホモログ、誘導体または免疫学的に活性なフラグメントおよび／もしくは機能的なフラグメントをコードする本発明のＤＮＡの使用を、任意のハイブリダイゼーション方法において具体化する。本発明はさらにまた、これらの本発明のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列に関する。好ましいサイトカイニンオキシダーゼは、植物サイトカイニンオキシダーゼ、より具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸである。
【０１１８】
細胞、組織または器官（好ましくは、植物起源の）においてタンパク質の発現をもたらすために、タンパク質を、その細胞に直接導入し得るか（例えば、マイクロインジェンクションまたは微粒子銃手段によって）、あるいはそのタンパク質をコードする単離された核酸を、発現可能な形式で、その細胞、組織または器官に導入し得る。
【０１１９】
好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、上記に定義されるような、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質、そのホモログまたは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なフラグメントおよび／または機能的なフラグメントをコードする、コード配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。本発明の好ましいタンパク質は、サイトカイニンオキシダーゼのアミノ酸配列を含む。好ましいサイトカイニンオキシダーゼは、植物サイトカイニンオキシダーゼ、およびより具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸである。
【０１２０】
「ベクター」または「ベクター配列」は、形質転換によって生物に導入され得、そしてその生物中で安定に維持され得るＤＮＡ配列を意味する。ベクターの維持は、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅの培養物中で可能である。他のベクター（例えば、ファージミドベクターおよびコスミドベクター）は、細菌および／またはウイルスにおいて維持および増幅され得る。ベクター配列は、一般に、制限酵素によって認識される固有の部位のセットである、マルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）（ここに、１以上の非ベクター配列が挿入され得る）を含む。
【０１２１】
従って、「非ベクター配列」とは、ベクター内に含まれる１以上のＭＣＳ部位に取り込まれるＤＮＡ配列を意味する。
【０１２２】
「発現ベクター」は、挿入された非ベクター配列のための発現可能な形態の作製を可能にする適切な調節配列または制御配列を含むことによって、この非ベクター配列によってコードされるタンパク質の発現を可能にするベクターのサブセットを形成する。発現ベクターは、以下：細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクター）、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）、および植物細胞（例えば、ジャガイモウイルスＸベース発現ベクター）を含む生物において、タンパク質発現を可能にすることが当業者に公知である。
【０１２３】
本発明は、上記で定義されるような、任意のサイトカインオキシダーゼ、そのホモログ、誘導体ならびに／あるいは免疫学的に活性なフラグメントおよび／または免疫学的に機能的なフラグメントを明らかに含む。好ましくは、このサイトカインオキシダーゼは、植物のサイトカインオキシダーゼであり、より具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸである。
【０１２４】
生物学的系において、発現ベクターによって媒介されるタンパク質産物に対する代替物として、化学的なタンパク質合成物が適用され得る。合成ペプチドは、液相または固相において製造され得る。しかし、固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  １９６３）は、最も一般的な方法であり、そしてペプチド直鎖を製造するためにアミノ酸の連続的な添加を必要とする。固相ペプチド合成は、以下の３工程からなるサイクルを含む：（ｉ）成長ペプチド鎖のアミノ酸のカルボキシ末端を固体支持体または樹脂に固定する工程；（ｉｉ）鎖構築であって、成長ペプチド鎖に添加されるべきアミノ酸の活性化、カップリングおよび脱保護からなる工程；ならびに（ｉｉｉ）完成したペプチド鎖の樹脂からの除去および保護基のアミノ酸側鎖からの除去を含む切断工程。固相ペプチド合成における一般的なアプローチにおいて、アミノ酸のアミノ末端保護基として、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル／ｔ−ブチル）およびＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）が挙げられる。アミノ酸側鎖保護基としては、以下が挙げられる：メチル（Ｍｅ）、ホルミル（ＣＨＯ）、エチル（Ｅｔ）、アセチル（Ａｃ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、アニシル、ベンジル（Ｂｚｌ）、トリフルオロアセチル（ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｙｌ）（Ｔｆａ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＮＳｕ、ＯＳｕ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、４−メチルベンジル（Ｍｅｂ）、チオアニジル、チオクレシル、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、４−ニトロフェニル（ＯＮｐ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−ニトロベンゾイル（ＮＢｚ）、２−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）、４−トルエンスルホニル（Ｔｏｓｙｌ、Ｔｏｓ）、ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）、ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、２，４，５−トリクロロフェニル、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｉｔｙｌ、Ｔｒｔ）、および２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）。鎖構築の間に、ＦｍｏｃまたはＢｏｃを除去することにより、成長鎖に結合されたアミノ酸残基の活性化されたアミノ末端を生じる。得られたアミノ酸のカルボキシ末端は、例えばＨＢＴＵによって高い活性エステルに変換することにより活性化される。現在の技術（例えば、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ９０５０  Ｓｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて、５０個の残基までの直鎖ペプチドを、製造し得る。多くのガイドラインが、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む生物学的系における使用に適したペプチドを生成するのに利用可能である：（ｉ）ｃｙｓ、ｍｅｔ、ｔｒｐ（ペプチド合成の間に容易に酸化および／または分解される）またはａｒｇのような処理が困難なアミノ酸の使用を限定すること；（ｉｉ）疎水性アミノ酸（ペプチドを可溶性にし得る）を最小にすること；および（ｉｉｉ）アミノ末端がグルタミン酸（ピログルタメートに環化し得る）になるのを阻止すること。
【０１２５】
「発現可能な形態」とは、単離された核酸分子が、構成的にまたは以下による続く誘導のいずれかにより、ｍＲＮＡに転写されるのに適切な形態および／またはタンパク質を産生するために翻訳されるのに適切な形態であることを意味する：細胞内シグナルまたは細胞外シグナル（環境刺激またはストレス（マイトジェン、無酸素、低酸素、温度、塩、光、脱水など））または化学的化合物（例えば、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）もしくは抗生物質（テトラサイクリン、アンピシリン、リファンピシン、カナマイシン））、ホルモン（例えば、ジベレリン、オーキシン、サイトカイニン、グルココルチコイド、ブラシノステロイド、エチレン、アブシシン酸など）、ホルモンアナログ（ヨード酢酸（ＩＡＡ）、２，４−Ｄなど）、金属（亜鉛、銅、鉄など）、あるいは特にデキサメタゾン。当業者に公知であるように、機能的なタンパク質の発現はまた、１以上の翻訳後改変体（例えば、グリコシル化、リン酸化、脱リン酸化、または特に、１以上のタンパク質−タンパク質相互作用）を必要とし得る。このようなプロセスの全ては、用語「発現可能な形態」の範囲内に含まれる。
【０１２６】
好ましくは、特定の細胞、組織、または器官（好ましくは、植物起源）のタンパク質の発現は、このタンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子、ゲノム遺伝子、合成オリゴヌクレオチド分子、ｍＲＮＡ分子またはオープンリーディングフレーム）をその細胞、組織または器官に導入および発現することによって行われ、ここで、この核酸分子は、適切な調節配列または制御配列（プロモーター、好ましくは、植物発現プロモーター、およびターミネーター配列を含む）と組み合わせて作動可能に配置される。
【０１２７】
本明細書において「プロモーター」に関する参照は、最も広い範囲の文脈にとられ、古典的な真核生物のゲノム遺伝子（ＣＣＡＡＴボックス配列を有するか、または有さない、正確な転写の開始に必要なＴＡＴＡボックスを含む）由来の転写調節配列、ならびに発生および／または外部刺激、あるいは組織特異的様式に応答して遺伝子発現を変えるさらなる調節エレメントまたは制御エレメント（すなわち、上流活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）を含む。
【０１２８】
用語「プロモーター」はまた、古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列を含み、この場合において、−３５ボックス配列および／または−１０ボックス転写調節配列を含み得る。
【０１２９】
用語「プロモーター」はまた、合成分子または融合分子または誘導体を記載するために使用される。これらの分子は、細胞、組織または器官内での核酸分子の発現を与えるか、活性化するか、または増強する。
【０１３０】
プロモーターは、さらに、それが作動可能に連結する核酸分子の発現を高めるため、そして／あるいは空間的発現および／または時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的な調節エレメントのさらなるコピーを含み得る。このような調節エレメントは、例えば、銅、グルココルチコイド、デキサメタゾン、テトラサイクリン、ジベレリン、ｃＡＭＰ、アブシシン酸、オーキシン、傷、エチレン、ジャスモネートまたはサリチル酸に応答して核酸分子の発現を駆動するため、あるいは分裂組織、葉、根、胚、花、種子または果実のような特定の細胞、組織または器官に核酸分子の発現を与えるために、異種プロモーター配列に隣接して配置され得る。
【０１３１】
本発明の文脈において、プロモーターは、好ましくは、植物発現可能なプロモーター配列である。非植物細胞（例えば、細菌、酵母細胞、昆虫細胞および動物細胞）においても機能するかまたは非植物細胞においてのみ機能するプロモーターは、本発明から排除されない。「植物発現可能」とは、プロモーター配列（それらに加えられるかまたはその中に含まれる任意のさらなる調節エレメントを含む）が、植物細胞、組織、または器官（好ましくは、単子葉植物または双子葉植物の細胞、組織または器官）において発現を少なくとも誘導し得るか、与え得るか、活性化し得るか、増強し得ることを意味する。
【０１３２】
プロモーター配列に関する、用語「植物操作可能」および「植物において操作可能」は、本明細書中で使用される場合、植物発現可能なプロモーター配列と等価と考えられる。
【０１３３】
二元ウイルス性植物発現系の一部としての調節可能なプロモーターはまた、当業者に公知である（Ｙａｄａｖ  １９９９−ＷＯ９９２２００３；Ｙａｄａｖ  ２０００−ＷＯ００１７３６５）。
【０１３４】
本発明の文脈において、「調節可能なプロモーター配列」は、必要に応じて、特定の条件下で、特定の細胞、組織、または器官、あるいは植物の細胞、組織、または器官の群において構造遺伝子上で発現を与え得るが、一般的に全ての条件下で植物全体を通じて発現を与えないプロモーターである。従って、調節可能なプロモーター配列は、植物内の特定の位置において、あるいは植物全体を通じて特定の条件下で（例えば、化学化合物または他の誘発物（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）による遺伝子発現の誘導に続いて）、作動可能に連結される遺伝子に対して発現を与えるプロモーター配列であり得る。
【０１３５】
好ましくは、本発明の実施において使用される調節プロモーターは、任意の状況における植物全体ではなく、構成的かまたは誘導に続いてかのいずれかで、植物内の特定の位置で発現を与える。任意のある時点で植物の特定の部分に（例えば、転移遺伝子因子（Ａｃ、Ｄｓ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、または他のトランスポゾン）内の構成的プロモーターの組み込みによって）発現を与えるために改変された、細胞特異的プロモーター配列、組織特異的遺伝子プロモーター配列、器官特異的プロモーター配列、細胞周期特異的プロモーター配列、誘導性プロモーター配列および構成的プロモーター配列が、このようなプロモーターの範囲内に含まれる。
【０１３６】
同様に、用語「組織特異的」とは、発現が、特定の組織または組織型（好ましくは、植物起源）（必ずしも、排他的にこの組織または組織型である必要はない）において優先的であることを示すととられる。
【０１３７】
同様に、用語「器官特異的」とは、発現が、特定の器官（好ましくは、植物起源）（必ずしも、排他的にこの器官である必要ない）において優先的であることを示すととられる。
【０１３８】
同様に、用語「細胞周期特異的」とは、発現が、優先的に周期性であり、細胞周期の１周以上（必ずしも、継続的な期である必要はない）の（必ずしも、排他的に周期細胞である必要はない）（好ましくは、植物起源）において生じることを示すととられる。
【０１３９】
当業者は、「誘導性プロモーター」が、転写活性が、発生刺激、化学刺激、環境刺激、または物理的刺激に応答して増加するかまたは誘導されるプロモーターであることを知っている。同様に、当業者は、「構成的プロモーター」が、大部分の（必ずしも全ての部分ではない）生物（好ましくは、植物）にわたって、その生長および発生の大部分の（必ずしも全てではない）段階の間、転写的に活性であるプロモーターであることを理解する。
【０１４０】
当業者は、過度な実験なしに、公に入手可能かまたは容易に利用可能な供給源からサイトカイニンオキシダーゼタンパク質の適切な発現を調節する際における使用のための適切なプロモーター配列を容易に選択し得る。
【０１４１】
プロモーター配列の調節制御下で、またはプロモーター配列との作動可能な連結下で核酸分子を配置することとは、発現がプロモーター配列によって制御されるように核酸分子を配置することを意味する。プロモーターは、そのプロモーターが調節する核酸分子の上流、または５’末端に、転写の開始部位の２ｋｂ以内に通常（必ずしもではなく）位置する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築において、それが天然の設定で制御する遺伝子（すなわち、プロモーターが由来する遺伝子）とプロモーターとの間の距離とおよそ同じである、遺伝子転写開始部位からの距離でプロモーターを位置付けることが一般的に好ましい。当業者に公知であるように、距離におけるいくつかの改変が、プロモーター機能の欠損なしで適合され得る。同様に、制御下で配置されるべき異種遺伝子に対して、調節配列エレメントの好ましい位置は、天然の設定におけるエレメント（すなわち、調節配列エレメントが由来する遺伝子）の位置によって規定される。さらに、当業者に公知であるように、この距離におけるいくつかの改変がまた生じ得る。
【０１４２】
本発明の遺伝子構築物での使用のために適したプロモーターの例は、とりわけ、表４に列挙されているプロモーターである。表４に列挙されているプロモーターは、例示の目的のためだけに適用され、そして本発明は、本明細書中に列挙されるリストによって限定されるべきではない。当業者は、本発明を実施するのに有用であるさらなるプロモーターを、ある位置に容易に提供する。
【０１４３】
全植物にわたって発現を誘導する構成的プロモーターまたはプロモーターの場合において、このような配列を、表４に列挙される組織特異的な１以上のプロモーター由来のヌクレオチド配列の付加によって、あるいは上記の組織特異的な１以上の誘導可能なプロモーター由来のヌクレオチド配列の添加によって改変し、このプロモーターに組織特異性を与えることが好ましい。例えば、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを、トウモロコシのＡｄｈ１プロモーター配列の付加によって改変し、以前に記載された（Ｅｌｌｉｓら、１９８７）ように、このプロモーターに、嫌気的に調節された根特異的発現性を与える。別の例は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターをトウモロコシグリシンリッチタンパク質ＧＲＰ３遺伝子のエレメントに融合することによって、根特異的遺伝子発現性または根過剰（ａｂｕｎｄａｎｔ）遺伝子発現性を与えることを記載する（ＦｅｉｘおよびＷｕｌｆｆ  ２０００−ＷＯ００１５６６２）。このような改変は、当業者によって慣用的な実験により達成され得る。
【０１４４】
用語「ターミネーター」とは、転写の終結の信号を送る転写ユニットの末端のＤＮＡ配列をいう。ターミネーターは、一次転写物の３’末端へのポリアデニル化配列の付加を促進する、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳ＤＮＡ配列である。ウイルス、酵母、糸状菌、細菌、昆虫、トリ、哺乳動物および植物に由来する細胞において活性なターミネーターは、公知であり、文献に記載されている。これらは、細菌、真菌、ウイルス、動物および／または植物から単離され得る。
【０１４５】
【表５】
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本発明の遺伝子構築物における使用に特に適切なターミネーターの例としては、とりわけ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）遺伝子ターミネーター配列、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子ターミネーター配列、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼターミネーター配列（ｔ３’Ｂｔ２）、Ｚｅａ  ｍａｙｓゼイン遺伝子ターミネーター配列、ｒｂｃｓ−１Ａ遺伝子ターミネーター、およびｒｂｃｓ−３Ａ遺伝子ターミネーター配列が挙げられる。
【０１４６】
本発明の好ましいプロモーター配列としては、根特異的プロモーター（例えば、限定しないが、表５に列挙され、実施例において概説されるプロモーター）が挙げられる。
【０１４７】
（表５．本発明の実施において使用するための例示的な根特異的プロモーター）
【０１４８】
【表６】
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当業者は、本発明の実施における使用に適切であり得るさらなるプロモーター配列およびターミネーター配列を認識する。このような配列は、いずれの過度の実験もなく容易に使用され得る。
【０１４９】
本発明の状況において、遺伝子またはタンパク質の「異所発現」または「異所過剰発現」は、これらの遺伝子またはタンパク質の、自然の条件下では通常生じない発現パターンおよび／あるいは発現レベルを与え、より詳細には、増大した発現レベルおよび／または減少した発現レベルを意味する。異所発現は、多くの方法によって達成され得、これらの方法としては、キメラ遺伝子を作製するために、単離された同種プロモーターまたは異種プロモーターへの、このタンパク質をコードするコード配列の作動可能な連結、および／または組換え遺伝子の複製または遺伝子の増殖作用を生じるために、それ自身の単離されたプロモーター（すなわち、このタンパク質の発現を自然に駆動する単離されていないプロモーター）へのこのコード配列の作動可能な連結が挙げられる。「異所同時発現」は、２つ以上の遺伝子またはタンパク質の異所発現または異所過剰発現を意味する。この遺伝子またはタンパク質の異所発現を与えるために、同じプロモーター、またはより好ましくは異なるプロモーターが使用される。
【０１５０】
好ましくは、本発明の状況において使用されるプロモーター配列は、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質もしくはホモログ、誘導体、または前出で定義されるようなその免疫学的に活性なフラグメントおよび／もしくは機能的フラグメントをコードするコード配列あるいはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結される。
【０１５１】
本明細書中で使用される場合、「発現の下方制御」は、遺伝子発現および／または活性な遺伝子産物のレベルおよび／または遺伝子産物活性のレベルを下げることを意味する。発現の減少は、例えば、プロモーター配列に対してセンス方向（同時抑制を生じる場合）に、またはアンチセンス方向にコード配列またはその一部を付加することによって、そしてさらに、例えば、変異の挿入（例えば、Ｔ−ＤＮＡ挿入またはトランスポゾンの挿入）によって、あるいは、例えば、ＡｎｇｅｌｌおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９８−ＷＯ９８３６０８３）、Ｌｏｗｅら（１９８９−ＷＯ９８５３０８３）、Ｌｅｄｅｒｅｒら（１９９９−ＷＯ９９１５６８２）またはＷａｎｇら（１９９９−ＷＯ９９５３０５０）によって記載される遺伝子サイレンシング戦略によって達成され得る。遺伝子発現をサイレンシングすることを目的する遺伝子構築物は、プロモーター配列に対してセンス方向および／またはアンチセンス方向でその中に含まれるこの遺伝子（またはその一つ以上の部分）のヌクレオチド配列を有し得る。遺伝子発現を下方制御する別の方法は、リボザイムの使用を含む。
【０１５２】
活性遺伝子産物のレベルまたは遺伝子産物の活性のレベルを調節すること（低下させることを含む）は、細胞、組織、器官または生物体をこの遺伝子産物、ホモログ、誘導体および／またはその免疫学的に活性なフラグメントを投与するかまたはこれらに暴露することによって達成され得る。免疫調節は、活性遺伝子産物のレベルおよび／または遺伝子産物の活性のレベルを下方制御し得る技術の別の例であり、そしてこの遺伝子産物のレベルおよび／または遺伝子産物の活性のレベルが調節される細胞、組織、器官もしくは生物体へ、または細胞、組織、器官もしくは生物において、この遺伝子産物に対する抗体を投与することまたはこの遺伝子産物に対する抗体へ暴露することまたはこの遺伝子産物に対する抗体を発現することを包含する。このような抗体は、「植物抗体（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、単鎖抗体、ＩｇＧ抗体および重鎖ラクダ抗体ならびにそれらのフラグメントを含む。
【０１５３】
活性遺伝子産物のレベルまたは遺伝子産物の活性のレベルを調節すること（低下させることを含む）は、さらに、細胞、組織、器官または生物体を、この遺伝子産物またはその活性のアゴニストを投与またはこれに暴露することによって達成され得る。このようなアゴニストとしては、前出に記載のように本発明に従って同定されるタンパク質（例えば、キナーゼおよびプロテイナーゼを含む）ならびに化学成分が挙げられる。
【０１５４】
本発明の状況において、上記で定義されるサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現の下方制御が認識される。好ましくは、このサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子は、植物サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子であり、より具体的にはＡｔＣＫＸである。本発明は、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質のレベルまたはサイトカイニンオキシダーゼ活性のレベルの下方制御をさらに含み、これによって、このサイトカイニンオキシダーゼタンパク質が上記で定義される。好ましくは、このサイトカイニンオキシダーゼタンパク質は、植物サイトカイニンオキシダーゼであり、より具体的にはＡｔＣＫＸである。
【０１５５】
「細胞運命（ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ）および／または植物発達および／または植物形態学および／または生化学および／または生理学の改変」とは、植物の１つ以上の発達の特徴および／または形態学的特徴および／または生化学的特徴および／または生理学的特徴が、本明細書中に記載される本発明に属する一つ以上の工程の実行によって変化されることを意味する。
【０１５６】
「細胞運命」とは、特に、細胞周期の間または細胞周期プロセスの結果として、植物発達または発達のための細胞プロセスの間に産生される特定の細胞の細胞型または細胞の特徴をいう。
【０１５７】
「植物発達」または用語「植物発達特徴」または類似の用語は、本明細書中で使用される場合、前駆細胞が発達する植物細胞（特に、特定の組織または器官型）の発達の運命を決定することに関与する植物の任意の細胞プロセスを意味するように考えられるべきである。植物発達に関係する細胞プロセスは、当業者に公知である。このようなプロセスには、例えば、形態形成、光形態形成、苗条の発達、根の発達、生長的発達、生殖的発達、幹の伸長、開花、ならびに細胞運命（特に、細胞周期に関係するプロセスまたは調節プロセス）を決定する際に関係する調節機構が挙げられる。
【０１５８】
「植物形態学」または用語「植物の形態学的特徴」または類似の用語は、本明細書中で使用される場合、植物の外見（任意の一つ以上の構造的特徴またはその構造的特徴の組み合わせを含む）をいうことが当業者に理解される。このような構造的特徴には、植物の任意の細胞、組織または器官、あるいは細胞、組織または器官の群（とりわけ、根、幹、葉、苗条、葉柄、突起様構造、花、花弁、柱頭、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、種子、胚、胚乳、種皮、糊粉、繊維、果実、形成層、木材、心材、柔組織、通気組織、篩要素、篩部または維管束組織を含む）の形状、大きさ、数、位置、色、きめ（ｔｅｘｕｒｅ）、配列、およびパターン化を含む。
【０１５９】
「植物生化学」または用語「植物生化学的特徴」または類似の用語は、本明細書中で使用される場合、植物の代謝および触媒プロセス（１次および２次代謝ならびに植物によって産生されるその産物（任意の低分子、巨大分子または化学物質（例えば、デンプン、糖、タンパク質、ペプチド、酵素、ホルモン、増殖因子、核酸分子、セルロース、ヘミセルロース、カロース、レクチン、繊維、色素（例えば、アントシアニン）、ビタミン、鉱物、微量養素、または多量養素を含むが、これらに限定されない）を含む）を含む）をいうことが当業者によって理解される。
【０１６０】
「植物生理学」または用語「植物の生理学的特徴」または類似の用語は、本明細書中で使用される場合、植物の機能的プロセス（発達プロセス（とりわけ、例えば、成長、増殖および分化、性的発達、有性生殖、結実、種子の発達、登熟、無性生殖、細胞分裂、休眠、発芽、光順応、光合成、葉の増殖、繊維生成、二次成長または木の生成）；外部的に適用される因子（例えば、金属、化学物質、ホルモン、増殖因子、環境、および環境ストレス因子（とりわけ、例えば、無酸素症、低酸素、高温、低温、脱水、光、日長、湛水、塩、重金属）に対する植物の応答）（この外部的に適用される因子への植物の適合応答を含む））をいうことが理解される。
【０１６１】
組換えＤＮＡを植物組織または細胞に導入するための手段としては、ＣａＣｌ２を使用する形質転換およびその変形（特に、Ｈａｎａｈａｎ（１９８３）によって記載される方法）、プロトプラストへの直接ＤＮＡ取り込み（Ｋｒｅｎｓら、１９８２；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、１９８４）、プロトプラストへのＰＥＧ媒介取り込み（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９０）、微粒子ボンバードメント、エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍら、１９８５）、ＤＮＡのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら、１９８６）、組織外植片または細胞の微粒子ボンバードメント（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９８８；Ｓａｎｆｏｒｄ，１９８８）、核酸を用いる組織の吸引浸潤、または植物の場合、本質的にＡｎら、（１９８５）、Ｄｏｄｄｓら（１９８５）、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３ａ、１９８３ｂ、１９８５）に記載されるようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物組織へのＴ−ＤＮＡ媒介移入が挙げられるが、これらに限定されない。単子葉植物の形質転換のための方法は、当該分野で周知であり、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｃｈｅｎｇら、１９９７−ＷＯ９７４８８１４；Ｈａｎｓｅｎ  １９９８−ＷＯ９８５４９６１，Ｈｉｅｉら、１９９４−ＷＯ９４００９７７；Ｈｉｅｉら、１９９８−ＷＯ９８１７８１３；Ｒｉｋｉｉｓｈｉら、１９９９−ＷＯ９９０４６１８；Ｓａｉｔｏら、１９９５−ＷＯ９５０６７２２）、微粒子ボンバードメント（Ａｄａｍｓら、１９９９−ＵＳ５９６９２１３；Ｂｏｗｅｎら、１９９８−ＵＳ５７３６３６９；Ｃｈａｎｇら、１９９４−ＷＯ９４１３８２２；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、１９９９−ＵＳ５８７４２６５／ＵＳ５９９０３９０；ＶａｓｉｌおよびＶａｓｉｌ、１９９５−ＵＳ５４０５７６５；Ｗａｌｋｅｒら、１９９９−ＵＳ５９５５３６２）、ＤＮＡ取り込み（Ｅｙａｌら、１９９３−ＷＯ９３１８１６８）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞のマイクロインジェクション（ｖｏｎ  Ｈｏｌｔ、１９９４−ＤＥ４３０９２０３）、ならびに超音波処理（Ｆｉｎｅｒら、１９９７−ＵＳ５６９３５１２）が挙げられる。
【０１６２】
細胞の微粒子ボンバードメントのために、微粒子が細胞へと推進されて、形質転換細胞を生成する。任意の適切な衝撃（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）細胞形質転換の方法論および装置が、本発明の実施において使用され得る。例示的な装置および手順は、Ｓｔｏｍｐら（米国特許第５，１２２，４６６号）ならびにＳａｎｆｏｒｄおよびＷｏｌｆ（米国特許第４，９４５，０５０号）に開示される。衝撃形質転換手順を使用する場合、この遺伝子構築物は、形質転換されるべき細胞において複製し得るプラスミドを組み込み得る。このような系において使用するための適切な微粒子の例としては、１〜５μｍの金の球が挙げられる。このＤＮＡ構築物は、任意の適切な技術によって（例えば、沈降によって）微粒子上に沈着され得る。
【０１６３】
植物全体は、当該分野で周知の手順に従って、形質転換された細胞またはトランスフェクトされた細胞から再生され得る。引き続いてクローン増殖し得る植物細胞は、器官形成によろうとまたは胚形成によろうと、本発明の遺伝子構築物を用いて形質転換され得、そしてこれから植物全体が再生される。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種に利用可能でありかつこの種に最も適切なクローン増殖系に依存して変化する。例示的な組織標的としては、葉の花盤（ｌｅａｆ  ｄｉｓｋ）、花粉、胚、子葉、胚軸、雌性配偶体、カルス組織、存在する分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根の分裂組織）、ならびに誘導された分裂組織（例えば、子葉の分裂組織、および胚軸の分裂組織）が挙げられる。
【０１６４】
用語「器官形成」は、本明細書中で使用される場合、苗条および根が成長点中心から経時的に発達するプロセスを意味する。
【０１６５】
用語「胚形成」は、本明細書中で使用される場合、体細胞からであろうと生殖体からであろうと、苗条および根が一致した様式で（経時的ではなく）一緒に発達するプロセスを意味する。
【０１６６】
好ましくは、本発明の方法に従って生成される植物は、遺伝子配列を用いてトランスフェクトまたは形質転換されるか、あるいは、とりわけ、例えば微粒子ボンバードメント、マイクロインジェクション、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（インプランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）形質転換を含む）、プロトプラスト融合、またはエレクトロポレーションのような当該分野で認識された任意の手段によるタンパク質の導入に敏感に反応する。最も好ましくは、この植物は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって生成される。
【０１６７】
植物、酵母、カビ、または糸状菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換またはアグロリスティックな（ａｇｒｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換は、Ｔ−ＤＮＡと呼ばれる形質転換ベクター配列の一部の、核への移行、およびこの真核生物のゲノムへのこのＴ−ＤＮＡの組み込みに基づく。
【０１６８】
「Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ」は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、より好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、そして最も好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのメンバーを意味する。
【０１６９】
「Ｔ−ＤＮＡ」、または移行されたＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡの境界に隣接する形質転換ベクターの一部（これは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのｖｉｒ遺伝子の活性化後にＴ−ＤＮＡ境界でニックされ、そして真核生物細胞の核に一本鎖ＤＮＡとして移行される）を意味する。
【０１７０】
本明細書中で使用される場合、「Ｔ−ＤＮＡ境界」、「Ｔ−ＤＮＡ境界領域」、または「境界領域」は、右Ｔ−ＤＮＡ境界（ＲＢ）または左Ｔ−ＤＮＡ境界（ＬＢ）のいずれかを意味する。このような境界は、この境界に隣接するＴ−ＤＮＡの一部としての境界内部領域、および／またはこの境界に隣接するベクター骨格の一部としての境界外部領域に隣接するコア配列を含む。このコア配列は、オクトピン型ベクターの場合は２２ｂｐ、およびノパリン型ベクターの場合は２５ｂｐを含む。右境界領域および左境界領域におけるこのコア配列は、不完全な反復を形成する。境界コア配列は、少なくともＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２からなるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍニッキング複合体による認識およびプロセシングには不可欠である。Ｔ−ＤＮＡに隣接するコア配列は、このＴ−ＤＮＡの移行を促進するためには十分である。しかし、このコア配列に隣接するＴ−ＤＮＡのみを保有する形質転換ベクターを使用する形質転換の効率は、低い。境界の内部領域および外部領域は、Ｔ−ＤＮＡ移行の効率を調節することが公知である（Ｗａｎｇら、１９８７）。Ｔ−ＤＮＡ移行を増大する１つのエレメントが特徴付けられ、そしてこれは、右境界外部領域に位置し、そしてオーバードライブと呼ばれる（Ｐｅｒａｌｔａら、１９８６，ｖａｎ  Ｈａａｒｅｎら、１９８７）。
【０１７１】
「Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクター」または「Ｔ−ＤＮＡベクター」は、それぞれ、少なくとも右および左の境界コア配列からなる右および左のＴ−ＤＮＡ境界に隣接するＴ−ＤＮＡ配列を含む任意のベクターを意味し、そして任意の真核生物細胞の形質転換のために使用される。
【０１７２】
「Ｔ−ＤＮＡベクター骨格配列」または「Ｔ−ＤＮＡベクター骨格配列」は、Ｔ−ＤＮＡ境界の外側、そしてより詳細には、境界コア不完全反復のニッキング部位の外側に位置するＴ−ＤＮＡ含有ベクターの全てのＤＮＡを意味する。本発明は、真核生物細胞のゲノムへのベクター骨格の組み込みが最小であるかまたは存在しないように最適化されたＴ−ＤＮＡベクターを含む。「最適化されたＴ−ＤＮＡベクター」は、真核生物細胞のゲノムへのベクター骨格配列の移入を減少するかまたはなくすかのいずれかのために設計されたＴ−ＤＮＡベクターを意味する。このようなＴ−ＤＮＡベクターは、当業者に公知であり、そしてこれらとしては、Ｈａｎｓｏｎら（１９９９）およびＳｔｕｉｖｅｒら（１９９９−Ｗ０９９０１５６３）によって記載されるものが挙げられる。
【０１７３】
本発明は、明らかに、任意のＴ−ＤＮＡベクター（２成分（ｂｉｎａｒｙ）形質転換ベクター、超２成分（ｓｕｐｅｒ−ｂｉｎａｒｙ）形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ｒｉ由来形質転換ベクターを含む）ならびにアグロリスティック形質転換において使用されるＴ−ＤＮＡ保有ベクターにおける、サイトカイニンオキシダーゼ、ホモログ、誘導体、または前出に記載のようなその免疫学的に活性なフラグメントおよび／あるいは機能的フラグメントをコードするＤＮＡ配列の封入を考慮する。好ましくは、このサイトカイニンオキシダーゼは、植物サイトカイニンオキシダーゼであり、より詳細にはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＫＸである。
【０１７４】
「２成分形質転換ベクター」は、以下を含むＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターを意味する：
（ａ）形質転換されるべき真核生物細胞において活性な少なくとも１つの目的の遺伝子および／または少なくとも１つの選択マーカーを含むＴ−ＤＮＡ領域；ならびに
（ｂ）少なくとも、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて活性な複製起源、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける選択のためのマーカーを含む、ベクター骨格領域。
【０１７５】
２成分形質転換ベクターのＴ−ＤＮＡ境界は、オクトピン型またはノパリン型のＴｉプラスミド由来であり得るか、またはその両方由来であり得る。２成分ベクターのＴ−ＤＮＡは、ヘルパープラスミドと共に真核生物細胞に移行されるのみである。
【０１７６】
「ヘルパープラスミド」は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で安定に維持され、そしてＴ−ＤＮＡの移入を可能にするために必要なｖｉｒ遺伝子のセットを少なくとも保有するプラスミドを意味する。このｖｉｒ遺伝子のセットは、オクトピン型またはノパリン型のＴｉプラスミドのいずれか由来であり得るか、またはその両方由来であり得る。
【０１７７】
「超２成分形質転換ベクター」は、ベクター骨格領域中に超有毒なＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株Ａ２８１（ＥＰ０６０４６６２，ＥＰ０６８７７３０）のＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域をさらに保有する２成分形質転換ベクターを意味する。超２成分形質転換ベクターは、ヘルパープラスミドと共に使用される。
【０１７８】
「同時組み込み形質転換ベクター」は、少なくとも以下を含むＴ−ＤＮＡベクターを意味する：
（ａ）植物において活性な、少なくとも１つの目的の遺伝子および／または少なくとも１つの選択マーカーを含む、Ｔ−ＤＮＡ領域；ならびに
（ｂ）少なくとも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて活性な複製起源、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける選択のためのマーカーを含むベクター骨格領域、ならびにＴ−ＤＮＡの移行を可能にするために必要なｖｉｒ遺伝子のセット。
【０１７９】
これらのＴ−ＤＮＡ境界およびこのＴ−ＤＮＡベクターのｖｉｒ遺伝子のセットは、オクトピン型またはノパリン型のいずれかのＴｉプラスミド由来であり得るか、あるいはこの両方由来であり得る。「Ｒｉ由来の植物形質転換ベクター」は、２成分形質転換ベクター（ここで、Ｔ−ＤＮＡ境界は、Ｔｉプラスミド由来であり、そしてこの２成分形質転換ベクターは、ｖｉｒ遺伝子の必要なセットを保有する「ヘルパー」Ｒｉプラスミドと共に使用される）を意味する。
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」または「選択マーカー」または「選択のためのマーカー」は、細胞に表現型を与える任意の遺伝子（ここで、このマーカーが発現されて、本発明の遺伝子構築物またはその誘導体を用いてトランスフェクトまたは形質転換される細胞の同定および／または選択を容易にする）を含む。本明細書中で意図される適切な選択マーカー遺伝子としては、とりわけ、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、細菌性カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、フォスフィノスリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子（Ｈａｓｅｌｏｆｆら，１９９７）、およびルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１８１】
「アグロリスティックな」、「アグロリスティック形質転換」または「アグロリスティック移行」は、本明細書中では、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の特徴と微粒子銃ＤＮＡ送達の特徴とを合わせた形質転換方法を意味する。このようにして、Ｔ−ＤＮＡ含有標的プラスミドは、ＶｉｒＥ２ありまたはなしで、ＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２のインプランタ産生を可能にするＲＮＡ／ＤＮＡと共に同時送達される（ＨａｎｓｅｎおよびＣｈｉｌｔｏｎ  １９９６；Ｈａｎｓｅｎら、１９９７；ＨａｎｓｅｎおよびＣｈｉｌｔｏｎ  １９９７−Ｗ０９７１２０４６）。
【０１８２】
「外来ＤＮＡ」は、組換え技術によって宿主細胞のゲノムに導入される任意のＤＮＡ配列を意味する。この外来ＤＮＡとしては、例えば、Ｔ−ＤＮＡ配列またはその一部（例えば、発現可能な形式で選択マーカーを含むＴ−ＤＮＡ配列）が挙げられる。外来ＤＮＡとしては、さらに、前出で定義されるような介在ＤＮＡが挙げられる。
【０１８３】
「組換え事象」は、部位特異的組換え事象またはトランスポゾンの「ジャンピング（ｊｕｍｐｉｎｇ）」によってもたらされる組換え事象のいずれかを意味する。
【０１８４】
「リコンビナーゼ」は、部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼのいずれかを意味する。
【０１８５】
「組換え部位」は、部位特異的組換え部位またはトランスポゾン境界配列のいずれかを意味する。
【０１８６】
「部位特異的組換え事象」は、一般に以下の３つのエレメントからなる系によって触媒される事象を意味する：ＤＮＡ配列の対（部位特異的組換え配列または部位）ならびに特定の酵素（部位特異的リコンビナーゼ）。部位特異的リコンビナーゼは、部位特異的組換え配列の方向に依存して、２つの部位特異的組換え配列間でのみ組換え反応を触媒する。２つの部位特異的組換え部位間の介在配列は、部位特異的組換え配列が互いに反対方向（すなわち、逆方向反復）である場合に、部位特異的な組換えの存在下で反転する。部位特異的組換え配列が互いに同じ方向（すなわち、直列反復）である場合、任意の介在配列は、部位特異的リコンビナーゼとの相互作用によって欠失される。従って、部位特異的組換え配列が、真核生物ゲノム中に組み込まれた外来ＤＮＡ配列の両方の末端で直列反復として存在する場合、この配列のこのような組み込みは、部位特異的組換え配列の、対応する部位特異的リコンビナーゼとの相互作用によって、実質的に反転され得る。多くの異なる部位特異的リコンビナーゼ系が使用され得、これらの系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｉｎリコンビナーゼ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ由来のＰｉｎＢ、ＰｉｎＤおよびＰｉｎＦ、ならびにｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系。リコンビナーゼは、一般に、インテグラーゼ、レソルバーゼまたはフリッパーゼである。二重特異的リコンビナーゼもまた、二重特異的リコンビナーゼに対応する２つの異なる部位特異的組換え部位の直列反復または逆方向反復と組み合わせて、使用され得る（ＷＯ９９／２５８４０）。２つの好ましい部位特異的リコンビナーゼ系は、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘおよび酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系である。これらの系において、リコンビナーゼ（ＣｒｅまたはＦＬＰ）は、それぞれの部位特異的組換え配列（それぞれ、ｌｏｘまたはＦＲＴ）と特異的に相互作用して、介在配列を反転または切除する。これら２つの系の各々についての部位特異的組換え配列は、比較的短い（ｌｏｘについては３４ｂｐ、そしてＦＲＴについては４７ｂｐ）。タバコ（Ｄａｌｅら、１９９０）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９９５）のような植物において、高い効果を有するこれらの系のうちいくつかは、すでに使用されている。部位特異的組換え系は、植物分子生物学において多くの適用を有し、これらとしては、相同組換えを制御するための方法（例えば、ＵＳ５５２７６９５）、挿入の標的化、遺伝子スタッキングなどのための方法（ＷＯ９９／２５８２１）、および複雑なＴ−ＤＮＡ組み込みパターンの解決のための方法、または選択マーカーの切除のための方法（ＷＯ９９／２３２０２）が挙げられる。
【０１８７】
部位特異的組換え配列は、切除または反転されるべきＤＮＡの末端に連結されなければならないが、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子は、別の場所に位置してもよい。例えば、リコンビナーゼ遺伝子は、すでに真核生物のＤＮＡ中に存在し得るか、または、直接細胞に導入されるか、交雑もしくは他花受粉によってかのいずれかで、後に導入されたＤＮＡフラグメントによって供給され得る。あるいは、実質的に精製されたリコンビナーゼタンパク質は、例えば、微量注入または粒子ボンバードメントによって、真核生物細胞に直接導入され得る。代表的には、部位特異的リコンビナーゼコード領域は、調節配列に作動可能に連結され、真核生物細胞中で部位特異的リコンビナーゼの発現を可能にする。
【０１８８】
「トランスポゾンがジャンプする（ｊｕｍｐｉｎｇ）ことによってもたらされる組換え事象」または「トランズポザーゼ媒介性組換え」は、以下の３つのエレメントからなる系によって触媒される組換え事象を意味する：ＤＮＡ配列の対（トランスポゾン境界配列）および特異的酵素（トランスポザーゼ）。トランスポザーゼは、逆方向反復として配置された２つのトランスポゾン境界配列の間のみを触媒する。異なるトランスポゾン／トランスポザーゼ系の多くが使用され得、これらとしては、Ｄｓ／Ａｃ系、Ｓｐｍ系およびＭｕ系が挙げられるが、これらに限定されない。これらの系は、トウモロコシに由来するが、少なくともＤｓ／Ａｃ系およびＳｐｍ系は、他の植物においても機能することが示されている（Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、１９９３、Ｓｃｈｌａｐｐｉら、１９９３、Ｖａｎ  Ｓｌｕｙｓら、１９８７）。それぞれ、１１ｂｐの境界配列および１３ｂｐの境界配列によって示されるＤｓ型のトランスポゾンおよびＳｐｍ型のトランズポゾンが、好ましい。
【０１８９】
トランスポゾン境界配列は、切除されるべきＤＮＡの末端に連結されなければならないが、トランスポザーゼをコードする遺伝子は、別の場所に位置してもよい。例えば、リコンビナーゼ遺伝子は、すでに真核生物のＤＮＡに存在し得るか、または、直接細胞に導入されるか、交雑もしくは他花受粉によってかのいずれかで、後に導入されたＤＮＡフラグメントによって供給され得る。あるいは、実質的に精製されたトランスポザーゼタンパク質は、例えば、微量注入または粒子ボンバードメントによって、真核生物細胞に直接導入され得る。
【０１９０】
本発明の一部として、トランスポゾン境界配列は、外来ＤＮＡ配列中に含まれ、その結果、これらの配列は、このＤＮＡ配列の外側にあり、そしてこのＤＮＡを、トランスポザーゼの作用によって移動し得るトランスポゾン様の存在に形質転換する。
【０１９１】
トランスポゾンは、しばしば、宿主ゲノムの別の位置で再組み込みするが、トランスポゾンが作用できた宿主の子孫の分離は、例えば、トランスポゾンの足跡のみを含む形質転換された宿主と、外来ＤＮＡをなお含む形質転換された宿主とを分離するために必要であり得る。
【０１９２】
本発明を実施する際に、遺伝的エレメントは、好ましくは、例えば、遺伝的エレメントの組み込み部位に接触し、そしてそこでの組換え事象を容易にする細胞中のリコンビナーゼタンパク質の発現、遺伝的エレメントを完全に切除すること、あるいは、元の組込み部位に一般に約２０ヌクレオチド長またはそれ以上の「足跡」を残すことによって、移動するように誘導される。本発明の方法に従って生成されたこれらの宿主および宿主細胞は、移動可能な遺伝的エレメントもしくはこれを含む遺伝子構築物の存在を検出するために、標準的な核酸ハイブリダイゼーション技術および／または核酸増幅技術によって、同定され得る。あるいは、移動可能な遺伝的エレメントが切除された形質転換された宿主細胞、組織および宿主の場合、このような技術を使用して、切除事象後に残された宿主ゲノム中の足跡を検出することが可能である。本明細書中で使用される場合、用語「足跡」は、本明細書中に記載される移動可能な遺伝的エレメントまたはこれを含む遺伝子構築物の任意の誘導体をいうように解釈されるべきであり、これは、この構築物で予め形質転換された細胞のゲノムからの、移動可能な遺伝的エレメントの切除、欠失または他の除去によって生成される。足跡は、一般に、少なくとも単一コピーの組換え遺伝子座または切除を促進するために使用されるトランスポゾンを含む。しかし、足跡は、遺伝子構築物に由来するさらなる配列（例えば、左側の境界配列、右側の境界配列、複製起点、使用される場合には、リコンビナーゼコード配列もしくはトランスポザーゼコード配列に由来するヌクレオチド配列、または他のベクター由来のヌクレオチド配列）を含み得る。従って、足跡は、組換え遺伝子座または使用される遺伝子構築物のトランスポゾンのヌクレオチド配列（例えば、ｌｏｘ部位もしくはｆｒｔ部位に対応するかまたは相補的なヌクレオチドの配列）に従って同定可能である。
【０１９３】
用語「細胞周期」は、細胞の増殖および分裂、ならびに特にＤＮＡの複製および有糸分裂の調節に関連する周期的な生化学的かつ構造的な事象を意味する。細胞周期は、以下のように呼ばれる期を含む：Ｇ０、Ｇａｐ１（Ｇ１）、ＤＮＡ合成（Ｓ）、Ｇａｐ２（Ｇ２）および有糸分裂（Ｍ）。通常、これらの４つの期は、連続的に生じるが、細胞周期はまた、改変された周期を含み、ここで、１以上の期は、存在せず、改変された細胞周期（例えば、核内有糸分裂、アシトキネシス（ａｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）、倍数体、多糸性および核内二倍化（ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ））を生じる。
【０１９４】
用語「細胞周期の進行」は、異なる細胞周期の期を通過するプロセスをいう。従って、用語「細胞周期進行速度」は、この細胞周期の期が進む速度、またはこの細胞周期の期を完了するために必要な時間の長さをいう。
【０１９５】
「ツーハイブリッドアッセイ」は、多くの真核生物の転写因子が、物理的に分離されている場合（すなわち、共有結合の崩壊）には標的遺伝子の発現を達成しない、２つのドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ）および活性化ドメイン（ＡＤ））を含むという観察に基づいたアッセイを意味する。ＤＢに融合した２つのタンパク質の一方およびＡＤに融合した２つのタンパク質のもう一方と物理的に相互作用し得る２つのタンパク質は、転写因子のＢＤドメインおよびＡＤドメインを再結合し、標的遺伝子の発現を生じる。酵母ツーハイブリッドアッセイにおける標的遺伝子は、通常、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子である。従って、酵母ツーハイブリッドアッセイにおけるタンパク質パートナー間の相互作用は、レポーター遺伝子産物の活性を測定することによって定量され得る（ＢａｒｔｅｌおよびＦｉｅｌｄｓ、１９９７）。あるいは、哺乳動物のツーハイブリッドシステムが使用され得、これは、例えば、レポーター遺伝子をコードするキメラ緑色蛍光タンパク質を含む（Ｓｈｉｏｄａら、２０００）。
【０１９６】
さらに、本発明のタンパク質の構造モチーフの折り畳みシミュレーションおよびコンピューター再設計は、適切なコンピュータープログラムを使用して実行され得る（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎ２５（１９９６）、２８６−２９９；Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１（１９９５）、６７５−６７９）。タンパク質折り畳みのコンピューターモデリングは、詳細なペプチドおよびタンパク質モデルの立体構造分析ならびにエネルギー的分析のために使用され得る（Ｍｏｎｇｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７（１９９５）、９９５−１０１２；Ｒｅｎｏｕｆ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６（１９９５）、３７−４５）。特に、適切なプログラムは、相補的ペプチド配列についてのコンピューター補助検索によって、サイトカイニンオキシダーゼ、そのリガンドまたは他の相互作用タンパク質の相互作用部位の同定のために使用され得る（Ｆａｓｓｉｎａ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ５（１９９４）、１１４−１２０）。タンパク質およびペプチドの設計のためにさらに適切なコンピューターシステムは、先行技術（例えば、Ｂｅｒｒｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２（１９９４）、１０３３−１０３６；Ｗｏｄａｋ、Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．５０１（１９８７）、１−１３；Ｐａｂｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（１９８６）、５９８７−５９９１）に記載される。上記のコンピューター分析から得られた結果は、例えば、本発明のタンパク質のペプチド模倣物またはそのフラグメントの調製のために使用され得る。タンパク質の天然のアミノ酸配列のこのような偽ペプチドアナログは、親タンパク質を非常に効果的に模倣し得る（Ｂｅｎｋｉｒａｎｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６）、３３２１８−３３２２４）。例えば、容易に利用可能なアキラルΩ−アミノ酸残基の、本発明のタンパク質またはそのフラグメントへの取り込みは、脂肪族鎖のポリメチレン単位によってアミノ結合の置換を生じ、それによって、ペプチド模倣物の構築のための簡便な戦略を提供する（Ｂａｎｅｒｊｅｅ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３９（１９９６）、７６９−７７７）。他の系における小さいペプチドホルモンの高活性のペプチド模倣物アナログは、先行技術において記載される（Ｚｈａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｓｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２４（１９９６）、３２７−３３１）。本発明のタンパク質の適切なペプチド模倣物はまた、連続的なアミンアルキル化を介したペプチド模倣物の組み合わせのライブラリーの合成、ならびに得られた化合物を（例えば、その結合、キナーゼ阻害特性および／または免疫学的特性について）試験することによって、同定され得る。ペプチド模倣物の組み合わせライブラリーの生成および使用のため方法は、先行技術（例えば、Ｏｓｔｒｅｓｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６７（１９９６）、２２０−２３４およびＤｏｒｎｅｒ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６）、７０９−７１５）に記載される。
【０１９７】
さらに、本発明のタンパク質の３次元構造および／または結晶構造は、本発明のタンパク質の生物学的活性のペプチド模倣物インヒビターの設計のために使用され得る（Ｒｏｓｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（１９９６）、１２９３３−１２９４４；Ｒｕｔｅｒｂｅｒ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６）、１５４５−１５５８）。
【０１９８】
本発明の方法において獲得または同定される化合物は、本発明の核酸、ペプチドまたはタンパク質のいずれかに結合し得る化合物である。同定される他の目的の化合物は、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現が、この化合物の作用によって増強されるかまたは減少されるかのいずれかの方法で、この遺伝子またはタンパク質の発現を調節する化合物である。あるいは、この化合物は、本発明のタンパク質のいずれかの活性を増強または減少させることによって、その作用を発揮し得る。ここで、好ましいタンパク質は、新規のサイトカイニンオキシダーゼである。
【０１９９】
この化合物または複数の化合物は、例えば、サンプル（例えば、植物、動物または微生物からの細胞抽出物）中に含まれ得る。さらに、この化合物は、当業者に公知であり得るが、これがサイトカイニンオキシダーゼ相互作用タンパク質を抑制または活性化し得ることはこれまで公知でないかもしれない。この反応混合物は、無細胞抽出物であり得るか、あるいは細胞または組織培養物を含み得る。本発明の方法のために適切な設定は、当業者に公知であり、そして例えば、一般に、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第三版（１９９４）の、とくに第１７章に記載される。複数の化合物は、例えば、反応混合物、培養培地に添加され得るか、または細胞に注入され得る。
【０２００】
化合物または複数の化合物を含むサンプルが、本発明の方法で同定される場合、アゴニストとして作用し得る化合物を含むことが同定された元々のサンプルから化合物を単離することが可能であるか、または例えば、それが複数の異なる化合物からなる場合に、サンプルあたりの異なる物質の数を減少させるように、元々のサンプルをさらに再分割し得、そして元々のサンプルの再分割を用いてこの方法を反復し得るかのいずれかである。サンプルの複雑性に依存して、上記の工程は、好ましくは、このサンプルが、本発明の方法に従って、限定された数の物質または１つの物質のみを含むと同定されるまで、数回実行され得る。好ましくは、このサンプルは、物質または類似の化学的特性および／もしくは物理的特性を含み、そして最も好ましくは、これらの物質は、同一である。好ましくは、上記の方法に従って同定される化合物またはその誘導体は、さらに、植物育種または植物細胞および組織培養物における適用のために適切な形態で処方される。
【０２０１】
用語「初期活力（ｅａｒｌｙ  ｖｉｇｏｒ）」は、植物が初期発生の間に迅速に生長する能力をいい、そして発芽後の十分発達した根系および十分発達した光合成機構の首尾よい確立に関する。
【０２０２】
用語「倒伏に対する耐性」または「直立性（ｓｔａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）」は、植物が、自身を地面に固定する能力をいう。直立または半直立で生長する植物について、この用語はまた、悪条件（環境条件）下で直立した姿勢を維持する能力をいう。この形質は、根系の大きさ、深さおよび形態に関する。
【０２０３】
本明細書中で使用される場合、用語「接木する」は、２つの異なる植物の一部を共に連結して、これらが一緒に結合して樹液が流れ得るようにし、こうして、生長および発達し得る単一の新たな植物を形成することをいう。従って、接木は、以下の２つの部分からなる：（ｉ）下の部分は、本明細書中で台木といわれ、そして実質的に根系および茎の一部からなる、ならびに（ｉｉ）上の部分は、接ぎ穂または接木であり、これは、植物の気生部分を生じる。
【０２０４】
本明細書中で使用される場合、ｔｂｌａｓｔｎは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）ファミリーのプログラムの一部であるアラインメント手段をいう（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。ＢＬＡＳＴは、単離された類似性領域のみを共有する配列間の関係を検出するために、最適な局所的アラインメント（すなわち、２つの核酸配列またはタンパク質配列のある部分のアラインメント）の領域を同定する補助をする（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）。本発明において、プログラムのＢＬＡＳＴ  ２．０パッケージのｂｌａｓｔｎは、全てのリーディングフレームで動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して、トウモロコシのサイトカイニンオキシダーゼタンパク質配列を比較するために使用された（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。
【０２０５】
以下の実施例および図面は、本発明の例示の意味で与えられ、決して限定ではない。本願に含まれる全ての参考文献の内容は、参考として援用される。
【０２０６】
（実施例１．本発明の配列の簡単な説明）
【０２０７】
【表７】
2004535753.tif 000017
（実施例２．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の遺伝子をコードする候補サイトカイニンオキシゲナーゼの同定）
６個の異なる遺伝子は、トウモロコシ由来のサイトカイニンオオキシゲナーゼ遺伝子に類似の配列を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａから同定された（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２５５：３２８〜３３３、１９９９；Ｈｏｕｄａ−Ｈｅｒｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １７：６１５〜６２６；ＷＯ９９／０６５７１）。これらの遺伝子を、ｔｂｌａｓｔｎプログラムを使用する、トウモロコシタンパク質配列を用いて公的なゲノムデータベースからヌクレオチド配列の６−フレーム翻訳をスクリーニングすることによって見出した。これらの配列を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様遺伝子すなわちＡｔＣＫＸとして命名した。これらは、ＡｔＣＫＸ１〜ＡｔＣＫＸ６として任意に番号が付けられた。以下のリストは、これらの遺伝子の情報を要約する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓサイトカイニンオキシダーゼとトウモロコシサイトカイニンオキシダーゼとの間および異なるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓサイトカイニンオキシダーゼ間のタンパク質配列相違の近似によって例示するために、推定ＯＲＦ境界およびタンパク質配列を示す。示されるＯＲＦ境界およびタンパク質配列を、これらのＡｔＣＫＸ遺伝子の作用の形態についての結論的な証拠として受け取るべきでない。ＤＮＡおよびタンパク質配列の比較のために、ＤＮＡｓｔａｒ製のプログラムＭｅｇＡｌｉｇｎを使用した。このプログラムは、整列のためのＣｌｕｓｔａｌ方法を使用する。タンパク質およびｃＤＮＡ配列の多重整列に関して、ギャップペナルティーおよびギャップ長ペナルティーを、１０ごとに設定した。タンパク質のペアの整列に関して、パラメーターは、以下のようであった：Ｋタプルは、１；ギャップペナルティーは、３；ウィンドウは、５；保存された対角線は、５。ｃＤＮＡのペアの整列に関して、パラメーターは、以下のようであった：Ｋタプルは、２；ギャップペナルティーは、５；ウィンドウは、４；保存された対角線は、４。タンパク質整列に関する類似性の群は、以下であった：（Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）、（Ｆ、Ｗ、Ｙ）、（Ｇ、Ａ）、（Ｓ、Ｔ）、（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、（Ｅ、Ｄ）、（Ｎ、Ｑ）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとタンパク質配列間に示される値は、全ての組み合わせに見出される最も低い値および最も高い値を示す。
【０２０８】
（Ａ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ１）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質１、配列番号１）
（データベースの位置）（登録番号、ｂａｃにおける位置）：ＡＣ００２５１０、２５５の完全相補鎖のうちのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ染色体ＩＩセクション２２５。クローンＴ３２Ｇ６由来の配列。
【０２０９】
（データベースにおいて推定されるＯＲＦ：）
１５５１７．．１６１８３、１６４１５．．１６５４２、１６６３１．．１６８９１、１６９９５．．１７２５７、１７３４４．．１７７５２。
【０２１０】
ＡｔＣＫＸ１  ｃＤＮＡ配列を、配列番号２５として列挙する。
【０２１１】
（推定されるタンパク質配列：配列番号２）
（相同性）
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの同一性％：
３１，５％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との類似性％：
３２，２％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの同一性％（範囲）：
３８，２％（ＡｔＣＫＸ２）〜５４，１％（ＡｔＣＫＸ６）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質との類似性％（範囲）：
３７，１％（ＡｔＣＫＸ２）〜５８，１％（ＡｔＣＫＸ６）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
（Ｂ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ２）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質２、配列番号３）
（データベースの位置）（登録番号、ｂａｃにおける位置）：ＡＣ００５９１７、２５５の完全相補鎖のうちのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ染色体ＩＩセクション１１３．クローンＦ２７Ｆ２３、Ｆ３Ｐ１１由来の配列。
【０２１２】
（データベースにおいて推定されるＯＲＦ：）
相補鎖、４０７２１．．４１０１２、４１０５４．．４１３６４，４１５１３．．４１７７０、４２５３５．．４２６６２、４３１５３．．４３７１１。
【０２１３】
（以下に注意してください：）
遺伝子推定プログラムＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を使用して本発明者らによって同定されたｃＤＮＡ配列は、データベース中の注釈の配列と異なった。新しいｃＤＮＡ配列に基づいて、データベースにおいて推定されるＯＲＦを、修正した；
相補鎖、４０７２１．．４１０１２、４１０９５．．４１３６４、４１５１３．．４１７７０、４２５３５．．４２６６２、４３１５３．．４３７１１。このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質配列を、配列番号４として列挙する。ＡｔＣＫＸ２のｃＤＮＡを、一工程ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＡｔＣＫＸ２トランスジェニック植物組織の総ＲＮＡから、ＰＴ−ＰＣＲによってクローン化し、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ配列決定反応キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を使用して配列決定した。これは、本発明者によって同定および推定されたｃＤＮＡ配列が、正しかったことを確認した。新しいＡｔＣＫＸ２  ｃＤＮＡ配列を、配列番号２６として列挙する。ＡｔＣＫＸ２のｃＤＮＡのヌクレオチド１１７１〜１２５４の対応する８４ｂｐのフラグメントを、配列番号３１として列挙する。この８４ｂｐのｃＤＮＡ配列の対応ペプチド配列を、配列番号３２として列挙する。
【０２１４】
（相同性）
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの同一性％：
３８，４％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との類似性％：
３７，５％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの同一性％（範囲）：
３４，９％（ＡｔＣＫＸ６）〜６４，５％（ＡｔＣＫＸ４）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質との類似性％（範囲）：
３６，５％（ＡｔＣＫＸ６）〜６６，１％（ＡｔＣＫＸ４）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
（Ｃ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ３）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質３、配列番号５）
（データベースの位置）（登録番号、ｂａｃにおける位置）：ＡＢ０２４０３５、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａゲノムＤＮＡ、第５染色体、Ｐ１クローン：ＭＨＭ１７、完全配列。
【０２１５】
（データベースにおけるＯＲＦの推定なし）
この遺伝子を、ＧＲＡＩＬ（ｆｔｐ：／／ａｒｔｈｕｒ．ｅｐｍ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ｘｇｒａｉｌ）、Ｇｅｎｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ＣＣＲ−０８１．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）およびＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を含むいくつかの遺伝子推定プログラムを使用して本発明者らによって同定された：
相補鎖、２９４１５．．２９７１８、２９８１３．．３００８１、３０１８３．．３０４４３、３０５２９．．３０６５６、３２１０７．．３２７１６。本発明者らによって同定された新しいＡｔＣＫＸ３  ｃＤＮＡ配列を、配列番号２７として列挙する。
【０２１６】
（自身のＯＲＦ予測に基づく、推定されたタンパク質配列：配列番号６）
（相同性）
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの同一性％：
３８，７％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓタンパク質との類似性％：
３９，２％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの同一性％（範囲）：
３８，８％（ＡｔＣＫＸ６）〜５１，０％（ＡｔＣＫＸ２）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質との類似性％（範囲）：
３９，９％（ＡｔＣＫＸ６）〜４６，７％（ＡｔＣＫＸ２）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）  （Ｄ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ４（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質４、配列番号７））
（データベース中における位置（受託番号、ｂａｃ上の位置））
１）ＡＬ０７９３４４、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ第４染色体、ＢＡＣクローンＴ１６Ｌ４（ＥＳＳＡプロジェクト）
２）ＡＬ１６１５７５、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ第４染色体、コンティグフラグメント番号７１。
【０２１７】
（データベースにおける予測されるＯＲＦ）
１）７６１８７〜７６８１４、７７１８９〜７７３１６、７７８２３〜７８０８０、７８３１８〜７８５８６、７８６７７〜７８９６８
（２）１０１００２〜１０１６２９、１０２００４〜１０２１３１、１０２６３８〜１０２８９５、１０３１３３〜１０３４０１、１０３４９２〜１０３７８３
ＡｔＣＫＸ４  ｃＤＮＡ配列は、配列番号２８として列挙される。
【０２１８】
（予測されるタンパク質配列）
配列番号８。
【０２１９】
（相同性）
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
４１．０％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓ  タンパク質との％類似性：
４１．０％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの％同一性（範囲）：
３５．２％（ＡｔＣＫＸ６）〜６４．５％（ＡｔＣＫＸ２）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  タンパク質との％類似性（範囲）：
３５．１％（ＡｔＣＫＸ６）〜６６．１％（ＡｔＣＫＸ２）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）。
【０２２０】
（Ｅ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ５（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質５、配列番号９））
（データベース中における位置（受託番号、ｂａｃ上の位置））
ＡＣ０２３７５４、Ｆ１Ｂ１６、完全配列、第１染色体。
【０２２１】
（データベースにおけるＯＲＦの予測はない）
この遺伝子を、いくつかの遺伝子予測プログラム（ＧＲＡＩＬ（ｆｔｐ：／／ａｒｔｈｕｒ．ｅｐｍ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ｘｇｒａｉｌ）、Ｇｅｎｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ＣＣＲ−０８１．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）およびＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）が挙げられる）を使用して、本発明者らによって同定した。
【０２２２】
４３７５６〜４４３４７、４４４３５〜４４５６２、４４７００〜４４９６６、４５４９３〜４５７５５、４６２００〜４６５６０。
【０２２３】
本発明者らによって同定され、そして予測された新規なＡｔＣＫＸ５  ｃＤＮＡ配列を、配列番号２９として列挙する。このｃＤＮＡについての予測されるタンパク質配列を、配列番号１０として列挙する。第２の潜在的なＡＴＧ開始コドンは、ゲノム配列において、９ヌクレオチド上流に存在する。これら２つの開始コドンのどちらが、タンパク質の第１のアミノ酸をコードするのかは、不明である。従って、この上流の開始コドンから開始する第２の潜在的なＡｔＣＫＸ５  ｃＤＮＡもまた、本明細書中に配列番号３４として列挙する。対応するゲノム配列を、配列番号３３、およびコードされるタンパク質を配列番号３５として列挙する。
【０２２４】
（相同性）
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
３９．１％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓ  タンパク質との％類似性：
３６．６％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの％同一性（範囲）：
４０．１％（ＡｔＣＫＸ２）〜４４．０％（ＡｔＣＫＸ３）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  タンパク質との％類似性（範囲）：
４１．６％（ＡｔＣＫＸ４）〜４６．４％（ＡｔＣＫＸ６）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）。
【０２２５】
（Ｆ．遺伝子名：ＡｔＣＫＸ６（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質６、配列番号１１））
（データベース中における位置（受託番号、ｂａｃ上の位置））
ＡＬ１６３８１８、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ  第３染色体、Ｐ１クローン  ＭＡＡ２１（ＥＳＳＡプロジェクト）。
【０２２６】
（データベースにおける予期されるＯＲＦ）
４６６３０〜４７２１５、４７３４３〜４７４７０、４７５９１〜４７８０６、４７８９９〜４８１６１、４８２４４〜４８５６５．
ＡｔＣＫＸ６  ｃＤＮＡ配列は、配列番号３０に列挙される。
【０２２７】
（予測されるタンパク質配列）
配列番号１２。
【０２２８】
（相同性）
Ｚ．ｍａｙｓ  ｃＤＮＡとの％同一性：
３７．３％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
Ｚ．ｍａｙｓ  タンパク質との％類似性：
３６．１％（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡとの％同一性（範囲）：
３４．９％（ＡｔＣＫＸ２）〜５４．１％（ＡｔＣＫＸ１）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）
他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  タンパク質との％類似性（範囲）：
３５．１％（ＡｔＣＫＸ４）〜５８．１％（ＡｔＣＫＸ１）（Ｄｎａｓｔａｒ／ＭｅｇＡｌｉｇｎ−Ｃｌｕｓｔａｌ法）。
【０２２９】
遺伝子ＡｔＣＫＸ３およびＡｔＣＫＸ５は、データベースにおいて推定サイトカイニンオキシダーゼとして注釈がつけられず、そしてこれらの遺伝子についてのＯＲＦは得られなかった。さらに、ＡｔＣＫＸ２について予測されるＯＲＦ（および、結果的にタンパク質構造）は、本発明者ら自身の予測と異なり、そして本発明者らの予測は、ＡｔＣＫＸ２  ｃＤＮＡの配列決定によって確認された。
【０２３０】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸ遺伝子１〜４およびトウモロコシＣＫＸ遺伝子の遺伝子構造の比較を、図１に示す。
【０２３１】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸ遺伝子によってコードされる予測されるタンパク質は、トウモロコシタンパク質と３２％と４１％との間の配列類似性を示し、一方、これらは互いに３５％と６６％との間の配列類似性を示す。この減少した配列保存に起因して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸ遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするか否かという推測は、明確ではない。タンパク質１〜４と予測されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＣＫＸ遺伝子の整列およびトウモロコシＣＫＸ遺伝子を、図２に示す。
【０２３２】
（実施例３．ＡｔＣＫＸ１を過剰発現するトランスジェニック植物は、上昇したサイトカイニンオキシダーゼ活性および変更された植物形態を示した）
（１．クローニング方法の説明）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  受託Ｃｏｌｕｍｂｉａ由来のＡｔＣＫＸ１遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのために使用される非相同配列は、小文字である）：
５’プライマーの配列：ｃｇｇｔｃｇａｃＡＴＧＧＧＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＡＣＧ（配列番号１３）
３’プライマーの配列：ｇｃｇｔｃｇａｃＴＴＡＴＡＣＡＧＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＣＧＧＣＡＧＴＡＴ（配列番号１４）。
【０２３３】
２２３５ｂｐのＰＣＲフラグメント（これらのプライマーによって増幅される）を、ｐＵＣ１９のＳａｌ  Ｉ部位に挿入した。この挿入物を配列決定し、そしてＰＣＲ増幅産物が、いずれの変異も含まないことを確認した。このベクターのＳａｌＩ／ＳａｌＩフラグメントを、２成分ベクターｐＢｉｎＨｙｇ−Ｔｘにおける改変ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３つのテトラサイクリンオペレーター配列を保有する）の下流のＳａｌＩ部位においてサブクローニングした（Ｇａｔｚら、１９９２）。生じた構築物を、標準的な形質転換プロトコールを使用して、タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を介して導入した。
【０２３４】
（２．トランスジェニック系の分子分析）
ＡｔＣＫＸ１転写物を高レベルで合成する、いくつかのトランスジェニック系を同定した（図３）。ＡｔＣＫＸ１転写物を発現するトランスジェニック系もまた、記載されるような（Ｍｏｔｙｋａら、１９９６）、アデニンに対する［２−３Ｈ］ｉＰの保存に基づくサイトカイニンオキシダーゼ活性についての標準的なアッセイによって決定されるような、上昇するサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。
【０２３５】
これは、表６において、２つのタバコ系および２つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系についての例示である。この結果で、ＡｔＣＫＸ１遺伝子は、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることが証明された。
【０２３６】
（表６．ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ活性）
【０２３７】
【表８】
2004535753.tif 000018
（３．トランスジェニック系における表現型の説明）
（３．１  タバコにおいて）
この植物は、減少した頂芽優性を有する小型化表現型（図７Ａ、ＢおよびＣ）および増加した根の産生（図８）を有する。
【０２３８】
（表現型の５つの分類）
１）強い−２つのクローン
２）中間−３つのクローン
３）弱い−４つのクローン
４）大きな花序を有する背の高い植物（ＷＴとして）−５つのクローン
５）ＷＴと類似−９つのクローン。
【０２３９】
（高さ（図７ＢおよびＣを参照のこと））
−ＷＴ：１００〜１５０ｃｍの間
−弱い：約７５ｃｍ
−中間：約４０〜４５ｃｍ（主茎は約２５ｃｍだが、側枝が過成長した）
−強い：約１０ｃｍ。
【０２４０】
トランスジェニックＡｔＣＫＸ１−４８およびＡｔＣＫＸ１−５０は、強い表現型を示した。以下は、ＷＴ植物と比較した幹の伸長についての測定である。
【０２４１】
【表９】
2004535753.tif 000019
（実験）
植物を、温室において、土壌で育てた。データを、系あたり少なくとも１０個の植物から収集した。
【０２４２】
（葉（図７ＤおよびＥを参照のこと））
ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック発現体の葉の形は、皮針形（より長く、かつ細い）であった：成熟葉の幅  対  長さの比は、野生型植物における１：２からＡｔＣＫＸ１トランスジェニックにおける１：３に減少した（図７Ｅ）。葉の数および葉の表面は、ＷＴと比較して減少した（図７Ｄを参照のこと）。顕著な相違もまた、葉の老化の進行について注目された。ＷＴタバコにおいて、葉の老化は、最も根元の葉において開始し、そして葉の色素の均一な減少を誘導する（図７Ｅ）。対照的に、強くＡｔＣＫＸ１を発現する植物の老化した葉は、葉脈にそって緑色のままであり、そして葉脈間の領域において黄色に変わり、これは、葉の老化が代わったことを示した。より年を取った葉の組織であればあるほど、より堅くなった。
【０２４３】
（根）
高度にこの遺伝子を発現する、インビトロで生育した植物は、より厚い（より強固な）根をより多く形成する能力（図８Ａ）によって、およびこの幹に沿った気根の形成によって、この野生型から容易に識別可能であった。
【０２４４】
実生を過剰発現するＡｔＣＫＸ１−５０について図８Ｃに例示したように、一次根はより長く、側根および不定根の数はより多かった（図９もまた参照のこと）。外因性サイトカイニンによる根成長阻害の用量応答曲線は、トランスジェニック実生の根が野生型の根よりサイトカイニン耐性であることを示した（図８Ｄ）。ｉＰＲに対するＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体の耐性は、ＡｔＣＫＸ２についてより顕著ではなかった。このことは、後者におけるｉＰ型サイトカイニンのより小さい変化と一致する（図１０を参照のこと）。空気中の植物部位（ａｅｒｉａｌ  ｐｌａｎｔ  ｐａｒｔｓ）が高度に減少したという事実にもかかわらず、根バイオマスの大きな増加が、土壌で生育させた成体植物について観察された（４〜５ヶ月間、土壌で生育した植物については、図８Ｂ参照のこと）。
【０２４５】
（節間距離）
・中間の表現型：野生型植物における花序の下の５番目および９番目の節間がそれぞれ５ｃｍおよび２ｃｍであることに比較して、花序の下の５番目の節間は約２．５ｃｍ長であって、そして９番目の節間は約０．５ｃｍ長であった。
【０２４６】
・強い表現型：植物ＡｔＣＫＸ１−５０  発芽後１３１日目に測定した下から２０番目の節間の長さは、野生型についての３９．２±３．８ｍｍと比較して、１．３±０．４ｍｍであった。
【０２４７】
（頂芽優性および分枝）
より多くの側枝が形成され、このことは、植物成長期（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ）の野生型植物と比較して、頂芽優性の減少を示す（図９を参照のこと）。側枝は主幹を過剰成長させ、中間のＡｔＣＫＸ１発現体については４０〜４５ｃｍの高さに達した。さらに、二次枝（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｂｒａｎｃｈ）さえも現れた。しかし、このつぼみは、頂芽優性から完全には解放されなかった。すなわち、側枝は実際に発生し続けることはなかった。この頂芽優性の減少は、より小さい苗条の頂端分裂組織によるオーキシン産生の減少に起因し得る（図１０を参照のこと）。
【０２４８】
（生殖発生）
ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体の開花の開始は遅れ、その花の数およびさく果あたりの種子収量は減少した。花のサイズは、トランスジェニック植物では変化せず、個々の種子の質量は、野生型植物由来の種子の質量に匹敵する。２つの代表的なＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体についてのデータを以下に要約する：
（Ａ．開花の開始）
【０２４９】
【表１０】
2004535753.tif 000020
実験：１系統あたり少なくとも１０体の植物についてデータを収集した。最初の花の完全な伸長を、開花の開始として定義した。ＤＡＧ＝発芽後の日数。
【０２５０】
（Ｂ．１植物あたりの種子さく果数）
【０２５１】
【表１１】
2004535753.tif 000021
実験：種子さく果数を、少なくとも５体の異なった植物から決定した。これらの植物を、冬季の間、温室環境下で生育させたことに留意のこと。これは、特にトランスジェニッククローンにおいて形成される花の数にネガティブな影響を与える。しかし、これら花の数を減少して形成するという一般的な図式は正しい。
「ｎ．ｄ．」は、「決定されず」である。
【０２５２】
（Ｃ．種子収量／さく果（ｍｇ））
【０２５３】
【表１２】
2004535753.tif 000022
実験：種子収量は、少なくとも１２の種子さく果について決定した。この種子さく果のサイズは、非常に変化し、従って標準偏差は大きい。「ｎ．ｄ．」は、「決定されず」である。
【０２５４】
（Ｄ．１００個の種子の質量（ｍｇ））
【０２５５】
【表１３】
2004535753.tif 000023
実験：種子バイオマスを、少なくとも５個の異なる種子さく果からの１００種子の質量として決定した。「ｎ．ｄ．」は、「決定されず」である。
【０２５６】
（３．２  シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））
−発芽の開始は野生型と同じであった。
【０２５７】
−全ての根系が拡大され、そして側根および不定根の数は増大された（図４Ａ〜４Ｄを参照のこと）。
【０２５８】
−気器官（ａｅｒｉａｌ  ｏｒｇａｎ）の成長は減少され、矮小表現型を生じ（図４Ｅおよび図４Ｆを参照のこと）、そして葉のバイオマスも減少した。葉および花の形成は遅延した。
【０２５９】
−これの生活環は、野生型に比べより長く、そしてこの種子収量は野生型に比べより小さい。
以下の形態計測データは、これらの表現型を例示する：
（根の発生）
【０２６０】
【表１４】
2004535753.tif 000024
実験：測定を、ＭＳ培地上のインビトロにて、発芽後８日目の植物について実施した。１系統あたり少なくとも１７体の植物を、スコア付けした。
【０２６１】
（苗条発生）
（Ａ．葉表面）
【０２６２】
【表１５】
2004535753.tif 000025
実験：発芽後３０日に形成された主要なロゼッタ葉の葉表面積を測定した。１クローンあたり３体の植物を分析した。
【０２６３】
（生殖発生）
（開花の開始）
【０２６４】
【表１６】ｐ７８下
2004535753.tif 000026
実験：植物を温室条件下にて生育させた。１クローンあたり少なくとも１３体の植物を分析した。ＤＡＧ＝発芽後の日数。
【０２６５】
結論：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックシロイヌナズナ植物の分析は、タバコから得られた結果を大いに確証付けし、そして減少したサイトカイニン含有量の結果の一般的な性質を示す。全ての根系は拡大し（全根長は、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体において約１１０〜１４０％増加した）、苗条は、よりゆっくりと発生し（開花を遅らせた）、葉のバイオマスは減少した。種子収量は、同様にトランスジェニック体において、より低い（データを示さず）。
【０２６６】
（実施例４：ＡｔＣＫＸ２を過剰発現するトランスジェニック植物は、増大したサイトカイニンオキシダーゼ活性および変化した植物の形態を示した）
（１．クローニングプロセスの説明）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ由来のＡｔＣＫＸ２遺伝子（クローニングのために使用した非相同性配列は小文字である）をＰＣＲ増幅した：
【０２６７】
【表１７】
2004535753.tif 000027
。
これらのプライマーによって増幅された３１０４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ｐＵＣ１９のＫｐｎＩ部位に挿入した。この挿入物を配列決定し、公開された配列に対して差異が、ＰＣＲ手順によって導入されていないことを確認した。このベクターのＫｐｎＩ／ＫｐｎＩフラグメントを、２成分ベクターｐＢｉｎＨｙｇ−Ｔｘ中の改変したＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３つのテトラサイクリンオペレーター配列を保持している）の下流のＫｐｎＩ部位にサブクローニングした（Ｇａｔｚら、１９９２）。得られた構築物を、標準的な形質転換プロトコルを使用するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質手転換を通してタバコ、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに導入した。
【０２６８】
（２．トランスジェニック系統の分子分析）
ＡｔＣＫＸ２転写物を高いレベルで合成する、いくつかのトランスジェニック系統を同定した（図６）。ＡｔＣＫＸ２転写物を発現するトランスジェニック系統はまた、増大したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは２つのタバコ系統および３つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系統について、表７中で例示する。この結果は、ＡｔＣＫＸ２遺伝子がサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明した。
【０２６９】
（ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック植物組織でのサイトカイニンオキシダーゼ活性）
【０２７０】
【表１８】
2004535753.tif 000028
（３．トランスジェニック系統の表現型の説明）
（３．１  タバコにおいて（図７〜図１０））
表現型の３つのカテゴリー：
１）強−１５つのクローン（ＡｔＣＫＸ１の中間の表現型に類似）
２）弱−６つのクローン
３）その他−野生型植物に類似、７つのクローン。
【０２７１】
（空気中の植物部位）
矮化特性がＡｔＣＫＸ２トランスジェニック体よりＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体においてより重篤である（ＡｔＣＫＸ１植物とＡｔＣＫＸ２植物とを、図７Ａおよび図７Ｂにて比較した）という点で、いくつかの軽微な量的差異を有する、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体に関して、植物の高さ、節間距離、分岐、葉の形態および黄変に関する観察は、類似していた。これを、強い表現型ＡｔＣＫＸ２−３８およびＡｔＣＫＸ２−４０を有するクローンの幹伸長および節間距離の測定について、以下に例示する：
（幹の伸長）
【０２７２】
【表１９】
2004535753.tif 000029
実験：植物を温室における土壌で生育させた。データを、系統あたり少なくとも１０体の植物から収集した。
【０２７３】
（節間距離）
【０２７４】
【表２０】
2004535753.tif 000030
実験：その下から２０番目の節間を、発芽後１３１日目で測定した。
【０２７５】
（根）
高度にこの遺伝子を発現する、インビトロで生育した植物は、より厚い（より強固な）根をより多く形成する能力によって、およびこの幹に沿った気根の形成によって、野生型植物から容易に識別可能であった。
【０２７６】
実生を過剰発現するＡｔＣＫＸ２−３８について図８Ｃに例示したように、主根はより長く、側根および不定根の数はより多かった（図９もまた参照のこと）。
【０２７７】
外因性サイトカイニンによる根成長阻害の用量応答曲線は、トランスジェニック実生の根が野生型の根よりサイトカイニン耐性であることを示した（図８Ｄ）。ｉＰＲに対するＡｔＣＫＸ１−２８のトランスジェニック体の耐性は、ＡｔＣＫＸ２−３８についてより顕著ではなかった。このことは、後者におけるｉＰ型サイトカイニンのより小さい変化と一致する（図１０を参照のこと）。
【０２７８】
ＷＴと比較した、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニック植物のＴＯ株の根のバイオマスの新鮮な状態の重量および乾燥重量の増加を、以下の表に示されるように、土壌で成長する植物について観察した：
【０２７９】
【表２１】
2004535753.tif 000031
実験：６つのＷＴ植物および３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ２クローンの６つの独立したＴ０株を、土壌上で成長させた。開花後、根系を、水で洗浄し、そして土壌をできる限り取り除き、そして新鮮な状態の重量および乾燥重量を測定した。
【０２８０】
根バイオマスの新鮮な状態の重量および乾燥重量をまた、以下の表に示されるように、ＷＴに比較して、水耕法で成長されたＡｔＣＫＸ２のトランスジェニックのＦ１子孫について観察した：
【０２８１】
【表２２】
2004535753.tif 000032
実験：土壌成長植物を、発芽後６０日間水耕システム（Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液）に移し、そしてさらの６０日間成長させた。水耕溶液を、連続的に通気し、そして３日ごとに新鮮な溶液と置換した。
【０２８２】
要約すると、水耕溶液中で成長されたトランスジェニック植物は、野生型植物よりも約６５〜１５０％より多い根バイオマス（新鮮な状態の重量）を形成した。乾燥重量の増加は、１０〜５０％であった。この差は、おそらくトランスジェニックのより大きい細胞容積に部分的に起因する。このことは、細胞壁の関連部分を減少させ、この壁は、乾燥物質の大部分を形成する。シュートバイオマスは、野生型シュートの２０％〜７０％に減少した。新鮮な状態における重量の差異は、シュート／根の比の移動を導き、これは、野生型において約８であったが、トランスジェニッククローンにおいては、約１であった。
【０２８３】
（結論）
空気中の植物部分の成長が減少されているという事実にも関わらず、根成長およびバイオマスの増加を、ＷＴコントロールと比較して異なる条件下で成長したＡｔＣＫＸ２トランスジェニックイネおよび成体植物について観察した。異なるトランスジェニック植物間の定量的な差を観察した：根バイオマスのより大きな増加を、最も強力に発現するクローンについて観察した。
【０２８４】
（再生的発達）
ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックにおける開花の開始を遅らせ、そしてさく果当たりの花および種子の数を減少させた。これらの効果は、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物において観察された効果と非常に類似したが、以下の表に示されるように、これらはＡｔＣＫＸ２トランスジェニックにおいてあまり主要ではなかった。花の大きさは、トランスジェニック植物において変更されず、そして個々の種子の重量は、野生型植物由来の種子の重量に匹敵した。
【０２８５】
（Ａ．開花の開始）
【０２８６】
【表２３】
2004535753.tif 000033
実験：データを、１株あたり少なくとも１０の植物について収集した。第一の花の完全な伸長を、開花の開始として規定した。ＤＡＧ＝発芽後の日数。
【０２８７】
（Ｂ．植物あたりの種子さく果の数）
【０２８８】
【表２４】
2004535753.tif 000034
実験：種子さく果の数を、少なくとも５つの異なる植物から決定した。これらの植物は、冬季の間は温室条件下で成長されたことに注意のこと。このことは、特にトランスジェニッククローンにおいて、形成される花の数にネガティブに影響した。しかし、それらが減少した数の花を形成するという一般的な想像は正しい。ｎ．ｄ．，未決定。
【０２８９】
（Ｃ．種子収量／さく果（ｍｇ））
【０２９０】
【表２５】
2004535753.tif 000035
実験：種子収量を、少なくとも１２の種子さく果について決定した。種子さく果のサイズは、非常の多種であり、従って大きな標準偏差であった。ｎ．ｄ．、未決定。
【０２９１】
（Ｄ．１００個の種子の重量（ｍｇ））
【０２９２】
【表２６】
2004535753.tif 000036
実験：種子バイオマスを、少なくとも５つの異なる種子さく果からの１００個の種子の重量として決定した。ｎ．ｄ．、未決定。
【０２９３】
（３．２  シロイヌナズナにおいて）
以下の形態計測データを、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックについて得た：
（根の発達）
【０２９４】
【表２７】
2004535753.tif 000037
実験：測定を、ＭＳ培地上で、インビトロで、８ｄ．ａ．ｇ．の植物に対して行った。１株あたり少なくとも１７の植物をスコア付けした。
【０２９５】
（シュート発達）
（葉の表面）
【０２９６】
【表２８】
2004535753.tif 000038
実験：発芽を測定した後の３０日後に形成された、主ロゼットリーフ（ｍａｉｎ  ｒｏｓｅｔｔｅ  ｌｅａｆ）の葉の表面積を測定した。１クローンあたり３つの植物を分析した。
【０２９７】
（再現的発達）
（開花の開始）
【０２９８】
【表２９】
2004535753.tif 000039
実験：植物を、温室条件下で増殖させた。１クローンあたり少なくとも１３の植物を分析した。ＤＡＧ発芽後の日数。
【０２９９】
（結論）
シロイヌナズナＡｔＣＫＸ２トランスジェニックは、減少した葉バイオマスおよびＡｔＣＫＸ１トランスジェニックに類似する矮化（ｄｗａｒｆｉｎｇ）表現型を有した（図５と図４Ｆとを比較のこと）。全根系はまた、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックシロイヌナズナにおいて大きくなった。全根長は、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックにおいて約５０％増加した。このＡｔＣＫＸ１トランスジェニックは、より長い主根、より多くの横方向の（ｓｉｄｅ）根を有し、そしてより外因性の根を形成する。ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックは、主根の増大した成長を欠くが、ＷＴよりも多くの横方向の根および側根を形成する。
【０３００】
（まとめ）
ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックについて観察された表現型は、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックに非常に類似するが、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックに同一ではなく、このＡｔＣＫＸ１トランスジェニックは、次いで、タバコトランスジェニックについて得られた結果に非常に類似するが同一ではなかった。このことは、これらの２つの植物種における減少したサイトカイニン含量の結果の一般的な性質を確認し、従って、類似の表現型が、同様に他の植物種において期待され得る。タバコとシロイヌナズナとの間の主な差は、ＡｔＣＫＸ２過剰発現植物における増加した主根成長の欠如である（データは、示されず）。
【０３０１】
（実施例５．ＡｔＣＫＸ３を過剰発現するトランスジェニック植物は、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性および変更された植物形態を示した）
（１．クローニングプロセスの説明）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ由来のＡｔＣＫＸ３遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのために使用される非相同性配列は以下の場合である）：
５’プライマーの配列：ｇｃｇｇｔａｃｃＴＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＧＡＡＴＣＡＡＧＣＴＡＴＴＣＡ（配列番号１７）
３’プライマーの配列：ｇｃｇｇｔａｃｃＣＡＡＡＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＣＧＡＣＴＡＡＣＡ（配列番号１８）
このＰＣＲ増幅によって生成される３３９７−ｂｐ  ＰＣＲフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＫｐｎｌ部位に挿入した。この挿入物を配列決定して、ＰＣＲ産物が、この遺伝子と比較して配列の変化を有さないことを確認した。このベクターのＫｐｎｌ／Ｋｐｎｌフラグメントを、二成分ベクターｐＢｉｎＨｙｇ−Ｔｘ（Ｇａｔｚら、１９９２）中の改変ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３つのテトラサイクリンオペレーター配列を保有する）の下流のＫｐｎｌ部位にサブクローニングした。この得られた構築物を、標準的な形質転換プロトコルを使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を通してタバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに導入した。
【０３０２】
（２．トランスジェニック株の分子分析）
ＡｔＣＫＸ３転写物を高レベルで合成するいくつかのトランスジェニックタバコ株を同定した（図１１Ａ）。ＡｔＣＫＸ３転写物を発現するトランスジェニックタバコ株はまた、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表８において３つの植物に対して例示される。このことは、ＡｔＣＫＸ３遺伝子がサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明する。
【０３０３】
（表８．ＡｔＣＫＸ４トランスジェニック植物組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ活性）
【０３０４】
【表３０】
2004535753.tif 000040
（３．植物表現型分析）
タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＡｔＣＫＸ３遺伝子の過剰発現によって生成される表現型は、ＡｔＣＫＸ１およびＡｔＣＫＸ２発現植物の表現型と基本的に類似した（すなわち、増加した発根および矮化）。しかし、タバコにおけるＡｔＣＫＸ３遺伝子の過剰発現は、ＡｔＣＫＸ２と比較して強力な表現型を生じた。この意味において、ＡｔＣＫＸ３過剰発現は、ＡｔＣＫＸ１過剰発現により類似した。
【０３０５】
（実施例６．ＡｔＣＫＸ４を過剰発現するトランスジェニック植物は、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性および変化した植物形態を示した）
（１．クローニングプロセスの説明）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ由来のＡｔｃＫＸ４遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのために使用される非相同性配列は以下の場合である）：
５’プライマーの配列：ｇｃｇｇｔａｃｃＣＣＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＣＣＣＧＴＴＴＧ（配列番号１９）
３’プライマーの配列：ｇｃｇｇｔａｃｃＡＧＡＣＧＡＴＧＡＡＣＧＴＡＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡ（配列番号２０）
このＰＣＲ増幅によって生成される２８９０−ｂｐ  ＰＣＲフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＫｐｎｌ部位に挿入した。この挿入物を配列決定して、ＰＣＲ産物が、この遺伝子と比較して配列の変化を有さないことを確認した。このベクターのＫｐｎｌ／Ｋｐｎｌフラグメントを、二成分ベクターｐＢｉｎＨｙｇ−Ｔｘ（Ｇａｔｚら、１９９２）中の改変ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（３つのテトラサイクリンオペレーター配列を保有する）の下流のＫｐｎｌ部位にサブクローニングした。この得られた構築物を、標準的な形質転換プロトコルを使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を通してタバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに導入した。
【０３０６】
（２．トランスジェニック株の分子分析）
ＡｔＣＫＸ４転写物を高レベルで合成するいくつかのトランスジェニックタバコ株を同定した（図１１Ｂ）。ＡｔＣＫＸ４転写物を発現するトランスジェニック株はまた、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表９において３つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよび３つのタバコに対して例示される。このことは、ＡｔＣＫＸ４遺伝子がサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明する。
【０３０７】
（表９．ＡｔＣＫＸ４トランスジェニック植物組織におけるサイトカイニンオキシダーゼ活性）
【０３０８】
【表３１】
2004535753.tif 000041
概して、このデータは、４つのサイトカイニンオキシダーゼについての見かけのＫｍ値が、基質としてのｉＰとともに０．２〜９．５μＭの範囲にあることを示し、このことはさらに、ＡｔＣＫＸ１〜４によってコードされるタンパク質が、実際に、本明細書に開示されるようなサイトカイニンオキシダーゼ酵素であることを実証する。
【０３０９】
（３．植物表現型分析）
タバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＡｔＣＫＸ４遺伝子の過剰発現によって生成される表現型は、ＡｔＣＫＸ１およびＡｔＣＫＸ２発現植物の表現型と基本的に類似した（すなわち、増加した発根、減少した頂芽優性、矮化、タバコの古い葉における葉脈間領域の黄変）。タバコにおけるさらなる表現型は、皮針形葉（変更された長さ−幅比）であった。
【０３１０】
（ＡｔＣＫＸを過剰発現するタバコ植物の一般的な観察）
概して、表現型分析は、ＡｔＣＫＸ遺伝子過剰発現が、タバコの植物シュートおよび根系において劇的な発達変更を引き起すことを実証し、この変更には、根系の増加した発達および空気中の植物部分の矮化が挙げられる。他の効果（例えば、変更された葉の老化、茎での不定根の形成など）もまた、本明細書に開示されるように観察された。これらの変更は、異なる遺伝子に対して、非常に類似するが、同一でなかった。タバコにおいて、ＡｔＣＫＸ１およびＡｔＣＫＸ３過剰発現体（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）は、ＡｔＣＫＸ２およびＡｔＣＫＸ４に類似した。一般に、前者の２つは、特にシュートにおいて、形質のより高い発現を示した。従って、特定のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子は、本発明の実施形態に記載される表現型を達成するために好ましくあり得る。
【０３１１】
（実施例７．ＡｔＣＫＸ５遺伝子のクローニング）
以下のプライマーを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ由来のＡｔｃＫＸ５遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングのために使用される非相同性配列は以下の場合である）：
５’プライマーの配列：ｇｇｇｇｔａｃｃＴＴＧＡＴＧＡＡＴＣＧＴＧＡＡＡＴＧＡＣ（配列番号２１）
３’プライマーの配列：ｇｇｇｇｔａｃｃＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴ（配列番号２２）
５’プライマーの配列は、ＡｔＣＫＸ５タンパク質の２つの潜在的な開始コドンを含み、最高の５’開始コドンは、下線を引かれ、そして第二のＡＴＧが、斜字体で示される。このＰＣＲ増幅によって生成された、２８４３−ｂｐ  ＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に平滑末端産物として挿入した。
【０３１２】
（実施例８．ＡｔＣＫＸ６遺伝子のクローニング）
以下のプライマーを用いて、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）からＡｔＣＫＸ６遺伝子をＰＣＲ増幅した（クローニングに用いた非相同配列を小文字で示す）。
【０３１３】
【表３２】
2004535753.tif 000042
このＰＣＲ増幅により生成された１９４９ｂｐのＰＣＲフラグメントを、平滑末端産物としてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。
【０３１４】
（実施例９．タバコ実生生長試験はＡｔＣＫＸトランスジェニック体の早期の生長力を実証した）
ＡｔＣＫＸ１−５０およびＡｔＣＫＸ２−３８を過剰発現するトランスジェニック体およびＷＴタバコの種子を、インビトロでＭＳ培地に蒔き、冷却処理の４日後に培養室に移し、そして６日後に発芽した。実生生長に対する観察を発芽の１０日後に実施し（図８Ｃもまた参照のこと）そしてこれを以下に要約する。１つのクローン当たり少なくとも２０の個体をスコア付けした。２つのほかの実験において同様のデータを獲得した。
【０３１５】
【表３３】
2004535753.tif 000043
（ＡｔＣＫＸ１およびＡｔＣＫＸ２植物、全体的な観察）
ＡｔＣＫＸ１およびＡｔＣＫＸ２を過剰発現するタバコ植物の実生は、発芽１０日後の形質転換していないコントロール植物よりも６０％多い不定根および３倍多い側根を有した。一次根の長さは、約７０％増加した。このことは（より多く、より長い副根（ｓｉｄｅ  ｒｏｏｔ）および二次根と共に）、根の長さの合計において７０〜１００％の増加を生じた。これらの結果は、サイトカイニンオキシダーゼの過剰発現が、主根および不定根の両方の生長および発達を増強し、早期の生長力を生じることを示した。
【０３１６】
（実施例１０．ＡｔＣＫＸ１を過剰発現するタバコ植物における変化した植物形態の組織学的分析）
異なる組織の顕微鏡分析によって、ＡｔＣＫＸトランスジェニック体における形態的変化が、細胞数および細胞形成の速度における顕著な変化により反映されることが明らかになった（図１０を参照のこと）。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体の茎頂分裂組織（ＳＡＭ）は、野生型におけるＳＡＭよりも小さく、そして僅かな細胞が側方器官形成の中心区域と末端区域との間の空間を占めるが、細胞は同じ大きさである（図１０Ａ）。減少したサイトカイニン含有量の結果としての減少した細胞数およびＳＡＭの大きさは、サイトカイニンがＳＡＭ増殖の制御において役割を果たすことを示す。分化パターンにおける明らかな変化は生じなかった。このことは、ＳＡＭにおける分化区域の空間的な組織化が、細胞数および局部的なサイトカイニン濃度から主に独立していることを示唆する。サイトカイニンオキシダーゼ過剰発現体における葉の全体的な組織パターンは、変化しなかった。しかし、師部および木部の大きさは、有意に減少した（図１０）。対照的に、柔組織および表皮細胞の平均細胞サイズは、４〜５倍増加した（図１０Ｃ、Ｄ）。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体の新規細胞を、野生型の葉の３〜４％の割合で形成し、そして最終的な葉細胞数を、野生型の５〜６％の範囲であると概算した。このことは、細胞分裂周期を維持するために葉においてサイトカイニンが絶対的に必要であることを示す。花器の細胞サイズも細胞形態も変化せず、そして１つの朔果（ｃａｐｓｕｌｅ）あたりに生成される種子は、野生型およびＡｔＣＫＸトランスジェニック植物において同様であった。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物の根分裂組織の細胞集団は、約４倍拡大し、そして中心柱および側方柱の両方における細胞数を増強した（図１０Ｅ、Ｆ）。最終的な根の直径は、全ての細胞型の根細胞の増加した直径に起因して６０％増加した。放射状の根のパターンは、野生型およびトランスジェニック体において同一であった（しばしば皮質細胞の第４層がトランスジェニック体の根において顕著であることを除く）（図１０Ｇ）。増加した細胞数およびわずかに減少した細胞長は、増強された根の生長が、増加した細胞増殖よりも増加した数の循環細胞に起因することを示す。低下したサイトカイニン含有量の存在下では、根分裂組織細胞は、それらが分裂組織を離れ、そして伸長を開始する前にさらなるラウンドの有糸分裂を生じなければならない。従って、分裂組織からの出口は、サイトカイニンに感受性の機構により調節される。明らかに、サイトカイニンは、根分裂組織においてネガティブな調節の役割を有し、そして野生型サイトカイニン濃度は、最大の根系の発達に阻害的である。従って、サイトカイニンオキシダーゼを過剰発現させることにより活性サイトカイニンのレベルを減少させることは、根の発達を刺激し、ＷＴ植物と比較してより多くの側根および不定根を伴い、根の大きさにおける増加を引き起こす。
【０３１７】
（実施例１１．ＡｔＣＫＸ１およびＡｔＣＫＸ２を過剰発現させたタバコ植物は、減少したサイトカイニン含有量を有する）
測定された１６の異なるサイトカイニン代謝の間に、最も大きな変化が、ＡｔＣＫＸ２過剰発現体におけるｉＰ型サイトカイニンにおいて生じた（表１０）：ｉＰ型サイトカイニンの含有量における全体的な減少は、ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体よりもＡｔＣＫＸ２発現植物においてより顕著であった。ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック体は、苗条においてより強い表現型を示した。どのサイトカイニン代謝物が分析された異なる特徴について関連しているかは未知である。それは、異なるサイトカイニン形態が、種々の発達プロセスにおいて異なる役割を果たすということかもしれない。より小さい変化は、Ｚ型サイトカイニンについて注目された。これは、物質の異なる接近性またはタンパク質のより低い基質特異性に起因し得る。個々のトランスジェニッククローンにおけるｉＰおよびＺ代謝物質の総量は、野生型の３１％〜６３％の間であった。Ｏ−グルコシドのサイトカイニン貯蔵プールもまた、トランスジェニック体において低下した（表１０）。Ｎ−グルコシドおよびＤＨＺ型サイトカイニンの濃度は非常に低く、そしてトランスジェニック実生において変化しないか、またはわずかに変化するのみであった（データは示していない）。
【０３１８】
（表１０．ＡｔＣＫＸトランスジェニック植物のサイトカイニン含有量）サイトカイニン抽出、免疫精製、ＨＰＬＣ分離、およびＥＬＩＳＡ法による定量を、Ｆａｉｓｓら（１９９７）により記載されるように実施した。約１００の２週齢の実生の３つの独立してプールしたサンプル（１サンプルあたり２．５ｇ）を、各クローンについて分析した。濃度は、ｐｍｏｌ×（ｇ新鮮重量）−１においてである。略語：ｉＰ、Ｎ６−（Δ２イソペンテニル）アデニン；ｉＰＲ、Ｎ６−（Δ２イソペンテニル）アデニンリボシド；ｉＰＲＰ、Ｎ６−（Δ２イソペンテニル）アデニンリボシド５’−一リン酸；Ｚ、トランス−ゼアチン；ＺＲ、ゼアチンリボシド；ＺＲＰ、ゼアチンリボシド５’−一リン酸；ＺＯＧ、ゼアチンＯ−グルコシド；ＺＲＯＧ、ゼアチンリボシドＯ−グルコシド。
【０３１９】
【表３４】
2004535753.tif 000044
（実施例１２．接木実験は、ＡｔＣＫＸの過剰発現に起因する矮化および増強された根の発達が、トランスジェニック組織に限定されることを示した）
どのサイトカイニンオキシダーゼ過剰発現の表現型への効果が発現組織に限定的である（すなわち、細胞自律的または器官自律的な特性である）かを調査するために、接木実験を実施した。ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックタバコ植物とＷＴタバコとの間で相互接木を行った。この実験に使用したトランスジェニック植物はＡｔＣＫＸ２−３８であり、これは、増強された根の生長および気生植物部分の減少した発達により特徴付けられる強い表現型を示した。実施例３〜６に記載されるように、これらは、タバコおよびシロイヌナズナにおけるサイトカイニンオキシダーゼ過剰発現から生じる２つの重要な表現型であった。
【０３２０】
植物は、接木した場合、約１５ｃｍの長さであり、そして接木連結点は土壌から約１０ｃｍ上であった。図１２は、接木後１５週の植物を示す。主な結果は、以下の通りであった：（ｉ）トランスジェニック台木上に接木したＷＴ継ぎ穂の気生的表現型は、ＷＴコントロール接木（ＷＴ台木上にＷＴ継ぎ穂）と同様であった。重要なことに、これは、台木におけるＡｔＣＫＸ２導入遺伝子の過剰発現は、この植物の非トランスジェニック体の気生部分の矮化を誘導しないことを示した（図１２を参照のこと）。トランスジェニック台木の改善された根の生長は維持された。このことは、ＡｔＣＫＸ導入遺伝子の改善された根の生長が自律的であり、そしてＡｔＣＫＸトランスジェニック苗条に依存しないことを示した（図１２Ｃ）。興味深いことに、トランスジェニック台木上に接木したＷＴ接ぎ穂はより健康そうであり、そしてより良く発達した。特に、これらの植物において、根出葉の老化を遅らせた（図１２Ａを参照のこと）；（ｉｉ）ＷＴ台木上に接木したトランスジェニック体継ぎ穂は、その由来となったトランスジェニック植物の気生部分に類似するようであった。すなわち、苗条矮化表現型もまた自律的であり、そして改善された根の生長に依存しない（図１２Ｂを参照のこと）。
【０３２１】
上記のトランスジェニック台木上に接木したＷＴ苗条の良好な外見に加えて、ＷＴ苗条の基本部分における不定根の形成が見られた（図１２Ｄ、右植物）。不定根の形成はまたＡｔＣＫＸトランスジェニック体の茎でも生じたが、ＷＴコントロール接木の茎では生じなかった（図１２Ｄ、左植物）。したがって、不定根の形成は、非自律的特性であるようである。
【０３２２】
要約すると、本発明において、ＡｔＣＫＸを過剰発現するタバコにおける増強された根の形成および苗条の矮化は自律的な特性であり、そして接木手順により分離され得ることを開示する。驚くべきことに、ＡｔＣＫＸトランスジェニック台木上のＷＴ継ぎ穂の接木は、より活発に生長する植物を生じ、そして葉の老化の遅延を引き起こした。
【０３２３】
接木の代替として、組織特異的プロモーターが、サイトカイニン過剰発現の自律的な表現型効果を分離するために使用され得る。従って、本発明において、組織特異的な様式で、サイトカイニンオキシダーゼの過剰発現は、植物の形態（例えば、苗条または根のシステム）を変化させるために使用され得る。
【０３２４】
（実施例１３．トランスジェニック植物における根特異的プロモーター下のＡｔＣＫＸ遺伝子の発現は、増加した根の生成を誘導する）
ＡｔＣＫＸ遺伝子（実施例４を参照のこと）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの根クラバータ（ｃｌａｖａｔａ）ホモログプロモーター（配列番号３６）の制御下にクローニングする。これは、根特異的な発現を駆動するプロモーターである。他の根特異的プロモーターもまた、本発明の目的のために使用され得る。例示的な根特異的プロモーターについては、表５を参照のこと。
【０３２５】
根において特異的にＡｔＣＫＸ遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、この植物の気生部分の生長および発達にネガティブな影響を及ぼさずに、増加した根の生成を示す。葉の老化および気生植物部分の生長に対するポジティブな効果が観察される。
【０３２６】
（実施例１４．トランスジェニック植物における老化誘導プロモーター下でのＡｔＣＫＸ遺伝子の抑制は、遅延された葉の老化および増強された種子生成を誘導する）
ＡｔＣＫＸ遺伝子から獲得され、そして内因性サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現を抑制するよう設計されたキメラ遺伝子構築物を、老化誘導プロモーター下にクローニングする。例えば、老化関連遺伝子（ＳＡＧ）から獲得されたプロモーター（例えば、ＳＡＧ１２プロモーター）が使用され得る（Ｑｕｉｒｉｎｏら、２０００）。老化した葉において特異的に内因性サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子を抑制するトランスジェニック植物は、この植物の形態および生長ならびに発達にネガティブな影響を及ぼさずに、遅延した葉の老化およびより高い種子生成を示す。
【０３２７】
（実施例１５．雌性生殖器官におけるＡｔＣＫＸ遺伝子の過剰発現は、単為結実性の果実の発達を誘導する）
ＡｔＣＫＸ遺伝子のオープンリーディングフレームを、雌性生殖器官において過剰発現を与えるプロモーター（例えば、胎座および胚珠において特異的に高発現する、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ由来のＤｅｆＨ９プロモーターまたはそのホモログの１つ）下にクローニングする。これらの組織において増強されたサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するトランスジェニック植物は、単為結実性の果実の発達を示す。
【０３２８】
【表３５】
2004535753.tif 000045
2004535753.tif 000046
2004535753.tif 000047
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2004535753.tif 000050
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、植物サイトカイニンオキジダーゼ遺伝子の概略図を示す。
トウモロコシから単離された異なるサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子（ＺｍＣＫＸ１、登録番号ＡＦ０４４６０３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２５５：３２８−３３３，１９９９）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離された異なるサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子（ＡｔＣＫＸ１〜ＡｔＣＫＸ４）の構造を示す。エキソンを、「Ｅ」と命名し、そして影付きの四角で示す。イントロンを、白い四角で示す。遺伝子のサイズ（ｋｂ、各構造の上部）、遺伝子登録番号（名前の下）および０．５ｋｂを示すサイズバーをさらに示す。
【図２】
図２は、植物サイトカイニンオキシダーゼアミノ酸配列の整列を示す。
トウモロコシ由来のサイトカイニンオキシダーゼのアミノ酸配列（ＺｍＣＫＸ１）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のサイトカイニンオキシダーゼのアミノ酸配列（ＡｔＣＫＸ１〜ＡｔＣＫＸ４）を整列する。同一のアミノ酸残基を、黒い四角で示し、類似のアミノ酸残基は、灰色の四角内にある。アミノ酸類似性の群：（Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）、（Ｆ、Ｗ、Ｙ）、（Ｇ、Ａ）、（Ｓ、Ｔ）、（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、（Ｅ、Ｄ）、（Ｎ、Ｑ）。
【図３】
図３は、ＡｔＣＫＸ−１を発現するタバコ植物およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のノーザンブロット分析を示す。
（Ａ）野生型ＳＮＮタバコ（レーン９）と比較した構成的に発現されるタバコ植物（レーン１〜８）のノーザンブロット分析。
（Ｂ）構成的に発現するクローンと誘導の１２時間後の葉におけるテトラサイクリン誘導性遺伝子発現の比較。レーン２〜９、４つの異なるＡｔＣＫＸ１−Ｗ３８ＴｅｔＲクローンの葉（＋、−、テトラサイクリン処理あり、またはテトラサイクリン処理なし）、レーン１、構成的に発現する３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１クローン。
（Ｃ）ＡｔＣＫＸ１遺伝子を構成的に発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のノーザンブロット分析。野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（レーン１）と比較したレーン２〜４、３個の異なる構成的に発現する３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１クローン。
【図４】
図４は、３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の成長特徴を示す。
（Ａ）２つの３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１を発現する実生（右）と比較した２つの野生型実生（左）。不定根の増大した形成およびトランスジェニック実生における増大した根の枝分かれに留意する。写真を、発芽から１４日後に撮った。植物を、垂直方向においてペトリ皿中のＭＳ培地においてインビトロで成長させた。
（Ｂ）Ａと同様。しかし根は、トルイジンブルーで染色した。
（Ｃ）発芽後３週間の３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック実生のペトリ皿の上面図。
（Ｄ）液体培地で増殖した３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物。
野生型実生の根は、これらの状態でわずかに増殖した（示さない）。
（Ｅ）３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１遺伝子を発現する形質転換体（Ｔ０）（右の３つの植物）、野生型の植物を、左に示す。
（Ｆ）土壌中で成長したＴ１植物の表現型。２つの３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１トランスジェニック植物と比較した野生型植物（左）。
【図５】
図５は、ＡｔＣＫＸ２過剰発現Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の表現型を示す。  野生型（左の植物）と比較した３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ２を発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のＴ１世代（右の２つの植物）。
【図６】
図６は、ＡｔＣＫＸ２を発現するタバコ植物およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のノーザンブロット分析を示す。
（Ａ）野生型ＳＮＮタバコ（レーン８）と比較した構成的に発現するタバコ植物（レーン１〜７）のノーザンブロット分析。
（Ｂ）ＡｔＣＫＸ２遺伝子を構成的に発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物のノーザンブロット分析。レーン２〜８、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（レーン１）と比較した７個の異なる３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ２クローンを構成的に発現するクローン。
【図７】
図７は、ＡｔＣＫＸ１およびＡｔＣＫＸ２を発現するタバコ植物の苗条表現型を示す。
（Ａ）６週齢の植物の上面図。
（Ｂ）開化期におけるタバコ植物。
（Ｃ）茎伸長の速度論。矢印は、開化の開始を示す。この段階における植物の年齢（発芽後の日数）および葉の数を、矢印の上に示す。バーは、ＳＤ；ｎ＝１２を示す。
（Ｄ）発芽後の６８日と１００日との間に形成された葉の数（ｎ＝１２）およびこれらの葉の最終表面積（１００％の野生型は、３６４６±１４４ｃｍ２；ｎ＝３である）。
（Ｅ）葉のサイズと老化の比較。葉は、上から節番号４、９、１２、１６および２０由来である（左から右）。
【図８】
図８は、ＡｔＣＫＸ発現トランスジェニックタバコ植物の根表現型を示す。
（Ａ）発芽後１７日目の実生。
（Ｂ）開化期における土壌で成長した植物の根系。
（Ｃ）発芽後１０日目の根の長さ、側根（ＬＲ）および不定根（ＡＲ）の数。  （Ｄ）外来性サイトカイニンによる根の成長阻害の用量応答曲線、バーは、±ＳＤ；ｎ＝３０を示す。
【図９】
図９は、３５Ｓ：：ＡｔＣＫＸ１を発現するタバコ植物における腋芽苗条分裂組織の成長を示す。
【図１０】
図１０は、野生型（ＷＴ）タバコに対するＡｔＣＫＸ１を過剰発現するタバコ植物の苗条分裂組織、葉分裂組織および根分裂組織の組織学を示す。
（Ａ）植物性の苗条の先端の分裂組織から縦軸の中央の切片。Ｐ、葉の原基。
（Ｂ）葉の二次葉脈における脈管組織。Ｘ、木部、ＰＨ、師部維管束。
（Ｃ）完全に発達した葉の横断面。
（Ｄ）葉の表皮の上部の走査電子顕微鏡写真。
（Ｅ）ＤＡＰＩで染色した根の尖部。ＲＭ、根の分裂組織。
（Ｆ）発芽後１０日目の根の分裂組織の縦軸の中央の切片。ＲＣ、根冠；ＰＭ、前分裂組織（ｐｒｏｍｅｒｉｓｔｅｍ）。
（Ｇ）頂端から１０ｍｍの横軸の根の切片。Ｅ、表皮、Ｃ１〜Ｃ４、皮質細胞層、Ｘ、木部、ＰＨ、師部、バーは、１００μｍである。
【図１１】
図１１は、ＡｔＣＫＸ３およびＡｔＣＫＸ４を発現するタバコ植物のノーザン分析を示す。
（Ａ）ＡｔＣＫＸ３を構成的に発現するタバコ植物のノーザンブロット分析を示す。レーンの名称は、個々のトランスジェニック植物の数を示し、ＷＴは、野生型ＳＮＮタバコを示す。上のブロットは、ＡｔＣＫＸ３特異的なプローブでプローブ化され、下のブロットは、２５Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブでプローブ化され、そしてＲＮＡ標識についてのコントロールとして役立つ。
（Ｂ）ＡｔＣＫＸ４を構成的に発現するタバコ植物のノーザン分析。レーンの名称は、個々のトランスジェニック植物の数を示し、ＷＴは、野生型ＳＮＮタバコを示す。上のブロットは、ＡｔＣＫＸ４特異的なプローブでプローブ化され、下のブロットは、２５Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なプローブでプローブ化され、そしてＲＮＡ標識についてのコントロールとして役立つ。
【図１２】
図１２は、ＡｔＣＫＸ２トランスジェニックタバコ植物および野生型植物の相反的な移植片を示す。
（Ａ）左の２つの植物：コントロール（ＷＴ台木に接木されたＷＴ若木）。右の２つの植物：ＡｔＣＫＸ２−３８トランスジェニック台木に接木されたＷＴ若木。
（Ｂ）左：コントロール（ＷＴ台木に接木されたＷＴ移植片）。
右：ＷＴ台木に接木されたＡｔＣＫＸ２−３８の若木。
（Ｃ）根の領域の拡大。
左：コントロール（ＷＴ台木に接木されたＷＴ若木）。
右：ＡｔＣＫＸ２−３８トランスジェニック台木に接木されたＷＴ若木。
（Ｄ）不定根の形成
左：コントロール（ＷＴ台木に接木されたＷＴ若木）。
右：ＡｔＣＫＸ２−３８トランスジェニック台木に接木されたＷＴ若木。
【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535753.tif 000208
【国際調査報告】
2004535753.tif 000209
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