(57)【要約】候補化合物がインスリンの効果を擬態するか又は拮抗するかを決定する方法であって、（ａ）ＩＲＡＰタンパク質成分と検出可能なタンパク質成分とを含むタンパク質構造を符号化する核酸配列を含む、トランスフェクトされた宿主細胞を提供し、その際、該検出可能なタンパク質成分は該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されており、更にその際、該検出可能なタンパク質成分は、該タンパク質成分を面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法と、該タンパク質成分を面外に位置する場合及び細胞内に位置する場合のどちらでも検出することができる第二の検出法とにより、アッセイすることができ；（ｂ）該トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させ；（ｃ）面外タンパク質成分を前記第一検出法により測定し、面外及び細胞内の検出可能なタンパク質成分の全量を前記第二検出法により測定し；そして、（ｄ）該面外の検出可能なタンパク質成分の量を、該面外及び細胞内の検出可能なタンパク質成分の全量と比較して、ＧＬＵＴ４小胞転座の程度の尺度を提供すること、を含む方法を開示する。別の方法においては、タンパク質構造は、ＩＲＡＰタンパク質成分と、該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されている第一の検出可能なタンパク質成分と、該ＩＲＡＰタンパク質成分の細胞質ドメインに融合されている第二の検出可能なタンパク質成分とを含み、その際、該第一の検出可能なタンパク質成分は、該第一タンパク質成分を面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法によりアッセイすることができ、該第二の検出可能なタンパク質成分は、該第二タンパク質成分を細胞内に位置する場合に検出することができる第二の検出法によりアッセイすることができる。本発明のアッセイを使用して、「候補化合物」がインスリンの擬態であるか又はアンタゴニストであるかを決定することができる。本発明は、化合物のライブラリーを自動化された高処理量スクリーニングにおいて試験するのに使用することができる。
2004503778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物がインスリンの効果を擬態するか又は拮抗するかを決定する方法であって、
（ａ）ＩＲＡＰタンパク質成分と検出可能なタンパク質成分とを含むタンパク質構造を符号化する核酸配列を含む、トランスフェクトされた宿主細胞を提供し、その際、該検出可能なタンパク質成分は該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されており、更にその際、該検出可能なタンパク質成分は、該タンパク質成分を面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法と、該タンパク質成分を面外に位置する場合及び細胞内に位置する場合のどちらでも検出することができる第二の検出法とにより、アッセイすることができ；
（ｂ）該トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させ；
（ｃ）面外タンパク質成分を前記第一検出法により測定し、面外及び細胞内の検出可能なタンパク質成分の全量を前記第二検出法により測定し；そして、
（ｄ）該面外の検出可能なタンパク質成分の量を、該面外及び細胞内の検出可能なタンパク質成分の全量と比較して、ＧＬＵＴ４小胞転座の程度の尺度を提供すること、を含む方法。
【請求項２】
抗体エピトープが検出可能なタンパク質成分上に存在し、前記エピトープが、免疫学的検出法である第一検出法により検出可能である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫学的検出法が、抗体エピトープを該エピトープについて高いアフィニティーを有する蛍光標識された抗体を用いて標識する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
免疫学的検出法が、抗体エピトープを該エピトープについて高いアフィニティーを有する第一の抗体を用いて標識する第一の工程と、該第一抗体を該第一抗体について高いアフィニティーを有する蛍光標識された第二の抗体により検出する第二の工程とを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
検出可能なタンパク質成分が、第二検出法により検出可能な特徴的な発光スペクトルを発することができるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
検出可能なタンパク質成分が蛍光タンパク質成分である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
蛍光タンパク質成分が緑色蛍光タンパク質である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
候補化合物がインスリンの効果を擬態するか又は拮抗するかを決定する方法であって、
（ａ）ＩＲＡＰタンパク質成分と、該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されている第一の検出可能なタンパク質成分と、該ＩＲＡＰタンパク質成分の細胞質ドメインに融合されている第二の検出可能なタンパク質成分とを含むタンパク質構造を符号化する核酸配列を含む、トランスフェクトされた宿主細胞を提供し、その際、該第一の検出可能なタンパク質成分は、該第一タンパク質成分を面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法によりアッセイすることができ、該第二の検出可能なタンパク質成分は、該第二タンパク質成分を細胞内に位置する場合に検出することができる第二の検出法によりアッセイすることができ；
（ｂ）該トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させ；
（ｃ）該第一タンパク質成分の量を、面外に位置する該第一タンパク質成分の量を表す前記第一検出法により測定し、該第二の検出可能なタンパク質成分の量を、該第二の検出可能なタンパク質成分の全量を表す前記第二検出法により測定し；そして、
（ｄ）面外の第一の検出可能なタンパク質成分の量を、該第二の検出可能なタンパク質成分の全量と比較して、ＧＬＵＴ４小胞転座の程度の尺度を提供すること、を含む方法。
【請求項９】
第一の検出可能なタンパク質成分が抗体エピトープを含み、前記エピトープが、免疫学的検出法である第一検出法により検出可能である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
免疫学的検出法が、抗体エピトープを該エピトープについて高いアフィニティーを有する蛍光標識された抗体を用いて標識する工程を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
免疫学的検出法が、抗体エピトープを該エピトープについて高いアフィニティーを有する第一の抗体を用いて標識する第一の工程と、該第一抗体を該第一抗体について高いアフィニティーを有する蛍光標識された第二の抗体により検出する第二の工程とを含む、、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
第二の検出可能なタンパク質成分が、第二検出法により検出可能な特徴的な発光スペクトルを発することができるものである、請求項８、９、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
第二の検出可能なタンパク質成分が蛍光タンパク質成分である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
蛍光タンパク質成分が緑色蛍光タンパク質である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
インスリンのアンタゴニストを同定する方法であり、更に、トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させる前か又はその後にインスリンを添加する工程が含まれる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させた後にインスリンを添加する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により同定されたインスリンアンタゴニスト又は擬態。
【請求項１８】
ＩＲＡＰタンパク質成分及び検出可能なタンパク質成分を含むキメラＩＲＡＰタンパク質であって、該検出可能なタンパク質成分が該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されており、更に、該検出可能なタンパク質成分は、該タンパク質成分を細胞において面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法と、該タンパク質成分を細胞において面外に位置する場合及び細胞内に位置する場合のどちらでも検出することができる第二の検出法とにより、アッセイすることができる、キメラＩＲＡＰタンパク質。
【請求項１９】
（ａ）ＩＲＡＰタンパク質成分と、（ｂ）該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されている第一の検出可能なタンパク質成分であって、該タンパク質成分を細胞において面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法によりアッセイすることができる前記第一の検出可能なタンパク質成分と、（ｃ）該ＩＲＡＰタンパク質成分の細胞質ドメインに融合されている第二の検出可能なタンパク質成分であって、該タンパク質成分を細胞内に位置する場合に検出することができる第二の検出法によりアッセイすることができる前記第二の検出可能なタンパク質成分とを含むキメラＩＲＡＰタンパク質。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載のキメラＩＲＡＰタンパク質を符号化するＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、候補化合物がインスリンの効果を擬態するか又は拮抗するかどうかを決定する方法に関する。特に、本発明に従えば、ＧＬＵＴ４小胞転座のレベルを、キメラＴＲＡＰタンパクを発現する宿主細胞のインスリン刺激後に定量化することができる。本発明の方法は、特に、グルコース摂取に関してインスリンの作用に影響を与える可能性のある薬剤を探索する際の高処理量スクリーニング法において使用することができる。
【０００２】
発明の背景
インスリン刺激によるグルコース摂取は、生理的に関連のある主要なインスリンの効果である。細胞へのグルコース摂取を特異的に高める化合物を発見できれば、これによりタイプＩ及びタイプＩＩの糖尿病の両方の処置に相当な利益がもたらされるであろう。
【０００３】
インスリン応答性脂肪細胞及び筋肉細胞においては、２つのグルコース輸送体が存在する（ＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ４）。インスリンはこれらの輸送体の細胞内隔絶局在位置から原形質膜への転座を促進することにより、筋肉細胞及び脂肪細胞へのグルコース摂取を刺激する。正味のグルコース摂取に関して最も重要な効果は、ＧＬＵＴ４の転座である。更に、ＧＬＵＴ１は偏在して発現するので（ＧＬＵＴ４は筋肉細胞及び脂肪細胞に制限されている）、糖尿病を効果的に処置するには必ずＧＬＵＴ４の転座の促進について特異的でなければならない。
【０００４】
放射性グルコースを用いたグルコース摂取の伝統的なアッセイ、或いは、トリチウム標識サイトカラシンＢ結合、又はトリチウム標識若しくはビオチン標識ビスマンノース標識（直接、細胞表面グルコース輸送体に結合する）の結合といったリガンド結合アッセイでは、ＧＬＵＴ１又はＧＬＵＴ４のいずれか一方に関するインスリンの効果を区別できない。
【０００５】
ＷＯ９５／０９２４０は、検出可能な異種ポリペプチドに融合されたＧＬＵＴ輸送体ポリペプチドを含むキメラＧＬＵＴ輸送体を開示している。開示されたキメラＧＬＵＴ輸送体は、候補化合物がインスリンの効果を擬態するか又は拮抗するかどうかを決定する方法に使用することができる。
【０００６】
インスリン応答性アミノペプチダーゼ（ＩＲＡＰ）はＧＬＵＴ４含有性小胞の一成分であり、インスリンシグナル伝達経路に関与する。ＩＲＡＰ及びＧＬＵＴ４は完全に共に局在化する。ＷＯ９６／０９３１７を参照するとこのアミノペプチダーゼを「ＧＴＶａｐ」と呼んでいる。
【０００７】
Ｔｈｕｒｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ３３８７６−３３８８３（１９９８）には、Ｍｕｎｃ１８ｃの高発現により３Ｔ３Ｌ１含脂肪組織におけるインスリン刺激によるｅＧＦＰ−ＩＲＡＰ／ｖｐ１６５の転座が抑制されるという実験が記載されている。
【０００８】
発明の要旨
本発明の第一の側面によれば、候補化合物がインスリンの効果を擬態するか又は拮抗するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）ＩＲＡＰタンパク質成分と検出可能なタンパク質成分とを含むタンパク質構造を符号化する核酸配列を含む、トランスフェクトされた宿主細胞を提供し、その際、該検出可能なタンパク質成分は該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されており、更にその際、該検出可能なタンパク質成分は、該タンパク質成分を面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法と、該タンパク質成分を面外に位置する場合及び細胞内に位置する場合のどちらでも検出することができる第二の検出法とにより、アッセイすることができ；
（ｂ）該トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させ；
（ｃ）面外タンパク質成分を前記第一検出法により測定し、面外及び細胞内の検出可能なタンパク質成分の全量を前記第二検出法により測定し；そして、
（ｄ）該面外の検出可能なタンパク質成分の量を、該面外及び細胞内の検出可能なタンパク質成分の全量と比較して、ＧＬＵＴ４小胞転座の程度の尺度を提供すること、を含む方法が提供される。
【０００９】
本発明の第二の側面によれば、候補化合物がインスリンの効果を擬態するか又は拮抗するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）ＩＲＡＰタンパク質成分と、該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されている第一の検出可能なタンパク質成分と、該ＩＲＡＰタンパク質成分の細胞質ドメインに融合されている第二の検出可能なタンパク質成分とを含むタンパク質構造を符号化する核酸配列を含む、トランスフェクトされた宿主細胞を提供し、その際、該第一の検出可能なタンパク質成分は、該第一タンパク質成分を面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法によりアッセイすることができ、該第二の検出可能なタンパク質成分は、該第二タンパク質成分を細胞内に位置する場合に検出することができる第二の検出法によりアッセイすることができ；
（ｂ）該トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させ；
（ｃ）該第一タンパク質成分の量を、面外に位置する該第一タンパク質成分の量を表す前記第一検出法により測定し、該第二の検出可能なタンパク質成分の量を、該第二の検出可能なタンパク質成分の全量を表す前記第二検出法により測定し；そして、
（ｄ）面外の第一の検出可能なタンパク質成分の量を、該第二の検出可能なタンパク質成分の全量と比較して、ＧＬＵＴ４小胞転座の程度の尺度を提供すること、を含む方法が提供される。
【００１０】
本発明の第一及び第二の側面の各々の工程（ｃ）における測定は、同時に又は逐次的に実施してもよい。それらを逐次的に実施する場合、実施する順序は重要ではない。本明細書中で使用する、「面外に位置する」という表現は形質膜の細胞外面上に位置することを意味する。「細胞内に位置する」という表現は、関連するタンパク質成分がその細胞内に位置することをいい、それには形質膜のシトソル面上に位置することが含まれ、並びにその細胞自身の内部の小胞内に位置することをいう。
【００１１】
本発明の第一及び第二の側面のアッセイは、例えば、化合物ライブラリーにおいて見出すことができるような「候補化合物」（化合物の混合物が含まれてもよい）がインスリンの擬態又はアンタゴニストであるかどうかを決定するのに使用することができる。本発明は、自動化された高処理量スクリーンにおいて化合物のライブラリーを試験するのに使用してもよい。本発明のアッセイは、インスリンのアンタゴニストである候補化合物を同定することにおいて最も関係があり；そのような化合物は主として医薬的な関心を集めている。
【００１２】
本発明の方法を使用してインスリンのアンタゴニストを同定する場合、本方法にはインスリンを添加する工程も含まれる。インスリンは、トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させる前かその後のどちらに添加してもよい。好ましくは、トランスフェクトされた宿主細胞を候補化合物と接触させた後にインスリンを添加する。本発明の方法を使用してインスリン擬態を同定する場合は、インスリンは試験系に導入しない。
【００１３】
本発明の第三の側面によれば、ＩＲＡＰタンパク質成分及び検出可能なタンパク質成分を含むキメラＩＲＡＰタンパク質であって、該検出可能なタンパク質成分が該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されており、更に、該検出可能なタンパク質成分は、該タンパク質成分を細胞において面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法と、該タンパク質成分を細胞において面外に位置する場合及び細胞内に位置する場合のどちらでも検出することができる第二の検出法とにより、アッセイすることができる、キメラＩＲＡＰタンパク質が提供される。
【００１４】
本発明の第四の側面によれば、（ａ）ＩＲＡＰタンパク質成分と、（ｂ）該ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合されている第一の検出可能なタンパク質成分であって、該タンパク質成分を細胞において面外に位置する場合に検出することができるが細胞内に位置する場合に検出することができない第一の検出法によりアッセイすることができる前記第一の検出可能なタンパク質成分と、（ｃ）該ＩＲＡＰタンパク質成分の細胞質ドメインに融合されている第二の検出可能なタンパク質成分であって、該タンパク質成分を細胞内に位置する場合に検出することができる第二の検出法によりアッセイすることができる前記第二の検出可能なタンパク質成分とを含むキメラＩＲＡＰタンパク質が提供される。
【００１５】
発明の具体的な説明
本発明の第一の側面の方法は、一般的にいえば、インスリン感受性細胞を、ＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合された検出可能なタンパク質成分を含有するキメラＩＲＡＰポリペプチドを符号化しているＩＲＡＰ構成体で、トランスフェクトすることからなる。検出可能なタンパク質成分は第一の検出法により検出することができ、その方法によれば、タンパク質成分が、細胞内ＧＬＵＴ４小胞におけるその出発位置から、検出可能なタンパク質成分が面外に存在する（すなわち、細胞外に位置する）場所である細胞表面膜へ転座された場合に、そのタンパク質成分を検出することができるが、かかる方法では、検出可能なタンパク質成分がそのように転座されずに細胞内に存在する場合は、その検出可能なタンパク質成分を検出することができない。また、検出可能なタンパク質成分は第二の検出法により検出することができ、その方法によれば、そのタンパク質成分が面外の位置に転座された場合と、そのように転座されずに細胞内に存在する場合の両方に、そのタンパク質成分を検出することができる。
【００１６】
従って、トランスフェクトされた宿主細胞がキメラＩＲＡＰポリペプチドを発現する場合は、第一の検出法を用いて検出される検出可能なタンパク質成分の量を第二の検出法により検出可能なタンパク質成分の量と比較することにより、ＧＬＵＴ４転座に関するインスリンの効果をアッセイで定量化することができる。本発明において使用する二重検出アプローチの利点は、ＴＲＡＰ発現レベルの変動を補正してアッセイに大きな信頼性を付与できることである。本発明を使用して、インスリンの効果を擬態するか又は拮抗する薬剤をスクリーニングすることができる。
【００１７】
本発明の第二の側面の方法は、キメラＩＲＡＰタンパク質に２種の検出可能なタンパク質成分が含まれ、一方はＩＲＡＰタンパク質成分の管腔ドメインに融合され、他方は細胞質ドメインに融合されているということを除いては、第一の側面の方法と同等である。
【００１８】
第一の検出法は、好ましくは、検出可能なタンパク質成分上の抗体エピトープをそのエピトープについて高いアフィニティーを有する標識された抗体を用いて検出する、免疫学的検出法である。また、検出可能なタンパク質成分は、エピトープタグについて高いアフィニティーを有する第一の抗体と第一の抗体について高いアフィニティーを有する第二の蛍光標識された抗体とを用いて検出してもよい。そのような免疫学的アッセイによれば、面外に位置する場合にのみ検出可能なタンパク質成分が検出される。このタイプの免疫学的アッセイは当技術分野において周知である。適する標識抗体は当技術分野において既知の手順により生成することができる。
【００１９】
第一の検出法により検出されるべき検出可能なタンパク質成分上のエピトープは、その検出可能なタンパク質成分の天然エピトープであるものであってもよく；従って、検出可能なタンパク質成分がＧＦＰタンパク質成分である場合は、それについて特異的な抗体が出現する可能性のある多数のエピトープを含有する。代わりとして、検出可能なタンパク質成分を組み換えて、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ又はＨｉｓ６エピトープタグといった適するエピトープタグを含めてもよい。
【００２０】
第二の検出法は、好ましくは、特徴的な発光スペクトルの生成に依存するものであり、発光スペクトルは第一の方法を用いて得ることができるものと区別することができるので、分光光度計などの適する装置により分析することができる。例えば、検出可能なタンパク質成分は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのような蛍光タンパク質成分を含んでいてもよい。本明細書中で使用される蛍光タンパク質とは、適当な電磁放射で励起した場合に蛍光を発することができるタンパク質のことをいい、そのアミノ酸配列が天然であるか又は組み換えられた蛍光タンパク質が含まれる。そのような蛍光タンパク質成分は、特定の波長での励起に応答して特徴的な発光スペクトルを生成するので、本質的には、分析する系におけるタンパク質成分の全量がアッセイされる。
【００２１】
本明細書中で使用する緑色蛍光タンパク質は、緑色光を発するタンパク質である。青色蛍光タンパク質（本発明において使用してもよい）は、青色光を発するタンパク質である。ＧＦＰは、北米太平洋岸北西地区のクラゲであるオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）、ウミシイタケであるＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、及びコザラクラゲ（Ｐｈｉａｌｉｄｉｕｍ ｇｒｅｇａｒｉｕｍ）から単離される。Ｗ． Ｗ． Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．， ３５：８０３−８０８（１９８２）； Ｌ． Ｄ． Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ７２Ｂ：７７−８５（１９８２）。
【００２２】
有用な励起及び発光スペクトルを有する種々のＡｅｑｕｏｒｅａ族のＧＦＰが、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａからの天然ＧＦＰのアミノ酸配列を修飾することによって組み換えられている。（Ｄ． Ｃ． Ｐｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １１１：２２９−２３３（１９９２）； Ｒ． Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９１：１２５０１−０４（１９９４））
本発明において使用することができる別の蛍光タンパク質は、インド洋−西太平洋地域に生息するイソギンチャクの近縁種であるＤｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａから単離された赤色蛍光タンパク質であり、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａ．， ＵＳＡから入手可能である。
【００２３】
他の適する検出可能なタンパク質成分は、シグナルの発生についての基質に依存するものである。例えば、酵素であるルシフェラーゼは、その基質であるルシフェリンと接触した場合に特徴的な発光スペクトルを生成する。別の例は、β−ガラクトシダーゼに基づく検出可能なタンパク質成分であり、その基質と接触した場合に特徴的な発光をもたらす。これらの例の両方においては、タンパク質成分の全量をアッセイすることができるタンパク質成分／基質の組合せを選択することが必要である。より特定的には、このことは、基質が細胞内に拡散して基質とタンパク質成分との間の必要な反応を起こすことを可能とするため、その基質は膜透過性のものでなければならないことを意味している。
【００２４】
現在のところ、本発明の第一の側面の検出可能なタンパク質成分は、キメラタンパク質においてＩＲＡＰのアミノペプチダーゼドメインを置き換える緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質成分が好ましい。これは、蛍光タンパク質成分のエピトープについて特異的な標識された抗体により免疫学的にアッセイすることができ、標準的な蛍光計を用いて蛍光測定によりアッセイすることができる。
【００２５】
本発明の第二側面の方法の場合は、現在のところ、第一の検出可能なタンパク質成分は、これまでに説明しようにエピトープタグを含むタンパク質成分であり、第二の検出可能なタンパク質成分は、キメラタンパク質においてＩＲＡＰのアミノペプチダーゼドメインを置き換える緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質成分であることが好ましい。
【００２６】
キメラＩＲＡＰタンパク質について符号化している核酸構成体は、分子生物学の標準的な技術により生成することができる。ＩＲＡＰタンパク質のＤＮＡ配列は、細胞質ドメイン（アミノ酸残基１〜１０９）、トランス膜部（アミノ酸残基１１０〜１３１）、及び管腔部（アミノ酸残基１３２〜９１６、そのうち残基１３２〜１５４は「茎状（ｓｔａｌｋ）」であり、残基１５５〜９１６はアミノペプチダーゼ触媒ドメインである）を含有するタンパク質を符号化している。ＩＲＡＰタンパク質の一部又は全てを符号化しているＤＮＡ配列を既知の方法により組み換えて、検出可能なタンパク質成分（又は複数の検出可能なタンパク質成分）を符号化する核酸配列を含ませてもよく、その結果、構成体により発現されるタンパク質産物は、検出可能なタンパク質成分（又は複数の検出可能なタンパク質成分）に融合されたＩＲＡＰタンパク質成分を含む。従って、例えば、機能的な蛍光タンパク質成分について符号化するＤＮＡ配列は商業的に入手可能であり、それを使用して、本発明のキメラＩＲＡＰタンパク質について符号化する核酸構成体を合成することができる。また、所望な符号化配列及び制御配列を含有する適するベクターの構成体は、当技術分野においてよく理解されている標準的な手法を使用する。
【００２７】
ＤＮＡ構成体において、検出可能なタンパク質成分について符号化するＤＮＡ配列は、ＩＲＡＰタンパク質の管腔部について符号化するＤＮＡ配列の末端で接合する（言い換えれば、ＩＲＡＰタンパク質の管腔部について符号化するＤＮＡ配列の全体はそのまま完全である）か、又はＩＲＡＰタンパク質の管腔部について符号化するＤＮＡ配列の全て若しくは一部を置き換える。
【００２８】
本発明の好ましい態様においては、その触媒アミノペプチダーゼドメインが欠けた不完全なＩＲＡＰタンパク質を符号化するＤＮＡ配列を使用して、キメラＩＲＡＰタンパク質について符号化する適するＤＮＡ構成体を合成する；従って、得られるＤＮＡ構成体においては、ＩＲＡＰのアミノペプチダーゼドメインについて符号化する配列は、検出可能なタンパク質成分について符号化する配列に換わる。実験結果は、そのようなＤＮＡ構成体により発現されたタンパク質は、内因性ＩＲＡＰ及びＧＬＵＴ４とは区別が付かない様式でインスリンに対して走行し応答することを示している。
【００２９】
宿主細胞を、当技術分野で既知の方法によりキメラＩＲＡＰ構成体を符号化するＤＮＡを含む適するベクターでトランスフェクトする。キメラＴＲＡＰタンパク質の発現について符号化する配列を有する細胞をトランスフェクトするのに使用する核酸は、ポリペプチドの発現について符号化するヌクレオチド配列に機能的に連結した発現制御配列を含む発現ベクターの形態である。使用されるポリペプチドの「発現についてコードするヌクレオチド配列」という語は、ｍＲＮＡの転写及び翻訳のときにポリペプチドを生成する配列をいう。これには、例えば、イントロンを含有する配列が含まれうる。本明細書中で使用する「発現制御配列」という語は、その配列が機能的に連結している核酸配列の発現を規定する核酸配列をいう。発現制御配列は核酸配列に機能的に連結し、その核酸配列の転写と適当であればその翻訳とを制御し規定する。従って、発現制御配列には、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質符号化遺伝子の上流の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンについてのスプライシングシグナル、その遺伝子の正確な解読枠を維持してｍＲＮＡの適切な翻訳を可能とすること、及び終止コドンが含まれうる。キメラＩＲＡＰタンパク質の長期の発現は細胞にとって害となる可能性があることから、その構成体又は各々の構成体の発現が、テトラサイクリン応答性プロモーター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｔ−Ｒｅｘ 系）、エクジソンをベースとする系、及び周知のメタロチオネインプロモーターといった誘導プロモーターの制御に基づく場合は都合がよい。
【００３０】
得られるトランスフェクトされた宿主細胞は、好ましくは、誘導プロモーターの制御下でキメラＩＲＡＰタンパク質を発現する。トランスフェクトして安定な細胞ラインを生成しうる適する宿主細胞には、含脂肪細胞（例えば、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞）、骨格筋細胞、又はあらゆる他のインスリン応答性細胞が含まれる。
【００３１】
キメラＩＲＡＰタンパク質を発現するトランスフェクト宿主細胞は、候補化合物がインスリンの効果を擬態するか又は拮抗するかどうかを決定するためのアッセイに使用することができる。
【００３２】
候補化合物がインスリンの効果を擬態するかどうかを決定するためのアッセイにおいては、本発明の第一又は第二の側面に従ったアッセイをインスリンなしで実施して、ＧＬＵＴ４小胞転座の程度を、候補化合物（及びインスリン）が存在しない対照実験において発生したものと比較する。ＧＬＵＴ４小胞転座の程度が対照より大きいということは、化合物がインスリンの擬態であることを示している。
【００３３】
候補化合物がインスリンの効果を拮抗するかどうかを決定するためのアッセイにおいては、本発明の第一の側面又は第二の側面に従ったアッセイをインスリンの存在下で実施して、ＧＬＵＴ４小胞転座の程度を、候補化合物が存在しない（しかし、同濃度のインスリン存在下の）対照実験において発生したものと比較する。ＧＬＵＴ４小胞転座の程度が対照より小さいということは、化合物がインスリンの効果を拮抗することを示している。
【００３４】
より詳細には、本発明のアッセイは次のように実施してもよい。安定なトランスフェクト細胞の培養物を候補化合物の存在下、適する成長培地の存在する適する条件のもと、インスリンの存在又は非存在下（アッセイを実施してインスリン擬態を同定するかアンタゴニストを同定するかに依存する）で既知の時間インキュベートする。例えば、５％ＣＯ２を含有する加湿したインキュベーター中、３７℃で、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）又はＨＡＭＳ Ｆ１２培地などの成長培地中で適する時間（例えば、１５分〜３時間）、細胞を候補化合物と共にインキュベートしてもよい。また、空気中、適するｐＨを維持するためＨＥＰＥＳ及び重炭酸ナトリウムを補給した培地中で、細胞を３７℃に維持する。全ての場合において、細胞には、インキュベーションの時間の間血清は添加しない。インスリンをその後に添加する場合は、これは例えば、５分〜１時間までの間でよい。
【００３５】
キメラＩＲＡＰタンパク質の発現が誘導性プロモーターの制御に基づく場合は、ＩＲＡＰ−ＧＦ融合タンパク質は、誘導体を細胞に添加し、誘導体の添加から既知の時間インキュベーションを行うことにより誘導される。
【００３６】
インキュベーションの後、第一の検出法を用いて細胞表面に存在するキメラＩＲＡＰタンパク質の存在について細胞を分析する。次いで、発現したキメラＩＲＡＰ融合タンパク質の全体レベルを第二検出法を用いて決定する。第一検出法から得られる結果（典型的には、シグナル強度）を、第二検出法から得られる結果（同様に典型的には、シグナル強度）で割って、比を与える。この比は、生成データにおける追加の信頼性レベルを提供する。例えば、そのような比を計算することにより、視野にあるトランスフェクトされた細胞の数、誘導体による融合タンパク質発現の誘導レベル、及び細胞の健康（細胞が死んだりウェルの表面から見えなくなる場合はシグナル減少が観察される）の変動について補正することができる。この追加の補正の主要な結果は偽陽性頻度の減少である。
【００３７】
本発明のアッセイは、並行したアッセイを標準的なマルチウェルプレート上で自動化する高処理量スクリーニングアッセイとしての使用に適している。
また、本発明の第一及び第二の側面の方法は、候補化合物が、ＧＬＵＴ４小胞転座を引き起こすインスリン以外の刺激の効果を擬態するか又は拮抗するかどうかを決定するのに使用してもよい。ＧＬＵＴ４小胞転座を引き起こすことができる他の刺激は、浸透ストレス（例えば、ソルビトールにより引き起こされうる）、非加水分解性ＧＴＰアナログの濃縮物（例えば、ＧＴＰγＳ）、ＡＭＰキナーゼ活性体（例えば、５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドリボシド； ＡＩＣＡＲ）、及びチロシンフォスファターゼ阻害剤（例えば、バナデート）である。この代わりのアッセイにおいて、候補化合物とのインキュベーションの後に、細胞を代わりの刺激物、例えば、インスリンではなくソルビトールと接触させる。また、アッセイの方法論はインスリンのアンタゴニストを同定するためのアッセイと同じである。
【００３８】
本発明を現時点で以下の実施例を参照することにより説明する。
実施例１
ＧＬＵＴ４含有性小胞の形質膜へのインスリン誘導性転座の蛍光抗体法を用いた検出
この実施例で使用したＩＲＡＰ−ＧＦＰ構成体は、ＩＲＡＰ断片６６−５３３（出発部位から細胞外の「茎状」領域の末端まで）を用いて構築し、その断片は本発明者らが入手可能な部分的なｃＤＮＡ ＩＲＡＰクローンからの特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより産出した。得られる断片をフランキング制限酵素部位を用いてｐｃＤＮＡ３ベクターへとクローニングした。また、Ｃ−末端 ｍｙｃ−タグを有するＧＦＰ３を、特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより産出し、生成物をｐｃＤＮＡ３へとＩＲＡＰインサートの下流にクローニングした。
【００３９】
ＣＨＯ−Ｔ細胞にＩＲＡＰ−ＧＦＰ構成体をトランスフェクト又は顕微注射して、２４時間後に２００ｎＭインスリンの存在又は非存在下で３０分間刺激した。これをインスリンシグナル伝達の阻害剤（例えば、ウォルトマニン）での処理の前に行った。
【００４０】
その後、形質膜の表面上に曝露されたＧＦＰを可視化するためだけに、以下に説明するように、事前に易透化することなく、細胞を固定し抗ＧＦＰ抗体（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。
【００４１】
細胞の免疫蛍光検査
ＰＢＳ中室温で２回洗浄後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間細胞を固定した。染色のため、固定した細胞を、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈した適当な抗体（この場合においては、抗ＧＦＰモノクローナル抗体）中で、３０分〜１時間インキュベートしてから、ＴＲＩＴＣ複合二次抗体の１：２００希釈液中で３０分〜１時間インキュベートした。全ての抗体インキュベーション工程の後、ＰＢＳ中で念入りに洗浄した。
【００４２】
全体のＩＲＡＰ−ＧＦＰ発現レベルはＧＦＰ蛍光のレベルで与えられる（これは本発明の第一の側面の第二の検出法に相当する）。細胞表面に曝露されたＩＲＡＰ−ＧＦＰは抗ＧＦＰ抗体での染色のレベルで与えられる（これは本発明の第一の側面の第一の検出法に相当する）。図１は、各々の検出法により得られる像の例を示している。
【００４３】
次いで、ＩＲＡＰ−ＧＦＰ蛍光による蛍光強度と表面ＩＲＡＰ−ＧＦＰ免疫染色とを、各々の処理条件について２０の視野において影像化された細胞から計算した。結果を表面：全ＩＲＡＰ−ＧＦＰの平均比で示す。得られる結果を表１及び図２に示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
実施例２
３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞におけるＧＬＵＴ４含有性小胞の形質膜へのインスリン誘導性転座の検出
３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞の含脂肪細胞表現型への分化を以下のように行った：
３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞（継代４〜１２）を２２ｍｍのガラス製カバースリップ上に接種し、成長させて集合とした。１０％（ｖ／ｖ） ミオクローンプラス（ｍｙｏｃｌｏｎｅ−ｐｌｕｓ）ＦＣＳ、０．２５μＭ デクサメタゾン、０．５ｍＭ イソブチルメチルキサンチン及び１６６ｎＭ インスリンを含有するＤＭＥＭ中で２日間（０日〜２日）、含脂肪細胞への分化を誘導した。更に２日間（２日〜４日）、この培地を１０％（ｖ／ｖ） ミオクローンプラスＦＣＳ及び１６６ｎＭ インスリンを含有するＤＭＥＭと取り替えた。４日から先は１０％（ｖ／ｖ） ミオクローンプラスＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中に細胞を維持し、２日ごとに培地を取り替えた。分化の開始後７日〜１０日は、３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞を使用した。
【００４６】
分化した３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞に実施例１で使用したＩＲＡＰ−ＧＦＰ構成体（ｐｃＤＮＡ３）を顕微注射した。
顕微注射は、エッペンドルフ半自動システム（エッペンドルフ５１７１及びエッペンドルフ５４２４圧力インジェクタ）及びＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００ＴＶ反転顕微鏡を用いて行った。マイクロピペット（外径０．２〜０．５μｍ）を、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ． Ｍｏｄｅｌ Ｐ−９７ニードル抜き器を用いてホウケイ酸ガラス製キャピラリ（ＧＣ１２０Ｆ−１０； Ｃｌａｒｋ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から抜いた。プラスミドを、インジェクション時間０．２〜１．０ｓ、６０〜２００ｈＰａの圧力で、０．２×ＴＥバッファー中２０〜２００μｇ／ｍｌで顕微注射した。顕微注射の間、ｐＨ７．４の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ ＮａＨＣＯ３を補給した成長培地中で細胞をインキュベートした。顕微注射後、１００ｎＭインスリンの存在又は非存在下で３０分間刺激する前に２時間血清が枯渇しないうちに、細胞を適する成長培地中３７℃で１６〜２４時間インキュベートして、注射したプラスミドＤＮＡにより符号化されたタンパク質を発現させた。
【００４７】
その後、これまでに説明したように、表面上に曝露されたＧＦＰを可視化するためだけに、事前に易透化することなく、４％パラホルムアルデヒド中で細胞を固定し、抗ＧＦＰ抗体で染色した。
【００４８】
ＩＲＡＰ−ＧＦＰ発現の全レベルは、検出されたＧＦＰ蛍光のレベルにより指示される（これは本発明の第一の側面の第二検出法に相当する）。細胞表面で曝露されたＩＲＡＰ−ＧＦＰは、抗ＧＦＰ抗体での染色のレベルにより与えられる（これは本発明の第一の側面の第一検出法に相当する）。ＩＲＡＰ−ＧＦＰを発現する顕微注射された細胞を、１６×対物レンズを用いた共焦顕微鏡により影像化した。図３は、各々の検出法により得ることができる像の例を示す。ＩＲＡＰ−ＧＦＰ蛍光による蛍光強度と表面ＩＲＡＰ−ＧＦＰ蛍光染色とを、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて各々の個々の細胞について計算し、バックグラウンドの蛍光像を控除した。各々の細胞について、バックグラウンド補正した表面ＩＲＡＰ−ＧＦＰ：全ＩＲＡＰ−ＧＦＰの比を計算した。得られた結果を図４に説明する。各々のデータ点は、一つの細胞についての赤色：緑色蛍光比を表す。表面ＩＲＡＰ−ＧＦＰ：全ＩＲＡＰ−ＧＦＰの比が高いということは、細胞がＩＲＡＰ−ＧＦＰの形質膜への転座を受けていることを示している。図４は、インスリン存在下において、有意な割合の細胞がこの方法を用いて検出可能な転座を受けていることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、抗ＧＦＰ抗体を用いて映像化されたＣＨＯ−Ｔ細胞におけるＩＲＡＰ−ＧＦＰのインスリン誘発性転座を説明する代表的な像を示す図である。
【図２】図２は、インスリン処理後の抗ＧＦＰ抗体のＩＲＡＰ−ＧＦＰ構成体を発現する未易透化ＣＨＯ−Ｔ細胞表面への結合の増加を示す図である。
【図３】図３は、各々の検出法により得ることができる像の例を示す図である。
【図４】図４は、インスリン処理後の抗ＧＦＰ抗体の未易透化３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞表面への結合の増加を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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