(57)【要約】本発明は核酸ワクチン接種に用いるための１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］−４−アミン誘導体のアジュバントとしての使用に関する。
2004509150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を含むアジュバント成分と、（ｉｉ）疾患状態に関連する抗原性ペプチドまたは蛋白をエンコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分とを含むワクチン組成物。
【請求項２】
（ｉ）１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体と、（ｉｉ）疾患状態に関連する抗原性ペプチドまたは蛋白をエンコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分とを含むキット。
【請求項３】
成分が実質的に同時投与されるところの、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
成分が単一の医薬上許容される処方内に含まれるところの、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が、式Ｉ−ＶＩ：
【化１】
2004509150.tif 000010
［式中、
Ｒ１１は直鎖または分岐鎖アルキル、ヒドロキシアルキル、アシルオキシアルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択される；ここで、該ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、ベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群から独立して選択される１または２個の基により置換されていてもよい；ただし、このベンゼン環が２個のこれらの基により置換されているならば、これらの基は合わせて６個以下の炭素原子を含むものとする；
Ｒ２１は水素、１ないし約８個の炭素原子を有するアルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択される；ここで、ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、ベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群より独立して選択される１または２個の基により置換されていてもよい；ただし、ベンゼン環が２個のこれらの基により置換されている場合、これらの基は合わせて６個以下の炭素原子を含むものとする；および
Ｒ１は、各々、水素、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシ、ハロゲンおよび１ないし約４個の炭素原子を有するアルキルからなる群から独立して選択される；
ｎは０ないし２の整数である；ただし、ｎが２であるならば、Ｒ１基は合わせて６個以下の炭素原子を含むものとする］；
【化２】
2004509150.tif 000011
［式中、
Ｒ１２は２ないし約１０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルケニルおよび２ないし約１０個の炭素原子を含む置換された直鎖または分岐鎖アルケニル（ここで、置換基は１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルおよび３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルならびに１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルにより置換された３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択される）からなる群から選択される；
Ｒ２２は水素、１ないし約８個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択される；ここで、ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、ベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびハロゲンからなる群から独立して選択される１または２個の基により置換されていてもよい；ただし、ベンゼン環が２個のかかる基により置換されている場合、該基は合わせて６以下の炭素原子を含むものとする；および
Ｒ２は、各々独立して、１ないし約４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲン、および１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される；
ｎは０ないし２の整数である；ただし、ｎが２である場合、Ｒ２基は合わせて６個以下の炭素原子を含むものとする］；
【化３】
2004509150.tif 000012
［式中、
Ｒ２３は水素、１ないし約８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択される；ここで、ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、ベンゼン環上、１ないし約４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル、１ないし約４個の炭素原子を有する直接または分岐鎖アルコキシおよびハロゲンからなる群から独立して選択される１または２個の基で置換されていてもよい；ただし、ベンゼン環が２個のかかる基で置換されている場合、該基は合わせて６個以下の炭素原子を含むものとする；
Ｒ３は、各々独立して、１ないし約４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンおよび１ないし約４個の炭素原子を有する３０の直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される；
ｎは０ないし２の整数である；ただし、ｎが２であるとすると、Ｒ３基は合わせて６個以下の炭素原子を含むものとする］；
【化４】
2004509150.tif 000013
［式中、
Ｒ１４は−ＣＨＲＡＲＢである（ここに、ＲＢは水素または炭素−炭素結合である；ただし、ＲＢが水素である場合、ＲＡは１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシ、１ないし約４個の炭素原子を有するヒドロキシアルコキシ、２ないし約１０個の炭素原子を有する１−アルキニル、テトラヒドロピラニル、アルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を含み、アルキル部分が１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシアルキル、２−、３−または４−ピリジルであり、さらにはＲＢが炭素−炭素結合である場合、ＲＢおよびＲＡは一緒になって、ヒドロキシおよび１ないし約４個の炭素原子を有するヒドロキシアルキルからなる群から独立して選択される１個またはそれ以上の置換基により置換されていてもよいテトラヒドロフラニル基を形成するものとする）；
Ｒ２４は水素、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、フェニルおよび置換フェニル（ここで、置換基は、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群から選択される）；および
Ｒ４は水素、１ないし約４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンおよび１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される］；
【化５】
2004509150.tif 000014
［式中、
Ｒ１５は水素；１ないし約１０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル；１ないし約１０個の炭素原子を含む置換された直鎖または分岐鎖アルキル（ここで、置換基は３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルおよび１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルで置換された３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択される）；２ないし約１０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルケニル；２ないし約１０個の炭素原子を有する置換された直鎖または分岐鎖アルケニル（ここで、置換基は３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルおよび１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルで置換された３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択される）；１ないし約６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル；アルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を有し、アルキル部分が１ないし約６個の炭素原子を有するアルコキシアルキル；アシルオキシ部分が２ないし約４個の炭素原子を有するアルカノイルオキシまたはベンゾイルオキシであり、アルキル部分が１ないし約６個の炭素原子を含むアシルオキシアルキル；ベンジル；（フェニル）エチル；およびフェニルからなる群から選択される；ここで、ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、ベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群から独立して選択される１または２個の基で置換されていてもよい；ただし、ベンゼン環が２個の前記した基で置換されている場合、該基は合わせて６個以下の炭素原子を含むものとする；
Ｒ２５は、
【化６】
2004509150.tif 000015
（式中、
ＲＸおよびＲＹは、独立して、水素、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、フェニルおよび置換フェニル（ここで、置換基は１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群から選択される）からなる群から独立して選択される；
Ｘは１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシ；アルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を含み、アルキル部分が１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシアルキル；１ないし約４個の炭素原子を含むハロアルキル；アルキル基が１ないし約４個の炭素原子を含むアルキルアミド；アミノ；置換アミノ（置換基は１ないし約４個の炭素原子を有するアルキルまたはヒドロキシアルキルである）；アジド；１ないし約４個の炭素原子を有するアルキルチオからなる群から選択される；
Ｒ５は水素、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンおよび１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される］；
【化７】
2004509150.tif 000016
［式中、
Ｒｔは水素、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンおよび１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される；
Ｒｕは２−メチルプロピルまたは２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルである；
Ｒｖは水素、１ないし約６個の炭素原子を有するアルキルまたはアルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を含み、アルキル部分が１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシアルキルである］
の一つにより特定される化合物またはその医薬上許容される塩であるところの、前記した請求項のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項６】
１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が式ＶＩの化合物であるところの、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
Ｒｔが水素であるところの、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
Ｒｕが２−メチルプロピルまたは２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルであり、Ｒｖが水素、メチルまたはエトキシメチルであるところの、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
化合物が
１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；および
１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
からなる群から選択されるところの、請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
各成分が、経口、経鼻、局所、経肺、筋肉内、皮下または皮内経路のいずれかによる投与に適した形態であるところの、前記した請求項のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
免疫原成分が粒子媒介遺伝子移入技術を用いた投与に適する形態であるところの、前記した請求項のいずれか一つに記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
アジュバント成分が粒子媒介遺伝子移入技術を用いた投与に適する形態であるところの、請求項１１記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
抗原に対する免疫応答を増大させる方法であって、抗原をエンコードする核酸およびイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を連続してまたは同時のいずれかで投与することを含む方法。
【請求項１４】
免疫原に対する哺乳動物の免疫応答を増大させる方法であって、前記した哺乳動物に請求項１ないし１２のいずれか一つに記載のワクチン組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
アジュバント成分の投与が、免疫原成分の投与前約７日から投与後約７日の間に１から７回行われるところの、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
アジュバント成分の投与が免疫原成分の投与と実質的に同時に行われるところの、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与されるところの、請求項１３ないし１４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
抗原性ペプチドにより開始される免疫応答を亢進する医薬の製造における、該ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を哺乳動物に投与した結果として該ペプチドが発現されるところの、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体の使用。
【請求項１９】
１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が請求項５において定義したとおりである、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が請求項６において定義したとおりである、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が約１ｍｇ／ｋｇないし５０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与されるところの、請求項１８ないし２０のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２２】
抗原性ペプチドである免疫原をエンコードするヌクレオチド配列と、抗原性ペプチドにより開始される免疫応答を向上させる１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体とを含む、ＤＮＡワクチン接種において使用するための個別、連続または同時投与用の成分の組み合わせ。
【請求項２３】
１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が請求項５において定義したとおりである、請求項２２記載の組み合わせ。
【請求項２４】
１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が請求項６において定義したとおりである、請求項２３記載の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＤＮＡワクチン接種における改良に関し、特に、排他的ではないが、ワクチン組成物、疾患状態に対する哺乳動物のワクチン接種法、および医薬の製造におけるある化合物の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
動物において免疫応答を誘発できる抗原を動物系中へ導入し、これにより動物を感染に対して防御することを含む伝統的なワクチン接種技術が長年にわたって知られている。プラスミドＤＮＡが動物細胞にインビボで直接感染できるという１９９０年代初頭における観察に従って、抗原性ペプチドをエンコードするＤＮＡを動物中に直接導入することにより、免疫応答を誘発するためにＤＮＡプラスミドを使用することに基づくワクチン接種技術の開発のために多大な努力がなされてきた。かかる技術は、「ＤＮＡ免疫化（ＤＮＡ　ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）」または「ＤＮＡワクチン接種（ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」と呼ばれ、ウイルス性、細菌性および寄生虫性疾患に対して様々な前臨床モデルにおいて防御抗体（体液性）および細胞媒介（細胞性）免疫応答を惹起するために用いられている。ガン、アレルギーおよび自己免疫疾患に対する治療および防御におけるＤＮＡワクチン接種技術の使用に関連しても研究が進行中である。
【０００３】
ＤＮＡワクチンは、通常、強力なプロモーターが挿入される細菌プラスミドベクター、抗原性ペプチドをエンコードする興味のある遺伝子およびポリアデニル化／転写停止配列からなる。興味のある遺伝子がエンコードする免疫原は、完全な蛋白であってもよいし、または単に、病原体、腫瘍または防御されることを意図される他の作用物質に関連する抗原性ペプチドであってもよい。プラスミドは、細菌、例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において成長させることができ、次いで単離され、宿主に投与される前に、意図する投与経路に応じて適当な培地中で調製される。
ＤＮＡワクチン接種に関連する有用なバックグラウンド情報は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， Ｊら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９７） １５：６１７−６４８において記載され、この開示は出典明示により本発明の一部とする。
【０００４】
伝統的なワクチン接種技術と比較してＤＮＡワクチン接種には多くの利点がある。まず、ＤＮＡ配列によりエンコードされる蛋白は宿主において合成されるので、該蛋白の構造または配置は疾患状態に関連する固有の蛋白と類似している。ＤＮＡワクチン接種は保存された蛋白から得られるエピトープを認識する応答に対して防御を提供するであろうと予想される。ＤＮＡワクチン接種は、保存された蛋白からエピトープを認識する細胞障害性Ｔリンパ球応答を生じることにより、ウイルスの異なる種に対して防御を提供する可能性もある。さらに、プラスミドは宿主細胞に直接導入され、ここで抗原性蛋白が産生できるので、長期間持続性免疫応答が惹起されるであろう。この技術により、様々な免疫原を単一の製剤中に組み入れて、多くの疾患状態に関連した同時免疫化を促進することもできる。
【０００５】
伝統的なワクチン接種療法よりも優れたＤＮＡワクチン接種に関連する多くの利点にもかかわらず、動物に投与されるプラスミドＤＮＡによりエンコードされる蛋白により誘発される免疫応答を増大させるアジュバント化合物の開発が望まれる。
ＤＮＡワクチン接種は、特にＤＮＡが直接表皮に投与される場合に、Ｔｈ１からＴｈ２応答へ免疫応答が不適切に偏向する場合がある（Ｆｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈａｙｎｅｓ Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒ． （１９９４）１０：１４３３−４１）。核酸ワクチンから要求される免疫特性は、標的とされる疾患によって変わることが認識されている。Ｔｈ１応答の優先的な刺激は、多くのウイルス性疾患およびガンに対するワクチンの有効性を提供し、Ｔｈが優勢なタイプの応答はいくつかの自己免疫応答に関連するアレルギーおよび炎症の抑制に有効である。従って、免疫応答を量的に高めるかまたは適応症に対して最も有効であるものへ応答の種類を変化させる方法が有用である。
【０００６】
従って、本発明の目的の一つは、ＤＮＡワクチン接種法と関連して使用できるアジュバント化合物を提供することである。関連するアジュバント、ならびにかかるアジュバントを含む改良されたＤＮＡワクチン接種の方法を提供することも目的の一つである。本発明の他の目的は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、今日まで、主に、伝統的なワクチン接種技術と比較したＤＮＡワクチン接種に関連する機械的相違のためにこれらの目的を満足することは困難であることが判明している。さらに、適当な化合物の同定は簡単ではなく、多くの公知免疫賦活剤がＤＮＡワクチン接種技術と組み合わせて試されてきたが、ほとんど成功せず、よくても成功はまちまちであった。例えば、ＩＦＮ−γの遺伝子および狂犬病ウイルス糖蛋白の同時投与は、Ｔヘルパー細胞応答および抗体応答の両方に関して抑制効果を有していた（Ｘｉａｎｇ ａｎｄ Ｅｒｔｌ）。
このような背景を考慮すると、本発明者らが向上した免疫応答、特に、ＤＮＡワクチン接種においてアジュバントとして用いた場合に向上した細胞性免疫応答を増進するのに有効であるアジュバント化合物を報告していることは非常に驚異的である。イミダゾキノリンアミン誘導体は、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを含むサイトカインの誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）である（例えば、Ｒｅｉｔｅｒｒら、Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４）５５：２３４−２４０）。これらの化合物およびその調製法は、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ９４／１７０４３に開示されている。本発明者らは、これらの誘導体はＤＮＡワクチン接種においてアジュバントとして有効に用いることができることを示した。
【０００７】
（発明の開示）
本発明の一の態様に従って、（ｉ）１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を含むアジュバント成分および（ｉｉ）疾患状態に関連する抗原性ペプチドまたは蛋白をエンコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分を含むワクチン組成物が提供され、該アジュバント成分は抗原性ペプチドまたは蛋白に対する哺乳動物における免疫応答を向上させる。
さらにもう一つの態様において、本発明は抗原に対する免疫応答を増大させる方法を提供し、該方法は、抗原をエンコードする核酸およびイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を連続または同時のいずれかで投与することを含む。
さらにもう一つの態様において、ヌクレオチド配列によりエンコードされる抗原に対する免疫応答の向上のための医薬の製造におけるイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体の使用が提供され、前記ヌクレオチド配列は前記誘導体と連続して、または同時に投与される。
さらにもう一つの態様において、本発明はさらに、核酸配列によりエンコードされる抗原に対する免疫応答を向上させるためのイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【０００８】
好ましくは、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体は、本明細書において定義した式Ｉ〜ＶＩの一つにより定義される化合物である。より好ましくは、式ＶＩにより定義される化合物である。１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体が
１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−ヒドロキシ−４−メチルプロピル）−２−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンからなる群から選択される式ＶＩの化合物である場合が特に好ましい。
もう一つの例において、本発明は疾患状態に対して哺乳動物において免疫応答を高める方法であって、前記哺乳動物に適当なベクター中で疾患状態に関連する抗原性ペプチドをエンコードする核酸配列を投与し、前記哺乳動物にワクチンアジュバントとして１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を追加的に投与して前記免疫応答を高めることを含む方法を提供する。さらに、免疫原に対する哺乳動物の免疫応答を増大させる方法であって、前記哺乳動物に適当なベクター中で、前記免疫原をエンコードするヌクレオチド配列を、免疫応答を刺激するために有効な量において投与し；さらに前記哺乳動物にワクチンアジュバントとして１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を、前記免疫応答を増大させるために有効な量において投与することを含む方法も提供される。好ましくは、前記方法において１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体は式ＶＩの化合物である。
さらにもう一つの態様において、本発明は、抗原性ペプチドまたは蛋白により開始される免疫応答を向上させる医薬の製造における１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体の使用を提供し、前記ペプチド／蛋白は、前記ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を哺乳動物に投与した結果として発現される。
【０００９】
（簡単な図面の記載）
図１
イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）は、インフルエンザウイルスからの核蛋白をエンコードするプラスミド（ｐＶＡＣ１．ＰＲ）でのワクチン接種後、細胞障害性Ｔ細胞応答を増大させる。ｐＶＡＣ１はベクター対照である。
図２
イミキモドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の増大により測定されるように、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでのワクチン接種後、インビボでのＣＤ４Ｔ細胞のクローンの拡大を増大させる。
図３
イミキモドは、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生細胞の増大により測定されるように、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでのワクチン接種後、インビボでの活性化されたＣＤ４Ｔ細胞の数を増大させる。
図４
イミキモドは、それぞれＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生細胞の増大により測定されるように、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでのワクチン接種後の、インビボでのＴｈ１およびＴｈ２応答の両者を誘発する。
図５
イミキモドはＨＩＶ抗原ＧａｇおよびＮｅｆをエンコードするプラスミド（ＷＲＧ７０７７．Ｇａｇ／Ｎｅｆ）でワクチン接種した後に細胞障害性Ｔ細胞応答を増大させる。ＷＲＧ７０７７はベクター対照である。
図６
イミキモドの類似体であるレシキモド（１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−エトキシメチル−１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生細胞の増大により測定されるように（それぞれ６Ａおよび６Ｂ）、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでワクチン接種した後にインビボでの活性化されたＣＤ４Ｔ細胞の数を増大させる。
図７
イミキモドの２つの類似体、１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンおよび１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンは、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生細胞の増大により測定されるように（それぞれ７Ａおよび７Ｂ）、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでのワクチン接種後に、インビボでの活性化されたＣＤ４Ｔ細胞の数を増大させる。
図８
イミキモドの局所投与は、ＨＩＶ抗原ＧａｇおよびＮｅｆをエンコードするプラスミド（ＷＲＧ７０７７．Ｇａｇ／Ｎｅｆ）でのワクチン接種後、細胞障害性Ｔ細胞応答を増大させる。
図９
イミキモドは卵白アルブミンをエンコードするプラスミドでのワクチン接種後、卵白アルブミン発現ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞で攻撃された動物において腫瘍の成長を遅らせる。
図１０
イミキモドは、卵白アルブミンをエンコードするプラスミドで前免疫した動物中に移植された卵白アルブミン発現ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞の腫瘍発生性を低下させる。
【００１０】
（発明の詳細な記載）
本明細書および添付の請求の範囲全体にわたり、特に記載しない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」なる用語または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」などの変化形は包括的に解釈され、すなわち、これらの用語の使用は、具体的に記載されていない整数または要素を包含できることを意味する。
前記のように、本発明は免疫原組成物、例えば、ワクチン組成物、ワクチン接種法、および哺乳動物に抗原性蛋白またはペプチドである免疫原をエンコードするヌクレオチド配列を導入して、該蛋白またはペプチドが哺乳動物体内で発現され、これにより哺乳動物内で抗原性蛋白またはペプチドに対して免疫応答を誘発させることを含むワクチン接種法の改良法に関する。かかるワクチン接種法はよく知られており、前記のＤｏｎｎｅｌｌｙらにおいて詳細に記載されている。
本明細書において使用する場合、ワクチン組成物なる用語は、免疫原をエンコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分、および１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を含むアジュバント成分を含む免疫原性分の組み合わせを意味する。組み合わせは、例えば、単一の医薬的に許容される処方中の２成分の混合物の形態、または別個の成分の形態、例えば、免疫原をエンコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分、および１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含むアジュバント成分を含むキットの形態であり、２成分は、個別、連続または同時投与される。２成分の投与は実質的に同時であるのが好ましい。
【００１１】
本明細書および請求の範囲全体にわたって言及される１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体は、好ましくは次の式Ｉ〜ＶＩ：
【化８】
2004509150.tif 000003
（式中、
Ｒ１１は、直鎖または分岐鎖アルキル、ヒドロキシアルキル、アシルオキシアルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択され、前記ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、所望によりベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群から選択される１または２個の基により所望により置換されていてもよい。ただし、前記ベンゼン環が２個のかかる基により置換されている場合、前記基は合わせて６以下の炭素原子を含むとする；Ｒ２１は、水素、１ないし約８個の炭素原子を有するアルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択され、該ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、所望によりベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群から独立して選択される１または２個の基により置換されていてもよい。ただし、ベンゼン環が２個の前記基により置換されている場合、該基は合わせて６個以下の炭素を含むとする；各Ｒ１は独立して、水素、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシ、ハロゲンおよび１ないし約４個の炭素原子を有するアルキルからなる群から選択され、ｎは０ないし２の整数である。ただし、ｎが２である場合、前記Ｒ１１基は合わせて６以下の炭素を含むとする）；
【化９】
2004509150.tif 000004
（式中、
Ｒ１２は、２ないし約１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルケニルおよび２ないし約１０個の炭素原子を含む置換直鎖または分岐鎖アルケニル（ここに、置換基は、１ないし約４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキルおよび３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択される）；および１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルにより置換されている３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２２は、水素、１ないし約８個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択され、該ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、所望によりベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびハロゲンからなる群から独立して選択される１または２個の基により置換されていてもよい。ただし、ベンゼン環が２個のかかる基により置換されている場合、該基は合わせて６以下の炭素原子を含むとする；各Ｒ２は独立して、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲン、および１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択され、ｎは０ないし２の整数である。ただし、ｎが２であるならば、前記Ｒ２基は合わせて６以下の炭素原子を含むとする）；
【化１０】
2004509150.tif 000005
（式中、
Ｒ２３は、水素、１ないし約８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択され、該ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、所望によりベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル、１ないし約４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびハロゲンからなる群から独立して選択される１または２個の基により置換されていてもよい。ただし、ベンゼン環がかかる２個の基により置換されている場合、該基は合わせて６以下の炭素原子を含むとする；各Ｒ５は、独立して、１ないし約４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲン、および１ないし約４個の炭素原子を有する３０の直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から独立して選択され、ｎは０ないし２の整数である。ただし、ｎが２であるならば、前記Ｒ３基は合わせて６以下の炭素原子を含むとする）；
【化１１】
2004509150.tif 000006
（式中、
Ｒ１４は−ＣＨＲＡＲＢ（式中、ＲＢは水素または炭素−炭素結合である。ただし、ＲＢが水素である場合、ＲＡは１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシ、１ないし約４個の炭素原子を有するヒドロキシアルコキシ、２ないし約１０個の炭素原子を有する１−アルキニル、テトラヒドロピラニル、アルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を含み、アルキル部分が１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシアルキル、２−、３−または４−ピリジルであるとする；さらにＲＢが炭素−炭素結合であるならば、ＲＢおよびＲＡは一緒になって、ヒドロキシおよび１ないし約４個の炭素原子を有するヒドロキシアルキルからなる群から独立して選択される１以上の置換基により所望により置換されていてもよいテトラヒドロフラニルを形成するものとする；Ｒ２４は、水素、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、フェニル、および置換フェニル（置換基は、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシ、およびハロゲンからなる群から選択される）；Ｒ４は、水素、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲン、および１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される）；
【化１２】
2004509150.tif 000007
（式中、
Ｒ１５は水素；１ないし約１０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル；１ないし約１０個の炭素原子を含む置換された直鎖または分岐鎖アルキル（ここで、置換基は３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルおよび１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルで置換された３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択される）；２ないし約１０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルケニル；２ないし約１０個の炭素原子を有する置換された直鎖または分岐鎖アルケニル（ここで、置換基は３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルおよび１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルで置換された３ないし約６個の炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択される）；１ないし約６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル；アルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を有し、アルキル部分が１ないし約６個の炭素原子を有するアルコキシアルキル；アシルオキシ部分が２ないし約４個の炭素原子を有するアルカノイルオキシまたはベンゾイルオキシであり、アルキル部分が１ないし約６個の炭素原子を含むアシルオキシアルキル；ベンジル；（フェニル）エチル；およびフェニルからなる群から選択される；ここで、ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、ベンゼン環上で、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群から独立して選択される１または２個の基で置換されていてもよい；ただし、ベンゼン環が２個の前記した基で置換されている場合、該基は合わせて６個以下の炭素原子を含むものとする；
Ｒ２５は、
【化１３】
2004509150.tif 000008
（式中、
ＲＸおよびＲＹは、独立して、水素、１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、フェニルおよび置換フェニル（ここで、置換基は１ないし約４個の炭素原子を有するアルキル、１ないし約４個の炭素原子を有するアルコキシおよびハロゲンからなる群から選択される）からなる群から独立して選択される；
Ｘは１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシ；アルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を含み、アルキル部分が１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシアルキル；１ないし約４個の炭素原子を含むハロアルキル；アルキル基が１ないし約４個の炭素原子を含むアルキルアミド；アミノ；置換アミノ（置換基は１ないし約４個の炭素原子を有するアルキルまたはヒドロキシアルキルである）；アジド；１ないし約４個の炭素原子を有するアルキルチオからなる群から選択される；
Ｒ５は水素、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンおよび１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される））
の一つにより規定される化合物、または前記化合物のいずれかの医薬的に許容される塩である。
【００１２】
好ましいアルキル基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、２−メチルプロピルおよびブチルである。最も好ましいアルキル基は、メチル、エチルおよび２−メチルプロピルである。好ましいアルコキシ基は、メトキシ、エトキシおよびエトキシメチルである。
前記化合物およびその調製法は、ＰＣＣ特許出願公開番号ＷＯ９４／１７０４３に開示されている。
ｎが０、１、または２である場合、ｎは好ましくは０または１である。
前記置換基Ｒ１〜Ｒ５は本明細書において一般に「ベンゾ置換基」と称する。好ましいベンゾ置換基は水素である。
前記置換基Ｒ１１〜Ｒ１５は、本明細書において一般に「１−置換基」と称する。好ましい１−置換基は、２−メチルプロピルまたは２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルである。
前記置換基Ｒ２１〜Ｒ２５は、本明細書において一般に「２−置換基」と表す。好ましい２−置換基は、水素、１ないし約６個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を含み、アルキル部分が１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシアルキルである。最も好ましくは、２−置換基は水素、メチルまたはエトキシメチルである。
【００１３】
特に好ましいのは、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンが次の式ＶＩ：
【化１４】
2004509150.tif 000009
（式中、
Ｒｔは、水素、１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲン、および１ないし約４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択される；
Ｒｕは２−メチルプロピルまたは２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルである；Ｒｖは水素、１ないし約６個の炭素原子を有するアルキル、またはアルコキシ部分が１ないし約４個の炭素原子を含み、アルキル部分が１ないし約４個の炭素原子を含むアルコキシアルキルである）により定義される化合物、または前記化合物のいずれかの生理学的に許容される塩である場合である。
式ＶＩにおいて、Ｒｔは好ましくは水素であり、Ｒｕは好ましくは２−メチルプロピルまたは２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルであり、Ｒｖは好ましくは、水素、メチルまたはエトキシメチルである。
好ましい１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンは次の化合物：
１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（Ｒｔが水素であり、Ｒｕが２−メチルプロピルであり、Ｒｖが水素である式ＶＩの化合物）；
１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（Ｒｔが水素であり、Ｒｕが２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルであり、Ｒｖがメチルである式ＶＩの化合物）；
１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（Ｒｔが水素であり、Ｒｕが２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルであり、Ｒｖが水素である式ＶＩの化合物）；
１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−エトキシメチル−１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（Ｒｔが水素であり、Ｒｕが２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルであり、Ｒｖがエトキシメチルである式ＶＩの化合物）；
またはその生理学的に許容される塩を含む。
【００１４】
本出願のワクチン接種法および組成物は、さまざまな疾患状態、例えば、ウイルス、細菌または寄生虫感染症、ガン、アレルギーおよび自己免疫障害に対して哺乳動物を防御または治療するために適用することができる。本発明の方法または組成物を用いることにより防御または治療できる障害または疾患状態のいくつかの具体例は次の通りである：
ウイルス感染症
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、１、２、６および７型ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状ヘルペス、乳糖種ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、パポーバウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス。
細菌感染症
ＴＢおよびハンセン病を引き起こすマイコバクテリア
肺炎球菌、好気性グラム陰性桿菌、マイコプラズマ、スタフィロコッカス感染症、ストレプトコッカス感染症、サルモネラ、クラミジア。
寄生虫
マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ病、トキソプラズマ症、住血吸虫症、フィラリア症。
ガン
乳ガン、結腸ガン、直腸ガン、頭部および頸部のガン、腎臓ガン、悪性黒色腫、咽頭ガン、卵巣ガン、子宮頚ガン、前立腺ガン。
アレルギー
ハウスダスト、ダニ、花粉および他の環境アレルゲンによる鼻炎
自己免疫疾患
全身性紅斑性狼瘡。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法または組成物は、ウイルス性疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳糖腫ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、または単純ヘルペスウイルス；細菌性疾患ＴＢ；乳ガン、結腸ガン、卵巣ガン、子宮頚ガン、および前立腺ガン；または喘息、慢性関節リウマチおよびアルツハイマー病の自己免疫疾患に対して防御するかまたはこれを治療するために用いられる。
これらの具体的な疾患状態は例示のためのみに記載したものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではないと理解される。
本出願において記載されるヌクレオチド配列は、哺乳動物系ないで発現されるが、抗原応答を惹起するために、全体的な蛋白をエンコードしてもよいし、または抗原応答を開始できるさらに短いペプチド配列だけをエンコードしてもよい。本明細書および添付の請求の範囲全体にわたって、「抗原性ペプチド」または「免疫原」なる語句は、関連する動物内での免疫応答を誘発できるすべてのペプチドまたは蛋白配列を含むことを意図される。しかしながら、最も好ましくは、動物系内の完全な蛋白の発現は天然の抗原提示を模倣しやすく、従って完全な免疫応答を引き起こすので、該ヌクレオチド配列は疾患状態に関連する完全な蛋白をエンコードするであろう。特定の疾患状態に関連する公知抗原性ペプチドのいくつかの非制限的な例としては、次のものが挙げられる：ヒト病原体に対して免疫応答を惹起できる抗原（該抗原または抗原性組成物は、ＨＩＶ−１（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ）、ヒトヘルペスウイルス、例えば、ｇＨ、ｇＬ　ｇＭ　ｇＢ　ｇＣ　ｇＫ　ｇＥまたはｇＤあるいはその誘導体またはイミディエートアーリー蛋白、例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２から得られるＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６、サイトメガロウイルス、特にヒト（例えば、ｇＢまたはその誘導体）、エプスタイン・バーウイルス（例えば、ｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状ヘルペスウイルス（例えば、ｇｐＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＥ６３）由来であるか、または肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原またはｐｏｌ）、Ｃ型肝炎ウイルス抗原およびＥ型肝炎ウイルス抗原由来であるか、または他のウイルス性病原体、例えば、パラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（例えば、ＦおよびＧ蛋白またはその誘導体）由来であるか、あるいはパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト乳糖種ウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８，ｅｇＬ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス、例えば、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、またはＭ蛋白、またはその組み合わせから得られる抗原である）、または細菌性病原体、例えば、エヌ・ゴノレエおよびエヌ・メニンジティディスを含むナイセリア種由来の抗原、例えば、トランスフェリン−結合蛋白、ラクトフェリン結合蛋白、ＰｉｌＣ、アドヘシン）；エス・ピオゲネス（例えば、Ｍ蛋白またはそのフラグメント、Ｃ５Ａプロテアーゼ、エス・アガラクティエ、エス・ミュータンス；エイチ・デュクレイイ；ブランハメラ・カタラーリス（例えば、高および低分子量アドヘシンおよびインベジン）とも呼ばれるエム・カタラーリスを含むモラクセラ種；ビー・パーツシス（例えば、ペルタクチン、百日咳毒素またはその誘導体、繊維状赤血球凝集素、アデニレートサイクラーゼ、フィムブリエ）、ビー・パラペルツッシスおよびビー・ブロンキセプチカを含むボルデテラ種；エム・ツベルクローシス（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、ＢまたはＣ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ１９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］、エム・ボビス、エム・レプレ、エム・アビウム、エム・パラツベルクローシス、エム・スメグマチスを含むマイコバクテリウム種；エル・ニューモフィラを含むレジオネラ種；腸毒素大腸菌（例えば、定着因子、非耐熱性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌（例えば、シガ毒素様毒素またはその誘導体）を含むエシェリキア種；ブイ・コレレ（例えば、コレラ毒素またはその誘導体）を含むビブリオ種；エス・ソンネイ、エス・ディセンテリエ、エス・フレクスネリを含むシゲラ種；ワイ・エンテロコリチカ（例えば、Ｙｏｐ蛋白）、ワイ・ペスティス、ワイ・シュードツベルクローシスを含むエルシニア種；シー・ジェジュニ（例えば、毒素、アドヘシンおよびインベジン）およびシー・コリを含むカンピロバクター種；エス・チフィ、エス・パラチフィ、エス・コレレスイス、エス・エンテリティディスを含むサルモネラ種；エル・モノサイトゲネスを含むリステリア種；エイチ・ピロリ（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むヘリコバクター種；ピー・エルジノーサを含むシュードモナス種；エス・アウレウス、エス・エピデルミディスを含むスタフィロコッカス種；イー・フェカーリス、イー・フェシウムを含むエンテロコッカス種；シー・テタニ（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、シー・ボツリナム（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）、シー・ディフィシレ（例えば、クロストリジウム毒素ＡまたはＢおよびその誘導体）を含むクロストリジウム種；ビー・アンスラシス（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むバチルス種；シー・ジフセリエ（例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体）を含むコリネバクテリウム種；ビー・ブルグドルフェリ（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ビー・ガリニ（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ビー・アフゼリ（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ビー・アンデルソニイ（例えば、ＯＳｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ビー・ハムシイを含むボレリア種；イー・エクイを含むエールリッヒア種およびヒト顆粒球エールリッヒア症の作用因子；アール・リケッチイを含むリケッチア種；シー・トラコマチス（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合蛋白）、シー・ニューモニエ（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合蛋白）、シー・シッタシを含むクラミジア種；エル・インタロガンスを含むレプトスピラ種；ティー・パリダム（例えば、希外膜蛋白）、ティー・デンティコーラ、ティー・ヒオディセンテリエを含むトレポネーマ種；あるいは寄生虫由来のもの、例えば、熱帯熱マラリア原虫（ピー・ファルシパルム）を含むプラスモジウム種；ティー・ゴンディ（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むトキソプラズマ種；赤痢アメーバ（イー・ヒストリティカ）を含むアメーバ種；ビー・ミクロティを含むバベシア種；ティー・クルーズを含むトリパノソーマ種；ジー・ランブリアを含むジアルディア種；エル・メジャーを含むレシュマニア種；ピー・カリニを含むニューモシスティス種；膣トリコモナス（ティー・バギナリス）を含むトリコモナス種；マンソン住血吸虫（エス・マンソン）を含む住血吸虫種、あるいは酵母由来のもの、例えば、シー・アルビカンスを含むカンジダ種；シー・ネオホルマンスを含むクリプトコッカス種から得られる。
【００１６】
エム・ツベルクローシスの他の好ましい具体的な抗原は、例えば、Ｒｖ２５５７、Ｒｖ２５５８、ＲＰＦｓ：Ｒｖ０８３７ｃ、Ｔｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｃ２４５０、Ｒｖ１００９、ａｃｅＡ（Ｒｖ０４６７）、ＰｓｔＳ１、（Ｒｖ０９３２）、ＳｏｄＡ（Ｒｖ３８４６）、Ｒｖ２０３１ｃ　１６ｋＤａｌ．、Ｔｂ　Ｒａ１２、Ｔｂ　Ｈ９、Ｔｂ　Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２およびｈＴＣＣ１（ＷＯ９９／５１７４８）である。エム・ツベルクローシスの蛋白は、融合蛋白およびその変異体も含み、ここにおいてエム・ツベルクローシスの少なくとも２，好ましくは３のポリペプチドが大きな蛋白中に融合されている。好ましい融合物としては、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩ（ＷＯ９９／５１７４８）が挙げられる。
クラミジアの最も好ましい抗原としては、例えば、高分子量蛋白（ＨＷＭＰ）（ＷＯ９９／１７７４１）、ＯＲＦ３（ＥＰ３６６４１２）、および疑似膜蛋白（Ｐｍｐ）が挙げられる。ワクチン処方の他のクラミジア抗原は、ＷＯ９９／２８４７５に記載されている群から選択される。
【００１７】
好ましい細菌ワクチンは、エス・ニューモニエ（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合蛋白）を含むストレプトコッカス種由来の抗原および蛋白抗原ニューモリシン（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １９８９， ６７， １００７； Ｒｕｂｉｎｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２５， ３３７−３４２）、およびその突然変異無毒化誘導体を含む。他の好ましい細菌ワクチンは、エイチ・インフルエンゼＢ型（例えば、ＰＲＰおよびその接合体）、非分類可能なエイチ・インフルエンゼ、例えば、ＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、蛋白Ｄおよびリポ蛋白Ｄ、およびフィムブリンおよびフィムブリン由来のペプチド（米国特許第５８４３４６４号）またはその多コピー変異株または融合蛋白を含むヘモフィルス種由来の抗原を含む。
本発明において用いることができる抗原は、さらにマラリアを引き起こす寄生虫由来の抗原を含んでもよい。例えば、熱帯熱マラリア原虫由来の好ましい抗原は、ＲＴＳ、ＳおよびＴＲＡＰを含む。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２蛋白の４のアミノ酸によりＢ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に結合したピー・ファルシパルムのスポロゾイト周囲（ＣＳ）蛋白のＣ末端蛋白の実質的に全てを含むハイブリッド蛋白である。その完全な構造は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１（公開番号ＷＯ９３／１０１５２、米国特許出願第９１２４３９０．７号の優先権を主張）に開示されている。酵母において発現された場合に、ＲＴＳはリポ蛋白粒子として産生され、ＨＢＶからのＳ抗原と同時発現された場合に、ＲＴＳ、Ｓとして知られる混合粒子を産生する。ＴＲＡＰ抗原は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５（公開番号ＷＯ９０／０１４９６）記載されている。本発明の好ましい具体例は、抗原性製剤が、ＲＴＳ、ＳおよびＴＲＡＰ抗原の組み合わせを含むマラリアワクチンである。多段マラリアワクチンの成分である候補の可能性がある他のマラリア原虫抗原は、熱帯熱マラリア原虫、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セクエストリン、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびマラリア原虫種におけるその類似体である。
【００１８】
本発明は抗腫瘍抗原の使用を意図し、ガンの免疫療法に有用である。例えば、前立腺ガン、乳ガン、直腸結腸ガン、肺ガン、膵臓ガン、腎臓ガンまたは黒色腫などの腫瘍拒絶抗原である。抗原の例としては、ＭＡＧＥ１、３およびＭＡＧＥ４または他のＭＡＧＥ抗原、例えば、ＷＯ９９／４０１８８に開示されているもの、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ　Ｅｏｓ１ともいう）ＳＡＧＥおよびＨＡＧＥ（ＷＯ９９／５３０６１）またはＧＡＧＥ（Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ｋａｗａｋａｍｉ， １９９６， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８， ｐｐｓ ６２８−６３６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９７年提出）；Ｃｏｒｒｅａｌｅら、（１９９７）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ８９， ｐ２９３）が挙げられる。実際、これらの抗原は広範囲に及ぶ腫瘍のタイプ、例えば、黒色腫、肺ガン、肉腫および膀胱ガンにおいて発現される。
本発明において用いられるＭＡＧＥ抗原は、発現エンハンサーまたは免疫学的融合パートナーを用いて融合蛋白として発現することができる。特に、Ｍａｇｅ蛋白は、ヘモフィルス・インフルエンゼＢから得られる蛋白Ｄと融合させることができる。特に、融合パートナーは、蛋白Ｄの最初の１／３を含む。このような構造は、ＷＯ９９／４０１８８に開示されている。ガン特異性エピトープを含む融合蛋白の他の例は、ｂｃｒ／ａｂ／融合蛋白を含む。
【００１９】
好ましい例において、前立腺抗原、例えば、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（ＰＮＡＳ９５（４）１７３５−１７４０　１９９８）、ＰＳＭＡまたはプロスターゼとして知られる抗原が用いられる。
プロスターゼは前立腺特異性セリンプロテアーゼ（トリプシン様）であり、２５４アミノ酸長で、保存されたセリンプロテアーゼ触媒トライアッドＨ−Ｄ−Ｓおよびアミノ末端プレプロペプチド配列を有し、潜在的な分泌機能を示す（Ｐ． Ｎｅｌｓｏｎ， Ｌｕ Ｇａｎ， Ｃ． Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｐ． Ｍｏｓｓ， Ｒ． Ｇｅｌｉｎａｓ， Ｌ． Ｈｏｏｄ ＆ Ｋ． Ｗａｎｄ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｓｅ， ａｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｉｎ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９９） ９６， ３１１４−３１１９）。推定グリコシル化部位が記載されている。予想される構造は、他の公知セリンプロテアーゼと非常に類似し、成熟ポリペプチドが一つの領域中に折り重なることを示す。成熟蛋白は２２４アミノ酸長であり、１つのＡ２エピトープが自然に加工されることが証明されている。
プロスターゼヌクレオチド配列および推定されるポリペプチド配列および相同体は、Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９， ９６， ３１１４−３１１９）および国際特許出願番号ＷＯ９８／１２３０２（および対応する米国特許第５９５５３０６号）、ＷＯ９８／２０１１７（および対応する米国特許第５８４０８７１号および米国特許第５７８６１４８号）（前立腺特異性カリクレイン）およびＷＯ００／０４１４９（Ｐ７０３Ｐ）に開示されている。
【００２０】
本発明は、プロスターゼ蛋白およびそのフラグメントおよび相同体（「誘導体」）に基づくプロスターゼ蛋白融合物を含む抗原を提供する。かかる誘導体は前立腺腫瘍の治療に好適な治療用ワクチン処方における使用に好適である。典型的には、前記特許および特許出願において開示されているように、フラグメントは少なくとも２０、好ましくは５０、より好ましくは１００の連続したアミノ酸を含む。
さらに好ましい前立腺抗原は、Ｐ５０１Ｓと呼ばれ、ＷＯ９８／３７８１４の配列番号１１３である。前記特許および特許出願において開示されている少なくとも２０、好ましくは５０、より好ましくは１００の連続したアミノ酸を含むその遺伝子によりエンコードされる免疫原フラグメントおよび部分が意図される。具体的なフラグメントは、ＰＳ１０８である（ＷＯ９８／５０５６７）。
他の前立腺特異性抗原は、ＷＯ９８／３７４１８およびＷＯ／００４１４９から公知である。もう一つはＳＴＥＡＰ　ＰＮＡＳ　９６　１４５２３　１４５２８　７−１２　１９９９である。
本発明に関連して有用な他の腫瘍関連抗原としては：Ｐｌｕ−１　Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４（２２） １５６３３−１５６４５， １９９９、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ（Ｓａｌｏｍｏｎら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １９９， ２１ ６１−７０、米国特許第５６５４１４０）Ｃｒｉｐｔｉｎ　米国特許第５９８１２１５が挙げられる。さらに、ガンの治療におけるワクチンに特に関連する抗原は、チロシナーゼおよびサルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）も含む。
【００２１】
本発明はまた、乳ガン抗原、例えば、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、ＥｐＣＡＭ、ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、マンマブロビン（米国特許第５６６８２６７号）またはＷＯ／００５２１６５、ＷＯ９９／３３８６９、ＷＯ９９／１９４７９、ＷＯ９８／４５３２８に開示されているものの組み合わせにおいても有用である。Ｈｅｒ２ｎｅｕ抗原は、とりわけ米国特許第５８０１００５号において開示されている。好ましくは、Ｈｅｒ２ｎｅｕは細胞外領域全体（およそ１〜６４５アミノ酸を含む）またはそのフラグメントおよびＣ末端５８０アミノ酸に近い細胞内領域の少なくとも免疫原性部分または全体を含む。特に、細胞内蛋白はそのフラグメントのホスホリル化領域を含む。かかる構造は、ＷＯ００／４４８９９に開示されている。特に好ましい構造は、ＥＣＤ　ＰＤとして知られ、その次に好ましいのはＥＣＤ　□ＰＤとして知られている（ＷＯ／００／４４８９９参照）。
本明細書において用いられるｈｅｒ２ｎｅｕは、ラット、マウスまたはヒトから得ることができる。
ワクチンは、腫瘍維持メカニズム（例えば、脈管形成、腫瘍浸潤）に関連した抗原、例えば、ｔｉｅ２、ＶＥＧＦを含んでもよい。
本発明のワクチンは、アレルギー、ガンまたは感染性疾患に加えて、慢性障害の予防または治療にも用いることができる。かかる慢性障害は、喘息、アテローム性動脈硬化症、およびアルツハイマー病などの疾患、および他の自己免疫障害である。避妊薬として用いられるワクチンも考慮される。
【００２２】
アルツハイマー神経変成病にかかりやすいかまたはかかっている患者の予防および治療に関連する抗原は、特にＮ末端３９〜４３アミノ酸フラグメント（ＡＢアミロイド前駆体蛋白およびさらに小さなフラグメント）である。この抗原は、国際特許出願番号ＷＯ９９／２７９４４において開示されている（Ａｔｈｅｎａ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
自己免疫障害のワクチンとしてまたは避妊ワクチンとして含めることができる有効な自己抗原としては：サイトカイン、ホルモン、成長因子または細胞外蛋白が挙げられ、より好ましくは、４−ヘリカルサイトカイン、最も好ましくはＩＬ−１３である。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭＣＳＦおよびＯＳＭが挙げられる。４−ヘリカルサイトカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３、ＧＭＣＳＦおよびＭＣＳＦが挙げられる。ホルモンとしては、例えば、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、絨毛膜刺激ホルモン（ＣＧ）、ＶＧＦ、ＧＨｒｅｌｉｎ、ａｇｏｕｔｉ、ａｇｏｕｔｉ関連蛋白および神経ペプチドＹが挙げられる。成長因子としては、例えば、ＶＥＧＦが挙げられる。
【００２３】
本発明のワクチンは、慢性状態およびガンなどの病気の免疫療法に特に適しているが、持続性感染症の治療にも適している。従って、本発明のワクチンは、感染性疾患、例えば、結核（ＴＢ）、ＨＩＶ感染症、例えば、エイズおよびＢ型肝炎（ＨｅｐＢ）ウイルス感染症などの免疫療法に特に適している。
特に好ましい例において、核酸は１以上の次の抗原をエンコードする：
ＨＢＶ−ＰｒｅＳ１ＰｒｅＳ２および表面ｅｎｖ蛋白、コアおよびｐｏｌ
ＨＩＶ−ｇｐ１２０ｇｐ４０、ｇｐ１６０、ｇｐ２４、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ
パピローマ−Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｌ１、Ｌ２
ＨＳＶ−ｇＬ、ｇＨ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥ、ｇＤ、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ３６、ＩＣＰ４
インフルエンザ−赤血球凝集素、神経蛋白
ＴＢ−マイコバクテリアスーパーオキシドジスムターゼ、８５Ａ、８５Ｂ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ１９ｋＤａＡｇ、ＰＰＤ３８ｋＤａＡｇ。
【００２４】
ヌクレオチド配列は、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡであってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であり、最も好ましくはｃＤＮＡ配列である。哺乳動物細胞内に抗原性ペプチドの配列を得るためには、抗原性ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列が適当なベクターシステムにおいて提示される必要がある。本明細書において用いられる「適当なベクター」とは、免疫応答を生じさせるために十分な量において、哺乳動物内で抗原性ペプチドを発現させることができる任意のベクターを意味する。
例えば、選択されたベクターは、抗原性ペプチドの発現を得るために正しい順序に配列したプラスミド、プロモーターおよびポリアデニル化／転写停止配列を含むことができる。これらの成分および所望により他の成分、例えば、エンハンサー、制限酵素部位および選択遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子を含むベクターの構造は、当業者に周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｖｏｌｓ １−３， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９に詳細に説明されている。
【００２５】
プラスミドが哺乳動物宿主内で複製し、動物の染色体ＤＮＡ内で統合するのを防ぐことが好ましいので、プラスミドは、好ましくは真核細胞において機能し得る複製の起点なしで産生するのが好ましい。
本発明の方法および組成物は、例えば、家畜、実験動物、養殖動物、捕獲された野生動物および、最も好ましくはヒトを含むすべての哺乳動物の予防または治療法に関連して用いることができる。
本発明者らは、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体がＤＮＡワクチンにおいてアジュバントとして用いられる場合にＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン特性の両方を向上させることができることを証明した。本明細書において用いられるアジュバントまたはアジュバント成分なる用語は、誘導体または誘導体を含む成分が所望の方法で免疫原に対する身体の応答を向上および／または変更するために作用することを意味する。従って、例えば、アジュバントは免疫応答を主にＴｈ１応答にシフトさせるか、または両タイプの応答を増大させるために用いることができる。
【００２６】
ＴＨ１タイプの免疫応答の優先的誘導物質は、細胞媒介応答を生じさせることができる。高レベルのＴｈ１−タイプサイトカインは、所定の抗原に対する細胞媒介免疫応答の誘発に有利である傾向にあるが、高レベルのＴｈ−２タイプサイトカインは抗原に対する体液性免疫応答の誘発に有利である傾向にある。
Ｔｈ１およびＴｈ２−タイプの免疫応答の区別は絶対的でないことに留意するのは重要である。実際に、個体は主にＴｈ１または主にＴｈ２とされる免疫応答を支持するであろう。しかしながら、サイトカインのファミリーを、Ｍｏｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｔ．Ｒ． ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ， Ｒ．Ｌ． （１９８９） ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ： ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ７， ｐ１４５−１７３）によるネズミＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンにおいて記載されているものに関連して考慮するのが好都合である場合が多い。伝統的に、Ｔｈ１−タイプの応答はＴ−リンパ球によるＩＮＦ−γおよびＩＬ−２サイトカインの産生と関連する。Ｔｈ１−タイプ免疫応答の誘発に直接関連する他のサイトカインは、Ｔ−細胞、例えば、ＩＬ−１２により産生されない。対照的に、Ｔｈ２−タイプの応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌と関連する。
【００２７】
抗原性ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む免疫原成分は、様々な方法において投与することができる。ベクターを、適当な媒体、例えば、緩衝塩溶液、例えば、ＰＢＳ中に懸濁されたそのままの形態（すなわち、リポソーム処方、ウイルスベクターまたはトランスフェクション促進蛋白と関連しない無膜ヌクレオチド配列）において投与し、次いで筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内注射することが可能であるが、以前のデータによると、筋肉内または皮下注射が好ましい［Ｂｒｏｈｍら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６ Ｎｏ． ９／１０， ｐｐ９４９−９５４ （１９９８）（その全体を出典明示により本発明の一部とする）］。ベクタを、例えば前記の経路に加えて経口、鼻または肺経路により投与するためにリポソームまたはポリラクチドコグリコリド（ＰＬＧ）粒子（２５）内に封入することも可能である。
本発明の好ましい態様に従って、免疫成分の皮内投与に関して、好ましくは遺伝子銃（ｇｅｎｅ−ｇｕｎ）［特に、パーティクルボンバードメント（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）］投与技術の使用によることが可能である。かかる技術は、免疫原成分を金ビーズ上にコーティングし、これを次いで高圧下で表皮中に、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４： ３７−４２（１９９６）に記載されているようにして投与することを含む。
【００２８】
抗原性ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、予防的または治療的に有効な量において投与される。投与される量は、一般に投与量あたりヌクレオチドが１ピコグラムないし１ミリグラムの範囲であり、粒子媒介送達については好ましくは１ピコグラムないし１０マイクログラムであり、他の経路については１０マイクログラムないし１ミリグラムである。正確な量は、免疫化される動物の種類および体重、投与経路、１Ｈ−イミダゾ−［４，５−ｃ］キノリン誘導体の有効性および投与量、治療または防御される疾患状態の性質、患者の免疫系が免疫応答を生じる能力および所望の防御または治療効力の程度によって相当変わり得る。これらの変数に基づいて、医師または獣医師は適当な投与量を決定することができるであろう。
抗原性ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分を１回だけ投与するかまたは繰り返し、例えば、１ないし７回、好ましくは１ないし４回、約１日ないし約１８ヶ月間隔で投与することができる。しかしながらここでも、この治療レジメは、関係する動物の大きさおよび種類、治療／防御される疾患、投与されるヌクレオチド配列の量、投与経路、選択される１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体の効力および投与量および獣医師または医師に明らかな他の因子によって著しく変わるであろう。
【００２９】
本明細書において明記したアジュバント成分は、同様に様々な異なる投与経路、例えば、経口、鼻、肺、筋肉内、皮下、皮内または局所経路により投与することができる。好ましくは、成分は皮内または局所経路により投与される。この投与は、ヌクレオチド配列の投与前約１４日ないし投与後約１４日の間に行うことができ、好ましくはヌクレオチド配列の投与前約１日ないし投与後約３日の間に行われる。アジュバント成分が実質的にヌクレオチド配列の投与と同時に投与される場合がもっとも好ましい。「実質的に同時」とは、アジュバント成分の投与がヌクレオチド配列の投与と好ましくは同時、そうでなくてもヌクレオチド投与の前後いずれかの少なくとも数時間以内であることを意味する。最も好ましい治療プロトコルにおいて、アジュバント成分はヌクレオチド配列の投与と実質的に同時に投与される。明らかに、このプロトコルは必要に応じて、前記の変数の種類に従って変えることができる。
ここでも、かかる変数に応じて、誘導体の投与量は変化するが、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である（ここに、「／ｋｇ」とは、関係する哺乳動物の体重を意味する。１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体のこの投与は、好ましくはヌクレオチド配列の二次投与またはブースター投与を繰り返される。最も好ましくは、投与量は約１ｍｇ／ｋｇないし約５０ｍｇ／ｋｇの間である。
【００３０】
アジュバント成分が原料化学物質状態において投与される１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体のみを含むことができるが、医薬処方の形態において投与するのが好ましい。すなわち、アジュバント成分は、好ましくは１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを、１以上の医薬的または獣医学的に許容される担体、および所望により他の治療成分と組み合わせて含む。担体は処方内の他の成分と適合性であり、その受容体に対して有害でないという意味で、「許容」されなければならない。処方の性質は、意図される投与経路に従って自然に変化し、製薬分野において一般的な方法により調製することができる。すべての方法は、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を適当な担体と結合させる工程を含む。一般に、処方は、誘導体を液体担体または微粉砕された固体担体、あるいは両者と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じて生成物を所望の処方に成形することにより調製される。経口投与に好適な本発明の処方は、独立した単位、例えば、カプセル、カシェ剤または錠剤（それぞれはあらかじめ決められた量の活性成分を含む）；粉末または顆粒；水性液体または非水性液体中溶液または懸濁液；あるいは水中油液体エマルジョンまたは油中水エマルジョンとして提供することができる。活性成分はボーラス、舐剤またはペーストにすることもできる。
【００３１】
錠剤は、所望により１以上の補助成分と共に圧縮または成形することにより製造することができる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの易流動性形態の活性成分であって、所望によりバインダー、滑剤、不活性希釈剤、潤滑、界面活性剤または分散剤と混合したものを、適当な機械で圧縮することにより調製することができる。不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適当な機械で成形することにより成形錠剤を調製することができる。
錠剤は、所望によりコートするかまたはスコアをつけてもよく、活性成分がゆっくりとまたは制御されて放出されるように処方することができる。
例えば、筋肉内、腹腔内、または皮下投与経路による注射用処方は、水性および非水性無菌注射溶液（酸化防止剤、緩衝剤、制菌剤および処方を意図される受容体の血液と等張にする溶質を含んでもよい）；ならびに水性および非水性無菌懸濁液（懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい）を含む。処方は、単一または多剤容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に入れてもよいし、使用直前に、無菌液体担体、例えば、注射用水を添加するだけでよい凍結乾燥状態において貯蔵してもよい。即席注射溶液および懸濁液は、すでに記載した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。口腔または鼻腔を経由する肺投与に好適な処方は、活性成分を含み、望ましくは０．５ないし７ミクロンの範囲の直径を有する粒子が受容体の気管樹枝状構造中に送達されるように提供される。かかる処方は、吸入装置における使用のための適当には例えばゼラチン製の穿孔可能なカプセル、あるいは活性成分、適当な液体プロペラントおよび所望により他の成分、例えば、界面活性剤および／または固体希釈剤を含む自己推進式処方としてのいずれかで好都合に提供される微粉末の形態である。自己推進式処方も用いることができ、この場合、活性成分は溶液または懸濁液の液滴の形態において分配される。かかる自己推進式処方は、当該分野において一般的なものと類似し、確立された方法により調製することができる。これらは好適には、所望の噴霧特性を有する、手動または自動のいずれかで機能するバルブを用いて提供される。有利には、該バルブは各操作により一定の体積、例えば５０ないし１００μＬを送達する計量タイプである。
【００３２】
さらには、アジュバント成分をアトマイザーまたはネブライザーにおいて使用するための溶液の形態にすることもでき、これにより吸入のための微細な液滴を生じるために加速された気流または超音波撹拌が用いられる。
鼻内投与に好適な処方は、一般に肺投与についてすでに記載したものと類似した形態を含むが、鼻腔内での停留を可能にするために、かかる処方は約１０ないし約２００ミクロンの範囲の粒径を有するのが好ましい。これは、適当ならば、適当な粒子サイズの粉末の使用、または適当なバルブの選択により達成することができる。他の好適な処方は、鼻の近くに保持した容器から鼻腔を通して急速に吸入することにより投与するために、約２０ないし約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末、および水性または油性溶液中約０．２ないし５％ｗ／ｗの活性成分を含む点鼻薬を含む。本発明の一例において、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体と同じ処方内に抗原性ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与できる。
従って、この例において、免疫原成分およびアジュバント成分は、同じ処方内に見いだされる。
【００３３】
好ましい例において、アジュバント成分は遺伝子銃投与に好適な形態において調製され、ヌクレオチド配列の投与と実質的に同時に該経路により投与される。この方法における使用に好適な処方を調製するために、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を凍結乾燥し、例えば、遺伝子銃投与に適した金ビーズ上に付着させることが必要である。
もう一つの例において、アジュバント成分は乾燥粉末として、高圧気体推進力により投与することができる。これは、ヌクレオチド配列の投与と実質的に同時であるのが好ましい。
一緒に処方されなくても、アジュバント成分をヌクレオチド配列と同じ投与部位またはその付近に投与することが適当である。
医薬製剤の他の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ （１９８５）に見いだすことができ、この開示の全体を出典明示により本発明の一部とする。
【００３４】
本発明を次の非制限的実施例を参照してさらに記載する。
実施例
１．イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）は核酸ワクチンに対する細胞障害性Ｔ細胞応答の大きさを増大させる。
プラスミドの構築およびＤＮＡ調製
使用されるプラスミドは、Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｙｏｕｎｇ， ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ， ＵＫから入手した、哺乳動物発現ベクターｐＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を修飾したものであり、ＥｃｏＲＩからＢｓｔＺＩまでの複数のクローニング部位が、５’が独自のＮｈｅ　Ｉ、Ｒｓｒ　ＩＩおよびＸｈｏＩに隣接し、３’が独自のＰａｃ　Ｉ、Ａｓｃ　ＩおよびＮｏｔ　Ｉ制限酵素部位に隣接したＥＭＣＶ　ＩＲＥＳ配列で置換されているｐＶＡＣ１に基づく。
インフルエンザ核蛋白発現プラスミド、ｐＶＡＣ１．ＰＲを、ｐＡＲ５０１（Ｄ． Ｋｉｏｓｓｉｓ博士（ＮＩＭＲ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）から贈与）からインフルエンザＡ型ウイルスＰＲ／８／３４の核蛋白をエンコードするＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを発現ベクターｐＶＡＣ１中に結紮することにより構築した。
プラスミドＤＮＡをイー・コリにおいて増殖させ、プラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｌｔｄ， Ｃｒａｗｌｅｙ， ＵＫ）を用いて調製し、−２０°で、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中約１ｍｇプラスミドＤＮＡ／ｍｌで貯蔵した。
ＤＮＡ免疫化のためのカートリッジの調製
Ａｃｃｅｌｌ遺伝子移入装置のカートリッジの調製は、すでに記載されているとおりにした（Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９３ Ｖｏｌ １２ Ｎｏ ９ ｐｐ７９１−７９７； Ｐｅｒｔｎｅｒら）。簡単にいうと、プラスミドＤＮＡを２μｍの金粒子（ＤｅＧｕｓｓａ Ｃｏｒｐ．， Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ， Ｎ．Ｊ．， ＵＳＡ）上にコートし、Ｔｅｆｚｅｌ管中に入れ、これを次にカートリッジとしての働きをするために１．２７ｃｍの長さに切断し、使用するまで４°で乾燥し貯蔵した。典型的なワクチン接種において、各カートリッジは〜０．０５μｇｐＶＡＣ１．ＰＲでコートでコートされた０．５ｍｇ金と合計０．５μｇＤＮＡ／カートリッジにするために添加された空のベクター（ｐＶＡＣ１）を含んでいた。
免疫化
イミキモドが核酸ワクチン接種により生じる細胞障害性Ｔ細胞応答を増大させることができるかどうかを調べるために、ｐＶＡＣ１．ＰＲを粒子媒介遺伝子移入（０．０５μｇ／カートリッジ）により、マウスの皮膚中に投与した。Ａｃｃｅｌｌ遺伝子移入装置を５００ｌｂ／ｉｎ２で使用して２つのカートリッジから、プラスミドをＣ５７ＢＩ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｌｔｄ， Ｍａｒｇａｔｅ， ＵＫから購入）の腹部皮膚の剃毛した標的部位に送達した（ＭｃＣａｂｅ　ＷＯ９５／１９７９９）。ワクチン接種直後に、イミキモド（０．３％（ｗ／ｖ）メチルセルロースおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを無菌水中に含むビヒクル中懸濁液として調製）を免疫化部位に１回皮下注射（３０ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するために、体重１０ｇあたり０．０５ｍｌを処方）することにより投与した。プラスミドおよびイミキモド対照はそれぞれ空のベクター（ｐＶＡＣ１）およびビヒクルであった。
細胞障害性Ｔ細胞応答
細胞障害性Ｔ細胞応答を、１週間後に集めた脾臓細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞−限定ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析により評価した。マウスを頸部脱臼により屠殺し、脾臓を氷冷ＰＢＳ中に集めた。脾臓細胞をリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中に細かく裂き、続いて赤血球を溶解させた（１５５ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる緩衝液中１分）。２分間ＰＢＳ中で洗浄して、粒状物質を除去した後、単一の細胞懸濁液を、あらかじめ捕獲ＩＦＮ−γ抗体でコートしたＥＬＩＳＰＯＴプレート中に等分し、ＣＤ８−制限同種ペプチドで刺激した。一夜培養した後、ＩＦＮ−γ産生細胞を抗ネズミＩＦＮ−γ−ビオチン標識抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、続いてストレプトアビジン−接合アルカリホスファターゼを適用することにより可視化し、イメージ分析を用いて定量化した。
この実験の結果（図１）から、ｐＶＡＣ１．ＰＲおよびイミキモドの組み合わせで処置されたネズミの脾臓における細胞障害性Ｔ細胞の数はｐＶＡＣ１．ＰＲ＋ビヒクル単独で処置されたものよりも多いことがわかる。対照プラスミド（ｐＶＡＣ１）＋イミキモドまたはビヒクル群間で違いはみられず、イミキモドの効果は抗原制限的であることがわかった。これらの結果から明らかに、イミキモドは核酸ワクチン接種の有効なアジュバントであることがわかる。
【００３５】
２．イミキモドは核酸ワクチンに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の程度を増大させる。
プラスミド、ＤＮＡおよびカートリッジの調製
ニワトリ卵白アルブミン発現プラスミド、ｐＶＡＣ１．ＯＶＡを、ｐＵＧＯＶＡ（Ｆ．Ｃａｒｂｏｎｅ博士から贈与）から得られるニワトリ卵白アルブミンをエンコードするＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを発現ベクターｐＶＡＣ１中に結紮することにより調製し、カートリッジを調製した（前記実施例１に記載したとおり）。
マウスおよび免疫化
オスまたはメスＤ０．１１．１０トランスジェニックマウス（６〜１０週令）をＢｕｒｙ Ｇｒｅｅｎ Ｆａｒｍの本発明者らの特定の病原体のない動物飼育施設において飼育した。これらのマウスが発現する導入遺伝子は、ＭＨＣ−ＩＩ分子（Ｉ−Ａｄ）に結合したニワトリ卵白アルブミンペプチド残基（残基３２３−３３９；ＯＶＡペプチド）特異性のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）である。このＴＣＲを特異的に認識するモノクローナル抗体ＫＪ１−２６を、ＴＣＲ−導入遺伝子Ｔ細胞の同定のために用いる。これらのマウスの数を調べることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞の大きな集団（４０〜６５％）がＫＪ１−２６＋であるが、ＣＤ４−ＣＤ８＋ＫＪ１．２６＋の非常に小さな集団も存在することがわかる（Ｐａｐｅ，ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ （１９９７） １５６：６７−７８）。
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｌｔｄ．（Ｍａｒｇａｔｅ， ＵＫ）から購入した。
測定される免疫パラメータの感受性を向上させる養子免疫伝達モデルを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞応答を調べた。ここで、卵白アルブミン蛋白から得られるペプチド配列を特異的に認識するＴ細胞を免疫化の前にトランスジェニックマウスからナイーブ野生型マウスへ養子導入した。簡単にいうと、免疫の２４時間前に、Ｄ０．１．１０脾臓細胞を６〜８週令のＢａｌｇ／ｃマウス中に養子導入した。脾臓細胞を前記実施例１におけるのと同様にして調製した。次に１００μｌの注射（すなわち、２５×１０６脾臓細胞／マウス）により細胞を側部尾静脈中に養子導入した。
マウスを粒子媒介遺伝子移入により卵白アルブミンをエンコードするプラスミド（ｐＶＡＣ１．ＯＶＡ；０．５μｇ／カートリッジ）およびイミキモド（３０ｍｇ／ｋｇ）、あるいは対照プラスミドまたはビヒクルで実施例１と同様に皮下的に免疫化した。
ＣＤ４Ｔ細胞応答
マウスを頸部脱臼により屠殺し、鼠径部または大動脈周辺リンパ節を集め、脾臓細胞について準備した（実施例１に記載）。ただし、赤血球溶解工程は省略した。
免疫化後のＣＤ４＋Ｔ細胞のクローン発現を測定するために、同種卵白アルブミンペプチドでインビトロで再攻撃した後の卵白アルブミン特異性Ｔ細胞の増殖を、免疫化後３日に集めたリンパ節調製物において評価した。トリチウムチミジンの増殖細胞による取り込みにより評価される増殖は、ｐＶＡＣ１．ＯＶＡ＋ビヒクルと比較してｐＶＡＣ１．ＯＶＡ＋イミキモドの組み合わせについて２倍以上であった（図２）。対照プラスミド（ｐＶＡＣ１）＋イミキモド間またはビヒクル群間で違いはみられず、このことはイミキモドのこうかは抗原制限的であることを示す。
免疫化の６日後に集められたリンパ節に関するＩＬ−２ＥＬＩＳＰＯＴ（前記実施例１）により評価されるＣＤ４Ｔ細胞活性化における実質的な増加（図３）は、ｐＶＡＣ１．ＯＶＡ単独と比較してｐＶＡＣ１．ＯＶＡ＋イミキモドの組み合わせについてみられた（７０％増大）。
これらの結果は、インビボのイミキモドのアジュバント効果は、両（すなわち、ＣＤ８＋細胞障害性およびＣＤ４＋ヘルパー）Ｔ細胞集団に及ぶことを示す。これらは、核酸ワクチン接種についてのイミキモドのアジュバント効果の有効性も確実にする。
【００３６】
３．イミキモドは核酸ワクチンに対してＴｈ１およびＴｈ２応答の両方を誘発する。
養子免疫伝達モデルを用いてＣＤ４＋サブセットを評価した（前記実施例２）。ＩＦＮ−γ−産生（Ｔｈ１）およびＩＬ−４産生（Ｔｈ２）細胞をＥＬＩＳＰＯＴにより評価した（前記実施例１）。イミキモドは両サイトカイン産生細胞における増大を誘発したが、この増大はＩＬ−４と比較してＩＦＮ−γについてさらに実質的であった（図４）。空のベクターで免疫化された対照においてサイトカイン産生細胞は検出されなかった。ＩＦＮ−γ−産生細胞への偏向は、イミキモドが核酸ワクチンのアジュバントとして作用するだけでなく、Ｔｈ１タイプの応答を優先的に誘発することを示し、後者は前記実施例１により実証される。
【００３７】
４．体液性免疫応答に関するイミキモドの影響
イミキモドが核酸ワクチン接種により生じる体液性応答を増大させるかどうかを調べるために、抗原をエンコードするプラスミド（例えば、インフルエンザウイルスから得られる核蛋白）をＰＭＧＴによりマウスの皮膚中に投与する。一次免疫につづいて１回以上のブースト免疫化を行い、各免疫間は少なくとも４週間あける。各免疫化の前および／または直後に、免疫化部位に１回皮下注射によりイミキモドを投与する。プラスミドおよびイミキモド対照は、それぞれ空のベクター（すなわち、抗原を有さない）およびビヒクルである。血液サンプルを尾静脈から免疫化の１ないし３日前、および１ないし３日後に集める。血清を分離し、その後の抗体分析のために−２０℃で貯蔵する。
体液性応答を、一次およびブースト免疫化後に集められた血清サンプル中の抗原特異性全ＩｇＧ抗体レベル（例えば、インフルエンザウイルスから得られる核蛋白）を測定することにより評価する。マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｆ９６ ｍａｘｉｓｏｒｐ， Ｌｉｆｅｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４℃で一夜インキュベートすることにより１０μｇ／ｍｌの抗原でコートし、洗浄緩衝液（５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で４回洗浄する。これに続いて、血清サンプルを連続してブロッキング緩衝液中希釈しながら１時間２０℃でインキュベーションする。未結合抗体を除去するためにさらに４回洗浄（前記の通り）した後、プレートをブロッキング緩衝液中希釈したペルオキシダーゼ接合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に１時間インキュベートする。結合抗体の量をさらに４回洗浄（前記の通り）し、続いてＴＭＢ基質溶液（Ｔ−８５４０−Ｓｉｇｍａ）を添加した後に測定する。２０℃で３０分光から保護した後、１Ｍ硫酸で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで読みとる。力価をＯＤが０．２に達する最高の希釈度と定義する。イミキモドで処理された免疫化されたマウスにおける抗体レベルが、イミキモドなしで免疫化されたマウスよりも増加することは、体液性応答に対するイミキモドの向上効果を示す。
【００３８】
５．イミキモドはＨＩＶ抗原に対する免疫応答を向上させる。
プラスミド、ＤＮＡおよびカートリッジ調製
ＧａｇおよびＮｅｆ抗原と発現するプラスミド（すなわち、ＷＲＧ７０７７Ｇａｇ／Ｎｅｆ）をＷＲＧ７０７７に基づいて構築した。ｐＵＣ１９のＥａｍ１１０５ｌ−ＰｓｔＩフラグメントを含むベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｔｄ．， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｂｕｃｋｓ， ＨＰ７ ９ＮＡから入手可能）を、両フラグメントの平滑末端に続くカナマイシン耐性遺伝子を含むｐＵＣ４ＫのＥｃｏＲＩフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて置換することにより、オリジナルのＷＲＧ７０７７プラスミドを構築した。ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１プロモーター／エンハンサー、イントロンＡは、Ｈａｒｒｉｅｔ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｓ）から入手したプラスミドＪＷ４３０３から得、これをＸｈｏｌ−Ｓａｌ１フラグメントとしてｐＵＣ１９のＳａｌ１サイト中に挿入し、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを組み入れた。遺伝子の５’末端から１９５ｂｐ欠失し、最初の６５アミノ酸を除去した、ＨＩＶ−１　２４８Ａ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ． Ｌ１５５１８、Ｇ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎから贈与）から得られる切頭Ｎｅｆ、およびＨＩＶ−１クレードＢ株ＨＸＢ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ． Ｋ０３４５５）を含むプラスミドｐＨＸＢΔＰｒ（Ｍａｓｃｈｅｒａら、１９９５）からのｐ１７ｐ２４（Ｇａｇ）のＰＣＲスティッチングにより、Ｇａｇ−Ｎｅｆ融合を生じさせた。結果として得られるＧａｇ−Ｎｅｆ融合物を次にＷＲＧ７０７７中にＮｏｔｌ−ＢａｍＨＩフラグメントとして結紮した。プラスミドＤＮＡおよびカートリッジ調製は実施例１において記載したとおりであった。
マウスおよび免疫化
実施例１において記載したようにして、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、イミキモドを調製し、投与した。ここで、マウスは一次免疫を受け、続いて４２日後にブースト免疫を受けた。イミキモド（１００ｍｇ／ｋｇ）をブーストのみで投与した。
細胞障害性Ｔ細胞応答
ブースト免疫化後５日に集めた脾臓細胞を刺激するために、ＧａｇおよびＮｅｆについてＣＤ８−制限同種ペプチドを用いてＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析を記載したとおりに行った（実施例１）。
イミキモドを同時投与した場合に、ビヒクルのみを有するプラスミドを受容した群と比較して、細胞障害性Ｔ細胞における実質的な増加が観察された（ＧａｇおよびＮｅｆについてそれぞれ１０倍および１００倍）（図５）。これらの知見は、イミキモドのアジュバント効果は抗原特異性でなく、特にＨＩＶについてのウイルス抗原の有効性を実証するものであることを示唆する。
【００３９】
６．イミキモドの類似体は核酸ワクチン接種について有効なアジュバントである。
ｐＶＡＣ１．ＯＶＡプラスミドを用いてカートリッジを調製し、免疫化およびＴ細胞応答は実施例２に記載したとおりであった。試験したイミキモドの類似体は１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−エトキシメチル−１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（すなわち、レシキモド）、１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンおよび１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンであった。
レシキモドを広範囲におよぶ投与量にわたって試験し、１ｍｇ／ｋｇが明らかに最適であった。免疫化の５日後に集めたリンパ節細胞の分析は、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４Ｔ細胞の６倍の増加を示し、ＩＬ−４産生ＣＤ４Ｔ細胞に関してわずかな影響しか及ぼさず（図６）、さらに実施例３において観察されるＴｈ１に偏った効果が支持された。
免疫化後５日のＴ細胞に対する影響を、３０ｍｇ／ｋｇを１回投与した他の２つの類似体について調査した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生ＣＤ４Ｔ細胞の両方にいて２倍の増大が１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンにより誘発された。同様の効果が、１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンについて観察された（図７）。
全体として、この実施例におけるこれらの結果は、アジュバント効果がイミキモドのみに制限されるのでなく、この化学種のさらに広範囲の化合物に及ぶことを示す。
【００４０】
７．局所適用は、核酸ワクチン接種についてのイミキモドの有効な投与経路である。
ＷＲＧ７０７７Ｇａｇ／Ｎｅｆプラスミドを用いてカートリッジを調製し、ＰＭＩＤ免疫化およびＴ細胞応答は実施例５において記載した通りであった。イミキモドを３０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。追加の群を用い、この群においてイミキモドは、免疫化直後にＰＭＩＤ部位に局所適用された２０μｌの５％（ｗ／ｖ）クリーム処方（すなわち、Ａｌｄａｒａ）を塗布することにより投与した。ブースト免疫化後６日および１１日に分析のために脾臓を集めた。
ｓ．ｃ．ビヒクル単独を有するプラスミドを投与された群と比較して、イミキモドがｓ．ｃ．注射または局所のいずれかで同時投与された場合に、細胞障害性Ｔ細胞における実質的な増加が観察された（すなわち、ブースト後１１日で約２倍）（図８）。これらの知見は、局所投与されたイミキモドはＰＭＩＤの有効なアジュバントであることを示し、ＰＭＩＤと組み合わせたアジュバントの調査において皮下注射は局所適用に代わる適切な代替経路であることを示唆する。
８．イミキモドは腫瘍増殖の予防のための有効なアジュバントである。
ｐＶＡＣ１．ＯＶＡプラスミドを用いてカートリッジを調製した（実施例２において記載したとおり）。カートリッジが０．１μｇのＤＮＡを含み、イミキモドが３０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与される以外は、実施例５において記載したようにして１２匹のマウスの群をＰＭＩＤにより免疫化した。
腫瘍攻撃
ブースト後２週間で、Ｅｇ７−ＯＶＡ細胞を、各マウスの脇腹に皮下注射することにより移植し（１０００００細胞／マウス）、腫瘍増殖をモニターした。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞はもともとＦ．Ｃａｒｂｏｎｅ（Ｍｏｏｒｅ， Ｍ．Ｗ．， Ｃａｒｂｏｎｅ， Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｂｅｖａｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｃｅｌｌ， ５４， ７７７−７８５， １９８８）により、マウス腹水リンパ腫リンパ芽球細胞系ＥＬ４をトランスフェクトして、安定してニワトリ卵白アルブミンを発現することにより生成された。
触知できる腫瘍の発生は、ｐＶＡＣ１．ＯＶＡ単独と比較して、ｐＶＡＣ１．ＯＶＡ＋イミキモドで免疫化されたマウスについてもっとも遅くなった（図９）。触知できる腫瘍はマウスの対照群（すなわち、空のベクター±イミキモドで免疫化されたマウス）についてより早く現れ、非常に速く増殖した。腫瘍発生性はｐＶＡＣ１．ＯＶＡ＋イミキモドで免疫化されたマウスについて２５％であった。対照的に、腫瘍発生性は、すべての他の群について４０％より大きかった（図１０）。これらの結果は、イミキモドがＰＭＩＤの抗腫瘍効果を向上させることができることを示し、イミキモドは疾患の治療のために核酸についての有効なアジュバントであることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【図１】イミキモドが、インフルエンザウイルスからの核蛋白をエンコードするプラスミド（ｐＶＡＣ１．ＰＲ）でのワクチン接種後、細胞障害性Ｔ細胞応答を増大させることを示す。
【図２】イミキモドが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の増大により測定されるように、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでのワクチン接種後、インビボでのＣＤ４Ｔ細胞のクローンの拡大を増大させることを示す。
【図３】イミキモドが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生細胞の増大により測定されるように、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでのワクチン接種後、インビボでの活性化されたＣＤ４Ｔ細胞の数を増大させることを示す。
【図４】イミキモドが、それぞれＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生細胞の増大により測定されるように、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでのワクチン接種後の、インビボでのＴｈ１およびＴｈ２応答の両者を誘発することを示す。
【図５】イミキモドが、ＨＩＶ抗原ＧａｇおよびＮｅｆをエンコードするプラスミド（ＷＲＧ７０７７．Ｇａｇ／Ｎｅｆ）でワクチン接種した後に細胞障害性Ｔ細胞応答を増大させることを示す。
【図６】イミキモドの類似体であるレシキモド（１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−エトキシメチル−１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）が、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生細胞の増大により測定されるように、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでワクチン接種した後にインビボでの活性化されたＣＤ４Ｔ細胞の数を増大させることを示す。
【図７】イミキモドの２つの類似体、１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−２−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンおよび１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンが、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４産生細胞の増大により測定されるように、卵白アルブミン蛋白をエンコードするプラスミドでのワクチン接種後に、インビボでの活性化されたＣＤ４Ｔ細胞の数を増大させることを示す。
【図８】イミキモドの局所投与が、ＨＩＶ抗原ＧａｇおよびＮｅｆをエンコードするプラスミド（ＷＲＧ７０７７．Ｇａｇ／Ｎｅｆ）でのワクチン接種後、細胞障害性Ｔ細胞応答を増大させることを示す。
【図９】イミキモドが卵白アルブミンをエンコードするプラスミドでのワクチン接種後、卵白アルブミン発現ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞で攻撃された動物において腫瘍の成長を遅らせることを示す。
【図１０】イミキモドが、卵白アルブミンをエンコードするプラスミドで前免疫した動物中に移植された卵白アルブミン発現ＥＧ７．ＯＶＡ腫瘍細胞の腫瘍発生性を低下させることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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