(57)【要約】本発明は、多能性幹細胞をエクスビボで分化させることによって得られる間葉性細胞の集団を提供する。多能性間葉性細胞は、次に、個人の筋骨格細胞機能を再構成するのに適合化させる特徴を有する骨芽細胞等の、より特殊化した細胞に分化させることができる。本開示に記載する組成物、方法、および技術は、種々の商業的に重要な診断、薬剤スクリーニング、および治療用途に使用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
集団内の少なくとも約30%の細胞が霊長動物多能性幹（pPS）細胞の系統の子孫であり、かつ間葉性細胞であるという特徴を有する、インビトロ培養で増殖する細胞集団。
【請求項２】
集団内の少なくとも約30%の細胞がCD29またはCD44を発現する、請求項1記載の細胞集団。
【請求項３】
集団内の少なくとも約30%の細胞がCD166 (ALCAM)、CD29、CD44、GATA-4、STRO-1、およびアルカリホスファターゼのうちの少なくとも3つを発現する、請求項1記載の細胞集団。
【請求項４】
集団内の少なくとも約30%の細胞が霊長動物多能性幹（pPS）細胞の系統の子孫であり、かつ骨芽前駆細胞および/または骨芽細胞であるという特徴を有する、インビトロ培養で増殖する細胞集団。
【請求項５】
集団内の少なくとも約30%の細胞がオステオカルシンおよびコラーゲン-1を発現する、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項６】
カルシウムを含む細胞外基質を形成する、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項７】
前記請求項のいずれか一項に記載の細胞集団およびその取得の元となった未分化pPS細胞株からなる、2つの細胞集団のセット。
【請求項８】
請求項7記載の細胞集団のセットに属する、請求項1〜6のいずれか一項記載の細胞集団。
【請求項９】
骨形成タンパク質（BMP）、ヒトTGF-β受容体のリガンド、またはヒトビタミンD受容体のリガンドを含む培地中でpPS細胞またはその子孫を分化させることにより得られる、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項１０】
BMP-4、デキサメタゾン、およびアスコルビン酸またはその類似体を含む培地中でpPS細胞またはその子孫を分化させることにより得られる、請求項9記載の細胞集団。
【請求項１１】
テロメラーゼ逆転写酵素を発現するように遺伝的改変した細胞を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項１２】
骨形成タンパク質を発現するように遺伝的改変した細胞を含む、前記請求項項のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項１３】
pPS細胞に分化をもたらした後に前記特徴を有する細胞を選択することを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞集団を取得する方法。
【請求項１４】
骨形成タンパク質（BMP）、ヒトTGF-β受容体のリガンド、またはヒトビタミンD受容体のリガンドを含む培地中でpPS細胞またはその子孫を培養することを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞集団を取得する方法。
【請求項１５】
BMP-4、デキサメタゾン、およびアスコルビン酸またはその類似体を含む培地中でpPS細胞またはその子孫を培養することを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞集団を取得する方法。
【請求項１６】
化合物を請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞集団と混合し、化合物に起因する間葉性細胞の任意の毒性または変調を判定することを含む、間葉性細胞の毒性または変調に対する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
手術または療法により人体または動物体を治療する、請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞集団を含む薬剤。
【請求項１８】
基質またはセラミック担体をさらに含む、請求項17記載の薬剤。
【請求項１９】
カルシウムまたは骨形成タンパク質をさらに含む、請求項17記載の薬剤。
【請求項２０】
個人の筋骨格細胞機能を再構成する薬剤の調製における、請求項1〜10のいずれか一項記載の細胞集団の使用。
【請求項２１】
請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞集団を個人に投与することを含む、個人の筋骨格細胞機能を再構成するまたは補う方法。
【請求項２２】
骨組織に請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞集団を接触させることを含む、骨組織を再生する方法。
【請求項２３】
人工義装具または副子を請求項1〜10のいずれか一項記載の細胞集団または請求項14〜16のいずれか一項記載の薬剤と組み合わせて患者に移植することを含む、ヒト患者の運動性を増加させる方法。
【請求項２４】
pPS細胞がヒト胚盤胞から単離されたかまたは前記細胞の子孫である、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞集団、方法、または使用。
【請求項２５】
pPS細胞がヒト胚幹細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の細胞集団、方法、または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、胚細胞および間葉性前駆細胞の細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、骨芽細胞および他の細胞種を形成するための、特有の培養条件および選択技術を用いた、ヒト多能性幹細胞の定方向分化に関与する。
【０００２】
関連出願の参照
本出願は、2001年7月6日に出願された係属中の米国特許仮出願第60/303,732号の優先権を主張する。米国および許可された他の管轄権における遂行のため、優先権出願は国際公開公報第01/51616号と共に本明細書によって完全に参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
再生医療は、バイオテクノロジー産業における重要で新しい試みである。以前の治療法では不十分な組織修復および疾患治癒を促進する上での使用が提案される、特殊化細胞の培養物を産生する方法が開発されている。
【０００４】
関心が現れてきた1つの分野に、骨組織の増強または修復への培養細胞の使用がある。発生過程の骨芽細胞前駆細胞および間葉性幹細胞について、公開された報告がいくつか存在する。
【０００５】
米国特許第5,691,175号、米国特許第5,681,701号、および米国特許第5,693,511号（Mayo財団）では、サルウイルス40ラージT抗原温度感受性変異株を発現する不死化正常ヒト胎児骨芽細胞について記述している。米国特許第5,972,703号（ミシガン）では、造血性ではなく、かつ骨成長因子への曝露により骨芽細胞に分化し得り、細胞外基質にカルシウムを沈着する骨前駆細胞の組成物が報告されている。米国特許第6,200,602号（DuPuy整形外科）では、非造血細胞および造血細胞からの軟骨または骨前駆細胞の単離が報告され、骨および軟骨再生にこれらを使用することが提案されている。
【０００６】
国際公開公報第95/22611号（ミシガン）では、骨前駆細胞を刺激するための、インサイチューで核酸を骨細胞に導入する方法が報告されている。動物モデルにおいて、II型コラーゲンおよびオステオトロピック（osteotropic）遺伝子を、骨の成長、修復、および再生の促進への使用について検討している。国際公開公報第99/39724号（オレゴン）では、骨芽細胞前駆細胞による骨欠損の治療を提案している。細胞を形質転換し、BMP-2等の骨形成タンパク質を発現させることが可能である。
【０００７】
骨幹細胞のテーマについては、J.E. Aubin（J. Cell Biochem. Suppl. 30/31:73、1998）によって総説されている。幹骨芽前駆細胞および原始的骨芽前駆細胞ならびに関連した間葉性前駆細胞は、骨の代謝回転および骨折の治癒における骨芽細胞の置換に寄与する。本論文では、成熟骨芽細胞表現型は既知の骨芽細胞マーカーのサブセットを発現している骨芽細胞の亜集団を伴い不均一であるという仮説を提唱し、複数の平行した分化経路および様々な前駆細胞プールの可能性を提起している。
【０００８】
Joynerら（Bone 21:1、1997）は、分化段階特異的モノクローナル抗体を用いたヒト骨芽前駆細胞の同定および濃縮について報告している。骨髄培養物との反応性、および胎児組織における骨芽細胞に隣接した前駆細胞領域への免疫組織化学的局在化から、特有の抗体を選択した。イムノパニングにより、この抗体により間質線維芽細胞コロニー形成単位（CFU-F）が選択された。Thiesら（Endocrinology 130:1318、1992）は、骨形成タンパク質-2が間質細胞の系統において骨芽細胞の分化を誘導し、細胞増殖に影響することなくアルカリホスファターゼ活性が用量依存的に増加することを報告している。
【０００９】
Liechtyら（Nature Med. 6:1282、2000）はヒト間葉性幹細胞（MSC）の移植について報告し、ヒツジにおける子宮移植後の部位特異的分化を実証している。MSC集団は正常なヒトドナーから腸骨稜吸引により採取し、免疫能が発達する前にヒツジに移植した。細胞は多くの組織に移植され、13ヶ月持続した。本論文は、この細胞が軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、心筋細胞、骨髄間質細胞、および胸腺間質への部位特異的分化を起こすことを報告している。
【００１０】
米国特許第5,908,784号（Case Western Reserve）は、骨髄細胞を採取し、ウシ胎仔血清を添加したBGJb培地で培養し、モノクローナル抗体でこれを同定することによりヒトMSCを取得することに関連する。インビトロにおける軟骨細胞の誘導は、固く詰まった細胞ペレットを軟骨誘導剤と接触させることを含む。米国特許第5,486,359号（Osiris Therapeutics）では、骨、軟骨、筋肉、または骨髄間質に分化し得るヒト間葉性幹細胞の単離を報告している。国際公開公報第97/40137号（Osiris）では、間葉性幹細胞を用いた骨の再生および増強のための系を提案している。組成物には、セラミック材質または再吸収可能な生体高分に結合したMSCまたは新鮮な骨髄細胞を含む。
【００１１】
これらの出版物で例示される細胞調製物のいずれかが、骨修復の治療的組成物として大量市場用に十分な量で生産され得るのか否かは不明である。
【００１２】
胚起源の未分化多能性幹細胞
医学研究の様々な分野で、どの特異的系譜の子孫を産生するようにも拘束されていない幹細胞に取り組んでいる。最近の数多くの発見から、胚細胞株が、多種多様な変性状態の再生医療において有効な細胞および組織の供給源となり得るという期待が募ってきた。胚幹細胞は様々な細胞種に分化し得ると考えられているため、多能性と称される（R.A.Pedersen、Scientif. Am. 280(4):68,、1999）。
【００１３】
胚幹細胞に関する初期の研究は、モデルとして近交系マウスを使用して行われた（Robertson、 Meth. Cell Biol. 75:173、1997；およびPedersen、Reprod. Fertil. Dev. 6:543、1997に総説される）。しかし、マウスES細胞と比較して、サルおよびヒトの多能性細胞はさらにより脆弱であることが判明し、また同じ培養条件には対応しない。培養における持続性およびその後の分化に影響を及ぼす因子も、かなり異なる。ごく最近になって、霊長動物の胚細胞の培養をエクスビボで可能にする発見がなされた。
【００１４】
Thomsonら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844、1995）は、モデルとしてアカゲザルとマーモセットを使用し、霊長動物から胚幹細胞を培養することに初めて成功した。彼らは次に、ヒト胚盤胞からヒト胚幹（hES）細胞株を派生させ（Science 282:114、1998）、維持と増殖を支持するためこの細胞株をマウス胚性線維芽細胞と共培養した。Gearhartらは、胎児性腺組織からヒト胚生殖（hEG）細胞株を派生させ（Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726、1998）、やはりフィーダー細胞上で支持した。hES細胞およびhEG細胞のどちらも、多能性幹細胞という念願の特性を有する。これらは、分化することなくインビトロで増殖し続けることができ、正常な核型を保持し、かつ分化して様々な成熟細胞種を産生する能力を保持する。
【００１５】
Geron Corporationでは、基本的にフィーダー細胞を含まない環境下で多能性幹細胞の持続的な増殖を可能にする新規な組織培養環境を開発した。豪州特許第AU729377号、および国際公開公報第01/51616号を参照されたい。フィーダーを含まない環境下で幹細胞を培養できることにより、ヒトの治療の規制基準に応じた細胞組成物が容易に産生され得る系が提供される。
【００１６】
ヒトの健康および疾患の管理における多能性幹細胞の可能性を理解するため、この細胞を治療的に重要な組織種の集団にする新しいパラダイムを開発することが現在必要である。
【発明の開示】
【００１７】
概要
本発明は、多能性細胞から間葉性系譜の細胞に分化した霊長動物細胞を効率的に産生する系を提供する。
【００１８】
本発明の1つの態様は、霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化することにより得られる、インビトロ培養において増殖する単離細胞または細胞集団である。細胞集団は、本開示の他の箇所で挙げる特徴を有する様々な種類の間葉性細胞を少なくとも約10%、約30%、または約60%含み得る。例えば、骨芽細胞およびその前駆細胞は、オステオカルシン、I型コラーゲン、およびアルカリホスファターゼを発現し得る。成熟骨芽細胞はオステオカルシンを発現し、カルシウムを含む細胞外基質を形成し得る。
【００１９】
これらの細胞はヒト胚幹（hES）細胞系譜由来であってよく、したがって誘導された任意の遺伝的変化を有し、元となった系統と同じゲノムを共有する。本発明の1つの態様においては、骨形成タンパク質（BMP）、ヒトTGF-β受容体のリガンド、またはヒトビタミンD受容体のリガンドを含む培地中でpPS細胞を分化させることにより、間葉性細胞が得られる。この培地はさらに、デキサメタゾン、アスコルビン酸-2-リン酸、ならびにカルシウムおよびリン酸の供給源を含んでもよい。必要に応じて、増殖能を増加させるために本発明の細胞を遺伝的に改変することができる。例えば、テロメラーゼ逆転写酵素の発現ベクターを用いる。本細胞を遺伝的に改変し、骨形成タンパク質を発現させることも可能である。
【００２０】
本発明の他の態様は、間葉性細胞もしくは骨芽細胞の毒性または変調について化合物をスクリーニングする方法であり、この方法では化合物を本発明の細胞または細胞集団と混合し、化合物に起因する間葉性細胞の任意の毒性または変調を判定する。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、本発明の細胞集団を含む、人体または動物体を治療するための薬剤である。薬剤は選択的に、基質もしくはセラミック担体、カルシウム、または骨形成タンパク質等のさらなる成分を含むかまたは添加することも可能である。
【００２２】
本発明の組成物を用いて、修復の必要な組織の再生を行うことができる。例えば、骨組織を本発明の骨芽細胞または前駆細胞集団に接触させることにより、骨組織を修復することが可能である。同様の方法で、この組成物を用いて、個人の筋骨格の細胞機能を再構成するまたは補うことができる。また、患者に本発明の細胞集団と併用して人工義装具または副子を移植することにより、ヒト患者における運動性を増加させることも可能である。
【００２３】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の記載により明らかになると考えられる。本開示に記載される組成物、方法、および技術は、診断、薬剤スクリーニング、および治療用途における使用にかなり期待できる。
【００２４】
詳細な説明
本発明は、骨の代謝回転および修復に関与する細胞を含むある種の間葉性細胞を調製し特徴付けするのに使用可能な技術を提供する。
【００２５】
pPS細胞が方向づけされない様式で分化可能であれば、複数の様々な組織種のマーカーを発現する不均一な細胞集団が得られる（国際公開公報第01/51616号；Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98：113、2001）。治療目的のためまたはインビトロで特定の細胞種を研究するためにpPS細胞を使用する上での重要な課題は、特徴が比較的均一である実質的な亜集団を含む細胞集団を得ることである。本開示の背景の項で概説したどの論文も、任意の種の胚幹細胞から骨芽細胞またはその前駆細胞を派生させる方法を開示も提案もしていない。
【００２６】
間葉性系譜の細胞の実質的に均一な集団が、この種の細胞に最適化した条件において多能性胚細胞を培養することによって得られることを、今回見い出した。実施例2（以下）で、いかにしてヒト胚幹（hES）細胞が初期の中胚葉細胞の系統に分化し得るかを説明する。hES細胞に胚様体を形成させ、次にこれを中胚葉細胞の表現型の特徴を有する細胞の系統を選択するのに適した条件下でプレーティングした。その後、単離した細胞株にテロメラーゼ逆転写酵素を形質導入し、増殖能を増加させた。この細胞株は自己再生能、および様々な成熟間葉性細胞種の前駆細胞を形成する能力を有する。
【００２７】
実施例3では、今度は間葉性細胞株を、コラーゲン-1、オステオカルシン、およびアルカリホスファターゼ活性の染色で同定される骨芽細胞系譜の細胞に分化させた。実施例3ではまた、骨芽細胞の特徴を有する細胞が、適切な培養環境においてヒト胚幹（hES）細胞を培養することにより直接得ることも可能であることを説明する。具体的には、0.1μMデキサメタゾン、5μMアスコルビン酸-2-リン酸、10 mMβ-グリセロリン酸、および100 ng/mL BMP-4を添加した市販の間葉性細胞増殖培地で、細胞を11日間培養した。
【００２８】
本発明の方法に従って得られるある細胞集団は、骨芽細胞およびその前駆細胞を高い比率で含む。培養条件がhES細胞に骨芽細胞表現型になるよう誘導するのか、この種の細胞の成長を促進するのか、または他の細胞種の成長を阻害するのかは未知である。実際に、これらの機構のいくつかが協力して働き、所望の種類の細胞を濃縮する可能性が十分ある。当然、骨芽細胞系譜の細胞の濃縮をもたらす機構は関心対象であるが、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はない。
【００２９】
この系によって産生される細胞は、その著しい均一性および機能的性質により、新しい治療様式の開発におよびインビトロで間葉性組織を研究する手段として有用である。
【００３０】
定義
原型の「霊長動物多能性幹細胞」（pPS細胞）は任意の種類の胚組織（胎児または前胎児組織）由来の全能性細胞であり、8〜12週齡のSCIDマウスで奇形腫を形成する能力、または組織培養において同定可能な全3胚葉の細胞を形成する能力等の標準技術として公認の試験によると、適切な条件下で3つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）すべての派生物である様々な細胞種の子孫を産生し得る特徴を有する。
【００３１】
pPS細胞の定義には、Thomsonら（Science 282:1145、1998）によって記載されるヒト胚幹（hES）細胞、アカゲザル幹細胞（Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844、1995）、マーモセット幹細胞（Thomsonら、Biol. Reprod. 55:254、1996）等の他の霊長動物の胚幹細胞、およびヒト胚生殖（hEG）細胞（Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726、1998）に例示される様々な種類の胚細胞が含まれる。他の種類の多能性細胞もまた、この用語に含まれる。胚組織、胎児組織、または他の供給源由来であるか否かにかかわらず、全3胚葉の派生物である子孫を産生し得る霊長動物起源の任意の細胞が含まれる。pPS細胞は、悪性の供給源由来ではない。細胞は核型が正常であることが望ましい（必ずしも必要とは限らない）。
【００３２】
pPS細胞培養物は、集団中の幹細胞およびその派生物の実質的な割合が、胚起源または成体起源の分化細胞と明らかに区別できる未分化細胞の形態学的特徴を示す場合に、「未分化である」と記載される。未分化pPS細胞は当業者により容易に認識され、2次元の顕微鏡視野において、典型的に、高い核/細胞質比および顕著な核小体を有する細胞のコロニーとして見える。集団内の未分化細胞のコロニーは、分化した隣接細胞に囲まれていることが多いと理解されている。
【００３３】
本開示の目的には、「間葉性細胞」は、最終分化細胞、または骨、歯組織、軟骨、腱、骨髄ストローマ、造血性系譜、もしくは筋肉等の間葉性組織の細胞の形成に拘束された増殖性の前駆細胞のどちらかでよい。間葉性幹細胞は、最終分化（有糸分裂後の）細胞、および骨芽細胞前駆細胞等のより拘束された複製可能な細胞と同様に、この用語に含まれる。間葉性細胞はすべて、間葉性系譜で最終的に分化するか、または間葉性系譜の子孫もしくはその前駆細胞を形成するよう制限される性質を有する。間葉性細胞は、核移植かまたはさもなければ再プログラミングしない限り、内胚葉細胞も外胚葉細胞も形成しない。
【００３４】
細胞の個体発生との関連では、形容詞「分化した」とは相対語である。「分化細胞」とは、比較する細胞よりも発生経路をさらに下方に進行した細胞のことである。したがって、多能性胚幹細胞は系譜を限定した前駆細胞（例えば、間葉性幹細胞）に分化可能であり、次に経路のさらに下流にある他の種類の前駆細胞（例えば、骨芽細胞前駆細胞）、続いて最終段階の分化細胞へと分化可能であり、この分化細胞が特定の組織種において特徴的な役割を果たすが、これ以上増殖する能力を保持するかどうかは未知である。
【００３５】
本開示で用いる「分化剤」とは、間葉性系譜の分化細胞（前駆細胞および最終的分化細胞を含む）を産生するために、本発明の培養系に用いる一群の化合物の1つを指す。化合物の作用形態に関しては限定しない。例えば、薬剤は、表現型の変化を誘導または補助することにより、特定の表現型により細胞の増殖を促進することによりもしくは他の増殖を遅延させることにより、または他の薬剤と合わせて未知の機構で作用することにより、分化過程を補助する可能性がある。
【００３６】
特記しない限り、本発明の技術により、骨に分化可能な任意の種類の前駆細胞を限定することなく生ずることが可能である。
【００３７】
「フィーダー細胞」または「フィーダー」とは、他の種類の細胞と共培養され、第2の種類の細胞が増殖できる環境を提供する1つの種類の細胞を表すのに用いられる用語である。pPS細胞集団は、分割後にpPSの増殖を支持するために新鮮なフィーダー細胞を添加せずに少なくとも1回増殖した場合、フィーダー細胞を「本質的に含まない」と称される。
【００３８】
「増殖環境」とは、目的の細胞がインビトロにおいて増殖、分化、または成熟する環境のことである。環境の特徴には、細胞を培養する培地、存在し得る増殖因子または分化誘導因子、存在する場合には支持構造（例えば、固体表面上の基層）が含まれる。
【００３９】
任意の適切な人工的操作手段によりポリヌクレオチドが細胞に導入された場合、または細胞がそのポリヌクレオチドを受け継いだ最初に改変された細胞の子孫である場合、その細胞は「遺伝的に改変された」と称される。ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする転写可能な配列を含むことが多く、これにより細胞はこのタンパク質をレベルを増加して発現することが可能となる。改変された細胞の子孫が同じ改変を有する場合、遺伝的改変は「遺伝性である」と称される。
【００４０】
本開示で用いる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を指す。本用語の範囲は、完全な免疫グロブリン分子だけでなく、当技術分野で周知の技術で調製され得て、かつ所望の抗体結合特異性を保持する免疫グロブリン分子の断片および派生物（単鎖Fv構築物、ダイマー、および融合構築物等）を意図的に包含する。
【００４１】
一般的技術
本発明の実施において有用な一般的技術をさらに緻密にするために、実施者は、細胞生物学、組織培養、および発生学の標準的な教科書および総説を参照することができる。
【００４２】
組織培養および胚幹細胞については、当業者は、Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (E.J. Robertson編、IRL Press Ltd. 1987)；Guide to Techniques in Mouse Development (P.M. Wassermanら編、Academic Press 1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M.V. Wiles、Meth. Enzymol. 225:900、1993)；Properties and uses of Embryonic Stemm Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P.D. Rathjenら、Reprod. Fertil. Dev. 10:31、1998)を参照することを望む場合がある。
【００４３】
骨細胞の調製および培養、ならびに骨病変の修復の一般的な原理は、Bone: The Osteoblast and Osteocyte (B.K. Hall、CRC Press 1990)；Differentiation and Morphogenesis of Bone(B.K. Hall、CRC Press 1994)；Principles of Bone Biology (J.P. Bilezikianら編、Academic Press 1996)；およびThe Cellular and Molecular Basis of Bone Formation and Repair (V. Rosenおよび S. Thies、R.G. Landes Co. 1995)に見出すことができる。興味のもたれる他の読み物には、The Bone People( K. Hulme、Viking Press 1986)；およびBone Appetit (B.E. Romano、West Coast Media Group 1998)が含まれる。
【００４４】
分子遺伝学および遺伝子操作の方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(Sambrookら、1989)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gaitら、1984)；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編、1987)；Method in Enzymology (Academic Press)のシリーズ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. MillerおよびM.P. Calos編、1987)；Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology、第3版(F.M. Ausubelら編、1987および1995)；およびRecombinant DNA Methodology II (R. Wu編、Academic Press 1995)に記載されている。 本開示で引用する遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、およびClonTech等の市販業者から入手可能である。
【００４５】
幹細胞の供給源
本発明は、様々な種類の多能性幹細胞、特に胚組織由来あり、かつ上記のように全3胚葉の子孫を産生し得る特徴を有する幹細胞で実施することが可能である。
【００４６】
既存の細胞株として使用される胚幹細胞および胚生殖細胞、またはヒトを含む霊長動物種の初代胚組織から樹立した細胞が、代表的な例である。
【００４７】
胚幹細胞
胚幹細胞は、霊長動物種のメンバーの胚盤胞から単離された（Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844、1995）。ヒト胚幹（hES）細胞は、Thomsonら（米国特許第5,843,780号；Science 282:1145、1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ページ以降、1998）およびReubinoffら、Nature Biotech. 18:399、2000の記載する技術により、ヒト胚盤胞細胞から調製することが可能である。hES細胞に相当する細胞種には、国際公開公報第01/51610号（Bresagen）に概説されるような、原始外胚葉様（EPL）細胞等のその多能性派生物が含まれる。
【００４８】
簡潔に説明すると、ヒト胚盤胞をヒトのインビボ着床前胚から得る。または、インビトロで受精した（IVF）胚を使用することもできる、または1細胞期のヒト胚を胚盤胞段階まで増殖させることもできる（Bongsoら、Hum Reprod 4: 706、1989）。G1.2培地およびG2.2培地で、胚を胚盤胞段階まで培養する（Gardnerら、Fertil. Steril. 69:84、1998）。プロナーゼ（Sigma）に短時間曝露することにより、発生した胚盤胞から透明帯を除去する。胚盤胞を1:50希釈したウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に30分間曝露し、DMEMで5分間3回洗浄し、1:5希釈したモルモット補体（Gibco）に3分間曝露する免疫手術（Solterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099、1975）により、内部細胞塊を単離する。DMEMでさらに2回洗浄した後、穏やかにピペッティングして無傷の内部細胞塊（ICM）から溶解した栄養外胚葉細胞を除去し、ICMをmEFフィーダー層上にプレーティングする。
【００４９】
9〜15日後、1 mM EDTAを添加したカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（PBS）に曝露することにより、ディスパーゼもしくはトリプシンに曝露することにより、またはマイクロピペットで機械的に解離することにより、内部細胞塊に由来する増殖物を凝集塊に解離し、新鮮な培地中のmEF上に再度プレーティングする。未分化の形態を有して増殖するコロニーをマイクロピペットで個別に選択し、機械的に凝集塊に解離し、再度プレーティングする。ES様の形態は、細胞質に対して核の比率が明らかに高く顕著な核小体を有する小型のコロニーとして特徴づけられる。得られたES細胞は、短時間トリプシン処理してダルベッコPBS（2 mM EDTAを含む）に曝露し、IV型コラゲナーゼ（約200 U/mL；Gibco）に曝露することにより、またはマイクロピペットで個別にコロニーを選択することにより、1〜2週間ごとに日常的に分割する。凝集塊の大きさは、約50〜100細胞が最適である。
【００５０】
胚生殖細胞
ヒト胚生殖（hEG）細胞は、最終月経期から約8〜11週間後に得られるヒト胎児物質中に存在する始原生殖細胞から調製することができる。適切な調製方法は、Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726、1998および米国特許第6,090,622号に記載されている。
【００５１】
簡潔に説明すると、生殖隆起を等張緩衝液ですすぎ、0.05% トリプシン/0.53 mM EDTAナトリウム溶液（BRL）0.1 mL中に置き、1 mm3の塊に切断する。次に100μLチップを通して組織をピペッティングし、細胞をさらに脱凝集する。37℃で約5分間インキュベートし、EG増殖培地約3.5 mLを添加する。EG増殖培地は、DMEM、4500 mg/L D-グルコース、2200 mg/L mM NaHCO3；15% ES認定ウシ胎仔血清（BRL）；2 mMグルタミン（BRL）；1 mMピルビン酸ナトリウム（BRL）；1000〜2000 U/mLヒト組換え白血病抑制因子（LIF、Genzyme）；1〜2 ng/mL ヒト組換えbFGF（Genzyme）；および10μMフォルスコリン（10% DMSO中）である。別のアプローチでは、ヒアルロニダーゼ/コラゲナーゼ/DNAseを用いてEG細胞を単離する。腸間膜を伴う生殖原基または生殖隆起を胎児物質から切り取り、生殖隆起をPBSですすぎ、その後HCD消化溶液（0.01% V型ヒアルロニダーゼ、0.002% DNAse I、0.1% IV型コラゲナーゼ、すべてSigma製でありEG増殖培地で調製する）0.1 mL中に置く。組織を細かく切って37℃で1時間または一晩インキュベートし、EG増殖培地1〜3 mLに再懸濁し、フィーダー層上にプレーティングする。
【００５２】
96ウェル組織培養プレートを、LIF、bFGF、およびフォルスコリンを含まない改変EG増殖培地で3日間培養したフィーダー細胞（例えば、STO細胞、ATCC番号CRL 1503）のサブコンフルエントな層で調製し、5000ラドのγ-照射で不活性化する。各ウェルに、初代生殖細胞（PGC）懸濁液約0.2 mLを添加する。7〜10日後に1回目の継代をEG増殖培地で行い、各ウェルを、あらかじめ照射したSTOマウス線維芽細胞で調製した24ウェル培養皿の1ウェルに移す。EG細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、毎日培地を交換してこの細胞を培養するが、典型的にこれは7〜30日後または1〜4継代後である。
【００５３】
未分化状態におけるpPS細胞の増殖
pPS細胞は、分化を促進せずに増加を促進する培養条件を用いて培養し、連続的に増殖させることが可能である。血清を含む代表的なES培地は、80% DMEM（ノックアウトDMEM、Gibco等）、20%の既知組成ウシ胎仔血清（FBS、Hyclone）または血清代替品（国際公開公報第98/30679号）のどちらか、1%非必須アミノ酸、1 mM L-グルタミン、および0.1 mMβ-メルカプトエタノールから作製する。使用する直前に、ヒトbFGFを4 ng/mLになるように添加する（国際公開公報第99/20741号、Geron Corp.）
【００５４】
従来通り、ES細胞は、典型的には胚または胎児組織由来の線維芽細胞であるフィーダー細胞層上で培養する。妊娠13日目のCF1マウスから胚を回収してトリプシン/EDTA 2 mLに移し、細かく切断し、37℃で5分間インキュベートする。10% FBSを添加し、細胞片を定着させ、細胞を90% DMEM、10% FBS、および2 mMグルタミンで増殖させる。フィーダー細胞層を調製するには、細胞を照射し、増殖を阻害するがES細胞を支持する因子の合成はできるようにする（約4000ラドγ-照射）。0.5%ゼラチンで培養プレートを一晩コーティングし、ウェル当たり375,000個の照射mEFをプレーティングし、プレーティングしてから5時間〜4日後に使用する。pPS細胞をプレーティングする直前に、新鮮なhES培地で培地を交換する。
【００５５】
Geronの研究者は、もう一つの方法としてpPS細胞がフィーダー細胞なしでも未分化状態で維持され得ることを見出した（国際公開公報第01/51616号）。フィーダーを含まない培養環境には、適切な培養基層、特にマトリゲル（Matrigel）（登録商標）またはラミニン等の細胞外基質が含まれる。pPS細胞は、＞15,000細胞cm-2（選択的には90,000 cm-2〜170,000 cm-2）でプレーティングする。典型的には、細胞が完全に分散される前に酵素消化を停止する（例えば、コラゲナーゼIVで〜5〜20分）。約10〜2000細胞の凝集塊を、さらに分散させることなく基層上に直接プレーティングする。
【００５６】
フィーダーを含まない培養物は、典型的には照射した初代マウス胚線維芽細胞、テロメル化したマウス線維芽細胞、またはpPS細胞由来の線維芽細胞様細胞を培養することにより馴化した栄養培地により支持する。フィーダーを20% 血清代替品および4 ng/mL bFGFを添加したKO DMEM等の無血清培地で約5〜6 x 104 cm-2の密度でプレーティングすることにより、培地を馴化することが可能である。24時間馴化した培地を0.2μmメンブレンでろ過し、さらに約8 ng/mL bFGFを添加し、これを用いてpPS細胞培養液を1〜2日間支持する。
【００５７】
顕微鏡下で、ES細胞は、高い核/細胞質比、顕著な核小体、細胞の接合部がほとんど識別できない小型のコロニー形成を伴って見える。霊長動物ES細胞は、時期特異的胚抗原（SSEA）3および4、ならびにTra-1-60およびTra-1-81と称する抗体を用いて検出可能なマーカーの1つまたは複数を発現する可能性がある（Thomsonら、Science 282:1145、1998）。未分化hES細胞はまた、典型的に、RT-PCRで検出されるようにOct-4およびTERTを発現する。インビトロにおけるhES細胞の分化では、典型的にこれらのマーカー（存在するならば）が消失し、SSEA-1の発現が増加する。
【００５８】
間葉性細胞および骨芽細胞を調製するための材料ならびに手順
本発明の細胞は、所望の表現型を有する細胞を濃縮する特殊な増殖環境で幹細胞を培養、分化、または再プログラミングすることにより得ることができる（所望の細胞の増殖によるか、または他の細胞種の阻害もしくは死滅による）。これらの方法は、前項に記載した霊長類多能性幹（pPS）細胞を含む多くの種類の幹細胞に適用可能である。
【００５９】
分化は、胚様体または凝集体の形成により選択的に開始し得る。例えば、ドナーpPS細胞培養物の増殖、またはEB形成を可能にする低付着性の基層を有する培養容器でpPS細胞を懸濁液として培養することによる。短時間コラゲナーゼ処理してpPS細胞を回収し、塊に解離し、非付着性の細胞培養プレートにプレーティングする。数日おきに凝集塊に培地を与え、適切な期間、典型的には4〜8日間後に回収する。代替的にまたはさらに、分化過程は非特異的分化パラダイムで培養することにより開始し得る。例えば、培地にレチノイン酸（RA）もしくはジメチルスルホキシド（DMSO）を含むことにより、またはこの細胞を培養する通常の細胞外基質から引き揚げることによる。米国特許出願第60/213,740号および国際公開公報第01/51616号を参照されたい。
【００６０】
間葉性細胞、詳細には骨芽細胞系譜の間葉性細胞の比較的均一な集団の産生は、以下の1つまたは複数のようなこのような細胞に有利な因子を含む増殖環境でpPS細胞（分化した、または分化を開始した後の細胞）を培養することにより達成され得る：
・BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、およびBMP-7に例示される骨形成タンパク質
・TGF-β1、TGF-β2、およびTGF-β3に例示されるTGF-βとその類似体、ならびにTGF-β受容体に結合するTGF-βスーパーファミリーの他のメンバー
・ビタミンD受容体のリガンド。例示的には1,25-ジヒドロキシビタミンD3である。他の類似体も周知である（例えば、Tsugawaら、Biol. Pharm. Bull. 23:66、2000を参照されたい）。
【００６１】
これら因子のいずれかの受容体に対する特異的抗体が、例に挙げた因子の代わりに（またはそれに加えて）使用し得る機能的な等価のリガンドであることが認められている。使用可能な他の添加物には：
・塩基性FGFのような線維芽細胞増殖因子等の他のモルフォゲン
・グルココルチコイド
・デキサメタゾンまたは他の小分子骨芽細胞成熟因子
・コラーゲン合成の過程において起こるプロリン水酸化の補因子であるアスコルビン酸（またはアスコルビン酸-2-リン酸等のその類似体）
・β-グリセロリン酸、または石灰化の過程におけるアルカリホスファターゼの他の基質
・カルシウムの供給源（基本培地に十分な濃度で既に存在するかどうか未知である）
が含まれうる。
【００６２】
細胞はまた、所望の細胞表現型の増殖の助けとなる適切な材質でコーティングした基層上で支持することも、またこのような材質の成分を含む培地で培養することも可能である。マトリゲル（登録商標）、ラミニン、コラーゲン（特にI型コラーゲン）、グリコサミノグリカン、オステオカルシン、およびオステオネクチンはすべて、それだけでまたは様々な組み合わせで、細胞外基質として適切である可能性がある。同様に増殖する骨芽細胞系譜の細胞に適切なものは、ゲル法によるガラス、シリカゲル、およびゾル-ゲル法によるチタニアである（Saravanapavanら、J. Biomed Mater. Res. 54:608、2001；Dieudonneら、Biomaterials 34:3041、 2002）。
【００６３】
本発明に従って得られる細胞は、数多くの表現型基準に従って特徴づけることができる。比較的未分化の間葉性細胞は、円形から卵形をした核を有し細胞境界が不明瞭である、特徴的な単核の卵形、星型、または紡錘型により認めることができる。細長い卵形をした核は、典型的に、顕著な核小体およびヘテロクロマチンと真正クロマチンの混合物を有する。この細胞は細胞質をほとんど含まないが、核から伸びたように見える細い突起を数多く有する。この細胞は典型的に、以下のマーカー：CD106（VCAM）、CD166（ALCAM）、CD29、CD44、GATA-4、およびアルカリホスファターゼの1つ、2つ、3つ、またはそれ以上で染色されるが、造血性系譜細胞のマーカー（CD14またはCD15）には陰性である。間葉性幹細胞はまた、STRO-1を発現する場合もある。
【００６４】
適切な条件下において、初期の間葉性細胞は、線維芽細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、細網細胞、および脂肪細胞等の多くの成人結合組織細胞種にさらに分化することが可能である。したがって、間葉性幹細胞は、1つまたは複数の特殊化した間葉性系譜の子孫を形成する能力によって同定することが可能である。
【００６５】
骨芽細胞および骨前駆細胞は、典型的に以下のリストのうちの少なくとも1つの特徴（典型的には少なくとも3つないし5つの特徴）を有する。
・約1.050ないし約1.090 g cm-3の密度
・オステオネクチン陽性（骨芽細胞および前駆細胞で陽性）
・オステオカルシン陽性（成熟骨芽細胞に特異的）
・約8〜約70μmの細胞直径
・立方形
・特にBMPの存在に対する、アルカリホスファターゼの上方制御された産生
・I型コラーゲン（プロコラーゲン）またはビメンチン陽性
・BMP受容体、PTH受容体、またはCD105（エンドグリン）等の、他の骨芽細胞特異的マーカー陽性
・外部環境を石灰化する能力、またはカルシウム含有細胞外基質を合成する能力の徴候
【００６６】
当業者は、軟骨細胞が典型的にII型コラーゲン、アグリカン、またはアルシアンブルーで染色されるプロテオグリカンを発現することを周知であると思われる。成熟型の軟骨細胞では、エラスチン、I型コラーゲン、X型コラーゲン、またはオステオカルシン陽性は1%未満である。造血細胞集団およびその前駆細胞は、CD45、CD34、CD13、AC133、ヘモグロビン、表面抗体、およびクラスII組織適合抗原のようなマーカーを有する。適切な環境下において、複製造血細胞は、造血コロニー形成単位（CFU）のアッセイ法においてコロニーを形成する。心筋細胞およびその前駆細胞は、典型的に、心筋トロポニンI（cTnI）、心筋トロポニンT（cTnT）、心房性ナトリウム利尿因子（ANF）、およびα心筋ミオシン重鎖（MHC）を発現する。線維芽細胞は容易に同定可能な形態を有し、典型的にコラゲナーゼIおよびメタロプロテアーゼ組織阻害剤I（TIMP）を発現する。横紋筋細胞は、典型的に、骨格α-アクチン、骨格ミオシン重鎖および軽鎖、ならびにトロポミオシン等の収縮タンパク質を発現する。初期の筋原性マーカーは、MyoDおよびミオゲニンである。腱および靭帯組織では、一定方向の線維配列においてI型コラーゲンが染色される。初期の腱および軟骨細胞前駆細胞は、典型的にスクレラキシスを発現する。脂肪細胞は、典型的に、脂質の蓄積を示すオイルレッドOで染色され、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ2（PPARγ2）、リポタンパク質リパーゼ（LPL）、および脂肪酸結合タンパク質（aP2）を発現する。
【００６７】
組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーへのフロー免疫細胞化学法またはアフィニティー吸着法、（例えば、固定化細胞または組織切片の）細胞内または細胞表面マーカーへの免疫細胞化学法、細胞抽出物のウェスタンブロット解析法、および細胞抽出物または培地に分泌された産物の酵素免疫測定法等の任意の適切な免疫学的技術を用いて検出し得る。選択的に細胞を固定化した後、かつ標識を増幅するため選択的に標識二次抗体または他のコンジュゲート（ビオチン‐アビジンコンジュゲート等）を使用し、標準の免疫細胞化学アッセイ法またはフローサイトメトリーアッセイ法で有意に検出可能な量の抗体が抗原に結合する場合、細胞による抗原の発現は「抗体検出可能である」と称される。
【００６８】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット解析法、ドットブロットハイブリダイゼーション解析法、または標準の増幅法における配列特異的プライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）により、mRNAレベルで検出することが可能である。一般的な技術の詳細については米国特許第5,843,780号を、骨芽細胞特異的PCRプライマーについては国際公開公報第99/39724号を参照されたい。本開示で挙げる他のマーカーの配列データは、GenBank（URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez）等の公的データベースから入手可能である。典型的な制御された実験において標準の手順に従い細胞試料についてアッセイ法を実行した結果、はっきりと識別可能なハイブリダイゼーション産物または増幅産物が生じる場合、mRNAレベルでの発現は本開示に記載するアッセイ法の1つにより「検出可能である」と称される。タンパク質またはmRNAレベルで検出されるような組織特異的マーカーの発現は、そのレベルが未分化pPS細胞または他の非関連細胞種等の対照細胞のレベルの少なくとも2倍、好ましくは10倍または50倍を超える場合、陽性であるとみなされる。
【００６９】
アルカリホスファターゼ活性の存在は、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定化し、メーカー（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）の記載するように基質としてベクターレッド（Vector Red）で発色することにより検出し得る。細胞内のカルシウムの蓄積および基質タンパク質への沈着はは、45Ca++中で培養し、洗浄して再度培養し、その後細胞内に存在する放射能または細胞外基質に沈着した放射能を測定することにより、測定し得る（米国特許第5,972,703号）；またはCa++アッセイキット（Sigmaキット#587）を用いて石灰化の培養基層をアッセイすることにより測定し得る。
【００７０】
所望の表現型の細胞表面上にマーカーが検出されたなら、これを免疫選択に使用し、イムノパニングまたは抗体による蛍光活性化セルソーティング等の技術によりその集団をさらに濃縮することが可能である。
【００７１】
現在、間葉性細胞および骨芽細胞がpPS細胞から産生可能であることを明らかにしているが、独自の目的に適するように本開示で説明する分化パラダイムを適応させることは十分に当業者の範囲内である。当業者は、例えば本開示の説明に従って得られる細胞および他の対照細胞種（初期ヒト間葉性幹細胞、肝細胞、または線維芽細胞等）と平行してpPS細胞またはその派生物を試験条件で培養し、上記のマーカーに従って得られる細胞の表現型を比較することにより、ある培養条件の適合性を容易に試験することが可能である。特定の成分を含み、除去し、または置換する培養および細胞分離条件の調整は、通常この種の発明に求められる日常的な最適化の問題であり、請求する本発明の精神から逸脱するものではない。
【００７２】
分化細胞の遺伝的改変
細胞は、ある種の医薬スクリーニングおよび治療的応用において複製する能力、ならびに間葉性細胞および骨芽細胞産生の蓄積を提供する能力を有することが望ましい場合もある。本発明の細胞が限定した発生系譜の細胞もしくは最終分化細胞まで発達する以前またはその後に、この細胞を選択的にテロメル化し、複製能を増加させることが可能である。テロメル化したpPS細胞は先に記載した分化経路を降りることができ、または分化細胞を直接テロメル化することも可能である。
【００７３】
適切なベクターによるトランスフェクションもしくは形質導入、相同組換え、または他の適切な技術により細胞を遺伝的に改変してテロメル化すると、典型的には内在性プロモーター下で起こる発現を上回りテロメラーゼの発現を増加させる異種性プロモーター下で、テロメラーゼ触媒コンポーネントを発現する。特に適しているのは、国際公開公報第98/14592号で提供されるヒトテロメラーゼの触媒コンポーネント（hTERT）である。ある種の応用においては、マウスTERT（国際公開公報第99/27113号）のような種相同体も使用可能である。ヒト細胞におけるテロメラーゼのトランスフェクションおよび発現は、Bodnarら、Science 279:349、1998およびJiangら、Nat. Genet. 21:111、1999に記載されている。他の例では、hTERTクローン（国際公開公報第98/14592号）をhTERTコード配列源として使用し、MPSVプロモーターの制御下にあるPBBS212ベクターのEcoRI部位、またはLTRプロモーターの制御下にある市販のpBABEレトロウイルスベクターのEcoRI部位に接合する。
【００７４】
分化pPS細胞または未分化pPS細胞は、ベクターを含む上清を用いて8〜16時間を上回る期間遺伝的に改変し、1〜2日間増殖培地に交換する。0.5〜2.5μg/mLピューロマイシンを用いて遺伝的に改変した細胞を選択し、さらに培養する。その後この細胞を、RT-PCR法によるhTERT発現、テロメラーゼ活性（TRAPアッセイ法）、hTERTの免疫細胞化学的染色、または複製能について評価することができる。以下のアッセイキットが研究の目的で市販されている：トラペーゼ（TRAPeze）(登録商標）XLテロメラーゼ検出キット(XL Telomerase Detection Kit)（カタログ番号s7707； Intergen Co.、ニューヨーク州パーチェス）；およびTeloTAGGGテロメラーゼPCR ELISAプラス（TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAplus)（カタログ番号2,013,89； Roche Diagnostics、インディアナ州インディアナポリス）。TERT発現は、RT-PCR法によりmRNAレベルで評価することも可能である。研究目的で市販されている物に、ライトサイクラーTeloTAGGG hTERT定量キット（LightCycler TeloTAGGG hTERT quantification kit)（カタログ番号3,012,344；Roche Diagnostics）がある。増殖を支持する条件下で連続して複製するコロニーをさらに培養して濃縮し、選択的に所望の表現型を有する細胞を限界希釈によりクローニングすることが可能である。
【００７５】
本発明のある態様においては、pPS細胞を多能性間葉性細胞または拘束された間葉性細胞に分化し、その後遺伝的に改変してTERTを発現させる。本発明の他の態様においては、TERTを発現するようにpPS細胞を遺伝的に改変し、その後骨芽細胞前駆細胞または最終的分化細胞に分化させる。TERT発現を増加させる修飾の成否は、TRAPアッセイ法または細胞の複製能が改善されたか否かを測定することにより判断することができる。
【００７６】
用途によっては、myc、SV40ラージT抗原、またはMOT-2をコードするDNAで細胞を形質転換するなどして（米国特許第5,869,243号、国際公開公報第97/32972号、および国際公開公報第01/23555号）、他の不死化方法を使用することも可能である。細胞を治療目的で使用する場合には、発癌遺伝子または腫瘍ウイルス産物によるトランスフェクションはあまり適していない。テロメル化した細胞は、増殖可能でありかつその核型の維持が可能である細胞を得ることが好都合な本発明の応用において、例えば医薬品スクリーニングおよび筋骨格機能を増大させるために分化細胞を個人に投与する治療手順において、特に関心がもたれる。
【００７７】
本発明の細胞はまた、組織再生に関与する能力、または投与部位に治療遺伝子を送達する能力を増強するために、遺伝的に改変することも可能である。所望の遺伝子をコードする既知の配列を用いてベクターを設計し、全特異的または分化した細胞種で特異的に活性のあるプロモーターに機能的に連結させる。特に関心対象となるのは、BMP-2またはBMP-4等の骨形成タンパク質を発現するように遺伝的改変した細胞である。国際公開公報第99/39724号を参照されたい。投与部位においてこれらまたは他の増殖因子を産生することにより、投与細胞の薬効が増強し、治療部位の近傍にある宿主細胞の増殖または活性が増加する可能性がある。
【００７８】
間葉性幹細胞、骨芽細胞前駆細胞、および最終分化細胞の使用
本発明は、多数の前駆細胞および成熟細胞を産生する方法を提供する。これらの細胞集団は、多くの重要な研究、開発、および商業目的に使用することが可能である。
【００７９】
本発明の細胞を用いて、他の系譜の細胞で優先的に発現されるcDNAに比較的汚染されないcDNAライブラリーを調製することが可能である。例えば、間葉性前駆細胞または骨芽細胞を1000 rpmで5分間遠心分離して回収し、標準的な技術（Sambrookら、前記）によりペレットからmRNAを調製する。cDNAに逆転写した後、未分化pPS細胞、他の前駆細胞、または骨芽細胞もしくはその他の発生経路による最終段階の細胞のcDNAをこの調製物から差し引くことができる。
【００８０】
本発明の分化細胞を用いて、間葉性細胞、骨芽細胞、および中間前駆細胞のマーカーに特異的な抗体を調製することも可能である。脊椎動物に免疫原性型の本発明の細胞を注射し、ポリクローナル抗体を調製することが可能である。モノクローナル抗体の産生は、米国特許第4,491,632号、米国特許第4,472,500号、および米国特許第4,444,887号、ならびにMethods in Enzymology 73B:3 (1981)等の標準的な参照に記載されている。特異的抗体分子は、免疫担当細胞またはウイルス粒子のライブラリーを標的抗原に接触させ、陽性選択したクローンを増殖させることによっても産生可能である。Marks ら、New Eng. J. Med. 335:730、1996およびMcGuinessら、Nature Biotechnol. 14:1449、1996を参照されたい。さらなる変法は、欧州特許出願第1,094,108A号に記載されるような、ランダムDNA断片の抗体コード領域への再構築である。
【００８１】
本発明のpPS細胞を用いた陽性選択、およびより広範に分布した抗原を有する細胞（分化した胚細胞等）または成人由来幹細胞を用いた陰性選択により、所望の特異性を取得することが可能である。次にこの抗体を用いて、組織試料を用いた免疫診断において共染色したり、最終分化骨芽細胞や他の系譜の細胞から前駆細胞を単離する等の目的で、混合細胞集団から所望の表現型の間葉性細胞を同定し回収することが可能である。
【００８２】
本発明の細胞は、転写産物の発現パターンおよび間葉性細胞に特徴的な新たに合成されるタンパク質を同定する上での関心対象でもあり、分化経路の方向づけまたは細胞間の相互作用の促進を支援する可能性がある。分化細胞の発現パターンを取得し、未分化pPS細胞、拘束された他種の前駆細胞（他の系譜に分化したpPS細胞等）、または最終分化細胞等の対照細胞株と比較する。
【００８３】
遺伝子発現の解析におけるマイクロアレイの使用は、Fritzら、Science 288:316、2000；「Microarray Biochip Technology」、L Shi, www.Gene-Chips.comにより一般的に総説されている。代表的な方法は、ジェネティックマイクロシステムズアレイ作製装置（Genetic Microsystems array generator）およびアキソン（Axon）ジーンピックス（GenePix）(商標）スキャナーを用いて行う。マイクロアレイは、まず解析するマーカー配列をコードするcDNA断片を増幅し、スライドガラスに直接スポットして調製する。関心対象である2種類の細胞のmRNA調製物を比較するためには、一方の調製物をCy3標識cDNAに変換し、もう一方の調製物をCy5標識cDNAに変換する。2つのcDNA調製物をマイクロアレイスライドに同時にハイブリダイズさせた後、洗浄して非特異的結合を除去する。それぞれの標識に適した波長でスライドをスキャンして生じた蛍光を定量化し、結果の型式を定めアレイ上の各マーカーのmRNA相対量の指標にする。
【００８４】
薬剤スクリーニング
本発明の間葉性細胞および骨芽細胞を用いて、このような細胞およびその多様な子孫の特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、小分子薬剤、ペプチド、オリゴヌクレオチド等）または環境条件（培養環境または操作）をスクリーニングすることが可能である。
【００８５】
ある態様においては、pPS細胞（未分化または分化）を用いて、後期間葉性前駆細胞または最終分化細胞への成熟を促進する因子、または長期培養におけるこのような細胞の増殖および維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば、様々なウェル内の細胞に候補成熟因子または増殖因子を添加し、さらなる培養および細胞用途の所望基準に従って生じる任意の表現型変化を判断することにより、それら因子を試験する。一例では、初期間葉性表現型を有するpPS由来細胞を用いて、筋細胞、軟骨、または脂肪細胞等の特定の細胞種への分化に方向づける能力について因子をスクリーニングする。
【００８６】
本発明の他のスクリーニング応用は、筋骨格組織の維持および修復への効果についての薬学的化合物の試験に関する。一例では、骨芽細胞の特徴を有するpPS由来細胞を用いて、カルシウム沈着影響を及ぼす能力について因子をスクリーニングする。細胞に対して薬理学的効果を有するように化合物を設計するため、または他所で効果を有するよう設計した化合物がこの組織種の細胞に意図されない副作用をもたらすかもしれないため、スクリーニングを行うこともある。本発明の任意の前駆細胞または最終分化細胞を用いて、スクリーニングを行うことも可能である。
【００８７】
当業者は一般に、標準的な教科書「In Vitro Methods in Pharmaceutical Research」、Academic Press、1997および米国特許第5,030,015号を参照する。候補薬学的化合物の活性の評価は、一般に本発明の分化細胞を、単独または他の薬剤と組み合わせた候補化合物と混合することを伴う。研究者は、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または機能的活性における任意の変化を判断し（未処理細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較して）、化合物の効果を観察された変化と関連づける。
【００８８】
まず細胞生存度、残存、形態、ならびに特定のマーカーおよび受容体の発現に及ぼす影響により、細胞毒性を判断することが可能である。染色体DNAに及ぼす薬剤の影響は、DNA合成または修復を測定することにより判断し得る。特に細胞周期の不定期における[3H]-チミジンまたはBrdUの取り込み、または細胞複製に必要なレベルを上回る取り込みが、薬剤の影響と一致する。望まれない効果には、中期の拡散によって判断される姉妹染色分体交換の異常な比率も含まれる。さらなる詳細については、当業者はA. Vickers（「In vitro Methods in Pharmaceutical Reseach」、Academic Press、1997の375〜410ページ）を参照されたい。
【００８９】
細胞機能の影響は、受容体結合、基質沈着、またはカルシウム加工等の、間葉性細胞もしくは骨芽細胞の表現型または活性を、細胞培養物または適切な動物モデルで観察する標準的な任意のアッセイ法を用いて、評価することができる。
【００９０】
治療用途
本発明はまた、代謝機能における先天性異常、病状の影響、または顕著な外傷の結果等の任意の明らかな必要性に対する筋骨格系の組織維持または修復を増強する、間葉性細胞または骨芽細胞の使用法も提供する。
【００９１】
細胞組成物の治療的投与への適合性を判断するために、まず細胞を適切な動物モデルで試験することができる。1つのレベルでは、細胞がインビボで生存する能力およびその表現型を維持する能力で細胞を評価する。細胞組成物を免疫不全動物（ヌードマウス、または化学的もしくは照射により免疫不全にした動物等）に投与する。再増殖の期間後に組織を回収し、pPS由来細胞がまだ存在しているか否かについて評価する。
【００９２】
これは、検出可能な標識（緑色蛍光タンパク質またはβ-ガラクトシダーゼ等）を発現し、あらかじめ標識した（例えば、BrdUまたは[3H]チミジンで）細胞を投与することにより、または続いて構成的な細胞マーカーを検出することにより（例えば、ヒト特異的抗体を用いて）、実施可能である。投与細胞の存在および表現型は、ヒト特異的抗体を用いた免疫組織化学法もしくELISA法により、または公表された配列データに基づいたヒトポリヌクレオチドに特異的な増幅を生じるプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を用いたRT-PCR解析法により評価できる。
【００９３】
適合性は、間葉性細胞の細胞集団による治療後の回復の程度を評価することによっても判断できる。例えば、ラット頭蓋冠欠損モデル（米国特許第6,200,606号）を用いて、骨および軟骨の再生能を判断することが可能である。ウサギ、イヌ、およびサルにおいて下顎骨欠損、上顎骨歯槽突起裂、ならびに骨切除間隙の確立された治療動物モデルが存在する（国際公開公報第99/39724号）。モデル病変への骨の沈着は、X線解析および他の技術によってモニタリング可能である。再構成された骨組織の機能については、標準の生体力学的試験により評価することができる。Minamideら、Spine 24:1863、1999；Takahashiら、J. Neurosurg. 90 (4 suppl.):224、1999；Helmら、J. Neurosurg. 88:354、1997を参照されたい。
【００９４】
適切な試験の後、本発明の分化細胞を、このような治療を必要とするヒト患者もしくは他の対象において組織再構成または再生のために使用することができる。目的とする組織部位への移植または移動を可能にし、機能的に欠損した部位の再構成または再生を可能にする方法で、細胞を投与する。このような治療の医療適用には、筋骨格の欠損、骨折の修復、脊髄の回復、義装具の取り付け、および骨粗鬆症関連傷害の再生が含まれる。
【００９５】
本組成物の投与は、修復する筋骨格の部位に依存することになる。例えば、外科的処置により組織が再構築されるかまたは副子もしくは人工股関節等の人工義装具を挿入するのに従い、骨形成が促進され得る。他の状況においては、侵襲手術が必要でないと予想され、注射により（脊柱の修復のため）またはガイド可能な内視鏡を用いて本組成物を投与することが可能である。
【００９６】
本発明の間葉性細胞および骨芽細胞は、ヒト投与のために十分な無菌条件下で調製される等張賦形剤を含む薬学的組成物の形で供給され得る。医薬品製剤の一般的な原理について、当業者はG. Morstyn およびW. Sheridan 編によるCell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy、Cambridge University Press、1996、ならびにHematopoietic Stem Cell Therapy、E.D. Ball、J. Lister、およびP. Law、Churchill Livingstone、2000を参照されたい。細胞賦形剤および組成物の付随成分の選択は、投与に用いられる装置により適合させられる。
【００９７】
必要に応じて、細胞調製物は、デキサメタゾンのような合成グルココルチコイド、またはBMP-2もしくはBMP-4等の骨形成タンパク質といった相補的な生理活性因子をさらに含むか、あるいは同時投与することが可能である。他に可能性のある付随成分には、骨再生の補助に適切なカルシウムまたはホスフェートの無機供給源が含まれる（国際公開公報第00/07639号）。必要に応じて、細胞調製物を担体基層または物質上で投与し、組織再生の改善を提供することが可能である。例えば、その物質は、顆粒状セラミック、またはゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノーゲン、もしくはオステオカルシン等の生体高分子であってよい。標準的な技術に従って（例えば、Mikosら、Biomaterials 14:323、1993；Mikosら、Polymer 35:1068、1994；Cookら、J. Biomed. Mater. Res. 35:513、1997）、多孔性基層を合成することが可能である。
【００９８】
本組成物は、いくらかの筋骨格異常を改善する間葉性細胞機能の再構成等の、所望の目的の取扱説明書を添付した適切な容器に選択的に包装してもよい。
【００９９】
本発明の特定の態様の限定されないさらなる例示として、以下の実施例を提供する。
【０１００】
実施例
実施例1：胚幹細胞のフィーダーを含まない増殖  
未分化ヒト胚幹（hES）細胞の樹立株は、基本的にフィーダー細胞を含まない培養環境で維持した。
【０１０１】
フィーダーを含まない培養物は、標準的な手順に従い単離した初期マウス胚線維芽細胞を用いて調製した馴化培地により維持した（国際公開公報第01/51616）。線維芽細胞は、Ca++/Mg++を含まないPBSで1度洗浄し、トリプシン/EDTA（Gibco）1.5〜2 mL中で約5分間インキュベートすることによりT150フラスコから回収した。線維芽細胞がフラスコからはがれた後、細胞をmEF培地（DMEM + 10% FBS）に回収した。細胞を4000ラドで照射してカウントし、mEF培地中に約55,000細胞cm-2で播種した（525,000細胞／6ウェルプレートのウェル）。
【０１０２】
少なくとも4時間後、SRを含むES培地（4 ng/mL組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF；Gibco）を添加した80%ノックアウトDMEM（Gibco BRL、メリーランド州ロックビル）、20%ノックアウト血清代替品（Gibco）、1%非必須アミノ酸（Gibco）、1 mM L-グルタミン（Gibco）、0.1 mMβ-メルカプトエタノール（Sigma、ミズーリ州セントルイス））で培地を交換した。プレートの表面積cm2当たり約0.3〜0.4 mLの培地を馴化した。hES培養液に添加する前に、馴化培地を4 ng/mLのヒトFGFを添加した。
【０１０３】
hES細胞を培養するプレートは、マトリゲル（登録商標）（Becton-Dickinson、マサチューセッツ州ベッドフォード）の原液を冷KO DMEMで約1:30に希釈し、9.6 cm2ウェル当たり 0.75〜1.0 mLずつ分注し、室温で4時間または4℃で一晩インキュベートすることによりコーティングした。
【０１０４】
hES培養液は、約200 U/mLコラゲナーゼIV中で37℃で約5〜10分間インキュベートすることにより継代した。顕微鏡下でピペットマン（商標）を用いて個々のコロニーを拾い上げるかまたはこすって剥がすことにより細胞を回収し、馴化培地中で小さな塊になるよう穏やかに解離し、マトリゲル（登録商標）でコーティングしたプレートに播種した。播種してから約1週間後、培養物はコンフルエントになり継代可能となった。これらの条件下で180日を超えて維持した培養物は、ES用の形態を示し続けた。
【０１０５】
試料ウェルを、ノックアウトDMEMで希釈したSSEA-4 (1:20)、Tra-1-60(1:40)、およびTra-1-81 (1:80)に対する一次抗体と37℃で30分間インキュベートすることにより、免疫細胞化学法を行った。細胞を温めたノックアウトDMEMで洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、その後、PBSで洗浄した。細胞をPBS中の5%ヤギ血清と室温で30分間インキュベートし、その後FITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG (1:125)（Sigma）と30分間インキュベートした。細胞を洗浄後、DAPIで染色し、封入した。
【０１０６】
細胞は、未分化ES細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼの発現についても試験した。これは、チャンバースライド上で細胞を培養し、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した後にPBSで洗浄することにより行った。次に、細胞をアルカリホスファターゼ基質（Vector Laboratories Inc.、カリフォルニア州バーリンゲーム）と室温暗所で1時間インキュベートした。封入前に、スライドを100%エタノール中で2〜5分間すすいだ。
【０１０７】
図1は、組織化学法で検出したhES細胞上のマーカーの発現を示す。SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、およびアルカリホスファターゼは、フィーダー上の細胞で見られるようにhESコロニーによって発現されていたが、コロニー間の分化細胞では発現されていなかった。
【０１０８】
hES細胞マーカーの発現は、逆転写PCR増幅法によってアッセイした。個々の遺伝子産物の放射性相対定量化には、クァンタムRNA（QuantumRNA)（商標）オルタネート 18S内部標準プライマー（Alternate 18S Internal Standard primer）（Ambion、テキサス州オースティン）を製造業者の説明に従って使用した。簡潔に説明すると、特定のプライマー対の増幅が比例する範囲を決定し、適切なオルタネート18sプライマー：競合物混合物と同時に増幅し、同時に比例範囲を有するPCR産物を生じた。アンプリタック（AmpliTaq)（商標）（Roche）をPCR反応液に添加する前に、製造業者の説明に従いこの酵素をタックスタート（TaqStart)（商標）抗体（Promega）と予めインキュベートした。 放射性PCR反応液は5%非変性ポリアクリルアミドゲルで解析し、乾燥させ、ホスフォイメージスクリーン（Molecular Dynamics）に1時間露光した。モレキュラーストーム860（Molecular Dynamics Storm 860）でスクリーンをスキャンし、イメージクァント（Image Quant）（商標）ソフトウェアでバンド強度を定量した。結果は、18sのバンドに取り込まれた放射能で標準化した、hTERTまたはOct-4バンドに取り込まれた放射能の比で表す。本実験に使用したプライマーの配列は、国際公開公報第01/51616号に見出し得る。
【０１０９】
転写因子Oct-4は通常は未分化hES細胞で発現され、分化に伴い下方制御される。馴化培地中マトリゲル（登録商標）上で21日間維持した細胞は、hTERTおよびOct-4を発現した。テロメラーゼ活性は、TRAPアッセイ法（Kim ら、Science 266:2011、1997；Weinrichら、Nature Genetics 17:498、1997）により測定した。フィーダーを含まない培養環境で維持した細胞は、40日間を超えて培養した後も、陽性テロメラーゼ活性を示した。
【０１１０】
フィーダーなしで培養した未分化細胞の多能性は、懸濁培養液中で4日間胚様体を形成させた後、ポリオルニチンコーティングしたプレートで7日間培養することにより判断した。免疫細胞化学法により、染色パターンが神経細胞および心筋細胞の系譜の細胞と一致し、細胞が内胚葉系譜のマーカーであるα-フェトプロテインについて染色されたことが示された。未分化細胞は、SCIDマウスへの筋肉内投与により奇形腫を形成する能力についても調べた。生じた腫瘍は、78〜84日後に切除した。組織学的解析により、全3胚葉由来の細胞種が同定された。
【０１１１】
実施例2：分化細胞株の樹立
胚様体は以下のようにして産生させた。hES細胞のコンフルエントな単層培養物を1 mg/mLコラゲナーゼ中で5〜20分間インキュベートし、細胞をプレートからこすって剥がして回収した。次に細胞を塊に解離し、1%非必須アミノ酸、1 mMグルタミン、0.1 mMβ-メルカプトエタノールを添加した80% KO（「ノックアウト」）DMEM（Gibco）および20% 非加熱不活性化FBS（Hyclone）からなる培地で非付着細胞培養プレート（Costar）にプレーティングした。細胞は、ウェル（6ウェルプレート）当たり培地2 mL中に1:1または1:2の比率で播種した。EBには、1日おきにウェル当たり培地2 mLを添加した。培地の体積が4 mL／ウェルを超えた場合には、EBを回収し新鮮な培地に再懸濁した。EBを懸濁液で4〜8日間培養した後、基層上にプレーティングした。
【０１１２】
分化細胞株は、胚様体由来細胞を回収し、さらに分化させて樹立した。細胞をPBS中の2 mg/mL II型コラゲナーゼ中で37℃で30分間インキュベートして回収した。細胞を解離して遠心分離し、分化培地に再懸濁して6ウェルプレートにプレーティングした。増殖する細胞をhEF培地（90% DMEM、10%加熱不活性化FBS、0.1 mM非必須アミノ酸、および2mM L-グルタミン）で継代し、2〜3日おきに培地を添加した。2継代後、細胞集団は線維芽細胞の形態学的特徴を有して均一であるように見えた。この細胞株をHEF1と命名した。
【０１１３】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）を発現するように、亜集団に形質導入した。これは、MoLV LTRで制御されるhTERTコード配列およびSV40初期プロモーターで制御されるピューロマイシン耐性遺伝子を含む、レトロウイルス構築物pBABEピューロhTERT（pBABE puro hTERT）を感染させることにより達成した。増殖培地を5 mLのレトロウイルス保存液（1 x 106 pfu/mL）および4μg/mLポリブレンを含む混合液と交換し、37℃でインキュベートした。8時間後、さらに5 mLのレトロウイルス/ポリブレン混合液を添加し、細胞を37℃でインキュベートした。翌日、レトロウイルス/ポリブレン混合液を除去し、新鮮な増殖培地と交換した。その翌日、培地を0.5マイクログラム/mLピューロマイシンを添加した増殖培地と交換した。1週間に約1度の間隔で8週間、ピューロマイシン含有培地で細胞を1:4の比率で分割し、テロメラーゼ活性を調べた。
【０１１４】
図2（パネルA）は、テロメル化したHEF1細胞株の形態を示す。パネルB（下）は、TRAPアッセイ法で測定したテロメラーゼ活性を示す。hTERT発現カセットを形質導入した細胞は、形質導入から20日後および65日後、陽性テロメラーゼ活性を示した。非形質導入細胞株またはベクター対照を形質導入した細胞は、テロメラーゼ活性を示さなかった。hTERT形質導入HEF1細胞とベクター対照を形質導入した細胞のどちらも2日ごとに約1回倍加したが、38日目で対照細胞は分裂が停止した。hTERTトランスフェクション細胞は、60日目（30倍加）を超えても一貫した増殖速度で増殖を続けた。
【０１１５】
ES細胞増殖培地は、実施例8のように6000ラドで照射し、約4.1〜5.5 x 104細胞cm-2で播種したHEF1細胞を用いて馴化した。マトリゲル（登録商標）基層上で培養するH9 hES細胞株の増殖を支持する能力について、この培地を試験した。hES細胞は、このHEF1馴化培地を用いて、未分化ES細胞の形態を示しつつ、かつhTERTおよびOct-4の発現を維持しつつ4継代を超えて維持された。
【０１１６】
実施例3：骨芽細胞様細胞へのさらなる分化
ヒトES細胞（H1細胞株、継代30）を、先に記載したようにフィーダーを含まない条件で維持した。本実験で使用するため、hES細胞をmEF馴化培地でマトリゲル（登録商標）上に約1 x 105 cm-2の密度で播種した。テロメル化HEF1細胞は、DMEM中の10% FBS、1%非必須アミノ酸、および2 mM L-グルタミンにより3.1 x 103 cm-2でプレーティングした。正常ヒト間葉性肝細胞（hMSC）は、BioWhittaker Inc.、メリーランド州（Cambrex Co.の子会社）から入手した。この細胞は、MSC増殖培地（BioWhittaker Inc.品番PT-3001）中で製造業者の説明に従って維持した。BJ5ta線維芽細胞細胞株（Bodnerら、Science 279:349、1998）は、1:3 M199/DMEM中の10% FBSで作製した標準培地で維持した。
【０１１７】
最終継代から2日後、それぞれの培地を骨芽細胞誘導培地（OIM）と交換し、分化を誘導した。OIMは、0.1μMデキサメタゾン、5μMアスコルビン酸-2-リン酸、10 mMβ-グリセロリン酸、および100 ng/mL BMP-4を添加したMSC増殖培地（ClonTechカタログ番号PT-3238）に基づく。2〜3日ごとに新鮮なOIMを細胞に添加した。
【０１１８】
OIMで11日間培養した後、すべての細胞が細胞形態に変化を示した。HEF1細胞、hMSC、およびBJ細胞は紡錘形から立方形に変化し、ある細胞はより平たくなった。hES細胞は、分化した集団が混合して見える異種性形態を示した。
【０１１９】
細胞をPBS中の2%パラホルムアミドで20分間固定してPBSで洗浄し、骨芽細胞マーカーについて解析した。アルカリホスファターゼ（AP）は、ベクター（Vector）基質（Vector Laboratries, Inc.、カリフォルニア州バーリンゲーム）で検出した。APの発現は、分化したH1細胞、ならびにHEF1、BJ、およびhMSC細胞の塊に明らかに局在していた。
【０１２０】
骨芽細胞から産生される基質タンパク質、コラーゲン-1およびオステオカルシンは、免疫染色により検出した。培養物を100% EtOHで2分間処理することにより、透過処理した。PBSで洗浄した後、培養物をPBS中の5%標準ヤギ血清と2時間インキュベートし、コラーゲン-1（1:10、Monosanカタログ番号P5041）またはオステオカルシン（1:50、Biomedical Technologies Inc.カタログ番号13T593）に対する一次ウサギ抗体とインキュベートした。染色は、FITC標識二次ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（1:100、Sothern Biotechnology Associates inc.カタログ番号4050-02）で発色させた。
【０１２１】
図3に結果を示す。パネルAおよびBは、マーカー、オステオカルシンおよびコラーゲン-1についての免疫細胞化学法を示す。パネルCは、アルカリホスファターゼ活性の染色を示す。これらの特徴は、骨芽細胞系譜の細胞の特徴である。
【０１２２】
これらのデータは、インビトロで適切な分化手順を施せばhES細胞もHEF1細胞も骨芽細胞を産生する能力を有するという仮説と一致する。
【０１２３】
本開示に記載する本発明のある種の適応は当業者の日常的な最適化の問題であり、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく実施可能であることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】免疫細胞化学法により検出された未分化ヒト胚幹（hES）細胞のマーカー発現を示す顕微鏡写真の複写物である。培養物は、マウス胚フィーダー細胞上で従来法に従って培養するか、または馴化培地中で細胞外基質マトリゲル（登録商標）もしくはラミニンを含むフィーダーを含まない環境下で培養した。フィーダーを含まない培養において増殖したhES細胞は、マウス初期線維芽細胞のフィーダー層上で増殖したhES細胞の表現型マーカーと類似した表現型マーカーを有する。
【図２】hES細胞から分化したHEF1と命名されたヒト細胞株の特性を示す。パネルAは、HEF1細胞株が線維芽細胞の形態学的特徴を有することを示す、位相差顕微鏡写真のコピーである。パネルB（下）は、テロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）のレトロウイルスベクターを形質導入されたHEF1細胞がテロメラーゼ活性を獲得したことを示す、TRAPアッセイ法の結果の複写物である。
【図３】骨芽前駆細胞および骨芽細胞を産生するための分化パラダイムを受けた細胞のマーカー発現を示す顕微鏡写真の複写物である。培地を骨芽細胞誘導培地（OIM）で置換し、その後11日間分化させた。OIMは間葉性幹細胞増殖培地から調製し、0.1μMデキサメタゾン、5μMアスコルビン酸-2-リン酸、10 mMβ-グリセロリン酸、および100 ng/mL BMP-4を添加した。用いた細胞はhES細胞株H1、テロメル化したhES由来の分化細胞株HEF1、ヒト間葉性幹細胞、およびBJ5ta線維芽細胞である。パネルAおよびBは、マーカー、オステオカルシンおよびコラーゲン-1についての免疫細胞化学法を示す。パネルCは、アルカリホスファターゼ活性の染色を示す。これらの特性は骨芽細胞系譜の細胞に特徴的であり、インビトロにおいて適切な分化手順を受けた場合、hES細胞とHEF1細胞の両方ともが骨芽細胞を産生することが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004535808.tif 000034
2004535808.tif 000035
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