(57)【要約】安定化されたヒアルロン酸から形成されるマイクロスフェア組成物が開示されている。ヒアルロン酸の独特な生物学的特性が、組織に接触した場合に非常に不活性な特性をもたらす。ヒアルロン酸のマイクロスフェア製剤は、結果的に流動性、物理的安定性および分解可能性を有するため、医学的に有用である。高密度マイクロスフェア製剤は、物理的安定性および抗線維症生物学的活性をもたらすため、組織内に局在化された塊を形成するために注射した場合に有用であり、特に、特定の外科的再構成に適している。適切なサイズ範囲の低密度マイクロスフェア製剤は、診断化合物および治療化合物を輸送するために血管系中に注射した場合に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化されたヒアルロン酸のマイクロスフェアを含んで成る直接組織に接触して使用するための注射可能な組成物において、組織に注射された場合に、前記マイクロスフェアの集合体に最密充填則が当てはまるように前記マイクロスフェアが実質的に球状でかつ均一であり、それによって相互連結孔を有する移植片を提供することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記マイクロスフェアが、少なくとも１つの中空コアを有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記マイクロスフェアが、スプレイ乾燥で作られることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記マイクロスフェアが、生体材料の非溶媒中に該生体材料溶液を導入することによって該生体材料溶液が凝固されて作られることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記マイクロスフェアが、イオン架橋されていることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記マイクロスフェアが、化学架橋されていることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記マイクロスフェアが、有機溶媒を含む溶媒混合物中で化学架橋されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記架橋されたマイクロスフェアが、１０重量％から１，０００重量％の間の流体吸収量を示すことを特徴とする請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記マイクロスフェアが、架橋剤をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記マイクロスフェアが、水溶性カルボジイミド架橋剤を用いて化学架橋されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記マイクロスフェアが、０．５から１００マイクロメートルの間の平均直径を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記マイクロスフェアが、０．５から２０マイクロメートルの間の平均直径を有することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記相互連結孔が生体内での流体の自由な輸送を可能にすることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
プロテアーゼ阻害剤、抗増殖剤、抗線維症剤、抗炎症剤をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記マイクロスフェアが、治療薬または診断薬をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記マイクロスフェアが、２重量％から５０重量％の間の濃度で液状媒体中に懸濁されていることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記液状媒体が水であることを特徴とする請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記液状媒体が、生理的ｐＨ近くのｐＨに緩衝化されていることを特徴とする請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
前記液状媒体が、非架橋ヒアルロン酸の緩衝化分散液を含むことを特徴とする請求項１６記載の組成物。
【請求項２０】
提供される移植片が抗線維症特性を示すことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
注射針またはカニューレを介して注射可能であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
３０ゲージの注射針またはカニューレを介して注射可能であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
着色色素または蛍光色素をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２４】
安定化されたヒアルロン酸のマイクロスフェアを含んで成る薬剤輸送に用いるための注射可能な組成物において、血管系に投与された後、前記マイクロスフェアが血中で水和された状態において実質的に球状でかつ直径が７マイクロメートル未満であり、それによって自由に循環するマイクロスフェアの集合体を提供し、前記マイクロスフェアが治療薬または診断薬をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項２５】
前記マイクロスフェアが、３０分間以上自由に循環することを特徴とする請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
ヒアルロン酸の分散液またはコロイド溶液をスプレイして、所望のサイズのマイクロスフェアを物理的に形成することを特徴とするヒアルロン酸マイクロスフェアを調製する方法。
【請求項２７】
膜形成能を高めるために、粒子スプレイに先立って、溶液中においてヒアルロン酸を化学架橋することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
水に混和性の有機溶媒を含む溶媒混合物中において凝集状態に調製した後、マイクロスフェアを架橋する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
請求項１記載の組成物の局所注射を用いた組織の外科処置のための装置。
【請求項３０】
前記組成物を組織の局所領域に注射するための手段を含むことを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３１】
眼のシュレム管への前記組成物の注射のために形成されたマイクロカニューレを含むことを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３２】
安定化されたヒアルロン酸と治療薬または診断薬とを含むマイクロスフェアを含んで成り、前記マイクロスフェアが組織と直接接触した場合に抗線維症活性を示すことを特徴とする、薬剤輸送における使用のための注射可能なマイクロスフェア組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組織の局所治療のための注射可能な生体材料に関する。
【０００２】
発明の背景
組織空間を確保するための外科的な補助材として働かせるため、または組織を付着させるため、または局所において組織の嵩を大きくするために、種々の生体適合材料すなわち生体材料が医療用移植片として使われてきた。初期の例として、顎や鼻の軟組織の永続的な再建のために使われるシリコンゴム材料の使用が挙げられる。その後の生分解性生体材料の開発により、再構成された牛コラーゲンのような材料や、例えば、ポリ酪酸、ポリグリコール酸、およびそれらの共重合体のような加水分解によって分解可能な合成高分子の使用が可能になった。そのような分解可能な生体材料は、新しい組織で空間が埋められる間に身体が徐々に移植片を吸収するのを可能とする。そのような生体材料の適用として、人工皮膚として用いられる多孔質コラーゲン移植片や骨の固定に使われるポリ酪酸移植片などが挙げられる
注射可能でかつ分解可能な生体材料は、低侵襲手術手段で組織領域に接近できる点で外科的に特に有用である。その例として、失禁治療において尿道括約筋の周囲の組織に注射される、または美容目的で軟組織の増大を目的に使われる、コラーゲン繊維の分散液（Ｚｙｄｅｒｍ， Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の使用が挙げられる。米国特許第５，８２４，３３３号明細書に記載の液体共重合体、および米国特許第５，６３３，００１号明細書に記載のデキストラン微粒子等の、種々の組成物からの同様の注射可能な材料が記載されている。
【０００３】
生体材料の外科的適用に関するほとんどの先行技術は、結果として、線維状組織の形成、および続いて、生体材料で占有されていた領域への組織内方生長をもたらした。特定の外科的適用において、空間を確保するために局所的に材料を適用する一方で組織内方成長を防止することも望まれている。例えば、神経、眼および腹部臓器の外科的修復において、結果として生じる線維症が、外科的修復の効果を複雑にしまたは無効にする。こうした外科的処置の場合に、移植片を形成するために組織に適用され、一方で、組織内方生長または線維芽細胞や線維状組織の増殖を防止できるような注射可能な生体材料を有することは望ましいことである。
【０００４】
特定の適用は、ビスコカナルオストミー （ｖｉｓｃｏｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）として知られている最近開発された眼の外科的治療を用いる。この治療法は、房水の排出を増加させるために、強膜弁（ｆｌａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｌｅｒａ）を外科的に開き、さらに、シュレム管に達するまで切開することを含んでいる。管を拡張させるために粘弾性物質として知られている高粘性溶液を管の中に注入し、それが線維柱帯網を開いて管状腺空間からの房水の流れを増加させ、さらに眼内圧を下げるように働く。粘弾性物質はまた線維症阻害剤（ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としても働き、流体の流れを妨げて処置の効果を無効にするであろう治癒反応による線維芽細胞の流入を減少させる。
【０００５】
眼科の処置に使われる粘弾性材料の主なものは、眼や関節の滑液のようないくつかのヒト組織中に見出されるグリコサミノグリカン成分である高分子量のヒアルロン酸（ＨＡ）あるいはヒアルロン酸ナトリウムを含む高粘性の液体である。高分子量のＨＡ溶液の極端に高い粘度のために、こうした処置で用いられる製剤は溶液中におよそ０．５−１％のヒアルロン酸を含んでいる。ＨＡやその誘導体は、白内障除去の間における眼の超音波水晶体吸引術用の溶液として長年眼科で適用されてきた。現用の粘弾性材料は、シュレム管やその他の組織の拡張には適しているが、外科的修復の長期間の維持をもたらすような生体内での滞留時間および流体輸送特性を持たない。シュレム管のような組織空間を外科的に治療する場合には、流体の流れのための外科的空間を拡張および維持できるバルキング特性（ｂｕｌｋｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）を有し、長期分解特性を有し、さらに創傷治癒の過程に伴う線維症を防止できるような、注射可能な材料を持つことが望ましい。
【０００６】
本発明はそのような目的のために、組織に適用できる、生体適合性でかつ注射可能なマイクロスフェア組成物および製剤を提供する。
【０００７】
従来技術
米国特許第５，９８５，３５４号明細書　Ｎｏｖ １６， １９９９ Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ， ｅｔ ａｌ．
親水性高分子からの多層高分子マイクロカプセルの調製
米国特許第５，９２２，３５７号明細書　Ｊｕｌ １３， １９９９ Ｃｏｏｍｂｅｓ， ｅｔ ａｌ．
高分子マイクロスフェアとその製造法
国際公開第９９／１１１９６号パンフレット　Ｍａｒ １１， １９９９ Ｃｏｎｓｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．
注射可能な組織再構成用材料
欧州特許出願公開第０２６５１１６号明細書　Ｎｏｖ ３， １９９８ Ｄｅｌｌａ Ｖａｌｌｅ， ｅｔ ａｌ．
ヒアルロン酸の架橋エステル
米国特許第５，８２４，３３３号明細書　Ｏｃｔ ２０， １９９８ Ｓｃｏｐｅｌｉａｎｏｓ， ｅｔ ａｌ．
軟組織修復および増大のための注射可能な液体共重合体
米国特許第５，６３３，００１号明細書　Ｍａｙ ２７， １９９７ Ａｅｇｅｒｕｐ
組織の増大のための組成物および方法
米国特許第５，１４３，７２４号明細書　Ｓｅｐｔ １， １９９２ Ｌｅｓｈｃｈｉｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．
生体適合性の粘弾性ゲルスラーリー、その製法と使用
国際公開第９０／０９４０１号パンフレット　Ａｕｇ ２３， １９９０ Ｍａｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．
架橋ヒアルロン酸塩ゲル、その使用と製法
米国特許第４，５８２，６４０号明細書　Ａｐｒ １５， １９８６ Ｓｍｅｓｔａｄ， ｅｔ ａｌ．
注射可能な架橋コラーゲン移植片材料
国際公開第８６／０００７９号パンフレット　Ｊａｎ ３， １９８６ Ｍａｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．
硝子体液代替物としての使用のための架橋アルロン酸ゲル
Ｏｂａｔｂａｕｍ， Ｓ．， Ｍ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， 最先端の緑内障手術：ビスコカナルオストミー（ｖｉｓｃｏｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）が道を照らすだろうか、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ． １９９９．
Ｗｅｌｓｈ， Ｎ．Ｈ．， ＦＲＣＳ ｅｔ ａｌ．， 開放隅角緑内障の患者における、コラーゲン排水デバイス設置によるシュレム管の“切開”， Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｌａｓｅｒｓ， Ｍａｒｃｈ １９９８， Ｖｏｌ．２９， Ｎｏ．３， ｐｐ２１６−２２６．
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発明の目的
本発明の目的は、手術、特に眼科における手術に使うための生体材料組成物を提供することである。この生体材料は、注射可能なマイクロスフェア製剤を含んでおり、そのマイクロスフェアは、生体適合性でかつ生分解性があり、高い固体濃度で投与可能である。その材料は、組織を拡張させることができ、ｉｎ ｓｉｔｕで移植片を形成でき、さらに、結果として生じる粒子マトリックスを介して流体を流通させることができる。さらには、線維形成の治癒反応を最小にするために、組織反応を実質的に減少させるようなマイクロスフェア製剤を提供することも本発明の目的である。
【０００８】
本発明の安定化されたマイクロスフェア組成物は本質的生体適合性を有するため、局所投与または非経口投与用に製剤化された治療または診断化合物のカプセル化または共製剤化（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）にも適用可能である。
【０００９】
発明の概要
本発明は、外科的目的のために組織と直接接触させるような用途に用いられる新規なマイクロスフェア組成物に関する。特に、線維症反応（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こさないで組織を処置するための組成物およびその使用を開示する。さらに、マイクロスフェア製剤の持つ本質的な組織生体適合性によって、局在的な薬剤輸送やその他の医療用途においてもそのような材料を適用できる。
【００１０】
本発明の方法に基づいて、流動性がありかつ生分解性である生体適合性マイクロスフェア製剤を含む組成物が提供される。その製剤は手術部位に投与され、組織空間の拡張または維持をもたらし、微粒子マトリックスを介した流体の流れを可能にし、さらに、線維症組織の沈積を防止する。その製剤は、緑内障の治療のための眼の中のシュレム管の拡張、細い血管の血管形成術、および神経の再構成の補助材としてのような、外科的適用のために注射によって投与される。
【００１１】
発明の説明
本発明は、組織空間を確保するためまたは必要量の薬剤または活性物質を輸送するために十分な量の生体材料を投与することによって手術で使うための流動性生体材料および方法を提供する。詳細には、生体材料のマイクロスフェア組成物は、シュレム管または眼の中の他の解剖学的部位に注射され、組織拡張をもたらし、さらに、組織空間を閉じるような線維症反応を引き起こすことなく眼の前房からの房水の流出の増加を維持するように設計される。
【００１２】
本発明の生体材料は、実質的に球形、すなわちマイクロスフェアに形成され、生理学的適合性の担体溶液中に適当に混合されている微小粒子を含んでいる。シュレム管に注入するのに必要な針の穴径は非常に小さく、およそ３０ゲージまたはそれ以下であるため、生体材料の流動特性が重要である。高い固体濃度での注射可能性を最大にするために、密度の高いマイクロスフェアの方が不規則な形状の粒子または繊維状微小粒子よりも好ましい。マイクロスフェアは、種々の生分解性高分子、好ましくはヒアルロン酸ナトリウムまたはヒアルロン酸から形成される。生体内での生分解時間を増加させるためにマイクロスフェアを架橋させる。本発明のマイクロスフェアは直径が０．０１から１００マイクロメートルの範囲にあり、望ましくは、１から２０マイクロメートルの範囲である。マイクロスフェアは、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または注射用滅菌水（ＷＦＩ）のような生理学的担体溶液中に分散される。製剤中のマイクロスフェアの濃度は、１重量％から５０重量％の範囲で、望ましくは２重量％より高い濃度である。
【００１３】
マイクロスフェアは、標準のスプレイ乾燥手法で、あるいはスプレイ凝固手法で作られる。スプレイ乾燥手法を用いて、小さいオリフィスノズルから気流（通常空気または窒素）中に噴霧形状で高分子の水性分散液またはコロイド溶液を注入する。液滴が気流中に落ちると、それらは凝縮し、乾燥して実質的に球形の生体材料の粒子になる。その粒子はサイクロン機構を用いて集められさらに処理される。スプレイ凝固手法では、高分子の分散液またはコロイド溶液は、小さいオリフィスノズルから、高分子の非溶媒である溶液が入った容器中に、噴霧形状で注入される。例として、イソプロピルアルコールまたはエチルアルコールが挙げられる。液滴は凝集し、水性成分の溶媒交換により乾燥される。この方法で密度の高いマイクロスフェアを製造するには、適当な凝集および溶媒条件を選ぶことが重要である。
【００１４】
マイクロスフェアは、非溶解性にするためおよび生体内での分解時間を増加させるために安定化される。マイクロスフェアは、イオン錯化および化学架橋を含む様々な方法で安定化される。マイクロスフェアは、例えば、カルボジイミド架橋剤を用いる等、様々な化学反応によって架橋できる。架橋を助ける物質もマイクロスフェア中に共に製剤化して差し支えない。出発物質のヒアルロン酸は、粒子形成を助けるために部分的に架橋されていて差し支えない。調製した後、水和していないまたは部分的に水和した状態でマイクロスフェアを化学架橋する方法は、マイクロスフェアの密度を増加させるように働く。架橋マイクロスフェアは、残存の架橋剤を除くために洗浄および乾燥される。次に、所望のサイズ範囲の集合体になるように、標準的な篩または濾過技術を用いて乾燥マイクロスフェアをサイズ分けする。
【００１５】
本発明に従って調製されたマイクロスフェアは、手術部位に投与するために、例えばリン酸緩衝生理食塩水、生理学的適合界面活性剤溶液、またはヒアルロン酸の希薄な緩衝溶液のような、生理学的担体中に懸濁される。生体内で適当な分解時間を持つようにマイクロスフェアはサイズ選択および安定化され、種々の医療適用のために製剤化され得ることが理解できるであろう。眼の中のシュレム管やその他の組織の治療のための外科的使用の実施において、非常に細いゲージの針やカニューレを用いて空間を見つけて接近し、続いて架橋マイクロスフェアのスラリーを注入する。スラリーは半固体性を有するため、シュレム管の直径を大きくするのに十分な拡張力をもたらす。スラリーは固体濃度が高いため、流体がマイクロスフェアマトリックスを通ってシュレム管の流出チャネルまで容易に流れることができるように、マイクロスフェアの最密充填を可能にする。
【００１６】
眼のシュレム管の治療のような、いくつかの症例では、粒子に付着した着色マーカーがあることは有利である。イオン結合または共有結合した発色団または蛍光団を持つように、本発明のマイクロスフェアまたは代わりに担体液を化学的に処理することができる。生物学的接合分野（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｉｅｌｄ）で用いられる例として、ヒアルロン酸の反応基と反応して蛍光標識マイクロスフェアを作成するフルオレセインイソチオシアネートがある。
【００１７】
空間の確保および抗線維症特性が非常に重要であるその他の外科的適用において、眼のシュレム管の治療に関して記載された製剤を用いることができる。例えば、圧力によって誘発される合併症を減らすため、または外科的修復を促進させるために、マイクロスフェア組成物を神経の周辺領域に適用して差し支えない。さらに同様に、生殖器、循環器、または消化器の外科的治療において、創傷治癒過程で結果として生じる線維症が外科的修復の効果を無効にするような状況で、マイクロスフェアの組成物を適用することができる。他の手法の場合には、製剤において述べたように、粒子のエアロゾルスプレイによって乾燥マイクロスフェアが湿った手術部位に直接投与される。マイクロスフェアはその部位の血清や血液で水和するであろう。
【００１８】
マイクロスフェア組成物は、注射針、カニューレ、およびカテーテルのような種々の外科的装置によって投与される。マイクロスフェアのサイズ、膨潤性および濃度の制御によって、特定の適用に適するように組成物の流動性を調整する。可溶性ヒアルロン酸、水溶性高分子、および界面活性剤のような流動促進剤（ｆｌｏｗ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を組成物の中に加えても良い。
【００１９】
薬剤の局所投与の目的で、薬剤または他の活性物質を、マイクロスフェア組成物中にカプセル化し、抱合させ、または共に製剤化しても差し支えない。抗炎症活性、抗増殖活性、抗線維活性等をもたらすことによって外科的適用を助けるような薬剤を選択して差し支えない。
【００２０】
外科的適用に加えて、本発明のマイクロスフェア組成物は、高い組織および血液適合性を有するため、治療薬または診断薬のための理想的な担体を提供する。線維症反応が最小化されているため、全身治療用の薬剤を局所部位に投薬して、予測可能な薬剤の放出特性をもたらすことができる。また、最終的な大きさがおよそ７マイクロメートルの赤血球よりも小さくなるようなサイズに形成して、毛細血管中にトラップされることを防ぐことによって、非経口投与が可能になるようにマイクロスフェアを調製することができる。生理学的適合溶液中にマイクロスフェアを懸濁させ、血液循環中に注射する。作成されたマイクロスフェアのヒアルロン酸表面が血液適合性を有するため、マイクロスフェアは、肝臓の細網内皮系による循環系からの除去に抵抗を示し、持続的薬剤輸送効果を得ることができる。
【００２１】
実施例
実施例＃１．　スプレイ凝固法によるＨＡマイクロスフェアの調製
スプレイ形成法（ｓｐｒａｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および溶媒乾燥によってヒアルロン酸（ＨＡ）を含むマイクロスフェアを作成した。高純度のＨＡおよび脱イオン水を用いて、濃度０．５％のＨＡの水溶液を作った。５０：５０から８０：２０の間の比率（ＪＰＡ／水溶液）、望ましくは６０％非溶媒の比率で、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を加えることによって、スプレイするのに適当な粘度に溶液の粘度を低下させた。
【００２２】
同軸スプレイヘッドを用いてＨＡ溶液をスプレイすることによって、マイクロスフェアを形成した。スプレイヘッドの内側の穴は溶液を担持し、かつ外側の穴は噴霧化のための気流を提供した。内側の穴の直径は０．２５ｍｍで、外側の穴は１．３７ｍｍであった。回収容器中に下向きにスプレイするようにスプレイヘッドを配置した。回収容器は、ＨＡの非溶媒としてのＩＰＡで、およそ５ｃｍの深さになるように満たされた。噴霧化のために５−１０ ＰＳＩの圧力で空気を供給し、空気圧ポンプまたはシリンジポンプに何れかによって駆動される標準シリンジを介して溶液を輸送した。内側の穴の径、空気の流速、溶液の粘度および溶液の流速によって、マイクロスフェアの直径を制御することができる。内側の穴の径、空気の流速、溶液の粘度を一定に保つことによって、溶液の流速を用いてサイズを制御した。
【００２３】
噴霧器の内側の穴から溶液が放出されると噴霧化され、球形の液滴が空気流によって下向きに運ばれ、回収容器中の溶媒浴に入る。非溶媒であるＩＰＡが粒子から残留している水溶液を取り除き、それによって凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）により粒子を固定する。そのようにして形成された粒子は通常、固体のマイクロスフェアである。粒子は、可視顕微鏡で測定して５−４０マクロメートルの範囲の直径を有する実質的に球形の形状であった。
【００２４】
凝固浴の溶液を最初に４５マイクロメートルのメッシュで濾過して、大きすぎるマイクロスフェアを除いた。その溶液をさらに濾過して、所望のサイズの画分を回収した。その後、マイクロスフェアを回収するため、溶液の最終濾液を１．２マイクロメートルの濾紙を通して濾過した。回収濾紙からマイクロスフェアを洗って取り除き、容器中に回収した。９０％のＩＰＡと１０％の１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）水溶液との溶液中で、２４時間マイクロスフェアを化学架橋し、ＩＰＡで洗浄し、さらに溶媒乾燥によって乾燥した。
【００２５】
実施例＃２−超音波スプレイ凝固法によるＨＡマイクロスフェアの調製
超音波スプレイおよび溶媒凝固法を用いて、ＨＡマイクロスフェアを作成した。非溶媒としてのＩＰＡが入った回収容器に向けられた、Ｌｅｃｈｌｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＵＳ−１（Ｌｅｈｌｅｒ ＡＧ， １００ｋＨｚ ａｔ 最大 ８ ワット）超音波スプレイヘッドを用いた。より小さなマイクロスフェアを作るために、穴径が０．３ｍｍになるように超音波スプレイヘッドを改良した。スプレイヘッドの動作部分は、スプレイ溶液を放出するための中央の穴を備えたチタニウム円盤で構成されている。ハウジングと円盤との間の環状の間隙は、空気流れがスプレイを導き、粒子を所望の方向に運ぶことを可能にする。様々なレベルのパワーが出せるＲＦアンプシステムでスプレイヘッドを作動させた。
【００２６】
濃度０．５％のＨＡ水溶液を同量のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）と混ぜ合わせ、完全に混合させた。スプレイに適するようにＩＰＡを加えて溶液の粘度を下げた。濃度５０ミリモル（ｍＭ）の水相中においてＥＤＣで２４時間溶液を処理した。ＨＡ溶液のＥＤＣ処理によって架橋が形成され、それによってＨＡの分子量が大きくなり、膜形成能（ｆｉｌｍ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）が強められた。
【００２７】
シリンジポンプを用いてスプレイヘッドを通してＨＡ溶液を注入することによって、マイクロスフェアを形成した。回収容器中に下向きにスプレイするようにスプレイヘッドを配置した。回収容器は、ＨＡの非溶媒としてのＩＰＡで、およそ５ｃｍの深さになるように満たされた。スプレイを下方に導くために空気を５−１５ ＰＳＩの圧力で供給した。超音波変換機と空気流はＨＡ溶液を流す前に作動させた。０．１から２．０ｃｃ／ｍｍの流速を用いた。最も均一でかつ小さな粒子サイズを提供するように、コントロラーを介して超音波の出力レベルを調節した。
【００２８】
噴霧された溶液が球形の液滴を作ると、それら液滴は空気流で下方に運ばれて回収容器の中の溶媒浴に入った。非溶媒のＩＰＡが粒子から残存している水溶液を除き、それによって凝固させて粒子を固定した。そのように作成された粒子は通常、内部が液体で満たされた薄い壁のマイクロスフェアである。粒子は、可視顕微鏡で測定して１−１０マクロメートルの範囲の直径を有する実質的に球形の形状であった。凝固浴の溶液を最初に２０マイクロメートルのメッシュで濾過して、大きすぎるマイクロスフェアを除いた。その後、マイクロスフェアを回収するため、溶液の最終濾液を１．２マイクロメートルの濾紙を通して濾過した。
【００２９】
実施例＃３−マイクロスフェアの調製後の架橋
実施例１または２の方法で調製されたマイクロスフェアを集め、ＩＰＡ中に保持した。次に、マイクロスフェアを架橋してそれらを安定化させた。１００ｍＭのＥＤＣ溶液を作った。９０％ＩＰＡと１０％ＥＤＣとの溶液の最終比率になるように、そのＥＤＣ溶液をマイクロスフェアに加えた。マイクロスフェアを２０℃で２４時間および４８時間架橋した。
【００３０】
架橋マイクロスフェアを回収し、残っている架橋剤を除くためにＩＰＡで３回洗浄した。得られたマイクロスフェアをガラススライド上に置き顕微鏡下で検査した。その工程の間、マイクロスフェアはその形状およびサイズを保っていた。スライド上の溶液が乾燥すると、水滴をスライドに加えて粒子を調べた。数分間に亘り、粒子はほとんど変化を示さなかった。別の試料スライドを調製し、１００ｍＭの塩酸（ＨＣｌ）の液滴をそのスライドに加えてその結果を観察した。マイクロスフェアは、壁が透明に変化することによって水和の証拠を示し、さらにほぼ１０−３０％において直径の膨潤を示した。対照的に、架橋工程で処理していないマイクロスフェアは、酸性溶液中で急速に膨潤しかつ溶解し始めた。それによって、架橋工程が高密度のマイクロスフェアを作るのに成功していることが示唆された。
【００３１】
実施例＃４−ＨＡのマイクロスフェアの注射可能な製剤
実施例＃２および＃３に従ってマイクロスフェアを作成した。連続濾過を用いて１０から４０マイクロメートルの間でマイクロスフェアを分画した。架橋マイクロスフェアを繰り返しＩＰＡで洗浄して、残存する全ての水性成分を除いた。１．２マイクロメートルの濾紙を通して濾過することによって、マイクロスフェア回収した。乾燥剤の層の上で、１５０−１７０℃の低温オーブンで濾紙を乾燥した。
【００３２】
乾燥後、マイクロスフェアを回収し、バイアル中に量り取った。ＤＩ水をマイクロスフェアに加えて混合し、固体濃度が２．６％のマイクロスフェアの懸濁液を得た。溶液は粘稠であるが、そのような高濃度でも混合可能である。内径が１５０マイクロメートルのマイクロ針を通して、困難なく懸濁液を押し出した。
【００３３】
実施例＃５−ＨＡマイクロカプセルの注射可能な製剤
実施例＃２および＃３に従ってマイクロスフェアを作成した。架橋後、濾過回収によってマイクロスフェアを濃縮した。生理学的な条件を代表する水和状態において全ての粒子の直径が４マイクロメートル未満になるようにサイズ分画した。
【００３４】
保存のために粒子を乾燥して差し支えない。マイクロスフェアを含有する高濃度ＩＰＡ溶液を−２０℃まで冷却し、臨界点乾燥を行った。得られた固形物は中空マイクロスフェアを含む。注射可能な製剤を形成するため、マイクロスフェアをリン酸緩衝生理食塩水溶液中に再懸濁させた。
【００３５】
実施例＃６−マイクロスフェアを介する流体の流れ
実施例＃１に記載の方法に従って、１％のＨＡ溶液のスプレイ凝固によってマイクロスフェアを調製した。９５：５の溶媒／水溶液比で、５０ｍＭのＥＤＣを用いて１１８時間マイクロスフェアを架橋した。マイクロスフェアを洗浄し、濾過して２０‐４５マイクロメートルのサイズ画分を得て、その後乾燥した。
【００３６】
脱イオン水中において１２．５％の固体濃度のマイクロスフェア溶液を製剤化した。マイクロスフェアをよく混合し完全に水和させた。水和後、約３ｍｍの厚さの固形物を作るように、直径約４ｍｍのルアー管（Ｌｕｅｒ ｔｕｂｅ）アダプターの末端にマイクロスフェアの一部を詰めた。１０マイクロメートルの細孔を有するナイロンメッシュを切り、管アダプターの末端上に張った。粒子マトリックスが押し出されないように、外周をシリコーンＯ−リングできちんと押さえた。垂直位にリング状スタンドクランプによって保持されている６０ｃｃのシリンジ外筒に管アダプターを取り付けた。気泡が入らないように注意してまず管アダプターをＤＩ水で満たし、シリンジを６０ｃｃの印までＤＩ水で満たした。液体を重力と大気圧だけで流した。
【００３７】
約５分以内に水分がナイロンのメッシュを通ってしみていくのが見えた。６０分以内に全ての水滴がメッシュ上に蓄積した。この時点での流れは少量のままであったが規則的に続いた。
【００３８】
実験の結果、架橋されたＨＡマイクロスフェアが最密充填されたマトリックスは、最小圧力で液体を流すことができることがわかった。粒子間の間隙中および水和粒子を介する流体の輸送は、マトリックスを介した流体の安定した流れを形成した。
【００３９】
実施例＃７−ＨＡマイクロスフェアの外科的使用
実施例＃４に従ってマイクロスフェア製剤を作り、１ｍｌの注射器に装填した。２０ゲージの注射針を用いて筋肉組織のｅｘｏ ｖｉｖｏ試料中に注射し、注射部位の周辺に局所的な組織の拡張および膨張を生じさせた。切開と顕微鏡によって注射部位を精査すると、マイクロスフェアの集合体が注射部位に密着した塊の移植片を形成しているのがわかった。
【００４０】
実施例＃８−ＨＡマイクロスフェアの薬剤輸送リザーバとしての使用
実施例＃４に従ってマイクロスフェア製剤を作り、１ｍｌの注射器に装填した。注射針を用いて、マイクロスフェア製剤中に組み込まれた薬剤の徐放性を可能にする移植片の塊を作るために哺乳動物の軟結合組織にその製剤を注射した。
【００４１】
実施例＃９−ＨＡマイクロスフェアの非経口的使用
得られるマイクロスフェアの濃度が約１％となるように、実施例＃５に従ってマイクロスフェア製剤を作った。注射可能な製剤を試験動物に静脈注射した。その結果、血流中を循環するマイクロスフェアの濃度は時間依存性を示し、生理学的な副作用はなかった。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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