(57)【要約】本発明は、１以上の適応突然変異を含有する核酸、およびＨＣＶレプリコン増強細胞に関する。適応突然変異は、ＨＣＶレプリコン活性を増強する突然変異である。ＨＣＶレプリコン増強細胞は、ＨＣＶレプリコンを維持する増強された能力を有する細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１以上のＮＳ３突然変異をコードする改変されたＨＣＶ  ＮＳ３コード領域（ここで、配列番号１のアミノ酸配列の番号付けに基づき示される該ＮＳ３突然変異の少なくとも１つは、
Ａｌａであるアミノ酸１０９５、
Ｇｌｙであるアミノ酸１２０２、および
Ｔｈｒであるアミノ酸１３４７よりなる群から選ばれる）、
ｂ）１以上のＮＳ５Ａ突然変異をコードする改変されたＨＣＶ  ＮＳ５Ａコード領域（ここで、配列番号１のアミノ酸配列の番号付けに基づき示される該ＮＳ５Ａ突然変異の少なくとも１つは、
Ｔｈｒであるアミノ酸２０４１、
残基２０３９と２０４０との間のＬｙｓの挿入、
Ｐｈｅであるアミノ酸２１７３、
Ｐｈｅであるアミノ酸２１９７、
Ｓｅｒであるアミノ酸２１９８、
Ｔｈｒであるアミノ酸２１９９、および
Ａｒｇであるアミノ酸２２０４よりなる群から選ばれる）、および
ｃ）１以上の脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム進入シグナル（ＩＲＥＳ）突然変異を含有する改変されたＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ領域（ここで、配列番号３のヌクレオチドの番号付けに基づき示される該ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ突然変異の少なくとも１つは、ヌクレオチド１７３６におけるアデニンの挿入である）
よりなる群から選ばれる領域を含んでなる核酸分子。
【請求項２】
該核酸分子が該ＮＳ５Ａコード領域を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
該ＮＳ５Ａ適応突然変異の少なくとも２つが存在する、請求項２記載の核酸分子。
【請求項４】
ＨＣＶ  ＮＳ３領域（該ＮＳ３領域は、前記の改変されたＮＳ３領域と同じ又は異なりうる）をコードする領域を更に含む、請求項２記載の核酸分子。
【請求項５】
該核酸分子が、ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ−ＰＣ領域、該ＮＳ３コード領域、ＨＣＶ  ＮＳ４Ａコード領域、ＨＣＶ  ＮＳ４Ｂコード領域、該ＮＳ５Ａコード領域、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂコード領域およびＨＣＶ  ３’ＵＴＲを含むＨＣＶレプリコンである、請求項４記載の核酸分子。
【請求項６】
該ＨＣＶレプリコンが、レポータータンパク質をコードする配列を更に含む、請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】
該ＨＣＶレプリコンが、選択タンパク質をコードする配列を更に含む、請求項５記載の核酸分子。
【請求項８】
該ＨＣＶレプリコンが、ＨＣＶコアコード領域、ＨＣＶ  Ｅ１コード領域、ＨＣＶ  Ｅ２コード領域、ＨＣＶ  ｐ７コード領域およびＨＣＶ  ＮＳ２コード領域を更に含む、請求項５記載の核酸分子。
【請求項９】
ａ）１以上のＮＳ３突然変異を含有する改変されたＨＣＶ  ＮＳ３コード領域（ここで、配列番号２のヌクレオチドの番号付けに基づき示される該ＮＳ３突然変異の少なくとも１つは、
シトシンであるヌクレオチド３６２５、
グアニンであるヌクレオチド３９４６、
アデニンであるヌクレオチド４３８０よりなる群から選ばれる）、
ｂ）１以上のＮＳ５Ａ突然変異を含有する改変されたＨＣＶ  ＮＳ５Ａコード領域（ここで、配列番号２のヌクレオチドの番号付けに基づき示される該ＮＳ５Ａ突然変異の少なくとも１つは、
ヌクレオチド６４５８と６４５９との間への３個のアデニン残基の挿入、
シトシンであるヌクレオチド６４６３、
チミンまたはウラシルであるヌクレオチド６８５９、
チミンまたはウラシルであるヌクレオチド６９３１、
シトシンであるヌクレオチド６９３４、
アデニンであるヌクレオチド６９３６、および
アデニンまたはグアニンであるヌクレオチド６９５３よりなる群から選ばれる）、および
ｃ）１以上の脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム進入シグナル（ＩＲＥＳ）突然変異を含有する改変されたＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ領域（ここで、配列番号３のヌクレオチドの番号付けに基づき示される該ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ突然変異の少なくとも１つは、ヌクレオチド１７３６におけるアデニンの挿入である）
よりなる群から選ばれる領域を含んでなる核酸分子。
【請求項１０】
該分子が前記の改変されたＮＳ５Ａコード領域を含み、前記の改変されたＮＳ５Ａ領域のヌクレオチド配列が、
ヌクレオチド６４５８と６４５９との間への３個のアデニン残基の挿入、
シトシンであるヌクレオチド６４６３、
チミンまたはウラシルであるヌクレオチド６８５９、
チミンまたはウラシルであるヌクレオチド６９３１、
シトシンであるヌクレオチド６９３４、
アデニンであるヌクレオチド６９３６および
アデニンまたはグアニンであるヌクレオチド６９５３よりなる群から選ばれる該ＮＳ５Ａ修飾の１以上で修飾された配列番号２の塩基６２５８−７５９８またはそのＲＮＡ形態により与えられる、請求項９記載の核酸分子。
【請求項１１】
該分子が、ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ−ＰＣ領域、修飾されたＨＣＶ  ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域およびＨＣＶ  ３’ＵＴＲを含むＨＣＶレプリコンであり、該修飾ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域が前記の改変されたＮＳ５Ａ領域を含む、請求項１０記載の核酸分子。
【請求項１２】
該５’ＵＴＲ−ＰＣ領域が配列番号２の塩基１−３７７のＲＮＡ形態であり、該３’ＵＴＲが配列番号２の塩基９３７４−９６０５のＲＮＡ形態である、請求項１１記載の核酸分子。
【請求項１３】
該分子が、ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ−ＰＣ領域、修飾されたＨＣＶ  ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域およびＨＣＶ  ３’ＵＴＲを含むＨＣＶレプリコンであり、ここで、該５’ＵＴＲ−ＰＣ領域が配列番号２の塩基１−３７７のＲＮＡ形態であり、該３’ＵＴＲが配列番号２の塩基９３７４−９６０５のＲＮＡ形態であり、該修飾ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域が、
アデニンであるヌクレオチド４３８０、
シトシンであるヌクレオチド３６２５、
グアニンであるヌクレオチド３９４６、
ヌクレオチド６４５８とヌクレオチド６４５９との間への３個のアデニン残基の挿入、
シトシンであるヌクレオチド６４６３、
ウラシルであるヌクレオチド６８５９、
ウラシルであるヌクレオチド６９３１、
シトシンであるヌクレオチド６９３４、
アデニンであるヌクレオチド６９３６および
アデニンまたはグアニンであるヌクレオチド６９５３よりなる群から選ばれる１以上の修飾で修飾された配列番号２の塩基３４２０−９３７１のＲＮＡ形態よりなる、請求項１０記載の核酸分子。
【請求項１４】
該レプリコンが、配列番号２のヌクレオチド３７８−３４１９のＲＮＡ形態を更に含むゲノムレプリコンである、請求項１３記載の核酸分子。
【請求項１５】
ａ）アルギニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３３５−５３３７、
ｂ）フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５２４２−５２４４、
ｃ）フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３１４−５３１６、
ｄ）セリンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３１７−５３１９、
ｅ）ヌクレオチド４８４３の後に挿入されたリシンをコードするヌクレオチド、
ｆ）グリシンをコードするよう修飾されたヌクレオチド２３２９−２３３１、トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド２７６４−２７６６、フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５２４２−５２４４、およびヌクレオチド１７３６の後に挿入された追加的なアデノシン、
ｇ）トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド４８４６−４８４８、およびフェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５２４２−５２４４、
ｈ）トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド４８４６−４８４８、およびフェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３１４−５３１６、
ｉ）トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド４８４６−４８４８、およびセリンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３１７−５３１９、
ｊ）グリシンをコードするよう修飾されたヌクレオチド２３２９−２３３１、およびヌクレオチド４８４３の後に挿入されたリシンをコードするヌクレオチド、
ｋ）フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３１４−５３１６、およびトレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３２０−５３２２、
ｌ）トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド４８４６−４８４８、フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３１４−５３１６、およびトレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３２０−５３２２、
ｍ）トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド４８４６−４８４８、フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３１４−５３１６、およびヌクレオチド１７３６の後に挿入された追加的なアデノシン、
ｎ）フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３１４−５３１６、トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３２０−５３２２、およびヌクレオチド１７３６の後に挿入された追加的なアデノシン、ならびに
ｏ）トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド５３２０−５３２２よりなる群から選ばれる１以上の異なる修飾よりなる配列番号３の塩基１−７９８９の核酸塩基配列またはそのＲＮＡ形態を含んでなる核酸分子。
【請求項１６】
前記の１以上の異なる修飾が、
ａ）Ｃ５３３７Ａ、
ｂ）Ｃ５２４３ＴまたはＵ、
ｃ）Ｃ５３１５ＴまたはＵ、
ｄ）ＴまたはＵ５３１８Ｃ、
ｅ）４８４３の後に挿入されたＡＡＡ、
ｆ）Ａ２３３０Ｇ、Ｇ２７６４Ａ、Ｃ５２４３ＴまたはＵ、および１７３６の後に挿入されたアデノシン、
ｇ）Ａ４８４７ＣおよびＣ５２４３ＴまたはＵ、
ｈ）Ａ４８４７ＣおよびＣ５３１５ＴまたはＵ、
ｉ）Ａ４８４７ＣおよびＴまたはＵ５３１８Ｃ、
ｊ）Ａ２３３０Ｇおよび４８４３の後に挿入されたＡＡＡ、
ｋ）Ｃ５３１５ＴまたはＵおよびＧ５３２０Ａ、
ｌ）Ａ４８４７Ｃ、Ｃ５３１５ＴまたはＵ、およびＧ５３２０Ａ、
ｍ）Ａ４８４７Ｃ、Ｃ５３１５ＴまたはＵ、および１７３６の後に挿入されたアデノシン、
ｎ）Ｃ５３１５ＴまたはＵ、Ｇ５３２０Ａ、および１７３６の後に挿入されたアデノシン、ならびに
ｏ）Ｇ５３２０Ａ
よりなる群から選ばれる、請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
該核酸がＲＮＡであり、該核酸塩基配列を含む、請求項１６記載の核酸。
【請求項１８】
該核酸がＲＮＡであり、該核酸塩基配列よりなる、請求項１７記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項記載の核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターであって、該ヌクレオチド配列が外因性プロモーターに転写的に共役していることを特徴とする前記発現ベクター。
【請求項２０】
請求項５〜８および１１〜１８のいずれか１項記載の核酸を含んでなる組換え細胞ヒト肝細胞癌細胞。
【請求項２１】
該肝細胞癌細胞がＨｕｈ−７細胞である、請求項２０記載の組換え細胞。
【請求項２２】
該細胞がＨｕｈ−７細胞に由来する、請求項２０記載の組換え細胞。
【請求項２３】
請求項５〜８および１１〜１８のいずれか１項記載の核酸をヒト肝細胞癌細胞内に導入する工程を含む製造方法により製造された組換え細胞。
【請求項２４】
ＨＣＶレプリコン増強細胞の製造方法であって、
ａ）細胞内にＨＣＶレプリコンを導入し維持し、
ｂ）該ＨＣＶレプリコンに関して該細胞を矯正して該レプリコン増強細胞を得る工程を含んでなる前記製造方法。
【請求項２５】
該細胞がヒト肝細胞癌細胞である、請求項２４記載の製造方法。
【請求項２６】
該細胞がＨｕｈ−７細胞であるか又はＨｕｈ−７細胞に由来する、請求項２４記載の製造方法。
【請求項２７】
ＨＣＶレプリコンを維持する該レプリコン増強細胞の能力を確認する工程を更に含む、請求項２６記載の製造方法。
【請求項２８】
機能的ＨＣＶレプリコンを含有するＨＣＶレプリコン増強細胞の製造方法であって、
ａ）細胞内に第１  ＨＣＶレプリコンを導入し維持し、
ｂ）該第１レプリコンに関して該細胞を矯正して矯正細胞を得、
ｃ）該矯正細胞内に第２  ＨＣＶレプリコン（該第２  ＨＣＶレプリコンは該第１  ＨＣＶレプリコンと同じ又は異なりうる）を導入し維持する工程を含んでなる前記製造方法。
【請求項２９】
該細胞がヒト肝細胞癌細胞である、請求項２８記載の製造方法。
【請求項３０】
該ヒト肝細胞癌細胞がＨｕｈ−７細胞である、請求項２９記載の製造方法。
【請求項３１】
該ヒト肝細胞癌細胞がＨｕｈ−７細胞に由来する、請求項３０記載の製造方法。
【請求項３２】
請求項２４〜２７のいずれか１項記載の製造方法により製造されたＨＣＶレプリコン増強細胞。
【請求項３３】
請求項２８〜３１のいずれか１項記載の製造方法により製造されたＨＣＶレプリコンを含有するＨＣＶレプリコン増強細胞。
【請求項３４】
化合物がＨＣＶ活性に影響を及ぼす能力の測定方法であって、
ａ）請求項３３記載のＨＣＶレプリコン増強細胞に該化合物を与え、
ｂ）該化合物が１以上のレプリコン活性に影響を及ぼす能力をＨＣＶ活性に対する影響の尺度として測定する工程を含んでなる前記方法。
【請求項３５】
該化合物がリボザイムである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該化合物がアンチセンス核酸である、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
化合物が有機化合物である、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
該工程（ｂ）がＨＣＶタンパク質の産生を測定する、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
該工程（ｂ）がＲＮＡ転写産物の産生を測定する、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願において引用されている参考文献は本発明の先行技術であると認められるものではない。
【０００２】
世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染していると見積もられている（Ｗａｓｌｅｙら，２０００．Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２０，１−１６）。ＨＣＶへの曝露は少数の場合には明らかな急性疾患を引き起こすが、ほとんどの場合には、該ウイルスは、肝炎を引き起こす慢性感染を確立し、肝不全および肝硬変へと徐々に進行させる（Ｉｗａｒｓｏｎ，１９９４．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４，２０１−２０４）。また、疫学的調査は、肝細胞癌の病理発生におけるＨＣＶの重要な役割を示している（Ｋｅｗ，１９９４．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４，２１１−２２０，Ａｌｔｅｒ，１９９５．Ｂｌｏｏｄ  ８５，１６８１−１６９５）。
【背景技術】
【０００３】
ＨＣＶゲノムは、約３０００アミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードする約９．５ｋｂ長の一本鎖ＲＮＡよりなる（Ｃｈｏｏら，１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，３６２−３６４，Ｃｈｏｏら，１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，３５９−３６２，Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，１１０５−１１１３）。該ＨＣＶポリタンパク質は、Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの順序でウイルスタンパク質を含有する。
【０００４】
個々のウイルスタンパク質は該ＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解により産生される。宿主細胞プロテアーゼは、推定構造タンパク質Ｃ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７を遊離させ、アミノ酸８１０におけるＮＳ２のＮ末端を産生する（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，１９９４．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，２７３１−２７３４，Ｈｉｊｉｋａｔａら，１９９３．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９０，１０７７３−１０７７７）。
【０００５】
非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂは恐らくウイルス複製装置を形成し、該ポリタンパク質から遊離される。ＮＳ２とＮＳ３のＮ末端とに会合した亜鉛依存性プロテアーゼがＮＳ２とＮＳ３との間の切断を引き起こす（Ｇｒａｋｏｕｉら，１９９３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，１３８５−１３９５，Ｈｉｊｉｋａｔａら，１９９３．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９０，１０７７３−１０７７７）。ＮＳ３のＮ末端ドメインに位置する特徴的なセリンプロテアーゼが、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ結合部におけるタンパク質分解切断を引き起こす（Ｂａｒｔｈｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，１９９３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，３８３５−３８４４，Ｇｒａｋｏｕｉら，１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，１０５８３−１０５８７，Ｔｏｍｅｉら，１９９３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４０１７−４０２６）。ＮＳ４ＡはＮＳ３活性のための補因子を与える（Ｆａｉｌｌａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４．６８，３７５３−３７６０，Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，米国特許第５，７３９，００２号）。ＮＳ５Ａは、インターフェロン耐性を付与する高度にリン酸化されたタンパク質である（Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，２０００．Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．，２０（１），６９−８３，Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ，１９９９．Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ．Ｓｕｐｐｌ．１，４７−４８）。ＮＳ５ＢはＲＮＡポリメラーゼを与える（Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，国際公開番号ＷＯ９６／３７６１９，Ｂｅｈｒｅｎｓら，１９９６．ＥＭＢＯ  １５，１２−２２，Ｌｏｈｍａｎｎら，１９９８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４９，１０８−１１８）。
【０００６】
Ｌｏｈｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，１１０−１１３，１９９９は、ビスシストロン性（ｂｉｓｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ＨＣＶレプリコンが肝細胞系において複製されうることを示している。該ビスシストロン性レプリコンは、ネオマイシンシストロンおよびＮＳ２−ＮＳ５ＢまたはＮＳ３−ＮＳ５Ｂシストロンを含有していた。「ＮＳ２−ＮＳ５Ｂ」はＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリタンパク質を意味する。「ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ」はＮＳ３−ＮＳ４−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリタンパク質を意味する。
【０００７】
２０００年１０月１１日付け公開のＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，欧州特許出願１  ０４３  ３９９（本発明の先行技術であるとは認められない）は、自律的ＨＣＶ  ＲＮＡ複製およびタンパク質発現のための細胞培養系を記載している。複製およびタンパク質発現は、定量的測定に十分な程度に多量に生じることが示されている。欧州特許出願１  ０４３  ３９９は、ＨＣＶに感染した先行細胞系または初代細胞培養が、ＨＣＶ複製を検出するための好ましい状況をもたらさないことを示している。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、１以上の適応（ａｄａｐｔｉｖｅ）突然変異を含有する核酸、およびＨＣＶレプリコン増強細胞に関する。適応突然変異は、ＨＣＶレプリコン活性を増強する突然変異である。ＨＣＶレプリコン増強細胞は、ＨＣＶレプリコンを維持する増強された能力を有する細胞である。
【０００９】
ＨＣＶレプリコンは、培養細胞内で自律的に複製し検出可能なレベルの１以上のＨＣＶタンパク質を与えうるＲＮＡ分子である。ＨＣＶレプリコンの基本サブユニットは、適当な５’ＵＴＲ部分コア（ＰＣ）領域および３’ＵＴＲと共にＨＣＶ  ＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質をコードしている。該５’ＵＴＲ−ＰＣ領域は、５’ＵＴＲ領域と、約３６ヌクレオチドの該コアの開始部とから構成される。追加的な領域が存在することが可能であり、それらには、ＨＣＶタンパク質または要素、例えば完全コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７またはＮＳ２をコードする領域、および他のタイプのタンパク質または要素、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム進入シグナル（ＩＲＥＳ）、レポータータンパク質または選択タンパク質をコードする領域が含まれる。
【００１０】
本出願は、ＨＣＶレプリコン活性を増強する種々の適応突然変異を同定するものである。レプリコン活性の増強は以下の少なくとも１つを引き起こす：細胞内のレプリコンの維持の増加、レプリコンの複製の増加、およびレプリコンタンパク質発現の増加。
【００１１】
適応突然変異は、本発明では、特定の領域に存在する参照配列に対する該適応突然変異の位置を同定することにより記載されている。与えられた参照配列に基づき、該参照配列とは異なるアミノ酸配列を有する同等の領域の対応位置において、同じ適応突然変異が生成されうる。同等の領域は同じ機能を有し、同じ機能を有するポリペプチドをコードしている。
【００１２】
レプリコン増強細胞は、ＨＣＶレプリコンの挿入および発現のための好ましい宿主である。レプリコン増強細胞は、まず、ＨＣＶレプリコンを含有する細胞を作製し次いで該レプリコンの細胞を矯正（ｃｕｒｅ）することにより産生される。「レプリコン増強細胞」なる語は、ＨＣＶレプリコンに関して矯正された細胞（ＨＣＶレプリコンが除去された細胞）、およびそのような細胞の後代を含む。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様は、以下の領域の少なくとも１つを含む核酸分子を記載する：改変されたＮＳ３コード領域、改変されたＮＳ５Ａコード領域、および改変されたＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ領域。該改変領域は１以上の適応突然変異を含有する。特定の適応突然変異に対する言及は、他の突然変異または適応突然変異の存在を除外するものではない。適応突然変異は、コード化アミノ酸配列または核酸配列に関して記載されている。
【００１４】
核酸分子は一本鎖であるか又は二本鎖の一部であることが可能であり、ＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。該核酸分子の構造に応じて、該分子はレプリコンとして又はレプリコンの製造において使用することができる。例えば、適切な領域を有する一本鎖ＲＮＡはレプリコンであることが可能であり、一方、レプリコンまたはレプリコン中間体をコードする配列の相補体を含む二本鎖ＤＮＡは該レプリコンまたはレプリコン中間体の製造において有用でありうる。
【００１５】
好ましい核酸分子は、１以上の適応突然変異を有する配列番号１、２または３からの領域を含有する核酸分子またはそのＲＮＡ形態である。「そのＲＮＡ形態」に対する言及は、リボースバックボーンを及びチミンではなくウラシルの存在を示す。
【００１６】
適応突然変異を含有する領域が存在するということは、少なくとも１つのそのような領域が存在することを示す。異なる実施形態においては、例えば、本明細書に記載の適応突然変異は、少なくとも、ＮＳ３領域中、ＮＳ５Ａ領域中、ＮＳ３およびＮＳ５Ａ領域中、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳおよびＮＳ３領域中、ＥＭＣＶおよびＮＳ５Ａ領域中、ならびにＥＣＭＶ  ＩＲＥＳ、ＮＳ３およびＮＳ５Ａ領域中に存在する。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、外因性プロモーと対になったＨＣＶレプリコンまたはＨＣＶレプリコン中間体のヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを記載する。「外因性プロモーターと対になった」ヌクレオチド配列との言及は、プロモーターがヌクレオチド配列の転写をもたらすような、およびこのプロモーターが転写されるべきヌクレオチド配列を天然において伴っていないような、ＲＮＡプロモーターの存在および位置を示す。この発現ベクターはＲＮＡレプリコンの生産に用いることができる。
本発明のもう１つの態様は、ヒト組換え肝細胞癌細胞を記載する。組換え細胞なる言及は、当初生成した細胞およびこの子孫を示す。
本発明のもう１つの態様は、ＨＣＶレプリコン増強細胞の製造方法を記載する。該方法は、（ａ）細胞内にＨＣＶレプリコンを導入し維持し、（ｂ）該ＨＣＶレプリコンの細胞を矯正（ｃｕｒｅ）する工程を含む。
【００１８】
本発明のもう１つの態様は、（ａ）細胞内にＨＣＶレプリコンを導入し維持し、（ｂ）該ＨＣＶレプリコンの細胞を矯正（ｃｕｒｅ）する工程を含む製造方法により製造されたＨＣＶレプリコン増強細胞を記載する。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、ＨＣＶレプリコンを含むＨＣＶレプリコン増強細胞の製造方法を記載する。該方法は、（ａ）細胞内に第１  ＨＣＶレプリコンを導入し維持し、（ｂ）該レプリコンの細胞を矯正（ｃｕｒｅ）し、（ｃ）該矯正細胞内に第２レプリコンを導入し維持する工程を含み、該第２レプリコンは該第１レプリコンと同じ又は異なりうる。
【００２０】
本発明のもう１つの態様は、ＨＣＶレプリコンをＨＣＶレプリコン増強細胞内に導入する工程を含む製造方法により製造されたＨＣＶレプリコンを含有するＨＣＶレプリコン増強細胞を記載する。該ＨＣＶレプリコン増強細胞内に導入されるＨＣＶレプリコンは、該ＨＣＶレプリコン増強細胞を製造するために使用したＨＣＶレプリコンと同じ又は異なりうる。好ましい実施形態においては、ＨＣＶレプリコン増強細胞内に導入されるＨＣＶレプリコンは、該増強細胞を製造するために使用したのと同じレプリコンである。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、本明細書に記載の適応突然変異を含むＨＣＶレプリコンを使用して、化合物がＨＣＶ活性に影響を及ぼす能力を測定する方法を記載する。該方法は、該ＨＣＶレプリコンを含む細胞に化合物を与え、該化合物が１以上のレプリコン活性に影響を及ぼす能力をＨＣＶ活性に対する影響の尺度として測定することを含む。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、ＨＣＶレプリコンを含むＨＣＶレプリコン増強細胞を使用して、化合物がＨＣＶ活性に影響を及ぼす能力を測定する方法を記載する。該方法は、該細胞に化合物を与え、該化合物が１以上のレプリコン活性に影響を及ぼす能力をＨＣＶ活性に対する影響の尺度として測定することを含む
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載している実施例は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示するものである。該実施例は本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を確認し使用することが可能である。
【００２３】
（発明の詳細な記載）
ＨＣＶレプリコンおよびＨＣＶレプリコン増強細胞は、検出可能なレベルのＨＣＶ  ＲＮＡおよびＨＣＶタンパク質を与える細胞培養を製造するために使用することができる。ＨＣＶレプリコンおよびＨＣＶレプリコン増強宿主は共に、細胞内でＨＣＶレプリコンを維持する能力に関して選択することにより得ることができる。後記実施例に例示するとおり、宿主細胞およびＨＣＶレプリコン中に存在する適応突然変異は共に、細胞内でのレプリコンの維持を補助しうる。
【００２４】
細胞培養系内でのＨＣＶ  ＲＮＡの検出可能な複製および発現は、ＨＣＶの複製および発現の研究、ＨＣＶおよび宿主相互作用の研究、ＨＣＶ  ＲＮＡの製造、ＨＣＶタンパク質の製造ならびに化合物が１以上のＨＣＶ活性をモジュレーションする能力を測定するための系の提供における使用を含む多種多様な用途を有する。
【００２５】
ＨＣＶレプリコンと共に使用するための好ましい細胞としては、Ｈｕｈ−７細胞およびＨｕｈ−７誘導細胞が挙げられる。「Ｈｕｈ−７誘導細胞」は、Ｈｕｈ−７細胞から出発して１以上の表現型および／または遺伝子型修飾を導入することにより得られた細胞である。
【００２６】
適応突然変異
適応突然変異は、宿主細胞内でＨＣＶレプリコンが維持され発現される能力を増強する。適応突然変異は、まず、野生型ＨＣＶ  ＲＮＡ構築物または突然変異ＨＣＶレプリコンの使用に関して選択されうる。初期選択は、ＨＣＶレプリコンを細胞に与え、レプリコンを含有するクローンを同定することを含む。
【００２７】
同定されたＨＣＶレプリコンの核酸配列は、標準的な配列決定技術を用いて決定することができる。投入ＨＣＶ構築物と選択構築物との配列比較は突然変異の位置を示す。特定の突然変異の効果は、例えば、特定の突然変異を含有するよう構築物を作製しこれらの突然変異の効果を測定することにより測定することができる。比較目的のための適当な制御構築物には、野生型構築物および既に評価されている構築物が含まれる。
【００２８】
適応突然変異はＨＣＶ  ＮＳ３およびＮＳ５Ａ領域中に優先的に見出された。ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ中の２つのサイレント突然変異を除き、該ＮＳ領域中に生じるコンセンサス突然変異は該推定アミノ酸配列に対する変化を引き起こした。注目すべきことに、該アミノ酸変化は、すべて又は多数の天然ＨＣＶ単離体において保存された残基において生じた。ＨＣＶ配列は当技術分野においてよく知られており、例えばＧｅｎＢａｎｋにおいて見出されうる。
【００２９】
本明細書に記載の適応突然変異は、参照配列と比較して示されうる。該参照配列は、例えばＮＳ３もしくはＮＳ５ＡのＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはアミノ酸配列中の適応突然変異の位置を与える。該配列の残部は、該参照配列と同じ又は異なる配列を有しうる機能的タンパク質をコードしている。
【００３０】
好ましいＮＳ３およびＮＳ５Ａ適応突然変異、ならびにそのような突然変異を得るために施されうる変化の具体例を、表１および２に示す。表１および２に示すアミノ酸番号は配列番号１に基づくものである。表１および２に示すヌクレオチド番号は配列番号２に基づくものである。配列番号１は、Ｃｏｎ１  ＨＣＶ単離体（受託番号ＡＪ２３８７９９）のアミノ酸配列を提供する。配列番号２はＣｏｎ１  ＨＣＶ単離体の核酸配列を提供する。
【００３１】
【表１】
2004528017.tif 000002
【００３２】
【表２】
2004528017.tif 000003
【００３３】
参照配列に基づき示される好ましい適応突然変異は、配列番号１のコード領域または同等配列を変化させて、示されている変化を得ることにより生成させることができる。表１および２に示す好ましい適応突然変異は、種々のＨＣＶ単離体間で保存されたアミノ酸において生じる。
【００３４】
適応突然変異は種々の効果を有する。いくつかの突然変異は、単独で又は他の突然変異との組合せで、ＨＣＶレプリコン活性を増強する。いくつかの場合には、２以上の突然変異が相乗効果を招き、１つの場合には、僅かに拮抗性の効果が観察された。
【００３５】
一旦同定された適応突然変異は、標準的な遺伝子技術を用いて出発構築物中に導入することができる。そのような技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。
【００３６】
適応突然変異を含有するＨＣＶレプリコンは、本明細書に記載の１以上の適応突然変異を含有するＮＳ３領域またはＮＳ５Ａ領域の周囲に構築されうる。最終的なレプリコンは、複製に必要なレプリコン成分を含有し、追加的な成分を含有しうる。
【００３７】
配列番号２は、以下のとおりに種々のＨＣＶ領域に関する参照点として使用することができる。
５’ＵＴＲ−ヌクレオチド１−３４１；
コア−ヌクレオチド３４２−９１４；
Ｅ１−ヌクレオチド９１５−１４９０；
Ｅ２−ヌクレオチド１４９１−２５７９；
Ｐ７−ヌクレオチド２５８０−２７６８；
ＮＳ２−ヌクレオチド２７６９−３４１９；
ＮＳ３−ヌクレオチド３４２０−５３１２；
ＮＳ４Ａ−ヌクレオチド５３１３−５４７４；
ＮＳ４Ｂ−ヌクレオチド５４７５−６２５７；
ＮＳ５Ａ−ヌクレオチド６２５８−７５９８；
ＮＳ５Ｂ−ヌクレオチド７５９９−９３７１；および
３’ＵＴＲ−ヌクレオチド９３７４−９６０５。
種々の構造および非構造領域のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００３８】
特定のアミノ酸をコードする核酸配列は、遺伝暗号の縮重を考慮して製造されうる。遺伝暗号の縮重は、ほとんどすべてのアミノ酸が、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされるために生じる。特定のコドンから特定のアミノ酸への翻訳は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｌｅｗｉｎ  ＧＥＮＥＳ  ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。アミノ酸は、以下のとおりにＲＮＡコドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ。
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ。
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ。
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ。
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ。
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ。
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ。
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ。
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ。
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ。
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ。
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ。
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ。
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ。
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ。
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ。
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ。
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００３９】
本明細書に記載の適応突然変異の１以上を含有するサブゲノムおよびゲノムレプリコンを含む構築物はまた、追加的な突然変異を含有しうる。該追加的突然変異は、適応突然変異、およびレプリコン活性を実質的に抑制しない突然変異でありうる。レプリコン活性を実質的に抑制しない突然変異は、細胞内に導入され検出可能な活性を有しうるレプリコンを与える。
【００４０】
ＨＣＶレプリコン
ＨＣＶレプリコンは、完全長ＨＣＶゲノムおよびサブゲノム構築物を含む。基本ＨＣＶレプリコンは、ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ−ＰＣ領域、ＨＣＶ  ＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質コード領域およびＨＣＶ  ３’ＵＴＲを含有するサブゲノム構築物である。ＨＣＶ  ＮＳ２、構造ＨＣＶタンパク質および非ＨＣＶ配列を与える核酸領域のような他の核酸領域が存在しうる。
【００４１】
該ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ−ＰＣ領域は、タンパク質の翻訳のための内部リボソーム進入シグナル（ＩＲＥＳ）および複製に必要な要素を与える。該ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ−ＰＣ領域は、ＨＣＶコアコード領域中に約３６ヌクレオチドにわたり伸長する天然に存在するＨＣＶ  ５’ＵＴＲ、およびその機能的誘導体を含む。該５’−ＵＴＲ−ＰＣ領域は、種々の位置（例えば、選択タンパク質、レポーター、タンパク質またはＨＣＶポリタンパク質をコードする配列の下流の部位）に存在しうる。
【００４２】
ＨＣＶの翻訳開始のための構造的要件を考慮して、翻訳を開始し複製を補助しうる５’−ＵＴＲ−ＰＣ領域の機能的誘導体を設計することができる（例えば、Ｈｏｎｄａら，１９９６．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２２，３１−４２を参照されたい）。５’−ＵＴＲ−ＰＣ領域に対する種々の修飾の影響は、レプリコン活性を測定する技術を用いて測定することができる。
【００４３】
該ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ−ＰＣ領域に加えて、非ＨＣＶ  ＩＲＥＳ要素も該レプリコン中に存在しうる。該非ＨＣＶ  ＩＲＥＳ要素は、ＨＣＶポリタンパク質をコードする領域の直上流を含む種々の位置に存在しうる。使用しうる非ＨＣＶ  ＩＲＥＳ要素の具体例としては、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳおよびウシウイルス性下痢ウイルスＩＲＥＳが挙げられる。
【００４４】
該ＨＣＶ  ３’ＵＴＲはＨＣＶの複製を補助する。ＨＣＶ  ３’ＵＴＲは、天然に存在するＨＣＶ  ３’ＵＴＲおよびその機能的誘導体を含む。天然に存在する３’ＵＴＲは、ポリＵ領域および約１００ヌクレオチドの追加的領域を含む（Ｔａｎａｋａら，１９９６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，３３０７−３３１２，Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖら，１９９６．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，３３６３−３３７１）。少なくともインビボでは、該３’ＵＴＲは複製に必須であるらしい（Ｋｏｌｙｋｈｏｌｏｖら，２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００  ４，２０４６−２０５１）。天然に存在する３’ＵＴＲ誘導体の具体例はＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，国際公開番号ＥＰ  １  ０４３  ３９９に記載されている。
【００４５】
ＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質コード領域は、細胞内で種々のタンパク質にプロセシングされうるポリタンパク質を与える。レプリコンの一部でありうる適当なＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質配列には、ＮＳ３−ＮＳ５Ｂのプロセシングを引き起こして機能的複製装置を与える種々のＨＣＶ株に存在するもの及びその機能的誘導体が含まれる。適当なプロセシングは、例えばＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをアッセイすることにより測定することができる。
【００４６】
ＮＳ５Ｂタンパク質がＲＮＡポリメラーゼ活性を付与する能力は、当技術分野においてよく知られた技術を用いて測定することができる（例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｓｃｅｓｃｏら，国際公開番号ＷＯ  ９６／３７６１９，Ｂｅｈｒｅｎｓら，１９９６．ＥＭＢＯ  １５：１２−２２，Ｌｏｈｍａｎｎら，１９９８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４９：１０８−１１８を参照されたい）。好ましくは、該活性ＮＳ５Ｂの配列は、配列番号１に記載のもの又は野生型ＮＳ５Ｂ（例えば、株ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−Ｎ、ＨＣＶ−Ｈ）と実質的に類似している。実質的に類似した配列は、検出可能なＨＣＶポリメラーゼ活性を与え、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ中に存在する配列に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸改変を含有する。好ましくは、１、２、３、４または５個以下の改変が存在する。
【００４７】
アミノ酸配列に対する改変は置換、挿入、欠失またはそれらの組合せを与える。種々の改変の部位が、保存された及び変異可能なアミノ酸を同定するために種々のＮＳ５Ｂポリメラーゼのアミノ酸配列を考慮して設計されることが可能であり、実験的に決定されうる。
【００４８】
ＨＣＶレプリコンは、多種多様な細胞において及びインビトロにおいて製造することができる。適当な細胞は、ＨＣＶレプリコンをコードする核酸の転写を可能にする。
【００４９】
追加的配列
ＨＣＶレプリコンは、ＨＣＶ配列に加えて非ＨＣＶ配列を含有しうる。該追加的配列は、複製および発現を妨げるものであるべきではなく、好ましくは、有用な機能を果たす。有用な機能を果たすよう使用しうる配列には、選択配列、レポーター配列、転写要素および翻訳要素が含まれる。
【００５０】
選択配列
ＨＣＶレプリコン中の選択配列は、該レプリコンを含有する細胞の同定を容易にする。選択配列は、典型的には、該選択配列を含有しない細胞の増殖を抑制する何らかの選択圧と共に使用される。選択配列の具体例には、リボザイムおよび抗生物質耐性をコードする配列が含まれる。
【００５１】
抗生物質耐性は、レプリコンを含有する細胞を選択するための抗生物質と共に用いることができる。抗生物質耐性を付与する選択配列の具体例としては、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）に対する耐性をコードする配列が挙げられる。
【００５２】
選択配列として機能するリボザイムは、細胞増殖を妨げる抑制性核酸分子と共に使用することができる。該リボザイムは該抑制性核酸を認識し切断する。
【００５３】
レポーター配列
レポーター配列は、レプリコン複製またはタンパク質発現を検出するために使用することができる。好ましいレポータータンパク質は、該タンパク質により産生された産物を測定することにより存在が検出されうる酵素タンパク質である。レポータータンパク質の具体例には、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、分泌性アルカリホスファターゼ、βグルクロニダーゼ、グリーン蛍光タンパク質およびその誘導体が含まれる。また、相補的核酸により標的化されうる参照配列を得るために、レポーター核酸配列を使用することができる。該相補的核酸のその標的へのハイブリダイゼーションは、標準的な技術を用いて測定することができる。
【００５４】
追加的配列の配置
追加的非ＨＣＶ配列は、好ましくは、ＨＣＶレプリコンゲノムまたはサブゲノムゲノム領域の５’側または３’側に位置する。しかし、該追加的配列は、該配列が検出可能なレプリコン活性を妨げない限り、ＨＣＶゲノム中に位置しうる。所望により、リボザイムと共にリボザイム認識配列を使用することにより、追加的配列は該レプリコンから分離されうる。
【００５５】
追加的配列は、該ＨＣＶポリタンパク質と同じシストロンの一部であることが可能であり、あるいは別々のシストロンであることが可能である。同じシストロンの一部の場合には、タンパク質をコードする選択またはレポーター配列は、キメラタンパク質として活性であるか又は細胞内で切断されてＨＣＶタンパク質から分離される産物を与えるべきである。
【００５６】
タンパク質をコードする選択およびレポーター配列は、別々のシストロンとして存在する場合には、翻訳に必要な要素を伴っていなければならない。そのような要素には５’ＩＲＥＳが含まれる。
【００５７】
検出方法
レプリコン活性を検出するための方法には、レプリコンＲＮＡおよびコード化タンパク質の産生または活性を測定する方法が含まれる。測定は定性的および定量的分析を含む。
【００５８】
ＲＮＡ産生を測定するのに適した技術には、ＲＮＡの存在または活性を検出する技術が含まれる。ＲＮＡの存在は、例えば、相補的ハイブリダイゼーションプローブまたは定量的ＰＣＲを用いて検出することができる。相補的核酸間のハイブリダイゼーションの測定および定量的ＰＣＲのための技術は当技術分野においてよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、および米国特許第５，７３１，１４８号を参照されたい）。
【００５９】
ＲＮＡ酵素活性は、リボザイム配列を使用することにより、該レプリコンに付与することができる。リボザイム活性は、該リボザイムが標的配列を切断する能力を検出する技術を用いて測定することができる。
【００６０】
タンパク質産生を測定するための技術には、産生タンパク質の存在または活性を検出するための技術が含まれる。特定のタンパク質の存在は、例えば免疫学的技術により測定することができる。タンパク質活性は、ＨＣＶタンパク質またはレポータータンパク質配列の活性に基づいて測定することができる。
【００６１】
ＨＣＶタンパク質活性を測定するための技術は、測定するタンパク質に応じて様々である。ＮＳ２／３、ＮＳ３およびＮＳ５Ｂのような種々の非構造タンパク質の活性を測定するための技術が当技術分野においてよく知られている（例えば、「背景技術」に記載の参考文献を参照されたい）。
【００６２】
また、レプリコン活性を測定するアッセイには、ビリオンを産生するレプリコンからのビリオンの産生を検出するアッセイ、およびそのような効果を奏するタンパク質を産生するレプリコンからの細胞変性効果を検出するアッセイが含まれる。細胞変性効果は、細胞生存性を測定するのに適したアッセイにより検出することができる。
【００６３】
レプリコン活性を測定するアッセイを用いて、化合物がＨＣＶ活性をモジュレーションする能力を評価することができる。そのようなアッセイは、ＨＣＶレプリコンを発現する細胞に１以上の試験化合物を与え、レプリコン活性に対する該化合物の効果を測定することにより行うことができる。２以上の化合物を含有する調製物がレプリコン活性をモジュレーションすることが判明している場合には、レプリコン活性化合物を同定するために個々の化合物またはより小さな化合物群を試験することができる。
【００６４】
ＨＣＶ活性を抑制することが確認された化合物は、レプリコン増強細胞を得るために使用することが可能であり、治療用化合物でありうる。化合物が治療用化合物として機能しうることは、効力および毒性を測定するためのチンバンジーのようなモデル動物を使用して確認することができる。
【００６５】
レプリコン増強細胞
レプリコン増強細胞は、まず、ＨＣＶレプリコンを維持しうる細胞を選択し次いで該レプリコンの細胞を矯正（ｃｕｒｅ）することにより製造される。このようにして製造された細胞は、後続のＨＣＶレプリコンのトランスフェクションの後にレプリコンを維持する能力を増強していることが判明した。
【００６６】
初期トランスフェクションは、野生型レプリコン、または１以上の適応突然変異を含有するレプリコンを使用して行うことができる。野生型レプリコンを使用する場合には、該レプリコンは、レプリコンの維持を促進する選択配列を含有すべきである。
【００６７】
細胞は、レプリコン抑制剤を使用する技術のような種々の技術を用いてレプリコンに関して矯正することができる。また、ＨＣＶレプリコンの複製は、コンフルエント細胞においては実質的に減弱する。したがって、細胞を高密度で培養することにより、レプリコンに関して細胞を矯正することが考えられる。
【００６８】
レプリコン抑制剤はレプリコン活性を抑制し、またはレプリコンを含有する細胞に対して選択する。そのような抑制剤の一例として、ＩＦＮ−αが挙げられる。他のＨＣＶ抑制性化合物も使用することができる。ＨＣＶ抑制性化合物は、例えば、Ｌｌｉｎａｓ−Ｂｒｕｎｅｔら，２０００．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０（２０），２２６７−２２７０に記載されている。
【００６９】
矯正された細胞がレプリコン増強細胞でありうることは、レプリコンを該細胞内に導入し後のレプリコン維持および活性の効率を測定することにより測定することができる。
【００７０】
(実施例)
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法を例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７１】
技術
本実施例は、適応突然変異およびレプリコン増強細胞を製造し分析するために用いる技術を例示する。
【００７２】
核酸の操作および組換えプラスミドの構築
核酸の操作は標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に従い行った。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ５００カラムを製造業者の説明に従い使用してＬＢブロス中のＯＮ培養から調製した。
【００７３】
所望の突然変異を含有するプラスミドは、突然変異に隣接する制限部位を使用する制限消化により、または適当な配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使用する関心領域のＰＣＲ増幅により構築した。該突然変異を該ＰＣＲプライマー中に挿入することにより、部位特異的突然変異誘発を行った。高忠実度熱安定ポリメラーゼを使用して、または校正（プルーフリーディング）酵素を含有するポリメラーゼの混合物を使用して（Ｂａｒｎｅｓら，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１，２２１６−２２２０）、ＰＣＲ増幅を行った。すべてのプラスミドは制限マッピングおよび配列決定により確認した。
【００７４】
ｐＨＣＶｎｅｏ１７．ｗｔは、Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒにより記載されているレプリコンＩ３７７ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ｗｔと同じＨＣＶビシストロンレプリコンのｃＤＮＡ（配列番号３）を含有する（Ｌｏｈｍａｎｎら，１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，１１０−１１３，ＥＭＢＬ−ｇｅｎｂａｎｋ番号ＡＪ２４２６５２）。該プラスミドは以下の要素を含む：ＨＣＶ−ＩＲＥＳと該コアの一部とを含むＨＣＶの５’非翻訳領域（ｎｔ１−３７７）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列；およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ；ＮＳ３からＮＳ５ＢまでのＨＣＶコード配列；ＨＣＶの３’ＵＴＲ。
【００７５】
ＮＳ５Ｂポリメラーゼの触媒アスパラギン酸（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２７３７および２７３８）をコードするＧＡＣトリプレット（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．６９３４−６９３９）が、アラニンをコードするＧＣＧに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ＧＡＡはｐＨＣＶＮｅｏ．１７と同じである。
【００７６】
ＮＳ５Ａタンパク質のセリン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２２０４）をコードするトリプレットＡＧＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３３５−５３３７）が、アルギニンをコードするＡＧＡに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ０はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００７７】
ＮＳ５Ａタンパク質のアスパラギン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０４１）をコードするトリプレットＡＡＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．４８４６−４８４８）が、トレオニンをコードするＡＣＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００７８】
ＮＳ５Ａタンパク質のセリン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１７３）をコードするトリプレットＴＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５２４２−５２４４）が、フェニルアラニンをコードするＴＴＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ２はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００７９】
ＮＳ５Ａタンパク質のセリン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９７）をコードするトリプレットＴＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３１４−５３１６）が、フェニルアラニンをコードするＴＴＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ３はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００８０】
ＮＳ５Ａタンパク質のロイシン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９８）をコードするトリプレットＴＴＧ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３１７−５３１９）が、セリンをコードするＴＣＧに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ４はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００８１】
リシンをコードする追加的なトリプレットＡＡＡが、バリン２０３９をコードするトリプレットＧＴＧ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．４８４０−４８４３）に変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ５はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００８２】
ＮＳ３タンパク質のグルタミン酸およびアラニン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１２０２および１３４７）をコードするトリプレットＧＡＡおよびＧＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．２３２９−２３３１および２７６４−２７６６）が、それぞれグリシンおよびトレオニンをコードするＧＧＡおよびＡＣＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ６はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。ＮＳ５Ａタンパク質のセリン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１７３）をコードするトリプレットＴＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５２４２−５２４４）が、フェニルアラニンをコードするＴＴＣに変化しており、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ中（該レプリコン配列のチミジン１７３６の後）に追加的なアデノシンが挿入されている。
【００８３】
ＮＳ５Ａタンパク質のアスパラギン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０４１）をコードするトリプレットＡＡＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．４８４６−４８４８）が、トレオニンをコードするＡＣＣに変化しており、ＮＳ５Ａタンパク質のセリン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１７３）をコードするトリプレットＴＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５２４２−５２４４）が、フェニルアラニンをコードするＴＴＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ７はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００８４】
ＮＳ５Ａタンパク質のアスパラギン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０４１）をコードするトリプレットＡＡＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．４８４６−４８４８）が、トレオニンをコードするＡＣＣに変化しており、ＮＳ５Ａタンパク質のセリン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９７）をコードするトリプレットＴＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３１４−５３１６）が、フェニルアラニンをコードするＴＴＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ８はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００８５】
ＮＳ５Ａタンパク質のアスパラギン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０４１）をコードするトリプレットＡＡＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．４８４６−４８４８）が、トレオニンをコードするＡＣＣに変化しており、ＮＳ５Ａタンパク質のロイシン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９８）をコードするトリプレットＴＴＧ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３１７−５３１９）が、セリンをコードするＴＣＧに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ９はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００８６】
ＮＳ３タンパク質のグルタミン酸（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１２０２）をコードするトリプレットＧＡＡ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．２３２９−２３３１）が、グリシンをコードするＧＧＡに変化しており、リシンをコードする追加的なトリプレットＡＡＡが、ＨＣＶポリタンパク質のバリン２０３９をコードするトリプレットＧＴＧ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．４８４０−４８４３）の後に挿入されている以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１０はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００８７】
ＮＳ５Ａタンパク質のセリン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９７）をコードするトリプレットＴＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３１４−５３１６）が、フェニルアラニンをコードするＴＴＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１１はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。ＮＳ５Ａタンパク質のアラニン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９９）をコードするトリプレットＧＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３２０−５３２２）は、トレオニンをコードするＡＣＣに変化している。
【００８８】
ＮＳ５Ａタンパク質のアスパラギン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０４１）をコードするトリプレットＡＡＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．４８４６−４８４８）が、トレオニンをコードするＡＣＣに変化しており、ＮＳ５Ａタンパク質のセリン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９７）をコードするトリプレットＴＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３１４−５３１６）が、フェニルアラニンをコードするＴＴＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１２はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。ＮＳ５Ａタンパク質のアラニン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９９）をコードするトリプレットＧＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３２０−５３２２）は、トレオニンをコードするＡＣＣに変化している。
【００８９】
プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１３は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ中（該レプリコン配列のチミジン１７３６の後）に追加的なアデノシンが挿入されている以外はｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ８と同じ突然変異を有する。
【００９０】
プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１４は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ中（該レプリコン配列のチミジン１７３６の後）に追加的なアデノシンが挿入されている以外はｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１１と同じ突然変異を有する。
【００９１】
ＮＳ５Ａタンパク質のアラニン（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２１９９）をコードするトリプレットＧＣＣ（ｐＨＣＶＮｅｏ１７配列のｎｔ．５３２０−５３２２）が、トレオニンをコードするＡＣＣに変化している以外は、プラスミドｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｍ１５はｐＨＣＶＮｅｏ１７と同じである。
【００９２】
プラスミドｐＲＢＳＥＡＰ．５は、ｐＢＣ１２／ＲＳＶ／ＳＥＡＰプラスミド（Ｂｅｒｇｅｒら，１９８８．Ｇｅｎｅ  ６６．１−１０）のヌクレオチド９０−１５８０に対応するヒト胎盤アルカリホスファターゼをコードする配列でＮｅｏコード配列が置換されたｐＨＣＶＮｅｏ．１７誘導体である。
【００９３】
ＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションは、Ｈｕｈ−７細胞を使用して行った。該細胞を、１０％  ＦＣＳで補足されたダルベッコ変法最少必須培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）中で増殖させた。通常の研究には、１×トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を使用して、週２回、細胞を１〜５継代した。
【００９４】
プラスミドをＳｃａＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、Ｔ７  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）でインビトロで転写した。転写混合物をＤＮアーゼＩ（０．１Ｕ／ｍｌ）で３７℃で３０分間処理して鋳型ＤＮＡを完全に除去し、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，１９８７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９）の方法に従い抽出し、ＲＮアーゼを含有しないリン酸緩衝食塩水（ｒｆＰＢＳ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に再懸濁させた。
【００９５】
ＲＮＡトランスフェクションは、Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍら，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６，４１０７−４１１３に記載の方法を若干修飾した方法で行った。サブコンフルエントな活発に増殖している細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して該組織培養容器から解離させた。３〜１０容積のＤＭＥＭ／１０％  ＦＣＳの添加によりトリプシンを中和し、細胞を、Ｈａｅｒｅｕｓ卓上遠心機中、４℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を穏やかなピペッティングにより氷冷ｒｆＰＢＳに再懸濁させ、血球計算器で計数し、前記のとおりに遠心分離した。ｒｆＰＢＳ洗浄を１回繰返し、細胞をｒｆＰＢＳ中で１〜２×１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコートを無菌エッペンドルフチューブ中でＲＮＡと混合した。該ＲＮＡ／細胞混合物を直ちにエレクトロポレーションキュベット（氷上で予冷されたもの）中に移し、パルスコントローラー（Ｂｉｏｒａｄ）を備えた遺伝子パルサー装置で２回パルスした。該実験に応じて、０．１、０．２または０．４ｃｍ電極間隙キュベットを使用し、設定を調節した（表３）。
【００９６】
【表３】
2004528017.tif 000004
【００９７】
電気ショックの後、細胞を室温で１〜１０分間（実質的には、すべてのサンプルをエレクトロポレーションするのに要する時間）放置し、ついで少なくとも２０容積のＤＭＥＭ／１０％  ＦＣＳで希釈し、該実験の必要に応じてプレーティングした。硫酸ネオマイシン（Ｇ４１８）の不存在下および存在下で種々の日数にわたり培養した細胞によるニュートラルレッドの取込みを測定することにより、生存およびトランスフェクション効率をモニターした。これらのパラメーターでは、Ｈｕｈ−７細胞の生存は通常４０〜６０％であり、トランスフェクション効率は４０％〜１００の範囲であった。
【００９８】
レプリコンＲＮＡの配列分析
ＨＣＶＮｅｏ．１７ＲＮＡで行った３つの異なるトランスフェクション実験から全ＮＳ領域を再クローニングした。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニキットを製造業者の説明に従い使用して又はＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，１９８７．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９に記載されているとおりに、選択したクローンからＲＮＡを抽出した。
【００９９】
レプリコンＲＮＡ（５μｇの全細胞ＲＮＡ）を、オリゴヌクレオチドＨＣＶＧ３４（５’−ＡＣＡＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＴ−３’；配列番号４）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を製造業者の説明に従い使用して逆転写し、ついで２Ｕ／ｍｌ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｈ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で消化した。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳからＨＣＶ  ３’末端までに伸長するｃＤＮＡ領域を、ＨＣＶＧ３９（５’−ＧＡＣＡＳＧＣＴＧＴＧＡＴＡＷＡＴＧＴＣＴＣＣＣＣＣ−３’；配列番号５）およびＣＩＴＥ３（５’−ＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣ−３’；配列番号６）ならびにＬａ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ）を使用するＰＣＲにより増幅した。
【０１００】
増幅したｃＤＮＡをＫｐｎＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、５．８ｋｂの断片をゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の説明に従い使用して５．６ｋｂのベクター断片（ＫｐｎＩで消化したプラスミドｐＲＢＳＲＡＰ．５から精製したもの）に連結した。連結したＤＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＨ１０ＢまたはＪＭ１１９株におけるエレクトロポレーションにより形質転換した。
【０１０１】
ＮＳ５Ａ領域の場合には、３つのクローン（ＨＢ７７、ＨＢ６０およびＨＢ６８）から単離した全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲに使用した。５μｇの全ＲＮＡ＋２０ｐｍｏｌのＡＳ６１オリゴ（５’−ＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＴＣＡ−３’，ＲＴアンチセンスオリゴ；配列番号７）を９５℃で５分間加熱し、ついでＤＭＳＯ（５％  ｆ．ｃ．）、ＤＴＴ（１０ｍＭ  ｆ．ｃ．）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ（１ｍＭ  ｆ．ｃ．）、１×Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔバッファー（１×ｆ．ｃ．）および１０ｕ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｇｉｂｃｏ）を２０μｌの総容積まで加え、４２℃で３時間インキュベートした。２μｌのこのＲＴ反応を使用して、Ｅｌｏｎｇａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ）を該製造業者により提供された説明書に従い使用してオリゴＳ３９（５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＣＣＧＧＣＴＧＡＴＡ−３’；センス；配列番号８）またはＳ４１（５’−ＧＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＣＣ−３’；センス；配列番号９）およびＢ４３（５’−ＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧ−３’；アンチセンス；配列番号１０）でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片を、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１ベクター中にクローニングし、Ｔｏｐ１０Ｆ’細菌株中に形質転換した。
【０１０２】
Ｑｉａｇｅｎ  ５００カラムを製造業者の説明に従い使用して、得られたアンピシリン耐性コロニーのＯＮ培養からプラスミドＤＮＡを調製した。所望のＤＮＡインサートの存在を制限消化により確認し、各プラスミドのヌクレオチド配列を自動配列決定により決定した。ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、ＧＣＧソフトウェアを使用して整列させた。
【０１０３】
ＴａｑＭａｎ
ＴａｑＭａｎ分析は、典型的には、ＨＣＶ特異的オリゴ／プローブ（オリゴ１：５’−ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ−３’；配列番号１１、オリゴ２：５’−ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ−３’；配列番号１２、プローブ：５’−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３’；配列番号１３）またはヒトＧＡＰＤＨ特異的オリゴ／プローブ（Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ，Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４３１０８８４Ｅ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１０ｎｇのＲＮＡを反応混合物（ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲキット，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で使用して行った。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００を以下の条件下で使用して行った：４８℃で３０分間（ＲＴ工程）、９５℃で１０分間ならびに４０サイクル：９５℃で１５秒間および６０℃で１分間。定量的計算を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルを一定とみなしてＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ＣＴ  Ｍｅｔｈｏｄ（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２  ＡＢＩ  ＰＲＩＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，１９９７年１２月に記載されている）を使用して行った。ＨＣＶ  ＲＮＡのすべての計算は、特異的対照に対する倍率相違として表されている。
【０１０４】
抗体および免疫学的技術
マウスモノクローナル抗体（抗ＮＳ３  ｍａｂ１０Ｅ５／２４）を標準的な技術（ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９８１．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７３，１−４６）により製造した。精製された組換えタンパク質を免疫原として使用した（Ｇａｌｌｉｎａｒｉら，１９９９．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，５６２０−５６３２）。
【０１０５】
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ分析では、抗ＮＳ３  ｍａｂ  １０Ｅ５／２４でのＥＬＩＳＡにより、ＮＳ３タンパク質の発現に関してトランスフェクト化細胞をモニターした。細胞を、４０，０００、３０，０００、１５，００および１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中に播き、氷冷イソプロパノールで固定した（トランスフェクションのそれぞれ１、２、３および４日後に行った）。該細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００＋０．０２％  ＳＤＳ（ＰＢＳＴＳ）中の５％  脱脂乾燥乳でブロッキングし、ついで、乳（Ｍｉｌｋ）／ＰＢＳＴＳ中で１：２０００希釈された１０Ｅ５／２４ｍａｂと共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴＳで５回洗浄した後、乳／ＰＢＳＴＳ中で１：２０００希釈された抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異的アルカリホスファターゼ共役二次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７４７３）と共に該細胞を室温で３時間インキュベートした。前記のとおりに再び洗浄した後、該反応をｐ−フェニルホスファート二ナトリウム基質（Ｓｉｇｍａ  １０４−１０５）で現像し、４０５ｎｍでの吸光度を時折測定した。
【０１０６】
該結果をスルホローダミンＢ（ＳＲＢ  Ｓｉｇｍａ  Ｓ  １４０２）での染色により正規化して、細胞数を求めた。該アルカリホスファターゼ基質を該ウェルから除去し、該細胞をＰＢＳで洗浄した。ついで該プレートを１％  酢酸中の０．４％  ＳＲＢと共に３０分間インキュベートし（２００μｌ／ウェル）、１％  酢酸で４回リンスし、ブロッティングして乾燥させ、ついで２００μｌ／ウェルの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０．５）を加えた。混合後、５７０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１０７】
フォーカスのニュートラルレッド／クリスタルバイオレット染色
Ｇ４１８の不存在下または存在下でのトランスフェクト化細胞の生存を、フォーカス／クローンのニュートラルレッドでのインビボ染色およびそれに続く／クリスタルバイオレット染色によりモニターした。該培地を該細胞から除去し、０．００２５％  ニュートラルレッド（Ｓｉｇｍａ  Ｎ２８８９）を含有する新鮮培地と交換し、該細胞を３７℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３．５％  ホルムアルデヒド中で１５分間固定し、再びＰＢＳ中で２回、ついで蒸留水で洗浄し、（生きた）フォーカスの数を計数した。ついで、２０％  メタノール中の０．１％  クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃ０７７５）溶液と共に室温で２０分間インキュベートし、ついで２０％  メタノール中で３回洗浄し、蒸留水で洗浄することにより、該細胞はクリスタルバイオレットで再染色されることが可能であった。
【０１０８】
内因性レプリコンに関して矯正された細胞の調製
１０ＩＦＮおよびＣｌ．６０／ｃｕと称されるレプリコン増強細胞を、種々のＨＣＶ抑制剤を使用して製造した。本明細書に記載の技術に基づき、更なるレプリコン増強クローンが容易に入手されうる。
【０１０９】
１０ＩＦＮは、ヒトＩＦＮ−α２ｂを使用してＨｕｈ−７細胞をレプリコンに関して矯正することにより得た。ＨＣＶレプリコンを含有するＨｕｈ−７細胞（ＨＢＩ１０，ＨＢＩＩＩ４，ＨＢＩＩＩ２７およびＨＢＩＩＩ１８と称される）を、１００Ｕ／ｍｌ  組換えヒトＩＦＮ−α２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）の存在下で１１日間培養し、ついでＩＦＮ−α２ｂの不存在下で４日間培養した。この期間のいくつかの時点で、該クローンをＨＣＶタンパク質およびＲＮＡの存在に関してウエスタンおよびノーザンブロット法により分析した。ＩＦＮ−α２ｂと共に７日間インキュベートした後、ＨＣＶタンパク質は、もはや、これらのクローンのいずれにおいてもウエスタンブロット法により検出不可能であり、ノーザンブロットにおいてＲＮＡシグナルで同様の効果が認められた。ＩＦＮ−α２ｂ処理細胞を、トランスフェクション実験に使用するまで液体窒素中で保存した。
【０１１０】
Ｃｌ．６０／ｃｕは、ＨＣＶ抑制化合物を使用してレプリコンに関してＨｕｈ−７細胞を矯正することにより得た。第４、９、１２および１５日にＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）を用いてＨＣＶ  ＲＮＡの存在を判定した。第９日から、ＨＣＶ  ＲＮＡの量は検出限界未満であった。該レプリコンの消失を更に試験するために、４００万細胞の矯正クローン６０細胞（１５日間の処理の後）を１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８の存在下でプレーティングした。生存可能な細胞は観察されなかった。このことは、Ｇ−４１８耐性を付与しうるＨＣＶレプリコンが存在しないことを証明している。
【実施例２】
【０１１１】
機能的ＨＣＶレプリコンを含有する細胞クローンの選択および特徴づけ
Ｈｕｈ−細胞（２〜８×１０６個）を、インビトロ転写レプリコンＲＮＡ（１０〜２０μｇ）でエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、２．５×１０３〜１０×１０３／ｃｍ２の範囲の密度でプレーティングし、０．８〜１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で培養した。レプリコンでトランスフェクトされた細胞の大多数はＧ４１８に対して一過性に耐性となり、該薬物の存在下で通常７〜１２日間で倍加し、一方、無関係なＲＮＡでトランスフェクトされた細胞および模擬トランスフェクト化細胞は７日間より長くは生存しなかった（データは示していない）。Ｇ４１８に対する一過性の耐性は、該トランスフェクト化ＲＮＡから発現されたＮｅｏタンパク質の維持によると考えられた。なぜなら、それは、複製不可能な突然変異レプリコンでも観察されたからである。トランスフェクションの約２週間後、一過性の耐性は減弱し、ほとんどの細胞は死に、ＨＣＶＮｅｏ．１７  ＲＮＡでトランスフェクトされたサンプルにおいては、該抗生物質に対して永久的に耐性である細胞の小さなコロニーが認められたが、他のレプリコンＲＮＡでトランスフェクトされた細胞では認められなかった。
【０１１２】
いくつかの実験においては、Ｇ４１８耐性コロニーの頻度は１０〜１００コロニー／１０６トランスフェクト化細胞であった。約２０個のＧ４１８耐性コロニーを単離し、増殖させ、分子的に特徴づけた。核酸のＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ分析は、すべてのクローンがＨＣＶ  ＲＮＡを含有するがＨＣＶ  ＤＮＡを含有しないことを示し、このことは、Ｇ４１８耐性が機能的レプリコンの存在によるものであったことを示している（データは示していない）。この結果は、ノーザンブロット分析および３Ｈ−ウリジンでの代謝標識により確認され、これらは、予想サイズのゲノムＨＣＶ  ＲＮＡおよびアンチゲノムＨＣＶ  ＲＮＡの両方の存在を示した（データは示していない）。最後に、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光実験は、これらのクローンがすべてのＨＣＶ非構造タンパク質およびＮｅｏタンパク質を発現することを示した（データは示していない）。
【０１１３】
クローンは細胞形態および増殖速度の点で異なっていた。レプリコンＲＮＡコピー数（５００〜１００００分子／細胞）およびウイルスタンパク質発現もクローンによって様々であった（データは示していない）。しかし、レプリコンＲＮＡおよびタンパク質の量は、継代および培養条件によっても様々であり、細胞をコンフルエントに到達させなかった場合には、より高く、このことは、レプリコンが、分裂中の細胞においては静止細胞の場合より効率的に複製されることを示唆している。ウイルスポリタンパク質のプロセシングは、トランスフェクト化細胞において認められたのと同様の速度論で生じた。
【０１１４】
興味深いことに、すべての試験クローンにおいて、ＨＣＶの複製は、該細胞をＩＦＮ−α２ｂで処理することにより効率的に抑制された。該ＥＣ５０は、該クローンに応じて１〜１０Ｕ／ｍｌであった。
【実施例３】
【０１１５】
適応突然変異の同定
ＨＣＶＮｅｏ．１７  ＲＮＡトランスフェクションに由来するＧ４１８耐性クローンが少数であったことは、該レプリコンを該宿主細胞に適応させうる突然変異（適応突然変異）が複製に必要でありうること、および／または、小さな割合のＨｕｈ−７細胞しか、ＨＣＶの複製に適合しないことを示唆した。その第１の仮定を証明するために、選択した細胞クローンに由来するレプリコンＲＮＡ中の突然変異を同定した。
【０１１６】
種々のレプリコンのＲＮＡ配列を、標準的な技術を用いて決定した。そのような技術は、いくつかの独立したクローンからのＲＮＡの単離、逆転写によるｃＤＮＡの産生、ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅および適当なベクター中へのクローニングを含むものであった。５つのクローン（ＨＢＩ１０、ＨＢＩＩＩ１２、ＨＢＩＩＩ１８、ＨＢＩＩＩ２７、ＨＢＩＶ１）からのほぼ全てのＨＣＶ  ＮＳ領域（ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの３’末端における１２６ｂｐおよびＨＣＶ  ＮＳ領域の５６５０ｂｐ（すなわち、３’末端における２９８ヌクレオチドおよび全ＮＳ  ＯＲＦおよび））に伸長するｃＤＮＡを再クローニングし配列決定した。また、３つの更なるクローン（ＨＢ７７、ＨＢ６８およびＨＢ６０）からのＮＳ５Ａコード領域（ｎｔ．４７８４−６１６２）を再クローニングし配列決定した。
【０１１７】
レプリコンＲＮＡ中に存在する突然変異を、該クローニング法に由来するものから区別するために、独立したＲＴ−ＰＣＲ実験に由来する少なくとも２つの単離物を各細胞クローンに関して配列決定した。該ヌクレオチド配列と該親配列との比較は、各単離物がいくつかの突然変異を含有することを示した（表４Ａおよび４Ｂ）。
【０１１８】
【表４】
2004528017.tif 000005
2004528017.tif 000006
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2004528017.tif 000008
【０１１９】
突然変異の頻度は１．７×１０−３〜４．５×１０−３（平均３×１０−３）であった。１以上のヌクレオチドの挿入も観察されたが、突然変異の大多数はヌクレオチド置換であった（表４Ａおよび４Ｂ）。
【０１２０】
１つの単離物のみにおいて見出された突然変異（非コンセンサス）の約８５％は、再クローン化断片中にランダムに分布しており、おそらく、ＰＣＲ増幅中の過誤取込みを含むであろう。逆に、該突然変異の残り（１５％）は、独立したＲＴ−ＰＣＲ実験に由来する２以上の単離物において共通であり（コンセンサス突然変異）、おそらく、鋳型ＲＮＡ中に存在する突然変異を反映するものであろう。
【０１２１】
コンセンサス突然変異はすべての単離物において見出され、同じクローンに由来する単離物に共通（コンセンサスＡ）であるか又は異なるクローンに由来する単離物に共通（コンセンサスＢ）であった。同じ細胞クローンに由来する追加的単離物の分析は、コンセンサスＡ突然変異が、１つのクローンに由来するすべての単離物に必ずしも存在するわけではないことを示した（データは示していない）。この観察は、コンセンサスＢ突然変異の存在と共に、単一細胞クローンにおいてさえも、種々の配列を有する分子の準種（クエザイスペーシス）としてレプリコンが存在することを示唆している。
【０１２２】
非コンセンサス突然変異とは異なり、コンセンサス突然変異はランダムには分布していなかったが、ＮＳ５Ａタンパク質（頻度１×１０−３）およびＮＳ３タンパク質（頻度０．５×１０−３）をコードする領域中に密集していた。ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする領域中には１つのコンセンサス突然変異のみが見出され（頻度０．１×１０−３ヌクレオチド）、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂをコードする領域中には全く見出されなかった。興味深いことに、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ中にも１つのコンセンサス突然変異が認められた。
【０１２３】
ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ中で見出された２つのサイレント突然変異を除き、ＮＳ領域中に存在するコンセンサス突然変異は推定アミノ酸配列における変化を引き起こした（表５Ａおよび５Ｂ）。注目すべきことに、これらのアミノ酸の変化は、すべて又はほとんどの天然ＨＣＶ単離物において保存された残基において生じた。興味深いことに、クローンＨＢ７７およびＨＢ６０は、同じアミノ酸突然変異（Ｓ２２０４Ｒ）を引き起こす異なるヌクレオチド置換（それぞれＣ５３３７ＡおよびＣ５３３７Ｇ）を示した。
【０１２４】
【表５】
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2004528017.tif 000010
【実施例４】
【０１２５】
コンセンサス突然変異の機能的特徴づけ
再クローン化レプリコンにおけるコンセンサス突然変異の同定は、選択した細胞クローンに含有されるレプリコンＲＮＡの複製能がそのような突然変異の存在に左右されることを示した。この仮定を証明するために、レプリコンに対するいくつかのコンセンサス突然変異の効果を分析した。
【０１２６】
ＮＳ５Ａ領域中に見出されたコンセンサス突然変異を、より詳細に分析した。コンセンサス突然変異を非コンセンサス突然変異から分離し、単一または複数のコンセンサス突然変異を含有するｐＨＣＶＮｅｏ．１７誘導体を構築した（表６）。
【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
これらの構築物からインビトロで転写されたＲＮＡをＨｕｈ−７細胞内にトランスフェクトし、ネオマイシン耐性コロニー（Ｇ４１８  ｃｆｕ）を計数することにより複製に対する影響を推定した。表６に示すとおり、単一コンセンサス突然変異を含有する１つの構築物を除くすべてはＧ４１８  ｃｆｕ効率における有意な増加を示し、したがって、このことは、対応する突然変異が複製を改善したことを示している。注目すべきことに、ＮＳ５Ａ中に単一突然変異を含有する２つの突然変異体（ｍ３およびｍ１５）は、明らかに、すべての他の単一突然変異体より効率的であった。２以上の突然変異を含有する突然変異体の結果は、いくつかの組合せ（ｍ８、ｍ９、ｍ１１および恐らくｍ１０）における相乗効果の存在を示したが、１つの突然変異体（ｍ７）においては僅かに拮抗性の効果をも示した。
【実施例５】
【０１２９】
選択の不存在下でのレプリコンの複製
Ｇ４１８選択の不存在下でのＨＣＶレプリコンの複製を、定量的ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）を用いて検出した。トランスフェクションの２４時間後、ＮＳ５Ｂポリメラーゼの触媒性ＧＤＤモチーフ中に突然変異を含有するＧＡＡ対照レプリコンを含むすべてのレプリコンでトランスフェクトされた細胞において、多量のレプリコンＲＮＡが検出された。この結果は、非常に初期の時点（トランスフェクションの２４時間後まで）の分析が実質的には投入ＲＮＡを測定していることを示唆した。ノーザンブロット分析はまた、２４時間後に、該トランスフェクト化ＲＮＡの大多数が細胞内で分解することを示した（データは示していない）。
【０１３０】
後の時点における分析は、レプリコンＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔでトランスフェクトされた細胞においては、レプリコンＲＮＡの量が第４日には相当に減少し、最終的には検出不可能になるが（６／８日）、レプリコンｍ０、ｍ３およびｍ１５でトランスフェクトされた細胞においては高いままであることを示した（表７）。第６日には、レプリコンＲＮＡの量は、レプリコンＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔ、ｍ０およびｍ２でトランスフェクトされた細胞においては検出不可能になったが、レプリコンｍ３およびｍ１５でトランスフェクトされた細胞においては検出可能であった（表７）。
【０１３１】
【表７】
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【０１３２】
ｍ０、ｍ３およびｍ１５レプリコンＲＮＡの維持は、インターフェロンαまたはＨＣＶ抑制性化合物での処理により阻止された（データは示していない）。さらに、ＲＮＡの維持は、適応突然変異以外にＮＳ５Ｂ  ＧＡＡ突然変異を保持する突然変異レプリコンでは観察されなかった（データは示していない）。総合すると、これらの結果は、定量的ＰＣＲが、トランスフェクション後の初期の時点で複製をモニターするために利用可能であり、突然変異を含有するレプリコンＲＮＡの複製能を評価するために利用可能であることを示している。
【０１３３】
表６および７に示す結果の比較は、ＴａｑＭａｎにより検出されるレプリコンＲＮＡの量とＧ４１８  ｃｆｕ効率との間に良好な相関が存在することを示した。しかし、いくつかの突然変異体（ｍ２、ｍ３）は、Ｇ４１８  ｃｆｕ効率に対する顕著な効果、およびＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにより測定される初期複製に対する有ったとしても僅かな効果を示し、一方、他の突然変異体（ｍ０）は逆の挙動を示した。
【実施例６】
【０１３４】
ＨＣＶレプリコン増強細胞
ＨＣＶレプリコンを宿主中に導入し、ついで該宿主を該レプリコンに関して矯正することにより、ＨＣＶレプリコン増強細胞を製造した。適応突然変異（またはそれらの組合せ）自体は、Ｇ４１８  ｃｆｕ効率を２桁までも増加させ、初期複製を同等に増強した。しかし、最も効果的な突然変異体においてさえも、小さな割合のトランスフェクト化細胞（＜５％、データは示していない）しか、機能的レプリコンを含有するＧ４１８耐性クローンを与えなかった。この観察は、少なくとも部分的には、Ｈｕｈ−７細胞の低いクローニング効率に帰され（データは示していない）、一部のＨｕｈ−７細胞が複製に適合したに過ぎなかった。
【０１３５】
いくつかのクローンを、それらをＩＦＮ−αまたはＨＣＶ抑制性化合物で約２週間にわたり処理することにより、内因性レプリコンに関して矯正した。該処理の終了時における分析は、ウイルスタンパク質もレプリコンＲＮＡも検出不可能であることを示した。
【０１３６】
矯正細胞（１０ＩＦＮおよびＣｌ．６０／ｃｕ）を突然変異レプリコンでトランスフェクトし、複製効率をネオマイシン耐性クローンの計数により（１０ＩＦＮ）またはＴａｑＭａｎにより（１０ＩＦＮおよびＣｌ．６０／ｃｕ）測定した。表８に示すとおり、すべての試験レプリコンに関して、１０ＩＦＮ細胞におけるＧ４１８  ｃｆｕ効率は親Ｈｕｈ−７細胞の場合より少なくとも５倍高かった。Ｇ４１８  ｃｆｕ効率におけるこの増加は、特に、突然変異体（ｍ３、ｍ５、ｍ８、ｍ９、ｍ１５）のサブセットに関連していた。
【０１３７】
【表８】
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【０１３８】
顕著だったのは、最良の突然変異体が、Ｇ４１８の不存在下で増殖した細胞クローンの２０〜８０％の範囲の多数のＧ４１８耐性クローンを与えたことであり（データは示していない）、このことは、１０ＩＦＮ細胞の大多数が複製に適合したことを示している。この結果は、ＴａｑＭａｎ分析により確認され（表９）、この場合、親Ｈｕｈ−７細胞に対する増加倍率は非常に高かった。該データは、適応突然変異を保持するレプリコンが、１０ＩＦＮおよびＣｌ．６０／ｃｕのようなレプリコン増強細胞内で活発に複製されることを示している。
【０１３９】
【表９】
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【０１４０】
９６ウェルマイクロタイタープレート中にプレーティングされたトランスフェクト化細胞においてＮＳ３タンパク質を検出するよう設計されたＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ）を用いて、レプリコン増強細胞においてウイルスタンパク質の発現を測定した。表１０に示すとおり、トランスフェクションの２４時間後、すべての試験レプリコンでトランスフェクトされた細胞は、低いが検出可能なレベルのＮＳ３タンパク質を発現した。
【０１４１】
【表１０】
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【０１４２】
表１０に示されている初期発現は、トランスフェクトされたＲＮＡの翻訳によるものであるらしい。なぜなら、それはすべてのレプリコン（ＧＡＡ突然変異を保持するレプリコンを含む）において比較しうるものであり、ＩＦＮ−αにより影響されなかったからである。トランスフェクションの４日後、ＮＳ３発現は、コンセンサス突然変異を保持するレプリコンでトランスフェクトされた細胞においては持続し増加したが、ｗｔおよびＧＡＡレプリコンでトランスフェクトされた細胞においてはもはや検出することができなかった。また、細胞をＩＦＮ−αの存在下で培養した場合には、ＮＳ３発現はほぼ完全に阻止された。
【０１４３】
総合すると、これらの結果は、Ｎ３発現のレベルが複製率を反映することを示した。実際のところ、ＮＳ３発現レベル（表１０）は、ＴａｑＭａｎにより測定したＲＮＡレベル（表９）と釣り合った。１０ＩＦＮ細胞の高い複製能は更に免疫蛍光実験により確認され、それは、レプリコンｍ８およびｍ１１でトランスフェクトされた細胞の５０％以上が高レベルのウイルスタンパク質を発現すること、および発現がＩＦＮ−αによりほぼ完全に阻止されることを示した。
【実施例７】
【０１４４】
完全長構築物の複製
本実施例は、本明細書に記載の適応突然変異を含有する完全長ＨＣＶゲノムがレプリコン増強宿主細胞内で複製される能力を例示する。ＨＣＶ単離物Ｃｏｎ−１（ＥＭＢＬ−Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３８７９９）（プラスミドｐＨＣＶＲＢＦＬ．ｗｔ）ならびにＮ２０４１ＴおよびＳ２１７３Ｆ突然変異（プラスミドｐＨＣＶＲＢＦＬ．ｍ８）またはＳ２１９７ＦおよびＡ２１９９Ｔ突然変異（プラスミドｐＨＣＶＲＢＦＬ．ｍ１１）を含有する２つの誘導体の完全長配列を、出発構築物として使用した。
【０１４５】
該出発構築物から転写されたＲＮＡを１０ＩＦＮ細胞内にトランスフェクトし、それらの複製能をＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光およびＴａｑＭａｎにより評価した。コンセンサス突然変異を含有する両方の構築物（ｐＨＣＶＲＢＦＬ．ｍ８およびｐＨＣＶＲＢＦＬ．ｍ１１）は複製されたが、該ｗｔ．構築物では複製の徴候は全く観察されなかった（データは示されていない）。
【実施例８】
【０１４６】
レポーター遺伝子を有するレプリコン
本実施例は、レポーター遺伝子および適応突然変異を含有するＨＣＶレプリコンを例示する。Ｎｅｏコード領域がヒト胎盤分泌性アルカリホスファターゼのコード領域で置換されたｐＨＣＶＮｅｏ１７．ｗｔ誘導体（ｐＲＢＳＥＡＰ５．ｗｔ）、ならびにＮ２０４１ＴおよびＳ２１７３Ｆ突然変異をも含有する誘導体（プラスミドｐＲＢＳＥＡＰ５．ｍ８）を構築した。これらのプラスミドから転写されたＲＮＡを１０ＩＦＮ細胞内にトランスフェクトし、それらの複製能を、アルカリホスファターゼの分泌を測定することにより評価した。分泌の速度論の分析は、プラスミドｐＲＢＳＥＡＰ５．ｍ８のみが複製に適合することを示唆した（データは示していない）。
【実施例９】
【０１４７】
配列番号１および２
配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．）１および２を以下に示す。
【０１４８】
【化１】
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【０１４９】
【化２】
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【０１５０】
他の実施形態も特許請求の範囲内である。いくつかの実施形態が示され説明されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐＨＣＶＮｅｏ．１７コード鎖の核酸配列（配列番号３）を示す。
【０１５２】
ｐＨＣＶＮｅｏ．１７の相違領域は次のとおりである。
１−３４１：ＨＣＶ  ５’非翻訳領域であり、これは、コア−ｎｅｏ融合タンパク質の翻訳を駆動する；
３４２−１１８１：コア−ｎｅｏ融合タンパク質、選択マーカー；
１１９０−１５５０：脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入シグナルであり、これは、ＨＣＶ  ＮＳ領域の翻訳を駆動する；
１５５１−１８００：脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入シグナルであり、これは、ＨＣＶ  ＮＳ領域の翻訳を駆動する；
１８０１−３１００：非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質；
１８０１−３１００：非構造タンパク質３（ＮＳ３）、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ；
３１０１−４６５０：非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質；
３１０１−３６９６：非構造タンパク質３（ＮＳ３）、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ；
３６９７−３８５８：非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）、ＮＳ３プロテアーゼ補因子；
３８５９−４６４１：非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）；
４６４２−４６５０：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）；
４６５１−７７５５：非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質；
４６５１−５９８２：非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）；
５９８３−６２００：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；
６２０１−７７５０：非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質；
６２０１−７７５０：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；
７７５１−７７５５：非構造タンパク質３から非構造タンパク質５ＢまでのＨＣＶポリタンパク質；
７７５１−７７５５：非構造タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；
７７５９−７９８９：ＨＣＶ  ３’非翻訳領域；および
７９９０−９３００：複製起点、βラクタマーゼコード配列およびＴ７プロモーターを含むプラスミド配列。
９３０１−１０６９０：複製起点、βラクタマーゼコード配列およびＴ７プロモーターを含むプラスミド配列。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐＨＣＶＮｅｏ．１７コード鎖の核酸配列（配列番号３）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｐＨＣＶＮｅｏ．１７コード鎖の核酸配列（配列番号３）を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ｐＨＣＶＮｅｏ．１７コード鎖の核酸配列（配列番号３）を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ｐＨＣＶＮｅｏ．１７コード鎖の核酸配列（配列番号３）を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ｐＨＣＶＮｅｏ．１７コード鎖の核酸配列（配列番号３）を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ｐＨＣＶＮｅｏ．１７コード鎖の核酸配列（配列番号３）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004528017.tif 000101
2004528017.tif 000102
2004528017.tif 000103
2004528017.tif 000104
2004528017.tif 000105
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