(57)【要約】本発明は、新規なＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ（補体レセプター）様ポリペプチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、および選択的結合因子を提供する。本発明はまた、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ（補体レセプター）様ポリペプチドを産生するための方法を提供する。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ（補体レセプター）様ポリペプチドと関連する疾患の、処置、診断、緩和、または予防のための方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号３、または配列番号６に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体に中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、
核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドに少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、または配列番号６に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号６、または（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号６、または（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体に中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、
核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体に中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；および
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、
核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを産生するプロセスであって、請求項５に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドを発現するのに適切な条件下で培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって産生された、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、前記核酸分子は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、ネイティブなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドについてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、プロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、ここで、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、核酸分子。
【請求項１２】
化合物が、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの活性または産生を阻害するか否かを同定するためのプロセスであって、該プロセスは、請求項５、６、または７に記載の細胞を該化合物に曝露する工程、および該細胞におけるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの活性または産生を測定する工程、を包含する、プロセス。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）成熟Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列であって、該成熟ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に含まれるアミノ酸配列を含み、そして必要に応じてさらに、アミノ末端メチオニンを含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７のオルソログについてのアミノ酸配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも約７０％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、フラグメント；
（ｅ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７、あるいは（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つに示されるいずれかのアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１、２、または３に記載の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチドで動物を免疫することによって産生された、抗体。
【請求項１９】
請求項１３、１４または１５に記載のポリペプチドを特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
モノクローナル抗体である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項２２】
請求項１８、１９、または２０に記載の抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様抗体またはそのフラグメントを用いて、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの量を検出または定量する方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのポリペプチドを特異的に結合する選択的結合因子またはそのフラグメントであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７の少なくとも１つに示されるアミノ酸配列のフラグメント；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の天然に存在する改変体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２４】
抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
ヒト化抗体である、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項３０】
ＣＤＲグラフト化抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項３１】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
可変領域フラグメントである、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項３２に記載の可変領域フラグメント。
【請求項３４】
選択的結合因子またはそのフラグメントであって、配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子。
【請求項３５】
検出可能な標識に結合されている、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項３６】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの生物学的活性をアンタゴナイズする、請求項２３に記載の選択的結合因子。
【請求項３７】
疾患、状態または障害を、処置、予防または改善するための方法であって、請求項２３に記載の選択的結合因子の有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
配列番号２、配列番号４、または配列番号７からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生された、選択的結合因子。
【請求項３９】
請求項１、２または３に記載のポリペプチドを結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項４０】
請求項１３、１４、または１５に記載のポリペプチド、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４１】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号７の成熟アミノ酸配列部分を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
請求項１３、１４、または１５に記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項４４】
水溶性ポリマーで共有結合的に改変されている、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
請求項４４に記載のポリペプチドであって、前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項４６】
請求項１、２または３に記載の核酸分子、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４７】
前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項１、２または３に記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項４９】
異種アミノ酸配列に融合された請求項１３、１４、または１５に記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項５０】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項４９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５１】
医学的状態を、処置、予防または改善するための方法であって、請求項１３、１４もしくは１５に記載のポリペプチド、または請求項１、２もしくは３に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを、患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５２】
被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の請求項１３、１４もしくは１５に記載のポリペプチド、または請求項１、２もしくは３に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現の存在または量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適切な膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞、
を備え、ここで、該細胞は、請求項１３、１４または１５に記載のタンパク質を分泌し、そして該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、かつ該細胞に有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項５４】
ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、１４または１５に記載のポリペプチドと化合物とを接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該ポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５５】
動物におけるポリペプチドのレベルを調節する方法であって、請求項１、２または３に記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５６】
請求項１、２または３に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、本明細書において参考として援用される、２０００年８月２日付けで出願された米国仮出願番号第６０／２２２，５０４号、および２０００年１１月２８日付けで出願された米国出願番号第０９／７２８，７８７号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規なＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、薬学的組成物、選択的結合因子、および方法に関する。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドと関連する疾患の診断、処置、改善、および／または予防のための方法もまた提供される。
【０００３】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規治療剤の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と合わされて、ゲノムの一部および全体へと重複配列を構築すること、ならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較によって、以前に同定された配列および／または構造の目印に対して相同性の程度を決定することが可能になる。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤としての使用のための有利な特性を、生成物に与え得る。
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における有意な技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発に関する可能性は、未だほとんど実現されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療分子に対して「標的」として作用し得る）は、未だ同定されていない。
【０００５】
従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、新規のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：）１、配列番号３、または配列番号６に記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００８】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドに対して、少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、または配列番号６に記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号６、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号６、または（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００９】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のコードされるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）成熟Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドのアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に含まれるアミノ酸配列を含み、そして必要に応じてさらにアミノ末端メチオニンを含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）についてのアミノ酸配列であって、ここでそのコードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列のフラグメント；
（ｅ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に記載のアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｃ）のうちの少なくとも１つのいずれかの対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００１１】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００１２】
また、上記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドも提供される。
【００１３】
本発明はまた、本明細書中に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に記載の組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにこの宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてそのようにして産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００１４】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明によって包含される。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様核酸分子は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドの発現およびレベルの増加（これは、循環レベルの増加を含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物である。
【００１５】
また、本発明のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドの誘導体が提供される。
【００１６】
さらに、本発明のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドを特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が提供される。このような抗体、およびペプチドは、アゴニスト性またはアンタゴニスト性であり得る。
【００１７】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチドまたは選択的結合因子、および１以上の薬学的に受容可能な処方剤を含む薬学的組成物もまた、本発明によって包含される。この薬学的組成物は、本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドの治療的有効量を提供するように使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００１８】
本発明のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドおよび核酸分子を使用して、本明細書中に列挙された疾患および障害を含む疾患および障害を処置、予防、改善、および／または検出し得る。
【００１９】
本発明はまた、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドに結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドを試験分子と接触させる工程、およびこのポリペプチドへの試験分子の結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドのアゴニストであるか、またはアンタゴニストであるかを決定する工程を包含する。本発明はさらに、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドの発現に対する分子の影響、またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２０】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドの発現を調節する方法およびレベルを調整（すなわち、増加または減少）する方法もまた、本発明によって包含される。１つの方法は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドの発現を調節または調整するエレメントを含む核酸分子が投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるような、遺伝子治療、細胞療法、およびアンチセンス療法が挙げられる。
【００２１】
このＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドは、そのリガンドを同定するために使用され得る。種々の形態の「発現クローニング」が、レセプターについてのリガンドをクローニングするために使用されている（例えば、Ｄａｖｉｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ，８７：１１６１〜６９を参照のこと）。これらおよび他のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様リガンドクローニング実験が、本明細書中により詳細に記載される。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様リガンドの単離により、このＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様シグナル伝達経路の新規なアゴニストおよび／またはアンタゴニストの同定または開発が可能になる。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様リガンド、抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様リガンド抗体およびその誘導体、低分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらのうちのいずれもが、１つ以上の疾患または障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を潜在的に処置するために使用され得る。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、構成上の目的のためのみであり、そしてそこに記載される内容を限定するように解釈されるべきではない。本願において列挙される全ての参考文献が、明確に、本明細書中に参考として援用される。
【００２３】
（定義）
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ）」は、本明細書において「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様」と省略され、そしてまた「ＡＧＰ−４１７７３」とも称される。用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ−ｌｉｋｅ　ｇｅｎｅ）」、または「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」とは、配列番号１、配列番号３、または配列番号６に示されるヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むかまたはこれらからなる、核酸分子をいう。
【００２４】
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、以下が挙げられる：Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド対立遺伝子改変体、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドオルソログ、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドスプライス改変体、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体、およびＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド誘導体。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、本明細書中に定義されるように、成熟ポリペプチドであり得、そして調製方法によって、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００２５】
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物または生物の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの代替形態のうちの１つをいう。
【００２６】
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド誘導体」とは、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチド、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド対立遺伝子改変体、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドオルソログ、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドスプライス改変体またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体をいう。
【００２７】
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸付加または置換もしくは内部欠失を有する、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に示されるポリペプチド、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド対立遺伝子改変体、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドオルソログ、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドスプライス改変体、および／またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体の、アミノ末端での短縮（リーダー配列を有しても有しなくてもよい）および／またはカルボキシ末端での短縮を含むポリペプチドをいう（ここで、得られるポリペプチドは、少なくとも６個以上のアミノ酸長である）。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングまたはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの膜貫通形態または膜結合形態について、好ましいフラグメントとして、膜貫通または膜結合ドメインを欠くような可溶性形態が挙げられる。好ましい実施形態において、短縮は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多いアミノ酸を含む。このように生成されたポリペプチドフラグメントは、約２５連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含む。このようなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドフラグメントは、必要に応じてアミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに対する抗体を作製するために用いられ得ることが理解される。
【００２８】
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様融合ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドアミノ酸配列と比べて、１つ以上のアミノ酸欠失、置換、または内部付加を有する、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリヌクレオチド、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド対立遺伝子改変体、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドオルソログ、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドスプライス改変体、またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体の、アミノ末端またはカルボキシル末端での１つ以上のアミノ酸の融合体（例えば、異種ペプチドまたは異種ポリペプチド）をいう。
【００２９】
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドオルソログ」とは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
【００３０】
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００３１】
用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体」とは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドフラグメント）、および／または付加（例えば、内部付加および／またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列（リーダー配列を有するかまたは有さない）を含むＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在する（例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド対立遺伝子改変体、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドオルソログ、およびＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドスプライス改変体）か、または、人工的に構築され得る。このようなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体は、配列番号１、配列番号３、または配列番号６に示されるＤＮＡ配列から変化するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および／または欠失を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００３２】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生し得る分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００３３】
用語「生物学的に活性なＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つの特徴的な活性を有するＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをいう。
【００３４】
用語「有効量」および「治療有効量」とは、各々、本明細書中に示されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子の量をいう。
【００３５】
用語「発現ベクター」とは、宿主細胞における使用に適切であり、そして異種核酸配列の発現を、指示および／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
用語「宿主細胞」を用いて、核酸配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいう。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【００３７】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定されるような、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸配列の列間の一致によって決定されるような、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうちより小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により取り扱われたギャップアラインメント（存在する場合）との間の一致の同一パーセントを測定する。
【００３８】
用語「類似性」は、概念に関するが、「同一性」とは対照的に、同一的一致および保存的置換の一致の両方を含む類似性の基準（尺度）をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）である。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間の類似性の程度は、これらの２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【００３９】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総ＤＮＡが供給源細胞から単離される場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない本発明の核酸分子、をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、任意の他の混入核酸分子、または天然の環境において見出される他の混入物（これらは、ポリペプチド産生におけるその使用、またはその治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げる）を実質的に含まない。
【００４０】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に連結しない（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）、本発明のポリペプチド、（３）天然には連結しないポリペプチドに作動可能に連結（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）する、本発明のポリペプチド、または（４）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、その治療的用途、診断用途、予防用途または研究用途を妨害する、その天然の環境において見出される任意の他の混入ポリペプチドまたは他の混入物を、実質的に含まない。
【００４１】
用語「成熟Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをいう。成熟Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドはまた、他の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型グリコシル化など）を含み得る。
【００４２】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を包含し、これは、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイド（シュード）イソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００４３】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質をいう。
【００４４】
用語「作動可能に連結された」を用いて、本明細書中では、隣接配列の配置をいい、ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成または構築される。従って、コード配列に作動可能に連結した隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳を行うことが可能であり得る。例えば、コード配列は、このプロモーターがコード配列の転写を指示し得る場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、これが正確に機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳性であるが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なおこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００４５】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子、またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様選択的結合因子の送達の達成または増強に適切な１つ以上の処方物質をいう。
【００４６】
用語「選択的結合因子」とは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに特異性を有する分子（単数または複数）をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子が、ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに結合し、かつヒトの非Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間変形（例えば、マウスポリペプチドおよびラットポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。
【００４７】
用語「形質導入」を用いて、１つの細菌から別のものへの遺伝子の移入（通常、ファージによる）をいう。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞の配列の獲得および移入をいう。
【００４８】
用語「トランスフェクション」を用いて、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡの取り込みをいう。そして、細胞は、その外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、そして、本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ　１３：１９７（１９８１）を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
【００４９】
用語「形質転換」は、本明細書中に使用される場合、細胞の遺伝特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含むように改変されている場合、形質転換されている。例えば、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝的に改変された場合、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、その形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へ物理的に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組み換わり得るか、複製されないエピソームエレメントとして一過性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、そのＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、安定に形質転換されているとみなされる。
【００５０】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
【００５１】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連した核酸分子が、配列番号１、配列番号３、または配列番号６の核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を包含すること、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を包含することが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４、または配列番号７におけるポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／もしくは欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００５２】
フラグメントは、配列番号２、配列番号４、または配列番号７のポリペプチドの少なくとも約２５個のアミノ酸残基、または約５０個、または約７５個、または約１００個、または約１００個より多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする分子を包含する。
【００５３】
さらに、関連したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子は、本明細書中で定義したとおりの中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号６の核酸分子、または配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子、または本明細書中に定義されるような核酸フラグメント、または本明細書に定義されるようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの完全に相補的な配列と、ハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含する。ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを関連した配列についてスクリーニングするために、本明細書中に提供されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様配列を用いてハイブリダイゼーションプローブが調製され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列のうちの、既知配列に対して顕著な同一性を示す領域は、本明細書中に記載されるとおりの配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
【００５４】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が非常に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ顕著に不一致のＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　第４章、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００５５】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響される。他の薬剤は、非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、ｆｉｃｏｌｌ、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨからほぼ独立する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　第４章、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００５６】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって評価され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）−６００／Ｎ−０．７２（ホルムアミド％）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、Ｇ＋Ｃ％は、ハイブリッド中での（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、１％の不一致毎に約１℃低下する。
【００５７】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例示として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中での５０℃という「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を可能にする。
【００５８】
「高度に」ストリンジェントな条件と「中程度に」ストリンジェントな条件との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長さのＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００５９】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ　ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な推定は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃　＋　Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）中でのナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　６８３頁（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編，１９８１）を参照のこと。
【００６０】
オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェンシー洗浄条件は通常、６×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中でのそのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００６１】
別の実施形態では、関連した核酸分子は、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号６に示されるヌクレオチド配列に対して約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなるか、または配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に示すポリペプチドに対して約７０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくは本質的にこれからなる。好ましい実施形態では、このヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号６に示されるヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８０パーセント、もしくは約８５パーセント、もしくは約９０パーセント、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるか、またはこのヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に示されるポリペプチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８０パーセント、もしくは約８５パーセント、もしくは約９０パーセント、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。
【００６２】
核酸配列における相違は、配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の保存的および／または非保存的改変をもたらし得る。
【００６３】
配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する、対応する改変）は、天然に存在するＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴と類似の機能的特徴および化学的特徴を有するＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを生じる。対照的に、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、以下を維持することに対するその影響が顕著に異なる、配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得る：（ａ）例えば、シートコンホメーションもしくはヘリックスコンホメーションとしての、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ（バルク）。
【００６４】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんど影響がないかまたは全く影響がないような、非ネイティブ残基によるネイティブなアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンによって置換され得る。
【００６５】
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によってではなく、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態が挙げられる。
【００６６】
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてクラスに分けられ得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６７】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーへの交換を含み得る。このような置換された残基は、非ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドオルソログと相同性であるヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの領域、またはこの分子の非相同性領域に導入され得る。
【００６８】
このような変更を作製する場合、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｉｎｄｅｘ）が、考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられる。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００６９】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える疎水性親水性アミノ酸指標の重要性が、当該分野で理解されている。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１，１９８２。特定のアミノ酸が、類似した疎水性親水性の指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され得、そしてなお、類似した生物学的活性を保持するということは公知である。疎水性親水性指標に基づいて変更を作製する際、疎水性親水性指標が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、疎水性親水性指標が±１内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして疎水性親水性指標が±０．５内であるアミノ酸置換がなおより特に好ましい。
【００７０】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得ること、特に、それによって作製される生物学的に機能的に等価なタンパク質またはペプチドが本発明における場合と同様に免疫学的な実施形態において使用されることが意図される場合になされることもまた、当該分野で理解される。タンパク質の最も大きな局所平均親水性は、隣接アミノ酸の親水性によって支配される場合、その免疫原性および抗原性（すなわち、そのタンパク質の生物学的特性）と相関する。
【００７１】
以下の親水性値が、アミノ酸残基に対して割りあてられる：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づいて変更を作製する際、親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして親水性値が±０．５内であるアミノ酸置換がなおより特に好ましい。当業者はまた、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」ともいわれる。
【００７２】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、そのような置換が所望されるときに当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの重要な残基を決定するために使用され得るか、または本明細書中に記載されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させるために使用され得る。
【００７３】
例示的なアミノ酸置換を、表Ｉに示す。
【００７４】
【表１】
2004504831.tif 000002
当業者は、周知技術を用いて配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示されるポリペプチドの適切な改変体を決定し得る。活性を崩壊させることなく変化され得る分子の適切な領域を同定するため、当業者は、活性に重要であると考えられない領域を標的し得る。例えば、同じ種由来または他の種由来の、類似した活性を有する類似のポリペプチドが既知の場合、当業者は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似したポリペプチドと比較し得る。そのような比較を用いて、当業者は、類似したポリペプチドの間で保存されているその分子の残基および部分を同定し得る。そのような類似したポリペプチドに対して保存されていないＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの領域における変化は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの生物学的活性および／または構造に逆の影響をおそらくほとんど与えないことが理解される。当業者はまた、たとえ比較的保存された領域においても、活性を維持したままで、天然に存在する残基を化学的に類似したアミノ酸で代用し得る（保存的アミノ酸残基置換）ことを理解する。従って、生物学的活性または構造に対して重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を崩壊させることなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００７５】
さらに、活性または構造に重要である類似したポリペプチドにおける残基を同定する構造−機能研究を、当業者は再検討し得る。そのような比較を考慮して、当業者は、類似したポリペプチドにおいて活性もしくは構造に重要であるアミノ酸残基に対応する、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのそのような予測された重要なアミノ酸残基の代わりに、化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【００７６】
当業者はまた、類似したポリペプチドにおける三次元構造に関連して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。そのような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造についてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを推測し得る。当業者は、タンパク質の表面上であると推測されるアミノ酸残基に対して極端な変更を作製しないように選択し得る。なぜなら、そのような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一アミノ酸置換を含む試験改変体を作製し得る。次いで、この改変体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。そのような改変体を使用して、適切な改変体に関する情報を集め得る。例えば、当業者が、特定のアミノ酸残基に対する変更が、崩壊された活性、不適当に減少された活性、または不適切な活性を生じることを発見した場合、そのような変更を有する改変体は、回避される。言い換えると、そのような慣用的な実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独または他の変異と組み合わせてのいずれかで、さらなる置換が回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００７７】
多数の科学刊行物が、二次構造の推測に向けられている。Ｍｏｕｌｔ　Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、２６：３６７−３８４、（１９７９）を参照のこと。さらに、二次構造の予測を補助するコンピュータープログラムが、現在利用可能である。二次構造を予測する方法の１つは、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％よりも大きい配列同一性、または４０％よりも大きい配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長により、二次構造の推測可能性（ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在的な折り畳みの数を含む）の増大がもたらされた。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照のこと。所定のポリペプチドもしくはタンパク質において限定された数の折り畳みが存在すること、および一旦構造の臨界の数が決定されると、構造予測が劇的により正確になること、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７（３）３６９−３７６（１９９７））。
【００７８】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４（１）：１５−９（１９９６））、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４（１３）４３５５−４３５８（１９８７））、および「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒ、前出を参照のこと）が、挙げられる。
【００７９】
好ましいＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ連結炭水化物鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ連結炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ連結部位が作製される、Ｎ連結炭水化物鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性なコンホメーションにリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００８０】
さらに、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体は、相同なポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成し得るか、または異種のポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能するためのエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその一部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合するリガンドまたはその一部分；触媒活性である酵素またはその一部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加するポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体とは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【００８１】
融合は、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体の、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでなされ得る。融合は、リンカー分子またはアダプター分子なしで直接的であり得るか、あるいはリンカー分子またはアダプター分子を使用して間接的であり得る。リンカー分子またはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基、代表的には約２０〜約５０個までのアミノ酸残基であり得る。リンカー分子またはアダプター分子はまた、融合部分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ、またはプロテアーゼの切断部位を有するように設計され得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載される方法に従って誘導され得ることが理解される。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部分（抗原に結合する、「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに食細胞による補体活性化および攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメインを含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方、Ｆａｂは短寿命である（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５−３１（１９８９））。治療タンパク質と一緒に構築される場合、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体固定およびおそらく胎盤輸送のような機能でさえ組込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野で公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８３】
【表２】
2004504831.tif 000003
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の全てまたは一部が、当業者に公知の方法を使用して、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて、融合され得る。得られるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物よりもインビボにおいて実質的に長い半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合により、融合ポリペプチドの二量化／多量体化が可能になる。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療品質、循環時間、もしくは減少した凝集などのような特定の品質を改善するように変更され得る。
【００８４】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ　Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ　１，Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ　Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｌｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を与えるように、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）から公的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００８６】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、標的のポリペプチドの少なくとも５０個連続するアミノ酸にわたるアラインメントを生じる。
【００８７】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ　ｏｐｅｎｉｎｇ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）の対角（ｄｉａｇｏｎａｌ）の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ　２５０またはＢＬＯＳＵＭ　６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列については、Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｖｏｌ．５（補遺３　１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ　６２比較行列については、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１０９１５−１０９１９を参照のこと）もまた、このアルゴリズムによって使用される。
【００８８】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較行列：ＢＬＯＳＵＭ　６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５〜１０９１９（１９９２））；
ギャップペナルティー：１２
ギャップレングスペナルティー：４
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｏｆ　Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：０
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【００８９】
核酸分子配列比較についての好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップレングスペナルティー：３。
ＧＡＰプログラムはまた、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメーターは、核酸分子比較についてのデフォルトパラメーターである。
【００９０】
他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較行列、類似性の閾値などが使用され得、これには、Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む。なされる特定の選択は、当業者に明らかであり、なされる特定の比較（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ）；さらに、比較が、所定の配列対の間である（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）か、または一つの配列と配列の大きなデータベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるか）に依存する。
【００９１】
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子は組換え手段および他の手段によって産生され得ることが、当業者によって理解される。
【００９２】
（核酸分子）
核酸分子は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、種々の方法（化学合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニングおよび／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含むが、これらに限定されない）で容易に獲得され得る。
【００９３】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））および／またはＡｕｓｕｂｅｌら編（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４））に記載される方法である。本発明は、本明細書中に記載される核酸分子およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９４】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が一つの種から同定された場合、その遺伝子の全てまたは一部は、同じ種由来のオルソログ遺伝子または関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用され得る。プローブまたはプライマーは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。さらに、配列番号１、配列番号３、または配列番号６に記載される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングし、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度または高いストリンジェンシーの条件をスクリーニングのために使用して、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小にする。
【００９５】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現クローニング（これは、発現されたタンパク質の性質に基づく陽性クローンの検出を使用する）によって同定され得る。代表的には、核酸ライブラリーは、宿主細胞表面において発現されそして提示されるクローニングタンパク質への抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）の結合によってスクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識を用いて修飾される。
【００９６】
以下に記載される説明に従って行われる組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを作製し、そしてコードされるポリペプチドを発現させ得る。例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を容易に作製し得る。次いで、この配列を使用して検出プローブまたは増幅プライマーを作製し得る。あるいは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、大量に産生され得る。
【００９７】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリメラーゼが、これら２つのプライマー間のｃＤＮＡの領域を増幅する。
【００９８】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−７３４（１９８９）によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されているか否かに依存して、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【００９９】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先度に関する「Ｅｃｏｈｉｇｈ．ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピューターアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が挙げられる。
【０１００】
（ベクターおよび宿主細胞）
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入し得る。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８５巻、Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）を参照のこと。
【０１０１】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のためならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１０２】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または他の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃ）（これらに対して市販の抗体が存在する）をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドから除去され得る。
【０１０３】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または宿主細胞系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１０４】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知であるいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。代表的には、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１０５】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じもしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列は得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子（単数または複数）を含み得る大きなＤＮＡ断片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法を使用する単離によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１０６】
複製起点は、代表的に、商業的に購入した原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクターの増幅は、いくつかの場合において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、複製起点部位は、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品番号３０３−３ｓ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むので、しばしば、使用される）。
【０１０７】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続くポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローニングされるか、またはなおベクターの一部として商業的に購入されるが、これはまた、本明細書中に記載されるような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１０８】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるタンパク質；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うタンパク質；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１０９】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の染色体の連続的な生成の内に直列に反復されるプロセスである。哺乳動物細胞についての適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１０】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガルノ配列（原核性物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。シャイン・ダルガルノ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのシャイン・ダルガルノ配列が、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、そして原核生物ベクターにおいて使用される。
【０１１１】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子のコード領域に位置するか、または直接Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドコード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性である任意のシグナル配列が、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子またはｃＤＮＡ核酸分子に対して同種（天然に存在する）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。大部分の場合において、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの分泌は、分泌されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子の一部であり得る。
【０１１２】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が、本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセスしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１１３】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプレ配列を付加し得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、−１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に除去されないかもしれない。例えば、最終タンパク質産物は、Ｎ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域を切断する場合、所望のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１１４】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない（大部分のｃＤＮＡについて）場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子に関するイントロンの位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様　ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側で、ポリ−Ａ転写終結配列の５’側である。好ましくは、イントロン（単数または複数）は、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの１つの側または他の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。イントロンが、挿入される宿主細胞に適合性である場合、任意の供給源（任意のウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得る。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１１５】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは各々、代表的には、宿主生物によって認識され、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内）に配置される非転写配列である。プロモーターは、慣習的に、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）の１つにグループ化される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または欠如、あるいは温度の変化）に応答してそれらの制御下で、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対してほとんど制御しないかまたは制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡから制限酵素消化によってプロモーターを取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子プロモーター配列は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子の増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して大きい転写および発現タンパク質のより高い産生が可能であり、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１１６】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；ならびにハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、それによって、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡ配列にそれらを連結し得る。
【０１１７】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１１８】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子転写を制御する際に目的となり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−３１０、１９８１）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ　２２：７８７−７９７，１９８０）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１４４−１４４５，１９８１）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２，１９８２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３７２７−３７３１，１９７８）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５，１９８３）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域もまた関心が高い：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，Ｃｅｌｌ　３８：６３９−６４６，１９８４；Ｏｒｎｉｔｚら，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　７：４２５−５１５，１９８７）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５−１２２，１９８５）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，Ｃｅｌｌ　３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−１４４４，１９８７）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，Ｃｅｌｌ　４５：４８５−４９５，１９８６）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６，１９８７）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−１６４８，１９８５；Ｈａｍｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：５３−５８，１９８７）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１，１９８７）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら，Ｃｅｌｌ　４６：８９−９４，１９８６）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，Ｃｅｌｌ　４８：７０３−７１２，１９８７）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ　３１４：２８��−２８６，１９８５）；ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３７２−１３７８，１９８６）。
【０１１９】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、比較的方向および位置に非依存性である。これらは、転写ユニットに対して５’側および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子に対して５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’側の部位に配置される。
【０１２０】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。所望される隣接配列の１つ以上が予めベクター内に存在しない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２１】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５　（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開番号ＷＯ　９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１２２】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはバキュロウイルス発現系のようなウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）のようなプラスミドが挙げられる。
【０１２３】
ベクターが構築され、そしてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが、増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドについての発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を含む周知の方法、または他の公知の技術によって達成され得る。選択される方法は、使用される宿主細胞の種類の機能にいくぶん関連する。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。
【０１２４】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合にＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを合成し、これは、続いて、培養培地から（宿主細胞がそのポリペプチドを培地に分泌する場合）収集され得るか、または直接そのポリペプチドを産生する宿主細胞から収集される（そのポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子へと折り畳まれる容易さなどの種々の因子に依存する。
【０１２５】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９から入手可能である。例としては、限定しないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ　ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：４２１６−４２２０（１９８０））、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ９２）のような哺乳動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルのＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５１）細胞株、およびＣＶ−１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ７０）細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株およびげっ歯類細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠失し得るか、または優性に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、限定しないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓから誘導された３Ｔ３株、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａｋハムスター細胞株が挙げられ、これらはＡＴＣＣより入手可能である。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現に関する分野の当業者にとって公知であり入手可能である。
【０１２６】
同様に、本発明に適切な宿主細胞として有用なのは細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ受託番号３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ受託番号５３３３８））の種々の菌株は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．などの種々の菌株もまた、本方法において使用され得る。
【０１２７】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１２８】
さらに、望ましい場合には、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−５７２（１９９３）；およびＬｕｃｋｌｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９（１９９３）に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。
【０１２９】
グリコシル化Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを発現するために、トランスジェニック動物もまた使用され得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用して、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳汁中に得ることができる。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを産生するために、植物もまた使用し得るが、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において生じるものとは異なり、ヒト治療の用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１３０】
（ポリペプチド産生）
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養素を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ　１６４０（ＲＰＭＩ　１６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に示されるように血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫培養物についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／または胎仔ウシ血清を補充したグレース培地である。
【０１３１】
代表的に、形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として添加される。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって指示される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養倍地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１３２】
宿主細胞によって産生されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが挙げられる。
【０１３３】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、このポリペプチドは、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１３４】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌についての封入体を含む）は、当業者に公知の任意の標準的技術を用いて宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイズ、および／または超音波破砕と、それに続く遠心分離によって溶解され、ペリプラズム／細胞質の内容物を放出し得る。
【０１３５】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、細胞内膜および／または細胞外膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後のペレット物質において見出される。次いで、ペレット物質を、極端なｐＨで、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下アルカリ性のｐＨで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下酸性のｐＨで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理されて、封入体を放出させ、分断させ、そして可溶化させ得る。次いで、この可溶化形態のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１３６】
いくつかの場合、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、単離の際に生物学的に活性でなくても良い。ポリペプチドをその三次構造に「再折り畳み」または変換し、そしてジスルフィド結合を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回復し得る。このような方法は、可溶化されたポリペプチドを、一定のｐＨ（通常は、７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体の可溶化に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤はより低い濃度で使用され、可溶化に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。共溶媒が、再折り畳みの効率を増加するのに使用され得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１３７】
封入体がＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１３８】
溶液からのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）のようなタグまたは他の小さなペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））をそのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、カラムマトリクスがタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによって、このポリペプチドは一工程で精製され得る。
【０１３９】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性によって結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド／ポリＨｉｓの精製のために使用され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　§　１０．１１．８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。
【０１４０】
さらに、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを特異的に認識し得、そして結合し得るモノクローナル抗体の使用を介して精製され得る。
【０１４１】
精製のための適切な手段としては、限定しないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｉｅｖｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）、続くゲル溶出、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合において、２つ以上の精製技術を、増加した純度を達成するために組み合わせ得る。
【０１４２】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３２（１９８５）；ならびに、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ（１９８４）に記載されるような当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さずに合成され得る。化学的に合成されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化されて、ジスルフィド結合を形成し得る。化学的に合成されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製された対応するＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換えまたは天然のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
【０１４３】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを得る別の手段は、生物学的サンプル（例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体）からの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用してモニターされ得る。
【０１４４】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様に対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７−１２３０３（１９９７）を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２６８−２７３（１９９９）もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、この異種プールのオリゴヌクレオチドはそれぞれが、５’ランダム化配列、中央部の予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団（小集団）を、予め決定された生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１４５】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。このプロセスは、確率論的な遺伝子またはそのフラグメントを産生すること、次いで、その確率論的な遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって行われる。次いで、この宿主細胞は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１４６】
（化学的誘導体）
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中以下に記載された開示を考慮して、当業者によって調製され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然に結合した分子の型または位置のいずれかにおいて異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然に結合した化学的な基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体は、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物は、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終産物の調製物の治療学的用途のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１４７】
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、いくつかの分子が示された分子量より多く、いくつかが少ない分子量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１４８】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−結合型またはＯ−結合型炭水化物、糖、ホスフェート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体の共有結合したマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に包含される。
【０１４９】
一般に、化学的誘導体化は、タンパク質と活性化ポリマー分子とを反応させるために用いられる任意の適切な条件下で実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、（ａ）ポリペプチドと活性化ポリマー分子（例えば、反応性エステルまたはポリマー分子のアルデヒド誘導体）とを反応させる工程であって、この反応が、配列番号２、配列番号４、または配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド改変体が、１つ以上のポリマー分子との結合を生じる条件下で行われる、工程、および（ｂ）反応産物を得る工程、を包含する。最適反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比がより大きくなればなるほど、結合したポリマー分子の割合がより多くなる。１つの実施形態において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のポリマー分子の部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１５０】
ポリペプチドのペグ化は、特に、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかによって実施され得る：Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０（１９９２）；ＥＰ　０１５４３１６；ＥＰ　０４０１３８４および米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書において記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応について、選択されたポリマーは、１つの反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、１つの反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水溶性である）であるか、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１５１】
別の実施形態において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、ビオチンと化学的に結合し得、次いで、結合されたビオチン／Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド分子は、アビジンへの結合が可能となり、その結果、四価のアビジン／ビオチン／Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド分子を生じる。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合し得、そして得られた結合体は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭとともに沈澱して１０の結合価の十量体の結合体を形成し得る。
【０１５２】
一般に、本発明のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド誘導体の投与によって緩和され得るかまたは調節され得る状態は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドについて本明細書において記載される状態を含む。しかし、本明細書において開示されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド誘導体は、誘導体化されていない分子と比較した場合、さらなる活性、増強した生物学的活性もしくは減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加した半減期もしくは減少した半減期）を有し得る。
【０１５３】
（遺伝的に操作された非ヒト動物）
非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、もしくはヒツジ、または他の家畜）は、本発明の範囲内にさらに含まれ、ここで、ネイティブＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする遺伝子は、破壊されており（「ノックアウト」）、その結果、この遺伝子の発現レベルは、有意に減少するかまたは完全に消失する。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を用いて調製され得る。
【０１５４】
本発明はさらに、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜）を含み、ここで、この動物についてのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子のネイティブな形態または異種Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子のいずれかは、この動物によって過剰に発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２８１２２に記載されるような、周知の方法を用いて調製され得る。
【０１５５】
本発明はさらに、非ヒト動物を含み、ここで、本発明のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの１つ以上についてのプロモーターは、１つ以上のネイティブＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの発現のレベルを変更するために、（例えば、相同組換え方法を用いることによって）活性化されるかまたは不活性化されるかのいずれかである。
【０１５６】
これらの非ヒト動物は、候補薬物スクリーニングのために用いられ得る。このようなスクリーニングにおいて、動物に対する候補薬物の影響が測定され得る。例えば、候補薬物は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの量は、候補薬物への動物の曝露後、測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する候補薬物の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病的状態を生じる得るか、または関連し得る。このような場合、遺伝子の発現を減少させる候補薬物の能力あるいは病的状態を予防または抑制する候補薬物の能力を試験し得る。他の例において、特に代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患または病的状態を生じ得るか、または関連し得る。このような場合、候補薬物がこのような代謝産物の産生を減少させる能力、あるいは候補薬物が病的状態を予防するかまたは抑制する能力を試験し得る。
【０１５７】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置される核酸の小型かつ高密度アレイである。アレイ内の各セルまたはエレメントは、その同種ｍＲＮＡについてのハイブリダイゼーションのための標的として働く単一種のＤＮＡの多数のコピーを有する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡはまず、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変換される。この物質は、このマイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡが洗浄によって除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各標的ＤＮＡに特異的に結合する標識されたｃＤＮＡの量を定量化することによって可視化される。このように、幾千もの遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットかつ並列様式で定量化され得る。
【０１５８】
このハイスループット発現プロファイリングは、以下を含むが、これらに限定されない本発明のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子に関して、広い範囲の適用を有する：治療のための標的としてのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様疾患関連遺伝子の同定および検証；Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子およびそのインヒビターの分子毒物学；治験のための代理マーカーの集団および世代の階層化；ならびに、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）における選択的化合物の同定を補助することによるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様関連低分子薬物発見の強化。
【０１５９】
（選択的結合因子）
本明細書で使用される場合、用語「選択的結合因子」とは、１つ以上のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を用いて調製され得る。本発明の例示的なＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド選択的結合因子は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの特定の部分に結合し得、これによってＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドレセプターへのこのポリペプチドの結合を阻害する。
【０１６０】
選択的結合因子（例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに結合する抗体および抗体フラグメント）は、本発明の範囲内にある。抗体は、単一特異性ポリクローナルを含むポリクローナル抗体、モノクローナル（ＭＡｂｓ）抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化（例えば、ＣＤＲ移植片化）抗体、ヒト抗体、単鎖および／または二重特異性抗体、ならびにそれらのフラグメント、改変体または誘導体であり得る。抗体フラグメントは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のそれらの部分を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素的切断によって生じるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現）によって生じるものが挙げられる。
【０１６１】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、動物（例えば、ウサギまたはマウス）において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって産生される。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを、免疫されるべき種において免疫原性であるキャリアタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター）と結合することが有用であり得る。また、凝集剤（例えば、ミョウバン）は、免疫応答を増強するために用いられる。免疫後、これらの動物を、採血し、そしてこの血清を抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド抗体力価についてアッセイする。
【０１６２】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の方法を用いて産生される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４））；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７）が挙げられる。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
【０１６３】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変され得る。１つの実施形態は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であり、一方、その鎖の残部が、別の種由来の抗体または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体である。このような抗体のフラグメントもまた、これらのフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照のこと。
【０１６４】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載されている方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を用いて、ヒト抗体の対応する領域についてのげっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部分を置換することによって実施され得る。
【０１６５】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに結合するヒト抗体はまた、本発明に包含される。内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を用いて、このような抗体は、必要に応じてキャリアと結合体化される、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様抗原（すなわち、連続した少なくとも６アミノ酸を有する）での免疫によって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、この動物における免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性遺伝子座を無能力化し、かつそのゲノム中に、ヒト重鎖および軽鎖のタンパク質をコードする遺伝子座を挿入することによって生成される。次いで、部分的に改変された動物（すなわち、全てよりも少ない改変の補体を有する）を交雑育種して、所望の免疫系の改変を全て有する動物を得る。免疫原を投与された場合、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む、（例えば、マウスではなく）ヒトのアミノ酸配列を含む抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５、ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびにＥＰ　５４６０７３Ｂ１およびＥＰ　５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によってか、またはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０１６６】
代替的なの実施形態において、ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリーから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。これらは、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの提示による模倣免疫選択（ｍｉｍｉｃ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、および選りぬきの抗原に対するそれらの結合によるファージの引き続く選択をプロセスする。このような技術の１つは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これは、このようなアプローチを用いた、ＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターに対する高親和性かつ機能的アゴニスト抗体の単離を記載している。
【０１６７】
キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、およびヒト化抗体は、代表的には、組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書に記載される材料および手順を用いて発現される。好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書において記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によってか、またはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０１６８】
本発明の抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様抗体は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの検出および定量のための、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））のような任意の公知のアッセイ方法において用いられ得る。これらの抗体は、用いられるアッセイ方法に適切な親和性によってＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに結合する。
【０１６９】
診断適用について、特定の実施形態において、抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様抗体は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生成し得るもののいずれか１つであり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉ）、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−１６３（１９９０）））であり得る。
【０１７０】
競合的結合アッセイは、標識された標準物（例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド、またはその免疫学的反応性部分）が、限られた量の抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様抗体との結合について、試験サンプルの分析物（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド）と競合する能力に依存する。試験サンプル中のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの量は、抗体に結合する標準物の量に反比例する。結合する標準物の量を決定するのを容易にするため、これらの抗体は、競合の前か後に代表的に不溶化され、その結果、これらの抗体に結合された標準物および分析物は、結合されていないままの標準物および分析物から、慣用的に分離され得る。
【０１７１】
サンドイッチアッセイは、代表的に、検出および／または定量されるべきタンパク質の２つの抗体（各々が、異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る）の使用を包含する。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプルの分析物は、代表的に、固体支持体上に固定される第１抗体に結合し、その後、第２の抗体がこの分析物に結合し、従って、不溶性の３つの部分の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体に検出可能な部分を標識してもよいし（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０１７２】
選択的結合因子（抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様抗体を含む）はまた、インビボでのイメージングに有用である。検出可能な部分で標識された抗体を、動物に、好ましくは、血流中に投与し得、そして宿主における標識された抗体の存在および位置をアッセイする。抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物において検出可能な任意の部分で標識され得る。
【０１７３】
本発明の選択的結合因子（抗体を含む）は、治療剤として用いられ得る。これらの治療剤は、一般に、以下の点において、アゴニストまたはアンタゴニストである：これらのいずれかが、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ、増強するかまたは減少させる。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに特異的に結合し得、そして、インビボまたはインビトロにおいてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの機能的活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、そして好ましくは、少なくとも約８０％、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの機能的活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、これによって、インビボまたはインビトロにおいてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様活性を阻害または排除する抗体であり得る。選択的結合因子（アゴニストおよびアンタゴニスト抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様抗体を含む）は、当該分野で周知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１７４】
本発明はまた、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様選択的結合因子（例えば、抗体）および生物学的サンプルにおいてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのレベルを検出するのに有用な他の試薬を備えるキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬を含み得る。
【０１７５】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、「発現クローニング」ストラテジーを用いてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様リガンドをクローニングするために使用され得る。放射線標識（１２５−ヨウ素）されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたは「親和性／活性−タグ化」Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合またはアルカリホスファターゼ融合）を結合アッセイに用いて、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様リガンドを発現する細胞型あるいは細胞株または組織を同定し得る。次いで、このような細胞または組織から単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、哺乳動物発現ベクターにクローニングし、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、または２９３）中にトランスフェクトして、発現ライブラリーを生成し得る。次いで、放射線標識されたかまたはタグ化されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを親和性試薬として用いて、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様リガンドを発現するこのライブラリーにおける細胞のサブセットを同定し、そして単離し得る。次いで、ＤＮＡを、これらの細胞から単離し、哺乳細胞中にトランスフェクトして、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様リガンドを発現する細胞の画分が、もとのライブラリーにおける発現よりも何倍も高い２次発現ライブラリーを生成する。この富化プロセスは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様リガンドを含む単一組換えクローンが単離されるまで、何度も反復され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様リガンドの単離は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様シグナル伝達経路の新規のアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するのに有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様リガンド、抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様リガンド抗体、低分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１７６】
（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド活性の他のモジュレーターについてのアッセイ）
いくつかの状況において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの活性のモジュレーターである分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、１つ以上のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるアッセイ）を用いて同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式、または注射によるインビボ様式、または経口送達、移植装置などのいずれかによって投与され得る。
【０１７７】
「試験分子」とは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）する能力についての評価下にある分子をいう。通常、試験分子は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまた、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド活性を（例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子発現に影響することによってか、またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって）間接的に調節し得ることもまた考慮される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、そしてなおより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数で、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと結合する。
【０１７８】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される、特定の実施形態において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、試験分子とＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で試験分子とともにインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定され得る。試験分子は、実質的に精製された形態においてかまたは粗混合物においてスクリーニングされ得る。
【０１７９】
特定の実施形態において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと相互作用し、その活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド発現を調節する分子は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、あるいはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの発現を指向するかまたは制御する核酸配列に相補的である核酸を含み、そしてこれらの核酸は、発現のアンチセンス調節因子として作用する。
【０１８０】
一旦、試験化合物のセットがＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと相互作用すると同定されると、この分子は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形態で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するための１以上のアッセイによって決定される。
【０１８１】
試験分子とＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの改変形態は、免疫アッセイ中で使用され得る。
【０１８２】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、多様なインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、その結合パートナーに対するＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させるその能力について試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１アッセイにおいて、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中に固定される。次いで、放射標識したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナー）および試験化合物は、このウェルに、一つずつ（いずれかの順序で）または同時にのいずれかで添加され得る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して、放射活性を計数し、結合パートナーがＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに結合する程度を決定し得る。代表的に、分子は、一定範囲の濃度にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上の要素を欠く一連のコントロールウェルが、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代わりは、タンパク質の「位置」を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーを固定し、試験分子および放射標識したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをインキュベートし、そしてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド結合の程度を決定する工程）を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５）を参照のこと。
【０１８３】
放射性標識に対する代替として、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））（これらは、比色定量的に検出され得る）に結合したストレプトアビジンを使用して検出され得るか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーに対する抗体（これらは、ビオチンに結合されている）もまた用いられ得、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとのインキュベーション後に、検出され得る。
【０１８４】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固体相基材への付着によって固定され得る。基材−タンパク質複合体は、相補タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体が、カラムに固定され得、そして試験分子および相補タンパク質がこのカラムを通過する。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成は、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識、抗体結合など）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１８５】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　補体レセプターポリペプチドとＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者のプロトコールを用いて実行され得る。このアッセイは、本質的に、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器に存在する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバに注入され得る。結合する相補タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコートされた側面に物理的に会合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定され得る。
【０１８６】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドとＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について、一緒に評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細書中に記載される通りである。
【０１８７】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドとＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーによる複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイライブラリー、合成ペプチドライブラリー、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１８８】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドとＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する化合物はまた、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源由来である。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーを発現する細胞への、その表面での結合は、試験化合物の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【０１８９】
細胞培養物はまた、候補薬物の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、候補薬物は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの量は、細胞培養物の候補薬物への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する候補薬物の実際の影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物への特定の影響を有し得る。このような場合に、候補薬物が遺伝子の発現を増加または減少させる能力、またはその薬物候補が細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害する能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、候補薬物が細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する能力が試験され得る。
【０１９０】
酵母ツーハイブリッド系（Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８〜９５８３（１９９１））を使用して、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに結合するかまたは相互作用する、新規なポリペプチドを同定し得る。例として、酵母ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインに融合したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの細胞質ドメインをコードするＤＮＡを含むハイブリッド構築物は、ツーハイブリッドベイト（ｂａｉｔ）プラスミドとして使用され得る。スクリーニングから出現する陽性クローンは特徴付けられ、さらに相互作用タンパク質を同定し得る。
【０１９１】
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：６６４−６６８（１９９４）を参照のこと。例えば、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（「タンパク質形質導入ドメイン」、またはＴＡＴ　ＰＤＴと称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：１５６９−１５７２（１９９９）；およびＮａｇａｈａｒａら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　４：１４４９−１４５２（１９９８）を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ−ＧＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（これは、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって観察されるように、細胞に結合する）が調製され、そしてこれらの構築物は、腹腔内投与後に組織を貫通する。次に、ｔａｔ−βｇａｌ融合タンパク質が構築される。この構築物で処置された細胞は、β−ｇａｌ活性を示した。注入に続いて、これらの手順を用いて、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織を含む）において発現が実証されることが見出された。これらの構築物は、細胞に入るためにある程度の変性を受けると考えられ；従って、細胞への移入後に、再折り畳みを必要とし得る。
【０１９２】
従って、ｔａｔタンパク質配列は、所望のタンパク質またはポリペプチドを細胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様アンタゴニスト（例えば、抗Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子の活性を阻害するために、細胞内投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子」は、本明細書中に定義されるような、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子およびＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの両方をいう。所望ならば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様タンパク質自体はまた、これらの手順を使用して、細胞に内部投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ，Ｅ．，「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｂｏｄｙ’ｓ　Ｃｅｌｌｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：１４６６−１４６７（１９９９）もまた参照のこと。
【０１９３】
（治療的用途）
本発明のポリペプチドおよび核酸で処置、診断、寛解または予防され得る、急性および慢性疾患の非排他的なリストを、以下に示している。
【０１９４】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ関連ポリペプチドは、補体系の活性化を刺激するように作用し得る。補体系は、単独で作用するか、宿主に対して外因性である細胞を破壊するために抗体と協同して作用し、そして細菌感染およびウイルス感染に対する主要な防御である。結合パートナーがＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ関連ポリペプチドまたはタンパク質に対して結合し、そしてこれを活性化する能力は、補体活性化を導き得る。このような結合パートナーは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ関連ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗体、ペプチド体（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、または低分子量有機分子）のアゴニストであり得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ関連ポリペプチドまたはタンパク質のアゴニストは、不十分な補体活性化または不完全な補体活性化によって特徴付けられる状態（例えば、細菌感染およびウイルス感染）を予防および処置するために用いられ得る。
【０１９５】
あるいは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ関連ポリペプチドまたはタンパク質のアンタゴニストを使用して補体活性化をブロックすることが所望され得る。アンタゴニストは、過剰な補体活性化によって特徴付けられる状態、特に免疫系障害（例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、炎症性関節炎、変形性関節症、炎症性関節疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症、狼瘡、糖尿病、炎症性腸疾患、移植片拒絶、および宿主対移植片病）を予防および処置するために有用である。アンタゴニストはまた、細胞および組織に対する望ましくない補体媒介性損傷を予防または処置するために有用である。１実施形態において、アンタゴニストは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ関連ポリペプチドまたはタンパク質の可溶性ドメインを含む。
【０１９６】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子のアゴニストおよびアンタゴニストに関する他の用途としては、以下の診断、予防、および処置が挙げられる：神経系障害（例えば、発作、アルツハイマー病、脳損傷、およびパーキンソン病）；損傷された組織（例えば、創傷および火傷によって）；虚血状態（例えば、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心筋梗塞、血管形成術、高血圧、および虚血）；代謝障害（例えば、肥満、糖尿病、および悪液質）；そして生殖障害、不妊、流産、早産および出産、ならびに子宮内膜症。
【０１９７】
（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様薬学的組成物は、治療有効量のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的に受容可能な処方薬剤または生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的に受容可能な処方薬剤または生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。
【０１９８】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０１９９】
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、解離もしくは放出の速度、吸着、または透過を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、バルク剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、複合体化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、芳香剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］）。
【０２００】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。このような組成物は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０１】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、自然状態では、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料で補充され得る。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０２】
このＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、この組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口）のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内にある。
【０２０３】
処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）にこの組成物を維持するために使用される。
【０２０４】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルに所望のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子は、滅菌の等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製は、所望の分子と、薬剤（例えば、注入可能なミクロスフェア、生体内腐食可能（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム）との処方物に関し得、これは産物の制御放出または持続放出を提供し、次いでこれが、デポ注射として送達され得る。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環における持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０２０５】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子は、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドまたはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液が、噴霧され得る。肺投与は、ＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載され、これは化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２０６】
特定の処方物が、経口投与され得ることもまた意図される。本発明の１つの実施形態において、このよう様式で投与されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子は、固体投薬形態（例えば、錠剤およびカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアとともに、またはこのようなキャリアを伴わずに処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして前全身的分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される場合に胃腸管内の点で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子の吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、芳香剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用され得る。
【０２０７】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子を含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２０８】
さらなるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続送達処方物または制御送達処方物中にＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを含む処方物を含む。種々の他の持続送達手段または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体内腐食可能な微粒子あるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術はまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が挙げられ得る。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３６８８−３６９２（１９８５）；欧州特許第３６，６７６号、同第８８，０４６号、および同第１４３，９４９号を参照のこと。
【０２０９】
インビボ投与のために使用されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様の薬学的組成物は、代表的には、無菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が、凍結乾燥される場合、これらの方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構築の前または後のいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈内溶液バッグまたはバイアル）内に配置される。
【０２１０】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水和粉末もしくは凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、即時使用型（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）の形態または投与の前に再構成を必要とする形態（凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１１】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが包含される。
【０２１２】
治療的に使用されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様の薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。当業者は、従って、処置のための適切な投薬レベルが、部分的には、送達される分子、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子が使用されている指標、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ）および状態（年齢および一般的な健康）に、依存して変化することを理解する。従って、臨床家は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２１３】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様分子の薬物動態学のパラメーターに依存する。典型的に、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単一用量として、もしくは経時的に２以上の用量（これは、同量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、または移植デバイスもしくはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そしてそれらによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２１４】
薬学的組成物の投与の経路は、以下のような公知の方法と一致する：例えば、経口的、静脈内、腹腔内、脳内（実質内の）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注入；または徐放性の系もしくは移植デバイスによる注入。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、もしくは注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２１５】
あるいはまたはさらに、組成物は、膜、スポンジ、または他の適切な材料（その上に所望の分子が吸収されるかまたはカプセル化される）の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的な投与を介し得る。
【０２１６】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から除去された細胞、組織、または器官は、これらの細胞、組織、および／または器官が引き続いて患者に移植し戻された後にＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様薬学的組成物に曝露される。
【０２１７】
他の場合において、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝的に操作された特定の細胞を移植することによって、送達され得る。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種、または外因性の細胞であり得る。必要に応じて、細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系による、または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２１８】
本発明のさらなる実施形態は、遺伝子治療または細胞治療による、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写に対してサイレントなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子、または過少発現される遺伝子を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。
【０２１９】
相同組換えは、もともとは、遺伝子を標的化して転写活性な遺伝子における変異を誘導するか、または修正するために開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．＆　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１、１９８９）。基本的な技術は、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ　４４：４１９−４２８，１９８６；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ　５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５８３−８５８７，１９８８）、または欠損遺伝子における特定の変異を修正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５７６−５７８，１９８７）の方法として、開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号（欧州特許第９１９３０５１号、同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開番号ＷＯ　９１／０９９５５）に記載されている。
【０２２０】
相同組換えによって、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、それを標的ＤＮＡに付着させることによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に対して相補的な標的ＤＮＡの小さな断片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に、親鎖と接触される。これは、細胞に挿入されてハイブリダイズしたＤＮＡの一般的な特性であり、そして従って、共有される相同領域を介して、内因性ＤＮＡの他の断片と組み換わる。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合には、これはまた、この組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレートとして働くことが可能である。従って、移入されたＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０２２１】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドと相互作用し得るかまたはその発現を制御し得るＤＮＡの領域（例えば、隣接配列）が、標的ＤＮＡのこれらの断片に付着する。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサ、または外因性転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードするＤＮＡの近位に、このＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な配向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部分を制御する。従って、所望のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの発現は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同の領域を含む）の使用によって、達成され得る。
【０２２２】
例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組換えを介して、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、変更される。これらの構成成分は、新たな転写ユニットの産生を実際に生じるような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される（ここで、ＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結する）。染色体ＤＮＡへのこれらの構成成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。
【０２２３】
本明細書中で記載されるように、変化された遺伝子発現は、通常は得られたままの細胞においてサイレントな（発現されていない）遺伝子の活性化（または発現させる）、ならびに得られたままの細胞において生理学的に有意なレベルでは発現されない遺伝子の発現の増加を包含する。この実施形態はさらに、調節または誘導のパターンが、得られたままの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なり、そして得られたままの細胞において発現される遺伝子の発現を減少（排除を含む）させるような、調節または誘導のパターンを変化させる工程を包含する。
【０２２４】
細胞の内在性Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子からのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの産生を増加するかまたはこれを引き起こすために相同定組換えが使用され得る方法の１つは、最初に、相同性組換えを使用して、部位特異的組換え系由来の組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，５：５２１−５２７，１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．，２２５：８９０−９００，１９９３）を、細胞の内在性ゲノムＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドコード領域の上流（すなわち、５’）に配置する工程を包含する。ゲノムＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に対して相同性の組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼによって、プラスミドを、このプラスミドの組換え部位を介して、この細胞株のゲノムＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組込み得る（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：２０２５−２０２９，１９９３；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５、１９９１）。転写を増大させることが知られている任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド中に適切に配置される場合、細胞の内在性Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子からの新たなまたは増加したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で一体化する。
【０２２５】
部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株のゲノムの他のいずれかの位置に第２の組換え部位を導入するために相同性組換えを使用することである。次いで、適切な組換え酵素が、二組換え部位細胞株に導入され、組換え現象（欠失、転化、および転移）を生じ（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．前出、１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｘｙｍｏｌｏｇｙ、１９９３）、これは、細胞の内在性Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子からの新規なまたは増加したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド産生を生じる、新しいかまたは改変された転写ユニットを作製する。
【０２２６】
細胞の内在性Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子からのＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの発現を増加するため、または引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子からの新たなまたは増加したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの産生を生じる様式で、遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増加するかまたは引き起こし、そして／または遺伝子（単数または複数）（例えば、転写リプレッサ）の発現を減少する工程を包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内在性Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子からの新たなまたは増加したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの産生が起こるように、細胞に導入する工程を包含する。
【０２２７】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）制御配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対スプライスドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、細胞中の標的遺伝子へのエレメント（ａ）〜（ｄ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｄ）は、内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）制御配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位。ここで、標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｆ）は、内在性遺伝子に作動可能に連結される。標的配列は、相同性組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡの予め選択された部位に対して相同性である。この構築物において、エキソンは、一般的に、制御配列の３’であり、そしてスプライスドナー部位は、このエキソンの３’である。
【０２２８】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中で記載されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの核酸配列）が公知である場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的なＤＮＡの部分は、合成されるか、またはそうでなければ、例えば、目的の領域に結合している特定の認識部位におけるネイティブのＤＮＡの適切な制限等によって得られ得る。この部分は、細胞に挿入された際に、標的配列として働き、そしてそのゲノム内の相同性領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの部分、およびそれに結合した任意のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的配列として使用され得る。
【０２２９】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド細胞治療（例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた企図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド産生細胞は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの天然産物である細胞であり得るか、または組換え細胞であって、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを産生するその能力が、所望のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする遺伝子またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの発現を増大する遺伝子で形質転換することによって増大された、組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子を送達するために適切なベクターによって、そしてその発現および分泌を促進することによって達成され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを投与されている患者における強力な免疫学的反応を最小化するために、異種のポリペプチドの投与と共に生じる場合、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源であり、そしてヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３０】
移植された細胞は、周辺組織の浸透を回避するようにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物細胞は、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する）の形態で患者に移植され得る。あるいは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしで、患者に直接移植され得る。
【０２３１】
生きた細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびそれらの患者への移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、そして容易に取り出し可能である。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植された際に、インビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。このデバイスは、レシピエント内の特定の部位への生きた細胞由来の分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生きた細胞をカプセル化するためのシステムは、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５７に記載される。ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願番号ＰＣＴ９１／００１５５；Ｗｉｎｎら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−３２９（１９９１）；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−２７５（１９９１）；およびＴｒｅｓｃｏら、ＡＳＡＩＯ　３８：１７−２３（１９９２）もまた参照のこと。
【０２３２】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の一例は、構成的または誘発性プロモーターに作動可能に連結され得るＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードするＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、構築物が挿入される細胞または組織型において活性であるという条件下で、内在性Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子に対して相同であっても異種であってもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されるＤＮＡ分子（例えば、相同性組換えのために有用な内在性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞を越える選択的優性を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化について）、細胞特異的内部移行因子、およびベクターによる発現を増大する転写因子、ならびにベクターの産生を可能にする因子を含み得る。
【０２３３】
遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、次いで、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して細胞に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターの使用による。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残る。
【０２３４】
さらに他の実施形態において、制御エレメントが、標的細胞におけるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子の制御された発現のために含まれ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答して駆動される。このようにして、治療的ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性タンパク質）を二量化するために用いられる低分子二量化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）（ＷＯ９６４１８６５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８６）；ＷＯ９７３１８９８（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７）およびＷＯ９７３１８９９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７）に記載のような）の使用を包含する。タンパク質の二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【０２３５】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞の内側に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体における凝集タンパク質の保持を生じる、条件的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞の内側で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得、それにより、凝集体またはクラスターを特異的に破壊し、その結果、このタンパク質は細胞から分泌され得る。Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８１６−８１７および２８７：８２６−８３０（２０００）を参照のこと。
【０２３６】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、以下の系が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子のダイマー（次いで、核に至り、ＤＮＡに結合する）を形成することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメインは、レセプターが天然のリガンドに結合する能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号；ＷＯ９６４０９１１、およびＷＯ９７１０３３７に記載される。
【０２３７】
さらに別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次いで、このレセプターは核に転移し、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するための、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン／リガンド結合ドメインを含む。エクジソン系はさらに、米国特許第５，５１４，５７８、ＷＯ９７３８１１７；ＷＯ９６３７６０９；およびＷＯ９３０３１６２に記載されている。
【０２３８】
別の制御手段は、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異したｔｅｔレプレッサタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子タンパク質を生じた変異したｔｅｔＲ−４アミノ酸の変化、すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載されている。
【０２３９】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号（Ｉｎｎｏｖｉｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）に記載されている。
【０２４０】
インビボの遺伝子治療は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする遺伝子を、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子の局所的な注射を介して、または他の適切なウイルスもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することによって達成され得る。Ｈｅｆｔｉ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２５：１４１８−１４３５（１９９４）。例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際公開番号ＷＯ９５／３４６７０；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えＡＡＶゲノムは、代表的には、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結したＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復を含む。
【０２４１】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、およびパピローマウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビトロのウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療的タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処理されたヒト細胞の送達によって、治療的タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実行のためのさらなる方法および材料は、アデノウイルスベクターに関する米国特許第５，６３１，２３６号；レトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６７２，５１０号；およびサイトカインを発現するレトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６３５，３９９号に記載されている。
【０２４２】
非ウイルス送達方法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡの送達（直接注射）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法としてはまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞を超えて選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全な測定）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のための）、細胞特異的内在化因子、ならびにベクターによる発現を増強する転写因子の使用、そしてベクター製造のための方法が挙げられ得る。遺伝子治療技術の実行のためのこのようなさらなる方法および材料は、エレクトロポレーション技術に関する米国特許第４，９７０，１５４号；核リガンドに関するＷＯ９６／４０９５８；遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する米国特許第５，６７９，５５９号；リポソームキャリアに関する米国特許第５，６７９，９５４号；リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法に関する米国特許第５，５９３，８７５号；および米国特許第４，９４５，０５０号（ここで、生物学的に活性な粒子が、ある速度で細胞に噴射され、それによってこの粒子は細胞の表面を貫通し、そして細胞内部に取り込まれる）に記載される。
【０２４３】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子治療または細胞治療はさらに、同じ細胞または異なる細胞において１以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることがまた、意図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこれらの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のようなカプセル化膜）中に含まれ得るか、またはこれらの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２４４】
遺伝子治療を介して、細胞における内在性のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド発現を増大させる手段は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドプロモーター中に１以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメントは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子の転写活性を増大するように作用し得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することが所望される組織に基づいて選択される；この組織においてプロモーターの活性化を与えることが公知のエンハンサーエレメントが、選択される。例えば、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドをコードする遺伝子が、Ｔ細胞において「オンにされる」場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、添加されるべき転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を使用して、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメント中に挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターならびに／または５’隣接配列および／もしくは３’隣接配列などの中に挿入される）。次いで、「相同組換え構築物」として公知のこの構築物は、エキソビボまたはインビボのいずれかで所望の細胞に導入され得る。
【０２４５】
遺伝子治療はまた、内在性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの発現を減少させるために使用され得る。このような改変は、代表的には、相同組換え方法を介して達成される。例えば、不活化のために選択されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換するように操作され得る。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモーターの転写活性化因子の結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得る；このような欠失は、プロモーターの活性を阻害し得、それによって対応するＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子の転写を抑制する。プロモーターのＴＡＴＡボックスまたは転写活性化因子結合部位の欠失は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドプロモーター（調節されるべきＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子と同種または関連の種由来の）の全てまたは関連部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位のヌクレオチドの１以上は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は、活性を減少させるかまたは完全に不活化される。この構築物は、代表的には、改変されたプロモーターセグメントに隣接するネイティブな（内在性の）５’および３’ＤＮＡ配列に対応するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含む。この構築物は、適切な細胞中に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）、直接または本明細書中に記載のウイルスベクターを介してかのいずれかで導入され得る。代表的には、細胞のゲノムＤＮＡへの構築物の組み込みは、相同組換えを介してであり、ここで、プロモーター構築物の５’および３’ＤＮＡ配列は、内在性の染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを介して、改変されたプロモーター領域を組み込む際の補助として役立ち得る。
【０２４６】
（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸およびポリペプチドのさらなる使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子および関連する遺伝子の染色体上の位置をマッピングするために使用され得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）によってなされ得る。
【０２４７】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、定量的または定性的にのいずれかで、哺乳動物の組織または体液サンプルにおけるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について試験するための診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２４８】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、サイトカイン、増殖因子、抗体、抗炎症剤、および／または化学療法剤（処置される兆候に適切な場合）の１つ以上と組み合わせて（同時にまたは引き続いて）使用され得る。
【０２４９】
１以上のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合、他の方法もまた使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ｍＲＮＡに相補的でありかつハイブリダイズする核酸分子によってもたらされ得る。例えば、選択されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子の少なくとも一部に対して相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子が、細胞に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの配列を使用する利用可能な技術によって設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、各々の選択されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。次いで、このアンチセンス分子が、対応するＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は阻止されるかまたは減少される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物体におけるＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの減少または非存在に関する情報を提供する。
【０２５０】
あるいは、遺伝子治療は、１以上のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドのドミナントネガティブなインヒビターを作製するために使用され得る。この状況において、各々の選択されたＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡが調製され得、本明細書中に記載のウイルスまたは非ウイルス方法のいずれかを使用して患者の細胞に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的には、その生物学的な役割において内在性のポリペプチドと競合するように設計される。
【０２５１】
さらに、生物学的に活性か否かにかかわらず、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドは、免疫原、すなわち、抗体を惹起し得る少なくとも１つのエピトープ含むポリペプチドとして使用され得る。Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチド（本明細書中に記載のような）に結合する選択的結合因子は、インビボおよびインビトロの診断目的のために使用され得、これには、体液または細胞サンプル中でＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの存在を検出するための標識形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体はまた、本明細書中で列挙したものを含む多くの疾患および障害を予防、処置、または診断するために使用され得る。これらの抗体は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに特徴的な活性の少なくとも１つを減少させるかまたはブロックするように、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに結合し得るか、あるいは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドに特徴的な活性の少なくとも１つを増大するために（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ　ＣＲ様ポリペプチドの薬物動態を増大させることによるものを含む）ポリペプチドに結合し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号１）を示す。また、ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）も示される。
【図２】
図２は、第二のヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号６）を示す。また、ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）も示される。
【図３】
図３は、ラットＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号３）を示す。また、ラットＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）も示される。
【図４】
図４は、既知のヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター（配列番号５）とヒトＡＧＰ−４１７７３（配列番号２）とのアミノ酸比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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