(57)【要約】本発明は特に、鼻腔内送達用のワクチン製剤の製造における、分割（ｓｐｌｉｔ）エンベロープウイルス調製物（分割インフルエンザウイルス調製物ではない）を含むワクチン製剤、そのようなワクチン製剤の製造方法、ならびに疾病の予防または治療における前記ワクチンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鼻腔内送達用のワクチン製剤の製造における、分割インフルエンザウイルス調製物以外の分割エンベロープウイルス調製物の使用。
【請求項２】
分割エンベロープウイルス調製物が、単独または混合物としての、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、および単純ヘルペスウイルスである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
分割エンベロープウイルス調製物が、ウイルス膜断片、ウイルス膜エンベロープタンパク質、ウイルス基質、および核タンパク質を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
１種以上の残留する分割剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
残留する分割剤が、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）９、ＮａＤＯＣ、サルコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）、Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭからなる群より選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
分割剤がＮａＤＯＣまたはサルコシルである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
安定化剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
安定化剤が界面活性剤である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
界面活性剤が、単独または混合物としての、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ８０ＴＭ）、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００ＴＭ）、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン製剤の製造方法であって、
（ａ）　エンベロープウイルスを分割すること、
（ｂ）　場合により、分割したエンベロープウイルス調製物を安定化剤と混合すること、
（ｃ）　場合により、分割したエンベロープウイルス調製物をアジュバント（キャリアーおよび／または免疫刺激剤）と混合すること、
を含んでなる、上記方法。
【請求項１２】
安定化剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ ８０ＴＭ）、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００ＴＭ）、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤である、請求項１１に記載のワクチン製剤の製造方法。
【請求項１３】
疾病の予防または治療用の鼻腔内ワクチン製剤の製造における、分割インフルエンザウイルス調製物以外の分割エンベロープウイルス調製物の使用。
【請求項１４】
（ａ）　分割エンベロープウイルス調製物、および（ｂ）　鼻腔内送達装置を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の鼻腔内ワクチン製剤の送達用キット。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチンを含んでなる鼻腔内送達装置。
【請求項１６】
圧閾値装置である、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
エンベロープウイルスが原因で起こる疾病にかかりやすい、または該疾病にかかっている哺乳動物を保護または治療する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチンを鼻腔経路で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１８】
ワクチン製剤がセロポジティブおよびセロネガティブ個体において免疫原性がある、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法、使用、キットまたは装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規なワクチン製剤、該ワクチンの製造方法、ならびに疾患の予防または治療における該ワクチンの使用に関する。特に、本発明は、分割（ｓｐｌｉｔ）エンベロープウイルス調製物を含むワクチンに関する。
【０００２】
エンベロープウイルスとは、ウイルスのコアが脂質に富んだ外膜で覆われているウイルスのことであり、その外膜にはウイルスタンパク質が含まれている。
【０００３】
特定の実施形態において、本発明のワクチン製剤の分割エンベロープウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｉｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ： ＲＳＶ）に由来するものである。エンベロープウイルスによる感染の危険性を、ＲＳＶを例にとって説明する。
【０００４】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）はパラミクソウイルス科のメンバーで、特に乳幼児において、下部気道疾患を引き起こす。最近の報告によれば、ＲＳＶは成人、特に初老の人々にとっても重大な病原体となることが示唆される。
【０００５】
ＲＳＶは、１１のメッセンジャーＲＮＡ（それぞれが単一のポリペプチドをコードしている）をコードする１５，２２２ヌクレオチドの非分節（−）鎖リボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムをもつエンベロープウイルスである。１１のタンパク質のうち３つは膜貫通表面タンパク質、すなわち、Ｇタンパク質（付着）、Ｆタンパク質（融合）およびＳＨタンパク質である。１つのタンパク質はビリオン基質タンパク質（Ｍ）であり、３つのタンパク質はヌクレオキャプシドの成分（Ｎ、ＰおよびＬ）であり、そして２つのタンパク質は非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）である。さらに２つのタンパク質Ｍ２−１およびＭ２−２が存在する。ＲＳＶには抗原的に区別される２つのサブグループがあり、サブグループＡおよびＢと呼ばれている。これらサブグループのウイルス株の特性を調べたところ、大きな差異はＧタンパク質にあって、Ｆタンパク質は保存されていることがわかった。
【０００６】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）はある季節に限って突然発生し、温帯では冬に、熱帯では雨期にピークとなる。
【０００７】
小児では、重症の下部気道疾患の主な原因がＲＳＶである。細気管支炎で入院している子供の４０〜５０％、肺炎で入院している子供の２５％は、ＲＳＶ感染が直接の原因で入院していると推定される。通常、一次ＲＳＶ感染には１才未満の乳児がかかり、２才までに９５％の子供が過去に感染したという血清学的証拠を有し、成人になると１００％の集団がそうである。
【０００８】
乳幼児においては、感染が約４０％の症例で上部気道から下部気道へと進行しており、その臨床的徴候は細気管支炎または肺炎のそれである。２ヶ月から６ヶ月までの乳児は重症のＲＳＶ感染症（主として、呼吸不全）を発症する危険が最も高い。しかし、心臓や肺の病気をかかえている子供（年齢を問わない）、早産児、および免疫無防備状態の幼児も同様に重大な合併症を起こす危険がある。
【０００９】
症状を呈する再感染が生涯を通じて起こり、ＲＳＶは成人（特に初老の人）でも重要な病原体となることが次第に明らかになってきた。
【００１０】
ＲＳＶ感染はほとんど必ずといっていいほど成人では過小診断されており、このことは、一部には、ＲＳＶ感染が子供の病気であると考えられていることによる。その結果、成人では、呼吸器疾患の原因を究明する目的でこのウイルスの証拠が捜し求められることはない。さらに、大多数の成人がそうであるように、このウイルスに対してある程度の部分免疫をもつ個人から採取された鼻腔分泌物中にＲＳＶを見つけ出すことは困難である。若者から中年までの成人は一般的に、ＲＳＶに感染すると、長引く風邪に似た症状を呈する。中年を過ぎた人々は、インフルエンザと事実上区別がつかない長期の呼吸器症候群を発症する可能性があり、これは肺炎をはじめとする下部気道症状を伴うことのある上部気道症状を呈する。施設に入所している初老の人々にとっては特に重大である。なんとなれば、彼らは感染しやすい多くの個体が一団となって生活しているからである。そのような集団（その多くは複数の医学的問題を抱えており、こうしたことがこの病気の経過をより重症にする可能性がある）の中で感染の広がりをくい止めるのは容易ではない。
【００１１】
さらに、成人および集団で生活している健康な初老の人々が入院する原因としてＲＳＶ感染の影響を調べている最近の研究によれば、こうした集団での重症の下部気道疾患におけるＲＳＶ感染の重大な役割が指摘されている。ＲＳＶは、成人を結果的に入院させることとなる重症の下部気道疾患を引き起こす、最も一般的な４種の病原体のうちの１つとなっている。また、初老の人々における重症のＲＳＶ感染は養護施設や突発的状況に限らないことも実証されている。それどころか、ＲＳＶ感染は集団で居住している初老の人々においては重症疾患の予測可能な原因となる。インフルエンザＡによる入院と同様に、ＲＳＶ感染に関係した入院は、長期の病院滞在によって証明されるように、かなりの死亡率、高い集中治療室での入院率、および高い人工呼吸器装着率と関係している。
【００１２】
これらの研究は、特に乳幼児、成人、および集団生活をしている健康な人と施設に入所している初老の人の双方において、ＲＳＶ感染の重大な合併症を予防することができる有効なワクチンが医療上および経済上必要であることを示している。
【００１３】
同様の危険性が他のエンベロープウイルスからも持ち上がっており、かくして、そのようなウイルスが原因で起こる感染症および疾患から効果的に防御することのニーズが依然として存在する。
【００１４】
本発明は、鼻腔内送達用に製剤化されたワクチンの製造における、分割インフルエンザウイルス調製物以外の分割エンベロープウイルス調製物の使用を提供する。
【００１５】
好ましくは、この調製物は製薬上許容される賦形剤を含有する。
【００１６】
本発明のワクチン製剤は、分割され得るエンベロープウイルスに由来するものである。このエンベロープウイルスは、ヒトまたは動物由来のウイルスを含めて、さまざまな起源に由来するものであってよい。ウイルスが例えばウシ由来のようにヒト以外に由来するものである場合は、そのウイルスを組換えウイルスとすることが好ましい。
【００１７】
本発明のワクチン製剤は、好ましくは、送達後に該エンベロープウイルスに対する防御免疫応答を刺激することができるものである。
【００１８】
本発明において、ウイルスとしては、以下に例示されるがこれらに限定されないあらゆるエンベロープウイルスが含まれる（ただし、インフルエンザウイルスを除く）：
１）　パラミクソウイルス科、例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＡおよびＢ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ−３など）、メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス；
２）　ヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス；
３）　フラビウイルス、例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス；
４）　トガウイルス、例えば、風疹ウイルス、東部、西部およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス；および
５）　レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス。
【００１９】
本発明のワクチン製剤は２種以上の分割ウイルス調製物を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明のワクチン製剤は、疾病に対する更なる保護を与えるため、病原体由来の１種以上の抗原を分割調製物と組み合わせて含むことができる。適当な抗原は、分割調製物に由来する必要はなく、例えば、上に挙げたウイルスおよび肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のような呼吸器疾患を引き起こす病原体に由来する抗原が含まれる。
【００２１】
ウイルスを分割するには、感染性（野生型もしくは弱毒化された）または非感染性（例えば、不活化された）全ウイルス粒子を、一般的には（必ずしもそうではないが）界面活性剤からなる分割剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を破砕濃度で用いて破砕または断片化することにより行う。分割されるウイルスは、２種以上の異なるウイルス由来の免疫原性エレメントをもつキメラな組換えウイルスであってもよい。こうした破砕により、ウイルスの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を変えるような、あらゆるウイルスタンパク質の完全なまたは部分的な可溶化が起こる。
【００２２】
好ましくは、分割ウイルスは、本発明に従ってウイルスに分割剤を接触させてウイルスのエンベロープを完全に破砕することにより得られる。他のウイルスタンパク質も完全にまたは部分的に可溶化されることが好ましい。分割した後ではウイルスの完全性が失われて、そのウイルスは非感染性になるが、このことは適当なｉｎ ｖｉｔｒｏタイトレーションアッセイで評価することができる。いったん破砕されると、一般的に、ウイルスのエンベロープタンパク質はインタクトな全ウイルス粒子とはもはや会合しない。好ましくは、他のウイルスタンパク質も完全にまたは部分的に可溶化され、したがって、分割した後ではインタクトな全ウイルス粒子とは会合しないか、部分的にしか会合しない。
【００２３】
分割剤がウイルスエンベロープおよびウイルスタンパク質に及ぼす効果は、本明細書に記載するような、分割したウイルスおよびウイルスタンパク質のショ糖クッション実験での移動と、ウェスタンブロット分析および電子顕微鏡検査による可視化によって追跡することができる。
【００２４】
本発明による分割（スプリット）ワクチンの調製には、分割剤とウイルス脂質分の一部または大部分を除去する追加のステップが含まれていてもよい。さらに、分割エンベロープウイルスの調製方法は、いくつかの異なる濾過および／またはその他の分離ステップ、例えば、超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離、およびクロマトグラフィーの各ステップを様々に組み合わせて含んでいてもよく、場合により、分割の前または後に不活化ステップを、例えばホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンまたはＵＶ処理を用いて、行ってもよい。分割方法はバッチ法、連続法または半連続法として実施することができる。
【００２５】
本発明による分割（スプリット）ワクチンは、一般的には、膜断片および膜エンベロープタンパク質、ならびにウイルス基質タンパク質や核タンパク質のような非膜タンパク質を、重大な意味をもつ全ウイルス粒子を存在させないで、含有する。本発明の分割ワクチンは通常、ウイルス構造タンパク質の大半または全部を含んでいるが、それらは必ずしも全ウイルス粒子中に存在するときと同じ割合ではない。好適な分割ウイルス調製物はウイルス構造タンパク質の少なくとも半分、好ましくは全部を含んでいる。一方、サブユニットワクチンは本質的に１種または２，３種の高度に精製されたウイルスタンパク質からなるものである。例えば、サブユニットワクチンは、ワクチン接種後に所望のウイルス中和抗体の誘導に関与することがわかっている精製されたウイルス表面タンパク質を含有する。
【００２６】
本発明においては、非イオン性およびイオン性の界面活性剤だけでなく、その他の各種試薬も分割剤として使用することができる。本発明のもとで有用な分割剤の例としては、次のものを挙げることができる：
１．胆汁酸およびその誘導体。胆汁酸には、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および前記胆汁酸のグリコ−、タウロ−、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸−、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミドのような誘導体が含まれる。具体的な例はデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）である；
【００２７】
２．非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノール類（ＴｒｉｔｏｎＴＭ系列）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）などのポリオキシエチレンエーテル類、および一般式（Ｉ）：
（Ｉ）　　　ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである］
で表されるポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル類、ならびにこれらの２種以上の組合せ。具体的な例はＴｗｅｅｎ ８０ＴＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭ、およびラウレス９である；
【００２８】
３．アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシド、ここで、アルキル鎖はＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１４であり、糖部分は任意のペントースもしくはヘキソース、または異なる結合（例えば、１→６、１→５、１→４、１→３、１−２）を有するそれらの組合せである。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい；
【００２９】
４．上記３の誘導体、ここで、１個以上のヒドロキシル基、好ましくは６ヒドロキシル基が修飾されており、例えば、エステル、エトキシレート、スルフェート、エーテル、カーボネート、スルホスクシネート、イセチオネート、エーテルカルボキシレート、第４級アンモニウム化合物などに修飾される；
【００３０】
５．アシル糖、ここで、アルキル鎖はＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１２であり、糖部分は任意のペントースもしくはヘキソース、または異なる結合（例えば、１→６、１→５、１→４、１→３、１−２）を有するそれらの組合せである。アシル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい；
【００３１】
６．構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−３−アミノ−１−プロパンスルホネートのスルホベタイン類、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１６のアルキル鎖またはアリールアルキル鎖である。アルキル鎖Ｒは飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい。Ｒ１およびＲ２はＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖である；
【００３２】
７．構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−グリシンのベタイン類、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１６のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい。Ｒ１およびＲ２はＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖である；
【００３３】
８．構造Ｒ−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ−ＯＨのポリオキシエチレンアルキルエーテル、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ２０、典型的にはＣ８〜Ｃ１４のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい。ｎは５〜３０、典型的には８〜２５である；
【００３４】
９．構造Ｒ−（Ｎ−Ｒ１）−グルカミドのＮ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８〜Ｃ１２のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐でも環状でもよい。Ｒ１およびＲ２はＣ１〜Ｃ６、典型的にはＣ１のアルキル鎖である。糖部分はペントースまたはヘキソースで修飾されていてもよい；
【００３５】
１０．Ｈｅｃａｍｅｇ：（６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチル−カルバモイル）−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド）；
【００３６】
１１．構造Ｒ−Ｃ６Ｈ４−Ｏ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ−ＯＨのアルキルフェノキシポリエトキシエタノール、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ１８、典型的にはＣ８のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい（ｎ＞＝３）；
【００３７】
１２．構造Ｒ，−Ｎ＋（−Ｒ１，−Ｒ２，−Ｒ３）の第４級アンモニウム化合物、ここで、ＲはＣ６〜Ｃ２０、典型的にはＣ２０のアルキル鎖である。アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよく、かつ／また分岐していてもよい。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はＣ１〜Ｃ４、典型的にはＣ１のアルキル鎖である；
【００３８】
１３．サルコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）：Ｎ−ラウリルサルコシンＮａ塩；
【００３９】
１４．ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）またはセタブロン（Ｃｅｔａｖｌｏｎ）。
【００４０】
最も好ましいものはＮａＤＯＣとサルコシルである。分割を行うために、適切には、分割剤を室温で、例えば一夜、分割すべきウイルスとインキュベートする。適宜、分割剤を組み合わせて用いてもよい。
【００４１】
分割ワクチン調製物は、好ましくは、少なくとも１種の界面活性剤（特に、非イオン性界面活性剤でありうる）を含有する。その１種以上の界面活性剤は分割方法からの残留物であってよく、かつ／または分割した後でウイルスに添加してもよい。分割された抗原物質は非イオン性界面活性剤の存在下で安定化されると考えられるが、本発明が必ずそのケースに当てはまるとは限らないことが理解されよう。安定化剤として適する非イオン性界面活性剤には、オクトキシノール類（ＴｒｉｔｏｎＴＭ系列）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）などのポリオキシエチレンエーテル類、および一般式（Ｉ）：
（Ｉ）　　　ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである］で表されるポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル、およびこれらの２種以上の組合せが含まれる。
【００４２】
Ｔｒｉｔｏｎ系列の好ましい非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ （ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−２０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−３０５、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５ Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ−１０１が挙げられる。特に好ましいものはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
【００４３】
好適な非イオン性界面活性剤には、さらに、上記の一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテル、特にポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルが含まれるが、これらに限定されない。最も好ましいポリオキシエチレンエーテルはポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス ９）である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルの別名がＣＡＳ登録に載っている。ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルのＣＡＳ登録番号は９００２−９２−０である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルはＭｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ（１２版：エントリー７７１７、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ． Ｉｎｃ．， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｎ．Ｊ．， ＵＳＡ； ＩＳＢＮ ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。ラウレス ９はエチレンオキシドをドデシルアルコールと反応させることにより形成され、平均９個のエチレンオキシド単位をもっている。
【００４４】
最終ワクチン製剤に含まれる安定化用界面活性剤の最終濃度は０．００１〜２０％の範囲、より好ましくは０．０１〜１０％、最も好ましくは約２％（ｗ／ｖ）までである。１種以上の界面活性剤が存在する場合、これらは一般的に最終製剤中にそれぞれが約２％までの濃度で存在し、通常はそれぞれが約１％までの濃度、好ましくはそれぞれが約０．６％までの濃度、より好ましくはそれぞれが約０．２％または０．１％までの微量で存在する。本発明のワクチン製剤には界面活性剤の任意の混合物を存在させることができる。
【００４５】
エンベロープウイルスは、血清または無血清法により適当な細胞基体上で複製させることにより生産することができる。組織培養で増えるウイルスは、例えば、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＨＥｐ−２などのヒト細胞、ＡＧＭＫ、Ｖｅｒｏ、ＬＬｃ−Ｍｋ２、ＬＬｃ−Ｍｋ２、ＦＲｈＬ、ＦＲｈＬ−２などのサル細胞、ＭＤＢＫなどのウシ細胞、ＭＤＣＫなどのイヌ細胞、ニワトリ胚性繊維芽細胞などの一次細胞、またはワクチン用ウイルスの生産に適する他の細胞タイプ（上記の細胞系に由来するクローンを含む）で生産することができる。
【００４６】
分割ワクチン調製物は、製薬上許容される賦形剤と組み合わせることが好ましい。使用する製薬上許容される賦形剤は、ワクチン製造の分野で慣用のものであってよい。所与のワクチン製剤で用いる賦形剤は、互いに適合性で、しかも組成物の必須成分とも適合するものである。そして、諸成分の性能、もし存在するのであれば活性物質の性能、を損なうような相互作用がまったく起こらないようにする。当然、賦形剤はすべて無毒性で、ヒトに使用するのに十分な純度のものでなければならない。適当な賦形剤の例は当技術分野で周知である。
【００４７】
ワクチン製剤はまた、キャリアーおよび／または免疫刺激剤でありうるアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは分割方法からの残存物であっても、かつ／または分割した後でウイルスに添加してもよい。本発明のワクチンで使用するのに適したアジュバントは当技術分野で周知である。
【００４８】
かくして、本発明のさらなる態様は、鼻腔内送達用のワクチン製剤の製造における、アジュバントと組み合わせた、分割エンベロープウイルス調製物（分割インフルエンザウイルス調製物ではない）の使用を提供する。好ましくは、この調製物は製薬上許容される賦形剤を含有する。
【００４９】
本発明のワクチン製剤は、該ワクチンを鼻腔経路で投与することによって、疾病にかかりやすい、または該疾病にかかっている哺乳動物を保護または治療するために使用することができる。本発明はそのような治療および保護方法にも及ぶものである。
【００５０】
痛みを伴う注射の必要性や、それに関連した「針への恐怖」ゆえの患者の応諾に与えるマイナスの影響を回避できることを別にしても、鼻腔内法などによる粘膜へのワクチン接種には興味がもてる。その理由は、動物では、抗原の粘膜投与が多くの病原体の侵入経路である粘膜表面において防御応答を効率よく引き出せるとわかったからである。さらに、鼻腔内ワクチン接種のような粘膜ワクチン接種は、鼻粘膜だけでなく生殖器粘膜などの離れた粘膜部位でも粘膜免疫を引き出しうることが提起されている。この分野での多くの研究にもかかわらず、ヒトへの使用に適した鼻腔内送達用の安全かつ有効なワクチンはまだ確認されていない。
【００５１】
本発明に従う鼻腔内投与は、液滴、スプレーまたは乾燥粉末形態で行うことができる。ネブライザー投与またはエーロゾル投与が可能なワクチン製剤も本発明の一部を構成する。
【００５２】
適当なアジュバントはどれも、適切な形態（溶液、非小胞性の溶液、懸濁液、粉末など）で本発明において使用することができる。好ましいアジュバントとしては国際公開ＷＯ ９９／５２５４９に例示されているものがあり、この文献の全内容を参照により本明細書に含めるものとする。好適なアジュバントには、Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭ、ラウレス ９およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限らない。
【００５３】
非イオン性界面活性剤はリピドＡの無毒性誘導体のような免疫刺激剤と組み合わせることが有利であり、かかるリピドＡ誘導体としては、モノホスホリルおよびジホスホリルリピドＡの無毒性誘導体、例えば、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）および３−脱−Ｏ−アシル化ジホスホリルリピドＡを含めて、米国特許第４，９１２，０９４号および英国特許第２，２２０，２１１号に記載されるものが含まれる。好ましい組合せは３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせたラウレス−９である。上記の免疫刺激剤は非イオン性界面活性剤を含まない製剤にも適宜使用することができる。
【００５４】
３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径が０．２μｍより小さい粒子サイズを有する乳剤の形をしており、その製造方法はＷＯ ９４／２１２９２に記載されている。モノホスホリルリピドＡと界面活性剤を含む水性配合物がＷＯ ９８４３６７０Ａ２に記載されている。
【００５５】
本発明の組成物中に処方される細菌性リポ多糖由来のアジュバントは、細菌源から精製して加工処理を施すことができるが、また、それらを合成することもできる。例えば、精製されたモノホスホリルリピドＡはＲｉｂｉら１９８６（１９８６， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ． Ｃｏｒｐ．， ＮＹ， ｐ４０７−４１９）に記載され、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．由来の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドＡは英国特許第２，２２０，２１１号および米国特許第４，９１２，０９４号に記載されている。その他の精製されたおよび合成のリポ多糖類もすでに記載されている（Ｈｉｌｇｅｒｓら、１９８６， Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ７９（４）： ３９２−６； Ｈｉｌｇｅｒｓら、１９８７， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６０（１）：１４１−６； およびヨーロッパ特許第０ ５４９ ０７４ Ｂ１）。特に好ましい細菌性リポ多糖アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００５６】
したがって、本発明において使用できるＬＰＳ誘導体は、構造がＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬの構造と類似している免疫刺激剤である。本発明の別の態様において、ＬＰＳ誘導体はアシル化単糖であってよく、これはＭＰＬの上記構造の下位部分である。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態において、アジュバントはＡＤＰ−リボシル化トキシンまたはその突然変異体である。かかるトキシンの例として、大腸菌由来のＨｅａｔ Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ （ＬＴ）、その突然変異体（例えばＬＴＲ１９２Ｇ）、およびこれらのトキシンの断片（例えばガングリオシド結合性成分（ＬＴＢ））がある。
【００５８】
その他の好適なアジュバントとして、ＱＳ２１のようなサポニンアジュバントが挙げられる。
【００５９】
ある促進系は、無毒性のリピドＡ誘導体とサポニン誘導体の組合せ、特にＷＯ９４／００１５３に記載されるようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ ９６／３３７３９に記載されるようなＱＳ２１がコレステロールで抑えられている、比較的反応性の低い組成物を含む。
【００６０】
本発明のワクチンを鼻腔内に投与するのに適した装置はスプレー装置である。好適な鼻スプレー装置はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍＢＨおよびＶａｌｏｉｓから販売されている。
【００６１】
鼻腔内使用に適したスプレー装置は、その性能が使用者によって加えられる圧力に左右されないものである。圧閾値（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）装置が特に有用である。なぜなら、閾値圧に達したときだけノズルから液体が放出されるからである。こうした装置によって、液滴の大きさが一定している噴霧を容易に達成することができる。本発明とともに使用するのに適した圧閾値装置は当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ ９１／１３２８１およびヨーロッパ特許第３１１ ８６３ Ｂ号に記載されている。現在、かかる装置はＰｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍＢＨから市販されており、また、Ｂｏｍｍｅｒ， Ｒ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎａｓａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９９， ｐ２６−３３にも記載されている。
【００６２】
好ましい鼻腔内装置は１〜５００μｍの範囲の液滴（液体として水を用いて測定）をもたらすものである。１０μｍより小さいと吸い込む危険があるため、１０μｍ未満の液滴を約５％以下にすることが望ましい。
【００６３】
本発明のワクチンとともに使用するのにさらに好ましい鼻腔内送達系の特徴は２用量（ｂｉ−ｄｏｓｅ）送達である。２用量装置は、それぞれの鼻孔に投与するために、１回のワクチン量を２つの小用量に分けて含有するものである。
【００６４】
本発明はまた、本発明の分割ワクチン製剤を含む鼻腔内送達装置を提供する。
【００６５】
本発明は、さらなる態様において、本明細書に記載する鼻腔内投与装置を含んでなるか、または、鼻腔内投与装置および該装置とともに使用する別のワクチン製剤を含んでなる医薬キットを提供する。
【００６６】
本発明のこの態様は、必ずしも液体製剤のスプレー送達に限らない。本発明のワクチンは他の形態で投与することもでき、例えば粉末として投与してもよい。
【００６７】
本発明のワクチン製剤は予防と治療の両目的に使用することができる。したがって、本発明は、感染症にかかりやすい、またはかかっている哺乳動物を保護または治療する方法を提供する。本発明の別の態様では、医療に使用するための本明細書に記載されるワクチンを提供する。ワクチン製剤については、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， Ｖｏｌｌｅｒら編， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ． １９７８に概説されている。
【００６８】
ワクチンは適切な投与計画、例えば１回量または２回量の投与計画、で送達することができる。ワクチンはナイーブ集団と感作集団、すなわち、セロネガティブ（血清反応陰性）個体とセロポジティブ（血清反応陽性）個体に使用することが可能である。
【００６９】
本発明では、より好ましくは、ワクチン製剤がアジュバントを含有し、かつ／または該製剤がウイルスへの曝露によってすでに感作された個体に投与される。
【００７０】
本発明はさらに、ワクチン製剤の製造方法であって、
（ａ）　エンベロープウイルスを分割すること、
（ｂ）　場合により、分割したエンベロープウイルス調製物を安定化剤と混合すること、
（ｃ）　場合により、分割したエンベロープウイルス調製物をアジュバント（該アジュバントはキャリアーおよび／または免疫刺激剤でありうる）と混合すること、
を含んでなる上記方法に関する。
【００７１】
好ましくは、上記方法はステップ（ａ）および（ｂ）、ステップ（ａ）および（ｃ）、またはステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含んでなる。好ましくは、安定化剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ ８０ＴＭ）、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００ＴＭ）、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を含有する。
【００７２】
必要に応じて、この方法で製造したワクチンを適当なキャリアーと混合する。
【００７３】
本発明はまた、エンベロープウイルスを適当な分割剤で処理することを含む、本明細書に記載するエンベロープウイルスの分割方法に関する。
【００７４】
本発明について以下の図面および実施例を用いて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７５】
実施例１．　分割ウイルスの作製
種々のウイルス科に属するエンベロープウイルスを界面活性剤などの分割剤の添加により分割した。この分割を評価するには、ショ糖勾配またはショ糖クッションでの分割ウイルスの移動とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による可視化により特徴づけし、また、分割ウイルス産物を電子顕微鏡で直接検査する。
【００７６】
この実施例に記載する分割ウイルスには、様々なエンベロープウイルス科の代表的なウイルスが含まれている。例えば、パラミクソウイルス科（呼吸器合胞体ウイルスＡおよびＢ、パラインフルエンザウイルス−３、流行性耳下腺炎ウイルス、および麻疹ウイルス）、トガウイルス科（風疹ウイルス）、およびヘルペスウイルス科（エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、または単純ヘルペスウイルス）のメンバーについて検討する。
【００７７】
ウイルス粒子を破砕（分割）するには、無細胞ウイルス調製物に可溶化濃度の界面活性剤のような分割剤を添加する。特に、界面活性剤として胆汁酸やアルキルグリコシドを使用する。界面活性剤を単独でまたは各種組み合わせて添加し、インキュベートしてこの方法を完結させる。
【００７８】
効果的に分割されたかを評価するには、初めに、ショ糖勾配またはクッションによる遠心分離を行う。簡単に述べると、界面活性剤で処理したサンプルと未処理のサンプルをショ糖勾配／クッション遠心分離にかけ、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析する。可溶性画分中のあらゆるタイプのウイルス粒子タンパク質が移動することで、効果的に分割されたことがわかる。ショ糖−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で効果的に分割されたと思われるサンプルを電子顕微鏡検査でさらに分析する。サンプルは標準的な陰性染色法を用いて可視化する。
【００７９】
ＲＳＶ、ＨＳＶおよびＰＩＶに対して以下の具体的な分割実験を実施した。
【００８０】
１．１　細胞培養条件
ヒト野生型ＲＳＶ／Ａ／ＬｏｎｇおよびＰＩＶ−３を、定常的無血清法でＶＥＲＯ細胞内にて複製させた。感染に先立って、ＶＥＲＯ細胞を集密状態になるまで４日間増殖させた。各ウイルスに次のウイルス生産条件を適合させた：ＲＳＶ／Ａに対してはＭＯＩ ０．０３、４日間、ＨＳＶ２に対してはＭＯＩ ０．００１、３５℃で３日間、ＰＩＶ−３に対してはＭＯＩ ０．０１、３７℃で５日間。収穫日に、細胞を溶解し、安定化剤を添加した後で細胞溶解液を回収し、直ちに−７０℃で保存した。
【００８１】
１．２　ウイルスの精製
１，０００×ｇで１０分間遠心分離して清澄化した後、ＰＥＧ６０００沈澱により上清からウイルス粒子をペレット化した。このペレットをＴｒｉｓ ５０ｍＭ−ＮａＣｌ ５０ｍＭ−ＭｇＳＯ４ ２ｍＭ ｐＨ７．５バッファー中に懸濁し、続いてベンゾナーゼ処理を行った。この溶液を５００ｋＤ ＡＧＴ膜で５倍容量のリン酸緩衝溶液に対して限外濾過し、続いて５倍容量のリン酸バッファー ｐＨ７．５に対してダイアフィルトレーションを実施した。
【００８２】
インタクトなウイルス粒子が生産され、本明細書に記載する電子顕微鏡検査（ＥＭ）およびショ糖クッションでの遠心分離により確認された。タンパク質の濃度を測定した。
【００８３】
１．３　ウイルスの分割
無細胞ウイルス調製物に分割剤を添加してウイルス粒子を分割した。
【００８４】
分割を有効なものとするためには、界面活性剤をその臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）より高い濃度で使用する必要がある。全ての界面活性剤はそのｃｍｃ濃度より高い最終濃度で使用した。Ｄ／Ｐ比（界面活性剤／タンパク質比）を検討した。Ｄ／Ｐ比≧２５のときに分割がうまくいった。Ｄ／Ｐ比は２５以上とすることが好ましい。
【００８５】
次の界面活性剤を２％の濃度で使用してウイルス粒子を分割した：デオキシコール酸ナトリウム、サルコシル、プランタケア（Ｐｌａｎｔａｃａｒｅ）およびラウレス９。
【００８６】
分割後、この溶液を処方用バッファー（ＰＯ４ １０ｍＭ／ＮａＣｌ １５０ｍＭ ｐＨ７．５）に対して透析して過剰の界面活性剤を除いた。
【００８７】
例として、ＲＳＶについての分割方法を以下にまとめて記載する。
【００８８】
2004510744.tif 000002
【００８９】
１．４　分割ウイルスの特徴づけ
出発ウイルスの完全性および分割の質を３０％ショ糖クッションでの超遠心分離（ＴＬ１００ Ｂｅｃｋｍａｎローターを使って５０，０００ｒｐｍで１時間）により判定した。画分を特異的なウェスタンブロットアッセイと電子顕微鏡検査により分析し、これらの画分の一部に対して感染力のタイトレーションを行った。
【００９０】
１．４．１　超遠心分離
遠心チューブに３０％ショ糖溶液（４５０μｌ）を半分まで満たした後、分析すべきサンプル（４５０μｌ）をこのショ糖クッションの上に穏やかにかつ慎重に載せ、その後Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬ１００ローターで５０，０００ｒｐｍ、＋４℃にて１時間、遠心分離を実施した。遠心分離後、チューブを３つの部分に分けてドレインした。上部相（３００μｌ）を「上清」と呼ぶ。中間相（３００μｌ）はサンプルとショ糖クッションとの境界相であり、ここでは「中間」と呼ぶ。下部相（３００μｌ）は完全なウイルスに対して遠心分離を行ったときの再懸濁ペレットを含むボトム液であり、ここでは「ペレット」と呼ぶ。
これら３つの画分をさらに分析した。
【００９１】
１．４．２　ウェスタンブロット分析
この分析によりウイルスの完全性を調べることができ（ペレット画分が陽性）、また、分割の効力を判定することができる（好ましくは、エンベロープタンパク質のような構造タンパク質の全部または大部分について上清画分が陽性）。
【００９２】
特定のウイルスタンパク質を特徴づけるために特異的抗体を使用した。
【００９３】
ＲＳＶ−Ａの場合は、非分割および分割画分を、抗Ｆタンパク質（表面タンパク質）、抗Ｇタンパク質（表面タンパク質）、抗Ｎタンパク質（ヌクレオキャプシド）、および抗Ｍタンパク質（基質）含量について分析した。
【００９４】
ＰＩＶ−３の場合は、非分割および分割画分を、そのＨＮタンパク質含量についてモノクローナル抗体を用いて、またＦ、Ｍ、ＨＮタンパク質含量についてはポリクローナル抗体を用いて分析した。
【００９５】
ＨＳＶの場合は、非分割および分割画分を、そのＧタンパク質、外皮タンパク質およびキャプシドタンパク質について抗体を用いて分析した。
【００９６】
分割の基準
分割を行う前のペレット画分中に試験した４種全てのタンパク質に対する陽性のウェスタンブロット（ＷＢ）シグナルが存在し、かつ他の２つの画分中にシグナルが存在しなければ、そのウイルス調製物にはインタクトな完全ウイルスが含まれていることとなる。
【００９７】
エンベロープが破砕され、かつエンベロープタンパク質が上清および／または中間画分に検出されたとき、その分割は有効であると見なした。ＲＳＶの場合は、例えばＦまたはＧがＳまたはＭ画分において検出されたときに、分割は有効であるとした。好ましくは、ＦおよびＧは実質的にＳおよび／またはＭ層に検出されて、ペレットには検出されない。
【００９８】
結果のまとめ
ＲＳＶＡについての結果を図１〜４に示す。
全てのウェスタンブロットの結果において、「Ｓｐｌｉｔ−Ｏ」は分割する前のウイルスを意味する。「Ｓ」、「Ｍ」および「Ｐ」は、それぞれ、ショ糖クッションでのサンプルの超遠心分離後に取得された「上清」、「中間」および「ペレット」画分をさす。レーンは左から右へ番号を付けた。容量はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せたサンプル量をさす。
【００９９】
図１は、ｍＡｂ Ｂ４（抗Ｆ）でプローブした分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
上のパネル：
2004510744.tif 000003
下のパネル：
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【０１００】
図２は、抗Ｍモノクローナル抗体でプローブした分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
上のパネル：
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下のパネル：
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【０１０１】
図３は、抗Ｇモノクローナル抗体でプローブした分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
上のパネル：
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下のパネル：
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【０１０２】
図４は、抗Ｎモノクローナル抗体でプローブした分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
上のパネル：
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下のパネル：
2004510744.tif 000010
【０１０３】
ＦおよびＧタンパク質に関して、分割後の中間および上清画分にシグナルが存在し、かつペレット画分にはバンドがほとんど存在しなければ、そのウイルスエンベロープは完全に破砕されたことになる。ＮおよびＭタンパク質に関しては、全ての画分にシグナルが存在すれば、これらのタンパク質が分割調製物中に存在することを示す。これらの結果からは、試験した４種全ての界面活性剤がＲＳＶＡウイルスの分割をもたらすことがわかる。
【０１０４】
全画分における４種全てのタンパク質に対するシグナルの分析、特に中間および上清画分における分割後のＮおよびＭタンパク質に対する比較可能なシグナルの分析から、試験した条件において、ＮａＤＯＣとサルコシルはウイルスの分割をもたらすだけでなく、全てのウイルス構造を破壊して構造および非構造タンパク質を可溶化することができることがわかる。
【０１０５】
同様の結果がＰＩＶ、ＨＳＶおよび麻疹ウイルスの分割の場合にも得られ、これらのウイルスは例えば２％のＮａＤＯＣまたはサルコシルを用いてうまく分割される。
【０１０６】
ＮａＤＯＣとサルコシルは全てのウイルスに使える好適な分割剤である。
【０１０７】
１．５　ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルスタイトレーション
分割後にウイルスの完全性が失われることから、そのウイルスは非感染性となる。成功したウイルス破砕の分析は、分割後のウイルス力価が１０６ｌｏｇまたはそれ以上低下することにより示される。
【０１０８】
１．６　電子顕微鏡検査（ＥＭ）による分析
電子顕微鏡検査による分析は、コントラスト剤としてホスホタングステン酸Ｎａを用いて標準的な２段階陰性染色法により行った（ＨａｙａｔおよびＭｉｌｌｅｒ， １９９０， Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ， ＭｃＧｒａｗ， Ｈｉｌｌ編）。グリッド（格子）を検査して、この材料の分割パターンを評価した。
【０１０９】
非分割ウイルス調製物と、ＮａＤＯＣまたはサルコシルで分割したＲＳＶＡ、ＨＳＶ２およびＰＩＶ３ウイルス調製物の電子顕微鏡検査による分析は、ウェスタンブロット分析で得られた観察を支持するものである。結果を示すために、ＲＳＶ、ＨＳＶおよびＰＩＶのデータを示す。
【０１１０】
図５は、ＥＭにより可視化されたＲＳＶ／Ａ出発材料を示す。図６は、ＮａＤＯＣで分割した後のＲＳＶ／Ａを示す。図７は、ＥＭにより可視化されたＰＩＶ３出発材料を示す。図８は、ＮａＤＯＣで分割した後のＰＩＶ３を示す。図９は、ＥＭにより可視化されたＨＳＶ２出発材料を示す。図１０は、サルコシルで分割した後のＨＳＶ２を示す。
【０１１１】
非分割ウイルス（インタクトな完全ウイルス）は、比較的よく保存されたまたは軽度の損傷を受けたウイルス粒子と若干の無定形物質を含んでいた。ＮａＤＯＣまたはサルコシルで分割したウイルスは、さまざまな程度に集合した無定形の物質が不均一に広がっている外観を示した。同様のデータが試験した全てのウイルスＲＳＶ、ＰＩＶおよびＨＳＶにおいて得られた。さらに、ＲＳＶやＰＩＶの場合には、ウイルスエンベロープまたは核タンパク質起源からの識別可能な構造体がほとんど認められなかった。
【０１１２】
実施例２．　分割（スプリット）ワクチンのマウスにおける免疫原性
分割したＲＳＶおよび／またはＰＩＶ調製物をマウスにワクチン接種するための免疫原として使用して、これらの調製物の免疫原性を評価した。簡単に説明すると、８週齢の雌マウスを鼻腔内送達用の分割ワクチン調製物で免疫する。アジュバントを添加してない対照も含める。数週間の間隔で２回投与する。
【０１１３】
最後に投与してから２週間後に、動物を犠牲にして血液、脾細胞、および／または鼻洗浄液を採取する。マウス血清をウイルス特異的ＥＬＩＳＡアッセイで試験することにより、血清中のウイルス特異的体液性免疫応答を評価する。さらに、抗体応答のアイソタイプ様相をアイソタイプ特異的アッセイで調べる。血清中の中和抗体の存在は、特異的なウイルス中和アッセイを用いて評価する。関連する局所免疫応答の誘導は、鼻洗浄液中の中和抗体をアッセイするか、あるいは鼻洗浄液中のウイルス特異的ＩｇＡをアッセイすることにより評価することができる。
【０１１４】
ウイルス特異的細胞性免疫応答の誘導は、回収した脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激、および細胞増殖の測定（トリチウム標識チミジンの取り込み）、および／または刺激した細胞からのＩＬ−５およびＩＦＮγの分泌により評価する。
【０１１５】
この実験における変動要因の影響は、分割（スプリット）製剤により誘発された応答の質および強さに特別の注意を払うことで評価される。
【０１１６】
２．１　分割ＲＳＶ製剤
以下の一連の実験は、分割したＲＳＶなどのウイルスが、鼻腔内（ＩＮ）経路で投与したとき、強力な免疫応答を引き出すことを示すものである。小児（ナイーブ）集団または初老（感作）集団のいずれかの免疫状態をより正確に反映させるために、感作動物または未感作動物において免疫原性を評価し、両集団での免疫原性を実証した。比較のためＩＭ送達を加えた。
【０１１７】
第１セットの実験では、８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、ＩＭまたはＩＮ経路で投与される分割ＲＳＶ調製物の免疫原性を試験した。初回感作を行うため、３×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）の生存ＲＳＶウイルスを６０μｌの容量（２×３０μｌ）で鼻腔内に投与した。初回感作から３週間後、動物にＲＳＶ分割抗原をワクチン接種した。ＲＳＶ分割産物の数量化は、ＲＳＶ Ｆタンパク質特異的ＥＬＩＳＡ（分割産物中に含まれるＦタンパク質を組換えＦＧタンパク質標準品に対して数量化する）に基づいていた。Ａグループのマウスは、１００μｌ中に４．２μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶ分割抗原を２１日間隔で２回、筋肉内経路により投与して免疫した。Ｂグループのマウスは、１００μｌ中に５０μｇのＡｌ（ＯＨ）３アジュバントとともに４．２μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶ分割抗原を２１日間隔で２回、筋肉内経路により投与して免疫した。Ｃグループのマウスは、１回目として６０μｌ中に２．７μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶ分割抗原を、２１日後に２回目として６０μｌ中に４μｇのＦタンパク質を含有するＲＳＶ分割抗原を鼻腔内経路により投与して免疫した。最後に投与してから２週間後に全ての動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【０１１８】
この実験の結果を図１１〜１６にまとめて示す。免疫応答を評価するために用いた最初の免疫リードアウト（ｒｅａｄ ｏｕｔ）は、ワクチン接種動物の血清中に存在する総ＲＳＶ ＦＧ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＦＧ特異的ＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａ）を測定するＥＬＩＳＡアッセイであった。これらのアッセイでは、９６ウェルディッシュに組換えＲＳＶ ＦＧ抗原をコーティングし、動物の血清を連続希釈してコーティングしたウェルに加える。結合した抗体を検出するには、ビオチン化抗マウスＩｇ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２Ａを添加し、次いでペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたストレプトアビジンで増幅する。ＯＰＤＡ基質を加え、続いて２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で処理し、４９０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定することにより結合抗体を定量する。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（４パラメーター式を使用）から抗体力価を算出し、ＥＵ／ｍｌで表す。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡアッセイに加えて、免疫感作によって引き出された免疫応答の質をさらに特徴づけるために中和アッセイを行った。この中和アッセイでは、動物血清の２倍希釈物を、９６ウェルの組織培養ディッシュにおいて、ＲＳＶ／Ａウイルス（３０００ｐｆｕ）およびモルモット補体とともに３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルにＨｅｐ−２細胞（１０４個／ウェル）を直接添加し、このプレートを３７℃で４日間インキュベートした。上清を吸引し、各ウェルに市販のＷＳＴ−１溶液を加えた。プレートを３７℃でさらに１８〜２４時間インキュベートした。ＯＤを４５０ｎｍでモニターし、タイトレーションを直線回帰分析により分析した。力価は未感染細胞について観察された最大ＯＤの５０％減少をもたらす血清希釈率の逆数として記録した。
【０１２０】
図１１は、総Ｉｇ ＥＬＩＳＡリードアウトを用いて得られた結果を示す。感作マウスにおいては、分割ＲＳＶ抗原を筋肉内（Ａ、Ｂグループ）または鼻腔内（Ｃグループ）経路で２回投与してワクチン接種することにより、強力な抗ＦＧ抗体応答が誘導された。
【０１２１】
詳細には、図１１は、生きているＲＳＶで感作し、次に分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）経路で投与して免疫したマウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えて４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｃグループにはそれぞれ２．７μｇと４．０μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。
【０１２２】
図１２は、中和アッセイの結果を示す。これらの感作動物においては、分割ＲＳＶ産物をＩＭまたはＩＮのいずれかで２回投与してワクチン接種することにより強力なウイルス中和抗体応答が誘導された。
【０１２３】
詳細には、図１２は、生きているＲＳＶで感作し、次に分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）経路で投与して免疫したマウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えて４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｃグループにはそれぞれ２．７μｇと４．０μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。
【０１２４】
図１３は、アイソタイプ分析の結果を示す。鼻腔内感作した動物では、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１の比が未感作マウスで得られたデータ（下記参照）と比べて増加しており、このことは、マウスが生きているウイルスで感作される（すなわち、初老集団における自然な状況）と、Ｔｈ１様応答のほうに向かう傾向があることを示唆している。
【０１２５】
詳細には、図１３は、生きているＲＳＶで感作し、次に分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）経路で投与して免疫したマウスにおける抗ＦＧ ＩｇＧアイソタイプ（ＥＬＩＳＡ）応答（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えて４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｃグループにはそれぞれ２．７μｇと４．０μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。
【０１２６】
図１４は、１回の抗原投与でさえ、感作集団では分割ＲＳＶによるＩＮワクチン接種に応答して強い免疫応答が生起することを示す。したがって、感作集団において、分割ＲＳＶはＩＮワクチン接種後に高力価の抗体応答を引き出すことができる強力な免疫原となる。
【０１２７】
詳細には、図１４は、生きているＲＳＶで感作し、次に分割ＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）経路で投与して免疫したマウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（１回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｂグループにはミョウバンアジュバントを加えて４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。Ｃグループにはそれぞれ２．７μｇと４．０μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。Ｄグループには感作のみを施して、ワクチン接種を行わなかった−このグループについて報告された抗体力価は、感作後２１日目に測定したとき検出レベルより低かった。
【０１２８】
第２の一連の実験では、未感作マウスを用いて、抗原用量とアジュバント添加が分割ＲＳＶ産物の免疫原性に及ぼす効果を立証した。マウスに１回目として２．４μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ抗原（送達量６０μｌ−２×３０μｌ）を投与した。３０日後に送達した２回目では、３．５μｇのＦタンパク質を含有する分割ＲＳＶ抗原をマウスに投与した。分割ＲＳＶは、アジュバントを添加しないで、またはアジュバントとして５μｇの大腸菌Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ （ＬＴ）を添加して、またはポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル０．５％（本明細書では「ラウレス９」）とともに投与した。対照グループは、１回目に２．０μｇのＦタンパク質を含有し、２回目に３．５μｇのＦタンパク質を含有する精製した完全ＲＳＶウイルスを鼻腔内投与して免疫した。最後のワクチン接種から２週間後に動物を犠牲にして、免疫応答を評価検討した。
【０１２９】
図１５および１６に示すように、未感作マウスにおいて抗体応答がＩＮ製剤により引き出された。ＥＬＩＳＡリードアウト（図１５）からは、ＩＮワクチン接種に対する応答がＩＭにより引き出される応答より低くなることが示唆されるが、中和リードアウト（図１６）からは、ＬＴアジュバントを添加した分割ＲＳＶ ＩＮ製剤が、中和抗体を誘導するうえでＩＭと少なくとも同じくらいすぐれており、他の製剤もＩＭに匹敵することが示唆される。かくして、ＩＮ経路で投与された分割ＲＳＶは未感作マウスにおいても免疫原性がある。
【０１３０】
詳細には、図１５は、分割ＲＳＶを鼻腔内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループにはそれぞれ２．４μｇと３．５μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。Ｂグループにはラウレス９アジュバントを加えてそれぞれ２．４μｇと３．５μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。ＣグループにはＬＴアジュバントを加えてそれぞれ２．４μｇと３．５μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で２回投与した。Ｄグループにはそれぞれ２．０μｇと３．５μｇの精製した完全ウイルスをＩＮ経路で２回投与した。Ｅグループには４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。
【０１３１】
図１６は、分割ＲＳＶを鼻腔内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）経路で投与して免疫した未感作マウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価（２回目のワクチン接種後）を示す。Ａグループには、２回に分けてそれぞれ２．４μｇと３．５μｇの分割ＲＳＶをＩＮ経路で投与した。Ｂグループには、ラウレス９アジュバントを加えた２．４μｇと３．５μｇずつの分割ＲＳＶを、２回に分けてＩＮ経路で投与した。Ｃグループには、ＬＴアジュバントを加えた２．４μｇと３．５μｇずつの分割ＲＳＶを、２回に分けてＩＮ経路で投与した。Ｄグループには、２回に分けてそれぞれ２．０μｇと３．５μｇずつの精製した完全ウイルスをＩＮ経路で投与した。Ｅグループには、４．２μｇずつの分割ＲＳＶをＩＭ経路で２回投与した。
【０１３２】
要約すると、これらの実験から、分割ＲＳＶ抗原はナイーブ集団と感作集団の両方において強い免疫原性を示すことが実証された。さらに、これらの実験で明らかになったことは、分割ＲＳＶの鼻腔内経路による効果的な投与が可能であり、しかも分割ＲＳＶが免疫原性を示すことである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
抗Ｆ抗体による分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
【図２】
抗Ｍ２抗体による分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
【図３】
抗Ｇ抗体による分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
【図４】
抗Ｎ抗体による分割ＲＳＶＡのウェスタンブロットを示す。
【図５】
ＥＭにより可視化されたＲＳＶ／Ａウイルス出発材料を示す。
【図６】
ＥＭにより可視化された、ＮａＤＯＣで分割したＲＳＶ／Ａウイルスを示す。
【図７】
ＥＭにより可視化されたＰＩＶ３ウイルス出発材料を示す。
【図８】
ＥＭにより可視化された、ＮａＤＯＣで分割したＰＩＶ３ウイルスを示す。
【図９】
ＥＭにより可視化されたＨＳＶ２ウイルス出発材料を示す。
【図１０】
ＥＭにより可視化された、サルコシルで分割したＨＳＶ２ウイルスを示す。
【図１１】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（２回目の投与後）を示す。
【図１２】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価（２回目の投与後）を示す。
【図１３】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗ＦＧ ＩｇＧアイソタイプ応答（２回目の投与後）を示す。
【図１４】
分割ＲＳＶを用いて筋肉内または鼻腔内経路により免疫した感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（１回目の投与後）を示す。
【図１５】
分割ＲＳＶを用いて鼻腔内経路により免疫した非感作マウスにおける抗ＦＧ抗体（ＥＬＩＳＡ）力価（２回目の投与後）を示す。
【図１６】
分割ＲＳＶを用いて鼻腔内経路により免疫した非感作マウスにおける抗ＲＳＶ／Ａ中和抗体力価を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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