(57)【要約】水分に敏感な材料（タンパク質、ペプチド、または生きた細胞などの生体材料を含む）を含む製品の調製方法であって、少なくとも以下の工程：（ｉ）少なくとも１種の活性物、糖重合体、および水溶性／混和性溶媒を含む被覆液体を提供する工程と、（ｉｉ）少なくとも水溶性ゲル形成固体粒子を含む大量の微粒子を提供する工程と、（ｉｉｉ）適した装置の加工処理チャンバ中で、大量の該微粒子を流動化する工程であって、それによって該微粒子の流動床を形成する工程と、（ｉｖ）飽和湿度条件下で、該被覆液体を害流動床の真下から上記流動床に噴霧する工程であって、それによって該微粒子をそれらで被覆する、噴霧する工程と、（ｖ）被覆された微粒子を乾燥させる工程とを含む方法が記載される。同様に組成物および使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水分に敏感な材料（タンパク質、ペプチド、または生きた細胞などの生体材料）を含む少なくとも以下の工程からなる製品の調製方法：
（ｉ）少なくとも１種の活性物、糖重合体、および水溶性／混和性溶媒からなる被覆液体を提供する工程と、
（ｉｉ）少なくとも水溶性ゲル形成固体粒子からなる大量の微粒子を提供する工程と、
（ｉｉｉ）該微粒子の流動床を形成するための適した装置の加工処理チャンバ中で、該大量の微粒子を流動化し、それによって該微粒子の流動床を形成する工程と、
（ｉｖ）飽和湿度条件下で、該被覆液体を該流動床の真下から該流動床に噴霧し、それによって該微粒子をそれらで被覆する工程と、
（ｖ）被覆された微粒子を乾燥させる工程とを含む方法。
【請求項２】
１またはそれより多くのさらなる被覆工程が、前記微粒子を、腸溶コーティング、膜コーティング、撥水コーティング、および／または味遮蔽（マスキング）コーティングでさらに被覆する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微粒子が加熱乾燥される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性物は、１または複数のタンパク質、ペプチド、または細胞からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記水溶性／混和性溶媒が、グリセロール、プロピレングリコール、またはグリセロールとプロピレンとの組合せである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記糖重合体が、デキストラン、フルクトース、フルイトース（fruitose）、グルコース、転化糖、ラクチトール、ラクトース、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、イソマルト、キシリトール、ポリデキストロース、またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記水溶性ゲル形成固体粒子が、アクリル酸塩およびその誘導体、アルブミン、アルギン酸塩、カルボマー、カラギーナン、セルロースおよびその誘導体、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、およびデンプンからなる群より選択される１または複数の水溶性ゲル形成固体粒子からなる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、湿度飽和環境で行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、無酸素環境で行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記被覆された微粒子が、注射用、舌下錠として、経口錠として、徐放性舌下錠として、マイクロカプセル中、ペッサリー、予め構成された固体用量（鼻スプレーまたは点鼻薬、液滴、洗眼薬または点眼薬、皮膚洗浄溶液用）、または飼料プレミックスとして組成物に形成される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が生体材料を安定化させる方法である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記微粒子が、５０ミクロン〜１ミリメートルの粒子サイズである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記活性物が、ホルモン、サイトカイン、または成長因子である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記活性物が、ヒト成長ホルモンもしくは動物成長ホルモン、またはそれらの誘導体、エリスロポエチン、カルシトニン、インターフェロン、インターロイキン、インスリン、またはコロニー刺激因子から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性物が酵素である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素が、ストレプトキナーゼ、ムラミダーゼ、パンクレアス、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ブロメライン、またはパパインからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記活性物がグルカンである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
グルカンがβ-１，３-グルカンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記活性物が微生物である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物が、１または複数のビフィズス菌、または乳酸菌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかの方法により製造された製品。
【請求項２２】
活性物および糖重合体被覆層で被覆された微粒子核を含む組成物。
【請求項２３】
腸溶コーティング、膜コーティング、撥水コーティング、味遮蔽コーティング、あるいは１または複数のそのようなコーティングで被覆される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記活性物が、タンパク質、ペプチド、または細胞を含む、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記活性物が、ホルモン、サイトカイン、または成長ホルモン、あるいはそれらの任意の２またはそれより多くの組合せである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記活性物が、ヒト成長ホルモンもしくは動物成長ホルモン、またはそれらの誘導体、エリスロポエチン、カルシトニン、およびインターフェロン、およびインターロイキン、インスリン、およびコロニー刺激因子を含む群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記活性物が微生物である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記微生物が、１または複数のビフィズス菌、または乳酸菌である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記活性物が止痢剤である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記活性物が成長促進剤（promotant）である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
アクリル酸塩、またはその誘導体、アルブミン、アルギン酸塩、カルボマー、カラギーナン、セルロース、またはその誘導体、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、またはデンプンの微粒子からなる、請求項２２〜３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、注射、舌下錠として、経口錠として、徐放性舌下錠として、マイクロカプセル、ペッサリー、予め構成された固体用量（鼻スプレーまたは点鼻薬、液滴、洗眼薬または点眼薬、皮膚洗浄溶液用）、または飼料プレミックスとしての形態である、請求項２２〜３１のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に生体材料の調製方法に関し、詳細には、生体タンパク質の調製方法に関するが、それに限定されない。
【背景技術】
【０００２】
例えば、ヒトおよび動物疾患の治療および予防や栄養補助食品として有用である、多くの生体材料（タンパク質または細胞全体など）は、限られた保管期限を有することが知られている。この限界は、一般に、貯蔵温度、例えば室温でのタンパク質の不安定性の結果であると考えられる。特定のタンパク質および／または細胞培養物の保管期限は、それらを冷蔵温度（すなわち、４℃〜８℃）で貯蔵することにより延長され得るが、そのような温度であってさえも、保管期限は１８ヶ月に満たないことが普通である。
【０００３】
当然のことながら、生物活性タンパク質は一般に、各タンパク質に特異的で複雑な三次元の様式で折りたたまれている。タンパク質は一般に、３つのレベルに体系化されており、すなわち、共有結合したアミノ酸残基の直鎖（ペプチド鎖）からなる一次構造；ペプチド鎖が規則的なパターン（αヘリックスおよびβ-プリーツシートなど）にフォールディングされている二次構造；および、フォールディングされた鎖がさらに自らをフォールディングして立体構造を形成する三次構造を有する。さらに、あるタンパク質は、密接した配置に拘束された１以上のいポリペプチド鎖からなり、四次構造と呼ばれるものを形成する。タンパク質の最終的な生物活性を決定づけるのは、三次構造および／または四次構造である。
【０００４】
タンパク質の最終構造は、多数の環境的要因、例えば、温度、ｐＨ、特定の補因子または金属の存在または不在、酸素、酵素、酸化剤もしくは還元剤の存在、および水または水分の存在により影響され得る。条件が最適でない場合、タンパク質は適切に形成されることができず、または変性する可能性があり、そのためその生体機能は失われるか、または少なくとも減少する。
【０００５】
動物、植物、および微生物の細胞は、最も広義では、複合タンパク質材料とみなされ得る、なぜなら、それらが細胞膜および／または細胞壁により取り囲まれた多数のタンパク質を含み、さらにその膜または壁が細胞表面にさらなるタンパク質を付加するからである。タンパク質と同様に、細胞の生育力もそれが存在する環境に依存する；例えば、温度、ｐＨ、特定の補因子または金属の存在または不在、特定の栄養分、代謝廃棄物、酸素、酵素、酸化剤または還元剤の存在または不在、および水または湿度の存在は、個別にまたは総合して生育力に影響するように作用し得る。例として、細菌の乳酸菌およびビフィズス菌（ヨーグルトに、またはヒトもしくは動物の健康栄養製品のプロバイオティクスとして一般に使用されていることにより商業的重要性を持つ）は、一般に、４℃ではほんの短い時間しか生存することができない。例えば、４℃より高い温度で、または加熱／凍結乾燥の間、そのような細菌は脱水により死亡する。細菌細胞死の主な原因は、細胞内および細胞表面に存在するタンパク質の変性に起因すると考えられる。
【０００６】
細胞培養物（細菌細胞培養物を含む）および生体タンパク質は、通常、溶液中で作製される。しかしながら、水は、時間および温度に依存してタンパク質を加水分解し、変性および機能の潜在的損失をもたらすことが知られている。そのような培養物またはタンパク質溶液の脱水は、脱水中、および既知の脱水手順が起こり得る高温において、タンパク質もまた変性し得るために、それらの安定性を改善し得ない。そのような問題を防ぐ試みで、細胞培養物およびタンパク性溶液の冷凍、またはそれらの凍結乾燥が使用されてきた。
【０００７】
真空下凍結乾燥（凍結乾燥）は、ワクチンなどに使用するためのタンパク質を調製する産業で一般に使用されている。プロセスには、従来的に、生体タンパク質溶液の凍結と、真空下で氷晶を水蒸気に変換すること（昇華）によるそこからの氷晶の除去とが含まれる。残念なことに、このプロセスはタンパク質の自然構造に損傷を引き起こし得る。
【０００８】
凍結乾燥により調製される生体タンパク質の安定性を増加させるために、緩衝剤または安定剤のような添加物が、製品配合に使用され得る。しかしながら、凍結乾燥中、数日かけて溶液温度がゆっくりと-２０℃に下げられる場合、添加物は、異なる凝固点で凝固し得る。結果として、最終生成物は、実際に複数の層（それぞれが個別の成分を表す）から構成される細かい膨れたケーキ様物質になり得る。本質的には、生体タンパク質を保護するために添加される添加物は、生体タンパク質から物理的かつ化学的に分離されて、添加物を保護剤として役に立たなくさせ得る。
【０００９】
例えば、ドライフルーツ、濃縮物、および粉乳を作るために、食品産業および乳業において通常使用される代替的手法は、加熱併用噴霧乾燥（spray-drying-using-heat）である。このプロセスには、熱空気の上昇流に対して溶液の細かい霧を噴霧塔の頂部から下に向けて噴霧することが含まれる。熱空気は、液滴が塔の底に到達する前に水をそこから除去する。噴霧乾燥は、通常、１９０℃より高い吸気温度で操作され、生成物温度は６０℃を越え得る。この操作環境で、生体タンパク質または細胞（細菌細胞など）の大部分は変性する。
【００１０】
当該技術分野で既知の別のタンパク質調製プロセスは、超臨界流体乾燥である。このプロセスにおいて、ペプチド、タンパク質、および核酸などの生体薬剤は、粒子形成するまで水溶液中に維持される。粒子形成の時点で、超臨界流体溶媒混合物の臨界点にある二酸化炭素中、制御された水素結合溶媒（エタノール、アセトン、およびイソプロパノールなど）を使用して、水性溶媒が除去される。
【００１１】
流動床噴霧乾燥は、加熱併用噴霧乾燥技術を改変したものである。そのプロセスは、通常、錠剤顆粒化のためにおよび／または熱安定材料を乾燥させるために、医薬産業および化学産業で使用される。プロセスには、活性物を含む溶液の細かい霧をスプレーヘッドの頂部から下方へ、一塊の乾燥賦形剤へ向けて噴霧することが含まれる。同時に、熱空気の上昇流が賦形剤の集団を通過して流動床を形成する。熱空気は、流動床の底で、湿った流動固体から水を除去する。
【００１２】
流動床噴霧乾燥技術は、約５０℃〜６０℃で熱安定な薬学的タンパク質に適用可能であり得る。しかしながら、タンパク質の自然構造は損なわれる可能性があり、したがって、タンパク質は、その生物活性を全て、または少なくとも一部損失し得る。
【００１３】
上記で記載されるような流動床噴霧乾燥には、さらなる問題が伴い得る。例えば、加工処理チャンバの頂部近くに位置するスプレーノズルは、賦形剤材料がスプレーノズルをブロックしないように、そのような材料の流動床表面より上に相当のクリアランスを有することが必要である。相当量の被覆材料または活性成分（複数可）を含有する液体は、ノズルのフィルター系をブロックし、加工処理の損失を導き得る。また、そのような頂部噴霧流動床操作は、被覆目的の噴霧よりも顆粒化にのみ理想的であり得る。活性成分（複数可）を含有する液体を加工処理チャンバの底部から噴霧する流動床噴霧乾燥装置が設計されてきた。例えば、Roto-Processor（登録商標）（Aeromatic, Switzerland）は、ペレット被覆用に設計され（直径が約１ｍｍまたはそれより大きいペレット）、Aerocoater（登録商標）プロセッサー（Aeromatic, Switzerland）は、穀粒、顆粒、ペレット、および小錠剤の被覆用に設計された。Roto-Processor（登録商標）およびAerocoater（登録商標）のいずれも微粒子被覆用に設計されてはいないと考えられる。
【００１４】
本発明の開発以前、利用可能な技法のうち、生体タンパク質および細胞を調製するために、マイクロカプセル化技法が最も有用であると判断されるかもしれない。典型的には、主な設備は必要とされず、バッチサイズは１０ｇ〜２０ｇほどの小ささであり得るので、マイクロカプセル化技法を豊富ではあり得ない生体タンパク質の調製に有用にしている。このプロセスは生体タンパク質を可溶化する有機溶媒を使用し、次いで生体タンパク質は、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）または水中油中固体（ｓ／ｏ／ｗ）乳濁液法のいずれかを使用して、高分子微小球中に封入される。タンパク質は、単なる濾過による水の除去および溶媒の蒸発除去後、固体微小球中に捕獲されている。
【００１５】
マイクロカプセル化技術は、製紙業においてカーボン紙または粘着紙を作成するために使用されてきており、少なくとも日本では、人工魚卵および装飾的製品などの食品が、魚または肉の風味を閉じこめるためのゼラチンマイクロカプセルを使用して作られる。
【００１６】
マイクロカプセル化は、貯蔵および将来的使用のための生体タンパク質および細胞全体を調製するための好ましい手段と判断され得るものの、この技術は、製薬業および生化学業においては依然として開発段階にある。この技術は、タンパク質が、使用される溶媒によりおよび必要な乳濁化／均質化プロセスにより変性する可能性が高いという点で明白な難点を有する。さらに、このプロセスに従って製造された製品の品質は、マイクロカプセルの核に微量の溶媒が残存するという事実により、望ましくないと判断され得る。そのような微量の溶媒は、この技術を使用して製造された製品の商業化を妨害し得る。
【００１７】
生物活性タンパク質および生存細胞培養物が、室温で実質的に安定であるように調製され得るならば、それは生物活性タンパク質および生存細胞培養物の保管期限を延長させ、冷蔵の必要をなくし得る。同時に、様々な代替的薬物送達法（例えば、従来の経口送達、舌下送達、鼻腔送達、頬側送達、眼および真皮送達さえも(occa/and even dermal delivery))が探索され得る。そのような代替的投与法は、通常使用される注射送達の浸潤性を最小化し得、これら分子全ての使用を完全に探求するという莫大な商業的機会をもたらし得る。
【００１８】
本明細書中で引用される文献の書誌詳細は、明細書の最後にまとめられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
改善された生体材料の調製方法、およびかかる方法により製造された生体材料を提供すること、または少なくとも有用な選択肢を人々に提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明１つの概括的態様において、水分に敏感な材料（タンパク質、ペプチド、または生きた細胞などの生体材料）を含む少なくとも以下の工程からなる製品の調製方法：
（ｉ）少なくとも１種の活性物、糖重合体、および水溶性／混和性溶媒を含む被覆液体を提供する工程と、
（ｉｉ）少なくとも水溶性ゲル形成固体粒子からなる大量の微粒子を提供する工程と、
（ｉｉｉ）適した装置の加工処理チャンバ中で、上記大量の微粒子を流動化し、それによって上記微粒子の流動床を形成する工程と、
（ｉｖ）飽和湿度条件下で、上記被覆液体を上記流動床の真下から上記流動床に噴霧し、それによって上記微粒子をそれらで被覆する工程と、
（ｖ）被覆された微粒子を乾燥させる工程とを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明のプロセスは、１またはそれより多くのさらなる被覆工程（微粒子を腸溶コーティング、膜コーティング、撥水コーティング、または味遮蔽コーティングでさらに被覆する）をさらに含み得る。
【００２２】
好ましくは、被覆された微粒子は加熱乾燥される。
【００２３】
好ましくは、上記活性物は、タンパク質、ペプチド、または細胞からなる。
【００２４】
本発明の被覆液体は、好ましくは、さらなる成分（アミノ酸、タンパク質、キレート剤、緩衝液、防腐剤、安定剤、抗酸化剤、潤滑剤、およびその中に含まれる活性物の機能を補完するか、それを安定させるように作用し得る他の添加剤など）を含む。
【００２５】
好ましくは、上記水溶性／混和性溶媒は、グリセロールまたはプロピレングリコールのいずれか、あるいはその両方である。
【００２６】
好ましくは、上記糖重合体は、以下のうちの１つから選択される：デキストラン、フルクトース、フルイトース、グルコース、転化糖、ラクチトール、ラクトース、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、イソマルト、キシリトール、ポリデキストロース、またはそれらの組合せ。
【００２７】
好ましくは、上記水溶性ゲル形成固体粒子は、以下のうちの少なくとも１または複数を含む；アクリル酸塩およびその誘導体、アルブミン、アルギン酸塩、カルボマー、カラギーナン、セルロースおよびその誘導体、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、およびデンプン。
【００２８】
好ましくは、結合剤は、以下の重合体から１つ選択される；アクリル酸塩およびその誘導体、アルブミン、アルギン酸塩、カルボマー、カラギーナン、セルロースおよびその誘導体、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、デンプン、またはそれらの組合せ。
【００２９】
好ましくは、工程は、Huttlin Turbojet（登録商標）Coaterで行われる。
【００３０】
好ましくは、生成物加工処理重量は、流動床加工処理チャンバの５０％ｗ／ｖを越える。より好ましくは、加工処理重量は７５％ｗ／ｖを越える。
【００３１】
好ましくは、工程は、湿度飽和環境で行われる。
【００３２】
好ましくは、工程は、閉鎖された滅菌環境にある装置の加工処理チャンバ内で行われる。
【００３３】
好ましくは、工程は、無酸素環境で行われる。そのような場合、加工処理チャンバ内の空気は、窒素または別の適した不活性ガスで置換され得る。
【００３４】
本明細書中に記載される方法に従って製造された室温で安定な生成物。好ましくは、該生成物は、タンパク質、ペプチド、または細胞の少なくとも１つを含む。
【００３５】
好ましくは、該生成物は、注射用、舌下錠、経口錠、徐放性舌下錠、マイクロカプセル、飼料プレミックス、ペッサリー、予め構成された固体用量（鼻スプレーまたは点鼻薬、液滴、洗眼薬または点眼薬、あるいは皮膚洗浄溶液用）として組成物に使用するのに適している。
【００３６】
生体材料を安定化させるために使用される場合の、本明細書中記載されるような方法。
【００３７】
ヒトを含む動物による摂取のための安定な徐放性錠剤またはマイクロカプセルを作成する方法。
【００３８】
ヒトを含む動物に投与するための錠剤またはマイクロカプセルを作成する方法であって、該錠剤は保護性腸溶コーティングを有する。本発明に使用され得る腸溶コーティング材料の例として、酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、酢酸トリメリト酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、メタクリル酸／メタクリル酸メチル共重合体、およびメタクリル酸／アクリル酸エチル共重合体が挙げられる。
【００３９】
本明細書中に記載されるような、実質的に室温で安定な止痢剤の製造方法。
【００４０】
本明細書中に記載されるような、実質的に室温で安定な成長促進剤配合物の製造方法。
【００４１】
本明細書中に記載されるような、実質的に室温で安定な減量剤の製造方法。
【００４２】
本明細書中に記載されるような、β-１，３-グルカンを含む実質的に室温で安定な錠剤またはマイクロカプセルの製造方法。
【００４３】
本明細書中に記載されるような、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む実質的に室温で安定な製品の製造方法。
【００４４】
本明細書中に記載されるような、インターフェロンを含む実質的に室温で安定な製品の製造方法。
【００４５】
ビフィズス菌を含む実質的に室温で安定な製品の製造方法。
【００４６】
乳酸菌を含む実質的に室温で安定な製品の製造方法。
【００４７】
乳酸菌およびビフィズス菌を含む実質的に室温で安定な製品の製造方法。
【００４８】
プロバイオティクスまたは微生物のいずれかを含む実質的に室温で安定な製品の製造方法。
【００４９】
本明細書中に記載される方法により製造される、実質的に室温で安定な製品。
【００５０】
活性物および糖重合体コーティング層で被覆された微粒子の核を含む組成物。
【００５１】
生体材料をヒトまたは動物へ送達するための、本明細書中に記載されるような組成物の使用。
【００５２】
本発明はまた、本出願の明細書に、個別にまたは総合して言及されるかまたは示される部分、要素、および特徴に、２つまたはそれより多くのそれらの部分、要素、または特徴の任意または全ての組合せで存在するとも概して言うことができ、本発明が関連する当該技術分野で既知の等価物を有する特定の完全体が本明細書中に記載される場合、そのような既知の等価物は、個別に記載される場合と同様に、本明細書中組み入れられるとみなされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明のこれらおよび他の形態（これらは、その新規形態全てで考慮されるべきである）は、例示的にあげる以下の記載から明らかになるだろう。本明細書中では明白に記述されないものの、多数の変更が本発明の範囲から逸脱することなく本発明になされ得ることが理解されるだろう。
背景
流動床技術を使用する錠剤製造の間に、本発明者らは、原材料が１０００ＣＦＵ／ｇ（ＣＦＵ＝コロニー形成単位）を越える数の細菌を有していた場合でさえも、製造された錠剤に常に細菌が含まれなかったことを発見した。どの加工処理パラメーターが明らかな殺菌効果の原因であるのかを明白にするために、本発明者らは、以下に概括的に記載される実験プロトコルを計画した。
【００５４】
実験を、Huttlin Turbojet Bed Coater (BWI Huttlin, Daimlerstrasse 7, D-79585, Steinen, Germany)で、三底部スプレー、三成分スプレーノズルジェット、および標準２０ミクロンフィルターバッグを取り付けた５Ｌの加工処理容器を用いて行った。乳酸菌のサンプルを、49 Barry Street, Bayswaster, Melbourne, AustraliaのChr. Hansen から調達した。１：１の比でビフィズス菌を持つ乳酸菌を、Gist-Brocade, Australiaから調達した。これらの細菌は、酸素存在下で容易に消滅する嫌気性菌である。流動化した材料が加工処理容器フィルターに接近して、細菌が２０ミクロンフィルターを通過して外に出る最適の機会を与えることを確実にするために、流動床の試験バッチサイズは、使用した５ＬのHuttlin Turbojet加工処理容器に推奨される重量の２倍である、４ｋｇであった。固体核（錠剤顆粒核材料）は、６６％ｗ／ｗブドウ糖、１３％ｗ／ｗゼラチン、１５％ｗ／ｗデンプンを含んだ。細菌を含んだ噴霧用液体は、３％ｗ／ｗマンニトール、１％ｗ／ｗアルブミン、１％ｗ／ｗグリセロール、１％ｗ／ｗリン酸ナトリウム緩衝液とともに、１．１６×１０１２ＣＦＵの乳酸菌、または３．５×１０１２ＣＦＵの乳酸菌／ビフィズス菌、のいずれかを含み、精製水で１０００ｍｌにされた。
【００５５】
固体核材料を吸引によりHuttlin Turbojet中に負荷して、２５０〜３００立方メートルの空気／時間の速度で流動化した。続いて、噴霧液体を、３０グラム／分の速度で、加工処理容器中に噴霧した。このプロセスを、４０〜４５℃の生成物温度で行った。材料を、４０℃の生成物温度で５％未満の水分含有量に乾燥させた。
２５０立方メートルの空気／時間に設定した流動速度で実行した実験は不十分であったことが発見された。この速度では、液体の９５％が固体核に噴霧された場合に、流動化した材料が崩壊した。３００立方メートルの空気／時間の速度での流動化が、この問題を解決した。
【００５６】
このプロセスの間に得られた顆粒のサンプルを維持して、顆粒の残りを、標準的な錠剤潤滑剤と混合してから錠剤に圧縮した。顆粒および錠剤を分析して、それらの生細菌数を評価した。得られた結果を以下の表１に提供する。
【００５７】
【表１】
2004528288.tif 000002
処理後、サンプルに生菌細胞の存在が検出されたことは非常に驚きであった。細菌細胞は、顆粒および錠剤の加工処理中、以下；加熱、２０ミクロンフィルターを通して可能な総通気、機械的製粉、空気乾燥、および錠剤圧縮を受けたのである。これらの実験中に生き延びたその実質的に多数の細菌は、なぜ発明者らが先に製造した錠剤が細菌を含まなかったのかを解明しなかった。一方で、この結果は、生きた細菌を安定化された形態で含むサンプルまたは製品を調製する新規プロセスを示唆した。
【００５８】
乳酸菌およびビフィズス菌培養物の供給者は、これらの細菌が非常に温度に敏感かつ熱不安定であることを表示した。そのような培養物が凍結乾燥を使用して加工処理される場合、細菌数は９０〜９９％で下落すると記されている。さらに、供給者は細菌がまた標準の錠剤圧縮プロセスに特に敏感であること、したがって約９９％での細菌の活性のさらなる下落が観測され得ることを表示している。
【００５９】
したがって、本発明者らは、凍結乾燥のような既知の工業的調製方法より優れていると思われる、新規熱乾燥法を発見した。本発明者らはさらに、この新規様式で（すなわちマイクロカプセルに）加工処理された細菌が５〜８トン／平方インチあたりの錠剤圧縮圧で生存し得ることを見いだした。
概要
本発明は、水分に敏感な材料、特に生体材料（タンパク質、ペプチド、ならびに微生物を含む植物および動物細胞など）を乾燥および保存する新規方法を提供する。大まかに言えば、本方法は、流動床噴霧加工処理技術とマイクロカプセル化技術とを組み合わせる。
【００６０】
大まかに言えば、本プロセスは、室温より上昇した温度で、少なくとも１種の糖重合体および水混和性／溶解性溶媒と組み合わせて少なくとも１つの所定の活性物を含む液体を、加工処理チャンバ中で適切に流動化された許容可能な粒子状賦形剤材料（微粒子）に噴霧することを含む。該微粒子のコーティングは、活性成分の安定なマイクロカプセル化を提供する。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「活性物」は一般に、タンパク質、ペプチドおよび細胞を含む。しかしながら、本発明が関連する技術分野の当業者は、本発明に従った調製の恩恵を受け得る他の材料または活性薬剤を容易に理解するだろう。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「細胞」は、天然に存在するものに加えて、化学合成または組換え技法を介して、実験室で人工的に製造されたものを示すことが理解されるだろう。
【００６２】
微粒子は、好ましくは粘着性表面を有し、液体または半固体に変わることなく比較的高い水分含有量を許容し得る天然または合成の重合体または単量体のいずれかからなる、水溶性ゲル形成固体粒子を含む。例えば、微粒子は、好ましくは、アクリル酸塩およびその誘導体、アルブミン（例えば卵アルブミン（オボアルブミン））、アルギン酸塩、カルボマー、カラギーナン、セルロースおよびその誘導体、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（例えばポビドン）、デンプン、またはそれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む。好ましくは、微粒子は、アルブミン、ゼラチン、およびプレゲルデンプン（例えば、プレゲルトウモロコシデンプン）を含む。微粒子は、好ましくは、直径が１００ミクロンであるが、代替的な大きさ（例えば５０ミクロン〜１ｍｍの粒子サイズ）が本発明で利用され得ることが理解されるだろう。水溶性ゲル形成固体粒子の微粒子は、本明細書中で「ヒドロゲル核」と呼ばれ得ることが留意されなければならない。
【００６３】
本発明で使用される微粒子の組成は、活性物を含む液体噴霧材料が集塊または損失なしに微粒子表面に効率的に結合することを確実にすることが理解されるだろう。
【００６４】
加工処理の間、粒子表面が加熱されすぎず、かつその表面に薄膜が形成されることを確実にするために、微粒子は水分で飽和していることが要求される。組成物はまた、それが、硬表面粒子よりも比較的ゆっくりした様式で、また連続した様式で乾燥して完全な表面コーティングを与えるという利点を有する。
【００６５】
上記で簡単に記載されるように、噴霧または被覆液体は、少なくとも活性物、糖重合体、および水溶性／混和性溶媒からなる。糖重合体は、好ましくは、マンニトール、イソマルト、キシリトール、ポリデキストロース、またはデキストランである。しかしながら、溶液中に含まれる活性物の厳密な性質に依存して、代替的な重合体が使用され得ることが理解されるだろう。適した糖重合体として、例えば、フルクトース、フルイトース、グルコース、転化糖、ラクチトール、ラクトース、マルチトール、マルトース、マルトデキストリン、ソルビトール、スクロース、トレハロース、またはそれらの組合せが挙げられ得る。水溶性／混和性溶媒は、好ましくは、グリセロールまたはプロピレングリコールのいずれかまたは両方である；しかしながら、本発明が関連する技術分野の当業者は、本発明で使用するのに適した代替的溶媒を理解し得る。
【００６６】
噴霧または被覆液体はまた、追加成分（追加タンパク質、アミノ酸、希釈剤、キレート剤、緩衝液、防腐剤、安定剤、抗酸化剤、潤滑剤、およびその中に含まれる特定の活性物の機能を補完するか、それを安定させるように作用し得る他の添加剤など）を含み得る。そのようなさらなる成分の厳密な性質は、活性物の性質に依存する。しかしながら、それぞれの例として、以下が挙げられる：アミノ酸、リシン、グリシン、Ｌロイシン、イソロイシン、アルギニン、システイン；タンパク質、ヒト血清タンパク質、アルブミン（例えば卵アルブミン（オボアルブミン））、ゼラチン；緩衝液、種々のリン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸／クエン酸塩緩衝液、トリス緩衝液；防腐剤、ヒドロキシ安息香酸誘導体；抗酸化剤、ビタミンＥ、アスコルビン酸；潤滑剤、水混和性シリコーン／ケイ酸塩；キレート剤、クエン酸、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ。当業者は、本発明で使用するのに適したものであり得る様々な他のタンパク質、アミノ酸、希釈剤、キレート剤、緩衝液、防腐剤、安定剤、抗酸化剤、および潤滑剤を理解するだろう。
【００６７】
プロセスは、好ましくは、閉鎖された滅菌環境で行われる。本明細書中で使用される場合、「滅菌環境」は、汚染物質を実質的に含まない環境として理解される。一般に、そのような「汚染物質」は微生物などを含むが、当業者は、製品の加工処理中に存在しないことが望まれ得る他の物質を理解するだろう。
【００６８】
プロセスが行われる環境は、例えば、活性物の酸化を最小限にするために、好ましくは、酸素を含まない。これは、本発明の方法の加工処理が実質的に実施される加工処理チャンバ内に含まれる空気を不活性ガス、好ましくは窒素で置換することにより達成され得る。しかしながら、二酸化炭素などの代替的なガスが利用され得ることが理解されるだろう。
【００６９】
本明細書中で簡単に上述されたように、微粒子は水分で飽和していることが要求される。したがって、プロセスは湿度飽和環境で行われると言われる。「湿度飽和環境」において、条件は、微粒子表面が溶解して完全な固体状態から実質的に液体状態に変化し始めるようなものである。湿度飽和は、本発明では、被覆液体をヒドロゲル核上に過剰に噴霧することにより達成される。
【００７０】
本発明の工程は、任意の適切な流動床噴霧装置で行われ得る。本明細書中で説明される実施例において、BWI Huttlin (Daimlerstrasse 7, D-79585, Steinen, Germany) 製のCPU Driven Turbojet(登録商標)Fluid Bed Coaterが使用された。本発明が関連する技術分野の当業者は、そのような装置になじみがあるだろう。しかしながら、必要であれば、さらなる情報を製造者より容易に入手することができる。
【００７１】
効率的かつ効果的なマイクロカプセル化を促進するために、本発明の工程で使用される装置に改良がなされ得ることが理解されるだろう。例えば、本明細書中に記載される実施例で使用されるHuttlin Turbojetは、以下のようにカスタム改良された：
・スプレーノズル(噴霧液体を加工処理チャンバへ送達する)の中心部を装置の操作中に取り外すことができるよう（ノズルを汚さない、またはブロックしないため）に、ノズルを再設計した。この改良により連続加工処理が可能になる。
・高粘性では流動化した材料がボルテックス様の様式で動き、低粘性では渦巻運動で循環するように、標準のHuttlin Turbojet装置に存在するセントラルエアリターンカラム（central air return column）を、円錐様配置で再配置および置換した。そのような変更は微粒子のコーティングを改善することができると考えられる。
・定置洗浄（Cleaning-In-Place）サイクル後、全ての接触表面が容易に加熱殺菌され得るように、それらをさらに鏡面磨きした。
・加工処理容器／チャンバ壁の内部表面を向いたさらなる圧縮空気スプレーノズルを、既存のダイナミックフィルター系配列を取り囲んで加えた。この改良は、チャンバ内部表面に沿ってチャンバ頂部から流れる圧縮空気の連続した流れを提供し、工程容器中の作用面が連続してきれいにされることを確実にし得る。この改良は、装置が繰り返し洗浄なしに連続して操作され得ることを確実にする。
・加工処理空気は、任意の段階で、再循環不活性ガス（窒素など）が、流動化のために空気の代わりに導入され得るように設計される。この改良は、生体タンパク質酸化を減少させることができ、嫌気性細菌の安定性を増加させ得る。
【００７２】
本発明のマイクロカプセル化プロセスは、従来にない底部噴霧被覆操作を使用する。すなわち、噴霧または被覆液体の噴霧は、加工処理容器の底部から上方に向かって起こる。そのため、スプレーノズルが実際に流動床内にはめ込まれることが理解されるだろう。バッチサイズに依存して、同時に上限３８個までのスプレーノズルが操作され得る。
【００７３】
噴霧液体は、それが流動床粒子の固体表面周囲を取り囲む連続したガラス状膜（「バイオガラス」膜）に自らを変換するような様式で加工処理される。液体からガラス状固体への変換は急速であるため、生体タンパク質または微生物の変性を防ぐ。生体タンパク質または微生物などの活性物は熱の害を受けず、熱は水のエバポレーションの潜熱により散逸する。
【００７４】
本発明のプロセスは、好ましくは、加工処理チャンバ内の微粒子の重量超過を含む。通常の流動床操作では、設備製造者により加工処理チャンバの容量の５０％ｗ／ｖを越えないことが推奨されている。例えば、加工処理容器が１００Ｌの場合、加工処理材料の重量は５０ｋｇより多くなるべきではない。しかしながら、本発明のプロセスは加工処理重量：容器の体積が５０％ｗ／ｖより多いことを考慮に入れている（またそのようにすることが好ましい）。このように、微粒子重量はふるいのような役割を果たすことができ、それによって、カプセル化プロセスが開始されたときに、噴霧液体は流動化微粒子を通過せずに加工処理チャンバの頂部に存在するダイナミックフィルター系を通って出る。
【００７５】
本発明の方法は、概括的に以下のように記載され得る：
1   適した構成の固体ヒドロゲル粒子(微粒子)が、吸引によりTurbojet中に負荷されて、流動化する。流動化は、１時間当たり２００〜５００立方メートルの間の速度で起こり得る。
２  微粒子は、それらがボルテックス様運動で流動化されるように高粘度の加工処理空気で約１時間、好ましくは３０℃〜８０℃に、より好ましくは、６０℃に加熱され、微粒子の内部が乾燥することを確実にする。
３  微粒子温度は、好ましくは、３５℃〜５５℃に下げられ、微粒子が渦巻型様式で動くように、加工処理空気の粘度も同様に、好ましくは、低下させられる。
４  微粒子温度が、好ましくは、約４０℃〜５０℃に到達した時点で、加工処理空気は、好ましくは、不活性ガス（窒素など）で置換される。この工程は、好ましくは、少なくとも約１０分持続し、全ての空気が窒素で置換されることを確実にする。
５  活性物を適切な噴霧または被覆溶液に固定化する。ベース溶液を、好ましくは、３８℃に加熱し、固体を完全に溶解させる。ターボジェット噴霧コーティングの前に、生体材料をベース溶液（約６０ｒｐｍで混合）に加えて十分に混合する。
６  次いで、所望量の被覆溶液を、微粒子が水分で飽和するが依然として渦巻様式で自由に流れ得るように、好ましくは、高速で（好ましくは、利用可能な最高速で）流動化微粒子上にターボジェット噴霧でコーティングする。噴霧コーティングは、好ましくは、１分当たり３０グラム〜６０グラムの速度で行われる。該被覆溶液または液体の微粒子への噴霧は、流動床の真下から起こる。
７  微粒子が水分で飽和した時点で、ターボジェットコーティング速度は、好ましくは、１分当たり１０グラム〜２０グラムの間に低下され、微粒子床が渦巻様式で連続して流れることを確実にする。このように、生体タンパク質を含む被覆溶液は、例えば水分を含まない窒素雰囲気で連続して脱水される。製品は、通常は乾燥されて、０．２５未満の水の活量をもたらす。
【００７６】
様々な製品形態または異なる活性物を含む製品の製造に適合するために、上記の加工処理工程およびパラメーターが変更され得ることが理解されるだろう。変更は、例えば以下に対してなされ得る：吸込プロセス空気温度、製品温度、流動化空気体積、液体噴霧速度、噴霧液体温度、噴霧液体粘度、噴霧液体固体含量、全核表面積、核の水溶性、吸気湿度、圧縮空気噴霧圧、装置フィルター孔サイズ、および自動脱塵の頻度。変更が１つのパラメーターに対してなされる場合、本発明が関連する技術分野の当業者は、最初に記載した変更を埋め合わせるために別のパラメーターに要求され得る任意の対応した調節を容易に識別し得る。さらに、ヒドロゲル核の分子量を増加させることにより、徐放性固体投薬量が作り出され得る。
【００７７】
そのうえ、所望の特徴を有する製品を得るために、さらなるコーティング工程が本発明に従った上記の一般工程に加えられ得る。例えば、乾燥工程の前または後に、得られる生成物またはマイクロカプセルは、さらなるコーティングで被覆され得る。本発明が関連する技術分野の当業者は、このことが有利であり得る状況を直ちに理解するであろう。例えば、得られる製品が経口投与されることが望まれる場合、胃での崩壊から製品を保護し得る腸溶コーティング、および／または、活性物の持続したもしくはゆっくりとした放出を可能にするものが利用され得る。一般に、そのようなさらなるコーティングは、微粒子を最初の被覆液体でコーティングするために使用されるものと同様なコーティング速度で行われる。
【００７８】
加工処理のバッチサイズは、使用される装置の加工処理チャンバの体積、およびその加重負担が要求されるかどうかに従って変化し得る。本明細書中に記載される実施例において、バッチサイズは、典型的には４ｋｇである。「バッチサイズ」は製品の加工処理に使用される全固体を指し、微粒子、被覆溶液の両方、および製品を配合するために使用される任意のさらなる被覆溶液に含まれる固体を構成する。したがって、本明細書中で使用される場合の特定の組成の割合は、全バッチサイズの割合という形で表される。
【００７９】
様々な他の変更例が、本明細書中提供される実施例から明らかになるだろう。
【００８０】
本発明は、ここでさらに以下の具体的で非制限的な実施例、および図を参照することにより説明される。
【実施例１】
【００８１】
微生物の安定化
実施例１Ａ
８リットルの生きたビフィズス菌培養物を、元の３０００Ｌ液体培養物（Sine Pharmaceutical Co., Ltd. # 905, Xinjinqiao Rd., Pudong, Shanghai, P. R. China）から得た。製造者から提供されたデータにより、３０００Ｌの発酵液体が全部で３×１０１６ＣＦＵ（コロニー形成単位）を含み、全部で２．１６×１０１４ＣＦＵのビフィズス菌を含む約８．３ｋｇの凍結乾燥材料を与えるということが確立された。すなわち、凍結乾燥後、生きた細菌集団が約９９％減少する。
【００８２】
実験室に到着後、培養物のサンプルを、４℃で安定性について試験した。ゼロ時で、２．４３×１０１６ＣＦＵ／３０００Ｌを記録した。４℃以下で１４日間貯蔵後、計測数は１．５×１０１４ＣＦＵ／３０００Ｌに減少した。すなわち、１５００分の１の細胞が４℃で２週間貯蔵後に生存した。
【００８３】
様々な糖添加物（以下に記載されるとおり）を含む液体培養物を、本発明に従って以下の様式で加工処理した：
１  固体微粒子核（ヒドロゲル核）材料を、吸引によりHuttlin Turbojet中に負荷した。
２  微粒子を、６０℃で１時間流動化および加熱した。
３  微粒子核温度を、４０°〜４５℃に低下させた。
４  プロセス空気を、窒素で置換し、１０分間フラッシュさせた。
５  微粒子を、３００立方メートルの空気／時間の速度で流動化した。
６  飽和湿度条件下で、３０グラム／分の速度で、ビフィズス菌被覆液体を、ヒドロゲル核粒子上にターボジェットコーティングした。
７  得られる生成物を、０．２５未満の水分活性に乾燥させた。
８  被覆マイクロカプセルのサンプルを、ゼロ時として、ならびに４℃、２５℃、および４０℃で貯蔵後に試験した。
【００８４】
このバイオカプセル化（bioencapsulation）工程を、以下に示されるように、微粒子またはヒドロゲル核、および被覆液体配合の４種の異なる組合せを使用して行った。
2004528288.tif 000003
2004528288.tif 000004
【００８５】
記録された結果を以下の表２に列挙し、３０００-Ｌの元の濃度に相当するＣＦＵとして表す。
【００８６】
【表２】
2004528288.tif 000005
【００８７】
結果は、従来の凍結乾燥プロセスと比較して、本発明に従った加工処理により１０倍より多くのビフィズス菌が生き延びることを示している。ＳＩＮＥ  ＲＸ２として示される反応は、最良の安定性結果を与えた。
【００８８】
Ｓｉｎｅ  ＲＸ１の加工処理の間に、ヒドロゲル核中に含まれるブドウ糖により水分が効果的に取り出されなかったということが見いだされた。アルブミンがヒドロゲル核配合物に加えられた場合（ＲＸ２〜ＲＸ４を参照）、加工処理は満足がいくものであった。
【００８９】
実施例１Ｂ
ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）6-1のさらなるバッチを、Sine Pharmaceutical Co., Ltd. # 905, Xinjinqiao Rd., Pudong, Shanghai, P. R. Chinaから輸入した。実施例１Ａで使用された培養物は、いくらかの老廃物を含んでおり、これがバイオカプセル化した最終的な固体マイクロカプセルにおける細菌の不安定性の一因であり得ると考えられた。したがって、本実施例で使用される培養物は、全老廃物が除去されており、濃縮され、緩衝溶液に再懸濁された。製造者から到着した時点で培養物をアッセイし、使用直前にサンプルもまたアッセイした。結果は、４．１×１０８ＣＦＵ／Ｌの細菌数を示した。
2004528288.tif 000006
2004528288.tif 000007
【００９０】
加工処理を、実施例１Ａで使用されたプロトコルに従って行った。
記録された結果を以下の表３に列挙し、４ｋｇのマイクロカプセルにおけるＣＦＵとして表す。
【００９１】
【表３】
2004528288.tif 000008
【００９２】
グリセロールをヒドロゲル核粒子に加えることにより、ビフィズス菌の生物学的安定性がさらに増強されることが、結果から明らかである。アルギン酸を被覆液体に加えることにより流動化が改善されるが、最終生成物における細菌の安定性に顕著に影響しなかったことが観測された。
【００９３】
この実施例から得られた結果は、本発明のプロセスが現在使用されている加工処理技法（例えば凍結乾燥）のものよりも優れているとみなされ得ることを、再び実証する。ＳＩＮＥ  ＲＸ６において、従来の凍結乾燥法では１００分の１と報告されているのと比較して、５分の１の細菌が本発明に従った加工処理を生き延びることがわかる。
【実施例２】
【００９４】
酵素の安定化
酵素は、様々な産業に用途を有する生体タンパク質である。例えば、それらは、動物飼料添加物として、ならびにヒトおよび動物用薬物として、食品加工に使用される。
実施例２ａ：成長促進剤（酵素成長促進剤２）として飼料中に組み込まれた安定化酵素
例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、およびセルラーゼなどの酵素は、動物飼料には一般的な添加物である。これらの酵素は、飼料の生物学的利用能を増加させる助けとなる。
【００９５】
動物飼料は、しばしば、酵素が、ビタミンおよびミネラル（硫酸銅および鉄など）と一緒に飼料中に混合されているように製造される。次いで、飼料は一般に、蒸気注入および噴出によりパレットに載せられる。パレチゼーション中の飼料の操作温度は、約１０分間、８０℃およびそれ以上に到達し得る。そのような条件下で、混合物に加えられた酵素の多くは変性する。さらに、そのような飼料が動物の胃に入る場合、酵素の多くはその酸性環境のために変性し得る。
【００９６】
飼料のパレチゼーションおよび胃中の酸性環境による酵素活性の損失に対抗するために、現在実践されているのは、少なくとも酵素の一部が生き残ることを期待して、膨大量の酵素を飼料プレミックス中に加えることである。
【００９７】
したがって、動物飼料における酵素の使用は理論的には有益であるものの、有効性は、経済的に実行可能であることを常に実証してこなかった。
【００９８】
加えられた酵素が曝され得る有害な環境要因から、それらが十分に保護される場合、明らかな経済的および成長の利益が存在し得る。オーストラリア特許出願第０７８７２１８７号は、核を有し、１つまたは複数の固定化酵素からなり、水溶性フィルム中にカプセル化され、保護性腸溶コーティングで被覆されたマイクロ顆粒を含む、成長促進剤を記載する。そのような製品は、飼料酵素分解に伴う問題にうち勝つ助けとなり得る。
【００９９】
オーストラリア特許第０７８７２１８７号は、前のパラグラフで記載されるそのような製品の製造方法を記載し、これは代表的には凍結乾燥および製粉を含む。本実施例は、本発明の方法が等価な製品を製造するために使用され得、これは明らかに製造コストを減少させ得ることを実証する。
【０１００】
酵素成長促進剤２用の配合は以下のとおりであり、４ｋｇバッチサイズ（％ｗ／ｗ）に対して表される：
ヒドロゲル核：プレゲルトウモロコシデンプン６７．５％、ポリビニルピロリドン（ポビドン）１０％。
被覆液体：プロテアーゼ２×１０５Vitapharm プロテアーゼ単位、アミラーゼ４．３×１０６Vitapharm アミラーゼ単位、リパーゼ５０ Vitapharm リパーゼ単位、セルラーゼ２×１０４Vitapharm  セルラーゼ単位、マンニトール２．５％、グリセロール７．５％、ポリビニルピロリドン（ポビドン）１．５％、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液１％、精製水で１ｋｇとした。
腸溶コーティング溶液（１Ｌバッチ）：酢酸フタル酸セルロース１０％、ｐＨ６に十分量の水酸化ナトリウム、精製水で１００％とした。
最終酸リンス溶液：ｐＨ３に十分量のクエン酸、精製水で１Ｌとした  。
【０１０１】
本実施例の成長促進剤は、好ましくは、１ｋｇ／トン飼料の割合で使用される。
【０１０２】
成長促進剤配合物を、以下のプロトコルを使用して、本発明に従って加工処理した：
１  ヒドロゲル核材料をHuttlin Turbojet チャンバ中へ吸引負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
２  ヒドロゲル核生成物の温度を４５℃に低下させた。
３  チャンバの内容物を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化する。
４  飽和湿度条件下３０ｇ／分の速度で、被覆液体をヒドロゲル核上にターボジェットコーティングした。
５  生成物を５％未満の水分含量に乾燥させた。
６  腸溶コーティング溶液を、３０ｇ／分の速度で、核上にターボジェットコーティングした。
７  クエン酸溶液を、３０ｇ／分の速度で、核上にターボジェットコーティングした。酸は、酢酸フタル酸ナトリウムセルロースを酢酸フタル酸セルロースに戻す役割を果たし、胃を通して酵素の腸溶保護を提供する。
【０１０３】
本発明の工程は、オーストラリア特許第０７８７２１８７号に記載される先の加工処理法と比較して１０分の１の加工処理時間を必要とし、また５０％まで製造コストを減少させることが観測される。
【０１０４】
さらに、その工程はいかなる有機溶媒またはアルデヒドも使用せず、製造全体が閉鎖された環境中で１工程で行われ得、操作者の酵素曝露が大きく減少し、かつ同様な腸溶保護を提供するために必要とされる酢酸フタル酸セルロースは半分に過ぎないことが留意され、また観測された。
【０１０５】
さらに、その工程により、室温で少なくとも２年間安定な製品が得られた。
【０１０６】
本実施例の配合および工程は、さらに最終で５％ｗ／ｗのワックスコーティング（例えば低融点マクロゴールまたはＰＥＧなど）を提供することにより変更され得る。この場合、マイクロカプセルは、球状化する前に、酵素構造を破壊する場合は最小限に破壊して、飼料混合物中に組み込まれ得ると考えられる。追加のワックスコーティングは、短い蒸気爆発に持ちこたえることが可能であり、したがって、球状化の間に使用される熱の大部分を取り上げる。
【０１０７】
実施例２ｂ：減量補助食品としての安定化酵素
上記に記載される成長促進剤２の適切な用量割合を決定するために行われた実験中、１ｋｇ／トン飼料での用量が最適な飼料転換を与えることが観測された。しかしながら、用量割合が増加して１０ｋｇ／トン飼料に達する場合、成長促進剤配合物は、明らかな減量を誘導することが留意される。
【０１０８】
したがって、減量酵素補助食品を配合して、２つの公開試験をヒトで行った。
2004528288.tif 000009
【０１０９】
上記の酵素成長促進剤２の調製に使用したプロトコルを用いて、減量補助食品を本発明に従い製造した。
【０１１０】
加工処理に続いて、マイクロカプセルを、１ｇ単位で防湿小袋に詰めた。１袋の投薬量を水と混ぜて各食事の前に取った。
【０１１１】
実施例２ｂ（ｉ）：減量研究１
９人の志願者を選び、上記に示されるように服用された場合、組成物が減量効果を有するのか判定した。
結果を以下の表４に示す：
【０１１２】
【表４】
2004528288.tif 000010
【０１１３】
１週あたり約１．０８ｋｇ、または６週かけて約７ｋｇの、一人当たりの平均減少量が観測された。
【０１１４】
減量研究２
２０人の志願者での二番目の研究を医師の監督下で行った。投薬割合は、「減量研究１」に対するとおりであった。
この研究結果は以下の表５にまとめられる。
【０１１５】
【表５】
2004528288.tif 000011
【０１１６】
一人当たりの平均減少量は、１週あたり約１．３７ｋｇ、または３週かけて約４．１ｋｇであった。
【０１１７】
２つの独立した研究から得られた結果は、本明細書中に記載される酵素配合物は効果的な減量補助食品であり得ることを示している。
【０１１８】
実施例２Ｃ：止痢処方としての安定化ブロメライン
プロテアーゼはヒトを含む動物の腸内病原の処置に使用され得ることが既に実証されている；オーストラリア特許第０７８５８５８７号およびオーストラリア特許第０２３６７３９２号。そのようなプロテアーゼの送達用組成物は、以下を含むものが記載されている：（ｉ）弱塩基と連係し、腸液溶解性の遅延放出性物質で部分的に被覆された生物活性物質を含む顆粒；（ｉｉ）１．６〜６の間のｐＨを有する酸性化剤；および（ｉｉｉ）ゲル形成剤。得られる製剤は、宿主腸表面を修飾し得、したがってこれは細菌コロニー形成の影響を受けにくい。したがって、製剤は下痢の予防および処置に有用である。
【０１１９】
以下に説明される実施例は、そのような止痢配合物を製造する改善された方法を提供する。
2004528288.tif 000012
【０１２０】
止痢配合物を、以下のプロトコルを使用して、本発明に従い加工処理した：
１  ヒドロゲル核を吸引により Huttlin Turbojet加工処理チャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
２  ヒドロゲル核生成物温度を４５℃に低下させた。
３  ヒドロゲル床を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
4   飽和湿度条件下３０ｇ／分の速度で、ヒドロゲル核を被覆液体でターボジェットコーティングした。
５  生成物を５％未満の水分含量に乾燥させた。
６  腸溶コーティング溶液を、３０ｇ／分の速度で、核上にターボジェットコーティングした。
7   クエン酸溶液を、３０ｇ／分の速度で、核上にターボジェットコーティングした。酸は、酢酸フタル酸ナトリウムセルロースを酢酸フタル酸セルロースに変換して、配合物中の酵素の腸溶保護を提供する。
【０１２１】
このプロセスは、そのような製品を製造するために使用される従来の方法と比較して、１２分の１の加工処理時間しか必要としないことが観測された。さらに、２０分の１の量のブロメラインが配合物に必要である（バイオガラスマトリックス中のブロメラインの安定性増加により）。
【０１２２】
さらに、製造全体が閉鎖された環境中で１工程で行われ得、操作者の酵素曝露が大きく減少し、かつ上記に記載される既知製品で得られるのと同様な腸溶保護を提供するために必要とされる酢酸フタル酸セルロースは１５分の１に過ぎないことが留意される。
【０１２３】
全体的に、製造コストは、従来の方法が使用されて同等な止痢配合物が作成される場合の５分の１に減少されると見積もられる。
【０１２４】
さらに、プロセスは、室温で少なくとも２年間安定な製品をもたらしたことが観測された。
【０１２５】
実施例２ｃ（ｉ）：止痢配合物に関する動物研究
実施例２ｃに従って製造された、止痢処置としての配合物の効果の研究を、中国のAnimal Husbandry Research Institute, Jinin Province,で行った。ほぼ同じ重量および年齢の９０匹の新生仔ブタを研究に使用した。
【０１２６】
仔ブタを、性別、重量、および年齢が同じ２群に無作為に分けた。１つの群には、実施例２ｃに従ったブロメライン製剤での処置を指定し、もう一方は対照群として使用した。使用する日に、０．７５ｇのブロメライン製剤（実施例２ｃ）を８．５ｇの水と混ぜてペーストにした。最初の１０ｍｌの用量が、生後７日目に処置群に与えられ、そして１０日目に繰り返された。対照群は何の処置も受けなかった。下痢発生率の観測を４５日目まで記録した。
結果を表６にまとめる：
【０１２７】
【表６】
2004528288.tif 000013
【０１２８】
この試験に使用された仔ブタは全て下痢に対する予防接種を受けた。それにもかかわらず、処置群は、対照群と比較して、ブロメライン製剤の２回投薬後、顕著な離乳前体重増加（０．５ｋｇ）、下痢発生率の減少（６．７対１７．８）、重症度の減少（３日間対５日間）、および使用された他の薬物数の減少（６対１０）を示した。
【０１２９】
実施例２ｄ：止痢処方としての安定化酵素ブロメライン＋βグルカン（Ｂ＆Ｂ製剤）
β-１，３-グルカンを実施例２ｃのブロメライン製剤に加えると、ブロメラインの止痢作用を増強する。
【０１３０】
β-１，３-グルカンは、フリーラジカル捕捉性質を持つ効果的な天然の非特異的免疫賦活薬と考えられる。これは、マクロファージを活性化させ、マクロファージがヒトを含む動物の免疫応答の開始および維持に本質的かつ中心的役割を果たすことにより作用すると考えられる。
【０１３１】
β-１，３-グルカンは、経口で、効果的で完全に安全かつ無毒性であることが知られている。異なる活性レベルを持つ複数の異なる型のβグルカンが存在し、その大部分は不活性で単なる食品賦形剤として使用される。しかしながら、β-１，３-グルカンは最も活性なβグルカンであり、酵母の細胞壁から得られ得る。
【０１３２】
β-１，３-グルカンは、多くの免疫関連徴候（例えば、ストレス関連免疫抑制など）の処置に有用であると考えることができ、これは、抗生物質および抗ウイルス処方と相乗的に作用すること、および抗真菌性質を表すことが示されてきた。したがって、β-１，３-グルカンは、生活習慣の改善に適したアジュバントと考えられ得る。本発明が関連する技術分野の当業者は、β-１，３-グルカンの投与の利益を受け得る動物の徴候を、容易に同定し得る。
【０１３３】
本実施例のＢ＆Ｂ製剤は、８ｋｇバッチサイズの状況で、以下を含む：
2004528288.tif 000014
【０１３４】
ブロメラインマイクロカプセルを、以下のプロトコルを使用して、本発明に従って加工処理した：
１  ブロメライン用ヒドロゲル核を吸引によりHuttlin Turbojetチャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
２  ヒドロゲル核生成物の温度を４５℃に低下させた。
３  ヒドロゲル床を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
４  飽和湿度条件下３０ｇ／分の速度で、被覆液体をヒドロゲル核上にターボジェットコーティングした。
５  生成物を５％未満の水分含量に乾燥させた。
６  酢酸フタル酸ナトリウムセルロース溶液を、３０ｇ／分の速度で、核生成物上にターボジェットコーティングした。
７  クエン酸溶液を、３０ｇ／分の速度で、最終コーティングとして、核上にターボジェットコーティングした。酸は、酢酸フタル酸ナトリウムセルロースを酢酸フタル酸セルロースに変換する役割を果たし、配合物中の酵素の腸溶保護を提供する。
【０１３５】
β-１，３-グルカンマイクロカプセルを、以下のプロトコルを使用して、本発明に従って加工処理した：
１  β-１，３グルカン用ヒドロゲル核を吸引によりHuttlin Turbojetチャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
２  ヒドロゲル核生成物の温度を４５℃に低下させた。
３  プロセス空気を窒素で置換し、１０分間フラッシュした。
４  ヒドロゲル床を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
５  飽和湿度条件下で３０ｇ／分の速度で、β-１，３グルカンコーティングをヒドロゲル核上にターボジェットコーティングした。
６  得られる生成物を５％未満の水分含量に乾燥させた。
７  酢酸フタル酸ナトリウムセルロース溶液を、３０ｇ／分の速度で、核生成物上にターボジェットコーティングした。
８  クエン酸溶液を、３０ｇ／分の速度で、最終コーティングとして、核上にターボジェットコーティングした。酸は、酢酸フタル酸ナトリウムセルロースを酢酸フタル酸セルロースに変換する役割を果たし、配合物中の酵素の腸溶保護を提供する。
【０１３６】
次いで、４ｋｇのブロメラインマイクロカプセルを４ｋｇのβ-１，３グルカンマイクロカプセルと混合して、Ｂ＆Ｂ配合物を調製する。
【０１３７】
このプロトコルを使用して、各７５０ｍｇのＢ＆Ｂ製剤は、１０ｍｇのブロメラインおよび１０ｍｇのβ-１，３-グルカンを含有する。
【０１３８】
この実施例に記載される手順の実行において、β-１，３-グルカン原材料が、乾燥形態で５ミクロン未満の粒子サイズを持つ非常に細かい粉末であることが留意された。液体形態では、それは２ミクロン未満の粒子サイズを持つ細かい懸濁液を形成する。したがって、活性成分を完全に捕捉するために、ゼラチンをベースとしたより溶解性のヒドロゲルが使用されなければならない。
【０１３９】
大部分の場合において、ゼラチンを使用してより良いヒドロゲルが得られることが、さらに留意された。しかしながら、ゼラチンは比較的高価であり、プレゲルデンプン（例えばプレゲルトウモロコシデンプン）は、記載のヒドロゲルにとってより経済的なベースを提供し得る。
【０１４０】
７５０ｍｇのＢ＆Ｂ製剤を８．５ｇの水と混ぜて１０ｍｌのペーストを作ることにより、単位用量を調製する。
【０１４１】
仔ブタの下痢予防のために推奨される投薬量は、生後１日目で１０ｍｌであり、５日目に投薬を繰り返す。重篤な下痢履歴をもつ農場では、投薬は、１０日目および１３日目に繰り返され得る。
【０１４２】
実施例２ｄ（ｉ）：Ｂ＆Ｂ製剤の使用を含む野外試験（Field trials）
仔ブタの下痢予防および処置におけるブロメライン＋Ｂグルカン製剤の有効性を試験するために、中国の山東省で野外試験を行った。
Ｂ＆Ｂ製剤を、実施例２ｄにおけるように調製した。試験に使用された他の薬物は、動物飼育および管理の分野で標準的なものであった。
【０１４３】
試験を、中国徳州市 Husbandry BureauのBreeding Good Pig Farmで行った。ここは毎年１０，０００匹を越えるブタを生産し、約４０％〜５０％の下痢発生率を有する。
【０１４４】
無作為に選択された９つの同腹仔を３つの群に分けた（３つの同腹仔／群）。２つの群は処置群として指定され、３番目の群は対照であった。全部で９７匹の仔ブタ（性別の混ざった、大きな白いヨーク仔ブタ）が、試験に含まれた。
【０１４５】
同腹仔を、Ｂ＆Ｂ製剤の最初の投与時点から２６日間観測した。
【０１４６】
処置群および対照群の全仔ブタは、予防接種され、病気（下痢および／またはそれに伴う症状を表す）になったときには同じ薬物を与えられた。
【０１４７】
試験計画は、以下の表７に要約される。
【０１４８】
【表７】
2004528288.tif 000015
【０１４９】
試験の結果は、以下の表８に要約される。
【０１５０】
【表８】
2004528288.tif 000016
【０１５１】
表８からわかるように、試験結果は、試験群における下痢発生率が、処置群１、処置群２、および対照群に対して、それぞれ５．１０％、４．２％、および１７．５９％であることを実証する。言い換えると、処置群と対照群との間で約７０％の下痢発生率の減少が観測された。このことは、Ｂ＆Ｂ製剤が仔ブタの下痢予防および／または処置に明らかな有効性を有することを実証した。
【０１５２】
平均日毎体重増加（ＭＤＷＧ）では群間の顕著な違いは観測されなかった（１日あたり１６４ｇ、１日あたり１７８ｇ、および１日あたり１６９ｇ）。
【０１５３】
さらに、結果は、製剤を２回投与することにより動物の健康のより効果的な改善が提供されることを示唆する。
【０１５４】
全体的には、この試験は、本発明に従ったＢ＆Ｂ製剤が離乳前下痢、および非特異的大腸菌下痢に対して効果を有することを示している。本発明者らは、配合物がヒトを含む他の動物への応用を有すると考える。本発明が関連する技術分野の当業者は、配合物を、ブタ以外の動物に投与するのに適するように、容易に変更または適合させ得る。
【実施例３】
【０１５５】
徐放性舌下安定化生物製剤
実施例３ａ：徐放性舌下安定化β-１，３-グルカン錠剤。
既に記載されたように、βグルカンは経口で効果的である。しかしながら、経口投与される場合、所望の免疫調節性効果を達成するために、一般に、相当の投薬量が要求される。βグルカン源に応じて、１日当たりおよそ１０ｍｇ〜２０００ｍｇの投薬範囲が推奨されてきた。推奨される投薬量の範囲が広いことは、市場にあるβグルカン製品のさまざまな純度および生物学的利用能によると考えられる。
【０１５６】
本実施例は、徐放性舌下β-１，３-グルカン配合物を提供し、これは適切に安定化され（例えば本発明のプロセスを介して）、特定の粘膜表面へ送達された場合に、１日あたり１０ｍｇの用量で臨床的に活性であり得る。
【０１５７】
本実施例に従った製品は、アレルギー状態（例えば枯草熱）の症状の処置または軽減に適し得る。
【０１５８】
本発明に従って加工処理される、徐放性舌下β-１，３-グルカン錠剤のための配合例は、以下の成分を含み得る：
2004528288.tif 000017
【０１５９】
この実施例の徐放性舌下β-１，３-グルカン錠剤を、本発明のプロセスに従って以下のように調製した：
1   Huttlin Turbojetを、装置製造者の指示通りに熱(１８０℃)を用いて殺菌した。
２  ヒドロゲル核材料を吸引によりHuttlin Turbojetチャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
３  ヒドロゲル核の温度を４０℃に低下させた。
４  チャンバ内容物を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
５  飽和湿度条件下で２５ｇ／分で、β-１，３グルカンコーティングをヒドロゲル核上にターボジェットコーティングした。
６  得られる生成物を３％未満の水分含量に乾燥させた。
７  各２００ｍｇのマイクロカプセルは１０ｍｇのβ-１，３-グルカンを含む。
８  生成物を、当該技術分野で使用される標準手順に従って、２００ｍｇの錠剤に圧縮した。
９  生成物を、窒素でフラッシュされたアルミニウム／アルミホイルパックに詰め、２５℃を越えない温度で貯蔵した。
【０１６０】
この実施例の錠剤は、ヒドロゲル核にゼラチン、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、およびアルブミンが高い比率で存在するために、遅い溶解速度（分未満）を有する。この組合せは、活性物質が標的吸収部位（口腔粘膜など）と連続した接触を有することを可能にする徐放性製品にとって理想的である。
【０１６１】
この実施例に従った製品に推奨される投薬レジメンは、これがアレルギー状態の処置または軽減に使用される場合:春の４週間前から毎日１錠を舌下で溶かし、その後６ヶ月続ける。処方の１５分前または後には食物または飲み物を取らないことが推奨される。
【０１６２】
この実施例に従った製品を、ともに重篤な枯草熱を長年患っている４９歳の女性(Mrs Y)および３９歳の男性(Mr X)で試験した。両被験者が、ドクムギ、花粉、およびハウスダストに対してアレルギー反応を起こすことが、皮膚感受性試験を使用して判定された。
【０１６３】
上記に推奨される用量で本実施例の錠剤を服用した後、両被験者は、これまでの年と比べて、今年の春はくしゃみの発生率、目のかゆみ、および鼻水が最小限であったことを報告した。両被験者は、彼らの症状が完全に治癒し得るかどうかを判定するために、翌年も彼らが治療を繰り返すことができることを要求した。
【０１６４】
本発明の本発明者らは、どのような特定の理論に縛られることも望まないが、β-１，３-グルカンの舌下使用がおそらく免疫系を脱感作させ、それにより炎症応答が抑制されたと考える。
【０１６５】
本実施例のβ−１，３−グルカン舌下錠を、１人の、気管支拡張薬スプレーおよびコルチコステロイド薬物を継続的に使用しなければならない重篤な喘息の４０歳男性(Mr Z)にも与えた。薬物(１日あたり１錠、舌下で溶かす)を使用して２週間後、喘鳴発生率は大きく減少し、気管支拡張薬スプレーおよびコルチコステロイド薬物を使用する必要性の頻度は半減した。しかしながら、薬物は、彼の喘息症状を減少させるのに有用であるものの、ある未知の理由から、鼻血の発生が存在した。したがって、β−１，３−グルカン処方を停止した。
【実施例４】
【０１６６】
生物活性タンパク質の安定化
本明細書中で既に記載したように、生体タンパク質およびペプチドは、製薬業を含む多数の産業に広い応用を有する。しかしながら、これらのタンパク質の多くは、貯蔵温度（室温など）で不安定であり得る。
【０１６７】
安定なタンパク質製品の製造における本発明の有効性は、インターフェロンを使用するこの実施例で実証される。しかしながら、これが他のタンパク質またはペプチドの調製に同じく応用可能であることが理解されるだろう。
【０１６８】
インターフェロンα、β、およびγは、抗ウイルス性、抗腫瘍性の免疫調節タンパク質である。外因性インターフェロンを動物の身体中に導入するために一般に使用される方法は、注射によるものである。天然および組換えインターフェロンα２ａおよび２ｂは、ウイルス性疾患および腫瘍疾患の治療用の、３００万〜１０００万ＩＵの注射液として市販されている。全ての市販されているインターフェロン注射製品は、約４℃〜８℃で貯蔵することを必要としている。なぜならば、それらは上昇した温度では不安定だからである。
【０１６９】
３００万〜５００万ＩＵ投薬量での注射によるインターフェロン投与は、顕著な副作用を伴う。さらに、インターフェロンは自然の血液タンパク質ではないので、数回注射後、患者がそれに対して免疫応答を生じ得ることはいたって普通である。したがって、インターフェロンが効果を有するために、投薬量は継続のたびに著しく増加することが必要である。これは副作用の悪化につながりえる。さらに、注射により投与された場合、外因性インターフェロンは血液を介して肝臓へ運ばれて、素早く代謝される。
【０１７０】
実施例４ａ：安定化インターフェロンα３００万ＩＵ注射物
本実施例は、室温で安定なインターフェロン注射物を提供する。
【０１７１】
安定化インターフェロン注射配合物は、以下の成分を含む：
2004528288.tif 000018
【０１７２】
用語「注射用水」は当該技術分野で標準的なものであることが理解される。これは、標準薬局方に記載されるような、注射可能な組成物を配合する際の使用に適した標準品質の水を示す。
【０１７３】
本実施例の安定化インターフェロン注射物を、本発明に従って以下の工程を使用して調製した：
１  インターフェロンα、グリシン、マンニトール、スクシニル化ゼラチン、プロピレングリコール、アスコルビン酸、および緩衝液を精製水に溶解し、次いで０．２２ミクロン膜フィルターで濾過した。アルブミンを加え、注射用水で重さを調整した。
２  Huttlin Turbojetチャンバを、設備製造者の指示通りに熱（１８０℃）を用いて殺菌した。
３  Huttlin装置を、濾過された窒素が循環するモードへ切り替えた。
４  ヒドロゲル核材料を吸引によりHuttlin Turbojetチャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
５  ヒドロゲル核生成物の温度を４０℃に低下させた。
６  チャンバ内容物を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
７  飽和湿度条件下で２５ｇ／分の速度で、インターフェロンαコーティングをヒドロゲル核上にターボジェットコーティングした。
８  得られる生成物を２％未満の水分含量に乾燥させた。
９  生成物を、無菌充填条件下で、窒素でフラッシュされた注射バイアルに詰めた。
【０１７４】
本実施例に従って調製された各５０ｍｇのマイクロカプセルは、３００万ＩＵのインターフェロンαを含有する。
【０１７５】
実施例４ｂ：安定化インターフェロンα６０，０００ＩＵペッサリー
膣表面でパピローマ感染および他のウイルス疾患を予防および治療するために、室温安定化インターフェロンペッサリーが作成され得る。
【０１７６】
本実施例の安定化インターフェロンペッサリー配合物は、以下の成分を含んだ：
2004528288.tif 000019
本実施例の安定化インターフェロンペッサリーを、本発明に従って以下の工程を使用して調製した：
１  インターフェロンα、グリシン、マンニトール、スクシニル化ゼラチン、プロピレングリコール、および緩衝液を水に溶解し、次いで０．２２ミクロン膜フィルターで濾過した。アルブミンを加え、注射用水で重さを調整した。
２  Huttlin Turbojetを、設備製造者の指示通りに１８０℃で殺菌した。
３  装置を、濾過された窒素が循環するモードへ切り替えた。
４  ヒドロゲル核材料を吸引によりHuttlin Turbojetチャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
５  ヒドロゲル核生成物の温度を４０℃に低下させた。
６  チャンバ内容物を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
９  飽和湿度条件下で２５ｇ／分の速度で、インターフェロンαコーティングをヒドロゲル核上にターボジェット噴霧した。
８  得られる生成物を２％未満の水分含量に乾燥させた。
９  生成物を、標準手順に従って、１ｇのペッサリーに圧縮した。
１０  生成物を、窒素でフラッシュされたアルミニウム／アルミホイルパックに詰め、２５℃を越えない温度で貯蔵した。
【０１７７】
本実施例に従って調製された各１ｇのマイクロカプセルは、６０，０００ＩＵのインターフェロンαを含有する。
【０１７８】
実施例４ｃ：安定化インターフェロンＡ２０００ＩＵ＆ムラミダーゼ舌下錠
極低用量（１０，０００未満ＩＵ／用量／成人）で、インターフェロンαはウイルス性疾患および腫瘍疾患の治療に効果的な薬物であることを実証した。
【０１７９】
皮下投与されたインターフェロンαは、現在、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を管理するための標準治療であるとみなされており、そのための市販製品が多数存在する；例えば、Wellferon TM Injection (Glaxo Wellcome), Intron - ATM Injection (Schering Plough),Roferon ATM Injection (Hoffmann-La Roche)、およびAnferon (Hualida Tianjin, China)。しかしながら、そのような製品の使用には例えば以下のような多くの不利益が伴うおそれがある。：患者による自己投与は苦痛であり、訓練を必要とする；高用量は多数の副作用（嘔吐、悪心、めまい、鼻汁、および他のインフルエンザ様症状を含む）を伴うおそれがある；治療コストは高いと考えられ得、例えばRoferon A Injectionを用いた通常のＢ型肝炎およびＣ型肝炎の治療は、オーストラリアではだいたいＡＵ＄８０００ぐらいかかる。また、製品は室温で安定ではないので、冷蔵して貯蔵しなければならない。
【０１８０】
過去約１０年間にわたり行われてきた研究は、低用量のインターフェロンαが口粘膜（oromucosal）経路（舌下投与を含む）を介して効果的に投与され得ることを示唆した。
【０１８１】
本実施例は、口粘膜経路（頬側または舌下）を介して投与され得る投薬形態を提供する。
【０１８２】
本発明の舌下徐放配合物は、インターフェロンα（２０００ＩＵ）およびムラミダーゼ塩酸塩（５０ｍｇ）の両方を含み、慢性ウイルス疾患の処置または寛解に有用である。ムラミダーゼ塩酸塩は、アジア諸国で広範な使用歴を持つ抗ウイルス剤である。
【０１８３】
本実施例の安定化インターフェロンαおよびムラミダーゼの舌下錠配合物は、以下の成分を含んでいる：
2004528288.tif 000020
【０１８４】
本実施例の安定化インターフェロンαおよびムラミダーゼの舌下錠を、本発明に従って以下の工程を使用して調製した：
１  インターフェロンα、グリシン、マンニトール、スクシニル化ゼラチン、プロピレングリコール、アスコルビン酸、および緩衝液を注射用水に溶解し、次いでアルブミンを加え、注射用水で重さを調整した。
２  Huttlin Turbojetチャンバを、設備製造者の指示通りに１８０℃での加熱により殺菌した。
３  装置を、濾過された窒素が循環するモードへ切り替えた。
４  ヒドロゲル核材料を吸引により改良型Huttlin Turbojetチャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
５  ヒドロゲル核生成物の温度を４０℃に低下させた。
６  チャンバ内容物を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
７  飽和湿度条件下で２５ｇ／分の速度で、インターフェロンαコーティングをヒドロゲル核上にターボジェット噴霧した。
８  得られる生成物を２％未満の水分含量に乾燥させた。
９  マイクロカプセルを、当該技術分野で使用される標準手順に従って、２００ｍｇの錠剤に圧縮し、窒素でフラッシュされたアルミニウム／アルミホイルパックに詰め、２５℃を越えない温度で貯蔵した。
【０１８５】
この実施例に従って製造された各２００ｍｇの錠剤は、２，０００ＩＵのインターフェロンα２ｂおよび５０ｍｇのムラミダーゼ塩酸塩を含有し、ゆっくりした溶解の特徴を有し、口内で溶解するのに１０分以上かかる。これは徐放性舌下製品として設計される。
【０１８６】
この実施例に従った製品は、慢性ウイルス感染の予防および／または処置のために、以下の好適な投薬レジメンに従って投与することが推奨される：６ヶ月から１年にわたり、１日おきに１錠を舌下で溶解させる。
【０１８７】
この実施例に従って製造された製品の異なる３つのバッチの錠剤中の活性物（インターフェロンα２ｂおよびムラミダーゼ）の安定性を、異なる３つの温度で研究した。結果を以下の表９にまとめる。
【０１８８】
各活性物の効力を、当該技術分野で使用される標準手順に従って評価した。簡単には、以下の工程が取られた：
１  インターフェロンおよびムラミダーゼを、存在する固相から安定かつ緩衝化された液体媒体中へ抽出した。
２  抽出された液体を、細胞変性効果アッセイ（ＣＰＥ）にかけて、錠剤中のインターフェロンの抗ウイルス活性を判定した（英国／欧州薬局方２０００の現法に従った）。
３  液体抽出物を、ＨＰＬＣ分析にかけて、錠剤中のムラミダーゼを定量した。
【０１８９】
【表９】
2004528288.tif 000021
【０１９０】
実施例４ｄ：風邪、インフルエンザ、および他の呼吸器疾患のための安定化インターフェロンαの鼻スプレー
インターフェロンαは、ウイルス性呼吸器疾患に対して効果的であることが知られている。ヒトを含む動物での臨床研究は、インターフェロンα鼻スプレーが、およそ数百単位〜１００万単位を超える用量で、インフルエンザおよび風邪に伴うものを含む呼吸器感染に対して効果的であることを実証した。しかしながら、高用量では、鼻血およびインフルエンザ様症状が観測され得る。
【０１９１】
水相に正確に配合されたインターフェロンα２ｂは、インターフェロンα２ｂの製造者により提供される情報に従って室温で１ヶ月まで安定であり得るが、２ヶ月以上では安定ではない。したがって、実行可能な市場的保管期限（例えば約１２〜１８ヶ月）を持つ、すぐに使える液体形態の、風邪、インフルエンザ、および他の呼吸器疾患の治療および／または予防用インターフェロン鼻スプレーは不可能である。
【０１９２】
実行可能な代替案は、予め構成された室温で安定な錠剤として存在する主要な活性成分（インターフェロンα）を有することである。したがって、インターフェロンαの使用直前に、錠剤が許容可能な液体希釈剤を含む鼻スプレーボトルに加えられ得る。再構成された溶液は、室温で４週間前後の保管期限を有し、この保管期限は大部分の呼吸器感染の治療の長さに適している。使用者は、治療の完了時にボトルを廃棄し得る。
【０１９３】
したがって、本実施例は、２つの構成成分を含む消費者製品を提示する：
１  本発明のプロセスに従って調製される、５０，０００ＩＵの安定化インターフェロンαを含む、箔包装されたインターフェロン錠剤；および
２  ５ｍｌの許容可能な希釈剤を含有し、鼻スプレーアプリケーターにねじを有するボトル。
【０１９４】
鼻スプレーアプリケーターは、０．１ｍｌに定量された溶液を噴霧することが好ましい。本実施例に従って、この投薬割合で、１０００ＩＵのインターフェロンαが噴霧毎に投与される。
【０１９５】
本実施例に従った配合物は、好ましくは、風邪およびインフルエンザの時期直前に開始して、毎日片方の鼻腔あたり１回の０．１ｍｌ（１０００ＩＵ）噴霧割合で投与される。
【０１９６】
本実施例の安定化錠剤は、以下の成分を含む：
2004528288.tif 000022
【０１９７】
本実施例の安定化錠剤を、本発明に従って以下の工程を使用して調製した：
１  インターフェロンα、グリシン、マンニトール、スクシニル化ゼラチン、プロピレングリコール、および緩衝液を注射用水に溶解し、次いで０．２２ミクロン膜フィルターで濾過する。アルブミンを加え、注射用水で重さを調整する。
２  Huttlin Turbojetチャンバを、設備製造者の指示通りに１８０℃での熱処理により殺菌した。
３  装置を濾過された窒素が循環するモードへ切り替えた。
４  ヒドロゲル材料核を吸引によりHuttlin Turbojetチャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
５  ヒドロゲル核生成物の温度を４０℃に低下させた。
６  装置チャンバ内容物を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
７  飽和湿度条件下で２５ｇ／分の速度で、インターフェロンαコーティングをヒドロゲル核上にターボジェット噴霧した。
８  得られる生成物を２％未満の水分含量に乾燥させた。
９  マイクロカプセルを、当該技術分野で使用される標準手順に従って、２００ｍｇの錠剤に圧縮した。
１０  錠剤を、窒素でフラッシュされたアルミニウム／アルミホイルパックに詰め、２５℃を越えない温度で貯蔵した。
【０１９８】
この実施例に従って製造された各２００ｍｇの錠剤は、５０，０００ＩＵのインターフェロンαを含有する。
【０１９９】
本実施例の液体希釈剤配合物の成分は、以下の表１０に提供される。
【０２００】
【表１０】
2004528288.tif 000023
【０２０１】
実施例４ｅ：風邪、インフルエンザ、および他の呼吸器疾患の治療のための安定化インターフェロンαの鼻スプレー
本実施例は、風邪およびインフルエンザ症状の軽減を助け得るさらなる活性成分を含む、代替的希釈剤配合物を提供する。
【０２０２】
本実施例の消費者製品は、実施例４ｄに列挙される２つの構成成分を含む；インターフェロンαを含有する錠剤、およびスプレーアプリケーターボトルなどに入った希釈剤。同様に、再構成されたインターフェロン鼻スプレーは１０００ＩＵインターフェロンα／０．１ｍｌを含む。
【０２０３】
本実施例の好適な投薬レジメンは、軽いインフルエンザまたは風邪の症状が現れたときに、朝と夜、片方の鼻腔あたり１回０．１ｍｌ（１０００ＩＵ）の噴霧である。５〜１０日間治療を続ける。
【０２０４】
本実施例の錠剤成分は、実施例４ｄのプロセスに従って調製される。
【０２０５】
本配合物の希釈剤配合は以下の表１１に与えられる：
【０２０６】
【表１１】
2004528288.tif 000024
【０２０７】
実施例４ｆ：目の充血疾患予防のための安定化インターフェロンα洗眼薬または点眼薬
既に記載したように、正確に配合された水性インターフェロンαは、室温で１ヶ月までは安定であり得るが２ヶ月では安定ではない。したがって、実行可能な商業的保管期限（例えば約１２〜１８ヶ月）を持つ、すぐに使える液体形態の、インターフェロン洗眼薬または点眼薬は不可能である。
【０２０８】
実行可能な代替案は、予め構成された室温で安定な錠剤として存在する主要な活性成分（インターフェロンα）を有することである。したがって、インターフェロンαの使用直前に、錠剤が許容可能な液体希釈剤を含む洗眼薬または点眼薬ボトルに加えられ得る。再構成された溶液は、室温で４週間前後の保管期限を有し得る。使用者は、治療の完了時にボトルを廃棄し得る。
【０２０９】
本実施例の消費者製品は、実施例４ｄに列挙される２つの構成成分を含む；インターフェロンαを含有する錠剤および希釈剤（ただし、この実施例では、適切な洗眼薬または点眼薬ボトル入りである）。同様に、再構成されたインターフェロン洗眼薬または点眼薬は、１０００ＩＵインターフェロンα／０．１ｍｌを含み、０．１ｍｌが好適な１回の投与用量である。
【０２１０】
本実施例の好適な投薬レジメンは、目の充血の処置のために、１日２回、片眼あたり１回０．１ｍｌ（１０００ＩＵ）の噴霧／滴下である。
本実施例のインターフェロンα錠剤配合物は、上記の実施例４ｄに記載されるものに従って、配合および加工処理される。
【０２１１】
本実施例の希釈剤配合物は、以下の表１２に提供される。この液体希釈剤が、好ましくは、高圧滅菌または他の方法で滅菌されることが理解されるだろう。
【０２１２】
【表１２】
2004528288.tif 000025
【０２１３】
実施例４ｇ：安定化インターフェロン皮膚スプレー−洗眼液と同様な配合物
【表１３】
2004528288.tif 000026
【０２１４】
皮膚スプレー（例えば創傷治癒用）を、実施例４ｆに従って配合した。しかしながら、この実施例では、液体希釈剤は皮膚への送達に適した容器中に存在した。
【０２１５】
実施例４ｈ：舌下送達用安定化エリスロポエチン（ＥＰＯ）
ＥＰＯの安定化配合物を、以下のプロセスに従って錠剤形態に調製した。
【０２１６】
本実施例の舌下ＥＰＯ錠剤を、本発明に従って以下の工程を使用して調製した：
１  ＥＰＯ、デキストラン、グリシン、トレハロース、エデト酸ナトリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、ロイシン、および緩衝液を注射用水に溶解し、次いでアルブミンを加え、注射用水で重さを調整した。
２  Huttlin Turbojetを、設備製造者の指示通りに１８０℃で加熱殺菌した。
３  装置を濾過された窒素が循環するモードへ切り替えた。
４  ヒドロゲル核材料を吸引により改良型Huttlin Turbojetチャンバ中へ負荷し、６０℃で１時間流動化および加熱した。
５  ヒドロゲル核生成物の温度を４０℃に低下させた。
６  チャンバ内容物を、１時間当たり３００立方メートルの速度で流動化した。
７  飽和湿度条件下で２５ｇ／分の速度で、ＥＰＯコーティングをヒドロゲル核上にターボジェット噴霧した。
８  得られる生成物を２％未満の水分含量に乾燥させた。
９  生成物を、標準手順に従って、２００ｍｇの錠剤に圧縮した。
【０２１７】
そのようにして製造された配合物を使用して、動物実験を行った。ラットを４群に分けた。第一群には、１日目に皮下注射で５０ＩＵのＥＰＯを与え、網状赤血球判定のために、２日目、４日目、および６日目に分析用血液サンプルを採取した。この投与様式は、ＥＰＯ治療の現在の送達経路を模倣している。
【０２１８】
第二群では、１日目、２日目、および３日目に、この実施例の配合物を用いて、ラットに舌下送達で一日量１２５ＩＵのＥＰＯを与えた。網状赤血球判定のために、２日目、４日目、６日目、および８日目に血液サンプルを採取した。
【０２１９】
第三群のラットには、１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に、舌下送達で一日量１２５ＩＵのＥＰＯを与えた。網状赤血球判定のために、２日目、４日目、６日目、８日目、および１０日目に血液サンプルを採取した。
【０２２０】
対照のラットには、第一群の５０ＩＵのＥＰＯ皮下注射と同じ容量の生理食塩水の皮下注射いずれかを与えた。第二対照群には、この実施例に従った、ＥＰＯを含まない配合物を与えた。
【０２２１】
結果
結果を図１に図示する。ここで対照動物は「正常範囲」図提示に表される。舌下ＥＰＯを与えられたラットは、対照動物の正常範囲を超える網状赤血球数の上昇を実証的に示し、舌下送達されたＥＰＯが活性であったことを示している。
【０２２２】
皮下注射されたＥＰＯは、２日後に網状赤血球数のピークを示し、これは４日間で正常範囲に急速に落ち込んだ。
【０２２３】
この実施例の配合物を、安定性について試験し、結果を図２に示す。この図に示されるように、ＥＰＯ含有舌下錠は、室温で少なくとも９ヶ月安定である。ＥＰＯの活性は、ヒトＥＰＯ免疫測定法により判定され、ラットの網状赤血球数により測定されるとおり、完全に生物学的に活性であることが見いだされた。
【０２２４】
この実施例は、安定化タンパク質（エリスロポエチンなど）が、舌下送達、鼻腔送達、および膣送達を含む、身体の粘膜表面との接触を通して放出および吸収されることを示す。これらの粘膜領域は、例えば、腎不全、ＡＩＤＳ、癌、遺伝病、手術、および月経により引き起こされる貧血の治療のための、タンパク質の身体内への輸送を可能にするリンパ系組織が豊富である。
【０２２５】
当業者は、本明細書中記載される本発明が詳細に記載されたものの他に改変および変更が可能であることを理解するだろう。本発明が、そのような改変および修飾を全て含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書に個別にまたはまとめて言及されるかまたは示される全ての工程、特徴、および組成物、ならびに任意の２つまたはそれより多くの該工程または特徴の任意および全ての組合せを含む。
【０２２６】
詳細には、本発明は具体的なタンパク質および微生物の調製を参照して記載および例示されたものの、所定の任意の細胞および／またはタンパク質もしくはペプチドの調製に等しく適用可能であることが、本発明が関連する技術分野の当業者により理解されるだろう。例えば、本発明のプロセスは、ホルモン、サイトカイン、および成長因子（ヒトまたは動物成長ホルモン、またはその誘導体）；組換え技術により製造されたものを含むエリスロポエチン（ＥＰＯ）（例えば、エポエチンα、エポエチンβ、およびエポエチンγ）；カルシトニン；インターフェロン（α−およびβ−およびγ−インターフェロンを含む）；ＩＬ２などのインターロイキン；インスリン；Ｇ-ＣＳＦおよびＧＭ-ＣＳＦなどのコロニー刺激因子の調製に容易に適用可能であり得る。本発明に使用され得る酵素の例として、ストレプトキナーゼ、ムラミダーゼ、パンクレアス、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ブロメライン、パパインなどが挙げられる。配合物は、２つまたはそれより多くの異なる酵素を含み得る。
【０２２７】
本明細書は、本発明に従って作られる多数の新規配合物の使用のための好適な投薬割合の例を提供する。代替的な投薬量およびその中の活性物の濃度は本発明者らにより想定され、本発明が関連する技術分野の当業者は、その中の活性物の濃度が変更されている製品を、本発明に従って容易に配合することができるだろう。
【０２２８】
本発明の、マイクロカプセルとして安定化された生体タンパク質はまた、身体の粘膜表面（例えば、舌下、鼻腔、膣）と接触したときに放出され得る。これらの粘膜領域は、タンパク質の身体内への輸送を可能にするリンパ系組織が豊富である。Charman et al (J. Pharm. Sci., Vol 89, pages 168 - 177 (2000))による、およびその後のMcLennan (APSA 2001 Conference Proceedings)による、皮下注射としての様々なタンパク質の調査は、タンパク質のリンパ吸収がタンパク質の分子量とともに増加し、リンパ系は皮下注射で投与されたタンパク質の全身利用能全体への寄与において重要であることを示した。安定化タンパク質マイクロカプセルは、皮下注射よりも患者に許容可能な投薬形態（舌下錠、鼻スプレー、または膣ペッサリーなど）を可能にし得る。
【０２２９】
さらに、本発明に従った製品が所望の投薬形態に到達するために操作またはさらに配合され得ることが理解されるだろう。例えば、本発明のマイクロカプセルは、カプセル化されて標準カプセル単位用量を形成し得るか、または当該技術分野で使用される様々な標準賦形剤および希釈剤と合わせられて、例えば錠剤または液体配合物を形成し得る。当業者は、本発明のマイクロカプセルがさらに配合され得る、また本発明の発明者らにより熟考される多くの他の方法を理解するだろう。
【０２３０】
最後に、本明細書中に記載される新規プロセスが、他の物質を調製するために、および材料を特定の目的のために操作するために使用され得ることが本発明の発明者らにより熟考される。詳細には、本発明のプロセスは、溶媒または水性方法（酢酸フタル酸セルロースのナトリウム塩など）を使用してマイクロカプセルの腸溶コーティングを可能にするため、核材料重合体をより高分子量に変えることにより、もしくは高分子量ゼラチン、ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、様々なセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、アルブミン、カラギーナン（配合の当業者は、所望の放出プロファイルを作り出すために様々な組合せを提供することができるだろう）などのヒドロゲル核の組合せを使用することにより徐放性を作り出すために、使用される重合体の性質およびコーティングの厚さを変更することにより持続放出性を作り出すために、および大量の固体集団の中で追跡物質の微小分布を可能にするために、操作され得ることが想定されている。
【０２３１】
タイトル、見出しなどは、この文書の読み手の理解を高めるために提供されるものであり、本発明の範囲を制限するものとして読まれるべきではない。
【０２３２】
上記および下記に記載される全ての出願、特許、および公報の完全な開示がある場合、それらは参照により本明細書に援用される。
【０２３３】
本明細書のいかなる先行技術の参照も、その先行技術が当該研究分野で共通の一般知識の一部を形成することの認知でもいかなる形の示唆でもなく、またそのように受け取られるべきではない。
【０２３４】
本明細書を通じて、文脈が他に要求しない限り、単語「含む（comprise）」、ならびに「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」などの変化形は、定められた完全体もしくは工程または完全体もしくは工程の群の包含を含意するが、その他の完全体もしくは工程または完全体もしくは工程の群の排除ではないことが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】ラットにおけるＥＰＯの舌下送達。網状赤血球数は、採取した血液サンプルから測定された１０１０／Ｌとしてそれを処置時または後の日数に対してプロットしているものを示す。正常範囲は（２本の太線）で表される；処置群は、１日目に５０ＩＵの皮下注射によるもの（中心にダイヤモンド型がある線）；１日目、２日目、および３日目に１２５ＩＵのＥＰＯの舌下送達によるもの（中心に四角形がある線）；１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に１２５ＩＵのＥＰＯの舌下送達によるもの（薄い色の三角形がある線）であった。
【図２】４℃（線を通るダイヤモンド型がある線）および室温（線を通る四角形がある線）で９ヶ月にわたるＥＰＯ錠剤の安定性を示す。
【図１】
2004528288.tif 000027
【図２】
2004528288.tif 000028
【国際公開パンフレット】
2004528288.tif 000029
2004528288.tif 000030
2004528288.tif 000031
2004528288.tif 000032
2004528288.tif 000033
2004528288.tif 000034
2004528288.tif 000035
2004528288.tif 000036
2004528288.tif 000037
2004528288.tif 000038
2004528288.tif 000039
2004528288.tif 000040
2004528288.tif 000041
2004528288.tif 000042
2004528288.tif 000043
2004528288.tif 000044
2004528288.tif 000045
2004528288.tif 000046
2004528288.tif 000047
2004528288.tif 000048
2004528288.tif 000049
2004528288.tif 000050
2004528288.tif 000051
2004528288.tif 000052
2004528288.tif 000053
2004528288.tif 000054
2004528288.tif 000055
2004528288.tif 000056
2004528288.tif 000057
2004528288.tif 000058
2004528288.tif 000059
2004528288.tif 000060
2004528288.tif 000061
2004528288.tif 000062
2004528288.tif 000063
2004528288.tif 000064
2004528288.tif 000065
2004528288.tif 000066
2004528288.tif 000067
2004528288.tif 000068
2004528288.tif 000069
2004528288.tif 000070
2004528288.tif 000071
2004528288.tif 000072
2004528288.tif 000073
2004528288.tif 000074
2004528288.tif 000075
2004528288.tif 000076
2004528288.tif 000077
2004528288.tif 000078
2004528288.tif 000079
2004528288.tif 000080
2004528288.tif 000081
2004528288.tif 000082
2004528288.tif 000083
2004528288.tif 000084
2004528288.tif 000085
2004528288.tif 000086
【国際調査報告】
2004528288.tif 000087
2004528288.tif 000088