(57)【要約】本発明はＨＣＶの種々の菌株及び変異体を認識する免疫応答を誘発しうるＨＣＶコンジュゲートに関する。該コンジュゲートはポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と１つまたは複数のＨＣＶミモトープとを含有する。好ましいＨＣＶミモトープはＨＣＶ　Ｅ２タンパク質の超可変領域を認識する抗体を産生しうる抗原を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と、
免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ１と、
免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ２と、
から成り、ＰＥＰ１及びＰＥＰ２の各々が、独立に選択された共有結合リンカーを介して前記担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６及び配列７から成るグループから選択された異なる配列から成ることを特徴とするＨＣＶコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項２】
更に、免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ３を含み、ＰＥＰ３は独立に選択された共有結合リンカーを介して前記担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６及び配列７から成るグループから選択された第三の配列から成り、前記第三の配列はＰＥＰ１またはＰＥＰ２とは異なる配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項３】
ＰＥＰ１が配列１を含み、ＰＥＰ２が配列２を含み、ＰＥＰ３が配列４を含むことを特徴とする請求項２に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項４】
前記担体がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体であることを特徴とする請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ＨＣＶコンジュゲートが、
免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ１と、
免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ２と、
免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ３と、
免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ４と、
免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ５と、
を含み、
ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４及びＰＥＰ５の各々が、独立に選択された共有結合リンカーを介して前記担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６及び配列７から成るグループから選択された異なる配列から成ることを特徴とする請求項１に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項６】
前記担体がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体であることを特徴とする請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４及びＰＥＰ５の各々が、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６及び配列７から成るグループから選択された異なる配列から本質的に構成されることを特徴とする請求項６に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項８】
前記コンジュゲートが以下の構造：
【化１】
2004509846.tif 000024
〔式中、
ＯＭＰＣはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体を表し、
アニオンは生理的ｐＨでアニオン性を有する低分子量部分を表し、
Ｌ１はＰＥＰ１をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ１の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ２はＰＥＰ２をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ２の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ３はＰＥＰ３をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ３の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ４はＰＥＰ４をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ４の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ５はＰＥＰ５をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ５の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ６はＰＥＰ６をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ６の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ７はアニオンをＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ７の各々及びアニオンの各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ８はキャッピング基をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ８の各々及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈの各々は独立に選択された結合負荷であり、ａ、ｂ、ｃ及びｈの各々は０よりも大きい値であり、
ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５及びＰＥＰ６が免疫原性ペプチドであり、但し、ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５及びＰＥＰ６のうちの少なくとも２つが、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５及び配列６から成るグループから選択された配列から成る〕
を有することを特徴とする請求項１に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項９】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８の各々が独立に構造：
【化２】
2004509846.tif 000025
〔式中、
ＯＭＰＣは“ｚ”位で連結され、
Ｒはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
Ｒ１及びＲ２の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ１及びＲ２の他方がＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５、ＰＥＰ６、アニオンまたはキャッピング基の連結位置であり、
各アニオンがカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸である〕
を有していることを特徴とする請求項８に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項１０】
ｇが０であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＬ８の各々が以下の構造：
【化３】
2004509846.tif 000026
〔式中、
ＯＭＰＣは“ｚ”位で連結され、
Ｒ１及びＲ２の一方が水素であり、Ｒ１及びＲ２の他方がＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５、ＰＥＰ６またはキャッピング基の連結位置であり、
ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５及びＰＥＰ６の各々が、配列８、配列９、配列１０、配列１１、配列１２、配列１３及び配列１４から成るグループから選択された１つの異なる配列から成る〕
を有していることを特徴とする請求項９に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項１１】
ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５及びＰＥＰ６の各々が、配列１５、配列１６、配列１７、配列１８、配列１９、配列２０及び配列２１から成るグループから選択された１つの異なる配列から成ることを特徴とする請求項１０に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項１２】
ｆが０であり、
ＰＥＰ１が配列１５から成り、
ＰＥＰ２が配列１６から成り、
ＰＥＰ３が配列１８から成ることを特徴とする請求項１０に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項１３】
ｄが０よりも大きい値であり、ｅが０よりも大きい値であり、ＰＥＰ４が配列１７から成り、ＰＥＰ５が配列１９から成ることを特徴とする請求項１２に記載のコンジュゲート、または医薬として許容されるその塩。
【請求項１４】
ｄが０よりも大きい値であり、ｅが０よりも大きい値であり、ｆが０よりも大きい値であり、ＰＥＰ１が配列１５から成り、ＰＥＰ２が配列１７から成り、ＰＥＰ３が配列１８から成り、ＰＥＰ４が配列１９から成り、ＰＥＰ５が配列２０から成ることを特徴とする請求項１０に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項１５】
前記キャッピング基の各々がＮ−アセチルシステインであることを特徴とする請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記キャッピング基の各々がＮ−アセチルシステインであることを特徴とする請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
第一及び第二の異なるＨＣＶコンジュゲートを含み、
前記第一のＨＣＶコンジュゲートが請求項１から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲートであり、
前記第二のコンジュゲートが、配列７の免疫原性ＨＣＶペプチドに共有結合的に連結されたポリペプチドまたはタンパク質を含む第二の担体を含むことを特徴とするＨＣＶコンジュゲート混合物または医薬として許容されるその塩。
【請求項１８】
前記第二の担体がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体であることを特徴とする請求項１７に記載のコンジュゲート混合物。
【請求項１９】
前記第二のコンジュゲートが、配列７の配列から本質的に構成された免疫原性ＨＣＶペプチドを含むことを特徴とする請求項１８に記載のコンジュゲート混合物または医薬として許容されるその塩。
【請求項２０】
前記第二のコンジュゲートが以下の構造：
【化４】
2004509846.tif 000027
〔式中、
ＯＭＰＣはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体を表し、
各アニオンは生理的ｐＨでアニオン性を有する低分子量部分を表し、
Ｌ１は免疫原性ＨＣＶペプチドをＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ１の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ２はアニオンをＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ２及びアニオンの各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ３はキャッピング基をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ３及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
ｎ、ｍ及びｐの各々は独立に選択された結合負荷であり、ｎ及びｐの各々は０よりも大きい値である〕
を有することを特徴とする請求項１９に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項２１】
前記第二のコンジュゲートについて、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々が独立に以下の構造：
【化５】
2004509846.tif 000028
ＯＭＰＣは“ｚ”位で連結され、
Ｒはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
Ｒ３及びＲ４の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３及びＲ４の他方が免疫原性ペプチド、アニオンまたはキャッピング基の結合位置であり、
各アニオンがカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸であり、
前記免疫原性ＨＣＶペプチドが配列１４の配列から成る〕
を有していることを特徴とする請求項２０に記載のコンジュゲート混合物または医薬として許容されるその塩。
【請求項２２】
前記第二のコンジュゲートについて、ｍが０であり、Ｌ１及びＬ３が以下の構造：
【化６】
2004509846.tif 000029
〔式中、
ＯＭＰＣは“ｚ”位で連結され、
Ｒ３及びＲ４の一方が水素であり、Ｒ３及びＲ４の他方が免疫原性ペプチドまたはキャッピング基の結合位置である〕
を有していることを特徴とする請求項２１に記載のコンジュゲート混合物。
【請求項２３】
前記第二のコンジュゲートの免疫原性ペプチドが配列２１から成ることを特徴とする請求項２２に記載のコンジュゲート混合物または医薬として許容されるその塩。
【請求項２４】
前記第二コンジュゲート中の前記キャッピング基の各々がＮ−アセチルシステインであることを特徴とする請求項２３に記載のコンジュゲート混合物。
【請求項２５】
（ａ）ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体の反応性部位に複数のリンカーを連結する段階と、
（ｂ）前記複数のリンカーに２以上の異なるＨＣＶ免疫原性ペプチドを連結する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）の生成物をキャッピングする段階とから成り、
前記２以上の異なるＨＣＶ免疫原性ペプチドが、配列１から成る第一のＨＣＶミモトープ配列、配列２から成る第二のＨＣＶミモトープ配列、配列３から成る第三のＨＣＶミモトープ配列、配列４から成る第四のＨＣＶミモトープ配列、配列５から成る第五のＨＣＶミモトープ配列、配列６から成る第六のＨＣＶミモトープ配列、及び、配列７から成る第七のＨＣＶミモトープ配列から成るグループから選択されることを特徴とする方法によって製造されるＨＣＶコンジュゲート。
【請求項２６】
前記段階（ｂ）が前記２以上の異なるＨＣＶ免疫原性ペプチドの同時コンジュゲーションによって行われることを特徴とする請求項２５に記載のＨＣＶコンジュゲート。
【請求項２７】
前記２以上の異なるＨＣＶ免疫原性ペプチドが、
前記第一のＨＣＶミモトープ配列から成る第一のＨＣＶ免疫原性ペプチドと、
前記第二のＨＣＶミモトープ配列から成る第二のＨＣＶ免疫原性ペプチドと、
前記第三のＨＣＶミモトープ配列から成る第三のＨＣＶ免疫原性ペプチドと、を含むことを特徴とする請求項３に記載のＨＣＶコンジュゲート。
【請求項２８】
有効量の請求項１に記載のコンジュゲートを被験者に接種する段階から成る免疫応答の誘発方法。
【請求項２９】
前記被験者がヒトであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
有効量の請求項１７に記載のコンジュゲート混合物を被験者に接種する段階から成る免疫応答の誘発方法。
【請求項３１】
前記被験者がヒトであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記担体にＰＥＰ１及びＰＥＰ２を同時にコンジュゲーションする段階を含むことを特徴とする請求項１に記載のコンジュゲートの製造方法。
【請求項３３】
前記担体にＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３及びＰＥＰ４を同時にコンジュゲーションする段階を含むことを特徴とする請求項４に記載のコンジュゲートの製造方法。
【請求項３４】
（ａ）有効量の請求項１に記載のコンジュゲートを被験者に接種して抗体を産生させる段階と、
（ｂ）前記被験者から前記抗体を採取する段階とを含む方法によって製造される抗血清。
【請求項３５】
（ａ）有効量の請求項１７に記載のコンジュゲート混合物を被験者に接種して抗体を産生させる段階と、
（ｂ）前記被験者から前記抗体を採取する段階とを含む方法によって製造される抗血清。
【請求項３６】
ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と、
配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６及び配列７から成るグループから選択されたＨＣＶミモトープを含む免疫原性ＨＣＶペプチドとを含み、前記免疫原性ＨＣＶペプチドが前記担体に共有結合的に連結されており、
前記担体がＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体であることを特徴とするＨＣＶコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項３７】
前記ミモトープが配列７の配列を含む請求項３６に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項３８】
前記免疫原性ＨＣＶペプチドが配列７の配列から本質的に構成される請求項３７に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項３９】
前記コンジュゲートが以下の構造：
【化７】
2004509846.tif 000030
〔式中、
ＯＭＰＣはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体を表し、
各アニオンは生理的ｐＨでアニオン性を有する低分子量部分を表し、
Ｌ１は免疫原性ＨＣＶペプチドをＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ１の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ２はアニオンをＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ２の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ３はキャッピング基をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ３の各々は同じでも異なっていてもよく、
ｎ、ｍ及びｐの各々は個別に選択された結合負荷であり、ｎ及びｐの各々は０よりも大きい値である〕
を有することを特徴とする請求項３６に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項４０】
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々が独立に以下の構造：
【化８】
2004509846.tif 000031
〔式中、
ＯＭＰＣは“ｚ”位で連結され、
Ｒはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
Ｒ３及びＲ４の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３及びＲ４の他方が免疫原性ペプチド、アニオンまたはキャッピング基の結合位置であり、
各アニオンがカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸であり、
前記免疫原性ＨＣＶペプチドが配列１４の配列から成る〕
を有していることを特徴とする請求項３９に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項４１】
ｍが０であり、Ｌ１及びＬ３が以下の構造：
【化９】
2004509846.tif 000032
〔式中、
ＯＭＰＣは“ｚ”位で連結され、
Ｒ３及びＲ４の一方が水素であり、Ｒ３及びＲ４の他方が免疫原性ペプチドまたはキャッピング基の結合位置である〕
を有していることを特徴とする請求項４０に記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
前記免疫原性ペプチドが配列２１から成ることを特徴とする請求項４に記載のコンジュゲートまたは医薬として許容されるその塩。
【請求項４３】
前記キャッピング基の各々がＮ−アセチルシステインであることを特徴とする請求項４０に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
有効量の請求項３６に記載のコンジュゲートを被験者に接種する段階から成る免疫応答の誘発方法。
【請求項４５】
前記被験者がヒトであることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）有効量の請求項３６に記載のコンジュゲートを被験者に接種して抗体を産生させる段階と、
（ｂ）前記被験者から前記抗体を採取する段階とから成る方法によって製造される抗血清。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）は、急性、活性または持続性の非Ａ非Ｂ型ウイルス肝炎の主な原因である。ＨＣＶは、初期感染に対する免疫応答を免れうる変異体を産生させる突然変異率が高い。（Ｐｕｎｔｏｒｉｅｒｏら，ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１７：３５２１−３５３３，１９９８）。ＨＣＶ感染によりしばしば持続性感染が生じ、肝硬変、肝細胞癌を誘発する頻度も高い。（Ａｌｔｅｒ，Ｂｌｏｏｄ　８５：１６８１−１６９５，１９９５参照）。
【０００２】
ＨＣＶを認識する抗体は、組換えＨＣＶタンパク質及び人工ペプチドの双方を使用して誘発できる。ＨＣＶを認識する抗体を誘発する組換えＨＣＶタンパク質は構造タンパク質Ｅ１及びＥ２を含む。（Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１２９４−１２９８，１９９４）。ＨＣＶ中に見出されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しているがＨＣＶタンパク質を認識する抗体を産生する能力を維持している人工ペプチドはファージディスプレーライブラリーを使用して選択された。（Ｐｒｅｚｚｉら，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１５６：４５０４−４５１３，１９９６；Ｐｕｎｔｏｒｉｅｒｏら，ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１７：３５２１−３５３３，１９９８）。このような人工ペプチドをＨＣＶミモトープと呼ぶ。
【０００３】
（発明の概要）
本発明主目的は、ＨＣＶの種々の菌株及び変異体を認識する免疫応答を誘発できるＨＣＶコンジュゲートである。該コンジュゲートはポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と１つまたは複数のＨＣＶミモトープとを含有している。好ましいＨＣＶミモトープは、ＨＣＶ　Ｅ２タンパク質の超可変領域を認識する抗体を産生できる抗原を提供する。
【０００４】
従って、第一の観点によれば本発明はＨＣＶコンジュゲートを記載している。該コンジュゲートは、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と免疫原性ＨＣＶペプチドとを含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。ＨＣＶペプチドは担体に共有結合的に連結されている。また、別のタイプのＨＣＶペプチド、反応性部位キャッピング基のような追加の基及びアニオンを担体に付着させてもよい。
【０００５】
“共有結合的に連結された”という用語は、生理的条件下で加水分解に対して安定な共有結合リンカーの存在を意味する。好ましくは、共有結合リンカーは、アダクト形成、酸化及び還元のような生理的条件下で生じ得る別の反応に対して安定である。
【０００６】
本発明の１つの実施態様では、共有結合的に連結された状態が“連結手段”によって得られる。本文中に記載の対応する構造、材料または作用及び等価の構造、材料または作用がこのような手段に包含される。
【０００７】
免疫原性ＨＣＶペプチドは、ＨＣＶを認識する免疫応答を誘発できる１つまたは複数の抗原決定基を含む。好ましい抗原決定基は、ＨＣＶの種々の菌株及び変異体を認識する抗体を誘発できるＨＣＶミモトープである。ＨＣＶペプチドの例は、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６または配列７のＨＣＶミモトープ配列から成るペプチドである。
【０００８】
好ましくは、ＨＣＶコンジュゲートが、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ１と免疫原性ＨＣＶペプチドＰＥＰ２とから成り、ここにＰＥＰ１及びＰＥＰ２の各々が、独立に選択された共有結合リンカーを介して担体に共有結合的に連結されており、且つ、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６及び配列７から成るグループから選択された異なる配列を含んでいるか、または、医薬として許容されるその塩から成る。ＨＣＶコンジュゲートは、配列１−７から成る２つのペプチドに加えて、配列１−７のペプチドを非限定例とする追加のペプチドを含有し得る。
【０００９】
別の観点によれば本発明は、（ａ）ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体の反応性部位に複数のリンカーを連結する段階と、（ｂ）該複数のリンカーに２つまたはそれ以上の異なるＨＣＶ免疫原性ペプチドを連結する段階と、（ｃ）段階（ｂ）の生成物をキャッピングする段階とから成る方法によって製造されるＨＣＶコンジュゲートを記載している。免疫原性ペプチドに反応しないリンカーにキャッピング基を付着させることによってキャッピングが行われる。２つまたはそれ以上の異なるＨＣＶ免疫原性ペプチドの各々は、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６または配列７から成る。
【００１０】
反応性部位はコンジュゲーションが可能な基である。好ましい反応性部位は、リシンのイプシロンアミノ基のような求核部位である。複数のリンカーという用語は２個以上のリンカーを意味する。
【００１１】
方法は、１つまたは複数のアニオンの連結、及び、配列１−７から成るペプチド以外の追加のＨＣＶ免疫原性ペプチドの連結のような追加段階を含み得る。配列１−７で示される２個またはそれ以上の異なるＨＣＶ免疫原性ペプチドに加えてこのような追加のＨＣＶ免疫原性ペプチドが含まれている。
【００１２】
別の観点によれば本発明は、本文中に記載の第一及び第二の異なるＨＣＶコンジュゲートを含むＨＣＶコンジュゲート混合物を記載している。好ましくは、第一のＨＣＶコンジュゲートは、配列１−７から成る第一の免疫原性ＨＣＶペプチド、配列２から成る第二の免疫原性ＨＣＶペプチド及び配列４から成る第三の免疫原性ＨＣＶペプチドに共有結合的に連結されたポリペプチドまたはタンパク質複合体担体を含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。第二のコンジュゲートは、配列７から成る免疫原性ＨＣＶペプチドを含むか、または、医薬として許容されるその塩から成る。第一及び第二のＨＣＶコンジュゲートは、追加のタイプのＨＣＶペプチド、反応性部位キャッピング基及びアニオンのような夫々の担体に付着された追加の基を含有し得る。
【００１３】
別の観点によれば本発明は、被験者の体内で免疫応答を誘発する方法を記載している。該方法は、有効量の本文中に記載のＨＣＶコンジュゲートを被験者に接種する段階を含む。
【００１４】
別の観点によれば本発明は、多数の免疫原性ＨＣＶペプチドを含有するＨＣＶコンジュゲートの製造方法を記載している。該方法は複数のペプチドを担体に同時にコンジュゲーションする段階を含む。
【００１５】
別の観点によれば本発明は、ＨＣＶを認識する抗体を含有する抗血清を記載している。このような抗血清は、（ａ）有効量の本文中に記載のコンジュゲートを被験者に接種して抗体を産生させる段階と、（ｂ）該被験者から抗体を採取する段階とから成る方法によって製造される。
【００１６】
本発明のその他の特徴及び利点は、種々の実施例を含む本文中の以後の記載から明らかであろう。提示された実施例は本発明の実施に有用な種々の化合物及び方法を記載している。これらの実施例は特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。当業者は本文中の開示に基づいて本発明の実施に有用な別の化合物及び方法を見出し、それらを使用することができるであろう。
【００１７】
（詳細な説明）
本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体と１つまたは複数のＨＣＶミモトープとを含有するＨＣＶコンジュゲートに関する。該コンジュゲートは、免疫応答を誘発するために使用されたＨＣＶミモトープを認識する抗体並びにＨＣＶの種々の菌株及び変異体を認識する抗体の誘発能を有している。
【００１８】
抗原を使用して免疫応答を誘発するために種々の技術を使用できる。以下に提示された実施例は、免疫応答タンパク質の複合体から成る担体を使用すること及び特定の抗原または組合せ抗原を使用することによって得られた利点を表すデータを含んでいる。これらの結果は、免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質の複合体を含有するコンジュゲートの一部として被験者に接種されたＨＣＶミモトープが、キメラミモトープ−Ｅ２タンパク質及びキメラミモトープ−Ｅ２タンパク質のＤＮＡベクターのような別の技術を使用して被験者に接種された同じＨＣＶミモトープペプチドに比べてより免疫応答を有利に誘発することを示唆する。
【００１９】
更に、組合せ抗原は、複数の個別コンジュゲートを含有する混合液中に存在する場合よりも単一コンジュゲート中に存在する場合に交差反応性抗体をより効率的に誘発することが知見された。このような組合せ抗原は好ましくは同時コンジュゲーション技術によって得られる。
【００２０】
ＨＣＶコンジュゲートは被験者の体内で免疫応答を誘発するために有効である。免疫応答の結果として、ＨＣＶを認識する抗体が産生される。免疫応答の発生及びその結果として生じる抗体の産生は治療または診断の用途で使用できる。
【００２１】
“被験者”という用語は、抗体を産生し得る哺乳動物を意味する。被験者の例は、ヒト、チンパンジー、マウス及びウマである。好ましい被験者はヒトである。抗ＨＣＶ抗体を産生するために、ＨＣＶに感染していないその他の被験者も使用できる。
【００２２】
診断用途としては、試験中の被験者の体内のＨＣＶの存在を検出するためにＨＣＶ抗体を使用する。このような抗体は、本文中に記載のＨＣＶコンジュゲートを使用して免疫応答を生じるように誘発された被験者から得られる。
【００２３】
治療用途としては、ＨＣＶ感染患者を治療したり、被験者を予防的に処置したりする。このような用途では、ＨＣＶ中和抗体を使用するかまたは産生させる。本文中に記載のＨＣＶコンジュゲートが種々の菌株及び変異体と反応する抗体の産生能は、ＨＣＶの初期感染を治療または阻止するため、及び、ｉｎ　ｖｉｖｏに生じたＨＣＶの突然変異体を防御するために有用である。
【００２４】
免疫原性ＨＣＶペプチド
免疫原性ＨＣＶペプチドは１つまたは複数のＨＣＶミモトープを含み、更に、他の基を含有し得る。好ましい他の基は、免疫応答を増強する基及び担体とのコンジュゲーションに関与する基である。免疫応答の増強に有効な他の基としては、インバジンの免疫促進性ドメインまたはヘルパーＴ細胞エピトープを含有するペプチドのような免疫原性ペプチドがある。（例えば、Ｗａｎｇ，国際公開ＷＯ９９／６６９５７及びＷａｎｇ，米国特許第５，７５９，５５１号参照）。
【００２５】
ＨＣＶミモトープの選択方法及び特定のミモトープに関してはＮｉｃｏｓｉａら，ＷＯ９９／６０１３２及びＰｕｎｔｏｒｉｅｒｏら，ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１７：３５２１−３５３３，１９９８に記載されている（双方の文献は参照によって本発明に含まれるものとする）。同定されたＨＣＶミモトープは標準コンジュゲーション技術を使用して製造できＨＣＶコンジュゲートに組込める。
【００２６】
免疫原性ＨＣＶペプチドはタンパク質中に見出される常在アミノ酸及びタンパク質中に普通には見出されない非天然アミノ酸とから構成され得る。タンパク質中に見出される常在アミノ酸はＬ鏡像異性体である（キラル中心をもたないグリシンは除外）。タンパク質中に見出される常在アミノ酸を表すために以下の標準名称を使用する：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン；
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸；
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸；
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン；
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン；
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン；
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン；
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン；
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン；
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン；
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン；
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン；
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン；
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン；
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン；
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン；
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン；及び
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン。
【００２７】
ＨＣＶコンジュゲートは１つまたは複数の異なる免疫原性ＨＣＶペプチドを含有し得る。好ましくは、少なくとも１つの免疫原性ＨＣＶペプチドが、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６または配列７のＨＣＶミモトープ配列を含むか、該ミモトープ配列から本質的に構成されるかまたは構成されている。“本質的に構成される”という表現は、ミモトープの免疫応答誘発能力を実質的に変化させない追加の基が存在してもよいことを意味する。本質的に構成されるという表現に包含される追加の基の例はリポーターアミノ酸及びコンジュゲーション関与基である。
【００２８】
後述の実施例で配列１−７として使用した配列及び呼称を以下に示す：
【００２９】
【化１０】
2004509846.tif 000002
【００３０】
配列１−７中のＸの各々は、グルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンを表す。場合によっては、配列３のペプチド中のＮ末端グルタミンからピログルタミンが自然に形成されることが知見された。
【００３１】
本発明の１つの実施態様では免疫原性ＨＣＶペプチドが以下の配列を含むか、該配列から本質的に構成されるかまたは構成されている：
【００３２】
【化１１】
2004509846.tif 000003
【００３３】
配列８−１４は配列１−７にＸ１Ｘ２が付加された配列に対応しており、ここにＸ１はリポーターアミノ酸であり、Ｘ２はイオウ含有アミノ酸である。配列８−１４のＸの各々はグルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンである。
【００３４】
リポーターアミノ酸は上記に列挙した２０種類の一般的なアミノ酸以外のアミノ酸である。リポーターアミノ酸の例を以下に示す：Ｎｖａ−ノルバリン；Ｎｌｅ−ノルロイシン；Ａｂｕ−２−アミノ酪酸；Ｄｂｕ−２，４−ジアミノ酪酸；Ｄｐｒ−２，３−ジアミノプロピオン酸；及びＣｈｇ−シクロヘキシルグリシン。
【００３５】
イオウ含有アミノ酸は反応性イオウ基を含有している。イオウ含有アミノ酸の例は、システイン及び非天然アミノ酸、例えばホモシステインである。更に、活性化及び担体との反応の前には反応性イオウがジスルフィド形態で存在してもよい。
【００３６】
本発明の別の実施態様では、免疫原性ＨＣＶペプチドが以下の配列を含むか、該配列から本質的に構成されるかまたは構成されている：
【００３７】
【化１２】
2004509846.tif 000004
【００３８】
配列１５−２１は、Ｘ１リポーター基（配列１５−２１ではＸ３として表す）がノルバリン、ノルロイシン、２−アミノ酪酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸またはシクロヘキシルグリシンを表し、Ｘ２イオウ含有アミノ酸がシステインを表す配列８−１４に対応する。配列１５−２１中のＸの各々はグルタミンまたはピログルタミン、好ましくはグルタミンである。
【００３９】
２つ以上のミモトープを含有する免疫原性ＨＣＶペプチドの例は配列２２及び２３によって表される。配列１及び７の双方のミモトープを含有する配列２２及び２３は以下の配列で表される：
【００４０】
【化１３】
2004509846.tif 000005
配列中のＸ、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は上記の定義と同義である。
【００４１】
ペプチドは当業界で公知の技術を使用して製造できる。このような技術としては化学合成及び生化学合成がある。ポリペプチドの化学合成技術の例は、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０に提示されている。核酸の細胞内導入及び核酸の発現を含む生化学合成技術の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９に提示されている。
【００４２】
ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体
ＨＣＶミモトープはポリペプチドまたはタンパク質複合体担体に共有結合的に連結されている。担体は、多数の抗原を含有するコンジュゲート作製用の骨格に供するために、また、免疫応答を増強するために使用され得る。
【００４３】
ポリペプチド及びタンパク質複合体担体としては免疫応答を増強し得る免疫原性担体が好ましい。免疫応答の増強は例えば、Ｔヘルパー細胞エピトープを供するかまたはアジュバント活性を供することによって得られる。免疫原性担体の例は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、ＯＭＰＣ由来のＭＭＰ、ジフテリアトキソイド、肝炎Ｂ型ウイルスの表面抗原、肝炎Ｂ型ウイルスのコア抗原、及び、ヒトのロタウイルスＶＰ６カプシドタンパク質である。
【００４４】
好ましい担体はＯＭＰＣである。ＯＭＰＣはコンジュゲーションに使用できる多数の基を保有している。基のコンジュゲーション適性は、供与される基のタイプ及びＯＭＰＣ中の基の位置に依存する。コンジュゲーションに使用できる求核官能基は当業界で公知の技術を使用して決定できる。（Ｅｍｉｎｉら，米国特許第５，６０６，０３０号参照）。コンジュゲーションに使用できる基のタイプの１つは、リシンのイプシロンアミノ基及びタンパク質のＮ末端アミノ酸のアルファアミノ基のようなアミノ酸に存在する一次アミノ基である。ＯＭＰＣはＦｕの米国特許第５，４９４，８０８号に記載されているような当業界で公知の技術を使用して得ることができる。
【００４５】
免疫原性ＨＣＶペプチドの組合せ
本出願は、ＨＣＶの種々の菌株及び変異体に交差反応する抗体を誘発するために使用できるＨＣＶミモトープの好ましい組合せ、及び、好ましい１つのミモトープを同定する。ミモトープの組合せは種々のコンジュゲートの混合液として使用することもできるが、種々のミモトープの組合せたものを含有する多重コンジュゲートを製造したほうが効力は大きいと考えられる。
【００４６】
多重コンジュゲート
１つの好ましい実施態様では、コンジュゲートが、担体に連結された２つまたはそれ以上の異なるタイプの免疫原性ＨＣＶペプチドと、担体に連結された１つまたは複数のキャッピング基とを含むか、これらの要素から本質的に構成されるかまたは構成されており、担体に連結された１つまたは複数のアニオンを含有し得る。他の実施態様では、少なくとも３つの異なるタイプの免疫原性ＨＣＶペプチドが存在するか、３つの異なるタイプの免疫原性ＨＣＶペプチドが存在するか、４つの異なるタイプの免疫原性ＨＣＶペプチドが存在するか、５つの異なるタイプの免疫原性ペプチドが存在するか、または、６つの異なるタイプの免疫原性ペプチドが存在する。
【００４７】
多重コンジュゲートは好ましくは、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５、配列６及び配列７から成るグループから選択された異なるＨＣＶミモトープ配列を含むかまたは該配列から本質的に構成された２つまたはそれ以上の免疫原性ＨＣＶペプチドを含有している。免疫原性ＨＣＶペプチドの各々は、独立に選択された共有結合リンカーを介して担体に連結され得る。好ましくは、このようなペプチドは以下の構造に記載されたようにＯＭＰＣにコンジュゲーションされている。
【００４８】
免疫原性ＨＣＶペプチドの組合せ例としては、以下の配列を含む組合せがある：（１）配列１、２及び４；（２）配列１、３及び５；（３）配列１、２、３、４及び５；（４）配列１、３、４、５及び６；（５）配列１、３、４、５及び７；（６）配列２、３、４、５及び２２；（７）配列１、２、３、４、５及び７。好ましくは、このようなペプチドの組合せが以下の構造に記載するようにＯＭＰＣにコンジュゲーションされている。
【００４９】
ＯＭＰＣへのコンジュゲーションを記載する本発明の実施態様では、コンジュゲートが以下の構造：
【００５０】
【化１４】
2004509846.tif 000006
〔式中、
ＯＭＰＣはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体を表し、
アニオンは生理的ｐＨでアニオン性を有する低分子量部分を表し、好ましくはアニオンはイオン化形態のカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸であり、
Ｌ１はＰＥＰ１をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ１の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ２はＰＥＰ２をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ２の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ３はＰＥＰ３をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ３の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ４はＰＥＰ４をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ４の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ５はＰＥＰ５をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ５の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ６はＰＥＰ６をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ６の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ７はアニオンをＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ７の各々及びアニオンの各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ８はキャッピング基をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ８の各々及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５及びＰＥＰ６が免疫原性ペプチドであり、但し、ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５及びＰＥＰ６のうちの少なくとも２つが、配列１、配列２、配列３、配列４、配列５及び配列６から成るグループから選択された配列を含み、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈの各々は個別に選択された結合負荷であり、ａ、ｂ、ｃ及びｈの各々は０よりも大きい値を表す〕を有しているか、または、医薬として許容されるその塩である。
【００５１】
キャッピング基はリンカーの反応性基と反応でき、キャッピング基に付着した該反応性基が以後の反応を受ける能力を阻害する化学的部分である。種々のリンカーに対して適当なキャッピング基は容易に得られる。例えば、マレイミド活性化ＯＭＰＣに対して適当なキャッピング基は、Ｎ−アセチルホモシステイン、ｎ−アセチルシステイン及びメルカプトエタノールようなチオール含有化合物である。アニオン性または非アニオン性のキャッピング基のような別のタイプのキャッピング基も使用できる。好ましくはコンジュゲート中に存在する複数のキャッピング基が同じ化学構造を有している。
【００５２】
“結合負荷”は、特定の基のモル数をリシンのモル数で除算して１００を乗算した値を表す。好ましくは、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈの結合負荷は約２５である。総合的に、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆの結合負荷は好ましくは約５から約２０の範囲であり、存在する個々の要素の結合負荷は好ましくは少なくとも約０．２である。別の実施態様では、総結合負荷ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆは少なくとも６、７または８であり、１８、１９または２０以下である。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆが存在するとき（即ち、０よりも大きい値のとき）、これらの個々の結合負荷は少なくとも約０．４、好ましくは少なくとも約１である。
【００５３】
好ましくは、存在するＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８の各々が独立に構造：
【００５４】
【化１５】
2004509846.tif 000007
〔式中、ＯＭＰＣは“ｚ”位に連結され、
Ｒはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
Ｒ１及びＲ２の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ１及びＲ２の他方がＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５、ＰＥＰ６、アニオンまたはキャッピング基の連結位置であり、
各アニオンがカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸である〕を有している。
【００５５】
“アルキレン”という用語は、炭素原子間の炭素−炭素単結合だけを含有している炭化水素基を意味する。アルキレン炭化水素基は１−１２個の炭素原子を有しており、直鎖状であるかまたは１つもしくは複数の分枝状もしくは環状の基を含有し得る。アルキレン基は２つの場所で別の官能基または構造部分に付着している。好ましくはアルキレン基は−（ＣＨ２）０−３−Ｃ６Ｈ１０−（ＣＨ２）０−３または−（ＣＨ２）０−３−Ｃ５Ｈ８−（ＣＨ２）０−３−であり、より好ましくはアルキレンは−Ｃ６Ｈ１０−または−Ｃ６Ｈ１０−ＣＨ２−である。
【００５６】
“置換アルキレン”という用語は、１つまたは複数の水素が−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３、アルキルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホノ、ホスホノ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＯ２、１−５個のハロゲンで置換された−Ｃ１−２アルキル、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３または−ＯＣＦ３から成る部分によって置換されたアルキレンを意味する。
【００５７】
“アルキル”という用語は、炭素−炭素単結合によって連結された１−８個の炭素原子から成る炭化水素基を意味する。アルキル炭化水素基は直鎖状でもよく、または、１もしくは複数の分枝状もしくは環状の基を含有してもよい。好ましくは、アルキルは１−４個の炭素原子である。
【００５８】
“置換アルキル”という用語は、１個または複数の水素が−ＮＨ２、−ＮＨＣＯＣＨ３、アルキルアミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、スルホノ、ホスホノ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＯ２、１−５個のハロゲンで置換された−Ｃ１−２アルキル、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３または−ＯＣＦ３から成る部分によって置換されたアルキルを意味する。
【００５９】
好ましくは、ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、ＰＥＰ５及びＰＥＰ６の各々が、配列８、配列９、配列１０、配列１１、配列１２、配列１３、配列１４及び配列２２から成るグループ、または、配列１５、配列１６、配列１７、配列１８、配列１９、配列２０、配列２１及び配列２３から成るグループから選択された異なる配列から構成され、そのカルボキシ末端アミノ酸のイオウを介してＯＭＰＣに連結されている。
【００６０】
より好ましい実施態様では、存在するＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７及びＬ８の各々が独立に以下の構造：
【００６１】
【化１６】
2004509846.tif 000008
〔式中、ＯＭＰＣは“ｚ”位に連結され、Ｒ１及びＲ２は上記と同義である〕を有している。好ましくは、ｇは０である（即ち、アニオン及びＬ７は存在しない）。
【００６２】
Ｍ６３コンジュゲート
別の好ましい実施態様では、ＨＣＶコンジュゲートがポリペプチドまたはタンパク質複合体担体を含有しており、（１）配列７のＨＣＶミモトープ配列を含むかまたは該配列から本質的に構成されるかもしくは構成されている免疫原性ＨＣＶペプチドと、（２）担体に連結された１つまたは複数のキャッピング基と、を含むか、または、これらの要素から本質的に構成されるかまたは構成されており、該コンジュゲートはまた、（３）担体に連結された１つまたは複数のアニオンを含有してもよい。
【００６３】
本発明の１つの実施態様では、コンジュゲートが以下の構造：
【００６４】
【化１７】
2004509846.tif 000009
〔式中、
ＯＭＰＣはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体を表し、
各アニオンは生理的ｐＨでアニオン性を有する低分子量部分を表し、好ましくはアニオンはイオン化形態のカルボン酸、スルホン酸、プロピオン酸またはホスホン酸であり、
Ｌ１はＨＣＶペプチドをＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ１の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ２はアニオンをＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ２の各々は同じでも異なっていてもよく、
Ｌ３はキャッピング基をＯＭＰＣに連結する共有結合リンカーであり、存在するＬ３の各々及びキャッピング基の各々は同じでも異なっていてもよく、
ｎ、ｍ及びｐの各々は個別に選択された結合負荷であり、ｎ及びｐの各々は０よりも大きい値を表す〕を有しているか、または、医薬として許容されるその塩である。
【００６５】
好ましくは、ｎ＋ｍ＋ｐの結合負荷は約２５である。別の実施態様では、ｎが少なくとも約０．４、少なくとも約１、少なくとも約３、少なくとも約５、または、少なくとも約８であり、約２０以下、または、約１８以下である。
【００６６】
好ましい実施態様では、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の各々が独立に以下の構造：
【００６７】
【化１８】
2004509846.tif 000010
〔式中、
ＯＭＰＣは“ｚ”位に連結され、
Ｒはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、
Ｒ３及びＲ４の一方が水素、アルキル、置換アルキルまたは−ＳＯ３Ｈであり、Ｒ３及びＲ４の他方が免疫原性ペプチド、アニオンまたはキャッピング基の結合位置であり、好ましくはＲ３及びＲ４の一方が水素である〕を含有している。
【００６８】
アルキレン、置換アルキレン、アルキル及び置換アルキルは上記と同義であり、好ましい基に関しても上記と同義である。好ましくは、免疫原性ＨＣＶペプチドが配列１４または配列２０から構成され、カルボキシ末端アミノ酸のイオウ基を介してＯＭＰＣに連結されている。
【００６９】
より好ましい実施態様では、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が独立に以下の構造：
【００７０】
【化１９】
2004509846.tif 000011
を有している。式中のＲ３、Ｒ４及び“ｚ”は上記と同義である。
【００７１】
本発明の種々の実施態様において、存在するアニオンの各々は、カルボン酸、スルホン酸またはリン酸であり、また、アニオンが全く存在しなくてもよい（ｍが０であり、Ｌ２が存在しない）。
【００７２】
ポリペプチドまたはタンパク質複合体担体の形成
ＨＣＶミモトープを含有する免疫原性ＨＣＶペプチドは、当業界で公知のコンジュゲーション技術（Ｔｏｌｍａｎら，米国特許第５，２７４，１２２号、Ｅｍｉｎｉら，米国特許第５，６０６，０３０号、Ｃｏｎｌｅｙら，米国特許第５，７６３，５７４号参照）を使用し、共有結合リンカーを介してポリペプチド及びタンパク質の複合体から成る担体にコンジュゲーションできる。コンジュゲートはまた、例えば１つまたは複数のアニオン基を含有するように修飾できる。
【００７３】
免疫原性ＨＣＶペプチドまたはアニオンを担体に連結する共有結合リンカーは生理的条件下で安定である。このようなリンカーの例は、非特異的架橋剤、モノジェネリックスペーサー及びバイジェネリックスペーサーである。
【００７４】
非特異的架橋剤及びそれらの使用は当業界で公知である。このような試薬及びそれらの使用例としては、グルタルアルデヒドとの反応、スクシニル化担体を添加してまたは非添加で行うＮ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとの反応、グリコシル化置換基を過ヨウ素酸塩で酸化し次いでホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムの存在下でタンパク質担体の遊離アミノ基に結合させる反応、芳香族アミノ基をジアゾ化し次いでタンパク質のチロシン側鎖残基に結合させる反応、イソシアナートとの反応、混合無水物との反応がある。全般的にはＢｒｉａｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．７８：５９，１９８５参照。
【００７５】
モノジェネリックスペーサー及びそれらの使用は当業界で公知である。モノジェネリックスペーサーは二官能性であり、コンジュゲーションが生じる前に一対の反応要素の一方だけを官能化する必要がある。モノジェネリックスペーサー及びその使用の一例は、カルボジイミドの存在下で二官能分子アジピン酸ジヒドラジドの一端に免疫原性ＨＣＶペプチドを結合させる処理である。ジアシル化ヒドラジンがグルタミンまたはアスパラギン側基と共に担体のカルボキシル基を形成すると推定される。次いで、カルボジイミドの存在下に第二の結合反応で担体タンパク質と反応させるとコンジュゲーションが生じる。
【００７６】
バイジェネリックスペーサー及びそれらの使用は当業界で公知である。バイジェネリックスペーサーは、一対の反応要素の各々が官能化された後に形成される。官能化された反応要素の各々が対応する反応要素と反応して１つまたは複数の安定な共有結合を形成したときにコンジュゲーションが生じる。（例えば、Ｍａｒｂｕｒｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：５２８２−５２８７，１９８６；Ｍａｒｂｕｒｇら，米国特許第４，６９５，６２４号参照）。
【００７７】
種々のプロセスの例を以下に挙げる。
【００７８】
プロセス１
１ａ．タンパク質担体求核基の画分を試薬と反応させてチオール基を形成する。このような試薬の一例はＮ−アセチルホモシステインチオラクトンである。
【００７９】
１ｂ．段階１ａの生成物を求核基と生理的ｐＨで負電荷をもつアニオンとを含む試薬と反応させる。このような試薬の一例はマレイミドアルカン酸である。
【００８０】
１ｃ．段階１ｂの生成物を求電子基が付加されるように予め誘導体化した免疫原性ペプチドと反応させる。
【００８１】
プロセス２
２ａ．タンパク質担体求核基の画分を二官能求電子試薬と反応させて求電子性タンパク質を形成する。このような試薬の一例はマレイミドアルカン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００８２】
２ｂ．段階２ａの生成物を求核基とアニオンとの双方を含む試薬と反応させる。このような試薬の一例はα−メルカプト酢酸である。
【００８３】
２ｃ．段階２ｂの生成物をチオール基のような求核基を含む免疫原性ペプチドと反応させる。
【００８４】
プロセス３
３ａ．タンパク質担体求核基の画分を求電子基とアニオンまたは初期（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ）アニオンとの双方を含む試薬と反応させる。このような試薬の例はＮ−（ブロモアセチル）−６−アミノカプロール酸及びコハク酸無水物である。
【００８５】
３ｂ．段階３ａの生成物の求核基の残留画分を、タンパク質担体にチオール基を形成する試薬、例えばＮ−アセチルホモシステインチオラクトンと反応させる。
【００８６】
３ｃ．段階３ｂの生成物を求電子基例えばマレイミドを含む基が付着するように予め誘導体化した免疫原性ペプチドと反応させる。
【００８７】
プロセス４
４ａ．タンパク質担体求核基の画分を求電子基とアニオンまたは初期アニオンとの双方を含む試薬、例えばＮ−（ブロモアセチル）−６−アミノカプロン酸及びコハク酸無水物と反応させる。
【００８８】
４ｂ．段階４ａの生成物の残留タンパク質求核基を二官能性求電子試薬と反応させてタンパク質に求電子部位を付加する。このような試薬の例は、マレイミドアルカン酸ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００８９】
４ｃ．段階４ｂの生成物をチオールのような求核基を含有する免疫原性ペプチドと反応させる。
【００９０】
プロセス５
５ａ．タンパク質担体アミノ基の画分を構造：
【００９１】
【化２０】
2004509846.tif 000012
〔式中、Ｒはアルキレン、置換アルキレン及びフェニルから成るグループから選択され、Ｒ１は水素、アルキル、置換アルキル及び−ＳＯ３Ｈから成るグループから選択され、ここに、アルキレン、置換アルキレン、アルキル及び置換アルキルは上記と同義であり、好ましい基も上記と同義である〕を有している架橋剤と反応させる。
【００９２】
５ｂ．段階５ａの生成物をチオールのような求核基を含有する免疫原性ペプチドと反応させる。
【００９３】
プロセス１−５は一般に、１つの段階の余剰試薬を第二段階の開始前に除去し未反応の官能基をキャッピングするという追加段階を含むであろう。以下の反応スキームはコンジュゲートを製造するために使用したプロセス５を追加段階と共に示す。反応スキーム中で担体、架橋剤、キャッピング基及びミモトープを表す成分は単なる代表例である。本発明の開示に基づいて当業者は反応スキームに示した成分を当業界で公知の成分及び本文中に記載の成分で置換できるであろう。
【００９４】
【化２１】
2004509846.tif 000013
【００９５】
製剤化及び投与
ＨＣＶコンジュゲートは本文中に提示した指針を当業界で公知の技術と共に使用して製剤化し患者に投与し得る。医薬投与に関する全般的指針は例えば、Ｍｏｄｅｒｎ　Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｋｕｒｓｔａｋ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｍｅｄ．Ｃｏ．１９９４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　１８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０；及びＭｏｄｅｒｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｂａｎｋｅｒ　ａｎｄ　Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に提示されている。これらの文献の各々は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００９６】
ＨＣＶコンジュゲートは酸性塩または塩基性塩として製造できる。医薬として許容される塩（水溶性もしくは油溶性または水分散性もしくは油分散性の物質）としては、慣用の無毒性塩、または、例えば無機または有機の酸または塩基から形成される第四級アンモニウム塩がある。このような塩の例には酸付加塩と塩基の塩とがあり、酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート、ウンデカン酸塩があり、塩基の塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム及びカリウムの塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウムの塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基との塩、アルギニン及びリシンのようなアミノ酸との塩がある。
【００９７】
種々の用量のＨＣＶコンジュゲートを静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内のような種々の経路で投与できる。好ましい経路は筋肉内である。
【００９８】
適当な投与計画は好ましくは、患者の年齢、体重、性別及び病態、投与経路、所望の効果、使用される特定化合物のような当業界で公知の要因を考慮に入れて決定される。コンジュゲートは、多段階免疫接種フォーマット（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｆｏｒｍａｔｓ）で使用できる。１回の用量は合計タンパク質が１μｇ−１．０ｍｇの範囲になる量であると予測され、本発明の好ましい実施態様ではこの範囲が０．１ｍｇ−１．０ｍｇである。
【００９９】
ＨＣＶコンジュゲートは好ましくはアジュバントと共に製剤化される。アジュバントの例は、ミョウバン、ＡｌＰＯ４、アルヒドロゲル、リピドＡ及びそれらの誘導体または変異体、フロインドの完全または不完全アジュバント、中性リポソーム、並びに、ワクチンとサイトカインまたはケモカインとを含有するリポソームである。
【０１００】
投与適期は当業界で公知の要因に依存する。初回投与の後、抗体価を維持するために１回または複数のブースター用量を引き続き投与してもよい。投与計画の一例は、初日の投与及び１カ月後の投与、４、６または１２カ月後の３回目の投与から成り、また、必要ならばもっと間隔をおいて追加のブースター用量を投与する。
【０１０１】
実施例
本発明の別の特徴を更に説明するために以下の実施例を提示する。実施例はまた本発明を実施するために有用な方法を示す。これらの実施例は特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０２】
実施例１：ペプチド合成
（市販のソースを使用する）固相ＦＭＯＣ化学法によってペプチドを直鎖状配列として所望通りに合成（ｃｕｓｔｏｍ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ）した。ＲＰ−ＨＰＬＣで判定して全部のペプチドが＞９０％の純度を有していた。一般的に、各ペプチドは２７−ｍｅｒのミモトープとカルボキシ末端から２番目の非天然残基とカルボキサミドとして存在するカルボキシ末端システインとを含む２９残基から構成されていた。このようなペプチドの例を以下に示す：
配列２４　ＸＴＨＴＴＧＧＱＡＧＨＱＡＨＳＬＴＧＬＦＳＰＧＡＫＱＮＸ３Ｃ（ここにＸ３はＮｌｅである），
配列２５　ＸＴＨＴＴＧＧＱＡＧＨＱＡＨＳＬＴＧＬＦＳＰＧＡＫＱＮＸ３Ｃ（Ｘ３はＣｈｇである），
配列２６　ＸＴＴＴＴＧＧＱＶＳＨＡＴＨＧＬＴＧＬＦＳＬＧＰＱＱＫＸ３Ｃ（Ｘ３はＮｖａである），
配列２７　ＸＴＴＶＶＧＧＳＱＳＨＴＶＲＧＬＴＳＬＦＳＰＧＡＳＱＮＸ３Ｃ（Ｘ３はＤｐｒである），
配列２８　ＸＴＨＴＴＧＧＶＶＧＨＡＴＳＧＬＴＳＬＦＳＰＧＰＳＱＫＸ３Ｃ（Ｘ３はＡｂｕである），
配列２９　ＴＴＴＴＴＧＧＱＶＧＨＱＴＳＧＬＴＧＬＦＳＰＧＡＱＱＮＸ３Ｃ（Ｘ３はＤｂｕである），
配列３０　ＴＴＴＴＴＧＧＶＱＧＨＴＴＲＧＬＶＲＬＦＳＬＧＳＫＱＮＸ３Ｃ（Ｘ３はＮｌｅである），
配列３１　ＸＴＨＴＴＧＧＶＶＳＨＱＴＲＳＬＶＧＬＦＳＰＧＰＱＱＮＸ３Ｃ（Ｘ３はＮｌｅである）。
【０１０３】
配列２４−３１中のＸの各々はグルタミンまたはピログルタミンであり、好ましくはグルタミンである。Ｘがグルタミンを表すペプチドを合成した。
【０１０４】
アミノ末端の連鎖を試験するために、Ｎ末端グリシンと、システインと、非天然残基と、末端残基がカルボキサミドとして存在する２７−ｍｅｒのミモトープ配列とを含む３０−ｍｅｒとしてペプチドを合成した。
【０１０５】
環化ミモトープペプチドを試験するために、合成及び環化は以前に公表された戦略に従った（Ｃｏｎｌｅｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ　１２：４４５−４５１，１９９４）。簡単に説明すると、Ｎ末端グリシン、システイン、リシンをもち、続いて２７−ｍｅｒミモトープ配列をもち、カルボキシ末端から２番目に他のアスパラギン酸をもち、カルボキシ末端に非常在（ｕｎｕｓｕａｌ）アミノ酸をもつペプチドを合成した。リシンのε−アミノとアスパラギン酸のβ−カルボキシルとを縮合させると環状生成物が得られた。
【０１０６】
所望通りに合成した肝炎Ｃ型ウイルス領域由来ペプチド（ＨＶＲ）をＥＬＩＳＡ抗原として使用した。これらは、ビオチン基非使用で製造するか（表１Ａ）、または、ビオチン基を使用しそれぞれ標準ペプチド吸着型もしくはストレプトアビジンビオチン捕獲型のＥＬＩＳＡフォーマットに適するように製造した（表１Ｂ）。
【０１０７】
【表１】
2004509846.tif 000014
2004509846.tif 000015
【０１０８】
実施例２：ペプチドコンジュゲート
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　ＯＭＰＣを、過剰量のヘテロ二官能性架橋剤スルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と２−８℃で２時間反応させることによってｐＨ８．０（１０ｍＭのＨＥＰＰＳバッファ）で活性化した。活性化したＯＭＰＣを３００Ｋ　ＭＷＣＯ　ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ　Ｄｏｍｉｎｇｕｅａ，ＣＡ）を使用して１０ｍＭのＨＥＰＰＳ，ｐＨ８．０または１．０ｍＭのＭＯＰＳ，ｐＨ７．１に２−８℃で１８−２４時間透析した。透析中にバッファを３回交換してスルホＮＨＳ及び余剰のｓＳＭＣＣを除去した。
【０１０９】
チオール含有ミモトープペプチドの各々を加えることによって個々の反応を進行させた。次に、ＯＭＰＣの未反応マレイミド基をＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）と反応させ、次いで３００Ｋ　ＭＷＣＯ　ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒによって１０ｍＭの（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ），ｐＨ８．０に透析して、余剰の未結合ペプチド及びＮＡＣを除去した。
【０１１０】
全ＯＭＰＣリシンに対するミモトープペプチドの結合負荷のパーセントを、リシンのモル数に対するミモトープ中の非天然アミノ酸のモル数の比に１００を乗算することによって計算した。６ＮのＨＣｌ中で１１０℃で２０時間処理することによって酸加水分解したコンジュゲートのアミノ酸解析に基づいて定量を行った。リシン含有ミモトープについては、ＯＭＰＣ由来のリシンの割合が得られるようにリシンの測定値を補正した。ＢＳＡを標準として使用するＬｏｗｒｙアッセイによってタンパク質濃度を測定した。ＯＭＰＣのタンパク質成分とミモトープペプチドとが共有結合的に連結したことを証明するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。結合負荷は８−１９％の範囲であった。
【０１１１】
試験したワクチンの幾つかは、３、５または６個が同時にコンジュゲーションした多重ミモトープを用いて製造した。これらを同時コンジュゲートペプチドワクチン（ＳＣＰＶ）と呼ぶ。これらのＳＣＰＶのミモトープ成分、及び、各ミモトープペプチドに会合した“リポーター”アミノ酸を表２に示す。ＳＣＰＶ調製物中のＯＭＰＣに対するペプチドの結合度を測定するために、他の非反復の“リポーター”アミノ酸を各ミモトープのＣ末端から２番目の残基として組込んだ。
【０１１２】
【表２】
2004509846.tif 000016
略号：Ｎｖａ−ノルバリン、Ｎｌｅ−ノルロイシン、Ａｂｕ−２−アミノ酪酸、Ｄｂｕ−２，４−ジアミノ酪酸、Ｄｐｒ−２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｃｈｇ−シクロヘキシルグリシン
【０１１３】
実施例３：ＤＮＡベクター免疫原
霊長類へのＤＮＡデリバリーによって免疫応答を誘発するために個別の６つの発現プラスミドを構築した。６つのミモトープ配列、即ち、配列１、３、４、５、６及び７を個別に菌株ＮのＨＣＶ　Ｅ２の外層ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）配列（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１７：Ｓ９４−Ｓ１０７，１９９３）に付着させて、キメラタンパク質を産生させた。ＨＶＲコーディング配列をこのＥ２配列から取出し、カルボキシル末端に（ｈｉｓ）６タグを付加した。これらの構築物を組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リーダー配列とインフレームさせてプラスミドＶ１ｊｎｓｔｐａにクローニングした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７４：１９５−２０５，１９９７）。
【０１１４】
全部の構築物をＤＮＡ配列解析によって検証した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＴｅｒｒｉｆｉｃブロス，１×塩中で増殖させた形質転換大腸菌ＤＨ５α株の培養物からプラスミドの大量調製物を調製した。標準法によってプラスミドを抽出した後、ＤＮＡをＣｓＣｌ密度勾配中で２回収集し、１０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡに十分に透析し、２００ｍＭの酢酸ナトリウムを含有する溶液からエタノール沈殿させた。
【０１１５】
実施例４：糖タンパク質免疫原
２９３Ｔ細胞培養物中の一過性発現による分泌産物として６つのキメラミモトープ含有糖タンパク質を産生させた。一般的な発現手順に従い、２９３Ｔ細胞をポリ−Ｄ−リシンで被覆した１７５ｃｍ２容のフラスコ（ＢｉｏＣｏａｔ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で培養し、６０−７０％の集密度でトランスフェクトした。
【０１１６】
滅菌した１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０中に１μｇ／μｌのＤＮＡをフラスコあたり約２５μｇの割合で使用し、指示された量のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　Ｐｌｕｓキット（ＧＩＢＣＯ）のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　Ｐｌｕｓ成分と混合した。この溶液を、７５μｌのリポフェクタミンを含有する２．０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、指示通りにインキュベートした。この４．０ｍｌを、１５ｍｌの新しいＯｐｔｉ−ＭＥＭを既に収容しているフラスコに加えた。５−６時間後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを基材とするリポフェクタミン−ＤＮＡ培地を除去し、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充した２４ｍｌのタンパク質非含有培地（ＣＥＬＬＧＲＯ　Ｆｒｅｅ−ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｒｕｍ，ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｏｒｍｏｎｅ，ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ，ＣｅｌｌＧｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ　ＶＡ）で交換した。この培地をトランスフェクション後の２４時間毎に採取し、３つの採取材料を低速遠心によって清澄化し、全部の材料が収集されるまで４℃で保存し、プールし、０．２２μフィルターで濾過した。次に培地を１０ｍＭのイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ７．８（出発バッファ）に透析し、０．２２μフィルターを使用して再び濾過した。
【０１１７】
約２．０Ｌの材料を１０ｍｌ容のＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に、４℃で約３ｍｌ／分の流速で充填した。カラムを出発バッファで洗浄し、次いで、（ａ）２０ｍＭのイミダゾールを加えた４０ｍｌのバッファ、（ｂ）４０ｍＭのイミダゾールを加えた１０ｍｌのバッファ、（ｃ）１００ｍＭのイミダゾールを加えた３０ｍｌのバッファ、及び、（ｄ）２５０ｍＭのイミダゾールを加えた１５ｍｌのバッファによって段階的に溶出させた。１００ｍＭのイミダゾールバッファによって本質的に全部のキメラ糖タンパク質が溶出した。各糖タンパク質の主要な溶出画分の部分量を、Ｎ末端タンパク質配列解析のためには水に透析し、ＥＬＩＳＡ試験のためにはリン酸塩緩衝生理食塩水に透析し、以後のワクチン製剤化のためには５ｍＭのトリエタノールアミン、１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．８に透析した。
【０１１８】
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを順次行うことによって測定した。ウェスタンブロットには抗−ＨＣＶ　ｇｐＥ２に特異的なネズミのモノクローナル抗体または抗−ｔｅｔｒａ−ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用した。リーダープロセシングの同定及び完了はＮ末端アミノ酸配列解析によって確認した。タンパク質配列解析は、これらの全部のタンパク質のｔＰＡリーダーの開裂がリーダー残基２２と２３とのｐｒｏとｓｅｒとの間で生じたことを示した。他方、天然型ｔＰＡでは正常な開裂が２３位と２４位（ｓｅｒとｇｌｎ）との間で生じる（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｆｏｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：１０８６，１９９０）。
【０１１９】
実施例５：ワクチン製剤
ウサギで行った最初の試験では、フロインドの完全アジュバンド及び不完全アジュバンド中で製剤化したペプチドコンジュゲートワクチンを使用した。ペプチドＯＭＰＣコンジュゲートワクチンを１０ｍＭのＨＥＰＰＳ，ｐＨ８．０中に５００μｇの全タンパク質用量で調製した。以後の試験は、モノホスホリルリピド−Ａ（ＭＰＬ−Ａ）を予め吸着させた６ｍＭのトリエタノールアミン生理食塩水ｐＨ７．０−８．０中の１．４ｍｇ／ｍｌのＡｌＰＯ４に各用量を吸着させて行った。ＡｌＰＯ４対ＭＰＬ−Ａの重量比は３．５対１であった。
【０１２０】
また、精製したキメラタンパク質を５ｍＭのトリエタノールアミン、１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．８中に５００μｇの全タンパク用量で調製した。ミョウバン対ＭＰＬ−Ａの重量比３．５対１でＭＰＬ−Ａを予め吸着させたミョウバンに各用量を吸着させた。ＤＮＡベクターワクチンを無菌のＰＢＳ，ｐＨ７．５に５．０ｍｇ／ｍｌで再懸濁させた。
【０１２１】
実施例６：免疫原性試験
ニュージーランド白ウサギ（２−２．５Ｋｇ）に対して各試験の開始時、４週目及び８週目に免疫原を注射した。隔週１回の割合で１２週目まで動物から採血し、血清を調製した。アカゲザルＭａｃａｃｕｓ　ｍｕｌａｔｔａ（＞２，５Ｋｇ）をミモトープＯＭＰＣコンジュゲートワクチン及びキメラミモトープ糖タンパク質ワクチンで、初日及び４、８及び２６週目に免疫感作した。
【０１２２】
各用量を筋肉内に接種し、各三角筋の２つの部位の間に均等に分布させた。サルを無菌ＰＢＳ中で調製したＤＮＡベクターワクチンによって免疫感作した。Ｎｏ．３のシリンジを装着したＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）のニードレスデバイスを使用して各動物に筋肉内接種した。各用量を各四頭筋の２つの部位の間に均等に分布させた。１２週目まで隔週１回、２４週目まで月１回、次いで３２週目まで再び隔週１回の割合で動物から採血し、血清を調製した。
【０１２３】
実施例７：ウェスタンブロットアッセイ
組換えタンパク質のウェスタンブロットアッセイは、４×ＮｕＰａｇｅバッファ中でサンプルを調製し、予め形成した４−１２％ＮｕＰａｇｅゲル（ＮＯＶＥＸ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で電気泳動させた後に一般的手順で行った。分離したタンパク質に３０ボルトを９０分間印加して、ＰＶＤＦ紙に転移させ、標準法で処理した。処理したＰＶＤＦシートをウサギまたはサルの免疫血清またはモノクローナル抗体に４℃で一夜接触させた。
【０１２４】
一般的に、ＨＲＰコンジュゲートした抗血清を第二抗体として使用した。マウスのモノクローナル抗体を検出するためには、ヤギ抗マウスＩｇＧのＦｃフラグメント特異的抗体を使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．Ｒｅｓ．，Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。ウサギの抗体を検出するためには、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃを使用した（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）。サルの抗体を検出するためには、ヤギ抗サルＩｇＧ　Ｈ＋Ｌを使用した（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｓ）。これらの全部の第二抗体は１：４０００の希釈度で使用した。ＥＣＬまたはＥＣＬ＋試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して全部のブロットを超高感度フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）に現像した。
【０１２５】
実施例８：ミモトープ及びＨＶＲペプチドに対する免疫血清のＥＬＩＳＡ
ホモロガス免疫ペプチド、ヘテロロガスミモトープまたはＨＶＲペプチドに対する抗体応答の測定は、本質的に文献（Ｔｏｌｍａｎら，１９９３，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．４１：４５５−４６６，１９９３及びＣｏｎｌｅｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ　１２：４４５−４５１，１９９４）に記載通りの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、または、ビオチニル化ペプチドＥＬＩＳＡのストレプトアビジン捕獲の使用によって行った。
【０１２６】
簡単に説明すると、標準ＥＬＩＳＡを使用する場合には、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中の０．２５μｇのタンパク質によって湿潤雰囲気下、４℃で一夜を要してコートした。プレートを十分に洗浄し、１×ブロッカーＢＳＡ（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でブロックし、十分に洗浄し、次いで被験血清及び対照血清の希釈物と３７℃で１時間反応させた。次にプレートを十分に洗浄し、コンジュゲートした第二抗体と反応させた。プレートを標準法によって反応処理し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１２７】
ビオチニル化ペプチドＥＬＩＳＡのストレプトアビジン捕獲を使用する場合には、２×ウェル容量にあたる５０ｐｍｏｌのビオチニル化ペプチドをブロッカーＢＳＡ中のストレプトアビジンコートしたＥＬＩＳＡプレート（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と各プレートをシールした後に室温で反応させた。次にプレートを十分に洗浄し、ブロックし、再び洗浄し、次いで被験血清及び対照血清の希釈物と３７℃で３０分間反応させた。この場合にも、洗浄、第二抗体との反応、処理及び測定などの方法の残りの段階は標準プロトコルに従った。
【０１２８】
実施例９：捕獲ＥＬＩＳＡ
組換え糖タンパク質に対する抗ミモトープ応答を測定するためにはＨＣＶ　Ｅ２糖タンパク質捕獲ＥＬＩＳＡを使用した。ＥＬＩＳＡプレートを５０ｐｇの２種類のネズミ抗−ＨＣＶ　Ｅ２モノクローナル抗体のいずれか一方によって湿潤環境下、４℃で一夜を要してコートした。これらのＭａｂは無血清培地を使用してハイブリドーマ細胞培養物から調製し、ＨｉＴｒａｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して精製した。これらの２つの抗体はＥ２のＮ末端から離間して局在する保存された決定基に結合すると考えられ、分析によればＥＬＩＳＡまたはＢＩＡＣｏｒｅで抗ミモトープ血清または抗ＨＶＲ血清がＥ２に結合することを妨害しなかった。
【０１２９】
２日目、プレートを洗浄し、ブロックし、精製糖タンパク質を捕獲した。再度の洗浄後、プレートを被験血清及び対照血清の希釈物と３７℃で１時間反応させた。この場合にも、洗浄、第二抗体との反応、処理及び測定などの方法の残りの段階は標準プロトコルに従った。
【０１３０】
実施例１０：ウサギにおける単一ミモトープコンジュゲートの免疫原性
ＨＣＶミモトープペプチドコンジュゲートから成る個別の５つのワクチンを４羽のウサギで試験した（表３）。ホモロガス免疫配列に対する応答の端点力価（ＧＭＴとして表す）は、Ｒ９ミモトープコンジュゲートの場合は１：５．７×１０５、Ｒ６ミモトープコンジュゲートの場合は１：７．６×１０６の範囲であった。ＯＭＰＣ担体及びフロインドアジュバントを使用したウサギは常にこのような高い範囲の抗ペプチド力価を示した。次に、４種類のＨＣＶ　Ｈ株ペプチド（Ｆａｒｃｉら，１９９６　Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９３：１５３９４−１５３９９）を使用し、ＨＶＲ配列に対するこれらの抗ミモトープ応答を試験した。
【０１３１】
【表３】
2004509846.tif 000017
ｎ．ｄ．−試験せず
【０１３２】
抗ミモトープＲ９抗体は４種類のＨＶＲペプチド全部を認識した。抗ミモトープＲ６及びＦ７８抗体は３種類のＨＶＲペプチド全部を認識した。他方、抗ミモトープＤ６抗体は３種類の変異配列しか認識せず、力価は低い値であった。抗ミモトープＨ１抗体はＨ株の変異体を全く認識しなかった。
【０１３３】
ＭＰＬ−Ａを使用して製剤化したときのコンジュゲートの免疫原性を測定するためにウサギで追加の試験を実施した。複合体及び製剤の双方が安定だったのでコンジュゲート及びＭＰＬ−ＡをＡｌＰＯ４に吸着させた。この系で、直鎖状Ｃ末端コンジュゲート、直鎖状Ｎ末端コンジュゲート及び環状ペプチドコンジュゲートから成る３種類のミモトープＭ６３コンジュゲートを試験した（表４）。
【０１３４】
【表４】
2004509846.tif 000018
【０１３５】
フロインドアジュバント中で製剤化した先出のコンジュゲートに比較したとき、直鎖状Ｃ末端形では端点力価として表されるコグネイトＭ６３ペプチドに対する応答は同様であった。更に、ヘテロロガスミモトープＦ７８及びＨＣＶ　ＢＫ株ＨＶＲペプチドに対する端点力価が＞１：１．５×１０６であることが知見された。従って、Ｍ６３ミモトープは幾つかの条件下では、ヘテロロガス配列に対する反応性が高力価である抗体を誘発する能力を有していると考えられる。Ｎ末端コンジュゲートまたは環状ペプチドコンジュゲートで免疫感作した動物から得られた免疫血清は上記のＭ６３ミモトープに比べてほぼ１００分の１以下のかなり低い端点力価を有していた。しかしながらこれらの血清はＣ末端コンジュゲートによって誘発された血清よりも高度にＨＣＶ　Ｈ株ＨＶＲ配列を認識した。
【０１３６】
実施例１１：ウサギにおけるＳＣＰＶの免疫原性
５種類の個別のコンジュゲートと４種類の異なる多重ミモトープワクチンとの混合物をウサギ免疫原性試験で試験した。５種類の個別コンジュゲートワクチンの混合物は５種類のコグネイトペプチドに対して１：６．５×１０５から１：２．６×１０６の範囲のＥＬＩＳＡ応答を誘発した（表５）。
【０１３７】
【表５】
2004509846.tif 000019
＊精製したガンマグロブリンによって試験を行った
【０１３８】
種々の混合物について、ＨＣＶ　Ｈ株ＨＶＲ変異体ペプチドに対するＥＬＩＳＡ力価は、一羽のウサギだけが変異体＃１及び＃３に応答することを示した。残りの血清はＨＣＶ　Ｈ株ＨＶＲ配列のいずれをも認識しなかった。
【０１３９】
３種類の異なるタイプのＳＣＰＶを調製し、試験し、結果を混合ミモトープ免疫動物に比較した。３種類のＳＣＰＶは、３種類のミモトープを含有する第一のワクチン、５種類のミモトープを含有する第二のワクチン、及び、６種類のミモトープを含有する第三のワクチンである。
【０１４０】
ペプチドのＥＬＩＳＡ試験は、ＳＣＰＶもまた抗ミモトープ応答を高力価で誘発できることを示した（表５）。単一ミモトープワクチン試験及び多重ミモトープワクチン試験でミモトープに対するＧＭＴの範囲は、６つのＳＣＰＶ試験のＲ９ミモトープに対する１：２５００という低い値からＲ６単一ミモトープ試験のほぼ１：７．５×１０６という高い値までオーバーラップした。ＳＣＰＶ　Ｎｏ．２及びＮｏ．４の双方でＲ９ペプチドが最も高度に結合したペプチドであった（表２）。
【０１４１】
全部の形態の多重ミモトープワクチンについて、主要ＨＣＶ　Ｈ株ＨＶＲに対する反応性について観察されたＧＭＴはほぼ１：２０，０００であった。混合ワクチンと対照的に、ＳＣＰＶ血清は変異配列に常に反応し、ＢＫ単離物ＨＶＲ配列に高い力価で反応した。全部のＥＬＩＳＡ力価を考察すると、５種類のミモトープペプチドを使用するＳＣＰＶが最も広い反応性パターンを誘発したと考えられる。
【０１４２】
実施例１２：アカゲザルにおけるＯＭＰＣコンジュゲート、キメラ糖タンパク質及びこれらのキメラタンパク質のＤＮＡベクターの免疫原性
アカゲザルを霊長類の免疫原性試験に使用し、ミモトープを基材とするワクチンの３つのデリバリー方法をＨＶＲ反応性抗体を広く誘発するという目標について比較した。ペプチドコンジュゲートを、５つの単一ミモトープ、５種類のミモトープから成る１つのＳＣＰＶ、及び、ＨＣＶ株ＢＫのＨＶＲ配列から成る１つのコンジュゲートとして作製した。Ｎ５コンジュゲーションは低い効率で生じた。
【０１４３】
ペプチドＥＬＩＳＡ、ビオチニル化ペプチドの捕獲によるＥＬＩＳＡ、及び、組換えキメラＥ２のＭａｂ捕獲によるＥＬＩＳＡの結果を表６Ａ−６Ｃに示す。
【０１４４】
【表６】
2004509846.tif 000020
2004509846.tif 000021
【０１４５】
これらの実験で、最も広い反応性を示す２つの血清の組合せはＭ６３コンジュゲートと５種類のミモトープペプチドから成るＳＣＰＶとによって構成されていた。抗Ｍ６３血清は標準ＥＬＩＳＡで１０ペプチド中の５ペプチドを認識し、捕獲ＥＬＩＳＡで１１ビオチニル化ペプチド全部を認識した。ＳＣＰＶ動物から得られた抗−５ミモトープ血清は標準ＥＬＩＳＡで１０ペプチド中の６ペプチドを認識し、捕獲ＥＬＩＳＡで１１ビオチニル化ペプチドのうちの８ペプチドを認識した。これらの２つの組合せで１４７−０７を除く全部のペプチドが認識される。また、ＨＶＣ　Ｈ株変異体＃２に対する反応は低い力価であり、微量反応体（ｒａｒｅ　ｒｅａｃｔｏｒ）として分類する必要がある。従って、Ｍ６３配列を使用する単一ミモトープコンジュゲートとＳＣＰＶとの組合せで２１のＨＶＲ配列のうちの１９配列が認識された。
【０１４６】
各ミモトープをディスプレーするキメラＥ２糖タンパク質を使用すると、免疫血清の組合せの各々はそのコグネイトミモトープをディスプレーするＥ２（表６Ｃ）と追加のキメラＥ２とを強力に認識した。ＳＣＰＶ誘発血清及び単一Ｒ９誘発血清の各々は６個の糖タンパク質全部を認識したが、単一Ｆ７８コンジュゲート血清は６個の糖タンパク質のうちの３個にしか結合しなかった。ミモトープＮ５−キメラは糖タンパク質と最も反応しなかった。
【０１４７】
これらのミモトープを霊長類試験で免疫原として使用するために他の２つのワクチン形態を調製した。先ず、ミモトープ−Ｅ２キメラタンパク質を哺乳動物の細胞から調製し、次に、これらの同じキメラ構築物を発現するＤＮＡベクターを作製した。各ワクチンを３匹のアカゲザルで試験し、合計では１２種類のワクチンを３６匹の動物で試験した。免疫血清をｇｐＥＬＩＳＡ対コグネイトキメラ糖タンパク質試験及びコグネイトミモトープペプチド及び全ＨＶＲペプチドを使用する全ペプチドＥＬＩＳＡで試験した（表７Ａ及び７Ｂ）。
【０１４８】
【表７】
2004509846.tif 000022
2004509846.tif 000023
【０１４９】
全部の免疫血清がそれらのコグネイトＥ２糖タンパク質を認識し、タンパク質ワクチン接種動物の血清は常にＤＮＡベクターワクチン接種動物よりも大きいＧＭＴを有していた。これらの抗糖タンパク質力価はミモトープペプチドに対して得られた力価よりも常に大きい値であった。Ｒ９−キメラタンパク質に関する１つのケースでは抗ミモトープ応答が全く観察されなかった。これは、ＨＣＶ　Ｅ２糖タンパク質の外層ドメインが反応性抗ＨＶＲ抗体を広く誘発するための特に良好なデリバリー構造でないことを示す。
【０１５０】
Ｍ６３免疫原及びＦ７８免疫原の双方の形態は１：４０から１：１４９０の範囲のＧＭＴでＨ株ＨＶＲ配列を最も認識する抗体を誘発したが、抗Ｍ６３キメラタンパク質だけがＢＫ株ＨＶＲペプチドを誘発した。双方の形態のワクチンによって誘発された抗Ｈ１血清はペプチド＃１４７−０８及び１４７−０９を認識する能力を有していた。この結果は抗Ｈ１コンジュゲート血清がこれらの２つの配列と強力に反応したという観察に一致した。
【０１５１】
残りのペプチドに関しては、血清の完全体が有意な程度に反応しなかった。これらの結果は、キメラミモトープ−Ｅ２タンパクのＤＮＡベクター及びこれらのミモトープ−Ｅ２タンパク質自体が弱い抗ＨＶＲ免疫原であることを示唆する。ミモトープコンジュゲートについて得られた結果と考え合わせると、コンジュゲートワクチンとして正式に提示した適切なＨＶＲミモトープの組合せが広い反応性の抗体応答を誘発する能力を有しており他の組合せ方法よりも優れていると考えられる。
【０１５２】
特許請求の範囲内でその他の実施態様が存在する。幾つかの実施態様を提示及び記載したが、本発明の要旨及び範囲を逸脱しない多様な変更が可能である。
【国際公開パンフレット】
2004509846.tif 000033
2004509846.tif 000034
2004509846.tif 000035
2004509846.tif 000036
2004509846.tif 000037
2004509846.tif 000038
2004509846.tif 000039
2004509846.tif 000040
2004509846.tif 000041
2004509846.tif 000042
2004509846.tif 000043
2004509846.tif 000044
2004509846.tif 000045
2004509846.tif 000046
2004509846.tif 000047
2004509846.tif 000048
2004509846.tif 000049
2004509846.tif 000050
2004509846.tif 000051
2004509846.tif 000052
2004509846.tif 000053
2004509846.tif 000054
2004509846.tif 000055
2004509846.tif 000056
2004509846.tif 000057
2004509846.tif 000058
2004509846.tif 000059
2004509846.tif 000060
2004509846.tif 000061
2004509846.tif 000062
2004509846.tif 000063
2004509846.tif 000064
2004509846.tif 000065
2004509846.tif 000066
2004509846.tif 000067
2004509846.tif 000068
2004509846.tif 000069
2004509846.tif 000070
2004509846.tif 000071
2004509846.tif 000072
2004509846.tif 000073
2004509846.tif 000074
2004509846.tif 000075
2004509846.tif 000076
2004509846.tif 000077
2004509846.tif 000078
2004509846.tif 000079
2004509846.tif 000080
2004509846.tif 000081
2004509846.tif 000082
2004509846.tif 000083
2004509846.tif 000084
2004509846.tif 000085
2004509846.tif 000086
2004509846.tif 000087
2004509846.tif 000088
2004509846.tif 000089
2004509846.tif 000090
2004509846.tif 000091
2004509846.tif 000092
2004509846.tif 000093
2004509846.tif 000094
2004509846.tif 000095
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509846.tif 000096
【国際調査報告】
2004509846.tif 000097