(57)【要約】本発明は、哺乳動物の細胞増殖性障害、特に、ｒａｓ媒介性細胞増殖性障害の処置におけるレオウイルスの認識を妨げるための方法に関する。哺乳動物は、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ヒト、およびヒト以外の霊長類から選択され得る。本発明の方法は、哺乳動物の免疫系を抑制するかまたはそうでなければ阻害すること、そして同時にまたはそれに続いて、有効量の１つ以上のレオウイルスを増殖している細胞の実質的な溶解を生じる条件下で増殖している細胞に投与することを包含する。詳細には、この方法によって、増殖性障害を処置するための免疫抑制型哺乳動物または免疫不全型哺乳動物のレオウイルス処置を提供する。免疫抑制、免疫阻害、または他の方法での哺乳動物の免疫不全状態の誘導は、レオウイルスをより有効にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のｒａｓ媒介性増殖性障害を処置するためのキットであって、該キットは、以下：
Ａ）１つ以上のレオウイルス、および
Ｂ）該１つ以上のレオウイルスを使用するための方法を記載した指示書
を含み、ここで該方法は、以下：
工程ａ）以下からなる群より選択される工程を実行する工程：
ｉ）該哺乳動物中の増殖している細胞に有効量の免疫抑制薬を投与する工程；
ｉｉ）該哺乳動物からＢ細胞またはＴ細胞を除去する工程；
ｉｉｉ）該哺乳動物から抗レオウイルス抗体を除去する工程；
ｉｖ）該哺乳動物から抗体を除去する工程；
ｖ）抗−抗レオウイルス抗体を該哺乳動物に投与する工程；および
ｖｉ）該哺乳動物の免疫系を抑制する工程；ならびに
工程ｂ）該哺乳動物中の増殖している細胞に、該増殖している細胞の実質的な溶解を生じる条件下で、有効量の該１つ以上のレオウイルスを投与する工程、
を包含する、キット。
【請求項２】
前記レオウイルスが、哺乳類レオウイルスおよびトリレオウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記レオウイルスが哺乳類レオウイルスである、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記レオウイルスがヒトレオウイルスである、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記レオウイルスが、血清型１のレオウイルス、血清型２のレオウイルス、および血清型３のレオウイルスからなる群より選択される、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記レオウイルスが血清型３のレオウイルスである、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記レオウイルスがトリレオウイルスである、請求項２に記載のキット。
【請求項８】
１つ以上の型のレオウイルスが投与される、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
１つ以上の株のレオウイルスが投与される、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
前記レオウイルスが野生単離物である、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
前記ｒａｓ媒介性増殖性障害が新生物である、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
前記ｒａｓ媒介性増殖性障害が神経線維腫症である、請求項１に記載のキット。
【請求項１３】
前記新生物が固形の新生物である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記新生物が、肺癌、前立腺癌、結直腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、ならびに中枢および末梢神経系癌からなる群より選択される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
前記新生物が、中枢神経系癌である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記新生物が、乳癌である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記新生物が、造血系の新生物である、請求項１１にキット。
【請求項１８】
前記レオウイルスが、固形の新生物内にまたはその近くに注射によって投与される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１９】
前記レオウイルスが哺乳動物に静脈内投与される、請求項１に記載のキット。
【請求項２０】
前記レオウイルスが哺乳動物に腹腔内投与される、請求項１に記載のキット。
【請求項２１】
前記哺乳動物が免疫応答性である、請求項１に記載のキット。
【請求項２２】
前記レオウイルスが免疫防御される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記レオウイルスがミセル中にカプセル化される、請求項１に記載のキット。
【請求項２４】
請求項１に記載のキットであって、ここで前記方法において、工程（ａ）の前に、有効量の該１つ以上のレオウイルスが、増殖している細胞の実質的な溶解を生じる条件下で投与される、キット。
【請求項２５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載のキット。
【請求項２６】
レオウイルスの約１〜１０１５のプラーク形成単位／ｋｇ体重が投与される、請求項１に記載のキット。
【請求項２７】
前記レオウイルスが単回用量で投与される、請求項１に記載のキット。
【請求項２８】
前記レオウイルスが１回より多い用量で投与される、請求項１に記載のキット。
【請求項２９】
前記新生物が転移性である、請求項１１に記載のキット。
【請求項３０】
前記方法が有効量の化学療法剤を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載のキット。
【請求項３１】
前記レオウイルスが、投与の前にプロテアーゼで処理される、請求項１に記載のキット。
【請求項３２】
前記新生物が膵臓癌である、請求項１１に記載のキット。
【請求項３３】
請求項１１に記載のキットであって、ここで前記方法が、新生物の実質的に全ての外科的切除、および全ての残存している新生物細胞の実質的な腫瘍崩壊を生じるために十分な量での外科手術部位へのレオウイルスの投与をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項３４】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物中の増殖している細胞に有効量の免疫抑制剤を投与する工程である、請求項１に記載のキット。
【請求項３５】
前記免疫抑制剤がレオウイルスと同時に投与される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記免疫抑制剤がレオウイルスの前に投与される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
前記免疫抑制剤が、シクロスポリン、ラパマイシン、タクロリムス、ミコフェノール酸、アザチオプリン、上記の薬剤のアナログ、放射線照射、ＨＩＶ感染、および抗−抗レオウイルス抗体からなる群より選択される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
免疫抑制剤、レオウイルス、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有している、薬学的組成物。
【請求項３９】
化学療法剤をさらに含有している、請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
改変型レオウイルスおよび免疫防御型レオウイルスからなる群より選択される少なくとも１つのレオウイルスを含有している、請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
免疫抑制剤およびレオウイルスを含有している薬学的組成物を包含している、キット。
【請求項４２】
化学療法剤をさらに包含している、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物からＢ細胞またはＴ細胞を除去する工程である、請求項１に記載のキット。
【請求項４４】
前記Ｂ細胞またはＴ細胞が、濾過およびヘム透析によって除去される、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記濾過がアフィニティークロマトグラフィーで行われ、アフィニティークロマトグラフィーは固体支持体に固定された抗体を含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記抗体が、抗Ｔ細胞または抗Ｂ細胞抗体である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記Ｂ細胞およびＴ細胞が放射線治療によって除去される、請求項４３に記載のキット。
【請求項４８】
前記Ｂ細胞およびＴ細胞が環式ステロイドの使用によって除去される、請求項４３に記載のキット。
【請求項４９】
前記環式ステロイドがシクロスポリンである、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
キットであって、以下：
ａ）哺乳動物からＢ細胞またはＴ細胞を除去するための手段；および
ｂ）レオウイルスを含有している薬学的組成物
を包含している、キット。
【請求項５１】
化学療法剤をさらに包含している、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物から抗レオウイルス抗体を除去する工程である、請求項１に記載のキット。
【請求項５３】
前記抗レオウイルス抗体が、ヘム透析および固定化レオウイルス上の血液の通過によって除去される、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記レオウイルスが固体支持体に対して固定される、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
キットであって、以下：
ａ）前記哺乳動物から抗レオウイルス抗体を除去するための手段；および
ｂ）レオウイルスを含有している薬学的組成物
を包含している、キット。
【請求項５６】
化学療法剤をさらに包含している、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物から抗体を除去する工程である、請求項１に記載のキット。
【請求項５８】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記抗体が、ヘム透析および固定化プロテインＡ上の血液の通過によって除去される、請求項５７に記載のキット。
【請求項６０】
前記工程ａ）が、抗−抗レオウイルス抗体を前記哺乳動物に投与する工程である、請求項１に記載のキット。
【請求項６１】
前記抗−抗レオウイルス抗体が静脈内投与される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記抗−抗レオウイルス抗体がヒト化抗体である、請求項６０に記載のキット。
【請求項６３】
抗−抗レオウイルス抗体、レオウイルス、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有している、薬学的組成物。
【請求項６４】
化学療法剤をさらに含有している、請求項６３に記載の薬学的組成物。
【請求項６５】
改変型レオウイルスおよび免疫防御型レオウイルスからなる群より選択される少なくとも１つのレオウイルスを含有している、請求項６３に記載の薬学的組成物。
【請求項６６】
抗−抗レオウイルス抗体およびレオウイルスを含有している薬学的組成物を包含している、キット。
【請求項６７】
化学療法剤をさらに包含している、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物の免疫系を抑制する工程である、請求項１に記載のキット。
【請求項６９】
前記免疫系が放射線治療によって抑制される、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
前記免疫系が環式ステロイドによって抑制される、請求項６８に記載のキット。
【請求項７１】
前記環式ステロイドがシクロスポリンである、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
少なくとも１つの前記レオウイルスが、組換えレオウイルスである、請求項１〜４、７〜３７、４３〜４９、５２〜５４、５７〜６２および６８〜７１のいずれかに記載のキット。
【請求項７３】
前記組換えレオウイルスが、２つ以上のレオウイルス株に由来する、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
請求項７３に記載のキットであって、ここで前記２つ以上のレオウイルス株が、Ｄｅａｒｉｎｇ株、Ａｂｎｅｙ株、Ｊｏｎｅｓ株およびＬａｎｇ株からなる群から選択される、キット。
【請求項７５】
請求項７２〜７４のいずれかに記載のキットであって、ここで前記組換えレオウイルスが、哺乳動物細胞を、異なるサブタイプのレオウイルスを用いて同時感染させることにより生じる、キット。
【請求項７６】
前記組換えレオウイルスが、天然に存在するものである、請求項７２〜７５のいずれかに記載のキット。
【請求項７７】
前記組換えレオウイルスが、天然に存在しないものである、請求項７２〜７５のいずれかに記載のキット。
【請求項７８】
請求項７２〜７７のいずれかに記載のキットであって、ここで前記組換えレオウイルスが、天然に存在する変異コートタンパク質コード配列を含む、キット。
【請求項７９】
請求項７２〜７７のいずれかに記載のキットであって、ここで前記組換えレオウイルスが、変異コートタンパク質コード配列を含む、キット。
【請求項８０】
請求項７２、７３および７５〜７７のいずれかに記載のキットであって、ここで前記組換えレオウイルスが、血清型１のレオウイルス、血清型２のレオウイルスおよび血清型３のレオウイルスからなる群から選択されるレオウイルスの再組み合わせより生じる、キット。
【請求項８１】
１より多い組換えレオウイルス株が投与される、請求項７２〜８０のいずれかに記載のキット。
【請求項８２】
請求項１〜３７、４３〜４９、５２〜５４、５７〜６２および６８〜７１のいずれかに記載のキットであって、ここで前記レオウイルスが、以下：血管内投与、くも膜下内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、局所投与、経口投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与および腫瘍内投与からなる群から選択される投与経路により投与される、キット。
【請求項８３】
請求項７２〜８１のいずれかに記載のキットであって、ここで前記組換えレオウイルスが、以下：血管内投与、くも膜下内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、局所投与、経口投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与および腫瘍内投与からなる群から選択される投与経路により投与される、キット。
【請求項８４】
前記レオウイルスが組換えレオウイルスである、請求項３８〜４０または６３〜６５のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項８５】
前記レオウイルスが、１つ以上の組換えレオウイルスである、請求項４１、４２、５０、５１、５５、５６、６６または６７のいずれかに記載のキット。
【請求項８６】
哺乳動物のｒａｓ媒介性増殖性障害を処置するための薬学的組成物の製造のための１つ以上のレオウイルスの使用であって、該薬学的組成物は、有効量の１つ以上のレオウイルスを含み、ここで該薬学的組成物は、以下の工程：
工程ａ）以下からなる群より選択される工程を実行する工程：
ｉ）該哺乳動物中の増殖している細胞に有効量の免疫抑制薬を投与する工程；
ｉｉ）該哺乳動物からＢ細胞またはＴ細胞を除去する工程；
ｉｉｉ）該哺乳動物から抗レオウイルス抗体を除去する工程；
ｉｖ）該哺乳動物から抗体を除去する工程；
ｖ）抗−抗レオウイルス抗体を該哺乳動物に投与する工程；および
ｖｉ）該哺乳動物の免疫系を抑制する工程；ならびに
工程ｂ）該哺乳動物中の増殖している細胞に、該増殖している細胞の実質的な溶解を生じる条件下で、該薬学的組成物を投与する工程、
を包含する方法を通じて使用される、使用。
【請求項８７】
請求項８６に記載の使用であって、ここで、該薬学的組成物は、免疫抑制剤および抗−抗レオウイルス抗体からなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、使用。
【請求項８８】
前記レオウイルスが、哺乳類レオウイルスおよびトリレオウイルスからなる群より選択される、請求項８６または８７に記載の使用。
【請求項８９】
前記レオウイルスが哺乳類レオウイルスである、請求項８８に記載の使用。
【請求項９０】
前記レオウイルスがヒトレオウイルスである、請求項８９に記載の使用。
【請求項９１】
前記レオウイルスが、血清型１のレオウイルス、血清型２のレオウイルス、および血清型３のレオウイルスからなる群より選択される、請求項９０に記載の使用。
【請求項９２】
前記レオウイルスが血清型３のレオウイルスである、請求項９１に記載の使用。
【請求項９３】
前記レオウイルスがトリレオウイルスである、請求項８８に記載の使用。
【請求項９４】
１つ以上の型のレオウイルスが投与される、請求項８６〜９３のいずれかに記載の使用。
【請求項９５】
１つ以上の株のレオウイルスが投与される、請求項８６〜９３のいずれかに記載の使用。
【請求項９６】
少なくとも１つのレオウイルスが野生単離物である、請求項８６〜９５に記載の使用。
【請求項９７】
前記ｒａｓ媒介性増殖性障害が新生物である、請求項８６〜９６に記載の使用。
【請求項９８】
前記ｒａｓ媒介性増殖性障害が神経線維腫症である、請求項８６〜９６に記載の使用。
【請求項９９】
前記新生物が固形の新生物である、請求項９７に記載の使用。
【請求項１００】
前記新生物が、肺癌、前立腺癌、結直腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、ならびに中枢および末梢神経系癌からなる群より選択される、請求項９７に記載の使用。
【請求項１０１】
前記新生物が、中枢神経系癌である、請求項９７または１００に記載の使用。
【請求項１０２】
前記新生物が、乳癌である、請求項９７または１００に記載の使用。
【請求項１０３】
前記新生物が、造血系の新生物である、請求項９７に記載の使用。
【請求項１０４】
前記レオウイルスが、固形の新生物内にまたはその近くに注射によって投与される、請求項９９に記載の使用。
【請求項１０５】
前記レオウイルスが前記哺乳動物に静脈内投与される、請求項８６〜１０４のいずれかに記載の使用。
【請求項１０６】
前記レオウイルスが前記哺乳動物に腹腔内投与される、請求項８６〜１０４のいずれかに記載の使用。
【請求項１０７】
前記哺乳動物が免疫応答性である、請求項８６〜１０６のいずれかに記載の使用。
【請求項１０８】
前記レオウイルスが免疫防御される、請求項８６〜１０７のいずれかに記載の使用。
【請求項１０９】
前記レオウイルスがミセル中にカプセル化される、請求項８６〜１０８のいずれかに記載の使用。
【請求項１１０】
前記方法において、工程（ａ）の前に、該薬学的組成物が、増殖している細胞の実質的な溶解を生じる条件下で投与される、請求項８６〜１０９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項８６〜１１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１１２】
レオウイルスの約１〜１０１５のプラーク形成単位／ｋｇ体重が投与される、請求項８６〜１１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１１３】
前記レオウイルスが単回用量で投与される、請求項８６〜１１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１１４】
前記レオウイルスが１回より多い用量で投与される、請求項８６〜１１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１１５】
前記新生物が転移性である、請求項９７または９９〜１０３のいずれかに記載の使用。
【請求項１１６】
前記方法が、有効量の化学療法剤の投与をさらに包含する、請求項８６〜１１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１１７】
前記レオウイルスが、投与の前にプロテアーゼで処理される、請求項８６〜１１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１１８】
前記新生物が膵臓癌である、請求項９７、１００または１０５〜１１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１１９】
請求項９７、９９〜１０３または１０５〜１１８のいずれかに記載の使用であって、前記方法が、前記新生物の実質的に全ての外科的切除、および全ての残存している新生物細胞の実質的な腫瘍崩壊を生じるために十分な量での外科手術部位へのレオウイルスの投与をさらに含む、使用。
【請求項１２０】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物中の増殖している細胞に有効量の免疫抑制剤を投与する工程である、請求項８６〜１１９のいずれかに記載の使用。
【請求項１２１】
前記免疫抑制剤が前記レオウイルスと同時に投与される、請求項１２０に記載の使用。
【請求項１２２】
前記免疫抑制剤が前記レオウイルスの前に投与される、請求項１２０に記載の使用。
【請求項１２３】
前記免疫抑制剤が、シクロスポリン、ラパマイシン、タクロリムス、ミコフェノール酸、アザチオプリン、上記の薬剤のアナログ、放射線照射、ＨＩＶ感染、および抗−抗レオウイルス抗体からなる群より選択される、請求項１２０〜１２２のいずれかに記載の使用。
【請求項１２４】
改変型レオウイルスおよび免疫防御型レオウイルスからなる群より選択される少なくとも１つのレオウイルスを含有している、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２５】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物からＢ細胞またはＴ細胞を除去する工程である、請求項８６〜１１９のいずれかに記載の使用。
【請求項１２６】
前記Ｂ細胞またはＴ細胞が、濾過およびヘム透析によって除去される、請求項１２５に記載の使用。
【請求項１２７】
前記濾過がアフィニティークロマトグラフィーで行われ、該アフィニティークロマトグラフィーは固体支持体に固定された抗体を含む、請求項１２６に記載の使用。
【請求項１２８】
前記抗体が、抗Ｔ細胞抗体または抗Ｂ細胞抗体である、請求項１２７に記載の使用。
【請求項１２９】
前記Ｂ細胞およびＴ細胞が放射線治療によって除去される、請求項１２５に記載の使用。
【請求項１３０】
前記Ｂ細胞およびＴ細胞が環式ステロイドの使用によって除去される、請求項１２５に記載の使用。
【請求項１３１】
前記環式ステロイドがシクロスポリンである、請求項１３０に記載の使用。
【請求項１３２】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物から抗レオウイルス抗体を除去する工程である、請求項８６〜１１９のいずれかに記載の使用。
【請求項１３３】
前記抗レオウイルス抗体が、ヘム透析および固定化レオウイルス上の血液の通過によって除去される、請求項１３２に記載の使用。
【請求項１３４】
前記レオウイルスが固体支持体に対して固定される、請求項１３３に記載の使用。
【請求項１３５】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物から抗体を除去する工程である、請求項８６〜１１９のいずれかに記載の使用。
【請求項１３６】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１３５に記載の使用。
【請求項１３７】
前記抗体が、ヘム透析および固定化プロテインＡ上の血液の通過によって除去される、請求項１３５に記載の使用。
【請求項１３８】
前記工程ａ）が、抗−抗レオウイルス抗体を前記哺乳動物に投与する工程である、請求項８６〜１１９のいずれかに記載の使用。
【請求項１３９】
前記抗−抗レオウイルス抗体が静脈内投与される、請求項１３８に記載の使用。
【請求項１４０】
前記抗−抗レオウイルス抗体がヒト化抗体である、請求項１３８または１３９に記載の使用。
【請求項１４１】
改変型レオウイルスおよび免疫防御型レオウイルスからなる群より選択される少なくとも１つのレオウイルスを含有している、請求項６４に記載の薬学的組成物。
【請求項１４２】
前記工程ａ）が、前記哺乳動物の免疫系を抑制する工程である、請求項８６〜１１９のいずれかに記載の使用。
【請求項１４３】
前記免疫系が放射線治療によって抑制される、請求項１４２に記載の使用。
【請求項１４４】
前記免疫系が環式ステロイドによって抑制される、請求項１４２に記載の使用。
【請求項１４５】
前記環式ステロイドがシクロスポリンである、請求項１４４に記載の使用。
【請求項１４６】
少なくとも１つの前記レオウイルスが、組換えレオウイルスである、請求項８６〜１２３、１２５〜１４０および１４２〜１４５のいずれかに記載の使用。
【請求項１４７】
前記組換えレオウイルスが、２つ以上のレオウイルス株に由来する、請求項１４６に記載の使用。
【請求項１４８】
請求項１４７に記載の使用であって、ここで前記２つ以上のレオウイルス株が、Ｄｅａｒｉｎｇ株、Ａｂｎｅｙ株、Ｊｏｎｅｓ株およびＬａｎｇ株からなる群から選択される、使用。
【請求項１４９】
請求項１４６〜１４８のいずれかに記載の使用であって、ここで前記組換えレオウイルスが、哺乳動物細胞を、異なるサブタイプのレオウイルスを用いて同時感染させることにより生じる、使用。
【請求項１５０】
前記組換えレオウイルスが、天然に存在するものである、請求項１４６〜１４９のいずれかに記載の使用。
【請求項１５１】
前記組換えレオウイルスが、天然に存在しないものである、請求項１４６〜１４９のいずれかに記載の使用。
【請求項１５２】
請求項１４６〜１５１のいずれかに記載の使用であって、ここで前記組換えレオウイルスが、天然に存在する変異コートタンパク質コード配列を含む、使用。
【請求項１５３】
請求項１４６〜１５１のいずれかに記載の使用であって、ここで前記組換えレオウイルスが、変異コートタンパク質コード配列を含む、使用。
【請求項１５４】
請求項１４６、１４７および１４９〜１５１のいずれかに記載の使用であって、ここで前記組換えレオウイルスが、血清型１のレオウイルス、血清型２のレオウイルスおよび血清型３のレオウイルスからなる群から選択されるレオウイルスの再組み合わせより生じる、使用。
【請求項１５５】
１より多い組換えレオウイルス株が投与される、請求項１４６〜１５４のいずれかに記載の使用。
【請求項１５６】
請求項８６〜１２３、１２５〜１４０および１４２〜１４４のいずれかに記載の使用であって、ここで前記レオウイルスが、以下：血管内投与、くも膜下内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、局所投与、経口投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与および腫瘍内投与からなる群から選択される投与経路により投与される、使用。
【請求項１５７】
請求項１４６〜１５５のいずれかに記載の使用であって、ここで前記組換えレオウイルスが、以下：血管内投与、くも膜下内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、局所投与、経口投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与および腫瘍内投与からなる群から選択される投与経路により投与される、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物の細胞増殖性障害、特に、ｒａｓ媒介性細胞増殖性障害の処置における、レオウイルス認識を妨げるための方法に関する。詳細には、この方法は、増殖性障害を処置するための、免疫抑制された哺乳動物または免疫不全哺乳動物のレオウイルス処置を提供する。免疫抑制、免疫阻害、または哺乳動物において免疫不全状態の誘導する他の事象は、レオウイルスをより有効なものにする。この方法は、このウイルスの全身的送達を妨害し得る免疫成分を選択的に除去すること；宿主免疫系によるレオウイルス認識を妨げること；およびレオウイルスでの処置後に免疫抑制宿主または免疫不全宿主からこのウイルスを除去すること、を包含し得る。
【０００２】
（参考文献）
以下の刊行物、特許出願、および特許が、本出願で引用される：
【０００３】
【表１】
2004505924.tif 000002
2004505924.tif 000003
2004505924.tif 000004
上記の刊行物、特許出願、および特許の全ては、各々の刊行物、特許出願、または特許が、詳細かつ個々に示され、その全体において参考として援用されているのと同じ程度で、その全体において参考として本明細書中で援用される。
【０００４】
（当該分野の状況）
正常な細胞増殖は、増殖を促進する癌原遺伝子と増殖を抑制する腫瘍抑制遺伝子との間での平衡によって調節される。腫瘍形成は、細胞性シグナルの解釈を支配するそれらの細胞成分の変異を生じる、ゲノムに対する遺伝的変更（例えば、前癌遺伝子の活性の増強または腫瘍抑制の不活化）によって引き起こされ得る。これらのシグナルの解釈は最終的には細胞の増殖および分化に影響を与え、そしてこれらのシグナルの誤った解釈によって腫瘍増殖（新生物）を生じ得ると考えられている。
【０００５】
癌原遺伝子Ｒａｓの遺伝的変更は、全てのヒトの腫瘍の約３０％に寄与していると考えられる（Ｗｉｅｓｓｍｕｌｌｅｒ，Ｌ．およびＷｉｔｔｉｎｇｈｏｆｅｒ，Ｆ．（１９９４）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　６（３）：２４７−２６７；Ｂａｒｂａｃｉｄ，Ｍ．（１９８７）Ａ　Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６，７７９−８２７）。Ｒａｓがヒトの腫瘍の発病において果たす役割は、腫瘍の型に特異的である。Ｒａｓ自体における活性化変異は、ヒトの悪性腫瘍のほとんどの型で見られ、そして膵臓癌（８０％）、散発性結直腸癌（４０〜５０％）、ヒト肺腺癌（１５〜２４％）、甲状腺腫瘍（５０％）、および骨髄性白血病（３０％）において多く存在する（Ｍｉｌｌｉｓ，ＮＥら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５５：１４４４；Ｃｈａｕｂｅｒｔ，Ｐ．ら（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４４：７６７；Ｂｏｓ，Ｊ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４９：４６８２）。Ｒａｓ活性化はまた、上流の有糸分裂促進シグナル成分によって、特にチロシンレセプターキナーゼ（ＲＴＫ）によって実証される。これらの上流の成分は、増幅されるかまたは過剰発現される場合、Ｒａｓのシグナル伝達活性によって、最終的にＲａｓ活性の上昇を生じる。この例としては、神経膠芽細胞腫の特定の形態ならびに乳癌のｃ−ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕにおける、ＰＤＧＦＲの過剰発現が挙げられる（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：１；Ｊａｍｅｓ，Ｐ．Ｗ．ら（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　９：３６０１；Ｂｏｓ，Ｊ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４９：４６８２）。
【０００６】
新生物についての現在の処置方法としては、手術、化学療法、および放射線治療が挙げられる。手術は、代表的に、初期段階の癌についての主要な処置として使用される；しかし、多くの腫瘍は外科的手段によっては完全には除去され得ない。さらに、新生物の転移性増殖は、手術による癌の完全な治癒を妨げ得る。化学療法は、抗腫瘍活性を有している化合物（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、および抗腫瘍性抗生物質）の投与を含む。化学療法の有効性は、しばしば、重度の副作用（吐き気および嘔吐を含む）、骨髄抑制、腎臓障害、および中枢神経系の抑制によって制限される。放射線治療は、正常細胞の、新生物細胞とは対照的な、放射線での処置後にそれら自体を修復するより高い能力に依存する。しかし、腫瘍の周辺組織の感受性に起因して、放射線治療は、多くの新生物を治療するために使用することができない。さらに、特定の腫瘍は、放射線治療に抵抗性であることが実証されており、そしてこれらは、その細胞の癌遺伝子または抗癌遺伝子の状態に依存し得る（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９３）ＰＮＡＳ　９０：５７４２−５７４６；Ｌｏｗｅ．Ｓ．Ｗ．ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：８０７−８１０；Ｒａｙｂａｕｄ−Ｄｉｏｇｅｎｅ．Ｈ．ら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５（３）：１０３０−１０３８）。新生物増殖を処置するための現在の方法に関連するこれらの欠点を考慮すると、癌のほとんどの型の処置のための改善された方法の必要性が、なお存在する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、増殖性障害の処置における既存のレオウイルス治療の有効性の増強に関する。
【０００８】
本発明は、哺乳動物の細胞増殖性障害、特にｒａｓ媒介性細胞増殖性障害の処置における、レオウイルス認識を妨げるための方法に関する。哺乳動物は、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ヒト、および非ヒト霊長類から選択され得る。この方法は、哺乳動物の免疫系を抑制するかまたはさもなければ阻害する工程、および、同時にかまたはそれに続いて、増殖中の細胞の実質的な溶解を生じる条件下で、有効量の１以上のレオウイルスをその増殖中の細胞に投与する工程を包含する。詳細には、この方法は、増殖性障害を処置するための、免疫抑制された哺乳動物または免疫不全哺乳動物のレオウイルス処置を提供する。免疫抑制、免疫阻害、または哺乳動物の免疫不全状態を誘導する他の事象は、レオウイルスをより有効なものする。この方法は、ウイルスの全身的送達を妨害し得る免疫成分を選択的に除去すること；宿主免疫系によるレオウイルス認識を妨げること；およびレオウイルスでの処置後に免疫抑制宿主または免疫不全宿主からウイルスを除去すること、を包含し得る。あるいは、レオウイルスは、増殖している細胞の実質的な溶解を生じる条件下で、免疫応答系が減退された哺乳動物に投与され得る。免疫系は、以下の１つ以上によって損なわれ得る：ＨＩＶ感染；化学療法または放射線治療の副作用として；Ｂ細胞集団および／またはＴ細胞集団の選択的除去によって；抗体（抗−抗レオウイルス抗体または全ての抗体）の除去によって、など。
【０００９】
免疫抑制または免疫阻害は、免疫抑制薬、免疫抑制剤によってか、または哺乳動物の免疫系を阻害するかもしくは哺乳動物を免疫不全にする任意の他の手段によって達成され得る。免疫抑制剤が使用される場合、免疫抑制剤は、レオウイルスの投与の前に投与され得るか、またはレオウイルスの投与と同時に投与され得る。哺乳動物は、レオウイルスの投与の前に、またはレオウイルスの投与と同時に、免疫抑制されるか、免疫不全にされるか、免疫阻害される。
【００１０】
レオウイルスは、哺乳類レオウイルスまたは鳥類レオウイルスであり得る。レオウイルスは、外側のカプシドが除去されるように改変され得、ビリオンが、リポソームまたはミセル中にパッケージングされるか、または外側カプシドのタンパク質が変異されている。レオウイルスおよび／または免疫抑制薬は、単回用量または複数回の用量で投与され得る。増殖性障害は新生物であり得る。固形新生物および造血性新生物の両方が標的とされ得る。免疫抑制は、より有効なレオウイルス処置を生じる。
【００１１】
従って、１つの局面において、本発明は、哺乳動物におけるｒａｓ媒介性増殖性障害を処置する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）以下：
ｉ）上記哺乳動物中の増殖中の細胞に有効量の免疫抑制剤を投与する工程；
ｉｉ）上記哺乳動物からＢ細胞またはＴ細胞を除去する工程；
ｉｉｉ）上記哺乳動物から抗レオウイルス抗体を除去する工程；
ｉｖ）上記哺乳動物から抗体を除去する工程；
ｖ）抗−抗レオウイルス抗体を上記哺乳動物に投与する工程；および
ｖｉ）上記哺乳動物の免疫系を抑制する工程；
からなる群より選択される工程を実行する工程、ならびに
ｂ）増殖中の細胞の実質的な溶解を生じる条件下で、上記哺乳動物中の増殖中の細胞に有効量の１つ以上のレオウイルスを投与する工程。
【００１２】
ヒトにおけるｒａｓ媒介性新生物を処置する方法もまた提供され、この方法は、哺乳動物の免疫系を抑制するかまたはさもなければ損なわせる工程、および、同時にかまたはそれに続いて、その新生物細胞の実質的な腫瘍崩壊を生じるに十分な量のレオウイルスを新生物に投与する工程、を包含する。レオウイルスは、固形新生物中またはその付近に注射によって投与され得る。
【００１３】
哺乳動物における新生物の転移を阻害する方法もまた提供され、この方法は、哺乳動物の免疫系を抑制するかまたはさもなければ損なわせる工程、および、同時にかまたはそれに続いて、その新生物細胞の実質的な溶解を生じるに十分な量でレオウイルスを哺乳動物に投与する工程、を包含する。
【００１４】
哺乳動物における疑わしいｒａｓ媒介性新生物を処置する方法もまた提供され、この方法は、その新生物の実質的に全てを外科的に除去する工程、その哺乳動物の免疫系を抑制または他の阻害をする工程、およびその手術部位またはその付近へ有効量のレオウイルスを投与する工程であって、それによって全ての残存している新生物細胞の腫瘍崩壊を生じる、工程、を包含する。
【００１５】
免疫抑制剤または免疫阻害剤（例えば、抗−抗レオウイルス抗体）、レオウイルス、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物もまた、提供される。
【００１６】
レオウイルスおよび別の成分（例えば、免疫抑制剤、哺乳動物からＢ細胞またはＴ細胞を除去するための手段、哺乳動物から抗レオウイルス抗体を除去するための手段、哺乳動物から抗体を除去するための手段、抗−抗レオウイルス抗体、および哺乳動物の免疫系を抑制するための手段）備えるキットもまた、提供される。
【００１７】
免疫抑制剤または免疫阻害剤、改変型レオウイルス、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物もまた、提供される。
【００１８】
本発明の方法および薬学的組成物は、他の形態の癌治療に関連する副作用を伴うことなく、新生物を処置するための有効な手段を提供する。免疫系の阻害または抑制は、抗レオウイルス抗体が形成されないので、ｒａｓ媒介性の増殖中の細胞に感染しそしてそれらを溶解させるレオウイルスの有効性を増大させる。レオウイルスは疾患と関係することが知られていないで、ウイルスの意図的な投与に関連するいかなる安全性の問題も、最小化される。
【００１９】
本発明の上記および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に示されているような、以下の本発明の好ましい実施態様のより詳細な説明から明らかである。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ヒトレオウイルスが、培養細胞の感染のために、活性化Ｒａｓシグナル伝達経路を必要とすることを実証した（Ｓｔｒｏｎｇ，ＪＥら、１９９８　ＥＭＢＯ　Ｊ　１７：３３５１）。さらに、本発明者らは、レオウイルスが多数の動物モデルにおいて腫瘍崩壊剤（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ　ａｇｅｎｔ）として使用され得ることを実証した（Ｌｅｅ，Ｐ．Ｗ．Ｋ．ら（１９９９））。ｖ−ｅｒｂＢ形質転換マウスＮＩＨ　３Ｔ３細胞またはヒトＵ８７神経膠芽細胞腫細胞から確立された腫瘍を保有している重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスは、このウイルスで処置された（Ｃｏｆｆｅｙ，ＭＣら、１９９８　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１３３２）。ウイルスの１回の腫瘍内注射は、腫瘍の退行を生じた。本発明者らはさらに、両側にＵ８７腫瘍異種移植片を与えた動物において、同側腫瘍内へのレオウイルスの一側注射が対側腫瘍の退行を生じることを実証した。この離れた腫瘍部位でのこの退行は、ウイルスの全身的拡散の結果である。機能的な免疫系がこの型の治療に対して果たし得る効果を試験するために、免疫応答性マウスモデルが確立された。ｒａｓ形質転換Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞から確立された腫瘍を保有する免疫応答性Ｃ３Ｈマウスの処置もまた、腫瘍の退行を生じたが、一連の注射を要した（Ｃｏｆｆｅｙ，ＭＣら、１９９８）。このように、免疫抑制剤とのこのウイルスの同時投与、または免疫応答が減退された動物に対するウイルスの投与は、レオウイルス処置の濃度および／または頻度を減少させる。さらに、動物の免疫抑制は、注射されたかあるいは全身的に送達された場合に、腫瘍から離れて同時に存在しているｒａｓ媒介性病変における応答速度を改善し得る。免疫抑制はまた、生体利用可能なウイルスを増加することによって、全身的送達を補助し得る。
【００２１】
本発明は、哺乳動物におけるｒａｓ媒介性増殖性障害を処置する方法に関し、これは、哺乳動物を免疫抑制するか、免疫阻害するか、またはさもなければ免疫不全にし、そして同時にまたはそれに続いて、増殖中の細胞にレオウイルスを投与することによる。
【００２２】
学名レオウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ａｎｄ　ｅｎｔｅｒｉｃ　ｏｒｐｈａｎ　ｖｉｒｕｓ）は、記述上の頭字語であり、これらのウイルスが（ヒトの任意の公知の疾患状態とは無関係であるが）呼吸管および腸管の両方から単離され得ることを示唆している（Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．（１９５９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１３０：９６６）。この用語「レオウイルス」は、レオウイルス属に分類される全てのウイルスを指す。
【００２３】
レオウイルスは、二本鎖の断片化されたＲＮＡゲノムを有するウイルスである。ビリオンは直径６０〜８０ｎｍの寸法であり、そして２つの同心性のカプシド殻を保有している。殻のそれぞれは正二十面体である。ゲノムは、１０〜１２個の不連続なセグメントである二本鎖のＲＮＡから構成され、１６〜２７ｋｂｐの全ゲノムサイズを有する。個々のＲＮＡセグメントは大きさが異なる。３個の異なる（しかし関連するレオウイルスの型）が、多くの種から回収されている。全ての３個の型は、共通の相補−固定抗原を共有する。
【００２４】
ヒトレオウイルスは３個の血清型から構成される：１型（Ｌａｎｇ株またはＴ１Ｌ）、２型（Ｊｏｎｅｓ株、Ｔ２Ｊ）、および３型（Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株、Ｔ３Ｄ）。この３個の血清型は、中和反応およびヘマグルチニン阻害アッセイに基づいて容易に同定することができる（Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．（１９５９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１３０：９６６；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら（１９９６）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ；Ｒｏｓｅｎ，Ｌ．（１９６０）Ａｍ，Ｊ．Ｈｙｇ．７１：２４２；Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｎ．Ｆ．（１９６７）Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．２３：１５０）。
【００２５】
レオウイルスは、任意の特定の疾患に関係することは知られていないが、多くのヒトが、彼らが成人期に達するまでの時間にレオウイルスに曝されている（すなわち、５歳未満の子供の２５％未満から、２０〜３０歳のヒトの５０％以上）（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｇ．Ｇ．およびＭｕｌｄｏｏｎ　Ｒ．Ｌ．（１９７３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２８：８１１；Ｓｔａｎｌｅｙ　Ｎ．Ｆ．（１９７４）、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｖｉｒａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｂ．ＫｕｒｓｔａｋおよびＫ．Ｋｕｒｓｔａｋ編、３８５−４２１、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。
【００２６】
哺乳動物レオウイルスについては、細胞表面認識シグナルはシアル酸である（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｇ．Ｄ．ら（１９８４）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３８：３７；Ｇｅｎｔｓｃｈ，Ｊ．Ｒ．Ｋ．およびＰａｃｉｔｔｉ，Ａ．Ｆ．（１９８５）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：３５６；Ｐａｕｌ　Ｒ．Ｗ．ら（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７２：３８２−３８５）。シアル酸の遍在性質に起因して、レオウイルスは多数の細胞株に効率良く結合し、このようにして多くの異なる組織を標的化し得る可能性がある；しかし、レオウイルス感染に対する感受性においては細胞株間で有意な差異が存在する。
【００２７】
本明細書中に記載されるように、本出願人らは、レオウイルス感染に対して耐性である細胞が、Ｒａｓ経路の遺伝子によって形質転換された場合にはレオウイルス感染に対して感受性になることを発見した。レオウイルス感染に対する細胞の「耐性」は、細胞のウイルス感染が有意なウイルスの産生または産出を生じないことを示す。「感受性」の細胞は、細胞変性作用、ウイルスタンパク質の合成、および／またはウイルス産生の誘導を示す細胞である。レオウイルス感染に対する耐性は、初期の転写よりもむしろ遺伝子翻訳のレベルで見出された、すなわち、ウイルス転写は生じるが、ウイルスタンパク質は発現されなかった。理論には束縛されないが、耐性細胞中でのウイルス遺伝子の転写は、二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）であると決定された約６５ｋＤａの細胞タンパク質のリン酸化に関係していると考えられる。ＰＫＲは、形質転換された細胞中では観察されなかった。ＰＫＲのリン酸化は、翻訳の阻害を導いた。リン酸化がＰＫＲの既知のインヒビターである２−アミノプリンによって抑制された場合には、レオウイルスタンパク質の合成の顕著な増大が、形質転換されていない細胞中で生じた。さらに、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスモデル（ここでは、腫瘍は、右および左の両方の背側に作成された）は、右側の腫瘍内に直接注射された場合にレオウイルスが腫瘍の大きさを有意に減少させたことを明らかにした；さらに、腫瘍の大きさの有意な減少がまた、レオウイルスを直接は注射されなかった左側の腫瘍についても記録された。このことは、レオウイルスの腫瘍崩壊能力が、全身的ならびに局所的であることを示している。
【００２８】
レオウイルスは、免疫応答性マウスの新生物を処置するために効率良く使用され得るが、本発明者らは、より多数（約１０倍）のレオウイルスおよび複数回の処置が、最良の効果には必要であり得ることを見出した。さらに、腫瘍内注射が、免疫応答性動物における最大の効果には必要であり得る。
【００２９】
これらの結果は、レオウイルスが、ＰＫＲを下方調節しそれによって再生するために、宿主細胞のＲａｓ経路機構を使用することを示した。形質転換されていない（レオウイルス耐性）細胞、およびＥＧＦＲで形質転換された、Ｓｏｓで形質転換された、またはｒａｓで形質転換された（レオウイルス反応性）細胞の両方について、ウイルス結合、内在化、非被覆（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）、およびウイルス遺伝子の初期転写は全て正常に行われた。形質転換されていない細胞の場合には、初期のウイルス転写物の二次構造によってＰＫＲのリン酸化を必然的に誘発し、それによってＰＫＲを活性化し、翻訳開始因子ｅＩＦ−２αのリン酸化を導き、従ってウイルス遺伝子の翻訳の阻害を導く。ＥＧＦＲで形質転換された細胞、Ｓｏｓで形質転換された細胞、またはｒａｓで形質転換された細胞の場合には、ＰＫＲリン酸化工程はＲａｓまたはその下流の成分の１つによって妨げられるかまたは逆流させられ、それによってウイルス遺伝子の翻訳を確実にする。Ｒａｓ（または下流の成分）の作用は、ＰＫＲリン酸化を遮断することによって形質転換されていない細胞中でのウイルス遺伝子の翻訳（従ってレオウイルス感染）を促進する、２−アミノプリン（２−ＡＰ）の使用によって模倣され得る。
【００３０】
ＳＣＩＤマウス中へのヒト腫瘍細胞の移植は、ヒトにおける種々の抗腫瘍薬の有効性を試験するための周知のモデル系として認識されている。ＳＣＩＤマウス中に移植されたヒト腫瘍に対する医薬品の有効性は、ヒトでの同じ腫瘍に対するそれらの有効性の指標であることは、すでに示されている。
【００３１】
これらの発見に基づいて、本出願人らは、哺乳動物中のｒａｓ媒介性増殖性障害を処置するための方法を開発した。代表的な哺乳動物として、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ヒト以外の霊長類、およびヒトが挙げられる。好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
【００３２】
本発明の方法においては、レオウイルスは個々の哺乳動物中のＲａｓ媒介性の増殖している細胞に対して投与される。本発明の１つの実施形態においては、一連のレオウイルス治療が１回または複数回投与される。レオウイルス治療の最初の投与後に、レオウイルスの続く投与を妨害し得る特定の免疫成分が患者から取り出される。これらの免疫成分として、Ｂ細胞、Ｔ細胞、抗体などが挙げられる。
【００３３】
Ｂ細胞またはＴ細胞集団のいずれかの除去は、いくつかの方法によって達成され得る。１つの方法においては、血液が濾過され得、そしてヘム透析が行われ得る。別の方法は、細胞集団を除去し得る体外化合物と、例えば、除去される細胞集団上の特異的なレセプターを認識する固定化抗体と結合させた血液の濾過である。細胞集団の除去のためのなお別の方法は、免疫抑制による。これは、最重要（ｆｉｒｓｔ　ｌｉｎｅ）放射線治療によって、またはシクロスポリンのような環式ステロイドによって行われ得る。
【００３４】
抗レオウイルス抗体の選択的除去もまた、患者の免疫系が治療的に投与されたレオウイルスを除去することを妨げ得る。抗体とウイルスとの相互作用を妨げることによってもまた、全身的処置ストラテジーを補助するし得る。抗体は、以下を含むいくつかの方法によって除去され得る：ヘム透析および血液を固定化レオウイルス上を通過させること（選択的抗体除去）；ヘム透析による全ＩｇＧ抗体の除去および血液を固定化プロテインＡ（ＰＲＯＳＯＲＢＡ，Ｃｙｐｒｅｓｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡとして商業的に入手することができる）上を通過させることによる；または、ヒト化抗イディオタイプ抗体（ここではレオウイルスに対するイディオタイプ）の投与による。
【００３５】
本発明の別の方法は、レオウイルスの免疫認識を遮蔽するかまたは損傷させることによって、正常な免疫機能を損傷させることなく、レオウイルスが全身的に作用することを可能にすることである。患者の免疫系がレオウイルスを認識することを妨げるために、本発明の別の実施形態は、レオウイルスおよびレオウイルス再配列株の連続的投与である。あるいは、レオウイルスは非ウイルス毒性のヒト化抗体で被覆（例えば、抗体のＦａｂ部分での被覆、ミセル中への被覆）され得る。
【００３６】
さらに、ウイルスは、感染性亜ウイルス（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子（ＩＳＶＰ）を生じるようにキモトリプシンで処理され得る。ＩＳＶＰは単独で使用され得るか、またはウイルス全体と併用され得、患者の免疫系によってそれほど認識されず、妨げられない試薬を提供し得る。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、投与後の患者からのレオウイルスの除去を含む。この方法は免疫抑制型または免疫不応答性のいずれかである患者について使用され得るので、一連の処置後に血流からウイルスを除去することが重要であり得る。レオウイルスは、ヘム透析に付随する体外抗レオウイルス抗体、Ｂ細胞増殖試薬、もしくはＵＶ不活化ウイルスのようなウイルスに対する免疫応答を刺激するアジュバント、またはフロイトのアジュバントを使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって除去され得る。
【００３８】
本発明の方法においては、レオウイルスは、個々の哺乳動物中のｒａｓ媒介性の増殖している細胞に対して投与される。使用され得るヒトレオウイルスの代表的な型として、１型（例えば、Ｌａｎｇ株またはＴ１Ｌ）；２型（例えば、Ｊｏｎｅｓ株またはＴ２Ｊ）；および３型（例えば、Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株、Ｔ３ＤまたはＴ３Ａ）が挙げられる；レオウイルスの他の株もまた使用され得る。好ましい実施形態においては、レオウイルスは、ヒトレオウイルス血清３型であり、より好ましくは、レオウイルスは、ヒトレオウイルス血清３型、Ｄｅａｒｉｎｇ株である。あるいは、レオウイルスは、ヒト以外の哺乳動物レオウイルス（例えば、ヒト以外の霊長類レオウイルス（例えば、ヒヒレオウイルス）；ウマレオウイルス；またはイヌレオウイルス）、あるいは非哺乳動物レオウイルス（例えば、トリレオウイルス）であり得る。レオウイルスの異なる血清型および／または異なる株の組合せ（例えば、異なる種の動物に由来する複数のレオウイルス）が使用され得る。
【００３９】
レオウイルスは、天然型（ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であり得るかまたは改変型であり得る。レオウイルスは、それが天然の供給源から単離され得そして研究室でヒトによって意図的に改変されていない場合に「天然型」である。例えば、レオウイルスは、それがヒト患者に由来する場合には、「野生供給原（ｆｉｅｌｄ　ｓｏｕｒｃｅ）」に由来し得る。
【００４０】
レオウイルスは改変され得るが、なお活性なｒａｓ経路を有している哺乳動物細胞を溶解性感染し得る。レオウイルスは、増殖している細胞への投与の前に、化学的または生化学的に（例えば、キモトリプシンまたはトリプシンのようなプロテアーゼでの処理によって）予め処理され得る。プロテアーゼでの予備処理によって、ウイルスの外殻またはキャプシドを除去し、そしてウイルスの感染性を増大させ得る。レオウイルスは、レオウイルスに対する免疫性を発現した哺乳動物による免疫応答を減少させるかまたは妨げるために、リポソームまたはミセル中に被覆され得る（ＣｈａｎｄｒｏｎおよびＮｉｂｅｒｔ、「Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ｒｅｏｖｉｒｕｓ　ｃａｐｓｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｕ１　ａｎｄ　ｍｕ１Ｃ　ｉｓ　ｂｌｏｃｋｅｄ　ｂｙ　ａｌｋｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，ｙｉｅｌｄｉｎｇ　ａ　ｎｅｗ　ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｓｕｂｖｉｒｉｏｎ　ｐａｒｔｉｃｌｅ」Ｊ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７２（１）：４６７−７５（１９９８））。例えば、ビリオンは、新規の感染性の亜ビリオン粒子を作成するために、ミセル形成濃度のアルキル硫酸界面活性剤の存在下にてキモトリプシンで処理され得る。
【００４１】
レオウイルスは、異なる病原性表現形を有する２つ以上の型のレオウイルスに由来する組換えレオウイルスであり得る。その結果、これは異なる抗原決定基を含み、それによってレオウイルスの亜型に対して予め暴露された哺乳動物による免疫応答を減少させるかまたは妨げる。このような組換えビリオン（再配列株としてもまた公知である）は、得られた再配列株とともに異なる亜型のレオウイルスを用いる哺乳動物細胞の同時感染、および得られたビリオンキャプシド中への異なる亜型の被覆タンパク質の取り込みによって作成され得る。
【００４２】
レオウイルスは、ビリオンの外側のキャプシド中への変異型被覆タンパク質（例えば、σ１）の取り込みによって改変され得る。タンパク質は、置換、挿入、または欠失によって変異させられ得る。置換は、天然のアミノ酸の代わりの異なるアミノ酸の挿入を含む。挿入は、１つ以上の位置でのタンパク質中へのさらなるアミノ酸残基の挿入を含む。欠失は、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。このような変異は、当該分野で公知の方法によって作成され得る。例えば、被覆タンパク質の１つをコードする遺伝子のオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発によって、所望される変異体被覆タンパク質の作成を生じ得る。レオウイルスに感染した哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ１細胞）中の変異型タンパク質のインビトロでの発現は、レオウイルスビリオン粒子中への変異型タンパク質の取り込みを生じる（ＴｕｒｎｅｒおよびＤｕｎｃａｎ、「Ｓｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｏｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｉｇｍａ１：ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８６（１）：２１９−２７（１９９２）；Ｄｕｎｃａｎら、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｇｌｏｂｕｌａｒ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｏｖｉｒｕｓ　ｃｅｌｌ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８２（２）：８１０−９（１９９１）；Ｍａｈら、「Ｔｈｅ　Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｑｕａｒｔｅｒ　ｏｆ　ｒｅｏｖｉｒｕｓ　ｃｅｌｌ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｉｇｍａ　１　ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｖｉｒｉｏｎ−ａｎｃｈｏｒｉｎｇ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７９（１）：９５−１０３（１９９０））。
【００４３】
レオウイルスは好ましくは、レオウイルスの免疫反応を減少させるかまたは排除するように改変されたレオウイルスである。このような改変型レオウイルスは、「免疫防御型レオウイルス」と呼ばれる。このような改変は、哺乳動物の免疫系からレオウイルスを遮蔽するための、リポソーム、ミセル、または他のビヒクル中へのレオウイルスのパッケージングを含み得る。あるいは、レオウイルスのビリオン粒子の外側のキャプシドは、外側のキャプシド中に存在するタンパク質が宿主の体液性および細胞性応答の主要な決定基であるので、除去され得る。
【００４４】
「増殖性障害」は、正常な組織の増殖よりも迅速に細胞増殖する任意の細胞性障害である。従って、「増殖性細胞」は、正常な細胞よりも迅速に増殖している細胞である。増殖性障害として、新生物が挙げられるがこれに限定されない。新生物は異常な組織増殖であり、一般的にははっきりとした塊を形成し、これは正常な組織増殖よりも迅速な細胞増殖によって生長する。新生物は、正常組織が有する構造体系よび機能配位の、部分的または全体的な欠損を示す。これらは、３つの主要な型に大きく分類され得る。上皮構造から生じる悪性新生物は癌腫、筋肉、軟骨、脂肪または骨のような結合組織から生じる悪性新生物は肉腫と呼ばれ、そして免疫系の成分を含む造血性構造（血液細胞の形成に関係している構造）に影響を与える悪性腫瘍は、白血病およびリンパ腫と呼ばれる。腫瘍は、癌の腫瘍性増殖である。本明細書中で使用される場合には、「新生物」（「腫瘍」とも呼ばれる）は、造血性新生物ならびに固形新生物を含むように意図される。他の増殖性障害として、神経繊維腫症が挙げられるがこれに限定されない。
【００４５】
増殖性障害の細胞の少なくともいくつかは、Ｒａｓ遺伝子（またはＲａｓシグナル伝達経路の成分）が直接（例えば、Ｒａｓ中の活性化変異による）または間接的（例えば、Ｒａｓ経路の上流の成分の活性化による）のいずれかで活性化される変異を有する。Ｒａｓ経路の上流の成分の活性化として、例えば、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）またはＳｏｓでの形質転換が挙げられる。Ｒａｓ、Ｒａｓの上流の成分、またはＲａｓシグナル伝達経路中の成分の活性化によって少なくとも一部生じる増殖性障害は、本明細書中では「Ｒａｓ媒介性増殖性障害」と呼ばれる。
【００４６】
「Ｂ細胞」はＢリンパ球をいう。Ｂリンパ球の２つの主要な亜集団（Ｂ−１およびＢ−２）が存在する。Ｂ−１細胞は自己再生し、そして比較的低い親和性を有して複数の抗原の範囲に結合する（多特異性）高いレベルの抗体を頻繁に分泌する。Ｂ細胞の大部分であるＢ−２細胞は、骨髄中の前駆体から直接生成され、そして高特異的抗体を分泌する。
【００４７】
「Ｔ細胞」はＴリンパ球をいう。Ｔ細胞は胸腺へと分化し、そして細胞内器官を有している細胞に対して作動するように特殊化される。Ｔ細胞は、それが体細胞の表面上に存在する場合にのみ、抗原を認識する。
【００４８】
「抗レオウイルス抗体」は、レオウイルスに結合する抗体をいう。「ＩｇＧ抗体」は、イムノグロブリンＧ抗体をいう。最も豊富な抗体の型であるＩｇＧは、細菌毒素を中和しそしてそれらの食作用を増強するために微生物に結合する主要な役割を有する。「ヒト化抗体」は、非抗原結合領域中のアミノ酸配列が変更されており、その結果、抗体がヒト抗体により近く似ており、そしてそのもとの結合能力をなお保持している抗体分子をいう。
【００４９】
本発明の方法による処置に特に感受性である１つの新生物は、膵臓癌である。これは、膵臓癌に関連するＲａｓ媒介性新生物の出現率に起因する。本発明の方法による処置に特に感受性である他の新生物として、乳癌、中枢神経系癌（例えば、神経芽細胞腫および神経膠芽細胞腫）、末梢神経系癌、肺癌、前立腺癌、結直腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、リンパ腫、および白血病が挙げられる。本発明の方法による処置に特に感受性である他の増殖性障害として、神経繊維腫症１が挙げられる。これはｒａｓ経路の活性化に起因する。
【００５０】
「増殖している細胞または新生物への投与」は、レオウイルスが、それが増殖している細胞または新生物の細胞（本明細書中では「新生物細胞」とも呼ばれる）と接触する様式で投与されることを示す。レオウイルスが投与される経路、ならびに処方物、キャリア、またはビヒクルは、新生物の位置ならびに型に依存する。広範囲の種々の投与経路が使用され得る。例えば、影響を受けやすい固形新生物については、レオウイルスは、新生物への直接的な注射によって投与され得る。造血性新生物については、例えば、レオウイルスは静脈内または血管内投与され得る。体内で容易には接近できない新生物（例えば、転移性または脳腫瘍）については、レオウイルスは、それが哺乳動物の体を通じて全身的に輸送され得それによって新生物に到達するような様式（例えば、髄こう内、静脈内、または筋肉内）で投与される。あるいは、レオウイルスは、単一の固形新生物に対して直接投与され得る。次いで、ここでレオウイルスは、転移部位へと体を通じて全身に運ばれる。レオウイルスはまた、皮下に、腹膜内に、局所的に（例えば、黒色腫について）、経口で（例えば、口頭または食道新生物について）、直腸に（例えば、結直腸新生物について）、膣に（例えば、子宮頚または膣新生物について）、鼻腔に、または吸入噴霧で（例えば、肺新生物について）投与され得る。
【００５１】
レオウイルスは、免疫無防備状態である哺乳動物かまたはレオウイルスエピトープに対する免疫性を発現していない哺乳動物に全身的に投与され得る。このような場合には、全身的に（すなわち、静脈内注射によって）投与されたレオウイルスは、増殖している細胞と接触し、細胞の溶解を生じる。
【００５２】
レオウイルス亜型に予め曝された免疫応答性の哺乳動物は、レオウイルス亜型に対する体液性および／または細胞性免疫を発現し得る。それにもかかわらず、免疫応答性哺乳動物中の固形腫瘍内へのレオウイルスの直接的な注射が、新生物細胞の溶解を生じることが見出されている。一方、レオウイルスが免疫応答性哺乳動物に全身的に投与された場合には、哺乳動物は、レオウイルスに対する免疫応答を生じ得る。レオウイルスが、哺乳動物がそれに対しては免疫性を発現していない亜型であるか、またはレオウイルスが免疫防御型であるように本明細書中で先に記載されているように改変されている（例えば、外側のキャプシドのプロテアーゼ消化またはミセル中でのパッケージングによる）場合には、このような免疫応答は回避され得る。
【００５３】
あるいは、レオウイルスに対する哺乳動物の免疫応答能力が、一般的に免疫系を抑制することが当該分野で公知である医薬品の事前投与または同時投与によって（Ｃｕｆｆら、「Ｅｎｔｅｒｉｃ　ｒｅｏｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｐｒｏｂｅ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ」Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　４２（２）：９９−１０８（１９９８））か、あるいは、抗−抗レオウイルス抗体としてのそのような免疫阻害剤の投与のいずれかによって抑制され得ることが、意図される。レオウイルスに対する哺乳動物の体液性免疫もまた、抗レオウイルス抗体を除去するための哺乳動物の血液の血漿搬出（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって一時的に減少させられ得るかまたは抑制され得る。レオウイルスに対する哺乳動物の体液性免疫は、哺乳動物への非特異的免疫グロブリンの静脈内投与によって、さらに一時的に減少させられ得るかまたは抑制され得る。
【００５４】
レオウイルスが、免疫抑制剤および／または免疫阻害剤の投与と組み合わせて、レオウイルスに対して免疫化された免疫応答性哺乳動物に投与され得ることが意図される。このような免疫抑制剤および免疫阻害剤は当業者に公知であり、そしてシクロスポリン、ラパマイシン、タクロリムス、ミコフェノール酸、アザチオプリン、およびそれらのアナログなどの試薬を含む。他の試薬が免疫抑制特性を有することは周知である（例えば、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、第７版、１２４２頁を参照のこと、その開示は本明細書中で参考として援用されている）。このような免疫阻害剤はまた、「抗−抗レオウイルス抗体」を含む。これは、抗レオウイルス抗体に対して指向された抗体である。このような抗体は、当該分野で公知の方法によって作成され得る。例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ」Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと。このような抗−抗レオウイルス抗体は、レオウイルスの投与の前、投与と同時、または投与の直後に投与され得る。好ましくは、有効量の抗−抗レオウイルス抗体が、投与されたレオウイルスに対する哺乳動物による免疫応答を減少または排除するために十分な時間の間投与される。用語「免疫抑制剤」または「免疫抑制薬剤」は、従来の免疫抑制剤、免疫阻害剤、抗体、および免疫系の無防備状態を生じる放射線治療またはＨＩＶ感染のような状態を含む。
【００５５】
用語「実質的な溶解」は、増殖している細胞の少なくとも１０％が溶解させられる、より好ましくは、少なくとも５０％、そして最も好ましくは少なくとも７５％の細胞が溶解させられることを意味する。溶解の割合は、哺乳動物中の腫瘍の大きさの減少、またはインビトロでの腫瘍細胞の溶解を測定することによって、腫瘍細胞について決定され得る。
【００５６】
「増殖性障害を有していると疑われる哺乳動物」は、哺乳動物が増殖性障害もしくは腫瘍を有し得ること、または増殖性障害もしくは腫瘍を有していると診断されていること、または増殖性障害もしくは腫瘍を有していると以前に診断されていること、腫瘍または腫瘍の実質的に全てが外科的に除去されていること、そして哺乳動物がいくらかの残存している腫瘍細胞を保有していると疑われることを意味する。
【００５７】
本発明はまた、薬学的組成物を含む。これは、有効成分として、１つ以上の免疫抑制剤または免疫阻害剤、および「薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤」を伴う１つ以上のレオウイルスを含有する。本発明の組成物の作製においては、有効成分／免疫抑制剤または免疫阻害剤、およびレオウイルスが、通常は賦形剤と混合され、賦形剤によって稀釈されるか、またはカプセル、袋（ｓａｃｈｅｔ）、紙、または他の容器の形態であり得るそのようなキャリア中に封入される。薬学的に受容可能な賦形剤が希釈剤として作用する場合には、これは固体、半固体、または液体材料であり得る。これは、有効成分についてのビヒクル、キャリア、または媒体として作用する。従って、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ、袋入りの薬（ｓａｃｈｅｔｓ）、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁物、乳濁物、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体として、または液体媒体中）、例えば、１０重量％までの活性化合物を含有している軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌の注射可能な溶液、ならびに滅菌のパッケージされた散剤の形態であり得る。
【００５８】
適切な賦形剤のいくつかの例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物はさらに：タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような潤滑剤；湿潤剤；乳濁剤；ならびに懸濁剤；メチル−安息香酸およびプロピルヒドロキシ−安息香酸のような保存料；甘味料；ならびに香味料を含有し得る。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することによって、患者への投与後に有効成分の迅速な、持続的な、または遅延させられた放出を提供するように処方され得る。
【００５９】
錠剤のような固体の組成物を調製するために、重要な有効成分／免疫抑制剤または免疫阻害剤、およびレオウイルスが、本発明の化合物の均質な混合物を含有している固体の事前処方組成物を形成するように、薬学的賦形剤と混合される。これらの事前処方組成物について均質であるという場合には、組成物が、錠剤、丸剤、およびカプセル剤のような等価に有効な単位投薬形態に容易に分割され得るように、有効成分が組成物全体にわたって均質に分散させられることが意味される。
【００６０】
本発明の錠剤または丸剤は、延長した作用の利点を付与する投薬形態を提供するように、被覆され得るかまたは他の方法で調合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部の投薬成分、および外部の投薬成分を含有し得、外部の投薬成分が内部の投薬成分を包む形態である。２つの成分は、胃での分解に抵抗するように作用し、そして内部の成分が十二指腸内へとインタクトで通過させるかまたは放出を遅らせる腸溶性の層によって分離され得る。種々の材料が、このような腸溶性の層または被覆のために使用され得る。このような材料として、多数の重合酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ａｃｉｄ）、およびセラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との重合酸の混合物が挙げられる。
【００６１】
本発明の新規の組成物が、経口投与または注射による投与のために取り込まれ得る液体の形態として、水溶液、適切に風味をつけたシロップ、水性または油性懸濁剤、および食用油（例えば、トウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）で香味づけた乳濁物、ならびにエリキシル剤、および類似の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００６２】
吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または吸入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）のための組成物は、薬学的に受容可能な水性溶媒もしくは有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液および懸濁物、ならびに散剤を含む。液体または固体の組成物は、本明細書中に記載されるような適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含有し得る。好ましくは、組成物は、局所または全身的な効果のために、経口または鼻腔の呼吸経路によって投与される。好ましい薬学的に受容可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によって噴霧され得る。噴霧溶液は、噴霧デバイスから直接吸入され得るか、または噴霧デバイスはフェースマスクテント、または断続的陽圧呼吸機器（ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｂｒｅａｔｈｉｎｇ　ｍａｃｈｉｎｅ）に取り付けられ得る。溶液、懸濁物、または散剤組成物は、好ましくは、適切な様式で処方物を送達するデバイスから、経口または鼻腔によって投与され得る。
【００６３】
本発明の方法において使用される別の好ましい処方物は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を使用する。このような経皮パッチは、制御された量での本発明のレオウイルスの持続的または断続的な注入を提供するために使用され得る。薬学的薬剤の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと。このようなパッチは、薬学的薬剤の持続的、拍動性の、またはオンデマンド送達のために構築され得る。
【００６４】
本発明での使用のための他の適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る。その開示は、本明細書中で参考として援用される。
【００６５】
免疫抑制剤または免疫阻害剤、およびレオウイルス、あるいは、免疫抑制剤または免疫阻害剤およびレオウイルスを含有している薬学的組成物は、適切な容器にパッケージされた必須の材料を提供する便利なキットにパッケージされ得る。キットはまた、化学療法剤をも含み得ることが意図される。
【００６６】
免疫抑制剤または免疫阻害剤は、適切な量で、そして哺乳動物の免疫系の免疫抑制または免疫阻害を生じるために十分な適切な投与スケジュールを使用して投与される。このような量およびスケジュールは、当業者に周知である。
【００６７】
レオウイルスは、増殖性障害を処置するために十分な量（例えば、「有効量」）で投与される。増殖性障害は、増殖している細胞へのレオウイルスの投与が増殖している細胞の溶解をもたらす場合に、「処置」される。これは、新生物の大きさの減少、または新生物の完全な排除を生じ得る。新生物の大きさの減少または新生物の排除は、一般的には、レオウイルスによる新生物細胞の溶解（「腫瘍崩壊」）によって引き起こされる。好ましくは、有効量は、腫瘍細胞の増殖を阻害することが可能な量である。好ましくは、有効量は、約１．０ｐｆｕ／ｋｇ体重〜約１０１５ｐｆｕ／ｋｇ体重、より好ましくは、約１０２ｐｆｕ／ｋｇ体重〜約１０１３ｐｆｕ／ｋｇ体重である。例えば、ヒトの処置のためには、存在する腫瘍の型、大きさ、および数に依存して、約１０２〜１０１７プラーク形成単位（ＰＦＵ）のレオウイルスが使用され得る。有効量は、個々の基準に対して決定され、そして少なくとも一部、レオウイルスの型の考慮；選択される投与経路；個体の大きさ、年齢、性別；患者の症状の重篤度；新生物の大きさおよび他の特徴などに基づき得る。治療の過程は、数日から数ヶ月まで続き得るか、または疾患の縮小が達成されるまで続き得る。
【００６８】
免疫抑制剤または免疫阻害剤、およびレオウイルスは、単回用量で、または複数回の用量（すなわち、１回以上の用量）で投与され得る。複数回の用量が、同時にまたは連続的に（例えば、数日から数週間の期間にわたって）投与され得る。レオウイルスはまた、同じ個体中の１つ以上の新生物に対しても投与され得る。
【００６９】
組成物は好ましくは、単位投薬形態で処方される。それぞれの投薬は、適切な量の免疫抑制剤または免疫阻害剤、および約１０２ｐｆｕ〜約１０１３ｐｆｕのレオウイルスを含有している。用語「単位投薬形態」は、ヒト被験体および他の哺乳動物について単位投薬として適切な、物理的に分離した単位をいう。それぞれの単位は、適切な薬学的賦形剤を伴って、所望される治療効果を生じるように計算された、予め決定された量のレオウイルスを含有している。
【００７０】
上記のように、レオウイルスが免疫応答性哺乳動物における固形の新生物の処置に有効であることが見出されている。未改変のレオウイルスの新生物への直接投与は、新生物細胞の腫瘍崩壊および免疫応答性動物中の腫瘍の大きさの減少を生じる。動物が、何らかの方法で免疫抑制または免疫不全にされる場合には、レオウイルスの全身的投与は腫瘍崩壊を生じることにおいてより有効である。
【００７１】
レオウイルスは、外科手術または新生物の除去と組合せて投与され得ることが意図される。従って、新生物の外科的除去、および新生物の部位でまたはその付近でのレオウイルスの投与を包含する、固形の新生物の処置のための方法が、本明細書中で提供される。
【００７２】
レオウイルスが、哺乳動物を免疫抑制にする放射線治療と組合せて、またはそれに加えて投与され得ることが意図される。
【００７３】
本発明のレオウイルスが、公知の抗ガン化合物または化学療法剤と組合せて、またはそれに加えて投与され得ることがさらに意図される。化学療法薬は、腫瘍の増殖を阻害し得る化合物である。このような薬剤として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、ヒドロキシウレア、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン（エピルビシンおよびドキソルビシン）、レセプターに対する抗体（例えば、ヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ））、エトポシド（ｅｔｏｐｓｉｄｅ）、プレグナソーム（ｐｒｅｇｎａｓｏｍｅ）、白金化合物（例えば、カルボプラチンおよびシスプラチン）、タキサン（例えば、タキソールおよびタキソテーレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ））、ホルモン治療薬（例えば、タモキシフェンおよび抗エストロゲン）、インターフェロン、アロマターゼインヒビター、プロゲステロン剤、ならびにＬＨＲＨアナログ。
【００７４】
本発明のレオウイルスおよび免疫抑制剤は、転移性の腫瘍の増殖を減少させることが見出されている。本発明の１つの実施形態においては、免疫抑制型哺乳動物に対して有効量のレオウイルスを投与する工程を包含する、哺乳動物の転移性腫瘍の増殖を減少させるための方法が提供される。
【００７５】
（有用性）
本発明のレオウイルスおよび免疫抑制剤は、種々の目的のために使用され得る。これらは、哺乳動物のｒａｓ媒介性増殖性障害を処置するための方法において使用され得る。これらは、新生物を減少または排除するために使用され得る。これらは、転移を処置するための方法において使用され得る。これらは、外科手術、化学療法、および放射線治療を含むガンの公知の処置と組合せて使用され得る。
【００７６】
本発明およびその利点をさらに説明するために、以下の特定の実施例が提供されるが、いかなる方法においても特許請求の範囲を限定するようには意味されない。
【００７７】
（実施例）
以下の実施例においては、全ての温度は（他の場所で特に示されていない限りは）摂氏であり、そして全ての割合は（他の場所で特に示されていない限りは）重量パーセントである。
【００７８】
以下の実施例においては、以下の略号は以下の意味を有する。略号が定義されていない場合は、その一般的に受容されている意味を有する：
μＭ＝マイクロモル
ｍＭ＝ミリモル
Ｍ＝モル
ｍｌ＝ミリリットル
μｌ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
μｇ＝マイクログラム
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｒｐｍ＝１分あたりの回転数
ＦＢＳ＝ウシ胎仔血清
ＤＴＴ＝ジチオスレイトール
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＤＭＥＭ＝ダルベッコ改変イーグル培地
α−ＭＥＭ＝α−改変イーグル培地
β−ＭＥ＝β−メルカプトエタノール
ＭＯＩ＝感染多重度
ＰＦＵ＝プラーク形成単位
ＭＡＰＫ＝ＭＡＰキナーゼ
ｐｈｏｓｐｈ−ＭＡＰＫ＝リン酸化ＭＡＰキナーゼ
ＨＲＰ＝西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＰＫＲ＝ニ本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ
ＲＴ−ＰＣＲ＝逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
ＧＡＰＤＨ＝グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
ＥＧＦＲ＝上皮増殖因子レセプター
ＭＥＫキナーゼ＝マイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＳＣＩＤ＝重症複合免疫不全
（一般的方法）
（細胞およびウイルス）
親ＮＩＨ−３Ｔ３、ならびにＨａｒｖｅｙ−ｒａｓ（Ｈ−ｒａｓ）およびＥＪ−ｒａｓ腫瘍遺伝子でトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｆａｌｌｅｒ博士（Ｂｏｓｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から懇意により譲り受けた。それらのＳｏｓ形質転換対照物を有しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＴＮＩＨ＃５と命名した）は、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｋａｒｉｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）から懇意により譲り受けた。Ｈ．−Ｊ．Ｋｕｎｇ博士（Ｃａｓｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｒｅｓｅｒｖｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、ｖ−ｅｒｂＢ腫瘍遺伝子でトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＴＨＣ−１１と命名した）とともに、親ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を好意によって贈与して下さった。マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターの転写制御下にＨａｒｖｅｙ−ｒａｓ遺伝子を含有している、Ｃ３Ｈ　１０Ｔ１／２マウス繊維芽細胞株の誘導体である２Ｈ１細胞を、Ｎｏｂｕｍｉｃｈｉ　Ｈｏｚｕｍｉ博士（Ｍｏｕｎｔ　Ｓｉｎａｉ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手した。これらの２Ｈ１細胞は、５０μＭのＺｎＳＯ４の存在下でＨ−ｒａｓ腫瘍遺伝子を発現する条件付ｒａｓ形質転換体である。全ての細胞株を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有しているダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。
【００７９】
ＮＩＨ−３Ｔ３　ｔｅｔ−ｍｙｃ細胞を、Ｒ．Ｎ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｇａｒｙ）から入手し、そして２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下または非存在下で、１０％の熱不活化ＦＢＳおよび抗生物質を含有しているＤＭＥＭ中で増殖させた（Ｈｅｌｂｉｎｇ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５７：１２５５−１２５８（１９９７））。テトラサイクリンの存在下では、ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現が抑制される。テトラサイクリンの除去によって、これらの細胞中で１００倍までのｃ−ｍｙｃの発現の増大を生じる。これはまた、形質転換された表現型を提示する。
【００８０】
ＰＫＲ＋／＋およびＰＫＲ０／０マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、Ｂ．Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士（ｔｈｅ　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）から入手し、そして以前に記載したようにウシ胎児血清および抗生物質を含有しているα−ＭＥＭ中で増殖させた（Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｌ．ら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１４：６０９５−６１０６（１９９５）；Ｄｅｒ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：３２７９−３２８３（１９９７））。
【００８１】
これらの研究で使用したレオウイルス血清３型のＤｅａｒｉｎｇ株を、Ｌ細胞の懸濁培養物中で増殖させ、そしてβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を抽出緩衝液から省いた事を除いてＳｍｉｔｈに従って精製した（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｅ．ら（１９６９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３９：７９１−８００）。［３５Ｓ］メチオニンで標識したレオウイルスを増殖させ、そしてＭｃＲａｅおよびＪｏｋｌｉｋによって記載されているように精製した（ＭａＲａｅ，Ｍ．Ａ．およびＪｏｋｌｉｋ，Ｗ．Ｋ．，（１９７８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８９：５７８−５９３）。精製したレオウイルスについての粒子／ＰＦＵ比は、代表的には１００／１であった。
【００８２】
（レオウイルス感染の免疫蛍光分析）
免疫蛍光研究のために、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＴＮＩＨ＃５、Ｈ−ｒａｓ、ＥＪ−ｒａｓ、２Ｈ１（＋／−ＺｎＳＯ４）、およびＴＨＣ−１１細胞をカバーガラス上で増殖させ、そして約１０ＰＦＵ細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でレオウイルスで感染させたか、または細胞に対するウイルスの投与と同一の様式での細胞に対するキャリア剤（リン酸緩衝化生理食塩水、ＰＢＳ）の塗布によって擬似感染させた。感染の４８時間後、細胞をエタノール／酢酸（２０／１）混合物中で５分間固定させ、次いで７５％、５０％、および２５％のエタノール中での段階洗浄、続くリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）での４回の洗浄によって再水和した。次いで、固定しそして再水和した細胞を一次抗体（ＰＢＳ中で１／１００に稀釈したウサギポリクローナル抗レオウイルス血清３型）［フロイントの完全なアジュバント中のレオウイルス血清３型でのウサギの注射、および続く放血によって調製した抗血清］に対して室温で２時間暴露した。ＰＢＳでの３回の洗浄後、細胞を、二次抗体［１０％のヤギ血清および０．００５％のＥｖａｎ’ｓ　Ｂｌｕｅを含有しているＰＢＳ中で１／１００に稀釈したヤギ抗−ウサギＩｇＧ（全分子）−フルオレセインイソチオシアネート結合体（ＦＩＴＣ）［Ｓｉｇｍａ　ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｆ−０３８２］］に対して室温で１時間暴露した。最後に、固定しそして処理した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで二倍量の滅菌水で１回洗浄し、乾燥させ、そして０．１％のフェニレンジアミンを含有している９０％のグリセロール中でスライド上に固定し、そしてＣａｒｌ　Ｚｅｉｓｓカメラをその上に取り付けたＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡で観察した（全ての写真についての倍率は２００倍であった）。
【００８３】
（ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）活性の検出）
ＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ　ｐ４４／４２　ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体キット（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を、製造業者に説明書に従って細胞溶解物中のＭＡＰキナーゼの検出のために使用した。簡潔には、サブコンフルエントな単層培養物を、推奨されるＳＤＳ含有サンプル緩衝液を用いて溶解させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてニトロセルロース紙上での電気的ブロッティングに供した。次いで、メンブレンを一次抗体（抗−全ＭＡＰＫまたは抗−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫ）でプローブし、続いて製造業者の機器マニュアルに記載されているように西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体によってプローブした。
【００８４】
（レオウイルス感染細胞の放射性標識および溶解物の調整）
ＮＩＨ−３Ｔ３、ＴＮＩＨ＃５、Ｈ−ｒａｓ、ＥＪ−ｒａｓ、２Ｈ１（＋／−ＺｎＳＯ４）、およびＴＨＣ−１１細胞のコンフルエントな単層を、レオウイルスで感染させた（ＭＯＩ　約１０ＰＦＵ／細胞）。感染の１２時間後、培地を、１０％の透析したＦＢＳおよび０．１ｍＣｉ／ｍｌの［Ｓ３５］メチオニンを含有しているメチオニンを含まないＤＭＥＭと置き換えた。３７℃で３６時間のさらなるインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、そして１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有している同じ緩衝液中に溶解させた。次いで、核を低速遠心分離によって除去し、そして上清を使用するまで−７０℃で保存した。
【００８５】
（インビトロでのキナーゼアッセイのための細胞質抽出物の調製）
種々の細胞株のコンフルエントな単層を、９６ウェル細胞培養プレート上で増殖させた。感染後の適切な時点で培地を吸引して除き、そして細胞を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオスレイトール、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、および５０μｇ／ｍｌのアプロチニンを含有している緩衝液で溶解させた。次いで、核を低速遠心分離によって除去し、そして上清を使用するまで−７０℃で保存した。
【００８６】
細胞質抽出物を、使用前に、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質マイクロアッセイ方法によってタンパク質濃度について正規化した。それぞれのインビトロでのキナーゼ反応には、２０μｌの細胞抽出物、７．５μｌの反応緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオスレイトール、および１０％のグリセロール）、ならびに７．０μｌのＡＴＰ混合物（７μｌの反応緩衝液中の１．０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）を含み、そして３７℃で３０分間インキュベートした（Ｍｕｎｄｓｃｈａｕ，Ｌ．Ｊ．およびＦａｌｌｅｒ，Ｄ．Ｖ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２３０９２−２３０９８（１９９２））。インキュベーションの直後、標識した抽出物を、Ｌａｅｍｍｌｉ　ＳＤＳサンプル緩衝液中で沸騰させるか、あるいはアガロース−ポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）ビーズを用いて沈殿させるか、または抗−ＰＫＲ抗体を用いて免疫沈降させるかのいずれかを行った。
【００８７】
（アガロースポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）沈降）
それぞれのインビトロでのキナーゼ反応混合物に対して、３０μｌの５０％のＡｇポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）６型スラリー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加し、そして混合物を４℃で１時間インキュベートした。吸着した標識したタンパク質を有するＡｇポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ）ビーズを、次いで、洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［７．５ｐＨ］、９０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ，２ｍＭのジチオスレイトール、１０％のグリセロール）で室温で４回洗浄し、そして２×のＬａｅｍｍｌｉ　ＳＤＳサンプル緩衝液と混合した。次いで、ビーズを５分間沸騰させ、そして解離したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００８８】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
感染後の種々の時点で細胞を抽出し、そして氷冷ＴＮＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．８］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁した。次いでこれに対して、１％の最終濃度にまでＮＰ−４０を添加した。５分後、核をペレット化し、そしてＲＮＡをフェノール：クロロホルム手順を使用して上清から抽出した。次いで、それぞれのサンプルに由来する当量の全細胞ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってランダムヘキサヌクレオチドプライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＲＴａｓｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲに供した（Ｗｏｎｇ，Ｈ．ら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：２５１−２５８）。次いで、ＲＴ−ＰＣＲ工程によるｃＤＮＡを、予め決定したＳ１配列に由来する適切なプライマー配列を使用するレオウイルスｓ１　ｃＤＮＡの選択的増幅に供した（Ｎａｇａｔａ、Ｌ．ら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，１２：８６９９−８７１０）。ＧＡＰＤＨプライマー（Ｗｏｎｇ，Ｈ．ら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：２５１−２５８）を、推定される３０６ｂｐのＧＡＰＤＨフラグメントを増幅するために使用した。これは、ＰＣＲおよびゲル充填コントロールとして提供される。ｓ１およびＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡの選択的増幅を、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用してＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲシステム　９６００を使用して製造業者のプロトコールに従って行った。９７℃で３０秒間の変性工程、５５℃で４５秒間のアニーリング工程、および７２℃で６０秒間の重合工程からそれぞれ構成されるＰＣＲを、２８サイクル行った。ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドを染み込ませたＴＡＥ−２％アガロースゲルを通じる電気始動によって分析し、そしてＰｏｌａｒｏｉｄ　５７フィルムを用いて紫外照明下で写真を撮影した。
【００８９】
（免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
抗レオウイルス血清３型の血清を用いて、３５Ｓ標識レオウイルスに感染した細胞溶解物の免疫沈降を、以前に記載されているように行った（Ｌｅｅ，Ｐ．Ｗ．Ｋ．ら（１９８１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１０８：１３４−１４６）。３２Ｐ標識細胞溶解物の免疫沈降を、抗ＰＫＲ抗体（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｍａｔｈｅｗｓ博士による，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）を用いて同様に行った。免疫沈降物を、Ｌａｅｍｍｌｉのプロトコール（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５）に従って不連続なＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００９０】
（実施例１　生存性に対する事前のレオウイルス暴露の影響）
Ｃ３Ｈマウスを、上記に記載したようにレオウイルスの注射でチャレンジした。２週間後、レオウイルスに対する抗体を、これらの動物中で検出した。レオウイルスに暴露した動物、および事前暴露しなかった動物に、Ｃ３腫瘍他家移植片を与えた。腫瘍の確立後、生存しているまたはＵＶ不活化レオウイルスを全ての動物に投与した。レオウイルスに事前暴露した動物は、事前暴露しなかったマウスよりも低い完全な腫瘍の退行の指標を有した。チャレンジした９匹の動物のうちの３匹（３３％）が完全な腫瘍の退行を有したことに対して、レオウイルスに事前暴露しなかった９匹のマウスのうちの６匹（６６％）が完全な腫瘍の退行を有した。
【００９１】
（実施例２　有効用量を減少させるための、免疫抑制剤とのレオウイルスの同時投与）
レオウイルスは、免疫不全型動物および免疫応答性動物の両方において腫瘍細胞崩壊剤として作用し得ることが実証されている。しかし、免疫応答性動物は、増大したウイルスの投与量および増大した処置頻度を必要とする。免疫抑制剤の存在下でのレオウイルスの同時投与が、免疫応答性動物での処置における投与量および頻度を減少させることを実証するために、Ｃ３Ｈマウスに、ｒａｓ形質転換Ｃ３Ｈ　１０Ｔ１／２細胞に由来する腫瘍を移植する。次いで、動物を、処置または擬似処置の開始前またはその時点のいずれかで、免疫抑制剤を用いて処置する。これらの２つの群の動物を、レオウイルスの単回の腫瘍内注射で処置するか、またはＵＶ不活化レオウイルスで擬似処置のいずれかを行う。第２および第３の試行の動物においては、別の日にレオウイルスの３回または５回のいずれかの注射を用いて、処置または擬似処置する。動物を、４週間の間、腫瘍の退行について追跡し、そして４週間の終わりに屠殺する。結果は、レオウイルスに加えた免疫抑制剤を用いる処置が、レオウイルスのみでの処置よりも、より有効な腫瘍の退行を生じることを示す。免疫抑制剤を用いて処置した動物は、溶解を達成するためにより少ない回数およびより少量のレオウイルスの投与を必要とすることを見出す。
【００９２】
（実施例３　離れた腫瘍の退行を増強させるための、免疫抑制剤とのレオウイルスの同時投与）
レオウイルスの単回の注射は、免疫不全型マウスにおいて全身的に送達された場合、腫瘍の退行を引き起こし得ることが実証されている。レオウイルスの全身的送達は、免疫応答性動物において腫瘍の退行を生じ得るが、増大した投与量および処置頻度が、免疫不全型動物において観察されるものと等しい結果を導くために必要とされることがまた、実証されている。免疫抑制剤の使用がこれらの免疫応答性動物中での高用量の必要性を緩和し得ることを実証するために、Ｃ３Ｈマウスに、重なっているそれらの後方の側腹部にｒａｓ形質転換Ｃ３Ｈ　１０Ｔ１／２細胞に由来する腫瘍を移植する。次いで、動物を、免疫抑制剤を用いて処置するか、または擬似処置のいずれかを行う。次いで、これらの２つの群を、レオウイルスの単回の静脈内注射で処置するか、またはＵＶ不活化レオウイルスを用いて処置するかのいずれかを行う。第２および第３の試行においては、動物に、それぞれ２日ごとに、レオウイルスまたはＵＶ不活化レオウイルスを３回または５回の静脈内注射で投与する。動物を、４週間の間、それぞれ２日ごとに腫瘍の退行を測定して追跡する。全ての動物を、４週間の終わりに屠殺する。結果は、レオウイルスに加えた免疫抑制剤を用いる処置が、レオウイルスのみでの処置よりもより有効な腫瘍の退行を生じることを示す。免疫抑制剤を用いて処置した動物は、溶解を達成するためにより少ない回数およびより少量のレオウイルスの投与を必要とすることを見出す。
【００９３】
（実施例４　体外免疫吸収（ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ））
宿主免疫系が治療的に適用されたレオウイルスを除去することを防ぐために、免疫成分（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および抗体）（これらは、全身的送達を妨害し得る）の選択的除去が、レオウイルスの治療的送達の前に達成される。
【００９４】
Ｂ細胞およびＴ細胞集団のいずれかまたは両方の除去は、細胞集団を除去し得る体外化合物（例えば、除去される細胞集団の特異的レセプターを認識する固定化抗体）と組合せた血液濾過を通じて行われ得る。
【００９５】
抗体の選択的除去はまた、宿主の免疫系が治療用ウイルスを除去することを妨ぎ得る。ウイルスとの抗体相互作用を防ぐこともまた、レオウイルスの全身的治療処置を補助し得る。これは、いくつかの方法によって達成され得る：
１）ヘム透析および血液を固定化レオウイルス上を通過させることによる抗レオウイルス抗体の除去（選択的抗体除去）；
２）ヘム透析および血液を固定化プロテインＡ（例えば、ＰＲＯＳＯＲＢＡＴＭ（Ｃｙｐｒｅｓｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））上を通過させることによる全ＩｇＧ抗体の除去；
３）ヒト化抗イディオタイプ抗体（ここではレオウイルスに対するイディオタイプ）の投与。
【００９６】
体外免疫吸収のための手順は、Ｓｉｎｇｈａｌの米国特許第４，７１１，８３９号およびＢａｌｉｎｔらの同第４，６８１，８７０号に記載されている。これらは、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００９７】
本発明の方法において、レオウイルスが投与され、免疫成分が除去され、そしてレオウイルスが再び患者に投与され得ることが理解される。これらの工程は、必要な場合に繰り返され得る。この方法が繰り返される回数は、患者の症状に基づいて実施する開業医によって決定され得る。
【００９８】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して詳細に示されそして記載されているが、形態および詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神および範囲を逸脱することなくその中で行われ得ることが、当業者によって理解される。
【国際公開パンフレット】
2004505924.tif 000005
2004505924.tif 000006
2004505924.tif 000007
2004505924.tif 000008
2004505924.tif 000009
2004505924.tif 000010
2004505924.tif 000011
2004505924.tif 000012
2004505924.tif 000013
2004505924.tif 000014
2004505924.tif 000015
2004505924.tif 000016
2004505924.tif 000017
2004505924.tif 000018
2004505924.tif 000019
2004505924.tif 000020
2004505924.tif 000021
2004505924.tif 000022
2004505924.tif 000023
2004505924.tif 000024
2004505924.tif 000025
2004505924.tif 000026
2004505924.tif 000027
2004505924.tif 000028
2004505924.tif 000029
2004505924.tif 000030
2004505924.tif 000031
2004505924.tif 000032
2004505924.tif 000033
2004505924.tif 000034
2004505924.tif 000035
2004505924.tif 000036
2004505924.tif 000037
2004505924.tif 000038
2004505924.tif 000039
2004505924.tif 000040
2004505924.tif 000041
2004505924.tif 000042
2004505924.tif 000043
2004505924.tif 000044
2004505924.tif 000045
2004505924.tif 000046
2004505924.tif 000047
2004505924.tif 000048
2004505924.tif 000049
2004505924.tif 000050
2004505924.tif 000051
2004505924.tif 000052
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505924.tif 000053
【国際調査報告】
2004505924.tif 000054
2004505924.tif 000055
2004505924.tif 000056