(57)【要約】本発明は、微量分析的および微量合成的分析および手順用の方法および装置に関する。本発明は、プラットフォームの回転による向心力を利用してマイクロチャネルへの流体の移動を誘導するマイクロシステムプラットフォームおよびプラットフォームの操作用の微量操作デバイスを提供する。これらのアッセイを、種々の目的（薬物候補化合物のスクリーニング、生命科学研究、および臨床および分子診断が含まれるが、これらに限定されない）で行うことができる。任意の広範な種々の微量分析または微量合成処理を行うための本発明の装置に特定の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）プラットフォーム表面に嵌め込んだ１つまたは複数の微量流体構造を具備する表面を有する基板を含む回転可能なプラットフォームであって、各微量流体構造は、
ｉ）試薬溶液を含む１つまたは複数の試薬リザーバと、
ｉｉ）サンプル溶液を含む１つまたは複数のサンプルリザーバと、
ｉｉｉ）混合マイクロチャネルであって、各混合マイクロチャネルはマイクロチャネルによってサンプルリザーバおよび１つまたは複数の試薬リザーバに流体で接続されているチャネルと、
ｉｖ）マイクロチャネルによって混合マイクロチャネルに流体で接続された回収チャンバーと
を含み、
前記混合マイクロチャネルは前記サンプル溶液と前記試薬溶液とを均一な混合物に混合するのに十分な長さを有するプラットフォーム中の長手方向の経路と定義し、前記プラットフォームのマイクロチャネル内の流体は、一定時間前記プラットフォームの回転運動および前記マイクロチャネルから流体を移動させるのに十分な回転速度から生じる向心力によって前記マイクロチャネルを介して移動する、向心力誘導型マイクロシステムプラットフォーム。
【請求項２】
前記各サンプルリザーバがサンプル投入ポートをさらに含む、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項３】
前記各試薬リザーバが試薬投入ポートをさらに含む、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項４】
前記各回収チャンバーが流体排出ポートをさらに含む、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項５】
前記回収チャンバーは光学的に透明である、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項６】
前記各サンプルリザーバは約１ｎＬから約５００μＬの容積である、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項７】
前記各試薬リザーバは約１ｎＬから約５００μＬの容積である、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項８】
前記各回収チャンバーは約２ｎＬから約１０００μＬの容積である、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項９】
前記各混合マイクロチャネルは９０°を超える角度の複数の屈曲を含む、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１０】
約２４から約１０，０００個の微量流体構造を含む、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１１】
前記プラットフォームの回転により、流体が混合マイクロチャネルに存在する時間がプラットフォーム上の各微量流体構造中と実質的に同一である流速で流体が各微量流体構造を介して誘導される、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１２】
前記各微量流体構造を通過する流体の流速が、約１ｎＬ／ｓから約１００μＬ／ｓである、請求項１１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１３】
前記各微量流体構造を通過する流体の流速が、約１ｎＬ／ｓから約５００μＬ／ｓである、請求項１１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１４】
円盤である、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１５】
前記マイクロシステムプラットフォームは、有機材料、無機材料、結晶材料、および無定形材料からなる群より選択される材料から構築される、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１６】
前記マイクロシステムプラットフォームは、シリコン、シリカ、石英、セラミック、金属、またはプラスチックからなる群より選択される材料をさらに含む、請求項１５に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１７】
前記マイクロシステムプラットフォームが半径約１から約２５ｃｍの円盤である、請求項１４に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１８】
前記マイクロシステムプラットフォームが厚さ約０．１から１００ｍｍであり、それに嵌め込まれた前記マイクロチャネルの断面寸法が５００μｍ未満であり、前記プラットフォームの断面寸法の１から９０％である、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項１９】
前記マイクロシステムプラットフォームが多数の空気チャネル、排気ポート、および換気チャネルをさらに含む、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項２０】
第１層および第２層を含み、前記第１層はサンプルリザーバ、試薬リザーバ、および回収チャンバーを具備し、第２層はマイクロチャネルおよび混合マイクロチャネルを具備し、前記第１層のサンプルリザーバ、試薬リザーバ、および回収チャンバーは、前記第１層が前記第２層とが接触している場合に第２層のマイクロチャネルおよび混合マイクロチャネルによって流体で接続されている、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項２１】
請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォームと、基板、回転手段、電源装置、およびユーザーインタフェース、ならびに操作制御手段を含む微量操作デバイスとを組み合わせ、前記回転手段はマイクロシステムプラットフォームに操作可能に連結され、回転により接触し、
前記プラットフォームのマイクロチャネル内の一定量の流体は、一定時間前記プラットフォームの回転運動および前記マイクロチャネルから流体を移動させるのに十分な回転速度から生じる向心力によって前記マイクロチャネルを介して移動する、向心力誘導型流体微量操作装置。
【請求項２２】
前記デバイスの回転手段がモーターである、請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
前記デバイスがマイクロシステムプラットフォームの回転の加速および速度制御用の回転運動制御手段を具備する、請求項２１に記載の装置。
【請求項２４】
前記微量操作装置が吸光度、蛍光、落射蛍光、または化学発光を測定する光学検出器をさらに具備する、請求項２１に記載の装置。
【請求項２５】
前記微量操作装置が、スキャニング、画像処理、または共焦点顕微鏡検出器をさらに具備する、請求項２１に記載の装置。
【請求項２６】
前記微量操作装置が放射線測定検出器をさらに具備する、請求項２１に記載の装置。
【請求項２７】
前記検出器が前記マイクロシステムプラットフォームの回転運動によってプラットフォーム上の回収チャンバーに配置される、請求項２１、請求項２４、請求項２５、または請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記検出器が光源および光検出器を具備する光学検出器である、請求項２４に記載の装置。
【請求項２９】
ａ）プラットフォームが静止している時に請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォームの１つまたは複数のサンプルリザーバに、生物サンプルを含む一定体積の流体を適用する工程であって、各サンプルリザーバに適用した前記生物サンプルは同一であるか異なり、
ｂ）プラットフォームが静止している時に請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォームの１つまたは複数の試薬リザーバに試薬を含む一定体積の溶液を適用する工程であって、各サンプルリザーバに適用した前記生物サンプルは同一であるか異なり、
ｃ）各サンプルリザーバおよび１つまたは複数の試薬リザーバから混合マイクロチャネルへの流体の流れの誘導に十分な回転速度でプラットフォームを回転させる工程であって、前記サンプル体積および試薬体積を混合マイクロチャネルに移行させて均一に混合するのに十分な時間前記プラットフォームを回転させ、
ｄ）前記サンプル体積と試薬体積との均一な混合物を回収チャンバーに送達させる工程と、
ｅ）回収チャンバーから均一な混合物を回収する工程と
を包含する、サンプルと１つまたは複数の試薬とを均一に混合する方法。
【請求項３０】
前記回収チャンバーが検出チャンバーをさらに具備し、前記均一な混合物は検出チャンバー中で検出される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
生物サンプル成分が、均一な混合物中の１つまたは複数の試薬と反応する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
生物サンプル成分が、均一な混合物中の１つまたは複数の試薬と反応して反応生成物を形成し、前記反応生成物が検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物サンプルが酵素種を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物サンプルが酵素種を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）プラットフォームが静止している時に請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォームの１つまたは複数のサンプルリザーバに、生物サンプルを含む一定体積の流体を適用する工程であって、各サンプルリザーバに適用した前記生物サンプルは同一であるか異なり、前記生物サンプルは生物学的反応または生化学的反応の１つの成分を含み、
ｂ）プラットフォームが静止している時に請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォームの１つまたは複数の試薬リザーバに、試薬を含む一定体積の溶液を適用する工程であって、各サンプルリザーバに適用した前記生物サンプルは同一であるか異なり、１つまたは複数の試薬は生物学的反応または生化学的反応の別の成分を含み、
ｃ）各サンプルリザーバおよび１つまたは複数の試薬リザーバから混合マイクロチャネルへの流体の流れの誘導に十分な回転速度でプラットフォームを回転させる工程であって、前記サンプル体積および試薬体積を混合マイクロチャネルに通過させて均一に混合するのに十分な時間前記プラットフォームを回転させ、
ｄ）前記サンプル体積と試薬体積との均一な混合物を回収チャンバーに送達させる工程と、
ｅ）回収チャンバーから均一な混合物を回収する工程と、
ｆ）前記生物学的反応および生化学的反応の生成物を検出する工程と
を包含する、生物学的反応または生化学的反応を行う方法。
【請求項３６】
前記回収チャンバーは検出チャンバーをさらに具備し、前記生物学的および生化学的反応の生成物が前記検出チャンバー中で検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生物サンプルが酵素種を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
１つまたは複数の前記試薬リザーバが、複数の定量キャピラリーを具備する定量多岐管に流体で接続され、計量された試薬溶液が１つまたは複数の計量キャピラリーからそれぞれの複数の混合マイクロチャネルに送達される、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項３９】
サンプルリザーバを混合マイクロチャネルに接続しているマイクロチャネルは、混合マイクロチャネルに１つまたは複数の試薬リザーバを流体で接続した１つまたは複数のマイクロチャネルより大きな内部寸法を有し、前記マイクロチャネルを介した前記サンプルリザーバからの流体の流れが試薬リザーバから混合マイクロチャネルへの流体の流れを促進する、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【請求項４０】
サンプルリザーバを混合マイクロチャネルに接続しているマイクロチャネルは、混合マイクロチャネルに１つまたは複数の試薬リザーバを流体で接続した１つまたは複数のマイクロチャネルより小さな内部寸法を有し、前記マイクロチャネルを介した前記試薬リザーバからの流体の流れがサンプルリザーバから混合マイクロチャネルへの流体の流れを促進する、請求項１に記載のマイクロシステムプラットフォーム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、１９９９年６月１８日に提出された米国仮特許出願６０／１４０，１０５（その開示が参考として本明細書中で明白に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、微量分析および微量合成の分析および手順を行うための方法および装置に関する。特に、本発明は、遺伝的、生化学的、および生物分析処理の超小型化に関する。詳細には、本発明は、小型化生化学アッセイ用のデバイスおよび方法を提供する。これらのアッセイを、種々の目的（薬物候補化合物のスクリーニング、生命科学研究、および臨床および分子診断が含まれるが、これらに限定されない）で行うことができる。本発明のマイクロシステム装置を使用する任意の広範な種々のこのような微量分析または微量合成処理用の方法も提供する。
【０００３】
（２．関連技術の背景）
種々の調査および研究分野における最近の開発では、微小規模（すなわち、１００μＬ未満の体積）での分析、特に生物分析アッセイ用の方法および装置の改良が必要とされている。薬学分野では、例えば、増加しつつある潜在的薬物候補のその生物学的機能を評価する必要がある。例として、結合化学の分野では、異なる化学的親和性または構成を有する種々の構造的サブユニットを組み合わせて、理論的には、サブユニットの各順列について潜在的に固有の生化学的性質を有する新規の分子を作製することができる。このように、比較的少数の構築物から化合物の巨大なライブラリーを合成することができ、このような化合物はそれぞれ通常未知の生物活性および有効性を有する潜在的な薬物誘導化合物である。
【０００４】
化合物ライブラリー開発へのより古典的なアプローチはまた、植物、真菌、および細菌から抽出した天然由来の化合物の使用を含む、漸増数の候補の産生である。部分的に、これは、これらの化合物の機能の理解を深める（これらの化合物を合成し使用する生物の代謝経路にどのように影響を与えるのか、微小構造におよび組成の相違にもとづいた化合物の同定および理解における改良の増加、およびこれらの化合物の抽出および精製法を含む）ことになる。
【０００５】
これらの薬物候補の漸増数の潜在的標的もまた同定されている。最近の生物学での進歩（特に、ヒトゲノム計画）により、生化学活性が種々の病態に関連する多数の分子が発見されている。これらの新規の標的により、どのようにして疾患の根底にある生物学的処理を有効に制御し且つ操作することができるのかという非常に正確で特異的な指標を得ることができ、これは、疾患に関連する代謝経路に影響を与えるこれらの標的の能力を向上させるか、減少させるか、または変化させることができる化合物を見出すために、通常スクリーニングによって薬物を同定しなければならない。
【０００６】
薬物候補および標的の機能、ならびに標的に対する候補の効果は、典型的には以下を含むスクリーニング処理によって新薬開発の初期段階で評価される：標的分子の一部またはドメインへの薬物候補の結合；薬物有効性に相関する薬物候補標的ドメインに結合する免疫アッセイ；薬物候補による標的の酵素活性の阻害を有効性のサインとして使用することができる酵素アッセイ；タンパク質／タンパク質結合；およびタンパク質／ＤＮＡ（ＲＮＡ）結合。さらなるアッセイは生細胞の使用に関連し、これらには、薬物候補に対する応答における転写レベルを監視する遺伝子発現、細胞生存度などの巨視的効果および生化学的効果の両方を調査するように設計された機能アッセイ、ならびに薬物誘導化合物との処理の結果としての細胞中および細胞によって産生された産物が含まれる。（Ｗａｌｌａｃｅ  ＆  Ｇｏｌｄｍａｎ、１９９７、「バイオアッセイデザインおよびその実施」、高処理スクリーニング：生物活性物質の発見、Ｊ．Ｐ．Ｄｅｖｌｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２７９から３０５頁）。
【０００７】
標的に対する化合物の最初のスクリーニングでは、可能なスクリーニング数は、およそ候補数に標的数をかけたものである。候補数および標的数が増大する結果、行うべきアッセイ数が急速に増大する。実行されるべきアッセイ数の増大に加えて、このようなスクリーニングの結果を適時に且つ有用な様式で得るためにアッセイ時間を短縮することが好ましい。最後に、例えば、容易に識別可能なシグナル（異なる特異的波長を有する蛍光部分など）の使用による単一の反応ウェル内の１つのサンプルに対する多重アッセイを行う「多重化」技術を使用して処理能力を増大させることができる。
【０００８】
薬物スクリーニングアッセイに加えて、生物学的研究により、膨大な遺伝情報の蓄積および解析されたＤＮＡによってコードされる遺伝子産物の機能とほとんど相関しない多様性が明らかにされている。一方では、ヒトゲノムのヌクレオチド配列の同定は、これらの配列の生物情報学的分析と結びつけて考えると、機能的タンパク質をコードすることができるかおそらくコードする多数のタンパク質コード配列（「読み取り枠」と呼ばれる）を同定するものである。しかし、これらの配列はいかなる情報（疾患に関連する変異を有する遺伝子座の相関など）も用いない単純な配列の「読み取り」によって明らかにされているので、タンパク質標的がコードされていることおよびこのような標的に指向する薬物候補の有用性を完全に理解および同定するために、このような遺伝子座の遺伝子産物の機能を同定しなければならない。他方では、ヒトゲノム配列決定の努力により、ヒト疾患に関連し得るか関連し得ない遺伝子変異（単一ヌクレオチド多形態「ＳＮＰ」）も同定されている。いずれの例でも、このヒトゲノム情報の産物をアッセイして、それぞれ新規の遺伝子座でコードされる遺伝子（「野生型」および変異体）の活性を決定しなければならない。生命科学研究の発展には、ヒトゲノム中の漸増数の同定遺伝子によってコードされるタンパク質の構造および機能を調査するための多数のアッセイを行う研究者が必要である。薬物スクリーニングで使用されている多数の同一のアッセイおよびアッセイ形式を他の生命科学研究に使用することができる。
【０００９】
現在、病態または病態発症の傾向に関連する遺伝子変異についての個体をアッセイすることができる、分子診断分野における多数のアッセイも行わなければならない。例えば、任意の特定の疾患および疾患傾向は、疾患感受性または重篤度を同定することができる１つを超える遺伝子のいくつかの異なる変異に関連し得る。病態の監視では、疾患は、発現レベルを診断に使用して疾患の重症度を予想することができる特定の遺伝子からなる「フィンガープリント」を有し得る。これらの遺伝子の発現レベルの監視により、異なる治療様式への反応（または反応の欠如）の指標を得ることができる。
【００１０】
薬物発見、生命科学研究、ならびに分子および臨床診断におけるこれらおよび他の適用では、非常に多数のアッセイを低コストで高度に並行して行うことができるシステムおよびアッセイが必要である。化合物および試薬コスト（アッセイに必要な体積の規模）を減少させるための最初のアプローチは現存のアッセイを小型化し、それを継続している。小型化には、より感度の高い検出スキーム（従来のシグナル（例えば、比色吸収、蛍光、および化学発光）のより良好な検出器および新規の化学またはアッセイ形式（例えば、画像処理、光学スキャニング、および共焦点顕微鏡）を含む）の開発を伴う。
【００１１】
小型化は、性能上の利点を付与することもできる。短い長さの規模で、拡散限定混合が迅速であり、これを利用して高感度アッセイを作製することができる（Ｂｒｏｄｙら、１９９６、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．、７１、３４３０から３４３１）。小型化圧力駆動システムにおける流体の流速は乱流であるよりもむしろ層流であるので、洗浄および流体の置換などの処理が十分に制御される。微細加工システムもまた、大きな表面積：体積比に依存するアッセイ（表面および種々のクロマトグラフィーアプローチへの結合を必要とするものなど）が可能である。
【００１２】
流体の取扱いの開発および小型化アッセイ用の処理は、主に従来の方法の縮小に関連する。最初の薬物スクリーニングの大部分を、０．５ｍＬ未満の操作体積の９６ウェルマイクロタイタープレートで行う。これらのプレートのウェルを検出用の光学キュベットと同様に反応用の「試験管」として使用する。典型的には、流体を、自動化ピペッティングステーションまたは外部チュービングおよびポンプを使用してこれらのプレートに送達させる。自動化もプレート洗浄（例えば、固相アッセイで使用される）などのプレートの取扱いおよびサブシステムへの送達に必要である。
【００１３】
小型化により０．０１５ｍＬと０．１ｍＬとの間全反応体積用に３８４ウェルおよび１５３６ウェルマイクロタイタープレートが作製される。しかし、標準的なプレート技術を小型化した場合に多数の問題が生じる。第１に、全体積がより小さく、且つプレートが周囲に開放されているので、一連のアッセイ中の流体の蒸発は結果に影響を与え得る。開放プレートの別の欠点は、ウェル中の流体メニスカスの存在である。種々の構成のメニスカス（例えば、プレート中の不完全部または接触角度および表面張力の相違による）は、サンプルの呼び出しに使用される光学シグナルに歪みが生じ得る。光学シグナル強度がアッセイ体積の減少に伴って減少するので、バックグラウンドの歪みの修正がより困難となる。最終的に、高密度プレート用の光学スキャニングシステムは、しばしば複雑で高価である。蒸発を最小限にし、より均一な光学経路が得られ、より簡単な検出スキームが得られる方法が望ましい。
【００１４】
これらのプレートに正確に定量された流体を送達させるための高度に正確なピペッティング技術が開発されている。低体積（数μＬ未満）用のこれらの流体送達法のほとんどは、高価な圧電性ピペッティングヘッドに依存し、これは複雑であり且つ多数のウェルを独立して処理することができるように多数の独立したピペットを組み合わせるか「組にそろえる」ことは困難である。結果として、流体送達は完全または部分的に連続している（すなわち、単一のマイクロピペッターまたは全プレートを処理するために繰り返し使用される小数の並行送達システム）。連続ピペッティングは、プレートを処理するために必要な時間が増加するので並行という目的が達成されない。したがって、流体移行工程数を減少させ且つ正確な方法が必要である。
【００１５】
マイクロタイタープレート中での流体処理もまた困難である。拡散混合を向上させながらウェルの寸法を小さくすると乱流が抑制され、数十ミクロンとμｍとの間の長さの規模での混合が困難となる。類似の理由で、多くのアッセイで重要な洗浄工程が問題となり得る。プレート上の流体の操作数およびプレート自体の操作（洗浄ステーションへのおよび洗浄ステーションからの通過など）の両方を減少させる方法により、汚染、残存、および流体の損失を改良しながらコストを減少させることができる。
【００１６】
したがって、当該分野で、より少量の生物サンプル材料を使用して生物分析アッセイをより迅速且つ経済的に実行するための改良された微量操作装置および方法が必要である。当該分野でのこの必要性に関連して、本発明者らは前記プラットフォームを回転させて、これによりプラットフォームの回転による向心力を利用してマイクロプラットフォーム中に嵌め込んだマイクロチャネルによって流体の移動が誘導されるように操作するためのマイクロシステムプラットフォームおよび微量操作デバイスを開発した（２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）に開示されている）。
【００１７】
（発明の要約）
本発明は、２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）に開示のマイクロシステムプラットフォームを提供する。
【００１８】
本発明は、プラットフォームの回転によって生じた向心力によって誘導される規定チャネル中のプラットフォームに流体が移動する、マイクロプラットフォーム上で微小規模の処理を行うための装置および方法を提供する。本発明の装置の第１の要素は、回転可能な構造（最も好ましくは円盤）であるマイクロプラットフォームであり、流体（サンプル）投入ポート、流体マイクロチャネル、試薬リザーバ、回収チャンバー、検出チャンバー、およびサンプル排出ポート（一般に「微量流体構造」と呼ばれる）を備える。求心加速度を得るために円盤を約１から約３０，０００ｒｐｍで回転させることによりプラットフォームの微量流体構造を介して流体を移動させることができる。本発明の円盤はまた、好ましくは、排気ポートおよび換気チャネルを具備する。排気ポート、特に換気ポートにより、液体と空気を置換する手段を提供し、このため円盤上の液体移動が確実に制約されない。円盤上の特定の部位はまた、好ましくは、液体を分析する要素およびこれらの各エフェクターの検出器を具備する。
【００１９】
本発明の円盤は、遠心分離分析分野に既存の円盤を超えるいくつかの利点を有する。流体チャネルの寸法が小さいので流動が層流であり、これにより混合および洗浄などの処理がより良好に制御されるという事実が最も重要である。第２に、微細加工によって寸法を小さくすることにより、巨視的システムよりさらに広い範囲の回転速度およびより優れた信頼性を有し、毛細管現象に依存する「受動的」弁調節の使用が可能である。これに、既に記載の小型化の利点が加わる。
【００２０】
本発明の第２の要素は、円盤の機能を制御する円盤プレーヤー／リーダーデバイスである微量操作デバイスである。このデバイスは、円盤を装着して回転させることができる機構およびモーターを具備する。さらに、このデバイスにより、好ましくはキーボードおよびコンピュータディスプレイを使用してユーザーが円盤中のマイクロシステムを操作し、データにアクセスし、分析するための手段が得られる。微量操作デバイスにより、能動弁などの円盤上の要素の作動手段、化学的または生物学的インキュベーション用の円盤の加熱の適用と制御、および円盤への流体の添加および円盤からの流体の除去手段も有利に得られる。本発明の微量操作デバイスは、２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）により詳細に記載されている。
【００２１】
本発明は、特に、プラットフォームのシールされた表面上で移動、混合、およびアッセイ可能に流体で接続された１つまたは複数のプラットフォーム層中に含まれる微量流体構成成分を具備するマイクロシステムプラットフォームを提供する。プラットフォームは、好ましくは、複数の個々のアッセイ用に十分な体積（好ましくは、約１ｎＬから約１ｍＬ）の試薬溶液を含む試薬リザーバを具備する。試薬リザーバは、特定量の試薬溶液が各回収チャンバーに送達されるように、マイクロチャネルによって１つまたはより好ましくは複数の回収チャンバー、より好ましくは検出チャンバー、および微量流体構成成分に流体で接続されている。より好ましくは、前記試薬リザーバは混合構造、最も好ましくはサンプルリザーバにも流体で接続されている混合マイクロチャネルに流体で接続されており、１つまたは複数の試薬とサンプルを混合し、得られた混合物は検出チャンバーに送達される。好ましい実施形態では、プラットフォームは、複数のサンプルリザーバおよび複数の検出チャンバーに流体で接続された混合構造を具備する。
【００２２】
本発明のプラットフォームの使用では、プラットフォームの静止時に流体（サンプルおよび試薬を含む）をプラットフォームに添加する。その後、サンプルモーター上のプラットフォームの回転により、マイクロチャネルを介した種々の処理工程への流体の移動が誘導される。好ましい実施形態では、本発明のプラットフォームにより、アッセイ生成物検出用の検出器、最も好ましくは光学検出器の使用が可能であり、回収チャンバーは好ましくはプラットフォームの外縁に光学キュベットを具備し、最も好ましくは、プラットフォームは回転モーターの作動によって固定検出器を通過してスキャンされる。本発明のプラットフォームは、最も好ましくは、以下のより完全に記載の微細加工技術を使用して構築され、使用した流体の体積は、使用した検出器が十分に感度が高い限り任意に小さくてよい。
【００２３】
本発明は、求心加速度を使用して流体を移動させる微量流体円盤の使用による現在の技術の問題を解決する。流体を含む構成成分が少量の体積を含むように構築されているので、アッセイを行うのに必要な試薬コスト、反応時間、および生物材料の量が低減されることが本発明の微量流体プラットフォームの利点である。流体を含む構成成分がシールされているので、異なる流体の示差的蒸発による実験上のエラーおよびそれによる試薬濃度の変化が排除されることもまた利点である。本発明の微量流体デバイスは完全に密閉されているので、蒸発および光学的ひずみは無視できるほど減少する。本発明のプラットフォームはまた、「受動的」混合および弁調節が有利に可能である。すなわち、プラットフォームの構成成分の構造上の配列（下記の形状、長さ、回転軸に対するプラットフォーム表面の位置、および構成成分の内部表面の性質（湿潤性など）など）およびプラットフォーム回転の動力学（速度、加速度、方向、および方向の変化）の結果として混合および弁調節が行われ、アッセイのタイミングおよび試薬送達が制御される。
【００２４】
本発明のプラットフォームの別の実施形態では、２０００年５月１６日発行の共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（本明細書中で参考として援用される）に開示されている計量構造を使用して、分割量の試薬を１つまたは複数のサンプルリザーバに流体で接続されたそれぞれの複数の混合構造に分散することにより、共通の試薬でのサンプルの並行処理および混合が可能である。これにより、自動化試薬分散機構の必要性が低減され、試薬分配に必要な時間が短縮され（複数の反応チャンバーへの試薬の分散を並行して行うことができる）、外部に適用した起電力手段を使用することなく少量（ｎＬからμＬ）を送達できる。
【００２５】
本発明のプラットフォーム上の複数の回収チャンバーの組み立てにより、使用される検出器を単純化することもでき、これにより各回収／検出チャンバーを、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ技術を使用するための当該分野で十分に開発されている機構を使用してスキャンすることができる。最後に、本発明のプラットフォームは有利には、当該分野で公知の液体送達手段（マイクロピペッターなど）に適合することができるそれぞれのサンプルおよび試薬の充填用のサンプルおよび試薬投入ポートを具備する。
【００２６】
本発明のプラットフォームにより、少なくとも３つの方法で自動化における需要が減らされる。第１に、２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）により完全に記載の円盤上計量構造の使用により、送達された流体の正確な計量の必要性が軽減する。不正確な体積のローディング（アッセイに必要なものよりわずかに過剰）および流体計量のための円盤の回転および微量流体構造の使用が可能であるので、高密度マイクロタイタープレートアッセイに従来必要であった技術より単純な（且つあまり高価ではない）流体送達技術を使用することができる。
【００２７】
第２に、微量流体プラットフォーム上の全流体「送達」数は、マイクロタイタープレートよりも減少する。プラットフォーム上で行われる全アッセイで使用される共通の試薬（試薬溶液、緩衝液、および酵素基質など）を再分割および等分する微量流体構造の使用によって、手動および自動ピペッティング工程数は少なくとも半分に減少する（アッセイの複雑さに依存する）。デバイスへの流体移動数の減少により、全アッセイ時間を減少させることができる。これらの構造の例は、２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号（本明細書中で参考として援用される）に開示されている。
【００２８】
最後に、本発明はまた、試薬とサンプルとの混合用、得られた反応生成物の洗浄用、アッセイ回収チャンバーの別の「洗浄」ステーションへの移行の必要性がないプラットフォーム上の手段を提供する。これはまた、アッセイデバイスの操作を軽減し、流体処理を制御および統合する。
【００２９】
本発明の装置の一定の好ましい実施形態を、この出願の以下の節および図面にさらに詳細に記載する。
【００３０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、生物サンプルの微量分析アッセイおよび微量合成アッセイに適合した、２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）に開示のマイクロプラットフォームおよび微量操作デバイスを提供する。
【００３１】
本発明の目的では、用語「サンプル」は、より複雑な混合物の成分として単離または検出されるか前駆体から合成される任意の流体、溶液、または混合物を含むことが理解される。特に、用語「サンプル」は、目的の任意の生物種を含むことが理解される。用語「生物サンプル」または「生物流体サンプル」は、任意の生物由来のサンプル（血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、涙、脳脊髄液、尿、汗、植物および野菜抽出物、精液、ならびに腹水が含まれるが、これらに限定されない）を意味すると理解される。
【００３２】
本発明の目的では、用語「向心力誘導型流体微量操作装置」は、分析用遠心分離機およびローター、微量規模遠心分離装置、および最も詳細には２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）に記載のマイクロシステムプラットフォームおよび円盤操作装置を含むことが意図される。
【００３３】
本発明の目的では、用語「マイクロシステムプラットフォーム」は、２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）に記載の向心力誘導型微量流体アレイを含むことが意図される。
【００３４】
本発明の目的では、用語「キャピラリー」、「マイクロキャピラリー」、および「マイクロチャネル」は、交換可能であり、適切な場合には湿潤または非湿潤材料のいずれかで構築されると理解される。
【００３５】
本発明の目的では、用語「試薬リザーバ」、「アッセイチャンバー」、「流体保持チャンバー」、「回収チャンバー」、および「検出チャンバー」は、流体を含む本発明のマイクロシステムプラットフォーム上の規定体積を意味すると理解される。
【００３６】
本発明の目的では、用語「投入ポート」および「流体投入ポート」は、プラットフォームに流体を適用するための手段を具備する本発明のマイクロシステムプラットフォームの開口部を意味すると理解される。
【００３７】
本発明の目的では、用語「排出ポート」および「流体排出ポート」は、プラットフォームから流体を取り出すための手段を具備する本発明のマイクロシステムプラットフォームの規定体積を意味すると理解される。
【００３８】
本発明の目的では、用語「キャピラリー接合部」は、表面またはキャピラリー力を利用して流速を抑制または加速するキャピラリーまたは他の流路中の領域を意味すると理解される。キャピラリー接合物は、流体で接続された流体成分（マイクロチャネルなど）よりも深く（プラットフォーム層に対して垂直に）および／または広い（プラットフォーム層に対して水平に）親水性基板中のポケット、凹部、またはチャンバーとして得られる。９０°未満の接触角の液体用に（ほとんどがプラスチック、ガラス、シリカで作製されたプラットフォーム上の水溶液など）、チャネル断面がキャピラリー接合物の境界面で増加するように、流路が妨げられる。キャピラリー圧によって流量障害力が生じ、これはチャネルの断面寸法に反比例し、液体の表面張力に正比例し、これはチャネルを含む材料と接触する流体の接触角のコサインを乗じたものである。本発明のマイクロチャネル中のキャピラリーに関する因子は、２０００年５月１２日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号および共同所有であり同時係属中の１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）で考察されている。
【００３９】
キャピラリー接合部を少なくとも３つの方法で構築することができる。１つの実施形態では、キャピラリー接合部は、１つの成分の側面の片側または両側の寸法が他の成分の側面寸法よりも大きい、２成分の接合部で形成される。例として、「湿潤」材料または「湿潤性」材料で作製された微量流体成分では、このような接合部は、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６に記載のキャピラリーの拡大でおこる。キャピラリーを介した流体流量は、このような接合部に妨げられる。一方、非湿潤材料または非湿潤性材料で作製された成分の接合物では、流路の圧縮（チャンバーまたはリザーバからキャピラリーへの排出など）により、流れを妨げるキャピラリー接合部が作られる。一般に、大きな直径（チャンバーなど）から小さな直径（キャピラリーなど）に成分の直径が変化するときにキャピラリー接合部が形成される非湿潤性システムと対照的に、湿潤システム中で小さな直径（キャピラリーなど）などからより大きな直径（チャンバーなど）に成分の直径が変化するときにキャピラリー接合部が形成されることが理解される。
【００４０】
キャピラリーまたは流路が示差的に処理された表面を有する成分を使用して、キャピラリー接合部の第２の実施形態を形成する。例えば、親水性（すなわち、湿潤性）のチャネルを、疎水性（非湿潤性）の個別の領域を有するように処理することができる。このような親水性領域を通過するチャネルなどを介して流体は流れる一方で、流体蒸発メニスカスは疎水性領域に衝突するので、流れが妨げられる。
【００４１】
側面寸法および表面の性質の両方が変化した成分用の、本発明のキャピラリー接合部の第３の実施形態が得られる。このような接合部の例は、より大きな側面寸法を有する疎水性成分（マイクロチャネルまたはリザーバ）へのマイクロチャネル開口部である。当業者は、側面寸法のサイズが異なるか親水性が異なるかその両方の性質を有する成分の接合部で、どのようにして本発明のキャピラリー接合部を作製することができるのかを認識する。
【００４２】
本発明の目的では、用語「毛細管現象」は、本発明のローターまたはプラットフォーム上の流体にかけられた回転運動または向心力の非存在下での液体の流れを意味し、部分的または完全な湿潤性表面によると理解される。
【００４３】
本発明の目的では、用語「キャピラリー微小弁」は、流体の流れが妨害され、典型的には本発明のローターまたはプラットフォームの回転によって得られる向心力による流体への圧力の印加によって誘導することができるキャピラリー接合部を具備するキャピラリーマイクロチャネルを意味すると理解される。キャピラリー微小弁は、接合部での流体への水力学的圧力の増加、最も好ましくはプラットフォームの回転速度の増加によって達成することができるキャピラリー接合部を具備すると理解される。
【００４４】
本発明の目的では、用語「流体連絡」または「流体で接続された」は、成分間で流体が流れるように操作可能に相互接続した成分を定義することが意図される。好ましい実施形態では、プラットフォームは、回転可能なプラットフォーム、より好ましくは円盤を具備し、これにより円盤の回転時の向心力により円盤上での運動が誘導される。
【００４５】
本発明の目的では、用語「換気チャネル」は、プラットフォーム上の成分（マイクロチャネル、チャンバー、およびリザーバなど）に接触し、流体移動によってプラットフォームおよびローターの成分から空気を置換可能な孔およびマイクロチャネルを含むプラットフォーム表面のポートを含むと理解される。
【００４６】
１つまたは複数の微量合成または微量分析システム（本明細書中で「微量流体構造」と呼ばれる）を具備する本発明のマイクロプラットフォーム（好ましくは、以後まとめて「円盤」といい、本発明の目的では、用語「マイクロプラットフォーム」、「マイクロシステムプラットフォーム」、および「円盤」は交換可能であると考える）が得られる。このような微量流体構造はまた、円盤の回転の際に成分間で流体が流れる操作可能に相互接続された本明細書中でさらに詳述の関連成分の組み合わせを含む。下記のように円盤に統合されるか、円盤に結合されるか、円盤上に置かれるか、円盤に接続されるか、円盤に嵌め込まれるモジュールとして、これらの成分を微細加工することができる。本発明の目的では、用語「微細加工する」は、ミリメートル以下の規模でのこれらの構造を生産させる処理をいう。これらの処理には、成形、フォトリソグラフィー、エッチング、打ち抜き、および当業者に公知の他の手段が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明はまた、デバイス内で円盤が回転して、円盤上の流体が流れる向心力が得られる、本発明の円盤の操作用の微量操作デバイスを含む。したがって、このデバイスにより、円盤回転の停止および開始および有利には円盤回転方向の変更のために回転速度を制御して円盤を回転させる手段が得られる。電気機械手段および制御手段の両方は、本明細書中でさらに記載のように、本発明のデバイスの成分として提供される。２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）にさらに記載のように、ユーザーインタフェース手段（キーパッドおよびディスプレイなど）もまた提供される。
【００４８】
本発明は、回転可能な分析／合成微量体積アッセイプラットフォームおよび回転の結果としてのプラットフォーム上の向心力から生じるプラットフォーム上の流体移動を達成するようなプラットフォームの操作用の微量操作デバイスである、特別に適合されたマイクロプラットフォームの組み合わせを提供する。本発明のプラットフォームは円形の円盤であることが好ましく且つ有利であるが、プラットフォーム上の流体に向心力を与えるように回転することができる任意のプラットフォームが本発明の範囲内であることが意図される。本発明の微量操作デバイスは、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）により十分に記載されている。
【００４９】
流体（試薬、サンプル、および他の液体成分）の移動を、プラットフォームの回転による求心加速度によって制御する。マイクロシステムプラットフォーム上の特定の微量流体構造に適切な速度および圧力下での流体の流れに必要な求心加速度の大きさを、因子（プラットフォームの有効半径、マイクロチャネルの内部直径、プラットフォームの回転方向および回転速度に関するプラットフォーム上マイクロチャネルの位置角が含まれるが、これらに限定されない）によって決定する。本発明の方法の一定の実施形態では、２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）に記載のように、未計量の流体（サンプルまたは試薬溶液のいずれか）は、プラットフォームに適用し、流体リザーバからマイクロチャネルに計量された流体は移動する。好ましい実施形態では、本発明のプラットフォームによって得られた計量流体サンプルは、約１ｎＬから約５００μＬである。これらの実施形態では、流体を複数の微量流体構造の成分の分散させる１つまたは複数の計量キャピラリーを具備する計量多岐管が得られる。
【００５０】
本発明のプラットフォーム成分は、互いに流体で接続されている。好ましい実施形態では、本発明のプラットフォーム表面を含むマイクロチャネルによって流体接続が得られる。マイクロチャネルのサイズを、本発明のプラットフォームおよび方法の特定の各実施形態に必要な特定の適用、流体の送達速度および量によって最適に決定される。マイクロチャネルサイズは、０．１μｍから円盤の厚さ（例えば、約１ｍｍ）に近い弁のサイズの範囲であり得る。好ましい実施形態では、マイクロチャネルの内部寸法は、０．５μｍから約５００μｍである。マイクロチャネルおよびリザーバの形状は、台形、円形、または必要に応じた他の幾何学的形状であり得る。マイクロチャネルは、好ましくは、約０．１から２５ｍｍの厚さのマイクロシステムプラットフォームに嵌め込まれており、プラットフォームの厚さを横切るマイクロチャネルの断面寸法は１ｍｍ未満であり、プラットフォームの断面寸法の１から９０％であり得る。サンプルリザーバ、試薬リザーバ、反応チャンバー、回収チャンバー、検出チャンバー、ならびにサンプル投入および排出ポートは、好ましくは、約０．１から２５ｍｍの厚さのマイクロシステムプラットフォームに嵌め込まれており、プラットフォームの厚さを横切るマイクロチャネルの断面寸法は、前記プラットフォームの断面寸法の１から７５％である。好ましい実施形態では、このようなチャネルを介した流体の送達を、所望の成分間で流体の移動を誘導させるのに十分な回転時間および回転速度でのプラットフォームの同時回転によって行う。
【００５１】
本発明のマイクロチャネルを介した流速は、マイクロチャネルの長手方向の長さまたは経路および流体粘度に反比例し、マイクロチャネルの水力直径の二乗、プラットフォームの回転速度の二乗、円盤の中心からのチャネル中の流体の平均距離、および向心力に供される流体の半径の範囲の積に正比例する。チャネルの水力直径は断面領域と断面の周囲との比に比例するので、流体がチャネルに流れる深さおよび幅を賢明に変化させることができる（Ｄｕｆｆｙら、１９９８、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７１、４６６９から４６７８および共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０（参考として援用される）を参照のこと）。
【００５２】
例えば、高密度の流体は同一の幾何学的パラメータおよび回転パラメータが与えられた低密度の流体よりも急速に流れる。同様に、低粘度の流体は同一の幾何学的パラメータおよび回転パラメータが与えられた高粘度の流体よりも急速に流れる。微量流体構造が動径方向に沿って置換される場合、それにより円盤の中心からの流体の平均距離が変化し、他のパラメータを維持しながら以下のように流速に影響を与える：中心からの距離が長いほど流速があがる。流体の半径範囲の増加または減少により、流速も増加または減少する。これらの依存性は、全て直線的である。水力直径の変化により、水力直径に対する流速が四次で依存し（または水力直径に対する流体の流速が四次で依存する）、流速は直径の長さに一致する。最後に、回転速度の増加により、流速または流体の流速は二次的に増加する。
【００５３】
投入および排出（流入および流出）ポートは、流体成分の導入または除去に使用される本発明のマイクロプラットフォームの成分である。流入ポートを、サンプルおよび試薬を円盤上に置くか円盤に注入するように提供する。これらのポート型は、一般に、円盤の中心に向かって設置する。流出ポートもまた、円盤から生成物を除去可能なように提供する。ポートの形状およびデザインは、特定の適用にしたがって変化する。例えば、サンプル投入ポートを、特に、円盤へのサンプルを有効に引き込むように毛細管現象が可能なように設計する。さらに、ポートを、自動化サンプル／試薬ローディングまたは生成物の除去が可能なように構成することができる。流入および流出ポートを整列させることが最も有利であり、これにより複数のサンプルが円盤に適用され、マイクロプラットフォームから生成物が除去される。
【００５４】
本発明のプラットフォームのいくつかの実施形態では、投入および排出ポートを、手動式ピペッターおよびプラットフォームのリザーバに流体を送達させる他の手段の使用に適用する。あるいは、有利な実施形態では、プラットフォームを自動化流体ローディングデバイスの使用に適用する。このような自動化デバイスの１つの例は、プラットフォームの表面に沿って動径方向に移動するロボットアームに設置した１つのピペットヘッドである。この実施形態では、プラットフォームを、適切なリザーバを処理するために動径方向に移動するピペットヘッドの下で回転モーターの軸に対して方位角方向で配置することができる。
【００５５】
別の実施形態は、プラットフォーム表面上のリザーバのサブセットまたは全てのいずれかで、複数のリザーバを処理するために適用したピペッターヘッドである。ピペッターヘッドがリザーバのサブセットを処理する実施形態では、１つのヘッドに３つのピペッティング単位（所与のアッセイで使用されるそれぞれの流体に対して１つ）を設置可能であり、これは、ピペッターの互いの空間的関係を変化させることなく３つ全てのリザーバを処理することができるような構成に配置される。図１に例示のように、これを、６つのこのようなピペットに拡大することができる（内部リングに３つおよび外部リングに３つ）。多数のヘッドを使用することができるが、プラットフォーム周囲に「低密度に」分散させる（例えば、３６０°に２４ヘッド）。ヘッドを含むアームおよびヘッド下のテーブルの配置を使用して、円盤全体に充填することができる。最後に、全てのリザーバを処理する特別に設計したヘッドもまた、有利に提供される。
【００５６】
換気チャネルもまた円盤上の空気操作システムに含まれ、これにより、流体の移動が流体の移動方向とは逆に流体含有マイクロチャネルが接続されたチャネルを介して空気を置換し、流体の移動をさらに誘導する正圧が得られる。
【００５７】
特定の適用に適切な種々の構成および表面被覆物を有する、円盤などの本発明のプラットフォームおよびこのようなプラットフォームを具備する微量流体成分が有利に得られる。プラットフォームの構成は、構造上の必要性、製造工程、および試薬適合性／耐化学性の関数である。特に、無機結晶性材料または無定形材料（シリコン、シリカ、石英、不活性金属など）または有機材料（プラスチック（例えば、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、アセトニトリル−ブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリプロピレン、およびメタロセン）など）から作製されたプラットフォームが提供される。これらを、下記の非改変または改変表面とともに使用することができる。プラットフォームはまた、熱硬化性材料（ポリウレタンおよびポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）など）から作製することができる。本発明によって、これらの材料の複合物または組み合わせから作製されたプラットフォームもまた得られる。例えば、プラットフォームは、プラットフォームの検出チャンバーを含む光学的に透明なガラス表面が嵌め込まれたプラスチック材料から製造される。あるいは、異なる材料で作製された層で構成されたプラットフォームを作製することができる。２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）に開示のように、これらの材料の表面の性質を特定の適用のために改変することができる。
【００５８】
好ましくは、円盤は、例えば、プラスチック、シリカ、石英、金属、またはセラミックで作製されたプラットフォーム上に微細加工された機械的、光学的、および流体制御成分が組み込まれる。以下により詳細に記載のように、これらの構造を、成形、フォトリソグラフィー、エッチング、打ち抜き、および他の適切な手段によってミリメートル以下の規模で構築する。複数の微量流体構造を具備するプラットフォームもまたは本発明に含まれ、微量流体およびリザーバのそれぞれの組み合わせまたは共有するこのようなリザーバにより流体で接続されることもまた認識される。このようなプラットフォームの例を、図１に示す。
【００５９】
プラットフォームの製造および組み立て
本発明のマイクロシステムプラットフォームを具備する基板に嵌め込まれた微量流体構造を提供する。プラットフォームを、互いに結合した別の成分を含む層として製造し、組み立てることが好ましい。図１に例示するように、本発明のプラットフォームの例示的実施形態に、２つの層（リザーバ層および微量流体層）を具備する。さらなる層を有するプラットフォームもまた本発明の範囲内である。
【００６０】
プラットフォームのリザーバ層を、アクリル、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはポリエチレンなどの熱可塑性材料から製造する。このような材料については、製作加工法には、機械加工および従来の射出成形が含まれる。射出成形では、プラットフォームの特徴を規定するために使用される成形インサートを、機械加工、放電研削機械加工、および当該分野で公知の他の手段を使用して作製することができる。
【００６１】
プラットフォームのリザーバは、熱硬化性材料または加熱、照射、または他のエネルギー源に供するまで液体形態で存在する他の材料から製造することもできる。熱硬化性材料の例には、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ポリウレタン、またはエポキシが含まれる。典型的には、これらの材料は、２つのパーツの製造から得られる。２つのパーツを所定の比で混合し、鋳型に注入するか鋳型の上に注ぎ、熱に供してプレポリマー流体中に存在するモノマー架橋を開始および完了させる。プレポリマー流体の鋳型への迅速な注入処理およびその後のパーツの架橋または硬化を、しばしば反応射出成形（ＲＩＭ）という。プレポリマー流体の鋳型上への流し込みおよびその後のパーツの架橋または硬化を、しばしば鋳造という。ＲＩＭまたは鋳造用の成形インサートを、標準的な機械加工、および当該分野で公知の他の手段を使用して製作することができる。
【００６２】
プラットフォームの微量流体層を、アクリル、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはポリエチレンなどの熱可塑性材料から製造することもできる。チャネルおよびキュベットの寸法がリザーバ層に見られる寸法よりもはるかに小さくてもよいので、これらの材料を使用した典型的な製作法には、機械加工および従来の射出成形だけでなく、圧縮／射出成形および型押しまたは硬貨鋳造も含み得る。射出成形では、プラットフォームの特徴を規定するために使用される成形インサートを、機械加工、放電研削機械加工などの従来の方法を使用して作製することができる。細かすぎて従来の方法では作製できない特徴を有する成形インサートには、種々の微細加工技術を使用する。これらには、フォトレジストおよびフォトマスクの使用によるシリコンウェハ基板上にパターンを作製するシリコンミクロ機械加工が含まれる（Ｍａｄｏｕ、１９９７、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）。シリコンウェハをエッチング剤に供した場合、フォトレジストはフォトレジスト下での薬剤のシリコンへの浸透を防止する一方で、シリコンの暴露領域中でエッチングされる。この方法では、シリコンにパターンをエッチングし、これを使用して型押しによって直接微細加工されたプラスチックパーツを作製することができる。この処理では、エッチングされたシリコンを高圧下およびプラスチックのガラス転移温度付近で平らな熱可塑性シートと接触させる。結果として、パターンがネガでプラスチックに移される。
【００６３】
エッチングされたシリコンを使用して、例えば、金属ニッケルを使用した電気メッキによって金属成形インサートを作製することもできる。異方性もしくは等方性ウェットエッチングまたは深反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）などの種々の技術の任意の１つを使用してエッチングしたシリコンを、金属鋳型の基礎として使用することができる。ニッケルのシード層が蒸発によってシリコン上に蒸着し、一旦このような電導性種層が形成されると、従来の電気メッキ技術を使用して厚いニッケル層を作製することができる。次いで、典型的には、シリコンを除去する（Ｌａｒｓｓｏｎ、１９９７、Ｍｉｃｒｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｂｕｌｌ．、１：３）。次いで、従来の射出成形または圧縮／射出成形にインサートを使用する。
【００６４】
成形インサート用のシリコンミクロ機械加工に加えて、代わりとしてシリコンをエッチングしないフォトリソグラフィーを使用して鋳型を作製することができる。シリコンまたは他の適切な基板上にフォトレジストパターンを作製する。シリコンミクロ機械加工においてのシリコンウェハのエッチングよりもむしろ、フォトレジストパターンおよびシリコンを電気メッキ、熱蒸着、または当該分野で公知の他の手段によって溶射する。次いで、金属レリーフパターンを、上記のように硬貨鋳造、射出成形、または圧縮／射出成形の鋳型として使用する。
【００６５】
プラットフォームの微量流体層を、リザーバ層生産用の上記の熱硬化材料を使用して製造することもでき、前記微量流体層の熱効果樹脂の成形パターンは上記のように調製される。反応−射出成形および鋳造は射出成形の高圧および高温を必要としないので、広範な種々の成形パターンを使用することができる。シリコンまたは金属成形インサートに加えて、記載のフォトレジストパターンを成形レリーフ自体として使用することもできる。フォトレジストは射出成形の高圧および高温に耐えられないが、鋳造またはＲＩＭのより穏やかな条件では有意な損害はない。
【００６６】
プラットフォームの組み立てには、リザーバ層への微量流体層の位置合わせおよび結合が含まれる。本明細書中に記載のアッセイの実行に有用なプラットフォーム上の微量流体構造用に、リザーバ層中の一定の微量流体経路を、微量流体層中の一定の微量流体経路に接続しなければならない。微量流体層およびリザーバ層上の基準マークの光学アラインメントまたはピンによる微量流体層上の穴、凹部、またはリザーバ層上の特徴づけによって、これらの微量流体経路の位置合わせを行うことができる。微量流体層中の微量流体経路よりもはるかに大きなリザーバ層中の微量流体経路またはその逆の設計によって、必要な位置合わせの許容範囲は緩和される。
【００６７】
コンフォーマルシーリング、熱シーリング、融着、両面接着テープまたは熱シールフィルムでの結合、紫外線（ＵＶ）硬化接着または熱硬化接着剤での結合、化学結合、または溶媒での結合を含む多数の方法で結合することができる。
【００６８】
コンフォーマルシーリングの要件は、片方または両方の層がエラストマー材料で作製されており、且つ結合表面が２つの層の物理的接触を制限させる粉塵および破片を含まないことである。好ましい組み立てアプローチでは、エラストマー微量流体層を強固なリザーバ層に関して位置合わせしてプレスする。エラストマー微量流体層をシリコンから作製することが有利であり、強固なリザーバをアクリルまたはポリカーボネートから作製することが有利であり得る。手動プレスによりファンデルワールス力により層を接着可能である。
【００６９】
熱シーリングまたは融着の要件は、リザーバ層および微量流体層が共に熱可塑性材料から製造され、且つ両層材料が無定形ポリマーの場合はガラス転移温度、半結晶性ポリマーの場合は融点以上の温度でシーリングされることである。好ましい組み立てアプローチでは、微量流体層をリザーバ層に関して位置合わせしてプレスし、この多層円盤を２つの平面加熱ブロック間に置き、加熱ブロックによって多層をプレスする。多層円盤の各表面の時間プロフィールに対する温度の調整および多層システムに適用した時間プロフィールに対する圧力の調整により、２つの層が結合し、各層内の特徴のばらつきも最小化可能な時間−温度−圧力プロフィールを決定することができる。例えば、１時間にわたる２５０ｐｓｉの定圧での２つのアクリル円盤を室温からアクリルのガラス転移温度まで加熱することは、幅２５０μｍの流体チャネルのばらつきを最小限にさせる手法である。別の組み立てアプローチでは、微量流体層およびリザーバ層の結合表面を、放射ランプを用いて非接触様式で個別に加熱し、結合表面がガラス転移温度に達した場合、微量流体層をリザーバ層に関して位置合わせしてプレスする。
【００７０】
両面接着テープまたは加熱シールフィルムを使用して、微量流体層とリザーバ層とを結合させることができる。結合前に、最初に、２つの層の間を流体が送達可能なようにテープ（またはフィルム）に穴をあけ、テープ（またはフィルム）をテープ（またはフィルム）／リザーバ多層に位置あわせし、その上に適用する。表面に熱シールフィルムを結合させるために、フィルムの接着ポリマー材料の、無定形ポリマーの場合はガラス転移温度、半結晶ポリマーの場合は融点を超える温度にフィルムを加熱する必要がある。接着テープまたは熱シールフィルムへの結合のために、典型的には、手動プレスを用いて適切な結合を行うことができる。
【００７１】
光重合ポリマー（例えば、ＵＶ硬化接着剤）または熱硬化性ポリマーを使用して、微量流体層とリザーバ層を接着することができる。１つのアプローチでは、この接着剤を層の両方に適用する。適用方法には、ペインティング、スプレー、浸漬コーティング、またはスピンコーティングが含まれる。接着剤の適用後、層を組み立て、紫外線照射または熱に暴露して接着剤の架橋または硬化を開始および完了する。別のアプローチでは、微量流体層およびリザーバ層を、接着剤のみを使用する一組のチャネルと組み立てる。これらのチャネルは、例えば、アッセイ用の流体チャネルおよびキュベットを取り囲み得る。微量流体層をリザーバの位置にあわせてプレスする。接着剤を種々のチャネルにピペッティングし、接着剤がこれらのチャネルに充填された後、組み立てられたシステムを紫外線照射または熱に暴露して接着剤を架橋または硬化させる。
【００７２】
最初に、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはシリコンを酸素プラズマに暴露し、その後同様に処理したシリコン表面上に周囲の環境下でプレスした場合、２つの表面は接着する。プラズマ処理により、シリコン表面がシラノール表面に変換し、表面が接触した場合にシラノール基はシロキサンに変換されたと考えられる（Ｄｕｆｆｙら、１９９８、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０、４９７４から４９８４）。この化学結合アプローチを使用して、シリコン微量流体層とリザーバ層とを接着させる。
【００７３】
溶媒結合の要件は、微量流体層およびリザーバ層の両方の結合表面を紫外線で溶媒和させるか可塑化することができることである。溶媒結合では、結合表面をそれぞれ適切な溶媒和流体でペイントするか、それぞれ適切な溶媒和蒸気に暴露して互いに位置併せをしてプレスする。可塑化によりポリマー分子がより移動性を持つようになり、表面が接触した場合、ポリマー分子は絡み合うようになる。一旦溶媒が蒸発すると、ポリマー分子はもはや移動性を失い、分子が絡み合うので、２つの表面が物理的に結合する。別のアプローチでは、微量流体層およびリザーバ層を、溶媒のみのために使用される一組の流体チャネルで組み立て、上記のように層がＵＶ硬化または熱硬化接着剤を使用したかのように層が結合する。
【００７４】
本発明のより詳細な説明のために図を参照すると、図１は、特に液相アッセイ用の多数の類似または同一の微量流体構造に適切な円盤の例の分解図を示す。ここで示した円盤は、一般式（第１の流体Ａと第２の流体Ｂとの混合およびその後の組み合わせた流体（Ａ＋Ｂ）と第３の流体Ｃとの混合）の９６アッセイを行った。これらのアッセイは「独立している」。流体Ａ、Ｂ、およびＣを適切な流入ポートによって各アッセイ用の各リザーバにロードする。この方法では、流体Ａ、Ｂ、およびＣは、全てのアッセイで同一である必要はないが、使用者が選択することができる。以下により完全に記載するように、より多数のこのような微量流体構造を有するプラットフォームが本発明で意図される。
【００７５】
この円盤は、所与の半径の円盤周囲微量流体構造の反復および異なる半径位置の置換用の構造の改変によって同一のアッセイを行うことができることを例示する。この方法では、アッセイ用の微量流体構造での円盤表面の完全な被覆が可能である。実行可能なアッセイの最大数は、再生可能に操作することができる流体体積（すなわち、円盤を組み立てることができる再生可能な最小寸法および都合の良い回転速度でのマイクロチャネルによる少量の流体の駆動に必要な水力学的圧力量）に依存する。これらを考慮して、６ｃｍの円盤を有する円形プラットフォームで１から５ｎＬの体積を有する１０，０００を超えるアッセイを行うことができると推定される。
【００７６】
図１では、プラットフォーム１００は、少なくとも２つの層から構成される。リザーバ層２０１は、微量流体層３０１に結合されている。リザーバ層の底面は、下記の微量流体層と対になっている場合、中心軸についてのプラットフォームの回転によって得られる向心力の推進下で流体が流れる密閉されたチャネルおよびリザーバ層の完全なネットワークを形成する。流体の流れによりアッセイ中の種々の成分流体が混合され、混合構造によるかアッセイ回収チャンバー中のサンプルおよび試薬リザーバから流体が移動する。さらに、流体の流れは、２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号（本明細書中で参考として援用される）に開示の構造を使用して、インキュベーションおよび洗浄工程を含めることができる。約１ｎＬ／ｓから約１０００μＬ／ｓの流体の流速は、約４から約３０，０００ｒｐｍの回転速度で達成される。２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６、１９９７年１２月１９日提出の０８／９９５，０５６、および１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される）に記載のように、「受動」またはキャピラリー弁を使用して、プラットフォーム中の流体の流れを制御することが好ましい。本発明のプラットフォーム操作では、回転誘導性静水圧と毛細管圧との間の競合は小さなチャネル中で発揮され、開口部を利用して回転依存性通門または弁調節システムが得られる。流体がプラットフォームの外縁に対して存在する検出チャンバーに堆積し、シグナル、最も好ましくは光学シグナルが検出される。
【００７７】
プラットフォーム１００は、好ましくは円盤の形状（直径約１０ｍｍから５０ｍｍ、厚さ約０．１ｍｍから約２５ｍｍの円形平面プラットフォーム）で提供される。プラットフォームを具備する各層は、好ましくは、実質的に他の層と同一の直径であるにもかかわらず、いくつかの実施形態では、異なる層の直径は完全に一致する必要はない。各層は約０．１ｍｍから約２５ｍｍの範囲の厚さを有し、この厚さは、層に含まれる微量流体成分の容積に一部依存する。
【００７８】
リザーバ層
リザーバ層２０１の構造を図２に示し、これは本発明のこのプラットフォームの実施形態をより明確に例示するために「底面」が示されている。この方法での表面の例示により、微量流体層３０１がどのような特徴で整列しているのかを容易に認められる（より完全には、以下の図４および図５に示す）。
【００７９】
リザーバ層２０１は、好ましくは、円盤の形状（直径約１０ｍｍから５０ｍｍ、厚さ約０．１ｍｍから約２５ｍｍの円形平面プラットフォーム）で提供される。層は、好ましくは、軸上に埋め込まれた、直径約１ｍｍから約２０ｍｍの中心穴２０２を具備する。中心穴２０２は、軸への接続用の押し出し金具と交換することができるか、結合させた微量流体層またはプラットフォーム表面の別の部分を使用して軸との位置合わせおよび接続を行う場合は全く存在しなくても良い。リザーバ層２０１はまた、位置合わせの特徴（近接するプラットフォーム上の取付具を締め付ける溝２０３など）を有し得るか、軸にプラットフォームをロードする場合はプラットフォームの上部表面に接触しない。この特徴を有する実施形態では、締め付け用取付具（バネが装着されていることが好ましい）上のピン（円盤としての溝中のスリップ）は低ｒｐｍでスピンし、締め付け用取付具を捕獲し、それによりそれに関するプラットフォームの方向が決定される。他の実施形態では、プラットフォームは、プラットフォーム表面に設置され、円盤がスピンするエミッタ／フォトダイオード対によって感知可能な反射／吸収ストライプである「ホームフラッグ」２０４を具備する。
【００８０】
図３は、リザーバ層の拡大断面図を示す。図に示すように、本発明のプラットフォームのこの実施形態は、３つのリザーバに加えて、アッセイの２つの同心円に配列された各アッセイ用の１つの回収／検出チャンバーを含む。各リザーバは、幅約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、長さ約０．０５ｍｍから約２０ｍｍ、厚さ０．０５ｍｍから約５ｍｍの寸法であり、約０．１ｎＬから約５００ｎＬの容積である。リザーバ２０５、２０６、および２０７を、アッセイの内輪に流体Ａ、Ｂ、およびＣを含むように設計し、リザーバ２１１はアッセイの内部セット用の検出チャンバーである。同様に、リザーバ２０８、２０９、および２１０は、アッセイの外輪に流体Ａ、Ｂ、およびＣを含み、２１２は検出チャンバーに対応する。この８つのリザーバ（２０５から２１２）の回収は、本発明の例示のプラットフォーム上で７．５°の方位角間隔で円盤周囲に合計４８回反復している。このようなリザーバのより小さいかより多数のアレイを有するプラットフォームは本発明の範囲内であり、最も好ましくは、微量流体層上の微量流体成分のパターンに適合する構成でプラットフォームの表面領域の周囲に等間隔で配置されている。
【００８１】
内輪のリザーバはまた、使用前に流体がロードされるローディング穴２１３を含む。ローディング穴２１３は、好ましくは、マイクロピペッター（例えば、チップ直径１．５ｍｍを有する標準的な２００μＬプラスチックピペット）；直径１ｍｍのマイクロピペットチップ；圧電性またはセラミック滴下送達システム（ＩＶＥＫ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＴから販売）；およびインクジェットベースの流体送達システム；などの自動化ローディングデバイスに適合する寸法である。圧電性またはインクジェット送達などの非接触送達システムでは、ポート寸法は、液滴サイズよりも数倍大きくなければならない（例えば、１ｎＬの液滴では０．２ｍｍ）。
【００８２】
アッセイ回収／検出チャンバーはまた、流体の運動によって置換される空気を逃がすことができる、約１００から約５００μｍの断面寸法の換気穴２１４を含む。これらの穴を、任意に、１つまたは複数の空気穴に収容リザーバが接続された、多岐管または一連のチャネルと交換することができる。
【００８３】
回収／検出チャンバーを、例えば、光学的に透明なプラスチックまたは他の材料で構成することによって光学信号にアクセス可能なように設計する。
【００８４】
微量流体層
本発明のプラットフォームの実施形態の微量流体層を、図４および図５に示す。
【００８５】
微量流体層３０１は、微量流体層と同一の側面寸法であることが最適である。軸上に取り付けるための任意の中心穴３０２も存在するが、これは全ての構成に必要というわけではない。
【００８６】
微量流体層は、微量流体構造３０４のアレイ３０３を含み、アレイ中の構造数は、プラットフォーム上で行われる並行アッセイ数の半分である。図に例示の実施形態では、このような構造が７．５°の角度で繰り返されて４８個存在する。微量流体構造３０４は、好ましくは、約５μｍから約５００μｍの断面寸法および約１０μｍから約３ｍｍの微量流体層の深さを有するマイクロチャネルを具備する。
【００８７】
図５は、微量流体構造の１単位の拡大図である。各微量流体構造は、１つの内輪および１つの外輪アッセイ用の微量流体を具備する。微量流体構造は、１つまたは複数の２ミクロンと１０００ミクロンとの間の範囲の深さの微量流体円盤表面の凹部からなるが、以下にさらに記載のように、凹部の幅は約２μｍから約５００μｍで変化する。
【００８８】
内輪アッセイの微量流体成分の構造を以下に示す。リザーバ２０５および２０６にそれぞれマイクロチャネルが作製されるようにリザーバ層と微量流体層との間の組み立てによってマイクロチャネル３０５および３０６は整列している。マイクロチャネル３０７は、マイクロチャネル３０８へのマイクロチャネル３０５および３０６を介した流体と置換される空気用の大きな空間である。いくつかの実施形態では、マイクロチャネル３０５および３０６は、混合マイクロチャネル３０８との接合前にキャピラリー接合物３０９を形成させるために狭められている。混合マイクロチャネルを、混合物がマイクロチャネルの長手方向の範囲を通過するように、異なる溶液を混合するように構成する。混合の程度は、流体の流速および混合マイクロチャネルの長手方向の範囲に依存し、これは、２つの流体が接触して混合される時間に比例する。混合の程度はまた、混合マイクロチャネルの側面範囲に依存し、さらに混合される流体の拡散定数に依存する。有用な範囲の粘度を有する流体の十分な混合の長さを有する混合マイクロチャネルを適応させるために、図５に記載の混合マイクロチャネルが提供される。図５に例示のように回転方向に対して垂直なプラットフォーム表面上の経路を通過するが回転軸からより近位からより遠位の位置のプラットフォーム表面に容易に達するように、数回屈曲させてマイクロチャネルを構成することによって混合を促進する。混合マイクロチャネル３０８は、約１ｍｍから約１００ｍｍの長さであり、いくつかの場合、その長さは屈曲の使用によって達成される。混合マイクロチャネル３０８は３１０でのキャピラリー接合物を有し、マイクロチャネルの内部直径は約０から９５％で変化し、キャピラリー接合物３１１に連結している。キャピラリー接合部３１１は、３１０でのキャピラリー接合物より側面または垂直方向またはその両方が大きい。
【００８９】
デバイス中での混合は拡散によって促進される。２つの少量のＡおよびＢを１つの容器に添加した場合、ＢへのＡの拡散および／またはＡへのＢの拡散は効果的な混合となる。この混合に必要な時間は、混合物が望ましい溶液内の分子と分子が拡散されなければならない距離との拡散定数に依存する。例えば、拡散定数Ｄの分子を含む０．５μＬの溶液Ａを１ｍｍ離してリザーバに添加する。この拡散定数の分子を含む溶液Ｂも添加する。溶液は、最初、溶液を区切る体積で占められる。流体の混和性が高い場合でさえ、完全に均質な溶液を得るための分散時間は、およそｔ＝２ｘ２／Ｄである。ｘ＝０．０５ｃｍ（０．５ｍｍ）およびＤ＝１０−５ｃｍ２／ｓでは、混合時間は５００秒であり、ほとんどの反応では受け入れられないほど長時間である。この混合時間を、例えば、機械的撹拌によって短縮することができるが、液体の流れが層流であり、混合を促進することが公知の乱流の渦巻きを含まないので、小さな構造に閉じ込められた流体中での撹拌は困難である。１ｍｍ３の容器中で流体ＡついでＢに置換する代わりに、流体ＡおよびＢを側面寸法ｄの長くて薄いキャピラリーに並行して置いた場合、混合時間は非常に短縮される。例えば、ｄが１００ミクロンの場合、混合時間ｔは２０秒である。デバイスの混合チャネルは、キャピラリーマイクロチャネルへの流体の流れＡおよびＢの同時注入によって長いキャピラリー中での流体の置換を刺激する。これらの流体は、最初にチャネルに並行して下に流れる。流体がプラットフォームの回転によって生じた向心力によってマイクロチャネルを介して押し出されるにつれて、流体間に拡散が起こる。十分に狭い直径、十分な長さ、および十分に低いポンピング速度のキャピラリーの選択により、ポンピング中にチャネルに存在するＡおよびＢの全体積のうちのＡおよびＢの一部を混合することができる。
【００９０】
流体がチャネルを通過するのに必要な時間に等しい必要な混合時間の設定によって、これらの選択を決定することができる。拡散に必要な時間は、
【数１】
2004529312.tif 000002
（式中、ｗはチャネルの側面サイズである）である。チャネル通過に必要な時間は、単純にチャネル長さを流速で割り、速度を、共同所有であり同時係属中の１９９７年８月１２日に提出した米国特許出願番号０８／９１０，７２６およびＤｕｆｆｙら、１９９９、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７１、４６６９から４６７８に記載のように以下の式
【数２】
2004529312.tif 000003
（式中、流体の性質は密度ｐおよび速度ηであり、ΔＲおよび＜Ｒ＞は求心加速度に供される流体の半径および平均半径位置であり、ｌおよびｄＨはチャネルの長さおよび水力直径である）で計算する。ｔｔがｔｍと少なくとも等しいか高くなるような変数の選択により、マイクロチャネル中での混合を確認する。
【００９１】
リザーバ２０７中の流入３１２はマイクロチャネル３１３に向かって突出しており、好ましくはキャピラリー接合部３１１と実質的に同一の寸法を有するキャピラリー３１４を形成する。マイクロチャネル３１３は３１５で側面寸法が変化しながら通過し、マイクロチャネルの内径は０％と９５％との間で変化してキャピラリー３１１に連結する。キャピラリー接合は、末端３２８で終了し、検出チャンバー２１１まで突出している混合マイクロチャネル３２７にさらにつながる。混合マイクロチャネル３２７は、長さ約１ｍｍから１００ｍｍであり、図に例示のように１つまたは複数の屈曲を含むことが好ましい。
【００９２】
外輪微量流体の構造を以下に示す。マイクロチャネル３１６および３１７は、マイクロチャネルがそれぞれ２０８および２０９から突出するように、リザーバ層と微量流体層との間での組み立てによって整列されている。マイクロチャネル３１８はマイクロチャネル３１６および３１７からマイクロチャネル３１９に流れる流体と空気が置換される拡張空間である。いくつかの実施形態では、マイクロチャネル３１６および３１７は、混合マイクロチャネル３１９への連結前にキャプラリー接合部３２０を形成するように狭くなっている。混合マイクロチャネル３１９は、３２１で側面寸法がキャピラリー接合部３２２に変化しながら通過する。同様に、リザーバ２１０中の流入３２３がマイクロチャネル３２４に向かって突出し、キャピラリー接合部３２５を形成し得る。マイクロチャネル３２４は、３２６で側面寸法がキャピラリー接合部３２２に変化しながら通過する。キャピラリー接合は、末端３３０で終了し、検出チャンバー２１２まで突出している混合マイクロチャネル３２９にさらにつながる。混合マイクロチャネル３２９は、長さ約１ｍｍから１００ｍｍであり、図に例示のように１つまたは複数の屈曲を含むことが好ましい。
【００９３】
外輪構造についての微量流体成分の寸法は、（本明細書のように）上記の内輪微量流体構造についての対応する成分と同一であり得る。流体の流速がプラットフォーム上の構造の位置と無関係に各微量流体構造流で実質的に同一であるように、成分の寸法を選択する。本発明のプラットフォームの設計における重要事項は、所与の回転速度で流体の流速を測定するマイクロチャネルの直径、長さ、および円盤上の位置、ならびに受動的または毛細管現象で弁調節される回転速度を測定する、キャピラリー接合部につながるチャネルの直径の半径位置である。図および本明細書中に記載のプラットフォームでは、内輪構造および外輪構造についての同一の成分寸法を使用して、同様に（すなわち、同一の回転速度で）アッセイを行う。これは、混合マイクロチャネルの長さの結果であり、外輪アッセイの流速が内輪での流速よりも高いにもかかわらず、実質的に完全に混合されるのに十分な長さである。さらに、各アッセイについての２つのキャピラリー弁調節事象との間の回転速度の分離は、アッセイ実行に必要な一連の流体の運動が内輪および外輪アッセイの両方で得られるほど十分に大きかった。別の実施形態では、内輪と外輪との間の微量流体成分の寸法は本明細書中に記載の検討材料に依存して異なり得る。
【００９４】
一般に、全ての半径位置でのマイクロチャネルと同一の直径および長さの使用により、異なる半径位置でのアッセイ構造で同等の性能を得ることができない。向心力誘導型流体ポンピングおよびキャピラリー弁調節を使用して（共同所有であり同時係属中の１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６（その各開示が明白に本明細書中で参考として援用される））、類似の様式で行われる構造を作製可能である。例えば、異なるアッセイ構造における対応するキャピラリー弁調節事象を同一の回転速度で起こるように、円盤を設計することができる。本明細書中での例では、使用されている２つの連続的弁調節事象（ｊ＝１、２）を有する２つの放射状に配列したアッセイ構造（ｉ＝１、２）が存在する。回転速度ω１１はω２１に等しく、ω１２はω２２に等しいことが望ましい。一般に、任意のｉ、ｊについて、ωｉｊはすべてのｉ、ｊについてΩｉに等しいことが望ましい。共同所有であり同時係属中の１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６に開示のように、キャピラリー弁が破裂する回転速度は、
【数３】
2004529312.tif 000004
（式中、ｋはキャピラリー接合部上の流体の流体密度、表面張力、および接触角に依存する定数であり、＜Ｒｉｊ＞はキャピラリー接合部の半径内部の流体の平均半径位置であり、ΔＲｉｊはキャピラリー接合部の半径内部の流体の半径範囲であり、ｄｉｊＨはキャピラリー接合部として使用されたチャネル水力直径である（上記の通り））である。これら３つの幾何学的変数を、操作して全ての構造ｉについて同一の回転速度でキャピラリー弁調節事象が起こることを確認することができる。典型的には、＜Ｒｉｊ＞およびΔＲｉｊは、円盤上での置換によっていくらか制約される。例えば、半径に沿って配列された同一のリザーバが同一の回転速度でゲート制御しなければならない場合、＜Ｒｉｊ＞は半径位置に比例し、全てのｉについてΔＲｉｊが同一であり、したがって、３つの変数の不変の獲得を維持するためにｄｉｊＨは半径位置に反比例して変化するはずであり、それにより回転速度が弁調節される。
【００９５】
組み立てたマイクロシステムプラットフォームの構造
図６は、リザーバ層のリザーバを微量流体層からのマイクロチャネルとが対になる組み立てプラットフォームの３つのアッセイ領域を示す。プラットフォーム層を上記および実施例１でさらに詳述のように対にする。
【００９６】
プラットフォームの流体要素を組み合わせた原理が理解されるので、これらのプラットフォームを種々の生物分析法に使用することができる。２つの流体をチャネルに移行させる受動的またはキャピラリー弁調節および拡散によって流体を混合するのを容易にするためのこのようなチャネルを使用して、任意の数の流体を含めることができ、これは２つの流体の混合に限定されず、本明細書中に記載のように、その後第１の混合物と第３の流体とさらに組み合わせることができる。さらに、混合比は混合すべき溶液を含むリザーバの幾何学的形状に依存するので（２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号（本明細書中で参考として援用される）にさらに完全に記載）、これらの幾何学的形状の別の配列によってこの範囲を超える混合比が得られる。
【００９７】
同様に、１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６（本明細書中で参考として援用される）にさらに完全に開示のように、キャピラリー弁調節は、幾何学、流体の性質、および回転速度に依存すると理解される。本発明のプラットフォームの微量流体層の別配列により、プラットフォーム表面上で利用可能な表面領域およびアッセイを行うために必要な微量流体の任意の１つの実施形態によって利用される表面範囲に一致するアッセイの任意の数の同心円を含むことができる。
【００９８】
本明細書中で開示の一般的形態のアッセイ用の別のプラットフォームの例は、同一のＶＡ体積を有する回収／検出チャンバーによって接続された流体の全アッセイ体積（ＶＡ）に等しい多数のリザーバを有するものである。共通の深さｔならびに試薬リザーバおよび回収／検出チャンバーとほぼ同一の領域を示すマイクロチャネルおよび内部アッセイ領域を有するリザーバでは、半径Ｒの円盤で実施可能な全アッセイ数は、およそ
【数４】
2004529312.tif 000005
である。Ｒ＝６ｃｍの半径、０．１ｃｍのリザーバの深さ、および１２μＬの全流体体積を有するプラットフォームでは、円盤上に適合し得る全アッセイ数は２３５である。
【００９９】
他の検討材料には、回転軸に関連するプラットフォーム上の成分の置換が含まれる。一般に、回収／検出チャンバーは、従来の回転スピードによって得られる水力学的圧力がマイクロチャネルによる流体の誘導および要素の混合および回収／検出チャンバーへの送達を誘導するために十分であるように、試薬リザーバよりもプラットフォームの縁に近づけるべきである。プラットフォームの外縁での回収／検出チャンバーの置換により、固定光学検出器を使用した検出も容易になる。しかし、非常に高密度のプラットフォームでは、アッセイ成分を整列させるための最も有効な方法ではない。例えば、未反応サンプルおよび試薬を含むリザーバ付近に回収／検出チャンバーを置くだけで所望の数のアッセイを行うことができる場合、種々の半径および方位角位置でキュベットを評価することができる検出器を使用する必要があり得る。光学システムのスキャニングの例は、光学シグナルを放射状にスキャニングする一方で、円盤を方位角によって光学下に示すことができる。この方法では、光学によって円盤表面上の任意のポイントを処理することができる。スキャニング法には、放射状に移動するリニアドライブの検出器が含まれるか、光学シグナルを、検電器で制御されたミラーシステムの使用によって放射状にスキャンすることができる。
【０１００】
アッセイ要件、流体要件、自動化または全てのこれらの要素における使いやすさまたは省略のいずれかによって決定される流体設計の多数の変形形態が可能である。例えば、キャピラリー弁は、インキュベーションで使用される高温での中間チャンバー中の流体を保持することが示されている（２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号（参考として援用される）にさらに広範に開示）。例えば、化学反応速度が遅いために中間インキュベーションを必要とするアッセイを、このような構造で行うことができる。
【０１０１】
あるいは、分散混合が不十分なアッセイは、混合を行うための流体の撹拌が必要であり得る。このような場合、共同所有であり同時係属中の１９９９年５月１９日提出の０９／３１５，１１４により完全に記載のように、撹拌によって誘導される突然の圧力変化に対して流体を保持する能動弁を使用することができる。
【０１０２】
共同所有であり同時係属中の１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６（参考として援用される）に開示のように、キャピラリー弁調節の性質を制御するための液体接触角を変化させるために、プラットフォーム表面を処理することも望ましい。
【０１０３】
以下の実施例は、本発明の一定の好ましい実施形態をさらに例示することを意図し、本発明を制限するものではない。
【０１０４】
実施例１
同時酵素阻害アッセイ
図に記載のプラットフォームを以下のように作製した。Ｌｉｇｈｔ  Ｍａｃｈｉｎｅｓの「Ｂｅｃｈｍａｎ」ソフトウェア（Ｌｉｇｈｔ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＨ）を起動させるＬｉｇｈｔ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  ＶＭＣ５０００を使用して、コンピュータ／数値コード機械処理を使用したアクリルの機械加工によってリザーバ層を製造した。
【０１０５】
微量流体層を以下のように製造した。微量流体構造（図５に記載の構造など）を、ＡｕｔｏＣＡＤ（Ａｕｔｏｄｅｓｋ、Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ  ＣＡ）およびＦｒｅｅｈａｎｄ（Ｍａｃｒｏｍｅｄｉａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）などのコンピュータ支援設計パッケージを使用して設計した。この設計を、透明なプラスチックシート上への高解像度（３３８６ｄｐｉ）での印刷によってフォトマスクに変換した。直径１２５ｍｍのシリコンウェハを、ネガティブフォトレジスト（ＳＵ−８（５０））の層で被覆し、５μｍと５００μｍとの間の所望の厚さを得るのに十分な速度（２００から８０００ｒｐｍ）でスピンコーター（Ｃｈｅｍａｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡから購入）でスピンした。シリコンウェハを焼成すると、表面が滑らかになり、フォトレジストが部分的に硬化した。シリコンウェハを従来のＵＶ源およびマスクアライナーを使用して紫外線（ＵＶ）光に暴露した。次いで、フォトレジストを、プロピレングリコールメチル酢酸エーテル中で感光させ、非架橋フォトレジストをジクロロメタンでの洗浄によって除去した。次いで、得られたレリーフを、トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル−１−トリクロロシランの蒸気への暴露によって不動態化し、これを微細加工用の鋳型として使用した（Ｄｕｆｆｙら、１９９８、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７０、４９７４から４９８４に記載）。
【０１０６】
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）オリゴマーと架橋剤（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）との１０：１混合物を、吸引処理後、鋳型に流し込んだ。ＰＤＭＳは透明な材料であるので、１重量％の液体色素の添加により円盤を光学的測定の基準として白色にし、蛍光測定用に黒色にした。注いだエラストマーを６５℃で１時間硬化させた。得られた微細加工ＰＤＭＳ部分を、鋳型からはがした。次いで、鋳型を再利用して微量流体層のさらなるコピーに加工した。
【０１０７】
２成分の単純な物理的接触によって作製されたＰＤＭＳ微量流体層とアクリルリザーバ層との間に可逆性の適合するシールの形成によって、マイクロプラットフォームを組み立てた。このシールは、物理的接着力（ファンデルワールス結合力および表面上に存在する部分的静電気の電荷）のみに基づき、使用した向心力誘導性圧力による漏出に対して円盤をシールするのに十分であった。
【０１０８】
図１に記載され、本明細書中に記載のように作製されたプラットフォームを使用して９６種の酵素阻害アッセイを同時および並行して行い、これにより本発明の微量流体プラットフォームにより従来の９６ウェルプレートマイクロタイタープレートで行っていた酵素アッセイの代替アッセイが得られることが示された。リザーバ層が微量流体層３０１と対をなすか結合する場合、流体はリザーバ層２０１中に形成されたリザーバに蒸着した。次いで、微量流体円盤３０１内のマイクロチャネルを介して流体が駆動されるように設計された回転プロフィールを使用して、プラットフォーム１００を回転させた。
【０１０９】
図１から図６に示したプラットフォームを使用して、均一アッセイモデルとしての９６種の同時酵素阻害アッセイを行った。酵素阻害アッセイでは、第２の流体中に存在する酵素の典型的には第３の流体（「Ｃ」）中の基質の反応を触媒する能力に対する第１の流体（「Ａ」）中に存在する化合物の効果を測定する。容易に測定される液体のパラメータ（光学密度など）を変化させるか蛍光部分が得られるように反応を選択した。流体Ａにインヒビターが存在しない場合、溶液Ａと酵素溶液Ｂとの混合は効果がない。このアッセイで検出された酵素活性は、最大検出値であり、測定されたパラメータに大きな変化をもたらした。しかし、流体Ａにインヒビターが存在する場合、流体Ａと流体Ｂとの混合により、十分な化学反応時間またはほとんどまたは全ての酵素分子中のインヒビターによって誘導された他の変化後、酵素分子は所望の反応を触媒できなくなった。この溶液を基質溶液と混合した場合、測定したパラメータはほとんどまたは全く変化しなかった。
【０１１０】
均一アッセイをモデル化するために選択された系は、インヒビターとしてのテオフィリン、酵素としてのアルカリ性ホスファターゼ、および基質としてのｐ−リン酸ニトロフェノール（ＰＮＰＰ）からなる。アルカリ性ホスファターゼの存在下では、透明なＰＮＰＰは可視光線スペクトルの青色部分を吸収するｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）に変換されて、黄色を呈する。インヒビターにおける標準的用量反応曲線を得るためにテオフィリンを０．０１ｍＭから１００ｍＭの濃度で使用した。アルカリ性ホスファターゼを１ｍｇ／ｍＬで使用し、ＰＮＰＰを０．５ｍＭ溶液として使用した。全ての溶液を、消イオン水中で０．１Ｍグリシンおよび０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液で作製した。
【０１１１】
これらのアッセイに使用したプラットフォームの寸法を以下に示した。プラットフォームの全体の直径は１２ｃｍであった。リザーバ層は、厚さ約３．２ｍｍであった。円盤の中心から最も近位のリザーバ２０５、２０６、および２０７の縁の半径位置は約３．２５ｃｍであり、「内径」と表示し、円盤の中心から最も遠位のリザーバ２０５、２０６、および２０７の縁の半径位置は約３．７ｃｍであり、「外径」と表示する。リザーバ２０５、２０６、および２０７は深さ約１．２ｍｍであった。各リザーバに対する角度を、適切な体積に適応することができるように選択した。リザーバ２０５および２０６が３μＬの体積に適応し、リザーバ２０７が６μＬに適応することができるように、リザーバ２０５および２０６に対する角度は１．６°であり、リザーバ２０７に対する角度は約２．１°であった。外側のリザーバ、２０８、２０９、および２１０では、内径は約４．１ｃｍであり、外形は４．５ｃｍであり、プラットフォームは厚さ約３．２ｍｍであった。それぞれ３μＬ、６μＬに適合するようにリザーバ２０８および２０９に対する角度は１．２５°であり、リザーバ２１０の角度は約１．７°であった。検出チャンバー２１１および２１２を、光学的に透明な材料で構築し、外径は約５．７ｃｍ、内径は約５ｃｍ、深さは１ｍｍ、角度は２．７°であった。
【０１１２】
微細加工された層は直径１２ｃｍであり、厚さは１ｍｍと５ｍｍとの間であり（厚さは重要ではない）、白色ＰＤＭＳから構成されていた。全微量流体構造の深さ（ＳＵ−８レリーフの高さによって測定）は１００μｍであった。混合マイクロチャネル３０８、３１３、３２７、３１９、３２４、および３２９の幅は１００μｍであった。混合マイクロチャネルの長さは、流体が求心加速度の影響下でチャネルを介してポンピングされたときに中程度の拡散定数（８×１０−６ｃｍ２／ｓ）で液体との拡散を介した十分な混合時間が得られるように選択した。これらの長さは、混合マイクロチャネル３０８および３１３については約１５ｍｍ、混合マイクロチャネル３２７については約３６ｍｍ、混合マイクロチャネル３１９および３２４については約１４ｍｍ、混合マイクロチャネル３２９については約２９ｍｍであった。これらの寸法により、混合マイクロチャネルの移動に２秒以上かかる流体が得られた。
【０１１３】
共同所有米国特許第６，０６３，５８９号、共同所有であり同時係属中の１９９６年１２月５日提出の米国特許出願番号０８／７６１，０６３、１９９６年１２月１８日提出の０８／７６８，９９０、および１９９７年８月１２日提出の０８／９１０，７２６（参考として援用される）に記載のように、流体の流れをキャピラリー弁調節によってプラットフォーム上で制御した。各内部アッセイ微量流体構造では、以下の４つのキャピラリー弁調節点が存在した：マイクロチャネル３０５および３０６とマイクロチャネル３０７との接合部；マイクロチャネル３１２とマイクロチャネル３１４との接合部；くびれ３１５とキャピラリー接合部３１１との接合部；およびくびれ３１０とキャピラリー接合部３１１との接合部。接合部につながるチャネルの幅は、マイクロチャネル３０５および３０６については１００μｍ、マイクロチャネル３１２については２００μｍ、キャピラリー接合部３１０および３１５については５０μｍであった。外部アッセイアレイでは、対応するマイクロチャネルは、内部アッセイアレイ中の接合部についての接合部と同一の幅を有する（マイクロチャネル３１６および３１７については１００μｍ；マイクロチャネル３２３については２００μｍ；およびキャピラリー接合物３２１および３２６については５０μｍ）。
【０１１４】
アッセイを以下のように行った。３μＬアリコートの上記の濃度のアルカリ性ホスファターゼおよびテオフィリン溶液を、リザーバ２０５および２０８（アルカリ性ホスファターゼ）ならびに２０６および２０９（テオフィリン）に入れた。６μＬアリコートのＰＮＰＰ溶液を、リザーバ２０７および２１０に入れた。プラットフォームを、３色測定可能な拡散反射率光学ヘッドを具備する装置の軸に置いた。最初に、プラットフォームを７５０ｒｐｍで１０から３０秒間回転させて、マイクロチャネル３０５、３０６、３１２、３１６、３１７、および３２３を準備した（すなわち、キャピラリー接合部を形成する大きさに保持されるポイントまでマイクロチャネルに流体をポンピングした）。次いで、回転速度を、４５ｒｐｍ／秒の加速度で８４０ｒｐｍの回転速度まで増加させた。この回転速度で、キャピラリー接合部３０９、３１４、３２０、および３２５での遠心分離によって誘導された圧力は、キャピラリー圧力を超えるのに十分であり、流体がチャネル３０８、３１３、３１９、および３２４に流入した。キャピラリー圧力によって維持される場合、８４０ｒｐｍの回転速度を３０秒間（実際は、数秒間少なくても良い）維持し、その間に３１０、３１５、３２１、および３２６でのキャピラリー接合部に流体がチャネルを介して通過する。次いで、回転速度を、約１８０ｒｐｍ／秒の加速度で１２００ｒｐｍの回転速度に増加させ、これを１秒間維持した。この回転速度で、流体がキャピラリー接合部３１１および３２２に充満し、マイクロチャネル３２７および３２９に流入する。次いで、回転速度を１５０ｒｐｍ／秒の割合で６００ｒｐｍまで減速し、５０秒間維持して検出チャンバー２１１および２１２に流体をポンピングした。
【０１１５】
図７ａから図７ｆは、一連の流体の流れを示す。８４０ｒｐｍでは、流体はリザーバ２０５、２０６、および２０７から流れ、くびれ３１０に保持された。同様に、基質溶液は２０７からくびれ３１５に流れた。２０５または２０６のいずれかの流体は最初に３０７および３０８に流れ、チャネル３０８の狭さにより流体が拡大領域３０７に蓄積されるための十分な抵抗が得られ、それにより反対側のチャネルの突出した液体境界を湿潤させる。この方法で、流体は互いに接触し、且つマイクロチャネルに共存することが保証される。
【０１１６】
別の実施形態では、キャピラリー接合部の直径ｘおよびｙを、流体のいずれか一方をより低回転速度で予め処分するように選択することができる。例えば、組成の変動により一方の流体の表面張力に変動する場合（例えば、生物学的流体である場合）、他方の流体を最初に移動させることが望ましい。この場合、流体の性質における全ての妥当な変動についてのキャピラリー弁調節ｒｐｍを他方の流体よりも高くする方法で可変性流体のキャピラリー接合部を狭くする。
【０１１７】
次いで流体を、マイクロチャネルを介して移動させ、くびれ３１０および３１５で保持した。８４０ｒｐｍと１２００ｒｐｍとの間の回転速度で、アルカリ性ホスファターゼ／テオフィリン混合物または基質溶液またはその両方由来の流体を、キャピラリー接合部３１１に充満させた。キャピラリー接合部３１１のデザインにより、いずれの流体も最初に他方の流体の流出キャピラリーを湿潤させ、それによりマイクロチャネル３２７に流れ込む。
【０１１８】
デバイス中での重要な混合の特徴は、マイクロチャネル３０８、３１３、および３２７の狭さにより可能となる。ＲＨで示すチャネルの回転誘導性圧力は、式
【数５】
2004529312.tif 000006
【数６】
2004529312.tif 000007
（式中、Ｑは流速であり、Ｐは誘導圧であり、Ｃは定数であり、ｌは流体が流れるチャネルの長さであり、ｄＨは水力直径である）で与えられる。マイクロチャネル３０８、３１３、および３２７の直径がリザーバ２０５、２０６、および２０７の直径と比較して非常に狭いので、流れの抵抗はマイクロチャネルに支配され、したがって混合マイクロチャネルの長さよりもほとんど排他的に流体の流れの通過による圧力低下が持続する。これにより、供給リザーバから混合チャネルへの流体の流れは厳密に既知の比で行われることが確証される。特に、流体が一方のリザーバから混合チャネルに、流体が他方のリザーバから流れるよりも速い速度で混合チャネルに流れると想定される。得られた圧力は、リザーバの内縁で流体のメニスカスから流体のより早く流れる流体との混合により他の流体の圧欲よりも減少するポイントに低下し、これは回転誘導型圧力が流体の半径範囲（上記のΔＲ）に比例するためである。より高い圧力はより遅く移動する流体を横切って存在するので、より速い流速が誘導される。このフィードバック過程により、リザーバ２０５、２０６、および２０７中の流体の内部メニスカスが得られる均圧現象が生じ、同一の動径速度（単位時間あたりの動径方向の同一距離）で外側に進行する。結果として、混合マイクロチャネル３０８における時間の関数としてのアルカリ性ホスファターゼとテオフィリンとの比は、以下の式
【数７】
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（式中、ＡＡおよびＢＢは時間関数としてのリザーバ２０５および２０６の断面積であるか、流体としてのメニスカスの半径位置がリザーバから取り除かれる）で正確に与得られる。流動比が一定である（本発明の場合のように）ことを所望する場合、半径位置の関数としての断面積の一定の比を維持するので十分である。これは、その比のみが一定であって、断面が一定であることを意図しないことに留意のこと。２０００年５月１６日発行の共同所有米国特許第６，０６３，５８９号（参考として援用される）にさらに完全に開示のように、式で示した比を、断面積とリザーバとの比の変化によって操作することができる。
【０１１９】
この式および分析はまた、混合マイクロチャネル３２７中の３つの流体の比の重要性を正確に説明している。流体が混合マイクロチャネル３２７に流入するにつれて、回転によって誘導された圧力は、リザーバ２０５、２０６、および２０７への流れに対する水圧耐性；チャネル３０８、３１３、および３１９に対する水圧耐性；ならびに混合マイクロチャネル３２７の水圧耐性に対して作用する。３０８、３１３、および３１９の長さと直径を同一にするよう選択するので、これらのチャネルの横切る水圧耐性も同一である。結果として、混合マイクロチャネル３２７ならびにリザーバ２０５、２０６、および２０７の水圧耐性は、流体の相対流速の決定要因である。さらに、マイクロチャネル３２７の耐性がそのより小さな直径によりリザーバの耐性が非常に高いので、上記の均圧現象により、流体が排出されるにつれてリザーバの内部部分から外部部分に移動する３つ全ての流体についてのメニスカスが生じる。この方法で、アルカリ性ホスファターゼおよびテオフィリン溶液が同時流動層流としてマイクロチャネル３０８に流入する。マイクロチャネル３０８は長く、回転速度によって流速が制御されるので、これらの同時流動により溶液を完全に混合させるためのこれらの流動間の境界を横切る拡散のために十分に長い時間が与えられる。マイクロチャネル３２７における流体の流れについて類似の記述が可能である。
【０１２０】
流体の流れおよび混合についてのこの記載は、アッセイ微量流体構造の「内輪」セットおよびこのような構造の「外輪」の両方に適用される。
【０１２１】
流体が検出チャンバー２１１および２１２に送達された後、反射率光学を使用して２つの波長４３０ｎｍ（予想される反応性生物（ＰＮＰ）の吸収）および６３０ｎｍでの反射（拡散）角での反射照射を測定した。６３０ｎｍでは反応性生物ＰＮＰ由来の吸収は存在しないので、この波長を使用して、プラットフォームにおける光学的不完全性散在散乱、または光学的に透明なチャンバー中の意図しない気泡を修正することができる。光学システムはまた、基準フォトダイオードに入射光線を送るビームスプリッターを有利に含んでいた。この光学システムで使用した２つの検出器は、拡散−反射光を測定するアッセイ検出器、入射光線のフラクションを測定する基準検出器であった。４３０ｎｍおよび６３０ｎｍの光源が有効であり、これらが「暗所」またはオフの場合に各検出器で測定した。測定した電圧は、以下であった：
ＶＤＤ：アッセイ検出器での暗所の測定、
ＶＲＤ：基準検出器での暗所の測定、
ＶＤ１：アッセイ検出器での吸収波長λ１（４３０ｎｍ）での測定、
ＶＤ２：アッセイ検出器での非吸収波長λ２（６６０ｎｍ）での測定、
ＶＲ１：基準検出器での吸収波長λ１（４３０ｎｍ）での測定、
ＶＲ２：基準検出器での非吸収波長λ２（６６０ｎｍ）での測定。
【０１２２】
４３０ｎｍでの吸光度を、式
【数８】
2004529312.tif 000009
から計算する。
【０１２３】
ここで、ＣＰＮＰは、黄色生成物（ｐ−ニトロフェノール）濃度であり、この濃度は、最初の溶液中のテオフィリン濃度に反比例する。
【０１２４】
プラットフォームを６０または１００ｒｐｍで回転させた時のデータを継続的に回収した。データを継続的に取ることができるので、化学反応速度を観察することができる。図８は、プラットフォーム上で同時に行った４８種のアッセイのデータを示し、これは、０から１０ｍＭの濃度範囲の１５種の各テオフィリンについて３倍の複製を示している。０から５００秒の各アッセイの確かさに対する時間の関数としてのデータの直線的一致の分析により、速度情報を抽出することができる。ミカエリス−メントン分析（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、１９７５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により、ミカエリス定数Ｋｍ＝（０．２７±０．０２）×１０−３Ｍが得られる。この値は、類似のアッセイ系におけるアルカリ性ホスファターゼで同定された値と同一の次数である（Ｆｏｕｌｄｓら、１９９０、「バイオセンサー：実施アプローチ」、Ｃａｓｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．、９７から１２４頁）。
【０１２５】
流体の光学データを得るための検出チャンバーへのポンピング後の時間（ここでは、２分間）の選択によって終点分析もまた可能である。図９は、終点測定（用量反応曲線）を示す。ラングミュア等温式へのこのデータの適合により、阻害定数（９．７±０．９）ｍＭを決定した。これらのデータでは、予備混合の試薬または色素の既知濃度の分析によって同定したところ、変異係数は約３から３．５％であり、その約１．５％は計測器および円盤のばらつきによる。
【０１２６】
これらの結果は、本発明のマイクロプラットフォームシステムを、酵素活性を同定するための酵素アッセイ用の従来の９６ウェルマイクロタイタープレートの代替物として使用することができることを示す。
【０１２７】
実施例２
トリプシンアッセイ
高処理薬物スクリーニングで使用される均一アッセイのさらなる型は、セリンプロテアーゼアッセイである。これらの酵素における関心は、広範な種々の正常および病理学的代謝条件におけるこれらの酵素誘導体の関連物から誘導される。
セリンプロテアーゼには、以下が含まれる：
・血餅を作製する凝固経路に関連するほとんどの因子、
・血餅を消化する酵素カスケード、
・炎症反応を媒介し、異物の食作用を促進し、感染細胞を溶解する捕体系のいくつかの成分、
・タンパク質の細胞内プロセシングの主要成分、
・いくつかのウィルスの主な破壊生成物、
・消化における活性因子、
・炎症に対する急性反応物反応のメンバー。
【０１２８】
最新のセリンプロテアーゼ高処理スクリーニング（ＨＴＳ）研究は、炎症に対する身体反応の調節に関する。例えば、感染して組織が死滅または損傷した場合、好中球がヒト白血球エラスターゼ、カテプシンＧ、および種々のプロテイナーゼを放出して、異物の分解を開始する。不運にも、多くの慢性疾患（気腫、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、膵炎、関節炎、および歯周炎を含む）は、好中球反応を活性化させる異常な炎症を起こす。セリンプロテアーゼの継続的な放出により、身体の生来の調節機構を圧倒し、組織損傷が増加する。しかし、これらの分子の遍在および重要さゆえ、特異的酵素インヒビターが必要である。
【０１２９】
セリンプロテアーゼの例は、トリプシンである。これは細胞内機構の重要な部分であるが、細胞溶解の際放出される。そのタンパク質分解活性は非常に強力なので、動物は出生前でさえ、有意な血液レベルで維持される構成性インヒビター（α１抗トリプシン）（α１−ＡＴ）を産生する。血液中のα１−ＡＴ活性を減少または消滅させる多数の遺伝子変異が同定されている。合衆国人口の１０％は、これらの変異の１つについてヘテロ接合性またはホモ接合性である。ヘテロ接合性集団でさえ、慢性肝疾患および肺疾患を罹患する傾向がある。さらに、慢性的炎症は、ヘテロ接合性の正常な個体における身体の過剰なα１−ＡＴの作製能力の圧倒を助長するトリプシンレベルを放出する。
【０１３０】
実施例１に記載のプラットフォームを使用して、トリプシンインヒビター（オボムコイドインヒビター）用のモデルアッセイを行った。
【０１３１】
本アッセイの手動での実行と本発明のマイクロシステムプラットフォームを使用して行ったアッセイとを比較すると、手動での実行は、以下を必要とする：トリプシンとオボムコイドインヒビターとの混合；３７℃で３０分間のインキュベーション；第１の流体混合物と基質ＢＯＤＩＰＹ  ＦＩ（カゼイン基質）との混合；および蛍光検出。
【０１３２】
上記プロトコールを使用して、ベンチ上でこのアッセイを行った。トリプシンを、５０μｇ／ｍＬの濃度で使用した。オボムコイドインヒビターを０から５０μｇ／ｍＬの範囲で使用した。蛍光基質ＢＯＤＩＰＹ  ＦＩを３３μｇ／ｍＬの濃度で使用した。３つの流体をそれぞれ３μＬ、３μＬ、および６μＬの体積で組み合わせた。この基質により、トリプシンが切断されたとき５２０ｎｍの蛍光ピークが得られる。標準的な実験用インキュベーターを使用してインキュベーションを行った。次いで、流体を上記の円盤の検出キュベットに移した。円盤を、５２０ｎｍに集中させたバンド通過フィルターを具備するエピ蛍光顕微鏡に置いた。円盤を、顕微鏡の対物レンズの下におき、蛍光シグナルを測定した。
【０１３３】
次いで、上記の濃度および体積を使用して、本発明の円盤上でアッセイを行った。先の実施例を参照して、トリプシンをアルカリ性ホスファターゼの代わりとし、オボムコイドインヒビターをテオフィリンの代わりとし、ＢＯＤＩＰＴＦＩ（カゼイン基質）をＰＮＰＰの代わりとする。流体運動に使用した回転プロフィールは、上記のものである。ここで、３７℃でのインキュベーションを、溶液が基質に接触する前の混合チャネル中での約１０秒間の混合に代える。
【０１３４】
図１０ａおよび図１０ｂは、本発明の円盤および器具を示す。これらのデータは、インキュベーション工程を行わない場合でさえ、関連濃度（０から５０μｇ／ｍＬ）のオボムコイドインヒビターに関して、円盤上で類似の性能を示す。
【０１３５】
上記の開示は本発明の一定の特異的実施形態を強調しているが、本発明に等価の全ての修正形態または変更形態が本発明の精神および範囲に含まれることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明のマイクロシステムプラットフォームの分解斜視図である。
【図２】
図１の分解斜視図に示すマイクロシステムプラットフォームの１つの構成成分（リザーバ層）の平面図である。
【図３】
図２に例示のリザーバ層の断面詳細図である。
【図４】
図１のマイクロシステムプラットフォームの別の構成成分（微量流体層）の平面図である。
【図５】
２つの微量流体アッセイ構造用の微量流体チャネルを具備する、図４の微量流体層の１つのセグメントの詳細を示す図である。
【図６】
図１のマイクロシステムプラットフォームを具備する、組み立てられたリザーバおよび微量粒子層のセグメントを示す図である。
【図７】
ａ〜ｆは、２つの微量流体アッセイ構造を具備するマイクロシステムプラットフォームの１つのセグメントを通過する流体の動きの順序を示す図である。
【図８】
本発明のデバイスを使用して実施した酵素阻害アッセイの速度データを示す図である。
【図９】
実施例１に開示の、本発明のデバイスを用いて実施した酵素阻害アッセイについてのインヒビター濃度の関数として酵素活性を示す用量反応曲線を示す図である。
【図１０】
ａ及びｂは、実施例２に開示の、本発明のデバイスを用いて実施した酵素阻害アッセイについてのインヒビター濃度の関数として酵素活性を示す別の用量反応曲線を示す図である。
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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