(57)【要約】本発明は、植物中での遺伝子発現の調節方法に関する。特に、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の植物細胞中での発現の操作が開示される。このようにしてより安定で且つ予測可能な発現が得られる。本発明は、転写後サイレンシングを増大または低減する方法にも関する。本発明はさらに、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む新規の核酸分子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に類似する核酸分子。
【請求項２】
前記３’−５’エキソヌクレアーゼドメインがＲＮアーゼＤ関連ドメインである請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記ポリペプチドが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項１または２記載の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項５】
配列番号２３のヌクレオチド配列またはその相補体を含む単離核酸分子。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が植物から得られるかまたは植物由来である請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項７】
細胞中で機能的なプロモーターと操作可能的に連結される請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子またはその相補体を含む単離組換え核酸分子。
【請求項８】
プロモーターが植物細胞中で機能的である請求項７記載の単離組換え核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子がセンス配向である請求項７記載の単離組換え核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子がアンチセンス配向である請求項７記載の単離組換え核酸分子。
【請求項１１】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に類似する核酸分子、プロモーターおよびターミネーターを含む発現カセット。
【請求項１２】
前記プロモーターが構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生的調節プロモーターである請求項１１記載の発現カセット。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
アミノ酸配列、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８を含む単離および実質的精製ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２４のアミノ酸配列を含む単離および実質的精製ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項１７】
請求項１１または１２記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項１８】
植物細胞である請求項１７記載の細胞。
【請求項１９】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が細胞中で発現される請求項１７または１８記載の細胞。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する内因性ヌクレオチド配列をさらに含む請求項１８または１９記載の植物細胞。
【請求項２１】
前記植物細胞中での前記内因性ヌクレオチド配列の発現が変更される請求項２０記載の植物細胞。
【請求項２２】
当該ヌクレオチド配列をさらに含む請求項１９記載の植物細胞であって、発現カセットを欠く植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現と比較した場合、植物細胞中の当該ヌクレオチド配列の発現が変更される植物細胞。
【請求項２３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する内因性ヌクレオチド配列を含む植物細胞であって、前記内因性ヌクレオチド配列中またはその調節領域中に突然変異を含む植物細胞。
【請求項２４】
突然変異が欠失または再配列である請求項２３記載の植物細胞。
【請求項２５】
突然変異が点突然変異である請求項２３記載の植物細胞。
【請求項２６】
突然変異が核酸分子の挿入に起因する請求項２３記載の植物細胞。
【請求項２７】
核酸分子の挿入が１つのＴ−ＤＮＡ境界領域を含む請求項２３記載の植物細胞。
【請求項２８】
挿入が転位性遺伝因子を含む請求項２３記載の植物細胞。
【請求項２９】
前記植物細胞中での前記内因性ヌクレオチド配列の発現が低減される請求項２３記載の植物細胞。
【請求項３０】
前記植物細胞中での前記内因性ヌクレオチド配列の発現が増大される請求項２３記載の植物細胞。
【請求項３１】
当該核酸分子を含む第二発現カセットをさらに含む請求項１８記載の植物細胞であって、前記第一発現カセットを欠く植物細胞中での当該核酸分子の発現と比較した場合、前記植物細胞中での当該核酸分子の発現が安定化される植物細胞。
【請求項３２】
当該核酸分子を含む第二発現カセットをさらに含む請求項１８記載の植物細胞であって、前記第一発現カセットを欠く植物細胞中での当該核酸分子の発現と比較した場合、前記植物細胞中での当該核酸分子の発現が低減される植物細胞。
【請求項３３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列のセンスＲＮＡ分子、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記ヌクレオチド配列のアンチセンスＲＮＡ分子をトランスジェニック的に発現する植物細胞であって、前記センスおよび前記アンチセンスＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得る植物細胞。
【請求項３４】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記植物細胞の内因性ヌクレオチド配列の発現が低減される請求項３３記載の植物細胞。
【請求項３５】
当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットをさらに含む請求項３４記載の植物細胞であって、前記センスおよび前記アンチセンスＲＮＡ分子を発現しない植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現と比較して、前記植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現が安定化されるかまたは増大される植物細胞。
【請求項３６】
請求項１１または１２記載の発現カセットを含む植物またはその子孫またはその種子。
【請求項３７】
請求項１８〜３５のいずれかに記載の植物細胞を含む植物、またはその子孫、またはその種子。
【請求項３８】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする内因性ヌクレオチド配列の植物細胞または植物中での発現の変更方法であって、前記ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるかまたは実質的に類似する方法であり、以下の：
前記植物細胞または植物中での前記内因性ヌクレオチド配列の転写または翻訳を変更する
過程を包含する方法。
【請求項３９】
植物細胞または植物中での前記内因性ヌクレオチド配列の転写または翻訳の変更が以下の：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、センス配向で発現し、あるいは
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、アンチセンス配向で発現し、あるいは
ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分のセンスＲＮＡ、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記ヌクレオチド配列またはその一部分のアンチセンスＲＮＡであって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得る前記センスおよび前記アンチセンスＲＮＡ分子を前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写体を特異的に切断し得るリボザイムを前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを前記植物細胞中で相同的組換えにより修飾し、あるいは
ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域と結合し得るジンクフィンガータンパク質を前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを修飾し得るキメラオリゴヌクレオチドを前記植物細胞中に導入する
過程を包含する請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
植物細胞または植物中での配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する内因性ヌクレオチド配列の発現の変更方法であって、前記植物細胞中での前記内因性ヌクレオチド配列の転写または翻訳を変更するための一手段を前記植物細胞中に導入する過程を包含する方法。
【請求項４１】
植物細胞または植物中での当該ヌクレオチド配列の発現の変更方法であって、以下の：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記植物細胞の内因性ヌクレオチド配列の前記植物細胞または植物中での発現を変更し、そして
ｂ）当該前記ヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記植物細胞または植物中に導入するが、この場合、前記植物細胞または植物中での当該前記ヌクレオチド配列の発現が変更される
過程を包含する方法。
【請求項４２】
請求項４１記載の方法であって、以下の：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞または植物中で、センス配向で発現し、あるいは
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞または植物中で、アンチセンス配向で発現し、あるいは
ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分のセンスＲＮＡ、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記ヌクレオチド配列またはその一部分のアンチセンスＲＮＡであって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得る前記センスおよび前記アンチセンスＲＮＡ分子を前記植物細胞または植物中で発現し、あるいは
ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写体を特異的に切断し得るリボザイムを前記植物細胞または植物中で発現し、あるいは
ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを前記植物細胞または植物中で相同的組換えにより修飾し、あるいは
ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域と結合し得るジンクフィンガータンパク質を前記植物細胞または植物中で発現し、あるいは
ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを修飾し得るキメラオリゴヌクレオチドを前記植物細胞または植物中に導入する
過程を包含する方法。
【請求項４３】
植物細胞または植物中での当該ヌクレオチド配列の発現の変更または安定化のための方法であって、以下の：
ａ）請求項１１または１２記載の第一発現カセットを含む植物細胞またはその植物を得て、そして
ｂ）当該前記ヌクレオチド配列を含む第二核酸分子を前記植物細胞または植物中に導入するが、この場合、前記第一発現カセットを欠く植物細胞または植物中での当該前記ヌクレオチド配列の発現と比較して、前記植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現が変更または安定化される
過程を包含する方法。
【請求項４４】
当該ヌクレオチド配列の発現が増大される請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
当該ヌクレオチド配列の発現が低減される請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
植物細胞または植物中での当該ヌクレオチド配列の発現の安定化方法であって、以下の：
ａ）３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に類似するポリペプチドをコードする前記植物細胞または植物の内因性ヌクレオチド配列の植物細胞中での発現変更を有する植物細胞または植物を得て、そして
ｂ）当該前記ヌクレオチド配列を前記植物細胞または植物中に導入するが、この場合、前記第一発現カセットを欠く植物細胞または植物中での当該前記ヌクレオチド配列の発現と比較して、前記植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現が安定化される
過程を包含する方法。
【請求項４７】
前記内因性ヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列と同一であるかまたは実質的に類似する請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
請求項４６記載の方法であって、前記内因性ヌクレオチド配列の発現が、以下の：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、センス配向で発現し、あるいは
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、アンチセンス配向で発現し、あるいは
ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分のセンスＲＮＡ、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と実質的に類似する前記ヌクレオチド配列またはその一部分のアンチセンスＲＮＡであって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得る前記センスおよび前記アンチセンスＲＮＡ分子を前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写体を特異的に切断し得るリボザイムを前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８と実質的に類似するポリペプチドに特異的に向けられるアプタマーを前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを前記植物細胞中で相同的組換えにより修飾し、あるいは
ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域と結合し得るジンクフィンガータンパク質を前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを修飾し得るキメラオリゴヌクレオチドを前記植物細胞中に導入する
ことにより変更される方法。
【請求項４９】
植物細胞中での前記内因性ヌクレオチド配列の発現が低減される請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドと相互作用し得る化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）相互作用を実行可能な条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８で記述されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその相同体、ならびに前記ポリペプチドと相互作用する能力に関して試験される化合物を併合し、そして
ｂ）前記ポリペプチドと相互作用し得る過程（ａ）からの化合物を選択する
ことを包含する方法。
【請求項５１】
請求項５０記載の方法により同定可能な化合物。
【請求項５２】
請求項５０記載の方法により同定可能な化合物であって、前記ポリペプチドの活性を変更し得る化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に、特に植物中での遺伝子発現の調節に、ならびに遺伝子サイレンシングに関する。本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含む新規のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む新規の単離核酸分子にも関する。
【０００２】
分子生物学および形質転換の技術の開発は、種々の望ましい特性を有するトランスジェニック植物の産生を可能にした。しかしながらいくつかのトランスジェニック系統では、従来活性な遺伝子の発現の損失が、開発的、環境的または未知のシグナルに応答して観察された。この現象は一般に、遺伝子サイレンシングと呼ばれる。それは、突然変異の場合より高い頻度で起こり、体細胞伝達中もずっと顕著に安定である。影響を受ける遺伝子座の染色体位置または構造は、遺伝子サイレンシングの頻度および強度を確定する因子であり、そして不活性化は多コピー中に存在する遺伝子に選択的に作用するようであり、配列冗長の結果であると考えられる。転写後サイレンシングは主として異常ＲＮＡ分子の精製を包含し、そして時折、ＤＮＡメチル化を伴うが、必ずというわけではなく、転写開始を妨害するサイレンシングは、ＤＮＡの高メチル化と、そしておそらくはサイレント遺伝子座でのクロマチン構造の変更とより厳密に相関する。今日、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は一般に、配列中で類似の転写領域を有する遺伝子由来のｍＲＮＡの特異的分解に起因する遺伝子発現の後成性不活性化を指す（Ｍｅｉｎｓ （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４３：２６１−２７３）。
【０００３】
植物中での遺伝子サイレンシングのメカニズムを理解する試みがなされてきた。例えばシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓでは、アグロバクテリウム・リゾゲネスＡｔｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓｒｏｌＢ導入遺伝子のサイレンシングに関する直接シーケンシングにより、別個の突然変異体遺伝子座ｅｇｓ１およびｅｇｓ２を有する２つの系統がＭ２集団から単離された（Ｄｅｈｉｏ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｌ （１９９４） ＰＮＡＳ ９１：５５３８−４２）。ｅｇｓ１突然変異はこのｒｏｌＢ導入遺伝子の不活性化をもたらすようであり、したがって野生型ｅｇｓ１対立遺伝子はサイレンシングを活発に防止し得る。転写後遺伝子サイレンシングにおいて影響を及ぼされるその他の突然変異体（遺伝子サイレンシングのサプレッサーに関するｓｇｓ１およびｓｇｓ２）は、Ｅｌｍａｙａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１７４７−５８に記載されている。この場合、突然変異体植物は、サイレンシングの放出に関与すると思われる劣性一遺伝子突然変異を保有した。さらに別の報告では、ＭＯＭと呼ばれる遺伝子の崩壊は、メチル化遺伝子の転写的サイレンシングを放出した（Ａｍｅｄｅｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０５：２０３−２０６）。有望ではあるが、しかしこれらの結果は依然として予備的である。
【０００４】
近年、シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから５つのＲｅｃＱ様タンパク質が単離され、特性化された（Ｈａｒｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８： ４２７５−４２８２）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ組換えおよび遺伝子サイレンシングに関連した方法に関与することが提唱されている。
【０００５】
活性遺伝子から不活性遺伝子への切替えは、未だ既知ではなく、当業者がこの減少を操作するのを可能にする道具が欠けている。関与することが提唱されているこのような酵素の一つがエキソヌクレアーゼである。エキソリボヌクレアーゼスーパーファミリーの最新検査は、既知のエキソリボヌクレアーゼの構造および系統発生学的分布を分析した（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２９：１０１７−１０２６）。著者等は、エキソリボヌクレアーゼを６つのスーパーファミリーおよび種々のサブファミリーに分類した。さらに進んだ論文は、新しく発見された酵素を特性化するために用いられる共通モチーフを提唱した。改良された特徴を有するトランスジェニック植物の生成において、多数の別個のトランスジェニック系統は、それらが遺伝子サイレンシングにより作用されないことを保証するために、数世代を通して試験されなければならない。これは時間を要し、非常に経費が掛かる。したがって、原価効率的方法で改良された特性を有する植物を得るために、植物細胞中での遺伝子サイレンシングを有効に且つ予測的に制御するのを可能にする新規の方法に対する長きに亘るがしかし実現されていない必要性が存在する。
【０００６】
機能性ゲノム学の分野において、遺伝子機能の分析がより効率的に実施され得るよう、遺伝子サイレンシングを全く有さないかまたは微々たるレベルで有する細胞または植物を提供する必要性も存在する。遺伝子サイレンシングに関与する遺伝子の発現を阻害または除去することにより、機能性ゲノム学における当該遺伝子の発現が、遺伝子サイレンシングの妨害を伴わずに分析され得る。
【０００７】
病原体、特にウイルス病原体に対する遺伝子発現または耐性のより緊縮制御のための細胞または植物中での遺伝子サイレンシング増大に関する当該分野での必要性がさらに存在する。
【０００８】
本発明は、植物細胞中での遺伝子発現を再現可能的に且つ予測可能的に操作するための方法に対する必要性を取り扱う。特に本発明は、植物細胞中でのヌクレオチド配列の安定且つ予測可能な発現に対する必要性を取り扱う。本発明によれば、これは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の植物細胞中での発現を操作することにより達成される。したがって本発明は、適切な系統が選択されるまでスクリーニングされねばならないトランスジェニック系統の数を低減することにより、そして植物細胞中でのヌクレオチド配列の安定且つ良好に制御された発現を提供することにより、従来技術を上回る明らかな進歩を提供する。
【０００９】
一局面において、本発明は、植物細胞中での遺伝子サイレンシングを制御するための新規の方法を包含する。本発明は、植物中での遺伝子サイレンシングの抑制または遺伝子サイレンシングの増大を包含する。好ましい実施態様では、これは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の植物細胞中での発現を変更することにより達成される。別の実施態様では、ヌクレオチド分子は、エキソヌクレアーゼ活性を含む、好ましくは３’−５’ＲＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。好ましくはポリペプチドは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含む。さらに好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、ＲＮアーゼＤ関連ドメインである。別の好ましい実施態様では、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるかまたは実質的に類似する。好ましくはヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する。もっとも好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号２３と同一であるかまたは実質的に類似する。別の実施態様では、本発明は、配列番号２４と同一であるかまたは実質的に類似するアミノ酸配列をふくむか、それからなるかまたはそれを有する新規に単離され、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【００１０】
好ましい実施態様では、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、その転写または翻訳を変えることにより変更される。例えば発現低減は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７または配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を植物細胞中で、センス配向で発現し；あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を植物細胞中で、アンチセンス配向で発現し；あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分のセンスＲＮＡ、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記ヌクレオチド配列またはその一部分のアンチセンスＲＮＡであって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得るセンスおよびアンチセンスＲＮＡ分子を植物細胞中で発現し；あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写体を特異的に切断し得るリボザイムを前記植物細胞中で発現し；あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを前記植物細胞中で相同的組換えにより修飾し；あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域と結合し得るジンクフィンガータンパク質を前記植物細胞中で発現し；
【００１１】
あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを修飾し得るキメラオリゴヌクレオチドを前記植物細胞中に導入することにより得られる。好ましくは、配列の発現は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１または配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域のゲノムコピーの挿入的突然変異誘発、点突然変異または欠失突然変異誘導により変更される。あるいは配列は、遺伝子配列の再配列に夜突然変異を有する。
【００１２】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドの発現増大も本発明の範囲内であり、例えば、本発明のヌクレオチド配列を植物細胞中で過剰発現させることにより得られる。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現の変更方法、ならびに植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現の安定化方法を包含する。好ましい実施態様では、当該ヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。別の好ましい実施態様では、当該ヌクレオチド配列は、植物細胞の内因性ヌクレオチド配列である。当該ヌクレオチド配列の発現は、好ましくは前記のような３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の植物細胞中での発現を変更することにより変更される。３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現変更を示す植物細胞は、当該ヌクレオチド配列、またはその一部分、またはいずれかの逆相補体も含む。好ましい実施態様では、当該ヌクレオチド配列、またはその一部分、またはその逆相補体は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現変更を示す植物細胞中に導入される。
【００１４】
好ましい実施態様では、当該ヌクレオチド配列は植物の病原体に由来し、またはそれと実質的に類似する。病原体は、例えば植物のウイルス、真菌または細菌病原体であるが、これらに限定されない。好ましくは病原体は、ウイルス病原体である。したがって、病原体の制御方法であって、前記のような３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現変更を示す植物細胞を得る過程を包含する方法であって、病原体由来のヌクレオチド配列と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列を植物細胞がさらに含む方法を提供することは、本発明のさらなる一局面である。本発明は、前記のような３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその逆相補体、またはその相補体を含む組換え核酸分子も包含する。
【００１５】
本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその相補体を含む本発明の核酸分子を含む発現カセットも包含する。好ましくは発現カセットは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
【００１６】
本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび／または活性を含むポリペプチドをコードする本発明の核酸分子を含むベクターにも関する。好ましくは、ベクターはさらに、本発明の核酸分子と操作可能的に連結されるプロモーターを含む。さらに好ましくは、ベクターはさらに、各々本発明の核酸分子に操作可能的に連結されるプロモーターおよびターミネーターを含む。さらに本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする本発明の核酸、組換え核酸分子、発現カセットまたはベクターを含む植物細胞（またはこのような植物細胞を含む植物）を包含する。本発明は、前記の植物細胞または植物の子孫、種子、および本発明のこのような植物の部分、ならびにその子孫も提供する。さらなる局面において、本発明は、前記のような３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドと相互作用し得る化合物の同定方法も提供する。好ましくは化合物は、前記のポリペプチドの活性を変更し得る。化合物は、ポリペプチドエキソヌクレアーゼまたは遺伝子サイレンシング活性を増大または低減することにより、ポリペプチドの活性を変更し得る。好ましい実施態様では、このような化合物は、核酸分子、例えばアプタマー、または小分子リガンドである。別の好ましい実施態様では、このような化合物は植物または植物細胞に適用され、そしてこのような適用は、植物または植物細胞中の３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドの活性の変更を引き起こす。このような化合物の適用は、植物細胞または植物中での当該ヌクレオチド配列のより安定且つ予測可能な発現を生じる。
【００１７】
したがって、本発明の核酸分子の発現の変更、即ち植物細胞中での当該核酸分子の安定且つ予測可能な発現により、本発明は、植物細胞および植物中での遺伝子発現の操作のための一般的方法を上回る大きい利点を提供する。形質転換の一般的方法は、当該ヌクレオチド配列を安定的且つ予測可能的に発現する植物を同定するための多数の植物を広範なスクリーニングおよび試験を要する。本発明の核酸分子の発現の抑制または低減は、転写後遺伝子サイレンシングのレベル低減、ならびに当該遺伝子の発現改善を生じる。したがって本発明は、よりタイムリーにそして原価効率的方法で、改良された植物、特に改良された商業的変異体の製造を可能にする。
【００１８】
したがって本発明は、以下を提供する：
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に類似する核酸分子またはその相補体。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号２２と同一であるかまたは実質的に類似する。さらに好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号２４と同一であるかまたは実質的に類似する。別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７のヌクレオチド配列と同一であるかまたは実質的に類似する。好ましくはヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１または配列番号２３と同一であるかまたは実質的に類似する。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号１と実質的に類似する。もっとも好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号２３と同一であるかまたは実質的に類似する。別の好ましい実施態様では、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、好ましくはＲＮアーゼＤ関連ドメインを含む。好ましくはポリペプチドは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、そしてもっとも好ましくは３’−５’ＲＮＡエキソヌクレアーゼ活性を含む。さらに別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は植物に由来する。
【００１９】
本発明はさらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるかまたは実質的に類似するアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその相補体を含む単離組換え核酸分子を提供する。さらに好ましくは、組換え核酸分子は、配列番号２３のヌクレオチド配列またはその相補体を含む。組換え核酸分子は、細胞中で機能性であるプロモーターと操作可能的に連結される。好ましくはプロモーターは、植物細胞中で機能性である。
【００２０】
好ましくは本発明のヌクレオチド配列は、核酸分子中でセンス配向であり、または組換え核酸分子中でアンチセンス配向である。さらに別の好ましい実施態様では、ポリペプチドはヘリカーゼドメインをコードしないかまたは含まない。
【００２１】
本発明はさらに以下を提供する：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるかまたは実質的に類似するアミノ酸配列を含む単離および実質的精製ポリペプチド。好ましくはポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。あるいはポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列から成る。
【００２２】
本発明はさらに、以下を提供する：
本発明の核酸またはＤＮＡ分子を含む発現カセット。好ましくは発現カセットはさらに、プロモーターおよびターミネーターを含む。さらに好ましくはプロモーターは、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生的調節プロモーターである。
【００２３】
本発明の核酸分子を含むベクター。
本発明の核酸または組換え核酸分子を含む細胞、ならびに本発明の発現カセットを含む細胞。好ましくは細胞は、植物細胞である。好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、前記の植物細胞中で発現される。別の好ましい実施態様では、発現カセットプロモーターは構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生的調節プロモーターである。別の好ましい実施態様では、発現カセットまたは組換え核酸分子は、植物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。さらに別の好ましい実施態様では、植物細胞は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７または配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する内因性ヌクレオチド配列を含む。好ましくは内因性ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１または配列番号２３と同一であるかまたは実質的に類似する。さらに好ましくは、内因性ヌクレオチド配列は、配列番号１と同一であるかまたは実質的に類似する。もっとも好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号２３と同一であるかまたは実質的に類似する。好ましくは、前記の植物細胞中での前記の内因性ヌクレオチド配列の発現は、変更される。
【００２４】
さらに好ましい実施態様では、植物細胞または植物は、本発明の核酸分子または組換え核酸分子、あるいは発現カセットまたはベクターを含み、そして当該ヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含むが、この場合、前記の植物細胞中の前記当該ヌクレオチド配列の発現は、本発明の前記の核酸分子を欠く植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現と比較して、変更される。別の実施態様では、当該ヌクレオチド配列は、プロモーターと操作可能的に連結される。さらに別の実施態様では、当該ヌクレオチド配列は発現カセット中に存在する。
【００２５】
本発明はさらに、植物細胞、ならびに本発明の核酸配列を含む植物からの子孫および種子を提供する。
本発明はさらに、以下を提供する：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する内因性ヌクレオチド配列を含む植物細胞であって、前記の植物細胞は、前記の内因性ヌクレオチド配列におけるまたはその調節領域における突然変異を含む。好ましくは前記の突然変異は、前記の内因性ヌクレオチド配列中への、またはその調節領域中への核酸分子の挿入によるものであり、前記の植物中での前記の内因性ヌクレオチド配列の発現は変更される。好ましくは、内因性ヌクレオチド配列は、配列番号１と同一であるかまたは実質的に類似する。もっとも好ましくは、ヌクレオチド配列は前記と同様であり、あるいは配列番号２３と実質的に類似する。好ましくは核酸分子の挿入は、１つのＴ−ＤＮＡ境界領域または転位性遺伝因子を含む。本発明の利点は、前記の植物細胞中での前記の内因性ヌクレオチド配列の発現が低減されることである。別の好ましい実施態様では、突然変異は、欠失または再配列による。さらに別の実施態様では、突然変異は点突然変異による。
【００２６】
好ましくは、植物細胞はさらに、当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、この場合、本発明の前記核酸分子を欠く植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現と比較して、前記植物細胞中での前記当該ヌクレオチド配列の発現は安定化または増大される。別の好ましい実施態様では、前記植物細胞中での前記の内因性ヌクレオチド配列の発現は増大される。
【００２７】
さらに別の好ましい実施態様では、植物細胞はさらに、当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットを含むが、この場合、本発明の前記の核酸分子を欠く植物細胞中での前記当該ヌクレオチド配列の発現と比較して、前記の当該ヌクレオチド配列の発現は低減される。
【００２８】
前記の核酸分子または発現カセット、あるいは組換え核酸分子を含む植物細胞を含む植物がさらに提供される。
【００２９】
本発明はさらに、以下を提供する：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列のセンスＲＮＡ分子、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記ヌクレオチド配列のアンチセンスＲＮＡ分子をトランスジェニック的に発現する植物細胞または植物であって、前記センスおよび前記アンチセンスＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得る植物細胞または植物。本発明の利点は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と実質的に類似する前記植物細胞の内因性ヌクレオチド配列の前期植物細胞中での発現が低減されることである。
【００３０】
別の好ましい実施態様では、植物細胞はさらに、第二ヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、この場合、前期センスおよび前記アンチセンスＲＮＡ分子を発現していない植物細胞中での前記第二ヌクレオチド配列の発現と比較して、前記植物細胞中での前記第二ヌクレオチド配列の発現が安定化されるかまたは増大される。
【００３１】
前記のようなセンスおよびアンチセンス構築物を含む植物細胞を含む植物、その種子または子孫も提供される。
【００３２】
本発明はさらに、以下を提供する：
植物細胞または植物中での配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する内因性ヌクレオチド配列の発現の変更方法であって、前記植物細胞または植物中での前記内因性ヌクレオチド配列の転写または翻訳を変更する過程を包含する方法。
【００３３】
好ましい実施態様では、植物細胞または植物中での前記内因性ヌクレオチド配列の転写または翻訳の変更は、以下の：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、センス配向で発現し、あるいは
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、アンチセンス配向で発現し、あるいは
【００３４】
ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分のセンスＲＮＡ、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記ヌクレオチド配列またはその一部分のアンチセンスＲＮＡであって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得るセンスおよびアンチセンスＲＮＡ分子を前記植物細胞中で発現し、あるいは
【００３５】
ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写体を特異的に切断し得るリボザイムを前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを前記植物細胞中で相同的組換えにより修飾し、あるいは
【００３６】
ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域と結合し得るジンクフィンガータンパク質を前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを修飾し得るキメラオリゴヌクレオチドを前記植物細胞中に導入する
過程を包含する。
【００３７】
本発明はさらに、以下を提供する：
前記と同様であるかまたは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と実質的に類似する内因性ヌクレオチド配列の植物細胞中での発現の変更方法であって、前記細胞中での前記内因性ヌクレオチド配列の転写または翻訳を変更するための一手段を前記植物細胞中に導入することを包含する方法。
【００３８】
本発明はさらに、以下を提供する：
植物細胞または植物中での当該ヌクレオチド配列の発現の変更方法であって、以下の：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記植物細胞の内因性ヌクレオチド配列の前記植物細胞または植物中での発現を変更し、そして
ｂ）当該前記ヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記植物細胞または植物中に導入するが、この場合、前記植物細胞または植物中での当該前記ヌクレオチド配列の発現が変更される
過程を包含する方法。
【００３９】
好ましい実施態様では、前記の過程ａ）は、以下の：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、センス配向で発現し、あるいは
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、アンチセンス配向で発現し、あるいは
【００４０】
ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分のセンスＲＮＡ、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記ヌクレオチド配列またはその一部分のアンチセンスＲＮＡであって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得るセンスおよびアンチセンスＲＮＡ分子を前記植物細胞中で発現し、あるいは
【００４１】
ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写体を特異的に切断し得るリボザイムを前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを前記植物細胞中で相同的組換えにより修飾し、あるいは
【００４２】
ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域と結合し得るジンクフィンガータンパク質を前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを修飾し得るキメラオリゴヌクレオチドを前記植物細胞中に導入する
ことを包含する。
【００４３】
本発明はさらに、以下を提供する：
植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現の変更、増大または安定化のための方法であって、以下の：
ａ）本発明のヌクレオチド配列を発現する本発明の発現カセットを含む植物細胞またはその植物を得て、そして
ｂ）当該前記ヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記植物細胞中に導入するが、この場合、前記発現カセットを欠く植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現と比較して、前記植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現が変更、増大または安定化される
過程を包含する方法。
【００４４】
あるいは、前記植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現は、低減または増大される。好ましくは、当該ヌクレオチド配列は、前記植物細胞の内因性ヌクレオチド配列と同一であるかまたは実質的に類似する。
本発明はさらに、以下を提供する：
植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現の安定化方法であって、以下の：　ａ）３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に類似するポリペプチドをコードする前記植物細胞の内因性ヌクレオチド配列の植物細胞中での発現を変更し、そして
ｂ）当該前記ヌクレオチド配列を前記植物細胞中に導入するが、この場合、前記植物細胞中での当該前記ヌクレオチド配列の発現が安定化される
過程を包含する方法。
【００４５】
好ましくは、ポリペプチドは、３’−５’ＲＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、ＲＮアーゼＤ関連ドメインである。好ましくは内因性ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する。
【００４６】
好ましくは、前記内因性ヌクレオチド配列の発現は、以下の：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、センス配向で発現し、あるいは
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分を前記植物細胞中で、アンチセンス配向で発現し、あるいは
【００４７】
ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその一部分のセンスＲＮＡ、ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する前記ヌクレオチド配列またはその一部分のアンチセンスＲＮＡであって、二本鎖ＲＮＡ分子を生成し得るセンスおよびアンチセンスＲＮＡ分子を前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写体を特異的に切断し得るリボザイムを前記植物細胞中で発現し、あるいは
【００４８】
ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるかまたは実質的に類似するポリペプチドに特異的に向けられるアプタマーを前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを前記植物細胞中で相同的組換えにより修飾し、あるいは
【００４９】
ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域と結合し得るジンクフィンガータンパク質を前記植物細胞中で発現し、あるいは
ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその調節領域の少なくとも１つの染色体コピーを修飾し得るキメラオリゴヌクレオチドを前記植物細胞中に導入する
ことにより変更される。
【００５０】
好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする前記内因性ヌクレオチド配列の植物細胞中での発現は低減される。
【００５１】
本発明はさらに、以下を提供する：
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドと相互作用し得る化合物の同定方法であって、以下の：
ａ）相互作用を実行可能な条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８で記述されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその相同体、ならびに前記ポリペプチドと相互作用する能力に関して試験される化合物を併合し、そして
【００５２】
ｂ）前記ポリペプチドと相互作用し得る過程（ａ）からの化合物を選択する
ことを包含する方法。
好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされる。
【００５３】
本発明はさらに、以下を提供する：
直前に開示された方法により同定可能な化合物。好ましくは化合物は、前記のポリペプチドの活性を変更し得る。さらに好ましくは、化合物はポリペプチドの遺伝子サイレンシング活性を低減または増大し得る。
配列表の説明
配列番号１　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＢ３６８５１に対応するヌクレオチド配列。
配列番号２　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＢ３６８５１。
配列番号３　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＤ２５６２３に対応するヌクレオチド配列。
配列番号４　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＤ２５６２３。
配列番号５　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ６９９３６に対応するヌクレオチド配列。
配列番号６　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ６９９３６。
配列番号７　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ４２２４１に対応するヌクレオチド配列。
配列番号８　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ４２２４１。
配列番号９　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＤ２６９６８に対応するヌクレオチド配列。
配列番号１０　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＤ２６９６８。
【００５４】
配列番号１１　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ２５９３１に対応するヌクレオチド配列。
配列番号１２　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ２５９３１。
配列番号１３　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＦ９８１８５に対応するヌクレオチド配列。
配列番号１４　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＦ９８１８５。
配列番号１５　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＡ８０１３７に対応するヌクレオチド配列。
配列番号１６　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＡ８０１３７。
配列番号１７　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＦ０６１６２に対応するヌクレオチド配列。
配列番号１８　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＦ００６１６２。
配列番号１９　　オリゴヌクレオチド３’特異的プライマー。
配列番号２０　　オリゴヌクレオチドｐＤ９９１。
【００５５】
配列番号２１　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ４２２４１に対応する補正ヌクレオチド配列。
配列番号２２　　補正ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ４２２４１。
配列番号２３　　シロイヌナズナからのＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
配列番号２４　　シロイヌナズナからのＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号２５　　オリゴヌクレオチドＴ−ＤＮＡ特異的プライマーＬＢ１。
配列番号２６　　オリゴヌクレオチドＴ−ＤＮＡ特異的プライマーＬＢ２。
配列番号２７　　オリゴヌクレオチドＴ−ＤＮＡ特異的プライマーＬＢ３。
配列番号２８　　オリゴヌクレオチド任意縮重プライマーＡＤ３。
配列番号２９　　オリゴヌクレオチドプライマー３６８５１ＴＤ＃３。
配列番号３０　　遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーＬ２２Ｆ４Ｆ。
【００５６】
配列番号３１　　遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーＬ２２Ｌ４Ｒ。
配列番号３２　　オリゴヌクレオチドプライマーＡｔＷＲＮ　ＣＤＳ　Ｆ。
配列番号３３　　オリゴヌクレオチドプライマーＡｔＷＲＮ　ＲＴ　Ｒ。
配列番号３４　　オリゴヌクレオチドプライマーＡｔＷＲＮＣＤＳ　Ｒ。
配列番号３５　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＧ５０９１７に対応するヌクレオチド配列。
配列番号３６　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＧ５０９１７。
配列番号３７　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＢＡＢ１１２２７に対応するヌクレオチド配列。
配列番号３８　　ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＢＡＢ１１２２７。
【００５７】
定義
明確にするために、本明細書中で用いられるある種の用語は以下のように定義され、用いられる：
【００５８】
変更する：植物細胞中でのヌクレオチド配列の発現を「変更する」とは、本発明の方法を適用後の植物細胞中でのヌクレオチド配列の発現のレベルが、方法を適用する前の細胞中でのその発現と異なることを意味する。好ましい実施態様では、発現を変更するとは、植物中でのヌクレオチド配列の発現が、方法適用前と比較して、本発明の方法を適用後に低減されることを意味する。「低減される」という用語は、本明細書中では、ヌクレオチド配列の発現がより低い、好ましくは有意に低い、さらに好ましくは検出されないことを意味する。別の好ましい実施態様では、発現を変更するとは、植物中でのヌクレオチド配列の発現が、方法適用前と比較して、本発明の方法を適用後に増大されることを意味する。
【００５９】
逆平行：「逆平行」とは、本明細書中では、一方のヌクレオチド配列では５’−３’方向に、そして他方のヌクレオチド配列では３’−５’方向に走るホスホジエステル結合を有する相補的塩基残基間で水素結合により対合される２つのヌクレオチド配列を指す。
【００６０】
相補的：「相補的」とは、逆平行ヌクレオチド配列における相補的塩基残基間の水素結合の形成時に互いに対合し得る逆平行ヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列を指す。
【００６１】
ＤＮＡシャッフリング：「ＤＮＡシャッフリング」とは、ＤＮＡ分子中に、好ましくは無作為に、突然変異または再配列を迅速、容易に且つ効率的に導入するための、あるいは２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子間のＤＮＡ配列の交換を、好ましくは無作為に、生成するための方法である。ＤＮＡシャッフリングに起因するＤＮＡ分子は、少なくとも１つの鋳型ＤＮＡ分子に由来する非天然ＤＮＡ分子であるシャッフル化ＤＮＡ分子である。シャッフル化ＤＮＡは、鋳型ＤＮＡによりコードされる酵素に関して修飾された酵素をコードし、そして好ましくは鋳型ＤＮＡによりコードされる酵素に関して変更された生物学的活性を有する。
【００６２】
二本鎖ＲＮＡ：「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）」分子は、ヌクレオチド配列のセンスＲＮＡ断片およびヌクレオチド配列のアンチセンスＲＮＡ断片を含み、これらはともに、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、それによりセンスおよびアンチセンスＲＮＡ断が対合し、そして二本鎖ＲＮＡ分子を形成するのを可能にする。
【００６３】
内因性：「内因性」ヌクレオチド配列とは、非形質転換化植物細胞のゲノム中に存在するヌクレオチド配列を指す。
【００６４】
必須の：「必須」遺伝子とは、植物の成長または生存に不可欠であるタンパク質、例えば生合成酵素、受容体、シグナル伝達タンパク質、構造遺伝子産物または輸送タンパク質をコードする遺伝子である。
【００６５】
発現：「発現」とは、細胞中でのヌクレオチド配列、例えば内因性遺伝子または異種遺伝子の転写および／または翻訳を指す。例えばアンチセンス構築物の場合、発現とはアンチセンスＤＮＡのみの転写を指し得る
【００６６】
発現カセット：「発現カセット」とは、本明細書中で用いる場合、適切な宿主中での特定のヌクレオチド配列の発現を指図し、それが導入される植物細胞中で機能的であるプロモーターを含み、終止シグナルと操作可能的に連結される当該ヌクレオチド配列と操作可能的に連結され得るＤＮＡ配列を意味する。それは典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要な配列も含む。コード領域は通常は当該タンパク質をコードするが、しかし当該機能性ＲＮＡ、例えばセンスまたはアンチセンス方向で、アンチセンスＲＮＡまたは非翻訳化ＲＮＡもコードし得る。当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであり得るが、これはその構成成分の少なくとも１つがその他の構成成分のうちの少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットは、天然であるがしかし異種発現に有用な組換え形態で得られたものでもあり得る。しかしながら典型的には発現カセットは、宿主に関して異種であり、即ち発現カセットの特定のＤＮＡ配列は宿主中で天然には生じないし、形質転換事象により宿主細胞または宿主細胞の先祖中に導入されていなければならない。発現カセット中でのヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーターの、または宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝露された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあり得る。多細胞生物、例えば植物の場合、プロモーターは特定の組織または器官あるいは発生の段階に対しても特異的であり得る。
【００６７】
異種ＤＮＡ配列：それが導入される宿主細胞と天然では会合されないＤＮＡ配列、例えば内因性ＤＮＡ配列の非天然多コピー。
【００６８】
相同ＤＮＡ配列：宿主細胞と天然で会合されるＤＮＡ配列。
【００６９】
同系：遺伝的に同一である植物。但し、それらは異種ＤＮＡ配列の存在または非存在により異なり得る。
【００７０】
単離された：本発明の情況では、単離ＤＮＡ分子または単離酵素は、人の手により、そのネイティブ環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではないＤＮＡ分子または酵素である。単離ＤＮＡ分子または酵素は精製形態で存在し得るし、あるいは非ネイティブ環境中に、例えばトランスジェニック宿主細胞中に存在し得る。
【００７１】
成熟タンパク質：細胞小器官、例えば葉緑体に対して普通は標的化され、そして一時ペプチドが除去されたタンパク質。
【００７２】
最小プロモーター：上流活性化の非存在下で、不活性であるかまたはプロモーター活性を大いに低減されたプロモーター素子、特にＴＡＴＡ素子。適切な転写因子の存在下では、最小プロモーターは転写を可能にするよう機能する。
【００７３】
「核酸」および「ヌクレオチド」とは、天然または合成または人工核酸またはヌクレオチドを指す。
【００７４】
植物：「植物」とは、発生の任意の段階の任意の植物または植物の部分を指す。そこには、切断、細胞または組織培養および種子も含まれる。本発明とともに用いられる場合、「植物組織」という用語は、全植物体、植物細胞、植物器官、植物種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養ならびに構造的および／または機能的単位に組織化される任意の群の植物細胞を包含するが、これらに限定されない。
【００７５】
プレタンパク質：普通は細胞小器官、例えば葉緑体に対して標的化され、そしてさらにその一時ペプチドを含むタンパク質。
【００７６】
有意の増大または低減：測定技法に固有の誤差の限界より大きい、例えば酵素活性における、または遺伝子発現における増大または低減、好ましくは対照細胞中での対照酵素または発現の活性の約２倍またはそれ以上の増大または低減、さらに好ましくは、約５倍またはそれ以上の増大または低減、もっとも好ましくは約１０倍またはそれ以上の増大または低減。
【００７７】
安定化する：植物細胞中でのヌクレオチド配列の発現を「安定化する」とは、同一または匹敵する条件下で植物が増殖される場合、本発明の方法を適用後のヌクレオチド配列の発現のレベルが、同一世代からのまたは多世代を通しての異なる植物中での同一組織からの細胞中でほぼ同一であることを意味する。
【００７８】
広義においては、「実質的に類似の」という用語は、ヌクレオチド配列に関して本明細書中で用いる場合、参照ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味するが、この場合、対応する配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同一の構造および機能を有するポリペプチドをコードし、例えばポリペプチド機能に影響を及ぼさないアミノ酸中の変化のみが起こる。望ましくは、実質的に類似のヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドをコードする。「実質的に類似の」という用語は、配列が特定の細胞中での発現を最適化するよう修飾されたヌクレオチド配列を含むよう特に意図される。実質的に類似のヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、望ましくは少なくとも２４％、さらに望ましくは少なくとも３０％、さらに望ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００７９】
配列比較は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３）のアルゴリズムに基づいて、ＧＡＰのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧ， ＳＥＱＷＥＢ適用を用いるデフォルトＧＡＰ分析を用いて実行される。参照ヌクレオチド配列と「実質的に類似の」ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ ＭＮａＰＯ４、１ｍＭＥＤＴＡ中で参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、さらに望ましくは５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ ＭＮａＰＯ４、１ｍＭＥＤＴＡ中でハイブリダイズし、５０℃で１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、さらに望ましくは５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ ＭＮａＰＯ４、１ｍＭＥＤＴＡ中で参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、好ましくは５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ ＭＮａＰＯ４、１ｍＭＥＤＴＡ中で参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、さらに好ましくは５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ ＭＮａＰＯ４、１ｍＭＥＤＴＡ中で参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、６５℃で０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。ヌクレオチド配列の相同体としては、前記のパラメターを用いて測定した場合に、参照アミノ酸配列と少なくとも２４％同一、さらに好ましくは少なくとも３５％同一、さらに好ましくは少なくとも５０％同一、さらに好ましくは少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が挙げられるが、この場合、相同体によりコードされるアミノ酸配列は、３’−５’エキソヌクレアーゼの生物学的活性を有する。さらに好ましくは、相同体は３’−５’ＲＮＡエキソヌクレアーゼの生物学的活性を有する。別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列の相同体は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むアミノ酸配列をコードする。
【００８０】
「実質的に類似の」という用語は、ポリペプチドに関して本明細書中で用いる場合、参照ポリペプチドに対応するタンパク質を意味するが、この場合、ポリペプチドは、参照タンパク質と実質的に同一の構造および機能を有し、例えばポリペプチド機能に影響を及ぼさないアミノ酸中の変化のみが起こる。ポリペプチドまたはアミノ酸配列に関して用いる場合、実質的に類似の配列と参照ポリペプチドまたはアミノ酸配列によりコードされるアミノ酸配列との間の同一性のパーセンテージは、前記のようなデフォルトＧＡＰ分析パラメターを用いて、望ましくは少なくとも２４％、さらに望ましくは少なくとも３０％、さらに望ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくはとも９９％である。相同体とは、前記のパラメターを用いて測定した場合に、参照ポリペプチドまたはアミノ酸配列と少なくとも２４％同一、さらに好ましくは少なくとも３５％同一、さらに好ましくは少なくとも５０％同一、さらに好ましくは少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列であり、この場合、相同体によりコードされるアミノ酸配列は、３’−５’エキソヌクレアーゼの生物学的活性を有する。さらに好ましくは、相同体は３’−５’ＲＮＡエキソヌクレアーゼの生物学的活性を有する。別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列の相同体は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むアミノ酸配列をコードする。
【００８１】
標的遺伝子：「標的遺伝子」とは、植物細胞中の任意の遺伝子である。例えば標的遺伝子は、既知の機能を有する遺伝子であるか、あるいはその機能が未知であるが、しかしその全体的または部分的ヌクレオチド配列が既知である遺伝子である。あるいは標的遺伝子およびそのヌクレオチド配列の機能は、ともに未知である。標的遺伝子は、植物細胞のネイティブ遺伝子であるか、あるいは例えば遺伝子形質転換により、植物細胞または前記の植物細胞の親細胞中に予め導入されていた異種遺伝子である。異種標的遺伝子は、植物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれるか、あるいは染色体外分子として、例えば自律的複製性染色体外分子として、植物細胞中に存在する。
【００８２】
形質転換：細胞、組織または植物体中に異種核酸分子を導入するための方法。形質転換化細胞、組織または植物は、形質転換過程の最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。
【００８３】
トランスジェニック：当該ＤＮＡ配列と操作可能的に連結された適切なプロモーターを好ましくは含む組換えＤＮＡ分子で形質転換された、好ましくは安定的に形質転換されたものである。
【００８４】
植物細胞中での遺伝子発現を再現可能的に且つ予測可能的に操作する能力は、改良された特性を有する新規の商業的変種の製造に関して重要な問題である。新規の特徴はしばしばトランスジェニック法により植物細胞中に導入されるが、しかしそれらの発現は時としては、個々の植物間の、または異なる世代間の変化を蒙る。この現象は遺伝子サイレンシングと呼ばれ、遺伝子サイレンシングによる影響を受けない系統の選択は、かなりの努力を要し、そして経費が掛かる。他の用途においては、植物細胞中での特定の内因性遺伝子の発現を低減するかまたは排除するのが望ましいが、しかし最新方法を用いても、安定的および再現可能的方法でこれをルーチンに達成するのはしばしば困難である。したがって、これらの必要性を取り扱い、そして予測可能かつ安定的方法での植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現を安定化させるかまたは変更させる新規の方法を提供することは、本発明の一目的である。本発明によれば、これは好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の植物細胞中での発現を変更することにより達成される。
【００８５】
Ｉ．３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
一局面において、本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する．好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、ＲＮアーゼＤ関連ドメインである。本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。好ましくはポリペプチドは、３’−５’ＲＮＡエキソヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は、植物から、好ましくは単子葉植物または双子葉植物から単離される。好ましくは植物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、アブラナ科、カノーラ、トマト、ジャガイモ、ナス科またはサトウダイコンであるが、これらに限定されない。さらに好ましくは、核酸分子はシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから単離される。
【００８６】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、典型的には、ｅｘｏＩ、ｅｘｏＩＩおよびｅｘｏＩＩＩと呼ばれる３つのサブドメインを含む（Ｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：５１１０−５１１８）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。これらのモチーフは、活性部位周囲に密集され、触媒的活性チロシンのほかに、触媒作用のために必要な２つの金属イオンのためのリガンドとして役立つ４つの負荷電残基を含有する．典型的には、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、約１４０アミノ酸長である。３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、例えばＤＮＡポリメラーゼ中に見出され、そこではそれらは時としては３’−５’エキソデオキシリボヌクレアーゼ（またはプルーフリーディング）ドメインと呼ばれる。
【００８７】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、例えば大腸菌リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＤ）、ビール酵母菌Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＲｒｐ６ｐタンパク質およびヒトワーナー症候群タンパク質を包含するポリペプチドのＲＮアーゼＤファミリー中にも見出される（Ｍｉａｎ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３１８７−３１９５参照）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。このようなどメインは、ＲＮアーゼＤ関連ドメインと呼ばれる。ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドのアラインメントは、Ｍｉａｎ（１９９７）に示されている。ＲＮアーゼＤ関連ドメインおよびプルーフリーディングドメインは類似していると思われる。
【００８８】
本発明の発明人等は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする植物ヌクレオチド配列に関してスクリーニングし、そしてこのようなヌクレオチド配列を首尾よく同定した最初の者達である。これは、実施例１に開示した方法により実行される。実施例１に開示した方法およびアルゴリズムを用いて同定されるアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号１〜１４および３５〜３８で記述され、ならびに以下のように手短に説明される。シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＣＡＢ３６８５１でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号２で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＬ３５５２８．２でＢＡＣ Ｆ１８Ａ５に見出される。シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＡＡＤ２５６２３でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号４で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ００５２８７．４でＢＡＣ Ｆ２０Ｄ２１に見出される。シロイヌナズナからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＡＡＣ６９９３６でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号６で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ００５７００．２でシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ第二染色体セクション２５５の１８１に見出される。シロイヌナズナからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＡＡＣ４２２４１でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号８で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ００５３９５．２でシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ第二染色体セクション２５５の１８１に見出される。シロイヌナズナからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＡＡＤ２６９６８でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号１０で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ００７１３５．７でシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ第二染色体セクション２５５の１９７に見出される。シロイヌナズナからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＡＡＣ２５９３１でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号１２で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ００４６８１．２でシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ第二染色体セクション２５５の１８２に見出される。
【００８９】
シロイヌナズナからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＡＡＦ９８１８５でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号１４で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ０００１０７．２でＢＡＣ Ｆ１７Ｆ８に見出される。シロイヌナズナからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＡＡＧ５０９１７でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号３６で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ０６９１５９でＢＡＣ Ｆ１４Ｇ９に見出される。シロイヌナズナからのゲノム配列から予測されるアミノ酸配列は、寄託番号ＢＡＢ１１２２７でＧｅｎＢａｎｋ中に見出され、配列番号３８で記述される。対応するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ０１６８８４でＢＡＣ Ｋ１６Ｈ１７に見出される。
【００９０】
ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ４２２４１の５’末端は不的確な注釈のために欠けており、そしてＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ４２２４１は３’−５’エキソヌクレアーゼドメインのｅｘｏＩモチーフを欠く、ということも本発明の発明人等は発見した。全３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むアミノ酸配列（ｅｘｏＩを含む）は、本出願で最初に開示され、配列番号２２で記述される。対応するヌクレオチド配列は、配列番号２１で記述される。
【００９１】
さらに本発明は、実施例２〜３に記述されたようなシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａからクローンかされたような配列番号２４の３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする全長ヌクレオチド配列をコードする核酸分子を提供する。本発明は、配列番号２３のヌクレオチド配列またはその相補体と同一であるかまたは実質的に類似する配列を含むかまたは有する核酸分子も提供する。配列番号２で記述されるアミノ酸配列中のおよそのアミノ酸位置１２９〜２８７間に３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを、本発明の発明人等は予測した。配列番号４のアミノ酸位置１３６〜２７１間のアミノ酸配列が３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン中に構成され、配列番号４のアミノ酸位置７６〜２１０間のアミノ酸配列が３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン中に構成され、配列番号１０のアミノ酸位置５７〜１９３間のアミノ酸配列が３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン中に構成され、配列番号１２のアミノ酸位置６６〜２０２間のアミノ酸配列が３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン中に構成され、配列番号３６のアミノ酸位置３８０〜５３８間のアミノ酸配列が３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン中に構成され、配列番号３８のアミノ酸位置３０〜１９３間のアミノ酸配列が３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン中に構成され、配列番号２４のアミノ酸位置１２９〜２８２間のアミノ酸配列が３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含む、ということも本発明の発明人等は予測した。
【００９２】
好ましくは本発明のヌクレオチド配列は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。本発明の別の局面では、ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施態様では、ヌクレオチド配列は、１つより多い３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする。
【００９３】
したがって本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるかまたは実質的に類似するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を開示する。好ましくはポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２と同一であるかまたは実質的に類似する。さらに好ましくは、ポリペプチドは配列番号２と同一であるかまたは実質的に類似する。もっとも好ましくは、ポリペプチドは配列番号２４のアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に類似する。
【００９４】
好ましくはヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３５または配列番号３７と同一であるかまたは実質的に類似する。さらに好ましくはヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号２１と実質的に類似する。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号１と同一であるかまたは実質的に類似する。もっとも好ましくはヌクレオチド配列は、配列番号２３と同一であるかまたは実質的に類似する。
【００９５】
本発明の発明人等は、本発明のヌクレオチド配列が遺伝子サイレンシングに関与することを予測し、実証した、そしてこのようなヌクレオチド配列を用いて、実施例５に記述されたように細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現を変更または安定化した同定した最初の者達である。本発明のヌクレオチド配列は、植物細胞中での別の当該ヌクレオチド配列の発現を変更または安定化するために有用である。
【００９６】
本発明の出願人等の開示に基づいて、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３６または配列番号３８と同一であるかまたは実質的に類似するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、好ましくは任意の所望の植物のゲノムから単離される。例えば配列番号１で記述されるヌクレオチド配列の全部または一部が、選定供給源生物体からのクローン化ゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片の集団（即ちゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在する他のヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズするプローブとして用いられる。このような技法としては、プレート化ＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング（プラークまたはコロニー；例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ． （１９８９）参照）、ならびにこのようなポリペプチド間に保存された配列ドメインに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによる増幅（例えばＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， “ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）参照）が挙げられる。例えば３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。これらの方法は、プローブ配列が得られる生物体に密接に関連した生物体からのヌクレオチド配列の単離に特に良くて記している。本発明のこのような核酸、と国配列番号２３の単離は、実施例７に記載されている。
【００９７】
本発明により教示される単離ヌクレオチド配列は、任意の所望の目的に適合するよう、標準遺伝子工学処理技法にしたがって操作される。例えばそれらは、コード配列およびメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るプローブとして用いられ得る。種々の条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、もっとも好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長を包含する。このようなプローブは、ＰＣＲにより選択生物からのヌクレオチド配列を増幅し、分析するために用いられる。
【００９８】
特異的ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノム配列とのプローブの選択的ハイブリダイゼーションに基づいた標準技法を用いて、選定植物のゲノム中のこれらのネイティブ遺伝子の位置をマッピングするためにも用いられる。これらの技法としては、プローブ配列内に同定または含入されるＤＮＡ多型の同定、ならびに２つの多型親系統のハイブリッドの自家受精から得られるマッピング集団中の既知のマップ位置の他のマーカーと比較して遺伝子の分離を追跡調査するためのこのような多型の使用が挙げられるが、これらに限定されない（例えばＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５： １０９ （１９８５）； Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：８２（１９９２）； Ｄ’Ｏｖｉｄｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５：１６９（１９９０）参照）。この方法での遺伝子のマッピングは、繁殖目的のために特に有用であるよう意図される。例えば、突然変異体遺伝子の遺伝子地図位置を知ることにより、フランキングＤＮＡマーカーが参照遺伝子地図から同定される（例えばＨｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ３：２１７ （１９８７）参照）。新規の繁殖系統への除草剤耐性特徴の遺伝子浸透中に、これらのマーカーを用いて、各回の戻し交雑後に回帰親中に依然として存在する連結フランキング染色体ＤＮＡの程度をモニタリングする。特異的ハイブリダイゼーションプローブは、ノーザンブロット分析のような標準技法を用いて植物中のｍＲＮＡのレベルを定量するために用いられる。
【００９９】
本発明の別の局面では、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換え核酸分子中に挿入される。組換え核酸分子は、好ましくはプロモーターと操作可能的に連結される。さらに好ましくは、プロモーターは植物細胞中で機能的である。組換え核酸分子は、例えば以下でさらに詳細に記載されるように、遺伝子形質転換により植物細胞中に導入され得る。
【０１００】
本発明は、前記のような３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子と操作可能的に連結されるプロモーターならびにターミネーターを含む発現カセットも提供する。本発明の発現カセットはさらに、エンハンサーを含み得る。
【０１０１】
別の局面において、本発明は、前記の３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。さらにベクターは、本発明の核酸分子と操作可能的に連結されるプロモーターおよびターミネーターも含む。本発明の核酸分子をさらに含む分子生物学の業界の当業者に既知のプラスミドおよびウイルスベクターが、本発明に包含される。
【０１０２】
ＩＩ．細胞中の３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを有するポリペプチドの発現の変更方法
本発明の発明人等は、本発明のヌクレオチド配列が遺伝子発現または転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を操作または変更するのに有用であることを最初に発見した。好ましくは遺伝子発現またはＰＴＧＳは、植物細胞中で操作または変更される。したがって本発明の一目的は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび／または活性を含むポリペプチドをコードする前記の植物のヌクレオチド配列の植物細胞中での発現を変更することである。
【０１０３】
実施例５および６に記載されているように、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子の発現の低減または防止は、検出可能レベルのＰＴＧＳの低減または排除を引き起こす。ＰＴＧＳのレベルは、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現のレベルを測定することにより確定される。本発明のこのような配列の置換は、植物中のＰＴＧＳ活性を回復する。
【０１０４】
さらに、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする本発明の核酸分子の過剰発現は、ＰＴＧＳのレベルを増大または補足する。
【０１０５】
本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子の発現を変更するための多数の方法を提供する。これらの方法は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子の発現のレベルの低減または増大を可能にし、これが次に当該核酸分子または遺伝子の発現の変更を生じる。
【０１０６】
例えば本発明の核酸分子の発現の変更は、以下の方法のうちの１つで達成される：
（１）「センス」抑制
本発明のヌクレオチド配列の発現の変更、好ましくはその発現の低減は、「センス」抑制により得られる（例えばＪｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１， ９５７−９７３に言及されている）。この場合、本発明のヌクレオチド配列の全体または一部分がＤＮＡ分子中に含まれる。ＤＮＡ分子は、好ましくは、標的遺伝子を含む細胞、好ましくは植物細胞中で機能的であるプロモーターと操作可能的に連結され、そしてヌクレオチド配列が発現可能である細胞中に導入される。ヌクレオチド配列は、「センス配向」でＤＮＡ分子中に挿入されるが、これは、ヌクレオチド配列のコード鎖が転写され得ることを意味する。好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は、十分に翻訳可能であり、ヌクレオチド配列中に含まれるすべての遺伝情報またはその一部分が、ポリペプチドに翻訳される。別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は、部分的に翻訳可能であり、短いペプチドが翻訳される。好ましい実施態様では、これはヌクレオチド配列中に少なくとも１つの未熟停止コドンを挿入することにより達成され、これが翻訳を停止させる。別のさらに好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は転写されるが、しかし翻訳産物は作製されていない。これは通常は、開始コドン、例えばヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの「ＡＴＧ」を除去することにより達成される。さらに好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列またはその一部分を含むＤＮＡ分子は、植物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列またはその一部分を含むＤＮＡ分子は、染色体外的に複製される分子中に含まれる。
【０１０７】
すぐ上に記載したＤＮＡ分子の１つを含入するトランスジェニック植物では、ＤＮＡ分子中に含まれたヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の発現は、好ましくは低減される。好ましくは、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列は、その発現が低減されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であり、さらに好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一、さらに好ましくは少なくとも９５％同一さらに好ましくは少なくとも９９％同一である。
【０１０８】
（２）「アンチセンス」抑制
別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列の発現の変更、好ましくはその発現の低減は、「アンチセンス」抑制により得られる。本発明のヌクレオチド配列の全体または一部分は、ＤＮＡ分子中に含まれる。ＤＮＡ分子は、好ましくは、植物細胞中で機能的であるプロモーターと操作可能的に連結され、そしてヌクレオチド配列が発現可能である植物細胞中に導入される。ヌクレオチド配列は、「アンチセンス配向」でＤＮＡ分子中に挿入されるが、これは、ヌクレオチド配列の逆相補体（時としては非コード鎖とも呼ばれる）が転写され得ることを意味する。好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列またはその一部分を含むＤＮＡ分子は、植物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列またはその一部分を含むＤＮＡ分子は、染色体外的に複製される分子中に含まれる。このアプローチを記載するいくつかの出版物が、さらなる例証のために引用される（Ｇｒｅｅｎ， Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５：５６９−５９７ （１９８６）； ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ， Ａ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｐｐ． １２５−１４１ （１９９１）； Ａｂｅｌ， Ｐ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ６９４９−６９５２ （１９８９）； Ｅｃｋｅｒ， Ｊ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：５３７２−５３７６（Ａｕｇ． １９８６））。
【０１０９】
すぐ上に記載したＤＮＡ分子の１つを含入するトランスジェニック植物では、ＤＮＡ分子中に含まれたヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列の発現は、好ましくは低減される。好ましくは、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列は、その発現が低減されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であり、さらに好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一、さらに好ましくは少なくとも９５％同一さらに好ましくは少なくとも９９％同一である。
【０１１０】
（３）相同的組換え
別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列に対応する少なくとも１つのゲノムコピーが、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：４０２１−２６（１９８８）でさらに例証されるように、相同的組換えにより植物のゲノム中で修飾される。この技法は、相同的組換えとして当業界で既知の方法により、互いに認識し、そして各々の間でヌクレオチド配列を交換するために相同配列の特性を用いる。相同的組換えは、細胞中のヌクレオチド配列の染色体コピーと形質転換により細胞中に導入されたヌクレオチド配列の進入コピーとの間で起こり得る。したがって特異的修飾は、ヌクレオチド配列の染色体コピー中に正確に導入される。一実施態様では、本発明のヌクレオチド配列の調節素子が修飾される。このような調節素子は、プローブとして本発明のヌクレオチドまたはその一部分を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、容易に得られる。既存の調節素子が異なる調節素子により置換され、したがってヌクレオチド配列の発現を変更するか、あるいはそれらは突然変異化されるかまたは欠失され、したがってヌクレオチド配列の発現を無くする。別の実施態様では、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の一部分または全ヌクレオチド配列の欠失により、あるいは突然変異により修飾される。植物細胞中での突然変異化ポリペプチドの発現も、本発明において意図される。内因性植物遺伝子を崩壊するためのこの技法のさらに最新の改善が記載されている（Ｋｅｍｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９： ８０２−８０３（１９９７）およびＭｉａｏ ａｎｄ Ｌａｍ， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ７：３５９−３６５（１９９５））。
【０１１１】
別の好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列の染色体コピー中の突然変異は、末端に二重ヘアピンキャップを有する二重鎖配座中のＲＮＡおよびＤＮＡ残基の連続ストレッチから成るキメラオリゴヌクレオチドで細胞を形質転換することにより、導入される。オリゴヌクレオチドの付加的特徴は、例えばＲＮＡ残基での２’−Ｏ−メチル化の存在である。ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、本発明のヌクレオチド配列の染色体コピーの配列と一列になるよう、そして所望のヌクレオチド変化を含有するよう設計される。例えばこの技法は、米国特許第５，５０１，９６７号ならびにＺｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：８７６８−８７７３でさらに例証される。
【０１１２】
（４）リボザイム
さらなる実施態様では、本発明のポリペプチドをコードする穴は、触媒性ＲＮＡまたはこのようなＲＮＡに特異的なリボザイムにより切断される。リボザイムはトランスジェニック植物中で発現され、そして植物細胞中の本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ量の低減を生じ、したがって細胞中に蓄積されるポリペプチドの量の低減をもたらす。この方法は、米国特許第４，９８７，０７１号でさらに例証される。
【０１１３】
（５）優性ネガティブ変異体
別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの活性が変えられる。これは、トランスジェニック植物中のタンパク質の優性ネガティブ変異体の発現により達成され、内因性タンパク質の活性の損失をもたらす。
【０１１４】
（６）アプタマー
さらなる実施態様では、タンパク質と特異的に結合する核酸リガンド、いわゆるアプタマーをトランスジェニック植物中で発現することにより、本発明のポリペプチドの活性が阻害される。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数的濃化によるリガンドの系統的進化）法により、選択的に得られる。ＳＥＬＥＸ法では、無作為化配列の領域を有する一本鎖核酸の候補混合物がタンパク質と接触され、そして標的との親和性増大を示す核酸が残りの候補混合物から分配される。分配核酸は増幅されて、リガンド濃化混合物を生じる。数回反復後、ポリペプチドとの最適親和性を有する核酸が得られ、トランスジェニック植物中での発現のために用いられる。この方法はさらに、米国特許第５，２７０，１６３号で例証されている。
【０１１５】
（７）ジンクフィンガータンパク質
本発明のヌクレオチド配列またはその調節領域と結合するジンクフィンガータンパク質も、ヌクレオチド配列の発現を変更するために用いられる。好ましくは、ヌクレオチド配列の転写は、低減または増大される。ジンクフィンガータンパク質は、例えばＢｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＰＮＡＳ ９５：１４６２８−１４６３３あるいはＷＯ ９５／１９４３１、ＷＯ ９８／５４３１１またはＷＯ ９６／０６１６６に記載されている（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
【０１１６】
（８）ｄｓＲＮＡ
本発明のヌクレオチド配列の発現の変更は、例えばＷＯ ９９／３２６１９、ＷＯ ９９／５３０５０またはＷＯ ９９／６１６３１（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたようなｄｓＲＮＡ干渉によっても得られる。
【０１１７】
（９）ＤＮＡ分子の挿入（挿入突然変異誘発）
別の好ましい実施態様では、ＤＮＡ分子が、本発明のヌクレオチド配列の染色体コピー中に、あるいはその調節領域中に挿入される。好ましくはこのようなＤＮＡ分子は、植物細胞中での転位を可能にする転位性遺伝因子、例えばＡｃ／Ｄｓ、Ｅｍ／Ｓｐｍ、突然変異誘発遺伝子を含む。あるいはＤＮＡ分子は、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡのＴ−ＤＮＡ境界を含む。ＤＮＡ分子は、植物細胞の染色体からＤＮＡ分子の一部を除去するために用いられ得るリコンビナーゼまたはインテグラーゼ認識部位も含む。この方法の一例は、実施例２に記述されている。Ｔ−ＤＮＡ、トランスポゾン、オリゴヌクレオチドを用いる挿入的突然変異誘発の方法、あるいは当業者に既知のその他の方法も包含される。挿入的突然変異誘発のためのＴ−ＤＮＡおよびトランスポゾンの使用方法は、Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８２：１２９−１３６およびＭａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ （１９９８） ＰＮＡＳ ９５：２０２１−２０２６（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されている。
【０１１８】
（１０）欠失突然変異誘発
さらに別の実施態様では、ヌクレオチド配列またはレギュレーター配列の一部分の欠失により、細胞または植物中の配列のゲノムコピー中に本発明の核酸分子の突然変異が作製される。欠失突然変異誘発の方法は、当業者に既知である（例えばＭｉａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ７：３５９参照）。さらに別の実施態様では、この欠失は、化学的突然変異誘発または放射線照射により植物の大集団中に無作為に作製され、そして本発明の遺伝子中に欠失を有する植物が前進または逆遺伝学により単離される。高速ニュートロンまたはガンマ線を用いた照射は、植物における欠失突然変異を引き起こすことが知られている（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ， （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １０：１５５−１６９； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １０：７５５−７６０； Ｒｅｄｅｉ ａｎｄ Ｋｏｎｃｚ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９２）， ｐｐ．１６−８２）。本発明の遺伝子における欠失突然変異は、線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ９：８５９−８６７）において示されたような、ゲノムＤＮＡのプール化組を用いたＰＣＲを用いて、逆遺伝子学戦略で回復され得る。前進遺伝子学戦略は、ＰＴＧＳを表示する系統の突然変異誘発とその後のＰＴＧＳの非存在に関するＭ２子孫のスクリーニングを包含する。これらの突然変異体の１つは、本発明の遺伝子を崩壊するものであると予測される。これは、これらの突然変異体からのゲノムＤＮＡを用いた本発明の遺伝子に関するサザンブロットまたはＰＣＲにより査定される。
【０１１９】
（１１）植物細胞中での過剰発現
さらに別の好ましい実施態様では、植物細胞中での３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび／または活性を含むポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列が過剰発現される。本発明の核酸分子の過剰発現のための核酸分子および発現カセットの例は、以下に記載される（実施例８〜１０参照）。核酸分子の過剰発現の当業者に既知の方法も、本発明に包含される。
【０１２０】
好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列の発現は、すべての植物細胞中で変更される。これは、例えば相同的組換えによりまたは染色体中挿入により得られる。これは、例えばすべての植物細胞中でセンスまたはアンチセンスＲＮＡ、ジンクフィンガータンパク質またはリボザイムを発現し得るプロモーターの制御下で、センスまたはアンチセンスＲＮＡ、ジンクフィンガータンパク質またはリボザイムを発現することによっても得られる。構成性発現、誘導性、組織特異的または発生的調節性発現も本発明の範囲内であり、植物細胞中での本発明のヌクレオチド配列の発現の構成性、誘導性、組織特異的または発生調節性変更を生じる。センスまたはアンチセンスＲＮＡ、ジンクフィンガータンパク質またはリボザイムの発現のための、あるいは本発明のヌクレオチド配列の過剰発現のための構築物が調製され、例えば以下で記載されるように、本発明の教示により植物細胞中で形質転換される。
【０１２１】
ＩＩＩ．植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現の操作方法
本発明の別の局面では、本発明のそして前記のようなヌクレオチドの発現変更を示す植物細胞が、植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現を変更または安定化するために用いられる。好ましい実施態様では、当該異種ヌクレオチド配列の発現の操作が望ましい。この場合、異種ヌクレオチド配列は、発現カセット中に導入される。異種ヌクレオチド配列は、好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび／または活性を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現変更を示す植物細胞中に導入される。好ましい実施態様では、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび／または活性を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドはれの発現低減を示す植物細胞が、当該ヌクレオチド配列の発現を安定化または増大するために用いられる。あるいは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび／または活性を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現増大を示す植物細胞は、好ましくは、当該ヌクレオチド配列の発現を低減するために用いられる。当該ヌクレオチド配列の構成性、誘導性、組織特異的または発生調節性変更は、好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の構成性、誘導性、組織特異的または発生調節性変更を用いることにより、得られる。
【０１２２】
別の好ましい実施態様では、植物細胞中での内因性ヌクレオチド配列の発現は、本発明を用いて操作される。この場合、内因性ヌクレオチド配列と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列またはその逆相補体が、本発明のヌクレオチド配列の発現変更を示す植物細胞中に導入される。好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列の発現増大を示す植物細胞は、好ましくは、当該内因性ヌクレオチド配列の発現を低減するために用いられる。
【０１２３】
あるいは本発明のヌクレオチド配列の発現低減を示す植物細胞は、当該ヌクレオチド配列の発現を増大するために用いられる。内因性ヌクレオチド配列の構成性、誘導性、組織特異的または発生調節性変更は、好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするそのヌクレオチド配列の発現の構成性、誘導性、組織特異的または発生調節性変更を示す植物細胞を用いることにより、得られる。内因性ヌクレオチド配列の任意の部分が用いられる。例えばヌクレオチド配列がコード領域を含む場合、全コード領域またはその一部分が用いられる。あるいは調節領域の一部分、好ましくは調節領域の転写化部分が用いられる。このような部分は、好ましくは発現カセットまたはベクター中に導入され、そして本発明のヌクレオチド配列の発現変更を示す植物細胞中で形質転換される組換え核酸分子中に導入される。好ましくは、用いられるヌクレオチド配列は、内因性ヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であり、さらに好ましくは少なくとも８０％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一、さらに好ましくは少なくとも９５％同一さらに好ましくは少なくとも９９％同一である。
【０１２４】
異種ヌクレオチド配列は、例えば蝋質デンプン、除草剤耐性、細菌、真菌またはウイルス疾患に対する耐性、昆虫耐性、栄養的質の強化、工業的過程における性能改善、生殖能力変更、例えば雄性不稔性または雄性稔性、収量安定性および収量増強に関与するポリペプチドをコードするが、これらに限定されない。本発明を用いて、このような特徴は植物細胞中で安定的且つ再現可能的に発現される。植物細胞中のその発現が本発明を用いて変更される内因性ヌクレオチド配列の例は、例えばＷＯ ９９／５３０５０に見出される。
【０１２５】
別の好ましい実施態様では、当該ヌクレオチド配列は、植物の病原体、好ましくはウイルス病原体から得られる。したがって、病原体を制御するための方法を提供することは、本発明のさらなる一局面である。好ましくは３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするそのヌクレオチド配列の発現変更を示す植物細胞は、前記と同様に得られる。好ましくは植物細胞はさらに、病原体由来のヌクレオチド配列と実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードするそのヌクレオチド配列の発現増大は、植物細胞中での遺伝子サイレンシング増大ならびに病原体に対する抵抗性または耐容性増大を生じる。
【０１２６】
ＩＶ．植物形質転換技法
本発明のヌクレオチド配列は、慣用的組換えＤＮＡ技法を用いて植物または細菌細胞中に組入れられ得る。一般に、これは、当業界で既知の標準クローニング手法を用いたヌクレオチド配列が異種である（即ち普通は存在しない）発現系への本発明のヌクレオチド配列の挿入を包含する。ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞中での挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳のための必要素子を含有する。当業界で既知の多数のベクター系、例えばプラスミド、バクテリオファージウイルスおよびその他の修飾化ウイルスが用いられ得る。発現系の構成成分は、任意に修飾されて、発現を増大する。例えば切頭化配列、ヌクレオチド置換またはその他の修飾は、任意に用いられる。当業界で既知の発現系は、適切な条件下で事実上あらゆる作物植物細胞を形質転換するために用いられる。形質転換化細胞は、全植物体中で再生される。
【０１２７】
Ａ．植物発現カセットの構築の要件
トランスジェニック植物中での発現を意図された遺伝子配列は、先ず、植物中で発現可能である適切なプロモーターと操作可能的に連結される。このような発現カセットは、任意に、導入遺伝子の発現のために必要とされるかまたは選択されるさらなる配列を含む。このような配列としては、転写ターミネーター、発現を強化するための外来配列、例えばイントロン、生活配列、ならびに特定の小器官および細胞区画に対する遺伝子産物のターゲッティングを意図された配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発現カセットは、以下に記載されえる植物形質転換ベクターに容易に移入される。以下は、典型的発現カセットの種々の構成成分の説明である。
【０１２８】
１．プロモーター
用いられるプロモーターの選定は、トランスジェニック植物中での導入遺伝子の空間的および時間的発現パターンを決定する。選定プロモーターは、特定の細胞型（例えば葉上皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞）中で、あるいは特定の組織または器官（例えば根、葉または花）中で導入遺伝子を発現し、そして選定は遺伝子産物の蓄積の所望の位置を反映する。あるいは選定プロモーターは、種々の誘導条件下で遺伝子発現を駆動し得る。プロモーターは、その強度を、即ち転写を促進する能力を変える。利用される宿主細胞系によって、当業界で既知の多数の適切なプロモーターのいずれかが用いられ得る．例えば構成性発現のためには、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、イネアクチンプロモーター、またはユビキチンプロモーターが用いられ得る。調節性発現のためには、タバコまたはシロイヌナズナからの化学誘導ＰＲ−１プロモーターが用いられ得る（例えば米国特許第５，６８９，０４４号参照）。
【０１２９】
２．転写ターミネーター
種々の転写ターミネーターが、発現カセット中での使用のために利用可能である。これらは、導入遺伝子およびその的確なポリアデニル化意外に転写の終結に関与する。適切な転写ターミネーターは、植物中で機能することが既知であるものであり、その例としては、ＣａＭＶ　３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーターおよびエンドウｒｂｃＳ　Ｅ９ターミネーターが挙げられる。これらは、単子葉および双子葉植物の両方に用いられ得る。
【０１３０】
３．発現の増強または調節のための配列
多数の配列が、転写ユニット内からの遺伝子発現を増強することが知られており、これらの配列は、トランスジェニック植物中でのそれらの発現を増大するために本発明の遺伝子とともに用いられ得る。例えば種々のイントロン配列、例えばトウモロコシＡｄｈｌ遺伝子のイントロンは、特に単子葉植物細胞中での発現を強化することが示されている。さらにウイルス由来の多数の非翻訳化リーダー配列も発現を増強することが既知であり、これらは特に双子葉植物細胞中で有効である。
【０１３１】
４．コード配列最適化
選定遺伝子のコード配列は任意に、当該作物種における最適発現のためのコード配列を変更することにより遺伝子工学処理される。特定の作物種における最適発現を達成するためのコード配列の修飾方法は、周知である（例えばＰｅｒｌａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：３３２４（１９９１）；およびＫｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ． １１：１９４（１９９３）； Ｆｅｎｎｏｙ ａｎｄ Ｂａｉｌｅｙ−Ｓｅｒｒｅｓ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：５２９４−５３００（１９９３）参照）。植物遺伝子における、そして高等植物、緑藻類およびシアノバクテリアにおけるコドン使用法を考慮に入れることによるコード配列の修飾方法は周知である（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：４７７−４９８（１９８９）； Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９２：１−１１（１９９０）における表４参照）。
【０１３２】
５．細胞内の遺伝子産物のターゲッティング
遺伝子産物をターゲッティングするための種々のメカニズムが植物中に存在することは基地であり、そしてこれらのメカニズムの作用を制御する配列は、多少詳細に特性化されている。例えば葉緑体に対する遺伝子産物のターゲッティングは、成熟タンパク質を産生するために葉緑体移入中に切断される種々のタンパク質のアミノ末端に見出されるシグナル配列により制御される（例えばＣｏｍａｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１５１０４−１５１０９（１９８８））。その他の遺伝子産物は、他の小器官、例えばミトコンドリアおよびペルオキシソームに局在化される（例えばＵｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １３：４１１−４１８（１９８９））。これらの産物をコードするｃＤＮＡは、これらの小器官に対する異種遺伝子産物のターゲッティングを実行するよう操作される。さらに、他の細胞区画に対する遺伝子産物のターゲッティングを引き起こす配列が特性かされている。アミノ末端配列は、ＥＲに対するターゲッティング、アポプラストおよびアリューロン細胞からの細胞外分泌に関与する（Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｈｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：７６９−７８３（１９９０））。さらに、アミノ末端配列は、カルボキシ末端配列とともに、遺伝子産物の液胞ターゲッティングに関与する（Ｓｈｉｎｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １４：３５７−３６８（１９９０））。前記の適切なターゲッティング配列と当該導入遺伝子配列との融合により、当業者は、導入遺伝子産物を任意の小器官または細胞区画に向けることができる。
【０１３３】
Ｂ．植物形質転換ベクターの構築
植物形質転換のために利用可能な多数の形質転換ベクターが植物形質転換業界の当業者に既知であり、そして本発明に関連する遺伝子は、任意のこのようなベクターとともに用いられる。ベクターの選定は、好ましい形質転換技法および形質転換のための標的種によっている。ある種の標的種に関しては、異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが選択され得る。形質転換にルーチンに用いられる選択マーカーとしては、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｒｒａ． Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８（１９８２）； Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０４：１８４−１８７（１９８３））、除草剤ホスフィノチリシンに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：１０６２（１９９０）， Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ ７９：６２５−６３１ （１９９０））、抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子（Ｂｌｏｃｈｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：２９２９−２９３１）、ならびにメトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｂｏｕｒｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２（７）：１０９９−１１０４（１９８３））そしてグリホセートに対する耐性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許第４，９４０，９３５号および第５，１８８，６４２号）が挙げられる。
【０１３４】
１．アグロバクテリウム形質転換に適したベクター
多数のベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いた形質転換に利用可能である。これらは、典型的には少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列を有し、ｐＢＩＮ１９のようなベクターを包含する（Ｂｅｖａｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８４））。アグロバクテリウム形質転換に適した典型的ベクターとしては、バイナリーベクターｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１、ならびにバイナリーベクターｐＣＩＢ１０およびそのヒグロマイシン選択誘導体が挙げられる（例えば米国特許第５，６３９，９４９号参照）。
【０１３５】
２．非アグロバクテリウム形質転換に適したベクター
多数のベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いた形質転換に利用可能である。これらは、典型的には少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列を有し、ｐＢＩＮ１９のようなベクターを包含する（Ｂｅｖａｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８４））。アグロバクテリウム形質転換に適した典型的ベクターとしては、バイナリーベクターｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１、ならびにバイナリーベクターｐＣＩＢ１０およびそのヒグロマイシン選択誘導体が挙げられる（例えば米国特許第５，６３９，９４９号参照）。
【０１３６】
２．非アグロバクテリウム形質転換に適したベクター
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの使用を伴わない形質転換は、選定形質転換ベクターにおけるＴ−ＤＮＡ配列に対する要件を免れ、その結果として、Ｔ−ＤＮＡ配列を含有する前記のもののようなベクターのほかに、これらの配列を欠くベクターが利用され得る。アグロバクテリウムによらない形質転換技法としては、粒子衝撃、プロトプラスト取込み（例えばＰＥＧおよび電気穿孔）ならびにマイクロインジェクションによる形質転換が挙げられる。ベクターの選択は、形質転換されている種に関する好ましい選択に大いによっている。非アグロバクテリウム形質転換に適した典型的ベクターとしては、ｐＣＩＢ３０６４、ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５が挙げられる（例えば米国特許第５，６３９，９４９号参照）。
【０１３７】
Ｃ．形質転換技術
当該コード配列が発現系中で一旦クローン化されれば、それは植物細胞中で形質転換される。植物の形質転換および再生のための方法は、当業界で周知である。例えばＴｉプラスミドベクターは、外来ＤＮＡの送達、ならびに直接ＤＮＡ取込み、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクションおよびマイクロプロジェクタイルのために利用されてきた。さらに、アグロバクテリウム属からの細菌は、植物細胞を形質転換するために利用され得る。
【０１３８】
本発明のヌクレオチド配列はこれらの広範なクラス内に入る任意の植物細胞中に挿入され得るが、しかしそれは、作物植物細胞、例えばイネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、サトウダイコン、ソラマメ、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、トウナス、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、カリン、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、タバコ、トマト、サトウモロコシおよびサトウキビ中で特に有用である。
【０１３９】
双子葉植物のための形質転換技法は当業界で周知であり、そしてアグロバクテリウムベースの技法およびアグロバクテリウムを要しない技法を包含する。非アグロバクテリウム技法は、直接的にプロトプラストまたは細胞による外因性遺伝物質の取込みを包含する。これは、ＰＥＧまたは電気穿孔媒介性取込み、粒子衝撃媒介性送達またはマイクロインジェクションにより成し遂げられ得る。各々の場合、形質転換化細胞は、当業界で既知の標準技法を用いて全植物体に再生される。ほとんどの単子葉種の形質転換は、目下ルーチンになってきた。好ましい技法としては、ＰＥＧまたは電気穿孔技法を用いたプロトプラスト中への直接遺伝子移入、カルス組織中への粒子衝撃、ならびにアグロバクテリウム媒介性形質転換が挙げられる。
【０１４０】
Ｄ．プラスチド形質転換
別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列はプラスチドゲノム中に直接形質転換される。遺伝子が相同的組換えにより、各植物中に存在する環状プラスチドゲノムの数千のコピー中に挿入されるプラスチド発現は、核発現化遺伝子を上回る莫大なコピー数利点を利用して、総可溶性植物タンパク質の１０％を容易に上回り得る発現レベルを可能にする。好ましい実施態様では、ヌクレオチド配列はプラスチドターゲッティングベクター中に挿入されて、所望の植物宿主のプラスチドゲノム中で形質転換される。ヌクレオチド配列を含有するプラスチドゲノムに対してホモプラスミー性の植物が得られ、ヌクレオチド配列の高発現を選択的に可能にする。プラスチド形質転換技法は、例えば米国特許第５，４５１，５１３号、第５，５４５，８１７号、第５，５４５，８１８号および第５，８７７，４６２号に、ＰＣＴ出願ＷＯ ９５／１６７８３およびＷＯ ９７／３２９７７に、そしてＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ７３０１−７３０５（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。プラスチド形質転換のための基礎技術は、例えばバイオリスティックｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓまたはプロトプラスト形質転換（例えば塩化カルシウムまたはＰＥＧ媒介性形質転換）を用いて、適切な標的組織中に、ヌクレオチド配列と一緒に選択可能マーカーをフランキングするクローン化プラスチドＤＮＡの領域を導入することを包含する。ターゲッティング配列と呼ばれる１〜１．５ ｋｂフランキング領域は、プラスチドゲノムを用いた相同的組換えを促し、したがってプラストムの特定領域の置換または修飾を可能にする。最初に、スペクチノミオシンおよび／またはストレプトマイシンに対する耐性を付与する葉緑体１６ＳｒＲＮＡおよびｒｐｓ１２遺伝子における点突然変異は、形質転換のための選択可能マーカーとして利用される（Ｓｖａｂ， Ｚ．， Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ， Ｐ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９０） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ８５２６−８５３０； Ｓｔａｕｂ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４， ３９−４５）。これらのマーカー間のクローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のためのプラスチドターゲッティングベクターの作製を可能にした（Ｓｔａｕｂ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ６０１−６０６）。形質転換頻度の実質的増大は、スペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌ａａｄＡ遺伝子である優性選択可能マーカーによる、劣性ｒＲＮＡまたはｒ−タンパク質抗生物質耐性遺伝子の置換により得られる（Ｓｖａｂ， Ｚ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９３） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ９１３−９１７）。プラスチド形質転換に有用なその他の選択可能マーカーは当業界で既知であり、本発明の範囲内に包含される。
【０１４１】
Ｖ．ポリペプチドの組換え的産生およびその使用
さらなる局面において、本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを組換え的に産生するための本発明のヌクレオチド配列の使用を開示する。宿主生物体中でのポリペプチドの組換え的産生のために、本発明のヌクレオチド配列は、選定宿主のために設計された発現カセット中に挿入され、それが組換え的に産生される宿主中に導入される。選定宿主に適した特定の調節配列、例えばプロモーター、シグナル配列、５’および３’非翻訳化配列ならびにエンハンサーの選択は、陶業業者の技術のレベル内である。適正リーディングフレームで操作可能的に連結された個々の素子を含有するその結果生じる分子は、宿主細胞中で形質転換され得るベクター中に挿入される。適切な発現ベクターおよびタンパク質の組換え的産生のための方法は、例えば大腸菌、酵母および昆虫細胞のような宿主細胞に関して周知である（例えばＬｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ６：４７（１９８８）参照）。特定の例としては、プラスミド例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、ｐＦＬＡＧ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ）、ｐＴｒｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）およびバキュロウイルス発現ベクター、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面体形成ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）が挙げられる。好ましいバキュロウイルス／昆虫系は、ｐＶＩ１１３９２／Ｓｆ２１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）である。組換え的産生ポリペプチドは、種々の標準技法を用いて単離され、精製される。用いられる実際の技法は、用いられる宿主生物体、酵素が分泌のために設計されているか否か、およびその他のこのような因子によって変わる。このような技法は、当業者には周知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， ｐｕｂ． Ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）の第１６章参照）。組換え的産生ポリペプチドは、種々の目的のために有用である。例えばそれらは、ポリペプチドと相互作用し、あるいはポリペプチドの活性を変える化学物質に関してスクリーニングするために検定に用いられる。
【０１４２】
ＶＩ．本発明のポリペプチドと相互作用する化合物の検定方法
本発明の別の局面では、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための検定が開示される。好ましい実施態様では、このような化合物はポリペプチドの活性を変更し得る。好ましくは化合物は、ポリペプチドの活性を阻害または刺激し得る。好ましくは子のような化合物は植物または植物細胞に適用され、その結果、植物または植物細胞中のポリペプチドの活性が変更される。このような植物または植物細胞では、当該および前記のヌクレオチド配列の発現が変更される．したがって本発明は、植物または植物細胞中での当該ヌクレオチド配列の発現を変更するための方法であって、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドをコードする前記の植物または植物細胞のヌクレオチド配列の活性を阻害し得る化合物を前記の植物または植物細胞に適用することを包含する方法をさらに開示する。好ましい実施態様では、当該ヌクレオチド配列は異種または内因性ヌクレオチド配列である。好ましくは植物細胞は、ＩＩ節に前記したような異種ヌクレオチド配列を含む。好ましくは植物細胞は、ＩＩ節に前記したような内因性ヌクレオチド配列と同一であるかまたは実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。
【０１４３】
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害剤検定：本発明のポリペプチドと相互作用する化合物の発見　ポリペプチドと化合物との間の相互作用を検出し得る３つの方法（蛍光相関分光分析、表面強化レーザー脱着／イオン化およびバイオコア技法）を以下に記載する。
【０１４４】
蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）理論は、１９７２年に開発されたが、しかしＦＣＳを実施するための技術が利用可能になったのは、最近である（Ｍａｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９７２） Ｐｈｙｓ． Ｒｅｖ． Ｌｅｔｔ．， ２９：７０５−７０８； Ｍａｉｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：１１７５３−１１７５７）。ＦＣＳは、小試料容積内の蛍光分子の平均拡散速度を測定する。試料サイズは１０３蛍光分子と小さく、試料容積は単一細菌の細胞質と同じくらい小さい。拡散速度は、分子の質量の一関数であり、質量が増大すると低減する。したがってＦＣＳは、質量の、したがって結合時の分子の拡散速度の変化を測定することにより、タンパク質−リガンド相互作用分析に適用され得る。典型的実験では、分析される標的は、ＮまたはＣ末端に挿入されたポリ−ヒスチジン配列のような配列タグを有する組換えタンパク質として発現される。発現は、大腸菌、酵母または昆虫細胞中で起こる。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えばポリヒスチジンタグを用いて、イミノ二酢酸アガロース上でキレート化されたＮｉ２＋のような金属キレートカラムに発現タンパク質を結合し得る。タンパク質は次に、蛍光タグ、例えばカルボキシテトラメチルローダミンまたはＢＯＤＩＰＹ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を用いて標識される。タンパク質は次に、溶液中で考え得るリガンドに曝露され、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， ＮＹ）から入手可能な計器を用いてＦＣＳにより、その拡散速度が確定される。リガンド結合は、タンパク質の拡散速度の変化により確定される。
【０１４５】
表面強化レーザー脱着／イオン化（ＳＥＬＤＩ）は、１９８０年代後半にＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐにより発明された（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ （１９９３） Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ７：５７６−５８０）。飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ）と結合されると、ＳＥＬＤＩは、チップ上に保持された分子を迅速に分析するための手段を提供する。それは、チップ上の標的タンパク質を共有結合することにより、リガンド−タンパク質相互作用分析に適用され得るし、このタンパク質と結合する小分子をＭＳにより分析し得る（Ｗｏｒｒａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：７５０−７５６）。典型的実験では、分析される標的は、ＦＣＳに関して記載されたように発現される。精製タンパク質は次に、さらなる調製を伴わずに検定に用いられる。それは、ポリ−ヒスチジンタグを利用することにより、またはその他の相互作用、例えばイオン交換または疎水性相互作用により、ＳＥＬＤＩチップに結合される。このように調製されたチップは、例えば連続方式（自動試料採取器）でリガンドをピペッティングし得る送達系を介して考え得るリガンドに曝露される。チップは次に、緊縮増強を示す洗浄、例えば漸増イオン強度を含有する緩衝液による一連の洗浄を施される。各洗浄後、チップにＳＥＬＤＩ−ＴＯＦを施すことにより、結合物質が分析される。標的を特異的に結合するリガンドは、それらを溶離するのに必要な洗浄液の緊縮性により同定される。
【０１４６】
Ｂｉａｃｏｒｅは、層上に固定されたタンパク質とのリガンドの結合時の表面層での屈折率の変化による。この系では、小リガンドの収集物は、固定タンパク質を有する２〜５μｌの細胞中に継続的に注入される。結合は、表面から屈折するレーザー光を記録することにより、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により検出される。概して、表面層での質量濃度の所定の変化に関する屈折率変化は、実際にはすべてのタンパク質およびペプチドに関して同一であり、単一方法を任意のタンパク質に対して適用可能にする（Ｌｉｅｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｓｅｎｓｏｒｓ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ４：２９９−３０４； Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ， ３６１：１８６−１８７）。典型的実験では、分析される標的は、ＦＣＳに関して記載したように発現される。精製タンパク質は次に、さらなる調製を伴わずに検定に用いられる。それは、ポリ−ヒスチジンタグを利用することにより、またはその他の相互作用、例えばイオン交換または疎水性相互作用により、Ｂｉａｃｏｒｅに結合される。このように調製されたチップは次に、連続方式（自動試料採取器）でリガンドをピペッティングするためにＢｉａｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）により販売されている計器中に組入れられる送達系を介して考え得るリガンドに曝露される。チップ上のＳＰＲシグナルが記録され、屈折率の変化は、固定標的とリガンドとの間の相互作用を示す。レートアンドオフレートｒａｔｅ ａｎｄ ｏｆｆ ｒａｔｅでのシグナル動力学の分析は、非特異的および特異的相互作用間の区別を可能にする。
【０１４７】
２．ｉｎ ｖｉｖｏ阻害検定
別の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの活性を変更する化合物に関するｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング検定は、本発明のヌクレオチド配列を過剰発現し得るトランスジェニック植物、植物組織、植物種子または植物細胞を使用する。
【０１４８】
次に化学物質が、トランスジェニック植物、植物組織、植物種子または植物細胞に、そして同系非トランスジェニック植物、植物組織、植物種子または植物細胞に適用され、そしてトランスジェニックおよび非トランスジェニック植物、植物組織、植物種子または植物細胞における遺伝子サイレンシングが化学物質の適用後に確定され、比較される。
【０１４９】
ＶＩ．遺伝子サイレンシングの変化を試験するための検定
植物細胞中での遺伝子サイレンシングの変更に関して試験するために、いくつかの方法を記載する。
【０１５０】
Ａ．植物細胞中へのマーカー遺伝子の導入およびその発現の分析
マーカー遺伝子は、野生型系統に、ならびに遺伝子サイレンシングの考え得る変更を伴う系統に導入される。遺伝子サイレンシングの変化は、低レベルのマーカー活性対抗レベルのマーカー活性を示す系統の数におけるＴ１子孫での差異として検出される。高レベルのマーカー活性を有する系統は、サイレンシングされているとは思えないが、一方、低レベルの活性を有するかまたは活性を有さない系統は、サイレンシングされていると思われる。非内因性マーカー遺伝子に関する選択は、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を包含する．これらのマーカーの各々に関する検定方法が記載されている（Ｉｓｈｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ９：１９３５−１９４９； Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７１８−３７２３； Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ．， ６：３９０１−３９０７）。
【０１５１】
Ｂ．内因性遺伝子の発現の分析
本検定方法は前記と同様であるが、但し、マーカー遺伝子の代わりに内因性遺伝子が用いられる。内因性遺伝子の発現は、野生型系統において、ならびに遺伝子サイレンシングの考え得る変更を示す系統において測定される。両型の系統はさらに、内因性遺伝子をサイレンシングするために用いられるトランスジェニック「サイレンシング」構築物を含む。このような「サイレンシング」構築物は、例えば、センス配向で、またはアンチセンス配向で、あるいは同一転写体においてアンチセンスおよびセンス配向の両方で、内因性遺伝子の転写を指図するプロモーターを含む。プロモーターは、例えば構成性、例えばＡＣＴＩＮ２（Ａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １０：１０７−１２１）、または誘導性、例えばＰＲ１（例えば米国特許第５，６１４，３９５号参照）、またはハイブリッド転写因子により活性化可能である（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４９：６３３−６３９）。「サイレンシング」導入遺伝子を有する植物では、遺伝子サイレンシングのレベルは、導入遺伝子を有さない植物と比較して、内因性遺伝子の機能、例えば突然変異体表現型の出現における変化を分析することにより査定される。これらの植物のＴ１子孫で観察された表現型の範囲を比較することにより、オリジナル系統が遺伝子サイレンシング能力の変更を有するか否かが確定される。用いられる内因性遺伝子としては、例えば：花弁が存在せず、蕚片が葉に変換されて補助花を有する突然変異体表現型を有するＡＰＥＴＡＬＡ１（Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １：３７−５２）、葉上の毛状体の数が非常に低減される突然変異体表現型を有するＧＬＡＢＲＯＵＳ１（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９１， Ｃｅｌｌ ６７：４８３−４９３）およびツユカビＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ単離物が感染性になり、そしてＳＡＲ遺伝子、例えばＰＲ１が誘導されない、いくつかの生態型の突然変異体表現型を有するＮＩＭ１（ＮＰＲ１としても既知である）（例えばＲｙａｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９：４２５−３９）が挙げられる。ＰＲ１の誘導は、ノーザンまたはＲＴ−ＰＣＲにより検出され得る。
【０１５２】
Ｃ．特性化サイレンシング化導入遺伝子の発現の分析
所定の系統が遺伝子サイレンシングを変更するか否かを確定するために、当該系統を特性化サイレンシング化遺伝子を有する系統と交雑して、Ｆ１およびＦ２子孫における作用を調べることにより、特性化サイレンシング化（転写後または転写的に）遺伝子の導入が成し遂げられる。特性化サイレンシング化遺伝子を有する系統に関しては、実験は、突然変異体バックグラウンドにおけるこの遺伝子の発現のレベルの変化を測定する。遺伝子サイレンシングを変更し得る劣性突然変異に関しては、Ｆ２子孫ホモ接合体、ヘテロ接合体および野生型を、サイレンシング化遺伝子の発現レベルの差に関する突然変異体対立遺伝子に関して比較する必要がある。遺伝子サイレンシングを変更し得る優性突然変異に関しては、サイレンシング化遺伝子の発現レベルにおける差に関する突然変異体対立遺伝子に関して、Ｆ１子孫へテロ接合および野生型を比較することができる。構成性プロモーターおよびマーカー遺伝子を有する系統が、このような実験に用いられる。
【０１５３】
ＶＩＩ．３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に関する検定
本発明のヌクレオチド分子および配列によりコードされるポリペプチド中の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に関して試験するために検定が利用可能である。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に関する検定は、Ｋａｍａｔｈ−Ｌｏｅｂ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：３４１４５−５０， Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２０：１１４−６およびＳｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：２３６１−８（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に含まれる）に記述されている。要するに、ポリペプチドまたはタンパク質は、放射能標識化ＤＮＡオリゴマーとともにインキュベートされる。インキュベーション後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、反応産物が分析される。
【０１５４】
ＶＩＩＩ．核酸分子によりコードされるポリペプチド
本発明は、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドおよびその変異体を提供する。これらのポリペプチドは、配列番号２、４、６、２２、１８、１２、１４、２４、３６および３８のヌクレオチド配列によりコードされるもの；配列番号１、３、５、２１、９、１１、１３、２３、３５または３７の配列と少なくとも７０％の配列類似性を有する核酸配列によりコードされるポリペプチドまたはその変異体および突然変異体により例示される。好ましくは単離および実質的精製ポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に類似する。
【０１５５】
本発明のポリペプチドは、種々の方法で、例えばアミノ酸置換、欠失、切頭化および挿入により変更され得る。このような操作方法は一般に、当業界で既知である。突然変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当業界で周知である（例えばＫｕｎｋｅｌ， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：４８８，（１９８５）； Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４：３６７（１９８７）；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ， ｅｄｓ． （１９８３） Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ならびにそこに引用された参考文献参照）。当該タンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得る（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。保存的置換が好ましい。
【０１５６】
本発明のタンパク質は、天然ポリペプチドならびにその変異体および修飾化形態を包含する。明らかに、突然変異をコードするＤＮＡ中で作られる突然変異は、リーディングフレームの外に配列を配置してはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生じ得る相補的領域を作製しない（欧州特許出願第７５，４４４号参照）。
以下の詳細な実施例を参照することにより、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、例証のために提示されるだけであって、別記しない限り、本発明を限定するよう意図されない。
【０１５７】
実施例
実施例１：３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドの同定
【０１５８】
方法１
ＧＣＧ　ＳＥＱＷＥＢ（バージョン１．１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭＥＭＥおよびＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈプログラムを用いて、ＲＮアーゼＤ関連モチーフをおそらくは含有する７つのシロイヌナズナポリペプチド配列を同定する。ＭＥＭＥは、一組の非一列化ポリペプチド配列を用いて開始し、共通モチーフを同定する。次にこれらのモチーフを用いて、これらのモチーフに関してその他の配列を検索するためのＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈへの入力として用いられ得る無ギャッププロフィールを作製する。先ず、線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓｍｕｔ−７遺伝子（ＺＫ１０９８．８、ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＡ８０１３７）をＢＬＡＳＴＰ検索に用いて、関連シロイヌナズナポリペプチド配列を同定する。一ペプチド配列が同定される（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＢ３６８５１、配列番号２）。次に、Ｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：５１１０−５１１８）の図４のブランチ４中のいくつかのタンパク質の配列を、シロイヌナズナ予測ポリペプチド配列（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＢ３６８５１、配列番号２）と一緒に用いて、ＭＥＭＥプログラムを用いて、共通モチーフを同定する。
【０１５９】
これらのタンパク質配列としては、以下のものが挙げられる：全線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓｍｕｔ−７（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＡ８０１３７、配列番号１６、ヌクレオチド配列配列番号１５に対応する）、線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓｍｕｔ−７関連タンパク質（ＺＫ１０９８．３、ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＡ８０１４１）のＣ末端（アミノ酸位置４２８〜末端）、ヒトＨ． ｓａｐｉｅｎｓ １００ｋＤａ仁多発性筋炎強皮症自己抗原（ＰＭＳＣ１００、ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＡ４６９０４）のＣ末端（アミノ酸位置２９１〜末端）、ビール酵母菌Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＲＲＰ６（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＮＰ　０１４６４３）のＣ末端（アミノ酸位置２１６〜末端）、ヒトＨ． ｓａｐｉｅｎｓワーナー症候群タンパク質（ＷＲＮ、ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＦ０６１６２、配列番号１８、配列番号１７のヌクレオチド配列に対応する）のＮ末端（アミノ酸位置１〜３３３）、全大腸菌ＲＮアーゼＤ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０９１５５）、および黄色ショウジョウバエＤ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｅｇａｌｉｔａｒｉａｎ（ＥＧＬ、ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＢ４９９７５）のＣ末端（アミノ酸位置５４６〜末端）ならびに全ファージφ−Ｃ３１仮説タンパク質１１（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＣＡＡ５３９０７）。他の配列領域またはモチーフを有するポリペプチド中のＲＮアーゼＤ関連モチーフの同定を可能にするために、いくつかのタンパク質の切頭化バージョンを用いる。第三に、５つのＭＥＭＥモチーフを同定する。第四に、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈを用いて、これらのモチーフを含有する配列に関してＧｅｎＰｅｐｔ植物部門を検索して、７つのシロイヌナズナポリペプチド配列を同定する。
【０１６０】
これらの配列に関するＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号を、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈプログラムの最低Ｐ値から最高Ｐ値までを列挙する：
ＣＡＢ３６８５１（配列番号２、配列番号１のヌクレオチド配列に対応する）、
ＡＡＣ６９９３６（配列番号６、配列番号５のヌクレオチド配列に対応する）、
ＡＡＤ２５６２３（配列番号４、配列番号３のヌクレオチド配列に対応する）、
ＡＡＤ２６９６８（配列番号１０、配列番号９のヌクレオチド配列に対応する）、
ＡＡＣ２５９３１（配列番号１２、配列番号１１のヌクレオチド配列に対応する）、
ＡＡＣ４２２４１（配列番号８、配列番号７のヌクレオチド配列に対応する）、
ＡＡＦ９８１８５（配列番号１４、配列番号１３のヌクレオチド配列に対応する）、
低い値は、無作為と有意に異なるより大きい確率を有する。
【０１６１】
ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ４２２４１の５’末端が不適格な注釈のために欠けていること、そしてＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＣ４２２４１は３’−５’エキソヌクレアーゼドメインのｅｘｏＩモチーフを欠くことも本発明の発明人等は開示した。全３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むアミノ酸配列（ｅｘｏＩを含む）は本出願において最初に開示され、そして配列番号２２で記述される。対応するヌクレオチド配列は、配列番号２１で記述される。
【０１６２】
方法２
線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓｍｕｔ−７タンパク質は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含有する。ＨＭＭサーチＨＭＭｓｅａｒｃｈ（隠れＭａｒｋｏｖモデル）プログラム（Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ．（１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５）を用いて、Ｐｆａｍデータベース（Ａ． Ｂａｔｅｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２８：２６３−２６６（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる））中に見出される３’−５’エキソヌクレアーゼプロフィールを含有するタンパク質配列に関してＧｅｎＰｅｐｔ植物部門を検索する。Ｐｆａｍは、タンパク質ドメインの多重アラインメントまたは保存タンパク質領域のデータベースである。これらのアラインメントは、タンパク質の機能関する連関を有するいくつかの進化的保存構造を示す。Ｐｆａｍアラインメントから建築されるプロフィールＨＭＭは、配列類似性が弱い場合でも、新規のタンパク質が既存のタンパク質ファミリーに属することを自動的に認識するために用いられる。５つのシロイヌナズナポリペプチド配列を同定する。これらの配列に関するＧｅｎＰｅｐｔ寄託を、ＨＭＭｓｅａｒｃｈプログラムの最低Ｐ値から最高Ｅ値までを列挙する：ＡＡＤ２５６２３、ＡＡＣ６９９３６、ＣＡＢ３６８５１、ＡＡＣ４２２４１およびＡＡＤ２６９６８。低い値は、無作為と有意に異なるより大きい確率を有する。
【０１６３】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインは、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩおよびＥｘｏＩＩＩと呼ばれる３つの配列モチーフから成る（Ｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：５１１０−５１１８）。これらのモチーフは、活性部位周囲に密集され、触媒的活性チロシンのほかに、触媒作用のために必要な２つの金属イオンのためのリガンドとして役立つ４つの負荷電残基を含有する。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２２、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８中のこれらのアミノ酸の存在、ならびに対応するアミノ酸配列中のそれらの位置を、以下の表１に示す。これらのアミノ酸配列中のｅｘｏＩ、ｅｘｏＩＩおよびｅｘｏＩＩＩモチーフの位置を、表２に示す。
【０１６４】
方法３
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを有するタンパク質をコードする付加的シロイヌナズナ遺伝子は、配列番号１によりコードされる遺伝子に関する実験的に確定されたｃＤＮＡ配列から出発して同定される。このタンパク質配列（配列番号２４）は、実施例６に記載したように同定される（下記参照）。照会として配列番号２４を用いたＢＬＡＳＴｐ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）は、１Ｅ−０３未満のＥ値を有する数個の予測シロイヌナズナタンパク質が存在することを明示する。この群のシロイヌナズナタンパク質から、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ ＤｅＣｙｐｈｅｒ機でのＰＦＡＭモデル（バージョン６．４）のＨＭＭデータベースと比較した照会として各タンパク質を用いて、ＨＭＭ検索を実施する。先の方法１および２により同定されなかった２つのシロイヌナズナタンパク質（ＡＡＧ５０９１７（配列番号３６）およびＢＡＢ１１２２７（配列番号３８））を同定する。ＡＡＧ５０９１７およびＢＡＢ１１２２７に対応するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３５および配列番号３７である。これらのタンパク質は、１Ｅ−０１より低いＨＭＭ検索からのＥ値を有し、有意であると思われる。比較のために、実施例１で同定されたすべてのシロイヌナズナ多ＴＰに関するＥ値を、同一ＨＭＭプログラム、ＰＦＡＭモデルおよびコンピューターサーバーを用いて再計算して、表１および２の第三カラムに示す。
【０１６５】
【表１】
2004504839.tif 000002
【０１６６】
【表２】
2004504839.tif 000003
【０１６７】
実施例２：ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における挿入突然変異誘発
挿入突然変異誘発は、当該遺伝子との物理的連結を提供することにより、直接逆遺伝子スクリーニングを促す。植物中では、Ｔ−ＤＮＡおよびトランスポゾン突然変異誘発物質はともに、挿入突然変異誘発物質として利用されてきた（Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ８２：１２９−１３６， Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ （１９９８） ＰＮＡＳ ９５：２０２１−２０２６）。任意の所定の遺伝子内のＴ−ＤＮＡは、一遺伝子特異的プライマーおよび一Ｔ−ＤＮＡ特異的プライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により検出され得る（Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３：７４３−７５０およびＫｒｙｓａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １１：２２８３−２２９０）。特異的ＰＣＲ産物は、Ｔ−ＤＮＡ素子が当該遺伝子内にまたはその付近に挿入された場合にのみ形成される。ＰＣＲ増幅の指数関数的性質のために、試料プール化により、数千の別個に形質転換されたシロイヌナズナ突然変異体をスクリーニングすることができる（Ｋｒｙｓａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。当該遺伝子の挿入を用いてＴ−ＤＮＡプールが一旦同定されれば、その挿入を有する単一植物の単離方法は、プール構築物のデコンヴォルーションを要する。
【０１６８】
配列番号１で記述されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの機能を査定するために、〜６０，４８０個の個々のタグ化シロイヌナズナ系統のプール（Ｋｒｙｓａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）を、Ｔ−ＤＮＡ左境界および配列番号１　３’−特異的領域に対応するプライマーの対を利用してＰＣＲによりスクリーニングする。配列番号１　３’−特異的プライマー（５’−ｃｇａ ｃａｔ ｇａｔ ｃｔｇ ａｔａ ｃａｔ ｃｇｔ ｔａｔ ｇｃｃ ａｔｔ−３’、配列番号１９）は、ＢＡＣ　Ｆ１８Ａ５、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＬ０３５５２８．２上の位置９６８１７〜９６７９０に対応する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴ−ＤＮＡベクターｐＤ９９１からの左境界プライマーは、配列番号２０（５’−ＣＡＴ ＴＴＴ ＡＴＡ ＡＴＡ ＡＣＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＣ−３’）で表される（Ｋｒｙｓａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。１つの特定のＰＣＲ産物を同定し、単離し、Ｓ１１．１３と命名する。ＰＣＲ増幅断片のシーケンシングは、配列番号１の予測ＣＤＳ領域のＴ−ＤＮＡ挿入２６ｂｐ５’を明示する。前記のようなプール構築物のデコンヴォルーション（Ｋｒｙｓａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）は、Ｓ１１．１３−８、Ｓ１１．１３−１３、Ｓ１１．１３−３４、Ｓ１１．１３−３８、Ｓ１１．１３−４１、Ｓ１１．１３−４４、Ｓ１１．１３−４８と命名された特異的Ｔ−ＤＮＡ素子を含有する７つの個々の系統の同定をもたらす。その後、個々の系統の遺伝子型確定のために、ＰＣＲを利用する。すべての系統が、挿入に関してヘテロ接合型であるが、但し、Ｓ１１．１３−３４は挿入に関してホモ接合型である。胚および苗段階では、系統Ｓ１１．１３−３４においては、可視的表現型は観察されない。
【０１６９】
実施例３：シロイヌナズナＳ１１．１３−３４系統における特性化サイレンシング化導入遺伝子の発現の分析
Ｓ１１．１３−３４系統（前記実施例２参照）を、転写後サイレンシング化ＧＵＳ導入遺伝子を有することが示されているＬ１系統と交雑する（Ｅｌｍａｙａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１７４７−１７５８）。サイレンシング化ＧＵＳ導入遺伝子を有する個々のＦ１子孫を自家受精させる。個々のＦ１植物から約１００のＦ２子孫が成長した。それらをＧＵＳ活性に関して試験した。実施例２に記載したように、ＰＣＲによりＲＮアーゼＤ関連ドメイン（ＲＤＲＤ）遺伝子におけるＴ−ＤＮＡ挿入に関する各Ｆ２植物の遺伝子型を確定する。同様に各植物に関してＰＣＲにより、ＧＵＳ導入遺伝子の存在を確定する。ＲＮアーゼＤ関連ドメイン遺伝子中の挿入に関してホモ接合型である植物中でのＧＵＳ活性のレベルを、挿入ＲＤＲＤ遺伝子に関してヘテロ接合型の植物および野生型植物と比較する。
【０１７０】
実施例４：シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａトランスジェニック系統８Ｚ−２および５はグリーン蛍光タンパク質レポーター遺伝子の転写後サイレンシングを示す
Ｂｅｃｈｔｏｌｄ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ８２：２５９−２６６， １９９８）により記載されたようなアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて、ＰＴＧＳを示すトランスジェニックシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａ植物を得る。用いたＴｉ−プラスミドは、バイナリーベクターｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ（１９８４） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：８７１１−８７２１）中での二重鎖化カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ　ＲＮＡプロモーターおよび転写ターミネーター（Ｇｏｏｄａｌｌ ａｎｄ Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ （１９８９） Ｃｅｌｌ ５８：４７３−４８３）により調節されたキメラグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｒｅｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＰＮＡＳ ９３：５８８８−９３）レポーター遺伝子を含有する。プラスミドは、ｐ３５Ｓ−ＧＦＰと呼ばれる。
【０１７１】
得られた３５Ｓ−ＧＦＰ形質転換体中のＰＴＧＳを評価するために、ＵＶ光（波長約３９０〜４８０ ｎｍの範囲）を用いたＧＦＰによりトランスジェニック植物でＧＦＰ発現をモニタリングする。ＰＴＧＳを示すトランスジェニック系統の選択は、植物発生の初期段階において正常ＧＦＰ発現を示した成熟植物中でのＧＦＰ発現の非存在に基づく。この判定基準に基づいて、Ｔ−ＤＮＡ挿入に関してホモ接合型である８Ｚ−２および５と呼ばれる２つの系統は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９８９）により記載されたようなＲＮＡブロットハイブリダイゼーションにより検出されたＧＦＰ−ｍＲＮＡレベルの大々的低減に関連したＰＴＧＳを示す。８Ｚ−２系統は、同胞植物の約９０〜９６％でＰＴＧＳを示す。系統５は、同胞植物の約３０〜３５％でＰＴＧＳを示す。
【０１７２】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９８９）により記載されたようなＤＮＡブロットハイブリダイゼーションは、転写後サイレンシング化８Ｚ−２系統がＴ−ＤＮＡの２つのコピーを保有することを明示する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた、そしてＴ−ＤＮＡ特異的プライマーの組合せを利用するさらなる分析（Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｆｌａｄｕｎｇ （２０００） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８：１１２８−１１３７）は、これら２つのコピーが直接タンデム反復で整列されることを示す。同様に、系統５は、１つの全長Ｔ−ＤＮＡおよび逆タンデム反復で整列された第二の切頭化Ｔ−ＤＮＡコピーを保有することが示された。８Ｚ−２系統中のＴ−ＤＮＡコピーのゲノム位置は、Ｔ−ＤＮＡ特異的プライマーＬＢ１（５’−ｔｔｃ ｇｇａ ａｃｃ ａｃｃ ａｔｃ ａａａ ｃａｇ ｇ−３’）、ＬＢ２（５’−ｔｔｇ ｃｔｇ ｃａａ ｃｔｃ ｔｃｔ ｃａｇ ｇｇｃ ｃ−３’）およびＬＢ３（５’−ｔｃａ ｇｃｔ ｇｔ ｇｃｃ ｃｇｔ ｃｔｃ ａｃｔ−３’）ならびに縮重プライマーＡＤ３（５’−ｗｇｔ ｇｎａ ｇｗａ ｎｃａ ｎａｇ ａ−３’、ここで、Ｗ＝Ａ／ＴおよびＮ＝Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ、配列番号２８）を用いて、熱不斉交錯ポリメラーゼ連鎖反応（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ８：４５７−４６３）により、第一染色体、ＢＡＣ　Ｆ２２Ｌ４５、遺伝子＃１１であると確定される。系統５におけるＴ−ＤＮＡコピーのゲノム位置は、第一染色体上のＢＡＣ　Ｆ２２Ｌ４に連結されることが確定された。
【０１７３】
実施例５：シロイヌナズナＳ１１．１３−３４系統におけるサイレンシング化８Ｚ−２導入遺伝子の発現の分析
８Ｚ−２系統（前記実施例４参照）をＳ１１．１３−３４系統（前記実施例２参照）と交雑させて、その結果生じたＦ１世代植物を自家受精させて、Ｆ２世代を得た。約６０のＦ２植物が増殖した。Ｓ１１．１３−３４親系統由来のＲＤＲＤ遺伝子中のＴ−ＤＮＡ挿入の存在に関して、ならびに８Ｚ−２親系統由来の３５Ｓ−ＧＦＰ　Ｔ−ＤＮＡに関して、試験した。ＲＤＲＤ遺伝子中のＴ−ＤＮＡ挿入の存在を、実施例２に記載したのと同様に実証する。このＴ−ＤＮＡ挿入に関してホモ接合型である植物を次に、３’特異的プライマー（配列番号１９）および３６８５１ＴＤ＃３（５’−ｇｃｔ ｃｃｇ ｃｃｃ ａｃａ ｔａａ ｔｔｃ ａａａ ｃａａ ｃａｃ−３’、配列番号２９）を用いてＰＣＲにより、ホモ接合性に関して調べる。ＤＮＡの野生型コピーだけがゲノム断片の増幅を生じるよう、これらのプライマーは、挿入部位を含めたゲノムＤＮＡの領域に及ぶ。同様の戦略を用いて、３５Ｓ−ＧＦＰ　Ｔ−ＤＮＡに対してホモ接合型である系統に関してスクリーニングする。先ず、Ｔ−ＤＮＡ特異的ＰＣＲプライマーＬＢ１および遺伝子特異的ＰＣＲプライマーＬ２２Ｆ４Ｆ（５’−ｔｔｃ ｇａａ ａａｃ ａｔｔ ａｃｃ ｔｃｃ ｇａｔ ｃ−３’）を用いることにより、３５Ｓ−ＧＦＰ　Ｔ−ＤＮＡの存在を実証する。
【０１７４】
次に、遺伝子特異的プライマーＬ２２Ｆ４ＦおよびＦ２２Ｌ４Ｒ（５’−ｇｇｃ ｔｔｔ ｔｇｃ ａｔｔ ｔｇｇ ｔａｔ ｃｔａ ｃｔａ ｇ−３’、配列番号３１）を用いることにより、３５Ｓ−ＧＦＰ　Ｔ−ＤＮＡを保有する植物をホモ接合性に関して試験する。Ｓ１１．１３−３４および８Ｚ−２導入遺伝子の両方に関してホモ接合型である植物、ならびに８Ｚ−２導入遺伝子に関してはホモ接合型であるが、しかしＳ１１．１３−３４導入遺伝子を有さない植物を自家受精させて、Ｆ３世代植物を得る。これらの植物および親系統８Ｚ−２を、実施例４に記載したようにＧＦＰ蛍光に基づいたＰＴＧＳの出現率に関して格付けする。表３に要約した結果は、３５Ｓ−ＧＦＰ導入遺伝子のＰＴＧＳがＴ−ＤＮＡ挿入物を有する植物中で失われて、ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドをコードする領域を妨害することを示す。
【０１７５】
【表３】
2004504839.tif 000004
【０１７６】
実施例６：シロイヌナズナＳ１１．１３−３４系統におけるＲＮアーゼＤドメイン関連タンパク質の発現
ＲＴ−ＰＣＲにより、コード配列の５’断片に及ぶ３２９ ｂｐ断片を増幅するよう、ＲＤＲＤ遺伝子ｍＲＮＡの蓄積を測定する。プライマーＡｔＷＲＮ　ＣＤＳ　Ｆ（５’−ａｔｇ ｔｃａ ｔｃｇ ｔｃａ ａａｔ ｔｇｇ ａｔｃ ｇａｃ ｇ−３’、配列番号３２）およびＡｔＷＲＮ−ＲＴ　Ｒ（５’−ｃｇｃ ｔｔａ ｔｃａ ａｃｃ ｔｃａ ｇｔａ ｇｃａ ｇｔｃ ｔｔｇ−３’、配列番号３３）を設計する。野生型シロイヌナズナ植物体から調製したＲＮＡ試料中で予測長の断片を検出する。この予測長断片も任意のその他の配列も、Ｓ１１．１３−３４突然変異体から調製されたＲＮＡ試料中では検出されない。これは、ＲＤＲＤｍＲＮＡは野生型植物中では発現されるが、しかしホモ接合型ＲＤＲＤ突然変異体Ｓ１１．１３−３４中では発現されないことを示す。
【０１７７】
実施例７：ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列の同定
シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ第四染色体コンティグ断片３７（ＡＴＣＨＲＩＶ３７、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＬ１６１５３７）上に位置するＡＴ４ｇ１３８７０としても既知である配列番号１をコードする遺伝子は、ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドをコードする。この遺伝子に関するｃＤＮＡを、以下のように単離する。ＡＴＣＨＲＩＶ３７中の遺伝子モデルにおけるエキソン／イントロン境界に基づいて、５’および３’ＲＡＣＥプライマーを設計する。５’および３’ＲＡＣＥを実施する（ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。その結果生じたアンプリコンをＴＡ−クローン化し（オリジナルＴＡ−クローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、シーケンシングする。解明ｃＤＮＡ配列（配列番号２３）は、ＧｅｎＢａｎｋ注釈で予測された配列と異なり、したがって実際のオープンリーディングフレームを同定する。配列番号２４は、このｃＤＮＡの塩基４２〜９０５の翻訳から予測されるタンパク質配列を含有する。この遺伝子からのｃＤＮＡ配列の分析は、「ｗｒｎｅｘｏ」と呼ばれるエキソヌクレアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＪ４０４４７６）に関するシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａｍＲＮＡとの高度の類似性を明示する。クローン化ｃＤＮＡ配列は、ｗｒｎｅｘｏの配列とほぼ同一である。２つの配列は、同一遺伝子に由来すると思われる。２つの配列間の差異は、ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドをコードするクローン化ｃＤＮＡ中に存在するがしかしｗｒｎｅｘｏ中には存在しない９つの余分の塩基（配列番号２３の塩基８３０〜８３８）中に認められる。
【０１７８】
実施例８：ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の過剰発現
ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドを過剰発現するよう設計されたトランスジェニック構築物を、第二導入遺伝子を含むトランスジェニック系統中に導入する。適切な系統は、サイレンシングをまったく伴わすにまたは完全サイレンシングを伴わずに、高レベルで第二導入遺伝子を発現し、好ましくは半分未満の植物がサイレンシングを示し、あるいはサイレンシング化植物は全植物の平均レベルの５０％Ｙ堀大きいレベルまでサイレンシングを示す。バイナリーＴ−ＤＮＡベクター中で、ＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネーター（ｐＪＧ３０４中のヌクレオチド２８６８〜２９３８（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４９：６３３−６３９））とともに、強力な構成性ＡＣＴ２プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ４１９９８）を用いて、ＧＵＳマーカー遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｓ６９４１４）を発現することにより、トランスジェニック構築物を作製する。この構築物を、アグロバクテリウム媒介性形質転換により、シロイヌナズナ中に導入する。高レベルのＧＵＳ活性を発現する単一Ｔ１植物からのＴ２植物を、サイレンシングに関して検査する。
【０１７９】
これらのＴ２植物、またはそれらの子孫も、２つの構築物のうちの１つを用いて形質転換される。一構築物は、前記の構築物で用いたものとは異なる強力なプロモーターおよび転写ターミネーターを用いて、ＲＮアーゼＤ関連ドメインコード配列（配列番号２３の塩基４２〜９０８）の過剰発現を可能にする。その他の構築物は対照であり、これは本質的にＲＮアーゼＤ関連ドメイン構築物と同一であるが、但し、ＲＮアーゼＤ関連ドメインタンパク質の代わりにマーカー遺伝子、例えばルシフェラーゼまたはＧＦＰが過剰発現されるかまたは遺伝子が過剰発現されない。これら２つのバイナリーベクター構築物は、ＧＵＳ構築物とは異なる選択可能マーカーを有し、したがってそれらは二次Ｔ−ＤＮＡ構築物で重複感染するために用いられる。これらの構築物の各々が前記のＴ２植物中で形質転換される場合、ＧＵＳ発現のレベルは、二重形質転換化Ｔ１子孫に関して確定される。ＲＮアーゼＤ関連ドメインタンパク質を過剰発現するＴ１植物は、サイレンシング増大のために、低レベルのＧＵＳ発現を有すると予測される。Ｔ１植物において差異が検出されない場合、ＲＮアーゼＤ関連ドメイン過剰発現構築物に関してホモ接合型である系統がＴ２世代で産生され、検査される。
【０１８０】
あるいは配列番号３、配列番号５、配列番号２１、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３５または配列番号３７のいずれかで記述されるヌクレオチド配列が、前記のような構築物中に含入され、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドの過剰発現のために用いられる。
【０１８１】
実施例９：ＲＤＲＤをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によるＳ１１．１３−３４系統のＰＴＧＳ欠陥の相補性は、ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドがＰＴＧＳに必要であることを確証する
ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むポリペプチドを過剰発現するよう設計された構築物を、実施例４に記載したようにシロイヌナズナ植物体中に導入する。プライマーＡｔＷＲＮ　ＣＤＳ　Ｆ（配列番号３２）およびＡｔＷＲＮ−ＣＤＳ　Ｒ（５’−ｔｔａ ｔｇａ ｇｃｃ ａｃｔ ｇａｃ ａ ａｔｃ ａｇｇ−３’、配列番号３４）を用いて、シロイヌナズナの葉から調製したＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲにより、ＲＮアーゼＤ関連ドメインを含むコード配列を増幅する。このＲＤＲＤコード配列を、バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ−１３８０（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ２３４３０１）中の強力な構成性ＵＢＱ３遺伝子プロモーター（ＢＡＣ　Ｆ１５Ａ１７、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＬ１６３００２）の調節下に置いた。その結果生じたＲＤＲＤ発現ベクターは、ｐＲＤＰ１と呼ばれる。
【０１８２】
相補性試験のために、ベクターｐＲＤＰ１を用いた野生型シロイヌナズナ植物体の形質転換により得られたＲＤＰ１形質転換体を、自家受精させる。その結果生じたＴ１世代植物を、ヒグロマイシン耐性表現型に関して試験して、ＲＤＰ１　Ｔ−ＤＮＡの存在を検出する。次に非黒マイシン耐性植物を自家受精させて、その結果生じたＴ２世代を、ヒグロマイシン耐性に関して採点して、単一遺伝子座でＴ−ＤＮＡ挿入物を用いてホモ接合型形質転換体を同定する。ホモ接合型ＲＤＰ１植物を、実施例５に記載した二重ホモ接合型Ｆ３世代８Ｚ−２、Ｓ１１．１３−３４形質転換体と交雑させて、Ｆ１世代を得る。Ｆ１植物を自家受精させて、その結果生じたカナマイシンおよびヒグロマイシンの両方に耐性であるＦ２世代植物を自家受精させて、Ｆ３世代を得る。Ｆ３植物を、抗生物質耐性に関してスクリーニングして、ＲＤＰ１、３５Ｓ−ＧＦＰおよびＳ１１．１３−３４Ｔ−ＤＮＡに対してホモ接合型である植物を同定する。これらの三重ホモ接合型系統、ホモ接合型親８Ｚ−２Ｓ１１．１３−３４系統およびホモ接合型８Ｚ−２　３５Ｓ−ＧＦＰ系統を、３５Ｓ−ＧＦＰ導入遺伝子のＰＴＧＳに関してスクリーニングする。
【０１８３】
実施例１０：シロイヌナズナプロモーターＰＴＧＳにおけるＲＤＲＤの過剰発現
ホモ接合型ＲＤＰ１形質転換体（実施例９参照）を、実施例９に記載した方法を用いることにより、ＰＴＧＳ系統８Ｚ−２および５と交雑させて、３５Ｓ−ＧＦＰおよびＲＤＰ１導入遺伝子の両方に対してホモ接合型であるＦ３世代植物を得る。実施例４に記載したＧＦＰ発現に関するこれらのホモ接合型系統の検定は、それぞれ元の８Ｚ−２および５系統と比較して、８Ｚ−２ＲＤＰおよび５ＲＤＰ植物の間でＰＴＧＳを示す植物の分画の増大が認められることを示す。したがって、ＲＤＲＤ導入遺伝子の付加的コピーの過剰発現は、ＰＴＧＳの１００％未満の出現率を示す系統のＰＴＧＳを促す。
【０１８４】
本発明は、本発明の個々の局面の単一の例証として意図される前記の特定の実施態様により範囲を限定されないし、機能的に等価である任意の構築物、核酸配列または形質転換化植物は、本発明の範囲内である。実際、本明細書中に示したものに加えた本発明の種々の修正は、前記の説明および添付の図面から、当業者に明らかになる。このような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るよう意図される。
種々の特許および参考文献が本明細書中に引用されており、それらの記載内容を、本明細書中に援用する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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