(57)【要約】単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子と組合せて含み、適宜、免疫原及び／又は免疫原をコードする核酸分子を更に含む組成物を開示する。免疫原に対する免疫応答を個体において誘導する方法であって、その個体に、単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８をコードする核酸分子及び適宜標的タンパク質及び／又は標的タンパク質をコードする核酸分子と組合せて投与することを含む当該方法を開示する。個体の免疫系を調節する方法であって、その個体に、単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子と組合せて投与することを含む当該方法をも開示する。加えて、ＩＬ−８をコードするヌクレオチド配列及びＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含む組換えワクチン、生弱毒化病原体並びに同方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む組成物：
単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；及び
単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２】
標的タンパク質及び／又は標的タンパク質をコードする核酸分子を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
調節エレメントに操作可能に結合されたＩＬ−８をコードするヌクレオチド配列と、調節エレメントに操作可能に結合されたＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチドを含むプラスミドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記のプラスミドが、調節配列に操作可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記の免疫原が、病原性抗原、癌関連抗原又は自己免疫疾患と関連する細胞に結合した抗原である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記の免疫原が、病原性抗原である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記の免疫原が、単純ヘルペス抗原である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記の単純ヘルペス抗原が、ＨＳＶ２ｇＤである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜８の組成物を含む、注射用医薬組成物。
【請求項１０】
免疫原に対する免疫応答を個体において誘導する方法であって、該個体に下記を投与することを含む当該方法：
単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；
単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；及び
標的タンパク質及び／又は標的タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１１】
前記の個体に下記を投与することを含む、請求項１０に記載の方法
ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；
ＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；及び
標的タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１２】
前記の個体に、ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＩＬ−８タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記の個体に、２以上の異なるプラスミドを投与することを含む、請求項１１に記載の方法であって、該２以上の異なるプラスミドが、集合的に、ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＩＬ−８タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む当該方法。
【請求項１４】
前記の個体に、ＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質及び／又は標的タンパク質を投与することを含む、請求項１１〜１３の何れか一つに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４に記載の方法であって、前記の標的タンパク質が、病原性抗原、癌関連抗原又は自己免疫疾患と関連する細胞に結合した抗原である当該方法。
【請求項１６】
請求項１０〜１５に記載の方法であって、前記の免疫原が、病原性抗原である当該方法。
【請求項１７】
請求項１０〜１６の何れか一つに記載の方法であって、前記の標的タンパク質が、単純ヘルペスウイルス抗原である当該方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１７の何れか一つに記載の方法であって、前記の標的タンパク質が、単純ヘルペスウイルス抗原ＨＳＶ２ｇＤである当該方法。
【請求項１９】
個体の免疫系を調節する方法であって、該個体に下記を投与することを含む当該方法
単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；及び
単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２０】
前記の個体に下記を投与することを含む、請求項１９に記載の方法
ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；
ＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２１】
前記の個体に、ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びＩＬ−８タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記の個体に、２以上のプラスミドを投与することを含む、請求項２０に記載の方法であって、該２以上の異なるプラスミドが、集合的に、ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びＩＬ−８タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む当該方法。
【請求項２３】
前記の個体に、ＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質を投与することを含む、請求項１９〜２２の何れか一つに記載の方法。
【請求項２４】
調節エレメントに操作可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列、ＩＬ−８をコードするヌクレオチド配列及びＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含む組換えワクチン。
【請求項２５】
前記の免疫原が、病原性抗原、癌関連抗原又は自己免疫疾患と関連する細胞に結合した抗原である、請求項２４に記載の組換えワクチン。
【請求項２６】
前記の免疫原が、病原性抗原である、請求項２４に記載の組換えワクチン。
【請求項２７】
免疫原に対する免疫応答を個体において誘導する方法であって、該個体に請求項２４に記載の組換えワクチンを投与することを含む当該方法。
【請求項２８】
前記の組換えワクチンが、組換えワクシニアワクチンである、請求項２４に記載の組換えワクチン。
【請求項２９】
ＩＬ−８をコードするヌクレオチド配列及びＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含む生弱毒化病原体。
【請求項３０】
病原体に対して個体を免疫化する方法であって、該個体に請求項２９に記載の生弱毒化病原体を投与することを含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、改良されたワクチン、個体を免疫原に対して予防のため及び／又は治療のために免疫化するための改良された方法、並びに改良された免疫療法用組成物及び改良された免疫療法に関係する。
【０００２】
発明の背景
免疫療法は、個体の免疫応答を調節して、望ましい治療効果を与えることをいう。免疫療法剤は、個体に投与した場合に、その個体の免疫系を調節して、最終的に、望ましくない免疫応答と関連する症状を低減させ又は最終的に、望ましい免疫応答を増大させることにより症状を緩和させるのに十分な組成物をいう。
【０００３】
幾つかの事例においては、免疫療法は、予防接種プロトコールの部分であり、該プロトコールにおいては、個体が免疫応答を生じる免疫原に、その個体をさらすワクチンを、その個体に投与する。かかる事例においては、免疫療法剤は、免疫応答を増大させ及び／又は免疫応答（細胞性アーム又は液性アーム）の一部分を選択的に増強させ、それは、特定の状態、感染又は疾患の治療又は予防に望ましいものである。
【０００４】
幾つかの事例においては、免疫療法剤は、免疫原なしで送達される。かかる事例においては、免疫療法剤は、免疫応答を減少させ若しくは抑制し、増強し若しくは増大させ、免疫系の一部分を減少させ若しくは抑制し、又は免疫系の一部分を増強し若しくは増大させることによって免疫系を調節するように与える。
【０００５】
幾つかの事例においては、免疫療法剤は、免疫応答の調節に関与するタンパク質にイン・ビボで結合させるために投与する場合には、抗体を含む。抗体と免疫応答の調節に関与するタンパク質との相互作用は、その個体における免疫応答の変化を生じる。例えば、もしこのタンパク質が自己免疫疾患に関与するならば、これらの抗体は、その役割における活性を阻止することができ、それらの症状又は疾患を低減させ又は排除することができる。
【０００６】
ワクチンは、個体を、標的抗原例えばアレルゲン、病原性抗原又はヒトの病気に関与する細胞と結合した抗原に対して免疫化するのに有用である。ヒトの病気に関与する細胞と結合した抗原には、癌結合性腫瘍抗原及び自己免疫疾患に関与する細胞と結合した抗原が含まれる。
【０００７】
かかるワクチンのデザインにおいて、予防接種された個体の細胞内で標的抗原を生成するワクチンは、免疫系の細胞性アームの誘導において効果的である。特に、生弱毒化ワクチン、組換えワクチン（無発病性ベクター使用）及びＤＮＡワクチンは、各々、予防接種された個体の細胞における抗原の生成へと導き、これは、免疫系の細胞性アームの誘導を生じる。他方、死滅させ又は不活性化したワクチン及びサブユニットワクチン（タンパク質だけを含む）は、液性応答を誘導するが、十分な細胞性免疫応答を誘導しない。
【０００８】
細胞性免疫応答は、しばしば、病原体感染に対する防御を与えるのに及び病原体感染、癌又は自己免疫疾患の治療に有効な免疫媒介療法を与えるのに必要である。従って、予防接種した個体の細胞において標的抗原を生成するワクチン例えば生弱毒化ワクチン、組換えワクチン（無発病性ベクター使用）及びＤＮＡワクチンは、しばしば、好ましい。
【０００９】
かかるワクチンは、しばしば、個体を、病原体感染又はヒトの病気に対する予防又は治療のために免疫化するのに有効であるが、改良されたワクチンに対する要求がある。増強された免疫応答を生じる組成物及び方法に対する要求がある。
【００１０】
同様に、幾つかの免疫療法剤は、患者における免疫応答を調節するのに有用であるが、改善された免疫療法剤組成物及び方法に対する要求がある。
【００１１】
発明の概要
本発明は、単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子と共に含む組成物に関係する。
【００１２】
本発明は、更に、単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子と共に含み、更に、標的タンパク質及び／又は標的タンパク質をコードする核酸分子をも含む組成物にも関係する。
【００１３】
本発明は、単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子と共に含む注射用医薬組成物に関係する。
【００１４】
本発明は、単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子と共に含み、更に、標的タンパク質及び／又は標的タンパク質をコードする核酸分子をも含む注射用医薬組成物に関係する。
【００１５】
本発明は、更に、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法であって、単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子と共に含み、更に、標的タンパク質及び／又は標的タンパク質をコードする核酸分子をその個体に投与することを含む当該方法に関係する。
【００１６】
本発明は、更に、個体の免疫系を調節する方法であって、その個体に、単離されたＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子を、単離されたＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子と共に投与することを含む当該方法に関係する。
【００１７】
本発明は、更に、調節エレメントに操作可能に結合された免疫原をコードするヌクレオチド配列、ＩＬ−８をコードするヌクレオチド配列、及びＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含む組換えワクチン、並びにかかる組換えワクチンを個体に投与することを含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関係する。
【００１８】
本発明は、更に、ＩＬ−８をコードするヌクレオチド配列及びＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含む生弱毒化病原体、並びに生弱毒化病原体を個体に投与することを含む、個体において病原体に対する免疫応答を誘導する方法に関係する。
【００１９】
好適具体例の詳細な説明
ここで用いる場合、用語「免疫調節タンパク質」は、ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＩＬ−８タンパク質を指すことを意味する。
【００２０】
ここで用いる場合、用語「標的タンパク質」は、免疫応答の標的タンパク質として作用する本発明の遺伝子構築物によりコードされるペプチド及びタンパク質を指すことを意味する。用語「標的タンパク質」及び「免疫原」は、交換可能に用いられ、それに対する免疫応答が誘出されうるタンパク質である。この標的タンパク質は、病原体又は望ましくない細胞型例えば癌細胞若しくは自己免疫疾患に関与する細胞（該細胞に対する免疫応答が望まれる）に由来するタンパク質と少なくとも一つのエピトープを共有する免疫原性タンパク質である。この標的タンパク質に対する免疫応答は、個体を、標的タンパク質が関係する特異的感染又は疾患から防護し且つ／又は治療するであろう。
【００２１】
ここで用いる場合、用語「遺伝子構築物」は、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子をいう。コード配列は、核酸分子を投与された個体の細胞中で発現を指示することのできるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに操作可能に結合された開始及び終止シグナルを含む。
【００２２】
ここで用いる場合、用語「発現可能形態」は、個体の細胞中に存在した場合にコード配列が発現されるように、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするコード配列に操作可能に結合された必要な調節エレメントを含む遺伝子構築物をいう。
【００２３】
ここで用いる場合、用語「エピトープの共有」は、他のタンパク質のエピトープと同一であるか又は実質的に類似する少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質をいう。
【００２４】
ここで用いる場合、用語「実質的に類似するエピトープ」は、一つのタンパク質のエピトープと同一ではないが、それにもかかわらず、そのタンパク質に対して交差反応する細胞性又は液性免疫応答を呼び出す構造を有するエピトープを指すことを意味する。
【００２５】
ここで用いる場合、用語「細胞内病原体」は、その生殖周期又は生活環の少なくとも部分において宿主細胞中に存在して病原性タンパク質を生成し又は生成されるウイルス又は病原性有機体を指すことを意味する。
【００２６】
ここで用いる場合、用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖により特徴付けられる疾患を指すことを意味する。
【００２７】
ここで用いる場合、用語「過剰増殖関連タンパク質」は、過剰増殖性疾患と関係するタンパク質を指すことを意味する。
【００２８】
この発明は、ＩＬ−８とＲＡＮＴＥＳの組合せが免疫応答を調節するという発見から生まれた。従って、これらのタンパク質及び／又はこれらのタンパク質をコードする核酸分子の組合せは、免疫療法剤として、又はワクチンの成分と組合せて若しくは該成分として送達することができる。ＲＡＮＴＥＳとＩＬ−８との組合せは、抗原特異的なＴｈ１型免疫応答を駆動すること及びワクチンの部分として投与した場合に防護免疫を増強することが見出されている。
【００２９】
ＣＴＬ応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、細胞内病原体に対する又は自己免疫疾患若しくは癌に関係する細胞に対するワクチンと共に若しくは該ワクチンの部分として投与した場合に、特に有用である。ＣＴＬ応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン及び核酸／ＤＮＡワクチンと共に投与した場合に、特に有用である。或は、ＣＴＬ応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、癌又は細胞内感染症を患っている患者に投与する免疫療法剤として有用である。ＣＴＬ応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、免疫無防備状態の患者に投与する場合に、有用である。
【００３０】
Ｔ細胞増殖応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、ワクチンと共に又はワクチンの部分として投与した場合に、特に有用である。或は、Ｔ細胞増殖応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、免疫療法剤として有用である。Ｔ細胞増殖応答を誘導して増強する免疫調節タンパク質は、免疫無防備状態の患者に投与する場合に、有用である。
【００３１】
ＲＡＮＴＥＳのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入れ番号は、Ｍ２１１２１であり、参考として、本明細書中に取り込む。ＲＡＮＴＥＳは、Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１， １０１８−１０２５（１９８８）に記載されており、参考として、本明細書中に取り込む。
【００３２】
ＩＬ−８のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入れ番号は、Ｍ２８１３０であり、参考として、本明細書中に取り込む。ＩＬ−８は、Ｍｕｋａｉｄａ，Ｎ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３（４），１３６６−１３７１（１９８９）に記載されており、参考として、本明細書中に取り込む。
【００３３】
この発明の幾つかの具体例により、ＩＬ−８とＲＡＮＴＥＳの組合せを個体に送達して、その個体の免疫系の活性を調節する。これらのＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳは、各々独立に、タンパク質形態で及び／又はそのタンパク質をコードするその個体における発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合されたヌクレオチド配列を含む核酸分子として、直接送達することができる。これらの核酸分子がその個体の細胞により取り込まれると、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列が細胞中で発現され、それにより、そのタンパク質がその個体に送達される。この発明の幾つかの面は、ＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８をコードする核酸分子をＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳをコードする核酸分子と共に送達する方法並びに送達のための組成物を提供する。従って、この発明の幾つかの具体例は、ＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子並びにＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８をコードする核酸分子を含む組合せに関係する。幾つかの具体例により、これらの組成物は、１）ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＩＬ−８タンパク質；２）ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子及びＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；３）ＲＡＮＴＥＳタンパク質、及びＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；４）ＩＬ−８タンパク質、及びＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；５）ＲＡＮＴＥＳタンパク質、ＩＬ−８タンパク質、及びＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；６）ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＩＬ−８タンパク質、及びＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；７）ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子並びにＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；８）ＩＬ−８タンパク質、及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子並びにＩＬ−８をコードする核酸分子；９）ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子並びにＩＬ−８タンパク質及びＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子よりなる群から選択する組合せを含む。
【００３４】
この発明の幾つかの具体例により、個体の免疫系の活性を調節するためにその個体に送達されるＩＬ−８とＲＡＮＴＥＳの組合せを、ワクチンと共に投与する。本発明の幾つかの面により、個体を、予防のため及び／又は治療のために、病原体又は異常な、病気に関係する細胞に対して免疫化する組成物及び方法を提供する。これらのＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳは、各々独立に、タンパク質形態で、及び／又はそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を個体における発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合して含む核酸分子として、直接送達することができる。核酸分子が個体の細胞により取り込まれると、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列がそれらの細胞中で発現され、それにより、そのタンパク質が個体に送達される。このワクチンは、任意の種類のワクチンであってよく、例えば、サブユニットワクチン若しくはタンパク質ワクチン、殺菌若しくは不活性化したワクチン、生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン、又は核酸若しくはＤＮＡワクチンであってよい。生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン、又は核酸若しくはＤＮＡワクチンの場合には、ＲＡＮＴＥＳタンパク質及び又はＩＬ−８タンパク質は、これらのワクチンの核酸分子によってコードされうる。ＩＬ−８タンパク質及び／又はＩＬ−８をコードする核酸分子をＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＲＡＮＴＥＳをコードする核酸分子と組合せて送達することにより、ワクチンにより誘導される免疫応答を、特に細胞性アームを増強することにより、調節することができる。幾つかの具体例により、これらの組成物は、ワクチン例えばタンパク質ワクチン及び／又は殺菌したワクチン及び／又は不活性化したワクチン及び／又は生弱毒化ワクチン及び／又は組換えワクチン及び／又はＤＮＡワクチンを、１）ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＩＬ−８タンパク質；２）ＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子及びＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；３）ＲＡＮＴＥＳタンパク質、及びＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；４）ＩＬ−８タンパク質、及びＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；５）ＲＡＮＴＥＳタンパク質、ＩＬ−８タンパク質、及びＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；６）ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＩＬ−８タンパク質、及びＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子；７）ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子並びにＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子；８）ＩＬ−８タンパク質、及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子並びにＩＬ−８をコードする核酸分子；９）ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＲＡＮＴＥＳタンパク質をコードする核酸分子並びにＩＬ−８タンパク質及びＩＬ−８タンパク質をコードする核酸分子よりなる群から選択する組合せと組合せて及び／又は包含して含む。
【００３５】
下記は、タンパク質形態の免疫調節タンパク質の製造及び投与の説明と、それに続く、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子の製造及び投与の説明である。ここに記載のように、この発明の組成物及び方法は、タンパク質及び核酸の組合せ並びにタンパク質のみを含む組成物及び方法並びに核酸のみを含む組成物及び方法を含むことができる。従って、以下に示す説明は、タンパク質と核酸の組合せの利用を含む組成物及び方法を含むことを意図している。
【００３６】
上記のように、ＲＡＮＴＥＳタンパク質及び／又はＩＬ−８タンパク質は、免疫療法及び／又は免疫応答を調節するためのワクチンプロトコールの部分として投与することができる。免疫調節タンパク質は、組換え技術により製造することができ、標準的タンパク質合成技術によって合成することができ、そして天然起源から精製することができる。このタンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマを生成することができ、単離精製手順において利用することができる。このタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離して、配列決定し、発現ベクターを含むベクターに取り込ませてあり、それらを宿主細胞に導入してから、これらのタンパク質を組換えにより発現させた。
【００３７】
これらの免疫調節タンパク質をコードする単離したｃＤＮＡは、その組換えタンパク質を生成することのできる組換え発現ベクターの構築の出発物質として有用である。このｃＤＮＡを発現ベクターを含むベクターに組み込み、それらを宿主細胞に導入してから、これらのタンパク質を組換えにより発現させる。
【００３８】
標準的技術及び用意に入手可能な出発物質を用いて、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を製造することができる。この核酸分子は、発現ベクターに組み込むことができ、次いで、それを宿主細胞に取り込ませる。タンパク質の製造のための周知の組換え発現系で使用するための宿主細胞は、周知であり、容易に入手できる。宿主細胞の例には、細菌細胞例えば大腸菌、酵母細胞例えばＳ．セレビシエ、昆虫細胞例えばＳ．フルギペルダ、非ヒト哺乳動物組織培養細胞チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びヒト組織培養細胞例えばＨｅＬａ細胞が含まれる。
【００３９】
幾つかの具体例において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、ＤＮＡ分子を周知の発現系で使用するための市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を大腸菌における免疫調節タンパク質の製造に利用することができる。例えば、市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を酵母のＳ．セレビシエ株における製造に利用することができる。例えば、市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を、昆虫細胞における製造に利用することができる。例えば、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ Ｉ又はｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を、哺乳動物細胞例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞における製造に利用することができる。当業者は、これらの市販の発現ベクター及び系その他を利用して免疫調節タンパク質を、日常的技術及び容易に入手できる出発材料によって製造することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， 第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）参照、参考として本明細書中に援用する。） こうして、これらの所望のタンパク質を、原核生物及び真核生物の系の両方で製造することができ、このタンパク質のプロセッシングを受けた型のスペクトルが見出される。
【００４０】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を利用することができ、又は周知の方法及び用意に入手できる出発物質を利用してベクターを作ることができる。必要な制御配列例えばプロモーター及びポリアデニル化シグナル及び好ましくはエンハンサーを含む発現系は、様々な宿主について容易に入手でき、当分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８８）を参照されたい。
【００４１】
免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合性の宿主をトランスフォームし、次いで、それを、外来ＤＮＡの発現が起きる条件下で培養して維持する。こうして生成された本発明のタンパク質を培養物から、細胞を溶解させることにより又は適宜培養培地（当業者に公知）から回収する。当業者は、かかる発現系を利用して生成した免疫調節タンパク質を、周知の技術を用いて単離することができる。天然起源からタンパク質を、抗体を用いて精製する方法は、組換えＤＮＡ技術により生成されたタンパク質を精製するために同様に適用することができる。
【００４２】
こ（れら）の免疫調節タンパク質は、医薬組成物中に配合することができる。適当な製薬用キャリアーは、この分野の標準的参考書Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ａ． Ｏｓｏｌ， に記載されている（参考として、本明細書中に取り込む）。本発明の医薬組成物は、活性剤を標的細胞に到達させることのできる任意の手段により投与することができる。ペプチドは、経口投与した場合には、消化されるものであるので、非経口投与（即ち、静脈、皮下、経皮、筋肉内投与）が、通常、吸収を最適化するために用いられる。静脈投与は、注入ポンプの助成により達成することができる。本発明の医薬組成物は、乳濁液として配合することができる。或は、それらを、鼻腔内投与又は吸入投与のためにエアゾール医薬として配合することができる。幾つかの場合には、局所投与が望ましいであろう。
【００４３】
投与する投薬量は、次のような因子によって変化する：薬力学的特徴；投与の方法及び経路；レシピエントの年齢、健康状態及び体重；症状の性質及び程度；並行する治療の種類；及び治療の頻度。通常、タンパク質の投薬量は、体重５０ｋｇ当たり約１〜３０００ミリグラムであり；好ましくは、体重５０ｋｇ当たり１０〜１０００ミリグラムであり；一層好ましくは、体重５０ｋｇ当たり２５〜８００ミリグラムである。通常、一人に、１日当たり８〜８００ミリグラムを、１日１〜６回の分割投与量で投与し、又は所望の結果を得るのに十分な持続的放出形態で投与する。局所投与のための配合物には、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体及び粉末が含まれる。慣用の製薬用キャリアー、水性、粉末又は油性ベース、増粘剤等が、必要であり又は望ましいであろう。経口投与のための組成物には、粉末若しくは顆粒、懸濁液若しくは溶液（水又は非水性媒質中）、カプセル、サッシェ又は錠剤が含まれる。増粘剤、調味剤、希釈剤、乳化剤、分散剤又は結合剤は、望ましいであろう。非経口投与、静脈投与、くも膜下投与又は脳室内投与のための組成物には、無菌水溶液が含まれうる（緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤をも含むことができ、これらは、好ましくは、無菌的であり且つ発熱物質を含まない）。この発明による静脈投与に適した医薬組成物は、無菌的であり且つ発熱物質を含まない。
【００４４】
非経口投与のためには、タンパク質を、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液又は凍結乾燥粉末として、製薬上許容しうる非経口投与用ビヒクルと共に配合することができる。かかるビヒクルの例は、水、塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び非水性ビヒクル例えば固定油も又、利用することができる。このビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性（例えば、緩衝剤及び防腐剤）を維持する添加剤を含むことができる。この配合物を、一般に用いられている技術により殺菌することができる。例えば、注射による投与に適した非経口投与用組成物は、１．５重量％の活性成分を０．９％ 塩化ナトリウム溶液中に溶解させることにより調製することができる。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、活性剤を哺乳動物の身体内の該剤の作用部位に到達させることのできる任意の手段により投与することができる。本発明の医薬組成物は、局所的治療が望まれるか全身的治療が望まれるか及び治療すべき領域に依存して、多くの方法により投与することができる。投与は、局所的投与（眼投与、膣内投与、直腸投与、鼻腔内投与、経皮投与を含む）、経口投与又は非経口投与であってよい。非経口投与には、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射若しくは筋肉注射、肺投与（例えば、吸入若しくは吹送法による）、又はくも膜下若しくは脳室内投与が含まれる。
【００４６】
幾つかの具体例においては、ＩＬ−８及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質は、各々、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与することにより送達され、該核酸分子は、細胞により取り込まれた際に発現されて該タンパク質を生成する。この発明のＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳタンパク質が、各々該タンパク質自体を投与することにより送達される具体例に加えて、幾つかの具体例は、これらのタンパク質自体の送達に加えて及び／又は該送達に代えて、これらのタンパク質をコードする核酸分子の送達を含む。幾つかの具体例においては、両タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、一本鎖核酸分子上にある。幾つかの具体例においては、組成物は、２つの核酸分子を含み、一つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、一つの核酸分子上にあり、他のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、他の核酸分子上にある。幾つかの具体例において、組成物は、２つの核酸分子を含み、一つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、一つの核酸分子上にあり、両タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、他の核酸分子上にある。
【００４７】
本発明は、更に、免疫調節タンパク質を送達するための組成物及びそれの利用方法に関係する。本発明の面は、調節エレメントに操作可能に結合されたＩＬ−８をコードするヌクレオチド配列及び／又は調節エレメントに操作可能に結合されたＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関係する。本発明は、更に、かかる核酸分子を含む注射用医薬組成物に関係する。
【００４８】
調節エレメントに操作可能に結合されたＩＬ−８をコードするヌクレオチド配列及び／又は調節エレメントに操作可能に結合されたＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、組換えベクター例えば組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス及び組換えワクシニアを含む幾つかの周知技術の何れかを用いて送達することができる。
【００４９】
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、５，７３９，１１８号、５，８１７，６３７号、５，８３０，７８６号、５，９６２，４２８号、５，９８１，５０５号、５，５８０，８５９号、５，７０３，０５５号、５，６７６，５９４号及びこれらにおいて引用されている優先権出願に記載されている（これらの各々を、参考として本明細書中に取り込む）。これらの出願に記載された送達用プロトコールに加えて、ＤＮＡ送達のための別報は、米国特許第４、９４５、０５０号及び５，０３６，００６号に記載されている（これら両者を、参考として本明細書中に取り込む）。
【００５０】
投与の経路には、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈、動脈、眼及び口内並びに局所的、経皮的経路（吸入又は坐薬による）又は粘膜組織への経路（膣、直腸、尿道、頬及び舌下組織への洗浄による等）が含まれるが、これらに限らない。好適な投与経路には、粘膜組織への経路、筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下注射が含まれる。遺伝子構築物を、伝統的注射器、ニードルレス注射用デバイス又は「マイクロインジェクタブルボンバードメントジーンガン」を含む手段（これらに限らない）により投与することができる。
【００５１】
これらの遺伝子構築物は、細胞により取り込まれた場合に、機能性染色体外分子として細胞内に存在し続けることができ及び／又は細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれうる。ＤＮＡを細胞内に導入することができ、そこでは該ＤＮＡは、プラスミド形態で、別個の遺伝物質であり続ける。或は、染色体に組み込むことのできる線状ＤＮＡをこの細胞に導入することができる。ＤＮＡを細胞に導入する場合には、ＤＮＡの染色体への組込みを促進する試薬を加えることができる。組込みの促進に有用なＤＮＡ配列も又、そのＤＮＡ分子に含ませることができる。或は、ＲＮＡを細胞に投与することができる。遺伝子構築物をセントロメア、テロメア及び複製起点を有する線状ミニ染色体として提供することも企図される。遺伝子構築物は、遺伝物質の部分を弱毒化した生きた微生物中に又は細胞中に存続する組換え微生物用ベクター中に保持することができる。遺伝子構築物は、組換えウイルスワクチンのゲノムの部分であってよく、遺伝物質は、細胞の染色体に組み込まれるか又は染色体外に存続し続ける。
【００５２】
遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。これらのエレメントには、プロモーター、開始コドン、停止コドン及びポリアデニル化が含まれる。加えて、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現には、しばしば、エンハンサーが必要とされる。これらのエレメントは、所望のタンパク質をコードする配列に操作可能に結合されていること及びそれらを投与する個体において調節エレメントが操作可能であることが必要である。
【００５３】
開始コドン及び停止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分と考えられる。しかしながら、これらのエレメントは、遺伝子構築物を投与する個体において機能的であることが必要である。これらの開始及び停止コドンは、コード配列とイン・フレームでなければならない。
【００５４】
用いるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、個体の細胞中で機能的でなければならない。
【００５５】
本発明の実施に有用な、特に、ヒト用の遺伝子ワクチンの製造に有用なプロモーターの例には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター、例えばＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）並びにヒト遺伝子例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインに由来するプロモーターが含まれるが、これらに限らない。
【００５６】
本発明の実施に有用な、特に、ヒト用の遺伝子ワクチンの製造に有用なポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限らない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられ、これは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）中にあり、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとして言及される。
【００５７】
ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントも又このＤＮＡ分子中に含まれうる。かかる追加的エレメントには、エンハンサーが含まれる。このエンハンサーは、次を含む群から洗濯することができるが、これらに限らない：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びウイルスエンハンサー例えばＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ由来のもの。
【００５８】
この構築物を染色体外に維持してその複数のコピーを細胞内で生成するために、哺乳動物の複製起点を有する遺伝子構築物を提供することができる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のプラスミドｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は、エプスタイン−バールウイルスの複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み、該領域は、組込みを起こさずに高コピー数のエピソーム性の複製を生じる。
【００５９】
免疫化応用に関係する幾つかの好適具体例においては、標的タンパク質、免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び、追加的に、かかる標的タンパク質に対する免疫応答を更に増強するタンパク質の遺伝子を含む核酸分子を送達する。かかる遺伝子の例は、他のサイトカイン及びリンホカイン例えばα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２をコードするものである。幾つかの具体例においては、ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子が、免疫化組成物中で用いる遺伝子構築物に含まれるのが好ましい。
【００６０】
もし何らかの理由により遺伝子構築物を受ける細胞を除去することが望ましいならば、細胞破壊のための標的として役立つ追加のエレメントを加えることができる。発現可能な形態のヘルペスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を、この遺伝子構築物に含ませることができる。薬物ガングシクロバーを個体に投与することができ、該薬物は、ｔｋを生成する任意の細胞を選択的に殺し、それ故、遺伝子構築物を有する細胞の選択的破壊のための手段を提供する。
【００６１】
タンパク質生成を最大にするために、この構築物を投与する細胞内での遺伝子発現によく適合した調節配列を選択することができる。その上、この細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は、これらの細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を生成することができる。
【００６２】
本発明の一つの方法は、核酸分子を、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、皮内に投与し、又は局所的に若しくは吸入、膣、直腸、尿道、頬及び舌下よりなる群から選択する粘膜組織への洗浄により投与するステップを含む。
【００６３】
幾つかの具体例においては、この核酸分子を、これらの細胞に、ポリヌクレオチド機能エンハンサー又は遺伝子ワクチン促進剤の投与と共に送達する。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許出願第０８／００８，３４２号（１９９３年１月２６日出願）、米国特許出願第０８／０２９，３３６号（１９９３年３月１１日出願）、米国特許出願第０８／１２５，０１２号（１９９３年１１月２１日出願）及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号（１９９４年１月２６日出願）に記載されている（各々を、参考として、本明細書中に組み込む）。遺伝子ワクチン促進剤は、米国特許出願第０８／２２１，５７９号（１９９４年４月１日出願）に記載されている（参考として、本明細書中に組み込む）。核酸分子と共に投与される協力剤を、それらの核酸分子との混合物として投与することができ、又は核酸分子の投与の前若しくは後に別個に同時に投与することができる。加えて、トランスフェクション剤及び／又は複製剤及び／又は炎症剤として機能して且つＧＶＦと同時に投与することのできる他の薬剤には、成長因子、サイトカイン及びリンホカイン例えばα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２並びに繊維芽細胞成長因子、表面活性剤例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイントの不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、及びスクアレンなどの小胞が含まれ、ヒアルロン酸も又用いられ、遺伝子構築物と共に投与されうる。幾つかの具体例においては、免疫調節タンパク質を、ＧＶＦとして用いることができる。
【００６４】
本発明による医薬組成物は、約１ナノグラムから約２０００マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、本発明による医薬組成物は、約５ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例においては、これらの医薬組成物は、約０．１〜５００マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約１〜３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約２５〜２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約１００〜２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【００６５】
本発明による医薬組成物は、使用する投与方法に従って配合される。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合には、それらは、無菌的で、発熱物質を含まず且つ粒子を含まない。好ましくは、等張配合物を用いる。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを含むことができる。幾つかの場合には、等張溶液例えばリン酸緩衝塩溶液が好適である。安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。幾つかの具体例においては、血管収縮剤をこの配合物に添加する。
【００６６】
この発明の幾つかの具体例により、免疫原に対する免疫応答を、免疫原、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳの組合せを個体に送達することにより誘導する方法を提供する。この発明の幾つかの具体例により、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳを送達するための薬剤（タンパク質又はそのタンパク質をコードする核酸分子）を、ワクチン組成物の成分として投与し或は補足物としてワクチン成分と共に投与する。このワクチンは、サブユニットワクチン、殺菌したワクチン、生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン又は核酸若しくはＤＮＡワクチンであってよい。生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン又は核酸若しくはＤＮＡワクチンの場合には、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳは、これらのワクチンの核酸分子によりコードされうる。別法として又は追加的に、ＩＬ−８及び／又はＲＡＮＴＥＳタンパク質を、アジュバントとして用いることができる。
【００６７】
幾つかの具体例により、免疫原、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳを、各々独立に、タンパク質形態で及び／又は個体における発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子として直接送達することができる。この核酸分子が個体の細胞により取り込まれた場合には、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列はそれらの細胞中で発現され、それにより、このタンパク質はその個体に送達される。
【００６８】
以下に示すように、免疫原、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳを送達する方法は、免疫原、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳの一つをそれぞれコードする遺伝子構築物の送達により達成することができる。以下で論じるように、この免疫原は、標的タンパク質として言及されうる。免疫原の投与を含まない具体例においては、以下の記載を、標的タンパク質をコードする遺伝子構築物の準備又は送達なしで実施することができる。
【００６９】
本発明は、標的タンパク質（即ち、病原体、アレルゲン又は個体自身の「異常な」細胞と特異的に結合しているタンパク質）に対する広い免疫応答を誘出するのに有用である。本発明は、病原性因子及び生物体に対して個体を免疫化して、病原体タンパク質に対する免疫応答がその病原体に対する防護免疫を与えるようにするのに有用である。本発明は、過剰増殖性細胞と特異的に結合した標的タンパク質に対する免疫応答を誘出することにより、過剰増殖性疾患例えば癌と戦うために有用である。本発明は、自己免疫疾患に関与する細胞と特異的に結合している標的タンパク質に対する免疫応答を誘出することにより、自己免疫疾患と戦うために有用である。
【００７０】
本発明の幾つかの面により、標的タンパク質及び免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを、それが発現される個体の組織の細胞に導入し、そうして、コードされたタンパク質を生成する。これらの標的タンパク質及び免疫調節タンパク質の一方又は両方をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは、個体の細胞内での発現に必要な調節エレメントに結合されている。ＤＮＡ発現のための調節エレメントには、プロモーター及びポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、他のエレメント（コザック領域など）も又、この遺伝子構築物に含ませることができる。
【００７１】
幾つかの具体例においては、標的タンパク質をコードする配列の発現可能型と両免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能型が、同じ核酸分子上に見出され、それは、個体に送達される。幾つかの具体例において、標的タンパク質をコードする配列の発現可能型は、一方又は両方の免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の核酸分子上に存在する。幾つかの具体例において、標的タンパク質をコードする配列の表現可能型及び免疫調節タンパク質の一つをコードする配列の発現可能型は、２つの免疫調節タンパク質の他方をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の一つの核酸分子上に存在する。かかる事例においては、両分子を個体に送達する。幾つかの具体例においては、標的タンパク質をコードする配列の発現可能型は、両免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の核酸分子上に存在する。かかる事例においては、両分子を、個体に送達する。幾つかの具体例においては、標的タンパク質をコードする配列の発現可能型は、２つの免疫調節タンパク質の一方をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の核酸分子上に存在し、該配列は、２つの免疫調節タンパク質の他方をコードする配列の発現可能型を含む核酸分子とは別個の核酸分子上に存在する。かかる事例においては、３分子すべてを個体に送達する。加えて、１つ、２つ又は３つのタンパク質をコードする１つ、２つ又は３つのＤＮＡ分子の任意の組合せを送達して、異なる複数の分子の複数の組合せを生成することができる。重要なことに、標的タンパク質、ＲＡＮＴＥＳタンパク質及びＩＬ−８のコード配列のコピーは、少なくとも一つの核酸分子で与えられる。
【００７２】
こ（れら）の核酸分子は、プラスミドＤＮＡ、組換えベクターの核酸分子として又は弱毒化ワクチン若しくは細胞ワクチン中に与えられた遺伝物質として与えることができる。或は、幾つかの具体例においては、標的タンパク質及び／又は衰退する又は両方の免疫調節タンパク質を、タンパク質として、それらをコードする核酸分子に加えて又はそれらをコードする核酸分子の代わりに送達することができる。
【００７３】
遺伝子構築物は、遺伝子発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合された標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。この発明により、遺伝子構築物の組合せ（標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現型を含むもの及び免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現型を含むものを含む）を提供する。この遺伝子構築物の組合せを含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子の生きた細胞への取り込みは、該ＤＮＡ又はＲＮＡの発現並びに標的タンパク質及び免疫調節タンパク質の生成を生じる。標的タンパク質に対して増強された免疫応答を生じる。
【００７４】
本発明を利用して、すべての病原体例えばウイルス、原核生物及び病原性真核生物例えば単細胞性の病原性生物及び多細胞性寄生性生物に対して、個体を免疫化することができる。本発明は、特に、個体を、細胞に感染し及び被包性でない病原体例えばウイルス、並びに原核生物例えば淋菌、リステリア菌及び赤痢菌に対して免疫化するのに有用である。加えて、本発明は又、個体を、原生動物病原体（生活環中に細胞内病原体である捨て絵時を含むもの）に対して免疫化するのにも有用である。表１は、本発明によるワクチンを製造することのできる幾つかのウイルスの科及び属の一覧を与える。表に列記された抗原のような病原性抗原上に提示されたエピトープと同じであるか又は実質的に類似する少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、ワクチンにおいて有用である。その上、本発明は又、個体を、原核及び真核原生動物病原体並びに多細胞性寄生性生物（表２に列記したものなど）を含む他の病原体に対して免疫化するのにも有用である。
【００７５】
病原体感染に対する防護のための遺伝子ワクチンの製造のためには、免疫原性タンパク質（これに対して防護免疫応答が開始されうるもの）をコードする遺伝物質を、遺伝子構築物中に標的のコード配列として含ませなければならない。病原体が細胞内に感染した （この場合に本発明は特に有用である） か又は細胞外にいるかによらずに、すべての病原性抗原が防護応答を誘出することは、ありそうにないことである。ＤＮＡ及びＲＮＡは、共に、比較的小分子であり、比較的容易に生成することができるので、本発明は、複数の病原性抗原についてワクチン接種することを可能にする更なる利点を提供する。この遺伝子ワクチンで用いられる遺伝子構築物は、多くの病原性抗原をコードする遺伝物質を含むことができる。例えば、幾つかのウイルス遺伝子を単一の構築物に含ませることができ、それにより、複数の標的を与えることができる。
【００７６】
表１及び２は、個体を感染から防護するための遺伝子ワクチンを製造することのできる幾つかの病原性因子及び生物体の一覧を含んでいる。幾つかの好適具体例において、個体を病原体に対して免疫化する方法は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ又はＨＢＶに対するものである。
【００７７】
本発明の他の面は、過剰増殖性疾患に特徴的な過剰増殖性細胞に対する広い防護免疫応答を与える方法及び過剰増殖性疾患を患っている個体を治療する方法を提供する。過剰増殖性疾患の例には、すべての形態の癌及び乾癬が含まれる。
【００７８】
免疫原性「過剰増殖性細胞」関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物の、個体の細胞への導入は、個体のワクチン接種された細胞においてそれらのタンパク質の生成を生じるということが発見されている。過剰増殖性疾患に対して免疫化するためには、過剰増殖性疾患と関係するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を個体に投与する。
【００７９】
過剰増殖関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるためには、それは、過剰増殖性細胞において排他的に生成されるか又は正常細胞と比較して一層高レベルで生成されるタンパク質でなければならない。標的抗原には、かかるタンパク質、その断片及びかかるタンパク質上に見出される少なくとも一つのエピトープを含むペプチドが含まれる。幾つかの事例において、過剰増殖関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の突然変異の産物である。その突然変異した遺伝子は、正常タンパク質では見出されない異なるエピトープを生じる僅かに異なったアミノ酸配列を有すること以外では正常タンパク質と殆ど同じであるタンパク質をコードしている。かかる標的タンパク質には、オンコジーン例えばｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ、及び転座遺伝子のｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦが含まれる。標的抗原としてのオンコジーン生成物に加えて、抗癌治療及び防護養生法のための標的タンパク質は、Ｂ細胞リンパ腫により生成された抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞レセプターの可変領域を含み、幾つかの具体例においては、これらは、自己免疫疾患のための標的抗原でも利用される。他の腫瘍関連タンパク質を、モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるタンパク質及びフォレート結合タンパク質を含む腫瘍細胞中で一層高レベルで見出されるタンパク質のような標的タンパク質として利用することができる。
【００８０】
本発明を利用して、個体を、幾つかの形態の癌の少なくとも一つに対して免疫化することができるが、本発明は、特定の癌を発生しやすいか又は癌を有していたことがありそれ故再発しやすい個体を、予防的に免疫化するのに、特に有用である。遺伝学及び技術並びに疫学の発達は、個体における癌発生の可能性の測定及び危険の評価を可能にした。遺伝的スクリーニング及び／又は家族病歴を利用して、特定の個体が幾つかの種類の癌の何れの一つを発生するかについての可能性を予想することができる。
【００８１】
同様に、既に癌を発生し、治療して癌を除去し或は緩解した個体は、特に、再発しやすい。治療養生法の部分として、かかる個体を、有していたと診断された癌に対して、再発と戦うために免疫化することができる。従って、一度個体がある種の癌を有していたこと及び再発の危険にあることが分かれば、該個体を、免疫系を、その癌の将来の出現と戦うために準備させるために免疫化することができる。
【００８２】
本発明は、過剰増殖性疾患を患っている個体の治療方法を提供する。かかる方法において、遺伝子構築物の導入は、標的タンパク質を生成する増殖過剰性細胞と戦うようにその個体の免疫系に指示し、促進する免疫療法剤として役立つ。
【００８３】
本発明は、自己免疫疾患を患っている個体を、細胞レセプター及び「自己」に向けられた抗体を生成する細胞を含む自己免疫と関係する標的に対する広域的防護免疫応答を与えることにより治療する方法を提供する。
【００８４】
Ｔ細胞媒介の自己免疫疾患には、リウマチ様関接炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの各疾患は、内因性抗原に結合して、自己免疫疾患と関係する炎症カスケードを開始するＴ細胞レセプターにより特徴付けられる。Ｔ細胞の可変領域に対するワクチンの接種は、ＣＴＬを含む免疫応答を誘出して、それらのＴ細胞を排除するであろう。
【００８５】
ＲＡにおいては、この病気に関与するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の幾つかの特異的な可変領域が特性決定されている。これらのＴＣＲには、Ｖβ−３、Ｖβ−１４、Ｖβ−１７及びＶα−１７が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物を用いるワクチン接種は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘出するであろう。Ｈｏｗｅｌｌ， Ｍ．Ｄ．等、１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０９２１−１０９２５；Ｐａｌｉａｒｄ， Ｘ．等、１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３２５−３２９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｗ．Ｖ．等、１９９２ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：３２６−３３３を参照されたい（各々を、参考として、本明細書中に取り込む）。
【００８６】
ＭＳにおいては、この病気に関与するＴＣＲの幾つかの特異的な可変領域が、特性決定されている。これらのＴＣＲには、Ｖβ−７及びＶα−１０が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物を用いるワクチン接種は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘出するであろう。Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ， Ｋ．Ｗ．等、１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１６−１０１９；Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｒ．等、１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４５：３４４−３４６を参照されたい（各々を、参考として、本明細書中に取り込む）。
【００８７】
強皮症においては、この病気に関与するＴＣＲの幾つかの特異的な可変領域が特性決定されている。これらのＴＣＲには、Ｖβ−６、Ｖβ−８、Ｖβ−１４及びＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８及びＶα−１２が含まれる。従って、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物を用いるワクチン接種は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫応答を誘出するであろう。
【００８８】
Ｔ細胞媒介の自己免疫疾患を患っている患者（特に、そのＴＣＲの可変領域が既に特性決定されている者）を治療するためには、滑液生検を行なうことができる。存在するＴ細胞の試料を採取して、それらのＴＣＲの可変領域を標準的技術を利用して同定することができる。この情報を利用して、遺伝子ワクチンを製造することができる。
【００８９】
Ｂ細胞媒介の自己免疫疾患には、狼瘡（ＳＬＥ）、グレーヴズ病、筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症及び悪性貧血が含まれる。これらの病気の各々は、内因性抗原に結合して、自己免疫疾患と関係する炎症カスケードを開始する抗体により特徴付けられる。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、ＣＴＬを含む免疫応答を誘出して、その抗体を生成するＢ細胞を排除するであろう。
【００９０】
Ｂ細胞媒介の自己免疫疾患を患っている患者を治療するためには、その自己免疫活性に関与する抗体の可変領域を同定しなければならない。生検を行なうことができ、炎症部位に存在する抗体の試料を採取することができる。それらの抗体の可変領域は、標準的技術を利用して、同定することができる。この情報を利用して、遺伝子ワクチンを製造することができる。
【００９１】
ＳＬＥの場合には、一つの抗原は、ＤＮＡであると考えられている。従って、ＳＬＥに対して免疫化すべき患者においては、血清を抗ＤＮＡ抗体についてスクリーニングすることができ、血清中に見出されるかかる抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ構築物を含むワクチンを、製造することができる。
【００９２】
ＴＣＲと抗体の両方の可変領域の間の共通する構造的特徴は、周知である。特定のＴＣＲ又は抗体をコードするＤＮＡ配列は、一般に周知の方法例えばＫａｂａｔ等、１９８７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（メリーランド、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従って、見出すことができる（参考として、本明細書中に取り込む）。加えて、抗体から機能的な可変領域をクローン化する一般的方法は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ， Ｖ．Ｋ．等、１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６に見出すことができる（参考として、本明細書中に取り込む）。
【００９３】
遺伝子ワクチンを改良するための免疫調節タンパク質のコード配列の発現可能型の利用に加えて、本発明は、改良された弱毒化生ワクチン及び組換えベクターを利用して抗原をコードする外来遺伝子を送達する改良されたワクチンに関係する。弱毒化生ワクチン及び組換えベクターを利用して外来抗原を送達するものの例は、米国特許第４，７２２，８４８号；５，０１７，４８７号；５，０７７，０４４号；５，１１０，５８７号；５，１１２，７４９号；５，１７４，９９３号；５，２２３，４２４号；５，２２５，３３６号；５，２４０，７０３号；５，２４２，８２９号；５，２９４，４４１号；５，２９４，５４８号；５，３１０，６６８号；５，３８７，７４４号；５，３８９，３６８号；５，４２４，０６５号；５，４５１，４９９号；５，４５３，３６４号；５，４６２，７３４号及び５，４８２，７１３号に記載されている（各々を、参考として、本明細書中に取り込む）。免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する（該配列は、ワクチン接種を受けた者において機能して発現を達成することのできる調節配列と操作可能に結合されている）。これらの遺伝子構築物を弱毒化生ワクチン及び組換えワクチンに混ぜて、この発明による改良されたワクチンを製造する。
【００９４】
本発明は、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチン及び組換えワクチンを含むワクチン組成物の部分として遺伝子構築物を個体の細胞に送達するステップを含む、個体を免疫化する改良された方法を提供する。これらの遺伝子構築物は、免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、それは、ワクチン接種を受けた者において機能して発現を達成することのできる調節配列と操作可能に結合されている。これらの改良されたワクチンは、増強された細胞性免疫応答を生じる。
【００９５】
実施例  ケモカインＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳをコードするＤＮＡワクチンは、抗原特異的なＴｈ１型免疫応答を駆動して、２型単純ヘルペスウイルスに対する防護免疫をイン・ビボで増強する
導入
免疫又は炎症反応の開始は、共刺激性分子、接着分子、サイトカイン及びケモカインの調和的発現を含む複雑な過程である。特に、ケモカインは、免疫細胞の宿主の防御の末梢部位への交通の分子的調節において重要である。このケモカインスーパーファミリーは、２つのシステイン残基を分けるシグナルアミノ酸配列の存在（αファミリー）又は非存在（βファミリー）に基づく２つのサブファミリーからなる。α及びβケモカインは、好中球、好酸球、好塩基球及び単球を含む様々な免疫細胞型の直接的移動を誘導することが示されている。αケモカインファミリー（ＣＸＣ型）、インターロイキン（ＩＬ）−８及びインターフェロンγ誘導性タンパク質（ＩＰ）−１０、及びβケモカインファミリー（ＣＣ型）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）及びマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−１αは、Ｔリンパ球を化学誘引することが示されている。特に、ＩＬ−８及びＩＰ−１０は、好中球を化学誘引して、血流から周囲の組織への移動を誘導することが知られている。同様に、ＲＡＮＴＥＳは、単球、未刺激ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞並びに刺激されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を化学誘引する。ＭＩＰ−１αは、好酸球を化学誘引して脱顆粒を生じさせることが知られている。ＭＩＰ−１αは又、好塩基球及びマスト細胞からのヒスタミン放出をも誘導し、好塩基球及びＢ細胞を化学誘引する。ＭＣＰ−１は、慢性の炎症性疾患において重要なケモカインである。ＭＣＰ−１は、単球を誘導して、血流から組織のマクロファージに移動させる。ＭＣＰ−１は又、活性化記憶サブセットのＴリンパ球を化学誘引する。最近の研究は、ケモカインレセプターがＴ細胞サブセットを示すこと及びケモカインが抗原特異的な免疫応答の生成に関与しうることを支持している。
【００９６】
ここで報告するように、このＤＮＡワクチンモデルを利用して、ケモカインが免疫応答を調節し、次いで、２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チャレンジからの防護に影響するかどうかを規定されたマウスモデル系で調べた。免疫応答及び防護免疫の調節を調べるために、ＨＳＶ−２タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物を、ケモカイン（ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α）をコードする遺伝子プラスミドと共に送達した。次いで、抗原特異的な免疫誘導及びチャレンジからの防護における調節効果を分析した。ＩＬ−８とＲＡＮＴＥＳの同時注入は、抗原特異的な免疫応答及びＨＳＶチャレンジからの防護を増強することが認められた。他方、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αの同時注入は、全体的に、防護状況に悪影響を有した。これらの研究は、ケモカインが、サイトカインを暗示する仕方で、重要な免疫応答及び病気の進行に作用して調節することができることを支持している。有意の免疫調節を、ケモカインｃＤＮＡの同時送達を利用することにより達成し、免疫応答だけでなく病気の防護にも影響を与えることができた。その上、ケモカイン遺伝子送達アジュバント特にＩＬ−８とＲＡＮＴＥＳの利用は、一層効き目のあるワクチンの作成において及びＨＳＶに対する免疫療法において重要でありえよう。
【００９７】
方法
マウス
４〜６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（インジアナ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）から購入した。それらを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （メリーランド、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）及びペンシルベニア大学ＩＡＣＵＣ（ペンシルベニア、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）のガイドラインの下で世話した。
【００９８】
試薬
ＨＳＶ−２株１８６（Ｐ． Ｓｃｈａｆｆｅｒ， ペンシルベニア大学、ペンシルベニア、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａからの寄贈）をＶｅｒｏ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， メリーランド、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）中で増殖させた。ＨＳＶ−２ ｇＤタンパク質をコードするＤＮＡワクチン、ｐＡＰＬ−ｇＤ２（ｐｇＤ）は、以前に、Ｐａｃｈｕｋ， Ｃ．Ｊ．等、「Ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−２ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ」Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ ２２６：７９−８９に記載されたものである（参考として、本明細書中に取り込む）。発現ベクター、ｐＣＤＮＡ３−ＩＬ−８、ｐＣＤＮＡ３−ＩＰ−１０、ｐＣＤＮＡ３−ＲＡＮＴＥＳ、ｐＣＤＮＡ３−ＭＣＰ−１、ｐＣＤＮＡ３−ＭＩＰ−１α、ｐＣＤＮＡ３−ＴＮＦ−α及びｐＣＤＮＡ３−ＴＮＦβは、以前に、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｊ．等、「ＣＤ８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ」Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８ １０２：１１１２−１１２４及びＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．等、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ ２８：１０８９−１１０３に記載されたように構築された（これらを、参考として、本明細書中に取り込む）。プラスミドＤＮＡを細菌中で生成して、ダブルバンデドＣｓＣｌ調製物により精製した。組換えＨＳＶ−２ ｇＤタンパク質（Ｇ．Ｈ． Ｃｏｈｅｎ及びＲ．Ｊ． Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ペンシルベニア大学、ペンシルベニア、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａからの寄贈）を、これらの研究において、組換え抗原として利用した。
【００９９】
マウスのＤＮＡ接種
ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿四頭筋に、１００μｌのリン酸緩衝塩溶液及び０．２５％ ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ， ミズーリ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）中に配合したｇＤ ＤＮＡ構築物を２８ゲージ針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， ニュウジャージー、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ）で注射した。様々なケモカイン及びサイトカインの遺伝子発現カセットの試料をｇｐＤプラスミド溶液と混合してから、注射した。
【０１００】
ＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、以前に、Ｓｉｎ， Ｊ．Ｉ．．等、「Ｉｎ ｖｉｖｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏｗａｒｄ ａ Ｔｈ１ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ａ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９ ７３：５０１−５０９ 及び Ｓｉｎ， Ｊ．Ｉ．．等、「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｈｕｍｏｒａｌ （Ｔｈ２） ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ （Ｔｈ１） ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−２ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ ２８：３５３０−３５４０に記載されたようにして行なった（これらを、参考として、本明細書中に取り込む）。特に、ｇＤ特異的なＩｇＧサブクラスの相対レベルの測定のために、ＨＲＰに結合させた抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Ｚｙｍｅｄ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰの代わりに用いた。これらのＥＬＩＳＡ力価を、ナイーブマウスの血清と同じ光学密度を示す最高希釈度の逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）として測定した。
【０１０１】
ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）増殖アッセイ
Ｔｈ細胞増殖アッセイを、以前に、Ｓｉｎ， Ｊ．Ｉ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９（前出）及びＳｉｎ， Ｊ．Ｉ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８（前出）に記載されたようにして行なった。単離した細胞の懸濁液を、１×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた。１×１０５細胞を含む１００μｌのアリコートを、直接、９６ウェルミクロ滴定プレート（平底プレート）の各ウェルに加えた。ＨＳＶ−２ ｇＤタンパク質を、１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌの終濃度で、三連で、ウェルに加えた。これらの細胞を、３７℃で、５％ ＣＯ２中で、３日間インキュベートした。１μＣｉのトリチウム化チミジンを各ウェルに加え、それらの細胞を３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。このプレートを収穫して、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をベータプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ， フィンランド国、Ｔｕｒｋｉ）中で測定した。刺激インデックスを下記式からそくていした：
【数１】
2004515213.tif 000002
自発的カウントのウェルは、１０％ ウシ胎児血清を含み、これは、無関係のタンパク質の対照として役立つ。細胞が健康な組織に対しては、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）を、ポリクローナル刺激物陽性対照として用いた。
【０１０２】
Ｔｈ１及びＴｈ２型のサイトカイン及びケモカイン
６×１０６の脾臓細胞を含む１ｍｌのアリコートを、２４ウェルプレートのウェルに加えた。２日間の３７℃での５％ ＣＯ２中でのインキュベーション後に、細胞上清を獲得してから、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１αのレベルを、市販のサイトカイン及びケモカインキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ， Ｉｎｔｌ．， Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， Ｃａ．及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， メリーランド、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を用いて、細胞外液体をこのサイトカイン又はケモカイン特異的なＥＬＩＳＡプレートに加えることにより検出するために利用した。
【０１０３】
膣内ＨＳＶ−２チャレンジ
マウスに、以前に記載されたＭｉｌｌｉｇａｎ， Ｇ．Ｎ．等、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒａｃｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｉｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２」Ｖｉｒｏｌ．１９９５ ２１２：４８１−４８９及びＭｃＤｅｒｍｏｔｔ等、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒａｃｔ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８４ ５１：７４７−７５３（これらを、参考として、本明細書中に取り込む）に、幾らかの改変を加えて、抗原投与した。ウイルスの接種の前に、膣内領域を先端に綿を付けたアプリケーター（Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， メイン、Ｇｕｉｆｏｒｄ）を０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸したもので拭いてから、乾燥した綿アプリケーターで清浄化した。次いで、マウスを、毎日、試験して、病理的状態及び生存率を評価した。
【０１０４】
統計分析
統計分析を、対スチューデント検定を用いて行なった。種々の免疫化グループ間で値を比較した。０．０５未満のｐ値を、有意とみなした。
【０１０５】
結果
ケモカインプラスミドの同時投与は、全身のＩｇＧ生成に影響を与える
選択したケモカインの抗原特異的な抗体応答に対するイン・ビボでの効果を、先ず調べた。対照として、動物を、ｇＤワクチン及び２つのプロ炎症性サイトカイン、ＴＮＦファミリー遺伝子（ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β）で免疫化した。これらのプロ炎症性サイトカインは、初期免疫応答に同様に関与していると考えられ、以前に生成したデータに基づいて陽性対照として役立つはずであるので、それらを研究した。図１に示したように、第２回目の免疫化の２週間後に集めて等しくプールした血清のＥＬＩＳＡ力価は、１２，８００（ＩＬ−８）、６，４００（ＩＰ−１０）、６，４００（ＲＡＮＴＥＳ）、６，４００（ＭＣＰ−１α）、ＴＮＦ−α（２５，６００）、ＴＮＦ−β（６，４００）及び６，４００（ｇＤ ＤＮＡワクチン単独）と測定された。これは、ＩＬ−８及びＭＩＰ−１αとの同時注入が、ｇＤ特異的ＩｇＧ抗体の中位の重要でない増強を生じることを示している。対照的に、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ又はＭＣＰ−１は、ｐｇＤワクチン接種単独のものと同様のレベルの抗体応答を示した。ＴＮＦ−α ｃＤＮＡ対照は、以前に正確に観察されたｇＤ ＤＮＡワクチン単独のものより有意に高い全身のＩｇＧレベルを生じた。
【０１０６】
ケモカインプラスミドによる同時免疫化は、ＩｇＧサブクラスをＴｈ１又はＴｈ２イソ型にシフトさせる
ＩｇＧサブクラスは、誘導された免疫応答のＴｈ１とＴｈ２の性質の指示を与える。同時注入により誘導されたＩｇＧサブクラスを分析した。各免疫化グループにより誘導されたＩｇＧイソ型を図２Ａに示し、ＩｇＧ２ａのＩｇＧ１に対する相対比（Ｔｈ１対Ｔｈ２）を図２Ｂに示してある。ｐｇＤで免疫化されたグループは、ＩｇＧ２ａ対ＩｇＧ１比０．６２を有した。ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ又はＴＮＦ−α遺伝子との同時注入は、ｇＤ特異的なＩｇＧ２ａのＩｇＧ１に対する相対比を０．８まで増大させた。他方、ＩＰ−１０又はＭＩＰ−１αとの同時注入は、ＩｇＧ２のＩｇＧ１に対する相対比を減少させた（０．３及び０．４）が、ＭＣＰ−１又はＴＮＦ−β遺伝子による同時免疫化は、ｐｇＤワクチン接種単独と類似したＩｇＧサブタイプパターンを生じた。この分析は、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳがＴｈ１表現型に対する免疫応答を、イン・ビボで、γ−ＩＦＮ型サイトカインと類似の仕方で駆動するという結論を支持する。
【０１０７】
ＩＬ−８とＲＡＮＴＥＳの同時注入は、Ｔｈ細胞の増殖応答を増強する
この細胞増殖は、細胞媒介による免疫の潜在能力の評価に利用される標準的パラメーターである。サイトカイン遺伝子による同時免疫化後のこれらの細胞増殖応答を、免疫化した動物由来の脾臓細胞をイン・ビトロでｇＤで刺激することにより測定した。図３Ａ〜３Ｃに示したように、ｐｇＤ ＤＮＡワクチン接種単独は、ｇＤ特異的なＴｈ細胞の増殖応答を生じた。Ｔｈ細胞の増殖応答の、ｇＤ ＤＮＡワクチン単独のそれを超える有意の増強が、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ又はＴＮＦ−α ｃＤＮＡとの同時注入により観察された。増殖の僅かな増強が、ＴＮＦ−β遺伝子との同時注入により認められた。対照的に、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１又はＭＩＰ−１α遺伝子による同時免疫化は、Ｔｈ細胞の増殖応答のレベルに対して最少の効果を有するようであった。しかしながら、これらの同時注入は、ＰＨＡ誘導された非特異的なＴｈ細胞の増殖応答に対して効果を示さなかった（Ｓ．Ｉ．範囲は、４０〜５０であった）。ｇＤプラスミドワクチン接種は、Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンドにおけるＣＴＬエピトープの欠如のために、ＣＴＬ応答を生じない。しかしながら、一層詳細に細胞性効果を評価するために、サイトカイン生成プロフィルを試験した。
【０１０８】
ケモカイン同時注入は、Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカインの生成に影響を及ぼす
Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ）及びＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０）は、免疫応答の極性化の理解における頼みの綱であった。Ｔｈ１免疫応答は、細胞性免疫の誘導を駆動すると考えられているが、Ｔｈ２免疫応答は、優先的に、液性免疫を駆動する。ＩｇＧ表現型の結果に基づいて、Ｔｈ１対Ｔｈ２の問題は、サイトカイン放出を直接分析することにより更に評価された。表３に示したように、ＩＬ−２生成は、ＩＬ−８ｃＤＮＡの同時注入によりほぼ７倍に劇的に増加した。ＩＬ−２は又、ＴＮＦ−αｃＤＮＡの同時注入によっても、ＭＩＰ−１αカセットの同時注入によっても誘導された。特に、ＩＦＮ−γの生成は、ＲＡＮＴＥＳの同時送達により２０倍に最も有意に増強され、ＩＬ−８の同時送達によって６倍に増強され、更に、イソ型分類結果を支持し且つＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳが、抗原依存様式でＴｈ１型細胞性免疫応答を媒介することを示している。ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βの同時注入は又、各々、ＩＬ−１０生成をも、ｐｇＤワクチン単独よりも有意に高く増強した。これは、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳが、Ｔｈ２型よりＴｈ１が優勢のＴ細胞を駆動することを示している。
【０１０９】
ケモカイン同時注入は、βケモカインの生成に影響する
ケモカインの同時注入が抗原依存様式でのβケモカインの生成を誘導することができるかどうかを測定するために、動物を同時免疫化して、脾臓細胞のβケモカインの放出レベルを、イン・ビトロで、組換えｇＤ抗原又は対照用抗原で刺激した後に分析した。表４に示したように、ＭＣＰ−１生成は、ＩＬ−８ｃＤＮＡの同時注入により劇的に増大したが、ＲＡＮＴＥＳとＭＩＰ−１αカセットとの同時注入により減少した。特に、ＭＩＰ−１αの生成は、ＲＡＮＴＥＳとＩＬ−８の同時送達により最も有意に増強される。ＲＡＮＴＥＳの場合には、ＩＬ−８とＲＡＮＴＥＳの同時注入は、ＲＡＮＴＥＳ生成をｐｇＤワクチン単独より一層高く増強した。これは、ＲＡＮＴＥＳが、ＨＳＶモデルにおいて、抗原特異的な免疫応答をＩＬ−８とは異なる仕方で調節することを示している。これは又、ケモカインが自身の生成を調節することをも支持している。
【０１１０】
ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳケモカインの同時注入は、膣内ＨＳＶ−２チャレンジからの防護を増強する
抗原特異的な免疫調節が病原体の複製に影響することは、重要なことである。ケモカインの同時注入の防護的効力を、マウスヘルペスチャレンジモデルにおいて分析した。マウスを、ＤＮＡベクターを用いて、ｉ．ｍ．で、０及び２週目に、同時免疫化してから、第２回目の免疫化の３週間後に、ＨＳＶ−２を投与した。ＨＳＶ−２は、粘膜皮膚に感染するので、膣内投与経路を選択した。図４Ａ及び４Ｂに示すように、ｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ／マウス）のみによる免疫化は、２００ＬＤ５０のＨＳＶ−２による膣内チャレンジから６３％のマウス生存率を生じた。ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳ ｃＤＮＡの同時注入は、この生存率を８８％に高めた（殆ど３０％の防護率の増大）が、４０μｇのＭＣＰ−１及びＩＰ−１０との同時注入は、この生存率を２５％にまで低下させた（約４０％の全体的防護率の減少）。同様に、ＭＩＰ−１αの同時注入も又、この生存率の低下を生じた。これは、ケモカインＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳが、ＨＳＶ−２感染からの防護を、抗原特異的な免疫調節により増強したという結論を支持する。
【０１１１】
ＴＮＦファミリーの同時注入は、膣内ＨＳＶ−２チャレンジからの防護を悪化させる
ＴＮＦファミリーの同時注入の防護的効果を、このヘルペスチャレンジモデルにおいて比較した。ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β ｃＤＮＡとの同時注入は、２５％まで減少した生存率を生じた（防護率の４０％の減少）（図４Ｃ）。このデータは、更に、ある種の免疫調節ｃＤＮＡの同時注入がワクチンの効力を低下させるであろうことを支持し、応答の質が特に重要であることを支持している。
【０１１２】
検討
ＨＳＶは、ヒトの病気のあるスペクトル例えば口辺ヘルペス、眼感染症、脳炎及び性器感染症の原因物質である。ＨＳＶは、ウイルスの宿主において潜伏期を確立して頻繁に再発することができる。ウイルス感染中、中和抗体は、ウイルス粒子を不活性化するが、細胞内ＨＳＶ感染を制御することはできない。むしろ、細胞媒介による免疫は、ＨＳＶ感染細胞を殺す主要なエフェクター機能である。Ｂ細胞抑制されたマウスのＨＳＶ一次感染を制御する能力又は養子移入されたＴ細胞のその後のウイルス感染を防止する能力は、更に、細胞媒介による免疫が、ウイルス感染とその拡大の阻止に直接関係しうることを示唆している。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が、共にＨＳＶ感染の阻止に関与することも又、十分に文献記載されている。その上更に、Ｔｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＳＶ−２チャレンジからの防護のための一層決定的な役割を演じているという幾つかの報告が為されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞がイン・ビボで涸渇すると、ＨＳＶに対する防護免疫は失われた。その上、Ｔｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞は、多量のＩＦＮ−γを生成する。ＩＦＮ−γは、ＨＳＶ感染細胞においてクラスＩ及びクラスＩＩをアップレギュレートして、細胞傷害性ＣＤ４＋Ｔ細胞による一層良好な認識を可能にし、抗ＨＳＶ効果を指示した。Ｔｈ１型サイトカインｃＤＮＡとの同時送達は、病状を悪化させる。同様に、プロトタイプのＴｈ１型サイトカインＩＬ−１２ｃＤＮＡの同時送達により増強された防護は、ＨＳＶチャレンジモデルにおいてＴｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介されており、これは、ＨＳＶ感染に対するＴｈ１型Ｔ細胞媒介の防護免疫の重要性を強調している。
【０１１３】
動物モデルにおいて、幾つかのＨＳＶ糖タンパク質又は特異的ウイルス成分を発現するＤＮＡ構築物の免疫化は、ウイルスチャレンジに対する完全な又は部分的な防護を与える。幾つかのＨＳＶウイルスタンパク質は、潜在的な免疫化の標的として分析されている。ｇＣ、ＩＣＰ１２７又はｇＤタンパク質をコードするｃＤＮＡによる免疫化は、動物におけるＨＳＶのイン・ビボチャレンジに対する抗原特異的な免疫応答及び防護を誘導することが示されている。最近、サブユニットワクチンを用いる臨床的試みが、再発性ＨＳＶ感染症からの防護に失敗したが、これは、この病原体に対する一層効果的なアプローチをデザインするには、更なる洞察が必要とされることを支持している。
【０１１４】
選択したケモカインの、ＨＳＶ−２感染に対する防護免疫の誘導に対するイン・ビボでの効果を、それらをｇＤ ＤＮＡワクチン構築物と共にプラスミドカセットとして同時注入することにより調べた。ＩＬ−８及びＭＩＰ−１αケモカイン遺伝子により同時免疫化したグループは、ｇＤで免疫化したグループよりも僅かに高いＩｇＧ応答を有した（ワクチンアジュバントとしてのＴＮＦαと同様の仕方で）。その上更に、抗原特異的なＩｇＧイソ型応答の調節は、分子アジュバントとしてケモカインを利用することにより達成されてきた。ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳは、ｇＤ特異的ＩｇＧ２ａのＩｇＧ１に対する相対比を、ｇＤ ＤＮＡワクチン単独又はＭＣＰ−１若しくはＴＮＦ−β対照との同時注入と比較して有意に増大させた。しかしながら、ＩＰ−１０及びＭＩＰ−１α遺伝子との同時注入は、ＩｇＧ２ａと比較してＩｇＧ１の一層有利な防護を誘導した。従って、これらの結果は、Ｔｈ１又はＴｈ２に対する液性免疫応答におけるシフトがケモカインにより調節されうるというＨＩＶモデルにおける以前の発見を拡張し、再び、ケモカインがイン・ビボでのサイトカイン生成を調節することができるということを示唆している。
【０１１５】
イン・ビトロ免疫パラメーター例えばＴ細胞増殖及びＣＴＬ応答は、細胞媒介性免疫の能力の評価に用いられてきた。ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳとのプラスミド同時注入のみが、一層高いＴｈ細胞増殖を、ＴＮＦ−α対照と類似の仕方で誘導した。ＩＬ−８同時免疫化は又、ｇＤ ＤＮＡワクチン単独よりも有意に高いＩＬ−２及びＩＮＦ−γの増大した生成をも生じ、これは、イソ型分類結果を更に支持しており、ＩＬ−８がＴｈ１型細胞性免疫応答を抗原依存的様式で媒介することを示している。ＩＬ−８同時注入は又、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１及びＲＡＮＴＥＳ生成をも増強し、これは、ＩＬ−８がイン・ビボでβケモカイン生成を緒節することができることを示している。ＲＡＮＴＥＳ同時注入は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳの増大した生成を生じたが、ＩＬ−２及びＭＣＰ−１の減少した生成を生じた。これは、ＲＡＮＴＥＳが、抗原特異的免疫応答を、ＨＳＶモデルにおけるＩＬ−８から異なる仕方で調節することを示している。
【０１１６】
ＨＳＶチャレンジの研究において、単独のｇＤワクチン接種は、６３％の生存率を、２００ＬＤ５０のＨＳＶ−２のチャレンジ接種物にて示した。ケモカインＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳ ｃＤＮＡの同時注入により、一層良好な生存率（８８％）及び一層少ない重いヘルペス病変形成が達成された。対照的に、ケモカイン遺伝子（ＩＰ−１０及びＭＣＰ−１）の同時送達は、チャレンジを受けたマウスの生存率を２５％まで減少させた（ｇＤワクチン単独よりも全体として５０％より大きい減少）。同様に、ＭＩＰ−１α同時注入も又、ワクチン接種された動物の生存率に負の影響を与えた。これらの観察は、各ケモカイングループにおいて試験された動物の総数（ｇＤ単独の生存率、１８匹中１３匹 ［７２％］；ＭＩＰ−１αの生存率、１８匹中１７匹 ［９４％］；ＩＰ−１０の生存率、１８匹中７匹 ［３９％］；ＭＩＰ−１αの生存率、１８匹中１０匹 ［５６％］））を考慮するならばすばらしいものである（図５）。これは、ＩＬ−８及びＲＡＮＴＥＳケモカイン遺伝子の同時注入は致死的ＨＳＶチャレンジからの防護を増強するが、ＩＰ−１０及びＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１α（一層少ない程度）との同時注入は、免疫応答の誘導にもかかわらず、動物を一層ウイルス感染にかかりやすくするということを示している。Ｔｈ１型サイトカイン遺伝子との同時注入は、致死的ＨＳＶチャレンジからの防護率を増大させるが、Ｔｈ２型サイトカイン同時注入は、動物のウイルス感染への感受性を増大させる。病因論の研究において、病原性感染への抵抗性のためのＴｈ１様サイトカイン応答の重要性が、報告されている。従って、Ｔｈ１及び／又はＴｈ２型免疫応答がこれらのケモカインによって駆動されるということはありそうなことであり、免疫応答の質に基づくＨＳＶ感染性チャレンジに対する防護に対する強い影響を生じる。
【０１１７】
ＴＮＦファミリーの場合には、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β遺伝子との同時注入も又、チャレンジを受けたマウスの生存率を２５％にまで減少させた（ｇＤワクチン単独よりも全体として生存率の５０％より大きい減少）。ＴＮＦ−α遺伝子を同時注入されたマウスのｇＤ特異的な抗体及びＴｈ細胞増殖レベル並びにサイトカイン生成レベル（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０）は、ｇＤ ＤＮＡワクチン接種だけのものよりずっと高かったが、ＨＳＶ−２感染に対するＴＮＦサイトカイン媒介の感受性は、それらの動物において認められた。この観察の原因は明らかでないが、応答の質が病原性感染の制御に有意に重要であることを強く支持している。
【０１１８】
結論として、これらのデータは、ケモカインがＴｈ１及び／又はＴｈ２型に対する免疫応答を抗原依存様式で調節することができることを示している。かかる活性は、以前は、サイトカインとだけ関係付けられてきた。これらのデータは、ケモカインが、抗原特異的免疫の誘導において、サイトカインのような中心的役割を有することを意味している。この発見は、感染性疾患に対する我々の武器を拡大する。その上更に、ケモカインの、癌治療のために免疫応答を調節するための利用も又、考えられる。
【０１１９】
【表１】
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【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
実施例に記載した実験においてＤＮＡベクターで免疫化したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）における全身性ｇＤ特異的のレベルを示す図である。各グループのマウス（ｎ＝１０）をｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ／マウス）とケモカイン遺伝子（４０μｇ／マウス）又はＴＮＦ遺伝子（４０μｇ／マウス）で、０及び２週目に免疫化した。これらのマウスを、第２回目の免疫化の２週間後に採血してから、グループごとに等しくプールした血清をｇＤとの反応用に連続希釈した。それらのＥＬＩＳＡ力価を、ナイーブマウスの血清と同じ光学密度を示す最高血清希釈度の逆として測定した。吸光度（Ｏ．Ｄ．）を、４０５ｎｍで測定した。
【図２Ａ】
図２Ａ及び２Ｂは、実施例に記載した実験においてＤＮＡベクターで免疫化したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）におけるＩｇＧサブクラスのレベルを示す図である。図２Ａにおいて、各グループのマウス（ｎ＝１０）を、ｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ／マウス）とケモカイン遺伝子（４０μｇ／マウス）又はＴＮＦ遺伝子（４０μｇ／マウス）で、０及び２週目に免疫化した。これらのマウスを、最後の免疫化の２週間後に採血してから、血清をｇＤとの反応用に１：１００に希釈した。吸光度（Ｏ．Ｄ．）を、４０５ｎｍで測定した。相対的光学密度を、各ＩｇＧサブクラスの光学密度／全光学密度として計算した。直線状のバーは、各マウスＩｇＧサブクラスの相対的光学密度の平均値（ｎ＝１０）を表している。
【図２Ｂ】
図２Ａ及び２Ｂは、実施例に記載した実験においてＤＮＡベクターで免疫化したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）におけるＩｇＧサブクラスのレベルを示す図である。図２Ｂは、ＩｇＧ２ａのＩｇＧ１に対する相対比を示している。平均（ｎ＝１０）ＩｇＧ２ａレベルは、各免疫化グループにおける平均ＩｇＧ１レベルにより除した。＊ｇＤ ＤＮＡワクチン単独の各対応イソ型と比較して、スチューデントのｔ検定を用いて、Ｐ＜０．０５で統計的に有意である。
【図３】
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、実施例に記載した実験において、αケモカイン ｃＤＮＡ（図３Ａ）、βケモカイン ｃＤＮＡ（図３Ｂ）及びＴＮＦ対照（図３Ｃ）で免疫化したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）における、イン・ビトロｇＤ刺激後の、脾臓細胞のＴｈ細胞増殖レベルを示す図である。各グループのマウス（ｎ＝２）を、ｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ／マウス）とケモカイン遺伝子（４０μｇ／ｍｌ）又はＴＮＦ遺伝子（４０μｇ／マウス）で、０及び２週目に、免疫化した。最後のＤＮＡ注入の２週間後に、２匹のマウスを犠牲にして、脾臓細胞を増殖アッセイ用にプールした。脾臓細胞を、１及び５μｇ／ｍｌのｇＤ−２タンパク質及び５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（陽性対照）で刺激した。刺激の３日後に、これらの細胞を収穫してｃｐｍを計数した。試料を、三連でアッセイした。これらの図は、同様の結果を有する３つの別々の実験の１つの結果を示している。ＰＨＡ対照試料は、４０〜５０の刺激インデックスを示した。＊ｇＤ ＤＮＡワクチン単独と比較して、スチューデントのｔ検定を用いて、Ｐ＜０．０５で統計的に有意である。
【図４】
図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、実施例に記載した実験において、ｇＤ ＤＮＡワクチンとαケモカインｃＤＮＡ（図４Ａ）、βケモカインｃＤＮＡ（図４Ｂ）及びＴＮＦ対照（図４Ｃ）で免疫化したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の生存率を示した図である。各グループのマウス（ｎ＝８）を、ｇＤ ＤＮＡワクチン（６０μｇ／マウス）とケモカイン遺伝子（４０μｇ／マウス）又はＴＮＦ遺伝子で、０及び２週目に、免疫化した。第２回目の免疫化の３週間後に、マウスは、ＬＤ５０２００のＨＳＶ−２株１８６（７×１０５ＰＦＵ）を用いて、ｉ． ｖａｇ．で、チャレンジを受けた。その後、マウスを、毎日試験して、生存率を評価した。生存マウスを、ウイルスチャレンジ後、６１日間にわたって計数した。これを、予想された結果を伴って、一回反復した。
【図５】
実施例に記載した実験において、ケモカイン同時注入の間での防護率の差異を示した図である。括弧内の数字は、生存動物数／全試験動物数である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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