(57)【要約】３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたはモノホスホリルリピドＡおよびそれらの誘導体および類似体と、顆粒球コロニー刺激因子またはインターロイキン−１２のようなサイトカインまたはリンホカインとを組み合わせた使用は、選択した抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答を増強するために抗原性組成物中のアジュバント組み合わせ物として有用である。
2004504260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性ウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体から、またはガン細胞もしくは腫瘍細胞から、またはアレルゲンから、またはアミロイドペプチドタンパク質から選択される抗原、ならびに効果的な免疫増強量の：（１）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたはモノホスホリルリピドＡおよびそれらの誘導体および類似体と（２）サイトカインもしくはリンホカイン、または該サイトカインもしくはリンホカインのアゴニストもしくはアンコダニストとの組み合わせ物を含んで成り、かつ、該アジュバントの組み合わせ物が脊椎動物宿主の該抗原に対する免疫応答を増強するものである抗原性組成物。
【請求項２】
選択される抗原が、タンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントである、請求項１に記載の抗原性組成物。
【請求項３】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される請求項１に記載の抗原性組成物。
【請求項４】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン−１２から成る群から選択される請求項１に記載の抗原性組成物。
【請求項５】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である請求項４に記載の抗原性組成物。
【請求項６】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される請求項５に記載の抗原性組成物。
【請求項７】
サイトカインまたはリンホカインがインターロイキン−１２である請求項６に記載の抗原性組成物。
【請求項８】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される請求項７に記載の抗原性組成物。
【請求項９】
さらに希釈剤またはキャリアーを含んで成る、請求項１に記載の抗原性組成物。
【請求項１０】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される請求項９に記載の抗原性組成物。
【請求項１１】
脊椎動物宿主に請求項１に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、病原性ウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体から選択される抗原を含む抗原性組成物が該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項１２】
脊椎動物宿主に請求項９に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、病原性ウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体から選択される抗原を含む抗原性組成物が該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項１３】
脊椎動物宿主に請求項１に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、病原性ウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体から選択される抗原を含む抗原性組成物が該宿主で細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項１４】
脊椎動物宿主に請求項９に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、病原性ウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体から選択される抗原を含む抗原性組成物が該宿主で細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項１５】
ガン細胞もしくは腫瘍細胞に由来する選択されるガン抗原または腫瘍関連抗原を含む抗原性組成物が有する脊椎動物宿主に治療的または予防的な抗ガン効果を誘導する能力を増す方法であって、ガン細胞もしくは腫瘍に由来する選択されるガン抗原または腫瘍関連抗原、ならびに効果的な免疫増強量の：（１）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたはモノホスホリルリピドＡおよびそれらの誘導体および類似体と（２）サイトカインもしくはリンホカイン、または該サイトカインもしくはリンホカインのアゴニストもしくはアンコダニストとの組み合わせ物を含んで成る抗原性組成物を該宿主に投与することを含んで成る上記方法。
【請求項１６】
選択したアレルゲンを含む抗原性組成物が有する脊椎動物宿主のアレルギー応答を調節する能力を増す方法であって、該アレルゲン、ならびに効果的な免疫増強量の：（１）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたはモノホスホリルリピドＡおよびそれらの誘導体および類似体と（２）サイトカインもしくはリンホカイン、または該サイトカインもしくはリンホカインのアゴニストもしくはアンコダニストとの組み合わせ物を含んで成る抗原性組成物を該宿主に投与することを含んで成る上記方法。
【請求項１７】
抗原性組成物が有する脊椎動物宿主のアミロイド沈着を特徴とする疾患を予防または処置する能力を増すための方法であって、アミロイドペプチドタンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントまたはそれらに対する抗体、ならびに効果的な免疫増強量の：（１）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたはモノホスホリルリピドＡおよびそれらの誘導体および類似体と（２）サイトカインもしくはリンホカイン、または該サイトカインもしくはリンホカインのアゴニストもしくはアンコダニストとの組み合わせ物を該宿主に投与することを含んで成る上記方法。
【請求項１８】
選択される抗原がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する、請求項１に記載の抗原性組成物。
【請求項１９】
選択されるＨＩＶ抗原がＨＩＶタンパク質、該タンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントである、請求項１８に記載の抗原性組成物。
【請求項２０】
選択される抗原がアミノ酸配列：
【表１】
2004504260.tif 000052
を有するＨＩＶペプチドである、請求項１９に記載の抗原性組成物。
【請求項２１】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項１８に記載の抗原性組成物。
【請求項２２】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン−１２から成る群から選択される、請求項１８に記載の抗原性組成物。
【請求項２３】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項２２に記載の抗原性組成物。
【請求項２４】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項２３に記載の抗原性組成物。
【請求項２５】
サイトカインまたはリンホカインがインターロイキン−１２である、請求項２２に記載の抗原性組成物。
【請求項２６】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項２５に記載の抗原性組成物。
【請求項２７】
さらに希釈剤またはキャリアーを含んで成る、請求項１８に記載の抗原性組成物。
【請求項２８】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項２７に記載の抗原性組成物。
【請求項２９】
選択される抗原がシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来する、請求項１に記載の抗原性組成物。
【請求項３０】
選択されるＳＩＶ抗原がＳＩＶタンパク質、該タンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントである、請求項２９に記載の抗原性組成物。
【請求項３１】
選択される抗原がアミノ酸配列：
【表２】
2004504260.tif 000053
から成るペプチドから選択されるＳＩＶペプチドである、請求項３０に記載の抗原性組成物。
【請求項３２】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項２９に記載の抗原性組成物。
【請求項３３】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン−１２から成る群から選択される、請求項２９に記載の抗原性組成物。
【請求項３４】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項３３に記載の抗原性組成物。
【請求項３５】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項３４に記載の抗原性組成物。
【請求項３６】
サイトカインまたはリンホカインがインターロイキン−１２である、請求項３３に記載の抗原性組成物。
【請求項３７】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項３６に記載の抗原性組成物。
【請求項３８】
さらに希釈剤またはキャリアーを含んで成る、請求項２９に記載の抗原性組成物。
【請求項３９】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される請求項３８に記載の抗原性組成物。
【請求項４０】
選択される抗原が淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に由来する、請求項１に記載の抗原性組成物。
【請求項４１】
選択される淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原が淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）タンパク質、該タンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントである、請求項４０に記載の抗原性組成物。
【請求項４２】
選択される抗原が、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ポーリンＢタンパク質である、請求項４１に記載の抗原性組成物。
【請求項４３】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項４０に記載の抗原性組成物。
【請求項４４】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン−１２から成る群から選択される、請求項４０に記載の抗原性組成物。
【請求項４５】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項４４に記載の抗原性組成物。
【請求項４６】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項４５に記載の抗原性組成物。
【請求項４７】
サイトカインまたはリンホカインがインターロイキン−１２である、請求項４４に記載の抗原性組成物。
【請求項４８】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項４７に記載の抗原性組成物。
【請求項４９】
さらに希釈剤またはキャリアーを含んで成る、請求項４０に記載の抗原性組成物。
【請求項５０】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項４９に記載の抗原性組成物。
【請求項５１】
選択される抗原がヒト呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する、請求項１に記載の抗原性組成物。
【請求項５２】
選択されるＲＳＶ抗原が、ＲＳＶタンパク質、該タンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントである、請求項５１に記載の抗原性組成物。
【請求項５３】
選択される抗原が、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質である、請求項５２に記載の抗原性組成物。
【請求項５４】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項５１に記載の抗原性組成物。
【請求項５５】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン−１２から成る群から選択される、請求項５１に記載の抗原性組成物。
【請求項５６】
サイトカインまたはリンホカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項５５に記載の抗原性組成物。
【請求項５７】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項５６に記載の抗原性組成物。
【請求項５８】
サイトカインまたはリンホカインがインターロイキン−１２である、請求項５５に記載の抗原性組成物。
【請求項５９】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項５８に記載の抗原性組成物。
【請求項６０】
さらに希釈剤またはキャリアーを含んで成る、請求項５１に記載の抗原性組成物。
【請求項６１】
３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡが安定な水中油型エマルションの状態で使用される、請求項６０に記載の抗原性組成物。
【請求項６２】
脊椎動物宿主に請求項１８に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＨＩＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項６３】
脊椎動物宿主に請求項２７に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＨＩＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項６４】
ＨＩＶ抗原が、アミノ酸残基：
【表３】
2004504260.tif 000054
を有するＨＩＶペプチドである、請求項６３項に記載の方法。
【請求項６５】
ＨＩＶ抗原が、アミノ酸配列：
【表４】
2004504260.tif 000055
を有するＨＩＶペプチドである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
脊椎動物宿主に請求項１８に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＨＩＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主で細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項６７】
脊椎動物宿主に請求項２７に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＨＩＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主で細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項６８】
ＨＩＶ抗原が、アミノ酸配列：
【表５】
2004504260.tif 000056
を有するＨＩＶペプチドである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＨＩＶ抗原が、アミノ酸配列：
【表６】
2004504260.tif 000057
を有するＨＩＶペプチドである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
脊椎動物宿主に請求項２９に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＳＩＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項７１】
脊椎動物宿主に請求項３８に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＳＩＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項７２】
ＳＩＶ抗原が、アミノ酸配列：
【表７】
2004504260.tif 000058
から成るペプチドから選択されるＳＩＶペプチドである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
脊椎動物宿主に請求項２９に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＳＩＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主における細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項７４】
脊椎動物宿主に請求項３８に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＳＩＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主における細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項７５】
ＳＩＶ抗原が、アミノ酸配列：
【表８】
2004504260.tif 000059
から成るペプチドから選択されるＳＩＶペプチドである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
脊椎動物宿主に請求項４０に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項７７】
脊椎動物宿主に請求項４９に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項７８】
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原が、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ポーリンＢタンパク質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
脊椎動物宿主に請求項４０に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主における細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項８０】
脊椎動物宿主に請求項４９に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主における細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項８１】
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原が、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ポーリンＢタンパク質である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
脊椎動物宿主に請求項５１に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ヒト呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項８３】
脊椎動物宿主に請求項６０に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＲＳＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主の免疫応答を誘導する能力を増すための方法。
【請求項８４】
ＲＳＶ抗原がＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
脊椎動物宿主に請求項５１に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＲＳＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主における細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項８６】
脊椎動物宿主に請求項６０に記載の抗原性組成物を投与することを含んで成る、ＲＳＶ抗原を含む抗原性組成物が有する該宿主における細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を増すための方法。
【請求項８７】
ＲＳＶ抗原がＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質である、請求項８６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、選択した抗原に対する脊椎動物の免疫反応を増強するために、抗原性組成物のアジュバント製剤として、サイトカインまたはリンホカイン、特に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子またはインターロイキン１２と組み合わさった３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡまたはモノホスホリルリピドＡ、およびそれらの誘導体および類似体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
免疫系は病原体を攻撃するために種々のメカニズムを使用する。しかしこのようなメカニズムのすべてが免疫感作後に活性化される必要はない。免疫感作により誘導される防御免疫は、病原体に抵抗するか、または排除するために適当な免疫応答を誘導するワクチンの能力に依存する。病原体に依存して、これには細胞性および／または体液性免疫応答が必要となり得る。
【０００３】
免疫応答におけるヘルパーＴ細胞の役割に関する現在の体系は、Ｔ細胞をそれらが生産するサイトカイン類に基づきサブセットに分類することがてき、そしてこのような細胞中で観察される明らかなサイトカインプロフィールがそれらの機能を決定するということである。このＴ細胞モデルには２つの主要なサブセットが関与する：細胞性および体液性（抗体）免疫応答の両方を増大する、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインタフェロンガンマを生産するＴＨ−１細胞；および体液性免疫応答を増大する、インターロイキン−４、インターロイキン−５およびインターロイキン−１０（それぞれＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０）を生産するＴＨ−２細胞である（参考文献１）。
【０００４】
免疫感作する生物により強い免疫応答を得るために、そして抗原を持つ病原体に対する宿主の抵抗を増強するために、抗原の免疫学的効力を増強することがしばしば望まれる。主に体液性（ＴＨ−２）の応答から、よりバランスのとれた細胞性（ＴＨ−１）および体液性（ＴＨ−２）の応答へと免疫応答をずらすことが望ましい場合もある。
【０００５】
細胞性の応答にはＣＤ８＋（細胞傷害性Ｔ−リンパ球）応答の生成が関与する。そのような応答は細胞内病原体に対するワクチンの開発に望ましい。種々の病原体に対する防御には、強力な粘膜応答、高い血清力価、ＣＴＬおよび激しい細胞性応答の誘導が必要である。このような応答は、通例のサブユニットワクチンを含めほとんどの抗原調製物により提供されなかった。中でもそのような病原体はヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）である。【０００６】
すなわち、体液性および細胞性免疫応答の両方を脊椎動物宿主に生成することができる抗原性組成物製剤を開発する必要がある。
【０００７】
発明の要約
したがって本発明の目的は、サイトカインもしくはリンホカイン、特に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）もしくはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、または該サイトカインもしくはリンホカインのアゴニストもしくはアンコダニストと組み合わせた３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））またはモノホスホリルリピドＡおよびそれらの誘導体および類似体を含む抗原性組成物中に、アジュバント混合製剤を使用することである。アジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与された時に免疫応答を増強する物質である。本発明のアジュバント製剤は、抗原性組成物中で選択された抗原と一緒に投与される。本発明の抗原性組成物は、脊椎動物宿主において選択された抗原に対する免疫応答を増強する。選択される抗原は、（１）病原性ウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体、または（２）ガン細胞もしくは腫瘍細胞、または（３）アレルゲンに対するアレルギー反応を調節するように、ＩｇＥの生産を妨害するためにアレルゲン、または（４）脊椎動物宿主において、アミロイド沈着を特徴とする疾患を予防または処置するような、アミロイドペプチドタンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントであることができる。本発明の一つの態様では、選択される抗原はＨＩＶに由来する。選択されるＨＩＶ抗原はＨＩＶタンパク質、該タンパク質に由来するポリペプチドまたはフラグメントでよい。本発明の特定の態様では、ＨＩＶ抗原は特異的ペプチドである。本発明の別の態様では、選択される抗原は淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）または呼吸合胞体ウイルスに由来する。
【０００８】
ＭＰＬ（商標）は水溶液として、または安定化された水中油型エマルション（安定なエマルションまたはＳＥ）として存在することができる。本発明の好適な態様では、水中油型エマルションはスクアレン、グリセロールおよびホスファチジルコリンを含む。ＳＥ製剤の場合は、ＭＰＬ（商標）はサイトカインまたはリンホカインと混合されて投与前に抗原性組成物を形成する。サイトカインまたはリンホカインを、エマルションに入れる必要はない。本発明の好適な態様では、ＭＰＬ（商標）はＳＥ状態である。抗原性組成物はさらに希釈剤またはキャリアーを含んでもよい。
【０００９】
本発明は、サイトカインもしくはリンホカイン、特にＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＬ−１２、または該サイトカインまたはリンホカインのアゴニストまたはアンタゴニストの効果的な免疫増強量の組み合わせを包含することにより、（１）哺乳動物宿主の免疫応答を誘導するために、病原性ウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体から、または（２）哺乳動物宿主に治療的または予防的抗ガン効果を誘導するために、ガン細胞もしくは腫瘍に由来するガン抗原または腫瘍関連抗原から、または（３）アレルゲンに対するアレルギー応答を穏やかにするように、ＩｇＥの生産を妨害するためにアレルゲンから、または（４）脊椎動物宿主において、アミロイド沈着を特徴とする疾患を予防または処置するような、アミロイドペプチドタンパク質から選択される抗原を含む抗原性組成物の能力を増加させる方法も対象とする。
【００１０】
本発明はさらに、効果的な免疫増強量のサイトカインもしくはリンホカイン、特にＧＭ−ＣＳＦもしくはＩＬ−１２を含むＭＰＬ（商標）、または該サイトカインまたはリンホカインのアゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせ物を含めることにより、脊椎動物宿主で細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するために、病原性ウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体から選択される抗原を含む抗原性組成物の能力を増す方法を対象とする。
【００１１】
発明の詳細な記述
アジュバント、サイトカインおよびリンホカインは、抗原自体では免疫原性がよくない種々の抗原に対する免疫応答の発生およびプロフィールを増強し、そして進める（ｓｔｅｅｒ）能力を有する免疫調節化合物である。アジュバント、サイトカインおよびリンホカインを適当に選択することにより、アジュバント、サイトカインまたはリンホカインの不存在下では発生しない良好な体液性および細胞性免疫応答を誘導することができる。特にアジュバント、サイトカインおよびリンホカインは、ワクチン中のサブユニットおよびペプチド抗原に対する免疫反応を増強する有意な効果を有する。それらの刺激活性は、タンパク質抗原に対して向けられた抗原−特異的な免疫応答の発生に対しても有益である。強力な粘膜応答、高い血清力価、ＣＴＬおよび激しい細胞性応答の誘導を必要とする種々の抗原では、アジュバントおよびサイトカイン／リンホカインの組み合わせ物がほとんどの抗原調製物では提供されないような刺激を提供する。
【００１２】
多くの研究で動物モデルを対象とした様々なアジュバント製剤が評価されたが、アルム［ａｌｕｍ（水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）］が現在、ヒトに広く使用するために認可された唯一のアジュバントである。種々の油中水型または水中油型の組み合わせからなる安定なエマルションであるアジュバントの１群は、それらの免疫増強能力のためにかなり注目された。このような製剤は一般に注入部位に抗原を安定化し、そして沈積させるように作用する代謝可能なまたは不活性油の種々の組み合わせから成る。１つのそのようなアジュバントは、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）であり、これは鉱物油、水および乳化剤を含む。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）はＩＦＡに熱で殺したマイコバクテリアが加えられている。このような種類のアジュバントの使用について特別な心配事は、肉芽腫様の病変を引き起こす多くは単核細胞浸潤の結果である注入部位に付随する炎症であった。したがって、他の化合物および製剤が有力なアジュバントとして調査されている。
【００１３】
１つのそのような化合物は、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標）であり、これはリビ イムノケムリサーチ社（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）（ハミルトン、マサチューセッツ州）から入手することができる。ＭＰＬ（商標）は米国特許第４，９１２，０９４号明細書（２）に記載され、これは引用により本明細書に編入する。
【００１４】
最近、リビ イムノケムリサーチ社は、ＭＰＬ（商標）と組み合わせた時にＭＰＬ（商標）ＳＥと称する安定化されたエマルションの形成をもたらす代謝可能な水中油型製剤を調剤した。安定化されたエマルションはスクアレン油、グリセロールおよびホスファチジルコリンを含むＭＰＬ（商標）のミクロ流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を通して生成される。現在の製剤はＧＭＰ−品質のミクロ流動化エマルションである。１または２％の油を含有するエマルションを、以下の実験で記載する。
【００１５】
ＭＰＬ（商標）ＳＥは、Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下または筋肉内注射した時、注射部位に付随する組織の識別できる病変を生じない。ＭＰＬ（商標）は含まないが同じ成分を含有する安定化されたエマルションも、比較の目的で作成した。具体的には、アジュバントＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて配合した４０アミノ酸ＨＩＶペプチドであるＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）、またはシステイン−欠失３９アミノ酸ペプチドであるＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）ペプチド（これは４０アミノ酸ペプチド（＋Ｃｙｓ）のアミノ酸数１７でシステイン残基を欠く）を用いた皮下または筋肉内の免疫感作により、免疫感作から２週間後に識別される細胞浸潤または組織異常は生じなかった。
【００１６】
また本発明の範囲は、これもまた米国特許第４，９１２，０９４号明細書（２）に記載されているＭＰＬ（商標）の前駆体形であるモノホスホリルリピドＡの使用である。さらに本発明の範囲内にあるのは、ＭＰＬ（商標）およびモノホスホリルリピドＡの誘導体および類似体である。
【００１７】
サイトカインおよびリンホカインのワクチン製剤への包含は、ワクチン効力の拡大または増強の将来性を示した（３）。サイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、Ｔヘルパー細胞サブユニットの拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）をＴｈ１サイトカインプロフィールへシフトすること（すなわちマウスのモデルにおけるＩｇＧ２サブクラスへ）を通して、細胞性免疫を誘起し、そして増強することが示された（４〜６）。マウスでは、組換えマウスＩＬ−１２がＴｈ１優勢免疫応答プロフィールを増強することが示された（３）。
【００１８】
ＩＬ−１２は、種々の抗原提示細胞、主にマクロファージおよび単球により生産される。自然なＴ−細胞からのＴＨ１細胞の誘導において、これは大変重要な要素である。ＩＬ−１２の生産またはそれに対して応答する能力が、防御ＴＨ−１様応答の発生、例えば寄生体の感染中、最も顕著にはリーシュマニア症に大変重要であることが示された（７）。ＩＬ−１２の効果は、大部分がＮＫ細胞およびＴヘルパー細胞により生産されるインターフェロン−ガンマにより媒介される。インターフェロン−ガンマは、Ｔ−依存的タンパク質抗原に対するＩｇＧ２ａ抗体の誘導（８）、およびＴ−非依存的抗原に対するＩｇＧ３応答（９）に大変重要である。もとはナチュラルキラー細胞刺激因子と呼ばれたＩＬ−１２は、ヘテロ二量体サイトカインである（１０）。組換え宿主細胞中でのＩＬ−１２タンパク質の発現および単離は、国際公開第９０／０５１４７号明細書（１１）に記載されている。
【００１９】
アジュバントとして有望な見込みがある別のサイトカインは、ＧＭＰ−ＣＳＦである。ＧＭＰ−ＣＳＦは特定の型のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）である。ＣＳＦは骨髄に見いだされる子孫細胞が特別な種類の成熟血液細胞に分化することを誘導するリンホカインの１ファミリーである。引用により本明細書に編入する米国特許第５，０７８，９６６号明細書（１２）に記載されているように、ＧＭ−ＣＳＦはマクロファージまたは前駆体単球を活性化し、非特異的な殺腫瘍活性を媒介する。ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をコードするヌクレオチド配列が記載された（１２）。ＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを含むプラスミドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で形質転換され、そして２０１１０−２２０９、バージニア州、マナッサス、１０８０１のブルヴァール大学のアメリカン タイプ 培養物 コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号３９９００で寄託された。引用により本明細書に編入する米国特許第５，２２９，４９６号明細書（１３）に記載されているように、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は酵母発現プラスミドにも挿入され、そしてＡＴＣＣに寄託番号５３１５７で寄託された。さらに引用により本明細書に編入する米国特許第５，０７３，６２７号明細書（１４）に記載されているように除去されたグリコシレーション部位を有するＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列が、ＡＴＣＣに寄託番号６７２３１で寄託された。
【００２０】
ＧＭ−ＣＳＦは免疫応答を増強することが知られている抗原提示細胞上のタンパク質分子をアップレギュレートし（１５）、そしてソート（ｓｏｒｔ）−精製したマウスＢ細胞のＩｇ分泌に影響を及ぼす（１６）ことが示された。
【００２１】
限定するわけではないがインターロイキン１−アルファ、１−ベータ、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８、インターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマ、顆粒球コロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子アルファおよびベータを含む他のサイトカインまたはリンホカインは、免疫調節活性を有することが示された。
【００２２】
任意のサイトカインまたはリンホカインの全身性投与に関連する関心事は、サイトカインまたはリンホカイン活性に付随する生物学的な結果である。さらにサイトカインまたはリンホカインの局所的な濃度が維持される場合、抗原−特異的な免疫応答の発生に関連するサイトカインまたはリンホカインの効果が増強されるはずである。
【００２３】
これまでの研究では、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２は別個に評価されてきた；様々な免疫応答のパラメーターの増強が観察された。
【００２４】
本明細書に記載する発明は、抗原、選択したサイトカインまたはリンホカインアジュバント、および第２アジュバント、ＭＰＬ（商標）（好ましくは安定な代謝可能なエマルション）の組み合わせを通して、抗原に特異的な免疫応答が増強されることを示す。
【００２５】
本発明の抗原性組成物に含めるために選択される抗原は、タンパク質に由来するペプチドまたはポリペプチド、ならびに任意の以下のフラグメントを含んで成る：サッカライド、タンパク質、ポリ−またはオリゴヌクレオチド、または他の高分子成分。本明細書で使用するように「ペプチド」とは、少なくとも６個の連続するアミノ酸を含んで成り、そして少なくとも１つの抗原決定基を含むが、一方「ポリペプチド」はペプチドよりも長い分子であるものの、完全長のタンパク質は構成しない。本明細書で使用するように「フラグメント」とは部分を含んで成るが、サッカライド、タンパク質、ポリ−またはオリゴヌクレオチド、または他の高分子成分のすべてではない。ＨＩＶの場合、本発明の抗原性組成物はさらに完全長のＨＩＶタンパク質を含んで成る。
【００２６】
本発明は、ＨＩＶに由来するペプチド抗原を使用したモデル系で例示される。これらのペプチドは、引用により本明細書に編入され、そして今、要約する米国特許第５，０１３，５４８号明細書（１７）および同第５，０１９，３８７号明細書（１８）に記載されているか、またはそれに由来する。これらのペプチドはＨＩＶ包膜タンパク質の領域に相当するアミノ酸配列を含んで成り、これに対して中和抗体およびＴ細胞応答が生成される。
【００２７】
ＨＩＶは、後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原であるヒトのレトロウイルスである。ＨＩＶはＴリンパ球の表面上のＣＤ４（Ｔ４）分子に対してその外部包膜糖タンパク質を付けることにより、すなわちＴ細胞に入り、そして感染させるためのレセプターとしてＣＤ４（Ｔ４）分子を使用して免疫系のＴリンパ球に感染する。免疫感作を通してＨＩＶ−感染に対して特異的な防御免疫応答を誘導する試みは、大変限られた成功しか生まなかった。現在、多くの取り組みが効果的および防御的接種法を決定するために進められている。このような中には弱毒化され、そしてＨＩＶに由来する抗原性エピトープを発現する組換え細菌ベクター（１９）、組換えアデノウイルス（２０）またはワクシニアウイルスベクター（２１）、ＤＮＡワクチン（２２）、およびＨＩＶの種々のＴおよびＢ細胞エピトープを含む合成ペプチド（２３）が含まれる。
【００２８】
ＨＩＶの外部包膜糖タンパク質ｇｐ１２０は、ヒトにおいて中和抗体を誘導することができると示された。全ｇｐ１２０分子の約１／３をコードする組換えタンパク質ＰＢ１は、中和抗体の形成を誘導する包膜タンパク質の一部を含むことが示された。しかしチンパンジーを対象とした研究では、完全なｇｐ１２０も、ＰＢ１も高力価の抗体の生産を誘導することはできないと証明された。
【００２９】
ｇｐ１２０の抗原決定基に対応し、そしてウイルスを中和し、そしてウイルスに対するＴヘルパーおよびＣＴＬ応答を誘導するｇｐ１２０に対する抗体応答を生成する短いペプチドが常法により合成された。
【００３０】
そのようなペプチドの１つがＴ１ＳＰ１０ＭＩＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）、およびシステイン−欠失変異体Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）と命名されたＣ４／Ｖ３マルチエピトープ−含有ＨＩＶ−１ＭＮペプチドである。これらのペプチドはＴｈ、ＴＣＴＬおよびＢエピトープを含むが、ＣＤ４結合を妨害する抗体は誘導しない。これまでにこのようなＣ４／Ｖ３ ＨＩＶペプチドは、ＣＦＡまたはＣＦＡ−様アジュバントと投与された時、免疫応答を誘導するための有望な候補であることが示された（２４〜２９）。このようなペプチドはこれまでに、マウスおよびヒトの両方でＣＤ４＋Ｔｈ細胞応答を誘起し、そしてＢａｌｂ／ｃマウスおよびＨＬＡ Ｂ７＋であるヒトの両方で、主中和決定基およびＣＤ８＋ ＣＴＬにより認識される部位を含むことが示された。この３９アミノ酸ペプチドは最近、ＨＩＶ−感染患者において免疫原性および安全性の両方が証明された（２８）。
【００３１】
Ｔ１ＳＰ１０ＭＩＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）は、４０アミノ酸の以下の配列を有する：
【００３２】
【表９】
2004504260.tif 000003
【００３３】
Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）は、１７位のシステイン無しで合成され、そして３９アミノ酸の以下の配列を有する：
【００３４】
【表１０】
2004504260.tif 000004
【００３５】
システイン残基は、Ｔｈ細胞、ＣＴＬまたはＢ細胞により認識される機能的エピトープの外側に位置する。ウイルスゲノムの様々な領域に由来する他のＨＩＶペプチドは、米国特許第５，８６１，２４３号（３０）、同第５，９３２，２１８号（３１）、同第５，９３９，０７４号（３２）、同第５，９９３，８１９号（３３）、同第６，０３７，１３５号明細書（３４）および欧州特許出願公開第６７１，９４７号明細書（３５）に記載され、これらも引用により本明細書に編入する。
【００３６】
ＨＩＶ抗原はタンパク質、該タンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントでよい。タンパク質はｇｐ４１、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０のような糖タンパク質でもよい。あるいはタンパク質はｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｎｅｆまたはｅｎｖのような遺伝子によりコードされるタンパク質でもよい。そのようなタンパク質に由来するペプチドは、少なくとも１つの抗原決定基（エピトープ）を少なくとも６つのアミノ酸長に含むだろう。
【００３７】
ＨＩＶペプチドに対する免疫応答は、ペプチドを医薬的に許容され得るキャリアー分子に共有結合（連結）することにより増強することができる。適当なキャリアー分子の例には、破傷風毒素、ジフテリア毒素、キーホールリンペットヘモシアニンおよびＨＩＶｇｐ１２０糖タンパク質のＴ細胞エピトープに対応する他のペプチドを含む。
【００３８】
現在、ＨＩＶに対する成功裏のワクチン法は、ＨＩＶに対する粘膜性免疫、ならびに良好なＣＴＬ応答を誘導する必要があると考えられている。Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）マルチ−エピトープペプチドおよび粘膜アジュバントであるコレラトキシンを使用した最近のマウスの研究では、鼻内免疫感作が中和血清ＩｇＧ１抗体を誘導したことを示した（３６）。ＨＩＶ−Ｖ３ループペプチドを使用した後の研究でも、粘膜が合成したＩｇＡ抗体およびペプチド−特異的ＣＴＬを含む強力な細胞性応答の誘導が証明された（３７）。ＨＩＶ−感染した個体の全身的な高力価、および予防または安定化における中和抗体の機能的役割は未知であるが、高力価のウイルス−特異的抗体はウイルスの伝播の防止に重要であると考えられている。
【００３９】
本発明の好適な態様では、ＭＰＬ（商標）を含み、そして次にサイトカイン、ＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦと混合される安定な水中油型エマルションが配合される。以下に与えるデータは、このような組み合わせが高力価のＨＩＶ−中和血清抗体をもたらすことを示した。ＭＰＬ（商標）ＳＥとＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせが免疫感作したメスのマウスの膣円蓋に高力価の抗原−特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの誘導する。ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを用いて配合したいずれのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドを用いたマウスの免疫感作でも、増強された抗原特異的な細胞の増殖およびサイトカインの培養物中への分泌ならびにペプチド−特異的なＣＴＬ応答の誘導により測定される強力な免疫応答を誘導した。
【００４０】
一般に、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２および選択したタンパク質またはペプチドをと混合したＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥの抗原／アジュバント製剤は、高力価の抗原−特異的およびウイルス中和抗体、ＩｇＧサブクラス比のより高い比率の補体−結合ＩｇＧ抗体（マウスでは好ましくはＩｇＧ２ａ）へのシフト、サイトカインの生産上昇およびインビトロでの抗原刺激に対応した単核細胞からの細胞増殖を誘導した。これの特性は、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２を用いても用いなくても、ＭＰＬ（商標）の不存在下で抗原およびＳＥの製剤を用いては観察されなかった。本発明の製剤はＣＴＬの誘導を通して、良好な細胞応答も誘導する。
【００４１】
ＭＰＬ（商標）ＳＥの利点は、製剤が肉芽腫様の蓄積および注入部位の炎症を誘導しない点にあり；そのような注入部位の反応は多くが油中水型または水中油型のアジュバント製剤により典型的に誘導される。
【００４２】
局所的な肉芽腫様の炎症無しで、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２と組み合わせたＭＰＬ（商標）の刺激効果を通して増強される免疫応答を誘導する能力は、ＨＩＶの処置について現在提案されている他のアジュバント製剤では報告されていない。
【００４３】
比較するためにＭＰＬ（商標）（ＳＥを含む、または含まない）にＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２を加えて、各々ＭＰＬ（商標）、ＳＥ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２またはＣＦＡ／ＩＦＡを個別に、またはＨＩＶペプチドを一緒に含めて、一連の実験を行った。結果の要約をここで与え、そして続いてより詳細に検討する。
【００４４】
第１実験では、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを用いて配合したＣ４／Ｖ３ ＨＩＶペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を皮下に免疫感作したＢａｌｂ／ｃマウスは、わずか２回の注射後に１０７を越える血清ＩｇＧ力価を生成した。抗体応答はＨＩＶを中和し、そしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂのペプチド−特異的抗体力価に有意な上昇を示した。ペプチドを含む培養物で刺激した脾臓細胞は、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５およびインターフェロン−ガンマを放出した。まとめると、これらの知見はバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２−型応答の誘導を示している。Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）に対して特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体は、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫感作したマウスの膣洗浄液に生成された。これらの知見は、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦとＨＩＶ−ペプチド抗原との組み合わせが、好ましい免疫応答プロフィールの誘導をもたらすことを示す。
【００４５】
この第１実験では、ＨＩＶペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）およびＳＥ含有アジュバント製剤、またはＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫感作したＢａｌｂ／ｃマウスが、ペプチドに特異的なＩｇＧ抗体力価を生成した（表１）。スクアレン、グリセロール、および乳化剤（ホスファヂルコリン）から成る水中油型の安定なエマルションは、Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）と混合した時にペプチドに特異的なＩｇＧ力価を増強する能力を示した。ＳＥを用いて配合した２５：ｇＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いた免疫感作を通して誘導されたＩｇＧ力価は、ペプチドおよびＣＦＡを用いて免疫感作し、そしてＩＦＡ中のペプチドで追加免疫したマウスに誘導された力価の約１／５の２次応答力価を誘導した。ＣＦＡ／ＩＦＡ配合ワクチンの受容体は、初回免疫感作に応答してＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）特異的ＩｇＧ力価を日常的に生成する。比較の目的で、マウスは２５：ｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）ペプチドを単独で用いて免疫感作した。
【００４６】
ＭＰＬ（商標）の水性およびＳＥ製剤は、フロイントアジュバントまたはサイトカインＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦでのマウスの免疫感作を通して誘導された応答と比較した。ＩＬ−１２と混合したＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）の受容体は、一般に数回の反復実験でペプチドに特異的な抗体力価を生成しなかった。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦまたはＭＰＬ（商標）ＳＥにＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を加えた受容体は低いが、しかし容易に検出可能なＩｇＧ抗体力価を生成した。ＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦを、Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）ペプチドを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥを含有する製剤に加えると、免疫感作に応答してＩｇＧの有意に高い力価を誘導した。実際に、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを組み合わせたマウスの免疫感作は、試験した他のどの製剤を用いて免疫感作したマウスから測定された力価よりもかなり大きな２次応答力価をもたらした。ペプチドに特異的なＩｇＧ力価は、フロイントアジュバントで製剤されたたとえ１２５μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いて免疫感作したマウスよりも高かった。
【００４７】
ＨＩＶ特異的免疫応答の望ましい特徴は、細胞性および体液性成分の間のバランスがとれている応答である。特定の免疫クロブリンアイソタイプのサブクラスが、Ｔｈ１またはＴｈ２のいずれかの優占（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｍｃｅ）に向かうＴヘルパー細胞のサブセットの型を歪める（ｓｋｅｗｉｎｇ）ことに相関していた。このような各Ｔヘルパー細胞サブセットが分泌するサイトカインは、ＩｇＧサブクラスの切り替えを支配する活性を証明した。ＩｇＧサブクラスの終点力価（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｔｉｔｅｒ）は、２次免疫感作から２週間後に集めたプール血清から測定した（表２）。Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）単独、あるいはＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかを配合して免疫感作したマウスは、数回の反復実験でＩｇＧサブクラス力価をもたらさないか、または低かった。ＩｇＧ３抗体はＥＬＩＳＡ法により検出できなかった。ＣＦＡで乳化したＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いて免疫感作し、そしてＩＦＡで追加免疫したマウスの群は、Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）に特異的なＩｇＧ１抗体を優占的に生じた。ＳＥ、ＭＰＬ（商標）ＳＥ、ＩＬ−１２を加えたＭＰＬ（商標）ＳＥ、またはＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥを含むペプチド製剤も、ＩｇＧ１抗体の高い力価を生じた。ＳＥを配合したワクチンの受容体は、有意なＩｇＧを繰り返し示したが、有意なＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ力価は示さなかった。ＭＰＬ（商標）のＳＥ製剤への包含は、増強されたＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）特異的抗体力価をもたらした。ＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦのいずれかをＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）に包含すると、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ抗体力価の比率にずれをもたらした。サイトカイン無しでは、ＭＰＬ（商標）ＳＥを配合したワクチンは、同様な力価のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを誘導した。ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦの両方がペプチドに特異的なＩｇＧ２ａの相対的血清濃度を上昇させた。さらにＭＰＬ（商標）ＳＥとＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせも、Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）に特異的なＩｇＧ２ａ抗体力価に有意な上昇を誘導した（ＭＰＬ（商標）ＳＥに比べて４７倍、そしてＳＥに比べて７４倍）。ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦをＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）ペプチドと一緒に免疫感作したマウスに生じた力価は、いかなるワクチン受容体群の中でも常に最高であった。
【００４８】
Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫感作したマウスからプールした血清から測定された高い抗体力価が、この群内の個々のマウスを表しているのかどうかを決定するために、この群内の個々のマウスをの力価を、フロイントアジュバントを配合したペプチドで免疫感作したマウスの力価と比較した（図１）。ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに関する個々の血清力価の平均は血清プールから測定された力価に類似することが決定された（データを示さず）。Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）とＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦとの同時配合（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、ＣＦＡ／ＩＦＡで免疫感作したマウスで誘導されたものよりも有意に高いＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価をもたらした。ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを配合したペプチドで免疫感作したすべてのマウスは、ＣＦＡ／ＩＦＡ製剤で免疫感作したマウスから測定されたものよりも高いＩｇＧ抗体の力価を生じた。このような結果は、ＭＰＬ（商標）ＳＥとＧＭ−ＣＳＦの組み合わせが、ペプチドに特異的な抗体の高い力価により測定されるような好ましい抗体応答プロフィール、および好ましいＩｇＧサブクラスの分布を生成することを示した。この製剤は使用する任意のワクチン製剤に最高のＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）特異的力価を日常的に誘導した。
【００４９】
水性ＭＰＬ（商標）、ＳＥまたはＭＰＬ（商標）ＳＥと一緒に配合したＧＭ−ＣＳＦを免疫感作したマウスの抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）ＩｇＧ力価の比較を行い、アジュバント補給剤としてのＧＭ−ＣＳＦの効果を測定した（図２）。この結果はＭＰＬ（商標）ＳＥとＧＭ−ＣＳＦおよびペプチドとの組み合わせが、高い力価の抗体の誘導における特定の態様に独特であることを示唆している。ＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）は、ＣＦＡ／ＩＦＡに匹敵する力価を誘導した。すなわち、ＭＰＬ（商標）およびＧＭ−ＣＳＦの免疫増強特性は、ＭＰＬ（商標）が水性状態であるか、または安定なエマルション状態のいずれかである場合に、一緒に配合した時に相乗的となる。
【００５０】
次にＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）特異的抗体力安定を、２次免疫感作から４週間後のマウスから得た膣洗浄液中で測定した（表３）。ＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスは、ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の両方に高い力価を生じた。他の製剤を用いて免疫感作したマウスから得た膣洗浄液中の抗体力価は、日常的に検出されなかった。膣洗浄液中のＩｇＧ対ＩｇＡの比率はＩｇＧに傾くので、そしてｓＩｇＡは測定されなかったので、膣洗浄液中で検出されたＩｇＡ抗体が粘膜組織で局所的に合成されると結論することはできない。実際に、検出されたＩｇＡおよびＩｇＧ力価は、膣の粘膜から遠くに位置する形質膜から分泌された浸出した免疫グロブリンの結果らしい。
【００５１】
このような結果から、ＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦのいずれかと組み合わせてＭＰＬ（商標）ＳＥを配合したＨＩＶペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で免疫感作したマウスは、高力価のペプチド特異的血清を有することが証明された。
【００５２】
これらの抗体力価が機能的に効果的であるかどうかを評価するために、ＨＩＶの研究室適応株により血清をインビトロで細胞の感染を阻害する抗体の能力について分析した。このアッセイは適当なＨＩＶ株で感染させた細胞からの培養上清に生成するウイルスの逆転写活性を測定した。ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦ、またはＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＩＬ−１２を用いて免疫感作したマウスに由来する血清は、有意にウイルスの感染性を低下させた（図３）。最大のウイルス逆転写酵素単位は、９，４８１から１０，４１１の範囲であった。その製剤を用いて免疫感作したマウスからの血清はウイルスの複製を阻害した。わずか１／２０のウイルス希釈でも、Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）と一緒にＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫感作したマウスからの血清は、ウイルスの複製を約５０％まで阻害した。この製剤の血清中和力価は、ＭＰＬ（商標）ＳＥ、ＩＬ−１２およびＨＩＶペプチド製剤を用いて免疫感作したマウスから得た血清に関する７１に比べると、１６００より大きくなると決定された。
【００５３】
これらの群のマウスからの血清の抗Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）力価は、ＣＦＡおよびＩＦＡでのマウスの免疫感作を通して誘導されたものと同様であった（幾分高く作用した）。ＣＦＡ／ＩＦＡで乳化したＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いて免疫感作したマウスの血清は、このアッセイにおいてＨＩＶの中和を示さなかった。ペプチドおよびアジュバントとしてＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥの組み合わせ物で免疫感作したマウスの血清は、他のどの血清よりも大きな中和活性を示した。均等な希釈で、ＧＭ−ＣＳＦおよびＨＩＶペプチドを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスの血清は、他のワクチン製剤の受容体からの血清よりも高いウイルス濃度を中和した。
【００５４】
次に培養におけるＨＩＶペプチドに特異的な脾臓細胞増殖を測定した。Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）に対する細胞応答性の測定のように、脾臓細胞をペプチドまたは対象タンパク質をインビトロで培養した。アッセイは３Ｈ−チミジンの分割している細胞のＤＮＡへの取り込みを測定した（表４）。アジュバント無しで免疫感作したマウスに由来する脾臓細胞とは異なり、ＳＥを用いて配合したＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で免疫感作したマウスに由来する脾臓細胞は、ペプチドに応答して激しく増殖した。ワクチン受容体からの脾臓細胞は、培養で無関係な抗原（リゾチーム）に対して応答しないか、または抗原刺激はなかった。すべての群がマイトジェンであるＣｏｎＡを用いた刺激に同様に応答した。ほとんどのグループ内で、抗原−特異的な用量依存的増殖応答があった。すべての３種類のペプチド用量で、最高度の増殖は、ＭＰＬ（商標）ＳＥを同時に混合したＧＭ−ＣＳＦを用いて免疫感作したマウス群について測定された。最低の増殖応答は、ＣＦＡ／ＩＦＡまたはＨＩＶペプチドを加えたＩＬ−１２配合ワクチンで免疫感作したマウス群の脾臓細胞から測定された。ペプチドと、ＳＥまたはＧＭ−ＣＳＦのいずれかで免疫感作したマウスの脾臓細胞は、培養で同様なレベルのチミジンの取り込んだ。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦと一緒にＭＰＬ（商標）ＳＥを用いたＨＩＶペプチドの混合製剤が、マウスの脾臓細胞に、抗原のインビトロ提示に応答して増殖するための最高の潜在的能力を提供することを示す。
【００５５】
培養した脾臓細胞は、それらが培養上清にサイトカインＩＬ−４（表５）およびインターフェロンガンマ（表６）を分泌する潜在的能力について調査された。これらのサイトカインは、抗原またはマイトジェンでインビトロ刺激してから３日および６日後に回収した培養上清中で測定した。ＩＬ−４の測定、Ｔヘルパー２型に関連するサイトカインの測定では、すべての群が３日までにマイトジェンであるＣｏｎＡを用いた刺激に応答して検出できるレベルで生産したが、ＭＰＬ（商標）ＳＥまたはＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスだけがペプチドの刺激に応答してＩＬ−４を生産した。ＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で免疫感作したマウスだけが、脾臓細胞を刺激するために使用したすべての用量のペプチドで培養物に検出可能なレべルのＩＬ−４を分泌した。培養から６日までに、ＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥと一緒にペプチドで免疫感作したマウスからの脾臓細胞が、ＭＰＬ（商標）ＳＥ、ＩＬ−１２を加えたＭＰＬ（商標）ＳＥ、またはＳＥと一緒にペプチドで免疫感作したマウスから検出されたレベルよりも高いＩＬ−４を分泌した。ＩＬ−４のレベルはＣｏｎＡを用いた培養物中のこのような細胞の刺激を通して誘導されるレベルよりもさらに高かった。ＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスから培養した脾臓細胞も、培養物に検出可能なレベルのＩＬ−５（別のＴヘルパー２型サイトカイン（示さず））を、６日のＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）での刺激に応答して分泌した。他の群からの脾臓細胞はこれらの培養物中に検出可能なＩＬ−５を生産しなかった。
【００５６】
ＣｏｎＡを含む培養での刺激から３日の応答で、すべての群のマウスからの脾臓細胞が、検出可能なレベルのインターフェロン−ガンマを培養物中に分泌した（表６）。ＭＰＬ（商標）ＳＥまたはＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスからの細胞だけが、３日のＨＩＶペプチドでの刺激に応答して検出可能なレベルのインターフェロン−ガンマを生産した。カルチー刺激の終わりの６日には、より高い濃度のインターフェロン−ガンマがＣｏｎＡおよびペプチドの両方に応答して観察された。中でもＭＰＬ（商標）ＳＥまたはＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスからの脾臓細胞の培養上清から測定されたインターフェロン−ガンマのレベルが興味深かった。このような２種類の受容体群からの脾臓細胞は、ＩＬ−１２を加えたＭＰＬ（商標）ＳＥまたはＳＥと一緒にペプチドで免疫感作したマウスからの脾臓細胞よりも培養上清中に顕著に高濃度のインターフェロン−ガンマを分泌した。
【００５７】
第１実験の結果は、ＭＰＬ（商標）を安定な水中油型エマルションに包含し、そして次いでエマルションをＨＩＶペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）およびＧＭ−ＣＳＦと混合することが中和抗体の誘導をもたらすことを示している。さらにＧＭ−ＣＳＦをＭＰＬ（商標）ＳＥおよびワクチン抗原と同時配合することにより、培養上清に分泌される上昇したレベルのＩＬ−４、ＩＬ−５およびインターフェロン−ガンマをもたらし、そして免疫感作する抗原を含む培養で刺激した脾臓細胞の増殖的応答を増強する。その製剤は調査した任意のワクチン製剤にも最高のＩｇＧ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ力価を誘導した。ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦをペプチドと一緒に組み合わせて免疫感作したマウスの群のみが、多数の繰り返し実験にわたり一貫して膣洗浄液中に検出可能なＩｇＧおよびＩｇＡ力価を有した。ＭＰＬ（商標）ＳＥ、ＩＬ−１２およびペプチドの組み合わせも、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２力価レベルの上昇、ウイルスの中和の上昇、脾臓細胞増殖の上昇およびＩＬ−４およびインターフェロン−ガンマの分泌をもたらした。
【００５８】
ＨＩＶペプチドを配合した１つのアジュバントによるマウスの免疫感作では、中和抗体を誘導する特性を含む免疫応答を生じなかった。
【００５９】
ＭＰＬ（商標）ＳＥまたは水性製剤としてＭＰＬ（商標）と一緒にＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いたマウスの免疫感作で、良好な抗体力価が誘導されることがしばしば観察された。しかしこのような製剤は、膣の抗体力価、中和抗体力価（または実験８で以下に記載する強力なＣＴＬ応答）を有する免疫応答を一貫して誘導しなかった。場合により、ペプチドを組み合わせたＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥは、膣洗浄液中にＩｇＡおよびＩｇＧの測定可能な力価を誘導した。幾つかの実験では、ワクチン製剤中のＭＰＬ（商標）にＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦのいずれかを加えることにより、ＣＦＡ／ＩＦＡで、またはサイトカインを含むか、または含まない任意のＭＰＬ（商標）ＳＥ製剤で免疫感作したマウスで生産された力価に類似する力価が生成された。この観察はＭＰＬ（商標）のＳＥ形がＨＩＶペプチドに特異的な高力価の抗血清に必要ないことを示唆している。ＳＥ賦形剤にＧＭ−ＣＳＦを加えることにより、ＳＥ単独またはＳＥおよびＩＬ−１２で免疫感作したマウスに比べて、ペプチドに特異的な力価の上昇が与えられた。しかし一般的には、良好なＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体力価の誘導は、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを含むペプチドの製剤に依存した。この製剤が、ＣＦＡ／ＩＦＡおよびペプチドのような他の製剤を用いた免疫感作を通して誘導される力価に類似するＩｇＧ力価を誘導したことは興味深い。ＧＭ−ＣＳＦを含むＭＰＬ（商標）およびペプチドとの組み合わせが、高い力価の中和抗体およびＣＴＬの両方を誘導を示す唯一の製剤であった（実験８を参照にされたい）。ＩＬ−１２をＭＰＬ（商標）ＳＥおよびペプチドに包含することも、好ましい免疫応答プロフィールを誘導した。この結果は、サイトカインＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２を同時配合したＭＰＬ（商標）ＳＥが、ＣＦＡおよびＩＦＡでの免疫感作と比較して抗体の応答に質的な差異を付加したことを示していた。この差異はＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの上昇レベルに起因すると考えられる。
【００６０】
第２実験では、わずかな変更を加えて第１のＢａｌｂ／ｃ−ＨＩＶペプチド実験のプロトコールに従った。サイトカインを含むまたは含まないＭＰＬ（商標）も水性状態で投与した。
【００６１】
アジュバントを含まないＨＩＶペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いたＢａｌｂ／ｃマウスの免疫感作は、有意な抗体力価を誘導しなかった。対照的に、種々のアジュバント／サイトカインの組み合わせを含むペプチド抗原の製剤は、２回の免疫感作後に高い抗体力価の誘導をもたらした。
【００６２】
ペプチドおよびＩＬ−１２で、またはＳＥのみでの免疫感作は、アジュバントを含まずに誘導した力価と区別できない力価をもたらした（表７）。ＧＭ−ＣＳＦを同時配合したペプチドの受容体は、力価にゆるやかな上昇を有した。ＣＦＡ／ＩＦＡを含むワクチンの受容体と比較して、ミクロ流動化したＭＰＬ（商標）ＳＥは、同様にペプチドに特異的な力価の生成を示した。ＣＦＡ／ＩＦＡワクチンの受容体と比較して、ＭＰＬ（商標）ＳＥは高レベルのペプチド特異的ＩｇＧ２ａを誘導した。使用した免疫感作計画が観察される抗体力価に影響を及ぼしたのかもしれない。しかしペプチドを配合したＭＰＬ（商標）（水性）を用いたマウスの免疫感作は、高力価のペプチド特異的抗体を誘導した。この製剤へのＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２の添加は、１０６よりも大きな力価の上昇をもたらした。すなわちＨＩＶペプチドとＭＰＬ（商標）およびサイトカインＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦの組み合わせにより、このペプチドに特異的な高力価の抗体が誘導された。
【００６３】
ペプチドとＭＰＬ（商標）およびＩＬ−１２、またはＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦのいずれかで免疫感作したマウスの群のみが、膣洗浄から得た液体から検出された比較的高力価の抗体を発生した（表８）。実際には、ペプチドとＭＰＬ（商標）およびＩＬ−１２を免疫感作したマウスの群だけがペプチドに特異的なＩｇＡを生産した。
【００６４】
培養中の脾臓細胞の増殖能力は、ペプチドでのインビトロ刺激に応答したチミジンの取り込みを通して測定した。表９のデータは増殖を標準化するために、ＣｏｎＡを用いた刺激を通して測定された最大の増殖に対して増殖を標準化した。ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかを含むＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウス、ならびにＧＭ−ＣＳＦのみで免疫感作したマウスからの脾臓細胞は、ペプチドに関係する低レベルの増殖を示した。対照的に、ペプチドをＭＰＬ（商標）およびＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて免疫感作したマウスからの脾臓細胞は、有意な増殖を示した。
【００６５】
インビトロで培養した脾臓細胞からのサイトカイン生産も測定した。ＩＬ−４については、ＭＰＬ（商標）ＳＥをＧＭ−ＣＳＦおよびＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）と組み合わせて免疫感作したマウスだけが、ペプチドでの刺激に応答して良好なレベルのＩＬ−４を分泌した（表１０）。インターフェロン−ガンマについては、ＭＰＬ（商標）ＳＥとＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれか、または水性ＭＰＬ（商標）とＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかで免疫感作したマウスが、容易に検出可能なレベルでこのサイトカインを培養上清中に生産した（表１１）。
【００６６】
すなわち、サイトカインＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２とＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥとの組み合わせが、ペプチド抗原に対して特異的な高力価の抗体を誘導した。力価はペプチドおよびＣＦＡ／ＩＦＡでのマウスの免疫感作を通して誘導された力価と同様であった。このデータは、これらの組み合わせが培養で準備した脾臓細胞に最高の増殖応答、およびペプチドの刺激に応答して最高レベルのインターフェロン−ガンマを分泌する脾臓細胞の樹立された集合も誘導したことを示す。
【００６７】
この第２実験の結果は、Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）とＭＰＬ（商標）およびサイトカインＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２との同時配合が、ペプチドおよびＣＦＡで免疫感作され、そしてペプチドおよびＩＦＡで追加免疫感作されたマウスで誘導された免疫応答プロフィールと同様か、より良いプロフィールを誘導することを示している。
【００６８】
第２免疫感作から２週間後の注入部位の組織学的評価（示さず）は、ミクロ流動化したＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスは単核細胞の真皮への浸潤を発生しないか、または維持しなかったことを示した。ヘマトキシリン／エオシン染色した組織は、アジュバント無しの受容体から調製した組織と同様に見えた。対照的に、アジュバント（油中水型のエマルション）としてＣＦＡおよびＩＦＡで免疫感作したＢａｌｂ／ｃマウスは、この領域に単核細胞の大きな蓄積を有した。ＧＭ−ＣＳＦおよびペプチドと一緒のＭＰＬ（商標）ＳＥの受容体は、ＧＭ−ＣＳＦを含まないＭＰＬ（商標）ＳＥ受容体と比べて、単核細胞の顕著ではあるが 周辺部の上昇を示した。ＧＭ−ＣＳＦおよびペプチドのみで免疫感作したマウスに由来する組織は、調査しなかった。
【００６９】
第２実験のプロトコールを、Ｂａｌｂ／ｃマウスの代わりにＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを用いて第３実験で行った。Ｓｗｉｓｓ−ＷｅｂｓｔｅｒマウスはＨＩＶ抗原を用いたアジュバント効果を決定するために使用し、ここでＭＨＣ−拘束ヘルパーＴ細胞エピトープは免疫応答に影響を及ぼさない。Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスはマウスの異系交配種であり；厳密な細胞実験は行わなかった。この実験では、相互の（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）抗−ＨＩＶペプチドＩｇＧの終点力価および膣洗浄終点相互終点ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価を測定しただけであった。表１２および１４に見られるように、応答プロフィールを第１実験および第２実験で測定したＢａｌｂ／ｃマウスから得たプロフィールと比較した。
【００７０】
第４実験は、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用してわずかな変更を加えて第２実験のプロトコールに従った。表１４に示すように、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかと一緒のＭＰＬ（商標）のアジュバント製剤は、ＭＰＬ（商標）単独より顕著に高いＩｇＧ ＧＭＴ応答を誘導した。表１５に示すように、ＧＭ−ＣＳＦと一緒のＭＰＬ（商標）ＳＥのアジュバント製剤は、有意なＩｇＧ２ｂサブクラス応答を誘導した。ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかと一緒のＭＰＬ（商標）のアジュバント製剤は、ＭＰＬ（商標）単独より顕著に高いＩｇＧ２ａサブクラス応答を誘導したが、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかと一緒のＭＰＬ（商標）ＳＥの製剤は、ＭＰＬ（商標）単独より高いＩｇＧ２ａサブクラス応答を誘導した。表１６に示すようにＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかと一緒のＭＰＬ（商標）のアジュバント製剤は、ＭＰＬ（商標）単独より顕著に高いＩｇＧ力価を膣洗浄液中に誘導した。最後に図４に示すようにＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかと一緒のＭＰＬ（商標）のアジュバント製剤、ならびにＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２のいずれかと一緒のＭＰＬ（商標）ＳＥ製剤は、ＭＰＬ（商標）単独またはＭＰＬ（商標）ＳＥ単独よりもそれぞれ大きな脾臓細胞の増殖を示した。
【００７１】
第５実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用してわずかな変更を加えて第２実験のプロトコールに従った；ＩＬ−１２はアジュバント製剤に含めなかった。表１７に示すようにＭＰＬ（商標）およびＧＭ−ＣＳＦの両方を含むアジュバント製剤は、ＭＰＬ（商標）単独よりも顕著に高いＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ応答を誘導した。さらにＭＰＬ（商標）およびＧＭ−ＣＳＦの両方を含むアジュバント製剤は、ＭＰＬ（商標）単独よりもすべてのＩｇＧサブクラスついて顕著に高い応答を誘導した。
【００７２】
第６実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用してわずかな変更を加えて第２実験のプロトコールに従った；ＩＬ−１２はアジュバント製剤に含めなかった。アミノ酸位１７のシステインの存在から、ＨＩＶペプチドは４０アミノ酸長であった。表１８に示すように、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦの両方を含むアジュバント製剤は、ＭＰＬ（商標）単独よりもすべてのＩｇＧサブクラスついて有意に高い応答、およびＭＰＬ（商標）ＳＥ単独よりもすべのサブクラスについて顕著に高い応答を誘導した。
【００７３】
第７実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用してわずかな変更を加えて第６実験のプロトコールに従った；ＩＬ−１２はアジュバント製剤に含めなかった。表１９に示すように、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦの両方を含むアジュバント製剤は、ＭＰＬ（商標）ＳＥ単独よりもすべてのＩｇＧサブクラスついて顕著に高い応答を誘導し、そしてＭＰＬ（商標）およびＧＭ−ＣＳＦの両方を含むアジュバント製剤は、ＭＰＬ（商標）単独よりもすべてのＩｇＧサブクラスついて顕著に高い応答を誘導した。
【００７４】
第８実験では、機能的な細胞性免疫の測定として、マルチエピトープペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）を一緒に配合したＭＰＬ（商標）ＳＥ、またはＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスの脾臓細胞がＨＩＶＭＮに特異的なＣＴＬ応答を生成する能力を評価した。
【００７５】
図５に示すように、ＭＰＬ（商標）ＳＥ、またはＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥで免疫感作したマウスの脾臓細胞は、非標識またはＩＩＩＢエピトープを用いてパルス−標識（ｐｕｌｓｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ）したいずれかの標的細胞に対して低い活性を示した。ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを用いて配合したＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）で免疫感作したマウスからの脾臓細胞は、１回の免疫感作後に良好なＨＩＶＭＮに特異的なＣＴＬ活性を誘導した。ＨＩＶＭＮに特異的なＣＴＬが媒介する標的細胞の溶解は、２次免疫感作から７日間経過した後に著しく増強された（図５）。別の実験で、アジュバント無しで免疫感作したマウスはＣＴＬ応答を誘導しなかった。水性ＭＰＬ（商標）およびペプチドを用いて免疫感作したマウスは、低い（＜３０％）ペプチド特異的ＣＴＬ応答を生成した。
【００７６】
ＨＩＶに対する免疫原性組成物の潜在的効力の評価の１つの難点は、ＨＩＶに感染した非ヒト霊長類がＡＩＤＳ−様の症状を発症しないことである。すなわち有効な動物モデルがＨＩＶにより引き起こされるヒトの症状を模倣しない。幸いにもＨＩＶに極めて関連しているスミアン免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）で感染した非ヒト霊長類が、ＡＩＤＳ−様症状を発症する。
【００７７】
これはＳＩＶ抗原の非ヒト霊長類での評価を可能とする。ＳＩＶ抗原はタンパク質、該タンパク質に由来するポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントでよい。タンパク質はｇｐ４１、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０のような糖タンパク質でよい。あるいはタンパク質はｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｎｅｆまたはｅｎｖのような遺伝子によりコードされるタンパク質でよい。そのようなタンパク質に由来するペプチドは少なくとも１つの抗原性決定基（エピトープ）を、少なくとも６個のアミノ酸長で含むだろう。
【００７８】
ＨＩＶに類似して、マルチエピトープＳＩＶペプチドを非ヒト霊長類に使用する。この実験は、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦと組み合わせた種々のペプチドがＣＴＬ応答を誘導することができるかどうかを評価するために行った。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）を、０、４、８および１８週にＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦと以下の３組のペプチドのいずれかを組み合わせて皮下に免疫感作した（表２０を参照にれたい）：
（１）各ペプチドは以下のＭａｍｕ Ａ★０１拘束ＣＴＬエピトープを含む：
【００７９】
【表１１】
2004504260.tif 000005
【００８０】
（２）あるいはこのような３種の各ペプチドを、以下の配列を有する無差別なＴ−ヘルパーエピトープと連結した：
【００８１】
【表１２】
2004504260.tif 000006
【００８２】
すなわち、３つのペプチドは以下の配列を有した：
【００８３】
【表１３】
2004504260.tif 000007
【００８４】
ヘパリン処理した血液を２週間毎に集め、そして末梢血の単核細胞をＣＴＬについて５１Ｃｒ放出アッセイ、新鮮な末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）の四量体染色および培養したＰＢＭＣの四量体染色により分析した。新鮮なＰＢＭＣの四量体染色および５１Ｃｒ放出による細胞溶解的致死はいかなる活性も明らかにしなかった。しかしのＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを用いて配合したＭａｍｕＡ★０１拘束Ｔｈ／ＣＴＬペプチドカクテルでのアカゲザル免疫感作は、四二体陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出をもたらした。表２１〜２４に与える結果は、各ペプチドで１１日間培養したＰＢＭＣで検出されたパーセント陽性、四量体陽性ＣＤ８＋（表２１〜２３）またはＣＤ４＋（表２４）Ｔ細胞として示す。
【００８５】
総じて、Ｔｈエピトープをもつ（Ｒｈ ５５、Ｒｈ１４２）またはもたない（Ｒｈ７３、Ｒｈ８０）いずれかのＣＴＬエピトープで免疫感作したすべての４匹のＭａｍｕＡ★０１陽性動物は、ｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖに特異的なＣＤ８陽性四量体陽性細胞を示した。予想通り、四量体陽性ＣＤ８細胞はＭａｍｕＡ★０１陰性動物（Ｒｈ１、Ｒｈ４７）で検出された。ＳＩＶ ｇａｇおよびｅｎｖ特異的免疫応答は初回免疫後に見られたが、ｐｏｌ特異的四量体陽性は、追加免疫後に観察された。１８週目の最終追加免疫投与がさらに応答を上げなかったので、表２１〜２４のデータには１４週以降を与えていない。
【００８６】
まとめると、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびヒトＧＭ−ＣＳＦで免疫増強したＭａｍｕＡ★０１拘束Ｔｈ／ＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ ＣＴＬエピトープペプチドカクテルを用いてアカゲザルを免疫感作すると、選択的かつ特異的な四量体アッセイにより証明される細胞応答を誘導した。
【００８７】
ＰＩＢタンパク質として知られている淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のポーリンＢタンパク質も、組換え的に発現し（４２、これは引用により本明細書に編入する）、そして淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）により引き起こされる感染の予防または処置に有望な抗原である。
【００８８】
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のポーリンＢタンパク質の修飾した変異体（このアミノ末端の１６アミノ酸はフィージに由来し、続いてポーリンＢタンパク質の成熟形が続く）を一緒に含むＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２の加えたＭＰＬ（商標）（ＳＥを含むかまたは含まない）を、ＭＰＬ（商標）（ＳＥを含むかまたは含まない）単独と比較するために、一連の実験を行った。結果のまとめは与えない。
【００８９】
第１実験では、組換えポーリンＢタンパク質で臀部の皮下に免疫感作したＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔａｒマウスが、抗原−特異的抗体力価を生成し、これはポーリンＢタンパク質が実現可能な候補抗原であることを示している。ＧＭ−ＣＳＦをＭＰＬ（商標）およびポーリンＢタンパク質に加えると、ＭＰＬ（商標）およびポーリンＢタンパク質の受容体に比べて上昇した血清力価のＩｇＧおよびＩｇＧ２ａをもたらした（表２５および２６を参照にされたい）。
【００９０】
第２実験では、ＩＬ−１２およびＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥを加えたポーリンＢタンパク質で臀部の皮下に免疫感作したＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔａｒマウスが、ＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥを加えたポーリンＢタンパク質の受容体に比べて高い抗原−特異的抗体（特にＩｇＧ）を誘導した。高い力価は初回および２次免疫感作後に観察された。ＩＬ−１２を製剤に含めると、膣洗浄液中で測定されるＩｇＧ力価に約１０倍の上昇をもたらした（表２７）。
【００９１】
自然な二量体形のヒト呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の精製した天然の融合（Ｆ）タンパク質は、ＲＳＶにより引き起こされる感染の予防に有望な候補抗原である（４３、引用により本明細書に編入する）。
【００９２】
ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２を加えたＭＰＬ（商標）（ＳＥを含むかまたは含まない）を、ＲＳＶの精製した天然のＦタンパク質を一緒に含む各ＭＰＬ（商標）（ＳＥを含むかまたは含まない）、リン酸アルミニウムまたはＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（ＳＥを含むかまたは含まない）それぞれと比較するために、一連の実験を行った。結果のまとめを今、与える。
【００９３】
第１実験では、天然のＲＳＶ Ｆタンパク質を筋肉内に免疫感作したＢａｌｂ／ｃマウスは、抗原特異的な抗体力価を生成し、Ｆタンパク質が実現可能な候補抗原であることを示した。ＧＭ−ＣＳＦをＭＰＬ（商標）に加えると、初回および２次免疫感作後の両方でＦタンパク質に対してＭＰＬ（商標）単独よりも高い終点力価を誘導し（表２８を参照にされたい）、そしてまた脾臓細胞のインビトロ刺激に対応してＭＰＬ（商標）単独よりも高い増強された細胞応答を誘導した（表２９を参照にされたい）。ＧＭ−ＣＳＦをＭＰＬ（商標）ＳＥを加えると、Ｆタンパク質に対してＭＰＬ（商標）ＳＥ単独よりも上昇した初回ＩｇＧ応答をもたらした（表２８を参照にされたい）。
【００９４】
第２実験では、第１実験を繰り返した。ＧＭ−ＣＳＦをＭＰＬ（商標）に加えると、初回および２次免疫感作後の両方でＦタンパク質に対してＭＰＬ（商標）単独よりも高い終点力価を誘導した（表３０を参照にされたい）。ＧＭ−ＣＳＦをＭＰＬ（商標）ＳＥに加えると、初回免疫感作後にＦタンパク質に対してＭＰＬ（商標）ＳＥ単独よりも高い終点力価を誘導した（表３０を参照にされたい）。ＧＭ−ＣＳＦをＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥを加えたＦタンパク質の製剤に加えると、免疫感作したマウスの脾臓細胞から測定されるように、ＧＭ−ＣＳＦを欠く製剤により誘導される活性より高い割合のＲＳＶに特異的な脾臓細胞ＣＴＬ活性が誘導された（表３１を参照にされたい）。
【００９５】
第３実験は、ＧＭ−ＣＳＦをＩＬ−１２に代えた。ＩＬ−１２をＭＰＬ（商標）と同時配合すると、ＭＰＬ（商標）のみを含むＦタンパク質の送達に比べて、初回免疫感作後により高いＩｇＧの力価を誘導した（表３２を参照にされたい）。しかしＩＬ−１２をＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥを加えても、エフェクター細胞のインビトロ刺激後に測定されるＲＳＶに特異的なＣＴＬ活性に対して効果がなかった（表３３を参照にされたい）。
【００９６】
ＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）（ＳＥを含むかまたは含まない）を、インフルエンザ ウイルス ＮＰ（ヌクレオキャプシド）タンパク質を一緒に含むＭＰＬ（商標）（ＳＥを含むかまたは含まない）それぞれと比較するために、１つの実験を行った。抗体力価を測定するための実験の行うにはＮＰの量が不十分であった。アジュバントを含む、または含まないＮＰペプチドで免疫感作したマウスを、最終免疫感作から１４日後の抗原刺激に対する脾臓細胞応答について分析した。ＧＭ−ＣＳＦをＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥを含む製剤に包含することは、ＣＴＬ活性に顕著な減少をもたらした（データは示さず）。
【００９７】
なぜ異常な結果が得られたのかは不明である。このアッセイの実施において、技術的問題があったのかもしれない。
【００９８】
本発明の抗原性組成物は、病原性ウイルス、細菌菌・カビまたは寄生体から選択された抗原、ならびにサイトカインまたはリンホカイン、特にＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２と組み合わせた免疫増強に効果的な量のＭＰＬ（商標）（水性状または安定なエマルション状で）を含んで成る抗原性組成物の投与後に、脊椎動物宿主の抗体応答および細胞性免疫を向上させることにより、免疫応答を調節する。免疫調節活性を有することが示された他のサイトカインまタはリンホカインは、限定するわけではないがインターロイキン１−アルファ、１−ベータ、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８、インターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマ、顆粒球コロニー刺激因子および腫瘍壊死因子アルファおよびベータを含む。
【００９９】
上記サイトカインまたはリンホカインのアゴニストまたはアンタゴニストも、本発明の範囲内にある。本明細書で使用するように、用語「アゴニスト」は、該サイトカインまたはリンホカインの活性を、または同様に機能を増強する分子を意味する。そのようなアゴニストの例は、該サイトカインまたはリンホカインの模造物である。本明細書で使用するように、用語「アンタゴニスト」は該サイトカインまたはリンホカインの活性を抑制または防止する分子を意味する。そのようなアンタゴニストの例は、可溶性ＩＬ−４レセプターおよび可溶性ＴＮＦレセプターである。
【０１００】
本明細書で使用するように、用語「効果的な免疫増強量」とは、本明細書に記載するアジュバントの組み合わせの用量を意味し、この用量は脊椎動物宿主に上昇した免疫応答を誘導するために適当である。詳細な投薬用量は、宿主の年齢、体重および医学的状態、ならびに投与法および抗原に依存する。好適な態様では、アジュバントの組み合わせは、１〜１００μｇ／用量の範囲でＭＰＬ（商標）を使用することである。適当な用量は当業者により容易に決定される。本発明の抗原性組成物は、免疫学的に許容される希釈剤またはキャリアーと常法により混合して、注入可能な液体溶液または懸濁液を調製することができる。
【０１０１】
本発明の抗原性組成物は、限定するわけではないが、鼻内、経口、膣内、直腸内、非経口、皮内、経皮（例えば国際公開第９８／２０７３４号明細書（４４）を参照にされたい、これは引用により本明細書に編入する）、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内を含む様々な経路によりヒトまたは非ヒト脊椎動物に投与される。抗原性組成物の抗原性成分（１つまたは複数）は、部分的には抗原の同一性、ならびに宿主の年齢、体重および医学的状態、ならびに投与法に大変依存するだろう。ここでも、適当な用量は当業者により容易に決定される。必要ではないが、抗原およびアジュバントの組み合わせを同時に投与することが好ましい。抗原性組成物の投与回数および投薬計画も、当業者により容易に決定される。場合により、アジュバントの組み合わせのアジュバント特性は、必要な投与回数または投薬計画のタイムコースを下げることができる。
【０１０２】
本発明のアジュバントの組み合わせは、限定するわけではないがヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染するウイルス、細菌、菌・カビもしくは寄生体微生物から、またはガン細胞もしくは腫瘍細胞を含む広い範囲の様々な病原性微生物に由来する広い種々の抗原を含む抗原性組成物に使用するために適している。抗原はタンパク質に由来するペプチドまたはポリペプチド、ならびに任意の以下のフラグメントを含んで成ることができる：多糖、タンパク質、ポリ−またはオリゴヌクレオチド、ガンまたは腫瘍細胞、アレルゲン、アミロイドペプチドタンパク質、または他の高分子成分。場合により、１以上の抗原をこの抗原性組成物に含む。
【０１０３】
本発明のアジュバントの組み合わせを含む望ましいウイルスワクチンは、限定するわけではないがヒト免疫不全症ウイルス、シミアン免疫不全症ウイルス、呼吸合胞体ウイルス、１〜３型パラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、鳥類感染性嚢性疾患ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マルク病ウイルス、ブタ呼吸および再生産症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または処置を対象とすることを含む。
【０１０４】
本発明のアジュバントの組み合わせを含む望ましい細菌性ワクチンは、限定するわけではないがインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（型に分類できる、またはできない両方）、ヘモフィルス ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、モラクセラ カターリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス アガラクティア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、トラコーマ クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア ニューモニア（Ｃｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥［型］結核菌細胞内複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア バーグトルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス プローロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラスマ ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）により引き起こされる疾患の予防および／または処置を対象とすることも含む。
【０１０５】
本発明のアジュバントの組み合わせを含む菌・カビ病原体に対して望ましいワクチンは、限定するわけではないがアスルペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）により引き起こされる疾患の予防および／または処置を対象とすることも含む。
【０１０６】
本発明のアジュバントの組み合わせを含む寄生体に対して望ましいワクチンは、限定するわけではないがリーシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｏｍｏｎａｓ）、トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスティスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）により引き起こされる疾患の予防および／または処置を対象とすることも含む。
【０１０７】
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、脊椎宿主に治療的または予防的抗ガン効果を誘導するための望ましいワクチンは、限定するわけではないが前立腺特異的抗原、癌胎児性抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３を含むガン抗原または腫瘍関連抗原の利用を含む。
【０１０８】
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、脊椎宿主におけるアレルゲンに対する応答を調節するための望ましいワクチンは、アレルゲンまたはそれらのフラグメントを含むワクチンである。そのようなアレルゲンの例は、米国特許第５，８３０，８７７号明細書（４５）および国際公開第９９／５１２５９号明細書（４６）に記載され（これらは引用により本明細書に編入する）、そして花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、菌・カビの胞子および薬剤（ペニシリンのような）を含む。ワクチンはアレルギー反応の原因であると知られているＩｇＥ抗体の生産を妨害する。
【０１０９】
本発明のアジュバントの組み合わせを含む、脊椎宿主におけるアミロイド沈着を特徴とする疾患を予防または処置するために望ましいワクチンは、アミロイドペプチドタンパク質（ＡＰＰ）の部分を含むワクチンである。この疾患はアルツハイマー疾患、アミロイドーシスまたはアミロイド形成疾患と様々に呼ばれている。β−アミロイドペプチド（Ａβペプチドとも呼ばれる）は、ＡＰＰの４２アミノ酸フラグメントであり、これはＡＰＰのβおよびγ分泌酵素による処理により生成され、そして以下の配列を有する：
【０１１０】
【表１４】
2004504260.tif 000008
【０１１１】
患者の中にはアミロイドの沈着が凝集したＡβペプチドの状態をとる者もいる。驚くべきことには、今、単離されたＡβペプチドの投与が脊椎動物宿主においてアミロイド沈着のＡβペプチド成分に対する免疫応答を誘導することが見いだされた（４７）。すなわち本発明のワクチンは、Ａβペプチド、ならびにＡβペプチドのフラグメントおよびＡβペプチドに対する抗体またはそれらの断片を加えた本発明アジュバントの組み合わせを含む。そのようなＡβペプチドの１つのフラグメントは、以下の配列を有する２８アミノ酸ペプチドである（４８）：
【０１１２】
【表１５】
2004504260.tif 000009
【０１１３】
ＨＩＶおよびＳＩＶの場合、抗原性組成物は少なくとも１つのタンパク質、該タンパク質から誘導されるポリペプチド、ペプチドまたはフラグメントを含んで成る。場合により、多数のＨＩＶまたはＳＩＶタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはフラグメントを抗原性組成物に含んでもよい。
【０１１４】
本発明のアジュバントの混合製剤は、ポリヌクレオチドワクチン（ＤＮＡワクチンとしても知られている）にアジュバントとして包含するためにも適当である。そのようなワクチンはさらにブピバカインのような促進剤を含んでもよい（米国特許第５，５９３，９７２号明細書（４９）を参照にされたい。これは引用により本明細書に編入する）。
【０１１５】
本発明をより良く理解するために、以下の実施例を説明する。実施例は具体的に説明することのみを目的とし、そして本発明の範囲を限定するとは解釈されない。
【０１１６】
【実施例】
実施例
実験１
ＨＩＶペプチドおよび種々のアジュバントを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの免疫感作
実施例１
材料および方法
動物
７〜９週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを、タコニックファーム社（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍ Ｉｎｃ．）（ゲルマンタウン、ニュージャージー州）から購入した。すべてのマウスは研究用動物の取り扱いの認定について、アメリカの委員会により認定された設備に収容した。マウスは実験開始前に１週間、収容設備に慣らした。
ペプチド
マルチエピトープＨＩＶ−１−ＭＮペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）の配列は以下の通りである：
【０１１７】
【表１６】
2004504260.tif 000010
【０１１８】
このペプチドは既に記載され（２８、２９）、そしてマウスおよびヒトの両方に主要な中和決定基であり、そしてＢａｌｂ／ｃマウスのＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される部位である、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞応答を誘起するＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ＭＮに由来する配列を含む。このペプチドはＲ．Ｓｃｅａｒｃｅ博士（デューク大学、ダラム、ノースキャロライナ州）により提供された。ＣＴＬ分析のために、ＨＩＶ−１−ＩＩＩＢのＶ３ループ内のＣＴＬエピトープに相当するペプチド（Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｃａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ（配列番号１２）、Ｈ−２Ｄｄ拘束）またはＨＩＶ−１−ＭＮ（Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ（配列番号１３）、Ｈ−２Ｄｄ拘束）を、ゲノシス バイオテクノロジーズ社（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）から購入した。（ウッドランド、テキサス州）。ペプチドは使用前に、滅菌水に溶解し、そして適当なバッファーまたは細胞培養培地に希釈した。
アジュバント
すべてのＭＰＬ（商標）を含有するアジュバント調製物は、リビ イムノケム リサーチ社（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，）（ハミルトン、マサチューセッツ州）から得た。ＭＰＬ（商標）はトリエタノールアミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、モンタナ州）を使用して水性製剤として調製した。可溶化後、ＭＰＬ（商標）は製造元の使用説明書に従い超音波処理して、滅菌濾過した乳光／透明溶液を生成した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは予め配合されたスクアレンを基材とした水中油（１〜２％油）エマルションとして提供され、０〜２５００μｇ／ｍｌのＭＰＬ（商標）の濃度範囲であった。リン酸アルミニウムは研究室で調製した。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）および不完全アジュバント（ＩＦＡ）は、ミシガン州、デトロイトのデフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入した。Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ペプチドおよびフロイントアジュバントは、２つの連結シリンジを使用して１：１の比率に乳化した。組換え的に発現したネズミＩＬ−１２は、ジォネティック　インスティテュート（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）により提供された。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは、イムネックス（Ｉｍｍｕｎｅｘ）（シアトル、ワシントン州）により供給され、Ｒ＆Ｄ システムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）により提供されたか、またはバイオソース インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（キャマリロ、カリフォルニア州）からキャリアーを含まない凍結粉末として購入した。
免疫感作
マウスは総容量０．２ｍｌを尾の両側に均等に分割して、臀部の皮下に免疫感作した。免疫感作は以下に示すように時間間隔を変動させて投与した。抗原およびサイトカインは、リン酸緩衝化生理食塩水に希釈して適当な濃度とし、そして免疫感作から１６時間以内に滅菌条件下でアジュバントに配合した。ワクチンは穏やかに撹拌しながら混合し、そして４℃に保存した。製剤は免疫感作直前にボルテックスで混合した。
サンプルの収集
動物は初回免疫感作前および示した時点で採血した。血清は個々のマウスから分析するか、または群内のマウスからのプールから分析した。膣洗浄は安楽死させたマウスについて行い、抗体レベルを評価した。これは２００：１ピペットを使用して、メスのマウスの膣円蓋に７５：１ ＲＰＭＩ−１０を注入することにより行った。円蓋は液体の送達および除去を繰り返すことにより洗浄し、これに次いで１０：１のＦＢＳを加えた。膣洗浄液をプールとして分析した。
細胞調製
増殖アッセイおよびインビトロサイトカイン分析のために、脾臓細胞を示した時点で得た。１つの細胞懸濁液を結果に示す３〜５匹のマウスのプールから調製した。増殖およびサイトカイン分析のために、細胞はＨＩＶペプチド抗原、対照タンパク質またはＲＰＭＩ−１０のみで一晩プレコートした丸底の９６ウェル培養プレートに懸濁した。脾臓細胞は５×１０５細胞／ウェルで、２×補充物を有する培養基を使用して加えた。細胞培養上清は、培養開始から３または６日のサイトカイン分析用に３連のウェルから回収した。
【０１１９】
上清を回収した直後に、培養に３Ｈ−チミジンを１８〜２４時間適用し、そして細胞の増殖を定量するために回収した。
固相酵素免疫検定法
ＨＩＶペプチドに特異的な抗体およびサブクラスの分布について分析するために、ペプチドを炭酸バッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）、またはＰＢＳに１μｇ／ｍｌの濃度に懸濁し、そして１００：１の容量で９６ウェルのマイクロタイタープレート（ヌンク：Ｎｕｎｃ）にまいた。３７℃で一晩インキューベーションした後、プレートを洗浄し、そして室温にて２〜４時間、ブロッキング（０．１％ゼラチン／ＰＢＳ）した。ＥＬＩＳＡプレートは、連続的に希釈した血清（ＰＢＳ、０．１％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、０．０２％アジ化ナトリウム）を加える前に、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）で洗浄した。１時間インキューベーションした後、ウェルを洗浄し、そしてビオチン化抗−アイソタイプ／サブクラス抗体の適当な希釈物を加えて４℃にて一晩インキューベーションした。ウェルを洗浄し、そしてストレプトアビジンを結合した西洋ワサビペルオキシダーゼとインキューベーションした。インキューベーション後、ウェルを洗浄し、そしてＡＢＴＳで発色させた。ウェルを４０５ｎｍで読んだ。力価を対照血清を使用して標準化した。
【０１２０】
サイトカインの分析には、細胞培養上清をＢＶＤ６−１１Ｂ１１（抗−ＩＬ４用）、またはＲ４−６Ａ２（インターフェロン−ガンマ用）をコートしたウェルに加えた。インキューベーションおよび洗浄後、ウェルをビモオチンで標識したＢＶＤ６−２４Ｇ２（ＩＬ４用）またはＸＭＧ１．２（インターフェロン−ガンマ用）を使用して発色させた。サイトカインの濃度は、組換えマウスインターフェロン−ガンマまたはインターロイキン４から作成した標準曲線を使用して決定した。すべてのサイトカイン試薬はファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。
ＨＩＶ−１ＭＮ中和アッセイ
中和アッセイは、デューク大学のＴｈｏｍａｓ Ｍａｔｔｈｅｗ博士の研究室で行った。簡単に説明すると、コード化した血清が研究室ウイルス単離物ＨＩＶ−１ＭＮ（ＮＩＨ）の中和に提供された。このアッセイは本質的にすでに記載したように行った（２５）。簡単に説明すると、試験血清の希釈物を９６ウェルのマイクロタイタープレート中でアリコートにわけた（２５：１／ウェル）。等容量の連続希釈したウイルスストックを各ウェルに加えた。インキューベーション後、ウイルス／抗体混合物をＡＡ５標的細胞に加えた。細胞は９６ウェルのマイクロタイタープレートで、新しい培地を１日おきに加えることにより培養した。感染から７日後、上清はウイルス複製、成功裏の感染またはそれらの阻害の測定としてウイルスの逆転写酵素の存在についてアッセイした。
【０１２１】
実施例２
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ） ＩｇＧ 終点力価
相互の抗−ＨＩＶペプチドに特異的ＩｇＧ終点力価は、初回免疫感作から示した時点にプール血清（ｎ＝５）から測定した。マウスは、特に示さないかぎり０日、および２７日に２５μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いて臀部に皮下で免疫感作した。フロイントアジュバントの受容体について、マウスはＣＦＡで乳化したペプチドで初回免疫し、そしてＩＦＡで追加免疫感作した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは、用量あたり２％スクアレンおよび５０μｇＭＰＬ（商標）を含むエマルションとして提供された。ＳＥはスクアレン、グリセロールおよび乳化剤から成る水中油型のエマルションである。組換えマウスＩＬ−１２は５０ｎｇ／マウスで送達された。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは１０μｇ／マウスで送達された。結果を表１に与える。
【０１２２】
【表１７】
2004504260.tif 000011
【０１２３】
実施例３
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ） ＩｇＧ 終点サブクラス力価
相互の終点ＩｇＧサブクラス力価は、初回免疫感作から６週間後、２次免疫感作から２週間後のプール血清（ｎ＝５ Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。マウスは、特に示さないかぎり２５μｇのペプチドを用いて臀部の皮下に免疫感作した。フロイントアジュバントの受容体について、マウスは完全フロイントアジュバントで乳化したペプチドで初回免疫し、そして不完全フロイントアジュバントで４および６週目に追加免疫感作した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは、用量あたり２％スクアレン油および５０μｇＭＰＬ（商標）を含むエマルションとして提供された。ＳＥはスクアレン、グリセロールおよび乳化剤から成る水中油型のエマルションである。組換えマウスＩＬ−１２は５０ｎｇ／マウスで送達された。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは１０μｇ／マウスで送達された。結果を表２に与える。
【０１２４】
【表１８】
2004504260.tif 000012
【０１２５】
実施例４
膣洗浄液ＩｇＧおよびＩｇＡ
抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ） 抗体力価
膣のＩｇＧおよびＩｇＡ抗−ペプチド抗体力価は、最終免疫感作から２週間後に得た洗浄液から測定した。５匹のＢａｌｂ／ｃ メスマウス群は、２５μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）および示したアジュバント製剤を用いて０、２８および４２日に免疫感作した。膣の抗体力価は、プールした膣洗浄液から測定した。結果を表３に与える。
【０１２６】
【表１９】
2004504260.tif 000013
【０１２７】
実施例５
脾臓細胞の増殖
Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）および種々のアジュバント製剤を用いて免疫感作したマウスに由来する脾臓細胞の増殖を測定した。５匹のＢａｌｂ／ｃ メスマウス群は、２５μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）および示したアジュバントを用いて０、２８日に免疫感作した。脾臓細胞は５６日目の培養物で樹立し、そして９６時間後の３Ｈ−チミジン取り込みを測定のために回収した。マウスは水性製剤または２％ＳＥを用いた安定なエマルションとして、５０ｎｇのＩＬ−１２、１０μｇのＧＭ−ＣＳＦ、５０μｇのＭＰＬ（商標）で免疫感作した。データは、刺激なしの培養で成長した細胞から測定された増殖値と比較してデルタｃｐｍとして示す。バックグラウンドの刺激のカウントは、＜８００ｃｐｍであった。結果を表４に与える。
【０１２８】
【表２０】
2004504260.tif 000014
【０１２９】
実施例６
脾臓細胞によるＩＬ−４の分泌
２５μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で刺激した脾臓細胞により培養物中に分泌されたＩＬ−４を測定した。脾臓細胞は５匹のＢａｌｂ／ｃ メスマウスのプールから回収し、そして示した抗原性の刺激（示したような５０ｎｇ ＩＬ−１２、１０μｇのＧＭ−ＣＳＦ、５０μｇ ＭＰＬ（商標））を用いて３または６日間のいずれかで培養した。インターロイキン−４のレベルはＥＬＩＳＡにより測定し、そして既知の濃度を有する標準と比較した。ブランクウェルは、このアッセイがこのような培養条件からインターロイキン−４を検出できなかったことを示す。検出感度の下限は２２単位／ｍｌであった。結果を表５に与える。
【０１３０】
【表２１】
2004504260.tif 000015
【０１３１】
【表２２】
2004504260.tif 000016
【０１３２】
実施例７
脾臓細胞によるインターフェロン−ガンマの分泌
２５μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で刺激した脾臓細胞により培養物中に分泌されたインターフェロン−ガンマ。脾臓細胞は５匹のＢａｌｂ／ｃ メスマウスのプールから回収し、そして示した抗原性の刺激（実施例６と同じ）を用いて３または６日間のいずれかで培養した。インターフェロン−ガンマのレベルはＥＬＩＳＡにより測定し、そして既知の濃度を有する標準と比較した。ブランクウェルは、このアッセイがこのような培養条件からインターフェロン−ガンマを検出できなかったことを示す。検出感度の下限は４ピコグラム／ｍｌであった。結果を表６に与える。
【０１３３】
【表２３】
2004504260.tif 000017
【０１３４】
【表２４】
2004504260.tif 000018
【０１３５】
実験２
ＨＩＶペプチドおよび種々のアジュバントを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの免疫感作
実施例８
材料および方法
動物
７〜９週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを、上記の実施例１に従い使用した。
ペプチド
実施例１に記載したＨＩＶ−１−ＭＮペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）を使用した。ペプチドは生理塩水中で１ｍｇ／ｍｌの濃度に再水和した。
アジュバント
ＭＰＬ（商標）を場合により安定なエマルション状態で使用する代わりに水性の製剤として保持することを除き、使用するアジュバントは実施例１に記載した通りであった。
免疫感作
マウスは総容量０．２ｍｌを尾の両側に均等に分割して、臀部の皮下に免疫感作した。免疫感作は以下に示す量のアジュバント（１つまたは複数）と一緒に２５μｇのＨＩＶペプチドを用いて、０および２１日に投与した。ＣＦＡ／ＩＦＡを受容したマウスは、０日にＣＦＡ、そして２１日にＩＦＡを受容した。希釈および混合は実施例１に記載した通りであった。
サンプルの採集
動物からのサンプルの採集は、各免疫感作の前日および２次免疫感作から１４日後に、実施例１のプロトコールに従い行った。
細胞調製
細胞の調製は、実施例１のプロトコールに従い、作成し、そして取り扱った。
固相酵素免疫検定法
ＥＬＩＳＡは、実施例１のプロトコールに従い行った。
ＨＩＶ−１ＭＮ中和アッセイ
中和アッセイは、ここでも実施例１のプロトコールに従いデューク大学で行った。
【０１３６】
実施例９
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ） ＩｇＧ 終点力価
相互の抗−ペプチドＩｇＧ終点力価は、２次免疫感作から１４日後に得られた個々のマウスからの幾何平均（ＧＭＴ）またはプールした血清から測定した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブクラス終点力価は、プールした血清から測定した。フロイントアジュバントの受容体について、マウスはＣＦＡで乳化した２５μｇのペプチドで初回免疫し、そしてＩＦＡで追加免疫感作した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは、用量あたり１％スクアレン油および５０μｇＭＰＬ（商標）を含むエマルションとして提供された。水性ＭＰＬ（商標）は用量あたり５０μｇで送達された。組換えマウスＩＬ−１２は４０ｎｇ／マウスで送達された。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは１０μｇ／マウスで送達された。結果を表７に与える。
【０１３７】
【表２５】
2004504260.tif 000019
【０１３８】
実施例１０
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ） ＩｇＧ 終点サブクラス力価
ＨＩＶ−ペプチド特異的な膣洗浄液の終点相互ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価は、２次免疫感作から１５日後のプール血清（ｎ＝５ Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。マウスは実施例９のように免疫感作した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは、用量あたり１％スクアレン油および５０μｇＭＰＬ（商標）を含むエマルションとして提供された。水性ＭＰＬ（商標）は用量あたり５０μｇで送達された。組換えマウスＩＬ−１２は４０ｎｇ／マウスで送達された。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは１０μｇ／マウスで送達された。結果を表８に与える。
【０１３９】
【表２６】
2004504260.tif 000020
【０１４０】
実施例１１
脾臓細胞の増殖
Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）および種々のアジュバント製剤を用いたインビトロ刺激（実施例１０と同様）に応答した脾臓細胞の増殖を測定した。細胞は全部で９６時間培養した。３Ｈ−チミジンを最後の１８時間、培養に加えた。データはＣｏｎＡを含む培養で刺激した細胞に対して標準化した増殖指数として与える（［平均 ｃｐｍ 抗原／平均 ｃｐｍ ＣｏｎＡ］−［平均 ｃｐｍ 培地／平均 ｃｐｍ ＣｏｎＡ］）×１００。結果として、培地で培養された細胞は０のバックグラウンド増殖を有する。結果を表９に与える。刺激しなかった培養で成長した細胞未満の増殖値は括弧に示す。
【０１４１】
【表２７】
2004504260.tif 000021
【０１４２】
実施例１２
脾臓細胞によるＩＬ−４の分泌
Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で刺激した脾臓細胞により培養物中に分泌されたインターロイキン−４を測定した。細胞は全部で９６時間培養した。細胞培養上清はＥＬＩＳＡによりＩＬ−４について分析した。すべての値は、１０ｎｇの無関係なタンパク質（リゾチーム）で刺激した細胞の上清から決定した値から差し引いた後の値であった。結果は表１０にｐｇ／ｍｌで与える。リゾチームにより誘導された刺激から差し引き後の検出限界未満の結果は、“ｂｄ”で示す。アジュバントは４０ｎｇのＩＬ−１２、１０μｇのＧＭ−ＣＳＦおよび５０μｇ ＭＰＬ（商標）であった
【０１４３】
【表２８】
2004504260.tif 000022
【０１４４】
実施例１３
脾臓細胞によるインターフェロン−ガンマの分泌
Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で刺激した脾臓細胞により培養物中に分泌されたインターフェロン−ガンマを測定した。細胞は全部で９６時間培養した。細胞培養上清はＥＬＩＳＡによりインターフェロン−ガンマについて分析した。すべての値は、１０μｇのリゾチームで刺激した細胞の上清から決定した値から差し引いた後の値であった。結果は表１１に単位／ｍｌで与える。リゾチームにより誘導された刺激から差し引き後の検出限界未満の結果は、“ｂｄ”で示す。アジュバントは実施例１２で使用したものと同じであった。
【０１４５】
【表２９】
2004504260.tif 000023
【０１４６】
実験３
ＨＩＶペプチドおよび種々のアジュバントを用いたＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの免疫感作
Ｂａｌｂ／ｃマウスの代わりにＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを用いて、実施例２のプロトコールに従った。相互の抗−ペプチドＩｇＧ終点力価および膣洗浄液終点相互終点ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価のみをこの実験では測定した。
【０１４７】
実施例１４
相互の抗−ＨＩＶペプチドＩｇＧ終点力価
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）ＩｇＧ終点力価は、２次免疫感作から１４日後に得た個々のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの幾何平均から測定した（ＧＭＴ）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブクラス終点力価も、プールした血清から測定した。フロイントアジュバントの受容体について、マウスはＣＦＡで乳化したペプチドで初回免疫し、そしてＩＦＡで追加免疫感作した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは、用量あたり１％スクアレン油および５０μｇＭＰＬ（商標）を含むエマルションとして提供された。水性ＭＰＬ（商標）は用量あたり５０μｇで送達された。組換えマウスＩＬ−１２は４０ｎｇ／マウスで送達された。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは１０μｇ／マウスで送達された。結果を表１２に与える。
【０１４８】
【表３０】
2004504260.tif 000024
【０１４９】
実施例１５
相互の抗−ＨＩＶペプチド ＩｇＧ 終点サブクラス力価
ＨＩＶ−ペプチドに特異的な膣洗浄液の終点相互ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体力価は、２次免疫感作から１５日後のプール血清（ｎ＝５ Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ）から測定した。マウスは実施例１４のように免疫感作した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは、用量あたり１％スクアレン油および５０μｇＭＰＬ（商標）を含むエマルションとして提供された。水性ＭＰＬ（商標）は用量あたり５０μｇで送達された。組換えマウスＩＬ−１２は４０ｎｇ／マウスで送達された。組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは１０μｇ／マウスで送達された。結果を表１３に与える。
【０１５０】
【表３１】
2004504260.tif 000025
【０１５１】
実験４
ＨＩＶペプチドおよび種々のペプチドを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの免疫感作
実施例２のプロトコールに従ったが、マウスは０および２８日に免疫感作し、そして血清学的評価のために０、２７および４１日に採血した。ＣＦＡ／ＩＦＡはＣＦＡを用いて０日に、ＩＦＡを用いて２８日に配合した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは５０μｇのＭＰＬ（商標）および２％ＳＥを用いて配合し、５０ｎｇＩＬ−２および１０μｇＧＭ−ＣＳＦを使用した。
【０１５２】
実施例１６
相互の抗−ＨＩＶペプチドＩｇＧ終点力価
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）ＩｇＧ終点力価は、初期免疫感作から４１日後、２次免疫感作から１３日後に、各々のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ＧＭＴ）および幾何平均（ｎ＝５　Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。結果を表１４に与える。ゼロ日で個々の力価はすべて５０未満であった。“［データなし］”の記述は、プロトコールの完了前に動物が死んだことを意味する。“ＳＤ”は標準偏差を意味する。
【０１５３】
【表３２】
2004504260.tif 000026
【０１５４】
実施例１７
相互の抗−ＨＩＶペプチドＩｇＧ 終点サブクラス力価
相互の終点抗−ペプチドＩｇＧサブクラス力価は、初期免疫感作から４１日後、２次免疫感作から１３日後のプールした血清（ｎ＝５　Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。結果を表１５に与える。
【０１５５】
【表３３】
2004504260.tif 000027
【０１５６】
実施例１８
膣洗浄液ＩｇＧおよびＩｇＡ
抗−ＨＩＶペプチド抗体力価
膣のＩｇＧおよびＩｇＡ 抗−ペプチド抗体力価は、初期免疫感作から４１日後、２次免疫感作から１３日後の洗浄液から測定した。結果を表１６に与える。
【０１５７】
【表３４】
2004504260.tif 000028
【０１５８】
実施例１９
脾臓細胞の増殖
Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）および種々のアジュバント製剤を用いて免疫感作したマウスに由来する脾臓細胞の増殖を測定した。脾臓細胞は３．３μｇ／ｍｌのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いて４日間インビトロで刺激した。結果は、刺激の不存在下での取り込みに対して、３．３μｇ／ｍｌのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）を用いたインビトロ刺激の結果として標識したチミジンの取り込みの変化として表４に示す（デルタｃｐｍ）。
【０１５９】
実験５
ＨＩＶペプチドおよび種々のペプチドを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの免疫感作
実施例２のプロトコールに従ったが、マウスは０および２２日に皮下に免疫感作し、そして血清学的評価のために４２日に採血した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは５０μｇのＭＰＬ（商標）および１％ＳＥを用いて配合したが、１０μｇＧＭ−ＣＳＦを使用した。
【０１６０】
実施例２０
相互の抗−ＨＩＶペプチドＩｇＧ終点力価
相互の抗−ペプチド終点ＩｇＧ力価は、初期免疫感作から４２日後、２次免疫感作から１３日後のプール血清（ｎ＝５　Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。ＩｇＧに関して標準偏差も含め幾何平均を測定した。結果は表１７に与える。
【０１６１】
【表３５】
2004504260.tif 000029
【０１６２】
実験６
ＨＩＶペプチドおよび種々のアジュバントを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの免疫感作
実施例２のプロトコールに従ったが、ＨＩＶペプチドはアミノ酸位１７にシステインを含み、そしてマウスは０および２１日に皮下に免疫感作し、そして血清学的評価のために−１（初回免疫感作の前日）、１３、２０および２８日に採血した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは５０μｇのＭＰＬ（商標）および１％ＳＥを用いて配合したが、１０μｇＧＭ−ＣＳＦを使用した。ＨＩＶペプチドＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）（２６）はアミノ酸位１７にシステインを含み、そして４０残基長である。Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）は、ジェノシス バイオテクノロジーズ（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ウッドランド、テキサス州）から購入した。
【０１６３】
実施例２１
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ＩｇＧ終点力価
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）ＩｇＧ終点力価は、初期免疫感作から２８日後に、個々のマウスから、そしてそれらの幾何平均から測定した。結果を表１８に与える。
【０１６４】
【表３６】
2004504260.tif 000030
【０１６５】
実験７
ＨＩＶペプチドおよび種々のアジュバントを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの免疫感作
実施例６のプロトコールに従ったが、マウス（ｎ＝３ Ｂａｌｂ／ｃ）は０および３２日に皮下に免疫感作し、そしてて血清学的評価のために３８日に採血した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは５０μｇのＭＰＬ（商標）および１％ＳＥを用いて配合したが、１０μｇＧＭ−ＣＳＦを使用した。
【０１６６】
実施例２２
相互の抗−ＨＩＶペプチド ＩｇＧ終点力価
相互の抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）ＩｇＧ終点力価は、初期免疫感作から３８日後に、個々のマウスから、そしてそれらの幾何平均（ｎ＝３ Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。結果を表１９に与える。
【０１６７】
【表３７】
2004504260.tif 000031
【０１６８】
実験８
Ｂａｌｂ／ｃマウスを対象としたＣＴＬ分析
マウスの免疫感作については実験６のプロトコールに従った。２次免疫感作から７日後のマウスから単離した脾臓細胞のＣＴＬ活性を評価した。ＭＰＬ（商標）ＳＥは５０μｇのＭＰＬ（商標）および１％ＳＥを用いて配合したが、１０μｇＧＭ−ＣＳＦを含んだが、または含まずに５０μｇの抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（＋Ｃｙｓ）を加えた。
【０１６９】
実施例２３
Ｂａｌｂ／ｃマウスを対象としたＣＴＬ分析
ＣＴＬ分析に関して、脾臓細胞を初回免疫感作から１４日後、そして２次免疫感作から７日後の免疫感作したマウスから取り出した。すでに記載したプロトコール（３４）に本質的に従った。簡単に説明すると、１群あたり３匹のマウスから赤血球−涸渇脾臓細胞をプールした。脾臓エフェクター細胞（４×１０６ｍｌ）を、１．５〜２ｍｌの容量で２４ウェルの培養プレート中にて７日間、１μｇ／ｍｌの“ＭＮ”、または“ＩＩＩＢ” １０ｍｅｒ ＣＴＬエピトープペプチドのいずれかで再刺激した。両ＣＴＬエピトープはＨ−２Ｄｄに限定されていた。培養は１０Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２（バイオソース：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を、少なくとも培養の５日間、補充した。細胞傷害活性の分析には、Ｐ８１５細胞はＣｒ５１で標識し、そして５μｇ／ｍｌペプチド（ＩＩＩＢまたはＭＮ）を４時間適用し、そして培養した脾臓エフェクター細胞に加えた。１００：１から３．７：１で、標的細胞に対して３倍希釈のエフェクター細胞を使用した。パーセントＣＴＬ活性は、（（特異的なクロム放出−自然なクロム放出）／（最大クロム放出−自然なクロム放出））×１００を使用して、クロム放出のパーセントとして計算した。クロム放出は６時間のインキューベーション期間後に評価した。クロムの平均自然放出は、常に最大放出の１５％未満であった。２８日からの結果を図５に示す。
【０１７０】
実験９
種々のＳＩＶペプチドおよびアジュバントを用いたアカゲザルの免疫感作
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を対象として、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦアジュバント製剤を、それが抗原−特異的なＣＴＬを誘導する能力について試験した。この実験では、それぞれがデューク大学のＢａｒｔｏｎ Ｈａｙｎｅｓ博士の研究室でＳＩＶ ｅｎｖからの無差別なＴ−ヘルパーエピトープを用い、または用いずに化学的に合成した３つの別個のＭａｍｕＡ★０１拘束ＣＴＬエピトープ（それぞれｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに由来する）から成る三価のペプチド免疫原を用いてアジュバント製剤を試験した。
【０１７１】
ＭａｍｕＡ★０１制限ＣＴＬエピトープを含むペプチドは以下の通りである：
【０１７２】
【表３８】
2004504260.tif 000032
【０１７３】
これらのＣＴＬ−含有エピトープは、以下の配列を有するＴ−ヘルパーエピトープにも連結した：
【０１７４】
【表３９】
2004504260.tif 000033
【０１７５】
このように、３つのマルチエピトープ ペプチドは、以下の配列を有した：
【０１７６】
【表４０】
2004504260.tif 000034
【０１７７】
ＣＴＬ分析は、ＭａｍｕＡ★０１拘束四量体染色分析により、バーバードメディカルスクールのＮｏｒｍａｎ Ｌｅｔｖｉｎ博士の研究室で行った。
動物、用量および免疫原：
ＨＬＡ−Ａホモロガス分子ＭａｍｕＡ★０１およびサブタイプＤＲβ０２０１を発現しているアカゲザルは、ＰＣＲにより同定し、そしてルイジアナ州ニュー イベリアでコロニーに収容した。
【０１７８】
実験には、各々表２０に記載する２匹の若いアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）の３群を含んだ。群１は２匹のＭａｍｕＡ★０１陽性、ＤＲβ０２０１陰性動物Ｒｈ７３およびＲｈ８０から成った。これらの動物はＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを一緒に含む三価のＭａｍｕＡ★０１拘束ＳＩＶ ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ ＣＴＬエピトープペプチド（短いペプチドカクテル）を投与した。群２は、ＭＰＬ（商標）ＳＥおよびＧＭ−ＣＳＦを一緒に含むＴｈ／ＳＩＶＣＴＬ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖエピトープペプチド（長いペプチドカクテル）を受容した２匹のＭａｍｕＡ★０１陽性、ＤＲβ０２０１陽性アカゲザルから成った。群３は、Ｔｈ／ＳＩＶＣＴＬ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖエピトープペプチド（長いペプチドカクテル）を接種した２匹のＭａｍｕＡ★０１陰性、ＤＲβ０２０１陽性動物から成った。表２０はＨＬＡ型による群および使用した免疫原を説明する。
【０１７９】
【表４１】
2004504260.tif 000035
【０１８０】
すべての群は、０、４および８週に１％の油および２５０μｇのヒトＧＭ−ＣＳＦ中の５０μｇのＭＰＬ（商標）ＳＥに配合した１ｍｌの各ペプチドカクテルで皮下に免疫感作した。１８週間の免疫感作で、ＭＰＬ（商標）ＳＥの用量を１％の油中で１２５μｇに増加した。すべての群について、２．４ｍｇの各々の長ペプチドおよび０．７５ｍｇの各々の短ペプチドを９００μｌの蒸留した脱イオン水に溶解した。次いでペプチド溶液はヒトＧＭ−ＣＳＦを再構成するために使用し、そして１００μｌのＭＰＬ（商標）ＳＥ製剤を加えた。
【０１８１】
実施例２４
アカゲザルを対象としたＣＴＬ分析
動物は２週間毎に採血し、そして新しいおよび培養した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）について四量体染色によるＭａｍｕＡ★０１拘束ＣＴＬに関して、ヘパリン処理した血液を分析した（５０）。ＰＢＭＣはｐｌｌｃ、ｐ６８Ａ、ｐ４１Ａまたはｐ４６のいずれかで０日に刺激し、そして次いでＩＬ−２の存在下で培養し、そして１１日に分析した。標準５１Ｃｒ放出アッセイも、培養したＰＢＭＣについて行った（５０）。
【０１８２】
四量体アッセイは以下のように行った：ｇａｇからのエピトープペプチドｐｌｌｃ、ｐｏｌからのｐ６８Ａまたはｐｏｌからのｐ６８Ａまたはｅｎｖからのｐ４１Ａを、精製したビオチン化ＭａｍｕＡ★０１と、β２ミクログロブリンの存在下でインキューベーションし、ついでアビジンと結合させ、そしてＰＥ（フィコエリトリン）に連結した。この四量体は次いでｐｌｌｃ、ｐ６８Ａまたはｐ４１Ａエピトープを認識するＴ細胞レセプターを持つマカークＣＤ８＋細胞を染色するために使用した。種々のＤＲβ２０１四量体は優勢ｅｎｖ ｐ４６エピトープの回りを包み、ｐ４６ Ｔｈエピトープを特異的に認識したＣＤ４＋細胞の染色を可能とした。この結果を表２１〜２４に示す。
【０１８３】
【表４２】
2004504260.tif 000036
【０１８４】
【表４３】
2004504260.tif 000037
【０１８５】
【表４４】
2004504260.tif 000038
【０１８６】
【表４５】
2004504260.tif 000039
【０１８７】
実験１０
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のポーリンＢタンパク質および
種々のアジュバントでのＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの免疫感作
異系交配したＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、各１０匹の５群に分割した。各群は１μｇの組換えポーリンＢタンパク質（ＦＡ１０９０株に由来し、１６個のアミノ酸をファージに由来するアミノ−末端に含み、ポーリンＢタンパク質の成熟形が続く）を受容した。第１群はアジュバントを受容しなかった：第２群は５０μｇのＭＰＬ（商標）を受容した；第３群は５μｇのＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）を受容した；第４群は２５μｇのＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した；第５群は５μｇのＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した。マウスは全容量０．２ｍｌを尾／臀部の基底の２部位に均等に分割して臀部の皮下に免疫感作した。免疫感作は０週および４週に投与した。
【０１８８】
実施例２５
相互の抗−ポーリンＢタンパク質ＩｇＧ 終点サブクラス力価
マウスは各免疫感作前および最終免疫感作から１３日後に採血した。血清を群内のマウスに由来するプールから分析した。相互の終点抗−ポーリンＢタンパク質ＩｇＧサブクラス力価はプールした血清（ｎ＝１０　Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ）から膣洗浄液により、３週および６週で測定した。結果を表２５に与える。すべての０日の免疫感作前の力価は５０未満であった。
【０１８９】
【表４６】
2004504260.tif 000040
【０１９０】
組換えポーリンＢタンパク質に対する個々の６週のＩｇＧ力価の幾何平均も測定した。結果を表２６に与える。
【０１９１】
【表４７】
2004504260.tif 000041
【０１９２】
実験１１
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のポーリンＢタンパク質および
種々のアジュバントでのＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの免疫感作
異系交配したＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、各５匹の６群に分割した。各群は１μｇの組換えポーリンＢタンパク質（ＦＡ１０９０株に由来し、１６個のアミノ酸をファージに由来するアミノ−末端に含み、ポーリンＢタンパク質の成熟形が続く）を受容した。第１群はアジュバントを受容しなかった（タンパク質はＰＢＳ中に配合した）：第２群は４０ｎｇのＩＬ−１２を受容した；第３群は５０μｇのＭＰＬ（商標）を受容した；第４群は４０ｎｇのＩＬ−１２を加えたＭＰＬ（商標）を受容した；第５群は２５μｇのＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した；第６群は４０ｎｇのＩＬ−１２を加えたＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した。マウスに全容量０．２ｍｌを臀部の皮下に免疫感作した。免疫感作は０週および４週に投与した。
【０１９３】
実施例２６
相互の抗−ポーリンＢタンパク質ＩｇＧ 終点サブクラス力価
および膣洗浄液ＩｇＧおよびＩｇＡ力価
マウスは各免疫感作前および最終免疫感作から１３日後に採血した。血清を群内のマウスに由来するプールから分析した。相互の終点抗−ポーリンＢタンパク質ＩｇＧサブクラス力価はプールした血清（ｎ＝５　Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ）から膣洗浄液により、そしてＩｇＧおよびＩｇＡ膣洗浄力価を、それぞれ３週および６週で測定した。結果を表２７に与える。すべての０日の免疫感作前の力価は５０未満であった。膣洗浄液分析用の出発希釈は１／５であった。
【０１９４】
【表４８】
2004504260.tif 000042
【０１９５】
実験１２
呼吸合胞体ウイルスＦタンパク質および種々のアジュバントでの
Ｂａｌｂ／ｃｒマウスの免疫感作
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、各５匹の７群に分割した。各群は３μｇの精製した天然のヒト呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質（二量体形）を受容した。第１群はアジュバントを受容しなかった（タンパク質はＰＢＳ中に配合した）：第２群は１００μｇのリン酸アルミニウム（ａｌｕｍ）を受容した；第３群は２０μｇのＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（アクイラ バイオファルマシューティカルズ社：Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、フラミンハム、マサチューセッツ州）を受容した；第４群は５０μｇのＭＰＬ（商標）を受容した；第５群は５μｇのＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）を受容した；第６群は２５μｇのＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した；第７群は５μｇのＧＨ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した。マウスに全容量０．２ｍｌを上腿の筋肉内に免疫感作した。免疫感作は０週および４週に投与した。
【０１９６】
実施例２７
相互の抗−ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧ 終点サブクラス力価
マウスは各免疫感作前および最終免疫感作から１３日後に採血した。血清を群内のマウスに由来するプールから分析した。相互の終点抗−ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧサブクラス力価はプールした血清（ｎ＝５ Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。結果を表２８に与える。すべての０日の免疫感作前の力価は５０未満であった。
【０１９７】
【表４９】
2004504260.tif 000043
【０１９８】
実施例２８
脾臓細胞の増殖
２．５μｇ／ｍｌのＲＳＶ Ｆタンパク質および種々のアジュバント製剤を用いたインビトロ刺激（実施例２７と同様）に応答した脾臓細胞の増殖を測定した。脾臓細胞は２次免疫感作から１４時間後に回収し、そして５×１０５細胞の密度で培養物中で樹立した。細胞は全部で９６時間培養した。３Ｈ−チミジンを最後の１８時間、培養に加えた。データはＣｏｎＡを含む培養で刺激した細胞に対して標準化した増殖指数として与える（［平均 ｃｐｍ 抗原／平均 ｃｐｍ ＣｏｎＡ］−［平均 ｃｐｍ 培地／平均 ｃｐｍ ＣｏｎＡ］）×１００。結果として、培地で培養された細胞は０のバックグラウンド増殖を有する。結果を表２９に与える。
【０１９９】
【表５０】
2004504260.tif 000044
【０２００】
実験１３
呼吸合胞体ウイルスＦタンパク質および種々のアジュバントでの
Ｂａｌｂ／ｃｒマウスの免疫感作
実験１２のプロトコールを繰り返した（種々のアジュバントを含む、または含まないＲＳＶ Ｆタンパク質を用いた０週および４週の免疫感作）。
【０２０１】
実施例２９
相互の抗−ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧ 終点サブクラス力価
マウスは各免疫感作前および最終免疫感作から１３日後に採血した。血清を群内のマウスに由来するプールから分析した。相互の終点抗−ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧサブクラス力価はプールした血清（ｎ＝５ Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。結果を表３０に与える。すべての０日の免疫感作前の力価は５０未満であった。
【０２０２】
【表５１】
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【０２０３】
実施例３０
脾臓細胞のＣＴＬ分析
ＲＳＶ Ｆタンパク質および示したアジュバントを用いた免疫感作の結果としての脾臓細胞のＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ−リンパ球）活性を、最終免疫感作から２週間後に評価した。データは、３３：１のエフェクター：標的細胞比で、ＲＳＶ−感染した標的細胞と培養した脾臓細胞のパーセント特異的ＣＴＬ活性を表す。パーセント特異的ＣＴＬ活性は実施例２４に記載したように、ＲＳＶ−感染した標的細胞に対して特異的な活性から非感染標的に対するＣＴＬ活性を引くことにより決定した。自然な脾臓細胞をインビトロ刺激細胞の供給源として、１．５のＭＯＩ（感染多重度）でＲＳＶを用いて２時間感染させた。免疫感作したマウスの脾臓細胞から応答細胞を刺激細胞に５：１の比率で加え、そして６日間培養した。５日に、標的細胞（Ｂａｌｂ／ｃ ＭＨＣ−Ｈ−２ｄ細胞系）をＲＳＶに１０のＭＯＩで２時間感染させ、そして一晩インキューベーションした。６日に、感染したおよび非感染標的細胞を回収し、そして３１Ｃｒを適用した。次いで１００：１〜３：１のＥ：Ｔ比でインビトロのエフェクター細胞を標的細胞に加えた。クロムの放出は、４時間のインキューベーション期間後に評価した。結果を表３１に与える。
【０２０４】
【表５２】
2004504260.tif 000046
【０２０５】
実験１４
呼吸合胞体ウイルスＦタンパク質および種々のアジュバントでの
Ｂａｌｂ／ｃｒマウスの免疫感作
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、各５匹の６群に分割した。各群は３μｇの精製した天然のＲＳＶＦタンパク質（二量体形）を受容した。第１群はアジュバントを受容しなかった（タンパク質はＰＢＳ中に配合した）：第２群は４０ｎｇのＩＬ−１２を受容した；第３群は５０μｇのＭＰＬ（商標）を受容した；第４群は４０ｎｇのＩＬ−１２を加えたＭＰＬ（商標）を受容した；第５群は２５μｇのＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した；第６群は４０ｎｇのＩＬ−１２を加えたＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した。マウスは、尾の両側に与える２つの容量間で等しく分割した全容量０．２ｍｌを臀部の皮下に疫感作した。免疫感作は０週および４週に投与した。
【０２０６】
実施例３１
相互の抗−ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧ 終点サブクラス力価
マウスは各免疫感作前および最終免疫感作から１３日後に採血した。血清を群内のマウスに由来するプールから分析した。相互の終点抗−ＲＳＶ Ｆタンパク質ＩｇＧサブクラス力価はプールした血清（ｎ＝５ Ｂａｌｂ／ｃ）から測定した。結果を表３２に与える。すべての０日の免疫感作前の力価は５０未満であった。
【０２０７】
【表５３】
2004504260.tif 000047
【０２０８】
実施例３２
脾臓細胞のＣＴＬ分析
ＲＳＶ Ｆタンパク質および示したアジュバントを用いた免疫感作の結果としての脾臓細胞のＣＴＬ活性を、最終免疫感作から２週間後に評価した。データは、３３：１のエフェクター：標的細胞比で、ＲＳＶ−感染した標的細胞と培養した脾臓細胞のパーセント特異的ＣＴＬ活性を表す。パーセント特異的ＣＴＬ活性は実施例２４に記載したように、ＲＳＶ−感染した標的細胞に対して特異的な活性から非感染標的に対するＣＴＬ活性を引くことにより決定した。自然な脾臓細胞をインビトロ刺激細胞の供給源として、１．５のＭＯＩでＲＳＶを用いて２時間感染させた。免疫感作したマウスの脾臓細胞から応答細胞を刺激細胞に５：１の比率で加え、そして６日間培養した。５日に、標的細胞（Ｂａｌｂ／ｃ ＭＨＣ−Ｈ−２ｄ細胞系）をＲＳＶに１０のＭＯＩで２時間感染させ、そして一晩インキューベーションした。６日に、感染したおよび非感染標的細胞を回収し、そして３１Ｃｒを適用した。次いで１００：１〜３：１のＥ：Ｔ比でインビトロのエフェクター細胞を標的細胞に加えた。クロムの放出は、４時間のインキューベーション期間後に評価した。２８日からの結果を表３３に与える。
【０２０９】
【表５４】
2004504260.tif 000048
【０２１０】
実験１５
インフルエンザウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質および
種々のアジュバントでのＢａｌｂ／ｃマウスの免疫感作
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、各５匹の６群に分割した。各群は、Ａ／ｄｒｏｎ／３０７／７２株に由来する１μｇのインフルエンザウイルスＶＰ（ヌクレオキャプシド）タンパク質を受容した。［チェック群］第１群はアジュバントを受容しなかった（ペプチドはＰＢＳ中に配合した）：第２群は１００μｇのリン酸アルミニウム（ａｌｕｍ）を受容した；第３群は５０μｇのＭＰＬ（商標）を受容した；第４群は５μｇのＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）を受容した；第５群は２５μｇのＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した；第６群は５μｇのＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＰＬ（商標）ＳＥを受容した。マウスは、全容量０．２ｍｌを臀部の皮下に疫感作した。免疫感作は０週および４週に投与した。
【０２１１】
実施例３３
脾臓細胞のＣＴＬ分析
インフルエンザ ＮＰペプチドおよび示したアジュバントを用いた免疫感作の結果としての脾臓細胞のＣＴＬ活性を、最終免疫感作から２週間後に評価した。評価はペプチドを適用した標的ｐ８１５細胞を使用して実施例３２の手順に従い行った（このペプチドはＮＰのアミノ酸１４７〜１５５に対応し、そして配列：Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ （配列番号１４）を有する）。ＭＰＬ（商標）またはＭＰＬ（商標）ＳＥを含む製剤中にＧＭ−ＣＳＦを包含すると、顕著なＣＴＬ活性の低下がもたらされた（データは示さず）。
【０２１２】
【表５５】
2004504260.tif 000049
【０２１３】
【表５６】
2004504260.tif 000050
【０２１４】
【表５７】
2004504260.tif 000051
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＦＡまたはＩＦＡ（三角）で、あるいは５０μｇのＭＰＬ（商標）２％の安定なエマルション（ＳＥ）（四角）で配合した２５μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）、マルチエピトープ３９アミノ酸ペプチドを用いて免疫感作した５匹のＢａｌｂ／ｃ メス マウス群から測定した相互の終点力価を示す。マウスを０日に免疫感作し、そして２８日に追加免疫感作した。ペプチドに特異的なＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価は、４２日に集めた血清からＥＬＩＳＡにより測定した。
【図２】ＳＥ単独、ＭＰＬ（商標）単独またはＭＰＬ（商標）ＳＥが、ＧＭ−ＣＳＦまたは抗−Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）ＩｇＧ力価の免疫増強特性に及ぼす効果を表す。５匹のメスのＢａｌｂ／ｃマウス群を０日に２５μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で免疫感作し、そして２８日に示したアジュバント製剤で追加免疫感作した。ＣＦＡおよびＩＦＡは１：１の比率で水性のペプチドと乳化した。ＧＭ−ＣＳＦは１０μｇ／用量で使用した。ＭＰＬ（商標）はマウスに水性製剤として５０μｇ、または１％ＳＥとの安定なエマルションの一部として２５μｇの最終濃度で送達された。力価は２次免疫感作から２週間後に測定した。データは５匹のマウスから測定された個々の力価を示す。
【図３】ウイルス中和アッセイの結果を示す。０日に、そして２８日に示した製剤で免疫感作したマウスから４２日に採取したプール血清は、希釈し（１／１６００）、そしてＴ細胞−適応ＨＩＶＭＮの希釈物に加えた後、インビトロのＡＡ５細胞に加えた。７日間の培養後、細胞培養上清はウイルスの複製の指標としてウイルス逆転写酵素についてアッセイした。
【図４】Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）および種々のアジュバント製剤で免疫感作したマウスに由来する脾臓細胞を増殖を示す。脾臓細胞はインビトロで４日間、３．３μｇ／ｍｌのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で刺激した。結果は、刺激の不存在下での取り込みに対して、Ｔ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）でインビトロ刺激した結果として標識したチミジンの取り込みにおける変化として表す（デルタｃｐｍ）。
【図５】２次免疫感作から７日後のマウスから単離した脾臓細胞のＣＴＬ活性を示す。脾臓細胞は、１０μｇのＧＭ−ＣＳＦを含むか、または含まない１％のＳＥ中の５０μｇのＭＰＬ（商標）を配合した５０μｇのＴ１ＳＰ１０ＭＮ（Ａ）（−Ｃｙｓ）で０日、そして２１日に免疫感作した３匹のＢａｌｂ／ｃ マウス群から回収した。細胞をＨＩＶＭＮＣＴＬエピトープペプチドと７日間培養した。ＩＬ−２を培養の最後の５日間に加えた。エフェクター脾臓細胞を、ＨＩＶＭＮを適用したクロム−標識Ｐ８１５細胞（別のＨＩＶＭＮと命名された株）またはペプチドなしに示した比率で加えた。パーセントＣＴＬ活性は：
特異的に放出されたｃｐｍ　　−　自然に放出されたｃｐｍ　　　 ×１００
全最大ｃｐｍ　　−　　自然に放出されたｃｐｍ
で計算した。
“Ｅ：Ｔ”は、エフェクター：標的細胞比を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2004504260.tif 000063
【図５】
2004504260.tif 000064
【国際公開パンフレット】
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2004504260.tif 000067
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2004504260.tif 000192
2004504260.tif 000193
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504260.tif 000194
2004504260.tif 000195
2004504260.tif 000196
2004504260.tif 000197
2004504260.tif 000198
【国際調査報告】
2004504260.tif 000199