(57)【要約】本発明は、特に早期のＨＰＶ（例えばＨＰＶ１６）を発現するケラチン生成細胞（又は他の細胞）を消滅させるための新規な遺伝子治療アプローチを提供する。好ましい具体例において、ＨＰＶタンパク質により誘発されるＨＰＶ特異性プロモーターを符号化する核酸構造を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）することを含み、プロモーターは細胞毒性遺伝子を含む核酸と操作可能にリンクし、それにより、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が感染する場合は、細胞毒性遺伝子の発現を引き起こし、それにより哺乳動物細胞の死を生じるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を産する細胞を選択的に殺傷する方法であって、哺乳動物細胞を、ＨＰＶタンパク質より誘発されるＨＰＶ特異的なプロモーターであって細胞毒遺伝子を含む核酸構造と操作可能にリンクする該プロモーターを符号化する核酸構造を用いてトランスフェクトし、それにより前記細胞はヒトパピローマウイルスが感染した場合に細胞毒遺伝子を発現し、それにより前記哺乳動物細胞の細胞死を生じる、
ことを含む該方法。
【請求項２】
前記トランスフェクトが、レトロウイルスベクター、アデノアソシエイトベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びシンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスベクターからなる群より選択されるベクターを用いるデリバリーを含む請求項１の方法。
【請求項３】
前記トランスフェクトが、脂質、リポソーム、カチオン性脂質及びデンドリマーからなる群より選択されるデリバリーエージェントを使用することを含む請求項１の方法。
【請求項４】
前記プロモーターがＨＰＶ　Ｅ２タンパク質によりアップレギュレートされるプロモーターである請求項１の方法。
【請求項５】
前記プロモーターがＨＰＶ−１６からのプロモーターである請求項１の方法。
【請求項６】
前記プロモーターが完全長のＨＰＶ　ＬＣＲを含む請求項１の方法。
【請求項７】
前記プロモーターがＥ２タンパク質に応じて核酸の転写を誘発するために十分な長さのＨＰＶ　ＬＣＲを含む請求項１の方法。
【請求項８】
前記ＬＣＲがＨＰＶ−１６　ＬＣＲである請求項６又は７の方法。
【請求項９】
前記プロモーターがＨＰＶ１６　ＬＣＲプロモーターである請求項１の方法。
【請求項１０】
前記細胞毒遺伝子がリシン遺伝子、アブリン遺伝子、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子及びチミジンキナーゼ遺伝子からなる群より選択される請求項１の方法。
【請求項１１】
前記核酸構造が単純ヘルペスチミジンキナーゼに操作可能にリンクするＨＰＶ−１６プロモーターを含む請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記方法が、さらに細胞をガンシクロビル（ＧＣＶ）及びアシクロビル（ＡＣＶ）と接触させることを含む請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記細胞が癌細胞である請求項１の方法。
【請求項１４】
前記癌細胞が上皮内新生物（ＩＮ）を含む細胞である請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記癌細胞が肛門生殖器間の癌を含む細胞である請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記細胞が転移細胞である請求項１の方法。
【請求項１７】
前記細胞が固形腫瘍である請求項１の方法。
【請求項１８】
異種構造エフェクター遺伝子と操作可能にリンクするＨＰＶプロモーターを含む核酸構造。
【請求項１９】
前記プロモーターがＨＰＶ　Ｅ２タンパク質によりアップレギュレートされる請求項１８の構造。
【請求項２０】
前記プロモーターがＨＰＶ−１６からのプロモーターである請求項１８の構造。
【請求項２１】
前記プロモーターが完全長のＨＰＶ　ＬＣＲである請求項１８の構造。
【請求項２２】
前記プロモーターがＥ２タンパク質に応じて核酸の転写を誘発するために十分な長さのＨＰＶ　ＬＣＲを含む請求項１８の構造。
【請求項２３】
前記プロモーターがＨＰＶ１６　ＬＣＲプロモーターである請求項１８の構造。
【請求項２４】
前記エフェクターがレポーター遺伝子、細胞毒遺伝子、腫瘍抑制遺伝子又はアポトーシス遺伝子からなる群より選択される請求項１８の構造。
【請求項２５】
前記エフェクターが細胞毒遺伝子である請求項１８の構造。
【請求項２６】
前記エフェクターがリシン遺伝子、アブリン遺伝子、シュードモナス外毒素遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子及びチミジンキナーゼ遺伝子からなる群より選択される細胞毒遺伝子である請求項１８の構造。
【請求項２７】
請求項１８〜２６のいずれか１項の構造を含む哺乳動物細胞。
【請求項２８】
レトロウイルスベクター、アデノアソシエイトベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びシンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスベクターからなる群より選択されるベクターにおいて請求項１８〜２６のいずれか１項の構造を含む組成物。
【請求項２９】
前記組成物が単位用量形態の医薬組成物である請求項２８の組成物。
【請求項３０】
脂質、リポソーム、カチオン性脂質及びデンドリマーからなる群より選択されるデリバリーエージェントにおいて請求項１８〜２６のいずれか１項の構造を含む組成物。
【請求項３１】
前記組成物が単位用量形態の医薬組成物である請求項２８の組成物。
【請求項３２】
請求項２５の構造を、細胞中において致死濃度の前記細胞毒を生成するに十分な濃度で用いて、前記細胞をトランスフェクトすることを含むＨＰＶに感染した細胞を治療する方法。
【請求項３３】
さらに前記細胞をガンシクロビル（ＧＣＶ）及びアシクロビル（ＡＣＶ）と接触させることを含む請求項３２の方法。
【請求項３４】
ＨＰＶに感染した細胞を選択的に殺傷するためのキットであり、請求項２８〜３１のいずれか１項の組成物を含むコンテナを含む該キット。
【請求項３５】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を産する細胞を選択的にラベルする方法であって、哺乳動物細胞を、ＨＰＶタンパク質より誘発されるＨＰＶ特異的なプロモーターであって細胞毒遺伝子を含む核酸構造と操作可能にリンクする該プロモーターを符号化する核酸構造を用いてトランスフェクトし、それによりヒトパピローマウイルスが感染した場合には前記細胞がレポーターの発現を誘発し、それにより前記哺乳動物細胞をラベルする、
ことを含む該方法。
【請求項３６】
前記トランスフェクトが、レトロウイルスベクター、アデノアソシエイトベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びシンドビスウイルスベクターからなる群より選択されるベクターを用いるデリバリーを含む請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記トランスフェクトが、脂質、リポソーム、カチオン性脂質及びデンドリマーからなる群より選択されるデリバリーエージェントの使用を含む請求項３５の方法。
【請求項３８】
前記プロモーターがＨＰＶ　Ｅ２タンパク質によりアップレギュレートされるプロモーターである請求項３５の方法。
【請求項３９】
前記プロモーターがＨＰＶ−１６からのプロモーターである請求項３５の方法。
【請求項４０】
前記プロモーターが完全長のＨＰＶ　ＬＣＲである請求項３５の方法。
【請求項４１】
前記プロモーターがＥ２タンパク質に応じて核酸の転写を誘発するために十分な長さのＨＰＶ　ＬＣＲである請求項３５の方法。
【請求項４２】
前記ＬＣＲがＨＰＶ−１６　ＬＣＲである請求項４０又は４１の方法。
【請求項４３】
前記レポーター遺伝子が酵素レポーター、側色レポーター、発光レポーター及び蛍光レポーターからなる群から選択される請求項３５の方法。
【請求項４４】
前記レポーター遺伝子がＦフラックス（Ｆｆｌｕｘ）遺伝子又は緑蛍光タンパク質遺伝子である請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記細胞が癌細胞である請求項３５の方法。
【請求項４６】
前記癌細胞が上皮内新生物（ＩＮ）を含む細胞である請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記癌細胞が肛門生殖器間の癌を含む細胞である請求項４５の方法。
【請求項４８】
前記細胞が転移細胞である請求項３５の方法。
【請求項４９】
前記細胞が固形腫瘍である請求項３５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年５月１２日に出願されたＵＳＳＮ６０／２０３，７０９の一部継続出願であり、その全体が全ての目的について参照として本明細書中に援用される。
連邦政府が支援した研究及び開発の下でなされた発明に対する権利についての声明
［適用なし］
【０００２】
本発明の分野
１つの具体例において、本発明は腫瘍学の分野に関する。より特定的には、本発明はＨＰＶ−感染上皮組織細胞を選択的に殺傷する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
１９７０年代まで、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染は、肛門生殖器間（ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ）のＳＣＣ（扁平細胞癌腫）及びその前駆体、高度の上皮内新生物又は高度の扁平上皮障害としても知られる高度の異形成において偶発的に関連することが次第に明らかになってきた。ＨＰＶ１６は、頚部及び肛門のＳＣＣの両方において発見される最も一般的なＨＰＶ型である。（Ｆｒｉｃｈ等（１９９７）Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　３３７（１９）：１３５０−１３５８；　Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ等（１９９９）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１８９（１）：１２−１９）。最近、ＨＰＶ関連障害用の全ての治療は、ＨＰＶ感染組織の切除又は除去に頼っている。これらの方法はＨＰＶ感染それ自体を治療せず、ウイルスは病気が再び発生する危険を被る前に取り去られる。癌への進行を妨げるために実行できる上皮腫瘍用のより良い治療方法の発展が緊急に必要性とされる。この仕事のゴールは、最近の遺伝子治療のアプローチを改良し、特に初期のＨＰＶ遺伝子（例えばＨＰＶ−１６）を発現させ及びＨＰＶネガティブ細胞に対し極微の毒となるケラチン生成細胞を除去することである。
【０００４】
ＨＰＶ遺伝子発現の調節は複雑であり、そして細胞及びウイルスの転写因子によりコントロールされる。ＨＰＶ腫瘍タンパク質Ｅ６及びＥ７の発現は、通常の頚部上皮細胞及び本来のヒトケラチン生成細胞のインビトロでの不死化に必要であり、そしてアップストリームレギュレーション領域（ＵＲＲ（ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｒｅｇｉｏｎ））又はロングコントロール領域（ＬＣＲ（ｌｏｎｇ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎ））中の調節シーケンスに依存する。ほとんどのＨＰＶ型について、ＬＣＲは主要な転写調節領域であり、そしてプロモーターシーケンスと同様に複数のホスト転写因子結合サイトを含む。（Ｂｅｒｎａｒｄ　ａｎｄ　（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔａｌｏｇｙ．１３０：　２１０−２１５；　Ｂｏｕｖａｒｄ等（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：　５４５１−５４５９；　Ｃｈｅｎ等（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５７：１６１４−１６１９；　Ｃｒｉｐｅ等（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：　３７４５；　Ｓｃｈｗａｒｚ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：１１１；ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１８４：９−１３）。複製シーケンスの起点（ｏｒｉ）もこの領域に含まれる。
【０００５】
ＨＰＶ　Ｅ１及びＥ２タンパク質は、ウイルスの複製及び転写のために重要なウイルス因子である（Ｂｅｒｎａｒｄ　ａｎｄ　（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔａｌｏｇｙ．１３０：　２１０−２１５；　Ｂｏｕｖａｒｄ等（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：　５４５１−５４５９；　Ｃｈｅｎ等（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５７：１６１４−１６１９；　Ｃｒｉｐｅ等（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：　３７４５；　ＭｃＢｒｉｄｅ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８４１１−１８４１４）。Ｅ２タンパク質は、１２−塩基対パリンドロームシーケンス、ＡＣＣＮ６ ＧＧＴ（シーケンスＩＤ　ＮＯ：１）、これはＥ２結合サイト（Ｅ２ＢＳ）として働く、と結合する転写調節体である（Ｂｏｕｖａｒｄ等（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：　５４５１−５４５９；　Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｃｈｅｎ等（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５７：１６１４−１６１９；　Ｈａｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｂｏｔｃｈａｎ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４（５４２０）：１６７３；　ＭｃＢｒｉｄｅ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８４１１−１８４１４）。ほとんどのＨＰＶからのＬＣＲは、４つのＥ２ＢＳ及び１つのＥ１結合サイトを含む。ＨＰＶ　Ｅ２タンパク質は、ＬＣＲプロモーターの活性化／抑制において及びＥ２発現を自動調節することにおいて、調節の役割を果たす。Ｅ２タンパク質はＨＰＶプロモーターを活性化又は抑制する能力を有し、それはＥ２結合サイトの位置及び完全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）のＥ２タンパク質の量に依存する（Ｂｅｒｎａｒｄ　ａｎｄ　（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔａｌｏｇｙ．１３０：　２１０−２１５；　Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　ＭｃＢｒｉｄｅ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８４１１−１８４１４）。低レベルの完全長のＥ２タンパク質が示され、他のホスト転写因子と組み合わせたＥ６プロモータからの転写を刺激するが、高いレベルの完全長のＥ２タンパク質がＥ６プロモータを抑制し得る。このフィードバック機構は、ＨＰＶゲノムがエピソーム形態にて維持される場合にほとんど観察される（Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｍａｉｔｌａｎｄ等（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　１８６（３）：２７５−８０；　Ｓｔｏｌｅｒ等（１９９２）Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２３（２）；　ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１８４：９−１３）。
【０００６】
低度及び高度の頚部上皮内新生物（ＣＩＮ）におけるＨＰＶ１６　Ｅ２転写因子のパターンを発現させる研究は、Ｅ２発現がＣＩＮ　Ｉ及びコイロサイト（ｋｏｉｌｏｃｙｔｉｃ）障害において最も高いことを示す。Ｅ２発現は、頚部上皮の表層にて検出され、ＣＩＮ　Ｉは基底層において検出される（Ｍａｉｔｌａｎｄ等（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１８６（３）：２７５−２８０）。　ＣＩＮ　ＩＩ障害においては、より低い発現が観察され、そしてＣＩＮ　ＩＩＩ 障害においてはほとんど観察されない。反対に、細胞内分布が非常に拡散したものであっても、浸潤癌においてＥ２発現の数種の回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）が存在する。
【０００７】
発明の概要
本発明は、特に早期にＨＰＶ（例えばＨＰＶ１６）を発現するケラチン生成細胞（又は他の細胞）を消滅させるための新規な遺伝子治療アプローチを提供する。本明細書中で記載される方法は、ＨＰＶ−ネガティブ細胞に対して、極微の毒性である。
【０００８】
本発明は所定のＨＰＶタンパク質（例えばＥ２タンパク質）の能力を利用し、ウイルス性ＨＰＶプロモータ因子をトランスアクティベート（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）し、外因性細胞毒性遺伝子／ｃＤＮＡ（例えば単純性遺伝子−ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）チミジンキナーゼ（ＴＫ））の発現をさせる（例えばＭｏｏｌｔｅｎ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．１：２７９−２８７；　Ｍｕｌｌｅｎ（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒａｐｙ，６３：１９９−２０７；　Ｎｉｓｈｉｈａｒａ等（１９９８）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１５２１−１５２６参照）。
【０００９】
好ましい態様において、この方法は、ＨＰＶ　Ｅ２応答性プロモータ配列のコントロール下で、ＬＣＲからＨＰＶに感染した又は感染する危険性が高い哺乳動物（ヒト又は獣）の細胞内へ、細胞毒性遺伝子（例えばＨＳＶ　１−細胞毒性殺傷遺伝子）を含む核酸構造を移すことを含む。細胞がＨＰＶに感染する場合、ＨＰＶタンパク質（例えばＥ２）が発現し、結果として該構造のトランスアクティベーション、及び細胞を殺すか又は１種又はそれ以上の医薬（例えばガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）等）に対して感受性にする細胞毒の発現を生じる。
【００１０】
それゆえ、ある態様において、本発明は選択的に（成長又は増殖を）抑制し或いはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を産する細胞を選択的に殺す方法を提供する。本方法は、ＨＰＶタンパク質により誘発されるＨＰＶ特異性プロモーターを符号化する核酸構造を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトすることを含み、プロモーターは細胞毒性遺伝子を含む核酸と操作可能にリンクし、それにより、前記細胞が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が感染する場合に細胞毒性遺伝子の発現を誘発し、それにより哺乳動物細胞の死を生じる。
【００１１】
所定の具体例において、当該トランスフェクトはレトロウイルスベクター、アデノアソシエイトベクター（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｅｃｔｏｒ）（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びシンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスベクターからなる群より選択されるベクターを用いるデリバリーを含む。トランスフェクトはデリバリーエージェント（トランスフェクションエージェント）、例えば脂質、リポソーム、カチオン性脂質及びデンドリマーからなる群より選択されるエージェントを使用することを含む。
【００１２】
該構造を含むプロモーターは、ＨＰＶ　Ｅ２タンパク質によりアップレギュレートされる（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。好適なプロモーターの１つはＨＰＶ−１６からのものである。限定するものではないが、他の好適なプロモーターは、本明細書中の表１において特定されるＨＰＶからのプロモーターを含む。所定の好適なプロモーターは、完全長のＨＰＶ　ＬＣＲを含む。所定の好適なプロモーターは、ＨＰＶタンパク質に応じて核酸の転写を起こすためのＨＰＶ　ＬＣＲの長さを含む。限定するものではないが、好適なＨＰＶ　ＬＣＲは本明細書中の表１にて特定されるＨＰＶからのＬＣＲを含む。所定の特に好適な具体例において、ＬＣＲはＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１又はＨＰＶ−１６ＬＣＲである。所定の最も好適な具体例において、プロモーターは、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１又はＨＰＶ−１６プロモーターである。
【００１３】
好ましい細胞毒遺伝子は（ｃＤＮＡ）は、限定するものではないが、リシン遺伝子、アブリン遺伝子、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子及びチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含む。１つの好適な具体例において、核酸構造は、単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子と操作可能にリンクするＨＰＶ−１６プロモーターを含む。
【００１４】
細胞毒性遺伝子がｔｋ遺伝子の場合は、本方法はさらに細胞とガンシクロビル（ＧＣＶ）、アシクロビル（ＡＣＶ）又はそれらの同属体（例えば、バルガンシクロビル（ｖａｌｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）及びバルアクロビル（ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ）等のようなＧＣＶ及びＡＣＶのバリルエステル）とを接触させることを含む。所定の具体例において、細胞は上皮細胞、癌細胞、上皮内新生物（ＩＮ）を含む細胞、肛門生殖器間の癌を含む細胞、転移癌、固形腫瘍を含む癌、疣を含む細胞である。
【００１５】
他の具体例において、異種構造エフェクター遺伝子と操作可能にリンクするＨＰＶプロモーターを含む核酸構造を提供する。好適な具体例において、ＨＰＶプロモーターはＨＰＶタンパク質（例えばＨＰＶ　Ｅ２タンパク質）によりアップレギュレートされたプロモーターである。好適なプロモーターは、限定するものではないが、本明細書中の表１内に特定されるＨＰＶからのプロモーターを含み、より好ましくはＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１又はＨＰＶ−１６からのプロモーターを含む。所定の具体例において、プロモーターは完全長のＨＰＶ　ＬＣＲである。所定の具体例において、プロモーターは十分な長さのＨＰＶ　ＬＣＲであり、Ｅ２タンパク質に応じて核酸の転写を誘発する。特に好ましい具体例において、プロモーターは、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１又はＨＰＶ−１６ＬＣＲプロモーターである。
【００１６】
好適な具体例において、エフェクターはレポーター遺伝子、細胞毒遺伝子、腫瘍抑制遺伝子又はアポトーシス遺伝子である。特に好適な細胞毒遺伝子は、限定するものではないが、リシン遺伝子、アブリン遺伝子、シュードモナス外毒素遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子及びチミジンキナーゼ遺伝子を含む。
【００１７】
さらに他の具体例において、本発明は本明細書中に記載の１種又はそれ以上の核酸構造を含んだ哺乳動物細胞を含む
【００１８】
本発明は、本明細書中に記載の核酸構造を含むベクターを含む組成物をも提供する。好適なベクターは、限定するものではないが、レトロウイルスベクター、アデノアソシエイトベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びシンドビスウイルスベクターを含む。組成物はさらに薬理学的に許容される賦形剤を含むことができる。所定の具体例において、組成物は単位用量形体（ｕｎｉｔ　ｄｏｓａｇｅ　ｆｏｒｍ）における医薬組成物である。
【００１９】
所定の具体例において、本発明はデリバリーエージェントにて本明細書中に記載されたような核酸構造を含む組成物を提供する。好適なデリバリーエージェントは、限定するものではないが、脂質、リポソーム、カチオン性脂質及びデンドリマーを含む。組成物は、さらに薬理学的に許容される賦形剤を含むことができる。所定の具体例において、組成物は単位用量形体における医薬組成物である。
【００２０】
本発明は、ＨＰＶに感染した細胞を治療する方法も提供する。本方法は本明細書中に記載される核酸構造を用いて細胞をトランスフェクトすることを含む。該構造は、好ましくは十分な濃度にてトランスフェクトされ、細胞内に致死濃度の細胞毒を生成する。本方法はさらに前記細胞をガンシクロビル（ＧＣＶ）、アシクロビル（ＡＣＶ）又はそれらの同属体と接触させることを含む。
【００２１】
さらに提供されるものは、ＨＰＶに感染した細胞を選択的に殺すためのキットである。該キットは、好ましくは本明細書中に記載される１種又はそれ以上の構造及び／又は組成物を含有するコンテナを含む。
【００２２】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を産する細胞を選択的にラベルする方法も提供する。これらの方法は、哺乳動物細胞を、ＨＰＶタンパク質により誘発されるＨＰＶ特異性プロモーターを符号化する核酸構造物を用いてトランスフェクトすることを含み、ここで該プロモーターはレポーター遺伝子を含む核酸と操作可能にリンクし、それにより細胞はヒトパピローマウイルスに感染する場合に哺乳動物細胞をラベルするレポーター遺伝子の発現を誘発する。トランスフェクトはベクター（レトロウイルスベクター、アデノアソシエイトベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等）を使用するデリバリーを含むことができる。トランスフェクトはデリバリーエージェント（例えば脂質、リポソーム、カチオン性脂質及びデンドリマー）を使用することを含む。
【００２３】
好ましい具体例において、プロモーターはＨＰＶ　Ｅ２タンパク質によってアップレギュレートされたプロモーターである。好適なプロモーターは、限定するものではないが、本明細書中の表１内に特定されるＨＰＶからのプロモーターを含み、より好ましくはＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１又はＨＰＶ−１６からのプロモーターを含む。所定の好ましいプロモーターは、完全長のＨＰＶ　ＬＣＲを含む。所定の好ましいプロモーターは、Ｅ２タンパク質に応じて核酸の転写を誘発するために十分な長さのＨＰＶ　ＬＣＲを含む。特に好ましいプロモーターは、限定するものではないがＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１又はＨＰＶ−１６　ＬＣＲを含む。好適なレポーター遺伝子は、限定するものではないが、酵素レポーター、側色レポーター、発光レポーター及び蛍光レポーターを含む。特に好ましいレポーターは、Ｆフラックス（Ｆｆｌｕｘ）遺伝子又は緑蛍光タンパク質遺伝子を含む。所定の具体例において、細胞は上皮細胞、癌細胞、上皮内新生組織（ＩＮ）を含む細胞、肛門生殖器間の癌を含む細胞、転移癌、固形腫瘍を含む癌、疣を含む細胞等である。
【００２４】
定義
本明細書中で使用される「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」とは、核酸が細胞に入るような、核酸のターゲット細胞へのデリバリーを意味する。用語「核酸」とは、分子量に関係無くＤＮＡとＲＮＡの両方を含み、そして用語「発現」とは細胞内の核酸の機能的な存在が任意に現れることであり、限定するものではないが、転写及び／又は翻訳並びに一過性発現及び安定発現の両方を含むものであると理解される。
【００２５】
「デリバリー」とは、所望の化合物が最終的にターゲット細胞内部又はターゲット細胞膜内又は膜上に位置するように、ターゲット細胞へ所望の化合物が移動されるプロセスを意味する。本発明の化合物の使用の多くにおいて、所望の化合物はターゲット細胞により直ちに吸収されない、そして脂質集合体を経由するデリバリーは所望の化合物を細胞内に得るための方法である。所定の使用において、特にインビボの条件下で、特定のターゲット細胞型へのデリバリーが好ましく、そして本発明の化合物により容易化される
【００２６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書中で交換可能に使用され、アミノ酸残渣のポリマーを意味する。この用語は、１種又はそれ以上のアミノ酸残渣が、自然発生したアミノ酸はもちろん、自然発生したアミノ酸に相当する人工アミノ酸類似物であるアミノ酸ポリマーに対して適用される。この用語はポリペプチドを作るアミノ酸を連結する伝承（ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ）ペプチド結合における変異体も含む。
【００２７】
本明細書中で、用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」或いは文法的に同等なものは少なくとも２つの一緒に共有結合するヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一本鎖又は二本鎖であり、そして以下に概説するように、数種の場合には代わりのバックボーンを有することができる代替の核酸類似物、例えばホスファアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ等（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）１９２５）及びそこでの参考文献；Ｌｅｓｔｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；　Ｓｐｒｉｎｚｌ等（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；　Ｌｅｓｔｉｎｇｅｒ等（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１４：３４８７；　Ｓａｗａｉ等（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５，　Ｌｅｓｔｉｎｇｅｒ等（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；　及びＰａｕｗｅｌｓ等（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ　Ｓｃｒｉｐｔａ　２６：１４１９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇ等（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１９：１４３７；　及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ等（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ参照）、並びにペプチド核酸バックボーン及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；　Ｍｅｉｅｒ等（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；　Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６；　Ｃａｒｌｓｓｏｎ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　３８０：２０７参照）を含むが、通常はホスホジエステル結合を含む。他の類似する核酸はポジティブバックボーンを有するもの（Ｄｅｎｐｃｙ等（１９９５）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：６０９７）；非イオン性バックボーンを有するもの（米国特許第５，３８６，０２３号、５．６３７，６８４号、５，６０２，２４０号、５，２１６，１４１号及び４，４６９，８６３号；　Ａｎｇｅｗ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ　３０：４２３；　Ｌｅｓｔｉｎｇｅｒ等（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；　Ｌｅｓｔｉｎｇｅｒ等（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１３：１５９７；　Ｃｈａｐｔｅｒ　２及び３，ＡＳＣ，Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　５８０，” Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ” ，Ｅｄ．　Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ　ａｎｄ　Ｐ．Ｄａｎ　Ｃｏｏｋ；　Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ等（１９９４），　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；　Ｊｅｆｆｓ等Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＮＭＲ　３４：１７；　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、及び非リボースバックボーン（米国特許第５，２３５，０３３号及び５，０３４，５０６号並びに　Ｃｈａｐｔｅｒ　６及び７，ＡＳＣ，Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　５８０，” Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ” ，Ｅｄ．　Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ　ａｎｄ　Ｐ．Ｄａｎ　Ｃｏｏｋに記載されるものを含む）を有するものを含む。１種又はそれ以上の炭環式糖を含有する核酸も核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ等（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ　ｐｐ１６９−１７６参照）。種々の核酸同属体がＲａｗｌｓ，　Ｃ＆Ｅ　Ｎｅｗｓ　６月２日，１９９７　３５頁に記載される。リボース−ホスファターゼバックボーンのこれらの修飾は、ラベルのようなさらなる部位を付け加えることを容易化し、又は生理学的な環境におけるこのような分子の安定性及び半減期を増加させるために行われることができる。
【００２８】
用語「異種構造」とは、それが符号化シーケンス及び調節シーケンスのような核酸シーケンスに関するとき、組換え構造の領域に一般的に結合し及び／又は特定の細胞に一般的に結合するシーケンスを意味ずる。それゆえ、核酸構造の「異種構造」領域は、天然には他の分子に結合して発見できない、他の核酸分子中の又はそれに付着する核酸の特定可能なセグメントである。例えば該構造の異種構造領域は、天然のシーケンスの符号化に関連して発見できないシーケンスにより、フランク（ｆｌａｎｋ）されるシーケンスを符号化することを含む。異種構造符号化シーケンスの他の例は、符号化シーケンス自体が天然に発見できない構造（例えばネイティブ遺伝子と異なるコドンを有する合成遺伝子）である。同様に、通常はホスト細胞中に存在しない構造を有する変換されたホスト細胞は、本発明の目的において異種構造とみなされる。
【００２９】
本明細書中で使用される「操作可能にリンクする」とは、プロモーターが核酸へ、プロモーターが核酸シーケンスの転写を媒介／調節するようにリンクすることを意味する。
【００３０】
発現を「誘発する」とは、遺伝子又はｃＤＮＡの転写及び／又は翻訳における増加を意味する。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１は本明細書中に記載される方法の１つの具体例である。ＨＰＶ１６　Ｅ２タンパク質を発現する細胞株は、ＨＰＶ１６　ＬＣＲのコントロール下でＨＳＶ１−ＴＫを発現するプラスミドを用いてトランスフェクトされた。プロドラッグＧＣＶ又はＡＣＶを用いたこれらの細胞の治療は、毒性燐酸化ＧＣＶ（ＧＣＰ）又は燐酸化ＡＣＶ（ＡＣＰ）の形成により細胞死を引き起こす。
【００３２】
図２は複製及び染色体外に維持されることができる遺伝子治療を表す。
【００３３】
図３Ａは初期プロモーターＰ９７の上流におけるＨＰＶ１６ウイルスＬＣＲの概略図である。Ｅ２の箱はＥ２タンパク質の結合サイトを表す。ＬＣＲは、示されるようなＡＰ１及びＮＦ１を含む多数のホスト転写因子のための結合サイトを含む。エンハンサーの箱はＨＰＶ１６の主要な構造エンハンサーの領域における転写因子用の結合サイトを含む。数字はＨＰＶ１６ゲノム内のヌクレオチド位置を表す。図３Ｂは、本研究において使用されるプラスミドの概略図である。プラスミドｐＮＳＸＨ−４、ｐＮＳＧＬＴＫ−８及びｐＮＳＧＬ０は、全てがルシフェラーゼ−ｌｕｃ＋ 遺伝子を運ぶｐＧＬ３ベーシックベクター（プロメガ社）から誘導される。
【００３４】
図４はｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いたトランスフェクションの７日後のＣａＳｋｉ細胞におけるＨＳＶ１−ＴＫ及びＨＰＶ−１６　Ｅ２のＲＴ−ＰＣＲ分析である。レーンＡ、Ｂ、及びＣは、約２８８の塩基対の生成物を与えるＨＳＶ１−ＴＫ特異性プライマーを使用して増幅されたＲＴ−ＰＣＲ生成物を表す。レーン（Ａ）ＨＳＣ３細胞からのｍＲＮＡ、（Ｂ）ＣａＳｋｉ細胞からのｍＲＮＡ、（Ｃ）ネガティブコントロールとしてＲＴを有さないＣａＳｋｉ細胞からのｍＲＮＡ。レーンＤ、Ｅ及びＦは、約２１６の塩基対の生成物を与えるＨＰＶ−１６　Ｅ２特異性プライマーを使用して増幅されたＲＴ−ＰＣＲ生成物を表す。レーン（Ｄ）ＨＳＣ３細胞からのｍＲＮＡ、（Ｅ）ＣａＳｋｉ細胞からのｍＲＮＡ、（Ｆ）ネガティブコントロールとしてＲＴを有さないＣａＳｋｉ細胞からのｍＲＮＡ。
【００３５】
図５はＨＰＶ１６ポジティブ及びＨＰＶ１６ネガティブ細胞株によるルシフェラーゼ発現の刺激を表す。ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ及びＨＳＣ３細胞株は、ＨＰＶ１６　ＬＣＲプロモーターのコントロール下でルシフェラーゼ遺伝子を運ぶｐＮＳＸＨ−４プラスミドを用いてトランスフェクトされる。親のプラスミドｐＧＬ３ベーシック（プロメガ社）からの活性は、参照として使用した。トランスフェクションより２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定し、そして対数スケールでプロットした。値は３つの平均である；バーは標準偏差を表す。
【００３６】
図６は　ＣａＳｋｉ細胞における、ガンシクロビル（ＧＣＶ）のインビトロでの細胞毒における投与量依存を表す。細胞は、０、５、１０及び２０μｇ／ｍｌ濃度のＧＣＶを用いて治療する前に、ｐＮＳＧＬＴＫ−８又はｐＮＳＧＬ０を用いてトランスフェクトし、又はＤＮＡを用いずに模擬トランスフェクトした。細胞生存能力を、治療の６日後におけるＭＴＳ細胞増殖アッセイにより測定した。値は３つの平均である；バーは標準偏差を表す。
【００３７】
図７はＣａＳｋｉ細胞における２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶのインビトロでの細胞毒の時間経過分析である。細胞はＧＣＶを用いて治療する前に、ｐＮＳＧＬＴＫ−８又はｐＮＳＧＬ０を用いてトランスフェクトし、又はＤＮＡを用いずに模擬トランスフェクトした。細胞生存能力を、ＧＣＶ治療の２、４、６及び１０日後におけるＭＴＳ細胞増殖アッセイにより測定した。値は３つの平均である；バーは標準偏差を表す。
【００３８】
図８は、ＣａＳｋｉ細胞におけるアシクロビル（ＡＣＶ）のインビトロでの細胞毒の投与量依存性を表す。細胞は、０、１０、２０及び３０μｇ／ｍｌ濃度のＡＣＶを用いて治療する前に、ｐＮＳＧＬＴＫ−８又はｐＮＳＧＬ０を用いてトランスフェクトされ、又はＤＮＡを用いずに模擬トランスフェクトした。細胞生存能力を、治療の１０日後におけるＭＴＳ細胞増殖アッセイにより測定した。値は３つの平均である；バーは標準偏差を表す。
【００３９】
図９は、３種の異なる細胞株：ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ及びＨＳＣ３における２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶのインビトロの細胞毒性を表す。細胞はＧＣＶを用いて治療する前に、ｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトし、又はＤＮＡを用いずに模擬トランスフェクトした。細胞生存能力を、治療の６日後におけるＭＴＳ細胞増殖アッセイにより測定した。値は３つの平均である；バーは標準偏差を表す。
【００４０】
図１０Ａ−１０Ｄは、ＨＰＶ１６　ＬＣＲプロモーターのコントロール下でＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現するｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトされ及び２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶに６日間曝されたＣａＳｋｉ細胞におけるアポトーシスの誘発を表す。細胞は修飾されたビオチニル化ＴＵＮＥＬ染色を使用して分析され、それは壊れたＤＮＡを暗褐色に染色する。細胞をＧＣＶに曝露後、以下の時間において分析した、図１０Ａ：０日、基準レベルのアポトーシスを示す、図１０Ｂ：２日、壊れたＤＮＡを染色する暗褐色を有する多数の細胞が存在する：図１０Ｃ：４日細胞は高度に濃縮された核又は非常に暗褐色の壊れたＤＮＡを有する、図１０Ｄ：６日、細胞の死により非常に少ない細胞が見える。細胞は細胞質が出ていったアポトーシス形態及び壊れた核を表す。
【００４１】
図１１Ａ−１１Ｃは、ＬＣＲプロモーターのコントロール下でＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現するｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトされ及び２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶに１０日間曝されたＣａＳｋｉ細胞におけるアポトーシスの誘発を表す。細胞は修飾されたビオチニル化ＴＵＮＥＬ染色を使用して分析され、それは壊れたＤＮＡを暗褐色に染色する。細胞をＧＣＶに曝露後、以下の時間にて分析した、図１１Ａ：０日、基準レベルのアポトーシス、図１１Ｂ：８日、細胞は暗褐色の壊れた核を示す、：図１１Ｃ：１０日、細胞は壊れた核を示し、細胞は細かい細胞内の結合を作り、そしてアポトーシスのボディを含む細胞はほとんど見られない。
【００４２】
図１２Ａ−１２Ｄは、ＨＰＶ１６　ＬＣＲプロモーターのコントロール下でＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現するｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトされ及び２０．０μｇ／ｍｌのＡＣＶに１０日間曝されたＣａＳｋｉ細胞におけるアポトーシスの誘発を表す。細胞は修飾されたビオチニル化ＴＵＮＥＬ染色を使用して分析され、それは壊れたＤＮＡを暗褐色に染色する。細胞をＡＣＶに曝露後、以下の時間にて分析した、図１２Ａ：０日、基準レベルのアポトーシス、図１２Ｂ：２日、壊れたＤＮＡを染色する暗褐色を有する多数の細胞が存在する、図１０Ｃ：６日、細胞は細胞質が出ていって壊れた形態及び壊れた核を表す、及び図１２Ｄ：１０日、細胞の死により数の減少が見られる。残った細胞は壊れた核及び数個の壊れたボディが見られる。
【００４３】
図１３は４種のパピローマウイルスＥ２タンパク質、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１１及びウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）−１のシーケンスアライメントを表し、トランスアクティベーション領域残渣の保存を表す。
【００４４】
図１４は、ＨＳＶ１−ＴＫ構造を用いてトランスフェクトされ及び変動するレベルのガンシクロビルに曝されたＨＰＶポジティブ及びＨＰＶネガティブ細胞の生存を表す。ＨＰＶポジティブ細胞はＣａＳｋｉ細胞であった。ＨＰＶネガティブ細胞は、ＨＳＣ３ヒト口腔癌細胞株、ＭＤＣＫ−Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ肝臓細胞株、Ｖｅｒｏ−Ａｆｒｉｃａｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎｋｅｙ肝臓細胞株及びヒト口腔扁平上皮細胞癌細胞、ＳＳＣ９であった。
【００４５】
図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃは、トランスフェクトされた細胞中のＨＳＶ１−ＴＫ構造（ｐＮＳＧＬＴＫ−８）の検出を表す。図１５ＡはＰＩによる細胞の核染色を表す。図１５Ｂは抗ＨＳＶ１−ＴＫ染色を表す。図１５Ｃは、ＨＳＶ１−ＴＫタンパク質の溶解した核及び細胞質分布を表す。
【００４６】
図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃは、ガンシクロビルで処理されたアポトーシス細胞におけるＨＳＶ１−ＴＫ構造（ｐＮＳＧＬＴＫ−８）の検出を表す。図１６ＡはＰＩによる細胞の核染色を表す。図１６Ｂは抗ＨＳＶ１−ＴＫ染色を表す。図１６Ｃは、ＨＳＶ１−ＴＫタンパク質の溶解した核及び細胞質分布を表す。
【００４７】
詳細な説明
本発明は、ケラチン生成細胞又は早期にＨＰＶ遺伝子（例えばＨＰＶ１６）を発現する他の細胞（例えば、高度の新生物（ＩＮ）又は高度の上皮扁平上皮新生組織異形成（ＳＩＬ）としても知られる高度の形成異常）を特定的に除去する新規な遺伝子治療アプローチを提供する。本発明の方法は、ＨＰＶに感染した細胞（例えばＨＰＶタンパク質を発現する細胞）の迅速な検出及び／又は効率的な殺傷を提供し、ＨＰＶネガティブ細胞に対しては極微の毒性である。
【００４８】
本発明の方法は、ＨＰＶタンパク質（例えばＥ２タンパク質）の能力を利用し、ウイルスプロモーター（例えばウイルスＨＰＶ１６プロモーター因子）をトランスアクティベート（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）し、外因性細胞毒及び／又は外因性レポーター遺伝子の発現をさせる（例えば単純性遺伝子−ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）チミジンキナーゼ（ＴＫ）（３２，３３，３４））。好適な具体例において、本方法は細胞毒及び／又はレポーター遺伝子を、ＨＰＶに感染する又は感染し得る細胞内へ移動させることを含む。
【００４９】
トランスフェクトされた細胞がＨＰＶに感染し又はＨＰＶに感染したものとなった場合は、発現されたＨＰＶタンパク質はウイルスプロモーターのコントロール下で遺伝子の発現を誘発する。該遺伝子は、典型的には対象細胞を殺すか細胞を細胞毒試薬（例えばガンシクロビル、アシクロビル等）に対して感受性にする細胞毒を発現する。その代わりに、又はさらに、異種構造遺伝子は１種又はそれ以上の検出可能なラベルを符号化し、感染細胞の迅速な特定及び／又は対象細胞内のＨＰＶの存在の確認を可能にする。
【００５０】
所定の好適な具体例において、異種構造遺伝子は細胞毒チミジンキナーゼ遺伝子（例えばＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）である。該遺伝子はＨＰＶ　ＬＣＲからのＨＰＶ　Ｅ２−応答プロモーター配列である。Ｅ２を発現する細胞は、それらをガンシクロビル（ＧＣＶ）又はアシクロビル（ＡＣＶ）のような非毒性プロドラッグに対して感受性にするＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現する。トランスフェクトされた細胞中のＨＳＶ１−ＴＫタンパク質ＧＣＶ又はＡＣＶをモノ燐酸化ＧＣＶ又はＡＣＶへそれぞれ燐酸化し、それから細胞質のキナーゼにより三燐酸化される。三燐酸化ＧＣＶ又はＡＣＶは細胞質のＤＮＡ内への導入において細胞死を誘発する。このスキームを図１のモデルとして描く。
【００５１】
細胞毒の選択的なアップレギュレートは、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）前駆体に対する新規なＨＰＶ特異性アプローチを表す。我々は、障害の比較的アクセス可能な膜領域及びこのサイトへの薬のデリバリーの比較的容易性が与えられる肛門生殖器間の上皮の治療が、このアプローチの成功のために理想的な適応であると信じる。
【００５２】
しかし、本発明の方法はＨＰＶ１６に対するものに限定されないことが分かる。むしろ本方法は任意のＨＰＶ感染及び関連する病理学に適用できる。数種の代表的なＨＰＶ型及び関連する臨床上の疾患を表１に示す。
2004505892.tif 000002
【００５３】
多数のプロモーターが本発明の方法を行うのに適している。好ましい具体例において、ＨＰＶタンパク質の存在に応答する任意のプロモーターは、本発明の構造物を使用するのに好適である。このようなプロモーターは野生型又は修飾されたＨＰＶから直ちに誘導される。
【００５４】
ＨＰＶ遺伝子発現の調節は、細胞質及びウイルス転写因子により調節される。ＨＰＶ腫瘍タンパク質Ｅ６及びＥ７の発現は、例えば、通常の頚部上皮細胞及び本来のヒトケラチン生成細胞のインビトロでの不死化に必要であり、そして上流のロングコントロール領域（ＬＣＲ（ｌｏｎｇ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎ））中の調節シーケンスに依存する。
【００５５】
ほとんどのＨＰＶ型について、上流調節領域（ＵＲＲ）又はＬＣＲは主要な転写調節領域であり、プロモーターシーケンス同様に多くのホスト転写因子結合サイトを含む（Ｂａｒｎａｒｄ　ａｎｄ　Ａｐｔ（１９９４）Ｄｅｒｍａｔａｌｏｇｙ，１３０：２１０−２１５；　Ｂｏｕｖａｒｄ等（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ．，１３：５４５１−５４５９；　Ｃｈｅｎ等（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５７：１６１４−１６１９；　Ｃｒｉｐｅ等（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：　３７４５；　Ｒｏｍａｎｃｚｕｋ等（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：１６０２−１６１１；　Ｓｃｈｗａｒｚ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：１１１；　ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１８４：９−１３）。複製シーケンスの起点（ｏｒｉ）もこの領域に含まれる。ＨＰＶ　Ｅ１及びＥ２タンパク質は、ウイルス複製及び転写のための重大なウイルス因子である（Ｂｅｒｎａｒｄ及びＡｐｔ（１９９４）Ｄｅｒｍａｔａｌｏｇｙ，１３０：２１０−２１５；　Ｂｏｕｖａｒｄ等（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：５４５１−５４５９；　Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０；　Ｃｒｉｐｅ等（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３７４５；　Ｄｏｗｈａｎｉｃｋ等（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９（１２）：７７９１−７７９９；　Ｓｔｅｇｅｒ等（１９９６）Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７４：１７３−１８５；Ｔｈｉｅｒｒｙ及びＹａｎｉｖ（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．，６：６６５５−６６６６）。Ｅ１タンパク質及びＥ２タンパク質は、起点認識及び複製開始のために必要である。Ｅ２タンパク質は重要な転写調節体でもあり、１２塩基対パリンドロームシーケンス、ＡＣＣＮ６ＧＧＴ（シーケンスＩＤ　ＮＯ：１）に結合し、それはＥ２結合サイトとしての役割を果たす（Ｅ２ＢＳ）（Ｂｏｕｖａｒｄ等（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：　５４５１−５４５９；　Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｃｈｅｎ等（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５７：１６１４−１６１９；　Ｈａｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｂｏｔｃｈａｎ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４（５４２０）：１６７３；　ＭｃＢｒｉｄｅ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８４１１−１８４１４）。ほとんどのＨＰＶからのＬＣＲは４つのＥ２ＢＳ及び１つのＥ１結合サイトを含む。
【００５６】
ＨＰＶ　Ｅ２タンパク質は、Ｅ２結合サイトの位置又は完全長のＥ２タンパク質の量に依存して、ＨＰＶプロモーターを活性化又は抑制能力を有する（Ｂｅｒｎａｒｄ　ａｎｄ　（１９９４）Ａｐｔ　Ｄｅｒｍａｔａｌｏｇｙ．１３０：　２１０−２１５；　Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｄｏｗｈａｎｉｃｋ等（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９（１２）：７７９１−７７９９；　ＭｃＢｒｉｄｅ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８４１１−１８４１４；　Ｒｏｍａｎｃｚｕｋ等（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：１６０２−１６１１；　Ｔｈｉｅｒｒｙ及びＹａｎｉｖ（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．，６：６６５５−６６６６）。低レベルの完全長のＥ２タンパク質は、他のホスト転写因子と組み合わせてＥ６プロモーターからの転写を刺激することが示される。
【００５７】
Ｅ２タンパク質は、Ｅ６プロモーターの活性化／抑制を良好に調節し、Ｅ２レベルを自動調節し及びＥ２及びＥ７腫瘍タンパク質のレベルを調節することにおいて、重要なバランスをとる役割を果たす。このフィードバック機構は、ＨＰＶゲノムがエピソームのままである場合は、感染の早い段階中にほとんどが基底細胞又は副基底細胞内で観察される（Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｍａｉｔｌａｎｄ等（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　１８６（３）：２７５−２８０；　Ｓｔｏｌｅｒ等（１９９２）Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２３（２）；　ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１８４：９−１３）。低度又は高度のＣＩＮにおけるＨＰＶ１６転写因子Ｅ２の発現パターンを調査する研究は、ＣＩＮ　Ｉ及びコイロサイト（ｋｏｉｌｏｃｙｔｉｃ）障害においてＥ２発現が最も高いことを示す。ＣＩＮ　ＩＩ障害においては、より低い発現が観察され、そしてＣＩＮ　ＩＩＩ 障害においてほとんど観察されない。反対に、細胞内分布が非常に分散したものであっても、浸潤癌においてＥ２発現の数種の回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）が存在する。Ｅ２発現は、ＣＩＮ　Ｉの基底層同様に、頚部上皮の表層にて検出される（Ｍａｉｔｌａｎｄ等（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１８６（３）：２７５−２８０）。
【００５８】
好適な具体例において、本発明はＨＰＶタンパク質に対して、より好ましくはＨＰＶ　Ｅ１又はＥ２タンパク質に対して応答性のプロモーターを利用する。最も好ましくは、プロモーターはＥ２対して応答性の（例えばＥ２により誘発され及び／又はアップレギュレートされる）プロモーターである。特に好ましい具体例において、プロモーターは完全長のＨＰＶ　ＬＣＲを含む。所定の具体例においては、プロモーターは、Ｅ１又はＥ２タンパク質に対して応答して、より好ましくはＥ２タンパク質に対して応答して核酸の転写を誘発するのに十分な長さのＨＰＶ　ＬＣＲを含む。特に好ましい具体例においては、プロモーターは完全長のＨＰＶ１６　ＬＣＲ又はそれらの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む。
【００５９】
しかし、本発明はＨＰＶ１６プロモーターの使用に限定されるものではない。他のヒトパピローマウイルス株（例えばＨＰＶ６、ＨＰＶ１１等）からの類似プロモーターも、本発明の方法に好適である。それゆえ本方法はＨＰＶ６又はＨＰＶ１１に関連する尖圭コンジローマ（疣）を治療するために使用されることができる。コンジローマから異形成及び癌までの範囲の障害は、これらの障害に関連するＨＰＶ型の範囲を標的にする本発明を用いて使用されることができる。
【００６０】
所定の具体例において、本発明は、複製可能かつ染色体外に保持されることができる遺伝子治療ベクターを利用する。ＬＣＲからのＥ１及びＥ２の低レベルの発現は、低い複製数とホスト細胞における変換効果の欠如を保証する。複数のＥ２結合サイトを加えることは、ウイルス起点（ＬＣＲ中のものを含む）又細胞質起点が使用される場合には、ベクターがエピソームとして維持されることを保証する。
【００６１】
このようなベクターはＥ２タンパク質のレベルの制約に影響されず、そして長期間維持することもできる。このようなベクターは、ウイルスゲノムはＥ２タンパク質及びＥ２結合サイト（Ｅ２のトランスアクティベーション−Ｅ２ＴＡドメイン）を介してホストクロマチンと相互作用し、そしてこの相互作用は娘細胞（ｄａｕｇｈｔｅｒ　ｃｅｌｌ）へのプラスミドＤＮＡの等しく安定な分離を保証するという考えに基づくものである。このようなベクターの１つを図２中に記載する。この構造は複数のＥＢＮＡ１結合サイトを有するｏｒｉＰを使用するＥＢＶからのＥＢＮＡ１をベースとするものに類似する。ＥＮＢＡ１は機能においてＥ２ＴＡと非常に類似するが、シーケンスの類似性はない。両方のウイルスが複製可能で、染色体外の形態として存在できる。両方のタンパク質が類似のＤＮＡ結合モチーフであり、両方のウイルスが細胞の有糸分裂中に凝縮した染色体と結合することができ、複製の不存在下でさえ細胞のより長い保持を生じ得る。
【００６２】
多種の細胞毒及び／又はレポーター遺伝子（ｃＤＮＡ）が本発明の方法において使用できる。これに関する好適な毒性物質は、限定するものではないが、アブリン、リシン、モデシン、シュードモナス属外毒素Ａ、ジフテリア毒、百日咳毒素及びシガ（Ｓｉｇａ）毒のようなホロ毒；リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、シュードモナス属外毒素Ａの酵素部分、ジフテリア毒Ａ鎖、百日咳毒素の酵素部分シガ（Ｓｉｇａ）毒の酵素部分、ゲロニン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリチン、バーレー毒、刺胞細胞及びヘビ毒ペプチド等のようなＡ鎖又はＡ鎖様の分子を含む。通常、トランスローケート及び細胞結合能力を欠く天然産のタンパク質合成抑制剤であるリボゾーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）も本明細書中で好適に使用される。
【００６３】
他の公知の細胞毒はチミジンキナーゼ（例えば単純性ヘルペスチミジンキナーゼ「ＨＳＶ−ｔｋ」）遺伝子であり、その生成物は細胞がガンシクロビル又はアシクロビルの存在下で成長した場合に，細胞に対して細胞毒となる。典型的には、チミジンキナーゼ又はチミジンキナーゼを符号化する遺伝子は、ターゲット細胞へ運ばれる。医薬ガンシクロビル、アシクロビル又はそれらの類似物等の投与は、ｔｋタンパク質を収容するものの選択的殺傷を生ずる。
【００６４】
所定の好適な具体例において、ガンシクロビル又はアシクロビルは経口投与される。経口デリバリー用のこれらの医薬の好適な形態は、限定するものではないが、全身の形態にてより良好な生物学的利用能を有するＧＣＶ及びＡＣＶのバリルエステル（例えばバルガンシクロビル及びバルアシクロビル等）である。重要な試験において、ガンシクロビルのバリルエステルであるバルガンシクロビルは、患者により経口服用された場合に、ガンシクロビルの生物学的利用能を誘発することが示された（Ｓｕｇａｗａｒａ等（２０００）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，Ｊｕｎ，８９（６）：７８１−７８９）。
【００６５】
上記細胞毒は単なる例証である。多数の他の細胞毒が当業者により公知である。
【００６６】
さらに、又は細胞毒の他に、本発明の方法はＨＰＶに感染した細胞内の１種又はそれ以上のレポーター遺伝子を特定的に発現し及びそれにより感染した細胞を特定及び／又は配置することに使用することができる。本明細書中で使用されるとき、レポーター遺伝子とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的な手段により検出可能な生成物を発現する遺伝子又はｃＤＮＡを意味する。これに関して利用できるラベルは、限定するものではないが、蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＥＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＥＰ）等）、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ及び他のＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるもの）等を含む。
【００６７】
さらに、細胞毒遺伝子及びレポーター遺伝子はそれほど限定される必要無く、任意の「エフェクター」遺伝子が事実上使用できる。このようなエフェクターは、限定するものではないが、アポトーシス誘発遺伝子（例えばＰ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ（例えばＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ９、Ａｐａｆｌ等）等）、腫瘍抑制剤等を含む。
【００６８】
実際に、本発明の方法は、ＨＰＶタンパク質により誘発されるＨＰＶ特異性プロモーターを符号化する核酸構造を使用して哺乳動物細胞（例えば１種又はそれ以上のＨＰＶを宿している細胞又はＨＰＶ感染の危険がある細胞）をトランスフェクトすることを含む。ＨＰＶプロモーターは細胞毒及び／又はレポーターを符号化する核酸と操作可能にリンクする。細胞がＨＰＶを宿し又はＨＰＶに感染する場合は、ＨＰＶタンパク質は細胞毒及び／又はラベルの発現を生じるＨＰＶ−特異性プロモーターのコントロール下において、核酸の発現を誘発する。
【００６９】
本方法は癌又は前癌（ｐｒｅ−ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）細胞の治療に非常に好適である。特に、本方法はケラチン生成細胞、より好ましくは肛門生殖器間ＳＣＣ（扁平上皮細胞癌腫）の細胞及びその前駆体、高度の上皮内新生物としても知られる高度の異形成、又は扁平上皮障害の細胞に対して適用される。本発明を使用して疣も治療できる。
【００７０】
本発明の方法の適用のためには、比較的アクセス可能な障害の粘膜領域及びこのサイトへの医薬のデリバリーの相対的な容易性が与えられた肛門生殖器間上皮の治療が理想的であることが分かる。それ以上に、異種構造核酸（例えばアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）分子）を用いた細胞の局所的トランスフェクションは、日常的に達成できることが分かる（例えばＷｒａｉｇｈｔ等（２０００）ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：５２１−５２５）。さらに、局所的な適用による細胞のトランスフェクションのために好適なトランスフェクション試薬も、当業者に公知であり、そして多くは市販入手できる（例えばカチオン性脂質、リポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ）（登録商標）、チャリオット（ＣｈａｒｉｏｔＴＭ）（登録商標）等）。
【００７１】
本発明の方法は、癌又は前癌細胞の治療に限定する必要はない。本方法はＨＰＶ感染が病因の構成要素であるような任意の条件の治療において適している。それゆえ、例えば所定の具体例において、本発明の方法は、生殖器の疣に関連するＨＰＶ６及び／又はＨＰＶ１１をターゲットするために使用される。細胞毒核酸構造は、クリーム又は軟膏中に組み入れられることができる（例えばリポソームカチオン性脂質、スターバースト（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）デンドリマー等を含む）。本課題はクリーム又は軟膏を疣に塗布し、それにより該構造を感染細胞中へトランスフェクトする。続けて、ガンシクロビル（ＧＣＶ）又はアシクロビル（ＡＣＶ）又はそれらの類似物（例えば、バルガンシクロビル、バルアシクロビル等）の投与は、感染（疣）細胞の殺傷する。
【００７２】
本発明の構造は、当業者に公知の任意の多数の方法によって、運ばれることができる。好適な具体例において、ＨＰＶプロモーターのコントロール下でレポーター及び／又は細胞毒遺伝子を符号化する核酸は、インビトロ及び／又はインビボで（ヒト又は哺乳動物細胞のような）細胞をトランスフェクトするための成分である（例えばクローンされる）遺伝子治療ベクターとして提供される。
【００７３】
核酸を細胞内にインビボ、半ビボ及びインビトロで導入するための多くのアプローチが当業者に公知である。これらは、限定するものではないが脂質又はリポソームベースの遺伝子デリバリー（例えばＷＯ９６／１８３７２；ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ及びＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ　米国特許第５，２７９，８３３；ＷＯ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ等（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１４参照）、エレクトロポレーション、カルシウムホスフェートトランスフェクション、ウイルスベクター、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、ミクロ注入、デンドリマー接合等である。特に好適な具体例において、トランスフェクションは複製を欠くレトロウイルスベクターの手段による（例えばＭｉｌｌｅｒ等（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０）；Ｋｏｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．ＮＩＨ　Ｒｅｓ．４：４３、及びＣｏｒｎｒｔｔａ等（１９９１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．２：２１５参照）。
【００７４】
遺伝子治療手順の再検討のために、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：８０８−８１３；　Ｎａｂｅｌ及びＦｅｌｇｎｅｒ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：２１１−２１７；　Ｍｉｔａｎｉ及びＣａｓｋｅｙ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６２−１６６；　Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，９２６−９３２；　Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６７−１７５；　　Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５７：４５５−４６０；　Ｖａｎ　Ｂｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６（１０）：１１４９−１１５４；　Ｖｉｇｎｅ（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　８：３５−３６；　Ｋｒｅｍｅｒ及びＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　５１（１）３１−３４；　Ｈａｄｄａｄａ等（１９９５）ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｄｏｅｒｆｌｅｒ及びＢｏ ｈｎ（ｅｄｓ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　Ｇｅｒｍａｎｙ；　及びＹｕ等（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａａｐｙ，１：１３−２６を参照されたい。
【００７５】
広く使用されるベクターはネズミ白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　（ＭｕＬＶ））、テナガザル白血病ウイルス（ｇｉｂｂｏｎ　ａｐｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　（ＧａＬＶ））、サル免疫不全ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　（ＳＩＶ））、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　（ＨＩＶ））、アルファウイルス及びそれらの組合せをベースとするものを含む（例えばＢｕｃｈｓｃｈｅｒ等（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）２７３１−２７３９；　Ｊｏｈａｎｎ等（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：１６３５−１６４０（１９９２）；　Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ等（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；　Ｗｉｌｓｏｎ等（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；　Ｍｉｌｌｅｒ等Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；　Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ等ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００，　及びＲｏｕｓｅｎｂｕｒｇ及びＦａｕｃｉ（１９９３）ｉｎ　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｐａｕｌ（ｅｄ）Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ及びそれらの中の参考文献、及び上記Ｙｕ等（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａａｐｙ；　米国特許６，００８，５３５号等参照）。
【００７６】
ベクターは随意にシュードタイプされ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）、該ベクターに対応するレトロウイルスにより感染されない細胞に対するベクターのホスト範囲を広げる。例えば水疱性口内炎ウィルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ ）は、造血幹細胞に感染可能なＶＳＶ−Ｇ シュードタイプＨＩＶベクターを構成することに使用される（Ｎａｌｄｉｎｉ等（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：２６３、及びＡｋｋｉｎａ等（１９９６）Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　７０：２５８１）。
【００７７】
アデノアソシエイトウイルス（ＡＡＶ）をベースとするベクターは、例えば核酸及びペプチドのインビボでの製造、並びにインビトロ及び半ビボ遺伝子治療手順において、ターゲット核酸を使用して、細胞を変換することにも使用される。ＡＡＶベクターのあらましについては、Ｗｅｓｔ等（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６０：３８−４７；　Ｃａｒｔｅｒ等（１９８９）米国特許第４，７９７，３６８号；　Ｃａｒｔｅｒ等ＷＯ９３／２４６４１（１９９３）；　Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１；　Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．９４：１３５１　ｆｏｒ　ａｎ　ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ＡＡＶ　ｖｅｃｔｏｒｓを参照されたい。組換えＡＡＶベクターの構成は、多数の刊行物中に記載され、それはＬｅｂｋｏｗｓｋｉ，米国特許第５，１７３，４１４号；　Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１１）：３２５１−３２６０；　Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；　Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８１：６４６６−６４７０；　ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等（１９８８）及びＳａｍｕｌｓｋｉ等（１９８９）Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．，６３：０３８２２−３８２８を含む。ｒＡＡＶにより変換され得る細胞株は、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３９８８−３９９６に記載されたものを含む。他の好適なウイルスベクターはヘルペスウイルス、レンチウイルス及びワクシニアウイルスを含む。
【００７８】
１つの特に好適な具体例において、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）はターゲット細胞をレポーター及び／又は細胞毒遺伝子を含む核酸を用いて、ターゲット細胞を、ＨＰＶプロモーターのコントロール下でトランスフェクトすることに使用される。レトロウイルス、特にレンチウイルス（例えばＨＩＶ、ＳＩＶ等）は、この適用のために特に好適である、なぜならそれらは非分離細胞に感染する可能性があるからである。核酸トランスフェクションのためにレトロウイルスを使用する方法は、当業者に公知である（例えば米国特許第６，０１３，５７６号参照）。
【００７９】
レトロウイルスはウイルスゲノムがＲＮＡであるＲＮＡウイルスである。ホスト細胞がレトロウイルスに感染する場合、ゲノムＲＮＡは、非常に効率的に感染細胞の染色体ＤＮＡへ統合されるＤＮＡ媒体へ逆転写される。統合されたＤＮＡ媒体はプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスの転写及び感染細胞への集合は、適切なヘルパーウイルスの存在下で又は汚染しているヘルパーウイルスを同時に生産することなくキャプシッドに包むことを可能にする適切なシーケンスを含む細胞株中で生じる。好適な具体例において、キャプシッドに包むためのシーケンスは適切なベクターを使用したコトランスフェクションにより提供されるので、ヘルパーウイルスは組替えレトロウイルスの製造に利用される必要はない。
【００８０】
レトロウイルスゲノム及びプロウイルスＤＮＡは３種の遺伝子：ｐｏｌ、ｇａｇ及びｅｎｖを有し、それらは２種の長末端繰返し（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）シーケンスによりフランクされる。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、キャプシッド及び核酸キャプシッド）タンパク質を符号化する；ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ依存（ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を符号化し、及びｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質を符号化する。５’ 及び３’ ＬＴＲはビリオンＲＮＡの転写及びポリアデニル付加を促進する。ＬＴＲは、ウイルス複製のために必要な他のシス作用シーケンスの全てを含む。レンチウイルスは、（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及び／又はＳＩＶ中の）ｖｉｔ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ及びｖｐｘを含むさらなる遺伝子を有する。
【００８１】
ゲノムの逆転写に必要なシーケンス（ｔＲＮＡプライマー結合サイト）及びウイルスＲＮＡを粒子内へ効率的にキャプシッドに包ませるために必要なシーケンス（Ｐｓｉサイト）は５’ ＬＴＲに隣接する。キャプシッドに包ませるため（又はレトロウイルスＲＮＡの感染ウイルスへのパッケージング）に必要なシーケンスがウイルスゲノムから無くなる場合は、ゲノムＲＮＡのキャプシッドに包ませることを妨げるシス欠損を生じる。しかし、生じた変異体は、全てのウイルスタンパク質の合成を指示する能力が未だある。
【００８２】
１つの好適な具体例において、本発明は、非分離細胞に感染させる能力がある組替えレトロウイルスを提供する。組替えレトロウイルスはウイルスＧＡＧ、ウイルスＰＯＬ、ウイルスＥＮＶ、通常の核酸と操作可能にリンクする異種核酸シーケンス、並びに上述のようなパッケージング、逆転写及び統合に必要なシス作用核酸シーケンスを含む。本発明の組換えレトロウイルスは、非分離細胞と同様に分離細胞に感染することができる。
【００８３】
好ましい具体例において、組替えレトロウイルスは、それゆえ、ネイティブウイルス（例えばｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ）の構造的な感染遺伝子が除去され及び核酸シーケンスの変わりに置きかえられ、ターゲット非分離細胞（例えばＨＰＶプロモーターのコントロール下でレポーター及び／又は細胞毒遺伝子を符号化するシーケンス）へと運ばれるように、遺伝子修飾される。ウイルスによる細胞の感染後、ウイルスはその核酸を細胞内に注入し、そしてレトロウイルス遺伝物質は随意にホスト細胞ゲノム内に統合することができる。レンチウイルスベクターを作成及び使用する方法は、米国特許６，０１３，５１６、５，９３２，４６７等において詳細に議論される。
【００８４】
他の好適な具体例において、ＨＰＶプロモーターのコントロール下で、レポーター及び／又は細胞毒遺伝子は、遺伝子治療に好適なアデノウイルスベクター内に配置される。アデノウイルスベクターの使用はＷＯ９６／２５５０７に詳細に記載される。特に好ましいアデノウイルスベクターは、Ｗｉｌｌ等（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒａｐ．５：１０７９−１０８８により説明される。アデノウイルスベクターはアデノウイルス初期（ｅａｒｌｙ）領域３及び／又は初期領域４における欠損を含み、そしてこの欠損はタンパク質ＩＸ遺伝子の数種又は全ての欠損を含む。１つの具体例において、アデノウイルスベクターはＥ１ａ及び／又はＥ２ｂシーケンスの欠損を含む。
【００８５】
多数の異なるアデノウイルスベクターが、遺伝子転移のために最適化される。そのようなアデノウイルスベクターの１つは、米国特許６，０２０，１９１に記載される。このベクターは、トランス遺伝子が操作可能にリンク可能でそしてさらにＥ１欠失及びＥ３領域からの１．６ｋｂの部分欠失を含むＣＭＶプロモーターを含む。これはトランス遺伝子（例えばβサブユニット遺伝子）及びその発現コントロールシーケンス、好ましくはベクター中に含まれるＣＭＶプロモーターが挿入されることができるＥ１領域内の欠失を含む複製欠失ベクターである。それは、さらに野生型アデノウイルスＥ２及びＥ４領域を含む。該ベクターは、アデノウイルスヌクレオチド２９２９２から３０８４０までの１５１９ヌクレオチドを包含するＥ３領域における欠失を含む（Ｒｏｂｅｒｔ等（１９８６）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ，　ｉｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，ｅｄ．，８：１−５１）。ベクター中のＥ３領域に対するこれらの修飾は以下のことを生じる：（ａ）Ｅ３領域中の全ての下流スプライスアクセプターサイト（ｓｐｌｉｃｅ　ａｃｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｔｅ）が欠失し、そしてｍＲＮＡだけがＥ３プロモーターから合成される（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ等（１９９６）Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６；　Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ等（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２２０：１５２−１６２，）；　（ｂ）Ｅ３ＡポリＡサイトが欠失する、しかしＥ３ＢポリＡサイトは維持される；（ｃ）Ｅ３ｇｐ１９Ｋ（ＭＨＣ　Ｉ　結合タンパク質）遺伝子は維持される；及び（ｄ）Ｅ３　１１．６Ｋ（Ａｄ死タンパク質）遺伝子が欠失する。
【００８６】
このようなアデノウイルスベクターは、任意のアデノウイルス抗原型からのアデノウイルスゲノムシーケンスを利用することができ、限定するものではないが、アデノウイルス抗原型２，５及び全ての他の好ましい非−腫瘍遺伝子抗原型を含む。
【００８７】
単独で、又はウイルスベクターと組み合わせて、多数の非ウイルスベクターも、ＨＰＶプロモーターのコントロール下でレポーター及び／又は細胞毒遺伝子を用いて細胞をトランスフェクトするために有用である。好適な非ウイルスベクターは、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ファージミド、リポソーム、水−油エマルジョン、ポリエチレンイミン、バイオリスティックペレット／ビーズ及びデンドリマーを含む。
【００８８】
リポソームは、１９６５年に細胞膜のモデルとして初めて記載され、そしてすぐに物質の細胞へのデリバリーに適用された。リポソームは、カチオン性リポソーム又はｐＨ感受性リポソームのいずれかとしての分類を生じる２種の機構の１つにより、ＤＮＡをとらえる。カチオン性リポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用し、安定な複合物を形成する。カチオン性リポソームは、典型的には正に荷電した脂質及び共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）からなる。一般的に使用される共脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む。ヘルパー脂質とも呼ばれる共脂質は、ほとんどの場合リポソーム複合体の安定化のために必要とされる。種々の正に帯電した脂質配合物は市販入手でき、他の多くは改良下にある。最も頻繁に例証される２種のカチオン性脂質は、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）及びリポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）である。リポフェクチンは、１９８７年にＰｈｉｌ　Ｆｅｌｇｎｅｒにより最初に報告された遺伝子を培養物中の細胞へ運ぶための市販入手できるカチオン性脂質である。リポフェクチンは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロイクス）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニアクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びＤＯＰＥの混合物である。
【００８９】
ＤＮＡ及びリポフェクチン又はリポフェクタミンは自発的に相互作用し、１００％の充填効率を有する複合物を形成する。言い換えると、十分な脂質が利用可能であれば、必然的に全てのＤＮＡは脂質と複合する。ＤＮＡ分子の負の電荷は、正に荷電したＤＯＴＭＡの群と相互作用するものと仮定される。脂質：ＤＮＡ比及びこれらの複合物を形成することに使用される全体の脂質濃度は、効率的な遺伝子転移のために重要であり、そして適用とともに変化する。リポフェクチンは線状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡを、培地中の種々の細胞内へ運ぶことに使用される。その導入の少し後に、リポフェクチンがインビボで遺伝子を運ぶことに使用できることが分かった。リポフェクチン−ＤＮＡ複合物の静脈内投与に続き、肺及び肝臓の両方は、これらの複合物の摂取及びトランス遺伝子発現のための著しい親和性を表した。他の組織内へのこれらの複合物の注入は、変化する結果を有し、そしてほとんどの部分では、肺又は肝臓内のいずれかへのリポフェクチン媒介遺伝子転移よりも非常に効率が良くない。
【００９０】
ＰＨ感受性、又は負に荷電したリポソームは、ＤＮＡを、それを有する複合物よりも、それとともに捕らえる。ＤＮＡと脂質の両方が同様に荷電するため、複合物形成よりも反発が起こる。依然として数種のＤＮＡは、これらのリポソームの水溶性内容物内に捕らえられるための処理を行う。数種の場合において、これらのリポソームは低いｐＨで不安定になり、そしてそれゆえｐＨ−感受性である。現在までのところ、カチオン性リポソームはインビボ及びインビトロの両方において、ｐＨ−感受性リポソームよりも非常に効率的な遺伝子デリバリーを有する。ｐＨ−感受性リポソームは、それらのカチオン性部位よりも、ＤＮＡデリバリーにおいて非常に効率的となる可能性を有し、減少した毒性及び血清タンパク質からの障害を用いてそのように行うべきである。
【００９１】
他のアプローチにおいて、ＤＮＡに複合するデンドリマーは、細胞をトランスフェクトすることに使用される。このようなデンドリマーは、限定するものではないが「スターバースト（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）」デンドリマー及び種々のデンドリマーポリカチオンである。
【００９２】
デンドリマーポリカチオンは、典型的にはコア分子又はデザインされた開始剤上で形成される３次元の高度に配列されたオリゴマー及び／又はポリマー化合物であり、オリゴマー及び／又はポリマー化合物を加え及び正に荷電した外表面を提供する反復反応シーケンスにより形成される。これらのデンドリマーは、ＰＣＴ／ＵＳ８３／０２０５２及び米国特許第４，５０７，４６６、４，５５８，１２０、４，５６８，７３７、４，５８７，３２９、４，６３１，３３７、４，６９４，０６４、４，７１３，９７５、４，７３７，５５０、４，８７１，７７９、４，８５７，５９９号に記載されるように調製される。
【００９３】
典型的には、デンドリマーポリカチオンは、ポリマーが加えられるコア分子を含む。ポリマーは正電荷を獲得できる末端基を含むオリゴマー又はポリマーであることができる。好適なコア分子は、コア分子のオリゴマー及び／又はポリマーに対する結合に利用できる少なくとも２つの反応性残基を含む。反応性残基の例は、特にヒドロキシル、エステル、アミノ、イミノ、イミド、ハライド、カルボキシル、カルボキシハライドマレイミド、ジチオピリジル、及びスルフィドリルである。好ましいコア分子は、特にアンモニア、トリス−（２−アミノエチル）アミン、リシン、オルニチン、ペンタエリトルトール、及びエチレンジアミンである。これらの残基の組合せも他の反応性残基として好適である。
【００９４】
本発明のデンドリマーポリカチオンの製造用に好適であるオリゴマー及びポリマーは、人体に良好に受け入れられる医薬的に許容可能なオリゴマー及び／又はポリマーである。これらの例は、特にα，β−エチレン性不飽和カルボン酸又はα，β−エチレン性不飽和アミドのアルキルエステルとアルキレンポリアミン又はポリアルキレンポリアミンとの反応から誘導されるポリアミドアミンである。好ましくはメチルアクリレート及びエチレンジアミンである。ポリマーはコア分子に対して、好ましくは共有結合する。
【００９５】
オリゴマー及び／又はポリマーに結び付くことができる末端基は、正電荷を獲得することができなければならない。これらの例は、アゾール並びに第一、第二、第三及び第四脂肪族及び芳香族アミン及びアゾールであり、それはＳ又はＯ、グアジニウム（ｇｕａｄｉｎｉｕｍ）並びにそれらの組合せで置換されることができる。末端カチオン性基は、好ましくは共有結合様式でオリゴマー及び／又はポリマーに結び付く。好ましい末端カチオン性基はアミン及びグアジニウムである。しかし、他のものも利用できる。末端カチオン性基は、オリゴマー及び／又はポリマーの全ての末端基の約１０〜１００％、好ましくは約５０〜１００％の割合で存在できる。
【００９６】
デンドリマーポリカチオンは、カチオン性基以外に０〜約９０％の末端反応性残基も含むことができる。末端カチオン性基以外の好適な末端反応性残基は、特にヒドロキシル、シアノ、カルボキシル、スルフィドリル、アミド及びチオエーテル基、及びそれらの組合せである。しかし、他のものも利用できる。
【００９７】
デンドリマーポリカチオンは、一般的に及び好ましくは、ポリヌクレオチドと非共有結合的に結合する。これは、組成物が一度細胞内に運ばれると容易に分離又は分解することを許容する。本明細書中での使用のために好適な典型的なデンドリマーポリカチオンは、約２，０００〜１，０００，０００Ｄａ、及びより好ましくは約５，０００〜５００，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。しかし、他の分子量も好適である。好適なデンドリマーポリカチオンは、約１１〜６０Å、及びより好ましくは約１５〜５５Åの流体力学的半径を有する。しかし、他のサイズも好適である。遺伝子治療におけるデンドリマーの製造及び使用は当業界で公知であり，例えば米国特許５，６６１，０２５に記載される。
【００９８】
適当な場合には、２種又はそれ以上のタイプのベクターが一緒に使用できる。例えば、プラスミドベクターはリポソームとともに使用されることができる。非ウイルスベクターの場合、核酸は当業界で公知の好適な手段により非ウイルスベクター中に導入されることができる。プラスミドについては、これは典型的には構造を好適な制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）サイト内へライゲートすることを含む。リポソーム、水−油エマルジョン、ポリエチレンアミン及びデンドリマーのようなベクターについては、ベクター及び構造は当業界で公知の条件下にて混合することにより結合できる。
【００９９】
治療上の核酸を含むベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、インビボで細胞の変換用の有機組織体へ直接的に投与される。投与は、分子を血液又は組織細胞との最終的な接触へ導入するために通常使用される任意のルートによる。核酸は任意の方法で、好ましくは医薬的に許容されるキャリアとともに投与される。そのようなパッケージされた核酸を投与する好適な方法は、当業者が利用できかつ公知である。
【０１００】
医薬的に許容できるキャリアは、組成物を投与することに使用する方法と同様に、投与される特別な組成物により部分的に決定される。従って、本発明の医薬組成物の種々の好適な配合がある。
【０１０１】
経口投与に適した配合物は、（ａ）水、塩類又はＰＥＧ４００のような希釈剤中に懸濁されるパッケージされた有効量の核酸のような液体溶液；（ｂ）カプセル、サッシェ又はタブレット、それぞれが予め決められた量の活性成分を、液体、固形、顆粒又はゼラチンとして含む；（ｃ）好適な液体中の懸濁液；（ｄ）好適なエマルジョン、により構成されることができる。タブレット形態は、１種又はそれ以上のラクトース、スクロース、マニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、トラガカントゴム（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ミクロ結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメローズ（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｏｓｅ）ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色料、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、加湿剤、防腐剤、香料、染料、崩壊剤、及び医薬的に融和性のキャリアを含むことができる。ロゼンジ形体は、香料中に活性成分含むことができ、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカントゴムであり、ゼラチン及びグリセリンのような不活性ベース中に活性成分を含む錠剤、又は活性成分のほかに公知のキャリアを含むスクロース及びアカシアエマルジョン、ゲル等も同様である。
【０１０２】
パッケージされた核酸は、単独で又は他の好適な成分と組み合わせてエアゾール配合物中にされ（すなわちそれらは噴霧されることができる）、吸入投与されることができる。エアゾール配合物は、加圧され許容できる、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような、噴霧剤中に配置されることができる
【０１０３】
直腸の投与用の好適な配合物は、例えばそれは坐薬ベースとともにパッケージされた核酸からなる坐薬を含む。好適な坐薬ベースは天然又は合成トリグリセリド、又はパラフィン炭化水素を含む。さらに、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール及びパラフィン炭化水素を含むベースとともにパッケージされた核酸との組合せからなるゼラチン直腸カプセルを使用することもできる。
【０１０４】
例えば、動脈内（注射で）、静脈内、筋肉内、真皮内、腹腔内及び皮下ルートによる非経口投与に適した配合物は、水溶又は非水溶浸透性無菌注入溶液を含むことができ、それは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び配合物を意図されたレシピエントを血液に浸透性にする溶質、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含む水溶又は非水溶無菌懸濁液を含むことができる。本発明の実施において、組成物は、例えば静脈点滴、経口、局所、腹腔内、膀胱内又は鞘内により投与され得る。非経口投与又は静脈内投与は、好適な投与の方法である。パッケージされた核酸の配合物は、アンプル又はバイアルのような単位用量又は複数用量封止容器内に存在できる。
【０１０５】
所定の好適な具体例は、局所的な投与を予期している。このような具体例は、クリーム、ジェル、フォーム、パップ、皮膚又はトランス皮膚パッチ等を含む。
【０１０６】
医薬配合物は前述したような無菌粉、顆粒、タブレットから製造できる。上述のように、半ビボ治療に関連して、パッケージされた核酸により形質導入された細胞も上述のように非経口投与又は静脈内投与されることができる。
【０１０７】
本発明に関連して、患者への投与は、時間にわたる有益な医薬的応答を果たすために十分でなければならない。用量は、治療される患者の体重又は表面積同様、使用される特定のベクターの効力及び患者の状態により決定される。用量のサイズも、特定の患者における特定のベクター又は形質導入される細胞の投与に伴う副作用の存在、性質及び規模により決定される。
【０１０８】
治療において投与されるベクターの有効量を決定することにおいて、内科医はベクター、ベクター細胞毒、病気の進行、及び抗−ベクター抗体の製造の循環血漿レベルを評価する。核酸のための典型的な用量は、投与のルート及び遺伝子デリバリーシステムに高度に依存する。デリバリー方法に依存して、用量は約１μｇ〜１００ｍｇ又はそれ以上に容易に範囲付けられる。一般的に、ベクターからの裸の（ｎａｋｅｄ）核酸の用量当量は、典型的な７０ｋｇの患者について約１μｇ〜１００μｇであり、ウイルス粒子を含むベクターの用量が計算され、治療上の核酸の当量が生じる。
【０１０９】
トランス遺伝子により符号化される生物学的に活性なタンパク質の持続性の発現について、それぞれに対するベクター中に含まれるトランス遺伝子を提供することに使用され、特定の表現型を達成するための本発明のウイルスベクターの用量は、ヒトについて約１０８ 感染ユニット（Ｉ．Ｕ．）から１０１１Ｉ．Ｕ．の範囲を生じる。
【０１１０】
投与について、本発明の形質導入される細胞は、患者の重量及び全体の健康に対する適用と同様に、ベクター、形質導入される細胞型、ベクターの副作用又は種々の濃度における細胞型のＬＤ５０により決定される比で投与される。投与は　後述の単一の又は分割した投与を介して達成できる。
【０１１１】
単位用量形態において、投与及び用量の均一性の場合については、非経口組成物を配合することが特に有利である。本明細書中で使用される用量単位は、治療される対象用の用量単位として好適な物理的に分離した単位であり、各単位は、予め決められた計算された特定の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ）を生成する量の活性成分を含み、必要な生理的なキャリアとの結合を生じる。本発明の新規な用量単位形態の特定は、配合に使用されるベクターの独特の特性及び合成の分野特有の制限により指図及び依存される。重要な活性成分（例えばウイルスベクター）は、上記議論されたような用量単位において生理学的に許容できるキャリアを用いて、便利かつ効率的な投与のために合成される。
【０１１２】
本発明のベクターの投与から生じる最大の利益及び特定の表現型の達成は、繰返し投与を必要としてもよい。このような繰返し投与は同じベクターの使用を必要とし、又は、ウイルス抗原提示を変え及びホスト免疫応答を減少させるために、その代わりに異なるベクターを使用することを含む。
【０１１３】
本発明の方法が上記構成（例えばガンシクロビル、アシクロビル等）以外に医薬の投与を必要とする場合は、医薬は当業者に公知の標準的な実施に従って投与される。それゆえ、例えばガンシクロビル、アシクロビル等の用量は当業者に公知である。さらに、ガンシクロビル及びアシクロビルのバリルエステル（例えばバルガンシクロビル及びバルアシクロビル等）が系の形態におけるより良好な生物学的利用能を有するものと信じられることが示される（Ｓｕｇａｗａｒａ等（２０００）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，Ｊｕｎ，８９（６）：７８１−７８９）。
【０１１４】
本発明の実施は、他に指示がない限りは、タンパク質化学、分子ウイルス学、ミクロ生物学、ＤＮＡ組換え技術、薬理学の慣用技術を使用し、これらは当業者の技術範囲内である。このような技術は文献中に十分に記載される（例えばＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａｕｓｕｂｅｌ等．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９５，　ａｎｄ　Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１７ｔｈ　ｅｄ．，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５参照）。
【０１１５】
さらに他の具体例において、本明細書中に記載された方法に従ってヒトパピローマウイルスに感染した哺乳動物細胞を除去するためのキットを提供する。１つの好適な具体例において、キットは、ＨＰＶプロモーターのコントロール下で細胞毒遺伝子を符号化する核酸を含む核酸構造を含有する１種又はそれ以上のコンテナを含む。場合によっては、該キットは１種又はそれ以上のカチオン性脂質及び／又はリポソーム或いは核酸構造のトランスフェクションに好適な他の試薬を含むことができる。所定の具体例において、核酸構造はクリーム又は軟膏を含むことができる。該キットは随意にベクターの伝達のための１種又はそれ以上の細胞株を含むことができる。
【０１１６】
該キットは、場合によっては本明細書中に記載される分子のデリバリーを容易にするための任意の試薬及び／又は装置を含むことができる。このような試薬は、限定するものではないが緩衝剤、薬理学的賦形剤、ラベル、ラベルされた抗体、ラベルされた核酸、蛍光ラベルの視覚化用フィルタセット、ブロッティング膜等を含む。
【０１１７】
さらに、該キットは本明細書中に記載される細胞のアッセイ方法又はトランスフェクションの実施のための方向付け（すなわちプロトコル）を含む指示材料（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ）を含むことができる。好ましい指示材料は、本発明の方法に従ってＨＰＶに感染した細胞を減じ又は除去するためのプロトコルを提供する。指示材料は典型的には記載又はプリントされた材料であるけれども、それらは限定するものではない。それらの指示を保存しそしてそれらを末端ユーザまで伝える任意の媒体は、本発明により企図される。このような媒体は、限定するものではないが電気的保存媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ　ＲＯＭ）等である。このような媒体はこのような指示材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。
【０１１８】
例
以下の例を例証のために提供するが、特許請求の範囲の発明を限定するものではない。
【０１１９】
例１
単純性ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ遺伝子を使用した、ヒトパピローマウイルス１６型感染細胞のウイルス特異的な治療
ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）は、肛門生殖器間の扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）及びその前駆体、上皮内新生物（ＩＮ）の発生に関連する。ＳＣＣを阻害するための上皮内新生物の治療に対するアプローチで、特にＨＰＶに対してターゲットにしたものはほとんど無い。我々は、ＨＰＶ　Ｅ２タンパク質により調節されるＨＰＶのロングコントロール領域（ＬＣＲ）（ｎｔ７４５０−ｎｔ１０４）中のＨＰＶ特異的なプロモーターによりドライブされる単純性ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ　１−ＴＫ）遺伝子を用いたＨＰＶ１６型感染細胞のウイルス特異的治療をデザインした。ＨＰＶ感染細胞中のＨＳＶ　１−ＴＫ遺伝子の発現がデザインされ、細胞をプロドラッグのガンシクロビル（ＧＣＶ）及びアシクロビル（ＡＣＶ）に対して感受性にする。ＨＰＶ１６ＬＣＲの特異性を評価するために、ＨＰＶ１６ＬＣＲのコントロール下でルシフェラーゼ発現プラスミドの活性を測定した。Ｅ２の発現を伴わないＨＳＣ３細胞と比較した場合、ＨＰＶ１６　Ｅ２発現細胞（ＣａＳｋｉ）において２０倍のルシフェラーゼ活性の発生が観察され、そしてＨＰＶ１８Ｅ２発現ＨｅＬａ細胞においては１０倍の発生が観察された。細胞が２０−３０μｇ／ｍｌのＧＣＶ又はＡＣＶのいずれかの中で６−８日間培養される場合、ＣａＳｋｉ細胞中のＨＰＶ　１６　ＬＣＲによりドライブされるＨＳＶ　１−ＴＫ遺伝子を発現するプラスミドのトランスフェクションは約８０％の成長抑制を生じ、そして我々は細胞死がアポトーシスにより媒介されることが分かった。これらの結果は、ＧＣＶ又はＡＣＶの投与により付随するＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の、ＨＰＶ　Ｅ２タンパク質により調節されるＴＫ発現を有するＨＰＶ−ポジティブケラチン生成細胞への直接的な遺伝子移動が、ＨＰＶ感染細胞に対する実行可能な重要な治療方法であることを示すものである。
【０１２０】
材料及び方法
プラスミド構造
図３Ａに示されるＨＰＶ１６ゲノムのＬＣＲにわたるＡ６２０ｂｐＤＮＡ断片（ｎｔ７４２０−ｎｔ１１７）を、以下のプライマーを使用して、（ＡＴＣＣから入手可能）プラスミドｐＨＰＶ１６からＰＣＲ増幅した：プライマーＵＲＲ１：５’ −ＣＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＴＴ−３’ （シーケンスＩＤ　ＮＯ：２　下線を付したシーケンスはＸｈｏＩ酵素のための切断サイトである）、及びプライマーＵＲＲ２：５’ −ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＣＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡ−３’ （シーケンスＩＤ　ＮＯ：３　下線を付したシーケンスはＨｉｎｄＩＩＩ サイトのための切断サイトである）。図３Ａに示されている生じたＰＣＲ生成物は、ＵＣＳＦ　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒにおいてシーケンスされ、ヌクレオチドシーケンスを確定した（Ｓｅｅｄｏｒｆ等（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１４５：１８１−１８５）。シーケンスは１２塩基対パリンドロームシーケンス、ＡＣＣＮ６ＧＧＴ（シーケンスＩＤ　ＮＯ：１）の４つのコピーを含み、それはＥ２Ｂ２として作用した。ＰＣＲ増幅ＬＣＲフラグメントは、修飾発光ルシフェラーゼ（プラスミドｐＮＳＸＨ−４）について符号化するｌｕｃ＋ｃＤＮＡの上流の、ｐＧＬ３−ベーシックベクター（プロメガ（ｐｒｏｍｅｇａ）、ＷＩ）のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ サイトへ複製された。
【０１２１】
完全長のＨＰＶ１６ＬＣＲ（ｐＮＳＧＬＴＫ−８）によりＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子がドライブされるプラスミドを構成するために、シーケンスを符号化するＨＳＶ１−ＴＫを取り巻く１．３ｋｂフラグメントをベクターｐＲＢ１０３からのＰＣＲを用いて増幅した。
【０１２２】
ＰＣＲを以下のプライマーを使用して行った：ＴＫ−フォーワード：５’ −ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＴＴＣＧＣＡＴ−３’ （シーケンスＩＤ　ＮＯ：４、下線を付したシーケンスはＨｉｎｄＩＩＩ サイトのための切断サイトである）、及びＴＫ−リバース：５’ −ＣＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＧＣＧＣＧＧＧＴＴＣＣＴＴＣ−３’ （シーケンスＩＤ　ＮＯ：５、下線を付したシーケンスはＸｂａＩ酵素のための切断サイトである）。ＰＣＲ増幅生成物はＵＣＳＦ　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒにおいてシーケンスされ、ヌクレオチドシーケンスを確定した。ルシフェラーゼ遺伝子は、およそ１．７ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ −ＸｂａＩフラグメントとしてプラスミドｐＮＳＸＨ−４から摘出され、プラスミドｐＮＳＧＬＴＫ−８を生じるシーケンスを符号化するＨＳＶ１−ＴＫを含む１．３ｋｂのＰＣＲ生成物により置きかえられ、ここでＨＳＶ１−ＴＫはＨＰＶ１６ＬＣＲプロモーターエレメントの下流である。ＨＳＶ１−ＴＫのみを含みＨＰＶ１６ＬＣＲを含まないコントロールプラスミドｐＮＳＧＬ０は、プラスミドｐＮＳＧＬＴＫ−８から、６２０ｂｐ　ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ＬＣＲシーケンスを摘出することにより構成された。生じるフラグメントはＫｌｅｎｏｗフラグメント及びｄＮＴＰｓを用いて充填され、そして再びライゲートされｐＮＳＧＬ０を生じた。生じるプラスミドを図３Ｂに示す。
【０１２３】
細胞培養及びトランスフェクション
ＨＰＶ１６ポジティブ不死化ＣａＳｋｉ（４１）及びＳｉＨａ（Ｂａｋｅｒ等（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，，６１（４）：９６２−７１；ｅｌ　Ａｗａｄｙ等（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５９（２）：３８９−９８）頚部癌細胞株、ＨＰＶ１８ポジティブＨｅＬａ頚部癌細胞株（Ｂｏｓｈａｒｔ等（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．，３（５）：１１５１−１１５７）、並びに不死化ＨＩＶネガティブ口腔癌細胞株、ＨＳＣ３（２３）を本研究において使用した。すべての細胞株は、グルタミン（２５．０μｇ／ｍｌ）、抗生物質及び１０％ウシ胎仔血清（１０％ＤＭＥＭ）を追加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ ｓ　修飾Ｅａｇｌｅ媒体（ＤＭＥＭ）中で成長させた。
【０１２４】
全てのトランスフェクションは、製造者の指示に従い、Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を使用するリン酸カルシウム媒介トランスフェクションにより行った。細胞を２×１０５ 細胞の密度で、２ミリリットルのＤＭＥＭの各ウェルに蒔き、そして５０−６０％の融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで成長させた。１μｇのプラスミドＤＮＡを、各細胞株をトランスフェクトするために使用した。リン酸カルシウム−ＤＮＡ混合物を細胞の上に４〜６時間覆い、それから２ｍｌの完全な媒体により置きかえられる。模擬トランスフェクション（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）については、リン酸カルシウムトランスフェクション試薬にＤＮＡは加えられない。標準的なルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を用いてプロモーター活性を測定するために、トランスフェクトした細胞を２４−４８時間後に採取した。ＲＴ−ＰＣＲによるＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子発現を分析するために、トランスフェクトされた細胞を４８−６０時間後に採取した。
【０１２５】
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、レポータープラスミドとして使用し、β−ガラクトシダーゼ発現についてアッセイし、トランスフェクション効率を決定した。トランスフェクトされた細胞をＸ−Ｇａｌ試薬を用いて染色し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。トランスフェクトされた細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒドの溶液中にｐＨ７．３で１０分間室温で固定した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＸ−Ｇａｌ試薬を用いて、３７℃で３０分〜２時間染色した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１を用いてトランスフェクトに成功した細胞は、光顕微鏡下で視覚化された場合は青色に染色された。青色の細胞の数を数え、トランスフェクション効率を決定した。
【０１２６】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の検出
ポリ（Ａ＋）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、ＲＮＡ単離キット（Ｂｏｅｈｒｉｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＩＮ）を使用して細胞株から調製した。約２×１０６ 個の細胞をＲＮＡ単離のために採取した。氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄した後、細胞を溶解緩衝液中に溶解し、２１規格ニードルを通して細胞を通過させることにより機械的に粉砕した。５０ｐｍｏｌビオチンでラベルされたオリゴ（ｄＴ）２０ を溶解物に加え、ストレプトアビジン磁気粒子と３７℃で５分間混合した。該磁気粒子を洗浄緩衝液中で３回洗浄した。ｍＲＮＡを、６５℃で２分間のインキュベーションにより溶出し、磁気粒子から完全に分離させ、そしてＡ２６０におけるＯ．Ｄ．を測定することにより定量した。
【０１２７】
ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の発現を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを遺伝子特異性プライマーＮＳＴＫ１，５’ −ＣＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＣＧ−３’ （シーケンスＩＤ　ＮＯ：６）及びＮＳＴＫ−２，５’ −ＧＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧ−３’ （シーケンスＩＤ　ＮＯ：７）を用いて行い、それはＴＫ遺伝子の２８８−ｂｐ領域を増幅した。ＨＰＶ１６Ｅ２遺伝子の発現を、遺伝子特異性プライマーＮＳＥ２−４，５’ −ＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴ−３’ （シーケンスＩＤ　ＮＯ：８）及びＮＳＥ２−５，５’ −ＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＡＧ−３’ （シーケンスＩＤ　ＮＯ：９）を使用してＲＴ−ＰＣＲにより分析し、ＨＰＶ１６Ｅ２遺伝子のシーケンスを符号化することにおいて２１６−ｂｐフラグメント（ｎｔ３３００〜ｎｔ３５１６にわたる）を増幅した。ＲＴ−ＰＣＲをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）を用いて行った。０．２μｇのｍＲＮＡを、５０℃で３０分間の第一ストランドｃＤＮＡ合成のために及び９４℃で２分間の変性のために、続けて９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分並びに７２℃で１０分の最終的な延長により構成されるＰＣＲ増幅３５サイクルのために使用した。生じたＰＣＲ生成物を、標準的なゲル電気泳動により、１．２％のアガロースゲル上で分析した。
【０１２８】
ルシフェラーゼアッセイによるルシフェラーゼ発現の検出
ＣａｓＫｉ、ＨＳＣ３及びＨｅＬａ細胞株を、プラスミドｐＮＳＸＨ−４及び上記コントロールベーシックプラスミドｐＧＬ３を用いてトランスフェクトした。２４時間後、細胞溶解物を５０．０μＬのルシフェラーゼアッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を用いて採取し、遠心分離し破片を除去した。溶解物をルシフェリン試薬と組合せ、製造者の指示に従い、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，　ＷＩ）を用いてルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定した。細胞溶解物を連続的に希釈し、そしてルシフェラーゼ発現を、１０秒間の信号統合を用いるＤｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　Ｐｌａｔｅ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して相対的な光ユニット（ＲＬＵ）として測定した。
【０１２９】
ＨＳＶ−ＴＫ＋細胞株に対するＧＣＶ及びＡＣＶのインビトロ効果
ＣａＳｋｉ、ＳｉＨａ、ＨＳＣ３及びＨｅＬａ細胞株を、ｐＮＳＧＬＴＫ−８又はｐＮＳＧＬ０プラスミドを用いてトランスフェクトし、又はプラスミドを用いないで模擬トランスフェクトした。遺伝子発現はトランスフェクション後４８時間許容され、その後トランスフェクトされた細胞をＧＣＶ（Ｃｙｔｏｖｅｎｅ，Ｒｏｃｈｅ，ＣＡ）又はＡＣＶ（Ｎｏｖａｐｈａｒｍ，ＵＳＡ　Ｉｎｃ，ＩＬ）に曝露した。１０％ＤＭＥＭ中で０−４０．０μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度の２種の異なる濃度の試薬にて細胞を培養することにより、トランスフェクトされる細胞についてＧＣＶ又はＡＣＶ殺傷曲線を決定した。成長は、６−１０日間、ＧＣＶ又はＡＣＶの存在下で維持されるようにされた、その後、細胞生存力をＭＴＳ細胞増殖アッセイ（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ及びＴａｎ（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３：４７４）により、製造業者の指示に従って測定した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　９６　ＡＱｕｅｏｕｓ 　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）。４９０ｎｍでの吸収は、培地中の生細胞の数の指標である。生存率パーセントを以下のように計算した。
％生存率＝［（吸光度４９０ テスト−吸光度４９０ バックグラウンド）／（吸光度４９０ 未処理細胞−吸光度４９０ バックグラウンド）］ ×１００
【０１３０】
トランスフェクトされた細胞株におけるアポトーシスの検出
ＣａＳｋｉ、ＳｉＨａ、ＨＳＣ３及びＨｅＬａ細胞株を、ｐＮＳＧＬＴＫ−８又はｐＮＳＧＬ０プラスミドを用いてトランスフェクトし、又はプラスミドを用いないで模擬トランスフェクトした。ＴＫ遺伝子発現はトランスフェクション後４８時間許容され、その後、トランスフェクトされた細胞を、１０％ＤＭＥＭ中で０−４０．０μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度の２種の異なる濃度のＧＣＶ又はＡＣＶ中で６−１０日の期間にわたって培養した。ＤｅａｄＥｎｄ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）は、改変されたＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄＵＴＰ　Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ）アッセイであり、その中で、酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）はビオチン化ヌクレオチドを３’ −ＯＨＤＮＡ末端（１，２０）に導入する。ストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）は、それからビオチニル化ヌクレオチドに結合し、それを過酸化水素及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、安定なクロモゲンにより検出した。この手順を使用すると、光顕微鏡下で視覚化された場合は、壊れた核は暗褐色へ染色された。
【０１３１】
結果
ＨＰＶＥ２タンパク質を発現する細胞株中においてＨＰＶ１６ＬＣＲを含むベクターからのルシフェラーゼレポーター発現のアップレギュレーション
ＨＰＶ１６ＬＣＲプロモーターがＨＰＶ１６ポジティブ細胞株中の外因の遺伝子発現をドライブするに十分であるかどうかを測定するために、ＣａＳｋｉ細胞をプラスミドｐＮＳＸＨ−４及びコントロールとしてｐＧＬ３ベーシックプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を用いて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流でトランスフェクトした。ＨＰＶネガティブ口腔上皮ＨＳＣ３細胞株はＥ２発現を示さないが、Ｅ２特異性プライマーを用いたＣａＳｋｉ細胞株のＲＴ−ＰＣＲ分析は、細胞株がＥ２遺伝子を発現する（図４）ことを示した。
【０１３２】
図５における結果は、ｐＮＳＸＨ−４を用いてトランスフェクトされたＣａＳｋｉ細胞が、ＬＣＲを含まないｐＧＬ３を用いてトランスフェクトされたＣａＳｋｉ細胞と比べ、２０倍高いルシフェラーゼ活性を表すことを示した。対照的に、プラスミドｐＮＳＸＨ−４がＨＰＶネガティブＨＳＣ３細胞へトランスフェクトされた場合は、ルシフェラーゼ活性のレベルはコントロール親プラスミドｐＧＬ３を用いた発現のレベルと同等であった。
【０１３３】
ＨＰＶ１６から及びＨＰＶ１８からのＥ２タンパク質のトランスアクティベーション領域は、機能的に同族である（２２）。ＨＰＶ１６Ｅ２タンパク質によるアップレギュレーションについてのこのプラスミドの特異性をＨＰＶ１８のものと比較して測定するために、ｐＮＳＸＨ−４及びｐＧＬ３プラスミドをＨＰＶ１８ポジティブＨｅＬａ細胞株へトランスフェクトした。図５における結果は、ＨｅＬａ細胞内において、ｐＮＳＸＨ−４が、ｐＧＬ３コントロールプラスミドを用いて検出されたルシフェラーゼ活性より１２倍高く活性化されることを示す、しかしこの発現レベルはＨＰＶ１６ポジティブＣａＳｋｉ細胞について測定されたものの約半分である。同時に、これらのデータは、ＨＰＶ１６ＬＣＲがＨＰＶ１６Ｅ２によりトランスアクティベートされ得ることを示し、そしてＨＰＶ１８Ｅ２タンパク質により、より小さい範囲で外因性遺伝子の発現をドライブすることを示す。
【０１３４】
ＨＰＶ１６ＬＣＲによりドライブされるＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子発現はＧＣＶ及びＡＣＶ感作を生じる
トランスフェクトされたＣａＳｋｉ細胞におけるＨＳＶ１−ＴＫの発現を、図４に示される様にＲＴ−ＰＣＲにより確認した。ＨＳＶ１−ＴＫｍＲＮＡはＣａＳｋｉ細胞７日間ポストトランスフェクション（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）において検出され、ＨＳＣ３細胞中においてＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の発現は検出されず、Ｅ２遺伝子発現も何も示さなかった。ＨＰＶ１６ＬＣＲのコントロール下でＨＳＶ１−ＴＫの発現がＧＣＶ又はＡＣＶに対する感受性を与えられるかどうかを決定するために、ｐＮＳＧＬＴＫ−８プラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞のＧＣＶ及びＡＣＶ感受性と、トランスフェクトされないＣａＳｋｉ細胞及びｐＮＳＧＬ０コントロールプラスミド（図３Ｂ）を用いてトランスフェクトされた細胞とを比較した。ＣａＳｋｉ細胞をトランスフェクトし、そして前述のように増加された濃度のＧＣＶ又はＡＣＶのいずれかに曝露した。図６は、プラスミドｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトし、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現する細胞における細胞生存力上のＧＣＶの用量依存効果があることを表す。細胞生存能力はＧＣＶの濃度とともに減少し、６日間プロドラッグに曝露後、２０μｇ／ｍｌのＧＣＶ濃度で最大の細胞死（約８０％）が観察された（図６）。ＣａＳｋｉ細胞において、それらが模擬トランスフェクト又はコントロールプラスミドｐＮＳＧＬ０を用いてトランスフェクトのいずれかをした場合は、細胞生存能力に対する十分な効果は観察できなかった。２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶを用いて１０日間、ｐＮＳＧＬＴＫ−８でトランスフェクトされた細胞の治療は、培地中の９５％以上の細胞を殺し（ 図７） 、進歩的な細胞死を示した。
【０１３５】
ｐＮＳＧＬＴＫ−８でトランスフェクトされたＣａＳｋｉ細胞の感作も、異なる濃度のＡＣＶに曝露後に試験した（図８）。ＡＣＶはＧＣＶより高い３０．０μｇ／ｍｌの濃度において及びＧＣＶよりも長い期間（ １０日） 曝露後、細胞毒効果を示した（図８）。模擬トランスフェクト又はプラスミドｐＮＤＧＬ０を用いてトランスフェクトされたＣａＳｋｉ細胞は、ＡＣＶに対して抵抗力があった。これらの結果は、ＨＣＶ１−ＴＫ遺伝子を発現する細胞だけがプロドラッグに対して感受性となることを示す。試験した濃度のＧＣＶ又はＡＣＶは、模擬トランスフェクトされた細胞又はＨＳＶ１−ＴＫを発現しない細胞については毒性を持たない。
【０１３６】
ＧＣＶを媒介する殺傷がＴＫ−トランスフェクトされたＣａＳｋｉ又はＳｉＨａ細胞に特異的であったかどうかを決定するために、ＳｉＨａ　ＨＰＶ１６−ポジティブ頚部癌細胞株及びＨＳＣ３細胞におけるＧＣＶの細胞毒効果も試験した。結果を図９に示す。これらのデータは、ＳｉＨａ細胞株が、ＧＣＶに対して、ｐＮＳＧＬＴＫ−８でトランスフェクトされた場合だけ感作され、６日後にＧＣＶ治療を用いて約４２％のＳｉＨａ細胞が殺傷される。２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶを使用し、２週間の延長した曝露を使用して、ｐＮＳＧＬＴＫ−８でトランスフェクトされたＳｉＨａ細胞及びＨｅＬａ細胞の９０％以上を殺した（データは示さない）。
【０１３７】
ＣａＳｋｉ細胞よりもＳｉＨａ細胞を使用したほうが低い毒性が示されることがトランスフェクション効率における差異を反映するかどうかを決定するために、β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドを使用してコントロールトランスフェクションを行った。これらの実験は、リン酸カルシウムトランスフェクション方法についてのトランスフェクション効率が全ての試験された細胞株について類似する、すなわち４０−６０％であることを示した（データは示さない）。試験された模擬トランスフェクトされた細胞株の全てにおいて、細胞生存能力はＤＮＡ−リン酸カルシウムトランスフェクション複合物への曝露により、又は使用された異なる濃度でのプロドラッグの細胞毒効果のために影響されなかった（図９）。
【０１３８】
ＨＳＶ１−ＴＫを発現する細胞のＧＣＶ及びＡＣＶ治療はアポトーシスを誘発する
オリゴヌクレオソーム（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡラベリング、核組織染色体異常、及びＴｄＴアッセイを用いた仁内（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性により見られるように（Ａｒｅｎｄｓ等、（１９９０）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３６：５９３；　Ｇｏｒｃｚｙｃａ等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　．５３：１９４５−１９５１）、多数の研究が、ＧＣＶ治療はＨＳＶ１−ＴＫを発現する細胞におけるアポトーシスを誘発すると報告している（Ｅｌｓｈａｍｉ等（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．３：８５−９２；　Ｈａｍｅｌ等（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　．５６：２６９７−２７０２）。アポトーシス細胞はアポトーシスボディ内に断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を示され、それがマクロファージ又は隣接細胞により食され及び消化され得る。ＨＳＶ１−ＴＫを発現するＣａＳｋｉ及びＳｉＨａ細胞がＧＣＶの存在下でアポトーシスを受けたかどうかを決定するために、２０μｇ／ｍｌのＧＣＶを使用した治療後に細胞の組織形態の調査を行った。プラスミドｐＮＳＧＬＴＫ−８でトランスフェクトされたＣａＳｋｉ及びＳｉＨａ細胞株を、０−２０．０μｇ／ｍｌ最終濃度の範囲の異なる濃度のＧＣＶの存在下において７日間培養し、そしてＴＵＮＥＬ染色により試験した。ｐＮＳＧＬＴＫ−８で４日間トランスフェクトしたＣａＳｋｉ細胞を２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶで４日間インキュベートした後、細胞はアポトーシス形態の特性を示し始めた（図１０）。顕微鏡評価は、核が高度に濃縮され、そして４日間の治療後に断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ）されることを表した（図１０）、そしてＧＣＶ治療の６日後に、ＴＵＮＥＬ染色は暗褐色に着色した高度に断片化された染色ＤＮＡを表した。アポトーシス細胞の細胞質も明確にパンチアウト（ｐｕｎｃｈｅｄ−ｏｕｔ）された態様を表し、そして多くの細胞において、膜の水疱も観察された。さらに６日間のＧＣＶ治療により、細胞死のため、領域内に見られる細胞はほとんど無かった。
【０１３９】
ＳｉＨａ細胞も、プラスミドｐＮＳＧＬＴＫ−８でトランスフェクトし、及び２０．０μｇ／ｍｌのＡＣＶで治療されたように（図１２）、２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶで８日間治療された後（図１１）、典型的なアポトーシス形態に関連する重要な細胞死を示した。ＴＵＮＥＬ染色核の典型的なアポトーシス形態は、ＡＣＶ曝露の６日後に観察され、治療の１０日後には明確な効果が見られた（図１２）。ＧＣＶ又はＡＣＶの不存在下では、基底レベルのアポトーシスのみが観察された。６〜８日間の２０．０μｇ／ｍｌの濃度のＧＣＶ又はＡＣＶでトランスフェクトされない細胞株のＴＵＮＥＬ染色は、アポトーシス細胞の増加を示さなかった（データは示さない）。
【０１４０】
さらに、「バイスタンダー効果（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ　ｅｆｆｅｃｔ）」として公知の現象において、ＴＫを発現しない細胞は、ＨＳＶ１−ＴＫを発現する細胞の存在下において殺され得る（Ｃｈｅｎ等（１９９５）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．６：１４６７−１４７６；　Ｅｌｓｈａｍｉ等（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．３：８５−９２；　Ｆｉｃｋ等（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：　１１０７１−１１０７５；　Ｆｒｅｅｍａｎ等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，．４６：５２７６−５２８１；　Ｈａｍｅｌ等（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，．５６：２６９７−２７０２）。これは細胞間の又はアポトーシスボディの食作用によるＧＣＶ搭載細胞及び核の物質の移動により生じ得る。ＨＳＶ１−ＴＫトランスフェクトされた細胞において、アポトーシスボディは核断片及び細胞小器官を含むことが分かり、食作用と一致する（図１０Ｃ（ｃ）、９Ｃ（ｄ））。
【０１４１】
ディスカッション
ＨＰＶ結合した高度のＣＩＮの治療は、頚部ＳＣＣの発生を減少させることを示し、高度の肛門ＩＮの治療は同様に肛門ＳＣＣの発生を減少させることができる。現行の治療様式はＨＰＶ特異的でなく、最初に物理的な破壊又は障害を除去することに頼っている。これらの方法は、特に肛門癌の場合は苦痛でありかつ高価であり得る。障害再発は頚部又は肛門のいずれかにおいては稀なことではなく、そして続けられる指令は治療後の患者のフォローアップを閉ざす。特にＨＰＶ感染細胞をターゲットにする治療は重要な治療の前進を表し、そして単独又は現行の治療学的アプローチと組み合わせて使用することができる。著しくＨＩＶ関連の免疫抑制を伴う数種の高度に危険な個体は、通常の治療と同様には応ずることができず、そしてしばしば異なる様式を使用する複数の治療の過程を必要とする（Ｋｉｖｉａｔ等（１９９３）ＡＩＤＳ．７：４３−４９；　Ｍａｉｍａｎ等（１９９３）Ｏｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎｅｃｏｌ．８２：１７０−１７４；　Ｍａｉｍａｎ（１９９８）Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ　Ｍｏｎｏｇｒ．２３：４３−４９；　Ｐａｌｅｆｓｋｙ（１９９４）ＡＩＤＳ　８：２３８−２９５；　Ｐａｌｅｆｓｋｙ（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７：４３７−４４１；　Ｐａｌｅｆｓｋｙ（１９９８）Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，２３：１５−２０；　Ｐａｌｅｆｓｋｙ等（１９９８）Ｊ　Ａｃｑｕｉｒ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃ　Ｓｙｎｄｒ　Ｈｕｍ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ．１７（４）：３２０−３２６；　Ｐａｌｅｆｓｋｙ等（１９９８）ＡＩＤＳ　１２（５）：４９５−５０３）。初期の研究段階にある治療に対するより新しいアプローチとしては、ＨＰＶ１６タンパク質に対する医療ワクチンを通じての免疫モジュレーション又はイミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）のような医薬を用いた局所的免疫応答のモジュレーションを含む。しかし、この報告に記載されるようなＨＰＶ特異性の医療アプローチは、完全な免疫応答を必要としないため、ＨＩＶポジティブな個体において特別な価値のものであり得る。
【０１４２】
このＨＰＶ特異性遺伝子治療アプローチの可能性を評価するために、ＨＳＶ１−ＴＫ自殺遺伝子を、ＨＰＶ感染細胞へ、ＨＰＶ　Ｅ２応答エレメントのコントロール下で運ぶシステムをデザインした。我々は、ＨＳＶ１−ＴＫの発現は、ＨＰＶ１６ポジティブ細胞をＧＣＶ又はＡＣＶのような非毒性プロドラッグに感受性にすることを示した。最近は、ＨＳＶ１−ＴＫ／ＧＣＶアプローチは数種の他の疾患のための重要な試みにおける研究下にある（Ｍａｒｃｅｌ及びＧｒａｕｓｚ（１９９７）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｅｎｒｏｌｅｍｅｎｔ　ｒｅｐｏｒｔ，　ｅｎｄ　１９９６．　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，８：７７５−８００；　Ｔａｋａｍｉｙａ等（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３；　Ｔｏｎｇ等（１９９６）Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．６１（２），１７５−１７９：　Ｙｅｅ等（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．７（１０），１２５１−１２５７）。ＨＳＶ１−ＴＫ／ＧＣＶ方法は、ラットにおいて哺乳動物上皮組織から発生する固体腫瘍を効率的に治療することに使用される（Ｗｅｉ等（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５８（１６）：３５２９−３５３２）。転写活性化された腫瘍又は組織特異的な自殺遺伝子治療アプローチも、下垂体乳腺刺激細胞について（Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ等（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１（９）：３４９３−５０５）及び乳癌について（Ｐａｎｄｈａ等（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１７（７）：２１８０−２１８９）使用することに成功した。成功した段階Ｉ臨床試験は、ヒトｅｒｂＢ−２遺伝子プロモーターによりターゲットされる乳癌特異的遺伝子プロドラッグ活性治療の安全性及び効力を試験することが指示された（Ｐａｎｄｈａ等（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１７（７）：２１８０−２１８９）。このアプローチは安全であることを示され、そして９０％までの場合にてターゲットされた遺伝子発現を生じる。この研究における我々の結果にそって、これらの研究は腫瘍又はウイルス感染細胞の独特な転写プロファイルを活用する遺伝子プロドラッグ活性化治療の発展のために有望である。
【０１４３】
肛門生殖器間ＩＮの治療のために、経口路のＧＣＶ、ＡＣＶ又はガンシクロビルのような他の活性経口医薬と組み合わせて、ＨＳＶ−ＴＫ自殺遺伝子をＨＰＶ１６ＬＣＲのコントロール下における発現を有するＨＰＶ１６感染肛門生殖器間粘膜上皮へ運ぶことからなるアプローチを提案する。これらの障害は粘膜であるか又は比較的接触可能なので、リポソーム運搬を使用する局所的なアプローチを使用して有効レベルのプラスミドを運ぶことを可能にする。カチオン性リポソームがＤＮＡのキャリアとして働き、領域、例えば肺、鼻上皮、動脈内皮、脾臓、脳及び多数の組織を規定する場合、多数のリポソーム／ＤＮＡ配合物は前臨床（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ）又は臨床的な研究における試験に成功した（Ｈｙｄｅ等（２０００）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，７，１１５６−１１６５；　Ｒｅｉｍｅｒ等（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，　２８９（２）：８０７−８１５；　Ｔａｋａｋｕｗａ等（１９９７）Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，．８８（２）：１６６−１７５）。これらの研究は、局所又は局在化された適用が投与の適切な方法である場合に、ＤＮＡリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｓ）が遺伝子のデリバリーにおいて効果的であることを示す。最近の遺伝子治療研究は、ＤＮＡ／リポソームの嚢胞性繊維症患者の鼻上皮への実質的な効力を伴う繰返し投与を行うことに成功した（Ｈｙｄｅ等（２０００）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，７，１１５６−１１６５）。
【０１４４】
我々のアプローチは、Ｅ２タンパク質によるＨＰＶ　ＬＣＲのトランスアクティベーション及びＨＰＶ（例えばＨＰＶ１６）ＬＣＲの能力を活用し、外因遺伝子の発現をドライブする。それゆえ、我々はＥ２タンパク質をトランスで提供できるＨＰＶ（例えばＨＰＶ１６）遺伝子シーケンスを有する細胞株を選択する。Ｅ２　ＯＲＦの遺伝子生成物は、エンハンサーシーケンス及びＬＣＲ中に位置するＥ２応答シーケンスをターゲットにするトランス作用機能を有する（Ｂｅｒｎａｒｄ及び（１９９４）Ａｒｃｈ．　Ｄｅｒｍａｔａｌｏｇｙ．１３０：２１０−２１５；Ｂｏｕｖａｒｄ等（１９９４）ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：５４５１−５４５９；　Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｃｒｉｐｅ等（１９８７）　ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３７４５；　ＭｃＢｒｉｄｅ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８４１１−１８４１４；　Ｓｃｈｗａｒｚ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：１１１）。我々の実験は、ＨＰＶ１６ゲノムの２５０以上のコピーを有するＣａＳｋｉ細胞株及びＨＰＶゲノムＤＮＡの１〜２種のコピーを有するＳｉＨａ細胞株にて行った（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎａｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８０：１７２５−１７３３）。Ｅ２の発現は両方の細胞株において確認され、そして両方の細胞株はＨＳＶ１−ＴＫを用いたトランスフェクション及びＧＣＶへの曝露後に殺された。ＳｉＨａ細胞よりもＣａＳｋｉ細胞における方が早く殺傷が起こることが観察された、そしてこれはより高いＨＰＶ１６ＤＮＡコピー数及びおそらくより高いレベルのＥ２タンパク質発現を反映するものであり得る。模擬トランスフェクト又はコントロールプラスミドを用いてトランスフェクトをされた細胞は、毒性を示さないかＨＰＶネガティブ細胞でもなかった。さらに、我々の結果は、ＨＰＶ１６ＬＣＲがＥ２タンパク質により活性化され、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の発現をドライブし、細胞をＧＣＶ又はＡＣＶに対し感受性にすることを示す。
【０１４５】
我々のシステムにおけるＥ２タンパク質の役割に加え、Ｅ１発現も重要であり得る。ＨＰＶポジティブ細胞からのＥ２タンパク質と結合するＥ１タンパク質は、複製の起点についてのウイルスシーケンスであるオリ（ｏｒｉ）と相互作用し、プラスミドＤＮＡ複写を誘発する（Ｇａｄｉ等（１９９９）Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｅｓｐ．　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．２０：１００１−１００６）。これはこの遺伝子治療方法のデザインにおいて有利に使用することができる。ｐＧＬ３ベーシックプラスミドは哺乳動物細胞中に複製の起点を有さないが、我々のベクター中に含まれるＬＣＲシーケンスはオリ（ｏｒｉ）シーケンスを含むので、トランスフェクトされたＣａＳｋｉ細胞における高レベルのルシフェラーゼ活性は、プラスミド複製を反映する。
【０１４６】
我々のデータは、「バイスタンダー効果」を除いては、このアプローチがＨＰＶ感染細胞に対して特異的でなければならないことを提案する。ＨＳＶ１−ＴＫを発現する細胞のＧＣＶ治療は、実際にＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現するものよりも多くの細胞を殺すことは以前に観察されていた。マウス結腸癌腫細胞から生じる局在化した腫瘍において、ＨＳＶ１−ＴＫ／ＧＣＶ方法を使用する研究は、わずか１０〜２０％の腫瘍細胞がＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を用いてトランスフェクトされるにもかかわらず、腫瘍は「バイスタンダー効果」のためにほとんど完全な退行を示すことが示された（Ｇａｇａｎｄｅｅｐ等（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，３（２）：８３−８８）。バイスタンダー効果に含まれる機構は完全に理解されていないが、それが感染細胞から非感染隣接細胞への、活性リン酸化ＧＣＶ又はＡＣＶの細胞内移動により生じることは起こり得る。バイスタンダー効果は、細胞−細胞接触又は細胞内連絡を通して、或いは間隙連結（ｇａｐ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を通して部分的に起こり（Ｃｈｅｎ等（１９９５）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．６：１４６７−１４７６；　Ｅｌｓｈａｍｉ等（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．３：８５−９２；　Ｆｉｃｋ等（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：　１１０７１−１１０７５；　Ｆｒｅｅｍａｎ等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，．４６：５２７６−５２８１　２１）、それを通してＧＣＶホスフェートはＴＫ−ポジティブ及びＴＫ−ネガティブ細胞間を循環する。隣接細胞によるＧＣＶホスフェートを積載した残骸の食作用も細胞死へと導くことができる（Ｈａｍｅｌ等（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，．５６：２６９７−２７０２）及び我々はトランスフェクトされたＨＰＶ１６細胞株中で、そのような食作用を観察した。
【０１４７】
多数の研究が、バイスタンダー効果に伴うＧＣＶ誘発細胞死はアポトーシスにより媒介されることを示す（Ｈａｍｅｌ等（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，．５６：２６９７−２７０２）。我々の研究において、我々は同様に細胞組織形態及びアポトーシスのＤＮＡ破片化特性を観察した。ＣａＳｋｉとＳｉＨａはｐ５３タンパク質が欠失し、又は非常に低いレベルで発現されるＨＰＶ１６ポジティブ細胞株であるために（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ等（１９９０）Ｃｅｌｌ，６３（６）：１１２９−１１３６；　Ｔｈｏｍａｓ等（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，７６９０−７７００）、それらの細胞株内でのＧＣＶ誘発アポトーシスがｐ５３依存機構を通じて生じることは起こり得ることである。
【０１４８】
インビボでのＨＰＶ誘発発癌のモデルにおいて、ＨＰＶ感染は上皮の基底層又は副基底層において最初に確立されることが分かる（Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｓｔｏｌｅｒ等（１９９２）Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２３（２）：１１７−１２８）。これらの細胞は、ＨＰＶ感染の潜在的な長期間のリザーバを構成する。基底細胞は少数のＨＰＶのエピソームのコピーを含み、及びＥ２のような低レベルのウイルスタンパク質を発現するけれども、ウイルス複製及びタンパク質発現は、細胞が分化する（ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）ときに増加する。低いレベルにおいて、Ｅ２タンパク質はＬＣＲ中のＥ６プロモーターの活性をアップレギュレートするが、Ｅ２タンパク質が蓄積されるとＥ６プロモーターは抑制される（Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｓｃｈｗａｒｚ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：１１１；　Ｓｔｏｌｅｒ等（１９９２）Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２３（２）：１１７−１２８４７）。Ｅ２発現に依り、Ｅ６プロモーターのコントロール下で外因遺伝子の発現をアップレギュレートする方法は、それゆえ低レベルのＥ２を発現する細胞において最大の毒性を有することが予想される。それゆえ、我々のアプローチはＨＰＶ感染基底又は副基底細胞の除去に特に好適であると信ずる、そして結果としてＨＰＶ感染のリザーバ−を除去することに効果的であると予想する。肛門生殖器間の上皮は連続的に基底及び副基底細胞層により再生される。ＨＰＶネガティブ基底及び副基底細胞が、消滅するＨＰＶポジティブ細胞に取って代わる場合、上皮を再発生させる時間にわたりＨＰＶ感染が発展的に無くなるであろう。この治療アプローチは、それゆえ上皮代謝回転の少なくとも１サイクルにわたって障害を繰返し曝すことを含む。
【０１４９】
本明細書中で記載されるアプローチはＩＮについては良好に働くが、浸潤性の癌の治療のためには効果が低い。ＨＰＶゲノムのホスト染色体ＤＮＡへの統合が、しばしば高度のＩＮ及び癌において見られる。統合を用いて、エピソームのＨＰＶ　ＤＮＡはＥ１／Ｅ２境界にて破壊し、Ｅ１及びＥ２の開いた読み枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を崩壊させる（Ｂｒｏｋｅｒ等（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７−２０８；　Ｃｒｉｐｅ等（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：　３７４５；　Ｅｌ　Ａｗａｄｙ等（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５９（２）：３８９−３９８；　ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１８４：９−１３）。Ｅ２発現のロスは、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の発現を減じ、そして癌細胞はＧＣＶに抵抗力のあるままであり得る。逆に、数種の頚部癌は低レベルのＥ２を発現し、そしてこれらの腫瘍はこのアプローチを用いて少なくとも部分的に治療可能である。
【０１５０】
バイスタンダー効果はＨＳＶ１−ＴＫを発現する細胞に隣接する細胞も殺し、それは数種の正常な非感染隣接細胞も含む。この効果は、より高いレベルのＥ２を発現する障害においてより区別される細胞を除去することもでき、そしてＨＳＶ１−ＴＫの発現をほとんど有さないか全く有さないと予想される細胞も排除する。それゆえ本明細書中に記載された治療アプローチにおいて、「イノセントバイスタンダー効果（ｉｎｎｏｃｅｎｔ　ｂｙｓｔａｎｄｅｒ　ｅｆｆｅｃｔ）」は潜在的に利点がある、なぜなら障害における細胞のフラクションだけがトランスフェクトされた場合に、それは細胞を殺すために許容し得るからである（Ｃｈｅｎ等（１９９５）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．６：１４６７−１４７６；　Ｆｒｅｅｍａｎ等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，．４６：５２７６−５２８１；　Ｇａｇａｎｄｅｅｐ等（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，３（２）：８２−８８）。しかし、この効果は障害のすぐ近くの細胞に対してのみに制限されることが適当であるが、それは通常の隣接ＨＰＶネガティブ細胞の毒性を導き得る。
【０１５１】
細胞殺傷を誘発させるためのこの研究において使用されるＧＣＶ及びＡＣＶの濃度は他のシステムにおいて明らかにされるものと同等であり、（Ｇａｌｖｅｚ等（１９９６）Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，２（１）：４７−５１；　Ｃｈｅｎ等（１９９５）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．６：１４６７−１４７６；３４，５１）そしてこれらの濃度はこれらの医薬の経口投与を用いて達成できる範囲内にあることも注目すべきことである。しかし、我々の経験において、ＡＣＶよりＧＣＶを用いて殺傷する方がより効率的であることを観察した、ＡＣＶはＧＣＶを用いるより高い濃度とＨＳＶ１−ＴＫポジティブ細胞へより長い期間曝すことが必要である。これらの医薬の代謝における研究は、ＡＣＶが、低いＤＮＡ導入（４４）を有するその活性トリホスフェート形態へと貧しくリン酸化されることを示した。ＧＣＶはより優れた細胞毒を生成することを示し、そして細胞をある細胞分裂を完了させ、その後初期Ｓ相に永久に抑える独特な遅延機構を通してマルチログ殺傷を誘発させることを示した。これは、ＧＣＶ及びバルガンシクロビルのようなより高度な経口生物学的利用能を有する最近改良された同属体が、インビボ治療用のより強い医薬となりうることを提案する。
【０１５２】
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１１及びウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）−１の４種のパピローマウイルスＥ２タンパク質のシーケンスアライメント（図１３）は、それらが３０％アミノ酸シーケンス同一性を有することを明らかにする（Ｈａｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｂｏｔｃｈａｎ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４（５４２０）：１６７３）。これらのＥ１タンパク質同様にこれらのタンパク質は、インタータイピック（ｉｎｔｅｒｔｙｐｉｃ）な交差変異型（ｃｒｏｓｓ−ｖａｒｉａｎｔ）にて互いに機能的に補うことができる（Ｈａｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｂｏｔｃｈａｎ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４（５４２０）：１６７３）。我々の研究において、細胞殺傷もＨＰＶ１８ポジティブＨｅＬａ細胞株中で観察され、我々の構成において使用されるＨＰＶ１６プロモーターエレメントは完全にＨＰＶ１６に対し特異的でないことを示した。ＨＰＶ１６プロモーターエレメントを含むプラスミドの使用は、他のＨＰＶ型に関連する障害において数種の効果を有することが期待されるが、好適なＨＰＶ型のコントロールエレメントを含むプラスミドを用いる治療に対する型特異的なアプローチは、これらの障害についてより効果がある。例えば、ＨＰＶ１８により生ずるＩＮは、ＨＰＶ１８特異性構造を用いて治療でき、そしてＨＰＶ６又はＨＰＶ１１に関連する尖圭コンジローマはＨＰＶ６及びＨＰＶ１１特異性ＬＣＲ構造を用いて治療できた。
【０１５３】
要約すると、我々は、ＨＰＶ１６プロモーターエレメントのコントロール下におけるＨＳＶ１−ＴＫのトランスフェクション及び続けてＧＣＶ又はＡＣＶの投与からなるＨＰＶ特異性遺伝子治療アプローチの可能性についてインビトロでの証拠を示した。さらなる実験を行い、動物モデルにおける安全性及び効果を試験するのと同様に、肛門生殖器間の上皮への遺伝子デリバリー方法を最適化することができる。
【０１５４】
例２
細胞毒構造の特異性
本明細書中で記載される方法の特異性を試験するために、ＨＰＶポジティブ細胞株（ＣａＳｋｉ）及び４種のＨＰＶネガティブ細胞株を、本明細書中に記載されるプラスミドｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトした。図１４に示されるように、ガンシクロビルへの曝露の６日後、細胞毒はＨＰＶポジティブ細胞株ＣａＳｋｉのみへ制限された。プラスミドｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトされた後に、異なる濃度のＧＣＶを用いて試験された４種の他の非ＨＰＶ細胞株（ＨＳＣ３−ヒト口腔癌細胞株、ＭＤＣＫ−Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞株、ＶＥＲＯ−アフリカ緑ザル腎臓細胞株、及びヒト口腔扁平上皮細胞癌細胞，ＳＳＣ９）は、重要な細胞毒効果を何も示さなかった。
【０１５５】
例３
アポトーシスのトランスフェクトされた細胞における存在ＨＳＶ１−ＴＫタンパク質の検出
ＣａＳｋｉ細胞を、ＨＳＶ１−ＴＫ構造（ｐＮＳＧＬＴＫ−８）によりドライブされるＨＰＶ１６ＬＣＲを用いてトランスフェクトした。４８時間後、細胞を固定し、ＨＳＶ−ＴＫタンパク質をポリクローナルウサギ抗ＨＳＶ１−ＴＫ抗体及びＦＩＴＣコンジュゲートされたヤギ抗−ウサギ第二抗体を用いて検出した。核染色は、ヨウ化プロピジウムを用いて行った。細胞を共焦顕微鏡により調査した。
【０１５６】
図１５ＡはＰＩによる細胞の核染色を示す。図１５Ｂは抗ＨＳＶ１−ＴＫの核染色を示す。図１５Ｃ、マージ（ｍｅｒｇｅ）は黄色（白黒写真中では明るい白）で示された核コロキャリゼーション（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を用いてＨＳＶ１−ＴＫタンパク質の核及び細胞質分布を示す。
【０１５７】
ガンシクロビル実験において、ＣａＳｋｉ細胞をＨＳＶ１−ＴＫ構造（ｐＮＳＧＬＴＫ−８）によりドライブされるＨＰＶ１６ＬＣＲを用いてトランスフェクトした。細胞を２０μｇ／ｍｌのＧＣＶを用いて２日間治療した。細胞を固定し、ＨＳＶ１−ＴＫタンパク質を、ポリクローナルウサギ抗ＨＳＶ１−ＴＫ抗体及びＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗−ウサギ第二抗体を用いて検出した。核染色は、ヨウ化プロピジウムを用いて行った。細胞を共焦顕微鏡により調査した。
【０１５８】
図１６ＡはＰＩによる細胞の核染色を示す。核の集団は早期のアポトーシスのために分裂して見える。図１６Ｂは抗ＨＳＶ１−ＴＫの核染色を示す。マージ（ｍｅｒｇｅ）（図１６Ｃ）は黄色（白黒写真中では明るい白）で示された核コロキャリゼーション（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を用いたＨＳＶ１−ＴＫタンパク質の核及び細胞質分布を示す。
【０１５９】
本明細書中に記載される例及び具体例は例証の目的のみであり、それらの見識内で種々の改変及び変更が当業者に提案され、並びにこの適用及び請求項の精神及び範囲内において含まれることができる。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、特許出願は全ての目的のために完全に参考文献として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は本明細書中に記載される方法の１つの具体例である。
【図２】
図２は複製及び染色体外に維持されることができる遺伝子治療を表す。
【図３】
図３Ａは初期プロモーターＰ９７の上流におけるＨＰＶ１６ウイルスＬＣＲの概略図である。図３Ｂは、本研究において使用されるプラスミドの概略図である。
【図４】
図４はｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いたトランスフェクションの７日後のＣａＳｋｉ細胞におけるＨＳＶ１−ＴＫ及びＨＰＶ−１６　Ｅ２のＲＴ−ＰＣＲ分析である。レーン（Ａ）ＨＳＣ３細胞からのｍＲＮＡ、（Ｂ）ＣａＳｋｉ細胞からのｍＲＮＡ、（Ｃ）ネガティブコントロールとしてＲＴを有さないＣａＳｋｉ細胞からのｍＲＮＡ。レーンＤ、Ｅ及びＦは、約２１６の塩基対の生成物を与えるＨＰＶ−１６　Ｅ２特異性プライマーを使用して増幅されたＲＴ−ＰＣＲ生成物を表す。レーン（Ｄ）ＨＳＣ３細胞からのｍＲＮＡ、（Ｅ）ＣａＳｋｉ細胞からのｍＲＮＡ、（Ｆ）ネガティブコントロールとしてＲＴを有さないＣａＳｋｉ細胞からのｍＲＮＡ。
【図５】
図５はＨＰＶ１６ポジティブ及びＨＰＶ１６ネガティブ細胞株によるルシフェラーゼ発現の刺激を表す。
【図６】
図６は　ＣａＳｋｉ細胞における、ガンシクロビル（ＧＣＶ）のインビトロでの細胞毒における投与量依存を表す。
【図７】
図７はＣａＳｋｉ細胞における２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶのインビトロでの細胞毒の時間経過分析である。
【図８】
図８は、ＣａＳｋｉ細胞におけるアシクロビル（ＡＣＶ）のインビトロでの細胞毒の投与量依存性を表す。
【図９】
図９は、３種の異なる細胞株：ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ及びＨＳＣ３における２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶのインビトロの細胞毒性を表す。
【図１０】
図１０Ａ−１０Ｄは、ＨＰＶ１６　ＬＣＲプロモーターのコントロール下でＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現するｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトされ及び２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶに６日間曝されたＣａＳｋｉ細胞におけるアポトーシスの誘発を表す。細胞をＧＣＶに曝露後、以下の時間において分析した、図１０Ａ：０日、基準レベルのアポトーシスを示す、図１０Ｂ：２日、壊れたＤＮＡを染色する暗褐色を有する多数の細胞が存在する：図１０Ｃ：４日細胞は高度に濃縮された核又は非常に暗褐色の壊れたＤＮＡを有する、図１０Ｄ：６日、細胞死により非常に少ない細胞が見える。細胞は細胞質が出ていった壊れた形体及び壊れた核を表す。
【図１１】
図１１Ａ−１１Ｃは、ＬＣＲプロモーターのコントロール下でＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現するｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトされ及び２０．０μｇ／ｍｌのＧＣＶに１０日間曝されたＣａＳｋｉ細胞におけるアポトーシスの誘発を表す。細胞をＧＣＶに曝露後、以下の時間にて分析した、図１１Ａ：０日、基準レベルのアポトーシス、図１１Ｂ：８日、細胞は暗褐色の壊れた核を示す、：図１１Ｃ：１０日、細胞は壊れた核を示し、細胞は細かい細胞内の結合を作り、そしてアポトーシスのボディを含む細胞はほとんど見られない。
【図１２】
図１２Ａ−１２Ｄは、ＨＰＶ１６　ＬＣＲプロモーターのコントロール下でＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を発現するｐＮＳＧＬＴＫ−８を用いてトランスフェクトされ及び２０．０μｇ／ｍｌのＡＣＶに１０日間曝されたＣａＳｋｉ細胞におけるアポトーシスの誘発を表す。細胞をＡＣＶに曝露後、以下の時間にて分析した、図１２Ａ：０日、基準レベルのアポトーシス、図１２Ｂ：２日、壊れたＤＮＡを染色する暗褐色を有する多数の細胞が存在する、図１０Ｃ：６日、細胞は細胞質が出ていった壊れた形体及び壊れた核を表す、及び図１２Ｄ：１０日、細胞の死により数の減少が見られる。残った細胞は壊れた核及び数個の壊れたボディが見られる。
【図１３】
図１３は４種のパピローマウイルスＥ２タンパク質、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１１及びウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）−１のシーケンスアライメントを表し、トランスアクティベーション領域残渣の保存を表す。
【図１４】
図１４は、ＨＳＶ１−ＴＫ構造を用いてトランスフェクトされ及び変更するレベルのガンシクロビルに曝されたＨＰＶポジティブ及びＨＰＶネガティブ細胞の生存を表す
【図１５】
図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃは、トランスフェクトされた細胞中のＨＳＶ１−ＴＫ構造（ｐＮＳＧＬＴＫ−８）の検出を表す。図１５ＡはＰＩによる細胞の核染色を表す。図１５Ｂは抗ＨＳＶ１−ＴＫ染色を表す。図１５Ｃは、ＨＳＶ１−ＴＫタンパク質の溶解した核及び細胞質分布を表す。
【図１６】
図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃは、ガンシクロビルで処理されたアポトーシス細胞におけるＨＳＶ１−ＴＫ構造（ｐＮＳＧＬＴＫ−８）の検出を表す。図１６ＡはＰＩによる細胞の核染色を表す。図１６Ｂは抗ＨＳＶ１−ＴＫ染色を表す。図１６Ｃは、ＨＳＶ１−ＴＫタンパク質の溶解した核及び細胞質分布を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505892.tif 000091
【国際調査報告】
2004505892.tif 000092
2004505892.tif 000093
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