(57)【要約】本発明は新規なレチニルレチノエート、その製造方法、その製造に有用な新規中間体、および有効成分としてレチニルレチノエートを含有する化粧料組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(１)のレチニルレチノエート。
【化１】
2004523525.tif 000016
(1)
【請求項２】
(ａ)下記一般式(２a)：
【化２】
2004523525.tif 000017
(2a)
の化合物を溶媒中で縮合剤および触媒の存在下、下記一般式(３a)：
【化３】
2004523525.tif 000018
(3a)
の化合物と反応させ、
(ｂ)下記一般式(２b)：
【化４】
2004523525.tif 000019
(2b)
の化合物を溶媒中で有機アミン触媒の存在下、上記一般式(３a)の化合物と反応させるか、または
(ｃ)下記一般式(２c)：
【化５】
2004523525.tif 000020
(2c)
(式中、Ｘは、ハロゲン、ｐ−トルエンスルホニルまたはメタンスルホニルを示す)
の化合物を溶媒中で有機アミン触媒の存在下、上記一般式(３a)の化合物と反応させることを特徴とする請求項１に記載の一般式(１)の化合物の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の一般式(１)の化合物を有効成分として含むことを特徴とする化粧料組成物。
【請求項４】
下記一般式(２b)のレチノール酸無水物。
【化６】
2004523525.tif 000021
(2b)
【請求項５】
請求項４に記載の一般式(２b)の化合物を有効成分として含むことを特徴とする化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレチノール誘導体およびその製造方法に関する。特に、本発明は下記一般式(１)の新規なレチニルレチノエート、その製造方法、その製造に有用な新規中間体、および一般式(１)の化合物を有効成分として含む化粧料組成物に関する。
【化１】
2004523525.tif 000002
(1)
【背景技術】
【０００２】
人は年を取るにつれて老化現象が深まる。特に、皮膚の場合はその変化が目立つ。皮膚老化の主な現状はシワ、肥厚、弾力の低下、カサツキ、荒れ、斑点等の増加であり、これは、長期間太陽光線にさらされることによるものと考えられる。太陽光によるこのような老化を光老化といい、太陽光による表皮と真皮組織の変化によって引き起こされる。
【０００３】
皮膚の光老化は、トレチノイン(all−トランス−レチノイン酸)、レチノールおよびその誘導体、ＡＨＡsなどを含有するクリームを皮膚に塗ると抑制できると報告されている。しかし、トレチノインは脂溶性であるため、吸収力が低く、生体内で不安定で、皮膚に刺激的で、潜伏期間中に皮膚のカサツキ、創傷、ハガレ等といった副作用を引き起こすことがある。従って、医薬および化粧品の主原料としてトレチノインを用いることには多くの問題がある(参照：USP 4,677,120)。他方、ビタミンＡ、レチノールの場合は、光、酸素、熱、脂質過酸化、または水に不安定であるのでほんど使用できない。従って、レチノールを使用するために、ＢＨＴ、ジ−α−トコフェロール、ＢＨＡ、アスコルビン酸、トコフェリルリノール酸等といった抗酸化剤を使用して安定にするか、外からの影響の遮断のためにリポソームまたはカプセルといったなんらかの手段を採用して安定にする等、付加的な経費を支払わなければならない問題がある(参照：USP 6,221,927 および USP 5,744,148)。上記のような理由によって、安定性が改善された誘導体が開発されてきた。今までに開発された誘導体は、光露出にまだ不安定で短期間内に結晶性物質から粘性物質となり、いくらかの色合いが変化する分解が起こり、過酸化物が形成される。その結果、好ましくない効果が生じ、何らかの毒性物質が生成し得、使用が制限される(参照：USP 6,183,774)。一方、ＡＨＡｓはビタミンＡに比べてより優れた安定性を持っており、コラーゲン合成を増進させることが知られている。しかし、上記作用のメカニズムが正確に解明されておらず、pＨによる皮膚刺激の懸念のため、その使用は制限的である(参照：USP 6,143,309, USP 6,022,896 および USP 5,962,015)。
【０００４】
従って、皮膚老化改善のためにビタミンＡの活性をそのまま維持しながら非刺激的で、安定性が向上した原料の開発が切実に求められている(参照：USP 6,180,670 および USP 5,863,942)。
【０００５】
発明の開示
本発明者らは、このような要求に答えるために鋭意研究を行った。抗シワ等の効果に優れたビタミンＡ(レチノール)とレチノイン酸を縮合させて得られた上記一般式(１)のレチニルレチノエートを見出し、本発明を完成した。本発明によって開発された一般式(１)の化合物は、既存のレチノールまたはレチノイン酸に比べて化学的安定性に優れており、皮膚毒性が低く、皮膚再生能においても優れた効果を示すことが確認された。
【０００６】
従って、本発明の目的は、一般式(１)の新規なレチニルレチノエートを提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、一般式(１)の化合物の製造方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、一般式(１)の化合物を製造する過程で有用に用いられるだけでなく、それ自体も皮膚老化防止効果を示す新規な中間体化合物を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、一般式(１)の化合物を有効成分として含有する皮膚老化防止用化粧料組成物を提供することにある。
【００１０】
発明を実施するための最良の形態
第１に、本発明は下記一般式(１)の新規なレチニルレチノエートに関する。
【化２】
2004523525.tif 000003
(1)
【００１１】
本発明にかかる一般式(１)の１３−トランス−レチニルレチノエートは皮膚に対して非刺激性であり、コラーゲン合成活性が増進されただけでなく、光(ＵＶ光)または熱(４０℃以上の高温)に対する高い安定性を示す。
【００１２】
本発明はまた一般式(１)の化合物の製造方法に関する。
【００１３】
一般式(１)の化合物は、
(ａ)下記一般式(２a)：
【化３】
2004523525.tif 000004
(2a)
の化合物を溶媒中で縮合剤および触媒の存在下、下記一般式(３a)：
【化４】
2004523525.tif 000005
(3a)
の化合物と反応させ、
【００１４】
(ｂ)下記一般式(２b)：
【化５】
2004523525.tif 000006
(2b)
の化合物を溶媒中で有機アミン触媒の存在下、上記一般式(３a)の化合物と反応させるか、または
【００１５】
(ｃ)下記一般式(２c)：
【化６】
2004523525.tif 000007
(2c)
(式中、Ｘはハロゲン、ｐ−トルエンスルホニルまたはメタンスルホニルを示す)
の化合物を溶媒中で有機アミン触媒の存在下、上記一般式(３a)の化合物と反応させることを特徴とする方法によって製造できる。
【００１６】
本発明にかかる上記製造方法について、より具体的に説明すれば次の通りである。
【００１７】
方法(ａ)において、縮合剤には、Ｎ,Ｎ−カルボニルジイミダゾール(ＣＤＩ)またはＮ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)またはエチルクロロホルメートを使用し、縮合反応を促進させるための触媒として好ましくは、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)または１−ヒドロキシベンゾトリアゾル(ＨＯＢＴ)を用いる。さらに、反応溶媒として好ましくは、無水有機溶媒、例えば、ジクロロメタン、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフランおよびジエチルエーテルからなる群から選ばれる１種またはそれ以上を用いる。反応は通常窒素雰囲気下で光と水分が遮断された状態で行われ、冷却〜加温された条件下で行われる。
【００１８】
方法(ｂ)および(ｃ)で触媒として用いられる有機アミンは、方法(ａ)で縮合反応時に用いられる触媒とピリジンまたはトリエチルアミンが好ましく用いられる。使用可能な溶媒の種類および反応条件は、方法(ａ)の説明と同様である。
【００１９】
しかし、本発明にかかる方法で用い得る塩基、縮合剤、触媒および溶媒は上記に列挙されたものに限定されるものではなく、反応に悪影響を及ぼさない範囲内で当業界に通常公知のものを用いることができる。また、上記説明した方法によって製造される一般式(１)の化合物は、通常の分離、精製方法、例えば、再結晶またはカラムクロマトグラフィー等などの方法を使用して精製することができる。
【００２０】
本発明で出発物質として用いられる一般式(３a)の化合物は、公知の方法(参照：USP 5,863,942; J.Am.Chem.Soc.,94,8613 (1972))によって下記一般式(３b)の化合物から容易に製造できる。
【化７】
2004523525.tif 000008
(3b)
【００２１】
特に、上記本発明にかかる方法において出発物質として用いられる一般式(２b)のレチノール無水物は、それ自体が新規な物質であり、これは本発明が提供するもう一つの対象物質である。一般式(２b)の化合物は一般式(１)の化合物を製造するための中間体として有用なだけでなく、それ自体も皮膚老化防止効果を持っているので、皮膚老化防止用化粧料組成物の有効成分としても使われ得る。
【００２２】
前述のように、本発明にかかる一般式(１)の化合物は皮膚に対して非刺激性で、コラーゲン合成活性が増進されるだけでなく光(ＵＶ光)または熱(４０℃以上の高温)に対する優れた安定性を示す。従って、皮膚老化防止用化粧料またはニキビ、乾癬等の皮膚疾患の治療および予防用医薬の機能性原料として有用に使われ得る。従って、本発明はまた、一般式(１)の化合物を有効成分として含有する化粧料組成物に関するものである。
【００２３】
より具体的には、一般式(１)の化合物は皮膚癌またはニキビ、乾癬等といった皮膚疾患によるシワ、ソバカス等の皮膚老化の予防または改善の目的のために用いることができる。特に、一般式(１)の化合物は有効濃度が低く、低濃度で効果を最大化させることができ、細胞毒性も極端に低く、皮膚安定性に優れており、光安定性および苛酷および加速条件で優れた相安定性を示すので化粧料および医薬添加剤として好適に使われ得る特徴を持っている。
【００２４】
一般式(１)の化合物の生理活性を確認するための実験は、下記のように行われた。一般式(１)の化合物の細胞毒性実験は正常ヒト繊維芽細胞(Newborn)を用いて１０-6ないし１０-3％(Ｗ／Ｖ)の濃度で行われており、皮膚刺激性実験は健康な成人の皮膚を対象にしたパッチ実験によって行われた。さらに、一般式(１)の化合物の細胞再生効果を確認するために、ヒト繊維芽細胞に対するコラーゲン合成増大効果を測定し、一般式(１)の化合物にＵＶ光(３５６nm)を時間毎に調べた後、化合物の１Ｈ  ＮＭＲを測定して光安定性を確認し、４０℃で時間毎に定量して熱安定性を確認した(実験例１〜５参照)。
【００２５】
上記実験の結果、本発明にかかる一般式(１)の化合物は皮膚老化抑制用医薬および化粧品原料として既存の商業的に使用されているレチノール、レチノイン酸、またはその他のレチノール誘導体等と比較して細胞に対して無毒性であり、人の皮膚に対して他のレチノール関連類似体より安全で、低濃度でも最大化されたコラーゲン合成増大効果を示し、既存のレチノール誘導体とは違って光または熱に対してより長期の安定性が維持できるので、医薬および化粧品(クリーム、ローション、エッセンス、軟膏、ゲル等の形態)に老化防止用有効成分として非常に効果的で、且つ便利に使われ得ることが確認された。
【００２６】
以下、本発明を下記実施例および実験例に基づいてより具体的に説明する。しかし、これらの実施例および実験例は本発明の理解を助けるためのみのもので、これらは本発明の請求範囲を何ら制限するものではない。
【００２７】
製造例１：一般式(３a)のレチノールの製造
炭酸カリウム１.５２g(０.０１１mol)を無水メタノール溶液３０mLに溶解したレチノールアセテート１.２０g(０.００３６mol、Roche社)に加え、混合物を窒素雰囲気下および光と水分を遮断した条件下で、ゆっくり常温で７時間攪拌した。反応液を濾過した後溶媒を減圧蒸留して除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60 for cc part, Merk Co., メッシュサイズ 270-400, ヘキサン／酢酸エチル＝4/1, v/v)により精製して薄黄色の標題化合物１.０１g(収率９６％)を得た。
【００２８】
実施例１：一般式(１)のレチニルレチノエートの製造
レチノイン酸１.２６g(０.００４２mol,Basf社)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)０.８７g(０.００４２mol)およびジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)の触媒量を、無水ジクロロメタン溶液５０mLに溶解したレチノール１.００g(０.００３５mol)に０℃で加えた。窒素雰囲気下および光と水分を遮断した条件下で反応液をゆっくり常温まで上げて１２時間攪拌した。反応液を濾過した後溶媒を減圧蒸留して除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル 60 for cc part, Merk Co., メッシュサイズ 270-400, ヘキサン／ジエチルエーテル＝19/1,v/v)により精製して薄黄色の標題化合物１.５５g(収率７８％)を得た。
1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 7.03 (dd, 1H, J = 26.4 Hz, 11.4 Hz, C20H), 6.67 (dd, 1H, J = 26.4 Hz, 11.4 Hz, C11H), 6.34 (d, 2H, J = 2.1 Hz, C19H, C12H ), 6.29 (d, 2H, J = 2.1 Hz, C7H, C24H), 6.18 (d, 2H, J = 9.9 Hz, C23H, C8H), 6.12 (d, 2H, J = 10.2 Hz, C10H, C21H), 5.82 (s, 1H, C17H), 5.69 (t, 1H, J = 7.2 Hz, C14H), 4.81 (d, 2H, J = 6.9 Hz, C15H2), 2.39 (s, 3H, C18CH3), 2.05 (t, 4H, J = 5.1 Hz, C4H2, C27H2), 2.03 (s, 3H, C13CH3), 1.99 (s, 3H, C22CH3), 1.94 (s, 3H, C9CH3), 1.74 (s, 6H, C5CH3, C26CH3), 1.65 (m, 4H, C3H2, C28H2), 1.50 (m, 4H, C2H2, C29H2), 1.06 (s, 12H, C1(CH3)2, C30(CH3)2)
【００２９】
製造例２：一般式(２b)のレチノール無水物の製造
レチノイン酸１.００g(０.００３３mol,Basf社)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)０.７５g(０.００３６mol)およびジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)の触媒量を無水ジクロロメタン溶液５０mlに溶解したレチノイン酸１.００g(０.００３３mol,Basf社)に０℃で加えた。窒素雰囲気下および光と水分を遮断した条件下で反応液をゆっくり常温まで上げて３時間攪拌した。反応液を濾過した後溶媒を減圧蒸留して除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル 60 for cc part, Merk Co., メッシュサイズ 270-400, ヘキサン／ジエチルエーテル＝19/1, v/v)により精製して薄黄色の標題化合物１.５８g(収率８２％)を得た。
1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 7.10 (dd, 2H, J = 13.4 Hz, 11.4 Hz, C11H, C20H), 6.32 (d, 2H, J = 16.2 Hz, C19H, C12H), 6.31 (d, 2H, J = 14.7 Hz, C10H, C21H), 6.18 (d, 2H, J = 0.1 Hz, C23H, C8H), 6.13 (d, 2H, J = 4.5 Hz, C7H, C24H), 5.78 (s, 2H, C17H, C14H), 2.40 (s, 6H, C18CH3, C13CH3), 2.04 (m, 4H, C4H2, C27H2), 2.02 (s, 6H, C22CH3, C9CH3), 1.72 (s, 6H, C5CH3, C26CH3), 1.62 (m, 4H, C3H2, C28H2), 1.47 (m, 4H, C2H2, C29H2), 1.03 (s, 12H, C1(CH3)2, C30(CH3)2)
【００３０】
実施例２：一般式(１)のレチニルレチノエートの製造
レチノール無水物１.００g(０.００１７mol)とトリエチルアミン０.３１g(０.００２１mol)を無水ジクロロメタン３０mLに溶解したレチノール０.６０g(０.００２１mol)溶液に０℃で加えた。窒素雰囲気下および光と水分を遮断した条件下で反応液をゆっくり常温まで上げて５時間攪拌した。反応液を濾過した後溶媒を減圧蒸留して除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル 60 for cc part, Merk Co., メッシュサイズ 270-400, ヘキサン／ジエチルエーテル＝9/1, v/v)により精製して薄黄色の標題化合物０.９１g(収率９２％)を得た。得られた化合物の１Ｈ  ＮＭＲデータは実施例１と同様であった。
【００３１】
実施例３：一般式(１)のレチニルレチノエートの製造
レチノイン酸１.００g(０.００３３mol)を無水トルエン１０mLに溶解し、ここに三塩化リン(ＰＣ１３)０.４６g(０.００３３mol)を滴加した。混合物を常温で光と水分を遮断した条件下および窒素雰囲気下で１５時間攪拌した。得られたレチノイン酸クロライド溶液を製造例１で製造したレチノール０.９５g(０.００３３mol)およびトリエチルアミン０.６１g(０.００４１mol)と共に０℃で２０分間無水メチレンクロライド溶液３０mLに滴加した。次に、反応液を常温で５時間攪拌した。反応液を飽和塩化ナトリウム水溶液３０mLに加えた。有機層を分離し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル 60 for cc part, Merk Co., メッシュサイズ 270-400, ヘキサン／ジエチルエーテル＝9/1, v/v)により精製して薄黄色の標題化合物１.５４g(収率８２％)を得た。得られた化合物の１Ｈ  ＮＭＲデータは実施例１と同様であった。
【００３２】
実験例１：細胞毒性試験
医薬および化粧品に用いられる原料としての１次安全性を検証するため、一般式(１)のレチニルレチノエートに対して正常ヒト繊維芽細胞(Newborn)を利用してＭＴＴ試験法(参照：Mossman T., Rapid colorimetric assay for cellular growth & amp;survival:application to proliferation & amp;cytotoxity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63, 1983)によって細胞毒性を検討し、その結果を図１に示した。
【００３３】
図１の結果から分かるように、本発明にかかる一般式(１)の化合物はパルミチン酸レチノールに類似の細胞毒性を有し、レチノール、レチノイン酸、またはその誘導体に比べて低い細胞内毒性を持っていることが確認された。
【００３４】
実験例２：皮膚刺激性実験
一般式(１)の化合物の皮膚刺激性を確認するために健康な成人の皮膚を用いたパッチテスト(Patch test)を行った。担体としてはカプリルカプリル酸トリグリセリド、すなわち、一般的なＯ／Ｗ剤製剤を用いて各グループ当たり２０人として２４時間テストした。
【００３５】
本実験で用いられる一般的なＯ／Ｗ剤形は下記方法によって製造した。
【００３６】
下記の表１に示した組成比で１−６項の液体部と７−１３項の油分部をそれぞれ７５−８０℃まで加熱して完全に溶解させた。液体部に油分部をゆっくり添加し、７５−８０℃で３０００rpmのホモミキサーで５分間乳化させた。乳化途中、混合物に１４項の中和剤を添加して中和した。第１次乳化終了後、混合物を冷却し、５０−５５℃で１５−１６項のレチニルレチノエートおよび香料を加えた後、３０００rpmのホモミキサーで３分間第２次乳化を行った。混合物を再び２７−３０℃まで冷却させてＯ／Ｗ剤形の組成物を製造した。
【００３７】
表１
【表１】
2004523525.tif 000009
(１)商品名：Ａr−６０(ＩＣＩ,ＵＳＡ)
(２)商品名：Ｍy−５２(ＩＣＩ,ＵＳＡ)
【００３８】
実験結果から下記方程式１によって刺激指数を計算し、その結果を下記表２に示した。
方程式１
刺激指数＝
{Σ(評価基準数値×当該評価数値の人数)／(総被検者×最高評価基準数値)}×１００
評価基準数値  ＋＋＋：５,  ＋＋：４,  ＋：３,  ＋−：２,  −：１
【００３９】
下記基準に基づいて刺激の程度を測定した。
１.９以下：最小刺激、
２.０−２.９：弱い刺激、
３.０−３.９：普通刺激、
４.０以上：強い刺激
【００４０】
表２
皮膚刺激実験結果(閉鎖式パッチテスト；２４時間、成人２０名)
【表２】
2004523525.tif 000010
Ｃ.Ｃ.Ｔ＝カプリルカプリル酸トリグリセリド
【００４１】
表２の結果から、本発明にかかる一般式(１)の化合物は既存のレチノールまたはパルミチン酸レチノールのような誘導体に比べて皮膚に対する刺激が非常に軽微であることが分かる。
【００４２】
実験例３：コラーゲン合成効果実験
一般式(１)の化合物の皮膚老化抑制剤としての有用性を確認するためにそのコラーゲン合成効果をレチノール、レチノイン酸、およびその誘導体を対照物質として次のように実験を行い、その結果を図２に示した。
【００４３】
実験方法は次の通りである。
使用細胞：正常ヒト繊維芽細胞(Newborn, passage: 6)
細胞培地：１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地
→試料処理時、ＦＢＳのないＤＭＥＭ培地使用
使用原料：レチノール誘導体、等
使用濃度：細胞毒性実験を通じて細胞に毒性のない濃度範囲を選択
⇒０.０００００１％，０.００００１％(w/v)
【００４４】
実験方法：６−ウェルプレートに１×１０5細胞／ウェルを植えた。細胞が約７９−８０％まで密集(confluent)するまで培養した。細胞に試験物質を処理した後、２日間培養(試験物質処理時、ＦＢＳは添加しない)した。２日後、細胞培地と細胞をそれぞれ分離して冷蔵庫で保管した。細胞抽出物に対しては蛋白質分析(BCA Protein Assay Kit, PIERCE 23225)を実施し、培地に対してはコラーゲン分析を実施した。
【００４５】
細胞抽出物を製造する方法：
培地を除去した後、ＰＢＳを少量入れた。細胞をスクレーパでこすった。１Ｎ  ＮaＯＨ１００μＬと蒸留水４００μＬを加えて生成混合物を一晩、放置した後、蛋白質分析を実施した。
【００４６】
コラーゲン分析：分析キット(Sircol Collagen assay kit −可溶性コラーゲンに特異的に結合する染料使用)
試験試料の製造：
１)試薬ブランク液(０.５Ｍ  酢酸または塩／緩衝剤溶液  １００μＬ)
２)標準コラーゲン
３)試験試料  １００μＬ(試料で処理した培地を濃縮させる−Amicon社のcentricon 10を使用)
【００４７】
各チューブに１.０mL Sircol Dye Reagent を添加し、３０分間混合した。混合物を５,０００g以上で１０分間遠心分離して上澄液は除去した。１.０mL Sircol Alkali Reagentを添加し、ゆっくり混合した後、吸光度を５４０nmで読取った。蛋白質量でコラーゲン分析値を補正した(参照：Mechanism of Aging and Development 73, 179-187, 1994)。
【００４８】
上記実験後、ＤＭＥＭ培地のみで処理したものを対照とし、対照に比べてコラーゲン生成量が増加した比率を図２に図示した。図２の結果から分かるように、レチノールに比べてパルミチン酸レチノールなどのレチノール誘導体はコラーゲン合成能が非常に低く、レチノイン酸に比べてレチノイン酸誘導体の場合も合成能が低かったが、本発明にかかる一般式(１)の化合物の場合にはレチノールまたはレチノイン酸に比べて低濃度でもコラーゲン合成増進効果が非常に優れていたことが確認された。すなわち、本発明にかかる一般式(１)の化合物は１０-6％(Ｗ／Ｖ)で４１.２９％の増進効果を示すが、これは同じ濃度でレチノールが示す効果４.９４％に比べ、約１０倍増大している。
【００４９】
実験例４：光安定性テスト
既存のレチノールと対比して一般式(１)の化合物の光安定性を調べるために、室温で試料１０ｍgにスペクトロライン(Spectroline；Model CM-10; Fluorescence analysis cabinet; Spectronics Corporation, Westbury, New York, USA)を用いてＵＶ−Ａ光(波長３５６nm)を時間毎に調べた後、ＮＭＲで定性的に確認し、結果を次の表３に示した。
【００５０】
表３
光安定性実験結果
【表３】
2004523525.tif 000011
(レベル：
４＝１Ｈ  ＮＭＲ確認時、定性変化無し
３＝１Ｈ  ＮＭＲ確認時、微細なノイズ(noise)が生じたが、定性変化無し
２＝１Ｈ  ＮＭＲ確認時、ノイズ(noise)が明確で、定性変化あり
１＝１Ｈ  ＮＭＲ確認時、定性確認が難しい)
【００５１】
表３の結果から分かるように、本発明にかかるレチニルレチノエートは既存のレチノールに比べて長波長のＵＶ光に非常に安定であった。
【００５２】
実験例５：熱安全性テスト
既存のレチノールと対比して一般式(１)の化合物の熱安全性を調べるために、室温、４０℃および４℃の恒温恒湿装置(湿度：５８％)で１ケ月間の相安定性を比較して下記条件下でＨＰＬＣ定量分析を実施し、その結果を下記表４に示した。
【００５３】
＜ＨＰＬＣ条件＞
１)カラム：Capcellpak UG 120 (5μm, 4.6mm*150mm, shiseido, Japan)
２)移動相
溶媒Ａ：０.１％酢酸を含有する水
溶媒Ｂ：０.１％酢酸を含有するアセトニトリル
溶媒Ｃ：０.１％酢酸を含有するメタノール
溶媒Ｄ：イソプロピルアルコール
【００５４】
【表４】
2004523525.tif 000012
３)検出器：UV(PDA 326nm),
Fluorescence : Ex : 326nm, Em : 460nm
【００５５】
表４
熱安定性実験結果
【表５】
2004523525.tif 000013
【００５６】
表４で示されたように、本発明にかかる一般式(１)のレチニルレチノエートは既存のレチノールに比べて熱安定性が非常に優れていることが分かる。
【００５７】
実験例６：ＲＡＲ(Retinoic Acid Receptor：レチノイン酸受容体)またはＲＸＲ(Retinoid X Receptor：レティーノーイドＸ受容体)に対する活性分析
レチノール誘導体化合物がＲＡＲおよびＲＸＲ受容体の活性に及ぼす影響を分析するために次のような実験を行った。
【００５８】
実験方法：ＲＡＲ／ＲＸＲ受容体の反応部位(response element)であるＤＲ１またはＤＲ５、チミンキナーゼプロモーター、およびＣＡＴ(chloramphenicol acetyl transferase)遺伝子からなる組換え遺伝子ＤＲ５−tk−ＣＡＴまたはＤＲ１−tk−ＣＡＴをＲＡＲα、β、γを発現させるプラスミドＤＮＡと共に適宜配合した後、リポフェクタミン(Lipofectamin；GibcoBRL)を使用して皮膚癌細胞株であるＨaＣaＴ細胞株に同時形質移入させた。その後、細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地で１日培養した後、レチノール誘導体を１μＭとなるように加えて、５％ＣＯ2、３７℃条件でさらに一日培養した。細胞をリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で洗浄した。各細胞で蛋白質を抽出した後、β−ガラクトシダーゼ活性を測定し、蛋白質を定量して形質感染効率を決定した。また、ＲＡＲまたはＲＸＲ受容体に対する転写活性程度はＣＡＴ  ＥＬＩＳＡ((Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)で分析した。
【００５９】
実験結果：下記表５の結果から分かるように、本発明にかかる一般式(１)の化合物はレチノールと同様に、３種類のＲＡＲ中のＲＡＲαに対して特異的な活性を示し、ＲＡＲβとＲＡＲγの場合、全般的にレチノイン酸一つに比べては高かったが、レチノールに比べては低い活性を示した。他方では、レチニルサリチラートとレチニルアセチルサリチラートといったレチノール誘導体はＲＡＲαに対してのみ弱い活性を示し、ＲＡＲβとＲＡＲγに対しては何ら活性を示さなかった。さらに、レチノールと上記レチノール誘導体らはレチノール効果のためか、ＲＸＲ受容体(α、β、γ)に対しては全く活性を示さなかった。
【００６０】
表５
ＲＡＲ／ＲＸＲに対する相対的活性
【表６】
2004523525.tif 000014
【００６１】
結論：本発明にかかる一般式(１)の化合物はレチノールおよびレチノイン酸の中間的性質を持つ特性を示し、ＲＡＲαに比較的特異的でありながら、高い活性を示しており、ＲＡＲβとＲＡＲγに対しては弱い活性を示した。
【００６２】
実験例７：ＡＰ−１蛋白質(activation protein-1)の活性抑制
ＡＰ−１(ｃ−Ｊun蛋白質が構成成分)は、皮膚シワの主原因であるコラゲナーゼの発現を誘導する転写調節因子である。レチノール誘導体が皮膚のシワを誘発する因子であるＡＰ−１に対して活性抑制作用を示せば、結局皮膚シワの予防および治療効果を提供できるので、これに対する研究を実験例６と同様に次のように行った。
【００６３】
実験方法：ＡＰ−１反応部位(ＴＲＥ)が含まれたコラゲナーゼプロモーター(collagenase promoter)を持つＣＡＴリポーター(Ｃoll−ＣＡＴ)を皮膚癌細胞株であるＨaＣaＴ細胞株にリポソームを使用して形質感染させた後、レチノール誘導体によるＡＰ−１の活性抑制程度を実験例６と同様にＣＡＴ  ＥＬＩＳＡで測定した。さらに、ＡＰ−１の一つの構成成分であるｃ−Ｊun(癌の転移、皮膚老化、炎症を誘発する蛋白質であり、同種異性体または異種異性体からなる)またはＲＡＲα発現ベクターを同時形質移入させてレチノール誘導体がｃ−Ｊunの転写活性に及ぼす影響を分析した。
【００６４】
実験結果：下記表７で示されたように、細胞でｃ−Ｊunが発現された場合、シワを誘発するコラゲナーゼの発現は約８.６倍増加した。ＲＡＲαと共にレチノールを処理すれば、コラゲナーゼの発現は約３３％抑制された。レチノイン酸は約６４％抑制された。一般式(１)の化合物を同じ方法で処理した結果、これらの値の中間程度の約５２％が抑制されるものと確認された。予想通りに、ＲＡＲαに活性を示さないレチニルアセチルサリチラートまたはレチニルサリチラートの場合にはｃ−Ｊunの活性に何ら影響を及ぼさなかった。
【００６５】
表７
コラゲナーゼの発現に対する相対的抑制度
【表７】
2004523525.tif 000015
【００６６】
結論：ＡＰ−１の活性抑制程度に対する上記実験結果もやはり、実験例６の結果と同じく、一般式(１)の化合物がレチノイン酸よりは低いがレチノールよりは優れたｃ−Ｊunの抑制活性を見せていることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明にかかる一般式(１)の化合物は、皮膚癌またはニキビ、乾癬等といった皮膚疾患によるシワ、ソバカス等の皮膚老化の予防、改善および治療に使用できる。特に、一般式(１)の化合物は有効濃度が低く、低濃度で効果を最大化させることができる。さらに、細胞毒性が顕著に低く皮膚安全性に優れ、苛酷または加速の条件下で優れた安定性を示すので、皮膚老化予防および改善のため化粧料およびニキビ、乾癬等といった皮膚疾患の治療医薬用の添加剤として効果的、且つ好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明にかかる一般式(１)の化合物と比較物質であるレチノイン酸、レチノール、レチノールパルミステート、レチノイン酸ポリエトキシル化レチンアミドおよびレチノール無水物の細胞毒性効果を比較したものである。
【図２】本発明にかかる一般式(１)の化合物と比較物質リンレチノイン酸、レチノール、パルミチン酸レチノール、レチノイン酸ポリエトキシル化レチンアミドおよびレチノール無水物のコラーゲン合成増加率を比較したものである(ここで、Ｒ−ＯＲは本発明にかかる一般式(１)のレチニルレチノエートを示し；Ｒ−Ａはレチノイン酸を示し；Ｒ−Ａ−ＰＥＧはレチノイン酸ポリエトキシル化レチンアミドを示し；Ｒ−ＯＨはレチノールを示し；Ｒ−ＯＨ−Ｐalはパルミチン酸レチノールを示し；ＲＯＲは一般式(２b)のレチノール無水物を示す。)
【図１】
2004523525.tif 000022
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月16日(2003.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚シワの予防または改善のための下記一般式(１)のレチニルレチノエートの用途。
【化１】
2004523525.tif 000050
(1)
【請求項２】
有効成分として請求項１に記載の一般式(１)の化合物を含む、皮膚シワの予防または改善のための化粧料組成物。
【請求項３】
皮膚シワの予防または改善のための下記一般式(２b)のレチノール無水物の用途。
【化２】
2004523525.tif 000051
(2b)
【請求項４】
有効成分として請求項３に記載の一般式(２b)の化合物を含む、皮膚シワの予防または改善のための化粧料組成物。
【国際調査報告】
2004523525.tif 000052
2004523525.tif 000053