(57)【要約】本発明は、植物のミトコンドリア内膜輸送体、特にミトコンドリア担体ファミリー（ＭＣＦ）のメンバーをコードする核酸及びこの核酸の使用に関する。また本発明は、核酸の断片、核酸又はその断片を含む構築物、及び核酸、その断片又は構築物を含む宿主細胞に関する。さらに本発明は、核酸、その断片、又は核酸もしくはその断片を含む構築物を使用したトランスジェニック植物の産生方法、及び植物、植物部分、植物細胞及び／又は種子のミトコンドリア内膜輸送特性のモジュレート方法に関する。
2004504843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）植物又は動物遺伝子バンク由来の核酸配列を用いてＭＣＦ欠失宿主細胞を相補し、ＭＣＦ陽性宿主細胞を選択することによって得ることができる核酸又はその断片、
ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する核酸もしくは配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する核酸又はその断片、
ｃ）配列番号２に示す配列を有するタンパク質もしくは配列番号４に示す配列を有するタンパク質をコードする配列を有する核酸又はその断片、
ｄ）ａ）〜ｃ）の核酸に相補的な核酸又はその断片、
ｅ）ａ）〜ｄ）の核酸の１以上の塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失によって得ることができる核酸、および
ｆ）遺伝コードの縮重に基づく、ａ）〜ｅ）の核酸とハイブリダイズする核酸又はその断片、
からなる群から選ばれる、植物又は動物ミトコンドリア内膜輸送体をコードする核酸。
【請求項２】
ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
宿主細胞においてプロモーターに対してアンチセンスに配向され、植物ＭＣＦメンバーの発現を阻害することができる、請求項１又は２に記載の核酸の断片。
【請求項４】
少なくとも１０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド、特に少なくとも２００個のヌクレオチドを含む、請求項３に記載の断片。
【請求項５】
発現調節エレメントの制御下に請求項１もしくは２に記載の核酸、又は請求項３もしくは４に記載の核酸断片を含む構築物。
【請求項６】
核酸又は断片が調節エレメントに対してアンチセンスに配向されている、請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
プラスミドの形態で存在する、請求項５又は６に記載の構築物。
【請求項８】
請求項１もしくは２に記載の核酸又はその断片、あるいは請求項５〜７のいずれか１項に記載の構築物を含む宿主細胞。
【請求項９】
細菌、酵母細胞、哺乳類細胞及び植物細胞から選ばれる、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１もしくは２に記載の核酸又はその断片、あるいは請求項５〜７のいずれか１項に記載の構築物を含むトランスジェニック植物。
【請求項１１】
核酸もしくは断片又は構築物がその天然の位置に対応しないゲノムの位置に組み込まれている、トランスジェニック植物。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の核酸を請求項８又は９に記載の宿主細胞で発現させることによって得ることができるタンパク質。
【請求項１３】
請求項１２に記載のタンパク質と反応する抗体。
【請求項１４】
以下のステップ：
請求項１もしくは２に記載の核酸又はその断片の植物細胞への挿入；及び
形質転換した植物細胞からの植物の再生、
を含むトランスジェニック植物の産生方法。
【請求項１５】
植物、植物部分又は植物細胞の好ましくはミトコンドリア内膜の輸送体特性の改変による植物の代謝物含量の改変方法であって、請求項１もしくは２に記載の核酸又はその断片、あるいは核酸又はその断片を含む請求項５〜７のいずれか１項に記載の構築物の植物細胞への挿入及び潜在的にはこの植物細胞からの全植物の再生を含む、前記方法。
【請求項１６】
輸送体がアミノ酸又はカルボン酸輸送体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
植物又は動物ミトコンドリア内膜輸送体をコードする少なくとも１種の遺伝子を遺伝子バンクから単離する方法であって、ＭＣＦ欠失酵母細胞を植物又は動物遺伝子バンク由来の核酸配列で形質転換し、陽性選択を行う、前記方法。
【請求項１８】
細菌、真菌、植物、動物及び／又はヒトから相同性配列を単離するための、請求項１もしくは２に記載の核酸又はその断片の使用。
【請求項１９】
原核細胞及び／又は真核細胞の内因性ＭＣＦメンバーの発現を阻害するための、調節エレメントの制御下にアンチセンスに配向される請求項１又は２に記載の核酸、あるいは調節エレメントの制御下にアンチセンスに配向されるその断片の使用。
【請求項２０】
改変されたミトコンドリア及び／又はプラスチド輸送特性を有するトランスジェニック作物植物を産生するための、請求項１もしくは２に記載の核酸又はその断片の使用。
【請求項２１】
ミトコンドリア及び／又はプラスチドにおけるミトコンドリア内膜輸送体により介在される物質輸送の阻害剤を同定するための、請求項１又は２に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物又は動物ミトコンドリア内膜輸送体、特にミトコンドリア担体ファミリー（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ：ＭＣＦ）のメンバーをコードする核酸、並びに特に植物のミトコンドリア輸送の改変のための上記核酸の使用に関する。さらに本発明は、上記核酸の断片、上記核酸又はその断片を含む構築物、並びに上記核酸又はその断片を含む宿主細胞、特に植物細胞に関する。さらに本発明は、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物の産生方法、並びに植物、特に植物部分のミトコンドリア内膜の輸送特性の改変方法に関する。
【０００２】
輸送体は、生物の機能において特別な役割を果たす。輸送体は、細胞もしくは生物への、又は細胞もしくは生物からの物質の受け取りまたは放出を決定し、こうして細胞間の物質の輸送と配分を制御する。しばしば代謝経路の個々のステップは異なる区画で進行し、これらの区画の間で中間物を輸送しなければならないから、細胞内物質配分のレベルで細胞小器官膜の輸送体には重要な調節機能がある。
【０００３】
特に重要な区画は、細胞の発電所とも呼ばれるミトコンドリアである。呼吸及び光呼吸過程のほかに、種々の代謝経路の多数の同化及び異化ステップもミトコンドリアで行われる。また、中心の「ハブ（ｈｕｂ）」として多数の代謝物の基本炭素骨格の流れを制御するクエン酸回路もミトコンドリアに局在する。従って多数の代謝物、例えばピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）、アミノ酸、カルボン酸及び脂肪酸をミトコンドリアへ又はミトコンドリアから輸送しなければならないことは明らかである。多数の物質が自由に通過できるミトコンドリア外膜と対照的に、ミトコンドリア内膜は高い特異性がある輸送系を有する。一群のこれらの輸送系は交換（対向輸送）の原理に従って働く担体を含む。この例としては、外因性ＡＤＰを内部ＡＴＰと交換するアデニルヌクレオチド担体、リンゴ酸（ｍａｌａｔｅ）を２−オキソグルタル酸（２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）と交換するジカルボン酸担体及びクエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）をリンゴ酸と交換するトリカルボン酸担体が挙げられる。その他の物質、例えばグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）及びアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）は交換なしで（単輸送）輸送されるが、幾つかの他の代謝物については輸送機構がまだ未知である。ミトコンドリア内膜の輸送系は代謝物交換を可能にし、従って、細胞質ゾル及びミトコンドリア区画の組込みのために必須である。これまで主として酵母及び動物系で分子レベルで同定されたミトコンドリア内膜輸送体の多くは、保存タンパク質構造と所定のシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列（「ミトコンドリアエネルギー転移配列」）の存在を特徴とするミトコンドリア担体ファミリー（ＭＣＦ）に属する（Ｐａｌｍｉｅｒｉ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３４６（１９９４），４８−５４）。系統分析に基づき、ＭＣＦメンバーは合計１７のサブファミリーに分けられるが、これまで基質が分かっているのは５つのサブファミリーだけである（Ｍｏｕａｌｉｊら、Ｙｅａｓｔ １３（１９９７），５７３−５８１）。
【０００４】
高等植物でも核コード遺伝子の大きなファミリーがこのタンパク質の代表種をコードするようである。しかしながら、これまでに多数の植物種においてＡＤＰ／ＡＴＰ輸送体及びキビ（Ｐａｎｉｃｕｍ）由来のリンゴ酸／２−オキソグルタル酸輸送体が単離され、特性決定されただけである。興味深いことにトウモロコシのｂｒｉｔｔｌｅ−１遺伝子によってコードされたプラスチドアデニル酸（ａｄｅｎｙｌａｔｅ）輸送体もＭＣＦメンバーである。従って高等植物のこのタンパク質ファミリーの分析はミトコンドリア輸送だけでなく、プラスチド輸送の研究にも有用でありうる（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３（１９９１），１３３７−４８；Ｓｈａｎｎｏｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１７（１９９８），１２３５−５２）。
【０００５】
酵母突然変異体ａｒｇ１１（Ｃｒａｂｅｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（１９９６），２５０１１−２５０１８）及びａｃｒ１（Ｐａｌｍｉｅｒｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，（１９９７），１１４−１１８）の分析によって、それぞれアルギニン／オルニチン又はコハク酸／フマル酸（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ／ｆｕｍａｒａｔｅ）輸送体として機能する２つのＭＣＦメンバーが同定された。
【０００６】
アミノ酸であるアルギニンの生合成と分解はミトコンドリア酵素と細胞質ゾル酵素の関与のもとで行われるから、アルギニン自体並びにその前駆体であるオルニチンもミトコンドリア内膜を通過しなければならない。酵母のａｒｇ１１突然変異体はアルギニン栄養要求性突然変異体として単離された。即ちアルギニンを含まない培地では成長することができない。ＡＲＧ１１遺伝子のクローニングとその遺伝子産物の生化学的特性決定により、これがオルニチン及びアルギニンの双方を輸送できるＭＣＦメンバーであることが示された。高等植物ではアミノ酸、アルギニンは窒素含量が高いので好適な窒素貯蔵形態である。ダイズの胚葉では遊離アミノ酸の形態で存在する窒素の６０％、及び種子タンパク質に存在する窒素の１８％がアルギニンとして存在する。細胞内輸送体、特にミトコンドリアアルギニン輸送体の同定は、作物植物のタンパク質含量及び／又はタンパク質組成の特異的な改変を行いうるための前提条件である。
【０００７】
ミトコンドリアで行われるクエン酸回路は全生物の代謝の中心にある。生合成前駆体としてクエン酸回路から除去された中間物は、いわゆるアナプレロティック反応により補充されなければならない。細胞質ゾルで行われるグリオキシル酸回路は、酵母並びに植物の双方で最も重要なアナプレロティック反応である。なぜならこの反応から生じるコハク酸がクエン酸回路の補充のために利用されるからである。しかしながらこのためにコハク酸をまず細胞質ゾルからミトコンドリアへ輸送しなければならない。酵母ではこの輸送はまたＭＣＦメンバーであるＡＣＲ１タンパク質によって行われる。ＡＣＲ１の不在下では、酵母細胞は唯一の炭素源としての酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）又はエタノールで成長することはできない。なぜならそれらの代謝により生じるコハク酸がミトコンドリアに到達しないからである。植物ではミトコンドリアへのコハク酸の輸送は、脂肪酸の形態で貯蔵された炭素の動員で決定的なステップである。β酸化に由来するアセチル−ＣｏＡはグリオキシソームでコハク酸に変えられる。次にこのコハク酸をクエン酸回路に導入することができる。貯蔵されたエネルギーを動員することができる効率と速度は、脂肪貯蔵性植物種子の発芽で中心的意義を有する。このことは、植物において、ミトコンドリアへのコハク酸輸送の操作を発芽挙動の特異的な改変のために使用することができることを意味する。
【０００８】
本発明の根底にあるのは、植物又は動物ミトコンドリア内膜輸送体、特に植物ＭＣＦメンバーの同定及び／又は単離のための方法及び手段、並びにこれらの方法及び手段に基いて代謝物のミトコンドリア輸送の改変及び潜在的にはまた代謝産物のプラスチド輸送の改変に関して植物を特異的に改変することができるさらなる方法及び手段を提供するという技術目的である。好ましい実施形態では、ミトコンドリア輸送の特異的な改変は、特にアルギニン輸送（作物植物におけるタンパク質含量及び／又はタンパク質組成を特異的に改変するため）及びコハク酸輸送（植物の発芽挙動を特異的に改変するため）に関する。
【０００９】
本発明に関する技術課題は、ミトコンドリア内膜輸送体、特に植物ＭＣＦメンバーをコードする遺伝子及びこれらの遺伝子によりコードされたタンパク質を酵母突然変異体ａｒｇ１１及びａｃｒ１の相補により同定し、特性決定することにより達成された。その場合、またミトコンドリア内膜の植物タンパク質が酵母でも正しく局在化されること、即ち目的部位に到達することが初めて示された。本発明によれば、
ａ）植物又は動物遺伝子バンク由来の核酸配列を用いてＭＣＦ欠失宿主細胞を相補し、ＭＣＦ陽性宿主細胞を選択することによって得ることができる核酸又はその断片、
ｂ）配列番号１もしくは配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する核酸又はその断片、
ｃ）配列番号２もしくは配列番号４に示す配列を有するタンパク質をコードする配列を有する核酸又はその断片、
ｄ）ａ）〜ｃ）の核酸に相補的な核酸又はその断片、
ｅ）ａ）〜ｄ）の核酸の１以上の塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失によって得ることができる核酸、及び
ｆ）遺伝コードの縮重に基づく、ａ）〜ｅ）の核酸とハイブリダイズする核酸又はその断片、
を含む群から選ばれる、好ましくは単離され、かつ完全に精製された核酸が提供される。
【００１０】
核酸は、ＤＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列、あるいはＲＮＡ配列、例えばｍＲＮＡ配列である。
【００１１】
本発明に関連して、「ＭＣＦメンバー」及び「ＭＣＦタンパク質」という用語は、ＭＣＦ活性を有するタンパク質、即ちミトコンドリア内膜、また潜在的にはプラスチド内膜を通る代謝物輸送に関与し、かつこのタンパク質ファミリーの典型的な特徴を有するタンパク質を意味する。典型的な特徴とは、一方では各々２つの膜領域を有する約１００個のアミノ酸を含むドメインの３回繰返しからなる一次構造であり、並びにいわゆる「ミトコンドリアエネルギー転移」シグネチャー（Ｐ−Ｘ−（Ｄ／Ｅ）−Ｘ−（ＬＩＶＡＴ）−（ＲＫ）−Ｘ−（ＬＲＨ）−（ＬＩＶＭＦＹ））の３回までの繰返しの存在である。本発明に関連して「ＭＣＦメンバー」及び「ＭＣＦタンパク質」という用語は、特にアルギニン／オルニチン輸送体分子及びコハク酸／フマル酸輸送体分子を含む。輸送体活性を示すために、例えばＰａｌｍｉｅｒｉら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１７（１９９７），４４７）が説明する方法を使用することができる。
【００１２】
本発明に関連して「ＭＣＦ欠失細胞」又は「ＭＣＦ欠失宿主細胞」という用語は、１以上の遺伝的欠陥により陰性に改変されたミトコンドリア輸送体特性を有し、それが陰性選択可能な表現型をもたらす細胞を意味する。ＭＣＦ欠失植物細胞では、潜在的にはプラスチド輸送も陰性に改変することができる。
【００１３】
従って、本発明に関連して「ＭＣＦ陽性細胞又は宿主細胞」とは、ＭＣＦメンバーをコードする核酸を天然に含む細胞、又はＭＣＦ陰性細胞の相補により、陰性に改変したミトコンドリア輸送を引き起こす遺伝的欠陥を少なくとも部分的に補い、従って陽性選択可能な表現型を示す核酸を含む細胞を意味する。
【００１４】
本発明で使用される「相補」という用語は、欠陥を引き起こす突然変異を保存しつつ生物の表現型に反映される遺伝的機能欠陥を補償することを表す。例えば類似の無傷の遺伝子（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＡＲＧ１１遺伝子）の存在によりＭＣＦ遺伝子（例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＲＧ１１遺伝子）の遺伝的欠陥が補われ、無傷の遺伝子が欠陥ＭＣＦ遺伝子の機能を継承するならば、本発明に関連する相補が存在するのである。
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明に従ってＭＣＦメンバー、特にアルギニン／オルニチン輸送体分子又はコハク酸／フマル酸輸送体分子をコードする核酸の単離と同定のために、ＭＣＦ欠失細胞又は宿主細胞が使用される。好ましいＭＣＦ欠失宿主細胞は真核細胞、例えば植物又は動物細胞、好ましくは酵母細胞である。本発明に従ったＭＣＦメンバーの同定は、ＭＣＦ欠失宿主細胞における特異的突然変異、特に酵母サッカロミセス・セレビシアエの特異的突然変異体の相補によって行われる。この工程において、植物又は動物遺伝子バンク、例えばｃＤＮＡバンク又はゲノムバンクの核酸配列をＭＣＦ欠失宿主細胞に形質転換し、続いてＭＣＦ陽性宿主細胞の選択が行われる。
【００１６】
特定の輸送体分子をコードする遺伝子の単離のためには、この輸送体分子の欠陥により特定の物質をミトコンドリアに輸送することができない好適な酵母突然変異体が必要である。Ｄｅｌｆｏｒｇｅら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７（１９７５），２３１）は例えばアミノ酸、アルギニンを含む培地でしか成長できない突然変異体ａｒｇ１１（ＭＧ４０９株）を記載する。さらに植物又は動物遺伝子で相補を行うために、ＵＲＡ３遺伝子を破壊し、ウラシル栄養要求性突然変異体を作製した（ＭＧ４０９ｕｒａ３−、１ｃ１６３６ｄ）。このことは、この突然変異体は成長のためにさらにウラシルを必要とすることを意味する。
【００１７】
本発明の核酸を提供するために、好適な酵母突然変異体、例えばａｒｇ１１／ｕｒａ３突然変異体を、植物又は動物ｃＤＮＡ遺伝子バンク由来のｃＤＮＡ断片を含み、酵母での使用に好適な発現プラスミドで形質転換する。これらの植物又は動物ｃＤＮＡ配列の発現によりアルギニンを含まない培地で成長できる形質転換体を選択することによって、植物又は動物ミトコンドリア輸送体分子をコードする配列を同定することができる。本発明によれば、既知のミトコンドリア輸送体分子に対して配列相同性を有するタンパク質をコードする核酸を好適な酵母発現プラスミドにクローニングし、特異的突然変異を相補する能力を試験することができる。従って本発明は、またＭＣＦタンパク質活性を有するタンパク質をコードする核酸の同定及び／又は単離のための前述の方法であって、ＭＣＦ欠失宿主細胞を植物又は動物遺伝子バンクの核酸配列で形質転換し、ＭＣＦ陽性宿主細胞を選択し、陽性宿主細胞に存在するＭＣＦコーディング核酸を標準的な方法を用いて単離及び／又は同定する、前記方法に関する。
【００１８】
ａｒｇ１１／ｕｒａ３酵母突然変異体と、酵母のプロトンＡＴＰアーゼＰＭＡ１のプロモーターを含む好適な発現プラスミドを使用して、酵母突然変異の相補をもたらすｃＤＮＡクローンを、シロイヌナズナから単離した。配列決定及び制限方法並びにその他の生化学的分子生物学的方法を使用した分析が明らかにしたところでは、本発明に従って単離されたこれらのシロイヌナズナｃＤＮＡ断片は植物ＭＣＦメンバーをコードする。これらのｃＤＮＡクローンの核酸配列を配列番号１及び配列番号３に示し、これらのｃＤＮＡクローンの対応するアミノ酸配列を配列番号２及び配列番号４に記載する。
【００１９】
また本発明は、特に核酸のコーディング配列内で、例えば本発明の核酸の１以上の塩基の置換、付加、逆位及び／又は欠失により得ることができる改変された核酸に関する。即ちまた本発明は、本発明の核酸の突然変異体、誘導体又は機能的等価物と呼ぶことができる核酸を含む。このような配列操作は、例えば核酸によってコードされたアミノ酸配列を特異的に改変して、例えばミトコンドリア輸送体の特異性を変えるために行われる。改変されたミトコンドリア輸送体をコードする核酸は、トランスジェニック植物を作製するために、農業で使用される植物の形質転換のために使用することができる。また特異的な配列改変は、核酸配列内に好適な制限部位を設け、または不要な核酸配列もしくは制限部位を取り除くという目的に行うことができる。その場合本発明の核酸はプラスミドに挿入され、微生物学／分子生物学の標準的方法を用いて組換えにより突然変異誘発、又は配列改変に供される。挿入、欠失又は置換、例えばトランジション及びトランスバージョンを作製するための好適な方法としては、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発法、プライマー修復法及び制限及び／又は連結法が挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡを参照）。また配列改変は、天然又は合成核酸配列を付加することによっても達成できる。合成核酸配列の例としては、また核酸断片の連結のためにこれらの断片に付加されるアダプター又はリンカーが挙げられる。
【００２０】
さらに本発明は、上記のａ）〜ｅ）の核酸の１つとハイブリダイズする核酸に関する。本発明に関連して使用される「ａ）〜ｅ）の核酸とハイブリダイズする核酸」という表現は、適度にストリンジェントな条件下でａ）〜ｅ）の核酸とハイブリダイズする核酸を意味する。例えば、ハイブリダイゼーション溶液（２５％ホルムアミド；５ｘＳＳＰＥ；０．１％ＳＤＳ；５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液；５０μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ；個々の成分の組成についてはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡを参照）中で放射性遺伝子プローブを用いて３７℃、２０時間でハイブリダイゼーションを行うことができる。この後に４２℃で２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中でフィルターを数回洗浄して、非特異的に結合したプローブを取り除く。フィルターは４２℃で０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、特に０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することが好ましい。
【００２１】
また本発明は、ＭＣＦ活性を有するポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸に関する。上記のポリペプチド又はタンパク質の配列は、配列番号１又は配列番号３に示す配列を有する核酸によりコードされるポリペプチド又はタンパク質に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に少なくとも８０％の相同性を有する。
【００２２】
本発明に関連して「少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に少なくとも８０％の相同性」という表現は、公知の方法、例えばコンピュータに基づく配列比較（「基本的局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」，Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０），４０３−４１０）を用いて決定することができるアミノ酸配列レベルでの配列マッチに関するものである。
【００２３】
当業者に公知の「相同性」という表現は、配列間のマッチで決まる２以上のポリペプチド分子間の関係の度合を表す。その場合、マッチとは同一的マッチ並びに保存的アミノ酸交換の双方を意味しうる。「相同性」のパーセンテージは、ギャップ又はその他の配列の特性を考慮して、２以上の配列でマッチする領域のパーセンテージから出てくる。
【００２４】
「保存的アミノ酸交換」という表現は、あるアミノ酸残基と別のアミノ酸残基の交換を意味し、その場合、この交換は交換されるアミノ酸の位置の極性又は電荷の変化を生じない。保存的アミノ酸交換の一例は、ある非極性アミノ酸残基と別の非極性アミノ酸残基の交換である。本発明に関連する保存的アミノ酸交換としては、例えば、
Ｇ＝Ａ＝Ｓ，Ｉ＝Ｖ＝Ｌ＝Ｍ，Ｄ＝Ｅ，Ｎ＝Ｑ，Ｋ＝Ｒ，Ｙ＝Ｆ，Ｓ＝Ｔ
Ｇ＝Ａ＝Ｉ＝Ｖ＝Ｌ＝Ｍ＝Ｙ＝Ｆ＝Ｗ＝Ｐ＝Ｓ＝Ｔ
が挙げられる。
【００２５】
相互関係を有するポリペプチド分子間の相同性は、公知の方法で決定することができる。通常、特別な必要条件を説明するアルゴリズムを有する特別なコンピュータープログラムが使用される。相同性の決定のための好ましい方法は、まず被検配列の間に最大マッチを生じる。２つの配列間の相同性の決定のためのコンピュータープログラムとしては、限定されるものではないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１９８４），３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ（ＷＩ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ｓ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０），４０３−４１０）を含むＧＣＧプログラムセットが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及びその他の供給元から入手可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０），４０３−４１０）。また公知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも相同性の決定のために使用することができる。
【００２６】
配列比較のための好ましいパラメーターとしては、例えば次のものが挙げられる。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０），４４３−４５３；
比較マトリックス：ＨｅｎｉｋｏｆｆのＢＬＯＳＵＭ ６２及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１９９２），１０９１５−１０９１９；
ギャップペナルティ（Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）：　　　　　　 　１２
ギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）：４
類似性閾値：　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　０
【００２７】
またＧＡＰプログラムも上記のパラメーターの使用のために好適である。上記のパラメーターは、アミノ酸配列比較のためのデフォルトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）である。
【００２８】
さらに、ｐｒｏｇｒａｍ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｓｕｉｔｅ、第９版（１９９７年９月）に記載のものを含むさらなるアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）、ギャップエクステンションペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）及び比較マトリックスが使用される。プログラムの選択は、行われる比較、並びに比較が配列対の間で行われるか（その場合はＧＡＰ又はＢｅｓｔ Ｆｉｔが好ましい）又はある配列と包括的な配列データバンクの間で行われるか（その場合はＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴが好ましい）の双方に依存する。
【００２９】
また本発明は、本発明の核酸又はその断片を宿主細胞で発現させることによって得ることができる、好ましくは単離され、かつ完全に精製されたタンパク質に関する。タンパク質は、配列番号１又は配列番号３に示す配列を有する核酸によりコードされるタンパク質と同じ輸送特性を有することが好ましい。このようなタンパク質の活性を立証するために、下記の実施例で説明するように例えば取り込み試験を行うことができる。
【００３０】
また本発明は、本発明のタンパク質と反応する、単離され、かつ完全に精製されたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体又はそれらのフラグメントに関する。
【００３１】
さらに本発明は、発現調節エレメントの制御下に本発明の核酸及び／又はその断片を含む構築物に関する。本発明に関連して「構築物」（またこの場合は、ベクターとも呼ぶことができる）という用語は、本発明の核酸又はその断片と少なくとも１つの付加的な核酸エレメント、例えば調節エレメントとの組合せを意味する。このような調節エレメントの例としては、構成的又は誘導性プロモーター、例えば細菌での発現のための大腸菌プロモーターａｒａＢＡＤ（Ｃａｒｒａ及びＳｃｈｌｉｅｆ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２（１９９３），３５−４４）、真菌系での発現のための酵母プロモーターＰＭＡ１（Ｒｅｎｔｓｃｈら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３７０（１９９５），２６４−２６８）、及び植物での発現のためのウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｐｉｅｔｒｚａｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４（１９８６），５８５７−５８６８）が挙げられる。さらに核酸又は断片に転写終止シグナルを付与することができる。このようなエレメントはすでに記載されている（例えばＧｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．，８（１９８４），２３−２９を参照）。転写開始及び終止部位は宿主生物に対して天然（同種）又は外来性（異種）であってよい。転写開始及び終止部位の配列は、合成又は天然起原であってよく、あるいは合成及び天然成分の混合物を含むことができる。本発明の特に好ましい実施形態では、構築物はプラスミドである。
【００３２】
核酸又は断片は構築物、特にプラスミド内で１以上の調節エレメントに対してアンチセンス配向並びにセンス配向の双方で存在することができる。核酸又は断片が、例えば調節エレメント、例えばプロモーターに対してセンス配向で位置する場合、特に形質転換して、ゲノムにより高いコピー数で組み込まれた後に、共抑制効果によりミトコンドリア内膜の内因性輸送体の活性を阻害又は減少することができる。核酸又は断片が構築物内で調節エレメントに対してアンチセンス配向で位置する場合、構築物を、例えば植物宿主細胞のゲノムに挿入し、その転写後に植物特有のミトコンドリア輸送体分子の形成を抑制することができる。
【００３３】
従って、本発明の好ましい実施形態は、プロモーターに対してアンチセンス配向にある本発明の核酸又はその断片を含む構築物を含む。その場合、上記構築物を含む宿主細胞ではミトコンドリア輸送体分子の発現又は場合によってはプラスチド輸送体分子の発現が阻害される。これによって、核酸断片は、少なくとも１０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド、特に少なくとも２００個のヌクレオチドを含む。本発明の核酸又はその断片を含む構築物を宿主細胞に挿入し、そこで翻訳不可能なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）に転写することができる。上記のＲＮＡはミトコンドリア輸送体の内因性遺伝子又はそれから転写されたｍＲＮＡに結合することによって、この内因性遺伝子の発現を阻害することができる。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態は、調節エレメント、例えばプロモーターに対してセンス配向にある本発明の核酸又は本発明の核酸断片を含み、プロモーターに対してアンチセンス配向にある別の同一もしくは異なる本発明の核酸又は別の同一もしくは異なる本発明の核酸断片が続く構築物に関する。この配列は内因性ＲＮＡの分解を誘導することができる二本鎖ＲＮＡの形成を可能にする（Ｃｈｕａｎｇ及びＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（２０００），４９８５−９０；Ｓｉｊｅｎ及びＫｏｏｔｅｒ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２２，（２０００），５２０−５３１）。
【００３５】
本発明の別の好ましい実施形態では、プラスミドは大腸菌及び／又は酵母に対する複製シグナル並びにプラスミドで形質転換された宿主細胞の陽性選択を可能にするマーカー遺伝子を含む。プラスミドを植物宿主細胞に挿入する場合、挿入方法に応じて当業者に公知の付加的な配列が必要となる場合がある。プラスミドが、例えばＴｉ又はＲｉプラスミドの誘導体であれば、挿入される核酸又はその断片に核酸又はその断片の植物ゲノムへの組込みを可能にするＴ−ＤＮＡ配列が隣接してなければならない。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は広く研究されており、例えば欧州特許第１２０５１６号明細書；Ｈｏｅｋｅｍａ，Ｔｈｅ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ，第Ｖ章（１９８５），Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ Ｋａｎｔｅｒｓ Ｂ．Ｖ．Ａｂｌａｓｓｅｒｄａｍ；Ｆｒａｌｅｙら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，４（１９８５），１−４６及びＡｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．，４（１９８５），２７７−２８７に記載されている。挿入された核酸又はその断片が、ひとたびゲノムに組込まれると、そこで通常は安定であり、また初めに形質転換された細胞の子孫でも保存される。
【００３６】
またゲノムに組込まれる配列は、例えば形質転換植物細胞に生物致死剤又は抗生物質、例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン又はホスフィノトリシンに対する耐性を付与する選択マーカーを含むことができる。使用されるマーカーは、形質転換ＤＮＡを含まない細胞に対して形質転換細胞を選択することを可能にする。
【００３７】
そこで本発明は、また本発明の核酸、特に配列番号１に示す配列を有する核酸もしくは配列番号３に示す配列を有する核酸又はその断片、あるいは本発明の核酸又はその断片を含む構築物を含む宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は細菌又は酵母、昆虫、哺乳類もしくは植物細胞であってよい。
【００３８】
さらに本発明は、ＭＣＦ活性を有するタンパク質をコードする本発明の核酸又はその断片、あるいは本発明の構築物をその細胞の少なくとも１つに含むトランスジェニック植物に関する。トランスジェニック植物は、様々な種、属、科、目、綱の植物、即ち単子葉植物及び双子葉植物の双方、並びに藻類、苔類、シダ類又は裸子植物であってよい。またトランスジェニック植物は、これらの植物のカルス（ｃａｌｌｉ）、植物細胞培養物並びに部分、器官、組織、及び収穫物又は増殖物質も含むことができる。本発明では、トランスジェニック植物は、特にタバコ、ジャガイモ、トマト、テンサイ、ダイズ、コーヒー、エンドウマメ、インゲンマメ、ワタ、イネ又はトウモロコシ植物である。
【００３９】
本発明に関連して「その細胞の少なくとも１つ」という表現は、トランスジェニック植物が安定的に組込まれた１以上の本発明の核酸又はその断片、あるいは本発明の構築物を含む少なくとも１個の細胞、但し好ましくは多数の細胞を含むことを意味する。本発明の核酸又はその断片あるいは構築物は、細胞核又はミトコンドリアもしくはプラスチドゲノムの双方に組込むことができる。好ましくは核酸、断片又は構築物は、天然の位置に対応しない細胞の位置に、あるいは天然のコピー数及び／又は配向に対応しないコピー数及び／又は配向で組込まれる。
【００４０】
また本発明は、以下のステップを含むトランスジェニック植物、好ましくは稔性植物の産生方法に関する：
本発明の核酸、特に配列番号１に示す配列を有する核酸もしくは配列番号３に示す配列を有する核酸又はその断片、あるいは本発明の核酸又はその断片を含む構築物の植物細胞への挿入；
形質転換した植物からの好ましくは稔性植物の再生。その場合、この植物の少なくとも１個の細胞がトランスジェニックであり、即ち安定的に組込まれた本発明の核酸を含み、そして好ましくはそれを発現する、即ち組込まれた核酸をＲＮＡに転写する細胞である。得られる植物は、少なくとも１つのミトコンドリアにおいてミトコンドリア内膜輸送体の改変された活性を有することが好ましい。
【００４１】
核酸を植物細胞に挿入するために多数の方法が利用可能である。これらの方法の多くは、挿入される核酸が構築物、例えばベクター内に存在することが必要である。例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、シャトルベクター等のベクターが知られている。多くの場合ベクターは、宿主細胞におけるベクターの安定化に、及び宿主細胞における複製を可能にする機能的単位を含む。またベクターは、核酸が機能的に結合され、核酸の発現を可能にする調節エレメントを含むことができる。
【００４２】
アグロバクテリア、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた形質転換のほかに、その他の多数の方法が利用可能である。これらの方法には、原形質体の融合、ＤＮＡのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、並びにバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）法及びウイルス感染法が含まれる。アグロバクテリアを用いた形質転換と異なり、注入及びエレクトロポレーション自体は、ベクターに対して特別の必要条件は提起されない。簡単なプラスミド、例えばｐＵＣ誘導体などを使用することができる。しかし、このように形質転換された細胞から全植物を再生しようとするときは、選択可能なマーカー遺伝子が存在することが有利である。
【００４３】
次に、形質転換した植物細胞から潜在的には選択のために抗生物質又は生物致死剤を含む好適な培地で全植物を再生することができる。次いで、得られた植物を、挿入されたＤＮＡの存在について試験することができる。形質転換細胞は標準的な方法では、植物の内部で成長する（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，５（１９８６），８１−８４を参照）。これらの植物を例のとおり成長させ、同じ形質転換された遺伝的形質又は他の遺伝的形質を有する植物と交雑することができる。得られた雑種個体は対応する表現型的特性を示す。
【００４４】
さらに本発明は、植物のミトコンドリア及び／又はプラスチド輸送特性の改変方法、特に植物細胞、植物組織、植物器官及び／又は全植物におけるミトコンドリアアルギニン／オルニチン輸送又はコハク酸／フマル酸輸送の改変方法に関する。その場合、本発明の核酸、特に配列番号１に示す配列を有する核酸もしくは配列番号３に示す核酸又はその断片が植物細胞及び／又は植物に挿入され、次いで全植物が再生され、その際改変された代謝物含量を有する植物が得られるように、その細胞の少なくとも１つで形質転換された核酸の発現が行われうる。
【００４５】
植物のミトコンドリア輸送特性を改変するために、輸送系の特異性（その場合は新しい化合物の輸送が可能になる）並びに輸送機構の双方が改変される。例えば本発明は、植物におけるミトコンドリア及び／又はプラスチド輸送の改変に関するものであり、その背景内でミトコンドリア内膜輸送体、特にＭＣＦ輸送体分子の親和性及び／又は基質特異性が、ミトコンドリアへ又はミトコンドリアからのより効率的な輸送が達成されるような効果に変えられる。例えばこれは、例えば複数の遺伝子コピーの挿入により、あるいは強力で構成的又は組織及び／又は時間特異的に発現するプロモーターの制御下に本発明の単離された核酸配列を含む構築物の挿入により、ＭＣＦ輸送体分子の過剰発現を生じさせることによって達成することができる。また内因性ＭＣＦ遺伝子の抑圧、抑制及び／又は共抑制によってミトコンドリア輸送の改変を達成することができ、その結果として、例えばミトコンドリア又はプラスチドの内部又は外部に特定の物質のターゲティングされた蓄積が生じる。内在するＭＣＦ活性を阻害するこのような効果は、本発明に従って、アンチセンス構築物を用いた植物細胞の形質転換及び／又は複数のセンス構築物の組込み（共抑制効果を得るため）及び／又はノックアウト方法を用いることによって達成することができる。また本発明の核酸を用いて、例えば相同組換えを介して内在する核酸に組込むことによって、ミトコンドリア内膜輸送体の内在する遺伝子の活性を直接阻害することもできる。
【００４６】
さらに本発明は、特に植物のミトコンドリア内膜又は植物のプラスチド内膜のミトコンドリア及び／又はプラスチド輸送の改変のための本発明の核酸の使用に関する。
【００４７】
好ましい実施形態においては、本発明は特にミトコンドリア内膜のアミノ酸及び／又はカルボン酸輸送を改変する方法に従って、上記の核酸の使用のための利用可能な方法を提供する。
【００４８】
特に本発明は、ミトコンドリアのアルギニン及びオルニチン輸送の改変方法に関する。アミノ酸、アルギニンは多くの植物の種子や貯蔵器官で窒素の主要な貯蔵形態を表す。貯蔵タンパク質に取り込まれ又は遊離アミノ酸として存在するアルギニンは、発芽中に酵素、アルギナーゼによってまずオルニチンと尿素に分解される。次いで生じた尿素はウレアーゼによってアンモニウムとＣＯ２に分解される。次に遊離したアンモニウムは、発芽中に特に重要なアミノ酸生合成に合流することができる。植物細胞では２種の酵素、アルギナーゼ及びウレアーゼがミトコンドリアのマトリックスに局在するから、細胞質ゾルに存在するアルギニンをまずミトコンドリア内膜に輸送しなければならない。
【００４９】
従って、本発明の特に好ましい実施形態は、アルギニン分解による窒素動員の効率を高めて、このようにして発芽挙動を改善するために、種々のプロモーター、例えばＣａＭＶ−３５Ｓ又は種子特異的プロモーターの制御下で本発明の植物ミトコンドリアアルギニン／オルニチン輸送体の過剰発現又は異所性発現を提供することである。
【００５０】
オルニチンはアルカロイド、例えばニコチン、アトロピン及びコカインの合成の前駆体である。従って、オルニチンプールを変えることによってアルカロイド含量の改変を達成することができる。
【００５１】
従って、本発明の別の特に好ましい実施形態は、植物のアルカロイド含量を改変するために、植物アルギニン／オルニチン輸送体の過剰発現又は異所性発現及びアンチセンス阻害を提供することである。
【００５２】
また本発明は、ミトコンドリアコハク酸輸送の改変方法に関する。植物ではミトコンドリアへのコハク酸の輸送は、脂肪酸の形態で貯蔵された炭素の動員において決定的なステップである。β酸化に由来するアセチル−ＣｏＡはグリコゾームでコハク酸に変換され、次にこれをクエン酸回路に導入することができる。貯蔵されたエネルギーを動員することができる効率と速度は特に脂肪貯蔵性種子の発芽で中心的意義を有する。
【００５３】
従って、本発明の好ましい実施形態は、脂肪酸のβ酸化からのエネルギー獲得の効率を高めて、このようにして種子の発芽挙動を改善するために、種々のプロモーター、例えばＣａＭＶ−３５Ｓ又は種子特異的プロモーターの制御下で植物ミトコンドリアコハク酸輸送体の過剰発現又は異所性発現を提供することである。
【００５４】
また本発明の核酸、特に配列番号１に示す配列を有する核酸又は配列番号３に示す配列を有する核酸を、細菌、真菌、植物、動物及び／又はヒトから相同性配列を単離するために使用することができる。相同性配列を探すことができるようにするために、まず遺伝子バンク、例えばゲノムバンク又はｃＤＮＡバンクを作製しなければならない。次に上記の核酸の一部を含むプローブによって、配列を遺伝子バンクから単離することができる。対応する遺伝子の同定及び／又は単離の後に、ＤＮＡ及びアミノ酸配列を決定し、これらの配列によってコードされるタンパク質の特性を分析することができる。
【００５５】
また原核細胞及び／又は真核細胞において、本発明のミトコンドリア内膜輸送体、特にＭＣＦメンバーの発現を研究するために、本発明の核酸を使用することができる。例えば、上記の核酸を原核細胞、例えば細菌に挿入すれば、真核生物ミトコンドリア内膜輸送体、特に真核生物ＭＣＦメンバーの、細菌により翻訳可能なＲＮＡ配列が形成される。この場合、原核生物と真核生物の膜構造の大きな相違にもかかわらず、上記のＲＮＡ配列が真核生物の基質特異性を有する機能的真核生物ＭＣＦメンバーに翻訳される。従って、これらの細菌細胞を輸送体分子及びその基質の特性の研究のために使用することができる。本発明に従えば、アンチセンス配向で調節エレメントの制御下にある本発明の核酸を、原核細胞及び／又は真核細胞におけるミトコンドリア内膜の内因性輸送体、特に内因性ＭＣＦメンバーの発現を阻害するために使用することができる。トランスジェニック作物植物の産生はこれらの核酸のもう一つの可能な用途である。
【００５６】
さらに本発明の核酸又はこれらの核酸によってコードされたＭＣＦ輸送体分子を除草剤の研究のために使用することもできる。植物に必須の輸送体分子の幾つかは輸送体の機能を阻害しうる除草剤の標的を表す。本発明に従って、本発明のＭＣＦ輸送体の阻害剤を探すために、特に酵母でスクリーニング法を行うことができる。酵母系でこれらの阻害剤をさらに試験し、化学的修飾により最適化することができる。次いで植物でこれらの阻害剤の試験を行うことができる。ミトコンドリア担体ファミリーが真核生物特異的であって、ＭＣＦメンバーをターゲティングする除草剤が土壌細菌に対して無害であるならば、除草剤研究のための本発明のＭＣＦ輸送体の使用は特に興味深い。異なる種由来のＭＣＦのタンパク質配列間の分岐が比較的高いので、非植物生物に対して毒性が低い除草剤を同定することが可能である。
【００５７】
多くの除草剤の作用部位がプラスチド又はミトコンドリアにあるから、除草剤の輸送は新しい耐性機構の開発のための好都合な出発点である。本発明は、プラスチドに局在化された本発明のＭＣＦメンバーの基質特異性のターゲティングされた改変を提供し、除草剤が作用部位に到達しない作物植物を産生することが可能となる。
【００５８】
後述の実施例及び図面は本発明を説明するものである。図面の説明については後述する。
配列表は下記説明のものを含む：
配列番号１は、シロイヌナズナ由来のＡｔＡＲＧ１１遺伝子のＤＮＡ配列（８９１個のヌクレオチドを含む）を示す。
【００５９】
配列番号２は、本発明のｍｃｆタンパク質のアミノ酸配列（２９６個のアミノ酸を含み、配列番号１から誘導される）を示す。
【００６０】
配列番号３は、シロイヌナズナ由来のＡｔＡＣＲ１遺伝子のｃＤＮＡ配列（９３０個のヌクレオチドを含む）を示す。
【００６１】
配列番号４は、本発明の別のｍｃｆタンパク質のアミノ酸配列（３０９個のアミノ酸を含み、配列番号３から誘導される）を示す。
【００６２】
配列番号５〜１０は、クローニングのために使用されるシロイヌナズナ由来のプライマーを示す。
【００６３】
実施例
全てに共通する手順
ａ）クローニング法：大腸菌におけるクローニング及び酵母の形質転換のためにベクターｐＤＲ１９５（Ｄ．Ｒｅｎｔｓｃｈら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３７０（１９９５），２６４−２６８）を使用した。植物の形質転換のために、遺伝子構築物をバイナリーベクターＣＨＦ３、ｐＰＺＰ２１２の誘導体（Ｐ．Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５（１９９４），９８９−９９４）にクローニングした。
【００６４】
植物中のタンパク質の局在化のためにベクターｐＳＭＧＦＰ４を使用した。
【００６５】
ｂ）細菌及び酵母株：種々のベクターの増幅とクローニングのために大腸菌株ＤＨ５αを使用した。
【００６６】
酵母株として１ｃ１６３６ｄ（ａｒｇ１１−１、ｕｒａ３−）、ＭＧ４０９（ｕｒａ３−）の誘導体（Ｄｅｌｆｏｒｇｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７（１９７５），２３１）及びＧ６０（ａｃｒ１，ｕｒａ３−）、２３３４４ｃ（ｕｒａ３−）の誘導体（Ｇｒｅｎｓｏｎら）を使用した。
【００６７】
ｃ）アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換：Ｈｏｆｇｅｎ及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（１９８８），９８７７）に従って直接形質転換して、アグロバクテリアへのＤＮＡ転移を行った。形質転換したアグロバクテリアのプラスミドＤＮＡを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７（１９７９），１５１３−１５２３）に従って単離し、好適な制限酵素で切断した後、ゲル電気泳動により分析した。
【００６８】
ｄ）植物の形質転換：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（株Ｃ５８Ｃ１、ｐＧＶ２２６０）が媒介する遺伝子転移によって植物の形質転換を行うことができる（Ｄｅｂｌａｅｒｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３（１９８５），４７７７−４７８８）。例えば減圧浸潤（Ｂｅｃｈｔｏｌｄらにより改変（Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ ｄｅ ｌ’Ａｃａｄｅｍｉｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅ ＩＩＩ，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｅ ｌａ Ｖｉｅ，３１６（１９９３），１１９４−１１９９）によってシロイヌナズナの形質転換が行われる。鉢（直径１０ｃｍ）を土で満たし、続いて蚊よけネットを鉢に張る。このネットの上にシロイヌナズナの種子を播種する。播種から６〜８週間後にこれらの植物を減圧浸潤のために使用する。減圧浸潤のために抗生物質（５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び１００μｇ／ｍｌリファンピシン）を含むＹＥＢ培地で対応するアグロバクテリア株の２ｘ１リットル培養物を２８℃で増殖させた。ＯＤ６００が１．５で、３０００ｇの細胞を回収し、６００ｍｌの浸潤培地（０．５ｘＭＳ培地（Ｓｉｇｍａ）、５％サッカロース、４４μＭベンジルアミノプリン）に再懸濁した。細菌懸濁液を２５０ｍｌのガラス缶詰めびん（ｇｌａｓｓ ｃａｎｎｉｎｇ ｊａｒ）に満たし、乾燥器の中に置く。シロイヌナズナ植物を「頭から先に」細菌懸濁液に浸し、次に５分間の減圧を適用する。３〜４週間後にこの植物の種子を回収する。表面殺菌のために種子を４％次亜塩素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、０．０２％ｔｒｉｔｏｎ中で１０分間振盪し、１５００ｇで遠心分離し、滅菌水で４回洗浄し、３ｍｌの０．０５％アガロース（種子５０００個あたり）に再懸濁する。種子−アガロース溶液を、ＭＳＳ培地（１ｘＭＳ、１％サッカロース、０．８％アガロース、５０μ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ５．８）の上にまく（種子５０００個に対して直径１３．５ｃｍのプレート）。水分損失を減少するために、プレートをＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で閉じる。カナマイシン耐性植物を土壌に植え直す。これらの植物の種子を回収して分析する。
【００６９】
実施例１
シロイヌナズナ由来のアルギニン／オルニチン輸送体遺伝子のクローニング
ＰＣＲによりシロイヌナズナのｃＤＮＡバンク遺伝子からＡｔＡＲＧ１１遺伝子を、プライマーＡｔＡＲＧ１１−ｆ（５’−ａｇｃｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｃｔｇｇｃｃｇｇａｇｔｔｔａｔｇ−３’、配列番号５）及びＡｔＡＲＧ１１−ｒ（５’−ｔｔｃｇｇａｔｃｃｔｃａａｔｃｔｃｃｔｇｔｇａｃａａｔａｔｃ−３’、配列番号６）で増幅した。プライマーＡｔＡＲＧ１１−ｆはＸｈｏＩ切断部位を含み、プライマーＡｔＡＲＧ１１−ｒはＢａｍＨＩ切断部位を含む。ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、同様に制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断されたプラスミドｐＤＲ１９５に連結した。次いでプラスミドを大腸菌細胞に形質転換した。
【００７０】
プラスミドへの挿入の配列決定を行った。８９１個のヌクレオチドを有するｃＤＮＡ配列を同定することができた（配列番号１）。配列番号２は、アルギニン−オルニチン輸送体分子の関連アミノ酸配列を示す。
【００７１】
約１μｇのプラスミドをＧｉｅｔｚの方法（Ｇｉｅｔｚら、Ｙｅａｓｔ １１（１９９５），３５５−３６０）に従って酵母株１ｃ１６３６ｄに形質転換した。次いでアルギニンを含まない最少培地で成長できた酵母突然変異体を選択した。
【００７２】
実施例２
シロイヌナズナ由来のコハク酸輸送体遺伝子のクローニング
ＰＣＲを用いてシロイヌナズナのｃＤＮＡ遺伝子バンクからＡｔＡＣＲ１遺伝子を、制限酵素ＸｈｏＩの切断部位を含むプライマーＡｔＡＣＲ１−ｆ（５’−ａｃｇｃｔｃｇａｇａｔｇｇｃｇａｃｇａｇａａｃｇｇａａｔｃ−３’、配列番号７）及びＮｏｔＩ切断部位を含むプライマーＡｔＡＣＲ１−ｒ（５’−ａｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔａｔａａａｇｇａｇｃａｔｔｃｃｇａａｇ−３’、配列番号８）を用いて単離した。
【００７３】
ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断し、同様に制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断されたプラスミドｐＤＲ１９５に連結した。次いで大腸菌細胞をプラスミドで形質転換した。
【００７４】
プラスミドの挿入の配列決定を行った。９３０個のヌクレオチドを含むｃＤＮＡ配列を同定することができた（配列番号３）。このＤＮＡ配列によりコードされるコハク酸輸送体のアミノ酸配列が配列番号４に示されており、３０９個のアミノ酸を含む。
【００７５】
約１μｇのプラスミドをＧｉｅｔｚの方法（Ｇｉｅｔｚら、Ｙｅａｓｔ １１（１９９５），３５５−３６０）に従って酵母株Ｇ６０に形質転換した。次いで唯一の炭素源としてエタノールを含む最少培地で成長することができた酵母形質転換体を選択した。
【００７６】
実施例３
ＡｔＡＲＧ１１及びＡｔＡＣＲ１遺伝子のベクターＣＨＦ３へのクローニング
植物で過剰発現を達成するために、ＡｔＡＣＲ１遺伝子とＡｔＡＲＧ１１遺伝子をベクターＣＨＦ３にクローニングした。遺伝子は対応するｐＤＲ１９５構築物からＢａｍＨ１及びＸｈｏ１で切取り、ＢａｍＨ１及びＳｍａ１により切断されたベクターＣＨＦ３に連結した（ＣＨＦ３−ＡＲＧ１１）。生じたプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換し、得られた細菌株をシロイヌナズナの形質転換のために使用した。
【００７７】
植物における局在化のために、ＰＣＲによりシロイヌナズナのｃＤＮＡ遺伝子バンクからＡｔＡＲＧ１１遺伝子をプライマーＡｔＡＲＧ１１−ＧＦＰ−ｆ（５’−ｔｔｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇａｔｔｔｃｔｇｇｃｃｇｇａｇｔｔｔａｔｇ−３’、配列番号９）及びＡｔＡＲＧ１１−ＧＦＰ−ｒ（５’−ａａｔｃｃｃｇｇｇａｔｃｔｃｃｔｇｔｇａｃａａｔａｔｃｔｇｇｇ−３’、配列番号１０）を用いて増幅した。プライマーＡｔＡＲＧ１１−ＧＦＰ−ｆはＢａｍＨＩ切断部位を含み、プライマーＡｔＡＲＧ１１−ＧＦＰ−ｒはＳｍａｌ切断部位を含む。ＢａｍＨＩ及びＳｍａｌにより切断されたＰＣＲ産物を、同様にＢａｍＨＩ及びＳｍａｌで切断されたベクターｐＳＭＧＦＰ４に連結した。蛍光顕微鏡法により遺伝子産物を細胞小器官に局在化した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａは、ＡＲＧ１１及びａｔＡＲＧ１１タンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅに従った疎水性分析を示す。
図１ｂは、例としてＡｔＡＲＧ１１を用いたＭＣＦメンバーの構造の概略図を示す。
【図２】
図２は、ｐＤＲ１９５中のＰＭＡプロモーターの制御下でＡｔＡＲＧ１１遺伝子を発現させたことによる酵母突然変異体ａｒｇＡＲＧ１１の相補を示す。
【図３】
図３は、ＰＭＡプロモーターの制御下でＡｔＡＣＲ１遺伝子を発現させたことによる酵母突然変異体ａｃｒ１の相補を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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