(57)【要約】試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、(a)DNA二重らせん結合剤と、(b)核酸ポリメラーゼと、(c)増幅産物内の相補的領域に対してハイブリダイズすることができるように、一本鎖の形にあるときに前記標的配列に対してハイブリダイズすることができ且つ化学結合基によって標識を有するプローブに5' 端に結合している増幅プライマーを含み、標識した前記プローブが前記標的核酸配列と同様の配列である試薬との存在下に該試料に対して核酸増幅を行い、且つ該標識が該DNA二重らせん結合剤から蛍光を吸収することができ、或いはそれに蛍光エネルギーを供与することもできるステップと、前記試料の蛍光をモニタするステップとを含む、前記方法。
2004532044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
(a)DNA二重らせん結合剤、
(b)核酸ポリメラーゼ、
(c)一本鎖の形にあるときに前記標的配列に対してハイブリダイズすることができ且つ化学結合基によって標識を有するプローブに5' 端で結合している増幅プライマーを含む試薬、
の存在下に該試料に対して核酸増幅を行うステップであって、
標識した前記プローブが前記標的核酸配列と同様の配列であり、但し、増幅産物内の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、及び、該標識が該DNA二重らせん結合剤から蛍光を吸収し又は該DNA二重らせん結合剤に蛍光エネルギーを供与し得るステップ；及び、
前記試料の蛍光をモニタするステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
(a)該標的核酸配列と、該DNA二重らせん結合剤と、該核酸ポリメラーゼと、該試薬とを含む疑いがある試料に添加するステップ；
(b)該プライマーが該標的核酸配列にハイブリダイズするとともに該プローブを含む増幅産物が形成される条件に前記試料を供するステップ；
(c)該標識したプローブが該増幅産物の相補的領域にハイブリダイズする条件に前記試料を供するステップ；及び
(d)ステップ(b)と(c)の少なくとも１つのステップの間に前記試料の蛍光をモニタするステップ、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該増幅産物が該プローブを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該DNA二重らせん結合剤が挿入色素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該DNA二重らせん結合剤が供与標識を含み、該プローブがその受容標識を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該DNA二重らせん結合剤が受容標識を含み、該プローブがその供与標識を含んでいる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該受容標識が固有の波長でエネルギーを放出する蛍光分子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該受容標識がローダミン色素又はCy5である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該受容標識が暗受容体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該暗受容体がDABCYL、メチルレッド、QSY-7ジアリールローダミン色素及び6-(ジメチルアミノ)-2-［4-［4-(ジメチルアミノ)フェニル］-1,3-ブタジエニル］-1-エチルキノリニウムペルクロレート(CAS No.181885-68-7)のいずれか１種より選ばれる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該増幅反応が該ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を含む、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該受容体分子が蛍光分子であり、該供与体分子と該受容体分子双方の蛍光がモニタされ、発光間の関係が計算される、請求項１〜８と請求項11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該試料からの蛍光シグナルを該増幅反応全体にモニタし、その結果を該試料中に存在している標的配列の量を定量するために用いる、請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該増幅反応が、標識したプローブに結合していない対応する追加の増幅プライマーの存在下に行われる、請求項１〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸増幅を検出する方法であって、
(a)核酸ポリメラーゼ、
(b)DNA二重らせん結合剤、
(c)一本鎖の形にあるときに標的配列に対してハイブリダイズすることができ且つ化学結合基によって第二標識を有するプローブに5' 端で結合している増幅プライマーを含む試薬、
の存在下に標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を行うステップであって、標識した前記プローブが前記標的配列と同様の配列であり、但し、増幅産物の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、及び、該DNA二重らせん結合剤又は第二標識の一方が、前記供給分子から蛍光エネルギーを吸収することができる受容標識を含む該DNA二重らせん結合剤又は第二標識のもう一方に蛍光エネルギーを供与することができる供与標識を含み、前記プライマーが前記標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができるステップ；及び、
該増幅反応中に蛍光の変化をモニタするステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
該増幅が、DNA鎖内の該標的ヌクレオチド配列のみが増幅されるように設計されている一対のプライマーを用いて行われる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
該プローブがRNAのスプライス領域か又はDNAのイントロンに特異的であるので、増幅したRNA又は増幅したDNAの１つだけが検出及び/又は定量される、請求項１〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
標的核酸配列の特性を求める方法であって、
(a)DNA二重らせん結合剤と、該標的配列の領域と同様である配列を含むプローブに5' 端で化学結合によって結合された増幅プライマーを含み且つ標識を更に含み、前記DNA二重らせん結合剤と該標識の一方が供与標識であり、もう一方が受容標識であり、該供与標識が該受容標識に蛍光エネルギーを供給することができる試薬との存在下に前記配列を増幅し、プローブ領域を組込んでいる増幅産物を形成するステップ、
(b)増幅産物をその該プローブ領域が該増幅産物の該相補的領域に対してハイブリダイズする条件に供するステップ、及び
(c)試料の蛍光をモニタするとともに該試料に対する該プローブ領域のハイブリダイゼーション又は該プローブ領域と該標的核酸配列間に形成される該二重らせんの不安定化の結果として蛍光が変化する前記配列の特有の具体的な反応条件を求めるステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
多型性及び/又は対立遺伝子変異を検出する方法であって、前記多型性又は変異を含むことが疑われる配列を請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法を用いて増幅するステップと、該プローブ領域が該増幅産物内のその相補的配列から融解する温度を生成した該蛍光シグナルを用いて測定するステップと、それを多型性又は対立遺伝子変異の存在に関係づけるステップとを含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項１〜19のいずれか１項に記載の方法において用いられるキットであって、標的配列に特異的なプローブに化学結合によって5' 端に結合される増幅プライマーを含み、該プローブが供与標識と受容標識のどちらか一方として作用することができる第一標識を含む試薬と、第二標識が供与標識と受容標識のどちらか一方として作用することができる第二標識を含むDNA挿入剤とを含み、該第一標識と第二標識が供与体‐受容体対を形成する、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドを、例えば、増幅反応をモニタすることにより、好ましくは定量的方法で、検出する方法、及びその方法に用いられるキットを提供する。該方法は、多型性又は対立遺伝子変異のような配列特性の検出に適するので、診断法に用いることができる。
既知の蛍光ポリメラーゼ鎖反応(PCR)モニタリング法には、わずかな第２世代のPCRサーマルサイクリング装置に使用し得る鎖特異的と一般の双方のDNAインターカレーター法が含まれている。
一般蛍光PCR法は、二本鎖DNA化学種に結合されている場合に強い蛍光を示すDNA挿入色素を利用するものである。増幅中DNAのバルク濃度が上昇することによる蛍光の増大は、反応の進行を測定するとともに初期の標的分子コピー数を求めるために使用し得る。更に、温度変化が制御された蛍光をモニタリングすることにより、DNA融解曲線が、例えば、PCRサーマルサイクリングの終わりに生じ得る。
これらの一般蛍光PCR法は、核酸のバルク濃度の上昇を時間による損失を伴わずにモニタする。１回の蛍光の読み取りは、反応毎に同じ時点で測定し得る。アンプリコンからのアーチファクトを識別し、且つアンプリコンを識別するために終点融解曲線分析を使用し得る。アガロースゲル電気泳動では肉眼で見えるようにすることができない濃度で産物のピークを見ることができる。
一般的なDNA融解曲線分析はPCRサーマルサイクリングを最適化するのに強力なツールであることがわかった。アンプリコンの融解温度を求めることにより、後のPCRサイクルの変性温度をその温度まで下げることが可能である。ゲノムDNAではなく第１世代反応産物からの増幅を最適化することにより、後のサイクルで生じるアーチファクトの生成が減少する。プライマーオリゴヌクレオチドとその補体の融解温度はそのアニーリング温度を求めるために用いることができ、実験的最適化の要求が少なくなる。
しかしながら、一般インターカレーター法は、準鎖特異的にすぎないので、鎖特異的検出を必要とする場合にはほとんど用いられない。
【０００２】
蛍光PCR鎖特異的法は、増幅反応の進行をモニタするために追加の核酸反応成分を利用するものである。これらの方法は、検出の基準として蛍光エネルギー転移(FET)を用いることができる。１種以上の核酸プローブを蛍光分子で標識し、その一方がエネルギー供与体分子として作用することができ、もう一方がエネルギー受容体分子である。これらは、それぞれリポーター分子と消光分子としてしばしば知られる。供与体分子は、通常は蛍光発光波長を示す個々の光の波長で励起する。受容体分子は、この発光波長で励起し、種々の距離依存性エネルギー転移機序により供与体分子の発光エネルギーを受容し得る。起こり得る蛍光エネルギー転移の個々の例は、蛍光共鳴エネルギー転移又は“FRET”である。一般に、受容体分子は密接に近接している(例えば、同じ分子、又は隣接分子について)供与体分子の発光エネルギーを受容する。FET又はFRET検出の基準は供与体発光波長の変化をモニタすることである。受容体が蛍光分子である場合、受容体発光波長をモニタすることができる。
２種類のFET又はFRETプローブが一般に用いられ、供与体を受容体から分離するために核酸プローブの加水分解を用いるものと、供与体分子と受容体分子の空間的関係を変えるためにハイブリダイゼーションを用いるものがある。
加水分解プローブは、TaqMan(登録商標)プローブとして市販されている。これらは、供与体分子と受容体分子で標識されるDNAオリゴヌクレオチドからなっている。プローブは、PCR産物の１つの鎖の特定の領域に結合するように設計されている。この鎖に対するPCRプライマーをアニールした後、Taq酵素は5' →3' ポリメラーゼ活性を有するDNAを伸長させる。Taq酵素は、5' →3' エキソヌクレアーゼ活性も示す。TaqMan(登録商標)プローブは、Taqエクステンションを開始することを妨げるリン酸化により3' 端で保護される。TaqMan(登録商標)プローブが産物鎖に対してハイブリダイズする場合には、伸長しているTaq分子はプローブを加水分解することができ、検出の基準として供与体を受容体から遊離させる。この場合のシグナルは累積し、供与体と受容体の遊離分子の濃度は増幅反応の各サイクルと共に増大する。
【０００３】
シグナル生成がプローブ加水分解反応の発生に左右されるという事実は、この方法に時間の損失が伴うことを意味する。更に、プローブが存在することによりPCR法の円滑な操作が中断されてしまう。
更に、加水分解が、特に多数の、例えば、50サイクルを超える増幅サイクルを必要とする場合、非特異的であり得ることがわかった。その場合には、プローブの非特異的加水分解が過度の高シグナルを生じる。
これは、そのような手法がIdaho Technologies Inc.製のRapidCycler(登録商標)やLightCycler(登録商標)のような急速熱風サーマルサイクラーの開発において重要になってきている急速PCR法とほとんど適合しないことを意味している。他の急速PCR装置は、例えば、同時係属英国出願第2334904号に記載されている。従来の熱循環より急速循環の利点は他の所でも報告されている。そのような手法は、例えば、寿命又は深刻な損傷の損失が避けられるならば結果の速度が重要である生物学的闘争の検出システムに特に有効である。
更に、シグナル生成は、概してアンプリコン又はプローブの融解温度よりプローブの加水分解に左右されるので、融解のヒステリシスに関する情報は重要ではない。
ハイブリダイゼーションプローブは、多くの外観に利用できる。分子ビーコンは、5' と3' の相補的配列を有するオリゴヌクレオチドであり、ヘアピンループを形成する。末端蛍光標識は、FRETの場合、ヘアピン構造が形成されるときに生じるように密接に近接している。相補的配列に対して分子ビーコンがハイブリダイズした後、蛍光標識が分離するので、FRETは起こらず、これが検出の基準である。
一対の標識したオリゴヌクレオチドを用いることもできる。これらは、供与体分子と受容体分子を一緒に架橋しているPCR産物鎖について密接に近接してハイブリダイズするので、FRETが起こり得る。高FRETが検出の基準である。このタイプの変異体には、１つの隣接したプローブを有する標識した増幅プライマーを用いた変異体が含まれる。
【０００４】
２つのプローブ、又は２つの標識分子を含む分子ビーコン型のプローブの使用は、プロセスに関係するコストが増大する。更に、この方法にはかなり長く知られた配列の存在を必要とするので、特に相互に密接に接近して結合するのに十分長い２つのプローブが既知である。これは、有効なプローブを設計するために使用し得る生物における保存配列の長さがHIVウイルスのような比較的短いものである診断用においては問題となるものである。
更に、一対のプローブの使用には、より複雑な実験設計が必要である。例えば、プローブの融解物によって示されるシグナルは双方のプローブからの融解の関数である。小さな不適合又はプローブの一方がスプライス領域を横切って結合することを必要とする場合(例えば、イントロンの両側の配列がプローブ部位として用いることができる試料におけるDNAに匹敵するRNAを検出する)の実験により、もう一方のプローブが最初に融解する場合には不正確な結果が生じ得る。
同時係属国際出願第99/28500号には、具体的な標的核酸配列の存在を検出する方法であって、a)その試料に前記配列に特異的なプローブを付加するステップであって、該プローブがDNA二重らせん結合剤に蛍光を供与するか又はそれから蛍光エネルギーを吸収することができる部分をもっている、前記ステップと、b)その混合物を増幅反応に供するステップと、c)該標的配列に対して該プローブをハイブリダイズし、該試料からの該蛍光をモニタするステップとを含む、前記方法が記載されている。その場合、反応は前記試料の蛍光を測定することにより、プローブに対してハイブリダイズしかつDNA二重らせん結合剤とプローブの蛍光部分との間にFET又はFRETの相互作用を生じるより多くの産物が形成される反応の過程でこれが変わるので、モニタすることができる。
同時係属国際特許出願第PCT/GB99/00504号には、試料中の標的配列の量を定量するように適合することができる具体的な核酸配列の存在を検出する同様の分析が記載されている。この分析においては、増幅反応が一組のヌクレオチドを用いて行われ、少なくとも一方が蛍光的に標識されている。従って、増幅産物は蛍光標識がその中に組込まれている。反応は、増幅産物に対してハイブリダイズすることができ、且つ前記蛍光標識ヌクレオチドから蛍光を吸収することができるし、それに蛍光エネルギーを供与することもできる反応性分子を含むプローブの存在下に行われる。その場合、反応は、前記試料の蛍光を測定することにより、プローブに対してハイブリダイズし且つそれらの間でFET又はFRET相互作用を生じるより多くの産物が形成する反応の過程でこれが変わるので、モニタすることができる。
【０００５】
国際特許出願第01/11078号には、試料中の標的核酸配列の存在を検出する他の関連した方法が記載されている。この分析においては、第一段階で標的配列が一本鎖になるので、それに対して試薬のプライマー領域がハイブリダイズすることができる。従って、これにより、標識したヌクレオチドを含み且つ産物の下流領域に相補的な5' 端の上流に標識したプローブ領域をもつ相補鎖を作成するために鎖のエクステンションを始めることができる。エクステンション相が完了すると、産物は鋳型鎖から溶融相中で分離されるので、一本鎖になる。この形での標識したプローブ領域はねじれるとともに産物鎖の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、そのときFET又はFRETによって蛍光エネルギーをもう一方の標識に供与することができる標識がそのようにするので、試料からの蛍光シグナルが変化する。シグナルのこの変化は、反応全体にモニタすることができ、増幅反応の進行がモニタされる。
スコルピオンプローブシステムの使用を含む分析は、英国特許第2338301号とNucleic Acids Research, 2000, vol. 28, no. 19, 3752-3761に開示されている。スコルピンプローブシステムは、結合部分によってプローブ部分に結合したプライマー部分を含んでいる。プローブシステムは、供与部分と受容部分の双方を含んでいる。この分析においては、第一段階で標的配列を一本鎖にするのでプライマー部分は標的配列に対してハイブリダイズすることができる。従って、これにより、産物の下流領域に対して相補的である5' 端の上流にプローブ部分をもつ相補鎖を作成する鎖のエクステンションを始めることができる。エクステンション相が完了すると、融解相の間に鋳型細胞から産物を分離するので、一本鎖になる。この形での標識したプローブ領域はねじれるとともに産物鎖の相補的領域に対してハイブリダイズすることができる。産物鎖の相補的領域に対してプローブ部分をハイブリダイズすると、供与部分と受容部分との間の空間的関係が変わるので、試料からの蛍光シグナルが変化する。
【０００６】
そこで、出願人は、代替的改良分析を見出した。
本発明は、試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法であって、
(a)DNA二重らせん結合剤と、(b)核酸ポリメラーゼと、(c)一本鎖の形にあるときに前記標的配列に対してハイブリダイズすることができ且つ化学結合基によって標識を有するプローブに5' 端で結合している増幅プライマーを含む試薬、との存在下に該試料に対して核酸増幅を行うステップであって、標識した前記プローブが前記標的核酸配列と同様の配列であり、但し、増幅産物内の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、及び、該標識が該DNA二重らせん結合剤から蛍光を吸収し又は該DNA二重らせん結合剤に蛍光エネルギーを供与し得るステップ；及び、前記試料の蛍光をモニタするステップ、を含む、上記方法を提供する。
本発明は、国際出願第01/11078号の従来技術より安価で簡便であり、驚くべきことに効果的である。本発明においては、DNA二重らせん結合剤は、非結合状態で反応混合物に添加され、その結合剤を国際出願第01/11078号のようにヌクレオチドか又は英国特許第2338301号のようにプローブシステムに結合する要求を不要にする。
本発明の分析においては、第一段階で標的配列を一本鎖にするので、試薬のプライマー領域はそれにハイブリダイズすることができる。従って、これにより、相補鎖を作成するために鎖のエクステンションを始めることができる。プライマー鎖は、産物の下流領域に相補的な5' 端の下流に標識したプローブ領域を有する。DNA二重らせん結合材料(好ましくは挿入色素)は、そのように形成された二重らせんの中に入り込む。エクステンション相が完了すると、溶融相中にその鋳型細胞から産物が分離されるので、一本鎖になる。この形の標識したプローブ領域はねじれるとともに産物鎖の相補的領域に対してハイブリダイズすることができるので、産物のプローブ領域と相補的領域の間にDNA二重らせん結合剤が入り込む。DNA二重らせん結合剤とプローブ標識が相互に接近することにより、蛍光エネルギー(供与体)を受容部分にFET又はFRETによって供与することができる蛍光部分がそのようにするので、試料からの蛍光シグナルが変化する。このシグナルの変化は、増幅反応の進行をモニタするために反応全体にモニタすることができる。
【０００７】
増幅の第二段階と続いての段階においては、産物鎖はそれ自体エクステンション用鋳型鎖として作用することができる。しかしながら、前記プローブに相補的な配列が作製される前にプローブとプライマー間の化学結合がエクステンション反応を停止させる。従って、プローブ領域は一本鎖のままである。
本発明の方法は、
(a)標的核酸配列を含むことが疑われる試料にDNA二重らせん結合剤と、核酸ポリメラーゼと、試薬とを添加するステップと、
(b)プライマーが標的核酸配列に対してハイブリダイズしかつプローブを含む増幅産物が形成される条件に前記試料を供するステップと、
(c)標識したプローブが増幅産物の相補的領域に対してハイブリダイズする条件に前記試料を供するステップと、
(d)ステップ(b)とステップ(c)の少なくとも１つのステップの間、前記試料の蛍光をモニタするステップと
を含むことが好ましい。
必要とされる場合、標識したプローブ領域に結合していない対応する増幅プライマーが増幅反応中に存在してもよい。このプライマーは、結果として、用いられる検出装置の動的範囲にシグナルを仲介する働きをすることができる従来の非標識増幅産物を作製する。プローブ/プライマーの複合構造の存在によって悪影響することがある反応効率を改善することができる。
供与標識から蛍光を吸収することができる受容標識がこの機能を行う場合、供与体からの蛍光が低下する。この低下を検出することができ、これはプローブ領域の結合を意味する。
最も好ましくは、蛍光を吸収することができる標識(受容体)は、それ自体蛍光分子であり、固有の波長で蛍光を放出する。そのようなプローブには、ローダミン色素又はCy5が含まれる。この場合、供与標識と異なる波長を有する受容体分子からの蛍光の増加は、プローブの結合を意味する。また、受容体は蛍光を発しない(暗受容体)。そのような受容体には、DABCYL、メチルレッド、QSY-7ジアリールローダミン色素又は6-(ジメチルアミノ)-2-［4-［4-(ジメチルアミノ)フェニル］-1,3-ブタジエニル］-1-エチルキノリニウムペルクロレート(CAS No.181885-68-7)が含まれる。
【０００８】
適切には、DNA二重らせん結合剤は供与標識を含み、受容標識はプローブ上に与えられる。この場合、また、受容体が蛍光を発する場合には、このように標識した増幅産物の存在は、同じ産物鎖の下流領域に主として結合している、プローブ上の受容体分子からの蛍光をモニタすることにより検出することができる。この場合、増幅産物からのシグナルは、蛍光標識のバックグラウンドシグナルと、また、非特異的増幅産物とも区別することができる。また、DNA二重らせん結合剤は受容標識を含むことができ、プローブは供与標識を含んでいる。
本発明のシステムにおいては、一般インターカレーターシグナルの上昇(DNAが増幅した場合)と２つの蛍光部分が密接に近接している場合にだけ生じる配列特異的シグナル(即ち、プローブが増幅産物に対してハイブリダイズする場合)との間で区別される。配列特異的シグナルが標識した増幅産物によってのみ生成するという事実は、システムが多量のバックグラウンドDNAを含む反応混合物中の特定の標的配列を検出する点で非常に特異的であることを意味する。これは、非特異的増幅産物がプローブ領域に対してハイブリダイズしないので、測定シグナルに寄与しないためである。配列特異的シグナルに加えて一般インターカレーターシグナルを測定することは、有益なことである。一般インターカレーターシグナルは反応混合物中の増幅度に比例するので、増幅の効率又は遮断を示すために用いることができる。
この種類の分析は、安価な試薬を用いて行うことができる。単一の標識プローブは、受容体分子と供与体分子双方を含むものより経済的である。
増幅は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)又はリガーゼ鎖反応(LCR)、鎖置換分析(SDA)又はNASBAのような既知の増幅反応、好ましくはPCRを用いて適切に行われる。
好ましくは、供与部分と受容部分の双方の蛍光がモニタされ、発光間の関係が計算される。
プローブに沿った標識の位置は重要でないが、一般にプローブの末端領域に位置する。１つを超える標識を試薬に用いることができるが、１つがより安価であるので好ましい。
FRETのようなFETのオーダーでは、供与部分の蛍光発光は受容部分より波長が短くなければならない。
【０００９】
従って、適切な組合わせを次の表に示す。
2004532044.tif 000003
* Molecular Probes、英国から入手できる
当業者は、他の多くのそのような組合わせが可能であることを認識している。
好ましくは、供与体及び/又は受容体として用いられる分子は尖った発酵ピークを生じ、発光の波長の重なりがほとんど又は全くない。これらの状況によって、増幅産物によって生成されるシグナルからの“鎖特異的ピーク”を分割することは必要としない。鎖特異的シグナル(即ち、受容体部分によって生じる)のみの簡単な測定によって標的配列によるFET又はFRETの程度に関する情報が得られる。
しかしながら、供与部分と受容部分からの蛍光シグナルのスペクトルの重なりがある場合には、例えば、スペクトル間の関係を経験的に求めるとともにこの関係を用いて２つのシグナルからのシグナルを標準化することにより結果とみなすことができる。
標識プローブをプライマーから分離する化学結合は、ヌクレオチド配列を結合することができるがDNAポリメラーゼによって認識されないいずれの分子も適切である。この要求を満たす広範囲の化学リンカーは利用できる。
【００１０】
リンカーの形成に用いることができる化学剤と反応の種類の例は、例えば、国際出願第95/08642号に記載されている。特に、化学リンカーは、２つのポリヌクレオチド配列と、プライマーと、プローブとを共に結合する原子群を含んでいる。リンカーは、慣用的方法のいずれによってもそれぞれのポリヌクレオチド配列に結合することができる。
一般的に言えば、リンカーは、プローブとプローブの配列にそれぞれ結合することができること又は個々のヌクレオチドに結合してからプローブ又はプライマー配列が引き続き作成されることによって第一官能基と第二官能基を有する有機化合物から得られる。リンカーは、一般的にはヌクレオチドに結合しないように設計されている。
リンカーの合成は、例えば、S. Agrawal et al, Nucleic Acids Research, 1986, 14, 6227や国際出願第88/02004号(Applied Biosystems); J. L. Ruth & D. E. Bergstrom, J. Org. Chem., 1978, 43, 2870; D. E. Bergstrom & M. K. Ogawa, J. Amer. Chem. Soc., 1978, 10, 8106; C. F. Bigge, P. Kalaritis, J. R. Deck & M. P. Mertes, J. Amer. Chem. Soc., 1980, 102, 2033; 欧州特許出願第063,879号に詳述されている。プローブとプライマーを結合する化学結合基を有する試薬の構造と合成については、国際特許出願第01/11078号に詳述されている。
特に、リンカーは複数の形のエチレングリコール、例えば、ヘキサエチレングリコール(HEG)を含んでいる。そのようなリンカーは、構造-(CHOH-CHOH)n(ここで、nは１より大きい整数、例えば、１〜10、適切には６である。)を有するものである。
プローブとプライマーを結合するリンカー基を含むそのような試薬は、Oswel Research Products Ltd, 英国から入手することができる。
本発明の方法は、その用途が非常に広い。本方法は、以下に詳述されるように、試料中の標的核酸配列に関して定量データと定性データ双方を作成するために使用し得る。特に、本発明は定量的増幅を提供するだけでなく、更に又は或いは、二重らせん不安定化温度又は融点のような確認データを得るために使用し得る。
【００１１】
本発明の方法においては、標識したプローブは増幅プライマーと共に欠くことができないものであるので、増幅反応の過程全体に存在する。本工程は検出を均質な方法で行うことを可能にするので、増幅とモニタリングはすべての試薬が最初に添加される単一の容器で行うことができる。後続の試薬添加ステップを必要としない。一部の不均質系においては本発明の方法を用いることができる。固体支持体の存在下に本方法を行うことは求められていないことに留意すること(後述されるようにこれは任意であるが)。
プローブは増幅反応全体に存在するので、蛍光シグナルは増幅反応の進行をモニタさせることができる。これにより、試料中に存在する標的配列の量を定量するための手段が与えられてもよい。
蛍光受容部分を用いる場合には、増幅反応の各サイクル中に、標的配列を含むアンプリコン鎖とプローブ領域が受容体シグナルを生成する。試料中のそのアンプリコンの量が増加するにつれて、受容体シグナルも強くなる。サイクルに対する増加率をプロットすることにより、増強の出発点を求めることができる。
標識したプローブはDNA又はRNAのような核酸分子を含むことができ、後者が一本鎖の形にあるときに標的核酸配列に対してハイブリダイズする。この場合、標的核酸を一本鎖にする条件が用いられる。また、プローブは、二本鎖の形で標的配列を結合するぺプチド核酸又は他の核酸類似体のような分子を含むことができる。
特に、用いられる増幅反応は、試料中に存在する標的核酸配列のいずれかが一本鎖になる条件、例えば、PCR又はLCRに試料を供するステップを必要とする。次に、適切なハイブリダイゼーション条件が起こるならば増幅反応の過程でプローブ領域はそれを含むアンプリコン鎖の下流領域に対してハイブリダイズすることが可能である。
好適実施態様においては、これらの条件が増幅反応の各サイクル中に適合されるようにプローブを設計することができる。従って、増幅反応の各サイクル中のある点でプローブは標的配列に対してハイブリダイズし、FET又はFRETの結果としてシグナルを生成する。増幅が進行するにつれて、プローブ領域が下流反応から分離又は融解するので、受容標識によって生成したシグナルが供与体分子又は受容体分子を含むかによって減弱又は増強する。例えば、受容体である場合、増幅の各サイクルにおいて受容標識からの蛍光ピークが生成する。ピークの強さは、プローブを含むより多くのアンプリコン鎖が利用できることから増幅が進行するにつれて増強する。
【００１２】
各サイクルの間、試料からの受容体標識の蛍光をモニタすることにより、増幅反応の進行を様々な方法でモニタすることができる。例えば、融解ピークによって得られるデータは、例えば、融解ピークの下の面積を計算し、このデータをサイクル数に対してプロットすることにより分析することができる。
蛍光は、既知の蛍光光度計を用いて適切にモニタされる。これらの、例えば、光電子倍増電圧の形のシグナルは、データプロセッサボードに送られ、各試料チューブに付随したスペクトルに変換される。複数のチューブ、例えば、96チューブを同時に評価することができる。このようにして反応全体に頻繁な間隔で、例えば、10分毎に１回データを集めることができる。
このようにして生成したスペクトルを、各シグナリング部分(即ち、DNA二重らせん結合剤及び/又はプローブ標識)の代表的なピークを形成するために、例えば、色素のような予め選択した蛍光部分の“適合部”を用いて分割することができる。各シグナルの強さの値を表し、必要な場合には、相互に商として表されるピークの下の面積を求めることができる。シグナルの強さ及び/又は比率の微分は、FET又はFRETの変化を反応によって又は温度のような異なる反応条件で記録されることを可能にする。上記の変化は、プローブと標的配列間の結合現象に関係する。微分ピークの下の面積の全体は、FET又はFRET効果の強さの値を計算することを可能にする。
これらのデータは、試料中に存在する標的核酸の量を定量する１つの手段を与える。
プライマー/標識したプローブ試薬は、溶液中に遊離していてもよく、固体支持体、例えば、産物を分離するのに有効な磁気ビーズのようなビーズの表面、又は表面プラズモン共鳴検出器の導波管や、例えば、DNAアレイのような検出装置の表面上に固定化されてもよい。選択は、調べられる具体的な分析の種類や用いられる具体的な検出手段に左右される。
【００１３】
プローブは、増幅反応に用いられるDNAポリメラーゼによって加水分解され、よって受容体分子を遊離するように設計することができる。これにより、累積したシグナルが得られ、システム内に存在する遊離プローブ標識の量が各サイクルと共に増加する。この分析においては、シグナルはプローブの加水分解に左右されないのでプローブがこのように消費されることは必要でない。
適切には、プローブは、標的配列からそのまま遊離されるので、適切なハイブリダイゼーション条件が増幅反応中に適合する場合に再び結合することができるように設計される。これは、例えば、増幅反応のエクステンション相の間であってもよい。しかしながら、シグナルはプローブ加水分解に左右されないので、プローブは増幅サイクル中の段階で標的配列からハイブリダイズし融解するように設計されてもよい。特に、プローブは、増幅反応による妨害が最も少なくなることが確実になるので、反応のエクステンション温度より低い温度でハイブリダイズするように設計されることが好ましい。
これにより、反応の各段階に存在する増幅産物の量に直接関係がある完全に可逆的なシグナルが得られる。更に、検出されるアンプリコンと共に欠くことのできないプローブがそれに対して急速にハイブリダイズすることができるので、反応速度が、例えば、急速PCRにおいて最も重要である場合に有利である。
このように作成されたデータは、様々な方法で説明することができる。最も簡単な形においては、増幅反応の過程又は最後の受容体分子の蛍光の増強は、存在する標的配列の量の増加を示し、増幅反応が進行したので、標的配列は実際に試料中に存在したことを示している。しかしながら、上記のように、増幅反応全体にモニタすることにより定量化も可能である。最後に、以下で更に述べる配列についての情報を得るために、終点測定としてか又は全体に、確認データ、特に融点分析を得ることが可能である。
【００１４】
従って、本発明の好適実施態様は、核酸増幅を検出する方法であって、(a)核酸ポリメラーゼと、(b)DNA二重らせん結合剤と、(c)一本鎖の形にあるときに標的配列に対してハイブリダイズすることができ且つ化学結合基によって第二標識を有するプローブに5' 端で結合している増幅プライマーを含む試薬、の存在下に該標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を行うステップであって、標識した前記プローブが前記標的配列と同様の配列であり、但し、増幅産物の相補的領域に対してハイブリダイズすることができ、及び、該DNA二重らせん結合剤又は第二標識の一方が、前記供給分子から蛍光エネルギーを吸収することができる受容標識を含む該DNA二重らせん結合剤又は第二標識のもう一方に蛍光エネルギーを供与することができる供与標識を含み、前記プライマーが前記標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができるステップ；及び、該増幅反応中に蛍光の変化をモニタするステップ、を含む、前記方法を含む。
適切には、受容標識はそれ自体蛍光であり、固有の波長で蛍光エネルギーを放出する。増幅は、当該技術において十分に理解されるようにDNA鎖内の標的ヌクレオチド配列のみが増幅されるように設計される一対のプライマーを用いて適切に行われる。核酸ポリメラーゼは、Taqポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼが適切である。
増幅反応を行うことができる適切な条件は、当該技術において周知である。最適条件は、含まれる具体的なアンプリコン、用いられるプライマーの種類、用いられる酵素によってそれぞれの場合に変えることができる。最適条件は、当業者がそれぞれの場合に求めることができる。典型的な変性温度は約95℃であり、典型的なアニーリング温度は約55℃であり、エクステンション温度は約72℃である。
【００１５】
本発明の具体的な実施態様においては、標識したプローブは、薬剤発見に用いることができる、RNA転写物を、例えば、発現実験において定量するために用いることができる。特に、この実施態様は、真核生物由来組織での発現実験に適切である。真核細胞においてタンパク質をエンコードするDNAは、イントロンと、DNA配列の非コード領域と、タンパク質配列をエンコードするエキソンとを含むことができる。非コードイントロン配列は、細胞“スプライシング”プロセス中のDNA配列に由来するRNA配列から除去される。PCRプライマーは、通常はコード領域で標的にし、逆転写酵素PCRが全核酸抽出物に用いられる場合、DNA依存性増幅とRNA依存性増幅双方によって産物が得られる。従って、PCRだけが発現実験に用いられる場合、ゲノムDNAと発現RNAによって生じる増幅を含む。
イントロンを横切ってコードエキソンの隣接した末端領域に結合するように設計された標識したプローブは、イントロン領域のために相互作用が制限されている。スプライスRNAはこれらの領域が除去されているので、コードエキソンの隣接した末端領域は１つの連続配列を形成し、プローブ領域の効率のよい結合を可能にする。
逆に、イントロン領域を結合するように設計される場合には、プローブ領域はゲノムDNAの増幅産物だけを検出することができる。そのようなプローブから生成されたシグナルは、DNA濃度にだけ関係し、試料のRNA濃度には関係しない。２種類の試薬を用いることも可能であり、各々が異なるプローブとプライマーをもち、一方がRNAのスプライス領域とともに用いるのに適した試薬であり、一方がDNA中のイントロンに適した試薬である。
従って、他の実施態様においては、プローブ領域はRNAのスプライス領域か又はDNA中のイントロンに特異的であるので、増幅されたRNA又は増幅されたDNAの一方だけが検出及び/又は定量される。
【００１６】
或いは又は更に、本発明の方法は、配列の特性を求めるためのハイブリダイゼーション分析に使用し得る。従って、他の態様においては、本発明は、核酸配列の特性を求める方法であって、(a)DNA二重らせん結合剤と、その標的配列の領域と同様である配列を含むプローブに5' 端で化学結合によって結合された増幅プライマーを含み且つ標識を更に含み、前記DNA二重らせん結合剤と該標識の一方が供与標識であり、もう一方が受容標識であり、該供与標識が該受容標識に蛍光エネルギーを供給することができる試薬との存在下に前記配列を増幅し、プローブ領域を組込んでいる増幅産物を形成するステップと、(b)増幅産物をその該プローブ領域が該増幅産物の該相補的領域に対してハイブリダイズする条件に供するステップと、(c)試料の蛍光をモニタするとともに該試料に対する該プローブ領域のハイブリダイゼーション又は該プローブ領域と該標的核酸配列間に形成される該二重らせんの不安定化の結果として蛍光が変化する前記配列の特性の具体的な反応条件を求めるステップとを含む、前記方法を提供する。
適切な反応条件としては、温度、電気化学、又は具体的な酵素又は化学剤の存在に対する応答が含まれる。これらの性質が変わるにつれて蛍光の変化をモニタすることにより、配列の正確な種類に特有の情報を得ることができる。例えば、温度の場合には、加熱の結果として試料中の配列からプローブが分離する温度を求めることができる。これは、全般的な診断において多型性及び/又は対立遺伝子変化を、例えば、検出、所望される場合には定量するするのに非常に有効であり得る。“多型性”とは、配列に、特に本来起こることができる転位、転換、挿入、欠失又は逆位が含まれる。
融解のヒステリシスは、標的配列が唯一の塩基対によって変化する場合には異なる。従って、例えば、試料が単一の対立遺伝子変異体だけを含む場合、プローブ領域の融解温度は他の唯一の対立遺伝子変異体を含む試料中に見られるものと異なる。双方の対立遺伝子変異体を含む試料は、対立遺伝子変異体のそれぞれに対応する２つの融点を示す。
従って、本発明の他の実施態様においては、多型性及び/又は対立遺伝子変異を検出する方法は、前記多型性又は変異を含むことが疑われる配列を本発明の方法を用いて増幅するステップと、該プローブ領域が該増幅産物内のその相補的配列から融解する温度を生成した該蛍光シグナルを用いて測定するステップと、それを多型性又は対立遺伝子変異の存在に関係づけるステップとを含んでいる。
【００１７】
同様の問題は、電気化学的性質についても、ある種の酵素又は化学剤の存在するときにも適用される。標識したプローブは、電気化学電位を印加することができる固体表面上に固定化することができる。標的配列の下流は、配列の正確な種類によっては具体的な電気化学値においてプローブに結合するか又はプローブから再瞬間標識される。
更に、プローブハイブリダイゼーションの速度論は、標的配列濃度を絶対的な事項で定量することを可能にする。試料からの蛍光の変化は、試料に対するプローブ領域のハイブリダイゼーション率を計算することを可能にすることができる。ハイブリダイゼーション率の増加は、試料中に存在する標的配列の量に関係する。増幅反応が進行するにつれて標的配列の濃度が増大するので、プローブ領域のハイブリダイゼーションは更に急速に起こる。従って、このパラメータは定量化の基準として用いることができる。このデータ処理の方式は、情報を与えるためにシグナルの強さに直接依存しないという点で有効である。
本発明の他の実施態様においては、本発明の方法において用いられるキットであって、標的配列に特異的なプローブに化学結合によって5' 端に結合される増幅プライマーを含み、該プローブが供与標識と受容標識のどちらか一方として作用することができる第一標識を含む試薬と、第二標識が供与標識と受容標識のどちらか一方として作用することができる第二標識を含んでいるDNA挿入剤とを含み、該第一標識と第二標識が供与体‐受容体対を形成する、前記キットである。
所望される場合には、プローブはビーズ、例えば、磁気ビーズのような支持体、又は消散波検出装置の導波管のような検出器に用いられる支持体に固定化することができる。キットの他の潜在的成分には、DNAポリメラーゼのような増幅反応に用いられる試薬が含まれる。
非蛍光受容体分子の使用は、同時係属特許出願第PCT/GB99/0504号に記載される分析に用いることができる。
ここで、添付の概略図を参照する実施例によって本発明を特に記載する。
【００１８】
図１は、本発明の方法で行われる分子相互作用を示す概略図である。示される増幅反応において、DNA分子(１)は増幅プライマー対(２)、(３)と接触させることにより増幅用に調製される。プライマーの１つ(２)は、化学結合(８)によって受容標識(７)を含むプローブ(６)に結合する。蛍光供与部分(10)は、反応混合物中に供給される。
DNA分子(１)を一本鎖にし(図１Ｂ)、プライマー(２、３)は周知の増幅反応においてそれぞれ前進プライマーと逆向きプライマーとして結合する。
次の増幅反応の過程で、アンプリコン産物(９)が構築される(図１Ｃ)。
この産物が次の増幅相で融解する場合、受容標識(７)を含むプローブ領域(６)はアンプリコン鎖の中の相補的領域を結合する(図１Ｄ)。インターカレーター部分(10)はプローブと産物の間に入り込む。蛍光インターカレーター部分(10)と受容標識(７)との間のFRET相互作用は、受容体に特有の波長でシグナルを生成する。
次に、受容体分子(７)からのシグナルを従来の蛍光検出装置を用いてモニタすることができる。
当業者は、第二プライマー(３)の使用が本発明に必須でないことを理解する。更に、当業者は、プローブ上の標識が供与標識であってもよく、インターカレーター部分が受容標識であってもよいことを理解する。
【００１９】
PCR増幅反応
PCR反応混合物は使用濃度が調製された次の試薬を含有した。
組成は、50 mM Trizma pＨ8.8、25℃、3 mM 塩化マグネシウム、8% w/vグリセロール、250 ng/μl 非アセチル化ウシ血清アルブミン、200μM dNTPのPCRヌクレオチド、0.01単位/μl ウラシル-n-グルコシラーゼ、0.04単位/μl Taq(エキソ5' -3' 欠失)DNAポリメラーゼ、0.03μM TaqStart抗Taq抗体とした。
Taq DNAポリメラーゼとTaqStart抗Taq抗体を、混合物に添加する前に10分間共にインキュベートした。
SYBRGoldを反応中の蛍光供与標識として基準溶液１：20,000〜１：200,000希釈液の最終濃度まで含めた。
反応の過程で試薬が加水分解しないことを確実にするためにTaq DNAポリメラーゼを用いた。本発明の方法に用いられる保持時間が非常に短いことからこのポリメラーゼの使用は必要ないことがわかった。
【００２０】
標的鋳型
数種の標的鋳型と関連がある遺伝子を調べた。これらを次に示す。
標的鋳型                            遺伝子
ヒト胎盤DNA                         ABIヒトβアクチンアンプリコン
ダイズ                              Lelレクチン
遺伝的に修飾されたダイズ            CP4 EPSPS
髄膜炎菌                            porA
トラコーマ・クラミジア              Ctプラスミド
プローブとプライマーを含む新規な外注オリゴヌクレオチド試薬を各標的遺伝子に対して調製した。各試薬は一般構造: FL  PROBE  HEG  PRIMERをもち、ここで、FLは蛍光部分であり、PROBEはプローブ配列であり、HEGはHEG(ヘキサエチレングリコール)であり、PRIMERは適切な標的配列に対してハイブリダイズするプライマー配列である。試薬はOswel Research Products Ltd.英国から入手できる。本発明の方法に用いるのに適した同じ一般構造を有する試薬は、国際出願第01/11078号の教示に従って調製することができる。
各遺伝子に対応する試薬の構造を次に示す。
遺伝子試薬構造
2004532044.tif 000004
【００２１】
検出される遺伝子配列の濃度は、所望されるように変えた。試薬の最終濃度は0.2μMであった。
本発明の方法の性能を、類似のTaqman(登録商標)分析を用いた実験と国際出願第99/28500号の実験を繰り返すことにより従来技術の方法と比較した。
ダーマルサイクラーリアルタイムPCR装置と消耗品をRocheから入手した。装置を従来の方法を用いて調整した。個々の産物とSYBRGoldによる色調整プログラムを行うことは非常に有益であることがわかった。Cy5による色調整プログラムを行うことも有益であることがわかった。
熱サイクルプロトコル：
本発明と国際出願第99/28500号の場合：
キャリオーバーを防止するために50℃で１分間保持した。
初期変性のために95℃で１分間保持した。
(95℃、5秒間；60℃、5秒間；74℃、5秒間；5秒間エクステンション、蛍光を集める)を50サイクル。
Taqman(登録商標)分析の場合：
キャリオーバーを防止するために50℃で１分間保持した。
初期変性のために95℃で１分間保持した。
(95℃、5秒間；60℃、20〜120秒間；ステップの終わりに蛍光を集める)を50サイクル。
これにより、本発明の方法が従来技術のTaqman(登録商標)分析を用いるよりかなり速いことがわかる。
サーマルサイクラーPCR装置は３つの検出器を用い、F1、F2、F3と示される。F1は、SYBRGoldとフルオレセインの発光を検出するように最適化された520 nmで作動する。F2はLC640で生成するシグナルを検出するように最適化された640 nmで作動する。F3は、LC705で検出するように最適化された705 nmで作動する。
SYBRGold挿入色素によって生成する非鎖特異的増幅シグナルを検出するためにF1(520 nm/フルオレセイン)光学検波器を用いた。プローブのCy5部分によって生成するシグナルを用いて個々の産物の増幅を検出するためにF3(705 nm/LC705色素)光学検波器を用いた。プローブシステムは、オリゴヌクレオチド合成中に取り込まれた色素の収量を良くするためにLC705の代りにCy5を用いた。
【００２２】
実施例１- βアクチン遺伝子の検出と定量化
図２は、本発明の方法を用いて種々の濃度のヒトDNAとしてのβアクチン系に対するサイクル数の関数としてF3検出器で測定した蛍光を示すグラフである。各組のデータは、試料中のDNAの濃度によって、ある数のサイクルに対して低レベルのバックグラウンド応答を示している。各組のデータの中で、試料中のヒトDNA濃度によってはあるサイクル数で実測蛍光が劇的に増加している。蛍光は、プライマーの下流で増幅産物に結合する試薬のプローブ部分によって生じる。この結合プロセスによって、Cy5部分がSYBRGold化学種に近接する。SYBRGold化学種は、蛍光を受け、放出された光はCy5部分によって吸収される。次にCy5自体が光を出し、F3検出器によって検出される。サイクル数が更に増加するにつれて、蛍光は最大に達し、徐々に低下する。これは、プローブ部分が増幅産物によって置きかえられるためであると思われる(化学を報告している二重ハイブプローブにも見られる“フック効果”としばしば呼ばれる)。
図２Ａのデータセットの分析により、図２Ｂに示される定量化曲線が得られる。曲線の相関係数はほぼ1.0であり、本発明の方法が核酸配列の定量化と同定に優れていることがわかる。
図３は、βアクチン遺伝子について国際出願第99/28500号の分析を用いて得られる比較データを示すグラフである。図３Ａは、DNAの濃度の関数としてのβアクチン系に対するサイクル数の関数として測定蛍光を示す図である。従来技術のシステムから得られたデータは、本発明の方法から得られたものよりノイズが多い。更に、本発明の方法をに用いた応答勾配の方が尖っており、本発明の方法を用いたサイクル閾値の方がわずかに低い。
図４は、従来方法に従ってTaqman(登録商標)分析を用いて得られた比較データを示すグラフである。応答曲線は、本発明と比べて相対的に低い。更に、Taqman(登録商標)方法は、本発明に比べて非常にゆっくりである。
【００２３】
実施例２- porA遺伝子の同定と定量化
図５は、本発明の方法を用いて種々の濃度のヒトDNAとしての髄膜炎系に対するサイクル数の関数としてF3検出器で測定した蛍光を示す図である。データは、構造配列番号５の試薬を用いている。各組のデータは、試料中のDNA濃度によるあるサイクル数に対して低レベルのバックグラウンド応答を示している。それぞれの組のデータの中で、試料中のヒトDNAの濃度に依存するあるサイクル数では実測蛍光が劇的に増大している。
図６は、porA遺伝子について国際出願第99/28500号の分析を用いて得られた比較データを示すグラフである。
図７は、従来技術のTaqman(登録商標)方法を用いて得られた比較データを示すグラフである。また、応答曲線は、本発明に比べて相対的に低い。更に、Taqman(登録商標)方法は、本発明に比べて非常にゆっくりである。Taqman(登録商標)応答曲線は、ノイズが多く、そのようなデータから作成された定量曲線は、本発明の方法より相関係数が低い。
【００２４】
実施例３- Ctプラスミド遺伝子の同定と定量化
図８は、本発明の方法を用いて種々の濃度のヒトDNAとしてのクラミジア系に対するサイクル数の関数としてF3検出器で測定した蛍光を示すグラフである。各組のデータは、試料中のDNAの濃度によってはあるサイクル数に対して低レベルのバックグラウンド応答を示す。それぞれの組のデータの中で、試料中のヒトDNA濃度に依存するあるサイクル数で実測蛍光が劇的に増大する。
図９は、従来技術のTaqman(登録商標)方法を用いて得られた比較データを示すグラフである。また、応答曲線は、本発明に比べて相対的に低い。更に、Taqman(登録商標)方法は、本発明に比べて非常にゆっくりである。
【００２５】
実施例４- CP4 EPSPS遺伝子の同定と定量化
図10は、本発明の方法を用いて種々の濃度の修飾遺伝子としての遺伝的に修飾したダイズ系に対するサイクル数の関数としてF3検出器で測定した蛍光を示す図である。図は、また、種々の濃度の修飾遺伝子に対するサイクル数の関数としてレクト系で生成した蛍光を示すグラフである。それぞれの組のデータの中で、試料中の関連した遺伝子の濃度に依存するあるサイクル数で実測蛍光が劇的に増大する。レクト系は対照として効果的に作用し、予想されるように蛍光とサイクル数応答曲線は、修飾した遺伝子の濃度とほとんど無関係である。修飾した遺伝子系の場合には、修飾した遺伝子の濃度の増大が蛍光が劇的に増強するサイクル数での低下が生じることがわかる。
図11は、従来技術のTaqman(登録商標)方法を用いて得られた比較データを示すグラフである。また、応答曲線は、本発明と比べて相対的に低い。更に、Taqman(登録商標)方法は、本発明に比べて非常にゆっくりである。
ほとんどすべての状況において、従来技術のTaqman(登録商標)方法を用いて得られたデータは、本発明の方法を用いて得られたものよりノイズが多い。更に、応答曲線は本発明より低く、本発明の方法を用いて得られたデータから作成された定量化曲線はTaqman(登録商標)方法から得られたものより相関係数が大きい。
本発明は、また、潜在的に非常に高速である方法を提供する。本発明の方法に示されるデータは、可能な最も速い操作方式での機器化を用いて得られた。相対的に短いプローブの長さが高速応答を生じるのを援助すると思われる。従って、本方法が行われる装置の現在の仕様書によって本方法の速度が制限されることは予想される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の方法で行われる分子相互作用を示す概略図である。
【図２】種々の濃度のヒトDNAとしてのβアクチン系に対するサイクル数の関数としてF3検出器で本発明の方法に従って測定した蛍光を示すグラフである。
【図３】種々の濃度のヒトDNAとしてのβアクチン系に対するサイクル数の関数として従来技術の比較法に従ってF3検出器で測定した蛍光を示すグラフである。
【図４】種々の濃度のヒトDNAとしてのβアクチン系に対するサイクル数の関数として従来技術のTaqman(登録商標)法を用いてF1検出器で測定した蛍光を示すグラフである。
【図５】種々の濃度の髄膜炎遺伝子としての髄膜炎系に対するサイクル数の関数としてF3検出器で本発明の方法に従って測定した蛍光を示すグラフである。
【図６】種々の濃度の髄膜炎遺伝子としての髄膜炎系に対するサイクル数の関数としてF3検出器で従来技術の比較法に従って測定した蛍光を示す図である。
【図７】種々の濃度の髄膜炎遺伝子としての髄膜炎系に対するサイクル数の関数としてF1検出器で従来技術のTaqman(登録商標)法を用いて測定した蛍光を示す図である。
【図８】種々の濃度のクラミジア遺伝子としてのクラミジア系に対するサイクル数の関数としてF3検出器で本発明の方法に従って測定した蛍光を示す図である。
【図９】種々の濃度のクラミジア遺伝子としてのクラジミア系に対するサイクル数の関数としてF1検出器で従来技術のTaqman(登録商標)法を用いて測定した蛍光を示す図である。
【図１０】種々の濃度の修飾遺伝子としての遺伝的に修飾したダイズ系のサイクル数の関数としてF3検出器で本発明の方法に従って測定した蛍光を示す図である。
【図１１】種々の濃度の修飾遺伝子としてのGMダイズ系に対するサイクル数の関数としてF1検出器で従来技術のTaqman(登録商標)法を用いて測定した蛍光を示す図である。
【図２Ａ】
2004532044.tif 000005
【図２Ｂ】
2004532044.tif 000006
【図３Ａ】
2004532044.tif 000007
【図３Ｂ】
2004532044.tif 000008
【図４】
2004532044.tif 000009
【図５】
2004532044.tif 000010
【図６】
2004532044.tif 000011
【図７】
2004532044.tif 000012
【図８】
2004532044.tif 000013
【図９】
2004532044.tif 000014
【図１０】
2004532044.tif 000015
【図１１】
2004532044.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004532044.tif 000017
2004532044.tif 000018
2004532044.tif 000019
2004532044.tif 000020
2004532044.tif 000021
2004532044.tif 000022
2004532044.tif 000023
2004532044.tif 000024
2004532044.tif 000025
2004532044.tif 000026
2004532044.tif 000027
2004532044.tif 000028
2004532044.tif 000029
2004532044.tif 000030
2004532044.tif 000031
2004532044.tif 000032
2004532044.tif 000033
2004532044.tif 000034
2004532044.tif 000035
2004532044.tif 000036
2004532044.tif 000037
2004532044.tif 000038
2004532044.tif 000039
2004532044.tif 000040
2004532044.tif 000041
2004532044.tif 000042
2004532044.tif 000043
2004532044.tif 000044
2004532044.tif 000045
2004532044.tif 000046
2004532044.tif 000047
2004532044.tif 000048
2004532044.tif 000049
2004532044.tif 000050
2004532044.tif 000051
2004532044.tif 000052
2004532044.tif 000053
2004532044.tif 000054
2004532044.tif 000055
2004532044.tif 000056
2004532044.tif 000057
2004532044.tif 000058
2004532044.tif 000059
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532044.tif 000060
2004532044.tif 000061
【国際調査報告】
2004532044.tif 000062
2004532044.tif 000063
2004532044.tif 000064
2004532044.tif 000065