(57)【要約】本発明は、ストレプトミセス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）の培養によって得られるシトルリマイシンと称される化合物およびその製薬上許容され得る塩に関する。本発明はさらに、前記シトルリマイシンの製造方法、微生物ストレプトミセス菌種ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）、並びに医薬としてのシトルリマイシンおよび医薬的に許容されるその塩の使用、特にニューロテンシンレセプターの抑制物質としてのそれらの使用、並びにシトルリマイシンまたはその製薬上許容され得る塩を含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉ
【化１】
2004510758.tif 000011
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ別個に１〜６個の炭素原子を有するアルキル残基である］
の化合物、その生理学的に許容され得る塩および誘導体、並びにそれらの全ての立体異性体および互変異性体。
【請求項２】
Ｒ１〜Ｒ４の１つ、２つ、３つまたは全部がブチル残基である請求項１に記載の式Ｉの化合物、その生理学的に許容され得る塩および誘導体、並びにそれらの全ての立体異性体および互変異性体。
【請求項３】
Ｒ１〜Ｒ４が３つのブチル残基および１つのプロピル残基から成る請求項１または２に記載の式Ｉの化合物、その生理学的に許容され得る塩および誘導体、並びにそれらの全ての立体異性体および互変異性体。
【請求項４】
Ｒ１〜Ｒ４が、２つのブチルおよび２つのプロピル残基、または１つのブチル、１つのペンチル、１つのエチルおよび１つのプロピル残基を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、その生理学的に許容され得る塩および誘導体、並びにそれらの全ての立体異性体および互変異性体。
【請求項５】
Ｒ１〜Ｒ４が、４つのブチル残基、または２つのブチル、１つのプロピルおよび１つのペンチル残基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、その生理学的に許容され得る塩および誘導体、並びにそれらの全ての立体異性体および互変異性体。
【請求項６】
２つまたは３つ以上の異性体の混合物を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項７】
ストレプトミセス菌種、ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）またはその変種もしくは変異体の１つを、炭素および窒素源を含む栄養媒体中で好気的条件下で培養し、慣用の方法で１つまたは２つ以上の標的化合物を単離および精製し、さらに適当な場合には、生理学的に許容され得る塩または誘導体に変換することによって得られる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、その生理学的に許容され得る塩および誘導体、並びにそれらの全ての立体異性体および互変異性体。
【請求項８】
ストレプトミセス菌種、ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）またはその変種もしくは変異体の１つを、炭素および窒素源を含む栄養媒体中で好気的条件下で培養し、慣用の方法で１つまたは２つ以上の標的化合物を単離および精製し、さらに適当な場合には、生理学的に許容され得る塩または誘導体に変換することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物、その塩および同等物、並びにそれらの全ての立体異性形態および互変異性体。
【請求項９】
培養が２０〜３５℃の温度および５〜８のｐＨで実施される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
医薬として使用される請求項１〜６のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその生理学的に許容され得る塩もしくは誘導体。
【請求項１１】
ニューロテンシンレセプターの抑制物質として使用される請求項１〜６のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその生理学的に許容され得る塩もしくは誘導体。
【請求項１２】
精神分裂病、パーキンソン病またはアルツハイマー病の治療用医薬の製造を目的とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその生理学的に許容され得る塩の使用。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその製薬上許容され得る塩もしくは誘導体の有効量および製薬上許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの式Ｉの化合物またはその生理学的に許容され得る塩を適当な賦形剤および／または担体と一緒にして適当な剤形に変換することからなる、請求項１３に記載の医薬の製造方法。
【請求項１５】
ストレプトミセス菌種ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ストレプトミセス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｓｐ．）ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）の培養によって得られる新規な活性化合物（シトルリマイシン）並びにそれらの製薬上許容され得る塩および誘導体に関する。本発明はさらに、前記シトルリマイシンの製造方法、前記ストレプトミセス菌種ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）、医薬としての前記シトルリマイシンの使用、特にニューロテンシンレセプターに対して親和性を有する物質としての使用、およびシトルリマイシン含有医薬に関する。
【０００２】
【従来技術】
ニューロテンシンは、脳および胃腸の１３アミノ酸ホルモンペプチドであり、中枢神経系および末梢系の両方において、中枢系神経伝達物質または神経調節物質として多様な生理学的活性の制御に必要とされる。ニューロテンシンは、末梢器官および中枢器官のいくつかの組織および細胞株で性状が特定された固有のレセプターとの相互作用を介して多くの機能を果たす。ニューロテンシンに関する研究は、精神分裂病、パーキンソン病およびアルツハイマー病におけるそれらの中心的役割を示唆している。ニューロテンシンレセプターに対して親和性を有する化合物は、したがって前記疾患の治療薬として有用である可能性がある。
【０００３】
今や、微生物、ストレプトミセス菌種ＳＴ１０１３９６、ＤＳＭ１３３０９株が、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞膜で発現されるヒトのニューロテンシンレセプタータンパク質を抑制する新規な活性物質を生成することができることが判明した。
本発明はしたがって、ストレプトミセス菌種ＤＳＭ１３３０９株によって生成される活性物質（シトルリマイシン）、並びにその生理学的に許容され得る塩、エステル、エーテルおよび他の明白な化学的同等物に関する。
【０００４】
本発明はしたがって下記式Ｉの化合物、並びに生理学的に許容され得るその塩および誘導体、例えばエステル、エーテルおよび他の明白な化学的同等物（全ての立体異性形態および互変異性形態を含む）に関する。
【０００５】
【化２】
2004510758.tif 000002
上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ別個に１〜６個、好ましくは２〜５個の炭素原子を有するアルキル残基である。
【０００６】
前記式Ｉの化合物のアルキル残基は直鎖でも分枝鎖でもよい。
アルキル残基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルおよびネオペンチルである。
【０００７】
本発明はさらに以下の化合物に関する：
１）上記式Ｉの化合物で、式中、残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つが直鎖または分枝鎖プロピル残基で、前記残基の残りが直鎖または分枝鎖ブチル残基であるもの（＝シトルリマイシンＡ：分子式Ｃ４１Ｈ７５Ｎ３Ｏ１１，ＭＷ：７８５）並びにその生理学的に許容され得る塩および誘導体。
【０００８】
２）上記式Ｉの化合物で、式中、
（ａ）残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の２つが直鎖または分枝鎖ブチル残基で、前記残基の２つが直鎖または分枝鎖プロピル残基であるもの；または
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が任意の順序で１つのブチル、１つのペンチル、１つのエチルおよび１つのプロピル残基で、前記残基が直鎖または分枝鎖のどちらかであるもの（＝シトルリマイシンＢ：分子式Ｃ４０Ｈ７３Ｎ３Ｏ１１，ＭＷ：７７１）並びにその生理学的に許容され得る塩および誘導体。
【０００９】
３）上記式Ｉの化合物で、式中、
（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が直鎖または分枝鎖ブチル残基であるもの；または
（ｂ）残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の２つが直鎖または分枝鎖ブチル残基で、１つが直鎖または分枝鎖プロピル残基で、さらに１つが直鎖または分枝鎖ペンチル残基であるもの（＝シトルリマイシンＣ：分子式Ｃ４２Ｈ７７Ｎ３Ｏ１１，ＭＷ：７９９）並びにその生理学的に許容され得る塩および誘導体。
【００１０】
もちろんのこと、式Ｉの化合物は、構造異性および立体異性を含む種々の異性体構造で存在できることは理解されよう。さらにまた本発明は、種々のそれらの構造異性および立体異性構造の各々において、個々の異性体としておよび異性体の混合物として存在する式Ｉの化合物も包含することも理解されよう。
【００１１】
本発明のシトルリマイシンＡからＣは、一般に異性体の混合物として単離される。シトルリマイシンＡに関しては、例えば単離されたサンプルは２つまたは３つ以上の以下の異性体を含むことができる：
異性体１：Ｒ１、Ｒ２およびＲ４＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｒ３＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３；
異性体２：Ｒ１、Ｒ２およびＲ３＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｒ４＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３；
異性体３：Ｒ１、Ｒ３およびＲ４＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｒ２＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３；
異性体４：Ｒ１＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４＝−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３。
【００１２】
シトルリマイシンＡの異性体は、単離された混合物中で任意の比率で存在することができる。
シトルリマイシンＡ−Ｃは、１つまたは２つ以上の物理化学的特性およびスペクトル特性のいずれか（例えば質量分析または１ＨＮＭＲおよび１３ＣＮＭＲ分光分析データ）によって特徴を示すことができる（下記表１および２を参照されたい）。
【００１３】
式Ｉの化合物は、配列の中央にシトルリン分子が取り込まれた４つのβ−ヒドロキシ酸と表現することができる。シトルリマイシンＡ−Ｃは前記β−ヒドロキシ酸のアルキル鎖の長さが異なる。式Ｉの化合物は、微生物ストレプトミセス菌種ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）を培養することにより得ることができる。前記微生物は Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ ＤＳＭＺ）に２０００年２月１４日に寄託され、受託番号ＤＳＭ１３３０９を得た。
【００１４】
したがって本発明はさらに、前記式Ｉの化合物の製造方法を提供し、本方法は、微生物ストレプトミセス菌種ＤＳＭ１３３０９、その変異体および変種を、１つまたは２つ以上の炭素源および１つまたは２つ以上の窒素源、並びに場合によって栄養性無機塩および／または微量元素を含む栄養媒体中で好気的条件下で培養し、続いて慣習的態様で前記化合物を単離および精製することを含む。
【００１５】
前記栄養媒体は、好ましくは炭素源、窒素源および栄養性無機塩供給源を含む。前記炭素源は、例えば澱粉、グルコース、シュクロース、デキストリン、フルクトース、糖蜜、グリセロール、ラクトースまたはガラクトースで、好ましくはグルコースである。窒素源は、例えばダイズミール、ピーナッツミール、酵母エキス、ビーフエキス、ペプトン、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、ゼラチンまたはカザミノ酸で、好ましくはダイズミールである。栄養性無機塩は、例えばリン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは硫酸マグネシウムで、好ましくは炭酸カルシウムおよび塩化コバルト（ＩＩ）である。
【００１６】
ＤＳＭ１３３０９株の培養は、２０〜３５℃の温度および５．０〜８．０のｐＨで実施することができる。好ましくはＤＳＭ１３３０９株は、２７℃（±１℃）およびｐＨ６．８〜７．０で培養される。
【００１７】
ＤＳＭ１３３０９株の培養は好ましくは４８〜２４０時間実施し、そのとき本発明のシトルリマイシンの最適収量が得られる。特に、サブマージ条件で（例えば振盪フラスコの他に実験室用発酵装置で）、６０〜１２０時間発酵させることによって培養を実施するのが好ましい。発酵の進行およびシトルリマイシンの生成は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはＬＣ−ＭＳによって、さらに培養ブロスの生物活性の測定によって検出することができる。得られた培養ブロスのろ液だけでなく菌糸体中にもシトルリマイシンが存在する。シトルリマイシンは、公知の分離技術を用いて単離できる。したがってシトルリマイシンは、水に非混和性溶媒（例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはブタノール）を用いてｐＨ３〜８で抽出するか、またはポリマー樹脂（例えば“Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ−２０（Ｒ）”または“ＭＣＩ（Ｒ） Ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ”（ミツビシケミカルインダストリーズ、日本）、“Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ（Ｒ）”（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， ＵＳＡ））、活性化木炭を用いる疎水性クロマトグラフィー、またはｐＨ３〜８のイオン交換クロマトグラフィーによって培養物から回収することができる。好ましい方法は、“ＭＣＩ（Ｒ） Ｇｅｉ ＣＨＰ−２０Ｐ”でのクロマトグラフィーである。活性物質はまた、水に混和性溶媒（例えばメタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノールまたはイソプロパノール）または水に非混和性溶媒（例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはブタノール）を用いてｐＨ３〜８で抽出することによって菌糸体からも回収できる。好ましい方法はメタノールによる抽出である。抽出物の濃縮および凍結乾燥によって活性な粗物質が得られる。
【００１８】
本発明のシトルリマイシンは、例えば以下のようにして粗物質から回収できる：
以下の技術のいずれかを用いる分画によって回収する：通常相クロマトグラフィー（定常相としてアルミナまたはシリカゲルを用い、溶離液として例えば石油エーテル、酢酸エチル、塩化メチレン、アセトン、クロロホルム、メタノールまたはその組合せを用い、さらにアミン（例えばＮＥｔ３）が添加される）；逆相クロマトグラフィー（逆相シリカゲル（例えばジメチルオクタデシルシリルシリカゲル（ＲＰ−１８とも称される）またはジメチルオクチルシリルシリカゲル（ＲＰ−８とも称される）を定常相として用い、溶離液として例えば水、緩衝液（すなわちリン酸、酢酸、クエン酸（ｐＨ２〜８））および有機溶媒（例えばメタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフランまたはそれら溶媒の組合せ）を用いる）；ゲル浸透クロマトグラフィー（例えば （Ｒ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｓｗｅｅｄｅｎ）、ＴＳＫｇｅｌ （Ｒ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ（ＴｏｓｏＨａａｓ， Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｊａｐａｎ）のような樹脂を、例えばメタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチルまたはそれらの混合物中で用いるか、または （Ｒ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０ および Ｇ−２５ を水の中で用いる）；反流クロマトグラフィー（２つまたは３つ以上の溶媒（例えば水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、石油エーテル、ベンゼンおよびトルエン）で構成された二相溶離液系を用いる）。前記の技術は繰り返し用いるか、または異なる技術を組み合わせて用いることができる。好ましい方法は逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）上でのクロマトグラフィーである。
【００１９】
本発明の化合物の明白な化学的同等物（誘導体）とは、化学的にわずかに異なる化合物、換言すれば同じ作用をもつか、または穏やかな条件下で本発明の化合物に変換される化合物である。前記同等物には、例えば本発明の化合物のエステル、エーテル、複合体または付加物が含まれる。
本発明の化合物は製薬上許容され得る塩および誘導体に変換することができ、それらは全て本発明に包含される。前記塩および誘導体は当業者に公知の標準的な方法によって製造できる。
【００２０】
式Ｉの化合物の生理学的に許容され得る塩とは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ ｅｄ．， ｐ．１４１８ （１９８５））に記載されているとおり、その有機塩および無機塩の両方を指す。例えばナトリウム塩およびカリウム塩のような塩は、本発明の化合物を適当なナトリウム塩基またはカリウム塩基で処理することによって製造できる。
【００２１】
遊離カルボン酸のエステルは文献に記載されている方法、例えば、以下の文献（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｊ． Ｍａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２， ｐ３９５）に記載されているように、脱水剤（例えばデシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下でアルコールで処理することによって製造できる。
本発明の化合物のエステル基は、例えば下記文献に記載されているように、例えばＢＦ３−エテラート、ＬｉＡｌＨ４、ＬｉＢＨ４またはＮａＢＨ４で処理することによって還元してエーテル基にできる（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｊ． Ｍａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２， ｐ．１２１３）。アミド基はＬｉＡｌＨ４との反応により同じ方法で還元することができる。
【００２２】
本発明のシトルリマイシンは、ニューロテンシンレセプター結合アッセイでＨＥＫ細胞膜で発現されるヒトニューロテンシンレセプタータンパク質の抑制を示す。本アッセイでは、シトルリマイシンＡは１６μＭのＩＣ５０を示した。
【００２３】
本発明の化合物並びに医薬的に許容できるその塩および誘導体は、単独で、別の化合物との混合物の状態で、および非経口投与を可能にする医薬組成物の形状で、動物（好ましくは哺乳類、特にヒト）に投与することができる。したがって、本発明はまた、医薬として使用される、特にニューロテンシンレセプターに対して親和性を有するニューロテンシン拮抗薬として使用される上記公式の化合物並びにその製薬上許容され得る塩および誘導体に関する。本発明はさらに、有効量の１つまたは２つ以上の標的化合物および／またはその１つまたは２つ以上の製薬上許容され得る塩および／または１つまたは２つ以上の誘導体を製薬上許容され得る担体とともに含有する医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明の化合物は、経口的、筋肉内、静脈内または他の投与態様で投与することができる。前記化合物またはその製薬上許容され得る塩もしくは誘導体を、場合によって他の製薬上活性な物質とともに含有する医薬組成物は、前記活性化合物を１つまたは２つ以上の製薬上許容され得る補助剤および／または賦形剤とともに混合して製造することができる。続いて前記混合物を適当な医薬形態、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル、顆粒、粉薬、乳液、懸濁液または溶液に変換できる。
【００２５】
補助剤および／または賦形剤の例を挙げれば、充填剤、乳化剤、潤滑剤、消臭用香料、着色剤および緩衝用物質、トラガカント、ラクトース、タルク、寒天、ポリグリコール、エタノールおよび水である。経口投与に適した好ましい組成物は、水に懸濁されたものまたは水溶液である。活性物質を例えば賦形剤または希釈剤を含まずに適当な形態、例えばカプセルとして投与することもまた可能である。
【００２６】
本発明はまた医薬の製造方法に関し、前記方法は、本発明の化合物の少なくとも１つを医薬として適当で生理学的に許容され得る担体、および適当な場合にはさらに適切な活性物質、添加剤または賦形剤とともに適当な剤形に変換することを含む。
個々の事例に適した調剤および投与方法は投与量の幅とともに、通常のとおり、処置される動物種、および個々の症状または疾患に応じて変動し、当業者に公知の方法を用いて最適化することができる。
【００２７】
【実施例】
以下は本発明の実施例であり、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１：産生株、ストレプトミセス菌種ＳＴ１０１３９６、ＤＳＭ１３３０９株の維持
維持培地の組成
産生株ＤＳＭ１３３０９は以下の培地で維持した：
麦芽エキス　　　　　　　　１０．０ｇ
グルコース　　　　　　　　　４．０ｇ
酵母エキス　　　　　　　　　４．０ｇ
寒天粉末　　　　　　　　　１５．０ｇ
脱イオン水　　　　　　　　　１リットル
ｐＨ　　　　　　　　　　　７．０−７．５
加熱によって前記成分を完全に溶解させた後、得られた溶液を試験管に分注し、１２１℃で２０分滅菌した。前記試験管を冷却し、傾斜位で固化させた。ワイヤループで寒天斜面にストレプトミセス菌種ＳＴ１０１３９６（ＤＳＭ１３３０９）の増殖物を画線し、良好な増殖が得られるまで２８℃（±１℃）でインキュベートした。良好に増殖した培養を冷蔵庫で＋８℃で保存した。
【００２８】
グリセロール使用シードの調製
培地の組成
酵母エキス　　　　　　　　　　４ｇ
可溶性澱粉　　　　　　　　　１５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４　　　　　　　　 　　１ｇ
ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ　　　　 　　０．５ｇ
脱イオン水　　　　　　　　　　１リットル
ｐＨ　　　　　　　　　　　　　７．０
上記の培養液を３００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬ量で分注し、１２１℃で２０分オートクレーブした。フラスコを室温に冷却し、上記の寒天斜面培養物を接種した。インキュベーションは、２８℃で５日間、回転振盪培養機で１８０ｒｐｍで実施した。前記の培養物の１．５ｍＬを１．５ｍＬのグリセロール（９９％）と混合して−２０℃で保存した。
【００２９】
実施例２：ストレプトミセス菌種ＳＴ１０１３９６、ＤＳＭ１３３０９株の振盪フラスコでの発酵
シード培地の組成
グルコース　　　　　　　　　２０ｇ
ダイズミール　　　　　　　　１０ｇ
ＣａＣＯ３　　　　　　　　　　 ０．０２ｇ
ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ　　　　　　０．００１ｇ
脱イオン水　　　　　　　　　　１リットル
ｐＨ　　　　　　　　　　　　６．８−７．０
上記の培地を５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬ量で分注し、２０分オートクレーブした。フラスコを室温に冷却し、各フラスコに上記の実施例１の良好に増殖した培養の１白金耳を接種し、７２時間２７℃（±１℃）で、回転振盪培養機で２４０ｒｐｍで振盪してシード培養物を得た。
【００３０】
生産培地の組成
グルコース　　　　　　　　　２０ｇ
ダイズミール　　　　　　　　１０ｇ
ＣａＣＯ３　　　　　　　　　 　０．０２ｇ
ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ　　　　　　０．００１ｇ
脱イオン水　　　　　　　　　　１リットル
ｐＨ　　　　　　　　　　　　６．８−７．０
上記の生産培地を５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬ量で分注し、１２１℃で２０分オートクレーブした。フラスコを室温に冷却し、上記のシード培地培養物を接種した（２％ｖ／ｖ）。発酵は、７２時間２７℃（±１℃）で、回転振盪培養機で２４０ｒｐｍで実施した。抑制物質シトルリマイシンＡ−Ｃの産生はその生物活性の検査により決定した。
【００３１】
実施例３：シトルリマイシンＡ−Ｃの単離および精製
培養ブロス（３リットル）を採集して凍結乾燥した。前記凍結乾燥生成物をメタノール（３リットル）で抽出し、活性抽出物をプールし、減圧下で濃縮し、さらに凍結乾燥して２５ｇの粗物質を得た。前記粗物質を調製用ＨＰＬＣで以下の条件を用いて精製した。
カラム：ＭＣＩ（登録商標）ＧｅｌＣＨＰ−２０Ｐ（６００×４０ｍｍ；Ｋｒｏｎｌａｂ）
溶離液：Ａ）水　　Ｂ）メタノール
2004510758.tif 000003
流速：２０ｍｌ／分
検出：３５８ｎｍ
活性分画は７５分後に溶出した。プールした分画を減圧下で濃縮し凍結乾燥した。
【００３２】
最終的精製は調製用ＨＰＬＣで以下の条件を用いて実施した。
カラム：ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）１００−ＲＰ１８−ＡＢ（５μ、２５０×２１ｍｍ；Ｍａｃｈｅｒｅｙ ＆ Ｎａｇｅｌ）
溶離液：Ａ）水　　Ｂ）ＣＨ３ＣＮ
2004510758.tif 000004
流速：１０ｍｌ／分
検出：３６０ｎｍ
活性分画はＬＣ−ＭＳで分析した。シトルリマイシンＡ−Ｃ含有分画は８７分（Ａ）、９７分（Ｂ）および９８分（Ｃ）後に溶出した。プールした分画を減圧下で濃縮して凍結乾燥した。３Ｌ培養ブロスからの総収量は各物質について１ｍｇであった。
シトルリマイシンＡ−Ｃの物理化学的特性およびスペクトル特性は下記の表１および２に示す。
【００３３】
〔表１〕
外観：無色
溶解性：メタノール、ＤＭＳＯ
ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー、質量分析）：
カラム：プロスファー（Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ）ＳＴＡＲＲＰ．１８ｅ（Ｍｅｒｃｋ）
（３０×２ｍＭ、３μｍ）
溶離液：ＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭのＮＨ４Ａｃ（ｐＨ４．５）
2004510758.tif 000005
流速：０．２５ｍＬ／分
温度：４０℃
検出：２１０ｎｍ、２３０、２５０、３２０、４００（ＵＶ）；
１００−２０００ａｍｕ（ＭＳ）
【００３４】
シトルリマイシンＡ
保持時間：７．３分
ＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー）：
７８４．７ａｍｕ（Ｍ−Ｈ）−
ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ（高分解能高速原子衝撃法マススペクトロメトリー）：
７８６．５４６５３６（Ｃ４１Ｈ７６Ｎ３Ｏ１１に対する計算値：７８６．５４７９８６（Ｍ＋Ｈ）＋）
分子式：Ｃ４１Ｈ７５Ｎ３Ｏ１１
ＭＳｎ−実験：装置：フィンガン（Ｆｉｎｇａｎｎ）ＬＣＱ
５μＬ／分でサンプルを注射筒で注入
ＥＳＩ＋：
ＭＳ２：７８６ａｍｕ（Ｍ＋Ｈ＋）は７６９ａｍｕ（−ＮＨ３）を提供する。
ＭＳ３：７６９ａｍｕは７５１ａｍｕ（−Ｈ２Ｏ）を提供する
ＥＳＩ−：
ＭＳ２：７８４ａｍｕ（Ｍ−Ｈ）−は、６２４ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１６Ｏ３）、６１０ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１８Ｏ３）、４６８ａｍｕ（−Ｃ１７Ｈ３２Ｏ５）、４５４ａｍｕ（−Ｃ１８Ｈ３４Ｏ５）を提供し、６２４ａｍｕおよび６１０ａｍｕの生成物は２５対７５の比率で生成される。
ＭＳ３：６２４ａｍｕは、４６８ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供する。
ＭＳ３：６１０ａｍｕは、４６８ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１４Ｏ２）、４５４ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供する。生成物は３３対６６の比率で生成される。
ＭＳ３：４６８ａｍｕは、４２５ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）、３３０ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）、３１２ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）、２６９ａｍｕ（−Ｃ１０Ｈ１７Ｏ３）を提供する。
ＭＳ４：４２５ａｍｕは、２８７ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）、２６９ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供する。
ＭＳ４：３１２ａｍｕは、２６９ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）を提供する。
ＭＳ５：２６９ａｍｕは、２２５ａｍｕ（−ＣＯ２）、１３１ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ２）を提供する。
ＭＳ３：４５４ａｍｕは、４１１ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）、３３０ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１２Ｏ）、３１６ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）、３１２ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１４Ｏ２）、２９８ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供する。
ＭＳ４：４１１ａｍｕは、２８７ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１２Ｏ）、２７３ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）、２６９ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１４Ｏ２）、２５５ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供する。
ほんのわずかの質量のみが提供されている。ニュートラルロスのために提示した全ての式は理論に基づき、ＨＲ−ＭＳで実証されたものではない。
１ＨＮＭＲ：表２を参照されたい。
１３ＣＮＭＲ：表２を参照されたい。
【００３５】
シトルリマイシンＡの異性体１の構造
【化３】
2004510758.tif 000006
【００３６】
シトルリマイシンＢ
保持時間：７．１分
分子式：Ｃ４０Ｈ７３Ｎ３Ｏ１１
ＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化質量分析法）：７７０ａｍｕ（Ｍ−Ｈ）−
ＭＳｎ実験
ＥＳＩ−：
ＭＳ２：７７０ａｍｕ（Ｍ−Ｈ）−は、６１０ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１６Ｏ３）、５９６ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１８Ｏ３）、４６８ａｍｕ、４５４ａｍｕ、４４０ａｍｕを提供する。
６１０ａｍｕおよび５９６ａｍｕの生成物は１：１の比率で生成され、４６８ａｍｕ、４５４ａｍｕおよび４４０ａｍｕの生成物は１５：５８：２７の比率で生成される。
ＭＳ３：６１０ａｍｕは、４６８ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１４Ｏ２）、４５４ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）、４４０ａｍｕ（−Ｃ１０Ｈ１８Ｏ２）を提供する。生成物は２１：６２：１７の比率で生成される。
ＭＳ３：５９６ａｍｕは、４６８ａｍｕ（−Ｃ７Ｈ１２Ｏ２）、４５４ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１４Ｏ２）、４４０ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供し、比率は６：５１：４３である。
ＭＳ３：４６８ａｍｕは、４２５ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）、３３０ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）、３１２ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）、２９８ａｍｕ（−Ｃ１０Ｈ１８Ｏ２）を提供する。
ＭＳ３：４５４ａｍｕは、４１１ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）、３３０ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１２Ｏ）、３１６ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）、３１２ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１４Ｏ２）、２９８ａｍｕ　（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供する。
ＭＳ３：４４０ａｍｕは、３９７ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）、３１６ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１２Ｏ）、２９８ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１４Ｏ２）、２８４ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供する。
ＭＳ４：３１２ａｍｕは２６９ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）を提供する。
【００３７】
シトルリマイシンＢの構造（ＭＷ＝７７１ａｍｕを有する異性体の混合物）
【化４】
2004510758.tif 000007
【００３８】
シトルリマイシンＣ
保持時間：７．４分
分子式：Ｃ４２Ｈ７７Ｎ３Ｏ１１
ＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化質量分析法）：７９８ａｍｕ（Ｍ−Ｈ）−
ＭＳｎ実験
ＥＳＩ−：
ＭＳ２：７９８ａｍｕ（Ｍ−Ｈ）−は、６３８ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１６Ｏ３）、６２４ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１８Ｏ３）、６１０ａｍｕ（−Ｃ１０Ｈ２０Ｏ３）を提供する。生成物は５：９０：５の比率で生成される。
ＭＳ３：６２４ａｍｕは、４８２ａｍｕ（−Ｃ８Ｈ１４Ｏ２）、４６８ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）、４５４ａｍｕ（−Ｃ１０Ｈ１８Ｏ２）、４４０ａｍｕ（−Ｃ１１Ｈ２０Ｏ２）を提供する。比率は１．６：９６：２：０．４である。
ＭＳ４：４６８ａｍｕは、４２５ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）、３３０ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）、３１２ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）、２８７ａｍｕ（−Ｃ１０Ｈ１５Ｏ２Ｎ）、２６９ａｍｕ（−Ｃ１０Ｈ１７Ｏ３Ｎ）を提供する。
ＭＳ５：４２５ａｍｕは、２８７ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）、２６９ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１６Ｏ２）を提供する。
ＭＳ５：３１２ａｍｕは、２６９ａｍｕ（−ＨＮＣＯ）を提供する。
ＭＳ５：２６９ａｍｕは、２２５ａｍｕ（−ＣＯ２）、１３１ａｍｕ（−Ｃ９Ｈ１４Ｏ）を提供する。
【００３９】
シトルリマイシンＣの構造（ＭＷ＝７９９ａｍｕの異性体の混合物）
【化５】
2004510758.tif 000008
【００４０】
〔表２〕
３００ＫのＭｅＯＤにおけるシトルリマイシンＡの１Ｈおよび１３ＣＮＭＲの分光分析データａ）
2004510758.tif 000009
2004510758.tif 000010
ａ）　ＨＣＡ１およびＨＣＡ２のデータは相互に取り替えることができる。
ｂ）　割り当て不能。
【００４１】
実施例４：生物活性アッセイ
ＳＰＡ［３Ｈ］ニューロテンシンレセプター結合アッセイ
ニューロテンシンレセプターに対する親和性を有する化合物は、［３Ｈ］ニューロテンシンの結合を置換し、放射能シグナルの減少をもたらすであろう。ＳＰＡ方法の場合、ＰＶＴ・ＷＧＡ（コムギ麦芽凝集素）被覆ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ）に直接固定されたレセプターは放射能標識リガンドと結合するはずである。リガンド−レセプター複合体は十分に接近して保持され、ビーズを刺激して光を放射させることができる。未結合放射能標識リガンドはビーズから離れているのでエネルギーを伝達することができず、したがって検出されない。サンプルは、深底穴（ウェル）プレートでアッセイ緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭバシトラシンおよび０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）により予め１：５に希釈される。アッセイでの最終希釈は１：２０である。
【００４２】
９６ウェルのイソプレート（Ｗａｌｌａｃ）をスクリーニングに用いた。各ウェルに以下を加えた：５０μＬのサンプル、アッセイ緩衝液中の５０μＬの膜（最終濃度１６μｇ／ウェル）、５０μＬのＰＶＴ−ＶＧＡビーズ（最終濃度０．７５μｇ／ウェル）および５０μＬの４ｎＭ［３Ｈ］ニューロテンシン。プレートを密封し、シェーカー（１１００ｒｐｍ）上で室温で２時間インキュベートした。計測（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ， Ｗａｌｌａｃ）の前に、ビーズを少なくとも２０分沈澱させた。
【００４３】
各プレートでそれぞれ、サンプルを含まない４つのウェルを用いて全レセプターリガンド結合を決定し、１μＭの（Ｌ−α，γ−ジアミノブチル）ニューロテンシンを含む別の４つのウェルを非特異的結合の決定に用いた。抑制活性は以下のように表される。
［１−（サンプルｄｐｍ−非特異的ｄｐｍ）／（全結合ｄｐｍ−非特異的ｄｐｍ）］×１００（％）　シトルリマイシンの活性は１６〜３０μＭの範囲に存在する。シトルリマイシンＡのＩＣ５０は１６μＭであると決定された。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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