(57)【要約】本発明は、新規性のあるヒトのヴォン・ヴィレブランド／トロンビナーゼ様ポリペプチドに対応するポリペプチドおよび変異体または変異株でコード化された新規性のあるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供するものである。これらのポリヌクレオチドは、ヒトの胎児の脳から得たＤＮＡライブラリから分離された核酸配列（Ｈｙｓｅｑクローン認識番号１５２５８９２４）から構成されている。本発明のその他の特徴としては、新規性のあるヒトのフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドに特有な抗体の生成のプロセスを含むベクターが挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトヴォン・ヴィレブランド／トロンボスポンジン活性を有する単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番号２または３のヌクレオチド配列、転写されるタンパク質をコードするそれらの部分、成熟タンパク質をコードするそれらの部分、それらの細胞外部分、またはそれらの活性ドメインを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの補体にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、請求項１に記載のポリヌクレオチドと約９０％より高い配列同一性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＤＮＡ配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの補体を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作される、宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞であって、該宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列に作動可能に会合する請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された、宿主細胞。
【請求項１０】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号４〜７、転写されるタンパク質をコードするそれらの部分、成熟タンパク質をコードするそれらの部分、それらの細胞外部分、またはそれらの活性ドメインからなる群より選択されるアミノ酸、を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドおよびキャリアを含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１３】
サンプルにおいて請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する方法であって、該方法が以下：
ａ）該サンプルを、請求項１に記載のポリヌクレオチドに結合しそして複合体を形成する化合物と該複合体を形成するのに十分な期間接触させる工程；および
ｂ）該複合体を検出し、それで複合体が検出される場合、請求項１に記載のポリヌクレオチドが検出される工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
サンプルにおいて請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する方法であって、該方法が、以下：
ａ）該サンプルをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドにこのような条件下でアニーリングする核酸プライマーと接触させる工程；
ｂ）少なくとも請求項１に記載のポリヌクレオチドの１部分を含む産物を増幅する工程；および
ｃ）概産物を検出し、そしてそれにより該サンプルにおける請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで前記ポリヌクレオチドが請求項１０に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡ分子であり、そして該方法がアニーリングされたＲＮＡ分子をｃＤＮＡポリヌクレオチドに逆転写する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１６】
サンプルにおいて請求項１０に記載のポリペプチドを検出する方法であって、該方法が以下：
ａ）該サンプルを、該ポリペプチドに結合しそして該ポリペプチドと複合体を形成する化合物と、該複合体を形成するのに十分な条件下でおよび期間で接触させる工程；および
ｂ）該複合体の形成を検出し、それで複合体形成が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドが検出される工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって、該方法が、以下：
ａ）ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な条件下および時間で、該化合物を請求項１０に記載のポリペプチドと接触される工程；ならびに
ｂ）該複合体を検出し、それでポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が同定される工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって、該方法が、以下：
ａ）細胞において、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間、請求項１０に記載のポリペプチドと該化合物を接触させる工程、ここで該複合体が該細胞においてレポーター遺伝子配列発現を駆動する、工程；および
ｂ）レポーター遺伝子配列発現を検出することによって該複合体を検出し、それで該ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が同定される工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載のポリペプチドを生成する方法であって、該方法が、以下：
ａ）請求項８に記載の宿主細胞を、該細胞において該ポリペプチドを発現するのに十分な時間、培養する工程；および
ｂ）該細胞培養物または工程（ａ）の細胞から該ポリペプチドを単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載のポリペプチドを含む、キット。
【請求項２１】
表面に付着された請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有のセグメントを含む、核酸アレイ。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有のセグメントに対して完全マッチを検出する、請求項２１に記載のアレイ。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有のセグメントに対してミスマッチを検出する、請求項２１に記載のアレイ。
【請求項２４】
請求項１０に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の治療的量を、それらを必要とする哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、処置の方法。
【請求項２５】
配列番号４〜７からなる群より選択される少なくとも１０個連続するアミノ酸を含む、ヴォン・ヴィレブランド／トロンボスポンジン活性を有するポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号４〜７からなる群より選択される少なくとも５個連続するアミノ酸を含む、請求項２６に記載のポリペプチド
【請求項２７】
請求項２５に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２６に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項１０に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（１．技術分野）
本発明は新規性のあるポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによってコード化された蛋白質を提供し、それと共にそれらのポリヌクレオチドおよび蛋白質の用途、特に治療、診断および研究分野における用途を提供するものである。本発明は、特に新規性のあるヒトのフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドに関連する。
【０００２】
（２．背景分野）
蛋白要素（例えば、リンホキン、インターフェロン、ＣＳＦ、ケモキン、およびインターロイキンのようなサイトキンを含む）の発見を目指す技術は過去１０年間に目覚しい発展を遂げた。今では当たり前となってしまった交配クローニングと発現クローニング技術は新規性のあるポリヌクレオチドを“直接”、すなわち、発見される蛋白質と直接関係する情報（例えば。交配クローニングの場合、蛋白質の部分的なＤＮＡ／アミノ酸配列；発現クローニングの場合の蛋白質の活動）に基づいてクローンしている。さらに、最近の“間接的”クローニング手法、例えば、今では良く知られている分泌先導配列モチーフの存在に基づくＤＮＡ配列を分離する方法や、ＰＣＲに基づく、あるいは、低厳格性交配に基づくクローニング手法は、例えば、リーダー連鎖クローニングにおけるその分泌性により、またＰＣＲベースの手法におけるその細胞または組織源により、または既知の生物学的活動を有する他の遺伝子との構造的な相似性により、生物学的な活動を持つことが知られている蛋白質に対して膨大なＤＮＡ／アミノ酸配列をもたらすことによって多大な進歩をこの分野にもたらした。
【０００３】
すでに認知されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド連鎖は、たとえば診断、法医学、遺伝子地図作成、遺伝子障害またはその他の原因となる突然変異の特定、およびＤＮＡおよびアミノ酸連鎖に依存するその他多くの種類のデータおよび生成物の作成など、数多くの用途を持っている。本発明はポリヌクレオチドおよびポリペプチドのコード化に関するものである。本発明は特に新規性のあるフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドとポリヌクレオチドに関するものである。
【０００４】
（３．発明の要約）
本発明の構成は、新規性のある分離されたポリペプチド、そのようなペプチドをコード化する新規性のある分離されたポリヌクレオチド、それらに含まれるものとして、組み換えＤＮＡ分子、クローンされた遺伝子またはそれらの退化変異体、アンチセンスポリヌクレオチド分子、およびそれらのポリペプチド上に存在する１つあるいはそれ以上のエピトープを特に認識する抗体、さらにそれらの抗体を生み出すヒブリドーマを含んでいる。特に、本発明のポリヌクレオチドは、胎児の脳から生成されたｃＤＮＡライブラリから分離された歩にヌクレオチド（Ｈｙｓｅｑクローン認識番号１５２５８９２４）に基づいている。
【０００５】
本発明の構成は、さらに本発明にポリヌクレオチドを含む発現ベクター、そのようなポリヌクレオチドを含むような遺伝子工学的な処理をされた細胞、およびそのようなポリヌクレオチドを発現するような遺伝子工学的な処理をされた細胞を含むものである。
【０００６】
本発明のポリヌクレオチドは分離されたポリヌクレオチドを提供する。すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３に指定されたヌクレオチドの任意の１つから成るポリヌクレオチド；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３の全長コーディング配列から構成されるポリヌクレオチド；および任意のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３の成熟した蛋白質コーディング配列の任意のヌクレオチド配列から構成されるポリヌクレオチドである。本発明のヌクレオチドはさらに、以下のものを含むが、それらに限定されないポリヌクレオチドを提供する。すなわち、（ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３に指定された任意の１つのヌクレオチド配列の補体；（ｂ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４−７のヌクレオチド配列コード化の厳格な交配条件下で交配するポリヌクレオチド；上述の任意のポリヌクレオチドの対立変種であるポリヌクレオチド；上述の任意の蛋白質の同族（例えばオーソログ）種をコード化するポリヌクレオチド；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４−７から成るポリペプチドの特定の領域または任意の切断部分から成るポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドである。
【０００７】
本発明の核酸配列はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３の任意の核酸配列の配列情報を含んでいる。配列情報は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３の配列情報を独自に識別または発現するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３のお任意の１つのセグメントでもよい。そのようなセグメントの１つは２０量体の１つがヒトのゲノムと完全にマッチする確率は１／３００であるから、２０量体の１つであっても良い。ヒトのゲノムの場合、１組の染色体に３０億個の塩基対が存在する。４２０  の２０量体が存在し得るわけだから、１組のヒトの染色体に存在する塩基対の数の３００倍もの２０量体が存在することになる。同じ分析を使った場合、１７量体がヒトのゲノムにおいて完全にマッチする確率は５分の１である。これらのセグメントを発現研究にアレイとして使用される場合は、１５量体セグメントを使うことができる。同様に、１５量体が発現された配列において完全にマッチする確率は、発現された配列が全体のゲノム配列の約５％以下から構成されているので、ほぼ５分の１になる。核酸フラグメントまたはサブ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を構成していることが望ましい。
【０００８】
同様に、単一のミスマッチを検知するために配列情報を使う上で、１つのセグメントは２５量体である。ヒトのゲノムにおいて２５量体がミスマッチ１個だけで現れる確率は、完全マッチの確率（１÷４２５）に各ヌクレオチド位置におけるミスマッチの増えた確率（３  ｘ  ２５）を掛けることで計算される。１つのミスマッチを有する１８量体１つのアレイで検知される確率は約５分の１である。１つのミスマッチを有する２０量体がヒトのゲノムの中で検知される確率は約５分の１である。
【０００９】
この用途に使われるコレクションは単一のポリヌクレオチドのコレクションであっても良い。各配列の配列情報または独特な認識情報のコレクションは、核酸の配列上に配置されていても良い。ある実施例においては、配列情報の各セグメントが核酸の配列上に配置され、そのセグメントを含むポリヌクレオチドを検知するようになっている。そのアレイはそのセグメントを含むポリヌクレオチドに対する完全な一致または不一致を検知するように構成することもできる。このコレクションには、コンピュータで読み取れるような形式をもたせることができる。
【００１０】
本発明は、さらに上述の核酸配列の任意のものの逆または直接補配列、核酸配列を含むクローニングまたは発現ベクター；および宿主細胞またはこれらの発現ベクターで変換された生体をも含む。
【００１１】
ヒトのフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様（“トロンボスポンジン様”）ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は約２３５個のアミノ酸を持ち推定分子量が非グリコシル化約２６  ｋＤａの蛋白質よりなる。蛋白質データベースをＰＳＩ−ＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルトシュール、Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ｖｏｌ．  ２５，  ｐｐ．  ３３８９−３４０２を参照し、本出願の一部とする）およびｅＭａｔｒｉｘソフトウェアで検索した結果、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４はアフリカツメガエルのトロンボスディン１先駆体およびフォン・ウィルブランド要素と相同であることが分かった。図１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（「トロンボスポンディス様」としても知られる）とアフリカツメガエルのトロンボスポンジン１先駆体蛋白質（「カエルトロンボスポンジン１先駆体」）とのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴアミノ酸配列アラインメントの比較であり、両配列の間にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の５８種類のアミノ酸残基に対して４８％の類似性があり、またＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の５８種類のアミノ酸残基に対して３６％の同一性が認められたことを示している。本発明の配列は、下記に定義するようなフォン・ウィルブランド要素またはトロンボスポンジン作用を持つことが予想される。
【００１２】
予測された約１８種の残基信号ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のほぼ残基１から残基１８でコード化された。細胞外部分はそれ自身にとって利用できる。これは哺乳類の細胞における発現、および非円形生成物の配列で確認することができる。シグナルペプチド領域の存在は、カイト−ドリトル疎水性予測アルゴリズム（Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １５７，  ｐｐ．  １０５−３１  （１９８２）を参照し、本出願の一部とする）によって予測された。実際の非円形サイトはコンピュータプログラムで予測されたものと異なる可能性があることを理解するであろう。
【００１３】
ｅＭａｔｒｉｘソフトウェアパッケージ（スタンフォード大学、カリフォルニア州スタンフォード市）（ウーら、Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．  ６，  ｐｐ．  ２１９−２３５  （１９９９）、ここに参照することにより本出願の一部とする）を使うことにより、フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の残基１２４−１３４にフォン・ウィルブランド要素タイプＤを持ち、先駆体糖蛋白質信号細胞シグネチャーをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の残基１０２−１５０に持つことが予想される。ＳＥＱ  いＤ  ＮＯ：４に対応する領域は、以下に示すとおりで、使用記号は、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンである；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の残基１２４−１３４に位置するフォン・ウィルブランド要素タイプＤ領域（ＣＷＣＥＤＧＫＶＴＣすなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）：ｐ値  １．９１８ｅ−０９、ＰＦ０００９４Ｃ（シグネチャーに対応する認識番号）；および
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の残基１０１−１５０に位置する先駆体糖蛋白質信号細胞シグネチャー（ＳＰＣＷＨＬＧＡＭＨＥＳＲＳＲＷＴＥＰＧＣＳＱＣＷＣＥＤＧＫＶＴＣＥＫＶＲＣＥＡＡＣＳＨＰＩＰＳＲ、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）ｐ値９．０５７ｅ−０９、ＰＤ０２５７６Ａ（シグネチャーに対応する認識番号）。
【００１４】
先駆体糖蛋白質信号細胞シグネチャーとフォン・ウィルブランド要素タイプＤ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の同じ領域に位置していることは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４が血餅形成過程に係わっていることを示している。
【００１５】
フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドはトロンボスポンジン科のメンバーならびにフォン・ウィルブランド要素の特性を持っている。トロンボスポンジン科のメンバーは血管形成または、腫瘍の成長を助ける新しい血管の血清を抑止する（例えば、ボルパートら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ｖｏｌ  ２１７，  ｐｐ．  ３２６−３２  （１９９５）、トクナガら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ｖｏｌ  ７９，  ｐｐ．  ３５４−９  （１９９９）、共にここに参照することにより、本出願の一部とする）。研究者たちは、トロンボスポンジンの下向き調節はカポシの肉腫、すなわち、医原性で後天性の抑疫としばしば関連づけられる腫瘍と関係があることを見出している（タラボレッティら、Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ｖｏｌ．  １８８，  ｐｐ．  ７６−８１  （１９９９）、ここに参照することにより、本出願の一部とする）。他の研究者らは、トロンボスポンジン１は、鎌状赤血球の流動中の付着にとって重要な役割を持つカルボキシ−ターミナル細胞結合領域を持っていることを発見した（ヒラーら、Ｂｌｏｏｄ，  ｖｏｌ．  ９４，  ｐｐ．  ３０２−３０９  （１９９９）  をここに参照することにより、本出願の一部とする）。
【００１６】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは例えば、異常出血、フォン・ウィルブランド病血友病、血管形成、鎌状赤血球貧血、ガン、およびエイズを伴う疾病の予防／または治療法の一部として利用することができる。フォン・ウィルブランド病は米国民の約１％が罹患するありふれた遺伝的出血病である。その原因は、血餅にとって重要なプラズマ蛋白質の中の欠陥にある。
【００１７】
本発明の分離されたポリペプチドはそれらに限られないがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４−７から成るポリペプチドまたは、対応する全長のまたは成熟蛋白質を含む。本発明のポリペプチドは（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３に規定されたヌクレオチドを持つ任意のポリヌクレオチド；または（ｂ）厳格な交配条件の下で（ａ）のポリヌクレオチドの補体として交配されるポリペプチドのいずれかによってコード化される生物活性をもつポリペプチドをも含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４−７に上げられている任意の蛋白質配列の生物または免疫活性変種、ならびに生物活性を保持することが望まれるそれらと「ほぼ同等のもの」  （すなわち、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を持つもの）もまた考慮に含める。本発明のポリペプチドはその全部または一部を化学的に合成してもよいが、本発明の遺伝工学的に処理された細胞（たとえば宿主細胞）を利用して遺伝子組み換え手段で生成されることが望ましい。
【００１８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む構成をも提供する。本発明のポリペプチド構成としては、本発明のほかにさらに親水性の担体、すなわち薬学的に妥当な担体を含んでもよい。
【００１９】
本発明は本発明のポリヌクレオチドによって変換または形質移入された宿主細胞をも提供する。
【００２０】
本発明はまた、望ましいポリペプチドの発現を許すような条件下で適切な培養液中で、本発明の宿主細胞を培養し、培養または宿主細胞からの蛋白質を生成することにより本発明のポリペプチドを生成する方法に関連する。望ましい実施例には、そのようなプロセスで製造された蛋白質が熟成した形態の蛋白質である場合を含む。
【００２１】
本発明によるポリヌクレオチドは、分子生物学的に熟達した者にとってさまざまな手法において応用することができる。それらの手法には、交配プローブへの応用、オリゴマーやプライマーへの応用、ＰＣＲへの応用、配列への応用、コンピュータ読み取り媒体への応用、染色体や遺伝子の地図作成への応用、蛋白質の遺伝子組み換え生産への応用、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの生成、その化学アナログなどへの応用が含まれる。たとえば、ｍＲＮＡが特定種類の細胞または組織に対しておおむね制限されているとき、サンプル内の特定の細胞または組織のｍＲＮＡの存在をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使って検知するための交配プローブとして本発明のポリヌクレオチドを使うことができる。
【００２２】
他の実施例としては、診断において発現された遺伝子の識別のための発現された配列タグとして、また、当業者に良く知られており、またヴォルラスらがＳｃｉｅｎｃｅ  ２５８：５２−５９（１９９２）において発表したように、ヒトのゲノムの物理的地図作りのための発現された配列タグとして当該ポリヌクレオチドを使用することができる。
【００２３】
本発明によるポリヌクレオチドは既存の組み換えＤＮＡ手法（サムブルック，  Ｊ．  ら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ）によって他の任意のヌクレオチドに結合することができる。ポリヌクレオチドへの結合に有益なヌクレオチド配列にはさまざまなベクターの中には、当該技術でよく知られたプラスミド、コスミド、ラムダファージ変種、ファジミドなどを含む。したがって、この発明は本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび当該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一般的にベクターは少なくとも１つの生体中で複製機能を果たす起源を含み，便利な制限エンドヌクレアーゼ・サイトおよび宿主細胞用の選択可能なマーカーを含んでいる。本発明のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列化ベクターが含まれる。本発明の宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり、単細胞生体または多細胞生体である。
【００２４】
本発明によるポリヌクレオチドは、他の蛋白質に現在応用されている、普通の手続きや方法にも使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは特にポリペプチドをバインドする抗体を生成するために使用することができる。そのような抗体、特に単クローン抗体は組織内のポリペプチドの検知およびに定量に有益である。本発明のポリペプチドは分子量マーカーとして、また保健食品として使用することができる。
【００２５】
また本発明の蛋白質と医薬品として妥当な担体から成る構成の有益な薬効量を哺乳動物に投与するステップから成る、医療状態の防止、処置、または回復のさまざまな方法が提供されている。
【００２６】
特に、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、迷走性の蛋白質発現または生物活性を含む疾患（の治療）および／または治療方法の一部として利用することができる。
【００２７】
本発明の方法は、また、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、ここに述べたような疾患の症状また兆候を示している個体に対して投与することから成る、疾患の治療方法をも提供するものである。さらに、本発明は、目標の遺伝子生成物の総合的な作用を調整するその他の物質や化合物を投与するステップから成る、上述したような疾病または疾患に対する治療法を含むものである。化合物やその他の物質は、目標遺伝子／蛋白質発現のレベルまたは目標蛋白質作用に対するそのような調節に影響を及ぼすことがある。具体的には、本発明のポリペプチド、または本発明のフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドのバインディング・パートナー（例えば特に反応性を持つ抗体）から成る構成の薬効量をヒトを含み、ヒトに限らない哺乳動物に投与することから成る、神経性疾患を含む医療状態の予防、治療または回復のための方法を提供する。治療を必要とする個体にとって、本発明によるポリペプチドか、またはこれらの結合剤（または抑制剤）のいずれかが有効であるかは、特定の状態または病理のメカニズムに依存する。
【００２８】
この方法によると、本発明のポリペプチドは細胞機能の生体外または生体内抑制を発生するために投与することができる。本発明のあるポリペプチドは、生体内用としてのみフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様蛋白質としてか、または他の治療法の補佐としてのみに投与することができる。一方、本発明の蛋白質または他の活性分は特定の凝結要素、サイトカイン、リンホカインその他の造血要素、塞栓または抗塞栓要素または薬剤の処方に含めることにより、そのような凝結要素、サイトカイン、リンホカインその他の造血要素、塞栓または抗塞栓要素または薬剤の効果を減少させることができる。
【００２９】
本発明はさらに上述の方法において有益な薬物を製造する方法を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、サンプル（たとえば、組織またはサンプル）中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在を検知する方法にも関連する。そのような方法は、例えば、ここに述べたような疾患の予後兆候および診断評価の一部として、またそのような状態に対する体質を示している対象の識別に利用することができる。
【００３１】
本発明はまた、本発明の方法を実施するために、ポリヌクレオチド・プローブおよび／または単クローン抗体から成るキット、ならびにオプションとして、定量的基準を提供する。さらに、本発明は、上述の疾患の治療のために臨床的な試みを行う場合における、医薬品の有効度を評価し、患者の経過を監視する方法をも提供する。
【００３２】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド発現または作用を調節（例えば増減）する化合物の識別方法も提供する。そのような方法は、たとえば、上述のように疾患の症状を軽減することのできる化合物の識別にも使用することができる。そのような方法は、本発明のポリプロピレンと作用しあう（例えば、結合する）化合物や他の物質の検定をも含む。
【００３３】
（５．１：定義）
「始原胚細胞（ＰＧＣ）」とは、生殖細胞やその他の細胞に分化する能力を持つ他の細胞系列、特に卵黄嚢、腸間膜、または生殖巣堤から胚形成中は隔離される小さい一群の細胞を指す。ＰＧＣはＧＳＣやＥＳ細胞の生成に携わる源である。
【００３４】
「生殖系列幹細胞（ＧＳＣ）」とは、生殖体の生産のために胚細胞を安定して連続的に供給する始原幹細胞から得られる幹細胞を指す。
【００３５】
「胚幹細胞（ＥＳ）」という用語は、胎児または成人において生殖細胞を含む多くの異種細胞を発生させ得る細胞を指す。
【００３６】
ＰＧＣ、ＧＳＣおよびＥＳ細胞は自己再生機能を持っている。したがって、これらの細胞は生殖系列を増殖させ、成人の特殊器官を形成する永久分化細胞を複数発生させるだけでなく、自分自身をも再生するのである。
【００３７】
「トチポーテント」とは、成熟した器官のあらゆる種類の細胞に分化し得る細胞の能力を指す。
【００３８】
「プルリポーテント」とは、成人の器官に存在する各種の分化細胞に分化し得る能力を持つ細胞を意味する。プルリポーテント細胞は、トチポーテント細胞に比較すると、分化能力が制限されている。
【００３９】
「ヌクレオチド配列」  はヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列を意味する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」はここでは互換的に用いられる。
【００４０】
一般的に、本発明により提供される核酸セグメントはゲノムおよび短オリゴヌクレオチドリンカーのフラグメントから、またはオリゴヌクレオチドの列から、または個々のヌクレオチドから組立てられ、微生物またはウイルスオペロン、または真核性の遺伝子から得られる調節要素から成る組み換え転写ユニットに発現され得る人工核酸を提供する。
【００４１】
「オリゴヌクレオチドフラグメント」または「ポリヌクレオチドフラグメント」、「ポーション」または「セグメント」は、ヌクレオチド残基の列を指し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または各種の交配プロセスにおいて、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子の相似または関連部分の識別または増幅に使われるに足りる十分な長さを持つことが望ましい。フラグメントまたはセグメントは本発明の各ポリヌクレオチド配列を明確に識別することができる。「オリゴヌクレオチド」または「核酸プローブ」は本発明において提供されているポリヌクレオチド配列に基づいて生成される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５個のヌクレオチド、通常は２０個以上のヌクレオチドを持つポリヌクレオチドの部分から成る。核酸プローブは６  ｋｂ以下、通常は１  ｋｂ以下のポリヌクレオチド配列の部分から成る。擬陽性を除去するための適切なテストののち、これらのプローブは、例えば細胞や組織の中に特定のｍＲＮＡ分子が存在するかどうかを決定するため、またはウォルシュらによって説明された染色体ＤＮＡから類似の核酸配列を分離するために使われる。（ウォルシュ，Ｐ．Ｓ．  ほか、１９９２、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ  １：２４１−２５０）
「プローブ」という用語は、天然に存在する、または、組み換え、または化学合成された、単一または複鎖核酸を指す。それらは、当業者によく知られたニックトランスレーション、クレノー・フィルイン反応、ＰＣＲなどの方法でラベルをつけることができる。本発明のプローブ、その標本および／またはラベリングは、サムブルック，Ｊ．  らにより、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー；またはオーショベル，  Ｆ．Ｍ．ら、１９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ，  ニューヨーク州ニューヨーク市、によって詳述されており、両者ともにここに言及することにより、本申請書の一部とする。
【００４２】
「厳密な」という用語は、当業者によって通常理解されている厳密性の意味で使われる。厳密な条件には、高度に厳密な条件（例えば、フィルター固定したＤＮＡを０．５  Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、６５℃の１  ｍＭ  ＥＤＴＡで交配し、６８℃の０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで洗浄）、および中程度に厳密な条件（例えば、４２℃の０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで洗浄）を含む。その他の交配条件は本文中の例によって説明する。
【００４３】
デオキシンオリゴニュークレオチドの交配の場合、その他の交配条件としては、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドに対して）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドに対して）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドに対して）および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドに対して）の６Ｘ  ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウムで洗浄する。
【００４４】
「組み換え」という用語は、ここでポリペプチドまたは蛋白質に関連して使われた場合、組み換え（例えば、微生物、昆虫、または哺乳類の）発現システムから得られたポリペプチドまたは蛋白質であることを意味する。「微生物」とは、バクテリアまたは真菌（例えば、イースト）の発現システムで生成される組み換えポリペプチドまたは蛋白質を指す。生成物としては、「組み換え微生物」としては天然に内生する物質が存在せず、関連する天然のグリコシレーションが付随していないポリペプチドまたは蛋白質を指す。例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ  のようなほとんどのバクテリア培養菌に発現されたポリペプチドまたは蛋白質にはグリコシレーションの変種は存在しない。イースト菌に発現されているポリペプチオや蛋白質は、一般的に哺乳類の細胞に発現されているものと異なるグリコシレーションを持っている。
【００４５】
「組み換え発現媒体またはベクター」という用語は、ＤＡＮ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現するためのプラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターを指す。発現媒体は、（１）例えばプロモーターまたはエンハンサーのような遺伝子発現において調節的な役割を持つ遺伝子要素、（２）ｍＲＮＡに転写され、蛋白質に翻訳される構造的またはユーディング配列、および（３）適切な転写開始および停止配列を持つ組合せから成る転写ユニットから成り得る。イーストまたは真核性発現システムで使用される目的の構造ユニットは、ホスト細胞による転写蛋白質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含むことが望ましい。また、組み換え蛋白質がリーダーに配列または輸送配列なしに発現された場合は、アミノターミナルメチオニン残基を含んでいてもよい。最終生成物を得るためには、残基は発現された組み換え蛋白質からその後切り離されても、されなくてもよい。
【００４６】
「組み換え発現システム」とは、組み換え転写ユニットを染色体ＤＮＡに安定的に組み込んだか、または染色体外に組み換え転写ユニットを運搬する宿主細胞を意味する。ここで定義されている組み換え発現システムは、発現すべきＤＮＡセグメントまたは人工遺伝子にリンクされた調節要素の導入によって異種のポリペプチドまたは蛋白質を発現するものである。この用語はまた、例えばプロモーターやエンハンサーのような遺伝子発現において調節的役割を持つ組み換え遺伝子要素を安定的に組み合わせている宿主細胞をも意味する。ここに定義された組み換え発現システムは、発現すべきＤＮＡセグメントまたは人工遺伝子にリンクされた調節要素の導入によって、細胞に内生するポリペプチドまたは蛋白質を発現するものである。その細胞は原核または真核細胞のいずれでもよい。
【００４７】
「オープン・リーディング・フレーム」、ＯＲＦという用語は、終止コドンを持たないアミノ酸に対する一連のヌクレオチドトリプレットを意味し、蛋白質に転写可能な配列である。
【００４８】
「発現モジューレーティングフラグメント」、ＥＭＦという用語は、操作可能にリンクされたＯＲＦまたは他のＥＭＦの発現をもジュレートするヌクレオチドを意味する。
【００４９】
ここで使われる意味としては、ＥＭＦが存在することによって配列の発現が変更されるとき、配列は「操作可能にリンクされた配列の発現をモジュレートする」と言われる。ＥＭＦは、プロモータとプロモータをモジュレートする配列（誘発因子）を含み、それらに限らない。ＥＭＦの１つのクラスは、特定の調節因子または生理事象に応じて作動可能にリンクされたＯＲＦの発現を誘発するフラグメントである。
【００５０】
「摂取変調フラグメント」ＵＭＦとは、リンクされたＤＮＡフラグメントの細胞への摂取をとりもつ一連のヌクレオチドを意味する。ＵＭＦは既知のＵＭＦを目標配列ないしは目標モチーフとして以下に説明するようなコンピュータを使ったシステムで容易に識別することができる。
【００５１】
ＵＭＦの存在と活動は、疑いのあるＵＭＦをマーカー配列に付着させて確認することができる。その結果の核酸分子を適切な条件下で、適切な宿主細胞で培養し、マーカー配列を決定する。上述のように、ＵＭＦはリンクされたマーカー配列の摂取の頻度を増加する。
【００５２】
「活性」という用語は、天然に発生するポリペプチドの生物学的および／または免疫学的な活動を保持するポリペプチドの形態を示す。本発明によれば、“生物活性”とは、ポリペプチドが本発明のポリペプチドの生物活動の少なくとも１つを保有することを意味する。「フォン・ビルブラント因子またはトロンボスポンジン活動」または「フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン活動」または「フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様活動」という用語は、フォン・ウィルブランドまたはトロンボスポンジン蛋白質のいずれかの生物活動に類似する生物活動を意味する。
【００５３】
「天然に発生するポリペプチド」という用語は、遺伝子工学的な処理を受けていない細胞によって生成されたポリペプチドを指し、特に、アセチル化、カルボキシル化、グリコシレーション、リン酸エステル化、脂質化、アシル化などを含む、ポリペプチドの翻訳の変更から生じる各種のポリペプチドを意味する。
【００５４】
「誘導体」とは、ユビキチン結合、ラベリング（例えば、放射性核種または各種の酵素に関して）共有結合ポリマー付着、例えばペジレーション（ポリエチレングリコ−ルによる誘導）およびオルニチンのようなアミノ酸の化学合成による挿入または代入のような手法を使って化学的に変性したポリペプチドで、ヒトの蛋白質では自然に生じないものを指す。
【００５５】
「変異体」（または「アナログ」）という用語は、天然のポリペプチドとアミノ酸の挿入、除去、および代入がされている点で異なり、例えば組み換えＤＮＡ手法を使って生成されたものを指す。目的とする活動を殺すことなくどのアミノ酸残基を交換、追加または除去すべきかを決定するためのガイドは、特定のペプチドの配列を相同ペプチドの配列と比較し、高相同性の領域（保護領域）に生じたアミノ酸配列変化数を最小にするかまたは、コンセンサス配列のあるアミノ酸と交換することにより見出すことができる。
【００５６】
アミノ酸「置換物質」は、同等な構造的および／または化学的特性、例えば伝統的なアミノ酸交替物質を持つ他のアミノ酸で１つのアミノ酸と置換した結果である。“伝統的”アミノ酸置換物質は、関連する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、および／または両親媒性の相似性を基礎に作られる。例えば、無極性（疎水性）のアミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み、中立極性のアミノ酸はグリシン、セリン、トレオニン、シスチン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含み、正電荷（塩基性）アミノ酸はアルギン、リシンおよびヒスチジンを含み、また、負電荷（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。「挿入」または「除去」は、通常約１個から５個のアミノ酸の範囲である。与えられた変化は、ポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、除去、または交換をシステマティックに行い、組み換えＤＮＡ手法を使い、結果として生じた組み換え変異体を検定して、実験的に決定される。
【００５７】
別の方法としては、機能の変更が望まれる場合は、挿入、除去または非伝統的な変更によって、変性ポリペプチドが工学的に作られる。そのような変更は、例えば、本発明のポリペプチドの１つまたは複数の生物学的機能または生化学的特性を変更することによって可能である。例えば、それらの変更はリガンド結合親和性と挿入親和性、または劣化／交替率のようなポリペプチド特性を変える。さらに、そのような変更は、発現のために選ばれたホスト細胞の発現、スケールアップなどのためにより適したポリペプチドを発生するように選択することができる。例えば、２硫化ブリッジを消去するために、システイン残基は除去または他のアミノ酸残基と入れ換えることができる。
【００５８】
「ほぼ同等」という用語は、ヌクレオチドとアミノ酸配列の両方に使用され、例えば、基準配列から１つまたは複数の交換、除去または追加があり、その結果として、基準配列と比較した場合に、機能上不利な差異を生じないような変異配列を指す。普通、そのようなほぼ同等な配列は、ここにリストされたものから２０％以上（すなわち、基準配列との比較の上でほぼ同等な配列における交換、追加、および／または除去された残基の数を、ほぼ同等な当該配列の全残基数で除した値が０．２以上）異ならないものを指す。そのような配列はリストされた配列に対して８０％の配列同一度を持つと言われる。ある実施例の場合、本発明のほぼ同等な、例えば、変異配列はリストされた配列に比べて３０％以上異ならない（７０％の配列が同一）；本実施例のある変形では、１０％以上異ならない（９０％の配列が同一）；本実施例のさらに別の変形では、５％以上異ならない（９５％の配列が同一）；本実施例のさらに別の変形では、２％以上異ならない（９８％の配列が同一）。本発明によるほぼ同等な、例えば、変異アミノ酸配列とは、リストされたアミノ酸配列に比べて、一般的に少なくとも９５％の同一度があることを指し、本発明のほぼ同等なヌクレオチド配列は、遺伝子コードの冗長性または縮退性を考慮して、より低いパーセントの配列同一度を持つ。本発明の目的において、ほぼ同等な生物活動とほぼ同等な発現特性を持つ配列は、ほぼ同等なものとみなされる。同一性の決定の目的のためには、成熟した配列の切断（例えば、擬似ストップコンドンを生成する突然変異）は除外すべきである。配列の同一度はジョタン・ハイン法で決定することができる。
【００５９】
そのようなほぼ同等な配列をコード化する核酸配列、例えば上述のパーセント同一度の配列は、当業者にとって良く知られた標準交配操作によって定常的に分離し、識別することが可能である。
【００６０】
必要な場合は、発現ベクターはポリペプチドを細胞の膜を通して導く「シグナルまたはリーダー配列」を含むように設計されていてもよい。そのような配列は、組み換えＤＮＡで手法によって異種の蛋白源から提供されるか、本発明のポリペプチドに天然に存在しているものである。
【００６１】
ポリペプチドの「フラグメント」、「ポーション」、または「セグメント」は、少なくも５個のアミノ酸、しばしば少なくとも約７個のアミノ酸、普通は約９−１０個のアミノ酸、そしてさまざまな実施例において、約１７個またはそれ以上のアミノ酸の一連のアミノ酸残基である。活性であるためには、ポリペプチドは生物および／または免疫的活性を示すための十分な長さを持っていなければならない。
【００６２】
また別の方法としては、これらの同一または同様なポリペプチドをコード化する組み換え変異体は、遺伝子コードの中にある「冗長性」を利用することにより、合成または選択することができる。各種のコドン置換物、例えば各種の制限部位を作り出す無変化連鎖は特定の原核または真核システムにおけるプラスミドまたはウィルスベクターまたは発現に導入されてクローニングを最適化することができる。ポリヌクレオチド配合における突然変異は、ポリペプチドの任意の部分の特性を修正するために、ポリペプチドに加えられる他のペプチドの領域またはポリペプチドに反映され、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または劣化／交換率のような特性を変更する。
【００６３】
「活性化」された細胞という用語は、ここで使用された場合、細胞内または細胞外膜を通過する交通に関与する細胞を指し、正常または疾病の過程の一部としての分泌細胞や酵素細胞を含む。
【００６４】
「精製」という用語は、他の生体高分子、例えばポリヌクレオチド、蛋白質などに指定された核酸またはポリヌクレオチドが存在することを意味する。ある実施例では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、指定された生体高分子の重量で９５％以上、より望ましくは重量で９９．８％以上を占めるところまで精製される（ただし、水、緩衝液、および他の分子量で１０００ダルトン以下分子は存在してもよい）。
【００６５】
「分離」とは、核酸またはポリペプチドが自然の供給源から得られる核酸またはポリペプチドに存在する少なくとも１つの要素（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離することを意味する。１つの実施例では、核酸またはポリペプチドは、溶剤、緩衝液、鉄、またはその溶液に通常存在する他の要素が存在するところにのみ（もしあるとすれば）存在する。「分離」または「精製」という用語は、天然の供給源中に存在する核酸またはポリペプチドに対しては使われない。
【００６６】
「感染」とはウイルスまたはウイルスベクターを使って適切な宿主細胞に核酸を導入することを指す。
【００６７】
「変換」とは、適切な宿主細胞にＤＮＡを導入して、ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体の一部として再製可能なようにすることを意味する。
【００６８】
「形質移入」とは、コーディング配列が実際に発現されているかどうかにかかわらず、適切な宿主細胞によって発現ベクターをとり上げることを意味する。
【００６９】
「中間フラグメント」という用語は長さが５ないし１０００の塩基から成る核酸で、１０−４０  ｂｐ  の長さが望ましい。
【００７０】
「分泌」蛋白質とは、膜を通して、または越えて運搬された蛋白質であり、適切な宿主細胞にそれが発現されたときに、アミノ酸配列にシグナル配列の結果運搬される場合を含む。「分泌蛋白質」の中には、それが発現されている細胞から完全に（例えば、可溶性蛋白質）または部分的に分泌された蛋白質をすべて含む。「分泌蛋白質」とは、小胞体の膜を通して運搬される蛋白質を含む。「分泌蛋白質」はまた、非典型的シグナル配列（例えば、インターロイキン−１ベータ、クラズニー，Ｐ．Ａ．およびヤング，Ｐ．Ｒ．（１９６２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４（２）：１３４−１４３）および破壊された細胞（例えば、インターロイキン−１レセプター・アンタゴニスト，  アーレンド，  Ｗ．Ｐ．  ほか（１９９８）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６：２７−５５を参照）
上述の各用語は、特に文脈上他の意味で使われていないかぎり、上述の意味で使われる。
【００７１】
（５．２：本発明の核酸およびポリペプチド）
本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に報告する。本発明の蛋白質のフラグメントは、生物学的な活性を展示する能力があり、本発明の蛋白質フラグメントにも包囲され、直線形又は、既知の方法を使って輪形にすることが出来る。例えば、これらは  Ｈ．  Ｕ．  サラゴヴィほか著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７３−７７８  （１９９２）とＲ．  Ｓ．  マクドウエルほか著、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４，  ９２４５−９２５３  （１９９２），  に記述されてあり、両者はここに参考として加える。そのフラグメントは、多目的の免疫グロブリンのような媒介体分子に融合され、蛋白質の結合部位の数価を上げる。例えば、蛋白質のフラグメントは免疫グロブリンのＦｃ部分に「リンカー」を介して結合することができる。蛋白質の２価の形態にとって、そのような合併はｉｇＧ分子のＦｃ部に対して行われ得る。他の免疫グロブリン・イソタイプもそのような合併を生成するために使用できる。例えば、蛋白質―ＩｇＭ合併は、本発明の１０価形態の蛋白質を生成する。
【００７２】
本発明はまた、開示された蛋白質の全長と成熟の二つの形体を提供する（例えば、信号配列又は前兆配列なしで）。この蛋白質符号化配列は、開示されたヌクレオチド配列の翻訳によって、配列リストの中で識別される。その蛋白質の成熟形体は、適当な哺乳類の細胞、又は他の宿主細胞に中で全長のポリヌクレオチドを発現して得られる。成熟形体の蛋白質の配列はまた全長形体のアミノ酸配列からも決定できる。本発明の蛋白質が膜で囲まれている場合、溶性形体の蛋白質もまた提供される。そのような形体では、蛋白質を膜で囲まれるようにする領域の一部又は全部は削除され、蛋白質が、その発現される細胞から充分に分泌されるようにする。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドは自然発生のＤＮＡ、又は全部或いは一部合成されたＤＮＡを含む。例えば、ｃＤＮＡとゲノム的なＤＮＡ、そしてＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３は、ｃＤＮＡの符号化領分の全部、またはその一部分を含む。当業界の既知の方法で、更に  ５’と  ３’の配列を取得できる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３のポリヌクレオチドのどれでも、又はその一部分をプローブとして使用し、適切な交配条件の下で、適当なｃＤＮＡ又はゲノムの  ＤＮＡを選別することによって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３のポリヌクレオチドのどれにでも対応する、全長の  ｃＤＮＡ又はゲノムの  ＤＮＡを取得できる。別の方法として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３のポリヌクレオチド（複数）は、適当なゲノムの  ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリ−ズにおける遺伝子の識別と／又は拡大をさせる適切なプライマー（複数）の基礎として使用できる。
【００７４】
本発明の核酸の配列は、一個以上の公開データベース、例えばｄｂＥＳＴ，  ｇｂｐｒｉ  とＵｎｉＧｅｎｅ、から取得可能なＥＳＴと配列（ｃＤＮＡとゲノムの配列を含む）から組み立てられる。
【００７５】
本発明の範囲内にはいる配列は、これら特定の配列に限定されず、その互換遺伝子と種の変形をも含む。互換遺伝子と種の変形は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３にて得られた配列、その代表的なフラグメント、又は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３と最低９０％同一、出来れば９９％同一のヌクレオチド配列を同種の他の分離物からの配列とを比較し、定常的に決定できる。更に、コドンの可変性に順応するため、ここに開示された詳細なＯＲＦと同様に、本発明は、同じアミノ酸の配列のため、核酸分子の符号化を含む。即ち、一個のＯＲＦの符号化部分に、１つのコドンを、同じアミノ酸を符号化するもう一つのコドンで代用することを明らかに考慮している。
【００７６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２を含む、本発明の核酸は、ＥＳＴをシードして組立てられた。ＥＳＴ配列は、当業者にとって知られているプログラムやアルゴリズムによって、完全長の核酸配列に拡張することができる。本発明によるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と名付けられた核酸は、ＥＳＴ配列をシードとして使って組立られた。次に回帰的なアルゴリズムをシードＥＳＴに適用して拡張することにより拡張集合を得て、この集合に属する異なるデータベース（すなわち、ＨｙｓｅｑのＥＳＴ配列を含むデータベース、ｄｂＥＳＴバージョン１１４、ｇｂ  ｐｒｉ  １１４、およびＵｎｉＧｅｎｅバージョン１０１  １）から追加配列を引き出した。集合を拡張する上述のデータベースからの追加配列がそれ以上なくなったとき、アルゴリズムは停止した。構成要素配列の集合への組み入れは、拡張する集合に対するＢＬＡＳＴＮヒットが３００以上のＢＬＡＳＴスコアであり、９５％以上の識別度であることに基づいて行われた。ＢＬＡＳＴとはＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌは頭文字であり、ローカルな配列の一致をサーチするために使われる（アルトシュル，  Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６：  ２９０−Ｒ００  （１９９３）  およびアルトシュル，  Ｓ．Ｆ．らＪ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１：  ４０３−１０  （１９９０））。ＢＬＡＳＴはヌクレオチドとアミノ酸配列のアラインメントをつくり、配列の類似性を決定する。アラインメントがローカルに行われるので、ＢＬＡＳＴは完全マッチを決定に有効である。
【００７７】
ＥＳＴ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、完全長遺伝子の識別配列情報、代表フラグメントまたは背グメンチ情報、または新規性のあるセグメント情報を提供することができる。
【００７８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む本発明の核酸に対する最も近い隣接結果は、アルゴリズムまたはプログラムを使ってデータベースをサーチすることによって得られる。Ｆａｓｔｘｙアルゴリズムを使ったＧｅｎｐｅｐｔに対するＦＡＳＴＡバージョン３のサーチが望ましい。最も近い隣接結果はＧｅｎｐｅｐｔから得られる各集団に対する最も近い同族体を示す（そしてその集団がコード化する翻訳されたアミノ酸配列を含む）。
【００７９】
本発明は、ここで開示したｃＤＮＡの配列に対応した遺伝子も提供する。これらの対応した遺伝子は、ここで開示した配列の情報を使い既知の方法に従って分離できる。それらの方法には、適切なゲノムのライブラリー、又は他のゲノムの材料源で、遺伝子の識別と／又は拡大をするために、開示された配列情報からプローブ、またはプライマーを作成することを含む。
【００８０】
本発明は、開示したポリヌクレオチドと蛋白質の種のオーソログも提示する。種のオーソログについては、ここに提示した配列から適切なプローブ又はプライマーを作り、望ましい種から適切な核酸源を選別することによって、分離・識別が可能である。
【００８１】
本発明はまた、開示したポリヌクレオチド（複数）又は蛋白質の対立形質の変形も包含する；即ち、自然発生する、分離されたポリヌクレオチドの代替形体で、それはまたポリヌクレオチド（複数）に符号化されたものと同一の、同族の、又は関係のある蛋白質を符号化する。
【００８２】
（５．３：本発明の核酸）
本発明の分離ポリヌクレオチドは、それに限らないが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３をコード化するポリヌクレオチド、またはその成熟蛋白質部分を含む。
【００８３】
本発明の分離ヌクレオチドはさらに、それに限らないがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３の任意のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３のポリヌクレオチドの完全長蛋白質コーディング配列からなるポリヌクレオチド；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３のポリヌクレオチドの成熟蛋白質コーディング配列をコード化するヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、それに限らないが、フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン活性を持つことが望ましく、かつ、（ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３の任意のヌクレオチド配列の補体および、（ｂ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４−１の任意のポリペプチドのコード化するポリペプチドに厳格な条件で交配するポリペプチド；上述の任意のポリペプチドの対立遺伝子変異体；上記の蛋白質のいずれかの種の相同物を符号化する一個のポリヌクレオチド；  又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４−７のポリペプチドの特定された領域又は切断部を形成する一個のポリヌクレオチド。関心対象の部分は符号化されたポリペプチドの性質による。例えば、受容体のようなポリペプチドの領域は、リガンドする、細胞外の、皮膜を通過する、又は細胞質の領域、又はそれらの組合せを含む；免疫グロブリン様の蛋白質の領域は、免疫グロブリン様の変形領域を含む；酵素のようなポリペプチドの領域は、触媒的な、そして基板を結合する領域を含む；そしてリガンドポリペプチドの領域は受容体を結合する領域を含む。
【００８４】
本発明の望ましいポリペプチドの切片を符号化するポリヌクレオチドは、本発明の１個以上の領域を形成する、キメラまたは融合蛋白質と異族蛋白質の配列を符号化するポリヌクレオチドを創生するために使用できる。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドは、更に、上記ポリヌクレオチドのいずれの補体も含む。
【００８６】
本発明によるポリヌクレオチド（複数）は、例えば、最低６５％位、最低７０％位、最低７５％位、最低８０％位、より典型的には最低９０％位，、そして更により典型的には最低  ９５％位、という風な配列の識別方法を上記の１個のポリヌクレオチドに与えることが出来る。本発明のポリヌクレオチドは、更に、上記ポリヌクレオチドのいずれの補体も含む。そのポリヌクレオチドはＤＮＡ  （ゲノム的、ｃＤＮＡ，、増幅したもの、或いは合成したもの）でもＲＮＡでも良い。そのようなポリヌクレオチドを取得するための方法とアルゴリズムは、当業界の熟練者には良く知られており、例えば、望ましい配列の識別されたポリヌクレオチドを定常的に分離することが出来る交配条件を決定する方法を含む。
【００８７】
本発明によるポリヌクレオチドは、十分に確立された組換えＤＮＡのテクニックにより他のヌクレオチド  配列のどの種類にも結合できる（参照：Ｊ．サムブルック他  １０  （１９８９）  分子のクローニング：  研究所マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、ＮＹ）。ポリヌクレオチドに結合する、有用なヌクレオチド配列は、様々なベクターを含む；例えば、プラスミド、コスミド、ラムダファージの派生物、ファージミド、及びこれらの類似物で、当業界では良く知られているもの。従って、本発明はまた  本発明のポリヌクレオチド  とその  ポリヌクレオチドを保有する宿主細胞を含むベクターを提供する。一般に、そのベクターは、少なくとも１個の有機体で機能する複製の源、便利な限定された内部核の部位、及び選出可能な、宿主細胞のマーカーを含む。本発明に拠るベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ創生ベクター、及び配列ベクターが含まれる。本発明に拠れば、宿主細胞は汎核性または真核性の細胞で良く、単一細胞の有機体、または多細胞の有機体の部分でもよい。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドは又、例えば同族性の組換え又はノックアウト方策を使って、機能するフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドを発現しない、又はフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドの変形を発現する動物を開発することを可能にする。そのような動物は、フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドの体内の活動とそのモジュレーターを研究するモデルとして役に立つ。
【００８９】
本発明のポリペプチドの体内での生物機能を決める望ましい方法では、同族性の組換えを使っている動物の細菌ラインで、本発明が提供する１個以上の遺伝子は超過発現されているか、又は活動停止となっている［カペッキ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８  １２９２  （１９８９）］。外生又は内生プロモーター要素の規制管理の下で遺伝子が超過発現されている動物は、遺伝子導入の動物として知られる。同族性の組換えによって活動停止となっている内生の遺伝子をもつ動物は「ノックアウト」物とされる。ノックアウト動物、望ましくはヒト以外の哺乳類、についてはここに参考として含まれた米国特許Ｎｏ．  ５，５５７，０３２に記載のとおり、準備できる。遺伝子導入の動物が生物学的なプロセスで、そして望ましくは病気の状態で、本発明のポリペプチドが演じる役割を決めるのに役立つ。遺伝子導入の動物は、油脂の新陳代謝を調節する化合物を識別するモデルシステムとして有用である。遺伝子導入の動物は、望ましくはヒト以外の哺乳類で、ここに参考として含まれた米国特許Ｎｏ．  ５，４８９，７４３とＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ９４／２８１２２に記載された方法を使って生成できる。
【００９０】
本発明のポリヌクレオチドのプロモーターの全部か一部が活性化か非活性化されて、本発明の  ポリヌクレオチドの発現のレベルが変更された場合、遺伝子導入の動物  は準備できる。非活性化は、上記の同族性の組換え方法を使って実行できる。活性化は、蛋白質発現を増加するために、同族性のプロモーターを補充するか、又は取替えてでも達成出来る。同族性の  プロモーターは、特定の組織にプロモーター活性を与えるとされる１個以上の異族性のエンハンサー要素を挿入して補充できる。
【００９１】
フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ＤＮＡ配列の知識は、内生フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドの発現を細胞の変化によって許し、あるいは増加させる。細胞を変化させ（例えば、相同組み換え）、異種のプロモーターの全部または一部によって天然に発生するフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様プロモーターを入れ換えて、フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチド発現の増加をもたらし、その結果、その細胞が高いレベルフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドを発現できるようにする。異種プロモーターはフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様コード化配列に作動的にリンクされるように挿入される。ＰＣＴ国際公告Ｎｏ．  ＷＯ９４／１２６５０、ＰＣＴ国際公告Ｎｏ．  ＷＯ９２／２０８０８およびＮｏ．  ＷＯ９１／０９９５５参照のこと。さらに、異種プロモータ−ＤＮＡに加えて、増幅可能なマーカーＤＮＡ（例えば、ａｄａ、ｄｈｆｒ、およびカルバニルリン酸シンターゼ、およびジハイドロオロターゼをコード化する多機能ＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡを異種プロモーターＤＮＡと一緒に挿入しても良い。フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様コード化配列にリンクされた場合、標準の選択方法によるマーカーＤＮＡの増幅は、細胞のフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様コーディング配列の共同増幅をもたらす。
【００９２】
本発明の範囲に入る配列は個々に説明するものだけではなく、その配列の対立形質変形をも含む。対立形質変形は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３で与えられるヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３のヌクレオチド配列の任意のものとすくなくとも９９．９９％同一のヌクレオチドを、同じ種のＶ別の分離体から得た配列と比較することによって、定期的に決定することができる。コドン変種性を与えるために、本発明は、ここに開示された特定のＯＲＦが行うのと同様に、同じアミノ酸配列のための核酸分子コーディングを含む。言い換えれば、ＯＲＦのコーディング領域の中には、同じアミノ酸をコード化する１つのコドンを他のコドンを代表することが、明示的に考慮されている。ここに開示する任意の特定配列は、例えばＯＲＦのような特定のフラグメントを両方向に再シーケンスすることによって（すなわち、両方の連鎖にシーケンスする）誤りを容易にスクリーニングすることができる。
【００９３】
本発明は更に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３，  １０−１３  と  １５  のヌクレオチド  配列、そのフラグメント、又は本発明の他のポリヌクレオチドのどれかを持つ核酸を含む、組換え構成物を提供する。一つの具体例では、本発明の  組換え構成物は、プラズミドまたはウイルスのようなベクターで構成され、その中に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３，  １０−１３  と  １５  のヌクレオチド  配列、又はそのフラグメントを持つ  核酸  が前向きまたは後ろ向きに挿入される。本発明のＯＲＦの１つを含むベクターの場合、そのベクターは更に調節的配列を含むかもしれない：例えば、ＯＲＦに活性的に連結されたプロモーターを含む。本発明のＥＭＦとＵＭＦを構成するベクターにとって、そのベクターはＥＭＦとＵＭＦに作動的にリンクされた異種ＯＲＦまたはマーカー配列を含んでも良い。多数の適切なベクターとプロモーターは、当業界の熟練者には知られており、本発明の組換え構成物を作製するために業者から入手できるものである。次のベクターは例として挙げる。細菌類：  ｐＢｓ，  ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ，  ＰｓｉＸ１７４，  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ，  ｐＢｓ  ＫＳ，  ｐＮＨ８ａ，  ｐＮＨ１６ａ，  ｐＮＨ１８ａ，  ｐＮＨ４６ａ  （ストラタ遺伝子）；  ｐＴｒｃ９９Ａ，  ｐＫＫ２２３−３，  ｐＫＫ２３３−３，  ｐＤＲ５４０，  ｐＲＩＴ５  （ファーマシア）。真核性細胞類：  ｐＷＬｎｅｏ，  ｐＳＶ２ｃａｔ，  ｐＯＧ４４，  ＰＸＴＩ，  ｐＳＧ  （ストラタ遺伝子）  ｐＳＶＫ３，  ｐＢＰＶ，  ｐＭＳＧ，  ｐＳＶＬ  （ファーマシア）。
【００９４】
本発明の分離されたポリヌクレオチドは、蛋白質を組換え的に創製するために、カウフマンほか，  核酸  Ｒｅｓ．  １９，  ４４８５−４４９０  （１９９１）で開示された、ｐＭＴ２  又はｐＥＤ  という発現ベクターの発現管理配列に活性的に連結することが出来る。多数の適切な発現管理配列が当業界で知られている。組換え蛋白質の一般的な発現方法も知られており、Ｒ．  カウフマン著，  「酵素学の方法論（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」  １８５，  ５３７−５６６  （１９９０）に例証されている。ここに定義されてあるように、「活性的に連結される」ということは、本発明の分離されたポリヌクレオチドと発現管理の配列は、ベクター又は細胞の中に配置され、その蛋白質は、連結したポリヌクレオチド／発現管理の配列とともにトランスフェクトされた宿主細胞によって発現される様になっている。プロモーターの部位は、ＣＡＴ  （クロラアンフェニコール［抗菌剤］の転移酵素  ｃｈｌ又はａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）  の  ベクター、又は選択可能なマーカー付きの他のベクターを使って、どの望ましい遺伝子からも選択出来る。２個の適当なベクターは  ｐＫＫ２３２−８と  ｐＣＭ７である。個々の名前がついた細菌プロモーターはｌａｃＩ，、ｌａｃＺ，、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａ  ＰＲ及びｔｒｃを含む。真核性のプロモーターは下記のものを含む：ＣＭＶ直近早期，  ＨＳＶ  サイミディンキナーゼ  早期と晩期のＳＶ４０，  レトロウイルスからのＬＴＲ，及びネズミのメタロサイオネイン−Ｉ。適当なベクター  とプロモーターの選択は、当業界での普通のレベルの技術で出来ることである。一般に、組換え発現のベクターは、複製の原型と選択可能なマーカーを含み、これらは宿主セルを変形させる。例：アンピシリン抗体のＥ．  ＣＯＬＩの遺伝子と  Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＲＰ１  の遺伝子、そして、高度に発現した遺伝子から取出した、下流の構造配列の転写を指示するプロモーターである。それらのプロモーターとしては、色々あるうち、３−燐酸グリセリンキナーゼ  （ＰＧＫ）、ａ−要素，  酸燐酸酵素、又はヒートショックの蛋白質のようなものが、グリコリチック酵素を符号化するオペロンから取出せる。異族構造の配列は、適当な位相で、［遺伝情報の］翻訳の開始と終結の配列を付けて組み立てられ、望ましくは、リーダー配列が翻訳された蛋白質をぺリプラズマのスペース、又は細胞外のベクターに分泌することを指揮できること。オプションとしては、異族的配列  が、望ましい特性を発揮するアミノ終止ペプチドを含む融合蛋白質  を符号化できることである。例えば、発現された組換え製品を安定化または単純に純化することである。細菌に使う有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと活性的な読取り段階で、適当な翻訳開始と終止と共に、望ましい蛋白質を符号化する構造的なＤＮＡ配列を挿入することによって造られる。
【００９５】
ベクターは、１個以上の表現型の選択可能なマーカーと複製の原型から形成され、ベクターの維持を保証し、望ましければ、宿主内で拡大をさせる。変形に適した汎核性の宿主には、以下の細菌を含むが、他のものも選択して使用できる。Ｅ．  ｃｏｌｉ  イーコライ菌，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ土中の棒状菌，  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  サルモネラ菌ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、及び  一般的な棒状菌群、ストレプトマイセスかび及び葡萄状球菌群の色々な種類。
【００９６】
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
代表的だがそれに限らない例として、有用な細菌用の発現ベクターは、選択可能なマーカーと、良く知られたクローニングのベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝子要素を構成する、商業的に入手可能なプラズミドから取出した複製の細菌の原型から構成される。そのような商業的に入手可能なベクターには、例えば  ｐＫＫ２２３−３  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）  と  ＧＥＭ  １  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）がある。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン（骨格）」のセクションは適当なプロモーターと発現される構造配列と結合される。適当な宿主菌株が変形し適当な細胞密度に成長した後、選択されたプロモーターは適当な手段で誘発又は抑圧解除され（例えば温度変更又は化学的誘発により）細胞は更に追加期間の間培養される。細胞は、普通、遠心力で収穫され、物理的又は化学的手段で撹乱され、そして残った粗いエキスは更に純化するために保存される。
【００９７】
本発明における核酸の配列の範囲に含まれるものは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３のヌクレオチドの配列（複数）のどれかに交配する核酸配列のフラグメント、又はその補完物で、そのフラグメントは約１０  ｂｐより大きく、出来れば２０−５０  ｂｐより、更に出来れば１００  ｂｐより、３００  ｂｐより、最も良ければ５００  ｂｐより大きい。例えば、１５，  １６又は２０  ｂｐ以上のヌクレオチドのフラグメントで選択的なもの（即ち、本発明のポリヌクレオチドのどの一個に特定して交配するもの）を考慮している。ポリヌクレオチドの一個に特定して交配することができるプローブは、同族の遺伝子における他のポリヌクレオチドの配列から本発明のポリヌクレオチドの配列を分化することが出来、又は他種の遺伝子から人間の遺伝子を分化することが出来、そしてユニークなヌクレオチド配列を基礎としていることが望ましい。
【００９８】
本発明により，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４−７、或いはその機能的同等物のどれかに対応する，  成熟した蛋白質の符号  配列を構成する、ポリヌクレオチドの配列は、組換えＤＮＡ  分子を創生する為に使用でき、そのＤＮＡ分子が、適当な宿主細胞内でその核酸、又はその機能的同等物の発現を指揮する。また、ｃＤＮＡが挿入する、ここで識別されたクローンのいずれか  も含まれる。
【００９９】
本発明の核酸配列は、記述の核酸の変形を符号化する配列へ更に指向されている。これらのアミノ酸の配列変形は、原型または変形のポリヌクレオチドに適当なヌクレオチドの変化をさせるという、既知の方法で作成できる。アミノ酸配列変形の構成には２個の可変要素がある：突然変異の位置と  突然変異の性質である。アミノ酸配列変形を符号化する核酸は、自然発生しないアミノ酸配列を符号化する為に、出来れば、ポリヌクレオチドを突然変異させて構成することが望ましい。これらの核酸の改造は、異種の核酸によって異なる部位（可変位置）又は高度に保存された領域（固定領域）で出来る。それらの位置での部位は、普通、シリーズで修正される；即ち、まず保守的な選択で代用する（例えば、疎水性  アミノ酸を、異なる疎水性アミノ酸で）、それから更に遠い選択で代用する（例えば、疎水性  アミノ酸を、負荷されたアミノ酸で）、その後、目標の部位で削除または挿入が出来る。アミノ酸配列の削除は、大体１から３０の残基に亘り、望ましいのは  大体１から１０の残基であり、普通は連続している。アミノ酸の挿入はアミノ−および／又はカーボオキシル−末端融合により、長さは１から１００以上の残基  に亘り，  単一または複数のアミノ酸残基  の配列内挿入も同様である。配列内挿入は、普通、１から１０のアミノ酸残基に亘り、望ましいのは１から５の残基である。末端挿入の例としては、分泌または異なる宿主細胞で細胞内の目標付けに必要な、異族の信号配列、及びＦＬＡＧのような  配列、又は発現した蛋白質を純化するのに有用なポリヒスタディン配列がある。
【０１００】
望ましい方法では、新規性のあるアミノ酸  配列を符号化するポリヌクレオチドは、部位に向けられた突然変異の誘発により変換される。この方法は、オリゴ（少数）ヌクレオチド配列を使ってポリヌクレオチドを変換し、望ましいアミノ酸変形を符号化させ、同時に、変換したアミノ酸の両隣の十分な量のヌクレオチドに、変換される部位の両側で安定した２重組織を形成させる。一般に、部位に向けられた突然変異誘発の技術は、当業界の熟練者達には良く知られており、このテクニックは次の出版物で例に挙げられている：エーデルマン他、ＤＮＡ  ２：１８３  （１９８３）。ポリヌクレオチド配列における部位特定の変化を創り出すための、多才で効率的な方法は、ゾラーとスミス著、核酸    Ｒｅｓ．  １０：６４８７  ６５００  （１９８２）で出版された。ＰＣＲも新規性のある核酸からアミノ酸配列変形を創生するために使える。最初の材料として少量のテンプレートＤＮＡを使う時、配列がテンプレートＤＮＡ内の対応する部分から僅かに異なるプライマーを使うと、望ましいアミノ酸変形を創生できる。ＰＣＲを拡大すると、そのプライマーで特定された位置のポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドテンプレートと異なるＤＮＡのフラグメント品の数が増える。このＤＮＡのフラグメント品はプラスミッド内の対応する部分を取替え、望ましいアミノ酸変形を符号化するポリヌクレオチドを与える。
【０１０１】
アミノ酸変形を創生するもう一つのテクニックは、カセット突然変異誘発テクニックで、ウエルス他著、遺伝子  ３４：３１５  （１９８５）に説明してある。他の突然変異誘発テクニックは当業界で良く知られている。例えば、前出のサムブルックス著作、そして「分子生物学における現行のプロトコール」、オースベル他著に述べられたテクニックである。遺伝子符号の内在的な退化性のため、ほぼ同一か、機能的に同等なアミノ酸配列を符号化する他のＤＮＡ配列を本発明の実行に使用し、これらの新規性のある核酸のクローン増殖と発現に使用して良い。それらのＤＮＡ  配列は、厳格な条件の下、適当で新規性のある核酸  配列  に交配可能なものを含む。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチドは又免疫反応を誘発する為に使用できる。例えば、ファン他、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：８７０  ８７２  （１９９９）に記述され、ここに参考として使われているように、ポリペプチドを符号化する核酸  配列は、裸のプラスミドＤＮＡを局部的に投与又は注射した後、望ましくは、ＤＮＡを筋肉内に注射した後、符号化したポリペプチドに対する抗体を生成するために使用される。核酸  配列は、望ましくは組換え発現ベクターに挿入され、裸のＤＮＡの形でも良い。
【０１０３】
（５．４：アンティセンス）
本発明のもう一つの側面は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３のヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、相似物又は派生物から成る核酸分子に交配可能か又は相補的な、分離されたアンティセンス核酸分子に関連する。１個の“アンティセンス”核酸は、蛋白質を符号化する“センス”核酸に相補的なヌクレオチド配列から成る：例えば、２重ストランドのうちｃＤＮＡ分子の符号化するストランドに相補的か、又はｍＲＮＡの配列に相補的である。特別な側面では、アンティセンス核酸分子が提供され、少なくとも約  １０，  ２５，  ５０，  １００，  ２５０又は５００のヌクレオチドを、又は符号化するストランド全部、又はその一部を補完する配列を構成する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４−７のいずれかの蛋白質のフラグメント、同族物、相似物又は派生物を符号化する核酸分子、又は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３の核酸配列に相補的なアンティセンス核酸が更に提供される。
【０１０４】
１つの具体例では、１個のアンティセンス核酸分子が、本発明のヌクレオチド配列における符号化ストランドの“符号化領域”に対してアンティセンスである。“符号化領域”という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを形成するヌクレオチド配列の領域を指す。もう１つの具体例では、アンティセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列の内、符号化ストランドの“符号化しない部分”に対してアンティセンスである。“非符号化領域”という用語は、５’  と  ３’の配列を指し、アミノ酸に翻訳されない符号化領域の横に付く（即ち、５’  と  ３’の翻訳されない領域とも言える）。
【０１０５】
ここに開示された、核酸を符号化する、符号化ストランドの配列、ｅ．ｇ．，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３、があるので、本発明のアンティセンス核酸は、ワトソンとクリック、又はフーグスティーンの基本的組合せの規則に従って設計できる。アンティセンス核酸分子は、ｍＲＮＡの符号化領域全体に対して相補的であり得るが、更に望ましいのは、ｍＲＮＡの符号化又は非符号化領域の一部分だけに対してアンティセンスである少数ヌクレオチドである。例えば、その  アンティセンス少数ヌクレオチドはｍＲＮＡの翻訳開始  部位を囲む領域に対して相補的であり得る。アンティセンス少数ヌクレオチドは、例えば、約５，  １０，  １５，  ２０，  ２５，  ３０，  ３５，  ４０，  ４５  又は  ５０個のヌクレオチドの長さでありうる。本発明のアンティセンス核酸は、化学合成を使って、又は当業界で知られている手続きを使って酵素結合反応によって造成できる。例えば、アンティセンス核酸（例：  アンティセンス少数ヌクレオチド）は、自然発生するヌクレオチド又は、分子の生物学的安定度を上げるために、或いは、アンティセンス  と  センス  核酸の間に形成された２重構造体の物理的安定度を上げるために、多様に修正されたヌクレオチドを使って化学合成出来る。例えば、燐酸硫化物の派生物  とアクリディンを代用したヌクレオチドが使用できる。
【０１０６】
アンティセンス核酸を生成する為に使用できる修正ヌクレオチドの例には、下記のものを含む：
５−フルオロウラシル，  ５−ブロモウラシル，  ５−クロロウラシル，  ５−ヨードウラシル、ハイポザンシン，  ザンシン，  ４−アセチルサイトシン，  ５−（カルボキシルハイドロキシルメチル）ウラシル，  ５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオユリディン，  ５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル，  ディハイドロウラシル，  ベータ−Ｄ−ガラクトシリクオシン，  イノシン，  Ｎ６−イソペンテナイラデニン，  １−メチルグアニン，  １−メチルイノシン，  ２，２−ディメチルグアニン，  ２−メチルアデニン，  ２−メチルグアニン，  ３−メチルサイトシン，  ５−メチルサイトシン，  Ｎ６−アデニン，  ７−メチルグアニン，  ５−メチルアミノメチルウラシル，  ５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル，  ベータ−Ｄ−マノシリクオシン，  ５’−メトキシカルボキシメチルウラシル，  ５−メトキシウラシル，  ２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン，  ウラシル−５−酸素酢酸  （ｖ），  ウイブトクソシン，  擬似ウラシル，  キオシン，  ２−チオサイトニン，  ５−メチル−２−チオウラシル，  ２−チオウラシル，  ４−チオウラシル，  ５−メチルウラシル，  ウラシル−５−酸素酢酸メチルエスター，  ウラシル−５−酸素酢酸  （ｖ），  ５−メチル−２−チオウラシル，  ３（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボオキシルプロピル）  ウラシル，  （ａｃｐ３）ｗ，  及び  ２，６−ディアミノピュリン。代替方法として，アンティセンス核酸は、核酸がアンティセンス指向でサブクローンとして挿入された発現ベクターを使って生物学的に生成できる（即ち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは目標とする核酸に対してアンティセンス指向となる。次のサブセクションで詳細説明する）。
【０１０７】
本発明のアンティセンス核酸分子は、通常、対象体に投与されるか、または本来の位置で生成されるので、それらは細胞のｍＲＮＡと／又は本発明の蛋白質を符号化するゲノムのＤＮＡと交配又は結合し、それによって蛋白質の発現を抑制する；例えば、転写と／又は翻訳を抑制することにより。その交配は、在来の  ヌクレオチドの相補性によって、又は、例えばＤＮＡの２重構造に結合するアンティセンス核酸分子の場合、２重螺旋の大きな溝内での特定の相互作用によって、安定した２重構造を形成する。本発明によるアンティセンス  核酸  分子の投与ルートの一例は組織部位へ直接注射することである。代替方法として、アンティセンス核酸分子を、選択された細胞を目標に修正し、組織全体に投与することも出来る。例えば、組織全体に投与する場合，  アンティセンス  分子を修正し、受容体のみに結合するようにするとか、又は選択された細胞の表面に発現された抗原に結合するようにする。例えば、アンティセンス核酸分子をペプチド、又は、細胞表面の受容体か  抗原に結合する抗体に連結する。アンティセンス核酸分子はまたここに述べたベクターを使って細胞に運ばれる。アンティセンス分子の十分な細胞間濃度を得る為に、アンティセンス核酸分子が強力なポルＩＩ又はポルＩＩＩプロモーターの支配下に置かれるようなベクターの構造物が望ましい。もう一つの具体化例では、本発明のアンティセンス  核酸分子はアノメリック核酸分子である。アノメリック核酸分子は、相補的なＲＮＡと２本のストランドが付いた特定の混成種を形成し、その中では、通常のものと異なり、ストランドがお互いに平行になっている（ゴーチエーほか（１９８７）核酸Ｒｅｓ  １５：  ６６２５  ６６４１）。また、アンティセンス核酸分子は２’−ｏ−メチルリボ  ヌクレオチドを構成し（井上ほか（１９８７）核酸  Ｒｅｓ  １５：  ６１３１−６１４８）、又は複合的なＲＮＡ−ＤＮＡの類似物を構成する（井上ほかＩｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２１５：  ３２７  ３３０）。
【０１０８】
（５．５：リボザイムとＰＮＡの半分）
更にもう一つの具体化例では、本発明のアンティセンス  核酸  がリボザイムである。リボザイムはリボ核酸的活性を持つ触媒的なＲＮＡ  分子で、ｍＲＮＡのような１本ストランドの核酸を２分することが出来、それに対して相補的な領域を持つ。従って、リボザイム（例えば、ハマーヘッドリボザイム；  （ハーゼルホフとゲアラック著  （１９８８）  自然  ３３４：５８５  ５９１）に記述はｍＲＮＡの転写体を触媒的に２分するために使用可能であり、それによりｍＲＮＡの翻訳を抑制する。本発明の核酸に対して特性を持つリボザイムは、ここに開示したＤＮＡのヌクレオチド  配列に基づいて設計できる（即ちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３）。例えば、テトラハイメナＬ−１９  ＩＶＳＲＮＡの派生体を造成して、その活性部位のヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡをＳＥＣＸ符号化する時に２分されるヌクレオチド配列に相補的であるようにする。参考例：チェックほか、米国特許．  Ｎｏ．  ４，９８７，０７１；  及び  チェックほか、米国特許．  Ｎｏ．  ５，１１６，７４２。代替方法として、ＳＥＣＸｍＲＮＡを使って、ＲＮＡ分子の溜りから特定のリボ核酸的活性を持つ触媒的なＲＮＡを選択出来る。参考例：  バーテルほか、（１９９３）  科学２６１：１４１１−１４１８。
【０１０９】
代替方法として、規制領域（例えば、プロモーターと／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド  配列を目標にして、目標細胞内の遺伝子の転写を防ぐ３重螺旋状の構造を形成し、遺伝子の発現は抑圧出来る。参考：へレン．  （１９９１）  抗癌薬品  Ｄｅｓ．  ６：  ５６９−８４；  ヘレンほか  （１９９２）  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ６６０：２７−３６；  及びメーハ−  （１９９２）  生物学検定  １４：  ８０７−１５。
【０１１０】
色々な具体例では、本発明の核酸は、例えば分子の安定性、交配、又は溶性を改善する為に、基礎の半分、糖分の半分、又は燐酸塩のバックボーンにおいて修正可能である。例えば、核酸のデオキシリボーゼ  燐酸塩のバックボーンは、ペプチド核酸を生成するように修正可能である（参考：ハイラップほか、（１９９６）  Ｂｉｏ又はｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｉｎ  ４：  ５−２３）。ここで使われているように、“ペプチド  核酸”又は“ＰＮＡ”の用語は、核酸の擬態を指す。例えばＤＮＡの擬態では、デオキシリボーゼ  燐酸塩のバックボーンは、擬似ペプチドのバックボーンに取って代わられ、４個の自然ヌクレオベースだけが保持される。ＰＮＡの中性バックボーンは、低イオン力の状態でＤＮＡとＲＮＡに特定交配をさせることが証明されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準の固体のぺプチド合成プロトコールを使って実行可能で、それはハイラップほか著の上記書  （１９９６）；ぺリー・オキーフほか著  （１９９６）  ＰＮＡＳ  ９３：  １４６７０−６７５に説明されてあるとおりである。本発明のＰＮＡは、治療と診断の用途に使える。例えば、ＰＮＡは配列−特定遺伝子発現を調整するためのアンティセンスまたは抗原薬剤として使用可能で、例えば、転写又は翻訳停止を誘発し、又は複製を抑制する。本発明  のＰＮＡの用途は、例えば、ＰＮＡに指揮されるＰＣＲの締付けにより、単一ベースで１対遺伝子の突然変異の分析に使う；他の酵素と組合わせて使うと人工的制限酵素となる。参考例：Ｓ１細胞核（ハイラップ  Ｂ．  （１９９６）、前出）；又はＤＮＡ  配列  と交配用のプローブ又はプライマーとして使う（ハイラップほか  （１９９６），  前出；  ぺリー・オキーフ  （１９９６），  前出）。
【０１１１】
他の具体例では，  本発明のＰＮＡを修正して安定性や細胞摂取を改善出来る。例えば、親油脂性、または他の助剤群をＰＮＡに添付して、ＰＮＡ−ＤＮＡの複合組織を形成して、又は当業界で知られている、リポサムやその他の薬品配送技術を使って修正する。例えば、ＰＮＡ−ＤＮＡ  の複合組織を生成すると、ＰＮＡとＤＮＡの有利な特性を組み合わせるかもしれない。その様な複合組織は、ＤＮＡの認知酵素、例えばＲＮ酵素ＨとＤＮＡポリマー酵素、をＤＮＡ部分と相互作用させ、同時に  ＰＮＡ部分は高度の結合相性と特性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡ複合組織を、底積み、核のベース間の結合数、及び指向の条件で選択された適当な長さの連結物を使って連結することが出来る（ハイラップ（１９９６）前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡ  複合組織の合成は、ハイラップ（１９９６）前出とフィンほか（１９９６）核酸  Ｒｅｓ  ２４：  ３３５７−６３に説明されたように実行できる。例えば、ＤＮＡ  チェーンは、標準の燐酸アミダイト結合化学と調整したヌクレオシド相似体を使って固定した支持台の上で合成出来る。例えば、５’−（４−メチオキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−サイミディン燐酸アミダイトをＰＮＡと、ＤＮＡの５’端の間に使う  （マグほか  （１９８９）  核酸調査Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：  ５９７３−８８）。それから  ＰＮＡモノマーは階段のように連結され、１個の５’  ＰＮＡ区分と１個の３’  ＤＮＡ区分の付いたキメリック分子を生成する（フィンほか（１９９６）前出）。代替方法としては、キメリック分子は１個の５’  ＰＮＡ区分と１個の３’  ＤＮＡ区分を付けて合成することが出来る。参照：ピーターソンほか、１９７５）  Ｂｉｏ  Ｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ５：  １１１９−１１１２４。
【０１１２】
他の具体例では、少数のヌクレオチドには、ペプチド（例：体内の宿主細胞を目標とする為に）又は細胞膜層を通過して搬送することを助ける薬剤（参考例：レツィンガーほか，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５５３−６５５６；ルメートルほか１９８７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：６４８−６５２；  ＰＣＴ出版  Ｎｏ．  Ｗ０８８／０９８１０）、又は血液−脳間の防壁（参考例：  ＰＣＴ出版Ｎｏ．  Ｗ０８９／１０１３４）のような、他の付属のグループを含む。更に、少数ヌクレオチドは、交配をきっかけに始動する２分薬剤で  （参考例：クロールほか、１９８８，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６）  又は［細胞間］挿入薬剤で（参考例：ゾン、１９８８，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５：  ５３９−５４９）  調整出来る。このために、少数ヌクレオチドをもう１つの分子に接合させてもよい。例えば、ペプチド、交配をきっかけに始動する交合薬剤、運搬薬剤、交配をきっかけに始動する２分薬剤、その他。
【０１１３】
（５．６：宿主）
本発明は更に、遺伝子工学的に設計された本発明ポリヌクレオチドを包含する、宿主細胞を提供する。例えば、その宿主細胞は、既知の変形、形質移入又は感染方法を使ってその宿主細胞に取入れられた本発明の核酸を包含するかもしれない。本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子工学的に設計された宿主細胞を提供し、その中では、それらのポリヌクレオチドは、細胞内でのポリヌクレオチドの発現を操作する宿主細胞に対して異族的な規制配列と協働する。
【０１１４】
本発明によるＤＮＡ配列の知識は、細胞の調整により内生ポリペプチドの発現をさせ、又は増加させる。細胞は調整可能で（例えば、同族性の組換えによって）、自然発生するプロモーターの全部か一部を、異族性のプロモーターの全部か一部で取替えることによって、細胞がポリペプチドをより高いレベルで発現されるのでポリペプチドの発現を増加する。この異族性のプロモーターは、望ましい蛋白の符号化配列に作動的に連結される様に挿入される。参考例：ＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ９４／１２６５０，  ＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ９２／２０８０８，  及び  ＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ９１／０９９５５。また、異族性のプロモーターＤＮＡの他に、拡大可能なマーカーＤＮＡ  （例：ａｄａ，  ｄｈｆｒ，  及び多機能を持った、カルバミルリン酸塩シンターゼ、アスパラテートシンターゼ、アスパラテートトランスカルバミラーゼ及びデハイドロオロターゼを符号化するＣＡＤ遺伝子）と／又はイントロンＤＮＡが異族性のプロモーターＤＮＡと共に挿入されることを考慮する。もし望ましい蛋白質のの符号化配列に連結されると、標準方法で選択されたマーカーＤＮＡの拡大は、細胞内で望ましい蛋白質の符号化配列を同時に拡大する。
【０１１５】
宿主細胞は、哺乳類の細胞のような高度に真核性の宿主細胞、イースト細胞のような低度に真核性の宿主細胞でも、又は細菌細胞のような汎核性細胞でも良い。組換え構成を宿主細胞へ導入するには、カルシウムリン酸塩の形質移入、ＤＥＡＥ，、デクサトランに仲介された形質移入、又はエレクトロポーレーション［電気穴あけ］によって実行される。（デイビス，  Ｌ．  ほか著、分子生物学の基本方法  （１９８６））。本発明のポリヌクレオチドの１個を持つ宿主細胞は、従来の方法で使用され、分離されたフラグメントによって符号化された遺伝子製品を生成する（ＯＲＦの場合）又はＥＭＦの支配下で異族性の蛋白質を生成する為に使用出来る。
【０１１６】
いかなる宿主／ベクターシステムを使って、現在の２５発明によるＯＲＦを１個以上発現することができる。これらは下記のものを制限無く含む：真核性の宿主、例えば：ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞、及び汎核性の宿主、例えば：Ｅ．  コーライとＢ．サブチリス。
【０１１７】
最も望ましい細胞は、通常、特別なポリペプチド又は蛋白質を発現しないもの、又はポリペプチド又は蛋白質を自然な低レベルで発現するものである。成熟蛋白質は、哺乳類細胞、イースト、細菌、又は適当なプロモーターの支配下の他の細胞内で発現出来る。細胞を持たない翻訳システムを使用して、本発明のＤＮＡ構成から取出したＲＮＡを使ってそのような蛋白質を生成できる。汎核性と真核性の宿主に使用する、適当なクローニング発現ベクターは、サムブルックほか著、分子のクローニング：研究所マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ  （１９８９）に記述されてあり、その開示は参考としてここに含む。
【０１１８】
色々な哺乳類細胞の培養システムを使って、組換え蛋白質を発現出来る。哺乳類細胞の発現  システムの例は、グルズマン著、細胞、２３：１７５（１９８１）に記述された、サルの腎臓ファイブロブラストの  ＣＯＳ  ７線、および他の細胞ラインで適応可能なベクターを発現出来るものは、例えば、Ｃ１２７、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞線である。哺乳類細胞の発現  ベクターは、複製の原体、適当なプロモーター及び必要なリボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、接着ドーナーとアクセプターの部位、転写の終結配列，  及び５’の側面に位置する非転写配列で形成される。例えば、ＳＶ４０のウイルスゲノム、ＳＶ４０原形、初期のプロモーター、エンハンサー、接着、及びポリアデニレーション部位から取出されたＤＮＡ配列を使って、必要な非転写の遺伝子要素を提供することができる。細菌培養で生成された組換えポリペプチドと蛋白質は、通常、細胞の小玉から最初抽出によって分離され、次に、１回以上の塩分添加、水分イオン交換、又は色相分析方法でサイズ除外と続く。必要に応じて、蛋白質を折り返して、成熟蛋白質の編成を完了することが出来る。最後に、高性能な液体色相分析方法（ＨＰＬＣ）を使用して、純化の手順を終了する。蛋白質の発現に使用する微生物の細胞は、凍結‐融解サイクル、音波破粋、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用等、従来の方法で破壊出来る。
【０１１９】
蛋白質の発現のために適した宿主細胞は各種存在している。哺乳類の宿主細胞は、例えば、サルのＣＯＳ細胞、中国産ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒトの腎臓の２９３細胞、ヒトの表皮のＡ４３１細胞、ヒトのＣｏｌｏ２Ｏ５細胞、３Ｔ３  細胞、ＣＶ  １  細胞、他の変形された霊長族の細胞ライン、正常な２重染色体細胞、初生組織の体外培養から得られた細胞列、初生の培養組織切片、ＨｅＬａ  細胞、ネズミ  Ｌ  細胞、ＨＫ，  ＨＬ  ６０，  Ｕ９３７，  ＨａＫ  又は  ジュルカット細胞である。
【０１２０】
代替方法としては，蛋白質をイースト又は昆虫のように低真核の中で、又は細菌のような汎核の中で生成することが出来る。潜在的に適切なイーストの亞種には、サッカロマイシスセレヴィシアエ、スキゾサッカロマイシスポムべ、クルイヴェロマイシス亞種、キャンディーダ、又は異族性の蛋白質を発現出来るイーストの亞種どれでも含む。潜在的に適切な細菌の亞種には、エスケリキア  コライ、バチラス  スブチリス、サルモネラ  チフィムリアム、又は異族性の蛋白質を発現出来る細菌の亞種どれでもを含む。もしその蛋白質がイーストか細菌で出来ている場合、機能的な蛋白質を得る為に、例えば、適当な部位の燐酸エステル化又はグリコシレーションにより、そこで生成された蛋白質を修正する必要があるかもしれない。そのような共有結合の添付は、既知の化学的又は酵素的な方法で達成出来る。
【０１２１】
本発明のもう１つの具体例では、細胞と組織は、誘導可能な規制要素の支配下で、本発明のポリヌクレオチドを形成する内生遺伝子を発現するように設計可能で、その場合、内生遺伝子の規制配列は同族性の組換えで置き換えられる。ここで説明されたように、遺伝子の目標設定を使って、遺伝子の既存の規制領域を、異なる遺伝子から分離された規制配列、又は遺伝子工学方法で合成された新規性のある規制配列で置き換えることができる。その規制配列は、プロモーター、エンハンサー、骨格取付領域、ガティブ規制要素、転写始動部位、制蛋白質結合部位、又はそれらの配列の組合せで構成される。代替方法としては、生成されたＲＮＡ又は蛋白質の構造又は安定性に影響する配列は取替え、除去、添付、又は目標設定で修正することが出来る。これらの配列には、ポリアデニレーション信号、ｍＲＮＡ安定性要素、接着部位、蛋白質の搬送又は分泌特性を改善または修正するためのリーダー配列、又は、蛋白質又はＲＮ  分子の機能又は安定性を変更又は改善する、その他の配列を含む。
【０１２２】
目標設定は、単に規制配列を挿入することで、遺伝子を新しい規制配列の支配下に置くこと、例えば、新しいプロモーター又はエンハンサー又は両者を遺伝子の上流にすることである。代替的には、目標設定は、単に規制要素を削除することで、例えば、組織特定のネガティブ規制要素を削除することである。代替方法としては、目標設定で既存の要素を取替える；例えば，  組織特定エンハンサーは、自然発生の要素よりも広い、又は異なった細胞タイプ特化を持つエンハンサーで置き換えられる。ここでは、自然発生の配列は削除され、新しい配列が加えられる。いずれの場合でも、目標設定の識別は、目標のＤＮＡと繋がっている１個以上の選択可能なマーカー遺伝子を使って容易になり、外因性ＤＮＡが宿主  細胞ゲノムに同化した細胞を選択出来る。目標設定の識別は、また、ネガティブな選択の特性を展示する１個以上のマーカー遺伝子を使って容易になり、ネガティブに選択可能なマーカーは、外因性ＤＮＡに連結されるが、目標配列の脇に位置するように編成され、そして、宿主細胞ゲノムの中の配列との正しい同族性の組換えが、ネガティブに選択可能なマーカーと安定した同化をしないように編成される。この目的に役立つマーカーには、単純疱疹ウイルスタイミディンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、又は細菌性ザンチン‐グアニン燐酸リボシル−トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を含む。
【０１２３】
本発明のこの側面に従って使える遺伝子目標設定、又は遺伝子活性化技術は更に詳しく下記に説明されている：米国特許  Ｎｏ．  ５，２７２，０７１チャペル宛；  米国特許Ｎｏ．  ５，５７８，４６１シャーウイン他宛；  国際申請Ｎｏ．  ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７（ＷＯ９３／０９２２２）セルデンほか、及び国際申請Ｎｏ．  ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６  （ＷＯ９１／０６６６７）  スクールチほか、これらの内容の全体が本書に参考として含まれている。
【０１２４】
（５．７：本発明のポリペプチド）
本発明の分離されたポリペプチドは下記のものから成るポリペプチドを制限無く含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４−７の１つとして設定されたアミノ酸配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３のヌクレオチド  配列のどれか１つによって符号化された  アミノ酸  配列、又は対応する全長の又は成熟した蛋白質。本発明のポリペプチドは又、次のものに符号化された、望ましくは生物学的、又は免疫学的な活性のあるポリペプチドを含む：  （ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３に設定されたヌクレオチド配列の一つを持つポリヌクレオチド、又は（ｂ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４−７に設定されたアミノ酸  配列のどれか１つを符号化するポリヌクレオチド、又は（ｃ）厳格な交配条件下で（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドの補体に交配するポリヌクレオチド。本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４−７として設定されたアミノ酸配列のどれかの、生物学的、又は免疫学的な活性のある変形、又は対応する全長の又は成熟した蛋白質；そしてそれらの“ほぼ同等のもの”（例：アミノ酸の分量が、最低６５％位、最低７０％位、最低７５％位，  最低８０％位、最低８５％位、最低９０％位、典型的には最低９５％位、更に典型的には最低９８％位、又は最も典型的には最低９９％位）で生物学的な活性を持つ。対立形質の変形に符号化されたポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４−７を構成するポリペプチドと比較して、活性が同様か、より高いか、又はより低いかもしれない。
【０１２５】
本発明の蛋白質の構成物は、更に許容できる媒体、例えば、親水性の、例えば、薬剤的に許容できる媒体を含むことが出来る。
【０１２６】
本発明  は、また本発明の宿主細胞を適切な培養媒体で育てる培養を構成するポリペプチド  を生成する方法と、細胞又は細胞が生育される培養体からの蛋白質を純化する方法に関するものである。例えば、発明の方法はポリペプチド生成プロセスを含み、その中で、本発明のポリヌクレオチドを含む適当な発現ベクターを収容する宿主細胞が符号化されたポリペプチドを発現させる条件下で培養される。ポリペプチドは培養体から簡単に回収可能で、又は宿主細胞から作られたリシン化合物から取り出して更に純化する。望ましい具体例は、そのプロセスで生成された蛋白質  は全長又は成熟形体であること。
【０１２７】
本発明は更に、本発明の核酸フラグメント又は退化した変形によって符号化された分離ポリペプチドを提供する。“退化した変形”とは、本発明の核酸フラグメント（例：ＯＲＦ）のヌクレオチドフラグメントとは異なる、ヌクレオチドフラグメントでヌクレオチド配列が異なっている。しかし、遺伝子符号の退化のために、それらは同一のポリペプチド配列を符号化する。本発明の望ましい核酸フラグメントは蛋白質を符号化するＯＲＦである。当業界で既知の色々な方法を利用して、本発明の分離されたポリペプチド又は蛋白質．のどれでも取得できる。最も単純なレベルでは、アミノ酸配列は、商業的に入手できるペプチド合成剤を使って合成出来る。この技術は、小さいペプチドと大きなポリペプチドのフラグメントを生成するのに特に役立つ。フラグメントは、例えば、原住のポリペプチドに対する抗体を生成するのに役立つ。
【０１２８】
代替方法では、自然にポリペプチド又は蛋白質を生成する細胞からのポリペプチド又は蛋白質は純化される。当業界の熟練者なら、本発明の分離されたポリペプチド又は蛋白質の１つを得る為に、既知のポリペプチドと蛋白質の分離方法を簡単に理解できる。これらの方法は、下記のものを制限無く含む：免疫色層分析法、ＨＰＬＣ、サイズ除外色層分析法、イオン交換色層分析法、及び免疫−親近性色層分析法。参考例：スコープス、蛋白質の  純化：  理論と実用、スプリンガ−フェアラグ  （１９９４）；  サムブルックほか、分子クローニング：  研究所マニュアル；  アウスベルほか，  分子生物学における現行のプロトコール。生物学的・免疫学的活性を保持するポリペプチドフラグメントは、約１００個以上のアミノ酸、又は約２００個以上のアミノ酸で構成されるフラグメント、そして特定の蛋白質の領域を符号化するフラグメントを含む。
【０１２９】
本発明のポリペプチドと  蛋白質は、望ましいポリペプチド又は蛋白質を発現するために変更された細胞から交互に純化できる。ここで使用されるように、細胞は、遺伝子の操作で、通常は生成しない、又は通常は低いレベルで生成する、望ましいポリペプチド又は  蛋白質を発現する様に変更されると言われる。当業界の熟練者は、本発明のポリペプチドと蛋白質のひとつを生成する１個の細胞を造る為に、組換え又は合成配列のどちらかを真核性又は汎核性細胞に導入し発現する手順を手安く取り入れることが出来る。
【０１３０】
純化されたポリペプチドは、体外の結合検定に使われ、これは当業界で良く知られた、ポリペプチドに結合する分子を識別する方法である。これらの分子は、次のものを制限無く含む：小さな分子、連結ライブラリーからの分子、抗体又はその他の蛋白質。結合の検定で識別された分子は、それから敵対者又はアゴニスト活性について体内組織培養の中で、又は動物のモデルで試験され、これは当業界で良く知られている。短くすると、分子は、数個の細胞培養か動物の中に注入され、その後細胞／動物の死亡又は残存の長さを試験される。
【０１３１】
更に、結合分子は、トキシンと混合しているかもしれない。例えば、リシン、コレラ、又は細胞に毒素となる化合物である。トキシンと結合する分子の合成物はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４−７の結合分子の詳細によって腫瘍  又は他の細胞に対して目標設定される。
【０１３２】
本発明の蛋白質はまた、遺伝子導入の動物の製品として発現される。例えば、遺伝子導入の牛、山羊、豚、羊のミルクの成分として。これらの動物は、蛋白質を符号化するヌクレオチド配列を含む体細胞、又は細菌細胞を持つことを特徴とする。
【０１３３】
蛋白質は既知の化学合成で製造することも可能である。本発明の蛋白質を合成的な方法で生成する方法は当業者に良く知られている。合成構造の蛋白質  配列は、第一、第二、又は第三の構造的、そして／又は適合的な特徴を蛋白質と共有するので、蛋白質の活性を含む生物学的な特質を所有するかもしれない。この技術は、小さいペプチドと大きなポリペプチドのフラグメントを生成するのに特に役立つ。フラグメントは、例えば、原住のポリペプチドに対する抗体を生成するのに役立つ。従って、これらは、自然で純化された蛋白質の、生物学的に活動的な、又は免疫学的な代用品として、治療用の製剤を選別する時に、そして抗体開発の免疫学的なプロセスで使用できる。
【０１３４】
ここで言う  蛋白質はまた、純化された蛋白質のと似たアミノ酸配列を特徴とする蛋白質を含み、その中に修正は自然にされてあるか、又は人為的に設計してある。例えば、ペプチド又はＤＮＡ配列での修正は、当業界の熟練者が既知の技術を使かって出来ることである。関心事の蛋白質  配列の修正は、符号配列で選択したアミノ酸残基の変更、代用、入れ換え、挿入又は削除を含む。例えば，  １個以上のシスチン残基が削除されるか、又は分子の適応性を変えるために、他のアミノ酸で入れ替えられる。そのような、変更、代用、入れ換え、挿入又は削除の技術は当業熟練者に良く知られている。（参照例：米国特許  Ｎｏ．  ４，５１８，５８４）。望ましくは、そのような変更、代用、入れ換え、挿入又は削除が、蛋白質の  望ましい活性を保持することである。蛋白質の機能に重要な蛋白質の領域は当業に良く知られているいろいろな方法できめられる。たとえば、アラニン走査方法は、１個のまたは連なったアミノ酸をアラニンで系統的に代用し、その後残ったアラニンを含む変形を試験して生物活動を探す。このタイプの分析は代用されたアミノ酸の生物活動における重要性を決める。
【０１３５】
蛋白質の配列の他のフラグメントと派生物で、蛋白質の活性の全部又は一部を保持すると期待され、選別又は他の免疫学的な方法に役立つものは、ここの開示を使って、当業界の熟練者によって簡単に作られる。そのような修正は、本発明に含まれている。
【０１３６】
本発明の分離された  ポリヌクレオチドを１個以上の昆虫発現  ベクター内の適切な規制配列に活性的に連結し、昆虫発現システムを使って、蛋白質を生成できる。バキュウロウイルス／昆虫細胞発現システムの材料と方法は、業者からキットとして入手できる。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．  （ｔｈｅ  ＭａｘＢａｔＴＭ  ｋｉｔ）で、その様な方法は当業界では良く知られており、サマーズとスミス著，  テキサス農業実験ステーションブレティンＮｏ．  １５５５  （１９８７）の記述を参考としてここに加える。ここで使われているように、本発明のポリヌクレオチドを発現する能力がある昆虫細胞は“変形されている”。本発明の蛋白質は、組換え蛋白質を発現するのに適切な培養条件で変形された宿主細胞を培養することによって、作成できる。その結果発現された蛋白質は、ジェル濾過とイオン交換色層分析のような既知の純化プロセスを使って、その培養から純化される（即ち、培養媒体か細胞エキス）。また、蛋白質の純化は下記のものを含む：蛋白質に結合する薬剤を含む親近円柱；コンカナヴァリンＡ−アガローゼ、へパリン−トヨパールＴＭ  又はチバクローム青３ＧＡセファローゼＴＭのような親近樹脂剤の上に位置する１個以上の円柱階段；フェニルエーテル、ブチルエーテル、又はプロピルエーテルのような樹脂を使って疎水性の相互作用色層分析を行う１個以上の階段；又は免疫親近性色層分析。
【０１３７】
代替的には、本発明の蛋白質を、純化を助ける形体で発現させても良い。例えば，下記のような融合蛋白質として発現できる：麦芽糖を結合する蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はチオレドキシン（ＴＲＸ）、又はヒスタグ。そのような融合蛋白質の発現と純化用のキットは夫々次の業者から入手できる：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ，  Ｍａｓｓ．），  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）及び  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。その  蛋白質は又、エピト−プで札を付け、その後エピト−プに向けた特定の抗体を使って純化される。その様なエピト−プの１つ（「ＦＬＡＧ（Ｒ）」）はコダック  （Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，  Ｃｏｎｎ．）から販売されている。
最後に、１個以上の逆相の高性能液体色層分析  （ＲＰ−ＨＰＬＱ  の手順で疎水性のＲＰ−ＨＰＬＣの媒体、例えば、垂れ下がったメチルを持つシリカジェル又は他の油脂グループを使う）を使って蛋白質を更に純化する。上記の純化手順の一部か全部を色々な組合せで使い、ほぼ均一な分離された組換え蛋白質を生成できる。このように純化された蛋白質には他の  哺乳類の  蛋白質が殆ど無く、本発明では“分離された蛋白質”と定義される。
【０１３８】
本発明のポリペプチドは相似物（変形）を含む。本発明のポリペプチドはヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様相似物を含む。これは、本発明のヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様ポリペプチドの本発明のフラグメントを包含し、そのポリペプチドは、１個以上の削除、挿入又は代用されたアミノ酸からなる。また、本発明のヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様ポリペプチドの  相似物は、ヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様ポリペプチドの融合体、又はヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様ポリペプチドの修正体を含み、その中でヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様ポリペプチド又は相似物は、他の半体又は複数の半体に融合される、例えば、半体又は他の治療用薬剤への目標設定。それらの相似物は、活性と／又は安定性のような特性改善を展示するかもしれない。ヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様ポリペプチド、又は相似物に融合される半体の例は、すい臓細胞へポリペプチドを運ぶ目標の半体、例えば、抗体をすい臓細胞へ運び、又は抗体をＴ−細胞、単核細胞、樹状細胞、顆粒性白血球などの免疫細胞、また、すい臓細胞または免疫細胞で発現された受容体とリガンドへの運搬を担当する。ヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様ポリペプチドに融合される他の半体には、治療用の薬剤、例えば免疫抑制剤、たとえばシクロスポーリン、ＳＫ５０６、アザチオプリン、ＣＤ３抗体およびステロイドを含む。また、ヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様ポリペプチドは、免疫刺激剤、免疫調整剤やその他のサイトキンたとえばアルファおよびベータインタアーフェロンに融合することが出来る。
【０１３９】
（５．７．１：ポリペプチドとポリヌクレオチドの独特性と類似性の決定）
望ましい独特性と／又は類似性は、試験された配列間で最大の一対を出すように設計されている。独特性と類似性の決定方法は、コンピュータープログラムに符号化されてあり、下記を制限無く含む：ＧＡＰを含むＧＣＧ  プログラムパッケジ（デヴェロー，  Ｊ．，ほか、核酸調査  １２（１）：３８７  （１９８４）；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ），  ＢＬＡＳＴＰ，  ＢＬＡＳＴＮ，  ＢＬＡＳＴＸ，  ＦＡＳＴＡ  （アルチュル，  Ｓ．Ｆ．  ほか、１．  分子生物学．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０），  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ  （アルチュル  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  核酸調査．  ｖｏｌ．  ２５，  ｐｐ．  ３３８９−３４０２，  参考としてここに含む），  ｅＭａｔｒｉｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ウーほか、Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．  ６，  ｐｐ．  ２１９−２３５  （１９９９），  参考としてここに含む），  ｅＭｏｔｉｆ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ネヴィル−マニングほか，  ＩＳＭＢ−９７，  ｖｏｌ  ４，  ｐｐ．  ２０２−２０９，  参考としてここに含む）  及び、カイト−ドゥーリトル疎水性予測アルゴリズム  （Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １５７，  ｐｐ．  １０５−３１  （１９８２），  参考としてここに含む）。ＢＬＡＳＴプログラムはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ［バイオテクノロジー情報国立センター］（ＮＣＤＩ）  と他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  アルチュル，  Ｓ．，  ほか、ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ２０８９４；  アルチュル，  Ｓ．，  ほか、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）から一般に販売されている。．
（５．８：キメリックと融合蛋白質）
本発明はまた複合又は融合蛋白質を提供する。ここで使われる“複合蛋白質”又は“融合蛋白質”は、他のポリペプチドに活性連結された本発明ポリペプチドで構成される。
【０１４０】
融合蛋白質の内部で、本発明のポリペプチドは、本発明の蛋白質の全部又は一部に対応する。一具体例では、融合蛋白質は、本発明の蛋白質の少なくても１つの生物学的に活性のある部分を含む。他の具体例では、融合蛋白質は、本発明の蛋白質の少なくても２つの生物学的に活性のある部分を含む。融合蛋白質の内部で、“活性連結された”という用語は、本発明のポリペプチドと他のポリペプチドは枠内でお互いに融合されていることの表示を意図する。ポリペプチドは、Ｎ−端末、Ｃ−端末、又は真中に融合できる。
【０１４１】
例えば、１つの具体例では、融合蛋白質は、第二蛋白質の細胞外の領域に活性連結された本発明のポリペプチドを含む。
【０１４２】
他の具体例では、融合蛋白質はＧＳＴ−融合蛋白質で、その中で本発明のポリペプチド配列がＧＳＴ（即ち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されている。
【０１４３】
他の具体例では、融合蛋白質は免疫グロブリン融合蛋白質で、その中で本発明のポリペプチド配列が、免疫グロブリン蛋白質類の一部から取出された配列に融合された１個以上の領域で構成される。本発明の免疫グロブリン融合蛋白質は薬剤の合成物に編製され、対象物に投与して、細胞の表面でのリガンドと本発明の蛋白質との間の相互作用を抑制し、それによって体内の信号の変換を抑制する。免疫グロブリン融合蛋白質を使って、同族のリガンドの生物的な利用可能性を管理する。リガンド／蛋白質  の相互作用の抑制は、繁殖的分化的障害（例えばガン）の治療と細胞の生存の調節（例えば、促進又は抑制）に役立つ。更に、本発明の免疫グロブリン融合蛋白質は２個の受容体を結合して２分子ポリマーにし、それによって細胞内信号を変換する。免疫グロブリン融合蛋白質も  免疫源として使用され、対象物の中に抗体を作り、リガンドを純化し、そして検定を選別する時に、本発明のポリペプチドのリガンドとの相互作用を抑制する分子を識別する。
【０１４４】
本発明の複合又は融合蛋白質は、標準組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、異なったポリペプチド配列に符号化されたＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って、枠内で結さつされる。従来の技術とは、例えば、結さつに鈍い端、又はヨロヨロした端をもつ端末を使い、抑制酵素の消化力で適当な端末を作り、望ましくない結合を避けるために、適当なアルカリ性の燐酸酵素処理として結合力のある末端を充填し、そして酵素的な結さつをする。他の具体例では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成器を含む、従来の技術で合成出来る。代替方法として、遺伝子フラグメントのＰＣＲ拡大は、アンカープライマーを使って遂行され、それによって２個の連続した遺伝子フラグメントの間に相補的な突出部を作り、それらは次に鍛えられ再拡大されて複合遺伝子配列を生成する（参考例：アウスベル他編集、“分子生物学における現行のプロトコール”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９２）。更に、多くの発現ベクターは、融合半体を符号化したものが市場で販売されている（例：ＧＳＴ  ポリペプチド）。本発明のポリペプチドを符号化する核酸を、融合半体が本発明の蛋白質に枠内で連結される様に、そのような発現ベクターの中にクローンすることができる。
【０１４５】
（５．９：遺伝子治療）
本発明のポリヌクレオチド遺伝子における突然変異は、符号化された蛋白質の正常機能を失う結果となる。本発明はこのように遺伝子治療を提供し、本発明のポリペプチドの正常な活性を復活する；又は本発明のポリペプチドに関連した病状を治療する。本発明のポリペプチドを符号化する、機能的な遺伝子の適当な細胞への配達は、ベクターを使って、体外、本来の位置で、又は体内で実行される。更に詳しく言うと、ウイルスのベクターを使って（例えば、腺ウイルス、腺関係のウイルス、又はレトロウイルス）、又は物理的なＤＮＡ移転方法を使って体外で（例：リポソーム又は化学治療）配達される。参考例：アンダーソン、Ｎａｔｕｒｅ  ［自然］，  補充ｖｏｌ．  ３９２，  ｎｏ．  ６６７９，  ｐｐ．２５−２０  （１９９８）。遺伝子治療技術の追加参考資料として、フリードマン、Ｓｃｉｅｎｃｅ科学］，  ２４４：  １２７５−１２８１  （１９８９）、ヴァ−マ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ［サイエンティフィックアメリカン］：  ６８−８４  （１９９０）；  及びミラー，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５７：  ４５５４６０  （１９９２）。本発明のヌクレオチド又は本発明のポリペプチドを符号化する遺伝子に関する入門は、染色体外の基板（一時的発現）又は人工染色体  （安定発現）を使って達成できる。また、細胞に望ましい効果、又は活性を繁殖、又は生成するために、本発明の蛋白質のよこで細胞の体外培養が出来る。処理された細胞は治療目的で体内に導入される。代替的に、その他のヒトの病状では、本発明のポリペプチドの発現を予防し、またはその活動を抑制することは病状の治療に役立つと考えられる。本発明のポリペプチドの発現をネガティブに規制するためにアンティセンス治療又は遺伝子治療を適用することを考慮している。
【０１４６】
蛋白質の発現を抑制する他の方法には、アンティセンス  分子、それらの補体、又は翻訳されたＲＮＡ配列を本発明の核酸に導入する方法、すなわち、当業界で知られている本発明の核酸の除去を図る、目標を定めた削除方法、又は組織特定のサイレンサーのようなネガティブ規制要素を挿入、などの方法が含まれる。さらに、本発明のポリペプチドの抑止は、本発明のポリペプチドのためにコード化する核酸と交配するアンチセンス分子の導入および本発明のポリペプチドのためにコード化する遺伝子の除去によって可能である。
【０１４７】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドを発現  するために、体内で遺伝子的に設計された細胞を提供する。その様なポリヌクレオチドは、細胞内でのポリヌクレオチドの発現を促進する宿主細胞に異族的な規制配列と協力関係にある。
【０１４８】
本発明が提供するＤＮＡ配列の知識は、細胞の調整により内生のポリペプチドの発現を増加、又は  減少させる。細胞は調整可能で（例えば、同族性の組換えによって）、自然発生するプロモーターの全部か一部を、異族性のプロモーターの全部か一部で取替えて、細胞がより高いレベルで蛋白質を発現するようにする。この異族性のプロモーターは、配列を符号化する望ましい蛋白質に作動的に連結される様に挿入される。参考例：ＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９４／１２６５０，  ＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９２１２０８０８，  とＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９１／０９９５５．また、異族性のプロモーターＤＮＡの他に、拡大可能なマーカーＤＮＡ  （例：ａｄａ，  ｄｈｆｒ，  及び多機能を持った、カルバミルリン酸塩シンターゼ、アスパラテート  トランスカルバミラーゼ及びデハイドロオロターゼを符号化するＣＡＤ遺伝子）と／又はイントロンＤＮＡが異族性のプロモーターＤＮＡと共に挿入されることを考慮する。望ましい蛋白質の符号配列に連結されると，  標準選択方法によるマーカーＤＮＡの拡大は、細胞内の望ましい蛋白質符号配列を共に拡大する。
【０１４９】
本発明のもう１つの具体例では、細胞と組織は、誘導可能な規制要素の支配下で本発明のポリヌクレオチドから成る１個の内生遺伝子を発現するように設計できる。その場合、内生遺伝子の規制配列は、同族性の  組換えによって置き換えられる。ここで説明されたように、遺伝子の目標設定を使って、１つの遺伝子の既存の規制領域を、異なる遺伝子から分離された規制配列、又は遺伝子工学方法により合成された新規性のある規制配列で置き換えられる。その様な規制配列は、プロモーター、エンハンサー、骨格取付領域、ネガティブ規制要素、転写始動部位、規制蛋白質結合部位、又はそれらの配列の組合せで構成される。代替的には、生成されたＲＮＡ又は蛋白質の構造又は安定性に影響する配列は、目標設定によって取替え、除去、添加又は修正される。これらの配列は、ポリアデニレーション信号、ｍＲＮＡ安定要素、接着部位、蛋白質の運送又は分泌特性を改善又は修正するリーダー配列、或いは、蛋白質又はＲＮＡ分子の機能又は安定性を変更または改良する、その他の配列で構成される。
【０１５０】
目標設定は、単に規制配列を挿入することで、遺伝子を新しい規制配列の支配下に置くこと、例えば、新しいプロモーター又はエンハンサー又は両者を遺伝子の上流にすることである。代替的には、目標設定は、単に規制要素を削除することで、例えば、組織特定のネガティブ規制要素を削除することである。代替方法としては、目標設定で既存の要素を取替える；例えば、組織特定エンハンサーは、自然発生の要素よりも広い、又は異なった細胞タイプ特化を持つエンハンサーで置き換えられる。ここでは、自然発生の配列は削除され、新しい配列が加えられる。いずれの場合でも、目標設定の識別は、目標のＤＮＡと繋がっている１個以上の選択可能なマーカー遺伝子を使って容易になり、外因性ＤＮＡが宿主細胞ゲノムに同化した細胞  を選択出来る。目標設定の識別は、また、ネガティブな選択の特性を展示する１個以上のマーカー遺伝子を使って容易になり、ネガティブに選択可能なマーカーは、外因性ＤＮＡに連結されるが、目標配列の脇に位置するように編成され、そして、宿主  細胞ゲノムの中の配列との正しい同族性の組換えが、ネガティブに選択可能なマーカーと安定した同化をしないように編成される。この目的に役立つマーカーには、単純疱疹ウイルスタイミディンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、又は  細菌性ザンチン‐グアニン燐酸リボシル−トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を含む。本発明のこの側面に従って使用できる遺伝子目標設定又は遺伝子活性化技術は、より詳細に米国特許Ｎｏ．  ５，２７２，０７１チャッペル宛；  米国特許Ｎｏ．  ５，５７８，４６１シャーウインほか宛；国際申請Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７  （ＷＯ９３／０９２２２）  セルデン他より；そして国際申請  Ｎｏ．  ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６  （ＷＯ９１／０６６６７）  スコウルチ他より；これらはその全体をここに参考として含む。
【０１５１】
（５．１０：遺伝子導入の動物）
本発明のポリペプチドの体内での生物機能を決める望ましい方法では、同族性の組換えを使っている動物の細菌ラインで、本発明が提供する１個以上の遺伝子は超過発現されているか、又は活動停止となっている［カペッキ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８  １２９２  （１９８９）］。外生又は内生プロモーター要素の規制管理の下で遺伝子が超過発現されている動物は、遺伝子導入の動物として知られる。同族性の組換えによって活動停止となっている内生の遺伝子をもつ動物は“ノックアウト”動物とされる。ノックアウト動物、望ましくはヒト以外の哺乳類、についてはここに参考として含まれた米国特許Ｎｏ．  ５，５５７，０３２に記載のとおり、準備できる。遺伝子導入の動物が生物学的なプロセスで、そして望ましくは病気の状態で、本発明のポリペプチドが演じる役割を決めるのに役立つ。遺伝子導入の動物は、油脂の新陳代謝を調節する化合物を識別するモデルシステムとして有用である。遺伝子導入の動物は、望ましくはヒト以外の哺乳類で、ここに参考として含まれた米国特許Ｎｏ．  ５，４８９，７４３とＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ９４／２８１２２に記載された方法を使って生成できる。
【０１５２】
本発明のポリヌクレオチドのプロモーターの全部か一部が活性化か非活性化されて、本発明のポリヌクレオチドの発現のレベルが変更された場合、遺伝子導入の動物は準備できる。非活性化は、上記の同族性の組換え方法を使って実行できる。活性化は、蛋白質発現を増加するために、同族性のプロモーターを補充するか、又は取替えてでも達成出来る。同族性のプロモーターは、特定の組織にプロモーター活性を与えるとされる１個以上の異族性のエンハンサー要素を挿入して補充できる。
【０１５３】
（５．１１：ヒトのフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドの用途と生物活動）
本発明のポリヌクレオチドと蛋白質は、ここに特定された１個以上の用途又は生物活動（ここに挙げた検定に関連するものを含む）を展示することが期待される。本発明の蛋白質について説明された用途又は活動は、その蛋白質又はその蛋白質を符号化するポリヌクレオチドの投与又は使用によって提示される（例えば、遺伝子治療又はＤＮＡの導入に適したベクター）。特殊な状態におけるメカニズム又は病理学が、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド又はそのモジュレーター（アクティベーター  又はインヒビター）は治療を必要とする対象物に効果があるかどうかを決める。従って、「本発明の治療構成物」は下記で構成される：分離されたポリヌクレオチド（組換えＤＮＡ分子、クローンされた遺伝子とその退化変形体を含む）、又は本発明のポリペプチド  （全長  蛋白質、成熟蛋白質及び切断又はその領域を含む）、又は化合物と他の物質で、目標の遺伝子／蛋白質発現又は目標の蛋白質の活動のレベルでの、目標の遺伝子製品の全体活動を調整するもの。そのような修正体は、ポリペプチド、類似形、（変形ｓ）で，  フラグメントと融合蛋白質、抗体そして他の結合蛋白質を含む；化合物で、本発明のポリペプチドを直接又は間接に活性化又は抑制する（ここで述べられたように、薬剤選別検定で識別された）；アンティセンス  ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドで３本螺旋の形成に適する；そして特に、抗体又は他の結合パートナーで、本発明の  ポリペプチドの１個以上のエピト−プを特に認知する。
本発明のポリペプチドは、同様に細胞の活性化に関係するか、又はここに述べられた、その他の生理学的な経路の１つに関連している。
【０１５４】
（５．１１．１：調査用途と実用性）
本発明が提供するポリヌクレオチドは調査研究社会で色々な目的に使用できる。そのポリヌクレオチドは以下の様に使用できる：分析、特徴調査又は治療の用途に組換え蛋白質を発現する為に；対応する蛋白質が優先的に発現される組織のマーカーとして（本質構成的に、又は組織分化、開発又は病気の特定の段階で）；ジェルの分子量マーカーとして；染色体のマーカー、又は染色体識別の札［タグ］（表示を付けて）として、又は関連した遺伝子位置の地図を作成する為に；潜在的な遺伝子障害を特定するために、患者の内在的なＤＮＡ配列を比較する為に；交配のプローブとして、そして新規性のある、関連したＤＮＡ配列を発見する為に；遺伝子の指紋取りのためにＰＣＲプライマーを取出す情報源として；他の新規のポリヌクレオチドを見つける過程で、既知の配列を“除外”するプローブとして；オリゴマーを選択して“遺伝子チップ”に添付するため、又は発現パターンの検査などのその他のサポート；ＤＮＡ免疫技術を使って、反蛋白質  抗体を上げること；そして、ＤＮＡ  抗体を上げる、又は他の免疫反応を引出す抗原として使用できる。ポリヌクレオチドが、他の蛋白質を結合する、又は潜在的に結合する、蛋白質を符号化する場合（例えば、受容体とリガンドの相互作用において），  ポリヌクレオチドはまた相互作用のワナの  検定に使い（例えばギュリスほか、細胞７５：７９１−８０３（１９９３）で記述されたもの）、即ち、他の蛋白質を符号化しそれで結合が発生するポリヌクレオチドを識別する為に、又は結合の相互作用の抑制剤を識別する為に使用する。
【０１５５】
本発明が提供するポリペプチドは、同様に下記のように検定で使用できる：大量選別の為の複数の蛋白質のパネルで生物活性を判断するため；抗体を上げるため、又は  他の免疫反応を引出すため；生物の液体における蛋白質（又はその受容体）のレベルを数量的に決定する為の検定で試薬として；対応するポリペプチドが優先的に発現される組織のマーカーとして  （本質構成的に、又は組織分化、開発又は病気の特定の段階で）；そして勿論、相関した受容体又はリガンドを分離するために。蛋白質が他の蛋白質と結合するか、結合の可能性を持つ場合（例えば、受容体とリガンドの相互作用において）、その蛋白質は結合を起こす他の蛋白質の識別、または結合作用の抑止剤の識別に利用することができる。これらの結合の相互作用に係わる蛋白質は、ペプチド、又は結合相互作用の小さな分子のインヒビター（抑制剤）、又はアゴニスト（対抗剤）の選別にも使用される。
【０１５６】
本発明のポリペプチドはまた、ヴォン・ヴィレブランド病／トロンボスポンジン様蛋白質と特に免疫反応する抗体物質を作るのに役立つ。本発明のポリペプチドに結合する抗体とその部分（ｅ．ｇ．，  Ｆａｂ  フラグメント）は、試料の中にその様なポリペプチドが存在することの確認に使用できる。
【０１５７】
その確認は、適切な免疫検定形態を使って行われ、特に抗体に結合された本発明のポリペプチドはポジティブコントロールとして使える。
【０１５８】
これらいずれの調査材料も、試薬の品質に又はキット形態にして調査用製品として開発可能である。
【０１５９】
上記に示した用途を実行する方法は当業界の熟練者には良く知られている。その様な方法を開示した参考資料は、以下のものを制限なく含む：“分子のクローニング：  研究所  マニュアル”、第２版  ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  サムブルック，  Ｊ．，  Ｅ．  Ｆ．  フリッチと  Ｔ．  マニアティス  編．，  １９８９、及び“酵素学方法論：  分子クローニング  技術への手引き”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  バーガー，  Ｓ．  Ｌ．  及び  Ａ．  Ｒ．  キンメル編．，  １９８７．
（５．１１．２：栄養面での用途）
本発明のポリヌクレオチドと  ポリペプチドは、また栄養源又は補充品として使用できる。そのような用途は、制限無く、蛋白質又はアミノ酸の補充品として、炭素、窒素、炭水化物のそれぞれの供給源として使用できる。その場合、ポリペプチド又は本発明のポリヌクレオチドは、各生物の飼料に添加できる、又は、粉末、錠剤、溶液、縣濁液、又はカプセルの形で、固体、液体の調剤を投与できる。微生物の場合、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドは微生物が培養されている培養体に添加できる。
【０１６０】
更に、本発明のポリペプチドは、分子量マーカーとして、また食料補充品として使用できる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を含むポリペプチドは、その未処理でグリコシレーションがされていない状態では、約２４ｋＤＡの分子量を持つ。蛋白質の食料補充品は良く知られており、本発明のポリペプチドを含む、適切な食料補充品の調製は、食料調合業の技術レベルで対応出来る。
【０１６１】
（５．１１．３：サイトキンと細胞繁殖／分化の活動）
本発明のポリペプチドは、サイトキン、細胞繁殖（誘発又は抑制のどちらか）、細胞分化（誘発又は抑制のどちらか）の活動を展示し、又は細胞総数における他のサイトキンの生成を誘発するかもしれない。本発明の  ポリヌクレオチドはそのような特質を展示するポリペプチドを符号化することが出来る。全ての既知のサイトキンを含む、これまで発見された多くの蛋白質要素は１回以上の要素依存の細胞繁殖検定で活性を展示した。従って、検定はサイトキン活動の便利な確認方法として役立つ。本発明の治療的構成内容の活動は、定常要素に依存する細胞繁殖の検定によって立証され、次の細胞ラインを制限無く含む：  ３２Ｄ，  ＤＡ２，  ＤＡ１Ｇ，  Ｔ１Ｏ，  Ｂ９，  Ｂ９／１１，  ＢａＦ３，  ＭＣ９／Ｇ，  Ｍ＋（ｐｒｅＢ  Ｍ＋），  ２Ｅ８，  ＲＢ５，  ＤＡ１，  １２３，  Ｔ１１６５，  ＨＴ２，  ＣＴＬＬ２，  ＴＦ−１，  Ｍｏ７ｅ，  ＣＭＫ，  ＨＵＶＥＣ，  及びＣａｃｏ。
【０１６２】
本発明の治療的構成内容は下記に使用できる：
Ｔ−細胞又はチモサイト繁殖の検定は、下記に述べられたものを制限無く含む：免疫学における現在のプロトコール、編集Ｊ．  Ｅ．  コリガン，  Ａ．  Ｍ．  クルイスビーク，  Ｄ．  Ｈ．  マーグリース，  Ｅ．  Ｍ．  シェバック，  Ｗ．  ストローバー、出版．  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （第３章、ネズミのリンフォサイト機能の体外検定３．１−３．１９；第７章，  ヒトにおける免疫学の研究）；高井ほか、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；  バータニオリほか、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４５：１７０６−１７１２，  １９９０；  バータニオリほか、細胞免疫学  １３３：３２７−３４１，  １９９１；  バータニオリほか、Ｉ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：３７７８−３７８３，  １９９２；  ボウマンほか、Ｉ．．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：１７５６−１７６１，  １９９４。
【０１６３】
サイトキン生成と／又は  膵臓細胞、リンパ腺細胞、又はチモサイトの繁殖の検定は下記に述べられたものを制限なく含む：ポリクローンのＴ細胞の刺激、クルイスビーク，  Ａ．  Ｍ．  ａｎｄ  シェバック，  Ｅ．  Ｍ．  免疫学における現在のプロトコール．  Ｊ．  Ｅ．  ｅ．ａ．  コリガン編集．  Ｖｏｌ  Ｉ  ｐｐ．  ３．１２．１−３．１２．１４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ．  １９９４；  及び、ネズミとヒトのインターロイケン−γの測定、シュライバー，  Ｒ．  Ｄ．  免疫学における現在のプロトコール．  Ｊ．  Ｅ．  ｅ．ａ．  コリガン編集．  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．  ６．８．１−６．８．８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ．  １９９４。
【０１６４】
ヘマトポイエティック及びリンフォポイエティック細胞の繁殖と分化の検定は、下記に述べられたものを制限無く含む：  「ヒトとネズミ類のインターロイキン２と４の測定」、ボトムリ，  Ｋ．，  デイビス，  Ｌ．  Ｓ．  及びリプスキー  Ｐ．  Ｅ．  ；「免疫学における現在のプロトコール」１．  Ｅ．  ｅ．  ａ．  コリガン  ｅｄｓ．  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．  ６．３．１−６．３．１２，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ．  １９９１；デフリースほか、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：１２０５−１２１１，  １９９１；  モローほか、自然  ３３６：６９０−６９２，  １９８８；グリーンバーガーほか、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８０：２９３１−２９３８，  １９８３；  ネズミとヒトのインターロイキン６の測定−ノーダン，  Ｒ．  免疫学における現在のプロトコール．  Ｊ．  Ｅ．  コリガン  ｅｄｓ．  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．  ６．６．１−６．６．５，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ．  １９９１；  スミスほか，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８３：１８５７−１８６１，  １９８６；  ヒトのインターロイキン１１の測定−ベネット，  Ｆ．，  ジアノッティ，  Ｊ．，  クラーク，  Ｓ．  Ｃ．及びターナー，  Ｋ．  Ｊ．  免疫学における現在のプロトコール．  Ｊ．  Ｅ．  コリガン編集．  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．  ６．１５．１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ．  １９９１；  ネズミとヒトのインターロイキン９の測定−シアレッタ，  Ａ．，  ジアノッティ，  Ｊ．，  クラーク，  Ｓ．  Ｃ．及びターナー，  Ｋ．  Ｊ．  免疫学における現在のプロトコール．  Ｊ．  Ｅ．  コリガンｅｄｓ．  Ｖｏｌ  １  ｐｐ  −  ６．１３．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ．  １９９１。
【０１６５】
Ｔ−細胞クローンの抗体への反応（これは、他のもののうち特に、ＡＰＣ−Ｔ  細胞の相互作用に影響する蛋白質と直接なＴ細胞効果を、繁殖とサイトキン生成を測定することによって識別する）の検定は下記に述べられたものを制限無く含む：免疫学における現在のプロトコール、編集：  Ｊ．  Ｅ．  コリガン、Ａ．  Ｍ．  クルイスビ−ク，  Ｄ．  Ｈ．  マーグリース，  Ｅ．  Ｍ．  シェバック，  Ｗ．ストローバー、出版社  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、ネズミのリンフォサイト機能の体外検定；第６章、サイトキンとそれらの細胞受容体；第７章，  ヒトにおける免疫学の研究）；ワインバーガーほか、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：６０９１−６０９５，  １９８０；  ワインバーガーほか、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １１：４０５４１１，  １９８１；  高井ほか、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；  高井ほか、Ｊ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８−５１２，  １９８９．
（５．１１．４：幹細胞成長要素の活動）
本発明のポリペプチドは、幹細胞成長要素活性を展示し、原始の黴菌細胞、胚幹細胞，  ヘマトポイエティックな幹細胞と／又は黴菌ラインの幹細胞を含むプルリポーテント及びトチポーテントな幹細胞の繁殖、分化と生存に活躍しているかもしれない。本発明のポリペプチドを体内又は体外の幹細胞に投与すると、トチポーテント又は  プルリポーテントな状態で細胞総数を維持したり拡大することが予想される。それは、損傷した、又は病気にかかった組織の再構築、移植、生物学的薬剤の製造、バイオセンサーの開発に役立つかもしれない。大量のヒト細胞を製造する能力は、ヒト蛋白質の生成に重要な実際用途を持ち、パーキンソン氏病、アルツハイマー氏病、その他の神経退化の病気を治療するために、現在それは非人間的供給源、又はドーナー、細胞移植から取得されねばならない；移植の組織、例えば骨髄、皮膚、軟骨、腱、骨、筋肉（心筋を含む）、血管、網膜、神経細胞、胃腸の細胞、その他；そして移植用の器官、例えば、腎臓、肝臓、膵臓  （インシュリン細胞群を含む）、心臓と肺臓。
【０１６６】
望ましい効果を達成するために、複数の異なった外因性の成長要素と／又はサイトキンを本発明のポリペプチドと共に投与されることを考慮しており、成長要素は以下のものを含む：他の幹細胞の維持要素、そして特に幹細胞要素（ＳＣＦ）を含む、白血病抑制要素（ＬＩＦ），  Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、インターロイキン，  ＩＬ６に融合された、組換え水溶性のＩＬ−６受容体、マクロファージ炎症性の蛋白質Ｉ−アルファ  （ＭＩＰ−１−アルファ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血小板要素  ４  （ＰＦ−４）、血小板から取出された成長要素（ＰＤＧＦ）、中性の成長要素、そして基本的なファイブロブラスト成長要素（ｂＦＧＦ）。
【０１６７】
トチポーテント幹細胞は、ほぼ如何なる成熟細胞タイプを発生させるので、培養中のこれらの細胞の拡大は、大量の成熟細胞の生産を助ける。幹細胞の培養技術は当業界で知られており、本発明の  ポリペプチドの投与は、選択的に他の成長要素そして／又はサイトキンと共にする、そして幹細胞総数の生存と繁殖を高めることが期待されている。これは、本発明のポリペプチド  を培養媒体に直接投与することによって達成出来る。代替方法としては、本発明のポリペプチドに代わって符号化するポリヌクレオチドと形質移入されたストロマ支持細胞が培養又は体内の幹細胞総数の為のフィーダー層として使える。フィーダー層のストロマ支持細胞は、胚状の骨髄ファイブロブラスト、骨髄ストロマ細胞、胎児の肝臓細胞、又は培養された胚状のファイブロブラストを含む（参照：米国特許  Ｎｏ．  ５，６９０，９２６）。
【０１６８】
幹細胞自体は、本発明のポリペプチドのオートクリン発現を誘発するために本発明のポリヌクレオチドと形質移入される。これによって、分化されていないトチポーテント／プルリポーテントな幹細胞ラインの生成が可能となり、それらはそのまま使用可能で、又はそれから望ましい成熟細胞タイプに分化できる。これらの安定した細胞ラインはまた分化されていないトチポーテント／プルリポーテントなｍＲＮＡの源  となり、ポリメラーゼ連鎖反応実験用のｃＤＮＡのライブラリやテンプレートを作成できる。これらの研究によって、幹細胞の繁殖と／または維持を規制する幹細胞総数の中の分化発現された遺伝子の分離と識別が可能となる。
【０１６９】
トチポーテント幹細胞総数の拡大と維持は、多くの病理学的な症状の治療に役立つ。例えば、本発明の  ポリペプチドは、培養体内の幹細胞を巧く操作する為に使われ、病気、自動免疫の疾病、事故による傷害、又は遺伝障害によって損傷を受けた細胞を補充したり、取替えたりするために使用される神経上覆細胞を作り出す。本発明のポリペプチドは、中性細胞の発生を誘導したり、神経と脳の細胞組織を再生する上で有用であり、即ち、中枢及び末梢神経の疾病や神経病理、また、神経細胞や神経組織の悪化、死滅、又は傷害を伴う機械的、外傷的障害の治療に使われる。更に、拡大された幹細胞の総数は、遺伝子療法の目的の為、そして移植または注入の後、植え付けた組織を宿主が拒否する可能性を減らす為、遺伝学的に変更することも出来る。
【０１７０】
本発明のポリペプチドの発現と幹細胞に対するその影響も操作可能で、管理された分化を達成して更に分化された幹細胞の細胞タイプにすることが出来る。分化されていない幹細胞総数から特定の分化された細胞タイプの純粋な総数を取得する広範的な方法としては、選択可能なマーカーを作動する、細胞タイプに適合したプロモーターを使用することである。この選択可能なマーカーは、望ましいタイプの細胞だけを生存させる。例えば、幹細胞は心筋細胞に（ウオバス他、分化、４８：１７３−１８２，  （１９９１）；  クルグ他、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９８（１）：２１６−２２４，  （１９９８））又は骨格筋肉細胞に（ブラウダ−、Ｌ．  Ｗ．  筋肉組織工学理論  ｅｄｓ．  ランザ他、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９７））分化するように誘発できる。代替方法としては、レチノ酸のような分化要素と、内生的な幹細胞要素活動を抑制して分化を進めるように、本発明の  ポリペプチドの敵対物とを存在させた所でその幹細胞を培養することによって、幹細胞の指揮された分化を達成出来る。
【０１７１】
幹細胞の体外培養体を使って、本発明の  ポリペプチドが幹細胞の成長要素活動を見せるかどうかを判定することが出来る。幹細胞は様々な細胞源（体内で血液細胞を増殖する幹細胞と胚体の幹細胞を含む）から分離され、トンプソンほかによるＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９２：７８４４−７８４８（１９９５）で述べられているように、本発明のポリペプチドのみの前で、又は他の成長要素又はサイトキニンとの組合せで、フィーダー層で培養される。本発明のポリペプチドの、幹細胞の繁殖を誘発する能力は、例えばバーンスタイン他の“血液”７７：２３１６−２３２１（１９９１）に述べられてあるように、準固体に支持された群生の形成によって決定される。
【０１７２】
（５．１１．５：造血調節活性）
本発明のポリペプチドは造血調節に関連しており、従って、骨髄またはリンパ細胞障害の治療に関連するものである。コロニー形成細胞の支持、あるいは因子依存性細胞系の支持においてわずかでも生物活性があることから、造血調節への関与を示し、例えば、赤血球前駆細胞単独で、または他のサイトカインと共に  成長や増殖を支持し、それによって、例えば、種々の貧血治療、または赤血球前駆体あるいは赤血球、またはそのいずれかの産生を刺激するための照射／化学療法と併用して使用するなどの利用性が示される、また、例えば、結果的に生じる骨髄抑制の予防または治療のための化学療法との併用において有用な顆粒球や単球／マクロファージ（すなわち、従来のＣＳＦ活性）などのような骨髄細胞の成長および増殖の支持において、巨核球の成長と増殖、したがって、血小板の成長・増殖を支持し、それによって、血小板減少症のような様々の血小板障害（疾患）に、一般に血小板輸血の代わりに、または補助として使用してその予防または治療を可能にする、および／あるいは、上記の造血細胞のいずれか、またはすべてに対して成熟を可能にする造血幹細胞の成長および増殖を支持し、したがって、種々の幹細胞障害（通常、再生不良性貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症をこれらに限らず含む移植によって通常治療される疾患など）、および、生体内か、または生体外（すなわち、骨髄移植、または末梢前駆細胞移植（相同または異種）と併せて）のいずれかにおいて、照射／化学療法後の幹細胞分画を正常細胞として、または遺伝子療法用遺伝子操作された細胞として再増殖させるなど、これらに限らず治療的利用性が示される。
【０１７３】
本発明の治療的組成物は以下において使用できる。
【０１７４】
種々の造血細胞系の増殖および分化に適した上述の検定
胚性幹細胞分化（胚性分化造血に影響を及ぼすタンパク質を他から同定する）検定には
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１４１−１５１，  １９９５；  Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：４７３−４８６，  １９９３；  ＭｃＣｌａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９０３−２９１５，  １９９３に記載の検定があり、またこれに限らない。
【０１７５】
幹細胞の生存および分化のための検定（リンパ−造血を調節するタンパク質を他から同定する）はＭｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ，  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｒ．  １．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  Ｖｏｌ  ｐｐ．  ２６５−２６８，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４；  Ｈｉｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５９０７−５９１１，  １９９２；  Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｒｎａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，  ＭｃＮｉｅｃｅ，  Ｉ．  Ｋ．  ａｎｄ  Ｂｒｉｄｄｅｌｌ，  Ｒ．  Ａ．  Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  Ｖｏｌ  ｐｐ．  ２３  ３９，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４；  Ｎｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２２：３５３  ３５９，  １９９４；  Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，  Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  Ｖｏｌ  ｐｐ．  １−２１，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４；  Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，  Ｓｐｏｏｎｃｅｒ，  Ｅ．，  Ｄｅｘｔｅｒ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ａｌｌｅｎ，  Ｔ．  Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｐｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｒ．  １．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  Ｖｏｌ  ｐｐ．  １６３−１７９，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４；  Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙ，  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  Ｈ．  Ｊ．  Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｒ．  １．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  Ｖｏｌ  ｐｐ．  １３９−１６２，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １９９４に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０１７６】
（５．１１．６：組織成長活性）
本発明のポリペプチドは、また骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織の成長あるいは再生、および創傷治癒および組織修復や置換や火傷、切開や潰瘍の治癒にも関与する。
【０１７７】
骨が正常に形成されていない場合において、靭帯または骨あるいはその両者の成長を促す本発明のポリペプチドは、人および他の動物における骨折および靭帯損傷あるいは欠損症の治癒において使用できる。本発明のポリペプチド、抗体、結合パートナーまたは他のモジュレータの組成物は開放骨折同様皮下骨折の軽減において予防的に使用でき、また人工関節の固定をも改善する場合がある。骨形成物質によって誘発される新規の骨形成は、先天性、外傷性、または腫瘍学的切除性頭蓋顔面欠損の修復に役立つし、また美容整形外科においても有用である。
【０１７８】
本発明のポリペプチドは、また骨形成細胞の誘引、骨形成細胞の成長刺激、骨形成細胞前駆体の分化の誘導に関与する。骨または靭帯修復あるいはその両者の刺激によるか、または、炎症あるいは炎症過程により媒介される組織破壊過程（コラゲナーゼ活性化、破骨細胞活性化など）を阻止するによる、骨粗しょう症、変形性関節炎（骨関節炎）、骨変性疾患、または歯周病の治療もまた本発明の組成物の使用が可能な場合がある。
【０１７９】
本発明のポリペプチドが関与する組織再生活性のもう一つのカテゴリーは、腱／靭帯様組織形成である。腱／靭帯様組織または他の組織形成の誘発は、これらの組織が正常に形成されていない場合において、人および他の動物における腱あるいは靭帯の損傷、奇形および他の腱または靭帯欠損の治癒に使用できる。このような腱／靭帯様組織誘発性タンパク質を使用した製剤は、腱または靭帯の骨あるいは他の組織への固定改善や、腱または靭帯組織の欠損修復にも使用できるだけでなく、腱または靭帯組織の破損を防ぐための予防にも使用できる場合がある。本発明の組成物によって誘発されたデノボ腱／靭帯様組織形成は、先天性、外傷性、または他の原因の腱あるいは靭帯欠損の修復に寄与し、また、腱または靭帯の取付け、修復のための美容整形手術にも使用できる。本発明の組成物は腱または靭帯形成細胞の誘発、腱または靭帯形成細胞の成長刺激、腱または靭帯形成細胞前駆体の分化の誘導、あるいは、腱／靭帯細胞または組織修復に作用するよう生体内に戻す生体外前駆体の成長の誘発を行う環境を提供する。本発明の組成物は、また腱炎、手根管症候群および他の腱または靭帯欠損症の治療にも有用である。本組成物には、また適切な基質および／または技術上周知のキャリアとしての隔離作用物質も含まれていることがある。
【０１８０】
本発明の組成物はまた、神経細胞の増殖と神経や脳組織の再生、すなわち、中枢および末梢神経系疾患や神経障害の治療に有用であるだけでなく、また神経細胞や神経組織の変性、死または外傷を含む機械的、外傷性障害にも有用である。さらに厳密には、末梢神経損傷、末梢神経障害および限局性神経障害などのような末梢神経系疾患、また、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症およびシャイ・ドレーガー症候群などの中枢神経系疾患の治療にも使用することができる。さらに、本発明によって治療される状態には、脊髄障害、脳外傷のような機械的、外傷性疾患および脳卒中のような脳血管疾患が含まれる。
【０１８１】
本発明の組成物は、またプレッシャー潰瘍、血管性機能不全に関連する潰瘍、手術創傷および外傷性創傷などをこれらに限らず含む非治癒性創傷の閉合をより良く、より速く促進するのに役立つ場合がある。
【０１８２】
本発明の組成物はまた、臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋肉、心筋）および血管（血管内皮を含む）組織などのような他の組織の産生または再生、あるいは、このような組織を形成する細胞の増殖の促進にも関与する。望ましい効果の一部は正常組織の再生を可能する線維性瘢痕の抑制または変調による。本発明のポリペプチドはまた、血管原性作用をも示す場合がある。
【０１８３】
本発明の組成物は、また腸保護、または肺や肝臓線維症の治療、種々の組織の再灌流損傷および組織的サイトカイン損傷から生じた状態にも有用である。
【０１８４】
本発明の組成物はまた、前駆体組織や前駆体細胞からの、前記した組織の分化を促進または阻害するために、または前記の組織の成長阻害にも有用である。
【０１８５】
本発明の治療的組成物は以下において使用できる。
【０１８６】
組織産生活性検定にはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ９５／１６０３５  （ｂｏｎｅ，  ｃａｒｔｉｌａｇｅ，  ｔｅｎｄｏｎ）；  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ９５／０５８４６  （ｎｅｒｖｅ，  ｎｅｕｒｏｎａｌ）；  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ９１１０７４９１  （ｓｋｉｎ，  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）に記載の検定があり、またこれに限らない。
【０１８７】
創傷治癒活性検定にはＷｉｎｔｅｒ，  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，  ｐｐ．  ７１−１１２  （Ｍａｉｂａｃｈ，  Ｈ．  Ｉ．  ａｎｄ  Ｒｏｖｅｅ，  Ｄ．  Ｔ．，  ｅｄｓ．），  Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ａｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ｅａｇｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｒｔｚ，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ７１：３８２−８４  （１９７８）に記載の検定があり、またこれに限らない。
【０１８８】
（５．１１．７：免疫刺激または抑制活性）
本発明のポリペプチドはまた、ここに記載の検定による活性をこれに限らず含む免疫刺激または免疫抑制活性を示す。本発明のポリヌクレオチドはこのような活性を示すポリペプチドをコードできる。タンパク質は、種々の免疫不全や免疫疾患（重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）など）の治療、例えば、Ｔおよび／またはＢリンパ球の成長や増殖の調節（上方、または下方）と同様、ＮＫ細胞や他の細胞集団の細胞溶解活性への作用においても有用である。これらの免疫不全は細菌あるいは真菌感染によるだけでなく、遺伝的またはウイルス（例えば、ＨＩＶ）、あるいは自己免疫疾患によって引き起こされる場合がある。さらに厳密には、ＨＩＮＴ、肝炎ウイルス、ヘルペス・ウイルス、放線菌、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ（リーシュマニア属）、マラリア  ｓｐｐ．  による感染症およびカンジダ症などのような種々の真菌感染症を含み、ウイルス、細菌、真菌または他の感染症によって生じる感染疾患は、本発明のタンパク質を用いて治療できる場合がある。もちろん、この点で、本発明のタンパク質は、免疫系への強化が一般に望ましい場合に、つまり、癌の治療においてもまた有用である。
【０１８９】
本発明のタンパク質を用いて治療される自己免疫疾患には、例えば、結合組織病、多発性硬化病、全身性エリテマトーデス、関節リューマチ、自己免疫肺性炎症、ギラン・バレー症候群、自己免疫甲状腺炎、インシュリン依存性真性糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主疾患および、自己免疫炎症性眼疾患が含まれる。このような本発明のタンパク質（または抗体を含むその拮抗物質）は、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸器系障害のようなアレルギー反応および状態（例えば、アナフィラキシー、血清病、薬物反応、食物アレルギー、昆虫毒液アレルギー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、過敏性肺炎、蕁麻疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、多型性紅疹、スティーヴンス・ジョンソン症候群、アレルギー性結膜炎、アトピー性角結膜炎、性病性角結膜炎、巨大乳頭状結膜炎、接触アレルギー）の治療にも有用である。他の免疫抑制が望まれる（例えば、臓器移植を含む）状態もまた、本発明のタンパク質（またはその拮抗物質）を用いて治療することができる場合がある。フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチドまたはその拮抗物質のアレルギー反応に対する治療効果は、累積性接触増加テスト（Ｌａｓｔｂｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １２５：５９−６６，  １９９８）、皮膚突き傷テスト（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｌｅｒｇｙ  ５４：４４６−５４，  １９９９）、モルモット皮膚感作テスト（Ｖｏｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｔｏｘｏｃｏｌ．  ７３：５０１−９）、およびマウス局部リンパ節試験ａｓｓａｙ  （Ｋｉｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｈｅａｌｔｈ  ５３：５６３−７９）などの生体内動物モデルによって評価できる。
【０１９０】
本発明のタンパク質を用いる場合、また、多くの方法で免疫反応を変調することも可能である。下方調節は、すでに進行中の免疫反応を抑制するか、または阻止するやり方で行われるか、あるいは、免疫反応の誘導の防御に関与する。活性Ｔ細胞の機能はＴ細胞反応の抑制によるか、またはＴ細胞における特異的トレランス（寛容）の誘導によって、あるいはその両方によって抑制される。Ｔ細胞反応の免疫抑制は一般に活性、非抗原特異的過程であり、これはＴ細胞の抑制物質への持続的暴露を必要とする。Ｔ細胞での非反応性または無反応の誘導に関連するトレランスは、それが一般に抗原特異的であり、寛容化物質への暴露が中止された後にも持続するという点で免疫抑制と区別される。操作的には、トレランスは、寛容化物質の無い状態における特定抗原への再暴露時にＴ細胞反応が起こらないことによって示される。
【０１９１】
下方調節または１つ以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えば、１１７のように）をこれに限らず含む）の防御、例えば、活性Ｔ細胞による高度レベルのリンホカイン合成の防御は、組織、皮膚および臓器移植の状態において、また、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）において有用である。例えば、Ｔ細胞機能を阻止することは、組織移植における組織破壊を減少する結果となるはずである。一般に、組織移植において移植の拒絶反応は、Ｔ細胞がそれを異物として認識することによって開始され、その後に移植片を破壊する免疫反応が続く。本発明の治療的組成物の投与は、Ｔ細胞のような免疫細胞によるサイトカインの合成を妨げ、したがって、免疫抑制剤として作用する。さらに、同時刺激がないことによって、Ｔ細胞が無反応化（アネルギー化）されることになり、これによって、被験者におけるトレランスが誘導される場合もある。Ｂリンパ球抗原阻止試薬による長期トレランスの誘導によって、これらの阻止剤の反復投与の必要性がなくなる。被験者において十分な免疫抑制またはトレランスを得るには、Ｂリンパ球抗原の組合せの機能を阻止する必要がある場合もある。
【０１９２】
臓器移植拒絶反応またはＧＶＨＤの予防における特定の治療的組成物の効力は、ヒトにおける有効性についての予測である動物モデルを用いて評価することができる。使用できる適切なシステムの例として、ラットにおける同種心臓移植片や、マウスにおける異種間膵島細胞移植片があり、これらのどちらもが、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：７８９−７９２  （１９９２）  およびＴｕｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８９：１１１０２−１１１０５  （１９９２）に述べられているように生体内ＣＴＬＡ４Ｉｇ  融合タンパク質の免疫抑制効果を検査するために使われている。さらに、ＧＶＨＤ（移植片対宿主疾患）のマウスモデル（Ｐａｕｌ  ｅｄ．，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９，  ｐｐ．  ８４６−８４７参照）  はこの疾患の進展時の本発明の治療的組成物の効果を測定するために使うことができる。
【０１９３】
抗原機能の阻止は、また自己免疫疾患の治療に対して治療的に有用である。多くの自己免疫疾患は、自己組織に反応的なＴ細胞の不適切な活性化の結果、および、その疾患の病態に関与するサイトカインや自己抗体の産生を促進した結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化の防御は病状を減少するか、または除去する。Ｔ細胞の刺激を阻止する試薬の投与は、Ｔ細胞活性化の抑制、およびこの疾患の過程に関与する自己抗体またはＴ細胞由来サイトカインの産出の防御に使うことができる。さらに、ブロッキング試薬の効力によって、この疾患からの長期的緩解につながる自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的トレランスが誘導される場合がある。自己免疫疾患の予防または緩解におけるブロッキング試薬の効力は、よく特徴化された、ヒト自己免疫疾患の動物モデルを用いて測定できる。この例には、マウス実験的自己免疫脳炎、ＭＥＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢ  ハイブリッド・マウスにおける全身性全身性エリスマトーシス、マウス自己免疫性膠原関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、マウス実験的重症筋無力症（Ｐａｕｌ  ｅｄ．，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９，  ｐｐ．  ８４０−８５６参照）がある。
【０１９４】
免疫反応を上げる手段としての抗原機能の上方調節（例、Ｂリンパ球抗原機能）は、また治療においても有用である。免疫反応の上方調節は既存の免疫反応を亢進させる形式か、または初期の免疫反応を誘発する形式で行われる。例えば、免疫反応の亢進は、インフルエンザ、感冒、および脳炎などのような全身性ウイルス疾患を含むウイルス感染の場合に有用な場合がある。
【０１９５】
あるいは、感染した患者の抗ウイルス性免疫反応は、患者からＴ細胞を除去し、本発明のペプチドを発現するか、あるいは本発明の水溶性ペプチドの刺激性形態のものと共に、ウイルス抗原パルス化ＡＰＣで、試験管内でＴ細胞を同時刺激し、そして、試験管内活性Ｔ細胞を患者に再び導入することによって増強されることがある。抗ウイルス免疫反応を亢進させる他の方法は、患者から感染細胞を分離し、それらに、細胞がその表面にタンパク質のすべて、または一部を発現するように、ここに記載する本発明のタンパク質をコードする核酸で形質移入し、そして、形質移入された細胞を患者に再び導入することであろう。ここで、感染細胞は同時刺激シグナルを送ることができ、それによって生体内でＴ細胞を活性化できるであろう。
【０１９６】
本発明のポリペプチドは形質移入された腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫反応を誘導するために必要な刺激シグナルを提供する。さらに、ＭＨＣ  クラス  Ｉ  または  ＭＨＣ  クラス  ＩＩ  分子を持たない、または、十分な量のＭＨＣ  クラス  Ｉ  または  ＭＨＣ  クラス  ＩＩ  分子を再発現できない腫瘍細胞は、ＭＨＣ  クラス  Ｉ  アルファ鎖タンパク質とβ２  ミクログロブリンタンパク質、あるいは、ＭＨＣ  クラス  ＩＩ  アルファ鎖タンパク質とＭＨＣ  クラス  ＩＩ  ベータ鎖タンパク質のすべて、または一部（例えば、細胞質内ドメイン切断部分）のすべて、または一部をコードする核酸で形質移入して、それによって、細胞表面にＭＨＣ  クラス  Ｉ  または  ＭＨＣ  クラス  ＩＩ  タンパク質を発現させることができる。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）  の活性を有するペプチドと共に、適切なクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣを発現させることによって、形質移入された腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫反応が誘導される。随意に、インバリアント（不変異）鎖のようなＭＨＣ  クラス  ＩＩ結合タンパク質  の発現を阻止するアンチセンス作成物をコードする遺伝子は、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡで同時形質移入して、腫瘍関連抗原の提示を促進し腫瘍特異的免疫を誘導することができる。このようにして、ヒト被験者におけるＴ細胞媒介免疫反応の誘導は、被験者における腫瘍特異的トレランスを十分克服できる。
【０１９７】
本発明のタンパク質の活性は、他にも方法はあるが、次の方法によって測定される。
【０１９８】
適切な胸腺または脾細胞の細胞毒性検定には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｄ  ｂｙ  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｐｕｂ．  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；  Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，  １９８１；  Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２８：１９６８−１９７４，  １９８２；  Ｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５：１５６４−１５７２，  １９８５；  Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；  Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８−５１２，  １９８８；  Ｈｅｒｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２４８８−２４９２，  １９８１；  Ｈｅｒｒｍａｎ  ａｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２８Ｌ１９６８−１９７４，  １９８２：  Ｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５：１５６４−１５７２，  １９８５；  Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；  Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１９９２−１９９８；  Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８−５１２，  １９８８；  Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７−３４１，  １９９１；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：３０７９−３０９２，  １９９４に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０１９９】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン反応およびアイソタイプスイッチング（Ｔ細胞依存性抗体反応を変調し、Ｔｈｌ／Ｔｈ２  プロフィールに影響するタンパク質を他から同定する）の検定にはＭａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４：３０２８−３０３３，  １９９０；  およびＡｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  Ｍｏｎｄ，  Ｊ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，  Ｍ．  Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  Ｊ．  Ｅ．  ｅ．ａ．  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｄｓ．  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．  ３．８．１−３．８．１６，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ．  １９９４に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０２００】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）検定（主にＴｈ１とＣＴＬ反応を生じるタンパク質を他から同定する）にはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｄ  ｂｙ  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｐｕｂ．  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；  Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３４９４−３５００，  １９８６；  Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５０８−５１２，  １９８８；  Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：３７７８−３７８３，  １９９２に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０２０１】
樹状突起細胞依存性検定（未処置のＴ細胞を活性化する樹状突起細胞によって発現されるタンパク質を他から同定する）には  Ｇｕｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｉｍｍｏｌ．  １３４：５３６−５４４，  １９９５；  Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７３：５４９−５５９，  １９９１；  Ｍａｃａｔｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５４：５０７１−５０７９，  １９９５；  Ｐｏｒｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８２：２５５−２６０，  １９９５；  Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：４０６２−４０６９，  １９９３；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５，  １９９４；  Ｍａｃａｔｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６９：１２５５−１２６４，  １９８９；  Ｂｈａｒｄｗａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９４：７９７−８０７，  １９９４；  ａｎｄ  Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７２：６３１−６４０，  １９９０に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０２０２】
リンパ球生存／アポトーシスの検定（スーパー抗原誘導後のアポトーシスを防ぐタンパク質およびリンパ球ホメオスタシスを調節するタンパク質を他から同定する）  には  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５−８０８，  １９９２；  Ｇｏｒｃｚｙｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：６５９−６７０，  １９９３；  Ｇｏｒｃｚｙｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１９４５−１９５１，  １９９３；  Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６６：２３３−２４３，  １９９１；  Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４５：４０３７−４０４５，  １９９０；  Ｚａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：８９１−８９７，  １９９３；  Ｇｏｒｃｚｙｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：６３９−６４８，  １９９２に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０２０３】
Ｔ細胞コミットメントおよび発達の初期段階に影響するタンパク質の検定には：  Ａｎｔｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８４：１１１−１１７，  １９９４；  Ｆｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１１１−１２２，  １９９４；  Ｇａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８５：２７７０−２７７８，  １９９５；  Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７５４８−７５５１，  １９９１に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０２０４】
（５．１１．８：アクチビン／インヒビン活性）
本発明のポリペプチドは、またアクチビンまたはインヒビン関連活性をも示す。本発明のポリヌクリオチドはこのような特性を示すポリペプチドをコードする。インヒビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の遊離を抑制する能力によって特徴づけられており、一方、アクチビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の遊離を刺激する能力によって特徴づけられている。このように、本発明のポリペプチドは、単独で、またはインヒビン系統群の一メンバーとのヘテロダイマー（ヘテロ二量体）として、雌哺乳類の受精能を減少させ、雄哺乳類の精子形成を減少させるインヒビンの機能に基づいた避妊薬として有用である。十分量の他のインヒビンを投与することによって、これらの哺乳類における不妊を誘発できる。あるいは、本発明のポリペプチドは、ホモダイマーとして、または他のタンパク質のインヒビン群サブユニットを持つヘテロダイマーとして、脳下垂体前葉細胞からのＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）遊離の刺激におけるアクチビン分子の機能に基づいた、受精能誘発治療剤として有用である。例えば、米国特許番号．  ４，７９８，８８５を参照されたし。本発明のポリペプチドは、また雌牛、羊および豚に限らず、このような家畜類の生涯生殖能を増加するように、性的に未熟な哺乳類の受精能の開始を前進させるためにも有用である。
【０２０５】
本発明のポリペプチドの活性は、他にも方法はあるが、次の方法によって測定できる。
【０２０６】
アクチビン／インヒビン活性の検定には、Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ９１：５６２−５７２，  １９７２；  Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７９−７８２，  １９８６；  Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７７６−７７９，  １９８６；  Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：６５９−６６３，  １９８５；  Ｆｏｒａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：３０９１−３０９５，  １９８６に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０２０７】
（５．１１．９：走化性／化学運動性活性）
本発明のポリペプチドは例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞または／および内皮細胞を含む哺乳類細胞の走化性または化学運動性活性に関与する。本発明のポリヌクレオチドは、そのような属性を示すポリペプチドをコードすることができる。走化性および化学運動性レセプターの活性は、作用の望ましい部位へ望ましい細胞集団を動員するか、誘引するために使うことができる。走化性／化学運動性組成物（例えば、タンパク質、抗体、結合パートナー、または発明のモジュレータは局所性感染症の治療においてだけでなく、創傷や他の組織の外傷の治療においても特定の利益を与える。例えば、リンパ球、単球または好中球の、腫瘍または感染部位への誘引によって、腫瘍または感染物質に対する免疫反応が改善される場合がある。
【０２０８】
タンパク質または、ペプチドは特定の細胞集団に対して、そのような細胞集団の方向または運動を直接または間接的に刺激できる場合、走化性活性を有する。好ましくは、タンパク質またはペプチドは細胞の有向運動を直接刺激する機能を有する。特定のタンパク質が細胞集団に対する走化性活性を有するかどうかは、そのタンパク質またはペプチドに周知の細胞走化性検定を行うことによって容易に判定できる。
【０２０９】
本発明の治療的組成物は以下において用いることができる。
【０２１０】
走化性活性の検定（走化性を誘導する、または防ぐタンパク質を同定する）は、蛋白質が１つの細胞集団の他の細胞集団への付着を誘導する能力だけでなく、タンパク質が膜内で細胞の遊走を誘導する能力をも検定する試験法からなる。
【０２１１】
移動および付着の適切な検定にはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｄ  ｂｙ  １．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｐｕｂ．  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｃｈａｐｔｅｒ  ６．１２，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ６．１２．１−６．１２．２８；  Ｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１３７０−１３７６，  １９９５；  Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＰＭＩＳ  １０３：１４０−１４６，  １９９５；  Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：１７４４−１７４８；  Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：５８６０−５８６７，  １９９４；  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：１７６２−１７６８，  １９９４に記載の検定があり、またこれらに限らない。
【０２１２】
（５．１１．１０：走化性および血栓溶解活性）
本発明のポリペプチドは、また止血、血栓溶解あるいは血栓症にも関与する場合がある。本発明のポリヌクレオチドは、そのような属性を示すポリペプチドをコードできる。組成物は種々の凝固障害（血友病のような遺伝的疾患を含む）の治療において、または外傷、手術あるいは他の原因から生じた創傷の治療において凝固や他の止血を促進させるために有用である。本発明の組成物は、また血栓の溶解または形成抑制およびそれから生じる状態（例えば、心臓や中枢神経血管の梗塞（例えば、脳卒中）のような）の治療や予防にも有用である。
【０２１３】
本発明の治療的組成物は以下において使用できる。
【０２１４】
止血や血栓活性の検定には、Ｌｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２６：１３１−１４０，  １９８６；  Ｂｕｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．  ４５：４１３−４１９，  １９８７；  Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５：７１−７９  （１９９１）；  Ｓｃｈａｕｂ，  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ３５：４６７−４７４，  １９８８に記載の検定があり、またこれに限らない。
【０２１５】
（５．１１．１：癌の診断および治療）
本発明のポリペプチドは癌細胞の産生、増殖または転移にも関与する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在または量の検出は、１種以上の癌の診断および／または予知に有用である。例えば、本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの存在または発現の増加によって、癌の遺伝性危険、前癌状態または進行性悪性腫瘍が示される場合がある。逆に、遺伝子における欠損、またはこのポリペプチドの不在は、癌状態に関連する場合がある。また、癌または癌の素因に関連する単一ヌクレオチド多型の同定は、診断あるいは予測にも役立つ場合がある。
【０２１６】
癌の治療では、腫瘍細胞増殖の抑制、血管新生（腫瘍増殖の補助に必要な新血管の成長）の抑制および／または腫瘍細胞の運動性や侵襲性を減らして転移を妨げることによって腫瘍の退行を促進する。本発明の治療的組成物は成人および小児腫瘍において有効であり、これには、充実性腫瘍／悪性腫瘍、局所進行性腫瘍、ヒト軟部組織肉腫、リンパ性転移などの転移性癌、多発性骨髄腫、急性・慢性白血病、リンパ腫などの血球悪性腫瘍が含まれ、また、口癌、喉頭癌、甲状腺癌を含む頭部および頸部の癌、小細胞癌、非小細胞癌を含む肺癌、小細胞癌および管性癌を含む乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、結腸直腸を含む消化管癌、および結腸直腸異常増殖に合併するポリープ、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌や前立腺癌を含む泌尿器癌、卵巣癌、子宮（子宮内膜を含む）癌、卵胞のｓｏｌｉｄ腫瘍を含む女性生殖器官の悪性腫瘍、腎細胞癌を含む腎臓癌、内因性脳腫瘍、神経芽細胞腫、アストロサイト（星状細胞）脳腫瘍、神経膠腫、中神経系における転移腫瘍細胞侵襲を含む脳腫瘍、骨腫を含む骨癌、悪性黒色腫（メラノーマ）、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、血管外皮細胞腫およびＫａｒｐｏｓｉ肉腫が含まれる。
【０２１７】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのモジュレータ（本発明のポリペプチドの生物活性のインヒビターと刺激物質を含む）は癌の治療のために投与される場合がある。治療的組成物は、単独に、または手術、化学療法、放射線療法、温熱療法およびレーザー療法のような癌の補助的療法と併せて治療的効果用量で投与することができ、有利な効果、例えば、腫瘍のサイズを減少する、腫瘍の成長速度を低下する、転移の阻害、または癌を必ずしも根絶させないで全体的な臨床状態を改善するなどの効果を提供する場合がある。
【０２１８】
本組成物は抗癌カクテルの一部として治療的有効量を投与することができる。抗癌カクテルは、本発明のポリペプチドまたはモジュレータと薬剤学的に許容される送達用キャリアに一種以上の抗癌剤を加えた配合剤である。癌の治療として抗癌カクテルを使用することは、日常的になっている。本発明のポリペプチドまたはモジュレータと組み合わせて治療として使用できる技術上周知の抗癌剤には、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、シクロホスファミド、塩酸シタラビン（シトシン・アラビノシド）、ダカルバジン、ダクチノマイシンン、ダウノマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、エストラムスチン燐酸ナトリウム、エトポシデ、（Ｖ１６−２１３）、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、フルタミデ、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロン・アルファ−２ｓ、インターフェロン・アルファ−２ｂ、酢酸リュープロライド（ＬＨＲＨ−遊離因子類似体）、ロムスチン、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェン・マスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、（ＭＴＸ）、マイトマイシン、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェンク、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラニン、インターロイキン−２、ミトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシデ、およびビンデシン硫酸がある。
【０２１９】
さらに、本発明の治療的組成物は、癌の予防的治療用に使うことができる。個人が癌になりやすい、技術上周知の遺伝的状態および／または環境状態（例えば、発癌物質への暴露）がある。これらの環境において、癌になる危険を少なくするために、治療的有効量の本発明のポリペプチドでこれらの個人を治療することは、有利な場合がある。
【０２２０】
試験管内モデルを用いて、可能性のある癌の治療としての本発明のポリペプチドの有効量を測定することができる。これらの試験管内モデルには、培養腫瘍細胞増殖の検定、軟寒天における培養腫瘍細胞の増殖（Ｐｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  Ｗｉｌｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  Ｃｈ  １８  ａｎｄ  Ｃｈ  ２１参照）、Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎ．  Ｉｎｓｔ，  ５２：９２１−３０（１９７４）に記載のヌードマウスにおける腫瘍システム、Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １７：４１０７−９（１９９７）に記載のＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ  検定における腫瘍細胞の移動性と侵襲性の可能性、および、Ｒｉｂａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｌ，  Ｊ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ４０：１１８９−９７（１９９９）  や  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  １７：４２３−９（１９９９）に各々記載の鶏絨毛尿膜の血管新生の誘導、または血管内皮細胞遊走の誘導のような血管形成の検定がある。適切な腫瘍細胞系は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  カタログから入手できる。
【０２２１】
（５．１１．１２：レセプター／リガンドの活性）
本発明のポリペプチドはまた、レセプター／リガンド相互作用のレセプター、レセプターリガンド、またはインヒビターあるいは、アゴニスト（作動薬）としての活性を示す。本発明のポリヌクレオチドはこのような特性を示すポリペプチドをコードする。このようなレセプターおよびリガンドの例には、サイトカイン・レセプターとそのリガンド、レセプター・キナーゼとそのリガンド、レセプター・ホスファターゼとそのリガンド、細胞間相互作用に関与するレセプターとそのリガンド（セレクチン、インテグリンおよびそれらのリガンドのような）細胞接着分子をこれに限らず含む）および抗原表示、抗原認識および細胞性、体液性免疫反応の進展に関与するレセプター／リガンド対があり、またこれらに限らない。レセプターとリガンドは、また関連するレセプター／リガンド相互作用の可能性があるペプチドまたは小分子インヒビターのスクリーニングにも役立つ場合がある。本発明のタンパク質（レセプターの断片とリガンドをこれらに限らず含む）はそれ自体レセプター／リガンド相互作用のインヒビターとして有用である。
【０２２２】
本発明のポリペプチドの活性は、他に方法もあるが、以下の方法によって測定できる。
【０２２３】
レセプターーリガンド活性の適切な検定には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｄ  ｂｙ  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｐｕｂ．  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｃｈａｐｔｅｒ  ７．２８，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ７．２８．  １−７．２８．２２），Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：６８６４−６８６８，  １９８７：Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６８：１１４５−１１５６，  １９８８；  Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６９：１４９−１６０  １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５９−６８，  １９９４；Ｓｔｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０，  １９９５に記載の検定があり、また検定はこれらに限らない。
【０２２４】
例として、本発明のポリペプチドは、１つまたは複数のリガンドのレセプターとして使われ、それによってそのリガンドの生物活性が伝達される。リガンドは結合検定、アフィニティ・クロマトグラフィ、ダイハイブリッド・スクリーニング検定、ＢＩＡコア検定、ゲル・オーバレイ検定または技術上周知の他の方法によって同定できる。
【０２２５】
薬物またはタンパク質がアゴニスト（作動薬）か、またはアンタゴニスト（拮抗薬）、あるいは部分的アゴニストか、または部分的アンタゴニストかの特性を決める試験には、競合的リガンドとしての他のタンパク質を使う必要がある。本発明のポリペプチドまたはそのリガンドは、従来の方法によって放射性同位元素、比色定量分子または毒素分子に結合されて標識される（「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」  Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  （ｅｄ）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２（１９９０）  ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。放射性同位元素の例としては、トリチウムや炭素−１４があるが、これらに限定されない。比色定量分子の例には、フルオレサミンのような蛍光分子、またはローダミンや他の比色定量分子があり、またこれらに限定されない。毒素の例には、リシンがあり、またこれに限定されない。
（５．１１．１３：薬物スクリーニング）
本発明は様々な薬物スクリーニング技法のいずれかにおいて、新しいポリペプチドまたはその結合断片を用いて、化合物をスクリーニングするのに役立つ。このような試験に用いるポリペプチドまたは断片（フラグメント）は、溶液中に遊離しているか、または固体支持体に付着しているか、あるいは、細胞表面に生じるか、または細胞内にある。薬物スクリーニングの１つの方法では、真核または原核宿主細胞を利用し、これらはポリペプチドまたはその断片を発現する組み換え核酸で安定に形質転換される。薬物は結合蛋白競合測定法で、このような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。生存能力のある、または固定化された形のこのような細胞は、標準結合検定に使うことができる。例えば、本発明のポリペプチドまたは断片とテストされた物質との間の複合物形成を測定するか、または新しいポリペプチドと技術上周知の適切な細胞系との間の複合形成における減少を調べることができる
結合能力、または本発明のポリペプチドの活性を変調する（すなわち、増加または減少させる）能力をスクリーニングできる検査化合物のソースとして、（１）無機および有機化合物ライブラリー、（２）天然物ライブラリーおよび（３）ランダムまたは模倣ペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子からなるコンビナトリアル・ライブラリーがある。
【０２２６】
ケミカルライブラリーは多くの市販源から容易に合成または購入でき、また、これには既知の化合物の構造的類似体、または天然物スクリーニングを介して「ヒット」または「リード」と同定されている化合物が含まれる。
【０２２７】
天然物ライブラリーのソースは、微生物（細菌や真菌を含む）、動物、植物または他の植生または海洋生物であり、また、スクリーニング用混合ライブラリーは、（１）土壌、植物または海洋微生物からのブロスの発酵および抽出、または（２）微生物自体からの抽出によって作成できる。天然物ライブラリーには、ポリケチド、非リボソーム・ペプチドおよびその（非天然性発生）変異体がある。総説は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−６８（１９９８）を参照されたし。
【０２２８】
コンビナトリアル・ライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物からなり、従来の自動合成法、ＰＣＲ、クローニングまたは特許化された合成方法によって容易に作成することができる。ペプチドとオリゴヌクレオチド・コンビナトリアル・ライブラリーが特に興味深い。なお、この他に興味深いライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣、多平行型合成収集、リコンビナトリアル、およびポリペプチド・ライブラリーがある。コンビナトリアル・ケミストリーとそれから作成されたライブラリーの総説はＭｙｅｒｓ，  Ｃｕｒｒ．  ｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照されたし。ペプチド模倣ライブラリーの総説および例は、Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ９（３）：２０５−２３  （１９９８）；  Ｈｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｏｉｌ，  １（１）：１１４−１９（１９９７）：Ｄｏｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，  ４（５）：７０９−１５（１９９６）（アルキル化ジペプチド）を参照されたし。
【０２２９】
ここに記載する種々のライブラリーを使用してモジュレータを同定することによって、本発明のポリペプチドに結合する「ヒット」の能力を至適化するための「ヒット」（または「リード」）候補の修飾（変更）が可能になる。次に、結合能検定で同定された分子について、生体内組織培養または技術上周知の動物モデルにおいてアンタゴニストまたはアゴニスト活性の測定を行う。要するに、分子を多数の細胞培養または動物に滴定して、次に細胞／動物の死亡または細胞／動物の生存延長についてテストする。
【０２３０】
このように、結合分子は毒素、例えば、リシンまたはコレラとの複合体を作るか、または放射性同位元素のような細胞に毒性のある他の化合物との複合体を作る。次に、毒素結合分子複合体は、結合分子の本発明のポリペプチドに対する特異性によって腫瘍または他の細胞を標的にする。あるいは、結合分子は標的化および映像目的のためのイメージング（画像）剤と複合体を作る。
【０２３１】
（５．１１．１４：レセプター活性の検定）
本発明はまた、ポリペプチド、例えばリガンドまたはレセプターの特異的結合を検出する方法をも提供する。この技術は、以前は不明であった、本発明のレセプター・ポリペプチドの結合パートナーの同定に、特に役立つ多くの検定を提供する。例えば、哺乳類または細菌の細胞、あるいはダイハイブリッド・スクリーニング検定を用いた発現クローニングは、結合パートナーをコードするポリヌクレオチドの同定に使うことができる。他の例として、適切に固定化された本発明のポリペプチドを用いたアフィニティ・クロマトグラフィーは、本発明のポリペプチドを認識し、結合するポリペプチドを分離するために使用することができる。本発明のポリペプチドの生物活性を変調する（つまり、増加または減少する）化合物、特に小分子の同定に用いられる多くの異なったライブラリーがある。本発明のレセプターポリペプチド用リガンドは、外来性リガンドまたは、リガンドのカクテルを本発明のレセプターの発現以外は遺伝学的に同じの２種の細胞集団に加えることによって同定できる。１種の細胞集団は本発明のレセプターを発現するが、他の細胞集団は発現しない。加えられたリガンドに対する２種の細胞集団の応答を比較する。あるいは、発現ライブラリーは、細胞内で本発明のポリペプチドと同時発現させることができ、可能性のあるリガンドを同定するためのオートクライン反応を検定することができる。
【０２３２】
さらに、他の例として、ＢＩＡコア  検定、ゲル・オーバーレイまたは技術的に周知の他の方法を用いて結合パートナーのポリペプチドを同定できるが、これには、（１）有機および無機化学ライブラリー、（２）天然物ライブラリーおよび（３）ランダム・ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子のようなコンビナトリアル・ライブラリーが含まれる。
【０２３３】
下流細胞内情報伝達分子の、本発明のポリペプチドの情報伝達カスケードにおける役割は決定できる。例えば、本発明のポリペプチドの細胞質内ドメインが、リガンドが同定されているタンパク質の細胞外部分に融合したキメラタンパク質は、宿主細胞内で生成される。次に、この細胞をキメラタンパク質の細胞外部分に特異的なリガンドと一緒に培養し、それによってキメラ・レセプターを活性化する。次に、細胞内情報伝達に関与する既知の下流タンパク質の予測される修飾、すなわち、燐酸化を測定できる。また、技術上周知の他の方法も、また、レセプター活性に関与する情報伝達分子の同定に使用できる。
【０２３４】
（５．１１．１５：抗炎症活性）
本発明の組成物は、また抗炎症活性をも示す。抗炎症活性は、炎症反応に関与する細胞に刺激を与えるか、細胞間相互作用（例えば、細胞癒着のような）を抑制または促進するか、炎症過程に関与する細胞の走化性を抑制または促進するか、細胞の血管外遊走を抑制または促進するか、あるいは、炎症をより直接的に抑制または亢進する他の因子の産出を刺激または抑制することによって得られる。このような活性を持つ組成物は、感染（敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害、菌体内毒素致死、関節炎、補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、あるいはＴＮＦやＩＬ−１のようなサイトカインの産出過剰によると思われる慢性、急性炎症状態の治療に、これらに限らず用いることができる。本発明の組成物は、また抗原性物質または抗原性材料に対するアナフィラキシーまたは過敏症の治療にも有用である。本発明の組成物は敗血症、急性膵炎、エンドトキシン・ショック、サイトカイン性ショック、慢性関節リューマチ、慢性炎症性リューマチ、真性糖尿病タイプ１による膵臓細胞障害、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、肺疾患に合併する炎症、他の自己免疫疾患または炎症性疾患のような状態の予防または治療にそれらの予防または治療法の一部として、急性、慢性骨髄性白血病の抗増殖性剤として、または子宮内感染症の前段階における早期分娩の予防において使用することができ、また使用はこれらに限らない。
【０２３５】
（５．１１．１６：白血病）
白血病および関連疾患は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの機能を促進または阻害する治療剤を投与することによって治療または予防することができる場合がある。このような白血病および関連疾患には、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球（顆粒球）性白血病、および慢性リンパ性白血病（これらの疾患の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ参照）が含まれ、またこれらに限らない。
【０２３６】
（５．１１．１７：神経系疾患）
本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの活性を変調する化合物の介入の効力をテストできる細胞タイプに関連し、またしたがって、治療的有用性の指標を見ながら治療できる神経系疾患には、神経系損傷および神経系疾患、あるいは、アクソンの連絡切断、神経細胞の退縮、変性、または脱髄を生じる神経系障害がこれらに限らず含まれる。本発明にしたがって患者（ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む）において治療される神経系病変には、以下の、中枢（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のどちらかの病変が含まれ、またこれらに限らない。
【０２３７】
（ｉ）物理的傷害または手術、例えば、神経系の一部を切断する病変、または圧迫損傷によって生じた病変を含む外傷性病変
（ｉｉ）脳梗塞または脳虚血、あるいは脊髄の梗塞または虚血などの神経系の一部における酸素欠乏による神経細胞損傷または死亡にいたる虚血性病変
（ｉｉｉ）例えば、膿瘍による感染の結果、またはヒト免疫不全症ウイルス、帯状疱疹、単純疱疹ウイルスによる感染と合併して、または、ライム病、結核、梅毒と合併して神経系の一部が感染の結果、破壊されるか、または損傷を受ける感染性病変
（ｉｖ）パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症と合併した変性に限らず、これらを含む変性過程の結果として、神経系の一部が破壊または損傷する変性（退縮）病変
（ｖ）栄養障害または代謝障害によって神経系の一部が破壊または損傷する、栄養上の疾患、または栄養障害に関連する病変で、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウエルニッケ病、タバコ・アルコール性弱視、マルキャファーヴァ・ビニャミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール性小脳変性が含まれ、また、これらに限らない。
【０２３８】
（ｖｉ）全身性疾患に合併する神経性病変で、糖尿病（糖尿病性神経障害、顔面麻痺）、全身性エリトマトーデス、癌または肉腫症が含まれ、また、これらに限らない。
【０２３９】
（ｖｉｉ）アルコール、鉛または特定の神経毒を含む毒性物質によって生じた病変
（ｖｉｉｉ）脱髄疾患によって神経系の一部が破壊または損傷する脱髄病変で、多発性硬化症、ヒト免疫不全症ウイルス関連脊髄症、横断性脊髄症、種々の病因論、進行性多病巣性白質脳障害、および中央脳橋ミエリン溶解が含まれるが、これらに限らない。
【０２４０】
本発明にしたがった有用な神経系疾患用治療剤は、神経細胞の生存または分化の促進についての生物活性を試験することによって選択できる。例えば、制限としてではなく、次の作用のいずれかを誘発する治療剤は本発明によると有用である。
（ｉ）培養液において神経細胞の生存時間を増加した。
【０２４１】
（ｉｉ）培養液または生体内において神経細胞の出芽を増加した。
【０２４２】
（ｉｉｉ）培養液または生体内において、神経細胞関連分子、例えば、運動ニューロンに関連するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼの産生が増加した。
【０２４３】
（ｉｖ）生体内神経細胞機能障害の症状を減少した。
【０２４４】
このような効果は技術上周知のいずれの方法によっても測定できる。好ましくは、実施例に限らず、神経細胞の生存率増加は、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １０：３５０７−３５１５）に示される方法によって測定でき、神経細胞の出芽の増加はＰｅｓｔｒｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０，  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．  ７０：６５−８２）  またはＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ４：１７−４２）に示される方法によって検出でき、神経細胞関連分子の産生増加は測定される分子によって、生物検定法、酵素学的検定、結合抗体、ノーザンブロット検定などで測定できる。また、運動ニューロン機能不全は、運動ニューロン障害、例えば、脱力感、運動ニューロン伝達速度または機能的能力障害などの物理的症状の評価によって測定できる。
【０２４５】
特定の具体例において、本発明にしたがって治療される運動ニューロン障害には、梗塞、感染症、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患または運動ニューロンおよび神経系の他の構成成分に影響する悪性腫瘍のような疾患、および筋萎縮性側索硬化症のような神経細胞に選択的に影響する疾患、ならびに、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、乳児性、若年性筋萎縮、幼児期の進行性球麻痺（ファチオ・ロンデ症候群）、灰白髄炎およびポリオ後症候群、および遺伝性運動感覚ニューロパシー（シャルコー・マリー・トゥース病）などに限らず含まれる。
【０２４６】
（５．１１．１８：その他の活性）
本発明のポリペプチドは、またさらに、次のような活性または作用のうちの１つ以上を示す。すなわち、細菌、ウイルス、真菌および他の寄生虫をこれらに限らず含む感染性物質の成長、感染または機能を抑制または抑止する、身長、体重、髪の色、眼の色、皮膚、脂肪の細い部分に対する割合または他の組織色素沈着、または臓器あるいは身体部分のサイズまたは形（例えば、乳房の増大または縮小、または骨の形態および形状における変化のような）をこれらに限らず含む身体的特徴に作用する（抑制または亢進）、男性または女性の受精能に作用する、食餌脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補助因子、他の栄養的因子または成分の代謝、異化、同化、処理、利用、保存、または排出に影響する、食欲、性欲、ストレス、認知（認知障害を含む）、抑鬱（鬱病性障害を含む）および狂暴症をこれらに限らず含む行動性特徴に作用する、鎮痛効果または他の痛み減少作用を与える、造血系以外の系における胚幹細胞の分化および成長を促進する、ホルモン、内分泌の活性化、酵素の場合、酵素の欠乏症を修正し、欠乏関連性疾患を治療する、過剰増殖疾患（例えば、乾癬のような）の治療、免疫グロブリン様活性（例えば、抗原または補体を結合する能力のような）、および、ワクチン成分において抗原として作用して、そのようなタンパク質、または、そのようなタンパク質と交差反応する他の物質あるいは実体に対して免疫反応を促進する。
【０２４７】
（５．１１．１９：多型の定義）
多型性を証明することによって、ヒト被験者におけるこのような多型の同定が可能になり、この遺伝薬理学的情報を診断や治療に使用できる。このような多型性は、例えば、種々の疾患状態（炎症または免疫反応に関与する疾患のような）に対する特異な素因または感受性あるいは、薬物投与に対する特異な反応に関連し、また、この遺伝情報を用いて、予防的または治療的処置を適切に合わせることができる。例えば、炎症または自己免疫疾患の素因に関連する多型が存在する場合は、多型の存在を同定することによって、ヒトにおけるこの状態を診断することができる。
【０２４８】
多型は、技術上周知の様々の方法において同定することができ、すべての場合、一般に患者からのサンプルを得て、このサンプルからＤＮＡを分析し、随意に、ＤＮＡの分離または増幅を行って、ＤＮＡにおける多型の存在を同定する。例えば、ＰＣＲを用いて適切なゲノムＤＮＡの断片を増幅し、次にそれを配列決定する。あるいは、ＤＮＡはアレル（対立遺伝子）特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション（一塩基ミスマッチの検出が可能な状態の下で適切なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする）にかけるか、または単一ヌクレオチド伸長検定（多型の位置のすぐ隣にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが１つ以上の標識ヌクレオチドで伸長している）にかける。さらに、従来の制限酵素断片長多型分析（多型の存在または不在によってゲノムＤＮＡに異なった消化をさせる制限酵素を用いて）を行う場合もある。本発明のヌクレオチド配列のアレイは、多型性の検出に使うことができる。このアレイは本発明のヌクレオチド配列を検出するために本発明のヌクレオチド配列の修飾したものを使っても良い。代用物において、本発明のヌクレオチド配列のどれか１つをこのアレイ上で置き換えて、これらの配列の変更を検出できる。
【０２４９】
あるいは、アミノ酸配列の変更で生じた多型はまた、タンパク質のアミノ酸配列の対応する変更を検出することによって、例えば、変異配列に特異的な抗体によっても検出できる。
【０２５０】
（５．１２．１：例）
本発明の一応用例はフォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチド又はその他の本発明混合物を有効量、病気又は疾患に罹った個人に投与する方法である。この場合、水溶性のプロトロンビナーゼ様発明受容体をコントロールする事により、有効量の投与を調整する事が可能である。投与方法は特に重要ではないが、非経口投与がどちらかと言うと好ましい。模範的な投与方法は静脈内ボーラスである。フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様ポリペプチド又はその他の本発明混合物の投与量は、ふつう処方医により決定される。投与量は、年令、体重、患者の健康状態や反応により異なるはずである。ふつう薬量当たりのポリペプチド量は、患者の体重１ｋｇ当たり０．１  ｍｇ乃至２５  ｍｇ、最も好ましい量は０．１ｍｇ乃至１０  ｍｇである。フォン・ウィルブランド／トロンボスポンジン様本発明ポリペプチドは、非経口用として、製薬学的に承認されている非経口担体とともに注射可能な形になっている。そういう担体は医学では良く知られているものであり、例えば水、塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、人間の血清アルブミン少量を含む溶液などが相当する。担体には、ポリペプチドの等浸透性と安定性を維持するための添加物や他の活性成分が僅かに含まれる場合もある。そういう溶液の準備は医学的な技術の範疇に属する。ふつう、サイトキン抑制剤はそのような媒体に１−８  ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調合される。
【０２５１】
（５．１２．２：関節炎と炎症）
慢性関節リューマチに対する発明混合物の免疫抑制効果は、実験用の動物モデル・システムで決定される。実験用モデル・システムはネズミを使った補助薬誘発関節炎である。その実験計画はＨｏｌｏｓｈｉｔｚ等（１９８３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１９：５６）又は、Ｂ．  Ｗａｋｓｍａｎ  （１９６３，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２３：１２９）により記述されている。この病気は、完全フロインド・アジュバンド（ＣＦＡ）の中に懸濁させた死んだマイコバクテリア結核菌を一回注射（ふつう皮内注射）する事により引き起こす事ができる。注射の方法は色々であるが、ネズミの場合、補助薬の混合液を尻尾の付け根に注射しても良い。抑制剤は約１−５  ｍｇ／ｋｇの量をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に入れ投与する。対照標準液はＰＢＳだけを使う。
【０２５２】
試験混合物の効果をテストする方法は、ＣＦＡに入っている死んだマイコバクテリア結核菌を皮内注射し、その後すぐ抑制剤を投与、その後１日おきに２４日までそれを継続する。マイコバクテリアＣＦＡを注射後１４，  １５，  １８，  ２０，  ２２，  そして２４日目に、上記Ｊ．  Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚにより記述されているような関節炎の総合点数が得られる。データ分析の結果、試験化合物は関節の腫れに劇的な効果を及ぼす事が、関節炎点数の減少により判明するはずである。
【０２５３】
（５．１３：製薬学的製剤及び投与方法）
蛋白質又は本発明の他の混合物（供給源の如何に拘わらず組み換え及び非組み換え供給源、抗体及び本発明ポリペプチドの他の結合剤を含む）を必要とする患者に、そのままの形で、又は様々な疾患を治療・回復させるのに必要な薬量を、適切な担体又は媒体と混合した製薬学的混合物として投与できる。そういう混合物には、蛋白質又は他の活性成分や担体の他に、希釈液、増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶剤、その他医学で良く知られている材料を含む事もできる。「製薬学的に容認できる」というのは、活性成分の生物学的効果には干渉しない非毒性の物質という意味である。担体の特徴は投与方法に依存する。本発明の製薬学的混合物の中には、サイトカイン、リンフォカイン、又は造血因子、例えばＭ−ＣＳＦ，  ＧＭ−ＣＳＦ，  ＴＮＦ，  ＩＬ−１，  ＩＬ−２，  ＩＬ−３，  ＩＬ−４，  ＩＬ−５，  ＩＬ−６，  ＩＬ−７，  ＩＬ−８，  ＩＬ−９，  ＩＬ−１０，  ＩＬ−１１，  ＩＬ−１２，  ＩＬ−１３，  ＩＬ−１４，  ＩＬ−１５，  ＩＦＮ，  ＴＮＦ０，  ＴＮＦ−１，  ＴＮＦ−２，  Ｇ−ＣＳＦ，  Ｍｅｇ−ＣＳＦ等、トロンボポエチン、幹細胞因子、エリスロポエチン等も含む事ができる。更に、本発明の蛋白質を病気又は疾患の治療に有効な他の物質と組み合わせる事も可能である。そういう物質の中には、本文で述べられているサイトカインを初め、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）など色々な成長因子が含まれる。
【０２５４】
更に製薬学的混合物の中には、本蛋白質の活動を活性化するか治療面での活動又は使用を補足する他の作用薬を含む事も可能である。こういう付加因子や物質は、本発明の蛋白質か他の活性成分と相乗効果を引き出す目的で、又は副作用を最小化する目的で製薬学的混合物の中に含む事ができる。反対に、凝血因子、サイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓崩壊、抗血栓因子、又は抗炎薬（例えば、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１Ｈｙ１、ＩＬ−１Ｈｙ２、抗ＴＮＦ、コルチコステロイド、免疫抑制剤）の副作用を最小限に抑える目的で、本発明の蛋白質や他の活性成分を特定の凝血因子、サイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓崩壊、抗血栓因子、又は抗炎薬の中に含む事も可能である。本発明の蛋白質は多量体（例えばヘテロダイマーかホモダイマー）で活性かも知れないし、あるいはそれ自身又は他の蛋白質との複合体として活性かも知れない。その結果、本発明の製薬学的混合物は、多量体か複合体の形で本発明の蛋白質を含むようになるかも知れない。
【０２５５】
本発明の製薬学的混合物（第１蛋白質を含む）の中に含む代わりに、第２蛋白質又は治療薬を第１蛋白質と一緒に投与する事もできる（例えば同時に、あるいは組み合わせる物質の治療濃度が治療部位で実現されるのを条件として異なる時に）。インスタント施用化合物の調剤及び投与技術は、ペンシルバニア州イーストンのＭａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．出版「レミントン製薬科学」を参考にしてもよい。治療学的に有効な投与量とは、症状の回復、例えば治療、治癒、予防、関連医療条件の回復、又は治療、治癒、予防、そういう条件の回復率の増大をもたらすに十分な化合物の量を意味する。個別の活性成分が単独で投与される場合には、治療学的に有効な投与量とはその活性成分のみに言及する。組み合わせて使用する場合は、治療学的に有効な投与量とは、複合投与が連続であろうと同時であろうと、治療効果をもたらす活性成分の総合量を意味する。
【０２５６】
本発明の治療方法又は使用方法の実践において、本発明の蛋白質又は他の活性成分は、治療学的に有効な量だけ、治療条件を有している哺乳動物に投与される。本発明の蛋白質又は他の活性成分は、本発明の方法を単独で投与する事もできるし、他の治療方法、例えばサイトカイン、リンフォカイン、その他の造血因子を使った治療方法と組み合わせて投与する事も可能である。サイトカイン、リンフォカイン、その他の造血因子のうち１つ又は複数と組み合わせて投与する場合は、本発明の蛋白質又は他の活性成分は、サイトカイン、リンフォカイン、その他の造血因子、血栓崩壊因子、又は抗血栓因子と同時に投与しても、連続的に投与しても良い。連続的に投与する場合は、本発明の蛋白質又は他の活性成分をサイトカイン、リンフォカイン、その他の造血因子、血栓崩壊因子、又は抗血栓因子とどのような順序で組み合わせて投与するかについては、診療医師がその適切性を決定する。
【０２５７】
（５．１３．１：投与経路）
適切な投与方法は、例えば、経口、直腸、経粘膜、腸内投与、内皮注射（筋肉内、皮下、髄内注射等）、くも膜下、直接心室内注射、静脈注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、眼内注射等が含まれる。製薬学的混合物に使用される本発明の蛋白質又は他の活性成分の投与、又は本発明の方法の実践は、通常の色々なやり方で実行できる。例えば、経口摂取、吸入、局所又は皮膚施用、皮下、腹腔内、腸管外注射等である。患者への投与はどちらかと言うと静脈注射が好ましい。
【０２５８】
全身ではなく局所に化合物を投与するのも可能である。例えば、関節炎を患っている関節又は繊維組織に直接注射する事などであり、その場合、デポー剤か持続放出性のものが多い。緑内障手術の合併症として生じがちな瘢痕を防ぐため、化合物を局所的に、例えば目薬として投与する事も可能である。更に薬物標的送達システムを使って投与する事もできる。例えば、関節炎を起こしている部位の組織又は繊維組織などを標的として、特定の抗体でコーティングしたリポゾーム等を使用する方法である。リポゾームは、症状を患っている細胞組織が選択的に標的としたり吸収したりする。
【０２５９】
本発明のポリペプチドは、要求されている作用部位に有効量を送達する方法であれば、どのような方法でも使用できる。適切な投与方法及び有効量の決定は、医療技術の範疇に含まれる。怪我の治療の場合同様、治療化合物を局部に直接投与しても良い。本発明ポリペプチドの適切な投与量の範囲は、適切な動物モデルを使った投与量又はそういうモデルを使った類似の研究結果から推定できる。その後、最大治療効果を上げるため、投与量は臨床医が必要に応じて調整すれば良い。
【０２６０】
（５．１３．２：混合物／製剤）
従って本発明に使われる製薬学的混合物は、媒体や補助剤で構成される生理学的に有効な担体を１つ乃至それ以上使った普通の方法で製剤できる。媒体や補助剤は活性化合物を製薬学的に利用可能な形に成形するのを助ける。こういう製薬学的混合物は、良く知られている方法で製造できる。例えば、混合、溶解、顆粒化、ドラジェー（糖衣）、微粒子化、乳化、カプセル化、エントラッピング又は凍結乾燥などの普通の方法である。適切な製法は投与方法により異なる。治療学的に有効な量を経口で投与する場合、本発明の蛋白質又は活性成分は、錠剤、カプセル、粉末、溶液、又はエリキシル剤の形で投与される。錠剤で投与する場合、本発明の製薬学的混合物には、更にゼラチンや補助剤のような固形の担体も含まれるかも知れない。錠剤、カプセル、及び粉末には、本発明の蛋白質又は活性成分が約５％乃至９５％含まれる。理想的には、本発明の蛋白質又は活性成分が約２５％乃至９５％含まれている方が好ましい。液体で投与する場合は、水、石油、動物性又は植物性の油、例えば落花生油、ミネラル油、大豆油、胡麻油、あるいは合成油のような液状担体を追加しても良い。液状の製薬学的混合物の中には、更に生理塩水、ブドウ糖又は他のサッカリド溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールのようなグリコール類を含めても良い。液体の場合は、本発明の蛋白質又は活性成分が重量比で約０．５乃至９０％含まれる。理想的には、本発明の蛋白質又は活性成分が重量比で約１乃至５０％含まれるのが好ましい。
【０２６１】
本発明の蛋白質又は活性成分の治療学的有効量を静脈、皮膚、又は皮下注射により投与する場合は、本発明の蛋白質又は活性成分は、発熱物質を含まず、非経口的に容認可能な液体の形で投与される。非経口的に容認可能なそういう蛋白質又は他の活性成分溶液をｐＨ、等浸透圧性、安定性等へ配慮して準備するのは、医療技術の範疇に属する。静脈、皮膚、又は皮下注射のために好ましい製薬学的混合物には、本発明の蛋白質又は活性成分の他に、等浸透圧性の担体、例えば塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、ブドウ糖注射、ブドウ糖と塩化ナトリウム注射、乳酸化したリンゲル注射、あるいは医療技術で良く知られている他の担体も含めるべきである。本発明の製薬学的混合物には、安定化剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、その他医療技術で良く知られている添加物を含めても良い。注射の場合、本発明の物質は液体の形で製剤しても良い。できればハンクス液、リンゲル液、生理塩水のような生理学的に合った緩衝剤が好ましい。経粘膜投与の場合は、特定の浸透剤が使用される。そういう浸透剤は、医学界で一般的に良く知られているものである。
【０２６２】
経口投与の場合、化合物は、医学界で良く知られ製薬学的に容認されている担体と活性化合物とを組み合わせる事により、容易に製剤できる。そういう担体は、本発明の化合物を錠剤、丸薬、ドラジー（糖衣）、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に製剤するのを可能にし、患者が経口摂取できるようにする。経口使用のための製薬学的準備は、必要であれば適切な補助剤を添加して錠剤かドラジーの中核を得た後、固形の担体を加え、混合体を粉末にし、その粒状の混合体を加工することにより得られる。特に適切な担体は砂糖（ラクトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール等も含む）やセルロース（例えばトウモロコシの澱粉、米の澱粉、じゃが芋の澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル・セルロース、ナトリウム・カルボキシメチル・セルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））等の増量剤である。必要なら、橋架け結合のポリビニル・ピロリドン、寒天、アルギン酸、その塩例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊薬（ママ）を加えても良い。ドラジーの中核には適切なコーティングが提供される。この目的のために濃縮砂糖液を使っても良い。その中にはアラビアゴム、タルク、ポリビニル・ピロリドン、カルボポル・ゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー液、及び適切な有機溶媒又は混合溶媒を含めても良い。活性化合物の含有量の組み合わせを強調するため又は内容を同定するため、錠剤やドラジー・コーティングに染料や色素を加えるのも可能である。
【０２６３】
経口使用製品の製薬学的準備には、ゼラチン製のプッシュ・フィット・カプセルやゼラチン、及びグリコールやソルビトール等可塑剤製の柔いシールド・カプセル等が使われる。プッシュ・フィット・カプセルには、活性成分をラクトースのような増量剤、澱粉のような結合剤、タルク、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、必要ならば安定剤と混合して入れる事もできる。ソフト・カプセルの場合は、活性成分は、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解するか懸濁させるかしても良い。更に安定剤を加えても良い。経口投与の場合の製剤は、その目的に適した量でなければならない。口内投与の場合は、通常の方法で成形される錠剤やトローチ剤を使用できる。
【０２６４】
吸入投与の場合は、本発明の化合物を加圧パック又は噴霧器からスプレーする事により投与する。その場合、適切な推薬、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、その他適当なガスを使用する。加圧噴霧の場合、投与量の単位は、一定量を送るバルブを使用する事により決定できる。吸入器に使用されるゼラチン等のカプセルや薬包は、ラクトースや澱粉のような適切な粉末ベースと化合物を粉末状態で混合して成形しても良い。混合物は巨丸剤注射や連続注入のような非経口投与用に製剤しても良い。注射用の製剤は、アンプルや多薬量容器のような単位薬量形式に保存剤を添加しても良い。混合物は、油又は液体の担体の中に懸濁、溶解、乳化させる形を取る事もできるし、懸濁剤、安定化剤、分散剤等の製剤用の物質を含んでも良い。
【０２６５】
非経口投与用の製薬学的混合物には、活性化合物が水溶性の形で含まれる液状のものもある。更に活性化合物の懸濁液を、適切な油液注射用の懸濁液として準備する事もできる。適切な脂質親和性の溶媒又は担体には、胡麻油のような脂肪油、オレイン酸エチルのような合成脂肪酸エステル、トリグリセリド、リポゾーム等も含まれる。液状注射懸濁液の中には、懸濁液の粘性を高める物質、例えばナトリウム・カルボキシルメチル・セルロース、ソルビトール、デキストラン等を含んでも良い。必要ならば、懸濁液の中に安定剤や化合物の溶解度を高める物質を含め、高濃度の溶液を準備する事も可能である。代替案として、使用前に活性成分を粉末状にしておき、消毒し発熱物質を含まない水等の適切な担体と組み合わせる方法もある。
【０２６６】
化合物は、通常の座薬ベース、例えばココアバターや他のグリセリドを含む座薬や固定浣腸のような直腸用の混合物にする事も可能である。上述の製剤法の他に、デポー剤用の混合物にする事も可能である。そういう長期持続用の方法は、インプラント（例えば内皮や筋肉内）や筋肉内注射により実現できる。従って例えば、適切なポリマー剤や疎水性の物質（例えば適当な油に乳化させた物質）、イオン交換樹脂、僅かに溶解する塩などの誘導体を使って化合物を製剤できる。
【０２６７】
本発明の疎水性化合物用の製薬学的担体は、ベンジルアルコール、無極性の表面活性剤、水混和性の有機ポリマー、及び水様性相で構成される共通溶媒システムである。共通溶媒システムはＶＤＰ共通溶媒システムでもあり得る。ＶＤＰは、３％ｗ／ｖのベンジルアルコール溶液、８％ｗ／ｖの無極性表面活性剤ポリソルベート８０、そして６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００を無水アルコールの中に入れたものである。ＶＤＰ共通溶媒システム（ＶＤＰ：５Ｗ）は、ＶＤＰを５％のブドウ糖水溶液で１：１に希釈したものである。このＶＤＰ共通溶媒システムには疎水性の化合物が良く溶け、全身投与の場合に毒性が少ない。当然ＶＤＰ共通溶媒システムの割合は色々であり、しかも溶解性や毒性の性質を壊す事がない。更に共通溶媒の構成成分も多種多様である。更に共通溶媒例えばポリソルベート８０の代わりに他の低毒無極性の表面活性剤を使う事もできるし、ポリエチレングリコールのフラクション・サイズにも様々な可能性がある。ポリエチレングリコールの代わりに他の生物適合性のあるポリマー、例えばポリビニル・ピロリドンを使う事もできる。ブドウ糖の代わりに他の糖類やポリサッカリドを使っても良い。代替案として、疎水性の製薬学的化合物には別の送達システムを使っても良い。疎水性の薬としては、リポゾームや乳化剤が送達用担体又は媒体として良く知られている。ジメチルスルフォキシドのようなある有機溶媒も、毒性は少し高いが使用可能である。更に、治療薬を含む固体疎水性ポリマーの半透性基質のような持続放出システムを使って化合物を送達しても良い。色々なタイプの持続放出物質が確立されており、医学界では良く知られている。持続放出カプセルは、その化学物質の性質次第ではあるが、化合物を２−３週間から長い時には１００日以上をかけて放出する。治療薬の科学的性質及び生物学的安定性次第ではあるが、蛋白質や他の活性成分の安定に必要だと思われる方法が追加される場合もあり得る。
【０２６８】
製薬学的混合物には、適切な固体又はゲル状の相から成る担体で構成されている場合もある。そういう担体の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、ポリエチレングリコールのようなポリマー等が挙げられる。本発明の活性成分の多くを、製薬学的に融和性のある反対イオン塩として提供する事も可能である。そういう製薬学的に容認可能な塩は、生物学的な有効性及び自由酸の性質を保持する塩であり、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基アミノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミン等の無機又は有機の塩基と反応させる事により得られる。
【０２６９】
本発明の製薬学的混合物は、本発明の蛋白質又は他の活性成分、及び蛋白質又はペプチド抗原の複合体の形でも可能である。蛋白質又はペプチド抗原は、Ｂリンフォサイト及びＴリンフォサイトに刺激信号を送る。Ｂリンフォサイトは、その表面にあるイミュノグロブリン受容体を通して抗原に対し反応する。Ｔリンフォサイトは、ＭＨＣ蛋白により抗原が出された後Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通して抗原に反応する。ＭＨＣ及び構造的に関連のある蛋白質（クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ遺伝子により宿主細胞上にコード化されている場合も含めて）は、ペプチド抗原をＴリンフォサイトに提供する働きをする。抗原成分も、純化されたＭＨＣペプチド複合体単独で、又はＴ細胞に直接信号を送る共同刺激分子とともに供給しても良い。代替案として、表面イミュノグロブリンやＢ細胞上の他の分子に結合可能な抗体、及びＴＣＲやＴ細胞上の他の分子に結合可能な抗体を、本発明の製薬学的混合物と組み合わせる事も可能である。
【０２７０】
本発明の製薬学的混合物は、リポゾームの形でも可能である。その場合、リポゾームの中で、本発明の蛋白質を、製薬学的に容認可能な他の担体とは別に、脂質のような両親媒性の物質と組み合わせる。脂質はミセル（コロイド分散状態）、不溶性の単一層、又は水溶液の中に層状相として凝集した形で存在している。リポゾーム形成に必要な脂質は、モノグリセリド、ジグリセリド、サルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等である。こういうリポゾームの製法は、公表されている医療技術の範疇に含まれている。例えば、米国特許番号４，２３５，８７１；４，５０１，７２８；４，８３７，０２８；４，７３７，３２３等で、これらは全て参考文献として本文書に含まれている。
【０２７１】
本発明の製薬学的混合物との関連で用いられる本発明の蛋白質又は他の活性成分の量は、治療される条件の性質及びその重症度により決定される。最終的には、各患者の治療に当たって、診察する医者が本発明の蛋白質又は他の活性成分の量を決定する。診察医は最初、本発明の蛋白質又は他の活性成分を少量投与し、患者の反応を観察する。治療学上最高の効果が得られるまで、本発明の蛋白質又は他の活性成分の量を増やしていき、その点に達したらもはや薬量を増やす事はしない。本発明の方法を実践するのに使われる色々な製薬学的混合物は、本発明の蛋白質又は他の活性成分を体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇから約１００  ｍｇ（できれば約０．１μｇから約１０  ｍｇ、更に理想的には約０．１μｇから約１  ｍｇ）含んでいるべきであると考えられている。骨、軟骨、腱、又は靭帯の退化に有効である本発明の混合物を用いた治療方法には、局部的、全身的、又はインプラントや装置の形で局所的に使用する方法などがある。投与に当たり、本発明の治療方法は、発熱物資を含まない生理学的に容認できる形で行われる。更にこの混合物は、カプセル化するか色々な方法で注射する事により、骨、軟骨、又は損傷した細胞組織へ送るのが好ましいかも知れない。怪我の癒しや細胞組織の修復には局部投与が適切かも知れない。本発明の蛋白質又は他の活性成分以外の治療に有効な物質（それも上記混合物の中に含める事が可能）を本発明の混合物の代わりに、又はその追加として、同時又は連続的に使用しても良い。骨や軟骨の形成を促すには、蛋白質又は他の活性成分を含む混合物を骨や軟骨の損傷部位に送る事ができ、骨や軟骨の発達に必要な構造を持ちしかも、再び体に吸収される基質が、その混合物の中に含まれているのが望ましい。そういう基質は、現在他の移植手術で使われている材料で作っても良い。
【０２７２】
基質材料の選択は生物適合性、生物分解性、物理学的性質、外見、及び相互作用的性質に基づいている。混合物の適用内容により調剤方法が決定される。混合物の基質になる可能性のあるのは生物分解性のあるもので、合成硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びポリ無水物である。この他に可能性のある材料は、生物分解性があり生物学的に明確な例えば骨や皮膚のコラーゲンなどである。他の基質は純粋の蛋白質か細胞外基質成分で構成されている。他に可能性のある基質は、生物分解性がなく化学合成された例えば焼結されたヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩、又はその他のセラミックである。基質は上記物質を複数組み合わせたもので構成するのも可能である。例えば、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト又はコラーゲンとリン酸三カルシウムなどである。生体セラミックは組成を変える事もできる。例えばカルシウム・アルミン酸塩・リン酸塩で、加工して穴の大きさ、粒子の大きさ及び形、又は生物分解性を変える事も可能である。現在好まれているのは、直径１５０乃至８００ミクロンの多孔性粒子からなる乳酸とグリコール酸５０：５０（分子量）の共重合体である。ある場合には、蛋白質混合物が基質から解離するのを防ぐのに、カルボキシルメチル・セルロースや自家凝血のような金属イオン封鎖剤を利用しても良い。
【０２７３】
金属イオン封鎖剤として好まれるのは、アルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースも含む）のようなセルロース材料である。この中には、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル・メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等も含まれる。その中でも最も好まれるのがカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の陽イオン塩である。この他にも金属イオン封鎖剤として好まれるのは、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン酸化物、カルボキシビニル・ポリマー、及びポリビニル・アルコールである。金属イオン封鎖剤の最適量は、全製剤重量当たり０．５−２０重量％、理想的には１−１０重量％で、これは蛋白質がポリマー基質から脱着するのを防ぐと同時に、混合物取り扱いの簡便化に必要な量を表しており、しかも始原細胞が基質に侵入するのを妨げる程の量ではないので、蛋白質は始原細胞の骨形成活動を助ける事ができる。更に、本発明の蛋白質又は他の活性成分を、骨や軟骨の欠陥、怪我、又は問題のある細胞組織の治療に役立つ他の物質と組み合わせても良い。こういう物質には、色々な成長因子が含まれる。例えば表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）などである。
【０２７４】
治療用混合物は現在獣医学の面でも価値が見出されている。本発明の蛋白質又は他の活性成分を用いた治療は、人間以外にも、家畜やサラブレッドの馬に特に使用できる。細胞組織の再生に蛋白質を含む製薬学上の混合物を用いるに当たり、その投与量は、診断する医師が蛋白質の活動に影響を及ぼす色々な要因を考慮した上で決定する。例えば、形成すべき細胞組織の重量、損傷部分、損傷を受けた細胞組織の状態、怪我の大きさ、損傷を受けた細胞組織の種類（例えば骨）、患者の年令、性別、食事、感染度合い、投与時間、他の臨床的要因等である。投与量は再生に使われる基質の種類によっても異なるし、製薬学的混合物の中に含まれる他の蛋白質の有無によっても違ってくる。例えば、最終混合物にＩＧＦ  Ｉ（インシュリン様成長因子Ｉ）のような他の既知の成長因子を加える場合も、投与量に影響が及ぶかも知れない。細胞組織や骨の成長や回復をＸ線、組織形態計測決定法、テトラサイクリン標識法のような方法で定期的に評価する事により、回復度合いをチェックできる。
【０２７５】
本発明のポリヌクレオチドは遺伝子療法に用いる事もできる。そういうポリヌクレオチドは哺乳類の形質発現を調べるため、生体内又は生体外で細胞に導入できる。本発明のポリヌクレオチドは、核酸を細胞や生物体に導入する方法として知られている他の方法を用いても投与できる（例えばウイルス媒介や裸のＤＮＡ等）。細胞は、繁殖させるため又は望ましい効果や活動を得るため、本発明の蛋白質を含む試験管内で培養する事も可能である。このようにして処理された細胞は、治療目的のため生体内に導入する事ができる。
【０２７６】
（５．１３．３：有効薬量）
本発明の使用に適した製薬学的混合物は、目的達成のために活性成分を有効量含む混合物である。より具体的に述べると、治療学的な有効量とは、治療を受ける対象の現在の症状の進行が抑えられる、あるいは緩和されるのに必要な量を意味する。有効量の決定は医療技術の能力の範疇に属するものであり、本文書で詳細に説明してきたので尚更そうである。本発明の方法に用いられる混合物の治療学的有効量は、まず試験管内での分析によって推定できる。例えば動物モデルを使って薬量を処方し、循環濃度の範囲を決め、次にそれを使ってより精確に人間の使用量を決定する。例えば動物モデルを使って薬量を処方し、循環濃度の範囲を決めるが、その中に細胞培養で決定されるＩＣ５０  （つまり蛋白質の生物学的活動を阻害する最大値の半分に相当する試験化合物の濃度）も含まれる。こういう情報は、人間の使用量をより精確に決定するのに利用できる。
【０２７７】
治療学的有効量とは、症状の回復又は患者の生存期間の延長を実現する化合物の量を意味する。そういう化合物の毒性及び治療学的効果は、細胞培養や実験動物を用いた標準の製薬学的手法により決定できる。例えば、ＬＤ５０（個体数が５０％死ぬ薬量）やＥＤ５０（個体数の５０％に治療学的に効果のある薬量）等の決定である。毒性と治療学的効果の薬量比は治療指数と言い、ＬＤ５０とＥＤ５０の比で表される。治療指数の高い化合物がより好ましい化合物である。この細胞培養分析と動物研究から得られるデータを使って、人間の使用量の範囲を処方する事ができる。そういう化合物の薬量はＥＤ５０を含む循環濃度内に納まり、毒性が全くあるいはほとんどないのが好ましい。薬量は薬の形態又は投与方法に基づいてその範囲内で変化する。正確な処方、投与方法、及び薬量は、患者の状態を見ながら、医者が決定するものである。例えば、Ｆｉｎｇｌ等、１９７５年、「治療学の薬理学的基礎」の第１章第１頁を参照の事。薬量及び期間は、血漿の活動レベルが半分であるような状態を提供するように個別に調整できる。そういう状態は、好ましい効果を維持するのに、あるいは最低有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分である。ＭＥＣは化合物の種類により異なるが、試験管内データに基づいて推測可能である。ＭＥＣを達成するのに必要な薬量は個人の特性や投与方法により異なるが、ＨＰＬＣ分析や生物検定を用いて血漿濃度を決定するのは可能である。
【０２７８】
投薬の間隔もＭＥＣの値を使って決定できる。化合物は、時間の１０−９０％、血漿値をＭＥＣ以上に維持する方法を使って投与されるべきである。できれば３０−９０％、最も好ましいのは５０−９０％である。局所投与又は選択的摂取の場合は、薬の有効局所濃度は血漿濃度とは関係ないかも知れない。
【０２７９】
本発明のポリペプチド又は他の混合物の薬量は、大人と子供では異なるが、毎日体重１ｋｇ当たり約０．０１乃至１００ｍｇの範囲になるであろう。より好ましいのは、毎日体重１ｋｇ当たり約０．１乃至２５ｍｇの範囲である。投薬は１日１回、又は等量であればその間隔を短くしても長くしても良い。
勿論、投与量は、治療される対象の年令、体重、症状の度合い、投与方法、及び処方医の判断によって異なってくる。
【０２８０】
（５．１３．４：包装）
混合物はパック又はディスペンサーを使って投与する事も可能である。その中に
活性成分を含む１単位又はそれ以上の単位の薬を入れる事ができる。パックは例えば金属製やブリスター・パックのようなプラスチック・フォイルでも良い。パックやディスペンサーには投与方法に関する手引書を添付しても良い。本発明の化合物を含む混合物を製薬学的に適合性のある担体に入れて処方し、それを適切な容器に入れ、特定の治療方法を示したラベルを貼る事も可能である。
【０２８１】
（５．１４：抗体）
本発明の中には、蛋白質又は本発明の蛋白質の断片への抗体も含まれている。本文書で使われている「抗体」という語は、イミュノグロブリン分子及びイミュノグロブリン（Ｉｇ）分子のうち免疫学的に活性な部分、つまり抗原と特異的に結合する（免疫反応を生じる）抗原結合部位を有している分子を意味している。そういう抗体の中には、ポリクロナル、単クロナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ表現ライブラリー等が含まれる。一般的に人間の抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのいずれかのクラスに関係している。これらの分子は、それに含まれる重鎖の性質により互いに異なっている。あるクラスの中にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２のようにサブクラスを持つのもある。人間の場合は、軽鎖はκ鎖やλ鎖である場合もある。本文書で抗体と言う場合は、そういうクラス、サブクラス、そして人間の抗体の全てを意味する。
【０２８２】
本発明の蛋白質に関連する単離蛋白を抗原として、又はその一部や断片として使う事も可能である。そしてそれを免疫抗原として使い、ポリクローン及び単クローン抗体準備の標準技術を用いて、免疫特異的に抗原に結合する抗体を作る事もできる。蛋白質全体を免疫抗原として使う事もできるし、免疫抗原として使われる抗原のペプチド断片を本発明が提供する事も可能である。抗原性のペプチド断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されているような全蛋白質のアミノ酸配列のうち少なくとも６つのアミノ酸残基から成っており、その抗原決定基（エピトープ）を取り囲んでいる。その場合、ペプチドの抗体は、全蛋白質あるいはエピトープを含む断片と特異的な免疫複合体を形成する。できれば、抗原性のペプチドは少なくとも１０のアミノ酸残基、あるいは少なくとも１５のアミノ酸残基、あるいは少なくとも２０のアミノ酸残基、あるいは少なくとも３０のアミノ酸残基からなっているのが好ましい。抗原性のペプチドによって囲まれているエピトープは、蛋白質の表面に位置しているのが望ましい。その部位はふつう親水性である。
【０２８３】
本発明のある部分に関しては、抗原性のペプチドにより囲まれているエピトープの少なくとも１つは、蛋白質の表面に位置している例えば親水性の部位である。人間の蛋白質配列の疎水性分析は、関連蛋白質のどの部位が親水性で、抗体生産用の表面残基をコード化しているかを示している。抗体生産の方法として、親水性と疎水性の部位を示す方法は、医療技術の面で既に良く知られている。例えば、Ｋｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｅｌ法又はＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法（フーリエ変換を使う場合も使わない場合も）などである。Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，  １９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：  ３８２４−３８２８；  Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：  １０５−１４２を参照の事。いずれも参考文献として本文書に全文が掲載されている。抗原蛋白、その誘導体、断片、類似体、又は同族体の中の１つ又はそれ以上の領域に特異的な抗体も、本文書に提供されている。
【０２８４】
本発明の蛋白質、その誘導体、断片、類似体、同族体、又はオルトログは、これら蛋白質構成要素へ免疫特異的に結合する抗体生産において、免疫抗原として利用する事ができる。
【０２８５】
本発明の蛋白質、その誘導体、断片、類似体、同族体、又はオルトログに対するポリクローン又は単クローン抗体の生産には、医学界で既に知られている色々な方法を利用する事ができる。（例えば、本文書に参考文献として取り上げている、抗体：実験室手引書、Ｈａｌｏｗ  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，  １９８８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹを参照の事。）
（５．１４．１：ポリクローン抗体）
ポリクローン抗体の生産にあたり、天然の蛋白質、その合成変異体、又はそれらの誘導体を１回又はそれ以上注射する事により、色々な実験動物、例えばウサギ、山羊、ハツカネズミ等の哺乳動物を、免疫化する事ができる。免疫抗原の準備の中には、天然の免疫抗原蛋白、免疫抗原蛋白を代表する合成ポリペプチド、又は組み換え型形質発現の免疫抗原蛋白等を含む事ができる。更に、免疫化される哺乳動物の体内で免疫抗原であると既に知られている第２の蛋白質とその蛋白質を結合させ、複合蛋白質にする事も可能である。そういう免疫抗原蛋白としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、血清アルブミン、牛のチログロブリン、大豆のトリプシン抑制剤等がある。更に補助物質を含めても良い。免疫反応を高めるために使用される色々な補助物質の中には、フロイント補助物質（完全及び不完全）、ミネラル・ゲル（例えばアルミニウム水酸化物）、表面活性物質（例えばリソレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノール等）がある。人間に使われる補助物質としては、カルメット・ゲラン、コリネバクテリウム・パルブム、又は類似の免疫刺激物質がある。この他にも使用可能な補助物質として、ＭＰＬ−ＴＤＭ補助物質（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロース・ジコリノミコール酸）もある。
【０２８６】
免疫抗原蛋白に対するポリクローン抗体分子は哺乳動物の例えば血液から単離し、蛋白質Ａか蛋白質Ｇを使ったアフィニティー・クロマトグラフィーのような良く知られて技術で純化する事ができる。それは主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する。その後、又は代替方法として、イミュノグロブリンの標的である特定の抗原又はそのエピトープを、カラム上で固定し、イミュノアフィニティー・クロマトグラフィーで免疫抗体を純化する事も可能である。イミュノグロブリンの純化に関しては、例えば、Ｄ．  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎが論じている（ペンシルバニア州フィラデルフィアのザ・サイエンティスト社出版、ザ・サイエンティスト、第１４巻、Ｎｏ．８（２０００年４月１７日）２５−２８頁）。
【０２８７】
（５．１４．２：単クローン抗体）
本文書で使用される「単クローン抗体」（ＭＡｂ）又は「単クローン混合物」は、ユニークな軽鎖遺伝子産物及びユニークな重鎖遺伝子産物からなる１種類の抗体分子だけを含む抗体分子個体群を意味している。特に、相補性を決定する単クローン抗体部位（ＣＤＲ）は、個体群の全分子に関して同一である。従ってＭＡｂは、ある抗原に特別の親和性を持ち、その抗原のエピトープと免疫反応を起こす事のできる抗原結合部位を含んでいる。
【０２８８】
単クローン抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５）に記述されているようなヒブリドーマ（雑種細胞法）を用いて準備できる。雑種細胞法では、ハツカネズミ、ハムスター、その他の実験動物を免疫剤で免疫化する。それは、免疫剤に特異的に結合する抗体を生産する又は生産できるリンパ球を引き出すためである。リンパ球は試験管内で免疫化する事も可能である。
【０２８９】
免疫化物質の中には、ふつう蛋白抗原、その断片又はその融合蛋白等が含まれる。一般的に、人間の細胞が要求される時には抹消血リンパ球、人間以外の哺乳動物が要求される時には脾臓細胞かリンパ腺細胞が使われる。次にリンパ球はポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使って不朽化した細胞株と融合させ、雑種細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、単クローン抗体：原理と実践、アカデミック・プレス、（１９８６）５９−１０３頁）。不朽化した細胞株は普通、形質転換した哺乳動物の細胞、特にげっ歯類、牛属、人間の骨髄腫細胞である。通常、ネズミかハツカネズミの骨髄腫の細胞株が用いられる。雑種細胞は適当な培地で培養する事ができる。培地には、融合しなかった不朽化細胞の成長や生存を阻害する物質を１種類乃至それ以上含むのが望ましい。例えば、親細胞に酵素であるヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠如している場合は、雑種細胞用の培地には普通、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を阻害するヒポキサンチン、アミノプテリン、そしてチミジン（ＨＡＴ培地）が含まれている。
【０２９０】
不朽化細胞は、融合率が良いもの、選別された抗体生産細胞の抗体発現を安定した高いレベルで支持するもの、ＨＡＴ培地等の培地に敏感なものが好ましい。より好ましい不朽化細胞は、ネズミ科の骨髄腫細胞株である。ネズミ科の骨髄腫細胞株は、カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒやバージニア州マナッサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎで入手できる。人間の骨髄腫及びハツカネズミ・ヒトへテロ骨髄腫細胞株も、人間の単クローン抗体生産に関して記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：  ３００１（１９８４）；  Ｂｒｏｄｅｕｒ等，  単クローン抗体生産技術及び応用、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，ニューヨーク、（１９８７）５１−６３頁）。
【０２９１】
次に抗原に対する単クローン抗体が存在するかどうかを、雑種細胞を培養する培地について分析する。雑種細胞が生産する単クローン抗体の結合特異性を、免疫沈降反応により、あるいは放射性同位元素標識免疫測定（ＲＩＡ）や酵素連結・特異的抗体吸着分析（ＥＬＩＳＡ）のような試験管内の結合分析によって決定するのが好ましい。そういう技術や分析方法は医学界では良く知られている。単クローン抗体の結合親和性は、例えば、マンソン及びポラードのスキャッチャード分析、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）により決定できる。抗原への特異性と結合親和性の高い抗体の単離が望まれる。
【０２９２】
求められている雑種細胞が同定されたら、その後、限界希釈法によりクローンをサブクローン化し、標準方法でそれを成長させる。この目的に適した培地は、例えば、ダルベッコのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地及び  ＲＰＭＩ−１６４０培地である。雑種細胞は、哺乳動物の体内で腹水として成長させる方法も可能である。
【０２９３】
サブクローンにより分泌された単クローン抗体は、蛋白質Ａセファローズ、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティー・クロマトグラフィー等の一般的なイミュノグロブリン純化方法により、培地又は腹水から単離し純化する事ができる。
【０２９４】
単クローン抗体は、米国特許番号４，８１６，５６７に記されているような組み換えＤＮＡ法によっても作成できる。本発明の単クローン抗体をコード化しているＤＮＡは、普通の方法を使って簡単に単離し配列を決定できる（例えば、ネズミの抗体の重鎖及び軽鎖をコード化している遺伝子へ特異的に結合できるオリゴヌクレオチドを使って）。本発明の雑種細胞は、そういうＤＮＡ源として好ましいものである。単離されたＤＮＡは次に発現ベクターに載せられ、それから組み換え宿主細胞の中で単クローン抗体を合成するために、猿のＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞のような普通はイミュノグロブリン蛋白を生産しない宿主細胞に形質移入される。ＤＮＡは例えば、同族体のネズミの配列の代わりに人間の重鎖・軽鎖一定領域のコード化された配列を使ったり（米国特許番号４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，  ８１２−１２（１９９４））、非イミュノグロブリン・ポリペプチドのコード化された配列をイミュノグロブリンのコード化された配列に共有結合させたりして修正する事も可能である。そういう非イミュノグロブリン・ポリペプチドを本発明の一定領域の代わりに、又は本発明抗体の抗原結合部位変動領域の代わりに使って、キメラ的なニ価抗体を作る事も可能である。
【０２９５】
（５．１４．２：人間化された抗体）
更に、本発明の蛋白抗原に対する抗体は、人間化した抗体又は人間の抗体で構成する事も可能である。こういう抗体は、イミュノグロブリンを投与しても人間に免疫反応を起こさせる事がないので、人間への投与に適している。人間化された形の抗体は、キメラ性のイミュノグロブリン、イミュノグロブリン鎖、又はその断片（例えばＦｖ，  Ｆａｂ，  Ｆａｂ’，  Ｆ（ａｂ’）２等抗原と結合する抗体のサブ配列）であり、これらは主に人間のイミュノグロブリンの配列で構成され、人間以外のイミュノグロブリンから得られた配列を最小限含んでいる。抗体の人間化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び彼の同僚の方法を踏襲し（Ｊｏｎｅ等、Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：  ５２２−５２５（１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：  ３２３−３２７（９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：  １５３４−１５３６（１９８８））、人間の抗体の配列の代わりに、それに対応するげっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列を使うことにより達成できる。（米国特許番号５，２２５，５３９も参照の事）  ある場合には、人間のイミュノグロブリンのＦｖ基質残基を、それに対応する人間以外の残基で置き換える。人間化された抗体は、受容体の抗体にも、移入性のＣＤＲにも、基質配列にも見出されないような残基で構成する事も可能である。一般的に、人間化された抗体は、少なくとも１つ、普通は２つの変動領域にり構成される。その場合、ＣＤＲ部分の全て又は実質的に全てが人間以外のイミュノグロブリンのそれに対応しており、基質部分の全て又は実質的に全てが人間のイミュノグロブリンのコンセンサス配列のそれである。人間化された抗体は、理想的には、イミュノグロブリンの一定領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、普通は人間のイミュノグロブリンのそれで構成するのが好ましい（Ｊｏｎｅｓ等  １９８６；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、１９８８；  及びＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｇｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：  ５９３−５９６（１９９２））。
【０２９６】
（５．１４．３：人間の抗体）
人間の抗体は、ＣＤＲを含めて軽鎖及び重鎖の実質的に全ての配列が、人間の遺伝子起源である抗体分子に関係している。そういう抗体は、本文書では「人間の抗体」又は「完全に人間の抗体」と呼ぶ。人間の単クローン抗体は、トリオマ技術、人間のＢ細胞の雑種細胞技術（Ｋｏｚｂｏｒ等、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：  ７２を参照の事）、及びＥＢＶ雑種細胞技術（Ｃｏｌｅ等，  単クローン抗体及び癌の治療，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ７７−９６頁を参照の事）で準備できる。人間の単クローン抗体は本発明の実用化の際に利用でき、人間の雑種細胞を使う事により（Ｃｏｔｅ等，  １９８３，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：  ２０２６−２０３０を参照の事）、あるいは人間のＢ細胞を試験管の中でＥＢＶ（エプシュタイン・バー・ヴィールス）により形質転換させる事により（Ｃｏｌｅ等，  単クローン抗体及び癌の治療，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ７７−９６頁を参照の事）生産できる。
【０２９７】
更に人間の抗体は、別の技術、例えばファージ表示ライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：  ３８１  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：  ５８１  （１９９１）  ）等を使っても生産できる。同様に、人間の抗体は、人間のイミュノグロブリンの遺伝子座を遺伝子導入動物、例えば内因性のイミュノグロブリン遺伝子を部分的に又は完全に不活性化したハツカネズミに導入する事によっても形成できる。抗原投与に対し、人間の抗体生産の観察が行われたが、遺伝子の再配列、集合、及び抗体のレパートリーを含むあらゆる面で、それは人間の体内で生じている内容に酷似している。これは例えば次の報告に記述されている：米国特許番号５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６、Ｍａｒｋｓ等、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，  ７７９−７８３  （９９２）；  Ｌｏｎｂｅｒｇ等（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，  ８５６−８５９  （１９９４））；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  （Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，  ８１２−１３  （１９９４）；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等，  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８４５−５１  （１９９６））；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８２６  （１９９６））；  及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  （Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３  ６５−９３  （１９９５））。
【０２９８】
人間の抗体は、自分の内因性抗体でなく完全に人間の抗体を生産するように修正された遺伝子導入動物を使って生産する事も可能である（ＰＣＴ出版ＷＯ９４／０２６０２を参照の事）。イミュノグロブリンの重鎖及び軽鎖をコード化した動物の内因性遺伝子を不活性化し、重鎖及び軽鎖のイミュノグロブリンをコード化した人間の活性遺伝子座が、その代わりに宿主のゲノムの中に挿入されている。人間の遺伝子は、例えば、人間のＤＮＡの必要な部分を含む酵母の人工染色体を使って導入する。希望の修正部分を全て提供する動物は、修正部分を完全には含まない中間遺伝子導入動物を交雑育種する事により後代として得られる。そういう動物の中ではハツカネズミが好ましく、ＰＣＴ出版ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９６／３４０８６で示されているように、それはＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（ゼノマウス）と呼ばれる。この動物は、完全に人間のイミュノグロブリンを分泌するＢ細胞を生産する。抗体は、例えばポリクローン抗体の準備として、関心のある免疫抗原で免疫化した後、そういう動物から直接得る事ができる。あるいは単クローン抗体を生産する雑種細胞のような動物起因の不朽化Ｂ細胞から得る事も可能である。人間の変動部位を持つイミュノグロブリンをコード化した遺伝子を回復させ、発現させて、直接抗体を得る事も可能である。あるいは更に修正を加えて、単鎖Ｆｖ分子のような抗体類似体を得る事もできる。
【０２９９】
内因性のイミュノグロブリン重鎖の形質発現が欠如している人間以外の宿主、例えばハツカネズミ等を生産する方法は、米国特許番号５，９３９，５９８に示されている。それは、胚幹細胞の中にある内因性重鎖遺伝子座の少なくとも１つからＪ部分の遺伝子を削除する方法があるが、それを含むやり方で得る事ができる。それは、その遺伝子座の再配列を防ぎ、再配列されたイミュノグロブリン重鎖遺伝子座の写しの作成を防ぐためである。削除は、選択可能な標識をコード化した遺伝子を含む標的ベクターにより行われる。そして胚幹細胞から、選択的標識をコード化した遺伝子を体細胞及び生殖細胞に含む遺伝子導入マウスを生産する。
【０３００】
例えば人間の抗体のように求められている抗体を生産する方法は、米国特許番号５．９１６，７７１に述べられている。それは、重鎖をコード化したヌクレオチド配列を含む発現ベクターを培養中の哺乳動物宿主細胞に導入し、軽鎖をコード化したヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入し、その２つの細胞を融合して雑種細胞を作る方法に関係している。雑種細胞は、重鎖と軽鎖を含む抗体を発現する。
【０３０１】
このやり方を更に改善する方法として、免疫抗原に臨床的に関連のあるエピトープを同定する方法、及びそのエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選別する相補的な方法が、ＰＣＴ出版ＷＯ９９／５３０４９に述べられている。
【０３０２】
（５．１４．４：Ｆａｂ断片及び単鎖抗体）
本発明では、本発明の抗原蛋白に特異的な単鎖抗体を生産するための技術は、調整可能である（例えば米国特許番号４，９４６，７７８を参照の事）。更に、蛋白質、又はその誘導体、断片、類似体、同族体に対し好ましい特異性を持つ単クローンＦａｂ断片の同定を迅速かつ効果的に行うために、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築方法を調整する事も可能である（例えばＨｕｓｅ等，  １９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：  １２７５−１２８１を参照の事）。ある蛋白抗原に特有の遺伝子型を含む抗体断片は、医学界で既に良く知られている技術を用いて生産可能である。例えば、（ｉ）ある抗体分子のペプシン消化により生産されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉ）  Ｆ（ａｂ’）２のジスルフィド・ブリッジを減らす事により生産されるＦａｂ断片；（ｉｉｉ）パパイン及び還元剤で抗体分子を処理する事により生産されるＦａｂ断片；及び（ｉｖ）Ｆｖ断片。
【０３０３】
（５．１４．５：生物特異的な抗体）
二重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を持つ単クローン抗体（人間又は人間化された抗体が好ましい）である。本件においては、結合特異性の１つは、本発明の抗原蛋白である。第２の結合標的はそれ以外の抗原であり、細胞表面の蛋白質、受容体、又は受容体サブユニットであるのが望ましい。
【０３０４】
二重特異性抗体の作成方法は、医学界では良く知られている。通常の方法としては、二重特異性抗体の遺伝子組み換え生産は、２つのイミュノグロブリン重鎖・軽鎖ペアの共同発現に基づいている。この場合２つの重鎖は、異なる特異性を有している（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０５：  ５３７−５３９  （１９８３））。イミュノグロブリン重鎖・軽鎖はランダムに組み合わされるので、その雑種細胞（クアドロマ）は、１０の異なる抗体分子の混合体を産する。その中で１つだけが、正しい二重特異性の構造を持っている。その正しい分子の純化は、普通アフィニティー・クロマトグラフィーにより行われる。同じような方法が、ＰＣＴ出版ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日出版）及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：  ３６５５−３６５９に述べられている。
【０３０５】
要求されている結合特異性（抗原抗体結合部位）を持つ抗体の変動領域は、イミュノグロブリンの一定領域配列に融合させる事ができる。ヒンジ（ちょうつがい）、ＣＨ２及びＣＨ３部位の少なくとも一部分で構成されるイミュノグロブリン重鎖の一定領域との融合が好ましい。軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖一定領域が、融合体の少なくとも１つに存在するのが望ましい。イミュノグロブリン重鎖（そしてできればイミュノグロブリン軽鎖も）の融合をコード化したＤＮＡが異なる発現ベクターに挿入され、適切な宿主有機体に同時形質移入される。二重特異性抗体の生産方法については、更に詳細は例えば、Ｓｕｒｅｓｈ等、酵素化学の方法、１２１：２１０  （１９８６）を参照の事。
【０３０６】
ＷＯ９６／２７０１１に述べられている別の方法によれば、遺伝子組み換え細胞培養から回収されるヘテロダーマーの割合を最大にするように、一対の抗体分子間のインターフェースを工夫する事も可能である。好ましいインターフェースは、抗体一定領域中にあるＣＨ３部位の少なくとも一部分で構成される。この方法によると、最初の抗体分子のインターフェースから得られる小さいアミノ酸側鎖を、チロシンやトリプトファンのような大きい側鎖で置き換える事ができる。大きいアミノ酸側鎖をアラニンやトレオニンのような小さいアミノ酸側鎖で置き換える事により、大きい側鎖に対して同じ又は類似の大きさの補償「キャビティー（腔）」を、第２の抗体分子のインターフェース上に作る事ができる。この方法で、ホモダイマーのような好ましくない最終生産物以上にヘテロダイマーを増やす事が可能である。
【０３０７】
二重特異性抗体は全長抗体として、又は抗体の断片  （例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）  として準備できる。抗体断片から二重特異性抗体を作る技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を使って準備できる。Ｂｒｅｎｎａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１  （１９８５）は、無傷の抗体が蛋白質分解して裂け、Ｆ（ａｂ’）２の断片を生成する方法について述べている。こういう断片は、ジチオール複合剤である砒酸ナトリウムの存在下で還元され、その結果、隣接したジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド結合の形成を阻害する。そのようにして生成されたＦａｂ’の断片は、チオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換される。
【０３０８】
次にＦａｂ’‐ＴＮＢ誘導体はメルカプトエチルアミンで還元するとＦａｂ’‐チオールに再び転換され、Ｆａｂ’‐ＴＮＢ誘導体と等モル量ずつ混合されて二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化剤として使用できる。
【０３０９】
その他に、Ｆａｂ’の断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて二重特異性抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙ等，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：２１７−２２５  （１９９２）は、完全に人間化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産について記述している。Ｆａｂ’断片はそれぞれ大腸菌から別々に分泌され、試験管内で化学結合を施され、その結果二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現している細胞及び人間の正常なＴ細胞に結合でき、それと同時に、人間の乳癌に対して細胞毒性リンパ球の溶解活動を誘発する。
【０３１０】
遺伝子組み換え細胞培養から直接二重特異性抗体の断片を形成し単離する方法も、種々報告されている。例えば、二重特異性抗体はロイシン・ジッパーを使って生産されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８（５）：１５４７−１５５３  （１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎ蛋白質から得られるロイシン・ジッパー・ペプチドは、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモダイマーはヒンジ部分で還元されモノマーを作り、再び酸化されて抗体へテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモダイマーの生産にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）に記されている”ｄｉａｂｏｄｙ”技術は、二重特異性抗体の断片を作るための代替機構を提供している。その断片は、リンカーにより互いに結合された重鎖変動領域（ＶＨ）と軽鎖変動領域（ＶＬ）から構成される。リンカーは短いので、同じ鎖上の２つの領域間でペアを作る事はない。従って、１つの断片のＶＨ領域をＶＬ領域は相補的なＶＬ領域及びＶＨ領域とペアを作るように強制され、その結果、抗原と結合する部位が２つ形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを用いた二重特異性抗体断片の作成方法も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ等，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：５３６８  （１９９４）を参照の事。
【０３１１】
３価以上の抗体も考えられている。例えば、トリ・スペシフィック（３特異性）な抗体も準備できる。Ｔｕｔｔ等，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：５０  （９９１）。典型的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープと結合できる。そのうちの少なくとも１つは本発明の蛋白抗原に由来する。イミュノグロブリン分子の反抗原用の腕を、白血球上のトリガ分子（例えばＣＤ２，  ＣＤ３，  ＣＤ２８，  Ｂ７のようなＴ細胞受容体分子）、あるいはＩｇＧ（ＦｃγＲ）のＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４），ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２），  ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に結合している腕と連結させる事も可能である。これは、細胞の防御機構を、特定の抗原を発現している細胞に集中させるためである。二重特異性抗体は、特定の抗原を発現している細胞に細胞毒性物質を向ける目的で利用できる。こういう抗体は、抗原と結合する腕及び細胞毒性物質や放射性核種キレート化剤（ＥＯＴＵＢＥ，  ＤＰＡＴＡ，  ＤＯＴＡ，  ＴＥＴＡ等）と結合する腕を所有している。別の二重特異性抗体は、本文書で述べられている蛋白抗原や、更に組織因子（ＴＦ）とも結合する。
【０３１２】
（５．１４．６：ヘテロ共役抗体）
ヘテロ共役抗体も本発明の範囲内にある。ヘテロ共役抗体は、２つの共有結合をした抗体で構成されている。そういう抗体の使用方法として例えば、免疫組織細胞で望ましくない細胞を攻撃する方法  （米国特許番号４，６７６，９８０）や、ＨＩＶ感染の治療（ＷＯ  ９１／００３６０；  ＷＯ  ９２／２００３７３；  ＥＰ  ０３０８９）が提案されている。そういう抗体は、合成蛋白化学で良く知られている方法（例えば架橋結合物質等を使う方法）を使って、試験管内で準備できると考えられている。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使って、又はチオエーテル結合を形成する事により構築できる。この目的に適した試薬は例えば、イミノチオレート、メチル−４−メルカプトブチルイミデート、米国特許番号４，６７６，９８０に掲載された試薬などである。
【０３１３】
（５．１４．７：作動体機能工学）
本発明の抗体は、作動体機能の面で調整するのが望ましい。これは例えば、癌治療などの際に抗体の効果を高めるためである。例えば、シスチン残基をＦｃ部位に導入し、分子内Ｓ−Ｓ結合形成をその部位で行わせる。このようにして作られたホモダイマーの抗体は、内在化能力を高めたり、補体媒介の細胞死滅や抗体依存の細胞毒性を増大させたりできる。Ｃａｒｏｎ等，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７６：  １１９１−１１９５  （１９９２）；  Ｓｈｏｐｅｓ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８：  ２９１８−２９２  （１９９２）を参照の事。抗癌作用を強められたホモダイマー抗体は、Ｗｏｌｆｆ等，  癌研究，  ５３：  ２５６０−２５６５  （１９９３）に述べられているように、ヘテロ・二作用架橋結合剤を使って準備する事も可能である。Ｆｃ二重部位を持つ抗体を作り、補体溶解やＡＤＣＣ能力を増進する事も可能である。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等，  抗癌薬設計，  ３：２１９−２３０  （１９８０）を参照の事。
【０３１４】
（５．１４．８：免疫共役）
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば細菌、カビ、植物、動物、又はそれらの断片由来の酵素学的に活発な毒素）、放射性アイソトープ（つまり放射性共役）のような細胞毒性物質を抗体と結合させた免疫共役とも関係している。
【０３１５】
そういう免疫共役の生成に用いられる化学療法剤は、上述の通りである。酵素学的に活性な毒素及びその断片は例えば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒の非結合活性断片、エクソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ・サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ蛋白、ｄｉａｎｔｈｉｎ蛋白、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ  蛋白（ＰＡＰＩ，  ＰＡＰＩＩ，  及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテシン等である。放射性共役抗体の生成には、２１２Ｂｉ，  １３１Ｉ，  １３１Ｉｎ，  ９０Ｙ，  １８６Ｒｅのような数多くの放射性核種が入手可能である。
【０３１６】
抗体と細胞毒性物質との結合には、種々の二作用性蛋白結合剤が使われる。二作用性蛋白結合剤には、Ｎ−サクシンイミジル‐３‐（２‐ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオレーン（ＩＴ）、イミドエステルの二作用性誘導体（ジメチル・アジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジサクシンイミジル・スベリン酸塩等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（Ｐ−アジドベンゾイル）へキサンジアミン等）、ビス‐ジアゾニウム誘導体（ビス‐（Ｐ‐ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン等）、ジイソシアン酸塩（トリエン２，６−ジイソシアン酸塩等）、ビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ‐２，４‐ジニトロベンゼン等）等がある。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３８：  １０９８  （１９８７）に述べられている方法で準備できる。炭素１４標識の１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン・トリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種と抗体との結合用の典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照の事。
【０３１７】
腫瘍攻撃の準備のために、抗体とストレプタビジンのような「受容体」を共役結合させる事も可能である。その場合、抗体・受容体共役体が患者に投与され、その後で結合しなかった共役体は、清澄剤を使い、それからアビジン等の「配位子」（細胞毒素と結合する）を投与する事によって、循環器系から除去される。
【０３１８】
（５．１５：コンピューター読取り可能な配列）
一応用例として、本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター読取り可能媒体上に記録できる。本文書で使用される「コンピューター読取り可能媒体」と言うのは、コンピューターにより読取り及びアクセスが可能な媒体全てを意味している。例えばフロッピー（登録商標）ディスクのような磁気記憶媒体、ハードディスク記憶媒体、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭのような光学記憶媒体、ＲＡＭやＲＯＭのような電子記憶媒体、磁気記憶媒体や光学記憶媒体等のハイブリッド等である。本発明のヌクレオチド配列を記録したコンピューター読取り媒体製品を製作するには、現在知られているコンピューター読取り媒体の中のどれをどのように使えば良いか、有能な技師であればすぐに分かるはずである。本文書で使用されている「記録される」という言い回しは、コンピューター読取り媒体に情報を保存するプロセスに言及している。有能な技師であれば、コンピューター読取り媒体に情報を記録する方法をどれでもすぐに採用して、本発明のヌクレオチド配列情報を含む製品を製作できるはずである。
【０３１９】
有能な技師は、本発明のヌクレオチド配列を記録するコンピューター読取り媒体を、色々なデータ記憶構造体を使って製作できる。どのデータ記憶構造体を選択するかは、通常記録された情報にアクセスする手段により決定される。更に、色々なデータ処理プログラムやフォーマットを使って、本発明のヌクレオチド配列情報をコンピューター読取り媒体上に記録できる。配列情報は、ワードパーフェクトやマイクロソフト・ワードのように商業用のソフトでフォーマットされたワープロ・テキストファイルで表す事もできるし、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、オラクルのようなデータベースの形式のＡＳＣＩＩで表す事も可能である。有能な技師であれば、データ処理構造のフォーマット（テキストファイルかデータベース）を使って、本発明のヌクレオチド配列情報を記録したコンピューター読取り媒体をすぐに得る事ができる。
【０３２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３、その代表的な断片、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３ヌクレオチド配列と少なくとも９９．９％同一であるヌクレオチド配列を、コンピューター読取り可能な形で提供する事により、有能な技師は、その配列情報をいつでも好きな時に色々な目的のためにアクセスできる。コンピューター読取り媒体の形で提供される配列情報をアクセス可能にするコンピューター・ソフトは、市販のものでいくらでも入手可能である。以下の例は、Ｓｙｂａｓｅシステム上でＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０  （１９９０））  及びＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇ等，  Ｃｏｍｐ．  Ｃｈｅｍ．  １７：  ２０３−２０７  （１９９３））探索アルゴリズムを実行するソフトを使って、核酸配列内のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の確認を行う方法を示している。そういうＯＲＦは、蛋白質をコード化した断片であるかも知れないし、発酵反応に使われる酵素や、商業的に有用な代謝産物の生産に使われる酵素等、商業的に重要な蛋白質の生産に使用されるかも知れない。
【０３２１】
本文書に述べられている「コンピューター利用システム」という語は、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するのに使われるハード、ソフト、及びデータ記憶手段を意味している。本発明のコンピューター利用システムにとって最低限必要なハードは、中央処理装置（ＣＰＵ）、インプット装置、アウトプット装置、そしてデータ記憶装置である。有能な技師であれば、現在入手可能なコンピューター利用システムのうち、本発明の使用に適しているのがどれであるかすぐ判断できる。上述の如く、本発明のコンピューター利用システムは、本発明のヌクレオチド配列を記録したデータ記憶装置、及び探索手段の支援と実行に必要なハードとソフトの装置で構成される。本文書で使用される「データ記憶装置」という言葉は、本発明のヌクレオチド配列情報を記録できる記憶装置（メモリー）か、本発明のヌクレオチド配列情報を記録している製品にアクセスするメモリー・アクセス装置のいずれかを意味している。
【０３２２】
本文書に使用される「探索手段」という語は、標的配列又は標的構造モチーフとデータ記憶装置に記録した配列情報とを比較するために、コンピューター利用システム上で実行される１つ又は複数のプログラムを意味している。探索手段は、特定の標的配列又は標的モチーフと一致する断片や既知の配列部位を同定するのに使用される。色々なアルゴリズムが既に商業化されているし、本発明のコンピューター利用システムに利用可能な探索手段実行用ソフトも数多く市販されている。そういうソフトには例えば、ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ  （ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＡ  （ＮＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＩＡ）等がある。有能な技師であれば、相同性探索用の種々のアルゴリズム又は実行ソフト・ユニットのうちいずれが、本発明のコンピューター利用システムに利用できるかすぐ判断できるはずである。本文書で使われる「標的配列」という語は、全ての核酸、６つ又はそれ以上のヌクレオチドのアミノ酸配列、あるいは２つ又はそれ以上のアミノ酸のアミノ酸配列を意味している。標的配列は長ければ長いほど、データベースの中でランダムには起きにくいという事が、有能な技師ならすぐに分かるはずである。標的配列のうち最も好ましい配列の長さは、約１０乃至１００のアミノ酸、又は約３０乃至３００のヌクレオチド残基である。しかし既に良く知られている事であるが、遺伝子発現や蛋白質処理等に関連する配列断片のような商業的に重要な断片の探索は、かなり短い長さで行われるかも知れない。
【０３２３】
本文書に使用される「標的構造モチーフ」又は「標的モチーフ」という語は、理性的に選択された配列又は配列の組み合わせの事であり、その配列は、標的モチーフのひだ上に形成される３次元構造に基づいて選ばれる。医学業界では色々な種類の標的モチーフが知られている。蛋白質の標的モチーフは、例えば、酵素の活性部位やシグナル配列などである。核酸の標的モチーフには、プロモーター（促進因子）配列、ヘアピン構造、誘発性発現要素（蛋白質結合配列）等が含まれる。
【０３２４】
（５．１６：変化配列の発現）
ＥＭＦ配列はゲノム内でのＯＲＦへの近接性から判定することができる。任意のＯＲＦから５’だけとられた長さが約１０から２００ヌクレオチドの遺伝子間セグメント、または遺伝子間セグメントのフラグメントが、作動可能にリンクされた３’ＯＲＦの発現を天然に発見されるＯＲＦ配列と同様に変化させる。ここで“遺伝子間セグメント”とは、二つのＯＲＦの間に存在するゲノムのフラグメントを指す。別の方法としては、既知のＥＭＦを本発明のコンピュータシステムの中で目標配列または目標モチーフとすることによりＥＭＦを識別することができる。
【０３２５】
ＥＭＦの存在や活動は、ＥＭＦトラップ・ベクターを使って確認することができる。ＥＭＦトラックベクターは一つのマーカー配列に対して一つのクローニング・サイト５’を含んでいる。マーカー配列は、たとえば抗生物質抵抗性または補完栄養要求要素のような認識可能な表現形をコード化し、それによって適切な宿主に適切な条件の下でＥＭＦトラップ・ベクターが置かれたことを検知することができる。上述のように、ＥＭＦは作動可能にリンクされたマーカー配列の発現を変化させる。様々なマーカー配列の詳細については以下に述べる。ＥＭＦであることが疑われる配列は、ＥＭＦトラップ・ベクター内のマーカー配列の上流の一つ異常の抵抗サイトにおける三つの読み取りフレームのすべてにおいてクローンされる。次に、ベクターは既知の手法で適切な宿主に変換され、変換された宿主の表現形は適切な条件の下で検査される。上述のように、ＥＭＦは作動可能にリンクされたマーカー配列の発現を変化させる。
【０３２６】
（５．１７：三重螺旋形成）
以上に加えて、本発明のフラグメントは、一般的に説明したように、三重螺旋形成またはアンティセンスＤＮＡまたはＲＮＡによって遺伝子発現をコントロールすることができ、それらの方法はともにポリヌクレオチド配列のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づくものである。
【０３２７】
こういう使用方法に適したポリヌクレオチドは、ふつう塩基の長さが２０乃至４０であり、転写に関係する遺伝子部位（三重へリックス‐Ｌｅｅ等，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ６：  ３０７３  （１９７９）；  Ｃｏｏｎｅｙ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １５２４１：  ４５６  （１９８８）；  Ｄｅｒｖａｎ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１：  １３６０  （１９９１）を参照の事）、又はｍＲＮＡ自体（アンチセンス‐Ｏｌｍｎｏ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：  ５６０  （１９９１）；遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣプレス、ボカレイトン、フロリダ（１９８８））に相補性を持って設計されている。三重へリックス形成は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を最適条件で遮断し、アンチセンスＲＮＡハイブリディゼーション法はｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を阻止する。両技術とも、モデル・システムにおいて有効である事が証明されている。本発明の配列に含まれる情報は、アンチセンス又は三重へリックスオリゴヌクレオチドの設計には必要である。
【０３２８】
（５．１８：診断用分析及び用具）
本発明は、核酸プローブ又は本発明の抗体（適当な標識化可能）を使用する事により、
本発明の１つのＯＲＦ又はその同族体の存在又は発現を、試験サンプル中で同定する方法も提供する。
【０３２９】
本発明のポリヌクレオチドを検出する方法であるが、普通は、ポリヌクレオチドに結合し複合体を形成する化合物をその複合体の形成に必要な時間サンプルと接触させ、その後でその複合体を検出する。その結果、もし複合体が存在すれば、本発明のポリヌクレオチドもサンプルの中に検出される事になる。その方法では更に、ハイブリディゼーションの厳しい条件の下に、そういう条件下で本発明のポリヌクレオチドをアニールする核酸プライマーにサンプルを接触させ、それからアニール化されたポリヌクレオチドを増幅させる。もしポリヌクレオチドが増幅すれば、本発明のポリヌクレオチドがサンプル中に検出される事になる。
【０３３０】
本発明のポリペプチドを検出する方法であるが、普通は、ポリペプチドに結合し複合体を形成する化合物をその複合体の形成に必要な時間サンプルと接触させ、その後でその複合体を検出する。その結果、もし複合体が存在すれば、本発明のポリペプチドもサンプルの中に検出される事になる。
【０３３１】
こういう方法は更に詳細に説明すると、試験サンプルを本発明の抗体の１つ又はそれ以上、又は核酸プローブの１つ又はそれ以上と定温培養させ、その後、試験サンプルの成分と核酸プローブか抗体との結合状態を分析する。
【０３３２】
核酸プローブか抗体を試験サンプルと共に定温培養する条件は様々である。培養条件は、分析に使われるフォーマット、検出方法、分析に使用される核酸プローブか抗体の種類及び性質に依存している。
【０３３３】
医療技術の訓練を受けた人は、一般に入手可能なハイブリディゼーション、増幅、又は免疫学的検定フォーマットのうちのいずれが、本発明の核酸プローブ又は抗体の使用に適しているかをすぐに判定できる。そういう検定は、Ｃｈａｒｄ，  Ｔ．，  放射性免疫検定及び関連技術入門、エルセヴィア・サイエンス出版社、アムステルダム、オランダ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，  Ｇ．Ｒ．等、免疫細胞化学技術、アカデミック・プレス、オーランド、フロリダ、第１巻（１９８２）、第２巻（１９８３）、第３巻（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｐ．，  免疫学的検定法の実践と理論：生化学及び分子生物学に於ける実験技術、エルセヴィア・サイエンス出版社、アムステルダム、オランダ（１９８５）等に説明されている。本発明の試験サンプルとしては、細胞、細胞の蛋白質又は膜抽出物、生体液（痰、血液、血清、血漿、尿等）等がある。上述の方法に使用される試験サンプルは、検定フォーマット、検出方法の性質、検定のサンプルとして使われる細胞組織、細胞、又は抽出物の性質等により異なっている。細胞の蛋白抽出物又は膜抽出物の準備方法は医学界では良く知られており、調整も容易であるから、利用システムに適したサンプルをすぐ得る事ができる。
【０３３４】
本発明の別の応用面では、本発明の検定を実行するのに必要な試薬を含む器具が一式提供される。特に本発明は、１つ又は複数の容器を入れる区画用具が提供される。それは以下の内容で構成されている：（１）最初の容器は本発明のプローブ又は抗体のうちの１つを含む；（２）別の１つ又はそれ以上の容器は、洗浄試薬、結合プローブ又は抗体の存在を検出できる試薬のうち１つを含む。
【０３３５】
更に詳細に説明すると、区画用具には、試薬を各々異なる容器に入れている用具全てが含まれる。そういう容器には、小さいガラス容器、プラスチック容器、又はプラスチックや紙の切れ端が入っている。そういう容器を使うと、試薬を１つの区画用具から別の区画用具に効果的に移す事ができる。試薬もサンプルも混じり合う事がないし、各容器に入っている物質や溶液を定量的に、１つの区画用具から別の区画用具へ加える事も可能である。そういう容器としては、試験サンプルを入れる容器、検定に使用される抗体を入れる容器、洗浄試薬（リン酸塩緩衝塩水、トリス緩衝液等）を入れる容器、結合抗体やプローブを検出するのに使われる試薬を入れた容器等がある。検出試薬には、標識された核酸プローブ、標識された二次抗体、あるいは一次抗体が標識されている場合は、標識された抗体と反応可能な酵素又は抗体の結合試薬が含まれる。医学技術に優れた人は、本発明で開示されたプローブ又は抗体が、当業界で良く知られている用具フォーマットのいずれに適しているかすぐ分かるはずである。
【０３３６】
（５．１９：医療画像）
本発明の新しいポリペプチド及び結合剤は、本発明の分子を発現する部位の医療画像にとって有益である（例えば本発明のポリペプチドが免疫反応に関係している場所、炎症又は感染部分の画像等）。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ等、米国特許番号５，４１３，７７８を参照の事。そういう方法には、標識薬又は画像剤の化学的付着、製薬学的に承認できる担体中の対象へ標識ポリペプチドを投与、生体内の標的部位で標識ポリペプチドの画像を撮る等のプロセスが関係している。
【０３３７】
（５．２０：スクリーニング分析法）
本発明は、その単離蛋白質及びポリヌクレオチドを使う事により、ＯＲＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−３，  １０−１３又は１５で説明されているヌクレオチド配列のいずれかと対応）によりコード化されているポリペプチドと結合した物質、又はその核酸によりコード化されたポリペプチドの特異領域と結合している物質を獲得・同定する方法も提供する。上記方法の詳細は、以下の段階で構成される。
（ａ）  本発明のＯＲＦによりコード化された単離蛋白質をある物質に接触させる。
（ｂ）  その物質が上記蛋白質又は上記核酸と結合するかどうか決定。
【０３３８】
従って普通、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物を同定するには、本発明のポリヌクレオチドと化合物をポリヌクレオチド／化合物複合体を形成するのに必要な時間接触させ、それからその複合体を検出する。そうする事により、もしポリヌクレオチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物が同定される。
【０３３９】
従って同様に普通、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するには、本発明のポリペプチドと化合物をポリペプチド／化合物複合体を形成するのに必要な時間接触させ、それからその複合体を検出する。そうする事により、もしポリペプチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリヌクレオチド（ママ）に結合する化合物が同定される。
【０３４０】
本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法として、更に、本発明のポリペプチドと化合物を細胞中で、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに必要な時間接触させる方法もある。その場合、その複合体は細胞の受容体の遺伝子配列の発現を促すので、受容体の遺伝子配列の形質発現を検出すればその複合体を検出できる。その結果、もしポリペプチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリペプチドに結合する化合物が同定される。
【０３４１】
こういう方法で同定される化合物には、本発明のポリペプチドの活動を調整する化合物（つまりその化合物がない場合の活動と比べポリペプチドの活動を増大させたり減少させたりする化合物）も含める事ができる。こういう方法で同定される化合物の中には、本発明のポリヌクレオチドの活動を調整する化合物（つまりその化合物がない場合の発現レベルと比べ形質発現を増大させたり減少させたりする化合物）を含める事も可能である。本発明の方法を使って同定されるような化合物は、医学技術で既に知られている標準検定方法を用いて、活動や形質発現の調整能力を試験する事が可能である。
【０３４２】
上述の方法でスクリーニングされる物質には、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体、製薬学上のその他の物質が含まれる。そういう物質は、無作為に選別したりスクリーニングを行ったりできる。あるいは蛋白質モデリング技術を使って、理性的に選別したり設計したりする事も可能である。
【０３４３】
無作為スクリーニングの場合、ペプチド、炭水化物、製薬学上の物質等は無作為に選択され、本発明のＯＲＦによりコード化されている蛋白質へ結合する能力について検定される。物質は理性的に選別又は設計する事も可能である。本文書では、ある物質が特定の蛋白質の構造に基づいて選択される時、その物質は「理性的に選別又は設計される」と呼ぶ。例えば、医療技術の訓練を受けた人は、既存の方法を適用して、特定のペプチド配列に結合する能力を持つペプチドや製薬学上の物質を容易に生産し、ひいては理性的に設計されたアンチペプチド（ママ）・ペプチド（例えばＨｕｒｂｙ等、合成ペプチドの応用：アンチセンス・ペプチド、合成ペプチド、使用者ガイド、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  ＮＹ  （１９９２）  ２８９−３０７頁を参照の事）、又は製薬学上の物質を作る事ができる。
【０３４４】
前述の内容の他に、広義の意味で、本発明のあるクラスの物質は、本発明のＯＲＦ又はＥＭＦの１つへの結合を通して、遺伝子発現をコントロールするために使用できる。上述通り、そういう物質は無作為にスクリーニングしても良いし、理性的に設計・選別しても良い。医療技術者は、ＯＲＦ又はＥＭＦを標的にする事により、単一のＯＲＦ又は複数のＯＲＦ（いずれも発現コントロールの面で同じＥＭＦに依存）の発現を調整し、配列特異性又は要素特異性の物質を設計する事ができる。あるクラスのＤＮＡ結合物質は、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合する事により三重へリックスを形成する塩基の残基を含んでいる。そういう物質は、古典的なホスホジエスター、リボ核酸バックボーンに基づかせても良いし、塩基付着能力を有する色々なスルフヒドリル誘導体又は重合誘導体でも良い。
【０３４５】
こういう方法に使用される物質は、普通２０乃至４０の塩基を含んでおり、転写に関係する遺伝子部位に相補的であるように（三重へリックス‐Ｌｅｅ等，  Ｎｕｅｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ６：３０７３  （１９７９）；  Ｃｏｏｎｅｙ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４１：４５６  （１９８８）；  及びＤｅｒｖａｎ等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：  １３６０  （１９９１）を参照の事）、あるいはｍＲＮＡ自体に相補的であるように（アンチセンス‐Ｏｋａｎｏ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：５６０  （１９９１）；遺伝子発現のアンチセンス抑制剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣプレス、ボカレイトン、フロリダ（１９８８））設計されている。三重ヘリックス形成はＤＮＡからＲＮＡへの転写阻害の面で最高の結果をもたらし、アンチセンスＲＮＡハイブリディゼーションはｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳するプロセスを阻害する。両技術とも、モデル・システムに於いて有効である事が証明されている。本発明の配列に含まれる情報は、アンチセンス、三重ヘリックス・オリゴヌクレオチド、その他のＤＮＡ結合物質の設計にとって必要である。
【０３４６】
本発明のＯＲＦの１つによりコード化されている蛋白質に結合する物質は、診断薬として用いる事ができる。本発明のＯＲＦの１つによりコード化されている蛋白質に結合する物質は、製薬学的な化合物の生成に使われる既知の技術に基づいて調剤可能である。
【０３４７】
（５．２１：プローブとしての核酸の利用）
本発明の別の様相は、自然界で得られるヌクレオチド配列を使って交配を行う、ポリペプチド特有の核酸交配プローブを提供することにある。本発明の交配プローブは、ヌクレオチドは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３のうち任意のものから得られる。対応する遺伝子は限られた数の組織にしか発現されないので、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３の任意のものから得られた交配プローブは、試料中のそのような組織細胞タイプのＲＮＡの存在を示す指標として使うことができる。
【０３４８】
交配の手法としては、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ交配のような任意の適切な交配手法を使うことができる。米国特許４，６８３，１９５と４，９６５，１８８に述べられたＰＣＲは、ヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別な用途である。ＰＣＲに用いられるそのようなプローブは組み換え法により生成されるか、化学的に合成されるか、またはその混合法により生成される。プローブは、同一配列の検知のための特定のヌクレオチド配列、または密接に関係した識別のための配列の退化したプールを持っている。
【０３４９】
核酸のための特定の交配プローブを製造する他の方法には、ｍＲＮＡプローブの製造のためのベクターに対して核酸配列をクローンする方法が含まれる。そのようなベクターは、当業者に知られており、商業的に入手可能であり、適切なＲＮＡポリメラーゼを、Ｔ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼおよび適切に放射態ラベルがつけられたヌクレオチドとして追加することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成することに使用できる。ヌクレオチド配列は、各々のゲノム配列をマップするための交配プローブを構成するために使用することができる。本発明で提供されるヌクレオチド配列は、一般に知られた遺伝子および／または染色体地図作成手法によってある染色体または染色体の特定領域に対してマップすることができる。これらの手法には、ｉｎ  ｓｉｔｕ交配、既知の染色体マーカーに対するリンケージ分析、既知の染色体に対する特定のフロー分類が施された染色体標本またはライブラリーを使った交配スクリーニングなどがある。染色体分布の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  交配の手法は、バーマほか  （１９８８）  Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ．にも説明されている。
【０３５０】
染色体標本の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  交配およびその他の物理染色地図作成手法は、付加遺伝子地図データによって照合することができる。遺伝子地図データの例は、１９９４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２６５：１９８１ｆ）  に示されている。物理的な染色体地図上の核酸の位置と特定の疾病（または特定の疾病に対する体質）の相関性は、その特定の疾病と関連するＤＮＡの領域を限定する上で役立つ。本発明のヌクロチド配列は正常者、保菌者または患者の間の遺伝子配列の違いを検知するのに使うことができる。ヌクロチド配列は、組み換えＤＮＡ技術の良く知られた手法によってポリペプチドを精製することに使われる。遺伝子を分離した後に、遺伝子の発現を行う方法を説いた出版物は数多くあるが、そのうちの１つがゲッデル（１９９０）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏである。ポリペプチドは原核か真核のいずれかのさまざまな宿主細胞で発現されている。宿主細胞は、特定のポリペプチド・ヌクレオチド配列を分離した同じ種または異なる種のどちらから得たものであってもよい。組み換えＤＮＡ技術によってポリペプチドを製造する利点には、精製のために十分な量の蛋白質が得られることと、単純な精製方法が存在することである。
【０３５１】
（５．２２：チップとアレイの配列見本の作成）
基本的な一例においては、６量体を５０ミクロンの表面に付着させて３  ｘ  ３  ｍｍのチップを作り、それを２０  ｘ  ２０  ｃｍのアレイに仕立てる。別の例では、９量体のオリゴヌクレオチドを１０  ｘ  １０ミクロンの表面に付着させて、９量体の５  ｘ  ５  ｍｍのチップを作り、そのようなチップの４０００ユニットで３０  ｘ  ３０  ｃｍのアレイを仕立てる。４，０００から１６，０００個のオリゴチップを正方形のアレイにする。配列キットの一部としてプレートまたは場合によってはチューブの集合を組み合わせてもよい。
【０３５２】
各アレイは互いに物理的、または疎水性表面で隔離してもよい。１つの方法としては、ＱＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  ＣａｎａｄａのＩｓｏ−Ｇｒｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  のような技術を使った疎水ストリップ隔離方法をとってもよい。
【０３５３】
疎水性グリッド膜フィルタ（ＨＧＭＦ）は、１０年ぐらい前から食品微生物学の分野で、コロニーの計量に自動化と数量的な拡張をもたらして重用されている。市場で入手可能なグリッドの１つが、ＱＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．  （Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｃａｎａｄａ）が販売しているＩＳＯ  ＧＲＩＤＴＭ  で、その本体は正方形  （６０  ｘ  ６０  ｃｍ）  のポリスルホン・ポリマー  （Ｇｅｌｍａｎ  Ｔｕｆｆｒｙｎ  ＨＴ−４５０，  孔径０．４５）  で、その上に１６００  （４０  ｘ  ４０）  個の正方形セルから成る疎水性インキのグリッドが塗布されている。ＨＧＭＦは、それまでに真空ろ過でバクテリアサスペンションを使って接種され、好みの差別化または選択培質上で培養されている。
【０３５４】
微生物成長は膜上の既知の位置と大きさのグリッドセルに限定されているので、ＨＧＭＦは通常のプレートまたは膜フィルタというより、むしろＭＰＮ装置のような働きをする。ピーターキンら（１９８７）は、ＨＧＭＦレプリケーターと組み合わせて使用した場合、ＨＧＭＦはゲノムライブラリを伝播させたり、記録することができる。そのような機器のあるものは、ＩＳＯ−ＧＲＩＤの１６００個のセルの各々の成長を複写し、マスターＨＧＭＦの多数のコピーをつくることができる（ピーターキンら、１９８７）。
【０３５５】
シャープら（１９８９）も、ＱＡ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＩＳＯ−ＧＲＩＤ  ＨＧＭＦと自動ＨＧＭＦカウンタ  （ＭＩ−１００  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｒ）  およびＲＰ−１００レプリケーターを使った。彼らは数多くの微生物培養のメンテナンスとスクリーニングのテクニックについて報告している。
【０３５６】
ピーターキンらのグループは、その後疎水性グリッド膜フィルターを使用したＤＮＡプローブのスクリーニング法について説明している（ピーターキンら、１９８９）。これらの著者は、直接ＨＧＭＦ上で効果的にコロニー交配を行う方法について報告している。それ以前は、ＨＧＭＦがプリントされているエポキシスルホンポリマーのＤＮＡ結合能力が低かったために、結果は思わしくなかった。しかし、ピーターキンら（１９８９）は、複写され培養されたＨＧＭＦをＤＮＡに接触させる前に、ポリエチレンイミンで処理しておくことによって、ＤＮＡの膜表面への付着が改善されることを報告している。この初期の研究は、セル状のＤＮＡ付着に関するもので、本発明とは目的が異なるが、ここに説明された方法は、フォーマット３  ＳＢＨに容易に適用できる。
【０３５７】
用途性の高い配列を迅速に識別するために、ピーターキンら（１９８９）は、さまざまなクローンから得た放射性ラベルつきプラスミドＤＮＡを使って、準備されたＨＧＭＦ上でＤＮＡに対する特性をテストした。これによって、組み換えプラスミドから得たＤＮＡは、容易に作成し、再製できるＨＧＭＦ複写上で１００の生体に対してコロニー交配によって迅速にスクリーニングすることができた。
【０３５８】
小型（２−３  ｍｍ）のチップの操作により、何千という反応の同時処理が可能である。本発明の解決は、チップとプローブを対応するアレイに保つことにある。ある例では、２５０，０００個の９量体を含むチップは、１  ｍｍの溝で隔離された８  ｘ  １２  のフォーマット（９６チップ）のアレイから成る  ８  ｘ  ８  ｍｍのプレート（１５  ｕｍ／オリゴヌクレオチド、ピーズら、１９９４）のシリコンウェーハ上で交配された。プローブは、マルチチャンネルピペットまたはピンアレイによって１チップ当たり１個のプローブを加えた。合計４０００個の６両体のすべてのスコアを得るために、違うものを使うか、または同じセットのチップアレイを数回再使用するかして、４２チップアレイを使う必要があった。
【０３５９】
上記の場合、この用途の前の説明で使った同じ記号を使うと  Ｆ＝９；  Ｐ＝６；Ｆ  ＋  Ｐ  ＝  １５であった。チップはＢｘｎＮのフォーミュラのプローブでもよく、ここに  ｘ  は特定の塩基  Ｂ  の数、そして  ｎ  は不特定塩基の数で、ｘ  ＝  ４−１０、ｎ  ＝  １−４であった。さらに効果的な交配を得るために、またはサポート・オリゴヌクレオチドの影響を避けるために、特定の塩基は不特定塩基で囲み、（Ｎ）ｎＢｘ（Ｎ）ｍのようなフォーミュラで表すようにしても良い。
【０３６０】
（５．２３：支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの標本作成）
オリゴヌクレオチド、すなわち、核酸の小セグメントは、例えば自動オリゴヌクレオチド合成装置を使って一般的に行われている化学的にオリゴヌクレオチドを直接合成することによって、容易に作成することができる。
【０３６１】
サポート固定さえたオリゴヌクレオチドは、当業者には良く知られたガラス、ポリスチレンまたはテフロン（登録商標）のような適当な支持体を使う方法によって標本を作成することができる。１つの方法は、標準的な合成装置を使って精密にスポットオリゴヌクレオチドを合成する方法である。固定方法としては、受動的吸着（井上および本道、１９９０  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２８（６）  １４６２−７２）；紫外線）（永田ほか、１９８５；ダーレンほか、１９８７、モリセイおよびコリンズ、Ｍｏｌ．１９８９）またはＤＮＡの共有結合（ケラほか、１９８８；  １９８９）などがあり、ここに挙げた参考文献は本出願の一部とする。
【０３６２】
別な方法は、リンクとして強力なバイオチンとストレプタビジンの相互作用を使う方法もある。例えば、ブルーデほか．（１９９４）は、バイオチニレートされたプローブの利用について述べており、それらはストレプタビジン被覆された磁気ビーズで固定されたデュプレックス  プローブである。ストレプタビジンを被覆したビーズはオスロー市のディナル社から購入することができる。もちろん、同じリンクのための化学はストレプタビジンに対して適用することができる。バイオティニレートされた標本は、例えば、オペロン・テクノロジーズ社（カリフォルニア州アラメダ市）などのさまざまな供給源から入手できる。
【０３６３】
ナンク・ラボラトリーズ（イリノイ州ネイパービル市）からも適切な材料を入手することができる。ナンク・ラボラトリーズは、コバリンクＮＨと呼ばれるマイクロウェル面に共有結合することができる。コバルトリンクＮＨは、更なる共有結合のための橋頭堡となる第２段階のアミノグループ（＞ＨＮ）が移植されたポリスチレン面である。コバリンクモジュールは、ナンク・ラボラトリーズから購入されたものである。ＤＮＡ分子はホストアミド結合によりコバリンクの５’端にのみ結合されることが可能であり、１  ｐｍｏｌ以上のＤＮＡの固定を可能にする（ラスムッセンほか、１９９１）。
【０３６４】
コバリンクＮＨストップを５’端へのＤＮＡの共有結合のために使用することは公開されている（ラスムッセンら、１９９１）。この技術においては、ホスホラミドン結合が使用されている。（チユーら、１９８３）これは，共有結合を１個だけ使用して固定するという利点がある。ホスホラミデーと結合によって、ＤＮＡがコバリンクＮＨ第２アミノグループに結合されており、後者は長さ２  ｎｍのスペーサーアームを介して、ポリスチレン表面に共有結合に移植されているスペーサーアームの端部に位置している。ホスホラミデート結合を経由してコバリンクＮＨにリンクするためには、オリゴヌクレチドターミナルは５’端リン酸塩グループを持っていなければならない。たぶんビオチンをコバリンクに共有結合し、ストレプタビジンをプローブの結合のために使うことも可能である。
【０３６５】
さらに詳しくは、このリンク方法はＤＮＡを水（７．５  ｎｇ／ｕｌ）に溶解し、１０分間９５℃で変性し、氷で１０分間冷やす過程を含む。次に、氷で冷やした０．１  Ｍ  １−メチルイミダゾール、ｐＨ  ７．０  （１−ＭｅＩｍ７）を加えて、最終的な濃度を１０  ｍＭ  Ｉ−ＭｅＩｍ７．とする。ｓｓ  ＤＮＡ溶液を次に氷冷却中のコバリンクＮＨストリップ（７５  ｕｌ／ｗｅｌｌ）に供給する。
【０３６６】
カーボダイイミド０．２  Ｍエチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カーボダイイミド（ＥＤＣ）を１０  ｍＭ  １−ＭｅＩｍ７  に溶解したものを新たに作り、ウエルあたり２５  ｕｌ  を加えた。ストリップは５０℃で５時間培養した。培養後、ストリップを例えばヌンク−インミュノウォッシュを使って洗った。最初に、ウエルを３回洗い、その後５分間洗浄液に浸漬し、最後に３回洗浄された（そのとき、洗浄液は５０℃に温めた０．４．  ４  Ｎ  ＮａＯＨ，  ０．２５％  ＳＤＳであった）。
【０３６７】
本発明にとってさらに適した方法は、ＰＣＴ特許申請ＷＯ  ９０／０３３８２（サザン＆マスコス）で公開されたもので、ここに言及することにより、本申請の一部とする。支持体に固定したオリゴヌクレオチドのこの作成方法では、ヌクレオチド３’−試薬をリン酸塩を介して供給結合ホスホジエステルによって市時代に支えられた脂肪族ヒドロオキシルグループにリンクする。オリゴヌクレオチドは、支持されたヌクレオシドと合成オリゴヌクレオチド鎖から取り除かれた保護グループに、支持体からオリゴヌクレオチドを切断しないような標準状態の下で合成される。適切な試薬としては、ヌクレオシドホスホラミダイトおよびヌクレオシドリン酸化水素が含まれる。
【０３６８】
ＤＮＡプローブアレイの標本のためのオンチップＤＮＡ標本作成の手法が使われる。例えば、ガラス板上で直接アドレス可能なレーザー操作フォトデプロテクションを実施することは、フォーダーら、（１９９１）に開示されたように可能であり、ここに言及することにより、本出願の一部とする。プローブをナイロン支持体の上に固定することは、ファンネスら、（１９９１）に開示されたように可能である。また、プローブは、ダンカンとキャバリエ、（１９８８）に示したようにテフロン（登録商標）にリンクすることも可能である；  これらすべての参照文献は、ここに言及することにより、本申請の一部とする。
【０３６９】
オリゴヌクロチドとナイロンサポートにリンクするためには、ファンネスら（１９９１）が述べるように、ナイロン表面をアルキル化によって活性化し、シアヌル酸塩化物でオリゴヌクレオチドの５’−アミンの選択活性化する必要がある。
【０３７０】
支持体に固定されたオリゴヌクレオチドを作成する別の方法としては、ピーズらが（１９９４，  ここに参照することにより、本申請の一部とする）で述べた光合成法がある。これらの著者は、固定されたオリゴヌクレオチドのプローブ（ＤＮＡチップ）のアレイを作成するために最近のフォトリトグラフ法を使用している。光を使って高密度でミニチュア化されたアレイとしてオリゴヌクレオチドプローブを合成するこれらの方法は、感光５’−保護Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシド・ホスホアラミダイト、表面リンク化学および多様な結合合成手法を駆使している。この方法により、２５６個の空間に定義されたオリゴヌクレオチドプローブを作成することができる。そして、ここに参照することにより本出願の一部とするＷＯ  ９５／０９２４８で説明したように、利点の多いフォーマット３配列に使用することができる。
【０３７１】
（５．２４：核酸フラグメントの標本作成）
配列決定すべき核酸は、ｃＤＮＡｓ、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、マイクロ切断染色体バンド、コスミドまたはＹＡＣ挿入片、およびＲＮＡ、さらに増幅段階のないｍＲＮＡを含む、さまざまなソースから得られる。例えば、サムブルックら（１９８９）は、高分子量ＤＮＡの哺乳類細胞の分離のためのプロトコルについて述べている（ｐ．  ９．１４−９．２３）。
【０３７２】
ＤＮＡフラグメントは、Ｍ１３、プラスミドまたはラムダベクターにクローンとして、および／またはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからＰＣＲまたはその他の増幅方法によって直接作成することができる。サンプルは、マルチウェルプレート上で生成し、取り分けることができる。約１００−１０００  ｎｇのＤＮＡサンプルが２−５００  ｍｌの最終容積として生成される。
【０３７３】
核酸は、当業者に知られている任意の方法、例えば、サンブルックら（１９８９）の９．２４−９．２８に述べられた制限酵素を使い、超音波とＮａＯＨ処理でせん断する方法で、フラグメント化される。（１９８９），  ｓｈｅａｒｉｎｇ  ｂｙ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ａｎｄ  ＮａＯＨ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
低圧せん断法もまた、シュリーファーらが（１９９０、ここに参照することにより、本出願の一部とする）述べたように適切である。この方法では、小型のフレンチプレッシャーセルに低圧から中圧のさまざまな圧力をかけてＤＮＡサンプルを通す。細胞に対する低圧から中圧の圧力調節はレバー装置でコントロールされる。これらの研究の結果、低圧せん断が音波や酵素ＤＮＡフラグメンテーション法の替わりになり得ることが明らかになった。
【０３７４】
特に好適なＤＮＡフラグメンテーション法としては、フィッツジェラルドら（１９９２）によって開示された２ベース識別エンドヌクエアーズ、ＣｖｉＪＩ  を使用する方法である。これらの著者は、彼らがショットガンクローニングおよび配列化に妥当であると考えた特性のサイズにＤＮＡを分割し、フラグメント化するための迅速な方法を説明した。
本発明の発明者は、これがランダムで、しかし比較的小さく、本配列決定技術に利用可能なＤＮＡフラグメントの生成上役立つことを発見した。
【０３７５】
制限エンドヌクレアーゼＣｖｉＪＩは、識別配列ＰｕＧＣＰｙを通常ＧとＣに分断してざっくりとした切り口をつくる。この酵素（ＣｖｉＩＬ＊＊）の特性を変化させる特殊反応条件は、準ランダム分布したＤＮＡフラグメントを小型の分子ｐＵＣ  １９（２６８８個の塩基対）から発生させる。フィッツジェラルドら（１９２）は、このフラグメンテーション法のランダム度を定量的に評価するため、迅速ゲル３過法によってサイズ的に分画されたｏｆ  ｐＵＣ  １９のＣｖｉＪＩ＊＊  ダイジェストを使用し、端部補修することなく、ラックＺマイナスＭ１３クローニングベクターに直接結紮した。７６個のクローンの配列検定の結果、ＰｕＧＣＰｙに加えてＣｖｉＪＩ＊＊  はｐｙＧＣＰｙとＰｕＧＣＰｕを制限し、新しい配列データはランダムフラグメンテーションと一致する割合で累積された。
【０３７６】
文献に報告されているとおり、この方法の長所は、音波破砕およびアガローズゲル分断法に比べて：必要なＤＮＡの量が少ないこと（２−５  ｕｇの代わりに０．２−０．５  ｕｇ）；処理ステップが少ない（予備結紮端部修復、化学的抽出、またはアガローズゲル電気営同および溶出などが不要）という点が挙げられる。
これらの利点は、フォーマット３による配列決定のためにＤＮＡを生成する際にも利用できる。
【０３７７】
核酸フラグメンツの取得または作成の具体的方法の如何にかかわらず、ＤＮＡを変性して交配のための端鎖体を提供することが重要である。これはＤＮＡ溶液を８０−９０℃で２−５分間培養することによって達成される。この溶液を次に２℃まで急速冷却し、ＤＮＡフラグメントがチップに接触するまでに再び再変性することを防ぐ。リン酸塩グループは当業者に知られた方法でゲノムＤＮＡから除去されなければならない。
【０３７８】
（５．２５：ＤＮＡアレイの標本作成）
アレイは、例えばナイロン膜から成る支持体の上にＤＮＡサンプルをスポッティングすることによって作成することができる。スポッティングは、金属製ピンのアレイ（その位置はマイクロタイタープレートのウェルのアレイに対応する）を使い、約２０  ｎｌのＤＮＡ溶液をナイロン膜に移すことで行うことができる。オフセットプリンティングのため、ウェルの密度以上のドット密度が得られる。使用されるラベルに応じて１  ｍｍ２  当たり１ないし２５ドットを設けることができる。あらかじめ選ばれた特定の行と列にスポットを置くことを避けることにより、別のサブセット（サブアレイ）を形成することができる。１つのサブアレイ中のサンプルは、異なる個人のＤＮＡ（または同じ遺伝子）同じゲノムセグメントであるか、または異なるオーバーラップするゲノムクローンでも良い。各サブアレイは同じサンプルのレプリカスポッティングを表していても良い。ある例では、選ばれた遺伝子セグメントは６４人の患者の増幅されたものである。各患者に対して、増幅された遺伝子が１枚の９６のウェルが設けられたプレート上にある（全９６ウェルが同じサンプルを持っている）。６４人の患者１人１人に１枚のプレートが準備される。９６ピンの装置を使うと、すべてのサンプルが１枚の８  ｘ  １２  ｃｍの膜にスポットされる。サブアレイには各患者から１つずつ、合計６４サンプルを設けうることもできる。９６のサブアレイが同一であるとき、ドットのスパンは１  ｍｍ２  で、サブアレイ間に１  ｍｍの間隔を設けてもよい。
【０３７９】
もう１つの方法としては、物理的なスペーサ−を設けた膜またはプレート（イリノイ州ネイパービル市のヌンク社）を使う方法で、その場合、膜と一体でプラスチックの格子が成形されており、その格子はマルチウェルプレート、または疎水性ストリップの底部に設けられる膜と同様なものであってもよい。固定された物理的スペーサーは、平らなリン貯蔵スクリーン、またはＸ線フィルムを露出することによってイメージをとる場合には望ましくない。
【０３８０】
本発明を以下の例で説明する。この開示により、当業者は本発明の範囲の中で、さまざまな実施例や変更ができることは明らかである。したがって、本発明の広範囲の様相は以下の例によって制限されるべきではない。本発明は、本発明の１つの様相を示すことを意図した実施例によって制限されるべきではなく、また、機能的に同等な構成や方法は発明の範囲内にある。事実、ここに示す望ましい実施例を考察すれば当業者にとって本発明の実施においてさまざまな改造や変形は可能である。したがって、本発明の範囲における唯一の制限は、提示された請求項によるものである。
【０３８１】
本仕様書中に言及されるすべての参考文献は、その言及により、ここにそれらすべてを本申請の一部とする。
【０３８２】
（６．０：実施例）
（実施例  １）
ヒトの胎児の脳のｃＤＮＡライブラリーからのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の分離
ヒトの胎児の脳から得られたｃＤＮＡライブラリーから標準のＰＣＲを使い、交配配列シグネチャー分析によって配列が決定され、サンガー配列手法を応用した結果、複数の新規性のある核酸（Ｈｙｓｅｑクローン認識番号１５２５８９２４）を得た。ライブラリーの挿入は挿入部に隣接するベクター配列に特有なプライマーを使ってＰＣＲにより増幅された。これらのサンプルはナイロン膜上にスポットされ、オリゴヌクレオチド・プローブを使って配列のシグネチャーが検知された。これらのクローンは、類似のまたは同一の配列ごとに分類され、ゲル配列決定のために各グループから単一の代表クローンが選ばれた。増幅された挿入部の５’配列は典型的なサンガー配列のプロトコルの中の逆Ｍ１３配列プライマーを使って演えきされた。ＰＣＲ生成物は、精製されてから、蛍光染料ターミネータサイクル配列決定にかけた。シングルパスゲル配列決定が３７７アプライドバイオシステムズを使って行われた。挿入部はこのライブラリーからは従来えられなかったものであり、また、公開されているデータベースにはないものであることが確認された。この配列は添付された配列リストの中でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として示される。
【０３８３】
（実施例  ２）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の集合
本発明によるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と名付けられた核酸は、ＥＳＴ配列をシードとして使って組立られた。次に回帰的なアルゴリズムをシードＥＳＴに適用して拡張することにより拡張集合を得て、この集合に属する異なるデータベース（すなわち、Ｈｙｓｅｑ’ｓのＥＳＴ配列を含むデータベース、ｄｂＥＳＴバージョン１１４、ｇｂ  ｐｒｉ  １１４、およびＵｎｉＧｅｎｅバージョン１０１  １）から追加配列を引き出した。集合を拡張する上述のデータベースからの追加配列がそれ以上なくなったとき、アルゴリズムは停止した。構成要素配列の集合への組み入れは、拡張する集合に対するＢＬＡＳＴＮヒットが３００以上のＢＬＡＳＴスコアであり、９５％以上の識別度であることに基づいて行われた。
【０３８４】
集められた接触部に対する最も近い隣接結果は、ＦＡＳＴＸＹアルゴリズムを使い、Ｇｅｎｐｅｐｔリリース１１４に対してＰＡＳＴＡバージョン３のサーチを行うことにより得られた。ＦＡＳＴＸＹはＦＡＳＴＡアラインメントの改良版で、ｉｎ−ｃｏｄｏｎフレームシフトを可能にするものである。最も近い隣接結果は、Ｇｅｎｐｅｐｔからの各集合に対して最も近い（また当該集合がコード化する翻訳されたアミノ酸配列を含む）同族体を示した。最も近い隣接結果を以下に示す。
【０３８５】
【表１】
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あるペプチドが以下に示すようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によってコード化されることが予測された。このポリペプチドは、翻訳された新規性のあるポリヌクレオチドを既知のポリペプチドに比較することによって、ポリペプチドを選択するＦＡＳＴＹ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ：ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ  から入手可能）と呼ばれるソフトウェアプログラムを使って予測された（Ｗ．Ｒ．  ピアソン、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８３：６３−９８  （１９９０）、ここに言及することにより、本申請の一部とする）。
【０３８６】
【表２】
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（実施例  ３）
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の集合）
新規性のあるヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の集合が、ＥＳＴ配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１をシードを使って行われた。そのシードは、ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアプログラムとＨｙｓｅｑ独自のソフトウェアを使って、ＥＳＴ配列を含んでいるＨｙｓｅｑの独自のデータベースから追加配列を引き出し、かつ、５’および３’端を拡張するプライマーを使ってゲル配列を決定する（３７７アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）シーケンサー）ことにより拡張された。構成要素配列の組み入れは、ＢＬＡＳＴスコアが１０００以上、ｐ−値がｐ−３であることを、基礎に（ホモロジーの長さに応じて行われた）。
【０３８７】
（ＥＸＡＭＰＬＥ  ４）
（Ａ．  細胞中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４−７の発現）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはその他の適切な種類の細胞をＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）および１０％牛の胎児の血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で７０％合流するまで成長させた。形質移入に先立って、媒質はＤＭＥＭと０．５％  ＦＣＳに変更された。細胞は、ＦｕＧＥＮＥ−６形質移入試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い、ｐＢＧａｌベクターによってＳＥＱ  ＥＤ  ＮＯ：３のＣｄｎａが形質移入された。要約すれは、ＦｕＧＥＮＥ−６の４μｌ  がＤＭＥＭ１００μｌ  に希釈され、５分間にわたって培養された。その後、これに１μｇのＤＮＡが加えられ、１５分間培養したのち、ＣＨＯ細胞の３５  ｍｍディッシュに加えられた。ＣＨＯ細胞は３７Ｃで５％のＣＯ２を使って培養された。２４時間後に、媒質と溶解産物が収集され、遠心分離され、検定緩衝液で透析された（１５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．６、１３４  ｍＭ  ＮａＣｌ、５  Ｍｍグルコース、３  ｍＭ  ＣａＣｌ２  およびＭｇＣｌ２）。
【０３８８】
（Ｂ．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を使った発現の研究）
準−定量的ポリメラーゼ連鎖反応−に基づく手法によってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の各種組織における発現が分析された。対象とする組織（成人の膀胱、成人の脳、成人の心臓、成人の腎臓、成人のリンパ節、成人の肝臓、成人の肺、成人の卵巣、成人の胎盤、成人の直腸、成人の脾臓、成人の精巣、骨髄、胸腺、甲状腺、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肝臓−脾臓、胎児の皮膚、胎児の脳、胎児のロイコサイトおよびマクロファージ）から発現された遺伝子の供給源としてはヒトのｃＤＮＡライブラリーが使われた。遺伝子特有のプライマーを使って、サンプルからＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−３、１０、１２−１３または１５の部分の増幅が行われた。増幅された生成物は、アガローズゲルに分離され、移転され、化学的にナイロンフィルタにリンクされた。このフィルタは、次にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から生成された放射能ラベル（３３Ｐ−ｄＣＴＰ）をつけられた２重鎖プローブにより、クレノウポリメラーゼを使い、ランダムプライム法で交配された。そのフィルタを洗浄し（高厳格洗浄）、数時間にわたりホスホイメージングスクリーンに露出させた。できた縞が特定のライブラリー内のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含むｃＤＮＡ、したがって発現、対応する細胞タイプまたは組織中の存在を示した。
【０３８９】
（７．０  等価物）
上述のように特定の実施例を詳しく開示したが、これは解説の目的のみ行われたものであり、以下に述べる特許請求の範囲を制限することを意図していない。特に、発明者は特許請求の範囲の主旨から逸脱することなく、本発明の様々な代入、変更および変化が可能であることを考慮している。核酸原料、特定のクローン、またはライブラリータイプの選択は、ここに述べた実施例により当業者にとって日常的なことであると信じられる。他の様相、利点、および変更は添付の特許請求の範囲で明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（“トロンボスポンジン様”）とアフリカツメガエルのトロンボスポンジン１先駆体蛋白質（“カエルトロンボスポンジン１先駆体”）とのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴアミノ酸配列の比較であり、両配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の５８のアミノ酸残基について４８％の相似性、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の５８のアミノ酸残基について３６％の同一性があることを示している。同図でＡ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンを意味する。ギャップは横線で示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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