(57)【要約】本発明は、減ニコチン組換えタバコ植物またはその部分を準備し、醗酵槽中でその植物またはその部分をそれからエタノールを生産するのに充分な時間醗酵させ、次いで醗酵槽からエタノールを収集することを含むエタノール醗酵生産のための方法を記述している。本発明はまた、動物個体に、減ニコチン組換えタバコ植物またはその部分を与えることを含む動物個体の飼育方法を開示している。本発明はまた、減ニコチン組換えタバコ植物またはその部分を準備し、組換え植物またはその部分からタンパクフラクションを取出すことを含む植物バイオマスからタンパクフラクションを生産する方法も開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
減ニコチン組換えタバコ植物またはその部分を準備し；
該植物またはその部分を、醗酵槽中において、それらからエタノールを生産するために充分な時間醗酵し；
該醗酵槽から該エタノールを収集する；ことを含むエタノールの醗酵による生産方法。
【請求項２】
前記減ニコチン組換えタバコ植物が、該組換え植物を創出した親植物に比較して、ニコチンが減少している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物におけるニコチンの生産を下方調節する異種核酸を含み且つ発現する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物を創出した親植物に比較して、還元糖を多く含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、タバコ中でニコチンを生合成するために必要な酵素の少なくとも一部をコードする異種DNA含み且つ発現するものであり、
該組換え植物が、非形質転換対照植物に比較して、該酵素のレベルが低く、該ニコチンの含量が少なく、かつ還元糖が多い、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、キノレートホスフォリボシル転移酵素、プトレッシンN-メチル転移酵素、アルギニン脱炭酸酵素、オルニチン脱炭酸酵素、S-アデノシル-メチオニン合成酵素、NADH脱水素酵素、及びホスフォリボシルアントラニレートイソメラーゼからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、非形質転換対照植物に比較して、キノレートホスフォリボシル転移酵素（QPRTase）の発現性が低減しているものであって、
該組換え植物が、5'から3'方向において、該植物細胞中で作動し得るプロモーターと、植物QPRTase mRNAの少なくとも一部をコードする異種DNAとを含み、該異種DNAは、センスまたはアンチセンス位において、該プロモーター及び該異種DNAと作動的に結合している、外来性DNA構築体を含む植物細胞を含有しており、
該組換え植物は、非形質転換対照植物に比較して、低減したQPRTase発現を示し且つニコチン含量が少ない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記減ニコチン組換え植物または前記植物部分が、非形質転換対照植物に比較して、低減したプトレッシンN-メチル転移酵素（PMT）発現性を有するものであって、
該組換え植物が、5'から3'方向に、該植物細胞中で作動し得るプロモーターと、植物PMT mRNAの少なくとも一部をコードする異種DNAとを含み、該異種DNAは、センスまたはアンチセンス位において、該プロモーター及び該異種DNAと作動的に結合している、外来性DNA構築体を含む植物細胞を含有しており、
該組換え植物は、非形質転換対照植物に比較して、低減したPMT発現を示し且つニコチン含量が少ない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記植物または前記植物部分が、セルロースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物または前記植物部分が、還元糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記醗酵段階の以前または以後において、前記植物または前記植物部分からタンパクフラクションを収集する段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
動物個体に、減ニコチン組換えタバコ植物またはその部分を与えることを含む、動物個体を飼育する方法。
【請求項１３】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物を創出した親植物に比較して、ニコチンが少ない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該植物におけるニコチンの生産を下方調節する異種核酸を含み且つ発現する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物を創出した親植物に比較して、含有する還元糖の量が多い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、タバコにおけるニコチンの生合成に必要な酵素の少なくとも一部をコードする異種DNAを含み且つ発現し、
該組換え植物が、非形質転換対照植物に比較して、該酵素のレベルが低く、ニコチン含量が少なく、且つ還元糖が多い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記給餌段階を、前記動物に、前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分を含む飼料作物を与えることにより行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記給餌段階を、前記動物に、前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分の葉を与えることにより行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記給餌段階を、前記動物に、前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分を含むサイレージを与えることにより行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記給餌段階を、前記動物に、前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分を、少なくとも一つの追加の栄養素と組合わせて含有させた飼料製品を与えることにより行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
減ニコチン組換えタバコ植物またはその部分を含む、飼料製品。
【請求項２２】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物を創出した親植物に比較して、ニコチンが少ない請求項２１に記載の飼料製品。
【請求項２３】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物におけるニコチンの生産を下方調節する異種核酸を含み且つ発現する、請求項２２に記載の飼料製品。
【請求項２４】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物を創出した親植物に比較して、含有する還元糖の量が多い、請求項２１に記載の飼料製品。
【請求項２５】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、タバコにおいてニコチンの生合成に必要な酵素の少なくとも一部をコードする異種DNAを含み且つ発現するものであり、
該組換え植物が、非形質転換対照植物に比較して、該酵素のレベルが低く、ニコチン含量が少なく、且つ還元糖が多い、請求項２１に記載の飼料製品。
【請求項２６】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、タバコの葉を含む、請求項２１に記載の飼料製品。
【請求項２７】
前記飼料製品が、サイレージを含む、請求項２１に記載の飼料製品。
【請求項２８】
前記飼料製品が、前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分を、少なくとも一つの追加の栄養素と組合わせて含有する、請求項２１に記載の飼料製品。
【請求項２９】
減ニコチン組換えタバコ植物またはその部分を準備し、
次いで、該組換え植物または該植物部分から、タンパクフラクションを収集する、
段階を含む植物バイオマスからタンパクフラクションを製造する方法。
【請求項３０】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物を創出した親植物に比較して、ニコチンが少ない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物においてニコチンの生産を下方調節する異種核酸を含み且つ発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、該組換え植物を創出した親植物に比較して、含有する還元糖の量が多い、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記減ニコチン組換えタバコ植物または前記植物部分が、タバコにおいてニコチンの生合成に必要な酵素の少なくとも一部をコードする異種DNAを含み且つ発現するものであって、
該組換え植物が、非形質転換対照植物に比較して、該酵素のレベルが低く、ニコチン含量が少なく、且つ還元糖が多い、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパクフラクションが、フラクションIタンパクを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパクフラクションが、本質的にフラクションIタンパクからなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパクフラクションが、フラクションIIタンパクを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパクフラクションが、本質的にフラクションIIタンパクからなる、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ニコチン含量を減少させたタバコを、特にタンパク、繊維、エタノール、及び動物飼料として利用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
タバコ植物は、大量のバイオマスを効率よく得るために使用することができる。このバイオマスは、単純に畑にタバコの種を密に直接播くことにより生産することができる。タバコは切られると活発に再生するので、植物が高さ約18から24インチに達したところで（通常タバコ植物は約4フィートで収穫する）畑に植えたタバコを刈り取り、刈り取った植物を、新たに繁茂成長した植物で置き換えられることができる。この様にして成長期間中に3から4回植物を収穫すれば、１エーカー当たり約100トンのタバコバイオマスを生産することができる。殆どの植物で含有している80から90パーセントの水を除去すると、10から20トンの乾燥固体が残留する。タバコは、バイオマスの生産において効率が良いことに加えて、極めて用途の広い植物である。コムギやトウモロコシのような穀類と異なり、必須アミノ酸の欠乏がない。タバコは本質的にアレルギーのないタンパク源であり、そのタンパクはヒト及びほとんどの家畜に重要な20アミノ酸の全てを含んでおり、糖類とデンプンについてはその大部分が消化し得るものである。またタバコは優れた食物繊維であり、反芻動物とっては牧草よりも消化性がよい。タバコの繊維容積は、アルファルファ及びコムギ籾殻よりも大きい。タバコバイオマスを発達させることにより、良好な農地を他の作物の栽培に転用することが可能となり、これは、農地が限られている国または地方にとっては考慮すべき重要なことである。
【０００３】
したがって、生産性が高く、有効にして無害な方法でこの植物を利用する新規方法の提供が望まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要約）
本発明は、ニコチン含量を減じた組換えタバコ植物が、非制限的であるが、(a)家畜などの飼料作物として；(b)動物の飼料または飼料成分として；(c)タンパク源として；(d)動物の飼料及び飼料製品に入れるための繊維源として；(e)エタノールの醗酵生産の基質として；(f)「モレキュラーファーミング」技術により生産される、組換えまたは遺伝子導入タンパクの供給源として；(g)一の植物、または植物の集団若しくは群に上記の二つまたはそれ以上を組合せて実施する際；等の種々の選択的用途に好適であることを見出したことに基いている。
【０００５】
通常、本発明を実施するために使用される減ニコチン組換えタバコ植物は、少なくともタバコ中のニコチンの生合成に必要な酵素の一部をコードする異種DNAを含み且つ発現するので、当該植物は、非形質転換対照植物に比較して、低い酵素レベルを示すとともに、非形質転換対照植物に比較して低いニコチン含量を示す。望ましい態様において、当該植物は、さらに非形質転換対照植物に比較して、還元糖レベルの増加を示す。
【０００６】
本発明の第一の態様は、上記のような減ニコチン組換えタバコ植物を準備し；当該植物からエタノールを生産するのに十分な時間、醗酵槽中で当該植物を醗酵し；次いで当該醗酵槽からエタノールを収集することを含む、エタノールの製造方法である。
用語「植物」は、植物の部分、及び植物抽出物、加水分解物などのような植物物理的及び化学的な一部を含む。
【０００７】
本発明の第二の態様は、動物に、上記のような減ニコチン組換えタバコを餌として与えることを含む動物を飼育する方法である。飼育は適当な方法、例えば、タバコを含む飼料作物を動物に与えることにより；タバコの葉を動物に与えることにより；タバコを含むサイレージを動物に与えることにより；及び／または任意に少なくとも一つの追加の栄養素と共にタバコを含む飼料製品を動物に与えることにより、行われる。
【０００８】
本発明の第三の態様は、減ニコチン組換えタバコ植物を含む飼料製品である。この飼料製品は、適当な形態をとることができ、例えばサイレージまたは少なくとも一つの追加の栄養素と組合せたタバコ植物である。この飼料製品は、葉（すなわち、植物を識別できるような葉または葉の断片若しくは葉の細片）或いは植物から取出されたその他の部分を含ませることができる。
【０００９】
本発明の第四の態様は、上記のような減ニコチン組換えタバコ植物を準備し、次いで組換えタバコ植物からタンパクフラクションを収集する段階を含む、植物バイオマスからタンパクフラクション（例えば、フラクションIタンパク及び/またはフラクションIIタンパク）を製造する方法である。
【００１０】
本発明の他の態様は、モレキュラーファーミングに上記のような組換えタバコ植物を利用することを含む。
【００１１】
本発明のそれ以外の目的及び態様については以下に示す明細書の記載において詳細に説明される。
【００１２】
（望ましい態様の詳細な説明）
本発明の方法に使用する植物は、非限定的にN tabacum, N rustica及びN glutinosaを含むNicotiana属の種、すなわちタバコである。本明細書で使用する場合、「タバコ」とは、Nicotiana属のいずれの植物、種または雑種をも意味、包含する。タバコのいずれの株及び変種を使用することができる。Nic1/Nic2二重突然変異のように既にニコチン含量が低下している株が望ましい。植物は、そのニコチン含量を減少させるために、以下に詳細に検討するような遺伝子導入方法により修飾される。
【００１３】
本明細書で使用される「減ニコチン」とは、ニコチン含量が、遺伝子導入植物を創出した遺伝子導入されていない「親」（または非修飾「対照」）植物の半分以下、望ましくは25%以下、より望ましくは20%以下または10%以下である組換え（または「遺伝子導入」）タバコ植物を意味する。本発明を実施するために使用される遺伝子導入植物においては、対応する非修飾対照植物に比較して、少なくとも1%若しくは5%程度の、わずかなニコチンが残留することは理解されるであろう。
【００１４】
本明細書で引用した米国特許文献の開示内容は、その全体を引用して本明細書に取り入れる。
【００１５】
A.  減ニコチンタバコ植物
本発明を実施するために使用される減ニコチンタバコ植物は、通常、異種ヌクレオチドを含み且つ発現する組換え植物であり、その異種ヌクレオチドの発現により、当該植物中のキノレートホスフォリボシル転移酵素（QPRTase）、プトレッシンメチル転移酵素（PMTase）、アルギニン脱炭酸酵素、オルニチン脱炭酸酵素、S-アデノシルメチオニン合成酵素、NADH脱水素酵素、またはホスフォリボシルアントラニル酸イソメラーゼが下方調節され、その結果植物中のニコチンの生産を減少させる植物である。適した組換え植物は、M. Conkling 等, PCT出願WO98/56923（1998年12月17日公開）及びM. Timko, PCT出願  WO00/67558（2000年11月16日公開）に開示されており、その開示内容は、その引用により本明細書に取り込む。通常、異種ヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス位において、下方調節される酵素をコードする核酸の少なくとも一部を含んでいる。
【００１６】
減ニコチンタバコは、対応するニコチンの減少していない植物に見出されるレベルに比較して、含有するタバコ特異的ニトロソアミンの量も少ないものが好ましい（例えば、少なくとも90、95または99重量パーセント以上）。
【００１７】
本発明の一態様は、非遺伝子導入対照植物に比較して、キノレートホスフォリボシル転移酵素（QPRTase）発現が低減した減ニコチン組換え植物を利用するものである。
当該組換え植物は、5'から3'の方向に、当該植物細胞中において作動し得るプロモーター及び植物キノレートホスフォリボシル転移酵素mRNAの少なくとも一部をコードする異種DNAを含み、当該異種DNAは、センスまたはアンチセンス位において、当該プロモーター及び当該異種DNAと作動的に結合している、外来性DNA構築体を含む組換え植物細胞を含有している。当該組換え植物は、これにより非遺伝子導入対照植物に比して、減少したQPRTase発現及び減少したニコチン含量を示す。
【００１８】
本発明の他の態様は、非形質転換対照植物に比較して、プトレッシンN-メチル転移酵素（PMTase）が減少した減ニコチン組換え植物を利用して実施される。
当該組換え植物は、5'から3'の方向に、当該植物細胞中において作動し得るプロモーター及び植物PMT mRNAの少なくとも一部をコードする異種DNAを含み、当該異種DNAが、センスまたはアンチセンス位において、当該プロモーター及び当該異種DNAと作動的に結合している、外来性DNA構築体を含む組換え植物細胞を含有しているものである。当該植物は、非形質転換対照植物に比して、減少したPMT発現を示すと共に、非形質転換対照植物に比して減少したニコチン含量を示す。
その他の態様は上に列記したその他の酵素を用いて同様に実施することができる。
【００１９】
上記のような核酸構築体は、（例えば）Thompson等に対する米国特許番号6,100,448及び6,037,525に記述されているように、上記構築体の上流（5'方向）及び／または下流（3'方向）にインスレータ部分を含むことができる。さらに、上記のような構築体は、（例えば）Thompson 等に対する米国特許番号5,773,695及び5,773,689に記述されているように、上記構築体の上流及び／または下流にマトリックス（またはスカフォールド）付着領域を含むことができる。
【００２０】
本明細書に記述されている植物は、通常ニコチン合成経路の一つの酵素を下方調節する一つの核酸を有するものとして記述されているが、本発明に利用される植物は、ニコチン合成経路の複数の酵素（例えば、PMTase及びQPRTaseの両者）を下方調節する複数の組換え核酸を含むことができることは理解されるであろう。
【００２１】
かくして、本発明の更なる他の態様は、非形質転換対照植物に比してQPRTase及びPMTase発現が共に減少した減ニコチン組換え植物を利用する。
当該組換え植物は、(i) 5'から3'の方向に、該植物細胞中で作動し得るプロモーター及び植物キノレートホスフォリボシル転移酵素mRNAの少なくとも一部をコードする異種DNAを含み、該異種DNAが、該プロモーターと作動的に結合している、第1の外来性DNA構築体と、(ii) 5'から3'の方向に、該植物細胞中で作動し得るプロモーター及び植物PMT mRNAの少なくとも一部をコードする異種DNAを含み、該異種DNAが、センスまたはアンチセンス位において、該プロモーター及び該異種DNAと作動的に結合している第２の外来性DNA構築体とを含有している。
当該植物は、非形質転換対照植物に比較して減少したPMT発現を示すと共に、非形質転換対照植物に比較して減少したニコチン含量を示す。
センス及びアンチセンスによる下方調節が本明細書において記述される場合、リボザイムまたは干渉相補性mRNAを使用するようなその他の技術を使用し得ることは理解し得るであろう。
【００２２】
本発明を実施するために使用することができる核酸配列の例としては、非限定的に、既知のタバコキノレートホスフォリボシル転移酵素遺伝子（NtQPT1）をコードするDNA（例えば、Conkling 等に対するPCT出願WO98/5556923；及びPMT1，PMT2，PMT3及びPMT4のようなタバコプトレッシンN-メチル転移酵素をコードするDNA）、ADC1及びADC2のようなタバコアルギニン脱炭酸酵素をコードするDNA、タバコオルニチン脱炭酸酵素（ODC）をコードするDNA、タバコS-アデノシルメチオニン合成酵素（SAMS）をコードするDNA、タバコNADH脱水素酵素をコードするDNA、及びタバコホスフォリボシルアントラニル酸イソメラーゼをコードするDNA（これらは既知であり、M. Timko 等に対するPCT出願WO 00/67558に記述されている）がある。
【００２３】
上記のような目的の酵素活性を有するタンパクの発現をコードする他のDNA配列を、上記のDNAまたは上に示した酵素タンパクをコードする他のDNA配列とハイブリダイズすることができる条件は、通常の方法で決定することができる。例えば、そのような配列のハイブリダイゼーションは低い厳密度またはより厳密な条件の下に実施することができる（例えば、上に示したタンパクをコードするDNAに対して、in situハイブリダイゼーションアッセイにおいて標準的な0.3 M NaCl, 0.03 Mクエン酸ナトリウム、0.1% SDS、60℃または70℃の洗浄厳密性で示される条件。J. Sambrook 等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)を参照）。一般的にそのような配列は、上に示した配列または上に示したタンパクをコードするDNA配列に対して、少なくとも65%相同、75%相同、80%相同、85%相同、90%相同、または95%以上相同であろう。（配列相同性の計算は二つの配列を最大に適合するように整列して行ない、適合する二つの配列のそれぞれにおけるギャップは最大適合において許容される。ギャップ長は、10またはそれ以下が望ましく、5またはそれ以下のギャップ長はより望ましく、2またはそれ以下のギャップ長はさらに望ましい。）
【００２４】
本発明の方法に使用される異種配列は、酵素配列をコードする完全な配列またはその部分に相補的なRNA産物を生成するように選択することができる。この配列は天然メッセンジャーRNAのいずれかの連続配列に相補的である。すなわち、当該異種配列は、5'末端またはキャッピング部位に隣接し、キャッピング部位の下流にあり、キャッピング部位及び開始コドンの間にある、外来性mRNA配列に相補的で、非コード領域の全てまたは一部のみを包含するものでもよく、非コード領域及びコード領域を架橋するものでもよく、コード領域の全体または部分に相補的なものでもよく、コード領域の3'-末端に相補的なものでもよく、mRNAの3'-非翻訳領域に相補的なものでもよい。
好適なアンチセンス配列としては、少なくとも約12，14または15〜約15，25，または35ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチド、少なくとも約100ヌクレオチド、少なくとも125ヌクレオチド、少なくとも約150ヌクレオチド、少なくとも約200ヌクレオチド、またはそれ以上である。さらに、この配列はその3'または5'末端において延長または短縮することができる（例えば、追加の1〜4または8核酸残基を加えることにより）。アンチセンス産物は、天然に存在する標的RNAのコードまたは非コード（または両方）部分に相補的とすることができる。個別のアンチセンス配列及びアンチセンス配列の長さは、目的とする阻害の程度、アンチセンス配列の安定性などにより変化するであろう。当業者であれば、この分野に使用可能な技術及びここに提供された情報を使用して、適当な酵素アンチセンス配列を選択することができるであろう。
【００２５】
前述したように、本発明は、ニコチン生産のセンス共抑制を施した植物を使用して実施することもできる。本発明を実施するために使用されるセンスDNAは、植物細胞中で発現した時に、その植物細胞中で本明細書で記述したような植物酵素の発現を抑制するのに充分な長さのものである。そのようなセンスDNAは、本質的に酵素をコードする完全なゲノムDNAまたは相補性DNA、或いは通常は、少なくとも15ヌクレオチド長を有するそのフラグメントである。
細胞における在来遺伝子の発現の抑制を生じるセンスDNAの長さを決める方法は、当業者にとって使用可能である。本発明はまた、発現時、その配列を含む内在性遺伝子を抑制または沈黙させることができる相補性アンチセンス及びセンス配列を含む二重鎖RNAをコードするDNAを含む植物を用いて実施することができる。適当な相補性領域は、少なくとも約20から25ヌクレオチドからなり、少なくとも約5ヌクレオチドで分離することができる。
【００２６】
本発明のさらに他の態様においては、Nicotiana植物細胞を、本明細書で記述したような植物酵素をコードするDNAのmRNA転写物に作用する（すなわち、切断する）酵素的RNA分子（すなわち、「リボザイム」）をコードするDNA部分を含むDNA構築体で形質転換する。
リボザイムは、標的mRNAの接着領域に結合する基質結合ドメインと、RNAの切断を触媒するドメインとを含み、翻訳及びタンパク生産を阻害する。結合ドメインは、標的mRNA配列に相補的なアンチセンス配列を含み、触媒モチーフとしては、ハンマーヘッドモチーフまたはヘアピンモチーフのようなその他のモチーフがある。RNA標的内のリボザイム切断部位は、最初リボザイム切断部位について標的分子を逐一調べて同定する（例えば、GUA，GUUまたはGUC配列）。
【００２７】
一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子に対応する15，20，30またはそれ以上の短いRNAを、予想される構造的特性について評価することができる。候補標的の適合性も、既知技術であるリボヌクレアーゼ防護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのし易さを試験することにより評価することができる。酵素的RNA分子をコードするDNAは、既知技術に従って作成することができる（例えば、T. Cech 等, 米国特許番号4,987,071; Donson 等, 米国特許番号5,589,367; Torrence 等,米国特許番号5,583,032; Joyce,米国特許番号5,580,967; Wagner 等,米国特許番号5,591,601;及び 米国特許番号5,622,854）。
植物細胞中にそのような酵素的RNA分子を生成し、酵素タンパク生産を妨害することは、本質的にアンチセンスRNA分子を生成する方法と同様に、植物細胞中の酵素活性を減少させる。すなわち、酵素を生産する細胞中においてmRNAの翻訳を妨害することによる。
用語「リボザイム」は、本明細書において、酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）として働くRNA含有核酸のことを記述するために使用し、「酵素的RNA分子」と互換的に使用する。
【００２８】
本発明のさらに他の態様において、ニコチン生産の下方調節は、米国特許番号5,272,065に記述されているように、干渉相補的mRNAを使用する、mRNAの翻訳阻害を利用することにより達成することができる。
【００２９】
酵素レベルを低下させることにより、非形質転換対照タバコ植物よりも低いニコチン含量のタバコ植物を作成するために、タバコ細胞を、適切に作動的に結合した調節配列または上記のようなリボザイムをコードする配列とともに、センスまたはアンチセンス位において、部分的酵素核酸配列、完全長酵素核酸配列を含有する外来性転写ユニットで形質転換することができる。適切な調節配列には、形質転換される植物中で作動する転写開始配列（「プロモーター」）、及びポリアデニル化/転写終結配列が含まれる。次いで、制限マッピング、サザンブロットハイブリダイゼーション、及びヌクレオチド配列分析のような標準的技術を使用して、アンチセンス方向に調節配列に作動的に結合した酵素配列を持つクローンを同定する。次いで形質転換に成功した細胞からタバコ植物を再生する。使用するアンチセンス配列は、内在性配列に相補的であることが最も望ましいが、外来性及び内在性配列の少しの変異は許容することができる。アンチセンスDNA配列は、調節される細胞中の内在性配列と、後に述べる厳密な条件下で結合できる程、充分な類似性をもつことが望ましい。組換えタバコ植物を作成するための個別の技術は当業者には既知であり、前記のM. Conkling 等, PCT出願WO98/56923（1998年12月17日公開）及びM. Timko, PCT出願WO00/67558（2000年11月16日公開）に詳細に説明されている。
【００３０】
B.  動物飼料または試料添加物としてのタバコ葉
本発明の第二の態様は、前記のような減ニコチン組換えタバコ（植物及び植物の部分の両方を含む）を、動物個体に食べさせることを含む、動物個体を養育する方法である。本発明に従って植物（または以下に述べる飼料製品）を与えることができる動物は、ウシ、ヒツジ、及びブタのような哺乳動物（反芻動物を含む）、並びにニワトリ及びシチメンチョウのような家禽、魚などである。
【００３１】
一の態様において、飼料として、または飼料製品を調製するために用いられる植物または植物部分は、前記のように増加した還元糖を含んでいる。
【００３２】
動物に食べさせる方法は、例えばタバコを含む飼料作物を動物に与えることにより、タバコの葉を動物に与えることにより、タバコを含むサイレージを与えることにより、及び／または少なくとも一つの追加の栄養素と共にタバコを含む飼料製品を動物に与えることにより行なうことができる。
【００３３】
本発明の飼料製品は、減ニコチンタバコ植物を含んでいる。この植物は、葉または細切した葉、植物部分（例えば、還元糖を含む抽出物）などのようないずれの形でも飼料製品の中に入れることができる。飼料製品は、他の栄養素または添加物とのバランスを考慮して、例えば、1，5または10重量パーセント〜90，95または99重量パーセント以上の適当量の組換え植物（または植物部分）を含ませることができる。飼料製品は、サイレージまたは少なくとも一つの追加の栄養素と組合わせたタバコ植物のようないずれかの適当な形態をとることができる。飼料製品は、葉（すなわち、識別可能な葉または細切した葉若しくは植物の砕片）或いは植物から分離されたその他の部分を含ませることができる。飼料製品は、乾燥または必要に応じ凍結乾燥することができる。飼い葉とする場合には、単純に畑に植えてあるタバコ植物の茎を動物に与えてもよく、後に使用するために、乾燥若しくは部分的に乾燥し、梱包して、任意に他の添加物（例えば、Glabeに対する米国特許4,034,117を参照）とを加えてもよく、或いは保存し、少なくとも部分的に醗酵してサイレージとして使用してもよい（例えば、Glabeらに対する米国特許4,015,018）。
【００３４】
本発明による動物飼料として使用され、または飼料製品を調製するためのタバコ植物は、通常、S. Austin-Phillipsらに対する米国特許番号5,900,525（WARF）に記述されているように、非修飾対照植物に比較して、高いレベルのフィターゼが含まれるようにフィターゼをコードする異種核酸を含みそして発現するように遺伝子操作して得ることができる。
【００３５】
本発明の飼料製品を調製するために、本明細書で記述したような植物または植物部分に組合わせることができる他の栄養素または添加物としては、糖類、脂肪、脂質、及び／またはタンパクがある。本発明による動物飼料を調製するために使用される糖類原料としては、例えば、トウモロコシ、エンバク、オオムギ、モロコシ、またはそれらの組合せがある。これらの穀類は、すり潰して動物飼料に使用される餌の中に入れることが望ましい。添加タンパク原料としては、例えば、ダイズ粉、魚粉、血液粉、家禽副産物（すり潰した鶏肉屑）、肉粉、羽毛分解物（例えば、Shihに対する米国特許番号4,908,220を参照）及びそれらの組合せがある。動物飼料は、全タンパク原料（タバコ植物及びその他の両方を含む）からのタンパクを、約13重量%〜25重量%含んでいる。植物または植物部分が、唯一のタンパク原料であってもよく、上記のように添加されるものでもよい。
ビタミン、ミネラル、抗生物質、及びその他の物質または化合物のような少量の栄養素を、必要に応じて飼料中に含めることができる。材料は、適当な方法で混合して、飼料ペレットのような適当な形態に製剤化することができる。必要に応じて、追加の栄養素を生産するようにタバコを遺伝子操作することができる。
【００３６】
C.  タバコを使用するエタノール醗酵
植物原料からエタノールまたはアセトンのようなその他の物質を生産する醗酵方法は、文献上よく知られている（例えば、C. Weizmann, Production of Acetone and Alcohol by Bacteriological Processes, 米国特許番号1,315,585（1919）を参照）。目的とする製品は、例えばバイオマス中の糖類、バイオマス中のセルロース及びヘミセルロース、または両者のような成分の醗酵により生産することができる。一般的に糖類及びデンプンはセルロース及びヘミセルロースよりも醗酵が容易である。醗酵操作は、種々の形態で具体化することができ、そのいくつかの例を以下に示す。醗酵は、未処理植物原料または植物原料中の種々の成分（例えば、糖及びセルロースフラクション）を使用して行なうことができ、以下に記述するようなフラクションI及び/またはフラクションIIタンパクの単離のような他の目的のために、タンパクフラクションのような成分を植物原料から分離する場合には、後者が望ましいことに注意する。また、そのバイオマスを、使用する操作に応じて（例えば、可溶性糖類を生産するためのセルロースの酵素消化）、個別の醗酵操作に適するように前処理することができる。
【００３７】
本発明を実施するために使用することができる醗酵操作の一の特定の例は、Jeffriesに対する米国特許番号4,663,284に示されており、これはキシロース代謝イーストを使用する醗酵により、D-キシロースからエタノールを生産する方法であって、醗酵操作の間に醗酵培地に少量のグルコースを加える方法を開示している。
【００３８】
Gongに対する米国特許番号4,511,656は、イースト変異株によるD-キシロースの醗酵により、D-キシロースからエタノールを直接生産する方法を提供している。この方法はさらに、D-グルコース及びD-キシロースのイースト醗酵によりセルロース及びヘミセルロースの混合物から直接且つ同時にエタノールを得る方法を提供している。
【００３９】
Gongらに対する米国特許番号4,490,468は、予めキシロースを異性化して得たキシルロールの嫌気性醗酵を提供している。
【００４０】
Gongに対する米国特許番号4,368,268は、キシロースからエタノールを生産する方法を提供している。この方法は、キシロースからキシルロースへ異性化し、キシルロースをエタノールへ醗酵するものである。本質的に、この方法は、イーストの変異株により、ヘミセルロース加水分解生成物中のキシロース単独または他の糖と組合わせたものを、好気的または嫌気的に醗酵するものである。
【００４１】
Wuに対する米国特許番号4,840,903は、植物バイオマスからエタノールを生産する方法を提供している。この方法は、セルロース及びヘミセルロースの加水分解物を含む基質を、バイオマスから生成することを含んでいる。セロビオース及びキシロースのいずれからもエタノールに醗酵することができる菌類Paecilomycesの一種（例えば、Paecilomyces sp. NF1）を選別し、単離し、この菌を基質に接種する。接種した溶液を細胞生存及び加水分解物のエタノールへの変換に適した条件下に醗酵させ、醗酵液からエタノールを回収する。
【００４２】
D. Spindlerらに対する米国特許番号5,100,791は、植物バイオマスからエタノールを生産する方法を記述している。この方法は、セルロース及びヘミセルロースの加水分解物を含む基質をバイオマスから生成することを含んでいる。セルロース及びグルコースのいずれもエタノールに醗酵する能力を有するイーストの一種であるBrettanomyces custersii (CBS 5512)を選別し、単離する。基質にこのイーストを接種し、接種した基質を細胞生存及び加水分解物をエタノールに変換するのに適した条件で醗酵する。
【００４３】
M. Lastickらに対する米国特許番号5,372,939は、予め定めた条件の下に、これらの糖類を醗酵可能な糖類に変換する酵素を使用してキシロース及びセルロースの混合流からエタノールを生産する方法を記述している。これは、セルラーゼを使用するセルロースからグルコースへの変換と、Schizosaccharomyces pombe ATCC No. 2476の存在下にキシロース異性化酵素を使用するキシロースからキシルロースへの変換を同時に行なうことによりなされる。この酵素操作により、これら醗酵可能な糖であるグルコース及びキシルロースのイーストによるエタノールへの変換を同じ醗酵で行なうことができる。
【００４４】
以上は、本発明を実施するために使用し得る醗酵操作の例であり、これに限定することを意図していない。この他の多数の方法が当業者には明らかであり、本明細書で記述した醗酵を実施するために使用することができる。また、基本的にエタノールを生産するための醗酵方法を記述したが、アセトンのような他の溶剤がこの発明の醗酵により生産できることは理解されるであろう。
【００４５】
D.  タバコ葉からフラクションI及びフラクションIIタンパクの分離
S. Wildman及びP. Kwanyuen (Leaf Proteins Inc.)に対する米国特許番号4,347,324及び4,268,632に記述されているように、タバコを含む一部の植物における多汁葉は10-20%の固形成分を含み、残りは水分である。固形成分は水溶性成分及び水不溶性成分からなり、後者は大部分葉の繊維性構造物質を構成する。
【００４６】
水溶性成分は2群に分類することができる。一群は比較的低分子量の化合物を含む。第二群はほとんどタンパクであり、その分子量は約30,000ダルトンかそれ以上である。第二群のタンパクは二つのフラクションに分けることができる。一つのフラクションはその分子量が約30,000ダルトンから100,000ダルトンのタンパクの混合物である。これらのタンパクはしばしば「フラクション2タンパク」と呼ばれている。残りの部分は分子量約550,000ダルトンを有する単一のタンパクであり、しばしば「フラクション1タンパク」と呼ばれる。
【００４７】
フラクション1タンパクは光合成に関係する酵素であり、リブロース1,5-ジホスフェートカルボキシラーゼ、カルボキシジスムターゼ、 リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ及びリブロース1,5-ジ（またはビス）ホスフェートカルボキラーゼ-オキシゲナーゼとしても知られている。フラクション1タンパクは葉の全タンパク成分の25%、及び葉の固形物質の10%を構成することがある。
【００４８】
精製すると、フラクション1タンパクは無臭、無味且つ無色であり、高い栄養価を有する。これらの性質を考慮し、高純度で得られることからすると、フラクション1タンパクは、動物及びヒトの食品添加物として潜在的に高い利用価値があると考えられる。ヒトの場合に、その添加物は、高蛋白食品またはその他の食品の成分となり得る。例えば、腎臓病のために透析を必要とする人の食品に対する補助剤として提案されている。
【００４９】
フラクション1タンパクを単離する種々な方法が知られている。フラクション1タンパクを単離する基本的方法3つが、S. Wildman及びP. Kwanyuenに対する米国特許番号4,347,324及び4,268,632に記述されている。これらの3方法はいずれも植物の葉、または葉及び茎をパルプにすることから始め、次いでパルプからの緑色のジュースを絞り取る。非常に細かい粒状の緑色の色素物質を含む緑色のジュースを、例えば、濾過または遠心分離により精製して、微細な粒状固形物を液体から分離する。得られた液体は褐色である。
【００５０】
最初の方法は、分子濾過により、褐色ジュース中の低分子量化合物からフラクション1タンパクの部分を分離してフラクション1タンパクを濃縮することに関するものである。フラクション1タンパクを通さずに小さな分子を通す孔による分子ふるいを利用して、小さな分子が孔を通るように褐色ジュースを加圧下に置く。こうしてフラクション1タンパクを含む溶液は、約10倍に濃縮され、次いで溶液中の小分子を除くために更に透析する。透析は、コロジオンタイプの透析バッグを使用して行なう。このバッグの孔は、フラクション1タンパクを通過させないが、より小さな分子はバッグから水の中に出て行くことができる。透析の間に、フラクション1タンパクの結晶が生じる。
【００５１】
第二の方法は、葉から得た褐色ジュースを、セファデックスクロマトグラフィーカラムを通すものである。セファデックスG-25またはG-50のいずれかを分離を行なうために使用することができる。適当なビーズを選択することにより、その構造の内部に小分子を侵入させて大分子を排除することができる。従って、大分子は密に詰めたセファデックスビーズの間隙に存在する液中にのみ存在する。この間隙空間は「ボイド容積」と言われる。分離を効率よく行なうために、褐色ジュースの容積はビーズの全容積の約25%を超えることはできない。ビーズは最初に緩衝液及び同じ緩衝液を含む褐色ジュースと平衡化し、次いでセファデックスカラムの上部に積層する。褐色液体は、緩衝液を使用してカラムから溶出する。ジュースがカラムを流下する時、小分子はビーズの中に浸透するので、その移動は遅れる。他方、大きなフラクション1分子はビーズの間隙によって形成された通路を通って速い速度でカラムを流下し、透明な褐色溶液としてカラムから出てくる。しかし、溶出により、少なくとも2倍に希釈された溶液を生じる。小分子の除去によりフラクション1タンパクをとりまく環境が変化し、当該タンパクは結化する。
【００５２】
第三の方法は、褐色ジュースを上記のようなセファデックスG-25カラムを通すものである。タバコ以外の全ての植物の抽出の場合のように、もしもフラクション1タンパクが結晶化しなければ、溶液が30-50%飽和になるまで硫酸アンモニウムを加える。これにより非結晶質物質の沈殿を生じるので、これを遠心分離により採取する。分離後、沈殿をその沈殿を生じさせたものより少量の緩衝液に再度溶解し、これに8%ポリエチレングリコールを加える。この混合物を蓋のない皿に入れて、シリカゲルを入れたもう一つの蓋のない皿の隣に置き、この二つの皿を同じ容器内に封入する。タンパク溶液から水が徐々に蒸発してシリカゲルに吸収される。時間の経過と共に、フラクション1タンパクの結晶が成長する。
【００５３】
Wildman及びKwanyuenに対する米国特許番号4,268,632は、葉をパルプへ変換し、パルプの液体部分をタンパクの変性を生じるよりも低い温度で加熱し、次いで当該液体部分を、フラクション1タンパク、すなわちリブロース  1,5-ジホスフェートカルボキシラーゼが結晶化する温度に冷却する、段階を含むフラクション1タンパクの単離方法を記述しいる。Wildman及びKwanyuenに対する米国特許番号4,347,324は、最初は必須と考えられていた加熱段階を省略できる以前の方法の改良を記述している。改良方法によると、リブロース  1,5-ジホスフェートカルボキシラーゼは、葉から得られたパルプの液体部分のpHを、約6からタンパクが変成して不定形固体として沈殿するよりも高いpH、すなわち約pH  5.0で見出される等電点より大きなpHの範囲で調節することにより結晶の形で得られる。不溶物の分離後、液体を、望ましくは環境温度以下に冷却しながら放置して、フラクション1タンパクを結晶化する。
【００５４】
D. Bourque (University Patents, Inc.)に対する米国特許番号4,400,471は、植物からタンパクを分離精製し；タンパクを適当な溶剤と混合して予定したpHのタンパク溶液とし；タンパク溶液と、タンパク溶液のpHよりも低く4.8から7.2の範囲のpHを有する沈殿溶液とを混合して、6.6から7.0の範囲のpHを有する混合溶液を調製し；次いで、混合溶液から溶剤の一部を除去してタンパクを結晶化させる、光合成生物からフラクション1タンパクを晶析分離する方法を記述している。
【００５５】
S. Johalに対する米国特許番号4,400,471は、タバコ葉のような植物原料からリブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ（RuBisCO）を調整する方法であって、水溶液中で植物原料を粉砕して懸濁液を作成し；すり潰した植物原料から溶液中にRuBisCOを放出させるために懸濁液を分画し；RuBisCOの結晶が選択的に形成されるように、溶液に充分な量のポリエチレングリコール（PEG）を加え（該結晶は不純物を含む）；溶液から結晶を分離し；結晶を水に再溶解し；再溶解した結晶を陰イオン交換樹脂に通し；カラムを洗浄して非結合物質を除き；樹脂から選択的にRuBisCOを溶出するのに充分な濃度で、カラムに、所定濃度の二価金属イオンを含む溶液を通す段階を含む、上記方法を記述している。S. Johalに対する米国特許番号4,588,691も参照。
【００５６】
フラクションIIタンパクは、フラクションIタンパクを分離する過程においてフラクションIタンパクを分離した後の残留可溶性タンパクとして分離するか、またはフラクションIタンパクの分離に関する前記検討から明白な他の技術により分離することができる。
【００５７】
E.  モレキュラーファーミング
M. Conkling等のPCT出願WO98/56923において指摘されているように、低レベルのニコチン生産またはニコチン生産のないタバコ植物は、医薬品、化粧品成分、または食品添加物のような商業的に価値のある製品を発現する遺伝子を導入する受容植物として魅力的である。モレキュラーファーミングのための適当な技術は、とりわけ、Goodman等（Calgene）に対する米国特許番号6,096,547、5,629,175、及び5,550,038に記述されている。タバコは、遺伝子操作が容易であり、１エーカー当たり非常に大量のバイオマスを生産するので目的とする生成物をコードする遺伝子を導入する受容植物として魅力的である。タバコ植物は、ニコチン生産の供給源として充てられるものが減少するにつれ、導入遺伝子産物の生産により多くの資源を使用することができるであろう。目的とする産物を生産する導入遺伝子でタバコを形質転換する方法は、本技術分野で既に知られており、適当な技術を、本発明の低ニコチンタバコ植物に使用すればよい。
【００５８】
導入遺伝子によりコードされ、上記のようなタバコ植物（PCT出願WO00/67558に記述されているタバコ植物を含む）中で発現する目的産物の例としては、非限定的に、哺乳動物、特にヒトのタンパク及びペプチド、例えば、インターロイキン-1（IL-1），IL-2、IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12及びその他のリンホカイン、エリスロポエチンすなわちEPO、アルファ、ベータ及びガンマインターフェロンのようなインターフェロン、G-CSF，GM-CSF及びM-CSFのような増殖因子、ファクターIからXII、特にファクターVIII及びファクターIX、のような血液因子、組織プラスミノーゲンアクチベーターすなわちtPA、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子-アルファ、ベータなど、成長ホルモン、インスリン、コラーゲンプラスミノーゲン活性因子、組織適合性抗原、受容体、受容体アンタゴニスト、抗体、1本鎖抗体、酵素、神経ポリペプチド、抗原、ワクチン、ペプチドホルモン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、及びフィターゼ、並びに抗菌ペプチドまたはタンパク、例えばプロテグリン、マゲイニン、セクロピン、セルコスポリン、メリチン、インドリシジン、デフェンション、β-デフェンシン、クリプチジン、クラバイニン、植物デフェンシン、ナイシン、バクテネシンなどがある。
【００５９】
ニコチン合成経路の酵素に関する構築体と同様に、タバコ植物に導入する前記タンパク及びペプチドをコードする構築体は、（例えば）Thompson等に対する米国特許番号6,100,448及び6,037,525に記述されているように、上記構築体の上流（5'方向）及び／または下流（3'方向）にインスレータ部分を含むことができ、または（例えば）Thompsonらに対する米国特許番号5,773,695及び5,773,689に記述されているように上記構築体の上流または/下流にマトリックス（またはスカフォールド）接着領域を含むことができる。
【００６０】
遺伝子導入タンパクまたはペプチドを、組換え植物からいずれかの適当な技術により収集することができ、通常、植物または葉のような植物部分を粉砕又はすり潰し、適当な溶剤でタンパクまたはペプチドを抽出し、次いでクロマトグラフィーのような精製技術を使用してタンパクまたはペプチドを単離する。但し、このような技術の選択は、単離する個別のタンパクまたはペプチドに依存する。S. Garger等（Biosource Technologies Inc.）に対する米国特許番号6,037,456は、植物から可溶性タンパクまたはペプチドを得る方法であって：（a）植物をホモジナイズして緑色ジュースホモジネートを作製し；（b）当該緑色ジュースホモジネートのpHを約5.2以下に調節し（例えば、約4.0から5.2）；（c）緑色ジュースホモジネートを、約45℃の最小温度で加熱し（例えば、45及び50℃の間）；（d）緑色ジュースホモジネートを遠心分離して上清を作成し（次いで、任意に上清を1回以上限外濾過工程にかけ、）；次いで（e）上清のタンパクまたはペプチドを、（例えば、クロマトグラフィー、親和性に基く精製方法、または塩析により）精製する連続段階を含む、方法を記述している。
適当なタンパクの例は、非限定的に、上記した導入遺伝子によりコードされるタンパクである。タンパクまたはペプチドを、植物と共に飼料成分として含めることを意図する場合には、植物または植物部分から、タンパクまたはペプチドを単離する必要がないことは理解されるであろう。
【００６１】
本発明は下記の非限定的な実施例において詳細に説明される。
【実施例１】
【００６２】
親系と比較したVector Burley 21-41のニコチン及び還元糖のレベル
低ニコチンタバコ変種であるVector Burley 21-41は、特許協力条約の下に公開されている国際特許公開WO98/56923に記述されているように、AgrobacteriumバイナリーベクターであるPYTY32を使用して、Burley 21 LAを形質転換することにより作製された。Burley 21 LAは、Burley 21の変種であり、Burley 21に比較してニコチンレベルが充分に減少している（すなわち、Burley 21 LAはBurley 21のニコチンレベルの8%を有する、Legg 等,(1971) Can. J. Genet. Cytol. 13: 287-91; Legg 等, (1969) J. Hered. 60: 213-17を参照）。Vector Burley 21-41は、親変種であるBurley 21 LAにもっとも近似する。一般的に、Vector Burley 21-41は、アルカロイド含量（例えば、ニコチン及びノルニコチン）及び還元糖の含量以外は、評価した全ての性質においてBurley 21 LAに近似する。Vector Burley 21-41は、ニコチン、ノルニコチン及び総アルカロイドの含量が、充分に低下していることにより、親のBurley 21 LAと区別することができる。後に示すように、Vector Burley 21-41の総アルカロイド濃度は、親のBurley 21 LAのレベルの約10%に低下している。Vector Burley 21-41のニコチン及びノルニコチンは、Burley 21 LAに比較して、それぞれ約6.7%及び32%未満である。したがって、Vector Burley 21-41は、Burley 21のニコチンレベルの0.54%に相当するニコチン濃度を有しているであろう。また、下記表1に示すように、Vector Burley 21-41は、Burley 21 LAに比較して（約10.29%対5.51%）、かなり高いレベル（+87%）の還元糖を有することが、予想外に見出された。このようにVector Burley 21-41中の還元糖は、親系におけるよりも約90%多いことが判明し、この植物の、本明細書で記述したような応用、特にエタノールを生産する醗酵操作への使用を、非常に望ましいものにしている。
【表１】
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【００６３】
以上、本発明について説明したが、本発明は、これらにより制限されるものではない。本発明は、本明細書に含まれる特許請求の範囲と等価なものと共に、特許請求の範囲によって規定される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535804.tif 000029
【国際調査報告】
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