(57)【要約】本発明は多剤耐性細胞、好ましくは多剤耐性細胞のディスコデルモライドでの処置法に関する。ディスコデルモライドはチューブリン変異を有する細胞のそうでなければ増殖非制御の限定に、および癌遺伝子ＲＡＦ−１のリン酸化の促進に有効であることが判明した。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの多剤耐性細胞と増殖阻害量のディスコデルモライドを接触させる段階を含む、多剤耐性細胞の増殖阻害の方法。
【請求項２】
多剤耐性細胞がタキサン類に耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多剤耐性細胞がパクリタキセルに耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞をインビボで増殖阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞を培養で増殖阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞が哺乳類由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
増殖阻害が哺乳類で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一つの抗新生物剤に耐性である少なくとも一つの癌細胞と、増殖阻害量のディスコデルモライドを接触させる段階を含む、癌細胞の増殖阻害の方法。
【請求項１０】
癌細胞が白血病細胞、リンパ腫細胞および固体腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞が多剤耐性細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
細胞がβ−チューブリンに変異を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
細胞がグルタチオンを過剰生産する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が哺乳類のである、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
多剤耐性細胞とディスコデルモライドを接触させる；そして細胞にアポトーシスを誘導させる段階を含む、多剤耐性細胞におけるアポトーシスを促進する方法。
【請求項１６】
多剤耐性細胞がパクリタキセルに耐性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
多剤耐性細胞が培養である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
多剤耐性細胞がインビボである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が哺乳類由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳類がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質β−チューブリンに変異を含む少なくとも一つの癌細胞と増殖阻害量のディスコデルモライドを接触させる；そして細胞の細胞分裂を阻害する段階を含む、β−チューブリン変異を有する癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２２】
多剤耐性細胞がパクリタキセルに耐性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
多剤耐性細胞がインビボで起こる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
細胞が哺乳類由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳類がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一つの抗新生物剤に耐性である細胞を含む腫瘍とディスコデルモライドを接触させる段階を含む、少なくとも一つの抗新生物剤に耐性の腫瘍の増殖を阻害する方法。
【請求項２７】
細胞がβ−チューブリンに変異を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞がグルタチオンを過剰生産する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が多剤耐性である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
細胞がｒａｆ−１を含み、ｒａｆ−１がディスコデルモライドの存在下でリン酸化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも一つの新生物剤がパクリタキセルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍が肺、前立腺、大腸、乳、卵巣、腎臓、脳、膵臓　食道、頭頸部、胃および肝臓腫瘍を含む群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新生物剤に耐性の細胞を処置するための方法に関する。現在、癌患者治療に良い結果を出すことを助ける細胞毒製薬剤が存在するが、多くの癌患者は現在化学療法処置に最適な新生物薬剤に耐性を発達させるか、耐性である。薬剤耐性の発達は、実質的に癌治療の効果を危うくさせる。
【０００２】
多剤耐性細胞は、抗新生物剤に耐性である細胞の一つの例である。この場合、細胞は１個以上の抗新生物剤に耐性である。多剤耐性は明確な現象である。しばしば一つのクラスの抗癌剤（すなわち、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン類、パクリタキセルを含むタキサン類、エピポドフィロトキシン類等）に耐性になった癌細胞は、また他の抗癌剤に耐性を示す。多剤耐性の発症は、多くの癌患者で良い結果を出すことに対する著しい障害を作る。多剤耐性薬剤は、共通して多くの一般的性質を有する；それらは一般に親油性であり、約３００ダルトンより大きいまたはより大きな分子量の弱塩基性分子である。多剤耐性細胞は、多剤耐性ではない細胞よりも低いレベルに抗癌剤を蓄積する傾向がある（Ｂｅｃｋ， ＷＴ， Ａｄｃ． Ｅｎｚｙｍ． Ｒｅｇｕｌ １９８４， ２２：２０７）。低いレベルでの薬剤の蓄積は、経膜チャネルタンパク質のファミリーの活性または量の増加と関連することが、あるモデルで示されている。
【０００３】
抗癌剤の細胞内濃度の減少ができる経膜チャネルタンパク質の例は、完全な膜タンパク質Ｐ−糖タンパク質である（Ｐｇｐ， Ｅｎｄｉｃｏｔｔ ＪＡ ａｎｄ Ｌｉｎｇ， Ｖ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８９， ５８：１３７）。タンパク質は抗新生物剤に結合し、薬剤を細胞外環境に放出すると考えられる。ＰｇｐをコードするＤＮＡであるＭＤＲ１　ｃＤＮＡは、多剤耐性表現型を作るのに十分である（Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９８６， ３２３：７２８）。これらのタンパク質は齧歯類およびヒトに存在する。抗新生物剤に対する耐性に関連する他のタンパク質は多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）である（Ｇｒａｎｔ ＣＥ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４， ５４：３５７）。ＭＲＰはドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシドおよびコルヒチンに対する多剤耐性を付与することが示されている。他の多剤耐性関連タンパク質のレビューのために、“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ”， Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｄａｌｔｏｎ， Ｃａｎｃｅｒ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ｐ． ４９８−５１２， ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．編， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， ＮＹ， １９９７参照。
【０００４】
上昇したレベルのＰｇｐは急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されない種々の癌、ならびに副腎、大腸、腎臓、肺および胸の癌を含むがこれらに限定されない種々の固体腫瘍に観察される（Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｄａｌｔｏｎ、前掲参照）。更に、種々の組織および細胞に起源を有する癌は多剤耐性を発症し得ることが広く認識されている。したがって、そうでなければ多剤耐性細胞に毒性のままである化合物を同定および使用する必要性がある。
【０００５】
多剤耐性に加えて、観察される抗新生物剤に対する他のタイプの耐性が存在する。これらは、例えば、変異タンパク質の結果としての１種以上の抗新生物剤に対する耐性である。抗新生物剤に対する耐性の一つの例は、微小管における変異またはチューブリン２量体によりもたらされる。例えば、タキサンファミリーに対する細胞性耐性は、ある場合、β−チューブリンサブユニットにおける変異と関連している。再び、多剤耐性細胞と同様に、タキサン耐性細胞に対して毒性のままである新生物剤の必要性がある。
【０００６】
本発明の要約
本発明は、ディスコデルモライド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ）で細胞を処置する方法に関する。一つの態様において、本発明は細胞をディスコデルモライドでインビボで処置することに関する。
【０００７】
本発明の他の態様において、本発明は少なくとも一つの多剤耐性細胞を増殖阻害量のディスコデルモライドと接触させる段階を含む。一つの実施態様において、多剤耐性細胞はタキサン類、例えばパクリタキセルに耐性である。他の実施態様において、多剤耐性細胞をインビボまたは培養で増殖阻害する。好ましくは，細胞は哺乳類、より好ましくはヒト由来である。
【０００８】
本発明の他の態様において、本発明は：少なくとも一つの抗新生物剤に耐性である、少なくとも一つの癌細胞を増殖阻害量のディスコデルモライドと接触させる段階を含む、癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。好ましい実際陽において、癌細胞は白血病細胞、リンパ腫細胞および固体腫瘍細胞からなる群から選択される。他の実施態様において、細胞はβ−チューブリンにおける変異を含み、他の実施態様において細胞はグルタチオンを過剰生産する。好ましくは、細胞は哺乳類のである。
【０００９】
本発明はまた：多剤耐性細胞とディスコデルモライドを接触させる；および細胞にアポトーシスを誘導する段階を含む、多剤耐性細胞におけるアポトーシスを促進する方法に関する。好ましい実施態様において、多剤耐性細胞はパクリタキセルに耐性である。細胞は培養またはインビボの細胞であり得る。好ましくは細胞は哺乳類およびより好ましくはヒト由来である。
【００１０】
本発明は更に：タンパク質β−チューブリンに変異を含む少なくとも一つの癌細胞と増殖阻害量のディスコデルモライドを接触させる；および細胞の細胞分裂を阻害する段階を含む、β−チューブリン変異を有する癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。一つの実施態様において、細胞はパクリタキセルまたは他の抗新生物剤に耐性である。好ましくは、増殖阻害はインビボで、およびより好ましくは増殖阻害は哺乳類、好ましくはヒトで起こる。
【００１１】
本発明はまた：少なくとも一つの抗新生物剤に耐性の細胞を含む腫瘍をディスコデルモライドと接触させる段階を含む、少なくとも一つの抗新生物剤に耐性の腫瘍の増殖を阻害する方法に関する。一つの実施態様において、細胞はβ−チューブリンにおける変異を含み、他の実施態様において細胞はグルタチオンを過剰生産する。更に別の実施態様において、細胞は多剤耐性である。好ましい実施態様において、少なくとも一つの新生物剤はパクリタキセルである。更に別の実施態様において、細胞はｒａｆ−１を含み、ｒａｆ−１はディスコデルモライドの存在下でリン酸化される。好ましくは腫瘍は肺、前立腺、大腸、乳、卵巣、腎臓、脳、膵臓　食道、頭頸部、胃および肝臓腫瘍を含む群から選択される。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１は、種々の癌細胞系におけるディスコデルモライドの抗増殖性活性を説明する表である。種々の癌細胞系を漸増濃度のディスコデルモライドまたはパクリタキセルとインキュベートし、細胞増殖のＩＣ５０をメチレンブルー染色により測定する。
【００１３】
図２（ａ）は、ディスコデルモライドへのパクリタキセル−耐性（Ｐｇｐ−１／ＭＲＰ）−過剰発現ヒト大腸腫瘍異種移植片（ＨＣＴ１５細胞）の感受性を評価するための試験における、平均腫瘍体積および図２（ｂ）は平均体重を提供する。−−□−−は１６．７％Ｃｒｍ．−８．３％ＥｔＯＨ／Ｄ５Ｗのコントロール溶液、ｉｖ、１×（ｄ．１４）である；−−●−−はディスコデルモライド、ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−◆−−はディスコデルモライド、ｉｖ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−◇−−は１２．５％ＥｔＯＨ／Ｄ５Ｗ、ｉｖ、１×／日（ｄ．１４−１６）を投与されたマウスである；そして−−×−−はパクリタキセル、ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１×／日（ｄ．１４−１８）を投与されたマウスである。
【００１４】
図３（ａ）は、ディスコデルモライドへのパクリタキセル−耐性（Ｐｇｐ−１／ＭＲＰ）−過剰発現ヒト大腸腫瘍異種移植片（ＭＩＰ１０１細胞）の感受性を評価するための試験における、平均腫瘍体積および図３（ｂ）は平均体重を提供する。−−□−−は１６．７％Ｃｒｍ．−８．３％ＥｔＯＨ／Ｄ５Ｗのコントロール溶液、ｉｖ、１×（ｄ．１４）である；−−●−−はディスコデルモライド、ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−◆−−はディスコデルモライド、ｉｖ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−◇−−はディスコデルモライド、ｉｖ、２．５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−○−−は１２．５％ＥｔＯＨ／Ｄ５Ｗ、ｉｖ、１×／日（ｄ．１４−１６）を投与されたマウスである；そして−−×−−はパクリタキセル、ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１×／日（ｄ．１４−１８）を投与されたマウスである。
【００１５】
図４は、ディスコデルモライドに対するパクリタキセル−耐性１Ａ９ＰＴＸ２２２（β−チューブリン変異）細胞感受性の評価である。−−●−−はパクリタキセルを投与された１Ａ９細胞である；−−○−−はパクリタキセルを投与された１Ａ９ＰＴＸ２２細胞である；−−▼−−はディスコデルモライド投与された１Ａ９細胞である；−−▽−−はディスコデルモライドを投与された１Ａ９ＰＴＸ２２細胞である。
【００１６】
図５は、ヌードマウス中でパクリタキセル耐性１Ａ９ＰＴＸ２２細胞がディスコデルモライドに耐性であることを証明する実験の結果である。図５（ａ）は動物に皮下的（ｓｃ）にホロー・ファイバーを移植した２４時間後に開始した処置を記載する（３ファイバー／動物、１ファイバー／各細胞系、６動物／化合物）。パクリタキセルを、ＩＶ、１日１回、５日間１５ｍｇ／ｋｇで投与した。媒体コントロールをパクリタキセルスケジュールにしたがって投与した。図５（ｂ）は５（ａ）と同じレジメであるが、パクリタキセルではなくディスコデルモライドをｉｖ、１回１５ｍｇ／ｋｇ注射で投与した。媒体コントロールをディスコデルモライドスケジュールにしたがって投与した。
【００１７】
好ましい実施態様の記載
（＋）−ディスコデルモライド（以後、“ディスコデルモライド”と呼ぶ）は、海洋性海綿動物Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔａの代謝物である（Ｇｕｎａｓｅｋｅｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５５：４９１２， １９９０参照。訂正：Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５６：１３４６， １９９１）。
【化１】
2004505890.tif 000003
【００１８】
その異なる化学構造にも関らず、ディスコデルモライドは医薬タキソールの活性物質であるパクリタキセルとほぼ同じ方法で機能すると考えられている。パクリタキセルと同様、ディスコデルモライドは精製チューブリンの寒冷誘導脱重合化の阻害に作用し、細胞内で微小管力学を妨害する（ｔｅｒ Ｈａａｒ Ｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６；３５：２４３−５０）。本化合物で処置した増殖細胞は、有糸分裂中に停止し、続いてアポトーシスを受ける（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １９９８； ９：６７−７６． ［Ｅｒｒａｔａ： Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １９９８：９：３６９−６７０］）。多くの試験において、ディスコデルモライドは精製チューブリンを重合化する能力に関してパクリタキセルより強力であり、ディスコデルモライドはパクリタキセルと競合的にチューブリンに結合することが示されている。パクリタキセルは腫瘍細胞において微小管を分裂させ、細胞死をもたらす。したがって、研究者らは、ディスコデルモライドのインビトロおよびインビボの両方でのディスコデルモライドの抗増殖性効果を確認する仕事をしてる。
【００１９】
研究者らが癌細胞の致死に関してパクリタキセルと比較してディスコデルモライドの優位性を証明しているが、致死は培養で行なわれている。本発明は、ディスコデルモライドがインビボで癌細胞の増殖の阻害に有効であることを証明するデータを提供する。加えて、本発明は少なくとも一つの抗新生物剤に耐性であることが証明されている細胞におけるインビボのディスコデルモライドの効果を証明する。下記の試験は、ディスコデルモライドがインビボおよび培養の両方での細胞の処置、および癌細胞が、例えば多剤耐性である；癌細胞がグルタチオンを過剰生産するか、または癌細胞が、細胞に抗新生物剤に対する耐性を付与する１個以上のタンパク質の変異を有するため、少なくとも一つの抗新生物剤に耐性である癌細胞の処置に有用であることを証明する。
【００２０】
したがって、“少なくとも一つの新生物剤に耐性である”なる用語は、本明細書で、例えば、多剤耐性である細胞；グルタチオンを過剰生産する傾向があるため、プラチナまたは他のアルキル化剤に耐性である細胞、および細胞に特定の化学療法剤に対する耐性を付与する１個以上の変異を細胞内に有する細胞を言及するために使用する。例えば、タキサン類に耐性の細胞は、β−チューブリンタンパク質に変異を含むことが示されている。本試験は、１個以上の抗新生物剤が癌細胞の増殖の適切な阻害に失敗した場合のディスコデルモライドの使用を支持する。“耐性”なる用語は、本明細書で、正常細胞対照物（すなわち、同じ起源の増殖制御細胞）が細胞毒性、細胞死または細胞静止（すなわち分裂しない）のいずれかを示す、少なくとも一つの新生物剤の存在下で生存できる細胞の言及に使用する。
【００２１】
“の増殖の阻害”なる用語は、本明細書で使用する限り、細胞、好ましくは癌細胞の増殖潜在能力を限定または減少させる特定の抗新生物剤の能力を言及する。したがって、特定の抗新生物剤は、特定の細胞が分割する速度の減少により細胞の増殖を阻害でき、細胞の静止（すなわち、非分裂状態）をもたらすことができるか、細胞毒性および／またはアポトーシスを含む細胞死を誘導できる。
【００２２】
ディスコデルモライド治療で利益を得ることができる少なくとも一つの抗新生物剤に耐性の癌由来の細胞の例は白血病およびリンパ腫、ならびに大腸、脾臓、前立腺、肝臓、肺および胸のような固体腫瘍を含む。図１はディスコデルモライドが多くの異なるタイプの癌細胞の増殖の阻害に有効であることを説明する表を含む。
【００２３】
一つの態様において、本発明は多剤耐性細胞の増殖の阻害のためのディスコデルモライドの使用に関する。多剤耐性は、１個以上の抗新生物剤に耐性である（すなわち細胞が生存）細胞を言及する、当分野で既知の用語である。“抗新生物剤”なる用語は、本明細書で癌細胞の増殖の阻害に使用でき、哺乳類の癌の処置のための治療に使用する分子の言及のために使用する。細胞は、細胞が１個以上の抗新生物剤に暴露されていなくてさえ、遺伝的変異を介して多剤耐性となり得る。より一般的に、多剤耐性は、１個の抗新生物剤への暴露によるものであり、それをついで１個以上の他の抗新生物剤に耐性である細胞に関して選択する。多剤耐性は、耐性が多くの臨床的に重要な医薬の効力をひどく損なうため、癌化学療法における主要な挑戦である。多剤耐性を誘導することが既知の薬剤は、例えば、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロンのようなアントラサイクリン系、パクリタキセルのようなタキサン類、エトポシドのようなトポイソメラーゼ阻害剤、およびビンブラスチンおよびブンクリスチン、ビノレルビンおよびコルヒチンのようなビンカアルカロイド類を含む。多剤耐性は培養およびインビボの両方で起こる。一般に、多剤耐性表現型を示す細胞系は天然製品に耐性であるが、アルキル化剤および抗代謝剤に感受性を残す。
【００２４】
多剤耐性遺伝子ファミリーは同定されており、ＡＢＣ（ＡＴＰ−結合カセット）スーパーファミリーの一部であると考えられる（Ｂｅｌｌａｍｙ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． １９９６， ３６：１６１−８３によりレビュー）。このメンバーのより共通のメンバーは、記載したタンパク質、Ｐｇｐである、上を見よ。多剤耐性に関与する第２のタンパク質はＭＲＰである。ＭＲＰも多くの天然製品に耐性を付与する。Ｐｇｐと同様、ＭＲＰは急性および慢性白血病および固体腫瘍の患者で上昇する。
【００２５】
少なくとも一つの抗新生物剤に耐性の細胞は、好ましくはディスコデルモライドとインビボで、好ましくは哺乳類中で接触させる。細胞を培養中でディスコデルモライドと接触させることもできる。本発明における好ましい哺乳類はヒトである；しかし、獣医学的適用が本発明の範囲内に更に包含される。
【００２６】
他剤耐性は培養中またはインビボでモニターできる。多剤耐性をモニタリングおよび評価する方法は既知であり、その理由のため本明細書では詳述しない。培養において、１個以上の抗新生物剤の存在下で、正常、分化組織から得たものを含む細胞の適合した、増殖制御培養と比較して、増殖または生存できる細胞を多剤耐性と呼ぶ。
【００２７】
多剤耐性をインビボで評価し、特定の処置レジメに関するまたはその間の多剤耐性を評価することも可能である。例えば、Ｐｇｐタンパク質またはタンパク質の多剤耐性ファミリーに属する他のタンパク質のレベルを評価する免疫細胞化学アッセイは当分野で既知である。これらのアッセイにおいて、正常、増殖制御細胞と比較して、癌細胞におけるタンパク質のレベルを比較することが可能である。多剤耐性をモニターするためのＲＮＡアッセイまたは免疫ブロットが、インシテュハイブリダイゼーション試験およびフローサイトメトリーアッセイを有するとして、文献に記載されている。
【００２８】
多剤耐性細胞におけるインビボでのディスコデルモライドの増殖阻害、そして好ましくは細胞毒性を証明するために、二つの異なるヒト腫瘍異種移植片（ＨＣＴ−１５およびＭＩＰ１０１）を別々に無胸腺ヌードマウスに移植する（下記実施例２参照）。ＮＶＰ　ＸＡＡ２９６−ＮＳは両方の腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の統計的有意（ｐ＜０．０１）な再現性のある阻害をもたらした。ＨＣＴ−１５モデルはパクリタキセルに完全に不応性であり、一方ＭＩＰ１０１モデルは１５ｍｇ／ｋｇ、１日１回、５日間投与したとき、パクリタキセルに耐性である。
【００２９】
１回注射として投与したディスコデルモライドは、両方の異種移植片モデルにおいて全ての試験した用量で、腫瘍増殖の用量依存的、統計的有意（ｐ＜０．０１）阻害を産生する。体重減少により測定した毒性は、ディスコデルモライドの１回注射を投与された生の（非腫瘍担持）無胸腺ヌードマウスが、投与後１週間で４％以上の体重減少がなく、投与後３週間でコントロールレベルに完全に回復したため、腫瘍依存的であるように見える。これらの実験は、パクリタキセルに耐性の二つの腫瘍モデルにおけるディスコデルモライドの抗腫瘍効果を証明する。両方の場合、ディスコデルモライドはアポトーシスを誘導できた。更なる実験において、ディスコデルモライドがＲａｆ−１、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬのリン酸化を促進することが証明された。
【００３０】
本発明の他の態様において、本発明は、細胞に少なくとも一つの抗新生物剤に対する耐性を付与する細胞性タンパク質における変異を有する癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。耐性のこの機構の例は、パクリタキセルのようなタキサン類に対する耐性を細胞に付与する、β−チューブリン変異を有する細胞である。本発明のこの態様において、本発明は少なくとも一つの細胞を増殖阻害量のディスコデルモライドと接触させることを含む。また、癌細胞が増殖阻害されたか否かを測定する方法は当分野で既知である。これらの試験は、長期にわたりモニターする細胞計数技術、フローサイトメトリー等を使用した細胞定量を含む。インビボ、細胞増殖阻害は、長期にわたる腫瘍の負荷の評価により、血液由来細胞においてモニターできる。同様に、腫瘍のその場でのサイズを、転移腫瘍におけるその進行または欠失でできるようにモニターできる。これらの方法の全ては腫瘍学医薬試験の分野の当業者に既知である。
【００３１】
近年公開された臨床試験の結果が、β−チューブリンにおける変異がパクリタキセルに対する固体腫瘍の耐性と関連することを示す（Ｍｏｎｚｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９９９， １７， （６）：１７８６−１７９３）。β−チューブリンタンパク質における１つ以上の変異が記載されている。これらはβ−チューブリンアミノ酸配列内のアラニン３６４および数個のロイシンの変異を含む。本発明は、パクリタキセルに不応性であり、β−チューブリン変異を有する細胞がディスコデルモライド治療に感受性であることを証明する。実施例３は、パクリタキセル耐性卵巣癌細胞系、１Ａ９ＰＴＸ２２および、パクリタキセルに感受性のその親細胞系１Ａ９を使用したディスコデルモライド感受性評価の実験である。これらの試験において、細胞はβ−チューブリン変異の存在に関係無く、ディスコデルモライドに感受性のままである。
【００３２】
少なくとも一つの抗新生物剤に対して癌細胞に耐性を付与するとして記載されている、少なくとも一つのβ−チューブリンタンパク質におけるいくつかの変異がある。天然ヒトβ−チューブリンの二つのアイソタイプのアミノ酸配列は、下記に配列番号１および配列番号２として提供する。
【表１】
2004505890.tif 000004
【００３３】
本発明の更に別の態様において、本発明はシスプラチンおよびそのアナログのようなプラチナ含有（ｐｌａｔｉｎｔｉｎｇ）薬剤に耐性の細胞を処置するためのディスコデルモライドの使用に関する。下記実施例１に記載のものと同一の方法を使用した実験において、卵巣細胞系２００８およびＣ１３を、ディスコデルモライドおよびパクリタキセルに対する感受性に関して試験する。Ｃ１３はパクリタキセルに耐性であり、グルタチオンの過剰生産が明確である。パクリタキセルとディスコデルモライドの比較の実験において、２００８細胞はディスコデルモライドおよびパクリタキセルに対して各々０．０６および０．８のＩＣ５０を有し、一方シスプラチン耐性細胞Ｃ１３は０．０３および１２のＩＣ５０を有する。これらの結果はシスプラチンに耐性のまたはグルタチオン過剰生産の癌細胞の処置のためのディスコデルモライドの利用性を証明する。
【００３４】
“接触させる”なる用語は、本発明で、少なくとも一つの抗新生物剤に耐性である癌細胞とディスコデルモライドを接触させるための任意の適当な送達法の言及に使用する。培養適用において、ディスコデルモライドの溶液を、単に細胞培養培地の薬学的に許容される緩衝液中に添加することが十分である。インビボ適用に関して、ディスコデルモライドは少なくとも一つの抗新生物剤に耐性の癌細胞に、ドラッグ・デリバリーの分野の当業者に既知の任意の適当な方法で送達できる。静脈内送達および腹腔内送達が好ましく、ドラッグ・デリバリーの分野の当業者は、この投与経路を介したドラッグ・デリバリーのための構成設計に精通している。
【００３５】
薬理学的に活性なディスコデルモライドを単独で、または１個以上の薬学的に許容される、好ましくは非経腸投与に適した担体と組み合わせて含む、薬学的に許容される製剤は、当業者に容易に認識されるであろう。このような製剤は適当な賦形剤を含み得る。好ましい送達製剤は、下記の実施例に提供する。このような製剤は、ディスコデルモライドとクレモフォア、プロピレングリコール、プロピレングリコールとＤ５Ｗ、エタノールＤ５Ｗまたは食塩水の組合せを含む。
【００３６】
培養において、使用する有効量は典型的にＩＣ５０濃度である（図１参照）。インビボ急性毒性量は、ＩＣ５０のフラクションで処置し、毒性を評価する臨床試験により測定する。マウスでのディスコデルモライドの有効量は、３週間に１回処置として投与して約（±５ｍｇ／ｋｇ）１５ｍｇ／ｋｇ；ラットで；３週間に１回処置として投与して約（±０．５）３ｍｇ／ｋｇ；およびマーモセットで；３週間に１回処置として投与して約（±０．５）１ｍｇ／ｋｇである。ヒトでの好ましい投与量および投与レジメは、もちろん、臨床試験の分野の当業者が既知の方法を使用した臨床試験により完全となり、特定の癌のタイプで最適化されるであろう；しかし、予期される投与量は好ましくはヒトで約１０ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇおよびより好ましくは約５０ｍｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇのディスコデルモライドである。
【００３７】
本発明の特定の実施態様を詳述するが、当業者には、これらの実施態様が限定でなく説明であることが明白であろう。
【００３８】
実施例１
多剤耐性細胞のインビトロ増殖阻害
化合物溶液の調製
９５％ｖ／ｖエタノール中の１０ｍｇ／ｍｌのディスコデルモライド（天然製品）の貯蔵溶液を調製し、−２０℃で貯蔵する。一定量を直接細胞培養培地で（インビトロアッセイに）またはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ；全インビボ実験に）で希釈する。
【００３９】
細胞および細胞培養条件
以下の細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｗｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）から得る；ヒト大腸癌ＨＣＴ−１５（ＣＣＬ２２５）およびＨＣＴ−１１６（ＣＣＬ２４７）、ヒト肺腺癌Ａ５４９（ＣＣＬ１８５）、ヒト大細胞癌ＮＣＩ−Ｈ４６０（ＨＴＢ１７７）、エストロゲン非依存性肺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＴＢ１７７）、前立腺癌細胞系Ｄｕ１４５（ＨＴＢ８１）。ヒトＫＢ−３１（薬剤感受性）およびＫＢ−８５１１（多剤耐性、Ｐｇｐ１７０過剰発現）類表皮癌細胞をＤｒ． Ｒ． Ｍ． Ｂａｋｅｒ， Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｕｆｆａｌｏ， ＮＹ， ＵＳＡ）から得、先に記載されている（Ａｋｉｙａｍ Ｓ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９８５；１１：１１７−１２６およびＦｏｊｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７；４５：３００２−３００７）。ヒト転移性前立腺癌ＰＣ−３ＭはＤｒ． Ｉ． Ｊ． Ｆｉｄｌｅｒ（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ， ＵＳＡ）から得る。エストロゲン依存性ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７／ＡＤＲ（多剤耐性）は、ＭＣＦ−７細胞系（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ２２）のサブラインであり、Ｄｒ． Ｄ． Ｆａｂｂｒｏ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得、先に記載されている（Ｂｏｌｂｅ ＧＣ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９３；２６８：６５８−６６４）。
【００４０】
抗増殖アッセイ
抗増殖アッセイのために、細胞を１．５×１０３／ウェルでマイクロタイタープレートに蒔き、一晩インキュベートする。化合物を１日目に連続希釈で添加する。プレートをついで更に５日間インキュベートする。これは、コントロール培養が少なくとも３細胞分裂をすることを可能にする。インキュベーション後、細胞を３．３％ｖ／ｖグルタールアルデヒドで固定し、水で洗浄し、０．０５％ｗ／ｖメチレンブルーで染色する。洗浄後、色素を３％ｖ／ｖ　ＨＣｌで溶出させ、光学密度を６６５ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０（Ｂｕｃｈｅｒｅｒ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定する。ＩＣ５０をコンピューター化システム（ＳｏｆｔＰｒｏ， Ｂｕｃｈｅｒｅｒ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、式（ＯＤ試験−ＯＤ開始）／（ＯＤコントロール−ＯＤ開始）×１００を使用して測定する。ＩＣ５０は、インキュベーション時間の最後に、コントロール培養（１００％）と比較して、ウェル当たり５０％の細胞を導く薬剤濃度として定義する。
【００４１】
材料
天然ディスコデルモライド（サンプル１）をＨａｒｂｏｒ Ｂｒａｎｃｈ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（Ｆｔ． Ｐｉｅｒｃｅ， ＦＬ， ＵＳＡ）から得る。合成ディスコデルモライドを、例えば、その内容を出典明示により本明細書に包含させるＳｍｉｔｈ ＡＢ、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０４８６５の方法を含む、文献に記載の多くの方法を使用して製造する。パクリタキセルはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）から得る。細胞培養物質はＩｎｔｅｇｒａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｌｌｉｓｅｌｌｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得る。ＨＰＬＣに関して、溶媒はＭｅｒｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のＨＰＬＣ勾配グレードである。液体培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および培地添加物はＧｉｂｃｏ／ＢＲＳ（Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からである。
【００４２】
結果
抗増殖アッセイ
ディスコデルモライドの抗増殖アッセイを、ヒト腫瘍系のパネルに対して測定する。表１に示すように、化合物は、薬剤感受性細胞に関してインビトロで低ナノモル範囲（〜２−２４ｎＭ）のＩＣ５０で強力な抗増殖活性を示す。パクリタキセルは強力な細胞毒性剤であるが、ＨＣＴ−１５大腸細胞に対してはディスコデルモライドよりも活性が低い（各々〜１２０対〜８ｎＭ　ＩＣ５０）。Ｐｇｐ１７０−過剰発現、多剤耐性ＫＢ−８５１１およびＭＣＦ−７／ＡＤＲ系において、パクリタキセルの活性の損失はディスコデルモライドで示されるよりも数倍高かった。
【００４３】
考察
ディスコデルモライドは、Ｐｇｐ１７０、プロテインキナーゼ−ＣおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの過剰発現のために多剤耐性であるＭＣＦ−７／ＡＤＲ細胞に対してパクリタキセルよりも強力である。
【００４４】
実施例２
多剤耐性細胞のインビボ増殖阻害
細胞系および組織培養
動物試験で使用する全細胞系は、マイコプラズマ汚染（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡによるＲａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）およびウィルス汚染（ＭＡ ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤによるＭＡＰ試験）がない。ＨＣＴ−１５ヒト大腸腫瘍細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２５から購入する。ＭＩＰ１０１ヒト大腸腫瘍細胞系はＤｒ． Ｒ． Ｋｒａｍｅｒ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）から得、先に記載されている（Ｎｉｌｅｓ ＲＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ． １９８７；５（６）：５４５−５２）。これらの細胞はＰｇｐ−１（ヒトＰｇｐ）過剰発現体であり、細胞をパクリタキセル耐性とする。全細胞系を１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させ、拡張させる。移植のための細胞増殖をＴ２２５組織培養フラスコで行なう。細胞を７０−９０％コンフルエンシーで回収し、１回１０％ＦＢＳ含有ＨＢＳＳで洗浄し、そのままのＨＢＳＳに懸濁する。
【００４５】
動物および腫瘍移植
異系交配無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）雌マウス（“Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ−ｎｕ”ｆｒｏｍ Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）をＭｅｔｏｆａｎｅ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｉｎｃ．， Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ， ＩＬ）で麻酔する。１×１０６細胞を含む細胞懸濁液（１００μＬ）を次いで各動物の右腋窩（側面）領域にｓｃ注射する。腫瘍を約１００ｍｍ３の体積が達成されるまで増殖させる。この時点で、腫瘍担持マウスを試験のために８つの群に分類する。分類工程は、腫瘍サイズの平均および範囲に関してバランスが取れたグループを作るようにする。
【００４６】
医薬および製剤
ディスコデルモライドは、海綿動物Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔａから、Ｇｕｎａｓｅｋｅｒａ ＳＰ， ｅｔ ａｌ．前掲の方法を使用して単離する。類似の純度の複数のバッチ（質量分析、および核磁気共鳴分析により測定して、全＞９５％純粋）を、種々の試験を通して使用する。固体ディスコデルモライドを純粋エタノールに溶解し、貯蔵溶液を作り、それを使用直前にクレモフォアＥＬ（Ｃｒｍ）およびＤ５Ｗで最終濃度１６．７％クレモフォアＥＬ、８．３％エタノールおよび７５％Ｄ５Ｗの濃度に希釈する。化合物を静脈内（ｉｖ）投与する。最初の試験において、ディスコデルモライドを５つの異なる投与スケジュールで両方の腫瘍に対して試験する：（ｉ）実験の１日目に２回１５ｍｇ／ｋｇ注射として３０ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｉ）１日目、２日目および３日目に３回１０ｍｇ／ｋｇ注射として３０ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｉｉ）１日目に１回注射として１５ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｖ）１日目に１５ｍｇ／ｋｇ注射、続いて１１日目に５ｍｇ／ｋｇ注射として２０ｍｇ／ｋｇ投与、および１日目に７．５ｍｇ／ｋｇ注射、続いて１１日目に２．５ｍｇ／ｋｇ注射として１０ｍｇ／ｋｇ投与。第２の試験において、ディスコデルモライドを実験の最初の日に１回注射として２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ注射する。加えて、１日目の７．５ｍｇ／ｋｇの注射、続く１１日目の２．５ｍｇ／ｋｇの注射を最初の試験から繰り返す。具体的なモデルに使用する実際の投与量、レジメおよび経路は、別々に各セクションで記載する。陽性コントロール動物は、Ｄ５Ｗで４倍希釈したパクリタキセルの臨床製剤（タキソール）を投与し、連続５日間、１日１回ｉｖで投与する。パクリタキセルのための媒体コントロールをパクリタキセルのスケジュールにしたがって投与する。最初の試験において、ディスコデルモライドのための媒体コントロール（１６．７％クレモフォアＥＬ、８．３％エタノールおよび７５％Ｄ５Ｗ）を１、２および３日目の３回の注射または１および１１日目の２回注射として投与する。第２の試験において、ディスコデルモライドのための媒体コントロールを１回注射で１日目に投与する。
【００４７】
腫瘍を測定し、個々の動物体重を１週間に１回記録する。標準実験を最初の投与から３週間全部行なう。
【００４８】
非腫瘍担持動物におけるディスコデルモライドの毒性を評価するために、８匹の生のヌードマウスの４つのグループに、化合物を、ｉｖで１回投与する（５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇ）。コントロールグループに媒体単独を投与する（１６．７％クレモフォアＥＬ、８．３％エタノールおよび７５％Ｄ５Ｗ）。体重を週１回記録する。
【００４９】
結果の計算
抗腫瘍活性をＴ／Ｃ％として示す（Δ処置グループ対媒体コントロールグループの腫瘍体積の比較）。回帰は、式：（１−Ｔ／Ｔ０）×１００％（式中、Ｔは実験の終了時の腫瘍体積およびＴ０は実験の開始時の腫瘍体積である）を使用して計算する。
【００５０】
この結果の統計的有意は、我々の代表的実験の分析に続く片側ステューデントｔ検定を使用して、一律に評価する。
【００５１】
結果
Ａ．皮下ＨＣＴ−１５大腸腫瘍モデル
結果を、ディスコデルモライドを：（ｉ）実験の１日目に２回１５ｍｇ／ｋｇ注射として３０ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｉ）１日目、２日目および３日目に３回１０ｍｇ／ｋｇ注射として３０ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｉｉ）１日目に１回注射として１５ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｖ）１日目に１５ｍｇ／ｋｇ注射、続いて１１日目に５ｍｇ／ｋｇ注射として２０ｍｇ／ｋｇ投与、および１日目に７．５ｍｇ／ｋｇ注射、続いて１１日目に２．５ｍｇ／ｋｇ注射として１０ｍｇ／ｋｇ投与で投与して、ＨＣＴ−１５大腸腫瘍における第１実験に関して、測定する。３０ｍｇ／ｋｇのディスコデルモライド投与を、１、２および３日目に１０ｍｇ／ｋｇ注射することにより投与された全動物は、実験の第３週目の始めまでに過剰な体重減少のために殺す。１日目に１５ｍｇ／ｋｇ注射、続く１１日目に５ｍｇ／ｋｇ注射により２０ｍｇ／ｋｇを投与されたグループの４匹の動物は、実験の第２週目に死ぬ。このグループの残りの４匹の動物は、過剰な体重減少のために殺す。１日目に１５ｍｇ／ｋｇ注射によりディスコデルモライドを投与した動物は、４３％Ｔ／Ｃを、１８．９％の体重減少と共に示す。１日目に２回１５ｍｇ／ｋｇ注射（合計用量３０ｍｇ／ｋｇ）は、２２％Ｔ／Ｃ、および２４．６％体重減少をもたらす。１日目に７．５ｍｇ／ｋｇ注射、続く１１日目に２．５ｍｇ／ｋｇ注射として１０ｍｇ／ｋｇの化合物の投与は、３１％Ｔ／Ｃと１７．３％体重減少をもたらす。全抗腫瘍効果は統計的有意である（ｐ＜０．０１）。最初の５日間に毎日１５ｍｇ／ｋｇ投与したパクリタキセルは、本実験で不活性である（９５％Ｔ／Ｃ）。第２試験において、ディスコデルモライドを実験の最初の日に１回注射として２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ注射する。加えて、１日目の７．５ｍｇ／ｋｇの注射、続く１１日目の２．５ｍｇ／ｋｇの注射を最初の試験から繰り返す。１日目の７．５ｍｇ／ｋｇ注射、続く１１日目の２．５ｍｇ／ｋｇ注射として１０ｍｇ／ｋｇで投与したディスコデルモライドは、２９％Ｔ／Ｃと１１．４％体重減少をもたらす。実験の１日目の１回注射としての２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇディスコデルモライドは、各々６２％Ｔ／Ｃ、４４％Ｔ／Ｃ、４３％Ｔ／Ｃ、４０％Ｔ／Ｃ、２８％Ｔ／Ｃおよび２７％Ｔ／Ｃをもたらす。対応する体重減少は３．５％（増加）、−１．９％、−７．９％、−８．５％、−１２．９％および−１１．０％である。全抗腫瘍効果は統計的有意である（ｐ＜０．０１）。第２の試験において、パクリタキセルは不活性である（９４％Ｔ／Ｃ）。第２試験の投与応答の反復において、第２実験で得られたのと類似の結果を得る。実験の１日目の１回注射としての２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇディスコデルモライドは、各々５４％Ｔ／Ｃ、４３％Ｔ／Ｃ、２３％Ｔ／Ｃ、２７％Ｔ／Ｃ、２５％Ｔ／Ｃおよび１９％Ｔ／Ｃをもたらす。対応する体重減少は１．７％（増加）、−８．９％、−２３．３％、−１７．６％、−２０．１％および−１３．４％である。全抗腫瘍効果は統計的有意である（ｐ＜０．０１）。第２の試験において、パクリタキセルは不活性である（８１％Ｔ／Ｃ）。ＨＣＴ１５異種移植片モデルおよび対応する平均体重の結果は、図２に示す。
【００５２】
Ｂ．皮下ＭＩＰ１０１大腸腫瘍モデル
第１実験のＭＩＰ１０１大腸腫瘍におけるディスコデルモライドの結果は、（ｉ）実験の１日目に２回１５ｍｇ／ｋｇ注射として３０ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｉ）１日目、２日目および３日目に３回１０ｍｇ／ｋｇ注射として３０ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｉｉ）１日目に１回注射として１５ｍｇ／ｋｇ投与、（ｉｖ）１日目に１５ｍｇ／ｋｇ注射、続いて１１日目に５ｍｇ／ｋｇ注射として２０ｍｇ／ｋｇ投与、および１日目に７．５ｍｇ／ｋｇ注射、続いて１１日目に２．５ｍｇ／ｋｇ注射として１０ｍｇ／ｋｇ投与を投与されたマウス由来のデータ点から測定する。３０ｍｇ／ｋｇのディスコデルモライド投与を、１、２および３日目に１０ｍｇ／ｋｇ注射することにより投与された全動物は、実験の５日目までに死ぬ。１日目に１５ｍｇ／ｋｇ注射、続く１１日目に５ｍｇ／ｋｇ注射により２０ｍｇ／ｋｇを投与されたグループの４匹の動物は、実験の第３週目の始めに、過剰な体重減少のために殺す。１日目に１５ｍｇ／ｋｇ注射によりディスコデルモライドを投与した動物は、３６％Ｔ／Ｃを、１８．９％の体重減少と共に示す。１日目に２回１５ｍｇ／ｋｇ注射（合計用量３０ｍｇ／ｋｇ）は、２４％Ｔ／Ｃ、および２３．％体重減少をもたらす。１日目に７．５ｍｇ／ｋｇ注射、続く１１日目に２．５ｍｇ／ｋｇ注射として１０ｍｇ／ｋｇの化合物の投与は、３８％Ｔ／Ｃと２１．３％体重減少をもたらす。全抗腫瘍効果は統計的有意である（ｐ＜０．０１）。最初の５日間に毎日１５ｍｇ／ｋｇ投与したパクリタキセルは、本実験で不活性である（８２％Ｔ／Ｃ）。第２試験において、ディスコデルモライドを実験の最初の日に１回注射として２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ注射する。加えて、１日目の７．５ｍｇ／ｋｇの注射、続く１１日目の２．５ｍｇ／ｋｇの注射を最初の試験から繰り返す。結果は図２にグラフとして示す。１日目の７．５ｍｇ／ｋｇ注射、続く１１日目の２．５ｍｇ／ｋｇ注射として１０ｍｇ／ｋｇで投与したディスコデルモライドは、３５％Ｔ／Ｃと１１．４％体重減少をもたらす。このグループの１匹の動物が、明らかな薬剤毒性のために死ぬ。実験の１日目の１回注射としての２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇディスコデルモライドは、各々５９％Ｔ／Ｃ、５７％Ｔ／Ｃ、４６％Ｔ／Ｃ、３７％Ｔ／Ｃ、２２％Ｔ／Ｃおよび１８％Ｔ／Ｃをもたらす。対応する体重減少は７．９％、１０．２％、１３．２％、１８．７％、１５．５％および１１．７％である。全抗腫瘍効果は統計的有意である（ｐ＜０．０１）。第２の試験において、パクリタキセルは統計的有意な腫瘍増殖の阻害を示す（５４％Ｔ／Ｃ、ｐ＜０．０１）。結果は、図３に要約する。
【００５３】
Ｃ．非腫瘍担持動物におけるディスコデルモライドの毒性
生の動物に実験の１回注射として５、７．５、１０または１５ｍｇ／ｋｇのディスコデルモライドを投与する。投与１週間後、動物は以下の体重変化を示す：各々＋８．７％、＋１２．２％、−１．２％および−４．１％。投与２週かｎの知、対応する体重変化は＋９．４％、＋３．２％、＋１．２％および−０．４％である。３週間後、全動物は下記の通り体重が増加する：＋９．４％、＋７．７％、＋５．６％および＋５．９％。媒体単独を投与された動物は、実験の各週で以下の体重変化を示す：＋５．５％、＋４．７％および＋５．９％。１回ｉｖ投与後、化合物は極小のそして一過性の体重減少のみをもたらし、また１０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇのみである。
【００５４】
Ｄ．考察
両方の大腸癌モデル、ＨＣＴ−１５およびＭＩＰ１０１において、１回注射で投与されたディスコデルモライドは、用量依存的、統計的有意な腫瘍増殖阻害を、２．５ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇの間の全投与量で示す。ＨＣＴ−１５モデルはパクリタキセルでの処置に完全に不応性であり、一方ＭＩＰ１０１モデルは最初の試験では応答を示さないが（８２％Ｔ／Ｃ）、第２の試験において、パクリタキセルは穏やかな、しかし統計的有意な腫瘍増殖の阻害を示す（５４％Ｔ／Ｃ、Ｐ＜０．０１）。
【００５５】
両方の腫瘍モデルに関して、最初の試験の２回の投与スケジュールのみを第２の試験で繰り返す；反復スケジュールは二つの実験の間で良好な再現性を証明する。ＨＣＴ−１５モデルにおいて、ディスコデルモライドの１回１５ｍｇ／ｋｇ注射は差塩ｙの試験で４３％Ｔ／Ｃを、および第２の試験で２７％Ｔ／Ｃ％となる。１日目の７．５ｍｇ／ｋｇ、続く１１日目の２．５ｍｇ／ｋｇの２回注射としての合計量１０ｍｇ／ｋｇ投与は、最初の試験で３１％Ｔ／Ｃを、および再試験で２９％Ｔ／Ｃをもたらす。ＭＩＰ１０１モデルにおいて、本化合物の１回１５ｍｇ／ｋｇ注射は、最初の実験で３６％Ｔ／Ｃを、および再試験で１８％Ｔ／Ｃをもたらす。１日目に７．５ｍｇ／ｋｇ、続く１１日目の２．５ｍｇ／ｋｇの２回注射としての合計量１０ｍｇ／ｋｇのディスコデルモライドは、最初の試験で３８％Ｔ／Ｃを、および再試験で３５％Ｔ／Ｃとなる。
【００５６】
ＨＣＴ−１５モデルにおいて、用呂油依存的試験を第３の実験で繰り返す。ディスコデルモライドの抗腫瘍効果は、２．５ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇの間の全投与量で良好な再現性を証明する（２．５ｍｇ／ｋｇで６２％Ｔ／Ｃおよび５４％Ｔ／Ｃ、５ｍｇ／ｋｇで４４％Ｔ／Ｃおよび４３％Ｔ／Ｃ、７．５ｍｇ／ｋｇで４３％Ｔ／Ｃおよび２３％Ｔ／Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇで４０％Ｔ／Ｃおよび２７％Ｔ／Ｃ、１２．５ｍｇ／ｋｇで２８％Ｔ／Ｃおよび２５％Ｔ／Ｃ、１５ｍｇ／ｋｇで２７％Ｔ／Ｃおよび１９％Ｔ／Ｃ）。投与応答試験の反復において、体重減少はより高く、最初の試験の１３％と比較して２３％に到達する。
【００５７】
結論として、ディスコデルモライドは、ヌードマウス中の異種移植片としての二つの既知の多剤耐性腫瘍系において用量依存的抗腫瘍効果を示す。
【００５８】
実施例３
β−チューブリン変異を有するパクリタキセル耐性細胞に対するディスコデルモライドのインビトロおよびインビボ抗腫瘍効果
細胞系および組織培養
全細胞系はマイコプラズマ汚染（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡによるＲａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）がない。ＬＳ１７４Ｔヒト大腸腫瘍細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから購入する。１Ａ９および１Ａ９ＰＴＸ２２卵巣腫瘍細胞系は、Ｄｒ． Ｔ． Ｆｏｊｏ， Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｂｒａｎｃｈ， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９２から得る。１Ａ９は卵巣癌細胞系Ａ２７８０のクローンである（Ｅｖａ Ａ， ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ １９８２， ２９５：１１６−１１９）。１Ａ９ＰＴＸＸ２２サブラインは独立したクローンとして、５μｇ／ｍＬベラパミルの存在下５ｎｇ／ｍＬパクリタキセルに曝すことによる１段階で１Ａ９歳傍系から単離する。１Ａ９ＰＴＸＸ２２歳傍系は、親１Ａ０よりも２４倍パクリタキセルに耐性であることが判明しているＧｉａｎｎａｋａｋｏｕ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７， ２７２（４）：１７１１８−１７１２５）。パクリタキセルに対する耐性は無薬剤培地での２年間の培養の後も維持され、１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞系で見られるβ−チューブリンにおけるＡｌａ３６４→Ｔｈｒ変異によるものである。全細胞系を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有制御、加湿雰囲気）中で繁殖および増殖させる。細胞増殖をＴ７５組織培養フラスコ（ＣＯＳＴＡＲ， Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＮＹ）で行なう。ホロー・ファイバー調製のために、細胞を７０−９０％コンフルエンシーで０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して回収する（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）。
【００５９】
インビトロ細胞毒性アッセイ
１Ａ９および１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞を９６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、組織培養インキュベーターに置き、一晩接着させる。翌朝、“０時間”プレートにおける生存細胞数（各細胞系で３ウェル）をＭＴＴアッセイを使用して測定する（Ａｌｌｅｙ ＭＣ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９８８， ４８：５８９−６０１）。
【００６０】
同時に薬剤を連続、１０倍希釈で実験プレートに添加する。対応する媒体をコントロールプレートに添加する。実験およびコントロールプレートをついで組織培養インキュベーターで７２時間培養する。インキュベーション後、生存細胞の数をＭＴＴアッセイを使用して各プレートで測定する。ＩＣ５０（細胞増殖の５０％阻害をもたらす所定の化合物の濃度）を、医薬処理プレートにおける細胞増殖（Ｔ−Ｔ０）と対応するコントロールプレートの細胞増殖（Ｃ−Ｔ０）の比較により測定する。各実験に関して、結果は２組のプレートの平均数を使用して計算する。
【００６１】
ホロー・ファイバーの調製
ＰＶＤＦホロー・ファイバー（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ， Ｇａｒｄｅｎａ， ＣＡ）を使用前に７０％ＥｔＯＨに７２時間浸す。この段階の後、ファイバーの全取り扱いを無菌法を使用した生物学的層流フード下で行なう。個々のファイバーを３ｍＬの氷冷組織培養培地で、２０ゲージ針を備えたシリンジを使用して洗い流す。次に、各ファイバーに適当な細胞懸濁液を充填し（１×１０６細胞／ｍＬの１Ａ９および１Ａ９ＰＴＸ２２細胞およびＬＳ　１７４Ｔ細胞に関しては０．５×１０６細胞／ｍＬ）、ファイバーの両端をホット・フラット・ニードル・ホルダーで密封する。ファイバーの全長を、各々約１５μＬの適当な細胞懸濁液を含む１．５ｃｍマイクロカプセル（更に“ホロー・ファイバー”と呼ぶ）に密封する。分離後、個々のホロー・ファイバーを６ウェルプレート（５ｍＬ培地中６ファイバー／ウェル）に入れ、一晩３７℃で組織培養インキュベーター中でインキュベートする。
【００６２】
ホロー・ファイバーの移植
異系交配無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）雌マウス（“Ｃｈｒｌ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ−ｎｕ”， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）をケタミン／キシラジン（各々１５０ｍｇ／ｋｇおよび１２ｍｇ／ｋｇ体重）のｉｐ注射により麻酔する。皮下移植のために、１個または２個のホロー・ファイバーを含む１１ゲージ套管針を動物の首の首筋に鋏で切った切開部に挿入し、ファイバーを套管針を収縮させながらプランジャーを押して放出させる。この工程を３つのホロー・ファイバーをインプラントするまで繰り返す。一つの創傷クリップを皮膚切開部を閉じるために使用する。手術後、各動物にｍｇ／ｋｇブトルフェノールの１回の皮下注射を投与し、任意の可能性のある疼痛を軽減させる。動物をケージに戻す前に加温パッド上で麻酔から回復させる。
【００６３】
インビボホロー・ファイバーアッセイ
移植１日後（３ホロー・ファイバー動物、各ホロー・ファイバーは１つの細Ｔ、胞系を含む：ＬＳ　Ａおよび１ＡＰＴＸ２２）動物を無作為に５グループの６匹マウス／グループに分類する。最初のグループは殺す；ホロー・ファイバーを取りだし、文献方法に従い（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ ＭＧ， ｅｔ ａｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９５， ５７（２）：１３１−１４１）処理して各ファイバーの生存細胞の数を測定する（Ｔ０）。
【００６４】
残りのグループは下記のように処理する：
グループ１：ディスコデルモライド、１５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ、１回
グループ２：ディスコデルモライドの媒体（１６．７％Ｃｒｅｍ． ＥＬ、８．３％エタノールおよび７５％Ｄ５Ｗ）、ｉｖ、１回
グループ３：パクリタキセル、１５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ、毎日５日間
グループ４：パクリタキセルの媒体（１２．５％クレモフォアＥＬ、１２．５％エタノールおよび７５％Ｄ５Ｗ）、ｉｖ、毎日５日間
【００６５】
６日目に全動物を殺し、ホロー・ファイバーを回収し、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ， ＭＧ（前掲）の方法にしたがって処理し、各ファイバーにおける生存細胞の数を測定する（Ｔ−実験化合物で処理した動物由来のファイバー、Ｃ−対応する媒体で処置した動物由来のファイバー）。抗腫瘍活性を％平均ΔＴ／平均ΔＣ［処置群対媒体コントロール群の比較、ここで％平均ΔＴ／平均ΔＣ＝（平均Ｔ−平均Ｔ０／平均Ｃ−平均Ｔ０）］×１００％。この結果の統計的有意は、両側ステューデントｔ検定を使用して、一律に評価する。
【００６６】
実験化合物および製剤
ディスコデルモライドは、海綿動物Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ ｄｉｓｓｏｌｕｔａから、Ｇｕｎａｓｅｋｅｒａ ＳＰ， ｅｔ ａｌ．前掲の方法を使用して単離する。類似の純度の複数のバッチ（質量分析、および核磁気共鳴分析により測定して、全＞９５％純粋）を、種々の試験を通して使用する。インビトロ細胞毒性アッセイのために、全化合物をＤＭＳＯに溶解し、細胞を含むプレートに添加し、所望の濃度を得る。細胞培養におけるＤＭＳＯの量は０．１％ｖ／ｖを超えない。パクリタキセルはＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入する。インビボホロー・ファイバーアッセイのために、固体ディスコデルモライドを純粋エタノールに溶解し、貯蔵溶液を作り、それを使用直前にクレモフォアＥＬ（Ｃｒｍ）およびＤ５Ｗで最終濃度１６．７％クレモフォアＥＬ、８．３％エタノールおよび７５％Ｄ５Ｗの濃度に希釈する。化合物をマウスに１回、１５ｍｇ／ｋｇ　ｉｖ注射として投与する。陽性コントロール動物にＤ５Ｗで４倍希釈したパクリタキセルの臨床製剤（タキソール）（１２．５％クレモフォアＥＬ、１２．５％エタノールおよび７５％Ｄ５Ｗ最終濃度）の製剤を投与し、連続５日間、１日１回ｉｖで投与する。媒体コントロールを対応する医薬スケジュールに従い投与する。
【００６７】
結果
インビトロ細胞毒性
最初の実験の結果を図５に要約するが、しかし、全実験をデュプリケートで行なう。１Ａ９細胞系において、パクリタキセルおよびディスコデルモライドのＩＣ５０は各々０．８ｎｇ／ｍｌ、および６ｎｇ／ｍｌである。パクリタキセル耐性１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞系において、対応するＩＣ５０は：１５ｎｇ／ｍｌおよび３ｎｇ／ｍｌである。１Ａ細胞系において、パクリタキセルおよびディスコデルモライドのＩＣ５０は各々０．４ｎｇ／ｍｌおよび３ｎｇ／ｍｌである。パクリタキセル耐性１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞系において、対応するＩＣ５０は９ｎｇ／ｍｌおよび３ｎｇ／ｍｌである。
【００６８】
インビボホローファイバーアッセイ
ホローファイバーにおけるヌードマウスに皮下的に移植した３つのヒト固体腫瘍細胞系に対するパクリタキセルおよびディスコデルモライドの抗腫瘍アッセイの結果は、図４に要約する。ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１日１回、連続５日で投与したパクリタキセルは、３３％、−８％、および７９％のＴ／Ｃを各々ＬＳ　１７４Ｔ、１Ａ９および１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞系で作る。ディスコデルモライドは、１回、１５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ注射として投与し、各細胞系で７％、８％および−１３％Ｔ／Ｃを作る。ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１日１回、連続５日で投与したパクリタキセルは、８％、２％、および９０％のＴ／Ｃを各々ＬＳ　１７４Ｔ、１Ａ９および１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞系で作る。ディスコデルモライドは、１回、１５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ注射として投与し、各細胞系で１３％、１４％および１３％Ｔ／Ｃを作る。両方の実験において、パクリタキセルを投与された動物は体重の５％を失い、ディスコデルモライドを投与された動物は体重の１０％を失う。
【００６９】
考察
１Ａ９ＰＴＸ２２細胞系は、パクリタキセルに曝すことにより、卵巣癌細胞系Ａ２７８０の１Ａ９クローン（Ｅｖａ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９８２， ２９５：１１６−１１９）由来であった（Ｇｉｎｎａｋａｋｏｕ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７， ２７２（４）：１７１１８−１７１２５）。１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞系は、１Ａ９と比較してインビトロでパクリタキセルに２４倍の耐性を示す。このレベルの耐性は無薬剤培地での２年間の培養の後も維持される。１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞系は、β−チューブリンにおけるＡｌａ３６４→Ｔｈｒ変異を有することが示され、パクリタキセルは１Ａ９ＰＴＸ２２細胞系から調製される変異チューブリンの重合化を誘導しない（Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ Ｐ．， 前掲）。これらのデータを一緒にして、変異β−チューブリンはパクリタキセルへの耐性を担うようである。
【００７０】
ここで、我々は、パクリタキセルと同様に、チューブリン重合化の安定化により細胞毒性を作用する天然産物でるディスコデルモライドに対する１Ａ９および１Ａ９ＰＴＸＸ２２細胞系インビトロおよびインビボ感受性を試験する。２つの別々のインビトロ細胞増殖阻害実験において、１Ａ９および１Ａ９ＰＴＸ２２細胞系の療養は、ディスコデルモライドに類似の感受性を示す（１Ａ９に関してＩＣ５０は６ｎｇ／ｍＬおよび３ｎｇ／ｍＬ、および１Ａ９ＰＴＸ２２に関してＩＣ５０は両方の実験で３ｎｇ／ｍＬである）。対照的に、１Ａ９ＰＴＸ２２細胞系は、親１Ａ９細胞よりもパクリタキセルに対して２０倍耐性である（１Ａ９細胞に関してＩＣ５０は０．８ｎｇ／ｍＬおよび０．４ｎｇ／ｍＬ、および１Ａ９ＰＴＸ２２細胞に関して、ＩＣ５０は１５ｎｇ／ｍＬおよび９ｎｇ／ｍＬ）。機構的に無関係な細胞毒性コントロールとして使用したドキソルビシンは、１Ａ９細胞に関して３ｎｇ／ｍＬの、および１Ａ９ＰＴＸ２２細胞に関して３−５ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を作り、後者が親１Ａ９細胞系と比較してこの化合物にわずかに（２倍）感受性が低いのみであることを示す。パクリタキセル耐性１Ａ９ＰＴＸ２２細胞系のディスコデルモライドに対するインビトロ感受性がどのようにインビボ応答に翻訳されるかを測定するために、化合物をホロー・ファイバーアッセイで試験する。第３の細胞系、大腸癌ＬＳ　１７４Ｔを更なる陽性コントロールとして使用する。ディスコデルモライドおよびパクリタキセルの両方をｉｖで、最適濃度で、実施例２に記載の投与スケジュールで投与する。ディスコデルモライドを１回、１５ｍｇ／ｋｇで、パクリタキセルを１日１回、５日間、１５ｍｇ／ｋｇで投与する。１Ａ９ＰＴＸ２２細胞系はディスコデルモライドでの処置に感受性であるが（最初の試験で１３％抑制、および再試験で１３％Ｔ／Ｃ、両方ｐ＜０．０１）、完全にパクリタキセルに不応性である（最初の試験で７９％Ｔ／Ｃおよび再試験で９０％Ｔ／Ｃ、両方ｐ＞０．０５）。ＬＳ　１７４Ｔ細胞系は両方の化合物に同等に感受性である。これらの結果はディスコデルモライドがチューブリンの変異のために耐性である腫瘍に対して有効な治療を提供できることを示す。
【００７１】
実施例４
ディスコデルモライドはＲａｆ−１リン酸化を誘導
細胞培養条件
本試験に使用するヒト非小細胞肺癌Ａ５４９、およびヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＣＴＴ， Ｒｏｃｋｗｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）から得る。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、および１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）が乳ＭＥＭに維持する。Ａ５４９細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に維持する。本試験で使用するヒト卵巣癌細胞系Ａ２７８０の一細胞クローンである１Ａ９およびパクリタキセル耐性サブラインＰＴＸ２２をＭ． Ｗａｒｔｍａｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）から得る。１Ａ９細胞およびＰＴＸ２２細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に維持する。ＰＴＸＸ２２維持培地はまた１５ｎｇ／ｍＬパクリタキセルおよび５μｇ／ｍＬベラパミルを含む。薬剤を実験に使用する５−７日前に培地から除去する。全維持培地は１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む。
【００７２】
抗増殖アッセイ：
細胞系をトリプシン処理し、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターで計数する。細胞を９６ウェルプレート（１９０μＬ／ウェル）に以下の密度でプレーティングした：Ａ５４９に関して１，０００細胞／ウェルおよびＭＤＡ−ＭＢ−４３５に関して３，０００細胞／ウェル。細胞数は、回収時に７５−９０％コンフルエンスの細胞密度をもたらす。プレートに０日目に蒔く。１日目に試験化合物を最終容量１０μＬ培地のウェルにトリプリケートで添加する。各細胞系の最初の細胞密度を１日目に１０μＬ　ＭＴＳ混合物（下記参照）を添加し、４時間インキュベートし、４９０ｎｍ（Ａ４９０）を測定することにより測定する。試験化合物添加２または３日後、１０μＬ／ウェルのＭＴＳ混合物を試験プレートに添加し、Ａ４９０を４時間後に読んだ。細胞含有ウェルに関するＡ４９０値を培地吸光度に対して補正し、ついで正味の増殖を測定するための開始時密度で標準化する。正味の増殖の割合を（Ａ４９０＋薬剤−Ａ４９０開始時）／（Ａ４９０−薬剤−Ａ４９０開始時）として計算する。化合物濃度の関数としての傷陰の増殖の割合のグラフを使用して５０％増殖阻害（ＩＣ５０）をもたらす濃度を計算する。ＭＴＳ混合物を、新たに細胞プレートに、フェナジンメタンスルホネート（ＰＭＳ）の１０μＬの０．９２ｍｇ／ｍＬ溶液対ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩）の１９０μＬの２ｍｇ／ｍＬ溶液の比率で添加の日に調製する。ＰＭＳおよびＭＴＳ溶液を、０．２ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、８．０ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、１．１５ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１３３ｍｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ／Ｌ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（ｐＨ＝７．３５）を含む緩衝化食塩水に調製し、ホイルに包んで−２０℃で貯蔵する。試験化合物をＤＭＳＯ中の貯蔵溶液としてと油性する。試験化合物希釈を２％ＤＭＳＯ／細胞維持培地に作り、アッセイプレートで希釈して全ウェル中最終０．１％ＤＭＳＯとする。
【００７３】
ウェスタンブロット：
細胞を１．５×１０６細胞／１００ｍｍプレートの密度でプレーティングする。翌日、細胞を媒体コントロール（０．１％ＤＭＳＯ）または試験化合物で２４時間処理する。臍傍を単層を２回ＰＢＳで洗浄し、ついで３００μｌの融解緩衝液［２０ｍＭ　トリス（ｐＨ８．０）、２ｎＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、０．０１２５％ＤＯＣ、２．５％グリセロール、１ｍＭバナデート、２５ｍＭフッ化ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（１：５００希釈、Ｓｉｇｍａ）］に融解する。融解物を１２，０００×ｇで回転させ、上清を新試験管に移した。融解物のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定する。サンプル（７５μｇ）を、Ｒａｆ−１およびＢｃｌ−ｘＬに関して各々７．５％または１４％トリス−グリシンゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、ニトロセルロースに移す。免疫検出を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｖｉｓｔｒａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇキット指示書に記載のように、以下の修飾を伴い行なう：膜を２０ｍＭ　トリス・ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４、１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび０．２％トゥイン２０（ＴＢＳＴ）含有緩衝液注で５％牛乳（カーネーション脱脂粉ミルク）で一晩ブロックし、続いて２時間、１次抗体（Ｒａｆ−１に関してＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｃ−１２およびＢｃｌ−ｘＬに関してＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｈ−６２）、続いて各々１：５００および１：２０００希釈の５％牛乳中フルオレッセイン架橋抗ウサギＩｇおよびＴＢＳＴ中の抗フルオレッセインアルカリホスフェート接合体とインキュベートする。ｓｔｏｒｍ ８６０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｎａｍｉｃｓ）を製造者の指示にしたがって蛍光産物の検出に使用する。
【００７４】
結果
ディスコデルモライドへの７２時間の暴露に続く細胞増殖における効果を、ＭＴＳアッセイで測定した。ＩＣ５０値をＡ５４９細胞で４５および６０ｎＭ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞で３および１５ｎＭ、１Ａ９細胞で１０および３９ｎＭ、およびＰＴＸ−２２細胞で２３および３７ｎＭである二つの独立した実験で測定する。細胞を５０、１００および１８０ｎＭディスコデルモライドで、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を２、２０、５０および９０ｎＭディスコデルモライドで処理して、Ｒａｆ−１およびＢｃｌ−ｘＬリン酸化上のディスコデルモライド処理の効果を測定する。本試験で陽性コントロールとして使用したパクリタキセル濃度の濃度は実施例２で使用したのと同じであった。
【００７５】
Ｒａｆ−１およびＢｃｌ−ｘＬの両方は、パクリタキセルまたはディスコデルモライドでのＡ５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の処置２４時間後にリン酸化される。Ｒａｆ−１のリン酸化は、よりゆっくり移動する付加的バンドの発現およびＢｃｌ−ｘＬののリン酸化は一つのバンドの広がりにより観察される。これらの結果は、Ｒａｆ−１リン酸化におけるパクリタキセルの効果が濃度依存性であるという先の試験と一致する（Ｔｏｒｒｅｓ Ｋ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ ＳＢ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９８：５８：３６２０−３６２６）。興味深いことに、Ｒａｆ−１リン酸化は低濃度のパクリタキセルがＲａｆ−１リン酸化なしに、恐らくｐ２１およびまたはｐ５３仲介アポトーシス経路を会してアポトーシスに導くため、細胞死に必要ではない。Ｒａｆ−１リン酸化に必要な最少パクリタキセル濃度は、Ｇ２／Ｍブロックの導入と一致し、Ｒａｆ−１活性化が分裂チェックポイントの間に活性化されるシグナルカスケードの要素であり得ることを示唆する。Ｒａｆ−１リン酸化の誘導に必要なディスコデルモライド濃度がＩＣ５０濃度より多いため、同様の濃度特異Ｔ系ディスコデルモライド作用も存在するようである。例えば、Ａ５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のＩＣ５０での処置は、細胞死を誘導するがＲａｆ−１リン酸化は誘導しないようである。
【００７６】
ディスコデルモライドがパクリタキセルに耐性である腫瘍細胞に有効である可能性を測定するために、我々は、１Ａ９卵巣癌細胞およびパクリタキセル耐性サブラインＰＴＸ−２２へのディスコデルモライドの効果を試験した。パクリタキセル耐性は、パクリタキセル蓄積を減少させないが、細胞、細胞性抽出物または精製チューブリンののチューブリン重合化の失敗に関連する。このサブラインは、パクリタキセルに２０−３０倍感受性が低いが、ビンカアルカロイドに感受性を残すことが報告されている。パクリタキセル７２時間ＩＣ５０値は１Ａ９細胞での６ｎＭからＰＴＸ−２２細胞の８０ｎＭにシフトする（１３倍感受性が低い）。興味深いことに、ディスコデルモライドは、１Ａ９およびＰＴＸ−２２上で各々２５および３０ｎＭであるＩＣ５０で測定して交叉反応性を示さない。Ｒａｆ−１はパクリタキセルおよびディスコデルモライドの両方で処理された１Ａ９親細胞で、ディスコデルモライドで処理されたＰＴＸ−２２細胞でリン酸化される。Ｒａｆ−１リン酸化はパクリタキセル処理に続いてＰＴＸ−２２細胞では観察されない。これらの試験は、ディスコデルモライドがパクリタキセル耐性である腫瘍の処置に有用であり得ることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【図１】種々の癌細胞系におけるディスコデルモライドの抗増殖性活性を説明する表である。種々の癌細胞系を漸増濃度のディスコデルモライドまたはパクリタキセルとインキュベートし、細胞増殖のＩＣ５０をメチレンブルー染色により測定する。
【図２】図２（ａ）は、ディスコデルモライドへのパクリタキセル−耐性（Ｐｇｐ−１／ＭＲＰ）−過剰発現ヒト大腸腫瘍異種移植片（ＨＣＴ１５細胞）の感受性を評価するための試験における、平均腫瘍体積および図２（ｂ）は平均体重を提供する。−−□−−は１６．７％Ｃｒｍ．−８．３％ＥｔＯＨ／Ｄ５Ｗのコントロール溶液、ｉｖ、１×（ｄ．１４）である；−−●−−はディスコデルモライド、ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−◆−−はディスコデルモライド、ｉｖ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−◇−−は１２．５％ＥｔＯＨ／Ｄ５Ｗ、ｉｖ、１×／日（ｄ．１４−１６）を投与されたマウスである；そして−−×−−はパクリタキセル、ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１×／日（ｄ．１４−１８）を投与されたマウスである。
【図３】図３（ａ）は、ディスコデルモライドへのパクリタキセル−耐性（Ｐｇｐ−１／ＭＲＰ）−過剰発現ヒト大腸腫瘍異種移植片（ＭＩＰ１０１細胞）の感受性を評価するための試験における、平均腫瘍体積および図３（ｂ）は平均体重を提供する。−−□−−は１６．７％Ｃｒｍ．−８．３％ＥｔＯＨ／Ｄ５Ｗのコントロール溶液、ｉｖ、１×（ｄ．１４）である；−−●−−はディスコデルモライド、ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−◆−−はディスコデルモライド、ｉｖ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−◇−−はディスコデルモライド、ｉｖ、２．５ｍｇ／ｋｇ、１×（ｄ．１４）を投与されたマウスである；−−○−−は１２．５％ＥｔＯＨ／Ｄ５Ｗ、ｉｖ、１×／日（ｄ．１４−１６）を投与されたマウスである；そして−−×−−はパクリタキセル、ｉｖ、１５ｍｇ／ｋｇ、１×／日（ｄ．１４−１８）を投与されたマウスである。
【図４】ディスコデルモライドに対するパクリタキセル−耐性１Ａ９ＰＴＸ２２２（β−チューブリン変異）細胞感受性の評価である。−−●−−はパクリタキセルを投与された１Ａ９細胞である；−−○−−はパクリタキセルを投与された１Ａ９ＰＴＸ２２細胞である；−−▼−−はディスコデルモライド投与された１Ａ９細胞である；−−▽−−はディスコデルモライドを投与された１Ａ９ＰＴＸ２２細胞である。
【図５】ヌードマウス中でパクリタキセル耐性１Ａ９ＰＴＸ２２細胞がディスコデルモライドに耐性であることを証明する実験の結果である。図５（ａ）は動物に皮下的（ｓｃ）にホロー・ファイバーを移植した２４時間後に開始した処置を記載する（３ファイバー／動物、１ファイバー／各細胞系、６動物／化合物）。パクリタキセルを、ＩＶ、１日１回、５日間１５ｍｇ／ｋｇで投与した。媒体コントロールをパクリタキセルスケジュールにしたがって投与した。図５（ｂ）は５（ａ）と同じレジメであるが、パクリタキセルではなくディスコデルモライドをｉｖ、１回１５ｍｇ／ｋｇ注射で投与した。媒体コントロールをディスコデルモライドスケジュールにしたがって投与した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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