(57)【要約】本発明は、バイオフィルムを制御する、即ちバイオフィルムを崩壊させる、バイオフィルムの形成を防止する、バイオフィルムを増加する、またはバイオフィルムを改変する、窒素複素環式化合物、組成物、及び方法を提供する。バイオフィルムの制御用試験化合物をスクリーニングする方法、及びその中で用いられるデバイスもまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上のバイオフィルムを制御する方法であって、基材上のバイオフィルムを制御するのに適した時間にわたって、
構造Ａ：
【化１】
2004528356.tif 000040
式中、ｎは１〜４であり；及び
ｎが１である場合、
Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びに
Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ6〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；
その際、ＲがＨである場合、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外であり；
ｎが２である場合、
Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びに
Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ4〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；
その際、ＲがＨである場合、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外であり；
ｎが３である場合、
Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びに
Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ5〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；
その際、ＲがＨである場合は、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外であり；または
ｎが４である場合、
Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びに
Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ1〜Ｃ20アルキルまたはＣ2〜Ｃ20アルケニルである；
を有する化合物、若しくはその塩、若しくはその立体異性体と基材を接触させる工程、または
構造Ｂ：
【化２】
2004528356.tif 000041
式中、
ｎ及びｍは独立して１、２、３、または４であり、
Ｘは、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、またはＣ2〜Ｃ20アルケニルであり；
Ｒ1及びＲ4は、独立してＨ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり、並びに
Ｒ2及びＲ3は、独立してＨ、またはアルキルであり；
ただし、ｎ及びｍが２である場合、Ｘは、Ｃ8〜Ｃ20アルキル、またはＣ8〜Ｃ20アルケニルであることを条件とする；
を有する化合物、若しくはその塩、若しくはその立体異性体とバイオフィルムを接触させる工程
を含む方法。
【請求項２】
構造Ａ：
【化３】
2004528356.tif 000042
式中、ｎは、１、３、または４であり；及び
ｎが１である場合、
Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びに
Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ6〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；
その際、ＲがＨである場合は、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外であり；
ｎが３である場合、
Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びに
Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ5〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；
その際、ＲがＨである場合は、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外であり；または
ｎが４である場合、
Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びに
Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ5〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルである；
を有する化合物またはその塩、またはその立体異性体。
【請求項３】
構造Ｂ：
【化４】
2004528356.tif 000043
式中、
ｎ及びｍは独立して１、２、３、または４であり；
Ｘは、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、またはＣ2〜Ｃ20アルケニルであり；
Ｒ1及びＲ4は、独立してＨ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びに
Ｒ2及びＲ3は、独立してＨ、またはアルキルであり；
ただし、ｎ及びｍが２である場合、Ｘは、Ｃ8〜Ｃ20アルキル、またはＣ8〜Ｃ20アルケニルであることを条件とする；
を有する化合物またはその塩、またはその立体異性体。
【請求項４】
請求項２に記載の化合物及びキャリアを含む組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の化合物及びキャリアを含む組成物。
【請求項６】
基材表面上のバイオフィルム制御を試験する装置であって：
取り外し可能な突起のない基材表面を保持する台を有し、該基材表面は、その上にバイオフィルムを成長させるものである第１の本体；及び
整列して第１の本体を受容するように適合され、複数の個別のウェルを有する第２の本体；
を含み、
第１および第２の本体が組み立てられ及び使用される場合に、ウェルが第１の本体の基材表面と流体の漏れない連通状態にある装置。
【請求項７】
基材表面上のバイオフィルム制御を試験する装置であって：
各本体が取り外し可能な突起のない基材表面を保持する台を有し、該基材表面は、その上にバイオフィルムを成長させるものである第１および第３の本体；及び
第１の面及び第２の面を有する第２の本体であって、第１の面及び第２の面に第１及び第３の本体をサンドイッチ状に整列して受容するように適合され、第１の面から第２の面まで伸長する複数の個別の開口部を有し、両端が開口しており、及び装置が組み合わされ及び使用される場合に、第１及び第３の本体の基材表面と流体の漏れない連通状態にあるウェルを提供する第２の本体；
を含む装置。
【請求項８】
基材表面上のバイオフィルムの制御用試験化合物をスクリーニングする方法であって：
請求項７に記載の装置を得る工程と；
バイオフィルム形成微生物を試験化合物と共に装置のウェルの中で、試験化合物が存在しない基材表面上にバイオフィルムの形成を可能にする条件下で培養する工程と；
試験化合物の存在下で基材表面上のバイオフィルム形成と、試験化合物の非存在下で基材表面上のバイオフィルム形成とを比較する工程と；
を含み、その際、化合物の存在下でのバイオフィルム形成が、試験化合物の非存在下のときより少ない場合には、試験化合物は基材表面上でのバイオフィルム形成に抑制活性を有し、及び、化合物の存在下でのバイオフィルム形成が、試験化合物が非存在下のときより多い場合には、試験化合物は基材表面上でのバイオフィルム形成に促進活性を有する方法。
【請求項９】
基材表面上に存在するバイオフィルムの分散用試験化合物をスクリーニングする方法であって：
請求項７に記載の装置を得る工程と；
バイオフィルム形成微生物を装置のウェルの中で、基材表面上にバイオフィルムを形成する条件下で培養する工程と；
基材表面上のバイオフィルムを試験化合物に接触させる工程と；
試験化合物の存在下での基材表面上のバイオフィルムの量と、試験化合物の非存在下での基材表面上のバイオフィルムの量とを比較する工程と；
を含み、その際、化合物の存在下でのバイオフィルムの量が、試験化合物の非存在下のときより少ない場合には、試験化合物は基材表面上でのバイオフィルム分散活性を有する方法。
【請求項１０】
バイオフィルム分散活性を有する化合物の、分散したバイオフィルム量への効果を増幅する方法であって：
バイオフィルムを、バイオフィルムの分散活性を有する化合物と共に、化合物にバイオフィルムを分散する作用をさせるに十分な時間培養する工程と；
バイオフィルムに塩基を添加する工程と；
化合物の効果を増幅するに十分な時間培養する工程と；
存在するバイオフィルムの量を測定する工程と；
を含み、その際、塩基の非存在下での効果と比較して、塩基の存在下で化合物の効果が増幅される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００１年４月２７日に出願された米国特許出願第６０／２８７，１３８号の利益を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、バイオフィルムを制御する、即ちバイオフィルムを崩壊させる、バイオフィルムの形成を防止する、バイオフィルムを増加する、またはバイオフィルムを変性する、化合物、組成物、及び方法に関する。バイオフィルムの制御用試験化合物をスクリーニングする方法、及びその中で用いられる装置もまた提供する。
【背景技術】
【０００３】
バイオフィルムは、様々な表面上に成長する細菌、古細菌、真菌、カビ、藻類、若しくは原虫、またはそれらの混合物のような微生物の粘液質の群生である（ネイチャー（Nature）、４０８巻、２８４〜２８６ページ、２０００年、１１月１６日参照）。バイオフィルムは、微生物が表面上に定着し、多糖類を包含する母組織の生成に携わる遺伝子を活性化するときに形成される。この母組織が、殺生物剤からバイオフィルム細菌を保護する可能性がある。
【０００４】
菌体数感知信号と呼ばれる分子は、バイオフィルム形成方法の一部分を始動及び調整する補助となる。細菌は絶えず低レベルの信号を分泌し、細菌表面上の受容体を通じて、或いは内部的に、信号を感知する。信号濃度を臨界閾値に到達させるに十分な細菌が存在する場合、受容体は行動変化を始動する。一旦これが起きると、細菌は共同行動をとることにより反応し、例えばバイオフィルムを形成し、病原菌の場合には、毒素のような毒性要因を展開する。細菌は、それら自体の種の仲間に伝達することに加えて、異種間の伝達も行い、その結果バイオフィルムが一を超える細菌種を含有する可能性もある。
【０００５】
バイオフィルムには、望ましくないことが多くある。例えば、バイオフィルムは、冷却システム、または水産養殖装備のような装備の表面を覆うことにより損害を与える。バイオフィルムはまた健康に有害な影響をもつ可能性がある。例えば、多くの院内感染はバイオフィルムが関与しており、バイオフィルムは移植片及びカテーテルを汚染することがあり得る。歯科用管路は、バイオフィルム形成の最有力候補である。バイオフィルムはまた、嚢胞性線維症患者の肺の感染から歯の腐食にまで広がる疾病の原因ともなる。
【０００６】
しかしながら、バイオフィルムにはまた望ましい可能性もある。例えば、バイオフィルムは薬剤製造の仕事などに用いられるバイオリアクターに用いられ、及びバイオフィルムはまた下水、及びその他の水処理システムの構成成分でもある。
【０００７】
バイオフィルムを防止する、または崩壊させる一つの方法は、菌体数感知信号を妨害することである。菌体数感知信号の受容体に結合するがこれを活性化しない、または信号合成を妨害する化学薬品が開発されてきた。信号を分解する酵素もまた開発されてきた。ある種の菌体数感知信号は、典型的にはアシル化されたホモセリンラクトン環構造を有する。ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／０６１７７は、報告によれば、ホモセリンラクトンの生成を促進または抑制する自動誘導物質合成反応のモジュレータの同定方法を提供している。ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／３２１５２は、報告によれば、細菌信号伝達の要因である、４，５−ジヒドロキシ−２，３−ペンタンジオンを提供しており、この要因は発光遺伝子発現を誘発する助力となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
バイオフィルムの形成及び成長を調節する作用剤、並びにそのような形成及び成長を試験する方法及びデバイスを特定する継続的な要求が存在する。本発明はこれらの問題を取り上げ、こうした方法を調節する特定の窒素複素環式分子、並びにそのような調節を試験する方法及びデバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、バイオフィルムを制御する、化合物、組成物、及び方法に関する。バイオフィルムを「制御する」とは、バイオフィルムを崩壊させる及び／またはバイオフィルムの形成を防止する、バイオフィルムの形成及び／または成長を増加する、またはバイオフィルムを変性する、ことを意味する。本発明は更に、バイオフィルムに対する化合物の効果を測定する分析及び方法に関する。基材表面上のバイオフィルムの制御を試験する装置もまた提供する。
【００１０】
引用された全ての文書は関連部分において本明細書に参考として組み入れられるが、いかなる文書の引用も、本発明に対応する先行技術であるという承認として解釈されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、基材表面上のバイオフィルムを制御する化合物及び方法を提供する。本発明はまた、バイオフィルム制御の活性を試験する化合物のスクリーニング方法、並びに基材表面上のバイオフィルム制御を試験する装置も提供する。「バイオフィルム」とは、様々な基材上に成長が可能な、例えば、細菌、古細菌、真菌、カビ、藻類、若しくは原虫のような微生物の粘液質の群生を意味する。バイオフィルムは、一以上の種を含むことができる。「基材」とは、その上にバイオフィルムが形成できるまたは形成したいかなる表面をも意味する。基材には、ポリマー、プラスチック、チュービング、セラミック、金属、ガラス、ヒドロキシアパタイト、皮膚、骨、または組織のような、硬いまたは柔らかい表面が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
本明細書での「バイオフィルムを制御する」とは、バイオフィルムを崩壊させる及び／またはバイオフィルムの形成を防止する、バイオフィルムの形成及び／または成長を促進する、或いはバイオフィルムを変性することを意味する。本発明は、バイオフィルムを制御するための構造Ａまたは構造Ｂを有する窒素複素環式化合物、それらの組み合わせ、それらの塩、またはそれらの立体異性体を提供する。基材上のバイオフィルムを制御する方法は、基材を、本明細書に記載される構造Ａまたは構造Ｂを有する化合物に、基材上のバイオフィルムを制御するに十分な時間に亘って接触させることを含む。
【００１３】
（構造Ａ）：
【００１４】
【化１】
2004528356.tif 000002
バイオフィルムを制御するのに用いられる、構造Ａを有する化合物において、ｎは１〜４であり、及びＲはＨ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルである。更に、ｎが１である場合、Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ；Ｃ6〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；その際、ＲがＨである場合、Ｒ1及びＲ2の１つはＨ以外である。ｎが２である場合、Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ4〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；その際、ＲがＨである場合、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外である。ｎが３である場合、Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ5〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；その際、ＲがＨである場合、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外である。ｎが４である場合、Ｒ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、またはＣ2〜Ｃ20アルケニルである。
【００１５】
（構造Ｂ）：
【００１６】
【化２】
2004528356.tif 000003
バイオフィルムを制御するのに用いられる、構造Ｂを有する化合物において、ｎ及びｍは独立して１、２、３、または４であり；Ｘは、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、またはＣ2〜Ｃ20アルケニルであり；Ｒ1及びＲ4は、独立してＨ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びにＲ2及びＲ3は、独立してＨ、またはアルキルであり；ただし、ｎ及びｍが２である場合、Ｘは、Ｃ8〜Ｃ20アルキル、またはＣ8〜Ｃ20アルケニルであることを条件とする。本明細書で提供される窒素複素環式化合物の塩、立体異性体、またはその組み合わせは、バイオフィルムを制御するのに有用であると本発明者らは考えている。
【００１７】
後に記載される、構造ＡまたはＢを有する新しい化合物、それらの塩、立体異性体、若しくはそれらの組成物もまた本発明により提供される。本発明の実施形態は、ｎが１である場合の構造Ａを有する化合物を提供し、Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びにＲ1及びＲ2は、独立してＨ、Ｃ6〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；その際、ＲがＨである場合、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外である。このような化合物は、例えば、本明細書の合成実施例１〜３に示されるように合成される。本明細書の実施例の見地から、当業者は関連した置換基を有する化合物を合成することができるであろう。Ｒ1及びＲ2が独立したアルケニルである化合物が、ｎ−デシルアミンの代わりに適切なアルケニルアミンを用いて実施例２のように調製される。Ｒがアルキルである化合物は、適切な１−アルキル−２−アゼチジンカルボン酸から実施例２のように調製され、この合成はクロムウェル（Cromwell）らにより、複素環式化学誌（J.Heterocyclic Chem.）（１９６８年）、５（２）、３０９〜３１１に記載されている。Ｒがアシルである化合物が、実施例９に類似した方法で、適切な２−アゼチジンカルボン酸アミドと酸塩化物との反応により調製される。
【００１８】
本発明の更なる実施形態は、ｎが３である場合の構造Ａを有する新しい化合物を提供し、Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びにＲ1及びＲ2は、独立してＨ；Ｃ5〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルであり；その際、ＲがＨである場合、Ｒ1及びＲ2の一つはＨ以外である。このような化合物は、例えば、本明細書の合成実施例７〜９に示されるように合成される。本明細書の実施例の見地から、当業者は関連した置換基を有する化合物を合成することができるであろう。Ｒ1及びＲ2が独立してアルケニルである化合物が、ｎ−オクチルアミンの代わりに適切なアルケニルアミンを用いて実施例７のように調製される。Ｒがアルキルである化合物が、適切な１−アルキル−２−ピペリジンカルボン酸から実施例７のように調製され、これはフー（Hu）らにより、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９９／４３６５８に記載されているように、２−ピペリジンカルボン酸の還元アルキル化を通して得られる。
【００１９】
本発明の更なる実施形態は、ｎが４である場合の構造Ａを有する新しい化合物を提供し、Ｒは、Ｈ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり；並びにＲ1及びＲ2は、独立して、Ｈ、Ｃ5〜Ｃ20アルキルまたはアルケニルである。このような化合物は、例えば、本明細書の合成実施例１０及び１１に示されるように合成される。本明細書の実施例の見地から、当業者は関連した置換基を有する化合物を合成することができるであろう。Ｒがアシルである化合物は、実施例９に類似した方法で、適切な２−アゼパンカルボン酸アミドの酸塩化物との反応により調製される。Ｒがアルキルである化合物は、適切な１−アルキル−２−アゼパンカルボン酸から実施例１０のように調製され、これは、２−アゼパンカルボン酸の還元アルキル化を通して得られる。２−アゼパンカルボン酸の合成は、ゼーバッハ（Seebach）ら（Liebigs Ann. Chem.（１９８９年）、（１２）、１２１５〜１２３２）により記載されている。Ｒ1及びＲ2がＨである化合物は、ｎ−オクチルアミンの代わりにアンモニアを用いた実施例１０の方法により、またはクロムウェル（Cromwell）らにより、複素環式化学誌（J.Heterocyclic Chem.）（１９７１年）、８（１）、１９〜２４に記載された方法により調製される。
【００２０】
本発明の更なる実施形態は、構造Ｂを有する新しい化合物を提供し、ｎ及びｍは独立して１、２、３、または４であり；Ｘは、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、またはＣ2〜Ｃ20アルケニルであり；Ｒ1及びＲ4は、独立してＨ、アルキル、アシル、またはアルコキシカルボニルであり、並びにＲ2及びＲ3は、独立してＨ、またはアルキルであり；ただし、ｎ及びｍが２である場合、Ｘは、Ｃ8〜Ｃ20アルキル、またはアルケニルであることを条件とする。このような化合物は、例えば、本明細書の合成実施例１２及び１３に示されるように合成される。本開示の見地から、当業者はまた、ｎ及びｍが独立して１、２、３、または４である場合、化合物をいかに製造するかを実施例１〜１３の見地から知るであろう。
【００２１】
「アルキル」とは、特に指定しない限り、１〜２０の炭素原子の完全に飽和した一価の炭化水素ラジカルを指す。アルキルは、直鎖でも分枝鎖でも可能である。好ましいのは、４、５、または６〜２０の炭素原子を含有するアルキル基であり、４、６、８、１０、または１２の炭素原子を含むものが特に好ましい。「アシル」とは、カルボニルを有する基を指す。「アルコキシカルボニル」は、−ＣＯＯＲを指し、この場合Ｒはアルキルである。「アルケニル」とは、一以上の二重結合を有する、２〜２０の炭素原子の不飽和一価の炭化水素ラジカルを指す。アルケニルは、直鎖でも分枝鎖でも可能である。好ましいのは、４〜２０の炭素原子を含有するアルケニル基であり、８、１０、または１２の炭素原子が特に好ましい。
【００２２】
「独立して」とは、この用語の直前の二以上の基が、等しいかまたは異なるかのいずれかであることを意味し、即ち用語の後に続く一覧からの一つの選択が、他方の選択に影響しないことを意味する。
【００２３】
「その塩」とは、本明細書に提供されるような窒素複素環式化合物と有機または無機酸の塩であって、例えば塩化物、臭化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩、または本開示の見地から当業者に既知のその他のものである。
【００２４】
本明細書に提供されるような窒素複素環式化合物によるバイオフィルムの制御は、試験化合物の存在下での処置の結果得られたバイオフィルムの量を、試験化合物の非存在下での処置の結果得られた量と比較して分析することにより測定される。処置の結果として存在するバイオフィルムの量での変化は、バイオフィルムのエキソポリサッカライド母組織ヘの効果、またはバイオフィルム中の微生物ヘの効果、またはエキソポリサッカライドと微生物との間の関係への効果としての結果である可能性がある。理論により束縛されることを望まないが、本発明者らは、本発明の窒素複素環式分子は、バイオフィルムの伝達における菌体数感知分子の活動を模倣し、妨害し、または改変する可能性があると考えている。本発明の化合物は、例えば毒素の生成を減少させることにより、毒性を減少させることにより、信号分子を妨害することにより、またはバイオフィルム、例えばバイオリアクター内のバイオフィルムにより生成される酵素の濃度を増加させることにより、バイオフィルムを改変する可能性もまたある。
【００２５】
「試験化合物」は、バイオフィルムを制御する上での活性をスクリーニングする候補化合物である。本明細書の実施例は、消費者及び医療環境に関連する細菌種における、並びに細胞壁型細菌を広く代表する細菌種における、バイオフィルムの分散及び形成を試験する。シュードモナス種を試験するのは、シャワー、トイレ、流し台、及び下水管の、中及び周囲に存在するように高湿度環境で形成されるバイオフィルム中に広く存在するため、並びに代表的グラム陰性細菌であるためである。表皮ブドウ球菌を試験するのは、表皮ブドウ球菌がヒトの皮膚に普通に見出されるため、並びに代表的グラム陽性細菌であるためである。緑膿菌及び表皮ブドウ球菌は日和見性の病原体であり、院内感染によくある原因物質であるため、医学上重要である。院内感染ではバイオフィルム状態でのこれらの有機体の成長が重要であると考えられている。加えて、これらの三つの有機体はバイオフィルムを処置する上での困難の幅を代表しており、その中でも緑膿菌を制御するのが最も難しい。本明細書に記載される、スクリーニングの手法は、例として黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンス、または癜風菌を包含するその他の細菌及び真菌にも適用することができる。
【００２６】
本明細書におけるバイオフィルムの成長の測定には、緑膿菌、蛍光菌、及び表皮ブドウ球菌のバイオフィルムを制御する上で活性な化合物を迅速に同定するために、細胞及び細胞外多糖類の両方の細胞を染色する定量的な全バイオフィルム染色染料としてクリスタル・バイオレットを用いる。更なる染料または分析も同様な方法でバイオフィルムの定量化に用いることも可能で、その方法には多糖類染色、ＤＮＡ染色、化学的または生化学的分析、酵素分析、或いはは物理的方法が挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は、一般にはバイオフィルム内に含有される細胞に対して有害である。
【００２７】
バイオフィルムの制御をする上での化合物の活性の程度を定量化するために、有害でない別の方法も用いることができる。細胞はバイオフィルムから損なわれずに、物理的、化学的、または生物学的方法、例えばこすり落す、音波処理、緩衝液中での攪拌（「ストマッキング」）、ガラスビーズ、化学薬品、酵素と共に振盪すること、または本開示の見地から当業者に既知のその他の方法により放出される可能性がある。次に放出された細胞の数が、寒天プレートを用いた古典的な細菌学的生菌数計数のような方法、蛍光活性化細胞分離（fluorescence activated cell sorting）、光散乱法、画像解析、酵素分析、或いは生化学的方法を伴うまたは伴わない蛍光・非蛍光の生菌・全菌の染色を用いて測定する。本開示の見地から当業者に既知のその他の方法もまた用いられてもよいが、しかしながら、現在利用可能な最も簡単で、最も費用効率が高い方法は、本明細書に記載されたクリスタル・バイオレット方法であると考えられる。
【００２８】
本明細書に開示される分析方法は、それらが化合物によるバイオフィルム制御の程度をメカニズムに関係なく測定するという意味において「機能的」である。それ故に、この分析は、バイオフィルムを制御する際の化合物の活性にかかわらず、化合物が細菌の成長に対して殺菌的、静的、或いは非抑制的であろうが、弁別することはない。追加の分析は、こうした活性化合物の活性メカニズムの解明に役立つであろうが、そうした活性化合物としては、最少阻害濃度分析、成長速度分析、非特定細胞溶解分析、特定のレポーター遺伝子またはタンパク質に基づく分析、及び本開示の見地から当業者に既知のその他の分析などがある。
【００２９】
本明細書に開示される発明に使用される機能的分析方法の利益としては、バイオフィルム制御の様々なメカニズムのいずれかを有する化合物を、この分析を用いて発見することができることである。この化合物には、現在は知られていないメカニズムにより活動する化合物が包含される。
【００３０】
本明細書で開示された分析方法は、硬い表面上に形成される可能性のあるバイオフィルムの研究、並びにバイオフィルムの感受性の研究、例えば様々な洗浄組成物に対する感受性の研究に特に適している。この方法をその他の種類の表面、例えば、柔らかい、多孔質の、または不規則な表面に適応させるための小さな変化は、本開示の見地から当業者には明らかであろう。
【００３１】
本発明は、分散したバイオフィルム量での、バイオフィルム分散活性を有する化合物の効果を増幅する方法もまた提供する。この方法は、バイオフィルムを、バイオフィルム分散活性を有する化合物と共に、その化合物がバイオフィルムを分散する作用をするに十分な時間に亘って培養する工程と、バイオフィルムに塩基を添加する工程と、化合物の効果を増幅するに十分な時間に亘って培養する工程と、存在するバイオフィルムの量を測定する工程と、を含む。塩基の非存在下での効果と比較して、塩基の存在下での化合物の効果が増幅される。塩基は、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、またはＮＨ4ＯＨのようないかなる塩基でも可能である。この分散分析における塩基の使用により、塩基を添加する工程がない分析と比べて分析の感度が高められる。
【００３２】
基材上のバイオフィルムを制御する方法での一実施形態では、化合物は構造Ａを有し、ｎは１であり；制御が、バイオフィルム形成の増加または存在するバイオフィルムの増加になる場合、Ｒはアルコキシカルボニルであり、Ｒ1はＨであり、Ｒ2は、Ｃ10〜Ｃ12アルキルであり；並びに制御がバイオフィルム形成の防止、または存在するバイオフィルムの分散になる場合、Ｒ及びＲ1はＨであり、Ｒ2はＣ6〜Ｃ12アルキルである。
【００３３】
基材上のバイオフィルムを制御する方法のもう一つの実施形態では、化合物は構造Ａを有し、ｎは２であり；制御が、バイオフィルム形成の増加または存在するバイオフィルムの増加になる場合、Ｒはアルコキシカルボニルまたはアシルであり、Ｒ1はＨであり、Ｒ2は、Ｃ6〜Ｃ12アルキルであり；並びに制御がバイオフィルム形成の防止または存在するバイオフィルムの分散になる場合、Ｒ及びＲ1はＨであり、Ｒ2はＣ10〜Ｃ12アルキルである。もう一つの実施形態では、ＲはＨであり、Ｒ1はＨであり、並びにＲ2はＣ10アルキルである。
【００３４】
基材上のバイオフィルムを制御する方法のもう一つの実施形態では、化合物は構造Ａを有し、ｎは３であり；別の方法としては、ＲがＨまたはアルコキシカルボニルであり、Ｒ1はＨであり、及びＲ2はＣ8アルキルであり；その際、制御がバイオフィルム形成の増加になる場合、Ｒはアルコキシカルボニル、アシル、またはＨであり、Ｒ1はＨであり、並びにＲ2はＣ8アルキルである。
基材上のバイオフィルムを制御する方法のもう一つの実施形態では、化合物は構造Ａを有し、ｎは４である。
【００３５】
基材上のバイオフィルムを制御する方法のもう一つの実施形態では、化合物は構造Ｂを有し、ｎ及びｍは１、３、または４であり；別の方法では、ｎ及びｍは２であり、好ましくは、ＸはＣ12アルキルであり、並びにＲ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4はＨである。ｎ及びｍが２である場合、並びに、制御がバイオフィルム形成の増加または存在するバイオフィルムの増加になる場合、Ｘは好ましくはＣ12アルキルであり、Ｒ2及びＲ3は好ましくはＨであり、並びにＲ1及びＲ4は好ましくはアルコキシカルボニルである。ｎ及びｍが２である場合、並びに制御がバイオフィルム形成の防止、または存在するバイオフィルムの分散になる場合、好ましくは、ＸはＣ12アルキルであり、Ｒ1〜Ｒ4はＨである。
【００３６】
（バイオフィルム制御の用途）
本発明は、バイオフィルムを制御するための方法及び化合物を提供する。この方法は、基材を上述の化合物に接触させる工程を含む。本発明の好ましい実施形態では、基材は化合物により処置され、例えば基材に適用される化合物は基材上に残留物を残す。バイオフィルムの制御のため、組成物は一以上の化合物を、例えば組成物の約０．００１重量％〜約９９重量％、約０．０１重量％〜約５０重量％、または約０．１重量％〜約１０重量％の濃度で含む。
【００３７】
本発明の実施形態の一つでは、上述の化合物及び／または組成物が、バイオフィルムを崩壊させる及び／またはバイオフィルムの形成を防止するために、高湿度環境において基材に適用される。基材は、硬い表面であり得、シャワー、トイレ、若しくは流し台のような浴室の表面、流し台またはごみ処理のような台所の表面、或いは布地の表面が挙げられる。別の方法では、本化合物及び／または組成物は、食器洗い機、冷蔵庫などの高湿度の電気器具の内部を処置するために用いることもできる。あるいは基材は、他の台所表面及び／またはその他の表面、例えば、スポンジ、まな板（木またはプラスチック）、または洗い布であることもできる。本発明の別の実施形態では、化合物及び／または組成物は洗濯の用途に用い、例えば洗濯機の管及び／または槽の内部に適用する。化合物または組成物は布地に適用することもできる。化合物または組成物は、悪臭を減少させる、洗浄を補助する、及び／または衣類、カーテンなどのような既製の布地上の湿った環境でのカビの成長を防止することができる。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物は、プール、温泉、及び／または温水浴槽内部での洗浄を減少する、及び／または塩素の使用を減少することにより、表面の汚れを防止するために用いることができる。本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物は、屋外の基材上、例えば羽目板、屋根ふき材、デッキ、及び／またはテラス上に、屋外のカビ及び／または藻類の成長を防止するために用いることができる。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物は、植物及び／または花用花瓶及び／または水瓶に、例えばより少ない洗浄でより長持ちするという利益の提供のために用いることができる。本発明の別の実施形態では、化合物及び／または組成物を自動車の空調ユニットに、並びにバイオフィルムを形成しやすいその他の空調ユニットに、バイオフィルムの形成を防止するため或いは処置するために用いることができる。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、化合物及び／または組成物は、家庭用の水の濾過システム上（例えば濾過器、覆い、及び／または給水線上）、並びに産業用水冷システム及び／または水処理システム上のバイオフィルムの形成を防止するために用いることができる。本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、地下のカビによるバイオフィルムの形成防止のために用い得る。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、化合物または組成物は、例えば抗生物質のような別の抗菌薬との組み合わせによる抗感染薬として用いることができる。化合物または組成物は、細菌感染のようなバイオフィルムの発生に関連した疾病状態の対象者、嚢胞性線維症またはＨＩＶの対象者、若しくは免疫障害を持つ対象者を治療するために用いることも可能である。或いは、カテーテル、チュービング、人工補装具などの医療デバイスまたは歯科用デバイスのための処置として、それらのデバイス上でのバイオフィルムの形成を防止及び処置するために本化合物及び／または組成物を用いることができる。本発明の別の実施形態では、化合物及び／または組成物を、歯または義歯上などの口腔ケアの用途に、歯垢及び／または臭気を制御するためにも用い得る。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、化合物及び／または組成物を、皮膚上でのバイオフィルムの形成を制御するために用い得る。例としては、ふけの制御（頭皮上のマラセジア属バイオフィルムの防止）、手／皮膚清浄剤（天然の微生物相の成長または回復の防止）、防臭剤の適用、またはフット・ケア（天然の微生物相を崩壊させない水虫のようなカビの成長の防止）である。本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を靴の手入れに適用して、靴の表面上ヘの細菌及び／または真菌のバイオフィルムの形成を制御することができる。本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、毒素性ショック症候群を防止するため、または不均衡な微生物相を回復するため（例えばおむつの中または膣管内の閉塞された皮膚）にも用いることができる。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、金属、セラミック、ガラス、複合材料、またはポリマー部品を有するいかなる加工機械にも用いることができ、特に紙、食品、薬、及び化粧品の加工用途に用い得る。本化合物及び／または組成物は、金属、セラミック、ガラス、複合材料、またはポリマー部品上のバイオフィルムの形成を防止するため、並びに紙製品における真菌または細菌のバイオフィルムの成長を防止するためにも用いることができる。
本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、食品及び／または飲料の防腐剤として用い得る。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、汎用表面塗被での生物汚染を防止するために用いることができる（例えば家屋、ボート、布地、じゅうたん、靴などへのペンキまたは塗被）。本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物は、汎用含浸材料（例えばプラスチック、木材、複合材料）に、または制御されたデリバリーシステムで用いることができる。本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、材料保護（例えば、木材、羽目板、屋根など）並びに機材保護のような建築用途に用い得る。本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物は、海水及び淡水での生物的汚染を防止するためにも用いることができる（例えば、ボート、ドック、桟橋、ブイ、ロープ、及び軍事用途）。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、バイオプロセッシング用途として、例えば汚水処理システム／プラント、バイオ治療システム、またはバイオプロセッシングシステム（例えば全細胞生体触媒）における最適なバイオフィルム形成を促進するためにも用いることができる。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、農業用途に、例えば農作物の保護、農作物の栄養分（所望のバイオフィルムの促進）のため、並びに流出液媒介汚染の防止（例えば、溝、ポンプなどで）に用いることができる。
本発明の別の実施形態では、本化合物及び／または組成物を、水産養殖用途に、例えば病気の予防、並びに最適な表皮バイオフィルムの促進に用いることができる。
【００４７】
（薬剤用量、製剤、及び投与）
薬剤用途における「治療的に有効な量」とは、バイオフィルム形成を減少すること、バイオフィルムを分散すること、またはバイオフィルムに対して毒性活性を有するといったバイオフィルムを制御する上での特定の医療目的を達成し得る、本発明の化合物の濃度、量、またはレベルを意味する。具体的な「治療的に有効な量」とは、治療の特定条件、患者の身体的条件、治療を受ける哺乳類の種類、治療期間、併用療法（もしあれば）の性質、使用される具体的な製剤、並びに化合物またはその塩の構造といった要因によって変化する。
【００４８】
いかなる好適な用量も、本発明の薬学的方法で投与できる可能性がある。投与される用量は既知の要因、例えば特定の化合物、塩、またはその組み合わせの薬力学特徴、及びその投与様態及び投与経路；年齢、健康、または患者の重量；症状の性質及び程度；薬及び患者の代謝の特徴、併用療法の種類；治療の頻度；または所望の効果に従って変化する。有効な投与量は、動物モデル試験システムまたは生体外試験システムからの用量対応曲線から推定することもできる。
【００４９】
用量単位は、希釈液、増量剤、キャリア、リポソームなどを含むことも可能である。単位は、丸薬、錠剤、カプセルなどのような固体またはゲル形態でも、或いは口腔、直腸、局所、静脈注射、非経口的投与または治療部位の内部若しくは周囲への注射に好適な流体形態でもよい。口腔投与の製剤は、非毒性で、製薬上許容できる、不活性キャリア、例えばラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体などを含むこともできる。本発明の方法による投与の局所適用には、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ジェル、スプレー、エアゾール、またはオイルが挙げられる。鼻腔投与に好適な製剤は、活性成分の水性溶液または油性溶液を包含する液体形態で投与されてもよく、例えば鼻腔用スプレー、点鼻薬、または噴霧器によるエアゾール投与によるものである。非経口的投与に好適な製剤には、意図する受容者の血液と等張の水性及び非水性製剤、及び血液構成要素または一以上の臓器を化合物の対象とするように設計された懸濁システムを包含する可能性のある、水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。
【００５０】
プロドラッグは、その所望の生物学的に活性である形態に変換するまでは、最小の治療活性を有する本明細書に提供される化合物の形態を指す。プロドラッグは、化合物に共有結合した一以上の官能基またはキャリアを有する化合物であり、その官能基またはキャリアは、体内の代謝方法により化合物から取り除かれ、それぞれの生物活性化合物を形成する。プロドラッグは、ヒドロキシ基またはアミン基が、哺乳類の被験者に投与された場合、例えば、それぞれ遊離したヒドロキシ基、またはアミン基を形成するように分裂するいずれかの基に結合した化合物を含む。プロドラッグの例には、アルコール及びアミン官能基の、酢酸塩、ギ酸塩、または安息香酸塩誘導体；官能基の、リン酸エステル、ジメチルグリシンエステル、アミノアルキルベンジルエステル、アミノアルキルエステル、またはカルボキシアルキルエステル；が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
代謝産物とは、代謝または生体内変化、例えば酸化、還元、若しくは加水分解などによる、より極性分子または抱合体への生体内変化によって生成される、本発明の化合物の崩壊または最終生成物、またはその塩を指す。化合物またはその塩の代謝産物は、より生物学的に活性な形態であることもできる。本発明の化合物代謝産物活性の分析は、本開示の見地から当業者に既知であり、例えばバイオフィルムの分散または防止を試験することである。
【００５２】
（添加物成分）
本発明は、上述の一以上の化合物、及び一以上の添加物成分を含む組成物を更に提供する。例えば、この組成物は約０．０００１％〜約５０％の上述の化合物、及び残部の添加物成分を含む。添加物成分の例には、抗生物質、殺生物剤、ビルダー、漂白剤、漂白剤活性化剤、漂白剤触媒、キャリア、二価陽イオン、酵素、酵素安定化システム、キレート剤、光学的光沢剤、汚れ放出ポリマー、染料転写剤、分散剤、泡抑制剤、染料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、柔軟剤、加水分解型界面活性剤を包含する界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、皺防止剤、その他の抗菌剤、殺菌剤、殺真菌剤、カラースペックル（color speckles）、シルバーケア（silvercare）、変色防止剤及び／または腐食防止剤、起泡防止剤、アルカリ性供給源、溶媒、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、香料、またはｐＨ制御剤が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤は、非イオン性、陰イオン性、両性、両親媒性、双性イオン性、カチオン性、半極性非イオン性、またはそれらの混合物であり得る。
【００５３】
本発明の組成物は、溶媒またはその混合物を含むこともできる。本発明による組成物中に組み込むのに好適な溶媒には、水性または有機に基づく溶媒が挙げられる。溶媒は、水、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールアミン、アルコール、プロピレングリコール誘導体、例えばｎ−ブトキシプロパノール若しくはｎ−ブトキシプロポキシプロパノール、２−（２−アルコキシエトキシ）エタノール、２−アルコキシエトキシエタノール、またはポリ（アルキレングリコール）アルキルエーテル、特にｎ−ブトキシプロポキシプロパノール、ブチルカルビトール（CARBITOL）（登録商標）、モノエタノールアミン（ＭＥＡ）、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ベンジルアルコール、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、若しくはジオール、例えば２−エチル−１，３−ヘキサンジオール、及び２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール、またはそれらの混合物を含むことも可能である。更に、隣接しないＣ4〜Ｃ8分枝鎖または直鎖アルキレングリコール、例えばヘキシレングリコール、（４−メチル−２，４−ペンタンジオール）、１，６−ヘキサンジオール、１，３−ブチレングリコール、及び１，４−ブチレングリコールは本発明の溶媒の実施形態である。本明細書に用いるもう一つの非水性、低極性溶媒は、モノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−Ｃ2〜Ｃ3アルキレングリコールモノＣ2〜Ｃ6アルキルエーテルである。このような化合物の具体例には、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、テトラエチレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノエチルエーテル、及びジプロピレングリコールモノブチルエーテルが挙げられる。ブトキシ−プロポキシ−プロパノール（ＢＰＰ）もまた溶媒として考えられる。本明細書で有用な、もう一つの種類の非水性、低極性有機溶媒は、より低分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。このような物質としては、少なくとも約１５０の分子量を有するものを意味する。約２００〜６００の範囲の分子量のＰＥＧが最も好ましい。溶媒は、典型的には本組成物の約０重量％〜約３０重量％の濃度で利用される。
【００５４】
組成物中に組み込まれ本明細書に記載の、２−アルキルアルカノールと溶媒との組み合わせは、許容できる湿潤能力を提供することで、ストリーキングのない気化をもたらす。「湿潤」とは、組成物が表面、特に疎水性の表面上に適用された場合に、単一の液滴の代わりに被膜を形成すること、及び／または乾燥した時に前記表面上に液滴を形成しないことを意味する。液滴の形成は、液滴が乾燥する間、目視可能な残留物（「ストリーキング」）を前記表面上に残す結果となり得る。それに対して、被膜として乾燥することにより、乾燥後に目視可能な残留物が減少される、または防止さえする結果となり得る（ストリーキングのない洗浄としての利益）。その上、本明細書に記載されるように湿潤能力は、前記組成物が適用された表面上に組成物の均一な被膜を形成する結果となる。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、上述の化合物は、プロクター＆ギャンブル社（Procter & Gamble Company）より入手可能なものと同様、市販の組成物に添加することも可能である。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、上述の化合物は、化粧品または医薬組成物に配合され得る。局所用化粧品または医薬組成物中の好適な添加物成分は、上記に列挙した添加物成分に加えて、または代わって、ｉ）皮膚軟化剤、ｉｉ）溶媒、ｉｉｉ）保湿剤、ｉｖ）増粘剤、ｖ）粉末、ｖｉ）香料、ｖｉｉ）ワックス、ｖｉｉｉ）防腐剤、ｉｘ）界面活性剤、ｘ）塩基、及びその他のものから成る群から選択される一以上の成分を含むキャリアを包含する。皮膚に部分的に適用可能である局所用組成物は、溶液、オイル、クリーム、軟膏、ジェル、ローション、シャンプー、リーブオン型及びリンスアウト型ヘアコンディショナー、乳液、洗浄剤、加湿剤、スプレー、皮膚貼付剤などを包含するいずれの形態でもあり得る。典型的には、約１〜約１０００、好ましくは約１〜約１００ミリグラム／平方インチの組成物を患部に適用する。当業者は、過度の実験をすることなく、選択された化合物及び組成物を使用する意図に従い、上述の組成物中に配合する適切な添加物成分及び量を選択できるであろう。
【００５７】
（本明細書で提供される化合物を含むキット）
本発明は、更に、本明細書に記載される化合物及び／または組成物、並びにこの化合物及び／または組成物を含む包装、或いは販売または使用に関連した広告の他の形態を有するその使用における説明書を含むキットに関する。使用説明書は、消費者製品の製造または供給会社により通常用いられるいかなる方式で包むこともできる。例としては、化合物及び／または組成物を保持する容器に貼付されるラベル上；容器に貼付されるかまたは購入時に渡されるシート上；或いは化合物及び／または組成物の購入若しくは使用につながる可能性のある、広告、実演、及び／またはその他の文章によるか口頭によるかの説明、における使用説明書の提供が挙げられる。
具体的には、説明書は化合物及び／または組成物の使用説明を含む。説明書は、例えば基材に適用する化合物及び／または組成物の推奨量に関する情報を加えて包むことも可能である。
【００５８】
（バイオフィルムバイアル瓶装置）
図１を参照すると、様々な表面上でのバイオフィルムの成長のための、及びバイオフィルムを試験するための、使い捨てバイオフィルム成長装置の断面図が示され、それは、内部に突き出たネジ５を含有する、プラスチックのバイアル瓶６（ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、またはその他のポリマーにより製造されるが、好ましくはポリプロピレンより製造される）を包含し、このバイアル瓶６にスクリューキャップ組立部品７を挿入することができる。スクリューキャップ組立部品は、成形プラスチックの先端部分１、くぼみをもつネジ部分３から成り、その上に、キャップ組立部品７がバイアル瓶６にねじ込まれたときに液体不浸透性の封を提供するＯリング２（シリコン、合成または天然ゴム、若しくはその他の好適な物質から製造される）が設置される。キャップ組立部品７のくぼみ空間の中に、バイオフィルムが成長する予定である表面を含む円板４が挿入され、その表面としてはポリマー、セラミック、金属、ガラス、複合材料、または木材のような天然の表面が挙げられるが、これらに限定されない。円板４は、暴露された円板表面がキャップのネジ部分３の末端部とぴったり重なるように、キャップ組立部品のくぼみ空間に挿入され、摩擦によるか、または好適な生体適合性接着剤（バイオフィルムの成長を抑制しない）の使用により所定位置に固定される。装置の有用な寸法には、くぼみをもつネジ部分３が約８ミリメートルの内径を有する、プラスチックバイアル瓶６が約１１ミリメートルの内径を有する、及び円板４が約８ミリメートルの直径を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
図１に示される装置を参照すると、バイオフィルムは円板４の表面上に成長する可能性がある。これは、バイアル瓶６の中に、細菌または真菌を接種した液体成長培地を設置し、円板４をその中に配置したキャップ組立部品７をねじ込み、バイアル瓶を適切な制御された温度環境において組織培養回転装置上に設置することにより、達成される。バイオフィルムを制御する候補である試験化合物を流体成長培地に、バイオフィルム形成前に、バイオフィルム形成後に、または形成前後に添加し得る。
【００６０】
（バイオフィルム成長試験槽の配列）
基材表面上のバイオフィルム制御を試験する装置は本発明の態様である。本装置は、取り外し可能な突起のない基材表面を保持する台を有し、該基材表面は、その上にバイオフィルムを成長させるものである第１の本体、及び、整列して第１の本体を受容するように適合され、複数の個別のウェルを有する第２の本体を含み、第１および第２の本体が組み立てられ及び使用される場合に、ウェルが第１の本体の基材表面と流体の漏れない連通状態にある。
【００６１】
図２ａを参照すると、再利用可能な二部分のバイオフィルム成長試験槽の配列（２Ｐ−ＧＣＡ）の面断面図が示され、図２ｂには、再利用可能な三部分構成（３Ｐ−ＧＣＡ）の面断面図が示される。２Ｐ−ＧＣＡ及び３Ｐ−ＧＣＡの両方共が、様々な物質上での現実的な条件下におけるバイオフィルムの成長並びに試験を可能にする。図２ａ、図２ｂ、図３、及び図４に示された本発明の部品の図によって制限することは意図しておらず、特定の簡単な改変が本開示の見地から当業者には明白であろう。
【００６２】
図２ａに描かれた本発明を参照すると、２Ｐ−ＧＣＡは、成長表面３０に取り付けられた、またはその一部分の様々な物質を受理するように構成することも可能な蓋組立部品９０、及び複数の個別の成長試験槽（ウェル）を含有し、組立部品の個別のウェル８０と表面３０との間に流体の漏れない連通状態を提供するように適合された容器組立部品１１０を包含する。蓋組立部品９０と容器組立部品１１０との接触は、ボルト４０及びナット４５の使用により、並びに位置合わせピン穴２０に挿入された位置合わせピン（好ましくはステンレス鋼から製造される）の使用により保持されるが、その際、流体の漏れない連通状態は個別のＯリング５０（シリコン、合成若しくは天然ゴム、またはその他の好適な物質から製造される）の使用によって、一つのウェル８０に対して単一のＯリングを用いることで保持される。本発明が完全に組み立てられた構成にある時、Ｏリング８０は容器組立部品１１０と表面３０の両方とに密着している。
【００６３】
図２ａを参照すると、蓋組立部品９０はポリマーの単一ブロック１０（例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはその他のポリマー）から、表面３０を受容するような寸法のくぼみ１００、位置合わせピン穴２０、表面を固定するネジ１３０に適合する穴、及びボルト４０を受容する穴を包含するように機械加工される。別の方法においては、蓋組立部品ブロックが、ポリマー以外の物質、例えば金属、複合材料、またはその他の物質から機械加工され得ること、若しくは所望のほぼいかなる物質から鋳造方法または成形方法により前もって形成され得ることは、本開示の見地から当業者には明白であろう。
【００６４】
図３及び図４を参照すると、蓋組立部品９０、及び容器組立部品１１０の平面図がそれぞれ示される。図３を参照すると、蓋組立部品ブロック１０はくぼみ１００を含有し、この中に表面３０が二つの表面固定ねじ１３０の使用により取り付けられている。加えて、蓋組立部品９０及び容器組立部品１１０の整列の補助となる二つの位置合わせピンを受理することを企図し、二つの位置合わせピン穴２０を含むことがわかる。加えて、四つの穴は、２Ｐ−ＧＣＡの二つの部品９０と１１０との間の接触を保持する四つのボルト４０を受理するように企図されている。図４を参照すると、容器組立部品ブロック７０の中に機械加工された同等の穴を見ることも可能であるが、その際、容器組立部品ブロック７０の中の穴１４０及び１５０は、蓋組立部品ブロック１０の中の穴１２０及び２０に、それぞれ適合するように企図され、その結果ボルト４０と位置合わせ穴２０に適合する位置合わせピンの連続性が保持される。
【００６５】
図２ａを参照すると、容器組立部品１１０もまた、ポリマーの単一ブロック６５（例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはその他のポリマー）から、表面３０を受容するような寸法のくぼみ１６０、位置合わせピン穴２０、表面を固定するネジ１３０に適合する穴、及びボルト４０を受理する穴を包含するように機械加工される。容器組立部品ブロックもまた、蓋組立部品ブロックのように、代替的に上述のようなポリマー以外の物質から製造され得ること、または別な方法では機械加工され得ることは、本開示の見地から、当業者には明白であろう。
【００６６】
図４を参照すると、本発明の容器組立部品１１０は、くぼみ１６０の中に機械加工された、複数の個別のウェル８０を含有し、このくぼみ１６０もまた、容器組立部品ブロックの中に機械加工されており、蓋組立部品９０から突き出た表面３０を受容する。この両方が図２ａ及び図３において参照されている。各ウェル８０は、図１に開示された、本発明で参照されるバイアル瓶６のような個別の成長バイアル瓶を模倣することが企図され、各々が、上述の種類のＯリング５０の座部（受容口）を提供するために、ウェルより大きい直径の、加えて０．５〜５ミリメートルのくぼみを包含するように機械加工される。
【００６７】
図２ａ及び図４を参照すると、容器組立部品１１０は、ポリマーまたはその他の物質から製造された取り付けアーム６０を含み、それは組織培養回転装置、または図１に開示された本発明に記載されるような本発明の完全に組み立てられた成長試験槽を、温度が制御された環境で滑らかに回転できる同様な回転デバイスに取り付けられるように適合される。こうした均一な回転は、対象表面３０上の個別の円形バイオフィルムの再現可能な成長を可能にする。
【００６８】
図２ａ、図３、及び図４に示される２Ｐ−ＧＣＡの発明を参照すると、この発明が使用される場合、個別のバイオフィルムの配列が対象表面３０上に成長する可能性がある。これは、Ｏリング５０を容器組立部品１１０の中のＯリング５０の座部に設置し、個別のウェル８０を同一のまたは異なる流体成長培地の同一のまたは異なる量により充填し、各ウェルに、同一のまたは異なる細菌若しくは真菌を個別にまたは共に接種し、位置合わせピン穴２０／１５０に挿入した位置合わせピンを用いて固定した対象表面を含有する蓋組立部品９０を取り付け、蓋組立部品と容器組立部品を共に、ボルト４０及びナット４５を用いて固定する。こうして組み立てられた全体のデバイスを組織培養回転装置上に取り付けアーム６０を用いて取り付ける。若しくは、対象表面側を下にしてデバイスを振盪培養器中に設置し、続いて適切な温度で回転または振盪して、或いは回転または振盪せずに、それぞれ培養することにより達成することもできる。
【００６９】
基材表面上のバイオフィルム制御を試験する更なる装置は本発明の態様である。装置は、第１及び第３の本体を含み、各本体は取り外し可能な突起のない基材表面を保持する台を有し、該基材表面は、その上にバイオフィルムを成長させるものであり、並びに第１の面及び第２の面を有する第２の本体を含み、第２の本体は、該第１及び第３の本体を該第１の面及び第２の面に、サンドイッチ状に整列して受容するように適合され、該第２の本体は、ウェルの各端に開口を提供する該第１の面から該第２の面まで伸長する複数の個別の開口部を有し、並びに該装置が組み合わされ及び使用される場合に、該第１及び第３の本体の該基材表面と流体の漏れない連通状態にある。
【００７０】
図２ｂを参照すると、図２ａに開示される容器組立部品の発明の別の実施形態が示される。図３及び図４に加えて図２ｂを参照すると、容器組立部品１１０は、複数のウェル８５が、全ブロック７０を通じて機械加工されるように改変され、Ｏリング５０の座部である追加のくぼみ１６０、並びにＯリング５０が加えられて、結果として新しい容器組立部品１１５になっていることがわかる。それにより、容器組立部品１１５は、二つの等しい蓋組立部品９０の一部として取り付けられた二つの等しい表面３０を受理するように機械加工されている。
【００７１】
３Ｐ−ＧＣＡは、容器組立部品が２つの等しい蓋組立部品９０を受理するように改変されている点を除いて、多くの点で２Ｐ−ＧＣＡと等しい。図２ａに描かれた四つのボルト４０は、完全に組み立てられた三部分組立部品の、より大きい寸法に適合するために僅かに延長され、結果として図２ｂに描かれた四つのより長いボルト５５となっている。この三部分の実施形態は、成長培地をバイオフィルムの成長が完了する前に変えなければならない場合に、ただ一つの蓋だけを取り外すことが必要であり、従ってもう一つの蓋の上のバイオフィルムの成長は、完全に妨害されないという利益を有する。加えて、バイオフィルムが成長培地を変えることなく成長できる場合には、二倍のバイオフィルムが形成され及び／または試験され得る。
【００７２】
２Ｐ−ＧＣＡ及び３Ｐ−ＧＣＡの両方の一実施形態では、蓋組立部品９０及び容器組立部品１１０／１１５のくぼみは、その寸法が標準的浴室タイルを表面３０として受理するように機械加工される。この調整は、タイルは、それ自体がバイオフィルム成長表面としての役割を果たすことができるか、または異なる対象物質の層への支持体としての役割を果たすことができるかのいずれかであるという利益を有し、この対象物質にはポリマー、セラミック、金属、ガラス、複合材料、または木材のような天然の表面が挙げられるが、これらに限定されない。こうした層はタイルに、接着剤、テープ、摩擦、またはその他の手段により取り付けられ、それによって完全に組み立てられた発明における実際のバイオフィルム成長表面としての役割を果たすことができる。
【００７３】
浴室タイルの実施形態では、図２ａ、図３、及び図４を参照すると、蓋組立部品９０の機械加工されたブロック１０の有用な寸法には、約１０９平方ミリメートルで、深さが約３ミリメートルのくぼみ１００を有する、約１５６平方ミリメートルで、厚さが約２５ミリメートルの大きさのブロックが挙げられるが、これに限定されない。こうした寸法は、約１０８平方ミリメートルの標準的浴室タイルに適合するに十分である。容器組立部品１１０のブロック６５の有用な寸法には、約１０９平方ミリメートルで深さが約３ミリメートルのくぼみ１６０の約３５ミリメートルの深さまで伸長し、並びに中心と中心の間が約１５〜１８ミリメートルの間隔を置く、直径約８〜１２ミリメートルの２４個の穴を有する、約１５６平方ミリメートルで、厚さが約４１ミリメートルの大きさのブロックが挙げられるが、これに限定されない。
【００７４】
浴室タイルの実施形態では、図２ｂ、図３、及び図４を参照すると、有用な寸法は、容器組立部品１１５が、厚さ４３ミリメートルを有し、第２の蓋組立部品９０に適合するためのブロック７０の反対側に加えられた、約１０９平方ミリメートルで深さが約３ミリメートルの追加のくぼみ１６０、並びにブロックに完全に通じるように伸長するウェルの穴８５を有することを除いて、上記と同じ寸法を包含する。
【００７５】
図２ｂ、図３、及び図４に示された３Ｐ−ＧＣＡの発明を参照すると、これらを使用する場合は、個別のバイオフィルムの配列は、対象の二つの表面３０上に成長する可能性があり、その場合二つの表面の各々は、同一のまたは異なる物質で製造されることもあり得る。これは、蓋組立部品９０の下部が、ネジ形ボルト６５及び四つのナット４５を用いて、流体成長培地の量を添加する前にしっかりと取り付けられることを除き、２Ｐ−ＧＣＡ発明について上述した方法と等しい方法で達成することも可能である。
【００７６】
本発明の２Ｐ−ＧＣＡと３Ｐ−ＧＣＡの両方の実施形態では、バイオフィルムを制御する試験化合物は流体成長培地に、バイオフィルムの形成前に、バイオフィルム形成後に、または形成前後に添加し得る。バイオフィルム形成及び／または分散に対するこのような化合物の効果の定量化は、上述のようにして達成される。使用後、表面３０は取り外して廃棄するか、または洗浄して再利用することができ、並びにウェル８０／８５は、試験管ブラシ及び市販の洗剤製剤を用いて、再利用のため容易に洗浄することができる。この方法は、硬い表面上に形成される可能性のあるバイオフィルムの研究、並びに、バイオフィルムの感受性、例えば様々な洗浄組成物に対する感受性の研究に特に適している。
【００７７】
本発明により提供される成長試験槽装置は、成長及び分析が両方共同じデバイス内で実行される再利用可能デバイスである。セリ（Ceri）ら（米国特許第６，３２６，１９０号または米国特許出願公開第２００１／００４９９７５号）にあるような突起を壊す、さもなければバイオフィルムを妨害するような物理的介入は必要ない。このデバイスは、基材として硬い不透水性表面に対して最適化されているが、基材としていかなる表面も可能であるという点において用途が広い。ロボットが取り外しできる蓋を用いることが可能で、計量工程を包含する流体の添加及び除去の全ての工程が自動化されることも可能であるという点で、デバイスはヒトの介入が限られた、または全くない自動化に容易に形態変更可能である。デバイスは、より高密度若しくはより低密度のウェルに、及び／またはより大きい若しくはより小さいウェルに対して容易に計測可能である。エアレーションは、ウェル中の流体の量を変えること、並びに回転装置若しくは振盪器の回転速度を変えることにより広範囲にわたって制御可能である。
【００７８】
基材表面上のバイオフィルムの制御の試験化合物のスクリーニング方法は、上述の装置を得ること、バイオフィルム形成微生物を該試験化合物と共に該装置のウェルの中に、該試験化合物が存在しない該基材表面上に、バイオフィルムの形成を可能にする条件下で培養する工程、及び該試験化合物が存在する場合の該基材表面上のバイオフィルム形成と、該試験化合物が存在しない場合の該基材表面上のバイオフィルム形成とを比較する工程を含み、本発明の態様である。該化合物の存在下でのバイオフィルム形成が、該試験化合物が存在しない場合より少ない場合には、該試験化合物は該基材表面上でのバイオフィルム形成に抑制活性を有し、並びに該化合物の存在下でのバイオフィルム形成が、該試験化合物が存在しない場合より多い場合には、該試験化合物は該基材表面上でのバイオフィルム形成に促進活性を有する。
【００７９】
基材表面上に存在するバイオフィルムの分散の試験化合物のスクリーニング方法は、上述の装置を得る工程と、バイオフィルム形成微生物を該装置のウェルの中で該基材表面上にバイオフィルムを形成する条件下で培養する工程と、該基材表面上のバイオフィルムを試験化合物に接触させる工程と、及び該試験化合物が存在する場合の該基材表面上のバイオフィルムの量と、該試験化合物が存在しない場合の該基材表面上のバイオフィルムの量とを比較する工程と、を含み、本発明の態様である。該化合物の存在下でのバイオフィルムの量が、該試験化合物が存在しない場合より少ない場合には、該試験化合物は該基材表面上でのバイオフィルムの分散に活性を有する。
【００８０】
本明細書で用いる全ての量、割合、百分率、及び比は、特に指定しない限り、重量に基づく。本明細書で引用したすべての米国特許は、参考として本明細書に組み込まれる。
【００８１】
長年にわたる特許法条約に従い、請求項を包含する本出願において用いられる用語「一（ａ）」及び「一（ａｎ）」は、「一以上」を意味する。
【００８２】
本明細書に記載される化合物は、従来の有機合成により調製することができ、これは当業者が過度の実験を行うことなく容易に入手可能である。具体的実施例については、本明細書の以下に記載する。
【実施例】
【００８３】
次の実施例は本発明の例示であり、本発明の範囲を限定することも、或いは制限することも意味するものではない。
【００８４】
種々の略語を本明細書で用いる。用い得る略語及びそれらの定義を以下の表１に示す。
【００８５】
【表１】
2004528356.tif 000004
【００８６】
（化合物合成実施例）
（実施例１）−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−（Ｓ）−（−）−２−アゼチジンカルボン酸（１）
【００８７】
【化３】
2004528356.tif 000005
（Ｓ）−（−）−２−アゼチジンカルボン酸（アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Company）、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）（１．００ｇ、９．８９ミリモル）を１２ｍＬの１：１のジオキサン：水に溶解する。トリエチルアミン（２．１ｍＬ、１４．８４ミリモル）を添加し、続いてＢＯＣ−ＯＮ（２．６８ｇ、１０．９ミリモル）を添加する。混合物を６．７５時間撹拌し、次に水（５０ｍＬ）に注ぎ、エーテルで抽出する（７回、各５０ｍＬずつ）。その水溶液を氷浴中で冷却し、氷冷した１ＮのＨＣｌ溶液でｐＨをおよそ２．５に調整する。得られた溶液を塩化メチレンで抽出する（３回、各５０ｍＬずつ）。組み合わされた有機抽出物をＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、及び減圧下で濃縮して油を生成する。ヘキサン（１００ｍＬ）をこの油に添加し、混合物を冷凍庫内に一晩置く。ヘキサンを静かに流し、生成物（１）を真空下で乾燥して白色の固体を生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+２０２．２
【００８８】
（実施例２）−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−（Ｓ）−（−）−２−アゼチジンカルボン酸ｎ−デシルアミド（２８５）
【００８９】
【化４】
2004528356.tif 000006
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−（Ｓ）−（−）−２−アゼチジンカルボン酸（１）（９０ｍｇ、０．４４７ミリモル）を周囲温度で塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解する。ｎ−デシルアミン（７２ｍｇ、０．４７０ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１６ｍｇ、０．８９５ミリモル）、及びＰｙＢＯＰ（２４４ｍｇ、０．４７０ミリモル）を連続的に添加する。反応物を室温で４日間攪拌し、次に減圧下で濃縮する。粗生成物を勾配溶離（ヘキサン中、１０％→６０％エチルアセテート）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物（２８５）を生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+３４１．４
化合物２８３、２８４、２８６を、ｎ−デシルアミンの代わりに、それぞれｎ−ヘキシルアミン、ｎ−オクチルアミン、ｎ−ドデシルアミンを用いて同様な方法で調製する。
【００９０】
（実施例３）−（Ｓ）−（−）−２−アゼチジンカルボン酸ｎ−デシルアミド（２８９）
【００９１】
【化５】
2004528356.tif 000007
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−（Ｓ）−（−）−２−アゼチジンカルボン酸ｎ−デシルアミド（２８５）（１６０ｍｇ、０．４７０ミリモル）を周囲温度で塩化メチレン（４ｍＬ）に溶解する。トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加し、この溶液を周囲温度で２時間攪拌する。該溶液を減圧下、４０℃で濃縮する。残留物を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液に注ぐ。飽和炭酸カリウム溶液によりｐＨを９に調整する。混合物を振盪し、層を分離する。水層を塩化メチレンで抽出する（３回、各５ｍＬずつ）。組み合わされた有機抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、及び減圧下で濃縮して所望の生成物（２８９）を固体として生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+２４１．２
化合物２８７、２８８、２９０を、それぞれ化合物２８３、２８４、２８６から同様な方法で調製する。
【００９２】
（実施例４）−Ｎ−（アセチル）−ＤＬ−プロリンｎ−デシルアミド（７）
【００９３】
【化６】
2004528356.tif 000008
Ｎ−（アセチル）−ＤＬ−プロリン（シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）、ミシガン州、セントルイス）（１００ｍｇ、０．６４ミリモル）を塩化メチレン（３ｍＬ）に周囲温度で溶解する。ｎ−ヘキシルアミン（７７ｍｇ、０．７６ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１８１ｍｇ、１．４０ミリモル）及びＰｙＢＯＰ（３９７ｍｇ、０．７６ミリモル）を連続して添加する。反応物を室温で１８時間攪拌し、次に減圧下で濃縮する。残留物を、勾配溶離（ヘキサン中、８０％→１００％エチルアセテート、続いてヘキサン中、５０％→１００％アセトン）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物（７）を生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+２４１．４
化合物８並びに９を、ｎ−ヘキシルアミンの代わりに、それぞれｎ−オクチルアミン、ｎ−デシルアミンを用いて同様な方法で調製する。
【００９４】
（実施例５）−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プロリンｎ−デシルアミド（１２）
【００９５】
【化７】
2004528356.tif 000009
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン（アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Company）、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）（１３７ｍｇ、０．６４ミリモル）を塩化メチレン（３ｍＬ）に周囲温度で溶解する。ｎ−デシルアミン（１２０ｍｇ、０．７６ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１８１ｍｇ、１．４０ミリモル）及びＰｙＢＯＰ（３９７ｍｇ、０．７６ミリモル）を連続して添加する。反応物を室温で４２時間攪拌し、次に減圧下で濃縮する。残留物を、勾配溶離（ヘキサン中、２０％→７０％エチルアセテート）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物（１２）を油として生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+３５５．２
化合物１０、１１，１５５、１６０を、ｎ−デシルアミンの代わりに、それぞれｎ−ヘキシルアミン、ｎ−オクチルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ドデシルアミンを用いて同様な方法で調製する。
【００９６】
化合物１５３、１５４、１５８、１５２、１５９を、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プロリンの代わりにＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリンを用いて、それぞれ、化合物１０、１１、１２、１５５、１６０と同様な方法で調製する。
【００９７】
（実施例６）−Ｌ−プロリンｎ−デシルアミド（３２）
【００９８】
【化８】
2004528356.tif 000010
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プロリンｎ−デシルアミド（１２）（１２０ｍｇ、０．３３９ミリモル）を塩化メチレン（４ｍＬ）に周囲温度で溶解する。トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加し、この溶液を周囲温度で２．５時間攪拌する。溶液を減圧下、４０℃で濃縮する。残留物を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液に注ぐ。飽和炭酸カリウム溶液によりｐＨを９に調整する。混合物を振盪し、層を分離する。水層を塩化メチレンで抽出する（３回、各５ｍＬずつ）。組み合わされた有機抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、及び減圧下で濃縮して所望の生成物（８０ｍｇ）を油として生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+２５４．８
【００９９】
化合物３０、３１、１６５、１６８を、それぞれ化合物１０、１１、１５５、１６０から同様な方法で調製する。
化合物１６３、１６４、１６６、１６２１６７を、それぞれ化合物１５３、１５４、１５８、１５２、１５９から同様な方法で調製する。
【０１００】
（実施例７）−（Ｒ）−（＋）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−ピペリジンカルボン酸ｎ−オクチルアミド（２２）
【０１０１】
【化９】
2004528356.tif 000011
（Ｒ）−（＋）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−ピペリジンカルボン酸（アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Company）、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）（１．００ｍｇ；４．３６ミリモル）を周囲温度で塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解する。ｎ−オクチルアミン（０．６２０ｇ、４．８０ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２４ｇ、９．６０ミリモル）、及びＰｙＢＯＰ（２．５０ｇ、４．８０ミリモル）を連続的に添加する。反応物を室温で２５時間攪拌し、次に減圧下で濃縮する。残留物を、勾配溶離（ヘキサン中、２０％→４０％エチルアセテート）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物（２２）を油として生成する。
ＩＳＭＳ：ＭＨ+３４１．２
化合物１９を（Ｒ）−（＋）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−ピペリジンカルボン酸の代わりに、（Ｓ）−（−）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−ピペリジンカルボン酸（アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Company）、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）を用いて、同様な方法で調製する。
【０１０２】
（実施例８）−（Ｒ）−（＋）−２−ピペリジンカルボン酸ｎ−オクチルアミド（２３）
【０１０３】
【化１０】
2004528356.tif 000012
（Ｒ）−（＋）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−ピペリジンカルボン酸ｎ−オクチルアミド（８）（１．００ｇ、２．９４ミリモル）を周囲温度で塩化メチレン（４０ｍＬ）に溶解する。トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を添加し、この溶液を周囲温度で７時間攪拌する。溶液を減圧下、４０℃で濃縮する。残留物を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液に注ぐ。飽和炭酸カリウム溶液によりｐＨを９に調整する。混合物を振盪して、層を分離する。水層を塩化メチレンで抽出する（３回、各５０ｍＬずつ）。組み合わされた有機抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、及び減圧下で濃縮して所望の生成物（２３）を固体として生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+２４０．８
化合物２０は化合物１９から同様な方法で調製される。
【０１０４】
（実施例９）−１−オクタノイル−（Ｒ）−（＋）−２−ピペリジンカルボン酸ｎ−オクチルアミド（２８）
【０１０５】
【化１１】
2004528356.tif 000013
（Ｒ）−（＋）−２−ピペリジンカルボン酸ｎ−オクチルアミド（２３）（１００ｍｇ、０．４１６ミリモル）を周囲温度で塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解する。トリエチルアミン（６３ｍｇ；０．６２４ミリモル）を添加し、この溶液を氷浴中で冷却する。塩化オクタノイル（７４ｍｇ、０．４５８ミリモル）を注射器により滴下する。溶液を１５分間撹拌し、次に周囲温度まで温める。追加した４．５時間の撹拌の後、溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液に注ぎ、塩化メチレン（２０ｍＬ）で抽出する。塩化メチレン抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、及び減圧下で濃縮する。残留物を、勾配溶離（ヘキサン中、０％→４０％エチルアセテート）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物（２８）を油として生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+３６７．４
化合物２１及び２４を、塩化オクタノイルの代わりに塩化アセチルを用いて、それぞれ化合物２０及び２３から同様な方法で調製する。
【０１０６】
（実施例１０）−（Ｓ）−（−）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−アゼパンカルボン酸ｎ−オクチルアミド（２）
【０１０７】
【化１２】
2004528356.tif 000014
（Ｓ）−（−）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−アゼパンカルボン酸（テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）（１９９４年）、３５（２）、２３７〜２４０に記載されているように調製される）（１．００ｇ、４．１１ミリモル）を、周囲温度で塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解する。ｎ−オクチルアミン（０．５８４ｇ、４．５２ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１７ｇ、９．０４ミリモル）、及びＰｙＢＯＰ（２．３５ｇ、４．５２ミリモル）を連続的に添加する。反応物を室温で２４時間攪拌し、次に減圧下で濃縮する。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２）を生成する。
【０１０８】
（実施例１１）−（Ｓ）−（−）−２−アゼパンカルボン酸ｎ−オクチルアミド（３）
【０１０９】
【化１３】
2004528356.tif 000015
（Ｓ）−（−）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−アゼパンカルボン酸ｎ−オクチルアミド（２）（１．００ｇ、２．８２ミリモル）を周囲温度で塩化メチレン（４０ｍＬ）に溶解する。トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を添加し、この溶液を周囲温度で７時間攪拌する。溶液を減圧下、４０℃で濃縮する。残留物を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液に注ぐ。飽和炭酸カリウム溶液によりｐＨを９に調整する。混合物を振盪し、層を分離する。水層を塩化メチレンで抽出する（３回、各５０ｍＬずつ）。組み合わされた有機抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、及び減圧下で濃縮して所望の生成物（３）を生成する。
【０１１０】
（実施例１２）−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリン１，１２−ジアミノドデカンビスアミド（２２５）
【０１１１】
【化１４】
2004528356.tif 000016
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリン（アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chemical Company）、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）（１６１ｍｇ、０．７４９ミリモル）を塩化メチレン（３ｍＬ）に周囲温度で溶解する。１，１２−ジアミノドデカン（７５ｍｇ、０．３７４ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５５ｍｇ、１．２０ミリモル）及びＰｙＢＯＰ（４０９ｍｇ、０．７８６ミリモル）を連続して添加する。反応物を室温で７時間攪拌し、次に減圧下で濃縮する。残留物を、勾配溶離（ヘキサン中、２０％→５０％エチルアセテート）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物（２２５）を生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+５９５．６
（実施例１３）−Ｄ−プロリン１，１２−ジアミノドデカンビスアミド（２２６）
【０１１２】
【化１５】
2004528356.tif 000017
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリン１，１２−ジアミノドデカンビスアミド（２２５）（１９０ｍｇ、０．３１９ミリモル）を塩化メチレン（４ｍＬ）に周囲温度で溶解する。トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を添加し、この溶液を周囲温度で１．７５時間攪拌する。溶液を減圧下、４０℃で濃縮する。残留物を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液に注ぐ。飽和炭酸カリウム溶液によりｐＨを９に調整する。混合物を振盪し、層を分離する。水層を塩化メチレンで抽出する（３回、各５ｍＬずつ）。組み合わされた有機抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、及び減圧下で濃縮して所望の生成物（２２６）を固体として生成する。ＩＳＭＳ：ＭＨ+３９５．４
【０１１３】
（分析参照実施例）
（主要な高生産性マイクロプレートスクリーニング方法）
記載される高生産性のスクリーニング方法は、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、またはその他の物質から製造される９６−ウェルのマイクロプレートに付け、その上にバイオフィルムを形成する細菌の能力、及びバイオフィルムは染色するがプラスチックは染色しないクリスタル・バイオレット（ＣＶ）のような染料により染色される細菌の能力に基づき、この方法では続いてエタノールによる染料の抽出、並びにマイクロプレートリーダーを用いた分光光度計による計量が行われる。
【０１１４】
こうしたスクリーニングの様々なバージョンが、幾つかの細菌種について詳しく記載されており（例えば、コーワン，Ｍ．Ｍ．（Cowan,M.M.）、及びフレッチャー，Ｍ．（Fletcher,M.）、１９８７年、微生物学的方法誌（J.Microbiol.Methods）７：２４１〜２４９；シー，Ｃ．（Shea,C.）及びウィリアムソン，Ｊ．Ｃ．（Williamson,J.C.）、１９９０年、バイオテクニック（Biotechniques）８：６１０〜６１１；オトゥール，Ｇ．Ａ．（O'Toole,G.A.）、及びコルター，Ｒ．（Kolter,R.）、１９８８年、分子微生物学（Mol.Microbiol.）２８：４４９〜４６１；ルー，Ｃ．Ｙ．（Loo,C.Y.）ら、２０００年、細菌学誌（J.Bacteriol.）、１８２：１３７４〜１３８２を参照のこと）、ほとんどいかなる細菌も使用できる。これらのスクリーニングはまた、酵母のような真菌に同様に使用するため、最適な染料及び成長培地を選択することにより改変することもできる。
【０１１５】
本発明は、簡単で迅速な自動化を促進するように設計された、改善されたスクリーニングに関する。それらは、バイオフィルムの形成を抑制または増加する化合物を発見するために、若しくは、更にバイオフィルムの分散を開始する化合物を発見するために用いることができる。スクリーニング方法はまた、バイオフィルム内に存在する細菌に対する殺生物剤またはその他の抗菌剤への感受性を測定するために用いることもできる。
【０１１６】
（参照実施例１）−バイオフィルムの形成を抑制する化合物についてスクリーニングする、バイオフィルム防止スクリーニング
緑膿菌株ＰＡＯ１（Ｒ２Ａ培地（微生物学的培地便覧（Handbook of Microbiological Media）；ＣＲＣプレス（CRC Press）、１９９７年、第２版、Ｒ．Ｍ．アトラス（R.M.Atlas）編集）中に成長し、Ｍｇ2+を除くが、０．３〜０．５％のフルクトース（ｐＨ７．０）及び３μＭの硫酸アンモニウム第１鉄を包含するように改変されている）、蛍光菌株ＡＴＣＣ１３５２５（Ｒ２Ａ培地中に成長し、Ｍｇ2+を除くが、０．３〜０．５％のピルビン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を包含するように改変されている）、表皮ブドウ球菌株ＡＴＣＣ３５９８４（ＴＳＢの１／４希釈液（微生物学的培地便覧（Handbook of Microbiological Media）；ＣＲＣプレス（CRC Press）、１９９７年、第２版、Ｒ．Ｍ．アトラス（R.M.Atlas）編集）中に成長し、１％フルクトース（ｐＨ７．０）及び３μＭの硫酸アンモニウム第１鉄を補充されている）から３ｍＬの一晩培養液を製造する。各種類の成長培地に、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を、１０ｍＭの最終濃度になるまで任意に添加する。
【０１１７】
ＰＳ、ＰＶＣ、またはＰＰ（好ましくはＰＰまたはＰＶＣ）の丸底の、１ウェル当たり１００μｌの上記のそれぞれの成長培地を含有する９６−ウェルのマイクロプレートに、試験される化合物（ＤＭＳＯ中に溶解されている）を添加して混合し、２５０〜５００μＭの最終濃度を得る。次にこれらのマイクロプレートは、同じそれぞれの成長培地中の化合物を連続的に希釈するため用いられ、例えば１６０μＭ及び３２μＭの同じ一揃いの化合物の最終濃度を含有するマイクロプレートを生じる。対照ウェルは、ＤＭＳＯのみを含有する希釈系に包含される。３ｍＬの一晩培養液から、三つの希釈プレートセット各々に、適切な培養液の同じ流体成長培地の１：１希釈液を、１ウェル当たり５μＬずつ接種する。覆いをしたプレートを、次に振盪しながら、３０℃（緑膿菌若しくは蛍光菌のため）または３７℃（表皮ブドウ球菌のため）、２００ｒｐｍ、１６〜２６時間、湿度が制御された環境で培養する。
【０１１８】
マイクロプレート表面に付いたバイオフィルム中に存在する細胞はＣＶにより染色されるが、これは、各ウェルから流体を取り除き、続いて１ウェル当たり１５０μｌのリン酸塩緩衝化生理食塩水溶液（ＰＢＳ）で３回濯ぎ（吸引及び添加）、１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳを最終的に添加した後に染色するか、または濯ぎなしに染色液を細菌培養液に直接添加して染色するかのいずれかによる。１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳまたは細菌培養液に、１％ＣＶ溶液（〜１０％エタノール中）２５μｌ／ウェルを添加する。室温で４５分間培養した後、染料溶液はプレートから取り除かれる。残留した染料は、脱イオン水流をプレートに満たし、及びプレートを４〜５回裏返しにすることにより、または自動ピペットを用いることにより、穏やかに濯いで、直ちに取り除く。濯いだプレートを、室温で０．５〜２時間、空気乾燥する。結合した染料を、１ウェル当たり１５０μＬの９５％エタノールの添加により抽出し、続いて１０〜１５秒間激しく撹拌し、室温で振盪せずに４５分間培養する。その後に、抽出されたＣＶの希釈していない試料または希釈した（エタノール中）試料のいずれかを、平底のポリスチレンのマイクロタイタープレートに移し、５８６ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。化合物を含有するウェルからの読みを、ＤＭＳＯのみを含有する対照ウェルからのデータの平均と比較する。複製試料を測定し、結果を複製ウェルのデータ点の平均として報告する。
【０１１９】
表２は本明細書に記載される化合物を用いて実行され、参照実施例１に指定された三つの細菌種のバイオフィルムに対して行われたバイオフィルム防止スクリーニングの結果を示す。データは、ＤＭＳＯの対照と比較し、各化合物の存在下に形成されたバイオフィルムの四通りの複製試料について平均した減少百分率により表されている。分析は指示された濃度の三つの化合物を用いて行われる。正の数は、化合物によるバイオフィルム形成の防止を示し、負の数は化合物によるバイオフィルム形成の増加を示す（変動係数百分率は、≦１０％である）。この表は、バイオフィルム形成の防止における、一以上の細菌種に対する特定の化合物の有効性を明らかに示している。
【０１２０】
【表２−１】
2004528356.tif 000018
【０１２１】
【表２−２】
2004528356.tif 000019
【０１２２】
【表２−３】
2004528356.tif 000020
【０１２３】
【表２−４】
2004528356.tif 000021
【０１２４】
【表２−５】
2004528356.tif 000022
【０１２５】
【表２−６】
2004528356.tif 000023
【０１２６】
【表２−７】
2004528356.tif 000024
【０１２７】
【表２−８】
2004528356.tif 000025
【０１２８】
【表２−９】
2004528356.tif 000026
【０１２９】
【表２−１０】
2004528356.tif 000027
【０１３０】
（参照実施例２）−既に形成されたバイオフィルムの分散を開始または促進する化合物についてスクリーニングする、バイオフィルム分散スクリーニング
参照実施例１のように、一晩培養液を製造し、１００μＬの成長培地を調合するが、参照実施例１で指定された条件を用いた細菌の接種及び成長の前には、化合物もＤＭＳＯも添加しない。
【０１３１】
ウェル中のバイオフィルムの成長後、流体を各ウェルから取り除き、続いて１ウェル当たり１５０μＬのＰＢＳにより一回濯ぎ、最終的に流体を取り除く。化合物の希釈液は、別々のマイクロプレート中で、参照実施例１に記載されたのと同じ方法を用いて製造され（ただし成長培地の代わりに１ウェル当たり、１００〜１５０μＬ量のＰＢＳを用いる）、続いて成長バイオフィルムを含有する濯いだウェルに添加するか、または各ウェルに添加するＰＢＳの１００〜１５０μＬ量に化合物を直接に添加するかのいずれかにより製造される。マイクロプレートは、次に２０〜２５℃で、２００ｒｐｍで振盪してまたは振盪せずに、０．５〜２４時間培養し、続いて参照実施例１に記載されているようにＣＶにより染色する。任意に、染色及び測定の前に、プレートを１５０μＬのＰＢＳで更に一回濯ぎ、続いて１〜１００ｍＭの水酸化ナトリウム溶液を添加し、２０〜２５℃で１５〜６０分培養する。次に、ＣＶによる染色及び測定を参照実施例１に記載されているように完了する。除去に対して抵抗する細菌バイオフィルムを用いるとき、この任意の二次的処置は、バイオフィルムを緩め、化合物の作用に対するスクリーニングの感受性を改善することを可能にする。
【０１３２】
（参照実施例３）−既に形成されたバイオフィルムの分散を開始または促進する化合物についてスクリーニングする、改善されたバイオフィルム分散スクリーニング
参照実施例２に開示された方法の変更は、分散スクリーニングの感度及び再生性を大いに改善するものであり、この明細書に開示する。この方法は、一つには、参照実施例２のようにＰＢＳ中で化合物により処置されたような栄養素不足のバイオフィルムが本質的に不安定であり、従ってバイオフィルム分散分析において多数の偽陽性の結果を生じる傾向があるという所見に基づいている。本明細書に記載される変更において、試験化合物がバイオフィルムの分散を始動しない限り、結果として得られるバイオフィルムが成長を続けるように、化合物は新しい流体成長培地の存在下で添加される。
【０１３３】
上記のように一晩培養液を製造し、１００μＬの適切な流体成長培地を、この方法により二重の９６ウェルのマイクロプレート中に調合し、分析される各細菌種のための二つの等しいマイクロプレートを設定する。化合物もＤＭＳＯも細菌の接種前には添加せず、参照実施例１で指定された条件を用いて、二重プレート中で２４時間成長を継続させる。
【０１３４】
ウェル中で試験されるバイオフィルムが成長した後、二重マイクロプレートの一つに付いたバイオフィルムの中に存在する細胞を、ＣＶで染色し、参照実施例１に記載されるように定量し、データを全プレートについて平均すると、結果として成長対照値、ｔ0となる。各マイクロプレート対の残りの複製を、ＤＭＳＯ中の化合物で、または対照ウェルとしてＤＭＳＯのみで処置するが、最初に細胞懸濁液をウェルから取り除き、次に新しい１００μＬ量の同じ適切な流体成長培地を添加し、続いて化合物のＤＭＳＯ溶液を直接添加及び混合することにより最終化合物濃度の３９０μＭを得る。次に化合物含有マイクロプレートの培養を、更に２２〜２６時間、参照実施例１に記載された同じ条件を用いて続ける。次に細胞懸濁液を取り除き、１ウェル当たり１００μＬの、ＰＢＳ中０ｍＭのＮａＯＨ溶液（表皮ブドウ球菌）、ＰＢＳ中２０ｍＭのＮａＯＨ溶液（蛍光菌）、またはＰＢＳ中３０ｍＭのＮａＯＨ溶液（緑膿菌）を添加し、室温で３０分間培養する。表皮ブドウ球菌に関しては、試験分析が表皮ブドウ球菌ベースでは増幅なしを示唆しているため、表皮ブドウ球菌懸濁液にはＮａＯＨを添加しない。マイクロプレートを、その後１ウェル当たり１５０μＬのＰＢＳで３回濯ぎ、続いて最終的に流体を取り除き、参照実施例１に記載されるようにＣＶで染色し、定量する。化合物を含有する各ウェルのデータが、結果として化合物の値、Ｒとなり、ＤＭＳＯのみを含有する対照ウェルのデータが平均され、第２の対照値、ｔ24を生成する。試験される各化合物のバイオフィルムの分散に対する効果は、二つの対照値と比較され、次のように計算される：
【０１３５】
【数１】
2004528356.tif 000028
及び
【０１３６】
【数２】
2004528356.tif 000029
表３は本明細書に記載される化合物を用いて実行され、参照実施例１に指定された三つの細菌種のバイオフィルムに対して行われたバイオフィルム分散スクリーニングの結果を示す。データは、二つの対照値と比較した、各化合物の存在下に形成されたバイオフィルムの、四通りの複製試料について平均した減少百分率により表されている。分析は、３９０μＭの化合物濃度を用いて、上記のように実行される。正の数は、化合物による既存のバイオフィルムの分散（減少）を示し、負の数は化合物による既存のバイオフィルムの増加（成長の刺激）を示す（変動係数百分率は、≦１５％である）。この表は、既存のバイオフィルム分散における、一以上の細菌種に対する特定の化合物の有効性を明らかに示している。
【０１３７】
【表３−１】
2004528356.tif 000030
【０１３８】
【表３−２】
2004528356.tif 000031
【０１３９】
【表３−３】
2004528356.tif 000032
【０１４０】
【表３−４】
2004528356.tif 000033
【０１４１】
【表３−５】
2004528356.tif 000034
【０１４２】
【表３−６】
2004528356.tif 000035
【０１４３】
（様々な硬い表面上に成長したバイオフィルムのスクリーニングモデル）
いかなる硬い表面上にも模範的バイオフィルムを成長させる定量的な方法が、バイオフィルムを制御する化合物、例えば参照実施例１を用いて発見できるような化合物の、有効性を試験する目的により開発されてきている。この方法はまた、バイオフィルム中に存在する細菌の、殺生物剤またはその他の抗菌剤に対する感受性を測定するために、及びバイオフィルムの分散を開始する化合物、例えば参照実施例２を用いて発見できるような化合物の有効性を測定するために用いることができる。定義されたバイオフィルムを表面上に成長させる、並びに試験する方法が、以前に記載されているが（例えば、米国特許第６，０５１，４２３号、第５，６０５，８３６号、第６，３２６，１９０号、米国特許出願公開第２００１／００４９９７５号、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／７７１６２、及びＥＰ１０３８９７２を参照のこと）、これらの方法は、多くの異なる表面への適用は可能ではなく、高生産性モードに適さない、容易に定量できない、或いはそれらが広く実施されることを制限するその他の特徴を有する。
【０１４４】
本発明は、ほとんどいかなる表面上（ポリマー、セラミック、金属、ガラス、複合材料、及び木材のような天然の表面）での、ほとんどいかなる細菌のバイオフィルムの成長にも適用できる方法に関し、この方法は定量的で、再現可能であり、及び高生産性にすることができる。本発明の方法はまた、酵母のような真菌に同様に使用するため、最適な染料及び成長培地を選択することにより変更することもできる。更に、本発明の方法は、シャワータイル表面、便器表面、皮膚表面、水道管、歯科用または医療用水道管、土壌試料などのような実世界の環境または自然環境に存在するバイオフィルムから得られる、天然の微生物接種材料の共同体に関して用いることができる。
【０１４５】
（参照実施例４）−個別のプラスチックバイアル瓶中の成長に基づく、バイオフィルムの成長及び試験方法
内部ネジ込み形キャップ及びＯリングを有する、ポリプロピレンの２ｍｌの極低温保存用バイアル瓶（コーニング（Corning）＃２０２７）を、シャワータイル、シャワー室のアクリルプラスチック、または便器の磁器の８ミリメートル円板をキャップの空洞に挿入することにより改変する。円板は、プラスチックキャップより直径を僅かに大きくするか、またはキャップの空洞に標準的シリコン接着剤を最初に適用するかのいずれかにより、キャップ内部の先端部とぴったり重なるように所定位置に固定する。最終結果は、図１に示すように、その上にバイオフィルムが成長できる均一な表面である。
【０１４６】
改変したバイアル瓶に、フルクトースまたはピルビン酸塩を補充した、０．５〜１ｍＬの変性Ｒ２Ａ培地（参照実施例１に記載されたように）を満たし、緑膿菌株ＡＴＣＣ１０１４５または蛍光菌株ＡＴＣＣ１３５２５の一晩培養液の５〜１０μＬを接種する。次に接種したバイアル瓶を、回転速度１〜３ｒｐｍに設定された、組織培養回転装置（ＶＷＲサイエンティフィック（VWR Scientific））に、２０〜２５℃で２４時間設置する。次に任意に、１ｍＬの流体培地を新しい培地に取り替え、さらに２４時間培養を継続するが、この培地の取り替え及び成長継続の手順は、所望の厚さのバイオフィルムを生成するため１〜３回行われる。
【０１４７】
成長後、バイアル瓶の底部を廃棄し、２００μＬの１％ＣＶ溶液（〜１０％エタノール中）を含有する新しいバイアル瓶の底部と取り替える。次にバイアル瓶に再度キャップをし、組織培養回転装置に再設置し、上記の設定で１５〜７５分間培養し、バイオフィルムを染色する。バイアル瓶のキャップを取り外し、四つの別々の脱イオン水中に静かに浸し、結合していないＣＶ染料を取り除き、続いて過剰の水をキャップ表面から取り除く。キャップ上の結合した染料は、次に、９５％エタノール中１％デオキシコール酸ナトリウム溶液の０．５〜１．０ｍＬ（及び染料の除去を補助するために、任意に直径１〜３ｍｍのガラスビーズ４〜６個）を含有する新しいバイアル瓶の底部にキャップをネジ込むことにより抽出する。その後に、参照実施例１に記載されるように、抽出したＣＶの希釈していない試料または希釈した（エタノール中）試料のいずれかを、平底のポリスチレンのマイクロタイタープレートに移し、５８６ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定する。
【０１４８】
表４は、標準的な白色の浴室タイルから作られた８ミリメートル円板を用いて、上記の蛍光菌について指定された成長及び定量条件を用い、バイオフィルムの成長の２４時間後に流体成長培地を１回取り替え、合計４８時間の成長により実行された、複製バイアル瓶分析による結果を示す。データは６個の複製につき、２００μＬの抽出された染料溶液について、５８６ｎｍで測定された光学密度として報告されている。対照バイアル瓶には、細菌を接種していないが、接種されたバイアル瓶と全く同じに処置されており、ブランクデータは、ＣＶ計量工程で緩衝液のみを含有したマイクロタイタープレートのウェルを表す。より小さい数は、バイオフィルムの成長がより少ないことを示す。該表は、この方法が対照と比較して良好な信号対雑音比をもつ再現可能なデータを結果としてもたらすことを示している。
【０１４９】
【表４】
2004528356.tif 000036
【０１５０】
（参照実施例５）−二部分成長試験槽配列に基づくバイオフィルムの成長及び試験方法
ポリプロピレンブロックを図２ａ、図３、及び図４に示すように機械加工し、参照実施例４に記載された極低温保存用バイアル瓶の底部の２４個を本質的に模倣した、２４個の個別の円筒形のウェルの配列を作成する（「ブロック底部」）。各ウェルは、Ｏリングまたはガスケットの座部を先端に提供するように機械加工されており、ウェルからウェルまでの間隔は、標準的な９６−ウェルマイクロプレートの間隔に適合するように設計されているため、流体操作にはマルチチャネルピペットを用いることができる。ポリプロピレンの別のブロックを機械加工して、図２ａ、図３、及び図４に図解されるように、１０８ｘ１０８ミリメートル表面（例えば浴室タイル、磁器、プラスチック、ガラス）に適合する埋め込み形の蓋を提供する（「ブロック上部」）。ブロック底部は、ブロック上部及び底部を一直線に合わせるための金属ピンを含有し、ブロック上部は、底部ブロックからのピンに適合するために開けられた穴を含む。ブロック上部はまた、埋め込み形の保持台の中に表面を留めるための位置決めネジを含む。更にブロック底部は、組織培養回転装置の電動部分に適合することを可能にする適応アームを含有する。表面が上部ブロックに取り付けられると、次に上部ブロックは、表面がＯリングまたはガスケットと接触するように底部と一直線に合わせられるが、このＯリングまたはガスケットが表面に封を提供する。上部及び底部ブロックを共にしっかりと留めて、Ｏリングに十分な圧力を提供し、封を作り出すために用いるネジに適合するネジ穴を、上部及び底部ブロックの両方の中に機械加工する。全体の組立部品は、従って、参照実施例３に記載されるような、バイアル瓶−キャップ組立部品の２４個を正確に模倣する。任意に、ブロックの設計は、その他の、より大規模な形式（４８または９６−ウェルのような）に適合するために容易に改変され得る。
【０１５１】
ブロック底部のウェルを、参照実施例１に記載される０．５〜１ｍＬの培地で満たし、及び参照実施例１に記載された細菌株の一晩培養液の５〜１０μＬを接種する。次にブロック底部と標準サイズの白色の浴室タイルを含有する上部を一直線に合わせて、共に留め、組立部品を、回転速度１〜３ｒｐｍに設定された組織培養回転装置（ＶＷＲサイエンティフィック（VWR Scientific））上に、または振盪培養器中に、適切な温度で２４時間設置する。次に任意に、各ウェル中の１ｍＬの流体培地を新しい培地に取り替え、及び更なる２４時間の培養を継続するが、この培地の取り替え及び成長継続の手順は、所望の厚さのバイオフィルムを生成するため１〜３回行われる。
【０１５２】
成長後、ブロック底部を取り外し、流体を取り除き、２００μＬの１％のＣＶ溶液（〜１０％エタノール中）に取り替える。次にブロックを再度組み立て、組織培養回転装置に再設置し、上述の設定で１５〜７５分間培養してバイオフィルムを染色する。ブロック部分を分解し、すべての結合していない染料が目視可能に取り除かれるまで、タイル表面を含有する上部ブロックを脱イオン水流で穏やかに濯ぐ。任意に、ブロック底部のウェルの面に吸収されたいかなる過剰の染料も試験管ブラシ及び市販の洗剤製剤を用いて取り除くが、これは時々生じる可能性のある非特定の染色に起因するいかなるバックグラウンドをも、減少するに役立つ。より迅速な別の方法として、染色されたブロック底部を、新しいまたは予め洗浄されたブロック底部と簡単に交換する。タイル表面に結合した染料は、次に９５％エタノール中１％デオキシコール酸ナトリウム溶液の０．５〜１．０ｍＬをピペットで各ウェルに注入し（及び染料の除去を補助するために、任意に直径１〜３ｍｍのガラスビーズ４〜６個）、ブロック上部及び底部を再度組み立て、組織培養回転装置に再設置し、続いて上述の設定を用いて０．５〜２時間培養するか、あるいは１〜５分間激しく撹拌するかのいずれかにより抽出する。その後に、参照実施例１に記載されるように、分解したブロックからピペットで取り出した、抽出されたＣＶの希釈していない試料または希釈した（エタノール中）試料を、平底のポリスチレンのマイクロタイタープレートに移し、吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定して対照と比較する。
【０１５３】
使用後、表面を取り外し廃棄して、ウェル８０／８５を、試験管ブラシ及び市販の洗剤製剤を用いて、再利用のため簡単に洗浄する。
【０１５４】
本成長及び試験方法は、バイオフィルムの形成を防止する化合物について試験することを記載しているが、最初に化合物が存在しない状態で単にバイオフィルムを成長させ、次にその後の化合物の添加の効果を測定することにより、バイオフィルムの分散を開始する化合物に関するスクリーニングに、本成長及び試験方法を容易に適用できることは、本開示の見地から当業者には明らかであろう。
【０１５５】
表５は、標準的な白色のつや消し浴室タイル上での、流体成長培地の二回交換を包含し、７２時間継続した蛍光菌のバイオフィルム成長に関する、記載された試験方法を用いて収集したデータを示す。ポリプロピレンブロックの上部及び底部を用いる。データは、接種されたウェルの１６個の複製、及び対照ウェルの８個の複製に対しての、２００μＬの抽出された染料溶液で５８６ｎｍで測定された光学密度として報告されている。対照ウェル（コラム５及び６）は、細菌を接種されていないが、接種されたウェル（コラム１〜４）と全く同様に処置される。より小さい数は、バイオフィルムの成長がより少ないことを示す。
【０１５６】
【表５】
2004528356.tif 000037
＊データが得られていない
【０１５７】
表６は、標準的な白色の光沢のある浴室タイル上での、流体成長培地の二回交換を包含する７２時間、表皮ブドウ球菌のバイオフィルムの成長についての記載された試験方法を用いて収集した、類似の光学密度データを示す。ポリプロピレンブロックの上部及び底部を用いる。データは、接種されたウェルの２０個の複製（コラム１〜５）、及び対照ウェルの４個の複製（コラム６）についての、光学密度測定値として報告されている。より小さい数は、バイオフィルムの成長がより少ないことを示す。
【０１５８】
【表６】
2004528356.tif 000038
＊データが得られていない
【０１５９】
表５及び表６は共に、上述の試験方法が複数の細菌種についての再現可能なバイオフィルムの成長を生じ、バイオフィルム制御化合物の有効性を試験するに好適であることを明らかに示している。
【０１６０】
（参照実施例６）−三部分成長試験槽配列に基づくバイオフィルムの成長及び試験方法
ブロックが貫通するように穴を開けることを除いて、参照実施例５のように、ポリプロピレンまたはテフロン（TEFLON（登録商標））ブロックを、図２ｂ、図３、及び図４に示されるように機械加工し、２４個の個別の円筒形のウェルの配列を作成する。図２ｂ、図３、及び図４に示されるように、上述の蓋組立部品（ブロック上部）と等しい二つの蓋組立部品が構築される。
【０１６１】
３Ｐ−ＧＣＡの使用は、流体成長培地がブロック底部のウェル中で取り替えられるとき、蓋組立部品のただ一つが取り外されることを除いて、参照実施例５に記載された２Ｐ−ＧＣＡにおける使用と同じである。敏感なバイオフィルムを調査する場合、この調整により、全体の方法を通じて敏感なバイオフィルムが全く妨げを受けないという利益がもたらされる。調査されるバイオフィルムが、妨害に対して敏感でない場合には、３Ｐ−ＧＣＡの更なる利益は、バイオフィルムの成長のために流体成長培地が両表面３０に接触するように、特に３Ｐ−ＧＣＡが組織培養回転装置に取り付けられている場合には、３Ｐ−ＧＣＡが各蓋組立部品９０の両表面３０上にバイオフィルムを成長させるために用いられ得るということである。
【０１６２】
２Ｐ−ＧＣＡ及び３Ｐ−ＧＣＡの両方が、成長培地組成物及び量、エアレーション（回転速度）、温度、培地の取り替え、接種材料の大きさ、若しくはその他の化学的、物理的、生物学的要因を最適化することにより、いかなる表面上にも、任意の細菌または真菌のバイオフィルムを成長させ試験するために十分に広い用途を有することは、本開示の見地から当業者には明らかであろう。
【０１６３】
表７は、標準的な白色のつや消し浴室タイル上で、流体成長培地の二回交換を包含する、７２時間の表皮ブドウ球菌のバイオフィルム成長について、上述の３Ｐ−ＧＣＡ方法を用いて試験した化合物を示す。ポリプロピレンブロック構成成分が用いられる。データは、試験される一化合物当たり、接種されたウェルの３個の複製について、接種された３個の対照ウェルの複製及び接種されていない３個の対照ウェルの複製と共に光学密度測定値として報告されており、コラム１（化合物３２）、２（化合物１６８）、３（化合物２２６）、４（接種された対照）、及び５（接種されていない対照）に対応している。より小さい数は、バイオフィルム成長の防止を示す。
【０１６４】
【表７】
2004528356.tif 000039
このデータから、化合物３２及び２２６は、明らかに強いバイオフィルム防止活性を有し、一方、化合物１６８は、この試験方法においてはるかにより穏やかな効果を有しており、この方法は、参照実施例１及び２に記載される方法に比べて大幅により現実的ではあるが、より低い生産性を有する。
【０１６５】
本成長及び試験方法は、バイオフィルムの形成を防止する化合物について試験することを記載しているが、最初に化合物が存在しない状態で単にバイオフィルムを成長させ、次にその後の化合物の添加の効果を測定することにより、バイオフィルムの分散を開始する化合物についてスクリーニングすることに、本成長及び試験方法を容易に適用できることは、本開示の見地から当業者には明らかであろう。
【０１６６】
本発明の特定の実施形態が例示され及び記載されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々なその他の変化及び改変が行われ得ることは、本発明の開示の見地から当業者には明らかであろう。そのため、本発明の範囲内にあるすべてのこうした変化及び改変を、添付の請求項の中に網羅することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】分析参照実施例４に記載された、プラスチック管に基づくバイオフィルムの成長及び発明の試験方法の面断面図である。
【図２ａ】分析参照実施例５に記載された、成長試験槽配列に基づくバイオフィルムの成長及び発明の試験方法の一実施形態の面断面図である。
【図２ｂ】分析参照実施例６に記載された、成長試験槽配列に基づくバイオフィルムの成長及び発明の試験方法の別の実施形態の面断面図である。
【図３】分析参照実施例５及び６に記載された、成長試験槽配列に基づくバイオフィルムの成長及び発明の試験方法の、二つの蓋の一つの平面図である。
【図４】分析参照実施例５及び６に記載された、成長試験槽配列に基づくバイオフィルムの成長及び試験方法の発明の中央部分の平面図である。
【図１】
2004528356.tif 000044
【図２ａ】
2004528356.tif 000045
【図２ｂ】
2004528356.tif 000046
【図３】
2004528356.tif 000047
【図４】
2004528356.tif 000048
【国際公開パンフレット】
2004528356.tif 000049
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【国際調査報告】
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