(57)【要約】本発明は、核酸の輸送とハイブリダイゼーションを遂行するために微小電気マイクロアレイを用いる遺伝子発現モニタリング法を提供する。細胞の集団、組織、又はその他の生物学的原料から、これらの方法に使用するためのｍＲＮＡ発現試料であって、生理的及び／又は病理的状態が異なり得る試料を得るための操作が記載されている。本発明は、生物学的物質の試料中に存在するｍＲＮＡから再利用可能な核酸転写物ライブラリーを作製するための方法を提供する。前記微小電気アレイ上での遺伝子発現のモニタリングを改善するために、前記転写物を増幅して所定の長さの試料核酸アンプリコンを得る。複数試料のアンプリコンが前記電気アレイ中の制御された部位に選択的にハイブリダイズされ得るので、異なる採取源から得られた前記ポリヌクレオチド集団の遺伝子発現プロフィールは、電気的ハイブリダイゼーション法を用いて、アレイフォーマットにおいて直接比較することができる。本発明は、電気的に補助されたプライマー伸長検出及び各検査部位ハイブリダイゼーション対照を用いて試料アンプリコンのレベルを検出する方法も提供する。本発明の改良法を用いて採集されたハイブリダイゼーションデータによって、ｍＲＮＡレベルの変化を前記生物学的原料中での前記コードされたタンパク質の対応する発現と相関させ、疾病における遺伝子発現の役割の研究を助けることが可能となるであろう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生物試料中に存在する少なくとも２つのｍＲＮＡ配列の相対量を検出する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生物試料からｍＲＮＡを単離することと、
（ｂ）各生物試料から少なくとも２つのｍＲＮＡ転写物を増幅してアンプリコンを得ることと（ここで、前記アンプリコンの長さは約３００塩基未満であり、前記増幅は線形増幅工程を備える）、
（ｃ）支持体の所定位置に結合された少なくとも２つのプローブに、工程（ｂ）で得た前記アンプリコンを電気的にハイブリダイズさせることと、
（ｄ）前記所定位置に結合されたプローブにハイブリダイズした各アンプリコンの量を検出することと
を備えた方法。
【請求項２】
少なくとも二つのｍＲＮＡ配列の相対量が少なくとも二つの試料中で検出され、工程（ｂ）の各試料に対して得られた各アンプリコンの群が、前記支持体上の電気的に制御された一群の所定位置へ選択的に電気的にハイブリダイズされる請求項１の方法。
【請求項３】
各試料に対する全てのアンプリコンの群が、検出工程（ｄ）に先立って電気的にハイブリダイズされる請求項２の方法。
【請求項４】
少なくとも２つのｍＲＮＡ配列の相対量が少なくとも１０の試料で検出される請求項２の方法。
【請求項５】
少なくとも２つのｍＲＮＡ配列の相対量が少なくとも５０の試料で検出される請求項４の方法。
【請求項６】
少なくとも５つのｍＲＮＡ配列の相対量が検出される請求項１の方法。
【請求項７】
少なくとも１０のｍＲＮＡ配列の相対量が検出される請求項１の方法。
【請求項８】
少なくとも２０のｍＲＮＡ配列の相対量が検出される請求項１の方法。
【請求項９】
少なくとも４０のｍＲＮＡ配列の相対量が検出される請求項１の方法。
【請求項１０】
少なくとも５０のｍＲＮＡ配列の相対量が検出される請求項１の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）において、前記生物試料から全ｍＲＮＡが単離される請求項１の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）において、前記生物試料からポリＡ  ｍＲＮＡが単離される請求項１の方法。
【請求項１３】
増幅工程（ｂ）が、工程（ａ）で単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する逆転写工程を備える請求項１の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）における増幅が、少なくとも２つのキメラプライマーを用いて前記ｃＤＮＡライブラリーの構成要素が増幅されるＤＮＡポリメラーゼ増幅工程をさらに備えた請求項１３の方法であって、各キメラプライマーが、目的のｍＲＮＡ配列のうちの一つに対して特異的な配列の上流にＲＮＡポリメラーゼ認識部位を備えた方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡポリメラーゼ増幅工程が線形である請求項１４の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）における増幅が、少なくとも一つの更なるプライマーを用いて前記ｃＤＮＡライブラリーの構成要素を増幅する幾何的ＤＮＡポリメラーゼ増幅工程をさらに備えた請求項１５の方法であって、少なくとも一つのプライマーが目的の各ｍＲＮＡ配列の一部に相補的であり、少なくとも一つのプライマーが目的の各ｍＲＮＡ配列の一部と同一である方法。
【請求項１７】
前記更なるプライマーが一群のランダムプライマー配列である請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記更なるプライマーがポリデオキシチミンプライマー配列である請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記更なるプライマーが目的の各ｍＲＮＡ配列に対して特異的な一群のプライマー配列である請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡポリメラーゼ増幅工程が幾何的である請求項１４の方法であって、少なくとも一つの更なるプライマーを用いて前記ｃＤＮＡライブラリーの構成要素が増幅され、少なくとも一つのプライマーが目的の各ｍＲＮＡ配列の一部に相補的であり、少なくとも一つのプライマーが目的の各ｍＲＮＡ配列の一部と同一である請求項１４の方法。
【請求項２１】
前記更なるプライマーが一群のランダムプライマー配列である請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記更なるプライマーがポリデオキシチミンプライマー配列である請求項２０の方法。
【請求項２３】
前記更なるプライマーが目的の各ｍＲＮＡ配列に対して特異的な一群のプライマー配列である請求項２０の方法。
【請求項２４】
前記キメラプライマーがアフィニティー部分で標識されている請求項１４の方法。
【請求項２５】
前記アフィニティー部分がビオチンである請求項２４の方法。
【請求項２６】
工程（ｂ）における増幅が、ストレプトアビジン及びアビジンからなる群から選択されるタンパク質を備えた表面上に、ＤＮＡポリメラーゼ増幅工程で得られた前記ＤＮＡを固定化することをさらに備えた請求項２５の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）における増幅が、ＤＮＡポリメラーゼ増幅工程で得られたＤＮＡのインビトロ転写をさらに備えた請求項１４の方法。
【請求項２８】
目的の前記増幅されたｍＲＮＡ配列がＩＩ型エンドヌクレアーゼ認識部位を備えた請求項１４の方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）における増幅が、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ消化工程をさらに備えた請求項２８の方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）における増幅が、インビトロ転写工程をさらに備えた請求項２９の方法。
【請求項３１】
工程（ｂ）における増幅がインビトロ転写工程を備えた請求項１の方法。
【請求項３２】
各アンプリコンの長さが約５０乃至約３００ヌクレオチドである請求項１の方法。
【請求項３３】
各アンプリコンの長さが約５０乃至約２００ヌクレオチドである請求項１の方法。
【請求項３４】
各アンプリコンの長さが約５０乃至約１００ヌクレオチドである請求項１の方法。
【請求項３５】
前記アンプリコンの長さの差が２０塩基未満である請求項１の方法。
【請求項３６】
前記アンプリコンの長さの差が１０塩基未満である請求項１の方法。
【請求項３７】
工程（ｄ）における検出が、標識ヌクレオチドを取り込ませるために前記アンプリコンがハイブリダイズされるプローブの酵素的伸長によって行われる請求項１の方法。
【請求項３８】
工程（ｄ）における検出が、前記アンプリコン中に取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することによって行われる請求項１の方法。
【請求項３９】
工程（ｄ）における検出が、
１）前記結合されたプローブにハイブリダイズした前記アンプリコンに、標識されたレポータープローブを電気的に又は受動的にハイブリダイズさせることと、
２）前記標識されたレポータープローブを検出することと
によって行われる請求項１の方法。
【請求項４０】
半導体チップ装置の電極上の浸透層に前記プローブが結合されている請求項１の方法。
【請求項４１】
工程（ｄ）における検出が、蛍光定量法、比色定量法、又は光度定量法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）による請求項１の方法。
【請求項４２】
前記検出が蛍光定量法による請求項４１の方法。
【請求項４３】
患者の生体試料から得られた核酸ライブラリーを保存し再使用する方法であって、
（ａ）患者の生体試料からｍＲＮＡを単離することと、
（ｂ）工程（ａ）で得た前記ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリーを作製することと、
（ｃ）目的のｍＲＮＡ転写物に対して特異的な配列の上流に位置するＲＮＡポリメラーゼ認識部位を備えた少なくとも一つのキメラプライマーと配列特異的プライマー及びランダムプライマーからなる群から選択される相補的核酸鎖に対する充填プライマーとを用いたＤＮＡポリメラーゼ反応であって、５’アフィニティー部分が標識されたキメラプライマーと５’アフィニティー部分が標識された配列特異的充填プライマーとからなる群から、使用する前記プライマーのうち少なくとも一つが選択されるＤＮＡポリメラーゼ反応によって、工程（ｂ）で得られたｃＤＮＡライブラリーを増幅することと、
（ｄ）アフィニティー結合部分で被覆された固相支持体に、工程（ｃ）から得られた増幅産物を結合させることと、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた前記結合した増幅産物をインビトロ転写反応用のテンプレートとして使用することと、
（ｆ）工程（ｅ）で得られた前記インビトロ転写産物を、前記固相支持体に結合された増幅産物から分離させることと、
（ｇ）工程（ｆ）で得られた前記結合した増幅産物を、少なくとも一つの更なるインビトロ転写反応用のテンプレートとして使用することと（ここで、得られたインビトロ転写産物の量は、工程（ｅ）で得られたものより著しく少なくはない）
を備えた方法。
【請求項４４】
工程（ｆ）と（ｇ）を反復することをさらに備えた請求項４３の方法。
【請求項４５】
工程（ｆ）と（ｇ）を反復することをさらに備えた請求項４４の方法。
【請求項４６】
工程（ｆ）と（ｇ）を反復することをさらに備えた請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記増幅された配列がＩＩ型エンドヌクレアーゼ認識部位を備え、前記方法が工程（ｅ）のインビトロ翻訳に先立ってＩＩ型エンドヌクレアーゼによって増幅産物を消化する工程をさらに備えた請求項４３の方法。
【請求項４８】
前記充填プライマーが配列特異的プライマーである請求項４３の方法。
【請求項４９】
前記充填プライマーがランダム配列プライマーである請求項４３の方法。
【請求項５０】
前記アフィニティー部分が、ビオチン、ハプテン、及び抗原性部分からなる群から選択される請求項４３の方法。
【請求項５１】
前記アフィニティー部分がビオチンである請求項４３の方法。
【請求項５２】
前記アフィニティー結合部分が、ストレプトアビジン及びアビジンからなる群から選択される請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記固相支持体が、常磁性ビーズ、ポリマービーズ、及び金属ビーズからなる群から選択される請求項４３の方法。
【請求項５４】
プローブ核酸配列への試料中に存在する核酸のハイブリダイゼーションの程度を検出する方法であって、
（ａ）支持体の所定位置に結合された核酸プローブへ、試料中に存在する前記核酸を電気的にハイブリダイズさせることと、
（ｂ）核酸ポリメラーゼ反応におけるテンプレートとして前記ハイブリダイズされた核酸を使用して前記結合されたプローブを伸長させることによって、伸長されたプローブに標識ヌクレオチドを取り込ませることと、
（ｃ）前記所定位置にある前記伸長された結合プローブ中に取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することと
を備えた方法。
【請求項５５】
前記標識ヌクレオチドが、蛍光部分、発色部分、化学発光部分、及びアフィニティー部分からなる群から選択される標識部分を含む請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記標識ヌクレオチドが蛍光部分を備える請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記核酸ポリメラーゼ反応がＤＮＡポリメラーゼ反応である請求項５４の方法。
【請求項５８】
前記核酸ポリメラーゼ反応が逆転写酵素反応である請求項５４の方法。
【請求項５９】
少なくとも一つの核酸を含有する試料中の少なくとも一つ目的の核酸配列の存在を決定するために、少なくとも二つの部位を備えた電気的に制御されるマイクロアレイ上で行われる核酸ハイブリダイゼーション反応アッセイにおける各検査部位に対する内部対照を与える方法であって、
（ａ）前記試料中に存在することが知られている第一の核酸配列に対して特異的な第一の核酸プローブと目的とする第二の核酸配列に対して特異的な第二の核酸プローブとからなる混合核酸プローブを、前記電気的に制御されるマイクロアレイ上の第一の検査部位へ付着させることと、
（ｂ）前記第一の核酸プローブと、前記目的の第二の核酸配列と同一であるか又は異なり得る目的の第三の核酸配列に対して特異的な第三の核酸プローブとからなる混合核酸プローブを、前記電気的に制御されるマイクロアレイ上の第二の検査部位に付着させることと、
（ｃ）前記第一及び第二の検査部位上の前記核酸プローブへ、少なくとも一つの試料から得られた前記試料核酸を電気的にハイブリダイズさせることと、
（ｄ）前記第一及び第二の検査部位にある前記第一の核酸プローブへの前記試料核酸のハイブリダイゼーションの程度を特異的に検出することと、
（ｅ）前記第一及び第二の検査部位にある前記第二及び第三の核酸プローブへの前記試料核酸のハイブリダイゼーションの程度を特異的に検出することと、
（ｆ）前記第一及び第二の検査部位にある前記第一の核酸プローブに対して得られたハイブリダイゼーション値を比較して標準化因子を得ることと、
（ｇ）（ｆ）で得られた前記標準化因子を用いて、前記第二及び第三のプローブに対して（ｅ）で得た前記ハイブリダイゼーション値を標準化することと
を備えた方法。
【請求項６０】
前記第一の核酸配列がハウスキーピング遺伝子をコードする配列であるか、又はハウスキーピング遺伝子をコードする配列と相補的な配列である請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記第一の核酸配列が、前記試料に添加された外来核酸配列である請求項５９の方法。
【請求項６２】
核酸ポリメラーゼ反応により前記第一の核酸配列を含有する前記試料核酸中に特異的に取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することによって、工程（ｄ）における特異的検出が行われる請求項５９の方法。
【請求項６３】
前記第一及び第二の検査部位において前記第一の核酸プローブにハイブリダイズした前記試料核酸に、前記第一の核酸に対して特異的な検出可能な部分を備えた第一のレポーター核酸を電気的に又は受動的にハイブリダイズさせる工程をさらに備え、（ｄ）における特異的な検出が前記検出可能な部分を検出することによって行われる請求項５９の方法。
【請求項６４】
前記第一の核酸プローブにハイブリダイズした前記試料核酸を核酸ポリメラーゼ反応用のテンプレートとして用いることによって、前記第一の核酸プローブを伸長する工程をさらに備え、（ｄ）における特異的な検出が前記ポリメラーゼ反応によって前記伸長された第一の核酸プローブ中に取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することによって行われる請求項５９の方法。
【請求項６５】
（ａ）に付着した前記第一の核酸プローブが前記プローブの酵素的伸長を妨げる保護基を含む請求項６４の方法。
【請求項６６】
核酸ポリメラーゼ反応により目的の前記第二及び第三の核酸配列を含有する前記試料核酸中に特異的に取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することによって、（ｅ）における特異的な検出が行われる請求項５９の方法。
【請求項６７】
前記第二の検査部位において前記第二の核酸プローブにハイブリダイズした前記試料核酸に、検出可能な部分を備えた第二のレポーター核酸プローブを電気的に又は受動的にハイブリダイズさせる工程をさらに備え、前記第二のレポータープローブが前記目的の第二及び第三の核酸配列に対して特異的であり、前記第二のレポータープローブが一以上のレポータープローブ配列を含有し、（ｅ）における特異的な検出が前記検出可能な部分を検出することによって行われる請求項５９の方法。
【請求項６８】
前記第二の核酸プローブにハイブリダイズした前記試料核酸を核酸ポリメラーゼ反応用のテンプレートとして用いることによって、前記第二及び第三の核酸プローブを伸長する工程をさらに備え、（ｅ）における特異的な検出が前記ポリメラーゼ反応によって前記伸長された第二及び第三の核酸プローブ中に取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することによって行われる請求項５９の方法。
【請求項６９】
（ｂ）に付着した前記第二の核酸プローブが前記プローブの酵素的伸長を妨げる保護基を含む請求項６８の方法。
【請求項７０】
第一の検出可能な部分が工程（ｄ）で検出され、第二の検出可能な部分が工程（ｅ）で検出される請求項５９の方法。
【請求項７１】
前記第一及び第二の検出可能な部分が、蛍光部分、発色部分、化学発光部分、及びアフィニティー部分からなる群から独立に選択される請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記第一及び第二の検出可能な部分が蛍光部分である請求項７１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、電気的マイクロアレイを利用して核酸の輸送及びハイブリダイゼーションを遂行する遺伝子発現モニタリング法を提供する。細胞の集団、組織、又はその他の生物学的原料から、これらの方法に使用するためのｍＲＮＡ発現試料であって、生理的及び／又は病理的状態が異なり得る試料を得るための操作が記載されている。本発明は、生体物質の試料中に存在するｍＲＮＡから再利用可能な核酸転写物ライブラリーを作製するための方法を提供する。前記マイクロ電気的アレイ上での遺伝子発現のモニタリングを改善するために、前記転写物を増幅して所定の長さの試料核酸アンプリコンを得る。複数試料のアンプリコンが前記電気アレイ中の制御された部位に選択的にハイブリダイズされ得るので、異なる採取源から得られた前記ポリヌクレオチド集団の遺伝子発現プロフィールは、電気的ハイブリダイゼーション法を用いて、アレイフォーマットにおいて直接比較することができる。本発明は、電気的に補助されたプライマー伸長検出及び各検査部位ハイブリダイゼーション対照を用いて試料アンプリコンのレベルを検出する方法も提供する。本発明の改良法を用いて採集されたハイブリダイゼーションデータによって、ｍＲＮＡレベルの変化を前記生物学的原料中での前記コードされたタンパク質の対応する発現と相関させ、疾病における遺伝子発現の役割の研究を助けることが可能となるであろう。
【０００２】
【発明の背景】
ヒトのゲノムには約１００，０００の遺伝子が含まれている。これらの遺伝子は、極めて異なるレベルで発現されている。すなわち、遺伝子種の大多数（９０％以上）は、１細胞当たり５〜１５コピーという低量で存在しているが、大量に存在する少数の遺伝子は１細胞当たり幾千ものコピーで発現される。基底発現レベルが異なることに加えて、遺伝子の発現は、細胞の状態や細胞の種類、細胞外の環境、疾患等に応答して調節される。従って、遺伝子レベルの変化に関する情報によって、ある条件下に生物体の病理学的及び／又は生理学的状態をさらに深く理解することが可能となる
現在、様々なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）種の発現レベルを分析する方法が多数存在する。様々な細胞群における遺伝子発現レベルの違いを分析するために、遺伝子発現のモニタリングの歴史における初期の頃には、サブトラクティブハイブリダイゼーションが用いられた（Ｓｃｏｔｔら）。この技術の感受性は不十分であるため、ポリヌクレオチド群中に低レベルで存在するメッセージを検出することができない。代表的な差の分析法は、最近、一部修正を加えられ、低いレベルで発現されるｍＲＮＡを検出するためにサブトラクションの後に増幅することを含んでいる（ＨｕｂａｎｋとＳｃｈａｔｚ）。この方法によれば、低いレベルで存在する発現が異なったメッセージを同定することができるが、増幅工程によって定量化が困難となる。
【０００３】
遺伝子発現の分野では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の改変が貴重であることが判明している。競合的ＰＣＲと組み合わせた逆転写（競合的ＲＴ−ＰＣＲ）は、標的ｍＲＮＡの配列とともに、既知量の外来ＲＮＡを同時に増幅することを含む（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら）。競合物質の濃度に基づいた滴定曲線から標的の量を推測する。この技術の問題点は、アッセイのダイナミックレンジの範囲が限られていること及び目的とする各標的に対して別々の競合物質を長時間かけて作成しなければならないことである。
【０００４】
リアルタイムのＰＣＲは、遺伝子発現モニタリングのための強力なアプローチである。元の方法では、臭化エチジウム及び改造サーモサイクラーを用いて増幅の間に二本鎖の種が蓄積されることを検出した（Ｈｉｇｕｃｈｉら）。非特異的な生成物を検出することが欠点であったが、当該標的が増幅される場合にのみ信号を作成するようにプローブをデザインすることによって、この欠点はその後克服された（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｌｅｅら）。このアプローチでは、豊富に存在する内部対照と、これよりずっと少ないレベルで存在する場合がある内在性の標的ｍＲＮＡとで増幅の直線レンジが類似していることが必要である。さらに、プライマーのデザインは重大であり、最適な効率のためには特別なソフトウェアプログラムが必要になる。
【０００５】
ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ（ｄｄ−ＰＣＲ）も、遺伝子発現のモニタリングのために適合させたＰＣＲに基づいた方法である。元のプロトコルでは、二つの異なる細胞群の全ｍＲＮＡを増幅するために、複数群の固定ランダムプライマーが用いられた。変性ポリアクリルアミドゲル上でＰＣＲ産物を分離してレベルの差を可視化する（Ｌｉａｎｇ及びＰａｒｄｅｅ）。このオリジナルの技術に対しては多くの変法が考案されている。しかし、一般的には、これらのＰＣＲに基づいた増幅方法は、バンドの強度とメッセージの量とに量的な相関性が欠如しており、再現性が一定せず、偽陽性のレベルが高い。従って、ｄｄ−ＰＣＲで作成した結果は、他の方法で確認しなければならない。
【０００６】
遺伝子発現連続分析法（ＳＡＧＥ）は、遺伝子発現をモニタリングする別の技術である。ある細胞群中のｍＲＮＡ転写物を一意的に同定する短い配列タグを単離し、鎖状につなぎ、クローン化し、配列を決定する（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら）。何れのタグの周波数も、対応する転写物の存在量を反映する。この技術は、強力ではあるがかなり複雑で、大量の配列データの生成及び分析を要し、前記増幅現象により定量化が偏る可能性がある。
【０００７】
本分野において最近開発されたものは、マイクロアレイの領域である（Ｓｃｈｅｎａら、ＤｅＲｉｓｉら、Ｚｈａｏら）。遺伝子に特異的なプローブを固形のマトリックス上に個々に配列して、対照群及び実験群から得た標識ｃＤＮＡとともにインキュベートする。プローブハイブリダイゼーションの強度と別の試料から採取した標的ｃＤＮＡの強度とを比較すると、対応するｍＲＮＡの発現に差があることが明らかになる。これらのアレイはストリンジェンシーの低い緩衝液中で受動的にハイブリダイズされるので、アレイ上の相補的プローブに対する適切な標的配列の利用可能性の差が均一でないこともある。さらに、各プローブのハイブリダイゼーションの特徴は、融解温度という事項及びプローブ−標的相互作用の親和性故に変化する。従って、これらの高密度マイクロアレイは高処理量を与えるが、様々なプロ−ブと標的の組み合わせ全てに関して、ハイブリダイゼーションの速度論が最適であるわけではない。
【０００８】
遺伝子発現の変化を検出する方法は、大きく前進してはいるが、前述したように、前記各方法には利点のみならず欠点もある。上記アプローチは全て、時間がかかり、若しくは複雑であり、大きな労働力を要し、又はこれらを併せ持っているという。複数のｍＲＮＡを同時にモニタリングすることができる迅速で高感度なアプローチがなお必要とされている。
【０００９】
【発明の概要】
本発明は、マイクロアレイフォーマット中に存在する相補的プローブに、標的ｍＲＮＡから得た増幅核酸を効率よく電気的にハイブリダイゼーションさせる方法を提供する。核酸のハイブリダイゼーションの輸送及び駆動に電界を使用することによって、ポリヌクレオチド群を迅速に分析することができる。米国特許第５，６０５，６６２号の記載にあるように、電気ハイブリダイゼーション装置を用いると、ハイブリダイゼーションアッセイは１〜５分ほどで完了する。さらに、マイクロアレイ上の各部位が個々に制御されるので、最適な条件下で、同一マトリックス上において様々な試料から得た標的を分析することができ、この技術特有の側面となっている。遺伝子発現モニタリング用途における電気ハイブリダイゼーション法及び装置の使用を改善することによって、開示した本方法は、配列特異的な最適化を最小限に抑えつつ、遺伝子発現の情報を迅速に作製する当業者の能力を劇的に増大させるであろう。
【００１０】
本発明の方法によって、研究及び臨床用途のための電気的にハイブリダイズした遺伝子発現モニタリングの使用が、幾つかの点で容易になるだろう。第一に、短縮した均一サイズのアンプリコンを使用することによって、本発明の方法は、クロスハイブリダイゼーション及び二次構造の形成からの干渉を最小限に抑えながら、比較及び定量的操作において多数の遺伝子を迅速かつ同時にモニタリングすることを可能とする。電気的アレイ中の各検査部位が選択的に制御され得るので、同一実験の同一マイクロアレイ上で幾つかの試料をスクリーニングし得るであろう。生物試料中の前記細胞のｍＲＮＡ発現レベルを決定する前記方法の好ましい実施例には、（ａ）少なくとも１つの生物試料からｍＲＮＡを単離することと、（ｂ）少なくとも２つの目的の遺伝子配列を前記単離したｍＲＮＡの集団から増幅して約３００未満の長さの短縮されたアンプリコンを得ることと、（ｃ）支持体の所定位置に結合した少なくとも２つのプローブに前記アンプリコンを電気的にハイブリダイズさせることと、（ｄ）前記所定位置の各プローブにハイブリダイズされた各アンプリコンの量を検出することとが含まれる。
【００１１】
本発明の一般的な方法の望ましい実施態様が幾つか同じように記載されているが、本発明の定量的な増幅工程には、前記生体試料から単離されたｍＲＮＡ群の逆転写から作成された一定量のテンプレートから、目的の配列を増幅する線形増幅工程が含まれることが好ましい。代表的な好ましいプロセスには、単一プライマーＤＮＡポリメラーゼ増幅及びインビトロ転写増幅が含まれる。所定の長さのアンプリコンを産生する「ブックエンディング」プライマーの対応対の使用を通じて、又は前記増幅過程において前記アンプリコンをある点で切断する内在性の又は導入されたＩＩ型エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって、前記増幅の間に前記アンプリコンを優先的に短くする。本発明の方法で使用するために生産された前記短縮アンプリコンの好ましい長さは、約５０から約３００塩基であり、さらに好ましい長さは約５０から約２００塩基、最も好ましい長さは約５０から約１００塩基である。
【００１２】
電気的に各別にコントロールされた検査部位のアレイ上で、本方法の電気的ハイブリダイゼーションのプロセスを実行し得るので、同一の電気的アレイ装置上で一回の実験を行う間に、複数の試料中の複数の遺伝子をモニターすることができる。一回の実験で試料の数が、少なくとも２つ又は少なくとも１０、或いは５０以上の場合にもアッセイし得る。同様に、一つの実験で少なくとも５又は１０、２０、４０、５０以上が同時にモニターされることもある。何万という検査部位を有する電気的マイクロアレイ装置が産生され、前記電気的ハイブリダイゼーションプロセスを１〜５分ほどで完了することができるので、前記アレイ上の検査部位の列に順次ハイブリダイズされた１００の異なる試料において、８０の遺伝子をモニターする実験を２〜３時間で完了し得る。
【００１３】
本発明の遺伝子発現モニタリング方法で使用し得る検出方法には、プライマー伸長標識、アンプリコン標識化、レポータープローブ検出、及びインターカレート色素をも含む、一般的に利用される核酸ハイブリダイゼーション相互作用検出方法が全て含まれる。これらの標識化方法における検出可能な部分は、フルオロフォア、又は化学発光、発色性、又はその他の検出可能な部分である。フルオロフォア部分の標識は、広く使用することが可能で、使用が比較的容易であるために、本発明に使用するのに好ましい。
【００１４】
第二の側面では、同一の試料核酸の再増幅を可能にすることによって、生体及び患者の貴重な試料の有効量と寿命を延長するために、ｍＲＮＡ試料から生産された再使用可能なビーズライブラリーの使用方法を本発明は提供する。本発明のこの方法の好ましい実施例には、（ａ）ｍＲＮＡを患者の試料から単離する工程と、（ｂ）前記単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを逆転写する工程と、（ｃ）目的のｍＲＮＡに特異的な配列の上流に位置する上流ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含有するプライマー及び充填プライマーを用いて前記ｃＤＮＡライブラリーを増幅する工程（ここで、前記プライマーのうち少なくとも１つはアフィニティ部分を含む）、（ｄ）（ｃ）で得た増幅生成物をアフィニティ結合部分でコートした固相支持体と結合する工程と、（ｅ）インビトロ転写反応のためのテンプレートとして、前記結合した増幅生成物を利用する工程と、（ｆ）工程（ｅ）で得たインビトロ転写生成物を、前記固相支持体に結合した前記増幅生成物から分離する工程と、（ｇ）工程（ｆ）で得た前記結合した増幅生成物を、さらに少なくとも１回行われるインビトロ転写反応のためのテンプレートとして利用する工程（ここで、産生されたインビトロ転写生成物の量は工程（ｅ）で産生された生成物よりも著しく少なくはない）とを含む。
【００１５】
さらに好ましい実施態様では、工程（ｆ）及び（ｇ）を１回又は２回、３回或いはそれ以上繰り返す。出願人らの観察したところによれば、連続的なインビトロ転写において産生された転写物の量は、その後の回に生産された転写産物量と比較して顕著に減少しているわけではに。次回に産生される転写産物の好ましい量は、前回の転写で産生された転写産物量の少なくとも約７０％、又はさらに好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは約９０％である。
【００１６】
本発明の前記再使用可能なライブラリー方法で使用するのに好ましいアフィニティ部分には、ビオチン、ハプテン、及び抗原性部分がある。ビオチンは特に好ましく、ビオチンをアフィニティ部分とする実施態様では、ストレプトアビジン及びアビジンが好ましいアフィニティ結合部分である。再使用可能なライブラリー方法で使用する好ましい固相支持体には、ビーズ、マイクロタイターウェル、及びピン等がある。代表的な好ましいビーズには、常磁性ビーズ、ポリマービーズ、及び金属性ビーズがある。
【００１７】
第三の側面では、プライマー伸長反応を用いて、さらなるレポータープローブの必要なしに前記電気的マイクロアレイへの標的配列のハイブリダイゼーションを検出し、又は前記標的配列を標識化する迅速な検出方法を本発明は提供する。本発明の該方法に関する好ましい実施例には、（ａ）所定部位で支持体に結合した核酸プローブに試料中の核酸を電気的にハイブリダイズさせる工程と、（ｂ）核酸ポリメラーゼ反応におけるテンプレートとして前記ハイブリダイズした核酸を使用して前記結合したプローブを伸長することによって、前記伸長したプローブ中に標識ヌクレオチドを取り込む工程と、（ｃ）前記伸長された結合プローブに取り込まれた前記標識ヌクレオチドを検出する工程とが含まれる。前記標識ヌクレオチドに対する好ましい標識部分には、蛍光部分、発色性部分、化学発光部分、アフィニティ部分が含まれる。特に好ましいのは蛍光部分である。前記方法に使用し得る核酸ポリメラーゼ反応には、ＤＮＡポリメラーゼ反応（ハイブリダイズされた核酸がＤＮＡである場合）及び逆転写酵素反応（ハイブリダイズされた核酸がＲＮＡの場合）がある。
【００１８】
本発明の第四の側面は、核酸を含有する試料中に核酸配列が存在することを決定するために、核酸ハイブリダイゼーション反応アッセイで用いる電気的に制御されたマイクロアレイ上の各検査部位に内部対照を提供する方法である。マイクロアレイの表面に前記試料及び試薬を割り当てるミクロ流体工学システムに起因する特有の不規則さのため、マイクロアレイ技術を実際に使用するには、前記内部対照が有用である。本方法の好ましい実施例には、（ａ）前記試料（例えば、内在性又はスパイクされた試料）中に存在することが知られている一番目の核酸配列に特異的な第一の核酸プローブと目的の第二の核酸配列に特異的な第二の核酸プローブとからなる混合核酸プローブを、電気的に制御されたマイクロアレイ上の第一の検査部位に付着させる工程と、（ｂ）前記第一の核酸プローブと前記第二の核酸配列と同一又は異なり得る目的の第三の核酸配列に特異的な第三の核酸プローブとからなる混合核酸プローブを、第二の検査部位に付着させる工程と、（ｃ）前記試料核酸を第一及び第二の検査部位上で前記核酸プローブと電気的にハイブリダイズする工程と、（ｄ）第一及び第二の検査部位において、前記第一の核酸プローブへの前記試料核酸のハイブリダイゼーションの程度を特異的に検出する工程と、（ｅ）第一及び第二の検査部位において、第二及び第三の核酸プローブへの前記試料核酸のハイブリダイゼーションの程度を特異的に検出する工程と、（ｆ）第一及び第二の検査部位において、第一の核酸プローブについて得られたハイブリダイゼーションの値を比較して標準化因子を得る工程と、（ｇ）（ｆ）で得た前記標準化因子を用いて、第二及び第三のプローブに関して、（ｅ）で得た前記ハイブリダイゼーションの数値を標準化する工程とを含む。
【００１９】
本発明の内部対照法の好ましい実施例では、関連試料細胞の種類を通じて定常状態レベルで維持されることが知られている内在性「ハウスキーピング」遺伝子配列を第一の対照配列として利用する。あるいは、外因性核酸配列が既知の濃度で前記試料に添加されることもある。第一及び第二及び第三の核酸プローブへの前記試料核酸のハイブリダイゼーションを特異的に検出するために利用される前記検出方法は、増幅した試料核酸を配列に特異的なプライマーで標識すること、プライマー伸長検出、結合した試料核酸へのレポータープローブのハイブリダイゼーション、又はこれらの組み合わせ等の任意の標準的な検出方法から独立に選択することができる。第一の核酸プローブへのハイブリダイゼーションが、第二及び第三の核酸プローブへのハイブリダイゼーションと識別可能な程度に検出できるように、容易に識別することができる２つの検出可能部分を使用することが望ましい。前記内部対照方法で使用するのに好ましい検出可能部分は、様々な発光波長を持つ蛍光部分である。あるいは、第一の選択的標識方法を実施した後に検出可能部分を使用して、まず第一の（対照）プローブへのハイブリダイゼーションの程度を決定した後、前記検出可能な信号の増加を測定することにより、同一の検出可能部分を使用して第二の選択的標識法を実行した後に第二及び第三のプローブへのハイブリダイゼーションの程度を決定してもよい。
【００２０】
【定義】
本明細書において「核酸」とは、デオキシリボ核酸及びリボ核酸ポリマー等、改変ＤＮＡ又はＲＮＡ等、合成オリゴヌクレオチド等、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ピラノシル核酸（ｐＲＮＡ）、並びにこれらの核酸の誘導体を含む任意の核酸ポリマーを意味する。
【００２１】
本明細書において「アンプリコン」とは、使用する増幅方法に応じて（例えば、ＤＮＡ  ＰＣＲはＤＮＡアンプリコンを与え、インビトロ転写はＲＮＡアンプリコンを与える。）ＲＮＡ又はＤＮＡの何れかであり得る増幅された核酸配列を意味する。増幅された核酸配列は、増幅が行われた元の核酸配列と同一の配列又は相補的な配列を備える。「短縮化されたアンプリコン（Ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）」とは、配列全体ではなく、完全な内在核酸配列の一部を含有するアンプリコンを意味する。
【００２２】
「電気的ハイブリダイゼーション」とは、ある領域内に核酸を濃縮して相補的な核酸をハイブリダイズさせるのに必要な時間を短縮するために電場を使用することを意味する。有利には、電気的ハイブリダイゼーションは、米国特許第５、６０５、６６２号に記載されているマイクロアレイ装置等の電気的に制御されるマイクロアレイ装置を用いて行われる。これらの装置は、浸透層によって又は緩衝液と電極との間でイオン交換を可能とするが緩衝液中の核酸と電極間の接触を抑制する物質の層によって被覆された各別に制御可能な電極を備えている。有利には、これらの電気的アレイ装置の浸透層内又は浸透層上の結合部分に、核酸捕捉プローブを付着させてもよい。
【００２３】
本明細書で使用する「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ等（スプライシングバリアントを含む）タンパク質をコードする生物の核酸配列又は分子遺伝学的操作によって作製されたそれらのコピー又は一部（ｃＤＮＡ、インビトロ転写されたＲＮＡ、クローニングされたＤＮＡ等）を意味する。本明細書で使用する「標的」とは、概ね目的の遺伝子を指す。
【００２４】
本明細書において広く使用される「増幅」には、分子遺伝学的操作を通じて（元のデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又は他の天然若しくは人工ヌクレオチド中の）核酸をコピーするための様々なプロセス及びプロセス群（逆転写、ＤＮＡポリメラーゼ反応、リガーゼ反応、インビトロ転写、及びこれらの組み合わせ）が包含される。「線形増幅（ｌｉｎｅａｒ  増幅）」又は「定量的増幅」とは、核酸又はその相補体のコピー数が、指数的にではなく時間の関数として線形に増加するように、実質的に一定量のテンプレートから核酸のコピーを生じせしめるプロセス及びプロセス群を指す。
【００２５】
【発明の詳細記載】
記載の方法は、とりわけ異なるポリヌクレオチド集団内の標的遺伝子の量との比較において、あるポリヌクレオチド集団中の標的遺伝子の量を決定するために設計されている。本発明の方法は、発現パターンの差を特定の生理及び／又は病理状態に相関させるためのデータを収集するのに特に適している。（米国特許第５、６０５、６６２号（その全体を本明細書に援用する）に記載されているもの等の）電気的核酸ハイブリダイゼーション技術及び装置は、様々な核酸ハイブリダイゼーションの操作を実施するのに必要な時間を劇的に減少させることができ、このため、様々な生物的アッセイ法のための極めて有用なツールである。本発明の方法によれば、生化学分野の当業者は、このツールをより完全に利用して、様々な生理的状態下にある生物中での遺伝子の発現を研究することが可能となる。
【００２６】
本発明の方法では、単細胞生物の細胞、インビトロ培養細胞株由来の細胞、及び多細胞生物の細胞又は組織を含む（これらに限定されない）任意の生体物質から得られたｍＲＮＡ集団から、標的遺伝子を定量的に増幅する。ある好ましい実施態様では、増幅された標的遺伝子（アンプリコン）は、ＩＩ型制限デンドヌクレアーゼを用いて酵素的に短縮される。別の好ましい実施態様では、短縮されたアンプリコンの作製は、増幅配列を「ブックエンド（ｂｏｏｋｅｎｄ）」する配列特異的なヌクレオチドによって媒介される。短縮されたアンプリコンは、目的の各標的遺伝子に対して特異的な相補的核酸を含むプローブを捕捉するために、電気的ハイブリダイゼーションによって分析される。これらの捕捉プローブは、好ましくは、マイクロアレイフォーマット中に固定化される。ハイブリダイズされた標的の検出は、捕捉プローブのプライマー伸長によって、又は標識された第２の相補種のハイブリダイゼーションによって、又はその他の手段によって実施し得る。
【００２７】
本発明の重要な側面は、同様のサイズ及び／又は長さが減少した標的核酸配列を作製することである。電気的ハイブリダイゼーションの効率性及び均一性は、標的のサイズが限定されると増加する。さらに、異なる標的の電気的な輸送及びハイブリダイゼーションの変動が減少するので、標的種のサイズが同様であれば、異なる標的の効率的な分析が促進される。さらに、調べている一（複数）の標的が、一本鎖核酸、特にリボ核酸を含んでいる場合には、長さを減少させることによって、二次構造の考慮は最小限で済む。このため、表１のデータに実証されているように、相対的に均一サイズの短縮された標的を利用することによって、電気的マイクロアレイ上での遺伝子発現モニタリングが向上する。
【００２８】
＜ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリーの調製＞
本発明の最初の工程は、目的の集団からポリヌクレオチド（通常はｍＲＮＡ）の試料を単離することである。ポリヌクレオチド集団は、インビトロで培養した細胞株から得られる様々な細胞種若しくは多細胞生物の臓器若しくは組織から得られる様々な細胞種、又は同じ種の異なる生物体から得られる同一の細胞種を含む（これらに限定されるものではない）様々な取得源に由来するものであり得る。前記ポリヌクレオチド集団は、インビトロ培養細胞株から又は成長、疾病、若しくは治療の異なる段階にある多細胞生物の臓器若しくは組織から得られる同一の細胞種に由来するものであってもよい。
【００２９】
分子遺伝学分野の当業者に周知の標準的な手段によって単離した後には、前記ｍＲＮＡ集団から一本鎖ｃＤＮＡを得るために逆転写を行う。ｃＤＮＡ合成は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。様々なｄＮＴＰ、緩衝液、及び逆転写活性を有する酵素は、様々な筋から市販されている。本出願人は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（ＴＭ）酵素系が最初のｃＤＮＡライブラリーを作製するのに非常に適していることを見出した。１ｓｔストランドの合成は、ポリアデニル化された全ＲＮＡ種にハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）プリマーによって行ってもよい。オリゴ（ｄＴ）プリマーは、通常、１０〜３０塩基長、より好ましくは１２〜１８塩基長であり、異なる長さのプライマーの混合物を含んでもよい。その他の適切なポリチミンプリマーには、米国特許第６、０２７、９２３号に記載されている複製不能ｄＴプライマー、及びオリゴ（ｄＴ）ｎＶ（Ｖ＝Ａ、Ｃ、又はＧ）プライマー等がある。
【００３０】
＜短縮されたアンプリコンの定量的作製：プライマー伸長及びインビトロ翻訳技術＞
本発明の転写−増幅の実施態様では、目的の各標的に対して特異的なキメラオリゴヌクレオチドを使用することによって、アンプリコンを作製する。ｃＤＮＡ合成に続き、ＤＮＡポリメラーゼを用いた一（又は複数）のキメラオリゴヌクレオチドのプライマー伸長によって、一（又は複数）の目的の標的を線形に増幅させ得る。ここに記載したプライマー伸長による、又はその他の手段（以下で使用されるインビトロ転写等）による線形増幅は、異なる試料間で定量的な比較を可能とするために必要である。前記キメラオリゴヌクレオチドの配列特異的部分は、ポリメラーゼ反応（ｃＤＮＡライブラリーから得られた場合にはＤＮＡポリメラーゼ）によるプライマー伸長の条件下で（分子生物学分野の当業者にとって周知である）、相補的な標的配列にアニールする程度に十分特異的である。目的の遺伝子配列に対する標的アンプリコンを作製するために、目的の各標的に対して特異的な一つのキメラオリゴヌクレオチドが使用される。これらのオリゴヌクレオチドは、５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有しており、該配列はＴ７、Ｔ３、ＳＰ６、又は別のＲＮＡポリメラーゼに対するコンセンサス結合部位であり得る。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位に隣接するのは、目的の標的遺伝子に特異的な配列である。該遺伝子特異的な配列の長さに制限はないが、目的とする一（又は複数）の標的への前記一（又は複数）のキメラオリゴヌクレオチドの効率的なアニーリングを促進するためには、前記遺伝子特異的な配列は、好ましくは、１５乃至３５塩基の長さであろう。前記オリゴヌクレオチドは、５’末端にビオチン部分を含有してもよいし、あるいは修飾を受けていなくてもよい。短縮されたアンプリコンの作製のためにＩＩ型エンドヌクレアーゼを用いる実施態様では、前記キメラプライマーは、３’末端に、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を含有してもよいであろう。
【００３１】
標的の調製に使用するキメラオリゴヌクレオチド群は、一般的には少なくとも２つの異なる標的種に相当するものであろうが、１０、２０、４０、又は時には最大５０の異なる標的種に相当するものであってもよい。およそ５０を超える異なる標的種になると、現在利用可能な増幅技術を用いた場合、増幅効率と結果の定量的な性質が損なわれるかもしれない。しかしながら、可能性としては、８０、９０、又は１００を超える特異的遺伝子を同時に測定するために改良増幅技術とともに本発明を使用することも、本方法によって意図されている。典型的には、前記キメラオリゴヌクレオチドは、実験条件下（例えば、細胞のタイプ、又は単一の細胞種に対する２つの異なる刺激）で異なって発現されることが知られた又は疑われている標的を代表するように選択されるか、又は発現データが得られない標的を代表するものであってもよい。前記群中のキメラオリゴヌクレオチドのうちの一つは、調べている様々な条件において同様のレベルで発現されることが知られているハウスキーピング遺伝子のレベル又は加えた外来対照配列のレベルの分析を可能とするように選択される。
【００３２】
一般的に使用されるハウスキーピング遺伝子の例には、グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素（ＧＡＤＰＨ）、β−アクチン、及びリボソームＲＮＡが含まれる。対照は、既知の濃度で初発物質に添加され、目的の標的とともに処理される外来配列を含んでもよい。このような配列の例は、βラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性を与える原核生物遺伝子）である（概説として、Ｒｉｅｓｃｈｌ，Ｕ．  ａｎｄ  Ｋｏｃｈａｎｏｗｓｋ，Ｂ．（１９９９）“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ”  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｐｐ．３−３０）．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；及びＦｅｒｒｅ  Ｆ．（１９９２）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｏｒ  ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ：Ｒｅａｌｉｔｙ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍｙｔｈ．  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．２，１−９）。既述の前記方法を実施する際に使用する具体的な対照配列の選択は、使用する生物、研究する細胞、及び構成的に発現された配列に対する研究者の習熟度に応じて、ケースごとに異なるであろう。しかしながら、与えられたガイドラインを用いれば、当業者は、本方法において対照として使用するための内在又は外来配列を容易に選択することができるだろう。
【００３３】
単一プライマー伸長は、好熱性のＤＮＡポリメラーゼ、通常は３’−５’エキソヌクレアーゼを欠いたポリメラーゼ誘導体（例えば、Ｖｅｎｔ（登録商標）Ｒ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ）によって誘導され得る。変性、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによって誘導されたプライマーの伸長が繰り返して行われる前記伸長反応の間に、一（複数）の標的の複数コピーが生じる。ｃＤＮＡプールから一（又は複数）の標的の一本鎖コピーを複数得たら、続いて、相補鎖を作製する。ある実施態様では、相補鎖の作製は、増幅された全ての標的に結合する共通のプライマーによって媒介される。該プライマーは、１ｓｔストランド  ｃＤＮＡ合成に使用されるオリゴ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドであり得、そのうち僅かな部分は、１ｓｔストランド  ｃＤＮＡ合成反応からプライマー伸長反応へと持ち越される。あるいは、前記プライマーは、ランダムな短いポリヌクレオチド配列（例えば、ランダムヘキサマープライマー）の混合物であり得る。該実施態様において、前記プライマーは、２ｎｄストランドの合成に使用されるプライマーのＴｍに相当する温度でアニールすることができる。別の実施態様では、目的とする各標的に対する遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドが用いられ、以下でさらに説明されているように、「ブックエンド」産物を与える。該プライマーは、一般に１５−３０塩基の長さであり、２ｎｄストランドが所定長のアンプリコンを与えるように、前記増幅された標的内の特異的な部位にハイブリダイズするであろう。前記プライマーは５’末端にビオチン部分を含有してもよいし、修飾を受けていなくてもよい。プライマーは、プライマー群中の最も低いＴｍで又はＴｍより僅かに低い温度でアニールさせる。プライマーがアニールするのに十分な時間を経た後、温度を上昇させ、好熱性ＤＮＡポリメラーゼによる前記プライマーの効率的な伸長を可能とさせる。
【００３４】
＜ＩＩ型エンドヌクレアーゼ切除又はブックエンディングによるアンプリコンの短縮化＞本発明に使用するアンプリコンは、好ましくは、約３００塩基未満、より好ましくは約２００塩基未満、最も好ましくは約１００塩基未満である。アンプリコンは捕捉プローブに特異的にハイブリダイズするのに十分なサイズでなければならないので、アンプリコンは、好ましくは１５塩基長より長く、より好ましくは少なくとも約５０塩基長である。さらに、本発明の方法に使用するアンプリコンの長さは著しく異なってもよいが、同じような長さであることが好ましく、長さの差は２０塩基未満、より好ましくは１０塩基未満であることが好ましい。短縮されたアンプリコンの作製は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼの使用を通じて、又は一続きの標的配列を「ブックエンド」するようにデザインされたプライマーを使用することによって達成し得る。以下には両方法が記載されているが、当業者によって他の方法も考案され得るかもしれない。定量的に増幅された短縮核酸が試料のｍＲＮＡから得られる限りは、別の増幅法によって作製した短縮アンプリコンを本発明の方法で使用することも本発明の範囲に属する。
【００３５】
第一の方法では、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって標的核酸配列の短縮を行う。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、前記認識部位から所定の距離で切断するので、その後各標的を単離し定量するために使用することができる遺伝子特異的な「タグ」を与える。該実施態様では、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、増幅用に使用されるキメラオリゴヌクレオチドの３’末端又は３’末端近傍に取り込まれる（上記）。可能な場合、該配列は目的とする一（又は複数）の標的中に存在し、一（又は複数）の前記キメラオリゴヌクレオチドは内在制限エンドヌクレアーゼ認識配列を用いるように設計されるであろう。この場合、前記一（又は複数）のオリゴヌクレオチドの遺伝子特異的な部分は、制限エンドヌクレアーゼ認識部分及び前記認識部位の５’の十分な隣接配列にアニールして、切除時に所望の長さのアンプリコンを与えるであろう。
【００３６】
内在性ＩＩ型制限酵素認識部位が目的の標的中に存在しない場合には、所望の部位に可能な限り似た標的内配列を選択する（エンドヌクレアーゼの認識部位の３’末端に完全に適合する配列が好ましい）。次いで、プライマー伸長の間に標的配列を変化させることによって、所望の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を生じさせるようにキメラオリゴヌクレオチドが設計されるであろう。このような改変には、増幅された標的中にＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作出するのに必要なようにヌクレオチドを変化、挿入、又は欠失させることを含み得る。
【００３７】
キメラオリゴヌクレオチドの３’末端への制限エンドヌクレアーゼ認識部位の近さは、部位が目的の標的内に存在するか、又はこのような部位がキメラオリゴヌクレオチド内に作出されなければならないかによって、ある程度は決められるであろう。内在性部位が使用されれば、前記キメラオリゴヌクレオチドは、前記制限エンドヌクレアーゼ認識部位の最後の塩基対で終了するか、又は別の標的特異的配列を含み得る。制限エンドヌクレアーゼ認識部位を与えるように標的配列を改変しなければならない場合には、キメラオリゴヌクレオチドは、（必ずというわけではないが）一般に、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を越えて伸長して、変異を受けたオリゴヌクレオチド配列が前記標的に効率的にアニールすることを可能とする。伸長がある場合には、ＩＩ型エンドヌクレアーゼによる切断時に十分な標的配列が確実に保持されるようにするために、２〜３塩基（ａ  ｆｅｗ  ｂａｓｅｓ）の長さにすぎないことが好ましいであろう。
【００３８】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって、ＩＩ型制限酵素認識部位とＩＩ型制限酵素切断部位の間に位置する標的特異的な配列に加えて、キメラプライマー内に含有される標的特異的な配列が後置されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有する標的断片を与えるであろう。キメラオリゴヌクレオチドが５’末端にビオチン部分を含有するのであれば、この時点で、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズを用いて、消化された断片を単離してもよいし、あるいは、制限酵素消化に先立って精製するために、ストレプトアビジンで結合された磁気ビーズにＶｅｎｔで増幅された物質を付けることもできる。増幅された一本鎖産物を充填する（ｆｉｌｌ  ｉｎ）ためにビオチン化された３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用するのであれば、消化に先立って、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに標的を付けることによって、任意の非特異的な物質から単離することができる。酵素消化に引き続き、増幅された標的のビーズが結合した３’末端から標的の５’末端を離すことができる。
【００３９】
消化に引き続き、ＲＮＡポリメラーゼによって媒介されるインビトロ転写反応におけるテンプレートとして標的断片を使用する（ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列は、キメラオリゴヌクレオチドを介して取り込まれる）。インビトロ転写の標準的な方法は、当業者に公知である。増幅された標的を作製するためにビオチン化されたキメラオリゴヌクレオチドを使用した場合には、複数回のインビトロ転写を行うことができる。ビーズが結合したテンプレートは将来のインビトロ転写反応のために使用することもできる。次いで、インビトロ転写されたテンプレートを清浄にし、ゲル濾過カラムを含む（これに限定されない）任意の標準的な方法によって脱塩する。
【００４０】
別の方法では、エンドヌクレアーゼ消化ではなくオリゴヌクレオチドプライマーを介して、短縮された標的を得る。一（又は複数の）増幅された一本鎖標的を充填するために、オリゴ（ｄＴ）、ランダムプライマー、又は遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いた場合には、充填反応の後にインビトロ転写反応を行う。２ｎｄストランドを得るために遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを使用する場合には、５’末端から所定の長さの箇所に位置する（一般的には、約３００塩基対未満離れている）標的内の配列にハイブリダイズするように該プライマーを設計する。この「初期ブックエンデイング」実施態様では、電気的ハイブリダイゼーションによって前記増幅された物質を直接分析できるように、インビトロ転写反応で生じたＲＮＡは、十分に短縮される。あるいは、ｃＤＮＡ産生及び遺伝子特異的プライマー又はランダムプライマーを用いたＤＮＡポリメラーゼを介した増幅に前記短縮されたＲＮＡ産物を別途供してもよい。
【００４１】
前記増幅された一（又は複数）の標的を充填するためにオリゴ（ｄＴ）又は一群のランダム配列が使用される場合には、インビトロ転写によって様々な長さのＲＮＡが得られると思われ、（以下に記載されているように）短すぎて電気的ハイブリダイゼーションに使用される捕捉オリゴヌクレオチドによって認識され得ないものや、長すぎて効率よく電気的に輸送及びハイブリダイズされ得ないものがあるだろう。これらの一（又は複数）の標的の検出を向上させるためには、インビトロ転写反応から得られたＲＮＡは、第二のｃＤＮＡ合成反応のためのテンプレートとして使用される。該方法の場合、目的の各標的に対して特異的な遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡを合成を開始する。一般に、該プライマーは１５−３０塩基長であり、前記第二のストランドが所定の長さ、一般的には約３００塩基対未満、より好ましくは約５０〜約３００塩基、より好ましくは約５０〜約２００塩基、最も好ましくは約５０〜約１００塩基になるように、前記プライマーは、前記増幅された標的内の特定の部位にハイブリダイズするであろう。該逆転写反応は、上述のように、当業者に公知の試薬や方法を用いて行われる。該反応の産物は、目的の各標的に対する短縮されたアンプリコンを含んでいるであろう。
【００４２】
＜短縮されたアンプリコンの電気的ハイブリダイゼーション＞
一（又は複数）の標的の分析は、電気的ハイブリダイゼーションを用いてマイクロアレイ上で行われる。具体的な電気的ハイブリダイゼーションの操作とプローブの付着は、装置毎にほとんど同じであり、生化学分野の同業者によって、下記の論述から改変することができるであろう。例示の目的で、図２に図示されたものと類似のＮａｎｏＣｈｉｐ（ＴＭ）電気的ハイブリダイゼーション装置を参照しながら説明する。しかしながら、電気的に割付可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｌｅ）微量生化学反応用の他の装置を使用して本発明の方法を実施してもよい。
【００４３】
米国特許第５、６０５、６６２号（その全体を参考文献として本明細書に援用する）に記載されているように、電気的マイクロアレイ表面上の浸透層との相互作用を介して捕捉プローブを固定化する。前記捕捉プローブが５’末端にビオチン部分を含有し、前記浸透層内にストレプトアビジンが取り込まれているストレプトアビジン−ビオチン相互作用を含む（これに限定されるものではない）様々な異なる方法によって、プローブの安定な相互作用を達成し得る。
【００４４】
電場輸送を用いて、目的の各標的に対して特異的なビオチン化捕捉プローブが前記マイクレアレイ上の異なる位置（すなわち検査部位）に固定化される（すなわち、電気的に検査部位に割り付ける）。ハイブリダイズしたアンプリコンを定量するためにプライマー伸長検出法を使用する場合には、捕捉プローブの３’リン酸上にビオチン標識が存在する必要はなく、このため、ポリメラーゼ反応における伸長にリン酸を利用することが可能となる。ＩＩ型エンドヌクレアーゼによる短縮を使用する実施態様では、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位とＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ制限部位の間にある標的配列に相補的となるようにこれらの捕捉プローブを設計する。前記捕捉プローブは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列及び上流配列を含む標的特異的配列をさらに含有してもよい。ブックエンディングプライマーを使用する実施態様では、一本鎖の増幅産物を充填し及び／又はｃＤＮＡを得るために使用されるキメラオリゴヌクレオチド及び遺伝子特異的オリゴヌクレオチドに対する結合部位に隣接した領域にハイブリダイズするように捕捉プローブを設計する。一般的には、前記捕捉プローブは約１８乃至約３０塩基を含むであろうが、電気的ハイブリダイゼーション操作とともにこれより短い又はこれより長い捕捉プローブを使用してもよい。捕捉プローブは、郵便番号方式によるプローブの割付で使用するために又は他の用途（例えば、選択的切除のための制限エンドヌクレアーゼ部位）のために非アンプリコン相補配列を含んでもよい。
【００４５】
好ましい実施態様において、対照配列に対して相補的な捕捉プローブがマイクロアレイの一以上の位置に割り付けられる。該対照配列は、検査を受ける様々な条件下で同じようなレベルで発現されるハウスキーピング遺伝子であってもよいし、又は増幅の前若しくは後に前記試料核酸混合物に添加される外来配列であってもよい。好ましい実施態様において、前記ハウスキーピング遺伝子に対して相補的な捕捉プローブは、各標的特異的な捕捉プローブと組み合わされ、該２つのプローブをマイクロアレイ上の所定の位置に同時に割り付ける。該実施態様によって、マイクロアレイの各位置を標準化し、より良好な定量的結果を得ることが可能となる。、流れのパターンや貯留（ｐｏｏｌｉｎｇ）等のために、試料核酸溶液を供給するために使用されるミクロ流体工学によって試料核酸溶液への各検査部位の曝露に変動が生じる。このため、各検査部位に位置する内部対照プローブを使用することによって、各検査部位の微小環境に関するアッセイデータを標準化することが可能となる。
【００４６】
続いて、短縮されたアンプリコン（インビトロ転写された一（又は複数）の標的テンプレート、又はそのｃＤＮＡコピー）のプールを前記固定化された捕捉プローブに電気的にハイブリダイズさせる。アレイ上の部位は電気的に制御されるので、ハイブリダイゼーションをマイクロアレイ内の一部の位置に限定することができる。このように、異なる試料に由来する短縮されたアンプリコンの異なるプールを同一のマイクロアレイ上で分析することができる。これらの実験の場合、ある条件、細胞種、又は他の採取源から得られた短縮されたアンプリコンの１つのプールを電気的ハイブリダイゼーション装置に注入し、前記マイクロアレイ内の一部の位置へ電気的に輸送し、その位置に存在する特異的な固定化捕捉プローブとハイブリダイズさせる。続いて、この標的プールを除去し、未結合の核酸を洗浄除去し、異なる条件、細胞種、又は他の採取源から得られた第二の標的のプールを注入し、同一の固定化標的特異的捕捉プローブを含有するマイクロアレイ内の異なる位置の一部へと電気的に輸送する。該第二の標的プールをハイブリダイズさせ、洗浄によって未結合の物質を除去する。続いて、様々な検出方法のうちの一つによって、ハイブリダイズした標的種を検出する。
【００４７】
同一のマイクロアレイ上で、異なる標的試料から得られた一群の標的を直接分析することを可能とする該操作は、遺伝子発現プロファイリングの分野における電気的ハイブリダイゼーションにとりわけ強みを示す。本発明の方法を用いれば、少なくとも２つ、少なくとも１０、時には５０以上もの試料を当業者が単一の実験でアッセイすることが容易となる。該方法の結果は、同一のチップ上にある二群のｍＲＮＡアンプリコン（一方の試料はリポポリ多糖で処理した単球から単離され、他方の試料は未処理の単球から単離された）のハイブリダイゼーションを示す図６に示されている。あるいは、異なるアンプリコンの試料中の発現パターンを分析するために、異なる電気的マイクロアレイを使用することも可能である。
【００４８】
＜電気的マイクロアレイ上にハイブリダイズしたアンプリコンの検出＞
一（又は複数）の標的を固定化捕捉プローブに電気的にハイブリダイズさせた後、プライマー伸長標識、アンプリコン標識（好ましくは、標識された配列特異的プライマー）、レポータープローブの検出、及び挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）色素等の一般的に用いられる全ての核酸ハイブリダイゼーション相互作用検出法を含む複数の手段によって結合した一（又は複数）の標的を検出し得る。これらの標識法における検出可能な部分は、フルオロフォア、化学発光部分、発色性部分、又はその他の検出可能な部分であり得る。フルオロフォア部分標識は、広く使用することができ且つ使用も相対的に容易であるために、本発明に使用するのに好ましい。
【００４９】
ある好ましい実施態様では、レポーター種（直接に又はシグナル発生系の別の一（又は複数）の成分との協調作用で検出可能な信号を生じるように標識された別の標的特異的オリゴヌクレオチド等）のハイブリダイゼーションによって、前記ハイブリダイズしたアンプリコンを検出する。直接的に検出可能な標識の例は、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄのようなｂｏｄｉｐｙ色素並びにＣｙ３及びＣｙ５のようなシアニン色素を含む（これらに限定されない）前記レポーター上に存在する蛍光部分である。ハウスキーピング遺伝子又は対照に相補的な捕捉プローブが各標識特異的な捕捉プローブと結合され、マイクロアレイ上の同じ位置に割り付けられている好ましい実施態様では、前記ハウスキーピング遺伝子のレポーターは一つの波長で発光するフルオロフォアで標識されるのに対して、目的の遺伝子のアンプリコンに対するレポーターは少なくとも一つの別の波長で発光する異なるフルオロフォアで標識される。各波長で生じた信号を分析することによって、前記マイクロアレイ上にハイブリダイズした全ての種の検出、及び前記ハウスキーピング遺伝子から得られた発現データを用いたその後の標準化が可能となる。
【００５０】
別の好ましい実施態様では、目的の前記遺伝子のハイブリダイズしたアンプリコンのうち少なくとも一部は、酵素的な検出によって行われる。この変法では、電気的なハイブリダイゼーションの後に、結合したＲＮＡ又はｃＤＮＡのアンプリコンの一（又は複数）の標的をテンプレートとして使用して、前記捕捉プローブのプライマー伸長を可能とする試薬とともにマイクロアレイをインキュベートする。ＲＮＡ標的の場合には、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをテンプレートとして使用するが、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをテンプレートとして使用しない逆転写酵素活性を有する酵素（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）逆転写酵素）を用いて伸長を行う。このような酵素を使用することによって、このような酵素を使用しなければ、捕捉プローブ又は標的分子の何れかの自己アニール領域の伸長から生じ得る非特異的な信号が減少するであろう。ｃＤＮＡ標的の場合、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用する。何れの場合にも、反応中に存在する一以上のヌクレオチドが標識されることになろう。前記ヌクレオチド種は、一（又は複数）のデオキシヌクレオチド又は一（又は複数）のジデオキシヌクレオチドであり得、任意の検出可能な部分、通常は蛍光部分によって標識し得る。本発明のプライマー伸長法で使用するための好ましい蛍光部分には、シアニン色素（例えば、Ｃｙ５及びＣｙ３）、並びにＢｏｄｉｐｙ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、フルオレセイン、及びクマリン等の他の蛍光色素が含まれる。伸長された捕捉プローブ中への一（又は複数）の標識ヌクレオチドの取り込みによって、前記アレイ中の各検査部位における蛍光シグナルとして前記アンプリコンの標的特異的なハイブリダイゼーションを検出することが可能となろう。前記反応中に含まれる他の試薬には、至適酵素活性のために緩衝溶媒が含まれる。このような溶媒は市販されており、当業者に公知である。前記ハウスキーピング標的に対する捕捉プローブが標的特異的な捕捉プローブとともに割り付けられている実施態様では、これらの２つの種は、検出工程において識別されなければならない。ある変形例では、目的の遺伝子に特異的な捕捉プローブのプライマー伸長の前、同時、又は後に、前記ハウスキーピング遺伝子に対して特異的なレポーターをハイブリダイズさせる。プライマー伸長反応中にレポーター種が伸長するのを防ぐために、前記レポーターは（例えば、ホスホルアミダイト化学反応又は本分野で公知の他の手段によって）３’末端が修飾される。前記ハウスキーピング特異的なレポーターは、伸長した前記標的特異的な捕捉プローブから生じた信号から、ハイブリダイズしたレポーターから得られた信号を区別できるように標識される（例えば、レポーターをＣｙ３で標識し、プライマー伸長反応に使用した一（又は複数）の標識ＮＴＰをＣｙ５で標識する）。好ましい変形例では、ハウスキーピング遺伝子に対する捕捉プローブも、プライマー伸長を阻止するために、例えば、アミノブロック基を用いて３’末端が修飾される。ハウスキーピング遺伝子にハイブリダイズしたブロックされた捕捉プローブは伸長しないと思われるので、ブロックされた捕捉プローブを使用することによっ��、ハウスキーピング遺伝子に相補的なレポーターの同時ハイブリダイゼーション及び標的特異的な捕捉プローブのプライマー伸長が可能となる。
【００５１】
信号の検出後には、ハイブリダイゼーションパターンを分析する。異なる被検試料中に等しいレベルで発現されているハウスキーピング遺伝子によって生じた信号は、試料間の総核酸濃度、電気的輸送、及び電気的ハイブリダイゼーション効率の差を標準化するために、並びに検査部位間の微小環境の変動を明らかにするために使用される。標準化を行った後に標的アンプリコン信号の強度に差があるということは、調べた条件下において、試料核酸中の元のｍＲＮＡの発現レベルが変化していることを示している。
【００５２】
＜本方法の適用＞
本発明の方法は、例えば、疾病及び発癌、刺激に対する細胞の生理化学的応答、並びに細胞の増殖及び分化の研究に使用するための様々な遺伝子発現実験モデルに容易に適用し得る。開示された本方法は、その速度、再現性、ハイブリダイゼーション実験に使用される遺伝子プローブの数、種類、及び濃度の柔軟性故に、これらの応用に関して理想的である。以下に概説されているように、開示された本方法は、一般的な発現実験の容易さと迅速性を大幅に増大させることができる。
【００５３】
例えば、本発明の方法は、試料中に存在する増幅されたｍＲＮＡの量を滴定するために容易に使用し得る。図５に示されているように、増幅された核酸の試料を系列希釈してもよい。続いて、ＮａｎｏＣｈｉｐ（ＴＭ）装置上の電気的に活性化された検査部位群の一部と各希釈を特異的にハイブリダイズさせ得る。系列希釈データから濃度曲線を作製することによって、前記試料中の前記増幅されたｍＲＮＡの元の濃度を決定し得る。対照として使用するための増幅に先立って特定量の対照配列を前記試料に加えるのであれば、この増幅されたｍＲＮＡの濃度は、前記試料中の元のｍＲＮＡ濃度を決定するために使用してもよい。このように、本発明の方法は、遺伝子発現の相対的定量測定のみならず、絶対的な定量的測定を得るために使用することもできる。
【００５４】
本発明の方法は、有利には、２つの異なる物理的又は化学的刺激を受けた細胞種中のｍＲＮＡの発現レベルを並行して比較するために使用することもできる。例えば、例５では、ＬＰＳ（リポ多糖）で処置した又は未処置（対照）の単球細胞中の４つの遺伝子の発現レベルを調べた。図６に示されているように、ＬＰＳ処置した単球と未処置の単球との間には、幾つかの遺伝子に顕著な変化が観察された。標的でない遺伝子の発現経路に対する化合物の効果をモニタリングしながら、コンビナトリアルライブラリーによるハイスループット創薬に使用するための遺伝子発現の化学的誘導物質又は抑制物質の候補をスクリーニングして副作用を最小限に抑えるために、同様の実験が当業者によって容易に考案されるであろう。
【００５５】
電気的に補助された同一のハイブリダイゼーション装置に対して複数の試料の検査を実施することができるという柔軟性の故に、具体的なアッセイのフォーマットを容易に変化させて、ある研究計画における新たな方向性に適応させることもできる。例えば、化学物質に曝露された細胞株及び曝露されていない細胞株から得た２つの試料中に存在する５０の異なる遺伝子をスクリーニングするために、研究者は１００個の検査部位のＮａｎｏＣｈｉｐ（ＴＭ）をまず使用し得る。目的の遺伝子を５個同定した時点で、研究者は、続いて、ストレプトアビジン浸透層から古いプローブを取り除き、元の５０のプローブのうち５つだけを用いて１００個の検査部位を再構成し、異なる濃度の化学物質で刺激した３つの群の細胞を用いて、５つの対照及び刺激を与えた１５の細胞試料からなるより大きな試料群を用いて結果を確認することができる。化学物質の見かけの大まかな臨界濃度が同定されたら、該およその臨界濃度付近を中心とした物質濃度で４つの細胞試料を刺激し得る。次いで、上記２０個の試料をスクリーニングするように構成したＮａｎｏＣｈｉｐ（ＴＭ）を用いて、各濃度で生じた増幅ｍＲＮＡの量を各試料の４つの系列希釈から求めることができる。各スクリーニングの工程は１０分から１時間で完了し得るので、本発明の方法を用いると、細胞試料に割り振った刺激の期間に応じて計画全体が日単位で終了するであろう。
【００５６】
以下の例は、本発明の様々な側面をさらに説明するためのものであって、いかなる意味においても本発明を限定することを意図するものではない。これらの例、及び本発明の実施態様及び用法についての前記論述に基づけば、当業者にとって本発明の幾つかの変法が自明であろう。かかる自明な変形も本発明の範囲に属するものである。
【００５７】
【実施例】
＜実施例１：短縮型アンプリコンを用いた遺伝子発現モニタリングのための一般的なプロトコール＞
Ａ．ｃＤＮＡ合成
製造業者の指示に従って、１０Ｕ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含めて、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いるｃＤＮＡ合成反応におけるテンプレートとして、全ＲＮＡ（５μｇ）又はポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（０．５μｇ）を用いた。５００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）か、又はオリゴ（ｄＴ）１７Ｖ（ここでＶ＝Ａ、Ｇ、又はＣである）か、又は３’末端から４番目の塩基上に複製不能な１，３−プロパンジオール部分を含むオリゴ（ｄＴ１８ＴｍｏｄＮ３）（米国特許６０２７９２３）のいずれかを用いて、合成をプライムした。外因性の標的遺伝子をコントロールとして用いた場合、この最初のｃＤＮＡ合成反応に標的の１００〜５００ｐｇのポリ（Ａ＋）ＲＮＡを含ませた。
【００５８】
Ｂ．ＤＮＡポリメラーゼを用いる線形増幅
ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）が媒介するプライマー伸長反応において、ｃＤＮＡ合成反応物の１／４〜１／２を用いた。１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（サーモポル緩衝液）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、各々２００ｎＭのｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、各々５０ｎＭのビオチン化キメラＴ７−標的特異的オリゴヌクレオチド（表２を参照のこと）、及び０．０４Ｕ／ｍｌの反応用ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いた。最終のＭｇ＋＋濃度は一般には、２．３ｍＭであったが、時には４．６ｍＭ程度に調整した。内部コントロール（外因性又は内因性のコントロール）に特異的なキメラオリゴヌクレオチドに加えて、１〜９の特定の標的に対するキメラプライマーを添加した。９５℃で１０分間試料を変性し、次いで、９５℃３０秒、５０〜６０℃６０秒、７２℃６０秒のサイクルを３０〜５０回繰り返した。最終サイクル後、試料を７２℃に５分間保持した。５０ｎｇのランダムヘキサマープライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は２００ｎＭの標的特異的オリゴヌクレオチドを添加して、増幅した標的に対して４２℃で１０分アニーリングさせた。温度を７０℃に上昇させることによって（１０分）、アニーリングしたプライマーを伸長させた。
【００５９】
Ｃ．ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズに対する増幅した標的の結合、及びインビトロ転写反応
３７℃で３０〜６０分、時々撹拌しながら、ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ（登録商標），Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に対する結合によって、増幅反応の混合物の他の成分から、増幅した標的を単離した。次いで、ビーズを磁気選別機（Ｄｙｎａｌ）上で単離し、Ｔ７  ＭｅｇａＳｈｏｒｔＳｃｒｉｐｔインビトロ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いるインビトロ転写反応のためのテンプレートとして、結合した標的を用いた。製造業者の指示に従って、反応物を３７℃で２〜４時間、インキュベートした。製造業者の指示どおり、Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ−３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いた単離によって過剰のＮＴＰから、転写されたＲＮＡを精製した。このＲＮＡ標的をマイクロエレクトロニックアレイ上での分析に直接用いるか、又は下記のように、第二のｃＤＮＡ合成反応におけるテンプレートとして用いた。
【００６０】
Ｄ．２回目のｃＤＮＡ合成
２０μｌのインビトロ転写されたＲＮＡを、第二のｃＤＮＡ合成反応においてテンプレートとして用いた。５０ｎｇのランダムヘキサマープライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（増幅重層解析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）において用いられることがある）、又は２００ｎＭの標的特異的オリゴヌクレオチドを、７０℃で１０分間、ＲＮＡ標的にアニーリングした。１×第一鎖緩衝液（Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加した；試料を４２℃で２分間インキュベートし、その後、３００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。反応物を４２℃で５０〜７５分、インキュベートした。反応ごとに、１μｇのＲＮａｓｅＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）及び１Ｕ  ＲＮａｓｅＨ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、そして試料を３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ−３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、又はＢｉｏ−Ｓｐｉｎ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のいずれかで試料を脱塩して、マイクロエレクトロニックアレイに用いた。
【００６１】
注：制限消化を行う場合、本発明者らはＲＮＡ標的を用い、そのＲＮＡをｃＤＮＡに変換することはしない。ｃＤＮＡ合成のためのランダムヘキサマーｖ．遺伝子特異的オリゴの選択は、生成された検出可能なｃＤＮＡの量の潜在的な減少に対して重み付けされた多重化実験において提供される有利なランダムヘキサマーに基づく。
【００６２】
Ｅ．電気的捕獲アドレッシング及び標的ハイブリダイゼーション
Ｎａｎｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて、５０ｍＭのヒスチジン中の５００ｍＭの標的特異的ビオチン化捕獲オリゴヌクレオチドを、ＮａｎｏＣｈｉｐＴＭ上の特定の部位に電気的に割り付けた。２．０Ｖの定電圧を用いて、１分間プローブを動かした；代表的には、２〜１０個のパッドを同時に割り付けさせた。５０ｍＭのヒスチジンを用いた洗浄によって、未結合のオリゴヌクレオチドを取り除いた。この試料内に内部コントロールを含ませた場合、この種についての５００ｎＭ捕獲を、標的特異的捕獲オリゴヌクレオチドとともに同時アドレスさせた；アミノ修飾因子を用いてこの内部コントロール捕獲を３’でブロックして、引き続くレポーティング反応における伸長を妨げる。
【００６３】
５０ｍＭのヒスチジン中のＲＮＡ標的又はｃＤＮＡ標的を、９５℃で５分のインキュベーションによって熱変性し、そして氷上で急速に冷却した。２．０Ｖを用いて、特定の捕獲オリゴヌクレオチドに対して標的を２〜３分間電気的にハイブリダイズさせた；代表的には、アレイ上の２〜１０個の部位を同時にアドレスした。５０ｍＭのヒスチジンを用いた洗浄によって、ハイブリダイズしていない核酸を取り除いた。
【００６４】
Ｆ．報告（レポーティング）
捕獲オリゴヌクレオチドに直接隣接して結合する０．５〜１μＭの３’Ｃｙ３−標識オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションによって、内部コントロール標的を検出する；このレポーターオリゴヌクレオチドを、酵素のレポーティング混合物に含んでもよい。捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする目的の標的を、Ｃｙ５標識したｄＣＴＰの存在下で捕獲プローブの伸長によって検出する。ＲＮＡ標的については、最終のハイブリダイゼーション反応及び洗浄を終了した後、ＮａｎｏＣｈｉｐＴＭを、以下とともに３７℃で１０分間、インキュベートした：１×第一鎖緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；各々０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｃＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；０．１２５ｍＭ  Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）；及び２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ｃＤＮＡ標的については、５０ｍＭのＮａＰＯ４中でＮａｎｏＣｈｉｐを３７℃で１０分間インキュベートし、その後捕獲オリゴヌクレオチドの酵素伸長を行った。１×第二鎖緩衝液（Ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を第一鎖緩衝液及び逆転写酵素の代わりに用いたこと以外は、ＲＮＡ標的について記載したとおりに、ハイブリダイズしたｃＤＮＡ標的のレポーティングを実施した。酵素伸長反応後、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４を用いて、ＮａｎｏＣｈｉｐｓＴＭを洗浄した。酵素レポーティング混合物の高い塩含量のために、加えた内部コントロールプローブ（Ｃｙ−３で標識した）は、３７℃のインキュベーション温度でかなり迅速にハウスキーピング配列にハイブリダイズする。Ｎａｎｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにおいて、Ｃｙ３で標識した内部コントロールレポーターからの蛍光、及び組み込まれたＣｙ５−ｄＣＴＰからの蛍光を検出した。
【００６５】
標的の定量のために、Ｃｙ３標識した内部の（外因性又は内因性の）対照遺伝子からのシグナル（その発現は、試験されている条件下で変化するとは予期されない）を均一化し、これによって標準化因子を得る。次に、この標準化因子によって、標的特異的シグナル（Ｃｙ５）を調整する。その後、これらの調整したハイブリダイゼーション値／蛍光値を比較することによって、実験条件下での標的遺伝子発現レベルの変化量を決定し得る。
【００６６】
＜実施例２：標的の酵素媒介性短縮＞
ｃＤＮＡ合成及び増幅は以下に記載のとおり行った。ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ媒介増幅及びフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応の後、実施例４に記載のように、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、及びｐ５３、並びにＣＯＸ１及びＧＡＰＤＨにおけるキメラプライマー変更部位の内因性配列におけるＢｐｍＩ制限部位を利用して、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＢｐｍＩでの消化によって、標的を酵素で短縮した。３７℃で１．５〜２時間、消化を実施した。次いで、ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズを添加し、そして３７℃でさらに３０〜６０分間、インキュベーションを継続した。上記のようにインビトロ転写反応において、ビーズに結合した標的を用い、そしてＮａｎｏＣｈｉｐＴＭマイクロアレイ上でＲＮＡ標的を分析した。
【００６７】
＜実施例３：マルチインビトロ転写反応のための、ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズに対して結合した標的の再使用＞
上記のような最初のｃＤＮＡ合成反応及びＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ媒介増幅の後、キメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識部位−遺伝子特異的オリゴヌクレオチドによって導入されたビオチン部分を介して、二本鎖の標的を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ上に固定した。次いで、これらの標的を、上記のように、インビトロ転写反応においてテンプレートとして用いる。インビトロ転写の後、ビーズ結合した標的を４℃に保管し、そして引き続くインビトロ転写反応において再使用し得る。このプロトコールのこの局面によって、最初の細胞ＲＮＡより多く得る必要なしに、所定の試料プールから目的の標的を再分析することが可能になる。
【００６８】
図３は、ビーズ結合した標的の単一のプールを、インビトロ転写の別々の３回に利用した時に得られた結果を示す。予期せぬことに、生成された転写物の量が転写の１回目と３回目との間にほんのわずかしか減少せず、この転写物の量の減少は、転写の回数の間で有意ではないことに注目されたい。さらに数回のインビトロ転写が可能であり、このとき、転写産物の量の反復による減少は最小限である。
【００６９】
＜実施例４：電気的ハイブリダイゼーションシステム、及び受動的ハイブリダイゼーションシステムにおけるハイブリダイゼーション効率に対するアンプリコンのサイズの効果の実証＞
細胞のメッセンジャーＲＮＡを、培養したＵ９３７単球（実施例５を参照のこと）から単離し、オリゴ（ｄＴ）１２−１７を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ハイブリダイゼーション値の標準化のためにＴＰＯＸ対照を用い、電気的（上記のような）手順、及び受動的なハイブリダイゼーション手順（以下にまとめる）の両方を利用して、約５０塩基、１００塩基、２５０塩基、及び５００塩基のサイズのＣＯＸ１、ＧＡＰＤＨ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、及びｐ５３のアンプリコンのハイブリダイゼーションを決定した。各標的についての１プライマーは、遺伝子特異的配列の上流にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識部位を含んだ；３’末端にＢｐｍＩ部位を組み込むように、これらのプライマーを設計した。他のプライマーは、１００ｂｐ、２５０ｂｐ、又は５００ｂｐの長さの産物を生成するように設計した。１００ｂｐの増幅した標的の一部分をＢｐｍＩで消化して、５０ｂｐのフラグメントを生成した。増幅後、同様のサイズの標的をプールして、Ｔ７  ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ又はＭｅｇａＳｈｏｒｔＳｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いるインビトロ転写反応においてテンプレートとして用いた。次いで、標的特異的捕捉オリゴヌクレオチド、及び対照（ＴＰＯＸ）特異的捕捉オリゴヌクレオチドで同時に割り付けたマイクロアレイの部位に対して、ＲＮＡ標的の異なるプールを、受動的に又は電気的に、ハイブリダイズさせた。Ｃｙ５−ｄＣＴＰの存在下での、ハイブリダイズした捕獲オリゴヌクレオチドの酵素的な伸長によって、ハイブリダイズした標的を検出した。内部対照ＴＰＯＸの場合、このレポーターをＣｙ３で標識した。
【００７０】
Ａ）標的配列の指数関数的増幅
ｃＤＮＡの指数関数的増幅のために、標準的ｃＤＮＡ合成反応の１／１０（２μｌ）を利用した。以下の存在下で増幅を実施した：１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；各々０．２μＭのプライマー；２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物；及び２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。ｃＤＮＡを９５℃で１０分間変性し、次いでサイクル（９５℃  ３０秒；５０〜６０℃  ６０秒；７２℃  １２０秒）によって増幅した。増幅反応は、一般に２５〜３０サイクルで実施した。プライマーのＴｍよりも５℃低くなるようにアニーリング温度を選択した。
【００７１】
Ｂ）ＲＮＡ標的の受動的ハイブリダイゼーション
４×ＳＳＣ、１×デンハート液、及び１００μｇ酵母ｔＲＮＡ中でのインキュベーションによって、１０ｎＭ  ＲＮＡ標的を捕獲−ロードしたマイクロアレイに受動的にハイブリダイズさせた。小さいペトリ皿中の湿潤な濾紙片上にマイクロアレイを置くことによってハイブリダイゼーションを実施した。この皿をパラフィルム（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎ，Ｎｅｅｎａｈ，ＷＩ）で密閉し、マイクロアレイを３７℃で１４〜１６時間インキュベートした。引き続いてハイブリダイゼーション溶液を取り出し、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４を用いた洗浄によって、未結合の標的を取り除いた。
【００７２】
Ｃ）標的化レポーターオリゴヌクレオチドの受動的ハイブリダイゼーション
マイクロアレイ上の標的種を検出するために、蛍光標識したレポーターオリゴヌクレオチドを排他的に用いる場合、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ中の固定された標的に対して、各々１μＭのレポーター種を受動的にハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション反応は、２３℃で５分間行う。次いで、マイクロアレイの画像化の前に５０ｍＭ  ＮａＰＯ４を用いた洗浄によって、未結合のレポーターを取り除いた。
【００７３】
電気的ハイブリダイゼーションデータを生成するために利用したハイブリダイゼーションを図４に示す。
【００７４】
【表１】
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これらの数は、蛍光の単位を示す。
【００７５】
上記のデータから理解されるように、ハイブリダイゼーション手順において用いられるアンプリコンの長さは、ハイブリダイゼーション効率に対して顕著な効果を有した。
【００７６】
＜実施例５：ＬＰＳで刺激した単球における遺伝子発現モニタリングの実証＞
２つ以上のフラスコに、１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）及び２００単位／ｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩ培地（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）を入れて、単球様細胞株Ｕ９３７を、フラスコ７５ｃｍ２あたり４×１０７細胞まで培養した。細胞を収集して、ＲＰＭＩ／ＦＢＳ／抗生物質、又はＲＰＭＩ／ＦＢＳ／抗生物質＋フェノールミリスチン酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかに、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌに再懸濁した。ＰＭＡ処理の７２時間後、細胞を収集してＦＢＳ及び抗生物質を含有するＲＰＭＩ培地に再懸濁した；ＰＭＡ処理した細胞を、５００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖類（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた処理によって誘導した。細胞をＬＰＳの添加後６時間で収集した。ＲＰＭＩ／ＦＢＳ／抗生物質培地中で維持した、誘導していない細胞もまた収集した（「未誘導（Ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ））。ｍＲＮＡ単離のために必要になるまで、未処理細胞及び処理済細胞を、液体窒素中で急速冷凍させた。
【００７７】
Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、ｍＲＮＡ単離を実施した。細胞のポリ（Ａ＋）ＲＮＡを単離し、そしてプロパンジオールで改変したオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを生成した。限定された増幅反応を、以下のとおり二重鎖反応で実施した：１つの増幅反応では、インターロイキンＩβ（ＩＬ１）及びトランスフォーミング成長因子β２（ＴＧＦβ２）についてのビオチン化キメラＴ７遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いた；そして第二の増幅反応では、インターロイキン６（ＩＬ６）及びｃ−ｊｕｎについてのビオチン化キメラＴ７遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いた。一本鎖の標的を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドの添加によって充填し、そしてインビトロ転写反応に用いた。生成したＲＮＡを、第二のｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして用いた。電気的捕獲アドレッシング、標的ハイブリダイゼーション、及びＤＮＡポリメラーゼを用いた酵素的伸長を実施例１に記載のように実行した。
【００７８】
本実験のハイブリダイゼーションの結果を図６に示しており、図７には図式的に示す。ＮＳは、増幅した標的のいずれに対しても相補的な配列を含まない非特異的なビオチン化オリゴヌクレオチドを示す。表記のように、単球細胞培養物に対するＬＰＳの添加は、ＩＬ１についての劇的に増大したｍＲＮＡ発現、ＴＧＦβ２及びｃ−ｊｕｎメッセンジャーの中度に増大した発現、並びにＩＬ６の最小限しか増大しない発現を誘発した。従って、例示されるように、２つの試料細胞集団の間の遺伝子の発現の変更は、本発明の方法を用いて容易にモニターされ得る。
【００７９】
＜実施例６：ＮａｎｉＣｈｉｐＴＭ電気的ハイブリダイゼーションデバイスを利用する、段階希釈及び定量方法の実証＞
Ａ）ＮａｎｏＣｈｉｐＴＭ上での段階的に希釈した短いＲＮＡ標的の検出
上記のように、キメラ遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドＤＮＡからβ−１ａ標的遺伝子を増幅した。５’プライマー（ｐＴ７ＡＡｍｐ．ｓ１）は、遺伝子特異的配列上流のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む；３’プライマーは、遺伝子特異的配列下流のポリ（ｄＴ）トラクト配列を含む。製造業者（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ）の指示に従って、Ｔ７  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキットを用いるインビトロ転写反応において、このＰＣＲ産物（全長β１ａ遺伝子を示す）をテンプレートとして用いた。この標的を逆転写してｃＤＮＡを生成し、そして第二の内部キメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識部位／遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ｐＴ７ＡｍｐＢｐｍ．ｓ１）を用いたＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ媒介増幅反応において、このｃＤＮＡ産物を用いた。この増幅した標的をＢｐｍＩを用いて酵素的に消化し、Ｔ７  ＭｅｇａＳｈｏｒｔＳｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いる第二のインビトロ転写反応において用いた。得られた短いＲＮＡ標的を、示したとおり段階希釈し、β−１ａ特異的捕獲オリゴヌクレオチドに電気的にハイブリダイズさせた。この電気的ハイブリダイゼーションのデータを図５ａに示す。
【００８０】
Ｂ）細胞ＲＮＡのプールにおける外因性標的の検出
全長β−１ａ標的を上記のように生成した。このＲＮＡを、２５０ｎｇの細胞のメッセンジャーＲＮＡに対して規定された量（０〜８００ｐｇ）添加した。次いでＲＮＡのプール全体をｃＤＮＡに逆転写し、Ｖｅｎｔ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ媒介増幅反応において、β−１ａ標的を増幅した。この増幅した標的をＢｐｍＩで酵素的に消化し、Ｔ７  ＭｅｇａＳｈｏｒｔＳｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いる第二のインビトロ転写反応において用いた。得られた短いＲＮＡ標的を、β−１ａ特異的捕獲オリゴヌクレオチドに対して電気的にハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションデータを図５ｂに示し、図５ｃに図式的に示す。
【００８１】
【表２】
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【表２】
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【表２】
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【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明のｍＲＮＡ遺伝子発現モニタリング法に使用する所定サイズの短縮アンプリコンを作製する二つの異なる方法の模式図。
【図２】
例で使用した装置と同様の電気的に割付可能なマイクロアレイ装置の模式図。表記の装置は、米国特許第５，６０５，６６２号に詳しく記載されている。該装置においては、アレイ上の検査部位は、電極によってアレイの平面中に区画形成されているが、核酸プローブが付着され得る浸透層によって前記電極から隔絶されている。
【図３】
ストレプトアビジン被覆磁気ビーズに固定された同一の増幅二本鎖ｃＤＮＡライブラリーから第１、第２、及び第３のインビトロ転写によって得られたＲＮＡ産物のアガロースゲル電気泳動による分離を示している。左端のレーンは、分子サイズマーカーである。
【図４】
５０、１００，２５０、及び５００ヌクレオチドのアンプリコンを用いた、５つの別個の遺伝子プローブに対するグレースケールハイブリダイゼーション蛍光データを示している。約１００塩基長のアンプリコンを用いると、最良の結果が得られることが明らかである。
【図５ａ】
β−ｌａ捕捉プローブにハイブリダイズした増幅試料プラスミド核酸の段階希釈に対するグレースケールハイブリダイゼーション蛍光データを示している。右端のＮＳは、検査部位に捕捉配列が付着していないことを示している。電気的アレイの列を通じてのハイブリダイゼーションシグナルの再現性に注目されたい。
【図５ｂ】
所定量の試料核酸配列に対するグレースケールハイブリダイゼーション蛍光データと、これらのデータから得られた濃度曲線をグラフで表したものとが示されている。
【図５ｃ】
所定量の試料核酸配列に対するグレースケールハイブリダイゼーション蛍光データと、これらのデータから得られた濃度曲線をグラフで表したものとが示されている。
【図６】
ＮａｎｏＣｈｉｐ（ＴＭ）の１２個の検査部位上にある４つの異なる遺伝子プローブと対照配列（ＮＳ）に対するグレースケールハイブリダイゼーション蛍光データが示されている。ＬＰＳによって誘導された又は誘導されていない単球からｍＲＮＡを単離し、例５に記載されているように増幅、ハイブリダイゼーション、及び記録を行った。処置を受けた単球では、ＩＬ１、ＴＧＦβ、及びＪＵＮのｍＲＮＡ発現レベルが明らかに変化しているが、ＩＬ６の発現レベルはごく僅か増加しているにすぎない。
【図７】
図６に示された結果をグラフで表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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