(57)【要約】様々な組織タイプにおける腫瘍マーカーとしてのプロテインキナーゼ「ＰＢＫ」（ＰＤＺ結合性キナーゼ）の使用が考察される。そのタンパク質の過剰発現を検出する方法、およびそれに有用なキットが説明される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非癌性細胞と比較してＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの検出方法であって：
（ａ）癌性であることが疑われる組織の試験サンプルを得；
（ｂ）該試験サンプル組織中の細胞に由来するｍＲＮＡを、ＰＢＫをコードするｍＲＮＡに相補的であり、かつそれに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのヌクレオチドプローブと接触させてハイブリダイゼーション産生物を形成し；
（ｃ）産生されるハイブリダイゼーション産生物の量を検出し；並びに
（ｄ）（ｃ）において検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を非悪性細胞において予想される量と比較する、
ことを含み、
ここで、（ｃ）において産生されるハイブリダイゼーション産生物の量が非悪性対照細胞によって産生されるものよりも多いという発見が該試験サンプルにおける癌性細胞の存在を示す方法。
【請求項２】
組織が前立腺、乳房、肺および大腸から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
組織が前立腺および乳房組織から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヌクレオチドプローブが配列番号１の少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＰＢＫをコードする前記ｍＲＮＡが配列番号２または配列番号３のタンパク質をコードする請求項１記載の方法。
【請求項６】
試験サンプルをヒト被験者から得る請求項１記載の方法。
【請求項７】
検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を同じ被検体から得られる非悪性組織のサンプルにおいて検出される量と比較する請求項１記載の方法。
【請求項８】
検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を予め決定される標準量と比較する請求項１記載の方法。
【請求項９】
非癌性細胞と比較してＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの検出方法であって：
（ａ）癌性であることが疑われる組織の試験サンプルを得；
（ｂ）該試験サンプル中の細胞に由来するｍＲＮＡ配列を、ＰＢＫをコードするｍＲＮＡに相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズする核酸配列プライマーを用いて増幅して増幅産生物を形成し；
（ｃ）産生される増幅産生物の量を検出し；並びに
（ｄ）（ｃ）において検出される増幅産生物の量を非悪性細胞において予想される量と比較する、
ことを含み、
ここで、（ｃ）において産生される増幅産生物の量が非悪性対照細胞によって産生されるものよりも多いという発見が該試験サンプルにおける癌性細胞の存在を示す方法。
【請求項１０】
組織が前立腺、乳房、肺および大腸から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
組織が前立腺および乳房組織から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ヌクレオチドプローブが配列番号１の少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む請求項９記載の方法。
【請求項１３】
ＰＢＫをコードするｍＲＮＡが配列番号２または配列番号３のタンパク質をコードする請求項９記載の方法。
【請求項１４】
試験サンプルをヒト被験者から得る請求項９記載の方法。
【請求項１５】
検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を同じ被検体から得られる非悪性組織のサンプルにおいて検出される量と比較する請求項９記載の方法。
【請求項１６】
検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を予め決定される標準量と比較する請求項９記載の方法。
【請求項１７】
増幅がＲＴ−ＰＣＲによるものである請求項９記載の方法。
【請求項１８】
前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、該サンプル組織中のＰＢＫ ｍＲＮＡの量を測定することを含み、ここで、非悪性前立腺組織と比較しての該サンプル中のＰＢＫ ｍＲＮＡのレベルの上昇は該サンプル組織が悪性であることを示す方法。
【請求項１９】
前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、該サンプル組織中のＰＢＫタンパク質の量を測定することを含み、ここで、非悪性前立腺組織と比較しての該サンプル中のＰＢＫのレベルの上昇は該サンプル組織が悪性であることを示す方法。
【請求項２０】
乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、該サンプル組織中のＰＢＫ ｍＲＮＡの量を測定することを含み、ここで、非悪性乳房組織と比較しての該サンプル中のＰＢＫ ｍＲＮＡのレベルの上昇は該サンプル組織が悪性であることを示す方法。
【請求項２１】
乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、該サンプル組織中のＰＢＫタンパク質の量を測定することを含み、ここで、非悪性乳房組織と比較しての該サンプル中のＰＢＫのレベルの上昇は該サンプル組織が悪性であることを示す方法。
【請求項２２】
細胞中のＰＢＫの活性を阻害する能力について試験化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）ＰＢＫを発現する細胞を試験化合物に対して曝露し；
（ｂ）該細胞におけるＰＢＫ活性の量を測定し；および
（ｃ）該曝露した試験細胞におけるＰＢＫ活性の量を該試験化合物に曝露してはいない対照細胞におけるものと比較する、
ことを含み、
ここで、対照細胞と比較しての該曝露した試験細胞におけるＰＢＫ活性の量の減少は該試験化合物が細胞におけるＰＢＫ活性を阻害することを示す方法。
【請求項２３】
曝露する工程をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
曝露する工程をｉｎ ｖｉｖｏで行う請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
非癌性細胞と比較してＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを検出するためのキットであって：
（ａ）長さが少なくとも２０ヌクレオチドであり、かつヒトＰＢＫ ｍＲＮＡ配列に相補的である標識核酸分子であって、該ヒトＰＢＫ ｍＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズして標識ハイブリダイゼーション産生物を形成することができる標識核酸分子；および
（ｂ）少なくとも１つのヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるＰＢＫ ｍＲＮＡのレベルを記載する印刷された取扱説明書、
を含むキット。
【請求項２６】
対照または標準として用いるための、ヒトＰＢＫをコードする既知量のｍＲＮＡをさらに含む請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
印刷された取扱説明書が、非癌性および癌性前立腺組織細胞において見出されるＰＢＫ ｍＲＮＡの比較レベルを記載する、請求項２５記載のキット。
【請求項２８】
印刷された取扱説明書が、非癌性および癌性乳房組織細胞において見出されるＰＢＫ ｍＲＮＡの比較レベルを記載する、請求項２５記載のキット。
【請求項２９】
プローブが配列番号１の一部に相補的である請求項２５記載のキット。
【請求項３０】
非癌性細胞における発現レベルと比較してＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質を検出するためのキットであって：
（ａ）ヒトＰＢＫに特異的に結合する標識抗体；および
（ｂ）少なくとも１つのヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるＰＢＫのレベルを記載する印刷された取扱説明書、
を含むキット。
【請求項３１】
標識モノクローナル抗体を含む請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
標識ポリクローナル抗体を含む請求項３０記載のキット。
【請求項３３】
ヒト組織タイプが前立腺組織である請求項３０記載のキット。
【請求項３４】
ヒト組織タイプが乳房組織である請求項３０記載のキット。
【請求項３５】
標識抗体が酵素標識、放射標識および蛍光標識からなる群より選択される標識を含む、請求項３０記載のキット。
【請求項３６】
ゲノムがその内在性ＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該破壊が完全に機能的なＰＢＫタンパク質の発現を妨げ、かつ該破壊が野生型マウスと比較してＰＢＫのレベルの低下を示す該トランスジェニックマウスを生じるトランスジェニックマウス。
【請求項３７】
破壊が内在性ＰＢＫ遺伝子への陽性選択発現カセットの挿入から生じる、請求項３６のトランスジェニックマウス。
【請求項３８】
野生型マウスに対してＰＢＫ活性のレベルの低下を示すトランスジェニックマウスの産生方法であって：
（ａ）ＰＢＫターゲッティングベクターをマウス胚性幹細胞に導入し；
（ｂ）該マウス胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入し；
（ｃ）該マウス胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し；
（ｄ）期限まで該移植されたマウス胚盤胞を発達させ；
（ｅ）ゲノムが少なくとも１つの対立遺伝子における内在性ＰＢＫ遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスを同定する、
ことを含む方法。
【請求項３９】
工程（ｅ）のトランスジェニックマウスを繁殖させてゲノムが内在性ＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子の両者に破壊を含むトランスジェニックマウスを得ることをさらに含む請求項３８記載の方法であって、ここで、該破壊が野生型マウスに対してＰＢＫ活性のレベルの低下を示す該トランスジェニックマウスを生じる方法。
【請求項４０】
ＰＢＫターゲッティングベクターが陽性選択発現カセットを含む請求項３９の方法。
【請求項４１】
ゲノムがトランスジーンを含み、該トランスジーンが組織特異的プロモーターに作動可能に連結するヒトＰＢＫをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックマウスであって、該ＤＮＡ配列が該組織の少なくとも幾つかの細胞において発現するトランスジェニックマウス。
【請求項４２】
発達が前記組織における新組織形成または肥厚である請求項４１記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４３】
組織特異的プロモーターが前立腺組織特異的プロモーターである請求項４１のトランスジェニックマウス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はヒト癌の腫瘍マーカーとして利用することができるタンパク質、およびその使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
様々な生化学的および免疫学的存在が哺乳動物における癌の存在、性質または程度を示すマーカーとして有用である。癌が産生するマーカー分子には、モノクローナル免疫グロブリン、ホルモン、分泌血清タンパク質、抗原、酵素およびアイソザイム、細胞表面マーカー、糖タンパク質および炭水化物、並びに細胞外マトリックスタンパク質およびムチンが含まれる。癌マーカーは、体液、例えば、血液、血漿、血清、浸出液、および尿中に現れる可溶性マーカーとして分類され得る。他の癌マーカーは、その特質上血清または他の体液中にいかなる有意の量でも放出されない細胞関連タンパク質および核酸である。細胞または組織関連腫瘍マーカーは、癌性細胞を含む組織サンプル中、またはそのような細胞を含む生物学的サンプル（例えば、脱落気管支上皮細胞を含有する痰サンプル）中で検出可能である。
【０００３】
癌マーカーは（非癌性または正常細胞と比較して）癌細胞のほとんど分化していない状態を反映する癌発達マーカーであることがあり、または細胞分裂経路の活性化もしくは細胞死経路の阻害による細胞における分子変化を反映するものであり得る。細胞におけるこれらのマーカーの発現は、細胞を異常または（悪性の可能性のある）癌性と同定するのに利用することができる。
【０００４】
癌においては、予測および治療の選択は、癌の成長の程度の他にその組織学的タイプに応じて変化する。癌の臨床診断が単一の試験に依存することはほとんどない；複数のマーカーを評価して治療計画の立案を補佐することができる。新規腫瘍マーカーを同定してヒト癌の検出、予測および監視の補佐をする必要性が存在し続けている。
【０００５】
発明の要約
本発明の一側面は、非癌性細胞と比較してＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの検出方法である。組織の試験サンプルを得、その試験サンプルからのｍＲＮＡを、ＰＢＫをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブと接触させてハイブリダイゼーション産生物を形成する。ハイブリダイゼーション産生物の量を測定し、非悪性組織のサンプル中で予測されるものと比較する。
【０００６】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの検出方法であって、ｍＲＮＡを組織の試験サンプルから得、ＰＢＫをコードするｍＲＮＡに特異的に結合する核酸配列プライマーを用いて増幅して増幅産生物を形成する方法である。増幅産生物の量を測定し、非悪性細胞におけるものと比較する。試験サンプルによって産生される増幅産生物の量が非悪性対照によって産生されるものよりも多いという知見は、試験サンプル中の癌性細胞の存在を示す。
【０００７】
本発明のさらなる側面は、前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のＰＢＫ ｍＲＮＡの量を測定することによる方法である。非悪性前立腺組織と比較して上昇したＰＢＫ ｍＲＮＡのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【０００８】
本発明のさらなる側面は、前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のＰＢＫタンパク質の量を測定することによる方法である。非悪性前立腺組織と比較して上昇したサンプル中のＰＢＫのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【０００９】
本発明のさらなる側面は、乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のＰＢＫ ｍＲＮＡの量を測定することによる方法である。非悪性乳房組織と比較して上昇したサンプル中のＰＢＫ ｍＲＮＡのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【００１０】
本発明のさらなる側面は、乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のＰＢＫタンパク質の量を測定することによる方法である。非悪性乳房組織と比較して上昇したサンプル中のＰＢＫのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【００１１】
本発明のさらなる側面は、ＰＢＫを発現する細胞におけるＰＢＫ活性を阻害する能力について試験化合物をスクリーニングする方法である。この方法は、細胞を試験化合物に対して曝露し、細胞中に存在するＰＢＫ活性の量を検出し；および曝露した試験細胞におけるＰＢＫ活性の量を試験化合物に対して曝露しなかった対照細胞のものと比較することを含む。対照細胞と比較して減少した曝露した試験細胞におけるＰＢＫ活性の量は、その試験化合物が悪性細胞においてＰＢＫ活性を阻害することを示す。
【００１２】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを検出するためのキットである。このキットは、長さが少なくとも２０ヌクレオチドであり、ヒトＰＢＫ ｍＲＮＡ配列に相補的であり、かつヒトＰＢＫ ｍＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズして標識ハイブリダイゼーション産生物を形成することができる標識核酸配列を含む。このキットは、さらに、少なくとも１種類のヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるＰＢＫ ｍＲＮＡのレベルを記載する印刷説明書を含む。
【００１３】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質を検出するためのキットである。このキットは、ヒトＰＢＫに特異的に結合する標識抗体、および少なくとも１種類のヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるＰＢＫのレベルを記載する印刷説明書を含む。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、そのゲノムがその内在性ＰＤＺ結合性キナーゼ（ＰＢＫ）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子内に破損を含むトランスジェニックまたは突然変異誘発マウスである。この破損は機能的ＰＢＫタンパク質の発現を妨げ、（野生型マウスと比較して）ＰＢＫ活性のレベルが低下したトランスジェニックまたは突然変異誘発マウスを生じる。
【００１５】
本発明のさらなる側面は、野生型マウスに対してＰＢＫ活性のレベルが減少したトランスジェニックマウスを産生するための方法である。この方法は、ＰＢＫターゲッティングベクターをマウス胚性幹細胞に導入し；該マウス胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入し；および該マウス胚盤胞を偽妊娠マウスに移植することを含む。
【００１６】
本発明のさらなる側面は、そのゲノムが、ヒトＰＢＫのすべてまたはその一部をコードするＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列が組織特異的プロモーターに作動可能に連結するトランスジーンを含むトランスジェニックマウスである。
【００１７】
詳細な説明
近年同定されたプロテインキナーゼが、本発明者らにより、腫瘍マーカーとして有用であることが確認されている。このキナーゼは Ｇａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７（１０）：５１６７ （２０００） によって「ＰＢＫ（ＰＤＺ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ：ＰＤＺ結合キナーゼ）」と命名され、また別途、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ２７５（２８）：２１５２５ （２０００） によって「ＴＯＰＫ」（Ｔ−ＬＡＫ ｃｅｌｌ−ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：Ｔ−ＬＡＫ細胞起源プロテインキナーゼ）と名付けられた。本明細書では、このキナーゼをＰＢＫ（ＰＤＺ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ：ＰＤＺ結合キナーゼ）と呼ぶ。ＰＤＺドメインは特定細胞下部位、例えば、上皮細胞タイトジャンクションおよびニューロンシナプス後高密度部でのタンパク−タンパク相互作用を介在する。大部分のＰＤＺドメインは、それらのタンパク質パートナーの最外カルボキシ末端配列に結合する。Ｆｕｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（２８）：２１４８６ （２０００）。
【００１８】
ＰＢＫは以下のアミノ酸配列を有する３２２アミノ酸セリン／トレオニンキナーゼである。
【００１９】
2004510442.tif 000002
Ｇａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７（１０）：５１６７ によって報告されたこのアミノ酸配列は１０７位にセリン（Ｓ）を含む（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１８９７２２；１０７位は上記配列において下線を付されたボールド体で示される）。Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ２７５（２８）：２１５２５ および本発明者らは、この位置にアスパラギン（Ｎ）を同定した（配列番号３）。ＰＢＫは特徴的なキナーゼサブドメインおよびＣ末端ＰＤＺ結合性Ｔ／ＳＸＶモチーフを有する。このセリン／トレオニンキナーゼ、すなわち二重特異性キナーゼのコンセンサスＤ−Ｘ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｎ配列が配列番号２の残基１６７−１７２に見出される（上記下線部）。ＰＢＫはヒトｈＤｌｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｄｉｓｃｓ−Ｌａｒｇｅ（Ｄｌｇ）腫瘍抑制タンパク質のヒト類似体）のＰＤＺ２に特異的に結合する。Ｇａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．。このＰＤＺキナーゼをコードする完全長ｃＤＮＡは本明細書では配列番号１として示される。
【００２０】
ＰＢＫキナーゼｍＲＮＡ発現の組織分布は、Ａｂｅらにより、精巣、Ｔ−ＬＡＫ（リンホカイン活性化キラーＴ）細胞、活性化リンパ系細胞およびＲＰＭＩ １７８８ Ｂ細胞リンパ腫細胞に特異的なものとして報告された。Ｇａｕｄｅｔらは、ＰＢＫのｍＲＮＡが胎盤において最も豊富であり、成人脳組織には存在していなかったと述べている。
【００２１】
「癌」、「悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）」および「悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）」という用語は、当業者によって理解されるように、様々なタイプの悪性新生物のいずれかを指すのに用いられる。新生物は細胞増殖によって生成される異常な組織増殖を指す。新生物は、通常は、構造的組織化の欠如および／または正常組織との機能的協調の欠如を示し、識別可能な組織塊を形成し得る。新生物は良性または悪性のいずれかであり得る。「悪性」は周囲の組織に侵入する新生物の能力を指す。悪性増殖は、通常、原発部位から解剖的に隔たっている部位へと転移しやすい。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、悪性腫瘍細胞または癌細胞は、悪性転換現象を経験した細胞を指す。悪性転換は、癌性増殖を引き起こす細胞能力を大きく増加させる細胞における変化を指し、悪性転換は、当該技術分野において公知のように、細胞の増殖特性、組織学、および／または細胞の形態における変化によって同定することができる。
【００２３】
「固形腫瘍」という用語は、その医学的に認められた意味で用いられ、白血病のような血液の癌は含まない。
【００２４】
ここで用いられる場合、「癌マーカー」または「腫瘍マーカー」は癌性増殖もしくは腫瘍の存在、またはその程度の指標である。当該技術分野においては、腫瘍マーカーは、臨床実務において有用である上では、１００％特異的であったり１００％感受性であったりする必要はないことが公知である。臨床癌診断は単一のマーカーの評価に依存することはほとんどなく、ヒト癌の診断を行う場合、通常は、さらなる診断、実験および臨床手順および観察が考慮される。
【００２５】
「癌診断」という用語は、癌または悪性腫瘍の存在の同定の他に、悪性疾患からの良性の区別化を指す。本明細書中で用いられる場合、予後は、当該技術分野において公知であるように、治療に対する応答、再発、生存時間、または他の効果指標の点で患者の経過がどの程度良好であるか、またはどの程度不十分であるかの評価または予測を指す。ここで用いられる場合、モニタリングは、疾患進行の徴候を検出するための患者の反復評価を指す。モニタリングは治療の期間中その治療の効果を評価するために行うことができるし、最小残余疾患、再発疾患、または継続する疾患の進行を検出するために治療後に行うこともできる。
【００２６】
前立腺癌は、前立腺から離れてはいるが前立腺癌を起源とする転移性腫瘍を含む、前立腺細胞から生じるあらゆる組織学的タイプの癌を指す。大部分の前立腺癌は腺癌であるが、癌肉腫、移行細胞、小細胞、原発性肉腫、および他の組織学的タイプもより低い頻度で生じる。前立腺癌は十分に認知されている疾患である。
【００２７】
乳癌は、乳房から離れてはいるが乳癌を起源とする転移性腫瘍を含む、乳房組織細胞から生じるあらゆる組織学的タイプの癌を指す。大部分の乳癌は上皮細胞から生じるが、他の組織学的タイプの乳癌も報告されている。乳癌は十分に認知されている疾患である。
【００２８】
腫瘍マーカーは、罹患していることが（すなわち、悪性もしくは癌性細胞を含むことが）疑われる組織内で、または様々な供給源、例えば、痰、尿、腫瘍液、もしくは乳汁からの剥脱細胞材料の間接的コレクションにより、アッセイすることができる。
【００２９】
本発明者らは、ＰＢＫ ｍＲＮＡが、対応する正常組織サンプルと比較して腫瘍組織サンプルにおいて過剰発現することを決定している。したがって、ＰＢＫまたはＰＢＫをコードする核酸分子の検出および／または定量的測定は悪性腫瘍の検出において有用である。本発明の一態様においては、本発明の方法が前立腺組織サンプルにおける前立腺癌細胞の存在の検出に用いられる。本発明の別の態様においては、これらの方法が乳房組織サンプルにおける乳癌細胞の存在の検出に用いられる。本発明のさらなる態様においては、これらの方法が大腸組織サンプルにおける大腸癌細胞の検出、および肺組織サンプルにおける肺癌細胞の検出に用いられる。
【００３０】
本発明はＰＢＫタンパク質およびその対立遺伝子変異体、並びにＰＢＫをコードする核酸分子（およびそれらの変異体）の、癌性組織を検出するためのマーカーとしての使用を含む。これらのマーカーは、同じ組織タイプの正常細胞におけるレベルと比較して、癌細胞においては増大したレベルで、特徴的に存在する。非癌性組織または非増殖性組織においては、ＰＢＫマーカーは低レベルまたは検出不能なレベルで存在し得る。ＰＢＫ「マーカー」にはＰＢＫタンパク質並びにそれらの変異体および断片、並びにＰＢＫまたはそれらの変異体もしくは断片をコードする核酸分子が含まれる。本明細書中で用いられる場合、ＰＢＫマーカーの「増大したレベル」は予め決定された標準を上回って増大するレベル、または対照サンプルにおけるレベルを上回って増大するレベルを指す。予め決定される標準は、疑われる悪性腫瘍について試験される組織と同じタイプの健常（非癌性）組織サンプルにおけるＰＢＫマーカーの通常の測定に基づくものであり得る。予め決定される標準はゼロもしくは検出不能であってもよく、または正の量であってもよい。あるいは、被験体を試験する場合には、予め決定される標準はその被験体の以前の試験結果に基づくものであってもよく、またはその被験体からの正常組織におけるＰＢＫの測定に基づくものであってもよい。
【００３１】
したがって、本発明の方法は、細胞、組織またはそれらの抽出物をヒトから単離し、さらにＰＢＫマーカーの比較レベルをＰＢＫ活性の増大を伴う疾患、例えば、癌、増殖性障害、病的血管形成、および炎症の指標として測定することを含む。本発明の好ましい方法は、細胞、組織またはそれらの抽出物をヒトから単離し、さらに細胞または組織の悪性状態を予測する助けとなるＰＢＫマーカーの比較レベルを測定することを含む。
【００３２】
疾患が存在しない場合であっても試験結果が正常標準から幾らか変動することがあることは医学的診断においてはよく知られている。したがって、正常標準はある範囲をもつ値を含み得る。疾患を示すことが認められているマーカーのレベル（「診断レベル」）は正常レベルの数倍であり得る。特定の組織または特定の疾患のＰＢＫマーカーの診断レベル、および疾患の存在をある程度の確実性で示唆する診断レベルを決定するのに、公知の統計法を用いることができる。例えば、ＰＢＫ ｍＲＮＡの診断レベルは、標的組織の正常レベルの１．５倍（１．５×）、正常レベルの２倍（２×）、正常レベルの５倍（５×）、正常レベルの１０倍（１０×）、正常レベルの１００倍（１００×）、正常レベルの５００倍（５００×）、正常レベルの１０００倍（１，０００×）、正常レベルの１５００倍（１，５００×）、またはそれ以上に設定することができる。通常、診断レベルは、その診断レベルの疾患マーカーが見出されるときには統計学的におそらく被験体が標的疾患を有する点に設定する。
【００３３】
疾患の指標と見なされるＰＢＫマーカーのレベルは試験する標的組織の間で異なっていてよい。正常ＰＢＫマーカー標準、およびＰＢＫマーカー診断レベルは、特定の組織タイプまたは疾患について、当該技術分野において公知の日常的な診断および臨床試験法を用いて決定することができる。当業者に明らかなように、本発明の方法のための標準または診断レベルを確立するためのデータを得るのにあらゆる数のプロトコルを用いることができる。
【００３４】
本発明の方法は、固形腫瘍、前立腺癌、肺癌、大腸癌、および乳癌を含むがこれらに限定されるものではない、ＰＢＫマーカーの増加に関連付けられている疾患状態を有することが疑われる被験体に、用いることができる。本発明の方法は、以前に標的状態を有すると診断されている被験体のモニタリング、標的状態の治療を受けている被験体のモニタリング、または以前に標的状態と診断されてはいない被験体のスクリーニングに用いることができる。本明細書に開示される方法は、前立腺組織サンプルおよび乳房組織サンプルをスクリーニングしてそれらに含まれる細胞が癌性であるかどうかを決定するのに特に適する。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合、スクリーニングおよび診断方法は、そのような方法が標的疾患の検出において１００％特異的または１００％感受性であることを示すものではない。しかしながら、複数のサンプルの試験においては、診断レベルまたはそれを上回るレベルであると判定されるサンプルの大部分は悪性組織を含む。本発明の方法の特異性および／または感受性は、当業者には明らかなように、試験される病的状態、用いられる生物学的サンプル、被験体の全身的健康状態、および他の要因に依存して様々であり得る。組織サンプル中の悪性と非悪性細胞との相対数が試験結果に影響を及ぼすことも容易に理解される。すなわち、非悪性細胞のより大きなサンプル内に悪性細胞の小病巣を含むサンプルは、基本的に全て悪性細胞を含むサンプルよりも偽陰性と判定される可能性が高い。
【００３６】
本発明の一態様においては、癌性細胞を含むことが疑われる組織サンプル中に存在するＰＢＫ ｍＲＮＡの量を測定し、予め決定された標準と比較するか、または同じタイプの正常（非癌性）組織のサンプル中に存在するＰＢＫ ｍＲＮＡの量と比較する。ｍＲＮＡレベルの様々な測定方法または比較方法が当該技術分野において公知である。ｍＲＮＡの定量的測定のための好ましい１つの方法は、当該技術分野において公知のように、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）技術を用いる。特に好ましい方法はＴＡＱＭＡＮ（Ｒ）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、リアルタイム蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のシステムを利用する。この方法は標的配列に相補的である蛍光発生プローブを用い、このプローブはＰＣＲ反応混合物に添加される。このプローブは、レポーターおよびクエンチャー色素が結合するオリゴヌクレオチドを含む。ＰＣＲの間に標的核酸が存在する場合、このプローブがフォワードおよびリバースプライマー部位の間で特異的にアニールする。ポリメラーゼがこのプローブを開裂し、レポーター色素の蛍光強度の増加を生じる。その後、蛍光発光を記録し、および／または測定する。例えば、Ｏｒｌａｎｄｏ， Ｃ．， Ｐ．， Ｐｉｎｚａｎｉ， ａｎｄ Ｍ．， Ｐａｚｚａｇｌｉ． ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ３６ （１９９８）： ２５５−２６９；Ｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１ｂｅｔａ， ＩＬ−１０， ＩＬ−１０ｒ， ＴＮＦａｌｐｈａ ａｎｄ ＩＬ−７ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ＵＶ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ”， Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ ４９（６）：２９０ （２０００） を参照のこと。当業者には公知のように、各々のプライマーおよびプローブのセットについてＰＣＲ反応の最適化が必要である。プライマーおよびプローブの選択の補助に市販ソフトウェアを利用することができる（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＰＥ／ＡＢＤ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）。例えば、Ｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ６：９８６ （１９９６）；Ｌｉｖａｋ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ４：３５７ （１９９５）；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７２７６ （１９９１）；Ｇｅｌｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ ４３：７５２ （１９９７）；Ｍａｒｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２ （１９９８） を参照のこと。
【００３７】
当該技術分野において公知のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、固定化組織サンプル、脱落細胞、および骨髄吸引物を含む組織サンプル中のＤＮＡまたはｍＲＮＡの測定が可能となる。ＰＣＲ技術の多くのバリエーションが公知であり、当業者は、分析するＤＮＡまたはｍＲＮＡの性質、組織、およびアッセイの望ましい感受性に基づいて適切なＰＣＲ条件を決定することができる。
【００３８】
本発明のさらなる態様においては、癌性細胞を含むことが疑われる組織サンプル中に存在するＰＢＫタンパク質の量を測定し、予め決定された標準と比較するか、または同じタイプの正常（非癌性）組織のサンプル中に存在するＰＢＫタンパク質の量と比較する。標的タンパク質に特異的に結合する標識モノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むがこれらに限定されるものではないタンパク質の定量的検出方法が公知である。ＰＢＫタンパク質の量はサンプルの容量当たりのＰＢＫタンパク質の量として、または総タンパク質に対するパーセンテージとして決定することができる。
【００３９】
本発明において有用である抗体には、配列番号１、配列番号２または配列番号３のペプチドに特異的に結合するもの、およびそのような抗体のフラグメントが含まれ、それらのフラグメントは配列番号１、配列番号２または配列番号３のペプチドに特異的に結合する。そのような抗体及び抗体フラグメントは、当該技術分野において公知の様々な技術によって産生することができる。「抗体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む免疫グロブリンのすべてのタイプを指す。これらのうち、ＩｇＭおよびＩｇＧが好ましい。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびウマを含むがこれらに限定されるものではないあらゆる種を起源とするものであってよく、またキメラ抗体であってもよい。
【００４０】
本発明の方法において用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２６５：４９５ （１９７５） の技術および当該技術分野において公知の他の技術に従って、ハイブリドーマ細胞系において産生することができる。腫瘍マーカーに特異的なモノクローナル抗体により、免疫放射線技術、免疫酵素技術、または免疫組織化学技術（これらは当該技術分野において公知である）を使用して、その腫瘍マーカーを検出することが可能となる。
【００４１】
癌マーカーに対する抗体は組織学的切片中の該マーカーの存在の検出、正常細胞からの腫瘍細胞の分別に有用である。免疫組織学的染色も、例えば外科的に切除したサンプルが切除縁に罹患組織を有するかどうかを評価するための、病変のより正確な定義付けを可能とする。したがって、ＰＢＫ抗体は、それらがパラフィン包埋組織またはホルマリン固定組織における使用に適するとき、特に有用である。
【００４２】
本発明の方法において有用である抗体は、当該技術分野において公知のように、検出可能なシグナルを生じるように標識することができる。そのような標識には放射性標識、蛍光標識および酵素標識が含まれる。適切なイムノアッセイの例には、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素結合イムノアッセイ等が含まれる。本明細書中で説明される抗体は、さらに、診断アッセイにおいて用いるのに適する固体支持体（例えば、ラテックスまたはポリスチレンのような材料から形成される、ビーズ、プレート、スライドまたはウェル）に結合させることができる。
【００４３】
本明細書中で開示される方法において用いるために被験体から採取されるサンプルは、一般には、組織のサンプル、または試験しようとする組織に由来する細胞を含む体液のサンプルである。サンプルは当該技術分野において公知であるあらゆる方法によって得ることができ、これには外科的切除、針吸引生検、およびパンチ生検が含まれるがこれらに限定されるものではない。当該技術分野において公知のように、ＰＢＫタンパク質または核酸分子の検出に先立ち、サンプルに追加の通常調製工程を施すことができる。そのような工程には、例えば、保存剤の添加またはマトリックス中への組織サンプルの固定化が含まれる。
【００４４】
本明細書中で開示される方法は、ＰＢＫタンパク質、そのタンパク質の断片もしくは変異体、またはＰＢＫタンパク質をコードする核酸（またはそれらの断片もしくは変異体）の測定による、生物学的サンプル中に存在するＰＢＫの量の評価を提供する。好ましい態様においては、ＰＢＫ ｍＲＮＡの量を測定する。しかしながら、当業者に明らかなように、悪性細胞および正常（非悪性）細胞中のＰＢＫマーカーの比較量を検出するあらゆる適切な方法を本発明において用いることができる。
【００４５】
本発明は、本明細書中で開示されるようなＰＢＫタンパク質またはペプチドの変異体の使用ももたらす。本明細書で提供されるＰＢＫタンパク質配列の天然変異体は、保存的なアミノ酸配列差異またはマイナーな非保存的配列差異の分だけ異なり得る。変異体ＰＢＫタンパク質またはペプチドは、好ましくは、本明細書で提供されるＰＢＫ配列（配列番号２および３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、またはそれ以上の配列同一性を有する。保存的アミノ酸置換には以下のグループ内での置換が含まれる：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【００４６】
「同一性パーセント」または「相同性パーセント」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の比較において見出される配列類似性のパーセンテージを指す。同一性パーセントはコンピューターを用いて、例えば、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を用いることによって決定することができる。ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラムは、別の方法、例えば、クラスタル（ｃｌｕｓｔａｌ）法（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ． Ｇ． ａｎｄ Ｐ． Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８８） Ｇｅｎｅ ７３： ２３７−２４４ を参照）に従って２つ以上の配列間のアラインメントを行うことができる。このクラスタルアルゴリズムは、すべてのペアの間の距離を調べることにより、配列をクラスターにグループ化する。これらのクラスターを二つ一組で、次いでグループとしてアラインメントする。２つのアミノ酸配列、例えば、配列Ａおよび配列Ｂの間での類似性パーセンテージは、配列Ａおよび配列Ｂの間で一致する残基の合計を、「配列Ａの長さ − 配列Ａ内のギャップ残基数 − 配列Ｂ内のギャップ残基数」で除算し、それに１００を乗算することによって算出する。２つのアミノ酸配列の間で低い類似性を示すかまたは類似性なしのギャップは類似性パーセンテージの決定には含まれない。核酸配列間の同一性パーセントは当該技術分野において公知の他の方法、例えば、Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法によってもカウントまたは算出することができる（例えば、Ｈｅｉｎ． Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：６２６−６４５ を参照）。
【００４７】
「実質的な配列類似性」という用語は、本明細書中で用いられる場合、本明細書に開示されるものに対して僅かな、かつ重大ではない配列変化を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはアミノ酸配列が等価であるとみなすことを意味する。実質的な配列類似性を有する分子は機能的に等価であり、すなわち、本明細書に具体的に開示される配列と実質的に同じ様式で機能して実質的に同じ組成物および結果を生じる。実質的な配列類似性を有する分子は、典型的には少なくとも約７０％の配列同一性を有し、好ましくは配列が少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％以上もの類似性を示す。
【００４８】
核酸、ペプチド、またはタンパク質分子への言及における「単離された」という用語の使用は、それらの分子がヒトの活動によってそれらの天然 ｉｎ ｖｉｖｏ 細胞成分から分離されていることを意味する。
【００４９】
ここで用いられる場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ポリヌクレオチドと、本明細書に開示されるＰＢＫタンパク質をコードする核酸分子との、ハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、および当該技術分野において周知の他の条件によって規定することができる。特には、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、またはハイブリダイゼーション温度の上昇によってストリンジェンシーを高めることができる。
【００５０】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ ＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であり、好ましくは約５００ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約２５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満である。有機溶媒、例えば、ホルムアミドの不在下では低ストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施することができ、これに対して少なくとも約３５％ホルムアミド、最も好ましくは少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施することができる。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が含まれる。変動するさらなるパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、および担体ＤＮＡの含有または排除は、当業者に周知である。これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを３０℃で、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳ中において行う。より好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを３７℃で、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）において行う。最も好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを４２℃で、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡにおいて行う。これらの条件に関する有用な変更は当業者には容易に明らかとなろう。
【００５１】
ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もストリンジェンシーの点で変更され得る。洗浄ストリンジェンシー条件は塩濃度および温度によって規定することができる。上述と同様に、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることにより、または温度を増加させることにより高めることができる。例えば、洗浄工程のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ ＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約１５ｍＭ ＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄工程のストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、最も好ましくは少なくとも約６８℃の温度が含まれる。好ましい態様においては、洗浄工程は２５℃で、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳにおいて行う。より好ましい態様においては、洗浄工程は４２℃で、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳにおいて行う。最も好ましい態様においては、洗浄工程は６８℃で、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳにおいて行う。これらの条件に関するさらなる変更は当業者には容易に明らかであろう。
【００５２】
本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（本明細書で定義される）下で、配列番号１によって表されるヌクレオチド配列の全体もしくは一部またはその相補体にハイブリダイズする核酸分子の検出（ここで、検出される核酸分子は機能的ＰＢＫタンパク質をコードする）も包含する。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、典型的には、長さが少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、または５０）ヌクレオチドである。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、ＰＢＫタンパク質をコードする核酸の一部もしくは全体の配列、またはその相補体に対して少なくとも８０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％以上同一である。本明細書に記載されるタイプのハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、または診断用プローブとして用いることができる。さらなる手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；および Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ） により、当該技術分野において容易に入手可能である。
【００５３】
本発明は、本明細書中で提供される診断法において用いるための、ＰＢＫマーカーの検出において有用なオリゴヌクレオチドプローブ、および　またはＰＢＫマーカーの検出において有用な抗体を含むキットを提供する。オリゴヌクレオチドプローブはＰＢＫヌクレオチド配列に基づくものであって、好ましくは、長さが約１０、２０、３０、４０、５０もしくはそれ以上のヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド対の組合せは、ＰＢＫ腫瘍マーカーのＰＣＲに基づく検出および腫瘍組織サンプルの ｉｎ−ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションにおけるプライマーとして有用である。これらのオリゴヌクレオチドは、分解に対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるため、１つ以上の修飾された連結基、糖残基および／または塩基を含んでいてもよい。このキットは、特定のタイプの組織におけるＰＢＫヌクレオチドマーカーの標準および診断レベルを記載した印刷された取扱説明書をさらに含んでもよい。この試験キットの構成要素は任意の適切な様式で一緒に包装され、典型的には、単一の容器内にすべての構成要素を含み、かつ試験を実施するための印刷された取扱説明書を含む。この試験キットは、標準または対照として用いられる、ＰＢＫをコードする既知量の核酸分子をさらに含んでいてもよい。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、ＰＢＫタンパク質に特異的な抗体を含み、かつ特定のタイプの組織におけるＰＢＫタンパク質の標準および診断レベルを記載した文書化された取扱説明書をさらに含む試験キットである。これらの抗体は固体支持体に結合されていてもよく、または検出可能な構成要素に結合されていてもよい。この試験キットの構成要素は任意の適切な様式で一緒に包装され、典型的には、単一の容器内にすべての構成要素を含み、かつ試験を実施するための印刷された取扱説明書を含む。
【００５５】
本発明は、潜在的な医薬作用、例えば、抗癌作用について薬剤をスクリーニングする方法であって、該薬剤がＰＢＫマーカーの減少を引き起こすものである前記方法をさらに提供する。そのような薬剤は、ＰＢＫ遺伝子の発現を転写もしくは翻訳レベルのいずれかで直接阻害するか、またはＰＢＫ活性を阻害するか、またはＰＢＫがはたらく生物学的経路内の工程を阻害し、その結果ＰＢＫマーカーの減少を引き起こす。このような方法は、ＰＢＫマーカーを過剰発現する細胞を薬剤に対して曝露し、次いで薬剤に曝露した後の細胞中のＰＢＫマーカーのレベルを測定することを含む。細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏであってもｉｎ ｖｉｖｏであってもよく、腫瘍細胞であっても新生物細胞であってもよい。特に好ましいのはヒト癌の組織培養法および非ヒト哺乳動物モデルである。薬剤は動物に全身的に投与することができ、または新生物増殖体に直接投与することもできる。ＰＢＫマーカーのレベルを予め決定された標準に対してまたは対照において見出されるレベルに対して比較する。ＰＢＫマーカーのレベルの減少は、その薬剤がＰＢＫ遺伝子発現または活性を阻害し、抗癌作用を有し得ることを示す。このようなスクリーニング法は、前立腺癌、乳癌、肺癌および大腸癌の動物モデルまたは細胞培養モデルにおける使用に特に適する。あるいは、このようなスクリーニング法は、同じタイプの非転換細胞と比較してＰＢＫマーカーのレベルが増大している悪性転換細胞系のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングによって行うこともできる。ＰＢＫマーカーのレベルが有意に減少する場合、たとえそのＰＢＫマーカーのレベルが標準または正常レベルを上回り続けているとしても、その薬剤は阻害性であるとみなすことができる。理想的には、ＰＢＫマーカーのレベルは、阻害性薬剤に対して曝露しなかった同じ細胞系に対して少なくとも２０％、２５％もしくは５０％、好ましくは少なくとも７０％以上減少する。ＰＢＫ ｍＲＮＡまたはＰＢＫタンパク質産生の潜在的阻害剤の例には、アンチセンスＲＮＡ、ＰＢＫタンパク質の競合阻害剤、例えば、ＰＢＫタンパク質の断片、またはＰＢＫタンパク質に対する抗体が含まれる。ＰＢＫ阻害剤は、ＰＢＫタンパク質をコードする核酸分子、すなわち、ＰＢＫ遺伝子もしくはそれらのＲＮＡ転写体、またはＰＢＫタンパク質それ自体、またはそれらのサブユニットに対するものであり得る。ＰＢＫ阻害剤として機能し得る物質には、これらに限定されるものではないが、ＰＢＫとその基質との相互作用を特異的に阻害する化合物、ＰＢＫタンパク質を特異的に分解または不活性化する化合物、およびＰＢＫタンパク質の発現を特異的に妨害する化合物が含まれる。そのような薬剤には、ＰＢＫの化合物阻害剤、タンパク質もしくはペプチドＰＢＫのアンタゴニストもしくは競合阻害剤、ＰＢＫタンパク質に対する抗体、およびＰＢＫの発現を阻害する分子、例えば、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー等が含まれ得る。
【００５６】
また本発明は、ＰＢＫ活性レベルの上昇が生じる癌性、新生物性、または過剰増殖性（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）増殖の治療方法を包含する。この方法は、癌細胞を、ＰＢＫの活性（または発現）を阻害する作用物質に対して曝露することを含み、作用物質の量はそうでなければそれらの細胞中に存在するであろうＰＢＫ活性（または発現）（すなわち、阻害性作用物質の不在下で生じると予想される活性または発現）を低下または阻害するのに十分なものである。好ましくは、ＰＢＫ阻害性作用物質は、ＰＢＫの活性または発現を同じ組織タイプの非罹患細胞に見出されるレベルまで低下させる量で提供される。ＰＢＫ阻害剤は、ＰＢＫマーカーが上昇している癌、新生物、または過剰増殖障害を患う被検体に全身投与することができ、または、例えば局所注射により、増殖物（ｇｒｏｗｔｈ）に直接投与することができる。この増殖物は、例えば、前立腺癌または乳癌であり得る。ＰＢＫ阻害剤の最適投与量は、癌の進行のタイプおよび程度、患者の全体的な健康状態、阻害剤の効力、並びに投与経路のような要因に応じて変化するだろう。ＰＢＫ阻害剤投与量の最適化は当技術分野における通常の技術の範囲内である。
【００５７】
ＰＢＫ阻害剤は、ＰＢＫタンパク質をコードする核酸分子、すなわち、ＰＢＫ遺伝子またはそれらのＲＮＡ転写産物、またはＰＢＫタンパク質それ自体、またはそれらのサブユニットを指向するものであり得る。ＰＢＫ阻害剤として機能し得る物質には、これらに限定されるものではないが、ＰＢＫとその基質との間の相互作用を特異的に阻害する化合物、ＰＢＫタンパク質を特異的に分解または不活性化する化合物、およびＰＢＫタンパク質の発現を特異的に妨害する化合物が含まれる。そのような作用物質には、ＰＢＫの化学物阻害剤、タンパク質もしくはペプチドＰＢＫアンタゴニスト、およびＰＢＫの発現を阻害する分子、例えば、三重らせん（ｔｒｉｐｌｅｘ）形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等が含まれ得る。
【００５８】
マウスＰＢＫキナーゼｃＤＮＡ配列が単離され（配列番号７）、コードされたアミノ酸配列が本発明者らによって以下のように決定された：
2004510442.tif 000003
【００５９】
セリン／トレオニンまたは二重特異性キナーゼのコンセンサスＤ−Ｘ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｎ配列には上記で下線が付されている。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０４１８８２は本質的に類似する配列を提供し、これはマウスＴＯＰＫ（Ｔ細胞起源プロテインキナーゼ（Ｔ−ｃｅｌｌ−ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ））と同定される。Ａｂｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ． ２７５（２８）：２１５２５ （２０００） も参照のこと。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０４１８８２で提供されるアミノ酸配列は、（上記配列において下線を付されたボールド体で示される）３１３位でイソロイシン（Ｉ）を挙げる。
【００６０】
また内在性ＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子のうちの少なくとも１つが機能的に破壊されている生殖細胞および／または体細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスも本発明によって提供される。この動物は、ＰＢＫ遺伝子破壊についてヘテロ接合であってもよく、またはより好ましくはホモ接合でありうる。内在性ＰＢＫ遺伝子が機能的に破壊されているホモ接合動物においては、ＰＢＫ活性は野生型動物において見出されるものに対して実質的に低下している。本発明のトランスジェニック動物は、ＰＢＫ阻害剤の効力の評価およびＰＢＫ阻害剤で治療することができる疾患状態の同定に陽性対照として用いることができる。内在性ＰＢＫ遺伝子が機能的に破壊されてはいるが異種ＰＢＫ遺伝子（好ましくは、ヒト）で再構成されているトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスも提供される。このような動物は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＰＢＫ活性を阻害する作用物質を同定するのに用いることができる。宿主細胞中の内在性ＰＢＫ遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物、その核酸構築物を含む組換えベクター、およびその核酸構築物が導入されている宿主細胞も本発明に包含される。内在性ＰＢＫの発現が野生型動物において見られるものに対して増加している非ヒト動物も提供される；そのような過剰発現はその動物の特定の組織タイプまたは解剖学的領域に限定され得る。異種ＰＢＫの発現が動物の特定の組織タイプまたは解剖学的領域において達成されている非ヒト動物も提供される。
【００６１】
本発明は、内在性ＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子のうちの少なくとも一方、より好ましくは両者が機能的に破壊されている体細胞および／または生殖細胞を有する非ヒト動物（好ましくは非ヒト哺乳動物、より好ましくはマウス）に関する。したがって、本発明は、改変されたＰＢＫ遺伝子を有し、したがって少なくとも１つの組織タイプにおけるＰＢＫ活性を欠く（または、野生型動物において観察されるものと比較してＰＢＫ活性が実質的に低下している）生存可能な動物を提供する。本発明の非ヒト動物は、例えば、ＰＢＫ阻害剤を評価するための標準対照として、それによりｉｎ ｖｉｖｏでヒトＰＢＫ阻害剤をスクリーニングするためのモデル系を創出し、および／またはＰＢＫ阻害剤での治療に対する疾患状態を確認するための正常ヒトＰＢＫ遺伝子のレシピエントとして有用である。
【００６２】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、ＰＢＫ遺伝子は、好ましくは、内在性対立遺伝子とその動物の胚性幹細胞前駆体に導入されている改変もしくは異種ＰＢＫ遺伝子、またはそれらの一部との間の相同組換えによって破壊されている。内在性ＰＢＫ遺伝子への無発現変異（ｎｕｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の導入の考慮に加えて、ＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子に点突然変異または欠失を導入してＰＢＫ遺伝子活性を改変するのに類似の技術を用いることができる。その後、胚性幹細胞前駆体を発達させ、機能的に破壊されたＰＢＫ遺伝子を含む改変されたＰＢＫ遺伝子を有する動物が生じる。この動物は機能的に破壊された１つのＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子を有することができ（すなわち、この動物はこの改変についてヘテロ接合であり得る）、より好ましくは、この動物は機能的に破壊された両方のＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子を有する（すなわち、この動物はこの改変についてホモ接合であり得る）。
【００６３】
本発明の一実施形態においては、両方のＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子の機能的破壊は、動物の細胞におけるＰＢＫ遺伝子産物の発現が非改変動物に対して実質的に不在である動物を生じる。別の実施形態においては、ＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子を、動物の細胞において改変された（すなわち、突然変異体または非野生型）ＰＢＫ遺伝子産物が産生されるように破壊することができる。
【００６４】
加えて、本発明の動物は、特定の疾患状態がＰＢＫの作用に関与し、したがって、ＰＢＫ阻害剤によって潜在的に治療し得るか否かを決定するのに有用である。例えば、機能的に破壊されたＰＢＫ遺伝子を有する本発明の動物において疾患状態を誘導する試みをなすことができる。続いて、疾患状態に対するその動物の羅病性または耐性を決定することができる。疾患状態に対する本発明の動物の耐性に基づき、ＰＢＫ阻害剤で治療可能である疾患状態を同定することができる。
【００６５】
本発明の別の態様は、機能的に破壊された内在性ＰＢＫ遺伝子を有するが異種ＰＢＫをコードする導入遺伝子（すなわち、別の種に由来するＰＢＫ遺伝子）もそのゲノム内に担持し、かつそれを発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。好ましくは、この動物はマウスであり、かつ異種ＰＢＫはヒトＰＢＫ、例えば、本明細書で提供される配列番号２または配列番号３のＰＢＫである。ヒトＰＢＫで再構成されている本発明の動物は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＰＢＫを阻害する作用物質の同定に用いることができる。例えば、この動物を、試験しようとする作用物質の存在下および不在下でＰＢＫの産生を誘導する刺激に曝露し、およびその動物におけるＰＢＫ応答を測定することができる。作用物質の不在下でのＰＢＫ応答と比較して作用物質の存在下でのＰＢＫ応答の減少に基づき、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＰＢＫを阻害する作用物質を同定することができる。
【００６６】
本発明のさらに別の態様は、宿主細胞中のＰＢＫ遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物に関する。この核酸構築物は：ａ）非相同置換部分；ｂ）第１ＰＢＫ遺伝子配列と実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を有する、非相同置換部分の上流に位置する第１相同領域；およびｃ）第２ＰＢＫ遺伝子配列と実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を有する、非相同置換部分の下流に位置する第２相同領域を含み、第２ＰＢＫ遺伝子配列は天然内在性ＰＢＫ遺伝子において第１遺伝子配列の下流に位置する。加えて、第１および第２相同領域は、核酸分子が宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における核酸構築物と内在性ＰＢＫ遺伝子との間の相同組換えに十分な長さのものである。ＰＢＫ遺伝子配列と「実質的な同一性」を有するヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるそのヌクレオチド配列と内在性ＰＢＫ遺伝子配列との間の相同組換えを可能にするのに十分なＰＢＫ遺伝子配列との配列同一性を有するヌクレオチド配列を説明しようとするものである。典型的には、フランキングする相同領域のヌクレオチド配列は、相同組換えの標的とされる内在性ＰＢＫ遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９８％、９９％または１００％同一である。最も好ましくは、フランキング相同領域は標的とされる内在性対立遺伝子と同質遺伝子的である（例えば、フランキング領域のＤＮＡは、ターゲッティング構築物を導入しようとする細胞と同じ遺伝的背景を有する細胞から単離される）。
【００６７】
好ましい実施形態においては、非相同置換部分は、当技術分野において公知のように、好ましくは調節エレメント（１つもしくは複数）に機能的に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む、陽性選択発現カセットを含有する。「陽性選択発現カセット」という用語は、陽性選択マーカーの発現を制御する調節エレメント（例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列）に機能的に連結された陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を指す。「陽性選択マーカー」は、そのマーカーを含む細胞の選択を許容する。別の好ましい実施形態においては、また核酸構築物は、相同領域の上流または下流のいずれかの遠位に陰性選択発現カセットも含む。好ましい陰性選択発現カセットは、調節エレメント（１つもしくは複数）に機能的に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む。
【００６８】
本発明の別の態様は、本発明の核酸構築物が組み込まれている組換えベクターに関する。本発明のさらに別の態様は、本発明の核酸構築物が導入されており、それにより核酸構築物と宿主細胞の内在性ＰＢＫ遺伝子との間の相同組換えが可能となり、その結果内在性ＰＢＫ遺伝子の機能的破壊が生じる宿主細胞に関する。この宿主細胞はＰＢＫを正常に発現する哺乳動物細胞であっても、多能性細胞、例えば、マウス胚性幹細胞であってもよい。核酸構築物が導入されており、かつ内在性ＰＢＫ遺伝子と相同的に組換えられている胚性幹細胞のさらなる発生は、胚性幹細胞の子孫であり、したがってそれらのゲノム内にＰＢＫ遺伝子破壊を担持する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物を生じる。次に、ＰＢＫ遺伝子破壊をそれらの生殖細胞系に担持する動物を選択して飼育し、すべての体細胞および生殖細胞においてＰＢＫ遺伝子破壊を有する動物を産生することができる。次いで、そのようなマウスを、ＰＢＫ遺伝子破壊についてホモ接合性にまで飼育することができる。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、「機能的に破壊されている」遺伝子は、その遺伝子の正常機能を妨げる、例えば、正常ＰＢＫ遺伝子産物の発現を妨げ、または正常量のＰＢＫ遺伝子産物の発現を妨げる配列改変を有する。機能的破壊を生じる突然変異は、挿入、欠失または点突然変異（１つもしくは複数）であり得る。一実施形態においては、ＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子の両方が、ＰＢＫ遺伝子産物の発現が動物の細胞中で実質的に低下するか、または不在であるように機能的に破壊される。「不在」という用語は、動物の細胞中で産生される正常ＰＢＫ遺伝子産物の量が本質的に検出不能であることを意味することが意図されている。このタイプの突然変異は当技術分野において「無発現変異」とも呼ばれ、そのような無発現変異を担持する動物は「ノックアウト動物」とも呼ばれる。別の実施形態においては、ＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子の両方が、改変した形態のＰＢＫ遺伝子産物が動物の細胞中で発現するように機能的に破壊される。例えば、１つ以上の点突然変異または欠失突然変異をＰＢＫ遺伝子に導入し、それによりそこでコードされるＰＢＫ遺伝子産物のアミノ酸配列を改変させることができる。さらに、ＰＢＫコードＤＮＡ配列を選択された組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーに連結させ、かつ生じるハイブリッドＤＮＡ分子を動物の胚に初期発生段階（例えば、受精卵母細胞段階）で標準法によって導入することにより、選択された組織（例えば、乳房、前立腺）において増加したレベルのＰＢＫを発現するトランスジェニック動物を産生することができる。
【００７０】
非相同置換部分はＰＢＫ遺伝子内の様々な位置に挿入可能であり、異なる相同領域がフランキングすることでその遺伝子が機能的に破壊されることは当業者には明らかであろう。ｍＰＢＫ遺伝子配列の機能的破壊は、（例えば、ｎｅｏ遺伝子の挿入により）全長ｍＰＢＫ ｍＲＮＡ転写産物の発現を妨げることができ、または改変した形態のｍＰＢＫをコードするｍＰＢＫ ｍＲＮＡ転写産物の発現につながり得る。
【００７１】
ＰＢＫ発現のレベルが低下した非ヒト動物は、さらに、当技術分野において公知のように、リコンビナーゼ技術を用いて得ることができ、そこでは内在性ＰＢＫ配列を標的とするリコンビナーゼがそのＤＮＡ配列を切除または再配置する。例えば、標的とされた遺伝子の発現を調節するためのリコンビナーゼを発現するアデノウイルスベクター系に関する米国特許第６，１２０，７６４号を参照のこと。
【００７２】
加えて、当技術分野において公知のウイルス遺伝子ベクターを用いて、内在性ＰＢＫを過剰発現するか、または異種ＰＢＫを発現する非ヒト動物（好ましくは、マウス）を提供することができる。好ましくは、異種ＰＢＫはヒトＰＢＫである。異種ＰＢＫの発現、または内在性ＰＢＫの過剰発現は、動物内の特定の組織タイプまたは組織の領域に限定することができる。組織特異的遺伝子の発現を駆動し、かつトランスジェニック非ヒト動物の提供において有用である様々なプロモーター／エンハンサーが同定されている。発現カセットは、プロモーターおよびポリアデニル化部位、並びに必要であるならば、エンハンサーエレメントを含む、挿入遺伝子の発現に必要な調節エレメントを含む。
【００７３】
ラットＣ（３）１の５’ＤＮＡ領域内のプロモーターエレメントを、遺伝子産物の前立腺特異的発現を指令し、およびトランスジェニックマウスを産生するために用いることができる。例えば、Ｚｈａｎｇら， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２０００ Ｊｕｎ １；４３（４）：２７８−８５ を参照のこと。プロモーターおよびラットＣ（３）１遺伝子の５’領域を、組換えＤＮＡ技術を用いてＰＢＫ遺伝子のコーディング領域に融合させる。雄性由来の前立腺を、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションにより、組換えＰＢＫ ｍＲＮＡの発現について検査することができる。
【００７４】
ヒト前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）および腺性カリクレイン−１（ｈＧＫ−１、ｈＫ２としても知られる）遺伝子は染色体１９上に、１２ｋｂ遺伝子間領域によって分離されて縦列に位置する。ＰＳＡ遺伝子調節エレメント単独、または遺伝子間領域と一緒の制御の下に配置される導入遺伝子は、前立腺特異的発現を示す。この遺伝子間領域は、高レベルの発現に対する高ＰＳＡ遺伝子コピー数の必要性を低下させる。例えば、Ｃｌｅｕｔｊｅｎｓら， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １１（９）：１２５６−６５ （１９９７）；Ｗｅｉら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ２（４）：４８７−４９６ （１９９８） を参照のこと。
【００７５】
またトランスジェニックマウスにおける標的とされた遺伝子の前立腺特異的発現は、プロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ；ＰＢ）プロモーターの断片を用いても達成することができる。小ＰＢ断片は前立腺特異的発現を指令するのに十分であるが、より大きな断片の使用は導入遺伝子発現のレベルを増加させる。例えば、Ｙａｎら， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３２：１２９−１３９ （１９９７） を参照のこと。
【００７６】
したがって、本発明は、当技術分野において公知の組織特異的プロモーターを用いて、ＰＢＫの組織特異的過剰発現のマウスモデルをさらに提供する。好ましい組織特異的プロモーターは前立腺特異的プロモーターである。そのようなマウスは、例えば、前立腺のような特定の組織においてヒトＰＢＫを発現することができ、または特定の組織においてマウスＰＢＫを過剰発現することができる。これらの動物は、ＰＢＫ活性に関するそれらの効果についての化合物のスクリーニングにおいて有用である。
【００７７】
導入遺伝子が誘導的に調節されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する様々な系が当技術分野において公知である。本発明のトランスジェニック動物におけるＰＢＫ発現の調節は、当技術分野において公知のように、原核生物のＴｅｔ（テトラサイクリン）リプレッサー／オペレーター／インデューサー系の成分を用いて達成することができる。例えば、米国特許第５，９６５，４４０号；米国特許第５，９２２，９２７号；米国特許第５，９１７，１２２号；米国特許第５，８５１，７９６号；米国特許第５，６５０，２９８号を参照のこと。
【００７８】
あるいは、「遺伝子スイッチ」をＢｏｎｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１９４２−４６ （２０００）に記載されるように挿入することにより、非ヒト動物におけるＰＢＫ遺伝子の発現を低下または除去することができる。Ｂｏｎｄらは、相同組換えを用いて、ドキシサイクリンに基づく遺伝子スイッチを挿入して標的遺伝子の発現を調節した。動物にドキシサイクリンが与えられるとき、標的遺伝子の発現が消滅する。この調節カセットは標的遺伝子の５’非翻訳領域に挿入される。
【００７９】
加えて、ヒトＰＢＫ遺伝子の機能をヒト細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはヒト組織移植片を含む非ヒト動物において改変することができる。そのような改変されたヒト細胞は、化合物をＰＢＫ活性に対する薬学的効果についてスクリーニングする上で有用である。ヒト宿主細胞において相同組換えによってヒトＰＢＫ（ｈＰＢＫ）遺伝子を標的とするため、ターゲッティングベクターはヒトＰＢＫ遺伝子配列と実質的な同一性を有するフランキング相同領域を含む。ヒトＰＢＫゲノムＤＮＡ配列は、標準技術を用いてヒトＰＢＫ ｃＤＮＡのすべてまたは一部を含むｃＤＮＡプローブでヒトゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって単離することができる。ヒトＰＢＫ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びヒトＰＢＫタンパク質の推定アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および２によって示される。マウスＰＢＫ遺伝子について説明されるように、ヒト細胞内のヒトＰＢＫ遺伝子配列の機能的破壊は、全長ｈＰＢＫ ｍＲＮＡ転写産物の発現を妨げることができ、または改変された形態のｈＰＢＫをコードするｈＰＢＫ ｍＲＮＡ転写産物の発現につながり得る。
【００８０】
宿主細胞内の内在性ＰＢＫ遺伝子の対立遺伝子を機能的に破壊するため、本発明のターゲッティングベクターを宿主細胞、例えば、ＰＢＫを正常に発現する分化細胞または胚性幹細胞に導入し、相同組換え体を選択する。ターゲッティングベクターは、外来性ＤＮＡの導入に好適であることが当技術分野において公知である幾つかの技術（例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、マイクロインジェクション、リポフェクション等）のうちのいずれによっても宿主細胞に導入することができるが、最も好ましくは、電気穿孔法によって宿主細胞に導入する。ベクターを宿主細胞に導入した後、導入されたターゲッティングベクターと内在性ＰＢＫ遺伝子との間の相同組換えを許容するのに十分な期間および条件下で細胞を培養する。宿主細胞を選択し、標準技術（例えば、正常内在性対立遺伝子を相同組換え対立遺伝子と区別するプローブを用いるサザンハイブリダイゼーション）により内在性ＰＢＫ遺伝子座での相同組換えについてスクリーニングする。
【００８１】
実施例
ｍＲＮＡの定量化
ＰＢＫ ｍＲＮＡを検出し、かつ腫瘍組織および正常（非腫瘍性）組織におけるＰＢＫ ｍＲＮＡの相対量を比較するための定量アッセイを設計した。このアッセイはリアルタイム蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＴａｑＭａｎ）を用いた。
【００８２】
ＴａｑＭａｎ配列検出器（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）には、核酸配列のハイスループット定量をもたらすためのＰＣＲに基づくアッセイおよびハードウェア／ソフトウェア機器が組み込まれている。熱サイクリング、蛍光検出、および用途特異的ソフトウェアの組合せは、ＰＣＲ産物の増加をサイクルごとに検出することを可能にする。定量的結果が得られる。
【００８３】
この方法は、ＰＣＲ反応混合物に添加された、標的配列に相補的な蛍光発生プローブを用いた。このプローブは、レポーターおよびクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）色素が結合するオリゴヌクレオチドを含有していた。ＰＣＲの過程で標的核酸が存在していた場合、プローブがフォワードとリバースプライマー部位との間に特異的にアニーリングした。ポリメラーゼがプローブを開裂し、それがレポーター色素をクエンチャー色素の影響から解放し、したがってレポーター色素の蛍光強度の増加が生じた。その後、蛍光放出を記録し、および／または測定した。例えば、Ｏｒｌａｎｄｏ， Ｃ．， Ｐ．， Ｐｉｎｚａｎｉ，およびＭ．， Ｐａｚｚａｇｌｉ．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．」Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ ３６ （１９９８）：２５５−２６９；Ｂｒｉｎｋら，「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１β， ＩＬ−１０， ＩＬ−１０ｒ， ＴＮＦα ａｎｄ ＩＬ−７ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ＵＶ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ」， Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ ４９（６）：２９０ （２０００） を参照のこと。
【００８４】
プライマーおよびプローブの配列：
フォワードプライマー：５’ ＡＧＴ ＴＡＡ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＡＡＧ ＴＴＡ ＡＴＧ Ｃ ３’ （配列番号４）
リバースプライマー：５’ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＧＧ Ａ ３’ （配列番号５）
プローブ：５’−（ＦＡＭ）−ＴＴＧ ＡＧＣ ＴＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＴＴ ＧＧＣ ＣＡＴ ＣＴＡ Ｇ−（ＴＡＭＲＡ）−３’ （配列番号６）
ＦＡＭは用いられた色素を指す；ＴＡＭＲＡはクエンチャーを指す。
【００８５】
ＰＣＲサイクリング条件：
４８℃３０分
９５℃１０分
以下を４０サイクル：
９４℃１５秒
６０℃１分
【００８６】
Ｔａｑｍａｎ分析に用いられた具体的な試薬および条件を表１に示す。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
簡潔に述べると、組織サンプルから誘導されるＲＮＡのみを欠く、試薬の「マスターミックス」を生成した。４５μＬのマスターミックスのアリコートを９６ウェルＴａｑｍａｎプレートの各ウェルに添加した。次に、特定のサンプルＲＮＡを、各々のサンプルを三重で、適切なウェル（総容量５μＬの水中に５０ｎｇのＲＮＡ）に添加した。製造業者の指示によってＴａｑｍａｎプレートを覆い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ内に入れた。上述のプライマーおよびプローブを用い、上述のＰＣＲ条件下で分析を行った。
【００８９】
サンプル
アデノイド、脂肪、副腎、脳、乳房、子宮頸、大腸、子宮内膜、心臓、視床下部、回腸、空腸、腎臓、肝臓、肺、子宮筋層、卵巣、膵臓、膵頭、胎盤、前立腺、直腸、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、甲状腺、扁桃腺、膀胱、子宮、胎児脳、および胎児腎臓について正常ヒト組織のサンプルを得た（剖検サンプルであった脳および胎児脳を除いて、地元の病院からの外科的サンプル）。
【００９０】
組織学的に診断された腫瘍組織および正常組織の対を形成するサンプルを得た。本明細書で用いられる場合、「対を形成する」サンプルは、同じ被検体から得られた腫瘍組織および正常組織のサンプルである。肺腫瘍の２３サンプル、前立腺腫瘍の９サンプル；大腸腫瘍の２０サンプル；および乳房腫瘍の９サンプルを研究した。
【００９１】
結果：正常組織
様々な正常（非癌性）組織タイプにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡの相対的な存在度を、上述の蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定した。結果を図１に示す。ＰＢＫ ｍＲＮＡは精巣において最も豊富であった。
【００９２】
結果：肺腫瘍組織
肺腫瘍サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡを、対を形成する正常肺組織サンプルにおけるものと比較した。図２に示されるように、２３の肺腫瘍サンプルのうちの１３サンプル（５７％）においてＰＢＫ ｍＲＮＡが、その対を形成する正常肺組織と比較したときに少なくとも１０倍高く発現した。
【００９３】
結果：前立腺腫瘍組織
前立腺腫瘍サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡを、対を形成する正常前立腺組織サンプルにおけるものと比較した。図３に示されるように、９の前立腺腫瘍サンプルのうちの７サンプル（７８％）においてＰＢＫ ｍＲＮＡが、その対を形成する正常前立腺組織と比較したときに少なくとも１０倍高く発現した。他の２つの腫瘍サンプルにおいては、腫瘍サンプル中のＰＢＫ ｍＲＮＡのレベルは正常組織において検出されるものと同じ（「０」）であった。
【００９４】
結果：大腸腫瘍組織
大腸腫瘍サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡを、対を形成する正常大腸組織サンプルにおけるものと比較した。図４に示されるように、２０の肺腫瘍サンプルのうちの５サンプル（２５％）においてＰＢＫ ｍＲＮＡが、その対を形成する正常大腸組織と比較したときに少なくとも１０倍高く発現した。
【００９５】
結果：乳房腫瘍組織
乳房腫瘍サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡを、対を形成する正常乳房組織サンプルにおけるものと比較した。図５に示されるように、９の乳房腫瘍サンプルのうちの６サンプル（６７％）において、ＰＢＫ ｍＲＮＡが、その対を形成する正常乳房組織と比較したときに少なくとも１０倍高く発現した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常ヒト組織におけるＰＢＫ ｍＲＮＡの発現をグラフで表す。ＰＢＫ ｍＲＮＡの相対的な豊富さが様々な組織にわたって評価され、それはサンプル中のＰＢＫ ｍＲＮＡのレベルの単位なしの測定値である。
【図２】図２は、ヒト肺腫瘍サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡの発現をグラフで表す。（対を形成する非癌性肺組織サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡの発現レベルと比較して）１０倍以上の過剰発現が検査した２３の肺腫瘍サンプルのうちの１３（５７％）で見出された。
【図３】図３は、ヒト前立腺腫瘍サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡの発現を、対を形成する正常前立腺サンプルと比較してグラフで表す。１０×以上の過剰発現が検査した９つの前立腺腫瘍サンプルのうちの７つ（７８％）で見出された。
【図４】図４は、ヒト大腸腫瘍サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡの発現を、対を形成する正常大腸組織サンプルと比較してグラフで表す。１０×以上の過剰発現が検査した２０の大腸腫瘍サンプルのうちの５つ（２５％）で見出された。
【図５】図５は、ヒト乳房腫瘍サンプルにおけるＰＢＫ ｍＲＮＡの発現を、対を形成する正常乳房組織サンプルと比較してグラフで表す。１０×以上の過剰発現が検査した９つの乳房腫瘍サンプルのうちの６つ（６７％）で見出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004510442.tif 000060
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