(57)【要約】本発明は、（ａ）空虚な空間を含む構造を有する、ヒアルロン酸誘導体の三次元基質と；（ｂ）セラミック材料によって構成される多孔性の三次元基質とによって構成され、（ｃ）場合により、薬理学的または生物学的活性成分を含有する、生体適合性である生体成分の材料の製造および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．連絡する細孔および／または微細繊維もしくはマイクロファイバーの絡み合いによって形成される空虚な空間を、細胞とともにか、または細胞なしに囲う構造を有する、ヒアルロン酸誘導体の三次元骨組みと；
ｂ．細胞とともにか、または細胞なしに、セラミック材料によってか、または少なくとも１種類のセラミック材料を含有する複合材料によって構成される、多孔性の三次元骨組みとによって構成され、
ｃ．場合により、薬理学的または生物学的活性物質を含有する、
生体適合性である生体成分の材料であって、
別個ではあるが、骨軟骨形成細胞によって構造的に統合された、軟骨部分および骨部分を含有する、加工された骨軟骨移植片を製造するため、ならびに構造的に統合された骨軟骨組織をin vivoで修復／再生するための材料。
【請求項２】
三次元骨組み（Ａ）が、カルボキシル官能基の一部または全部を、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環族もしくは複素環系列のアルコールでエステル化した、ヒアルロン酸エステルによって構成される、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項３】
三次元骨組み（Ａ）が、カルボキシル基の一部または全部を、同じ多糖類鎖またはその他の連鎖のアルコール官能基でエステル化した、ヒアルロン酸の自己架橋結合したエステルによって構成される、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項４】
三次元骨組み（Ａ）が、カルボキシル基の一部または全部を、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、複素環系列のポリアルコールでエステル化して、スペーサー鎖を用いて架橋結合を生成した、ヒアルロン酸の架橋結合した化合物によって構成される、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項５】
三次元骨組み（Ａ）が、ヒアルロン酸、またはヒアルロン酸の部分もしくは全エステルと、コハク酸とのヘミエステル、またはコハク酸とのヘミエステルの重金属塩によって構成される、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項６】
三次元骨組み（Ａ）が、ヒアルロン酸の硫酸化誘導体によって構成される、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項７】
三次元骨組み（Ａ）が、ヒアルロン酸またはその誘導体のアミドによって構成される、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項８】
多孔性の三次元骨組み（Ｂ）が、リン酸三カルシウムを包含するハイドロキシアパタイトもしくはその他のリン酸カルシウム；硫酸カルシウム；ハイドロキシアパタイトとリン酸三カルシウムとによって構成される複合材料；ハイドロキシアパタイトもしくはその他のリン酸カルシウム、または硫酸カルシウムと、その他のセラミック、生体適合性金属粒子またはポリマーとによって構成される複合材料；リン酸三カルシウムを包含するハイドロキシアパタイトもしくはその他のリン酸カルシウムで被覆されたセラミック材料；生体活性ガラスによって構成される、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項９】
薬理学的活性成分が、抗生物質、消毒剤および防腐剤、抗ウイルス、抗菌および抗真菌剤、非ステロイド系およびステロイド系抗炎症薬、細胞増殖抑止、細胞毒性、麻酔および抗癌剤で形成される群から選ばれる、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項１０】
生物学的活性成分が、生物材料への細胞の接着を助ける物質、成長因子、骨形態形成タンパク質、骨形成タンパク質、成長ホルモン、ビタミン、硫酸グルコサミンのようなその他の天然物質で形成される群から選ばれる、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項１１】
成分（Ａ）および（Ｂ）が不織布、膜、スポンジの形態をなす、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項１２】
骨−軟骨形成細胞が、骨細胞、軟骨細胞、骨髄細胞、間充織幹細胞で形成される群から選ばれる、請求項１記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項１３】
該細胞が、自家、同種、異種のものである、請求項１２記載の生体適合性である生体成分材料。
【請求項１４】
請求項１記載の加工された骨軟骨移植片を製造する方法であって、
−ヒアルロン酸誘導体に基づく三次元骨組み（Ａ）を製造する工程と；
−セラミック材料に基づく多孔性の三次元骨組み（Ｂ）を製造する工程と；
−骨組み（Ａ）および（Ｂ）を、接着材料および／または縫合によってか、もしくはヘルスケアおよび外科に用いられる物品でそれらを固定することによって結合する工程と；
−骨軟骨細胞を、in vitroで、生体適合性である生体成分材料上で培養する工程と；
−細胞を有する生体適合性である生体成分材料、および場合により１種以上の薬理学的または生物学的活性成分を骨軟骨欠損内に移植する工程と
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１記載の加工された骨軟骨移植片を製造する方法であって、
−ヒアルロン酸誘導体によって構成される三次元骨組み（Ａ）を製造する工程と；
−セラミック材料によって構成される多孔性の三次元骨組み（Ｂ）を製造する工程と；
−骨組み（Ａ）および（Ｂ）を、接着材料および／または縫合によってか、もしくはヘルスケアおよび外科に用いられる物品でそれらを固定することによって結合する工程と；
−in vitroで、生体適合性である生体成分材料上に骨−軟骨形成細胞を接種し、場合により培養する工程と；
−細胞を有する生体適合性である生体成分材料を、処置しようとする骨軟骨欠損以外の、骨軟骨組織を形成できる部位に移植する工程と；
−それを、場合により１種以上の薬理学もしくは生物学的活性成分と結びつけて、骨軟骨欠損内に移植する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１記載の骨軟骨移植片を製造する方法であって、
−ヒアルロン酸誘導体に基づく三次元骨組み（Ａ）を製造する工程と；
−セラミック材料に基づく多孔性の三次元骨組み（Ｂ）を製造する工程と；
−骨組み（Ａ）および（Ｂ）を、接着材料および／または縫合によってか、もしくはヘルスケアおよび外科に用いられる物品でそれらを固定することによって結合する工程と；
−１種以上の薬理学的または生物学的活性成分を場合により装荷した、細胞なしの生体適合性である生体成分材料を、骨軟骨欠損内に移植する工程と
を含む方法。
【請求項１７】
請求項１記載の加工された骨軟骨移植片を製造する方法であって、
−ヒアルロン酸誘導体に基づく三次元骨組み（Ａ）を製造し、分化したかもしくは未分化の間充織幹細胞または骨髄細胞を接種する工程と；
−セラミック材料に基づく多孔性の三次元骨組み（Ｂ）を製造し、分化したかもしくは未分化の間充織幹細胞または骨髄細胞を接種する工程と；
−骨組み（Ａ）および（Ｂ）を、接着材料および／または縫合によってか、もしくはヘルスケアおよび外科および培養に用いられる物品でそれらを固定することによって結合する工程と；
−細胞を有する生体適合性である生体成分材料を、場合により１種以上の薬理学的もしくは生物学的活性成分と結びつけて、骨軟骨欠損内に移植する工程と
を含む方法。
【請求項１８】
骨軟骨欠損の修復／再生のための、前記請求項記載の加工された骨軟骨移植片の使用。
【請求項１９】
不織布、膜、スポンジの形態での、前記請求項記載の加工された骨軟骨移植片の使用。
【請求項２０】
不織布を、ヒアルロン酸のベンジルエステル（ＨＹＡＦＦ（登録商標）１１）で作成する、請求項１９記載の加工された骨軟骨移植片の使用。
【請求項２１】
不織布を、架橋結合したヒアルロン酸（ＡＣＰ（登録商標））で作成する、請求項１９記載の加工された骨軟骨移植片の使用。
【請求項２２】
スポンジを、ヒアルロン酸のベンジルエステル（ＨＹＡＦＦ（登録商標）１１）で作成する、請求項１９記載の加工された骨軟骨移植片の使用。
【請求項２３】
スポンジを、架橋結合したヒアルロン酸（ＡＣＰ（登録商標））で作成する、請求項１９記載の加工された骨軟骨移植片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、
ａ．連絡する細孔、および／または微細繊維もしくはマイクロファイバーの絡み合いによって形成される空虚な空間を含む構造を有する、ヒアルロン酸誘導体の三次元基質と；
ｂ．セラミック材料によってか、または少なくとも１種類のセラミック材料を含有する複合材料によって構成される、多孔性の三次元基質と；
によって構成され、
ｃ．場合により、薬理学的または生物学的活性成分を含有する
生体適合性である生体成分材料の、
別個ではあるが、構造的に統合された軟骨部分および骨質部分を含有する、加工された骨軟骨移植片を、骨軟骨形成細胞を用いて製造するため、ならびに構造的に統合された骨軟骨組織をin vivoで修復／再生するための、製造および使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
大規模な関節炎、壊死の後のか、または外傷もしくは腫瘍除去の結果としての、関節からの骨軟骨組織の喪失は、欠損を修復するのに形成外科手術を必要とする。
【０００３】
そのような欠損の、関節代置による処置は、用いられる非生物学的材料が、摩耗かつ裂開しやすく、代置自体動くのに困難なことがあるという事実によって制限される。
【０００４】
これに代えて、自家、同種または異種の骨移植片を援用することが可能である。骨を置き換える理想的な方法は、同種および異種移植片より優れた骨形成能を有する、自家組織を移植することであって、それは、骨形成および軟骨形成細胞系へと分化する間充織細胞の、その再吸収の際の存在によって示されるとおりである［K.L.B. Brown et al., Surg., 1982, 64A, 270-279］。その上、同種移植片および異種移植片は、組織適合性の抗原を保有していて、免疫抑制的な処置を患者に与えることを必要にさせるが、自家移植片は、いかなる免疫学的応答も誘発しない。その上に、同種および異種移植片は、ウイルス、たとえばＨＩＶ、肝炎またはＢＳＥを被移植者に伝染させることがある。
【０００５】
骨自家移植片は、移植片を供与部位から取り出すときに、患者に第二の外傷を与え、また入手できる組織が少量であるため、この操作の使用は、非常に限定されている。
【０００６】
整形外科的探索は、長い間、組織移植片を援用する必要性を軽減または排除するような、骨軟骨移植片に適した新たな人工的材料の研究に集中している。
【０００７】
必要条件を満たすためには、材料は、生体適合性であり、骨成長に匹敵する速度で生体吸収可能であり、負荷に耐えることができ、滅菌および加工が容易であり、骨活性である、すなわち、それは、骨始原細胞への間充織細胞の分化を誘導するための骨誘導物質（osteoinductor）でなければならず、移植片内での骨成長を可能にするための骨案内物質（osteoconductor）でなければならない。
【０００８】
骨再生のための文献に報告された手法は、セラミック、ポリマー、複合材料および生物活性分子の使用を参照している。
【０００９】
化学的および構造的な観点からは、リン酸カルシウムが、生物学的ハイドロキシアパタイトによって主として構成される、骨の無機質部分に類似するという事実は、骨形成を誘導するための生物材料としてのセラミックの使用を促す。
【００１０】
最も一般的に用いられるセラミックは、β−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）および合成ハイドロキシアパタイトである。それらは、細胞の定着および骨成長を助けるその多孔性のために、骨案内物質であることが立証されている。
【００１１】
同系ラットにおける皮下インプラントで実施された研究によって、骨髄細胞と多孔性セラミックとの組合せが、骨形成を促進して、細孔内に新たな骨が形成されることが示されている。その上、軟骨の単離された小部域が、認め得るいかなる軟骨内骨化もなしに観察された［H. Ohgushi et al., J. Orthop. Res., 1989, 4, 568-578］。
【００１２】
ポリマーの広汎な使用は、特定の用途の必要条件はもとより、生物分解の特性も満たすことができる、異なる組成および構造が得られる可能性によって説明される。ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマーまたは誘導体は、骨細胞の増殖のための生物材料として、様々な形態で用い得ることが知られている。そのような骨組みを用いることの主な短所は、移植された材料に対して誘発される免疫応答に代表される。
【００１３】
機械的および生物学的双方の観点から満足できる生物材料を創出するために、ポリマーとリン酸カルシウムとの混合物によって形成される、様々な複合材料が研究されている。
【００１４】
少なくとも１種類のヒアルロン酸誘導体を含有する骨組みを、組織成長のための生物材料として用い得ることもまた知られている。
【００１５】
ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンの交互残基で構成される、多糖類エーテルである。その入手源、および用いられる製造および決定の方法にに応じて、５０，０００〜１３，０００，０００Daの変動幅のある分子量を有する、直鎖状のポリマー鎖である。自然界には、細胞周囲のゲル、脊椎動物の結合組織（それが主要成分となっている）の基本物質、関節の滑液、硝子体液、ヒト臍帯、および雄鶏のとさか中に存在する。
【００１６】
ヒアルロン酸は、水和、プロテオグリカン組織化、細胞分化、増殖および血管形成のような、多くの生物学的過程にきわめて重大な役割を果たす［J. Aiger et al., L. Biomed. Mater. Res., 1998, 42, 172-181］。
【００１７】
ヒアルロン酸画分は、組織修復を増進し、眼内液を置き換えるのに用いることができるか、またはヨーロッパ特許第０１３８５７２号および第０５３５２００号公報に記載されたとおり、関節病理を処置するために関節内経路によって投与できることも公知である。
【００１８】
ヒアルロン酸は、組織修復過程、特に初期肉芽期に根本的な役割を果たして、凝固基質を安定化し、その分解を制御し、炎症過程に関与する細胞、たとえば繊維芽細胞および内皮細胞の動員を助け、最後に上皮細胞のその後の移動を方向付ける。
【００１９】
ヒアルロン酸溶液の適用は、創傷または火傷の患者における組織修復過程を促進できることが知られている。組織修復過程の様々な段階におけるヒアルロン酸の役割は、P.H. Weigelら［J. Theor. Biol., 119:219, 1986］による理論的モデルの構築によって記載されている。
【００２０】
ヒアルロン酸の低分子量画分、およびその自己架橋結合した誘導体の使用は、骨誘導物質である医薬化合物の製造でも公知である［ＷＯ  ９３／２０８２７］。
【００２１】
ヒアルロン酸の全エステルまたは部分エステル（ＨＹＡＦＦ（登録商標））、およびその自己架橋結合した誘導体（ＡＣＰ（登録商標））は、医薬および化粧品分野、ならびに生物分解できる材料の分野におけるそれらの使用のとおり、公知である［米国特許第４，８５１，５２１号；第４，９６５，３５３号および第５，６７６，９６４号明細書］。
【００２２】
特に、特許出願のＷＯ  ９３／２０８５８は、外科手術における骨充填材として用いられる、ヒアルロン酸および／またはそのエステル誘導体を含有する結合用溶液およびペーストを記載している。
【００２３】
最後に、ヒアルロン酸のエステルは、米国特許第５，５２０，９１６号明細書に記載された方法によれば、不織構造の形態で加工されている。
【００２４】
三次元形態でのヒアルロン酸誘導体、および特に不織組織の形態で加工されたヒアルロン酸の部分および全エステル（ＨＹＡＦＦ（登録商標））は、細胞および／またはそのような細胞から生成された生成物を含有する生物学的材料の製造の際に骨組みとして用いられている。
【００２５】
たとえば、軟骨再形成の組織工学手順において、ヒト軟骨細胞を培養するために、ヒアルロン酸のベンジルエステル（ＨＹＡＦＦ（登録商標）−１１）を、骨組みとして、不織繊維構造の形態で用いることの可能性が、最近調査されている。これらの３Ｄ培養では、軟骨細胞は、II型コラーゲンまたはプロテオグリカンのような、ガラス状の軟骨特異的な基質分子を生成することができた［J. Aiger et al., L. Biomed. Mater. Res., 1998,42, 172-181］。
【００２６】
その上、本発明者らは、下記のものを含有する材料を記載している、特許出願のＷＯ  ９７／１８８４２に言及することができる：
【００２７】
ａ．特定の結合組織の細胞へと部分的にか、または完全に分化した、その上該細胞によって分泌された基質を含有する、骨髄からの自家もしくは同種幹細胞の有効な培養体、あるいはこれに代えて、
【００２８】
ａ’．完全にか、もしくは部分的に分化した骨髄幹細胞、またはこれに代えて、組織の成熟細胞によって分泌された細胞外基質；
【００２９】
ｂ．ヒアルロン酸誘導体、特に部分または全エステル（ＨＹＡＦＦ（登録商標））からなる三次元基質。
【００３０】
間充織細胞と組み合わせて用いられる、ヌードマウスに皮下移植された、スポンジ形態のヒアルロン酸誘導体（ヒアルロン酸のベンジルエステルで作成されたＨＹＡＦＦ（登録商標）−１１のスポンジ、および架橋結合したヒアルロン酸で作成されたＡＣＰ（登録商標）スポンジ）は、形成される組織の量に関しては、多孔性セラミックより優れた骨および軟骨形成能を示した［L.A. Solchaga et al., J. Orthop. Res., 17, 1999, 205-213］。
【００３１】
もう一つの実験で、上記２種類のヒアルロナン誘導体に基づく生物材料が、自家修復のための関節軟骨の自然治癒応答を増進できるその能力について試験された。これらのポリマーの骨軟骨欠損（ウサギの大腿骨顆部に与えた）への導入は、修復過程のための適切な骨組みを与え：実際、ＨＹＡＦＦ（登録商標）−１１およびＡＣＰ（登録商標）スポンジで処置した欠損は、優れた骨充填を示し、顆部の表面は、主として、硝子軟骨で構成された［L.A. Solchaga et al., J. Orthop. Res., 18, 2000, 773-780］。
【００３２】
骨軟骨欠損を修復するときに、関節軟骨と、その裏にある内側の骨構造との間の安定的な境界面の発達を保証することは、極めて重要であると判明している。
【００３３】
骨軟骨組織の再生のための、骨案内物質である生物材料の骨組みを覆って縫い合わせた、加工された軟骨によって構成された複合材料が、ウサギの関節に形成された欠損内に移植された。６ヶ月後、自然の種に構造的に類似する骨軟骨組織への複合材料の改造を、軟骨と軟骨下骨との間に明確な到達指標をもって観察することができた［D. Schaefer et al., 4th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, 2000］。
【００３４】
したがって、ヒアルロン酸誘導体およびセラミック材料の使用は、軟骨および骨の再生／修復に関して、かつ分化および未分化細胞の培養向けの骨組みとして、ともに既に公知であり、その結果、当業者は、骨軟骨移植片を作成するのにこれらの材料のいずれかを用い得ることを推論する可能性はあったであろうが、本発明が立証したとおり、２種類の材料を結合したならば、天然の骨軟骨組織のように、構造的に統合されているが、組織間の浸透は皆無である、軟骨および骨の別個の形成が得られることは、予測できなかったのである。
【発明の開示】
【００３５】
本発明は、生体適合性である生体成分材料の製造および使用に関するものであって、該材料は、
【００３６】
ａ．連絡する細孔、および／または微細繊維もしくはマイクロファイバーの絡み合いによって形成される空間を含む構造を有する、ヒアルロン酸誘導体の三次元基質と；
【００３７】
ｂ．セラミック材料、または少なくとも１種類のセラミック材料を含有する複合材料によって構成される、多孔性の三次元基質と；
によって構成され、
【００３８】
構造的に統合され、加工された骨軟骨移植片を、骨軟骨形成細胞を用いて製造すること、および骨軟骨組織をin vivoで修復／再生することを目的とする。
【００３９】
本発明のさらに一つの主題は、ヒアルロン酸誘導体と、セラミックもしくはその誘導体、または骨活性の特性を有するもう一つの成分であってよい、もう一つの材料との結合によって得られる、上記の複合生物材料の骨軟骨欠損の修復／再生のための使用である。骨形成細胞と結び付けた該複合材料を、加工された骨軟骨組織の製造に用いることが可能である。
【００４０】
三次元骨組み（Ａ）に用いられるヒアルロン酸誘導体は、下記の群からから選ばれる：
【００４１】
−カルボキシル官能基の一部または全部を、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環族もしくは複素環系列のアルコールでエステル化した、ヒアルロン酸エステル［ＥＰ  ０２１６４５３  Ｂ１］;
【００４２】
−カルボキシル基の一部または全部を、同じ多糖類鎖またはその他の連鎖のアルコール官能でエステル化した、ヒアルロン酸の自己架橋結合したエステル［ＥＰ  ０３４１７４５  Ｂ１］;
【００４３】
−カルボキシル基の一部または全部を、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族もしくは複素環系列のポリアルコールでエステル化して、スペーサー鎖を用いて架橋結合を生成した、ヒアルロン酸の自己架橋結合した複合材料［ＥＰ  ０２６５１１６  Ｂ１］;
【００４４】
−ヒアルロン酸、またはヒアルロン酸の部分もしくは全エステルと、コハク酸とのヘミエステル、またはコハク酸とのヘミエステルの重金属塩［ＷＯ  ９６／３５７２０７］；
【００４５】
−ヒアルロン酸のＯ−硫酸化誘導体［ＷＯ  ９５／２５７５１］またはＮ−硫酸化誘導体［ＷＯ  ９８／４５３３５］；
【００４６】
−ヒアルロン酸またはその誘導体のアミド［ＷＯ  ００／０１７３３］。
【００４７】
このヒアルロン酸誘導体は、不織布、膜、スポンジの形態であってよい。該ヒアルロン酸誘導体はまた、薬理学的または生物学的活性物質を含んでよい。
【００４８】
Ｂによれば、多孔性の三次元骨組みは、
【００４９】
−リン酸三カルシウムを包含する、ハイドロキシアパタイトもしくはその他のリン酸カルシウム；
【００５０】
−硫酸カルシウム；
【００５１】
−ハイドロキシアパタイトとリン酸三カルシウムとによって構成される複合材料；
【００５２】
−（ａ）ハイドロキシアパタイトもしくはその他のリン酸カルシウム、または硫酸カルシウムと、
（ｂ）その他の生体適合性であるセラミック、金属粒子またはポリマーと
によって構成される複合材料；
【００５３】
−リン酸三カルシウムを包含する、ハイドロキシアパタイトもしくはその他のリン酸カルシウムで被覆されたセラミック材料；
【００５４】
−生体活性ガラス
によって構成されてよい。
【００５５】
該材料はまた、薬理学的または生物学的活性物質を含んでよい。
【００５６】
選択肢となる薬理学的活性物質は、抗生物質、消毒剤および防腐剤、抗ウイルス、抗菌および抗真菌剤、非ステロイド系およびステロイド系抗炎症薬、細胞増殖抑止、細胞毒性、麻酔および抗癌剤である。
【００５７】
生物学的活性物質のうちでは、該生物材料への細胞の接着を助けるもの、たとえばフィブロネクチン、「ＲＧＤ」もしくはインテグリン配列、「形質転換成長因子β」（ＴＧＦ−β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性もしくは塩基性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＢＦまたはｂＦＢＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子のような成長因子、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６のような骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３のような骨形成タンパク質（ＯＰ）、成長タンパク質、ビタミンＣ、Ｄ、Ｅのようなビタミン、硫酸グルコサミンのようなその他の天然物質を、本発明者らは列挙しなければならない。
【００５８】
骨軟骨移植片のための複合生物材料の成分を構成する、様々な三次元基質は、充分に接着性である、天然、合成または半合成の生体適合性である、好ましくは吸収可能な接着剤を用いて組み立てられる。たとえば、臨床的実施に広く用いられ、この目的に適し、かつ効果的であることが判明している、生物学的起源のフィブリン接着剤を用いることができる。
【００５９】
これに代えて、複合生物材料の成分を構成する様々な三次元基質の材料が許すならば、それらを、ヘルスケアおよび外科に用いられるとおり、縫合によってか、またはねじもしくは釘のような物品で結合することができる。
【００６０】
複合の生体成分材料が準備されたなら、それは、欠損部位に、そのまま、いかなる細胞成分またはその産物もなしに移植されて、骨軟骨組織のin vivoでの再生／修復の際の支持構造として作用することができる。
【００６１】
これに代えて、該複合材料は、適切に接種された分化または未分化細胞を含有してもよく、該細胞を移植前に増殖させるための骨組みとして用いることができる。
【００６２】
その上、前記の２成分を、骨軟骨形成細胞をその中に接種した後に組み立てることができる。特に、ヒアルロン酸誘導体によって構成された三次元骨組みに、始原細胞または成熟軟骨細胞を装荷して、軟骨組織を修復／再生してもよい。三次元の多孔性基質は、間充織細胞または成熟骨細胞を培養するための骨組みとして用い、骨を修復／再成することができる。
【実施例】
【００６３】
骨軟骨移植片の製造例
細胞培養
文献から、間充織幹細胞（ＭＳＣ）として知られる始原骨軟骨細胞は、軟骨細胞および骨細胞へと分化することも公知である。
【００６４】
本発明の場合は、間充織幹細胞を、ラット骨髄から単離し、文献［Lennon et al., In vitro Cell Devel. Biol., 1996, 32, 602-611］に掲載されたプロトコルに従って増殖かつ展開させた。
【００６５】
初代細胞がコンフルエンスに達したとき、それを酵素処理によって皿から剥離させ、展開させて、異なる条件に用いるための異なる調製品を得た。
【００６６】
間充織幹細胞が軟骨細胞系に沿って分化するのを助けるには、１０ng/mlのＴＧＦ−β１の存在下で増殖させた。間充織幹細胞が骨細胞へと分化するのを助けるには、たとえば、１００nMのデキサメタゾン、１０mMのβ−グリセロリン酸塩、および０．０５mMのアスコルビン酸−２−リン酸エステル（骨形成強化物質）で補強した。
【００６７】
培地は、３〜４日ごとに交換した。
【００６８】
in vitroでの複合移植片の構成
コンフルエンスに達する前に、酵素処理によって細胞を皿から剥離させ、計数し、無血清培地に５ｘ１０6／mlの濃度で懸濁させ、たとえば無菌真空（bland vacuum）の手法によって、材料中に装荷した。
【００６９】
ＴＧＦ−β１に曝露させたＭＳＣは、複合移植片の軟骨成分を構成するために、ヒアルロン酸誘導体（ＨＹＡＦＦ（登録商標）−１１）で作成したスポンジに装荷し、骨形成補強物質に曝露させたＭＳＣは、骨形成のための多孔性リン酸カルシウムセラミック成分に装荷した。細胞装荷したＨＹＡＦＦ（登録商標）−１１のスポンジおよびセラミックを組み合わせ、フィブリン接着剤で結び付けて、複合骨軟骨移植片を形成した。該移植片を、３７℃で３０分間温置し、次いで、同系ラットの背中に鈍器で作成した特別なポケットに皮下移植した。
【００７０】
３〜６週後に、動物を屠殺し、材料を組織学的に処理した。
【００７１】
結果
複合材料は、in vivo移植後も一個の小片として残存し、容易に除去することができる繊維性組織の薄層内に封入されていた。何らかの方法で分離してしまった軟骨部および骨部の徴候は、皆無であった。
【００７２】
３週後には、ヒアルロン酸誘導体に基づく基質の空虚な空間内、特に材料の周辺部に、繊維軟骨組織を認めることができた。６週後には（図１）、充分に組織化された繊維軟骨が、部分的に吸収された材料全体に分布した。軟骨細胞は、細胞外基質によって囲まれた小腔内に定位された。軟骨組織の細胞外基質中には、II型軟骨のみを認め得るにすぎなかった。
【００７３】
移植３週後には、骨組織は、セラミック材料の細孔内に認めることができ、この組織の量は、時間とともに増加した。
【００７４】
フィブリン接着剤は、６週後には完全に吸収されていた。
【００７５】
２種類の材料において、軟骨および骨の別個の形成を認めることができ：骨組織または軟骨組織のいずれも、２種類の材料間の到達指標を越えなかった。同時に、２種類の材料は、到達指標をまさに越えた繊維組織およびコラーゲン繊維が存在したために、構造的に統合された複合材料を形成した。
【００７６】
これは、その特異的な軟骨誘導能および骨誘導能のために、間充織細胞の軟骨形成性および骨形成性分化のための骨組みとして働く、異なる材料を用いて、加工された骨軟骨組織の複合移植片を構成することが可能なことを示唆する。
【００７７】
本発明をこのように説明したが、この実験が作業の条件および方法に関して様々な方法で変更できることは、明らかである。そのような変更は、本発明の精神および目的からの逸脱と見なしてはならず、当業者には明白であるようないかなる変更も、付記された請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１ａ】移植６週後に採取したサンプルの巨視的外見（図１ａ）、および組織切片（図１ｂ：トルイジンブルーで染色；ｘ４）である。
【図１ｂ】移植６週後に採取したサンプルの巨視的外見（図１ａ）、および組織切片（図１ｂ：トルイジンブルーで染色；ｘ４）である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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