(57)【要約】哺乳動物細胞におけるＮＥＴ−４の発現または生物学的活性、もしくはＮＥＴ−４　ｍＲＮＡの発現を減少させるＮＥＴ−４のモジュレーターを提供する。ＮＥＴ−４モジュレーターとしては、アンチセンス分子、リボザイム、抗体および抗体フラグメント、タンパク質およびポリペプチド、ならびに小分子が挙げられる。ＮＥＴ−４モジュレーターは、ＮＥＴ−４遺伝子発現を減少させるための組成物および方法、ならびに哺乳動物細胞（腫瘍細胞を含む）の増殖を阻害するための方法、および新生物疾患を処置するための方法における用途を見出す。
2004505018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質、ポリペプチド、および小分子からなる群より選択される、単離されたＮＥＴ−４モジュレーター。
【請求項２】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターが、アンチセンス分子である、請求項１に記載の単離されたＮＥＴ−４モジュレーター。
【請求項３】
前記アンチセンス分子またはその相補体が、配列番号１の配列の少なくとも１５の連続する核酸を含む、請求項２に記載の単離されたＮＥＴ−４モジュレーター。
【請求項４】
前記アンチセンス分子またはその相補体が、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズする、請求項３に記載の単離されたＮＥＴ−４モジュレーター。
【請求項５】
前記アンチセンス分子が、配列番号２〜６からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項２に記載の単離されたＮＥＴ−４モジュレーター。
【請求項６】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターが、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項１に記載の単離されたＮＥＴ−４モジュレーター。
【請求項７】
前記抗体または抗体フラグメントが、モノクローナルである、請求項６に記載の単離されたＮＥＴ−４モジュレーター。
【請求項８】
前記抗体または抗体フラグメントが、ヒト化されている、請求項７に記載の単離されたＮＥＴ−４モジュレーター。
【請求項９】
薬学的に受容可能なキャリア中に治療有効量のＮＥＴ−４モジュレーターを含む、組成物。
【請求項１０】
２つ以上のＮＥＴ−４モジュレーターを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターが、アンチセンス分子である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
哺乳動物細胞におけるＮＥＴ−４の発現を減少させるための薬学的組成物の調製のための、請求項１に記載のＮＥＴ−４モジュレーターの使用。
【請求項１３】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターがアンチセンス分子である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記アンチセンス分子またはその相補体が、配列番号１の配列の少なくとも１５の連続する核酸を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記アンチセンス分子またはその相補体が、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記アンチセンス分子が、配列番号２６からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターが、タンパク質およびポリペプチドからなる群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターが、小分子である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１９】
哺乳動物細胞においてＮＥＴ−４の発現を減少させる方法であって、請求項１に記載のＮＥＴ−４モジュレーターを該細胞に投与する工程を包含し、ここで該ＮＥＴ−４モジュレーターは、該哺乳動物細胞にエキソビボで投与される、方法。
【請求項２０】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターが、アンチセンス分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンチセンス分子またはその相補体が、配列番号１の配列の少なくとも２０の連続する核酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アンチセンス分子またはその相補体が、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンチセンス分子が、配列番号２６からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターが、タンパク質およびポリペプチドからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＥＴ−４モジュレーターが、小分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
新生物疾患を処置するための薬学的組成物の調製のための、請求項１に記載のＮＥＴ−４モジュレーターの使用であって、該新生物疾患が重篤度において低減されるように、該ＮＥＴ−４モジュレーターを哺乳動物細胞に投与する工程を包含する、使用。
【請求項２７】
生物学的サンプル中の結腸腫瘍細胞の存在を検出するための診断キットであって、該キットは、配列番号１８、１９、２０、２１、および２２からなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、ならびにストリンジェントな条件下で配列番号１のポリヌクレオチドとハイブリダイズしない少なくとも１つのコントロールオリゴヌクレオチドを備える、キット。
【請求項２８】
少なくとも３つの前記オリゴヌクレオチドを備える、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
５つの前記オリゴヌクレオチドを備える、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ＮＥＴ−４遺伝子の発現および／または生物学的活性を阻害するための組成物ならびに方法を提供する。このような組成物および方法は、新生物疾患の処置における有用性を見出される。
【０００２】
（発明の背景）
ＮＥＴ−４は、４回膜貫通レセプター（ｔｅｔｒａｓｐａｎ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーのメンバーである。この分子の機能を開示する報告は、発表されていない。４回貫通（ｔｅｔｒａｓｐａｎ）ファミリーは、Ｍａｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｔ．ら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１１：４２８〜４４２、１９９７に議論されている。リンパ腫細胞株における４回貫通遺伝子の発現は、Ｆｅｒｒｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：３４６〜３５２、１９９８に議論されている。
【０００３】
従って、当該分野には、このタンパク質ファミリーと必須のプロセスまたは病理学的プロセスとの間の相関関係についての必要性がある。本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するためのＮＥＴ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を開示することによって、この必要性を充足するために役立つ。
【０００４】
（発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、ＮＥＴ−４のインヒビターを提供する。本発明のインヒビターとして、アンチセンス分子、リボザイム、抗体または抗体フラグメント、タンパク質またはポリペプチド、および小分子が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアンチセンス分子は、配列番号１の少なくとも１０、１５、もしくは２０の連続するヌクレオチドを含むか、またはストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸にハイブリダイズする。配列番号１の少なくとも１５、２０もしくは２５の連続するヌクレオチドを含むか、またはストリンジェントな条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズするアンチセンス分子が、より好ましい。代表的なアンチセンス分子は、本明細書中で配列番号２〜６として提供される。
【０００５】
さらなる実施形態において、１以上のＮＥＴ−４インヒビターを薬学的に受容可能なキャリア中に含む組成物が提供される。
【０００６】
さらなる実施形態は、ＮＥＴ−４遺伝子の発現または生物学的活性を減少させる方法を提供する。
【０００７】
本発明の各方法は、共通して本発明の１以上の本発明のＮＥＴ−４インヒビターの哺乳動物細胞への投与を含む。
【０００８】
本発明は、さらに結腸腫瘍細胞を検出するためのキットを提供し、このキットは、配列番号１８、１９、２０、２１、および２２からなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
ＮＥＴ−４は、タンパク質の４回貫通スーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、４つの膜貫通ドメインおよび２つの細胞外領域によって特徴付けられる。「新しいＥＳＴ４回貫通」について、ＮＥＴタンパク質と呼ばれる特定のファミリーは、このスーパーファミリー内である（Ｓｅｒｒｕ，Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１４７８：１５９〜１６３、２０００）。Ｓｅｒｒｕらは、７つのＮＥＴタンパク質（ＮＥＴ−１〜ＮＥＴ−７と命名される）の存在を報告し、そして細胞株パネルにおける発現を研究した。ＮＥＴ−４は、Ｔリンパ球細胞株において発現されたが、研究されたほとんどのＢリンパ球細胞株によっては発現されなかった。
【００１０】
ＮＥＴタンパク質のいずれかに関して、推定される機能の情報は、現在まで発表されていない。スーパーファミリーそれ自体は、１９９０年に発見され、そして１９９７年現在、２０のメンバーが同定された。この分子の機能の１つは、特定の細胞表面タンパク質をグループ分けすることであり、この機能によって、機能的なシグナル伝達複合体の形成および安定性が増加することが示唆されている。Ｍａｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｔ．ら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１１：４２８〜４４２、１９９７。図１は、４回貫通タンパク質の図式的な構造を示す。現在利用可能な情報は、いくつかの４回貫通タンパク質が、癌の発症または増殖において阻害的な役割を果たし得、一方、他のタンパク質は癌細胞においてより高いレベルで発現されることを示す。例えば、ＣＤ９の発現は、癌腫細胞の機動および転移を抑制し（Ｉｋｅｙａｍａ，Ｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１２３１〜１２３７、１９９３）、そしてＣＤ９の発現は、黒色腫細胞の転移に反比例する（Ｓｉ，Ｚ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　５４：３７〜４３、１９９３）。ＣＤ９の発現の減少は、胸部癌腫の芳しくない予後と相関する（Ｍｉｙａｋｅ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６：１２４４〜１２４９、１９９６）。ＣＤ８２の発現は、前立腺癌細胞株の転移を抑制し得る（Ｄｏｎｇ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６８：８８４〜８８６、１９９５）。
【００１１】
本発明は、癌における４回貫通タンパク質の役割についての情報を実質的に追加し、そしてまたＮＥＴ−４の発現を阻害することによって癌細胞の増殖を調節するための方法および組成物を提供する。本発明によると、ＮＥＴ−４は、ＤＮＡマイクロアレイスクリーニングを使用して試験された結腸癌患者サンプルの８３％において過剰発現される。腫瘍細胞増殖におけるＮＥＴ−４発現の役割をさらに調査するために、結腸癌細胞株ＳＷ６２０の細胞を、ＮＥＴ−４の配列に基づく種々のアンチセンス分子に曝露した。表２〜５および７に示されるように、ＳＷ６２０細胞の、配列番号２〜６それぞれのアンチセンス分子でのトランスフェクションは、ＳＷ６２０細胞の増殖を１日目で始まり、そして４日目まで連続して有意に減少させた。同様に、ＭＲＣ９細胞のアンチセンス分子（配列番号５）でのトランスフェクションはまた、ＭＲＣ９細胞の増殖を有意に減少させた（表６）。
【００１２】
増殖への効果が、ＮＥＴ−４の発現への特異的な効果に起因したか否かを決定するために、ＮＥＴ−４メッセージレベルを、５つの異なるアンチセンス分子に曝露したＳＷ６２０細胞株において測定した。表１に示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露された細胞は、対応する逆のコントロールオリゴヌクレオチドで処理した細胞と比較した場合、有意に低いレベルのＮＥＴ−４　ｍＲＮＡを有した。
【００１３】
従って、ＮＥＴ−４のポリヌクレオチド配列に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＥＴ−４発現の特異的なインヒビターであり、そしてこれは、結腸癌細胞の減少した増殖と相関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、結腸癌および他の癌（ここで、増加したＮＥＴ−４の発現が、癌細胞の増殖、遊走、転移、および生存における役割を果たす）のインビボでの処置に適切である。しかし、本発明は、アンチセンスインヒビターの使用に限定されない。本明細書の結果に基づいて、ＮＥＴ−４の発現を阻害するため、またはＮＥＴ−４の機能を調節もしくは阻害するための他の組成物および方法もまた、細胞増殖を調節するために適切である。なぜなら、ＮＥＴ−４は、膜貫通タンパク質であり、抗体は、その効果を阻害するために特に適切だからである。
【００１４】
本発明は、一般的に、ＮＥＴ−４の発現および機能を、特に癌細胞において（より詳細には結腸癌細胞において）調節することに関連する。より詳細には、本発明は、ＮＥＴ−４のアゴニストおよびアンタゴニスト（アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイム、タンパク質またはポリペプチド、抗体またはそのフラグメントならびに小分子を含む）；ＮＥＴ−４モジュレーターを含む組成物；哺乳動物細胞の化学療法および／または放射線治療を補充するための方法、ならびに新生物疾患を処置するための方法を提供する。これら各々の方法は、共通して、哺乳動物細胞への１以上のＮＥＴ−４モジュレーターの投与を有する。
【００１５】
（ＮＥＴ−４のインヒビターは、ＮＥＴ−４遺伝子の発現の減少に効果的である）
本発明のＮＥＴ−４インヒビターとして、アンチセンス分子およびリボザイム、タンパク質またはポリペプチド、抗体またはそのフラグメントならびに小分子が挙げられる。これらのＮＥＴ−４インヒビターは、これらがＮＥＴ−４の発現および／または生物学的活性を減少し、結果として癌細胞の増殖を調節、阻害、または予防するという共通の特徴を共有する。本明細書中で開示された例示的なＮＥＴ−４インヒビターに加えて、代替的なインヒビターは、本明細書中で詳細に開示されるか、またはそうでない場合には容易に利用可能でありかつ当業者の専門技術内であるかのいずれかの方法論を使用する、慣用的な実験によって獲得され得る。
【００１６】
（アンチセンス分子およびリボザイム）
本発明のＮＥＴ−４インヒビターとして、哺乳動物細胞に投与された場合に、例えば、ＮＥＴ−４　ｍＲＮＡの細胞内レベルを減少することに有効なアンチセンス分子が挙げられる。アンチセンス分子は、配列特異的な様式で核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）に結合する。相補的な配列を有するｍＲＮＡに結合される場合、アンチセンス分子は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する（Ａｌｔｍａｎらに対する米国特許第５，１６８，０５３号；Ｉｎｏｕｙｅに対する米国特許第５，１９０，９３１号、Ｂｕｒｃｈに対する米国特許第５，１３５，９１７号；Ｓｍｉｔｈに対する米国特許第５，０８７，６１７号、およびＣｌｕｓｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：３４０５〜３４１１（１９９３）、これはダンベル（ｄｕｍｂｂｅｌｌ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する）。
【００１７】
アンチセンス技術は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分なように二重らせんが開く能力を促進する、三重らせん形成によって遺伝子の発現を制御するために使用され得る。Ｇｅｅら、Ｈｕｂｅｒ　ａｎｄ　Ｃａｒｒ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」、Ｆｕｔｕｒａ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，ＮＹ；１９９４）。あるいは、アンチセンス分子は、ＮＥＴ−４遺伝子の制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは転写開始部位）とハイブリダイズするように設計され得、そして遺伝子の転写をブロックするか；または転写物のリボソームへの結合を阻害することによって翻訳をブロックする。Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＲＮＡ：Ｎｅｗ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ　ａｎｄ　Ｂ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ編、１９８７　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、４０１頁）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ編、１９８９、ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１００４〜１０１２（１９９３）；ＷＯ９５／１０６０７；米国特許第５，３５９，０５１号；ＷＯ９２／０６６９３；ならびにＥＰ−Ａ２−６１２８４４、これらのそれぞれが本明細書中で参考として援用される。
【００１８】
簡単には、このような分子は、転写されたＮＥＴ−４　ｍＲＮＡ配列の領域に相補的であり、そしてこれらとワトソン−クリックの塩基対を形成し得るように構築される。生じたこの二本鎖核酸は、ｍＲＮＡの次のプロセシングを妨害し、それによってタンパク質合成を阻害する。
【００１９】
一般的に、ＮＥＴ−４コード領域に相補的な配列の一部を使用して、遺伝子発現を調節し得る。ＮＥＴ−４　ｃＤＮＡの配列は、本明細書中で配列番号１として示される。あるいは、アンチセンスＲＮＡに転写され得るｃＤＮＡ構築物は、アンチセンスＲＮＡの産生を容易にするために細胞または組織へ導入され得る。従って、本明細書中で使用される場合、語句「アンチセンス分子」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ分子として合成されているか、ＲＮＡ分子として合成されているかに関わらず）、および哺乳動物細胞に導入された場合に、アンチセンスＲＮＡ分子の産生を促進する、全てのプラスミド構築物を、広範に包含する。本明細書中で記載される場合、アンチセンス分子を使用して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現、およびその発現のためにＮＥＴ−４を必要とする任意の他の遺伝子を阻害し得る。
【００２０】
本発明は、ＮＥＴ−４ポリヌクレオチドの正常な機能を妨害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関連する。アンチセンス技術に幅広く適用可能な当該分野で公知のアンチセンス分子の任意の改変またはバリエーションが、本発明の範囲内に含まれる。このような改変としては、米国特許第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；および同第５，９５８，７７３号に開示されるようなリン含有結合の調製が挙げられる。
【００２１】
本発明のアンチセンス化合物として、米国特許第５，９５８，７７３号に開示されたような改変された塩基およびそこに開示された特許物が挙げられ得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強するための１以上の部分または結合体にこのオリゴヌクレオチドを化学的に結合することによって、改変され得る。このような部分または結合体として、脂質（例えば、コレステロール）、コール酸、チオエーテル、脂肪鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミトイル部分、ならびに例えば、米国特許第５，５１４，７５８号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９７，６９６号、および同第５，９５８，７７３号に開示されるその他が挙げられる。
【００２２】
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲内であり、例えば、米国特許第５，０１３，８３０号、同第５，１４９，７９７号、同第５，４０３，７１１号、同第５，４９１，１３３号、同第５，５６５，３５０号、同第５，６５２，３５５号、同第５，７００，９２２号および同第５，９５８，７７３号に記載される方法を使用して本発明のオリゴヌクレオチドから調製され得る。
【００２３】
アンチセンス技術において、特定の標的に最適なアンチセンス分子を選択するために、ある程度の慣用的な実験が必要とされ得る。効率的であるために、アンチセンス分子は好ましくは、接近可能であるか、または曝露される標的ＲＮＡ分子の部分に標的化される。いくつかの場合において、標的ｍＲＮＡ分子の構造についての情報が利用可能であるが、アンチセンスを使用する阻害への現在のアプローチは、実験によるものである。本発明によると、この実験は、実施例１に記載の方法を使用して、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトすることによって、慣用的に実施され得る。細胞中のｍＲＮＡレベルは、ｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡレベルのアッセイによって、処理された細胞およびコントロール細胞において、慣用的に測定され得る。生物学的効果は、当該分野で公知であるような、細胞増殖または細胞の生存度を測定する方法によって、慣用的に決定され得る。
【００２４】
ｃＤＮＡレベルをアッセイおよび分析することによって、アンチセンス活性の特異性を測定することは、アンチセンスの結果を確認する当該分野で認識された方法である。処理された細胞およびコントロール細胞由来のＲＮＡが逆転写され、そして生じたｃＤＮＡの集団が分析されるべきことが、示唆されている（Ｂｒａｎｃｈ，Ａ．Ｄ．、Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．２３：４５〜５０、１９９８）。本発明に従って、ＳＷ６２０細胞の培養物が、ＮＥＴ−４を標的化するように設計された５つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号２〜６に示されている。ＮＥＴ−４に対応するｍＲＮＡのレベルは、処理された細胞およびコントロール細胞で測定された。配列番号２〜６は、アクチンｍＲＮＡレベルへ標準化されたときのＮＥＴ−４　ｍＲＮＡの劇的な減少を引き起こした。
【００２５】
本明細書中に記載のように使用するためのアンチセンス分子は、当業者に公知の任意の方法（例えば、固相ホスホラミダイトの化学的合成による化学合成を含む）によって合成され得る。ＷＯ９３／０１２８６；米国特許第６，０４３，０９０号；米国特許第５，２１８，０８８号；米国特許第５，１７５，２６９号；および米国特許第５，１０９，１２４号（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。あるいは、ＲＮＡ分子は、ＮＥＴ−４　ｃＤＮＡまたはその部分をコードするＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボでの転写によって作製され得、ただしこのＤＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６など）の下流でベクターに組込まれる。標識されたヌクレオチドとこのようなプロモーターの下流である直線化されたＮＥＴ−４　ｃＤＮＡフラグメントとを、適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下でインキュベートすることによって、大量のアンチセンスＲＮＡが、生成され得る。このようなアンチセンス分子は、好ましくは少なくとも１０、１５、または２０のヌクレオチド長である。より好ましくは、アンチセンス分子は、少なくとも２５のヌクレオチド長である。特定の実施形態において、本明細書中のアンチセンス分子は、配列番号１のＮＥＴ−４　ｃＤＮＡ配列に独特な配列、または高いストリンジェンシーの条件下で、配列番号１のｃＤＮＡにハイブリダイズし得る配列を含む。本発明の状況において、高いストリンジェンシーは、例えば、５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、６５℃のような標準的なハイブリダイゼーション条件、またはそれと等価な条件を意味する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ（前出）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００２６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的には、以下のような結合を使用することによって、内因性のヌクレオチド分解性酵素による分解に耐えるように設計される：ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホラミダイト、リン酸エステル、および他のこのような結合（Ａｇｒｗａｌら、Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２８：３５３９〜３５４２（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７〜６６６５（１９７１）；Ｓｔｅｃら、Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２６：２１９１〜２１９４（１９８５）；Ｍｏｏｄｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：４７６９〜４７８２（１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７（１２）：４８６３〜４８７１（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４０：１３７〜１４３（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７〜４０２（１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７〜１００（１９８９）；Ｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏｈｅｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、９７〜１１７頁（１９８９）；Ｊａｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：７２７３〜７２４６（１９８８））。可能性のあるさらなる改変または代替的な改変として、隣接配列の５’末端および／もしくは３’末端での付加、ならびに／またはイノシン、キューオシンおよびワイブトシン、ならびにアセチル−、メチル−、チオ−、および他の改変された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのような非伝統的塩基の封入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の代替的な実施形態において、ＮＥＴ−４インヒビターはリボザイムであり得る。リボザイムは、ＲＮＡ基質（例えば、ｍＲＮＡ）を特異的に切断するＲＮＡ分子であり、細胞の遺伝子発現の特異的な阻害または妨害を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「リボザイム」は、特異的な認識、およびＲＮＡ切断酵素活性のためのアンチセンス配列を含むＲＮＡ分子を含む。触媒鎖は、標的ＲＮＡの特定の部位を、化学量論を超える濃度で切断する。
【００２８】
本発明の状況において使用され得る広範な種々のリボザイムとして、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ　４８：２１１〜２２０（１９８７）；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：５９６〜６００（１９８８）；ＷａｌｂｏｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：１９６（１９８８）；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５（１９８８）に記載されるような）；ヘアピンリボザイム（例えば、１９９３年１０月１９日に発行されたＨａｓｅｌｏｆｆらの米国特許第５，２５４，６７８号、および１９９０年３月２６日に公開されたＨｅｍｐｅｌらの欧州特許公開番号０　３６０　２５７によって記載されるような）；ならびにテトラヒメナリボソームＲＮＡに基づくリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号を参照のこと）が挙げられる。本発明のリボザイムは、代表的にはＲＮＡからなるが、ＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはこれらのキメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）から構成されてもよい。
【００２９】
リボザイムは、任意のＲＮＡ転写物に標的化され得、そしてこのような転写物を触媒的に切断し得る（米国特許第５，２７２，２６２号；米国特許第５，１４４，０１９号；ならびにＣｅｃｈらに対する米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，１８０，８１８号、同第５，１１６，７４２号および同第５，０９３，２４６号）。本発明の特定の実施形態に従って、任意のこのようなＮＥＴ−４　ｍＲＮＡ特異的リボザイム、またはこのようなリボザイムをコードする核酸が、宿主細胞に送達され、ＮＥＴ−４遺伝子発現の阻害をもたらし得る。従って、リボザイムなどは、真核生物プロモーター（例えば、真核生物ウイルスプロモーター）に連結されたリボザイムをコードするＤＮＡによって、宿主細胞へ送達され得、その結果、核への導入の際に、このリボザイムは直接転写される。
【００３０】
（タンパク質およびポリペプチド）
本明細書中に開示されるアンチセンス分子およびリボザイムに加えて、本発明のＮＥＴ−４モジュレーターはまた、ＮＥＴ−４遺伝子の発現を減少するかまたはＮＥＴ−４の生物学的活性の１つ以上を減少するかのいずれかにおいて有効なタンパク質またはポリペプチドを含む。当業者が、慣用的実験を介してこのようなＮＥＴ−４インヒビターを迅速に同定し得る種々の方法が、当該分野において容易に利用可能である。本発明は、以下の例示的方法論によって限定されない。
【００３１】
ＮＥＴ−４の生物学的活性のインヒビターは、細胞増殖（特に、腫瘍細胞の増殖、特に、結腸細胞の増殖）と干渉するタンパク質および／またはポリペプチドを含む。このような干渉は、非競合的または未競合的阻害を介して（例えば、アロステリック部位への結合を介して）、あるいは別のタンパク質に通常結合する領域への結合によって、間接的に生じ得る。従って、ＮＥＴ−４に結合するタンパク質および／またはポリペプチドを同定するために利用可能な方法は、本明細所中に開示される方法論を介してそのＮＥＴ−４阻害活性について特徴付けられ得るリード化合物を同定するために使用され得る。
【００３２】
タンパク質間相互作用を検出および分析するための方法を記載する多数の文献が、当業者に入手可能である。Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．Ｍ．ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５９：９４−１２３（１９９５）は、本明細書中に参考として援用される。このような方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：物理的方法（例えば、タンパク質親和性クロマトグラフィー、親和性ブロッティング、免疫沈降、および架橋）、ならびにライブラリーベースの方法（例えば、タンパク質プロービング、ファージディスプレーおよびツーハイブリッドスクリーニン）。タンパク質間相互作用を同定するために利用され得る他の方法としては、遺伝的方法（例えば、遺伝子外（ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ）サプレッサー、合成的致死効果、および未結合非相補性の使用）が挙げられる。例示的な方法は、以下により詳細に記載される。
【００３３】
本発明のＮＥＴ−４インヒビターは、ＮＥＴ−４タンパク質と潜在的なインヒビタータンパク質のパネルまたはライブラリーとの間の直接的相互作用に依存する生物学的スクリーニングアッセイを介して同定され得る。生物学的スクリーニング方法論（種々の「ｎ−ハイブリッド技術」を含む）は、例えば、Ｖｉｄａｌ，Ｍ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７（４）：９１９−９２９（１９９９）；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）：９０−６（１９９８）；Ｂｒａｃｈｍａｎｎ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（５）：５６１−５６８（１９９７）；およびＷｈｉｔｅ，Ｍ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０００１−１０００３（１９９６）に記載され、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。
【００３４】
ツーハイブリッドスクリーニング方法論は、阻害特性を有するＮＥＴ−４結合タンパク質について新しいかまたは既存の標的ｃＤＮＡライブラリーを検索するために利用され得る。このツーハイブリッド系は、レポーター遺伝子の転写の増加によってタンパク質間相互作用を検出する遺伝子的方法である。この系は、部位特異的転写アクチベーターが、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有するという事実に依存する。このＤＮＡ結合ドメインは、発現される特定の遺伝子に対して活性化ドメインを標的化する。転写アクチベーターの組立て式の性質のために、このＤＮＡ結合ドメインは、いずれのドメインの活性も損失することなく、転写活性化ドメインからの共有結合的に切断され得る。さらに、これらの２つのドメインは、転写機構に関連しない２つのタンパク質間のタンパク質−タンパク質接触によって近位にされ得る。従って、ツーハイブリッドは、機能的な系を作製するために構築される。第１のハイブリッド（すなわち、ベイト（ｂａｉｔ））は、目的のタンパク質に融合した転写アクチベーターＤＮＡ結合ドメインからなる。第２のハイブリッド（標的）は、転写活性化ドメインとタンパク質またはポリペプチドのライブラリーとの融合によって作製される。ベイトタンパク質と標的ライブラリーのメンバーとの間の相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインの近接を生じ、結果としてレポーター遺伝子の発現の上方制御を生じる。
【００３５】
酵母Ｇａｌ４またはＥ．ｃｏｌｉ　ＬｅｘＡ　ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）および酵母Ｇａｌ４または単純疱疹ウイルスＶＰ　１６転写活性化ドメインのいずれかを最も通常利用する種々のツーハイブリッドベースの系が、当業者に利用可能である。Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．−Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９５７８−９５８２（１９９１）；Ｄａｌｔｏｎ，Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ　６８：５９７−６１２（１９９２）；Ｄｕｒｆｅｅ，Ｔ．Ｋ．ら，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．７：５５５−５６９（１９９３）；Ｖｏｊｔｅｋ，Ａ．Ｂ．ら，Ｃｅｌｌ　７４：２０５−２１４（１９９３）；およびＺｅｒｖｏｓ，Ａ　Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２（１９９３）。通常使用されるレポーター遺伝子としては、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌａｃＺ遺伝子ならびに選択可能酵母遺伝子（例えば、ＨＩＳ３およびＬＥＵ２）が挙げられる。Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｄｕｒｆｅｅ，Ｔ．Ｋ．，前出；およびＺｅｒｖｏｓ，Ａ．Ｓ．，前出。相互作用するタンパク質についてのスクリーニングが、慣用的な実験を介して実施され得るような広範な種々の活性化ドメインライブラリーが、容易に入手可能である。
【００３６】
ＮＥＴ−４相互作用タンパク質の同定のための適切なベイトタンパク質は、本明細書中で配列番号１として表されるＮＥＴ−４　ｃＤＮＡ配列に基づいて設計され得る。このようなベイトタンパク質は、全長ＮＥＴ−４タンパク質またはそのフラグメントのいずれかを含む。
【００３７】
ＮＥＴ−４ベイト構築物および標的ライブラリーを調製するためのプラスミドベクター（例えば、ｐＢＴＭ１１６およびｐＡＳ２−１）は、当業者に容易に入手可能であり、そして、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のような販売元から入手され得る。これらのプラスミドベクターは、ｃＤＮＡと、それぞれＬｅｘＡまたはＧａｌ４ＢＤとしてのＤＮＡ結合ドメインとのインフレームでの融合を可能にする。
【００３８】
本発明のＮＥＴ−４モジュレーターは、代替的に、タンパク質間相互作用を検出するための当該分野で利用可能な物理的または生化学的方法の１つを介して同定され得る。
【００３９】
ＮＥＴ−４は、他の細胞表面タンパク質と相互作用すると考えられる。タンパク質親和性クロマトグラフィー方法論を介して、潜在的ＮＥＴ−４インヒビターとして試験されるリード化合物は、固体マトリックス（例えば、セファロースビーズ）に共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合される場合、ＮＥＴ−４に対するその特定の保持によって同定され得る。タンパク質親和性カラムの調製は、例えば、Ｂｅｅｃｋｍａｎｓ，Ｓ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５２７−５３５（１９８１）およびＦｏｒｍｏｓａ，Ｔ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：２４−４５（１９９１）に記載される。細胞タンパク質の全成分を含む細胞溶解物は、ＮＥＴ−４親和性カラムを通過し得る。ＮＥＴ−４についての高い親和性を有するタンパク質は、低塩条件下で特異的に保持されるが、一方、細胞タンパク質の大部分は、このカラムを通過する。このような高親和性タンパク質は、高塩条件下で、カオトロピック溶媒またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、固定されたＮＥＴ−４から溶出され得る。いくつかの実施形態において、ＮＥＴ−４特異的結合タンパク質の同定における補助として、この溶解物の調製の前に、この細胞を放射性標識することが好ましくあり得る。哺乳動物細胞を放射性標識するための方法は、当該分野で周知であり、そして例えばＳｏｐｔａ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０３５３−１０３６０（１９８５）において提供される。
【００４０】
親和性カラムクロマトグラフィーに適切なＮＥＴ−４タンパク質は、適切な親和性樹脂上での迅速な精製を可能にするためのタンパク質またはポリペプチドに融合され得る。例えば、ＮＥＴ−４　ｃＤＮＡは、グルタチオン−アガロースカラムへの融合タンパク質の吸着を促進するために、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のコード領域に融合され得る。Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０（１９８８）。あるいは、融合タンパク質は、プロテインＡ（これは、免疫グロブリンＧを保有するカラム上で精製され得る）；オリゴヒスチジン含有ペプチド（これは、Ｎｉ２＋を保有するカラム上で精製され得る）；マルトース保有タンパク質（これは、アミロースを含む樹脂上で精製され得）；およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（これは、メトトレキセートカラム上で精製され得る）を含み得る。本明細書中に示されるＮＥＴ−４融合タンパク質の調製のために適切な１つの例示的なタグは、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）についてのエピトープであり、これに対するモノクローナル抗体が容易に入手可能であり、そしてこのエピトープから、抗体および親和性カラムが調製され得る。
【００４１】
ＮＥＴ−４親和性カラムで特異的に保持されるタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供された後に同定され得る。従って、細胞が、細胞溶解物の精製の前に放射性標識され、そしてＮＥＴ−４親和性カラムを通過する場合、ＮＥＴ−４についての高い親和性を有するタンパク質は、オートラジオグラフィーによって検出され得る。ＮＥＴ−４特異的結合タンパク質の同定は、当業者に容易に利用可能なタンパク質配列決定技術（例えば、Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｃ．Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．ｐｐ．１６６−１７０（１９９０））によって決定され得る。
【００４２】
（抗体または抗体フラグメント）
本発明のＮＥＴ−４モジュレーター（アンタゴニストおよびアゴニスト）は、ＮＥＴ−４の遺伝子発現および／または生物学的活性の調節において有効な抗体および／または抗体フラグメントを含む。適切な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であり得る。抗体は、従来のハイブリドーマベースの方法論によって、ＮＥＴ−４接種動物から単離された抗血清から、または組換えＤＮＡ技術を介して誘導され得る。あるいは、本発明の抗体または抗体フラグメントは、容易に利用可能なファージディスプレイライブラリーの１つ以上の使用によって、インビトロで同定され得る。例示的な方法は、本明細書中に開示される。
【００４３】
本発明の１つの実施形態において、ＮＥＴ−４モジュレーターは、以下のようにして産生され得るモノクローナル抗体である。例えば、バキュロウイルスベースの系におけるＮＥＴ−４　ｃＤＮＡの発現によって、ＮＥＴ−４タンパク質が産生され得る。この方法によって、ＮＥＴ−４　ｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、適切なプラスミドベクターに連結され、引き続いてタンパク質産生を促進するためにＳｆ９細胞をトランスフェクトするために使用される。さらに、ＮＥＴ−４タンパク質の親和性精製を促進するために、エピトープタグまたは他の部分を組み込むことが有利であり得る。ＮＥＴ−４を発現するＳｆ９細胞のクローンは、例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって同定される。溶解物が調製され、そしてＮＥＴ−４タンパク質が、親和性クロマトグラフィーによって精製され、そして精製されたタンパク質が、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射されて、抗体産生を誘導する。生じる免疫応答を増加するために、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント）を添加することが有利であり得る。
【００４４】
血清は、特異的抗体の産生について試験され、そして陽性の特異的抗体力価を有する動物由来の脾臓細胞は、ハイブリドーマクローンを作製するために、骨髄腫細胞と細胞融合するために使用される。ハイブリドーマクローン由来の上清は、ＮＥＴ−４に対する特異性を有するモノクローナル抗体の存在について試験される。モノクローナル抗体方法論の一般的な記載については、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと。
【００４５】
バキュロウイルス発現系に加えて、他の適切な細菌発現系または酵母発現系は、ＮＥＴ−４タンパク質またはそのポリペプチドの発現のために利用され得る。バキュロウイルス系を用いる場合、動物の接種の前に精製を容易にするための、市販の親和性タグのうちの１つを利用することが有利であり得る。したがって、ＮＥＴ−４　ｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、例えば、アガロースゲル精製および適切なタグタンパク質（例えば、６−Ｈｉｓ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）または他のこのような容易に入手可能な親和性タグ）とインフレームで連結されることによって、単離され得る。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ．１６０−１６１（Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．およびＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｊ．Ｊ．編、１９９８）を参照のこと。
【００４６】
本発明の他の実施形態において、ＮＥＴ−４モジュレーターは、ヒト化抗ＮＥＴ−４モノクローナル抗体である。句「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体（代表的には、マウスモノクローナル抗体）由来の抗体をいう。あるいは、ヒト化抗体は、親の非ヒト抗体の抗原結合特性を保持するかまたは実質的に保持するが、ヒトに投与する場合に、親抗体と比較して減少した免疫原性を示すキメラ抗体由来であり得る。句「キメラ抗体」とは、本明細書中で使用される場合、代表的には異なる種起源の２つの異なる抗体由来の配列を含む抗体をいう（米国特許第４，８１６，５６７号）。最も代表的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメント、一般的にはヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【００４７】
ヒト化抗体は、ヒトにおいて親マウスモノクローナル抗体よりもはるかに低免疫原性であるため、これらは、アナフィキラシーの危険性がはるかに少ないヒトの処置のために使用され得る。従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療用途（例えば、新生物疾患の処置のための放射線増感剤としての使用、または、例えば、癌治療の副作用を低減するための方法における使用）において好ましくあり得る。
【００４８】
ヒト化抗体は、種々の方法によって達成され得、これらの方法としては、例えば、以下が挙げられる：（１）ヒトフレームワークおよび定常領域への非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植（当該分野で「ヒト化」と呼ばれるプロセス）、あるいは（２）全非ヒト可変ドメインの移植であるが、これらを表面残基の置換によってヒト様表面で「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」こと（当該分野で「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれるプロセス）。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「ベニアされた（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体の両方を含む。これらの方法は、以下に記載される：例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７（１９９４）；ならびにＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。
【００４９】
句「相補性決定領域」とは、ネイティブの免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　ＮＩＨ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）を参照のこと。句「定常領域」とは、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。本発明において、マウス定常領域は、ヒト定常領域によって置き換えられる。本発明のヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリン由来である。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γまたはμのいずれかから選択され得る。
【００５０】
抗体をヒト化する１つの方法は、非ヒト重鎖配列および軽鎖配列を、ヒト重鎖配列および軽鎖配列と整列する工程、非ヒトフレームワークを選択し、そしてこのような整列に基づいてヒトフレームワークと置換する工程、ヒト化配列のコンホメーションを予測するために分子モデリングする工程、および親抗体のコンホメーションと比較する工程を包含する。このプロセスに続いて、ヒト化配列モデルの予測されるコンホメーションが、親の非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンホメーションに密接に近づくまで、ＣＤＲ領域中の残基の復帰変異（これは、ＣＤＲの構造をかき乱す）を繰り返す。このようなヒト化抗体は、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌレセプターを介して、取り込みおよびクリアランスを促進するためにさらに誘導され得る。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号（これらの特許は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００５１】
代替的なＮＥＴ−４インヒビター抗体は、当該分野で一般に公知の他の方法によって容易に入手され得ることが理解される。ＮＥＴ−４に対する高い特異性を有する抗体を同定するための１つの例示的な方法は、ファージディスプレー技術である。
【００５２】
高親和性抗体を産生するためのファージディスプレーライブラリーは、以下において記載されている：例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４（１）：１−２０（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０（１９９７）およびＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ，Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１１４９−１１５４（１９９６）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。ファージディスプレー技術の利点の１つは、従来のハイブリドーマ技術によっては容易に単離できないヒト起源の抗体を単離する能力である。さらに、ファージディスプレー抗体は、動物の免疫系に依存せずにインビトロで単離され得る。
【００５３】
抗体ファージディスプレーライブラリーは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５２−５５４（１９９０）の方法によって達成され得、これは本明細書中に参考として援用される。手短に言うと、抗体の可変領域のコード配列は、ファージマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）のアミノ末端に融合される。抗体可変領域−ｐＩｌｌ融合構築物の発現は、ファージ表面上での抗体の「提示」を生じ、対応する遺伝物質はファージ粒子内に含まれる。
【００５４】
ファージライブラリーをスクリーニングするために適切なＮＥＴ−４タンパク質は、例えば、記載される（前出）ようなバキュロウイルスＳｆ９細胞中での発現によって、入手され得る。あるいは、ＮＥＴ−４コード領域は、ＮＥＴ−４タンパク質の所望の領域に特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅され得る。所望の領域は、図１に示される構造に基づいて選択され得る。上記で議論されるように、ＮＥＴ−４タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母中で、市販の１つの親和性タグとの融合物として発現され得る。
【００５５】
次いで、得られる融合タンパク質は、固体マトリックス（例えば、組織培養プレートまたはビーズ）に吸着され得る。所望の抗ＮＥＴ−４結合特性を有するファージ発現抗体は、連続的パニング（固体マトリックスの場合）またはＮＥＴ−４抗原カラムへの親和性吸着によって、引き続いて単離され得る。所望のＮＥＴ−４阻害活性を有するファージは、感染によって細菌へと再導入され得、そして当業者に公知の標準的な方法によって増殖され得る。陽性の抗体−ｐＩｌｌファージについてのスクリーニングのための方法の総説については、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，前出を参照のこと。
【００５６】
（小分子）
本発明はまた、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法論の慣用的な適用を介して容易に同定され得る小分子のＮＥＴ−４モジュレーター（アンタゴニストおよびアゴニスト）を提供する。Ｐｅｒｓｉｄｉｓ，Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１６：４８８−４８９（１９９８）。ＨＴＳ方法は、一般に、治療可能性についてのリード化合物（例えば、小分子）の迅速なアッセイを可能にする技術をいう。ＨＴＳ方法論は、試験材料のロボットでの取り扱い、陽性シグナルの検出、およびデータの判読を利用する。このような方法論としては、例えば、可溶性分子を使用するロボットスクリーニング技術、ならびに細胞ベースの系（例えば、上で詳細に記載されるツーハイブリッド系）が挙げられる。
【００５７】
操作の容易さおよび溶液中とは対照的な、細胞の状況内で生じる相互作用の臨床的関連性の利点を有する、種々の細胞株ベースのＨＴＳ方法が利用可能である。リード化合物は、放射能の組み込みを介して、または読出しとしての吸光度、蛍光または発光に依存する光学的アッセイを介して、同定され得る。Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（６）：６２４−６３１（１９９８）、これは、本明細書中に参考として援用される。
【００５８】
ＨＴＳ方法論は、例えば、ＮＥＴ−４の生物学的活性の１つ（特に、他の細胞表面タンパク質と相互作用するその能力）をブロックするリード化合物についてスクリーニングするために、利用され得る。この方法によって、ＮＥＴ−４タンパク質は、このタンパク質を発現する細胞から免疫沈降され得、そしてロボットスクリーニングに適切なアッセイプレート上のウェルに適用される。次いで、個々の試験化合物は、免疫沈降されたタンパク質と接触され得、そしてＮＥＴ−４活性に対する各試験化合物の影響が評価される。
【００５９】
（ＮＥＴ−４モジュレーターの有効性を評価するための方法）
本明細書中に記載される方法の１つ、またはさもなくば当該分野で利用可能な技術のいずれかによって同定されるリード分子またはリード化合物（アンチセンス分子またはリボザイム、タンパク質および／またはペプチド、抗体および／または抗体フラグメント、あるいは小分子であろうと）は、ＮＥＴ−４遺伝子発現または生物学的活性を阻害するその能力について、種々のインビトロ、エキソビボおよびインビボの動物モデルアッセイ系においてさらに特徴付けられ得る。実施例においてさらに詳細に議論されるように、本発明のＮＥＴ−４インヒビターは、ＮＥＴ−４の発現レベルの低減において、および癌細胞増殖の阻害において有効である。従って、本発明は、当業者が、これらのパラメーターの各々についての候補インヒビターの影響を評価することを可能にする方法をさらに開示する。
【００６０】
上記のように、そして実施例に示されるように、候補ＮＥＴ−４インヒビターは、内因性ＮＥＴ−４を発現するか、または組換えＮＥＴ−４プラスミド構築物を用いる哺乳動物細胞（例えば、ＳＷ６２０）のトランスフェクションによってＮＥＴ−４を発現するようにされる細胞への投与によって試験され得る。
【００６１】
効果的なＮＥＴ−４阻害分子は、例えば、ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定されるようなＮＥＴ−４　ｍＲＮＡのレベルを減少する。実施例１；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（編、Ｇｌｉｃｋ、Ｂ．Ｒ．およびＰａｓｔｅｒｎａｋ、Ｊ．Ｊ．１９９８）（本明細書中に参考として援用される）。あるいは、効果的なＮＥＴ−４阻害分子は、細胞におけるＮＥＴ−４タンパク質のレベルを減少し得る。所定の候補アンチセンス分子の有効性は、哺乳動物細胞へ投与される場合、ＮＥＴ−４発現に実質的な効果を有さないとして公知のコントロール「アンチセンス」分子との比較よって評価され得る。例示的なコントロール分子としては、実施例２に開示されるＲＣオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６２】
本明細書中で考察される１つ以上の方法によってＮＥＴ−４遺伝子発現および／または細胞増殖を減少するのに有効なＮＥＴ−４インヒビターは、容易に入手可能な動物モデル系の１つにおける効力についてインビボでさらに特徴付けられ得る。癌および遺伝子に関連する遺伝的な不安定性の研究のための種々の動物モデル系は、例えば、本明細書中に参考として援用されるＤｏｎｅｈｏｗｅｒ、Ｌ．Ａ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｒｖｅｙｓ　２９：３２９−３５２（１９９７）において考察される。
【００６３】
（ＮＥＴ−４インヒビターおよびその組成物の投与）
本発明は、ＮＥＴ−４インヒビターおよび１つ以上のＮＥＴ−４インヒビターを含有する組成物ならびにこれらの本発明のインヒビターをインビボ、エキソビボ、およびインビトロ用途（ＮＥＴ−４または機能的に下流分子の発現および活性を減少または除去するのに有利な）で使用する方法を提供する。ＮＥＴ−４インヒビターは、癌治療剤および他の薬剤を補う薬物としての用途を見出し得る。ＮＥＴ−４インヒビターはまた、過剰増殖の他の疾患における用途を見出し得る。
【００６４】
組成物は、治療的な処置のために非経口的に、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、経口的にまたは局部的に（ｌｏｃａｌｌｙ）投与され得る。好ましくは、この組成物は、経口的にまたは非経口的に（すなわち、静脈内に、腹腔内に、皮内にもしくは筋肉内に）投与される。
【００６５】
本発明の組成物は、１つ以上のＮＥＴ−４インヒビターを含み、そして薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含み得る。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなど）が、使用され得、そして安定性を高めるために他のタンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど、中程度の化学的改変などに供されたもの）を含み得る。
【００６６】
哺乳動物における疾患の処置に有用なＮＥＴ−４インヒビターは、他の天然に存在する免疫グロブリンまたは他の生物学的分子を実質的に用いずにしばしば調製される。好ましいＮＥＴ−４インヒビターはまた、哺乳動物に投与される場合に、最小の毒性を示す。
【００６７】
本発明の組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌され得る。得られた溶液は、使用のためにパッケージングされるか、または無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥され得、この凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わせられ得る。この組成物は、おおよその生理的条件に必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム）および安定剤（例えば、１〜２０％マルトースなど））を含み得る。
【００６８】
本発明のＮＥＴ−４インヒビターを投与するための適切な方法の選択は、想定された適用の性質およびＮＥＴ−４インヒビターの性質に依存する。従って、例えば、ＮＥＴ−４インヒビターの投与のための正確な方法論は、このインヒビターがアンチセンス分子、タンパク質および／またはペプチド、抗体または抗体フラグメントあるいは小分子であるか否かに依存する。他の考察は、例えば、このＮＥＴ−４インヒビターが腫瘍細胞増殖、浸潤、または転移を阻害するために、あるいは他の癌治療剤に対する添加剤として使用されるか否かを含む。
【００６９】
アンチセンス分子の投与のための種々の方法は、当該分野において入手可能である。例示的な方法としては、遺伝子送達技術（ウイルスベースの方法および非ウイルスベースの方法の両方ならびにリポソーム媒介送達方法を含む）が挙げられる。
【００７０】
遺伝子送達方法論は、例えば、腫瘍細胞増殖を減少するか、または腫瘍の放射線処置および／もしくは化学療法処置を補うのに効果的である。Ｗｈｅｌｄｏｎ、Ｔ．Ｅ．ら、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ　Ｏｎｃｏｌ　４８（１）：５−１３（１９９８）（分割照射法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ　ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）の増強のための遺伝子送達方法論）。これらの方法論によって、実質的な治療利益は、有意に１００％未満のトランスフェクション効率、トランスフェクトされたインヒビターの過渡的な保持および／または治療に対して無反応の標的細胞の亜集団の存在にもかかわらず達成され得る。
【００７１】
あるいは、遺伝子送達方法論は、腫瘍細胞中の内因性ＮＥＴ−４を直接ノックアウトするために使用され得る。例えば、ＮＥＴ−４遺伝子は、ＮＥＴ−４インヒビターを保有する遺伝子送達ベクターのトランスフェクションによって標的化され得る。腫瘍細胞への好ましいトランスフェクションまたは腫瘍細胞内の発現は、腫瘍特異的なプロモーターまたは細胞周期特異的なプロモーター（例えば、前立腺特異的抗原に対するプロモーターまたは免疫グロブリン遺伝子に対するプロモーター（Ｖｉｌｅ、Ｒ．Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７（１９９３）およびＶｉｌｅ、Ｒ．Ｇ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌ．５：４３７−４４３（１９９４）））の使用を介して、あるいは特定の器官または構造に限局される栄養ウイルス（例えば、中枢神経系における増殖中の細胞のみを感染し得る複製選択的および神経栄養ウイルス）の使用を介して達成され得る。
【００７２】
従って、治療利益を達成するために、腫瘍細胞中のＮＥＴ−４は、優先的に阻害されるべきである。これは、ＮＥＴ−４インヒビター、ＮＥＴ−４アンチセンス分子、ＮＥＴ−４遺伝子特異的リプレッサー、またはＮＥＴ−４遺伝子のタンパク質産物のインヒビターを発現する遺伝子をトランスフェクトすることによって達成され得る。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、句「遺伝子送達ベクター」とは、一般的に目的のアンチセンス分子を保有し、そして特定の実施形態において、目的のアンチセンス分子の発現を指向し得る核酸構築物をいう（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、第２１章、ｐｐ．５５５−５９０（編、Ｂ．Ｐ．ＧｌｉｃｋおよびＪ．Ｊ．Ｐａｓｔｅｒｎａｋ、第２版、１９９８）；Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１：５１−６４（１９９４）；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：８４５−８５２（１９９４）；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：１８５−１９３（１９９５）；ならびにＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．６：１４８−１５３（１９９４）に記載されるような）。
【００７４】
ＮＥＴ−４インヒビターの投与に適切な多くのウイルスベースの遺伝子送達ベクター系および非ウイルスベースの遺伝子送達ベクター系は、記載されている。ウイルスベースの遺伝子送達系としては、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、スプマウイルスおよびレンチウイルス）ベクター系；アデノウイルスベクター系；アデノ随伴ウイルスベクター系；ならびに単純疱疹ウイルスベクター系が挙げられるが、これらに限定されない。各型のウイルスは、寄託所または収集所（例えば、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ　２０１１０−２２０９）から容易に入手可能であるか、または一般的に入手可能な材料および技術を使用して既知の供給源から単離され得る。
【００７５】
本発明の遺伝子送達ベクター系は、インビトロ治療レジメンおよびエキソビボ治療レジメンの両方における適用を見出す。これらの適用の各々は、以下にさらに詳細に記載される。
【００７６】
（１．レトロウイルス遺伝子送達ベクター系）
本発明の１つの局面において、ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子を保有または発現するように構築されたレトロウイルス遺伝子送達ベクターが、提供される。本明細書中で使用される場合、用語「ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子」とは、一般的にＮＥＴ−４阻害活性を有する核酸配列をいう。より詳細には、このようなアンチセンス分子は、ＮＥＴ−４遺伝子発現を減少する。本発明のレトロウイルス遺伝子送達ベクターは、幅広い種々のレトロウイルス（例えば、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、およびＤ型レトロウイルスならびにスプマウイルスおよびレンチウイルスを含む）から容易に構築され得る。ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（第２版、１９８５）を参照のこと。
【００７７】
任意の上のレトロウイルスは、本明細書中に提供される開示、および標準的な組換えＤＮＡ技術を受け、レトロウイルス遺伝子送達ベクターを組み立てるかまたは構築するために容易に利用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（第２版、１９８９）およびＫｕｎｋｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８（１９８５）を参照のこと。さらに、本発明の特定の実施形態において、レトロウイルス遺伝子送達ベクターの一部分は、異なるレトロウイルス由来であり得る。
【００７８】
レトロウイルスベクター（ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の発現に適切な）は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたはエレメントを定義する遺伝子座、あるいは他の手段（例えば、選択的スプライシング、核ＲＮＡ搬出、メッセンジャーの翻訳後修飾、またはタンパク質の転写後修飾）によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含むべきである。このようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長い末端反復（ＬＴＲ）またはそれらの部分、ならびに使用されるレトロウイルスに適切な＋鎖および−鎖プライマー結合部位（レトロウイルスベクター中にすでに存在していない場合）を含まなければならない。必要に応じて、レトロウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択可能マーカー（例えば、ネオマイシン耐性、ＴＫ、ハイグロマイシン耐性、フレオマイシン耐性、ヒスチジオール耐性、またはＤＨＦＲ）、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終止配列を含み得る。本発明の１つの局面において、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、１つ以上の異種配列、第２鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲを含むレトロウイルス遺伝子送達ベクター構築物（ここで、このベクター構築物は、ｇａｇ／ｐｏｌまたはｅｎｖコード配列を欠く）が、提供される。
【００７９】
他のレトロウイルス遺伝子送達ベクターは、本発明の文脈（例えば以下に開示されるもの（各々が参考として本明細書中に援用される）を含む）において同様に利用され得る：ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；Ｖｉｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４（１９９３）；Ｖｉｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７（１９９３）；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：８３−８８（１９９３）；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３（１９９２）；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５（１９９３）；米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２およびＷＯ９１／０２８０５。
【００８０】
上記のレトロウイルス遺伝子送達ベクター構築物との使用に適切なパッケージング細胞株は、用意に調製され得る。例えば、米国特許第５，７１６，８３２号および同第５，５９１，６２４号を参照のこと。これらのパッケージング細胞株は、組換えベクター粒子の産生のためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とまた呼ばれる）を作製するために利用され得る。ヒトから作製されたパッケージング細胞株（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株を使用することが好ましくあり得、それにより、ヒト血清における不活化を防ぐ組換えレトロウイルスの産生を可能にし得る。
【００８１】
（２．アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ベクター系）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一般的に遺伝子送達ベクターの開発について、そして特にＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子をコードするポリヌクレオチドの送達について特に適切にする多くの特性を有する。ＡＡＶ発現系の一般的な総説については、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９（５）：４７０−４７５（１９９８）を参照のこと。ＡＡＶは、アデノヘルパーウイルスまたはヘルペスヘルパーウイルスなしでは非感染性である非病原性の欠損ヒトパルボウイルスである。従って、ヘルパーウイルスの非存在下で、ＡＡＶは、宿主ゲノムへ潜在的に組み込まれるようになる。さらに、ＡＡＶは、幅広い範囲の分裂中の細胞型および休止細胞型の両方を形質導入し得る点において上で考察したレトロウイルスよりも優れた利点を有する。
【００８２】
種々のＡＡＶ遺伝子送達ベクターは、１つ以上のＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の発現を指向するために利用され得る。このようなベクターの代表的な例としては、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、ＷＯ９３／０９２３９；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８（１９８９）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４−１６５（１９８８）；およびＦｌｏｎｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２２）：１０６１３−１０６２７（１９９３）（本明細書中に参考として援用される）によって開示されるＡＡＶベクターが挙げられる。
【００８３】
簡単には、本発明のＡＡＶ遺伝子送達ベクターは、５’アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復；ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子をコードするポリヌクレオチド：標的組織、器官または細胞においてその発現を調節するＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子に作動可能に連結された配列：および３’アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復を順序正しく含み得る。ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の発現に適切な調節配列は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサー／プロモーター配列である。さらに、ＡＡＶベクターは、好ましくは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列のようなポリアデニル化配列を有し得る。
【００８４】
一般的に、ＡＡＶベクターは、複製、パッケージング、宿主細胞ゲノムへの効率的な組み込みおよび染色体からの救出を可能にするようにＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の各末端でＡＡＶ　ＩＴＲの１つのコピーを有するべきである。５’ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ　ＤＮＡゲノムの５’末端でヌクレオチド１〜１４５からなり、そして３’ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムのヌクレオチド４６８１〜４５３６を含む。好ましくは、ＡＡＶベクターはまた、ＩＴＲの末端に続いて少なくとも１０ヌクレオチド（すなわち、「Ｄ領域」と総称される部分）を含む。
【００８５】
アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ベクターの最適なパッケージングは、５’および３’ＩＴＲが約２〜５ｂｐだけ分離されることを必要とする。しかし、ＩＴＲ配列間の理想の間隔は、利用される特定のパッケージング系に依存して変わり得ることが明らかである。この間隔は、２つのＩＴＲの間の核酸配列の全体のサイズを、２ｋｂおよび５ｋｂとの間に持ってくるように「詰め込み（ｓｔｕｆｆｅｒ）」または「充填（ｆｉｌｌｅｒ）」ポリヌクレオチドフラグメントを組み込むことによって達成され得る。従って、ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子が２〜５ｋｂよりも小さい場合、非コード詰め込みポリヌクレオチドは、例えば、３’ＩＴＲ配列〜５’ＩＴＲ配列、およびＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の５’へ組み込まれ得る。この詰め込みフラグメントの正確なヌクレオチド配列は、最終構築物の必須エレメントではない。
【００８６】
詰め込みフラグメントを取り込むことよりむしろ、意図される正確な適用に依存して、ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の複数コピーは、特に最適なＩＴＲ配列間隔を達成するように挿入され得る。独自のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルのそれぞれと共に２つ以上の別個の転写ユニットとしてポリヌクレオチドを組織化することが好ましくあり得る。
【００８７】
本発明の組換えＡＡＶベクターは、種々のアデノ随伴ウイルス（例えば、血清型１〜６を含む）から作成され得る。例えば、任意のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲは、複製、組み込み、除去および転写機構に関して類似の構造および機能を有することが予測される。
【００８８】
本発明の特定の実施形態において、ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の発現は、別個のプロモーター（例えば、ウイルスプロモーター）によって達成され得る。この点において適切なプロモーターの代表的な例としては、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＭｏＭＬＶプロモーターが挙げられる。本発明の文脈において同様に利用され得る他のプロモーターとしては、細胞または組織特異的プロモーターあるいは誘導プロモーターが挙げられる。代表的な誘導プロモーターとしては、テトラサイクリン応答プロモーター（例えば、「Ｔｅｔ」プロモーター）（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｂａｒｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：２７２３−２７２９（１９９７）；Ｂｌａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：７９７−７９９（１９９９）；Ｂｏｈｌら、Ｂｌｏｏｄ　９２：１５１２−１５１７（１９９８）；およびＨａｂｅｒｍａｎら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：１６０４−１６１１（１９９８）に記載されるような）；エクジソンプロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３３４６−３３５１（１９９６）に記載されるような）；ならびに他の調節プロモーターまたはプロモーター系（Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０２８−１０３２（１９９６）に記載されるような）が挙げられる。
【００８９】
ＡＡＶ遺伝子送達ベクターはまた、このベクターに対して所望の機能をもたらすのを援助するさらなる配列（例えば、アデノウイルス由来）を含み得る。このような配列は、例えば、アデノウイルス粒子においてＡＡＶ遺伝子送達ベクターをパッケージングするのを援助する配列を含む。
【００９０】
アデノ随伴ウイルスベクターを産生するのに適したパッケージング細胞株は、所定の容易に利用可能な技術によって慣用的に調製され得る。例えば、米国特許第５，８７２，００５号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。最低限、本発明のＡＡＶ遺伝子送達系に適切なパッケージング系は、ＡＡＶ複製およびカプシド遺伝子を含む。
【００９１】
好ましいパッケージング細胞株は、ＡＡＶヘルパーウイルスおよびＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子を含むＡＡＶ遺伝子送達ベクターの両方を含み得る。代表的なパッケージング細胞株系の詳細な記載については、例えば、Ｈｏｌｓｃｈｅｒ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６８：７１６９−７１７７（１９９４）；Ｃｌａｒｋ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：１３２９−１３４１（１９９５）；およびＴａｍａｙｏｓａ，Ｋ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．７：５０７−５１３（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００９２】
あるいは、ＡＡＶのパッケージングは、無細胞系においてインビトロで達成されて、トランスフェクションプロトコールまたはパッケージング細胞株を不必要にし得る。このようなインビトロ系は、ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子およびヘルパーウイルス機能を供給するＲｅｐ−タンパク質、カプシドタンパク質およびアデノウイルスタンパク質の供給源を保有するＡＡＶ遺伝子送達ベクターを組み込む。後者のタンパク質は、典型的に細胞抽出物の形態で供給される。代表的なインビトロ系は、さらにＤｉｎｇ，Ｌ．ら、Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．４：１１６７−１１７２（１９９７）およびＺｈｏｕ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３２４１−３２４７（１９９８）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００９３】
（３．他のウイルス遺伝子送達ベクター系）
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベースのベクターに加えて、多数の他のウイルス遺伝子送達ベクター系はまた、ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の発現のために利用され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、アデノウイルスベクターが、使用され得る。このようなベクターの代表的な例としては、例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６−６２７（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１−４３４（１９９１）；ＷＯ９３／９１９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（１）：２１５−２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．９０（２４）：１１４９８−５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８８（６）：２８３８−４８（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ　７５（２）：２０７−２１６（１９９３）；Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−１２９１（１９９３）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４（１９９３）；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８（１９９２）；およびＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ　１０１（２）：１９５−２０２（１９９１）；およびＷＯ９３／０７２８３；ＷＯ９３／０６２２３；およびＷＯ９３／０７２８２によって記載されるものが挙げられる。
【００９４】
本発明の遺伝子送達ベクターはまた、ヘルペスウイルスを含む。このようなベクターの代表的な例としては、Ｋｉｔ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９−２３６（１９８９）によって開示されるもの；ならびに米国特許第５，２８８，６４１号およびにＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）よって開示されるものが挙げられる。さらなる例示的な単純疱疹ウイルスベクターとしては、ＷＯ９５／０４１３９に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ＬａｃＺ（Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、Ｇｅｌｌｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１６６７−１６６９（１９８８）ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ；Ｆｉｎｋ、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：１１−１９（１９９２）に記載されるＨＳＶ　Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ；ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ）に記載されるＨＳＶ７１３４、２ＲＨ１０５およびＧＡＬ４、ならびに登録番号ＡＴＣＣ　ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ　ＶＲ−２６０としてＡＴＣＣで寄託されたものが挙げられる。
【００９５】
遺伝子送達ベクターはまた、例えば、ポリオウイルス（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３８５−３８８（１９８９）；およびＳａｂｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　１：１１５−１１８（１９７３））；ライノウイルス；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルス）（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３１７−３２１（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ　８：１７−２１（１９９０）；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ　８９／０１９７３）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１０８−１１４（１９７９））；インフルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓら、Ｃｅｌｌ　５９：１１０７−１１１３（１９８９）；ＭｃＭｉｃｈｅａｌら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：１３−１７（１９８３）；およびＹａｐら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３：２３８−２３９（１９７８））；ＨＩＶ（Ｐｏｚｎａｚｓｋｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５３２−５３６（１９９１））；はしか（ＥＰ　０　４４０，２１９）；アストロウイルス（Ｍｕｎｒｏｅら、Ｊ．Ｖｉｒ．６７：３６１１−３６１４（１９９３））；およびコロナウイルス、ならびに他のウイルス系（例えば、ＥＰ０，４４０，２１９；ＷＯ　９２／０６６９３；米国特許第５，１６６，０５７号）を含む、広範な種々の他のウイルスから作製され得る。
【００９６】
（４．非ウイルス遺伝子送達ベクター）
例えば、核酸発現ベクター；殺傷されたアデノウイルス単独に連結されたかまたは連結されていないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　３：１４７−１５４（１９９２）を参照のこと）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）を参照のこと）；真核生物細胞送達ベクター；光重合したヒドロゲル物質の沈着；携帯型遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号において記載されるような）；米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ　９２／１１０３３において記載されるような電離放射線；核電荷の中和または細胞膜との融合のような、ＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子の発現のための他の遺伝子送達ベクターおよび方法が使用され得る。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１４：２４１１−２４１８（１９９４）およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１５８１−１５８５（１９９４）において記載されている。
【００９７】
粒子媒介性送達が、使用され得る。手短にいうと、目的のＮＥＴ−４阻害アンチセンス分子は、高レベルの発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入され得、次いで、アシアロオロソムコイド（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）において記載されるような）、インスリン（Ｈｕｃｋｅｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　４０：２５３−２６３（１９９０）において記載されるような）、ガラクトース（Ｐｌａｎｋ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ　３：５３３−５３９（１９９２）において記載されるような）、ラクトースまたはトランスフェリンのような細胞標的化リガンドに連結された、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミンのようなポリマーＤＮＡ結合陽イオンのような合成遺伝子送達分子と共にインキュベートされ得る。
【００９８】
裸のＤＮＡもまた、使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号において記載されている。取り込み効率は、生分解性ラテックスビーズを使用して改善され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始後、細胞に効率的に輸送される。この方法は、疎水性を増加するためにビーズの処理によってさらに改善され得、それにより、エンドソームの破壊およびＤＮＡの細胞質への放出を促進する。
【００９９】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許５，４２２，１２０号、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、およびＷＯ９１／１４４４４５、ならびに欧州特許公開番号５２４，９６８において記載されている。核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入され得、次いで、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトース、またはトランスフェリンのような細胞標的化リガンドに連結された、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンのようなポリマーＤＮＡ結合陽イオンのような合成遺伝子送達分子と共にインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または遍在性の活性プロモーターの制御下で、遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。使用に適切なさらなる非ウイルス送達は、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（２４）：１１５８１−１１５８５（１９９４）において記載されるアプローチのような機械的送達系を含む。さらに、このようなベクター送達系のコード配列および発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。
【０１００】
例示的なリポソーム遺伝子送達ビヒクルおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同第４，７６２，９１５号、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、およびＷＯ９１／１４４４５、欧州特許公開番号５２４，９６８、およびＳｔａｒｒｉｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６〜２４０頁（１９７５）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｈｏｋａｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．６００：１（１９８０）；Ｂａｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５５０：４６４（１９７９）；Ｒｉｖｅｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１１９（１９８７）；Ｗａｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７８５１（１９８７）；Ｐｌａｎｔ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：４２０（１９８９）において記載されるような遺伝子送達ビヒクルである。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、腫瘍細胞におけるＮＥＴ−４メッセンジャーＲＮＡの発現を検出するための診断キットとして処方され得る。診断キットは、ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズし得る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み得る。好ましくは、このポリヌクレオチドは、少なくとも１０塩基対長である。好ましい実施形態において、このキットは、配列番号１８、１９、２０、２１および２２からなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、ならびにストリンジェントな条件下で配列番号１のポリヌクレオチドとハイブリダイズしない少なくとも１つのコントロールオリゴヌクレオチドを含む。このキットはまた、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも３つ（例えば、５つ全てのオリゴヌクレオチド）を含み得る。
【０１０２】
（実施例）
以下の実験的な例は、限定ではなく、例示のために提供される。
【０１０３】
（実施例１）
（ＮＥＴ−４　ｍＲＮＡのアンチセンス阻害）
（Ａ．トランスフェクション混合物の調製）
各トランスフェクション混合物について、キャリア分子（好ましくは、リピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）またはコレステロイド（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｉｄ））を、水中０．５ｍＭの作業濃度に調製し、そして超音波処理して均一な溶液を生じ、そして０．４５μｍ　ＰＶＤＦ膜を通してろ過した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２〜６）を、滅菌Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水中で１００μＭの作業濃度に調製した。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドを、マイクロチューブ中で、ＯｐｔｉＭＥＭＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中に２μＭまでか、または約２０μｇオリゴ／ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭＴＭまで希釈した。別々のマイクロチューブ中で、リピトイドまたはコレステロイド（代表的に、約１．５〜２ｎｍｏｌリピトイド／μｇ　アンチセンスオリゴヌクレオチドの量で）を、オリゴヌクレオチドを希釈するために使用されたのと同じ容量のＯｐｔｉＭＥＭＴＭ中に希釈した。希釈されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、希釈したリピトイドに直ぐに添加し、そして上下にピペッティングすることによって混合した。
【０１０５】
（Ｂ．トランスフェクション）
ＳＷ６２０またはＭＲＣ９細胞を、トランスフェクションの１日前に、血清を含む増殖培地中で、組織培養皿にプレートし、６０〜９０％のトランスフェクションの密度を得た。オリゴヌクレオチド／リピトイド混合物を、混合の直後に、１００〜３００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度まで、細胞に添加した。細胞を、トランスフェクション混合物と共に、３７℃、５％ＣＯ２で、４〜２４時間インキュベートした。インキュベーション後、トランスフェクション混合物を取り出し、そして血清を含む通常の増殖培地と交換した。
【０１０６】
総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮＥＡＳＹＴＭキット（Ｑｉａｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して抽出した。
【０１０７】
（Ｃ．逆転写）
標的ｍＲＮＡのレベルを、Ｒｏｃｈｅ　ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ機械を使用して定量した。標的ｍＲＮＡについての値を、内部コントロール（例えば、β−アクチン）に対して正規化した。
【０１０８】
各２０μｌの反応について、抽出されたＲＮＡ（一般に、全部で０．２〜１μｇ）を、滅菌した０．５または１．５ｍｌの微小遠心管に配置し、そして水を、総量１２．５μｌまで添加した。２．５μｌ　Ｈ２Ｏ、２．０μｌ　１０×反応緩衝液、１０μｌ　オリゴｄＴ（２０ｐｍｏｌ）、１．０μｌ　ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、０．５μｌ　ＲＮＡｓｉｎ（登録商標）（２０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、および０．５μｌ　ＭＭＬＶ逆転写酵素（５０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を（列挙された順序で）混合することによって調製した、７．５μｌの緩衝液／酵素混合物を、各管に添加した。内容物を、上下にピペッティングすることによって混合し、そして反応混合物を、４２℃で１時間、インキュベートした。各管の内容物を、増幅の前に遠心した。
【０１０９】
（Ｄ．ＲＴ反応物のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ増幅）
以下の順で混合することによって、増幅混合物を調製した：１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１４０μＭ　各ｄＮＴＰ、０．１７５ｐｍｏｌ　各オリゴ、１：５０，０００希釈のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、０．２５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１ユニット　Ｔａｑポリメラーゼ、および２０μｌまでのＨ２Ｏ（ＰＣＲ緩衝液ＩＩは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴより１０×濃度で入手可能である）。１×濃度で、ＰＣＲ緩衝液ＩＩは、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８．３および５０ｍＭ　ＫＣｌを含む。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）は、二本鎖ＤＮＡに結合される場合、蛍光を発する色素である。二本鎖ＰＣＲ産物が増幅の間に生成される場合、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ由来の蛍光が増加する。
【０１１０】
増幅産物の各２０μｌのアリコートに、２μｌのテンプレートＲＴを添加し、そして標準的なプロトコルに従って増幅を行なった。
【０１１１】
以下の表１において示されるように、ＮＥＴ−４メッセージレベルは、ＳＷ６２０細胞におけるアクチンメッセージと比較して減少した。ＡＳは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを示し、そしてＲＣは、対応するコントロールオリゴヌクレオチドを示す。
【０１１２】
【表１】
2004505018.tif 000003
（実施例２）
（細胞増殖アッセイ）
細胞を、１ウェル当り５０００細胞の密度で、９６ウェルプレートに播種した。４日間の増殖アッセイについて、各日に１つ、５つの独立した９６ウェルプレートを調製した。一晩のインキュベーション後、細胞を、上記の手順を使用してトランスフェクトした。増殖アッセイの各日に、全ての培地を、１つのプレートから取り出し、そして−７０℃で凍結した。４日目に、全てのプレートを、各ウェルにおいて、ＤＮＡの量、従って細胞の数を決定するＱｕａｎｔｏｓＴＭアッセイキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中で発育させた。結果を、以下の表２〜６に示す。各表において、結果は、蛍光の単位で表される。
【０１１３】
【表２】
2004505018.tif 000004
2004505018.tif 000005
オリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０１１４】
【表３】
2004505018.tif 000006
（実施例３）
（Ｎｅｔ−４　ｍＲＮＡ発現）
多くの正常組織および腫瘍細胞株の定量的ＰＣＲを使用して、Ｎｅｔ−４の発現を分析した。定量的リアルタイムＰＣＲを、製造業者の指示に従って、Ｒｏｃｈｅ　ＲＮＡ単離キットを使用して、細胞からＲＮＡをまず単離することによって行なった。１マイクログラムのＲＮＡを使用して、製造業者の緩衝液および推奨された濃度のオリゴｄＴ、ヌクレオチド、およびＲｎａｓｉｎを使用して、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この第１鎖ｃＤＮＡは、機械のマニュアルにおいて推奨されるように、Ｒｏｃｈｅ　ｌｉｇｈｔ−ｃｙｃｌｅｒを使用する定量的リアルタイムＰＣＲについてのテンプレートとして機能した。Ｎｅｔ−４を、正方向プライマーＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡ（配列番号１２）および逆方向プライマーＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＡ（配列番号１３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、内部標準と比較して増幅が増幅の直線的段階に入るサイクルに基づいて、そして製造業者によって提供されるソフトウェアを使用して定量した。第１鎖ｃＤＮＡ反応における量または全テンプレートにおける小さな差異を、正方向プライマー５’−ＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧ−３’（配列番号１４）および逆方向プライマー：５’−ＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧ−３’（配列番号１５）を使用する別々の定量的ＰＣＲ反応中の増幅されたアクチンの量に対して正規化することによって、減少させた。正常組織におけるＮｅｔ−４　ｍＲＮＡレベルについての結果を、表８に示す；腫瘍細胞株におけるＮｅｔ−４　ｍＲＮＡレベルについての結果を、表９に示す。
【０１１５】
【表４】
2004505018.tif 000007
【０１１６】
【表５】
2004505018.tif 000008
（実施例４）
（細胞増殖のアンチセンス阻害）
コロニー形成に対するＮｅｔ−４発現の効果を、軟質寒天アッセイにおいて試験した。軟質寒天アッセイを、最初に、細胞上での層形成の数時間以内に新たにプレーティングした、２ｍｌの０．６％寒天含有培地の下層を構築することにより実施した。細胞層を、０．０５％トリプシンを用いてプレートから上述のようにトランスフェクトされた細胞を除去し、そして培地中で二度洗浄することにより、下層上に形成した。この細胞をＣｏｕｌｔｅｒカウンターで計数し、そして培地中に１ｍｌ当たり１０６個になるまで再懸濁した。１０μｌのアリコートを、９６ウェルプレート中に培地と共にプレーティングするか（ＷＳＴ１での計数をチェックするために）、または軟質寒天アッセイのためにさらに希釈した。２０００の細胞を、０．６％寒天下層上の８００μｌの０．４％寒天にプレーティングした（二連ウェル）。細胞層の寒天が固まった後、２ｍｌの培地を上面に滴下し、そしてアンチセンスまたは逆コントロールオリゴを、送達ビヒクルなしで添加した。新鮮な培地およびオリゴを３〜４日毎に添加した。１０日〜３週間でコロニーが形成した。コロニーの領域を目視で計数した。Ｗｓｔ−１代謝値を用いて、出発細胞数における小さな差について補正した。
【０１１７】
表１０に示すように、Ｎｅｔ−４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（９６０ＡＳ；配列番号５）は、逆コントロールオリゴヌクレオチド（９６０ＲＣ；配列番号１０）と比較してコロニー数の減少を導いた。アンチセンスオリゴヌクレオチド９６０ＡＳ（配列番号５）によるコロニー数の減少は、ｋＲＡＳ　ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドｋＲＡＳ　２５７６ＡＳ（ＧＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＡＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡ）（配列番号１６）による減少（逆コントロールオリゴヌクレオチドｋＲＡＳ　２５７６ＲＣ（ＡＧＡＡＣＧＧＡＧＧＧＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧ）（配列番号１７）と比較した場合）と同様である。
【０１１８】
【表６】
2004505018.tif 000009
（実施例５）
（結腸マイクロアレイ分析）
正常および癌性組織を、当該分野で周知のレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）技術を用いて患者から収集した（例えば、Ｏｈｙａｍａら（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２９：５３０−６；Ｃｕｒｒａｎら（２０００）Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５３：６４−８；Ｓｕａｒｅｚ−Ｑｕｉａｎら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２６：３２８−３５；Ｓｉｍｏｎｅら（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ　１４：２７２−６；Ｃｏｎｉａら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１１：２８−３８；Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：９９８−１００１を参照のこと）。
【０１１９】
ｃＤＮＡプローブを、患者細胞から単離した総ＲＮＡから調製した。ＬＣＭは特定の細胞型の単離を提供し、実質的に同質の細胞サンプルを提供するので、これは、類似の純粋なＲＮＡサンプルを提供した。
【０１２０】
総ＲＮＡを、最初に、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを用いて逆転写してｃＤＮＡにし、次に第２鎖のＤＮＡ合成を行った。次いで、ｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーター媒介発現（例えば、Ｌｕｏら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ　５：１１７−１２２を参照のこと）を用いてインビトロで転写して、アンチセンスＲＮＡを生成し、次いでこのアンチセンスＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。第２セットのｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーターを用いてインビトロで再度転写し、アンチセンスＲＮＡを提供した。必要に応じて、このＲＮＡを再度ｃＤＮＡに変換し、第３ラウンドまでのＴ７媒介増幅が、より多くのアンチセンスＲＮＡを生成することを可能にした。従って、この手順は、蛍光標識に用いられる最終的なＲＮＡを生成するために２回または３回のラウンドのインビトロ転写を提供した。蛍光プローブを、最初に、アンチセンスＲＮＡ混合物にコントロールＲＮＡを加え、そしてこのＲＮＡ出発物質から蛍光標識したｃＤＮＡを生成することにより作製した。腫瘍ＲＮＡサンプルから調製した蛍光標識ｃＤＮＡを、正常細胞ＲＮＡサンプルから調製した蛍光標識ｃＤＮＡと比較した。例えば、正常細胞由来のｃＤＮＡプローブをＣｙ３蛍光色素（緑色）を用いて標識し、そして腫瘍細胞から調製したｃＤＮＡプローブをＣｙ５蛍光色素（赤色）を用いて標識した。
【０１２１】
用いた各アレイは、同一の空間的配置およびコントロールスポットセットを有した。各マイクロアレイを２つの領域に分割した。各領域は、各アレイにおける合計約９２１６スポットに対して各々半分、１２群の３２×１２スポットを有するアレイを有した。単位アレイ当たり少なくとも２つの各クローンの複製物を提供するこの２つの領域は、同一にスポットされる。スポットを０．５ｋｂ〜２．０ｋｂのＰＣＲ増幅産物を用いて達成し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｇｅｎ　ＩＩＩスポッターを用い、製造元の推奨に従ってスポットした。このアレイにおける２４の領域の各々の第１列は、約３２のコントロールスポット（４つのネガティブコントロールおよび８つの試験ポリヌクレオチド）を有した。試験ポリヌクレオチドを、２〜６００ｐｇ／スライドの濃度範囲および１：１の比で、標識反応の前に各サンプルにスパイク（ｓｐｉｋｅ）した。各アレイの設計のために、２つのスライドを、標識反応において逆標識（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ）した試験サンプルとハイブリダイズさせた。これは、各クローンについて４連の測定（各サンプルについて、１つの色が２つ、そしてもう一方の色が２つ）を提供した。
【０１２２】
示差的発現アッセイを、等量の腫瘍細胞由来のプローブと同一患者の正常細胞由来のプローブとを混合することにより実施した。このアレイを、５×ＳＳＣ／０．２％　ＳＤＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で６０℃にて約２時間インキュベーションすることによりプレハイブリダイズさせ、次いで水中で３回、イソプロパノール中で２回洗浄した。アレイのプレハイブリダイゼーション後、次いでプローブ混合物を、高ストリンジェンシーの条件下（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および０．２％　ＳＤＳ中で４２℃にて一晩）でこのアレイとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、アレイを以下のようにして５５℃にて３回洗浄した：１）１×ＳＳＣ／０．２％　ＳＤＳ中での第１の洗浄；２）０．１×ＳＳＣ／０．２％　ＳＤＳ中での第２の洗浄；および３）０．１×ＳＳＣ中での第３の洗浄。
【０１２３】
次いで、このアレイを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ＩＩＩ二色レーザースキャナー／ディテクターを用いて、緑色および赤色についてスキャンした。この画像をＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ａｕｔｏｇｅｎｅを用いて処理し、各スキャンセット由来のデータを正規化して、正常に対する発現比を提供した。マイクロアレイ実験からのデータを、Ｅ．Ｊ．Ｍｏｌｅｒ、Ｍ．Ａ．Ｂｏｙｌｅ、およびＦ．Ｍ．Ｒａｎｄａｚｚｏらにより２０００年１１月２０日に出願された米国特許出願番号６０／２５２，３５８（表題「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｃｙ　ｉｎ　ｃＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｄａｔａ」）（この出願は本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるアルゴリズムに従って分析した。
【０１２４】
この実験を繰り返した（両方の「色の方向（ｃｏｌｏｒ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」においてアッセイを実施するために、今回は、反対の色を用いて２つのプローブを標識した）。各実験を、時々、さらに２つのスライド（各色の方向において１つ）を用いて繰り返した。アレイにおける各配列の蛍光レベルを４つのアレイ由来の８つの複製スポット／遺伝子または２つのアレイ由来の４つの複製スポット／遺伝子もしくはいくつかの他の順列の幾何学的平均の比として表した。このデータを各複製領域に存在するスパイクしたポジティブコントロールを用いて正規化し、そしてこの正規化の正確性を、各差異の有意性の最終的な決定に含めた。また、各スポットの蛍光強度を各複製領域におけるネガティブコントロールと比較して、各サンプルにおいてどのスポットが有意な発現レベルを検出したかを決定した。
【０１２５】
蛍光強度の統計的分析を各セットの複製スポットに適用して、各示差的測定の正確性および有意性を評価し、これにより各患者の腫瘍サンプルと正常サンプルとの間に発現における差がないという帰無仮説を試験するｐ値を得た。マイクロアレイの最初の分析の間、ｐ＞１０−３の場合にこの仮説を受け入れ、そして示差的な比率を、これらのスポットについて１．０００に設定した。全ての他のスポットは、腫瘍サンプルと正常サンプルとの間の発現における有意な差を有する。腫瘍サンプルが検出可能な発現を有し、正常サンプルがそうでない場合、この比率を１０００で切り捨てる。なぜなら正常サンプルにおける発現についての値はゼロであり、そしてこの比率は数学的に有用な値ではない（例えば、無限大）からである。正常サンプルが検出可能な発現を有し、そして腫瘍サンプルがそうでない場合、この比率を０．００１までで切り捨てる。なぜなら、腫瘍サンプルにおける発現の値はゼロであり、この比率は数学的に有用な値ではないからである。これらの後者の２つの状態を、本明細書中で「オン／オフ」として参照する。データベースのテーブルを、９５％信頼水準（ｐ＞０．０５）を用いて構成させた。
【０１２６】
結腸腫瘍細胞におけるＮｅｔ−４の発現レベルにおける（一致する正常な結腸細胞と比較しての）差は、９１．６７％の患者において２倍以上（「＞＝２×」）であり、６６．６７％の患者において２．５倍以上であり、そして３３．３３％の試験した患者において５倍以上であった。
【０１２７】
（実施例６）
（インサイチュハイブリダイゼーション分析）
インサイチュハイブリダイゼーション分析を実施し、正常結腸組織および腫瘍肺組織、ならびに腫瘍結腸組織および腫瘍肺組織におけるＮｅｔ−４の発現を、以下のオリゴヌクレオチドの混合物を用いて特徴付けた：
Ｎｅｔ−４オリゴ８６４
ＣＣＣＴＴＧＴＡＧＴＧＣ（配列番号１８）
Ｎｅｔ−４オリゴ８６５
ＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号１９）
Ｎｅｔ−４オリゴ８６６
ＣＣＧＡＴＡＴＧＣＴＣＴＧ（配列番号２０）
Ｎｅｔ−４オリゴ８６７
ＴＴＡＧＧＴＴＣＣＡＡＴＣＡ（配列番号２１）
Ｎｅｔ−４オリゴ８６８
ＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＡＣＴＧ（配列番号２２）
この結果を図２に示す（図２Ａ−腫瘍結腸組織、図２Ｂ−腫瘍肺組織、図２Ｃ−正常結腸組織、および図２Ｄ−正常肺組織）。
【０１２８】
前述から、本発明の特定の実施形態が、説明の目的で本明細書中に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による以外は限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、４回貫通タンパク質の図式的な構造を示す。アミノ末端（Ｎ）およびカルボキシル末端（Ｃ）ならびに細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインが、ボールドフェースで示されている。１８個の４回貫通遺伝子のうち１２個で見出された高度に保存されたアミノ酸は、丸の中に示されている。１４個以上の４回貫通で見出された高度に保存されたアミノ酸は、ボールドフェースの丸の中に示されている。保存されたＰＸＳＣモチーフは、種々の４回貫通のＥＣ２内の異なる位置に配置され、従って浮いている矢印で示されている。アスタリスクは、膜貫通ドメイン内の保存された荷電アミノ酸を示す。
【図２】
図２は、Ｎｅｔ−４　８６４：ＣＣＣＴＴＧＴＡＧＴＧＣ（配列番号１８）；Ｎｅｔ−４　８６５：ＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号１９）；Ｎｅｔ−４　８６６：ＣＣＧＡＴＡＴＧＣＴＣＴＧ（配列番号２０）；Ｎｅｔ−４　８６７：ＴＴＡＧＧＴＴＣＣＡＡＴＣＡ（配列番号２１）；およびＮｅｔ−４　８６８：ＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＡＣＴＧ（配列番号２２）からなるオリゴヌクレオチドの混合物を使用する、腫瘍結腸組織（図２Ａ）、腫瘍肺組織（図２Ｂ）、正常結腸組織（図２Ｃ）、および正常肺組織（図２Ｄ）のインサイチュハイブリダイゼーション分析を示す。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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