(57)【要約】本発明は、生物の増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株の培養物または収集物に関する。本発明はまた、生物の増殖を阻害する化合物が作用する標的を特定する方法、および株が株の培養物または収集物に存在する程度を特定する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記培養物は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない株を少なくとも１つ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記特定工程は、前記培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸のヌクレオチド配列を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記特定工程は、前記細胞培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸を特定するための増幅反応を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅反応の産物は、検出可能な色素で標識される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記特定工程は、ハイブリダイゼーション手順を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記特定工程は、前記細胞培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸と、核酸アレイを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオ
フォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物は、天然化合物のライブラリーから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物は、合成化合物のライブラリーから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養物中でより迅速に増殖した前記株における前記遺伝子産物が、少なくとも１つの他の生物においておいて相当する物を有するかどうかを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【請求項１７】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項１８】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項１９】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項２０】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項２１】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項２２】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する、固体成長培地上の株のアレイを得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記株のアレイを接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項２３】
前記アレイ中の少なくとも１つの株は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
種々の濃度の前記化合物と、前記複数の培養物のそれぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖が阻害される株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項２５】
前記複数の培養物における少なくとも１つの株が、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
第１の化合物を用いて第１の培養物上で請求項１に記載の方法を実施すること、
第２の化合物を用いて第２の培養物上で請求項１に記載の方法を実施すること、および
前記第１の培養物で特定された株を、前記第２の培養物で特定された株と比較することを含む方法。
【請求項２７】
第１の化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を含む株のアレイを、前記生物の増殖を阻害する前記第１の化合物を含む第１の固体培地上で、および前記生物の増殖を阻害する第２の化合物を含む第２の固体培地上で成長させること、および
前記第１の固体培地上で成長した株のパターンを、前記第２の固体培地上で成長した株のパターンと比較すること
を含む方法。
【請求項２８】
前記第１の化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項３０】
前記培養物中の少なくとも１つの株は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過小発現しない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部に相補的な核酸を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部と相補的なアンチセンス核酸を発現し、前記アンチセンス核酸の発現により、前記株における前記遺伝子産物の発現が低下する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記株における前記遺伝子産物をコードする核酸のヌクレオチド配列を決定することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸を特定するための増幅反応を実施することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅反応の産物は、検出可能な色素で標識される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記特定工程は、ハイブリダイゼーション手順を実施することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸と、核酸アレイを接触させることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物は、天然化合物のライブラリーから得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物は、合成化合物のライブラリーから得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した前記株における前記遺伝子産物が少なくとも１つの他の生物において相当する物を有するかどうかを決定することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項４４】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項４５】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項４６】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項４７】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項４８】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項４９】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
種々の濃度の前記化合物と、前記培養物それぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖速度が低減される株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項５０】
化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
第１の化合物を用いて第１の培養物上で請求項２９に記載の方法を実施すること、
第２の化合物を用いて第２の培養物上で請求項２９に記載の方法を実施すること、および
前記第１の培養物で特定された株を、前記第２の培養物で特定された株と比較することを含む方法。
【請求項５１】
第１の化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む株のアレイを、前記生物の増殖を阻害する前記第１の化合物を含む第１の固体培地上で、および前記生物の増殖を阻害する第２の化合物を含む第２の固体培地上で成長させること、
前記第１の固体培地上で成長した株のパターンを、前記第２の固体培地上で成長した株のパターンと比較すること
を含む方法。
【請求項５２】
前記第１の化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５３】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物の発現レベルを調節する様々な濃度の調節剤と、前記複数の培養物それぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖速度が低減される株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項５４】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物。
【請求項５５】
前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項５４に記載の培養物。
【請求項５６】
前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項５４に記載の培養物。
【請求項５７】
前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項５４に記載の培養物。
【請求項５８】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【請求項５９】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【請求項６０】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【請求項６１】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【請求項６２】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【請求項６３】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【請求項６４】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物。
【請求項６５】
前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項６４に記載の培養物。
【請求項６６】
前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項６４に記載の培養物。
【請求項６７】
前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項６４に記載の培養物。
【請求項６８】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【請求項６９】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【請求項７０】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【請求項７１】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【請求項７２】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【請求項７３】
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【請求項７４】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含み、、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項７５】
過剰発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターを、前記遺伝子産物の過剰発現を促進するプロモーターで置き換えることにより変更されている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
過剰発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターに、前記遺伝子産物の過剰発現を促進するプロモーターを有する調節要素を挿入することにより変更されている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記調節要素は、調節可能なプロモーター、レプレッサにより認識されるオペレーター、転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、および上流活性化配列からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記遺伝子に対応する前記特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する前記遺伝子産物を特定する工程は、増幅反応を実施すること、および前記遺伝子に対応する特有の増幅産物を検出することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じプロモーターで置き換えられている、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、各遺伝子産物が所望の発現レベルで発現されるように選択された複数のプロモーターで置き換えられている、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、調節可能なプロモーターを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項７４に記載の方法。
【請求項８５】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項８６】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項８７】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を得ることであって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項８８】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項８９】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【請求項９０】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に相当する該特有の産物を検出することにより、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物中で、より迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項９１】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項９２】
過小発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターを、前記遺伝子産物の過小発現を促進するプロモーターで置き換えることにより変更されている、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
過小発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターに、前記遺伝子産物の過小発現を促進するプロモーターを有する調節要素を挿入することにより変更されている、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記調節要素は、調節可能なプロモーター、レプレッサにより認識されるオペレーター、転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、および上流活性化配列からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記遺伝子に対応する前記特有の産物を検出することにより、前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する前記遺伝子産物を特定する工程は、増幅反応を実施すること、および前記遺伝子に対応する特有の増幅産物を検出することを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じプロモーターで置き換えられている、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、各遺伝子産物が所望のレベルで発現するように選択された複数のプロモーターで置き換えられている、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、調節可能なプロモーターを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９９】
各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１００】
前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項９１に記
載の方法。
【請求項１０１】
前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０３】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項１０４】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに相当する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項１０５】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項１０６】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに相当する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過小発現される株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【請求項１０７】
生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【請求項１０８】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む株の培養物または収集物から核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【請求項１０９】
前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられ、前記プライマー対中のプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
それぞれの前記遺伝子に関する天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
複数の調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換え、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においた、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【請求項１１６】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【請求項１１７】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【請求項１１８】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【請求項１１９】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【請求項１２０】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドによりその活性が相補され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【請求項１２１】
生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の培養物または収集物であって、前記化合物と接触させられている第１の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられていない第２の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に対応する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと
を含む方法。
【請求項１２２】
前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられており、前記プライマー対中のプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記１つより多い調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換え、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においた、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２６】
生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用した同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１２７】
生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記第２の株の培養物または収集物は、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用した同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む、比較することを含む方法。
【請求項１２８】
生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同一のプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む、比較することを含む方法。
【請求項１２９】
生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株が前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過剰発現される株を含む方法。
【請求項１３０】
生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記株の培養物または収集物は、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物、から核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株が前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１３１】
生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１３２】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増殖反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【請求項１３３】
前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、
前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１３７】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１３８】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１３９】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１４０】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応を実施であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１４１】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１４２】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること
を含む方法。
【請求項１４３】
前記プライマー対は少なくとも２つの組に分けられ、各プライマー対は識別可能な色素で標識されるプライマーを含み、各プライマー対を標識するのに使用される前記識別可能な色素は、プライマー対の他の組を標識するのに使用される色素と識別可能である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、
前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられており、前記プライマー対のうちのプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４７】
前記遺伝子それぞれに関する天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記１つより多い調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換えられており、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においている、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識、ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群からの選択に基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１５０】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて増幅反応を実施することであって、前記プライマー対の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識、ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計される、実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１０〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１５１】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１５２】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１５３】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、緊縮条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【請求項１５４】
複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いてた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現される株を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減する化合物の標的を特定するための試薬および方法を提供する。さらに、本発明は、新規治療用化合物または新規標的に対して作用する化合物を特定するための試薬および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
多くの重要な治療化合物は、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減あるいは排除することで作用する。例えば、ほとんどの抗生物質化合物は、病原体の増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減あるいは排除することで作用する。同様に、癌を治療または回復するのに使用される化合物はまた、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減あるいは阻害する。
【０００３】
現在の薬物発見方法は、有効な治療薬であるか、または有効な治療薬を提供するように最適化され得るものを特定するために、大量の見込みある治療用化合物をスクリーニングすることを包含する。例えば、治療活性に関して評価されるべき化合物は、コンビナトリアルケミストリーにより生成される化合物ライブラリーの成員、または天然産物ライブラリーの成員であってもよい。
【０００４】
不運にも、現在の方法は手間がかかり、かつ時間を消費し、すでに特定されたか、または既存の治療薬によりすでに標的とされている遺伝子産物に対して作用する化合物をもたらし得る。したがって、新規化合物または新規標的に対して作用する化合物をもたらす迅速なスクリーニング技法が必要である。
【０００５】
さらに、抗菌活性を有するが、それらの標的が未知であるという事実に起因して感染を患う個体に投与することができない大量の化合物が特定されている。したがって、抗菌活性を有する化合物が作用する標的の特定を可能にする方法が必要である。
【０００６】
配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表を含む、「コピー１」、「コピー２」、「コピー３」、および「ＣＲＦ」と表記したＣＤ−ＲＯＭの４つのコピーと一緒に出願される。ＣＤ−ＲＯＭのコピーそれぞれには、３６，２２０，５８７バイトのサイズの、２００２年２月８日に創ったファイル名０２８ｖｐｃ−ｆｉｎａｌ．ｔｘｔが含まれる。これらの複製ＣＤ−ＲＯＭ上の情報は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００７】
定義
本明細書で使用される場合、「増殖に必要な」または「増殖に必要とされる」という専門用語は、遺伝子転写物および／または遺伝子産物の欠如あるいはかなりの減少が細胞成長を完全に排除する場合、ならびに遺伝子転写物および／または遺伝子産物の欠如が単に細胞成長を低減する場合を包含する。
【０００８】
「Ｅ．ｃｏｌｉまたはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)」とは、エシェリヒア・コリまたはシゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ゾンネ (Shigella sonnei)、シゲラ２Ａ(Shigella 2A)を含むシゲラ属の種としてこれまで分類されてきた任意の生物を意味する。
【０００９】
「相同コード核酸」とは、配列番号８〜３７９５またはそれらの一部からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物をコードする核酸に相同的な核酸を意味する。幾つかの実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４、ならびにそれらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有し得る。他の実施形態では、相同コード核酸は、配列番号８〜３７９５の１つに相補的なヌクレオチド配列、およびそれらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％ヌクレオチド配列同一性を有し得る。同一性は、デフォルトパラメータのＢＬＡＳＴＮバージョン２．０、またはデフォルトパラメータのｔＢＬＡＳＴＸを用いて測定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。あるいは、「相同コード核酸」は、機能的オルソログクラスターに対する所定の遺伝子の一員により特定することができる。このオルソログクラスターの他の成員はすべて、相同であるとみなされる。かかる機能的オルソログクラスターのライブラリーは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COGに見出すことができる。遺伝子は、上記ウェブサイトで利用可能なＣＯＧＮＩＴＯＲプログラムを用いることにより、あるいはＣＯＧの成員に対する所定の遺伝子の直接ＢＬＡＳＴＰ比較およびTatusov, R.L., Galperin, M.Y., Natale, D.A. and Koonin, E.V. (2000) The COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution. Nucleic Acids Research v.28 n.1, pp．33-36に記載されるようなこれらの結果の解析により、オルソログ群のクラスター、すなわちＣＯＧに類別することができる。
【００１０】
「相同コード核酸」という用語はまた、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムを用いて決定される場合に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８のうちの１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号８〜３７９５のうちの１つのヌクレオチド配列を含む核酸により発現が阻害されるポリペプチド、またはそれらの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、または１５０個の連続アミノ酸を含む断片に対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。あるいは、タンパク質同一性または類似性は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＸ、デフォルトパラメータのＢＬＡＳＴＮ、またはデフォルトパラメータのｔＢＬＡＳＴＸを用いて特定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【００１１】
「相同コード核酸」という用語はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするコード核酸、ならびに配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸を包含する。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、約４５℃で６×ＳＳＣ中でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーション、続く約６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄を意味する。他の例示的ストリンジェントな条件は、例えば、使用される特定のプローブに適切なように、３７℃、４８℃、５５℃、および６０℃での６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を指してもよい。
【００１２】
「相同コード核酸」という用語はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸、ならびに配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸を包含する。本明細書で使用する場合、「中程度の条件」とは、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続く約４２〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回、好ましくは３〜５回の洗浄を意味する。
【００１３】
「相同コード核酸」という用語はまた、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物をコードする遺伝子により活性が補完され得る遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。幾つかの実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物により活性が補完される遺伝子産物をコードし得る。他の実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８のポリペプチドのうちの１つにより活性が補完される遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００１４】
「相同アンチセンス核酸」という用語は、配列番号８〜３７９５の配列のうちの１つ、およびそれらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％ヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。相同アンチセンス核酸はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の配列のうちの１つ、およびそれらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％ヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸であってもよい。核酸同一性は、上述のように決定され得る。
【００１５】
「相同アンチセンス核酸」という用語はまた、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を包含する。相同アンチセンス核酸はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を包含する。
【００１６】
「相同アンチセンス核酸」という用語はまた、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的なヌクレオチド配列に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を包含する。相同アンチセンス核酸はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を包含する。
【００１７】
「相同ポリペプチド」とは、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により、あるいは相同アンチセンス核酸により、活性またはレベルが阻害されるポリペプチドに対して相同的なポリペプチドを意味する。「相同ポリペプチド」という用語は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により、または相同アンチセンス核酸により活性またはレベルは阻害されるポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチド、あるいは配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により、または相同アンチセンス核酸により活性またはレベルは阻害されるポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、または１５０個の連続アミノ酸を含む断片に対するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチドを包含する。同一性または類似性は、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定され得る。あるいは、タンパク質同一性または類似性は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータでのＴＢＬＡＳＴＸ、またはデフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＮを用いて特定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【００１８】
相同ポリペプチドという用語はまた、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、または１５０個の連続アミノ酸に対して、少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチドを包含する。
【００１９】
サルモネラ属という用語は、エシェリヒア・コリに密接に関連したグラム陰性腸内細菌の大きなグループに関する一般名である。サルモネラ属により引き起こされる疾患は、食料品または給水の汚染に起因する場合が多く、毎年何百人もの人々が罹患している。サルモネラ属分類学の伝統的な方法は、それぞれが血清学的に識別可能な株に、別個の種名を割り当てることに基づいていた(Kauffmann, F 1966 The bacteriology of the Enterobacteriaceae. Munksgaard, Copenhagen)。サルモネラ属の血清学は、表面抗原に基づいている（Ｏ［菌体］およびＨ［べん毛］）。サルモネラ属の２，４００種以上の血清型または血液型亜型が既知である(Popoff, et al. 2000 Res. Microbiol. 151:63-65)。したがって、各血清型は、別個の種であるとみなされ、したがって多くの場合名称が付与された（例えば、ｓ．パラティフィ(S．paratyphi)、ｓ．タフィマリアム(S．typhimurium)、ｓ．・ティフィ(S．typhi)、 ｓ．エンテリディティス(S. enteriditis)等）。
【００２０】
しかしながら、１９７０代および１９８０年代までには、この系が扱いにくいだけでなく、不正確であることが認められた。続いて、多くのサルモネラ種が単一種（すべての血清型および血液型亜型Ｉ、ＩＩおよびＩＶ、ならびにアリゾナ (Arizona)のすべての血清型）にまとめられ、第２の種であるＳ．ボンゴリもまた認識された(Crosa, et al. 1973,
J. Bacteriol. 115:307-315)。種の名称は高可変表面抗原に基づいているが、サルモネラは、主に病原性決定基を除いて、別の状況では非常に類似している。
【００２１】
サルモネラ種に関する正式名に関する議論が幾つか存在する。一般に(Brenner, et al. 2000 J. Clin. Microbiol. 38:2465-2467)、受け入れられている名称は、サルモネラ・エンテリカである。Ｓ．エンテリカは、６つの亜種（Ｉ：Ｓ．エンテリカ亜種エンテリカ、ＩＩ：Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ(salamae)、ＩＩＩａ：Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ(arizonae)、ＩＩＩｂ：Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ(diarizonae)、ＩＶ：Ｓ．エンテリカ亜種ホウテナエ(houtenae)、およびＶＩ：Ｓ．エンテリカ亜種インディカ(indica)）に分けられる。亜種Ｉ内では、血清型または血液型亜種をそれぞれ識別するために血清型が使用される（例えば、Ｓ．エンテリカ血清型エンテリディティス(Enteriditis)、Ｓ．エンテリカ血清型タフィマリアム(Typhimurium)、Ｓ．エンテリカ血清型チフィ(Typhi)、およびＳ．エンテリカ血清型コレラエスイス(Choleraesuis)等）。従来の取り決めは、最初の使用時にこれ（サルモネラエンテリカ血清型タフィマリアム）を綴り、その略記型（サルモネラ・タフィマリアム、またはＳ．タフィマリアムタフィマリアム）を使用することである。属および種名（サルモネラ・エンテリカ）はイタリック体で記載されるが、血清型／血液型亜種名（タフィマリアム）はイタリック体で記載されないことに留意されたい。分類学委員会は、依然として公式上正確な種名を推奨しなくてはならないため、この後者のシステムはＣＤＣにより使用されるものである(Brenner, et al. 2000 J. Clin. Microbiol. 38:2465-2467)。分類学的優先および医療上の重要性の両方の関係により、これらの血清型の幾つかは最終的には完全な種名称を受け得る（ｓ．ティフィが最も顕著であろう）。
【００２２】
したがって、本明細書で記載する場合、「サルモネラ・エンテリカ、またＳ．エンテリカ」は、血液型亜種チフィ、タフィマリアム、パラチフィ（Paratyphi）コレラエスイス等を包含する。しかしながら、「公式」名の訴えは処理中であり、分類学的名称は変更し得る（Ｓ．コレラエスイスは、単に優先に基づいてＳ．エンテリカを置き換えることができる種名である）。
【００２３】
「誘導物質」とは、細胞または微生物と接触させて置いた場合に、望ましいプロモーターから、転写、あるいは阻害剤および／または促進剤クリアランス／ファイデリティを増加する作用物質または溶液を意味する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸を意味する。したがって、「配列番号Ｘの核酸」または「ヌクレオチド配列を含む核酸」という専門用語は、配列番号ＸのＤＮＡ配列、およびＤＮＡ配列中のチミジンをＲＮＡ配列中でウリジンで置換し、かつＤＮＡ配列のデオキシリボース骨格をＲＮＡ配列中でリボース骨格で置換したＲＮＡ配列の両方を包含する。修飾核酸は、天然に存在しないヌクレオチドまたは構造を有する核酸、例えばヌクレオチド間リン酸残基がメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、およびリン酸エステルである核酸である。シロキサン架橋、炭酸架橋、チオエステル架橋のような非リン酸ヌクレオチド間、ならびに当該技術分野で既知の多くの他のもまた、修飾核酸に使用され得る。
【００２５】
修飾核酸はまた、α−アノマーヌクレオチドユニット、ならびに１，２−ジデオキシ−ｄ−リボフラノース、１，２−ジデオキシ−１−フェニルリボフラノース、およびＮ4，Ｎ4−エタノ−５−メチル−シトシンのような修飾ヌクレオチドを含んでもよく、本発明の使用に意図される。修飾核酸はまた、デオキシリボース−リン酸骨格全体を、化学的には完全に異なるが構造的には類似した、２−アミノエチルグリシンユニットを含有するポリアミド（ペプチド）骨格と交換したペプチド核酸であってもよい。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「過剰発現する」という専門用語は、野生型細胞が保有するレベルよりも高い遺伝子産物レベル、または野生型遺伝子産物の親和性よりも低い試験化合物に関する親和性のいずれかを保有する株を指す一方で、「過小発現する」という専門用語は、野生型細胞が保有するレベルよりも低い遺伝子産物レベル、または野生型遺伝子産物の親和性よりも高い試験化合物に関する親和性のいずれかを保有する株を指す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
［発明の概要］
本発明のいくつかの態様を以下の番号が付けられた段落で説明する。
【００２８】
１．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００２９】
２．前記培養物は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない株を少なくとも１つ含む、段落１に記載の方法。
【００３０】
３．前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落１に記載の方法。
【００３１】
４．前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落１に記載の方法。
【００３２】
５．前記特定工程は、前記培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸のヌクレオチド配列を決定することを含む、段落１に記載の方法。
【００３３】
６．前記特定工程は、前記細胞培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸を特定するための増幅反応を実施することを含む、段落１に記載の方法。
【００３４】
７．前記増幅反応の産物は、検出可能な色素で標識される、段落６に記載の方法。
【００３５】
８．前記特定工程は、ハイブリダイゼーション手順を実施することを含む、段落１に記載の方法。
【００３６】
９．前記特定工程は、前記細胞培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸と、核酸アレイを接触させることを含む、段落１に記載の方法。
【００３７】
１０．前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、段落１に記載の方法。
【００３８】
１１．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア (Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム (Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス (Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モラクセラ・カタルハリス(Moraxella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ (Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)からなる群から選択される生物の培養物である、段落１に記載の方法。
【００３９】
１２．前記化合物は、天然化合物のライブラリーから得られる、段落１に記載の方法。
【００４０】
１３．前記化合物は、合成化合物のライブラリーから得られる、段落１に記載の方法。
【００４１】
１４．前記化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、段落１に記載の方法。
【００４２】
１５．前記培養物中でより迅速に増殖した前記株における前記遺伝子産物が、少なくとも１つの他の生物においておいて相当する物を有するかどうかを決定することをさらに含む、段落１に記載の方法。
【００４３】
１６．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【００４４】
１７．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４５】
１８．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４６】
１９．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４７】
２０．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４８】
２１．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４９】
２２．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する、固体成長培地上の株のアレイを得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記株のアレイを接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００５０】
２３．前記アレイ中の少なくとも１つの株は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない、段落２１に記載の方法。
【００５１】
２４．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
種々の濃度の前記化合物と、前記複数の培養物のそれぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖が阻害される株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００５２】
２５．前記複数の培養物における少なくとも１つの株が、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない、段落２３に記載の方法。
【００５３】
２６．化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
第１の化合物を用いて第１の培養物上で段落１に記載の方法を実施すること、
第２の化合物を用いて第２の培養物上で段落１に記載の方法を実施すること、および
前記第１の培養物で特定された株を、前記第２の培養物で特定された株と比較することを含む方法。
【００５４】
２７．第１の化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を含む株のアレイを、前記生物の増殖を阻害する前記第１の化合物を含む第１の固体培地上で、および前記生物の増殖を阻害する第２の化合物を含む第２の固体培地上で成長させること、および
前記第１の固体培地上で成長した株のパターンを、前記第２の固体培地上で成長した株のパターンと比較すること
を含む方法。
【００５５】
２８．前記第１の化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、段落２６または２７に記載の方法。
【００５６】
２９．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００５７】
３０．前記培養物中の少なくとも１つの株は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過小発現しない、段落２９に記載の方法。
【００５８】
３１．前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部に相補的な核酸を含む、段落２９に記載の方法。
【００５９】
３２．前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部と相補的なアンチセンス核酸を発現し、前記アンチセンス核酸の発現により、前記株における前記遺伝子産物の発現が低下する、段落２９に記載の方法。
【００６０】
３３．前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記株における前記遺伝子産物をコードする核酸のヌクレオチド配列を決定することを含む、段落２９に記載の方法。
【００６１】
３４．前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸を特定するための増幅反応を実施することを含む、段落２９に記載の方法。
【００６２】
３５．前記増幅反応の産物は、検出可能な色素で標識される、段落３４に記載の方法。
【００６３】
３６．前記特定工程は、ハイブリダイゼーション手順を実施することを含む、段落２９に記載の方法。
【００６４】
３７．前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸と、核酸アレイを接触させることを含む、段落２９に記載の方法。
【００６５】
３８．前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、段落２９に記載の方法。
【００６６】
３９．前記化合物は、天然化合物のライブラリーから得られる、段落２９に記載の方法。
【００６７】
４０．前記化合物は、合成化合物のライブラリーから得られる、段落２９に記載の方法。
【００６８】
４１．前記化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、段落２９に記載の方法。
【００６９】
４２．前記培養物中でよりゆっくりと増殖した前記株における前記遺伝子産物が少なくとも１つの他の生物において相当する物を有するかどうかを決定することをさらに含む、段落２９に記載の方法。
【００７０】
４３．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７１】
４４．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７２】
４５．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７３】
４６．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７４】
４７．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７５】
４８．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７６】
４９．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
種々の濃度の前記化合物と、前記培養物それぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖速度が低減される株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７７】
５０．化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
第１の化合物を用いて第１の培養物上で段落２９に記載の方法を実施すること、
第２の化合物を用いて第２の培養物上で段落２９に記載の方法を実施すること、および
前記第１の培養物で特定された株を、前記第２の培養物で特定された株と比較することを含む方法。
【００７８】
５１．第１の化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む株のアレイを、前記生物の増殖を阻害する前記第１の化合物を含む第１の固体培地上で、および前記生物の増殖を阻害する第２の化合物を含む第２の固体培地上で成長させること、
前記第１の固体培地上で成長した株のパターンを、前記第２の固体培地上で成長した株のパターンと比較すること
を含む方法。
【００７９】
５２．前記第１の化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、段落４９または５０に記載の方法。
【００８０】
５３．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物の発現レベルを調節する様々な濃度の調節剤と、前記複数の培養物それぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖速度が低減される株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００８１】
５４．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物。
【００８２】
５５．前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落５４に記載の培養物。
【００８３】
５６．前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落５４に記載の培養物。
【００８４】
５７．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、段落５４に記載の培養物。
【００８５】
５８．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００８６】
５９．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００８７】
６０．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００８８】
６１．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００８９】
６２．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００９０】
６３．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００９１】
６４．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物。
【００９２】
６５．前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落６４に記載の培養物。
【００９３】
６６．前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落６４に記載の培養物。
【００９４】
６７．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、段落６４に記載の培養物。
【００９５】
６８．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【００９６】
６９．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【００９７】
７０．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【００９８】
７１．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【００９９】
７２．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【０１００】
７３．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【０１０１】
７４．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含み、、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１０２】
７５．過剰発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターを、前記遺伝子産物の過剰発現を促進するプロモーターで置き換えることにより変更されている、段落７４に記載の方法。
【０１０３】
７６．過剰発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターに、前記遺伝子産物の過剰発現を促進するプロモーターを有する調節要素を挿入することにより変更されている、段落７４に記載の方法。
【０１０４】
７７．前記調節要素は、調節可能なプロモーター、レプレッサにより認識されるオペレーター、転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、および上流活性化配列からなる群から選択される、段落７６に記載の方法。
【０１０５】
７８．前記遺伝子に対応する前記特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する前記遺伝子産物を特定する工程は、増幅反応を実施すること、および前記遺伝子に対応する特有の増幅産物を検出することを含む、段落７４に記載の方法。
【０１０６】
７９．増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じプロモーターで置き換えられている、段落７５に記載の方法。
【０１０７】
８０．増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、各遺伝子産物が所望の発現レベルで発現されるように選択された複数のプロモーターで置き換えられている、段落７５に記載の方法。
【０１０８】
８１．各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、調節可能なプロモーターを含む、段落７５に記載の方法。
【０１０９】
８２．各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む、段落７５に記載の方法。
【０１１０】
８３．前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、段落７４に記載の方法。
【０１１１】
８４．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、段落７４に記載の方法。
【０１１２】
８５．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１３】
８６．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１４】
８７．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を得ることであって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１５】
８８．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１６】
８９．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【０１１７】
９０．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に相当する該特有の産物を検出することにより、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物中で、より迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１８】
９１．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１９】
９２．過小発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターを、前記遺伝子産物の過小発現を促進するプロモーターで置き換えることにより変更されている、段落９１に記載の方法。
【０１２０】
９３．過小発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターに、前記遺伝子産物の過小発現を促進するプロモーターを有する調節要素を挿入することにより変更されている、段落９１に記載の方法。
【０１２１】
９４．前記調節要素は、調節可能なプロモーター、レプレッサにより認識されるオペレーター、転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、および上流活性化配列からなる群から選択される、段落９３に記載の方法。
【０１２２】
９５．前記遺伝子に対応する前記特有の産物を検出することにより、前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する前記遺伝子産物を特定する工程は、増幅反応を実施すること、および前記遺伝子に対応する特有の増幅産物を検出することを含む、段落９１に記載の方法。
【０１２３】
９６．増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じプロモーターで置き換えられている、段落９２に記載の方法。
【０１２４】
９７．増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、各遺伝子産物が所望のレベルで発現するように選択された複数のプロモーターで置き換えられている、段落９２に記載の方法。
【０１２５】
９８．各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、調節可能なプロモーターを含む、段落９２に記載の方法。
【０１２６】
９９．各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む、段落９２に記載の方法。
【０１２７】
１００．前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、段落９１に記載の方法。
【０１２８】
１０１．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、段落９１に記載の方法。
【０１２９】
１０２．前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む、段落９１に記載の方法。
【０１３０】
１０３．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１３１】
１０４．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに相当する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１３２】
１０５．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１３３】
１０６．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに相当する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過小発現される株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【０１３４】
１０７．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１３５】
１０８．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む株の培養物または収集物から核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１３６】
１０９．前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、段落１０８に記載の方法。
【０１３７】
１１０．前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、段落１０８に記載の方法。
【０１３８】
１１１．増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、段落１０９に記載の方法。
【０１３９】
１１２．前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられ、前記プライマー対中のプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、段落１０８に記載の方法。
【０１４０】
１１３．それぞれの前記遺伝子に関する天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、段落１１１に記載の方法。
【０１４１】
１１４．複数の調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換え、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においた、段落１１１に記載の方法。
【０１４２】
１１５．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４３】
１１６．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４４】
１１７．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４５】
１１８．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４６】
１１９．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４７】
１２０．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドによりその活性が相補され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４８】
１２１．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の培養物または収集物であって、前記化合物と接触させられている第１の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられていない第２の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に対応する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと
を含む方法。
【０１４９】
１２２．前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、段落１２１に記載の方法。
【０１５０】
１２３．前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられており、前記プライマー対中のプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、段落１２１に記載の方法。
【０１５１】
１２４．前記遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、段落１２１に記載の方法。
【０１５２】
１２５．前記１つより多い調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換え、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においた、段落１２１に記載の方法。
【０１５３】
１２６．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用した同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１５４】
１２７．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記第２の株の培養物または収集物は、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用した同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む、比較することを含む方法。
【０１５５】
１２８．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同一のプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む、比較することを含む方法。
【０１５６】
１２９．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株が前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過剰発現される株を含む方法。
【０１５７】
１３０．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記株の培養物または収集物は、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物、から核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株が前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１５８】
１３１．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１５９】
１３２．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増殖反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１６０】
１３３．前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、段落１３２に記載の方法。
【０１６１】
１３４．前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、
前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、段落１３２に記載の方法。
【０１６２】
１３５．増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、段落１３４に記載の方法。
【０１６３】
１３６．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６４】
１３７．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６５】
１３８．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６６】
１３９．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６７】
１４０．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応を実施であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６８】
１４１．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６９】
１４２．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること
を含む方法。
【０１７０】
１４３．前記プライマー対は少なくとも２つの組に分けられ、各プライマー対は識別可能な色素で標識されるプライマーを含み、各プライマー対を標識するのに使用される前記識別可能な色素は、プライマー対の他の組を標識するのに使用される色素と識別可能である、段落１４２に記載の方法。
【０１７１】
１４４．前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、
前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、段落１４２に記載の方法。
【０１７２】
１４５．増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、段落１４４に記載の方法。
【０１７３】
１４６．前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられており、前記プライマー対のうちのプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、段落１４２に記載の方法。
【０１７４】
１４７．前記遺伝子それぞれに関する天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、段落１４６に記載の方法。
【０１７５】
１４８．前記１つより多い調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換えられており、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においている、段落１４６に記載の方法。
【０１７６】
１４９．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識、ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群からの選択に基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１７７】
１５０．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて増幅反応を実施することであって、前記プライマー対の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識、ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計される、実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１０〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１７８】
１５１．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１７９】
１５２．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１８０】
１５３．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、緊縮条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１８１】
１５４．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いてた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現される株を含む方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８２】
本発明は、細胞増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現するか、または細胞増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過小発現する株を含む株の収集物または培養物を利用する（すなわち、培養物中の株の少なくとも幾つかは、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する）。幾つかの実施形態では、本発明は、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する株、および細胞増殖に必要とされる同じ遺伝子産物を過小発現する株の両方を含む株の収集物または培養物を使用する。好ましくは、培養物または収集物中の存在する株はそれぞれ、細胞増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する（すなわち、培養物中の株のすべてが、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する）。各株において過剰発現または過小発現される遺伝子産物は、細胞増殖に必要とされる任意の遺伝子産物であってもよい。遺伝子産物は、核酸またはポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用する場合、「培養物」という用語は、液体成長培地の単一アリコット中で成長する複数の株を指し、「収集物」という用語は、それぞれが液体成長培地の別個のアリコット中で、または固体成長培地上の種々の位置上で成長している複数の株を指す。
【０１８３】
幾つかの実施形態では、望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、細胞増殖に必要とされる複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現し得る。この実施形態では、１つまたは複数の株において過剰発現または過小発現される遺伝子産物は、機能的に関連され得るか、あるいは機能的に非関連であり得る。これは、２つ以上の遺伝子産物が細胞中で類似の機能を共有する場合、あるいは細胞が特定の最終産物をもたらす多数の生化学経路を有する場合、化合物の特定を促進し得る。
【０１８４】
あるいは、過剰発現または過小発現される遺伝子産物が複数の遺伝子を含有するオペロンの一部である遺伝子によりコードされる場合、所望の遺伝子は過剰発現または過小発現され得るが、一方オペロン中の残りの遺伝子は、それらが、細胞の特定の化合物の存在下で成長する能力に影響を与えないレベルで発現される。例えば、所望の遺伝子は、調節可能なプロモーターの制御下に置かれてもよく、転写終結因子は所望の遺伝子の３’に配置されてもよく、プロモーター、好ましくは構成的プロモーターは、転写終結因子の３’およびオペロン中の残りの遺伝子の５’に配置されてもよい。
【０１８５】
幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含み得る。幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも２個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも１０個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも２０個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも３０個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも５０個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも１００個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも３００個の遺伝子産物、あるいは配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される３００個より多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含んでもよく、ここで株の培養物または収集物中の各株は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される単一遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。あるいは、望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現してもよい。
【０１８６】
他の実施形態では、株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含み得る。幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも２個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも１０個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも２０個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも３０個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも５０個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも１００個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも３００個の遺伝子産物、あるいは配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる３００個より多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含んでもよく、ここで株の培養物または収集物中の各株は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸によりコードされる単一遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。あるいは、望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸によりコードされる複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現してもよい。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む。幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも２個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１０個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも２０個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも３０個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも５０個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１００個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも３００個の遺伝子産物、あるいは配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３００個より多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含んでもよく、ここで株の培養物または収集物中の各株は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択される単一遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。あるいは、望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択される１つより多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現してもよい。
【０１８８】
他の実施形態では、株の培養物または収集物は、上記に定義されるような相同コード核酸によりコードされる少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む。望ましい場合、株の培養物または収集物は、相同コード核酸によりコードされる１つより多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現する１つまたは複数の株を含んでもよい。さらなる実施形態では、株の培養物または収集物は、上記に定義される少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い相同ポリペプチドが過剰発現または過小発現される株を含む。望ましい場合、株の培養物または収集物は、１つより多い相同ポリペプチドを過剰発現または過小発現する１つまたは複数の株を含んでもよい。
【０１８９】
例えば、幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される、少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株あるいは株の群を含み、ここで各株は、１つの遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。
【０１９０】
望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現し得る。
【０１９１】
さらなる実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる、少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株あるいは株の群を含み、ここで各株は、１つの遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。
【０１９２】
望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現し得る。
【０１９３】
さらなる実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む、少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株あるいは株の群を含み、ここで各株は、１つの遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。
【０１９４】
望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択される複数のポリペプチドを過剰発現または過小発現し得る。
【０１９５】
本発明の方法は、任意の望ましい細胞または生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定するのに使用され得る。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、細菌、真菌、または原生動物の増殖を阻害する化合物の標的を特定するのに使用される。さらなる実施形態では、本発明の方法は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の成長を阻害する化合物の標的を特定するのに用いられる。
【０１９６】
過剰発現は、当業者が精通している各種技法を用いて得てもよい。例えば、過剰発現は、野生型細胞よりも高レベルの、遺伝子産物をコードするか、または遺伝子産物を含むｍＲＮＡを転写するプロモーターに、遺伝子産物をコードする遺伝子を作動可能に連結することにより得てもよい。様々なプロモーターを用いて、遺伝子産物を過剰発現してもよい。遺伝子産物を過剰発現するのに使用されるプロモーターは、比較的強力なプロモーター、中程度のレベルの活性を保有するプロモーター、または比較的弱いプロモーターであってもよく、構成性プロモーターまたは調節可能なプロモーターであってもよい。幾つかの実施形態では、遺伝子産物の過剰発現の度合いを最適化するために、それぞれが異なる程度に遺伝子産物を過剰発現する幾つかの株を使用してもよい。
【０１９７】
幾つかの実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物それぞれは、様々なレベルで遺伝子産物を発現する幾つかの異なる株を創出するために、様々な強度の幾つか異なるプロモーターの制御下に置かれてもよい。株それぞれの遺伝子産物の発現レベルは、野生型細胞に対して所望のレベルの発現（すなわち、所望のレベルの過剰発現または過小発現）を提供するプロモーターを特定するために、野生型細胞の発現レベルと比較される。続いて、所望の発現レベルを有する株は、以下に記載するように試験化合物と接触させるべき株の培養物または収集物中に含まれる。
【０１９８】
プロモーターは、遺伝子産物が発現される細胞型において活性であるように選択される。例えば、哺乳類細胞における遺伝子産物の過剰発現に関して、遺伝子産物をコードする遺伝子は、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオニンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｔｅｔＰプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、または当業者に既知の他のプロモーターのようなプロモーターに作動可能に連結され得る。酵母では、遺伝子産物をコードする遺伝子は、ＣＹＣ１、ＡＤＨＩ、ＡＤＨＩＩ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＰＨＯ５、ＰＧＫ、または当該技術分野で使用される他のプロモーターのようなプロモーターに作動可能に連結され得る。同様に、細菌では、遺伝子産物をコードする遺伝子は、ＳＰ６、Ｔ３、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、温度調節λプロモーター、バシラスａｐｒＥおよびｎｐｒＥプロモーター（米国特許第５，３８７，５２１号）、バクテリオファージλＰLおよびＰRプロモーター(Renaut, et al., (1981) Gene 15:81)、ｔｒｐプロモーター(Russell, et al., (1982) Gene 20:23)、ｔａｃプロモーター(de Boer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21)、B. サブチリス(B. subtilis)アルカリプロテアーゼプロモーター（Stahl et al, (1984) J. Bacteriol. 158, 411-418)、B. サブチリス (Yang et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11, 237-249)またはＢ．アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)(Tarkinen, et al, (1983) J. Biol. Chem. 258, 1007-1013)のαアミラーゼプロモーター、B. サブチリス由来の中性プロテアーゼプロモーター(Yang et al, (1984) J. Bacteriol. 160, 15-21)、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター(Studier and Moffatt (1986) J Mol Biol. 189 (1):113-30)、バシラス属において活性なB. サブチリスｘｙｌプロモーターまたは突然変異ｔｅｔＲプロモーター(Geissendorfer & Hillen (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:657-663)、スタフィロコッカスエンテロトキシンＤプロモーター(Zhang and Stewart (2000) J. Bacteriol. 182 (8)2321-5)、スタフィロコッカス・アウレウス由来のｃａｐ８オペロンプロモーター(Ouyang et al., (1999) J. Bacteriol. 181(8):2492-500)、ラクトコッカス(lactococcal)ｎｉｓＡプロモーター(Eichenbaum (1998) Appl Environ Microbiol. 64(8):2763-9)、アコレプラスマ・ライドラウィイ(Acholeplasma laidlawii)由来のプロモーター(Jarhede et al., (1995) Microbiology 141 (Pt 9): 2071-9)、ネイセリア・メニンジチジスのｐｏｒＡプロモーター(Sawaya et al., (1999) Gene 233:49-57)、ネイセリア・ゴナホエアのｆｂｐプロモーター(Forng et al., (1997) J. Bacteriol. 179:3047-3052)、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素遺伝子プロモーター(Schmitt and Holmes (1994) J. Bacteriol. 176(4):1141-9)、Ａ群ストレプトコッカス属(Streptococci)由来のｈａｓＡプロモーター(Alberti et al., (1998) Mol Microbiol 28(2):343-53)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のｒｐｏＳプロモーター(Kojic and Venturi (2001) J. Bacteriol. 183:3712-3720)、およびｐＬＵＥＸ５ＢＡにおけるＩＰＴＧ誘導プロモーター(Krause et al., J. Mol. Biol. 274:365 (1997)に作動可能に連結され得る。スタフィロコッカス・アウレウスで有用であり得る別の実施形態では、プロモーターは、スタフィロコッカス・アウレウスのｘｙｌＡプロモーター由来のｘｙｌＯオペレータに融合させた改変Ｔ５プロモーターを含む、新規誘導プロモーター系であるＸｙｌＴ５である。このプロモーターは、米国特許出願第１０／０３２，３��３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。別の実施形態では、プロモーターは、ｌａｃＯ２成分誘導プロモーター系であってもよく、ここではＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が染色体上に組み込まれ、かつｌａｃＵＶ５／ｌａｃＯにより調節され（Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111:35-41、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＴ７  遺伝子１０プロモーターがｌａｃＯオペレータと融合される。他の実施形態では、プロモーターは、米国特許出願第１０／０３２，３９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される、Ｅ．フェカリスにおいて機能的なキシロース誘導プロモーターを保有する、プラスミドｐＥＰＥＦ３またはｐＥＰＥＦ１４由来のプロモーターであってもよい。使用してもよい他のプロモーターは、当業者が精通しているものである。真菌では、遺伝子産物をコードする遺伝子は、ＣａＡＣＴ１プロモーター（Morschhauser, Mol. Gen. Genet. 257:412-420 (1998)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるテトラサイクリン調節可能なプロモーター、または２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるプロモーター、あるいは当業者が精通している他のプロモーターに作動可能に連結され得る。生物およびプロモーターの他の組合せも本発明で使用され得ることが理解されよう。
【０１９９】
幾つかの実施形態では、過剰発現は、増殖に必要とされる遺伝子の発現を駆動する天然プロモーターを、調節可能なプロモーターで置き換えるための相同組換えを用いることで達成され得る。例えば、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法は、調節可能なプロモーターの制御下に増殖に必要とされる遺伝子を配置させるのに使用され得る。２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／８１５，２４２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／４９２，７０９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／７１１，１６４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および米国特許出願第０９／７４１，６６９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）は、本発明の方法のいずれかで使用され得る増殖に必要とされる遺伝子および遺伝子産物を開示している。
【０２００】
簡潔に言えば、これらの方法の幾つかの実施形態では、細胞は、細菌細胞のような一倍体細胞であってもよい。天然プロモーターに対して相同性を有するヌクレオチド配列が隣接した調節可能なプロモーターを含む線状プロモーター置き換えカセットは細胞に導入される。幾つかの実施形態では、このカセットはまた、選択マーカーまたは発現が容易に特定されるマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。カセットは、米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、二本鎖核酸または一本鎖核酸であってもよい。相同組換え時に、天然プロモーターは調節可能なプロモーターと置き換えられ、増殖に必要とされる遺伝子は調節可能なプロモーターの制御下に置かれる。増殖に必要とされる遺伝子が、調節可能なプロモーターの制御下にある株を、調節可能なプロモーターが野生型細胞におけるレベル以上の増殖に必要な遺伝子産物レベルを提供する条件下で成長させる。例えば、株は、調節可能なプロモーターから発現を誘導する誘導物質の存在下で、あるいは調節可能なプロモーターに対するレプレッサの作用を減少または排除する条件下で成長させてもよい。
【０２０１】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の自然プロモーターそれぞれを、単一の所望の置き換えプロモーターで置き換えるのではなく、過剰発現または過小発現されるべき遺伝子産物に関して所望の発現レベルを提供する複数の置き換えプロモーターが使用される。この方法は、単一の置き換えプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的な単一標識プライマーを使用するのではなく、複数の置き換えプロモーター中の適切なヌクレオチド配列に相補的な複数の標識プライマーを使用する以外は上記に記載するように実施される。
【０２０２】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子産物のレベルまたは活性が、かかる遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部に相補的なアンチセンス核酸を転写することで低減される実施形態では、アンチセンス核酸をコードするヌクレオチド配列の長さが各遺伝子に関して異なるように株を設計してもよい。増幅反応は、その結果各遺伝子に相当する増幅産物が、特有の長さ、または同じ長さの他の増幅産物と識別され得る色素を有するように、アンチセンス核酸をコードする遺伝子の各末端にあるプライマーを用いて上述のように実施される。あるいは、アンチセンス核酸をコードするヌクレオチド配列の長さは、各遺伝子に関して特有でない場合があるが、増幅反応に使用されるプライマーは、各遺伝子に相当する増幅産物の長さが特有であるように選択され得る。
【０２０３】
別の実施形態では、自然プロモーターを、株の培養物または収集物中の株において、他の組換えプロモーターに存在するヌクレオチド配列と異なる特有のヌクレオチド配列を内部にまたは隣接して含むプロモーターで置き換えてもよい。この実施形態では、各プロモーターは、株の培養物または収集物においてより迅速にあるいはよりゆっくりと増殖する株を特定するのに使用され得る特有の「タグ」を、該プロモーターに隣接して含むか、または有する。タグは、上述の各増殖に必要な遺伝子に関して特有の大きさを有する増幅産物を生成する増幅方法を含む、ハイブリダイゼーションベースの方法または増幅ベースの方法を用いて検出され得る。
【０２０４】
あるいは、増幅に必要とされる遺伝子の転写を誘導する自然プロモーターを、調節要素がプロモーターからの転写レベルを調節するように、相同組換えにより細胞の染色体に調節要素を挿入することで調節可能とさせてもよい。調節要素は、レプレッサ（例えば、ｌａｃ、ｔｅｔ、ａｒａＢＡＤレプレッサ）により認識されるオペレータ、または転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列であってもよい。幾つかの実施形態では、調節要素は、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、または上流活性化配列であってもよい。自然プロモーターに対して相同性を有するヌクレオチド配列が隣接した調節要素を含む線状調節要素挿入カセットを細胞に導入してもよい。幾つかの実施形態では、このカセットはまた、選択マーカーまたは発現が容易に特定されるマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。カセットは、米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、二本鎖核酸または一本鎖核酸であってもよい。相同組換え時に、調節要素は染色体に導入され、増殖に必要とされる遺伝子は調節要素の制御下に置かれる。増殖に必要とされる遺伝子が調節要素の制御下にある株を、調節可能なプロモーターが野生型細胞におけるレベル以上の増殖に必要な遺伝子産物レベルを提供する条件下で成長させる。例えば、株は、プロモーターから発現を誘導する誘導物質の存在下で、あるいはプロモーターに対するレプレッサの作用を減少または排除する条件下で成長させてもよい。各増殖に必要な遺伝子に関して特有の大きさを有する増幅産物を生成する増幅方法を用いて、株の培養物または収集物において過剰表現（overrepresent）または過小表現（underrepresent）される株を検出してもよいことは理解されよう。例えば、望ましい場合、調節要素内のヌクレオチド配列に相補的なプライマーを増幅反応に使用してもよい。
【０２０５】
プロモーター置き換えカセットまたは調節要素挿入カセットは、ＰＣＲまたは他の増幅方法により生成されるアンプリコンのような二本鎖核酸、またはオリゴヌクレオチドのような一本鎖核酸であってもよい。例えば、一本鎖核酸は、Ellis et al., PNAS 98:6742-6746, 2001（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて染色体に導入され得る。
【０２０６】
幾つかの実施形態では、プロモーター置き換えカセットまたは調節要素挿入カセットが導入される細胞は、増大した組換え頻度を有する。例えば、細胞は、染色体に挿入されるＤＮＡを通常分解する１つまたは複数のエキソヌクレアーゼを欠如し得るか、またはそのレベルまたは活性が低減され得る。さらなる実施形態では、細胞は、エキソヌクレアーゼを欠如し得るか、またはそのレベルが低減され得て、かつ相同組換えの媒介に関与するタンパク質を発現または過剰発現する。例えば、上記方法がエシェリヒア・コリまたは他の腸内原核生物で実施される場合、直鎖状核酸を分解するＲｅｃＢＣＤ組換え経路のエキソヌクレアーゼＶの活性が低減または排除された細胞（例えば、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＣ、またはｒｅｃＤ突然変異体）を使用してもよい。幾つかの実施形態では、細胞は、相同組換えの頻度を高める１つより多いｒｅｃＢ、ｒｅｃＣ、およびｒｅｃＤ遺伝子における突然変異を有する。例えば、細胞は、ｒｅｃＢおよびｒｅｃＣ遺伝子の両方に突然変異を有し得る。
【０２０７】
プロモーター置き換えまたは調節要素挿入方法はまた、ｓｂｃＡ突然変異を保有する細胞のような、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥＴレコンビナーゼ系の活性が活性化されたエシェリヒア・コリ細胞で実施されてもよい。ｒａｃプロファージのＲｅｃＥ遺伝子がＥｘｏＶＩＩＩ  ５’−３’エキソヌクレアーゼをコードする一方で、ＲａｃプロファージのＲｅｃＴ遺伝子は、再生およびＤ−ループ形成を促進する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質をコードする。したがって、ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴの遺伝子産物または類似の機能を有するタンパク質は、相同組換えを促進する。ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴ遺伝子は同じオペロンに存在するが、通常発現されない。しかしながら、ｓｂｃＡ突然変異体は、ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴ遺伝子の発現を活性化する。幾つかの実施形態では、上記方法は、ｒｅｃＢおよびｒｅｃＣ遺伝子における突然変異ならびにｓｂｃＡ突然変異を保有する細胞で実施されてもよい。ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴ遺伝子は構成的または条件的に発現され得る。例えば、上記方法は、ｓｂｃＡ２３、ｒｅｃＢ２１、およびｒｅｃＣ２２突然変異を保有するエシェリヒア・コリ株ＪＣ８６７９で実施されてもよい。
【０２０８】
幾つかの実施形態では、上記方法は、ｓｂｃＢ突然変異を保有する細胞のような、ＲｅｃＦ経路を介した組換えが増強されたエシェリヒア・コリ細胞で実施されてもよい。
【０２０９】
ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴ遺伝子産物、または類似の機能を有するタンパク質は、エシェリヒア・コリ以外の原核生物で条件的または構成的に発現され得ることが理解されよう。幾つかの実施形態では、これらのタンパク質は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスにおいて条件的にあるいは構成的に発現され得る。例えば、これらの遺伝子産物をコードするプラスミドを生物に導入してもよい。望ましい場合、これらの遺伝子産物をコードするコード配列は、これらの遺伝子産物が発現される生物のコドン選択を反映するように最適化され得る。同様に、幾つかの実施形態では、生物は、相同組換えの頻度を高めるｒｅｃＢ、ｒｅｃＣ、ｒｅｃＤ、ｓｂｃＡ、またはｓｂｃＢ突然変異に類似した突然変異を含有してもよい。
【０２１０】
さらなる実施形態では、プロモーター置き換えまたは調節要素挿入方法は、バクテリオファージラムダ（λ）のＲｅｄ系、または相同組換えの頻度を高めるための他のファージ由来の類似の系を利用する細胞で行ってもよい。Ｒｅｄ系は、３つの遺伝子、すなわちγ、β、およびｅｘｏ（これらの産物は、Ｇａｍ、Ｂｅｔ、およびＥｘｏタンパク質である）を含有する（Ellis et al. PNAS 98:6742-6746, 2001、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。Ｇａｍタンパク質は、ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼＶを阻害し、したがってＢｅｔａおよびＥｘｏが、組み込まれるＤＮＡの末端に接近することが可能となり、相同組換えを促進する。Ｂｅｔａタンパク質は、相補的一本鎖核酸への一本鎖核酸のアニーリングを促進し、かつ鎖交換を媒介する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。Ｅｘｏタンパク質は、組換えの基質として作用することができる３’オーバーハングを残す二本鎖ＤＮＡ依存性５’−３’エキソヌクレアーゼである。したがって、λｒｅｄタンパク質または類似の機能を有するタンパク質の構成的または条件的発現は相同組換えを促進する。
【０２１１】
λ  Ｂｅｔａ、ＧａｍおよびＥｘｏタンパク質、または類似の機能を有するタンパク質は、エシェリヒア・コリ以外の原核生物で構成的または条件的に発現され得ることが理解されよう。幾つかの実施形態では、これらのタンパク質は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスにおいて条件的または構成的に発現され得る。例えば、これらの遺伝子産物をコードするプラスミドを生物に導入してもよい。望ましい場合、これらの遺伝子産物をコードするコード配列は、これらの遺伝子産物が発現される生物のコドン選択を反映するように最適化され得る。
【０２１２】
幾つかの実施形態では、細胞は、１つより多い上述の特性の結果として、相同組換えの増加した頻度を有し得る。幾つかの実施形態では、増大した組換え頻度は、細胞を成長させる培養条件に依存する細胞の条件特性であってもよい。例えば、幾つかの実施形態では、λ  Ｒｅｄ  Ｇａｍ、Ｅｘｏ、およびＢｅｔａタンパク質、またはｒｅｃＥおよびｒｅｃＴタンパク質の発現は調節され得る。したがって、細胞は、上述の特性の任意の組合せの結果として、相同組換えの増加した頻度を有し得る。例えば、幾つかの実施形態では、細胞は、ｓｂｃＡおよびｒｅｃＢＣ突然変異を保有してもよい。
【０２１３】
幾つかの実施形態では、生物の染色体に挿入されるべき直鎖状二本鎖ＤＮＡは、上述するように、ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴ、またはλ  Ｂｅｔａ、ＧａｍおよびＥｘｏタンパク質、あるいは類似の機能を有するタンパク質を構成的または条件的に発現する生物に導入される。幾つかの実施形態では、生物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスであり得る。幾つかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、ｒｅｃＢＣおよびｓｂｃＡ突然変異または類似の突然変異を有する生物に導入されてもよい。
【０２１４】
他の実施形態では、生物の染色体に挿入されるべき一本鎖ＤＮＡは、λ  Ｂｅｔａタンパク質、または類似の機能を有するタンパク質を発現する生物に導入される。幾つかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、λ  Ｂｅｔａタンパク質およびＧａｍタンパク質の両方、または類似の機能を有するタンパク質を発現する生物に導入される。さらなる実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、λ  Ｂｅｔａ、ＧａｍおよびＥｘｏタンパク質、または類似の機能を有するタンパク質を発現する生物に導入される。λタンパク質または類似のタンパク質は、構成的または条件的に発現され得る。幾つかの実施形態では、生物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスであり得る。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、直鎖状核酸は、相同組換えの増大した頻度を有する第１の生物の染色体に挿入され、続いて本方法を直接適用しにくい第２の生物に移入されてもよい。例えば、直鎖状核酸をエシェリヒア・コリの染色体に挿入し、続いて接合または形質導入により第２の生物に移入してもよい。第２の生物に導入した後、核酸は、相同組換えにより第２の生物の染色体に導入され、それにより第１の生物の染色体から、第２の生物の染色体において相当する位置へ、調節要素を効率的に移入する。
【０２１６】
他の実施形態では、細胞は真菌細胞のような二倍体細胞であってもよい。幾つかの実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子のコピーの１つを崩壊させてもよく、この遺伝子を不活性にする。さらなる実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子のコピーの１つを崩壊させてもよく、また増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子の他のコピーを調節可能なプロモーターの制御下に置いてもよい。かかる株は、それぞれの側に崩壊されるべき標的配列に相同的な核酸が隣接した発現可能な優性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む崩壊カセットを用いて、相同組換えにより増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子の第１のコピーを崩壊することで生成され得る。増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子の第２のコピーは、それぞれの側に増殖に必要な遺伝子用の天然プロモーターに相同的な核酸が隣接した調節可能なプロモーターを含むプロモーター組換えカセットを用いて、相同組換えにより調節可能なプロモーターの制御下に置かれ得る。プロモーター組換えカセットはまた、調節可能なプロモーターの５’に位置するが、天然プロモーターに相同的な核酸との間にある選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０２１７】
他の実施形態では、過剰発現は、ベクターにおいて所望のプロモーターに、増殖に必要とされる遺伝子を作動可能に連結することにより達成され得る。ベクターは、染色体外で複製するベクター、または染色体に組み込まれるベクターであってもよい。例えば、ベクターが細菌細胞で使用される場合、ベクターはｐＢＲ３２２ベースのベクターまたはＰ１もしくはλのようなバクテリオファージベースのベクターであってもよい。ベクターがサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)で使用される場合、ベクターは、２ミクロンサークルに基づいたベクター、または酵母染色体の複製起点を組み込んだベクターであってもよい。ベクターが哺乳類細胞で使用される場合、ベクターは、レトロウイルスベクター、ＳＶ４０ベースのベクター、ウシパピローマウイルスに基づいたベクター、アデノウイルスに基づいたベクター、またはアデノ随伴ウイルスに基づいたベクターであってもよい。ベクターがカンジダ・アルビカンスで使用される場合、ベクターは、ＣａＰＣＫ１、ＭＥＴ２５、ＭＡＬ２、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１、１０、ＳＴＥ２、またはＳＴＥ３プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含むベクターであってもよい。幾つかの実施形態では、以下の刊行物（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるベクターを使用してもよい：ＣＩｐ１０（カンジダ・アルビカンス用の効率的かつ利便性の高い組み込みベクター）(Murad et al., Yeast 16(4):325-7 (2000)；形質転換用ベクターｐＣＰＷ７(Kvaal et al., : Infect Immun 67(12):6652-62 (1999)；形質転換用ベクターｐＣＷＯＰ１６(Kvaal et al., : Infect Immun 65(11):4668-75 (1997)；株ＣＡ９のヒスチジン栄養要求性の補完によりＣａで直接クローニングするのに使用されるべき二重ＡＲＳベクターであるｐＲＭ１(Pla et al., Gene 165(1):115-20 (1995)；カンジダ・アルビカンスの形質転換用に開発されたものであり、ＡＤＥ２遺伝子マーカーおよび自己複製を促進するカンジダ属自己複製配列（ＣＡＲＳ）要素を保有するｐＭＫ１６（Sanglard and Fiechter Yeast 8 (12):1065-75 (1992)；エシェリヒア・コリ、サッカロミセス・セレビシエおよびカンジダ・アルビカンスで自己複製するプラスミドベクター（ｐＲＣ２３１２で示す）が構築された（このプラスミドは、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、およびカンジダ・アルビカンス由来の自己複製配列（ＡＲＳ）を含有する）(Cannon et al., Mol Gen Genet 235 (2-3):453-7 (1992)；対象の遺伝子がＣａＭＡＬ２マルターゼプロモーターの制御下に存在することができ、かつＣａＲＰ１０遺伝子座に安定に組み込まれ得る、カンジダ・アルビカンスで使用するための発現ベクター（ＣＩｐ１０−ＭＬＡ２ｐ）が構築された(Backen et al., Yeast 16 (12) 1121-9 (2000))；（Volker, R. S., A. Sonneborn, C.E. Leuker, and J.F. Ernst. 1997. Efg1p、ヒト病原体カンジダ・アルビカンスの形態形成の必須調節因子は真菌で形態形成プロセスを調節するｂＨＬＨタンパク質の保存種類の成員である(EMBO 16:1982-1991)、およびカンジダ・アルビカンスＵＲＡ３遺伝子、カンジダ属ＡＲＳ配列、および複製起点を含有するサッカロミセス・セレビシエ２ミクロンサークルの一部を含有するカンジダ・アルビカンス形質転換ベクターが構築された(Goshorn et al., Infect Immun 60(3):876-84 (1992)）。上述の生物または本発明が実施される任意の他の生物で使用するのに適した様々な他のベクターは当業者に精通している。
【０２１８】
遺伝子産物の過小発現は様々な方法で得られ得る。例えば、一実施形態では、遺伝子産物の過小発現は、細胞内の遺伝子産物のレベルまたは活性を低減する作用物質を提供することで達成され得る。一実施形態では、作用物質は、遺伝子産物をコードする核酸に相補的であるか、または遺伝子産物をコードする核酸の一部に相補的であるアンチセンス核酸を含み得る。例えば、アンチセンス核酸をコードする核酸は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結させてもよい。転写の誘導物質または転写の抑制を緩和する作用物質を含有する培地のような適切な条件下で成長させると、アンチセンス核酸が細胞で発現され、それにより細胞内の遺伝子産物のレベルまたは活性が低減される。幾つかの実施形態では、転写の誘導物質または転写の抑制を緩和する作用物質の濃度は、最適な結果を提供するように変更させてもよい。かかる方法は、米国特許出願第０９／８１５，２４２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／４９２，７０９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／７１１，１６４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／７４１，６６９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、または２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。前文中に引用した特許出願はそれぞれ、本発明の方法のいずれかで使用され得る増殖に必要とされる遺伝子および遺伝子産物を開示している。
【０２１９】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子産物の過小発現は、遺伝子産物が過剰発現される方法に関して上述した方法のような方法を用いて遺伝子産物の発現が構成的または調節可能なプロモーターの制御下にある株を構築することにより達成され得る。遺伝子産物を過小発現する細胞を提供するために、遺伝子産物の発現が野生型細胞のレベル未満のレベルで発現される条件下で細胞を成長させる。例えば、レプレッサが調節可能なプロモーターからの転写のレベルを減少させる条件下で細胞を成長させてもよい。
【０２２０】
他の実施形態では、過小発現は、増殖に必要とされる遺伝子産物が過剰発現される実施形態に関して上述したように、ベクターにおいて所望のプロモーターに、増殖に必要とされる遺伝子を作動可能に連結させることにより達成され得る。幾つかの実施形態では、ベクターは、遺伝子の染色体コピー（単数または複数）を崩壊させた細胞中に存在してもよい。
【０２２１】
増殖に必要とされる遺伝子産物は、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／８１５，２４２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／４９２，７０９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／７１１，１６４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および米国特許出願第０９／７４１，６６９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法を含む様々な方法を用いて特定され得る。前文に列挙した出願に開示される増殖に必要な遺伝子および遺伝子産物はそれぞれ本発明の方法のいずれかに使用され得る。簡潔に述べると、一実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物は、ベクターにおいて調節可能なプロモーターに、ランダムゲノム断片を作動可能に連結することにより特定される。ランダムゲノム断片は、制限酵素による部分的消化、超音波処理および噴霧(nebulization)のような技法を用いた機械的せん断、またはＤＮアーゼＩ消化により生成され得る。適切な作用物質を用いてプロモーターからの転写を誘導すると、発現ベクターは、挿入ゲノム断片に相当するＲＮＡ分子を産生する。挿入ゲノム断片がプロモーターに関してアンチセンス方向にある場合では、産生される転写物は遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、その結果転写物は様々な遺伝子から産生されるセンスｍＲＮＡと相互作用し、それによりセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率またはレベルを減少させ、したがってこれらのセンスｍＲＮＡ分子によりコードされるタンパク質の産生を減少させる。センスｍＲＮＡが増殖に必要とされるタンパク質をコードする場合では、誘導性条件下で成長させた細胞は、成長することができないか、または実質的に減少した速度で成長する。さらに、産生される転写物が非翻訳ＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、非翻訳ＲＮＡが増殖に必要とされる場合では、誘導性条件下で成長させた細胞はまた、成長することができないか、または実質的に減少した速度で成長する。対照的に、非誘導性条件下で成長させた細胞は正常な速度で成長する。続いて、アンチセンス核酸が相補的である遺伝子が特定され、本発明の方法で利用される。
【０２２２】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子は、上述のように、増殖に必要な遺伝子用の天然プロモーターを、調節可能なプロモーターで置き換えることにより特定され得る。プロモーターが活性であるか、または抑制されていない条件下でのかかる株の成長を、プロモーターが不活性であるか、または抑制されている条件下での成長と比較する。株が、プロモーターが不活性であるか、または抑制されている条件下では成長することができないか、または実質的に減少した速度で成長するが、プロモーターが活性であるか、または抑制されていない条件下で正常に成長する場合、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される遺伝子は、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする。例えば、プロモーター置き換えを用いて特定される増殖に必要な遺伝子および遺伝子産物は、米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。前文に列挙した出願に記載される遺伝子および遺伝子産物はそれぞれ、本発明の方法のいずれかで使用され得る。
【０２２３】
本発明は、生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法を包含する。この方法は、生物の株の混合物を含む培養物を使用する。培養物中の株の少なくとも幾つかは、生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現する。好ましくは、培養物中の株のそれぞれが、生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現する（すなわち、培養物中の株はすべて、生物の増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する）。かかる株は、上述の方法を用いて得られ得る。培養物は、任意数の株を含んでもよい。例えば、培養物は、少なくとも２個の株、少なくとも１０個の株、少なくとも２０個の株、少なくとも３０個の株、少なくとも５０個の株、少なくとも１００個の株、少なくとも３００個の株、または３００個より多い株を含んでもよい。幾つかの実施形態では、培養物は、概して生物の増殖に必要とされる遺伝子産物のすべてまたはほとんどを過剰発現する株を含んでもよい。
【０２２４】
培養物を、生物の増殖を阻害する化合物と接触させる。化合物は、任意の供給源から得られる候補薬剤化合物であってもよい。例えば、化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いて生成される化合物、天然産物ライブラリーからの化合物、または不純なもしくは不完全な精製化合物（例えば、不完全に精製した天然抽出物中の化合物）であってもよい。培養物を、化合物が作用する遺伝子産物を過剰発現しない培養物中の生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の化合物と接触させて、その結果、化合物が作用する上記遺伝子産物を過剰発現する株は、上記化合物が作用する上記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に培養物中で増殖する。したがって、十分な期間後に、化合物が作用する遺伝子産物を過剰発現する株は、化合物が作用する遺伝子産物を過剰発現しない株よりも培養物中で優勢である。好ましい実施形態では、成長条件およびインキュベーション期間は、唯一の株、すなわち化合物の標的を過剰発現する株が培養物から回収されるように選択される。したがって、一実施形態では、それぞれが種々の増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する複数の株を含有する複数の培養物を、様々な濃度の化合物の存在下で成長させてもよい。化合物濃度を変更させるほかに、増殖に必要な遺伝子産物の発現が調節可能なプロモーターの制御下にある実施形態では、複数の培養物を、プロモーターからの転写に対するレプレッサの影響を低減する誘導物質または作用物質のような、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質の様々な濃度で成長させてもよい。培養物は、その標的が特定される化合物の存在下で（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質の存在下で）液体培地中で成長させてもよく、あるいは増殖に必要な遺伝子発現を過剰発現する株を含む液体培養物は、その標的が特定される化合物の非存在下で成長させた後、化合物を含有する（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質も含有する）固体培地上に導入してもよいことが理解されよう。
【０２２５】
化合物の標的である過剰発現される遺伝子産物の特定は、様々な方法を用いてなされ得る。例えば、幾つかの実施形態では、化合物と接触させた株の培養物または収集物中に存在する核酸を、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物中に存在する核酸と比較して、株の対照培養物または収集物に対して、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物において過剰表現される核酸を特定してもよい。あるいは、幾つかの実施形態では、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物中の存在する核酸を分析して、株の対照培養物または収集物と比較することなく、存在する核酸を特定してもよい。
【０２２６】
本発明の幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物においてより迅速に増殖した株、すなわち株の培養物または収集物における他の株に対して、試験化合物の存在下で増殖する能力が高い株は以下のように特定される。過剰発現される遺伝子それぞれと相関し、互いに識別可能な増幅産物は、試験化合物の存在下で成長させた培養物または収集物から得られる。増幅産物は、特定の増幅産物が株の培養物または収集物において過剰表現されるかどうかを決定するために、互いに識別される。幾つかの実施形態では、遺伝子産物それぞれに相当する増幅産物は、増幅産物が互いに識別され得る長さを有する。別の実施形態では、１つまたは複数の増幅産物は、類似のまたは同一の長さを有するが、増幅産物に結合された色素のような検出可能な作用物質に基づいて互いに識別可能である。幾つかの実施形態では、過剰表現される増幅産物は、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物からの増幅産物を、試験化合物と接触させなかった株の培養物または収集物からの増幅産物と比較することにより特定される。あるいは、過剰表現される増幅産物は、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる増幅産物を単に特定することにより特定されてもよい（例えば、たった１つの株または数個の株が試験化合物の存在下で増殖され得る）。識別可能な増幅産物を生成する上記方法は、試験化合物の存在下でより迅速にまたはよりゆっくりと増殖する株の特定を容易とするために、本明細書中に記載の増幅に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する株を生成する方法のいずれかと併用してもよい。
【０２２７】
例えば、本発明の幾つかの実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの自然プロモーターそれぞれを、単一の所望の置き換えプロモーターで置き換えてもよい。プロモーターが置き換えられた株を含有する株の培養物または収集物を試験化合物の存在下で所望の期間成長させた後、増幅反応は、以下の通りに培養物から得られる核酸で実施される。
【０２２８】
株の培養物または収集物からの核酸を、望ましい場合に少なくとも２分割量に分割してもよい。好ましい実施形態では、株の培養物または収集物からの核酸は、４分割量に分割される。置換えプロモーター内の、増殖に必要な遺伝子内の、またはプロモーターもしくは増殖に必要な遺伝子に隣接した核酸配列内のヌクレオチド配列に相補的な単一プライマーは、少なくとも２つの部分（核酸の各分割量に対して１つの部分）に分割される。プライマーの各部分は、別個の検出可能な色素、例えばApplied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な６ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＮＥＤ（商標）、およびＰＥＴ（商標）色素で標識される。例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能なＤＳ−３１またはＤＳ−３３色素の組を用いて、プライマーを標識してもよい。あるいは、Amersham Biosciencesから入手可能なＨＥＸ（商標）、ＮＥＤ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、およびＴＥＴ（商標）色素を使用してもよい。したがって、培養物からの核酸が分割量に分割される場合、単一色素で標識した単一プライマーを使用してもよい。培養物からの核酸が分割量に分割される場合、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または４個より多い、識別可能な色素で標識されたプライマーを使用してもよい。標識プライマーの部分それぞれは、株の培養物または収集物からの核酸の分割量のそれぞれに添加され、その結果核酸の各分割量は、プライマー上に単一の検出可能な色素を有する単一標識プライマーを受け取る。幾つかの実施形態では、プライマーは、３つの部分、４つの部分、または４つより多い部分に分割され、各部分は、その部分上に、他の部分上の色素と識別可能な色素を有する。
【０２２９】
核酸の分割量それぞれはまた、プロモーター内の、置き換えプロモーターの制御下に置かれた増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の１つに特有なヌクレオチド配列内の、またはプロモーターもしくは増殖に必要な遺伝子に隣接したヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列に相補的である非標識プライマーそれぞれを有する非標識プライマー組を受け取る。分割量はそれぞれ、置き換えプロモーターの制御下に置かれた１／Ｎ増殖に必要な遺伝子に特有なプライマー（ここでＮは分割量の数である）を受け取る（すなわち、株の培養物または収集物が、増殖に必要とされる遺伝子が置き換えプロモーターの制御下に置かれ、４分割量に分割される１００個の株から構成された場合、株の培養物または収集物からの核酸の４分割量それぞれは、２５個の遺伝子に相補的なプライマーを受け取る）。非標識プライマーは、それぞれが、他の非標識プライマーにより産生される増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように選択される。好ましくは、増幅産物は、約１００〜約４００ヌクレオチド長であるが、互いに識別され得る任意の長さを使用してもよい。さらに、実施形態の幾つかでは、増幅産物の幾つかは同一のまたは非常に類似した長さを有し得るが、識別可能な色素による標識におり、互いに識別可能であり得る。
【０２３０】
核酸増幅反応は、核酸分割量それぞれで行われる。次に、増幅産物を長さで分離して、株の培養物または収集物において表現が増加した増幅産物（すなわち、株の培養物または収集物においてより迅速に増殖した細胞に由来する増幅産物）を特定する。次に、増幅産物を相当する遺伝子と相関させて、どの株が株の培養物または収集物においてより迅速に増殖したかを決定する。望ましい場合、化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる増幅産物を、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物から得られる増幅産物と比較することにより、培養物において表現が増加した増幅産物を特定してもよい。あるいは、望ましい場合、化合物と接触させなかった対照培養物と比較することなく、化合物と接触させた培養物から得られる増幅産物を直接特定してもよい。
【０２３１】
例えば、幾つかの実施形態では、核酸アリコットそれぞれからの増幅産物をプールし、キャピラリー電気泳動にかける。増幅産物は、増幅産物に結合された蛍光色素を検出することで検出され、それらの長さを決定して、株の培養物または収集物において表現が増加または減少した増幅産物を特定する。図１Ａおよび図１Ｂはこの方法の一実施形態を示し、ここでは増殖に必要とされる遺伝子を過小発現する複数の株を含む培養物で実施された増幅反応からの増幅産物の非存在が、欠如した増幅産物に相当する遺伝子に対して試験化合物が作用することを示す。この方法はまた、試験化合物が相当する遺伝子に作用したために、増殖に必要とされる遺伝子を過剰発現する株の培養物または収集物で実施される増幅反応で過剰表現される増幅産物を特定するのにも使用され得ることは理解されよう。
【０２３２】
あるいは、別の実施形態では、第１の増幅反応は、過剰発現される遺伝子のすべての上流または下流に存在するヌクレオチド配列に相補的な第１のプライマー（例えば、過剰発現される遺伝子すべての上流にある置き換えプロモーター中のヌクレオチド配列の相補的なプライマー）、および株それぞれに特有なヌクレオチド配列に相補的なプライマー（例えば、増殖に必要な遺伝子それぞれ内のヌクレオチド配列に相補的なプライマー）組を用いて、化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる核酸で実施される。増殖に必要な遺伝子ぞれぞれのための２つの増幅プライマーのうちの１つは、上述のように色素で標識される。好ましくは、過剰発現される遺伝子すべての上流または下流のヌクレオチド配列に相補的な共通プライマーが色素で標識される。増幅反応で使用されるプライマーは、増殖に必要な遺伝子それぞれに相当する増幅産物が、特有の長さ、または同じ長さの他の増幅産物と識別することが可能な色素を有するように設計される。第２の増幅反応は、第１の増幅反応の場合と同じプライマーを用いて、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物で行われる。第１の増幅反応からの増幅産物を第２の増幅反応からの増幅産物と比較して、株の培養物または収集物で過剰表現される１つまたは複数の増幅産物を特定する。例えば、第１の増幅反応からの増幅産物は、第２の増幅反応からの増幅産物とは別個のポリアクリルアミドゲルのレーン、またはそれと別個のキャピラリーに流してもよく、２つのレーンまたはキャピラリーを互いに比較する。望ましい場合、第１の増幅反応からの増幅産物が第２の増幅反応からの増幅産物と異なるレーンまたはキャピラリーに流される実施形態では、同じ色素を用いて、第１の増幅反応および第２の増幅反応におけるプライマーを標識してもよい。あるいは、望ましい場合、異なる色素を用いて、第１の増幅反応および第２の増幅反応におけるプライマーを標識してもよい。望ましい場合、第１の増幅反応からの増幅産物が第２の増幅反応からの増幅産物と異なるレーンまたはキャピラリーに流される実施形態では、同じ色素を用いて、第１の増幅反応および第２の増幅反応におけるプライマーを標識してもよい。あるいは、望ましい場合、異なる色素を用いて、第１の増幅反応および第２の増幅反応におけるプライマーを標識してもよい。
【０２３３】
あるいは、幾つかの実施形態では、第２の増幅反応におけるプライマーは、第１の増幅反応で使用される色素と識別可能である異なる色素で標識される。この実施形態では、増幅反応物をプールして、ポリアクリルアミドゲル上の同じレーンまたは同じキャピラリーに流してもよく、各増幅反応からの産物は、各増幅産物に関して存在する各色素の量を比較することにより比較される。図２Ａおよび図２Ｂはこの方法の一実施形態を示し、ここでは化合物と接触させた増殖に必要とされる遺伝子を過小発現する複数の株を含む培養物で実施される増幅反応からの増幅産物の非存在が、欠如した増幅産物に相当する遺伝子に対して試験化合物が作用することを示す。この方法はまた、試験化合物が相当する遺伝子に作用したために、増殖に必要とされる遺伝子を過剰発現する株の培養物または収集物で実施される増幅反応で過剰表現される増幅産物を特定するのにも使用され得ることは理解されよう。
【０２３４】
望ましい場合、培養物をアリコットに分割するのではなく、個々の増幅反応は、株の培養物または収集物から得られる核酸で実施されてもよい。各増幅反応は、増殖に必要な遺伝子のたった１つに特異的な増幅産物を生じるプライマーを含有する。個々の増幅反応それぞれから生じた増幅産物はプールされ、培養物において表現が増加した増幅産物は、上述のように特定される。
【０２３５】
別の実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物が、これらの遺伝子産物をコードする遺伝子の自然プロモーターを置き換えた調節可能なプロモーターから過剰発現される株の培養物または収集物は、所望数の世代で試験化合物の存在下で成長させることが可能となる。好ましくは、株の培養物または収集物は、少なくとも２０世代で試験化合物の存在下で成長させることが可能となる。核酸が株の培養物または収集物から単離され、置き換えプロモーター（複数可）またはその５'末端に隣接したヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列に相補的であるプライマー、および増幅に必要な遺伝子またはそれに隣接したヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列に相補的であるプライマーを用いて増幅反応が実施される。生じた増幅産物（複数可）は、置き換えプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的なプライマーを用いて直接配列決定される。
【０２３６】
本発明の一実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターは、プラスミド調製技法のような方法を用いて、培養物においてより迅速に増殖した株から得られる。続いて、核酸配列決定技法を用いて、過剰発現された遺伝子のヌクレオチド配列を決定する。
【０２３７】
あるいは、化合物の標的である過剰発現される遺伝子産物の独自性は、過剰発現された遺伝子のヌクレオチド配列を特定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸増幅反応を実施することにより決定されてもよい。例えば、培養物から回収される株からの核酸調製物（例えば、精製プラスミド）のアリコットをそれぞれ、種々の増殖に必要な遺伝子を増幅するＰＣＲプライマー対と接触させて、どのプライマー対が増幅産物を生じるかを決定してもよい。
【０２３８】
化合物の標的である遺伝子産物の独自性を決定するさらに別の方法は、培養物中の株において過剰発現された増殖に必要な遺伝子それぞれを含有するＤＮＡチップのような核酸アレイを得ることを包含する。各増殖に必要な遺伝子は、アレイ中の既知の位置を占める。回収された株からの核酸調製物（例えば、プラスミド調製物）は、放射性部分または蛍光部分のような検出可能な作用物質で標識され、標識核酸がアレイ上の相補的核酸にハイブリダイズするのを可能にする条件下で核酸アレイと接触させて配置される。標識核酸がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定して、回収された株で過剰発現された遺伝子を特定する。望ましい場合、化合物と接触させた培養物からのハイブリダイズした核酸を、化合物と接触させなかった対象培養物からのハイブリダイズした核酸と比較してもよい。あるいは、対照培養物からの核酸と比較することなく、化合物と接触させた培養物からのハイブリダイズした核酸を直接特定してもよい。
【０２３９】
本発明の幾つかの実施形態では、複数の株が、化合物の存在下でより迅速に増殖し得る。このことは、様々な原因に起因し得る。例えば、化合物の濃度は、１つの遺伝子産物（すなわち、標的遺伝子産物）を過剰発現する細胞にのみ増殖が制限されるのに十分高くない場合がある。標的遺伝子産物を過剰発現する株は培養物において最も優勢な株であると同時に、他の株も増殖する場合がある。かかる場合では、培養物において最も優勢である株における遺伝子産物の独自性は、培養物中の増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子それぞれのレベルを定量化することにより特定され得る。これは、定量的ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーション、または上述のアレイ技術を用いて実現され得る。
【０２４０】
他の場合では、多数の株が、共通の機能属性の結果として培養物においてより迅速な増殖を示す。例えば、より迅速に増殖する株はそれぞれ、例えばセリンプロテアーゼ活性のような共通の酵素活性を有する遺伝子産物を過剰発現し得る。あるいは、より迅速に増殖する株はそれぞれ、ｃＡＭＰ結合ドメインのような共通の機能ドメインを有する遺伝子産物を過剰発現し得る。かかる場合では、より迅速に増殖する株の共通属性は、化合物の作用様式または化合物の標的の生化学活性に関する情報を提供し得る。例えば、より迅速に増殖した株において過剰発現される遺伝子のすべてがセリンプロテアーゼである場合、化合物はセリンプロテアーゼ活性を阻害することにより作用し、標的タンパク質はセリンプロテアーゼである。望ましい場合、化合物は誘導体化されてもよく、より迅速に増殖した株それぞれに対する誘導体化された化合物の有効性は、共通活性または結合部位を共有する広範囲の標的と相互作用することが可能な誘導体（すなわち、もとの化合物よりも、全ての株の増殖を阻害する能力が大きな誘導体）を特定するために、あるいは所望の標的に対してより大きな特異性を有する誘導体（すなわち、もとの化合物よりも、株の１つに対する特異性が大きな誘導体）を特定するために、本明細書中に記載されるように評価され得る。例えば、増殖に必要とされる遺伝子産物のほかに、細胞中で発現される非必須遺伝子産物もまた、初期試験化合物に結合し得ることが可能である。かかる場合では、増殖に必要とされる遺伝子産物に特異的な初期試験化合物の誘導体を得ることが望ましい。さらに、増殖に必要な２つの遺伝子産物が、初期試験化合物に結合し得ることが可能であるが、遺伝子産物の１つに対する特異性が望ましい。
【０２４１】
幾つかの実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する多数の株それぞれを含有する単一培養物を用いるのではなく、本発明の方法は、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する個々の株（すなわち、株の収集物）それぞれのアレイを用いて実施され得る。例えば、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する個々の株それぞれは、多重ウェルプレートの異なるウェル中で成長させてもよい。各ウェルを化合物（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質）と接触させる。ウェルそれぞれ中の株の増殖レベルを決定して、より迅速に増殖した株を特定する。より迅速に増殖した株において過剰発現した遺伝子産物の独自性は、上述のように決定される。
【０２４２】
別の実施形態では、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する個々の株それぞれ（すなわち、株の収集物）を、寒天板のような固体培地上の異なる位置で成長させてもよい。培地は、化合物、および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質を含有する。株それぞれの増殖レベルを決定して、より迅速に増殖した株を特定する。より迅速に増殖した株において過剰発現された遺伝子産物の独自性は、上述のように決定される。
【０２４３】
化合物開発に優先順位を付すために、あるいは化合物がすでに特定されているかどうか、または化合物の標的がすでに特定された薬剤の標的であるかどうかを決定するために、上記方法を用いてもよい。特に、産物が天然産物である場合、化合物を開発する際のかなりの努力を注ぐ前に化合物がすでに特定されたかどうかを決定することが好適である。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、部分的精製または精製天然産物、あるいはコンビナトリアルケミストリーにより生産される化合物の標的は、上述の方法を用いて特定され、既知の薬剤の標的と比較される。標的が既知の薬剤の標的と同一である場合、化合物のさらなる開発は中止される。
【０２４４】
本発明の幾つかの実施形態では、異なる遺伝子産物を過剰発現する株それぞれ（すなわち、株の収集物）のアレイは、評価されるべき化合物を含有する固体培地上で成長させる。アレイ中の各株の位置、およびその株により過剰発現される遺伝子産物は既知である。化合物の存在下で成長するコロニーパターンを評価し、すでに特定された薬剤の存在下で成長するコロニーパターンと比較する。評価される化合物の存在下で成長するコロニーパターンが、すでに特定された薬剤の存在下で成長するコロニーパターンと同じである場合、化合物のさらなる開発は中止される。
【０２４５】
別の実施形態では、上述のアッセイでより迅速に増殖した株における遺伝子産物の配列を、異種生物からの遺伝子産物の配列と比較して、化合物により成長が阻害される種の可能性ある範囲を決定する。遺伝子産物が、異種の種からの遺伝子産物に対して高度の相同性を有する場合、この化合物はまたこれらの異種の種の成長も阻害する可能性が高い。相同性は、当業者が精通している様々な方法のいずれかを用いて決定され得る。例えば、相同性は、ＢＬＡＳＴＰまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムを用いて決定され得る。続いて、化合物の、異種の種の成長を阻害する能力は、化合物の存在下および非存在下での、異種の種の細胞の成長と比較することで確認され得る。
【０２４６】
幾つかの実施形態では、本発明は、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する株、および細胞増殖に必要とされる同じ遺伝子産物を過小発現する株の両方を含む株の収集物または培養物を使用する。株の培養物または収集物を化合物と接触させて、株の培養物または収集物中の存在する核酸を分析する。好ましくは、過剰発現する株に由来する核酸は、過小発現する株に由来する核酸と識別することができる。例えば、過剰発現する株は、上述のようにプロモーター置き換えを用いて得られてもよく、一方過小発現する株は、アンチセンス核酸を発現させることにより得られてもよい。したがって、一実施形態では、過剰発現する株または過小発現する株からの核酸を一意的に増幅する増幅プライマーが設計され得る。化合物が、培養物において過剰発現および過小発現される遺伝子産物に作用する場合、遺伝子産物を過剰発現した培養物または収集物中の株から得られる増幅産物はが培養物または収集物において過剰表現される一方で、遺伝子産物を過小発現する株から得られる増幅産物は、培養物または収集物において過小表現される。望ましい場合、化合物と接触させた培養物または収集物からの核酸を、化合物と接触させなかった対象培養物または収集物からの核酸と比較してもよい。あるいは、対照培養物または収集物と比較することなく、化合物と接触させた培養物または収集物からの核酸を直接分析してもよい。
【０２４７】
細胞増殖を阻害する化合物の標的を特定する現在の方法は、手間がかかり、かつ時間を消費する。上記方法を用いて、多数の化合物の標的を迅速に特定することが可能であり得る。かかる方法では、上述の方法は、多数の化合物それぞれに関して同時に実施される。例えば、化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いて生成される化合物ライブラリーの成員、または天然産物ライブラリーの成員であってもよい。かかる方法では、増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現する複数の株それぞれを含む複数の培養物それぞれ、あるいは増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現する個々の株それぞれの複数の収集物が得られる。各株の培養物または収集物を、ライブラリー中の種々の化合物と接触させて、化合物の標的を上述のように特定する。
【０２４８】
本発明の別の実施形態では、生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物は、生物の増殖に必要とされる異なる遺伝子産物を過小発現する株を含む生物の株の混合物（すなわち、培養物中の株の少なくとも幾つかが、生物の増殖に必要とされる遺伝子産物を過小発現する）を含む培養物を用いて特定される。好ましくは、培養物中の株それぞれは、生物の増殖に必要とされる異なる遺伝子産物を過小発現される（すなわち、培養物中の株のすべてが、生物の増殖に必要とされる遺伝子産物を過小発現する）。かかる株は、上述の方法を用いて得られ得る。培養物は、任意数の株を含んでもよい。例えば、培養物は、少なくとも２個の株、少なくとも１０個の株、少なくとも２０個の株、少なくとも３０個の株、少なくとも５０個の株、少なくとも１００個の株、少なくとも３００個の株、または３００個より多い株を含んでもよい。幾つかの実施形態では、培養物中の株は、概して生物の増殖に必要とされる遺伝子産物のすべてまたはほとんどを過小発現し得る株を含んでもよい。
【０２４９】
培養物を、生物の増殖を阻害する化合物と接触させる。化合物は、任意の供給源から得られる候補薬剤化合物であってもよい。例えば、化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いて生成される化合物、天然産物ライブラリーからの化合物、または不純なもしくは不完全な精製化合物（例えば、不完全に精製した天然抽出物中の化合物）であってもよい。培養物を、化合物が作用する遺伝子産物を過小発現する培養物中の生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の化合物と接触させて、その結果、化合物が作用する遺伝子産物を過過小発現しない株は、上記化合物が作用する上記遺伝子産物を過小発現する株よりも迅速に培養物中で増殖する。したがって、十分な期間後に、化合物が作用する遺伝子産物を過小発現する株は、化合物が作用する遺伝子産物を過小発現しない株よりも培養物中で優勢ではない。一実施形態では、成長条件およびインキュベーション期間は、唯一の株、すなわち化合物の標的を過小発現する株が培養物において減少した速度で増殖するように選択される。別の実施形態では、成長条件は、化合物の標的を過小発現する株が培養物から回収されないように選択される。したがって、一実施形態では、それぞれが種々の増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する複数の株を含有する複数の培養物を、様々な濃度の化合物の存在下で成長させてもよい。化合物濃度を変更させるほかに、増殖に必要な遺伝子産物の発現が調節可能なプロモーターの制御下にある実施形態では、複数の培養物を、誘導物質またはプロモーターからの転写に対するレプレッサの影響を低減する作用物質のような、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質の様々な濃度で成長させてもよい。培養物は、その標的が特定される化合物の存在下で（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質の存在下で）液体培地中で成長させてもよく、あるいは増殖に必要な遺伝子発現を過小発現する株を含む液体培養物は、その標的が特定される化合物の非存在下で成長させた後、化合物を含有する（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質も含有する）固体培地上に導入してもよい。
【０２５０】
化合物の標的である過小発現される遺伝子産物の独自性は、様々な方法を用いて決定され得る。例えば、幾つかの実施形態では、化合物と接触させた株の培養物または収集物中に存在する核酸を、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物中に存在する核酸と比較して、株の対照培養物または収集物に対して、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物において過小表現される核酸を特定してもよい。あるいは、幾つかの実施形態では、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物中の存在する核酸を分析して、株の対照培養物または収集物と比較することなく、欠如しているかまたは低減されたレベルで存在する核酸を特定してもよい。
【０２５１】
本発明の幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物においてよりゆっくりと増殖した株、すなわち試験化合物の存在下で増殖する能力が低いか、または試験化合物の存在下で増殖しない株は以下のように特定される。過小発現される遺伝子それぞれと相関し、互いに識別可能な増幅産物は、試験化合物の存在下で成長させた培養物または収集物から得られる。増幅産物は、特定の増幅産物が株の培養物または収集物において過小表現されるかどうかを決定するために、互いに識別される。幾つかの実施形態では、遺伝子産物それぞれに相当する増幅産物は、増幅産物が互いに識別され得る長さを有する。別の実施形態では、１つまたは複数の増幅産物は、類似のまたは同一の長さを有するが、増幅産物に結合された色素のような検出可能な作用物質に基づいて互いに識別可能である。幾つかの実施形態では、過小表現される増幅産物は、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物からの増幅産物を、試験化合物と接触させなかった株の培養物または収集物からの増幅産物と比較することにより特定される。あるいは、株の培養物または収集物中の過小表現される増幅産物は、株の培養物または収集物中で、どの増幅産物が欠如しているか、または低減されたレベルで存在するかどうかを単に決定することにより特定されてもよい。識別可能な増幅産物を生成する上記方法は、試験化合物の存在下でよりゆっくりと増殖する株の特定を容易とするために、本明細書中に記載の増幅に必要とされる遺伝子産物を過小発現する株を生成する方法のいずれかと併用してもよい。
【０２５２】
例えば、本発明の幾つかの実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの自然プロモーターそれぞれを、単一の所望の置き換えプロモーターで置き換えてもよい。プロモーターが置き換えられた株を含有する株の培養物または収集物を試験化合物の存在下で所望の期間成長させた後、増幅反応は、以下の通りに培養物から得られる核酸で実施される。
【０２５３】
株の培養物または収集物からの核酸は、少なくとも２アリコットに分割される。好ましい実施形態では、株の培養物または収集物からの核酸は、４アリコットに分割される。置換えプロモーター内の、増殖に必要な遺伝子内の、またはプロモーターもしくは増殖に必要な遺伝子に隣接した核酸配列内のヌクレオチド配列に相補的な単一プライマーは、４つの群に分割される。各群は、別個の検出可能な色素、例えばApplied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な６ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＮＥＤ（商標）、およびＰＥＴ（商標）色素で標識される。例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能なＤＳ−３１またはＤＳ−３３色素組を用いて、プライマーを標識してもよい。標識プライマーの群それぞれは、株の培養物または収集物からの核酸のアリコットのそれぞれに添加され、その結果核酸の各アリコットは、プライマー上に単一の検出可能な色素を有する単一標識プライマーを受け取る。
【０２５４】
核酸のアリコットそれぞれはまた、プロモーター内の、置き換えプロモーターの制御下に置かれた増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の１つに特有なヌクレオチド配列内の、またはプロモーターもしくは増殖に必要な遺伝子に隣接したヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列に相補的であるそれぞれの非標識プライマーを有する非標識プライマー組を受け取る。アリコットはそれぞれ、置き換えプロモーターの制御下に置かれた１／Ｎ増殖に必要な遺伝子に特有なプライマー（ここでＮはアリコットの数である）を受け取る（すなわち、株の培養物または収集物が、増殖に必要とされる遺伝子が置き換えプロモーターの制御下に置かれ、４アリコットに分割される１００個の株から構成された場合、株の培養物または収集物からの核酸の４アリコットそれぞれは、２５個の遺伝子に相補的なプライマーを受け取る）。非標識プライマーは、それぞれが、他の非標識プライマーにより産生される増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように選択される。好ましくは、増幅産物は、約１００〜約４００ヌクレオチド長であるが、互いに識別され得る任意の長さを使用してもよい。さらに、実施形態の幾つかでは、増幅産物の幾つかは同一のまたは非常に類似した長さを有し得るが、識別可能な色素による標識により、互いに識別可能であり得る。
【０２５５】
核酸増幅反応は、核酸アリコットそれぞれで行われる。次に、増幅産物を長さで分離して、株の培養物または収集物において表現が減少したか、もしくは存在しない増幅産物を特定する。次に、増幅産物を相当する遺伝子と相関させて、どの株が株の培養物または収集物においてよりゆっくりと増殖したかを決定する。望ましい場合、化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる増幅産物を、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物から得られる増幅産物と比較することにより、培養物において表現が減少した増幅産物を特定してもよい。あるいは、望ましい場合、化合物と接触させなかった対照培養物と比較することなく、化合物と接触させた培養物において欠如しているかまたは低減されたレベルで存在する増幅産物を直接特定してもよい。
【０２５６】
例えば、幾つかの実施形態では、核酸アリコットそれぞれからの増幅産物をプールし、キャピラリー電気泳動にかける。増幅産物は、増幅産物に結合された蛍光色素を検出することで検出され、それらの長さを決定して、株の培養物または収集物において表現が減少した増幅産物を特定する。図１Ａおよび図１Ｂはこの方法の一実施形態を示し、ここでは増殖に必要とされる遺伝子を過小発現する複数の株を含む培養物で実施された増幅反応からの増幅産物の非存在が、欠如した増幅産物に相当する遺伝子に対して試験化合物が作用することを示す。
【０２５７】
あるいは、別の実施形態では、第１の増幅反応は、過剰発現される遺伝子のすべての上流または下流に存在するヌクレオチド配列に相補的な第１のプライマー(例えば、過剰発現される遺伝子すべての上流にある置き換えプロモーター中のヌクレオチド配列の相補的なプライマー）、および株それぞれに特有なヌクレオチド配列に相補的なプライマー（例えば、増殖に必要な遺伝子それぞれ内のヌクレオチド配列に相補的なプライマー）組を用いて、化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる核酸で実施される。増殖に必要な遺伝子ぞれぞれのための２つの増幅プライマーのうちの１つは、上述のように色素で標識される。好ましくは、過剰発現される遺伝子すべての上流または下流のヌクレオチド配列に相補的な共通プライマーが色素で標識される。増幅反応で使用されるプライマーは、各増殖に必要な遺伝子に相当する増幅産物が特有の長さを有するように設計される。第２の増幅反応は、第１の増幅反応の場合と同じプライマーを用いて、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物で行われる。第１の増幅反応からの増幅産物を第２の増幅反応からの増幅産物と比較して、株の培養物または収集物で過小表現される１つまたは複数の増幅産物を特定する。例えば、第１の増幅反応からの増幅産物は、第２の増幅反応からの増幅産物とは別個のポリアクリルアミドゲルのレーン、またはその増幅産物と別個のキャピラリーに流してもよく、２つのレーンまたはキャピラリーを互いに比較する。
【０２５８】
あるいは、幾つかの実施形態では、第２の増幅反応におけるプライマーは、第１の増幅反応で使用される色素と識別可能である異なる色素で標識される。この実施形態では、増幅反応物をプールして、ポリアクリルアミドゲル上の同じレーンまたは同じキャピラリーに流してもよく、各増幅反応からの産物は、各増幅産物に関して存在する各色素の量を比較することにより比較される。図２Ａおよび図２Ｂはこの方法の一実施形態を示し、ここでは化合物と接触させた増殖に必要とされる遺伝子を過小発現する複数の株を含む培養物で実施される増幅反応からの増幅産物の非存在が、欠如した増幅産物に相当する遺伝子に対して試験化合物が作用することを示す。
【０２５９】
望ましい場合、培養物をアリコットに分割するのではなく、個々の増幅反応は、株の培養物または収集物から得られる核酸で実施されてもよい。各増幅反応は、増殖に必要な遺伝子のたった１つに特異的な増幅産物を生じるプライマーを含有する。個々の増幅反応それぞれから生じた増幅産物はプールされ、培養物において表現が減少した増幅産物は、上述のように特定される。
【０２６０】
一実施形態では、培養物中の各株の表現は、増殖に必要とされる遺伝子またはその一部をコードする核酸を含むアレイに、培養物から得られる増殖に必要とされる遺伝子またはその一部をコードする検出可能に標識した核酸をハイブリダイズすることにより評価され得る。増殖に必要とされる遺伝子産物またはその一部をコードする各核酸は、アレイ上の既知の位置を占める。アレイ上の各位置からのシグナルを定量化して、培養物で過小表現される増殖に必要な遺伝子産物をコードする核酸を特定する。望ましい場合、化合物と接触させた培養物からのハイブリダイズした核酸を、化合物と接触させなかった対照培養物からのハイブリダイズした核酸と比較してもよい。あるいは、対照培養物からの核酸と比較することなく、化合物と接触させた培養物からのハイブリダイズした核酸を直接特定してもよい。
【０２６１】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子産物を過小発現する各株は、特有の核酸配列（本明細書中では「タグ」とも呼ばれる）を含有するように構築され得る。タグは、各株の染色体中に、または染色体外ベクター中に含まれてもよい。例えば、タグは、増殖に必要とされる遺伝子産物またはかかる遺伝子の一部をコードする遺伝子に相補的なアンチセンス核酸をコードするベクターに含まれ得るか、あるいはタグは、アンチセンス核酸自体に含まれてもよい。培養物中の各株の表現は、タグそれぞれに相補的なプライマーを用いて増幅反応を実施して、生じた増幅産物のレベルを定量化して、培養物から過小表現されるか、または存在しないタグを特定することにより評価され得る。各タグは１つの株に相応するため、培養物から過小表現されるか、または存在しない株は特定され得る。望ましい場合、化合物と接触させた培養物中に存在するタグを、化合物と接触させなかった対照培養物中に存在するタグと比較してもよい。あるいは、対照培養物と比較することなく、化合物と接触させた培養物中に存在するタグを分析してもよい。
【０２６２】
望ましい場合、特有のタグはまた、増殖に必要とされる遺伝子産物が過剰発現される実施形態で使用され得ることが理解されよう。かかる実施形態の幾つかの態様では、タグは、遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を駆動するプロモーター内にまたはそれ隣接して存在し得る。かかる実施形態では、培養物中でより迅速に増殖する株において過剰発現される遺伝子産物は、培養物中の遺伝子産物に相当する特有のタグの存在またはその量を検出することにより特定され得る。
【０２６３】
本発明の幾つかの実施形態では、複数の株が、化合物の存在下であまり迅速に増殖し得ない。このことは、様々な原因に起因し得る。例えば、化合物の濃度は、１つの遺伝子産物（すなわち、標的遺伝子産物）を過小発現する細胞にのみ増殖を減少するのに十分高くない場合がある。標的遺伝子産物を過小発現する株は培養物においてあまり優勢でないと同時に、他の株もまた過小表現され得る。かかる場合では、培養物において最も優勢でない（または培養物から回収されない）株における遺伝子産物の独自性は、培養物中の増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子それぞれのレベルを定量化することにより特定され得る。これは、定量的ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーション、または上述のアレイ技術を用いて実現され得る。
【０２６４】
他の場合では、多数の株が、共通の機能属性の結果として培養物においてあまり迅速でない増殖を示す。例えば、あまり迅速に増殖しない株（または培養物から回収されない株）はそれぞれ、例えばセリンプロテアーゼ活性のような共通の酵素活性を有する遺伝子産物を過小発現し得る。あるいは、あまり迅速に増殖しない株（または培養物から回収されない株）はそれぞれ、ｃＡＭＰ結合ドメインのような共通の機能ドメインを有する遺伝子産物を過小発現し得る。かかる場合では、あまり迅速に増殖しない株（または培養物から回収されない株）の共通属性は、化合物の作用様式または化合物の標的の生化学活性に関する情報を提供し得る。例えば、あまり迅速に増殖しない株において過小発現される遺伝子のすべてがセリンプロテアーゼである場合、化合物はセリンプロテアーゼ活性を阻害することにより作用し、標的タンパク質はセリンプロテアーゼである。望ましい場合、化合物は誘導体化されてもよく、より迅速に増殖した株それぞれに対する誘導体化された化合物の有効性は、共通活性または結合部位を共有する広範囲の標的と相互作用することが可能な誘導体（すなわち、もとの化合物よりも、全ての株の増殖を阻害する能力が大きな誘導体）を特定するために、あるいは所望の標的に対してより大きな特異性を有する誘導体（すなわち、もとの化合物よりも、株の１つに対する特異性が大きな誘導体）を特定するために、本明細書中に記載されるように評価され得る。
【０２６５】
幾つかの実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する多数の株それぞれを含有する単一培養物を用いるのではなく、本発明の方法は、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する個々の株（すなわち、株の収集物）それぞれのアレイを用いて実施され得る。例えば、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する個々の株それぞれは、多重ウェルプレートの異なるウェル中で成長させてもよい。各ウェルを化合物（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質）と接触させる。ウェルそれぞれ中の株の増殖レベルを決定して、あまり迅速に増殖しなかったか、または全く増殖しなかった株を特定する。あまり迅速に増殖しなかったか、または全く増殖しなかった株において過小発現した遺伝子産物の独自性は、上述のように決定される。
【０２６６】
別の実施形態では、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する個々の株それぞれ（すなわち、株の収集物）を、寒天板のような固体培地上の異なる位置で成長させてもよい。培地は、化合物、および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質を含有する。株それぞれの増殖レベルを決定して、あまり迅速に増殖しなかった株（または培養物から回収されない株）を特定する。あまり迅速に増殖しなかった株（または培養物から回収されない株）株において過小発現される遺伝子産物の独自性は、上述のように決定される。
【０２６７】
化合物開発に優先順位を付すために、あるいは化合物がすでに特定されているかどうか、または化合物の標的がすでに特定された薬剤の標的であるかどうかを決定するために、上記方法を用いてもよい。特に、産物が天然産物である場合、化合物を開発する際のかなりの努力を注ぐ前に化合物がすでに特定されたかどうかを決定することが好適である。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、不完全な精製または精製天然産物、あるいはコンビナトリアルケミストリーにより生産される化合物の標的は、上述の方法を用いて特定され、既知の薬剤の標的と比較される。標的が既知の薬剤の標的と同一である場合、化合物のさらなる開発は中止される。
【０２６８】
本発明の幾つかの実施形態では、異なる遺伝子産物を過小発現する株それぞれ（すなわち、株の収集物）のアレイは、評価されるべき化合物を含有する固体培地上で成長させる。アレイ中の各株の位置、およびその株により過小発現される遺伝子産物は既知である。化合物の存在下であまり成長しないか、または成長することができないコロニーパターンを評価し、すでに特定された薬剤の存在下であまり迅速に成長しないか、または成長することができないコロニーパターンと比較する。評価される化合物の存在下であまり成長しないか、または成長することができないコロニーパターンが、すでに特定された薬剤の存在下であまり成長しないか、または成長することができないコロニーパターンと同じである場合、化合物のさらなる開発は中止される。
【０２６９】
別の実施形態では、上述のアッセイであまり迅速に増殖しなかった株（または培養物から回収されなかった株）における遺伝子産物のヌクレオチド配列を、異種生物からの遺伝子産物のヌクレオチド配列と比較して、化合物により成長が阻害される種の可能性ある範囲を決定する。遺伝子産物が、異種の種からの遺伝子産物に対して高度の相同性を有する場合、この化合物はまたこれらの異種の種の成長も阻害する可能性が高い。相同性は、当業者が精通している様々な方法のいずれかを用いて決定され得る。例えば、相同性は、ＢＬＡＳＴＰまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムを用いて決定され得る。続いて、化合物の、異種の種の成長を阻害する能力は、化合物の存在下および非存在下での、異種の種の細胞の成長と比較することで確認され得る。
【０２７０】
細胞増殖を阻害する化合物の標的を特定する現在の方法は、手間がかかり、かつ時間を消費する。上記方法を用いて、多数の化合物の標的を迅速に特定することが可能であり得る。かかる方法では、上述の方法は、多数の化合物それぞれに関して同時に実施される。例えば、化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いて生成される化合物ライブラリーの成員、または天然産物ライブラリーの成員であってもよい。かかる方法では、増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過小発現する複数の株それぞれを含む複数の培養物それぞれ、あるいは増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過小発現する個々の株それぞれの複数の収集物が得られる。各株の培養物または収集物を、ライブラリー中の種々の化合物と接触させて、化合物の標的を上述のように特定する。
【０２７１】
本発明の幾つかの実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子またはそれらの一部に相補的な核酸（すなわち、増殖に必要な遺伝子産物またはそれらの一部をコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸をコードする核酸）が調節可能なプロモーターに作動可能に連結される株が構築される。各株が異なる増殖に必要とされる遺伝子産物に対するアンチセンス核酸を発現する複数のかかる株を含む培養物を、増殖を阻害する様々なレベルの化合物の存在下で、および調節可能なプロモーターからの転写レベルを調節する様々なレベルの作用物質の存在下で成長させる。核酸試料は、培養物から得られ、検出可能に標識され、増殖に必要な遺伝子産物またはそれらの一部をコードする遺伝子を含有する核酸を含む固体支持体にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションのレベルを、増殖に必要な遺伝子産物それぞれをコードする各核酸に関して定量化して、株それぞれが培養物中で増殖した割合を決定する。培養物中の株により発現されるアンチセンス核酸が、化合物の標的をコードする遺伝子のすべてまたは一部に相補的でない場合（すなわち、非特異的株）、その株に関するハイブリダイゼーション強度は、化合物濃度と相関されない（図３を参照）一方、培養物中の株により発現されるアンチセンス核酸が、化合物の標的をコードする遺伝子のすべてまたは一部に相補的である場合、その株に関するハイブリダイゼーション強度は、化合物濃度と密接に相関される（図４を参照）。この様式では、化合物の標的が特定されてもよい。上述のように、単一培養物中の株を成長させるのではなく、各株を固体培地上の異なる位置で、あるいは多重ウェルプレートの異なるウェル中で成長させてもよいことが理解されよう。
【０２７２】
本明細書中の方法は、これらの化合物の標的を迅速に特定することが可能であるために、増殖を阻害する複数の化合物それぞれに関して同時に実施されてもよい。
【０２７３】
本発明の幾つかの実施形態を、以下の欄に概要する。本発明は任意の生物の培養物に適用されてもよく、生物の増殖に必要とされる任意の遺伝子産物が過剰発現または過小発現されてもよいことが理解されよう。したがって、以下の実施例に記載される生物および遺伝子産物は単なる例示であり、本発明の範囲を限定しない。
【０２７４】
本発明において使用するための細胞増殖に必要とされる遺伝子は文献から特定されてもよく、以下の方法を用いて特定されてもよく、あるいは当業者が精通している他の方法を用いて特定されてもよい。本発明の幾つかの実施形態では、培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む。配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物の特定を以下に記載する。
【実施例１】
【０２７５】
細胞増殖に必要とされる遺伝子の少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡを発現することによる、細胞増殖に必要とされる遺伝子の特定
ランダムゲノム断片を、細胞増殖に必要とされる遺伝子を特定したい生物から得る。ランダムゲノム断片は、制限酵素による部分的消化、超音波処理および噴霧のような技法を用いた機械的せん断、またはＤＮアーゼＩ消化により得ることができる。ランダムゲノム断片を、ベクターにおいて調節可能プロモーターに作動可能に連結する。挿入ゲノム断片がプロモーターに関してアンチセンス方向にある場合は、産生される転写物は遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、その結果、転写物は様々な遺伝子から産生されるセンスｍＲＮＡと相互作用をし、それによりセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率またはレベルを減少させ、したがってこれらのセンスｍＲＮＡ分子によりコードされるタンパク質の産生を減少させる。センスｍＲＮＡが増殖に必要とされるタンパク質をコードする場合は、誘導性条件下で成長させた細胞は、成長することができないか、または成長速度がかなり低下する。さらに、産生される転写物が非翻訳ＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、非翻訳ＲＮＡが増殖に必要とされる場合は、誘導性条件下で成長させた細胞はまた、成長することができないか、または成長速度がかなり低下する。対照的に、非誘導性条件下で成長させた細胞は正常な速度で成長する。続いて、アンチセンス核酸が相補的である遺伝子が特定され、本発明の方法で利用される。したがって、細胞増殖に必要とされる遺伝子を特定するために、調節可能プロモーターからの転写を誘導する作用物質の存在下におけるベクターを含有する細胞増殖の程度を、作用物質の非存在下における細胞増殖の程度と比較する。作用物質の非存在下においては十分に成長するが、作用物質の存在下においては増殖がかなり減少する細胞は、細胞増殖に必要とされる遺伝子の少なくとも一部に相補的なアンチセンス核酸をコードするベクターを含む。
【０２７６】
上記方法を用いて、エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスにおける細胞増殖に必要とされる遺伝子を特定した。エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスにおける細胞増殖に必要とされる遺伝子の特定は、以下の米国特許出願に記載されている（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）：２００１年３月２１日に出願された米国特許出願第０９／８１５，２４２号、２０００年１月２７日に出願された米国特許出願第０９／４９２７０９号、２０００年１１月９日に出願された米国特許出願第０９／７１１１６４号、２０００年１２月１９日に出願された米国特許出願第０９／７４１６６９号、および２００１年３月２１日に出願された米国特許出願第０９／８１５，２４２号。細胞増殖に必要とされるこれらの遺伝子を特定するのに使用される方法を以下に概要する。
【０２７７】
エシェリヒア・コリの増殖に必要とされる遺伝子を特定するために、ランダムゲノム断片を、ＩＰＴＧ誘導発現ベクターｐＬＥＸ５ＢＡ（Krause et al., J. Mol. Biol. 274:365 (1997)：この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、またはｐＬＥＸ５ＢＡの改変型であるｐＬＥＸ５ＢＡ−３’（Ｔ７ターミネーターを含有する合成リンカーが、ｐＬＥＸ５ＢＡのＰｓｔＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に連結されている）にクローニングした。特に、ｐＬＥＸ５ＢＡ−３’を構築するために、以下のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｐＬＥＸ５ＢＡのＰｓｔＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した：
５’−ＧＴＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡ−３’（配列番号１５７７９）本出願全体にわたって挿入される正確な配列番号）
５’−ＡＧＣＴＴＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡ−３’（配列番号１５７８０）。
【０２７８】
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡのランダム断片を、ＤＮアーゼＩ消化または超音波処理により生成して、Ｔ４ポリメラーゼで充填し、ｐＬＥＸ５ＢＡまたはｐＬＥＸ５ＢＡ−３’のＳｍａＩ部位にクローニングした。活性化または誘導時に、プロモーターがランダムゲノム断片を転写した。
【０２７９】
液体培地中で転写誘導の効果を調査するために、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む、または含まない新鮮な培地中に１：２００で培養物を逆希釈し、３０分（ｍｉｎ）毎にＯＤ450を測定することで、成長曲線を作成した。固体培地上で転写誘導の効果を調査するために、一晩の培養物の１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、および１０8倍希釈物を調製した。これらの希釈物の０．５〜３μｌのアリコットを、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む、または含まない選択寒天プレートにスポット(spot)した。一晩インキュベーションした後、プレートを比較して、ＩＰＴＧに対するクローンの感受性を評価した。
【０２８０】
試験した数多くのクローンのうち、幾つかのクローンが、ＩＰＴＧ誘導後にエシェリヒア・コリの成長を阻害する配列を含むと特定された。したがって、挿入核酸配列が対応する遺伝子、または挿入核酸を含有するオペロン内の遺伝子は、エシェリヒア・コリの増殖に必要とされる。
【０２８１】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、およびクレブシエラ・ニューモニアエの増殖に必要とされる核酸は以下のように特定された。スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、エンテロコッカス・フェカリスのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、誘導プロモーターから転写された。
【０２８２】
スタフィロコッカス・アウレウスの場合は、スタフィロコッカス・アウレウスのｘｙｌＡプロモーター由来のｘｙｌＯオペレーターに融合させた改変Ｔ５プロモーターを含む、新規誘導プロモーター系であるＸｙｌＴ５を使用した。このプロモーターは、米国特許出願第１０／０３２，３９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。このハイブリッドプロモーターからの転写は、キシロースにより誘導することができる。
【０２８３】
サルモネラ・タフィマリアムのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、ｐＬＥＸ５ＢＡにおいてＩＰＴＧ誘導プロモーター(Krause et al., J. Mol. Biol. 274: 365 (1997)）、またはその誘導体から転写された。クレブシエラ・ニューモニアエのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、ｐＬＥＸ５ＢＡ−ＫａｎにおいてＩＰＴＧ誘導プロモーターから発現された。ｐＬＥＸ５ＢＡ−Ｋａｎを構築するために、ｐＬＥＸ５ＢＡをＣｌａＩで完全に消化して、ｂｌａ遺伝子を除去した。次に、プラスミドを部分的ＮｏｔＩ消化処理して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。次に、３．２ｋｂｐ断片をゲル精製して、ｐＫａｎπ由来の平滑末端化１．３ｋｂｐのｋａｎ遺伝子に連結した。Ｋａｎ耐性形質転換体をＫａｎプレート上で選択した。ｋａｎ遺伝子の配向性をＳｍａＩ消化により調べた。ｂｌａ遺伝子と同じ配向性のｋａｎ遺伝子を有するクローンを用いて、クレブシエラ・ニューモニアエの増殖に必要とされる遺伝子を特定した。
【０２８４】
シュードモナス・エルジノーザのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、２成分誘導プロモーター系から転写された。染色体上に、ｌａｃＵＶ５／ｌａｃＯにより調節されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ（Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111:35-41：この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。別個のプラスミド上で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＴ７遺伝子１０プロモーターをｌａｃＯオペレーターと、さらに多数のクローニング部位と融合させた。
【０２８５】
スタフィロコッカス・アウレウスの場合は、スタフィロコッカス・アウレウスのゲノム断片のショットガンライブラリーを、ＸｙＩＴ５誘導プロモーターを保有するベクターｐＸｙＩＴ５−Ｐ１５ａにクローニングした。ＸｙＩＴ５プロモーター／オペレーターのすぐ下流にある特有のＢａｍＨＩ部位でベクターを線状化した。線状化ベクターをシュリンプ(shrimp)アルカリホスファターゼで処理して、線状化末端が再封鎖するのを防いだ。スタフィロコッカス・アウレウス株ＲＮ４５０から単離したゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３Ａで完全に消化したか、あるいはＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長のランダムゲノム断片をゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、線状化および脱リン酸化したベクターに、０．１対１のモル比で添加して、連結して、ショットガンライブラリーを形成した。
【０２８６】
連結産物を、エレクトロコンピテント  エシェリヒア・コリ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’(Stratagene)に形質転換し、カルベニシリンを１００μｇ／ｍｌで補充したＬＢ培地上で平板培養した。総計５×１０5個以上になったコロニーを掻取って合わせて、続いてプラスミド精製した。
【０２８７】
次に、精製ライブラリーをスタフィロコッカス・アウレウスＲＮ４２２０エレクトロコンピテントに形質転換した。平板培養１回当たり５００コロニーの１００〜１５０平板培養物を生成するために、生じた形質転換体を、ＬＢ＋０．２％グルコース（ＬＢＧ培地）＋１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＬＢＧ＋ＣＭ１５培地）を含有する寒天上で平板培養した。コロニーをロボット採取して、３８４ウェル培養皿のウェル中に配列させた。各ウェルは、ＬＢＧ＋ＣＭ１５液体培地１００μｌを有していた。接種した３８４ウェル皿を、３７℃で１６時間インキュベートし、各ウェルを、２％キシロースを含むまたは含まない固体ＬＢＧ＋ＣＭ１５培地上にロボットにより格子状に並べた(grid)。格子状に並べたプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、続いてキシロースの存在下で成長が鈍った整列コロニーをマニュアルで採点した。
【０２８８】
２％キシロースを含む培地上で成長感受性である整列コロニーは、キシロースを含まない同様の培地上では成長することができ、以下のようにさらに成長感受性分析した。キシロースを含まないプレートからのコロニーを手動で採取して、ＬＢＧ＋ＣＭ１５を有する９６ウェル培養皿の個々のウェルに接種し、３７℃で１６時間インキュベートした。これらの培養物を、新鮮な培地へ１／１００に自動的に希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、それらを３８４ウェルアレイ中で段階希釈して、続いて２％キシロースを含む培地またはキシロースを含まない培地上へ格子状に並べた。３７℃で１６時間成長させた後、２つの培地上で生じたアレイを互いに比較した。両方の培地上のすべての希釈物で同様に成長したクローンを陰性と採点し、それらについてはこれ以上検討しなかった。キシロース培地上で成長したが、非キシロースプレート上の同じ段階希釈では成長することができなかったクローンに、その差に基づいてスコアを与えた。すなわち、キシロースプレート上では１０4以下の段階希釈で成長し、非キシロースプレート上では１０8以下の段階希釈で成長するクローンには、観察される成長のｌｏｇの差を表す「４」のスコアを与えた。
【０２８９】
サルモネラ・タフィマリアムおよびクレブシエラ・ニューモニアエに関して、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む新鮮な培地またはＩＰＴＧを含まない培地に１：２００で培養物を逆希釈し、３０分（ｍｉｎ）毎にＯＤ450を測定することで、成長曲線を作成した。固体培地上での転写誘導の効果を調査するために、一晩の培養物の１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、および１０8倍希釈物を調製した。これらの希釈物の０．５〜３μｌのアリコットを、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むまたは含まない選択寒天プレートにスポットした。一晩インキュベーションした後、プレートを比較して、ＩＰＴＧに対するクローンの感受性を評価した。
【０２９０】
シュードモナス・エルジノーザの増殖に関与する核酸を以下のように特定した。シュードモナス・エルジノーザのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、２成分誘導プロモーター系から転写された。染色体上に、ｌａｃＵＶ５／ｌａｃＯにより調節されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ(Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111:35-41)。発現プラスミド上に、ｌａｃＯオペレーター、さらに多数のクローニング部位と融合させた、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＴ７遺伝子１０プロモーターが存在した。このハイブリッドプロモーターからの転写は、ＩＰＴＧにより誘導することができる。プロモーターの下流にあるゲノムＤＮＡが、アンチセンス方向で、増殖に関与する遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部を含む場合、プロモーターからの発現の誘導により、検出可能な程度に増殖が阻害される。
【０２９１】
シュードモナス・エルジノーザのゲノム断片のショットガンライブラリーを、ｐＥＰ５、ｐＥＰ５Ｓ、またはＴ７ｌａｃＯ誘導プロモーターを保有する他の同様に構築されたベクターにクローニングした。Ｔ７ｌａｃＯプロモーター／オペレーターのすぐ下流にある特有のＳｍａＩ部位でベクターを線状化した。線状化ベクターをシュリンプアルカリホスファターゼで処理して、線状化末端が再封鎖するのを防いだ。シュードモナス・エルジノーザ株ＰＡＯ１から単離したゲノムＤＮＡを、ＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長のランダムゲノム断片をゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、線状化および脱リン酸化したベクターに、２対１のモル比で添加して、連結して、ショットガンライブラリーを作成した。
【０２９２】
連結産物を、エシェリヒア・コリ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’(Stratagene) エレクトロコンピテントに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンまたはストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを有するＬＢ培地上で平板培養した。総計５×１０5個以上になる生じたコロニーを掻取って合わせて、続いてプラスミド精製した。
【０２９３】
次に、精製ライブラリーをエレクトロコンピテントシュードモナス・エルジノーザ株ＰＡＯ１に形質転換した。平板培養１回当たり５００コロニーの１００〜１５０平板培養物を生成するために、生じた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンまたはストレプトマイシン４０μｇ／ｍｌを有するＬＢ寒天上で平板培養した。コロニーをロボット採取して、３８４ウェル培養皿のウェル中に配列させた。各ウェルには、ＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０液体培地１００μｌを有していた。接種した３８４ウェル皿を、室温で１６時間インキュベートし、各ウェルを、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むまたは含まない固体ＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０培地上へロボットにより格子状に並べた。格子状に並べたプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、続いてＩＰＴＧの存在下で成長が鈍った整列コロニーに関してマニュアルで採点した。
【０２９４】
１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む培地上で成長感受性である整列コロニーは、ＩＰＴＧを含まない同様の培地上では成長することができ、以下のようにさらに成長感受性分析した。ＩＰＴＧを含まないプレートからコロニーを手動で採取して、ＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０を有する９６ウェル培養皿の個々のウェルに接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。これらの培養物を、新鮮な培地中へ１／１００に自動的に希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、それらを３８４ウェルアレイ中で段階希釈して、続いて１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むまたは含まない培地上へ格子状に並べた。３７℃で１６時間成長させた後、得られた段階希釈スポットのアレイを、２つの培地間で比較した。両方の培地上のすべての希釈物で同様に成長したクローンを陰性と採点し、それらについてはこれ以上検討しなかった。ＩＰＴＧ培地上で成長したが、非ＩＰＴＧプレート上の同じ段階希釈で成長することができなかったクローンに、その差に基づいてスコアを与えた。すなわち、ＩＰＴＧプレート上では１０4以下の段階希釈で成長し、非ＩＰＴＧプレート上で１０8以下の段階希釈で成長するクローンには、観察される成長のｌｏｇの差を表す「４」のスコアを与えた。
【０２９５】
誘導時に、シュードモナス・エルジノーザの成長または増殖に負の影響を与えたこれらのベクターを特定した後、それらのベクターに含まれる挿入物または核酸断片を、さらなる特徴付けをするために単離した。所定のベクターを、核酸配列決定した。
【０２９６】
Ｅ．フェカリスの増殖に関与する核酸を以下のように特定した。ゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、ｘｙｌオペレーター／レプレッサにより調節される、それぞれＣＰ２５またはＰ５９プロモーターを含有するベクターｐＥＰＥＦ３またはｐＥＰＥＦ１４から発現された。プロモーターの下流にあるゲノムＤＮＡが、アンチセンス方向で、増殖に関与する遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部を含有する場合、プロモーターからの発現の誘導により、検出可能な程度に増殖が阻害される。
【０２９７】
Ｅ．フェカリスのゲノム断片のショットガンライブラリーを、キシロース誘導プロモーターを有するベクターｐＥＰＥＦ３またはｐＥＰＥＦ１４にクローニングした。プロモーター／オペレーターのすぐ下流にある特有のＳｍａＩ部位でベクターを線状化した。線状化ベクターをアルカリホスファターゼで処理して、線状化末端が再封鎖するのを防いだ。Ｅ．フェカリス株ＯＧ１ＲＦから単離したゲノムＤＮＡを、ＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長のランダムゲノム断片をゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、線状化および脱リン酸化したベクターに、２対１のモル比で添加して、連結して、ショットガンライブラリーを作成した。
【０２９８】
連結産物を、エシェリヒア・コリ株ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)に形質転換し、１５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｒｍ）を含むＬＢ培地上で平板培養した。総計５×１０5個以上になる生じたコロニーを掻取って合わせて、続いてプラスミド精製した。
【０２９９】
次に、精製ライブラリーをＥ．フェカリス株ＯＧ１ＲＦエレクトロコンピテントに形質転換した。平板培養１回当たり５００コロニーの１００〜１５０平板培養物を生成するために、生じた形質転換体を、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを有するＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ（ＴＨ）寒天上で平板培養した。コロニーをロボット採取して、３８４ウェル培養皿のウェル中に配列させた。各ウェルには、ＴＨＢ＋Ｅｒｍ１０μｇ／ｍｌ  １００μｌを有していた。接種した３８４ウェル皿を、室温で１６時間インキュベートし、各ウェルを、５％キシロースを含むまたは含まない固体ＴＨ寒天＋Ｅｒｍ上へロボットにより格子状に並べた。格子状に並べたプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、続いてキシロースの存在下で成長が鈍った整列コロニーをマニュアルで採点した。
【０３００】
５％キシロースを含む培地上で成長感受性である整列コロニーは、キシロースを含まない同様の培地上では成長することができ、さらに成長感受性分析した。キシロースを含まないプレートからコロニーを手動で採取して、ＴＨＢ＋Ｅｒｍ１０を含有する９６ウェル培養皿の個々のウェルに接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。これらの培養物を、新鮮な培地へ１／１００に自動的に希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、５％キシロースを含むプレートまたはキシロースを含まないプレート上で段階希釈した。３７℃で１６時間成長させた後、生じた段階希釈スポットのアレイを、２つの培地間で比較した。両方の培地上で同様に成長したコロニーを陰性と採点し、対応するコロニーについてはこれ以上検討しなかった。非キシロースプレート上の段階希釈と同じ段階希釈で成長することができなかったキシロース培地上のコロニーに、その差に基づいてスコアを与えた。例えば、キシロース培地上のコロニーが−４の段階希釈に対してのみ成長する一方で、非キシロースプレート上では−８の段階希釈に対して成長することが可能である場合、相当する形質転換体コロニーには、観察される成長のｌｏｇの差を表す「４」のスコアを与えた。
【０３０１】
誘導時に、Ｅ．フェカリスの成長または増殖に負の影響を与えたこれらのベクターを特定した後、それらの発現ベクターに含まれる挿入物または核酸断片をさらに特徴付けするために単離した。所定のベクター中の挿入物を、ヌクレオチド配列決定した。
【０３０２】
他の制限酵素および他のエンドヌクレアーゼまたは方法論がランダムゲノム断片を生成するのに用いられうることが理解されよう。さらに、ランダムゲノム断片は、機械的せん断により生成されてもよい。超音波処理および噴霧は、ＤＮＡの機械的せん断に一般に使用される技法である。
【実施例２】
【０３０３】
エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスの増殖に対して有害な影響を有する核酸断片を転写する特定クローンのヌクレオチド配列決定
エシェリヒア・コリの成長を阻害する核酸配列のヌクレオチド配列を、ＱＩＡＰＲＥＰ(Qiagen, Valencia, CA)および製造業者により提供される方法を用いて単離したプラスミドＤＮＡを用いて決定した。挿入物を配列決定するのに使用されるプライマーは、５’−ＴＧＴＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号１５７８１）および５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＣ−３’（配列番号１５７８２）であった。これらの配列は、ｐＬＥＸ５ＢＡ中のポリリンカーに隣接する。
【０３０４】
スタフィロコッカス・アウレウスの成長を阻害する核酸配列のヌクレオチド配列を以下のように決定した。スタフィロコッカス・アウレウスを標準的な実験室培地（プラスミドを選択するための１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有するＬＢまたはＴＢ）中で成長させた。培養管または２ｍｌの深いウェルマイクロタイタープレート中、３７℃で一晩成長させた。
【０３０５】
スタフィロコッカス・アウレウスの溶菌は以下のように実施した。培養物（２〜５ｍｌ）を遠心分離し、細胞ペレットを、リソスタフィンの１．５ｍｇ／ｍｌ溶液（もとの培養物の２０μｌ／ｍｌ）中に再懸濁した後、懸濁緩衝液(Qiagen)２５０μｌを添加した。あるいは、細胞ペレットを懸濁緩衝液(Qiagen)２５０μｌに直接再懸濁して、そこに１ｍｇ／ｍｌリソスタフィン溶液５〜２０μｌを添加した。
【０３０６】
製造業者により提供される指示書に従って、ＱｉａｇｅｎｅミニプレップキットまたはＷｉｚａｒｄ(Qiagen)ミニプレップキットを用いてＤＮＡを単離した。
【０３０７】
ゲノムＤＮＡ挿入物を、以下のようにＰＣＲにより精製プラスミドから増幅した。
【０３０８】
Ｑｉａｇｅｎ精製プラスミド１μｌを、総反応容量２５μｌのＱｉａｇｅｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲｍｉｘに入れた。スタフィロコッカス・アウレウスに関して、以下のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
ｐＸｙｌＴ５Ｆ：ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号１５７８３）
ＬｅｘＬ  ＴＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴ（配列番号１５７８４）
【０３０９】
同じ方法をサルモネラ・タフィマリアムおよびクレブシエラ・ニューモニアエに関して行った。サルモネラ・タフィマリアムおよびクレブシエラ・ニューモニアエに関して、以下のプライマーを使用した：
５’−ＴＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号１５７８４）、および
５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＣ−３’（配列番号１５７８２）。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間を用いて、ＰＥ  ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９５℃１５分
工程２．９４℃４５秒
工程３．５４℃４５秒
工程４．７２℃１分
工程５．工程２に戻って、２９回
工程６．７２℃１０分
工程７．４℃で保持
ＰＣＲ産物を、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１０】
シュードモナス・エルジノーザに関して、「２」以上の希釈平板培養スコアを与えられた形質転換コロニーからのプラスミドを、以下のように単離して、成長阻害を引き起こすゲノムＤＮＡ挿入物を得た。シュードモナス・エルジノーザを、標準的な実験室培地（プラスミドを選択するための１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンまたはストレプトマイシン４０μｇ／ｍｌを有するＬＢ）中で成長させた。マイクロタイタープレート中の１００μｌ培養ウェル中で３０℃で一晩成長させた。挿入ＤＮＡを増幅するために、培養物２μｌを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲミックス２５μｌ中に入れた。ＰＣＲ反応は、９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。プラスミドｐＥＰ５Ｓに関して、以下のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
Ｔ７Ｌ１＋：ＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧ（配列番号１５７８５）
ｐＳｔｒＡ３：ＡＴＡＡＴＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＴＡＴＣＡＴＡＣＧ（配列番号１５７８６）。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間で、ＰＥ  ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９５℃１５分
工程２．９４℃４５秒
工程３．５４℃４５秒
工程４．７２℃１分
工程５．工程２に戻って、２９回
工程６．７２℃１０分
工程７．４℃で保持
ＰＣＲ産物は、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１１】
続いて、精製ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲｍｉｘを用いて直接サイクルシークエンス（配列決定）した。以下のプライマーを配列決定反応に使用した：
Ｔ７／Ｌ２：ＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号１５７８７）。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間で、ＰＥ  ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９４℃１５分
工程２．９６℃１０秒
工程３．５０℃５秒
工程４．６０℃４分
工程５．工程２に戻って、２４回
工程６．４℃で保持
ＰＣＲ産物を、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１２】
Ｅ．フェカリスに関して、「２」以上の希釈平板培養スコアを与えられた形質転換コロニーからのプラスミドを、以下のように単離して、成長阻害を引き起こすゲノムＤＮＡ挿入物を得た。Ｅ．フェカリスを、マイクロタイタープレート中の１００μｌ培養ウェルにおいて、ＴＨＢ１０μｇ／ｍｌＥｒｍ中で、３０℃にて一晩成長させた。挿入ＤＮＡを増幅するために、培養物２μｌを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲｍｉｘ２５μｌ中に入れた。ＰＣＲ反応は、９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。以下のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
ｐＸｙｌＴ５：ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号１５７８３）、およびｐＥＰ／ｐＡＫ１プライマー。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間で、ＰＥ  ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９５℃１５分
工程２．９４℃４５秒
工程３．５４℃４５秒
工程４．７２℃１分
工程５．工程２に戻って、２９回
工程６．７２℃１０分
工程７．４℃で保持
ＰＣＲ産物は、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１３】
続いて、精製ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲｍｉｘを用いて直接サイクルシークエンス（配列決定）した。以下のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
ｐＸｙｌＴ５：ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号１５７８３）。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間で、ＰＥ  ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９４℃１５分
工程２．９６℃１０秒
工程３．５０℃５秒
工程４．６０℃４分
工程５．工程２に戻って、２４回
工程６．４℃で保持
【０３１４】
ＰＣＲ産物は、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１５】
上述の手順それぞれから得られた増幅ゲノムＤＮＡ挿入物を自動配列決定した。エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスの増殖を阻害したアンチセンス核酸のヌクレオチド配列は、添付の配列表に、配列番号８〜３７９５として列挙されている。
【実施例３】
【０３１６】
単離核酸と既知の配列との比較
上述のベクターから得られるサブクローニングしたエシェリヒア・コリのゲノム断片の核酸配列を、以下のデフォルトパラメータ：
フィルタリングオフ、ギャップを開放するためのコスト＝５、
ギャップを伸長するためのコスト＝２、
ランのｂｌａｓｔ部分におけるミスマッチに関するペナルティ＝−３、
ランのｂｌａｓｔ部分におけるマッチに関する報酬＝１、
期待値（ｅ）＝１０．０、
ワードサイズ＝１１、
一行表記数＝１００、
表示するアラインメント数（Ｂ）＝１００を用いて、
ＢＬＡＳＴバージョン１．４またはバージョン２．０．６を使用して、GenBankにおける既知のエシェリヒア・コリ配列と比較した。ＢＬＡＳＴは、Altschul, J Mol Biol. 215:403-10(1990)（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。該ベクターは、センス方向およびアンチセンス方向の両方の核酸配列を含むことが見出された。既知の遺伝子、オープンリーディングフレーム、およびリボソーム結合部位の存在を、遺伝情報を有する公的データベース、ならびにＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐプログラムＦＲＡＭＥＳおよびＣＯＤＯＮＰＲＥＦＥＲＥＮＣＥのような様々なコンピュータプログラムと比較することにより決定した。産生されたＲＮＡ転写物が染色体遺伝子座由来の発現ｍＲＮＡ（または非翻訳ＲＮＡ）に相補的であるように、クローニングした断片がプロモーターに方向付けられる場合、クローンを「アンチセンス」と称した。クローンが、染色体遺伝子座由来の野生型ｍＲＮＡの一部に同一であるＲＮＡ断片をコードする場合、クローンを「センス」と称した。
【０３１７】
上述の発現ベクターから得られるスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、またはエンテロコッカス・フェカリス由来のサブクローニングした断片のヌクレオチド配列を、以下のように、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、またはエンテロコッカス・フェカリス、および他の微生物由来の既知の配列と比較した。まず、各クローンが染色体上の１の位置から生じ、それがキメラでないことを確認するために、選択クローンのヌクレオチド配列を、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、またはエンテロコッカス・フェカリスのゲノム配列と比較して、染色体上の正確な位置にクローンをアラインした。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮ  ｖ２．０．９プログラムを使用して比較し、TIGRから認可された不完全スタフィロコッカス・アウレウスゲノム配列、ならびにＮＣＢＩ非重複性GenBankデータベースを、ゲノムデータの供給源として使用した。サルモネラ・タフィマリアム配列は、Genome Sequencing Center (http://genome.wustl.edu/gsc/salmonella.shtml)、および Sanger Centre (http://www.sanger.ac.uk/projects/S_typhi)から入手可能な配列と比較した。シュードモナス・エルジノーザ配列は、私有データベースおよびNCBI GenBankデータベースと比較した。Ｅ．フェカリス配列は、私有データベースと比較した。
【０３１８】
ＢＬＡＳＴＮ解析は、フィルタリングをオフとした以外はデフォルトパラメータを使用して実施した。多重断片の連結から生じた挿入物についてはさらなる解析は実施しなかった。
【０３１９】
一般に、アンチセンス分子およびそれらの相補的遺伝子は以下のように特定される。まず、考え得る完全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を利用可能なゲノムデータベースから抽出する。かかるデータベースとしては、GenBank非重複性（ｎｒ）データベース、TIGRから利用可能な未完成ゲノムデータベース、およびIncyte Genomicsにより開発されたＰａｔｈｏＳｅｑデータベースが挙げられる。後者のデータベースは、完全ＯＲＦ解析を含む４０個を超える注釈付きの細菌ゲノムを含む。データベースが所定の細菌ゲノムに関して不完全である場合、ゲノム中のすべてのＯＲＦを抽出する必要は必ずしもなく、所定のクローンに相補的である利用可能なゲノム配列の一部におけるＯＲＦのみを抽出することが必要である。GeneMarkのようなＯＲＦを特定するためのコンピュータアルゴリズムが利用可能であり、当該技術分野で既知である。クローンＤＮＡの、相補的ＯＲＦ（複数可）との比較により、クローンがセンスクローンであるか、またはアンチセンスクローンであるかどうか決定することができる。さらに、データベースから抽出された各ＯＲＦは、GenBank（ｎｒ）タンパク質データベース、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ等を含む十分に注釈が付けられたデータベース中の配列と比較することができる。密接に関連した微生物中の遺伝子または密接に関連した遺伝子の説明は、これらのデータベースから入手可能である場合が多い。同様の方法を用いて、非翻訳ＲＮＡをコードする遺伝子に相当するアンチセンスクローンを特定する。
【０３２０】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスの増殖を阻害する上述のクローニングした核酸配列それぞれを用いて、微生物ゲノム配列のＰａｔｈｏＳｅｑ  ｖ４．１（２０００年３月公開）データベース中の対応するスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスのＯＲＦを特定した。この目的で、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮ  ２．０．９コンピュータアルゴリズムを使用した。フィルタリングをオフにした以外はデフォルトパラメータを使用した。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ解析に関するデフォルトパラメータは以下の通りであった：
期待値（ｅ）＝１０
アラインメントヴューオプション：ペアを成す(pairwise)
フィルタークエリー配列（ＢＬＡＡＴＮを用いた場合ＤＵＳＴ、他のものを用いた場合ＳＥＧ）＝Ｔ
ギャップを開放するためのコスト（ゼロは挙動を誘起する）＝０
ギャップを伸長するためのコスト（ゼロは挙動を誘起する）＝０
ギャップドアラインメントに関するＸ下降値（ビットで）（ゼロは挙動を誘起する）＝０
デフライン中のＧＩの表示＝Ｆ
ヌクレオチドミスマッチに関するペナルティ（ＢＬＡＳＴのみ）＝−３
ヌクレオチドマッチに関する報酬（ＢＬＡＳＴのみ）＝１
一行表記数（Ｖ）＝５００
表示するアラインメント数（Ｂ）＝２５０
ヒットを伸長するための閾値＝デフォルト
ギャップドアラインメントの実施（ＢＬＡＳＴＸを用いた場合は利用可能ではない）＝Ｔ
使用するクエリー遺伝コード＝１
ＤＢ遺伝コード（ＴＢＬＡＳＴ［ｎｘ］のみに関して）＝１
使用するプロセッサー数＝１
ＳｅｑＡｌｉｇｎファイル
クエリーデフラインの信頼＝Ｆ
マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２
ワードサイズ＝デフォルト
データベースの有効長（実サイズに関してはゼロを使用）＝０
保持する領域からの最良ヒット数＝１００
ヒットを判断するのに使用される領域長＝２０
検索スペースの有効長（実サイズに関してはゼロを使用）＝０
データベースに対して検索するクエリー鎖（ＢＬＡＳＴ［ｎｘ］およびＴＢＬＡＳＴＸに関して）、３が両方、１が上部、２が下部＝３
ＨＴＭＬ出力の作成＝Ｆ
【０３２１】
あるいは、公的および私的データ源の調査をすることによりＯＲＦを特定およびリファインした。これらの生物に関する完全長遺伝子タンパク質およびヌクレオチド配列は、様々な供給源から構築された。シュードモナス・エルジノーザに関しては、遺伝子配列は、シュードモナス属(Pseudomonas)ゲノム配列決定プロジェクトから採択された（http://www.pseudomonas.comからダウンロード）。クレブシエラ・ニューモニアエ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、およびサルモネラ・ティフィに関しては、ＰａｔｈｏＳｅｑ  ｖ４．１（２０００年３月に公開）からのゲノム配列を、GenePro Inc. 451 Bishop St., N.W., Suite B, Atlanta, GA, 30318, USAから購入した遺伝子発見ソフトウェアＧｅｎｅＭａｒｋ  ｖ２．４ａを用いてＯＲＦについて再解析した。
【０３２２】
誘導プロモーターからの転写が、相補的ＯＲＦ、遺伝子間配列または遺伝子内配列に対するＲＮＡアンチセンスの発現をもたらすクローンとして、アンチセンスクローンが特定された。
【０３２３】
ＯＲＦは、ＰａｔｈｏＳｅｑ以外のデータベースを用いても特定され得ることが理解されよう。例えば、ＯＲＦは、２０００年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／１９１，０７８号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて特定され得る。
【０３２４】
エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスの増殖を阻害するアンチセンス核酸に対応するＯＲＦは、添付の配列表に、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、および５９１６〜１００１２として列挙される。特定されたＯＲＦによりコードされるポリペプチドは、添付の配列に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、および１００１３〜１４１１０として示される。
【０３２５】
他の実施形態では、培養物は、上記に定義されるような相同コード核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む。さらなる実施形態では、培養物は、上記に定義されるような相同ポリペプチドを過剰発現または過小発現する株を含む。
【０３２６】
相同コード核酸は、以下の実施例４に記載されるように得られ得る。
【実施例４】
【０３２７】
相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドの特定
他の病原体からの相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチド（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸に相同的な核酸、配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸に相同的な核酸、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、ならびに１４９４５〜１５７７８のポリペプチドに相同的なポリペプチドを含む）は、以下に記載するような方法を用いて特定され得る。
【０３２８】
例えば、幾つかの実施形態では、本明細書中に記載するスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な核酸、アンチセンス核酸、およびポリペプチド（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸、配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸、ならびに配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、ならびに１４９４５〜１５７７８のポリペプチドを含む）は、原核生物および真核生物において増殖に必要とされる相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドを特定するのに使用され得る。例えば、プラスモディウム(Plasmodium)種のような原生生物、植物、エントアモエーバ(Entamoeba)種およびコントラセクム(Contracaecum)種のような動物、ならびにカンジダ(Candida)種（例えば、カンジダ・アルビカンス）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、およびアスペルギルス・フミガーツスのような真菌の増殖に必要とさえる核酸またはポリペプチドが特定され得る。本発明の一実施形態では、モネラ、具体的にはグラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方を含む細菌を精査して、細胞増殖に必要とされる遺伝子を特定する。同様に、相同アンチセンス核酸も特定され得る。
【０３２９】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要とされる遺伝子およびポリペプチド（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸に相補的な配列、ならびに配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、ならびに１４９４５〜１５７７８のポリペプチドを含む）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびコンピュータデータベース解析のような方法を用いて、これらの生物および他の生物から増殖に必要とされる相同コード核酸または相同ポリペプチドを特定するのに使用することができる。同様に、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、またはサルモネラ・ティフィの増殖を阻害するアンチセンス核酸（配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸、またはそれらに相補的な配列を含む）もまた、核酸ハイブリダイゼーションまたはコンピュータデータベース解析を用いて、相同アンチセンス核酸を特定するのに使用され得る。
【０３３０】
例えば、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の核酸配列（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸、および配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）は、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス、および所定の他の細菌または真菌種から生成されるゲノムライブラリーをスクリーニングするのに使用される。例えば、ゲノムライブラリーは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、またはアナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)を含む他の生物、あるいはブドウ球菌属のコアグラーゼ陰性種を含む上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種の生物由来であり得る。幾つかの実施形態では、ゲノムライブラリーは、エシェリヒア・コリ以外の生物由来であり得る。
【０３３１】
標準的な分子生物学的技法を用いて、様々な細胞または微生物からゲノムライブラリーを作成する。一態様では、ライブラリーを作成し、ニトロセルロース紙に結合する。次に、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４、または配列番号８〜３７９５の核酸、あるいはその一部をプローブとして使用して、相同配列に関してライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０３３２】
例えば、ライブラリーをスクリーニングして、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびにストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を特定してもよい。
【０３３３】
また、ライブラリーをスクリーニングして、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズする核酸配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を特定してもよい。
【０３３４】
続いて、上記のように特定した相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドは、本明細書中に記載される方法で使用することができる。幾つかの実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドは、複数の微生物の増殖に必要とされる遺伝子を特定するのに使用され得る。かかる遺伝子は、複数の微生物に対して有効な広範囲の抗生物質に関する重要な標的である。
【０３３５】
例えば、上述の方法を用いて、配列番号８〜３７９５の配列のうちの１つ、それらの配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれらの配列に相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸あるいは相同アンチセンス核酸を単離することができる。また、上述の方法を用いて、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のヌクレオチド配列のうちの１つ、それらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれらに相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸あるいは相同アンチセンス核酸を単離することができる。幾つかの実施形態では、上述の方法を用いて、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の配列のうちの１つ、それらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸あるいは相同アンチセンス核酸を単離することができる。相同性は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて測定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。例えば、相同ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるコード配列のうちの１つの天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を含んでもよい。かかる対立遺伝子変異体は、配列番号８〜３７９５、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列と比較した場合に、１つまたは複数のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド付加を有し得る。
【０３３６】
さらに、上記手順を用いて、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムを用いて決定される場合に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８のうちの１つの配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号８〜３７９５のうちの１つの核酸により、またはそれらの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、もしくは１５０個の連続アミノ酸を含む断片により発現が阻害されるポリペプチドに対して、少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸配列相同性あるいは類似性を有するポリペプチドをコードする相同コード核酸を単離し得る。あるいは、タンパク質相同性または類似性は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＸ、またはデフォルトパラメータでのＴＢＬＡＳＴＮを用いて特定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０３３７】
あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドは、増殖に関与する核酸もしくはポリペプチドに対する所望レベルのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列相同性を有する配列、または微生物増殖に関与する核酸に対するアンチセンス核酸を特定するためのデータベースを検索することで特定され得る。GenBankおよびGenSeqを含む様々なかかるデータベースは、当業者に利用可能である。幾つかの実施形態では、データベースをスクリーニングすることにより、増殖に必要とされる核酸、増殖を阻害するアンチセンス核酸、または増殖に必要とされる核酸の一部、もしくは増殖を阻害するアンチセンス核酸の一部に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を特定する。例えば、相同コード配列は、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相同的な核酸、それらの配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同的な核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相同的な核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同的な核酸、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相同的な核酸、それらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同的な核酸、あるいは上述の核酸のいずれかに相補的な配列に相同的な核酸を特定するためのデータベースを用いることで特定され得る。他の実施形態では、データベースをスクリーニングすることにより、増殖に関与するポリペプチドまたはその一部に対して、少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸配列相同性あるいは類似性を有するポリペプチドを特定する。例えば、データベースをスクリーニングすることにより、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、ならびに１４９４５〜１５７７８のうちの１つを含むポリペプチドに相同的なポリペプチド、配列番号８〜３７９５のうちの１つの核酸により発現が阻害されるポリペプチド、または上述のポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、もしくは１５０個の連続アミノ酸を含む断片に相同的なポリペプチドを特定し得る。幾つかの実施形態では、データベースをスクリーニングすることにより、相同コード核酸、相同アンチセ��ス核酸または相同ポリペプチドが得られたスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、またはサルモネラ・ティフィ種以外の細胞または微生物からの相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを特定し得る。例えば、データベースをスクリーニングすることにより、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、あるいはアナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella   pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)などの微生物、あるいはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌属を含む、上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種の生物由来の相同ポリペプチドを特定し得る。幾つかの実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドは、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である。
【０３３８】
別の実施形態では、核酸アレイおよびマイクロアレイを用いて、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を特定することができる。核酸アレイは、ガラスチップ、ナイロン膜等の上の特定位置に堆積されたＤＮＡ試料の高密度アレイである。この技術は、例えば米国特許第５８０７５２２号（これは、参照により本明細書に援用される）に見出される。かかる実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を特定したい生物からの核酸を含むアレイを、プローブが相同体に特異的にハイブリダイズし得る条件下で、相同体を特定したい核酸またはその一部を含む検出可能なプローブと接触させる。例えば、アレイは、相同核酸を特定したい生物由来のＯＲＦに相当するＰＣＲ産物を含有する１２×２４ｃｍナイロンフィルターから構成され得る。例えば、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、あるいは相同ポリペプチドをコードする核酸は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)において、あるいはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌属を含む上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種において特定することができる。
【０３３９】
あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を、異種細胞において、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、またはサルモネラ・ティフィ種由来の増殖に必要な配列あるいはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を転写し、アンチセンス核酸が細胞または微生物の増殖を阻害するかどうかを決定することにより特定することができる。
【０３４０】
あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を、相同アンチセンス核酸が特定された微生物において、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的なヌクレオチド配列に相同的なアンチセンス核酸、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相同的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、または上述の核酸のいずれかの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸のような相同アンチセンス核酸を転写して、上述のように微生物の増殖が阻害されるかどうかを決定することにより特定することができる。
【０３４１】
別の実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するための縮重プライマーを生成するために増殖に必要とされるヌクレオチド配列の保存部分を使用することで特定することができる。ＰＣＲ技法は、当該技術分野で既知である。本明細書中で特定されたヌクレオチド配列から生成された縮重プローブを用いてＰＣＲ産物が首尾よく産生されることは、スクリーニングされる種において相同遺伝子配列が存在することを示す。続いて、この相同遺伝子は、本発明で利用される。
【０３４２】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンスの増殖に必要とされる遺伝子、またはそれらに相補的な配列に相同的な核酸は、以下に記載するように、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス以外の細胞または微生物からの相同コード核酸、相同ポリペプチドをコードする核酸、または相同アンチセンス核酸を特定するのに使用され得る。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な遺伝子、またはそれらに相補的な配列に相同的な核酸は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、および上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種における相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドをコードする核酸を特定するのに使用され得る。本発明の幾つかの実施形態では、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、またはサルモネラ・ティフィ由来の増殖に必要な配列、またはそれらに相補的な配列に相同的な核酸（配列番号８〜３７９５の１つに相同的な核酸を含む）は、エシェリヒア・コリ以外の生物において増殖に必要な配列を特定するのに使用される。
【０３４３】
本発明の別の実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドをコードする核酸は、増殖に必要であると特定された配列、またはそれらの一部に相補的なアンチセンス核酸（配列番号８〜３７９５の核酸のような、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つ、またはそれらの配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を含む）を、配列が得られた種以外の種において機能することが可能なベクターに転移することにより特定される。例えば、ベクターは、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)において、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種において機能的であり得る。本発明の幾つかの実施形態では、ベクターは、エシェリヒア・コリ以外の微生物において機能的であり得る。当業者に理解されるように、ベクターは種特異的なある特定の要素を含み得る。これらの要素としては、プロモーター配列、オペレーター配列、レプレッサ遺伝子、複製起点、リボソーム結合配列、終結配列等を挙げることができる。アンチセンス核酸を使用するために、当業者は、培養細菌細胞からの所定の配列を含有するベクターを単離して、これらの配列を単離および精製して、これらの配列をスクリーニングされるべき細菌種において使用するのに適応されるベクターにサブクローニングするための標準的分子生物学的技法を使用することを理解する。
【０３４４】
様々な他の種のためのベクターが当該技術分野で既知である。例えば、エシェリヒア・コリで機能する数多くのベクターが当該技術分野で既知である。また、Pla等は、サルモネラ・タフィマリアム、シュードモナス・プチダ、およびシュードモナス・エルジノーザを含む多数の関連ある宿主において機能する発現ベクターを報告している(J. Bacteriol. 172(8):4448-55 (1990)）。BrunschwigおよびDarzins（Gene (1992) 111:35-4、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）は、シュードモナス・エルジノーザのためのシャトル発現ベクターについて記載した。同様に、様々なグラム陽性微生物にわたって自由に転移可能である発現ベクターの多くの例が存在する。エンテロコッカス・フェカリスのための発現ベクターは、ｐＡＫ８０骨格に適切なプロモーターを組み込むことにより操作され得る（Israelsen, H., S.M. Madsen, A. Vrang, E.B. Hansen and E. Johansen. 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61:2540-2547、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０３４５】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な配列、またはそれらの一部に相補的なアンチセンス核酸を、所定の第２の細胞または微生物（すなわち、特定された核酸が得られた細胞または微生物以外の細胞または微生物）において機能的なベクターにサブクローニングした後に、細菌成長阻害に関して試験するために、アンチセンス核酸を条件的に転写する。転写されると、第２の細胞または微生物の成長を阻害する、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の核酸のヌクレオチド配列を、第２の細胞または微生物の既知のゲノム配列と比較して、第２の生物由来の相同遺伝子を特定する。第２の細胞または微生物由来の相同配列が既知でない場合、相同配列は、上述のように、増殖に必要とされる所定のスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス配列へのハイブリダイゼーションによって、あるいは所定の増殖に必要なヌクレオチド配列に基づいたＰＣＲプライマーを用いた増幅によって特定および単離されてもよい。このようにして、第２の細胞または微生物の増殖に必要とされ得る配列は特定され得る。例えば、第２の微生物は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)であり得るか、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種であり得る。本発明の幾つかの実施形態では、第２の微生物は、エシェリヒア・コリ以外の生物である。
【０３４６】
次に、上述のようにして特定される第２の細胞または微生物由来の相同核酸配列は、アンチセンス方向で、誘導プロモーターのようなプロモーターに作動可能に連結され、第２の細胞または微生物に導入され得る。したがって、増殖に必要とされるスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス遺伝子を特定するための本明細書中に記載される技法を用いて、第２の細胞または微生物由来の特定されたヌクレオチド配列が第２の細胞または微生物の増殖を阻害するかどうかを決定し得る。例えば、第２の微生物は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ��ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)であり得るか、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種であり得る。本発明の幾つかの実施形態では、第２の微生物は、エシェリヒア・コリ以外の生物であり得る。
【０３４７】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス以外の微生物の増殖に必要とされるアンチセンス核酸、またはそれらに相当する遺伝子を、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンスのＯＲＦ（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６−１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸を含む）を含有するマイクロアレイにハイブリダイズさせて、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス配列と他の細胞または微生物由来の増殖に必要な核酸との間の相同性を判定してもよい。例えば、増殖が必要な核酸は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)由来であるか、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種の由来でありうる。幾つかの実施形態では、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要なヌクレオチド配列、または相同核酸は、エシェリヒア・コリ以外の生物の増殖に必要な配列を特定するのに使用される。本発明の幾つかの実施形態では、増殖に必要な配列は、エシェリヒア・コリ以外の微生物由来の配列であってもよい。スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス以外の細胞または微生物由来の増殖に必要な核酸を、プローブがマイクロアレイ上のヌクレオチド配列に対して種々のレベルの相同性を有する場合にハイブリダイゼーションが行われ得る様々な条件下でアレイとハイブリダイズさせてもよい。これは、細胞または微生物間の相同性の示唆、ならびにこれらの細胞または微生物における他の考え得る必須遺伝子への手がかりを提供する。
【実施例５】
【０３４８】
他の細菌種におけるエシェリヒア・コリの増殖に必要とされる核酸に対する核酸相同性の特定
相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドをコードする核酸は以下のように特定され得る。第１の生物において特定されたアンチセンス分子の、第２の生物の増殖を阻害する能力（それにより、第１の生物からの遺伝子に対して相同的な第２の生物中の遺伝子は、第２の生物の増殖に必要とされることを確認する）は、エシェリヒア・コリの成長を阻害するアンチセンス核酸の幾つかを用いることにより実証された。ＩＰＴＧを用いたアンチセンスＲＮＡ発現誘導時にエシェリヒア・コリの成長を阻害する発現ベクターを、エンテロバクター・クロアカエ、クレブシエラ・ニューモニアエ、またはサルモネラ・タフィマリアムに直接形質転換した。次に、上述の方法に従って、形質転換細胞を成長阻害に関してアッセイした。液体培地中での成長後に、細胞を様々な段階希釈で平板培養し、コロニーが観察される希釈度の最大１０倍の希釈度により決定される場合の「誘導対非誘導」アンチセンスＲＮＡ発現に関する成長のｌｏｇ差を算出することによりスコアを決定した。これらの実験の結果を以下の表Ｉに示す。微生物においてアンチセンスＲＮＡ発現の影響が観察されない場合、クローンは表Ｉでマイナス（−）と示される。対照的に、表Ｉ中のプラス（＋）は、用いられる条件下で、その微生物において、非誘導性プレート上のコロニーを観察するのに必要な細胞の数よりも、誘導プレート上のコロニーを観察するのに必要な細胞の数が、少なくとも１０倍より多いことを意味する。
【０３４９】
表Ｉ
エシェリヒア・コリの増殖を阻害するアンチセンス核酸に対する他の微生物の感受性
分子番号  S. typhimurium  E. cloacae  K. pneumoniae
EcXA001         +            +            -
EcXA004         +            -            -
EcXA005         +            +            +
EcXA006         -            -            -
EcXA007         -            +            -
EcXA008         +            -            +
EcXA009         -            -            -
EcXA010         +            +            +
EcXA011         -            +            -
EcXA012         -            +            -
EcXA013         +            +            +
EcXA014         +            +            -
EcXA015         +            +            +
EcXA016         +            +            +
EcXA017         +            +            +
EcXA018         +            +            +
EcXA019         +            +            +
EcXA020         +            +            +
EcXA021         +            +            +
EcXA023         +            +            +
EcXA024         +            -            +
EcXA025         -            -            -
EcXA026         +            +            -
EcXA027         +            +            -
EcXA028         +            -            -
EcXA029         -            -            -
EcXA030         +            +            +
EcXA031         +            -            -
EcXA032         +            +            -
EcXA033         +            +            +
EcXA034         +            +            +
EcXA035         -            -            -
EcXA036         +            -            +
EcXA037         +            +            -
EcXA038         +            +            +
EcXA039         +            -            -
EcXA041         +            +            +
EcXA042         -            +            +
EcXA043         -            -            -
EcXA044         -            -            -
EcXA045         +            +            +
EcXA046         -            -            -
EcXA047         +            +            -
EcXA048         -            -            -
EcXA049         +            -            -
EcXA050         -            -            -
EcXA051         +            -            -
EcXA052         +            -            -
EcXA053         +            +            +
EcXA054         -            -            +
EcXA055         +            -            -
EcXA056         +            -            +
EcXA057         +            +            -
EcXA058         -            -            -
EcXA059         +            +            +
EcXA060         -            -            -
EcXA061         -            -            -
EcXA062         -            -            -
EcXA063         +            +            -
EcXA064         -            -            -
EcXA065         +            +            -
EcXA066         -            -            -
EcXA067         -            +            -
EcXA068         -            -            -
EcXA069         -            +            -
EcXA070         -            -            -
EcXA071         +            -            -
EcXA072         +            -            +
EcXA073         +            +            +
EcXA074         +            +            +
EcXA075         +            -            -
EcXA076         -            +            -
EcXA077         +            +            -
EcXA079         +            +            +
EcXA080         +            -            -
EcXA082         -            +            -
EcXA083         -            -            -
EcXA084         -            +            -
EcXA086         -            -            -
EcXA087         -            -            -
EcXA088         -            -            -
EcXA089         -            -            -
EcXA090         -            -            -
EcXA091         -            -            -
EcXA092         -            -            -
EcXA093         -            -            -
EcXA094         +            +            +
EcXA095         +            +            -
EcXA096         -            -            -
EcXA097         +            -            -
EcXA098         +            -            -
EcXA099         -            -            -
EcXA100         -            -            -
EcXA101         -            -            -
EcXA102         -            -            -
EcXA103         -            +            -
EcXA104         +            +            +
EcXA106         +            +            -
EcXA107         -            -            -
EcXA108         -            -            -
EcXA109         -            -            -
EcXA110         +            +            -
EcXA111         -            -            -
EcXA112         -            +            -
EcXA113         +            +            +
EcXA114         -            +            -
EcXA115         -            +            -
EcXA116         +            +            -
EcXA117         +            -            -
EcXA118         -            -            -
EcXA119         +            +            -
EcXA120         -            -            -
EcXA121         -            -            -
EcXA122         +            -            +
EcXA123         +            -            -
EcXA124         -            -            -
EcXA125         -            -            -
EcXA126         -            -            -
EcXA127         +            +            -
EcXA128         -            -            -
EcXA129         -            +            -
EcXA130         +            +            -
EcXA132         -            -            -
EcXA133         -            -            -
EcXA136         -            -            -
EcXA137         -            -            -
EcXA138         +            -            -
EcXA139         -            -            -
EcXA140         +            -            -
EcXA141         +            -            -
EcXA142         -            -            -
EcXA143         -            +            -
EcXA144         +            +            -
EcXA145         -            -            -
EcXA146         -            -            -
EcXA147         -            -            -
EcXA148         -            -            -
EcXA149         +            +            +
EcXA150         -            -            -
EcXA151         +            -            -
EcXA152         -            -            -
EcXA153         +            +            -
EcXA154         -            -            -
EcXA155         -            -           ND
EcXA156         -            +            -
EcXA157         -            -            -
EcXA158         -            -            -
EcXA159         +            -            -
EcXA160         +            -            -
EcXA162         -            -            -
EcXA163         -            -            -
EcXA164         -            -            -
EcXA165         -            -            -
EcXA166         -            -            -
EcXA167         -            -            -
EcXA168         -            -            -
EcXA169         -            +            -
EcXA171         -            -            -
EcXA172         -            -            -
EcXA173         -            -            -
EcXA174         -            -            -
EcXA175         -            -            -
EcXA176         -            -            -
EcXA178         -            -            -
EcXA179         -            -            -
EcXA180         +            -            -
EcXA181         -            -            -
EcXA182         -            -            -
EcXA183         -            -            -
EcXA184         -            -            -
EcXA185         -            -            -
EcXA186         -            -            -
EcXA187         +            +            +
EcXA189         +            -            -
EcXA190         +            +            +
EcXA191         +            +            -
EcXA192         -            +            -
【０３５０】
したがって、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドをコードする核酸は、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンスの増殖を阻害するアンチセンス核酸の、他の生物の成長を阻害する能力を測定することにより特定され得る。これは、アンチセンス核酸が得られた生物以外の種に直接アンチセンス核酸を形質転換することにより評価され得る。特に、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida  tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種の成長を阻害するアンチセンス核酸の能力を評価し得る。本発明の幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸の、エシェリヒア・コリ以外の生物の成長を阻害する能力を評価してもよい。幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸は、アンチセンス核酸が評価される生物において機能的である発現ベクターに挿入される。
【０３５１】
アンチセンス核酸の、異種生物の増殖を阻害する能力を評価する上記方法は、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な核酸のいずれかに相補的なアンチセンス核酸（配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸のような、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４に相補的なアンチセンス核酸を含む）またはその一部、相同コード核酸に相補的なアンチセンス核酸またはその一部、あるいは相同アンチセンス核酸を用いて実施され得ることが理解されよう。
【０３５２】
異種細胞または微生物における陰性の結果は、その細胞または微生物がその遺伝子を欠如していることを意味するのでなく、かつ陰性の結果はその遺伝子が必須でないことを意味するのでもないことを当業者は理解するであろう。しかしながら、陽性の結果は、異種細胞または微生物がその細胞または微生物の増殖に必要とされる相同遺伝子を含むことを意味する。相同遺伝子は、本明細書中に記載の方法を用いて得ることができる。例えば、相同遺伝子は、相同遺伝子によりコードされる遺伝子産物のレベルまたは活性を低減したアンチセンス配列に基づいたプライマーを用いてＰＣＲ手順を実施することにより、またはサザンブロットを実施することにより単離され得る。
【０３５３】
当業者は、アンチセンス核酸が得られた微生物で作動するアンチセンス分子が、異種細胞または微生物で必ずしも作動するとは限らないことを理解するであろう。
【実施例６】
【０３５４】
他の細菌種におけるスタフィロコッカス・アウレウスの増殖に必要とされる核酸に相同的な核酸の特定
スタフィロコッカス・アウレウス由来の増殖に必要な核酸に相同的な核酸を以下のように特定した。スタフィロコッカス・アウレウスの成長を阻害する３９個のアンチセンス核酸を発現ベクターに挿入し、発現をキシロース誘導Ｘｙｌ−Ｔ５プロモーターの制御下においた。Ｘｙｌ−Ｔ５プロモーターの制御下にあるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有するベクターを用いて、表皮ブドウ球菌におけるＸｙｌ−Ｔ５プロモーターからの発現がスタフィロコッカス・アウレウスにおける発現に匹敵することを示した。
【０３５５】
以下のようにエレクトロポレーションによりベクターを表皮ブドウ球菌に導入した：表皮ブドウ球菌を液体培地中で中対数相(mid-log phase)にまで成長させた後、遠心分離により収集した。細胞ペレットを１／３培養容量の氷冷ＥＰ緩衝液（０．６２５Ｍ  スクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ＝４．０）に再懸濁して、再び遠心分離により収集した。次に、細胞ペレットを１／４０容量のＥＰ緩衝液を用いて再懸濁し、氷上で１時間インキュベートさせた。続いて、細胞を保管のために−８０℃で凍結させた。エレクトロポレーションするために、解凍したエレクトロコンピテント細胞５０μｌをプラスミドＤＮＡ０．５μｇと合わせた後、biorad製の遺伝子パルサエレクトロポレーション装置を用いて、１０ｋＶ／ｃｍ、２６μＦａｒａｄ、２００オームの電気パルスに付した。細胞を外殖培地２００μｌ中にすぐに再懸濁し、２時間インキュベートした後、プラスミドベクターを維持するための選択薬剤とともに、固体成長培地上で平板培養した。これらの平板培養の一晩の成長により得られるコロニーを選択し、選択薬剤とともに液体培地中で培養し、続いてスタフィロコッカス・アウレウスに関して上記したように希釈平板培養分析して、誘導物質キシロースの存在下での成長感受性を試験した。
【０３５６】
結果を以下の表ＩＩに示す。第１カラムは、表皮ブドウ球菌に導入したスタフィロコッカス・アウレウスのアンチセンス核酸の分子番号を示す。第２カラムは、アンチセンス核酸が表皮ブドウ球菌の成長を阻害したかどうかを示し、「＋」は成長が阻害されたことを示す。評価した３９個のスタフィロコッカス・アウレウスのアンチセンス核酸のうち、２０個が表皮ブドウ球菌の成長を阻害した。
【０３５７】
表ＩＩ
スタフィロコッカス・アウレアスの増殖を阻害するアンチセンス核酸に対する他の微生物の感受性
分子番号   S. epidermid
SaXA005        +
SaXA007        +
SaXA008        +
SaXA009        +
SaXA010        +
SaXA011        -
SaXA012        -
SaXA013        -
SaXA015        +
SaXA017        -
SaXA022        +
SaXA023        -
SaXA024        -
SaXA025        +
SaXA026        +
SaXA027        -
SaXA027b       -
SaXA02c        -
SaXA028        -
SaXA029        +
SaXA030        +
SaXA032        +
SaXA033        +
SaXA034        -
SaXA035        +
SaXA037        +
SaXA039        -
SaXA042        -
SaXA043        -
SaXA044        -
SaXA045        +
SaXA051        +
SaXA053        -
SaXA056b       -
SaXA059a       +
SaXA060        -
SaXA061        +
SaXA062        +
SaXA063        -
SaXA065        -
【０３５８】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な核酸のいずれかに相補的なアンチセンス核酸（配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸のような、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４に相補的なアンチセンス核酸を含む）またはその一部、相同コード核酸に相補的なアンチセンス核酸またはその一部、あるいは相同アンチセンス核酸を用いて相同遺伝子を特定する上記方法。
【０３５９】
相同核酸はまた、相補性分析を用いて特定され得る。
【実施例７】
【０３６０】
機能的補完による相同核酸の特定
相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、相同ポリペプチドをコードする核酸は以下のように特定され得る。スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な遺伝子産物または相同ポリペプチドにより活性が補完され得る遺伝子産物は、遺伝子産物の活性を低減または排除する必須遺伝子中に突然変異を有する生物に対してプラスミドまたは細菌人工染色体を導入することにより創出される部分二倍体を用いて特定される。幾つかの実施形態では、突然変異は、温度感受性突然変異のような条件的な突然変異であってもよく、その結果生物は許容条件下では増殖するが、プラスミドまたは細菌人工染色体上の遺伝子による補完がされていない非許容条件下では増殖することは不可能である。あるいは、Roth et al. (1987） Biosynthesis of Aromatic Amino Acids in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, F.C. Neidhardt, ed., American Society for Microbiology, Publisher, pp.2269-2270（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように複製が構築されてもよい。かかる方法は当業者によく知られている。あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、相同ポリペプチドをコードする核酸は、上述のように調節プロモーターの制御下に、増殖に必要とされる遺伝子または増殖に必要とされる遺伝子の少なくとも一部に相補的な核酸をおいて、細胞にプラスミドまたは細菌人工染色体を導入し、プラスミドまたは細菌人工染色体の非存在下で増殖を防止または低減する条件下で増殖することが可能な細胞を特定することにより特定され得る。
【０３６１】
相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、相同ポリペプチドをコードする核酸は、以下のようにデータベースを用いて特定され得る。
【実施例８】
【０３６２】
データベース解析による相同核酸の特定
必須遺伝子に相同的であることを見出すのにデータベース方法論を用いることができることを実証するために、９個の原核生物を分析して、詳細に比較した。まず、各生物の遺伝子配列の最も信頼性の高い供給源を、公的および私的データ源の調査を実施することにより評価した。研究した９個の生物は、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、およびサルモネラ・ティフィである。これらの生物の完全長遺伝子タンパク質およびヌクレオチド配列は様々な供給源から構築された。エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、およびヘリコバクター・ピロリに関しては、遺伝子配列は、公的配列決定プロジェクトから採択され、ＧｅｎＰｅｐｔ１１５データベース（NCBIから利用可能）から得られた。シュードモナス・エルジノーザに関しては、遺伝子配列は、シュードモナス属(Pseudomonas)ゲノム配列決定プロジェクトから採択された（http://www.pseudomonas.comからダウンロード）。クレブシエラ・ニューモニアエ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、およびサルモネラ・ティフィに関しては、ＰａｔｈｏＳｅｑ  ｖ４．１（２０００年３月に公開）からのゲノム配列を、GenePro Inc. 451 Bishop St., N.W., Suite B, Atlanta, GA, 30318, USAから購入される遺伝子発見ソフトウェアＧｅｎｅＭａｒｋ  ｖ２．４ａを用いてＯＲＦについて再解析した。
【０３６３】
続いて、所定の遺伝子に対する全ての相同遺伝子を見つけ出すために、アンチセンス方法論により見出された必須遺伝子を、所定の得られたプロテオームと比較した。この比較は、ＦＡＳＴＡプログラムｖ３．３を用いて行われた。２５％を超えて同一であり、かつ２つの遺伝子間のアラインメントが１の遺伝子の７０％を超える長さを網羅する(cover)場合に、相同的である遺伝子とみなした。上記基準を満たす最も有意なスコアリングマッチとして定義される、９個の生物それぞれに関する最良の相同体を表ＩＩＩに示した。表ＩＩＩは、上述のように評価した９個の生物それぞれで特定した遺伝子に関して、上述のように特定した最良ＯＲＦ（遺伝子座(LOCUS)ＩＤと表示したカラム）、配列番号、同一性、およびクエリー配列と良好にアラインするタンパク質の量（範囲）を列挙する。
【０３６４】
表ＩＶは、本明細書中に記載する方法を用いて、エンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・エルジノーザ、およびスタフィロコッカス・アウレウスにおいて増殖に必要とされると特定された遺伝子のＰａｔｈｏＳｅｑクラスターＩＤを列挙する。同じＰａｔｈｏＳｅｑクラスターＩＤに表示したカラムに示す場合、これらの配列は互いに対して相同性を有し、したがって、同じＰａｔｈｏＳｅｑクラスターに分類される。したがって、本明細書中に記載する方法は、相同性を共有する幾つかの種において増殖に必要とされる遺伝子を特定した。
【０３６５】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６４】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
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【表８４】
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【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
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【表８８】
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【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【表９６】
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【表９７】
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【表９８】
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【表９９】
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【表１００】
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【表１０１】
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【表１０２】
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【表１０３】
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【表１０４】
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【表１０５】
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【表１０６】
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【表１０７】
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【表１０８】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【表１１１】
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【表１１２】
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【表１１３】
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【表１１４】
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【表１１５】
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【表１１６】
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【表１１７】
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【表１１８】
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【表１１９】
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【表１２０】
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【表１２１】
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【表１２２】
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【表１２３】
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【表１２４】
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【表１２５】
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【表１２６】
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【表１２７】
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【表１２８】
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【表１２９】
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【表１３０】
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【表１３１】
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【表１３２】
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【表１３３】
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【表１３４】
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【０３６６】
表ＩＶ
PathoSeq  Enterococcus  Escherichia  Pseudomonas  Staphylococcus
クラスター  faecalis       coli        aeruginosa   aureus
ID
15       EFA102326     ECO101796    PAE100280    SAU102515
55       EFA100151     ECO104157    PAE100416    SAU100633
57       EFA100617     ECO102690    PAE105434    SAU100158
1443      EFA100689     ECO103692    PAE101987    SAU100952
1861      EFA101412     ECO103231    PAE104331    SAU101793
2286      EFA103268     ECO103265    PAE104314    SAU101756
2362      EFA101425     ECO100662    PAE101537    SAU101236
2367      EFA101417     ECO103226    PAE103206    SAU101798
2549      EFA101410     ECO103233    PAE104329    SAU101791
3816      EFA101159     ECO103243    PAE104319    SAU100546
3857      EFA101415     ECO103228    PAE103204    SAU101796
4322      EFA101165     ECO103237    PAE104325    SAU100141
4569      EFA100955     ECO103217    PAE103215    SAU101808
4948      EFA101160     ECO103242    PAE104320    SAU100547
5818      EFA100742     ECO103224    PAE103208    SAU101800
8159      EFA101163     ECO103239    PAE104323    SAU100139
8296      EFA101164     ECO103238    PAE104324    SAU100140
8316      EFA101409     ECO103234    PAE104328    SAU101790
8494      EFA103062     ECO103884    PAE104311    SAU100433
8498      EFA101411     ECO103232    PAE104330    SAU101792
8499      EFA101416     ECO103227    PAE103205    SAU101797
7                     ECO100071    PAE100837    SAU102674
8       EFA101340                  PAE106580    SAU100118
28       EFA101403                  PAE102647    SAU100514
41       EFA101753     ECO100148                 SAU101565
63       EFA101685                  PAE103857    SAU100331
147                    ECO100645    PAE100543    SAU100053
548                    ECO100377    PAE100604    SAU100747
730                    ECO103592    PAE103108    SAU100061
1721      EFA101686     ECO100663                 SAU101996
1749      EFA101477     ECO102557                 SAU100613
2153      EFA102656     ECO100184                 SAU101869
2790      EFA102764     ECO100500                 SAU101578
3164      EFA101162     ECO103240                 SAU102602
3312      EFA103174                  PAE105008    SAU100521
3926      EFA100194     ECO103220                 SAU101806
4441      EFA102541                  PAE105364    SAU101814
5685      EFA100190     ECO103264                 SAU100157
7417      EFA102788     ECO101684                 SAU102992
7437      EFA102351     ECO100084                 SAU100056
7579                    ECO102470    PAE102641    SAU100607
7726      EFA102551     ECO103221                 SAU101805
7727      EFA100978     ECO103218                 SAU101807
8092                    ECO102035    PAE102964    SAU100794
8158      EFA103365                  PAE104318    SAU102880
8161      EFA100210                  PAE104326    SAU102527
8162      EFA101414                  PAE103203    SAU101795
8164      EFA100741     ECO103223                 SAU101801
8493      EFA101141                  PAE104310    SAU100432
10185     EFA102728     ECO104092                 SAU102578
35                     ECO102870                 SAU100497
44                                  PAE101061    SAU101143
54                                  PAE100225    SAU100123
85                     ECO101104                 SAU101262
184                                 PAE104901    SAU101366
362      EFA102736                               SAU100414
575      EFA101790                               SAU100133
579      EFA102110                               SAU101624
911                                 PAE105432    SAU102054
941                    ECO101365                 SAU102162
952      EFA100615                               SAU100964
1084      EFA100289     ECO102819
1141                    ECO102255                 SAU102356
1232                    ECO100703                 SAU101346
1274                                 PAE103655    SAU102264
1337                    ECO102562                 SAU100567
1350                    ECO100930    PAE103901
1374                    ECO103659                 SAU101385
1427      EFA100394                               SAU100714
1535                    ECO101207                 SAU101561
1653      EFA102655                               SAU101868
1849      EFA100642                               SAU101653
1932      EFA100919                               SAU101365
2156      EFA101150                               SAU101271
2189                    ECO102827    PAE100476
2238                    ECO101436                 SAU101092
2338      EFA103038                               SAU100518
2411      EFA102802                               SAU102246
2501      EFA101121                               SAU100996
2974                                 PAE102537    SAU102125
3027                    ECO103959                 SAU200242
3239      EFA103021                               SAU100300
3244      EFA100399                               SAU101891
3386      EFA100426                               SAU100886
3447      EFA102915                               SAU102112
3460      EFA102023                               SAU101399
3682      EFA100740                               SAU101802
3771      EFA101540                               SAU100275
4424      EFA102542                               SAU101815
4654                    ECO100488    PAE106184
5148      EFA100065                               SAU100658
7227      EFA100023                               SAU100436
7240                    ECO103672                 SAU101682
7278                                 PAE101620    SAU301370
7374                                 PAE106765    SAU103042
7375      EFA102051                               SAU103038
7402                    ECO103572    PAE106044
7419                    ECO101686                 SAU102693
7436      EFA101792                               SAU101495
7504      EFA101670                               SAU102603
7653      EFA100397                               SAU100246
7660      EFA102352     ECO103698
7719      EFA100756                               SAU100496
7725      EFA100739                               SAU101803
8040      EFA101736                               SAU101197
8058      EFA103571                               SAU101242
8077      EFA100200                               SAU102231
8082      EFA101080                               SAU100199
8116      EFA101963                               SAU101028
8122      EFA101737                               SAU101198
8141      EFA102780                               SAU102433
8177      EFA103348                               SAU202126
8178      EFA101022                               SAU102283
8181      EFA101541                               SAU102909
8191      EFA102022                               SAU101398
8234      EFA103033                               SAU100745
8237      EFA101682                               SAU101266
8238      EFA103295                               SAU100963
8251                                 PAE100662    SAU100596
8300      EFA101120                               SAU100944
8539      EFA101339                               SAU101400
8610                    ECO103661                 SAU102298
8874      EFA100748                               SAU101155
9028      EFA103210                               SAU100731
9996      EFA102338                               SAU100175
10234     EFA102186                               SAU102933
10248                   ECO102828                 SAU101220
10297                                PAE105229    SAU101381
10328     EFA101079                               SAU101547
10345     EFA100295                               SAU100659
10365     EFA100641                               SAU101655
10393     EFA103504                               SAU100961
10402     EFA101833                               SAU100880
12426     EFA101413                               SAU101794
14277     EFA103081                               SAU200088
14330     EFA101161                               SAU102881
14455     EFA101424                               SAU101771
14520     EFA100211                               SAU101789
15660     EFA103375                               SAU102694
【０３６７】
本明細書の最後にある表ＶＩＡは、上記解析で使用される配列に関する、配列番号、クローン名、および生物を示す。本明細書の最後にある表ＶＩＢは、上記解析で使用される配列に関する、クローン名、クローン配列番号、ＰａｔｈｏＳｅｑ遺伝子座、遺伝子配列番号（タンパク質）、遺伝子マーク付き (Genemarked) 遺伝子、および完全長ＯＲＦタンパク質配列番号を示す。本明細書の最後にある表ＶＩＣは、上記解析で使用される配列のＰａｔｈｏＳｅｑ遺伝子座、ヌクレオチド配列番号、およびタンパク質配列番号を示す。
【０３６８】
本発明の幾つかの実施形態では、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が、所望のレベルの発現を提供する構成的または調節可能なプロモーターのような所望のプロモーターの制御下にある株は、以下の実施例９〜１３において記載するように、相同組換えにより、天然プロモーターを所望のプロモーターで置き換えることにより構築される。実施例９〜１３では代表生物としてカンジダ・アルビカンスを使用しているが、他の生物において同様の方法が利用され得ることが理解されよう。
【実施例９】
【０３６９】
プロモーターを置き換えることによる、増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株の構築
増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株はまた、これらの遺伝子産物の転写を自然に誘導するプロモーターを、所望レベルの発現を提供するプロモーターで置き換えることにより構築され得る。上述のように、かかる株は、増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法、ならびに増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を特定する方法において有用である。
【０３７０】
例えば、幾つかの実施形態では、天然プロモーターは、細胞の染色体上に存在するプロモーターを所望のプロモーターと交換するための相同組換えを用いる技法を用いることにより置き換えることができる。かかる方法論では、プロモーター置換カセット(cassette)を含む核酸が細胞に導入される。図５Ａに示すように、プロモーター置換カセットは、染色体中の天然プロモーターの５’である配列に相同的な５’領域、染色体プロモーターを置き換えるためのプロモーター、および染色体中の天然プロモーターの配列３’に相同的な３’領域を含む。幾つかの実施形態では、プロモーター置換カセットはまた、天然プロモーターの配列５’に相同的な５’領域と染色体プロモーターを置き換えるためのプロモーターとの間に配置された特定可能マーカーまたは選択可能マーカーをコードする核酸を含んでもよい。望ましい場合、プロモーター置換カセットはまた、図５Ｂに示すように、特定可能マーカーまたは選択可能マーカーをコードする遺伝子の転写ターミネーター３’を含んでもよい。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、相同組換えは、天然プロモーターを含有する染色体領域とプロモーター置換カセットとの間で行われ得る。プロモーター置換カセットが染色体に組み込まれた細胞が特定または選択される。相同組換えが起こったことを確認するために、細胞の染色体構造をサザンブロット分析またはＰＣＲにより確証してもよい。
【０３７１】
幾つかの実施形態では、プロモーター置換カセットは、ＰＣＲ産物または制限断片のような線状核酸として細胞に導入されてもよい。あるいは、プロモーター置換は、プラスミド上で細胞に導入されてもよい。図５Ａおよび図５Ｂは、相同組換えによる染色体プロモーターの、所望のプロモーターによる置換を示す。
【０３７２】
幾つかの実施形態では、プロモーター置換カセットが導入された細胞は、線状ＤＮＡで形質転換される細胞の能力を高める突然変異、または相同組換えの頻度を高める突然変異を有し得る。例えば、細胞がエシェリヒア・コリ細胞である場合、その細胞は、ＲｅｃＢＣＤ組換え複合体のエキソヌクレアーゼＶをコードする遺伝子において突然変異を有し得る。細胞がエシェリヒア・コリ細胞である場合、その細胞は、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥＴレコンビナーゼを活性化する突然変異、および／またはＲｅｃＦ経路による組換えを高める突然変異を有し得る。例えば、エシェリヒア・コリ細胞は、ｓｂｃＡまたはｓｂｃＢ突然変異を有するＲｅｃＢまたはＲｅｃＣ突然変異体であり得る。あるいはエシェリヒア・コリ細胞は、ｒｅｃＤ突然変異体であってもよい。他の実施形態では、エシェリヒア・コリ細胞は、λ  Ｒｅｄ組換え遺伝子を発現してもよい。例えば、相同組換えを利用する技法で使用するのに適したエシェリヒア・コリ細胞は、Datsenko, K.A. and Wanner,B.L., PNAS 97:6640-6645 (2000)、Murphy, K.C., J. Bact 180:2053-2071 (1998)、Zhang, Y., et al., Nature Genetics 20: 123-128 (1998)、およびMuyrers, J.P.P. et al., Genes & Development 14: 1971-1982 (2000)（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。同様の遺伝子において突然変異を有する細胞がエシェリヒア・コリ以外の生物で構築され得ることが理解されよう。
【０３７３】
幾つかの実施形態では、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて、調節可能なプロモーターの制御下に、増殖に必要である遺伝子を置いてもよい。
【０３７４】
プロモーター置換が実施されるべき生物が二倍体である場合、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が所望のプロモーターの制御下にある株は、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）（本発明の方法のいずれかで使用されうる増殖に必要とされる遺伝子および遺伝子産物を開示する）に記載される方法を用いて構築され得る。かかる方法では、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の染色体コピーの１つが不活性化される。例えば、遺伝子は、薬剤に対する耐性を提供するか、またはある特定の培養条件下での成長を可能にするポリペプチドのような選択可能または検出可能遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入、あるいはヌクレオチド配列による置換により不活性化され得る。増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の他の染色体コピーは、相同組換えにより調節プロモーターの制御下に置かれる。得られた株は、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を特定するために、および本発明の方法で使用され得る。
【０３７５】
例えば、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が調節プロモーターの制御下にある、二倍体細胞を構築する方法の１つを図６Ａおよび図６Ｂに示す。図６Ａおよび図６Ｂに示した方法では、必須カンジダ・アルビカンス遺伝子ＣａＫＲＥ９の染色体コピーの１つを、ＣａＫＲＥ９遺伝子に相同的な核酸配列がＡＣＴ−１プロモーターおよびＳＡＴ１遺伝子の３’末端にあるＰＣＫ１ターミネーター配列の制御下にあるＳＡＴ１遺伝子を含む核酸に隣接するカセットを用いて崩壊させる。カンジダ・アルビカンス内のエシェリヒア・コリＳＡＴ１遺伝子の存在により、薬剤のアセチル化を可能とし、薬剤を無毒化して、１ミリリットル当たり２００マイクログラムの濃度のストレプトスリシンの存在下で株が成長するのを可能にする。カンジダ・アルビカンス中のＳＡＴ１遺伝子の発現は、そのＤＮＡ配列がこの生物の遺伝コードに順応するように変更されるように遺伝子を操作することにより、ならびにＣａＡＣＴ１プロモーター(Morschhauser et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 257:412-420)およびＣａＰＣＫ１ターミネーター配列(Leuker et al. (1997) Gene 192:235-40)を提供することにより可能となる。この遺伝的に改変されたマーカーはＣａＳＡＴ１と呼ばれ、これは２００１年２月１６日に出願された同時係属中の米国特許出願第０９／７８５，６６９号（公開番号ＵＳ２００１−００３１７２４−Ａ１）（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）の主題である。
【０３７６】
カンジダ・アルビカンスはまた、第２の殺真菌化合物であるブラストサイジンに対して感受性であり、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)由来のその同族耐性遺伝子は、カンジダ・アルビカンスにおける発現のために同様に遺伝的に操作され（ＣａＢＳＲ１）、優性薬剤耐性表現型を付与することがわかった。崩壊されるべきカンジダ・アルビカンス遺伝子の配列５’および３’と同一の約６５ｂｐのフランキング配列を含むいずれかの優性選択可能マーカーのＰＣＲ増幅により、任意の所定のカンジダ・アルビカンス遺伝子用の遺伝子崩壊カセットの構築が可能となる。
【０３７７】
Baudin等(1993, Nucleic Acids Research 21:3329-30)の方法を用いることで、遺伝子崩壊現象が、ＰＣＲ増幅遺伝子崩壊カセットによるカンジダ・アルビカンス株の形質転換、および野生型遺伝子を優性選択可能マーカーで正確に置換させた薬剤耐性形質転換体に関する選択後に達成され得る。かかる突然変異株は、ストレプトスリシン（しかしこれに限定されない）のような薬剤の存在下における成長に関して選択され得る。生じた遺伝子崩壊は一般に、二倍体のカンジダ・アルビカンスにおいてヘテロ接合性であり、１つの相同染色体上の対立遺伝子対の１コピーが崩壊され、他の相同染色体上の他の対立遺伝子は、初期の親株に見られるように野生型対立遺伝子として残存する。崩壊対立遺伝子は非機能的であり、この対立遺伝子からの遺伝子の発現は皆無である。生物のゲノム中の遺伝子全てに関してこのプロセスを繰り返すことにより、遺伝子崩壊の組を生物中のあらゆる遺伝子に関して得ることができる。上記方法は遺伝子の望ましいサブセットにも適用させることができる。
【０３７８】
図６Ａおよび図６Ｂに示す方法では、カンジダ・アルビカンスＣａＫＲＥ９遺伝子の第２の染色体コピーは、置き換えられるべきプロモーター領域に相同的な核酸配列がＣａＨＩＳ３遺伝子（選択可能マーカーをコードする）、ＡＤＨターミネーター（ＣＡＨＩＳ３遺伝子の３’末端に存在する）、およびテトラサイクリン調節可能なプロモーター（以下に記載）を含む核酸に隣接するプロモーター置換カセットを用いて、調節可能なプロモーターの制御下に置かれる。
【０３７９】
テトラサイクリンの調節可能なプロモーター系は、最初はＳ．セレビシエのために開発されたが、カンジダ・アルビカンスで使用するために改変される。Gari et al., 1997, Yeast 13:837-848、およびNagahashi et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:372-375を参照されたい。簡潔に言えば、条件発現は、まずＳ．セレビシエＧＡＬ４（アミノ酸７８５〜８８１）またはＨＡＰ４（アミノ酸４２４〜５５４）の転写活性化ドメインに融合されたエシェリヒア・コリＴｅｔＲテトラサイクリンレプレッサドメインまたはＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜２０７）を含む、トランス活性化融合タンパク質を構築することにより達成される。多重ＣＴＧコドン補正が導入されて、カンジダ・アルビカンス遺伝コードに従った。エシェリヒア・コリＴｅｔＲ（アミノ酸１〜２０７）＋Ｓ．セレビシエＧＡＬ４（アミノ酸７８５〜８８１）、ならびにエシェリヒア・コリＴｅｔＲ（アミノ酸１〜２０７）＋Ｓ．セレビシエＨＡＰ４（アミノ酸４２４〜５５４）のトランス活性化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列はともに、カンジダ・アルビカンスにおける適正な発現のために改変された。
【０３８０】
カンジダ・アルビカンスにおけるトランス活性化タンパク質の構成的発現は、ＣａＡＣＴ１プロモーターおよびＣａＡＣＴ１ターミネーター配列を提供することにより達成することができる。しかしながら、融合タンパク質を発現させるのに、カンジダ・アルビカンスにおいて機能的である任意の調節領域、プロモーターおよびターミネーターを使用することができることが理解されよう。したがって、カンジダ・アルビカンスにおいて機能的なプロモーター、トランス活性化融合タンパク質のコード領域、およびカンジダ・アルビカンスにおいて機能的なターミネーターを含む核酸分子を用いて、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が、調節可能なプロモーターの制御下にある細胞を得ることができる。かかる核酸分子は、プラスミド、コスミド、トランスポゾン、または可動性遺伝子要素であり得る。好ましい実施形態では、ＴｅｔＲ−Ｇａｌ４またはＴｅｔＲ−Ｈａｐ４トランス活性化因子は、ｕｒａ３およびｈｉｓ３栄養要求性マーカーのいずれかを用いることにより、カンジダ・アルビカンス株に安定に組み込むことができる。
【０３８１】
最初はＳ．セレビシエ遺伝子発現のために開発されたヘテロテトラサイクリンプロモーターは、ＡＤＨＩ  ３’ターミネーター配列、可変数のテトラサイクリンオペレーター配列のコピー（２個、４個、または７個のコピー）、およびＣＹＣ１基底プロモーターを含有する。テトラサイクリンプロモーターは、所定の遺伝子のオープンリーディングフレームのすぐ上流に置かれる場合に、テトラサイクリンプロモーター依存性調節に好ましい配向性で、ＣａＨＩＳ３およびＣａＳＡＴ１選択可能マーカーの両方に隣接してサブクローニングされた。ＣａＨＩＳ３−ＴｅｔプロモーターカセットのＰＣＲ増幅により、標的遺伝子のヌクレオチド位置−２００および−１（開始コドンに対して）付近のプロモーター配列に相同的な６５ｂｐのフランキング配列が組み込まれ、それにより形質転換のための条件プロモーター置換断片が産生される。ＣａＳＡＴ１崩壊カセットを用いて、本明細書中に記載するように、ヘテロ接合体とされたカンジダ・アルビカンス株に形質転換されると、プロモーター置換断片と野生型対立遺伝子のプロモーターとの間での相同組換えにより、残存野生型遺伝子がテトラサイクリンプロモーターにより条件付きで調節される遺伝子である株が生成される。形質転換体は、Ｈｉｓ原栄養株として選択され、サザンブロットおよびＰＣＲ分析により確証される。
【０３８２】
図６Ａおよび図６Ｂに示した方法では、プロモーターは、テトラサイクリンの非存在下で誘導され、テトラサイクリンの存在下で抑制される。クロルテトラシクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メクロサイクリン、メトサイクリン、塩酸ミノサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、およびオキシテトラサイクリンを含むが、これらに限定されないテトラサイクリンの類縁体もまた、改変遺伝子対立遺伝子の発現を抑制するのに使用することができる。
【０３８３】
発現を促進するための抗生物質エフェクター分子の結合により活性化され（すなわち、その同族オペレーター配列に結合し）、かつ抗生物質エフェクターの非存在下で抑制される（すなわち、オペレーター配列に結合しない）、ｔｅｔＲ’と称される突然変異テトラサイクリンレプレッサ（ｔｅｔＲ）分子に基づいたテトラサイクリンプロモーター系の代替的変異体を、野生型ｔｅｔＲの代わりに、あるいはｔｅｔＲに加えて使用してもよい。例えば、上記方法は、発現が薬剤輸送に関与する遺伝子（例えば、ＣａＣＤＲ１、ＣａＰＤＲ５、またはＣａＭＤＲ１）が遮断されているような、テトラサイクリンの非存在条件下において抑制されるのが望ましい場合に、ｔｅｔＲの代わりにｔｅｔＲ’を用いて実施することができる。また、上記方法は、抗生物質エフェクター分子の存在下で発現を高めるか、またはさらに抑制するために、ｔｅｔＲが活性化ドメインに融合され、ｔｅｔＲ’が一般的なレプレッサ（例えば、ＣａＳｓｒ６またはＣａＴｕｐ１）に融合された二重活性化／レプレッサ系においてｔｅｔＲおよびｔｅｔＲ’分子の両方を組み込むように適応させることができる(Belli et al., 1998, Nucl Acid Res 26: 942-947、これは参照により本明細書に援用される）。条件発現を提供するこの方法もまた意図される。
【０３８４】
上記方法はまた、対立遺伝子の組換えによる遺伝子の単一対立遺伝子を、ヘテロプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含むプロモーター置換断片で改変することにより一倍体生物に適用させてもよく、その結果遺伝子の発現は、ヘテロプロモーターにより条件付きで調節される。一倍体病原体生物における好ましい遺伝子サブセット、またはその全ゲノムに関してこのプロセスを繰り返すことにより、条件付き突然変異株の収集物または完全な組を得ることができる。好ましい遺伝子サブセットは、他の生物（例えばカンジダ・アルビカンスおよびＳ．セレビシエ）の標的遺伝子と実質的なヌクレオチド配列相同性を共有する遺伝子を含む。例えば、上記方法は、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、黒色アスペルギルス (Aspergillus niger)、黄色アスペルギルス(Aspergillus flavis)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、コクシジオイデス・イムミチス(Coccidioides immitis)、エキソファリア・ダーマティディティス(Exophalia dermatiditis)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、ニューモシスティス・カリーニー(Phneumocystis carinii)、トリコスポロン・ベイゲリイ(Trichosporon beigelii)、リゾープス・アルヒズス(Rhizopus arrhizus)、ムコール・ロウキシイ(Mucor rouxii)、リゾムコール・プシスル(Rhizomucor pusillus)、またはアブシディア・コリムビゲラ(Absidia corymbigera)のような動物真菌病原体、またはボトリチス・シネレア(Botrytis cinerea)、エリシフェ・グラミニス(Erysiphe graminis)、マグナポルテ・グリセア(Magnaporthe grisea)、プシニア・レコディタ(Puccinia recodita)、セプトリア・トリチシイ(Septoria triticii)、チレチア・コントロベルサ(Tilletia controversa)、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)のような植物真菌病原体、あるいは上記種のいずれかの属の範疇にある任意の種を含むが、これらに限定されない一倍体真菌病原体に適用させてもよい。同様に、上記方法は、上記細菌種および属を含む細菌に適用させてもよい。
【０３８５】
条件発現を達成するための手段はテトラサイクリンプロモーター系に制限されず、他の条件プロモーターを用いて実施することができることが理解されよう。かかる条件プロモーターは、例えば、特定の条件下でプロモーターからの転写を抑制するレプレッサにより、あるいは例えば誘導物質の存在下にある場合、プロモーターからの転写を増加するトランス活性化因子により調節され得る。例えば、カンジダ・アルビカンスＣａＰＣＫ１プロモーターは、グルコースの存在下では転写されないが、コハク酸塩のような他の炭素源上で成長させた細胞において高発現レベルを有し、したがって、改変対立遺伝子の条件発現に採用することもできる。この目的のために、ＣａＨＩＳ１およびＣａＳＡＴ１の両方が、上記説明におけるテトラサイクリンプロモーターに対する代替物としてＣａＰＣＫ１プロモーターを用いてグルコース含有培地で成長させるのに必須であることがわかっている。この場合は、ＣａＰＣＫ１プロモーターは、発現される遺伝子にとって異種であり、生物にとっては異種ではなく、かかるヘテロプロモーターもまた本発明に含まれる。テトラサイクリンプロモーターを機能的に置き換えることができる代替的プロモーターとしては、他の抗生物質ベースの調節可能プロモーター系（例えば、プリスチナマイシン誘導性プロモーター、すなわちＰＩＰ）、ならびにカンジダ・アルビカンス条件付き調節プロモーター（例えば、ＭＥＴ２５、ＭＡＬ２、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１、１０、ＳＴＥ２、またはＳＴＥ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８６】
必須ではないが、まず遺伝子崩壊を実施し、ヘテロ接合性株を構築し、薬剤標的確証プロセス中のヘテロ接合体株収集物として別々に収集することができる。所定の遺伝子に関するヘテロ接合性株は、およそ半分の正常一倍体レベルの特定遺伝子産物を発現する。したがって、これらの株は、低減されたレベルのコードされた遺伝子産物を有する構築物を提供し、これらの株は、本明細書中に記載される方法で使用され得る。しかしながら、本発明のこの実施形態で採用されている対立遺伝子改変の手順の順序は重要でなく、条件発現対立遺伝子をまず構築し、続いて残存野生型対立遺伝子を崩壊するなど、種々の順序でこれらの工程を実施することが可能であることが、当業者には明らかである。しかしながら、プロモーター置き換え工程が最初に実施される場合、遺伝子崩壊工程で使用される配列に相同的な配列を欠失させることが好ましい。
【０３８７】
あるいは、条件発現は、条件プロモーターに依存する手段以外の手段により達成することができる。例えば、条件発現は、一倍体またはヘテロ接合性株における野生型対立遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる温度感受性対立遺伝子で置換することにより達成することができ、次に、それらの表現型を非許容温度で解析する。関連するアプローチでは、ヘテロ接合性株において、活性化条件中に遺伝子産物を不安定化するための、残存野生型対立遺伝子へのユビキチン化シグナルの挿入は、遺伝子不活性化に起因する表現型の影響を検査するのに採択され得る。
【０３８８】
別の代替法では、切除可能なトランス活性化因子により調節される構成的プロモーターを使用することができる。プロモーターは、プロモーターに特徴的な基底レベルにまで発現を抑制するために、標的遺伝子に対して上流に置かれる。例えば、株が真菌生物である場合、ｌｅｘＡオペレーター要素を含有する異種プロモーターはｌｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインおよび任意の転写活性化因子ドメイン（例えば、ＧＡＬ４、ＨＡＰ４、ＶＰ１６）から構成される融合タンパク質と併用して、標的遺伝子の構成的発現を提供してもよい。５−ＦＯＡにより媒介される対抗選択を用いて、融合タンパク質をコードする遺伝子を切除した細胞を選択することができる。この手順により、機能的転写活性化因子の非存在下で、ｌｅｘＡ異種プロモーターにより提供される基底レベルへの標的遺伝子の発現の抑制に関連した表現型の検査が可能となる。このアプローチにより生成される株は、本発明で使用され得る。
【０３８９】
あるいは、標的遺伝子の条件発現は、ＤＮＡ結合転写活性化因子ドメインを含有するトランス活性化因子を用いることなく達成することができる。カセットは、標的遺伝子の５’部分に相同的な配列を含有する直列反復配列と隣接した、例えばＵＲＡ３選択可能マーカーの下流にある異種構成プロモーターを含有するように構築され得る。標的の上流にあるさらなる相同配列は、このカセットに付加されると、天然プロモーターの、標的遺伝子の開始コドンまたはオープンリーディングフレームのすぐ上流にある上述の異種プロモーターカセットによる相同組換えおよび置換を促進する。条件発現は、異種構成的プロモーターおよびＵＲＡ３マーカーを切除した（したがって、遺伝子の発現に必要とされる標的遺伝子の上流にある調節配列を欠如する）株を５−ＦＯＡ含有培地を用いることで選択し、同一条件下で成長させた野生型株に対する得られた株の成長を検査することにより達成される。
【０３９０】
標的遺伝子ＣａＫＲＥ９の改変対立遺伝子を構築するのに使用される場合の上記方法の特定の用途を以下の実施例１０に提供する。
【実施例１０】
【０３９１】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が、調節可能プロモーターの制御下にあるカンジダ・アルビカンス株の構築
工程１（すなわち、遺伝子置換）で使用されるＳＡＴ選択可能マーカーのＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＲＣ−ＡＳＰにおけるＳＡＴ崩壊カセットに相補的な２５個のヌクレオチド、およびＣａＫＲＥ９オープンリーディングフレームに隣接する領域に相同的な６５個のヌクレオチドを含有する。図６Ａおよび図６Ｂは、遺伝子産物をコードする遺伝子が、調節可能プロモーターの制御下にあるカンジダ・アルビカンス株を構築する手順を示す。図６Ａおよび図６Ｂが示すように、２．２ｋｂのｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ崩壊断片は、ＰＣＲ増幅および形質転換後の相同組換えによる第１の野生型ＣａＫＲＥ９対立遺伝子の生じた遺伝子置換後に生じた。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：ｐＲＣ１８−ＡＳＰ  ５〜５０ｎｇ、各プライマー１００ｐｍｏｌ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭ  トリス−ｐＨ８．３、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Gibco)１ユニット。ＰＣＲ増幅は、５分  ９４℃、１分  ５４℃、２分  ７２℃を１サイクル、４５秒  ９４℃、４５秒  ５４℃、２分  ７２℃を３０サイクルであった。形質転換は、BraunおよびJohnson(Braun, B.R., and A.D. Johnson(1997), Control of filament formation in Candida albicans by the transcriptional repressor TUP1, Science 277:105-109)に従って、カンジダ・アルビカンスに適応させるためにわずかに変更（３０℃および４２℃でのより短いインキュベート時間（それぞれ１時間および５分）、ならびに形質転換される物質のより多い量（エタノール沈殿したｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ  ＰＣＲ産物５０μｇ）を含む）した酢酸リチウム法を用いて実施した。形質転換した細胞をＹＰＤプレート上へ延展して、３０℃で一晩インキュベートし、ＳＡＴの発現のためのプレインキュベーション時間を提供し、その後ストレプトスリシン（４００μｇ／ｍｌ）を含有するＹＰＤ培地上へのレプリカ平板法を行った。ストレプトスリシン耐性コロニーは、３６時間後に検出され、ｃａｋｒｅ９Δ：ＳＡＴ／ＣａＫＲＥ９ヘテロ接合体は、ＣａＫＲＥ９およびｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ対立遺伝子の両方を増幅する適切なプライマーを用いたＰＣＲ分析により特定された。
【０３９２】
工程２（プロモーター置換）で使用される条件プロモーターのＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＢＳＫ−ＨＴ４におけるＣａＨＩＳマーク付きテトラサイクリン調節プロモーターカセットに相補的な２５個のヌクレオチド、および転写開始点に対して−２７０〜−２０５のプロモーター領域に相当する相同配列の６５個のヌクレオチド、およびＣａＫＲＥ９オープンリーディングフレームのヌクレオチド１〜６５を含有する。生じた２．２ｋｂのＰＣＲ産物を、工程１で産生したｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ／ＣａＫＲＥ９ヘテロ接合性株に形質転換して、Ｈｉｓ+形質転換体をＹＮＢ寒天上で選択した。ｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ対立遺伝子およびＣａＨＩＳ３−Ｔｅｔ−ＣａＫＲＥ９対立遺伝子の両方を含有する真正ＣａＫＲＥ９株をＰＣＲ分析により決定した。通常、２個の別個の株を構築して評価し、任意の所定の薬剤標的の最終的な表現型について信頼性の高い決定をする。最終的な表現型は、必須遺伝子の遺伝子産物の非存在により引き起こされる表現型である。
【０３９３】
生じた株の表現型を以下のように評価した。
【実施例１１】
【０３９４】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が、調節可能なプロモーターの制御下にあるカンジダ・アルビカンス株の表現型の評価
３つの別個の方法を用いて、ＣａＫＲＥ９遺伝子の１コピーが崩壊され、他方の１コピーが調節可能なプロモーターの制御下にあるカンジダ・アルビカンス株の表現型を評価した。最初に、ＹＮＢプレート、および１００μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＹＮＢプレートの両方の上に、およそ１．０×１０6個の細胞を画線(streak)して、室温で４８時間後の成長速度を比較することにより、株の最終的な表現型を迅速に決定した。ＣａＫＲＥ９のような必須遺伝子に関して、テトラサイクリンの存在下では有意な成長は検出されない。第２のアプローチでは、テトラサイクリンプロモーター調節標的遺伝子の発現に通常必要とされるトランス活性化因子遺伝子が（標的化組み込み中に創出されるＣａＬＥＵ２配列複製間の組換えにより）切除されたｕｒａ-細胞を選択するために、６２５μｇ／ｍｌ  ５−フルオロ酸(flororotic acid)（５ＦＯＡ）および１００μｇ／ｍｌ  ウリジンを含有するカザミノ酸プレート上に細胞を画線することにより、遺伝子の本質的性質が決定され得る。また、増殖に必要とされない遺伝子の１コピーが崩壊され、他のコピーが調節可能なプロモーターの制御下にある株がかかる条件下で活発な成長を示すのに対して、上述のように調製したＣａＫＲＥ９株は成長できない。ＣａＫＲＥ９株と関連した最終的な表現型の定量的評価は、１００μｇ／ｍｌ  テトラサイクリンを補充しないＹＮＢ５．０ｍｌ、またはそれを補充したＹＮＢ５．０ｍｌに接種した２×１０3個の細胞／ｍｌの一晩培養物を用いて、３０℃での２４時間および４８時間のインキュベーション後に、光学密度（Ｏ．Ｄ．600）を測定することにより実施される。通常、増殖に必要とされる遺伝子が誘導プロモーターの制御下にある株に関して、光学密度の有意な増加が、誘導物質の非存在下で４８時間後に検出されることはない。実証した必須遺伝子に関する細胞死（殺傷性(cidal)）と成長阻害（静止(static)）の最終的な表現型の区別は、２４時間および４８時間のインキュベーション後の上記テトラサイクリン処理培養物からの生存細胞（Ｔ＝０での２×１０3個の洗浄細胞の等価物からのコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の数により判断されるような）の割合を決定することにより達成される。殺傷性の最終的な表現型をもたらす株は、抑制条件下におけるインキュベーション後に生存細胞の割合の減少（すなわち、２×１０3個ＣＦＵ未満）を示す株である。
【０３９５】
テトラサイクリンで調節可能なプロモーターの制御下にある遺伝子産物レベルの変動を決定するために、実施例１２に記載する実験を実施した。
【実施例１２】
【０３９６】
誘導条件および抑制条件下での標的レベルの変動
ＣａＨＩＳ３ヘテロ接合体株、およびＣａＨＩＳ３遺伝子の染色体の１コピーが崩壊され、他方が調節可能なプロモーターの制御下にあるテトラサイクリンプロモーター調節ＣａＨＩＳ３株の両方を、３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）に対する感受性に関して野生型（二倍体）ＣａＨＩＳ３株と比較した（図７Ａ〜図７Ｄ）。３−ＡＴとは、ＣＡＨＩＳ３によりコードされる酵素であるイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼの競合阻害剤であり、ともにそれぞれ薬剤のモデルおよび薬剤標的として作用する。テトラサイクリンプロモーターにより維持されるＣａＨＩＳ３の構成的発現レベルにより達成される過剰発現は、野生型およびＣａＨＩＳ３ヘテロ接合体株の両方の成長を完全に阻害するのに十分な濃度で３−ＡＴ耐性を付与する（図７Ａ）。観察される表現型は、ノーザンブロット分析により決定されるＣａＨＩＳ３の予測７．５倍過剰発現を考慮して予測されたものと一致している（図８を参照）。ヘテロ接合性ＣａＨＩＳ３株は、野生型またはテトラサイクリンプロモーターベースの過剰産生ＣａＨＩＳ３株のいずれかに顕著に影響を及ぼすことが不可能な中程度の３−ＡＴ濃度に対して感受性の増加（すなわち、ハプロ不全表現型）を示す（図７Ｂ）。３−ＡＴに対する差次的感受性に関して評価した第３のＣａＨＩＳ３発現レベルは、完全な遮断を達成するのに通常使用されるテトラサイクリン０．１％の閾値濃度を用いて、テトラサイクリン調節株の部分的抑制によりもたらされた。
【０３９７】
このＣａＨＩＳ３発現のレベルは、生育に必要とされる最小発現レベルを表し、予想通り、中程度の３−ＡＴ濃度でヘテロ接合性ＣａＨＩＳ３株に対して薬剤感受性の増加を示す（図７Ｃ）。同様に、フルコナゾールおよびツニカマイシンに対する株特異的薬剤耐性および感受性表現型は、それらのそれぞれ既知の薬剤標的であるＣａＥＲＧ１１およびＣａＡＬＧ７の発現レベルの増加および減少により示された。ともにこれらの結果は、３つの異なる発現レベルがカンジダ・アルビカンス株収集物を用いて達成され、それらは、既知の薬剤とそれらの既知の薬剤標的との間の予測薬剤感受性表現型を示すことを実証する。
【実施例１３】
【０３９８】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードするカンジダ・アルビカンス遺伝子の特定
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードするカンジダ・アルビカンス遺伝子は、上述のように遺伝子の染色体の１コピーが崩壊され、遺伝子の他の染色体コピーが調節可能なプロモーターの制御下にある株を構築することにより特定される。増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を特定するために、遺伝子の改変対立遺伝子を含有する株を、条件発現下にある遺伝子の第２の改変対立遺伝子が実質的に過小発現されるか、または発現されない条件下で培養した。株の生存度および／または成長を、同じ条件下で培養した野生型株の生存度および／ｍまたは成長と比較した。生存度もしくは成長の損失または低減は、遺伝子によりコードされる遺伝子産物が増殖に必要とされることを示した。上述に記載するようにして調製した株が遺伝子を発現するレベルは、非改変対立遺伝子の５０％未満、３０％未満、２０％未満、好ましいくは１０％未満であり得る。使用される異種プロモーターに応じて、発現レベルは、例えば抗生物質、金属イオン、特定の化学物質、栄養分、ｐＨ、温度等により制御され得る。
【０３９９】
例えば、上述の方法を用いたカンジダ・アルビカンス条件遺伝子発現は、ＣａＫＲＥ１、ＣａＫＲＥ５、ＣａＫＲＥ６、およびＣａＫＲＥ９を用いて実施された（図９）。ＣａＫＲＥ５、ＣａＫＲＥ６、およびＣａＫＲＥ９は、Ｕｒａブラスター法を用いた遺伝子崩壊により実証されるように、カンジダ・アルビカンスにおいて必須であるか、または条件付きで必須であることが予測される（ＣａＫＲＥ９ヌル株は、グルコース上で生存不可能であるが、ガラクトース上では生存可能である）。ＣａＫＲＥ１は、カンジダ・アルビカンスにおいて、Ｕｒａブラスター法を用いて非必須遺伝子として実証されている。上記遺伝子に関してヘテロ接合性株は、ＣａＳＡＴ１崩壊カセットを用いたＰＣＲベースの遺伝子崩壊方法、続いて野生型対立遺伝子の天然プロモーターのテトラサイクリン調節プロモーター置換により構築された。これらの株がそれぞれ活発に成長することは、テトラサイクリンの非存在下で発現が正常に進行することを示唆する。テトラサイクリンが成長培地に添加されると、これらのテトラサイクリンプロモーター調節遺伝子の発現は有意に減少されるか、または発現しなくなる。テトラサイクリンの存在下では、上記の３つの必須のカンジダ・アルビカンス遺伝子それぞれが調節可能なプロモーターの制御下にある株は成長が止まった。予想通り、ＣａＫＲＥ１株のみが、ＣａＫＲＥ１発現の抑制にもかかわらず活発な成長を示す。
【０４００】
標的の確証における上記方法の有用性をさらに検査するために、４つの既知の必須遺伝子ＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ７、ＣａＡＵＲ１、およびＣａＦＫＳ１、ならびに予測必須遺伝子ＣａＳＡＴ２、およびＣａＫＲＥ１の発現が調節可能なプロモーターの制御下にある株の成長を、誘導条件下と抑制条件下とで比較した（図１０）。予想通り、ＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ７、ＣａＡＵＲ１、およびＣａＦＫＳ１が調節可能なプロモーターの制御下にある株は、非必須遺伝子ＣａＫＲＥ１が調節可能プロモーターの制御下にある株と異なり、抑制条件下で成長することはできなかった。さらに、予想通り、ＣａＳＴＡ２遺伝子が調節可能プロモーターの制御下にある株は、カンジダ・アルビカンスにおいてこの遺伝子が不可欠であることを示す。カンジダ・アルビカンスにおいて使用するための優性選択可能マーカーとして操作されたＣａＳＡＴ２遺伝子は、Ｓ．セレビシエ遺伝子に相同的であるが、エシェリヒア・コリのＳａｔ１遺伝子に無関係であるカンジダ・アルビカンス遺伝子である。
【０４０１】
生成された他の崩壊データに基づくすべての場合に、テトラサイクリン調節遺伝子がテトラサイクリンの存在下で非機能的であるレベルに抑制されることは、予測される応答である。さらに、Ｓ．セレビシエ対応物が必須でないことが既知である２つのさらなるカンジダ・アルビカンス遺伝子（ＣａＹＰＤ１、およびＣａＹＮＬ１９４ｃ）に、条件遺伝子崩壊の上記方法論を適用する際に、これらの株がテトラサイクリンの存在下でインキュベートされる場合に成長阻害は観察されなかった。これらの結果は、条件遺伝子発現の上記方法が遺伝子不可欠性に関して信頼性の高い指標であることを示す。
【０４０２】
さらに、カンジダ・アルビカンスにおける必須遺伝子の完全組を特定するための迅速かつ正確な手段であるこの方法の有用性は、遺伝子崩壊および条件発現の上記２工程方法を用いた、多数の遺伝子のヌル表現型の分析により実証された。標的遺伝子は、真菌特異的かつ必須であるとして選択された。かかる遺伝子は、以下に記載するスクリーニングアッセイにおける標的必須遺伝子と称される。
【０４０３】
文献検索により、総計８９個の遺伝子に関するＵＲＡブラスターベースの遺伝子崩壊実験の報告を特定し、ホモ接合性欠失株を構築することができないことに基づいて総計８９個の遺伝子のうちの１３個の遺伝子を必須であると推定した。１３個の遺伝子は、ＣａＣＣＴ８(Rademacher et al., Microbiology, UK 144, 2951-2960 (1998))、ＣａＦＫＳ１(Mio et al., J. Bacteriol, 179, 4096-105 (1997)、およびDouglas, et al., Antimicrob Agents Chemother 41, 2471-9 (1997))、ＣａＨＳＰ９０(Swoboda et al., Infect Immun 63, 4506-14 (1995))、ＣａＫＲＥ６(Mio et al., J. Bacteriol 179, 2363-72 (1997))、ＣａＮＭＴ１(Weinberg et al., Mol Microbiol 16,241-50 (1995))、ＣａＰＲＳ１(Payne et al., J. Med. Vet. Mycol. 35, 305-12 (1997))、ＣａＰＳＡ１(Care et al., Mol Microbiol 34, 792-798 (1999))、ＣａＲＡＤ６(Care et al., Mol Microbiol 34, 792-798 (1999))、ＣａＳＥＣ４（Mao et al., J. Bacteriol 181, 7235-7242 (1999))、ＣａＳＥＣ１４(Monteoliva et al., Yeast 12, 1097-105 (1996))、ＣａＳＮＦ１(Petter et al., Infect Immun. 65, 4909-17 (1997))、ＣａＴＯＰ２(Keller, et al., Biochem J., 329-39 (1997))、およびＣａＥＦＴ２(Mendoza et al., Gene 229, 183-1991 (1999))である。これらの１３個の推定必須遺伝子、ならびにカンジダ・アルビカンスのＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ１、およびＣａＡＵＲ１は、上記方法によって最初は特定されない。しかしながら、これらの１７個の遺伝子のいずれか１つが調節可能なプロモーターの制御下にある株（例えば、図１０のＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ１、およびＣａＡＵＲ１株、ならびに図９のＣａＫＲＥ６株）は、本発明の方法で使用され得る。これらの１７個の遺伝子のいずれかは、上述の方法における比較対照として、あるいは必須遺伝子の収集における不可欠性に関する陽性対照として含まれてもよい。これらの１７個の遺伝子のいずれかに対応するヌクレオチド配列を含む核酸分子は、薬剤標的として本発明の方法において使用されてもよく、あるいはそれらは、キット中または核酸マイクロアレイ中の対照として、別個にあるいはサブグループに含まれてもよい。
【０４０４】
上述に記載するような方法を用いて、配列番号１４９４５〜１５７７８のポリペプチドをコードする配列番号１４１１１〜１４９４４の遺伝子は、増殖に必要であると特定された。本明細書の最後に提供した表ＶＩＩに、それらのカンジダ属名称とともに特定遺伝子の配列番号を列挙する。表ＶＩＩに示されるカンジダ属名称は、特定カンジダ・アルビカンス遺伝子に相同的であるサッカロミセス・セレビシエ遺伝子を特定することにより系統立てられた。カンジダ属名称はまた、サッカロミセス・セレビシエゲノムにおける相同サッカロミセス・セレビシエ遺伝子の位置を参照して記載している。例えば、カンジダ名称ＣａＹＡＬ０３８Ｗは、相同サッカロミセス・セレビシエ遺伝子が酵母染色体１（例えば、ＹＢは酵母染色体２を意味する）、セントロメアの左アーム（Ｒはセントロメアの右アームを意味する）、位置０３８、ワトソン鎖に関するｗ（クリック鎖に関するｃ）上に存在していたことを意味する。相同サッカロミセス・セレビシエ遺伝子は、genome-www.stanford.edu/saccharomycesから特定された。配列番号１４１１１〜１４９４４の遺伝子、配列番号１４１１１〜１４９４４に相補的な核酸、または配列番号１４９４５〜１５７７８のポリペプチドに対する相同性を有する相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、および相同ポリペプチドは、上述の方法のいずれかを用いて特定され得る。
【０４０５】
上述のように構築される株の改変遺伝子の不可欠性を評価するために、代替的方法が利用可能である。上述のように構築された株内の改変遺伝子対立遺伝子の発現の抑制は、トランス活性化因子タンパク質をコードする遺伝子の相同組換え媒介性切除により可能である。例えば、標的遺伝子の条件発現がテトラサイクリン調節プロモーターを用いて達成される場合、構成的発現（非抑制条件下）は、トランス活性化因子遺伝子（ＴｅｔＲ−ＧＡＬ４ＡＤ）の相同組換え媒介性切除により抑制され得る。このようにして、無条件に達成可能な抑制レベルは、トランス活性化因子タンパク質のテトラサイクリン媒介性不活性化により産生されるレベルとは別個に産生される。トランス活性化因子遺伝子の切除は、株構築に使用される選択可能マーカーおよび組み込み戦略により可能となる。ＴｅｔＲ−ＧＡＬ４ＡＤトランス活性化因子遺伝子を含有するＣａＵＲＡ３マーク付きプラスミドの、ＣａＬＥＵ２遺伝子座への安定な組み込みは、組み込まれたプラスミドに隣接するＣａＬＥＵ２のタンデム複製をもたらす。続いて５−ＦＯＡ含有培地上での対抗選択を実施して、ＣａＵＲＡ３マーク付きトランス活性化因子遺伝子の切除に関して選択し、この代替的な抑制戦略により標的遺伝子は必須であることがわかるかどうかを直接検査することができる。
【０４０６】
５−ＦＯＡ含有培地上で必須であると特定されたが、テトラサイクリン補充培地上で任意の検出可能な成長障害のない遺伝子の例は、遺伝子ＣａＹＣＬ０５２ｃ、ＣａＹＮＬ１９４ｃ、およびＣａＹＪＲ０４６ｃの３つである。おそらくこれは、テトラサイクリンの添加により不完全に不活性化される遺伝子産物よりも、トランス活性化因子遺伝子が完全に排除された条件下でより低い基底レベルの発現を示す標的遺伝子に起因する。したがって、上述の方法は、所定の遺伝子が宿主株の生存に必須であるかどうかを決定するための２つの別個のアプローチを提供する。
【実施例１４】
【０４０７】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を、過剰発現または過小発現することが可能な細胞を生成するためのプロモーター置換
プロモーター置換のための標的を選択する。プロモーター置換カセットは、ｒｒｎＢターミネーターおよびｌａｃプロモーターがＣＡＴ遺伝子の３’に位置するように、ｐＡＣＹＣ１８４に、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２転写ターミネーター、続いてｌａｃプロモーターを含む核酸を挿入することにより得られる。プロモーター置換カセット（ＣＡＴ−ｒｒｎＢＴ１Ｔ２−ｐｌａｃ）はＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ産物は、標的プロモーター（すなわち、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を誘導するプロモーター）に対する相同性を有する６０〜８０ｂｐ、および上述のようにＣＡＴ／ｒｒｎＢＴ１Ｔ２／ｐｌａｃテンプレートに対する相同性を有する２０ｂｐを有するプライマーを用いた別のラウンドのＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。相同性を有する領域は、相同組換え時に、ＣＡＴ／ｒｒｎＢＴ１Ｔ２／ｐｌａｃカセットが標的遺伝子のプロモーターを置換するが、そのShine-Delgarnoモチーフは影響を受けない状態にしておくように選択される。
【０４０８】
プロモーター置換カセットは、コンピテントＪＣ８６７９に形質転換される。ＪＣ８６７９は、E. coli genetics stock centerから入手可能である。ＪＣ８６７９は、短い線状ＤＮＡの組換えを可能とし、またｌａｃプロモーターの滴定調節を可能とするｌａｃＹ突然変異を含有する。様々なレベルのＩＰＴＧを含有するＬＢ／クロラムフェニコールプレート上に形質転換細胞を蒔き、正確なレベルの発現が達成されることを保証し、生存可能とする。プロモーター置換カセットが正確に組み込まれたかどうかは、コロニーＰＣＲにより確認される。望ましい場合、挿入プロモーターによる標的遺伝子の適正な調節は、誘導物質が存在しないか、またはもとのコロニーが得られるレベルよりも低レベルで存在する場合に、成長欠陥に関して組み込み体を試験することにより確認され得る。誘導物質（ＩＰＴＧ）の非存在下、またはクローンを得るのに使用されたよりも低レベルの誘導物質の存在下で成長することができないことにより、標的遺伝子が挿入プロモーターにより適正に調節されることが確認される。ｌａｃプロモーターおよび株ＪＣ８６７９を例として使用しているが、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を、過剰発現または過小発現することが可能な細胞を生成するために、上記方法は、任意の適切な調節可能プロモーターおよび生物または株を用いて実施することもできることが理解されよう。
【実施例１５】
【０４０９】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を、過剰発現または過小発現することが可能な細胞を生成するためのオペレーター挿入
それぞれの側に標的プロモーターに相同的な４０個のヌクレオチドが隣接したｌａｃオペレーターを含むオリゴヌクレオチドを設計する。標的プロモーターは、オペロン中のｙａｂＢ  ｙａｂＣ  ｆｔｓＬ  ｆｔｓＩ  ｍｕｒＥ遺伝子のような増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を駆動するプロモーターである。オリゴヌクレオチド配列（配列番号１５８１０）およびプロモーターに相同的な領域の位置を図１１に示す。プロモーターの配列はまた、示した−１０領域および−３５領域の位置ととともに示されている（配列番号１５８１１）。一本鎖オリゴヌクレオチドを、λ  ＢｅｔａおよびＧａｍタンパク質を発現する細菌に形質転換する。形質転換混合物中の細胞を希釈して、ＩＰＴＧを含有する培地上で平板培養する。ｌａｃオペレーターが標的プロモーターに組み込まれたコロニーを、コロニーＰＣＲにより特定する。望ましい場合、挿入オペレーターによる標的プロモーターの適正な調節は、ＩＰＴＧを含有するか、またはＩＰＴＧを含有しない培地中で特定されたコロニーを成長させることにより確認される。コロニーは、ＩＰＴＧを含有する培地上で増殖するが、ＩＰＴＧを含有しない培地上では成長することができず、それにより標的プロモーターが挿入オペレーターにより適正に調節されることを確認する。増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を過剰発現または過小発現する細胞を生成するために、上述の方法は、任意の標的プロモーターおよび任意のオペレーターを用いて実施することができることが理解されよう。
【０４１０】
本発明の方法において、増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株は、生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定するか、または化合物の活性をプロファイリングするために使用される。実施例１６〜１８は、増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する細胞を用いて、生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法について記載している。
【実施例１６】
【０４１１】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を過剰発現する株は、高い抗生物質濃度において成長することが可能である
増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する細胞が高い抗生物質濃度において成長することが可能であることを確認するために、既知の抗生物質の標的であるスタフィロコッカス・アウレウス由来の１１個の遺伝子を、以下のように上述のキシロース誘導性プロモーターＸｙｌＴ５に作動可能に連結した。遺伝子、およびこれらの遺伝子の産物を標的とする抗生物質を以下の表Ｖに列挙する。
【０４１２】
表Ｖに示すようにスタフィロコッカス・アウレウスの増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする１１個の遺伝子それぞれに関して、ＰＣＲプライマー対を設計した。各遺伝子用の上流プライマーは、天然リボソーム結合部位（Ｓ−Ｄ配列）を含んでいた。さらに、遺伝子の指向性クローニングを促進するために、適切な制限酵素用の制限部位をプライマーに設計した。ＰＣＲ反応は、反応容量５０μｌ当たり、以下の条件（Ｐｆｕポリメラーゼ２Ｕ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、プライマーそれぞれ４００ｎＭ、スタフィロコッカス・アウレウスＲＮ４５０ゲノムＤＮＡ（テンプレート）５〜１０ｎｇ）下で、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene, San Diego)を用いて実施した。反応は、９４℃で５分間の初期加熱、続いて９４℃で３０秒／５５℃で３０秒／７２℃で５分間を２５サイクル、および７２℃での伸長を７分で終了という条件で行った。
【０４１３】
増幅遺伝子を、以下のようにＸｙｌＴ５プロモーターに作動可能に連結した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲクリーニングキットを用いて精製し、続いて適正な制限酵素を用いて消化した。得られた断片を、ＸｙｌＴ５プロモーターを含有するプレカットベクターＤＮＡと１６℃で一晩連結させた。連結混合物を、０．３Ｍ  酢酸ナトリウムの存在下で−８０℃で２０分間エタノール沈殿した。沈殿ＤＮＡを４℃にて３０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心沈殿させ、７０％ＥｔＯＨ１ｍｌで洗浄した。ＤＮＡペレットを風乾し、ＥＢまたは滅菌水中に溶解した。スタフィロコッカス・アウレウス細胞を形質転換するために、沈殿ＤＮＡをエレクトロポレーションコンピテント細胞４５μｌと混合して、室温で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ／細胞混合物を、２ｍｍキュベット中でエレクトロポレートし（設定：２ボルト、２５μＦ、２００Ω）、０．２μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＢ２培地４５０μｌと混合した。細胞を振とうしながら３７℃で９０分間インキュベートした。形質転換細胞を、プラスミド選択のためにクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレート上へ蒔いた。各クローニング反応のための幾つかのコロニーを採取し、画線して、純粋な培養物を得た。ベクター特異的プライマーを用いたコロニーＰＣＲ反応を実施して、挿入物の大きさと独自性を確認した。
【０４１４】
遺伝子歩行(gene-walking)配列決定を用いて、各クローニングされた遺伝子の幾つかのクローンに関して全挿入物を完全に配列決定した。ＰＣＲプロセス中にＤＮＡ配列が突然変異されたクローン化遺伝子を使用することを回避するためにこれを実施した。
【０４１５】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が適正な誘導物質レベルでの誘導時にそれらの特定の阻害剤に対する耐性を付与することができることを実証するために、その遺伝子がキシロース誘導性プロモーターに作動可能に連結された各クローンの細胞を、種々の抗生物質濃度および誘導物質濃度の組合せで、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ培地中で成長させた。これは、１０倍過剰量でマトリックスフォーマットにおいて勾配濃度で抗生物質および誘導物質を含有するマイクロタイタープレート（９６または３８４ウェル）を用いて達成された（図１２を参照）。播種した細胞を含む培地（９倍容量）を、５０μｌ（３８４ウェルプレートに関して）または２００μｌ（９６ウェルプレートに関して）の最終容量のために、抗生物質／誘導物質１倍容量を含有するウェルに分配した。プレートを周期的に振とうしながら３７℃でインキュベートし、細胞の成長を、Ｕｌｔｒａｍａｒｋリーダーを用いてＯＤ６００での光学密度の自動測定によりモニタリングした。有意な成長が、適切な誘導物質濃度において特定濃度の抗生物質が存在する条件下では観察されたが、その特定の抗生物質濃度において誘導物質が非存在である条件下では観察されなかった場合、特定の遺伝子を過剰発現するクローンをその特定抗生物質（阻害剤）に対して耐性であるとした。
【０４１６】
結果を図１３および図１４に示す。図１３に示すように、適切な濃度の誘導物質においてｄｅｆＢ遺伝子産物を過剰発現する細胞は、ｄｅｆＢ遺伝子産物に作用する高濃度の抗生物質アクチノニンで成長することが可能であった。同様に、図１４に示すように、適切な濃度の誘導物質においてｆｏｌＡ遺伝子産物を過剰発現する細胞は、ｆｏｌＡ遺伝子産物に作用する高濃度の抗生物質トリメトプリムで成長することが可能であった。
【０４１７】
したがって、増殖に必要とされる遺伝子産物の高発現は、野生型細胞の成長を阻害または防止する抗生物質濃度の存在下で細胞を成長させることが可能である。
【０４１８】
【表１３５】
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【実施例１７】
【０４１９】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の過剰発現は、過剰発現される遺伝子産物を標的とする抗生物質に対する特異的耐性を付与する
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を過剰発現する細胞が、その遺伝子産物を標的とする抗生物質に対して特異的に耐性であることを明らかにするために、以下の実験を実施した。幾つかの同一化合物プレートを上記実施例１４のように調製し、ここでは異なる抗生物質を異なるウェル中に存在させた。種々の遺伝子を過剰発現する細胞を含む培地を、これらのプレートのそれぞれに別個に分配した。プレートインキュベーションおよび成長測定は上記実施例１６に記載するのと同様に行った。１つの特定の遺伝子のみを過剰発現する細胞が、過剰発現される遺伝子の産物を標的とする抗生物質に対する耐性を獲得したが、過剰発現されなかった遺伝子の産物を標的とする他の抗生物質に対する耐性を獲得しなかった場合、成長は特異的であると考えられた。
【０４２０】
図１５に示すように、ｆａｂＩ遺伝子の過剰発現は、ｆａｂＩ遺伝子の遺伝子産物であるエノール−アシル担体タンパク質レダクターゼに作用するトリクロサンに対する耐性を付与した。しかしながら、ｆａｂＩ遺伝子の過剰発現は、それぞれ他の遺伝子産物に作用するセルレニン、トリメトプリム、またはアクチノニンに対する耐性を付与しなかった。
【０４２１】
同様に、図１６に示すように、ｆｏｌＡ遺伝子の過剰発現は、ｆｏｌＡ遺伝子の遺伝子産物であるジヒドロ葉酸レダクターゼに作用するトリメトプリムに対する耐性を付与した。しかしながら、ｆｏｌＡ遺伝子の過剰発現は、それぞれ他の遺伝子産物に作用するトリクロサン、セルレニン、またはアクチノニンに対する耐性を付与しなかった。
【０４２２】
図１７に示すように、ｄｅｆＢ遺伝子の過剰発現は、ｄｅｆＢ遺伝子の遺伝子産物であるペプチドデフォルミラーゼに作用するアクチノニンに対する耐性を付与した。しかしながら、ｄｅｆＢ遺伝子の過剰発現は、それぞれ他の遺伝子産物に作用するセルレニン、トリメトプリム、またはトリクロサンに対する耐性を付与しなかった。
【０４２３】
図１８に示すように、ｆａｂＦ遺伝子の過剰発現は、ｆａｂＦ遺伝子の遺伝子産物であるβケト−アシル担体タンパク質シンターゼＩＩに作用するセルレニンに対する耐性を付与した。しかしながら、ｆａｂＦ遺伝子の過剰発現は、それぞれ他の遺伝子産物に作用するトリクロサン、トリメトプリム、またはアクチノニンに対する耐性を付与しなかった。
【０４２４】
したがって、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の過剰発現は、過剰発現される遺伝子産物を標的とする抗生物質に対する特異的耐性を付与する。
【実施例１８】
【０４２５】
増殖に必要とされる遺伝子を過剰発現する株の混合物からの標的遺伝子産物をコードする遺伝子を、過剰発現する株の選択
抗生物質の標的とされる遺伝子産物を発現する株が、それぞれ増殖に必要とされる異なる遺伝子を過剰発現する株の混合物から選択され得ることを確認するために、以下の実験を実施した。増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする９個の遺伝子の１つを過剰発現するスタフィロコッカス・アウレウス株を上述のように構築した。９個の過剰発現される遺伝子とは、ｆａｂＦ、ｄｅｆＢ、ｆｏｌＡ、ｆａｂＩ、ｉｌｅＳ、ｆｕｓＡ、ｇｙｒＢ、ｍｕｒＡ、ｒｐｏＢであった。９個の株の混合物を、様々な濃度の誘導物質、およびアクチノニン、セルレニン、トリクロサン、またはトリメトプリムの標的を過剰発現しない株の成長を阻害するのに十分な濃度のこれらの抗生物質を含有する培地中で、９６ウェルプレート中のウェルで成長させた。
【０４２６】
成長は、適切な誘導物質濃度および４個の抗生物質のうちの１つをそれぞれ含有するウェル中で観察された（図１９を参照）。抗生物質のうちの１つの存在下で成長した培養物を以下のように分析した。培養物をプレートのウェルから取り出し、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート上で段階希釈物を平板培養することにより単一コロニーを得た。各培養物に関して少なくとも６０個の個々のコロニーからプラスミドを単離して、抗生物質耐性を付与する遺伝子を、ベクター特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を実施することにより増幅した。続いて、ＰＣＲ産物を配列決定した。
【０４２７】
セルレニンの存在下で成長した培養物から得られるプラスミドはすべてｆａｂＦ配列を含有していた。同様に、トリクロサンの存在下で成長したクローンから得られるプラスミドはすべて、ｆａｂＩ遺伝子を含有していた。アクチノニンの存在下で成長したコロニーから得られるプラスミドはすべて、ｄｅｆＢ遺伝子を含有していた。さらに、トリメトプリムの存在下で成長したコロニーから得られるプラスミドの８１％はｆｏｌＡ遺伝子を含有していた。ｆｏｌＡ遺伝子を含有するプラスミドの１００％回収を提供するように成長条件をさらに最適化することができた。
【０４２８】
これらの結果は、抗生物質により標的とされる遺伝子産物を発現する株が、増殖に必要とされるそれぞれ異なる遺伝子を過剰発現する株の混合物から選択されうることを実証する。
【実施例１９】
【０４２９】
識別可能な長さを有する増幅産物の特定
上述のように、ｐｂｐＣ、ｓｅｃＡ、ｙｌａＯ（Ｂｓ）、ｙｐｈＣ（Ｂｓ）、ｔｒｐＳ、ｐｏｌＣ、ｆａｂＩ、ｒｐｓＲ（Ｂｓ）、ｆａｂＦ（ｙｊａＹ）、ｉｌｅＳ、ｍｕｒＣ、ｆｍｈＢ、ｍｕｒＡ（Ｂｓ）、ｍｕｒＦ（Ｂｓ）、ｆｔｓＺ、ｔｕｆＡ、ｇｙｒＡ、ｒｐｏＢ、ｇｒｌＡ、またはｆｏｌＡ（ｄｆｒＡ）遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス核酸がＸｙｌＴ５プロモーターから転写されたプラスミドを用いて、増殖に必要とされるとして上述の遺伝子を特定した。アンチセンス核酸の配列を以下のように本明細書中で提供する：
ｔｕｆＡ          配列盤後１３５９
ｙｌａＯ          配列盤後１３８０
ｒｐｏＢ          配列番号１３９２
ｐｏｌＣ          配列番号１４０９
ｍｕｒＣ          配列番号１４１６
ｆｍｈＢ          配列番号１４４４
ｙｐｈＣ          配列番号１４６３
ｇｙｒＡ          配列番号１４８３
ｉｌｅＳ          配列番号１６３６
ｓｅｃＡ          配列番号１６５１
ｆａｂＩ          配列番号１６９７
ｍｕｒＡ          配列番号２０８６
ｇｒｌＡ          配列番号２３３１
ｔｒｐＳ          配列番号２５０５
ｆｏｌＡ          配列番号２５２６
ｐｂｐＣ          配列番号２６３４
ｆａｂＦ          配列番号２９８８
ｍｕｒＦ          配列番号３５２２
ｒｐｓＲ          配列番号３５６３
ｆｔｓＺ          配列番号３５９８
相当するアンチセンス核酸をコードするプラスミドが核酸の混合物中に存在する場合に、以下の長さを有する増幅産物を生じる増幅プライマーを設計した：
ｙｐｈＣ  ２６０ｂｐ          ｓｅｃＡ  ２６７ｂｐ
ｆｏｌＡ  ２３０ｂｐ          ｔｕｆＡ  ２４３ｂｐ
ｆａｂＩ  ２２０ｂｐ          ｇｙｒＡ  ２２５ｂｐ
ｔｒｐＳ  ２０８ｂｐ          ｉｌｅＳ  ２１５ｂｐ
ｆａｂＦ  １８９ｂｐ          ｍｕｒＦ  ２０３ｂｐ
ｍｕｒＡ  １７６ｂｐ          ｆｍｈＢ  １８１ｂｐ
ｒｐｏＢ  １５９ｂｐ          ｙｌａＯ  １６９ｂｐ
ｇｒｌＡ  １５１ｂｐ          ｐｂｐＣ  １５６ｂｐ
ｍｕｒＣ  １２９ｂｐ          ｐｏｌＣ  １４５ｂｐ
ｒｐｓＲ  １０９ｂｐ          ｆｔｓＺ  １１７ｂｐ
【０４３０】
各プライマーの５’プライマーは、ｘｙｌＴ５プロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である一方で、３’プライマーは、アンチセンスクローン内のヌクレオチド配列に相補的であった。各対の５’プライマーは、各増幅反応に関して同一であった。ヌクレオチド配列ＧＴＴＴＣＴＴが、３’プライマーの５’末端上に添付された。各対のプライマーの１つをＶＩＣまたは６ＦＡＭのいずれかで標識した。
【０４３１】
ｇｒｌＡ遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス核酸をコードするプラスミド、またはｆｍｈＢ遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス核酸をコードするプラスミドのいずれかが、１１個のチューブそれぞれに２倍に段階希釈される（すなわち、第１のチューブは、ｇｒｌＡプラスミドまたはｆｍｈＢプラスミドを１００ｐｇ有し、一方最後のチューブは、ｇｒｌＡプラスミドまたはｆｍｈＢプラスミドを０．１０ｐｇ有する）以外は、上欄それぞれに列挙した遺伝子に相補的なアンチセンス核酸を含有する１０個のプラスミドの２組を、１１個のチューブ中に等量で混合した。増幅反応を混合物で実施し、増幅産物を５％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロースゲル(Bio Whittaker Molecular Applications Rockland, ME)上で分離した。ｇｒｌＡまたはｆｍｈＢプライマーそれぞれに関する１５１ｂｐまたは１８１ｂｐ増幅産物のレベルは、希釈度が増大するとともに段階的に特異的に減少する一方、未希釈の産物のレベルは一定のままであった。アッセイにより、ｇｒｌＡまたはｆｍｈＢプラスミドに相当する増幅産物で示されるテンプレート濃度が１／１０に減少したことが容易に検出された。
【実施例２０】
【０４３２】
増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を過小発現する株に相当する増幅産物の選択的消失
ｙｐｈＣ、ｆｏｌＡ、ｆａｂＩ、ｔｒｐＳ、ｆａｂＦ、ｍｕｒＡ、ｒｐｏＢ、ｇｒｌＡ、ｍｕｒＣ、またはｒｐｓＲ遺伝子内のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス核酸（上記実施例１９に記載）をコードするプラスミドを含有するスタフィロコッカス・アウレウス株を、培養物中の各株の細胞数が同一となるように、同一培養物中で一緒に混合した。１０個の株を含む培養物それぞれを、以下のいずれかの濃度で、以下のいずれかの抗生物質と接触させた：
スペクチノマイシン−２．５、５．０μｇ／ｍｌ
ムプリオシン−４．３、８．６、１７．２μｇ／ｍｌ
セルレニン−４．５、９．０、１８．０μｇ／ｍｌ
【０４３３】
スペクチノマイシンはｒｐｓＲ遺伝子の産物に作用し、ムプリオシンはｉｌｅＳ遺伝子の産物に作用し、セルレニンはＦａｂＦ遺伝子の産物に作用する。各抗生物質に関する中間濃度はそのＩＣ５０である。
【０４３４】
細胞が初期ｌｏｇ相に到達するまで、１０個の株を含有する培養物を富培地(rich medium)（Ｌ−ブロス、アンチセンスＬＢ＋アンチセンスプラスミドを維持するためのクロラムフェニコール用）で成長させ、続いて上記に列挙したいずれかの濃度（好ましくはＩＣ５０付近）で上述の化合物の１つと接触させた。培養物を、化合物がその標的を過小発現する株の成長を特異的に阻害するのを可能にするのに十分な時間成長させた。好ましくは、培養物を少なくとも１６時間、より好ましくは２４〜４８時間成長させた。偽陽性を招き得る株に選択的圧力をかける間は、培養物を成長させないことが望ましい。
【０４３５】
遠心分離により細胞を収集し、培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。ＰＣＲ増幅は、実施例１９に記載するように実施した。増幅産物を上述のようにＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上に流した。各アンチセンス核酸に対応する増幅産物の量を決定し、薬剤と接触させていない対照培養物中の量、または化合物が作用する遺伝子産物をコードする遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的でない他のアンチセンス核酸に相当する増幅産物の量と比較した。それぞれの場合において、抗生物質が作用する標的に対応する増幅産物のみがゲル上で検出できなかった。
【０４３６】
遺伝子産物のレベルまたは活性が、増殖に必要とされる遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写することにより、またはかかる遺伝子の天然プロモーターを調節可能プロモーターで置き換えることにより調節される実施形態では、アンチセンス核酸の転写を誘導するのに、または調節可能なプロモーターからの転写を誘導するのに使用される誘導物質に関する用量反応曲線を完成することが望ましい。かかる実施形態では、化合物が作用する標的を過剰発現または過小発現しない株の成長をできるだけ妨害せずに、特定の試験化合物の効果を検出するために最適転写レベルを提供する最低濃度の誘導物質を使用することが望ましい。また、化合物が作用する標的を過剰発現または過小発現する株の差次的成長を得るための最適量を決定するために、さまざまな量の試験化合物に培養物を接触させることも望ましい。好ましくは、株が増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する場合、化合物レベルは、好ましくは約ＩＣ90以上である。好ましくは、株が増殖に必要とされる遺伝子産物を過小発現する場合、化合物レベルは好ましくは約ＩＣ50以下である。
【０４３７】
望ましい場合には、増幅産物は上述の色素を用いて検出され得ることが理解されよう。また、増幅産物はＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲを含む任意の望ましい増幅方法を用いて検出され得ることも理解されよう。
【０４３８】
たとえ本明細書において前述の記載がどんなに詳細に見えたとしても、本発明は多くの方法で実施することができることが理解されよう。また上述するように、本発明の特定の形態または態様を記載する際に特定の専門用語を使用することは、かかる専門用語の最も広い合理的な意義が意図されないこと、または専門用語が関連する本発明の形態または態様の任意の特定の特徴を包含することを制限するように本明細書中で再定義されることを含意するものと解釈されるべきではないことにさらに留意されるべきである。したがって、本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載してきたが、本明細書中の開示を鑑みて当業者には明らかであろう他の実施形態もまた本発明の範囲内である。したがって、本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲およびその任意の等価物のみを参照することにより規定されると意図される。本明細書中に引用した文書はすべて、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０４３９】
表ＶＩＡ
配列番号    クローン名         生物
8     E3M10000001A02     Enterococcus faecalis
9     E3M10000001A06     Enterococcus faecalis
10     E3M10000001B01     Enterococcus faecalis
11     E3M10000001B02     Enterococcus faecalis
12     E3M10000001B05     Enterococcus faecalis
13     E3M10000001B06     Enterococcus faecalis
14     E3M10000001B08     Enterococcus faecalis
15     E3M10000001B10     Enterococcus faecalis
16     E3M10000001C02     Enterococcus faecalis
17     E3M10000001C09     Enterococcus faecalis
18     E3M10000001D02     Enterococcus faecalis
19     E3M10000001D04     Enterococcus faecalis
20     E3M10000001D05     Enterococcus faecalis
21     E3M10000001D09     Enterococcus faecalis
22     E3M10000001E01     Enterococcus faecalis
23     E3M10000001E02     Enterococcus faecalis
24     E3M10000001E03     Enterococcus faecalis
25     E3M10000001E04     Enterococcus faecalis
26     E3M10000001E08     Enterococcus faecalis
27     E3M10000001E09     Enterococcus faecalis
28     E3M10000001F02     Enterococcus faecalis
29     E3M10000001F04     Enterococcus faecalis
30     E3M10000001F06     Enterococcus faecalis
31     E3M10000001F07     Enterococcus faecalis
32     E3M10000001G02     Enterococcus faecalis
33     E3M10000001G03     Enterococcus faecalis
34     E3M10000001G04     Enterococcus faecalis
35     E3M10000001G05     Enterococcus faecalis
36     E3M10000001H02     Enterococcus faecalis
37     E3M10000001H03     Enterococcus faecalis
38     E3M10000001H04     Enterococcus faecalis
39     E3M10000004A04     Enterococcus faecalis
40     E3M10000004C03     Enterococcus faecalis
41     E3M10000004D01     Enterococcus faecalis
42     E3M10000004D02     Enterococcus faecalis
43     E3M10000004D10     Enterococcus faecalis
44     E3M10000004E11     Enterococcus faecalis
45     E3M10000004F08     Enterococcus faecalis
46     E3M10000004F10     Enterococcus faecalis
47     E3M10000004G01     Enterococcus faecalis
48     E3M10000004H11     Enterococcus faecalis
49     E3M10000005A07     Enterococcus faecalis
50     E3M10000005B01     Enterococcus faecalis
51     E3M10000005B08     Enterococcus faecalis
52     E3M10000005C01     Enterococcus faecalis
53     E3M10000005C03     Enterococcus faecalis
54     E3M10000005C04     Enterococcus faecalis
55     E3M10000005D03     Enterococcus faecalis
56     E3M10000005D04     Enterococcus faecalis
57     E3M10000005D10     Enterococcus faecalis
58     E3M10000005E01     Enterococcus faecalis
59     E3M10000005E02     Enterococcus faecalis
60     E3M10000005E03     Enterococcus faecalis
61     E3M10000005E08     Enterococcus faecalis
62     E3M10000005F07     Enterococcus faecalis
63     E3M10000005F10     Enterococcus faecalis
64     E3M10000005G05     Enterococcus faecalis
65     E3M10000005H04     Enterococcus faecalis
66     E3M10000006B03     Enterococcus faecalis
67     E3M10000006C01     Enterococcus faecalis
68     E3M10000006C12     Enterococcus faecalis
69     E3M10000006D03     Enterococcus faecalis
70     E3M10000006E11     Enterococcus faecalis
71     E3M10000006F04     Enterococcus faecalis
72     E3M10000006G04     Enterococcus faecalis
73     E3M10000006G12     Enterococcus faecalis
74     E3M10000006H09     Enterococcus faecalis
75     E3M10000007A02     Enterococcus faecalis
76     E3M10000007B02     Enterococcus faecalis
77     E3M10000007B03     Enterococcus faecalis
78     E3M10000007C03     Enterococcus faecalis
79     E3M10000007C04     Enterococcus faecalis
80     E3M10000007D03     Enterococcus faecalis
81     E3M10000007E05     Enterococcus faecalis
82     E3M10000007F01     Enterococcus faecalis
83     E3M10000007F06     Enterococcus faecalis
84     E3M10000007G01     Enterococcus faecalis
85     E3M10000008C03     Enterococcus faecalis
86     E3M10000008C08     Enterococcus faecalis
87     E3M10000008C09     Enterococcus faecalis
88     E3M10000008D08     Enterococcus faecalis
89     E3M10000008E02     Enterococcus faecalis
90     E3M10000008G05     Enterococcus faecalis
91     E3M10000008G09     Enterococcus faecalis
92     E3M10000008H02     Enterococcus faecalis
93     E3M10000009C07     Enterococcus faecalis
94     E3M10000009C09     Enterococcus faecalis
95     E3M10000009D01     Enterococcus faecalis
96     E3M10000009E02     Enterococcus faecalis
97     E3M10000009E03     Enterococcus faecalis
98     E3M10000009E05     Enterococcus faecalis
99     E3M10000009G02     Enterococcus faecalis
100    E3M10000010C08     Enterococcus faecalis
101    E3M10000010D05     Enterococcus faecalis
102    E3M10000010F01     Enterococcus faecalis
103    E3M10000010G05     Enterococcus faecalis
104    E3M10000010G07     Enterococcus faecalis
105    E3M10000010G09     Enterococcus faecalis
106    E3M10000010G10     Enterococcus faecalis
107    E3M10000010H02     Enterococcus faecalis
108    E3M10000011A09     Enterococcus faecalis
109    E3M10000011B03     Enterococcus faecalis
110    E3M10000011B09     Enterococcus faecalis
111    E3M10000011C07     Enterococcus faecalis
112    E3M10000011D03     Enterococcus faecalis
113    E3M10000011H02     Enterococcus faecalis
114    E3M10000011H05     Enterococcus faecalis
115    E3M10000012B01     Enterococcus faecalis
116    E3M10000012B02     Enterococcus faecalis
117    E3M10000012B07     Enterococcus faecalis
118    E3M10000012B08     Enterococcus faecalis
119    E3M10000012C01     Enterococcus faecalis
120    E3M10000012D10     Enterococcus faecalis
121    E3M10000012E08     Enterococcus faecalis
122    E3M10000012F05     Enterococcus faecalis
123    E3M10000012F06     Enterococcus faecalis
124    E3M10000012F07     Enterococcus faecalis
125    E3M10000012F10     Enterococcus faecalis
126    E3M10000012G02     Enterococcus faecalis
127    E3M10000012G07     Enterococcus faecalis
128    E3M10000013A06     Enterococcus faecalis
129    E3M10000013A07     Enterococcus faecalis
130    E3M10000013C05     Enterococcus faecalis
131    E3M10000013D02     Enterococcus faecalis
132    E3M10000013D08     Enterococcus faecalis
133    E3M10000013D10     Enterococcus faecalis
134    E3M10000013E02     Enterococcus faecalis
135    E3M10000013E08     Enterococcus faecalis
136    E3M10000013F05     Enterococcus faecalis
137    E3M10000013F12     Enterococcus faecalis
138    E3M10000013G10     Enterococcus faecalis
139    E3M10000013H03     Enterococcus faecalis
140    E3M10000013H05     Enterococcus faecalis
141    E3M10000013H10     Enterococcus faecalis
142    E3M10000014B12     Enterococcus faecalis
143    E3M10000014E12     Enterococcus faecalis
144    E3M10000014G09     Enterococcus faecalis
145    E3M10000015B04     Enterococcus faecalis
146    E3M10000015B12     Enterococcus faecalis
147    E3M10000015E12     Enterococcus faecalis
148    E3M10000016A03     Enterococcus faecalis
149    E3M10000016A04     Enterococcus faecalis
150    E3M10000016C11     Enterococcus faecalis
151    E3M10000016D03     Enterococcus faecalis
152    E3M10000016F06     Enterococcus faecalis
153    E3M10000016F10     Enterococcus faecalis
154    E3M10000016H05     Enterococcus faecalis
155    E3M10000016H10     Enterococcus faecalis
156    E3M10000017A09     Enterococcus faecalis
157    E3M10000017D09     Enterococcus faecalis
158    E3M10000018A07     Enterococcus faecalis
159    E3M10000018C02     Enterococcus faecalis
160    E3M10000018E01     Enterococcus faecalis
161    E3M10000018G09     Enterococcus faecalis
162    E3M10000018H06     Enterococcus faecalis
163    E3M10000019B06     Enterococcus faecalis
164    E3M10000019D02     Enterococcus faecalis
165    E3M10000019E03     Enterococcus faecalis
166    E3M10000019E04     Enterococcus faecalis
167    E3M10000020G04     Enterococcus faecalis
168    E3M10000020H05     Enterococcus faecalis
169    E3M10000021A08     Enterococcus faecalis
170    E3M10000021A11     Enterococcus faecalis
171    E3M10000021B10     Enterococcus faecalis
172    E3M10000021C03     Enterococcus faecalis
173    E3M10000021C04     Enterococcus faecalis
174    E3M10000021C08     Enterococcus faecalis
175    E3M10000021D04     Enterococcus faecalis
176    E3M10000021E10     Enterococcus faecalis
177    E3M10000021G04     Enterococcus faecalis
178    E3M10000021G10     Enterococcus faecalis
179    E3M10000021G11     Enterococcus faecalis
180    E3M10000021H11     Enterococcus faecalis
181    E3M10000022A04     Enterococcus faecalis
182    E3M10000022A11     Enterococcus faecalis
183    E3M10000022B04     Enterococcus faecalis
184    E3M10000022B05     Enterococcus faecalis
185    E3M10000022B07     Enterococcus faecalis
186    E3M10000022C05     Enterococcus faecalis
187    E3M10000022C06     Enterococcus faecalis
188    E3M10000022C09     Enterococcus faecalis
189    E3M10000022D04     Enterococcus faecalis
190    E3M10000022F05     Enterococcus faecalis
191    E3M10000022F06     Enterococcus faecalis
192    E3M10000022F08     Enterococcus faecalis
193    E3M10000022G02     Enterococcus faecalis
194    E3M10000022G12     Enterococcus faecalis
195    E3M10000023A03     Enterococcus faecalis
196    E3M10000023A06     Enterococcus faecalis
197    E3M10000023A07     Enterococcus faecalis
198    E3M10000023A09     Enterococcus faecalis
199    E3M10000023B02     Enterococcus faecalis
200    E3M10000023B06     Enterococcus faecalis
201    E3M10000023C03     Enterococcus faecalis
202    E3M10000023C04     Enterococcus faecalis
203    E3M10000023C06     Enterococcus faecalis
204    E3M10000023C08     Enterococcus faecalis
205    E3M10000023C09     Enterococcus faecalis
206    E3M10000023D02     Enterococcus faecalis
207    E3M10000023D04     Enterococcus faecalis
208    E3M10000023D10     Enterococcus faecalis
209    E3M10000023E04     Enterococcus faecalis
210    E3M10000023E07     Enterococcus faecalis
211    E3M10000023E09     Enterococcus faecalis
212    E3M10000023F02     Enterococcus faecalis
213    E3M10000023F10     Enterococcus faecalis
214    E3M10000023G02     Enterococcus faecalis
215    E3M10000023G04     Enterococcus faecalis
216    E3M10000023G10     Enterococcus faecalis
217    E3M10000023H08     Enterococcus faecalis
218    E3M10000024A03     Enterococcus faecalis
219    E3M10000024A04     Enterococcus faecalis
220    E3M10000024A08     Enterococcus faecalis
221    E3M10000024C06     Enterococcus faecalis
222    E3M10000025A06     Enterococcus faecalis
223    E3M10000025B01     Enterococcus faecalis
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962    E3M10000041G12     Enterococcus faecalis
963    E3M10000041H04     Enterococcus faecalis
964    E3M10000041H05     Enterococcus faecalis
965    E3M10000041H06     Enterococcus faecalis
966    E3M10000041H07     Enterococcus faecalis
967    E3M10000041H08     Enterococcus faecalis
968    E3M10000041H09     Enterococcus faecalis
969    E3M10000041H10     Enterococcus faecalis
970    E3M10000041H11     Enterococcus faecalis
971    E3M10000042A03     Enterococcus faecalis
972    E3M10000042A08     Enterococcus faecalis
973    E3M10000042A10     Enterococcus faecalis
974    E3M10000042B01     Enterococcus faecalis
975    E3M10000042B02     Enterococcus faecalis
976    E3M10000042B04     Enterococcus faecalis
977    E3M10000042B08     Enterococcus faecalis
978    E3M10000042B09     Enterococcus faecalis
979    E3M10000042B10     Enterococcus faecalis
980    E3M10000042B11     Enterococcus faecalis
981    E3M10000042C02     Enterococcus faecalis
982    E3M10000042C03     Enterococcus faecalis
983    E3M10000042C04     Enterococcus faecalis
984    E3M10000042C10     Enterococcus faecalis
985    E3M10000042D01     Enterococcus faecalis
986    E3M10000042D02     Enterococcus faecalis
987    E3M10000042D03     Enterococcus faecalis
988    E3M10000042D06     Enterococcus faecalis
989    E3M10000042D09     Enterococcus faecalis
990    E3M10000042D11     Enterococcus faecalis
991    E3M10000042D12     Enterococcus faecalis
992    E3M10000042E05     Enterococcus faecalis
993    E3M10000042E12     Enterococcus faecalis
994    E3M10000042F11     Enterococcus faecalis
995    E3M10000042G01     Enterococcus faecalis
996    E3M10000042G05     Enterococcus faecalis
997    E3M10000042G07     Enterococcus faecalis
998    E3M10000042G08     Enterococcus faecalis
999    E3M10000042G11     Enterococcus faecalis
1000    E3M10000042G12     Enterococcus faecalis
1001    E3M10000042H06     Enterococcus faecalis
1002    E3M10000042H08     Enterococcus faecalis
1003    E3M10000042H11     Enterococcus faecalis
1004    E3M10000043A02     Enterococcus faecalis
1005    E3M10000043A03     Enterococcus faecalis
1006    E3M10000043A05     Enterococcus faecalis
1007    E3M10000043A08     Enterococcus faecalis
1008    E3M10000043A09     Enterococcus faecalis
1009    E3M10000043A10     Enterococcus faecalis
1010    E3M10000043A11     Enterococcus faecalis
1011    E3M10000043B01     Enterococcus faecalis
1012    E3M10000043B02     Enterococcus faecalis
1013    E3M10000043B03     Enterococcus faecalis
1014    E3M10000043B06     Enterococcus faecalis
1015    E3M10000043B08     Enterococcus faecalis
1016    E3M10000043B09     Enterococcus faecalis
1017    E3M10000043B10     Enterococcus faecalis
1018    E3M10000043B11     Enterococcus faecalis
1019    E3M10000043B12     Enterococcus faecalis
1020    E3M10000043C01     Enterococcus faecalis
1021    E3M10000043C08     Enterococcus faecalis
1022    E3M10000043C09     Enterococcus faecalis
1023    E3M10000043D01     Enterococcus faecalis
1024    E3M10000043D02     Enterococcus faecalis
1025    E3M10000043D09     Enterococcus faecalis
1026    E3M10000043D10     Enterococcus faecalis
1027    E3M10000043D12     Enterococcus faecalis
1028    E3M10000043E03     Enterococcus faecalis
1029    E3M10000043E07     Enterococcus faecalis
1030    E3M10000043E08     Enterococcus faecalis
1031    E3M10000043E10     Enterococcus faecalis
1032    E3M10000043E11     Enterococcus faecalis
1033    E3M10000043F03     Enterococcus faecalis
1034    E3M10000043F04     Enterococcus faecalis
1035    E3M10000043F06     Enterococcus faecalis
1036    E3M10000043F08     Enterococcus faecalis
1037    E3M10000043F10     Enterococcus faecalis
1038    E3M10000043F12     Enterococcus faecalis
1039    E3M10000043G03     Enterococcus faecalis
1040    E3M10000043G04     Enterococcus faecalis
1041    E3M10000043G05     Enterococcus faecalis
1042    E3M10000043G07     Enterococcus faecalis
1043    E3M10000043G08     Enterococcus faecalis
1044    E3M10000043G10     Enterococcus faecalis
1045    E3M10000043G11     Enterococcus faecalis
1046    E3M10000043G12     Enterococcus faecalis
1047    E3M10000043H02     Enterococcus faecalis
1048    E3M10000043H05     Enterococcus faecalis
1049    E3M10000043H08     Enterococcus faecalis
1050    E3M10000043H09     Enterococcus faecalis
1051    E3M10000043H11     Enterococcus faecalis
1052    E3M10000044C02     Enterococcus faecalis
1053    E3M10000044E01     Enterococcus faecalis
1054    K1M10000002F02     Klebsiella pneumoniae
1055    K1M10000003C01     Klebsiella pneumoniae
1056    K1M10000004F06     Klebsiella pneumoniae
1057    K1M10000007F01     Klebsiella pneumoniae
1058    K1M10000008C02     Klebsiella pneumoniae
1059    K1M10000008C10     Klebsiella pneumoniae
1060    K1M10000008G10     Klebsiella pneumoniae
1061    K1M10000009D04     Klebsiella pneumoniae
1062    K1M10000013E04     Klebsiella pneumoniae
1063    K1M10000013E06     Klebsiella pneumoniae
1064    K1M10000019D06     Klebsiella pneumoniae
1065    K1M10000020B02     Klebsiella pneumoniae
1066    K1M10000021H06     Klebsiella pneumoniae
1067    K1M10000022C10     Klebsiella pneumoniae
1068    K1M10000023E09     Klebsiella pneumoniae
1069    K1M10000023E10     Klebsiella pneumoniae
1070    K1M10000030C07     Klebsiella pneumoniae
1071    K1M10000030E07     Klebsiella pneumoniae
1072    K1M10000031B11     Klebsiella pneumoniae
1073    K1M10000032E11     Klebsiella pneumoniae
1074    K1M10000033B02     Klebsiella pneumoniae
1075    K1M10000033E01     Klebsiella pneumoniae
1076    K1M10000036G08     Klebsiella pneumoniae
1077    K1M10000037D10     Klebsiella pneumoniae
1078    K1M10000038H09     Klebsiella pneumoniae
1079    K1M10000039H03     Klebsiella pneumoniae
1080    K1M10000043C01     Klebsiella pneumoniae
1081    K1M10000043D05     Klebsiella pneumoniae
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1086    K1M10000044G05     Klebsiella pneumoniae
1087    K1M10000045A07     Klebsiella pneumoniae
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1089    K1M10000003D03     Klebsiella pneumoniae
1090    K1M10000010C02     Klebsiella pneumoniae
1091    K1M10000021H10     Klebsiella pneumoniae
1092    P1M10000008C06     Pseudomonas aeruginosa
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1094    P1M10000010C03     Pseudomonas aeruginosa
1095    P1M10000014H10     Pseudomonas aeruginosa
1096    P1M10000015C06     Pseudomonas aeruginosa
1097    P1M10000015C09     Pseudomonas aeruginosa
1098    P1M10000016C04     Pseudomonas aeruginosa
1099    P1M10000018B01     Pseudomonas aeruginosa
1100    P1M10000018C01     Pseudomonas aeruginosa
1101    P1M10000018E01     Pseudomonas aeruginosa
1102    P1M10000018G01     Pseudomonas aeruginosa
1103    P1M10000019F01     Pseudomonas aeruginosa
1104    P1M10000021G03     Pseudomonas aeruginosa
1105    P1M10000021G05     Pseudomonas aeruginosa
1106    P1M10000022D09     Pseudomonas aeruginosa
1107    P1M10000024D06     Pseudomonas aeruginosa
1108    P1M10000024E06     Pseudomonas aeruginosa
1109    P1M10000024H03     Pseudomonas aeruginosa
1110    P1M10000025A06     Pseudomonas aeruginosa
1111    P1M10000025G07     Pseudomonas aeruginosa
1112    P1M10000025H07     Pseudomonas aeruginosa
1113    P1M10000026E06     Pseudomonas aeruginosa
1114    P1M10000026F04     Pseudomonas aeruginosa
1115    P1M10000026G09     Pseudomonas aeruginosa
1116    P1M10000026H02     Pseudomonas aeruginosa
1117    P1M10000026H05     Pseudomonas aeruginosa
1118    P1M10000027A06     Pseudomonas aeruginosa
1119    P1M10000027B02     Pseudomonas aeruginosa
1120    P1M10000027G05     Pseudomonas aeruginosa
1121    P1M10000028A08     Pseudomonas aeruginosa
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1123    P1M10000028E02     Pseudomonas aeruginosa
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1132    P1M10000033G08     Pseudomonas aeruginosa
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1180    P1M10000055A11     Pseudomonas aeruginosa
1181    P1M10000055C08     Pseudomonas aeruginosa
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1183    P1M10000056C07     Pseudomonas aeruginosa
1184    P1M10000056F05     Pseudomonas aeruginosa
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1186    P1M10000056G01     Pseudomonas aeruginosa
1187    P1M10000058B07     Pseudomonas aeruginosa
1188    P1M10000059B04     Pseudomonas aeruginosa
1189    P1M10000059B10     Pseudomonas aeruginosa
1190    P1M10000059B11     Pseudomonas aeruginosa
1191    P1M10000059D11     Pseudomonas aeruginosa
1192    P1M10000059H08     Pseudomonas aeruginosa
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1194    P1M10000060E03     Pseudomonas aeruginosa
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1200    P1M10000062A12     Pseudomonas aeruginosa
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1207    P1M10000062E08     Pseudomonas aeruginosa
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1209    P1M10000062G11     Pseudomonas aeruginosa
1210    P1M10000062H01     Pseudomonas aeruginosa
1211    P1M10000062H04     Pseudomonas aeruginosa
1212    P1M10000063F02     Pseudomonas aeruginosa
1213    P1M10000063G02     Pseudomonas aeruginosa
1214    P1M10000063H02     Pseudomonas aeruginosa
1215    P1M10000064A10     Pseudomonas aeruginosa
1216    P1M10000064C02     Pseudomonas aeruginosa
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3656    S1M10000021G12     Staphylococcus aureus
3657    S1M10000024E04     Staphylococcus aureus
3658    S1M10000028H08     Staphylococcus aureus
3659    S1M10000022B07     Staphylococcus aureus
3660    S1M10000003A05     Staphylococcus aureus
3661    S1M10000003A09     Staphylococcus aureus
3662    S1M10000003E01     Staphylococcus aureus
3663    S1M10000004C11     Staphylococcus aureus
3664    S1M10000007E08     Staphylococcus aureus
3665    S1M10000021G06     Staphylococcus aureus
3666    S1M10000024C06     Staphylococcus aureus
3667    S1M10000024D01     Staphylococcus aureus
3668    S1M10000027D07     Staphylococcus aureus
3669    S1M10000027E03     Staphylococcus aureus
3670    S1M10000027G01     Staphylococcus aureus
3671    S1M10000029A03     Staphylococcus aureus
3672    S1M10000032B10     Staphylococcus aureus
3673    S1M10000032C07     Staphylococcus aureus
3674    S1M10000038D04     Staphylococcus aureus
3675    S1M10000047D07     Staphylococcus aureus
3676    S1M10000048B03     Staphylococcus aureus
3677    S1M10000048B06     Staphylococcus aureus
3678    S1M10000048C10     Staphylococcus aureus
3679    S1M10000048F05     Staphylococcus aureus
3680    S4M10000001C01     Salmonella typhimurium
3681    S4M10000002B06     Salmonella typhimurium
3682    S4M10000002B09     Salmonella typhimurium
3683    S4M10000002G04     Salmonella typhimurium
3684    S4M10000002G08     Salmonella typhimurium
3685    S4M10000005G05     Salmonella typhimurium
3686    S4M10000005H02     Salmonella typhimurium
3687    S4M10000006A06     Salmonella typhimurium
3688    S4M10000006A08     Salmonella typhimurium
3689    S4M10000006C05     Salmonella typhimurium
3690    S4M10000006F08     Salmonella typhimurium
3691    S4M10000007G01     Salmonella typhimurium
3692    S4M10000008C08     Salmonella typhimurium
3693    S4M10000008H10     Salmonella typhimurium
3694    S4M10000009A05     Salmonella typhimurium
3695    S4M10000010B05     Salmonella typhimurium
3696    S4M10000010D04     Salmonella typhimurium
3697    S4M10000010H04     Salmonella typhimurium
3698    S4M10000011D08     Salmonella typhimurium
3699    S4M10000011E08     Salmonella typhimurium
3700    S4M10000012B06     Salmonella typhimurium
3701    S4M10000012B12     Salmonella typhimurium
3702    S4M10000012D02     Salmonella typhimurium
3703    S4M10000013H02     Salmonella typhimurium
3704    S4M10000014B05     Salmonella typhimurium
3705    S4M10000014D04     Salmonella typhimurium
3706    S4M10000014D07     Salmonella typhimurium
3707    S4M10000014H02     Salmonella typhimurium
3708    S4M10000015B11     Salmonella typhimurium
3709    S4M10000015E09     Salmonella typhimurium
3710    S4M10000016A02     Salmonella typhimurium
3711    S4M10000018D09     Salmonella typhimurium
3712    S4M10000018E10     Salmonella typhimurium
3713    S4M10000018F10     Salmonella typhimurium
3714    S4M10000018G03     Salmonella typhimurium
3715    S4M10000018H04     Salmonella typhimurium
3716    S4M10000019F05     Salmonella typhimurium
3717    S4M10000019G04     Salmonella typhimurium
3718    S4M10000019G05     Salmonella typhimurium
3719    S4M10000019H06     Salmonella typhimurium
3720    S4M10000020A04     Salmonella typhimurium
3721    S4M10000020F05     Salmonella typhimurium
3722    S4M10000020G10     Salmonella typhimurium
3723    S4M10000022D04     Salmonella typhimurium
3724    S4M10000022D12     Salmonella typhimurium
3725    S4M10000022E12     Salmonella typhimurium
3726    S4M10000022G07     Salmonella typhimurium
3727    S4M10000022H06     Salmonella typhimurium
3728    S4M10000023F01     Salmonella typhimurium
3729    S4M10000024B02     Salmonella typhimurium
3730    S4M10000024C06     Salmonella typhimurium
3731    S4M10000024C11     Salmonella typhimurium
3732    S4M10000024F08     Salmonella typhimurium
3733    S4M10000024G01     Salmonella typhimurium
3734    S4M10000024G04     Salmonella typhimurium
3735    S4M10000024G09     Salmonella typhimurium
3736    S4M10000024H02     Salmonella typhimurium
3737    S4M10000025A11     Salmonella typhimurium
3738    S4M10000025E02     Salmonella typhimurium
3739    S4M10000025E05     Salmonella typhimurium
3740    S4M10000025H07     Salmonella typhimurium
3741    S4M10000026C10     Salmonella typhimurium
3742    S4M10000026D04     Salmonella typhimurium
3743    S4M10000026E06     Salmonella typhimurium
3744    S4M10000026E12     Salmonella typhimurium
3745    S4M10000027C10     Salmonella typhimurium
3746    S4M10000027E02     Salmonella typhimurium
3747    S4M10000029B12     Salmonella typhimurium
3748    S4M10000029D12     Salmonella typhimurium
3749    S4M10000030D03     Salmonella typhimurium
3750    S4M10000030F07     Salmonella typhimurium
3751    S4M10000030G11     Salmonella typhimurium
3752    S4M10000032B12     Salmonella typhimurium
3753    S4M10000033F08     Salmonella typhimurium
3754    S4M10000033G05     Salmonella typhimurium
3755    S4M10000033G09     Salmonella typhimurium
3756    S4M10000034A02     Salmonella typhimurium
3757    S4M10000034A09     Salmonella typhimurium
3758    S4M10000034D06     Salmonella typhimurium
3759    S4M10000034H05     Salmonella typhimurium
3760    S4M10000034H09     Salmonella typhimurium
3761    S4M10000035B01     Salmonella typhimurium
3762    S4M10000035D01     Salmonella typhimurium
3763    S4M10000035D02     Salmonella typhimurium
3764    S4M10000035E03     Salmonella typhimurium
3765    S4M10000035F02     Salmonella typhimurium
3766    S4M10000035F09     Salmonella typhimurium
3767    S4M10000036D07     Salmonella typhimurium
3768    S4M10000036F07     Salmonella typhimurium
3769    S4M10000037A04     Salmonella typhimurium
3770    S4M10000037A10     Salmonella typhimurium
3771    S4M10000037E10     Salmonella typhimurium
3772    S4M10000037H09     Salmonella typhimurium
3773    S4M10000001H01     Salmonella typhimurium
3774    S4M10000002F06     Salmonella typhimurium
3775    S4M10000008D01     Salmonella typhimurium
3776    S4M10000009G11     Salmonella typhimurium
3777    S4M10000011F09     Salmonella typhimurium
3778    S4M10000020F08     Salmonella typhimurium
3779    S4M10000021E07     Salmonella typhimurium
3780    S4M10000022B05     Salmonella typhimurium
3781    S4M10000025H11     Salmonella typhimurium
3782    S4M10000026B10     Salmonella typhimurium
3783    S4M10000026E03     Salmonella typhimurium
3784    S4M10000029A03     Salmonella typhimurium
3785    S4M10000029C11     Salmonella typhimurium
3786    S4M10000030F06     Salmonella typhimurium
3787    S4M10000032F03     Salmonella typhimurium
3788    S4M10000032G01     Salmonella typhimurium
3789    S4M10000034C05     Salmonella typhimurium
3790    S4M10000034H04     Salmonella typhimurium
3791    S4M10000035A09     Salmonella typhimurium
3792    S4M10000035B06     Salmonella typhimurium
3793    S4M10000035F01     Salmonella typhimurium
3794    S4M10000037A08     Salmonella typhimurium
3795    S4M10000037E03     Salmonella typhimurium
【０４４０】
表ＶＩＢ
クローン名    クローン   PathoSeq   遺伝子     Genemarked    完全長 ORF
配列番号   遺伝子座   配列番号     遺伝子      タンパク質
(protein)                   配列番号
E3M10000001A02      8     EFA101409    4934    EFA1c0022_orf_11   10524
E3M10000001A06      9     EFA100642    4884    EFA1c0041_orf_56   10792
E3M10000001B01     10     EFA101409    4934    EFA1c0022_orf_11   10524
E3M10000001B02     11     EFA100739    4888    EFA1c0022_orf_23   10537
E3M10000001B02     11     EFA102549    5000    EFA1c0022_orf_24   10538
E3M10000001B02     11     EFA102551    5001    EFA1c0022_orf_25   10539
E3M10000001B05     12     EFA101165    4922    EFA1c0022_orf_8p   10559
E3M10000001B06     13     EFA101164    4921    EFA1c0022_orf_7p   10558
E3M10000001B08     14     EFA100642    4884    EFA1c0041_orf_56   10792
E3M10000001B10     15     EFA101409    4934    EFA1c0022_orf_11   10524
E3M10000001C02     16     EFA103038    5017    EFA1c0030_orf_17   10613
E3M10000001C09     17     EFA103021    5015    EFA1c0030_orf_16   10612
E3M10000001D02     18     EFA101159    4916    EFA1c0022_orf_2p   10543
E3M10000001D04     19     EFA100742    4891    EFA1c0022_orf_20   10534
E3M10000001D04     19     EFA101417    4942    EFA1c0022_orf_18   10531
E3M10000001D04     19     EFA102554    5002    EFA1c0022_orf_19   10532
E3M10000001D05     20     EFA100955    4902    EFA1c0022_orf_28   10542
E3M10000001D05     20     EFA100978    4904    EFA1c0022_orf_27   10541
E3M10000001D09     21     EFA100210    4870    EFA1c0022_orf_9p   10560
E3M10000001D09     21     EFA100211    4871    EFA1c0022_orf_10   10523
E3M10000001E01     22     EFA101162    4919    EFA1c0022_orf_5p   10555
E3M10000001E01     22     EFA101163    4920    EFA1c0022_orf_6p   10557
E3M10000001E02     23     EFA103038    5017    EFA1c0030_orf_17   10613
E3M10000001E03     24     EFA100210    4870    EFA1c0022_orf_9p   10560
E3M10000001E03     24     EFA100211    4871    EFA1c0022_orf_10   10523
E3M10000001E04     25     EFA100642    4884    EFA1c0041_orf_56   10792
E3M10000001E08     26     EFA102502    4995    EFA1c0031_orf_36   10627
E3M10000001E09     27     EFA100210    4870    EFA1c0022_orf_9p   10560
E3M10000001E09     27     EFA100211    4871    EFA1c0022_orf_10   10523
E3M10000001F02     28     EFA102502    4995    EFA1c0031_orf_36   10627
E3M10000001F04     29     EFA102541    4998    EFA1c0028_orf_3p   10602
E3M10000001F06     30     EFA100642    4884    EFA1c0041_orf_56   10792
E3M10000001F07     31     EFA101164    4921    EFA1c0022_orf_7p   10558
E3M10000001G02     32     EFA101409    4934    EFA1c0022_orf_11   10524
E3M10000001G03     33     EFA100210    4870    EFA1c0022_orf_9p   10560
E3M10000001G03     33     EFA100211    4871    EFA1c0022_orf_10   10523
E3M10000001G04     34     EFA101165    4922    EFA1c0022_orf_8p   10559
E3M10000001G05     35     EFA101160    4917    EFA1c0022_orf_3p   10549
E3M10000001H02     36     EFA102541    4998    EFA1c0028_orf_3p   10602
E3M10000001H03     37     EFA100210    4870    EFA1c0022_orf_9p   10560
E3M10000001H03     37     EFA100211    4871    EFA1c0022_orf_10   10523
E3M10000001H04     38     EFA100742    4891    EFA1c0022_orf_20   10534
E3M10000001H04     38     EFA101417    4942    EFA1c0022_orf_18   10531
E3M10000001H04     38     EFA102554    5002    EFA1c0022_orf_19   10532
E3M10000004A04     39     EFA101417    4942    EFA1c0022_orf_18   10531
E3M10000004A04     39     EFA102554    5002    EFA1c0022_orf_19   10532
E3M10000004C03     40     EFA100478    4880    EFA1c0012_orf_2p   10486
E3M10000004D01     41     EFA101412    4937    EFA1c0022_orf_14   10527
E3M10000004D01     41     EFA101413    4938          #N/A          #N/A
E3M10000004D01     41     EFA101414    4939    EFA1c0022_orf_15   10528
E3M10000004D02     42     EFA102022    4974    EFA1c0044_orf_10   10881
E3M10000004D02     42     EFA102023    4975    EFA1c0044_orf_10   10882
E3M10000004D10     43     EFA101162    4919    EFA1c0022_orf_5p   10555
E3M10000004D10     43     EFA101163    4920    EFA1c0022_orf_6p   10557
E3M10000004E11     44     EFA101086    4910    EFA1c0040_orf_90   10763
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E3M10000012G07     127    EFA101411    4936    EFA1c0022_orf_13   10526
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