(57)【要約】Ｎ−グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質、これらタンパク質をコードする核酸分子、それらを含有する医薬組成物、及び、可溶性ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の量を増加させる方法。前記ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質は、血管新生を刺激し維持するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列識別番号１、配列識別番号３、配列識別番号５から成るグループから選択されるポリヌクレオチド配列、または、前記配列のうちの少なくとも１つとストリジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、そして、それに挿入された、少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位をコードするヌクレオチド配列を有する、単離核酸分子。
【請求項２】
配列識別番号２、配列識別番号４、配列識別番号６から成るグループから選択されるアミノ酸配列を有し、更に、それに挿入された、少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位を有する単離ポリペプチド。
【請求項３】
前記少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位が、ＮＸＴのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から成る、請求項１の単離核酸分子。
【請求項４】
前記少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位が、配列識別番号１、配列識別番号３又は配列識別番号５のヌクレオチド２８６−２９４に挿入されている、請求項１の単離核酸分子。
【請求項５】
請求項１の核酸分子の発現によって産生される単離ポリペプチド。
【請求項６】
血管内皮成長因子レセプター−１に結合する請求項２の単離ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１の核酸分子を有するベクター。
【請求項８】
請求項７のベクターでトランスフェクト又はトランスフォームされた宿主細胞。
【請求項９】
請求項２のポリペプチドを有効量が含有する医薬組成物。
【請求項１０】
更にヘパリンを含有する、請求項９の医薬組成物。
【請求項１１】
宿主細胞から可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７を作製するための方法であって、
配列認識番号１のヌクレオチド配列に少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位を挿入する工程と、
前記挿入されたＮ−グリコシル化部位を有する前記ヌクレオチド配列を宿主細胞にトランスフォーム又はトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクトされた宿主細胞を、挿入Ｎ−グリコシル化部位を有する前記ヌクレオチド配列が発現されるように培養培地中で培養する工程と、そして
発現されたポリペプチドを、前記宿主細胞が培養された培養培地から単離する工程、を有する、宿主細胞から可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７を作製するための方法。
【請求項１２】
更に、前記ポリペプチドが発現された後に、前記培養されたトランスフェクション宿主細胞をヘパリンに対して曝露させる工程を有する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位が、ＮＸＴのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から成る、請求項１１の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位がコードする前記ヌクレオチド配列が、配列識別番号１のヌクレオチド２８６−２９４に挿入されている、請求項１１の方法。
【請求項１５】
宿主細胞から、可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７， ＶＥＧＦ−Ｂ１８６又はＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５ポリペプチドの量を増加させるための方法であって、
配列識別番号１、配列識別番号３又は配列識別番号５のヌクレオチド配列から成るグループから選択されるヌクレオチド配列に、少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位を挿入する工程と、
前記挿入されたＮ−グリコシル化部位を有する前記ヌクレオチド配列を宿主細胞にトランスフォーム又はトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクトされた宿主細胞を、Ｎ−グリコシル化部位を有する前記ヌクレオチド配列が発現されるように培養培地中で培養する工程と、そして
発現されたポリペプチドを、前記宿主細胞が培養された培養培地から単離する工程、を有する、宿主細胞からの、可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７， ＶＥＧＦ−Ｂ１８６又はＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５ポリペプチドの量を増加させるための方法。
【請求項１６】
更に、前記ポリペプチドが発現された後に、前記培養されたトランスフェクトされた宿主細胞をヘパリンに対して曝露させる工程を有する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位が、ＮＸＴのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から成る、請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列識別番号１、配列識別番号３、又は、配列識別番号５のヌクレオチド２８６−２９４に挿入されている、請求項１５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ＶＥＧＦ−ＢのＮ−グリコシル化によって可溶性タンパク質が増加するという発見に関する。
【０００２】
哺乳動物の血管系の二つの主要な構成要素は、内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は、哺乳動物のすべての血管とリンパ管との内表面の内層を形成する。新しい血管の形成は、二つの異なるプロセス、即ち、脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は血管新生 （ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって起こりうる（リソー，ダブリュ（Ｒｉｓａｕ， Ｗ），Ｎａｔｕｒｅ　３８６：６７１−６７４（１９９７）を参照）。脈管形成は、初期胚の原始血管叢の形成に於いて起こるもののような、内皮細胞前駆体の成熟内皮細胞への目的部位（インサイチュ）での分化と、これらの細胞の血管を形成するための連携作用、とによって特徴付けられる。これに対して、血管新生、即ち、既存の血管の成長と分岐とによる血管の形成、は、後の胚形成に於いて重要であり、成体に於いて起こる血管の成長の大部分をつかさどる。血管新生は、内皮細胞の増殖、細胞外マトリクスの分解、血管の分岐、それに続く細胞接着事象、を含む生理学的に複雑なプロセスである。成体に於いて、血管新生は、厳密に制御され、正常な状況では女性の生殖系に限定される。しかしながら、血管新生は、組織損傷に応答してスイッチ・オンされることが可能である。固型腫瘍は、周囲の組織に於いて血管新生を誘発させることができ、これによって、腫瘍の成長を維持し、転移の形成を促進する（フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．１：２７−３１，（１９９５））。複雑な血管新生プロセスの背後に存在する分子機構についてはほとんど理解されていない。
【０００３】
血管新生は、又、それが疾患の様々な続発症に役割を果たす、又は、それらに直接関わる、多数の病理状態にも関係している。いくつかの具体例として、種々の肝臓疾患に関連する新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、糖尿病の新血管新生続発症、高血圧症の新血管新生続発症、外傷後の新血管新生、頭部外傷による新血管新生、慢性肝感染（たとえば、慢性肝炎）の新血管新生、高温又は低温外傷による新血管新生、ホルモンの過多に関連する機能障害、血管腫の形成、及び血管新生術後の再狭窄、が挙げられる。関節炎では、新しい毛細血管が、関節に侵入し、軟骨を破壊する。糖尿病においては、網膜における新しい毛細血管が硝子体に侵入し、出血と失明を引き起こす（フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）および シン，ワイ（Ｓｈｉｎｇ， Ｙ．）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０９３１−１０９３４ （１９９２））。これら及びその他の疾患に於ける血管新生因子の役割はまだはっきりと確立されていない。
【０００４】
血管新生は、非常に多くの生理的又は病理的プロセスに於いて重要な役割を果すものである為、血管新生の制御に関連する因子について鋭意研究されてきた。血管新生の調節には、多数の成長因子が関連していることが示されている。これらには、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、及び肝細胞成長因子 （ＨＧＦ）が含まれる。たとえば、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）を参照。
【０００５】
内皮細胞特異的成長因子の特定のファミリー、即ち、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）とそれらに対応するレセプター、とが、内皮細胞成長及び分化の刺激と、分化細胞の或る種の機能との主要な原因となっていることが示唆された。これらの因子は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーであり、主として内皮レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を介して作用するものと考えられる。前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの成長因子は、システイン−ノットスーパーファミリーの成長因子に属し、それは、又、ニューロトロフィンとトランスフォーミング成長因子−βを含む。
【０００６】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーに於いて８種類のタンパク質が同定されている。即ち、二つのＰＤＧＦ（Ａ及びＢ）と、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバーである。ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバーとは、ルードヴィッヒ　インスティテュート　フォー　キャンサー　リサーチ（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とヘルシンキ大学の国際特許出願ＷＯ９６／２６７３６及び米国特許第５，８４０，６９３号及び第５，６０７，９１８号に記載のＶＥＧＦ−Ｂ、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他のＥＭＢＯ　Ｊ．１５：２９０−２９８（１９９６）、リー（Ｌｅｅ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１９８８−１９９２（１９９６）及びヒューマン・ゲノム・サイエンス（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社の米国特許第５，９３２，５４０号及び第５，９３５，５４０号に記載のＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧＦ２、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）及びアチェン（Ａｃｈｅｎ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５４８−５５３（１９９８）に記載のＶＥＧＦ−Ｄ、マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９２６７−９２７１（１９９１）に記載の胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、そしてヒューマン・ゲノム・サイエンス社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）に記載のＶＥＧＦ３である。各ＶＥＧＦファミリーメンバーは、それらのＶＥＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ）において、ＶＥＧＦに対して３０％ないし４５％のアミノ酸配列同一性を有する。このＶＥＧＦホモロジードメインは、前記システイン−ノットモチーフを形成する８つの保存されたシステイン残基を含んでいる。それらの活性、生理状態において、前記タンパク質はダイマーである。ＶＥＧＦファミリーの機能的特徴としては、内皮細胞そして近縁細胞タイプに対する様々なレベルのマイトジェン活性、血管透過性の誘発、及び血管新生及びリンパ管新生特性がある。
【０００７】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、複数のソースから単離されているホモダイマー糖タンパク質である。ＶＥＧＦは内皮細胞に対する高度に特異的なマイトジェン活性を示す。ＶＥＧＦは、胚時期の脈管形成と成体期の血管新生における新しい血管の形成において重要な調節機能を有する（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０：４３５−４３９， １９９６； フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３９−４４２， （１９９６）， フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）及びデイヴィス−スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ）， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．， １８： ４−２５， （１９９７）で検討）。ＶＥＧＦが果たす役割の重要性は、一つのＶＥＧＦ対立遺伝子の不活性化によって、血管系の発達不全によって胚が致死することを示す研究に示されている（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３５−４３９， （１９９６）； フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３５−４３９；フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３８０： ４３９−４４２， （１９９６））。ＶＥＧＦの単離と性質は、既に研究されている。フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７： ２１１−２１８， （１９９１）及びコノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７： ２１９−２２３， （１９９１）を参照。
【０００８】
更に、ＶＥＧＦは、単球に対して強い化学誘引活性を示し、内皮細胞中でプラスミノーゲン活性化因子およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビタを誘発し、更に、微小血管透過性を誘発することができる。後者の活性により、それは、時として血管透過性因子（ＶＰＦ）と称される。ＶＥＧＦは、又、ある種の造血細胞に対して化学誘引性である。最近の文献に、ＶＥＧＦが樹状細胞の成熟を阻止し、それによって、腫瘍に対する免疫応答の効果を低減させることが示されている（多くの腫瘍はＶＥＧＦを分泌する）（ガブリロヴィッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）他， Ｂｌｏｏｄ ９２： ４１５０−４１６６， （１９９８）； ガブリロヴィッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）他， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５： ２９６３−２９７０， （１９９９））。
【０００９】
血管内皮成長因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）は、ＶＥＧＦに類似の血管新生及びその他の特性を有するが、組織に於ける分布と発現はＶＥＧＦと異なる。特に、ＶＥＧＦ−Ｂは、心臓で強く発現され、肺では弱くしか発現せず、これに対してＶＥＧＦはその反対である（オロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ， Ｂ．）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：２５７６−２５８１（１９９６））。ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、メラノーマ、正常皮膚、及び筋肉に於けるＶＥＧＦ−Ｂ　ｍＲＮＡの存在が示された。このことは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂとは、それらが多く組織において同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）されるという事実にも拘わらず、機能的な相違を有する可能性があることを示唆している。ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの成長因子の比較は、ＶＥＧＦ−Ｂの１６７アミノ酸アイソフォームが、グリコシル化が完全に欠如した唯一のファミリーメンバーであることを示している。標的遺伝子組換え研究によって、ＶＥＧＦ−Ｂ欠乏が軽い心臓表現型（ｍｉｌｄ ｃａｒｄｉａｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）と冠状動脈系障害をもたらすことが示された（ベッロモ（Ｂｅｌｌｏｍｏ）他， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８６：Ｅ２９−３５ （２０００））。
【００１０】
ヒトＶＥＧＦ−Ｂは、細胞内レチノイン酸結合タンパク質タイプ−Ｉ（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞タンパク質のスクリーニングによる酵母コ−ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング技術（ｙｅａｓｔ ｃｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒａｐ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して単離された。双方のヒトとマウスＶＥＧＦ−Ｂのヌクレオチド及びアミノ酸配列を含む単離と特徴付けは、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ の国際特許出願ＷＯ９６／２６７３６及び，米国特許第５，８４０，６９３号及び第５，６０７，９１８号、及びオロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９３： ２５７６−２５８１， （１９９６）に詳細に記載されている。ヒトＶＥＧＦ−Ｂのヌクレオチド配列は、ジェンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）寄託番号Ｕ４８８０１にも見られる。ＷＯ９６／２６７３６，米国特許第５，８４０，６９３号及び米国特許第５，６０７，９１８号の全開示を、ここに参考文献として合体させる。ＶＥＧＦ−Ｂに対するマウスの遺伝子とヒトの遺伝子はほとんど同一であり、共に、約４ｋｂのＤＮＡの長さである。これら遺伝子は、７つのエキソンからなり、それらのエキソンイントロン構成は、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦ遺伝子のそれと類似している（グリモンド（Ｇｒｉｍｍｏｎｄ）他， Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｒｅｓ． ６：１２４−１３１（１９９６）； オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１９３１０−１９３１７ （１９９６）； タウンソン（Ｔｏｗｎｓｏｎ）他， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２０：９２２−９２８（１９９６））。
【００１１】
ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３を発現するようにトランスフェクトされた細胞を使用して、内皮細胞特異性レセプターチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化を誘導する培地の能力をスクリーニングすることによって、ＰＣ−３前立腺癌細胞ライン（ＣＲＬ１４３５）の馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）から単離された。ＶＥＧＦ−Ｃは、組換えＶＥＧＦＲ−３との親和性クロマトグラフィを使用して精製され、ＰＣ−３ｃＤＮＡライブラリからクローニングされた。その単離と特徴付けは、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他， ＥＭＢＯ Ｊ．， １５： ２９０−２９８， （１９９６）に詳細に記載されている。
【００１２】
ＶＥＧＦ−Ｄは、ハイブリダイゼーションプローブとして、“Ｓｏａｒｅｓ Ｂｒｅａｓｔ ３ＮｂＨＢｓｔ”と命名されたヒトｃＤＮＡライブラリから得られた発現配列タグでのスクリーニングによって、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社から市販されているヒト胸ｃＤＮＡライブラリから単離された（アチェン（Ａｃｈｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９５： ５４８−５５３， （１９９８））。その単離と特徴付けは、国際特許出願ＷＯ９８／０７８３２と米国特許第６，２３５，７１３号とに詳細に記載されている。これらの文献は、更に、ＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸残基９３−２０１から成るＶＥＧＦ−Ｄの生物活性フラグメントの単離も記載している。ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子は成体ヒトにおいて広く発現されるが、もちろん、至るところに発現されるものではない。ＶＥＧＦ−Ｄは、心臓と、肺と骨格筋において強く発現する。中間レベルのＶＥＧＦ−Ｄが、脾臓と、卵巣と、小腸と、結腸で発現し、より低いレベルの発現は、腎臓、すい臓、胸腺、前立腺、睾丸で起こる。脳、胎盤、肝臓又は末梢血白血球からのＲＮＡにおいてはＶＥＧＦ−Ｄ　ｍＲＮＡは検出されなかった。
【００１３】
ＰｌＧＦは、（妊娠の）満期の胎盤ｃＤＮＡライブラリから単離された。その単離と特徴付けは、マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ８８： ９２６７−９２７１， （１９９１）に詳細に記載されている。今のところ、その生物学的機能はよく理解されていない。
【００１４】
ＶＥＧＦ３は、結腸組織由来のｃＤＮＡから単離された。ＶＥＧＦ３は、ＶＥＧＦに対して約３６％の同一性と約６６％の類似性を有すると言われている。ＶＥＧＦ３をコードする遺伝子の単離方法は明らかでなく、その生物活性の特徴付けは国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）には開示されていない。
【００１５】
二つのタンパク質間の類似性は、それらの一方のタンパク質のアミノ酸配列と、保守的アミノ酸置換とを第２のタンパク質の配列と比較することによって決定され、これに対して同一性は、保守的アミノ酸置換を含まずに決定される。
【００１６】
上述したように、前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーメンバーは、主として、レセプターチロシンキナーゼに結合することによって作用する。一般に、レセプターチロシンキナーゼは、特定の成長因子（単数又は複数）に結合可能な細胞外ドメインと、通常はそのタンパク質のアルファヘリックス部分である膜貫通ドメインと、レセプターが、たとえば、タンパク質リン酸化によって調節されることが可能な膜近傍ドメインと、レセプターの酵素成分であるチロシンキナーゼドメインと、多くのレセプターにおいて、チロシンキナーゼのその基質の認識と結合に関与するカルボキシル−末端テールとから成る糖タンパク質である。
【００１７】
２つの異なるサブクラスに属する、５つの内皮細胞特異性レセプターチロシンキナーゼ、すなわち、３つの血管内皮細胞成長因子レセプター、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１），ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）と、そして、Ｔｉｅファミリーの２つのレセプター、Ｔｉｅ及びＴｉｅ−２（Ｔｅｋ）が同定されている。これらのレセプターは、その特異性と親和性において互いに異なる。これらのすべては、シグナル伝達に必要な、内因性のチロシンキナーゼ活性を有する。
【００１８】
ＶＥＧＦに結合することが知られているレセプターチロシンキナーゼは、ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２，ＶＥＧＦＲ−３のみである。ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２は、高い親和性でＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦ−１は、更に、ＰｌＧＦにも結合する。ＶＥＧＦ−ＢはＶＥＧＦＲ−１に高い親和性で結合するが、ＶＥＧＦＲ−２又は−３には結合しない（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５：１１７０９−１１７１４（１９９８））。ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３のリガンドであることが示されており、それは、更にＶＥＧＦＲ−２を活性化する（ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １５： ２９０−２９８， （１９９６））。ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する（アチェン（Ａｃｈｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５： ５４８−５５３， （１９９８））。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２のリガンドは、リジェネロン・ファーマシューティカルス社（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５（ＷＯ９６／１１２６９）に記載されている。Ｔｉｅのリガンドはまだ同定されていない。
【００１９】
また、新規な１３０−１３５ｋＤａＶＥＧＦアイソフォーム特異的レセプターが、精製され、クローニングされた（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他， Ｃｅｌｌ， ９２： ７３５−７４５， １９９８）。このＶＥＧＦレセプターは、ヘパリンに対して弱い親和性を示す、エキソン７コード配列を介してＶＥＧＦ１６５アイソフォームに特異的に結合することが分かった（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他， Ｃｅｌｌ， ９２： ７３５−７４５， （１９９８））。驚くべきことに、このレセプターは、初期段階の神経形態形成に関与するレセプターである、ヒトのニューロピリン−１（ＮＰ−１）と同じであることが示された。ＰｌＧＦ−２も、ＮＰ−１と相互作用するようである（ミグダル（Ｍｉｇｄａｌ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ， ２７３： ２２２７２−２２２７８， （１９９８））。
【００２０】
ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３は内皮細胞によって異なった発現をする。一般に、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とは共に、血管内皮において発現され（オールリッチス（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）他， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ８： １１−１８， （１９９２）； カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７８： ２０７７−２０８８， （１９９３）； デュモント（Ｄｕｍｏｎｔ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０３： ８０−９２， （１９９５）； フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０７： １−１０， （１９９６））、そして、ＶＥＧＦＲ−３は、ほとんど、成体組織のリンパ内皮中に発現される（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９： ３５６６−３５７０， （１９９５））。ＶＥＧＦＲ−３は、又、腫瘍の周囲の血管系にも発現される。
【００２１】
ＶＥＧＦＲ−１は、主として発達中において内皮細胞に発現されるものではあるが、それは、胚形成の初期段階中に造血前駆細胞中にも見つけることができる（フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｎａｔｕｒｅ， ３７６： ６６−７０， （１９９５））。成体において、単球と、マクロファージも、このレセプターを発現する（バーレオン（Ｂａｒｌｅｏｎ）他， Ｂｌｏｏｄ， ８７： ３３３６−３３４３， （１９９５））。胚においては、ＶＥＧＦＲ−１が全部ではないが、大半の血管において発現される（ブライアー（Ｂｒｅｉｅｒ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０４： ２２８−２３９， （１９９５）； フォン（Ｆｏｎｇ）他， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０７： １−１０， （１９９６））。
【００２２】
ＶＥＧＦの同定と特徴付け以来、多くの重要な知見が、血管新生因子の活性と、新規な因子の解明に集中している。初期の知見は、血管新生が正常な発達と生理機能とに必要であることを示した。胚形成、損傷治癒、及び黄体形成等のプロセスは、すべて、血管新生と血管新生因子が関連している。たとえば損傷治癒中において、ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡのレベルが増加することは、ＶＥＧＦの発現と治癒プロセスとの間の直接的相関関係を示唆している。又、ＶＥＧＦ調節の欠損は、損傷治癒障害と関連しているかもしれない（フランク，エス（Ｆｒａｎｋ， Ｓ．）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０５：１２６０７−１２６１３（１９９５））。
【００２３】
別の重要な知見は、血管新生と腫瘍の発達との間の関連に関する。腫瘍の増殖と転移は、共に、血管新生依存プロセスである（フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．）およびシン，ワイ（Ｓｈｉｎｇ， Ｙ．）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０９３１−１０９３４ （１９９２））。たとえば、腫瘍細胞が動物に導入されたとき、ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡの発現バターンは、壊死性の、腫瘍増殖領域の周囲の細胞中において最も高いレベルを示す。これらの領域内において多くの血管が同定された。これらの領域におけるＶＥＧＦの発現は、酸素欠乏状態である低酸素血症が壊死性腫瘍中におけるＶＥＧＦの発現と放出の起因となることを示唆している。ＶＥＧＦ−Ｂの発現は、又、腫瘍増殖とも直接的に関連付けられている（米国特許第５，８４０，６９３号を参照）。ＶＥＧＦ−Ｂ発現は、腫瘍関連マクロファージと、更に、卵巣上皮腫瘍に於いて特に、上方制御される（ソウター（Ｓｏｗｔｅｒ））他， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ７７：６０７−１４， （１９９７））。ＶＥＧＦ−Ｂ　ｍＲＮＡは、腺癌、乳癌、リンパ腫、扁平上皮癌、メラノーマ、線維肉腫、及びシュワン細胞腫を含む、調べられた大半の腫瘍細胞系に検出可能である（サルヴェン（Ｓａｌｖｅｎ）他， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． １５３：１０３−８（１９９８））。
【００２４】
ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーのメンバーがバリアント転写産物を作り出すことが示された。ＶＥＧＦは、選択的スプライシングにより、異なる転写産物を示すことが示された。ヒトのＶＥＧＦ遺伝子は、５種類のｍＲＮＡ種を有し （ノイフェルト（Ｎｅｕｆｅｌｄ）他， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １３：９−２２（１９９９））、これによって、その分子質量と生物特性とが異なるタンパク質を作り出す（カーメリット，ピー（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ， Ｐ．）， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６：３８９−３９５ （２０００））。ｈＶＥＧＦ−Ａ１６５アイソフォームが、大半のヒト組織に於ける主な転写産物であり、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２への結合に加えて、ニューロピリン−１レセプターに対する特有の親和性を備えたポリペプチドを作り出す。ｈＶＥＧＦ１２１とｈＶＥＧＦ１８９アイソフォームは、正常組織においてはより低レベルで発現される。ｈＶＥＧＦ２０６アイソフォームは、主として、胚組織に発現される（ホウク（Ｈｏｕｃｋ）他， Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ５：１８０６−１４（１９９１））のに対して、ｈＶＥＧＦ１４５は、腫瘍細胞ラインにのみ見つけることができる（ポルトラック（Ｐｏｌｔｏｒａｋ）他， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７２：７１５１−８（１９９７））。更に、ＶＥＧＦは、又、病理状態においてはアイソフォーム特異的に調節される。肺及び結腸癌において、ｈＶＥＧＦ１６５とｈＶＥＧＦ１２１とが上方制御され、これに対してｈＶＥＧＦ１８９は変わらず、このことは、悪性腫瘍に於けるＶＥＧＦのアイソフォーム特異的役割を示唆している（チェン（Ｃｈｅｕｎｇ）他， Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ． ２９：９１０−４（１９９８））。 マウスＶＥＧＦ−Ｂでのアイソフォーム特異的ＶＥＧＦターゲッティング実験によって、ｍＶＥＧＦ１６４とｍＶＥＧＦ１８８が、出生後の成長と心臓血管系の正常機能の維持のためにより重要であり、他方、ｍＶＥＧＦ１２０は、脈管形成を開始し、促進することが示された（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ５：４９５−５０２（１９９９））。
【００２５】
胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は、三種類のアイソフォームを有し、それらは、組織及び発達特異的に発現される（マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：９２５−３１（１９９３）； カオ（Ｃａｏ）他， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２３５：４９３−８（１９９７））。
【００２６】
ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生成されたＶＥＧＦ−Ｂの２つのアイソフォームが認識されている（グリモンド（Ｇｒｉｍｍｏｎｄ）他， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：１２４−１３１（１９９６）； オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１９３１０−１９３１７ （１９９６）； タウンソン（Ｔｏｗｎｓｏｎ）他， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２０：９２２−９２８（１９９６））。それらは、１６７のアミノ酸残基の細胞結合型（ＶＥＧＦ−Ｂ１６７）と、１８６のアミノ酸残基の分泌型（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）である。これらアイソフォームは、シグナル配列を除いて１１５のアミノ酸残基の同一のＮ末端ドメインを有している。前記共通のＮ末端ドメインは、エキソン１−５によってコードされる。残るエキソン６Ａ，６Ｂ及び７の差次的な使用によって、前記２つのスプライスアイソフォームが作り出される。エキソン６に於ける選択的スプライス−受容部位の使用による、１０１ｂｐの挿入が、フレームシフトとＶＥＧＦ−Ｂ１６７　ｃＤＮＡのコード領域の停止が導入される。このように、前記２つのＶＥＧＦ−Ｂアイソフォームは異なるＣ末端ドメインを有する。
【００２７】
ＶＥＧＦ−Ｂの前記２つのスプライスアイソフォームの異なるＣ末端ドメインは、それらの生化学的及び細胞生物学特性に影響を与える。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７のＣ末端ドメインは、複数の保存されたシステイン残基と塩基性アミノ酸残基の伸展とにより、ＶＥＧＦの対応する領域に構造的に関係している。従って、このドメインは、高度に親水性かつ塩基性であり、従って、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７は、その産生細胞がヘパリン又は高塩濃度で処理されない限り、分泌時に細胞結合状態に留まるであろう。前記ＶＥＧＦ−Ｂ１６７と結合する細胞結合分子は、恐らく、細胞表面又は細胞周囲ヘパリン硫酸プロテオグリカンである。恐らく、このアイソフォームの細胞結合は、その固有の塩基性Ｃ末端ドメインを介して起こるものである。
【００２８】
ＶＥＧＦ−Ｂ１８６のＣ末端ドメインは、データベース中の公知のアミノ酸配列と有意な類似性を有さない。ＶＥＧＦ−Ｂ１８６のＣ末端ドメインの疎水性は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の親水性で塩基性のＣ末端ドメインと対照的である。これは、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６はその分泌時に細胞結合状態に留まらないという観察によって支持される。最近の証拠は、このアイソフォームが、タンパク質分解的に処理され、これによってタンパク質の生物特性が調節されることを示している（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５：１１７０９−１１７１４（１９９８））。
【００２９】
前記ＶＥＧＦ−Ｂアイソフォームのグリコシル化において更に別の相違が見られる。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７はまったくグリコシル化されていないのに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ１６６は、０−グリコシル化されるがＮ−グリコシル化されない。
【００３０】
ＶＥＧＦ−Ｂの両アイソフォームは、又、ＶＥＧＦとヘテロダイマーを形成し、このことは、ＰＤＧＦ−様タンパク質の分子間及び分子内ジスルフィド結合に前記８つのシステイン残基が関与しているという観察と一致している。更に、多くの組織においてＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとが共発現するということは、ＶＥＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦヘテロダイマーが自然発生することを示唆している。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７−ＶＥＧＦヘテロダイマーは細胞結合状態に留まる。これに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６とＶＥＧＦとのヘテロダイマーは培地中において細胞から自由に分泌される。ＶＥＧＦは、また、ＰｌＧＦともヘテロダイマーを形成する（ディ・サルヴォ（ＤｉＳａｌｖｏ）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ７７１７−７７２３ （１９９５））。このファミリーの成長因子のメンバー間のヘテロダイマー複合体の産生は、多種多様な血管新生又は調節分子のためのベースを提供することが可能であるかもしれない。
【００３１】
分泌ＶＥＧＦ−Ｂ１６７は細胞結合状態に留まることから、多量の可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７を得ることは本質的に困難である。従って、可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の量を増加させるための方法を開発することが求められている。
【００３２】
発明の要旨
本発明は、Ｎ−グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂと、可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７タンパク質の量を増加させるための方法とに関する。
【００３３】
第１の態様において、本発明は、少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位をコードするヌクレオチド配列が挿入され、かつ、配列識別番号１（ＶＥＧＦ−Ｂ１６７をコードする配列）、配列識別番号３（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６をコードする配列）、配列識別番号５（ＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５をコードする配列）から成るグループから選択されるポリヌクレオチド配列を有する精製単離核酸分子を提供する。前記ポリヌクレオチド配列を有する前記核酸分子は、裸（ｎａｋｅｄ）状態および／又はベクター又はリポソーム中に含まれるものであってもよい。前記推定Ｎ−グリコシル化部位は、−ＮＸＴ−，−ＮＸＳ−又は−ＮＸＣ−であり、ここで、Ｎは、アミノ酸アスパラギンを表し、Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、Ｔ，ＳおよびＣは、それぞれ、アミノ酸スレオニン、セリン及びシトシンを表す。従って、前記Ｎ−グリコシル化部位をコードするヌクレオチド配列は、ａａｙ−ｎｎｎ１−（ｗｇｙ／ｗｃｎ）−ｎｎｎ２から成り、ここで、−ｎｎｎ１−はｔｇａ，ｔａｒ又はｃｎｎでなく、そして−ｎｎｎ２−は好ましくはｃｃｎでなく、ここで、ｗはアデニン又はチミン／ウラシルを表し、ｇはグアニンを表し、ｙはシトシン又はチミン／ウラシルを表し、ｃはシトシンを表し、ｎはアデニン、シトシン、グアニン又はチミン／ウラシルを表し、ｔはチミン／ウラシルを表し、ａはアデニンを表し、そしてｒはグアニン又はアデニンを表す（Ｎ−グリコシル化のルールは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｉｃｅｄｏｃ．ｐｌ？ＰＤＯＣ００００１に記載されている）。好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、ａａｙ−ｎｎｎ１−（ａｇｙ／ｗｃｎ） −ｎｎｎ２から構成される。
【００３４】
本発明は、上述した核酸分子と、更に、前記ポリヌクレオチドのフラグメント、更に、前記ポリヌクレオチドの非コード鎖に対して十分な類似性を有してストリジェントな条件下でそれらに対してハイブリダイズし、配列識別番号１、配列識別番号２、配列識別番号３又は配列識別番号５に対して少なくとも９０％の同一性を示すＶＥＧＦ−Ｂ又はそのフラグメント又はアナログをコードし、かつ、ＶＥＧＦＲ−１に結合する、前記ポリヌクレオチドのバリアントを含む。従って、そのような、それに挿入される、少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位をコードするヌクレオチド配列を有する、そのようなポリヌクレオチドフラグメント及びバリアントは、本発明の態様として意図される。ストリジェントハイブリダイゼーション条件の一例は以下の通りである。５　Ｘ　ＳＳＣ、２０ｍＭ　ＮａＰＯ４，ｐＨ６．８，　５０％ホルムアミドで４２℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２　Ｘ　ＳＳＣ中４２℃での洗浄、である。当業者は、ハイブリダイズされる配列の長さと、ＧＣヌクレオチド塩基含有量に応じて経験的にこれらの条件を変えることが望ましく、又、そのようなバリエーションのための十分に確立された公式が存在する、ということを理解している。たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， 第２版、ｐ．９．４７−９．５１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９）を参照。
【００３５】
更に、他の非ヒト哺乳動物ＶＥＧＦ−Ｂ形態をコードするポリヌクレオチドを有し、そこに挿入される少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位をコードするヌクレオチド配列を有する、精製単離核酸分子も本発明の態様であり、それらによってコードされるポリペプチドも本発明の態様である。
【００３６】
本発明の第２の態様は、配列識別番号２（ＶＥＧＦ−Ｂ１６７）、配列識別番号４（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）、配列識別番号６（ＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５）から成るグループから選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、そこに挿入された少なくとも一つのＮ−グリコシル化部位を有するタンパク質の精製と単離に関する。この精製単離タンパク質は、好ましくは、本発明の前記核酸分子の発現によって作成される。上述したように、前記少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位は、−ＮＸＴ−，−ＮＸＳ−又は−ＮＸＣ−であり、ここで、Ｎは、アミノ酸アスパラギンを表し、Ｘはいかなるアミノ酸でもよく、Ｔ，ＳおよびＣは、それぞれ、アミノ酸スレオニン、セリン及びシトシンを表す。好ましくは、前記Ｎ−グリコシル化部位は、−ＮＸＴ−又は−ＮＸＳ−であり、特に好ましくは−ＮＸＴ−である。又、Ｘと、Ｔ又はＳに続くアミノ酸はプロリンではない。
【００３７】
ここでの使用において、「ＶＥＧＦ−Ｂ」という用語は、集合的に、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６ポリペプチドアイソフォーム、更に、配列識別番号１，配列識別番号３又は配列識別番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ＶＥＧＦＲ−１に結合、および／又は、ＶＥＧＦ−Ｂの脈管形成刺激活性を有する、それらのフラグメント又はアナログを指す。前記活性物質は、好ましくは、ＶＥＧＦ−Ｂの特徴であるところの、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ここで、Ｘａａはいかなるアミノ酸であってもよい）を含む。
【００３８】
保守的置換、挿入又は欠失を有するが、それでもＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を保持しているポリペプチドが、本発明の範囲に含まれることは明らかである。当業者にとって、そのようなポリペプチドを作り出すために容易に使用可能な方法、たとえば、部位特異的突然変異や特異的な酵素開裂及びライゲーションの使用、は周知であろう。当業者には、又、単数又は複数のアミノ酸又はアミノ酸残基が、非自然発生アミノ酸又はアミノ酸アナログによって置換されたペプチド擬似化合物又は化合物は、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性の必要な要素を保持可能であることも周知であろう。そのような化合物は、当該技術において公知の方法によって容易に製造、テストすることができ、それらも又、本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
更に、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂで起こることが知られている、選択的スプライシングから得ることができるＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドの可能なバリアント形態と、ＶＥＧＦ−Ｂをコードする核酸配列の自然発生対立遺伝子バリアントは、本発明の範囲に含まれる。対立遺伝子バリアントは周知であり、単数又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有するが、そのコードされるポリペプチドの機能が実質的に変化しない、別形態の核酸配列を表す。
【００４０】
そのようなＶＥＧＦ−Ｂのバリアント形態は、修飾のためにＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドの非必須領域をターゲッティングすることによって調製することができる。これらの非必須領域は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの成長因子の強力に保存された領域の範囲外にあるものと予想される。特に、ＶＥＧＦ−Ｂを含む、ＶＥＧＦファミリーの成長因子は、ダイマー性であり、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−Ｂは、Ｎ末端ドメイン、すなわち、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦホモロジードメインの８つのシステイン残基の完全な保存を示す（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９６ ９３ ２５７６−２５８１； ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９６ １５ ２９０−２９８）。これらのシステインは、分子内及び分子間ジスルフィド結合に関与していると考えられている。更に、Ｃ末端ドメインには、更に、強力ではあるが、完全にではなく保存されたシステイン残基が存在する。分子内ジスルフィド結合によって形成される、各サブユニットのループ１，２及び３は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの成長因子のレセプターへの結合に関与している（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）他， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， １９９５ １２ １５９−１６４）。
【００４１】
当業者は、単数又は複数のシステインが保存されないレセプター結合ＶＥＧＦ−Ｂアナログが知られているので例外もあるかもしれないが、大半のケースにおいては、これらのシステイン残基が、提案されたバリアント形状において保存されるはずであることを周知している。同様に、当業者には、ループ１，２及び３に存在する活性部位もまた保存されるはずである、ということは周知である。しかしながら、前記分子の他の領域は、生物機能に関して重要性が低いものであると予測でき、従って、修飾のための適切なターゲットを提供するものである。修飾ポリペプチドの、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を示す能力は、内皮細胞増殖アッセイなどの標準的な活性アッセイ手法によって容易にテストすることができる。
【００４２】
好ましくは、アミノ酸置換が使用される場合、その置換は、保守的、すなわち、一つのアミノ酸は、類似のサイズで、電荷特性が類似のものによって置換される。ここでの使用において、「保守的置換」とは、１つのアミノ酸が、すなわち、類似の特性を有する、別の生物的に類似の残基によって置換されることをいう。保守的置換の具体例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、又はメチオニンなどの１つの疎水性残基の、別の残基との置換、又は、１つの極性残基の、別の極性の残基との置換、たとえば、アルギニンのリジンとの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、グルタミンのアスパラギンとの置換、等、がある。互いに置換可能な中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンがある。「保守的置換」という用語は、更に、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含む。保守的置換の具体例を次の表１に示す。
【００４３】
【表１】
2004504042.tif 000002
【００４４】
あるいは、保守的アミノ酸は、下記の表２に示されているように、レーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ），（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版； Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｐｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ． ＮＹ：ＮＹ （１９７５）， ｐｐ．７１−７７）に記載されているようにグループ分けすることができる。
【００４５】
【表２】
2004504042.tif 000003
【００４６】
保守的置換の具体例を下記の表３に示す。
【００４７】
【表３】
2004504042.tif 000004
【００４８】
もし望ましい場合は、本発明の前記ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質を、たとえば、アミド化、カルボキシル化、又はリン酸化、あるいは、本発明のペプチドの、酸添加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル、及びＮアシル誘導体の作成、によって修飾することができる。また、それらのタンパク質を、他の成分との共有結合性又は非共有結合性複合体を形成することによって、ペプチド誘導体を作るために修飾することも可能である。共有結合複合体は、化学成分を、前記ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖、又は、Ｎ又はＣ末端において官能基に結合させることによって調製することができる。
【００４９】
特に、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質は、非限定的に、放射性標識、蛍光標識、酵素（たとえば、比色定量又は蛍光測定反応を触媒するもの）、基質、固体マトリクス、又はキャリア（たとえばビオチン又はアビジン）を含むレポーター基に共役結合させることができる。前記ポリペプチドは、アフィニティ精製を補助するべく、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ）、又はヒスチジン等の、エピトープタグに結合させることが可能である。本発明によるポリペプチドは、更に、検出可能な標識によって標識することができる。前記ポリペプチドは、適当な、画像処理のための、超磁性体、常磁性体、高電子密度、エコジェニック（ｅｃｏｇｅｎｉｃ）、又は放射性の薬剤に共有又は非共有結合させることができる。診断アッセイ用として、放射性又は非放射性標識を使用することができる。放射性標識の具体例としては、１２５Ｉや３２Ｐ等の、放射性原子又は基がある。非放射性標識の具体例としては、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ等の酵素標識又は、フルオレセイン−５−イソシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識がある。標識は、直接的又は間接的、共有結合的又は非共有結合的に行うことができる。
【００５０】
前記修飾ポリペプチドの、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を示す能力は、線維芽細胞増殖アッセイなどのルーチン的な活性分析手法によって容易にテストすることができる。
【００５１】
本発明の核酸とポリペプチドとは、合成手段、又は、組換え手段によって作成することができ、あるいは、自然源から精製することも可能であると明確に理解されるであろう。
【００５２】
ここでの使用において、「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉、「それを含むが、それに限定されることはない」ということを意味する。それに対応する意味は、「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という言葉にも適用される。
【００５３】
本発明の第３の態様は、本発明の第１態様の核酸分子を有するベクターと、本発明の核酸分子又はベクターによってトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。これらは、真核又は原核由来のものとすることができる。これらの細胞は、本発明のポリペプチドの発現用に特に適しており、組換えバキュロウイルスに感染した、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な、Ｓｆ９又はＨＦ細胞などの昆虫細胞、そして、適当な発現プラスミドによってトランスフェクトされたヒト胚腎臓細胞ライン２９３−ＥＢＮＡを含む。本発明の好適なベクターは、本発明に拠る核酸が、単数又は複数の適当なプロモータ、および／又はその他のコントロール配列に作動連結されて、それらベクターによってトランスフォーム又はトランスフェクトされた適当な宿主細胞が、本発明のポリペプチドを発現することが可能な、発現ベクターである。その他の好適なベクターは、アデノウィルス、ワクシニア、又はレトロウィルスベースのベクター又はリポソームのように、哺乳動物細胞のトランスフェクション用、あるいは、遺伝子治療用として適当なものである。そのようなペプチドの変種は当該技術において公知である。
【００５４】
本発明は、又、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを発現可能なベクターの製造方法を提供し、この方法は、前記第１態様の核酸分子を、前述したように、単数又は複数の適当なプロモータ、および／又は他のコントロール配列に作動連結する工程を有する。
【００５５】
本発明は、更に、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供し、この方法は、本発明の核酸又はベクターを宿主細胞中で発現させる工程と、前記宿主細胞から、又は、前記宿主細胞の培養培地から前記ポリペプチドを単離する工程とを有する。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、適当な医薬用キャリアと組み合わせて使用することができる。その結果得られる組成物は、有効量のグリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ又はその薬剤学的に許容可能な非毒性の塩、そして、薬剤学に許容可能な固体又は液体のキャリア又はアジュバンドとを有する。そのようなキャリア又はアジュバンドの具体例としては、非限定的に、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、鉱油、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、白糖、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、シックナー、安定剤、懸濁剤、そしてこれらの組み合わせがある。それらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、クリーム、軟膏（ｓａｌｖｅ）、エリキシル、シロップ、ウェーファー、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、又は、その他の従来形状のものとすることができる。その製剤形態は、その投与形態に応じて調製される。組成物は、グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂと、更に、オプションとして、ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ、非グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰｌＧＦおよび／又はヘパリンを含むことができる。前記グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂを有する組成物は、前記活性化合物を、約０．１〜９０重量％、最も一般的には、約１０〜３０重量％含む。
【００５７】
筋肉内投与用として、好ましくは、塩酸塩等の、前記グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂの適当な可溶性塩形態の、殺菌製剤を、パイロジェンフリー水（蒸留）、生理的食塩水又は５％グルコース溶液などの薬用希釈液に溶解させて投与することができる。適当な不溶性形態の前記化合物は、水性ベース、又は、オレイン酸エチル等の長鎖脂肪酸の薬剤的に許容可能なオイルベース中の懸濁剤として調合、投与することができる。
【００５８】
更に別の態様において、本発明は、宿主細胞から可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７を製造する方法と、宿主細胞から可溶性ＶＥＧＦ−Ｂ１６７，ＶＥＧＦ−Ｂ１８６又はＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５タンパク質の量を増加させるための方法とを提供する。これらの方法は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７，ＶＥＧＦ−Ｂ１８６又はＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５タンパク質をコードするヌクレオチド配列に少なくとも１つの推定Ｎ−グリコシル化部位を挿入する工程と、前記挿入されたＮ−グリコシル化部位を有する前記ヌクレオチド配列を宿主細胞にトランスフォーム又はトランスフェクトする工程と、前記トランスフェクトされた宿主細胞を、挿入Ｎ−グリコシル化部位を有する前記ヌクレオチド配列が発現されるように培養培地中で培養する工程と、発現されたポリペプチドを、前記宿主細胞が培養された培養培地から単離する工程とを有する。これらの方法は、更に、前記ポリペプチドが発現された後に、前記培養されたトランスフェクション宿主細胞をヘパリンに対して曝露させる工程を有することができる。
【００５９】
以下、本発明を添付の図面を参照して更に詳細に説明する。
【００６０】
好適実施例の詳細説明
例１：　グリコシル化部位の導入
前述したように、ＶＥＧＦ−Ｂは、Ｎ−グリコシル化部位が完全に欠如した、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーメンバーである。ＶＥＧＦ−Ｂに対するＮ−グリコシル化の影響を分析するために、Ｎ−グリコシル化部位をＶＥＧＦ−Ｂに導入した。ＶＥＧＦ−ＢのＮ−グリコシル化を導く変異を導入するのに最も適した部位を決定するために、ＶＥＧＦ−Ａ，ＰｌＧＦ及びＶＥＧＦ−Ｂそれぞれの最初の９９のアミノ酸のアミノ酸配列をアラインメントした（図１を参照）。アミノ酸６５−６７におけるＶＥＧＦ−ＡとＰｌＧＦのＮ−グリコシル化部位は図１においてイタリック体で示されている。推定Ｎ−グリコシル化部位（ＮＸＴ）をコードするヌクレオチドを、ｈＶＥＧＦ−Ｂ（配列識別番号１）のヌクレオチド２８６−２９４に相当する位置に挿入した。位置２８６−２９４に正常に見られる置換されたヌクレオチドは、アミノ酸残基ＱＶＲをコードするものであり、これらのアミノ酸残基を図１において太字で示す。
【００６１】
例２：　組換ベクターの調製
双方のＶＥＧＦ−Ｂの自然発生アイソフォーム（すなわち、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６）と、人工スプライスバリアント（エキソン１−５のみから成る）を、Ｎ−グリコシル化部位を有する、と、有しない、６種類の哺乳動物発現ベクターを構築した。
【００６２】
ＰＣＲを使用して、ヒスチジンタグをコードするヌクレオチドを、ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６をコードするヌクレオチド配列のＣ末端に付加した。次に、ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６をコードするヌクレオチド配列を、標準クローニング手法を使用してｐＳｅｃＴａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に挿入し、ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６を構築した。ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６の全配列を、配列識別番号７として示す。
【００６３】
ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴを構築するために、３’プライマー：５’−ＴＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡ−３’（配列識別番号８）を使用してヌクレオチド位置２８９−２９７にＮ−グリコシル化部位を導入した、ジェンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ４８８０１からのヌクレオチド１−３２５を包含するＰＣＲ産物を産生した。このＰＣＲ生成物を次に、全長ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６とプラスミドにクローニングし、ここで、それは、対応の配列に、ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−ＮＸＴを作成するために、置換された。次に、標準クローニング手法を使用して、ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−ＮＸＴのＮ末端と、ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６のＣ末端を共にクローニングよってヒスチジンタグを付加し、ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴを産生した。標準クローニング手法を使用してｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴを構築するため、ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴ をコードするヌクレオチド配列をｐＳｅｃＴａｇＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴの全配列を配列識別番号９として示し、前記プラスミドを図２に示す。
【００６４】
ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７−Ｈ６を構築するために、５’プライマー： ５’−ＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴ−３’（配列識別番号１０）と３’ プライマー： ５’−ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣ−３’（配列識別番号１１）と、テンプレートとしてｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７とを使用して、ジェンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ４８８０１からのヌクレオチド２５０−５６７、前記ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド、停止コドン、ＮｏｔＩ制限部位、及び末端クランプヌクレオチドを包含する３４９ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。この３４９ｂｐのＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、このＫｐｎＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、標準クローニング手法を使用して、このベクターから除去されたＫｐｎＩ−ＮｏｔＩフラグメントに置換するべくｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７−Ｈ６に挿入した。ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７−Ｈ６の全配列を配列識別番号１２に示す。
【００６５】
同様に、ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７−Ｈ６−ＮＸＴを、ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、このベクターから除去されたＫｐｎＩ−ＮｏｔＩフラグメントに置換するべく、ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴに挿入することを除いて、上述のように構築した。ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７−Ｈ６−ＮＸＴの全配列を配列識別番号１３に示し、前記プラスミドを図３に示す。
【００６６】
ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５−Ｈ６を構築するために、５’プライマー： ５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’（配列識別番号１４）と３’プライマー： ５’−ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＧＣＡＣＴＧ−３’（配列識別番号１５）と、テンプレートとしてｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７とを使用して、ジェンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ４８８０１からのヌクレオチド１−４１１、前記ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド、停止コドン、ＮｏｔＩ制限部位、及び末端クランプヌクレオチドを包含する４４３ｂｐのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、それによって得られた３２０ｂｐのフラグメントを、標準クローニング手法を使用して、このベクターから除去されたＫｐｎＩ−ＮｏｔＩに置換するべくｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴに挿入した。ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５−Ｈ６の全配列を配列識別番号１６に示す。
【００６７】
ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５−Ｈ６−ＮＸＴを構築するため、ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、このベクターから除去されたＫｐｎＩ−ＮｏｔＩフラグメントに置換するべく、ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴに挿入することを除いて、上述と同じ手法を使用した。ｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５−Ｈ６−ＮＸＴの全配列を配列識別番号１７に示し、前記プラスミドを図４に示す。
【００６８】
下記の表４は、潜在的グリコシル化部位（ＮＸＴ）を有する、及び、有しない、とで構築されたＶＥＧＦ−Ｂの自然発生１８６及び１６７アミノ酸アイソフォームと、人工スプライスバリアント（エキソン１−５のみから成る）の発現ベクターをリストしている。
【００６９】
【表４】
2004504042.tif 000005
【００７０】
例３：　組換えタンパク質のトランスフェクションと発現
ヒスチジンタグＶＥＧＦ（陽性コントロール）、ＶＥＧＦ−ＣのヒスチジンタグＶＨＤ（陰性コントロール）、及びヒスチジンタグハイブリッド８４−１１（陽性コントロール）を含有する発現ベクターに加えて、上述したヒトＶＥＧＦ−Ｂの６種類の哺乳動物発現ベクター、それぞれを、サムブルック，ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．）他， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ， Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）， １６．３３−１６．３６（１９８９）に記載の手法に従って、ＣａＰＯ４−媒介トランスフェクションを使用して２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、１２−２４時間かけて、Ｓ３５メチオニンとＳ３５システイン（Ｐｒｏｍｉｘ　アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））とで代謝標識した。馴化上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を、ヒトＶＥＧＦ−Ｂに対して特異的な抗血清（８７４）と、ペンタヒスチジンに対して特異的なモノクローナル抗体（Ｈ５　ｍＡｂ，キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））と免疫沈降反応させた。
【００７１】
図５−８に示されているように、前記挿入推定Ｎ−グリコシル化部位を備えて作成された３つのコンストラクトはグリコシル化されている。
【００７２】
図５−７から判るように、上清と可溶化物の比較と、細胞結合したタンパク質を遊離させるためのヘパリンとの使用は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７が細胞表面、又は細胞内にほとんど完全に保持されていることを示している。グリコシル化後、上清中に約５０倍のＶＥＧＦ−Ｂ１６７の増加が検出可能である（図５）。図６及び図７に図示されているように、収集前の２時間に１００μｇ／ｍｌのヘパリンによる処理によってＶＥＧＦ−Ｂ１６７は上清中に遊離される。又、収集前の２時間、２００μｇ／ｍｌのヘパリンで処理した非グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ１６７と比較して、非ヘパリン処理２９３Ｔ細胞の上清中には約２倍のグリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ１６７が検出可能であることも判明した。更に、ヘパリン処理無しのグリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ１６７と比較して、収集前の２時間２００μｇ／ｍｌヘパリンによって処理された上清中に検出されるグリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の量に約３倍の増加があり、そして、収集前の２時間２００μｇ／ｍｌのヘパリンでの処理によって上清中に検出されるグリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の量は、同じヘパリン処理の上清中に検出された非グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の量と比較して、約６倍の増加がある。
【００７３】
図６及び図７は、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６も、細胞表面と細胞内とに部分的に保持されていることを示している。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７とは対照的に、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６の大半は、グリコシル化とヘパリン処理時に、すぐに上清中に放出される（図６及び図７）。ヘパリン処理されたものと未処理の２９３Ｔ細胞間においては上清中にみられるＶＥＧＦ−Ｂ１８６の量において大きな相違はないようである。従って、上清中のＶＥＧＦ−Ｂ１８６とＮ−グリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ１８６タンパク質レベルの相違（約３倍のグリコシル化ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）は、主として、分泌および／又は産生の促進とによるものであって、細胞表面結合タンパク質の遊離によるものではないようである。
【００７４】
図８は、ＶＥＧＦ−ＢＥＸ１−５は、Ｎ−グリコシル化された場合にのみ効率的に培地中に遊離される（可溶性タンパク質の５０倍以上の増加）ということを示している。細胞表面にＶＥＧＦ−Ｂを保持するシグナルが、エキソン６及び７コードドメインにあると考えられことから、このことは予想外である（図８）。この同じ理由により、ヘパリンでの処理は測定されなかった。
【００７５】
例４：　組換えタンパク質のＶＥＧＦレセプター１結合
組換えＶＥＧＦ−ＢがＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦＲ−１）に結合する能力を、ＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ＶＥＧＦＲ−１−Ｆｃ）とからなる可溶性融合タンパク質を使用して分析した。上述の例３のようにしてトランスフェクトさせた２９３Ｔ細胞由来の生合成標識馴化培地を、ＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇと結合させたプロテインＡセファロース（ＰＡＳ）で免疫沈降させた。ビーズを、ＰＢＳで３回洗浄し、結合したタンパク質を溶出させ、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）によって分離した。乾燥させたゲルを、１２−２４時間、ホスホイメージャ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）プレートに曝露した。更に、細胞可溶化物をＨ５　ｍＡｂで免疫沈降させた。
【００７６】
上清中に大量のＶＥＧＦ−Ｂが存在していたときは、ＶＥＧＦＲ−１に対する結合は観察することができなかった。これは、収集前２時間１００μｇ／ｍｌのヘパリンでの処理後のＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６−ＮＸＴ−Ｈ６及びＶＥＧＦ−Ｂエキソン１−５−ＮＸＴ−Ｈ２で見られた（図７及び図８）。
【００７７】
例５：　ＢａＦ３　ＶＥＧＦＲ−０１ＥＣ／ＥｐｏＲ細胞生存の刺激
ＶＥＧＦ−３へＮ−グリコシル化部位を導入することの影響は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７とＶＥＧＦ−Ｂ１６７−ＮＸＴおよび／又はＶＥＧＦ−Ｂ１８６及びＶＥＧＦ−Ｂ１８６−ＮＸＴとによってトランスフェクトされた細胞からの馴化培地の、ＢａＦ３　ＶＥＧＦＲ−０１ＥＣ／ＥｐｏＲ細胞の生存を刺激する能力を測定することによってアッセイすることができる。そのアッセイのために、ＶＥＧＦレセプター１の細胞外ドメインと、エリスロポエチンレセプターの細胞内ドメインとのキメラレセプターで安定的にトランスフェクトされたＢａＦ３細胞を使用する。生存のために、これらの細胞は、インターロイキン−３又はＶＥＧＦＲ−１に結合可能ななんらかの成長因子、たとえば、ＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｂ又はＰｌＧＦのいずれかを必要とする。細胞を、２０，０００／ウェルの密度で９６−ウェルプレートに蒔種し、予め、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７とＶＥＧＦ−Ｂ１６７−ＮＸＴ，ＶＥＧＦ−Ｂ１８６とＶＥＧＦ−Ｂ１８６−ＮＸＴ、あるいはこれらの両方、でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞によって馴化された種々の量の培地の存在下で成長させる。偽（ｍｏｃｋ）（すなわち空（ｅｍｐｔｙ）の）ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの馴化培地をコントロールとして使用することができる。アッセイの前に、前記馴化培地から、適当な抗体を使用した免疫沈降によって潜在的に障害となるタンパク質を除去しておくべきである。たとえば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから市販されている、モノクローナル及びポリクローナル抗ｈＶＥＧＦ抗体の混合物を使用して、アッセイの前に馴化培地からＶＥＧＦ−Ａを除去することができる。ＣＯＳ細胞によって発現される量は（たとえあるとしても）無視できる程度であり、その作用は、ベースラインノイズにおいて可視できないため、培地からＰｌＧＦを予め除去する必要はない。４８時間後、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド　チアゾールブルー） 比色定量アッセイを行い、マイクロタイタープレートリーダーを使用して５４０ｎｍでデータを収集することができる。
【００７８】
膜貫通ドメインの直前にヒトＶＥＧＦＲ−１のコード配列中にＢｇｌＩＩ部位を形成するために、ＶＥＧＦＲ−１の塩基対１９９８−２２６８を、内在性ＢｃｌＩ部位を含むプライマー５’−ＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡＧＴＧＧ−３’と、ＢｇｌＩＩ部位を含む５’−ＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＴＡＧＡＣＴＴＧＴＣＣ−３’でＰＣＲ増幅し、そのＰＣＲフラグメントを、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ　ＳＫＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクターのＶＥＧＦＲ−１のＢｃｌＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。前記ヒトエリスロポエチンレセプターの膜貫通及び細胞内ドメインを、ＥｐｏＲ　ｘ　Ｂ＋Ｂ／ｐｃＤＮＡＩから切り離し、ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして、得られたプラスミドにサブクローニングした。ＥｐｏＲ　ｘ　Ｂ＋Ｂは、ＲＴＫ細胞外ドメインのインフレームライゲーションのための推定膜貫通（ＴＭ）／細胞外（ＥＣ）ドメイン接合部に付加された内部ＢｇｌＩＩ部位を有するＥｐｏＲのクローンである。そのベクターの骨格は、ｐＣＤＮＡ１−ａｍｐである（〜５．４ｋｂ、オリジナルの１．７５ｋｂ　ＥｐｏＲクローンは、ＫｐｎＩを使用してｐＣＤＮＡ−１−ａｍｐにサブクローニングされ、その配列はＬｏｄｉｓｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＭＩＴによって報告された）。前記ＴＭとＥｐｏＲの細胞質ドメインとを含む〜１ｋｂフラグメントは、ＢｇｌＩＩ（５’）−ＮｏｔＩ（３’）消化を使用してこのクローンから切り離すことができる。
【００７９】
前記ＶＥＧＦＲ−１／ＥｐｏＲコンストラクトは、最後に、ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして、ｐＥＦ−ＢＯＳベクター（ミズシマ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ）他， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １８ （１７）： ５３２２　１９９０年９月１１日）にサブクローニングされた。これによって得られたプラスミドを、ＢａＦ３細胞内にエレクトロポーレーションし、２５０ミリグラム／ｍＬゾエシン（ｚｏｅｃｉｎ）での選択によって安定した細胞プールが生成された。
【００８０】
以上の説明及び例は、本発明を単に例示する目的で記載されたものであって、限定的であることを意図されるものではない。当業者は本発明の精神及び本質を取り入れたここに開示された実施例の改変に想到するであろうから、本発明は、添付の請求項の範囲内のすべて及びそれらの均等物を含むものと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＶＥＧＦ−ＡとＰｌＧＦのＶＥＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ）とＶＥＧＦ−Ｂとのアミノ酸配列のアラインメント。
【図２】
そこに組み込まれたＮ−グリコシル化部位を有する、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６−Ｈ６−ＮＸＴの図。
【図３】
そこに組み込まれたＮ−グリコシル化部位を有する、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７−Ｈ６−ＮＸＴの図。
【図４】
そこに組み込まれたＮ−グリコシル化部位を有するＶＥＧＦ−Ｂのエキソン１−５をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＳｅｃＴａｇＡ−ｈＶＥＧＦ−Ｂ−エキソン１−５−Ｈ６−ＮＸＴの図。
【図５】
潜在的グリコシル化部位（ＮＸＴ）を有する、及び、有しない、でのｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７の発現を図示する図。
【図６】
潜在的グリコシル化部位（ＮＸＴ）を有する、及び、有しない、でのｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７とｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現を図示する図。
【図７】
潜在的グリコシル化部位（ＮＸＴ）を有する、及び、有しない、でのｈＶＥＧＦ−Ｂ１６７とｈＶＥＧＦ−Ｂ１８６の発現とレセプター結合とを図示する図。
【図８】
潜在的グリコシル化部位（ＮＸＴ）を有する、及び、有しない、でのｈＶＥＧＦ−Ｂのエキソン１−５によってコードされるポリペプチドの発現とレセプター結合とを図示する図。
【図２】
2004504042.tif 000006
【図３】
2004504042.tif 000007
【図４】
2004504042.tif 000008
【図５】
2004504042.tif 000009
【図６】
2004504042.tif 000010
【図７】
2004504042.tif 000011
【図８】
2004504042.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004504042.tif 000013
2004504042.tif 000014
2004504042.tif 000015
2004504042.tif 000016
2004504042.tif 000017
2004504042.tif 000018
2004504042.tif 000019
2004504042.tif 000020
2004504042.tif 000021
2004504042.tif 000022
2004504042.tif 000023
2004504042.tif 000024
2004504042.tif 000025
2004504042.tif 000026
2004504042.tif 000027
2004504042.tif 000028
2004504042.tif 000029
2004504042.tif 000030
2004504042.tif 000031
2004504042.tif 000032
2004504042.tif 000033
2004504042.tif 000034
2004504042.tif 000035
2004504042.tif 000036
2004504042.tif 000037
2004504042.tif 000038
2004504042.tif 000039
2004504042.tif 000040
2004504042.tif 000041
2004504042.tif 000042
2004504042.tif 000043
2004504042.tif 000044
2004504042.tif 000045
2004504042.tif 000046
2004504042.tif 000047
2004504042.tif 000048
2004504042.tif 000049
2004504042.tif 000050
2004504042.tif 000051
2004504042.tif 000052
2004504042.tif 000053
2004504042.tif 000054
2004504042.tif 000055
2004504042.tif 000056
2004504042.tif 000057
2004504042.tif 000058
2004504042.tif 000059
2004504042.tif 000060
2004504042.tif 000061
2004504042.tif 000062
2004504042.tif 000063
2004504042.tif 000064
2004504042.tif 000065
2004504042.tif 000066
2004504042.tif 000067
2004504042.tif 000068
2004504042.tif 000069
2004504042.tif 000070
2004504042.tif 000071
2004504042.tif 000072
2004504042.tif 000073
2004504042.tif 000074
2004504042.tif 000075
2004504042.tif 000076
2004504042.tif 000077
2004504042.tif 000078
2004504042.tif 000079
2004504042.tif 000080
2004504042.tif 000081
2004504042.tif 000082
2004504042.tif 000083
2004504042.tif 000084
2004504042.tif 000085
2004504042.tif 000086
2004504042.tif 000087
2004504042.tif 000088
2004504042.tif 000089
2004504042.tif 000090
2004504042.tif 000091
2004504042.tif 000092
2004504042.tif 000093
2004504042.tif 000094
2004504042.tif 000095
2004504042.tif 000096
2004504042.tif 000097
2004504042.tif 000098
2004504042.tif 000099
2004504042.tif 000100
2004504042.tif 000101
2004504042.tif 000102
2004504042.tif 000103
2004504042.tif 000104
2004504042.tif 000105
2004504042.tif 000106
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504042.tif 000107
【国際調査報告】
2004504042.tif 000108