(57)【要約】本発明は、新規ヒトポリ（Ａ）ポリメラーゼ酵素（ＰＡＰ）、その核酸及びアミノ酸配列、及びその使用、並びに当該新規酵素に対する抗体及びその使用に関する。新規酵素は、ＰＡＰガンマと命名され、既知のＰＡＰとは関連しない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２及び／又は４に記載のポリ（Ａ）ポリメラーゼγ（ＰＡＰγ）についてのアミノ酸配列、及び／又はポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）活性を有するその機能的部分、並びに当該配列の本質的に相同的な変異体。
【請求項２】
請求項１記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号１及び／又は３に記載の核酸配列、及び遺伝子コードの縮重に起因する当該核酸配列の変異体。
【請求項３】
請求項２記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項４記載の宿主細胞を適当な培養培地で培養すること及び当該培地からＰＡＰγを回収することを含む、組換えＰＡＰγの生産方法。
【請求項６】
ＰＡＰ関連疾病又は疾患の検出のための、請求項２記載の核酸配列又はその部分の使用。
【請求項７】
ＰＡＰγ特異的部分が使用される請求項６記載の使用。
【請求項８】
ＰＡＰγに選択的であって他のＰＡＰに反応しない、請求項１記載のＰＡＰγに対する抗体。
【請求項９】
ＰＡＰγ関連疾病及び疾患を検出するための、請求項８記載の抗体の使用。
【請求項１０】
請求項１記載のＰＡＰγを含む試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒトポリ（Ａ）ポリメラーゼ酵素（ＰＡＰ）、その核酸及びアミノ酸配列、及びその使用、並びに当該新規酵素に対する抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物のメッセンジャーＲＮＡの大部分は、その３’末端が２００〜２５０のアデノシン残基の尾部（ｔａｉｌ）で終わる。ポリ（Ａ）テイルの機能は十分には解明されていないが、詳細な研究によって、翻訳調節、及びｍＲＮＡの安定性制御を経て、遺伝子発現を調節することにおけるポリ（Ａ）テイルの役割が強調されている（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ及びＴｏｌｌｅｒｖｅｙ，２０００；Ｓａｃｈｓ及びＶａｒａｎｉ，２０００参照）。
【０００３】
ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルが転写後、プレ（ｐｒｅ）−ｍＲＮＡに加えられるが、哺乳動物の核のポリアデニル化の生化学が広範囲にわたって研究されている（Ｗａｈｌｅ及びＲｕｅｇｓｅｇｇｅｒ，１９９９；Ｚｈａｏら，１９９９参照）。反応は多段階であり、２つの別個の段階；ＲＮＡ開裂及びアデノシン付加を経て進行する多構成分反応である。両反応とも、高度に保存された配列要素、ヘキサヌクレオチドＡＡＵＡＡＡに依存する。少なくとも６個のトランス作用する（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）タンパク質因子がイン・ビボの反応に要求される。
【０００４】
これら因子の１つ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）は、ポリ（Ａ）テイル付加に応答性の酵素である。哺乳動物のＰＡＰは、哺乳動物の中の幾つかの種、ヒト、マウス及びウシにおいて同定され、それらの種からクローン化されている（Ｒａａｂｅら，１９９１；Ｔｈｕｒｅｓｓｏｎら，１９９４；Ｗａｈｌｅら，１９９１；Ｚｈａｏ及びＭａｎｌｅｙ，１９９６）。実験データは、ＰＡＰのリン酸化の程度がゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵成熟（Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅら，１９９５）及び初期発生の間に変化することを示す。これらの場合、遺伝子発現において鍵となる（ｋｅｙ）調節機構は、母系ｍＲＮＡの選択的な翻訳活性化であり、当該ｍＲＮＡは長いポリ（Ａ）テイルを得て、ポリリボソームに入る（ｒｅｃｒｕｉｔ）。ＰＡＰリン酸化は、細胞周期の間と同様に変化する（Ｃｏｌｇａｎ及びＭａｎｌｅｙ，１９９７；Ｃｏｌｇａｎら，１９９６）。ＰＡＰは、有糸分裂において進行が止められたヒーラ（ＨｅＬａ）細胞で過リン酸化され、酵素活性が阻害される。有糸分裂に入る細胞がＲＮＡの通常の抑制及びタンパク質合成を示し、これにＰＡＰ活性の阻害が幾つかの様式で寄与する可能性があることも知られている。
【０００５】
多数の型のポリ（Ａ）ポリメラーゼ酵素（ＰＡＰ）が哺乳動物の細胞系及び組織で同定されている（Ｗａｈｌｅ及びＲｕｅｇｓｅｇｇｅｒ，１９９９；Ｚｈａｏら，１９９９で参照される、例えばＴｈｕｒｅｓｓｏｎら，１９９４）。ヒーラ細胞の核抽出物は、幾つかの型のＰＡＰを含有し、免疫ブロッティングによって同定される、９０，１００，１０６ｋＤａという明確な分子量を有する。１０６ｋＤａ型は翻訳後、リン酸化によって修飾されることが以前から示されている（Ｔｈｕｒｅｓｓｏｎら，１９９４）。一連の択一的にスプライシングされたｍＲＮＡが同定されていることから、幾つかの型のＰＡＰが択一的なスプライシングによって発生している（Ｒａａｂｅら，１９９１；Ｔｈｕｒｅｓｓｏｎら１９９４；Ｗａｈｌｅら，１９９１；Ｚｈａｏ及びＭａｎｌｅｙ，１９９６）。択一的なスプライシング及び翻訳後修飾の組合せは、ＰＡＰイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の非常に複雑なパターンの可能性を生じさせる。多数のＰＡＰイソフォーム及びその機能的特徴の同定は未だ解決していない問題のままである。しかしながら、ＰＡＰは、種々の非細胞の場所（核、細胞質）で種々の反応（例えば、ＲＮＡ開裂、ＡＡＵＡＡＡ依存性及び非依存性アデノシン付加）の全セットに関与するため、種々のＰＡＰはイン・ビボの種々の機能に応答性であると仮定することが合理的であると思われる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼが幾つかの疾患、例えば乳癌に関連する（Ｓｃｏｒｉｌａｓら，１９９８、Ｓｃｏｒｉｌａｓら，２０００）ことが知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明者は、各天然イソフォームを表すＰＡＰをヒーラ細胞から生化学的に分離し精製することを達成した。特異的な（ＣＰＳＦ及びヘキサヌクレオチドＡＡＵＡＡＡ依存性）及び非特異的な（ＣＰＳＦ非依存性）イン・ビトロポリアデニル化アッセイを用いた機能的な比較によってイソフォーム間の差異が明らかとなった。これらの差異はＣＰＳＦ／ＰＡＰ／ＲＮＡ複合体の安定性に関係する。ＲＴ−ＰＣＲによって、５個の択一的にスプライシングされた型のＰＡＰ  ｍＲＮＡが同定された。これらの型は、予めクローン化されたヒト及びウシＰＡＰの択一的にスプライシングされた変異体である。これらの型は、択一的なスプライシングによるそれらのカルボキシ末端において異なり、カルボキシ末端ＰＡＰイソフォームを生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
驚くべきことに、推定されたイソフォームの１つ（９０ｋＤａ）は、ある別個の遺伝子によってコードされた新規のヒトＰＡＰ酵素であり、以前同定されたヒトＰＡＰ遺伝子に関連するものではないことが分かった（Ｋｙｒｉａｋｏｐｏｕｌｏｕら，２００１）。
【０００８】
新規のＰＡＰは、ヒト遺伝子命名法委員会（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によってＰＡＰγと命名され、現在ＰＡＰＯＬＡと再命名された遺伝子によってコードされる既知のＰＡＰから区別されることとなった。ＰＡＰγは、ＰＡＰＯＬＧと命名された特有の遺伝子にコードされ、以前同定された哺乳動物ＰＡＰには関係がない。そのヌクレオチド配列及び推定のアミノ酸配列が配列表に提供されている。ＰＡＰγは、以前同定されたヒトＰＡＰとの、そのＮ末端部分（最初の５００アミノ酸）における、ある程度のヌクレオチド配列ホモロジー、約７５％を分担する。Ｃ末端部分は、この位置から開始するが、遺伝子ＰＡＰＯＬＡ及びＰＡＰＯＬＧによってコードされる２つの型のヒトＰＡＰの間に分配される最後の１８アミノ酸を除外して新規のＰＡＰγに特有のものである。
【０００９】
故に、本発明は、配列表配列番号２及び配列番号４に記載のポリ（Ａ）ポリメラーゼγ（ＰＡＰγ）に関するアミノ酸配列及び／又は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）活性を有するその機能部分、並びに本質的に相同な、９０％程度の相同性の当該配列の変異体に関する。
【００１０】
本発明はまた、請求項１記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号１及び／又は配列番号３に記載の核酸配列、及び当該核酸配列の、遺伝子コードの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ：一種のアミノ酸に複数の遺伝暗号が対応していること）に起因する変異体に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、上記の核酸配列を含むベクター、並びにそのベクター、及びＰＡＰγをコードする核酸配列の発現のために必要な他の要素を含む宿主細胞に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、上記宿主細胞を適当な培養培地で培養すること、及び当該培地からＰＡＰγを回収することからなる組換えＰＡＰγの生産方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、上記核酸配列又はその部分の、ＰＡＰγ関連疾病又は疾患の検出のための使用に関する。実際、当該核酸配列又はその部分は、例えば、患者サンプル中の対応する配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして使用されることとなる。
好ましくは、配列のＰＡＰ特異的部分が使用される。
【００１４】
本発明はまた、ＰＡＰγに選択的で他のＰＡＰと反応しない、ＰＡＰγに対する抗体に関する。これは、当該抗体がＰＡＰγのＣ末端部分に存在するエピトープに指向性であることを意味する。従来法によって産生されるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体又は抗体のフラグメントが想起される。例示されている抗体が、下の詳細なセクションに記述される。
本発明による抗体は、異なった型の癌、例えば乳癌などのＰＡＰ関連疾病の検出に使用することができる。
【００１５】
最後に、本発明は、本発明によるＰＡＰγを含む試薬に関する。当該試薬は、ＲＮＡを合成し修飾するために、又はＰＡＰγ活性を撹乱する（ｐｅｒｔｕｒｂ）か影響しない新規な医療用薬物の展開のための標的として意図される。好ましくは、当該薬物標的は、ＰＡＰγの特有なＣ末端部分に由来する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
新規なＰＡＰγがクローン化され、組換えタンパク質が原核発現系において発現された。クローニング及び精製のための手法が以下に表されている。初期動力学的解析によって、新しいヒトＰＡＰγが、ＰＡＰＯＬＡ遺伝子にコードされたヒトＰＡＰと同様に良好か又はそれ以上に良好であることを明らかにした。
以下の全てのヌクレオチド及びアミノ酸数は、好ましいものとして、それぞれ配列番号３及び４を参照する。
【００１７】
図１には、組換えＰＡＰγが、Ｍｎ（ＩＩ）の存在下の非特異的アッセイを用いる、ポリ（Ａ）テイルを合成することに高特異性を有することが示されている。反応混合物は、終濃度：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．６（ＲＴ），４０ｍＭ  ＫＣｌ，４０μＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１．０ｍＭ  ＤＴＴ，０．９単位Ｒｎａｓｉｎ（リボヌクレアーゼ阻害剤），０．１％ＮＰ−４０，０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ2，０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ及び放射線非標識及び放射線標識ＲＮＡ基質オリゴＡ（１５）（３３０フェントモル（ｆｍｏｌ））の混合物を含有する。ＰＡＰが１７．５，３５及び７０ｎｇの３種の異なる量でそれぞれ反応に添加される。反応は３７℃，３０分で進行する。反応をプロテイナーゼＫ緩衝液で停止し、ＲＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、それを１６％アクリルアミド：ビスアクリルアミド（１９：１）−７Ｍ尿素ゲルで泳動する。ゲルを一晩、ホスホイメージャー・スクリーン（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ  ｓｃｒｅｅｎ）に曝し、そして解析する。レーンは以下のように表示する。レーン１：陰性対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＰＡＰなし）、レーン２〜４：０．５ｍＭ  ｒＡＴＰ、レーン５〜７：０．５ｍＭ  ｒＵＴＰ、レーン８〜１０：０．５ｍＭ  ｒＧＴＰ、レーン１１〜１３：０．５ｍＭ  ＣＴＰ及びレーン１４〜１６：０．５ｍＭ  ｄＡＴＰ。
【００１８】
図２には、ＰＡＰγが、ＡＡＵＡＡＡ及びＣＰＳＦ依存性アッセイにおいても機能することが示されている。このデータは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ活性がＰＡＰγに関連するという決定的な証拠を提供する。反応混合物は、終濃度：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．３（ＲＴ），４０ｍＭ  ＫＣｌ，４０μＭ  ＥＤＴＡ，９．６％グリセロール，０．２４ｍＭ  ＤＴＴ，０．９単位Ｒｎａｓｉｎ（リボヌクレアーゼ阻害剤），０．０１％ＮＰ−４０，０．７２ｍＭ  ＭｎＣｌ2，０．２ｍｇ／ｍｌ  １ｍＭ  ＡＴＰ，２．５％ＰＶＡ，２０ｍＭリン酸クレアチニン及び放射線標識ＲＮＡ基質Ｌ３（５３）（合計７０フェントモル（ｆｍｏｌ））の混合物を含有する。ＣＰＳＦ（ウシ胸腺から部分精製）３μｌ及びＰＡＰ５０ｎｇが反応に加えられた。反応は、３０℃，１５〜３０分で進行する。反応をプロテインキナーゼＫ緩衝液で停止し、ＲＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、それを１０％アクリルアミド：ビスアクリルアミド（１９：１）−７Ｍ尿素ゲルで泳動する。ゲルを一晩、ホスホイメージャー・スクリーンに曝し、そして解析する。レーンは以下のように表示する。レーン１：陰性対照（ＰＡＰなし）、レーン２：ＰＡＰ＋ＣＰＳＦ。
【００１９】
ヒーラの核抽出物におけるＰＡＰγの新しく可能となった検出の特有のＣ末端部分に対する特異的なポリクローナル血清の顕色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（図３）。タンパク質をＳＤＳゲルからイモビロンＰ（ｉｍｍｏｂｉｌｏｎＰ）膜に転写し、免疫染色及び視覚化をＥＣＬプラス（ＥＣＬｐｌｕｓ）試薬で行った。レーンは以下のように表示する。
レーン１：既知のヒトＰＡＰ遺伝子に対する２０：１４モノクローナル抗体（１：１０希釈）。３つのイソフォームが９０，１００，１０６ｋＤａで明らかである。このモノクローナル抗体は、２つの異なったＰＡＰ遺伝子から始まるＰＡＰの間に分けられたＰＡＰγの領域を有するエピトープに指向性である。
レーン２，３：１つのイソフォーム，９０ｋＤａの特異的な認識のためのＰＡＰγのアミノ酸５０５近辺で開始する特有の領域に位置するＣ末端部分を含むポリペプチドに対して生じるポリクローナル血清（各希釈１：２０００，１：４０００）。このような特有のポリペプチドの例として、ＰＡＰγのアミノ酸５２１からＣ末端に位置するアミノ酸を含むポリペプチドがある。この新規な抗体はＰＡＰγに特異的である。この新規な抗体は、ＰＡＰγの特有なＣ末端部分に対して発生する。以下にその産生の詳細な説明を表す。
レーン４：前免疫（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）血清（１：２０００希釈）−検出されたシグナルなし。
【００２０】
原核細胞系での発現のための別個のクローニングベクターにおけるＰＡＰγのクローニング
１．ｐＥＴ−３２ａ（＋）ベクターにおけるクローニング
ＰＡＰγのコーディング配列を、ヒーラ総ＲＮＡから逆転写によって誘導されるｃＤＮＡライブラリーを用いるＰＣＲによって増幅した。５’部分からの最初の１４７９ｎｔを増幅するのに使用されたプライマーは以下のものであった：プライマー（ａ）（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３’）、ＮｃｏＩサイト（下線部）を開始コドンの上流に導入したもの；及びプライマー（ｄ）（５’−ＧＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＧＡＧＴＴＧＣ、ＳａｃＩサイトを停止コドンの下流に導入したもの（以下に説明されるｐＣＡＬ−ｃベクターに対するクローニング理由として、ＫｐｎＩ制限酵素認識部位を同時に導入しなければならず、ＰＡＰγを発現する全てのｐＥＴ−３２ａクローンにおけるＣ末端に２つの余分なａａを導入した。ＮｃｏＩクローニングサイトは、Ｌｙｓをグルタミン酸に変えることによって、配列中の第２のａａに点突然変異を導入する））。そのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター中にクローン化し、その後に消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）ＮｃｏＩ／ＳａｃＩ及びライゲーションによって、（ＮｃｏＩ／ＳａｃＩ消化された）ｐＥＴ−３２ａに挿入した。クローンをｐＥＴ−３２（Ｈ１−４９３）と命名する−（Ｈは、タグがＮ末端に位置することを示し、数字１−４９３は、ヒトＰＡＰ配列のアミノ酸１で始まり、アミノ酸４９３で終わるポリペプチドセグメントを指す）。プライマーの別の対（ｐａｉｒ）を、ＰＡＰγの２２０８ｎｔ３’まで達するフラグメントをＰＣＲによって増幅するために使用した。内部プライマー（ｃ）５’−ＧＣＣＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＧＴ−３’及びプライマー（ｇ）（５’−ＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧ−３’)。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔでクローン化し、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩによって消化し、プラスミドｐＰＡＰγ（Ｈ１−４９３）のＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩの制限酵素認識部位の間に挿入した。生じたクローンをｐＰＡＰγ（Ｈ１−６８３）と命名する。ＰＡＰγ配列の全長を決定するために、３’ＲＡＣＥ方法論が「クロンテック・スマート・レース（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｓｍａｒｔ  Ｒａｃｅ）ｃＤＮＡ増幅キット」によって、２つの上流域の特異的プライマー：プライマー（ｈ）（ＣＡＡＣＡＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡ）及びプライマー（ｉ）（ＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＴＡＧ）を用いて行われた。部分的に重ね合わされた（ｓｅｍｉｎｅｓｔｅｄ）後のＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター中にクローン化し、停止コドンの同定の確認のために配列決定した。ＰＡＰγの新しい全長３’端を、新しい巡目のＰＣＲ増幅によって、ｐＧＥＭ−Ｔベクター挿入物、及びプライマー対（ｃ）及びプライマー（ｊ）（５’−ＧＡＧＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＧ）を用いてクローン化した。その新しい３’端を、消化ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩによって、同じ開始クローンｐＰＡＰγ（Ｈ１−４９３）中にクローン化した。
【００２１】
ｐＥＴ−３２（ａ）ベクターは、ＰＡＰγの遺伝子のＮ末端に、組換えタンパク質の溶解性（ｓｏｌｕｂｌｅ）画分の発現を増加するチロドキシン（ｔｈｙｒｏｄｏｘｉｎｅ）タグ、アフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製を可能とするヒスチジンタグ及びＳ−タグを導入する。そのタグは約２０ｋＤａである。
【００２２】
２．ｐＣＡＬ−ｃベクターにおけるクローニング
同じクローニング戦略を用いたが、制限酵素認識切断においては、対となるＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩを使用した。ｐＣＡＬ−ｃベクターは、カルモジュリン親和性樹脂とのアフィニティー精製のために使用することができる４ｋＤａカルモジュリンペプチドタグを導入し、ｐＰＡＰγ（１−７３６Ｃ）と命名されたクローン、又は数字が、コードされたＰＡＰγアミノ酸を示す一方、数字の後のＣが、Ｃ末端に位置するタグを表すものとして同様に命名されたクローンを生じさせる。
【００２３】
大腸菌における、ＰＥＴ３２ａベクターでクローン化された組換え型ＰＡＢγの発現及び精製
プラスミドを含有するＰＡＰγが、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌株を形質転換するために使用された。１コロニーを、１００ｍｌＴＢ培地（リン酸塩を含有）中、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び３４μｇ／ｍｌクロランフェニコールの存在下で接種し、３７℃で静置することによって増殖させる。１００ｍｌの培養液を、必要な抗生物質を含有するＴＢ培地中の最終１Ｌ（ｌｔ）培養液に接種する。菌は、３７℃で激しく振盪することによって増殖し続け、ＯＤ600０．５〜１．０辺りで、０．４２ｍＭ  ＩＰＴＧ＋０．５２４ｍＭ  ＭｇＣｌ2を用いて誘導される。細胞を、誘導３時間後の遠心処理によって回収し、ペレットを−７０℃で凍結した。
【００２４】
抽出物は、細胞を氷上で解凍することによって作製し、５０ｍｌ溶解緩衝液（２０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）／ＫＯＨ  ｐＨ７．５，０．５Ｍ  ＫＣｌ，１．０％ＮＰ−４０，１．０％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０，１０％グリセロール，５ｍＭイミダゾール，２０ｍＭβ−メルカプトエタノール＋１錠のＥＤＴＡ非存在（ｆｒｅｅ）プロテアーゼ阻害剤）で溶解した。次に、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）（３ｘ１０秒）、遠心処理：３９０００ｇで２０分、及び０．４５μｍのろ過処理を行った。細胞抽出物は、バッチに関して（ｂａｔｃｈｗｉｓｅ）、溶解緩衝液で平衡化した１ｍｌタロン（Ｔａｌｏｎ）樹脂（Ｃｏ＋＋アフィニティーアガロース）に混合し、４℃，１時間の回転処理（ｒｏｔａｔｉｏｎ）によってタンパク質を結合させる。この樹脂を、クロマトグラフィーカラムに手動で充填し、２０カラム体積の溶解緩衝液で洗浄する。その後、２０体積の洗浄緩衝液（界面活性剤とβ−メルカプトエタノールがない溶解緩衝液）で洗浄する。タンパク質は、５体積の溶出緩衝液（２０ｍＭヘペス／ＫＯＨ  ｐＨ７．５，０．５Ｍ  ＫＣｌ，１０％グリセロール，２００ｍＭイミダゾール，０．５Ｍ  ＫＣｌ）によって溶出する。溶出液を、２０ｍＭヘペス／ＫＯＨ  ｐＨ７．５，０．５Ｍ  ＫＣｌ，１．０％ＮＰ−４０，１．０％ツイーン−２０，１０％グリセロール，５０ｍＭイミダゾールで平衡化した１ｍｌハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ）キレーティングカラムに装填する。カラムを１０カラム体積の平衡化緩衝液及び１０体積の洗浄緩衝液（界面活性剤がなく、０．０５Ｍ  ＫＣｌを含有する平衡化緩衝液）で洗浄する。タンパク質を５体積の溶出緩衝液（２０ｍＭヘペス／ＫＯＨ  ｐＨ７．５，０．０５Ｍ  ＫＣｌ，１０％グリセロール，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２００ｍＭイミダゾール）で溶出する。
【００２５】
溶出液を、２０ｍＭヘペス／ＫＯＨ  ｐＨ８．６，０．０５Ｍ  ＫＣｌ，１０％グリセロール，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2緩衝液で平衡化したヘパリン・ハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ）カラムに装填する。カラムを５体積の平衡化緩衝液で洗浄し、組換えタンパク質を、０．５ｍｌ毎の画分として、０．５Ｍ  ＫＣｌを含有する同緩衝液５体積で溶出する。全て緩衝液において、用事調製で（ｆｒｅｓｈｌｙ）０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，１．０μｇ／ｍｌロイペプチン，１．０ｍｇ／ｍｌペプスタチン，１．０μｇ／ｍｌアプロチニンを加える。
【００２６】
大腸菌における、ｐＣＡＬ−ｃベクターでクローン化された組換え型ＰＡＢγの発現及び精製
プラスミドを含有するＰＣＡＬ−ｃ  ＰＡＰγが、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌株を形質転換するために使用された。１コロニーを、５０ｍｌＴＢ培地（リン酸緩衝液を含有）＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中に接種し、３７℃で静置することによって増殖させる。５０ｍｌの培養液を、抗生物質を含有するＴＢ培地中の最終５００ｍｌ培養液に接種する。菌は、３７℃で激しく振盪することによって増殖し続け、ＯＤ600０．５〜１．０辺りで、０．４２ｍＭ  ＩＰＴＧ＋０．５２４ｍＭ  ＭｇＣｌ2を用いて誘導される。細胞を、誘導３時間の遠心処理によって回収し、ペレットを−７０℃で凍結する。抽出物は、細胞を氷上で解凍することによって作製し、３０ｍｌ溶解緩衝液−（Ｃａ結合緩衝液）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．１５Ｍ  ＫＣｌ，０．１％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−１００，１０％グリセロール，１ｍＭ  Ｍｇ（ＣＨ3ＣＯＯ），２ｍＭ  ＣａＣｌ2，１ｍＭイミダゾール，１０ｍＭβ−メルカプトエタノール＋１錠のＥＤＴＡ非存在（ｆｒｅｅ）プロテアーゼ阻害剤）で溶解した。次に、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）（４ｘ３０秒）、遠心処理：３９０００ｇで２０分、及び０．４５μｍのろ過処理を行った。
【００２７】
細胞抽出物は、バッチに関して（ｂａｔｃｈｗｉｓｅ）、結合緩衝液で平衡化した０．７５ｍｌカルモジュリン樹脂（アフィニティーアガロース）に混合し、４℃，一晩の回転処理（ｒｏｔａｔｉｏｎ）によってタンパク質を結合させる。この樹脂を、クロマトグラフィーカラムに手動で充填し、２０カラム体積の洗浄Ｉ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．２Ｍ  ＫＣｌ，０．１％トライトン−１００，１０％グリセロール，１ｍＭ  Ｍｇ（ＣＨ3ＣＯＯ），２ｍＭ  ＣａＣｌ2，１ｍＭイミダゾール，１０ｍＭβ−メルカプトエタノール）で洗浄する。その後、２０体積の洗浄ＩＩ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５，０．２５Ｍ  ＫＣｌ，１０％グリセロール，１ｍＭ  Ｍｇ（ＣＨ3ＣＯＯ），２ｍＭ  ＣａＣｌ2，１ｍＭイミダゾール）で洗浄する。組換えタンパク質を、０．５ｍｌ毎の画分として、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１Ｍ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，１０％グリセロール，０．５ｍＭ  ＤＴＴ及び１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有する緩衝液７体積で溶出する。全て緩衝液において、用事調製で（ｆｒｅｓｈｌｙ）０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，１．０μｇ／ｍｌロイペプチン，１．０ｍｇ／ｍｌペプスタチン，１．０μｇ／ｍｌアプロチニンを加える。
【００２８】
ＰＡＰγを特異的に認識するポリクローナル血清の産生
アミノ酸５２１で始まり、アミノ酸６８３で終わるポリペプチドとして表される、ＰＡＰγ配列の特有の部分は、ｐＥＴ−３２（ａ）ベクターでクローン化され、組換えポリペプチドを精製し、ウサギの免疫に使用する。
【００２９】
４９１ｎｔ長のフラグメントは、上記アミノ酸を含み、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）としてプラスミドｐＥＴ−３２（６６８）及び、プライマーの対：プライマー（ｐ）（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＴＴＧＴＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＣ−３’）及びプライマー（ｇ）（５’−ＧＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧ−３’)を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローン化し、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩとの制限酵素消化後、ｐＥＴ３２（ａ）ベクターに挿入する。組換えポリペプチドを、組換えタンパク質の精製スケジュール（ｓｃｈｅｄｕｌｅ）に本質的に記載されているように、発現して精製する。抗原は９５％を超える純度であり、０．９ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。５００μｌの抗原を、２匹の別個のウサギへの繰り返し投与の注射のために使用した。
【００３０】
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【００３１】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１：本発明による新規なＰＡＰγのＤＮＡ配列。
配列番号２：配列番号１記載のＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列。
配列番号３：本発明による新規なＰＡＰγの相同性変異体のＤＮＡ配列。
配列番号４：配列番号３記載のＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ポリ（Ａ）ポリメラーゼ活性の、ｒＡＴＰの特異的な取り込みによる実例である。図１は、異なったヌクレオチドアナローグの存在下での組換え全長ＰＡＰγの重合活性を示す。
【図２】本発明によるＰＡＰγの特異的なポリアデニル化活性を示す。
【図３】６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に泳動された異なった抗体による、ヒーラ細胞の核抽出物における天然ＰＡＰイソフォームの認識を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月8日(2003.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４個のｃＤＮＡクローン：
第一のｃＤＮＡクローン［ｐＰＡＰ＿（Ｈ１−４９３）］は、プライマー５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３’及びプライマー５’−ＧＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＧＡＧＴＴＧＣによって定義される位置の間の配列を含有する；
第二のｃＤＮＡクローン［ｐＰＡＰ＿（Ｈ１−６８３）］は、プライマー５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３’及びプライマー５’−ＧＡＧＡＧＣＴＣＴＡＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧ−３’によって定義される位置の間の配列を含有する；
第三のｃＤＮＡクローン［ＰＡＰ＿の全長］は、プライマー５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３’及びプライマーＧＡＧＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＧによって定義される位置の間の配列を含有する；
第四のｃＤＮＡクローン［ｐＰＡＰ＿（１−７３６Ｃ）］は、プライマー５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３’及びプライマー５’−ＧＡＧＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＧによって定義される位置の間の配列を含有する、
の組合せによって定義されるアミノ酸配列を含むヒトポリ（Ａ）ポリメラーゼγ（ＰＡＰγ）。
【請求項２】
請求項１記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号１に記載の核酸配列、及び遺伝子コードの縮重に起因する当該核酸配列の変異体。
【請求項３】
請求項１記載の、コードされる配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、及び／又はポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）活性を有するその機能的部分、並びに当該配列の相同的な変異体。
【請求項４】
請求項２記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項５記載の宿主細胞を適当な培養培地で培養すること及び当該培地からＰＡＰγを回収することを含む、組換えＰＡＰγの生産方法。
【請求項７】
ＰＡＰ関連疾病又は疾患の検出のための、請求項２記載の核酸配列又はその部分の使用。
【請求項８】
ＰＡＰγ特異的部分が使用される請求項７記載の使用。
【請求項９】
ＰＡＰγに選択的であって他のＰＡＰに反応しない、請求項１記載のＰＡＰγに対する抗体。
【請求項１０】
ＰＡＰγ関連疾病及び疾患を検出するための、請求項９記載の抗体の使用。
【請求項１１】
請求項１記載のＰＡＰγを含む試薬。原明細書の請求項１〜１０を補正した。
【国際調査報告】
2004523235.tif 000028
2004523235.tif 000029
2004523235.tif 000030