(57)【要約】新規エンテロキナーゼ開裂配列が提供される。また、融合タンパク質構築物中に存在する目的タンパク質を迅速に単離するための方法も開示され、この融合タンパク質構築物は本発明の新規エンテロキナーゼ開裂配列およびその融合構築物を固体基体上に捕獲するためのリガンド認識配列を含む。本発明の好ましい実施形態は、既知エンテロキナーゼ開裂基質 （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ の３０倍までの開裂速度を示す。
2004503219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロキナーゼ認識配列を含み、かつ下記式を有するポリペプチド：
（１）Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号１）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸であり、存在する場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＴｒｐであり；Ｘａａ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；並びにＺ１およびＺ２は任意であり、独立に１以上のアミノ酸を有するポリペプチドである）。
【請求項２】
Ｘａａ１がＡｓｐであり、Ｘａａ２がＩｌｅであり、Ｘａａ３がＡｓｎであり、Ｘａａ４がＡｓｐであり、かつＸａａ５がＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、もしくはＴｙｒである請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
Ｚ１がリガンド認識配列である請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｚ１がストレプトアビジン結合ドメインである請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
ストレプトアビジン結合ドメインが配列：Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号６）、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５）、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号２１０）、Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２１１）、並びにそれらの直列配置の組合せおよび反復から選択される請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｚ２が目的タンパク質である請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドＸａａ５−Ｚ２が目的タンパク質である請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
エンテロキナーゼ認識配列を含み、かつ下記式を有するポリペプチド：
Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号２）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｖａｌであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｔｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＳｅｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；並びにＺ１およびＺ２は両者とも任意であり、独立に１以上のアミノ酸を有するポリペプチドである）。
【請求項９】
Ｘａａ５がＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、もしくはＴｙｒである請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｚ１がリガンド認識配列である請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｚ１がストレプトアビジン結合ドメインである請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ストレプトアビジン結合ドメインが配列：Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号６）、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５）、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号２１０）、Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２１１）、並びにそれらの直列配置の組合せおよび反復から選択される請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１３】
表１、２、３、および４に示される、配列番号１０−７３および７５−１９３からなる群より選択される配列を有するエンテロキナーゼ認識配列を含むポリペプチド。
【請求項１４】
アミノ末端からカルボキシ末端の方向に配置された以下のドメインを含むエンテロキナーゼ開裂性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド：リガンド認識配列、式 Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２０８）または Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２０９）を有するエンテロキナーゼ認識配列、および目的タンパク質。
【請求項１５】
環状ＤＮＡを含み、かつ請求項１４記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
組換え宿主細胞における発現のための、プロモーター配列に機能的に連結された請求項１４記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１７】
発現した融合タンパク質の培養培地への分泌を達成するための、ポリヌクレオチドに機能的に連結されたシグナル配列をさらに含む請求項１６記載の発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞が原核性である請求項１８記載の宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞が真核性である請求項１８記載の宿主細胞。
【請求項２１】
目的タンパク質を単離するための方法であって：
（ａ）アミノ末端からカルボキシ末端の方向に配置された以下のドメイン：リガンド認識配列、式：
（ｉ）Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５（配列番号２０６）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸であり、存在する場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＴｒｐであり；Ｘａａ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよい）
または
（ｉｉ）Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ５（配列番号２０７）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｖａｌであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｔｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＳｅｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよい）
を有するエンテロキナーゼ認識配列、および目的タンパク質を含むエンテロキナーゼ開裂性融合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを発現する組換え宿主細胞を該融合タンパク質の発現に適する条件下で培養し；
（ｂ）発現した融合タンパク質を固体支持体上に固定化した結合リガンドと、結合リガンドおよびリガンド認識配列の間での結合複合体の形成に適する条件下で接触させ；
（ｃ）結合複合体をエンテロキナーゼと接触させ；並びに
（ｄ）目的タンパク質を回収する、
ことを含む方法。
【請求項２２】
（ａ１）前記融合タンパク質が発現時に分泌されない工程（ａ）の後に、宿主細胞を溶解する工程、および（ａ２）細胞片を培養培地から分離する工程をさらに含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
（ａ１）前記融合タンパク質が発現時に分泌される工程（ａ）の後に、分泌された融合タンパク質を含有する培養培地を収集する工程をさらに含む請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記融合タンパク質が下記式を有する請求項２１記載の方法：
（１）Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号１）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸であり、存在する場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＴｒｐであり；Ｘａａ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；Ｚ１は配列 Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ（配列番号８４）を含むポリペプチドであり、並びに Ｘａａ５−Ｚ２ は目的タンパク質である）。
【請求項２５】
前記融合タンパク質が下記式を有する請求項２１記載の方法：
（２）Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号２）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｖａｌであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｔｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＳｅｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；Ｚ１は配列 Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ（配列番号８４）を含むポリペプチドであり；および Ｘａａ−Ｚ５ は目的タンパク質である）。
【請求項２６】
Ｘａａ５がＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒである請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
目的遺伝子パッケージを単離するための方法であって：
（ａ）遺伝子パッケージにおいて目的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させる工程であって、該目的タンパク質はエンテロキナーゼ開裂配列に融合しており、該エンテロキナーゼ開裂配列は該遺伝子パッケージの表面上に発現するポリペプチドに融合している、工程；
（ｂ）遺伝子パッケージを目的タンパク質のリガンドと、該リガンドおよび該目的タンパク質の間での結合複合体の形成に適する条件下で接触させる工程であって、該リガンドは固体支持体上に固定化することが可能である、工程；
（ｃ）該接触工程（ｂ）の前後のいずれかに、該リガンドを固体支持体上に固定化する工程；
（ｄ）工程（ｂ）において形成された固定化結合複合体をエンテロキナーゼと接触させる工程；および
（ｅ）目的遺伝子パッケージを該固体支持体から回収する工程、
を含む方法。
【請求項２８】
リガンドがビオチニル化され、固定化が固定化されたストレプトアビジンまたはアビジンに結合させることによる請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
リガンドを、該リガンドに結合する固定化抗体に結合させることによって固体化する請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）の後に、（ｂ１）支持体を洗浄して非結合物質を除去する工程をさらに含む請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記目的タンパク質が抗体またはそれらの断片である請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記回収された遺伝子パッケージを、細菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および酵母からなる群より選択される宿主中で増幅する請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子パッケージがバクテリオファージ、細菌、細菌胞子、酵母細胞、酵母胞子、昆虫細胞、真核生物ウイルス、および哺乳動物細胞からなる群より選択される請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子パッケージが繊維状バクテリオファージであり、かつ前記宿主の表面上に発現するポリペプチドが：遺伝子ＩＩＩタンパク質（配列番号２１３）；ドメイン２：：ドメイン３：：膜貫通ドメイン：：遺伝子ＩＩＩタンパク質の細胞内ドメイン（配列番号２１５）；およびドメイン３：：膜貫通ドメイン：：遺伝子ＩＩＩタンパク質の細胞内アンカー（配列番号２１７）からなる群より選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子パッケージがＭ１３ファージである請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
目的タンパク質の活性を制御するための方法であって、
（ａ）組換え宿主中で下記エレメント：（ｉ）（ｉｉ）に融合している第１タンパク質、（ｉｉ）（ｉｉｉ）に融合しているエンテロキナーゼ開裂配列、（ｉｉｉ）第２タンパク質、を含む融合タンパク質を発現させる工程であって、該融合タンパク質はエレメント（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のコンフォメーションのために活性が抑制されている工程；
（ｂ）該第１タンパク質および第２タンパク質が分離し、それにより該第１タンパク質及び該第２タンパク質の少なくとも一方が目的タンパク質の活性を示すように融合タンパク質をエンテロキナーゼで処理する工程、
を含む方法。
【請求項３７】
前記第２タンパク質が目的タンパク質で、かつプロテアーゼであり、並びに前記第１タンパク質がそのプロテアーゼの阻害剤である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記第１タンパク質が目的タンパク質で、かつプロテーゼであり、並びに前記第２タンパク質がそのプロテアーゼの阻害剤である請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記第１タンパク質がｓｃＦｖ抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインであり、前記第２タンパク質がｓｃＦｖ抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインであり、かつ前記目的タンパク質が前記第１タンパク質と前記第２タンパク質との結合によって形成されるｓｃＦｖである請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
前記第２タンパク質がｓｃＦｖ抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインであり、前記第１タンパク質がｓｃＦｖ抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインであり、かつ前記目的タンパク質が前記第１タンパク質と前記第２タンパク質との結合によって形成されるｓｃＦｖである請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
組換え宿主の表面上での融合タンパク質の発現を検出するための方法であって：
（ａ）組換え宿主中で、該宿主の表面上に発現するポリペプチドに融合している第２タンパク質、第２タンパク質に融合しているエンテロキナーゼ開裂配列、エンテロキナーゼ開裂配列に融合している第１タンパク質を含む融合タンパク質を発現させる工程；
（ｂ）該宿主を固体支持体上に固定化された該第１タンパク質のリガンドと、リガンドおよび第１タンパク質の間での結合複合体の形成に適する条件下で接触させる工程；
（ｃ）非結合物質を除去する工程；
（ｄ）あらゆる結合複合体をエンテロキナーゼで処理する工程；
（ｅ）該固体支持体から放出される宿主を回収する工程であって、該回収された宿主は該融合タンパク質の確認された発現物である工程、
を含む方法。
【請求項４２】
前記第２タンパク質が抗体または抗体断片である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記第１タンパク質がストレプトアビジン結合ポリペプチドであり、かつリガンドがストレプトアビジンである請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
標的に対する特異的親和性を有するディスプレイ・ライブラリーからディスプレイ・ポリペプチドを選択する方法であって：
（ａ）多数の遺伝子パッケージを含むポリペプチドのディスプレイ・ライブラリーを提供する工程であって、各遺伝子パッケージは融合タンパク質を発現し、該融合タンパク質はディスプレイ・ポリペプチド・ライブラリー・メンバーと該融合タンパク質を遺伝子パッケージに固定するポリペプチドとの間にエンテロキナーゼ認識配列を含む工程；
（ｂ）ディスプレイ・ライブラリーを標的と接触させる工程；
（ｃ）該接触工程（ｂ）の前後のいずれかに、標的を固体支持体上に固定化する工程；
（ｄ）非結合遺伝子パッケージを結合遺伝子パッケージから分離する工程；
（ｅ）結合遺伝子パッケージをエンテロキナーゼで処理する工程、並びに
（ｆ）放出される遺伝子パッケージを回収および増幅する工程、
を含む方法。
【請求項４５】
遺伝子パッケージがＭ１３ファージである請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
融合タンパク質を遺伝子パッケージに固定するポリペプチドが少なくともドメイン３：：膜貫通ドメイン：：遺伝子ＩＩＩタンパク質の細胞内ドメイン部分を含む請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ディスプレイ・ポリペプチドがヒトＦａｂを含む請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
ディスプレイ・ポリペプチドが、長さが１０から２１アミノ酸のペプチドを含む請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
各ペプチドが２つのシステイン残基を含有する請求項４８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規エンテロキナーゼ認識配列の発見および使用に関する。また、本発明は、リガンド認識配列、新規エンテロキナーゼ認識配列および目的タンパク質を含む融合タンパク質の構築および宿主細胞からの発現にも関する。エンテロキナーゼ酵素を固体支持体上に固定化された融合タンパク質と共にインキュベートすることを含む単純な一工程手順によって融合構築物から高度に精製された目的タンパク質を単離するのにリガンドおよびエンテロキナーゼ認識配列を用いる方法も開示される。
【０００２】
政府の財政援助
本発明は、部分的には、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍ， Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ Ｎｏ． ７０ＮＡＮＢ７Ｈ３０５７ の下での財政援助をもってなされた。政府は、結果として、本発明において特定の権利を保持する。
【０００３】
背景
セリンプロテアーゼエンテロキナーゼ（ＥＫ）、別名エンテロペプチダーゼは、十二指腸および空腸粘膜に存在するヘテロダイマー糖タンパク質であり、食品タンパク質の消化に関与する。具体的には、エンテロキナーゼは、十二指腸管腔において、トリプシノーゲンからの酸性プロペプチドの開裂によるトリプシノーゲンの活性トリプシンへの変換を触媒する。このトリプシンの活性化は、多くの膵臓チモーゲンの活性化につながるタンパク分解反応カスケードを開始させる（Ａｎｔｏｎｏｗｉｃｚ， Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍｐ．， ７０：１６９−１８７ （１９７９）；Ｋｉｔａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１（１６）： ７５８８−７５９２ （１９９４））。ＥＫはトリプシノーゲン分子上の基質配列 （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ に高度に特異的であり、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ 結合に作用して開裂を仲介する。
【０００４】
ウシ十二指腸粘膜から単離されたＥＫは１５０，０００の分子量（ＭＷ）および３５％の炭水化物含量を示す。この酵素は重鎖（ＭＷ 約１１５，０００）およびジスルフィド結合した軽鎖（ＭＷ 約３５，０００）を含んでなる（Ｌｉｅｐｎｉｅｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５４（５）： １６７７−１６８３ （１９７９））。前出のＫｉｔａｍｏｔｏらは、異なる生物から単離されたエンテロキナーゼがその生物に応じて８２〜１４０ｋＤａの重鎖分子量可変性及び３５〜６２ｋＤａの軽鎖可変性を示すことを報告した。重鎖はその酵素を腸刷子縁膜に固定させるように機能し、軽鎖は触媒性サブユニットである。
【０００５】
ウシエンテロキナーゼの軽鎖をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび機能的発現が報告されている（Ｌａ Ｖａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８（３１）： ２３３１１−２３３１７ （１９９３））。このｃＤＮＡ配列は、消化、凝結およびフィブリン溶解に関与する様々な哺乳動物セリンプロテアーゼと高度に相同である２３５アミノ酸タンパク質をコードする。このｃＤＮＡ軽鎖産生物はＳＤＳ−ＰＡＧＥでＭＷ ４３，０００Ｄａで移動し、ＥＫ特異的蛍光発生基質 Ｇｌｙ−（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−ベータ−ナフチルアミドの開裂において高レベルの活性を示す。Ｌａ Ｖａｌｌｉｅの米国特許第５，６６５，５６６号はＣＨＯ細胞におけるエンテロキナーゼ軽鎖のクローニングおよび発現を記載し、Ｖｏｚｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）， １４（１）； ７７−８１ （１９９６） はメチロトローフ酵母 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ に形質転換した発現ベクターからのｒＥＫＬの産生を記載する。
【０００６】
Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２（５０）： ３１２９３−３１３００ （１９９７） は、組換えまたは精製ウシエンテロキナーゼの部分的還元のいずれかによって産生されたエンテロキナーゼ軽鎖が （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ 配列を有する小ペプチドに対する正常な活性を有するものの、その軽鎖単独ではエンテロペプチダーゼホロ酵素と比較してトリプシノーゲンに対する活性が劇的に低下していることを報告した。したがって、この小基質の認識は軽鎖のみを必要とし、これに対してトリプシノーゲンの効率的な開裂は重鎖の存在にも依存する可能性がある。融合タンパク質中の （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ 配列をホロ酵素よりも高い効率で開裂する軽鎖単独での改善された能力は、折り畳まれた融合タンパク質内でのその位置に依存してペンタペプチドに容易にアクセスするその能力のためであり得ることが示唆されている。
【０００７】
Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３（９）： ９８２−９８７ （１９９５） は、組換え軽鎖エンテロキナーゼ（ｒＥＫＬ）の産生への、融合タンパク質中の （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ ペンタペプチド基質の自己触媒性基質としての使用を報告した。本質的には、ｒＥＫＬ ｃＤＮＡ を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤｓｂＡタンパク質のコーディング配列のＣ末端にインフレームで融合させた。これは大腸菌周辺質空間への分泌を指向する。これら２つのドメインを、成熟ｒＥＫＬドメインのＮ末端のすぐ上流に融合させた （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ リンカー／開裂配列によって接合させた。Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅらは、この遺伝子融合構築物を発現する細胞から可溶性ＤｓｂＡ／ｒＥＫＬ融合タンパク質を回収した。融合タンパク質を部分的に精製した後、（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓペンタペプチドの自己触媒に続いて活性ｒＥＫＬを回収した。
【０００８】
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ， ３７６（１１）： ６８１−６８４ （１９９５） は、自然状態のキマーゼプロペプチドの代わりにエンテロキナーゼ開裂部位を含むユビキチン融合タンパク質からの、タンパク分解活性化を含む方法による、酵素的に活性な組換えヒトキマーゼ（ｒＨＣ）、肥満細胞に存在するプロテイナーゼの産生を記載する。Ｗａｎｇらは、キマーゼ遺伝子に連結するエンテロキナーゼ開裂配列に連結するユビキチンのコーディング配列を含む発現ベクターで大腸菌を形質転換した。融合タンパク質を発現させ、その再折り畳み融合タンパク質からのキマーゼのエンテロキナーゼ介在活性化について分析した。ヒトキマーゼを用いる比較研究において立証されるように、最高濃度のエンテロキナーゼで約２．５％の折り畳み融合タンパク質が酵素的に活性なｒＨＣに変換された。これらの分析から、Ｗａｎｇらは、活性化の目的で生来のプロペプチドの代わりにエンテロキナーゼ開裂部位を用いることが、自然状態のプロペプチドの存在が組換え系において発現するＨＣの折り畳みおよび活性化に必須ではないことを示すものと結論付けた。
【０００９】
Ｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０６： １９９−２０６ （１９８０） は、ウシ腸粘膜から均一になるまで精製したエンテロキナーゼホロ酵素の特異性を、その酵素を様々な既知配列を有するタンパク質と共にインキュベートし、次いで得られた断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することによって調べた。得られたタンパク質断片の分析は、リジンまたはアルギニンのいずれかが開裂したペプチド結合の（アミノ末端に向かって）すぐ上流のアミノ酸位置（Ｐ１位置）を占めることができ、酸性アミノ酸がこのリジンまたはアルギニンのすぐ上流（Ｐ２位置）に存在しなければならず、かつ開裂したペプチド結合の上流の第２および第３アミノ酸（Ｐ２およびＰ３位置）に酸性アミノ酸が存在するときに加水分解が増加することを示した。
【００１０】
加えて、Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｊａｎｓｋａ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， １４（３） １１０−１１２ （１９８９） は、リジル、アルギニル、またはシステイニル誘導体、Ｓ−アミノエチルシステインを基本リジン残基の代わりに用いることができ、アスパルチル、グルタミル、またはＳ−カルボキシメチルシステインを基本アルギニン残基の代わりに用いることができることを示す研究を報告した。加えて、彼らは、開裂したペプチド結合（「易切断性結合（ｓｃｉｓｓｉｂｌｅ ｂｏｎｄ）」として知られる）上流の第３アミノ酸位置のアスパラギンがエンテロキナーゼによる加水分解を遅くさせ、かつ第４および第５上流位置での変化が大きな可変性を示すものの加水分解の速度をも遅くさせることを報告した。
【００１１】
現在、高度に特異的な （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ エンテロキナーゼ認識配列を様々な化学的及び生物学的用途に用いる利点についての現行の研究は有望ではあるものの、これらの潜在的な用途は加水分解の特異性および速度を制限するように作用する酵素／基質動態によって妨害されている。したがって、天然および組換えの両者のエンテロキナーゼが商業的な量で容易に入手可能であるため、この （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ ペンタペプチド認識配列で現在観察されるものよりもさらに高い特異性と、それに加えて高い加水分解速度を示すさらなるエンテロキナーゼ開裂配列を同定することが有利である。
【００１２】
特に、エンテロキナーゼによって迅速かつ特異的に開裂する新規ペプチドの発見には大規模タンパク質精製の分野において有益な用途が見出される。
【００１３】
発明の要約
したがって、新規エンテロキナーゼ認識配列を同定することが本発明の目的である。ファージ・ディスプレイ技法を用いて、エンテロキナーゼによる迅速な開裂に高度に特異的な基質を提供する幾つかの新規エンテロキナーゼ認識配列が発見されている。加えて、単離された配列のデータの分析に基づき、本発明は、初期の配列単離体を上回る改善された特異性および易切断性結合での改善された開裂速度を有する短いペプチドの化学的合成も開示する。これらの短いペプチド配列は約５〜１０アミノ酸長、より好ましくは５〜９アミノ酸長、最も好ましくは５もしくは６アミノ酸長である。この新規エンテロキナーゼ認識配列は目的タンパク質に融合した融合タンパク質構築物に融合パートナーとして組み込むことができ、または融合タンパク質ディスプレイに、その融合タンパク質に対する開裂可能性をエンテロキナーゼに付与する組換え遺伝子パッケージとして含めることができる。
【００１４】
本発明の好ましいエンテロキナーゼ認識配列は、エンテロキナーゼ酵素に対する高い結合特異性だけではなく、開裂認識ドメイン内の予め決定された部位でのその酵素による迅速な開裂をも示す。そのような配列は、宿主細胞から発現するほとんどすべての目的タンパク質の迅速な精製に有用である。
【００１５】
また、本発明は、目的タンパク質に融合する本発明の新規エンテロキナーゼ認識配列を含むエンテロキナーゼ開裂性融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列も提供する。加えて、このＤＮＡ構築物は、目的エンテロキナーゼ開裂性タンパク質を容易に捕獲するための手段を提供し、エンテロキナーゼ認識配列での開裂によって放出されて純粋な目的タンパク質を生じる、リガンド結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン基質を結合するためのストレプトアビジン結合ペプチドを特異的に認識し、かつそれに結合するリガンド認識配列をコードするヌクレオチド配列を任意に含む。
【００１６】
エンテロキナーゼ認識配列は、それらに融合するリガンド認識配列があろうとなかろうと、選択された位置が否定的な特性、例えば、目的タンパク質の生物学的活性の妨害または破壊を伴わない限り、融合タンパク質に沿ってどこに位置してもよい。加えて、目的タンパク質は完全な成熟タンパク質またはタンパク質の突然変異体、例えば、欠失突然変異体もしくは置換突然変異体として存在することができる。
【００１７】
より大きな融合タンパク質の１ドメインとして存在する目的タンパク質を単離及び精製するための方法も本発明によって提供される。目的タンパク質は、好ましくは、融合タンパク質を固体基体上に捕獲し、続いてその固定化複合体をエンテロキナーゼで処理することにより、融合タンパク質の残部から容易に開裂することができる。一実施形態においては、融合タンパク質を宿主細胞から培養培地中に分泌させる。その培養培地を、基体上に固定されたリガンド結合パートナー、例えば、ストレプトアビジンまたはビオチンを含むカラムを通過させる。融合タンパク質のリガンド認識配列はリガンド結合パートナーと結合複合体を形成し、それにより融合タンパク質をカラム上に固定化または捕獲する。次に、エンテロキナーゼをカラムに添加して目的タンパク質を捕獲された融合タンパク質から開裂させ、目的タンパク質をリガンド結合パートナーに結合した融合タンパク質複合体から放出させる。精製された目的タンパク質はフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）上清中に集められる。
【００１８】
別の実施形態においては、リガンド認識配列、エンテロキナーゼ開裂配列および目的タンパク質またはそれらの断片を含む融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを、まず宿主細胞をその発現ベクターでトランスフェクトし、かつその融合タンパク質の発現に適する条件下でインキュベートすることによって単離することができる。最も好ましくは、発現ベクターは、培養培地中への発現融合タンパク質の分泌を達成するため、（例えば、リガンド認識配列のＮ末端に）適切な分泌シグナル配列も含む。
【００１９】
バッチ精製プロセスにおいて、融合タンパク質のリガンド認識配列に対するリガンド結合パートナーでコートしたビーズを成熟融合タンパク質を含む培養培地に直接添加することができる。捕獲された融合タンパク質を有するこれらのビーズは、例えば、濾過により、または磁性粒子の場合には磁界内に固定化することにより単離することができ、培養培地の望ましくない成分は除去する。所望の目的タンパク質をビーズおよびその融合パートナーから分離するため、次にエンテロキナーゼ酵素またはそれらの活性断片を添加してビーズを接触させ、結合した融合タンパク質と共にインキュベートする。融合タンパク質の開裂の後、ビーズを再度単離することができ、ビーズ／リガンド結合パートナー／エンテロキナーゼ認識配列複合体から開裂された目的タンパク質を精製された形態で集めることができる。
【００２０】
別の実施形態においては、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターは細胞膜を越えて発現した融合構築物を輸送するためのシグナル配列を含んでなくてもよい。この場合、融合タンパク質の発現後、融合タンパク質を固体基体上に捕獲し、続いて捕獲されたタンパク質複合体をエンテロキナーゼで処理する前に、宿主細胞を溶解し、細胞片を、例えば濾過または遠心によって、培養培地から除去することができる。
【００２１】
本発明による具体的なエンテロキナーゼ認識配列が表１−４（下記）に示される。本明細書に提示されるエンテロキナーゼ認識配列の開裂データの分析から、好ましいエンテロキナーゼ配列の２つの群に対する一般式がわかる。そのような好ましいエンテロキナーゼ認識配列は、下記一般式を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む：
（１）Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号１）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸であり、存在する場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＴｒｐであり；Ｘａａ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；並びにＺ１およびＺ２は両者とも任意であり、独立に１以上のアミノ酸を有するポリペプチドである）
または
（２）Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号２）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｖａｌであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｔｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＳｅｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；並びにＺ１およびＺ２は両者とも任意であり、独立に１以上のアミノ酸を有するポリペプチドである）。
【００２２】
好ましくは、上記式（１）および（２）の両者において、Ｚ１はリガンド認識ドメインを含むポリペプチドであるか、または前記リガンドの結合パートナーと接触させることによって配列番号１の融合タンパク質を固定化するのに有用な配列であり、並びに好ましくは、Ｚ２は目的タンパク質であるポリペプチド、またはそれを組み込むポリペプチドである。最も好ましくは、目的タンパク質は、Ｘａａ５が目的タンパク質のＮ末端となるように、および易分裂性結合Ａｒｇ−Ｘａａ５でのエンテロキナーゼ開裂が目的とするタンパク質全体をエンテロキナーゼ認識配列および（存在する場合には）Ｚ１から遊離させるように、Ｘａａ５−Ｚ２で記載されるポリペプチドで構成される。また、好ましくは、Ｘａａ５はＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒである。
【００２３】
エンテロキナーゼ開裂配列の特に好ましい群は、アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５（配列番号３）（ここで、Ｘａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、もしくはＴｙｒである）を含有するポリペプチドを含む。
【００２４】
好ましいエンテロキナーゼ開裂配列の別の群は、アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５（配列番号４）（ここで、Ｘａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく、好ましくは、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、もしくはＴｙｒである）を含有するポリペプチドを含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、上記式（１）および（２）（配列番号１または２）におけるＺ１またはＺ２は式：Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５）の改変ストレプトアビジン・リガンド認識配列を含み、好ましくは、その配列はエンテロキナーゼ認識配列のＮ末端であろう（すなわち、少なくともＺ１の一部であろう）。そのような配列の包含は、エンテロキナーゼ認識配列、またはそれを含むあらゆるポリペプチドがストレプトアビジン基質に固定化されることを可能にするだろう。
【００２６】
加えて、さらなるエンテロキナーゼ認識配列ならびに他の目的の酵素に対する最適基質を単離するのに本発明のファージ・ディスプレイ法を用いることが可能であることも考えられる。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、本発明の新規エンテロキナーゼ認識配列を介してリガンド認識配列に融合する目的のタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。目的のタンパク質は、融合構築物においてドメインとして発現可能なあらゆるタンパク質またはそれらの断片であり得る。融合構築物は、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において、細胞間タンパク質として発現させ、細胞の破壊および細胞上清からの融合構築物の取り出しによって単離することができる。あるいは、融合構築物は、その融合タンパク質を産生する宿主細胞からのシグナリング分泌に有効なペプチドシグナル配列を含むことができる。これは、大腸菌または他の宿主細胞を溶解して発現した融合タンパク質を放出させる必要性を除外し、それにより、特には望ましくない細胞の破片を除去するための、さらなるタンパク質精製工程の必要性を排除する。大腸菌において発現するペプチドの培養培地への分泌を容易にすることが知られるシグナルペプチド配列には、Ｐｅｌ Ｂ、ｂｌａ、およびｐｈｏＡが含まれる。
【００２８】
融合構築物のリガンド認識配列ドメインは、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジンを認識するか、またはそれに対する親和性を示すあらゆる配列であり得る。好ましい認識配列には、ストレプトアビジン結合配列 Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号６）並びに改変ストレプトアビジン結合配列 Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５）およびＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号７）が含まれる。さらなる好ましい認識配列には、ストレプトアビジン結合配列 Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号２１０）および Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２１１）が含まれる。改変ストレプトアビジン結合配列へのシステインの付加はそのドメインを幾らかよりタンパク質らしくし（ドメインが三次元構造を得る）、トリプトファンの付加はその結合配列をより良好なＵＶ吸収体にし（したがって、それをよりアッセイし易くする）、およびアルギニンの付加は溶解性を補助する。好ましい実施形態においては、ストレプトアビジン・リガンド認識配列または改変ストレプトアビジン・リガンド認識配列を本出願において開示される新規エンテロキナーゼ認識配列のアミノ末端で融合させる。幾つかのそのような配列を縦列で付加することで、多量体固定化部位を提供することができる。
【００２９】
別の実施形態においては、本発明は、本発明のエンテロキナーゼ認識配列のＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端のいずれかで融合する目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする、宿主細胞を形質転換するためのＤＮＡ発現ベクターを提供する。エンテロキナーゼ認識配列は、さらに、特定のリガンドに結合し、かつリガンド認識配列およびそれに結合するあらゆる目的のタンパク質を固体基体に捕獲するのに用いることができるリガンド認識配列に融合していてもよい。好ましくは、リガンド認識配列は、エンテロキナーゼ認識配列および目的のタンパク質に対して、固体基体上に捕獲されたときにエンテロキナーゼ酵素での融合構築物の処理により目的のタンパク質をその構築物から放出するように位置する。発現ベクターに含まれるさらなるＤＮＡ配列は、選択された宿主細胞における融合タンパク質の発現を容易にするプロモーターを含むことができ、そしてまた、好ましくは、精製工程に先立つ融合タンパク質の培養培地への分泌を容易にするシグナル配列も含むことができる。
【００３０】
別の実施形態においては、発現ベクターは、発現した融合タンパク質の培養培地への分泌を指向するシグナル配列を含まない。この方法によると、宿主細胞において融合タンパク質が発現した後、宿主細胞を溶解して、例えば濾過により、細胞の破片を培養上清および融合タンパク質から分離し、従来の方法のいずれかに従って目的のタンパク質を単離する。
【００３１】
本発明によると、所望の遺伝子産物は宿主微生物から発現する融合タンパク質として産生され、その融合タンパク質はリガンド認識配列および目的のタンパク質の間に挿入された新規エンテロキナーゼ開裂配列を含む。上記方法で産生された融合タンパク質から、認識配列内のペプチド結合を特異的に認識および加水分解することが可能なエンテロキナーゼでその融合タンパク質を処理したとき、所望のペプチドまたはタンパク質が成熟形態で得ることができることが見出されている。必要であれば、エンテロキナーゼを、目的のタンパク質のＮ末端側から塩基性アミノ酸残基を特異的に遊離することが可能であるアミノペプチダーゼまたは目的のタンパク質のＣ末端側から塩基性アミノ酸残基を特異的に遊離することが可能であるカルボキシペプチダーゼと共に用いることができる。
【００３２】
宿主細胞において形質転換された発現ベクターから翻訳される本発明の最も好ましい融合タンパク質は、リガンド認識配列のアミノ末端に融合する分泌シグナル配列を含み、このリガンド認識配列は本発明の新規エンテロキナーゼ認識配列のアミノ末端に融合し、この新規エンテロキナーゼ認識配列はそのカルボキシ末端で目的のタンパク質のアミノ末端に融合する。目的のタンパク質は幾つかの安易な工程で単離し、かつ迅速に精製することができる。本質的には、融合タンパク質を適切な条件下で宿主系、例えば、大腸菌などにおいて発現させる。発現後、融合タンパク質を宿主細胞から培養培地中に分泌させる。次に、その培養培地を固体基体上に固定化されたリガンド結合パートナーと、固定化されたリガンド結合パートナーへのリガンド認識配列の結合に適する条件下で接触させる。得られた複合体をエンテロキナーゼで処理することで、目的のタンパク質が、続いてそれをフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）上清から高度に精製された生物学的に活性のある形態で単離できるように、固定化融合複合体から放出される。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、目的のタンパク質を迅速に精製するための方法であって、
（ａ）以下のエレメント：本発明のエンテロキナーゼ認識配列、目的のタンパク質およびリガンド認識配列を含む融合タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、該エレメントは融合構築物として、各々のエレメントが完全に機能的であり、かつ該構築物中の他のいかなるエレメントの機能性をも妨害するエレメントがないような様式で発現し；
（ｂ）培養培地または細胞抽出物のサンプルを固体基体上に固定された該リガンド認識配列のリガンド結合パートナーと接触させ；
（ｃ）該サンプルをエンテロキナーゼと共にインキュベートし；
（ｄ）工程（ｃ）から放出されたあらゆる目的のタンパク質を回収する、
ことを含む前記方法を提供する。任意に、１以上の洗浄工程を精製プロセスに含めることができる。
【００３４】
別の実施形態においては、目的のタンパク質を単離する前に、宿主細胞を溶解し、細胞の破片を融合タンパク質から分離することができる。
【００３５】
本発明の具体的な実施形態は以下を含む：
エンテロキナーゼ認識配列を含み、かつ式：
Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号１）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＴｒｐであり；Ｘａａ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；並びにＺ１およびＺ２は両者とも任意であり、独立に１以上のアミノ酸を有するポリペプチドである）
を有するポリペプチド。好ましくは、Ｘａａ１はＡｓｐであり、Ｘａａ２はＩｌｅであり、Ｘａａ３はＡｓｎであり、Ｘａａ４はＡｓｐであり、かつＸａａ５はＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、もしくはＴｙｒである。
【００３６】
特定の実施形態において、ポリペプチドＺ１はリガンド認識配列、例えば、ストレプトアビジン結合ドメインである。具体的なストレプトアビジン結合ドメインは配列：Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号６）、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５）、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号２１０）、Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２１１）、並びにそれらの縦列配置の組合せおよび反復から選択することができる。
【００３７】
さらなる実施形態において、ポリペプチドＺ２は目的のタンパク質である。好ましくは、ポリペプチドＸａａ５−Ｚ２が目的のタンパク質であり、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、ＥＫでの処理および易切断性（ｓｃｉｓｓｉｌｅ）結合の開裂で単離される目的のタンパク質を生じる、融合タンパク質である。
【００３８】
本発明の他の具体的な実施形態は以下を含む：
エンテロキナーゼ認識配列を含み、かつ式：
Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号２）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｖａｌであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｔｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＳｅｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；並びにＺ１およびＺ２は両者とも任意であり、独立に１以上のアミノ酸を有するポリペプチドである）
を有するポリペプチド。好ましくは、Ｘａａ５はＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、もしくはＴｙｒである。
【００３９】
特定の実施形態において、ポリペプチドＺ１はリガンド認識配列、例えば、ストレプトアビジン結合ドメインである。具体的なストレプトアビジン結合ドメインは配列：Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号６）、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（配列番号５）、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（配列番号７）、Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号２１０）、Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ（配列番号２１１）、並びにそれらの縦列配置の組合せおよび反復から選択することができる。
【００４０】
さらなる実施形態において、ポリペプチドＺ２は目的のタンパク質である。好ましくは、ポリペプチドＸａａ５−Ｚ２が目的のタンパク質であり、すなわち、配列番号１のポリペプチドが、ＥＫでの処理および易切断性結合の開裂で単離される目的のタンパク質を生じる、融合タンパク質である。
【００４１】
本発明の好ましいエンテロキナーゼ認識配列は、表１、２、３、および４（下記）に示されるように、配列番号１０〜７３および７５〜１９３からなる群より選択することができる。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に配置された以下のドメインを含むエンテロキナーゼ開裂性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する：リガンド認識配列、式 Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２０８）または Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ（配列番号２０９）を有するエンテロキナーゼ認識配列、および目的のタンパク質。環状ＤＮＡを含み、かつ該ポリヌクレオチドを含むベクターも考慮される。組換え宿主における発現のためのプロモーター配列に機能的に連結されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも考慮される。ポリヌクレオチドに機能的に連結されたシグナル配列をさらに含む、すなわち、発現した融合タンパク質の培養培地への分泌を達成するための発現ベクターも考慮される。そのようなベクターで形質転換した組換え原核または真核宿主細胞も考慮される。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は以下を含む：
目的のタンパク質を単離するための方法であって：
（ａ）アミノ末端からカルボキシ末端の方向に配置された以下のドメイン：リガンド認識配列、式：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５（配列番号２０６）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＴｒｐであり；Ｘａａ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよい）
または、
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ５（配列番号２０７）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｖａｌであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｔｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＳｅｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよい）
を有するエンテロキナーゼ認識配列、および目的のタンパク質を含むエンテロキナーゼ開裂性融合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを発現する組換え宿主細胞を該融合タンパク質の発現に適する条件下で培養し；
（ｂ）発現した融合タンパク質を固体支持体上に固定された結合リガンドと、結合リガンドとリガンド認識配列との間での結合複合体の形成に適する条件下で接触させ；
（ｃ）結合複合体をエンテロキナーゼと接触させ；そして
（ｄ）目的のタンパク質を回収する、
ことを含む前記方法。
【００４４】
該融合タンパク質が発現時に分泌されない場合、前記方法は、任意に、工程（ａ）の後に、宿主細胞を溶解し、かつ細胞の破片を溶解物から分離するさらなる工程を含むことができる。該融合タンパク質が発現時に分泌される場合、前記方法は、任意に、分泌された融合タンパク質を含有する培養培地を集めるさらなる工程を含むことができる。
【００４５】
前記方法において、前記融合タンパク質は、好ましくは、下記式を有する：
Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号１）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＴｒｐであり；Ｘａａ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；Ｚ１は配列 Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ（配列番号８４）を含むポリペプチドであり、および Ｘａａ５−Ｚ２ は目的のタンパク質である）。
【００４６】
前記方法の別の好ましい実施形態においては、融合タンパク質は下記式を有する：
Ｚ１−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ５−Ｚ２（配列番号２）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｖａｌであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｔｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＳｅｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよく；Ｚ１は配列 Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ（配列番号８４）を含むポリペプチドであり；および Ｘａａ−Ｚ５ は目的のタンパク質である）。
最も好ましくは、Ｘａａ５はＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒである。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態においては、目的の遺伝子パッケージを単離するための方法であって：
（ａ）遺伝子パッケージにおいて目的のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させる工程であって、該目的のタンパク質はエンテロキナーゼ開裂配列に融合され、該エンテロキナーゼ開裂配列は該遺伝子パッケージの表面上に発現するポリペプチドに融合される、前記工程；
（ｂ）遺伝子パッケージを目的のタンパク質のリガンドと、該リガンドと該目的のタンパク質との間での結合複合体の形成に適する条件下で接触させる工程であって、該リガンドは固体支持体上に固定化することが可能である工程；
（ｃ）該接触工程（ｂ）の前または後のいずれかに、該リガンドを固体支持体上に固定する工程；
（ｄ）工程（ｂ）において形成された固定化結合複合体をエンテロキナーゼと接触させる工程；および
（ｅ）目的の遺伝子パッケージを該固体支持体から回収する工程、
を含む前記方法が提供される。
【００４８】
前記方法において、リガンドは、例えば、そのリガンドをビオチン化し、次いで固定化されたストレプトアビジンまたはアビジンに結合させることによって固定化することができる。あるいは、リガンドは、該リガンドと結合する固定化抗体に結合させることによって固体化する。
【００４９】
遺伝子パッケージは、好ましくは、バクテリオファージ、細菌、細菌胞子、酵母細胞、酵母胞子、昆虫細胞、真核生物ウイルス、および哺乳動物細胞からなる群より選択される。前記方法において回収された目的の遺伝子パッケージは、細菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および酵母を含むがこれらに限定されるものではない適切な宿主において増幅させることができる。好ましい遺伝子パッケージは糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３誘導ファージ）であり、かつ前記宿主の表面上に発現する、すなわち、融合タンパク質を遺伝子パッケージの表面に固着させるポリペプチドは：遺伝子ＩＩＩタンパク質（配列番号２１３）；ドメイン２：：ドメイン３：：膜貫通ドメイン：：遺伝子ＩＩＩタンパク質の細胞内ドメイン（配列番号２１５）；およびドメイン３：：膜貫通ドメイン：：遺伝子ＩＩＩタンパク質の細胞内アンカー（配列番号２１７）からなる群より選択される。
【００５０】
好ましい実施形態において、目的のタンパク質は抗体またはそれらのフラグメントである。
【００５１】
本発明は、さらに、目的のタンパク質の活性を制御するための方法であって、
（ａ）組換え宿主において下記エレメント：（ｉ）（ｉｉ）に融合する第１タンパク質、（ｉｉ）（ｉｉｉ）に融合するエンテロキナーゼ開裂配列、（ｉｉｉ）第２タンパク質を含む融合タンパク質を発現させる工程であって、該融合タンパク質はエレメント（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の立体配座のために活性が抑制されている工程；
（ｂ）該第１タンパク質および第２タンパク質が分離し、それにより該第１タンパク質及び該第２タンパク質の少なくとも一方が目的のタンパク質の活性を示すように融合タンパク質をエンテロキナーゼで処理する工程、
を含む前記方法を提供する。
【００５２】
前記方法の一実施形態においては、前記第２タンパク質は目的のタンパク質で、かつプロテアーゼであり、並びに前記第１タンパク質はそのプロテアーゼの阻害剤である。別の実施形態においては、前記第１タンパク質は目的のタンパク質で、かつプロテアーゼであり、並びに前記第２タンパク質はそのプロテアーゼの阻害剤である。別の実施形態においては、前記第１タンパク質はｓｃＦｖ抗体の可変軽（ＶＬ）ドメインであり、前記第２タンパク質はｓｃＦｖ抗体の可変重（ＶＨ）ドメインであり、かつ前記目的のタンパク質は前記第１タンパク質と前記第２タンパク質との会合によって形成されるｓｃＦｖである。別の実施形態においては、前記第２タンパク質はｓｃＦｖ抗体の可変軽（ＶＬ）ドメインであり、前記第１タンパク質はｓｃＦｖ抗体の可変重（ＶＨ）ドメインであり、かつ前記目的のタンパク質は前記第１タンパク質と前記第２タンパク質との会合によって形成されるｓｃＦｖである。
【００５３】
本発明は、さらに、組換え宿主の表面上での融合タンパク質の発現を検出するための方法であって：
（ａ）組換え宿主において、該宿主の表面上に発現するポリペプチドに融合する第２タンパク質、第２タンパク質に融合するエンテロキナーゼ開裂配列、エンテロキナーゼ開裂配列に融合する第１タンパク質を含む融合タンパク質を発現させる工程；
（ｂ）該宿主を固体支持体上に固定された該第１タンパク質のリガンドと、リガンドと第１タンパク質との間での結合複合体の形成に適する条件下で接触させる工程；
（ｃ）非結合物質を除去する工程；
（ｄ）あらゆる結合複合体をエンテロキナーゼで処理する工程；
（ｅ）該固体支持体から放出される宿主を回収する工程であって、該回収された宿主は該融合タンパク質の確認された発現物（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）である工程、
を含む前記方法を提供する。
【００５４】
好ましい実施形態において、第１タンパク質はストレプトアビジン結合ポリペプチドで、かつリガンドはストレプトアビジンであり、並びに第２タンパク質は抗体または抗体フラグメントである。
【００５５】
また、本発明は、標的に対する特異的親和性を有するディスプレイ・ライブラリーからディスプレイ・ポリペプチドを選択する方法であって：
（ａ）様々な遺伝子パッケージを含むポリペプチドのディスプレイ・ライブラリーを提供する工程であって、各遺伝子パッケージは融合タンパク質を発現し、該融合タンパク質はディスプレイ・ポリペプチド・ライブラリー・メンバーと該融合タンパク質を遺伝子パッケージに固着させるポリペプチドのとの間にエンテロキナーゼ認識配列を含む工程；
（ｂ）ディスプレイ・ライブラリーを標的と接触させる工程；
（ｃ）該接触工程（ｂ）の前または後のいずれかに、標的を固体支持体上に固定する工程；
（ｄ）非結合遺伝子パッケージを結合遺伝子パッケージから分離する工程；
（ｅ）結合遺伝子パッケージをエンテロキナーゼで処理する工程、並びに
（ｆ）放出される遺伝子パッケージを回収および増幅する工程、
を含む前記方法も提供する。
【００５６】
好ましくは、遺伝子パッケージはＭ１３ファージである。より好ましくは、融合タンパク質を遺伝子パッケージに固着させるポリペプチドは少なくともドメイン３：：膜貫通ドメイン：：遺伝子ＩＩＩタンパク質の細胞内ドメイン部分を含む。特定の実施形態においては、ディスプレイ・ライブラリーの遺伝子パッケージによって示されるディスプレイ・ポリペプチドはヒトＦａｂを含む。他の実施形態においては、ディスプレイ・ポリペプチドは、例えば長さが１０〜２１アミノ酸のペプチドを含む。特定の実施形態は、２つのシステイン残基を含有するディスプレイ・ペプチドを含む。
【００５７】
図面の簡単な説明
図１および図２は、基質ファージ・ライブラリーの５回のスクリーニングからのファージ単離体のエンテロキナーゼ開裂の時間経過を示す。試験した単離体は、９０の配列決定単離体のうちで繰り返し出てくる配列を有するものであった。これらの単離体を、既知のエンテロキナーゼ開裂配列 ＤＤＤＤＫ を含む単離体（５−Ｈ１１）およびエンテロキナーゼによって認識されないポリペプチドをディスプレイする非選択ファージとの比較で試験する。図１は、３０ｎＭ組換え軽鎖エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いるエンテロキナーゼ開裂を示す；図２は、１３０ｎＭ組換え軽鎖エンテロキナーゼを用いるエンテロキナーゼ開裂を示す。
【００５８】
定義
本明細書で用いられる場合、「組換え」という用語は、非天然に改変もしくは操作された核酸、外来性核酸でトランスフェクトした宿主細胞、または単離したＤＮＡの操作および宿主細胞の形質転換によって非天然に発現させたポリペプチドを説明するのに用いられる。組換えは、遺伝子工学技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されているＤＮＡ分子を特に包含する用語であり、分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを説明するための形容詞としての用語「組換え」の使用は天然のそのような分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを明確に排除する。
【００５９】
「バクテリオファージ」という用語は、本明細書で用いられる場合、ＤＮＡコアおよび多数の異なるタンパク質分子の凝集によって形成される保護殻を含む細菌ウイルスとして定義される。「Ｆｆファージ」という用語は、本明細書で用いられる場合、Ｍ１３、ｆ１、およびｆｄ並びにそれらの組換え誘導体を含む集合から選択されるファージを示す。「糸状ファージ」という用語は、本明細書で用いられる場合、Ｆｆファージ、ＩＫｅ、Ｐｆ１、Ｐｆ３、および当該技術分野において公知の他の関連ファージを含む集合から選択されるファージを示す。バクテリオファージには、糸状ファージ、ファージλ、Ｔ１、Ｔ７、Ｔ４等が含まれる。「バクテリオファージ」及び「ファージ」という用語は、本明細書では交換可能に用いられる。また他に注記されない限り、「バクテリオファージ」及び「ファージ」という用語は「ファージミド」、すなわち、ヘルパーファージとの宿主細胞への同時感染によってファージミド・ゲノムを含む感染性ファージ様粒子が生じ得るように糸状ファージのパッケージング・シグナルを含むプラスミドも包含する。ファージ・ディスプレイ技術を介した本発明のエンテロキナーゼ開裂配列の単離に特に有用なファージは、組換え体で一本鎖ＤＮＡの糸状Ｍ１３ファージおよびその誘導体である。本出願において、「Ｍ１３ファージ」への言及は、Ｍ１３ファージ（野生型）およびＭ１３ファージから誘導されるファージ（すなわち、「Ｍ１３誘導ファージ」）の両者を包含する。そのようなＭ１３誘導ファージは野生型Ｍ１３ファージのすべてのポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、Ｆ＋ 大腸菌に感染して感染性ファージ粒子を産生することができる。換言すると、Ｍ１３誘導ファージは野生型Ｍ１３遺伝子のすべての機能的バージョンを含む。当業者に馴染みの様々な目的、例えば、サイレント突然変異の組み込み、ファージの生存力もしくは感染性に影響を与えない天然遺伝子のトランケーション、制限部位の除去もしくは挿入、またはＭ１３ゲノムの遺伝子間領域への非天然遺伝子の付加のため、Ｍ１３誘導ファージにおいては天然Ｍ１３遺伝子が改変されていてもよい。「Ｍ１３ファージ」という用語は、具体的には、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１３ｍｐ８、Ｍ１３ｍｐ９のようなファージを含む。Ｕ．Ｓ． ５，２３３，４０９；Ｕ．Ｓ． ５，４０３，４８４；Ｕ．Ｓ． ５，５７１，６９８（すべては参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００６０】
「遺伝子パッケージ」という用語は、本明細書で用いられる場合、適切な状況においてパッケージを構築し、かつそのパッケージの表面に少なくとも部分的に露出される少なくとも１種類のタンパク質をコードする遺伝子メッセージを含むパッケージを示す。遺伝子パッケージには、バクテリオファージ、細菌細胞、胞子、真核生物ウイルス、および真核細胞が含まれる。
【００６１】
「宿主」という用語は、本明細書で用いられる場合、遺伝子パッケージが増殖可能である細胞型を示す。宿主には、細菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および酵母が含まれる。幾つかの遺伝子パッケージはそれら自体の宿主、例えば、酵母および細菌細胞である。ウイルス遺伝子パッケージについては、別々の宿主細胞が必要である。糸状ファージに適切な宿主はグラム陰性細菌、例えば、大腸菌である。バキュロウイルスに適切な宿主は昆虫細胞である（Ｏｊａｌａら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２８４（３）：７７７−８４ （２００１）を参照）。
【００６２】
「エンテロキナーゼ」という用語は、本明細書で用いられる場合、消化プロセスに関与する触媒カスケードの一部としてのトリプシノーゲンからトリプシンへの開裂および活性化を容易にする膵臓ヒドロラーゼである。「エンテロキナーゼ」には、あらゆる供給源から単離される天然酵素、ならびに組換え技術によって産生される酵素の両者が含まれる。本明細書に記載されるエンテロキナーゼは、ジスルフィド連結した約１２０ｋＤａの重鎖と約４７ｋＤａの軽鎖とを含む二量体として存在することができる。あるいは、触媒ドメインを含む軽鎖を単独で用いることもできる。軽鎖は天然供給源から単離することができ、または組換えで産生することができる。
【００６３】
「エンテロキナーゼ認識配列」という用語は、本明細書で用いられる場合、エンテロキナーゼ酵素と接触してそれにより開裂する、通常は３０アミノ酸未満の短ポリペプチドである配列を示す。「エンテロキナーゼ認識配列」及び「エンテロキナーゼ開裂配列」という用語は本明細書では交換可能に用いられる。
【００６４】
「エンテロキナーゼ認識ドメイン」という用語は、本明細書で用いられる場合、エンテロキナーゼ酵素が「エンテロキナーゼ認識ドメイン」内の特定部位を認識して開裂するために存在しなければならないアミノ酸の完全配列を示し、これはそれらの配列が酵素と直接物理的に接触するか、または実際の開裂部位に近接しているのかには無関係である。
【００６５】
「易切断性結合」という用語は、本明細書で用いられる場合、エンテロキナーゼ酵素によって開裂されるアミド結合を介して連続アミノ酸を結合する特定のペプチド結合を示す。標準命名法によると、易切断性結合はエンテロキナーゼ認識配列内のＰ１およびＰ１’アミノ酸の間に生じる。
【００６６】
「リガンド認識配列」という用語は、本明細書で用いられる場合、既知リガンドまたは結合パートナーを認識する、すなわち、それに結合するアミノ酸の配列を示す。タンパク質またはタンパク質断片の単離または精製のプロセスにおいて用いられる場合、リガンド認識配列はリガンドまたは結合パートナーに対する高い特異性および高い親和性を示すことが望ましい。リガンド認識配列の例としては、ビオチン結合パートナーを認識するだろうストレプトアビジン（もしくはアビジン）、またはストレプトアビジン結合パートナーと結合複合体を形成するだろうストレプトアビジン結合配列（例えば、配列番号５を参照）が挙げられるだろう。リガンド結合パートナーの他の例としては、特定のペプチド抗原に対して生じる抗体が挙げられ、そのペプチド抗原はリガンド認識配列としての使用に適するだろう。具体的なリガンド認識配列の他の例としては、Ｍｙｃ−タグ（Ｍｕｎｒｏ ＆ Ｐｅｌｈａｍ， Ｃｅｌｌ， ４６：２９１−３００ （１９８６）；Ｗａｒｄら， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１：５４４−５４６ （１９８９））、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０ （１９８８））、ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら， Ｃｅｌｌ， ６３：８４３−８４９ （１９９０）；Ｍａｒｔｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４ （１９９２））、α−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１４１６３−１４１６６ （１９９１））、ポリヒスチジンタグ（特に、ヘキサヒスチジン・テール）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびＴ７遺伝子１０−タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７ （１９９０））が挙げられ、それらのすべては組換え遺伝子産物の検出および、幾つかの場合には、その精製にもうまく用いられている。
【００６７】
「融合タンパク質」という用語は、本明細書で用いられる場合、１以上の遺伝子配列を組み合わせることで作製されるハイブリッド遺伝子の発現によって形成されるポリペプチドを示す。典型的には、融合タンパク質は、ｃＤＮＡを既存の遺伝子とインフレームで発現ベクターにクローニングすることによって産生される。
【００６８】
「目的のタンパク質」という用語は、本明細書で用いられる場合、その天然供給源から単離及び精製することができるか、もしくは組換えＤＮＡ技術によって産生させ、かつその天然供給源もしくは組換え宿主細胞から発現させることができるか、またはあらゆる化学合成法によって生成することができるあらゆるタンパク質、それらの断片、またはあらゆる長さのポリペプチドを示す。
【００６９】
「ディスプレイ・ライブラリー」という用語は、本明細書で用いられる場合、ディスプレイされるタンパク質またはペプチドにおいてのみ異なる複数の遺伝子パッケージを示す。ディスプレイされるタンパク質またはペプチドは、Ｆａｂのディスプレイ・ライブラリーにおけるように、部分的に高度に相同であり、かつ他の部分においては可変であり得る。ディスプレイされるペプチドのライブラリーは、長さおよび共通のフランキング配列以外に内部相同性を示さないか、または固定内部アミノ酸、例えば、システインを有することができる。またディスプレイ・ライブラリーは、すべてが同じアンカータンパク質に融合し、かつ同じ遺伝子パッケージ上にディスプレイされる所定の細胞型に由来するｃＤＮＡのコレクションを含むこともできる。
【００７０】
詳細な説明
本発明は、新規の、高度に特異的で、迅速に開裂するエンテロキナーゼ認識配列を提供する。本発明の新規エンテロキナーゼ認識配列は３つ以上の残基を有する小ポリペプチドであり、組換え軽鎖エンテロキナーゼによって特異的に認識および開裂される基質を提供する。
【００７１】
また、本発明は、本発明のエンテロキナーゼ開裂配列を、好ましくは宿主細胞の形質転換および目的のタンパク質の発現のための発現ベクターの一部として、コードするＤＮＡ配列も考慮する。この発現ベクターは、好ましくは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、この融合タンパク質は、好ましくはシグナル配列、リガンド認識配列、新規エンテロキナーゼ開裂配列および目的のタンパク質を含む、幾つかのドメインを含む。場合によって、シグナル配列を欠く融合タンパク質も本出願によって想定される。
【００７２】
標準組換えＤＮＡ技術を用いて宿主細胞を発現ベクターで形質転換し、適切な条件下でその宿主細胞によって融合タンパク質を発現させる。シグナル配列は、目的のタンパク質の単離及び精製に先立つ目的のタンパク質の培養培地への分泌を容易にするのに望ましい。これは、宿主細胞において目的のタンパク質が分解する潜在的な問題を回避し、並びに宿主細胞の溶解の必要性と、それに続いて生じる、全細胞溶解物中に存在する望ましくないタンパク質および他の細胞破片での細胞培地の混入を回避する。この方法により、望ましくない産物を除去するさらなる精製工程なしに、目的のタンパク質を培養培地から直接精製することができる。しかしながら、また本発明の方法は細胞溶解後の非分泌タンパク質の精製も想定する。例えば、シグナル配列を欠く目的のタンパク質を、本明細書で説明される方法により、本発明の新規エンテロキナーゼ開裂配列を含む融合構築物から精製することができる。
【００７３】
また本発明は、目的のタンパク質の発現および迅速な精製のためのカセットの構築も記載する。記載されるカセットを用いることで、事実上あらゆる目的のタンパク質をそのＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端のいずれかで本発明の新規エンテロキナーゼ開裂配列に融合させることができる。以下に記載される実施例によってわかるように、精製された目的のタンパク質が容易に得られる。
【００７４】
前述のように、本発明はいかなる数の目的のタンパク質の単離および精製にも用いることができる。エンテロキナーゼ認識ドメインのＰ１’位置に生じ得るすべてのアミノ酸を知ることにより、目的のタンパク質の（ＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端のいずれかに生じる）第１アミノ酸が構築物においてＰ１アミノ酸と融合し得るか否かを決定することができる。精製しようとするタンパク質のこの第１アミノ酸がＰ１’位置に許容される場合、Ｐｎ−Ｐ１アミノ酸を除去するエンテロキナーゼでの処理は精製溶出物から精製タンパク質を直接に即時単離することを可能にする。本明細書で用いられる場合、Ｐｎ−Ｐ１はエンテロキナーゼ認識ドメインの一部であり、かつ目的のタンパク質のアミノ末端側に生じるアミノ酸を示す。しかしながら、目的のタンパク質の第１アミノ酸がＰ１’位置の「下流」、すなわち、Ｐ２’、Ｐ３’等に融合しなければならないとしても、依然として高度に精製されたタンパク質は精製溶出物から単離することができ、必要とされる唯一の次の精製工程は精製タンパク質からの望ましくない末端アミノ酸の除去である。多くの場合、余分のアミノ酸（１つもしくは複数）は生物学的活性に対する効果なしに目的のタンパク質に結合したままにすることができ、したがって、次の精製／開裂工程は不必要である。
【００７５】
本発明の新規エンテロキナーゼ認識配列は、遺伝子パッケージの表面上のディスプレイとして発現される、限定されることはないが、抗体またはそれらのフラグメントを含む目的のタンパク質の放出に用いることもできる。表面タンパク質または表面タンパク質の一部（スタンプ（ｓｔｕｍｐ））を含み、これがエンテロキナーゼ認識配列に連結され、このエンテロキナーゼ認識配列が遺伝子パッケージの表面上の目的のタンパク質に連結される融合構築物の発現およびディスプレイに続いて、その遺伝子パッケージを含む培養物又は精製遺伝子パッケージをエンテロキナーゼで処理することで目的のタンパク質が融合タンパク質構築物から放出されるだろう。この方法によると、遺伝子パッケージ上の融合タンパク質・ディスプレイは本発明のエンテロキナーゼ認識配列のＮ末端またはＣ末端（好ましくは、Ｎ末端）で融合する目的のタンパク質を含み、エンテロキナーゼ認識配列の他方の末端（好ましくは、Ｃ末端）は遺伝子パッケージの表面上に発現するタンパク質またはそれらの一部に融合する。融合のディスプレイのための宿主細胞はあらゆる適切な細胞であってよく、これには、限定されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、細菌胞子もしくは酵母胞子、昆虫細胞、または哺乳動物細胞が含まれる。
【００７６】
エンテロキナーゼとのインキュベーションに続き、放出された目的の遺伝子パッケージは、当該技術分野において公知の方法を用いて集め、増幅することができる。例えば、そのように放出されたＦｆファージをＦ＋ 大腸菌に感染させることができる。
【００７７】
好ましい実施形態において、ファージ宿主は、目的のタンパク質、例えば、抗体またはそれらの機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ等）を含み、これが本発明のエンテロキナーゼ認識配列に融合し、このエンテロキナーゼ認識配列がファージ表面タンパク質またはそれらの一部に融合する融合タンパク質をディスプレイするだろう。最も好ましくは、融合タンパク質はＭ１３ファージにおいて発現される。用いられるファージ表面タンパク質は、例えば、Ｍ１３糸状バクテリオファージの完全遺伝子ＩＩＩタンパク質（配列番号２１３）；遺伝子ＩＩＩタンパク質のドメイン２、ドメイン３、膜貫通ドメイン、および細胞内アンカードメイン（配列番号２１５）；遺伝子ＩＩＩのドメイン３、膜貫通ドメイン、およびタンパク質の細胞内アンカードメイン（配列番号２１７）；糸状バクテリオファージの成熟遺伝子ＶＩＩＩタンパク質、または宿主バクテリオファージ、好ましくはＭ１３ファージの表面上に安定に発現し得るこれらのタンパク質のあらゆる変更、改変、トランケート、もしくは突然変異した形態であり得る。
【００７８】
バクテリオファージの表面上での発現およびディスプレイの後、バクテリオファージをエンテロキナーゼとインキュベートすることによって目的のタンパク質を放出する代わりに、発現した融合タンパク質を目的のタンパク質のリガンド、例えば、目的の抗体もしくは抗体フラグメントの場合には抗原と結合させることによって目的のタンパク質を単離することができる。このリガンドはカラムもしくは他の固体支持体に固定化されていても、液体媒体中に懸濁されていてもよい。支持体を洗浄するか、または培養培地等を濾過することによって非結合物質を除去した後、リガンド／ファージ・ディスプレイ複合体をエンテロキナーゼとインキュベートして遺伝子パッケージを放出させ、その後リガンドから溶出することによって（ディスプレイされる目的のタンパク質をコードする遺伝子を担持する）目的の遺伝子パッケージを集めることができる。次に、回収された遺伝子パッケージを適切な宿主内で増幅することができる。また本明細書に開示されるエンテロキナーゼ開裂配列は、阻害剤ポリペプチドに対する開裂性リンカーとして、特定の目的のタンパク質の活性、特異性、半減期または他の機能の制御に用いることもできる。例えば、プロテアーゼが阻害剤の存在下で不活性であるように、例えば、新規エンテロキナーゼ開裂配列の一方の末端に融合するプロテアーゼ、およびエンテロキナーゼ開裂配列の他方の末端に融合するそのプロテアーゼの阻害剤を含む融合タンパク質を宿主細胞から発現させるか、または宿主細胞もしくはファージの表面上にディスプレイさせることができる。その阻害剤の活性化または影響の除去が望ましいとき、融合タンパク質をエンテロキナーゼとインキュベートすることで阻害剤がプロテアーゼから解離され、それにより阻害剤からプロテアーゼが遊離される。
【００７９】
類似のタイプの融合構築物において、本発明のエンテロキナーゼ認識配列を、組換え宿主細胞において発現するか、またはディスプレイ宿主、例えば、遺伝子パッケージ上にディスプレイされる一本鎖抗体またはｓｃＦｖフラグメントの軽鎖と重鎖エレメントとの間の連結配列として用いることができる。融合体をエンテロキナーゼとインキュベートすることで重鎖と軽鎖エレメントとの間の連結が除去され、重鎖および軽鎖エレメント（例えば、ｓｃＦｖの場合にはＶＨおよびＶＬドメイン）をより自由に、すなわち、リンカーからのいかなる立体的制約なしに会合させることを可能にする。
【００８０】
また本明細書に開示されるエンテロキナーゼ認識配列は、宿主細胞またはバクテリオファージの表面上での融合タンパク質の適切な発現および／またはディスプレイを確認するのに用いることもできる。この実施形態においては、融合タンパク質ディスプレイは目的のタンパク質を含み、これはエンテロキナーゼ認識配列に融合され、このエンテロキナーゼ認識配列はリガンド・マーカー、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチドに融合される。宿主細胞またはバクテリオファージの表面上での発現およびディスプレイの後、その構築物をカラムまたは他の支持体に固定されたストレプトアビジン（Ｓｖ）と接触させる。融合体を適性にディスプレイする宿主は固定化リガンド（例えば、Ｓｖ）に結合し、一方、ディスプレイしない宿主は洗い流すことができる。エンテロキナーゼとインキュベートすることで結合宿主を単離することができる。次に、これらのディスプレイが確認された宿主を、例えば、回収されたディスプレイが確認された結合体を再培養してエンテロキナーゼで前処理し、妨害されていない目的のタンパク質をディスプレイさせておくことにより、目的の標的に結合する目的のタンパク質を同定する選択において用いることができる。
【００８１】
本発明のエンテロキナーゼ認識配列を遺伝子パッケージ上にディスプレイされるタンパク質またはペプチドの選択において用いることができる。ディスプレイされるライブラリー・メンバーとディスプレイ融合タンパク質のアンカードメインとの間に位置するエンテロキナーゼ認識配列を用いてディスプレイ・ライブラリーを調製する。この遺伝子パッケージのライブラリーを標的タンパク質と接触させる。標的タンパク質は、ディスプレイ・ライブラリーのメンバーと結合させる前または後のいずれかに固定化する。ライブラリーの非結合メンバーを洗い流す。固定化遺伝子パッケージをエンテロキナーゼで処理し、放出されるパッケージを培養する。例えば、Ｆｆパッケージは大腸菌の感染に用い、一方、ディスプレイ酵母遺伝子パッケージは適切な増殖培地において増殖させる。この方法の利点は、緩衝条件を変更する必要がなく、かつ放出されるパッケージが遺伝子パッケージ本体との幾らかの非特異的相互作用ではなくディスプレイされるタンパク質またはペプチドとして結合しているときわめて考えられることである。
【００８２】
新規エンテロキナーゼ認識配列の同定
新規エンテロキナーゼ開裂配列を同定するため、約２×１０８アミノ酸配列の多様性を有する基質ファージ・ライブラリをエンテロキナーゼに対してスクリーニングした。基質ファージ・ライブラリはディスプレイ・ポリペプチド内にペプチド多様化領域（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）を含むように設計した。この領域は１３の連続するアミノ酸からなり、このディスプレイ・ポリペプチドは各々の位置にシステインを除くあらゆるアミノ酸が生じることができるように設計されたものであった。基質ファージ・ライブラリは、直鎖およびジスルフィド制約ストレプトアビジン認識配列のＮ末端縦列配置を含めることによっても特徴付けた。スクリーニングは合計で５ラウンドストリンジェンシーを高めながら行い、固定化ストレプトアビジンに結合した後、組換え軽鎖エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手）と共にインキュベートすることによって放出され得るファージを得た。第５ラウンドのスクリーニングの後に残る９０種の単離体をさらなる配列分析のためにランダムに選択した。
【００８３】
９０種のラウンド５の単離体に関するＤＮＡ配列分析により実質的な配列の崩壊（ｃｏｌｌａｐｓｅ）が示された。それらの単離体を配列の類似性によってグループ分けしたとき、９０種の単離体のうちの８２種がカルボキシ側で塩基残基が続く酸性残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）からなる簡単なジペプチドモチーフを（合計で９９の出現に対して）１例以上含んでいた。９９例のうちで観察されたジペプチドの頻度は、Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＤＲ）６６％、Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＫ）１８％、Ｇｌｕ−Ａｒｇ（ＥＲ）１４％、およびＧｌｕ−Ｌｙｓ（ＥＫ）４％であった。
【００８４】
複数回現れる配列を、既知のＥＫ開裂配列 （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ を含む単離体および非選択（無関係の）対照と比較することによりさらに調べた。これらの単離体のうち、（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ を含む試験配列よりも迅速に開裂するものが幾つか見出された（下記実施例を参照）。
【００８５】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリの調製
本発明のエンテロキナーゼ認識配列を、バクテリオファージの表面上にディスプレイされたストレプトアビジン認識配列に融合した潜在的なエンテロキナーゼ認識配列の多様ライブラリから単離した。１０８種以上のディスプレイ配列多様性を有するファージ・ディスプレイ・ライブラリを、例えば、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ １９９６） および Ｕ．Ｓ． ５，２２３，４０９ （Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、並びに Ｄｏｗｅｒら、Ｕ．Ｓ． ５，４３２，０１８（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示される方法に従って構築することができる。オリゴヌクレオチド・ライブラリを、バクテリオファージ構造タンパク質、好ましくはアクセス可能なファージタンパク質、例えば、バクテリオファージ外殻タンパク質をコードする適切なベクターに挿入する。様々なバクテリオファージを本発明において用いることができるが、ベクターは繊維状バクテリオファージ、例えば、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、Ｍ１３等であるか、またはそれら由来である。
【００８６】
ファージベクターはバクテリオファージ構造タンパク質をコードする遺伝子の５’領域に位置するクローニング部位を含むように選択されるか、または該部位を含むように構築され、エンテロキナーゼ認識配列は新規エンテロキナーゼ認識配列を同定するプロセスにおいて該酵素に利用され得る。
【００８７】
適切なベクターは、認識配列が成熟外殻タンパク質のＮ末端に近接して発現するように、本発明の認識配列をコードするオリゴヌクレオチド配列の配向化クローニングを可能にする。外殻タンパク質は、典型的には、リーダー配列を有する前駆体タンパク質として発現する。したがって、処理されたバクテリオファージ外部タンパク質のＮ末端が、ペプチドの第１残基、すなわち、リーダータンパク質をコードする配列の３’末端と成熟タンパク質をコードする配列の５’末端または５’末端の一部との間に存在するように、オリゴヌクレオチド・ライブラリを挿入することが好ましい。
【００８８】
ライブラリは、潜在的エンテロキナーゼ認識配列（およびストレプトアビジンまたは他のリガンド認識配列）を含むオリゴヌクレオチドを、選択したクローニング部位にクローニングすることによって構築する。公知の組換えＤＮＡ技術（一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８９）（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照）を用いて、とりわけ望ましくない制限部位を除去し、かつ所望のものを追加するオリゴヌクレオチドを構築し、除去されたあらゆる配列の正しい部分を再構築し、存在するのであればスペーサー、保存残基またはフレームワーク残基を挿入し、並びに（必要であれば）活発な感染性ファージを産生する翻訳フレームを修正する。オリゴヌクレオチドの中心部分は、一般には、１以上の認識配列およびあらゆる追加残基、例えば、あらゆるスペーサーまたはフレームワーク残基を含む。それらの配列は、最終的に、形成されたバクテリオファージ粒子外部のアクセス可能な表面上の成熟タンパク質のＮ末端に融合するか、その内部のペプチド（スペーサーまたはフレームワーク残基を有するか又は有していない）として発現する。
【００８９】
オリゴヌクレオチドの可変エンテロキナーゼ認識配列はライブラリの供給源を構成する。ライブラリのサイズは可変コドンの数、したがって、所望のペプチドのサイズに従って変化する。一般には、ライブラリは少なくとも約１０６メンバーであり、通常は少なくとも１０７、典型的には１０８以上のメンバーである。
【００９０】
可能性のあるエンテロキナーゼ認識配列のランダム収集物をコードする一連のコドンを形成し、最終的にはベクターにクローン化されるオリゴヌクレオチドの収集物を生成するため、コドンモチーフ、例えば、（ＮＮＫ）ｘ（ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ（名目上、等モル濃度）であり得、ＫはＧまたはＴ（名目上、等モル濃度）であり、かつｘは典型的には約５、６、７、または８以上である）が用いられ、それによりペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、およびオクタペプチドまたはそれ以上のライブラリが生じる。第３位はＧまたはＣであってもよく、「Ｓ」と命名される。したがって、ＮＮＫまたはＮＮＳは、（ｉ）すべてのアミノ酸をコードし、（ｉｉ）１つの停止コドンのみをコードし、また（ｉｉｉ）コドンの偏りの範囲を６：１から３：１に減少させる。より長いペプチドを用いると、生成されるライブラリのサイズがクローニングプロセスにおいて制約される可能性があることを理解するべきである。適切な組換えベクターにおけるオリゴヌクレオチドのランダム生成混合物からのペプチドの発現は Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ４４：１７７−１８３ （１９８６）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）において考察されている。
【００９１】
例示的コドンモチーフである（ＮＮＫ）６ は、３２のコドン、１２種類のアミノ酸の各々について１つ、５種類のアミノ酸の各々について２つ、３種類のアミノ酸の各々について３つ、および１つの（アンバー）停止コドンを生じる。このモチーフはオリゴヌクレオチド合成の標準方法で利用可能であるほどに公平なコドン分布を生じるが、１コドン残基を含むペプチドに対して偏りを生じる。例えば、ヘキサコドンの完全な収集物は１コドンアミノ酸のみで形成されるペプチドの各々をコードする１つの配列を含むが、３コドンアミノ酸のみを有するペプチドの各々をコードする７２９（３６）の配列を含む。
【００９２】
１コドン残基に対する偏りを最小化する代わりのアプローチは、各々が２０の遺伝的にコードされたアミノ酸のうちの１つのコドンを表す２０の活性化トリヌクレオチドの合成を含む。ＭｃＢｒｉｄｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：２４５ （１９８３）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）に一般的に記載されるように、これらを通常の手段によって合成し、支持体から除去はするが塩基および５’−ＯＨ保護基は維持させ、モノヌクレオチドの活性化に用いられる方法による３’Ｏ−ホスホロアミドの付加（およびベータシアノエチル基でのリン酸保護）によって活性化する。これらの三量体を基本要素として用いて変性「オリゴコドン」を調製する。これらの三量体を所望のモル比で混合し、シンセサイザに導入する。これらの比は通常ほぼ等モルであるが、変性オリゴヌクレオチド収集物によってコードされる特定のアミノ酸の過剰および過小提示を得るため、制御された不等比であってもよい。オリゴコドンを形成するための三量体の縮合は、本質的には、活性化モノヌクレオチドを基本要素として用いる通常の合成について記載される通りに行う。一般には、Ａｔｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｎ， ｅｄ． ｐ．３５−８２ （１９８４）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照のこと。したがって、この手順により、可能性のあるペプチド配列の等しい分布（または制御された不等分布）をコードすることが可能であるクローニング用のオリゴヌクレオチドの集団が生じる。このアプローチは、（ＮＮＫ）６モチーフによって生じる偏りの範囲が各追加アミノ酸残基ごとに３倍に増加するため、より長いペプチド配列の生成において特に有用であり得る。
【００９３】
コドンモチーフが上に定義される通りの（ＮＮＫ）ｎであり、かつｎが８である場合、２．６×１０１０の可能性のあるオクタペプチドが存在する。これらのオクタペプチドの大部分を含むライブラリは生成することが困難であり得る。したがって、その可能性のある配列の約０．１％から１％、５％、または１０％までの配列を用いてサブセット・ライブラリを構築することによりオクタペプチドのサンプリングを達成し、次にその組換えバクテリオファージ粒子のサブセットをスクリーニングすることができる。ライブラリ・サイズが大きくなるに従い、より低いパーセンテージが許容可能である。所望であれば、サブセット・ライブラリの多様性を拡張するため、回収されたファージ・サブセットに突然変異誘発を施し、続いて次のラウンドのスクリーニングに処することができる。この突然変異誘発工程は２つの一般的な方法で達成することができる。すなわち、回収されたファージの可変領域に突然変異を誘発することができ、または当該技術分野において公知の方法により初期可変領域に隣接する領域に追加の可変アミノ酸を付加することができる。
【００９４】
ペプチド・ライブラリを多様化するか、またはスクリーニングの早期ラウンドにおいて見出されるペプチド周辺を多様化して十分な開裂性を持たせるのに様々な技術を本発明において用いることができる。アプローチの１つにおいては、陽性ファージ（スクリーニングの早期ラウンドにおいて同定されるもの）を配列決定して活性ペプチドの特性を決定する。次に、一次オリゴヌクレオチド配列の僅かな変化を生成するため各工程で組み込まれるすべての塩基を低レベルで用いて、これらのペプチド配列に基づきオリゴヌクレオチドを合成する。その後、この（僅かに）変性したオリゴヌクレオチドの混合物を親和性ファージにクローン化する。この方法によって、出発ペプチド配列に系統的に制御された変化が生じる。しかしながら、突然変異誘発に先立って個々の陽性ファージの配列決定が必要であり、したがって、少数の回収されたファージの多様性を拡大するのに有用である。
【００９５】
選択されたファージ・ペプチドの認識配列周辺を多様化するための別の技術として、適合度の低い条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによる、ペプチドにおけるヌクレオチド変化の僅かな取り込みミスが挙げられる。Ｌｅｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５ （１９８９）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）のプロトコルは、ヌクレオチド比およびマンガンイオンの添加を変更して２％の突然変異頻度を生じる。
【００９６】
選択されたファージを多様化するためのさらに別のアプローチは、回収されたファージのプールまたはサブセットの突然変異誘発を含む。スクリーニングから回収されたファージをプールし、一本鎖ＤＮＡを単離する。このＤＮＡを、例えば、亜硝酸、ギ酸、またはヒドラジンで処理することによって突然変異を誘発する。これらの処理によりＤＮＡに様々な損傷が生じる。次に、損傷を受けたＤＮＡを、損傷部位に遭遇したときに塩基の取り込みミスを生じる逆転写酵素を用いてコピーする。次いで、可変領域にフランキングする部位に特異的な制限ヌクレアーゼ（１種類もしくは複数種類）で切断することにより、可変ペプチドをコードする配列を含むセグメントを単離する。その後、この突然変異誘発セグメントを非損傷ベクターＤＮＡに再クローン化する。そのＤＮＡを細胞にトランスフォームし、二次ライブラリを構築する。一般的な突然変異誘発法は、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３：３１３１−３１４５ （１９８５）、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：２４２−２４６ （１９８５）、および Ｍｙｅｒｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １， ８．３．１−８．３．６， Ａｕｓｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）（これらの各々は参照することにより本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【００９７】
開裂性であることが見出されたペプチド（１つもしくは複数）にさらなるアミノ酸を追加する第２の一般的なアプローチにおいては、様々な方法が利用可能である。その１つにおいては、早期スクリーニングにおいて選択されたペプチドの配列を個々に決定し、決定された配列および隣接する変性配列が組み込まれた新規オリゴヌクレオチドを合成する。次に、これらをクローン化して二次ライブラリを生成する。
【００９８】
ペプチド担持ファージのプールに第２の可変配列領域を添加する別のアプローチにおいては、一次可変領域に隣接して制限部位を導入する。好ましくは、酵素はその認識配列の外側、例えば、４塩基５’オーバーハング、認識部位の３’側４塩基を遊離するＢｓｐＭＩ、を切断するべきである。したがって、認識部位は一次変性領域から４塩基に配置することができる。第２可変領域を挿入するため、ファージＤＮＡのプールを消化し、オーバーハングをＫｌｅｎｏｗ断片で充填することにより平滑末端化する。次に、二本鎖の平滑末端化した変性合成オリゴヌクレオチドをこの部位にライゲートし、一次可変領域に並列する第２可変領域を生成する。その後、前記と同様にこの二次ライブラリを増幅してスクリーニングする。
【００９９】
ここで説明されるペプチド・ライブラリは、酵素エンテロキナーゼによって認識および開裂され得る新規アミノ酸配列の同定に用いられている。この手順は、他のタンパク質修飾酵素の部位特異性の同定に用いることもできる。例として、前記Ｄｏｗｅｒに記載されるように、Ｘａ因子は配列 Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ の後を開裂する。例えば、基本構造：シグナル配列−可変領域−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｐＩＩＩを有する、ｐＩＩＩを含むディスプレイ用のＭ１３ファージにおいて、可変領域コドンのライブラリを構築することができる。次に、このライブラリからのファージをＸａ因子に暴露した後、Ｎ末端に露出する Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ に特異的である抗体（例えば、３Ｅ７）でスクリーニングする。３Ｅ７を用いる前開裂スクリーニング工程を行って大腸菌プロテアーゼによって開裂されるクローンを除去することができる。スクリーニングの後、Ｘａ因子での開裂に適合するランダム配列を有するライブラリのメンバーのみが単離され、それらの配列は Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ 部位を模倣する。
【０１００】
プロテアーゼ基質同定の別のアプローチは、担体タンパク質と複合体の固定化に用いられるレポーター配列（例えば、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）との間への可変領域の配置を含む。ライブラリは、そのレポーター配列に結合する受容体（例えば、３Ｅ７抗体）を用いて固定する。所望のプロテアーゼを用いる処理により、開裂に適合する配列を有するファージクローンが放出される。
【０１０１】
本発明の新規エンテロキナーゼ認識配列の同定を容易にするため、リガンド認識配列、例えば、配列番号５を潜在的なＥＫ認識配列に結合する融合パートナーとしてファージ・ライブラリに含めることができる。この方法によると、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、配列番号５）は外殻タンパク質の表面上にエンテロキナーゼ開裂配列と共に発現する。次に、基本構造：ファージ−ＥＫ認識配列−ストレプトアビジン結合ペプチドを有する、得られた構築物を、ストレプトアビジン結合ペプチド部分を介してストレプトアビジン（またはアビジン）に結合させる。ストレプトアビジンは表面、例えば、マイクロタイタープレートまたはアフィニティカラム上に固定化することができる。その代わりに、例えば蛍光活性化細胞ソーターでの、ソーティング法による検出および／または単離のため、ストレプトアビジンを、例えば、蛍光体で標識して活性ファージ・ペプチドをタグ化することもできる。
【０１０２】
所望の特異性を持たないペプチドを発現するファージは洗浄によって除去する。必要とされる洗浄の程度および厳密性は各々のリガンド／エンテロキナーゼ認識配列について決定される。結合インキュベーションおよびそれに続く洗浄の条件を調製することにより、または、その代わりに、ここに開示されるように、認識配列をそれらの開裂効率または速度が増加するように改変することにより、特定の制御程度を回収されるペプチドの結合特性全体にわたって発揮させることができる。
【０１０３】
リガンド結合パートナーに幾らかの親和性および特異性を付与するペプチド配列がひとたびわかると、結合親和性に影響を及ぼすようにこのコア配列周辺の多様性を変化させることができる。例えば、可変ペプチド領域をその同定された配列の一端または両端に配置することができる。既知配列は、例えば、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３８：４９１−４９７ （１９８７）に記載される、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ およびインテグリン・ファミリーの受容体の場合と同様に、文献から同定することができ、または、本発明の内容におけるように、スクリーニングの早期ランドから誘導することができる。
【０１０４】
有用なエンテロキナーゼ認識配列、すなわち、（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−Ｘａａ（配列番号８）（ここで、Ｘａａは天然トリプシノーゲン部位におけるＩｌｅ、または合成したＥＫ開裂性融合タンパク質に組み込まれる場合には、あらゆるアミノ酸である）が既に公知であるため、ファージ・ディスプレイ・ライブラリを新規エンテロキナーゼ認識配列についてスクリーニングするための実際的な標準が提示されており、（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−Ｘａａ より特異性に劣るか、またはそれに匹敵するだけ、もしくはそれよりも遅い開裂速度を有する開裂配列はあまり望ましくない。したがって、上に概述される方法によって多くの新規エンテロキナーゼ開裂配列を発見することはできるが、我々は （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−Ｘａａ（配列番号８）と比較した場合に利点が提供されるエンテロキナーゼ開裂配列の単離に絞った。
【０１０５】
ペプチドの合成
上に概述される手順に続いて、スクリーニング・プロセスから回収される組換えファージにおいて発現される新規エンテロキナーゼ認識配列をコードする合成ポリヌクレオチドを単離して配列決定し、コードされるアミノ酸配列を明らかにすることができる。認識配列を分析して潜在的なコンセンサス配列、認識モチーフ、または認識ドメインを同定した後、これらの配列を変化させてそれらを潜在的な追加エンテロキナーゼ認識配列として評価することが望ましい。予め決定された配列および長さのペプチド配列を化学合成することにより、追加エンテロキナーゼ認識配列を評価することができ、かつ元のファージ・ライブラリから同定された単離体よりも良好な特異性および開裂速度を有する追加配列を同定する可能性が高い。
【０１０６】
合成は当業者に公知の方法論によって行うことができる（Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， （Ｓｅｔｌｏｗ， Ｊ．Ｋ．， ｅｄ．）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．， （１９９０） ｖｏｌ． １２， ｐｐ． １−１９；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９８９）， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ を参照）（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。本発明のエンテロキナーゼ認識配列は化学合成または半合成のいずれかによって作製することができる。化学合成または半合成法では、非天然アミノ酸残基が組み込むことができる。
【０１０７】
本発明のエンテロキナーゼ認識ペプチドは、好ましくは、固相ペプチド合成を用いて調製する（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５： ２１４９ （１９６３）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：５１３２ （１９８５））（これらは参照することによりここに組み込まれる）。固相合成は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ基と反応して後に容易に開裂する結合を形成する適切な樹脂、例えば、ハロメチル樹脂、例えば、クロロメチル樹脂およびブロモメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、またはｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジン樹脂に保護アミノ酸をカップリングさせることにより、推定ペプチドのカルボキシ末端で開始する。例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で、α−アミノ保護基を除去し、例えばＴＥＡで中和した後には、合成における次のサイクルを開始する準備が整っている。次に、残留するα−アミノ保護基および、必要であれば、側鎖保護アミノ酸を縮合によって所望の順番で連続的にカップリングさせ、樹脂に結合した中間体化合物を得る。その代わりに、幾つかのアミノ酸を互いにカップリングさせてオリゴペプチドを形成させた後、そのオリゴペプチドを成長する固相ポリペプチド鎖に付加することもできる。
【０１０８】
２つのアミノ酸、またはアミノ酸とペプチド、またはペプチドとペプチドとの縮合は通常の縮合法、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート］法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法）、およびＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ法に従って行うことができる。
【０１０９】
ペプチドの化学合成に共通なのは、様々なアミノ酸部分の反応性側鎖をその部位で適切な保護基を用いて、鎖が完全に組み立てられた後に最終的にその基が除去されるまで保護することである。アミノ酸または断片のα−アミノ基の保護も共通であり、その間実体がカルボキシ基で反応し、それに続いてα−アミノ−保護基が選択的除去されることでその位置での次の反応の生成が可能となる。したがって、所望の配列内に位置するアミノ酸残基の各々をペプチド鎖内に含み、様々なこれらの残基が側鎖保護基を有する中間体を生成することが、合成における一工程として、共通である。その後、精製の後に所望の結果生成物が生じるように、一般にこれらの保護基を実質的に同時に除去する。
【０１１０】
α−およびε−アミノ側鎖基を保護するための典型的な保護基は、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ２）］、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、アダマチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、ジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）等によって例示される。
【０１１１】
カルボキシ基の保護基として、例えば、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ−ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等を例示することができる。必要に応じて、アミノ基およびカルボキシ基以外の官能基を有する特定のアミノ酸、例えば、アルギニン、システイン、およびセリンを適切な保護基によって保護することが望ましい。例えば、アルギニン内のグアニジノ基はニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｍｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護することができる。システイン内のチオール基はｐ−メトキシベンジル、トリフェニルメチル、アセチルアミノメチルエチルカルバモイル、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチル−ベンジル（Ｔｍｂ）等で保護することができ、セリン内のヒドロキシル基はベンジル、ｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニル等で保護することができる。
【０１１２】
所望のアミノ酸配列が完成した後、試薬、例えば、液体ＨＦ、およびペプチドを樹脂から開裂するだけではなく、すべての残留側鎖保護基も開裂する１種類以上のチオ含有スカベンジャーで処理することにより、中間体ペプチドを樹脂支持体から除去する。ＨＦ開裂の後、タンパク質配列をエーテルで洗浄し、大容量の希酢酸に移し、水酸化アンモニウムで約８．０に調整したｐＨで攪拌する。ｐＨ調整で、ポリペプチドはその望ましい高次構造配置をとる。
【０１１３】
本発明によるポリペプチドは、ペプチド合成をサービスとして提供する企業によって商業的に調製することもできる（例えば、ＢＡＣＨＥＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ；Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）。
【０１１４】
融合タンパク質の調製
本発明によると、新規エンテロキナーゼ認識配列を目的タンパク質またはそれらの断片の単離および精製に用いることができる。この方法によると、目的タンパク質は、本発明による新規エンテロキナーゼ認識配列をも他のドメインとして含む組換え融合タンパク質の１ドメインとして存在する。好ましくは、目的タンパク質の第１アミノ酸はＥＫ開裂配列のＣ末端に連結し、最も好ましくは、目的タンパク質のＮ末端アミノ酸はエンテロキナーゼ認識配列のＰ１’位をとる。このような方法では、エンテロキナーゼによる開裂が目的タンパク質を最初のアミノ酸残基で正確に分離し、外側のＮ末端アミノ酸を目的タンパク質から除去するさらなる処理を行う必要性がなくなる。
【０１１５】
また、新規ＥＫ認識配列は、好ましくは、そのアミノ末端で融合タンパク質の第３ドメインとしてのリガンド認識配列にライゲートし、リガンド結合パートナー、例えば、ストレプトアビジンへの固定化を容易にする。
【０１１６】
融合タンパク質は、遺伝子工学の通常の方法によるＤＮＡ操作を用いて構築する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ １９８９ を参照）。目的タンパク質を回収するために設計される融合タンパク質のドメインの好ましい配置は（Ｎ末端からＣ末端に移動して）：リガンド認識配列、エンテロキナーゼ認識配列および目的タンパク質である。本発明の好ましい融合タンパク質の構築においては、リガンド認識配列をコードするポリヌクレオチドをエンテロキナーゼ認識配列をコードするポリヌクレオチドの５’かつインフレームに結合させ、次にそれを、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’およびインフレームに連結する。好ましくは、目的タンパク質のＮ末端アミノ酸のコドンは融合タンパク質構築物においてＰ１’位（すなわち、ＥＫ開裂配列の易分断性結合のちょうどＣ末端）をとるように位置する。融合タンパク質発現構築物は、典型的には、選択された宿主において転写を指向するプロモーター、リボゾーム結合部位、およびトランスフォームされた宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を指向する分泌シグナルも含む。
【０１１７】
本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチドを含むプラスミドは、当該技術分野において公知の技術によりＤＮＡ断片を選り抜きの発現ベクターにライゲートすることによって構築することができる。構築には、通常のＤＮＡライゲーション技術を用いることができる。例えば、制限酵素法を用いて、単離および／または合成の後に融合タンパク質に翻訳される配列を含むヌクレオチド配列を重要な部位で制限消化し、ＤＮＡ配列オーバーハングを、相同オーバーハングまたは配列を有する別のＤＮＡ分子に融合させるためのテンプレートとして創出することができる。その代わりに、既存のオーバーハングを有するか、または当該技術分野において公知の技術を用いることによって平滑末端化されているＤＮＡ断片上に一本鎖ＤＮＡオーバーハングを合成で構築することもできる。その後、各ヌクレオチド配列の相同一本鎖ＤＮＡオーバーハングを商業的に入手可能なリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートし、同じ生物の異なる領域に由来するＤＮＡまたは異なる生物もしくは源に由来するＤＮＡを含む融合ＤＮＡ断片を創出する。理論的には、ライゲートすることができるＤＮＡ断片の数またはライゲートした断片のサイズに対する唯一の制限は、選り抜きのベクターまたは発現ベクターに挿入することができる断片のサイズによって制限される。
【０１１８】
類似の方法により、融合ＤＮＡ断片を、適切な制限酵素（１種類もしくは複数種類）で処理して発現のために挿入しようとするＤＮＡ断片の５’および３’末端に適合するスプライト部位がその内部に創出されている発現ベクターにライゲートすることができる。ライゲーションが完了した後、リガンド認識およびエンテロキナーゼ認識配列に融合する目的タンパク質を発現させるため、その組換えベクターを適切な宿主細胞に導入する。
【０１１９】
目的タンパク質の単離および精製
融合タンパク質を発現させるため、発現ベクターでトランスフォームした細胞を目的タンパク質の発現に適する条件下での細胞培養において成長させる。発現後、細胞を溶解して融合タンパク質を細胞培養物中に放出させることができ、または、好ましくは、融合タンパク質は宿主細胞の破壊または溶解を行う必要なく培養培地への融合タンパク質の分泌を容易にするシグナル配列を含む。融合タンパク質を培養上清から直接単離することができるため、培養培地への融合タンパク質の分泌が好ましい。細胞が溶解を必要とする場合、細胞の溶解の際に放出される細胞の残骸から融合タンパク質を分離するのに１以上のさらなる精製工程が必要である。これは、目的タンパク質の収量の減少、またはその生物学的活性の低下を生じ得る。
【０１２０】
本発明の融合タンパク質は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、サイズ測定カラムクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィー）、遠心、差別的溶解度を含む標準法により、またはタンパク質精製のための他のあらゆる標準技術により、単離および精製することができる。
【０１２１】
本発明の一態様においては、発現した融合タンパク質を含む細胞培養上清を、融合タンパク質構築物に含まれるリガンド認識配列に特異的な固定化リガンド結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン（すなわち、融合タンパク質がビオチンまたは他のストレプトアビジン結合ドメインを含む場合）を収容するカラムに通過させることにより、多量の融合タンパク質を単離および精製することができる。結合後、カラムを洗浄してあらゆる非結合融合タンパク質を除去する。この洗浄工程に続いて、エンテロキナーゼ認識配列の開裂に適するインキュベーション条件下および酵素濃度でカラムをエンテロキナーゼと接触させる。その後、放出されたタンパク質を溶出し、当該技術分野において公知の標準法によって実質的に純粋かつ生物学的に活性の形態で回収する。ほとんどの場合において、回収された目的タンパク質はさらなる精製工程はいかなるものも必要としない。その代わりに、融合タンパク質の結合パートナー／ＥＫ開裂配列部分を単離または固定化し、目的タンパク質を溶液中に遊離させるため、培養培地をリガンド結合パートナーと接触させる前にエンテロキナーゼを培養培地に添加することができる。
【０１２２】
以下の非限定的な例を参照することによって本発明をさらに説明することができる。
【０１２３】
実施例
ＥＫ開裂配列のファージ・ディスプレイ・ライブラリの構築およびスクリーニング（ｉ）基質ファージ・ライブラリの構築
Ｍ１３ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質のＮ末端で外来性ポリペプチドをディスプレイするように、ファージ・ディスプレイ・ライブラリを設計した。外来性ポリペプチドは、直列リガンド認識配列、潜在的ＥＫ認識配列のテンプレートとして機能する１３アミノ酸の多様化セグメント、Ｘａ因子開裂部位、前記ドメイン同士を連結するセグメント、および前記ドメインを遺伝子ＩＩＩタンパク質のＮ末端に連結するセグメント、を有する８６ｍｅｒの融合タンパク質であった。この外来性ディスプレイ・ポリペプチドの配列は以下の通りであった：
ＡＥＷＨＰＱＦＳＳＰＳＡＳＲＰＳＥＧＰＣＨＰＱＦＰＲＣＹＩＥＮＬＤＥＦＲＰＧＧＳＧＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＧＡＱＳＤＧＧＧＳＴＥＨＡＥＧＧＳＡＤＰＳＹＩＥＧＲＩＶＧＳＡ−（遺伝子ＩＩＩタンパク質のＮ末端）（配列番号９）
（ここで、各Ｘ位にはシステインを除くあらゆるアミノ酸残基が許容される）。
下線が付されたセグメントは、Ｎ末端からＣ末端方向に見て、それぞれ直鎖状ストレプトアビジン結合配列、拘束されたストレプトアビジン結合ループ、およびＸａ因子開裂部位を示す。この設計は４．２×１０１６の潜在的多様性をもたらした。約２×１０８の異なるディスプレイ・ポリペプチドがスクリーニング用のライブラリに含まれていた。
【０１２４】
（ｉｉ）ライブラリの新規エンテロキナーゼ開裂配列についてのスクリーニング
２×１０８のディスプレイ・ポリペプチド配列の多様性を有する基質ファージ・ライブラリを、ポリスチレン磁性ビーズ上に固定されたストレプトアビジンへの結合の後にエンテロキナーゼ開裂によって放出され得るファージについてスクリーニングした。
【０１２５】
ファージを合計で５ラウンド、スクリーニングした。各スクリーニングのラウンドにおいて、２アリコートのファージを、別々のチューブ内において室温で３０分間、ＥＫアッセイ・バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中でインキュベートすることによりストレプトアビジン・ビーズに結合させた。ＥＫアッセイ・バッファ（５００μＬ×５）で洗浄した後、ビーズ結合ファージを組換え軽鎖エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と共にアッセイバッファ中、室温でインキュベートした。
【０１２６】
各スクリーニング条件から得られた４０までのランダムに選択したファージ単離体のＤＮＡ配列分析を、ラウンド２および引き続くすべてのラウンドで行って、基質選択の進行をモニターした。ラウンド３の後にコンセンサス配列パターンを明瞭に識別することができなかったため、ラウンド４および５においてスクリーニング条件のストリンジェンシーを高めた。
【０１２７】
ラウンド１〜３において、２種類の異なるエンテロキナーゼ濃度を用いた。３２０ｎＭ感受性ファージ集団は３つのラウンドのすべてにおいて一貫して３２０ｎＭエンテロキナーゼで処理し、１．３μＭエンテロキナーゼ感受性ファージ集団は３つのラウンドのすべてにおいて一貫して当該濃度１．３μＭで処理した。
【０１２８】
ラウンド４において、ラウンド３から得られた３２０ｎＭエンテロキナーゼ感受性ファージをストレプトアビジン・ビーズに結合させた後、エンテロキナーゼ・アッセイ・バッファ中で６５ｎＭエンテロキナーゼと共に３０分間インキュベートした。これらのビーズを微量遠心機内で３０秒間遠心することによってペレット化し、エンテロキナーゼ開裂したファージを含む上清を取り出した。新鮮な６５ｎＭエンテロキナーゼを含むアッセイ・バッファをビーズに添加して、さらに１．５時間インキュベーションし、残存するファージを開裂した。
【０１２９】
ラウンド５については、ラウンド４から得られた３０分エンテロキナーゼ感受性ファージの２アリコートを、１０ｎＭエンテロキナーゼまたは３０ｎＭエンテロキナーゼのインキュベーションのため、別々のバッチのストレプトアビジン・ビーズに結合させた。
【０１３０】
各ラウンドにおいて「開裂した」ファージの上清をストレプトアビジン・ビーズから採取した後、それら上清を新鮮なストレプトアビジン・ビーズの２回の連続するバッチと室温で３０分間混合し、ストレプトアビジン結合ドメインを保持するあらゆる遊離のファージを除去した。最終的な非結合ファージ上清を宿主大腸菌細胞の感染に用いて、スクリーニングの引き続くラウンドの各々においてそのファージ集団を増幅した。
【０１３１】
ラウンド５から得た増幅したファージ集団を、ファージＥＬＩＳＡによってエンテロキナーゼ開裂について試験した。ラウンド５ファージ集団を、陰性対照としての非選択基質ライブラリに由来するファージに対してスクリーニングした。
【０１３２】
個々のファージサンプルをストレプトアビジン被覆マイクロタイターウェルに結合させた後、異なる濃度のエンテロキナーゼにより室温で２時間処理した。抗ファージ抗体−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートおよびＨＲＰ活性アッセイを用いて放出されなかったファージを検出した。ラウンド５ファージ集団について観察される、エンテロキナーゼ濃度の増加に伴うストレプトアビジン結合ファージにおける６３０ｎｍでの吸光度の減少は、エンテロキナーゼ基質がうまく選択されたことを示していた。
【０１３３】
（ｉｉｉ）特異的エンテロキナーゼ開裂配列の同定
ラウンド５から得たランダムに選択した９０のファージ単離体のうちの８２のＤＮＡ配列は、配列類似性によってグループ分けしたとき、Ａｓｐ−Ａｒｇに対するコドン配列を６６％の頻度で、またＧｌｕ−Ａｒｇに対するものを１４％、Ａｓｐ−Ｌｙｓに対するものを１８％、およびＧｌｕ−Ｌｙｓに対するものを４％にて含む、単純な酸性アミノ酸−塩基性アミノ酸の二つのコドンのモチーフを生じた。単離ラウンド２〜４から得た配列を酸−塩基モチーフについて再検討し、単一ＥＫ開裂部位ペプチド基質を表１、２および３に示す。易切断性結合（Ｐ１’）に対して上流（Ｎ末端）の６ｍｅｒに注目したが、それはこのペプチド長が高特異性基質を示すものと考えられたためである。これらのペプチドをＰ１’アミノ酸残基を含む７ｍｅｒとして列挙する。ボールド体のアミノ酸残基はディスプレイ・ペプチドの多様化領域からのものであり、標準体で表されるアミノ酸残基はファージタンパク質からの定常残基である。
【０１３４】
【表１】
2004503219.tif 000003
【０１３５】
【表２】
2004503219.tif 000004
【０１３６】
【表３】
2004503219.tif 000005
2004503219.tif 000006
【０１３７】
易切断性結合のＮ末端側の多様化領域からの少なくとも３つのアミノ酸を有する配列決定済ラウンド５ ＥＫ認識配列を表４に示す。２以上の酸−塩基の組合せを有する（および、したがって二つの開裂部位を含むものと疑われる）配列か、または酸−塩基の組合せを持たない配列は表から排除されている。酸−塩基の組合せを含み、かつ易切断性結合のＣ末端側のアミノ酸を含む６ｍｅｒが示される。ＥＫ開裂基質は易切断性結合の上流の３〜６アミノ酸によって定められるものとした。
【０１３８】
【表４】
2004503219.tif 000007
2004503219.tif 000008
【０１３９】
選択されたファージにおいて２つ以上現れる５種類の配列を下記表５に示す。興味深いことに、天然エンテロキナーゼ基質配列 （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ は１例だけが同定された（０５−Ｈ１１）。
【０１４０】
【表５】
2004503219.tif 000009
【０１４１】
表５に示される配列の各々をディスプレイするファージを、ファージＥＬＩＳＡを用いて、エンテロキナーゼ開裂の反応速度論について個別に試験した。ストレプトアビジン結合ファージを３０ｎＭまたは１３０ｎＭエンテロキナーゼのいずれかで３０分間処理した。ファージ放出の時間経過を図１（３０ｎＭ ＥＫで放出）および図２（１３０ｎＭ ＥＫで放出）に示す。選択されなかった基質ライブラリからのファージ、すなわち、単離体５−Ｆ０８（配列番号１９６）は対照として用いた。
【０１４２】
エンテロキナーゼ開裂の反応速度論は用いた２種類のエンテロキナーゼ濃度の間で異なっていた。３０ｎＭエンテロキナーゼの場合、１３０ｎＭエンテロキナーゼの場合には観察されなかったファージ放出の遅延が認められた。これは、放出を成功させるために酵素が１つのファージ上の３〜５コピーの基質ペプチドを切断することが必要となることに起因するであろう。
【０１４３】
各ファージ型のエンテロキナーゼ開裂速度の比較において、表５に示される単離体５−Ｈ０４（配列番号１８８）が最も容易に切断され、（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ 含有認識配列の５−Ｈ１１（配列番号１９４）の開裂速度は少なくとも３つの他の単離体、すなわち、５−Ａ０８（配列番号１３７）、５−Ｂ０５（配列番号１４５）および ５−Ｈ０４（配列番号１８８）よりも遅かった。
【０１４４】
（ｉｖ）好ましいエンテロキナーゼ開裂部位の比較分析
開裂の速度および程度に加えて予想開裂部位をさらに試験するため、表６に示される７つの試験ペプチドを化学合成し、エンテロキナーゼと接触させ、かつＨＰＬＣおよび質量分析によって分析した。
【０１４５】
【表６】
2004503219.tif 000010
【０１４６】
予想開裂部位、すなわち、酸−塩基ジペプチドモチーフに続く部位を試験するため、各試験ペプチドの６０〜１００μｇを２０Ｕの組換え軽鎖エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で完全に消化し（３６〜４８時間）、逆相ＨＰＬＣによって分析した。生成物ピークを水／アセトニトリル（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）勾配で溶出し、エレクトロスプレー質量分析によって同定した。この開裂試験の結果を表７に示す。
【０１４７】
【表７】
2004503219.tif 000011
【０１４８】
ＨＰＬＣはすべての消化が完全に行われたことを示した（まったく開裂されない陰性対照を除く）。「％ＡＣＮ」からは、Ｈ２Ｏ／アセトニトリル勾配中で所定の開裂断片が溶出される位置が推定される。ＧＤＤＤＤＫ（残基１−６、配列番号１９７）およびＮＫＡＫＤＲ（残基１−６、配列番号２０１）に対する予想生成物ピークはＨＰＬＣによっては検出されなかったが、開裂部位は代わりの生成物ピーク、すなわち、開裂部位のＣ末端側のペプチドの分析から決定することができた。
【０１４９】
これらの結果は、すべての場合において、ペプチド結合のエンテロキナーゼ触媒による加水分解が予想位置で生じることを示した（表６における矢印を参照）。陰性対照ペプチド（配列番号１９８）では開裂は生じなかった。
【０１５０】
（ｖ）開裂の相対速度
ペプチドをエンテロキナーゼで消化し、アリコートを時間設定された間隔でＨＰＬＣによって試験して開裂の程度を定量した。各試験ペプチドについて、約５００μＭのペプチドを５０ｎＭの組換え軽鎖エンテロキナーゼで消化した。７種の合成ペプチドを、開裂したときに蛍光が増加する蛍光脱離基を有する商業的に入手可能な標準ＥＫ開裂基質、ＧＤＤＤＤＫ−β−ナフチルアミン（ＧＤＤＤＤＫ−βＮＡ、配列番号２０３；ＢＡＣＨＥＭ、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡから）と比較した。基質開裂のモル速度を表８に示す。
【０１５１】
【表８】
2004503219.tif 000012
【０１５２】
ペプチド ＧＮＹＴＤＲＭＦＩ（配列番号１９９）および ＤＩＮＤＤＲＳＬＦ（配列番号２００）は、天然エンテロキナーゼ認識配列を含む２つの対照ペプチド、すなわち、ＧＤＤＤＤＫＩＹＶ（配列番号１９７）および ＧＤＤＤＤＫ−βＮＡ（配列番号２０３）よりもかなり迅速に開裂した。これら２つの対照ペプチドは、ほぼ等しい速度で、試験した残りの３つのペプチドよりも迅速に開裂した。
【０１５３】
（ｖｉ）参照ペプチドとの基質競合
基質加水分解の速度は幾つかの要素、すなわち、酵素および基質の濃度、Ｋｍ（ミカエリス定数）値、並びにＫｃａｔ（触媒速度定数）値に依存する。プロテアーゼが２つの基質（ａおよびｂ）を加水分解する際の相対効率を比較する方法の１つは、両基質を１つの反応系において酵素と共に同時にインキュベートし、各々の生成物形成の速度（ＶａおよびＶｂ）を測定することである。生成物形成の総量が少ない場合（＜１０％）、２つの競合基質の出発濃度は同じであって、反応は以下の定常状態で行われる：
Ｖａ／Ｖｂ＝（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）ａ／（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）ｂ
Ｋｃａｔ／Ｋｍの相対比率は基質加水分解の相対速度から決定することができる。
【０１５４】
エンテロキナーゼによる加水分解の相対効率を比較するため、参照ペプチド（ＧＤＤＤＤＫ−βＮＡ、２５０μＭ、配列番号２０３）を試験ペプチドのうちの１つ（２５０μＭ）と同時にインキュベートしてエンテロキナーゼで処理し、生成物形成の相対速度を測定した。生成物をＨＰＬＣによって定量し、初期開裂速度を算出した。表９は、各ペプチドの個々の開裂速度、および参照ペプチド開裂速度に対する試験ペプチド開裂速度の相対比率を示す。
【０１５５】
【表９】
2004503219.tif 000013
【０１５６】
これらの結果は、ペプチド Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号２０４）（ここで、易切断性結合がＡｒｇとＸａａとの間に存在し、かつＸａａはあらゆるアミノ酸、例えば、基質から切断されるポリペプチドの第１アミノ酸残基であり得る）がエンテロキナーゼによる開裂の優れた基質として機能することを示した。配列番号２０４を含む試験ペプチドの開裂速度は、５００μＭで個々に試験したとき、参照ペプチドの速度の３．１倍であった。比率Ｋｃａｔ／Ｋｍは、２５０μＭでの競合条件で試験したとき、参照ペプチドよりも３０倍大きかった。これらの結果は、さらに、基質ペプチド Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号２０５）を既知基質 （Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ より優れたものとして示している。配列番号２０５を含む試験ペプチドは、５００μＭで個別に試験したとき、参照ペプチドの速度の１．８倍であり、かつ比率Ｋｃａｔ／Ｋｍは、２５０μＭでの競合条件で試験したとき、参照ペプチドよりも３．５倍大きかった。
【０１５７】
（ｖｉｉ）易切断性結合のＣ末端側の残基の同定
発見されたＥＫ認識基質がＰ１’位、すなわち、そのＥＫ認識基質から切断されるポリペプチドのＮ末端となる位置に存在するアミノ酸の種類に対して優先性を示すかどうかを試験するため、追加の実験を行った。エンテロキナーゼによる最も効率的な開裂のため、ラウンド５単離体を選択した。Ｐ１’位に存在するどのようなアミノ酸がエンテロキナーゼによる最も効率的な開裂を促進するのかを決定することは有用ではあるが、エンテロキナーゼによる何らかの開裂を促進するＰ１’位に存在するアミノ酸を全て知ることも重要である。
【０１５８】
ファージ単離体のＤＮＡ配列決定は、Ａｓｐ−Ａｒｇ（ＤＲ）モチーフに続くＰ１’位に２０種のアミノ酸のうちの１６種を有するファージクローンを同定した。配列決定したそれらの単離体の中では、いかなる単離体においても、Ａｓｐ−Ａｒｇ に続くＰ１’位に以下の４種のアミノ酸だけは観察されなかった：Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、ＡｒｇおよびＣｙｓ（これらは、基質ファージ・ライブラリを作製したとき、１３ｍｅｒ可変部分において許容されなかった）。これらのアミノ酸がＰ１’位に存在するようないかなるファージ単離体も存在しないことは、Ｘａａ位置にＬｙｓ、Ｐｒｏ、ＡｒｇまたはＣｙｓを有する Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号２０４）のようなＥＫ認識配列が開裂されないことを意味するものではない。そうではなく、そのような認識配列は、Ｘａａ（Ｐ１’）位に他のアミノ酸を有する認識配列よりも開裂の効率が劣ることを示す。
【０１５９】
Ｐ１’残基の例をＥＫ開裂について試験するのにファージＥＬＩＳＡアッセイを用いた。易切断性結合（Ｐ２−Ｐ１）の前に Ａｓｐ−Ａｒｇ モチーフを示す、スクリーニングのラウンド２〜５から得られた１７の単離体を、エンテロキナーゼ開裂分析用に選択した。ファージをマイクロタイターウェル内に固定化したストレプトアビジンに結合させた後、１００ｎＭまたは３００ｎＭの組換え軽鎖エンテロキナーゼで３０分間処理した。各々の単離体について、エンテロキナーゼ処理の後に得られたＥＬＩＳＡシグナルをエンテロキナーゼ処理なしで得られたシグナルと比較した。次の３つの陰性対照を含めた：非選択基質ファージ・ライブラリ、開裂部位を含まない単離体５−Ｆ０８（配列番号１９６）、および多様化（１３ｍｅｒ）配列の代わりにトロンビン開裂部位を有する無関係であるが機能的なディスプレイ・ペプチドを伴うファージ。
【０１６０】
これらの結果は、１００ｎＭ濃度で、Ｐ１’位にＭｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ残基をディスプレイするファージはエンテロキナーゼ処理に対して最も高感受性であり、Ｐ１’位に残基Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ残基をディスプレイするファージは１００ｎＭエンテロキナーゼ処理に対する感受性に劣り、かつＰ１’位に残基Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、およびＴｙｒをディスプレイするファージはエンテロキナーゼ処理に対して最も抵抗性であることを示した。エンテロキナーゼ濃度を３００ｎＭに上昇させたとき、すべてのファージ単離体は容易に開裂した。
【０１６１】
好ましいＥＫ開裂配列を選択するため、スクリーニングのラウンド４および５から得た配列情報の分析を行い、易切断性結合の上流位置のアミノ酸に対する優先性を検出した。最も多数の群、すなわち、Ｐ２およびＰ１位に Ａｓｐ−Ａｒｇ モチーフを有する開裂配列については、あるアミノ酸配列が５以上の単離体において現れる場合にそのアミノ酸を該配列における所定位置に好ましいものと見なした。ファージ残基が所定位置に現れた場合、それはカウントしなかった。この分析から、好ましいＥＫ認識配列のファミリーは以下の式を有するものと定義された：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｘａａ５（配列番号２０６）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、もしくはＶａｌであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、もしくはＴｒｐであり；Ｘａａ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＴｈｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよい）。
【０１６２】
次に多い数の群、すなわち、Ｐ２およびＰ１位に Ｇｌｕ−Ａｒｇ モチーフを有する開裂配列については、あるアミノ酸が４以上の単離体において現れる場合にそのアミノ酸を該配列における所定位置に好ましいものと見なした。この分析から、好ましいＥＫ認識配列のファミリーは以下の式を有するものと定義された：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｘａａ５（配列番号２０７）
（ここで、Ｘａａ１は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、ＡｓｐもしくはＧｌｕであり；Ｘａａ２は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｖａｌであり；Ｘａａ３は存在するかまたは存在しないアミノ酸残基であり、存在する場合には、Ｔｙｒであり；Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＳｅｒであり；およびＸａａ５はいかなるアミノ酸残基であってもよい）。
【０１６３】
Ｐ２およびＰ１位に他の酸−塩基の組合せ、すなわち、Ａｓｐ−Ｌｙｓ および Ｇｌｕ−Ｌｙｓ を有するラウンド２〜４から得られた配列の分析では、上流位置Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５またはＰ６のいずれのおいてもいかなる優先性も示されなかった。
【０１６４】
前記説明に続いて、さらなるエンテロキナーゼ開裂配列を同定及び合成することができ、さらにそれを融合タンパク質の発現において使用することによりあらゆる目的タンパク質の精製を簡便化することができる。本明細書に説明される手順に従うことにより幾つかの新規開裂配列が発見され、さらに驚くべきことに天然ＥＫ認識配列である（Ａｓｐ）４−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号８）の数倍の開裂速度を示す２つの配列が試験された。さらなるＥＫ認識配列は、本明細書の教示に従って当業者に明らかになるであろう。例えば、本明細書に開示されるＥＫ開裂性認識配列にマイナーな改変を施すことにより、ＥＫ認識を喪失させることなく、かつ本発明の範囲を逸脱することなしに、合成の容易さまたは幾つかの他の特性を改善することができる。
【０１６５】
同様に、易切断性結合から遠位の位置（例えば、配列番号１のアミノ酸２−６または３−６または４−６に対応する配列）での置換による好ましいＥＫ認識配列の消失は、それらの配列を含む融合タンパク質のＥＫ開裂の特異性および速度は上に開示される好ましい配列よりも大きく劣るかもしれないが、ＥＫ認識配列として機能することが予想される。
【０１６６】
説明した実施形態および構成要件のさらなる置換、改変および変形は、上述されるか、または添付の請求の範囲によって定義される発明から逸脱することなしに為し得ることは当業者に理解されるであろう。
【０１６７】
本明細書で引用される刊行物は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、３０ｎＭ組換え軽鎖エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いるエンテロキナーゼ開裂を示す。
【図２】
図２は、１３０ｎＭ組換え軽鎖エンテロキナーゼを用いるエンテロキナーゼ開裂を示す。
【図１】
2004503219.tif 000014
【図２】
2004503219.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004503219.tif 000016
2004503219.tif 000017
2004503219.tif 000018
2004503219.tif 000019
2004503219.tif 000020
2004503219.tif 000021
2004503219.tif 000022
2004503219.tif 000023
2004503219.tif 000024
2004503219.tif 000025
2004503219.tif 000026
2004503219.tif 000027
2004503219.tif 000028
2004503219.tif 000029
2004503219.tif 000030
2004503219.tif 000031
2004503219.tif 000032
2004503219.tif 000033
2004503219.tif 000034
2004503219.tif 000035
2004503219.tif 000036
2004503219.tif 000037
2004503219.tif 000038
2004503219.tif 000039
2004503219.tif 000040
2004503219.tif 000041
2004503219.tif 000042
2004503219.tif 000043
2004503219.tif 000044
2004503219.tif 000045
2004503219.tif 000046
2004503219.tif 000047
2004503219.tif 000048
2004503219.tif 000049
2004503219.tif 000050
2004503219.tif 000051
2004503219.tif 000052
2004503219.tif 000053
2004503219.tif 000054
2004503219.tif 000055
2004503219.tif 000056
2004503219.tif 000057
2004503219.tif 000058
2004503219.tif 000059
2004503219.tif 000060
2004503219.tif 000061
2004503219.tif 000062
2004503219.tif 000063
2004503219.tif 000064
2004503219.tif 000065
2004503219.tif 000066
2004503219.tif 000067
2004503219.tif 000068
2004503219.tif 000069
2004503219.tif 000070
2004503219.tif 000071
2004503219.tif 000072
2004503219.tif 000073
2004503219.tif 000074
2004503219.tif 000075
2004503219.tif 000076
2004503219.tif 000077
2004503219.tif 000078
2004503219.tif 000079
2004503219.tif 000080
2004503219.tif 000081
2004503219.tif 000082
2004503219.tif 000083
2004503219.tif 000084
2004503219.tif 000085
2004503219.tif 000086
2004503219.tif 000087
2004503219.tif 000088
2004503219.tif 000089
2004503219.tif 000090
2004503219.tif 000091
2004503219.tif 000092
2004503219.tif 000093
2004503219.tif 000094
2004503219.tif 000095
2004503219.tif 000096
2004503219.tif 000097
2004503219.tif 000098
2004503219.tif 000099
2004503219.tif 000100
2004503219.tif 000101
2004503219.tif 000102
2004503219.tif 000103
2004503219.tif 000104
2004503219.tif 000105
2004503219.tif 000106
2004503219.tif 000107
2004503219.tif 000108
2004503219.tif 000109
2004503219.tif 000110
2004503219.tif 000111
2004503219.tif 000112
2004503219.tif 000113
2004503219.tif 000114
2004503219.tif 000115
2004503219.tif 000116
2004503219.tif 000117
2004503219.tif 000118
2004503219.tif 000119
2004503219.tif 000120
2004503219.tif 000121
2004503219.tif 000122
2004503219.tif 000123
2004503219.tif 000124
2004503219.tif 000125
2004503219.tif 000126
2004503219.tif 000127
2004503219.tif 000128
2004503219.tif 000129
2004503219.tif 000130
2004503219.tif 000131
2004503219.tif 000132
2004503219.tif 000133
2004503219.tif 000134
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503219.tif 000135
【国際調査報告】
2004503219.tif 000136
2004503219.tif 000137
2004503219.tif 000138
2004503219.tif 000139
2004503219.tif 000140
2004503219.tif 000141
2004503219.tif 000142