(57)【要約】本発明は幹細胞を含有する液体中に存在する微生物を不活性化させる方法に関し、本方法には前記液体を光増感剤と混合して光増感剤を活性化させる工程が含まれる。本発明によると、所定の構造を有する正に帯電した光増感剤が用いられる。驚くべきことに、この化合物を使用することで幹細胞の損傷は大幅に低減される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−幹細胞を含有する液体を光増感剤と混合する工程、ならびに
−光増感剤を活性化させる工程
を含む、該液体中に存在する微生物を不活性化させる方法であって、光増感剤として、式Ｉａ〜Ｉｄ
【化１】
2004510448.tif 000008
【化２】
2004510448.tif 000009
【化３】
2004510448.tif 000010
【化４】
2004510448.tif 000011
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、
−水素、
−ハロゲン原子、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアシル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアシルオキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニル（これらのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてこれらのそれぞれは、
−ヒドロキシル、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルおよび−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６（Ｒ５は（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、そしてＲ６は（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキルであり、そしてｍおよびｎは独立して１〜１０であり、このアミノ基のそれぞれの置換基は直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてこれらのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）から選ばれる一つから三つの基で置換されていてもよいアミノ、
−ニトリル、および
−ハロゲン原子、
から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
−（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリール基および（Ｃ６〜Ｃ２０）の複素環式アリール基（これらのそれぞれは、
−ヒドロキシル、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる一つから三つの基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されていてもよいアミノ、
−ニトリル、
−ハロゲン原子、および
−（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ１０）のアルケニル、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選ばれる少なくとも一つの原子を含む複素環式アリール基（Ｐ、ＮまたはＳは（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる基で置換されていてもよく、そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
からなる群より独立して選ばれ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の基の少なくとも一つは第四級窒素原子を含み、そしてＸは薬学的に許容され得る対イオンである。〕
を備える化合物からなる群より選ばれる化合物を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも一つが、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されている窒素原子を含む（Ｃ６〜Ｃ２０）の複素環式アリール基であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複素環式アリール基がピリジニウム基であり、その中の窒素が（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキル基で置換されていることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも一つが、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる一つから三つの基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されていてもよいアミノで置換されている（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリール基であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アリール基が、アルキルが独立して（Ｃ１〜Ｃ３）のアルキルであるところのトリアルキルアミノフェニル基であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも二つが第四級窒素原子を含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの三つが第四級窒素原子を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、
−幹細胞を含有する液体を光増感剤と混合する工程、および
−光増感剤を活性化させる工程
を含む、当該液体中に存在する微生物を不活性化させる方法に関する。
【０００２】
幹細胞は、例えば、移植目的のためのおよび化学療法薬による介入後のための所望の型の細胞を生育させるためにますます利用されている。幹細胞の主要な供給源は臍帯である。幹細胞を含有する溶液は、ウイルス（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）、真菌および細菌などの種々の微生物で汚染されているかもしれない。臍帯血サンプルの１０％には汚染が見られる（未発表データ、発表のために提出中）。これにより、所望の目的のための臍帯血サンプルの利用が大幅に制限を受けるか、または除外されることさえある。
【０００３】
血漿、赤血球、血小板、白血球および骨髄などの血液産物に存在する生物体を不活性化させることは知られている。例えば、米国特許第５，３６０，７３４号には、光増感剤を血液産物に添加し、光を照射して光増感剤を活性化させ、それによってウイルス性病原物質を不活性化させる工程を含む方法が記載されている。このような方法によって細胞は損傷を受け、これは、例えば赤血球の溶血によって実証される。米国特許第５，３６０，７３４号に開示される方法は特に血漿タンパク質の影響を対象とし、そして赤血球を安定させるために、この方法によって血漿タンパク質の影響を軽減する。幹細胞の使用目的を考えれば、この細胞の損傷を極力避けるべきである。
【０００４】
本発明の目的は、幹細胞の損傷を最小限に抑えつつ、幹細胞を含有する液体中の微生物を不活性化させる方法を提供することにある。
したがって、本発明は、光増感剤として、式Ｉａ〜Ｉｄ
【０００５】
【化５】
2004510448.tif 000002
【０００６】
【化６】
2004510448.tif 000003
【０００７】
【化７】
2004510448.tif 000004
【０００８】
【化８】
2004510448.tif 000005
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、
−水素、
−ハロゲン原子、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアシル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアシルオキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニル（これらのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてこれらのそれぞれは、
−ヒドロキシル、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルおよび−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６（Ｒ５は（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、そしてＲ６は（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキルであり、そしてｍおよびｎは独立して１〜１０であり、このアミノ基のそれぞれの置換基は直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてこれらのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）から選ばれる一つから三つの基で置換されていてもよいアミノ、
−ニトリル、および
−ハロゲン原子、
から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
−（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリール基および（Ｃ６〜Ｃ２０）の複素環式アリール基（これらのそれぞれは、
−ヒドロキシル、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる一つから三つの基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されていてもよいアミノ、
−ニトリル、
−ハロゲン原子、および
−（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ１０）のアルケニル、Ｎ、Ｏ、ＰおよびＳから選ばれる少なくとも一つの原子を含む複素環式アリール基（Ｐ、ＮまたはＳは（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる基で置換されていてもよく、そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
からなる群より独立して選ばれ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の基の少なくとも一つは第四級窒素原子を含み、そしてＸは薬学的に許容され得る対イオンである。〕
を備える化合物からなる群より選ばれる化合物を用いることを特徴とする、序文に記載されている方法に関するものである。
【０００９】
驚くべきことに、（例えば、ＰＣＴ／ＮＬ９９／００３８７号に開示されるように）たとえ保護剤が存在しなくても、上記に開示されるような光増感性化合物を用いることによって、幹細胞の損傷が避けられることが知られている。このことは大きな驚きである。というのは、光線力学的処理などによって白血球が有意に影響を受けることが分かっているからである。特に、異質遺伝子的刺激に対する白血球の応答は大幅に減少し、さらには存在する抗原に対する白血球の能力も悪影響を受ける。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４が脂肪族基である場合、一般的に短鎖、例えば１〜６個の原子を持つものが好ましい。
【００１０】
本発明においては、幹細胞を含有する液体について言及する場合、「液体」という用語は、少なくとも幹細胞を含有するあらゆる水溶液として理解されるべきである。他の細胞型は９９．９９５％まで存在していてもよく、すなわち臍帯血でもよい。赤血球を除いた溶液などの幹細胞を多くした溶液を用いることが有利であり、このような溶液は通常、０．５〜３％の幹細胞を含有することになる。もちろん、幹細胞をさらに多くした溶液を用いることも可能である。この溶液が水溶液である限り、本技術において一般的に認識されているようなタンパク質様成分、塩、安定剤を含有していてもよい。
【００１１】
「光増感剤」という用語は、本技術において十分に認識されているように、光エネルギーを吸収し、その結果として光増感剤が活性化されるという物質である。活性化された光増感剤はその次に、他の化合物と反応することが可能である。これにより、光増感剤が修飾を受けるかまたは不活性化するかもしれないものの、その中で光増感剤が再度用いられることが可能である光触媒サイクルを形成するために、光増感剤がもともとの（光で活性化される前の）状態に戻る傾向の方がより強い。事実上、吸収される光エネルギーが微生物の不活性化に用いられる。
【００１２】
「微生物」という用語は、ウイルス粒子だけでなく、あらゆる単細胞生物を意味すると理解される。単細胞生物の例としては、例えば細菌など、具体的にはシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ）などの原核生物、および例えばクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）や酵母など、具体的にはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）などの真核生物が挙げられる。
【００１３】
「ウイルス粒子」という用語は、一本鎖または二本鎖であって、細胞膜、あるいはタンパク質様の皮膜を有し、そして幹細胞を含有する液体中に存在するかもしれないあらゆるＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスを意味すると理解される。具体例としては、ＨＩＶウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスが挙げられる。
【００１４】
「薬学的に許容され得る対イオン」という用語は、例えば、ＯＨ−、Ｃｌ−、酢酸イオンまたはクエン酸イオンなどの陰電荷を帯びたあらゆる無機のまたは有機の対イオンを意味すると理解される。実際の活性化合物Ｉの陽電荷を中和するのに必要な量と同量の対イオンＸが存在することは、言うまでもない。
【００１５】
第一の態様によれば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも一つが、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されている窒素原子を含む（Ｃ６〜Ｃ２０）の複素環式アリール基である。複素環式アリール基がピリジニウム基であり、その中の窒素が（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキル基で置換されていることが好ましい。
【００１６】
第二の態様によれば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも一つが、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる一つから三つの基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されていてもよいアミノで置換されている（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリール基である。アリール基が、アルキルが独立して（Ｃ１〜Ｃ３）のアルキルであるところのトリアルキルアミノフェニル基であることが好ましい。
【００１７】
上記に規定された基の中の第四級窒素原子が、幹細胞を完全な状態で維持する一方で、ウイルス粒子、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を除去するのに非常に適していることが分かっている。
【００１８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも二つが第四級窒素原子を含むことが好ましく、そしてＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの三つが第四級窒素原子を含むことがより好ましい。このような化合物が、最も好ましい結果を与えるようである。
【００１９】
さて、模範的な態様および図面に言及することによって本発明を説明する。ここで、
実施例
幹細胞
新鮮な臍帯血から、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）を用いて幹細胞を沈降させて単離した（ペルーテリ・ピー（Ｐｅｒｕｔｅｌｌｉ　Ｐ．）ら、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ．　７６　（４）　ｐｐ　２３７−４０　（１９９９）；アドルノ・ジー（Ａｄｏｒｎｏ　Ｇ．）ら、Ｃｌｉｎ．　Ｌａｂ．　Ｈａｅｍａｔｏｌ．　２０　（６）　ｐｐ　３４１−３　（１９９８））。全自動血球計数装置（Ｓｙｓｍｅｘ　Ｋ１０００、東亞医用電子社、神戸市、日本）を用いて測定すると、得られた溶液は１ｍＬあたり２０×１０６個の細胞を含んでいた。
シュードモナスで汚染された幹細胞を含有する溶液の光線力学的処理
臍帯血中に見出される種々の汚染微生物のうちで、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が最も不活性化が困難であることが分かったので、この微生物を用いて光線力学的不活性化を実証する。
【００２０】
スパイクの容量がその溶液の全容量の１０％未満となるように、かつ細菌数が約１０５／ｍＬとなるように、幹細胞溶液にシュードモナス・アエルギノーサの原液を添加した。増感剤のモノフェニル−トリ（Ｎ−メチル−４−ピリジル）ポルフィリンクロリド（ＴｒｉＰ（４）、ミッドセンチュリー社（Ｍｉｄ−Ｃｅｎｔｕｒｙ）、ポーゼン、イリノイ州、アメリカ合衆国）を、終濃度が２５μＭとなるように添加した。この懸濁液を完全に混合し、直径が６ｃｍのポリスチレン培養皿（グライナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ）、アルフェン・アーン・デン・ライン、オランダ）中に３ｍＬのアリコットに分け、そして、横軸型レシプロシェーカー（６０サイクル／分、ジーエフエル社（ＧＦＬ）、ブルグベーデル、ドイツ）上で５分間、暗所にて室温で撹拌した。これらの皿（一つの時点あたり一枚）を、３００Ｗのハロゲンランプ（フィリップス社（Ｐｈｉｌｉｐｓ）、アイントホーベン、オランダ）にて上方から照射した。光を１ｃｍの水のフィルターに通過させることで、サンプルの温度上昇を防いだ。６００ｎｍを超える波長の光のみを透過するカットオフフィルターを、すべての実験において用いた。ＳＥＬ０３３検出器が具備されているＩＬ１４００Ａ光度計（インターナショナル・ライト社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｇｈｔ）、ニューベリーポート、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）で測定すると、細胞層における放射照度は３５ｍＷ／ｃｍ２であった。次のパラメーターが測定された。
【００２１】
−シュードモナス・アエルギノーサの不活性化、および
−幹細胞の生存の程度
−（ｃｆｕ−ｅ、ｂｆｕ−ｅ、ｃｆｕ−ｍ、ｃｆｕ−ｇｍおよびｃｆｕ−ｇｅｍで判断されるとおりの）幹細胞の分化に与える本処理の影響
図１は、この処理の間に細菌が効率良く死滅したことを示す。
【００２２】
図２は、ＣＤ３４陽性細胞（幹細胞）の生存の程度がコントロール実験（照射なし、増感剤なし）についての許容誤差の範囲内にあることを示す。
図３は、幹細胞の分化に関する種々のテストの結果を示す（メガカルト−シー（ＭｅｇａＣｕｌｔ−Ｃ）技術マニュアル（第３．０．３版、１９９９年３月、ステムセル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、バンクーバー、カナダ）の中のヒト巨核球前駆細胞およびマウス巨核球前駆細胞の定量化のための評価に記載のとおりに測定される。）。要するに、幹細胞を含有する５０００個の白血球をペトリ皿上で培養する。図３に示されるこのデータは、一つの血液サンプルに由来する細胞についてのものである。さらに表１は、四つの血液サンプルについてのデータを示し、そして表２は、五つの血球サンプルの平均を示し、図３にグラフとして描かれている結果を確認している。これらの結果から、この実験において、細胞を保護するという本技術の状況で開示されたさらなる測定法を行うことができないという事実にかかわらず、幹細胞の分化に与える本処理の影響は有意ではないことが示される。
【００２３】
【表１】
2004510448.tif 000006
【００２４】
【表２】
2004510448.tif 000007
図２および図３の実験において、照射の継続時間は１時間であった。
ＶＳＶの不活性化
ＶＳＶの五つのログ（ｌｏｇ）を１ｍＬの幹細胞産物に添加し、その後、このものを５０μＭのシルセンス（Ｓｙｌｓｅｎｓ）の存在下で、１０ｍＷ／ｃｍ２で照射した。
【００２５】
光線力学的処理の後で、２％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭでサンプルを１０倍に希釈し、１０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離処理に付した。この上清を（ＰＣＴ／ＮＬ９９／００３８７号に記載されているように）ウイルスの測定に使用する。
【００２６】
コロニー測定または細菌の不活性化について既述したようにして、幹細胞濃縮物を調製した。
この図４に示されるプロトコルに続けて、ＶＳＶの五つのログを容易に死滅に至らせることができた。
【００２７】
（略語）
ＣＦＵ−Ｅ
赤芽球コロニー形成細胞は、１〜２個のクラスターの中に８〜２００個の赤芽球を産生する。それぞれのクラスターは少なくとも８個の赤芽球を含有しているはずであり、最も小さくかつ最も急速に成熟する赤血球系コロニーを生じさせる始原体と言及されて記録される。
【００２８】
ＢＦＵ−Ｅ
赤芽球バースト形成細胞は三つのより小さいクラスターか、または一つの大きなクラスターを産生する。これには、２００個を超える赤芽球と、１６のより個性的な細胞および１００００のより個性的な細胞を含有する極めて大きいが純粋な赤芽球コロニーとが含まれる。
【００２９】
これはＣＦＵ−Ｅよりも前段階のクラスの赤血球前駆細胞であり、ＣＦＵ−Ｅが産生する赤芽球コロニーよりも大きな複数個のクラスターの赤芽球コロニーを生じさせることができるという、より高い増殖能力を有する。
【００３０】
成熟したＢＦはＣＦＵ−Ｅの直近の前駆体であり、３〜８個の間のクラスターを含有する。
初期のＢＦＵ−Ｅは、９個以上の赤芽球のクラスターを生じさせるこれらの始原体である。ＣＦＵ−ＥとＢＦＵ−Ｅとを区別することが困難であることから、本明細書ではこれらをひとまとめに扱って、ＣＦＵ−Ｅと示している。
【００３１】
ＣＦＵ−Ｇ
２０を超える細胞を含有する顆粒球のクローン原性始原体。
【００３２】
ＣＦＵ−Ｍ
中央部に集中した核を有するマクロファージを２０細胞を超えて含有するマクロファージのクローン原性始原体は、非常に巨大になる可能性がある。
【００３３】
ＣＦＵ−ＧＭ
顆粒球−マクロファージ前駆細胞は２０以上の顆粒球およびマクロファージを産生する。
【００３４】
ＣＦＵ−ＧＥＭ
顆粒球・赤芽球・マクロファージ・巨核球前駆細胞は２０以上の細胞を産生する。
【００３５】
白血球の条件培地中で少なくとも１８日間生育させた後、または組み換え型成長因子を用いる場合は１４〜１６日後に、このようなコロニーを評価することが最も好ましい。後者のケースにおいて、複数の系統のコロニーを記録する場合は特別の注意を払う必要がある。少数の顆粒球、マクロファージ、および／または巨核球が、ヘモグロビン化赤血球系細胞の球状の塊の周囲に出現するかもしれない。高出力下で試験を行わない場合、このタイプの複数の系統のコロニーを混じりけのない赤芽球コロニーとして誤って記録する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】幹細胞を含有する溶液から細菌が効率良く除去されていることを示す。
【図２】処理前後の幹細胞の生存の程度を示す。
【図３】非処理細胞と比較しての幹細胞の分化に与える影響を示す棒グラフを表す。
【図４】水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の除去を示す。
【図１】
2004510448.tif 000012
【図２】
2004510448.tif 000013
【図３】
2004510448.tif 000014
【図４】
2004510448.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004510448.tif 000016
2004510448.tif 000017
2004510448.tif 000018
2004510448.tif 000019
2004510448.tif 000020
2004510448.tif 000021
2004510448.tif 000022
2004510448.tif 000023
2004510448.tif 000024
2004510448.tif 000025
2004510448.tif 000026
2004510448.tif 000027
2004510448.tif 000028
2004510448.tif 000029
2004510448.tif 000030
2004510448.tif 000031
2004510448.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成14年9月17日(2002.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【書類名】明細書
【発明の名称】幹細胞を含有する液体中の微生物を不活性化させる方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】−幹細胞を含有する液体を光増感剤と混合する工程、ならびに
−光増感剤を活性化させる工程
を含む、該液体中に存在する微生物を不活性化させる方法であって、光増感剤として、式Ｉ
【化１】
2004510448.tif 000033
〔式中、Ｒ１は、
−水素、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアシル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアシルオキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニル（これらのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてこれらのそれぞれは、
−ヒドロキシル、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルおよび−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６（Ｒ５は（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、そしてＲ６は（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキルであり、そしてｍおよびｎは独立して１〜１０であり、このアミノ基のそれぞれの置換基は直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてこれらのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）から選ばれる一つから三つの基で置換されていてもよいアミノ、
−ニトリル、および
−ハロゲン原子、
から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
−（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリール基および（Ｃ６〜Ｃ２０）の複素環式アリール基（これらのそれぞれは、
−ヒドロキシル、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる一つから三つの基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されていてもよいアミノ、
−ニトリル、
−ハロゲン原子、および
−（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ１０）のアルケニル
から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
からなる群より選ばれ、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、ピリジニウム基であり、その中の窒素が（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキル基で置換され、そしてＸは薬学的に許容され得る対イオンである。〕
を備える化合物を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】Ｒ１が、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる一つから三つの基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されていてもよいアミノで置換されている（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリール基であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】アリール基が、アルキルが独立して（Ｃ１〜Ｃ３）のアルキルであるところのトリアルキルアミノフェニル基であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】光増感剤は、モノフェニル−トリ（Ｎ−メチル−４−ピリジル）ポルフィリンクロリドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、
−幹細胞を含有する液体を光増感剤と混合する工程、および
−光増感剤を活性化させる工程
を含む、当該液体中に存在する微生物を不活性化させる方法に関する。
【０００２】
幹細胞は、例えば、移植目的のためのおよび化学療法薬による介入後のための所望の型の細胞を生育させるためにますます利用されている。幹細胞の主要な供給源は臍帯である。幹細胞を含有する溶液は、ウイルス（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）、真菌および細菌などの種々の微生物で汚染されているかもしれない。臍帯血サンプルの１０％には汚染が見られる（未発表データ、発表のために提出中）。これにより、所望の目的のための臍帯血サンプルの利用が大幅に制限を受けるか、または除外されることさえある。
【０００３】
血漿、赤血球、血小板、白血球および骨髄などの血液産物に存在する生物体を不活性化させることは知られている。例えば、米国特許第５，３６０，７３４号には、光増感剤を血液産物に添加し、光を照射して光増感剤を活性化させ、それによってウイルス性病原物質を不活性化させる工程を含む方法が記載されている。このような方法によって細胞は損傷を受け、これは、例えば赤血球の溶血によって実証される。米国特許第５，３６０，７３４号に開示される方法は特に血漿タンパク質の影響を対象とし、そして赤血球を安定させるために、この方法によって血漿タンパク質の影響を軽減する。幹細胞の使用目的を考えれば、この細胞の損傷を極力避けるべきである。
【０００４】
本発明の目的は、幹細胞の損傷を最小限に抑えつつ、幹細胞を含有する液体中の微生物を不活性化させる方法を提供することにある。
したがって、本発明は、光増感剤として、式Ｉ
【０００５】
【化５】
2004510448.tif 000034
〔式中、Ｒ１は、
−水素、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアシル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアシルオキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニル（これらのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてこれらのそれぞれは、
−ヒドロキシル、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルおよび−（Ｒ５−Ｚ）ｍ−Ｒ６（Ｒ５は（ＣＨ２）ｎであり、ＺはＯまたはＳであり、そしてＲ６は（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキルであり、そしてｍおよびｎは独立して１〜１０であり、このアミノ基のそれぞれの置換基は直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてこれらのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）から選ばれる一つから三つの基で置換されていてもよいアミノ、
−ニトリル、および
−ハロゲン原子、
から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
−（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリール基および（Ｃ６〜Ｃ２０）の複素環式アリール基（これらのそれぞれは、
−ヒドロキシル、
−（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる一つから三つの基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されていてもよいアミノ、
−ニトリル、
−ハロゲン原子、および
−（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ１０）のアルケニル
から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）
からなる群より選ばれ、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、ピリジニウム基であり、その中の窒素が（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキル基で置換され、そしてＸは薬学的に許容され得る対イオンである。〕
を備える化合物を用いることを特徴とする、序文に記載されている方法に関するものである。
【０００６】
驚くべきことに、（例えば、ＰＣＴ／ＮＬ９９／００３８７号に開示されるように）たとえ保護剤が存在しなくても、上記に開示されるような光増感性化合物を用いることによって、幹細胞の損傷が避けられることが知られている。このことは大きな驚きである。というのは、光線力学的処理などによって白血球が有意に影響を受けることが分かっているからである。特に、異質遺伝子的刺激に対する白血球の応答は大幅に減少し、さらには存在する抗原に対する白血球の能力も悪影響を受ける。Ｒ１が脂肪族基である場合、一般的に短鎖、例えば１〜６個の原子を持つものが好ましい。
【０００７】
本発明においては、幹細胞を含有する液体について言及する場合、「液体」という用語は、少なくとも幹細胞を含有するあらゆる水溶液として理解されるべきである。他の細胞型は９９．９９５％まで存在していてもよく、すなわち臍帯血でもよい。赤血球を除いた溶液などの幹細胞を多くした溶液を用いることが有利であり、このような溶液は通常、０．５〜３％の幹細胞を含有することになる。もちろん、幹細胞をさらに多くした溶液を用いることも可能である。この溶液が水溶液である限り、本技術において一般的に認識されているようなタンパク質様成分、塩、安定剤を含有していてもよい。
【０００８】
「光増感剤」という用語は、本技術において十分に認識されているように、光エネルギーを吸収し、その結果として光増感剤が活性化されるという物質である。活性化された光増感剤はその次に、他の化合物と反応することが可能である。これにより、光増感剤が修飾を受けるかまたは不活性化するかもしれないものの、その中で光増感剤が再度用いられることが可能である光触媒サイクルを形成するために、光増感剤がもともとの（光で活性化される前の）状態に戻る傾向の方がより強い。事実上、吸収される光エネルギーが微生物の不活性化に用いられる。
【０００９】
「微生物」という用語は、ウイルス粒子だけでなく、あらゆる単細胞生物を意味すると理解される。単細胞生物の例としては、例えば細菌など、具体的にはシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ）などの原核生物、および例えばクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）や酵母など、具体的にはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）などの真核生物が挙げられる。
【００１０】
「ウイルス粒子」という用語は、一本鎖または二本鎖であって、細胞膜、あるいはタンパク質様の皮膜を有し、そして幹細胞を含有する液体中に存在するかもしれないあらゆるＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスを意味すると理解される。具体例としては、ＨＩＶウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスが挙げられる。
【００１１】
「薬学的に許容され得る対イオン」という用語は、例えば、ＯＨ−、Ｃｌ−、酢酸イオンまたはクエン酸イオンなどの陰電荷を帯びたあらゆる無機のまたは有機の対イオンを意味すると理解される。実際の活性化合物Ｉの陽電荷を中和するのに必要な量と同量の対イオンＸが存在することは、言うまでもない。
【００１２】
第一の態様によれば、少なくともＲ１が、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシおよび（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルキニルから選ばれる一つから三つの基（そのそれぞれは直鎖でも分岐鎖でもよく、そしてそのそれぞれはヒドロキシルおよびハロゲン原子から選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい）で置換されていてもよいアミノで置換されている（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリール基である。アリール基が、アルキルが独立して（Ｃ１〜Ｃ３）のアルキルであるところのトリアルキルアミノフェニル基であることが好ましい。
【００１３】
上記に規定された基の中の第四級窒素原子が、幹細胞を完全な状態で維持する一方で、ウイルス粒子、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を除去するのに非常に適していることが分かっている。
【００１４】
さて、模範的な態様および図面に言及することによって本発明を説明する。ここで、
実施例
幹細胞
新鮮な臍帯血から、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）を用いて幹細胞を沈降させて単離した（ペルーテリ・ピー（Ｐｅｒｕｔｅｌｌｉ　Ｐ．）ら、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ．　７６　（４）　ｐｐ　２３７−４０　（１９９９）；アドルノ・ジー（Ａｄｏｒｎｏ　Ｇ．）ら、Ｃｌｉｎ．　Ｌａｂ．　Ｈａｅｍａｔｏｌ．　２０　（６）　ｐｐ　３４１−３　（１９９８））。全自動血球計数装置（Ｓｙｓｍｅｘ　Ｋ１０００、東亞医用電子社、神戸市、日本）を用いて測定すると、得られた溶液は１ｍＬあたり２０×１０６個の細胞を含んでいた。
シュードモナスで汚染された幹細胞を含有する溶液の光線力学的処理
臍帯血中に見出される種々の汚染微生物のうちで、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が最も不活性化が困難であることが分かったので、この微生物を用いて光線力学的不活性化を実証する。
【００１５】
スパイクの容量がその溶液の全容量の１０％未満となるように、かつ細菌数が約１０５／ｍＬとなるように、幹細胞溶液にシュードモナス・アエルギノーサの原液を添加した。増感剤のモノフェニル−トリ（Ｎ−メチル−４−ピリジル）ポルフィリンクロリド（ＴｒｉＰ（４）、ミッドセンチュリー社（Ｍｉｄ−Ｃｅｎｔｕｒｙ）、ポーゼン、イリノイ州、アメリカ合衆国）を、終濃度が２５μＭとなるように添加した。この懸濁液を完全に混合し、直径が６ｃｍのポリスチレン培養皿（グライナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ）、アルフェン・アーン・デン・ライン、オランダ）中に３ｍＬのアリコットに分け、そして、横軸型レシプロシェーカー（６０サイクル／分、ジーエフエル社（ＧＦＬ）、ブルグベーデル、ドイツ）上で５分間、暗所にて室温で撹拌した。これらの皿（一つの時点あたり一枚）を、３００Ｗのハロゲンランプ（フィリップス社（Ｐｈｉｌｉｐｓ）、アイントホーベン、オランダ）にて上方から照射した。光を１ｃｍの水のフィルターに通過させることで、サンプルの温度上昇を防いだ。６００ｎｍを超える波長の光のみを透過するカットオフフィルターを、すべての実験において用いた。ＳＥＬ０３３検出器が具備されているＩＬ１４００Ａ光度計（インターナショナル・ライト社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｇｈｔ）、ニューベリーポート、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）で測定すると、細胞層における放射照度は３５ｍＷ／ｃｍ２であった。次のパラメーターが測定された。
【００１６】
−シュードモナス・アエルギノーサの不活性化、および
−幹細胞の生存の程度
−（ｃｆｕ−ｅ、ｂｆｕ−ｅ、ｃｆｕ−ｍ、ｃｆｕ−ｇｍおよびｃｆｕ−ｇｅｍで判断されるとおりの）幹細胞の分化に与える本処理の影響
図１は、この処理の間に細菌が効率良く死滅したことを示す。
【００１７】
図２は、ＣＤ３４陽性細胞（幹細胞）の生存の程度がコントロール実験（照射なし、増感剤なし）についての許容誤差の範囲内にあることを示す。
図３は、幹細胞の分化に関する種々のテストの結果を示す（メガカルト−シー（ＭｅｇａＣｕｌｔ−Ｃ）技術マニュアル（第３．０．３版、１９９９年３月、ステムセル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、バンクーバー、カナダ）の中のヒト巨核球前駆細胞およびマウス巨核球前駆細胞の定量化のための評価に記載のとおりに測定される。）。要するに、幹細胞を含有する５０００個の白血球をペトリ皿上で培養する。図３に示されるこのデータは、一つの血液サンプルに由来する細胞についてのものである。さらに表１は、四つの血液サンプルについてのデータを示し、そして表２は、五つの血球サンプルの平均を示し、図３にグラフとして描かれている結果を確認している。これらの結果から、この実験において、細胞を保護するという本技術の状況で開示されたさらなる測定法を行うことができないという事実にかかわらず、幹細胞の分化に与える本処理の影響は有意ではないことが示される。
【００１８】
【表１】
2004510448.tif 000035
【００１９】
【表２】
2004510448.tif 000036
図２および図３の実験において、照射の継続時間は１時間であった。
ＶＳＶの不活性化
ＶＳＶの五つのログ（ｌｏｇ）を１ｍＬの幹細胞産物に添加し、その後、このものを５０μＭのシルセンス（Ｓｙｌｓｅｎｓ）の存在下で、１０ｍＷ／ｃｍ２で照射した。
【００２０】
光線力学的処理の後で、２％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭでサンプルを１０倍に希釈し、１０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離処理に付した。この上清を（ＰＣＴ／ＮＬ９９／００３８７号に記載されているように）ウイルスの測定に使用する。
【００２１】
コロニー測定または細菌の不活性化について既述したようにして、幹細胞濃縮物を調製した。
この図４に示されるプロトコルに続けて、ＶＳＶの五つのログを容易に死滅に至らせることができた。
【００２２】
（略語）
ＣＦＵ−Ｅ
赤芽球コロニー形成細胞は、１〜２個のクラスターの中に８〜２００個の赤芽球を産生する。それぞれのクラスターは少なくとも８個の赤芽球を含有しているはずであり、最も小さくかつ最も急速に成熟する赤血球系コロニーを生じさせる始原体と言及されて記録される。
【００２３】
ＢＦＵ−Ｅ
赤芽球バースト形成細胞は三つのより小さいクラスターか、または一つの大きなクラスターを産生する。これには、２００個を超える赤芽球と、１６のより個性的な細胞および１００００のより個性的な細胞を含有する極めて大きいが純粋な赤芽球コロニーとが含まれる。
【００２４】
これはＣＦＵ−Ｅよりも前段階のクラスの赤血球前駆細胞であり、ＣＦＵ−Ｅが産生する赤芽球コロニーよりも大きな複数個のクラスターの赤芽球コロニーを生じさせることができるという、より高い増殖能力を有する。
【００２５】
成熟したＢＦはＣＦＵ−Ｅの直近の前駆体であり、３〜８個の間のクラスターを含有する。
初期のＢＦＵ−Ｅは、９個以上の赤芽球のクラスターを生じさせるこれらの始原体である。ＣＦＵ−ＥとＢＦＵ−Ｅとを区別することが困難であることから、本明細書ではこれらをひとまとめに扱って、ＣＦＵ−Ｅと示している。
【００２６】
ＣＦＵ−Ｇ
２０を超える細胞を含有する顆粒球のクローン原性始原体。
【００２７】
ＣＦＵ−Ｍ
中央部に集中した核を有するマクロファージを２０細胞を超えて含有するマクロファージのクローン原性始原体は、非常に巨大になる可能性がある。
【００２８】
ＣＦＵ−ＧＭ
顆粒球−マクロファージ前駆細胞は２０以上の顆粒球およびマクロファージを産生する。
【００２９】
ＣＦＵ−ＧＥＭ
顆粒球・赤芽球・マクロファージ・巨核球前駆細胞は２０以上の細胞を産生する。
【００３０】
白血球の条件培地中で少なくとも１８日間生育させた後、または組み換え型成長因子を用いる場合は１４〜１６日後に、このようなコロニーを評価することが最も好ましい。後者のケースにおいて、複数の系統のコロニーを記録する場合は特別の注意を払う必要がある。少数の顆粒球、マクロファージ、および／または巨核球が、ヘモグロビン化赤血球系細胞の球状の塊の周囲に出現するかもしれない。高出力下で試験を行わない場合、このタイプの複数の系統のコロニーを混じりけのない赤芽球コロニーとして誤って記録する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】幹細胞を含有する溶液から細菌が効率良く除去されていることを示す。
【図２】処理前後の幹細胞の生存の程度を示す。
【図３】非処理細胞と比較しての幹細胞の分化に与える影響を示す棒グラフを表す。
【図４】水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の除去を示す。
【国際調査報告】
2004510448.tif 000037
2004510448.tif 000038
2004510448.tif 000039