(57)【要約】本発明は、少なくとも一つのフェニルアルキルカルボン酸誘導体と組合せまたは複合した少なくとも一つのポリマーを含有する医薬組成物、少なくとも一つのフェニルアルキルカルボン酸誘導体との新規な複合ポリマーおよびとりわけ癌治療におけるそれらの用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞−媒介性免疫反応を抑制する医薬品を生産するための、少なくとも１つの麻疹ウイルスの核タンパク質、あるいは該核タンパク質の約１００〜１３０アミノ酸Ｃ末端領域の全てまたは一部を含むフラグメントを含むタンパク質の調製品の使用。
【請求項２】
上記フラグメントが、様々な麻疹ウイルスの核タンパク質の間で保存されているＣ末端領域の少なくとも１つの配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記フラグメントが、：
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸４１１〜４２１、または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント；
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸４８９〜５０６、または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント；
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸５１６〜６２５、または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント
から選択されることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記タンパク質の調製品が、麻疹ウイルスのエンベロープ糖タンパク質ＦおよびＨからもなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
前記医薬品が、炎症性の病状の予防または治療用であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６】
前記医薬品が、アレルギー性接触皮膚炎の予防または治療用であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬品が、移植拒絶反応または移植片対宿主疾患の予防または治療用であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
前記調製品に存在する前記麻疹ウイルスのＮＰタンパク質の量を測定することを含むことを特徴とする、麻疹ウイルスの調製品の潜在的な免疫抑制能力の評価方法。
【請求項９】
前記調製品を、前記ＮＰタンパク質に対する少なくとも１つの抗体、および好ましくはタンパク質の約１１０アミノ酸Ｃ末端領域で担持されているエピトープに対する少なくとも１つの抗体と接触させること、ならびに形成される抗体／抗原複合体を定量することを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
麻疹ウイルスのタンパク質の調製品の潜在的な免疫抑制能力を評価するためのＤＮＦＢまたはＫＬＨで感作されるマウスの使用。
【請求項１１】
上記マウスが、ＣＤ４６受容体を発現するトランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ワクチン製造のため、核タンパク質の１１０〜１３０アミノ酸Ｃ末端領域が欠失または変更され、上記Ｎ末端領域の少なくとも１つの配列が様々な麻疹ウイルスの間で保存されている麻疹ウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、麻疹ウイルス由来の免疫抑制剤に関するものである。
【０００２】
パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属は、特に麻疹ウイルス（ＭＶ） 、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、牛疫ウイルスおよび小型反芻動物ウイルス（ｐｅｓｔ ｄｅｓ ｐｅｔｉｔｅｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ）（ＰＰＲＶ）を含む。それらは、厳密な感染親和性を示す。例えば、麻疹ウイルスは、ヒトおよびいくつかの大型サルの種にのみ感染する。
【０００３】
麻疹ウイルスは、エンベロープウイルスである。天然のリポタンパク質であるウイルスエンベロープは、２つの糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）および２つのサブユニットＦ１およびＦ２からなる融合（Ｆ）タンパク質を含む。ＨＡタンパク質は、ウイルスの宿主細胞受容体への結合に関与する。ヒトで、ＭＶ受容体は、少なくともワクチン用菌株の場合、赤血球を除く全ての細胞で発現されるＣＤ４６膜糖タンパク質として同定されている。
【０００４】
ネガティブな状態の１本鎖ＲＮＡからなるウイルスゲノムは、ヌクレオカプシド、らせん状のリボ核タンパク質粒子で保護されている。ヌクレオカプシドは、３つのタンパク質：ウイルス性ＲＮＡと直接結合する核タンパク質（ＮＰ）、並びにＲＮＡとも結合する他の２つのタンパク質、ウイルスゲノムの複製および転写に関わるリンタンパク質（Ｐ）およびＬタンパク質からなる。エンベロープ−ヌクレオカプシド集合体の凝集は、ヌクレオカプシドおよびウイルスエンベロープの界面に位置するマトリックスタンパク質（Ｍ）にて供給される。
【０００５】
ＭＶの感染で起こる免疫抑制作用の存在は、長い間公知であった。それは、１９０８年にＶＯＮ ＰＩＲＱＵＥＴによって最初に記載され、彼らは、麻疹に罹っている患者の大多数が、ツベルクリン試験で遅延過敏性皮膚反応の強度の過渡的な減少を示すと報告した［ＶＯＮ ＰＩＲＱＵＥＴ、Ｄｅｓｃｈ．Ｍｅｄ、Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、３０、１２９７〜１３００、（１９０８）］。以来、これらの免疫抑制作用は、他の研究者らによって確認され［ＴＡＭＡＳＨＩＲＯら；Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ、６、４５１〜４５４（１９８７）；ＢＥＣＫＦＯＲＤら、Ｓ．Ａｆｒ．Ｍｅｄ．Ｊ、６８、ｎｏ．１２、８５８〜８６３（１９８５）；ＨＩＲＳＣＨら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ、３１、１〜１２、（１９８４）］、そして、二次感染の進行を促進することで、それらがＭＶの感染に続く死の主要な原因を構成することを確認した。
【０００６】
加えて、この免疫抑制は、程度は弱いものの、生きた麻疹ウイルスの弱毒株を使用する麻疹予防接種の場合でも観察された［ＦＩＲＥＭＡＮら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、４３、２６４〜２７２（１９６９）；ＷＥＩＳＳ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８、５４６〜５４７、（１９９２）；ＨＵＳＳＥＹら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ、１７３、１３２０〜１３２６、（１９９６）；ＢＯＵＣＨＡＵＤ ｅｔ Ｍｏｕａｓ、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎｅ、１４９、ｎｏ．６、３５１〜３６０、（１９９８）］。
【０００７】
ＭＶの病原性菌株またはワクチン菌株に感染した患者の循環血液由来のＴリンパ球は、分裂促進因子、アレルゲンまたは追加免疫抗原に対して増幅させる能力の減少を示すことが観察された［ＣＯＯＶＡＤＩＡら、Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ、５３、ｎｏ．１１、８６１〜８６７（１９７８）；ＨＩＲＳＨら、上記参照；ＢＯＲＲＯＷおよびＯＬＤＳＴＯＮＥ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９１、８５〜１００（１９９５）；ＨＵＳＳＥＹら、上記参照］。
【０００８】
麻疹ウイルス属、および特にＭＶの免疫抑制作用を指令する機構は、未だにあまり理解されていない。事実、研究しやすい実験動物のモデルを欠いているため、これらの機構に関する殆どの知見は、インビトロでなされている。
この結果、ＭＶがマクロファージ［ＥＳＯＬＥＮら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６９、ｎｏ．６、３９５５〜３９５８（１９９５）］、胸腺上皮細胞［ＶＡＬＥＮＴＩＮら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、ｎｏ．３、２２１２〜２２２１（１９９９）］ 、および単核細胞由来［ＦＵＧＩＥＲ−ＶＩＶＩＥＲら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１８６、ｎｏ．６、８１３〜８１２（１９９７）；ＳＣＨＮＯＲＲら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、ｎｏ．１０、５３２６〜５３３３１（１９９７）］または臍帯血由来［ＧＲＯＳＪＥＡＮら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１８６、ｎｏ．６、８０１〜８１２（１９９７）］の樹状細胞のような感染した免疫細胞のアポトーシス、および分裂促進因子に対するリンパ組織増殖性反応の欠失、ならびにＧ０／Ｇ１期でＴリンパ球の細胞周期の停止［ＭｃＣＨＥＳＮＥＹら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４０、ｎｏ．４、１２６９〜１２７３（１９８８）；ＮＡＮＩＣＨＥら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３、ｎｏ．３、１８９４〜１９０１（１９９９）］によって死を誘発することが観察された。インビトロで感染したＢリンパ球による抗体の生産の抑制は、Ｔリンパ球および抗原−提示細胞によりサイトカイン生産の撹乱が観察されたように［ＧＲＩＦＦＩＮ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９１、１１７〜１３４（１９９５）；ＬＥＯＰＡＲＤＩら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ、１４９、ｎｏ．７、２３９７〜２４０１（１９９２）］観察されている［ＧＡＬＡＭＡら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏ、５０、ｎｏ．２、４０５〜４１５（１９８０）；ＣＡＳＡＬＩら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１５９、ｎｏ．５、１３２２〜１３３７（１９８４）］。
【０００９】
これら様々な作用に関与するウイルス成分は、未だ理解が乏しいままである。
ＳＣＨＬＥＮＤＥＲら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、ｎｏ．２３、１３１９４〜１３１９９（１９９６）］およびＮＩＥＷＩＥＳＫら［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７１、７２１４〜７２１９（１９９７）］は、ＭＶまたはＵＶ−不活化ＭＶ（ＭＶ−ＵＶ）がインビトロで分裂促進因子−誘導性Ｔリンパ球増殖の欠失を誘導すると報告している；この作用は、エンベロープタンパク質ＨおよびＦを伴うと考えられている。
【００１０】
ＵＶ−不活化ＭＶとＣＤ ４６分子との相互作用は、単核細胞によるＩＬ−１２分泌を抑制することも観察されている ［ＫＡＲＰら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３、ｎｏ．５２７２、２２８２３１、（１９９６）］。
最終的に、ＲＡＶＡＮＥＬら［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１８６、２６９〜２７８（１９９７）］は、ＮＰタンパク質がその免疫グロブリン生産を抑制することで、Ｂリンパ球の機能に影響を及ぼすと報告している［ＲＡＶＡＮＥＬら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１８６、ｎｏ．２、２６９〜２７８（１９９７）］。
【００１１】
それゆえ、麻疹ウイルスの免疫抑制作用の現在利用可能な知見は、未だ大変断片的なものである。加えて、単離した細胞集団でのインビトロの研究から主に得られる利用可能な結果は、免疫反応を生じる生理学的な相互作用の複雑性について不完全な概念を与えるに過ぎない。
【００１２】
麻疹ウイルス−誘導性免疫抑制に関与する機構のより完全な知見は、特に新規な免疫抑制治療法を得たり、あるいは免疫抑制作用を欠失しているか、または減弱した免疫抑制作用を示すにすぎない麻疹ウイルスワクチンを製造することを可能にしうる。
【００１３】
ここで、本発明者らは、麻疹ウイルス−誘導性免疫抑制を研究するため、マウス実験モデルを開発した。
【００１４】
この結果、ウイルス複製物が全く存在しないときでさえも、２つの異なるモデル：
１）ＣＤ ８−依存接触過敏性の抑制；
２）ＣＤ ４−依存ツベルクリン型遅延過敏性の抑制
によって、麻疹ウイルスタンパク質が細胞−媒介性免疫反応（ＧＥＬＬおよびＣＯＯＭＢＳ分類法に従ったＩＶ型反応）の抑制を誘導するのが観察できた。
【００１５】
また、驚くことに、細胞媒介性免疫反応のこの抑制は、ＮＰタンパク質、より特にこのタンパク質の約１２５ Ｃ末端アミノ酸に相当する領域を主に伴い、そして、それがＣＤ ４６細胞受容体の関与を必要としないことも認められた。しかし、エンベロープ糖タンパク質ＦおよびＨならびにＣＤ ４６受容体も免疫抑制作用を増大させる。
【００１６】
本発者らは、麻疹ウイルスがそれらの天然の宿主とは異なる宿主で免疫抑制を誘導できることも観察し、これらのウイルスで誘導される免疫抑制を指令する機構が種特異的でないことを示した。
【００１７】
本発明の対象は、細胞−媒介性免疫反応を抑制する医薬品を生産するための少なくとも１つの麻疹ウイルスの核タンパク質、あるいは上記核タンパク質の約１００〜１３０アミノ酸Ｃ末端領域の全てまたは一部を含むそれらのフラグメントを含むタンパク質の調製品の使用である。
【００１８】
本発明の１つの具体例によれば、上記のフラグメントは、様々な麻疹ウイルスの核タンパク質の間、ならびに特に麻疹ウイルスＭＶ、ＣＤＶおよびＰＰＲＶの核タンパク質の間で保存されている上記Ｃ末端領域の少なくとも１つの配列を含む。
【００１９】
Ｃ末端領域は、核タンパク質の部分を示し、それらについては、配列がある麻疹ウイルスから別のウイルスに最も分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｓ）しているが、それにもかかわらず、この領域内に幾つかの非常に保存された部分がある（例えば、ＤＩＡＬＬＯら［Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、７５、２３３〜２３７、（１９９４）］を参照）。
【００２０】
本発明に従って使用できる保存された部分に相当する上記Ｃ末端領域のフラグメントの中で、特に、：
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸４１１〜４２１または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント；
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸４８９〜５０６または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント；
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸５１６〜６２５または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント
が挙げられるであろう。
【００２１】
上で示した部分は、ＤＩＡＬＬＯら［上記参照］にて公表された配列のアミノ酸の番号付けを引用している。
有利には、本発明に従って使用できるタンパク質の調製品は、麻疹ウイルスのエンベロープ糖タンパク質ＦおよびＨをも含む。
本発明に従って使用できる調製品は、例えば、特に紫外線処理による麻疹ウイルス不活化で得られる；それは、タンパク質または上記のそれらのフラグメントを使って得てもよい。
【００２２】
本発明に従って使用できる麻疹ウイルスタンパク質およびそれらのフラグメントも、それら自体は公知である；それらは、従来法、例えばウイルス培養物からの精製、あるいは有利には遺伝子工学またはペプチド合成にて製造されてもよい。
【００２３】
麻疹ウイルスタンパク質の調製品で誘導される細胞−媒介性免疫の抑制は、抗炎症剤の多量投与での治療で生じるものか、またはデクサメタゾンのような強力な免疫抑制剤を基にしたものに匹敵する。
【００２４】
本発明は、細胞−媒介性免疫反応の抑制が望ましい総ての病状の予防または治療の状況において実施されてもよい。例えば、特に病原因子での感染で生じる炎症性の病状（ハンセン病、結核病、リーシュマニア症、リステリア症、カンジダ症など）、または様々な感作因子にて誘導されるアレルギー性接触皮膚炎が挙げられるであろう。それは、移植拒絶または移植片対宿主疾患の予防あるいは治療で実践されてもよい。
【００２５】
本発明は、新規なワクチン、特に、免疫抑制作用を欠くか、または減弱された免疫抑制作用を有する麻疹ワクチンの開発の状況で使用できる。特に、これらのワクチンは、核タンパク質の総ての部分、特に上記核タンパク質の約１１０〜１３０アミノ酸Ｃ末端領域が欠失または変更している麻疹ウイルスから得てもよい。それは、特に、様々な麻疹ウイルスの間で保存されている少なくとも１つの配列で１つ以上の修飾、および／または上記保存されている配列の１つ以上の欠失によって、変更されてもよい。有利には、上記修飾または上記欠失は、先に言及した配列４１１〜４２１、４８９〜５０６または５１６〜６２５の少なくとも１つと関係している。
【００２６】
本発明の対象は、麻疹ウイルスの調製品、例えば麻疹ウイルスワクチンまたは本発明に従った免疫抑制剤として使用できる調製品の潜在的な免疫抑制能力を評価する方法でもある。
【００２７】
本発明の最初の変形によれば、上記の潜在的な免疫抑制能力は、上記調製品に存在する上記麻疹ウイルスのＮＰタンパク質の量を測定することで評価される。
【００２８】
この最初の変形の好ましい具体例によれば、上記方法は、上記調製品を上記ＮＰタンパク質に対する少なくとも１つの抗体、および好ましくは上記ＮＰタンパク質の約１１０アミノ酸Ｃ末端領域にて担持されるエピトープに対する少なくとも１つの抗体と接触させること、ならびに、それ自体が当業者に公知のあらゆる適切な手段にて形成される抗体／抗原複合体を定量することを含む。
【００２９】
本発明の最初の変形によれば、上記の潜在的な免疫抑制能力は、ＤＮＦＢまたはＫＬＨに感作したマウスを用いて評価される。
有利には、特に麻疹ウイルスエンベロープタンパク質ＨおよびＦを含む調製品の潜在的な免疫抑制能力を評価するため、上記マウスは、ＣＤ ４６受容体を発現するトランスジェニックマウスである。ＣＤ ４６受容体を発現するトランスジェニックマウスは、それ自体公知である；それらは、例えば、ＴＨＯＲＬＥＹら［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ、２７、７２６〜７３４（１９９７）］またはＥＶＬＡＳＨＥＶら［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７４、１３７３〜１３８２（２０００）］に記載されているようにして得てもよい。
【００３０】
本発明は、遅延過敏性反応における様々な麻疹ウイルス調製品のインビトロのマウスのモデルでの抑制作用を例示する非限定的な実施例に言及する以下の記載からより明らかに理解されるであろう。
【００３１】
実施例１：ＵＶ−不活化麻疹ウイルスによるマウスの遅延過敏性反応の抑制
細胞−媒介性免疫反応におけるＵＶ−不活化麻疹ウイルスの作用は、インビボのマウスで、遅延過敏性の２つの側面： ＤＮＦＢに対する接触過敏性およびツベルクリン型過敏性を示すＫＬＨに対する遅延過敏性を表すモデルを用いて試験した。
７〜１１週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＩＦＦＡ ＣＲＥＤＯ）を、これらの実験に使った。
Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ ＭＶ（ＡＴＣＣ ＶＲ−２４）、および対照として他のパラミクソウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ、Ａ菌株長群）を使った。ウイルスをサル腎臓繊維芽細胞（Ｖｅｒｏ）で個別に増殖させた。細胞の５０％が細胞変性様相を呈したときに行われる細胞の機械的な溶菌後、感染性ウイルス粒子を含む細胞溶解物を−８０℃で凍結させ、そして解凍し、そして遠心分離し、最後に−８０℃で貯蔵した。ウイルスの各々のバッチを、４℃で４５分間ＵＶ露光（２５４ｎｍ）して不活化させた。感染特性の喪失を、Ｖｅｒｏ細胞で試験した。
感染していないＶｅｒｏ細胞培養物の上清からなる「ダミー」の調製品を対照として使った。
ＭＶの腹膜内注射を、野生型マウスまたはＣＤ ４６分子を発現するトランスジェニックマウスのいずれかに行った。
様々な調製品を、ＵＶ露光にて不活化したＲＳＶ（ＲＳＶ−ＵＶ）について５×１０６個のウイルス粒子、およびＵＶ露光にて不活化したＭＶ（ＭＶ−ＵＶ）について１０６個または５×１０６個のウイルス粒子の割合で、マウスの腹膜腔（ＩＰ）に注射した（注射容量：５００μｌ）。
【００３２】
ＤＮＦＢ接触過敏性試験
ＤＮＦＢ（２，４−ジニトロフルオロベンゼン、ＳＩＧＭＡ）を、使用直前に、アセトン、オリーブオイル（４：１）で希釈した。ＤＮＦＢ接触過敏性（ＣＨＳ）反応を、ＧＡＲＲＩＧＵＥら［Ｃｏｎｔａｃｔ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、３０、ｎｏ．４、２３１〜２３７（１９９４）］に従って、記載のようにして生じさせた。ウイルス調製品またはダミー調製品の注射６時間後、２４μｌの０．５％ＤＮＦＢ溶液を、予め剃った２ｃｍ２以上の腹部皮膚に塗った。５日後、感作した動物、および対照群からの非感作動物に、右耳の各々の表面に亘って１０μｌのＤＮＦＢの非刺激剤溶液、および左耳に亘って１０μｌのアセトン−オリーブオイル溶液を散布した。耳の厚みを、塗布前および塗布後の各々の日に測微計（ＪＨ１５；Ｂｅｌｌ ＳＡ、Ｆｒａｎｃｅ）を使って測定した。耳の浮腫を次の式：［（Ｔ−Ｔ０）右耳］−［ （Ｔ−Ｔ０）左耳］（ＴおよびＴ０は、それぞれ顕在化前後の耳の厚みの値である）を使って算出する。
【００３３】
結果を図１（ａ）に示し、それらは、塗布後の様々な時間での耳の浮腫の大きさ平均を表している。
図１（ａ）の凡例：
▲：ＲＳＶ−ＵＶ
●：５×１０６個のＭＶ−ＵＶ
□：１０６個のＭＶ−ＵＶ
○：ダミー調製品
△：非感作マウス
【００３４】
ＫＬＨ遅延過敏性試験
遅延過敏性を、肉趾浮腫を測定する従来試験を使って測定した。ウイルス調製品またはダミー調製品の注射６時間後、マウスを、完全フロイントアジュバンド中で乳化した３００μｇのＫＨＬ（キーホールリンペットヘモシアニン、ＳＩＧＭＡ）の皮下注射で感作させた。７日後、２回目の注射（ＰＢＳバッファー中１５０μｇのＫＬＨ）を、感作させた動物、および対照群からの非感作動物の左足の肉趾に施した；右足にＰＢＳのみを注射した。肉趾の厚みを、増強注射後２４時間前および４８時間後に測定した。肉趾浮腫を次の式：［（Ｔ−Ｔ０）右肉趾］−［ （Ｔ−Ｔ０）左肉趾］ （ＴおよびＴ０は、それぞれ増強注射前後の肉趾の厚みの値である）を使って算出する。
【００３５】
結果を図１（ｂ）に示し、それらは、増強注射後２４時間の肉趾浮腫の平均の大きさを表している。
図１（ｂ）の凡例：
陰影棒：ダミー調製品
黒色棒：５×１０６個のＭＶ−ＵＶ
灰色棒：１０６個のＭＶ−ＵＶ
白色棒：非感作マウス
【００３６】
これらの結果は、ＭＶ−ＵＶを注射したマウスが接触過敏性またはツベルクリン型過敏性のいずれかに関わらず、ダミー調製品を注射した対照マウスの約１／２未満の遅延過敏性反応を生じることを示している。
同様な条件下で、ＲＳＶ−ＵＶを注射した対照マウスは、ダミー調製品を注射した対照マウスと同等の遅延過敏性反応を生じる。
それゆえ、ＭＶは、あらゆるウイルス複製物なしにインビボで免疫抑制を誘導する。
【００３７】
実施例２：マウスの遅延過敏性反応の抑制における麻疹ウイルス核タンパク質（ＮＰ）の役割
マウスで、ＭＶ−ＵＶで誘導される免疫抑制作用のＮＰの寄与を研究するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＦｃγＲ受容体を欠いたマウス（ＦｃγＲＵＵ−／−×ＦｃγＲ−／−；０００５８５６ＭＭ；ＴＡＣＯＮＩＣ、ＵＳＡ）に、精製した組み換えＮＰを腹腔内に注射した。
組み換え核タンパク質を、次のプロトコルに従って製造した：
スポドプテラ　フラギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ） ｓｆ−９細胞に、細胞あたり１ ＰＦＵの割合で、ＭＶ ＮＰのコード配列を含む組み換えバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶＮＰ）を感染させた。３日間の培養後、細胞を遠心分離（２５０ｇ、５分間、４℃）にて収集し、そして細胞生産物をＰＢＳバッファーにて洗浄した。さらに、細胞を低張バッファー（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭ ＮａＣｌ）に置き、そして非イオン洗浄剤、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を加えて溶解させた。劣化の問題を避けるため、プロテアーゼ抑制剤を細胞溶解時に加え、そして溶解物を４℃に保った。核を除去するため、溶解物を１０００ｇで遠心分離し、１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で超遠心分離（１０００ｇ、１０分）を行い、そして細胞残骸を除去した。 回収した上清を、ＳＷ４１ローター（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用い、ＣｓＣｌ中で１２℃、３６００ｒｐｍで２時間遠心分離した。この勾配は、２ｍｌの４０％ ＣｓＣｌ（Ｗ／Ｖ）、２ｍｌの３０％ ＣｓＣｌ 、２ｍｌの２５％ ＣｓＣｌ 、および２ｍｌの５％サッカロース（Ｗ／Ｖ）の工程で構成される。３０％密度のＣｓＣｌで目視できるバンドを形成するＮＰを引き上げて回収し、ＰＢＳで希釈し、そして３６００ｒｐｍで２時間遠心分離した。最終ペレットをＰＢＳに再懸濁した。各バッチを、タンパク質アッセイ（ＢＡＣ Ｋｉｔ ＰＩＥＲＣＥ）、アクリルアミドゲルおよびウエスタンブロッティングにて試験した。
各実験について、１００μｇのＮＰ、５×１０６個のＭＶ−ＵＶ粒子または５００μｌのダミー調製品を、上記実施例１に記載のプロトコルに従ってマウスの腹膜腔に注射した。　そして、これらの動物を、上記実施例１に記載のように、ＤＮＦＢまたはＫＬＨに感作させた。
【００３８】
結果を図２（ａ）〜２（ｄ）で示す。
図２（ａ）：Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
●：５×１０６個のＭＶ−ＵＶ
◆：組み換えＮＰ
○：ダミー調製品
△：非感作マウス
図２（ｂ）：ＦｃγＲ−／−マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
●：５×１０６個の ＭＶ−ＵＶ
◆：組み換えＮＰ
○：ダミー調製品
△：非感作マウス
図２（ｃ）：Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＫＬＨ過敏性試験
図２（ｄ）：ＦｃγＲ−／−マウスのＫＬＨ過敏性試験
【００３９】
ダミー調製品を注射したマウスがＤＮＦＢ過敏性反応に特有な浮腫を呈する一方で、ＮＰは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでＭＶ−ＵＶにより生じるのと同様なＤＮＦＢに対する過敏性反応の抑制を誘導する。高濃度のＮＰで行った追加実験は、この作用が用量依存的であることを示している；４０μｇのＮＰの注射で誘導される抑制は、１００μｇの注射後に観察されるものより僅かに弱く、さらに４μｇのＮＰの注射後では、抑制は観察されない。
ＫＬＨ過敏性反応の場合、ＮＰで誘導される抑制は、僅かに強いが、ＭＶ−ＵＶで誘導されるものに匹敵する。
一方、ＦｃγＲを欠いたマウスで、ＮＰまたはＭＶ−ＵＶの免疫抑制作用は、ＤＮＦＢ過敏性反応の場合には観察されない。ＫＬＨ過敏性反応の場合、ＮＰでの免疫抑制作用は観察されず、ＭＶ−ＵＶでの弱い免疫抑制作用が観察される。
【００４０】
実施例３：マウスの遅延過敏性反応の抑制における麻疹ウイルスエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＦの役割
マウスで誘導される免疫抑制でＭＶエンベロープタンパク質の役割を解析するため、エンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＦを欠いた組み換え麻疹ウイルスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＣＤ４６分子を発現するトランスジェニックマウスのいずれかで使った。
ＣＤ４６のトランスジェニックのマウスを、ＣＤ４６プロモーターの制御下で、イソ型ＣＤ４６ ＢＣ Ｃｙｔ−１の分子をエンコードするヒト遺伝子のＣＤＮＡをマウス卵母細胞に注射することで作製した。これらのマウスは、Ｈ−２ｂ遺伝的背景で、偏在してＣＤ４６分子を発現する［ＴＨＯＲＬＥＹら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２７、７２６〜７３４（１９９７）］。
Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎタグ（ＥＤタグ）ＭＶは、全ゲノムの分子クローニングによるＥｄｏｍｏｎｓｔｏｎ菌株由来の組み換えＭＶである［ＴＯＢＥＲら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７２、ｎｏ．１０、８１２４〜８１３２（１９９８）］。ＭＧＶ ＭＶは、エンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＦを欠いた組み換えＭＶである［ＳＰＩＥＬＨＯＦＥＲら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７２、ｎｏ．３、２１５０〜２１５９（１９９８）］。
ＭＶ菌株を、上記実施例１に記載のプロトコルに従って、増殖させ、収穫し、そしてＵＶ−不活化した。
各実験について、５×１０６個の ＭＶ−ＵＶ、ＥＤタグ−ＵＶまたはＭＧＶ−ＵＶの粒子あるいは５００μｌのダミー調製品を、実施例１に記載のプロトコルに従って、マウスの腹膜腔に注射した。
そして、動物を実施例１に記載のようにＤＮＦＢに感作させた。
【００４１】
結果を、ＣＤ５７ＢＬ／６マウスについて図３（ａ） 、およびＣＤ４６のトランスジェニックマウスについて３（ｂ）に示す。
図３（ａ）および３（ｂ）の凡例：
●：ＭＶ−ＵＶ
□：ＥＤタグ−ＵＶ
■：ＭＧＶ−ＵＶ
○：ダミー調製品
△：非感作マウス
【００４２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＭＧＶ−ＵＶの注射を受けたＣＤ４６のトランスジェニックマウスで、同等な強度の抑制作用を観察した。両者の場合、この作用は、１００μｇの精製したＮＰの注射での結果に匹敵する （結果は示していない）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスで、ＭＧＶ−ＵＶの抑制作用は、ＭＶ−ＵＶまたは対照組み換えウイルスＥＤタグ−ＵＶによって生じたものにも匹敵する。
一方、ＣＤ４６のトランスジェニックマウスで、ＭＶ−ＵＶおよびＥＤタグ−ＵＶの抑制作用は、ＣＨＳ反応ＤＮＦＢの抑制でＭＧＶ−ＵＶの作用よりも大きい。ＭＶ−ＵＶまたはＥＤタグ−ＵＶの注射が浮腫の形成を完全に抑制するのに対し、ＭＧＶ−ＵＶの注射は、浮腫の局所的な抑制のみを誘導する。
これらの結果は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質ＨおよびＦが過敏性反応の抑制の誘導には必須ではないものの、ＣＤ４６受容体の存在下で、それらは、この反応が完全に抑制されるまで、免疫抑制作用を増大させることができることを示している。
ウイルス調製品の注射後２週間目にＤＮＦＢでの感作を行う更なる実験を行った。これらの条件下で、糖タンパク質ＨおよびＦを含むウイルス調製品について、過敏性反応に対する抑制作用を観察したところ、ＣＤ４６のトランスジェニックマウスの場合、この受容体の発現がウイルスタンパク質の免疫抑制作用の持続期間を増大できることが示された。
【００４３】
実施例４：ハプテンに特異的なリンパ球の細胞毒性活性（ＣＬＴＬＳ）におけるＵＶ不活性麻疹ウイルスの作用
感作後に誘導される細胞毒性活性を解析するため、ＭＶ−ＵＶまたはＮＰを注射した、あるいは注射していない、およびＤＮＦＢに感作したＣ５７ＢＬ／６マウスならびにＣＤ４６のトランスジェニックマウスの脾臓細胞をＤＮＢＳ（２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸：ＳＩＧＭＡ）に結合するＥＬ４標的細胞の溶解能力について試験した。
各実験について、１００μｇのＮＰ、５×１０６個のＭＶ−ＵＶ粒子または５００μｌのダミー調製品をマウスの腹膜腔に注射し、そして、上記実施例１に記載のプロトコルに従って動物をＤＮＦＢに感作させた。
【００４４】
各動物の脾臓を除去し、そして細胞懸濁液を焼結ガラスのスライドの間で臓器を磨り潰して製造した。脾細胞を洗浄し、赤血球細胞を０．８３％ ＮＨ４Ｃｌの存在下で３７℃で５分間溶解させた。
脾細胞を同様な方法でナイーブなマウスの脾臓から単離し、そして１５００ ｒａｄで照射し、ＡＰＣの役割を働かせるため、４ｍＭのＤＮＢＳ溶液で培養してハプテンを付加した。
感作したマウスの脾細胞およびハプテンを付加した脾細胞を、ｍｌあたり２×１０６個の細胞の割合で、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳで同時に培養した。５日間培養した後、ＡＰＣの存在下で培養により再度刺激した脾細胞は、試験用のエフェクター集団を構成する。
【００４５】
標的細胞として作用するＥＬ−４細胞（ｍｌあたり１０６個の細胞）を、トリチュウム化チミジン（培養培地のｍｌあたり１０μＣｉで３７℃、３時間）の存在下でＰＲＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳで培養し、そしてＰＲＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳで２回洗浄した。そして、上記に記載のように、トリチウム標識したＥＬ−４細胞の一部にＤＮＢＳを付加した。標的細胞を、穴あたり２×１０４個の細胞の割合で、９６−穴プレートに分配した。エフェクター細胞も、標的／エフェクター率の減少に応じて、同一の穴に分配した。対照穴（自発的な溶解）は、標的細胞のみを含む。４時間同時に培養した後、細胞をフィルターに移し、分あたりのカウント数を液体シンチレーション （ＷＡＬＬＡＣ計数器）の存在下で計測した。
細胞毒性％を式：
細胞毒性％＝１００（Ｓ−Ｅ）／Ｓ
［Ｓは、自発的な溶解（エフェクター細胞がないトリチウム化およびハプテン化したＥＬ−４）に相当し、Ｅは、実験的な溶解（エフェクター細胞の存在下でトリチウム化およびハプテン化したＥＬ−４）に相当する］ を使って測定する。
【００４６】
結果を、図４（ａ）〜４（ｃ）に示す。
図４（ａ）：ＭＶ−ＵＶを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの細胞の細胞毒性活性
◆：ＭＶ−ＵＶ
■：ダミー調製品
図４（ｂ）：組み換えＮＰを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
●：組み換えＮＰ
■：ダミー調製品
図４（ｃ）：ＭＶ−ＵＶを注射したＣ４６マウスのＫＬＨ過敏性試験
◆：ＭＶ−ＵＶ
■：ダミー調製品
図４Ａおよび４Ｂで示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＭＶ−ＵＶまたはＮＰの注射は、対照マウス（ダミー調製品）の場合と比べてＣＴＬ活性に影響を与えない。一方、ＭＶ−ＵＶの注射は、トランスジェニックＣＤ４６マウス起源のリンパ球のＣＴＬ活性を著しく抑制する（ｐ＜０．０５）（図４Ｃ）。
それゆえ、このＣＴＬ活性の欠如は、ＣＤ４６分子の発現に依存しているようである。
【００４７】
実施例５：ハプテンに特異的なＣＤ８ Ｔリンパ球の増殖におけるＵＶ−不活化麻疹ウイルスおよびＮＰの作用
ＣＤ８ Ｔリンパ球（ＣＤ８ＬＴ）がＤＮＦＢに対する接触過敏性に関与するエフェクター集団を構成するため［ＫＥＨＲＥＮら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１８９、ｎｏ．５、７７９〜７８６（１９９９）］、ＤＮＦＢに対するＣＳＨ反応の抑制がＭＶ−ＵＶおよびＮＰで誘導されるかどうかの疑問は、感作期の間にＣＤ８ＬＴの活性の欠如が研究されるという結果であった。実験を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＣＤ４６分子を発現するトランスジェニックマウス、またはＦｃγＲ受容体を欠いたマウスで行った。
各実験について、上記実施例１に記載のプロトコルに従って、１００μｇのＮＰ、５×１０６個のＭＶ−ＵＶの粒子、５００μｌのダミー調製品または５００μｌのＰＢＳバッファーをマウスの腹膜腔に注射し、そして動物をＤＮＦＢに感作させた。
ＤＮＦＢの塗布領域を出しているリンパ節由来の各マウスのＣＤ８ＬＴを、次のプロトコルに従って単離した：
各動物のハプテンの塗布領域を出しているリンパ節（鼠径部、上腕および腋生のリンパ節）を、動物の感作後４日目に除去し、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳに置いた。リンパ節を、焼結ガラスのスライドの間で磨り潰し、抽出した細胞を洗浄し、そして、プラスチック上に付着させて巨大面を除去するため、３７℃で２時間インキュベーターに置いた。そして、細胞をラットモノクローナル抗体：ＧＫ１．５（抗−ＣＤ４）、Ｍ１／７０（抗−マクロファージ）、ＲＡ３−６Ｂ２（抗−Ｂ２２０）、Ｍ５／１１４（抗−分類ＩＩ）、ＲＢ６−８Ｃ５（抗−顆粒球）の存在下で、３７℃で３０分間培養した。細胞に結合しない過剰な抗体を除去するため、細胞をＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳで洗浄した。そして、細胞をラット抗体（ＢＩＯＭＡＧ）に対する免疫グロブリンに結合する磁気ビーズの存在下で、振とうしながら４℃で３０分間培養した。ビーズの表面に存在する免疫グロブリンで認識される抗体に結合する細胞を、磁石上に懸濁液を通過させて除去した。リンパ球の精製を、抗−ＣＤ８抗体を使ってネガティブに選択した細胞を標識し、そしてフローサイトメトリーでの解析で確認した。この様にして、ネガティブに選択した細胞集団は、９５％以上のＣＤ８ Ｔリンパ球を構成した。
【００４８】
こうして単離したＣＤ８ＬＴを、ＤＮＢＳに結合したか、対照ハプテンに結合したナイーブなマウスの脾細胞から製造したＡＰＣ、ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸：ＳＩＧＭＡ）あるいは１００μｇのＮＰ、５×１０６個のＭＶ−ＵＶの粒子、５００μｌのダミー調製品または５００μｌのＰＢＳバッファーを与えたマウスの脾細胞から製造したＤＮＢＳに結合するＡＰＣのいずれかの存在下で、腹膜腔に注射して３日間同時に培養した。ＡＰＣを上記実施例４で記載のプロトコルに従って製造した。
【００４９】
細胞培養物を９６−穴プレート中のＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＣＳで製造した。ＣＤ８ Ｔリンパ球（ＣＤ８ＬＴ）を、穴あたり５×１０５個の細胞の割合で、ハプテンに結合するか、または結合しない１０６個のＡＰＣの存在下で培養した。各条件で、ＣＤ８ＬＴおよびＡＰＣを別々に培養し、ＣＤ８ＬＴの自発的な増殖がないことと、およびＡＰＣが正確に照射されていることを確認することができた。細胞培養を９０時間行った。７２時間後、０．５μＣｉのトリチウム化チミジンを各穴に加えた。細胞をフィルター上に移し、１分あたりのカウント数を液体シンチレーション（ＷＡＬＬＡＣ計数器）の存在下で計測した。
【００５０】
ハプテン特異的増殖指数を、次の式：
［Ｃｐｍ（ハプテンに結合するＣＤ８ＬＴ＋ＡＰＣ）］／［ Ｃｐｍ（ハプテンに結合しないＣＤ８ＬＴ＋ＡＰＣ）］に従って算出した。
抗原−特異的増殖指数の平均値を、図５（ａ） （ナイーブなマウスのＡＰＣ）および５（ｂ）（ＣＤ８ＬＴ供与体として同様な処理を受けているマウスのＡＰＣ）に表す。
【００５１】
図５（ａ）に示す結果は、ダミー調製品を注射し、感作したＣＤ８ＬＴマウスは、ＤＮＢＳに結合したナイーブなマウスのＡＰＣには強く反応するが、対照ハプテンに結合したナイーブなマウスのＡＰＣには反応しないことを示しており、これは、反応の抗原特異的な性質を示している。一方、ＭＶ−ＵＶまたはＮＰの調製品を注射したマウスの場合、ＤＮＢＳに結合するナイーブなマウスのＡＰＣに対するＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＣＤ４６マウスのＣＤ８ＬＴの反応の抑制を観察した。この抑制は、ＦｃγＲ受容体が欠如したマウスのＣＤ８ＬＴの場合、観察されなかった。
【００５２】
図５（ｂ）に示す結果は、ＭＶ−ＵＶまたはＮＰを注射したマウス起源のＡＰＣの存在下で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＤＮＶＢに感作したＣＤ４６のトランスジェニックマウスのＣＤ８ Ｔリンパ球の抗原−特異的な増殖が抑制されることを示している。
【００５３】
この抑制は、ＦｃγＲ受容体が欠如したマウスのＣＤ８ＬＴの場合、観察されない。 【００５４】
ＭＶ−ＵＶまたはＮＰの注射を受けた感作したマウス由来のＣＤ８ Ｔリンパ球は、ＣＤ８ Ｔリンパ球の増殖の欠如を示す。加えて、ＭＶ−ＵＶまたはＮＰを注射したマウス由来のＡＰＣは、インビトロでＣＤ８ Ｔリンパ球を活性化することができない。
【００５５】
これらの現象は、ＣＤ４６分子の発現には依存していないが、ＦｃγＲ受容体を欠いたマウスで観察されず、このことは、ＭＶ−ＵＶおよびＮＰもが、ナイーブなＣＤ８リンパ球の感作期のレベルのみならず、抗原との二次接触に続くエフェクターのレベルでも作用するので、この受容体を介してＡＰＣの機能に障害を与え得ることを示している。
【００５６】
実施例６：接触過敏性反応のエフェクター期におけるＵＶ−不活化麻疹ウイルスまたは核タンパク質ＮＰの作用
この作用を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＣＤ４６分子を発現するトランスジェニックマウスで試験した。
動物を、上記実施例１で記載のようにＤＮＦＢに感作させた。５日後、１００μｇのＮＰ、５×１０６個のＭＶ−ＵＶの粒子または５００μｌのダミー調製品を、上記実施例１に記載のプロトコルに従って、マウスの腹膜腔に注射し、塗布するＤＮＦＢを６時間後に塗布した。
【００５７】
ＤＮＦＢ塗布後の様々な時間で浮腫の厚みを測定し、結果を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて図６（ａ）、およびＣＤ４６のトランスジェニックマウスについて６（Ｂ）に示した。
【００５８】
図６（ａ）および６（ｂ）の凡例：
●：５×１０６個のＭＶ−ＵＶ
◆：組み換えＮＰ
○：ダミー調製品
△：非感作マウス
【００５９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスで、ＭＶ−ＵＶまたはＮＰのかなりの抑制作用が観察され、ＤＮＦＢに対する感作前に施された注射の場合で観察された作用と同様である（実施例２参照）。
【００６０】
ＣＤ４６のトランスジェニックマウスで、ＭＶ−ＵＶの抑制作用は、ＤＮＦＢの感作前に施された注射の場合で観察された作用とも同等である（実施例３参照）。浮腫の形成の完全な抑制が観察された。
【００６１】
これらの結果は、ＭＶタンパク質が炎症反応の予防のみならず治療においても効果的であり、この場合においても、ＣＤ４６受容体の発現が免疫抑制作用を増加させることを示している。
【００６２】
実施例７：ＥＬＩＳＡによるＭＶ核タンパク質ＮＰのアッセイ
ウイルス調製品中の核タンパク質の量をＥＬＩＳＡにて測定した。
９６−穴プレートを、炭酸塩バッファー（腹水の１／６００希釈）中で、抗−ＮＰ３３．４抗体［ＬＩＢＥＡＵら、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ、１３４、３００〜３０４（１９９４）］で覆った。
４℃で一晩培養後、プレートを５％脱脂乳中のＰＢＳバッファーでブロックし、ＭＶ−ＵＶ上澄み液と４℃で一晩、再び培養する。１μｇ／ｍｌのビオチニル化抗−ＮＰ抗体ｃｌ １２０［ＧＩＲＡＵＤＯＮおよびＷＩＬＤ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、５４、３２５〜３３２（１９８１）］を添加した後、プレートを１／１０００に希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）ペルオキシダーゼ結合体（ＳＩＧＭＡ）と培養する。基質（ＡＢＴＳ：ＳＩＧＭＡ）の添加および４５分間の培養後、ＯＤを４００ｎｍで読み取る。標準曲線を、ＭＶに感染したＶｅｒｏ細胞から精製した一連のＮＰの希釈液を使って設定する。
【００６３】
実施例８：様々な麻疹ウイルスのタンパク質による遅延過敏性反応の抑制
ＵＶ−不活化イヌジステンパーウイルスによるＤＮＦＢ接触過敏性反応の抑制
Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＦｃγＲ受容体を欠いたマウスに、上記実施例１に記載のプロトコルに従って、５×１０６個の粒子のＵＶ−不活化イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ／ＵＶ）、１００μｇのＭＶ ＮＰ、５×１０６個のＭＶ−ＵＶ粒子または５００μｌのＰＢＳの腹膜内注射を施し、そしてＤＮＦＢに感作させた。
ＤＮＦＢ塗布後の様々な時間で、浮腫の厚みを測定した。結果を図７（ａ）および７（ｂ）に示す：
図７（ａ）：Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
○：ＭＶ−ＵＶ
◆：ＣＤＶ−ＵＶ
▲：組み換えＮＰ
■：ＰＢＳ
×：非感作マウス
図７（ｂ）：ＦｃγＲ−／−マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
○：ＭＶ−ＵＶ
◆：ＣＤＶ−ＵＶ
▲：組み換えＮＰ
■：ＰＢＳ
×：非感作マウス
これらの結果は、接触過敏性反応が、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスで、ＵＶ−不活化ＣＤＶウイルス（ＣＤＶ−ＵＶ）（核タンパク質ＮＰと同量）で著しくブロックされることを示している。一方、ウイルスもＮＰも、ＦｃγＲ受容体を欠いたマウスでは効果的でなく（図７ｂ）、このことは、麻疹ウイルスの免疫抑制作用にＦｃγＲが必要であることを意味している。
【００６４】
ＮＰによるＫＬＨ遅延過敏性反応の抑制
小型反芻動物ウイルス核タンパク質（ＤＩＡＬＬＯらによって公表された配列から得られるＰＰＲＶＮＰ）または麻疹ウイルス核タンパク質（ＭＶ−ＮＰｃ）の１２５ Ｃ末端アミノ酸の組み換え調製品を、実施例２に記載のように得た。ＮＰｃを生産するため、麻疹ウイルス核タンパク質の１２５ Ｃ末端アミノ酸をエンコードする構築物を、ヒスチジンタグを含むベクターｐＱＥ−３２（ＱＩＡＧＥＮ）にクローニングした。そして、ＮＰｃ＋Ｈｉｓタグの一部を、実施例２に記載のようにＳｆ−９の感染で使用されているバキュロウイルスにクローニングした。３日間培養後、細胞を回収した。製造元にて示されているプロトコルに従って、ＱＩＡＧＥＮのＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（登録商標）キットを使って得た細胞ペレットからＮＰｃを精製した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、上記実施例１に記載のプロトコルに従って、１００μｇのＰＰＲＶＮＰ、１００μｇのＭＶ−ＮＰｃ、１ｍｇのデクサメタゾンまたは５００μｌのＰＢＳの腹膜内注射を施し、そしてＫＬＨに感作させた。
結果を、増強注射後、２４時間および４８時間の肉趾浮腫の大きさの平均を表す図８に示す。
【００６５】
図８の凡例：
中程度の灰色棒：ＰＢＳ
濃い灰色棒：ＰＰＲＶＮＰ
薄い灰色棒：デクサメタゾン
白色棒：ＭＶ−ＮＰｖ
黒色棒：非感作マウス
【００６６】
これらの結果は、ＰＰＲＶＮＰ、ＭＶ−ＮＰｃまたはデクサメタゾンを注射したマウスが、ＰＢＳを注射した対照マウスよりも実質的に弱い遅延過敏性反応を発生させることを示している。
【００６７】
最大の抑制作用がＭＶ−ＮＰｃで観察される。ＰＰＲＶＮＰの抑制作用は、デクサメタゾンの場合と類似している。
【００６８】
実施例９：ＵＶ−不活化麻疹ウイルスによる混合されたリンパ球反応の抑制
混合されたリンパ球反応は、インビトロで同種移植片拒絶のモデルを構成する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０５個のＭＶ−ＵＶ粒子または５００μｌのダミー調製品を腹膜内に注射した。
４８時間後、脾細胞をこれらのマウスの脾臓から調製し、そして１５００ ｒａｄで照射したＣ５７ＢＬ／６マウスから得た脾細胞との混合培養で刺激した。
【００６９】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５×１０６個／ｍｌ）からの応答細胞を、同数のＣ５７ＢＬ／６刺激細胞と共に、１０％ＦＣＳ、１０Ｍｍ ＨＥＰＥＳ、２Ｍｍグルタミン、５×１０６Ｍ ２β−メルカプトエタノールおよび１５μｌのゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ培地で、３７℃、７％ ＣＯ２で３日間培養した。細胞増殖を、１６時間のチミジン−３Ｈ（１μＣｉ／穴）の取り込みにより第３日目に評価した。
【００７０】
結果を図９に示す。これらの結果は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの細胞による刺激に対する反応における、ＢＡＬＢ／ｃマウスからのリンパ球の反応のＭＶ−ＵＶによる抑制を示す。【００７１】
図９の凡例：
□：ダミー調製品
■：ＭＶ−ＵＶ
【図面の簡単な説明】
【図１（ａ）】
塗布後の様々な時間での耳の浮腫の大きさ平均を表している。
【図１（ｂ）】
増強注射後２４時間の肉趾浮腫の平均の大きさを表している。
【図２（ａ）】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
【図２（ｂ）】
ＦｃγＲ−／−マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
【図２（ｃ）】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＫＬＨ過敏性試験
【図２（ｄ）】
ＦｃγＲ−／−マウスのＫＬＨ過敏性試験
【図４（ａ）】
ＭＶ−ＵＶを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの細胞の細胞毒性活性
【図４（ｂ）】
組み換えＮＰを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
【図４（ｃ）】
ＭＶ−ＵＶを注射したＣ４６マウスのＫＬＨ過敏性試験
【図７（ａ）】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
【図７（ｂ）】
ＦｃγＲ−／−マウスのＤＮＦＢ過敏性試験
【図１】
2004503506.tif 000002
【図２】
2004503506.tif 000003
【図３】
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【図４】
2004503506.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年10月2日(2002.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞−媒介性免疫反応を抑制する医薬品を生産するための、少なくとも１つの麻疹ウイルスの核タンパク質、あるいは該核タンパク質の約１００〜１３０アミノ酸Ｃ末端領域の全てまたは一部を含むフラグメントを含むタンパク質の調製品の使用。
【請求項２】
上記フラグメントが、様々な麻疹ウイルスの核タンパク質の間で保存されているＣ末端領域の少なくとも１つの配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記フラグメントが、：
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸４１１〜４２１、または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント；
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸４８９〜５０６、または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント；
−麻疹ウイルスの核タンパク質のペプチド配列のアミノ酸５１６〜６２５、または他の麻疹ウイルスの核タンパク質の相当する配列を含むフラグメント
から選択されることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記タンパク質の調製品が、麻疹ウイルスのエンベロープ糖タンパク質ＦおよびＨからもなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
前記医薬品が、炎症性の病状の予防または治療用であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６】
前記医薬品が、アレルギー性接触皮膚炎の予防または治療用であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬品が、移植拒絶反応または移植片対宿主疾患の予防または治療用であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
前記調製品に存在する前記麻疹ウイルスのＮＰタンパク質の量を測定することを含むことを特徴とする、麻疹ウイルスの調製品の潜在的な免疫抑制能力の評価方法。
【請求項９】
前記調製品を、前記ＮＰタンパク質に対する少なくとも１つの抗体、および好ましくはタンパク質の約１１０アミノ酸Ｃ末端領域で担持されているエピトープに対する少なくとも１つの抗体と接触させること、ならびに形成される抗体／抗原複合体を定量することを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
麻疹ウイルスのタンパク質の調製品の潜在的な免疫抑制能力を評価するためのＤＮＦＢまたはＫＬＨで感作されるマウスの使用。
【請求項１１】
上記マウスが、ＣＤ４６受容体を発現するトランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ワクチン製造のため、核タンパク質の１１０〜１３０アミノ酸Ｃ末端領域が、様々な麻疹ウイルスの間で保存されている上記Ｃ末端領域の少なくとも１つの配列で欠失または変更されている麻疹ウイルスの使用。
【国際調査報告】
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