(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞を培養する方法およびこのような細胞の大規模培養において組換えタンパク質を製造する方法に関する。タンパク質は、例えば、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞において因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを大規模生産する方法において、
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に、因子ＶＩＩを発現するか、あるいは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を接種し、少なくとも細胞が最小クロス・シード（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）密度に到達するまで、前記種母培養物を増殖させ；
（ｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） マクロ多孔質担体を含有する大規模培養容器に、前記細胞が前記担体の中に移動する条件下に、前記増殖種母培養物を移し；
（ｉｉｉ） 少なくとも前記細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を増殖させ；
（ｉｖ） 因子ＶＩＩの発現または因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの発現に適当な条件下に、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持し；そして
（ｖ）　前記維持した培養物から因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを回収する；
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
前記マクロ多孔質担体が、
（ａ） 約１５０〜３５０ μｍの全体の粒子直径を有し、
（ｂ） 約１５〜約４０ μｍの平均孔開口直径をもつ孔を有し、そして
（ｃ） 約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接種工程前に、前記細胞が動物由来成分を欠如する培地中で増殖するように適合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記接種工程前に、前記細胞が懸濁培養において増殖することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約１ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約２．５ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約５ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドが少なくとも約８ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物細胞を大規模培養する方法において、
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に、細胞を接種し、少なくとも細胞が最小クロス・シード（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）密度に到達するまで、前記種母培養物を増殖させ；
（ｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） マクロ多孔質担体を含有する大規模培養容器に、前記細胞が担体の中に移動する条件下に、前記増殖種母培養物を移し；そして
（ｉｉｉ） 少なくとも前記細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を増殖させる；
ことを含んでなる方法。
【請求項１０】
（ｉｖ） 培地を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する、
ことをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程 （ｉｖ） が：
（ｉｖ） 連続的潅流により、すなわち、培地の連続的収集により、保持装置を使用して培養容器中で細胞含有担体を保持し、かつ新鮮な培地を連続的に添加することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する、
ことを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程 （ｉｖ） が：
（ｉｖ） 細胞含有担体の沈降後、培養上清の一部分を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する、
ことを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程：
（ｖ） 担体の沈降前に培養の温度設定点より低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、
ことをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
担体の沈降前に培養の温度設定点より５ ℃〜３０ ℃低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
培養の温度設定点より５ ℃〜２０ ℃低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
培養の温度設定点より５ ℃〜１５ ℃低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
培養の温度設定点より約１０ ℃低い前もって決定した温度に培養物を冷却する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マクロ多孔質担体が、
（ａ） 約１５０〜３５０ μｍの全体の粒子直径を有し、
（ｂ） 約１５〜約４０ μｍの平均孔開口直径をもつ孔を有し、そして
（ｃ） 約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する、
請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記接種工程前に、前記細胞が動物由来成分を欠如する培地中で増殖するように適合されている、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記接種工程前に、前記細胞が懸濁培養において増殖することができる、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が所望のポリペプチドを産生する、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドがヒト因子ＶＩＩまたはヒト因子ＶＩＩ関連ポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
所望のポリペプチドが野生型因子ＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−因子ＶＩＩ、Ｓ６０Ａ−因子ＶＩＩ、Ｒ１５２Ｅ−因子ＶＩＩ、Ｓ３４４Ａ−因子ＶＩＩ、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物細胞がＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項２５】
前記マクロ多孔質担体がセルロースをベースとする、請求項９に記載の方法。
【請求項２６】
前記マクロ多孔質担体が前記電荷密度を付与する表面ＤＥＡＥ基を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
工程 （ｉｉ） 前に、サイズが累進的に増加する種母培養容器を使用して工程 （ｉ） を反復することをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドを製造する方法において、
（ｉ） ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を準備し；
（ｉｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に前記細胞を接種し、少なくとも細胞が最小クロス・シード（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）密度に到達するまで、前記種母培養物を増殖させ；
（ｉｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） マクロ多孔質担体を含有する大規模培養容器に、前記細胞が前記担体の中に移動する条件下に、前記増殖種母培養物を移し、ここで前記担体は、
（ａ） 約１５０〜３５０ μｍの全体の粒子直径を有し、
（ｂ） 約１５〜約４０ μｍの平均孔開口直径をもつ孔を有し、そして
（ｃ） 約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有し、
（ｉｖ） 少なくとも前記細胞が前もって最小の所望密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で前記大規模培養物を増殖させ、そして
（ｖ） 前記ポリペプチドが産生される条件下に、前記大規模培養を維持する、
を含んでなる方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドがヒト因子ＶＩＩまたはヒト因子ＶＩＩ関連ポリペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞がＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞から成る群から選択され、そして前記細胞をヒト因子ＶＩＩコーディング核酸でトランスフェクトする、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳動物細胞を培養する方法およびこのような細胞の大規模培養において組換えタンパク質を製造する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
例えば、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、因子Ｘ、およびプロテインＣを包含する、凝固カスケードに関係するタンパク質は、種々の病理学症状を治療する有用な治療剤であることが証明されている。薬学的製品の源としてヒト血漿を使用することは多数の欠点を有するので、組換え系においてこれらのタンパク質を製造することが好ましい。しかしながら、凝固タンパク質は、例えば、アスパラギン連鎖 （Ｎ−連鎖） グリコシル化；Ｏ−連鎖グリコシル化；およびｇｌｕ残基のγ−カルボキシル化を包含する、種々の共翻訳および翻訳後修飾に暴露される。この理由で、哺乳動物細胞中でそれらの製造することが好ましく、これにより組換えタンパク質を適当に修飾することができる。
【０００３】
しかしながら、哺乳動物細胞の培養は伝統的に動物血清または他の動物由来成分の存在下に実施されてきている。無血清培養方法は変動する結果を生成してきている。特に、培養の開始から大規模生産体積を獲得するまで、血清の非存在下に細胞を培養することは問題があった。足場依存性細胞系統は血清含有培地中で通常増殖させ、次いでこの培地を特定の目的、例えば、培地中で分泌されるタンパク質の蓄積のために、無血清培地に交換することができる。大規模懸濁培養は、例えば、培養容器中で懸濁細胞を保持する信頼できる装置の欠如を包含する、他の困難を提示する。
【０００４】
こうして、工業的量の凝固タンパク質、特に組換えヒト因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを製造する大規模に哺乳動物細胞を培養する方法がこの分野において要求されている。
【０００５】
発明の要約
本発明は、下記の工程により実施される、哺乳動物細胞において因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを大規模生産する方法を提供する：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に、因子ＶＩＩを発現するか、あるいは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を接種し、少なくとも細胞が最小クロス・シード（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）密度に到達するまで、種母培養物を増殖させ；
（ｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） マクロ多孔質担体を含有する大規模培養容器に、細胞が前記担体の中に移動する条件下に、増殖種母培養物を移し；
【０００６】
（ｉｉｉ） 少なくとも細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で大規模培養物を増殖させ；
（ｉｖ） 因子ＶＩＩの発現または因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの発現に適当な条件下に、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持し；そして
（ｖ）　維持した培養物から因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを回収する。
【０００７】
好ましくは、マクロ多孔質担体は、
（ａ） 約１５０〜３５０ μｍの全体の粒子直径を有し、
（ｂ） 約１５〜約４０ μｍの平均孔開口直径をもつ孔を有し、そして
（ｃ） 約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。
【０００８】
ある態様において、細胞は動物由来タンパク質を欠如する培地中でおよび／または懸濁培養において増殖するように適合されている。ある態様において、使用する細胞は、工程 （ｉ） における接種工程前に、細胞は動物由来タンパク質を欠如する培地中で増殖するように適合されている。好ましくは、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドは少なくとも約１ ｍｇ／ｌの培養物、より好ましくは少なくとも約２．５ ｍｇ／ｌの培養物、より好ましくは少なくとも約５ ｍｇ／ｌの培養物最も好ましくは少なくとも約８ ｍｇ／ｌの培養物のレベルで生産される。
【０００９】
他の面において、本発明は、下記の工程により実施される、哺乳動物細胞を大規模培養する方法を提供する：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に、細胞を接種し、少なくとも細胞が最小クロス・シード（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）密度に到達するまで、種母培養物を増殖させ、
（ｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） マクロ多孔質担体を含有する大規模培養容器に、細胞が担体の中に移動する条件下に、増殖種母培養物を移し、そして
（ｉｉｉ） 少なくとも細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で大規模培養物を増殖させる。
【００１０】
ある態様において、この方法は、下記の工程をさらに含む：
（ｉｖ） 培地を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
１つの態様において、この方法は、下記の工程を含む：
（ｉｖ） 連続的潅流により、すなわち、培地の連続的収集により、保持装置を使用して培養容器中で細胞含有担体を保持し、かつ新鮮な培地を連続的に添加することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
【００１１】
本発明の他の態様において、この方法は、下記の工程を含む：
（ｉｖ） 細胞含有担体の沈降後、培養上清の一部分を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
ある態様において、この方法は、下記の工程をさらに含む：
（ｖ） 担体の沈降前に培養の温度設定点より低い前もって決定した温度に培養物を冷却する （設定点より５ ℃〜３０ ℃低い、例えば、５ ℃〜２０ ℃低い、または５ ℃〜１５ ℃低い、または約１０ ℃低い）。
【００１２】
ある態様において、細胞は所望のポリペプチド、好ましくは凝固因子、最も好ましくはヒト因子ＶＩＩまたはヒト因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを産生し、所望のポリペプチドは野生型因子ＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−因子ＶＩＩ、Ｓ６０Ａ−因子ＶＩＩ、Ｒ１５２Ｅ−因子ＶＩＩ、Ｓ３４４Ａ−因子ＶＩＩ、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａを包含するが、これらに限定されない。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、特に哺乳動物細胞により発現される所望のポリペプチドを工業的量で製造するために、哺乳動物細胞を大規模培養する方法を提供する。１つの面において、本発明は、動物由来成分を欠如する培地中で懸濁コンピテント哺乳動物細胞を培養することに関する。他の面において、本発明は、正の表面電荷を有するマクロ多孔質担体を使用すると、動物由来成分の非存在下に懸濁コンピテント細胞の増殖に適当な環境が得られ、このような細胞により所望のタンパク質の産生レベルを高くすることができるという発見に基づく。
【００１４】
細胞：
本発明の実施において、培養する細胞は好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは確立された哺乳動物細胞であり、下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＣＨＯ （例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１ （例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベイビーハムスター腎 （ＢＨＫ）、およびＨＥＫ ２９３ （例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９−７２， １９７７） 細胞系統。
【００１５】
好ましいＢＨＫ細胞系統はｔｋ− ｔｓ １３ ＢＨＫ細胞系統 （ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０， １９８２）、（以後においてＢＨＫ ５７０細胞と呼ぶ） である。ＢＨＫ ５７０細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） （米国マリイランド州２０８５２、ロックビレパークローンドライブ１２３０１） からＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ １０３１４で入手可能である。また、ｔｋ− ｔｓ １３ ＢＨＫ細胞系統はＡＴＣＣから受け入れ番号ＣＲＬ １６３２で入手可能である。
【００１６】
好ましいＣＨＯ細胞系統は、ＡＴＣＣから受け入れ番号ＣＣＬ ６１で入手可能であるＣＨＯ Ｋ１である。他の細胞系統は下記のものを包含するが、これらに限定されない：Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ （ラットヘパトーム；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ （ラットヘパトーム；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺 （ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１）；ＤＵＫＸ細胞 （ＣＨＯ細胞系統） （ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０， １９８０） （ＤＵＫＸ細胞をまたＤＸＢ１１細胞と呼ぶ）、およびＤＧ４４ （ＣＨＯ細胞系統） （Ｃｅｌｌ， ３３：４０５， １９８３およびＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：５５５， １９８６）。
【００１７】
また、３Ｔ３細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞と他の細胞との融合物は有用である。ある態様において、細胞は、突然変異体または組換え細胞、例えば、それらが由来された細胞型と品質的または定量的に異なるスペクトルの酵素 （タンパク質の翻訳後の修飾を触媒する酵素、例えば、グリコシル化酵素、例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび／またはグルコシダーゼ、またはプロセシング酵素または安定化酵素、例えば、プロペプチド） を発現する細胞であることができる。
【００１８】
ある態様において、本発明の実施において使用する細胞は懸濁培養において増殖することができる。本明細書において使用するとき、懸濁コンピテント細胞は大きい、硬い凝集物を形成しないで懸濁増殖することができる細胞、例えば、単分散性であるか、あるいはほんのわずかの細胞／凝集物で解放された凝集物で増殖する細胞である。懸濁コンピテント細胞は下記のものを包含するが、これらに限定されない：適合または操作しないで懸濁増殖する細胞 （例えば、造血細胞またはリンパ系細胞） および付着依存性細胞　（例えば、上皮細胞または繊維芽細胞） を懸濁増殖に徐々に適合させることによって懸濁コンピテントとされた細胞。
【００１９】
培地：
本発明は、動物由来成分を欠如する培地中で哺乳動物細胞を培養することを包含する。本明細書において使用するとき、「動物由来」成分は完全な動物において産生される任意の成分 （例えば、血清から単離し、精製されたタンパク質） であるか、あるいは完全な動物において産生される任意の成分を使用することによって作られた成分 （例えば、動物から単離し、精製された酵素を使用して植物源物質を加水分解することによって作られたアミノ酸） である。
【００２０】
対照的に、動物タンパク質の配列を有する （すなわち、動物におけるゲノム起原を有する） が、完全な動物から単離し、精製された成分を欠如する培地中のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養 （例えば、組換え酵母または細菌細胞、または確立された連続的哺乳動物細胞系統、組換え体または非組換え体中の） において産生されるタンパク質は「動物由来」成分ではない（例えば、酵母または細菌細胞中で産生されるインスリン、または確立された哺乳動物細胞系統、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫまたはＨＥＫ細胞中で産生されるインスリン、またはＮａｗａｌｍａ細胞中で産生されるインターフェロン）。
【００２１】
例えば、動物タンパク質の配列を有する （すなわち、動物におけるゲノム起原を有する） が、組換え非動物細胞中で産生されるタンパク質 （例えば、酵母または細菌細胞中で産生されるインスリン） は「動物由来」成分ではない。したがって、動物由来成分を欠如する細胞培養培地は、組換え的に産生される動物タンパク質を含有できる培地である；しかしながら、このような培地は、例えば、動物の血清またはタンパク質、または動物血清から精製された他の生成物を含有しない。さらに、培地は完全な動物から単離し、精製された任意の他の成分、例えば、脂質、またはアミノ酸を含有しない。このような培地は、例えば、植物に由来する１または２以上の成分を含有することができる。
【００２２】
本発明の条件下に細胞の増殖および維持を支持する、動物由来成分を欠如する細胞培養培地を使用することができる。典型的には、培地は水、モル浸透圧濃度調節因子、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、無機または組換え鉄源、１または２以上の合成または組換え増殖因子、ビタミン、およびコファクターを含有する。慣用の成分に加えて、因子ＶＩＩの産生に適当な培地は、因子ＶＩＩ中のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化を促進するビタミンＫ１を約０．１〜５０ ｍｇ／ｌ、好ましくは約０．５〜２５ｍｇ／ｌ、より好ましくは約１〜１０ ｍｇ／ｌ、最も好ましくは約５ ｍｇ／ｌの濃度で含有する。
１つの態様において、培地は下記の組成を有する：
【００２３】
2004510439.tif 000002
【００２４】
2004510439.tif 000003
【００２５】
2004510439.tif 000004
【００２６】
2004510439.tif 000005
【００２７】
2004510439.tif 000006
【００２８】
2004510439.tif 000007
【００２９】
好ましい態様において、本発明の実施において使用する細胞は、動物由来成分を欠如する培地、例えば、血清を欠如する培地、または動物由来成分およびタンパク質を欠如する培地中の懸濁増殖に対して適合されている。このような適合手順は下記の文献に記載されている：例えば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ， Ｅ． Ｃ． Ｂｅｕｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ｐｐ． ６１９−６２３， １９９５ （ＢＨＫおよびＣＨＯ細胞）；Ｃｒｕｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｔｅｃｈ． １１：１１７−１２０， １９９７ （昆虫細胞）；Ｋｅｅｎ ＆ Ｓｔｅｗａｒｄ， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２０３−２１１， １９９５ （骨髄腫細胞）；Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９７２−９７８， １９９３ （ヒト腎臓２９３細胞）。
【００３０】
本発明の特に好ましい態様において、宿主細胞はヒト因子ＶＩＩまたはヒト因子ＶＩＩ関連ポリペプチドを発現するように操作され、かつ血清または動物由来成分の非存在下に増殖するように適合されたＢＨＫ ２１またはＣＨＯ細胞である。
【００３１】
培養法
本発明は、下記の工程により実施される哺乳動物細胞を大規模培養する方法を提供する：
（ｉ） 動物由来成分を欠如する培地を含有する種母培養容器の中に、細胞を接種し、少なくとも細胞が最小クロス・シード（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）密度に到達するまで、種母培養物を増殖させ、
（ｉｉ） （ａ） 動物由来成分を欠如する培地および （ｂ） マクロ多孔質担体を含有する大規模培養容器に、細胞が担体の中に移動する条件下に、増殖種母培養物を移し、そして
（ｉｉｉ） 少なくとも細胞が前もって決定した密度に到達するまで、動物由来成分を欠如する培地中で大規模培養物を増殖させる。
【００３２】
ある態様において、本発明の方法は下記の工程をさらに含んでなる：
（ｉｖ） 培地を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
ある態様において、本発明の方法は下記の工程を含んでなる：
（ｉｖ） 連続的潅流により、すなわち、培地の連続的収集により、保持装置を使用して培養容器中で細胞含有担体を保持し、かつ新鮮な培地を連続的に添加することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
【００３３】
ある態様において、本発明の方法は下記の工程を含んでなる：
（ｉｖ） 細胞含有担体の沈降後、培養上清の一部分を規則的に収集し、新鮮な培地と置換することによって、動物由来成分を欠如する培地中で工程 （ｉｉｉ） において得られた培養物を維持する。
ある態様において、本発明の方法は下記の工程をさらに含んでなる：
（ｖ） 担体の各沈降前に培養の温度設定点より低い前もって決定した温度に培養物を冷却する。
他の態様において、温度は温度設定点より５ ℃〜３０ ℃低い、または５ ℃〜２０ ℃低い、または５ ℃〜１５ ℃低い、または約１０ ℃低い。
【００３４】
接種および初期増殖：工程 （ｉｉ） のために十分な数の細胞が得られるまで、工程 （ｉ） を反復して種母培養容器の大きさを累進的に増加できることが理解されるであろう。例えば、５リットル、５０リットル、または５００リットルの１または２以上の種母培養容器を順次に使用することができる。種母培養容器は、本明細書において使用するとき、約５リットル〜約５００リットルの容量を有する容器である。典型的には、細胞を種母培養容器の中に約０．２〜０．４×１０６細胞／ｍｌの初期密度で接種し、培養物が約１．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に到達するまで増殖させる。本明細書において使用するとき、最小クロス・シード（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）密度は約０．８〜約１．５×１０６細胞／ｍｌである。
【００３５】
マクロ多孔質担体：本明細書において使用するとき、マクロ多孔質担体は下記の性質を有する粒子、通常セルロースをベースとする粒子である： （ａ） それらは懸濁培養において使用できるために十分に小さい （細胞に対して有意な翦断損傷を引き起こさない攪拌速度を使用する）； （ｂ） それらは細胞が粒子の内部空間の中に移動できるために十分な大きさの孔および内部空間を有する、および （ｃ） それらの表面 （外部および内部） は正に帯電している。１系列の態様において、担体は、
（ａ） 約１５０〜３５０ μｍの全体の粒子直径を有し、
（ｂ） 約１５〜約４０ μｍの平均孔開口直径をもつ孔を有し、そして
（ｃ） 約０．８〜２．０ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。
【００３６】
ある態様において、正電荷はＤＥＡＥ （Ｎ， Ｎ−ジエチルアミノエチル） 基により提供される。有用のマクロ多孔質は下記のものを包含するが、これらに限定されない：Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １ＴＭおよびＣｙｔｏｐｏｒｅ ２ＴＭ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｃｈ． ニュージャージー州ピスカタウェイ）。Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １ＴＭ担体は特に好ましく、これらは２３０ μｍの平均粒子直径、３０ μｍの平均孔大きさ、および１．１ ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。
【００３７】
大規模培養条件：本明細書において使用するとき、大規模培養容器は、少なくとも約１００リットル、好ましくは少なくとも約５００リットル、より好ましくは少なくとも約１０００リットル、最も好ましくは少なくとも約５０００リットルの容量を有する。典型的には、工程 （ｉｉ） は、１５０リットルの培地および７５０ ｇのマクロ多孔質担体を含有する５００リットルの培養容器の中に、約５００リットルの増殖種母培養物 （約１．０×１０６細胞／ｍｌを有する） を移す。
移した後、細胞は典型的には最初の２４時間以内に担体の内部の中に移動する。大規模培養は、例えば、温度、ｐＨ、溶解酸素テンション （ＤＯＴ） 、および攪拌速度の適当な条件下に維持され、そして体積は培地を培養容器に添加することによって徐々に増加される。
【００３８】
高いレベルのタンパク質発現：細胞を増殖させて高いレベルの所望のタンパク質を産生させるとき、工程 （ｉ）、（ｉｉ）、および （ｉｉｉ） を 「増殖」 期と表示し、そして工程 （ｉｖ） を 「産生」 期と表示する。産生期において、培地を典型的には２４時間の間隔で細胞含有担体の沈降；培養上清の収集；および新鮮な培地との置換により交換する。冷却工程を担体の沈降直前に適用して （培養温度設定点より５ ℃〜３０ ℃低い、または５ ℃〜２０ ℃低い、または５ ℃〜１５ ℃低い、または約１０ ℃低い温度に冷却して） 細胞の酸素必要条件を減少させると同時に細胞を培養容器の底に沈降させる。
【００３９】
冷却工程は、１０〜２４０分間、例えば、２０〜１８０分間、または３０〜１２０分間実施した後、細胞含有マクロ多孔質担体を沈降させる。典型的には、この工程は次のようにして実施する：バイオリアクターを冷却し、温度をモニターする。バイオリアクターの温度が培養の設定点より低い前もって決定した温度、例えば、設定点より１０ ℃低い温度に到達したとき、バイオリアクターの攪拌機を停止し、細胞含有担体を沈降させる。培地を交換したとき、温度を再び培養の設定点に調節する。新鮮な培地を添加するとき、それを典型的には培養の設定点に近い温度に前もって加温する。
【００４０】
選択的に、培養の連続的潅流モードを使用することができ、ここで培地を連続的に収集し、ある種の保持装置、例えば、ある種の沈降装置を使用して培養容器中で担体を保持し、新鮮な培地を連続的に添加する。
【００４１】
いったん培地が培養容器から除去されると、それを１または２以上のプロセシング工程にかけて所望のタンパク質を得る。このようなプロセシングは下記のものを包含するが、これらに限定されない：担体の中に固定化された細胞を取出す遠心または濾過；アフィニティークロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手順 （例えば、調製用等電点電気泳動 （ＩＥＦ）；分別溶解度 （例えば、硫酸アンモニウム沈降）；抽出およびその他。一般に、下記の文献を参照のこと：Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２；および， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ．−Ｃ， ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， 編者， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９。
【００４２】
因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドの精製は、例えば、下記のものを包含する：抗因子ＶＩＩ抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィー （例えば、下記文献を参照のこと、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：１１０９７， １９８６；およびＴｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７：７７８５， １９８８） および因子ＶＩＩａまたはトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼを使用する、タンパク質分解切断による活性化、例えば、因子ＩＸａ、カリクレイン、因子Ｘａ、およびトロンビン。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｏｓｔｅｒｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１：２８５３， （１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ， 米国特許第４，４５６，６９１号；およびＨｅｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１：１８３６ （１９８３）。選択的に、因子ＶＩＩはそれをイオン交換クロマトグラフィーカラム、Ｍｏｎｏ−Ｑ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） またはその他に通過させることによって活性化させることができる。
【００４３】
大規模生産のためのポリペプチド
ある態様において、本発明の実施において使用する細胞は内因的因子ＶＩＩ遺伝子を発現するヒト細胞である。これらの細胞において、内因的遺伝子は完全であるか、あるいはその場で修飾されているか、あるいは因子ＶＩＩ遺伝子の外側の配列は内因的因子ＶＩＩ遺伝子の発現を変更するように修飾されていることができる。
【００４４】
他の態様において、組換え遺伝子からヒト因子ＶＩＩを発現させるように、任意の哺乳動物源からの細胞を操作する。本明細書において使用するとき、「因子ＶＩＩ」または「因子ＶＩＩポリペプチド」は野生型因子ＶＩＩ （すなわち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ならびに野生型因子ＶＩＩに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を示す因子ＶＩＩの変異型を包含する。用語「因子ＶＩＩ」は非切断 （チモーゲン） 形態の因子ＶＩＩポリペプチド、ならびにそれぞれの生物活性形態を生ずるようにタンパク質分解的にプロセシングされたもの （これは因子ＶＩＩａと表示することができる） を包含する。典型的には、因子ＶＩＩは残基１５２と１５３との間で切断されて因子ＶＩＩａを生ずる。
【００４５】
本明細書において使用するとき、「因子ＶＩＩ関連ポリペプチド」は、因子ＶＩＩａの生物学的活性が野生型因子ＶＩＩａの活性に関して実質的に変更または減少されている変異型を含む、ポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、ポリペプチドの生物学的活性を変更または崩壊させる、特異的アミノ酸配列の変更が導入されている因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａを包含するが、これらに限定されない。
【００４６】
血液凝固における因子ＶＩＩの生物学的活性は、（ｉ） 組織因子 （ＴＦ） に結合するその能力および （ｉｉ） 活性化された因子ＩＸまたはＸ （それぞれ、因子ＩＸａまたはＸａ） を産生する因子ＩＸまたは因子ＶＩＩ関連ポリペプチドのタンパク質分解的切断を触媒するその能力に由来する。本発明の目的に対して、例えば、米国特許第５，９９７，８６４号に記載されているように、因子ＶＩＩａの生物学的活性は、因子ＶＩＩ欠乏血漿およびトロンボプラスチンを使用して血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって、定量することができる。このアッセイにおいて、生物学的活性は対照試料に関する凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの因子ＶＩＩ活性を含有するプールしたヒト血清標準と比較することによって「因子ＶＩＩ単位」に変換される。
【００４７】
選択的に、因子ＶＩＩａの生物学的活性は、（ｉ） 脂質膜の中に埋め込まれたＴＦと因子Ｘを含んでなる系中で因子Ｘａを産生する因子ＶＩＩａの能力を測定する （Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１９９１９−１９９２４， １９９７）； （ｉｉ） 水性系中の因子Ｘの加水分解を測定する；（ｉｉｉ） 表面プラズモン共鳴をベースとする計装を使用してＴＦに対するその結合を測定する （Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．　４１３：３５９−３６３， １９９７） そして （ｉｖ） 合成基質の加水分解を測定することによって定量することができる。
【００４８】
野生型因子ＶＩＩに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を有する因子ＶＩＩの変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１または２以上において試験したとき、同一細胞型において産生された因子ＶＩＩａの比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％を示す変異型を包含する。
【００４９】
野生型因子ＶＩＩａに関して実質的に減少した活性を有する因子ＶＩＩ変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１または２以上において試験したとき、同一細胞型において産生された野生型因子ＶＩＩａの比活性の約２５％より少ない、好ましくは約１０％より少ない、より好ましくは約５％より少ない、最も好ましくは約１％より少ない比活性を示す変異型を包含する。野生型因子ＶＩＩａに関して実質的に変更された活性を有する因子ＶＩＩ変異型は、ＴＦ独立的因子Ｘタンパク質分解活性を示す因子ＶＩＩ変異型およびＴＦに結合するが、因子Ｘを切断しない変異型を包含するが、これらに限定されない。
【００５０】
因子ＶＩＩの変異型は、野生型因子ＶＩＩと実質的に同一であるか、またはそれよりもすぐれた生物学的活性を示すか、あるいは野生型因子ＶＩＩに関して実質的に変更されたまたは減少した生物学的活性を示すかどうかにかかわらず、１または２以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により野生型因子ＶＩＩの配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、これらに限定されない。野生型因子ＶＩＩと実質的に同一の生物学的活性を有する因子ＶＩＩ変異型の非限定的例は次の通りである：
【００５１】
Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ （Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３５２：１８２−１９２， １９９８）；米国特許第５，５８０，５６０号に開示されているような増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異型；残基２９０と２９１との間または残基３１５と３１６との間でタンパク質分解的に切断された因子ＶＩＩａ （Ｍｏｌｌｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４８：５０１−５０５， １９９５）；および因子ＶＩＩａの酸化された形態 （Ｋｏｍｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３６３：４３−５４， １９９９）。
【００５２】
野生型因子ＶＩＩに関して実質的に減少したまたは変更された生物学的活性を有する因子ＶＩＩの非限定的例は次の通りである：Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ （Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２９：３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ （Ｋａｚａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：６６−７２， １９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩ （Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｅｎｄｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １５：５１５−５２０，１９９８）、およびＧｌａドメインを欠如する因子ＶＩＩａ （Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ３１７：２４５−２４９， １９９３）。
【００５３】
本発明は、また、１または２以上の問題のタンパク質を発現する哺乳類細胞の大規模培養を包含する。このような発現は、内因的遺伝子から、またはタンパク質をコードする組換え遺伝子をこのような細胞の中に導入した後であることができる。このような因子は下記のものを包含するが、これらに限定されない：因子ＶＩＩＩ；因子ＩＸ；因子Ｘ；プロテインＣ；組織因子；レニン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルトシノニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；心房ナトリウム排泄増加因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲンアクチベーター （ｔ−ＰＡ）；
【００５４】
ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ヒトマクロファージ阻害タンパク質 （ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミューラー抑制物質；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、β−ラクタマーゼ；ＤＮアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子 （ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子のレセプター；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子 （ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６ （ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、または神経増殖因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板由来増殖因子 （ＰＤＧＦ）；繊維芽細胞増殖因子、例えば、α−ＦＧＦおよびβ−ＦＧＦ；
【００５５】
表皮増殖因子 （ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子 （ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ （ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９；エリトロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質 （ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−β、および−γ；コロニー刺激因子 （ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン （ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊加速因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分；
【００５６】
輸送タンパク質；ホーミングレセプター （ｊｅｇ ｋｅｎｄｅｒ ｉｋｋｅ ｕｄｔｒｙｋｋｅｔホーミングレセプター、ｍｅｎ ｇａｒ ｕｄ ｆｒａ ａｔ ｄｕ ｖｅｄ ｅｒ ＯＫ？， ＩＭｑ， ２００１−０９−１８）；アドレッシン；調節タンパク質；抗体；および上記ポリペプチドの任意のフラグメント。
下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
【００５７】
実施例
実施例１．　因子ＶＩＩの無血清製造
大規模培養において因子ＶＩＩを調製するために、下記の実験を実施した。
因子ＶＩＩエンコーディングプラスミドで形質転換したＢＨＫ細胞系統を、血清の非存在下に懸濁培養で増殖するように適合させた。適合後、細胞を回転培養において順次に増殖させた；細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。使用した培地は血清および他の動物由来成分を含有しなかった。
【００５８】
最後に、マクロ多孔質Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １担体 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｃｈ．） を含有する１００リットルの調製バイオリアクターの中に６リットルの種母培養物を接種し、次いで接種後２４時間に懸濁細胞は担体の中に固定化された。３６ ℃、ｐＨ ６．７〜６．９および飽和の５０％の溶解酸素テンション （ＤＯＴ） において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。
【００５９】
細胞密度がほぼ２×１０６細胞／ｍｌに到達したとき、生産期を開始させ、培地の交換を２４時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の８０％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 （すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞） および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
調製期間の間に、細胞は３〜６×１０６細胞／ｍｌおよび２〜７ ｍｇの因子ＶＩＩ／リットルの力価に到達した。
【００６０】
実施例２．　因子ＶＩＩの無血清製造
大規模培養において因子ＶＩＩを調製するために、下記の実験を実施した。
ヒト因子ＶＩＩの発現用プラスミドベクターｐＬＮ１７４は記載された （ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３）。簡単に述べると、それはヒト因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列を保持し、挿入されたｃＤＮＡの転写用マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にポリペプチド、および選択可能なマーカーとして使用するためのＳＶ４０初期プロモーターの制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡを含む。
【００６１】
γ−カルボキシル化認識配列をコードするプラスミドベクターを構築するために、そのポリペプチドを含む因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡを含有するクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を使用した （ｐＬＮ１７１）。（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１９９１９−１９９２４）。このクローニングベクター上の逆位ＰＣＲ仲介突然変異誘発により因子ＶＩＩのポリペプチド後に因子ＶＩＩをコードするｃＤＮＡの中に、停止コドンをコードするヌクレオチド配列を挿入した。ＮａＯＨを使用する処理および引き続く下記のプライマーとともにポリメラーゼＰｗｏ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） およびＴａｑ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ） ポリメラーゼを使用するＰＣＲにより鋳型プラスミドを変性した：
ａ）　５’−ＡＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ−３’
ｂ）　５’−ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＣＣ−３’
【００６２】
生ずる混合物をＤｐｎＩで消化して残留鋳型ＤＮＡを消化し、大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） をＰＣＲ生成物で形質転換した。クローンを配列決定により突然変異の存在についてスクリーニングした。正しいクローンからのｃＤＮＡをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） に移した。生ずるプラスミドをｐＬＮ３２９と命名した。ＣＨＯ Ｋ１細胞 （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１） を、Ｆｕｇｅｎｅ６法 （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ） に従い、等しい量のｐＬＮ１７４およびｐＬＮ３２９でトランスフェクトした。メトトレキセートを１ μＭに添加し、Ｇ−４１６を０．４５ ｍｇ／ｍｌに添加することによって、トランスフェクタントを選択した。トランスフェクタントのプールを限界希釈法によりクローニングし、クローンからのＦＶＩＩの発現を測定した。
【００６３】
高い生産性のクローンをさらにサブクローニングし、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地中で２．４ ｐｇ／細胞／日の特異的ＦＶＩＩ発現を示すクローンＥ１１を選択した。商業的に入手可能な動物由来成分を含まないＣＨＯ培地中の無血清懸濁培養に対して、クローンを適合させた。
適合させた細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
２５日後、６リットルの回転培養物を５０リットルのバイオリアクターの中に接種した。細胞をバイオリアクター中で増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【００６４】
最後に、マクロ多孔質Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １担体 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｃｈ．） を含有する５００リットルの調製バイオリアクターの中に５０リットルの種母培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。３６ ℃、ｐＨ ７．０〜７．１および飽和の５０％の溶解酸素テンション （ＤＯＴ） において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。細胞密度がほぼ１０〜１２×１０５細胞／ｍｌに到達したとき、調製期を開始させ、培地の交換を２４時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の８０％を収集し、新しい培地と置換した。
【００６５】
収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 （すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞） および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
調製期間の間に、細胞は２〜３×１０７細胞／ｍｌおよび８ ｍｇの因子ＶＩＩ／リットルの力価に到達した。
【００６６】
実施例３．　因子ＶＩＩの無血清製造
大規模培養において因子ＶＩＩを調製するために、下記の実験を実施した。
高い生産性ＣＨＯクローンを実施例２に記載されているようにして調製した。
使用した培地は動物由来成分を含まなかった。
適合させた細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
２５日後、６リットルの回転培養物を５０リットルのバイオリアクターの中に接種した。細胞をバイオリアクター中で増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【００６７】
最後に、マクロ多孔質Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １担体 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｃｈ．） を含有する５００リットルの調製バイオリアクターの中に５０リットルの種母培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。３６ ℃、ｐＨ ７．０〜７．１および飽和の５０％の溶解酸素テンション （ＤＯＴ） において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。細胞密度がほぼ１０〜１２×１０５細胞／ｍｌに到達したとき、調製期を開始させ、培地の交換を２４時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の８０％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 （すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞） および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
【００６８】
第１４日以降から、培地を２ ｇ／ｌのＨＹ−ＳＯＹ （大豆加水分解物タンパク質） で強化した。
第４１日以降から、培養物を設定点より１０ ℃低い温度 （すなわち、２６ ℃） に冷却し、直ちに毎日の培地交換物を導入した。冷却工程の目的は、攪拌を停止する前に、細胞の酸素必要条件を減少させることであり、細胞を有する担体を発酵槽の底に沈降させた。
調製期間の間に、細胞は２．５〜３．５×１０７細胞／ｍｌおよび８〜１３ ｍｇの因子ＶＩＩ／リットルの力価に到達した。
【００６９】
本明細書において言及したすべての特許、特許出願、および参考文献は、引用することによって本明細書の一部分とされる。
前述の説明に照らして見ると、本発明の多数の変形は当業者にとって明らかとなるであろう。このような明らかの変形は本発明の完全な意図する範囲内に入る。
【国際公開パンフレット】
2004510439.tif 000008
2004510439.tif 000009
2004510439.tif 000010
2004510439.tif 000011
2004510439.tif 000012
2004510439.tif 000013
2004510439.tif 000014
2004510439.tif 000015
2004510439.tif 000016
2004510439.tif 000017
2004510439.tif 000018
2004510439.tif 000019
2004510439.tif 000020
2004510439.tif 000021
2004510439.tif 000022
2004510439.tif 000023
2004510439.tif 000024
2004510439.tif 000025
2004510439.tif 000026
2004510439.tif 000027
2004510439.tif 000028
2004510439.tif 000029
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510439.tif 000030
【国際調査報告】
2004510439.tif 000031
2004510439.tif 000032
2004510439.tif 000033
2004510439.tif 000034