(57)【要約】本発明は、ＣＡＲＰタンパク質（心臓アンキリンリピートタンパク質）についての遺伝子のコード配列の上流部分から誘導され、心筋細胞においてインビボで導入遺伝子の発現のレベル及び特異性を制御することができるプロモーター配列に関する。本発明はそれ故、心筋細胞におけるインビボでの核酸の移入と発現のための組成物、構築物、ベクター及びインビボでのそれらの使用を述べる。本発明の対象はまた、一部の心臓疾患を検討するためのモデルを構成するトランスジェニック動物を作製するためのプロモーター配列の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドであって、配列番号１を有するＣＡＲＰタンパク質についての遺伝子のコード部分の上流にある配列の、又は高ストリンジェンシー条件下で該配列とハイブリダイズする配列の、フラグメントを含むことを特徴とし、心臓細胞において該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された遺伝子のインビボでの特異的発現を誘導することができる、上記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１の配列と少なくとも９３％の同一性を示すことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
該フラグメントが、ＣＡＲＰタンパク質についてのマウス遺伝子のヌクレオチド−２２６６から＋９２の間に位置する配列内に含まれることを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかで定義されたＤＮＡ配列の制御下に置かれた、治療目的の、タンパク質又はＲＮＡをコードする配列を含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項５】
配列番号２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を示すＤＮＡ配列の制御下に置かれた、治療目的の、タンパク質又はＲＮＡをコードする配列を含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項６】
該タンパク質又は該ＲＮＡが、心臓細胞の増殖を活性化する、免疫応答を低下させる又は抑制する、血管新生を誘導する、筋収縮能、心肥大、心不全及び心筋炎を矯正することができることを特徴とする、請求項４及び５のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項７】
治療目的の該タンパク質が、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、アンギオポエチン、及びサイトカインを含むファミリーのタンパク質であることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項８】
治療目的の該タンパク質が活性化又は抑制性転写因子であることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項９】
治療目的の該タンパク質が、インターロイキン−１０、インターロイキン−２及びインターロイキン−８のような免疫抑制タンパク質であることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項１０】
治療目的のＲＮＡが、心臓細胞における遺伝子の発現を制御する又はｍＲＮＡの転写を遮断することを可能にするアンチセンスＲＮＡであることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項１１】
該タンパク質が、ＮＯＳ（一酸化窒素シンテターゼ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びカタラーゼから選択される、低酸素症を軽減するための作用物質であることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項１２】
請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１３】
請求項４から１１のいずれか一項に記載の発現カセットを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１４】
心臓細胞において有効な複製起点を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１５】
プラスミド、コスミド又はウイルスによってキャプシド化されていない何らかのＤＮＡであることを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１６】
アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス又はそれらの誘導体から選択される組換えウイルスであることを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１２から１６のいずれか一項に記載のベクターを含有することを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１２から１６のいずれか一項に記載のベクターと化学的又は生化学的移入因子を含有する組成物。
【請求項１９】
請求項１２から１６のいずれか一項に記載のベクターを含有することを特徴とする薬剤。
【請求項２０】
請求項１から３及び１２から１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はベクターの有効量を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２１】
心不全の治療を意図する薬剤の製造のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２から１６のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２２】
心肥大の治療を意図する薬剤の製造のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２から１６のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２３】
低酸素症の治療を意図する薬剤の製造のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２から１６のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２４】
心臓移植の際の拒絶反応を予防するための薬剤を製造するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２から１６のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２５】
治療目的のタンパク質をコードする遺伝子がレポーター遺伝子で置換されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを担うことを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項２６】
ａ）請求項１２から１６のいずれか一項に記載のベクターを単離すること、および
ｂ）目的とする該遺伝子が発現される条件下で、該ベクターの有効量を心臓組織に導入することを特徴とする、治療目的の遺伝子をインビボで発現する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学の分野に関する。特に遺伝子適所発現の分野、より特定すると導入遺伝子の特異的発現のための新規システムの設計と開発に関する。本発明の対象は、特に、心筋細胞においてインビボで導入遺伝子の発現のレベルと特異性を制御することができる新規プロモーター配列である。本発明はそれ故、心筋細胞において核酸の発現を制御し、指令することを可能にする新規組成物、構築物及びベクターを述べる。本発明から生じる適用は、例えば実験、臨床、治療及び診断分野において、より特定すると一部の心臓疾患の治療及び／又は予防のために、数多く存在する。
【背景技術】
【０００２】
導入遺伝子の発現のレベルの制御と適所送達は多くの適用のために必要である。例えば、遺伝子治療では、治療の成功には導入遺伝子から合成されるタンパク質の適所送達が必要であり、それによって副作用の拡大を制限することが可能になると考えられる。トランスジェニック動物の構築及び遺伝子の作用の研究は、すべて、タンパク質の発現の特異性の適切な制御が使用できること、および改善を提供しうることの例である。
【０００３】
これに関して、多くのプロモーターを、それらの心臓特異的発現を指令する能力に関して試験した。それらは特に、ラットにおける心臓ミオシン軽鎖（ＭＬＣ−２）（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｓ．Ａ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６４（１９８９）１８１４２−８；Ｌｅｅ  Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１２６（１９９２）１５８７５−８５）、マウスにおける心臓α−アクチン（Ｂｉｂｅｎ  Ｃ．ら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，１７３（１９９６）２００−１２）、ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）（Ｈａｒｒｉｓ  Ａ．Ｎ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２９（１９９７）５１５−２５）、α−又はβ−ミオシン重鎖（α−又はβ−ＭＨＣ）（Ｃｏｌｂｅｒｔ  Ｍ．Ｃ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１００（１９９７）１９５８−６８）、ウサギにおける筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｃ．Ｋ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１３（１９９３）５６７−７４）、又は心臓トロポニンＴ（米国特許第５，２６６，４８８号）をコードする遺伝子のプロモーターである。
【０００４】
これらのプロモーターは、ある程度の組織特異性を与えることが知られている一方、またそれらの活性レベルは、一般に１０から１００の因数で、いわゆる強力なプロモーターのレベルよりもかなり低く、治療用途に実際に考慮することができないことも知られている。
【０００５】
例として、Ｆｒａｎｚ  Ｗ．Ｍ．ら（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，３５（１９９７）５６０−６）及びＧｒｉｓｃｅｌｌｉ  Ｆ．ら（Ｃ  Ｒ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＩＩＩ，３２０（１９９７）１０３−１２）は、アデノウイルス構築物においてラットα−ＭＨＣ及びＭＬＣ−２をコードする遺伝子の上流配列の活性レベルが、約１０の因数でＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーターのレベルよりも実質的に低いままであることを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願は、それ故、より詳細には、ＣＡＲＰ（心臓アンキリンリピートタンパク質）遺伝子の上流領域から誘導される新規プロモーター配列に関する。これは、心臓特異的発現を指令することができるだけでなく、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターのような強力なプロモーターに匹敵するインビボでの高いレベルの発現を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＭＬＣ−２ｖ遺伝子の発現の調節においてホメオボックス遺伝子Ｎｂｘ２．５の下流で働く心筋細胞の分化のための第一のマーカーの１つを構成する、ＣＡＲＰタンパク質は、マウス（Ｚｏｕ  Ｙ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２４（１９９７）７９３−８０４）、ウサギ（Ａｉｈａｒａ  Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２８（１９９９）３１８−２４）、及びヒト（Ｃｈｕ  Ｗ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７０（１９９５）１０２３６−４５）において検討され、その遺伝子のコード部分が配列決定された。
【０００８】
Ｋｕｏ  Ｈ．ら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６（１９９９）４２２３−３４）は、１０Ｋｂのフラグメントをクローン化し、マウスＣＡＲＰ遺伝子のコード配列の２．５Ｋｂ上流のフラグメントを配列決定した。５’における欠失をフラグメントにおいて作製して、転写位置＋１に対してヌクレオチド−１６６から＋４７までのプロモーターの２１３ｂｐの領域がインビトロでの心臓特異的発現を付与するのに十分であることを示し、そのことは、５’末端に、プロモーターの特異性を制御するためのエレメントが存在することを示唆した。Ｋｕｏらはまた、ＣＡＲＰ遺伝子の２．５Ｋｂ上流のフラグメントを含むトランスジェニックマウス系統を生成して、胚発生の初期段階で心臓及び骨格筋細胞における導入遺伝子の特異的発現を示し、次に発生の間にこの発現を抑制した。
【０００９】
特許出願第ＷＯ００／１５８２１号は、転写位置＋１に対して、ヌクレオチド−２２８５から＋６２までに位置する、マウスＣＡＲＰ遺伝子のコード配列の上流５’側の部分を述べている。この配列を、アデノウイルスベクターを通して特にそのインビボ活性について評価した。得られる活性のレベルは、しかしながら、非常に低いままであるので、インビボでの活性を検出するためには、アデノ関連ウイルスの２つの逆方向末端反復配列（ＡＡＶ−ＩＴＲ）の間のプロモーター配列を単離する必要があることが認められた。
【００１０】
本出願人は、ＣＡＲＰタンパク質についての遺伝子の５’の領域をよりよく特徴付けることに焦点を合わせた。その結果、ＣＡＲＰ遺伝子の上流の新規配列を特定し、この新規配列の予想外の有益な特性、特にインビボでの活性レベルの有意の改善を明らかにすることができた。
【００１１】
本出願人は実際に、意外にも、この新たに特定された配列はインビトロでは有意の発現をもたらさないが、逆にインビボでは、心臓組織における発現の高い選択性を保存しながら、いわゆる強力なプロモーターに等しい非常に良好な活性レベルを得られることを発見した。
【００１２】
本発明の対象は、それ故、ＣＡＲＰタンパク質についての遺伝子のコード配列の上流部分、又は高ストリンジェンシー条件下で該上流配列とハイブリダイズする部分を含むポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドは、その制御下に置かれた導入遺伝子の心臓組織における特異的発現を誘導することができる。
【００１３】
本発明はまた、配列番号１の配列と少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を示す、天然由来の又は化学合成によって得られるポリヌクレオチドに関する。さらに一層好ましくは、本発明に従ったポリヌクレオチドは配列番号１の配列と少なくとも９８％の同一性を示す。
【００１４】
天然由来の発現ポリヌクレオチドは、制限酵素を用いて細胞ＤＮＡを開裂することによって得られるゲノムＤＮＡフラグメントを意味すると理解される。
【００１５】
化学合成によって得られる発現ポリヌクレオチドは、自動合成によって、例えば適当な自動装置を使用して作製されるＤＮＡフラグメントを意味すると理解される。
【００１６】
本発明に関して、「高ストリンジェンシー条件」の語は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＣＳＨ，Ｎ．Ｙ．米国）又はその新しい版の１つによって与えられる意味で使用される。例として、ハイブリダイズしていないフラグメントを排除するために０．２ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの存在下に６５℃で３回の洗浄が必要であるようなハイブリダイゼーション条件である。
【００１７】
発現の「特異的」性質とは、プロモーターの活性が心臓組織の細胞において有意に大きく高いことを意味する。非特異的発現は他の細胞でも存在しうるが、対応する活性のレベルは心臓組織で認められるものに比べてほとんどの場合非常に低い（無視しうる）ままであり、概して少なくとも１０の因数でより低い。
【００１８】
実施例で提示する結果は、これに関して、１０００の因数に達しうる発現の差を示し、これは、インビボでの心臓細胞における本発明に従ったポリヌクレオチドの高い選択性を反映する。
【００１９】
さらに、下記の実施例で提示する結果は、ポリヌクレオチドの使用が、心臓組織に特異的であることが知られている他のプロモーターに関するレベルを上回る、高いレベルの発現を本発明の系に提供することを示しており、その差は１００の因数を越えることが可能である。これらの要素は、それ故、心臓組織での目的とする核酸の発現に関して、強度と特異性の見地から本発明に従ったポリヌクレオチドの利点と予想外の特性を例証する。
【００２０】
好都合には、本発明に従ったポリヌクレオチドは、転写位置＋１に対して、−２２６６から＋９２までの配列の部分を含み、その配列を配列番号１として付属物に示す。
【００２１】
本発明の対象は、それ故、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の配列とハイブリダイズする配列である。
【００２２】
本発明は、それにもかかわらず、マウス遺伝子の上流のフラグメントを含むポリヌクレオチドに限定されず、同じ特性を持つ、すなわち心臓組織においてインビボで導入遺伝子の発現を特異的に誘導することができる、いかなる機能的変異体又は他のいかなる種の他のいかなる配列にも関する。
【００２３】
そこで、当業者は、ＡＦ１３１８８４の参照番号の下にＧｅｎＢａｎｋに寄託されているヒト遺伝子の上流配列を好都合に参照することができる。その配列を配列番号２として付属物に示す。本発明は、従って、例えば一部の構造の欠失によって修飾されているが、配列番号１の配列と同じか又は類似した機能を保持する、ＣＡＲＰタンパク質についての遺伝子の上流配列のフラグメントを含むいかなる配列もカバーする。
【００２４】
好ましくは、本発明に従ったポリヌクレオチドは、配列番号２の配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を示す。
【００２５】
発現の機能的変異体は、上述したようなポリヌクレオチドの特性を保持する、何らかの修飾された配列を意味すると理解される。修飾は、考慮される配列内のヌクレオチドの１又はそれ以上の付加、突然変異、欠失及び／又は置換を含みうる。これらの修飾は、特に部位指定突然変異誘発のような従来の分子生物学の方法によって、又はより実際的にはシンセサイザーでの配列の人工合成によって導入しうる。得られた変異体をその後、配列番号１の配列を持つポリヌクレオチドと同等の、心筋細胞における発現の特異性を制御する能力に関して試験する。
【００２６】
本発明のもう１つの対象は、上記で定義されるようなポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、任意に該ポリヌクレオチドの発現が心筋において特異的に指令されるように導入遺伝子に作動可能に連結された発現カセットに関する。
【００２７】
好都合には、本発明のカセットは、導入遺伝子のヌクレオチド配列の３’に位置する、転写の終結のためのシグナルをさらに含む。
【００２８】
好ましくは、導入遺伝子は、心不全、心肥大、低酸素症、虚血のような心臓疾患又は心臓移植拒絶反応に関与しうるタンパク質又はＲＮＡをコードする、治療目的の核酸を含む。
【００２９】
治療目的のタンパク質として、中でも特に次のものが挙げられる：
−例えばＶＥＧＦファミリーの成員、ＦＧＦファミリーの成員、より特定するとＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、アンギオゲニン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、散乱因子（Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ）／ＨＧＦ、アンギオポエチンファミリーの成員、サイトカイン、特にＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８を含めたインターロイキン、アンギオテンシン−２、プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、活性脂質の合成に関わる分子（プロスタグランジン、Ｃｏｘ−１）のような、血管新生を誘導するタンパク質；
−ホスホランバン、ホスホランバン阻害因子、ＳＥＲＣＡ−２ａ、β２−アドレナリン受容体あるいはジストロフィン又はミニジストロフィン（ＦＲ９１  １１９４７号）のような、心筋収縮能の制御に関与するタンパク質；
−ｂｃｌファミリーの成員であるタンパク質のような、特にアポトーシスを遮断する、低温防護作用を持つタンパク質、及びＡＫＴ／ＰＫＢのようなプロテインキナーゼ；
−例えば融合タンパク質ｔｅｔＲ−ＮＬＳ−ＶＰ１６、エストロゲン受容体から誘導される融合タンパク質、ステロイドホルモン受容体から誘導される融合タンパク質、プロゲステロン受容体から誘導される融合タンパク質、Ｒｉｖｅｒａら（Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（１９９６）１０２８−１０３２）が記述しているＣＩＤ（二量体化の化学的誘導物質（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ））系のタンパク質のような、ＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン及び転写活性化又は抑制ドメインを含む、例えば天然又はキメラ核内受容体のような転写因子。特に、キメラ核内受容体として、核内受容体ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））、特に、一次構造の修飾を伴わないその天然形態の、あるいは配列番号３の配列を持つＰＰＡＲγ２のような１又はそれ以上のリガンド結合部位又はＥ／Ｆドメインを含む修飾されたＰＰＡＲγ２としての（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３０２（１９９６）９３−１０９）、特許出願第ＷＯ９６／２３８８４号及び第ＦＲ９９０７９５７号において、またＦｒｏｈｎｅｒｔら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（１９９９）３９７０−３９７７）及びＭｕｋｈｅｒｊｅｅら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（１９９７）８０７１−８０７６）によって述べられているような、ＰＰＡＲγ２が挙げられる；
−免疫シグナル伝達経路を完全に又は部分的に阻害し、それによって心臓移植の期間を延長することを可能にする、例えばインターロイキン２及び１０のような免疫抑制因子；
−ＮＯＳ（一酸化窒素シンテターゼ）、Ｂ細胞白血病／リンパ腫２（ｂｃｌ−２）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びカタラーゼのような低酸素症を軽減するために作用物質として関与するタンパク質。
【００３０】
治療目的のＲＮＡとして、例えば遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御し、それ故、欧州特許第ＥＰ１４０３０８号に述べられている手法に従ってタンパク質への翻訳を遮断するために有用であるアンチセンスＲＮＡ、ならびに欧州特許第ＥＰ３２１２０１号に述べられているような標的ＲＮＡを選択的に破壊することができるリボザイムが挙げられる。
【００３１】
本発明はタンパク質又はＲＮＡの特定例に限定されず、当業者により、単純な慣例的実験操作によって、心臓細胞におけるいかなる核酸の発現のためにも使用されうることは明白である。
【００３２】
本発明の対象は、さらに、本発明に従ったポリヌクレオチド又は発現カセットを含むベクターである。そのようなベクターは、標的組織における導入遺伝子の発現のために必要な他のいかなるＤＮＡ配列も含むことができ、特に心臓細胞において有効な複製起点を含みうる。
【００３３】
本発明のベクターは多様であり、特にプラスミド、エピソーム、染色体、ウイルス又はファージ、天然及び／又は起原でありうる。好ましくはプラスミド又は組換えウイルスである。
【００３４】
ポリヌクレオチド又は発現カセットを含むプラスミドの例示として、例えば下記で述べるプラスミドｐＸＬ３６３４、ｐＸＬ３７２８及びｐＸＬ３７５９が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
第一の実施態様に従えば、本発明に従ったベクターはプラスミド型である。プラスミドベクターとして、中でも特に、当業者に既知であり、一般に複製起点を含むクローニング及び／又は発現プラスミドが挙げられる。また、例えば特許出願第ＷＯ９６／２６２７０号に述べられているような、洗練された複製起点及び／又はマーカーを担う新世代プラスミドが挙げられる。
【００３６】
好ましい実施態様に従えば、プラスミドベクターはミニプラスミドであり、宿主細胞におけるその機能性が、該細胞に特異的であり、外来性である少なくとも１つのタンパク質の存在を必要とする複製起点を含む。そのようなベクターは、特に特許出願第ＷＯ９７／１０３４３号に述べられている。
【００３７】
第二の実施態様に従えば、本発明に従ったベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの中で、特に、その調製が当業者に既知の方法に従って実施しうる、組換えアデノウイルス、組換えアデノ関連ウイルス、組換えレトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスが挙げられる。好ましくは、特に特許出願第ＷＯ９５／２２６１７号に述べられているアデノウイルス−レトロウイルスキメラベクター、ならびにＬｅｂｌｏｉｓら（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２０００）１（４）、３１４−３２２）及び特許出願第ＷＯ９７／４７７５７号に述べられているエピソーム／アデノウイルスベクターのようなキメラウイルスベクターを使用する。
【００３８】
この実施態様に従ってアデノウイルスを使用するとき、これらは好ましくは欠損アデノウイルスから誘導されるベクターである、すなわちそれらは標的細胞において自律的に複製することができない。これらの欠損ウイルスの構築ならびにそれらの感染特性は文献で広く記述されている（特にＳ．ＢａｅｃｋとＫ．Ｌ．Ｍａｒｃｈ，Ｃｉｒｃｕｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８２（１９９８）２９５−３０５）；Ｔ．Ｓｈｅｎｋ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙら（１９９６）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ｉｎ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２１１−２１４８，ＥＤＳ−Ｒａｎｅｓ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｓ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；Ｙｅｈ，Ｐ．ら、ＦＡＳＥＢ  １１（１９９７）６１５−６２３参照）。
【００３９】
構造と特性が幾分異なる様々なアデノウイルス血清型が特性付けられている。これらの血清型の中で、本発明に関しては２型又は５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）あるいは特許出願第ＦＲ９３０５９５４号に述べられているもののような動物由来のアデノウイルス又は混合由来のアデノウイルスの使用が好ましい。本発明に関連して使用できる動物由来のアデノウイルスの中で、イヌ、ウシ、マウス（Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、鳥類又はサル由来のアデノウイルスが挙げられる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくは特許出願第ＷＯ９４／２６９１４号に述べられているようなＣＡＶ２アデノウイルス（Ｍａｎｈａｔｔａｎｎ又はＡ２６／６１株）である。
【００４０】
本発明の欠損アデノウイルスは一般に、各々の末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、キャプシド被包を可能にする配列（Ｐｓｉ）、Ｅ１遺伝子、そして当業者に既知の手法によってさらに不活性化されたＥ２、Ｅ４及びＬ１−Ｌ５遺伝子の少なくとも１つを含む（Ｌｅｖｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１（１９９１）１９５、欧州特許第１８５５７３号；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ  Ｊ．３（１９８４）２９１７）。
【００４１】
好都合には、本発明に関連して使用する組換えアデノウイルスは、そのゲノムのＥ１領域内に欠失を含む。より特定すると、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ領域の欠失を含む。厳密な例として、ヌクレオチド４５４−３３２８、３８２−３４４６又は３５７−４０２０に影響を及ぼす欠失が挙げられる（Ａｄ５のゲノムに関して）。
【００４２】
好ましい変法に従えば、本発明に関連して使用する組換えアデノウイルスは、さらに、そのゲノムのＥ４領域内に欠失を含む。より特定すると、Ｅ４領域の欠失はすべてのオープンリーディングフレームに影響を及ぼす。厳密な例として、３３４６６−３５５３５又は３３０９３−３５５３５の欠失が挙げられる。Ｅ４領域における他の種類の欠失が特許出願第ＷＯ９５／０２６９７号及びＷＯ９６／２２３７８号に述べられており、それらは参照してここに組み込まれる。
【００４３】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）については、それらは、感染する細胞のゲノム内に安定且つ部位特異的に組み込まれる比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の増殖、形態又は分化への影響を誘発することなく、広いスペクトルの細胞に感染することができる。さらに、それらはヒトにおける疾病には関与しないと思われる。ＡＡＶゲノムはクローン化され、配列決定され、特性付けられている。約４７００個の塩基を含み、各々の末端に、ウイルスのための複製起点として働く約１４５塩基の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を持つ。ゲノムの残りの部分は、キャプシド化機能を担う２つの必須領域に分けられる：ウイルスの複製とウイルス遺伝子の発現に関わるｒｅｐ遺伝子を含む、ゲノムの左側部分、ウイルスキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む、ゲノムの左側部分。
【００４４】
インビトロ及びインビボでの遺伝子の移入のためのＡＡＶ由来のベクターの使用は文献の中で記述されている（特にＷＯ９１／１８０８８号；ＷＯ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、欧州特許第４８８５２８号参照）。これらの特許出願は、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が欠失して、目的とする遺伝子で置換された様々なＡＡＶ由来の構築物、及び目的とする該遺伝子をインビトロ（培養細胞上に）又はインビボ（直接生物内に）で移入するためのそれらの使用を述べている。本発明に従った欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）にはさまれた本発明の核酸を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド化遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を担うプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞系統にコトランスフェクションすることによって作製しうる。産生された組換えＡＡＶを、その後、従来の手法によって精製する。
【００４５】
レンチウイルスもこの実施態様に従って使用しうる；それらは、目的とする遺伝子の静止細胞への移入と効率的で安定な組込みを可能にする。
【００４６】
例えばＦＩＶ（ネコ伝染性ウイルス）、ＥＩＡＶ（ウマ伝染性貧血ウイルス；ＷＯ９８／５１８１０号）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、ＣＡＥＶ（ヤギ関節炎脳脊髄炎ウイルス）（ＷＯ９８／３９４６３号；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２（１９９６）２６３−２６７；Ｓｃｈｎｅｌｅら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  １１（２０００）４３９−４４７）のような動物レンチウイルスのＨＴＬＶ−１、又はヒトではあまり病原性が高くない、ＡＩＤＳを引き起こすものに関連するレンチウイルス、ＨＩＶ−２（Ｋｕｎｄｒａら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  ９（１９９８）１３７１−１３８０）が挙げられる。
【００４７】
発現カセットは組換えゲノムの様々な部位に挿入することができる。抑圧された又は過剰の配列の置換として、Ｅ１、Ｅ３又はＥ４領域のレベルに挿入しうる。また、ウイルスの産生のためにシスで必要な配列（ＩＴＲ配列及びキャプシド化配列）の外側の、他のいかなる部位でも挿入しうる。
【００４８】
しかし、上述したベクターへの本発明に従った配列の導入は必須ではないので、これらの配列を含むＤＮＡで心臓細胞を直接トランスフェクションしうることに留意すべきである。
【００４９】
本発明に従った核酸配列は、核酸を、それらの細胞内への侵入又は核内への輸送を促進する化合物と共有結合し、生じた複合体を任意に、国際特許出願第ＷＯ９４／２７２３８号におけるようにポリマー微粒子にキャプシド化した後、導入することができる。
【００５０】
もう１つの実施態様に従えば、核酸配列を、国際特許出願第ＷＯ９５／１０５３４号におけるように、それらの細胞内への侵入を促進するポリペプチドを含むトランスフェクション系に含めることができる。
【００５１】
これらのポリヌクレオチド、カセット及びベクターは、当業者に既知の何らかの手段によって、例えば冠状動脈注入によって（Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１（１９９４）５１−５８）、心臓内注射によって、心外膜注射によって、すなわち心室壁を通して（Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ  Ｒｅｓ，７３（１９９３）１２０２−１２０７）、心膜内注射によって（Ｆｒｏｍｅｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，６（１９９９）６８３−６８８）、又は冠状静脈のレトロフュージョン（ｒｅｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）によって（Ｂｏｅｃｋｓｔｅｇｅｒｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１００（Ｓｕｐｐｌ  Ｉ）（１９９９）、Ｉ−８１５）、インサイチューで投与することができる。
【００５２】
本発明に従ったポリヌクレオチド、カセット又はベクターは、例えばそれらの心臓細胞へのトランスフェクションを促進する化学的又は生化学的移入剤の助けを得て、それらを含有する組成物の形態で好都合に投与しうる。「化学的又は生化学的移入剤」の表現は、細胞内への核酸の侵入を促進する何らかの化合物を意味すると理解される。これは、カチオン脂質、ペプチド、ポリマー（ポリエチレンイミン、ポリリシン）、ナノ粒子のようなカチオン物質、あるいは非カチオンリポソーム、非カチオンナノ粒子又はポリマーのような非カチオン物質を含みうる。そのような物質は当業者に周知であり、特に特許出願第ＷＯ９５／１８８６３号、ＷＯ９７／１８１８５号及びＷＯ９８／１５６３９号に述べられている。
【００５３】
本発明は、さらに、そのようなポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含有する薬剤、ならびに医薬上適合性の賦形剤と共に医薬上有効な量でそれらを含有する医薬組成物に関する。
【００５４】
そのようなポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターは、心臓病の治療のため、特に心不全、低酸素症、心肥大、心筋炎、心臓虚血の治療及び／又は予防のため、又は心臓移植の際の拒絶反応を予防するために、特に目的とするタンパク質をコードする遺伝子を発現しうる心臓組織に供給送達するための薬剤の製造のために好都合に使用しうる。
【００５５】
そのような薬剤は、例えば、治療することを所望する心臓疾患に応じた損傷遺伝子の機能的形態を発現することができる、本発明に従ったカセット又はベクターを含有しうる。
【００５６】
好ましくは、医薬組成物は、注射用製剤、特に心臓内注射のための医薬適合性の賦形剤を含有する。これは特に、等張無菌塩類溶液（一ナトリウム又は二ナトリウムリン酸塩、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウム等、又はそのような塩の混合物）、あるいは、場合によって、滅菌水又は生理食塩水を加えて注射用溶液を調製することができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物を含みうる。例えばヒドロゲルのような他の賦形剤も使用しうる。このヒドロゲルは、何らかの生体適合性で非細胞傷害性の（ホモ又はヘテロ）ポリマーによって調製しうる。そのようなポリマーは、例えば特許出願第ＷＯ９３／０８８４５号に記述されている。特にエチレン及び／又はプロピレンオキシドから得られるもののように、それらの一部は市販されている。注射のために使用する用量は、様々なパラメータに従って、特に求める目的（標識化、病理学、スクリーニング等）、発現する導入遺伝子、又は所望する発現の期間に従って調節しうる。
【００５７】
一般に、本発明に従った組換えアデノウイルスは、１０４〜１０１４ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１０ｐｆｕの用量の形態で製剤し、投与する。ｐｆｕ（プラーク形成単位）の語はウイルス溶液の感染力に相当し、適切な細胞培養を感染させて、感染細胞のプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための手法は当該技術において周知である。
【００５８】
本発明の対象は、さらに、治療目的の導入遺伝子が発現されうるように、本発明に従ったポリヌクレオチド、カセット又はベクターを使用する際に該導入遺伝子を発現する方法である。
【００５９】
さらに、本発明はまた、上述したようなカセット又はベクター（特にアデノウイルス）で修飾された細胞に関する。「修飾された」細胞との表現は、本発明に従ったポリヌクレオチド又はカセットを含有する細胞を意味すると理解される。これらの細胞は、特許出願第ＷＯ９５／１４７８５号に述べられている方法に従って、生体内への移植が意図されうる。これらの細胞は基本的にヒト心臓細胞である。
【００６０】
本発明はまた、トランスジェニック動物、特に治療目的のタンパク質をコードする遺伝子がレポーター遺伝子で置換されている、上記で定義したようなポリヌクレオチド又はカセットを担うマウスに関する。そのようなトランスジェニックマウスは、ＣＡＲＰタンパク質をコードする遺伝子の調節配列への作用に関して分子をスクリーニングするために使用しうる。
【００６１】
分子をマウスに投与し、犠牲剖検した後、レポーター遺伝子で染色された組織を特定するために組織切片を調製する。
【００６２】
本発明に従ったトランスジェニック動物はまた、心不全、心肥大、心筋過形成及び心筋梗塞のような遺伝的由来の心臓疾患の基礎となる分子機序を理解するための分子生物学試験の手段を構成する。
【００６３】
例として、インターフェロン−１（ＩＦＮ−１）をコードする遺伝子が不活性化される心筋炎を検討するためのマウスモデルが挙げられる（Ａｉｔｋｅｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０（１９９４）１−１３９）。
【００６４】
本発明に従って対象とする他の動物モデルは、癌原遺伝子又は癌遺伝子、例えば過形成のモデルを構成するｃ−ｍｙｃ（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１０（１９９０）３７０９−３７１６）、心室肥大のモデルのためのｐ２１−ｒａｓ（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７０（１９９５）２３１７６−２３１７８）、一部の心筋症を検討するためのエプスタイン−バーウイルスの核抗原（Ｈｕｅｎら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７４（１９９３）１３８１−１３９１）のような導入遺伝子に連結された、本発明に従ったポリヌクレオチドを含みうる。
【００６５】
もう１つの実施態様に従えば、本発明に従ったトランスジェニック動物は心臓肥大の実験モデルを構成し、導入遺伝子が、例えばカルモジュリン（Ｇｒｕｖｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３３（１９９３）３７６−３８８）、インターロイキン−６又はインターロイキン−６受容体（Ｈｉｒｏｔａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９２（１９９５）４８６２−４８６６）、カルジオトロフィン−１（Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９２（１９９５）１１４２−１１４６）、及び最後にα−アドレナリン受容体（Ｍｉｌａｎｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９２（１９９４）１０１０９−１０１１３）をコードする発現カセットを含む。
【００６６】
それに加えて、ＣＡＲＰ遺伝子の発現上昇を可能にするように修飾された、本発明に従ったポリヌクレオチドも本発明の一部を形成する。そのようにして得られるトランスジェニック動物は、心筋梗塞のための実験ツールを構成する（Ｓｔａｎｔｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌ  Ｒｅｓ，８６（２０００）９３９−９４５）。
【００６７】
本発明を実施するために、当業者は、次のマニュアル「ＳＡＭＢＲＯＯＫら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）」、又はその最近の版の１つを好都合に参照することができる。
【００６８】
下記の実施例を用いて本発明をより詳細に述べるが、実施例は例示であり、非制限的とみなされるべきである。
【実施例１】
【００６９】
ＣＡＲＰ遺伝子の上流ポリヌクレオチドの特性付け
ＣＡＲＰタンパク質をコードするマウス遺伝子の５’にある配列の２．３ＫｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントをクローン化し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を用いてチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、ＰＮＡＳ，７４、５４６３）に従って両方の鎖について塩基配列決定した。その配列は図１に示されており、それ故、転写位置＋１に対してヌクレオチド−２２６６から＋９２までのマウスＣＡＲＰタンパク質をコードする遺伝子の上流部分（配列番号１）を含む。
【実施例２】
【００７０】
ＣＡＲＰプラスミドベクターの構築
２．１  プラスミドｐＸＬ３６３４
プラスミドｐＸＬ３６３４を得るために、実施例１で特性付けた２．３ＫｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位の充填後、あらかじめＸｈｏＩとＳｍａＩで消化しておいたプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。このプラスミドの図式的表示を図３に示す。
【００７１】
２．２  プラスミドｐＸＬ３７２８
プラスミドｐＸＬ３７２８は、ヒト線維芽細胞インターフェロンのシグナルペプチドとＦＧＦ１（線維芽細胞増殖因子１）のｃＤＮＡとの融合（ｓｐ−ＦＧＦ１、Ｊｏｕａｎｎｅａｕら、ＰＮＡＳ  ８８（１９９１），２８９３−２８９７）をコードする遺伝子を、ヒトサイトメガロウイルス初期領域（ｈＣＭＶ  ＩＥ）及びＳＶ４０ウイルス後期領域のポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ  ＳＶ４ＣＧ）から得られるプロモーターの制御下で導入したプラスミドｐＸＬ２７７４（ＷＯ９７／１０３４３号）から誘導されるベクターである、プラスミドｐＸＬ３１７９から得られる。
【００７２】
プラスミドｐＸＬ３７２８を得るために、その末端を充填した、実施例１で特性付けた２．３ＫｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、あらかじめＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化しておいたプラスミドｐＸＬ３１７９（ｐＣＯＲ  ＣＭＶ−ＦＧＦ）にクローン化した。このプラスミドの図式的表示を図４に示す。
【００７３】
２．３  プラスミドｐＸＬ３７２９
プラスミドｐＸＬ３７２９を得るために、プラスミドｐＸＬ３６３４のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを、あらかじめＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩで消化しておいたプラスミドｐＸＬ３７２８にクローン化した。
【実施例３】
【００７４】
比較プラスミド
３．１  プラスミドｐＸＬ３１３０及びｐＸＬ３１５３
プラスミドｐＸＬ３１３０及びｐＸＬ３１５３はそれぞれ、特許出願第ＷＯ００／１８９０８号に述べられているようにＣＭＶエンハンサー（−５２２、−６３）に連結されたヒト平滑筋α−アクチンプロモーター（−６８０、＋３０）及びマウスＳＭ２２プロモーター（−４３６、＋４３）を含む。
【００７５】
３．２  プラスミドｐＸＬ３６３５
ＲＳＶ−２２９、＋３４プロモーターを、ＲＳＶプロモーターのより長いバージョンを含む構築物（Ａｄ１．０ＲＳＶＬＡｃＺに含まれる、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９０（１９９２）６２６−３０）から、それぞれＰＣＲフラグメントの５’と３’にＳｗａＩとＸｂａＩ部位を導入するプライマー、５’−ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＴＧＣ  ＡＡＴ−３’及び５’−ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  Ａ−３’を用いたＰＣＲによってクローン化した。次にこれら２つの制限部位を使用してプロモーターフラグメントをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃに導入し、ｐＸＬ３６３５を作製した。
【００７６】
３．２  プラスミドｐＸＬ３０３１
プラスミドｐＸＬ３０３１はＳｏｕｂｒｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６（１９９９）、１４８２−８によって述べられている通りである。ｐＧＬ３ｂａｓｉｃから得られる修飾Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（細胞質性）をコードするｌｕｃ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＶＵ４７２９５）を、ヒトサイトメガロウイルス初期領域（ｈＣＭＶ  ＩＥ，ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＳ５ＩＥＥ）から得られるプロモーター及びＳＶ４０ウイルス後期領域のポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ  ＳＶ４ＣＧ）の制御下で導入したプラスミドｐＸＬ２７７４（ＷＯ９７／１０３４３号）から誘導されるベクターである。
【実施例４】
【００７７】
細胞培養
ラット心筋細胞の初代培養を樹立した。そのために、ＣＯ２で飽和した室内で妊娠ラットを死亡させた。腹部を開いた後、子宮角を切除し、ＰＢＳ中、室温で洗う。胚をその膜から切り離し、胎盤を切断する（１ラット当り１０から１２の胚）。心臓を切除し、ＡＤＳ／グルコース中で洗う。双眼レンズ下に、耳介と大脈管を切除し、その後心室だけを保持するように心臓を再びＡＤＳ／グルコース中で洗浄し、滅菌ＡＤＳ／グルコース中で３回すすぐ。
【００７８】
次に、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌのトリプシンＴ  ４６７４（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を使用して、静かに攪拌しながら（１分当り６０から１００回転）３７℃で２０分間、各心臓当りＡＤＳ／グルコース／トリプシン混合物０．３ｍｌ中で心臓をトリプシン処理する。
【００７９】
その後上清を取り除き、補体除去したＦＣＳ  １ｍｌを加えてトリプシンを不活性化する。１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を除去し、心臓細胞を補体除去ＦＣＳ  １ｍｌ中に取る。平行して、細胞の完全な分離が得られるまで、トリプシンによる処理の段階を５から６回反復する。細胞のプールを１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次にＦＣＳ中で２回洗って、最後に細胞をグリッドフィルターでろ過する。
【００８０】
そのようにして分離した細胞を、２４穴平板については１０６細胞／穴の濃度で、又は１２穴平板については２×１０６細胞／穴の濃度で培養に入れる。各々の穴は培地１ｍｌを含む。
【００８１】
培地は、総容量１００ｍｌについて、ＤＭＥＭ  ６８ｍｌ（ピルビン酸不含）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｍ１９９  １７ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ  ４５３０）、補体除去ウマ血清  １０ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｈ６７６２）、補体除去ＦＣＳ  ５ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）及び１００×Ｐｅｎｉ／Ｓｔｒｅｐｔｏ／グルタミン混合物１ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含む。
【００８２】
心筋細胞を約１又は２日間培養する。
【実施例５】
【００８３】
心筋細胞の初代培養のトランスフェクション
心筋細胞の初代培養を、プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ  １ｎｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、上述したようなプラスミドｐＸＬ３６３５及びｐＸＬ３６３４の各々１ｎｇから１００ｎｇの範囲の可変量、ｐＵＣ１９の適量５００ｎｇを含む、各穴につき５００ｎｇに等しい総量のＤＮＡとコトランスフェクションする。
【００８４】
そのために、プラスミドの混合物を、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、重炭酸塩５０ｍＭ中２０μｌの最終容量でＤＮＡ  １μｇ（１０ｍＭの脂質溶液０．３μｌ）につきＲＰＲ  １２０５３５Ｂ  ６ｎｍｏｌ（Ｂｙｋら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．４１（１９９８）２２９−３５）と共にインキュベートし、次に５秒間渦動攪拌して、室温で再び約２０分から３０分間インキュベートする。
【００８５】
その後混合物を無血清培地２５０μｌに加え、細胞と共に少なくとも２時間インキュベートする。最後に培地を取り出し、細胞を５％ＣＯ２の存在下に３７℃の温度で２４時間から７日間までの期間インキュベートする。
【００８６】
トランスフェクション後２４時間目又は４８時間目に細胞を採集し、Ｒｅｎｉｌｌｉａルシフェラーゼ及びＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ  Ｌｕｃキットにより、製造者の指示に従って分析する。Ｖｉｃｔｏｒ装置で活性を読み取る。
【実施例６】
【００８７】
ポリヌクレオチドのインビトロ活性の比較評価
ＣＡＲＰポリヌクレオチド（ｐＸＬ３６３４）及びＲＳＶ（ｐＸＬ３６３５）プロモーターの相対活性を、ラット心筋細胞の初代培養での一過性トランスフェクションにおいてインビトロで評価し、プラスミドｐＲＬ−ＣＭＶの活性と比較して表示した（図５）。
【００８８】
結果は、使用したＣＡＲＰ遺伝子の上流ポリヌクレオチド（ｐＸＬ３６３４）が、ＣＭＶプロモーターのものに比べて０．０４％というレベルの非常に低いインビトロ活性を持つことを示している。
【００８９】
非特異的で強力なＲＳＶプロモーター（ｐＸＬ３６３５）の相対活性もやはり低く、それぞれ標準ＣＭＶプロモーターの０．０５％と０．６８％である。
【実施例７】
【００９０】
アデノウイルスの構築
ＣＡＲＰプロモーターの制御下でルシフェラーゼの発現を可能にするアデノウイルスをＣｒｏｕｚｅｔら（ＰＮＡＳ，９４（１９９７）１４１４−１４１９）の方法に従って構築し、発現カセットはプラスミドｐＸＬ３６３４のものと同じであった（図３）。
【００９１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えを可能にするシャトルベクターを２段階で構築した。第一に、プラスミドｐＸＬ３７５８を作製するためにＣＡＲＰプロモーター（フラグメント：クレノウ／ＢａｍＨＩで充填したＸｈｏＩ）をＩＴＲ−ΨとｐＩＸ領域の間でｐＸＬ３４７４（ＳｃａＩ及びＢｇｌＩＩで消化した）に導入した。次に、ＢｓｔＢＩＩ（クレノウで充填した）及びＢｓｔＥＩＩで消化したｐＸＬ３７５８に、ルシフェラーゼｃＤＮＡとＳＶ４０ポリアデニル化部位を含むフラグメント（ｐＸＬ３６３４のクレノウ／ＢｓｔＥＩＩで充填したＢａｍＨＩフラグメント）を導入することによってｐＸＬ３７５９を作製した。ｐＸＬ３７５９を図６Ａに図式的に示す。
【００９２】
大腸菌における相同的二重組換えを、ＲＳＶ−ＬａｃＺ発現カセットがＥ１領域に導入されているΔＥ１／ΔＥ３アデノウイルスゲノムを含有するプラスミドｐＸＬ３２１５に対して、上述したように実施した。プラスミドｐＸＬ３２１５は、プラスミドＲＫ２の複製起点、テトラサイクリン耐性遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ２６８９の誘導体である（Ｃｒｏｕｚｅｔら、ＰＮＡＳ，１９９７）。この二重組換えの産物であるプラスミドｐＸＬ３７７８を、発現カセットの塩基配列決定によって調べる。線状ウイルスゲノムを遊離するためにＰａｃＩで開裂した後、ウイルスＡＶ１．０ＣＡＲＰ−Ｌｕｃ＋を作製するためにプラスミドをＰｅｒ．Ｃ６細胞系統（ＷＯ９７／００３２６号）にトランスフェクションする。
【００９３】
ウイルスを制限分析による発現カセットの配列決定によっても検討し、ＲＣＡ  Ｅ１＋（複製コンピテントアデノウイルス）粒子の存在をプローブΨとのハイブリダイゼーションによって試験する。
【００９４】
Ｐｅｒ．Ｃ６系統でのウイルスの増幅によって高いウイルス力価を持つ株を入手し、ウイルス粒子をＣｓＣｌ勾配で精製する。ウイルス粒子中のこのウイルスの力価／ｍｌ（ｖｐ／ｍｌ）をクロマトグラフィーによって調べ、骨格筋又は心筋細胞の感染後のルシフェラーゼ活性の滴定によってインビトロでその活性を測定して、対照として使用したＣＭＶプロモーターを含むウイルスと比較する。
【実施例８】
【００９５】
インビボでのＤＮＡの注入
体重２００ｇのＣＤ  ＳＰＲＡＧＵＥラットを、１ｍｌ／ｋｇのケタミン（７０ｍｇ／ｍｌ）／キシラジン（６ｍｇ／ｍｌ）混合物を腹腔内経路で注射して麻酔する。
【００９６】
開腹後、停止フランジとＢＤ  ２６Ｇ＊３．８針（短ベゼル）を備えるＳｔｅｒｉｆｌｅｘカテーテル（参照番号１６７．１０  Ｇ１９  Ｖ）に接続した１００μｌハミルトンガラスシリンジにより、経横隔膜経路で心筋内注射を実施する。
【００９７】
ＮａＣｌ  ０．９％に調整したＤＮＡ溶液５０μｌを５秒間注入する。
【００９８】
動物を犠牲死亡させた後、心臓を切除し、０．９％ＮａＣｌ溶液中で洗って、顕微鏡検査する。次にそれらを、プロテアーゼ阻害因子（ＣＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を補足したキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１５１Ａ）内の溶解緩衝液中で、ホモジナイザー（Ｕｌｔｒａ−ｔｈｕｒａｘ，Ｄｉａｘ６００  Ｈｅｉｄｏｌｐｈ）を用いて摩砕し、４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、該キットによってルシフェラーゼ活性を分析する。装置：ＬＵＭＡＴ  ＬＢ  ９５０１（上清１０μｌ＋Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ基質５０μｌ）で読取りを行う。Ｍｉｒら（ＰＮＡＳ  ９６（１９９９）４２６２−４２６７）が述べている検定法を用いてルシフェラーゼ活性を心臓当りのルシフェラーゼ質量（ｐｇルシフェラーゼ／心臓）に変換する。
【００９９】
代替的には、心臓を３．７％パラホルムアルデヒドに固定し、ＦＧＦ−１の発現に関して免疫組織化学によって分析する。
【実施例９】
【０１００】
ＣＡＲＰポリヌクレオチドのインビボ活性の比較評価
図７Ａにまとめた結果は、プラスミドｐＸＬ３０３１とｐＸＬ３６３４の１、５、２５及び１２５μｇの漸増用量を注射したときに得られるルシフェラーゼの発現レベルが有意の異ならないことを示しており、従ってＣＡＲＰ遺伝子の上流ヌクレオチドがＣＭＶのような強力なプロモーターのものに等しい高いレベルの発現を誘導しうることを明らかに証明している。
【０１０１】
他方で、もう１つの強力なウイルスプロモーター、ＲＳＶプロモーター（ｐＸＬ３６３５）に関して得られる発現は、ＣＭＶプロモーター又はＣＡＲＰ遺伝子の上流ポリヌクレオチドで得られるものよりも弱い（図７Ｂ）。
【０１０２】
さらに、平滑筋細胞プロモーターの上流のＣＭＶエンハンサー（ＳＭ  α−アクチン、ｐＸＬ３１３０又はＳＭ２２、ｐＸＬ３１５３）の付加は、インビトロで非常に効率的であることが明らかにされているが（ＷＯ００／１８９０８号）、インビボで心臓細胞においては無効であると思われる。
【実施例１０】
【０１０３】
ＣＡＲＰポリヌクレオチドの発現の特異性の評価
プラスミドｐＸＬ３６３４、ｐＸＬ３４３５及びｐＸＬ３０３１の各々２５μｇを心臓内経横隔膜注射によってラットに投与した。
【０１０４】
平行して、エレクトロトランスファーを伴って又は伴わずに、マウスの群の頭蓋脛側筋にこれらのプラスミド各々１０μｇの筋肉内注射を実施した。
【０１０５】
上述したような注射から７日後にルシフェラーゼの発現を分析した（ＰＮＡＳ  ９６（１９９９）４２６２−４２６７）。
【０１０６】
心臓におけるルシフェラーゼの発現レベルを頭蓋脛側筋で認められたレベルと比較して表示し、図８にまとめている。
【０１０７】
結果は、ＣＡＲＰ遺伝子の上流ポリヌクレオチドとＣＭＶプロモーターが、心臓組織において最も高い発現を誘導することができるただ２つのプロモーターであることを明らかに示している。しかし、心臓／筋の発現比率はＣＭＶプロモーターに関しては１であるが、ＣＡＲＰ遺伝子の上流ポリヌクレオチドを使用するときにはこの比率が１００に近く、心臓組織に対する後者の非常に高い選択性を明らかに示している。
【０１０８】
ポリヌクレオチドの発現の特異性の卓越性はまた、タンパク質ＳＭ−２２及びアクチンをコードする遺伝子のもののような、平滑筋細胞に特異的なエンハンサーとプロモーターを含む他の構築物に対しても明らかであり、それらについても心臓／筋発現比率を例示として図８に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】マウスＣＡＲＰタンパク質をコードする遺伝子の上流ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】ヒトＣＡＲＰタンパク質をコードする遺伝子の上流ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３】プラスミドｐＸＬ３６３４の図式的表示である。
【図４】プラスミドｐＸＬ３７２８の図式的表示である。
【図５】ＣＭＶプロモーター（ｐＲＬ−ＣＭＶ）の標準活性に対する、プラスミドｐＸＬ３６３５及びｐＸＬ３６３４のインビトロでの相対活性を示す。各々のプロモーターの活性は、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ活性で基準化したＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ活性を表わす。
【図６Ａ】プラスミドｐＸＬ３７５９の図式的表示である。
【図６Ｂ】アデノウイルスＡＶ１．０  ＣＡＲＰ−Ｌｕｃ＋の図式的表示である。
【図７Ａ】ラットに様々な量のプラスミドｐＸＬ３０３１及びｐＸＬ３６３４を心臓内経横隔膜注射した後７日目のルシフェラーゼ活性（ｐｇルシフェラーゼ／心臓）を示す。
【図７Ｂ】ラット心臓に２５μｇのプラスミドｐＸＬ３０３１及びｐＸＬ３６３５、ｐＸＬ３１３０、及びｐＸＬ３１５３を心臓内経横隔膜注射した後７日目のルシフェラーゼ発現（ｐｇルシフェラーゼ／心臓）を示す。
【図８】プラスミドｐＸＬ３０３１、ｐＸＬ３６３４、ｐＸＬ３６３５、ｐＸＬ３１５３、及びｐＸＬ３１３０の心臓内投与後に得られた心臓における発現の関数としての、心筋での発現に対する心臓でのルシフェラーゼの発現の比率を表わす。
【図１】
2004519222.tif 000002
【図２】
2004519222.tif 000003
【図３】
2004519222.tif 000004
【図４】
2004519222.tif 000005
【図５】
2004519222.tif 000006
【図６Ａ】
2004519222.tif 000007
【図６Ｂ】
2004519222.tif 000008
【図７Ａ】
2004519222.tif 000009
【図７Ｂ】
2004519222.tif 000010
【図８】
2004519222.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2004519222.tif 000012
2004519222.tif 000013
2004519222.tif 000014
2004519222.tif 000015
2004519222.tif 000016
2004519222.tif 000017
2004519222.tif 000018
2004519222.tif 000019
2004519222.tif 000020
2004519222.tif 000021
2004519222.tif 000022
2004519222.tif 000023
2004519222.tif 000024
2004519222.tif 000025
2004519222.tif 000026
2004519222.tif 000027
2004519222.tif 000028
2004519222.tif 000029
2004519222.tif 000030
2004519222.tif 000031
2004519222.tif 000032
2004519222.tif 000033
2004519222.tif 000034
2004519222.tif 000035
2004519222.tif 000036
2004519222.tif 000037
2004519222.tif 000038
2004519222.tif 000039
2004519222.tif 000040
2004519222.tif 000041
2004519222.tif 000042
2004519222.tif 000043
2004519222.tif 000044
2004519222.tif 000045
2004519222.tif 000046
2004519222.tif 000047
2004519222.tif 000048
2004519222.tif 000049
2004519222.tif 000050
2004519222.tif 000051
2004519222.tif 000052
2004519222.tif 000053
2004519222.tif 000054
2004519222.tif 000055
2004519222.tif 000056
2004519222.tif 000057
2004519222.tif 000058
2004519222.tif 000059
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004519222.tif 000060
【国際調査報告】
2004519222.tif 000061
2004519222.tif 000062
2004519222.tif 000063
2004519222.tif 000064
2004519222.tif 000065