(57)【要約】本発明は、動物の他の位置に外植することのできる組織を含め、自己由来組織の成長を促進するためのin vivoの方法と、矯正構造を形成するためのその使用とに関する。具体的には、本発明は、（１）組織の部位特異的再生、及び（ｂ）移植用の新生組織の合成、のための方法及びシステムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
i．  動物の器官又は体腔内に人工空間又は環境を創出するステップと；
ii.  前記人工空間の周囲組織からの多分化能細胞の浸潤、及び成長／又は分化を導くマトリックスを、前記人工空間に導入するステップと、
を含む、軟組織、又は軟組織の前駆細胞の生成を促進する方法。
【請求項２】
前記人工空間から前記多分化能細胞またはそれを由来とする組織を回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記回収された細胞が動物に再移植される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記人工空間が骨膜組織内又は骨膜組織近傍に創出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記人工空間が、軟組織器官の間葉部分と、前記器官の隣接上皮又は緻密間葉層との間に創出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組織が、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、脾臓、歯、象牙質、粘膜及び骨から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記人工空間が、バルーン又は嚢など、軟組織の一部を後退させるための流体作動性部分を有する後退具により創出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記人工空間を創出しようとする区域を、その部位の結合組織を部分的に分解する作用物質で処理して、空間の形成を促進するために細胞をどかす、及び／又は、前記空間への細胞の遊走を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記作用物質が、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ及びコンドロイチナーゼから成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記マトリックスが多孔質生分解性ポリマである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記マトリックスが、前記人工空間又は環境への注射時には溶液であるが、in situで寸法の安定性を獲得する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記マトリックスがヒドロゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒドロゲルが、プルロニックス・ヒドロゲル、アルギン酸塩、ポリエチレングリコールポリ乳酸コポリマから形成されるヒドロゲル、及びテトロニックス・ヒドロゲルから成る群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マトリックスが、前記浸潤細胞の成長を促進するために適した栄養物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記マトリックスが、前記浸潤細胞の成長及び／又は分化を促進する一種以上の成長因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記一種以上の成長因子が、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、又は FGF-2)、酸性線維芽細胞成長因子 (aFGF)、上皮成長因子(EGF)、ヘパリン結合成長因子(HBGF)、線維芽細胞成長因子 (FGF)、血管内皮成長因子 (VEGF)、トランスフォーミング増殖因子 (TGF-α、TGF-β、及び骨形態形成たんぱく、例えばBMP-2、-3、-4、-7を含む)、Wnts、ヘッジホッグ (ソニック、インディアン及びデザート・ヘッジホッグを含む）、トランスフォーミング増殖因子-α(TGF-α）、ノギン、アクチビン、インヒビン、インシュリン様成長因子 (例えばIGF-I及びIGF-II)、成長及び分化因子5、6、又は7 (GDF 5、6、7)、白血病阻害因子 (LIF/HILDA/DIA)、Wntタンパク質、血小板由来成長因子 (PDGF)、ビトロネクチン (VN)、ラミニン (LN)、骨シアロプロテイン(BSP)、及びオステオポンチン(OPN)、副甲状腺ホルモン関連ポリペプチド(PTHrP)等から成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マトリックスが一種以上の抗血管形成性作用物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記マトリックスが、コラーゲン、コンドロネクチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカン鎖から成る群より選択される一種以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記マトリックスが天然及び合成のポリマの複合材である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記生分解性マトリックスが、前記人工空間への前記浸潤細胞の遊走を促進する走化性物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
遮蔽物及び／スペーサが前記人工空間内に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
i.  動物の骨膜組織内又は骨膜組織近傍に人工空間を創出するステップと；
ii.  前記人工空間の周囲の骨膜からの軟骨細胞の成長と適合する多孔質生分解性ポリマ・マトリックスを、前記人工空間に導入するステップと、
を含む、軟骨又は骨組織の生成を促進する方法。
【請求項２３】
前記生分解性マトリックスが、前記軟骨細胞の成長を促進するために適した栄養物質を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生分解性マトリックスが、前記軟骨細胞の成長を促進する一種以上の成長因子を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記成長因子が、ソマトメジン、ヘッジホッグたんぱく、副甲状腺関連ホルモン、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング増殖因子-β、軟骨成長因子、及びこれらの組み合わせ、から成る群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生分解性マトリックスが一種以上の抗血管形成性作用物質を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記人工空間を、その部位の結合組織を部分的に分解する作用物質で処理して、空間の形成を促進するために細胞をどかす、及び／又は、前記空間への細胞の遊走を促進する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記作用物質が、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ及びコンドロイチナーゼから成る群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
a.  人工空間を生じさせる組織後退具と；
b.  多分化能細胞の浸潤、及び成長及び／又は分化を導くマトリックスと；
c.  （選択的に）前記空間の形成を促進するために細胞をどかす、及び／又は、前記空間への細胞の遊走を促進する、ために、前記部位で結合組織を部分的に分解する作用物質と、
を含む、in vivoで組織の生成を促進するキット。
【請求項３０】
in vivoでの組織の生成を促進するためのキットであって、
ａ．  多分化能細胞の浸潤、及び成長及び／又は分化を導くマトリックスを、in vivoで寸法上安定した状態で形成でき、溶液の形であるマトリックス前駆物質と；
ｂ．  前記マトリックス前駆物質と混合されているか、又は、前記マトリックス前駆物質との混合になじむ形である、TGF-β及びb-FGFと；
ｃ．  in vivoの人工空間又は環境への注射に向けた前記マトリックス前駆物質、TGF-β及びb-FGFの調製を解説した、前記キットに付随した（文書又は図面による）指示と
を含む、キット。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載のキットを市販するステップと、
b.  in vivoで組織を生成させるために、本キットをどのように用いるかについて、本キットを購入する客に指示を提供するステップと
を含む、再生医療事業を行う方法。
【請求項３２】
a.  請求項１又は２２に記載の方法を行うために患者から細胞又は組織を分離する際の指示を提供するステップと；
b.  前記分離された細胞又は組織を保存するための細胞保存業を提供するステップと、
を含む、再生医療事業を行う方法。
【請求項３３】
a.  請求項１又は２２に記載の方法を行うために患者から細胞又は組織を分離する際の指示を提供するステップと；
b.  例えば細胞集団を展開させる、又は、細胞を分化させる、など、前記分離された細胞又は組織をさらに処理するサービスを提供するステップと、
を含む、再生医療事業を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の背景
細胞分化は、胚で開始する形態発生の中心的な特徴であり、一生物の生涯にわたり、成体組織の修復及び再生機序において様々な程度で続く。成体組織における形態発生の程度は様々な組織間で異なり、中でも当該組織の細胞ターンオーバーの段階に関係している。これを基に、組織は３種類の広いカテゴリー：（１）細胞分裂がなく、初期の発生段階で形成された細胞の大半が成体の生涯全般に渡って存続する静止細胞集団を持つ、神経及び骨格筋などの組織；（２）一般に細胞分裂はほとんど起きないが、適切な刺激に応答して細胞が分裂し、分化上決定された同じ種類の娘細胞になる、条件的に更新する集団を含有する、肝臓などの組織；及び（３）成体において急速かつ継続的な細胞ターンオーバーを特徴とする、血液、精巣及び重層扁平上皮を含む恒久的に更新する集団を持つ組織、に分類することができる。ここで、最終分化細胞は比較的に短い寿命を有し、幹細胞又は前駆細胞として知られる異なる下位細胞集団の増殖を通じて置き換えられる。
【０００２】
組織工学は、再建手術及び移植を目的とした解剖学的組織及び器官を創り出すことでヒトの治療に役立つ可能性を持つ科学分野として台頭してきた。これは、体内の組織及び構造物の置換、修復及び再建用の新しい器具を生むために、物質科学及び細胞分子生物学、及び医学といった科学分野を結び付けるものである。数多くの方法が過去１０年の間に提唱されてきた。その方法の１つは、組織特異的な細胞を、開放した多孔質ポリマスキャフォールドに組み合わせて、それを後で移植できる、というものである。細胞培養により多数の細胞をポリマー・器具に添加し、拡散により維持することができる。移植後、血管の内植が起き、細胞がリモデルして新しい安定な組織が形成されていくにつれ、ポリマーは加水分解していく。
【０００３】
in vitro又はin vivoでの細胞成長のための組織再生器具を作製する方法が数多く、解説されてきた。器官の機能を置換したり、又は、構造上の支持物を提供するためのポリマー・器具が解説されている。このような方法は Vacanti, et al., Arch. Surg. 123:545-49 (1988)；Yannas, et al.の米国特許第4,060,081号；Bellの米国特許第4,485,097号；及びSchmidt, et al. の米国特許第4,520,821号に報告されている。概略的には、Vacanti, et al.及びSchmidt, et al. が用いた方法は、細胞と一緒にインプラント及び接種するために、既存のポリマー・ファイバー組成物を選択及び適合させることにより実行でき、Yannas 及び Bellの方法では、大変特別に改良されたコラーゲン製のスポンジ様の構造物を作製する。
【０００４】
しかしながら、大半の場合、従来技術では、ドナーとレシピエントの間で、例えば少なくとも１つのMHC不適合を有する細胞などの同種異系移植片を用いる必要がある。その結果、このような移植片は、移植物の免疫拒絶の可能性、及び／又は、移植片がリンパ球を含有する場合の移植片対宿主応答の可能性、があるために、商品化には問題があるであろう。従って、移植用の自己由来細胞源が求められている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明の局面の１つは：
i.  例えば哺乳動物、そして好ましくはヒト、などの動物の器官又は体腔内に人工空間又は環境を創出するステップと；
ii.  前記人工空間の周囲組織からの多分化能細胞の浸潤、及び成長／又は分化を導くマトリックス、好ましくは寸法安定性のマトリックスを、前記人工空間又は環境に導入するステップと、
を含む、軟組織、又は軟組織の前駆細胞の生成を促進する方法に関する。
【０００６】
いくつかの好適な実施態様では、前記人工空間を、骨膜組織近傍又は骨膜組織内に創出する。例えば本発明は、
i.  動物の骨膜組織近傍又は骨膜組織内に人工空間を創出するステップと；
ii.  前記人工空間の周囲の骨膜からの軟骨細胞の成長と適合する多孔質生分解性ポリマ・マトリックスを、前記人工空間に導入するステップと、
を含む、軟骨又は骨組織の生成を促進する方法を提供するものである。
【０００７】
いくつかの好適な実施態様では、前記人工空間を、例えば軟組織の間葉細胞部分と、隣接する上皮又は緻密間葉層との間など、器官の層同士の間に創出し、例えば当該組織を肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、脾臓、歯、象牙質、粘膜及び骨から成る群より選択する。
【０００８】
いくつかの他の実施態様では、前記人工空間を心臓組織内に創出する。
【０００９】
さらに他の実施態様では、本方法は、例えば心膜内、腹腔内、胸膜内、滑膜内、リンパ内又は脳脊髄内腔／空間など、既存の体腔内に人工空間を創出することを伴う。
【００１０】
本方法に、例えば貯蔵するか、又は当該動物に再移植するなどのために、当該人工空間から多分化能細胞又はそれを由来とする組織を回収する更なるステップを含めることができる。
【００１１】
いくつかの実施態様では、本人工空間を、例えばバルーン又は嚢など、軟組織の一部を後退させるための流体作動性部分を有する後退具により創出する。
【００１２】
いくつかの好適な実施態様では、本人工空間を創出しようとする区域を、その部位の結合組織を部分的に分解する作用物質で処理して、空間の形成を促進するために細胞をどかす、及び／又は、当該空間への細胞の遊走を促進する。例えば、当該区域を、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ及びコンドロイチナーゼから成る群より選択される作用物質で処理することができる。
【００１３】
いくつかの好適な実施態様では、本人工空間に用いるマトリックスは、例えば多孔質生分解性ポリマなどの生分解性マトリックスである。本マトリックスに、浸潤細胞の成長を促進するために適した栄養物質を含めることができる。さらに本マトリックスに、浸潤細胞の成長を促進する一種以上の成長因子を含めることもできる。さらに、前記人工空間への前駆細胞の遊走を促進する走化性物質をそれに含めてもよい。いくつかの好適な実施態様では、本マトリックスは、一種以上の線維芽細胞成長因子（FGF）及び一種以上のトランスフォーミング増殖因子を含み、そしてさらにより好適な実施態様では、塩基性FGF（bFGF）及びTGF-β1もしくはTGF-β2を含む。
【００１４】
いくつかの実施態様では、軟骨、又は、比較的に無血管性の環境で発生する組織を形成するために本方法を用いる場合などでは、一種以上の抗血管形成性作用物質を本マトリックスに含めることが好ましいであろう。
【００１５】
軟骨などの特定の組織の形成においては、例えば圧迫包帯又は膨張性空気ブラッタ（原語：blatter）を体腔の近位に印加するなど、本マトリックスに外圧を印加すると有利であろう。
【００１６】
いくつかの実施態様では、本マトリックスは、注射時には溶液であるが、in situで凝固する（寸法の安定性を獲得する）ような材料である。しかしながら凝固後、本マトリックスは尚、周囲組織からの細胞の遊走／浸潤が可能なように、充分に多孔質でなければならない。プルロニックスTM、アルギン酸ナトリウム又はカルシウム、ポリエチレングリコールポリ乳酸コポリマ、及びテトロニックスTMを含め、これらの性質を持つヒドロゲルが数多くある。
【００１７】
さらに本マトリックスに、コラーゲン、コンドロネクチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、及びグリコアスミン（原語：glycoasmine）グリカン鎖から成る群より選択される一種以上の細胞外マトリックスタンパク質を含めることもできる。
【００１８】
本発明の別の局面は、
a.  人工空間を生じさせる組織後退具と；
b.  多分化能細胞の浸潤、及び成長／又は分化を導くマトリックスと；
c.  （選択的に）空間の形成を促進するために細胞をどかす、及び／又は、当該空間への細胞の遊走を促進する、ために、当該部位で結合組織を部分的に分解する作用物質と、
を含む、in vivoで組織の生成を促進するキットに関連する。
【００１９】
本発明のさらに別の局面は、
a.  上述したものなどのキットを市販するステップと、
b.  in vivoで組織を生成させるために、本キットをどのように用いるかについて、本キットを購入する客に指示を提供するステップと
を含む、再生医療事業を行う方法に関連する。
【００２０】
本発明のさらに別の局面は、
a.  本方法を行うために患者から細胞又は組織を分離する際の指示を提供するステップと；
b.  前記分離された細胞又は組織を保存するための細胞保存業を提供するステップと、
を含む、再生医療事業を行う方法に関連する。
【００２１】
本発明の別の局面は、
a.  本方法を行うために患者から細胞又は組織を分離する際の指示を提供するステップと；
b.  例えば細胞集団を展開させる、又は、細胞を分化させる、など、前記分離された細胞又は組織をさらに処理するサービスを提供するステップと、
を含む、再生医療事業を行う方法を提供するものである。
【００２２】
発明の詳細な説明
Ｉ．  概観
本発明は、自己由来組織の成長を促進するin vivo法と、動物内の他の位置に外植可能な組織を含む矯正構造を形成するためのその使用法とに関する。具体的には、本発明は、（ａ）組織の部位特異的な再生、及び（ｂ）移植用の新生組織の合成、のための方法及びシステムに関する。本発明の方法は、「in vivoバイオリアクタ」と呼ばれ、患者の自己の身体を細胞源、スキャフォールド及び薬物送達伝播体として用いるものである。いくつかの実施態様では、本方法は：
a.  例えば骨の場合には骨膜周囲のポケット、又は、軟組織の間葉部分の人工空間など、目的の組織種の生存区域近傍にポケット又は包又は嚢窩を創出するステップと；
b.  （選択的に）周囲組織中の細胞外マトリックスを消化して、細胞を前記ポケット内に放出させる酵素などの作用物質に前記ポケットを接触させるステップと；
c.  前記ポケット内の多分化能細胞（幹細胞又は前駆細胞）の浸潤、及び成長及び／又は分化を促進する、成長因子などの作用物質又は生体材料を前記ポケット内に導入するステップと、
を含む。さらに本方法は、例えば心膜内、腹腔内、胸膜内、滑膜内、リンパ内又は脳脊髄内腔／空間など、既存の体腔内に人工環境を創出するためにも行うことができる。
【００２３】
前駆細胞を前記空間から回収することもできるが、又は代替的に、前記細胞を、所望の機能的かつ組織学的エンドポイントの細胞又は組織表現型まで成熟させてから、回収することもできる。本方法により分離された細胞／組織をさらにex vivoで操作して、例えばさらに展開又は分化させることができる。当該細胞／組織は、低温保存など保存することも、又は、移植に用いることもできる。
【００２４】
例えばいくつかの好適な実施態様では、本方法を、軟骨又は骨組織の生成を促進するために用いることができる。このような実施態様では、本方法は、動物の骨膜組織内又は骨膜組織近傍に人工空間を創出するステップと、その後、前記人工空間周囲の骨膜からの軟骨細胞の成長にとって適合性ある多孔質の生分解性ポリマ・マトリックスを前記人工空間内に導入するステップと、を含む。
【００２５】
他の実施態様では、前記人工空間は真皮、真皮下及び／又は皮内部位に創出される。このような実施態様は、皮膚又は筋肉（例えば筋衛星細胞）から本人工空間への幹の遊走を促進するために有用であろう。
【００２６】
いくつかの実施態様では、外因性の細胞を本人工空間に導入することができる。例えば導入される細胞は、当該部位に浸潤する、及び／又は、治癒過程を支援する、幹細胞又はその後代細胞の成長又は維持を促進する因子を、天然で、又は遺伝子操作により、産生するような細胞であってよい。
【００２７】
さらに他の好適な実施態様では、本方法を、軟組織、又は軟組織の前駆細胞の生成を促進するために用い、この場合、本方法は、動物の軟組織の間葉部分に人工空間を創出するステップと、前記人工空間の周囲の間葉組織からの多分化能細胞の浸潤及び成長及び／又は分化を導くマトリックスを前記人工空間に導入するステップと、を含む。
【００２８】
本方法にはいくつかの利点がある。例えば本方法では患者自身の身体をスキャフォールド及びバイオリアクタとして用いるため、微小環境を規定する上での治癒過程の役割及び影響力が最大となる。それは、組織塊を操作／再生するために患者自身の細胞を用いるため、細胞の回収及びin vitroでの培養が不要となる。患者自身の身体及び細胞を用いて組織を操作することとなるため、免疫拒絶が問題となることはない。また治癒／再生過程で身体の役割を最大にし、介入を最小限にするというコンセプトを用いているため、侵襲性の低い手術法に容易に適合させることができる。
【００２９】
当該組織前駆細胞には、以下：上皮細胞、軟骨及び軟骨を形成する他の細胞、マクロファージ、皮膚の細胞、筋細胞、毛嚢、線維芽細胞、器官の細胞、骨芽細胞及び骨を形成する他の細胞、内皮細胞、粘膜細胞、胸膜の細胞、耳管の細胞、鼓膜の細胞、腹膜の細胞、シュワン細胞、角膜上皮細胞、歯肉の細胞、神経細胞、神経幹細胞、例えば中枢神経系（CNS）幹細胞、例えば脊髄又は脳幹細胞や、自律神経系（ANS）幹細胞、例えば小腸、膀胱、肝臓、腎臓、肺、膀胱、及び心臓、（例えば交感もしくは副交感神経及び神経節を操作するため）からの神経節後幹細胞、気管上皮細胞、肝細胞、膵細胞、及び心臓の細胞、のいずれをも含めることができる。さらに当該組織前駆細胞は神経内分泌幹細胞であってもよい。
【００３０】
本方法は組織再生に幅広い応用性がある一方で、いくつかの好適な実施態様では、本方法を、骨軟骨、肝臓、腎臓、膀胱、膵組織、骨格筋、及び心筋の生成に用いることができる。
【００３１】
本器具及び方法は、美容整形、歯科用インプラント、及び心臓手術にとって特に有用である。美容整形においては、口唇及び乳房などの軟組織増大術や、顔面骨増大術にそれを用いることができる。インプラント歯科学では、嚢窩を骨膜の下方に配置する場合には歯槽堤の水平及び垂直方向の増強術に、そして嚢窩を歯科用インプラントの配置前にシュナイダー膜の下方に配置する場合には洞の増強術に、それを用いることができる。さらに本方法は、歯科用インプラントを用いた歯科治療の一部として、顎の骨再生を案内するためにも、用いることができる。
【００３２】
ＩＩ．  定義
「幹細胞」は比較的に未分化の細胞であり、増殖するよう誘導することができ、また、後に一種以上の成熟細胞種に分化していく後代細胞を生じさせつつ、一方で親の発生上の可能性を持つ一個以上の細胞を保持することが可能である。数多くの生物学的事例においては、幹細胞は２種以上の異なる細胞種の後代を生じることができるため「多能」でもあるが、この点は「幹性」には必要ではない。自己再生という点が、もう一つの古典的な幹細胞の定義部分であり、その点がこの文献で用いられるときに重要である。理論的には自己再生は２つの主要な機序のいずれかで起きる。幹細胞は非対称に分裂して、一方の娘細胞は幹状態のまま、そして他方の娘細胞は何らかの異なる他の特異的機能及び表現型を発現する場合がある。反対に、一集団内の幹細胞のいくつかが対称に分裂して２つの幹になり、こうしてその集団の特定の幹細胞が全体として維持され、その集団の残りの細胞が分化した後代のみになることがある。形式上、幹細胞で始まった細胞が分化した表現型へ進行した後、「逆行」して幹細胞表現型を再発現することは可能である。
【００３３】
「前駆細胞」は、より原始的な細胞表現型を有する（即ち、完全に分化した後の細胞よりも、発生上の経路もしくは進行のより初期の段階にある）ものである。しばしば前駆細胞は、有意な又は大変高い増殖可能性を有することがある。前駆細胞は、発生上の経路や、当該細胞が発生及び分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞種になることも、又は単一の分化細胞種になることもある。幹細胞と同様、前駆細胞として始まった細胞も、分化した表現型に進行した後、「逆行」して前駆細胞表現型を再発現する可能性がある。
【００３４】
「組織」とは、その天然マトリックス中に埋め込まれた特定の細胞の集合体又は凝集体であり、この場合の天然マトリックスは、特定の生存細胞により産生されるものである。
【００３５】
「分化」とは、細胞が特化表現型を担う、即ち、他の細胞種とは別個の特徴又は機能を一種以上獲得する、発生上のプロセスを言う。大半の使用においては、分化後表現型とは、特定の発生上経路での成熟エンドポイントである細胞表現型を言う。数多くの、しかしすべての組織においてではないが、分化のプロセスはこれらの場合の細胞周期からの脱出と関係しており、細胞は分化するとその増殖能を失うか、又は大きく制限される。
【００３６】
「増殖」とは、細胞分裂による、一集団中の細胞数の増加（成長）を言う。細胞増殖は一般に、成長因子及び他の分裂促進因子を含め、環境に応答した複数のシグナル伝達経路の調和した活性化の結果起きると、理解されている。さらに細胞増殖は、細胞増殖を遮断もしくは負に影響する細胞内もしくは細胞外シグナルの作用や機序から解放されることによっても、促進されると考えられる。
【００３７】
「再生」とは、疾患又は外傷後の細胞集団、器官又は組織の再成長を意味する。
【００３８】
細胞の「濃縮」とは、ある一種類の細胞の収率（割合）を、開始培養物又はプレパラート中にあるその種類の細胞の割合に比べて増加させることを意味する。
【００３９】
ここで用いる「成長因子」には、細胞増殖、細胞分化、組織再生、細胞誘引、創傷修復及び／又は何らかの発生もしくは増殖プロセスを調節又は媒介する、あらゆる可溶性因子が含まれる。成長因子は、天然源からの抽出、合成化学法を用いた生成、組換えＤＮＡ技術を用いた生成、及び、当業者に公知の他の技術を含め、いかなる適した手段により作製してもよい。成長因子という用語には、由来となった元の成長因子又は関連する成長因子と同様な（一種又は複数の）生物活性又はその一部分を有する、あらゆるその前駆体、変異体、誘導体又は他の形が含まれるものと、意図されている。
【００４０】
「ヒドロゲル」は、有機ポリマ（天然又は合成）が硬化又は凝固して、水分子又は他の溶液を閉じ込めた三次元構造の開放格子構造を形成してゲルを形成したときに形成される物質である。凝固は例えば凝集、凝固、疎水性相互作用、又は架橋により、起きるものでよい。本発明で用いるヒドロゲルは急速に凝固して細胞を適用部位に維持することで、適用部位でのファゴサイトーシス又は細胞死という問題をなくし、新細胞の成長を高める。また当該のヒドロゲルは生体適合性があり、例えばヒドロゲル中に懸濁された細胞にとって非毒性である、などである。
【００４１】
用語「チャンネル」とは、ほぼ50乃至500μm厚の材料のシートを貫通した一定のもしくは規則的に変化した横断面積の穴を言い、規定された横断方向の幾何学形状を有し、この幾何学形状は矩形でも、卵形でも、円形でも、又は、これらの幾何学形状のいずれかで、その１つの上に、細胞寸法又はそれより小型のイタヤガイなどの微細な特徴が押し付けられた形状でもよい。さらに規定された化学的性質を表面に有し、そして規定された寸法、典型的には75乃至1000μm、の横方向の寸法を持つが、この寸法は各個々の組織又は器官種（例えば肝臓用の矩形もしくは卵型のチャンネルの場合、その好適なチャンネル寸法は一方の軸方向で100乃至200μmであり、他方の軸方向で少なくとも100μmである；胚性幹細胞のチャンネルの寸法は200乃至1200μmの範囲であることが好ましい）に応じて至適化する。チャンネルの特徴は、細胞の器質化などの細胞挙動を左右するよう、デザインされる。細胞挙動は、任意の穴があるという理由だけでは起きない。チャンネルは、細胞を誘導してチャンネル内で器質化させ、血管が内部に組み込まれた固体の形、又は、凝集もしくは回転楕円面の形状で、組織が形成されるように、デザインされる。構造の誘導は静止状態（潅流なし）で起こさせても、又は、組織によっては、形態発生中に当該チャンネルを通じて流体を潅流して組織典型的な構造の形成を支援してもよい。アレイを通る潅流速度と、栄養物／代謝産物／テスト化合物の濃度の両方を、何らかの手段でチャンネルの両側から個別に制御することができる。
【００４２】
ＩＩＩ．  代表的な実施態様
Ａ．組織の後退
好適な実施態様では、組織後退具を用いて人工空間を生じさせる。前記後退具は、適切な組織をどけて、組織の間葉部分に接する空間や、骨膜内の空間を、選択的に形成するものである。例えば本発明の方法において有用な後退具の例には、例えば血管鏡と同様に、既存の開創内で作業する又は開創を膨張させるためだけでなく、組織を後退させるバルーン又は嚢などの流体作動性部分を備える。本後退具のこの流体充填部分は可撓性であり、従って本後退具で移動させる組織を傷付けかねない鋭利な先端がない。前記流体充填部分の軟質材料は、組織の輪郭に所望の程度、なじみ、組織を損傷しないよう、精確な圧力を観察することができる。
【００４３】
手術で用いる流体作動性後退具。本後退具は、加圧した流体を導入したときに膨張可能な部分を有する。前記の膨張可能な部分は、充分に強度のある材料から成り、体内の隣接組織を押し広げるのに充分な圧力まで膨張させる。骨膜などの組織に用いる場合、前記の膨張可能な部分は好ましくは、膨張過程で変形するように充分な剛性を有するとよく、例えば膨張させようとする箇所から「抜け出る」先端部分を有するなどするとよい。
【００４４】
当該嚢は、空気又は水又は他の流体で加圧することができる。当該嚢内に用いる流体は、事故で体内に漏れ出たときにも安全でなければならない。従って、空気の他には、デキストロース水、通常の生理食塩水、CO2、及びN2などの他の流体が安全である。当該嚢内の圧力を監視及び調節して、組織の壊死を防ぐために、本後退具がかける力を組織にとって安全なレベルに維持するようにすることができる。本後退具は水銀計で100mmほどの平均拡張期圧の高い圧力、又はそれより高い圧力を、より短い時間、組織に印加することができ、尚、安全に制御できる。血管鏡などの典型的な膨張性器具は、充分な流体圧を支持する強度を有するよう適合されていない限り、適さないであろう。当該嚢は、ケブラー又はマイラーなど、ステンレス鋼、ナイロン、又は他の繊維で補強すると、穿孔を防いだり、構造的形状及び支持を希望通りに提供できるような材料で成るものでよい。このような材料は、約数ポンドから最高で約500mg Hg圧又はそれ以上の必要な流体圧力を保持すると共に、移動させる組織に必要な力を印加するために充分な強度がある。
【００４５】
いくつかの実施態様では、ステント及び他の障壁を用いて、膨張区域の形状又は体積の保持に役立てることができる。
【００４６】
場合によっては、特に当該人工空間が骨に当接するような場合、超音波又は他の切断もしくは切除具を用いて周囲組織を取り除き、当該の人工空間を膨張可能にできる。
【００４７】
Ｂ．マトリックス
いくつかの実施態様では、当該の人工空間に、この人工空間の周囲の組織からの多分化能細胞の浸潤、及び成長及び／又は分化を導くマトリックスを注入する。適したマトリックスは遊走性前駆細胞の浸潤、増殖及び分化が可能な適切な化学的及び構造的性質を有するものである。
【００４８】
いくつかの実施態様では、本マトリックスを合成の、生分解性生体適合性ポリマから形成する。用語「生体侵食性」又は「生体分解性」とは、ここで用いる場合、in vivoで酵素的又は化学的に分解してより簡単な化学種になる物質を言う。「生体適合性」とは、当該物質に対する強力な免疫反応を惹起せず、有毒でもなく、また分解しても非毒性、非免疫原性で、排出又は代謝により身体から取り除かれる化学種になる物質を言う。
【００４９】
組織の器質化を、当該マトリックスの微小構造により調節してもよい。特定のポアの大きさ及び構造を利用して、ホストからの組織内植や、移植された細胞の器質化のパターン及び程度を制御してもよい。マトリックスの表面幾何学的形状及び化学的性質を、移植された細胞又はホスト細胞の付着、器質化、及び機能を制御するように調節してもよい。いくつかの好適な実施態様では、本マトリックスを、新しい組織の血管化及び植え付けが起きるまで、栄養物及び気体が、マトリックス表面に付着した細胞に自由に拡散できるような充分な介在間隙を有する繊維構造を有するポリマから形成する。前記介在間隙は典型的には50から300ミクロンの範囲内である。ここで用いる「繊維状」には、自身がからみ合った一本以上のファイバや、編み合わされた又は編み合わされてないメッシュ状の複数のファイバ、及びスポンジ様の器具が含まれる。
【００５０】
当該支持構造は生体適合性（例えば浸潤細胞にとって有毒でないなど）であり、場合によっては、当該支持構造は生分解性でもよい。当該支持構造は本人工空間への挿入前でも、又は後でも成形することができる。
【００５１】
場合によっては、当該支持構造は可撓性及び／又は圧縮可能及び弾性であることが望ましい。特にこれらの場合、当該支持構造を移植時に変形させることで、患者の小さな開口部を通じて、又は、患者の小さな開口部に挿入されたカニューレ又は装置を通じて移植ができるようにしてもよい。移植後、当該支持構造はその所望の形状及び方向に膨張する。
【００５２】
いくつかの実施態様では、本マトリックスはポリマである。使用できるポリマの例には天然及び合成ポリマがあるが、合成ポリマが再現性及び放出動態の制御の上で好ましい。使用できる合成ポリマには、生体侵食性のポリマ例えばポリ（ラクチド）(PLA)、ポリ（グリコール酸（PGA）、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）、及び他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、分解性ポリシアノアクリレート及び分解性ポリウレタン、がある。天然ポリマの例には、アルブミン、コラーゲン、フィブリン及び合成ポリアミノ酸などのタンパク質、及びアルギン酸塩などの多糖、ヘパリン、グリコサミノグリカン（例えばヒアルロン酸、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、ケラトスルフェート、ケラトポリスルフェート、等）、及び他の天然で発生する糖単位の生分解性ポリマがある。
【００５３】
いくつかの実施態様では、本マトリックスは複合材であり、例えば天然及び非天然で発生するポリマの複合材である。実例を挙げると、本マトリックスは、フィブリン及び人工ポリマから成る複合材であってもよい。
【００５４】
PLA、PGA及びPLA/PGAコポリマは、生分解性マトリックスを形成するために特に有用である。PLAポリマは通常、乳酸の環状エステルから調製される。L( + ) 及びD( - )型の乳酸の両者とも、PLAポリマや、光学的に不活性なD(-) 及びL(+)乳酸の.DL-乳酸混合物を調製するために用いることができる。ポリラクチドを調製する方法は特許文献に詳しく記載されている。その教示を引用をもってここに援用することとする。以下の米国特許では、適したポリラクチド、それらの性質及び調製法が詳細に解説されている：Doroughの米国特許第1,995,970号；Schneiderの第2,703,316号；Salzbergの第2,758,987 号；Zeileの第2,951,828号；Higginsの第2,676,945号；及びTrehuの第2,683,136号；第3,531,561号。
【００５５】
PGAはグリコール酸（ヒドロキシ酢酸）のホモポリマである。グリコール酸のポリ（グリコール酸）への転化においては、グリコール酸をまずそれ自体と反応させて、環状のエステルグリコリドを形成し、この環状エステルグリコリドは熱及び触媒の存在下で高分子量直鎖ポリマに転化する。PGAポリマ及びそれらの性質はCyanamid Research Develops World's First Synthetic Absorbable Suture", Chemistry and Industry, 905 (1970)により詳細に解説されている。
【００５６】
いくつかの実施態様では、本マトリックスはヒドロゲルである。本発明を実施するために適した様々なヒドロゲルの例には、限定はしないが、(1)体温で凝固又は硬化する温度依存的ヒドロゲル、例えばプルロニックスTM；(2)イオンにより架橋するヒドロゲル、例えばアルギン酸ナトリウム；(3)可視光又は紫外光への暴露で硬化するヒドロゲル、例えばアクリレート末端基を持つポリエチレングリコールポリ乳酸コポリマ；及び(4)pHの変化で硬化又は凝固するヒドロゲル、例えばテトロニックスTMなど、がある。
【００５７】
いくつかの実施態様では、当該マトリックスは光もしくは放射性硬化性ポリマである。光硬化性グリコサミノグリカンの一例が米国特許第5763504号に解説されている。他の実施態様では、当該マトリックスは化学的硬化性ポリマである。
【００５８】
これらの様々なヒドロゲルを形成するために使用できる材料の他の例には、イオンにより架橋するアルギン酸塩、ポリホスファゼン、及びポリアクリレートなどの多糖、又は、温度変化により凝固するポリ（オキシエチレン）-ポリ（オキシプロピレン）ブロック・ポリマであるプルロニックスTM（ポロキサマーズTMとしても知られる）などのブロック・コポリマ、又は、pHの変化で凝固するエチレンジアミンのポリ（オキシエチレン）-ポリ（オキシプロピレン）ブロック・ポリマであるテトロニックスTM（ポロキサミンTMとしても知られる）がある。
【００５９】
さらに別の実施態様では、本マトリックスはイオン性ヒドロゲルである。アルギン酸塩又はキトサンなどのイオン性多糖を用いることができる。一例では、海草から単離される糖質ポリマであるアルギン酸などの陰イオン塩を、カルシウム陽イオンなどのイオンで架橋することにより、ヒドロゲルを作製する。ヒドロゲルの強度は、カルシウムイオン又はアルギン酸塩のいずれかの濃度を増すことにより、高められる。例えば米国特許第4,352,883 号は、アルギン酸塩を二価の陽イオンで室温の水中でイオン的に架橋することによりヒドロゲル・マトリックスを形成する方法を解説している。
【００６０】
マトリックス中に用いるポリマはすべて、細胞がその後成長及び増殖するために充分な支持を提供するのに必要な機械的及び生化学的パラメータを満たさねばならない。当該ポリマは、その機械的性質の特徴付けを、例えば引っ張り強度についてはインストロン・テスタを用いて、ポリマ分子量についてはゲル透過クロマトグラフィ（GPC）により、ガラス転移温度については示差走査熱分析（DSC）により、そして接着構造については赤外（IR）分光によるなどで行い、毒性の特徴付けを、エームス検定法及びin vitro奇形発生性検定法を含む最初のスクリーニング・テストで、そして免疫原性については動物での移植実験、炎症、放出及び分解実験で、行うことができる。
【００６１】
いくつかの実施態様では、例えば基底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアゴム、コラーゲンタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、ポリビニルアルコール、これらの混合物、及び細胞培養の当業者に公知の他の親水性及びペプチド付着物質などの成分で、本ポリマをコーティングすることにより、本ポリマへの細胞の付着を高める。本ポリマ・マトリックスをコーティングするために好適な物質はポリビニルアルコール又はコラーゲンである。
【００６２】
浸潤細胞の増殖及び機能を促進するために、本マトリックスに、適した栄養物質（例えば血清、塩化カルシウムなどの塩類、アスコルビン酸、及びアミノ酸など）及び成長因子（下に記載）をさらに含めることができる。
【００６３】
本マトリックスには、例えばフィブロネクチン、RGDポリペプチド等や、それらの類似体、組換え型、生物学的等価性変異型、コポリマ又はこれらの組み合わせ、などの付着因子を含めてもよい。
【００６４】
付着及び／又は成長因子は、遮蔽物及びスペーサを通じて当該部位に送達できる。前記遮蔽物及びスペースには、重合化などのそれらの製造時にこれらの因子を含浸させることができるが、又は、製造後に接着又は架橋などにより添加することもできる。さらに当該因子を、当該部位にそれらがゆっくりと放出されるように封入又は同様な処理を施してもよい。さらに、前記遮蔽物及びスペーサは、例えば生分解性スポンジ、メッシュ、フィブリンクロット、コラーゲン・ゲル、軟骨又は、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、分離された骨膜細胞、ポリジオキサン、ポリエステル、アルギン酸塩等や、それらの類似体又はそれらの組み合わせから作製された他の種類の生物学的スカフォールディング材料など、付着及び成長因子を含浸させたマトリックスを当該部位に送達又は当該部位に固定することができる。又は、本マトリックスを上述の膜で被覆することができる。
【００６５】
Ｃ．  細胞外マトリックスの消化
本発明の更なる実施態様では、欠陥部位を処理して（好ましくは移植前に）、欠陥部位近傍の結合組織及び細胞外マトリックスを分解させ、及び／又は、前駆細胞を開放して、細胞（例えば間質細胞）をその区域から開放して本インプラントのスキャフォールドに遊走させる。酵素を用いて欠陥部位を処理する場合、このような酵素には、限定はしないが、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、及び／又は、ヒアルロニダーゼ、Dnase、プロナーゼ、コンドロイチナーゼ等がある。
【００６６】
Ｄ．  成長因子
いくつかの実施態様では、生物活性分子を当該細胞に加えることが好ましいであろう。多種の生物活性分子を、ここに解説したマトリックスを用いて送達できる。これらをここでは総括的に「因子」又は「生物活性因子」と呼ぶ。
【００６７】
本発明に従った使用に適した生物活性化合物には、成長因子、例えば塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、又は FGF-2)、酸性線維芽細胞成長因子 (aFGF)、上皮成長因子(EGF)、ヘパリン結合成長因子(HBGF)、線維芽細胞成長因子 (FGF)、血管内皮成長因子 (VEGF)、トランスフォーミング増殖因子 (TGF-α、TGF-β、及び骨形態形成たんぱく、例えばBMP-2、-3、-4、-7を含む)、Wnts、ヘッジホッグ (ソニック、インディアン及びデザート・ヘッジホッグを含む）、トランスフォーミング増殖因子-α(TGF-α）、ノギン、アクチビン、インヒビン、インシュリン様成長因子 (例えばIGF-I及びIGF-II)、成長及び分化因子5、6、又は7 (GDF 5、6、7)、白血病阻害因子 (LIF/HILDA/DIA)、Wntタンパク質、血小板由来成長因子 (PDGF)、ビトロネクチン (VN)、ラミニン (LN)、骨シアロプロテイン(BSP)、及びオステオポンチン(OPN)、副甲状腺ホルモン関連ポリペプチド(PTHrP)等がある。
【００６８】
生物活性分子を本マトリックス中に取り込ませ、さらに拡散及び／又は本マトリックスの分解により、一定の期間にわたって放出させることができ、あるいはこれらを細胞懸濁液で懸濁させることができる。他の実施態様では、当該生物活性分子をマイクロスフィアの形で提供するか、あるいは、適宜、本人工空間内に含まれた又は本人工空間の近傍にある外因性細胞に産生させることもできる。
【００６９】
いくつかの実施態様では、成長因子の代わりに、受容体媒介型シグナル伝達を誘導する、当該成長因子受容体に対する抗体を用いることができる。同様に、例えばリガンド依存的もしくは非依存的態様などで、受容体活性を作動させる低分子を用いることもできる。
【００７０】
いくつかの実施態様では、本方法で、米国特許第6,149,902号に解説されたようなNotch機能のアゴニストを利用する。Notchアゴニストには、Delta及びSerrateなどのポリペプチド、シグナル伝達を誘導するNotchに対する抗体や、Notch依存的シグナル伝達を誘導する低分子、がある。
【００７１】
いくつかの実施態様では、幹／前駆細胞の増殖又は分化を惹起する酵素の阻害剤を用いて、浸潤細胞を調節することができる。例えばKuzbanianメタロプロテアーゼ・ファミリーのメンバーは、細胞による成長因子応答に関与している。このメタロプロテアーゼ活性を阻害又は増強する作用物質を用いれば、増殖又は分化の速度を調節できる。
【００７２】
ステロイド系抗炎症薬は、移植されたマトリックスに対する炎症を減らし、こうして、本人工空間内に成長していく線維芽細胞組織の量を減らすために用いることができる。
【００７３】
これらの因子は当業者に公知であり、市販されており、又は文献に記述されている。in vivoでの投薬量は、細胞培養でのin vitro放出実験に基づいて計算する。有効投薬量とは、以下の例で詳述するように、コントロールに比較したときに細胞増殖又は生存を高める投薬量である。
【００７４】
Ｅ．抗血管形成因子
例えば比較的に無血管性の環境中に発生する軟骨又は組織を形成するために本方法を用いるなど、いくつかの実施態様では、一種以上の抗血管形成作用物質を本マトリックスに含めることが望ましいであろう。
【００７５】
用語「抗血管形成性作用物質」とは、血管の形成又は成長を減少させることのできる組成物を言う。抗血管形成性作用物質の例には、限定はしないが、エンドスタチンたんぱく、アンジオスタチンたんぱく、TNP-470、アンジオザイム、抗VEGF、ベネフィン、BMS275291、ブリオスタチン-I (SC339555)、CAI、CM101、コンブレタスタチン、デクスラゾキサン(ICRF187)、DMXAA、EMD 121974、フラボピリドール、GTE、IM862、インターフェロン-α、インターロイキン-12、マトリックス・メタロプロティナーゼの阻害剤、例えばマリマスタット、メタレット、メタスタット、MMI-270、ネオバスタット、オクレオチド（ソマトスタチン）、パクリタキセル（タキソール）、プルリチン（原語：purlytin）、PTK787、スクアラルニン、スラジスタ (FCE26644)、SU101、SU5416、SU6668、タモキシフェン（ノルバデックス）、テトラチオモリブデート、サリドミド、ビタキシン及びキセロダ（カペシタビン）、シクロオゲナーゼ（原語：cycloogenase）、血小板因子4 (PF-4)、N末端切断型タンパク質分解された PF-4フラグメント、ヒトプロラクチンの16kDaのN末端フラグメント、フィブロネクチンの小タンパク質フラグメント、マウス上皮成長因子、及びトロンボスポンジン、がある。
【００７６】
さらに、ここで用いる用語「アンジオスタチンたんぱく」とは、プラスミノーゲン分子のうちで、in vivoで抗血管形成活性を有するkringle領域フラグメントを言う。アンジオスタチンたんぱくの例は、米国特許第5,837,682号及び米国特許第5,854,221号に見られよう。プラスミノーゲンは、kringle 1-5と呼ばれる５個のkringle領域フラグメントや、kringle間領域を含有する。用語「アンジオスタチンたんぱく」とは、あらゆる一個のkringle領域、あらゆるkringle領域の組み合わせ、又はin vivoでの抗血管形成活性を維持したあらゆるkringle間領域に加えたkringle領域を言うものであることを理解されたい。ある好適な実施態様では、アンジオスタチンたんぱくは、ヒトプラスミノーゲンのうちの約kringle領域1-3、kringle領域 1 5、kringle 領域1-4 又は kringle 領域1-5である。
【００７７】
用語「エンドスタチンたんぱく」及び「アンジオスタチンたんぱく」には、さらに、それぞれエンドスタチンたんぱく又はアンジオスタチンたんぱくの一方又は両方の末端から、あるいはいずれかのタンパク質の内部領域から、一個以上のアミノ酸が取り除かれた短縮型タンパク質であって、尚当該タンパク質にin vivoでの血管形成阻害活性が残っているような短縮型タンパク質も含まれる。用語「エンドスタチンたんぱく」及び「アンジオスタチンたんぱく」には、さらに、それぞれエンドスタチンたんぱく又はアンジオスタチンたんぱくの一方又は両方の末端に、あるいは内部位置に、一個以上のアミノ酸が追加された延長型タンパク質又はペプチドであって、尚当該タンパク質にin vivoでの血管形成阻害活性が残っているような延長型タンパク質又はペプチドも含まれる。
【００７８】
さらに用語「アンジオスタチンたんぱく」及び「エンドスタチンたんぱく」には、アンジオスタチンたんぱく及びエンドスタチンたんぱく誘導体も含まれる。アンジオスタチンたんぱく誘導体には、プラスミノーゲンのうちで抗血管形成活性を有するkringle領域フラグメントのアミノ酸配列を有するタンパク質が包含される。アンジオスタチンたんぱくには、さらに、プラスミノーゲンのkringle領域フラグメントの抗血管形成性アンジオスタチン・フラグメントに相当する配列を有するペプチドも包含される。「抗血管形成性アンジオスタチン・フラグメント」とは、「抗血管形成性アンジオスタチン・サブ配列」と呼ばれる、プラスミノーゲンのうちのkringle領域フラグメントのサブ配列に、そのアミノ酸配列が相当するようなペプチドである、と定義しておく。
【００７９】
抗血管形成性作用物質は、VEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤であってもよい。このクラスの抗血管形成性作用物質の例には：
・4-(4-ブロモ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-チオモルホリノエトキシ) キナゾリン；
・6,7-ジメトキシ-4-(3-ヒドロキシ-4-メチルフェノキシ)キナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン；
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-7-(2-ヒドロキシエトキシ)-6-メトキシキナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エトキシ)キナゾリン；
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-7-(2-メトキシエトキシ)キナゾリン；
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-(メチルスルフィニル)エトキシ)キナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-メトキシエトキシ)キナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン;
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン;
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-メトキシエトキシ)キナゾリン；
・7-(2-アセトキシエトキシ)-4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-6-メトキシキナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-モルホリノエトキシ)キナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-ピペリジノエトキシ)キナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-(ピロリジン-1-イル)エトキシ)キナゾリン；
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-7-(2-メトキシエチルアミノ)キナゾリン；
・4-(4-クロロ-2-フルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-シクロペンチルオキシエトキシ) キナゾリン；
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-メチルチオエトキシ)キナゾリン；
・4-(2,4-ジフルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン；
・4-(2,4-ジフルオロ-5-ヒドロキシアニリノ)-6-メトキシ-7-(2-メトキシエトキシ)キナゾリン；
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-6-メトキシ-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン；
・4-(2-フルオロ-5-ヒドロキシ-4-メチルアニリノ)-7-メトキシアセトアミドキナゾリン；
・4-(4-ブロモ-2,6-ジフルオロアニリノ)-6-メトキシ-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン、
及びこれらの塩、特にこれらの塩酸塩、がある。
【００８０】
Ｆ．骨膜バイオリアクタ
発生中の胚における骨格組織の発生で骨膜（軟骨膜）が果たす役割は良く確立されている。Developmental Anatomy, 6th Edition, L.B. Arey, (Saunders) (1954); 及び Yoo et al. Clin. Orthop., Suppl. 355, S73-81 (1998)を参照されたい。形成層は、子宮内で四肢の形成及び進化の源となる軟骨形成性細胞を含有する。従って、骨及び軟骨組織の治癒及び再生において、骨膜が活発な役割を果たせ、また果たしているはずと考えるのが論理的である。しかしながら、成体における骨及び軟骨の欠損の修復及び再生における骨膜の実用性はほとんど探索されていない。今日までのところ、骨膜が関係する唯一の外科的手法は、関節表面の修復にあたって酵素消化及び細胞移植と共に骨膜片を用いるという、関節表面の欠損の修復においてである。このプロセスはジェンザイム−カーティセル・プロセスとしても知られ、ある程度の成功を収めている。
【００８１】
オドリスコル及び共同研究者たちは骨膜の可能性の理解及び利用での努力を開拓した。彼らは、ウシ胎児血清及びTGF-ベータを添加した標準的な培地を用いた好気性条件下で、軟骨性組織マトリックスを、in vitroで回収された骨膜から得ることができることを、「器官培養モデル」を用いて実証した2,8。O'Driscoll et al. Clin. Orthop. Suppl. 367, S186-203 (1999); 及びO'Driscoll et.al. J. Bone Joint Surg. Am., 76(7), 1042-1051 (1994)。さらに彼らは、２つの因子、即ち、ドナー部位 (Gallay et.al., J. Orthop. Res., 12(4), 515-525 (1994))と、外植後の骨膜の生存率の維持とが、in vitroでの軟骨形成の成功にとって重要であることを示した (O'Driscoll et.al. Cell Transplant., 8(6), 611-616 (1999))。
【００８２】
しかしながら、現在探索されているこの骨膜法、即ち、骨膜が（ａ）細胞の供給源、及び（ｂ）局所環境を規定するための生物活性作用物質の供給源、として働く骨膜法では、その利点にもかかわらず、２つの重大な欠点がある。それらは（ａ）骨膜の生存率を得、維持する、及び（ｂ）よく定義されたエンドポイントまで骨膜をex vivo培養する。
【００８３】
「in vivoバイオリアクタ」という典型は、オドリスコルの提起した問題に対処するのに役立つだけでなく、骨膜の生存性及びex vivo操作という問題も解決する。
【００８４】
ある実施態様では、本方法は、本「in vivoバイオリアクタ」法を用いた軟骨組織の生成において以下のステップを含む。
【００８５】
１．  骨膜の形成層と骨との間に、バルーン血管形成術及び骨切除（原語：debriment）と同様な技術の組合せを用いてポケットを創出する。
２．  形成層を酵素消化して、又はせずに、成長因子を含有するゲルで前記ポケットを充填する。
３．  軟骨性組織の浸潤により前記ポケットが成熟する。
４．  必要に応じて組織の生検をする。
５．  骨膜−軟骨性組織を回収する。
６．  関節表面又は骨性部位のいずれかに移植する。
【００８６】
このように、本「in vivoバイオリアクタ」により、まだ骨に付着した状態で骨膜を操作することが可能である。こうして操作の間中、骨膜を確実に生存状態に置けるであろう。骨膜と骨との間にポケットを創出することにより、生体材料（スキャフォールド）及び成長因子で環境を変化させながらも、天然ミリューを維持でき、天然の治癒プロセスを活かすことができる。また、軟骨形成の際に、骨膜の機械的な変形という正の作用を利用できる可能性がある。さらに、骨膜周囲にポケットを創出することで、骨膜のex vivo培養の必要性、及び／又は、ex vivoで培養された細胞を用いた補充、の必要性が低下する。このことは、臨床上、時間面、及びFDAの観点から見て、大きな長所である。最後に、ここで解説した通りにin vivoで組織を生成させる方法により、同一条件下で軟骨組織及び骨組織の両方を成長させる機会が提供される。
【００８７】
ＩＶ．  実施例
Ａ．アルギン酸塩ゲルの調製
アルギン酸ナトリウムの1%、2%、2.5% 及び 3% (w/v) 溶液を、150 mM NaCl 及び 10 mM KClを含有する30 mM Hepesで作製した。これらの溶液のゲル化を、200 もしくは300 mM CaSO4、又は50、75、100、150もしくは300 mM CaCl2 を含有する10 mM Hepes溶液、及び、150 mM NaCl 及び 10 mM KClを含有する溶液を等量加えて開始させた。溶液はすべてオートクレーブで滅菌し、無菌の手製Y-ピースを用いて混合した。ゲル化時間は視覚的に判断した。さらにゲルを、カルシウム塩の沈殿物の存在を含め、外観上での均質性についても点検した。
【００８８】
イオン的に架橋されたアルギン酸塩・ヒドロゲルを、４つのアルギン酸ナトリウムから調製し、その組成、固有粘度及び分子量を表１に詳述する。これらアルギン酸塩のうちの２つはグルクロン酸を比較的に低率（40%）で含有し、以降、M1及びM2と呼ぶことに留意されたい。比較的に高いグルクロン酸含有量（65-75%）を有する２つのアルギン酸塩は、G1及びG2と呼ぶ（NB。in vivo形成で我々が用いるアルギン酸塩はG2である）。
【００８９】
二価のイオンを添加することで開始されるアルギン酸ナトリウムのゲル化を、CaSO4 又はCaCl2 をカルシウムイオンの供給源として用いて調査した。手製のYピースを開発してこれら二者の溶液を混合し、最終生成物内の分散をより均質にした。対照的に拡散的な硬化法を用いる場合には、ゲル化しつつある中身のうちでまだゲル化していない内側の部分のアルギン酸塩分子が、急速に生じつつあるゲル化域内のゼロ活動領域に向かって外側に拡散していくにつれ、この内側部分でアルギン酸塩が枯渇するのを観察する。
【００９０】
ゲル化は、200もしくは300 mM のCaSO4 をアルギン酸ナトリウムの2% (w/v)溶液に添加することで誘導できた。しかしながら、ゲル化が終了するには数時間という時間が必要だった。さらに、いずれの場合でもCaSO4 沈殿物が、ゲル全体、特に300 mM のCaSO4 を用いたときに明白に見られた。沈殿物が存在したためにゲルの均質性が低下し、またゲル・マトリックス中の細胞の拡散及び生存率に負の影響を与えるかも知れない。
【００９１】
CaCl2 を用いて、より急速なアルギン酸ナトリウムの架橋を沈殿物を形成させずに行えるかを調査した。急速なゲル化（＜１分）が、50、75、又は100 mM のCaCl2を含有する溶液を用いたM1、M2、G1及びG2の1% 及び2%（w/v)溶液で誘導された。1% (w/v) のアルギン酸ナトリウム溶液で、又は50 mMのCaCl2で形成されたゲルの機械的特性はいずれも、許容できない弱さであり、ここではそれ以上、調査しなかった。対照的に、2% (w/v)アルギン酸塩及びより高い濃度のカルシウムイオン(75 及び100 mM) を用いて形成されたゲルは、視覚的に判断したところ、機械的により安定であった。
【００９２】
in vitro研究用のゲル・マトリックス中に細胞が拡散していくのを促進するためには、ゲルの多孔性は高い方が好ましい。これは、グルクロン酸残基の長いブロックを含有するグルクロン酸残基を多く含み、可撓性の弾性セグメントの数が抑えられていることでより硬質の開放し、かつ静的なネットワークが形成されるようになったアルギン酸塩を用いることで達成できる。この理由のため、アルギン酸塩のグルクロン酸含有量を最高で70%まで増すと、ゲルの機械的剛性が高まり、係数も高まることが観察されている。従って、G1及びG2 から形成されるゲルの提供するより多孔質であると思われる構造は、M1 及び M2を用いたゲル形成よりも、組織操作用途により適しているようだった。G1及びG2で形成したゲルのうちでは、G2はG1に比較して分子量及び固有粘度が高いため、より均質なゲルを一貫して生成した（表１を参照されたい）。すべてのゲル試料の均質性は、非ゲル化性イオンの非存在下では低下した（データは図示せず）。
【００９３】
ゲルを2%、3%又は 4% (w/v)のG2 溶液、及び75、100、150又は300 mM のCaCl2 溶液から形成して、G2のゲル化の潜在的能力をさらに調査した。いずれの場合でも、ゲル化は大変急速（＜１分）であり、視覚検査ではゲルは均質に見えた。3% 又は4% (w/v) のG2溶液を100、150 及び300 mM CaCl2 溶液と、Yピースを用いて配合することで形成されたゲルは、小型の様々な輪郭の硬質ペレットを生じた。対照的に、2% (w/v) G2 溶液に75 mM CaCl2を加えてゲル化を誘導した場合には、ゲルの形状は、成形及び造形が容易であり、従って注射による送達を必要とするin vivo投与の可能性に適したものとなった。
【００９４】
【表１】
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【００９５】
表１．用いたアルギン酸塩の組成、固有粘度、分子量及び供給業者
Ｂ． in vitro実験
オドリスコル（上記）が開発した器官培養モデルを用いた軟骨形成のin vitro研究を行って、骨膜軟骨形成に必要な時間枠及び条件を調べた。
【００９６】
骨膜軟骨形成の更なるin vitro研究を行って、アルギン酸塩ゲル懸濁液を用いて器官培養モデルを評価した。簡単に説明すると、ほぼ3×3mmの寸法の骨膜外植片をアルギン酸塩ゲル懸濁液中で、TGF-β1、b-FGF、二者の組み合わせを添加して、又は成長因子の非存在下で、培養した。b-FGF 及びTGF-β1を10 ng/mlの濃度で、それぞれ、２日毎に、最初の１週間は各培地の交換時に、そしてin vitro培養の最初の２週間、投与した。
【００９７】
さらに、培養物には50μg/mlのアスコルビン酸をin vitro培養の最初の４週間、毎日添加した。１週目、３週目、６週目及び８週目の時点で行った当該外植片の組織分析 (Ｈ＆Ｅ；及びサフラニン-Ｏ染色）の結果は、アガロースゲルを用いた器官培養モデルのそれと同様だった（データは示さず）。つまり、in vitroで１週間培養した後では、外植片のいずれも、サフラニン−Ｏ染色を用いたグリコサミノグリカンに対する染色で陽性を示さなかった。追加の成長因子の非存在下、又は、b-FGFのみを８週間にわたって添加して培養した外植片では、骨膜からの目立った新生軟骨形成は観察されなかった。外因性TGF-β1を投与した場合のin vitro培養物では３週間後に軟骨形成が明白となったが、８週間のin vitro培養後に最も顕著であった。以前のアガロース・ベースの器官培養研究と同様、このin vitro培養物にb-FGF及びTGF-β1の組み合わせを添加すると、新生軟骨形成はさらに促進された。b-FGF及びTGF-β1を最初の１週間、そしてin vitro培養の最初の２週間投与した場合の、1、3、6及び 8週間のin vitro 培養後の典型的な骨膜外植片のサフラニン−Ｏ染色を、観察した。このグリコサミノグリカンを豊富に含む新生組織は、免疫組織化学法で特徴付けたときにコラーゲン・タイプＩＩを含有することが判明した。
【００９８】
これらのin vitro研究では、最初のin vivoでの実現可能性研究（下記）の時点を確立することができた。さらにこれらの研究から、b-FGF及びTGF-β1の両方をゲル形成に取り入れると、in vivoでの骨膜軟骨形成が亢進すると考えられることは明白である。
【００９９】
b-FGFがTGF-β1と相乗作用して骨膜由来軟骨形成を亢進させることができるという観察をより広く応用できるよう、器官培養モデルを用いた更なるin vitro研究を現在、ウシ骨膜組織を用いて行っているところである。骨膜外植片での新生軟骨形成を、4、7、10、14、21及び28日目の時点で組織学的分析（Ｈ＆Ｅ；及びサフラニン−Ｏ染色法）、免疫組織化学法及び生化学的分析を行って評価することになる。
【０１００】
Ｃ．  in vivo実験
最初の実現可能性研究を行ったが、当該研究は、ニュージーランド・ウサギモデルの脛骨内の骨膜に人工空間を創出して新生軟骨性組織を再生させた外科的手術を含んだ。最初の実験は、手術状の技術の完璧性に関係した。これは人工空間（寸法で約1×1センチメートル及び深さ0.5-1センチメートル）を脛骨の骨膜に創出することを含んだ。当該部位で結合組織を部分的に分解する、又は、当該空間の形成を促進する、及び／又は、当該空間内への細胞の遊走を促進する、ためには、骨膜の酵素消化は必要でないことが判明した。当該空間の周囲の骨膜からの軟骨細胞の成長にとって適合性ある生分解性アルギン酸塩ゲルをこの人工空間内に導入した。
【０１０１】
前記手術法を用い、成長因子を含有するアルギン酸塩ゲルの移植を１２匹のウサギに行った。これらを手術から1、2、4、6、8又は12週間後の時点でと殺し、人工ポケット及び周囲区域の組織学的分析を行った。これにより、人工空間内の新生軟骨形成の存在を各時点で判定することができ、また、周囲組織に及ぼすアルギン酸塩ゲルの作用も評価できる。これらの研究では、新生組織のin vivo生成に向けた骨膜ポケットの創出の実行可能性が確立された。さらに、術後のウサギに何ら可視の不具合はないことは明白である。各時点は、軟骨形成の同時in vitro研究で得られた結果に基づいて選択された。
【０１０２】
この手法を用いて手術法を行って、ウサギモデルの右側及び左側後肢の両方の脛骨の骨膜内に人工空間を創出すると、この人工空間内に新生組織を再生させることができた。成長因子を全く含まない（コントロール）又は、b-FGF及びTGF-βの両方を10ng/mlの濃度で含有するアルギン酸塩ゲルを人工空間内に導入した。その後この「骨膜ポケット」をフィブリン接着剤で密封して、ゲルが定位置に保持されていることを確認した。
【０１０３】
前記ポケット内の新生組織のin vivo成熟の時点を、軟骨形成のin vitro研究から判定した。ウサギを4、6、8 及び12週目の時点でと殺し、脛骨全体をEDTAを用いて脱灰した。
【０１０４】
図１は、TGF-β1及びb-FGFを含有するアルギン酸塩で充填した人工空間の創出後４週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。 １は、ポケット内に発生した新しい骨の形成区域である。
図２は、（TGF-β1及びb-FGFを含有しない）アルギン酸塩で充填した人工空間の創出後６週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。３は、人工空間（ポケット）と骨との間の境界である。新しい骨は左側である。新しい骨の成長で予測された通りに、新しい骨の成長区域には、大型の血管４が集合している。図３は、骨の端部から髄腔内に向かった骨の断面図を示す。
図４は、TGF-β1及びb-FGFを含有するアルギン酸塩で充填した人工空間の創出後８週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。骨膜は今や正常に見え、血管は正常骨でよりももはや大きくなく、全体的な骨の外観も、より成熟している（暗く着色）。
図５は、（TGF-β1及びb-FGFを含有しない）アルギン酸塩で充填した人工空間の創出後８週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。その形態は成長因子で処理した肢の８週目の時点でのものに同様に見える。図示のように、新しい骨の古い骨との融合が観察された。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、TGF-β1及びb-FGFを含有するアルギン酸塩で充填した人工空間の創出後４週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。
【図２】図２及び３は、（TGF-β1及びb-FGFを含有しない）アルギン酸塩で充填した人工空間の創出後６週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。
【図３】図２及び３は、（TGF-β1及びb-FGFを含有しない）アルギン酸塩で充填した人工空間の創出後６週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。
【図４】図４は、TGF-β1及びb-FGFを含有するアルギン酸塩で充填した人工空間の創出後８週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、（TGF-β1及びb-FGFを含有しない）アルギン酸塩で充填した人工空間の創出後８週間目に撮影したウサギ後肢の顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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