(57)【要約】【課題】【解決手段】式：ｐＴｏｘ−ｐＴａｒｇを有するキメラポリペプチド（ここで、ｐＴｏｘは、ＨＩＶ−１のＶｐｒペプチド等のウイルスアポトーシスペプチド、又細胞のミトコンドリア内膜、アデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）タンパク質と相互作用するアミノ酸モチーフＨ（Ｆ／Ｓ）ＲＩＧを含有するＨＩＶ−１  Ｖｐｒペプチドの断片であり、ｐＴａｒｇは、抗体又は細胞の外膜に結合する抗体断片である）。キメラペプチドの細胞への結合に引き続いて、細胞のアポトーシスが生じる。キメラポリペプチドをコードするベクター、該ベクターを備えた組換え宿主細胞が提供される。前記キメラペプチドは、癌細胞等の細胞にｐＴｏｘを誘導するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞のアポトーシスを誘導又は抑制する方法であって、透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）の活性を調節することができる二元機能性キメラ分子を特定の組織細胞集団にホーミングすることを備えた方法。
【請求項２】
前記孔の開放又は閉鎖を制御することにより、前記キメラ分子が特定の真核細胞の透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）の活性を調節する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記キメラ分子が少なくとも第一の機能性分子と第二の機能性分子とを備え、前記第一の機能性分子が組織細胞集団へ特異的に誘導する機能を有し、前記第二の機能性分子が前記特定の細胞の透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）に連関したアポトーシス活性を調節する機能を有する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記キメラ分子が少なくとも第一の機能性分子と第二の機能性分子とを備え、前記第一の機能性分子が組織細胞集団へ特異的に誘導し且つ侵入させる機能を有し、前記第二の機能性分子が前記特定の細胞の透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）に連関したアポトーシス活性を調節する機能を有する方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記キメラ分子が少なくとも第一の機能性分子と第二の機能性分子とを備え、前記第一の機能性分子が対象組織細胞集団へ特異的に誘導し且つ侵入させる機能を有し、前記第二の機能性分子が特異的に誘導する機能とミトコンドリアの透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）又はその断片の開放又は閉鎖の制御により前記細胞のアポトーシスによる死亡を誘導又は抑制する機能とを有する方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記キメラ分子が、式：Ｔａｒｇ−Ｔｏｘを有し
（ここで、Ｔｏｘはウイルス又はレトロウイルスのアポトーシスペプチド若しくはペプチド類似物又は特定の真核細胞の透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）と相互作用して前記細胞のアポトーシスを引き起こすタンパク質の断片であり、Ｔａｒｇは、
抗体、
抗体断片、
組換え抗体断片、
Ｍ３５０／ＳｃＦｖ、
Ｖ４６１／ＳｃＦｖ、
ホーミングペプチド、及び
表ＩＩＩから選択される任意のペプチド
から選択される）、
前記分子が前記細胞を特異的に結合し、細胞中に入る、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記キメラ分子が式：Ｔａｒｇ−Ｓａｖｅを有し
（ここで、Ｓａｖｅはウイルス若しくはレトロウイルス若しくは細胞の抗アポトーシスペプチド若しくはペプチド類似物又は特定の真核細胞の透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）と相互作用して前記細胞のアポトーシスを抑制するタンパク質の断片であり（但し、Ｓａｖｅペプチドがウイルスペプチドである場合には、ＳａｖｅはサイトメガロウイルスのｖＭＩＡタンパク質ではない）、Ｔａｒｇは、
抗体、
抗体断片、
組換え抗体断片、
Ｍ３５０／ＳｃＦｖ、
ホーミングペプチド、及び
表ＩＩＩから選択される任意のペプチド、
から選択される）、
前記分子が前記細胞を特異的に結合して細胞中に入る、方法。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法であって、前記キメラ分子が、前記第二の機能性分子をミトコンドリア又はミトコンドリアの膜間腔へ特異的に配送する機能を有するミトコンドリア局在化配列（ＭＬＳ）を含む方法。
【請求項９】
Ｔｏｘが、表Ｉのペプチド群から選択される請求項１、２、３、４、５、６、及び８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｓａｖｅが、表ＩＩのペプチド群から選択される請求項１、２、３、４、５、及び７に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法であって、前記キメラ分子の前記第二の機能性分子が、ミトコンドリアのＰＴＰＣのＡＮＴ（アデニンヌクレオチド輸送体アイソフォーム１、２、又は３とも称される）と特異的に相互作用する機能を有する方法。
【請求項１２】
組織細胞集団中に特異的に入ることができる、アポトーシスによる前記細胞の死亡を誘導又は抑制するためのキメラ二機能性分子であり、第二の機能性分子に共有結合された第一の機能性分子を少なくとも備え、該第一の機能性分子が対象組織細胞集団へ特異的に誘導し且つ侵入させる機能を有し、前記第二の機能性分子が特異的に誘導する機能とミトコンドリアの透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）又はその断片の開放又は閉鎖の制御により前記細胞のアポトーシスによる死亡を誘導又は抑制する機能とを有する分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキメラ分子であって、式：Ｔａｒｇ−Ｔｏｘを有し（ここで、Ｔｏｘはウイルス又はレトロウイルスのアポトーシスペプチド若しくはペプチド類似物又は特定の真核細胞の透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）と相互作用して前記細胞のアポトーシスを引き起こすタンパク質の断片であり、Ｔａｒｇは、
抗体、
抗体断片、
組換え抗体断片、
Ｍ３５０／ＳｃＦｖ、
Ｖ４６１／ＳｃＦｖ、
ホーミングペプチド、及び
表ＩＩＩから選択される任意のペプチド
から選択される）、
前記分子が前記細胞を特異的に結合して細胞中に入る、キメラ分子。
【請求項１４】
請求項１２に記載のキメラ分子であって、式：Ｔａｒｇ−Ｓａｖｅを有し
（ここで、Ｓａｖｅはウイルス若しくはレトロウイルス若しくは細胞の抗アポトーシスペプチド若しくはペプチド類似物又は又は特定の真核細胞の透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）と相互作用して前記細胞のアポトーシスを抑制するタンパク質の断片であり（但し、Ｓａｖｅペプチドがウイルスペプチドである場合には、ＳａｖｅはサイトメガロウイルスのｖＭＩＡタンパク質ではない）、Ｔａｒｇは、
抗体、
抗体断片、
組換え抗体断片、
Ｍ３５０／ＳｃＦｖ、
ホーミングペプチド、及び
表ＩＩＩから選択される任意のペプチド、
から選択される）、
前記分子が前記細胞を特異的に結合して細胞中に入る、キメラ分子。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４に記載のキメラ分子であって、前記第二の機能性分子をミトコンドリア膜又は膜間腔へ特異的に配送する機能を有するミトコンドリア局在化配列（ＭＬＳ）を含むキメラ分子。
【請求項１６】
Ｔｏｘが表Ｉのペプチド群から選択される請求項１３又は１５に記載されたキメラ分子。
【請求項１７】
Ｓａｖｅが表ＩＩのペプチド群から選択される請求項１４及び１５に記載のキメラ分子。
【請求項１８】
前記ＴａｒｇとＴｏｘペプチドが、３乃至１８アミノ酸を有するペプチドリンカーを介して共有結合されている請求項１３、１５、及び１６に記載のキメラ分子。
【請求項１９】
前記ＴａｒｇとＳａｖｅペプチドが、３乃至１８アミノ酸を有するペプチドリンカーを介して共有結合されている請求項１４、１５、及び１７に記載のキメラ分子。
【請求項２０】
請求項１２乃至１９の何れか１項に記載のキメラ分子をコードするベクター。
【請求項２１】
請求項１３又は１４に記載のＴａｒｇを分泌し、２００１年１月２４日に、ｎ°Ｉ２６１７の受託番号で、国立微生物培養収集所（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）に寄託されたハイブリドーマ。
【請求項２２】
請求項２１のハイブリドーマによってコードされる精製モノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項２０に記載のベクターを備えた組換え宿主細胞。
【請求項２４】
表面に腫瘍関連抗原を有する癌細胞であって、請求項１２乃至１９の何れか１項に記載のキメラ分子が結合されている癌細胞。
【請求項２５】
表面に腫瘍関連抗原を有する癌細胞が生体試料中に存在するか測定する方法であって、
ａ）対象生体試料を、請求項１２乃至１９に記載のキメラペプチド分子と、本発明の前記キメラ分子と前記癌細胞の表面上に存在する前記抗原との結合が可能な条件下で接触させることと、
ｂ）一般的な技術によって結合を検出することと、
ｃ）工程ｂ）で検出された結合を必要に応じて定量することと、
を備えた方法。
【請求項２６】
表面に腫瘍関連抗原を有する生体試料中の腫瘍又はウイルス感染細胞にアポトーシスによる死を誘導する方法であって、対象生体試料を、請求項１６又は１７に記載のキメラペプチド分子に、本発明の前記キメラ分子と前記癌細胞の表面上に存在する前記抗原との結合が可能な条件下で且つ細胞内に侵入してアポトーシス又はウイルス感染細胞により細胞を死滅させるのに十分な時間にわたって、接触させることを備えた方法。
【請求項２７】
ミトコンドリアのアポトーシスによる細胞死を抑制する方法であって、対象生体試料を、請求項１７又は１９に記載のキメラ分子に、本発明の前記キメラ分子と対象細胞との結合が可能な条件下で且つ対象細胞内に侵入してアポトーシスによる細胞死を抑制させるのに十分な時間にわたって、接触させることを備えた方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の細胞死を抑制する方法であって、前記対象細胞が、以下の細胞集団：神経細胞、心筋細胞、及び肝細胞から選択される方法。
【請求項２９】
透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）の活性に影響を及ぼす興味の対象である活性物質を同定する方法であって、
ａ）透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）を有する細胞を含有する生体試料を、候補物質の存在下で、請求項１２乃至１９に記載のキメラペプチドに接触させることと、
ｂ）前記物質の非存在下において、キメラペプチドの前記透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）との結合を比較することと、
ｃ）透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）を有する細胞成分を含んだ細胞抽出物の調製物に対する、前記選択した物質の活性を必要に応じて調べることと、
を備えた方法。
【請求項３０】
透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）のＡＮＴペプチドと相互作用する興味の対象である活性物質を同定する方法であって、
ｄ）透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）のＡＮＴペプチドを有する細胞を含有する生体試料を、候補物質の存在下で、請求項１２乃至１９に記載のキメラペプチドと接触させることと、
ｅ）前記物質の非存在下において、キメラペプチドの前記透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）のＡＮＴペプチドとの結合を比較することと、
ｃ）透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）のＡＮＴペプチドを有する細胞成分を含んだ細胞抽出物の調製物に対する、前記選択した物質の活性を必要に応じて調べることと、
を備えた方法。
【請求項３１】
ミトコンドリア抗原を同定する方法であって、前記抗原が請求項１３又は１６に記載のＴｏｘの特質を有する高分子又は分子又はペプチドと相互作用する能力を有する方法。
【請求項３２】
ミトコンドリア抗原を同定する方法であって、前記抗原が請求項１４又は１７に記載のｓａｖｅの特質を有する高分子又は分子又はペプチドと相互作用する能力を有する方法。
【請求項３３】
病的な感染症又は疾病を治療又は予防する方法であって、請求項１２乃至１９の何れか１項に記載のキメラ分子を少なくとも含有する薬学的組成物を患者に投与することを備えた方法。
【請求項３４】
請求項１２乃至１９の何れかに記載のキメラ分子を少なくとも含有する薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００１年２月２日に出願された米国仮出願第６０／２６５，５９４号の利益を主張する。この出願の開示内容全体を基礎とし、参照により本明細書に援用する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的には、治療用の細胞死制御分子に関する。より具体的には、本発明は、透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）に作用するペプチド又は偽ペプチド部分が抗体、組換え抗体断片、又はホーミングペプチド等の細胞標的誘導分子に共有結合された分子に関する。その結果得られるキメラ分子は、ＰＴＰＣ及び／又はその主要成分であるアデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）を標的として、細胞死（アポトーシス）を誘発又は阻害させるポリペプチド又はペプチド類似分子である。本発明は、ＰＴＰＣ相互作用部分がアポトーシス誘発性のＨＩＶ−１  Ｖｐｒ由来ペプチド（若しくは偽ペプチド）又はＡＮＴ由来ペプチド（若しくは偽ペプチド）であるこのようなキメラ分子にも関する。本発明は、このようなキメラ分子をコードする核酸配列構築物又はこれらのキメラ分子の一部をコードする核酸配列構築物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
現在、ミトコンドリアが細胞の生死を制御する上で重要な役割を果たしていることには一致が見られている（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｋｒｏｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）。増大しているシグナル伝達関連分子のみならず、多くの代謝物やある種のウイルスエフェクターもミトコンドリアに作用し、ミトコンドリアの膜の透過化に影響を与えているようである。ミトコンドリア特異的なアポトーシス誘発性因子の使用が、癌の治療における新たな概念として出現しているものと思われる（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０００，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。同様に、ミトコンドリア膜の安定化能を活用して、過剰なアポトーシスが存在する疾病（神経変性疾患、虚血、ＡＩＤＳ、劇症肝炎等）の治療に細胞保護作用を有する分子を使用することが可能であるかもしれない。
【０００４】
ミトコンドリア膜の透過化（ＭＭＰ、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）は、膜間腔からのカスパーゼ活性化因子及びカスパーゼ非依存性デスエフェクターの放出、内部膜間電圧（ΔΨｍ）の散逸、並びに酸化的リン酸化の擾乱を伴うアポトーシス性細胞死の中心を成す現象である（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，１９９８；Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｒｏｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，２０００；Ｋｒｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｅｍａｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９９；Ｗａｌｌａｃｅ，１９９９）。Ｂｃｌ−２ファミリーの構成要素の中でアポトーシスを誘発又は抑制するものは、アデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）；内膜（ＩＭ）中）との相互作用、電圧依存性陰イオンチャネル（ＶＤＡＣ；外膜（ＯＭ）中）を通じて、及び／又は自律性のチャネル形成活性を通じて、内部及び外部ＭＭＰを調節する（Ｄｅｓａｇｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｒｏｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，２０００；Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９９）。ＡＮＴとＶＤＡＣは、ミトコンドリアの二つの膜が並んだ部位に組織化されたポリタンパク質構造である透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の主成分である（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，１９９９；Ｋｒｏｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，２０００）。
【０００５】
ミトコンドリアのフェーズは、５０％を超える癌に関わっているＢｃｌ−２ファミリーの発癌遺伝子及び癌抑制遺伝子（総説として、５；２８）の制御下にある（２９）。Ｂｃｌ−２ファミリーの構成要素は全て、アポトーシスの制御に積極的な役割を果たしており、アポトーシス誘発性のもの（Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ等）とアポトーシス抑制性のもの（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−ｌ等）がある（Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ３，６１４−２０（１９９７））。
【０００６】
ミトコンドリアのメガチャネルは、ミトコンドリア膜の透過性の調節に関与しているミトコンドリア内膜とミトコンドリア外膜の間に位置する接触部位に形成されるポリタンパク質複合体である。ミトコンドリアのメガチャネルは、ミトコンドアリア関連ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、ポリン（電圧依存性陰イオンチャネル、すなわちＶＤＡＣ）、アデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）、末梢型ベンゾジアゼピン受容体（ＰＢＲ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、及びサイクロフィリンＤ、並びにＢｃｌ−２ファミリーの構成因子を含む一群のタンパク質から構成されている。生理的な条件では、ＰＴＰＣは、ミトコンドリアのｐＨ、ΔΨｍ、ＮＡＤ／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈレドックス平衡、及びマトリックスタンパク質のチオール酸化によるカルシウムのコンダクタンスの調節を介して、ミトコンドリアのカルシウムホメオスタシスを制御している（Ｍ．Ｚｏｒａｔｔｉ，  Ｉ．Ｓｚａｂｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２４１，１３９−７６（１９９５）．  Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｍ．Ｎａｒｉｔａ，  Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９９，４８３−４８７（１９９９）．  Ｍ．Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３４１，２３３−２４９  （１９９９）．  Ｋ．Ｗｏｏｄｆｉｅｌｄ，  Ａ．Ｒｕｃｋ，  Ｄ．Ｂｒｄｉｃｚｋａ，  Ａ．Ｐ．Ｈａｌｅｓｔｒａｐ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３３６，２８７−９０（１９９８）．  Ｐ．Ｂｅｒｎａｒｄｉ，  Ｋ．Ｍ．Ｂｒｏｅｋｅｍｅｉｅｒ，  Ｄ．Ｒ．Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，  Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  ２６，５０９−１７（１９９４）．  Ｆ．Ｉｃｈａｓ，  Ｌ．Ｊｏｕａｖｉｌｌｅ，  Ｊ．Ｍａｚａｔ，  Ｃｅｌｌ  ８９，１１４５−５３（１９９７））。
【０００７】
アポトーシス及びこれに関連する形態の制御された細胞死は、数多くの病気に関わっている。細胞死プロセスの過剰又は不足は、自己免疫疾患及び神経変性疾患、癌、虚血、並びにウイルス及び細菌性感染症等の病的な感染症又は疾病に関与している。本明細書には、細胞死の制御異常に伴う疾病にミトコンドリアがほとんど随所で関わっていることを示すほんの数例が挙げられている。
【０００８】
虚血の様々なモデル（心臓、肝臓、腎臓、又は脳）では、例えばＣｓＡ（又は免疫を抑制しないその類縁体−Ｍｅ−Ｖａｌ４−ＣｓＡ）等のミトコンドリア膜を安定化することができる分子を用いることによって、塊状アポトーシス（ｍａｓｓｉｖｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）及びそれによって生じる臓器レベルでの急性症状を弱めることが可能である。さらに、ＶＤＡＣは低酸素再灌流後におけるラット海馬の神経細胞の破壊に必須である。神経変性疾患の分野では、極めて多くの観察から、ミトコンドリアによるアポトーシスの制御が密接に関わっていることが示唆されている（Ｋｒｏｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ  ２０００，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ参照）。神経毒であるメチル−４−フェニルピリジニウムは、ミトコンドリアの透過性遷移とチトクロムｃの排出をもたらす。ニトロプロピオン酸又はロテノン等のミトコンドリア毒による中毒は、霊長類とげっ歯類にハンチントン病型の病気を誘発する。
【０００９】
ＰＴＰＣは、二つのミトコンドリア膜間の接触部位に位置する動的なタンパク質複合体であり、ＰＴＰＣの開放によって、１５００Ｄａ未満の溶質が内膜上に自由拡散することが可能となる。ＰＴＰＣの形成には、様々なコンパートメントに由来するタンパク質（ヘキソキナーゼ（サイトゾル）、ポリン（電圧依存性陰イオンチャネルとも称される（ＶＤＡＣ、外膜）、末梢型ベンゾジアゼピン受容体（ＰＢＲ、外膜）、ＡＮＴ（内膜）、及びサイクロフィリンＤ（マトリックス））の会合を伴う。複数のアポトーシス誘発性シグナル伝達経路を統合することができ、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘファミリー由来のタンパク質によって調節されるので、ＰＴＰＣは、アポトーシスの多くの実例に関わっていると考えられている。Ｂｃｌ−２ファミリーには、それぞれ、ＰＴＰＣの開放を抑制又は促進する死亡抑制性の（Ｂｃｌ−２様）構成因子と死亡誘導性の（Ｂａｘ様）構成因子が含まれる。報告によれば、ＢａｘとＢｃｌ−２は、ＰＴＰＣ内のＶＤＡＣ及びＡＮＴと相互作用する。生理的な条件では、ＡＮＴは、ＡＤＰ及びＡＴＰの特異的な対向輸送体（ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）である。しかしながら、ＡＮＴは、Ｃａ２＋、アトラクチロシド、ＨＩＶ−１のＶｐｒ由来ペプチド、及び様々な酸化促進剤を含む様々なアポトーシス誘発因子と相互作用することにより、致死孔（ｌｅｔｈａｌ  ｐｏｒｅ）を形成することもできる。ミトコンドリア膜の透過化は、外膜中のＢｃｌ−２／Ｂａｘ−様タンパク質によって調節される非特異的なＶＤＡＣ孔によって（１２；１６）、及び／又はミトコンドリアマトリックスと細胞質間の代謝性ＡＴＰ／ＡＤＰ勾配の変化によって（１７）も制御され得る。
【００１０】
本分野では、虚血、神経変性疾患、劇症肝炎、及びウイルス感染症における細胞保護分子（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）が必要とされている。
【００１１】
本発明に係るキメラ分子のその他の用途としては、化粧品の調製又は植物若しくは野菜若しくは花の早期死滅の予防（とりわけＰＴＰＣの開放を抑えるための）を想定することができる。
【００１２】
従来の化学療法剤は、腫瘍に対する選択性の低さに起因する重篤な副作用により治療の有効性に限界がある。特異的な腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体（及びＳｃＦｖ）の開発と腫瘍血管新生に対して特異的なホーミングペプチドの同定によって、送達を誘導するアプローチによる抗癌剤の選択性の増強を検討することが可能となった。しかしながら、モノクローナル抗体と抗癌剤（ドキソルビシン（Ｔｒａｉ．  Ｐ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ  １９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２１２）、メトトレキセート（Ｋａｎｅｌｌｏｓ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ７５：３１９）、及びビンカアルカロイド（Ｓｔａｒｌｉｎｇ  Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４１：２９６５））とを用いたこのような試みで公表されているものの大部分は不成功に終わっている。これらの抗体−薬物抱合体の効力は穏やかなものにすぎず、対応する非抱合薬物に比べて細胞毒性が低いのが通常である。実際に、培養腫瘍細胞に対する抗原特異的な細胞毒性が実証されることは稀であった。一般に、腫瘍が十分に定着する前に治療を開始するか、又は極めて大用量（最大９０ｍｇ／ｋｇ、薬物等価用量（ｄｒｕｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｄｓｅ））を使用しなければ、腫瘍異種移植動物モデル内でのこれらの抱合体のインビボ治療効果は観察されない。従って、これらの薬剤を用いたときに、ヒトの臨床検査で有意な抗腫瘍効果が観察されなくても（Ｅｌｉａｓ  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ａｍ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５０：１１１４）（Ｓｃｈｎｅｃｋ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）驚くには当たらない。現に、抱合体の最高循環血清濃度は、それらのインビトロＩＣ５０値と同じ範囲でしかなく、せいぜい腫瘍細胞の僅か約５０％を消滅させ得るにすぎない。
【００１３】
これらの観察結果から、モノクローナル抗体を介して治療用量の細胞毒性薬物を送達する従前の試みは、薬物の選択が不適切であったために、臨床試験において殆ど成功を見ていないと結論付けられた。考えられる（部分的な）解決策の一つとしては、患者の腫瘍部位に治療レベルの抱合体を与えるのであれば、臨床的に用いられている抗癌剤よりずっと高い効力を保有する薬物から免疫抱合体を構成しなければならないとの結論であった。メイタンシノイド、エンジイン、又はインターカレート物質ＣＣ１０６５を含むこのような毒素は、正式に、化学療法剤であるドキソルビシン、メトトレキセート、及びビンカアルカロイドより１００乃至１０００倍細胞毒性が強いことが示された（Ｃｈａｒｉ  ＲＶＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：７０４９）（Ｃｈａｒｉ  ＲＶＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：１２７）。
【００１４】
その他、「Ａｄｅｐｔ」と名付けられたアプローチも設計された。この抗体誘導式酵素プロドラッグ療法（Ａｄｅｐｔ、ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、腫瘍細胞表面に酵素を誘導するためにモノクローナル抗体を使用することに基礎を置いており、最終的には、酵素が適切な非活性プロドラッグから抗癌剤を選択的に送達することが予定されている。何れのケースでも、臨床試験が進行中であるが、現在まで、癌の化学療法に導入されたものは存在せず、標的腫瘍細胞を死滅させるための新しいツールが必要とされている。Ｂａｇｓｈａｗｅ  ＫＤ，１９９０．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ−  ｅｎｚｙｍｅ／ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＡＤＥＰＴ）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．１８（５）：７５０−２．Ｍｅｌｔｏｎ  ＲＧ，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ＲＦ．１９９６  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，８８（３−４）：１５３−６５．  Ｒｉｈｏｖａ  Ｂ．１９９７；  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１４９−１６９．  Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ．２０００．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｇｕｓ  ９（６）：１２３１−４２。
【００１５】
最近、化学療法によって誘導されるアポトーシスの新しい有望な標的としてミトコンドリアが挙げられている（１−７）。レジノイド（ｒｅｓｉｎｏｉｄ）酸誘導体ＣＤ４３７、ロニダミン、ベトゥリニック酸、及び亜ヒ酸塩を含む４つの異なる抗癌剤が、ミトコンドリアに対する直接作用によって癌細胞のアポトーシスを誘導することが示されている。これらの抗癌剤とミトコンドリアの相互作用は、少なくとも一部が透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）の開放に起因するミトコンドリア内膜の透過性の増大をもたらす。ＰＴＰＣの開放は、ミトコンドリアマトリックスの膨張、内部膜間電位（ΔΨｍ）の散逸、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成の増大、及び膜間腔から細胞質へのアポトーシス誘発性タンパク質の放出をもたらす。このようなミトコンドリアのアポトーシス誘発性エフェクターには、カスパーゼ活性化因子チトクロムｃ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、及びプロカスパーゼが含まれる（２−６）。ＣＤ４３７、ロニダミン、ベトゥリニック酸、及び亜ヒ酸塩によって誘導されたアポトーシスの徴候は全て、特定のＰＴＰＣタンパク質（すなわち、サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ、サイクロフィリンＤのリガンド）とボンクレキン酸（ＢＡ、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）のリガンド））に作用する二つの物質によって抑えられる。このため、ＰＴＰＣの開放は、これらの物質によって引き起こされるアポトーシスにとって決定的な現象であるものと思われる。
【００１６】
ハチ毒から単離されたペプチドであるマストパランは、ＣｓＡ阻害可能な機序を介してミトコンドリア膜の透過化を誘導し、無処置の細胞に加えるとミトコンドリア効果を介してアポトーシスを誘導することが知られた最初のペプチドである。このペプチドは、α−ヘリックス構造を有しており、ヘリックスの一方の側に分布した正電荷を幾つか有している。類似のペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ又は（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（Ｋ＝リジン、Ｌ＝アラニン、Ａ＝ロイシン））を精製されたミトコンドリアに加えたときに、ミトコンドリアの膜を崩壊させることが最近見出されたが、この効果の機序は明らかにされていない。
【００１７】
各組織の脈管構造は高度に特殊化されている。リンパ組織中の内皮は、リンパ球ホーミングのための組織特異的受容体を発現しており、ファージホーミングを用いた最近の研究により、他の正常な組織の脈管構造中に前例のない程度の分化が明らかとされた。表面にランダムなペプチド配列が置き換えられたファージのライブラリをインビボでスクリーニングすることによって、多数の正常組織に対する特異的なホーミングペプチドが得られた。ファージペプチドがホーミングした組織特異的内皮性分子は、転移性悪性細胞の受容体として働く可能性がある。腫瘍脈管構造の探索によって、血管新生性の新生脈管構造中に選択的に発現された内皮性受容体にホーミングするペプチドが得られた。これらの受容体、及び各個の正常組織の脈管構造に対して特異的な受容体は、特定の部位に治療法を誘導する上で有用である可能性が存在する。Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ，  Ｒａｊｏｔｔｅ  Ｄ．２０００；Ａｎ  ａｄｄｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：８１３−２７．
Ｅｌｌｅｒｂｙらは、最近、ミトコンドリア毒性を有する（ＫＬＡＫＬＡＫ）２モチーフを、内皮細胞と相互作用する標的誘導ペプチドに融合させた。このような融合ペプチドは内部移行され、新生血管由来の内皮細胞中にミトコンドリア膜の透過化を誘導し、ヌードマウスに移植されたＭＤＡ−ＭＤ−４３５乳癌異種移植を死滅させる。同様に、Ｂａｘに融合されたインターロイキン−２（ＩＬ−２）タンパク質を含有する組換えキメラタンパク質は、ＩＬ−２受容体を有する細胞にインビトロで選択的に結合し、該細胞を死滅させる。このように、細胞表面に誘導し、細胞質内に移動させ、ミトコンドリア膜の透過化を介してアポトーシスを誘導する特異的細胞毒性物質は、癌の治療において有用な可能性がある。
【００１８】
形質転換細胞を選択的に根絶させることが本分野において必要とされている。一つの戦略は、選択した細胞種に毒性物質を誘導することである。より具体的には、ミトコンドリアの透過化とアポトーシスを制御する方法と試薬が本分野で必要とされている。
【発明の開示】
【００１９】
発明の要約
少なくとも従来技術に存する幾つかの制約を克服するために、本発明は、細胞誘導部分（ＴＡＲＧと名付ける）と、ＰＴＰＣ相互作用部分（ＴＯＸ／ＳＡＶＥと名付ける）と、任意的なミトコンドリア局在化配列（ＭＬＳ）とを含有する多機能性分子のペプチド又は偽ペプチドファミリーを提供する。本発明の好ましい態様では、前記多機能性分子のＴＯＸ／ＳＡＶＥ部分は、ＰＴＰＣの中心的成分であるアデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ、Ａｄｅｎｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ）と直接相互作用するペプチド又はペプチド類似分子である。
【００２０】
したがって、本発明は、二つのカテゴリーの標的とされた細胞死制御分子を含む。
【００２１】
・ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸは、ＰＴＰＣ依存性ミトコンドリア膜の透過化とこれに続く細胞死を誘導する多機能性分子である。
【００２２】
・ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＳＡＶＥは、ＰＴＰＣ及び／又はＡＮＴとの相互作用を通じて、ミトコンドリア膜の透過化から細胞を保護し、その結果、細胞を細胞死から保護する多機能性分子である。
【００２３】
本発明は、さらに、本発明のキメラポリペプチドをコードするベクターを提供する。また、本発明は、本発明のベクターを備えた組換え宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、その表面上に腫瘍関連抗原を有する癌細胞であって、前記キメラポリペプチドの抗体又は抗体断片を介して、本発明のキメラペプチドが結合された癌細胞を提供する。本発明は、癌細胞を検出する方法も提供する。
【００２４】
本発明は、本発明のポリペプチドを用いてアポトーシスを誘導又は抑制する方法も提供する。本発明は、腫瘍細胞中にアポトーシスを誘導する方法を提供する。本発明は、ウイルス感染細胞中にアポトーシスを誘導する方法を提供する。
【００２５】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを産生するハイブリドーマを提供する。本発明は、これらのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体も提供する。
【００２６】
本発明は、ＰＴＰＣと相互作用する興味の対象である活性物質を同定する方法も提供する。本発明は、ＡＮＴペプチドと相互作用する興味の対象である活性物質を同定する方法も提供する。本発明は、ミトコンドリアの抗原を同定する方法も提供する。
【００２７】
本発明は、本発明のポリペプチドを患者に投与することにより、病的な感染症又は疾病を治療又は予防する方法も提供する。本発明は、本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
ミトコンドリアの内膜タンパク質ＡＮＴ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ、ＡＤＰ／ＡＴＰキャリアとも称される）との物理的及び機能的な相互作用を介して、ＨＩＶ−１にコードされたアポトーシス誘発性タンパク質Ｖｐｒがミトコンドリア膜の透過化を誘導することが最近発見された。これは、様々な異なる技術、すなわち表面プラズモン共鳴、電気生理学、合成プロテオリポソーム、精製ミトコンドリアに関する研究（呼吸測定、電子顕微鏡、細胞小器官蛍光光度法）、及び無処置細胞のマイクロインジェクションを用いて示された。これらの発見は、２０００年９月１１日に出願された米国仮出願第６０／２３１，５３９号（開示内容全体を基礎とし、参考文献として本明細書に援用する）に詳しく記載されている。
【００２９】
本発明は、ミトコンドリアの透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）と相互作用するペプチド分子（ｐＴｏｘと名付ける）と細胞を標的として誘導することができる分子（ｐＴａｒｇと名付ける）との会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に基づいた新規細胞毒性抱合体に関する。本発明は、ミトコンドリアの透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）と相互作用するペプチド分子（ｐＳＡＶＥと名付ける）と救出のために細胞を標的として誘導することができる分子（ｐＴａｒｇと名付ける）との会合に基づいた新規細胞保護抱合体にも関する。本発明の具体的な態様では、本発明の細胞毒性抱合体は、ウイルス由来のアポトーシス誘発性ペプチドを含む。
【００３０】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸは、腫瘍細胞又は特定の哺乳動物細胞種と選択的に相互作用する腫瘍特異的分子であり、前記多機能性分子は前記哺乳動物又は腫瘍細胞種によって選択的に内部移行し、前記多機能性分子はＰＴＰＣ及び／又はＡＮＴと相互作用して、アポトーシス又は何らかの細胞死プロセスを引き起こす強力なミトコンドリア毒性を発揮する。
【００３１】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸは、血管新生内皮細胞に対して選択毒性を表す。本発明の別の態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸは、腫瘍細胞に対して選択毒性を表す。
【００３２】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＡＲＧ部分は、抗体又は組換え抗体断片である。本発明の別の態様では、多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＡＲＧ部分は、腫瘍ホーミング（ｈｏｒｎｉｎｇ）ペプチド（たとえば、ＣＮＧＲＣペプチド、肺ホーミングペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ）である。
【００３３】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＯＸ部分は、ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質のＣ末端部分（アミノ酸５２−９６）に由来するペプチド又はペプチド類似体である。
【００３４】
本発明の1つの態様では、前記多機能性ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＯＸ部分は、ＢａｘもしくはＢｉｄタンパク質等のアポトーシス誘発性のＢｃｌ−２ファミリー構成因子、又はそれらの断片である。
【００３５】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＯＸ部分は、表１に記載されているペプチド配列群の中から選択されるＤ−ペプチド、Ψ−ペプチド、又はレトロ−インベルソペプチドである。
【表１】
2004532005.tif 000002
【００３６】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＳＡＶＥのＳＡＶＥ部分は、表２に記載されているペプチド配列群の中から選択されるＬ−ペプチド、Ｄ−ペプチド、又はレトロ−インベルソペプチドである。
【表２】
2004532005.tif 000003
【００３７】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＳＡＶＥのＴＡＲＧ部分は、表３に記載されているペプチド配列群の中から選択されるＬ−ペプチド、Ｄ−ペプチド、又はレトロ−インベルソペプチドである。
【表３】
2004532005.tif 000004
【００３８】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴａｒｇ部分は、デカン酸ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＯ−である。
【００３９】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＡＲＧ部分は、抗体、組換え抗体、組換え抗体断片、又はＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）である。
【００４０】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＡＲＧ部分は、以下のベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１（図１）によってコードされている。
【００４１】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＡＲＧ部分は、以下のベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０（図２）によってコードされている。
【００４２】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸのＴＡＲＧ部分は、ＥｌｌｅｒｂｙらによってＰＣＴ／ＵＳ００／０１６０２に定義されている腫瘍ホーミングペプチドである。
【００４３】
本発明の1つの態様では、前記多機能性分子ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸ／ＳＡＶＥのＴＡＲＧ部分は、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  Ｒ，  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉによって定義されている脳又は腎臓ホーミングペプチドである（Ｎａｔｕｒｅ  １９９６  Ｍａｒ  ２８：３８０（６５７２）：３６４−６．  Ｏｒｇａｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）。
【００４４】
本発明の1つの態様では、ｐＴｏｘは、ＨＩＶ−１のＶｐｒペプチド又はその断片である。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）は、９６アミノ酸の平均長と約１５ｋＤの分子量を有する、ビリオン随伴性ウイルス遺伝子産物である。Ｖｐｒは、ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の間で高度に保存されたウイルスタンパク質である。「Ｙｕｑｉ  Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｔ．Ｅｌｄｅｒ、“Ｙｅａｓｔ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ＨＩＶ−１  ＶＰＲ，”  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５，ｄ９０５−９１６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １，２０００」を参照。
【００４５】
Ｖｐｒはオリゴマーとして特定されており、その構造的な特徴に基づいて３つのドメイン（両親媒性αヘリックスを形成すると予測されている負に荷電したアミノ末端領域（アミノ酸１７−３４）、中央の疎水性ドメイン（アミノ酸３５−７５）、及び正に帯電したカルボキシ末端ドメイン（アミノ酸８０−９６））に分けられると考えられている。Ｖｐｒの変異分析により、核内移行、ビリオン組み入れ、及びＶｐｒの細胞周期抑止は、異なる機能ドメインによって媒介されていることが示唆されている。アミノ末端のヘリックス内の構造モチーフは、Ｖｐｒをビリオンにパッケージングし、タンパク質の安定性を維持するのに重要なようである。中央の疎水性領域、特にロイシン−イソロイシン（ＬＲ）ドメインは、Ｖｐｒの核移行に関わっていると報告されている。Ｖｐｒの細胞周期抑止機能の多くは、カルボキシ末端内の正に荷電した領域内に位置づけられることが明らかとされた。「Ｔｏｍｏｙｕｋｉ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｎｏｂｕｍｏｔｏ  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｈｉｒｏｍｉｔｓｕ  Ｎａｋａｕｃｈｉ，  ａｎｄ  Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｋｏｉｔｏ，“Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｖｐｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ，”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４３（５），４３７−４４７，１９９９」を参照。
【００４６】
ヒト免疫不全ウイルス１型のウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）のアミノ酸配列を以下に示す。
【００４７】
ＭＥＱＡＰＥＤＱＧＰＱＲＥＰＹＮＥＷＴＬＥＬＬＥＥＬＫＳＥＡＶＲＨＦＰＲＩＷＬＨＮＬＧＱＨＩＹＥ
ＴＹＧＤＴＷＡＧＶＥＡＩＩＲＩＬＱＱＬＬＦＩＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧＶＴＲＱＲＲＡＲＮＧＡＳＲＳ
Ｖｐｒ及び保存されたＨ（Ｆ／Ｓ）ＲＩＧ反復モチーフを含有するペプチドは、ヒトＣＤ４細胞を素早く貫通し、アポトーシスによるミトコンドリアの機能不全と死を引き起こすことができる。より具体的には、組換えＶｐｒ及び保存された配列ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧを含有するＶｐｒのＣ末端ペプチドは、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球の透過化、ミトコンドリア膜電位の劇的な減少を引き起こし、最終的には細胞死を招来させ得る。Ｖｐｒ及び保存された配列を含有するＶｐｒペプチドは素早く細胞を貫通して、ＤＮＡと共存し、顆粒密度（ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）の増加と密集したアポトーシス小体（ｄｅｎｓｅ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂｏｄｙ）の形成とを引き起こす。Ｖｐｒ処理した細胞はアポトーシスを起こし、これはＤＮＡの断片化の実証によって確認された。「Ｃ．Ａｒｕｎａｇｉｒｉ，  Ｉ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅ，  Ｄ．Ｈｅｗｉｓｈ  ａｎｄ  Ａ．Ａｚａｄ，“Ａ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｖｐｒ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ，  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １９９７；２：６９−７６．」を参照。
【００４８】
酵母モデル系を用いて、ＶｐｒのＣ末端部分、特に配列ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧに関連した細胞破壊活性が存在することが確認されている。Ｖｐｒ及び配列ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧを含有するＶｐｒの一部は、ヒトリンパ球を含む広範な哺乳類細胞を死滅させることができる。「Ｉ．Ｇ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅ，  Ａ，Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ，  Ｐ．Ｍ．  Ｓｔｒｉｋｅ，  ａｎｄ  Ａ．Ａ．  Ａｚａｄ，“Ｃｙｔｏｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ＶＰＲ  ａｎｄ  Ｓａｃｌｐ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｂｉｏａｓｓａｙｅｄ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，”  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  Ｖｏｌ．４，  Ｎｏ．３，  ｐｐ．１８１−１８６，１９９７」を参照。
【００４９】
１２アミノ酸のαヘリックスモチーフ（Ｖｐｒ７１−８２）内のＣ末端部分（Ｖｐｒ５２−９６）は、重要な意味を持つアルギニン（Ｒ）残基を幾つか含有しており（Ｒ７３、Ｒ７７、Ｒ８０）、種々の病原性ＨＩＶ−１分離株の間で強固に保存されている（Ｌ．Ｇ．  Ｍａｃｒｅａｄｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２，  ２７７０−２７７４（１９９５）．  Ｉ．Ｇ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４１０，  １４５−１４９（１９９７）．  Ｅ．Ｊａｃｏｔｏｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１，３３−４５（２０００））。このため、本発明のキメラポリペプチドのアポトーシス誘発性部分（ｐＴｏｘ）は、例えば、配列ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ（ＨＩＶ−１  Ｖｐｒ７１−８２）、ＨＦＫＩＧＣＫＨＳＫＩＧ、Ｖｐｒ７１−９６、Ｖｐｒ５２−９６、又はＤ［ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ］のような偽ペプチド変種を含有し得る。
【００５０】
Ｖｐｒペプチドの他の変種を本発明に利用することもできる。一対のＨ（Ｆ／Ｓ）ＲＩＧ配列モチーフ（ＨＩＶ−１  Ｖｐｒの残基７１−７５及び７８−８２）を包含するＶｐｒのペプチド断片は、細胞膜の透過化と死を酵母及び哺乳類細胞に引き起こすことが示されている。ペプチドＶｐｒ５９−８６（Ｖｐｒの残基５９−８６）は、残基６０−７７を包含し、残基６２の近傍にねじれ（ｋｉｎｋ）を有するαヘリックスを形成する。反復配列モチーフ（ＨＦＲＩＧ）のうち第一のモチーフは明瞭なαヘリックスドメインの中に関与しているのに対して、第二のモチーフ（ＨＳＲＩＧ）はヘリックスドメインの外側に位置し、規則性が減少した領域が後置されたリバースターンを形成していることが示されている。一方、ペプチドＶｐｒ７１−８２とＶｐｒ７１−９６（配列モチーフはＮ末端に位置している）は、Ｃ２Ｈの化学シフトによって判断したところによると、同様の条件下で大部分が構造化されていなかった。このように、ヘリックス構造が先行しているときには、ＨＦＲＩＧとＨＳＲＩＧモチーフは、それぞれα−ヘリックス構造とターン構造を採っているが、単独では大部分が構造を形成していないことが示されている。これらの知見には、これらのモチーフを含有する合成ペプチドの構造−機能の相関を解釈するための示唆が存在する。例えば、ＨＦＲＩＧとＨＳＲＩＧ配列モチーフは、ヘリックス構造が先行しているときには、それぞれヘリックス構造とターン構造を採っているが、完全長のＶｐｒにおけるように、単独では大部分が構造を形成していないので、本発明のキメラポリペプチドのｐＴｏｘ成分として使用する場合、それらが完全長のタンパク質におけると同一の構造を確実に採ることができるようにするために、ヘリックスの少なくとも１乃至２ターンを支えるのに十分な７乃至８残基をＶｐｒのＮ末端に含めるべきである。「Ｓｈｅｎｇｇｅｎ  Ｙａｏ，  Ａｌｌａｎ  Ｍ．  Ｔｏｒｒｅｓ，Ａｈｍｅｄ  Ａ．  Ａｚａｄ，  Ｉａｎ  Ｇ．  Ｍａｃｒｅａｄｉｅ  ａｎｄ  Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｓ．  Ｎｏｒｔｏｎ，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ＨＩＶ−１  Ｖｐｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  Ｃａｕｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｒｒｅｓｔ，”  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．４：４２６−４３５（１９９８）．」を参照。Ｖｐｒ遺伝子は９６アミノ酸のタンパク質をコードしているが、異型が観察されている（例えば、ＨＩＶ−１ＨＸＢ２由来のＶｐｒｓは、それぞれ、９７及び９０個のアミノ酸残基を有する。）。これらの変種も、本発明に利用できることが理解されるであろう。
【００５１】
最も効果的な毒性を与えるためには、天然の配列から得た約８つのアミノ酸で、ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧの両側を囲むべきである。Ｖｐｒ結合、ミトコンドリア膜の透過化、又はアポトーシスを阻害又は増強する９アミノ酸超のＶｐｒポリペプチド及びペプチド、並びにサイズが少なくとも１０−２０、２０−３０、３０−５０、５０−１００、及び１００−３６５アミノ酸のペプチドを本発明に用いることもできる。これらのポリペプチド及びペプチドをコードするＤＮＡ断片も本発明に包含される。隣接する残基は、上述したヘリックス構造を崩壊させるものにするべきではない。
【００５２】
Ｖｐｒ変種及び他のウイルスのアポトーシスペプチドのアポトーシス媒介能を評価することが可能であり、これによって、それらを本発明でｐＴｏｘとして使用することが適切かどうかを評価することができる。Ｖｐｒ又はその他のウイルスのアポトーシスペプチドのＡＮＴへの結合を評価するために、多くの技法を使用し得ること、及びこれらの態様が本発明の範囲を限定するものでは決してないことが理解される。例えば、1つの態様では、Ｖｐｒ又はその他のウイルスのアポトーシスペプチドのＡＮＴへの結合を評価するために、表面プラズモン共鳴を使用する。別の態様では、Ｖｐｒ又はその他のウイルスアポトーシスペプチドのＡＮＴへの結合を評価するために、電気生理学を使用する。別の態様では、Ｖｐｒ又はその他のウイルスアポトーシスペプチドのＡＮＴへの結合を評価するために、精製されたミトコンドリアが使用される。別の態様では、Ｖｐｒ又はその他のウイルスのアポトーシスペプチドのＡＮＴへの結合を評価するために、合成プロテオリポソームが使用される。別の態様では、Ｖｐｒ又はその他のウイルスのアポトーシスペプチドのＡＮＴへの結合を評価するために、生きた細胞のマイクロインジェクションが使用される。これらの技術は、米国仮出願弟６０／２３１，５３９号に記載されている。
【００５３】
別の態様では、Ｖｐｒ−ＡＮＴの相互作用をスクリーニングするために、以下のように、ＳＵＮＹで開発された酵母ツーハイブリッド系（Ｆｉｅｌｄｓらの米国特許５，２８２，１７３号；Ｊ．Ｌｕｂａｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｇｏｆｆ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５９−６４，１９９５；Ｒ．Ｂｒａｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂｏｅｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５６１−５６８，１９９７；Ｒ．Ｂｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆｉｎｌｅｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３１：６６３−７０４，１９９７；Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２４１−２６３，１９９５に記載されている）を使用することもできる。相互作用に不可欠なＶｐｒ若しくはその一部、又はその他のウイルスアポトーシスペプチドをＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合して、Ｇａｌ  ４転写活性化ドメインに融合されたＡＮＴ分子とともに、ヒスチジン欠損プレート上で増殖するためにＧＡｌ４活性に依存する株に導入することができる。Ｖｐｒポリペプチド又はその他のウイルスアポトーシスペプチドがＡＮＴ分子と相互作用することにより、両分子を含有する酵母の増殖が可能となり、この相互作用を阻害又は変化させる分子（すなわち、増殖を阻害又は増強することによって）をスクリーニングすることができる。別の態様では、酵母ツーハイブリッドアッセイにおける結合を測定するために、検出可能なマーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ）を使用することができる。
【００５４】
あるいは、Ｖｐｒペプチド断片又はその他のウイルスのアポトーシスペプチドの結合特性は、Ｖｐｒペプチド断片又はその他のウイルスのアポトーシスペプチドのＡＮＴ発現細胞への結合をＦＡＣＳ分析で分析することによって測定することができる。これにより、ペプチドの結合の性質を決定し、ペプチドがＡＮＴに結合する相対的能力を識別することが可能となる。同様に、ＡＮＴ結合活性を特定するためには、Ｖｐｒ又はその他のウイルスのアポトーシスペプチドを用いたインビトロ結合アッセイを使用することができる。
【００５５】
別の具体的な態様では、本発明の細胞毒性抱合体には、アデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）由来のアポトーシス誘発性ペプチドが含まれる。前記抱合体のアポトーシス誘発部分（ｐＴｏｘ）は、例えば、配列ＤＫＲＴＱＦＷＲＹＦＰＧＮ（ｈＡＮＴ２１０４−１１６［Ａ１１４Ｐ］）又は［ＤＫＲＴＱＦＷＲＹＦＰＧＮ］等の偽ペプチド変種を含有することができる。
【００５６】
別の具体的な態様では、本発明の細胞保護抱合体には、ＡＮＴ由来の抗アポトーシスペプチドが含まれる。前記抱合体の抗アポトーシス部分（ｐＳａｖｅ）は、例えば、配列ＤＫＲＴＱＦＷＲＹＦＡＧＮ（ｈＡＮＴ２１０４−１１６）、配列ＬＡＳＧＧＡＡＧＡＴＳＬＣＦＶＹＰＬ（ＡＮＴ１１７−１３４）、又はＤ［ＤＫＲＴＱＦＷＲＹＦＰＧＮ］等の偽ペプチド変種を含有することができる。
【００５７】
本発明のキメラポリペプチドのｐＴａｒｇ成分は、抗体又は抗体断片であり得る。抗体又は抗体断片は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の全部又は一部であり得る。「抗体」という語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの断片、並びに組換えによって作製された任意の結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒｓ）を含むものとする。約１０７Ｍ−１以上のＫａで結合すれば、抗体が特異的に結合すると定義する。結合パートナー又は抗体の親和性は、伝統的な技術、例えば、「Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９）」に記載されている技術を用いて容易に測定することができる。
【００５８】
本明細書で使用する「抗体断片」という語には、以下のものが含まれる。
【表４】
2004532005.tif 000005
モノクローナル抗体の断片は、小さな抗原誘導分子として特に興味深い。抗体断片は、他のｐＴｏｘ因子を有するようにデザインされた本発明のキメラポリペプチド（治療用抱合体等）を組み立てるのにも有用である。インビボで使用する場合、抗体の断片は薬物動態学的な挙動が変化しているので細胞毒性物質を用いた癌の治療に有用であるとともに、身体の組織中に素早く浸透させるのに有用であり、治療技術に優れた効果を発揮するため有益である。
【００５９】
本発明に使用するのに特に適した抗体断片は、抗原結合活性を有する最小のＦｖ断片である。Ｆｖ断片の二つの鎖は、共有結合を持たず、非共有結合的相互作用も小さく、Ｆｄ及びＦａｂ断片の軽鎖よりも会合の安定性が低いが、機能的なＦｖ断片が数多くの様々な抗体に対して発現されている。本発明に使用されるＦｖ断片を安定させるには、二つの方策を利用することができる。第一に、二つのドメイン間でジスルフィド結合を形成できるようにするためにＶＨとＶＬの各鎖上の選択した残基をシステインに変異させる。第二に、一本鎖Ｆｖとして知られる単一のポリペプチド鎖としてＦｖが得られるように、あるドメインのＣ末端と別のドメインのＮ末端との間にペプチドリンカーを導入する。
【００６０】
このように、一本鎖Ｆｖｓ（ＳｃＦｖｓ）（ポリペプチドリンクによって互いに共有結合で係留され、一つのポリペプチド鎖を形成する組換えＶＬ及びＶＨ断片）は、本発明において有用である。Ｆｖ遺伝子を発現させるためには、骨髄腫細胞、昆虫、酵母、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞を含む幾つかの系を効果的に使用することができる。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中での発現は、頻繁に使用されている製造法であって、細胞内発現と分泌の両者によって、ＳｃＦｖを高収率で作製することが可能となる。
【００６１】
ＳｃＦｖ分子の作製には、あるドメインのＣ末端と別のドメインのＮ末端の間の３５乃至４０Åという距離を架橋して、Ｆｖ構造が正しくフォールディングし組み立てられるようにするための適切なペプチドリンカーを同定することが必要である。数種の異なるリンカーが用いられており、機能的なＳｃＦｖを与えることが示されている。通常、３−１８アミノ酸の平均長を有するポリペプチドがリンクとして使用される。それらは、セリン及び／又はグリシン残基に富んでいてもよく（これにより柔軟性が得られる）、あるいは、帯電したグルタミン酸及び／又はリジン残基に富んでいてもよい（これにより溶解度が向上する）。リンカーは、適切な長さとコンフォメーションのタンパク質断片を既存のタンパク質構造から検索して選択することもできるし、１５アミノ酸の配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３等の簡易で柔軟な構造を基礎として新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）設計することによって選択することもできる。
【００６２】
可能な二つの方向性の活性な一本鎖Ｆｖ分子（ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨ）は何れも本発明に使用できるが、本来のコンフォメーションを維持して完全な抗原結合を保つには、一方のドメインのＮ末端又は他方のドメインのＣ末端が遊離状態にあることが必要な可能性があるので、抗体の中には、一方の方向性が好適なものがあるかもしれない。
【００６３】
ＳｃＦｖには、凝集し易く、二量体、三量体、及び多量体を形成するものが存在するかもしれない。安定なｐＴａｒｇ構造を作製するためには、極めて短いリンカーを用いるか、又はリンカーを全く用いない場合に二量体又はその他の多量体が形成される可能性を調べることができる。ある特異性を有する抗体のＶＨを別の特異性を有するＶＬに融合させることによって（この逆も同様）、二つの異なる結合特異性を有するｐＴａｒｇ分子を作出するために、このようなアプローチを使用することも可能である。
【００６４】
ジスルフィド結合によって安定化されたＦｖ’ｓは、本発明のキメラポリペプチドのｐＴａｒｇ成分として用いることもできる。ＶＨドメインとＶＬドメインの間にジスルフィド結合を導入してジスルフィドで連結されたＦｖを形成させるには、システインに変異させたときに、結合部位のコンフォメーションに直接影響を与える可能性が少なく且つＦｖの構造に緊張を与えずにジスルフィド結合を形成することができる、各鎖上の近接した残基を同定する必要がある。このようなジスルフィド結合の形成をもたらし、抗原結合特性を保持している安定化されたＦｖ断片を産生させ得ると思われる部位が、ＣＤＲ領域とフレームワーク領域の両方に見出されている。
【００６５】
サイズが小さく、インビボでのクリアランスが迅速で、安定であり、加工もし易いので、本発明において用いられるＳｃＦｖｓは、疾病（特に癌）の治療において様々な用途を有している。ＳｃＦｖｓは、抗原に対して、モノクローナル抗体と同じ親和性と特異性を表すことができる。異なる特異性を有する多数のＳｃＦｖが構築されている。それらは、強力な毒素（ｐＴｏｘ）に遺伝的に融合するのに有用である。ＳｃＦｖが一価であることが不利益ならば、結合効率が増大した二価又は多価の構築物を利用することもできる。
【００６６】
本発明の好ましい態様では、細胞毒性抱合体の標的誘導部分（ｐＴａｒｇ）は、腫瘍特異的抗体の組換え部分（ＳｃＦｖ）（Ｍ３５０及びＶ４６１モノクローナル抗体のＳｃＦｖ形式等）である。このハイブリドーマは、２００１年１月２４日に、受託番号Ｉ−２６１７でＣＮＣＭに寄託した。
【００６７】
本発明のキメラポリペプチドのｐＴａｒｇ成分は、好ましくは、モノクローナル抗体又はその断片である。ヒト細胞抗原に対するモノクローナル抗体が好ましい。現在、数多くの腫瘍関連抗原が公知であり、性質も特定されているが、これらに対する抗体により、様々な種類の腫瘍に誘導することが可能となる。有用な腫瘍関連抗原は、正常組織には存在せずに、腫瘍細胞上に高レベルで存在しているもの、好ましくは、腫瘍の全細胞上に均一に存在しているものである。また、抗原は、腫瘍から血液へと流出すべきではない。
【００６８】
一般的に使用されている腫瘍関連抗原とそれらに対する抗体の例を下表に記す。
【表５】
2004532005.tif 000006
【００６９】
重要な検討事項は、腫瘍部位に局在する抗体の絶対量である。したがって、腫瘍に大量に局在して、大用量のｐＴｏｘを輸送するが、循環及び身体の他の部分からは素早く除去され、非特異的な毒性を最小限に抑える分子が理想的な分子となろう。無処置の完全な抗体は、通例、長期間にわたって循環し、腫瘍部位に高レベルの活性を蓄積させるのに対して、抗体の断片はこれより急速に除去され、正常組織への投薬量が節約される。
【００７０】
抗体断片は、ファージディスプレイ技術によって調製することもできる。ファージディスプレイは選択の技術であり、この技術では、抗体断片（ＳｃＦｖ）を線状ファージｆｄの表面上に発現される。このために、抗体可変遺伝子のコード配列を、ファージ粒子の末端に位置するマイナーコートファージタンパク質ＩＩＩ（ｇ３ｐ）をコードする遺伝子と融合させる。融合された抗体断片をビリオン表面上にディスプレイし、不溶化抗原上への吸着により、断片を有する粒子を選択することができる（パニング）。細菌細胞を再感染させるために、溶出後、選択した粒子を使用する。吸着と感染を繰り返すことにより、濃縮が達成される。細菌のプロテアーゼはｇ３ｐタンパク質と抗体断片との結合を切断することができ、感染細菌細胞によって可溶性抗体断片が産生されることになる。可溶性ＳｃＦｖを放出するためには、ｇ３ｐ遺伝子の切除を行うか、抗体遺伝子とｇ３ｐ遺伝子間にアンバー停止コドンを設ける。
【００７１】
免疫グロブリン及びその変異種は公知であり、組換え細胞培養中で数多く調製されている。例えば、米国特許第４，７４５，０５５号、欧州特許第２５６，６５４号、Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６（１９８２）、欧州特許第１２０，６９４号、欧州特許１２５，０２３号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１２３：７３９（１９７９）、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０）、Ｒａｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１：２０７３（１９８１）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４）、欧州特許第２５５，６９４号、欧州特許第２６６，６６３号、及びＷＯ  ８８／０３５５９を参照。再集合された免疫グロブリン鎖も公知である。例えば、米国特許第４，４４４，８７８号、ＷＯ  ８８／０３５６５、欧州特許第６８，７６３号、及びこれらに引用されている参考文献を参照。免疫グロブリン軽鎖又は重鎖定常領域をコードしているＤＮＡが公知であり、又はｃＤＮＡライブラリーから容易に手に入れることができ、若しくは合成される。例えば、Ａｄａｍｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：２７１１−２７１９（１９８０）、Ｇｏｕｇｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：２７０２−２７１０（１９８０）、Ｄｏｌｂｙら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ７７：６０２７−６０３１（１９８０）、Ｒｉｃｅら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ７９：７８６２−７８６５（１９８２）、Ｆａｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６−２８８（１９８２）、及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−２５６（１９８４）を参照。これらの素材及び技術は、本発明のキメラポリペプチドのｐＴａｒｇを合成するために用いることができる。
【００７２】
本発明のキメラポリペプチドのｐＴａｒｇ成分として用いられるポリクローナル抗体は、本分野において周知である手法を用いて、様々な採取源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、又はラットから容易に作製することができる。一般的には、精製された細胞表面タンパク質若しくは糖タンパク質又は細胞表面タンパク質若しくは糖タンパク質のアミノ酸配列に基づく適宜にコンジュゲートされたペプチドを、通例非経口的注入によって宿主動物に投与する。細胞表面タンパク質又は糖タンパク質の免疫原性は、アジュバント（例えば、フロイントの完全又は不完全アジュバント）の使用によって増強することができる。強化免疫の後、少数の血清サンプルを集め、細胞表面タンパク質又は糖タンパク質に対する反応性を調べる。このような測定に有用である様々なアッセイの例には、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、及びサンドイッチアッセイの他に、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８」に記載されているアッセイが含まれる。米国特許第４，３７６，１１０号及び第４，４８６，５３０号を参照。
【００７３】
ｐＴａｒｇ成分として用いられるモノクローナル抗体は、周知の手法を用いて容易に調製することができる。例えば、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号、及び４，４１１，９９３号、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，  ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．），１９８０．」に記載されている手法を参照。簡潔に述べると、必要に応じてアジュバントの存在下で、単離精製された細胞表面タンパク質又は糖タンパク質、複合細胞表面タンパク質又は糖タンパク質を、約３週の間隔で少なくとも一回、好ましくは少なくとも二回、マウス等の宿主動物の腹腔内に注射する。次いで、従来のドットブロット技術又は抗体捕捉（ＡＢＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃａｐｔｕｒｅ）によってマウスの血清をアッセイし、何れの動物が融合に最良であるかを決定する。約２乃至３週間後に、マウスの静脈内に、細胞表面タンパク質若しくは糖タンパク質又は複合細胞表面タンパク質若しくは糖タンパク質を追加免疫する。その後、マウスを屠殺し、確立されたプロトコールに従って、脾臓細胞をＡｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）等の市販の骨髄腫細胞と融合させる。簡潔に述べると、骨髄腫細胞を培地中で数回洗浄し、骨髄腫細胞１に対して脾臓細胞約３の比率で、マウスの脾臓細胞に融合させる。融合剤は、本分野で使用されている任意の適切な物質、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。融合細胞を選択的に増殖させる培地を含有するプレート中に融合細胞を蒔く。次いで、約８日間、この融合細胞を増殖させることができる。得られたハイブリドーマからの上清を集め、まず、ヤギ抗マウスＩｇでコートしたプレートに加える。洗浄の後、１２５Ｉ標識細胞表面タンパク質又は糖タンパク質等の標識を各ウェルに加えた後、インキュベートする。続いて、オートラジオグラフィーによって、陽性ウェルを検出することができる。陽性クローンは大量培養で増殖させることができ、引き続き、プロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して上清を精製する。
【００７４】
ｐＴａｒｇ成分に対するモノクローナル抗体は、「Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：  Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１−９（１９９０）」（参考文献として本明細書に援用する）に記載されている技法等の別の技法を用いて作製することもできる。同様に、結合パートナーは、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を取り込むための組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。このような技術は、「Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：３９４（１９８９）」に記載されている。
【００７５】
ｐＴａｒｇ成分として用いられるモノクローナル抗体及びその断片には、キメラ抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体をヒト化したものが含まれる。このようなヒト化抗体は、公知の技術によって調製することができ、抗体をヒトに投与したときの免疫原性を減らせるという利点がある。1つの態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体（又はその抗原結合部位のみ）の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とを備える。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位とヒト抗体由来の（抗原結合部位を欠く）可変領域断片とを備えてもよい。キメラ抗体及びさらに加工したモノクローナル抗体を作製する操作には、「Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，１９８８）」、「Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，１９８７）」、「Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，１９８９）」、及び「Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ  （ＴＩＰＳ  １４：１３９，Ｍａｙ  １９９３）」に記載されている操作が含まれる。遺伝子組換えで抗体を作製する操作は、英国特許第２，２７２，４４０号、米国特許第５，５６９，８２５号、及び５，５４５，８０６号、並びにこれらの優先権主張の基礎となっている関連出願（参考文献として、全て本明細書に援用する）に見ることができる。
【００７６】
本発明のさらなる態様では、細胞毒性キメラポリペプチドの標的誘導部分（ｐＴａｒｇ）は、腫瘍ホーミングペプチド（ｔｕｍｏｒ  ｈｏｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）である。このような腫瘍ホーミングペプチドには、Ｅｌｌｅｒらによって、ＰＣＴ／ＵＳ００／０１６０２（開示内容全体を基礎とし、本明細書に参照文献として援用する。）の実施例Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩに記載された全てのホーミング配列が含まれる。
【００７７】
本発明の好ましい態様では、前記キメラポリペプチドは、配列ＣＮＧＲＣＧＧ−ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ、又はＣＮＧＲＣＧＧ−Ｄ［ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ］、又はＣＮＧＲＣＧＧ−Ｖｐｒ５２−９６、又はＣＮＧＲＣＧＧ−ＤＫＲＴＱＦＷＹＦＰＧＮ、又はＣＮＧＲＣＧＧ−Ｄ［ＤＫＲＴＱＦＷＹＦＰＧＮ］、又はＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧＧ−ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ、又はＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧＧ−Ｄ［ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ］、又はＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧＧ−Ｖｐｒ５２−９６、又はＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧＧ−ＤＫＲＴＱＦＷＹＦＰＧＮ、又はＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧＧ−［ＤＫＲＴＱＦＷＹＦＰＧＮ］、又はＭ３５０／ＳｃＦｖ−ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ、又はＭ３５０／ＳｃＦｖ−Ｄ［ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ］、又はＭ３５０／ＳｃＦｖ−Ｖｐｒ５２−９６、又はＭ３５０／ＳｃＦｖ−ＤＫＲＴＱＦＷＹＦＰＧＮ、又はＭ３５０／ＳｃＦｖ−Ｄ［ＤＫＲＴＱＦＷＹＦＰＧＮ］を有する。
【００７８】
本発明のキメラポリペプチドは、様々な慣用技術によって作製することができる。このような技術には、「Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２８９：３−１３，１９９７」、「Ｈ．Ｂａｌｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｍａｓｃａｇｎｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４８：３１−４７，１９９６」、「Ｆ．Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．９：１５１−１５５，１９９６」、「Ｊ．Ｆｏｘ，  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２４９−２５８，１９９５」、及び「Ｐ．Ｌｅｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：４０−４８，１９９３」に記載されている技術が含まれる。
【００７９】
ペプチドは、古典的なＦｍｏｃをベースとした合成及び偽ペプチド合成を用いて、マルチチャネルのペプチド合成機で合成することができる。本発明の1つの態様では、Ｖｐｒ５２−９６、Ｖｐｒ７１−９６、Ｖｐｒ７１−８２、並びに表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩに記載されている全てのＴｏｘ、Ｓａｖｅ、及びＴＡＲＧペプチドは、固相ペプチド化学合成によって合成される。樹脂から切断した後、逆相ＨＰＬＣによって、ペプチドを精製し、分析する。ＨＰＬＣ鑑定によれば、ペプチドの純度は、通例、９８％以上である。各ペプチドの完全性は、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型分析法によって調節することができる。生体液中でペプチドが急速に崩壊するのを避けるために、有利には、一又は数個のアミド結合を、レトロ−インベルソ（ＮＨ−ＣＯ）、メチレンアミノ（ＣＨ２−ＮＨ）、カルバ（ＣＨ２−ＣＨ２）、又はカルバザ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ））結合のようなペプチド結合イソステアによって置き換えることができる。
【００８０】
あるいは、所望のペプチドを産生するための発現ベクター中に所望のペプチド配列をコードするＤＮＡ配列をサブクローニングすることによって、本発明のキメラポリペプチドを調製することもできる。有利には、ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適切なリーダーペプチド又はシグナルペプチドをコードする配列に融合される。あるいは、従来の技法を用いて、ＤＮＡ断片を化学的に合成してもよい。ＤＮＡ断片は、公知の制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  １９９７  Ｃａｔａｌｏｇ，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  １９９７  Ｃａｔａｌｏｇ，Ｐｒｏｍｅｇａ  １９９７  Ｃａｔａｌｏｇ）を用いて、ＤＮＡ、例えばＨＩＶ−１のクローンを制限エンドヌクレアーゼ消化し、アガロースゲル電気泳動等の慣用手段で単離することによって作製することもできる。
【００８１】
別の態様では、所望のタンパク質又はペプチド断片をコードするＤＮＡ配列を単離し、増幅するために、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法を用いることができる。ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドが、５’及び３’プライマーとして用いられる。オリゴヌクレオチドは、増幅されたＤＮＡ断片の発現ベクター中への挿入を容易にするために、制限エンドヌクレアーゼのための制限部位を含有することができる。ＰＣＲ技術は、「Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）」、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９８９），ｐ．１８９−１９６」、及び「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９０）」に記載されている。もちろん、ポリペプチド及びＤＮＡ断片を調製するためには多くの技術を使用することができ、この態様は本発明の範囲を限定するものでは決してないことは理解されるであろう。
【００８２】
ＴＡＲＧをＴＯＸに連結し、またＴＡＲＧをＳＡＶＥに連結するためには、分子の化学特性に応じて、幾つかの方法を使用することができる。例えば、応用免疫学の分野で日常的に使用されている、ハプテンをキャリアタンパク質に連結する方法がある。1つの態様では、例えば、カルボジイミド結合を用いて、予め作製されたＰＴＰＣ制御分子（ＴＯＸ又はＳＡＶＥ）を抗体断片（ｐＴａｒｇ）として抗体に抱合させることができる。カルボジイミドには、一般式Ｒ−Ｎ＋Ｃ＝Ｎ−Ｒ（Ｒ及びＲは、脂肪族又は芳香族である）を有する一群の化合物が含まれ、ペプチド結合を合成するために使用される。調製操作は簡易で、比較的早く、温和な条件下で行われる。カルボジイミド化合物はカルボキシル基を攻撃して、それらを遊離アミノ基の反応部位へと変化させる。カルボジイミド結合は、抗体産生用の様々な化合物を抱合させるために使用されている。
【００８３】
水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、ＰＴＰＣ制御分子（ＴＯＸ又はＳＡＶＥ）を抗体又は抗体断片分子に抱合させるのに有用であり得る。このような抱合には、アミノ基（例えば、ＰＴＰＣ制御分子（ＴＯＸ又はＳＡＶＥ）によって与えられ得る）とカルボキシル基（抗体又は抗体断片によって与えられ得る）の存在が必要である。
【００８４】
ペプチド結合の直接形成のためにカルボジイミドを用いることに加え、ＥＤＣを用いてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルのような活性エステルを調製することもできる。次いで、アミノ基のみに結合するＮＨＳエステルは、オキソルビシンの単一のアミノ基とアミド結合を形成させるために使用することができる。抱合体の形成収率を増加させるために、抱合にはＥＤＣとＮＨＳを併用するのが一般的である。
【００８５】
ＰＴＰＣ制御分子（ＴＯＸ又はＳＡＶＥ）を抗体又は抗体断片に抱合させるための他の方法を使用することも可能である。例えば、過ヨウ素酸ナトリウム酸化に引き続き適切な反応剤の還元的アルキル化を使用することができるし、グルタルアルデヒド架橋を使用することもできる。しかしながら、本発明のキメラポリペプチドを作製する方法として何れの方法を選択したかにかかわらず、抗体又は抗体断片が標的誘導能を保持し、ＰＴＰＣ制御分子（ＴＯＸ又はＳＡＶＥ）がその活性を維持していることを測定しなければならないことを認識すべきである。
【００８６】
本発明のキメラポリペプチドには、ＰＴＰＣ制御分子（ＴＯＸ又はＳＡＶＥ）（ｐＴａｒｇ）と抗体又は抗体断片（ｐＴｏｘ）との間に機能的に介在された特異的に切断不能又は切断可能なリンカーペプチドをさらに取り込ませてもよい。このようなリンカーペプチドをキメラ構築物中に導入することによって、無傷の抗体又は抗体断片から無傷のＰＴＰＣ制御分子（ＴＯＸ又はＳＡＶＥ）を分離するように切断され得る部位が、得られたキメラポリペプチドの中に与えられる。このようなリンカーペプチドは、例えば、トロンビン切断、第Ｘ因子切断、又は他のペプチダーゼ切断に対して感受性のあるペプチドであり得る。あるいは、キメラポリペプチドがメチオニンを欠いている場合には、臭化シアン処理に対して感受性のあるペプチドによって、抗体又は抗体断片を分離させてもよい。一般的には、このようなリンカーペプチドは、リンカーペプチド内にのみ見出され、キメラポリペプチドを構成するＴＡＲＧ、ＴＯＸ，又はＳＡＶＥ断片中の何れの位置にも見出されない部位を描くであろう。
【００８７】
本明細書には、生理的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤等の他の成分とともに、有効量の本発明のキメラポリペプチドを含む組成物が記載されている。前記キメラペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するために使用されている公知の方法に従って調合することができる。それらは、唯一の活性物質として、又は所定の適応症に適した他の公知の物質とともに、薬学的に許容される希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸緩衝溶液）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント、及び／又は担体とともに、混合物として混ぜ合わせることができる。薬学的組成物用の適切な剤形には、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄ．１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ」に記載されているものが含まれる。
【００８８】
さらに、このような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと錯体を形成させるか、又はポリ酢酸、ポリグリコール酸、ハイドロゲル、デキストラン等のポリマー化合物中に取り込ませるか、又はリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層又は多層小胞、赤血球ゴースト、若しくはスフェロプラスト中に取り込ませることができる。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出の速度、及びインビボクリアランスの速度に影響を与えるものと思われ、意図する用途に応じて選択される。
【００８９】
キメラポリペプチドを含む本発明の組成物は、任意の適切な態様（例えば、局所的に、非経口的に、又は吸入によって）で投与することができる。「非経口」という用語には、例えば、皮下、静脈内、又は筋肉内経路による注入が含まれるが、（例えば、疾病又は傷害部位への）局所的な投与も含まれる。インプラントからの徐放も想定される。当業者であれば、治療すべき疾患の性質、患者の体重、年齢、及び一般的な状態、並びに投与経路のような要素に応じて、適切な投与量が変動し得ることを認識することができるであろう。動物試験によって予備的な用量を決定してもよく、本分野で受容されている慣行に従って、ヒトに投与するために投与量の増減を行う。
【００９０】
生理的に許容される剤形で核酸を含む組成物も想定されている。例えば、注入用にＤＮＡを調合してもよい。
【００９１】
最も一般的な応用の一つでは、本発明は、本発明のキメラポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡセグメントを取り込んだ組換えベクターに関する。本発明において、「キメラポリペプチド」という用語は、ウイルスのアポトーシスペプチドの少なくとも一部が抗体又は抗体断片の少なくとも一部に結合（ｃｏｕｐｌｅ）されている任意のポリペプチドを含むものとして定義される。それぞれ、ＤＮＡセグメントとＤＮＡセグメント由来のメッセンジャーの転写と翻訳が機能的になされるように結合を行うことが可能である。
【００９２】
本発明のベクターは、キメラポリペプチドをコードする配列が、有効なプロモーターに隣接し、プロモーターの制御下に配置されるように構築されるのが一般的であろう。一定のケースでは、前記プロモーターは原核生物のプロモーターを備え、前記ベクターは原核生物宿主内での発現に適合されているであろう。別のケースでは、前記プロモーターは真核生物のプロモーターを備え、前記ベクターは真核生物宿主での発現に適合されているであろう。後者のケースでは、前記ベクターは、通例、カルボキシ末端アミノ酸の３’の位置であり、且つ前記コードされているキメラポリペプチドの転写ユニットの中にポリアデニル化シグナルをさらに含んでいるであろう。本発明のベクターにおいて特に実用性が高いプロモーターは、発現に使用する細胞に応じて、サイトメガロウイルスプロモーター及びバキュロウイルスプロモーターである。ベクターのプロモーターの正確な性質に関わりなく、本発明の組換えベクターは、以下に記されているＤＮＡセグメントを取り込むであろう。
【００９３】
本明細書では、本発明のベクターを取り込んだ組換え宿主細胞の権利も請求されている。組換え宿主細胞は、真核細胞又は原核宿主細胞の何れであってもよい。真核細胞を使用する場合には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が実用的であろう。別の態様では、バキュロウイルスプロモーターと組み合わせて使用する場合には、昆虫細胞株であるＳＦ９又はＳＦ２１を使用することができる。
【００９４】
以下の実施例で、本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００９５】
実施例１
マウスモノクローナル抗体（Ａｃ Ｍ３５０）の取得
免疫化の原料としてヒト胎児細胞を選択した。腫瘍細胞上に存在するエピトープに対するモノクローナル抗体を産生させるための免疫化の原料として本発明者らが胎児細胞を使用したのは、胎児と腫瘍の抗原が似ていることが周知であったからである。癌胎児性抗原は、子宮内で成育している間に存在する糖タンパク質であり、出生時には消滅し、病的な状態、特に悪性腫瘍中に再発現することがある。この抗原群の例は多数存在し、最もよく知られたモデルは、７０％の肝臓腫瘍に伴うフェトプロテインと、ヒトの臨床治療に頻繁に用いられ、消化管の癌に罹患した患者をモニターするパラメータである＜＜胎児性腫瘍抗原＞＞である。
【００９６】
Ａ．  Ｍ３５０クローンの作製
これらの胎児細胞は、２５週齢の女の胎児の乳腺芽を無菌採取して取得した。機械的に乳腺芽を０．５ｍｍ３の断片に分離してから、コラーゲナーゼとヒアルロジナーゼで改変した３７℃のダルベッコ培地に細胞を再懸濁し、顕微鏡下で観察した後、３０分乃至４時間振盪させた。オルガノイドが出現したらすぐに、細胞をＦｉｃｏｌｌの上に載せ、洗浄し、次いで、ｈｅｐｅｓ、インシュリン、コレラ毒素（ｃｈｏｌｅｒｃｉ  ｔｏｘｉｎ）、コルチゾール中、無カルシウムＤＭＥＭ−Ｆ１２培地の中で培養した。一週間に一度、細胞を継代培養した。この技法を用いて、細胞を１０−２０倍に分裂させて、免疫化するのに十分な細胞を得た。
【００９７】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に４回免疫した。融合は、古典的なＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの技術に従って行った。スクリーニングは、胎児の乳腺細胞、成人の乳腺細胞、及び乳癌を用いて行った。数個のクローンが現れ、そのうちの一つ（Ｍ３５０クローン）を乳癌及び正常な乳房組織に対して特に検査した。１５０の腫瘍切片、すなわち、浸潤性管内（ｉｎｔｒａ−ｃａｎａｌａｒ）及び小葉内腺癌、浸潤性小葉腺癌を検査した。検査は、アルカリホスファターゼを用いた免疫酵素技術を用いて行った。検査した腫瘍は全て陽性であったが、乳房試料から採取し、平行して検査した正常な組織は陰性か弱い陽性であった。正常組織の各スライドには、パレアル組織（ｐａｌｅａｌ  ｔｉｓｓｕｅ）内の小葉型上皮構造と空洞が含まれていた。
【００９８】
Ｂ．その他のハイブリドーマ
関連乳癌抗原に対する新しいマウスモノクローナル抗体の取得。
【００９９】
この技術では、３つの異なる乳癌細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡ、ＺＲ７５−１）の混合物を、Ｃ５７／Ｂ１６マウスの腹腔内に４回免疫した。融合とスクリーニングの後、正常な乳房組織と悪性腫瘍、その他の腫瘍試料、及び末梢血細胞に対して特異性を調べた。表面腫瘍標識を示すモノクローナル抗体を選択した。
【実施例２】
【０１００】
実施例２
Ａ  細胞株とウイルス
５％  ウシ胎児血清を補充したＴＣ１００の中に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９昆虫細胞、Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ｃｏｌｌ．，１９７７）の卵巣組織に由来する挿入細胞（ｉｎｓｅｒｔ  ｃｅｌｌ）とＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞）由来の昆虫細胞とを２８℃で維持し、組換えバキュロウイルスの増殖と組換えタンパク質の作製に使用した。バキュロウイルスのウイルスＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と組換え導入ベクターＤＮＡを昆虫細胞に同時トランスフェクションした後に、組換えバキュロウイルスを得る。
【０１０１】
Ｂ．  組換え導入ベクター：ｐＶＬ−ＰＳ−ｇｐ６７１
組換えウイルスを作製するための導入ベクターとして、導入ベクターｐＶＬ１３９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の組換え導入ベクターｐＶＬ−ＰＳｇｐ６７１を使用する。これは、５’から３’方向に、ｇｐ６７バキュロウイルス糖タンパク質のペプチドシグナル配列と、Ｈｉｓ（６）−Ｔａｇをコードする配列と、第Ｘａ因子の認識配列と、ｓｃＦｖ配列をサブクローニングするためのポリリンカー領域と、リンク配列（細胞毒性ペプチドとＳｃＦｖとの共有結合に必要なＧＧＣ）とを含んでいる。
【０１０２】
ｇｐ６７由来の前記シグナルペプチド配列は、ｐＶＬ１３９２プラスミドのＢｇ／ＩＩ部位に、ｇｐ６７のＰＣＲ産物（ＰＳｇｐ６７−ＢａｃｋとＰＳｇｐ６７−Ｆｏｒをプライマーとし、市販のｐｃＧＰ６７−ＢプラスミドをテンプレートとしたＰＣＲによって得た）を挿入して付加した。次いで、ｇｐ６７配列の３’末端へのオリゴヌクレオチドの挿入を使用して、Ｈｉｓ（６）−Ｔａｇ配列及び第Ｘａ因子の認識配列をコードする配列を付加した。同様にして、細胞毒性ペプチドとＳｃＦｖとの共有結合に必要なペプチドモチーフ（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）の配列を、ポリリンカーの３’部分に付加した（最初のＧは、Ｘｍａｌ部位の最後のヌクレオチドによってコードされている）。
【０１０３】
重複プライマー：
Ｔｈ１：ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣ  （ＢａｍＨＩ−Ｈｉｓ（６））
Ｔｈ２：ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＡＡＴＴＣ  ＣＣＡＴＧ（第Ｘａ因子の切断−ＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ）
Ｔｈ３：ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡ
（Ｐｓｔ１−ＸｍａＩ−ＧＧＳ−ＳＴＯＰ−ＢａｍＨＩ）
Ｔｈ４：ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＧ（Ｔｈ１  Ｔｈ２のリンク）
Ｔｈ５：ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  Ｔ
（Ｔｈ２とＴｈ３のリンク）
Ｔｈ６：ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＣＡＴ  ＣＣＣ  ＣＣ
（Ｔｈ３とｐＶＬ、−ｐｇ６７のリンク）
をＢａｍＨ１及びＢｇｌＩに挿入
Ｃ  ＳｃＦｖ  ＤＮＡ断片の合成
Ｍ３５０のＶＨ及びＶＬ領域：
Ｍ３５０ハイブリドーマから単離された総ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用いる逆転写用のテンプレートとして使用した（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＩＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。これらのｃＤＮＡと特異的プライマー（マウスＩｇ−Ｐｒｉｍｅ−Ｋｉｔ、Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて実施したＰＣＲによって、ＶＨとＶＬ鎖が選択的に増幅された。次いで、ｐＳＴ−Ｂｌｕｅ  １プラスミド中に、これらの領域を「平滑末端」としてクローニングし、配列を決定した。
【０１０４】
他のハイブリドーマのＶＨ及びＶＩ領域：
選択したハイブリドーマから単離された総ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用いる逆転写用のテンプレートとして使用した（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＩＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。特異的プライマー（マウスＩｇ−Ｐｒｉｍｅ−Ｋｉｔ、Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いたＰＣＲによって、ＶＨとＶＬ鎖が選択的に増幅された。次いで、これらの産物をｐＧＥＭＴ（ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｒｏｎｔ  ＰＲＯＭＥＧＡ）ベクター中にクローニングし、配列を決定した。クローンｔｈｅｒａｐ．９９Ｂ３（図３）、クローンｔｈｅｒａｐ．８８Ｅ１０（図４）、及びｔｈｅｒａｐ．１５２Ｃ３（図５）から、新しい３つのＶＨ及びＶＬ配列が確定された。
【０１０５】
ＳｃＦｖ−導入ベクターの獲得：
二段階の融合ＰＣＲによって、ＶＨ−リンク−ＶＬキメラＤＮＡを得た（図１２）。第一段階では、それぞれ、ＶＨ鎖の３’とＶＬ鎖の５’末端にリンク配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を付加した。第二段階は、キメラＤＮＡ（ＶＨ−リンク−ＶＬ）を与えるＰＣＲ融合物であった。この第二段階で用いたプライマーの群によって、ＶＨとＶＬには、それぞれ、最終産物をｐＶＬ−ＰＳｐ６７１ベクター中にサブクローニングするために使用できる５’−ＥｃｏＲＩ部位と３’−ＸｍａＩ部位が導入される（図１３）。
【０１０６】
Ｄ  組換えバキュロウイルスの同時トランスフェクションと精製
リポフェクション法（Ｆｅｌｏｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｉｎｇｏｌｄ，１９８９）（ＤＯＴＡＰ；Ｒｏｃｈｅ）により、ウイルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び組換え導入ベクターＤＮＡ（ｐＶＬ−ＰＳｇｐ６７１−ＳｃＦｖ）をＳｆ９細胞に同時トランスフェクトした。組換えウイルスのスクリーニングと精製は、ＳｕｍｍｅｒｓとＳｍｉｔｈ（Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８７）によって記載された一般的な操作によって実施した。組換えウイルスはＢＡＣ−ＰＳｇｐ６７１−ｓｃＦｖと名付けられ、増幅して１０８のＭＯＩを有するウイルス原液とした。
【０１０７】
Ｅ  組換えタンパク質の分析
感染細胞を集め、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、試料還元緩衝液中に再懸濁した（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）。煮沸（１００℃、５分）後、変性条件下での１２．５％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）によって、タンパク質試料を分離した。クマシーブルー染色によりタンパク質の見かけの分子量をチェックするか、又は半乾燥ブロッター装置（Ａｎｃｏｓ）を用いて、タンパク質をニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ；ＢＡＳ  ８５、０．４５μｍ）に転写した。次いで、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）で、ニトロセルロース膜を染色した後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０と５％の無脂肪乳（ＴＳ−ｓａｔ）を含有するＴｒｉｓ−生理食塩水緩衝液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐｈ７．４、０．２Ｍ  ＮａＣｌ）の溶液でブロッキングした。Ｈｉｓ（６）−Ｔａｇ（ＳＩＧＭＡ）に対するマウスモノクローナル抗体を一次抗体、ヒツジ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体を二次抗体として（１；３０００  Ａｍｅｒｓｈａｍ）用いて、ＳｃＦｖを検出した。メーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の記載に従って、ＥＣＬ試薬を用いることにより免疫反応性のあるバンドを可視化した。
【０１０８】
Ｆ  タンパク質の産生と精製
ウイルス原液を得るために、ＩＰＬ４１培地と５％  ＦＣＳ中で培養したＳｆ９昆虫細胞に、対数期にあるＭＯＩ１の組換えバキュロウイルスを感染させる。５％  ＦＣＳを加えたＩＰＬ４１培地中、２８℃で７日間インキュベートした後に、８０００ＲＰＭ、１５分の遠心により、上清を採取する。Ｘｐｒｅｓｓ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｅｒ）中で培養したＨｉｇｈ−ｆｉｖｅ昆虫細胞に、ＭＯＩ１０の対数期にある組換えバキュロウイルスを感染させ、感染から１時間半後に、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を遠心により採集し、無血清のＸｐｒｅｓｓ培地中に再懸濁した。２８℃で４日間インキュベートした後、８０００ＲＰＭ、１５分の遠心により、上清を採取する。次いで、２回の硫安沈殿によってこれらの上清を濃縮する。沈降により得られた沈殿を１２時間透析し、メーカー（Ｑｉａｇｅｎ）の記載に従って、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズのバッチを用いて精製した。透析（２日、ＰＢＳ、４℃）とクマシー染色による分析の後、細胞毒性ペプチドと共有結合させるために、精製タンパク質を使用した。
【実施例３】
【０１０９】
実施例３
ＳｃＦｖをｐＴｏｘに連結させる方法
Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成を用いてペプチドを組み立て、最後のＦｍｏｃ脱保護後に、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、プロピオニルオキシスクシンイミドエステルを前記ペプチドのαアミノ基と反応させた。反応（３０分）の最後に、ペプチド樹脂を塩化メチレンで洗浄し、酸性条件下で、ペプチドを古典的な方法で切断し、脱保護した。次いで、活性化されたペプチドをＨＰＬＣで精製し、その完全性を質量分析によって確認した。続いて、活性されたペプチドを１０：１のモル比でＳｃＦｖと反応させた（ｐＨ７、ＰＢＳ、ガラス管を室温で３時間攪拌）。次いで、４℃、ＰＢＳに対して、４８時間透析を行った。
【０１１０】
この方法を用いて、４つのＴｏｘペプチドをＳｃＦｖに連結させた。
【０１１１】
Ｔｏｘ１１
ＳｃＦｖ−Ｍ３５０−Ｊａｃ５（Ｖｐｒ７１−９６［Ｃ７６１］）
Ｃｔｒ１  Ｔｏｘ１１Ｉ
ＳｃＦｖ−Ｍ３５０−Ｊａｃ５Ｍ（Ｖｐｒ７１−９６［Ｃ７６Ｓ；Ｒ７３，８０Ａ］）
Ｔｏｘ  １２
ＳｃＦｖ−Ｖｐｒ５２−９６［Ｃ７６Ｓ］
Ｃｔｒ１  Ｔｏｘ１２
ＳｃＦｖ−Ｖｐｒ５２−９６［Ｃ７６Ｓ；Ｒ７３Ａ；Ｒ８０Ａ］
【実施例４】
【０１１２】
実施例４
Ｔａｒｇ−Ｔｏｘ又はＴａｒｇ−Ｓａｖｅ構造の例
全てのＴｏｘペプチドは、任意にＮ末端ビオチンとＣ末端アミド官能基（ａｍｉｄｅ  ｆｏｎｃｔｉｏｎ）を有することができる。Ｔｏｘ０は、Ｔａｒｇとの会合を必ずしも必要としないＴｏｘペプチドである。Ｔｏｘ１、Ｔｏｘ２、Ｔｏｘ５、Ｔｏｘ６、Ｓａｖｅ１、Ｓａｖｅ２、及びそれらの各コントロールは、ＴａｒｇとＴｏｘ／Ｓａｖｅモチーフの間にｇｌｙ−ｇｌｙ（−ＧＧ−）リンカーを任意に有することができる。
【表６】
2004532005.tif 000007
【実施例５】
【０１１３】
実施例５
細胞（細胞株）及び無細胞系におけるミトコンドリア及び核のアポトーシスパラメータの評価
Ａ．細胞
ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＣＯＳ、及びＨｅＬａ細胞を完全培地（２ｍＭ  グルタミン、１０％  ＦＣＳ、１ｍＭ  ピルビン酸塩、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、及び１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中で培養する。ＣＤ４を発現し、ヒトＢｃｌ−２遺伝子又はネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性ベクター（Ａｉｌｌｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９６９８−９７０５）のみを安定にトランスフェクトしたジャーカット細胞は、Ｎ．Ｉｓｒａｅｌ（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐａｒｉｓ）から頂いた。Ｎｅｏ及びＢｃｌ−２  Ｕ９３７細胞（Ｚａｍｚａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ）、及びＣＥＭ−Ｃ７細胞は、１０％  ＦＣＳ、抗生物質、及び０．８μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を補充したＲＰＭＩ  １６４０グルタマックス培地中で培養する。
【０１１４】
実施した細胞検査は、候補物の経路（細胞内への浸透、次いで細胞内の所在）、及び標的細胞のアポトーシス状態（ΔΨｍ、細胞死エフェクターの活性化と再配置、核ＤＮＡ中の含量）を決定する。これらのパラメータを決定するためには、細胞及び／又は候補分子を標識するために蛍光プローブを使用すること、及び以下の二つの分析手法、すなわち、マルチパラメータの細胞蛍光測定法と蛍光顕微鏡を実施することが必要である。神経保護作用に関する限り、マウスの胎仔から得た皮質神経細胞の初代培養に対して検査を行った。心臓保護作用に関しては、マウスの胎仔から得た心筋細胞の初代培養に対して検査を行った。
【０１１５】
−細胞内経路の検査：ビオチン（ストレプトアビジンに抱合した蛍光色素を用いて、又は細胞成分の分画後のリガンドブロットによって検出）又はＦＩＴＣ（生きた細胞の直接的な観察、ビデオ顕微鏡、及び画像解析によって検出）のうち何れかを連結したＴＡＲＧ−ＴＯＸ又はＴＡＲＧ−ＳＡＶＥペプチドを細胞に加える。ミトコンドリア配送シグナル（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）（例えば、アポトーシス誘導因子又はオルニチントランスカルバミラーゼ）を挿入することによって、ＴＯＸ又はＳＡＶＥがミトコンドリアへ配送されやすくすることが可能である。同様に、配列及び一定の側鎖（リン酸化、メチル化）を修飾し、続いてペプチドをペプチド類似物に置き換えた後に、ミトコンドリア経路への配送が調べられる。
【０１１６】
−腫瘍及び内皮細胞株、並びに一次神経細胞に対するアポトーシスのマルチパラメータ分析。ミトコンドリアの膜電位の状態（ＪＣＩ、ＤｉｏＣ６、ｍｉｔｏＴｒａｃｋｅｒｓ）と核の凝縮（Ｈｏｅｓｃｈｔ）を測定するために、蛍光プローブが使用されるであろう。同様に、アポトーシスのポストミトコンドリアパラメータは、古典的な低倍数性試験とアネキシンＶ−ＦＩＴＣによる細胞表面標識を用いて調べる。
【０１１７】
この種の試験では、ＴＡＲＧ−ＴＯＸの細胞毒性能（すなわち、（ミトコンドリアに対する影響により）腫瘍又は内皮細胞株を死滅させる能力（最良のＴＡＲＧ−ＴＯＸは、過剰発現しているＢｅｌ−２細胞株も死滅させなければならない））、又は神経細胞を様々なアポトーシス発生処理に供したときのＴＡＲＧ−ＳＡＶＥの細胞保護能のうち何れかが検討される。
【０１１８】
Ｂ．アポトーシスの調節
サイクロスポリン  Ａ（ＣｓＡ；１μＭ）、ボンクレキン酸（ＢＡ；５０μＭ）、及び／又はカスパーゼ阻害剤Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐフルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋ；５０μＭ；Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、Ｂｏｃ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（Ｂｏｃ−Ｄ．ｆｍｋ）、又はＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＦＡ．ｆｍｋ；全て１００μＭで使用し、２４時間毎に添加、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した又は補充していない完全培地中で、（１乃至５μＭ）のｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘとともに、ＰＢＳ洗浄した細胞（１−５×１０５／ｍｌ）をインキュベートする。ｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘに曝露させている間、健康なドナーから採取し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製したヒト初代ＰＢＬを、血清を全く加えていないＲＰＭＩ  １６４０グルタマックス培地中で培養する。これに対して、ＰＨＡ幼弱化細胞（２４時間の１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｐ［Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ］；１００Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ］とともに４８時間）は、１０％  ＦＣＳとともに培養する。
【０１１９】
Ｃ．無処置細胞におけるアポトーシスに伴う変化の細胞蛍光測定法による測定
細胞蛍光測定法に関しては、以下の蛍光色素：ミトコンドリアの膜間電位（ΔΨｍ）の定量には３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＯＣ（６）３；４０ｎＭ）、スーパーオキサイド陰イオンの発生測定にはハイドロエチジン（４μＭ）、生存性の測定にはヨウ化プロピジウム（ＰＩ；５μＭ）を用いる（Ｚａｍｚａｍｉ，Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３６７−３７７）。二倍体に満たない細胞（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ）の頻度は、５ｍＭ  グルコースを補充したＰＢＳ、ｐＨ  ７．４中の５００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅで処置した（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．；３０分、室温）エタノール透過処理細胞のＰＩ（５０μｇ／ｍｌ）染色によって測定する（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１３９：２７１−２８０）。
【０１２０】
Ｄ．生きた細胞の蛍光染色と免疫蛍光
アポトーシスのミトコンドリア及び核の特徴を評価するために、カバーグラス上で培養した細胞を、ΔΨｍ感受性色素クロロメチル−Ｘ−ローザミン（ＣＭＸＲｏｓ；５０ｎＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）又は５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨウ化物（ＪＣ−１、２μＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ΔΨｍ非感受性色素Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ（１μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（２μＭ，Ｓｉｇｍａ）とともに、完全培地中において、３７℃で３０分間インキュベートする（Ｍａｒｚｏ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８１：２０２７−２０３１）。
【０１２１】
Ｅ．ｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘの内部移行のインサイチュ測定
ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸ／ＳＡＶＥの内部移行をインサイチュ測定する場合、ＴＡＲＧ−（ＭＬＳ）−ＴＯＸ／ＳＡＶＥとともに細胞を様々な時間インキュベートした後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、４％  パラホルムアルデヒドと０．１９％  ピクリン酸を用いて、室温で１時間細胞を固定する。ＰＢＳ中、室温で（５分間）、固定した細胞を０．１％  ＳＤＳで透過状態にし、１０％  ＦＣＳでブロッキングして、ヤギ抗マウスＰＥ抱合体［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．］によって明らかにされるヘキサ−ヒスチジンタグ（クローンＨＩＳ−１、ＩｇＧ２ａ、ＳＩＧＭＡ）に対して特異的なｍＡｂ、ヤギ抗マウスＩｇＧ１  ＦＩＴＣ抱合体によって検出されるＨＳｐ６０に対して特異的なｍＡｂ（ｍＡｂ  Ｈ４１４９［Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．］）、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ  ＦＩＴＣ抱合体によって検出されるチトクロムｃオキシダーゼに対して特異的なｍＡｂ（ＣＯＸ；ｍＡｂ  ２０Ｅ８−Ｃ１２［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．］）で染色するか、あるいは、Ｔａｒｇがビオチン化されたペプチドのときには、ストレプトアビジン−ＰＥ試薬を３０分加えた後に、蛍光（及び／又は共焦点）顕微鏡により蛍光強度を検出する。
【０１２２】
Ｆ．ミトコンドリアのパラメータのインビトロでの評価
記載に従って（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ラットの肝臓からミトコンドリアを精製し、２５０ｍＭ  スクロース＋０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ  ＋  １０ｍＭ  −ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸、ｐＨ＝７．４中に再懸濁する。ＰＴを誘導するために、ＰＴ緩衝液（２００ｍＭ  スクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−サクシネート、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホスフェート、２μＭ  ロテノン、及び１０μＭ  ＥＧＴＡ−Ｔｒｉｓ）中に、ミトコンドリア（０．５ｍｇタンパク質／ｍｌ）を再懸濁し、光（５４５ｎｍ）の９０℃散乱光をＦ４５００蛍光分光計（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）でモニターして、２ｍＭ  アトラクチロシド（Ａｔｒ）、１μＭ  サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、５μＭ  ＣａＣｌ２、及び／又は０．５乃至２０μＭのｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘ又はｐＴａｒｇ−ｐＳａｖｅ添加後の大規模な膨潤を測定した。ΔΨｍを測定する場合、１μＭ  ローダミン１２３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を補充した緩衝液中で、ミトコンドリア（０．５ｍｇタンパク質／ｍｌ）をインキュベートし、ローダミン蛍光（励起５０５ｎｍ、発光５２５ｎｍ）の消光を記載に従って測定する（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。単離された核に対するアポトーシス発生活性、ＤＥＶＤ−ａｆｃ切断活性、並びにチトクロムｃ及びＡＩＦの免疫検出を測定するまで、ミトコンドリアから得られた上清（６８００ｇ、１５分；次いで、２０，０００ｇ、１時間；４℃）をー８０℃で凍結させる。チトクロムｃとＡＩＦは、それぞれ、モノクローナル抗体（クローン７Ｈ８．２Ｃ１２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とポリクローナルウサギ抗血清（Ｓｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）によって検出する。
【表７】
2004532005.tif 000008
【０１２３】
Ｇ．ＡＮＴの精製とリポソーム中への再構成
以前の記載に従って（８）、ラットの心臓のミトコンドリアからＡＮＴを精製した。機械的剪断後、２２０ｍＭ  マニトール、７０ｍＭ  スクロース６、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２００μＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ズブチリシン、ｐＨ７．４の中にミトコンドリアを懸濁し、氷上に８分間放置し、分画遠心（５分、５００×ｇ、及び１０分、１０，０００×ｇ）により二回沈降させた。６％［ｖ：ｖ］のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により、室温で６分間、４０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中にミトコンドリアタンパク質を可溶化し、可溶化したタンパク質を超遠心（３０分、２４，０００×ｇ、４℃）によって回収した。続いて、このＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出液２ｍｌを、１ｇのヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＧｅｌ  ＨＴＰ、ＢｉｏＲａｄ）を充填したカラムにかけて、前記緩衝液で溶出し、２０ｍＭ  ＭＥＳ、２００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ６．０で溶出した［ｖ：ｖ］。続いて、ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と線形ＮａＣｌグラジエント（０−１Ｍ）を用いたＨｉｔｒａｐ  ＳＰカラムでサンプルを分離した。タンパク質濃度は、ミクロＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｌｌ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて測定した。精製したＡＮＴ及び／又は組換えＢｃｌ−２をＰＣ／カルジオリピンのリポソーム中に再構成した。簡潔に述べると、リポソームを調製するために、１ｍｌのクロロホルム中に４５ｍｇのＰＣと１ｍｇのカルジオリピンを混合し、窒素下で溶媒を蒸発させた。０．３％  ｎ−オクチル−β−Ｄ−ピラノシドを含有する１ｍｌのリポソーム緩衝液（１２５ｍＭ  スクロース＋１０ｍＭ  ２−ヒドロキシエチルピペラジンーＮ’−２エタンスルホン酸；Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４）の中に、乾燥した脂質を再懸濁し、室温で４０分間継続的にボルテックスすることにより混合した。次いで、ＡＮＴ（０．１ｍｇ／ｍｌ）又は組換えＢｃｌ−２（０．１ｍｇ／ｍｌ）をリポソーム［ｖ：ｖ］と混合し、室温で２０分間インキュベートした。最後に、４℃で一晩、プロテオリポソームを透析した。
【０１２４】
Ｈ．孔開放アッセイ
１ｍＭ  ４−ＵＭＰと１０ｍＭ  ＫＣｌの存在下で、ＡＮＴ−プロテオリポソームを既述のとおりに氷上で音波処理（５０Ｗ、２２秒、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）した（２８）。次いで、Ｓｅｐａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で、リポソームを非封入産物から分離した。３ｍｌになるように、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２５ｍＭ  サッカロース、ｐＨ７．４の中に２５μｌ分量のリポソームを希釈し、様々な濃度のアポトーシス誘発物質と混合し、室温で１時間インキュベートした。処置の３０分前に、ＢＡ、ＡＴＰ、及びＡＤＰ等のミトコンドリア膜透過化阻害剤となり得る物質をリポソームに加えた。リポソーム緩衝液＋０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の中に希釈した１０μｌのアルカリホスファターゼ（５Ｕ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えた後、攪拌しながら、試料を３７℃で１５分間インキュベートし、１５０μｌのストップ緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１０）を加えて、４−ＭＵＰの４ＭＵへの酵素的転換を停止させた。続いて、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒの蛍光分光光度計を用いて、４−ＭＵ依存性の蛍光（３６０／４５０ｎｍ）を定量した（２８）。１００％の応答を求めるために、各実験で、アトラクチロシド（アポトーシス誘発性の透過性遷移誘発物質）を標準物質として使用した。Ｖｐｒ由来のペプチド又はｐＴａｒｇ−ｐｔｏｘによって誘導された４−ＭＵＰ放出のパーセントを以下のように算出した。
【０１２５】
［（ｐＴａｒ−ｐＴｏｘによって処理したリポソームの蛍光−未処理のリポソームの蛍光）／（アトラクチロシドによって処理したリポソームの蛍光−未処理のリポソームの蛍光）］×１００
【表８】
2004532005.tif 000009
【０１２６】
Ｉ．結合アッセイとウェスタンブロット
記載のとおりに（ｚａｍｚａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、マウス肝臓のミトコンドリアを単離した。チトクロムＣの放出を測定するために、ｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘ処理したミトコンドリアから得られた上清（６８００ｇで１５分間、次いで、２０，００００ｇで１時間、４℃）を、チトクロムｃの免疫検出（マウスモノクローナル抗体クローン７Ｈ８．２ＣＩ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）まで−８０℃で凍結させた。結合アッセイのために、室温で３０分間、５μＭ（結合アッセイ）のｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘ又はビオチン−ｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘとともに、精製ミトコンドリアをインキュベートした（１００μｌの膨潤緩衝液中に２５０μｇのタンパク質）。ビオチン化Ｖｐｒ５２−９６とのインキュベーション後（上段）又は前（下段）の何れかに、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．６、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、アプロチニン（１００Ｕ／ｍｌ）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び２０％グリセロールを含有する１５０μｌの緩衝液を用いてミトコンドリアを溶解させた。そのミトコンドリアリガンドと複合体を形成したビオチン標識Ｖｐｒ５２−９６を捕捉するために、１５０μｌのアビジン−アガロース（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ、Ｐｉｅｒｃｅから入手）を加える前に、１ｍＭのＥＤＴＡを加えた２倍容量のＰＢＳでこのような抽出液を希釈した（ローラードラム中、４℃で２時間）。前記アビジン−アガロースをＰＢＳでバッチ式に洗浄し（５×５ｍｌ；１０００ｇ、５分、４℃）、４％  ＳＤＳと５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含有する２倍濃縮されたＬａｅｍｍｌｉ緩衝液１００μｌ中に再懸濁して、室温で１０分間インキュベートし、遠心した（１０００ｇ、１０分、４℃）。最後に、９５℃で上清を５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により分析した後、ウェスタンブロット及びヒトＡＮＴに対するウサギのポリクローナル抗血清（ミネソタ州、ミネソタ大学、Ｈｏｒｍｅｌ研究所のＨｅｉｄｅ  Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄ博士から頂いた；Ｒｅｆ）を用いて免疫検出した。
【０１２７】
Ｊ．精製ミトコンドリアのフローサイトメトリー分析
記載どおりに（ｚａｍｚａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、マウス肝臓のミトコンドリアを単離する。ＰＴ緩衝液（２００ｍＭ  スクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−サクシネート、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホスフェート、２μＭ  ロテノン、及び１０μＭ  ＥＧＴＡ）中に、精製ミトコンドリアを再懸濁する。ＦＳＣ／ＳＳＣパラメータ上のゲーティングとＦＳＣ−Ｗパラメータの主ピーク上のゲーティングによって、サイトフローメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ，Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による検出をミトコンドリアに限定する。これらの二重ゲーティングが適切であることは、ΔΨｍ非感受性ミトコンドリア色素であるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（Ｒ）  Ｇｒｅｅｎ（７５ｎＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；緑色蛍光）を用いたミトコンドリアの標識によって事後的に確認する。低いΔΨｍを有するミトコンドリアのパーセントを決定するために、ＣＣＣＰ又はｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘ分子の１０分前に、ΔΨｍ感受性蛍光色素ＪＣ−１（２００ｎＭ；５７０−５９５ｎｍ）を加える。低いΔΨｍを有するミトコンドリアのパーセントは、ドットプロットＦＳＣ／ＦＬ−２（赤色蛍光）ウインドウにおいて測定する。
【０１２８】
Ｋ．アポトーシスの無細胞系
ミトコンドリアの上清中のＡＩＦ活性は、記載に従い（Ｓｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ｂ）、ＨｅＬａ細胞の核に対して検査する。簡潔に述べれば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて染色された精製ＨｅｌＬａ核に、ＡＩＦを含有するミトコンドリアの上清を加え（９０分、３７℃）、Ｅｌｉｔｅ  ＩＩサイトフルオロメータ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析して、低倍数性の核の頻度を測定する。幾つかの実験では、単離されたミトコンドリア、ジャーカット又はＣＥＭ細胞から得たサイトゾル（記載（Ｓｕｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ａ）に従って調製）、及び／又はｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘを核に加える。ミトコンドリア上清中のカスパーゼ活性は、蛍光発生基質としてＡｃ−ＤＥＶＤ−アミド−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。
【０１２９】
Ｌ．ＰＴＰＣの精製とリポソームへの再構成
公表されているプロトコール（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９８ｂ）に従って、Ｗｉｓｔａｒラットの脳からＰＴＰＣを精製し、リポソーム中に再構成する。要約すれば、ホモゲナイズした脳をｔｒｉｔｏｎ可溶性タンパク質の抽出に供し、タンパク質をＤＥ５２樹脂の陰イオン交換カラムに吸着させ、ＫＣｌグラジエントで溶出し、一晩透析して、ヘキソキナーゼ活性が最大の画分をホスファチジルコリン／コレステロール（５：１，ｗ：ｗ）小胞中に取り込ませる。透析工程の間には、記載に従って（Ｓｃｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）作製・精製された疎水性膜貫通ドメインを欠く（Δ２１９−２３９）組換えヒトＢｃｌ−２（１−２１８）を、総ＰＴＰＣタンパク質の５％に相当する用量になるように加える（約１０ｎｇ  Ｂｃｌ−２／ｍｇ脂質）。５ｍＭ  リンゴ酸塩と１０ｍＭ  ＫＣｌの中で、透析から回収されたリポソームを７秒間超音波処理し（１２０Ｗ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加え、１２５ｍＭ  スクロース＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で溶出する。１２５ｍＭ  スクロース＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）の中で、ｐＴａｒｇ−ｐＴｏｘ、［５２−９６］Ｖｐｒ、又はアトラクチロシドの存在下又は非存在下において室温で６０分間、一定分量のリポソーム（約１０７）をインキュベートする。次いで、リポソームを３，３’ジヘキシロカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＯＣ６（３）、８０ｎＭ、室温で２０−３０分、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と平衡化させ、記載に従って（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；  Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ｂ）、ＤｉＯＣ６（３）の保持をＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅサイトフルオロメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で分析する。
【０１３０】
３組の５×１０４のリポソームを分析し、ＰＴＰＣリポソームにおいて０．２５％  ＳＤＳ（１５分、室温）で得られた減少を１００％と考えて、結果をＤｉＯＣ６（３）蛍光の減少の％として表す。
【０１３１】
ＴＡＲＧとＴＯＸ又はＴＡＲＧとＳＡＶＥペプチド又はペプチド類似物の組み合わせである全てのキメラ分子の他、先述の技術を実施する際に利用することができる本発明に係るペプチド及び構築物の具体例が、表Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩに示されている。
【実施例６】
【０１３２】
実施例６
表面プラズモン共鳴は、Ｔｏｘ０、Ｔｏｘ１、Ｔｏｘ５、Ｔｏｘ６、Ｓａｖｅ１が精製ＡＮＴを結合するが、精製ＶＤＡＣを結合しないことを示している。
【０１３３】
方法論
様々なペプチドを固定化するために、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐｓ  ＳＡ（ストレプトアビジンをコートしたセンサーチップ）を使用した。Ｔｏｘ１は０．７ｎｇ／ｍｍ２の密度で、Ｔｏｘ０は３．７ｎｇ／ｍｍ２の密度で、Ｃｔｒ１  Ｔｏｘ０は１．４ｎｇ／ｍｍ２の密度で、Ｔｏｘ５は１ｎｇ／ｍｍ２の密度で、Ｔｏｘ６は１ｎｇ／ｍｍ２の密度で、Ｓａｖｅ１は１．３ｎｇ／ｍｍ２の密度で、対照ペプチドは０．８ｎｇ／ｍｍ２の密度で固定化した。１０μＬ／分の速度で１０分間（会合５分、解離５分）、ＡＮＴとＶＤＡＣ相互作用の会合と解離の速度を経過観察した。ＫＳＣＮ  ３Ｍを１分間流して、リガンドを再生させた。得られたセンサーグラムは、二重参照法を用いて、ＢｌＡｅｖａｌ３．１ソフトウェアにより解析した（Ｍｙｓｚｋａ  Ｄ．Ｇ．２０００．Ｋｉｎｅｔｉｃ，ｅｑｕｉｌｉｒｉｕｍ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＢＩＡＣＯＲＥ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２３：３２５−３４０）。まず、リガンドを用いたセンサーグラムから、対応する検体溶媒で得られたセンサーグラムを差し引く。次に、対照ペプチドリガンドで得られたセンサーグラムによる差し引きを行った。Ｔｏｘ及びＳａｖｅペプチドに対する対照ペプチドは、β２−アドレナリン作動性受容体の配列に対応するｂｉｏｔ−Ｈ１９Ｃであった。（Ｌｅｂｅｓｇｕｅ  Ｄ．，  Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．，  Ｍｉｊａｒｅｓ  Ａ．，  Ｇｒａｎｉｅｒ  Ｃ．，  Ａｒｇｉｂａｙ  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈｏｅｂｅｋｅ  Ｊ．（１９９８）  Ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｌｉｋｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  β  ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４８：１２３−１３３）。Ｔｏｘ０に対する対照ペプチドがＣｔｒ１Ｔｏｘ０であった。
【０１３４】
結果
図６は、４つのＡＮＴ濃度（６．２５−５０ｎＭ）に対するＡＮＴとＶｐｒとの相互作用を示している。ドリフティングベースラインありの単純ラングミュアモデルを用いたセンサーグラムの分析が最良であり、１６０のＲｍａｘで、０．１５ｎＭのＫｄが得られた（ｘ２＝７．２４）。ＡＮＴとＴｏｘ１との相互作用を示すセンサーグラムに対しても同じ分析を行った（図７）。１０倍高いＶＤＡＣ濃度で、Ｔｏｘ０及びＴｏｘ１の両者とのＶＤＡＣ相互作用を調べると（図８及び９）、センサーグラムは、ペプチドリガンドとの極めて低い会合しか示さず、得られた曲線は、様々なラングミュアの結合モデルによって分析することができなかった。
【０１３５】
他の３つのペプチドは、５０ｎＭの濃度で、ＡＮＴとの相互作用を検査した（図１０）。精製ＡＮＴは、それぞれ、０．１、０．７、及び０．０１ｎＭの相対親和性でＴｏｘ５、Ｔｏｘ６、及びＳａｖｅ１を認識した。唯一つのＡＮＴ濃度で得られたこれらの値は、３つのペプチドに対するＡＮＴの相対親和性を与えるにすぎない。同じく、同じペプチドと相互作用させるために５０ｎＭのＶＤＡＣを使用しても、図１１に示されているように、いかなる特異的な結合も得られなかった。
【０１３６】
本明細書には、以下の参考文献を引用した。本明細書に引用されている各参考文献の開示内容全体を基礎として、本明細書に参考文献として援用する。
【参考文献】
【０１３７】
2004532005.tif 000010
2004532005.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１Ａ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｂ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｃ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｄ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｅ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｆ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｇ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｈ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｉ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ４６１のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ａ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｂ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｃ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｄ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｅ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｆ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｇ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｈ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｉ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｊ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｋ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｌ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｍ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｎ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｏ】ベクターｐＡＣｇｐ６７−ＳｃＦｖ３５０のヌクレオチド配列を示す。
【図３】クローンｔｈｅｒａｐ  ９９Ｂ３から得られたＶｈ及びＶＬのヌクレオチド配列を示す。
【図４】クローンｔｈｅｒａｐ．８８Ｅ１０から得られたＶｈ及びＶＬのヌクレオチド配列を示す。
【図５】クローンｔｈｅｒａｐ．１５２Ｃ３から得られたＶｈ及びＶＬのヌクレオチド配列を示す。
【図６】表面プラズモン共鳴曲線を示す。
【図７】表面プラズモン共鳴曲線を示す。
【図８】表面プラズモン共鳴曲線を示す。
【図９】表面プラズモン共鳴曲線を示す。
【図１０】表面プラズモン共鳴曲線を示す。
【図１１】表面プラズモン共鳴曲線を示す。
【図１２】ＳｃＦｖ−ｔｒａｎｓｆｅｒｔベクターを得るための手法を示す。
【図１３】ＳｃＦｖ−ｔｒａｎｓｆｅｒｔベクターを得るための手法を示す。
【図１Ａ】
2004532005.tif 000012
【図１Ｂ】
2004532005.tif 000013
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2004532005.tif 000022
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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