(57)【要約】（Ａ）配列番号２もしくは配列番号１６のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の機能的等価変異体を含むポリペプチド；または（Ｂ）ポリペプチド（Ａ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；または（Ｃ）ポリペプチド（Ａ）と免疫反応性である抗体；または（Ｄ）ポリヌクレオチド（Ｂ）と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチド；を活性成分として含む医薬組成物；ならびに診断的および治療的適用における（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望により薬学的に許容される担体または希釈剤とともに、（Ａ）配列番号２もしくは配列番号１６のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の機能的等価変異体を含むポリペプチド；または（Ｂ）ポリペプチド（Ａ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；または（Ｃ）ポリペプチド（Ａ）と免疫反応性である抗体；または（Ｄ）ポリヌクレオチド（Ｂ）と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチド；を活性成分として含む医薬組成物。
【請求項２】
活性成分が、配列番号２または配列番号１６からの少なくとも５０連続アミノ酸を有する部分を含むポリペプチド（Ａ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
活性成分が、配列番号１または配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡであるか、あるいは配列番号１または配列番号１５に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであるポリヌクレオチド（Ｂ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
活性成分が、配列番号１または配列番号１５からの、少なくとも１００連続塩基を有する部分を含むポリヌクレオチド（Ｂ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
活性成分が、配列番号２または配列番号１６からの、少なくとも５０連続アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
配列番号１５のヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１において特定されたポリペプチド（Ａ）と免疫反応性である抗体。
【請求項９】
請求項１において特定されたポリヌクレオチド（Ｂ）に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１において特定されたポリヌクレオチド（Ｂ）の少なくとも１５連続ヌクレオチドまたはそれの相補体を含み、検出可能なシグナルを提供するように標識された、ポリヌクレオチド・プローブ。
【請求項１１】
炎症性疾患の処置方法であって、有効量の、請求項１において特定されたポリペプチド（Ａ）、または請求項１において特定されたポリヌクレオチド（Ｂ）、または請求項１において特定された抗体（Ｃ）、または請求項１において特定されたアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Ｄ）を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項１２】
炎症性疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項１または２において特定されたポリペプチド（Ａ）、請求項１および３〜５のいずれかにおいて特定されたポリヌクレオチド（Ｂ）、請求項１において特定された抗体（Ｃ）、または請求項１において特定されたアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Ｄ）の使用。
【請求項１３】
疾患が炎症性または閉塞性気道疾患である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
細胞または組織中の請求項１において特定されたポリヌクレオチド（Ｂ）の存在を検出する方法であって、細胞または組織由来のＤＮＡを、ポリヌクレオチド（Ｂ）の少なくとも１５連続ヌクレオチドまたはその相補体を含むポリヌクレオチド・プローブと、該プローブがポリヌクレオチド（Ｂ）と特異的にハイブリダイズする条件下で接触させ、そしてハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出することを含む方法。
【請求項１５】
対象が炎症性疾患を有するか否かを測定する方法であって、該対象からの細胞サンプルにおける請求項１および３〜５のいずれかにおいて特定されたポリヌクレオチド（Ｂ）の発現レベルを測定すること、および当該レベルを、健康対象からの細胞サンプル中の該ポリヌクレオチドの発現レベルと比較することを含む方法。
【請求項１６】
炎症性疾患を有する対象の、薬物での処置をモニターする方法であって、請求項１および３〜５のいずれかにおいて特定されたポリヌクレオチド（Ｂ）、または請求項１もしくは２において特定されたポリペプチド（Ａ）の発現レベルあるいは処置後の対象からの細胞サンプル中の当該ポリペプチドの活性レベルを測定すること、および当該レベルを、該処置前のそれぞれのレベルと比較することを含む方法。
【請求項１７】
請求項１および３〜５のいずれかにおいて特定されたポリヌクレオチド（Ｂ）のフラグメントの増幅のためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドの対であって、ここで該対は少なくとも１５ヌクレオチド長であり、そして、ヒトゲノムＤＮＡまたは適当なヒトｃＤＮＡ標的とのポリメラーゼ連鎖反応に使用した場合、該ポリヌクレオチド（Ｂ）のヌクレオチド配列の一部または全部を含むＤＮＡフラグメントの合成をもたらすような配列を有する該対。
【請求項１８】
候補物質を請求項１または２において特定されたポリペプチド（Ａ）と組み合わせそして該ポリペプチド（Ａ）の活性に対する候補物質の効果を測定することを含む、炎症性疾患の処置における使用に適した物質の同定方法。
【請求項１９】
請求項１または２において特定されたポリペプチド（Ａ）に結合する、炎症性疾患の処置における使用に適した物質の同定方法であって、候補物質を該ポリペプチド（Ａ）と混合すること、および結合が起こったか否かを測定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、治療的および診断的適用におけるＥＸ２０と呼ばれる炎症関連Ｇタンパク質共役受容体の遺伝子の使用、ＥＸ２０によりコードされるタンパク質分子および関連分子に関する。
【０００２】
幾つかの疾患、例えば多くの呼吸性および炎症性疾患の発症および持続には、病理学的状態の発症の間の、多くの表現型の変化を受ける種々の細胞型の参加が関与している。これらの表現型の変化は、種々の遺伝子およびタンパク質の発現および機能化における特異的変化の結果である。発現が特定の生理学的または病理学的状態において変化している遺伝子またはタンパク質の検出は、したがって、病理学的および治療的に重要な遺伝子またはタンパク質の同定につなげることができる。
【０００３】
炎症中に組織内に誘引される細胞は、種々の炎症性食細胞、例えば、好中球性および好酸球性の顆粒球および単球を含む。これらの細胞は、急性及び慢性気管支炎の両方、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、喘息、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、原発性硬化性胆管炎およびクローン病における呼吸器管炎症を含むいくつかの炎症疾患組織破壊と連関された。
【０００４】
いくつかの炎症性呼吸疾患においては、炎症性組織に存在する増加した数の好中球、マクロファージおよび他の白血球がある。種々の白血球および内皮細胞による化学誘引物質の放出の結果として、肺への高度な移動は、炎症の部位でのこれらの細胞の蓄積に貢献する。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のレベルの増加は、好中球の機能的寿命を増加させ、そして食細胞性および酸化的破裂活性ならびに前記疾患の炎症性プロセスを調節するのに重要なプロ炎症性サイトカインの産生の両方を増加させることが示された。
【０００５】
炎症性状態における白血球の作用の重要なステップは、これらの細胞の、該組織への、例えば呼吸炎症の気道への、またはリウマチ様関節炎の関節への移動、細胞活性化および一定の炎症性メディエーター、ロイコトリエン、酸素ラジカル、プロテアーゼの放出を含む。発現がサイトカイン刺激により、例えばＧＭ−ＣＳＦによりアップレギュレートされる遺伝子およびタンパク質の単離は、治療上の有益性を提供するために活用され得る分子標的を同定し得る。
【０００６】
最近、差次的遺伝子発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の検出および差次的に発現した遺伝子の単離のための幾つかの方法および技術が開発された。変化を、例えば、プロテオミクス・アプローチを使用するタンパク質レベルで同定することができ、そして転写調節の変化を、ディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇ， Ｐ．， ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１）、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ， Ｖ．Ｅ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ．， ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ， Ｋ．Ｗ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０：４８４−４８７）、固体支持体に結合した複合ｃＤＮＡプローブ高密度ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドアレイのディファレンシャル・ハイブリダイゼーション（Ｃｈｅｅ， Ｍ． Ｙａｎｇ， Ｒ．， Ｈｕｂｂｅｌｌ， Ｅ． Ｂｅｒｎｏ， Ａ． Ｈｕａｎｇ， Ｘ．Ｃ．， Ｓｔｅｒｎ， Ｄ．， Ｗｉｎｋｌｅｒ， Ｊ．， Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ．Ｊ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ． Ｓ． ａｎｄ Ｆｏｄｏｒ， Ｓ．Ｐ．Ａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６） ２７４：６１０−６１４； Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ．Ｊ．， Ｄｏｎｇ， Ｈ． Ｂｙｒｎｅ，Ｍ．Ｃ．， Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ， Ｍ．Ｔ．， Ｇａｌｌｏ， Ｍ．Ｖ．，Ｃｈｅｅ， Ｍ．Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｃ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｍ．， Ｈｏｒｔｏｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ， Ｅ．Ｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９６） １４：１６７５−１６８０； Ｓｈｅｎａ， Ｍ．， Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．， Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｗ． ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ， Ｐ．Ｏ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５） ２５０：４６７−４７０）およびｃＤＮＡサブトラクション法（ｃＤＮＡ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）、例えばレプレゼンテーショナル・ディファレンス分析（Ｈｕｂａｎｋ， Ｍ．， ａｎｄ Ｓｃｈａｔｚ， Ｄ．Ｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５６４０−５６４８）を含む幾つかの方法によって検出することができる。
【０００７】
差次的に発現した遺伝子を同定するために使用できる１つの方法は、ｃＤＮＡのレプレゼンテーショナル・ディファレンス分析（ｃＤＮＡ−ＲＤＡ）である。ｃＤＮＡ−ＲＤＡは、ＰＣＲに基づくサブトラクティブ・エンリッチメント法（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）である。最初に複合ゲノムの間の差の同定のために開発され、それが種々の組織または細胞サンプルの間で変化した発現を有する遺伝子の単離を可能とするように適合化された（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ， Ｎ．， ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９４６−９５１； Ｈｕｂａｎｋ， Ｍ．， ａｎｄ Ｓｃｈａｔｚ， Ｄ．Ｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５６４０−５６４８； Ｏ’Ｎｅｉｌｌ， Ｍ． Ｊ．， ａｎｄ Ｓｉｎｃｌａｉｒ， Ａ．Ｈ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２６８１−２６８２）。この技術は、いくつかの間違った陽性物の単離、すなわち望まれない差産物が、競合的に排除され、そして稀な転写物を生産する遺伝子がまた検出および単離できる事実を含む幾つかの利点を提供する。
【０００８】
炎症性状態において過剰発現する遺伝子の同定は、炎症性状態の理解に重要な機会を提供するであろう。これらの遺伝子およびタンパク質の過剰発現に関連した組織分布および疾患は、適切に選択された患者由来の組織サンプルを用いて確立され得る。さまざまな技術、例えば組織学的手法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学がこの目的に適用され得る。これらの遺伝子の過剰発現は、多くの臨床的に重要な適用があり得る疾患状態においてそれらが重要であることを示す。
【０００９】
Ｇタンパク質共役受容体の同定は、特に有利である。白血球の移動および活性化に必要なシグナルは、しばしば、３つの細胞内ループおよび３つの細胞外ループにより接続された７回膜貫通へリックス（ＴＭ−ＩからＶＩＩ）を特徴とする７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する受容体を介して伝達される。ＧＰＣＲ遺伝子ファミリーは、最大の既知のレセプターファミリーである。ＧＰＣＲは、細胞外シグナルのトランスデューサーであり、それらは組織が幅広いシグナル伝達分子に応答することを可能にする。Ｇタンパク質は治療的適用における重要な標的である。というのは、それらは広範な生理学的および病理学的プロセスに関与するからである。現在市販されている医薬の６０〜７０％が、ＧＰＣＲスーパーファミリーのメンバーに、実際に作用すると概算されている。
【００１０】
種々のクローニング・ストラテジーおよびデータベース・マイニング・アプローチ（ｄａｔａｂａｓｅ ｍｉｎｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ）により、多くのＧＰＣＲがクローニングされている。しかし、リガンドの同定は遅れており、そのタンパク質生成物が、基準として配列類似性および予測的三次元構造を使用して、ＧＰＣＲファミリーのメンバーである多くのＧＰＣＲ遺伝子が存在するが、それに対するリガンドは知られていない。これらの受容体は、オーファンＧタンパク質共役受容体（ｏＧＰＣＲ）として一般に知られている。
【００１１】
炎症細胞において発現しそしてそれらの過剰発現と疾患状態との関連を確立しているＧタンパク質共役受容体の遺伝子の同定は、多くの臨床的に重要な適用があり得る炎症状態の理解の重要な機会を提供するであろう。同定されたＧＰＣＲは、該遺伝子または該遺伝子のタンパク質産物を直接の標的とした治療（小分子医薬、アンチセンス分子、抗体分子）の開発を導き得るか、または、このような医薬の開発が該遺伝子を直接的にターゲティングすることよりも容易な場合には、上流または下流での生化学的経路を標的とし得る。該遺伝子および配列変異体を含むポリヌクレオチド配列は、炎症性状態の臨床診断的試験を開発するために使用され得る。さらに、これらの炎症性状態に関与するＧＰＣＲのＤＮＡ配列および、これらの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に関する情報は、組換え技術によるタンパク質の大規模製造、ならびに天然に該タンパク質を生成する組織および細胞の同定を促進する。このような配列情報は、また、ＧＰＣＲ遺伝子によりコードされるタンパク質と特異的に反応する抗体物質または他の新規結合分子の製造を可能にし、これはタンパク質が関与する天然リガンド／抗リガンド結合反応の調節に使用され得る。
【００１２】
上記の疾患における炎症プロセスを調節するのに重要なサイトカインの刺激後に、例えばＧＭ−ＣＳＦにより、ＥＸ２０の発現がアップレギュレートされることが見出された。さまざまな白血球サブセット（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ）におけるＥＸ２０の観察される炎症疾患関連過剰発現の見地において、ＥＸ２０およびそれによりコードされるタンパク質は上記の炎症疾患の診断においていて有用であり、そして、コードされるタンパク質はそれらの疾患の処置に適した医薬の同定のための治療的標的として有用である。
【００１３】
したがって、１つの観点において、本発明は、所望により薬学的に許容される担体または希釈剤とともに、（Ａ）配列番号２または配列番号１６のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の機能的等価変異体、すなわち、その生物学的または他の機能的活性を保持した変異体、例えば配列番号２または配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体を上昇させることができる変異体を含むポリペプチド；または（Ｂ）ポリペプチド（Ａ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（以後、ＥＸ２０と呼ぶ）；または（Ｃ）ポリペプチド（Ａ）と免疫反応性である抗体；または（Ｄ）ポリヌクレオチド（Ｂ）と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチド；を活性成分として含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本明細書で使用する用語は、以下の意味を有する：
“単離”は、その本来の環境から除かれた物質を意味する。
“ハイブリダイゼーション”または“ハイブリダイズ”は、ポリヌクレオチド鎖が、塩基対形成を介してその相補鎖と結合する任意の工程を意味する。
“ストリンジェントな条件”は、２０％までの塩基対ミスマッチを可能にする実験条件を意味し、典型的に６５℃で０．１ＸＳＳＣ（１５ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ　７．０）の２回、１５分洗浄である。
【００１５】
“相同性”または“相同的な”は、部分的であるか、または配列が同一である場合には完全であり得る、ヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の類似の程度を意味する。
“発現ベクター”は、転写のために提供される追加的セグメントに作動可能に連結された所望のポリペプチドをコードするセグメントを含む直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００１６】
“アンチセンス”は、標的タンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）における、オリゴ−またはポリヌクレオチドの、その相補的配列へのハイブリダイゼーションを介したタンパク質合成の選択的阻害を意味する。アンチセンスという概念は、最初に、ＺａｍｅｃｎｉｋおよびＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：２８０−２８４； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：２８５−２８８）により提案され、続いて実験的ツールとしておよび推定治療分子を生成する手段としての両方の広い適用が発見された（Ａｌａｍａ， Ａ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． ３６：１７１−１７８； Ｄｅａｎ， Ｎ．Ｍ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ２４：６２３−６２９； Ｂｅｎｎｅｔ， Ｃ．Ｆ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８０：９８８−１０００； Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
【００１７】
本明細書で使用する“変異体”は、アミノ酸配列に関して、１個以上のアミノ酸により変えられているアミノ酸配列を意味する。変化は、アミノ酸置換、欠失または挿入を含み得る。ヌクレオチド配列に関して、本明細書で使用する“変異体”なる用語は、１個以上のヌクレオチドにより変えられているヌクレオチド配列を意味する；変化は、ヌクレオチド置換、欠失または挿入を含み得る。好ましいアミノ酸配列番号２または配列番号１６の機能的同等変異体は、配列番号２または配列番号１６と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてとりわけ９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有するものである。
【００１８】
配列番号２または配列番号１６のような参照配列とｘ％同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列の１００アミノ酸当たり、１００−ｘ個のアミノ酸の変化までを含み得る以外、参照配列と同一の配列を意味する。例えば、参照配列と少なくとも８０％同一性を有する対象アミノ酸配列において、参照配列における２０％までのアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基により置換、欠失または挿入されていてよい。アミノ酸配列間の同一性パーセントは、既知のコンピュータープログラム、例えばＢｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ（Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０） ６：２３７−２４５）のアルゴリズムをベースにしたＦＡＳＴＤＢプログラムを慣用的に使用して決定できる。
【００１９】
ポリヌクレオチド（Ｂ）は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。特定の実施態様では、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、配列番号１または配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡであるか、あるいは配列番号１または配列番号１５に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＤＮＡである。そのようなハイブリダイゼーション要件を満たすヌクレオチド配列は、１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換の結果であるものを含む。
【００２０】
本発明は、また、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明のさらなる観点において、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、配列番号１または配列番号１５からの、少なくとも２０、例えば少なくとも５０、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも５００、例えば少なくとも１０００、例えば少なくとも１１００連続塩基を有する部分を含む。本発明のいっそうさらなる観点において、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、配列番号２または配列番号１６からの、少なくとも１０、例えば少なくとも５０、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも３００連続アミノ酸をコードするヌクレオチドを含む。
【００２２】
ポリヌクレオチド（Ｂ）は、ＧＰＣＲのファミリーまたはサブファミリーのメンバーの中で保存されているアミノ酸配列モチーフを使用して設計された縮重プライマーを使用したＰＣＲにより、最初にそのフラグメントを単離することにより単離され得る。縮重プライマーは、ヒト細胞、特に白血球からまたはとりわけ貪食細胞、例えば好中性および好酸性顆粒球からまたはゲノムＤＮＡから単離されたＲＮＡから調製したｃＤＮＡ由来のフラグメントを増幅させるために使用され得る。単離フラグメントを次いで配列決定し、完全長クローンを、最初に、その配列およびヒト細胞、特に白血球からまたは特に貪食細胞、例えば好中性および好酸性顆粒球からまたはゲノムＤＮＡから単離したＲＮＡを使用して設計した遺伝子特異的プライマーを使用した５’および３’　ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端急速増幅）を使用した、５’および３’’末端を含む重複フラグメントを単離し、続いて標準法によってこれらのフラグメントを接続することにより得る。
【００２３】
ポリヌクレオチド（Ｂ）はまた、最初に、ＧＰＣＲのファミリーまたはサブファミリーのメンバーの中で保存されているアミノ酸配列モチーフを使用して設計した、縮重プライマーを使用したＰＣＲにより、そのフラグメントの単離により単離され得る。縮重プライマーは、ヒト細胞、特に白血球からおよびとりわけ貪食細胞、例えば好中性および好酸性顆粒球からまたはゲノムＤＮＡから単離したＲＮＡから調製した、ｃＤＮＡからのフラグメントを増幅させるために使用され得る。単離フラグメントを次いで配列決定し、完全長クローンを、このフラグメントまたはその一部を、ヒトｃＤＮＡライブラリー、好ましくは白血球または、とりわけ顆粒球ｃＤＮＡライブラリーまたはヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用することにより得る。
【００２４】
例えば配列番号１または配列番号１５の配列を有する、ポリヌクレオチド（Ｂ）はヌクレオチドから調製され得、それには既知の方法および装置を使用した化学合成、例えば、自動固相合成が含まれる。
【００２５】
ポリペプチド（Ａ）は、前記のポリヌクレオチド配列を、転写のためのプロモーターおよび他の適当な調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、細菌、植物、昆虫、酵母、動物またはヒト細胞のような原核生物または真核生物の宿主細胞に導入し、そして適当な条件下で組換え発現ベクターを含む宿主細胞を培養することにより製造され得る。このようなポリペプチドの組換え発現のための技術は既知であり、例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９９０に記載されている。
【００２６】
本発明の観点において、ポリペプチド（Ａ）は配列番号２または配列番号１６からの、少なくとも１０、例えば少なくとも５０、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも３００連続アミノ酸を含む。
【００２７】
本発明は、また、配列番号１６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、特に組換えポリペプチドを提供する。
【００２８】
ポリペプチド（Ａ）は、１個以上の異種ポリペプチドとの組換え融合タンパク質として、例えば精製を促進するために、発現し得る。例えば、それは、本発明のポリヌクレオチド配列と異種ポリペプチド配列の間に位置する開裂部位を含む、ポリヒスチジンのような異種ポリペプチドとの組換え融合タンパク質として発現し得、その結果、配列番号２または配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、周知技術を使用して異種部分から開裂および精製され得る。
【００２９】
ポリペプチド（Ａ）は、また、アミノ酸から全体または一部が合成され得、それには周知の化学的方法、例えば自動固相合成が含まれる。
【００３０】
ポリペプチド（Ａ）は既知の標準法により精製され得る。
【００３１】
本発明は、また、前記のポリペプチド（Ａ）と免疫反応性である抗体（Ｃ）を提供する。該抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。このような抗体は慣用法を使用して製造され得る。精製抗原に対するポリクローナル抗体を製造する方法は、確立されている（Ｃｏｏｐｅｒ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １１参照）。典型的に、ウサギ、またはマウスのような宿主動物を、精製ポリペプチド（Ａ）またはその免疫原性部分を抗原として免疫化し、適当な時間の後に、宿主血清を集め、ポリペプチドに対して特異的な抗体に関して試験する。精製抗原に対するモノクローナル抗体の製造法は確立されている（Ｃｈａｐｔｅｒ １１， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．参照）。ポリクローナル抗体の製造のために、血清を飽和硫酸アンモニウムまたはＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘで処理できる。モノクローナル抗体の製造のために、免疫化動物の脾臓またはリンパ球を除去し、不死化するか、既知の方法によりハイブリドーマを製造するのに使用する。不死化細胞により分泌された抗体は、例えば、ウエスタン・ブロット分析を使用して、望ましい特異性の抗体を分泌するクローンを決定するためにスクリーニングする。ヒト化抗体は、慣用法で製造できる。
【００３２】
別の観点において、本発明は、ポリヌクレオチド（Ｂ）に相補的なヌクレオチド配列、特に配列番号１または配列番号１５に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Ｄ）を提供する。該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＤＮＡのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートアナログのようなＤＮＡのアナログ、ＲＮＡ、ＲＮＡのアナログ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは慣用法で、例えば自動固相法を使用して合成できる。
【００３３】
本発明は、また、前記のポリヌクレオチド（Ｂ）の少なくとも１５連続ヌクレオチドまたはそれの相補体を含むポリヌクレオチド・プローブを提供する。プローブは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。通常、これは１５から５０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであるか、または例えば１１００まで、例えば１０００まで、例えば５００までの（Ｂ）の連続ヌクレオチドを含む比較的長い分子であり得る。該プローブは、例えばフルオロフォアまたは化学ルミネセンス物質または放射性標識で標識でき、検出可能なシグナルを提供する。
【００３４】
ポリヌクレオチド・プローブは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号１５の配列を有するポリヌクレオチド・フラグメントを有するポリヌクレオチド・フラグメントと選択的にハイブリダイズできる。該プローブは、このようなハイブリダイゼーション条件下で、その同族配列にのみハイブリダイズする配列を有する。上記のＤＮＡプローブは、ノーザンおよびサザン・ブロット分析、ドット・ブロットおよびスロット・ブロット分析、および蛍光イン・シテュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む多くのスクリーニングの適用に有用である。
【００３５】
本発明はまた、前記のポリヌクレオチド（Ｂ）、すなわちＥＸ２０のフラグメントのＤＮＡ増幅のためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの対を含み、ここで、該対の各プライマーは、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、そして該対は、ヒトゲノムＤＮＡまたは適当なヒトｃＤＮＡ標的とのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用した場合、ＥＸ２０の配列を全てまたは好ましくは一部含むＤＮＡフラグメントの合成をもたらすような配列を有する。プライマー対は、好ましくはＥＸ２０のコード領域またはその一部を増幅することができる。このようなプライマー対の例は、以後、各々配列番号３〜４および配列番号５〜６として示す。
【００３６】
好中球性または好酸球性の炎症により特徴付けられる炎症性疾患におけるポリペプチド（Ａ）の役割は、通常のアレルゲン誘発性の、動物の炎症状態のモデル、例えば卵白アルブミン誘発性のラットまたはマウスのモデルを使用して測定できる。
【００３７】
前記のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはプローブ（以後、集合的に本発明の薬剤と呼ぶ。）は、前記のような炎症性疾患の処置（予防的または対症的）または診断に使用され得る。いくつかの炎症状態において、ＥＸ２０のアップレギュレーションは抗炎症事象（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｖｅｎｔ）を誘導し得、その結果、このアップレギュレーションを促進する処置が適当であり得る。例えば、ポリペプチド（Ａ）は、該ポリペプチドを欠く、またはそうでなくてもそれを必要とする哺乳類、特にヒトの処置に使用され得る；ポリヌクレオチド（Ｂ）は、ＥＸ２０活性の増加が望まれている、例えば、対象が変異したＥＸ２０遺伝子を有するか、または欠いている場合の遺伝子治療に使用され得る；あるいは、抗体（Ｃ）またはアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Ｄ）は、必要な場合のＥＸ２０活性を阻害するために使用され得る；抗体（Ｃ）は、ポリペプチド（Ａ）の検出、または発現のレベルの測定に、あるいはポリペプチド（Ａ）のリガンド／抗リガンド結合活性の阻害のために使用され得る；そして本発明のプローブは、ＥＸ２０遺伝子の存在または不存在の検出、すなわち、遺伝的異常性の検出に、あるいは、例えば炎症性疾患の診断において、細胞サンプルにおけるＥＸ２０の発現のレベルを測定するために使用され得る。
【００３８】
“遺伝子治療”は、個体の体細胞への遺伝的物質の導入に基づくヒトの疾患の処置の試みを意味する。遺伝子導入は、インビボで遺伝子担持ウイルス性または非ウイルス性ベクターを血液または組織へ直接的に投与すること、またはエキソビボで研究室において操作した細胞に遺伝的物質を移入すること、続いて、遺伝子含有細胞を個体に送達すること、により達成され得る。細胞内の遺伝的物質を変えることにより、遺伝子治療は、罹患している病気の病態生理を改善し得る。動物における特定の組織および臓器系への遺伝子送達の適当なベクターおよび方法は、それぞれ、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ， Ｎ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３に記載されている。前記のポリヌクレオチド（Ａ）に関連して、遺伝子治療には、適当な制御エレメント下でＥＸ２０遺伝子の発現カセットを含むウイルス性または非ウイルス性遺伝子治療用ベクターの、疾患個体の肺への送達が含まれ、それにより病気の病態生理が改善されるか、または軽減される。
【００３９】
したがって、本発明は、
炎症性疾患、特に炎症性または閉塞性気道疾患の処置方法であって、有効量の前記のポリペプチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）、抗体（Ｃ）またはアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Ｄ）を、それを必要とする対象に投与することを含む方法；
【００４０】
炎症性疾患の処置のための医薬の製造のための、前記のポリペプチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）、抗体（Ｃ）またはアンチセンス・オリゴヌクレオチド（Ｄ）の使用；
【００４１】
対象由来の遺伝サンプルを、前記のポリヌクレオチド・プローブと、プローブが相補的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする条件下でインキュベートし、第１反応産物を産生し、そして第１反応産物を正常遺伝サンプルで得たコントロール反応産物と比較することを含み、第１反応産物とコントロール反応産物の差異が対象における遺伝子異常または疾患の素因を示すものである、対象における遺伝子異常または疾患の素因を検出する方法；
【００４２】
例えば、配列番号１または配列番号１５を含むポリヌクレオチド（Ｂ）の存在の検出方法であって、細胞または組織由来のＤＮＡを、前記のポリヌクレオチド・プローブと、プローブがポリヌクレオチド（Ｂ）と特異的にハイブリダイズする条件下で接触させ、そしてハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出することを含む方法；
【００４３】
患者におけるポリヌクレオチド（Ｂ）のヌクレオチド配列における異常を検出する方法であって、患者から単離したＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列を、増幅する配列を標的とする前記のプライマーの対を使用したポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、そして多形性が存在するか否かの測定のために増幅配列を分析することを含む方法；
を提供する。
【００４４】
“多形性”なる用語は、前記のポリヌクレオチド（Ｂ）の配列と比較した任意の配列の差異を意味する。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチド・プローブと相補的ポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、インシテュ（例えばＦＩＳＨ）ハイブリダイゼーション、ノーザンまたはサザン・ブロット分析、ドット・ブロットまたはスロット・ブロット分析を使用して検出し得る。異常性は、また、例えば配列感受性ゲル電気泳動（ＣＳＧＥ）およびＤＮＡ配列決定により検出し得る。遺伝的異常性は、個体のＥＸ２０タンパク質の、正常ＥＸ２０タンパク質のアミノ酸配列と比較したアミノ酸配列における変化、あるいはタンパク質の欠失をもたらし得る。あるいは、変化はアミノ酸配列を変えないが、代わりに、遺伝子の５’−もしくは３’−末端のいずれかでの制御エレメントの配列を変えることにより、または遺伝子のイントロン配列領域内の制御エレメントの配列を変えることにより、ＥＸ２０遺伝子の発現を変え得る。変化は、また、遺伝子の転写が処理されるまたは翻訳される方法に影響し得る。本発明は、また、個体のＥＸ２０遺伝子のポリヌクレオチド配列における異常性を検出するため、または個体の細胞におけるＥＸ２０の発現のレベルを測定するためのキットを含む。このような使用のためのハイブリダイゼーション・キットは、検出可能な、例えば化学ルミネッセンス、放射性または蛍光性の標識をその中に包含させることにより修飾し得る、前記のプローブ（Ｅ）を含み、そして標識試薬、すなわち、放射性同位体、化学ルミネッセンスまたは蛍光基をハイブリダイズ産物に包含させる試薬のような他の試薬、および緩衝液を含み得る。ＰＣＲ増幅キットは、上記のようなプライマー対を、ＴａｑポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼと共に含み得、そして増幅用緩衝液等のような付加的な試薬を含み得る。ＰＣＲ増幅キットの特定の実施態様には、ＣＳＧＥおよびＤＮＡ配列決定を含む、ポリヌクレオチド変化を検出する多くの技術に特異的な付加的な試薬が含まれ得る。
【００４６】
ポリヌクレオチド（Ｂ）の発現のレベルの測定は、前記のような炎症性疾患の診断において使用され得る。したがって、本発明は、対象が炎症性疾患、例えば、上昇したＧＭ−ＣＳＦレベルと連関する炎症性疾患を有するか否かを測定する方法を含み、ここで該方法は、該対象からの細胞サンプルにおいて、前記のポリヌクレオチド（Ｂ）、特に配列番号１または配列番号１５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ）、またはストリンジェント条件でそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（Ａ）の発現レベルを測定すること、および当該レベルを、健康対象からの細胞サンプル中の該ポリヌクレオチドの発現レベルと比較することを含む。ポリヌクレオチド（Ｂ）の上昇した発現レベルは、炎症性疾患を示唆する。測定されたレベルは、該炎症性疾患の性質を示唆する。ポリヌクレオチド（Ｂ）の発現レベルは、例えば、ノーザン・ブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、インシチュ・ハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタン・ブロット・ハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって、決定され得る。
【００４７】
例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用する診断試験において、ｍＲＮＡを、所望の細胞、例えば、ＢＡＬ液細胞（ＢＡＬ ｆｌｕｉｄ ｃｅｌｌ）または末梢血細胞から単離する。２種のプライマーであって、一方は、配列番号１のヌクレオチド７６５と７８３の間の領域の配列と同一の配列を有し、他方は、配列番号１のヌクレオチド８１５−８３５の逆相補物であるヌクレオチド配列を有する、プライマーを設計する。適当に修飾されそして標識されたプローブを、次いで、配列番号１のヌクレオチド７８７−８１３の間の配列に対応して作成する。適当なコントロール遺伝子を使用して、これらの２種のプライマーおよびプローブを、ＴａｑＭａｎ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）装置において使用して、調査中の患者および健康対象から採取したサンプル中のＥＸ２０のｍＲＮＡ量を測定する。診断目的でインシチュ・ハイブリダイゼーションを使用するとき、配列番号１に示す配列の任意の部分に対応する約２００〜１２００ｂｐのプローブを使用できる。種々の長さのいくつかのオーバーラップ・プローブをそのような試験、例えば実施例３に記載のものにおいて使用することができる。サンプルを、患者から収集し、そしてパラフィンに包埋することができる。そのようなサンプルは、例えば、末梢血細胞、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液細胞、または種々の組織切片であり得る。実施例３において記載したように調製された標識リボプローブを、次いで使用し、これらのサンプル中のＥＸ２０の発現レベルを測定し、そしてそれによって炎症性状態を同定することができる。
【００４８】
本発明は、また、前記のような炎症性疾患、例えば、上昇したＧＭ−ＣＳＦレベルと連関する疾患を有する対象の、薬物、例えば本発明の薬剤として前記したようなものでの処置をモニターする方法を含み、ここで該方法は、前記のポリヌクレオチド（Ｂ）もしくはポリペプチド（Ａ）の発現レベルまたは処置後の対象からの細胞サンプル中の当該ポリペプチドの活性レベルを測定すること、および当該レベルを、該処置前のそれぞれのレベルと比較することを含む。該比較により望ましいと示される場合には、該薬物の該対象ヘの投与はそれに応じて変えられ得る。
【００４９】
炎症性状態、例えば炎症性気道疾患の阻害または反転における本発明の薬物の有効性は、動物モデル、例えば、気道炎症または他の炎症性状態の、マウスまたはラットモデル、例えば、Ｓｚａｒｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （１９９７） ２０２：４９−５７； Ｒｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． （１９９３） １４８：９３２−９３９； Ｔｓｕｙｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． （１９９５） ９６：２９２４−２９３１； Ｃｅｒｎａｄａｓ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：１−８； Ｄｕｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． （１９９４） ７３：１１−１８；およびＷｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９２） ８９：９７８４−９７８８に記載されるように実証され得る。
【００５０】
本発明が適用可能である炎症性疾患は、炎症性または閉塞性気道疾患、例えば内因性（非アレルギー性）喘息および外因性（アレルギー性）喘息の両方を含むいかなるタイプまたは起源の喘息を含む。喘息の処置は、また、喘鳴徴候を示し、「幼児喘鳴」と診断されるかまたは診断可能な、４または５歳未満の対象の処置を包含するものと理解され、「幼児喘鳴」は、よくある疾患の患者カテゴリーであり、現在では、しばしば、初期または早期喘息患者と同定される（便宜上、この特定の喘息状態を、「幼児喘鳴症候群」と呼ぶ）。
【００５１】
、本発明が適用可能である他の炎症性または閉塞性気道疾患および状態は、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺または気道疾患（ＣＯＲＤまたはＣＯＡＤ）を含み、これらは特に他の吸入薬物治療における、慢性気管支炎またはそれに関連する呼吸困難、気腫、ならびに他の薬物治療の結果である気道反応亢進の増悪を含む。
【００５２】
本発明は、また例えば急性、アラキドン酸性、カタル性、クループ性、慢性またはフチノイド性気管支炎を含む、いかなるタイプまたは起源の気管支炎の処置に適用可能である。本発明が適用可能であるさらなる炎症性または閉塞性気道疾患は、いかなるタイプまたは起源の塵肺（通常、職業性である炎症、肺の疾患であって、慢性または急性であれ、気道閉塞を頻繁に伴い、そしてほこりの反復吸入によって引き起こされるもの）を含み、これらは例えば、アルミノシス、炭症、石綿症、プチロシス（ｐｔｉｌｏｓｉｓ）、シデロシス、シリコシス、タバコシスおよび綿肺症を含む。
【００５３】
これらの抗炎症活性について、特に好中球または好酸球活性化の阻害に関連して、本発明の薬剤は、また、好中球または好酸球関連性障害、例えば好中球増加症または好酸球増加症、特に気道の好中球または好酸球関連性障害（例えば肺組織の病的な好酸球浸潤に関係する）の処置において有用であり、これらには、気道および／または肺に影響を与える好酸球増加症、ならびに例えば、Ｌｏｅｆｆｅｒ症候群、好酸球肺炎、寄生性（特に後生動物）侵入（熱帯性好酸球増加症を含む）、気管支肺アスペルギルス症、結節性多発性動脈炎（チャーグ・ストラウス症候群を含む）、好酸球性肉芽腫および薬物反応により起こる気道に影響を与える好酸球関連障害の結果または付随の気道の好酸球関連性障害；ならびに、急性および慢性気管支炎、ＣＯＰＤ、ＡＲＤＳ、気腫、リウマチ様関節炎、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、原発性硬化性胆管炎およびクローン病のような好中球関連性障害が含まれる。
【００５４】
本発明の薬剤は、任意の適当な経路で、例えば錠剤またはカプセル剤の形態で、例えば経口的に；非経腸的に、例えば静脈内；局所的に、例えば軟膏剤またはクリーム剤で；経皮的、例えばパッチ剤で；吸入により；または経鼻的に投与され得る。
【００５５】
本発明の薬剤を含む医薬組成物は、慣用の希釈剤または賦形剤、およびガレヌス分野において既知の技術を使用して製造され得る。したがって、経口投与形態には錠剤およびカプセル剤が含まれ得、吸入用組成物にはエアロゾルまたは他の噴霧可能製剤または乾燥粉末製剤が含まれ得る。
【００５６】
本発明は、（ｉ）吸入可能な形態、例えばエアロゾルまたは他の噴霧可能な組成物の、あるいは吸入可能な粒子の、例えば微分化された形態の本発明の薬剤（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）；（ｉｉ）吸入可能な形態の本発明の薬剤（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）を含む吸入可能な医薬；（ｉｉｉ）吸入デバイスと組み合わせた吸入可能な形態の本発明の薬剤（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）を含む医薬製剤；および（ｉｖ）吸入可能な形態の本発明の医薬（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）を含む吸入デバイスを含む。
【００５７】
本発明の実行に用いる本発明の薬剤の投与量は、もちろん、例えば、処置する特定の状態、所望の効果および投与様式に依存して変動し得る。一般に、吸入による投与のための適当な一日投与量は、１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇのオーダーの範囲であるが、経口投与の適当な一日投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇのオーダーのものである。
【００５８】
前記のポリペプチド（Ａ）は、その活性の促進剤（アゴニスト）または阻害剤（アンタゴニスト）を同定するために、すなわち、炎症性疾患、特に炎症性または閉塞性気道疾患の処置に有用な化合物を同定するために使用され得る。したがって、本発明は、また、候補物質とポリペプチド（Ａ）を組み合わせそして該ポリペプチド（Ａ）の活性に対する候補物質の効果を測定することを含む、炎症性疾患の処置における使用に適した物質の同定方法を提供する。ポリペプチド（Ａ）の活性は、例えば、細胞内Ｃａ２＋またはｃＡＭＰ（サイクリックＡＭＰ）レベルを測定することにより、形状の変化により、または適当なレポーター遺伝子アッセイにより測定され得る。本発明には、また、前記のポリペプチド（Ａ）に結合する、炎症性疾患の処置における使用に適した物質の同定方法であって、候補物質を該ポリペプチド（Ａ）と混合すること、および結合が起こったか否かを測定することを含む方法が含まれる。
【００５９】
本発明を、以下の実施例により説明する。実施例で使用する略語は、以下の意味を有する：
ＢＬＡＳＴ：ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ｃＡＭＰ：環状アデノシン一リン酸
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ：エチレン−ジアミン四酢酸
ＥＩＡ：酵素イムノアッセイ
ＥＳＴ：発現配列タグ
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球マクロファージ刺激因子
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸
ＩＰＴＧ：イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド
ＬＭＰ：低融点
ＭＯＩ：感染多重度
ＰＢＳ：リン酸緩衝性生理食塩水
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオライド
ＲＰＭＩ：Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＥＶ：タバコエッチウイルス
【００６０】
実施例１
血液（２００ｍｌ）を、クエン酸ナトリウムを含む試験管に、滅菌条件下で呼吸器疾患の病歴のない正常ドナーから集める。好中球を確立された方法で精製する。ＰＢＭＣを、末梢血細胞から、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）遠心により分離する。主に顆粒球および赤血球である残りの細胞集団を、赤血球融解溶液（１５５ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ　ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ＰＨ　７．３）で処理する。純度を測定するために、顆粒球をＨａｎｓｅｌ染料（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ）で染色し、高倍率の光顕微鏡で区別する。好酸球の汚染は２％未満であることが分かる。刺激のために、好中球を５００万細胞／ｍｌの濃度で、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ中に再懸濁する。細胞を、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下または非存在下で５時間培養する。総ＲＮＡを、製造者の記載の通りＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して抽出する。１ｍｌのＴＲＩＺＯＬを、各５００万個のペレット化好中球の再懸濁のために使用する。ｍＲＮＡを、ＭＥＳＳＡＧＥＭＡＫＥＲ　ｍＲＮＡ単離キット（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して、製造者が推奨する条件で精製する。３００ｎｇのｍＲＮＡを使用して、第１鎖合成のためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｃｈｏｉｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）およびオリゴ（ｄＴ）を用いてｃＤＮＡを合成する。二本鎖ｃＤＮＡを、等体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで一回抽出し、そして０．５容量部の７．５Ｍ　酢酸アンモニウムおよび２．５容量部のエタノールで沈降させる。遠心分離の後、得られたペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして１６μｌの滅菌水中に再懸濁する。
【００６１】
好中球におけるＧＭ−ＣＳＦ刺激後に優先的に発現する遺伝子を単離するために、得られたｃＤＮＡサンプルをｃＤＮＡサブトラクションおよび選択的富化手法で使用する。
【００６２】
実施例２
本実施例は、ｃＤＮＡ−ＲＡＤによってサブトラクションされたライブラリーの生成およびＥＸ２０ ｃＤＮＡクローンの単離を記載する。
【００６３】
ｃＤＮＡ−ＲＡＤを、Ｈｕｂａｎｋ， Ｍ．， ａｎｄ Ｄ．Ｇ． Ｓｃｈａｔｚ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５６４０−５６４８； ａｎｄ Ｏ’Ｎｅｉｌｌ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ａ． Ｈ． Ｓｉｎｃｌａｉｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：２６８１−２６８２によって本質的に記載されているように実行する。未刺激および刺激された好中球から単離されたｍＲＮＡから調製された二本鎖ｃＤＮＡサンプルを、ＤｐｎＩＩ制限酵素で消化し、そして２４マー（配列番号７）を１２マー（配列番号８）オリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって得られるＲ−アダプターにライゲートする。両方の「テスター」（刺激された好中球のｃＤＮＡ）および「ドライバー」（未刺激の好中球のｃＤＮＡ）を、Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍおよびＥｘｐａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ １（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して生成する。５種の１００μｌ　ＰＣＲをそれぞれのテスターについて、および１０種をそれぞれのドライバーについて、実施する。ＤｐｎＩＩ消化を使用し、ドライバーおよびテスターアンプリコンの両方からＲ−アダプターを除去する。２４マー（配列番号９）を１２マー（配列番号１０）にアニーリングすることによって得られたＪ−アダプターを、次いで、テスター集団にライゲートさせる。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを、５μｌの反応物中で、６７℃で２０時間実施する。異なる産物１（ＤＰ１）を作成するため、２５０ｎｇのテスターｃＤＮＡを、２５μｇのドライバーｃＤＮＡと、１００：１の比率で混合する。ＤＰ１　ｃＤＮＡを、次いで、ＤｐｎＩＩで消化し、Ｊ−アダプターを除去し、その後、Ｎ−アダプターをライゲートし、これは２４マー（配列番号１１）を１２マー（配列番号１２）オリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって得られたものである。異なる産物２（ＤＰ２）を作成するため、３１．２５ｎｇのテスターを、２５μｇのドライバーｃＤＮＡと、８００：１の比率で混合する。消化され、そして過剰のアダプターを、該ｃＤＮＡをＭｉｃｒｏｃｏｎ３０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）上で洗浄することによって除去する。サブトラクションされたライブラリーをアガロースゲル電気泳動で分画化する。
【００６４】
１．５％ＬＭＰアガロースゲル中のフラクションを、Ａｇａｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ）で４２℃で一夜消化し、滅菌水で三回洗浄し、そしてＭｉｃｒｏｃｏｎ３０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮する。ライゲーションに先立ち、サブトラクションされたＰＣＲ　ｃＤＮＡ混合物を、追加的ｄＡＴＰおよびＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と、２０分間インキュベートし、ほとんどのｃＤＮＡフラグメントが「オーバーハング（Ａ ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）」を含むことを確保する。
【００６５】
約１０ｎｇのｃＤＮＡを、２５ｎｇのｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートし、そして該ライゲーションを、５０μｌ　Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入する。該ライブラリーを５０μｇ／ｍｌ　カルベシリン、および１００ｍＭ　ＩＰＴＧおよび５０μｇ／ｍｌ　Ｘ−Ｇａｌを含む寒天プレート上に置く。プレートを３７℃で一夜、次いで、一時的に４℃でインキュベートし、明瞭に識別可能な青／白色染色し、そしてプラスミドを該白色コロニーの３ｍｌ培養物から精製する。個々のクローンのインサートを、Ｍ１３リバースおよびフォワード・プライマーを使用して、自動ＡＢＩ３１０シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）上で、それらのヌクレオチド配列を決定することによって分析する。得られた配列を、ＢＬＡＳＴアルゴニズムを使用して配列類似性サーチで分析し、そして配列アラインメントを、ＧＣＧソフトエウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１）を使用して行う。
【００６６】
ＥＸ２０と称するクローンを、ヒト・オーファンＧＰＣＲ　ＨＭ７４（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ１０９２３； Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ＬＤ７８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５（１０）：１２３９−１２４９， １９９３）のデータベース・エントリーに有意な配列類似性を有するインサートを含むものとして同定する。次いで、ＥＸ２０遺伝子の完全長コード領域を、公的なデータベースにおいて既知の配列を用いてＰＣＲにより単離する。増幅産物を、自動ＡＢＩ３１０シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）上で、Ｍ１３リバースおよびフォワード・プライマーならびに遺伝子特異的プライマーを使用して、両方の鎖に対するそれらのヌクレオチド配列を決定することによって分析する。得られた配列を分析し、および配列コンティグを、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１）を使用して得る。得られたｃＤＮＡ配列コンティグ（配列番号１）は試験された領域においてＨＭ７４と９９％の配列同一性を示す。
【００６７】
このヌクレオチド配列が翻訳されると、配列番号２に示す３８７アミノ酸残基のタンパク質となる。ＥＸ２０遺伝子の他の配列変異対もまた単離される。配列番号１５に示されるこれらの変異体のうちの１つは、コード領域における数箇所の１塩基相違および配列番号１の１０８６〜１０９０位のヌクレオチドの５塩基長の欠失により特徴付けられる。このヌクレオチド配列が翻訳されると、配列番号１６に示される３６３アミノ酸のオープン・リーディング・フレームとなる。この場合のＥＸ２０タンパク質は、タンパク質配列における１８箇所の１アミノ酸置換およびトランケーションにより特徴付けられ、その結果、配列番号２に示されるタンパク質配列と比較して２４アミノ酸残基短い細胞内Ｃ末端を有するタンパク質となる。これらのアミノ酸配列の相違は、例えばリガンド結合、受容体の活性化またはＥＸ２０受容体と共役した下流へのシグナル伝達事象において機能的な意義を有し得る。
【００６８】
実施例３
この実施例は、インシチュ・ハイブリダイゼーションによるＥＸ２０遺伝子の発現および組織分布の分析を記載する。
【００６９】
標識リボプローブを生成するために、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位の間に１１６１ｂｐ挿入物を含むサブクローンを構築する。このサブクローンの挿入物は、下記実施例４の挿入物と同一であり、同じ方法で製造される。この構築物中に、ベクター中のＳＰ６プロモーターを使用して、インシテュ・ハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用できる挿入物のアンチセンス鎖を転写する。ベクター中のＴ７プロモーターは、ネガティブ・コントロールとして使用するセンス鎖を転写するのに使用する。パラフィン包埋サンプルからの連続組織切片を、１．２ｋｂ挿入物から合成した放射標識ｃＲＮＡプローブとハイブリダイズする。リボプローブを、３３Ｐ−ウリジン ５’−トリホスフェートと、ＳＰ６（アンチセンス）およびＴ７（センス）ＲＮＡポリメラーゼの存在下、インビトロで転写する。プローブを次いでカラム精製し、次いで５％ＴＢＥ−尿素アクリルアミドゲルでの電気泳動に付し、サイズおよび純度を確認する。組織切片をプロテイナーゼＫで消化し、次いで、プローブと約８．０ｘ１０８ｄｐｍ／ｍｌで、６５℃にて１８時間ハイブリダイズする。スライドをＲＮＡｓｅ　Ａで処理し、ストリンジェント条件下で２時間、０．１ｘＳＳＣ中で６５℃にて洗浄する。スライドを、次いでＫｏｄａｋ ＮＴＢ−２エマルジョンで被覆し、４℃で７日間曝し、Ｋｏｄａｋ Ｄ−１９現像液および定着液を使用して現像する。スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、Ｎｉｋｏｎマイクロスコープに接続したＳｏｎｙ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｈｏｔｏ Ｃａｍｅｒａを使用して写す。アンチセンス・プローブとのハイブリダイゼーションに加えて、別のセクションを二つのタイプのコントロール・プローブとハイブリダイズする。全ての組織を、最初に、ベータ−アクチンｍＲＮＡに対するプローブとスクリーニングし、ＲＮＡがサンプル内に保存されていることを確認する。隣接連続セクションは、また、アンチセンス・プローブとして、遺伝子の同じ領域由来のセンス・コントロール・リボプローブとハイブリダイズをする。
【００７０】
像を評価すると、白血球サブセットにおけるさまざまな炎症性疾患により影響される組織において、ＥＸ２０遺伝子が優勢的に過剰発現していることが分かる。ＣＯＰＤ、気腫、ＡＲＤＳおよび喘息における呼吸器の炎症におけるマクロファージおよび好中球に、リウマチ様関節炎における滑液組織単球に、クローン病における好中球および類上皮組織球に、強いシグナルが観測される。リンパ球のサブセットは、また、喘息およびＣＯＰＤにおける気道において、リウマチ様関節炎における滑膜において、そして湿疹様皮膚炎における炎症性湿潤物においても強いシグナルを示す。炎症組織における炎症性細胞のシグナル強度は、非炎症性または正常に見える組織におけるこれらと同一の細胞タイプのシグナル強度と比較して一貫して大きい。
【００７１】
実施例４
本実施例は、哺乳類発現系における、完全長機能的ＥＸ２０の、安定なトランスフェクションを使用した発現およびＥＸ２０タンパク質の天然リガンドまたは人工アゴニストの同定のためのトランスフェクト細胞の使用に関する。
【００７２】
発現ベクターの構築
独特なＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を、ＥＸ２０開始コドン（ＡＴＧ）の５’に、ＰＣＲ増幅により以下のプライマー（配列番号１３）：
５’−ＴＣＡＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＡ−３’
を使用して挿入する。他のプライマー（配列番号１４）を使用して、ＥＸ２０の停止コドン（ＴＡＡ、逆相補：ＴＴＡ）に対して３’の独特なＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位に挿入する。
５’−ＧＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣ−３’
組換え増幅産物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化させ、１１７６ｂｐフラグメントとしてＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）哺乳類発現ベクターにライゲートし、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換する。形質転換体を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に存在するアンピシリン耐性遺伝子を使用して選択し、ＥＸ２０挿入物を含む組換えベクターを、無作為に選択したコロニーからプラスミドを単離し、そしてプラスミドを制限消化およびアガロースゲル電気泳動により、標準法を使用して同定する。
【００７３】
哺乳類細胞中のＥＸ２０の安定な発現
プラスミド・ベクター含有組換えＥＸ２０挿入物を、次いで、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトする。１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミン含有ダルベッコ修飾イーグル培地／Ｈａｍ’ｓ ｆ１２（５０：５０）で増殖させたＣＨＯ細胞のコンフルエントな（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）フラスコをトリプシン処理し、１：２０希釈で、６ウェルプレートの２ウェルに２ｍｌ／ウェルの同じ培地中でプレーティングする。細胞を次いで３７℃にて５％ＣＯ２で２４時間培養する。翌日、トランスフェクション混合物を調製する。１μｇプラスミドＤＮＡを、各ウェルに関して１００μｌ　ＯｐｔｉＭＥＭ無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に混合する。各ウェルで１０μｌリポフェクタミンを１００μｌ　ＯｐｔｉＭＥＭ中に、別の試験管で希釈する。２つの溶液を混合し、１５分、室温でインキュベートする。インキュベーション中、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄して血清を除去する。次いで、０．８ｍｌ／トランスフェクションの無血清ＯｐｔｉＭＥＭを、ＤＮＡ−リポソーム・トランスフェクション混合物に添加し、１ｍｌのその溶液を次いで各ウェルに添加する。コントロール細胞を同様の方法で、但しプラスミドＤＮＡをトランスフェクション混合物から除いて処理する。細胞を次いで、３７℃にて５％ＣＯ２で５時間インキュベートし、次いでトランスフェクション混合物を２ｍｌ通常増殖培地と置きかえる。
【００７４】
２４時間後、トランスフェクタントを、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、そしてそれらをＴ７５フラスコに１ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に再プレーティングすることにより選択する。細胞を次いで３７℃にて５％ＣＯ２で、コントロールのフラスコの細胞が死ぬまで培地を２日毎に定期的に変えてインキュベートする。次いで、細胞を、９６ウェルプレートの個々のウェルにそれらを１細胞／ウェルの密度にプレーティングし、それらをコンフルエンスまで増殖させることにより希釈クローン化する。細胞の更なる拡張後、個々のコロニーを、ＲＴ−ＰＣＲによりおよびＥＸ２０タンパク質に対して発生させたポリ−またはモノクローナル抗体を使用してＥＸ２０の発現に関してスクリーニングする。
【００７５】
細胞内カルシウム・アッセイを使用した天然リガンドおよびアゴニストの同定
ＥＸ２０レセプター・タンパク質を安定に発現するトランスフェクト細胞系および非トランスフェクト・コントロールを、Ｔ１６２フラスコでコンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理し、適当な容量、約５０ｍｌの抗生物質を含まない増殖培地に再懸濁する。細胞を３０，０００細胞／ウェルで、１００μｌ／ウェルで９６−ウェルプレートに蒔き、これは翌日のアッセイ時にコンフルエント単層を形成させる。２４時間後、細胞を、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび２．５ｍＭプロベネシッド含有１００ｍｌ細胞培養培地中の細胞質性カルシウム・インディケーター Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ（４ｍＭ）と３７℃にて６０時間インキュベートする。細胞を、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび２．５ｍＭプロベネシッド含有ＰＢＳで４回洗浄し、１００ｍｌのその溶液を次いで各ウェルに添加する。天然リガンドおよび合成ライブラリー由来のコレクションからの試験化合物を、細胞に添加し、フルオレッセント・シグナルを最初の６０秒間は毎秒、次の３０秒間は５秒毎に読む。天然または合成アゴニストは、ＥＸ２０発現および非発現コントロール細胞における同じ化合物により生成されるシグナルのレベルの比較によって同定される。
【００７６】
実施例５
本実施例は、ＡＴＧ開始コドン後に６ヒスチジン・タグを有する完全長ＥＸ２０の、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞中のバキュロウイルス系を使用した発現、および得られたポリペプチドの精製に関する。
【００７７】
組換えＥＸ３３バキュロウイルスの構築
独特なＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を、ＥＸ２０開始コドン（ＡＴＧ）の５’に、ＰＣＲ増幅により、以下のプライマー（配列番号１３）：
５’−ＴＣＡＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＡ−３’
を使用して挿入する。他のプライマー（配列番号１４）を使用して、ＥＸ２０の停止コドン（ＴＡＡ、逆相補：ＴＴＡ）に独特なＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）の３’部位を挿入する。
５’−ＧＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣ−３’
【００７８】
組換え増幅産物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化させ、１１７６ｂｐフラグメントとしてＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化ｐＦａｓｔｂａｃ（登録商標）ＨＴａバキュロウイルス・トランスファー・ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にライゲートする。この構築物において、ＥＸ２０遺伝子は、ＥＸ２０コード領域が６ｘＨｉｓ親和性タグ、続いてスペーサー領域、ＴＥＶプロテアーゼの認識部位および更なる７アミノ酸リンカー領域の後に置かれるため、融合タンパク質として発現される。６ｘＨｉｓタグを含むＥＸ２０融合タンパク質の発現は、親和性精製を助け、ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位は、６ｘＨｉｓタグの除去に使用する。組換えＥＸ２０の配列を、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃバキュロウイルス発現系）により担持されるＢａｃｍｉｄ ＤＮＡに転位させる。ＥＸ２０組換えＢａｃｍｉｄｓを、ＤＨ１０Ｂａｃ細胞から単離し、転位をＰＣＲ分析により確認する。
【００７９】
Ｓｆ９細胞の組換えＥＸ２０　Ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡでのトランスフェクションおよび組換えバキュロウイルス・ストックの増幅
組換えＥＸ２０　Ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを、Ｓｆ９細胞に公開されたプロトコールを使用してトランスフェクトする（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃバキュロウイルス発現系マニュアル；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。組換えバキュロウイルスを培養培地から２７℃で３日後に回収する。細胞上清を、５００ｘｇの遠心により５分間浄化し、４℃で保つ。組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞（ＳＦ９００ ＳＦＭＩＩ培地；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が１ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度でありそして感染多重度（ＭＯＩ）が４８時間で０．０１となるように感染させることにより増幅させる。Ｓｆ９細胞を次いで１０００ｘｇで５分間、遠心する。高力価ウイルスを含む上清を４℃で貯蔵する。
【００８０】
組換えＥＸ２０のＳｆ９細胞中での発現
２ｘ１０５および３ｘ１０６細胞／ｍｌの間の密度で、ＳＦ９００　ＳＦＭＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、シェーカー・フラスコ（９０ＲＰＭで回転）またはスピナー・フラスコ（７５ＲＰＭで回転）のいずれかで維持しているＳｆ９細胞を、増幅組換えバキュロウイルスで、１．５ｘ１０６の細胞密度でＭＯＩが２．０で６０時間感染させた。続いて、感染Ｓｆ９細胞を１０００ｘｇで５分遠心し、上清を注ぎ出し、細胞ペレットを−８０℃で凍結させる。
【００８１】
粗融解物の調製
細胞（１ｘ１０９）を、１００ｍｌの融解緩衝液（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ　７．９、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ　Ｅ−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ　イミダゾール、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、４０ｐｇ／ｍｌ　ＡＥＢＳＦ、０．５ｐｇ／ｍｌ　ロイペプチン、１ｐｇ／ｍｌ　アプロチニンおよび０．７ｐｇ／ｍｌ　ペプスタチンＡ）に再懸濁する。細胞を、氷上で１５分インキュベートし、次いで３９，０００ｘｇで３０分、４℃で遠心する。
【００８２】
金属キレート親和性クロマトグラフィー
金属キレート親和性クロマトグラフィーを、室温にてＢｉｏＣＡＤクロマトグラフィー・ワークステーションに接続したカラムで行なう。２０ｍｌ　Ｐｏｒｏｓ　ＭＣ／Ｍ（１６ｍｍＤ×１００ｍｍＬ）カラムをＮｉ２＋で、使用前および各注入後に満たす。Ｎｉ２＋で満たすために、カラムを１０カラム容量（ＣＶ）の５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　８、１Ｍ　ＮａＣｌ、続いて１０ＣＶの水で洗浄する。カラムを、５００ｍｌの０．１Ｍ　ＮｉＳＯ４　ｐＨ　４．５−５で満たし、１０ＣＶの水で洗浄し、次いで任意の非結合Ｎｉ２＋を、５ＣＶの０．３Ｍ　ＮａＣｌでの洗浄により除去する。全ての段階を２０ｍｌ／分の流速で行なう。満たしたＭＣ／Ｍカラムを、５ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ　７．９、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ　Ｅ−メルカプトエタノール、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１００ｍＭ　イミダゾール）で平衡化し、部位を飽和させ、続いて１０ＣＶの緩衝液Ａ（０．５ｍＭ　イミダゾール以外、緩衝液Ｂと同じ）で満たす。ラン当たり９０〜９５ｍｌの粗融解物を、２０ｍｌ／分の流速で、カラムに充填する。続く段階を、３０ｍｌ／分の流速で行なう。任意の非結合物質を１２ＣＶの緩衝液Ａでの洗浄により除去し、ＥＸ２０は０〜５０％緩衝液Ｂの１０ＣＶにわたる勾配で溶出する。フラクション（８ｍｌ）を勾配にわたり回収する。ＥＸ２０含有フラクションを合わせ、プロテアーゼ阻害剤を、上記融解緩衝液に関して記載の最終濃度まで添加する。ＤＴＴも最終濃度１ｍＭまで添加する。合わせたフラクションを、一晩、４リットルの２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ　７．９、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．２ｍＭ　ＰＭＳＦに対して４℃で透析する。タンパク質濃度を測定し、必要な場合には、サンプルをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心デバイス（ＭＷカットオフ５０ｋＤａ）で４℃にて濃縮する。デバイスを、使用前に水で濯ぐ。−８０℃での長期貯蔵に使用する緩衝液は、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ　７．９、１ｍＭ　ＤＴＴ、約１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％グリセロールである。グリセロールは、４℃での貯蔵では、サンプルから除くことができる。
【００８３】
実施例６
本実施例は、ＥＸ２０タンパク質に対するポリクローナル抗体の生成に関する
【００８４】
免疫化
ウサギの皮下部位４箇所を、５００μｇ精製ＥＸ２０タンパク質で以下のスケジュールにしたがって免疫化する：
【表１】
2004505648.tif 000002
【００８５】
試験採血（５００μｌ）を取り、血清を抗体力価に関して評価する。血清を、最大力価が得られたときに回収する。これは、血液（１０ｍｌ）を取り、それを、４℃で２時間凝血させることにより行なう。血液を１０００ｘｇで５分遠心し、血清を分離する。血清を除去し、アッセイまで−２０℃で貯蔵する。
【００８６】
ＥＬＩＳＡスクリーニング
Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ　９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｂａｓｌｅ， ＣＨ）を固体支持体として使用し、精製ＥＸ２０タンパク質（１００ｎｇ／ウェル）で４℃にて一夜コートする。プレートを３時間、３７℃にて２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）および０．０２％ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ）含有ＰＢＳで遮断する。遮断後、プレートを一晩室温で、異なる希釈のＰＢＳ中の血漿と共にインキュベートする。ポリクローナル抗体の存在を、ウサギに対するビオチン標識ＩｇＧ−抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清、１：２５０００希釈）で、４０分のインキュベーション時間でチェックする。アルカリホスファターゼ接合ストレプトアビジン（Ｉｍｍｕｎｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｄｉａｎｏｖａ， ＣＨ）を、次いで１：１００００の希釈で添加する。反応の展開を、ジエタノールアミンに溶解したホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ、ｆ．ｃ．　１ｍｇ／ｍｌの添加により行なう。４５分後、４０５ｎｍの吸光度を４９０ｎｍを参照して、ＥＬＩＳＡプレート・リーダー（Ｂｉｏｒａｄ）で読む。
【００８７】
ポリクローナル抗体の精製
５ｍｌタンパク質Ａ−アガロースを、クロマトグラフィーカラムに注ぎ、６カラム容量の０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（Ｔｒｉｓ）緩衝液ｐＨ　７．５で洗浄する。抗−ＥＸ２０抗体を含むウサギ血清を、Ｔｒｉｓ緩衝液で希釈（１／２）し、タンパク質Ａ−アガロースに添加する。非結合タンパク質を、６容量のＴｒｉｓ緩衝液でカラムを洗浄することにより除去する。ＩｇＧは、３カラム容量の０．１Ｍグリシン緩衝液　ｐＨ　３．０でカラムから溶出し、１ｍｌフラクションとして２８μｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓを含む試験管に回収する。タンパク質含有に関して陽性のフラクションを、純度に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件下でチェックする。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖に対応する５０および２５Ｋｄの二つのバンドを可視化する。免疫グロブリンのみを含むフラクションをプールし、タンパク質濃度に関して再チェックし、−２０℃で貯蔵する。
【００８８】
実施例７
この実施例は、ＥＸ２０タンパク質に対するモノクローナル抗体の生成に関する
【００８９】
免疫化
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、腹腔内（ｉｐ）で１００μｇのＥＸ２０タンパク質で下記のスケジュールにしたがって免疫化する：
【表２】
2004505648.tif 000003
【００９０】
該動物を融合のための脾臓細胞の調製のために屠殺した後に、血清を抗体力価に関してＥＬＩＳＡ（実施例６）により評価する。抗体力価が十分（１／１０００から１／１００，０００）である場合にはハイブリドーマをスクリーニングし、そうでなければ棄てる。
【００９１】
ミエローマ細胞の調製
Ｓｐ２／０マウス・ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ　＃ＣＲＬ　１５８１；２０μｇ／ｍｌ　８−アザグアニン含有培養培地に維持）を、融合前に１週間、ＲＰＭＩ１６４０（８−アザグアニジンを含まない）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン（各々５０ＩＵ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）中で培養する。細胞を遠心（２００ｘｇ、５分）で回収し、冷ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄する。９６ウェル・マイクロタイタープレート当たり、約２．５ｘ１０６細胞を使用する。
【００９２】
脾臓細胞懸濁液の調製
マウスを麻酔（Ｆｏｒｅｎｅ）の過量投与により屠殺し、脾臓を解剖し、細胞ストレイナー（７０μｍメッシュ細胞ストレイナー；Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ， Ｃａｔ． Ｎｏ ２３５０）を通して圧縮する。細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄し（上記の通り）、計数する：５．１０６細胞／９６ウェルプレートが必要である。
【００９３】
ミエローマ細胞および脾臓細胞の融合
脾臓およびミエローマ細胞を混合し（２：１）、遠心し（２００ｘｇ、５分）、ペレットを３７℃水浴で温める。予め温めたポリエチレングリコール４０００（１ｍｌ／１０８細胞）を、１分間かけてゆっくり添加し、次いで２０ｍｌの予め温めた培地を２分間かけて添加する。遠心後、ペレットを注意深く選択培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１０％ＢＭ ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｌｅｗｅｓ， ＵＫ； Ｃａｔ． Ｎｏ． １ ０８８ ９４７からの支持細胞置換）、１０％ＨＡＴ−培地添加物（非融合ミエローマ細胞に対して選択するためのヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン細胞；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｌｅｗｅｓ， ＵＫ； Ｃａｔ． Ｎｏ． ６４４ ５７９）に再懸濁し、２００μｌ／ウェルの９６ウェル・マイクロタイタープレートにプレーティングする。
【００９４】
５日間の後、ハイブリッド細胞のクラスターは、マイクロタイター・ウェルの底を倒立顕微鏡で試験することにより同定できる。１０〜１４日後、培養上清を抗体の存在に関してＥＬＩＳＡ（実施例５）により試験する。陽性クローンを２４ウェル・アッセイプレートに拡張し、再試験する。
【００９５】
陽性ハイブリドーマのクローニング
まだ陽性である拡張クローンを、限定希釈によりクローン化する。細胞を、連続的に４希釈段階で９６ウェル・マイクロタイタープレートで希釈する；５、２、１および０．５細胞／ウェル。ＨＡＴ−培地添加物を、ＨＴ−培地添加物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｌｅｗｅｓ， ＵＫ； Ｃａｔ． Ｎｏ． ６２３ ０９１）で置きかえる。約１週間後、細胞をＥＬＩＳＡ（実施例５）でスクリーニングする。一陽性クローンを含むこれらのウェルの細胞を拡張する。
【００９６】
モノクローナル抗体上清の製造
ハイブリドーマが過増殖しそして死ぬまで、細胞を培養フラスコで標準培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン）中にて増殖させる。残骸を遠心により除去し、抗体を含む上清をＥＬＩＳＡ（実施例７）を使用した力価で力価測定し、その後滅菌条件下で４℃、−２０℃または−７０℃で貯蔵する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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