(57)【要約】本発明は、真核細胞における部位特異的ポリヌクレオチド置換のための組成物および方法を含む。これらの方法は、単一ポリヌクレオチド置換、ならびに遺伝子スタッキング方法を含む。本発明で使用するための好ましい真核細胞は、植物細胞および哺乳動物細胞である。
2004504055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において部位特異的遺伝子置換を得る方法であって、：
ａ）２つまたはそれ以上の不可逆的組換え部位（ＩＲＳ）が隣接したレセプターポリヌクレオチドを含むレセプター構築物を含む真核細胞を準備し、
ｂ）２つまたはそれ以上の不可逆的相補組換え部位（ＣＩＲＳ）が隣接したドナーポリヌクレオチドを含むドナー構築物を、該細胞に導入し、そして
ｃ）該レセプター構築物および該ドナー構築物を、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させ、
ｄ）ここで該不可逆的リコンビナーゼが、第１および第２の型の組換え部位との間の組換え、ならびに該ドナーポリヌクレオチドによる該受容体ポリヌクレオチドの置換を触媒し、それにより置換構築物を形成すること
を含む方法。
【請求項２】
前記ドナー構築物が、直鎖状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ドナー構築物が、環状ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ドナー構築物が、染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記レセプター構築物が、染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レセプター構築物が、２つのＩＲＳを含み、前記ドナー構築物が、２つのＣＩＲＳを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＲＳが、互いに対して逆位であり、ＣＩＲＳが、互いに対して逆位である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ドナーポリヌクレオチドが、所定の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記レセプター構築物が、前記ＩＲＳの一方に隣接しているプロモーターをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターが、前記ＩＲＳから５’末端方向に位置する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レセプター構築物が、選択マーカーに作動可能に連結される第２のプロモーターをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記レセプターポリヌクレオチドまたは前記ドナーポリヌクレオチドが、ネガティブ選択マーカーをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記レセプターポリヌクレオチドまたは前記ドナーポリヌクレオチドが、前記不可逆的リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記レセプターポリヌクレオチドが、前記不可逆的リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記不可逆的リコンビナーゼポリペプチドが、φＣ３１インテグラーゼ、大腸菌ファージＰ４リコンビナーゼ、大腸菌ファージラムダリコンビナーゼ、リステリアＵ１５３もしくはＡ１１８ファージリコンビナーゼ、またはアクチノファージＲ４　Ｓｒｅリコンビナーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記不可逆的リコンビナーゼが、バクテリオファージφＣ３１インテグラーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記置換構築物を可逆的リコンビナーゼと接触させることにより、前記置換構築物中の望ましくないヌクレオチド配列を欠失させることをさらに含む方法であって、前記置換構築物が、該可逆的リコンビナーゼと適合する１つまたはそれ以上の対の直接的に配向された可逆的組換え部位（ＲＲＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記可逆的リコンビナーゼが、ファージＰ１由来のＣｒｅ、酵母のＦＬＰ、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ、ｐＳＲ１プラスミドのＲリコンビナーゼ、およびバシラスファージ由来のβリコンビナーゼからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記レセプター構築物が、２つのＩＲＳを含み、前記ドナー構築物が、２つのＣＩＲＳを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ドナーポリヌクレオチドが、２つの前記ＲＲＳを含み、その２つが、互いに対して逆に配向している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＲＳが、プロモーターおよび所定の遺伝子に隣接している、請求項２０に記載に方法。
【請求項２２】
前記レセプター構築物が、２つの前記ＲＲＳをさらに含み、その２つが、互いに対して逆に配向している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＲＳが、前記２つのＩＲＳが隣接する様にプロモーターおよび前記レセプターポリヌクレオチドと隣接する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レセプター構築物が、３つのＩＲＳを含み、前記ドナー構築物が、３つのＣＩＲＳを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記３つのＩＲＳが、同一である２つのＩＲＳおよび同一でない１つのＩＲＳで構成され、前記３つのＣＩＲＳが、同一である２つのＣＩＲＳおよび同一でない１つのＣＩＲＳで構成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ドナーポリヌクレオチドが、所定の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記レセプター構築物が、前記ＩＲＳの１つに隣接しているプロモーターをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロモーターが、前記ＩＲＳから５’方向に位置する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記レセプター構築物が、選択マーカーに作動可能に連結される第２のプロモーターをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記レセプターポリヌクレオチドまたは前記ドナーポリヌクレオチドが、ネガティブ選択マーカーをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記レセプターポリヌクレオチドまたは前記ドナーポリヌクレオチドが、前記不可逆的リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記レセプターポリヌクレオチドが、前記不可逆的リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記不可逆的リコンビナーゼポリヌクレオチドが、φＣ３１インテグラーゼ、大腸菌ファージＰ４リコンビナーゼ、大腸菌ファージラムダリコンビナーゼ、リステリアＵ１５３もしくはＡ１１８ファージリコンビナーゼ、またはアクチノファージＲ４　Ｓｒｅリコンビナーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記不可逆的リコンビナーゼが、バクテリオファージφＣ３１インテグラーゼである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞または植物細胞から選択される、請求項１または１７に記載の方法。
【請求項３６】
前記真核細胞が、植物細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法により生産される植物細胞。
【請求項３８】
請求項３７に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項３９】
前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
トランスジェニック植物を生産する方法であって、：
ａ）２つの不可逆的組換え部位（ＩＲＳ）が隣接した染色体レセプターポリヌクレオチドを含むレセプター植物を準備し、
ｂ）２つの相補不可逆的組換え部位（ＣＩＲＳ）が隣接した染色体ドナーポリヌクレオチドを含むドナー植物を準備し、
ｃ）該ＩＲＳと該ＣＩＲＳ間の組換え、および該ドナーポリヌクレオチドによる該レセプターポリヌクレオチドの置換を触媒し、それにより該トランスジェニック植物において染色体置換構築物を形成する不可逆的リコンビナーゼポリペプチドを発現するトランスジェニック植物を生産するために、該ドナー植物を該レセプター植物と交雑させる工程
を含む方法。
【請求項４１】
前記レセプター植物が、シングルコピーレセプター系統である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記レセプター植物および前記ドナー植物が、同一種である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記レセプターポリヌクレオチドが、前記不可逆的リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記不可逆的リコンビナーゼポリヌクレオチドを発現しない前記トランスジェニック植物の子孫を選択することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記染色体置換構築物が、前記ドナーポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記プロモーターが、前記レセプター植物に由来するものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記レセプターポリヌクレオチドまたは前記ドナーポリヌクレオチドが、ネガティブ選択マーカーをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＩＲＳが、互いに対して逆位であり、前記ＣＩＲＳが、互いに対して逆位である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記不可逆的リコンビナーゼポリヌクレオチドが、φＣ３１インテグラーゼ、大腸菌ファージＰ４リコンビナーゼ、大腸菌ファージラムダリコンビナーゼ、リステリアＵ１５３もしくはＡ１１８ファージリコンビナーゼ、またはアクチノファージＲ４　Ｓｒｅリコンビナーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記不可逆的リコンビナーゼが、バクテリオファージφＣ３１インテグラーゼである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記トランスジェニック植物を、可逆的リコンビナーゼをコードする核酸を含む植物と交雑させることをさらに含む方法であって、前記染色体置換構築物が、該可逆的リコンビナーゼと適合する１つまたはそれ以上の対の直接的に配向された可逆的組換え部位（ＲＲＳ）をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項４０ないし５１のいずれか１項に記載の方法により生産されるトランスジェニック植物。
【請求項５３】
細胞における遺伝子スタッキングの方法であって、：
ａ）少なくとも１つの不可逆的組換え部位（ＩＲＳ）を含む標的ポリヌクレオチド、互いに対して逆に配向している２つの可逆的組換え部位（ＲＲＳ）を含む標的構築物を染色体中に含む細胞を準備し、
ｂ）第１のドナーポリヌクレオチド、２つの相補不可逆的組換え部位（ＣＩＲＳ）、および互いに対して逆に配向している２つのＲＲＳを含む第１のドナー構築物を該細胞に導入し、
ｃ）該標的構築物および該第１のドナー構築物を、該ＩＲＳおよび該ＣＩＲＳのそれぞれと適合し、ここで該不可逆的組換え部位が該第１のドナーポリヌクレオチドを該標的構築物へ組み込み、それにより第１の染色体組込み構築物を形成する、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させ、
ｄ）遺伝子座を、該ＲＲＳのそれぞれと適合する可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させて、それにより第１の染色体形質構築物を形成することにより、該第１の染色体組込み構築物中の望ましくないヌクレオチド配列を欠失させ、
ｅ）２つのＩＲＳ、第２のドナーポリヌクレオチドおよび１つのＲＲＳを含む第２のドナー構築物を、該細胞に導入し、
ｆ）該第１の染色体形質構築物および該第２のドナー構築物を、該第２のドナーポリヌクレオチドを該第１の染色体形質構築物に組み込み、それにより第２の染色体組込み構築物を形成する該不可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させ、
ｇ）第２の染色体組込み構築物を含む細胞（ここで、該第１のドナーポリヌクレオチドが、該第２のドナーポリヌクレオチドに隣接している）に関して選択し、
ｈ）選択した該第２の染色体組込み構築物を、該ＲＲＳのそれぞれと適合している可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させて、それにより第２の染色体形質構築物を形成することにより、選択した該第２の染色体組込み構築物中の望ましくないヌクレオチド配列を欠失させ、
ｉ）２つのＣＩＲＳ、第３のドナーポリヌクレオチドおよび１つのＲＲＳを含む第３のドナー構築物を、該細胞に導入し、
ｊ）該第２の染色体形質構築物および該第３のドナー構築物を、該第３のドナーポリヌクレオチドを該第２の染色体形質構築物を組み込み、それにより第３の染色体組込み構築物を形成する該不可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させ、
ｋ）該第３の染色体組込み構築物を含む細胞（ここで、該第２のドナーポリヌクレオチドが、該第３のドナーポリヌクレオチドに隣接している）に関して選択し、
ｌ）選択した該第３の染色体組込み構築物を、該ＲＲＳのそれぞれと適合する可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させて、それにより第３の染色体形質構築物を形成することにより、選択した該第３の染色体組込み構築物中の望ましくないヌクレオチド配列を欠失させること
を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ドナー構築物のいずれか１つが、環状ベクターである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記レセプター構築物が、染色体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ドナーポリヌクレオチドのいずれか１つが、プロモーターに作動可能に連結される所定の遺伝子を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記ドナーポリヌクレオチドが、選択マーカーをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記レセプター構築物が、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記レセプターポリヌクレオチドが、前記不可逆的リコンビナーゼポリペプチドをコードする前記核酸を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記不可逆的リコンビナーゼポリペプチドが、φＣ３１インテグラーゼ、大腸菌ファージＰ４リコンビナーゼ、大腸菌ファージラムダリコンビナーゼ、リステリアＵ１５３もしくはＡ１１８ファージリコンビナーゼ、またはアクリノファージＲ４Ｓｒｅリコンビナーゼである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記不可逆的リコンビナーゼが、バクテリオファージφＣ３１インテグラーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記レセプター構築物が、選択マーカーに作動可能に連結されるプロモーターをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記選択マーカーが、ネガティブ選択マーカーである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記真核細胞が、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
前記真核細胞が、植物細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０００年７月２１日に出願した米国仮出願第６０／２２０，０６２号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、真核細胞への核酸の特異的かつ安定な組込みを得るための方法の分野に関連する。より具体的には、本発明は、標的構築物における核酸の部位特異的置換を得るための方法に関する。本発明は、φＣ３１インテグラーゼのような真核生物リコンビナーゼポリペプチドを使用する部位特異的組換え系を利用する。
【０００３】
［背景］
１９８０年代の初めの先駆的な形質転換の躍進以来、多くの研究への取り組みは、当然のことながら技術の横の広がりに向けられてきた。この重要視の結果、様々な植物種を形質転換することが今や可能である。しかしながら、相反して形質転換プロセス自体の効率を向上させるのに専念するような注目は少なくなった。多くの微生物系に比較して、植物の形質転換はやや時代おくれのように感じる。何百万もの独立した形質転換体が多くの微生物系を用いて日常的に得られるのに対し、植物では、その数は１〜２桁の範囲であるのが一般的である。したがって、遺伝子発見に対するショットガン形質転換アプローチは、本気では受け入れられなかったオプションである。
【０００４】
高度に一貫性のある表現型により比較的数少ない代表的クローンの解析を必要とする微生物遺伝子転換と異なり、植物遺伝子転換は、非常に変わりやすいレベルとパターンの発現を示す別個の形質転換体を伴う。したがって、典型的なＤＮＡ構築物に関して、２０〜３０個の別個の一次形質転換体が必要である。新たな特徴を有する商業的開発のために、何百もの別個の形質転換体を、適切な導入遺伝子構造および発現を有する少数のものに関してスクリーニングする。
【０００５】
植物中の導入遺伝子発現における高い可変性の根本的な理由は、完全には理解されていないが、少なくとも４つの要素がこの現象に関与している。（１）組織培養：体細胞クローンの変化が、組織培養再生植物に関連してきた。染色体構造および倍数性、ＤＮＡ配列、ＤＮＡ修飾、およびトランスポゾン活性の変化はすべて、体細胞クローン変異体で報告されている（Ｐｅｓｈｋｅ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， １９９２ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３０：４１−７５； Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４３：１７９−８８）。（２）組込み部位：テロメアまたはヘテロクロマチンのような染色体構造は、隣接した遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ａｎｄ Ｚａｋｉａｎ， １９９４ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．， ８：１４１１−２２； Ｈｏｗｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １４０：１０３３−４５； Ｗａｌｌｒａｔｈ ａｎｄ Ｅｌｇｉｎ， １９９５ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ９：１２６３−７７）。導入遺伝子はランダムな位置で組込まれるため、導入遺伝子発現に対する染色体の影響は、別個の形質転換体間で異なると予測することができる（Ｍｅｙｅｒ， ２０００ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４３：２２１−３４）。（３）導入遺伝子重複性：形質転換植物は、多くの場合、可変数の導入遺伝子を含む。遺伝子発現およびコピー数との間に正の相関関係が存在するのは稀である。対照的に、多くの場合、余分の完全または部分的導入遺伝子コピーが、転写後および転写遺伝子サイレンシングに関連してきた（Ｍｕｓｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４３：２４３−６０； Ｍａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４３：４０１−１５）。（４）遺伝子突然変異：任意の遺伝子操作に関して予測されるように、点突然変異、欠失または再配列を獲得する可能性が常に存在する（Ｂａｔｔａｃｈａｒｙｙａ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ６：９５７−６８）。
【０００６】
植物遺伝子転換における現法は、多くの場合、挿入遺伝子座において複雑な組込み構造をもたらす。典型的に、導入分子の複数の完全および／または部分的コピーが、直接および／または間接反復として配列される。また、構築物を含む所望の生物または植物の挿入後には不必要な選択マーカーおよび他の調節領域が挿入される。これらの複雑なパターンは、研究に関してかならずしも妨害になるとは限らないが、商業用途には望ましくない。構造的証拠書類は、規制による許可に前もって必要なものであり、簡素な組込みパターンは容易に特徴付けられる。反復ＤＮＡもまた、構造的および機能的に不安定な傾向にある。反復配列は、染色体内および染色体間組換えに関与し得る。複雑な組込み遺伝子座が適切な表現型をもたらした場合でさえ、繁殖および播種生産プログラムに関与する数多くの交雑により、その規定発現パターンとともに、その本来の構造を維持するのは困難であり得る。複数遺伝子コピーは、特に幾つかが間接反復として配列する場合に、相同性依存的遺伝子サイレンシングに関連することが多い（Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４３：１７９−８８； 上述のＭｕｓｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【０００７】
部位特異的組換え系に基づく方法は、ゲノムから過剰の関連コピーを除去することで、ランダムに組込まれたシングルコピー導入遺伝子を得るために（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ａｎｄ Ｏｗ， １９９９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６：１１１１７−１１１２１； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ａｎｄ Ｏｗ， ２００１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４６：５６１−５６６）、またゲノム中の既知の染色体位置でＤＮＡを挿入するために（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：１３５１−５５； Ｂａｕｂｏｎｉｓ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， １９９３ Ｎｕｃｌ．， Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１：２０２５−２９； Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ７：６４９−５９）、記載されてきた。これらの方法は、自由に可逆的である部位特異的組換え系を利用する。これらの可逆的系としては、以下の：バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘ系（上述のＢａｕｂｏｎｉｓ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， １９９３； Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ７：６４９−５９）、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰ−ＦＲＴ系（上述のＯ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１）、酵母Ｚｙｇｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉのＲ−ＲＳ系（Ｏｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４７： ６５３−６６０）、バクテリオファージＭｕ由来の修飾Ｇｉｎ−ｇｉｘ系（Ｍａｅｓｅｒ ａｎｄ Ｋａｈｍａｎｎ， １９９１ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２３０：１７０−７６）、枯草菌プラスミド由来のβ−リコンビナーゼｓｉｘ系（Ｄｉａｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ６６３４−６６４０）、および細菌トランスポゾンＴｎ１０００由来のγδ−ｒｅｓ系（Ｓｃｈｗｉｋａｒｄｉ ａｎｄ Ｄｏｒｇｅ， ２０００ ＦＥＢＳ ｌｅｔ． ４７１： １４７−１５０）が挙げられる。Ｃｒｅ、ＦＬＰ、Ｒ、Ｇｉｎ、β−リコンビナーゼ、およびγδは、リコンビナーゼであり、ｌｏｘ、ＦＲＴ、ＲＳ、ｇｉｘ、ｓｉｘ、およびｒｅｓは、それぞれ組換え部位である（Ｓａｄｏｗｓｋｉ， １９９３ ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ７：７５０−６７； Ｏｗ ａｎｄ Ｍｅｄｂｅｒｒｙ， １９９５ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １４：２３９−２６１による書評）。
【０００８】
上記組換え系は、単一ポリペプチドリコンビナーゼが同一またはほとんど同一の配列の２つの部位間の組換えを触媒するという特性の共通点がある。各組換え部位は、リコンビナーゼが結合する逆位反復が隣接した、鎖交換が起きる短い非対称のスペーサー配列から構成される。スペーサー配列の非対称性は、組換え部位に配向性を付与し、組換え反応の結果を作用する。シスの直接または間接的に配向された部位間の組換えは、それぞれ介在ＤＮＡを除去するか、または反転させる。トランスの部位間の組換えは、２つの直鎖状ＤＮＡ分子の相互転座、または２つの分子の少なくとも１つが環状である場合には同時組込みを引き起こす。組換えにより生成する産物部位自体が続く組換え用基質であるため、反応は自由に可逆的である。しかしながら、実際には、２つの組換え部位が密接に関連した分子内相互作用の蓋然性が、未関連の部位間の分子間相互作用よりもかなり大きいことから、除去は本質的には不可逆的である。結論としてゲノム組換え部位に挿入されるＤＮＡ分子は容易に除去されるであろうという。
【０００９】
自由に可逆的な組換え系に対して、不可逆反応を触媒することができる組換え系が存在する。バクテリオファージ　λ由来のかかる系の１つでは、λインテグラーゼは、それぞれａｔｔＢおよびａｔｔＰとして既知の非類似性配列を、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ由来のものに組換える。この反応には、標的部位のＤＮＡ超らせんと付帯タンパク質ＩＨＦおよびＦＩＳとが必要である。ａｔｔＬ×ａｔｔＲからａｔｔＢおよびａｔｔＰを形成する逆反応には、ＸＩＳとして知られるさらなる除去特異的タンパク質が必要である。突然変異インテグラーゼタンパク質は、これらの要件なしで分子間反応ではなく分子内反応を行うことができる。これらの突然変異λインテグラーゼを用いて、Ｌｏｒｂａｃｈ等（２０００ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２９６： １１７５−８１）は、ヒトゲノムに導入された組換え標的中のＤＮＡ反転を実証した。
【００１０】
従来技術で記載される、より有用な不可逆的組換え系は、ストレプトミセスファージφＣ３１組変え系である。６８ｋＤａのインテグラーゼタンパク質は、ａｔｔＢ部位をａｔｔＰ部位で組換える。これらの部位は、クロスオーバー点でたった３つの塩基対の相同性を共有する。この相同性は、インテグラーゼタンパク質の結合部位と推定される逆位反復に隣接する。φＣ３１ａｔｔＢおよびａｔｔＰの両方に関する最小の既知機能的サイズは、およそ３０〜４０塩基対である。同種の結合部位を組換える際のφＣ３１インテグラーゼ酵素の効力は、ｒｅｃＡ突然変異大腸菌において、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで実証された（Ｔｈｏｒｐｅ ＆ Ｓｍｉｔｈ， １９９８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５： ５５０５−１０）。ファージλ系とは異なり、φＣ３１組込み反応は、それが宿主細胞を必要としないという点で簡素である。ファージλ突然変異インテグラーゼ系とは異なり、分子間反応ならびに分子内反応が可能である。
【００１１】
可逆的組換え系を使用する従来技術では、ＤＮＡがゲノムから除去または元の状態へと交換されないような複雑なストラテジーが必要である。１）ＤＮＡ分子がシングルコピーとして導入され、２）挿入ＤＮＡが容易に元の状態へと除去されず、３）遺伝子組込みプロセスと関連するが、その後もはや必要とされない過剰のＤＮＡを除去することができ、および／または４）さらなるＤＮＡを、すでに挿入されたＤＮＡに隣接する既存部位に追加することができるような、導入遺伝子の安定な部位特異的組込みを達成するための組成物および方法が、当該技術分野で必要とされている。
【００１２】
［発明の概要］
本発明は、限定数の組込みおよび／または除去工程を伴う、導入遺伝子の安定な部位特異的組込みを得るための組成物および方法の必要性を満たす。これらの組込みおよび／または除去工程は、１）ＤＮＡ分子がシングルコピーとして導入されること、２）挿入ＤＮＡが容易に元の状態へと除去されないこと、３）遺伝子組込みプロセスに関連するが、その後もはや必要とされない過剰ＤＮＡを除去することができること、および／またはさらなるＤＮＡを、すでに挿入されたＤＮＡに隣接する既存部位に追加することができることを導き出す。
【００１３】
特に、本発明は、ファージφＣ３１由来のもののような不可逆的組換え部位および不可逆的リコンビナーゼの使用を含む、真核細胞における遺伝子置換の方法を提供する。本発明は、導入されるＤＮＡのシングルコピーの安定な組込みを提供するだけでなく、１または２工程でドナー構築物によりレセプター構築物を置換させる様式での不可逆的リコンビナーゼの使用について初めて記載する。したがって、本明細書中に記載する置換方法は、従来技術の組込みおよび除去方法よりも優れている。
【００１４】
本発明は、具体的には、１）２つの不可逆的組換え部位（これ以降、「ＩＲＳ」と称する）が隣接したレセプターポリヌクレオチドを含むレセプター構築物を含む真核細胞を準備し、２）２つの不可逆的相補組換え部位（これ以降、「ＣＩＲＳ」と称する）が隣接したドナーポリヌクレオチドを含むドナー構築物を、上記細胞に導入し、そして３）上記レセプター構築物および上記ドナー構築物を、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させる工程とを含む、真核細胞において部位特異的遺伝子置換を獲得する方法を提供する。好ましくは、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドは、φＣ３１リコンビナーゼであり、リコンビナーゼは、第１（ＩＲＳ）および第２（ＣＩＲＳ）の型の組換え部位間の組換えを触媒し、ドナーポリヌクレオチドによりレセプターポリヌクレオチドを置換させ、および置換構築物を形成させる（図１Ａ）。φＣ３１組変え部位の場合では、ＩＲＳがａｔｔＰである場合、ＣＩＲＳはａｔｔＢであり、あるいはＩＲＳがａｔｔＢである場合、ＣＩＲＳはａｔｔＰである。
【００１５】
本発明の方法は、複数の型のドナー構築物由来のポリヌクレオチドを、複数の型のレセプター構築物に移入させるのに使用することができる。例えば、本発明は、プラスミドのような環状ベクター由来のポリヌクレオチドを染色体に、あるいはある染色体由来のあるＤＮＡセグメントを別の染色体に移入させるのに使用することができる。本発明はまた、ポリヌクレオチドが２つのＣＩＲＳ間に位置する限り、どんな長さの直鎖状ポリヌクレオチドを移入するのにも使用することができる。好ましくは、移入されるべきＤＮＡは、１０００〜２０００ｂｐである。本発明のこの態様により、ｃＤＮＡライブラリー由来のポリヌクレオチドを、染色体のようなレセプター構築物に直接的に移入させることが可能となり、ポリヌクレオチドをプラスミドベクターにクローニングするというさらなる介在工程が省かれる。
【００１６】
また、置換構築物を可逆的リコンビナーゼと接触させることを含む、置換構築物中の望ましくないヌクレオチド配列を欠失する方法も、本発明に含まれる。これらの方法では、ドナー構築物およびレセプター構築物はそれぞれ、可逆的リコンビナーゼにより認識される２つまたはそれ以上の可逆的組換え部位（これ以降、「ＲＲＳ」と称する）を含む。一実施形態では、可逆的リコンビナーゼは、Ｃｒｅであり、組換え部位は、ｌｏｘ部位である。
【００１７】
置換および欠失ストラテジーの両方を組み合わせて、本発明は、真核細胞における遺伝子スタッキングの方法を提供する。本発明の方法は、抗生物質耐性マーカーのような、さらなる懸念をもたらし得る他の不要のＤＮＡを組み込むことなく、ゲノム位置での一連の形質遺伝子の正確なスタッキングをもたらす。この方法について、以下でさらに詳述する。
【００１８】
これらの上記方法および下記方法は、ポリヌクレオチドで形質転換することができる、任意の真核細胞にポリヌクレオチドを安定に組み込むのに使用することができる。好ましい実施形態では、真核細胞は、植物または動物細胞である。したがって、本発明はさらに、トランスジェニック哺乳動物および植物を生産する方法を含む。本明細書に記載するトランスジェニック植物の生産方法は、１）２つの不可逆的組換え部位（ＩＲＳ）が隣接した染色体レセプターポリヌクレオチドを含むレセプター植物を準備する工程と、２）２つの不可逆的相補組換え部位（ＣＩＲＳ）が隣接した染色体ドナーポリヌクレオチドを含むドナー植物を準備する工程と、３）ハイブリッドトランスジェニック植物を生産するために、上記ドナー植物と上記レセプター植物とを交雑させる工程を含む。本発明によれば、この方法により生産されるトランスジェニック植物は、ＩＲＳとＣＩＲＳとの間の組換え、およびドナーポリヌクレオチドによるレセプターポリヌクレオチドの置換を触媒して、それによりトランスジェニック植物において染色体置換構築物を形成する不可逆的リコンビナーゼポリペプチドを発現する。好ましい実施形態では、レセプター植物は、シングルコピーレセプター系統である。さらなる実施形態では、置換構築物を含むが、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドを発現しないトランスジェニック植物の子孫を選択する。
【００１９】
図はすべて、概略図（正確な縮尺率ではない）を表す。遺伝子転写用プロモーターは、図中で明瞭に示しているが、転写終結を促し、あらゆるコード領域の下流に存在するターミネーターは、簡素化するために、個々のエレメントとして示していない。
【００２０】
［詳細な説明］
本発明は、真核細胞において安定な部位特異的ポリヌクレオチド置換または挿入を得る方法を提供する。例えば、本発明は、部位特異的様式で、遺伝子を第２の遺伝子で置換する方法を提供する。本発明の方法は、すでに利用可能な方法を超える利点を幾つか提供する。例えば、本発明の方法により、選択マーカーを必要とせずに、真核細胞のゲノムに直鎖状ＤＮＡ分子を導入することが可能である。したがって、例えば、ｃＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングする中間工程を必要とせずに、ｃＤＮＡ分子を真核細胞に導入することができる。本発明はまた、真核細胞の染色体に所望のポリヌクレオチドを導入した後、ＤＮＡを細胞に導入するのに使用した選択マーカー等のような不必要なＤＮＡを除去する手段を提供する。さらに、単一染色体遺伝子座で、２つまたはそれ以上の遺伝子を「スタッキング」するか、または順次導入する本発明の方法を使用することができる。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、真核細胞の染色体においてポリヌクレオチドの安定な部位特異的置換を達成するためのリコンビナーゼ系を使用する。本明細書中で使用する場合「リコンビナーゼ系」という用語は、リコンビナーゼ（可逆的または不可逆的）および組換え反応においてその基質として作用する組換え部位を指す。それにもかかわらず、本明細書中に記載した方法は、複数型のドナー構築物から複数型のレセプター構築物へとポリヌクレオチドを移入するのに使用することができる。例えば、本発明は、プラスミドのような環状ベクターから染色体へ、ある環状ベクターから別の環状ベクターへ、またはある染色体から別の染色体へ、ポリヌクレオチドを移入するのに使用することができる。より重要なことに、本発明は、染色体または環状ベクターに直鎖状ポリヌクレオチドを移入するのに使用することができる。好ましくは、直鎖状ポリヌクレオチドは、置換されるレセプター部位のＤＮＡとほぼ同じ長さである。環状ベクターという用語が環状染色体を含むことが理解されよう。
【００２２】
本発明の一実施形態では、真核細胞において部位特異的遺伝子置換を得る方法は、不可逆的リコンビナーゼ、ならびにドナー構築物およびレセプター構築物を含む細胞を準備することを包含し、ここでドナー構築物は、２つまたはそれ以上のＩＲＳを含み、レセプター構築物は、２つまたはそれ以上のＣＩＲＳを含む。不可逆的リコンビナーゼは、ＩＲＳとＣＩＲＳとの間の組換えを触媒し、レセプターポリヌクレオチドをドナーポリヌクレオチドで置換し、それにより置換構築物を形成する（図１参照）。好ましい実施形態では、レセプター構築物は、２つのＩＲＳを含み、ドナー構築物は、２つのＣＩＲＳを含む。別の実施形態では、レセプター構築物は、３つのＩＲＳを含み、ドナー構築物は、３つのＣＩＲＳを含む。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「不可逆的リコンビナーゼ」という用語は、２つの相補不可逆的組換え部位間での組換えを触媒することができるが、さらなる因子の補助を得ずに、この組換えにより形成されるハイブリッド部位間の組換えを触媒することはできないポリペプチドを指す。不可逆的リコンビナーゼポリペプチド、および不可逆的リコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は、当該技術分野で記載されており、日常的な方法を用いて得ることができる。例えば、φＣ３１インテグラーゼをコードする核酸断片を含むベクターは、米国特許第５，１９０，８７１号に記載されており、アクセッション番号Ｂ−１８４７７の下で、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４から利用可能である。他の不可逆的リコンビナーゼの例としては、大腸菌ファージＰ４リコンビナーゼ（Ｏｗ ＆ Ａｕｓｕｂｅｌ， １９８３ Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５： ７０４−７１３）、大腸菌ファージラムダインテグラーゼ（Ｌｏｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２９６： １１７５−８１）、リステリアＡ１１８ファージリコンビナーゼ（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏ． ３５： ３２４−３４０、およびアクチノファージＲ４　Ｓｒｅリコンビナーゼ（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８： ３３７４−３３７６）が挙げられる。
【００２４】
したがって、「不可逆的組換え部位」および「ＩＲＳ」という用語は、不可逆的リコンビナーゼ用の２つの基質の１つ目として作用することができ、その部位での組換え後にハイブリッド組換え部位へと改変される、組換え部位を指す。「相補不可逆的組換え部位」および「ＣＩＲＳ」という用語は、不可逆的リコンビナーゼ用の２つの基質の２つ目として作用することができ、その部位での相同組換え後にハイブリッド組換え部位へと改変される組換え部位を指す。したがって、本発明の一実施形態では、ベクタードナー構築物は、１つまたはそれ以上のＣＩＲＳを含み、染色体レセプター構築物は、１つまたはそれ以上のＩＲＳを含む。別の実施形態では、染色体ドナー構築物の両方が２つのＣＩＲＳを含み、染色体レセプター構築物は、２つのＩＲＳを含む。
【００２５】
不可逆的リコンビナーゼおよびその対応するＩＲＳの一例は、φＣ３１インテグラーゼ、ならびにａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位である。ａｔｔＢ部位およびａｔｔＰ部位は、ＩＲＳまたはＣＩＲＳのいずれかを指すことができることが理解されよう。ａｔｔＢがＩＲＳである場合、ａｔｔＰはＣＩＲＳでなくてならない。逆に、ａｔｔＰがＩＲＳである場合、ａｔｔＢはＣＩＲＳでなくてはならない。φＣ３１インテグラーゼは、真核細胞では見られないさらなる因子の非存在下にて、ａｔｔＢ×ａｔｔＰの反応のみを触媒する。リコンビナーゼは、ａｔｔＢとａｔｔＰとの間の組換え時に形成されるａｔｔＬとａｔｔＲハイブリッド組換え部位との間の組換えを媒介することはできない。φＣ３１インテグラーゼのようなリコンビナーゼは単独で逆反応を触媒することができないため、φＣ３１ａｔｔＢ×ａｔｔＰの組換えは安定である。したがって、これらのリコンビナーゼの使用は、ハイブリッド部位がリコンビナーゼ用の基質として作用することができ、したがって組換え反応の逆転をもたらすＣｒｅ−ｌｏｘまたはＦＬＰ−ＦＲＴ系のような他の組換え系とは異なる。例えば、標的部位への環状分子の挿入は、同じ導入ＤＮＡのが逆の除去を導き得る。不可逆的リコンビナーゼは、逆反応を触媒することができず、したがって組込みは安定である。
【００２６】
より一般的には、「組換え部位」という用語は、組換え事象用の基質として作用することができるリコンビナーゼにより認識されるヌクレオチド配列を指す。「組換え部位」という用語内には包含されないが、本発明はまた、「偽組換え部位」の使用を含む。偽組換え部位は、真核染色体において天然に存在し、かつリコンビナーゼ用の基質として作用することができるポリヌクレオチド配列である。偽組換え部位は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１８９８７（国際公開第００／１１１５５号）に記載される。
【００２７】
組換え部位は一般に、配向性を有しており、換言すると、それらはパリンドロームではないことを理解されたい。組換え部位は典型的に、コアまたはスペーサー領域で分離される左および右アームを含む。したがって、ａｔｔＢ組換え部位は、ＢＯＢ’から構成され、ここでＢおよびＢ’は、それぞれ左および右アームであり、Ｏはスペーサー領域である。同様に、ａｔｔＰは、ＰＯＰ’であり、ＰおよびＰ’は、アームであり、Ｏは、同様にスペーサー領域である。ａｔｔＢとａｔｔＰ部位との間の組換え、および標的での付随する核酸の組込み時に、組込んだＤＮＡに隣接する組込み部位を「ａｔｔＬ」および「ａａｔＲ」と称する。したがって、上述の専門用語を用いると、ａａｔＬおよびａｔｔＲ部位は、それぞれＢＯＰ’およびＰＯＢ’から構成される。本明細書中でのほとんどの表現では、「Ｏ」は省略され、ａｔｔＢおよびａｔｔＰは例えば、それぞれＢＢ’およびＰＰ’と称される。互いに関する組換え部位の配向性は、どの組換え事象が起こるかを決定することができる。組換え部位は、２つの異なる配向性であってもよく、すなわち直接的に配向されるか（同じ方向）、または逆に配向され得る。組換え部位が、単一核酸分子状に存在し、互いに対して直接的に配向される場合、リコンビナーゼにより触媒される組換え事象は典型的に、介在核酸の除去である。組換え部位が逆に配向される場合、任意の介在配列が典型的に反転される。
【００２８】
任意の適切な方法により、組換え部位を含む真核細胞に、リコンビナーゼを導入することができる。例えば、ポリペプチド形態にあるリコンビナーゼを、例えばマイクロインジェクションまたは他の方法により導入することができる。しかしながら、現在好ましい実施形態では、リコンビナーゼをコードする遺伝子を細胞に導入する。遺伝子の発現は、リコンビナーゼの生産をもたらし、次に、それが、相当する組換え部位間での組換えを触媒する。さらに、従来の形質転換方法により、レセプターおよびドナー構築物を、真核細胞に導入することができる。必要ならば、例えば米国特許第６，１１４，６６０号に記載されるように、複雑な組込みパターンの分離により、シングルコピー導入遺伝子の構築を容易にするのに、逆方向組換え部位を使用することができる。あるいは、分子スクリーニング方法から、シングルコピートランスジェニックレシピエントを得ることができる。
【００２９】
本発明の方法は、宿主生物のゲノムにポリヌクレオチドを安定に組み込むために使用することができる。上述するように、本発明は、１）２つのＩＲＳが隣接したレセプターポリヌクレオチドを含むレセプター構築物を含む真核細胞を準備し、２）２つのＣＩＲＳが隣接したドナーポリヌクレオチドを含むドナー構築物を上記細胞に導入し、そして３）上記レセプター構築物および上記ドナー構築物を、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させる工程とを含む、真核細胞において部位特異的遺伝子置換を得る方法を提供する。図１Ａは、この事象体系を例示する。例えばＣｒｅ−ｌｏｘ組換え（ここで、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰをｌｏｘＰで、ｌｏｘ５１１をｌｏｘ５１１で組換える）を用いた可逆的リコンビナーゼ系（図１Ｂ参照）の使用もまた、ＤＮＡ交換反応（ｌｏｘ５１１は、野生型ｌｏｘＰ配列の変異体である）を引き起こすであろうことに留意されたい。しかしながら、交換反応は可逆的であり、したがって、不可逆的リコンビナーゼ系により触媒される不可逆反応よりも低効率である。好ましくは、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドは、φＣ３１リコンビナーゼであり、リコンビナーゼは、ＩＲＳとＣＩＲＳとの間の組換えを触媒し、ドナーポリヌクレオチドによるレセプターポリヌクレオチドの置換をもたらす。
【００３０】
本発明の一実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、所定の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む。「プロモーター」は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与したＤＮＡ領域を指す。「誘導プロモーター」とは、例えば温度、ｐＨ、転写因子および化学物質のような環境因子または発達因子により発現レベルが変更可能である遺伝子の発現を誘導するプロモーターを指す。ＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントとの機能的関係に置かれる場合に、「作動可能に連結される」。例えば、シグナル配列用ＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写を刺激する場合には、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は近接しており、シグナル配列の場合には、近接しており、かつリーディングフレーム内にある。しかしながら、例えばエンハンサーは、それらがその転写を制御するコード配列と近接する必要はない。連結は、利便性のよい制限部位、またはその代わりに挿入されるアダプターもしくはリンカーでの連結により達成される。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「所定の遺伝子」は、宿主細胞または宿主生物に所望の形質を付与するポリペプチドをコードする。所望の形質は、例えば、油または脂肪酸産生の増加、もしくはもっと単純には、宿主細胞または宿主生物のよる所定の遺伝子でコードされるポリペプチド産生の増加であり得る。「所定の遺伝子」は、本発明により限定されず、真核細胞で発現され得る任意の遺伝子を含むことが当業者には理解されよう。
【００３２】
ドナー構築物、そしてより具体的にはドナーポリペプチドにおいてプロモーターへ所定の遺伝子を作動可能に連結することに加えて、レセプター構築物において１つまたはそれ以上のプロモーターを含むこともまた望ましい。好ましい実施形態では、レセプター構築物は、２つのＩＲＳのうちの一方に隣接する１つのプロモーターを含む。より好ましくは、プロモーターは、２つのＩＲＳのうちの一方から５’方向に位置する。レセプター構築物におけるＩＲＳに隣接したプロモーターの配置により、組換え事象後にドナーポリペプチドの発現が可能である。さらなる実施形態では、レセプター構築物は、選択マーカーまたはリコンビナーゼ遺伝子自体に作動可能に連結されるさらなるプロモーターを含む。
【００３３】
プロモーターは、所定の遺伝子に自然に関連し得るか、あるいは異なる遺伝子または異なる種から得られる異種プロモーターであり得る。トランスジェニック植物または他の生物のすべての組織中の遺伝子の直接発現が望ましい場合、「構成的」プロモーターを使用することができ、それは一般に、ほとんどの環境条件、および発達または細胞分化の状態下において活性である。植物で使用するための適切な構成的プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域および領域ＶＩプロモーター、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡに由来する１’または２’−プロモーター、および当業者に既知の植物において活性な他のプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターとしては、ゴマノハグサモザイクウイルス由来の完全長転写プロモーター、アクリンプロモーター、ヒストンプロモーター、チュブリンプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター（ＭＡＳ）、特にアラビドプシス（Ｓｕｎ ａｎｄ Ｃａｌｌｉｓ， １９９７ Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １１（５）：１０１７−１０２７）、ｍａｓ、ＭａｃまたはダブルＭａｃプロモーターに由来する様々なユビキチンまたはポリユビキチンプロモーター（米国特許第５，１０６，７３９号にて、およびＣｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５：３７３−３８１で記載される）、および当業者に既知の様々な植物遺伝子由来の他の転写開始領域が挙げられる。かかる遺伝子としては、例えば、アラビドプシス由来のＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３３： １２５−１３９）、アラビドプシス由来のＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ第Ｕ４３１４７号、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２５１：１９６−２０３）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来のステアロイルアシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ第Ｘ７４７８２号、Ｓｏｌｏｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０４：１１６７−１１７６）、トウモロコシ由来のＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ第Ｘ１５５９６号、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０８：５５１−５６５）、およびトウモロコシ由来のＧｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ第Ｕ４５８５５号、Ｍａｎｊｕｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３３：９７−１１２）が挙げられる。
【００３４】
植物用の他の有用なプロモーターとしては、ＴｉまたはＲｉ−プラスミド由来、植物細胞由来、プロモーターが植物中で機能的であることがわかっている植物ウイルスまたは他の宿主由来のものも挙げられる。植物中で機能し、したがって本発明の方法で使用するのに適切な細菌プロモーターとしては、オクトピンシンテターゼプロモーターおよびノパリンシンターゼプロモーターが挙げられる。適切な内因性植物プロモーターとしては、リブロース−１，６−二リン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、α−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、および熱ショックプロモーターが挙げられる。
【００３５】
一般に、発現されるポリヌクレオチド（例えば、所定の遺伝子）は、発現カセット中に存在し、それは、ポリヌクレオチドが、所定の宿主細胞で機能的な発現制御配列（例えば、プロモーターおよびターミネーター）に作動可能に連結されていることを意味する。大腸菌で使用するための発現カセットは、Ｔ７、ｔｒｐ、またはラムダプロモーター、リボソーム結合部位、および好ましくは転写終結シグナルを含む。真核細胞に関しては、制御配列は典型的に、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス等に由来するエンハンサー、およびポリアデニル化配列を任意に含むプロモータを含み、またスプライスドナーおよびアクセプター配列を含んでもよい。酵母では、利便性のよいプロモーターとしては、ＧＡＬ１−１０（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， １９８４ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４： １４４０−１４４８）、ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５８：２６７４−２６８２）、ＰＨＯ５（Ｍｅｙｈａｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８２ ＥＭＢＯ Ｊ．， ６：６７５−６８０）、およびＭＦα（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｏｓｈｉｍａ， １９８２， ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ （ｅｄｓ． Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ， Ｊｏｎｅｓ， ａｎｄ Ｂｒｏａｃｈ） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ． １８１−２０９）が挙げられる。
【００３６】
あるいは、特定組織中の所定の遺伝子発現を誘導するか、そうでなければより正確な環境または発達制御下にあるプロモーターを使用することができる。かかるプロモーターを本明細書では「誘導」または「抑制」プロモーターと称する。誘導プロモーターにより転写に影響し得る環境条件の例としては、病原体攻撃、嫌気性条件、エチレン、温度上昇、または光の存在が挙げられる。発達制御下のプロモーターとしては、葉、根、果実、または花のようなある種の組織のみで転写を開始するプロモーターが挙げられる。プロモーターの作動もまた、ゲノム中のその位置により様々であり得る。したがって、誘導プロモーターは、ある位置で完全または部分的に構成的になり得る。誘導プロモーターは多くの場合、リコンビナーゼ遺伝子の発現を制御するのに使用され、したがって、組換え反応の時期を制御することが可能となる。
【００３７】
トマト由来の組織特異的Ｅ８プロモーターは、所望の遺伝子産物が果実中に存在するように遺伝子発現を誘導するのに特に有用である。例えば、Ｌｉｎｃｏｌｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：２７９３−２７９７； Ｄｅｉｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８ ＥＭＢＯ Ｊ．， ７： ３３１５−３３２０； Ｄｅｉｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １００： ２０１３−２０１７を参照されたい。他の適切なプロモーターとしては、胚貯蔵タンパク質をコードする遺伝子由来のものが挙げられる。光誘導性であり、光合成組織のみで活性なシロイヌナズナの１，５−リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子（「ｓｓｕ」プロモーター）、葯特異的プロモーター（欧州特許第３４４０２９号）、および例えばシロイヌナズナの種子特異的プロモーター（Ｋｒｅｂｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ８７：８５９）を含めたさらなる器官特異的、組織特異的、および／または誘導外来プロモーターもまた既知である（例えば、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ３８：２２１に引用される参照文献を参照）。例示的な緑色組織特異的プロモーターとしては、トウモロコシホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）プロモーター、小サブユニットリブロースビスカルボキシラーゼプロモーター（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、国際公開第９３／０７２７８号に記載されるような植物ＴｒｐＡ遺伝子から単離されるプロモーターのような髄特異的プロモーターであってもよい。
【００３８】
他の生物に関する誘導プロモーターとしては、例えばアラビノースプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および熱ショックプロモーター、ならびに当業者に既知の多くの他のプロモーターが挙げられる。Ｓ． ｐｏｍｂｅのような酵母において有用な抑制プロモーターの例は、ビタミンＢ１により抑制可能なＰｍｎｔプロモーターである。
【００３９】
本発明を用いて、上述のプロモーターの１つまたはそれ以上に作動可能に連結される所定の遺伝子をレセプター細胞に移入することができ、より具体的にはレセプター構築物に組み込むことができる。さらに、レセプター構築物に所定の遺伝子を組み込んだ際に、レセプター構築物中のプロモーターに所定の遺伝子を作動可能に連結することができる。本発明の１つの利点は、所定の遺伝子を、センスまたはアンチセンス配向でレセプター構築物に挿入し、したがってセンスまたはアンチセンスｍＲＮＡとして転写することができることである。所定の遺伝子のセンスおよびアンチセンス発現の両方は、所定の遺伝子を互いに対して逆位である２つのＩＲＳと隣接させ、レセプターポリヌクレオチドを互いに対して逆位である２つのＣＩＲＳと隣接させることで達成することができる（例えば図５参照）。このストラテジーは、ドナー構築物がｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡのような直鎖状ＤＮＡ構築物である場合に特に有用である。したがって、本発明は、１）互いに対して逆位である２つのＩＲＳが隣接した所定の遺伝子を含むドナー構築物、２）互いに対して逆位である２つのＣＩＲＳが隣接したレセプターポリペプチドに隣接したプロモーターを含むレセプター構築物、および３）不可逆的リコンビナーゼポリペプチド、を含む真核細胞を包含し、ここでドナー構築物とレセプター構築物を接触することにより、結果としてＩＲＳとＣＩＲＳとの間の組換え、およびドナーポリヌクレオチドによるレセプターポリヌクレオチドの置換が生じる。本発明はさらに、１）ａ）互いに対して逆位である２つのＩＲＳが隣接した所定の遺伝子を含むドナー構築物、ｂ）互いに対して逆位である２つのＣＩＲＳが隣接したレセプターポリペプチドに隣接したプロモーターを含むレセプター構築物、およびｃ）不可逆的リコンビナーゼポリペプチド、を真核細胞に導入すること、および２）ＩＲＳとＣＩＲＳとの間の組換え、およびドナーポリペプチドによるレセプターポリペプチドの置換が起きるように、ドナー構築物およびレセプターを、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドと接触させることとを含む、所定の遺伝子のアンチセンス発現を達成する方法を含む。次に、アンチセンス配向で所定の遺伝子を有する置換構築物を含む真核細胞を、当業者に既知の方法で選択する。
【００４０】
本発明はまた、コンカテマーＤＮＡ分子のシングルユニットコピーを組み込むのに特に有用である。遺伝子銃送達のような細胞へのＤＮＡのある導入方法は、多くの場合、多数の連結ＤＮＡ分子の挿入に関連している。このことは、導入環状プラスミドＤＮＡの切断により生産される直鎖状ＤＮＡ分子に先だつ連結により引き起こされると考えられる。本発明は、コンカテマーＤＮＡ内のシングルユニットコピーを、コンカテマーの残部を用いずに、レセプター標的部位に組み込むことができる方法を提供する。このストラテジーは、場合によっては、図３Ａに例示するように、無傷の環状ＤＮＡの組込みよりも効率的である。高い効率は、基質の利用可能性に起因する。直接ＤＮＡ送達方法は、高い割合の染色体外分子のコンカテマー化を生産し、それは同時組込み反応用のシングルコピー環状基質の数を減少させる。交換反応に関して、図３Ｂ、または図１０および１１のように、基質の唯一の要件がドナーポリヌクレオチドに隣接する２つのＣＩＲＳであるため、コンカテマーは、依然として効果的である。
【００４１】
部位特異的遺伝子置換が本発明の宿主細胞で起きるためには、リコンビナーゼポリペプチドは、細胞中に存在しなくてはならない。本発明の幾つかの実施形態では、リコンビナーゼの導入は、リコンビナーゼをコードする核酸を細胞に導入することで達成される。リコンビナーゼをコードする遺伝子は、細胞において一過的または安定的に発現され得る。ドナー構築物の導入前、後またはそれと同時に、リコンビナーゼ遺伝子を細胞に導入することができる。リコンビナーゼ遺伝子は、ドナー構築物自体または別個のベクター内に存在することができる。図５Ａ〜Ｂは、リコンビナーゼ遺伝子が別個のベクター上に存在する場合の本発明の一実施形態を示す。しかしながら、リコンビナーゼ遺伝子は、レセプター構築物内に、より好ましくはレセプターポリヌクレオチド内に存在することが好ましい。図６Ａ〜Ｂは、リコンビナーゼ遺伝子がレセプターポリヌクレオチド内に存在する好ましい部位特異的置換ストラテジーを示す。他の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、トランスジェニック真核生物、例えばトランスジェニック植物、動物、真菌類等に挿入された後、ＩＲＳおよびＣＩＲＳを含むドナーならびにレセプター構築物を含む生物と交雑される。したがって、本発明は、組換え部位を含む核酸、ならびにリコンビナーゼコードポリヌクレオチド配列が標的真核細胞で機能するプロモーターに作動可能に連結される核酸を提供する。
【００４２】
所望の遺伝子置換が起きた細胞の選択を容易にするために、標的構築物は、（好ましくは組換え部位間に）ネガティブ選択マーカーを含むことができる。組込み用構築物の導入およびリコンビナーゼとの接触後、続いて細胞に対してネガティブ選択を行い、ネガティブ選択マーカーを保持する細胞を排除する。ネガティブ選択マーカーの適切な例は、当業者には既知であり、例えば、ガンシクロビルと接触すると哺乳動物細胞を死滅させる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。この方法により、抗生物質耐性遺伝子または他の選択マーカーのような外来性ＤＮＡを有する生じた形質転換細胞を用いずに、所望の遺伝子置換に関して選択することができる。図４は、その様なネガティブ選択マーカーを利用した好ましい部位特異的置換ストラテジーを示す。
【００４３】
また本発明には、置換構築物を第２のリコンビナーゼと接触させることを含む、置換構築物中の望ましくないヌクレオチド配列を欠失する方法が含まれる。これらの方法では、ドナー構築物およびレセプター構築物はそれぞれ、可逆的リコンビナーゼにより認識される（またはそれと適合している）２つまたはそれ以上の可逆的組換え部位（これ以降、「ＲＲＳ」と称する）を含む。しかしながら、第２のリコンビナーゼが不可逆的リコンビナーゼである場合も、本方法は作動し得る。図７は、可逆型（図７Ａ）または不可逆型（図７Ｂ）のいずれかの第２のリコンビナーゼ系を用いた、もはや必要のないＤＮＡの欠失を表し、ここで対応するＩＲＳおよびＣＩＲＳをａｔｔＰ−２およびａｔｔＢ−２として示す。
【００４４】
不可逆的リコンビナーゼと同様に、可逆的リコンビナーゼは、２つの相補的ＲＲＳ間の組換えを触媒する。組換えにより生成される産物部位はそれ自体続く組換え用の基質であるため、リコンビナーゼおよび組換え部位を「可逆的」と称する。適切な可逆的リコンビナーゼ系は、当業者に既知であり、例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系が挙げられる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ系では、組換え部位を「ｌｏｘ部位」と称し、リコンビナーゼを「Ｃｒｅ」と称する。ｌｏｘ部位が平行配向にある（すなわち、同一方向である）場合、Ｃｒｅは、介在ポリヌクレオチド配列の欠失を触媒する。ｌｏｘ部位が逆位にある場合、Ｃｒｅリコンビナーゼは、介在ポリペプチド配列の反転を触媒する。この系は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓａｕｅｒ， Ｂ．， １９８７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７：２０８７−２０９６）、哺乳動物細胞（Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：５１６６−５１７０； Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：１４７−１６１）、ならびにタバコ（Ｄａｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｇｅｎｅ， ９１： ７９−８５）およびアラビドプシス（Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ７（４）：６８７−７０１）のような植物を含む様々な宿主細胞で機能する。植物でのＣｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼ系の使用はまた、米国特許第５，５２７，６９５号およびＰＣＴ出願国際公開第９３／０１２８３号に記載されている。ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９８６ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４：２２８７−２３００）、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ７６、ｌｏｘ７５、ｌｏｘ４３、ｌｏｘ４４（Ａｌｂｅｒｔ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ７（４）：６４９−６５９）を含む幾つかの種々のｌｏｘ部位が知られている。
【００４５】
幾つかの他の組換え系もまた、これら用途で使用するのに適している。これらとしては、例えば酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｌｙｚｎｉｋ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２４（１９）：３７８４−９）、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ（Ｃｒｉｓｏｎａ， Ｎ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２４３（３）：４３７−５７）、大腸菌のＰｉｎリコンビナーゼ（例えば、Ｋｕｔｓｕｋａｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｇｅｎｅ， ３４（２−３）：３４３−５０）、赤痢菌属由来のＰｉｎＢ、ＰｉｎＤおよびＰｉｎＦ（Ｔｏｍｉｎａｇａ Ａ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７３（１３）：４０７９−８７）、ならびにｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系（Ａｒａｋｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２５（１）：２５−３７）が挙げられる。したがって、リコンビナーゼ系は、大量で数が増加しつつある供給源から利用可能である。本発明の一実施形態では、可逆的リコンビナーゼは、Ｃｒｅであり、ＲＲＳはｌｏｘ部位である。
【００４６】
可逆的組換え部位を用いる場合、ドナー構築物およびレセプター構築物中の両方のＲＲＳは同一であるか、またはほぼ同一である。ドナー構築物中のＲＲＳは、逆に配向しており、レセプター構築物中のＲＲＳは、逆に配向しているのがまた好ましい。これらの実施形態では、ドナー構築物によるレセプター構築物の部位特異的置換は、直接的に配向されたＲＲＳ対を含む置換構築物を生じる。したがって、置換構築物中の直接的に配向された可逆的組換え部位の１つまたはそれ以上の対のある１つの成員は、レセプター構築物に由来し、１つまたはそれ以上の対の他の成員は、ドナーポリヌクレオチドに由来する。置換構築物を可逆的リコンビナーゼと接触させることにより、直接的に配向されたＲＲＳ間のポリヌクレオチド配列が除去される。ＲＲＳを含む例示的構築物を図７〜１３に示す。
【００４７】
本発明の一実施形態では、所望の最終構築物中で不必要な置換構築物中のポリヌクレオチド配列を上述の方法を用いて欠失させる（各種例に関して図７〜１３を参照）。より具体的には、図１０のように、ドナー構築物は、選択マーカー、２つのＲＲＳが隣接する所定の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含み、このセグメント全体が、２つのＩＲＳに隣接している。ドナー構築物中の２つのＲＲＳは、逆に配向している。レセプター構築物は、インテグラーゼコード領域を含むレセプターポリヌクレオチド、プロモーターおよび選択マーカーを含み、ここでレセプターポリヌクレオチドは、２つのＣＩＲＳおよびプロモーターに隣接しており、レセプターポリヌクレオチドおよびプロモーターは、２つのＲＲＳに隣接している。レセプター構築物中の２つのＲＲＳは、逆に配向しており、レセプター構築物中の各ＲＲＳは、ドナー構築物中のＲＲＳにとって組換え性である（例えば、図９参照）。別の実施形態では、ＩＲＳは、互いに対して逆位であり、ＣＩＲＳは、たがいに対して逆位である（図１１を参照）。
【００４８】
上述の方法のほかに、本発明は、特定染色体遺伝子座で所定の複数のポリヌクレオチドを順次「スタッキング」する方法も提供する。スタッキングは、最終産物中において不必要なＤＮＡを組み込む必要なく達成される。この方法の２つの実施形態の概略図を図８および９に示す。本発明のスタッキング方法では、レセプター構築物は、先述のものと同一である（図７Ａに示した）。これらの方法で使用するドナー構築物（図８Ａ）は、所定遺伝子、および単一のＣＩＲＳ（例えば、φＣ３１系のａｔｔＢ）を含み、これらの成分は、逆位ＲＲＳ（例えばｌｏｘ部位）対に隣接している。また、選択マーカーコード領域がドナー構築物中に存在するが、選択マーカー用のプロモーターは存在しない。好ましくは、このマーカーは、レセプター構築物で使用したものと異なる。第２のＣＩＲＳ（例えば、φＣ３１系のａｔｔＢ）は、選択マーカーコード領域の上流にある。
【００４９】
上述するような従来型の方法を用いて、レセプター構築物を宿主細胞の染色体に組み込む。同様に、望ましい場合は、例えば米国特許第６，１１４，６００号に記載されるような複雑な組換えパターンの分離により、シングルコピー導入遺伝子の構築を容易にするために、隣接逆位組換え部位を使用することができる。あるいは、分子スクリーニング方法から、シングルコピートランスジェニックレシピエントを得ることができる。
【００５０】
次に、ドナー構築物を、その染色体にレセプター構築物が組み込まれた細胞に導入する。不可逆的リコンビナーゼ（例えば、φＣ３１）と接触すると、ドナー構築物のａｔｔＢ部位とレセプター構築物上のａｔｔＰ部位との間で組換えが起こる（図８Ａ〜Ｂ）。ドナー構築物中には２つのａｔｔＢ部位が存在するため、いずれか部位がゲノムａｔｔＰ部位と組換えすることができる。所定のヌクレオチオドの下流にあるａｔｔＢ部位がａｔｔＰと組換えする場合、生じる組換え事象は、選択マーカーｓｅｌ２（図示していない）の発現を活性化しないであろう。他方で、選択マーカーコード領域の上流にあるａｔｔＢ部位がａｔｔＰと組換えする場合、レセプター構築物中のａｔｔＰに隣接して存在するプロモーターは、選択マーカーコード領域に作動可能に連結されるようになるであろう（図８Ｂ）。これにより、後者の類の組込み事象に関して選択することが可能となる。生じた構造は、形質遺伝子の機能に必要のない２つのＤＮＡ断片間に所定のポリヌクレオチドおよび関連ａｔｔＢ部位を有する。したがって、これらの外来性断片は、直接的に配向されたＲＲＳ（例えば、ｌｏｘ）部位ではさまれたＤＮＡのリコンビナーゼ媒介性欠失により除去することができる（図８Ｂ〜Ｃ）。
【００５１】
外来性断片の除去後に、宿主細胞は、逆に配向されたＲＲＳ（例えばｌｏｘ）対が隣接した所望のポリヌクレオチドおよびＣＩＲＳ（例えば、ａｔｔＢ）のみを保持する。したがって、ａｔｔＢ部位は、第２の所定の遺伝子を含む第２のドナー構築物による２回目の組換え用の標的として使用することができる（図８Ｃ〜図８Ｅ）。両方の選択マーカーが染色体から除去されたため、同じ２つのマーカーの一方をこの第２の組換えに使用することができる。組換えおよび除去反応は、第２、第３、および続く組込み用構築物を用いて望ましいように繰り返される（図８Ｄ〜Ｊ）。これにより、互いに隣接した一連のポリヌクレオチドが生じる。遺伝子スタッキングはまた、逆位配向性にある不可逆的組換え部位を用いて達成することができる。このストラテジーの例を図９Ａ〜Ｊに図示する。
【００５２】
典型的に、真核細胞に導入されるレセプターおよびドナー構築物、ならびに他の構築物は、組換え発現技法を用いて調製される。組換え発現技法には、組換え核酸の構築およびトランスフェクトした細胞中での遺伝子の発現が含まれる。これらの目的を達成するための分子クローニング技法は、当該技術分野で既知である。組換え核酸の構築に適切な様々なクローニングおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ増幅方法は、当業者に既知である。多くのクローニングの実施により、当業者に指示するのに十分なこれらの教示および説明の例は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏｍ ＣＡ （Ｂｅｒｇｅｒ）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， （１９９８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ） （Ａｕｓｕｂｅｌ）に見られる。
【００５３】
ポリヌクレオチド構築物の構築は一般に、細菌において複製することが可能なベクターの使用を必要とする。細菌からプラスミドを精製するための大量のキットが市販されている。その適切な使用に関しては、製造業者の説明書に従うべきである（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＪ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪ（ともに、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ（Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ）、およびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｄｇｅｎ）を参照）。次に、さらに単離して精製したプラスミドを、他のプラスミドを生産するように操作し、細胞をトランスフェクトするのに使用し、あるいは植物を感染および形質転換するためにアグロバクテリウム・チュメファシエンスに組み込むことができる。アグロバクテリウム属が形質転換の手段である場合、シャトルベクターが構築される。ストレプトミセス属またはバシラス属でのクローニングも可能である。
【００５４】
上述のように、選択マーカーは、多くの場合、ポリヌクレオチド構築物に、および／または真核細胞に構築物を導入するのに使用されるベクターに組み込まれる。これらのマーカーにより、所定のポリヌクレオチドを含む細胞のコロニーの選択が可能である。多くの場合、ベクタードナー構築物は、例えば大腸菌、または標的細胞に導入される前にベクターが複製される他の細胞で機能的な１つの選択マーカーを有するであろう。第２の選択マーカーも、組込み用構築物に含まれ得るが、その選択マーカーの除去が望ましい場合、マーカーは、所定のポリヌクレオチドに隣接する組換え部位の対の外側に置かれる。
【００５５】
大腸菌用の選択マーカーの例としては、抗生物質（すなわち、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、エリスロマイシン）に対する耐性を特徴付ける遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼのような他の型の選択可能な酵素活性を付与する遺伝子、あるいはラクトースオペロンが挙げられる。哺乳動物細胞で使用するのに適切な選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬剤耐性を付与する原核細胞遺伝子であるｇｐｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、これはミコフェノール酸で選択することができる）、ｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、これはＧ４１８、ハイグロマイシンもしくはピューロマイシンで選択することができる）、およびＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ、これはメトトレキセートで選択することができる）が挙げられる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ， １９８１ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８：２０７２； Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＆ Ｂｅｒｇ， １９８２ Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １：３２７）。
【００５６】
植物細胞用の選択マーカーは、多くの場合、例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはクロラムフェニコールのような殺生剤または抗生物質に対する耐性、あるいはクロルスルフロンまたはＢａｓｔａのような除草剤耐性を付与する。選択マーカーに適したコード配列の例は、抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与する酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８２ Ｇｅｎｅ， １９：３２７）、酵素ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｐｔ遺伝子（Ｇｒｉｔｚ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， １９８３ Ｇｅｎｅ， ２５：１７９）、および除草剤化合物ホスフィノスリシンおよびビアラホスに対する耐性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子（欧州特許第２４２２３６号）である。
【００５７】
１つよりも多い所定の遺伝子が真核細胞に導入される場合、各外因性核酸に異なる選択マーカーを使用することが一般的に望ましい。このことにより、所望の外因性核酸の両方を含む細胞に関して同時に選択することが可能となる。
【００５８】
上述の組成物および方法は、ポリヌクレオチドを任意の真核細胞に安定に組み込むのに使用することができる。本発明の真核細胞の非限定的な例としては、動物、植物、真菌、細菌および他の微生物由来の細胞が挙げられる。一実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞で使用することができる部位特異的置換方法の例は、図４および５に見られる。別の実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。植物細胞で使用することができる部位特異的置換方法の例は、図６に見られる。幾つかの実施形態では、細胞は、多細胞生物、例えばトランスジェニック植物または動物の一部である。本発明の方法は、トランスジェニックコムギ、トウモロコシおよび動物を用いた場合のような、トランスジェニック物質を得るのが困難な状況で特に有用である。これらの状況では、まれに起こるシングルコピー挿入を発見することは、多数の別個に得られるトランスジェニッククローンをあらかじめ獲得することを必要とし、それ自体多大な努力を要する。特に所定の植物標的としては、例えばコメ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、バナナ、ヤシ、ユリ、ラン、およびスゲを含む単子葉植物である。例えば、タバコ、リンゴ、ジャガイモ、ビート、ニンジン、ヤナギ、ニレ、カエデ、バラ、キンポウゲ、ペチュニア、フロックス、スミレ、およびヒマワリを含む双子葉植物もまた適切な標的である。
【００５９】
したがって、本発明はさらに、１）２つのＩＲＳが隣接した染色体レセプターポリヌクレオチドを含むレセプター植物をし、２）２つのＣＩＲＳが隣接した染色体ドナーポリペプチドを含むドナー植物を準備し、そして３）トランスジェニック植物を生産するように、上記ドナー植物と上記レセプター植物を交雑させる工程とを含む、トランスジェニック植物の生産方法を包含し、ここで上記ドナー植物または上記レセプター植物のいずれかは、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドを含む。ドナーおよびレセプター植物は、同一もしくは異なる属または種であり得る。本発明のこの態様の一実施形態を図１２に示す。
【００６０】
この方法で生産されるトランスジェニック植物は、ＩＲＳとＣＩＲＳとの間の組換え、およびドナーポリヌクレオチドによるレセプターポリヌクレオチドの置換を触媒し、それによりトランスジェニック植物中に染色体置換構築物を形成する不可逆的リコンビナーゼポリペプチドを発現する。好ましい実施形態では、レセプター植物は、シングルコピーレセプター系統である。さらなる実施形態では、不可逆的リコンビナーゼポリペプチドを発現しないトランスジェニック植物の子孫を選択する。他の好ましい実施形態では、染色体置換構築物は、ドナーポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターを含み、より好ましくは、該プロモーターは、レセプター構築物に由来する。本発明はまた、上述のトランスジェニック植物を、可逆的リコンビナーゼをコードする核酸を含む植物と交雑させることを包含し、ここで染色体置換構築物は、可逆的リコンビナーゼに適合する直接的に配向された可逆的組換え部位（ＲＲＳ）の１つまたはそれ以上の対をさらに含む（図１２ＢおよびＣ参照）。
【００６１】
当業者に既知の幾つかの手段のいずれかにより、組換え部位および／またはリコンビナーゼコード遺伝子を含むポリヌクレオチド構築物を、標的細胞および／または生物に導入することができる。例えば、様々な従来の技法により、ＤＮＡ構築物を、植物の培養または器官のいずれかで植物細胞へ導入することができる。例えば、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ粒子照射のような遺伝子銃方法を用いて植物細胞に直接導入することができ、あるいはＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技法を用いて導入することができる。粒子媒介性形質転換技法（「遺伝子銃」としても既知である）は、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｎａｔｕｒｅ， ３２７：７０−７３； Ｖａｓｉｌ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．， １１：１５５３−１５５８、およびＢｅｃｋｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ５：２９９−３０７に記載されている。これらの方法は、小ビーズまたは粒子のマトリクス内に、または表面上に核酸を有する小粒子による細胞浸透を含む。遺伝子銃ＰＤＳ−１０００Ｇｅｎｅ　Ｇｕｎ（Ｂｉｏｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）は、ヘリウム圧を使用して、ＤＮＡ被覆金またはタングステンミクロキャリアを標的細胞に向けて加速する。このプロセスは、植物、細菌、真菌、藻類、無傷動物細胞、組織培養細胞、および動物胚を含む生物由来の広範な組織および細胞に適用可能である。動物および患者の生組織用の本質的に穏やかなエレクトロポレーション方式であれる電子パルス送達を使用することが可能である（Ｚｈａｏ， １９９５ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １７：２５７−２６２）。
【００６２】
他の形質転換方法も、当業者には既知である。マイクロインジェクション技法が当該技術分野で既知であり、科学および特許文献に十分に記載されている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を用いたＤＮＡ構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ３：２７１７ （１９８４）に記載されている。エレクトロポレーション技法は、Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：５８２４ （１９８５）に記載されている。植物プロトプラストのＰＥＧ媒介性形質転換およびエレクトロポレーションはまた、Ｌａｚｚｅｒｉ， Ｐ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．， Ｂｉｏｌ． ４９：９５−１０６ （１９９５）でも議論さされている。単子葉植物および双子葉植物の両方で異種遺伝子を導入および発現するための方法が既知である。例えば、米国特許第５，６３３，４４６号、第５，３１７，０９６号、第５，６８９，０５２号、第５，１５９，１３５号、および第５，６７９，５５８号、Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２：４２１−４７７を参照されたい。単子葉植物の形質転換は特に、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９２）， ３３８：２７４−２７６）、遺伝子銃（例えば、欧州特許出願第２７０，３５６号）、およびアグロバクテリウム（例えば、Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８７） ８４：５３４５−５３４９）を含む様々な技法を用いて達成することができる。
【００６３】
植物の形質転換のために、ＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組み合わせて、従来型アグロバクテリウム・チュメファシエンス宿主ベクターに導入してもよい。Ａ．チュメファシエンス宿主の病原性機能は、その細菌により細胞を感染する場合、導入遺伝子および（存在する場合）隣接マーカー遺伝子（複数可）の、植物細胞ＤＮＡへの導入を誘導するであろう。アグロバクテリウム・チュメファシエンス媒介性形質転換技法は、科学文献に十分に記載されている。例えば、Ｈｒｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３３：４９６−４９８ （１９８４）， Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：４８０３ （１９８３）、およびＨｏｏｙｋａａｓ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １３：３２７−３３６ （１９８９）， Ｂｅｃｈｔｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ Ｄｅ Ｌ Ａｃａｄｍｉｅ Ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅ Ｉｉｉ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｅ Ｌａ Ｖｉｗｅ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ３１６：１１９４−１１９９ （１９９３）， Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：５５３６−５５４０ （１９８８）を参照されたい。植物および細胞培養物に関する遺伝子移入方法の説明に関しては、例えば、Ｆｉｓｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ ５５：５−３６ （１９９３）、およびＰｏｔｒｙｋｕｓ， ＣＩＢＡ Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍｐ． １５４：１９８ （１９９０）を参照されたい。
【００６４】
ポリヌクレオチド配列を細胞へ送達するための他の方法としては、例えば、リポソームベースの遺伝子送達（Ｄｅｂｓ ａｎｄ Ｚｈｕ （１９９３） 国際公開第９３／２４６４０号； Ｍａｎｎｉｎｏ ａｎｄ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６ （７）： ６８２−６９１； Ｒｏｓｅ 米国特許第５，２７９，８３３号； Ｂｒｉｇｈａｍ （１９９１） 国際公開第９１／０６３０９号； およびＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−７４１４）、ならびにパピローマウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターの使用（例えば、Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７２：９５−１０４； Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １： ３６７−３８４； および総説に関してＨａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９ （Ｐｔ ３）：２９７−３０６； Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６（５） ２７３１−２７３９； Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６（５）：１６３５−１６４０ （１９９２）； Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｖｉｒｏｌ． １７６：５８−５９； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：２３７４−２３７８； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：２２２０−２２２４ （１９９１）； Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、およびＲｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｆａｕｃｉ （１９９３） ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｐａｕｌ （ｅｄ） Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびその中の参照文献； 上述のＹｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９４）； Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） 米国特許第４，７９７，３６８号； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， 国際公開第９３／２４６４１号（１９９３）； Ｋｏｔｉｎ （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１； ＡＡＶベクターの総説に関してＭｕｚｙｃｚｋａ （１９９４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｓｔ． ９４：１３５１およびＳａｍｕｌｓｋｉ（上述）； Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ， 米国特許第５，１７３，４１４号； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５（１１）：３２５１−３２６０； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４：２０７２−２０８１； Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６４６６−６４７０； ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） ａｍｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６３：０３８２２−３８２８）が挙げられる。
【００６５】
導入ドナーポリヌクレオチドの組込みパターンを解析することができる方法は、当業者に既知である。例えば、形質転換細胞からＤＮＡを抽出し、１つまたはそれ以上の制限酵素でそのＤＮＡを消化して、ポリヌクレオチド構築物の標識断片にハイブリダイズさせることができる。挿入配列はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて同定することができる（例えば、これらおよび他の適切な方法に関してＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照）。
【００６６】
上記形質転換技法のいずれかにより得られる形質転換植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型、したがって所望の表現型を保有する植物全体を再生させることができる。かかる再生技法は、組織培養生長培地中のある植物ホルモンの操作に依存し、典型的に所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された殺生剤および／または除草剤マーカーに依存する。培養プロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｔｕｒｅ， ＰＰ． １２４−１７６， Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）、およびＢｉｎｄｉｎｇ， Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ， Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ， ｐｐ． ２１−７３， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， （１９８５）に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植体、体細胞胚（Ｄａｎｄｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔ． Ｍｅｔｈ．， １２：１４５ （１９８９）； ＭｃＧｒａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， ８：５１２ （１９９０））、器官、またはそれらの一部から得ることもできる。かかる再生技法は、一般に、Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．， ３８：４６７−４８６（１９８７）に記載されている。
【００６７】
ほとんどの脊椎動物種のトランスジェニックおよびキメラ動物を生産する方法も有用である。かかる種としては、マウスおよびラットのようなげっ歯類、ウサギ、ヒツジおよびヤギ（ｏｖｉｎｅｓ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅｓ）、ウシおよびバッファローのようなウシ亜科（ｂｏｖｉｎｅｓ）を含む非ヒト動物が挙げられるが、これらに限定されない。トランスジェニック動物を得る方法は、例えばＰｕｈｌｅｒ， Ａ．， Ｅｄ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌ．， １９９３、Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ， Ｅｄｓ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８）， １９９３、およびＰｉｎｋｅｒｔ， ＣＡ， Ｅｄ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９４に記載されている。特定遺伝子改変を有するトランスジェニック魚類もまた、特許請求した方法を用いて作製することができる。トランジェニック魚類の作製の一般法に関して、例えば、Ｉｙｅｎｇａｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ５：１４７−１６６を参照されたい。
【００６８】
ゲノムに特定の改変を有するトランスジェニックまたはキメラ動物を得る一方法は、受精卵母細胞を組換え部位が隣接する所定のポリヌクレオチドを含むベクターと接触させることである。マウスのような幾つかの動物に関して、受精をｉｎ　ｖｉｖｏで実施し、卵を手術で取り出す。他の動物、特にウシでは、生きている動物または食肉処理場の動物から卵を取り出し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで卵を受精させるのが好ましい。ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， 国際公開第９１／０８２１６号を参照されたい。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの受精により、実質的に同調細胞に改変を導入することが可能となる。次に、約１６〜１５０個の細胞を含む着床前胚が得られるまで、受精卵母細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養する。１６〜３２細胞期の胚を桑実胚と記載する。３２個以上の細胞を含む着床前胚を胎盤胞と称する。これらの胚は、典型的に６４個の細胞段階にある胞胚腔の発達を示す。望ましい場合、胚細胞中の所望の外因性ポリヌクレオチドの存在は、当業者に既知の方法により検出することができる。着床前段階にまで受精卵母細胞を培養する方法は、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１： ４１４； Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ． Ｎ．Ｙ． （１９８６）（マウス胚）、Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１５： ６８０（ウサギおよびブタ胚）、Ｇａｎｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ８１：２３−２８； Ｒｅｘｒｏａｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． ６６： ９４７−９５３（ヒツジ胚）、およびＥｙｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ８５： ７１５−７２０； Ｃａｍｏｕｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ７２： ７７９−７８５、およびＨｅｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７： ５９６８（ウシ胚）に記載されている。時には、着床前胚は、着床までの間凍結保存される。着床前胚を適切な雌に移入して、導入遺伝子が組込まれると、発達段階に応じて、トランスジェニックまたはキメラ動物を誕生させる。キメラ動物は、真の生殖系列トランスジェニック動物を形成するのに繁殖させることができる。
【００６９】
あるいは、上記方法は、所望のドナーポリヌクレオチドのシングルコピーを有する胚幹細胞（ＥＳ）得るために使用することができる。これらの細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで着床前胚から得られる。例えばＨｏｏｐｅｒ， ＭＬ． Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｐｌａｎｎｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ （Ｍｏｒｄｅｒｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｖ．１）， Ｉｎｔ’ｌ． Ｐｕｂ． Ｄｉｓｔｒｉｂ．， Ｉｎｃ．， １９９３； Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９， ２５５−２５８を参照されたい。形質転換ＥＳ細胞を、非ヒト動物由来の杯盤胞と組み合わせる。ＥＳ細胞は、胚のコロニーを形成させ、胚によっては生じたキメラ動物の生殖系列を形成する。Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０： １４６８−１４７４ （１９８８）を参照されたい。あるい生物を再構成することができるＥＳ細胞または体細胞（「体細胞再増殖細胞」）は、除核受精卵母細胞への移植のための核源として使用し、トランスジェニック動物を生み出すことができる。例えば、Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８５： ８１０−８１３を参照されたい。
【００７０】
上述に一般的に記載するように、本発明は、所望の部位特異的組換えを達成する幾つかのストラテジーを提供する。これらのストラテジーには、たとえば第２のポリヌクレオチドによる染色体ポリヌクレオチドの置換を得る方法が含まれる。幾つかの実施形態では、選択マーカーのような望ましくないＤＮＡの非存在下で、所定のポリヌクレオチドを細胞ゲノムに導入する。他の実施形態は、選択マーカーのような望ましくないＤＮＡが、所望の所定のポリヌクレオチドを含む細胞の選択を容易にするためにそれらが使用された後、細胞ゲノムから欠失される方法を提供する。これらの特定のストラテジーについて、以下の実施例でさらに記載している。
【００７１】
本出願全体にわたって、様々な刊行物を参照している。これらの刊行物、およびそれら刊行物全体内に引用した参照文献すべての開示は、本明細書が関連する技術の状況をより完全に記載するために、参照により本出願に援用される。先述の事項は、本発明の好ましい実施形態に関するものであり、本発明の範囲を逸脱することなく多数の変化が本明細書中でなされてもよいこともまた理解されるべきである。本発明は、以下の実施例によりさらに説明するが、それは、いかなる場合においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。それどころか、様々な他の実施形態、修飾およびそれらの均等物に対する方策がなされてもよく、本明細書中の詳細な説明に目を通した後に、本発明の精神および／または併記の特許請求の範囲から逸脱することなく、それが当業者の心に自然に浮かび得ることが明らかに理解されよう。
【００７２】
［実施例］
実施例１
直鎖状または環状標的構築物を用いた遺伝子置換
本実施例は、ストレプトミセス属のバクテリオファージφＣ３１の部位特異的組換え系が、真核細胞中の遺伝子置換ストラテジーにおいて機能することを示す。このストラテジーは、バクテリオファージφＣ３１由来の系のような部位特異的組込み系を利用する。環状ファージＤＮＡ染色体の細菌ゲノム中への挿入は、ｉｎｔによりコードされるインテグラーゼであり、細菌の結合部位ａｔｔＢとファージの結合部位ａｔｔＰとをそれぞれ組換え、ａｔｔＬおよびａｔｔＲとして知られる新たなハイブリッド配列を形成する、単一のポリペプチドφＣ３１タンパク質を必要とする。ａｔｔＢ部位およびａｔｔＰ部位は、交差地点を中心とする５３ｂｐの広がり内に、たった１６個の塩基対マッチを共有する。なお、以下では、記号ＢＢ’、ＰＰ’、ＢＰ’およびＰＢ’を、それぞれａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲと互換的に用いる。ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲの逆配向は、それぞれＢ’Ｂ、Ｐ’Ｐ、Ｐ’ＢおよびＢ’Ｐとして表わす。
【００７３】
物質および方法
組換えＤＮＡ
全体を通して、標準的な方法を用いた。大腸菌株ＸＬ２−Ｂｌｕｅ（ｒｅｃＡ１　ｅｎｄＡ１　ｇｙｒＡ９６　ｔｈｉ−１　ｈｓｄＲ１７　ｓｕｐＥ４４　ｒｅｌＡ１　ｌａｃ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ　ｌａｃ１ｑ　ＺΔＭ１５Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）Ａｍｙ　Ｃａｍｒ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）をＤＮＡ構築物の宿主として機能した。
【００７４】
培地
分裂酵母株を、必要に応じてアデニン、ヒスチジン、ロイシンまたはウラシルを２２５ｍｇ／ｌで補充した最少培地（ＥＭＭ−低グルコース、Ｂｉｏ１０１）で成長させた。５−ＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．製）を加えた最少プレートをＧｒｉｍｍ等（（１９８８） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１５： ８１−８６）にしたがって調製し、アデニン、ヒスチジンおよびロイシンを補充した。使用の際には、チアミンを５μｇ／ｍｌで加えた。
【００７５】
２つのφＣ３１　ａｔｔＰ標的を有するＳ． ｐｏｍｂｅ
ＡｐａＩ−ＳａｃＩ断片としてｐＨＳ２８２（ＴｈｏｒｐｅおよびＳｍｉｔｈ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５ ： ５５０５−５５１０）から単離した、８４ｂｐのφＣ３１　ａｔｔＰ部位（ＰＰ’と略す）を、Ｓ． ｐｏｍｂｅの組込みベクターｐＪＫ１４８（ＫｅｅｎｅｙおよびＢｏｅｋｅ （１９９４） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３６： ８４９−８５６）の同一部位にクローニングし、ｐＬＴ４４を作製した。このプラスミドを、酢酸リチウムによるＮｄｅＩで切断したＤＮＡでの形質転換によりＳ． ｐｏｍｂｅ　ｌｅｕ１−３２対立遺伝子へターゲティングした。ｐＬＴ４４との相同組換えによりＬｅｕ＋に変換されたレシピエント宿主ＦＹ５２７（ｈ−ａｄｅ６−Ｍ２１６　ｈｉｓ３−Ｄ１　ｌｅｕ１−３２　ｕｒａ４−Ｄ１８）を、サザン解析により調べた。ＦＹ５２７ａｔｔＰ（図３Ａ）と示すＬｅｕ＋の形質転換体の１つは、ｐＬＴ４４のシングルコピーを保持していることがわかった。ＦＹ５２７ａｔｔＰｘ２（図３Ｂ）と示す他の形質転換体は、タンデムに挿入されたｐＬＴ４４を保有し、したがって２つのａｔｔＰ部位を含有している。
【００７６】
２つのφＣ３１　ａｔｔＢ部位を含む組込みｕｒａ４＋ベクター
１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片上のｐＴＺｕｒａ４（Ｓ． Ｆｏｒｓｂｕｒｇ）から除去したＳ． ｐｏｍｂｅのｕｒａ４＋遺伝子を、同じ酵素で切断したｐＪＫ１４８に挿入し、ｐＬＴ４０を作製した。５００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片としてｐＨＳ２１から単離したφＣ３１　ａｔｔＢ部位（ＢＢ’と略す）を、これらの酵素で切断したｐＬＴ４０内に連結し、ｐＬＴ４２を作製した。ほとんどのｌｅｕ１遺伝子をＸｈｏＩ断片を欠失させることによりｐＬＴ４２から除去し、ｐＬＴ４５を作製した。これにより、ｐＬＴ４５には２２９ｂｐのｌｅｕ１が残り、その形質転換効率はｌｅｕ１相同性をまったく有さないプラスミドの形質転換効率と同程度まで低下した。ｕｒａ４の他方直近に、同一配向で第２のａｔｔＢ部位を有するｐＬＴ５０を、まず、ａｔｔＢ　ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片をｐＬＴ４２からｐＵＣ１９にサブクローニングし、これをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩＩを用いて除去し、次に、これをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＬＴ４５に挿入することより構築した。最終構築物中の第２のａｔｔＢ部位は、各鎖について一度配列が決定され、第１のａｔｔＢ部位と同一であることがわかった。
【００７７】
直鎖状ＤＮＡの形質転換
ａｔｔＢ−ｕｒａ４＋−ａｔｔＢの直鎖状ＤＮＡを、ｐＬＴ５０から精製したＡｔｔＩＩ−ＡｌｗＮＩ断片として、または、鋳型としてｐＬＴ５０を用いたＰＣＲ生成物として調製した。ＰＣＲは、ｐＪＫ１４８のプラスミド骨格に対応するＴ３プライマーおよび第２のプライマー（５’　ｇｇｃ　ｃｃｔ　ｇａａ　ａｔｔ　ｇｔｔ　ｇｃｔ　ｔｃｔ　ｇｃｃ　３’；配列番号：１）を用い、標準条件を用いて行った。
【００７８】
φＣ３１インテグラーゼの抑制合成
ビタミンＢ１により抑制されるＳ． ｐｏｍｂｅのＰｍｎｔプロモーターを、ｐＭＯ１４７から１．２ｋｂのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片として除去し、同一の酵素で切断したｈｉｓ３＋、ａｒｓ１ベクターｐＢＧ２（Ｏｈｉ等、（１９９６） Ｇｅｎｅ １７４： ３１５−３１８）に挿入し、ｐＬＴ４１を作製した。φＣ３１のｉｎｔコード領域を含む２．０ｋｂのＳａｃＩ断片を、ｐＨＳ３３（ＴｈｏｒｐｅおよびＳｍｉｔｈ （１９９８）、上記）からｐＬＴ４１のＳａｃＩ部位に移入した。発現がＰｍｎｔの制御下にあるようにｉｎｔコード領域が配向しているクローンを、ｐＬＴ４３と表わした。
【００７９】
分子解析
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製のＧｅｎｉｕｓ系を用いてサザン解析を行った。９９８ｂｐのｌｅｕ１の内部ＥｃｏＲＶ断片、１．８ｋｂのｕｒａ４断片、および２．０ｋｂのφＣ３１　ｉｎｔ遺伝子をランダムプライマー法によってジゴキシゲンで標識し、プローブとして用いた。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＴｕｒｂｏ　ＰＦＵ酵素またはＶＥＮＴポリメラーゼを用い、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＣｅｔｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　９６００上で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。標準Ｔ３およびＴ７プライマーを可能な限り用いた。ｕｒａ４プライマー（５’　ｇｔｃ　ａａａ　ａａｇ　ｔｔｔ　ｃｇｔ　ｃａａ　ｔａｔ　ｃａｃ　３’（配列番号：２））およびｐＪＫ１４８プライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。すべてのＰＣＲ反応には、アニーリング温度５１℃および伸長時間３０秒を用いた。
【００８０】
結果および考察
直鎖状ＤＮＡを介した遺伝子置換
本実験は、φＣ３１の部位特異的組換え系は、直鎖状ｃＤＮＡを標的細胞中に送達するための有効な手段であることを示している。ｃＤＮＡ基質を調製するため、直鎖状分子を、その両端の連結反応またはＰＣＲ合成の結合部位により連結し、その後、染色体上に位置する標的部位のタンデム対と組換え、挿入用ｃＤＮＡと標的ＤＮＡを置換することとなる。このような遺伝子置換反応が有効かどうかを試験するため、タンデムに挿入されたｐＬＴ４４を有するＦＹ５２７誘導体を単離した。ＦＹ５２７ａｔｔＰｘ２と示されるこの株は、ｌｅｕ１遺伝子およびベクター配列によって分離される、ｌｅｕ１遺伝子座にある２つの直接配向のａｔｔＰ部位を有する（図２Ｂ）。ＦＹ５２７ａｔｔＰｘ２をａｔｔＢ部位に隣接したｕｒａ４＋を含む直鎖状ＤＮＡで形質転換した。直鎖状基質は、ｐＬＴ５０（図２Ａ）からゲル精製断片として、または、このプラスミドの増幅物からＰＣＲ生成物として得られた。ｐＬＴ４５由来のプラスミドｐＬＴ５０は、ｕｒａ４＋遺伝子の他方側に、第２の直接的に配向されたａｔｔＢ部位を有する。両方の直鎖状基質とも、ｐＬＴ４３で同時形質転換した場合、ほぼ同一の形質転換効率を与え、Ｕｒａ＋形質転換体の数を刺激した（表１）。いくつかの実験では、その頻度は、複製プラスミドの対照の頻度と同程度に高かった。
【００８１】
２つの５’部位と２つの３’部位との間で起きる組換えを伴う、意図する遺伝子置換の事象を、図２Ｂに示す。２つの交差は同時にではなく順次に起こり得るが、最終生成物は同一である（図２Ｃ、クラス１）。８つの代表的なＵｒａ＋　Ｈｉｓ−のクローンのＸｂａＩ制限パターンを調べると、７つが３つのクラスに分けられるパターンを示した。これらのうちの３つはクラス１のパターンを有し、この場合、ｌｅｕ１プローブは３ｋｂおよび２０ｋｂのバンドにハイブリダイズし、ｕｒａ４プローブは２０ｋｂのバンドにハイブリダイズした（図２Ｃ）。第２および第３のクラスは、ａｔｔＰ標的への部位特異的挿入の前の、直鎖状断片の以前の環化に起因すると思われる事象を示す。図２Ｄは、複製されたａｔｔＢ部位間の組換えに起因するであろう環化反応を示す。環状体の５’ａｔｔＰ部位への組込みは、プラスミドのバンドサイズを５．５ｋｂから７．４ｋｂまで増大させる。このバンドは、ｕｒａ４およびｌｅｕ１の双方のプローブにハイブリダイズすることになる（図２Ｅ、クラス２）。このパターンは、１つの形質転換体に見出された。３’ａｔｔＰ部位への組込みは、１８ｋｂのバンドを２０ｋｂまで増大させ、これにより両方のプローブでの検出が可能となる（図２Ｆ、クラス３）。このパターンは、３つの形質転換体に見出された。残りのクローンは、２つのｕｒａ４のコピーと、他のｌｅｕ１のコピーとを有し、これは、ｌｅｕ１遺伝子座での遺伝子増幅を示唆している。これについては、これ以上解析しなかった。
【００８２】
【表１】
2004504055.tif 000003
【００８３】
環状ＤＮＡを介した遺伝子置換
直鎖状ＤＮＡの形質転換から回収したクラス２および３の構造は、環状中間体を示唆する。しかし、直鎖状断片は、容易にアニーリングし得る相補性の一本鎖の末端を有していない。この分子構造は、ａｔｔＢ部位間の分子内再結合、または、２つの末端間のある種の連結反応のいずれかに合致している。おそらく、高い環化率は、直鎖状のＤＮＡ末端によって促進されたものである。二本鎖の分解は酵母における遺伝子組換えを刺激することから（Ｓｚｏｓｔａｋら、（１９８３） Ｃｅｌｌ ３３： ２５−３５）、直鎖状末端は、より容易にストランドに入り込むか、または、末端と連結し得る。これが真実である場合、クラス２および３の組込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）は、環状ＤＮＡの使用により最小化されることとなる。
【００８４】
ＦＹ５２７ａｔｔＰｘ２の形質転換について、ｐＬＴ５０プラスミドＤＮＡを用いて調べた（表１参照）。この形質転換由来の８つの代表的なＵｒａ＋　Ｈｉｓ−クローンの組込み構造について解析した。８つのクローンのうちの６つは、同じ３つのクラスに、すなわち３つはクラス１に、１つはクラス２に、２つはクラス３に分けられた。クラス２および３の組込み体が優勢であることは、複製されたａｔｔＢ部位間の組換えが直鎖状基質を必要としないことを示している。この事象がＳ． ｐｏｍｂｅまたはφＣ３１インテグラーゼのいずれによって促進されるかは、いまだ決定していない。１つの可能性としては、インテグラーゼがａｔｔＰが存在しなくてもａｔｔＢと相互作用することが考えられる。φＣ３１インテグラーゼは、各ＤＮＡ基質の二本鎖を分解させることにより組換えを触媒する、インベルターゼ−レゾルバーゼクラスの酵素の一員である。これがａｔｔＢ部位で発生するのであれば、二本鎖の分解は、一般化された相同組換え系を補充するものとなり得る。しかし、このような組換えは精製成分を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏの研究では検出されていない（Ｔｈｏｒｐｅ， Ｈ． Ｍ．およびＳｍｉｔｈ， Ｍ． Ｃ． Ｍ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： ５５０５−５５１０）。あるいは、内因性Ｓ． ｐｏｍｂｅの組換え遺伝子はこのプラスミドの再構成を促進し得る。プラスミド上の直接反復の間の相同性を最少まで、すなわち、ａｔｔＢでは３４ｂｐ、そしてａｔｔＰでは３９ｂｐ（Ｇｒｏｔｈら、（２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ５９９５−６０００）まで減らすことにより、この望まない副反応の頻度を低下させ得る。
【００８５】
組込み構造のこれら３つのクラスの他に、ａｔｔＢｘａｔｔＰ部位の不完全な組換えに起因する組込みパターンの可能性が存在する。これは、ｐＬＴ４３が細胞から失われた場合と同様に、インテグラーゼタンパク質の量が制限される場合に起こりうる。Ｈｉｓ＋表現型が選択されなかった場合には、Ｈｉｓ−のコロニーを容易に発見することができる。４つの部位間における単一の組換え事象から４つの可能な構造が発生し得る；５’ａｔｔＢ×５’ａｔｔＰ、３’ａｔｔＢ×３’ａｔｔＢ、３’ａｔｔＢ×５’ａｔｔＰおよび５’ａｔｔＢ×３’ａｔｔＰ。引き続いて第２のａｔｔＢ×ａｔｔＰ反応が発生する場合には、５’ａｔｔＢ×５’ａｔｔＰおよび３’ａｔｔＢ×３’ａｔｔＢの組込み体はクラス１構造に変換され、ｕｒａ４＋マーカーは消失するので、３’ａｔｔＢ×５’ａｔｔＰおよび５’ａｔｔＢ×３’ａｔｔＰの組込み体は見出されない。８つの単離物のうちの１つは、５’ａｔｔＢ×５’ａｔｔＰ反応を通した無傷のｐＬＴ５０の取り込みに一致するパターンを示す。このクラス４構造を図１Ｇに示す。ｕｒａ４プローブは２．３ｋｂの単一バンドを検出し、ｌｅｕ１プローブは３ｋｂ、５．６ｋｂおよび１８ｋｂのバンドを検出した。ＮｄｅＩを用いた切断により、ｌｅｕ１およびｕｒａ４プローブの両方にハイブリダイズする１２ｋｂのバンドが得られ、これは２つのマーカーの物理的結合に一致する。残りの単離物は完全なプラスミドを取り込むだけでなく、ｌｅｕ１およびｕｒａ４の両方にハイブリダイズする他のバンドも有していた。これは、より複合的な事象を示し、おそらく、遺伝子座における遺伝子増幅を示す。
【００８６】
ＦＹ５２７ａｔｔＰｘ２株への組込みについても、５’ａｔｔＰまたは３’ａｔｔＰのいずれかの部位で染色体中に挿入することができるインタクトのｐＬＴ４５（図３Ａ）を用いて調べた。染色体中のさらなるａｔｔＰ標的は、形質転換効率を有意に変化させなかった。ｐＬＴ４３を用いて得られたＨｉｓ＋の形質転換体の数だけ正規化すると、φＣ３１インテグラーゼが媒介するＦＹ５２７ａｔｔＰｘ２の形質転換の効率は、ｐＬＴ４５を用いたＦＹ５２７ａｔｔＰの形質転換に匹敵するものであった。標的およびドナー分子の両方の、このように複製された部位は、遺伝子置換ストラテジーで観察される増大した形質転換頻度に必要と思われる。
【００８７】
インテグラーゼＤＮＡの最適濃度の決定
ｐＬＴ５０（図３Ｂ）を用いたＦＹ５２７ａｔｔＰｘ２およびｐＬＴ４５（図３Ａ）を用いたＦＹ５２７ａｔｔＰの形質転換を、ある範囲のｐＬＴ４３のＤＮＡ濃度（０、０．１、１、５、１０ｍｇ）を用いて行った。図３は、両方の組の形質転換が、ｐＬＴ４３ＤＮＡ５ｍｇを用いた場合にＵｒａ＋のコロニーのピーク数をもたらすことを示す。ｐＬＴ５０／ＦＹ５２７ａｔｔＰｘ２の形質転換では、ｐＬＴ４５／ＦＹ５２７ａｔｔＰの形質転換と比較して４〜１４倍多い数の形質転換体が産生された。この観察は、上記で考察した結果と一致する。しかし、正確な事象の頻度がより低く、ｐＬＴ４５については８８％であるのに対してｐＬＴ５０については３８％であることにより、より高い形質転換頻度は相殺される。
【００８８】
要約
本実施例は、２重部位での組換え反応が非常に効率的であることを示す。正確な遺伝子置換事象頻度は、複製プラスミドベクターの形質転換効率の約１４％〜２４％である（表１）。図３Ｃは、最適なインテグラーゼ遺伝子濃度において、転換効率が複製プラスミドが達するレベルまでさらに上昇することを示す。複製プラスミドの高い形質転換効率は、細菌および酵母の機能選択によるクローニングを可能とする。これらの結果は、直接選択によるクローニングもまた、２つの部位でのφＣ３１の組換え系で実現され得ることを示す。直鎖状ｃＤＮＡ分子のライブラリは、クローニングベクター系を経る必要はない。代わりに、隣接ａｔｔ部位により連結し、動物または植物細胞のゲノムａｔｔ−ａｔｔ標的に直接導入することができる。
【００８９】
直鎖状ＤＮＡに由来する環状分子の組込みから構成される競争的な副反応が観察されるものの、これらの望まれない事象は、最小の機能結合部位を用いることにより最小に抑えることができる。加えて、２つのａｔｔＰ部位間の、標的部位のＤＮＡがネガティブ選択マーカーをコードしていた場合には、マーカーの全体が置換された場合のみが検出されることになる。
【００９０】
実施例２
ゲノムプロモーターの背後への発現コード領域の挿入
本実施例は、選択マーカーの同時導入を必要としない遺伝子置換ストラテジーによる、所定の動物染色体標的へのＤＮＡ断片の送達のための一般的なストラテジーを例示する。置換ストラテジでは宿主ＤＮＡの対応する断片が損失することになるので、対抗選択マーカーの損失が遺伝子置換の選択基準となりうる。このアプローチでは、さらなる不要なＤＮＡを取り込むことなく、形質遺伝子が正確に組込まれることとなる。
【００９１】
本実施例は、本方法が、宿主細胞に存するゲノムプロモーターの背後への直接的な配置を介する、ｃＤＮＡ分子の機能的発現を試験するのに有用であることも例示する。これにより、大腸菌の増殖用ベクター中、例えば、プラスミドまたはファージベクター中にｃＤＮＡを先にクローニングする必要は回避される。研究者はデータベースから遺伝子配列を選択し、その遺伝子配列に対応する適当なプライマーを作製し、選択したｍＲＮＡ配列を選択的に逆転写させ、そのｃＤＮＡを形質転換に十分な量まで増幅させることができる。ｍＲＮＡから産生されたｃＤＮＡは合成ａｔｔＰまたはａｔｔＢ部位に連結し、遺伝子置換ストラテジーに直接使用することができる。本例では、ａｔｔＢの合成オリゴマーはｃＤＮＡを同一配向で隣接するように設計されている。
【００９２】
方法
標的構築物は、Ｐｃ−ａｔｔＰ−ｔｋ−Ｐｓ−ｚｅｏ−ａｔｔＰ断片から構成されている（図４）。用いられている略号：Ｐｃはヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ｔｋはチミジンキナーゼコード領域、ＰｓはＳＶ４０初期プロモーター、ｚｅｏはゼオマイシン耐性コード領域。本例のａｔｔＰ部位は、上記φＣ３１系のような不可逆的組換え系のクラスに属する組換え部位である。Ｐｓ−ｚｅｏ断片により、宿主ゲノム中の標的構築物の選択が可能となる。ｔｋ遺伝子は、対抗選択マーカーである。適当な培養条件下で、機能性のｔｋ遺伝子が欠失した細胞が生存する一方、機能性のｔｋ遺伝子を保持するものは生じない。他の選択マーカー、対抗選択マーカーおよびプロモーターの使用も可能である。
【００９３】
組込み構築物は、同一配向のａｔｔＢ部位の組に隣接した遺伝子断片から、本例では、ｃＤＮＡから構成される（図４）。もしｔｋの上流のａｔｔＰがｃＤＮＡの５’末端の上流にあるａｔｔＢと組換わり、ｚｅｏの下流のａｔｔＢがｃＤＮＡの３’末端の下流のａｔｔＢと組換わると、次にこの二重の組換えの事象、ゲノムからｔｋ遺伝子を除去することになる。この遺伝子置換はＰｃ−ａｔｔＲ−ｃＤＮＡ連結を選択し、ｃＤＮＡの発現をもたらす。組換えの他の可能な組合せは、染色体を分解することとなる。
【００９４】
実施例３
ヒトゲノムにおける遺伝子置換
本実施例は、所定の哺乳動物の染色体標的にＤＮＡ断片を送達するための、実施例２におけるよりもより詳細なストラテジーを例示する。好ましくは、哺乳動物の染色体標的は、ヒト染色体標的である。本実施例は、ｃＤＮＡ分子が、ゲノム標的発現プロモーターの背後、センスまたはアンチセンス配向に、部位特異的に挿入可能であることを示す。ｃＤＮＡの発現が表わす表現型は、遺伝子機能の手がかりを解明し得るものであるから、このｃＤＮＡの組込みストラテジーは機能性ゲノムの解析のためのツールとなりうる。
【００９５】
方法
組換えＤＮＡ
全体にわたって、標準的なクローニング方法を使用した。ＤＮＡクローニングに用いた大腸菌株ＪＭ１０９［Ｆ’ｔｒａＤ３６　ｌａｃＩｑ　Ｄ（ｌａｃＺ）Ｍ１５　ｐｒｏＡ＋Ｂ／ｅ１４−（ＭｃｒＡ−）　Ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）　ｔｈｉ　ｇｙｒＡ９６（Ｎａｌｒ）　ｅｎｄＡ１　ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−ｍｋ＋）　ｒｅｌＡ１　ｓｕｐＥ４４］は、Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ中で成長させた。
【００９６】
対照ｈｐｔ発現構築物
ハイグロマイシン耐性遺伝子のコード領域であるｈｐｔ断片を、ｐ３５Ｓ−ｈｐｔ（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｊ．： ６４９−５９）をＳａｌＩで切断したものから回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋／−）のＳａｌＩ部位にサブクローニングした。次に、ｈｐｔ遺伝子を含む、このプラスミドからのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ断片を、ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、カールズバッド、カリフォルニア州）のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｈｐｔは、ヒト部位メガロウイルスプロモーターであるＰｃ由来のｈｐｔを発現する。
【００９７】
φＣ３１インテグラーゼ発現ベクター
ｐＪＨＫ１（図５Ａ）はＰｃ−ｉｎｔ断片を有し、ここで、ｉｎｔはφＣ３１インテグラーゼコード領域である。ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏをＮｓｉＩおよびＢｓｍＩで切断し、ゼオシン耐性コード領域（１，８００ｂｐ〜２，７６７ｂｐ）から構成される断片をほとんど除去した。残ったベクターは平滑末端連結反応によって再環化した。φＣ３１インテグラーゼ遺伝子を含む１．９ｋｂのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ゼオシン感受性のｐｃＤＮＡ３．１誘導体のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＪＨＫ１を生成した。φＣ３１インテグラーゼ断片のＮｈｅＩに近い末端は、合成コザック（Ｋｏｚａｋ）配列（５’−ＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＣＴＴＡＣＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣ−３’；配列番号：３）を有する。
【００９８】
逆に配向されたφＣ３１ａｔｔＢ部位に隣接したｈｐｔベクターの組込み
ｐＪＨＫ２（図５Ｃ）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋／−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）骨格中にＢＢ’−ｈｐｔ−Ｂ’Ｂ断片を含有し、ここで、ＢＢ’およびＢ’Ｂはそれぞれ直接配向および間接配向のφＣ３１ａｔｔＢ部位である。ｈｐｔ断片はｐ３５Ｓ−ｈｐｔ（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５、前出）のＳａｌＩによる切断から得られ、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋／）のＳａｌＩ部位にサブクローニングすることにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｈｐｔを作製した。５３ｂｐのＫｐｎＩ−ＢＢ’−ＫｈｏＩオリゴ（５’−ＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＣＡＣＣＴ−３’；配列番号：４）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｈｐｔの対応する部位に挿入し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＢＢ’−ｈｐｔを生成した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＢＢ’−ｈｐｔの対応部位への挿入のためにＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として回収する前に、ＫｐｎＩ−ＢＢ’−ＸｈｏＩリンカーをｐＭＥＣＡ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ． ２４： ６， ９２２−９２５， １９９８）にさらにサブクローニングして、ｐＪＨＫ２を生成した。
【００９９】
逆位ａｔｔｐ部位により隣接したｔｋを有するゲノム標的
ｐＪＨＫ３（図５Ａ）は、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ骨格中にＰｃ−ＰＰ’−ｔｋ−Ｐ’Ｐ断片を含有し、ここで、ｔｋはヒト単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼコード領域であり、ＰＰ’およびＰ’Ｐは、それぞれ、直接配向および間接配向のφＣ３１ａｔｔＰ部位である。２つの５３ｂｐのφＣ３１ａｔｔＰ部位（５’−ＡＧＴＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＣＧＴＡＧＧＧ−３’；配列番号：５）を、適当な隣接制限酵素部位を用いて合成した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐ’Ｐ−ＡｆＩＩＩのオリゴを、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏの対応する部位に挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｐ’Ｐを生成した。ｐＩＣ１９Ｒ／ＭＣ１−ＴＫ由来の１．８５ｋｂのＫｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　ｔｋ断片（Ｋｉｒｋ Ｔｈｏｍａｓ博士、ユタ大学）を対応部位に結合させ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｔｋ−Ｐ’Ｐを生成した。ｔｋ遺伝子は、１４７ｂｐのエンハンサーをその５’末端に含む。ＮｈｅＩ−ＰＰ’−ＸｈｏＩオリゴをｐｃＤＮＡ３．１−ｔｋ−Ｐ’Ｐの対応部位に挿入し、ｐＪＨＫ３を作製した。
【０１００】
標的細胞系
ｐＪＨＫ３構築物を、製造業者の指示に従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ガイザースバーグ、メリーランド州）を使用して、ヒト細胞系２９３Ｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、メリーランド州）にトランスフェクトした。細胞は、１０％のウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。ｐＪＨＫ３構築物は、ｔｋ遺伝子の上流に単一のＸｈｏＩ部位を有し、下流に単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する。３２個の安定してトランスフェクトされた細胞系由来のＤＮＡを、ｔｋプローブを用いるサザンハイブリダイゼーションのために、ＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで切断した。２つの細胞系は、ＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩのいずれかで切断したＤＮＡにおいて単一のハイブリダイゼーションバンドを示し、これは、組込み分子のシングルコピーの存在を示唆する。ａｔｔＰ部位を切断するＢｓｔＥＩＩで切断したＤＮＡにハイブリダイズすることにより、予想される２ｋｂの内部ｔｋ断片が明らかとなった。
【０１０１】
ガンシクロビル耐性解析
ｔｋ遺伝子の機能発現をガンシクロビル（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）処理によって試験した。細胞は２４ウェルの組織培養プレート（１×１０３細胞／ウェル）中に接種し、一晩成長させた。ガンシクロビル（０〜５０ｍＭの範囲）を各ウェルに添加し、細胞成長を数日間観察した。野生型の２９３Ｔ細胞はガンシクロビルに対して試験した最高濃度（５０ｍＭ）まで非感受性であったのに対し、単一のＰｃ−ＰＰ’−ｔｋ−Ｐ’Ｐ断片を備えた２つの細胞系はガンシクロビルに感受性であった。
【０１０２】
φＣ３１インテグラーゼを介した組換え
ｐＪＨＫ１およびｐＪＨＫ２の双方を４μｇずつ、ｐＪＨＫ３のシングルコピーを保有する１×１０６個の２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションから３日後、細胞を順に希釈して、５０ｍＭのハイグロマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）またはガンシクロビルを含む新鮮なＤＭＥＭに移した。耐性のある細胞をトランスフェクションから約１４日後に単離し、さらに解析した。直鎖状ＤＮＡのトランスフェクションのため、ＢＢ’−ｈｐｔ−Ｂ’Ｂの直鎖状断片を、ｐＪＨＫ２から精製したＫｐｎＩ断片として調製した。
【０１０３】
分子解析
製造業者のマニュアルに従ってＱＩＡａｍｐＲ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して２９３Ｔ細胞からゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムのサザンハイブリダイゼーションを標準プロトコルで行い、ここで、ＤＮＡプローブは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製のｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（カタログ番号１００４７６０）を使用して作製した。
【０１０４】
結果および考察
比較ゲノム解析や転写プロファイリング解析に関係するようなｍＲＮＡは、ａｔｔＰ末端を備えたプライマーを用いるＰＣＲによって選択的に増幅させることができる。図５Ａに示すように、ａｔｔＰ末端は逆配向を向き、これにより、ｃＤＮＡは標的中いずれの配向でも挿入可能である。二重の組換え反応は、センス発現（図５Ａ）またはアンチセンス発現（図５Ｂ）のために標的プロモーターの背後でｃＤＮＡを融合させ、これにより、遺伝子産物の過剰または過少産生がもたらされ得ることが予想される。付随的に、対抗選択性遺伝子の損失は、部位特異的遺伝子置換の検出を提供することとなる。以下の図面では、プロモーターを明示しているが、単純化のため、転写の終結を促進し各コード領域の下流に位置する配列であるターミネーターは、別個のエレメントとして示していない。
【０１０５】
シングルコピー標的細胞系
直鎖状ＤＮＡ断片の選択的挿入のためにヒトゲノム中の標的部位を作製するため、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏベクター骨格中にＰｃ−ＰＰ’−ｔｋ−Ｐ’Ｐ断片を有するｐＪＨＫ３構築物を、ヒト細胞系２９３Ｔにトランスフェクトした。ｔｋ遺伝子の発現は、ヌクレオシドのアナローグであるガンシクロビルに対する感受性を付与する。ベクター骨格はゼオシン耐性遺伝子を含むので、ｐＪＨＫ３のランダム組込みから得られたゼオシン耐性のコロニーを精製し、サザンハイブリダイゼーションによって解析した。
【０１０６】
標的細胞系の分子解析
３２個の細胞系由来のゲノムＤＮＡをＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｔｋＤＮＡをプローブとした。ＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩは、ｔｋの上流または下流をそれぞれ一度切断する。ｔｋプローブにハイブリダイズすることにより、挿入されたｐＪＨＫ３の両側に導入遺伝子の宿主ＤＮＡの境界の断片が明らかとなる。ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ中に検出された単一のハイブリダイゼーションバンドにより、ｐＪＨＫ３の挿入されたシングルコピーの存在が示されることになる。２つの細胞系、ＪＨＫ３ａおよびＪＨＫ３ｂは、この予想を満たした。ＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩの断片サイズは予想されなかったが、これは、この断片がＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩの宿主切断部位の最も近い位置に依存することによる。細胞系ＪＨＫ３ａについては、ＸｈｏＩで切断したＤＮＡ中におよそ７ｋｂの単一バンドが、また、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＤＮＡ中におよそ７ｋｂの単一バンドが明らかとなった。細胞系ＪＨＫ３ｂは、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ中に、それぞれおよそ１３ｋｂの単一バンドおよびおよそ１０ｋｂの単一バンドを示した。
【０１０７】
構造的には、Ｐｃ−ＰＰ’−ｔｋ−Ｐ’Ｐ断片は、両方の細胞系において完全であった。ａｔｔＰ配列は、ＢｓｔＥＩＩ部位を含んでいた。ＢｓｔＥＩＩによる切断により、ｔｋプローブにより検出されるおよそ２ｋｂの単一のｔｋ断片が放出され、両方の系がこのパターンを示した。Ｐｃ−ＰＰ’−ｔｋ−ＰＰ’断片は、ｔｋの発現に対しても機能性であった。これらの２つの細胞系において、成長培地へのガンシクロビルの添加は、成長培地の色変化がないことおよび顕微鏡試験によって確認されたように、試験した最低濃度（１ｍＭ）においても、代謝活性の停止をもたらした。これに比して、非トランスジェニック親系は、試験した最高濃度（５０ｍＭ）までガンシクロビルへの耐性があり、成長培地は赤みがかった色から黄色みがかった色へと変色し、細胞は増殖した。
【０１０８】
簡単のため、図５ではＰｃ−ＰＰ’−ｔｋ−Ｐ’Ｐ断片の下流にゼオシン耐性マーカーを示すが、分子データは、これが上流にあっても適合し得ることを示した。選択マーカー遺伝子の相対配置は重要ではないので、その正確な位置は決定しなかった。
【０１０９】
標的遺伝子座へのｈｐｔの交換
ゲノム標的でＤＮＡ交換反応を行う概念を試験するため、細胞系ＪＨＫ３ａおよびＪＨＫ３ｂにｐＪＨＫ２を、φＣ３１インテグラーゼを発現する構築物であるｐＪＨＫ１とともにまたは、それだけでトランスフェクトした。構築物ｐＪＨＫ２はＢＢ’−ｈｐｔ−Ｂ’Ｂ断片を含み、ここで、ＢＢ’およびＢ’Ｂはそれぞれ５３ｂｐのａｔｔＢ配列の順配向または逆位を示す（図５Ｃ）。ｈｐｔ　５’−ａｔｔＢおよびｔｋ　５’−ａｔｔＰの間の組換えにより、Ｐｃはｈｐｔと連結し、これにより、ｈｐｔの発現とハイグロマイシン耐性の付与とが可能となる。しかし、ｈｐｔ　５’−ａｔｔＢおよびｔｋ　３’−ａｔｔＰの間の組換えにより、Ｐｃはｈｐｔのアンチセンス配向と連結し、細胞はハイグロマイシン感受性を維持することとなる。したがって、回収されたハイグロマイシン耐性コロニーの数は、全ＤＮＡ標的事象の半分のみを示す。
【０１１０】
表２は、２つの細胞系を用いたトランスフェクションの結果を列挙する。ｈｐｔ遺伝子を発現するＰｃ−ｈｐｔ断片を保有する対照プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｈｐｔ（図５Ｄ）は、細胞１００万個当たりおよそ３，２００個のハイグロマイシン耐性コロニーが得られる。これは、ランダム組込み頻度が約０．３％であることを示す。ｐＪＨＫ１およびｐＪＨＫ２の両方をトランスフェクトした場合には、およそ８８〜５５０のハイグロマイシン耐性コロニーが回収された。標的事象の半分のみがハイグロマイシン耐性として計測されたと仮定すると、これはおよそ１８０〜１，１００の標的事象、または、およそ２．８％〜１７％の間のランダム形質転換頻度となる。対して、ハイグロマイシン耐性コロニーは、ｐＪＨＫ１またはｐＪＨＫ２のいずれか一方がトランスフェクション基質としたときには見出されなかった。
【０１１１】
ハイグロマイシン耐性の表現型は、ｈｐｔがゲノムプロモーターの背後に組込まれたことを示す。ハイグロマイシン耐性コロニーは対照、すなわち、ｐＪＨＫ１を伴わずにｐＪＨＫ２でトランスフェクトしたものからは回収されず、したがって、耐性表現型はｈｐｔ５’−ａｔｔＢ部位とｔｋ　５’ａｔｔＰ部位との間の組換えにより、Ｐｃ−ｈｐｔ接合が形成されることによるものであるはずである。ｈｐｔ　３’−ａｔｔＢ部位とｔｋ　３’−ａｔｔＰ部位との間でも組換えが生じたかどうかを試験するため、代表的なクローンをＰＣＲで解析した。ｈｐｔと、ｔｋ　３’ａｔｔＰ配列に隣接するＤＮＡとに対応するプライマーを、代表的なハイグロマイシン耐性クローンについてＰＣＲ反応に用いた（図５Ｆ）。予想される１．２ｋｂのＰＣＲ産物が８つの代表的なクローンのすべてにおいて検出されたが、先祖であるＪＨＫ３ａまたは２９３Ｔからは検出されなかった。これは、ｈｐｔ　５’−ａｔｔＢとｔｋ　５’−ａｔｔＰの配列との間（センス配向）の組換えが、ｈｐｔ　３’−ａｔｔＢとｔｋ　３’−ａｔｔＰとの間の組換えによって達成され得ることを示す。同様に、ｈｐｔ　５’−ａｔｔＢとｔｋ　３’−ａｔｔＰの配列との間（アンチセンス配向）の組換えがｈｐｔ　３’−ａｔｔＢおよびｔｋ−５’−ａｔｔＰの間の組換えによって達成され得ることが予想される。これらの二重の組換え反応により、ｔｋＤＮＡを除外して交換される。
【０１１２】
ＤＮＡ標的由来のガンシクロビル耐性
ｈｐｔ　５’−ａｔｔＢとｔｋ　５’−ａｔｔＰとの間の組換えにより、Ｐｃはｈｐｔに連結するだけでなく、ｔｋをＰｃから除く。それゆえ、標的の事象は、ガンシクロビル耐性の表現型を産生すると予想される。ハイグロマイシンのクローンを５０μＭのガンシクロビルを含む培地上に移すと、その１週間後、１２個のクローンのうち９個がこのヌクレオシドアナローグに対してはっきりとした耐性を示した。他のクローンはガンシクロビルに対して感受性、または低レベルの耐性を示した。感受性または低い耐性の表現型には、様々な理由が考えられる。例えば、細胞の代謝状態に応じて、先に合成されたｔｋタンパク質が細胞からなくなるのにより時間を要することがある。また、標的遺伝子座から外部に交換されたｔｋ遺伝子が他のゲノムのどこかに組込まれていることもある。
【０１１３】
まとめとして、ハイグロマイシンに対する耐性と、ガンシクロビルに対する感受性と、正しい分子結合とを示すクローンの回収は、図５Ａに示すようなＤＮＡ交換の事象と一致する。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
実施例４
直鎖状ＤＮＡ分子を用いた植物細胞における遺伝子置換
本実施例は、植物細胞の直鎖状ＤＮＡ分子を用いた遺伝子置換のためのストラテジーを示す。実施例２と比較して、本実施例は２つのさらなる特長を含む。第１に、宿主細胞はインテグラーゼまたはリコンビナーゼタンパク質を産生し、それゆえ、同時形質転換用インテグラーゼまたはリコンビナーゼ発現構築物は必要とされず、第２に、形質遺伝子は逆位ａｔｔＢ部位に隣接している。これにより、遺伝子断片をゲノムプロモーターの背後にいずれかの配向で配置することが可能となる。一方の配向ではセンス転写が起こり、他方の配向ではアンチセンス転写が起こることとなる。センス発現は遺伝子の過剰発現を導く可能性があり、一方で、アンチセンス発現は対応する宿主遺伝子または遺伝子ファミリーの抑制を導く可能性がある。
【０１１６】
図６は、２つの特異的な構築物を用いた一般的なストラテジーを示す。標的構築物はＲＢ−ｐ−ａｔｔＰ−ｉｎｔ−３５Ｓ−ｃｏｄＡ−３５Ｓ−ｎｐｔ（逆位ａｔｔＰ）−ＬＢ断片から構成される。以下のような略称が用いられる：Ｐはプロモーター、３５ＳはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ｃｏｄＡはシトシンデアミナーゼ遺伝子コード領域、ｎｐｔはカナマイシン耐性遺伝子コード領域。ａｔｔＰ部位および対応するｉｎｔ遺伝子は、φＣ３１系のような不可逆的組換え系のクラスに属する。ＲＢおよびＬＢは、アグロバクテリウム属媒介性遺伝子移入に由来する、左右のＴ−ＤＮＡの境界の配列を示す。３５Ｓ−ｎｐｔ断片により、宿主ゲノム中の標的構築物の選択が可能となる。ｃｏｄＡ遺伝子は、シトシンデアミナーゼをコードする対抗選択マーカーであり、補充性の５−フルオロシトシンを毒性の５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）に変換することができる酵素であるシトシンデアミナーゼをコードする。５−フルオロシトシンを培養培地に添加した場合には、機能性のｃｏｄＡ遺伝子を失った細胞のみが生き残ることになる。他の選択マーカー、対抗選択マーカーおよびプロモーターを使用することができる。
【０１１７】
組込み構築物は遺伝子断片、本例では、逆位ａｔｔＢ部位の組に隣接したｃＤＮＡから構成される。ｃｏｄＡの対抗選択マーカーが失われることとなる２つの可能な配置が実現され得る。一方の配置では、ｃＤＮＡはセンス配向に転写される（図６Ａ）。他方の配置では、ｃＤＮＡはアンチセンス配向に転写される（図６Ｂ）。
【０１１８】
実施例５
遺伝子を染色体および除去した外来性ＤＮＡに導入するための２つのリコンビナーゼ系の使用
本実施例は、遺伝子を所定の染色体標的に送達した後、不要なＤＮＡの除去を行うための２つの異なる組換え系を組み合わせるための一般的なストラテジーを例示する。このストラテジを図７に図示する。
【０１１９】
方法
図７に、２つの特定構築物を用いた一般的なストラテジーを示す。レセプター構築物は、組換え部位が配列において同一またはほぼ同一である組換え系のクラスに属する１組の逆位組換え部位に隣接した、Ｐ−ａｔｔＰ−ｉｎｔ−Ｐ−ｓｅｌ１断片から構成される。これらの組換え系は、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系、ＦＬＰ−ＦＲＴ系、Ｒ−Ｒｓ系およびβリコンビナーゼ−ｓｉｘ系を含む。Ｐはプロモーターを、ｓｅｌ１は選択マーカーを、ｉｎｔは各ａｔｔＰ部位に対応するインテグラーゼまたはリコンビナーゼコード領域を示す。本例におけるａｔｔＰ部位は、図７Ａに示されるφＣ３１系のような不可逆的組換え系のクラスか、または、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系、ＦＬＰ−ＦＲＴ系、Ｒ−Ｒｓ系、もしくはβリコンビナーゼ−ｓｉｘ系のような、図７Ｂに示すような可逆的組換え系のクラスのいずれかに属する組換え部位であってもよい。
【０１２０】
ドナー組込み構築物は、ａｔｔＢ−ｓｅｌ２−Ｐ−ｔｒａｉｔから構成され、ここで、Ｐ−ｔｒａｉｔは、組換え部位が配列において同一またはほぼ同一である組換え系のクラスに属する逆位組換え部位の組に隣接している。「Ｔｒａｉｔ」は、ゲノムへと操作される形質を与える遺伝子である。本例のａｔｔＢ部位は、φＣ３１系のような不可逆的組換え系のクラスか、または、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系、ＦＬＰ−ＦＲＴ系、Ｒ−Ｒｓ系やβリコンビナーゼ−ｓｉｘ系のような、可逆的組換え系のクラスのいずれかに属する組換え部位であってもよい。
【０１２１】
工程１：逆位組換え部位に隣接したＰ−ａｔｔＰ−ｉｎｔ−Ｐ−ｓｅｌ１標的構築物を、従来の形質転換法により宿主ゲノムに挿入する。所望の場合には、逆位組込み部位を用い、例えば、米国特許第６，１１４，６００号に記載されているような複雑な組込みパターンの分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）により、シングルコピーの導入遺伝子の構築を容易にすることも可能である。あるいは、シングルコピートランスジェニックレシピエントは、分子スクリーニング法によって得ることができる。
【０１２２】
工程２：組込み構築物を、標的構築物を含む遺伝子導入細胞系である標的系に形質転換する。本例では、標的系はインテグラーゼまたはリコンビナーゼを産生する。標的系がインテグラーゼまたはリコンビナーゼを発現しない場合、インテグラーゼまたはリコンビナーゼに対応する遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を組込み構築物とともに同時導入してもよい。組込み構築物は、ａｔｔＰｘａｔｔＢの組換えによってゲノム標的に組込まれる。これにより、形質遺伝子が、形質遺伝子の機能に必要とされず組換え部位により挟まれたＤＮＡの部位特異的欠失によって除去され得る２組の断片の間に配置される。
【０１２３】
工程３：次に、２組の不要なＤＮＡを挟む組換え部位に対応するリコンビナーゼ、またはリコンビナーゼ遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を、安定なあるいは一過性のいずれかの方法により宿主細胞に導入する。例えば、リコンビナーゼ遺伝子の安定な導入は、遺伝子交差、または、安定な形質転換の別の過程を通すことができる。リコンビナーゼの一過性の導入は、タンパク質またはｍＲＮＡ分子を送達する形質転換方法、または、ＤＮＡ分子の安定な組込みにならないリコンビナーゼ遺伝子の送達によって行うことができる。
【０１２４】
工程４：導入したリコンビナーゼによる不要なＤＮＡの部位特異的組換えが有効なとき、宿主細胞は、逆位組換え部位の組に隣接した所望の形質遺伝子のみを含むこととなる。
【０１２５】
第１の不可逆的組換え系の不可逆的組換え部位を認識しない、第２の不可逆的組換え系を用いる不要なＤＮＡの除去を行うストラテジーの変形例を図７Ｂに示す。レセプター標的構築物は、第２の不可逆的組換え系に由来する１組の不可逆的組換え部位ａｔｔＰ−２（ＰＰ’−２）に隣接した、Ｐ−ａｔｔＰ−ｉｎｔ−Ｐ−ｓｅｌ１断片から構成される。ドナー組込み構築物は、ａｔｔＢ−ｓｅｌ２−Ｐ−ｔｒａｉｔから構成され、ここで、Ｐ−ｔｒａｉｔは、第２の不可逆的組換え系に由来する１組の不可逆的組換え部位ａｔｔＢ−２（ＢＢ’−２）に隣接している。
【０１２６】
工程１：ａｔｔＰ−２部位に隣接したＰ−ａｔｔＰ−ｉｎｔ−Ｐ−ｓｅｌ１標的構築物を、従来の形質転換によって宿主ゲノムに挿入する。
【０１２７】
工程２：ゲノム標的へのａｔｔＰ×ａｔｔＢの組換えによって組込むことにより、組込み構築物を標的系に形質転換する。これにより、形質遺伝子は、形質遺伝子の機能に不要であり、ａｔｔＰ−２×ａｔｔＢ−２の部位特異的組換えにより除去され得る２組の断片の間に配置されることとなる。
【０１２８】
工程３：次に、ａｔｔＰ−２およびａｔｔＢ−２部位に対応するリコンビナーゼを、安定なあるいは一過性の方法によって宿主細胞中に導入する。
【０１２９】
工程４：導入したリコンビナーゼによる不要なＤＮＡの部位特異的な組換えが有効なとき、宿主細胞は１組のハイブリッドの組換え部位ＰＢ’−２およびＢＰ’−２に隣接し、所望の形質遺伝子のみを含むこととなる。
【０１３０】
実施例６
遺伝子スタッキング
本実施例は、所定の染色体標的に一連の遺伝子を送達し、その後不要なＤＮＡを除去するための２つの異なる組換え系の使用を組み合わせるための一般的なストラテジーを例示する。同一のゲノム部位への形質遺伝子の連続的な付加は「遺伝子スタッキング」と呼ばれる。この方法によれば、抗生物質耐性マーカーのような、付加的な問題を引き起こし得る他の不要なＤＮＡを組込むことなく、ゲノム配置に一連の形質遺伝子が正確にスタッキングされる。この方法は、動物および植物細胞を含む、ＤＮＡによって形質転換され得るすべての細胞に適用可能である。
【０１３１】
方法
一連の特定構築物を用いる本ストラテジの実施例を図８に示す。レセプターまたは標的構築物は、図７Ａに示すものと同一であるが、本例のａｔｔＰ部位はφＣ３１系のような不可逆的組換え系のクラスに由来する必要がある。
【０１３２】
第１のドナーまたは組込み構築物はａｔｔＢ−ｓｅｌ２−Ｐ−ｔｒａｉｔ１−ａｔｔＢを保持し、ここで、Ｐ−ｔｒａｉｔ１−ａｔｔＢは、配列において組換え部位が同一またはほぼ同一である、可逆的組換え系のクラスに属する１組の逆位組換え部位に隣接している。例示を目的として、ここで、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系は、組換え系の上記クラスの例として用いられる。しかし、他の可逆的リコンビナーゼもまた適している。遺伝子ｔｒａｉｔ１はゲノムへと操作されるべき形質遺伝子であり、Ｐはプロモーターを示し、ｓｅｌ２は選択マーカーコード領域である。本例のａｔｔＢ部位は、φＣ３１系のような不可逆的組換え系のクラスに属する組換え部位に由来するものである必要がある。
【０１３３】
工程１：逆位ｌｏｘ部位に隣接したＰ−ａｔｔＰ−ｉｎｔ−Ｐ−ｓｅｌ１標的構築物を、従来の形質転換により宿主ゲノムに導入する（図８Ａ）。
【０１３４】
工程２：この組込み構築物を標的系、すなわち、標的構築物を含むトランスジェニック系に形質転換する（図８Ａ）。本実施例では、標的系はインテグラーゼまたはリコンビナーゼを産生する。標的系がインテグラーゼまたはリコンビナーゼを発現しない場合には、インテグラーゼまたはリコンビナーゼに対応する遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を組込み構築物とともに同時導入してもよい。組込み構築物は、ゲノム標的へのａｔｔＰ×ａｔｔＢ組換えにより組み込まれることとなる。組込み構築物中には２つのａｔｔＢ部位が存在していることから、いずれの部位もゲノムａｔｔＰ部位と組換わり得る。ｔｒａｉｔ１の下流のａｔｔＢ部位がａｔｔＰ部位と組換わる場合には、得られる組込み体は選択マーカーｓｅｌ２の発現を活性化しないこととなる。一方で、ｓｅｌ２の上流のａｔｔＢ部位がａｔｔＰと組換わる場合には、Ｐ−ａｔｔＲ−ｓｅｌ２連結が形成されることとなる。上流のプロモーターによるｓｅｌ２の転写により、選択表現型が表わされることとなる。このクラスの組込み事象が選択され得る。得られる構造では、形質遺伝子の機能に必要でなく、かつ直接的に配向されたｌｏｘ部位により挟まれたＤＮＡの部位特異的欠失により除去され得る、２組の断片の間にＰ−ｔｒａｉｔ１−ａｔｔＢ断片が配置される（図８Ｂ）。
【０１３５】
工程３：次に、２組の不要なＤＮＡを挟む組換え部位に対応する組換え遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質を、安定なまたは一過性の方法のいずれかによって宿主細胞中に導入する。例えば、組換え遺伝子の安定な導入は、遺伝子交差を介して、または安定な形質転換の別の過程を介することができる。リコンビナーゼの一過性の導入は、タンパク質またはｍＲＮＡ分子を送達する形質転換方法、または、ＤＮＡ分子の安定な組込みとならない組換え遺伝子の送達によって導入することができる。
【０１３６】
工程４：不要なＤＮＡの部位特異的組換えが成功した場合には、宿主細胞は所望のｔｒａｉｔ遺伝子、および、１組の逆位ｌｏｘ部位に隣接したａｔｔＢ部位のみを保持することとなる（図８Ｃ）。染色体の標的遺伝子座における単一のａｔｔＢ部位は、このとき、部位特異的組換えの別の過程のための標的として機能することができる。さらに、宿主ゲノム中の選択マーカー遺伝子の欠如は、先に使用したマーカーｓｅｌ１およびｓｅｌ２がその後の形質転換のために再度使用可能であることを意味することとなる。
【０１３７】
工程５：ｔｒａｉｔ２の導入（図８Ｃ）。第２の形質遺伝子ｔｒａｉｔ２は、以下の断片ａｔｔＰ−Ｐ−ｔｒａｉｔ２−ａｔｔＰ−ｌｏｘ−Ｐ−ｓｅｌ２を含む構築物の組込みによって導入することができる。なお、ｓｅｌ１またはｓｅｌ２マーカーが再度、選択マーカーとして機能することができる。いずれのａｔｔＰ部位も、ゲノムａｔｔＢ部位と組換わって標的部位にＤＮＡを組込み、ｓｅｌ２によってコードされる選択可能な表現型を与えることができる。ｔｒａｉｔ２の下流のａｔｔＰ部位がａｔｔＢと組換わると、組込み構造は、図８Ｅに示すようなものとなる。Ｐ−ｔｒａｉｔ２の上流のａｔｔＰ部位がａｔｔＢと組換わると、組込み構造は図８Ｄに示すようなものとなる。２つのクラスの組込み構造は、分子解析により決定することができる。図８Ｄに示すクラスのみが、さらなる遺伝子スタッキングに有用なものとなる。図８Ｄに示すクラスは取っておき、一方、図８Ｅに示すクラスは廃棄する。
【０１３８】
工程６：工程３および４を繰り返し、図８Ｄに示す構造から不要なＤＮＡを除去する。これにより、図８Ｆに示す組込み構造が得られる。
【０１３９】
工程７：ｔｒａｉｔ３の導入（図８Ｆ）。第３の形質遺伝子ｔｒａｉｔ３は、断片ａｔｔＢ−Ｐ−ｔｒａｉｔ３−ａｔｔＢ−ｌｏｘ−Ｐ−ｓｅｌ２を含む構築物を組込むことにより導入することができる。なお、ｓｅｌ１またはｓｅｌ２マーカーが再度、選択マーカーとして機能することができる。いずれのａｔｔＢ部位もゲノムａｔｔＰ部位と組換わってＤＮＡが標的部位を組込む可能性があり、ｓｅｌ２によりコードされる選択可能な表現型を与えることができる。いずれのａｔｔＢがａｔｔＰと組換わるかにより、組込み構造が異なることとなる。２つの組込み構造は分子解析によって決定することができる。さらなる遺伝子スタッキングを行うことができる構造を図８Ｇに示すが、これは、Ｐ−ｔｒａｉｔ３の上流のａｔｔＢ部位の間での組換えに由来するものである。
【０１４０】
工程８：工程３および４を繰り返して図８Ｇに示す構造から不要なＤＮＡを除去する。これにより、図８Ｈに示す組込み構造が得られる。
【０１４１】
工程９：ｔｒａｉｔ４の導入（図８Ｈ）。第４の形質遺伝子ｔｒａｉｔ４は、断片ａｔｔＰ−Ｐ−ｔｒａｉｔ４−ａｔｔＰ−ｌｏｘ−Ｐ−ｓｅｌ２を含む構造を組込むことにより導入することができる。なお、ｓｅｌ１およびｓｅｌ２マーカーが再度、選択マーカーとして機能することができる。いずれのａｔｔＰ部位もゲノムａｔｔＢ部位と組換わって標的部位にＤＮＡを組込む可能性があり、ｓｅｌ２によりコードされる選択可能な表現型を与えることができる。いずれのａｔｔＰがａｔｔＢと組変わるかに応じて、組込み構造は異なることとなる。２つの組込み構造は分子解析によって決定することができる。さらなる遺伝子スタッキングを行うことができる構造を図８Ｉに示すが、これは、Ｐ−ｔｒａｉｔ４の上流のａｔｔＰ部位の組換えに由来するものである。
【０１４２】
工程１０：工程３および４を繰り返して、図８Ｉに示す構造から不要なＤＮＡを除去する。これにより、図８Ｊに示す組込み構造が得られる。
【０１４３】
工程１１：ｔｒａｉｔ５の導入（図８Ｊ）。第５の形質遺伝子ｔｒａｉｔ５のスタッキングを、図８Ｊに示す。原則として、これは第３の形質遺伝子ｔｒａｉｔ３のスタッキングのストラテジーによって示されるのと基本的に同一である。同様に、第６の形質遺伝子のスタッキングは、第２および第４の形質遺伝子のスタッキングと同一である。この繰り返しパターンは何度も繰り返すことができ、同一のマーカー遺伝子を各形質転換事象における使用のために「リサイクル」することができる。
【０１４４】
変形例
直接的に配向された部位の組の代わりに、逆位ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位の組もまた用いることができる。図９に、この可能性を示す。事象の組は、逆位ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位の組を除いて、図８に示すものと基本的に同じである。
【０１４５】
実施例７
コンカテマーＤＮＡ由来の遺伝子置換
本実施例は、遺伝子置換ストラテジーによりＤＮＡ断片を所定の染色体標的に送達するための一般的なストラテジーを、第２の組換え系とともに例示し、不要なＤＮＡは、その後ゲノムから除去することができる。組込み用ＤＮＡは、コンカテマー型であり、遺伝子銃のような所定の遺伝子移入方法によって得ることができる。
【０１４６】
結果
図１０に、２つの特異的な構築物を用いる、本方法のための一般的なストラテジーを示す。標的構築物は、配列において組換え部位が同一またはほぼ同一である可逆的組換え系のクラスに属する１組の逆位組換え部位に隣接している、Ｐ−ａｔｔＰ−ｉｎｔ−Ｐ−ｓｅｌ１−ａｔｔＰ断片から構成される。これらの組換え系は、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系、ＦＬＰ−ＦＲＴ系、Ｒ−Ｒｓ系、およびβリコンビナーゼ−６系を含む。図１０において、Ｐはプロモーターを示し、ｓｅｌ１は選択マーカーコード領域を示し、ｉｎｔは各ａｔｔＰ部位に対応するインテグラーゼまたはリコンビナーゼコード領域を示す。本例のａｔｔＰ部位は、φＣ３１系のような不可逆的組換え系のクラスに属する組換え部位である。
【０１４７】
組込み構築物は、ａｔｔＢ−ｓｅｌ２−ｐ−ｔｒａｉｔ１−ａｔｔＢを含み、ここで、Ｐ−ｔｒａｉｔセグメントは、組換え部位が同一またはほぼ同一の配列である不可逆的組換え系のクラスに属する、１組の逆位組換え部位に隣接している。例示を目的として、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系をこの組換え系のクラスの実施例として用いるが、他の可逆的組換え系もまた適している。遺伝子ｔｒａｉｔ１はゲノムへと操作される形質遺伝子であり、Ｐはプロモーターを示し、ｓｅｌ２は選択可能マーカーコード領域である。本例のａｔｔＢ部位はφＣ３１系のような不可逆的組換え系のクラスに属する組換え部位に由来する。
【０１４８】
工程１：逆位ｌｏｘ部位に隣接したＰ−ａｔｔＰ−ｉｎｔ−Ｐ−ｓｅｌ１−ａｔｔＰ標的構築物を、従来の形質転換によって宿主ゲノム中に導入する（図１０Ａ）。所望の場合には、逆位ｌｏｘ部位を用いて、例えば、米国特許第６，１１４，６００号に記載されているような複雑な組込みパターンの分割により、トランスジェニック系のシングルコピーの構築を容易とすることができる。また、シングルコピーのトランスジェニックレシピエントは、分子スクリーニング法によって得ることができる。
【０１４９】
工程２：組込み構築物を標的系、すなわち、標的構築物を含むトランスジェニック系に形質転換する（図１０Ａ）。本実施例では、標的系は、インテグラーゼまたはリコンビナーゼを産生する。標的系がインテグラーゼまたはリコンビナーゼを発現しない場合には、インテグラーゼまたはリコンビナーゼに対応する遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を組み込み導入物とともに同時導入するようにしてもよい。組込み構築物は、ゲノム標的中にａｔｔＰｘａｔｔＢの組換えによって組み込まれることとなる。組込み構築物中には２つのａｔｔＢ部位が存在しており、２つのａｔｔＰ部位はゲノム標的に存在することから、いずれかのａｔｔＢ部位もいずれかのゲノムａｔｔＰ部位と組換わり得る。この場合、ｓｅｌ２の上流のａｔｔＢ部位がｉｎｔの上流のａｔｔＰと組換わる場合にのみ、Ｐ−ａｔｔＲ−ｓｅｌ２連結が形成されることとなる。上流のプロモーターによるｓｅｌ２の転写が、選択可能な表現型を表わすこととなる。この組込み事象が選択される可能性があり、下流における第２のａｔｔＰ×ａｔｔＢ組換えがその後に続く必要がある。図１０Ａに示すように、ｔｒａｉｔ１のすぐ下流のゲノムａｔｔＰおよびａｔｔＢ部位の間の組換えにより、図１０Ａ、Ｂに示す配置をもたらすこととなる。しかし、ｔｒａｉｔ１のさらに下流の他のａｔｔＢ部位がゲノムａｔｔＰ部位と組換わるとしても、最終結果は同じであることとなる。すなわち、得られる構造では、形質遺伝子の機能に必要でなく、かつ直接的に配向されたｌｏｘ部位に挟まれたＤＮＡの部位特異的欠失によって除去され得る２組の断片の間に、Ｐ−ｔｒａｉｔ１断片が配置される（図１０Ｂ）。
【０１５０】
工程３：次に、２組の不要なＤＮＡを挟む組換え部位に対応するリコンビナーゼ遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を、安定なまたは一過性の方法のいずれかによって宿主細胞中に導入する。例えば、リコンビナーゼ遺伝子の安定な導入は、遺伝子交差を介して、または安定な形質転換の別の過程を介することができる。一過性のリコンビナーゼの導入は、タンパク質またはｍＲＮＡ分子を送達する形質転換方法により、または、ＤＮＡ分子の安定な導入とならない組換え遺伝子の送達により導入することができる。
【０１５１】
工程４：不要なＤＮＡの部位特異的組換えが成功した場合には、宿主細胞は、逆位ｌｏｘ部位の組に隣接した所望の形質遺伝子のみを含むこととなる（図１０Ｃ）。
【０１５２】
変形例
直接的に配向された部位の組ではなく、逆位ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位の組を用いてもよい。図１１に、この場合のあり得る構造を示す。事象の組は、逆位ａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位の対を除いて、図１０として示されたものと類似している。
【０１５３】
実施例８
染色体組換えを介したアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における導入遺伝子転座　本実施例は、バクテリオファージφＣ３１の部位特異的組換え系を用いて、ある植物系から別の植物系へ導入遺伝子を転座させるストラテジーを示す。このストラテジーでは、また、第２の部位特異的組換えを用いて不要なＤＮＡを除去し、これにより、宿主ゲノム中に形質遺伝子のみを残すようにする考えも組み込む。
【０１５４】
研究室系（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｌｉｎｅ）（ドナー系）を、特異的な組換え部位の組に隣接した導入遺伝子で形質転換する。対応する部位の組を、エリート系、所望のフィールド変種（ｆｉｅｌｄ ｖａｒｉｅｔｙ）（レセプタ系）に導入する。研究室系をエリート系と交雑させると、研究室系染色体とエリート系染色体との間で部位特異的組換えが発生する。リコンビナーゼの存在下では、導入遺伝子は研究室系染色体からエリート系染色体へ、隣接するＤＮＡの転座を伴うことなく転座する。基本的に、転座事象は、非相同または相同染色体の間で起こり得る。相同染色体の間での場合、転座事象は、相同染色体中の異なる位置間で、または、同一の位置で起こり得る。
【０１５５】
図１２Ａに、本例で用いる２つの植物系を示す。標的植物系を、ｐＣＤ４２６で形質転換した。この「レセプター」構築物は、アグロバクテリウム属遺伝子移入ベクターｐＰＺＰ２１１に由来するものであった。ＲＢとＬＢとの間、すなわち、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ転移ＤＮＡの左右の境界の配列の間は、以下のＤＮＡセグメントｌｏｘＰ−３５Ｓ−ＰＰ’−ｎｐｔ−３５Ｓ−ｉｎｔ−ＰＰ’−（逆位ｌｏｘＰ）である。ここで、３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ　ＲＮＡプロモーターであり、ｌｏｘＰはＣｒｅ−ｌｏｘ組換え系の野生型組換え部位であり、ＰＰ’はφＣ３１リコンビナーゼ系のａｔｔＰ部位であり、ｎｐｔはネオマイシントランスフェラーゼのコード領域であり、ｉｎｔはφＣ３１組換え系のインテグラーゼをコードする。図中プロモーターを明確に示すが、簡単にするため、転写の停止を促進しかつ各コード領域の下流に位置するターミネータは別のエレメントとしては図示しない。
【０１５６】
第２の植物系を、ｐＰＺＰ２１１に由来する「ドナー」構築物であるｐＣＤ４１４で形質転換した。ＲＢとＬＢとの間に、ＢＢ’−ｂａｒ−ｌｏｘＰ−Ｐ３−ｇｕｓ−（逆位ｌｏｘＰ）−３５Ｓ−ＢＢ’−ｄｈｌＡ−３５Ｓ−ａａｃＣ１から構成されるＤＮＡセグメントを挿入した。ここで、ｂａｒは除草剤バスタに対する耐性をコードし、Ｐ３はサトウキビ杆状バドナウイルス（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）プロモーターであり、ｇｕｓはβ−グルクロニダーゼのコード領域であり、ｄｈｌＡはハロアルカンデハロゲナーゼのコード領域（Ｎａｅｓｔｅｄら、１９９９， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １８： ５７１−７６）であり、ａａａＣ１はゲンタマイシン耐性をコードする。Ｐ３−ｇｕｓ断片は、レセプターエリート系へ遺伝子移入することになる（ｄｅｓｔｉｎｉｅｄ）、代表的な形質遺伝子を表わす。
【０１５７】
ドナー系をレセプター系と交雑させた場合には、インテグラーゼが促進する部位特異的組換えが、２つの染色体の間で予想された。ｎｐｔに近いＰＰ’がｂａｒに近いＢＢ’と組換わった場合には、３５Ｓはｎｐｔから切り離され、ｂａｒに融合する。この事象は、バスタに対する耐性を与える。他のいずれのＰＰ’ｘＢＢ’組換えも、ｂａｒ選択可能な表現型を生むことはない。下流でのＰＰ’ｘＢＢ’事象が同様に生じた場合には、３５Ｓ−ｄｈｌＡ連結が開裂する。ｄｈｌＡの発現はＤＣＥ（１，２−ジクロロエタン）に対する感受性を与える。すなわち、バスタとＤＣＥとに耐性を有する植物は、ドナー染色体からレセプター染色体に転座したＤＮＡの、ｂａｒ−ｌｏｘＰ−Ｐ３−ｇｕｓ−（逆位ｌｏｘＰ）−３５Ｓセグメントを有するはずである。
【０１５８】
この詳細なシナリオにおいて、ドナーおよびレセプター系はＴ−ＤＮＡのランダム送達によってそれぞれ形質転換したものであり、ドナーおよびレセプター部位は異なる遺伝子座にあることとなる。それにもかかわらず、ドナーおよびレセプター部位が同じ遺伝子座（相同染色体の同一の位置）にあっても、同じ原則が当てはまる。すべての場合に、導入遺伝子の両側での部位特異的組込みにより、ドナーの導入遺伝子に隣接するドナーＤＮＡの連結障害物（ｌｉｎｋａｇｅ ｄｒａｇ）が排除される。
【０１５９】
結果および考察
ドナーおよびレセプター系
野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｅｃｏｔｙｐｅ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を、ｐＣＤ４２６を用いてアグロバクテリウム媒介性形質転換により形質転換した。同様に、野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｅｃｏｔｙｐｅ Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ）をｐＣＤ４１４を用いて形質転換した。この２種の生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）は十分な多型マーカーを有し、必要であれば、ドナーＤＮＡの量をレセプター系のバックグランドにおいて概算することができる。これは、Ｌａｎｓｂｅｒｇ生態型およびＣｏｌｕｍｂｉａ生態型としてそれぞれ表わされる、ドナー研究室系とエリートフィールド変種との間の代表的な遺伝子移入プログラムを促進する。
【０１６０】
３５ｓ−ＰＰ’−ｎｐｔ断片によって付与されるカナマイシン耐性を有するＣｏｌｕｍｂｉａ系を、サザンハイブリダイゼーションによって解析した。カナマイシン耐性植物の約１０％が、図１２Ａに示すような、ｐＣＤ４２６がコードするＴ−ＤＮＡの無傷のシングルコピーを有していることがわかった。ゲンタマイシン耐性を有するＬａｎｓｂｅｒｇ系についても、３５ｓ−ａａａＣ１　ＤＮＡによって付与されるシングルコピーの挿入に関して、スクリーニングを行った。原則的には、ドナーまたはレセプター系が複数の導入遺伝子のコピーを含んでいるかどうかにかかわらず、３５ｓ−ＢＢ’−ｄｈｌＡ連結の全てのコピーが壊れない限り、ｄｈｌＡマーカーでの対抗選択は有効ではないであろう。
【０１６１】
Ｆ１植物
表３は、ｐＣＤ４２６の３つのシングルコピーと、ｐＣＤ４１４系の７つのシングルまたは低コピーとの間で、対で交雑させた表を示す。可能な２１対の組合せのうち１８を交雑させ、Ｆ１子孫を得た。Ｆ１子孫はゲンタマイシン耐性に関して選択した。ＰＣＲアッセイを用いて、レセプター遺伝子座も有する植物を同定した。これらの基準を満たすものをＦ２種子の産生に関して選択した。さらに、これらのＦ１植物について、部位特異的組換えに関する１組の試験を行った。
【０１６２】
第１の試験では、バスタを塗った葉のそれぞれにおける、バスタ耐性に関して調べた。交雑のいくつかの組合せでは、数枚の葉が除草剤に対する耐性の微候を示して緑色のままであったのに対し、親の葉は黄変した。用いた第２の試験は、３５Ｓ−ＰＢ’−ｂａｒ結合の存在に関する、葉のＤＮＡについてのＰＣＲ解析であった。ｂａｒおよびｎｐｔの両方の３’末端に存在する、３５Ｓおよびｎｏｓ３’ターミネーターに対応するプライマーは、１．１ｋｂの３５Ｓ−ＰＰ’−ｎｐｔの非組換え結合、および／または、０．８ｋｂの組換え３５Ｓ−ＰＢ’−ｂａｒ結合を増幅させる（図１２Ａ、図１２Ｂ）。２つの結合バンドの相対的な存在度は組換えの量を示すはずである。いくつかのＦ１植物では、０．８ｋｂの３５Ｓ−ＰＢ’−ｂａｒ結合が見出された。しかし、この０．８ｋｂの生成物の存在量が、１．１ｋｂの生成物に比して比較的少ないことは、わずかの細胞しか組換わっていないことを示唆する。
【０１６３】
第３の試験は、Ｆ１の花および葉の組織に関するサザン解析であった。ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩの組み合わせで切断し（図１２Ａ、図１２Ｂにおいて、それぞれＥ、Ｈ、Ｓで表わす）、３５Ｓプローブにハイブリダイズさせた。図１２Ａおよび１２Ｂに、親および組換え染色体から予想される切断パターンを示す。ＣＤ４２６では、ハイブリダイゼーションプローブは３．１ｋｂの単一バンドとして検出されると予想される。ＣＤ４１４では、プローブは２つのバンドにハイブリダイズするはずであり、その一方の予想サイズは２．５ｋｂであり、他方は宿主の最も近い切断部位の位置に応じたサイズを有する、導入遺伝子の宿主の境界のバンドである。所定のＤＮＡ断片が転座される二重の組換えの事象において、レセプター染色体は２．２ｋｂおよび１．１ｋｂの２つの新たなバンドを示し、一方、ドナー染色体は１．９ｋｂの新たな単一バンドおよび同じサイズの導入遺伝子の宿主の境界断片を示すはずである。
【０１６４】
組換えが検出された場合には、Ｆ１植物は組換え事象に関してキメラであった。ハイブリダイゼーションシグナルの大部分は、３．１ｋｂおよび２．５ｋｂの親断片へのものであった。しかし、ブロットをより長い露出時間にかけたところ、組換えバンドが検出された。強いハイブリダイゼーションがおよそ２ｋｂ〜３．１ｋｂの領域に見られたことから、予想された２．２ｋｂおよび１．９ｋｂの組換えバンドはバックグランドから観察することができなかった。しかし、１．１ｋｂのバンドがいくつかの植物の、花と葉の両方の組織において明確に検出された。このハイブリダイゼーションパターンは、いくつかの他の交雑に由来するＦ１子孫に関しても同様であった。サザン解析およびＰＣＲのデータは両方とも、組換えが細胞の少ない部分だけで起きていることを示した。
【０１６５】
この組換え率の低さは、３５Ｓ−ｉｎｔ導入遺伝子の乏しい発現、組換えに関する２つの関与部位の位置的効果、および／または、相同染色体の同じ位置に位置しない部位に関して予想される組換え率の一般的な低さによる可能性がある。同様の、そしてさらに低い頻度の、「異所性の（ｅｃｔｏｐｉｃ）」染色体組換えが、タバコ（Ｑｉｎ他、１９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１： １７０６−１０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（本研究室にて、未公開）およびタバコとアラビドプシスとのハイブリッド細胞（Ｋｏｓｈｉｎｓｋｙら、２０００， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２３： ７１５−２２）におけるＣｒｅ−ｌｏｘを媒介とした染色体転座に関して以前に観察されている。それにもかかわらず、バスタ耐性の表現型、３５Ｓ−ＰＢ’−ｂａｒ結合のＰＣＲでの検出、および１．１ｋｂの３５Ｓ−ＢＰ’−（逆位ｌｏｘＰ）結合のサザンデータは、すべてドナーからレセプター染色体への導入遺伝子の転座と一致するものである。
【０１６６】
Ｆ２子孫
組換えが検出されなかった交雑を含む、各交雑からの２つの代表的なＦ１植物を、Ｆ２種子のために自己受精させた。Ｆ２の苗木にバスタを噴霧した。表３から、１８個の交雑のうちの５個が、バスタ耐性（ＢａｒＲ）のＦ２子孫を産出する少なくとも１つのＦ１系を有し、３つの他の交雑がバスタに部分的な耐性を示すＦ２植物を産出し、一方で、残りの１０個の交雑がＢａｒＲ子孫を産出しなかったことが示される。これは、葉に塗布するアッセイを用いたＦ１植物において見られたのと同一の耐性パターンである。
【０１６７】
３つのレセプター系のすべてがＢａｒＲ子孫を産出したことが特に重要である。このことは、成功した導入遺伝子の転座がゲノムのほんのわずかな位置に限定されていないことを示す。７つのドナー系のうちの４つのみがＢａｒＲ子孫をもたらし、これらの交雑のうちのいくつかは部分的なＢａｒＲ植物を産出した。部分的な耐性は、遺伝子サイレンシングによって引き起こされるようなｂａｒ遺伝子の乏しい発現による可能性がある。しかし、より可能性の高い説明によれば、部分的なバスタ耐性は、３５Ｓ−ＰＢ’−ｂａｒ結合の胚伝達（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）ではなく後期の体細胞性組換え（ｓｏｍａｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるものである。発育上の後期の組換え事象により、３５Ｓ−ＰＢ’−ｂａｒ結合を有する細胞がより少なくなることが予想される。
【０１６８】
興味深いことに、ＢａｒＲ子孫を産生できなかった１０個の交雑のうち８個が、ドナー系ＣＤ４１４−１０、ＣＤ４１４−６１、およびＣＤ４１４−８２に由来していた。３つの系すべては、ドナーＤＮＡのシングルコピーを保有していると予測された。しかし、これらの系はｐＣＤ４１４のＴ−ＤＮＡのインタクトのコピーを有していない可能性がある。ｂａｒやＢＢ’配列のような、このＤＮＡセグメントの重要エレメント内の検出されないＤＮＡ再配列または点突然変異が、組換えが観察されなかったことを説明し得る。
【０１６９】
耐性植物を生む交雑のいずれの組合せにおいても、すべての同胞種の植物が同様ということではなかった。この植物のうちのいくつかは、同胞種よりも大きく成長するにつれ、他のものよりもバスタに対して高い耐性を示すように思われた。高いレベルのＢａｒＲは、転座事象の胚伝達により、または、親ドナーおよびレセプターの両方の染色体の同時分離の場合には、発達上の早期の組換え事象による可能性がある。
【０１７０】
Ｆ２の苗木をサザンブロットにより解析した。ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩの組合せで切断し、ｂａｒのＤＮＡをプローブとした。バンドのクラスターとハイブリダイズする３５Ｓプローブと異なり、ｂａｒプローブはドナー構築物のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を表わす１．１ｋｂのシングルバンドを検出することが予想される（図１２Ａ）。組換え量に応じて、２．２ｋｂの３５Ｓ−ＰＢ’−ｂａｒバンドを見て取ることができる。このバンドが、１．１ｋｂの親バンドと比較してより低い強度でハイブリダイズする場合には、これは体細胞中の組換えを示す。雄性および雌性の両方の配偶子が組換え事象を伝達するならば、２．２ｋｂのバンドだけが、１．１ｋｂのバンドなしに、存在するはずである。２．２ｋｂのバンドは、強度の差はあるものの、調べたＦ２の苗木の８つすべてに見ることができた。調べた１つの苗木では、２．２ｋｂのバンドは、１．１ｋｂのバンドと同様の強度でハイブリダイズした。このバンドパターンは、雄性または雌性の生殖系列のいずれか（両方ではない）による胚伝達に一致し、これにより、導入遺伝子の転座事象に関してヘテロの接合体が導かれる。そうであれば、導入遺伝子の転座事象（親配置）を欠く相同染色体は、遺伝子を導入しないＣｏｌｕｍｂｉａ生態型植物への戻し交雑で分離することができる。かかる戻し交雑由来のＢａｒＲ子孫は、導入遺伝子の転座レセプター染色体に関してヘミ接合体であり、これらの中では、その半分までは、相互転座遺伝子座を有するドナー染色体から分離された。
【０１７１】
【表３】
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【０１７２】
不要なＤＮＡの除去
転座後のもはや必要ではないＤＮＡは宿主ゲノムからその後除去され得るという条件の下で、導入遺伝子の転座技術が設計されている。ドナーおよびレセプター遺伝子座は、第２の組換え系由来の、本例では、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系由来の、逆位組換え部位の組を含む（図１２Ａ）。導入遺伝子の転座の後、レセプター染色体上の新たな配置は、Ｐ３−ｇｕｓ断片によって例示される、形質遺伝子以外のＤＮＡの直接的に反復されるｌｏｘＰ部位隣接セグメントの組を有する（図１２Ｂ）。図１２Ｃは、ｃｒｅ遺伝子を発現する植物に交雑させると、Ｃｒｅリコンビナーゼを媒介としたｌｏｘＰに特異的な組換えにより、不要なＤＮＡが欠失され、逆位ｌｏｘＰ部位の組に隣接した形質遺伝子のみが残ることを示す。逆位ｌｏｘＰ部位は互いに組換わって介在したＤＮＡを反転させることができるので、形質遺伝子は植物のセントロメアに対してそのいずれの配向でも存在することとなる。これにより、所与の標的部位からの２つの明確な発現パターンが生じる。
【０１７３】
可能な変形例
上記実験に示した特定の設計は、φＣ３１と異なる、自由に可逆的反応を与える他の組換え系での使用のために、変更することができる。図１３に一例を示し、ここで、Ｃｒｅ−ｌｏｘは形質遺伝子（Ｐ２−ｇｕｓ）をドナーからレセプター染色体へ転座させるために用いられる。ＦＬＰ−ＦＲＴのような第２の組換え系を用いて、その後不要なＤＮＡを除去する。
【０１７４】
ドナー構築物ｐＶＳ７８は、ランダムな位置でゲノムに形質転換される。Ｐ１−ｂａｒ選択マーカーは直接的に配向されたｌｏｘＰ部位に隣接し、ドナー構築物断片は逆位ｌｏｘ５１１部位の組に隣接している。ｌｏｘ５１１対立遺伝子は、ｌｏｘＰと組換わらない。このため、ｃｒｅ遺伝子がゲノムに導入された場合には、ｌｏｘＰ×ｌｏｘＰおよびｌｏｘ５１１×ｌｏｘ５１１の組換えの事象、複雑な遺伝子座をシングルコピーに分割するだけでなく、Ｐ１−ｂａｒマーカーが除かれることとなる。この分割工程は、ドナー系をレセプター系中に交雑させるよりも前またはそれと同時に行うことができる。このようなレセプター系の例として、ＶＳ１１がある。図１３に示すように、ドナーおよびレセプター染色体の間、ｌｏｘＰ×ｌｏｘＰの間、およびｌｏｘ５１１とｌｏｘ５１１の間における、二重の部位特異的組換えにより、Ｐ１−ａｈａ結合が形成されることとなり、ここで、Ｐ１はイネアクチンプロモーターであり、ａｈａはアセトヒドロキシ酸シンターゼコード領域である。ａｈａの発現はイマゼタピル耐性を与える。上記のように、Ｐ１−ｌｏｘＰ−ａｈａセグメントは直接的に配向されたＦＲＴ部位に隣接しているため、その後、ＦＬＰリコンビナーゼの導入により除去することができる（図１３に図示せず）。
【０１７５】
要約
現在の形質転換方法によれば、導入したＤＮＡの、予測できない組込み位置、パターンおよびコピーがもたらされる。標的レセプター系の生成により、ゲノム中に標的部位をランダムに配置させる現在の形質転換方法を使用することからなることが予見されている。シングルコピー標的系は、複雑な複数コピーを伴う上記方法に好適であろう。導入遺伝子の転座ストラテジーは、隣接逆位組換え部位を組み込むものであり、そのため、シングルコピーの形質転換体を得るための、分割に基づくストラテジー（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、１９９９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９６： １１１１７−１１１２１；ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＯｗ、２００１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４６： ５６１−５６６；米国特許第６，１１４，６００号）に適したものである。
【０１７６】
一旦標的系を得れば、これらについて部位の完全性（ｓｉｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）および発現パターンに関して特定することができる。望ましいと思われるものについては、その後のＤＮＡ挿入のための標的部位として用いることができる。次に、標的部位はエリート系から出して繁殖させることができる。その後、形質遺伝子（またはＤＮＡセグメント内の複合的な形質遺伝子）を、研究室系の標的部位への部位特異的組込みにより、または、研究室系ゲノムへのＤＮＡのランダム組込みにより、導入してもよい。形質遺伝子のセグメントは、次いで、本実施例に示したように、ドナー系染色体からエリート系レセプター染色体へと転座させることができる。
【０１７７】
エリートのバックグランドへの標的部位の導入の際、エリートの変種が一定して進化していることが認められる。例えば、標的部位はランダムに配置される可能性があり、遺伝子Ｘの隣に位置する（ｌａｎｄ）。次に、Ｘ標的は、例えばテキサスのエリート系Ａ、ネブラスカのエリート系Ｂ、そしてアルゼンチンのエリート系Ｃというように、広い範囲で戻し交雑する。時間が経過するにつれ、エリート系Ａ、Ｂ、Ｃは、新たなエリート系Ａ２、Ｂ２、そしてＣ２へと進化し得る。しかし、これらの新たなエリート系は新規に現れることはなく、原種Ａ、Ｂ、そしてＣからそれぞれ進化するものであるので、Ｘ標的遺伝子座を保持している可能性が高い。このため、おそらく前の導入遺伝子の改善版である新たな導入遺伝子、または複数の導入遺伝子から構成されるＤＮＡ断片を、この遺伝子座への部位特異的組換えにより、研究室系からエリート系Ａ２、Ｂ２、Ｃ２へと、再び転座させることが可能である。エリートのバックグランドで標的系が確立されれば、導入遺伝子転座技術は、研究室系からエリート系への導入遺伝子のシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）を容易なものとし、これは遺伝子導入形質の商業化において、大変な労力と時間の節約となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび図１Ｂは、可逆的または不可逆的組換え系を用いたＤＮＡ交換反応を示す。不可逆的組換え系（図１Ａ）では、ＩＲＳとＣＩＲＳ間の組換えにより、不可逆的リコンビナーゼにはもはや認識されることのないハイブリッド部位が形成される。可逆的組換え系（図１Ｂ）では、ＲＲＳとＲＲＳ間の組換えにより、互いに組換え続けることができる２つの産物であるＲＲＳ部位が生産される。したがって、その部位と交換するＤＮＡはまた、元の状態へと交換することができる。この例は、ＲＲＳ−１およびＲＲＳ−２と称した２つの異なるＲＲＳ部位を示す。
【図２】
図２Ａ〜Ｇは、酵母（Ｓ． ｐｒｏｍｂｅ）のｌｅｕ１遺伝子座での二重部位組換えストラテジーを示す。ｐＬＴ５０に由来する直鎖状ａｔｔＢ−ｕｒａ４＋−ａｔｔＢ　ＤＮＡ（図２Ａ〜Ｂ）は、分子の両端で組み換わり、正確な遺伝子置換をもたらす（図２Ｃ、クラス１）。さらに、副反応が幾つか観察され、標的遺伝子座の５’ａｔｔＰ（図２Ｅ、クラス２）または３’ａｔｔＰ部位（図２Ｆ、クラス３）に挿入される前に、相同組換えにより直鎖状分子が再環化して、環状中間体を形成した（図２Ｄ）。環状ｐＬＴ５０を形質転換基質として使用する場合、ｐＬＴ５０の５’ａｔｔＢ部位とｌｅｕ１遺伝子座の５’ａｔｔＰ部位の単一組換えが図示した構造（図２Ｇ、クラス４）を生産する１つのクローンを回収した。エンドヌクレアーゼＸｂａＩ（Ｘ）またはＮｄｅＩ（Ｎ）切断産物の予測サイズを示す。
【図３】
図３は、インテグラーゼ−ＤＮＡ濃度の関数として形質転換効率を示す（パネルＣ）。ＦＹ５２９ａｔｔＰ（パネルＡ）またはＦＹ５２９ａｔｔＰｘ２（パネルＢ）を、様々な量のｐＬＴ４３ＤＮＡとともに、それぞれｐＬＴ４５またはｐＬＴ５０　ＤＮＡ１μｇで形質転換した。
【図４】
図４は、直鎖状ｃＤＮＡ分子を、哺乳動物細胞の染色体に組み込むためのストラテジーを示す図である。この場合では、ＩＲＳまたはＣＩＲＳの各対を、直接反復配列として配列させる。
【図５】
図５Ａおよび図５Ｂは、哺乳動物細胞への組込み時の直鎖状ｃＤＮＡのセンスおよびアンチセンス発現に関するストラテジーを示す。この場合では、ＩＲＳまたはＣＩＲＳの各対を、間接反復配列として配列させる。図５Ｃ〜Ｄは、導入レポーター遺伝子ｈｐｔのセンス発現を実証するためのＤＮＡ基質を示す。図５Ｅは、ヒトゲノム中のシングルコピーレセプター構築を示す。図５Ｆは、ＤＮＡ交換のＰＣＲ検出に関するストラテジーを示す。
【図６】
図６Ａおよび図６Ｂは、植物細胞への組み込み時のｃＤＮＡのセンスおよびアンチセンス発現に関するストラテジーを示す。これらの方法を実施する際、選択マーカーをｃＤＮＡに結合させない。
【図７】
図７は、所望のポリヌクレオチドのみを組み込むための一般的ストラテジーを示す。選択マーカーのような外来性ＤＮＡを除去する。白矢頭は、可逆的リコンビナーゼ用の組換え部位を表し、「ｉｎｔ」は、リコンビナーゼをコードする遺伝子であり、「ｓｅｌ１」および「ｓｅｌ２」は、選択マーカーである。「Ｐ」は、プロモーターであり、「ｔｒａｉｔ」は、発現すると、細胞に所望の形質を付与する所定のポリヌクレオチドである。
【図８】
図８Ａ〜Ｊは、遺伝子を「スタッキング」するための一般的ストラテジーを示す。「ｔｒａｉｔ１」、「ｔｒａｉｔ２」等は、発現すると、細胞に所望の形質を付与する所定の個々の遺伝子である。
【図９】
図９Ａ〜Ｊは、遺伝子を「スタッキング」するための第２のストラテジーを示す。この場合、逆位組換え部位を使用する。
【図１０】
図１０Ａ〜Ｃは、ＤＮＡコンカテマーの単一ユニットが、遺伝子置換によりゲノムに挿入することができるストラテジーを示す。この例では、直接的に配向された二重組換え部位を使用する。
【図１１】
図１１Ａ〜Ｃは、ＤＮＡコンカテマーの単一ユニットが、遺伝子置換によりゲノムに挿入することができるストラテジーを示す。この例では、間接的に配向された二重組換え部位を使用する。
【図１２】
図１２Ａ〜Ｃは、植物染色体間のポリヌクレオチドの部位特異的置換（あるいは「ＤＮＡ断片転座」事象とも呼ばれる）、続く形質遺伝子（Ｐ３−ｇｕｓが例示される）の発現にもはや必要とされないＤＮＡの除去に関するストラテジーを示す。
【図１３】
図１３は、可逆的リコンビナーゼを用いた、植物染色体間のポリヌクレオチドの部位特異的置換に関するストラテジーを示す。ここでは、Ｃｒｅ−ｌｏｘを、ドナー染色体からレセプター染色体へ形質遺伝子（Ｐ２−ｇｕｓ）を転座するのに使用し、次にＦＬＰ−ＦＲＴのような第２の可逆的組換え系を、不必要なＤＮＡを除去するのに使用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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