(57)【要約】哺乳類の前駆細胞、その子孫、またはその混合物を哺乳類の胚フィーダー細胞上で培地中で培養することを含む、哺乳類の内胚葉に由来する、肝前駆細胞のような前駆細胞、その子孫、またはその混合物の増殖方法が開発される。培地には１つまたは複数のホルモンおよび他の増殖剤が添加され得る。これらのホルモンおよび他の増殖剤には、インスリン、デキサメタゾン、トランスフェリン、ニコチンアミド、血清アルブミン、βメルカプトエタノール、遊離脂肪酸、グルタミン、ＣｕＳＯ４、およびＨ２ＳｅＯ３が含まれ得る。また培地には抗体も含まれ得る。重要なことに、培地には血清が含まれない。本発明は、それぞれ上皮成長因子を添加または除去することによる、肝前駆細胞の肝実質細胞または胆管細胞への分化のような、前駆細胞のその成体の運命への分化の誘導方法も含まれる。その後、前駆細胞は、増殖および分化因子の同定、毒性試験、薬剤開発、抗菌試験、または人工肝臓のような体外臓器の調製といった過程の１つまたは複数において使用できるという点から、哺乳類前駆細胞を生産する方法は有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地の存在下でフィーダー細胞を含む層の上で、細胞間接着分子抗原を発現するが古典的主要組織適合性抗原は発現しない、内胚葉由来の前駆細胞、その子孫、またはその混合物を培養する段階を含む、内胚葉由来の前駆細胞、その子孫、またはその混合物の増殖方法。
【請求項２】
前駆細胞、その子孫、またはその混合物が脊椎動物細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前駆細胞、その子孫、またはその混合物がヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、ウサギ細胞、ラット細胞、マウス細胞、またはその組み合せを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前駆細胞、その子孫、またはその混合物が肝臓、肺、腸、膵臓、甲状腺、性腺の前駆細胞、またはその組み合せを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前駆細胞、その子孫、またはその混合物が肝臓に由来する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
培地が基礎培地を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
基礎培地がダルベッコ変法イーグル培地およびハムＦ１２を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
培地が少なくとも１つのホルモンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ホルモンがインスリンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
培地がグルココルチコイドホルモンをさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
グルココルチコイドホルモンがデキサメタゾンである、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
培地が鉄飽和トランスフェリンをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
培地がニコチンアミドをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
培地が血清アルブミンをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
培地が少なくとも１つの還元剤をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
還元剤がβメルカプトエタノールである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
培地が少なくとも１つの脂質補給剤を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
脂質補給剤が遊離脂肪酸混合物を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
遊離脂肪酸混合物が、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、またはその組み合せを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
培地がグルタミン酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
培地が微量元素をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
微量元素がＣｕＳＯ４を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
微量元素がＨ２ＳｅＯ３を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
培地が抗酸化剤を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
抗酸化剤がＨ２ＳｅＯ３を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
培地が抗生物質をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
培地が上皮成長因子をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
フィーダー細胞の供給源が、少なくとも１つの脊椎動物から得た組織を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
脊椎動物が胚を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
脊椎動物が、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、またはその組み合せを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
フィーダー細胞がクローンである、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
クローンがＳＴＯ５である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
フィーダー細胞が間質細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
フィーダー細胞が線維芽細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
肝前駆細胞がＭＨＣクラスＩｂを弱く発現する、ＯＸ１８を弱く発現する、αフェトプロテインを発現する、アルブミンを発現する、サイトケラチン１９を発現する、またはその組み合せである、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
ＩＣＡＭがＩＣＡＭ−１である、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
肝子孫細胞がＭＨＣクラスＩｂを発現する、ＩＣＡＭを弱く発現する、ＯＸ１８を弱く発現する、αフェトプロテインを発現する、アルブミンを発現する、サイトケラチン１９を発現する、またはその組み合せである、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
ＩＣＡＭがＩＣＡＭ−１である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
肝前駆細胞、その子孫、またはその組み合せが、積み重なったコロニーとして増殖する請求項１記載の方法。
【請求項４０】
肝前駆細胞のクローニングをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
クローニングに細胞数の希釈、クローニング・カラー（ｃｏｌｌａｒ）、アガロース中での増殖、ビーズ上での増殖、フローサイトメトリー、またはその組み合せが利用される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
肝前駆細胞が少なくとも１回の有糸分裂を行なう、請求項１記載の方法。
【請求項４３】
肝前駆細胞が少なくとも１０回の有糸分裂を行なう、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
肝前駆細胞が、別の運命をもつ娘細胞を生む、請求項１記載の方法。
【請求項４５】
娘細胞が胆管細胞に分化する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
娘細胞が肝実質細胞に分化する、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
肝前駆細胞、その子孫、またはその混合物、および少なくとも１つの肝増殖因子を含むと考えられる試料を提供する段階、前駆細胞、その子孫、またはその混合物と試料とを混合する段階、ならびに肝前駆細胞の増殖の刺激を観察する段階を含む、肝増殖因子の同定方法。
【請求項４８】
肝前駆細胞、その子孫、またはその混合物、および少なくとも１つの肝分化因子を含むと考えられる試料を提供する段階、前駆細胞、その子孫、またはその混合物と試料とを混合する段階、ならびに肝前駆細胞の分化を観察する段階を含む、肝分化因子の同定方法。
【請求項４９】
肝前駆細胞、その子孫、またはその混合物、および少なくとも１つの肝毒素を含むと考えられる試料を提供する段階、前駆細胞、その子孫、またはその混合物と試料とを混合する段階、および肝前駆細胞の死を観察する段階を含む、肝毒素の同定方法。
【請求項５０】
肝前駆細胞、その子孫、またはその混合物、および肝前駆細胞・代謝に影響を与える能力があると考えられる薬剤を提供する段階、前駆細胞、その子孫、またはその混合物と試料とを混合する段階、ならびに肝前駆細胞の代謝の変化を観察する段階を含む、薬剤の開発方法。
【請求項５１】
肝前駆細胞、その子孫、またはその混合物、および抗菌効果を持つと考えられる薬剤を少なくとも１つ提供する段階、前駆細胞、その子孫、またはその混合物と薬剤とを混合する段階、ならびに肝前駆細胞の増殖の変化を観察する段階を含む、新規の抗菌剤の同定方法。
【請求項５２】
肝前駆細胞、その子孫、またはその混合物を提供する段階、および前駆細胞、その子孫、またはその混合物を、体外肝臓として働くために十分な細胞群が得られるまで、バイオリアクター中で培養する段階を含む、体外肝臓の調製方法。
【請求項５３】
肝前駆細胞、その子孫、またはその混合物を増殖させる方法であって、
（ａ） 細胞間接着分子抗原を発現し、主要組織適合性抗原を発現しない、少なくとも１つの肝前駆細胞を提供する段階、および
（ｂ） 少なくとも１つのフィーダー細胞の生合成産物を含む培地中で肝前駆細胞を培養する段階
を含む方法。
【請求項５４】
培地がグルココルチコイド、インスリン、上皮成長因子、ニコチンアミド、またはその組み合せをさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
フィーダー細胞の生合成産物が、ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭化水素、蛋白質、糖蛋白質、リポ蛋白質、またはその組み合せを含み、生合成産物が肝前駆細胞の増殖または分化を促進する、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
フィーダー細胞の生合成産物が、インスリン様成長因子、インターロイキン６ファミリーの増殖因子、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、細胞外マトリックス、またはその組み合せを含み、生合成産物が肝前駆細胞の増殖または分化を促進する、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも１つの肝前駆細胞が、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット、またはマウスから得られる少なくとも１つの細胞を含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも１つの肝前駆細胞のクローニングをさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５９】
増殖因子の添加をさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
肝実質細胞、胆管細胞、またはその組み合せを生産するための分化因子の添加をさらに含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
培地が無血清である、請求項１記載の方法。
【請求項６２】
内胚葉由来の前駆細胞、その子孫、またはその混合物を無血清培地の存在下、フィーダー細胞を含む層の上で培養することを含む、内胚葉由来の前駆細胞、その子孫、またはその混合物を増殖させる方法。
【請求項６３】
前駆細胞、その子孫、またはその混合物が肝臓、肺、腸、膵臓、甲状腺、性腺の前駆細胞またはその組み合せを含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
培地がダルベッコ変法イーグル培地およびハムＦ１２を含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６５】
培地が少なくとも１つのホルモンを含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６６】
ホルモンが、インスリン、グルココルチコイドホルモン、トランスフェリン、上皮成長因子、またはその組み合せである、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
フィーダー細胞の供給源が、少なくとも１つの脊椎動物から得た組織を含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６８】
脊椎動物が、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、またはその組み合せを含む、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
フィーダー細胞がクローンである、請求項６２記載の方法。
【請求項７０】
フィーダー細胞が間質細胞を含む、請求項６２記載の方法。
【請求項７１】
肝前駆細胞が、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）抗原を発現する、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩａ抗原を発現しない、ＭＨＣクラスＩｂを弱く発現する、ＯＸ１８を弱く発現する、αフェトプロテインを発現する、アルブミンを発現する、サイトケラチン１９を発現する、またはその組み合せである、請求項６２記載の方法。
【請求項７２】
ＩＣＡＭがＩＣＡＭ−１である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
肝子孫細胞が、ＭＨＣクラスＩａを発現しない、ＭＨＣクラスＩｂを発現する、ＩＣＡＭを弱く発現する、ＯＸ１８を弱く発現する、αフェトプロテインを発現する、アルブミンを発現する、サイトケラチン１９を発現する、またはその組み合せである、請求項６２記載の方法。
【請求項７４】
ＩＣＡＭがＩＣＡＭ−１である、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
肝前駆細胞のクローニングをさらに含む、請求項６２記載の方法。
【請求項７６】
肝前駆細胞が少なくとも１回の有糸分裂を行なう、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
肝前駆細胞が少なくとも１０回の有糸分裂を行なう、請求項７５記載の方法。
【請求項７８】
肝前駆細胞が、別の運命をもつ娘細胞を生む、請求項７５記載の方法。
【請求項７９】
娘細胞が胆管細胞に分化する、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
娘細胞が肝実質細胞に分化する、請求項７８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１． 発明の分野
本発明は、多能性細胞、幹細胞、および他の初期肝前駆細胞を含む、哺乳類肝前駆細胞のクローン増殖のための新規の条件に関する。特に、本発明は合成培地および共培養でフィーダー細胞を使用して肝前駆細胞を増殖させる方法に関する。また、本発明はフィーダーとして使用され、肝前駆細胞の増殖を支持する能力のある細胞にも関する。
【０００２】
２． 関連技術の説明
哺乳類組織の多能性前駆細胞群の同定は、臨床的および商業的に重要であり、また発生過程と組織のホメオスタシスの理解のためにも重要である。前駆細胞群は、遺伝子療法、細胞移植、および生体人工臓器の組織工学の理想的な標的である（Ｍｉｌｌａｒ， Ａ．Ｄ． １９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５７， ４５５； Ｌａｎｇｅｒ， Ｒ．およびＶａｃａｎｔｉ， Ｊ．Ｐ． １９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０， ９２０； Ｇａｇｅ， Ｆ．Ｈ． １９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９２， １８）。
【０００３】
増殖能および／または多能性の高い組織特異的な「運命づけられた」幹細胞または前駆細胞が存在することは、各々組織に合った特定の方法を用いてクローン同定した、造血幹細胞（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ， Ｇ．Ｊ．ら、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１， ５８）、神経幹細胞（Ｄａｖｉｓ， Ａ．Ａ．およびＴｅｍｐｌｅ， Ｓ． １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７２， ２６３； Ｓｔｅｍｐｌｅ， Ｄ．Ｌ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ｊ． １９９２ Ｃｅｌｌ ７１， ９７３）、および上皮幹細胞（Ｊｏｎｅｓ， Ｐ．Ｈ．およびＷａｔｔ， Ｆ．Ｍ． １９９３ Ｃｅｌｌ ７３， ７１３）の研究から明らかである。これらの前駆細胞は、正常な造血、神経、または上皮組織のホメオスタシスを担う、および重度の傷害後に再生応答を担う細胞だと考えられている（Ｈａｌｌ， Ｐ．Ａ．およびＷａｔｔ， Ｆ．Ｍ． １９８９ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０６， ６１９）。
【０００４】
哺乳類の成体の肝臓は、通常は代謝回転が遅く、静止状態の組織であるにも関わらず、高度の肝毒性による傷害または部分的肝切除の後に回復する能力が非常に高い（Ｆｉｓｈｂａｃｋ， Ｆ．Ｃ． １９２９ Ａｒｃｈ． Ｐａｔｈｏｌ． ７， ９５５）； （Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｇ．Ｍ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｒ．Ｍ． １９３１ Ａｒｃｈ． Ｐａｔｈｏｌ． １２， １８６）。マウスにおける最近の試験データでは、一連の移植実験で調べたところ、成体の実質細胞は、ほぼ無限の増殖可能性を持っていることが示唆された（Ｏｖｅｒｔｕｒｆら、１９９７ Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５１， １２７３）； （Ｒｈｉｍ， Ｊ．Ａ．ら、１９９４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３， １１４９）。これらの実験では不均質の幹細胞群を利用しているため、観察された増殖可能性が成体の実質細胞に由来するのか、成体の実質細胞の亜集団に由来するのか、および／または実質細胞の未成熟期（即ち、前駆細胞）に由来するのかを証明する能力が限定されている。さらに実験では、使用された宿主がアルブミン・ウロキナーゼ導入遺伝子またはチロシン分解酵素の欠損を持っていたため、胆管上皮分化の証拠が示されていない；このいずれの宿主も、肝細胞系を選択するような特性を持つ。したがって、このアッセイ法では両能性細胞群の試験ができなかった。
【０００５】
いくつかの組織学的試験により、妊娠中期の胎児の初期肝細胞が、胆管上皮および成熟幹細胞に分化する両能性の能力を持つことが確立している（Ｓｈｉｏｊｉｒｉ， Ｎ． １９９７ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈ． ３９， ３２８−３５）。肝臓の発生は、内胚葉の上皮が造心中胚葉と相互作用をした直後に、腹側前腸内胚葉から始まる（Ｄｏｕａｒｉｎ， Ｎ．Ｍ． １９７５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． ５３， ４２７）； （Ｈｏｕｓｓａｉｎｔ， Ｅ． １９８０ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ９， ２６９）。この肝臓への関係づけは、マウスでは胎齢（Ｅ） ８日で起きる。肝臓発生の最初の段階は、形態学的変化の前に、内胚葉において血清アルブミンおよびαフェトプロテインのｍＲＮＡが誘導されて、明らかになる（Ｇｕａｌｄｉ， Ｒら、１９９６ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０， １６７０）。マウス胎齢Ｅ ９．５日で、特定の細胞が増殖し、糸のような形で横中隔の間充織に侵入し、肝臓原基を形成する。その後、肝臓の質量は劇的に増加するが、質量の増加は主に造血細胞によるもので、これはマウスではＥ１０に胎児肝にコロニーを形成し（Ｈｏｕｓｓａｉｎｔ， Ｅ． １９８１ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １０， ２４３）、肝細胞に影響を与えて極度にゆがんだ不規則な形をとらせる（Ｌｕｚｚａｔｔｏ， Ａ．Ｃ． １９８１ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ２１５， １３３）。興味深いことに、遺伝子ターゲティング変異マウスを用いた最近のデータは、いくつかの遺伝子の欠損により、Ｅ１２からＥ１５の間に、致死的な肝不全、実質細胞のアポトーシス、および／または壊死が引き起こされたことを示す（Ｇｕｎｅｓ， Ｃ．ら、１９９８ ＥＭＢＯ Ｊ． １７， ２８４６）、（Ｈｉｌｂｅｒｇ， Ｆ．ら、１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５， １７９１）、（Ｍｏｔｏｙａｍａ， Ｊ．ら、１９９７ Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ６６， ２７）、（Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｃら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７３， ６９９）。ストレス活性化カスケード （Ｇａｎｉａｔｓａｓ， Ｓ．ら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ６８８１）、（Ｎｉｓｈｉｎａ， Ｈ．ら、１９９９ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６， ５０５） または抗アポトーシスカスケード（Ｂｅｇ， Ａ．ら、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７６， １６７）、（Ｌｉ， Ｑ．ら、１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４， ３２１）、（Ｔａｎａｋａ， Ｍら、１９９９ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０， ４２１）の一部である遺伝子の破壊は、不活化された遺伝子が広く発現されるにも関わらず、肝発生をひどく損なうが、造血は損なわない。肝細胞が発生ストレスの刺激に本来感受性なのか、胎児肝自体の中の特定の微小環境がそのような破壊的な効果を引き起こすのかは明らかではない（Ｄｏｉ， Ｔ．Ｓら、１９９９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， ２９９４）。一方で、成体肝の基礎的構築は、門脈を取り囲む胆管上皮の最初の円柱の出現に依存する（Ｓｈｉｏｊｉｒｉ， Ｎ． １９９７ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈ． ３９， ３２８）。免疫組織学的には、肝内胆管上皮細胞の分化の最初の徴候は、胆汁特異的サイトケラチン（ＣＫ）の発現である。上皮細胞の細胞質中間フィラメント（ＩＦ）タンパク質���あるＣＫタンパク質は、多重遺伝子族によってコードされ、組織および分化に特異的に発現される（Ｍｏｌｌ， Ｒら、１９８２ Ｃｅｌｌ ３１， １１）。成体の肝実質細胞はＣＫ１９を全く発現しないが、成体の胆管上皮細胞は発現するので、ＣＫ１９は胆汁マーカーの中で最も目を引くものの１つである。ＣＫ８とＣＫ１８のみが初期の肝細胞から成体の肝実質細胞まで通して発現される（Ｍｏｌｌ， Ｒら、１９８２ Ｃｅｌｌ ３１， １１）。マウスのＥ１４に相当するラットの発現のＥ１５．５において、胆管前駆細胞はＣＫ１８抗体およびＣＫ８抗体の両方によって強く染色され、一部の胆管前駆細胞はＣＫ１９を発現する。発生が進むに連れ、成熟しつつある胆管はＣＫ１９に加えてＣＫ７も徐々に発現し始め、ＡＬＢの発現を失う（Ｓｈｉｏｊｉｒｉ， Ｎら、１９９１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１， ２６１１）。ラットのＥ１３という早い時期の肝細胞は均一な細胞群と考えられているが、全ての初期の肝細胞が胆管上皮細胞系に分化することができるのかどうか、およびこのような運命がどのようにして決定されるのかはまだ分かっていない。レトロウイルスベクターを用いるような、決定的な系統マーキング試験は肝細胞については行われておらず、両能性肝前駆細胞の立証に必要なクローン培養条件は決定されていない。
【０００６】
クローン増殖分析の１つの大きな障害は、造血細胞の爆発的な増加であり、これにより肝細胞のエクスビボでの増殖が観察できなくなる。したがって、肝細胞の濃縮方法を用いる必要がある。胎児肝において造血細胞を分画が必要な表面マーカーは、詳細に調べられているが（Ｄｚｉｅｒｚａｋ， Ｅら、１９９８ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １９， ２２８）、肝前駆細胞のマーカーの研究は初期段階で、これらはまだあまり決定されていない（Ｓｉｇａｌ， Ｓら、１９９４ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９， ９９９）。さらに、成体肝細胞で通常使用されるエクスビボの増殖条件では、ＡＬＢ発現のような組織特異的機能の損失を伴った分化が起きる（Ｂｌｏｃｋ， Ｇ．Ｄ．ら、１９９６ Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３２， １１３３）。組織特異的ｍＲＮＡを合成するやや改善した能力と、翻訳後に完全に組織特異的遺伝子を調節する修復能力とは、無血清で、ホルモン、増殖因子、および／または一部の細胞外マトリックス成分が定義されている混合物を用いて維持された肝細胞にのみ、見受けられる（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ｍ．ら、１９８４． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４， １９２９； Ｅｎａｔ Ｒら、１９８４ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８１， １４１１）。しかし、増殖する胎児肝細胞は、インビボでそのような血清タンパク質の発現を維持する。当技術分野で明らかでないのは、インビトロで肝前駆細胞を維持して増殖させるためにどうしたらよいかである。肝前駆細胞のエクスビボの増殖を維持する条件の同定には、未充足の需要がある。同様に、新しく肝組織から単離された肝前駆細胞のクローン増殖能力を決定するためのインビトロコロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）法に対する未充足の需要がある；クローン増殖は、培養液に接種された単一の細胞が、接種された細胞に由来するクローンの娘細胞群を生成する能力と定義される。高い細胞密度で接種され、肝臓培養において近接して増殖する細胞の塊からなるクローン増殖も他の研究者により記述されている（Ｂｌｏｃｋ， Ｇ．Ｄ．らＪ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９６， １３２， １１３３）；しかし、これらの以前の研究に記述されている細胞のコロニーは、継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）できず、したがって、定義からしてクローンとは言えず、有用性が限られている。
【０００７】
インビトロで肝実質細胞を増殖させる試みもなされてきた。ノートン（Ｎａｕｇｈｔｏｎ）らの米国特許第５，５１０，５２４号は、肝細胞の培養は生体適合性であるが生きていない材料の３次元フレームワークに依存すると主張している。人工的フレームワークがなく、肝前駆細胞が増殖および培養できるような培養条件には未充足の需要がある。また、胆管細胞および肝実質細胞の両方を生成する能力のある両能性分化能を持ち、ならびに特に人工肝臓の成分としての利用、肝毒素の試験、および薬剤開発に適する、クローン化肝前駆細胞には未充足の需要がある。
【０００８】
ノートンらの米国特許第５，５５９，０２２号では、「予備細胞（ｒｅｓｅｒｖｅ ｃｅｌｌ）」の特徴付けに使用される染料であるエオシンＹに結合する肝予備細胞を特許請求しているが、肝予備細胞の同定に、確立されたマーカーを使用しておらず、また予備細胞のクローン増殖の方法も、生存能力のある肝予備細胞の単離に用いたマーカーも提供されていない。少なくとも１つの特異的マーカーの発現および肝実質細胞または胆管細胞のいずれかに分化する能力を含め、肝前駆細胞に必須の多くの特徴を持つ細胞の単離および培養法を開示している方法には、未充足の需要がある。肝前駆細胞のクローン増殖の方法にも未充足の需要がある。クローン増殖は、多能性肝前駆細胞の明確で厳密な区別および同定方法として必須である。
【０００９】
ポンティング（Ｐｏｎｔｉｎｇ）の米国特許第５，４０５，７７２号は、細胞増殖のための培地を特許請求している。米国特許第５，４０５，７７２号では、３〜３０μｇ／ｍｌコレステロール、５〜３０μｇ／ｍｌヌクレオシド、および２〜１００μｇ／ｃｍ２のＩＶ型コラーゲンまたは０．５〜１００μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチンのいずれかが必要とされる。これには肝前駆細胞の増殖に特異的で、かつ最適化された培地が必要である。
【００１０】
クリ・ハークーチ（Ｋｕｒｉ−Ｈａｒｃｕｃｈ）らの米国特許第４，９１４，０３２号は、肝実質細胞を培養する過程を特許請求している。本発明とは反対に、米国特許第４，９１４，０３２号は肝前駆細胞の培養または肝細胞のクローン増殖の条件のいずれも開示していない。同様に、クリ・ハークーチらの米国特許第５，０３０，１０５号は、肝実質細胞培養を処理することによって薬剤を評価する方法を特許請求している。規定された細胞群を試験に使用するためのクローン増殖条件、および肝前駆細胞の培養のための方法には、未充足の需要がある。
【００１１】
ノートンらの米国特許第５，８５８，７２１号は、間質細胞のトランスフェクションを特許請求している。しかし米国特許第５，８５８，７２１号は、生体適合性の生きていない材料のフレームワークを必要とする点で限定されている。これとは対照に、本発明では合成のメッシュワークを必要としない増殖条件といった未充足の需要がある。
【００１２】
本発明者らは、はるかに有用な肝前駆細胞からではなく、肝実質細胞のような成熟した肝細胞を培養するのは不適当であると認識した。発明者らは肝前駆細胞の単離パラメーターおよびクローン増殖の要件を注意深く決定した。前駆細胞ならびに前駆細胞の選択および培養方法には、肝不全の患者の治療薬、および毒性物質の評価、および薬剤の評価を含め、多くの利用方法がある。
【００１３】
リード（Ｒｅｉｄ）らの米国特許第５，５７６，２０７号および５，７８９，２４６号は、フィーダーおよびホルモン添加合成培地の必要性を開示している。これらの先行研究は、胚の肝臓の間質細胞と、規定された細胞外マトリックス基底、および無血清のホルモン添加培地を組み合せて用いて、肝前駆細胞の増殖条件としている。しかし、使用された合成培地は本発明で使用されたものよりも、複雑であり；細胞は精製されたマトリックス基底（ＩＶ型コラーゲンおよびラミニン）上に接種されたが、本明細書ではフィーダー（マトリックスを供給する）の上に直接まかれており；また、胚間質細胞は、胚肝臓からの初代培養として調製され、細胞株として確立されなかった。胚間質細胞株を使用することにより、フィーダー細胞は、はるかに簡単で、実際的で、再現性のある細胞支持手段となる。さらに、ＳＴＯフィーダーは肝前駆細胞に限定して支持するのではなく、複数の種類の組織から得た前駆細胞にも使用できると考えるのは、合理的である。先行特許では、肝前駆細胞培養液は、高い細胞密度で接種され、その増殖はコロニー形成として観察されたが、これは細胞のクローンではなく、塊の増殖が誘導されたことを意味する。
【００１４】
３． 発明の概要
本発明は、前駆細胞、その子孫、またはその混合物を増殖させる方法に関する。特に、本発明は内胚葉由来の前駆細胞、その子孫、またはその混合物を増殖させる方法に関する。細胞は内胚葉組織から得られる。その後、内胚葉由来の前駆細胞、その子孫、またはその混合物は、培地中で、フィーダー細胞を含む層の上で培養される。前駆細胞、その子孫、またはその混合物は、脊椎動物細胞であり得る。前駆細胞、その子孫、またはその混合物は、ＩＣＡＭまたはＩＣＡＭ−１陽性、および古典的ＭＨＣクラスＩ抗原陰性の表現型を発現する。古典的ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＭＨＣクラスＩａ抗原とも呼ばれる。
【００１５】
本発明は無血清の、ホルモン添加合成培地、およびフィーダー細胞を用いた肝幹細胞および他の前駆細胞の培養方法にも関する。また、本発明は前駆細胞の子孫、または前駆細胞および前駆細胞の子孫の組み合せを培養する方法にも関する。好ましくは、前駆細胞は肝前駆細胞である。同様に、本発明は特定の培養条件を用いて肝臓の多能性前駆細胞をクローニングする方法にも関する。好ましくは、本発明は肝臓の多能性前駆細胞をクローニングする方法に関する。肝臓の多能性前駆細胞は、任意の無脊椎動物または脊椎動物種、より好ましくは哺乳類に由来できる。より好ましくは、肝臓の多能性前駆細胞は、ヒト、霊長類、ブタ、イヌ、ラット、ウサギ、またはマウスに由来する。最も好ましくは、多能性前駆細胞はヒトに由来する。本発明は肝前駆細胞およびその子孫のエクスビボの増殖に必要な特定の培養条件を開示する。本発明は肝前駆細胞のフィーダー細胞として、ＳＴＯマウス胚細胞のような胚のフィーダー細胞の使用も開示する。フィーダー細胞は、本発明で開示される新規で無血清のホルモン添加合成培地（ＨＤＭ）と組み合せて使用される。この組み合せによって、細胞が悪性形質転換せずに、Ｅ１５ラット肝から種々のラット胎児肝細胞株を確立することができた。
【００１６】
さらに、本発明は肝前駆細胞およびその子孫の増殖を支持する能力のあるフィーダー細胞のクローニング方法に関する。
【００１７】
本発明はフィーダーとして使用されると肝前駆細胞の増殖を支持する、特定の細胞株にも関する。
【００１８】
また、本発明は肝前駆細胞のクローニング方法にも関する。本発明は、新しく単離された肝前駆細胞のクローン増殖能力を決定するためのインビトロコロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）法の開発のための、幹細胞株およびＨＤＭ−ＳＴＯ共培養系の使用を開示する。ＣＦＡを、特異的な抗原プロファイルによって精製された細胞と組み合せると、両能性肝前駆細胞が明らかになる。例えば、マウスのＥ１１．５に対応するＥ１３ラット肝から得た増殖能力の高い前駆細胞は、古典的ＭＨＣクラスＩ（ＲＴ１Ａ１）−、ＯＸ１８ （汎ＭＨＣクラスＩ）ｄｕｌｌ、および細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）＋という同じ表現型を持つ。
【００１９】
また本発明はクローン肝細胞増殖を支持できる培地にも関する。培地は、いくつかの特定のホルモンおよび栄養を特徴とし、血清を含まない。
【００２０】
さらに、本発明はフィーダー細胞の生合成産物を含む培地における肝前駆細胞の培養に関する。
【００２１】
さらに本発明は肝実質細胞および胆管細胞の表現型を含む、肝細胞の分化の誘導方法に関する。本発明では、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、前駆細胞コロニーの増殖と、肝実質細胞または胆管上皮細胞としてのいずれかの運命の両方に影響を与えることが開示される。
【００２２】
５． 好ましい態様の詳細な説明
本発明は幹細胞の増殖および利用の過程である。外胚葉、中胚葉、および内胚葉起源の組織を含め、種々の組織が、前駆細胞の適当な供給源である。外胚葉組織には、皮膚組織、脳組織、および他の神経組織が含まれる。中胚葉組織には、筋肉、血液、および造血系が含まれる。内胚葉組織には、消化管、胃、膵臓、甲状腺、および消化器系に伴う腺が含まれる。特に、本発明は肝幹細胞および他の肝前駆細胞の増殖の過程である。本過程には、単離した肝幹細胞および／または肝前駆細胞および／またはその子孫の細胞群を、クローン増殖すなわち非常に低い細胞密度での増殖を支持する能力のある増殖条件に暴露することを含む。好ましい態様では、この過程には、フィーダー細胞層上での肝前駆細胞の増殖を支持するため、無血清の、ホルモン添加合成培地の使用が含まれる。フィーダー細胞の機能は複数あり、栄養の供給、接着表面の提供、および肝前駆細胞の生存、増殖および／または分化に必要な特定の増殖因子および細胞外マトリックスを培地中に分泌することが含まれる。別の好ましい態様では、この過程には肝幹細胞および肝前駆細胞の増殖を支持する能力のある細胞の選択が含まれる。フィーダー細胞は、爬虫類、鳥類、甲殻類、魚類、環形動物、軟体類、線虫類、昆虫類、または哺乳類、好ましくはヒト由来でよい。好ましくは、フィーダー細胞は胚組織に由来する。また好ましくは、フィーダー細胞は胚組織に由来する。また好ましくは、フィーダー細胞は胚の肝組織に由来する。また、フィーダー細胞は遺伝子組換えされていても良い。さらに好ましい態様では、この過程には幹細胞を最適に支持するフィーダー細胞のクローニングが含まれる。
【００２３】
親和性に基づく相互作用、例えば、アフィニティパニング、補体と組み合せたイムノサージャリー、フローサイトメトリー、遠心水簸、分画遠心等、肝幹細胞および肝前駆細胞を単離する任意の方法が使用できる。単離された肝幹細胞および前駆細胞は、一部または全ての表現型マーカー（古典的ＭＨＣクラスＩ−、ＩＣＡＭ−１＋、ＯＸ１８ｄｕｌｌ、αフェトプロテイン＋、またはアルブミン＋）を発現する能力を持つ。本発明の別の態様では、肝前駆細胞は、塊、コロニーまたはクラスターとして積み重なった細胞の形成で特徴付けられる増殖パターンを発現する。
【００２４】
本発明の好ましい態様では、幹細胞は無血清のホルモン添加合成培地（ＨＤＭ）で選択的に増殖する。
【００２５】
ＨＤＭの組成には、約４０ ｎｇ／ｍｌまでのＥＧＦ、約５〜１０μｇ／ｍｌまでのインスリン、約１０−６ Ｍまでのデキサメタゾンまたは他のグルココルチコイドホルモン、約１０μｇ／ｍｌまでの鉄飽和トランスフェリン、約５ ｘ １０−２ Ｍまでのニコチンアミド、約２％までのウシ血清アルブミン、約５ ｘ １０−４ Ｍまでの２−メルカプトエタノールまたは同等の還元剤、約８μｅｑ／ｌまでの遊離脂肪酸、約２ ｘ １０−２ Ｍまでのグルタミン、約１ ｘ １０−６ ＭまでのＣｕＳＯ４、約３ ｘ １０−８ ＭまでのＨ２ＳｅＯ３、および選択的に抗生物質を添加した、ダルベッコ変法イーグル培地およびハムＦ１２の混合物を含むがこれに限定されることのない、栄養培地が含まれる。抗生物質には、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、および他の当技術分野で一般的な抗生物質、およびその組み合せが含まれる。当業者には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の代わりに、最小限の試験後に、他の栄養培地、例えば、ハムＦ−１０、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、またはＭＣＤＢ １５１およびＭＣＤＢ ３０２を含むＭＣＤＢシリーズも使用できることが理解されると思われる。細胞培養の最も最低の条件は、ホルモンなしでフィーダーを使用することであり；上述のホルモン要件の中で最も重要なのはグルココルチコイド、インスリン、トランスフェリン、およびＥＧＦで、これは前駆細胞の増殖のためのホルモン性分裂促進剤を構成している。他のホルモン因子も添加でき、２次的な増殖効果があるかも知れないが、上述の重要な要件を置き換えるものではない。同様に、当業者が行なえるようなホルモン組成の変更は、本発明の範囲内である。
【００２６】
好ましい範囲には、１０〜５０ ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、２〜１０μｇ／ｍｌインスリン、５ ｘ １０−７ Ｍ〜５ ｘ １０−６ Ｍデキサメタゾン（９ａ−フルオロ−１６ａ−メチル−プレドニゾロン）、５〜２０μｇ／ｍｌ鉄飽和トランスフェリン、２〜８ ｘ １０−３ Ｍニコチンアミド、０．０５〜０．５％血清アルブミン、２〜８ ｘ １０−５ Ｍ ２−メルカプトエタノール、５〜１０μｅｑ遊離脂肪酸混合物、１〜３ ｘ １０−３ Ｍグルタミン、０．５〜２ ｘ １０−６ Ｍ ＣｕＳＯ４、１〜５ ｘ １０−８ Ｍ Ｈ２ＳｅＯ３、１〜５μＭパルミチン酸、０．１〜０．４μＭパルミトレイン酸、０．５〜１．２μＭステアリン酸、０．５〜２μＭオレイン酸、１〜５μＭリノール酸、および０．２〜０．８μＭリノレン酸が含まれる。
【００２７】
本発明の無血清のホルモン添加合成培地は、肝細胞のクローン増殖に適している。このＨＤＭには、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ）、ハムＦ１２、ＲＰＭＩ １６４０、ウィリアムズＥ培地等のようないくつかのオプションのうちの任意の基礎培地を含み得る。好ましい態様は、ダルベッコ変法イーグル培地とハムＦ１２の１：１の混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、例えばＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）である。基礎培地には、好ましい濃度１０ ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子ＥＧＦ（例えば、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓより）、好ましい濃度５μｇ／ｍｌのインスリン（例えばＳｉｇｍａ）、１０−６Ｍデキサメタゾン（例えばＳｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌ鉄飽和トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、４．４ ｘ １０−３Ｍニコチンアミド（例えばＳｉｇｍａ）、０．２％ウシ血清アルブミン（例えばＳｉｇｍａ）、５ ｘ １０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール（例えばＳｉｇｍａ）、７．６ μｅｑ／ｌ遊離脂肪酸混合物（２．４μＭパルミチン酸、０．２１μＭパルミトレイン酸、０．８８μＭステアリン酸、１μＭオレイン酸、２．７μＭリノール酸、および０．４３μＭリノレン酸）、２ ｘ １０−３Ｍグルタミン（例えばＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１ ｘ １０−６Ｍ ＣｕＳＯ４、３ ｘ １０−８Ｍ Ｈ２ＳｅＯ３および抗生物質を添加する。インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−６ファミリー、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を含むがこれらに限定されないフィーダー細胞から分泌される増殖因子は、フィーダーの効果を増強するために培地に添加でき、単独または種々の組み合せで添加してもフィーダーの効果を置き換えるものではない。これは、フィーダー細胞は、単独またはこれらの増殖因子との組み合せで必要とされる他のシグナルも生産していることを意味する。
【００２８】
本発明の別の態様では、肝前駆細胞は単一の前駆細胞から増殖する、すなわち、細胞がクローニングされる。コロニーで細胞を増殖させることは、単一の細胞に由来する細胞の増殖と黙示的および明示的に定義されるクローン増殖とは必ずしも同じではない。限界希釈法と呼ばれる、前駆細胞を培養プレートのウェル１つあたり１細胞またはそれ未満に希釈する方法を含め、当技術分野で周知のいくつかのクローニング方法の任意のものが適当である。同様に前駆細胞は、クローニングリング、選択的剥離、微粒子上の希釈培養、フローサイトメトリーを用いた単細胞ソート、マイクロピペットまたは光学ピンセットを用いた個々の細胞の選択、および寒天を用いてもクローニングできる。
【００２９】
本発明の別の態様では、クローニングされた前駆細胞の多くが有糸分裂できる。前駆細胞は少なくとも１回の有糸分裂ができることが好ましく、少なくとも１０回の分裂ができることがさらに好ましい。
【００３０】
本発明のさらに別の態様では、肝前駆細胞およびその子孫は、フィーダー細胞の代謝および生合成産物を添加した培地で増殖する。添加物は、調整培地、すなわち生きたフィーダー細胞が以前にインキュベートされた培地の形でよい。好ましくは、添加は、フィーダー細胞の調整培地から、肝前駆細胞およびその子孫の増殖を維持し増加するタンパク質、ペプチド、脂質、炭化水素、および代謝調節因子を含む因子を単離する形で良い。タンパク質は、細胞外マトリックスの可溶性および不溶性成分、および上皮成長因子およびインスリン様成長因子を含む増殖因子を含み得る。
【００３１】
さらに好ましくは、胚または成体細胞または他の適当な細胞であるフィーダー細胞の層を用いて、肝細胞は培養で選択的に増殖する。１つの態様では、フィーダー細胞は間質細胞または線維芽細胞である。線維芽細胞または他の適当な細胞は、例えばトランスフェクションにより、遺伝子組換えされていてもよい。好ましくは、線維芽細胞または他の適当な細胞はヒト、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット、またはマウスの中胚葉細胞であるが、また他の哺乳類および鳥類の中胚葉細胞も適している。さらに、線維芽細胞は、クローニングされ肝前駆細胞を支持する能力について選択され得る。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、単離された肝前駆細胞は、上皮成長因子（ＥＧＦ）または他の分化シグナルの選択的使用またはその欠如により、肝実質細胞または胆管細胞系に運命づけられている。
【００３３】
本発明のさらに好ましい態様では、単離された幹細胞および他の肝前駆細胞は、体外肝補助装置として使用され得る人工肝臓の成分として使用できる。本発明のさらに好ましい態様では、単離された肝前駆細胞およびその子孫を含む人工肝臓は、肝の機能不全または不全を患う患者の生命を維持するために使用される。
【００３４】
６． 実施例
以下の実施例は、本発明を例示するものであるが、本発明はこれらの具体的な実施例に限定されない。当業者はこれらの実施例から本発明を実行する手段を得るものと思われる。当業者は本発明の範囲に含まれる多くの別の態様を認識すると思われる。
【００３５】
６．１ 肝幹細胞および肝前駆細胞の調製および分析
ラット
チャールズ・リバー・ブリーディングラボラトリー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（Ｗｉｌｍｉｎｇｏｎ， ＭＡ）から、妊娠したフィッシャー３３４ラットを入手する。時刻を設定した妊娠には、午後に動物を一緒にして、プラグが観察された朝を０日とする。成体の肝細胞には、オスのフィッシャー３３４ラット（２００〜２５０ ｇ）が使用される。
【００３６】
幹細胞株の確立
胎齢１５日の胎児肝が調製される。単細胞懸濁液は、０．０５％トリプシンおよび０．５ ｍＭ ＥＤＴＡまたは１０ユニット／ｍｌサーモリシン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）および１００ユニット／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）で肝臓を３７℃でインキュベートして得られる。細胞は、フィコール−パーク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）に重ね、４５０ｇで１５分間密度勾配遠心を行なう。ｔｈ１１２０−３およびｒｔｅｒ６またはｒｈｅｌ４３２１について、底部の画分の細胞を、それぞれ１７ ｍｇ／ｍｌ ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）または１２μｇ／ｍｌラミニン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）でコートした組織培養ディッシュに接種する。無血清のホルモン添加培地ＨＤＭは、ダルベッコ変法イーグル培地およびハムＦ１２の１：１の混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）に、２０ ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１０−７Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌ鉄飽和トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、４．４ ｘ １０−３Ｍニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）、０．２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、５ ｘ １０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、７．６ μｅｑ／ｌ遊離脂肪酸、２ ｘ １０−３Ｍグルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１ ｘ １０−６Ｍ ＣｕＳＯ４、３ ｘ １０−８Ｍ Ｈ２ＳｅＯ３および抗生物質を添加したものである。記載の各濃度は、培地中の最終濃度である。４週間の培養後、トリプシン処理した細胞をマイトマイシンＣで処理したＳＴＯマウス胚線維芽細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）のフィーダー層上で培養する。Ｔｈ１１２０−３、ｒｔｅｒ６およびｒｈｅｌ４３２１は、胎児肝細胞の３つの独立した調製物からクローニングし、ＨＤＭを用いてＳＴＯフィーダー細胞上で維持する。細胞株の確立後、全ての培養に関してＥＧＦの濃度は１０ ｎｇ／ｍｌに低下させる。
【００３７】
細胞接着アッセイ法
フィブロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ラミニン、およびＩＶ型コラーゲンに対する細胞の接着は、これらのタンパク質を０．３〜１０μｇ／ｍｌでコートした９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を用いて評価する。２００ｇで１５分間のパーコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）密度勾配遠心によりＳＴＯ細胞を除去した後、各ウェル中で３ ｘ １０４細胞の肝細胞株ｔｈ１１２０−３、ｒｔｅｒ６、およびｒｈｅｌ４３２１をＨＤＭを用いて１０時間培養する。浮遊細胞を除去するために２回すすいだ後、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を含む新しい培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を添加して、生存可能な接着細胞の数を測定する。４時間後に、製造元のプロトコールにしたがって、吸光度を決定する。
【００３８】
ＳＴＯ亜系統
ＡＴＣＣから得た１００個の親ＳＴＯ細胞は、１０％の熱で不活化した胎児ウシ血清、２ ｘ １０−３Ｍグルタミン、５ ｘ １０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、および抗生物質を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、１００ｍｍ培養ディッシュで７日間培養する。細胞の形態および増殖速度によって、さらに解析するために４つのサブクローンが選択される。ｒｔｅｒ６のＣＦＡは４つのサブクローンで行われるが、その１つであるＳＴＯ６はマイトマイシンＣ処理後に培養プレートに接着しなくなる。１つのサブクローンＳＴＯ５はアダムス博士（Ｄｒ． Ｊ． Ｍ． Ａｄａｍｓ， Ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から提供を受けたｐＥＦ−Ｈｌｘ−ＭＣ１ｎｅｏまたはｐＥＦ−ＭＣ１ｎｅｏによってトランスフェクトする。Ｎｄｅ Ｉ部位で線状にしたプラスミドを、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によって細胞中に導入する。Ｇ４１８選択後、６つのクローンが単離される。各々３つのクローンがＣＦＡで分析される。
【００３９】
コロニーの免疫組織化学染色
培養プレートはメタノール−アセトン（１：１）で室温で２分間固定し、すすぎ、２０％のヤギ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含むハンクス液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＨＢＳＳ））により、４℃でブロックする。αフェトプロテインとアルブミンの二重免疫組織化学のためには、プレートは抗ラットアルブミン抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）処理後にテキサスレッド結合抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）、およびＦＩＴＣ結合抗ラットαフェトプロテインポリクローナル抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉｌｂｕｒｇ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とインキュベートする。アルブミンとＣＫ１９の二重標識には、抗αフェトプロテイン抗体の代わりに、抗ＣＫ１９モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ）およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）が使用される。
【００４０】
Ｅ１３の胎児肝の解離
胎児肝は１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４および１ｍＭ ＥＧＴＡ （ｐＨ ７．４）を添加した、Ｃａ＋＋フリーの氷冷ＨＢＳＳ中に切開して入れる。肝臓は１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４、および１ ｍＭ ＣａＣｌ２で調製されたＨＢＳＳ中の０．２％ ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）および１６．５ユニット／ｍｌサーモリシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、粉砕する。３７℃で１０分間インキュベーションした後、細胞懸濁液を０．０２５％トリプシンおよび２．５ ｍＭ ＥＤＴＡ （Ｓｉｇｍａ）で１０分間消化する。その後、１ ｍｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を添加してトリプシンを抑制する。最後に、細胞を２００ユニット／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼＩ （Ｓｉｇｍａ）で処理する。全ての実験において、肝臓１つあたり３〜５ ｘ １０５細胞が得られる。
【００４１】
成体肝細胞の単離
肝細胞を単離するために、２段階の肝臓潅流法が用いられる。潅流後、細胞を５０ｇで１分間、２回遠心し、大きな実質細胞を濃縮する。生存度はトリパンブルー排除による測定によると＞９０％である。
【００４２】
フローサイトメトリー分析
細胞はＦＡＣＳｃａｎ （Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）で分析し、Ｍｏｆｌｏｗ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ （Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ， ＣＯ）を用いてソートする。Ｅ１３胎児肝から得た細胞懸濁液は、非特異的抗体結合を予防するために、氷上で２０％ヤギ血清（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）および１％硬骨類のゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を含むＨＢＳＳとインキュベートする。すすいだ後、細胞はＦＩＴＣ結合抗ラットＲＴ１Ａａ，ｂ，ｌ抗体Ｂ５ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）およびＰＥ結合抗ラットＩＣＡＭ−１抗体１Ａ２９（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と懸濁する。一部の実験では、３色染色のため、細胞はビオチン化抗ラット単形性ＭＨＣクラスＩ抗体ＯＸ１８ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した後、ストレプトアビジン−レッド６７０ （ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）による第２の染色を行なう。全ての染色は、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４， ０．２ ｍＭ ＥＧＴＡ、および０．２％ ＢＳＡ （ｐＨ ７．４）を含み、Ｃａ＋＋フリーの氷冷ＨＢＳＳを用いて行なう。確立された３つの細胞株は、トリプシン処理をして、パーコール密度勾配遠心によってフィーダー細胞を除去する。ラットヘパトーマ細胞株ＦＴＯ−２Ｂおよびラット肝上皮細胞株ＷＢ−Ｆ３４４ならびに成体肝細胞は、胎児肝細胞株と比較するために染色する。細胞株は、それぞれフォアニエー博士（Ｄｒ． Ｒ．Ｅ．Ｋ． Ｆｏｕｒｎｉｅｒ， Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）、およびソウ博士（Ｄｒ． Ｍ．−Ｓ． Ｔｓａｏ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ， Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ， ＮＣ）から贈与された。細胞はブロックして、ＦＩＴＣ結合Ｂ５， ＯＸ１８， ＰＥ結合１Ａ２９、または抗ＦＩＴＣ結合ラットインテグリンβ１抗体Ｈａ２／５ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により染色する。ＯＸ１８にはＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧが使用される。マウス細胞群を排除するために、３つの胎児肝細胞株の細胞懸濁液は、ビオチン化抗マウスＣＤ９８で染色後、ストレプトアビジン−レッド６７０および抗ラットモノクローナル抗体による第２の染色を行なう。
【００４３】
細胞ごとに、異なる相対数で様々な抗原が発現される。現実的な使用法では、特定の抗原の発現レベルは、発現なし、低レベルの発現、多くの抗原にとって通常の発現レベル、および高レベルの発現であり得る。この使用法では、「低い（ｌｏｗ）」という用語は弱い（ｗｅａｋまたはｄｕｌｌ）と互換的に使用される。発現レベルのより詳しい記述を行なうこともできるが、多くの目的にはこれらの４つのレベルで充分である。例えばフローサイトメトリーによる抗原発現の測定は、抗原発現について連続的な範囲を提供することは明らかである。
【００４４】
肝細胞株、ソートした細胞、および成体肝細胞のＣＦＡ
肝細胞株は細胞株の維持に使用されたのと同一のＨＤＭを用いて、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯフィーダー層上に、９．６ ｃｍ２あたり５００細胞で、３連で播く。播く前に、細胞はトリプシン処理をして、パーコール密度勾配遠心によってフィーダー細胞を除去する。培養液は２日ごとに培地を取り換えながら１０〜１４日インキュベートする。その後、αフェトプロテインおよびアルブミンの二重免疫蛍光染色が行われる。各ウェル１００コロニーを、コロニーの形態、ＰまたはＦ型、およびαフェトプロテインおよびアルブミンの発現について分析する。コロニーはＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ （Ｂａｘｔｅｒ， ＭｃＧａｗ Ｐａｒｋ， ＩＬ）を用いて染色し、各ウェルのコロニー数を数える。初代のソートした細胞および成体肝細胞のＣＦＡでは、記述のように播く細胞数を変更する。別のわずかな変更として、培養期間を１４および１７日の間に延長し、デキサメタゾンの濃度を１０−６Ｍに上昇させる。他の手順は上述のように実行される。成体肝細胞のＣＦＡでは、調製後、細胞懸濁液から、少数の肝細胞クランプが除去されない。したがって、クランプから不確定数のコロニーが作られる可能性がある。ソートした細胞上の胆管分化のＣＦＡでは、コロニーのアルブミンおよびＣＫ１９の二重免疫蛍光染色がＥＧＦの存在下または非存在下で、培養５日目に行われる。培養５日目に、ＣＫ１９＋細胞を１個を超えて持つコロニーは、ＣＫ１９＋コロニーとして数える。１０日および１５日目には、２個のＣＫ１９＋細胞のクラスターを複数含むコロニー、または３個を超えるＣＫ１９＋細胞のクラスターを１つ含むコロニーは、ＣＫ１９＋コロニーとして数える。各ウェルで約１００のコロニーが数えられる。各点は３連の染色した培養物の平均±ＳＤを表す。
【００４５】
６．２． ホルモン添加合成培地を用いた、マウス胚細胞のフィーダーを用いた胎児ラット肝細胞株の作製および解析
どれだけの期間、胎児肝細胞が維持され、エクスビボで増殖し、子孫を産生できるかを知るために、ラットＥ１５肝細胞の単純な長期培養を試みる。造血単核細胞を除去するために密度勾配遠心を行なった後、胎児肝細胞をＩＶ型コラーゲンまたはラミニンでコートした培養ディッシュおよびＨＤＭ（実施例６．１参照）を用いて培養する。細胞は４週間以上、生存する。しかし、新しくＩＶ型コラーゲンまたはラミニンでコートしたディッシュ上の２次培養では、さらには増殖しない。マイトマイシンＣ処理のＳＴＯ胚マウス線維芽細胞株を２次培養のフィーダー層として使用すると、細胞の多くの塊が増殖する。最終的に、４つの独立した実験から、いくつかの安定した肝細胞株が確立される。
【００４６】
αフェトプロテインおよびアルブミンの免疫組織分析は、細胞株のクローニングの前に、連続的に増殖する細胞群で行われる。αフェトプロテインおよびアルブミンの両方のタンパク質は、細胞群が肝細胞系起源であることを確認するマーカーとして使用される。Ｐコロニーと呼ばれる、細胞の積み重なりを形成する傾向のある細胞群では、αフェトプロテインおよびアルブミンを強く発現したが、Ｆコロニーと呼ばれる平坦な単層では、αフェトプロテインの発現が低下し、アルブミンは発現しなかった。胚マウス線維芽細胞ＳＴＯは、いずれの抗体にも反応性を示さない。さらに解析するために、Ｐ型またはＦ型のコロニーという形態的な基準により、独立した実験で、３つのクローニングされた肝細胞株が選択される。Ｒｈｅｌ４３２１（図１Ａ）は、主に小さな細胞の詰まったＰ型コロニーからなり、ｔｈ１１２０−３（図１Ｃ）は、Ｆ型コロニーの平らな単層のみを形成する。Ｒｔｅｒ６（図１Ｂ）はこの２つの表現型の中間である。興味深いことに、ｒｔｅｒ６の不均一性は、平らなコロニーを連続３回クローニングした後でも観察される。ｒｈｅｌ４３２１およびｒｔｅｒ６の単一細胞に由来するコロニーの不均一性を見るために、９．６ ｃｍ２（６穴プレートの１つのウェル）あたり５００細胞の密度で播種し、細胞をＳＴＯ線維芽細胞上で１０〜１４日培養した。その後、コロニーの形態およびαフェトプロテインおよびアルブミンの発現の解析をした。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆはその結果を表す。ｒｈｅｌ４３２１（図２Ｂ）およびｒｔｅｒ６（図２Ｃ）の細胞株、ならびにクローニング前の元の細胞群（図２Ａ）は、ほぼ全てのＰ型コロニーで強くαフェトプロテインを発現するのに対して、Ｆ型コロニーでは発現しない。さらに、αフェトプロテインとアルブミンの両方の強い発現は、Ｐ型コロニーのみに観察される。クローニングされた肝細胞株の形態的違いは、Ｐ型コロニーの割合と相関している（図２Ｂおよび２Ｃ）。ｒｔｅｒ６およびｒｈｅｌ４３２１のＣＦＡのＰ型コロニーの割合は、それぞれ３３．３％（±８．６％ ＳＤ）および６５．７％（±４．０％ ＳＤ）である。１ウェルあたりの総コロニー数を数えて、クローン増殖効率（コロニー効率）を計算する。ｒｔｅｒ６およびｒｈｅｌ４３２１の効率は、それぞれ４５．７％（±１．３％ ＳＤ）および３６．４％（±１．１％ ＳＤ）である。ｔｈ１１２０−３細胞は、側面の境界にそって互いに強く接着しあっており、単細胞懸濁液の調製が、非常に困難である。しかし、ｔｈ１１２０−３細胞は、重なり合ったクラスターを形成しない。
【００４７】
マウス肝細胞のラミニン、ＩＶ型コラーゲン、およびフィブロネクチンのような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質に対する接着は発生段階によって異なるため、各細胞株が特定のＥＣＭ成分に接着するときの選好性を次に調べる。成体肝細胞での所見と同様に、ＩＶ型コラーゲンはｔｈ１１２０−３の接着に最も効果的であるが（図１Ｃ）、ｒｔｅｒ６（図１Ｂ）およびｒｈｅｌ４３２１（図１Ａ）ではそれほどでもない。ラミニンはｒｈｅｌ４３２１の接着に最も有効な基質である（図１Ａ）。この選好性は、マウス胎児肝細胞の初代培養と同様である。要約すると、Ｐ型コロニーにおけるαフェトプロテインおよびアルブミンの保存された発現、ならびにｒｈｅｌ４３２１によるラミニンヘの優先した接着は、Ｐ型コロニーを産生している細胞群がより厳密に肝前駆細胞と関連していることを示唆する。
【００４８】
６．３ コロニー形成のためのＳＴＯサブクローンの単離；肝前駆細胞のアッセイ法
増殖能力の高い、両能性肝前駆細胞を同定するためのＣＦＡシステムを開発するために、培養系は、クローン播種密度で細胞の増殖を支持し、重要な元の肝機能を保存するものでなくてはならない。初期の肝臓発生に最も重要なマーカーのうちの２つがアルブミンおよびαフェトプロテインである。Ｆ型ではなくＰ型のコロニーがクローン増殖中にαフェトプロテインおよびアルブミンの発現を維持するので、Ｐ型コロニーを最適化する培養条件が最良である。したがって、ｒｔｅｒ６のＰ型コロニーを支持するＳＴＯサブクローンの能力が比較される。１つのクローンＳＴＯ５は、他の全ての亜系統および親株以上にＰ型コロニー形成を支持する（図２Ｄ）。ｒｈｅｌ４３２１のＣＦＡも、ＳＴＯ５が親ＳＴＯよりも有効なフィーダーであることを確認する（図２Ｅ）。Ｅ１０．５の消化管の内側を覆っている間充織細胞で発現するマウスＨ１ｘ遺伝子産物は、胎児肝細胞の増殖に必須である。Ｈ１ｘ遺伝子のｍＲＮＡ発現がＳＴＯサブクローンで分析されても、サブクローン間での発現の有意な差はない（データは示さず）。さらに、マウスＨ１ｘのＳＴＯ５中の安定なトランスフェクタントは、コロニー形成アッセイ法を改善しない（図２Ｆ）。しかし、トランスフェクタントの１つのクローンは、比較的高密度の継代で、ＳＴＯ５の元の形態をより安定的に持続させるので、このクローンはさらなる実験に使用される。
【００４９】
６．４ 表面抗原マーカーおよびコロニー形成アッセイ法を用いた、Ｅ１３胎児肝からの肝前駆細胞の同定
肝形成と大量の造血とが、胎児肝の中に共存する。これまで、造血前駆細胞の抗原性プロファイルは広く分析されてきたが、初期の肝前駆細胞の研究はまだ初期段階である。本研究で確立された３つの肝細胞株、成体肝癌細胞株（ＦＴＯ−２Ｂ）、成体ラット肝由来の上皮細胞株（ＷＢ−Ｆ３４４）、および新しく単離された成体肝細胞を用いて、肝細胞の抗原性プロファイルが分析される。ＦＴＯ−２Ｂ、ＷＢ−Ｆ３４４、および成体肝細胞と比較して、最も未熟な胎児肝細胞株ｒｈｅｌ４３２１は、古典的ＭＨＣクラスＩ（ＲＴ１Ａ１）の発現がないという点で、非常に独特である（図３Ａ〜３Ｘ）。細胞株ｔｈ１１２０−３（図３Ｉ〜３Ｌ）は、ＲＴ１Ａ１、ＯＸ１８（汎ＭＨＣクラスＩ）、およびＩＣＡＭ−１のパターンがｒｈｅｌ４３２１と類似しているが（図３Ａ〜３Ｄ）、ｒｔｅｒ６（図３Ｅ〜３Ｈ）はＲＴ１Ａ１およびＯＸ１８の発現が比較的高い（図３）。さらに、異なる実験で得られた別の細胞株は、ｒｈｅｌ４３２１と同一の形態を持つが、やはりＲＴ１Ａ１−、ＯＸ１８ｄｕｌｌ、およびＩＣＡＭ−１＋である。インテグリンｂ１の発現は、全ての細胞株で類似しているが、ＲＴ１Ａａ， ｂ， １およびＩＣＡＭ−１のパターンは細胞において独特である。成体肝細胞の抗原性プロファイルはＲＴ１Ａ１＋、ＯＸ１８＋、およびＩＣＡＭ−１＋である。成体ラット中では、赤血球を除く全ての骨髄細胞がＭＨＣクラスＩ分子を強く発現するので、胎児肝細胞群は、ＭＨＣクラスＩ発現によって造血細胞群から分離できる。ラットＥ１３肝臓から得られた細胞懸濁液を抗ＲＴ１Ａ１およびＩＣＡＭ−１抗体で染色する。図４Ａは、ＲＴ１Ａ１およびＩＣＡＭ−１の２色染色パターンを示す。どの画分に肝細胞群が含まれているかを決定するために、蛍光活性化セルソートによって５つの画分を単離し、クローン増殖能力をＣＦＡによってスクリーニングする。図４Ｂは、ソート後の、５つの画分の再ソート結果を表す。アルブミンおよびαフェトプロテインの発現で定義される肝細胞コロニーは、形態的にも区別可能なので、各ウェルの肝コロニーの数を数えることが可能である。肝コロニーの大部分は、ＲＴ１Ａ１ｄｕｌｌおよびＩＣＡＭ−１＋のゲートで検出され（表１、図４Ｂ、ゲート２）、Ｐ型コロニーの頻度は７５．６％（±４．９％ ＳＤ）である。ゲート１は、はるかに少ないコロニー数を示し、他の画分のコロニー形成能力を持つ細胞の数はごくわずかだった。ゲート１および２では、全ての肝コロニーにおいて、αフェトプロテインおよびアルブミンの両方の発現が確認される。ゲート２の細胞に由来する一部のコロニーは、他よりも大きい。肝細胞上のＭＨＣクラスＩ発現を詳細に調べるために、細胞分画のために、ＲＴ１Ａ１、ＩＣＡＭ−１、およびＯＸ１８の３色の染色、ならびにもう１つのパラメーターとして側方散乱光（ＳＳＣ）が使用される。胎児肝細胞はＥ１１という早期の胎齢でも脂肪滴を含むので（Ｌｕｚｚａｔｔｏ， １９８１）、細胞の粒状度を反映する側方散乱光（ＳＳＣ）は、造血細胞から肝細胞を分離するために有用なパラメーターである。図４Ｃは、ゲート２に最も多数のコロニー形成細胞が含まれていることを示す。ＳＳＣに基づいてＲ２でゲートをかけると��ゲート２に対応する細胞群は明らかにＲＴ１Ａ１−およびＯＸ１８ｄｕｌｌの表現型を示す（図４Ｃ、４Ｄ）。ＣＦＡにより、Ｒ４にはゲート２よりも多くのコロニー形成細胞が含まれることが確認される（表１）。これらの結果は、Ｅ１３ラット肝から得られたＲＴ１Ａ１−およびＯＸ１８ｄｕｌｌ、およびＩＣＡＭ−１＋細胞群の大部分が、αフェトプロテイン＋およびアルブミン＋のコロニーを生成する肝細胞であることを示唆する。これはｒｈｅｌ４３２１細胞で見られるのと同一の抗原性プロファイルである（図３）。
【００５０】
【表１】ＲＴ１ＡおよびＩＣＡＭ−１の発現に基づいてソートしたＥ１３胎児肝由来の肝コロニーの頻度
2004510434.tif 000003
【００５１】
ＳＴＯ５ｈｌｘ上でのコロニー形成培養は、Ｅ１３の胎児肝の各画分から得られる、示された数の細胞を含む。肝コロニーの数を、３連の染色した培養物から確立した（平均±ＳＤ）。コロニー形成の効率は、培養液に接種した細胞のうち、１６日の培養後に分析したところ、コロニーを形成するようになった割合を示す。
【００５２】
６．５． Ｅ１３肝細胞および成体肝細胞の異なる培養要件
Ｅ１３肝臓から得られたソートされた肝細胞の成長要件は、決められたＳＴＯ５フィーダーおよびＨＤＭを用いて調べられた。ＥＧＦは成体肝細胞の強力な増殖因子であることが以前から知られている。したがって、ソートした肝細胞のコロニー形成に対するＥＧＦの効果を調べる。ＲＴ１Ａ１− ＯＸ１８ｄｕｌｌ、ＩＣＡＭ−１＋肝細胞のコロニーサイズはＥＧＦがないと大きくなるが、成体肝細胞はＥＧＦの存在下でのみ、コロニーを生成した（図６Ｃ）。さらに、成体肝細胞に由来するコロニーの形態は、通常Ｆ型であるが、ＲＴ１Ａ１−肝細胞はＥＧＦなしでＰ型コロニーを形成する。しかし、コロニー効率はＥＧＦがないとわずかに低下する（図６Ａ）。興味深いことに、ＥＧＦのない培養条件は、２種類のＰコロニー、Ｐ１およびＰ２を際立たせた。培養１２日目にはコロニーの大部分はＰ２型であるが、図６Ａのような典型的な形態を持たないコロニーもあるので、２つのタイプを完全に区別するのは困難である。これらの結果は、胎児肝細胞および成体肝細胞は、その増殖要件ならびにＲＴ１Ａ１発現（図３および４）およびコロニーの形態において、本質的に異なることを示唆している。
【００５３】
増殖が最大に到達したと思われる培養３週間後に、ＲＴ１Ａ１− 、ＯＸ１８、およびＩＣＡＭ−１の発現を評価する。図５Ｂ〜５Ｄに示すように、ＲＴ１Ａ１の発現は誘導されず、ＯＸ１８の発現は低下している。ＩＣＡＭ−１のレベルは変化しない。さらに、単一コロニーの平均細胞数を、回収した細胞数、ラット肝細胞の割合、およびコロニー効率から計算する。見積もられる細胞数は３〜４ ｘ １０３（表２）に達する。これは、コロニーを形成する単一細胞が、この培養条件では平均で約１１〜１２回分裂したことを示す。
【００５４】
【表２】単一肝コロニーにおける細胞数の計算
2004510434.tif 000004
【００５５】
図４ＣのＲ４からソートした細胞は、６０ ｍｍまたは１００ ｍｍのディッシュでＳＴＯ５ｈｌｘフィーダー細胞上で培養した。示された期間培養した後、全ての細胞を回収し、総細胞数を計算した。ラット細胞の割合は、ラットＩＣＡＭ−１およびマウスＣＤ９８の発現に基づく、フローサイトメトリー分析による。コロニー効率は、培養に接種された細胞のうち、コロニーを形成したものの割合を示す。３連の染色した培養（平均）からのデータは、平行して行なった実験から得られた。
【００５６】
単一コロニー中の平均細胞数＝（回収した細胞の数 ｘ ラット細胞のパーセンテージ／１００）／接種した細胞の数 ｘ コロニー効率／１００）
【００５７】
６．６ ＲＴ１Ａ１−肝前駆細胞が両能性である証拠
ラット胎齢Ｅ１３において、肝細胞は成熟した肝実質細胞および胆管上皮細胞を生み出す両能性前駆細胞だと考えられる。しかし、本発明以前では、この２つの運命が単一の細胞から生ずるのかどうかを示す直接の証拠がなかった。ＲＴ１Ａ１− ＯＸ１８ｄｕｌｌ ＩＣＡＭ−１＋の胎児肝細胞がこの培養系で胆管細胞系に分化できるかどうかを知るために、胆管上皮細胞に特異的なマーカーとして抗ＣＫ１９でコロニーの染色を行なう。ＣＫ１９は、胎児肝で１５．５日以降に胆管上皮前駆細胞で発現され、この時点で細胞のアルブミン発現が消失する。ソートされたＲＴ１Ａ１− ＩＣＡＭ−１＋細胞をＥＧＦの存在下または非存在下で培養し、その運命は培養５日目にＣＫ１９およびアルブミンの発現によってモニターする。最初から５日後、ＥＧＦ処理した培養物ではＣＫ１９＋のコロニーがほとんどないが、ＥＧＦのない培養物ではＣＫ１９＋細胞を含むコロニーがいくつか見られる。ＣＫ１９の強度はかなり弱いが、ＣＫ１９＋細胞ではアルブミン発現が低下している。培養１０日目には、ＣＫ１９のみまたはアルブミンのみを発現するコロニーや、両方が陽性のコロニーが存在する。単一コロニーの中でのＣＫ１９＋およびアルブミン＋細胞のパターンは相反している。両方陽性のコロニーおよびＣＫ１９のみ陽性のコロニーの数は、やはりＥＧＦ非存在下のほうが高い（図７Ａ）。ＥＧＦ存在下では、１０日目には多くのコロニーがアルブミン＋細胞のみからなる（図７Ｂ）。最終的には、両方陽性のコロニーの数は、１５日目にＥＧＦ非存在下では１００％近くになる（図７Ａ）。全体では、ＥＧＦは培養を通してＣＫ１９＋のコロニーの出現を劇的に抑制する（図７Ｂ）。これらの結果は、Ｅ１３胎児肝から得たＲＴ１Ａ１−、ＯＸ１８ｄｕｌｌ、およびＩＣＡＭ−１＋細胞が、胆管細胞系に分化でき、その運命はインビトロではＥＧＦに影響されることを示唆する（図８）。
【００５８】
６．７ 肝幹細胞および肝前駆細胞のクローン増殖を支持する能力のあるフィーダー細胞の単離およびクローニングのためのプロトコール
ブタ、ビーグル、ウサギ、マウス、またはサルの新鮮な胚組織または凍結組織（例えば、肝臓、肺、腎臓、筋肉、腸）を、カルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で細かく切り刻む。ＰＢＳで２回すすいだ後、０．２５％トリプシンと３７℃で１０分間、または室温で６０分間電磁攪拌機を用いて撹拌しながら、細胞懸濁液をインキュベートする。残った細胞の塊は、懸濁液をメッシュで濾過して除去する。その後、細胞を血清（例えば、１０％胎児ウシ血清）および任意の種々の増殖補給剤（例えば、２ ｍＭグルタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびＭＥＭ非必須アミノ酸）を添加した基礎培地（例えば、イーグルＭＥＭ）を用いて組織培養ディッシュで培養する。プラスチックの基底および血清添加培地は、多くの場合中胚葉由来（例えば、間質細胞）である支持細胞（「フィーダー細胞」）の候補である細胞群の増殖を可能にし、かつ別の種類の細胞（例えば、前駆細胞）の生存、増殖、および／または機能を支持する因子を提供する、一般的な条件である。フィーダー細胞は、コンフルエントまたはそれに近くなったら、０．０５％トリプシンを用いて継代培養する。継代培養を数回行なったら、増殖した細胞を凍結ストックとして調製し、使用まで凍結保存する。フィーダー細胞の別の供給源は、市販の初代培養フィーダー細胞またはフィーダー細胞株である。いずれの場合も、適当なフィーダー細胞を同定するためには、以下の基準が必要である。
【００５９】
フィーダー細胞は以下を支持する：
１） 古典的ＭＨＣクラスＩ抗原陰性、ＩＣＡＭ−１陽性、および／または非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原弱陽性という表現型マーカーを持つ肝前駆細胞のクローン増殖；
２） 古典的ＭＨＣクラスＩ抗原陰性、ＩＣＡＭ−１陽性、非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原弱陽性、αフェトプロテイン陽性、アルブミン陽性、またはＣＫ１９陽性という表現型マーカーを持つ子孫を持つ前駆細胞のクローン増殖；または
３） 両能性肝前駆細胞の定義に必要な、肝細胞系および胆管細胞系の両方への誘導可能な分化。
【００６０】
当技術分野では、古典的ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＭＨＣクラスＩａ抗原としても知られる。非古典的ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＭＨＣクラスＩｂ抗原としても知られる。ＭＨＣ抗原は、異なる種では異なる呼び方をされる：例えば、ラットではＲＴ１，マウスではＨ−２、およびヒトではＨＬＡである。
【００６１】
上記のアッセイ法は以下に説明される：
【００６２】
肝前駆細胞のクローン増殖の条件
肝前駆細胞は、増殖を停止した、すなわち増殖を予防するように処理されたフィーダー細胞上に、９．６ ｃｍ２あたり５００細胞を接種する。フィーダー細胞は、マイトマイシンＣまたは放射線照射（細胞の種類によって３０００〜５０００ラド）で処理して、増殖を停止する。増殖停止したフィーダー細胞および前駆細胞には、無血清ＨＤＭを供給する。例えば、齧歯類細胞のＨＤＭは、ダルベッコ変法イーグル培地とハムＦ１２の１：１混合物に１０ ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、 ５μｇ／ｍｌインスリン、１０−６Ｍデキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌ鉄飽和トランスフェリン、４．４ ｘ １０−３Ｍニコチンアミド、０．２％ウシ血清アルブミン、５ ｘ １０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、７．６ μｅｑ／ｌ遊離脂肪酸混合物、２ ｘ １０−３Ｍグルタミン、１ ｘ １０−６Ｍ ＣｕＳＯ４、３ ｘ １０−８Ｍ Ｈ２ＳｅＯ３および抗生物質を添加したものである。培養液は、２日ごとに培地を交換しながら１０〜１４日間インキュベートする。その後、αフェトプロテイン、アルブミン、および／またはＣＫ１９の２重免疫蛍光染色を行なって子孫の運命を同定する。αフェトプロテインおよびアルブミンの発現について、約１００のコロニーが分析される。さらに、コロニーの形態、Ｐ型かＦ型かも適切な子孫の同定に役に立つ場合がある。
【００６３】
フィーダー細胞と肝前駆細胞の理想的な組み合せは、同一の種から得られたものである。好ましくは、フィーダー細胞は肝前駆細胞と同一の組織および同一の種から得られる。しかし、１つの種からのフィーダーと別の種からの前駆細胞を混合することも可能である。例えば、齧歯類のフィーダーでさえも、ヒト肝前駆細胞に使用できる。可溶性および不溶性の因子（種および／または組織特異的な可能性がある）は、肝幹細胞または肝前駆細胞のクローン増殖を助ける。このような因子の供給源には、次のようなものがある：
１） 最適な種および組織のフィーダー細胞を培養した条件培地。フィーダー細胞は間質細胞のみならず、任意の種類の細胞で良い。
２） 重要な因子が既知の場合には、肝前駆細胞に活性を示す最適なフィーダー細胞に由来する適切な分子（シグナル）を合成するために、それぞれ転写または翻訳のためのｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを任意の細胞に導入することによって生物活性のあるフィーダー細胞群を作製できる供給源。
３）肝前駆細胞に活性な最適フィーダー細胞から得られるシグナルが、タンパク質、ペプチド、炭化水素、脂質、糖ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、またはその組み合せであるかに関わらず、重要な因子が既知の場合には、そのようなシグナルを培地に添加することによってフィーダー細胞を完全に置き換えることもできる供給源。
【００６４】
上述の実施例は、例示のためのみに説明されており、本発明の範囲または態様を制限するものではない。上記に特に説明されていない他の態様も、当業者には明らかであると思われる。しかし、そのような他の態様も、本発明の範囲および精神に含まれると考えられる。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ、正しく限定される。
【００６５】
本明細書で引用された全ての特許および出版物は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】１５日目の胎児ラットの肝臓から得た肝細胞株の特徴付けである。
【図２】線維芽細胞フィーダー細胞上のコロニー形成アッセイ法である。
【図３】成体肝細胞中の様々な細胞株上のラット細胞表面抗原の発現である。
【図４】１３日目の胎児ラットの肝臓の表現型分析を現す。
【図５】ＥＧＦ存在下および非存在下での肝臓コロニーの特徴付けである。
【図６】ＲＴ１Ａ１−肝細胞上のＣＫ１９発現の誘導を表す。
【図７】ＳＴＯ５フィーダー細胞上の肝臓コロニー形成の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図３Ｓ】
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【図３Ｔ】
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【図３Ｕ】
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【図３Ｖ】
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【図３Ｗ】
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【図３Ｘ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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