(57)【要約】ペプチドの骨格または側鎖を切断する切断酵素の活性部位阻害因子を同定するための方法、および、得られた不活性化因子を使用して標的切断酵素を阻害する方法。動力学的アッセイを使用して標的プロテアーゼの活性部位に強固に結合するが容易に切断されないペプチド基質を同定する。場合により、これらの非切断性であるが強固に結合する基質を構造的に改変して最適化された特性を有する阻害性化合物を作成することができる。さらに、これらの基質はプロテアーゼの遷移状態または基底状態配座に対して明瞭な特異性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．複数の基質のそれぞれを標的切断酵素と接触させることにより非切断性基質アッセイを行い、少なくとも１つの非切断性基質を同定する工程；および、
ｂ．標的酵素および少なくとも一つの基質を用いて切断酵素活性部位結合アッセイを行い、少なくとも一つの活性部位結合基質を同定する工程、
を含み、
それによってペプチドコアを含む非切断性の活性部位結合性切断酵素阻害因子を同定することを含む、前記工程ａおよび工程ｂをどの順序で行っても良い、切断酵素阻害因子の同定方法。
【請求項２】
非切断性基質がアッセイ中で最もよく切断される基質の切断性の約35％よりも低い切断性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
非切断性基質がアッセイ中で最もよく切断される基質の切断性の約20％よりも低い切断性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
非切断性基質がアッセイ中で最もよく切断される基質の切断性の約10％よりも低い切断性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
切断酵素阻害アッセイが、核磁気共鳴分光法、赤外分光法、紫外線-可視光分光法、蛍光分光法、リン光分光法、質量分光法、およびマイクロ波分光法から選ばれる分光学的方法を用いて切断酵素への基質の結合性を評価することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
非切断性基質アッセイが、核磁気共鳴分光法、赤外分光法、紫外線-可視光分光法、蛍光分光法、リン光分光法、質量分光法、およびマイクロ波分光法から選ばれる分光学的方法を用いて切断酵素に対する基質のkcatを評価することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
更に、非切断性阻害因子の機能的および構造的類似体を選択する工程、および、標的切断酵素および前記非切断性阻害因子の少なくとも一つの構造的類似体を用いて阻害因子アッセイを行い、少なくとも一つの非切断性阻害因子を同定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
非切断性結合基質アッセイを行う工程が、複数の基質のそれぞれを標的切断酵素と接触させ、少なくとも一つの高kcat基質および少なくとも一つの非切断性低kcat基質を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
標的切断酵素と同じクラスの切断酵素に対する非切断性阻害因子の選択性を評価して前記阻害因子が前記標的切断酵素に選択的であるかどうかを決定することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
更に、標的切断酵素を複数の基質と接触させるに先立ち、前記標的切断酵素について最適な基質切断条件を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
切断酵素阻害因子が１〜９個のアミノ酸残基を有するペプチドコアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドコアが１〜６個のアミノ酸残基を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドコアが１，２または３個のアミノ酸残基を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドコア中の少なくとも一つのアミノ酸が、S4、S3、S2、S1、S1'、S2'およびS3'から選ばれる標的切断酵素の少なくとも一つの活性部位に結合する、請求項１１、１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドコアがL-アミノ酸、D-アミノ酸、誘導体化アミノ酸および修飾アミノ酸からなる群より選ばれる１以上の残基を含む、１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドコア全体またはその一部が、β-アミノ酸、ペプトイド、１以上の原子が異なる原子団または官能基によって置換されたアミノ酸からなる群より選ばれるペプチド類似物から構成される、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ペプチドコアがペプチド結合と異なる結合によって連結した２以上のアミノ酸を含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
標的切断酵素が精製切断酵素または粗混合物として供給される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
更に、切断酵素阻害アッセイを行うに先立ち、切断反応に最適なpH範囲を２pH単位で決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
切断酵素阻害活性アッセイが、更に、標的切断酵素、少なくとも一つの高kcat基質、および少なくとも一つの非切断性基質を用いて少なくとも一つの非切断性阻害因子を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
更に酵素／基質相互作用に関する動力学的パラメータを同定することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
選択した数の非切断性基質について競合結合アッセイを行う工程を含み、前記競合アッセイを行う工程が、前記選択した非切断性基質のそれぞれについて以下の工程を行うことを含む、請求項２０記載の方法：
標的切断酵素、高kcat基質の第１の集団、および前記選択した非切断性基質を用いて第１の競合結合アッセイを行い、複数の非切断性阻害因子を同定する工程；
各前記非切断性阻害因子について、前記標的切断酵素、高kcat基質の第２の集団、および前記非切断性阻害因子を用いて第２の競合結合アッセイを行う工程であって、前記高kcat基質の第２の集団が、前記高kcat基質の第１の集団よりも多くの数の基質を含む、前記工程；および、
前記非切断性阻害因子の阻害効果を定量して非切断性阻害因子の順位表を作成する工程。
【請求項２３】
さらに、非切断性切断酵素阻害因子の一部を共有結合的に不活性化反応体に連結して、遷移状態切断酵素不活性化因子および基底状態切断酵素不活性化因子からなる群より選ばれる少なくとも一つの切断酵素不活性化因子を得ることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
不活性化反応体が以下の組合せから選ばれる位置に存在する、請求項２３記載の方法：ペプチドコアのN-末端；ペプチドコアのC-末端。
【請求項２５】
保護基が以下の組合せからなる位置に存在する、請求項２３記載の方法：ペプチドコアのC-末端；ペプチドコアのN-末端。
【請求項２６】
不活性化反応体が標的切断酵素の遷移状態配座または標的切断酵素の基底状態配座に結合する、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
さらに、ペプチドコアを不活性化反応体に共有結合的に連結するに先立ち前記ペプチドコア不安定な複数の検出基に共有結合的に連結して複数の候補阻害因子を作製する工程を含み、各前記候補阻害因子は相同なペプチドコアを有するが異なる検出基を有するものである請求項２３記載の方法において、更に、以下を含む前記方法：
各前記候補阻害因子について、標的切断酵素、少なくとも一つの高kcat基質、および前記候補阻害因子を用いて競合結合アッセイを行うこと；および、
前記阻害因子の阻害効果を定量し、各々が異なる検出基を有する候補阻害因子の順位表を作成すること。
【請求項２８】
さらに、標的切断酵素と同じクラスの切断酵素に対する切断酵素不活性化因子の選択性を評価し、前記阻害因子が前記標的切断酵素に選択的であるかを決定することを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
ペプチドコアを不活性化反応体に共有結合的に連結することが、ペプチドコアを複数の不活性化反応体に共有結合的に連結して複数の切断酵素不活性化因子を作製することを含み、各前記切断酵素不活性因子は相同なペプチドコアを含むが異なる不活性化反応体を含むものである、請求項２３記載の方法であって、更に以下を含む前記方法：
各前記切断酵素不活性化因子について、標的切断酵素、少なくとも一つの高kcat基質、および前記切断酵素不活性化因子を用いて競合結合アッセイを行う工程；および、
前記複数の切断酵素不活性化因子の阻害効果を定量して切断酵素不活性化因子の順位表を作成する工程であって、各前記切断酵素不活性化因子が異なる不活性化反応体を含む、前記工程。
【請求項３０】
更に以下を含む、請求項２９記載の方法：
切断酵素不活性化因子の組を少なくとも一つ提供する工程であって、前記組が順位表から選択される切断酵素不活性化因子、並びに、異なるペプチドコアおよび前記選択される切断酵素不活性化因子と同じ不活性化反応体を含む他の切断酵素不活性化因子を含む、前記工程；
動力学的定数Ki、kcatおよびKmを前記切断酵素阻害因子の組の各メンバーについて決定する工程；
切断酵素阻害因子の前記組の選択されたメンバーについての(log(ki)、log(Km/kcat))を表す第１の点(x,y)の組について第１の直線回帰を行い、y=MT * x + BTで表され、第１の回帰係数RTを有する第１の直線（MTは直線の傾き、BTはy切片）を作成する工程；
切断酵素阻害因子の前記組の選択されたメンバーについての(log(ki)、log(Km))を表す第２の点(x,y)の組について第２の直線回帰を行い、y=MG * x + BGで表され、第２の回帰係数RTを有する第２の直線（MGは直線の傾き、BGはy切片）を作成する工程；および、
RTとRGとを比較し、前記不活性化反応体が遷移状態切断酵素不活性化因子として機能するか基底状態切断酵素不活性化因子として機能するかを決定する工程。
【請求項３１】
不活性化反応体が遷移状態切断酵素不活性化因子として機能する、請求項３０記載の方法において、更に、
TSS=RT/(ABS(1-MT) * 1/P)（Pは直線上の点の数）である遷移状態スコアTSSを前記不活性化因子について計算する工程；および、
切断酵素不活性化因子の組の各メンバーについて、ITS=log(TSS/(Ki))である遷移状態阻害因子スコアITSを計算する工程、
を含む前記方法。
【請求項３２】
更に、
第１および第２の直線回帰を行い、異なる不活性化反応体を含む切断酵素不活性化因子の少なくとも一つの追加的な組について遷移状態スコアおよび遷移状態阻害因子スコアを計算すること；および、
前記遷移状態スコアまたは前記遷移状態阻害因子スコア、またはその両方を、前記切断酵素不活性化因子の組について比較すること、
を含む請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
不活性化反応体が基底状態切断酵素不活性化因子として機能する、請求項３２記載の方法において、
基底状態スコアGSSを前記不活性化因子について計算する工程であって、GSS=RG/(ABS(1-MG) * 1/P)（Pは直線上の点の数）である前記工程；および、
切断酵素不活性化因子の組の各メンバーについて、基底状態阻害因子スコアIGSを計算する工程であって、IGS=log(GSS/(Ki))である前記工程、
を含む前記方法。
【請求項３４】
更に、
第１および第２の直線回帰を行い、異なる不活性化反応体を含む切断酵素不活性化因子の少なくとも一つの追加的な組について基底状態スコアおよび基底状態阻害因子スコアを計算すること；および、
前記基底状態スコアまたは前記基底状態阻害因子スコア、またはその両方を、前記切断酵素不活性化因子の組について比較すること、
を含む請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
以下を含む、活性部位切断酵素阻害因子を同定する方法：
標的切断酵素について基質切断条件に最適なpH範囲を決定する工程；
複数の基質の各々を前記標的酵素と前記最適なpH範囲内で接触させて少なくとも１つの高kcat基質および少なくとも一つの非切断性低kcat基質を同定する工程；
前記最適なpH範囲内で前記標的酵素、前記高kcat基質の第１の集団、および選択した数の前記非切断性基質のそれぞれを用いて一連の第１の競合結合アッセイを行って、各々が異なるペプチドコアを有する複数の非切断性阻害因子を同定する工程；
前記標的酵素、前記高kcat基質の第２の集団、および前記非切断性基質のそれぞれを用いて一連の第２の競合結合アッセイを行う工程であって、高kcat基質の前記第２の集団が高kcat基質の前記第１の集団よりも多くの数の基質を含む、前記工程；
前記非切断性阻害因子の阻害効果を定量して非切断性阻害因子の順位表を作成する工程；
前記標的酵素と同じクラスの切断酵素について前記非切断性阻害因子の選択性を評価し、前記阻害因子が前記標的切断酵素に選択的であるか否かを評価する工程；
前記ペプチドコアを、複数の不活性化反応体に共有結合的に連結して複数の切断酵素不活性化因子を作製する工程であって、前記切断酵素不活性化因子の各々は相同なペプチドコアを含むが異なる不活性化反応体を含むものである、前記工程；
各切断酵素不活性化因子に対して前記標的酵素、少なくとも一つのkcat基質、および前記切断酵素不活性化因子を用いて、競合結合アッセイを行う工程；
前記切断酵素不活性化因子の阻害効果を定量し、異なる不活性化反応体を含む切断酵素不活性化因子の順位表を作成する工程；
切断酵素不活性化因子の少なくとも一つの組を提供する工程であって、前記組は、前記順位表から選択される切断酵素不活性化因子および前記選択した切断酵素不活性化因子と同じ不活性化反応体および異なるペプチドコアを含む複数の他の切断酵素不活性化因子を含む、前記工程；
切断酵素不活性化因子の前記組の各メンバーについて動力学的定数Ki、kcatおよびKmを決定する工程；
切断酵素阻害因子の前記組の選択されたメンバーについての(log(ki)、log(Km/kcat))を表す第１の点(x,y)の組について第１の直線回帰を行い、y=MT * x + BTで表され、第１の回帰係数RTを有する第１の直線（MTは直線の傾き、BTはy切片）を作成する工程；
切断酵素阻害因子の前記組の選択されたメンバーについての(log(ki)、log(Km))を表す第２の点(x,y)の組について第２の直線回帰を行い、y=MG * x + BGで表され、第２の回帰係数RTを有する第２の直線（MGは直線の傾き、BGはy切片）を作成する工程；
RTとRGとを比較し、前記不活性化反応体が遷移状態切断酵素不活性化因子として機能するか基底状態切断酵素不活性化因子として機能するかを決定する工程であって、前記不活性化反応体が遷移状態酵素不活性化因子として機能する場合は更に遷移状態スコアTSSを前記不活性化因子について計算する工程であって、TSS=RT/(ABS(1-MT) * 1/P)（Pは直線上の点の数）である前記工程および切断酵素不活性化因子の前記組の各メンバーについて、遷移状態阻害因子スコアITSを計算する工程であって、ITS=log(TSS/(Ki))である前記工程を含み、一方、前記不活性化反応体が基底状態切断酵素不活性化因子として機能する場合は、更に基底状態スコアGSSを前記不活性化因子について計算する工程であって、GSS=RG/(ABS(1-MG) * 1/P)（Pは直線上の点の数）である前記工程および切断酵素不活性化因子の前記組の各メンバーについて、基底状態阻害因子スコアIGSを計算する工程であって、IGS=log(GSS/(Ki))である前記工程を含む、前記工程；および、
前記標的切断酵素と同じクラスの切断酵素に対する前記切断酵素不活性化因子の選択性を評価し、前記阻害因子が前記標的酵素不活性化因子に対して選択的であるかどうかを評価する工程。
【請求項３６】
更に、同定された遷移状態切断酵素不活性化因子または基底状態切断酵素不活性化因子を用いて、コンビナトリアルケミストリーを利用してさらなる切断酵素不活性化因子を合成することを含む、請求項２３または３５記載の方法。
【請求項３７】
標的切断酵素を遷移状態切断酵素不活性化因子又は基底状態切断酵素不活性化因子と共に結晶化し、結合複合体を作製することを含む、請求項２３または３５記載の方法。
【請求項３８】
結合複合体のX-線結晶構造を解析することを含む請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
共有結合的にデリバリー分子を遷移状態切断酵素不活性化因子または基底状態切断酵素不活性化因子に連結することを更に含む請求項２３または３５記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか１項記載の方法によって同定される切断酵素阻害因子。
【請求項４１】
標的プロテアーゼとその基質とを接触させる工程を含む標的切断酵素活性を阻害する方法であって、前記基質がペプチドコアまたは類似体を含み、前記コア自体は前記標的切断酵素に本来的に結合することができ、かつ、前記コア自体は本来的に前記切断酵素による切断に不利であり、それによって切断活性が阻害される、前記方法。
【請求項４２】
標的切断酵素を基質またはその類似体と接触させることを含む標的切断酵素活性を阻害する方法であって、前記基質がESBからTSB酵素状態へ低結合エネルギーを保存し、一方高TSRエネルギー状態および限定された基質の自由度を維持する、前記方法。
【請求項４３】
ペプチドコアが共有結合的に不活性化因子に連結している、請求項４１または４２記載の方法。
【請求項４４】
ペプチドコア中の少なくとも一つのアミノ酸がS4、S3、S2、S1、S1'、S2'およびS3'からなる群より選ばれる標的切断酵素の活性部位残基の少なくとも一つに結合する、請求項４１または４２記載の方法。
【請求項４５】
切断酵素が、プロテアーゼ、プロテインホスファターゼ、エステラーゼ、タンパク質の糖ベースの側鎖を切断する酵素、リポタンパク質または脂質官能化タンパク質を切断する酵素、およびタンパク質から補因子を切断する酵素からなる群より選ばれる、請求項１、２６、４１または４２記載の方法。
【請求項４６】
ペプチドコアが、L-アミノ酸、D-アミノ酸、誘導体化アミノ酸、および修飾アミノ酸からなる群より選ばれる１以上の残基を含む請求項１、２６、４１または４２記載の方法。
【請求項４７】
ペプチドコア全体またはその一部が、β-アミノ酸、ペプトイド、１以上の原子が異なる原子団または官能基によって置換されたアミノ酸からなる群より選ばれるペプチド類似物から構成される、請求項１、２６、４１または４２記載の方法。
【請求項４８】
ペプチドコアがペプチド結合と異なる結合によって連結した２以上のアミノ酸を含む、請求項１、２６、４１または４２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ペプチド切断酵素は、ペプチドおよびタンパク質分子を特定の領域で切断する（骨格を切断するにせよ、補欠分子団または置換基を切断するにせよ）という性質において重要な化学種であり、その切断パターンは基質サブドメインの酵素による認識、および各ペプチド切断酵素の活性部位の遷移状態および／又は基底状態における特定の立体配座によって決定される。これ以後、用語、切断酵素とはペプチド切断酵素をいう。現在、プロテアーゼはこのクラスの酵素の最も重要なメンバーのうちであり、プロテアーゼはペプチド結合を切断し、種々の病原生物の病理学的過程において重要な役割を果たしている。他の重要なメンバーには例えば以下が含まれる：酵素活性の生理学的制御に重要である、プロテインホスファターゼ；アミノ酸エステラーゼのようなエステラーゼ；タンパク質の糖ベースの側鎖を切断する酵素；リポタンパク質または脂質官能化タンパク質を切断する酵素；タンパク質から補因子を切断する酵素。ここで、ほとんどのタンパク質分解酵素はエステル結合の加水分解も触媒するので、酵素的切断の一つの範疇における化学反応を操作することにおける進展は他の範疇の切断反応に移転することができることに注意すべきである。
【０００２】
切断酵素を阻害することの有用性をプロテアーゼ阻害剤によって説明する。プロテアーゼ阻害剤は、AIDS、癌、マラリア、糖尿病、アルツハイマー病、および関節炎を含む（ただし、これらに限定されない）多様な破壊的な疾病の治療のための最も有望な薬剤群の一つである。これらの疾病は細胞タンパク質を破壊するプロテアーゼを利用して蔓延し、宿主を弱らせ場合によっては死に至らしめる。プロテアーゼ阻害薬剤はこの病原性プロテーアゼを阻害することによってこれらの疾病を治療する。最近まで、これらの薬剤の大部分は試行錯誤的機構によって生み出されてきた（Appeltら、1991）。このランダムな方法に本質的な問題と闘うため、1990年代に合理的薬剤設計法が導入され実行された（Appeltら、1991）。合理的薬剤設計法は複雑な３次元コンピューターモデリング、コンビナトリアルケミストリーおよび極めて高度なハイスループットスクリーニング(HTS)を利用する。この進歩によりHIVプロテアーゼ阻害剤の開発の道が開かれた（Vaccaら、1994、Ericksonら、1990、Robertsら、1990）。プロテアーゼ阻害剤の成功は高血圧を含む他の異常についても報告された（RadzickaとWolfenden、1996）。
【０００３】
抗寄生虫性プロテアーゼ阻害剤化学療法は動物モデルにおいて効果的であることが示されている。フルオロメチルケトン-誘導体化ジペプチドはマウスマラリアを治癒することが示され(Rasnick、1985)、ビニルスルホン誘導体化ジペプチドは動物モデルにおいて皮膚リーシュマニア症感染（Palmerら、1985）、およびシャーガス病におけるトリパノゾーマ・クルジ(Tripanasoma cruzi)の複製を治癒することができ（Brommeら、1996）、システインプロテアーゼ阻害剤は住血吸虫症動物モデルの病気の進行を止める、あるいは治癒することができる（Rasnick、1985）。さらに研究により、致死的寄生虫負荷の完全な治癒が臨床的に許容できるプロテアーゼ阻害剤投与治療計画によって達成され得ること（Brommeら、1996）および経口投与経路を通じて達成され得ることが示された（Klenertら、1992）。最後に、多くのプロテアーゼ阻害剤治療において、阻害剤がその標的に完全に特異的でない場合であっても毒性が報告されていないので、化学療法開発の魅力的な土台としてこれらの化合物に重要な注意が向けられている。この宿主副作用の欠如は哺乳動物系と比較して異種生物のプロテアーゼに比較的冗長性が欠落していることと関係しているかもしれない(McKerrowら、1999)。さらに、宿主プロテアーゼが単に異種生物内のプロテアーゼ濃度を上まわっているだけかもしれない。さらに、病原因子は低分子量阻害剤を取り込み、従ってこれを濃縮するように天然に適合しているかもしれない。実際、感染疾病に関する動物モデルの開発は合理的薬剤設計モデルのためのプロテアーゼ阻害剤の有用性を明らかにした。
【０００４】
しかしながら、合理的薬剤設計は速度（Service、2000）、費用（Service、2000）および有効性（LadburyおよびPeters、1994）の点で重大な限界を有している。例えば、合理的薬剤設計が使用する予想される標的のX-線結晶構造の大部分は入手できない（Service、2000）。従って、大部分の薬剤標的はこの実験系によっては利用できない。利用できる１％の標的についても、効果的なリード化合物に至る効率的なアルゴリズムがないために失敗率は膨大である（LadburyとPeters、1994；Lahana、1999）。伝統的スクリーニング手段に依存する方法については、システムが未だ非論理的であり、帰納的アルゴリズムのより合理的な開発を必要とする。10,000のリード化合物中わずか１つが最終的に薬剤として評価される（Parrilら、1999）。実際、CAPTROPRIL（抗高血圧薬）、PREDNISONE（抗最近薬）、およびPRAZIQUANTEL（抗寄生虫薬）を含む、現在、市場において最も効果的な薬剤の多くは純然たる偶然の発見（セレンディピティーserendipity）によって発見されたものである。合理的薬剤設計の効果が無いことの結果として、年間僅かに40-45の新薬しか作られていない（Kubinyi、1999）。従って、世界の1/3は基本医薬品がない（Service、2000）。明らかに、プロテアーゼ阻害剤開発のリード化合物発見における失敗を低減するより良いアルゴリズムに対する需要がある。
【０００５】
発明の概要
本発明は切断酵素を不活性化する方法を提供する。本方法においては、酵素を以下の特性の組合わせを含む特徴を有する短いペプチド-またはペプチド類似物-化学的配列を含む基質と接触させる：酵素活性部位の遷移状態、あるいは基底状態、またはその両方の立体配座に対する本質的に高い結合アフィニティー；および切断酵素の活性部位の切断位置に存在する典型的な基質結合、例えばペプチド結合、を切断する可能性がほとんど又は全く無い。本発明の阻害因子はその高い能力および高い特異性に関して注目に値する。
【０００６】
さらに、本発明は標的酵素、好ましくは標的プロテアーゼの活性部位阻害因子を同定するための簡便な方法を提供し、各阻害因子は高い結合アフィニティーと低い切断感受性を有する。ペプチドまたはペプチド様基質からなるどの１以上の基質が標的切断酵素の活性部位に強固に結合し、かつ容易に切断されないかを明らかにするためのアッセイが用いられる。切断されないが強固に結合するこれらの基質は更なる改変なしに使用することができ、または、場合により構造改変して切断-阻害性分子を生成するための鋳型として利用することができ、いずれの場合も切断酵素不活性化因子と呼ばれ、標的酵素の活性を阻害するために使用することができる。特に好ましい態様において、本発明の方法によって同定される切断酵素不活性化因子は標的酵素に対する選択性を示す。すなわち、前記切断酵素不活性化因子は他の酵素を最小限にしか阻害しない。
より具体的には、本発明は、複数の基質の１以上を標的プロテアーゼと接触させ、少なくとも一つの低kcat基質（この用語は非切断性または難切断性基質に対して用いる）を同定すること；標的プロテアーゼを含む反応体の組合せおよび少なくとも一つの低kcat基質を用いた結合アッセイを行い、低kcatペプチド-またはペプチド様-コアを含む少なくとも一つの化学種を同定すること（前記コアは前記プロテアーゼに対して高い結合アフィニティーを有する）を含む活性部位プロテアーゼ阻害剤を同定する方法を提供する。低kcatはアッセイにおいて最適な基質の切断の好ましくは35％未満、より好ましくは20％未満、最も好ましくは10％未満であるkcatとして定義される。コア自体が切断酵素不活性化因子として使用されることもあるし、それ自体若しくはコアと一緒になって切断酵素に対して補助的な不活性化特性有する部分と共有結合的に連結されることもある。
【０００７】
さらに、補助的な不活性化部分を有するまたは有しないコア自体が改善された生理学的特性、例えば膜を通した生理学的輸送を有する類似化合物を作成するための鋳型として機能することがあり、このような補助的不活性化因子による置換は場合により行われても行われなくても、また、鋳型形態から改善された生理学的特性を有する類似体形態への形態変化の前に行われても後で行われても良い。置換、未置換または類似体形態へ転換されているにせよ、基質が上述したコアを含む各場合において、高い結合アフィニティーを有する低kcat基質は切断酵素不活性因子と称される。種々の酵素／基質相互作用および複合体の特徴はアッセイを実施する必要性に応じて決定される。
【０００８】
本方法は３つの型のアッセイを含む：基質の切断性の決定；基質結合アフィニティーの決定；および、場合により基質の特性の最適化。列挙した最初の２つのアッセイのどちらを１番目に行っても良い；最適化は切断性および結合アフィニティーのいずれも既知となった後に最も有益である。本発明を特に差別化する特徴は非切断性および／または難切断性基質を阻害因子としてより優先させ選択することである。手順については、得られる正確さのため、動力学的解析方法がこれらのアッセイを行うためには好ましい態様である。しかしながら、本発明の範囲を逸脱することなく、切断性、結合アフィニティーおよび他の重要な特性を測定するための競合基質が存在しない場合においても代わりに非動力学的解析（例えば、核磁気共鳴解析のような、計測手段による反応後解析を含む解析）を使用することができることは言うまでもない。
【０００９】
本方法の一態様において、競合結合アッセイは選択した数の低kcat基質について行われる。選択した各低kcat基質について、標的プロテアーゼ、高kcat基質の第１の集団、および選択した低kcat基質を用いて第１の競合結合アッセイを行い、複数の低kcat阻害因子を同定する。その後、各低kcat阻害因子について、前記標的プロテアーゼ、高kcat基質の第２の集団、および前記低kcat阻害因子を用いて第２の競合結合アッセイを行うが、高kcat基質の第２の集団は高kcat基質の第１の集団の基質よりも多数の基質を含む。次にこの低kcat阻害因子の阻害効果を定量して低kcat阻害因子の順位表を作成する。
【００１０】
典型的には、前の工程で（競合結合の解析を容易にするために）低kcat基質に結合させていた検出標識の代わりに不活性化置換基を用いて、補助的不活性化置換基がペプチドコアのC末端に結合される。不活性化反応体は好ましくは標的プロテアーゼの遷移状態立体配座に結合するか、または、標的プロテアーゼの基底状態立体配座に結合する。場合により、本方法はペプチドコアを複数の不活性置換基の１以上に共有結合させ複数の切断酵素不活性化因子の１以上を生成させることを含み、各切断酵素不活性化因子は相同な類似体ペプチド−またはペプチド様-コアを含むが異なる不活性化反応体を含む。各切断酵素不活性化因子について、標的プロテアーゼ、少なくとも一つの高kcat基質、およびプロテアーゼ不活性化因子を用いて競合結合アッセイを行う。次に切断酵素不活性化因子の阻害効果を定量し、不活性化因子の順位表を作成する。各不活性化因子は異なる不活性化反応体を含むものである。本発明は、C-末端の代わりに、またはC-末端に加えて、N-末端に検出可能標識および補助的不活性化置換基を使用することを考慮する。これは、切断酵素活性部位に対する配列認識位置は両側の切断位置を囲むことがあり、従って、この方法は切断位置付近で互いにほぼ対称的になるようなアプローチに適合させるものである。
【００１１】
場合により、本方法は順位表から選択される切断酵素不活性化因子、および種々のペプチドコアを含む他の複数の切断酵素不活性化因子であって、それぞれが選択した切断酵素不活性化因子の不活性化置換基と同一の不活性化置換基を有する切断酵素不活性化因子を含む一組の切断酵素不活性化因子を入手または合成することを考慮する。動力学的定数Ki、kcat、kmをこのプロテアーゼ阻害因子の組の各メンバーについて決定し、その後前記切断酵素不活性因子の組の選択した各メンバーについて、(log(Ki),log(Km/Kcat))を表す第１の点(x,y)の組について第１の直線回帰を行い、y=MT＊x＋BTによって表され（式中、MTは直線の傾き、BTはy切片の値）、第１の回帰係数RTを有する第１の直線を作成する。次に、前記切断酵素不活性因子の組の選択した各メンバーについて、(log(Ki),log(Km))を表す第２の点(x,y)の組について第２の直線回帰を行い、y=MG＊x＋BGによって表され（MGは直線の傾き、BGはy切片の値）第２の回帰係数RGを有する第２の直線を得る。次に回帰係数RTとRGを比較し、不活性化反応体が遷移状態不活性化因子として作用するか基底状態不活性化因子として作用するかを決定する。
【００１２】
不活性化反応体が遷移状態切断酵素不活性化因子として機能することが分かったならば、本方法は場合により、更に遷移状態スコアTSS（TSS=RT/(ABS(1-MT)*1/P、式中Pは直線上の点の数)をその不活性化反応体について計算すること、および、遷移状態阻害因子スコアITS（ITS=log(TSS/(Ki))を切断酵素不活性化因子の組の各メンバーについて計算することを含む。一方、不活性化物質が基底状態不活性化因子であることが分かったならば、本方法は場合により更に基底状態スコアGSS（GSS=RG/(ABS(1-MG)*1/P、式中Pは直線上の点の数)を不活性化反応体について計算すること、および基底状態阻害因子スコアIGS（IGS=log(GSS/(Ki))を不活性化因子の組の各メンバーについて計算することを含む。所望であれば、第１および第２の直線回帰並びに遷移状態スコアおよび遷移状態阻害因子スコア（または、基底状態スコアおよび基底状態阻害因子スコア）の計算を異なる不活性化物質を含む切断酵素不活性化因子の追加的な１以上の組について行うこともでき、遷移状態スコアまたは遷移状態阻害因子スコア、またはその両方をプロテアーゼ阻害因子の組について比較することができる。
【００１３】
本方法を最も効率的に使用するために、標的切断酵素を複数の基質と接触させるに先立ち、その標的切断酵素について最適な基質切断条件を決定することを含む予備的工程が推奨される。例えば、切断反応および続く競合アッセイについて最適pH範囲を約２pH単位で決定しておくことが推奨される。
場合により、ペプチドコアを不活性化反応体に共有結合させるに先立ち、そのペプチドコアを複数の不安定な検出基に共有結合させて、相同なペプチドコアを含むが異なる検出基を含む複数の候補阻害因子を作成することができる。各候補阻害因子について、標的切断酵素、少なくとも一つの高kcat基質、および前記候補阻害因子を用いて競合結合アッセイを行うことができる。次に、この候補阻害因子の阻害効果を定量し、候補阻害因子の順位表を作成する。各候補阻害因子は異なる検出基を含む。
【００１４】
加えて、場合により、標的プロテアーゼと同じクラスのプロテアーゼに対する非切断性阻害因子または切断酵素不活性化因子の選択性を評価し、その阻害因子が標的プロテアーゼについて選択的であるかどうかを決定する。
好ましくは、切断酵素不活性化因子のペプチドコアの少なくとも１つのアミノ酸が選択した標的酵素の少なくとも一つの活性部位残基に結合する。前記酵素活性部位残基は、S4、S3、S2、S1、S1'、S2'、およびS3'からなる群に存在する。
本方法は、場合により更に標的プロテアーゼを遷移状態プロテアーゼ不活性化因子または基底状態プロテアーゼ不活性化因子と共に結晶化させ結合複合体を生成することを含む。所望であれば、結合複合体のX-線結晶構造を解析することができる。
【００１５】
本方法は、有効なペプチドベースの阻害因子種の非-ペプチド類似体を作成し、薬理特性を最適化することを考慮しており、それにより不活性化官能基がペプチドベース形態に付加されることまたは類似形態にのみ付加されることがある。あるいは、不活性化官能基を付加する工程全体を省略することもあり得る。
また、本発明の方法により、遷移状態プロテアーゼ阻害因子または基底状態プロテアーゼ阻害因子へのデリバリー分子の結合も考慮されている。デリバリー分子とは、好ましくは薬剤の他の特性の薬理効果を減じることなく薬剤分子の膜透過性を増強する置換基または独立した会合分子である。さらに、異なる遷移状態プロテアーゼ阻害因子または基底状態プロテアーゼ阻害因子を鋳型として用い、コンビナトリアルケミストリーを使用して他のプロテアーゼ阻害因子を合成することもできる。本発明はまた、ここに記載した方法の実施により同定されるプロテアーゼ不活性化因子を不活性化因子として使用することを包含することを意図している。また、本発明が、ペプチド類似物ベースの基質の使用を考慮していることは言うまでもない。それらには、例えば、以下が含まれる：D-アミノ酸；他の非天然又は天然の異常α-アミノ酸；β-アミノ酸；ポリアミド骨格のα-アミノ位置の置換基の代わりまたはそれに加えて骨格アミドN部位に１以上の置換基を含むペプトイド；および当業者が予測する他のペプチド代替物、および、生理的使用のために改良された特性を得るためにペプチドの１以上の原子が異なる原子団または官能基によって置換されているペプチド類似物。
【００１６】
発明の詳細な記述
第１部  理論
Ａ．酵素触媒反応のモデル
本発明によって提供されるプロテアーゼ阻害因子開発のための方法は、酵素触媒反応のいくつかの本質的に異なる理論から導かれるいくつかの異なる仮定の思いもよらぬかつ新規な統合に基づいている。我々の主要な仮定のいくつかはMenger(1992)によって構築され、後にMurphy(1995)によって改良された「分離-部位」酵素モデル（酵素の活性部位は個別かつ分離した結合中心および反応中心から構成されていると予測する）から導かれている。この概念は、アセチルコリンエステラーゼはアセチルコリン四級アンモニウム基に結合する陰イオンからなる結合部位と実際のエステル加水分解現象を生じさせるエステル特異的反応部位によって特徴付けられるという提唱により（Bergmannら、1950）1950年に最初に提出された。分離-部位理論は酵素／基質（ES）相互作用という事象を記述するための理想化であるが、この理論はプロテアーゼ阻害因子を設計し得る有用な基礎を提供する。このようにして、「分離-部位」理論は「原理主義者」的立場として知られる酵素触媒反応の一般的理論（Schowen1978）よりも優れている。
【００１７】
酵素触媒反応の「原理主義者」的立場
酵素触媒反応の「原理主義者」的立場は、遷移状態(TS)安定化が酵素触媒反応についての主要な機構であるというポーリングの説明（Pauling1946、Pauling1948）を前提とする。実際、遷移状態理論はほとんど60年間存在してきており、トンネル補正（Kraut、1988）が取り込まれたにしても、二原子-二原子反応に関する気相反応および二分子の原子−二原子反応事象の速度の正確な予測に根ざしている。遷移状態理論には２つの重要な仮定がある。第１に遷移状態の崩壊が酵素速度を制御すること、そして、第２に遷移状態複合体(transition state complex)が反応物と平衡にあること。遷移状態理論の基本的方程式はk=κvK（式中、kは実験条件下で観察される速度定数、κは透過係数(transmission coefficient)、vは反応座標上の遷移状態の基準モード振動数、Kは反応物からの遷移状態形成に関する平衡定数）である（KreevoyとTruhlar、1986）。
【００１８】
２つのプロファイルが遷移状態安定化に関連しており（Menger、1992）、これらはいたるところで言及されるであろう。第１のプロファイル（プロファイルI-図１ａ）においては、基質(S)の濃度は酵素(E)の基質(S)に対するKmよりも低く、従って、酵素／基質複合体(ES)の見かけの結合エネルギーはE+Sのエネルギーよりも低い（より高いKm）。従って、ESの自由エネルギーはE+Sの自由エネルギーよりも高い。第２のプロファイル（プロファイルII-図２ａ）では、基質(S)の濃度は基質(S)に対する酵素(E)のKmよりも高く、従ってESの見かけの結合エネルギーは高く（より低いKm）、ESの自由エネルギーは従ってE+Sの準位よりも低い。
【００１９】
どちらの場合においても重要な仮定は、EとSの間の強固な複合体はES（基底状態）のより低い自由エネルギーを生じるということである。これらのモデルに基づき、触媒反応に関する「原理主義者」的立場（Schowen、1978）は、ES複合体の強固さは、プロファイルIシナリオにおいては何ら効果を生せず（ESは常にE+Sよりも高いので、ΔGcatが影響を受けないから触媒反応に影響を与えない）、または、触媒反応の全体的な自由エネルギーが増加するので（ΔGcatが増加する）プロファイルIIシナリオにおいては触媒反応を減速するであろうというものである。従って、原理主義者的理論は、基底状態反応物相互作用は浪費的（プロファイルＩ）であり、ある場合には触媒現象を妨害することさえある（プロファイルII）と予測する。しかしながら、触媒反応に有益であることが知られたES間の強固な基底状態相互作用の例が沢山あるので、この理論的見解には重大な欠陥がある。
【００２０】
分離部位モデル
Menger(1995)の「分離-部位」モデルは古典的な原理主義的（Schowen、1978）理論よりも進歩したものである。このモデルは、強固な基底状態相互作用が浪費的であるという正しくない予測の欠陥を修正する洗練された主張を提供し、従って原理主義者的理論におけるパラドックスを説明する。原理主義者的立場の問題は、ES間の結合と反応が一つの空間的「中心」で起こるとして扱うことである。「分離部位」理論の核心は、逆に基底状態(ES)および遷移状態(TS)相互作用は、酵素の別個の結合領域(ESBおよびTSB)および酵素の別個の反応領域(ESRおよびTSR)の間で進行するエネルギー論の総和として記述することができるというものである。言い換えると、ESの自由エネルギーはESB＋ESRと等しく、TSの自由エネルギーはTSB＋TSRに等しい（BおよびRにより、独立の結合中心および反応中心をそれぞれ表す）という「分離-部位」として酵素を記述することができる。ESのエネルギーはKmを決定する。結合エネルギーの触媒反応への転換はkcatを決定する。本明細書において、用語「E+S」、「ES」および「TS」は文脈に依存してこれらの種の物理的実体をいう場合もあり、これらの種の反応座標上の自由エネルギーをいうこともあることに注意する。
【００２１】
いくつかの仮定がこの分離-部位モデルの基礎となっている。第１に、基底状態および遷移状態準位におけるESB中心のエネルギー論は常に安定化および引力である（例えば、水素結合、ファンデルワールス力およびイオン性の力）。第２に、ESR中心におけるエネルギー論は常に不安定化である（例えば、脱溶媒和のようなエネルギー的に高価な作業、基質を囲むための酵素の立体配座変化によるひずみ、および基質折りたたみによるひずみの変化によるもの）。触媒反応性基は反応中心に位置している。基底状態において触媒反応性基間には反応が起こらないので、ESRだけが不安定化効果および続く自由エネルギー増加によって支配され得る。ESBは、結果として、常にESRよりも低いエネルギーにある。第３に、ESBにおける安定化力はTSBにおいて保存される。このことは、安定化力の強さがESBとTSBとの間で同じであることを意味しない。（実際、この技術における沢山の例がESBにおけるこの力がTSBで強められることを証明している）。そうではなく、TSBで保存されるのはESBに由来する力の起源および方向性である。実際この型の保存の種々の例がこの技術で知られている。
【００２２】
例えば、システインプロテアーゼ（Kamphuis、1984）およびセリンプロテアーゼ(Polgar、1988)はどちらもオキシアニオンホールを利用する。この構造はESBにおける基底状態およびTSBにおける遷移状態のいずれにおいても基質P1カルボニルに対する重要な結合官能基として働く。X-線結晶解析により、基底状態において作られる重要な結合性接触の多くは確かに多くの酵素で遷移状態でも共有されていることが示されている。実際、ESBおよびTSBにおける接触およびそれらの保存は最重要である。それらによって与えられる構造的特徴は阻害因子による開発の資源かもしれないからである。
別の例では、基質sp2混成炭素原子における置換反応の結果として四面体付加体の形成を介した固有の鏡像異性性がTSBに存在する（Wolfenden、1999）。この鏡像異性性の基礎である結合相互作用はESBにおける弱い接触により開始するが、E+Sまたは生成物からは発しない。上記議論に基づけば、基質の原子の幾何学配置は、酵素と複合体を形成しているときには（これらの原子は結合相互作用を提供する）、溶液中で遊離状態にあるときの基質の幾何学的配置と同一ではないことに注意すべきである。従って、結合相互作用およびそれらの幾何学的配置はESBにて生み出され、その結果、TSBにて共有される（かつ強められる）。従って、「結合」の重要性は結合性相互作用および潜在的幾何学配置の両方において明らかにされ、そのどちらも、本明細書で提示されるように、ESBおよびTSBにおける「保存」という概念を規定する。実際、遊離の基質とひずみを受けてESおよびTSを形成している基質とを酵素が区別できることに寄与するのはこのような構造的特徴である。
【００２３】
これらの見解の重要性は、潜在的阻害因子は結合力自体を利用するだけでなく、それらの結合性相互作用を構成する原子のESにおける幾何学的配置をも利用するはずであるということである。以下で論じるように、阻害因子開発の伝統的パラダイムにおける重大な欠陥は、これらの結合相互作用の完全な利用を許さない点であると我々は考えている。
前の見解に対する別の結果は、ESRにおける不安定化相互作用はTSRで保存されないということである。例えば、ESRにおける脱溶媒和のような事象はTSRにおける遷移状態に達する前に既に生じていた。このことを考慮すると、TSRは触媒反応基が実際に反応する場であるので、高度に切断性の基質類似物に対してTSRは安定化し、そのエネルギーを低下させ触媒反応速度の増強につながることが期待されるであろう。TSRが酵素阻害因子上の親電子物質のような不安定化力によって不安定化される場合は、この反対の帰結（阻害）が予想される（そのような親電子物質の記述については工程VIIを参照せよ）。ここで、要点は、実際の触媒反応事象は基底状態では起こらず（例えば、システインプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼの触媒性三つ組原子はTSRにおいてのみ反応し、ESRでは反応しない）、しばしば、遷移状態レベル阻害因子はTSRの安定化を打ち消すことによってその効果を奏する。
酵素触媒反応の分離-部位モデルの先の考察は以下に提示する我々の議論の枠組みを明らかにするものであり、プロテアーゼ阻害因子の伝統的な設計における重要な弱点を明らかにする。さらに、上記考察は本発明の阻害因子設計がどのようにこの欠点を克服するかに関する基礎を提供する。
【００２４】
酵素動力学（キネティクス）の更なる関連原理
Kcat、KmおよびKcat/Km
酵素触媒反応を調べるために多くの方法があるので、kcat、KmおよびKcat/Kmの値に関する仮定を再検討することが重要である。なぜなら、それらは我々が規定したキネティクスに関する基盤に適用されるからである。一次速度定数であるkcatは酵素活性部位あたり単位時間に生成物に変換される基質分子の最大数として、または、単位時間あたりの酵素ターンオーバー回数（代謝回転数）として定義される。遷移状態プロット上では、kcatは単にエネルギー図上の最も高い点と最も低い点の差である。従って、プロファイルIキネティクス（S＜Kmの場合）においては、これはE+SとTSのエネルギーの差であり、一方、プロファイルIIキネティクス（S＞Kmの場合）では、ESとTSのエネルギーの差である。kcat/kmは、Km＞Sである低基質濃度における遊離酵素（全酵素ではない）の濃度を参照する見かけの二次速度定数であり、従って、反応速度vはE*S*kcat/Kmに等しい。従って、この結果はいかなる基質濃度でも維持され、遊離酵素および遊離基質の反応の特性に関するものであるから重要である。さらに、kcat/Kmの値は拡散律速（108〜109）（典型的には「最適に進化した」酵素に特徴的である）よりも大きくはなり得ない（AlberyとKnowles、1977）。触媒速度は１秒間に酵素１モルあたりに生成される産物のモル数を参照する第３の定数によって記述される。伝統的には、kcat/Kmの極大化は速度の極大化と並行すると理解されている（Fersht、1985）。
【００２５】
kcat/Kmについて３つの主な仮定がある（Fersht、1985）：
１．高いkcat/Km値は酵素の遷移状態への相補性を表す
高いkcat/Kmは基質の遷移状態に対する酵素の最大相補性を反映する。これは特に遷移状態安定化が酵素触媒反応の主要な態様である場合だと推定されている。（多数の意見によれば、基底状態不安定化も触媒反応機構として無視できない）。
【００２６】
２．Kcat/kmは特異性定数である
第２の仮定は、kcat/Kmが特異性定数であり、高い値は与えられた基質に対する高い特異性を表すというものである。これに関連して、「特異性」とは酵素が異なる基質を識別できることをいう。大きな基質は単純にそれらの立体的な嵩によって識別し得るが、より小さな基質の識別はより困難な作業であり、結合性(Km)およびターンオーバー（kcat）の両方の関数である。簡単に言えば、この技術分野で理解されているように、これらの動力学パラメータのどちらも単独では特異性の特徴付けには充分でないが、これらの組み合わせは充分であろう。
「特異的」であるためには、酵素は活性化形態（例えば遷移状態）に固有の基質上の構造的特徴を区別することができなくてはならない。伝統的には、基底状態における基質と遷移状態における基質との微妙な構造的相違の集合の全体が特異性に関する識別機構として酵素によって利用されると理解されてきた。効果的な阻害因子はこの集合全体をおそらく利用するであろうが、どのようにそれを行うかは全く未知である（Wolfenden、1999）。構造的相違の位置は非活性部位位置のこともあり、活性部位の近くまたは活性部位に存在することもある。分離-部位モデルに基づき、我々は構造的相違が全体としてESBにおける結合エネルギーに寄与し、それがTSBにおいて保存され強められることを主張する。したがって、阻害因子はESBとTSB間で保存される結合力を利用することができる能力によって特徴付けられなければならない。しかしながら、結合力「集合体」の全体は高度に連結しているので、酵素結合という事象も酵素反応性における事象と複雑に連結していることになる（以下で論じるように、分離-部位モデルが示唆することと異なる）。多くの実例において単一の酵素残基が結合および反応にどのように寄与するか、従って結合および反応の機能が分離-部位モデルが仮定するように分離したものでないことを後に論じる。
【００２７】
しかしながら、ここでの要点は、結合および反応中心の両方におけるこれらの相互作用集合の相互連結した性質により（Maら、2000）、結合および反応という事象を同時に利用することは困難である。実際、ESBおよびTSBの有利な結合エネルギー（結合機能）を破壊せずにもっぱら遷移状態（反応性機能）の低下を防止することのできる阻害因子を発見することはまれである。このことが歴史的に高品質の遷移状態阻害因子を作製することが難しかった理由かもしれない。さらに、この複雑性が起因する特有の様式は強固に結合するペプチドコアへの「反応性部分」の付加（遷移状態類似物の構築における伝統的な手法）によるものであると我々は仮定しているが、このことは後に明らかになる。
【００２８】
３．高い速度を有する最適に進化した酵素は高いkcatと高いKmによって特徴付けられる
第３の仮説は、kcat/Kmの極大化は典型的には酵素速度の極大化と並行するということである。これは大部分の酵素で典型的な傾向ではあるが、常に正しいというわけではない。例えば、代謝経路におけるような制御酵素は低いKmによって特徴付けられる傾向がより高い。低いKmによって酵素は迅速に代謝経路に入ることができ、従って流入速度を制御することができ、代謝経路の反応中間物による過剰負荷を防止することができるからである(Fersht、1985)。しかしながら、大部分の酵素については、任意のkcat/Kmを有する酵素で任意の一定の基質値については、kcatおよびKmのそれぞれが最も高い値を有する酵素が最も高い速度を有し、一方その反対は低いkcaおよび同様に低いKmを有する酵素について真であることが理解される。
【００２９】
Fersht(1985)は標的酵素の進化についてのいくつかの原則を述べている。これらの原則は完全に理論上のものだが、以下で述べるいくつかの予測が基づく有用な基礎を提供する。第１に、酵素はその触媒反応速度を目的論的に極大化する方向に進化すると仮定されている；すなわち、原始的酵素は標的基質の遷移状態へ向けて極大相補性、従って標的基質への極大特異性を獲得する方向へ進化する。この目標へ向かって、標的基質に対する酵素の高いkcat/kmは第１段階である。この様式において、酵素は与えられたkcat/KmパラメータについてKmが低く(Km＜S)kcatが低いプロファイルII様シナリオから開始するとFersht(1985)によって論じられている。分離-部位モデルの仮定を用いると、ESBの低下はESRの増加よりも少なく、これが低いKmに至ると仮定することができる。その結果、低いESBは低いTSBにつながる。しかしながら、TSBが低いにもかかわらず（基質の遷移状態に対する酵素の極大相補性について予測されるように）TSRの値が触媒反応にあまり有益でなく、酵素の低いkcatにつながる。従って、原始の酵素においては、ESにおける固有結合エネルギーの平凡な転換はかなり低い触媒反応速度を生じさせるものである。Fersht(1985)は、これは低いKmが「熱力学的ピット」を生じさせ、反応はここから「這い上が」らなければならないが、特定の基質に対して高いKmを有する酵素の場合にはそうではないからであろうと述べている。従って、原始の酵素に関する要点は、１）Kmはkcatよりも重要である、および２）低いkcatおよび低いKmによって特徴付けられる酵素は進化の初期段階にあると考えられる、ということである。
【００３０】
進化の第２段階において、酵素はその触媒反応を増加させるように進化し、一方標的基質に対するkcat/Km比を維持する。従って、酵素は、その酵素に関する一定の特異性を維持し、遷移状態に対する極大相補性を維持するが（一定のkcat/Km）、kcat/Kmを一定に維持するような様式でKmおよびkcatの両方を個々に上昇させる。kcatおよびKmの両方を増加させる手段は種々の機構を含み得る。
例えば、分離-部位モデルの原理を採用するのであれば、Kmの上昇はESRの上昇を介して明示される。これは、ESB接触は触媒反応的に好都合なのでESB接触が維持され（かつ増加しない）従ってTSBにおいて保存されると期待されるという仮説に基づいている。従って、ESBおよびTSB接触は進化段階で維持されるが、一方ESRの上昇はそれによってKmが上昇する特徴的な改変であると我々は考えている。ESRを上昇させるために採用し得るいくつかの機構がこの技術分野において知られている。これらの一つは「ひずみ」（基底状態における基質のゆがみをいう現象であり、それにより基質は遷移状態立体配座に最大適合するようになる。）として知られている。主要な結合性接触は基底状態において既に確立しており遷移状態において保存されるが（以下で論じる）、基質上の特定の更なる化学基が基質を更に歪ませて遷移状態形態に型どるために利用されることがある。
【００３１】
ESR増加の仮定される第２の機構は、有名な「配座誘起(induced fit)」モデル（Fershtら、1988中の例）である。このモデルにおいては（基質と反対に）酵素が活性中心において歪められ（従ってESRを上昇させる）、堅牢な基質の回りに適合することができるようになる。酵素上の化学基がこの歪みのためのエネルギーを供給するために使用される。配座誘起の多数の例が文献中に存在し、それらにはこれまでに作製されたトリオースホスフェートイソメラーゼの最初の結晶構造遷移状態（1970年に作製された）において報告された観察が含まれる。構造的に、酵素は阻害因子が結合して遷移状態を作り出した場合、自身の主軸の回りに収縮するが、阻害因子が透析によって除去されると膨張することが見出された（JohnsonとWolfenden、1970）。いくつかの遷移状態があるので酵素の幾何学的配置のこの柔軟性は巧妙であり、触媒作用溝における僅かな移動の結果として活性部位ポケットが調整され得るのであれば結合に有利であろう。
【００３２】
配座誘起理論には利点と欠点がある。欠点は、kcatにおける対応する増加無しにKmを増加させるために配座誘起が利用される点で、従ってFersht(1985)によって触媒反応には非-有益であると論じられている。さらに、配座誘起は多数のエントロピー的障害に直面している。なぜなら、酵素は活性化の自由エネルギーを低下させるためにエントロピー障壁を低下させなければならないからである（Maら、2000）。しかしながら、配座誘起の潜在的な利点は、活性部位における酵素の柔軟性は、単一の遷移状態立体配座への正確な結合に限定されているのではなく、一連の遷移状態に柔軟に結合する（Maら、2000）という酵素の選択権を許す点である。このことは、顕著な利点であり、特に上述したように遷移状態が実際には単一構造ではなく集合体の平均である場合には利点となる。逆に言えば、「歪み」はkcatおよびKmの両方を増加させ、それによって触媒反応速度を増大させるという正の支援を強化させることにより助けとなるので、２つのESR上昇力のうち、より重要であるとしばしば考えられる（Fersht、1985）。
【００３３】
ESRの上昇によってKmが増加する機構にかかわらず、ここで最も重要な点は、最適に進化した酵素は原始的プロファイルIIキネティクスシナリオからプロファイルＩシナリオ(Km＞Ｓ)へ移行し、その過程は触媒反応速度も上昇させる、という仮想的結論に関する。この見解は重要である。なぜなら、本発明の方法は、標的プロテアーゼは進化の進歩した段階にあり、プロファイルＩキネティクスに従い、したがって高いKm値を有するという仮定を用いて開発されているからである。典型的には、より高いKm値は今のところSの１〜10倍である（Kraut、1988）。この高いKmは、遷移状態速度律速段階より前に生じる基質分子のボルツマン分布として記述することができ、遷移状態と基底状態間で生じる類似性のためよく知られている（Kraut、1988）。
kcat/Km値を一定に保つため（従って基質の遷移状態に対する特異性と相補性を維持するため）、Kmの増加はkcatの等価な増加を生じさせる。進化した酵素におけるkcatの増加は（原始的酵素のTSRと関連して）TSRの低下を通して達成させると考えられる。これが生じ得る機構はよく分かっていないが本明細書では探究しない。触媒反応に関して、進化した酵素のkcatはKm値よりも速度増強により関与するという顕著な証拠がある。
【００３４】
この観察は、極大触媒反応速度のためにはEとSのより弱い結合が好ましいことを示唆し（Fershtが論じたように、1985）、従って、EとSとの結合の重要性を減じるように見える。しかしながら、ここで主張する要点は、KmはもっぱらESRの上昇（歪み、配座誘起、または他の力による）を介して上昇するのであって、ESBの上昇によるわけではないという点である。我々の重要な仮定は、最適に進化した酵素においてはES、従ってKmが高いという仮説に直観的には反したものである：kcatが触媒反応に重要な変数である最適に進化した酵素においても、ESBとTSBはなお安定化力としての主要な働きをする。実際、この意見はこの分野の何人かの研究者によって支持されており、彼らは基底状態における強固な結合相互作用は触媒反応に対して無駄ではないことを証明している（Murphy、1995およびMenger、1992）。この見解は本発明の方法にとって重要であろう。なぜなら、本方法はESBおよびTSBにおける結合相互作用を利用するからである。
【００３５】
本節を以下に要約する：進化の過程で、基質の遷移状態に対する特異性および相補性が最初に最大化され（ESBおよびTSBにおける結合性接触を保存することにより）、かつ、これが保持され、一方、触媒反応速度は歪曲力（ひずみ、または配座誘起）によりESRを上昇させる（Kmを上昇させる）機構を通じて増強され、対応するkcatの増加を生じさせ（それによりkcat/Kmは一定に保持され維持される）、それによりkcatは触媒反応に寄与する動力学的変数となった。しかしながら、重要な点は、最適に進歩した酵素において触媒反応に関してkcatはKmよりもより重要であっても、ESBおよびTSBにおける固有エネルギーはなお保存され、触媒作用エネルギーへの転換に非常に重要であるという点である。ここで、われわれは効果的なプロテアーゼ阻害因子が利用すべきなのはこれらの最適エネルギーであることを提唱する。
【００３６】
Kcat/Kmに関する仮定と本発明の方法との関連性
以下で詳述する本発明の方法は、もともと前述した仮定に基づいている：第１に、標的プロテアーゼは進化の進んだ段階にあり、それ故、第２にそれらの触媒反応はkcatによって駆動されており、従って、第３に、高いkcat基質がそれらの活性部位に存在する。トリペプチド、ジペプチドまたはモノペプチドの最適な順列の組合せが標的酵素のS1-S3結合部位に存在すると仮定され（BergerとSchechter、1970）、これらは高ターンオーバーに晒され得る。第４に、Kmは酵素の触媒作用にそれほど重要でないかも知れないが（それ故、酵素はプロファイルＩキネティクスによって駆動される）、ESBおよびTSBによって与えられるKmの固有自由エネルギーは触媒装置の重要な構成部分である。結合を生じさせるのは、トリペプチド、ジペプチドおよびモノペプチドの最適な順列が存在するからということになる。最も強力な実施態様において、本発明の方法は標的酵素のトリペプチド基質アミノ酸のP1-P3における組合せの全ての可能性をスクリーニングする（ジペプチドおよびモノペプチドを含めて8,420アミノ酸）。我々はトリペプチドは充分に長いと考えている。なぜなら、固有振動モード検索法により、一次遷移状態鞍点は遷移状態の自由度が増加するにつれて（自由度はクラスターサイズが増加するにつれて増加する）指数関数的に上昇すると報告されているからである（TsaiとJordan、1993）。トリペプチドの使用によりキネティクスを単純に保つ一方、この方法の予測性を可能な限り高く維持することができる。しかしながら、より短い、または長いペプチドも使用することができる。
【００３７】
触媒反応機構に関する仮説：遷移状態効果および基底状態効果
ここまでに論じてきた仮説および理論を用いて酵素反応がどのように駆動するかを説明することができる。述べてきたように、種々の理論、ある場合には本質的に全く矛盾する理論がこの技術においてこの問題に関して沢山存在する。この節では、これらのどの仮説を我々が採用し、どれに異議を申し立て、（おそらくは）我々の新規な系によりどれが置換えられるかを明らかにする。
酵素学における主要な定説は、遷移状態安定化または基底状態不安定化またはこの両方の組合せが酵素触媒反応に利用されるというものである。遷移状態効果（図1b）については、いくつかの可能性の中で２つの最も重要なシナリオを再検討する。
【００３８】
第１のシナリオでは、ΔGES（従って、Kmおよび見かけのES結合エネルギー）は酵素反応において一定である。一定のKmにもかかわらず強固な結合相互作用がES間に起こる。思い出されるように、ESRは不安定化されるはずなので、ESBは一定のKmとなるべく補償するため同等に安定化されるはずである。ここでの重要な観察はKmが一定の場合であってもESBはなお低下し得ることである。さらに、ΔGESは不変であるので、結合相互作用におけるESから得られたエネルギーの全ては完全に触媒反応エネルギーに転換される。ここでのより重要な観察は、これが起こる機構である：ESBの低下がTSBにおいて保存されるため（上記で論じたように、結合相互作用および幾何学的配置はTSBにおいて保存され増強されるという仮定による）、TSの正味のエネルギーも低下する。このTSBの低下は触媒反応への第１の主要な寄与である。
【００３９】
触媒反応への第２の主要な寄与は、TSRを低下させ、従ってTS低下に寄与する、酵素の触媒中心による反応に由来する。基底状態における反応中心のエネルギー論は遷移状態において保存されないので、これから導かれることとして、ESRの増加はTSRの増加へ翻訳されないことを思い出すことが重要である。これらの反応の正味の結果は、触媒遷移状態(TS)は非触媒遷移状態(TSU)に比較して低下し、このことは-ΔGcatの全体的増加（kcat/Km増加）と等しい活性化エネルギーの低下を生じさせることである。前述の議論において仮定したように、kcat/Km変数は触媒反応速度の増強を予測するものである。
従って、ΔGb（遷移状態への酵素結合の自由エネルギー）の増加はMurphy(1995)によって遷移状態安定化効果（図１ｂ）を同定するための特徴的なパラメーターであると仮定されている。遷移状態安定化のこの第１のシナリオからの重要な結論は、基底状態相互作用がどのように無駄であるかに関する「原理主義者」的理論のパラドックスおよび第１の主要な欠陥を解決し、基底状態相互作用がどのように触媒反応を加速することに関与するかを証明していることである。従って、我々は、ESBおよびTSBにおける結合性相互作用が触媒反応に非常に重要であり、効果的な阻害因子はこれらの力を最大に利用すべきであるということを再度強調する。
【００４０】
遷移状態効果に関する第２のシナリオは、基底状態効果は触媒反応を妨害するというよりも、どれほど強く触媒反応を補助するかを特に強調する。ここで、ES間の強固な結合による総ESの低下（低いKm）（ESRが上昇するよりもESBはさらに大きく低下する）にも関わらず、触媒反応速度はなお増大する。ここでも、原理主義者的理論と反対に、この状況は基底状態相互作用が実際にどれほど触媒反応に有益であるかを説明している。ここでも、速度促進の原因はESBがTSBで保存されていることである。TSRにおけるいかなる低下も除いて、正味の結果はESが低下するよりもさらにTSが低下し、ΔGbの増加を生じさせ、従って酵素速度の増加を生じさせることである。
従って、ある酵素は遷移状態安定化と独立に、または共同して働く基底状態不安定化効果（AlberyおよびKnowles、1977；Jencks,1987）によっても駆動されると仮定される。基底状態不安定化が独立に働く場合（図１ｃ）のこの効果の一つの例は、ESRが増加し、一方ESBが一定であることによってΔGESが増加する（従って、Kmが増加し、みかけのES結合エネルギーが低下する）場合である。従って、TSBはESBにおける保存のために変わらない。TSRも不変であり、TSの正味のエネルギーに変化を与えない（一定である）。TSが低下していないという事実にもかかわらず、-ΔGcatの全体的な増加および増加した速度（kcat/Kmによって予測される）に匹敵する、遷移状態に達するために必要な活性化エネルギーの低下がなお存在する。この例では、増加した触媒反応速度と一定のΔGbを証明することは基底状態駆動触媒反応事象を同定することである（Murphy、1995）。ここでの要点は、遷移状態安定化が速度増強の唯一の触媒機構として働くという原理主義者の見解とは反対に、基底状態不安定化効果が触媒反応に対する別のかつ可能なストラテジーを提供する点である。
【００４１】
上記シナリオのいずれにおいてもKmが優先されることをここで注目しておく。本質的に、高いKmは高いESに翻訳され、これは遷移状態安定化が機能しなくても、基底状態不安定化と独立に機能しても、または基底状態不安定化と共同して機能しても、基底状態不安定化態様における活性化エネルギーを減少させるであろう。重ねて、このパラダイムは最適に進化した酵素について上記で提示したものと矛盾しない。これらの酵素について、ESB（およびTSB）は低くなければならず、一方ESRはESおよびKmが高くなるように増加しなければならない。kcatが触媒反応を駆動する。ESBおよびTSBにおいて結合性接触を利用する場を通じてKmを低下させるが、追加的にESRを低下することができる阻害因子は、遷移状態安定化効果または基底状態不安定化効果が触媒反応を駆動するいずれの場合においても速度増加に対抗する可能性を提供する。
【００４２】
最後に、「均一結合(uniform binding)」（図１ｄ）の中立的効果は簡単に述べるに値する。この場合は、TSの低下はΔGcの同じ変化と並行し、正味の触媒反応を生じないシナリオである。この例では、ESBは一定のESRにて低下し、TSBの等価な減少を生じさせ、ESおよびTSCの両方を同じ値だけ減少させる。同じシナリオはESBが一定のESRにて増加する場合にも適用される。従って、固有結合エネルギーは全く触媒反応に転換されずΔGcatに変化は無く、従って、速度に変化は起こらない。従って、ΔGbの正味の変化が０であることは均一結合の定義である（Murphy、1995）。
要約すると、酵素は均一結合のような手段により触媒作用に全く正味の変化を生じない経路をたどることができ、または、遷移状態安定化または基底状態不安定化効果のいずれかにより触媒反応を起こすことができる。これらの機構は、基質の代謝回転はおそらくは上述した種々の機構またはそれらの組合せとしての異なる機構的経路によって行われ得るという点で酵素キネティクスの非常に複雑な性質を強調するものである。どの経路を実際にたどるかは個々の酵素に依存する。これらの可能性を認識していることは、触媒反応に好都合な可能な経路のいくつかまたは全部と機構的に対抗して作用すべきプロテアーゼ阻害因子のカスタム設計に適切である。
その結果として、基底状態不安定化および遷移状態不安定化に関して提示された仮説を利用して、本発明のプロテアーゼ阻害因子同定方法から得られる動力学的現象の予測の基礎が提供されるであろう。
【００４３】
反応座標
上記で概説した仮定に基づき、ここで触媒反応に関する反応座標を記述する。この解析は遷移状態安定化が触媒反応を駆動する主要なメカニズムである状況に適用される。基底状態不安定化は後述の議論で扱う。
触媒反応機構はミカエリス（Michaelis）複合体(ES)を形成する酵素と基質間の結合事象から開始する。我々は、酵素／基質結合は低下したESBを生じさせると仮定している。２つの可能性は、ESはKmが一定であるように一定に維持される（ESBはESRの増加と同じだけ低下し、一定のKmに相当し、kcatは高いことを必要とする）か、Kmが低下するように低下し得る（ESBはESRの増加よりも多く低下する）ことである。どちらの例においても、ESBが低下して酵素と基質との間の強固な結合を保証し、それによりこの複合体は予備的な遷移状態へ進行することができ、最後には律速段階遷移状態へ進行することができることが本質的であると我々は主張する。この過程の際に、初期反応基群が予備的会合を形成し、自由度の低下による顕著なエントロピー損失がある。
【００４４】
触媒反応における第２の主要な事象は仮定される遷移状態形成である。TSBは低い（ESBにおける結合エネルギーの保存のため）。これは触媒性残基の続く相互作用によって生じる好都合な触媒作用事象のためにTSRの低下に至る、またはTSRの低下と同時に生じる。従って、TSは低下する。TSがESが基底状態において安定化されるよりも大きく安定化されるならば、ΔGbは増加し、このことは酵素が高いkcat/Kmの基質とともに遷移状態安定化を利用して触媒作用的に前進することを意味する（図１）。ここから導かれる結論は、酵素はES形成からの特異的結合エネルギーを利用して歪みおよびエントロピー損失を克服することであり、このことがESRの上昇によって起こるということである（Jencks、1987）。
【００４５】
酵素と基質の強固な結合が触媒反応の成功に必要であることを強調するため、我々は、ESBの低下がKmの低下を生じさせるか否かのいずれにしろESBは常に低下する、ということを繰り返し述べる。これには２つの重要な理由がある：１）低下したESBはESを遷移状態に移行させるための最初の事象であり、ともかくも遷移状態安定化が起こるのであれば必要とされる事象であり、２）ESBにおける強固な結合は、改善されないにしても、TSBにおいて維持される必要があり、それにより触媒性残基は続いて反応することができ、TSRを低下させ、最後にはTSをESの総低下量よりも大きく低下させることができる。低下したESB変数の質を維持（従ってTSBにおける好都合な結合性接触を維持）することは伝統的なプロテアーゼ阻害因子発見モデルの重大な弱点の一つであると我々は考えている。我々はこの議論を後述の節で入念に検討するが、伝統的なプロテアーゼ阻害因子スクリーニングモデルの全体像から始めることにする。
【００４６】
遷移状態類似体の伝統的設計
「遷移状態類似体」とは、基質の遷移状態に「似ている」分子であり、従って酵素は遊離の基質に対するアフィニティーよりも顕著に大きなアフィニティーをもってこれに結合するであろう。クルツ(Kurz)方程式は遷移状態類似体の結合能を記述する：ke/ku=KS/KT（式中、keは触媒される反応の速度定数である；kuは触媒されない反応の速度定数である；KSは基質の解離定数である；KTは遷移状態解離定数である）。従って、酵素触媒反応について1012の速度が観察されるならば、その酵素は基底状態基質に結合するアフィニティーよりも1012倍高いアフィニティーで遷移状態類似体に結合することになる。（クルツ方程式は速度増強のためのストラテジーとして基底状態不安定化も利用する酵素について偏向していることに注意することは重要である）。
遷移状態類似体を操作する伝統的かつ一般的な方法は天然基質類似体に酵素の遷移状態を模倣する反応分子を接続することである。従って遷移状態類似体の結合は活性部位を「ロック」し、従って、「エネルギーの山」をさらに乗り越えて生成物反応へ進行することができない。この方法において、標的酵素に対して高い特異性（高いkcat／Km）を有する類似体が最初に同定される。いくつかの優れた高処理能の方法（例えばジーンチップ）が存在し、標的酵素による高ターンオーバーに資するそのような基質ペプチド配列が同定される。次にこの高kcat/Kmペプチドコアに反応性部分が接続されて最終的な候補阻害因子が作製され、これはTSRを増大させるであろう（上記で概説した仮説に基づく）。結果として、TSBを低下させる好都合な結合事象はTSRの増加を打ち消すにあまり十分でなく、従って、TSI（阻害因子を含む遷移状態）は変化しないかまたは増大する。正味の結果はΔGbが増大せず、速度の増強はない。
【００４７】
速度増強のないことを説明し得るいくつかの動力学的シナリオが可能である。１）TSBの減少がTSRの増加よりも大きくても正味のTSI（阻害因子を含む遷移状態）をESの低下に対して十分に低下させるには足りず、従ってΔGbの増加が生じる。２）TSRはTSBが低下する量とおなじだけ増加し、TSIはTSU（遷移状態、非触媒的）と同じレベルに止まり、この場合もΔGbは増加しない。３）TSRはTSBの低下よりも多く増加し、TSIはTSUよりも大きくΔGbはプラスになる。我々は、従来設計された遷移状態類似体について観察されている速度増強の欠落は、阻害に関する以下のいずれかの仮定が満たされた場合に起こると考えている。
１．TSIがΔGbが増大するに足りるほど低下することは決してなく、従って一般的遷移状態安定化効果が事実上排除される。
２．TSRが常に増加してTSBの低下を打ち消す。
３．ESBが常に低下してESが結合および遷移状態に接近することができる（そこで阻害がおこるであろう）。
プロテアーゼ阻害因子開発のためのどんなストラテジーもこれらの基準を満たさなければならないと我々は提唱する。
【００４８】
本発明の方法の理論的開発の概要
上述したように、「分離-部位」モデルは「原理主義者的立場」よりも進歩していることを示す。このモデルは遷移状態安定化-駆動（および基底状態不安定化-駆動）触媒反応を成功裡に予測する。阻害因子設計の従来の方法から離れるに際して、本発明は「分離部位」モデルを阻害因子候補を作製するための出発点として採用する。
阻害因子設計の理論的基礎として、「分離-部位」モデルはいくつかの利点を有する。このモデルの別個の独立した結合および反応中心は、単純化された動力学と計算を可能にする。興味深いことに、このモデルの単純さはより良好な動力学的予測と相関し、効果的で能率的な方法で阻害因子を成功裡に発見することを可能とする。
【００４９】
我々の考えでは、伝統的な阻害因子開発モデルは「分離-部位」モデルをエミュレートしていないので失敗する。しかしながら、残念なことに、「分離部位」モデルは重大な問題のために修正せずには使用することができない：このモデルは酵素触媒反応を単純化しすぎる。実際には、結合および反応中心はこのモデルが前提とするほど分離したものではない（以下に証拠を提供する）。我々は、この障害を克服する方法を考案し、なお分離-部位モデルの仮定が可能な限り維持される、ペプチド切断酵素阻害因子同定方法を設計することが可能であることを示す。重要なことに、本発明の方法は、分離-部位モデルの基本的理論的原理と調和させつつ、阻害因子設計または同定の過程を、標的酵素への強固な結合および触媒反応と関連する酵素の特定の立体配座に対する顕著な特異性を示す阻害化合物へ向けて実験的に進める。従って、阻害因子設計および同定の我々の新規な方法は実験的動力学方法論を再評価することによって伝統的な阻害剤設計法の主要な欠陥を「修正」するものである。本発明の方法は、分離-部位モデルの仮定を利用するので、高度に特異的で強力なペプチド切断酵素阻害因子という成果により効率的にたどり着く。
【００５０】
本発明の理論的基盤は以下の問題を研究することにより更に説明される：（１）分離-部位モデルの欠陥はどこにあるか？；（２）遷移状態阻害因子開発に関する伝統的な方法がどのようにこの欠陥に陥りやすく、従って妨害を受けるのか？；そして、（３）我々の新規な方法がどのように伝統的設計法のこの欠陥を修正し、そうすることにより、阻害因子に成功裡に「ヒット」する可能性を高めるかのか？
【００５１】
分離-部位モデルの欠陥
我々の見解によれば、ESおよびTSの結合中心と反応中心はこの理論が主張するほどは分離していない。説明のため、システインプロテアーゼ、パパインによる触媒反応を考える。システインプロテアーゼ活性部位「オキシアニオンホール」は基質P1基のカルボニル基を落とし込むことに関与している（Kamphuisら、1984）。これは活性部位システイン残基(Cys25)の主鎖およびGln19の側鎖の寄与による水素結合からなっている。これらが一緒になって、これらの連鎖がESBを低下させる重要な結合性相互作用を可能とし、この相互作用はTSBでも保存される（これはまさに分離-部位モデルが予測することである）。しかしながら、分離-部位モデルが予測するようにTSBおよびESBにおける結合だけがこれらの結合中心残基によって与えられる機能というわけではない。
【００５２】
そうではなく、どちらの残基もTSR反応中心にも寄与する。ミカエリス複合体および遷移状態の両方においてP1酸素を取り込むために酸素を水素結合することに寄与する（これは、例えばESBおよびTSBを低下させる）同じシステイン残基が、そのチオレート残基を媒介として同じP1カルボニル基に対する親核性攻撃（アシル化）にも関与する。この後者の事象は四面体付加体の生成を可能とし、基質のアミン脱離基の脱落がこれに続き、その結果TSRの低下を生じさせる。多くのシステインプロテアーゼにおいて、この一連の事象が速度律速段階を規定する。
これらの同じ「結合」残基が「反応」中心に寄与することは、例えば、基底状態においてESB安定化を形成するCys25およびGln19からの同じ水素結合が親核性攻撃（TSRも直接低下させる減少）の結果として形成されるオキシアニオン上の負電荷の酸-触媒反応様安定化にも関与することによって支持される。従って、システインプロテアーゼ機構というこの特定の特徴において、ESBの安定化は単一の残基を媒介としてTSRの安定化と協同して起こる。
【００５３】
システインプロテアーゼの結合中心と反応中心が分離-部位モデルが予測するほど空間的に離れていない他の事例はパパインのAsp158残基の作用によって例示される。Asp158は基質のS1位置の窒素と水素結合するために機能するだけでなく、反応中心における生化学的攻撃のためにシステインプロテアーゼの触媒三つ組を配向させる役割としても機能すると言われている（これはTSR低下に関与する事象であろう）（Wangら、1994）。これらの例は酵素活性部位における結合中心および活性中心を規定する集合の一部がどのようにして同じ残基内に局在し得るかを証明するのに役立つ。従って、ここでの主要な結論は、結合中心および反応中心は実際に密接に連結しており、分離-部位理論によるそれらの分離は全く酵素活性部位を単純化しすぎている。
【００５４】
伝統的方法の論評
阻害因子設計のための伝統的方法は「分離-部位」モデルをエミュレートできず、それ故いくつかの問題を露呈する。
問題点１：反応性部分とペプチドコアの結合相互作用との干渉
第１に、伝統的方法は、結合（ESB低下）に関与するだけでなく触媒反応的に好都合な遷移状態の安定化（TSR低下）にも関与するであろう高いkcat/Kmのペプチドコアを使用する。続いてこの高いkcat/Kmペプチドコアの非常に近くに反応性阻害部分が付加された場合、上記で示したように、その部分はこの系のESBおよびTSBにおいてペプチドコアにすでに存在している好都合な結合とおそらく負に干渉して好ましくない複合体化を生じさせるという好ましくない複雑な状況を生じさせる。我々の前述の仮定を用いてより具体的にいうと、分子の結合に影響を与えずにTSRを増加させることだけを期待して反応性部分を付加した（上記、第２の阻害因子仮定）にもかかわらず、その部分が結合コアに非常に近いことが同時にかつ迂闊にもESB低下（第３の阻害因子仮定）という事象と干渉することがある。これがおこる機構は、結合（ESB/TSBによる）および反応（TSRによる）の両方に関与する残基との直接的な干渉を介したものである。上記で論じたように、「分離-部位」モデルの欠陥に関する我々の主張に基づけば、ペプチド分子の結合部分は反応中心とは独立に「固定」されたものではなく、従って、結合を妨害する可能性は非常に高い。例えば、トリプシンのようなセリンプロテアーゼについてZ-Argのような反応性の高kcat/Km基質類似体のArgに付加されたフルオロメチルケトン反応基を例として採用する（Z-Argはトリプシンの自然な類似体である）。この例では、ArgはP1にて非常に強固に結合しており、従って、結合において（すなわち、ESBおよびTSBにおいて）重要な役割を果たしている。この機能に加えて、Argはまたこのプロテアーゼを触媒作用について活性化し、従って、トリプシンの活性中心（TSR）でもある。フルオロメチルケトンがArgに近いため、Argによって与えられる結合機能をこれが妨害し得ることはありそうなことである。最終的な結論は、反応性部分はESBおよびTSBにおける好都合な結合性接触を妨げてはならず、このことは阻害因子の結合のためには極めて重要である。
【００５５】
伝統的プロテアーゼ阻害因子設計モデルによって開発された高kcat/Kmペプチドコアの好都合な結合性接触を反応性部分が妨げることは、ESBおよびTSBにおける相互連結した結合性相互作用の全てに「雪だるま効果」を及ぼすことに注意する。上記で論じてきたように、結合性と反応性は複雑な相互作用の集合によって連結している。説明のため、TSにおける個々の結合相互作用が協同的、付加的および相乗的であり、一方、これらの相互作用の小さな撹乱は分子全体の結合性に破滅的であり得る十分な証拠を考慮することができる。
反応性部分の官能基とペプチドコアの結合官能基との間のポテンシャルエネルギー「連結」は活性部位で生じる結合の自由度を指数関数的に高めるであろうことを予測する（そして多数の変数によって反応の動力学を複雑化させるであろう）。この妨害のレベルはこの相互作用によって増加した自由度と直接相関するであろう。この数は膨大であり得る。特に反応性部分がESBまたはTSBと無限の様式で相互作用し得る場合は膨大であり得る。例えば、遷移状態（その特性の多くはTSBから引き出される）は「分離-部位」モデルが予測するよりも高度に「拡散」し、より高度に相互連絡される。遷移状態は単一の一義的に定まる（BaldwinとRose、1999）ポテンシャルエネルギー表面の「鞍点」ではない。一つの鞍点というこの単純化しすぎた説明は気相の分子反応を説明することができるかもしれないが、水性媒体中の遷移状態を記述するには十分でない。
【００５６】
Maら(2000)は、遷移状態は実際に多数の活性化立体配座からなる（同じ振動的-平均化構造を有する均一または不均一な集合）表面であって、これが酵素が実際に結合するものであろうと主張した。固有モード検索法によって一次鞍点はクラスターサイズが増加すると指数関数的に増加するであろうことが示された（TsaiとJordan、1993）。従って、この情報は、反応性部分がTSB結合中心とも相互作用するのならば系はずっと複雑になる可能性があることを意味する。
従って、阻害因子設計アルゴリズムの目標は、可能な自由度が最も少なくなるように阻害因子／酵素モデルを単純化することで、それによって動力学的予測性を最大にすることであるべきであろう。このことはおそらく２つの一般的努力によって達成することができる：１）可能な自由度を最小にすることによって表面の鞍点の数を最小にする、および２）遷移状態の拡散的性質を実験的に可能な限り単純化し、独立の結合および反応中心という分離―部位モデルの仮定に（可能な限り）接近できるようにする。
【００５７】
問題点２：ペプチドコアは触媒反応性であり反応性部分による阻害を打ち消す
伝統的方法の第２の重要な問題点は、反応性阻害部分に結合している高kcat/Kmペプチドコアはそれ自体が触媒反応ターンオーバーを誘導するものであり、従って酵素阻害に対して反作用的という特性によっても特徴づけられる点である；すなわち、特定のプロテアーゼによる切断性を本質的にコードするペプチドコアは、反応性阻害部分によって完全には弱めることができない程度にその酵素を切断反応へ向かわせるかもしれない。ペプチドコアは高kcat/Km分子の一部であるので（従ってTSRを低下させる）、そもそも効率的にターンオーバーする類似体でもある。我々は、反応性部分フルオロメチルケトンに結合したトリペプチドの例を用いて説明する。TSRにおける遷移状態低下に関与しているP1アミノ酸のせいで、（高kcat/Kmを有する基質について予想されるように）反応性フルオロメチルケトン親電子基（すなわち求核基）が第２の阻害因子仮定によって要求されるようにこの効果を打ち消す（TSR増大）のはより困難になる。従って、これは主要な問題の根幹である。
上記で論じたように最適に進化した酵素においては触媒反応に対してkcatがKmよりも重要である。従って、阻害因子全体の中のペプチドコアの高いkcat特性のために、反応性部分による（TSR低下を媒介とする）kcat低下を打ち消すことがより困難になる。要約すると、好結果を与える遷移状態阻害因子のための上述した２つの重要な仮定は伝統的な阻害因子設計方法によっておそらく妨げられてしまうであろう。実際、これが遷移状態類似体設計において起こる非常に多くの失敗の原因であろう（Wolfenden、1999）。
【００５８】
新規な阻害因子設計システムの目標
結合中心および反応中心が分離-部位モデルが予測するほど単純簡潔に分離されているとすると、原理的には伝統的な阻害因子設計方法は機能するはずである。なぜなら、反応性部分はペプチド結合コアとは干渉せず（従って前述の「雪だるま」効果は回避される）、同様に、ペプチド結合コアは酵素の反応中心においてTSRの低下に関与しないからである。
阻害因子設計のための新規な方法は従って以下の特徴を含む阻害化合物を生み出さなければならない。第１に、好都合な結合性接触がESBおよび続いてTSBで保存されなければならない。阻害因子のこのペプチドコアは次に酵素との強い結合相互作用（これは我々が強調してきたように触媒反応にとって非常に重要である）によって特徴づけられるという基準を満足するであろう。第２に、阻害因子はTSRを低下させず従って阻害因子の目的を破壊しないペプチドコアを含まなければならない。これは反作用的阻害事象を生じさせるはずである（TSRの増加）。第３に、阻害因子はESBおよびTSBにおけるどのような好都合な結合性接触にも影響を与えることなくTSRを独立に上昇させる反応性部分を含まなければなならない。
これらは本発明の目標である。酵素／阻害因子システムはまずその中の自由度を減少させることにより単純化される。このため、本方法は酵素の結合中心と反応中心を分離する実験的基準（可能な限り分離-部位モデルの仮定に近い）を採用し、それによって反応性部分と結合したペプチドコアとの間の破壊的な連関を防止する。
【００５９】
阻害因子設計のための新規な方法：従来のプロテアーゼ阻害因子設計法の従前の問題点の修正
本明細書に記載の実験方法は分離-部位モデルを可能な限りエミュレートするように設計されている。キネティクスは計算がより単純化されるように、より経験的になっている；このモデルは進行につれて評価および改善される。本方法は可能な限り反応性から結合性を分離しようと試みる。このアプローチの本質は、もっぱら結合に関与するが触媒反応には有意は程度には関与しない非反応性（すなわち非切断性）ペプチドコアに反応性部分（阻害因子がプロテーゼを「ロック」することができる能力を与えている部分）が結合されていることである。結合はするが切断酵素によって切断されないペプチドコアに反応性部分が結合しているため、反応性部分はもっぱら遷移状態反応に関与し、結合コアと干渉しないまたはこれに影響を与えない。この方法の目的は現行の方法から著しく外れたものであって、阻害因子設計の基礎として、切断性基質ではないそのような非反応性結合ペプチドコアを見いだし利用することである。
【００６０】
従って、本発明のアプローチの第１部分（以下の工程Ｉから工程III；特に工程III）はそのようなペプチドコアを同定するための方法論を提供する。そのようなペプチドコアは非常に低いkcatと、しかしながら標的活性部位への非常に強固な結合によって特徴づけられる。この非切断性の強固に結合するペプチドコアは本方法においては「ビヒクル」と呼ばれる。ビヒクルが活性部位に強固に結合することにより、常にESRの増加よりも多くESBが低下し、その結果Kmは低下するかまたは少なくとも一定である。ここでのポイントは、活性部位における好都合な直接の結合性接触および活性部位から離れた好都合な弱い接触（協同して働きESBを低下させる）によってESBが低下することである。ESBとTSBの間で結合が保存されるという観察に基づき、ESBにおけるビヒクルと酵素の間のこれらの好都合な結合性接触はTSBにおいて更に強化される。従って、ESを形成するビヒクルと酵素間の効率的な結合は、前述した反応座標における触媒反応が成功するための仮定が満たされていることを保証する：１）ESBにおける結合相互作用およびその利用；および２）ESは遷移状態に移行することがあり得、従ってビヒクルはTSBにおける遷移状態にも結合できる。
【００６１】
ビヒクルはもっぱら基底状態においてのみ結合性で（Kmを低下させる）、従って遷移状態集合体とは何ら相互作用を有しないと反論する批評家たちがいるかもしれない。具体的には、それが真実であるなら、このことはそのようなビヒクルとTSBとの間に結合相互作用は全くおこらないことを示唆するであろう。しかしながら、本発明の方法において、ビヒクルは標的酵素に対して可能な最も高いkcat値によって通常特徴づけられるであろう基質を「競合排除(putcompete)」するという固有の資質によって顕著に特徴づけられ、従って、TSBに対する強固な結合によって特徴づけられる（工程III）ことを我々は強調する。前述した仮定に基づいて詳しく述べると、高kcat基質は高ターンオーバー（高kcat）によって特徴づけられるので、優れた酵素との遷移状態結合相互作用を達成するであろう。従って、競合ビヒクルは遷移状態において（TSBにおいて）天然高kcat基質類似体よりもさらに好都合な結合相互作用を有することによっても特徴づけられる筈であるということになる。
【００６２】
従って、活性部位に対して高kcat基質基質類似体よりも大きな競合能をこのビヒクルが有することに基づき、ビヒクルは高cat基質類似体がTSBに対して有していた親和性よりも大きな親和性をTSBに対して有しているであろうと我々は結論する。反対に、ビヒクルがもっぱらESBに対してのみ親和性を有しているとすると（低Kmビヒクル）、（TSBに結合せずに）排他的にESBに結合することは、通常特異的（高kcat値に基づくである）高kcat基質の遷移状態に酵素が結合することを原理的には排除しないはずなので、高kcat基質がそうであるように酵素の活性部位において好都合に結合するということはありそうもない。
従って本方法は、ESBおよび／またはTSBにおいて結合性接触の集合に対して、典型的に代謝回転（ターンオーバー）される高kcat基質よりも大きな親和性をもって結合することが可能なビヒクルを生じさせることが期待される。これらのビヒクルに関する競合阻害アッセイを工程IIIに示す。この競合アッセイの鍵となる特徴は、ESに対する排他的かつ強固な結合性（低Km）を有するビヒクルを同定するために設計されたというよりも寧ろESBおよび／またはTSBに対して強固な結合性を有するビヒクルを同定するために設計されていることである。結論として、我々はこのビヒクルはESBおよびTSBに対する高アフィニティーによって特徴づけられることを主張する。
【００６３】
さらに、また重要なことに、このビヒクルは非触媒反応性（すなわち、低kcat）であり、従って、触媒反応を生じさせるような様式でTSを低下させることはできない。具体的には、このビヒクルの非触媒反応的性質はこのビヒクルがTSRと有利には相互作用しないことを意味する。従って、ΔGbは増加（遷移状態駆動触媒反応の定義）せず、酵素の触媒反応速度は増大しない。これを説明する３つの可能な動力学的シナリオが存在する。第１の場合においては、TSV（ビヒクルを伴う遷移状態）はESが低下する量と同じ量だけ減少し、（上述したように）均一結合(uniform binding)を生じさせる。したがって、活性化エネルギーになんら変化はなく、触媒反応速度はまったく増強されない。第2の場合においては、TSBが低下する量と同じだけTSRが増加し、これによりTSVは変化しないまま維持される。この場合、ESは低く、かつ、活性化エネルギーに正味の増加があり、したがって触媒反応は起こらない。第3の場合においては、TSBの減少よりも多くTSRが増加し、これによりTSVが増大し、活性化エネルギーの増加のもっとも大きな可能性を誘導する。この場合も非触媒反応シナリオである。この第3の場合はビヒクルに関してもっとも阻害的なシナリオを提供するが、ビヒクルの排他的な結合相互作用がTSRの反応中心と相互作用すること可能性は低いので、このケースは起こりそうもない。
【００６４】
触媒反応が妨害される動力学的様式に関係なく、ここで関係のあることは、これらの全ての可能なシナリオにおいて、ビヒクル／酵素結合の結果としての速度増加はありえないことである。このことにより、このビヒクルは結合性にのみ関与し（低いkcatを有するから）、ターンオーバーには関与しないので、このビヒクルはTSRとは有利に相互作用しないという結論が導かれる。従って、TSRの「反応中心」はESBおよびTSBの結合中心とは分離されており、この状況は新規な本方法が伝統的モデルよりもより近く分離-部位モデルへ近づくことを可能とするものである。
本方法の別の重要な部分（以下の工程VII）は、TSRを上昇させるということを最終目標として、（ESRに対してではなく）もっぱらTSRと相互作用する反応性部分をスクリーニングする。このスクリーニングはTSRにおける遷移状態相互作用のスクリーニングのためにこの分野で知られた方法論を用いて行われる。われわれは伝統的方法にくらべた本方法の主要な利点をここで列挙する。伝統的な方法のように、本方法は効率的に活性部位に対する高アフィニティー結合ペプチドコアを同定する。本発明の方法において、この活性部位に対する全ての潜在的な高kcat基質よりも高い親和性で結合するビヒクルが同定される。この利点は伝統的な方法によっても与えられ、それによれば高kcat/Km基質類似体が同定される。この利点は高kcat/Km基質類似体が同定されるという伝統的方法によっても与えられる。しかしながら、伝統的方法による高kcat/Km基質類似体はTSRを低下させる。従って、伝統的方法によると、TSBおよびESBに強固に結合する同じペプチドコアがTSRとも相互作用する。ES相互作用における結合中心および反応中心は伝統的方法の基質類似体よっては区別されない。対照的に、本発明によって同定される非触媒反応性ビヒクルはTSBおよびESBに結合するがTSRとは相互作用しない。従って本発明のビヒクルにおいてはTSBおよびESBは効果的にTSRから「分離」されており、このことはESにおける結合中心および反応中心はあたかも別個のものであるかのごとく取り扱うことができることを示唆する（これは「分離-部位」モデルと一致する）。
【００６５】
この分離から導かれる、伝統的方法に比較した主要な利点は以下のとおりである：結合性と反応性がビヒクル中で「分離」されているので、TSR-上昇性反応部分をビヒクルに付加するという本発明の方法における実験的追加は、ビヒクルがTSBおよびESBと共有する正の結合性相互作用を妨害することなく行うことができる。対照的に、伝統的方法におけるように、高kcat/Km基質類似体へのTSR-上昇性反応部分の付加は、結合中心および反応中心が高度に連関しており「分離」されていないので、強固に結合するペプチドコアの強固な結合性相互作用を妨害する可能性が大きい。
加えて、伝統的方法はTSRを低下させる基質類似体を採用するので、阻害作用を妨害する。対照的に本発明の方法によって操作されたビヒクルは触媒反応性特性を有していない。このことは第２の主要な利点を生み出す：ビヒクルが非触媒反応性特性を有するため、本発明によって同定されるビヒクルはTSRを低下させることあり得ず、従って阻害効果に反作用的に機能することはない。
【００６６】
さらに、伝統的方法によって作製された阻害因子分子の結合性部分と反応性部分間で生じる相互作用間の複雑さの結果として、この伝統的な系の全体はあまり経験的なものではなく、動力学はより複雑化しており、研究がより困難で予測が難しく、従って効果的に結合する強力なペプチド切断酵素阻害因子を同定することがより困難である。対照的に、本発明の方法の基礎にある分離部位仮説によれば動力学がそれほど複雑化しておらず研究がそれほど困難でない単純化された系が可能である；予測はより効率的で、結合する強力なペプチド切断酵素阻害因子を同定することがより容易である。従って、本発明の方法はTSBおよびESBとにおいて生じる有利な結合を妨害しない様式でTSRを増大させる効果的な非触媒反応性（低kcat）ビヒクルを明らかにする。kcatが０であるのが理論的に最も好ましい状況であろうが、零ではない低いkcatも許容でき、特にペプチドコアの阻害的特性が１以上の置換基によって更に官能化されて補助されている場合は許容できる。
【００６７】
基底状態不安定化によって駆動される触媒反応の阻害
上述の議論は遷移状態触媒反応が酵素ターンオーバーの態様であることを仮定している。しかしながら、酵素の触媒反応の態様はこの代わりに基底状態不安定化でもあり得る（図１ｃ）。この場合も、本発明の方法はなお適用可能である。基底状態不安定化においては、酵素の基底状態が充分に不安定化されて、酵素の速度が触媒反応性であるように活性化エネルギーEaを低下させるが、遷移状態は低下しない。この例では、ESとTSとの差が減少する。これを達成するためには、TSBも低下しないためESBは一定に維持されなければならない。その代わり、ESRが上昇し、これが見かけの結合エネルギーを低下させ（Kmを増加させる）続いてESを上昇させ、それによって速度を促進させる。従って、固有結合エネルギーは結合から触媒反応へ翻訳され、従ってそのエネルギー（ΔGb）は不変である。この最後の特徴はMurphy(1995)によって基底状態不安定効果の特徴を定義づけるものとして述べられている。
【００６８】
基底状態不安定化を触媒反応の重要な形態として支持する優秀な議論が文献的に存在する。Jencks(1987)らによる論文ではES複合体の不安定化が触媒反応の全ての形態に本質的であると述べられている。不安定化の小さな変化は触媒反応の小さな変化には重要ではないが、速度の大きな増加には本質的であると述べられている。実際、遷移状態安定化は必要であるが速度増強には充分ではないことが示唆されている。
我々の知るところによれば、基底状態不安定化方法を利用した阻害因子を作製する方法は存在しない。これは一般的な文献では基底状態不安定化が酵素触媒反応の重要な機構と考えられていないからかも知れない。しかしながら、本発明の方法は原理的に遷移状態安定化、基底状態不安定化、またはその組合せによって作用する酵素を阻害する阻害因子を作製するために充分に融通性がある。どのようにして触媒反応性基底状態不安定化の中和が達成できるかは以下に論じる。
【００６９】
阻害を達成するために、本発明の方法の工程は強固に結合する非触媒性ペプチドコアを同定する（工程IからIII）。このペプチドコアは強固に結合するので、基底状態および遷移状態で結合中心における有利な接触を通して酵素の見かけの結合エネルギー増加を生じさせる。従って、ESBはESRが上昇するよりも多く低下する。これによりESの低下を生じさせることができ、これが不変または低下したKmへ翻訳される。その結果、原理的にはこの効果だけで、触媒反応が生じる場合、および通常の触媒反応のシナリオにおいてESが上昇する場合を相殺するであろう。ESBが低下するのでTSBも低下すると反論することができるかも知れない（ESBとTSB間の保存原理と一致する）。しかしながら、このペプチドコアは非触媒反応性であり、そのことはTSRが上昇したよりも多くはTSBが低下しなかったことを意味する。これはこのペプチドコアの固有の特性である。さらに、反応性部位を非触媒反応性ペプチドに付加することは、基底状態において遷移状態への移行を妨害する追加的効果を生じさせ得る。この場合も、阻害因子の結合性部分は反応性部分と分離して構築してあるのでこのペプチドコアの阻害的結合事象が反応性部分によって負に影響される可能性は少なくなっている。
ここまでの議論から、本発明は新規なだけでなく、この分野で従来文献的および実践的に一般に受け入れられてきたパラダイムによれば禁忌されてきたアプローチをとったものであることが明らかであろう。本発明の利点および経験的成功を以下の節で例示する。
【００７０】
第II部  本発明の方法
プロテアーゼはペプチド成分を含む基質の切断を触媒するタンパク質である。これらは普遍的に見出され色々な意味で一つのクラスとして切断酵素を代表するものであるから、本発明の方法を例示するために切断酵素の原型例としてプロテアーゼを用いる。
本明細書において用語「プロテアーゼ」は、短いまたは長い、いかなる長さであっても、ポリペプチドをペプチド結合にて、例えばペプチド結合の加水分解によって開裂させる酵素を言う。従って、プロテアーゼの基質はポリペプチドである。基質は天然に存在するペプチドであっても合成ポリペプチドであってもよい。大部分のプロテアーゼはポリペプチド内の一定のペプチド配列に対して特異性を示し、本発明は有効で特異的なプロテアーゼ阻害因子（ここでは「プロテアーゼ不活性化因子」と呼ぶ）を同定するに際してこの特異性を利用するように設計されている。「有効性」は強固な結合（低kI）を有する阻害として定義され、「特異性」は触媒反応を生じさせる酵素の立体配座（例えば遷移状態または基底状態）に対する最大相補性によって特徴付けられる。３つめの特性、「選択性」は標的プロテアーゼと他のプロテアーゼを区別することができるという阻害因子の特徴によって定義される。選択性はしばしば「有効性」および「特異性」の両方の自然な結果である。ときどき、短いポリペプチド（例えばペプチド）を切断するプロテーゼのサブセットを規定するために用語「ペプチダーゼ」がこの分野で使用される。しかし、本明細書においては用語「プロテアーゼ」は「ペプチダーゼ」を含むことが意図されている。
【００７１】
プロテアーゼの基質はBergerとSchechter(1970)の方法によって簡便に特徴付けおよび分類される（図２）。彼らはまずパパインの特異性を評価し、パパイン活性部位に７つのサブサイトがあること、そのうちの４つがアシル基側(S1-S4)にあり、３つは脱離基側(S1'-S3')にあることを示した。彼らの古典的な命名法を本明細書でも使用する。"S"位置は酵素のサブサイトを表し、それぞれのかつ相関する"P"位置はその特定のサブサイトに結合する基質残基を表す。切れやすい結合の切断事象は基質と酵素の間のP1/S1結合溝で生じ、基質のN-末端は最も高い番号のS部位に最も近く、基質のC-末端は最も高い番号のS'部位に近い。
【００７２】
本発明の方法によって同定されるプロテアーゼ不活性化因子はR1-(Xaa)n-R2という一般式を有する（式中、R1は随意の保護基、Xaaはアミノ酸残基、nは１〜９、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜６、更に好ましくは１、２または３、R2は随意のプロテアーゼ不活性化反応体である）。R1-(Xaa)nをコアまたはビヒクルと呼ぶ。不活性化反応体は以下の特徴を有する。第１に、それらは酵素が存在する場合に環境条件下でコアに対して不活性である。第２に、それらは酵素の存在下では活性化される。第３に、標的酵素に結合すると、それらは解離するよりも早く反応または結合する(Fersht、1985)。保護基は有機化学の技術分野でよく知られており、本発明はビヒクルまたはプロテアーゼ不活性化因子上の特定の保護基の使用に限定されない；実際、上記で述べたように、保護基の存在は任意である。保護基または保護部分には以下が含まれる：Z=カルボベンズオキシ；B=Boc=t-ブトキシ；Ac=アセチル；Suc=スクシニル（COOHおよびCH2CH2COがアミノ末端に付加されていても良い）；Mu=モルフィリン；MeOS=メトキシスクシニル；グルタリル=グルタル酸；D=天然に存在するLアミノ酸ではなく、D-アミノ酸；Nva-ノルバリン、Abu-アミノ酪酸のような非天然アミノ酸も使用することができ、フェニル基その他の使用することができる。
【００７３】
不活性化反応体の例は（文献的に一般に記載される「自殺反応体」も含まれる）には、フルオロメチルケトン(FMK)、クロロメチルケトン(CMK)、ジアゾメチルケトン、ビニルスルホン(VS)、ビニルスルホンフェニル(VSPまたはVSPh)、エポキシド(Ep)、ケトアミド(CONHまたはKA)、クロロメタン、CONH-CH2-ピリジルまたはCONH-ピリジル（KPy、KPyrまたはK）、CONH-4-モルホフェニル(KM)、CONH-エチル（KE、KCまたはKE2）、αケト酸(AK)、ミカエル受容体、ペプチドアルデヒド、アセトアルデヒド、ニトリル、ヒドロキシメート、シクロプロペノンおよびエポキシスクシンアミドが含まれる。
アミノ酸残基は天然に存在するアミノ酸でもノルロイシン、オルニチンのような非天然アミノ酸でもよい。それらはD-アミノ酸またはL-アミノ酸であってもよく、いかなる種類の誘導体または改変体も含まれ得る。アミノ酸はペプチド結合によって結合されていてもよく、エステル結合のような他の型の結合によって結合されていてもよい。それらは薬理的使用の特性を改善するために、α-アミノ酸でもβ-アミノ酸でもペプトイド（ポリアミド骨格のα-アミノ位置上の置換基の代わりまたはそれに加えてアミドN-部位に１以上の置換基を含む）またはペプチドの１以上の原始が異なる原子団又は置換基によって置き換えられたペプチド類似物であってもよい。ペプチドはどのような長さであっても良い。
【００７４】
プロテアーゼ不活性化因子の不活性反応体以外の部分は本明細書ではペプチドコアと呼ぶ。構造的にはこのこのペプチドコアはR1-(Xaa)n、または保護基が無い場合は単に(Xaa)nと表される（上記参照）。ペプチドコアは標的プロテアーゼ上の基質結合部位の１以上アミノ酸(SからS')と結合する１以上のアミノ酸（PからP'）を含む（図２）。
本発明の方法は、動物または植物にとって病原性の細菌、真菌および原生生物のような生物によって生成されるプロテアーゼ、またはその阻害が有用な目的に役立つであろうプロテアーゼの阻害因子を同定するために使用することができる。好ましくは、このプロテアーゼ不活性化因子は病原性生物または特定の疾病状態に特異的なプロテアーゼに対して選択的であり、標的とされない宿主のプロテアーゼを阻害しない。標的プロテアーゼは既知のプロテアーゼであっても未知のプロテアーゼであってもよい。
当業者であれば、プロテアーゼ、基質の既知の特徴および先立つ測定結果に依存して本方法の記載した全ての工程を行うことができ、あるいは１以上の工程は研究者の裁量により省略することができることを理解するであろう。例えば、ペプチド切断に関する一般的なスクリーニング（工程Ｉ）は良く特徴付けられたプロテアーゼの場合は省略することができる。同様に、候補基質のテスト（工程IV）またはプロテアーゼの天然の基質の切断を阻害する能力に関するプロテアーゼ阻害因子のテスト（工程VIII）は時間および資金が不十分であるなら省略することができる。なぜなら、この工程は有用な情報を生み出すが活性部位プロテーゼ阻害因子の究極的な同定のためには必要なものではないからである。
【００７５】
さらに、当業者であれば認識できるように、いくつかの測定が行われる順序は変えることができる。例えば、選択性調査（工程IX）は共有結合的に連結した不活性化反応体の阻害能を明らかにする工程VII、Ｂ部の直後に行うことができる。この場合、研究者は工程VII-Ｃ部における遷移状態アッセイまたは基底状態アッセイを行う時間と費用を掛ける前に潜在的阻害因子の選択性を評価したいかも知れない。以下の工程は例外なく行わなければならないが、どのような順序で行っても良く動力学的アッセイに限られない：工程II（基質切断スクリーニング）および工程III（競合アッセイ）。工程VII（遷移状態アッセイまたは基底状態アッセイ）は所望の時に行うことができる。
【００７６】
上述したように、本発明の方法は精製した標的プロテアーゼまたはプロテアーゼ活性を有する粗混合物である出発物質を用いて行うことができる。一旦粗混合物が特徴付けられれば、精製したプロテアーゼの代わりとして加えられることを除いて、精製した酵素と同じ様式で使用することができる。もちろん、入手可能であれば精製した酵素を出発物質として使用することが好ましい。以下に述べる手順は精製した標的酵素および粗混合物に等しく適用可能であることが言うまでもない；しかしながら、この実験プロトコルに粗混合物について示唆される改変、付加、欠失がある場合はそれらを記載する。使用する量は検出装置上でタンパク質分解的に検出可能な量である。
【００７７】
予備工程（工程P）：基質切断のための明確な、最適アッセイ条件の予備的決定
標的プロテアーゼによるタンパク質分解性切断のための最適環境はこのプロテアーゼの遷移状態阻害因子の同定に至る実験を行う前に確立される。これに関して、最適な活性部位触媒反応を可能とするpHおよび他のアッセイ条件（例えば温度、補助因子の必要性、およびバッファー条件）に関する情報または測定が有用である。加えて、そのプロテアーゼの機構的分類に関する一般的概念のような予備的な特性解析データが入手可能又は利用できるのならば、この情報は触媒反応の条件を最適化するのに役立つ。機構的分類の例には、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびメタロプロテアーゼが含まれる。
基質切断のための最適なアッセイ条件を決定するための予備的アッセイは標的プロテアーゼの代表的な基質を使用する。例えば、標的プロテアーゼがカテプシン-L様システインプロテアーゼの場合はZ-Phe-Arg-AFCのような代表的なエンドペプチダーゼ基質が使用され、プロテアーゼがセリンプロテアーゼと予測される場合はZ-Arg-AFCが使用される。AFCは発色団7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンを表し、これはペプチドから切り離されると蛍光を発する。あるいは、切断されると蛍光を停止させる発色団を代わりに用いても良い。他の適切な発色団にはパラ-ニトロ-アニリン(PNA)、7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC)、および7-アミノ-4-カルバモイルメチルクマリン(ACC)が含まれ、発色団の選択は以下によって決まるであろう：費用および合成の困難さ；蛍光検出のための波長；プロテアーゼとの共存性；および他の実用上の考慮。
【００７８】
標的プロテアーゼが精製プロテアーゼである場合、予備的アッセイにおける代表的な基質濃度は好ましくは飽和条件を保証するため酵素濃度の少なくとも50〜100倍高くし、非線形動力学的現象を誘導するかも知れない変数が入り込むのを防止するためμモル濃度範囲よりも低いことが好ましい。このアッセイにおいて、精製したプロテアーゼはアッセイバッファー中で飽和量の基質に加えられる。
標的プロテアーゼは「粗混合物」の一部であっても良い。この場合、予備的アッセイは以下で詳細に記載するように改変される。
【００７９】
Ａ．最適pHおよびpH範囲の決定
全てのアッセイ最適化のうち、標的プロテアーゼの最適pH範囲の決定は最も重要である。出発pH点は典型的には標的プロテアーゼの生物学的起源から推論することができ、または予め分かっていることもある。例えば、テニア属（Taenia）システインプロテアーゼはテニア属寄生虫のリソソーム（酸性環境）中に存在するので、0.4Mクエン酸塩、pH4.9（WO 00/63350）の酸性バッファーをプロテアーゼ活性調査に使用する。標的プロテアーゼのpHプロファイルはその活性部位クラスに代表的な一群の基質（例えば、プロテアーゼがエンドペプチダーゼである場合はエンドペプチダーゼ基質、プロテアーゼがアミノペプチダーゼである場合にはアミノペプチダーゼ基質、等）についてのpH範囲を測定することによって調べることができる。pH対活性曲線をプロットし、最も代表的な基質の最大切断についてpHを好ましくは1/100単位で決定する。異なる基質について最適pHの変動が観察される場合、典型的には、標的プロテアーゼの生物学的位置のpHにもっとも近いpHを後続の研究のための最適pHとする。好ましくは、このアッセイは最適pH±１pH単位、より好ましくは±0.5pH単位、最も好ましくは±0.1pH単位にて行われる。
【００８０】
Ｂ．最適な外的条件の決定
前述したストラテジーに類似のストラテジーに従ってプロテアーゼ活性を補助するために外来性構成要素が必要かどうかを決定することができる。例えば、システインプロテアーゼはしばしばその活性のために還元条件を必要とし、カルパインはカルシウムの添加により活性化され、メタロプロテアーゼは一般に活性化のために金属補因子を要求する。従って、標的プロテアーゼによる最適切断のための条件はプロテアーゼごとに異なりそれぞれ決定しなければならない。例えば、テニア属システインプロテアーゼのためには、代表的な基質Z-Pe-Arg-AFC（WO 00/6330）の切断条件を最適化するためにはアッセイバッファーに10mM L-システインを添加しなければならないことが明らかにされている。
【００８１】
Ｃ．最適インキュベーション温度
プロテアーゼ切断のための最適温度を決定するためにアッセイインキュベーション温度も変動させる。標的プロテアーゼがヒトに由来するのであればこの温度は典型的には37℃であり、これは大部分の酵素活性について生理学的な温度である。ヒトの寄生虫テニア属プロテアーゼについては、切断のための最適な温度は37℃であると決定されている（WO 00/63350）。
【００８２】
Ｄ．最適インキュベーション時間
アッセイにおける上記条件が明らかになったならば、最もよく切断される基質（「高kcat基質」として知られる）を個々に標的酵素とインキュベーションし、時間vs.切断プロットを作成することが有用であろう。反応の10％未満が完了する時間を将来の判断のために記録する。10％完了まで進行していない反応は典型的には基質濃度が飽和のままであり、従って以下で論じるように基質濃度が低下した場合に起こり得る濃度依存性多面的注意事項が避けられる。このことは後に行う動力学的評価を複雑にすることがある。従って、反応が進行しすぎて基質濃度が変化した場合は動力学的変数は信用できないかも知れない。
【００８３】
Ｅ．「粗混合物」中の標的プロテアーゼ
上述したように、標的プロテアーゼは精製した単離プロテアーゼであってもよく、粗混合物の一部であってもよい。「粗混合物」はその中に標的プロテアーゼが存在する生物学的構成成分の収集物又は寄せ集めである。典型的には粗混合物は未精製または部分精製された生物学的サンプルである。粗混合物を使用するアッセイにおいて、上述した最適触媒反応条件を明らかにすることは特に重要である。アッセイ環境をより「細かく調整」するほどそれらの規定した条件下で活性なプロテアーゼの数を狭める可能性が大きくなる。一群の基質切断のための最適な環境条件が決定されている場合でも、プロテアーゼのイソ型が存在する可能性がなお存在し、さらに１以上のプロテアーゼが与えられた条件で機能する可能性が存在する。しかしながら、１以上のプロテアーゼが与えられたアッセイ条件で最適に機能する場合であっても、触媒事象における生物学的機構がいくつかの保存されたパターンに従うということはあり得ることで、かつ、その可能性が高い。これは活性部位内部における類似した生物学的機構のために、規定したアッセイ条件下で１以上のプロテアーゼによる切断が最適であるという事実に基づいている。実際、異なるクラスのプロテアーゼについて活性部位レベルにおける重要な生物学的保存性がしばしば存在している。例えば、システインおよびセリンプロテアーゼはどちらも重要な遷移状態の一つにある基質との４面体付加体を利用する類似の機構で進行する（Kamphuisら、1984；Polgarら、1988）。
【００８４】
特定の環境にある２以上のプロテアーゼの機構が完全に保存されているかどうかを綿密な解析をせずに評価することは不可能である。しかしながら、特定の生物学的活性又は機構に束縛されるつもりはないが、与えられた環境条件にて作用する１以上のプロテアーゼの活性部位機構には実際に保存性があり、その活性部位に特異的な阻害因子はそれらのプロテアーゼの触媒反応事象を抑制するはずであるという仮定のもとにこれらの手順を進める。この仮定が完全には正しくないとしても、以下に概説する方法は一つまたはその他、または全ての活性部位に対していくらかのアフィニティーを有する阻害因子を生成することが期待される。実施例で明らかにしたように、精製プロテアーゼとそのプロテアーゼを含む粗混合物とについて同じ阻害因子（Z-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMK）が作製された。この議論は１以上のプロテアーゼが非常に特異的な環境条件において活性であることを仮定しているが、実際には規定された条件下で活性なただ一つのプロテアーゼを含む粗混合物が存在することがあり得る。
【００８５】
粗混合物中に存在するプロテアーゼについて最適な触媒反応環境を決定するための手順は上記で概説したものと同様であるが以下の任意的改良を行う。最適インキュベーション時間が決定されるまでは、典型的には長いインキュベーション時間（例えば、18〜24時間）を採用する。この手順はプロテアーゼの機構クラスについて何か知られているかどうかに依存して変動し得る。粗混合物中のプロテアーゼはその定義のとおり精製されていないので、以下に記載する予備的な活性最適化アッセイにおいて、用語「活性」は「プロテアーゼ」と互換的に使用する。
粗混合物はタンパク質およびタンパク質様物質を脂質、核酸および炭水化物のような他の細胞構成物から単離するために設計された方法を用いて生物学的サンプルから調製される。標的プロテアーゼの既知のまたは考えられる生物学的起源に依存して特定の技法が使用される。タンパク質の遊離のための多くの手法がこの技術分野で知られており、本発明は粗混合物を調製するための特定の方法に限定されない。例えば、テニア属プロテアーゼのプロテアーゼの場合、このプロテアーゼは周辺膜タンパク質であろうと考えられた。従って、この寄生虫を酸性バッファー中で激しく撹拌し、続いて遠心し、この結果、システインプロテアーゼ様活性（基質切断および阻害プロファイルに基づく）を上清中に遊離した（WO 00/63350）。一方、タンパク質が膜結合性であると考えられる場合、変性剤可溶化法を使用することができる。
【００８６】
所望であれば、粗混合物をさらに精製することができる。例えば、ゲルろ過のようなサイズ排除クロマトグラフィーにかけることができ、これにより粗混合物中の構成成分をサイズにより分離することができる。ゲルろ過媒体はBioSpra、Pharmaciaその他のようないくつかの業者から入手できる。例えば、タンパク質分解活性を含む粗混合物をゲルろ過カラムに装荷して分画することができる。上記で決定した切断のための最適条件を用いた画分調査を行って所望の活性を含む部分画分を検出することができる。場合により、広範囲の分離能を有するゲルろ過カラムを最初に使用し、次に（ゲルろ過レジンを交換することにより）最も適切な範囲にこのカラムを縮小することでこのプロテアーゼを部分精製することができる。活性が溶液中に溶解できない場合、別の部分精製ストラテジーが必要であろう。場合により、イオン交換または逆相クロマトグラフィーのような、標的酵素のさらなる精製を行うこともできる。
【００８７】
好ましくは、広範囲のpHを調査する。必ずしも必要ではないが、生物学的に興味のある酵素が由来する生物学的環境のpHに関する知見は役に立つ。プロテアーゼの機構的クラスが知られているまたは推測できる場合は、pH vs.活性プロファイルを１以上の代表的異質を用いて作製する。機構的分類が知られていない場合は、種々の機構的クラスを代表する基質についてpH vs.活性曲線を作製する。種々の機構的クラスについての可能な基質は以下の表に含まれる。例えば、可能な基質には、システインプロテアーゼについてはZ-Phe-Arg-X、セリンプロテアーゼについてはZ-Arg-AFCが含まれる（式中、Xは検出基である。例えば、Xは7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンである）。
【００８８】
種々の酵素に対する代表的基質の例
2004535560.tif 000002
【００８９】
pH vs.活性プロファイルの作製に続いて、この結果を検討して検出に使用するpH最適値および特異的基質を決定する。プロテアーゼの機構的クラスが知られていない場合、テストした種々の基質に関するプロテアーゼ活性の解析に関して評価および決定を行う。いくつかの異なる酵素活性が粗混合物中に観察されることがある；活性は種々の代表的基質について観察される切断によって明らかにされる。どの活性を調査のために選択するかは研究者の判断力に任される。例えば、特定の基質に対してもっと高い切断性を示す条件を選択することができる。一方、関心のある生物学的活性が特定のpHにおいて現れる例では、その特定のpHを選択してもよい。テニア属プロテアーゼの場合（WO 00/63350）、更なる研究のために選択された活性は、酸性pHにて観察された最も高い活性であった。これは関心のあるプロテアーゼがリソソーム、酸性オルガネラに局在していると考えられたからである。研究のために選択された活性は酸抽出の結果得られた上清に由来するものであり、最大活性はpH 4.9にて記録され、これはリソソームのpHに等しかった。
【００９０】
観察した特異的基質の切断に基づいて活性を選択した後、pH最適条件を改良することができる。pH vs.活性曲線において二重ピークが観察されるかもしれないことに注意する。これはしばしば重複酵素または同じ酵素の２つのイソ型を表す。ベル型の挙動から外れてそのようなピークが現れることは示したpHにおいて１以上の主要な酵素が作用していることを示すものである。
pH最適条件および一般的検出基質を同定したならば、粗混合物濃度用量曲線を基質切断活性について作製する。粗混合物を決定したpH最適条件にて特異的基質に濃度を増加させながら加える。続いて、各濃度におけるプロテアーゼの活性の時間経過を追跡する。活性を記録した濃度および時間を測定する。
外因性変数、最適インキュベーション温度および最適インキュベーション時間を精製した標的酵素について上述したように測定する。
【００９１】
工程Ｉ．好ましい切断パターンを同定するためのタンパク質基質の一般的スクリーニング
これは標的プロテアーゼの切断優先性の一般的情報を得るために本方法の最初またはもっと後に行うことのできる任意選択のスクリーニングである。より具体的には、このスクリーニングは、基質切断と関連する基質のP3、P2およびP1部位におけるパターンを明らかにするために使用される。このスクリーニングは典型的には基質として天然に存在するタンパク質を用いて行う。このタンパク質基質は最も一般的なスクリーニングを行うために全アミノ酸を含むことが好ましい。好ましいタンパク質基質にはアルブミンおよびインスリンが含まれる。プロテアーゼの天然の基質が知られている場合、このタンパク質を基質の切断のための資源として使用する。実施例１において、我々はヒト免疫グロブリンGをT.soliumシステインプロテアーゼによる切断をテストするためのタンパク質供給源として採用した。なぜなら、このタンパク質が切断の天然の標的として作用するかも知れないことが以前に決定されていたからである。タンパク質基質はプロテアーゼの予測される生物学的位置に基づいて選択することもできる。例えば、酸性システインプロテアーゼはアルブミンのような一般的な取込タンパク質を切断することが知られており、従ってアルブミンはシステインプロテアーゼのスクリーニングに使用することができる。好ましくは、質量分光測定を使用してタンパク質基質切断を追跡する。
プロテアーゼをアッセイバッファー中、予備的最適化アッセイにおいて決定した切断のための最適条件下でインキュベーションする。切断パターンを解析してプロテアーゼの切断優先性、すなわち位置P3、P2および／またはP1位置に頻繁に現れるアミノ酸またはアミノ酸クラスを決定する。切断が見られない場合、切断が観察されるまでプロテアーゼ濃度、反応条件および／または基質を変える。
【００９２】
工程II.  高および低kcat基質の決定
これは別のスクリーニング手順である。これにより標的プロテアーゼの最も効率的な合成ペプチド基質（高kcat基質）をin vitro で検出することが可能である。あまりよく切断されない基質（低kcat基質）も明らかにされる。
Ａ．合成基質のスクリーニング
このスクリーニング手順により標的プロテアーゼによって最も効率的に切断される合成基質が同定される。好ましくは、スクリーニングされる基質はトリペプチド、ジペプチド、および／または単一のアミノ酸を含む化合物であるが、所望であればより長いペプチドも使用できる。スクリーニングされる基質のN-末端は場合により（例えば、化学合成の結果として保護基で）誘導体化されていてもよく、好ましくは検出基が切断事象の検出を容易にするためにC-末端に付加されている。本方法は特定の保護基および／または検出基の使用に限定されず、同一または異なるC-末端上の検出基の代わりにまたはそれに加えて検出基がN-末端に付加されていても良いことは当然である。
【００９３】
本発明の方法によく適した検出基は7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(AFC)のような蛍光定量用の基であり、これは高品質蛍光測定装置によって検出することができる。本発明との関連では、蛍光定量基はペプチドコア（単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチドその他限定されない）に付加されている場合は非蛍光性であるが、切り離されると蛍光を発する基である。しかしながら、蛍光定量的検出はプロテアーゼ活性を測定できる唯一の機構ではないことに注意すべきである。実際、動力学的同位体効果（Cleland、1995）を含むいくつかの方法がこの技術分野で既に知られている。研究者の裁量によりいずれを選択しても良い；本発明は特定の検出基の選択によって限定されることは意図していない。実施例２において、P3-P1において種々の置換を有するAFC-結合モノペプチド、ジペプチド、およびトリペプチドをEnzyme Systems Products社(Livermore、CA)から入手し、切断してAFC基を遊離させ、次にこれを蛍光測定器によって遊離の分子として測定した（AFC光吸収：400nm；AFC放射光505nm）。AFC切断は利用できる蛍光測定器用に前もって作製した標準曲線に基づいてモル量に変換される。
【００９４】
研究者はペプチド基質の広いクラスについてスクリーニングするか、より限定されたペプチド基質のクラスをスクリーニングするかを選択することができる。20種類の天然に存在するL-アミノ酸を考慮すると、スクリーニングのために理論的に得られるトリペプチド、ジペプチドおよび／または単一のアミノ酸を含む化合物は8,420種である。そのような大きな数を扱う場合、マイクロアレイシステムや自動化装置のような高処理装置が利用できることの利点は明白である。しかしながら、こうした装置立てが利用できない場合、この完全な手順の全体を10x50mmのフリントガラス試験管（Fisher Scientific社から入手可能）、インキュベーター、および一般的な蛍光測定器または検出装置で極めて安価に行うことができる。
コストと時間により、しばしばより小規模の基質パネルがスクリーニングに使用されることになる。この場合、プロテアーゼの既知のまたは推定される機構的クラスの観点からこのプロテアーゼによって切断されるタンパク質の代表である基質を使用することが好ましい。標的プロテアーゼについての代表的な基質を選択するいくつかの方法がある。例えば、質量分光分析スクリーニングはP3-P1におけるどのアミノ酸の組合せが標的プロテアーゼによる切断に好まれるかに関する情報を与えるであろう。加えて、プロテアーゼの天然の基質が知られている場合、代表的な基質はその既知の基質の位置P1、P3および／またはP3のアミノ酸を解析し、対応する位置に同様な特徴（例えば、疎水性、極性、非極性）を有するアミノ酸をもつ基質を選択することによって予測することができる。加えて、標的プロテアーゼの活性部位クラスの観点から、ある位置にあるアミノ酸が好まれることが知られている、または観察されることがある。例えば、多くのセリンプロテアーゼはP1にアルギニンを好む。
【００９５】
どのくらい多くの基質を使用するかに関係なく、予備的アッセイにおいて決定した最適タンパク質分解条件を用いて、標的プロテアーゼを個々に入手できる基質と共にインキュベーションする。平衡状態に到達させるため、プロテアーゼを添加する前に基質をアッセイバッファー中で短時間（例えば、約20分間）プレインキュベーションしておくことが可能であれば有用である。プロテアーゼはあまり遅く添加してはならない。実施例２においては、エントペプチダーゼ基質Z-Phe-Arg-AFC（Z=C6H5-CH2-O-CO、N-末端用の保護基）はテニア属システインプロテアーゼの小さなライブラリー中でいくつかの他の基質よりも効率的に切断されることが決定された。この評価はAFC蛍光定量基の迅速な切断に基づくものである。
【００９６】
Ｂ．基質切断の動力学的パラメーターの評価
標的プロテアーゼが精製され定量されている場合、各基質の切断についてVmaxを計算するが、但し、プロテアーゼの濃度は既知であることを条件とする。kcatはVmaxの直接の関数であるので、これらの値はかなり迅速に決定される。例えば、AFCが検出基として使用される場合、kcatとVmaxはAFC基の遊離のキネティクスから計算する。結果は、標的プロテアーゼによる基質切断を動力学的に表したものである。（粗混合物におけるように）プロテアーゼの濃度が決定できない場合は、Vmaxのみを計算する。この評価ではKmは必要なく、典型的には計算されないことに注意すべきである。
【００９７】
Ｃ．高kcatおよび低kcat基質の同定
上記の結果に基づき、最も高いおよび低いkcatの値（または、プロテアーゼ濃度が未知の場合は、Vmax）を有する基質を同定する。高kcat基質は標的プロテアーゼのための検出化合物、および潜在的なペプチド結合コア（工程III）と阻害因子の競合のための供給源として使用する。
低kcat（又は低Vmax）基質は２つのクラスに分けることができる：結合せず、従ってターンオーバーされない基質、および、結合するがターンオーバーされず（非触媒反応性結合）おそらくは活性部位に固定される基質。後者の条件に従う基質はプロテアーゼ活性の潜在的阻害因子として注目される。なぜなら、それらは結合するが、ターンオーバーされるための生物学的特徴を備えていないからである。それらは活性部位へ「デリバリー」されるので、この観点から、以後、「ビヒクル」と呼ぶ。上記で議論したように、結合ビヒクルに重要な利点を与えるのはこの可能性である。なぜなら、ペプチドコアの設計目標は酵素／基質複合体(ESB)の結合エネルギーおよび遷移状態(TSB)の結合エネルギーを低下させるが、触媒反応的に結合するペプチドコアがするように遷移状態の反応エネルギーを低下させない基質を同定することだからである。第Ｉ部で強調したように、阻害因子によるESBおよびTSBの利用は本発明の方法の重要な利点であることを我々は主張する。
【００９８】
工程III.  阻害性非触媒反応結合基質の同定
この結合アッセイは低kcat基質の組について行い、非結合性基質を、結合するが非触媒反応性である基質から区別する。より具体的には、このアッセイにより、ESBおよび／またはTSBに非常に強固に結合するがTSRを低下させる効果を有しないことによって特徴付けられる酵素／基質を同定することを可能とし、従って、酵素の「結合」中心と「反応」中心は効果的に分離される。（思い出されるであろうが、ESRはESB、TSBおよびTSRと全く独立であり、従って、この議論ではあまり深く考慮しない）。
標的酵素によって僅かしか加水分解されない、または全く加水分解されず、さらに活性部位において本質的に結合特性を有するコアを同定することは本発明の固有の特徴である。このアッセイのために、核磁気共鳴または他の分光学のような非動力学的方法を使用して酵素-基質複合体内の結合を評価することもできる。しかしながら、本発明の最も簡便で好ましい態様としては競合結合アッセイが好まれる。
【００９９】
触媒反応を駆動する酵素の立体配座への強固な結合を示す低kcat基質を同定することに加えて、このアッセイは更に、非常に強固に結合しているので高kcat基質の切断を阻害する基質を選抜する。最終的な結果は、最も一般的なトリペプチド、ジペプチドまたは単一アミノ酸の組合せ（通常高kcat/Km比を有するもの）よりも動力学的により有利な様式で活性部位に結合することのできるトリペプチド、ジペプチドまたは単一アミノ酸モチーフの同定である。このアッセイの具体的な例は実施例３に与えてある。この工程によって同定される強固に結合する非触媒反応性基質は、本明細書においては「非切断性」または「非加水分解性」と称され、阻害因子または不活性化因子と称され、せいぜい僅かしか切断されない基質を代表し、非触媒反応的に標的プロテアーゼと結合する基質である。
【０１００】
第I部で述べたように、特定の酵素について遷移状態安定化が触媒反応を駆動する場合には、この工程で強固に結合した基質はESBにのみ結合しTSBには結合しないと反論されるかも知れない。従って、そのような結合であれば基底状態阻害を暗示するのみであろう。しかしながら、この工程の重要な特徴は、TSBにも結合することにより触媒反応に関与する高kcat基質に対してこの結合した基質は競合排除的であるということである。従って、この場合、結合競合性基質「ビヒクル」がそのような高kcat基質よりも有利に結合するのであれば、このビヒクルは最も強固な結合特性によって特徴づけられるであろう立体配座であるTSBにも結合するはずであると我々は断定する。従って、これが阻害の態様であろう。なぜなら、高kcat基質は遷移状態に最も強固に結合するのであるから。しかしながら、本発明の方法の範囲はこの仮説または本明細書に記載の他の仮説の理論的範囲に限定されない。
【０１０１】
多数の基質についてKmを決定することは、進歩した装置と広範な資源が入手可能でなければ非常に時間を消費する作業である。この問題を最小限にするため、このアッセイは、消耗的な資源および動力学モデリングを使用することなく、非常に低いKm値（または以下の工程においてはKi）を有する基質を迅速かつ効果的に選抜するために設計されている（実際のKmは決定しないことに注意せよ）。標的プロテアーゼに対して際だって強固なアフィニティーを有する基質の非常に大きな集団を迅速に解析することができる。
【０１０２】
標的プロテアーゼの潜在的競合阻害は２つの部分からなる手法により決定される。第１に、上位kcat基質の少数を含むカクテルよりもプロテアーゼにより有利に結合するであろう低kcat基質の最初のプールを同定する。アッセイのこの部分の目的は、高kcat基質のプロテアーゼ切断の低kcat競合基質による順位付けされた阻害を表す、よく差別化されたプロファイルを得ることである。ここでは阻害の定性的プロファイルが定量値を得ることよりも重要である。従って、より高いストリンジェンシーをこの競合アッセイに導入するような態様で、多様かつより高濃度の一連の高kcat基質によってカクテル用量を増加させる（多用量スクリーニング）。このようにして競合能に基づく低kcat基質間の差別化を増大させれば、プールの大きさが着実に減少するにつれて最も強固に結合するペプチドのみを選抜することが可能になる。
このように、カクテルの「用量」の増加の結果によるストリンジェンシーの増加により、最も高い阻害能を有する基質を選抜することが期待される。この方法は最初のプールから阻害性基質の集団を同定するための効果的な「フィルター」機構として働く。次に、この最後のプールをそのKi値（これは基質のKm値も等しい）について動力学的に評価することができる。
【０１０３】
Ａ．高kcatおよび低kcat基質の選択
評価した基質の全パネルのうち、最も高いkcat値を有する基質集団（典型的には上位１％）を「TOPカクテル」（上位カクテル）を構成するために選択し、最も低いkcat値を有する第２の基質集団（例えば、最下位から20％）を「BOTTOM基質」（下位カクテル）としてテストするために選択する。低kcat選択物は理想的には全く切断されない基質を含む。出発パーセンテージの選択は研究者が何を「高」および「低」と決定するかに主観的に依存し、実験結果に基づいて変動し得る。しかしながら、合理的な出発点は、高kcat基質についてはスクリーニングした全基質の上位１％にあるkcat値を示す基質を選択し、低kcat基質については最下位から１％にあるkcat値を示す基質を選択することである。記憶を呼び覚ますために述べるが、用語「ビヒクル」はTOPカクテルの切断を阻害することのできる低kcat基質の部分集団をいうために使用する（従ってこれらの基質は活性部位にデリバリーされる）。
説明のため、TOPカクテルが、kcatの大きくなる順に基質v、w、x、yおよびzを含むとする（zが最も高いkcat値を有する）。BOTTOMカクテル（低kcat基質の最初のプール）はkcatが大きくなる順に基質a、b、c、dおよびeを含むとする（aが最も低いkcat値を有する）。
【０１０４】
Ｂ．初期プールの解析
本実験は最初に最も低いkcat基質（すなわち、ａ）の阻害試験をTOPカクテルに対して開始し、次に２番目に低いkcat基質（すなわち、b）について行い、以下同様に行う。アッセイ条件は予備的最適化アッセイにおいて明らかにしたものとする。決定した最も低いkcat基質（すなわち、a）にアッセイバッファー中でTOPカクテルを加え、短時間（約20〜30分）の間平衡化させる。TOPカクテル中の基質のそれぞれは等しい濃度で存在しなければならない。次に、標的プロテアーゼを加える。aに加えて全てのBOTTOM kcat基質（すなわちb、c、d、e）を個々にかつ別々にTOPカクテルを阻害する能力についてテストする。テストする低kcat基質の濃度はTOPカクテル中の各基質のそれぞれの濃度と等しくなければならず、飽和条件を保証するため、それらの濃度は利用できる酵素の濃度の少なくとも50〜100倍であることが推奨される。例えば、低kcat基質、ａが１μMで存在する場合、カクテル用に選択される高kcat基質のそれぞれ（すなわち、v、w、x、y、z）は最終アッセイバッファー中でそれぞれ約１μMでなければならない。酵素の濃度が少なくとも100倍低いので（すなわち、酵素濃度は多分１pM）、飽和条件はなお満たされている。
【０１０５】
低kcat基質は競合阻害因子としてテストされるので、その結合定数はここではKiと表すこととし、一方、TOPカクテル中の個々の高kcat基質に対する酵素のアフィニティーはKmaと表すことにする（Kma=高kcat基質に対するKm値の平均）。KiおよびKmaは純粋に理論的なもので、ここで計算されるのではないことに注意する。これらのビヒクルの実際のKiは後になるまで決定する必要はなく、Kmaは全く計算する必要がない。実際、本方法においてこの段階でKiの計算の必要性がないことはかなりの時間と費用を削減する重要な特徴である。TOPカクテルとテストする低kcat基質は両方とも飽和量にあるため、このシナリオは[S]＞Kmaの環境として記述されるプロファイルIIを反映すると考えられ、従って、見かけの[ES]の結合エネルギーはE+Sの結合エネルギーよりも低いであろう。この方法の第１の部分の目的は、低kcat基質による阻害能の相対プロファイルを得ることである。ここでは定量的阻害に関しては何も強調しない。いくつかのシナリオが結果としてあり得る。
【０１０６】
シナリオＩ．低濃度の低kcat基質によるプロファイルII：このシナリオでは、標的プロテアーゼの阻害はいくつかの低kcat基質について観察され、低kcat基質についての阻害プロファイルはさらに解析すること無しに得られる。
シナリオII．阻害無し：ありそうもないことだが、最初のアッセイにおいてどの低kcat基質についても全く阻害が観察されないことがあり得る。理論に束縛される意図はないが、これは酵素が触媒反応事象に自身のP3-P1サブサイトを使用しないという異常な事例に帰属するのかもしれない。最初のスクリーニングで不満足な阻害しか得られなかった場合は、以下の３つの実験のいずれかまたは１以上を行うことができる（シナリオIIA、IIBおよびIIC）。
【０１０７】
シナリオIIA.  低濃度低kcat基質による、しかし、カクテル中の高kcat基質の数を減少させたプロファイルII：この実験では、低kcat基質およびカクテルの濃度に関しては同じアッセイ条件が維持されるが、元のカクテル中のkcat基質の数を減少させる。言い換えると、1.0％BOTTOMカクテルの代わりに、0.1％または0.2％カクテルのような低パーセンテージBOTTOMカクテルを使用する。このストラテジーが成功するならば、このカクテル中の高kcat基質の数の減少により阻害プロファイルが得られるであろう。シナリオIにおけるように、この方法の第２部分（２次用量スクリーニング）へ進む前に濃度を「固定」させることが重要である。
【０１０８】
シナリオIIB．高濃度の低kcat基質によるプロファイルII
この実験においては、基質濃度は飽和に維持されるが、テストする低kcat基質の濃度を増加させる。これを行うための方法の一例はカクテル中の全濃度の合計と同じ低kcat基質濃度を使用することであろう。上述した例に従えば、TOPカクテル中の高kcat基質が、５つの基質についてそれぞれ１μMで存在しているのであれば、低kcat基質の新たな濃度は５μMとなるであろう（この場合も、酵素濃度は低く、例えば1pMに維持される）。理論にとらわれる意図はないが、カクテル中の個々の基質の濃度がプロテアーゼに対してなお飽和していても([S]＞Kma)、プロファイルIIに従ってブラウン力学は低kcat基質と酵素との間のより大きな衝突を許すと考えら得る。この場合も、このストラテジーが成功するなら、低kcat基質の濃度を増加により阻害プロファイルが得られるであろう。
【０１０９】
シナリオIIC．低濃度の高kcat基質によるプロファイルＩ
ある場合には、TOPカクテル中の各構成成分の基質濃度が飽和していない（[S]＜Kma）プロファイルI-様シナリオへアッセイを移行させることが好ましいかも知れない。この場合は、テストする低kcat基質濃度は飽和に維持されるが、カクテル中の高kcat基質濃度は個々の基質に対する本来のKmより下に減少させる。本質的に、このアッセイはプロファイルII条件からプロファイルI様シナリオへシフトされる。この場合、[ES]の見かけの結合エネルギーはE+Sの結合エネルギーよりも高くなり、競合的低kcat基質による阻害の可能性が高まる。なぜなら、後者はなお飽和状態にあり、増大したブラウン力のためにプロテアーゼの活性部位により結合し易いからである。この場合も、低kcat基質のいくつかにより阻害的外観を有する明瞭な差別化パターン（阻害プロファイル）が見られるまで濃度を調整する。
最終的に阻害プロファイルが得られた場合、差別化された低kcat基質は更なる差別化のために二次スクリーニング（この方法の第２部分）に進ませ、標的プロテアーゼに対して何ら阻害を生じない低kcat基質は選抜プールから除去する。前に述べたように、阻害的でもある低kcat基質は、標的プロテアーゼの活性部位に実際にデリバリーされるので本明細書では「ビヒクル」と称する。[S]＞Kmaであるので、後の工程のために低kcat基質（ビヒクル）および高kcat基質の濃度を「固定」することが重要である。
【０１１０】
Ｃ．ビヒクルの２次用量スクリーニング
このスクリーニングアッセイにおいては、条件をよりストリンジェントにし、新たに発見されたビヒクルの各々の阻害能をより差別化することを可能にする。TOPカクテル中の高kcat基質の濃度を増加させる。例えば、最初の解析において１％TOPカクテルを使用したならば、今度は工程IIからのkcat値の上位２％にある全ての基質を含む、高kcat基質の２％カクテルを作製する。我々の実験によれば、カクテルパーセンテージの増加は低kcat基質間の阻害能の差別化を増大させることが示されている（実施例３）。上記の最初のスクリーニングから進んできたビヒクルをこの新たなカクテルにより再度その競合阻害能についてテストする。最初、それらの濃度は前述のプロトコルにおいて「固定」しておいた濃度と同一に設定する。カクテル中の各高kcat基質の濃度も維持する。この新たなカクテル中への新たな基質の添加は１％カクテルにおける各構成成分の濃度と等価でなければならない。言い換えると、このカクテルは等しい濃度の追加の基質が混合物に加えられることを除いて前のように調製しなければならない。例えば、元のカクテル中の各構成成分の濃度が１μMであったなら、この混合物へのその後の新たな添加も１μMでなければならない。シナリオIIに記載した実験の一つにおけるように阻害プロファイルが得られていたならば、開始濃度は「固定」しておいた濃度と同じとするが、但し、カクテル中の基質構成成分の数を増加させる。この条件は上述の４つの全ての場合に適用される。
【０１１１】
原理的には、ビヒクルと１％カクテルとの間よりもビヒクルと２％カクテルの間に、より強い競合が期待される。なぜなら、標的プロテアーゼにとって有利な高kcat基質のより多くの組合せが衝突に利用できるからである。
ここで、ここまで進んできたビヒクルについて、場合によりビヒクル阻害指数(V)を決定する。これは、阻害能Pに阻害の維持Mを乗じたもの、従ってV=P*Mである。Pは上位カクテルの存在下におけるパーセント阻害に等しく、Mは最後に使用したカクテルの存在下におけるパーセント阻害に等しい。この例では２％カクテルとなろう。V値が高いほど、阻害が大きい。我々は実験の中で（実施例３）、V値はカクテルの結果として阻害を測定する簡便な方法を提供することを述べた。ビヒクルを種々の階層に帰属させることはかなり簡単になる。例えば、実施例３において、我々はZ-LLL-AFC、Z-LLY-AFCおよびMu-LY-AFCの精製プロテアーゼ阻害のV値はそれぞれ0.582、0.552および0.452であることを見出した（Pに関しては最初のカクテルを用い、Mについては最後のカクテルを用いた）。このグループはビヒクルの第１「階層」を規定する。第２「階層」において、我々はB-VPR-AFC、Z-SY-AFC、Z-RR-AFCおよびB-LGR-AFCをV値がそれぞれ0.116、0.09、0.09および0.07に等しいことによって特徴付けられることを見出した。２つの階層間の断絶は明瞭に識別可能であった。この式の有用性は、順位付けが非常に簡単、単純かつ迅速になることである。また、単にビヒクル阻害効率の定性的測定として使用されているだけだが、さらに「堅牢さ」の測定も実施例３で参照されている。
【０１１２】
さらに、我々はT.soliumシステインプロテアーゼのビヒクル阻害に関する実験において（実施例２）、阻害能の低いビヒクルは低いV値によって特徴付けられ、従って、高阻害能を有するビヒクルに比較して阻害能を失い易いことに気が付いた。定性的な観点から、より高い阻害能を有するビヒクル（すなわち、M-LY-FMK）において阻害の堅牢さが大きいことにも気が付いた。
このスクリーニングは低kcatビヒクル間の更なる差別化レベルを提供する。典型的には、初期スクリーニングにおいて上位の阻害を生じさせたビヒクルの相対阻害プロファイルは同じものが維持されるが、阻害能の低いビヒクルは以前の阻害値を失う。この工程を行う場合、高いV値を有する上位階層阻害性ビヒクルが３次用量スクリーニングへ移される。
【０１１３】
Ｄ．ビヒクルの３次用量スクリーニング
この工程では、TOPカクテルの濃度を再度増加させる。現在使用している例に従えば、２次用量スクリーニングから進められたビヒクルを、３％カクテルを用いてプロテアーゼ活性部位と競合させる。適切な濃度の選択に関して上述した同じ注釈がこのスクリーニング手順にも適用される。ビヒクルの選択基準について述べておかなければならない。標的酵素による高kcatカクテル中の構成成分切断の阻害は主要な選択基準である。従って、この時点でビヒクルのkcat変数にはあまり重要性が置かれず、阻害能（低Kiと等価であろうが、％阻害として測定される）により多くの重要性が置かれる。例えば、ａおよびｂが最も低いkcat基質であって、aはbよりも低いkcatを有している場合、ｂのkcat値がaのkcat値よりも高いにもかかわらず、その競合阻害能がaより高いためにｂが選択されることがあり得る。この場合も、順位付けはカクテルに対する標的酵素切断のパーセント阻害に基づき、典型的にはV値によって決定され、kcat値にはよらない。研究者によって選ばれる裁量的数字に基づき（例えば、最下位20％）、阻害に使用する低kcat基質は相変わらず工程IIスクリーニングの下位パーセンテージ内にある筈である。
理想的には、これらのkcat値は工程Iスクリーニングにおいて低kcatビヒクルの大部分が類似のkcat値を有するくらい非常に低いであろう。このスクリーニング方法の要点は、kcat値の相違にかかわらず最も低いKiを有すると予想されるビヒクルを同定することである。
【０１１４】
Ｅ．ビヒクルの最終用量スクリーニング
必要により、または所望により、ビヒクルのさらなる用量スクリーニングを行う。高kcat基質のパーセンテージカクテルを漸次増加させ、前の工程から「進級」したビヒクルに添加する。これにより阻害能の低いビヒクルを排除する手段が提供される。目的は、高度に切断性の基質による競合を増強させても同じビヒクルは類似の阻害パターンを与えるというデータプロファイルを得ることである。言い換えると、カクテル構成成分が増加しても一貫して酵素を阻害するビヒクルは主要な阻害因子候補として進級させるべきビヒクルである。より高いストリンジェンシーでスクリーニングを続けると、前の工程で阻害性であったビヒクルは阻害パターンを失い、最も堅牢なビヒクルが残る筈である。従って、実際にKiを測定することなく、ビヒクル阻害能を差別化し順位付けできるカクテルパーセンテージが達成されるまでカクテル添加を続ける。
【０１１５】
研究者は低kcatビヒクルのリストがカクテルの標的プロテアーゼによる切断の阻害因子として矛盾無く順位付けできたという確信が得られたならばスクリーニングを停止する。この選抜は所望であれば全8,420種の可能なビヒクルの組合せという最初の出発点から迅速かつ効果的に行うことができる。最終的なリストは１％、２％、３％カクテル等における一貫した阻害プロファイルに基づくビヒクルの順位付けである。この順位付けされたビヒクルの上位10％（または別の任意のパーセンテージ）を次の工程におけるKi計算のために選抜する。
【０１１６】
Ｆ．最も阻害性であるビヒクルのKi値の決定
取り扱い可能な候補ビヒクルの組が同定されたなら、この分野において既によく記述された伝統的な動力学的モデリング法によってKiの決定も行うことができる。典型的には、良好なKiを得るためには阻害濃度は実験的にKiの0.5〜５倍に変動させる。従って、Kiの決定は、ビヒクルを阻害因子であるかのごとく取り扱い、カクテルおよびカクテルの個々の構成成分を基質であるかのごとく取り扱うことによって行う。基質の平均濃度は飽和レベルに維持しなければならない（Kmの50〜100倍）。プロテアーゼの基質としてカクテルを使用するかカクテル中の個々の高kcat基質を使用するかに関係なく、競合阻害因子としてのビヒクルのKi値は全ての基質に対して類似する筈である。なぜなら、標的プロテアーゼに対する阻害因子のKiは阻害因子および活性部位の関数であり基質とは独立だからである。
Kiの導出は非線形フィッティングによることが推奨されるが、非線形コンピューターモデリングを利用することができない場合は、イーディーホフステー、ヘーンズ、およびコーニッシュ-ボーデンのような適切な方法による導出を使用することもできる。最初の方法については増幅された非線形性の誤差の可能性が大きくなること、および最後の方法については低濃度におけるデータ解釈の誤りと速度の遅さ故に、これらのプロットは非線形法よりも好まれない。ラインウィーバー・バーク法の２次プロットも使用できるが好ましくはない。しかしながら、古典的ラインウイーバー-バークプロットは本方法においてこれらのまたは他の動力学的測定には通常使用しない。この計算法の簡便な特徴は、阻害因子について決定されたKi値は基質として使用された場合のビヒクルのKm値と等価でもあるという点である。
【０１１７】
Ｇ．最終的な順位付け
この工程は候補阻害ビヒクルの順位付けをもって終わる。Ki値が低くなるほど、そのビヒクルに割り当てられる順位は高い。Ki決定は最終的な順位付けの基礎である。この時点で、基質の初期パネルは阻害能を有するいくつかの低kcat/Km候補へ絞られている。このアプローチの利点は、大量フィルタリング計画を実行するまでKi決定が延期されることであって、それによりビヒクルのこのような順位付けが非常に効率的になる。
【０１１８】
Ｈ．工程IIIの理論的利点
以下はこの工程の利点を簡単にまとめたものである。より詳細な考察は第Ｉ部に述べた。第１に、同定されたビヒクルはESBおよびTSBとの強固な結合によって特徴付けられる。高kcat基質がこのビヒクルによって強く競合されるという事実は、このビヒクルがESBに結合するだけでなく、TSBにも結合するという有効性を示すものである。第２に、このビヒクルはTSBおよびESBに結合するが、低kcatによって特徴付けられ、従ってこのビヒクルはTSRと全く相互作用しない。従って、このビヒクルにおいてTSBおよびESBは効率的にTSRから「分離」され、このことはESの結合中心と反応中心は別個であることを示唆しており、「分離-部位」モデルと矛盾しない。従って、第２の主要な利点は、後の工程（工程VII）においてTSR上昇性反応部位をこのビヒクルに実験的に付加することは、このビヒクルがTSBおよびESBと共有する正の結合性相互作用を妨害しそうもないということである。なぜなら、結合性と反応性はこのビヒクルにおいては「分離」されているからである。第３に、このビヒクルの非触媒反応特性のために、このビヒクルはTSRを低下させることはできず、従って、阻害に対して反作用的な状況を生成しない。本方法の第４の主要な利点は、「分離-部位」様仮定への単純化であり、これによってキネティクスがあまり複雑化しておらず、研究するためにあまり困難でなく、予測がより効率的であり、結合性で強力なプロテアーゼ阻害因子の同定がより容易であるような単純な系が可能となる。
【０１１９】
Ｉ．更なる観察結果
１．緩慢に結合するビヒクル
ゆっくりとした結合現象は、可逆阻害因子のキネティクスには典型的には従わない強固に結合するビヒクル阻害因子に関連している。これらの例においては、酵素-阻害因子と酵素との間の平衡は非常に緩慢に達成され、従って定常状態が観測されるまでに少なくとも数秒または数分を要する。それらの非共有結合的相互作用にもかかわらず、ゆっくりと結合する阻害因子の酵素に対するアフィニティーは非常に高いのでごく少量でも標的酵素を阻害するであろう。従って、非常に強固に結合する阻害因子は[EI]形成に関して低い速度定数を有し、このことは阻害の速度の遅さがキネティックモデルにおいて明白となることを意味する。しかしながら、あまり強固に結合しない阻害因子も緩慢な結合を示すことがある。ゆっくりと結合するビヒクルはこの分野で知られたいくつかの動力学的モデル（SzedlacsekとDuggleby,  1995）によって解析することができ、これによって、数は限られるが、この現象をしばしば区別することができる。
【０１２０】
２．P3-P1を含まない基質結合
プロテアーゼの活性部位に結合する残基はP5からP4'の範囲であり得ることが知られているが（BergerとSchechter, 1970）、サブサイト位置P3からP1は結合の最も可能性の高い候補であり、従って、本発明の方法において解析のために最初に選ばれる。しかしながら、標的プロテアーゼが結合のためにP3-P1部位を使用しないことがある。どのビヒクルについても阻害が見られない場合は、このライブラリーを改善してP3-P1以外の部位をスクリーニングすることができる。例えば、トリペプチドコアを使用して、P1'-P3'部位またはP2-P1'部位等のような他の三つ組をスクリーニングすることができる。必要であれば、基質ライブラリーを用いて、基質のいくつかの異なる部分を結合についてスクリーニングすることができる。
【０１２１】
３．アッセイの実行可能性
ａ．飽和を達成するために基質またはビヒクル濃度のいずれかをミリモル濃度に上げなければならない場合、イオン強度効果、非特異的結合、および行き詰まり阻害が誤った動力学的結果を生じさせることがある。
ｂ．Kmの10倍という基質濃度は酵素を飽和させるのに充分でないことがある。従って、プロファイルIIの場合におけるように飽和条件が要求される場合、Kmの10倍よりも高い基質濃度、好ましくはKmの50倍、より好ましくはKmの100倍の濃度を使用しなければならないことが示唆される。
ｃ．試薬のコンタミネーション、基質阻害、または定常状態効果も非線形効果を生じさせることがあり、これらから保護しなければならない。
ｄ．高kcat基質は（外因性活性化成分がそうであるように）酵素の活性化に働くことがあり、動力学的結果の解釈を複雑化させる。
粗混合物に対する工程IIIは精製プロテアーゼいついてのように行うが、但しkcatの代わりにVmを使用する。
【０１２２】
工程IV：天然阻害試験
ここでは天然基質の切断を阻害する能力についてリード候補ビヒクルをテストする。実施例４においては、T.soliumシステインプロテアーゼに対するリードビヒクル、suc-Leu-Tyr-AFCは、ウエスタンブロット解析によって示したように、このプロテアーゼの本来のヒトIgG切断を阻害する能力によって特徴付けられた。
標的プロテアーゼの生物学に基づき、そのプロテアーゼによる切断の標的であると期待されるかも知れない天然基質を選択する。例えば、プロテアーゼがリソソームに局在する場合（例えば、システインプロテアーゼ）、標的基質分子にはリソソームに輸送される分子（例えばアルブミン）が含まれるであろう。プロテアーゼが生理学的膜を分解すると疑われる場合は（例えば、コラゲナーゼ活性）、コラーゲンを天然基質として選択することができる。好ましくは、その速度故に切断反応の解析には質量分光解析を用いる。プロテアーゼがビヒクルの存在下にあるときに天然基質に対する一般的切断点が消失することは、そのビヒクルの能力の証明である。
この情報は潜在的な使用者のために順位付けした阻害因子の能力に更なる定性的特徴を付加することを意図したものにすぎず、ビヒクルの昇格または順位付けのための選抜基準として役立てるつもりではない。従って、この工程は任意的なもので時間と資源が入手できる場合にのみ行うべきであろう。
【０１２３】
工程V：遷移状態特性を明らかにするための非触媒反応性ビヒクルの評価
この工程は任意的なものだが、ここでは新たに同定された最良のペプチドコアを遷移状態結合への関与能力についてスクリーニングする。この特性は結合発色団の化学構造およびペプチドコアの化学構造の変化による効果を観察することにより評価することができる。後で２番目に最良のペプチドコアまたは他のペプチドコアを使用することを決定した場合、それらもまた遷移状態特性についてスクリーニングすることができる。コアは強固な結合アフィニティーを有しており、ESのみを低下することに関与する可能性が最も高いので、コア自身は遷移状態結合に関与しそうもない；しかしながら、確かにTSBに関与することが明らである化合物がいくつか同定されるかも知れない。すなわち、このコアはTSBにおいて強化される結合を形成することがある。遷移状態評価を行うための方法は本質的には以下の工程VII(C)に記載した方法と同一であり、従って、より詳細な説明はその節のためにとっておく。本質的には、Kiは既知だがkcatは非常に低く正確なkcat/Kmを提供できない阻害因子であるかの如くこのビヒクルを扱う。本発明のこの工程は、各阻害因子および相同なペプチド系列（阻害因子系列と呼ぶ）におけるその同一-発色団類似体について、異なる発色団に結合したペプチドの同じ系列（並行系列と呼ぶ）のそれぞれの代表的メンバーから効率的にkcat/Km値を借用する。後者の系列の各メンバーは少なくとも僅かに切断されることが知られたものとする。これにより、並行系列のそれぞれの対応するメンバーのそれぞれの類似Km/kcatに対して阻害因子Ki値をプロットした、阻害因子Ki値の系列間プロットが可能になる。
【０１２４】
最初に、異なる検出基を保持する類似基質の新たな系列を得る、または合成する。例えば、Z-Leu-Leu-Leu-AFCが試験ビヒクルだとすると、類似基質はZ-Leu-Leu-Leu-X（式中Xは7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC)のような別の不安定な検出基である（工程VIIにおけるのと異なり不活性化反応体ではない））とすることができる。新たな基Xは、好ましくは元の蛍光発生基よりも不安定であり、Xの切断は検出可能な事象である。本手順のこの部分は、ペプチドコアがその性質により触媒反応に至らないので挑戦的である。類似基質を設計する際に広範囲の種々のX基を利用することは有用であり、非常に高感度の検出装置の利用も有用である。上述の例では、選択されるXはAFCよりもZ-Leu-Leu-Leuから切り離されやすい基である。
【０１２５】
第２に、ビヒクルおよび新たに合成した基質のペプチドコアの個々の残基をペプチド中の単一の位置について変化させる（例えば、Leu-Tyr-AMCコアについては、Pro-Tyr-AMC、Phe-Tyr-AMC、Ile-Tyr-AMC、Val-Tyr-AMCその他をそれらのAFC類似体と並行して評価することが出来る）：これらの類似体系列が遷移状態をプロービングするというのが理論である。工程VII(C)において後述するように、ビヒクル（ここではAFC-結合ペプチド）のlog(Ki) を、それぞれの対応する相同な基質（ここではAMC-結合ペプチド）の（この工程で測定しておいた）log(Km/kcat)値に対してプロットする。好ましくは、この系列間プロットは１ダースかそれ以上のデータ点を含む。データ点はプロット上で拡散して分布するであろうが、次にこれをラインフィッティング操作にかけ、少なくとも一つ、より一般には３以上の同一でない、共存する直線を明らかにする；各点は明らかにした線の１以上に割り当てられるかも知れない。統計的ラインフィッティングアルゴリズムのいずれを用いても良い；それらはこの分野において一般に知られたものである。各線について、回帰値（相関値としても知られる）Rに傾きを乗じて、工程VIIで更に説明および考察するように、以下の式を用いて遷移状態スコアを得る。
【０１２６】
2004535560.tif 000003
式中、
R=回帰値
M=傾き
P=線上の点の数
X=選択した不活性化反応体
【０１２７】
Pは阻害機構の評価には重要ではないので、Pの使用は任意である。m=1である場合（律速段階阻害が明らかにされる、極めてありそうもない場合）、０除算を避けるため、１の代わりに0.99を使用すべきである。
最も高い遷移状態スコアを持つ線は1.0に近い傾きをもつ線であることが期待される。なぜなら、これが切断工程に関する遷移状態類似体間の理想的な関係を表すからである。遷移状態スコアが高いほど、結合事象がビヒクルの遷移状態で生じる可能性が高い。さらに、遷移状態において相関が無い場合、基底状態における相関を調べる。工程Vにおいて、素混合物は精製プロテアーゼについて使用する方法と同一の方法で取り扱われるが、ただし、Vmをkcatの代わりに使用する。従って、Km/Vm対Kiをkcat/Km対Kiの代わりにプロットする。
【０１２８】
工程VI.  ビヒクルの選択性調査
この工程は任意的であるが、この工程において、選択した上位ビヒクルを、他のプロテアーゼパネルとの比較において、同じおよび多様な活性部位機構クラス内で標的プロテアーゼのみを阻害し得る能力について調べる。好ましくは、全プロテアーゼクラスを代表する種々のヒトプロテアーゼを選択すべきであり、これにはシステインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、その他が含まれるが、より小さなパネルを使用することもできる。これらのプロテアーゼの数が多いほど、本方法はより汎用性となる。これらのテストに使用する基質は（この場合も上位ビヒクルがテストされる）、各々がそれぞれのプロテアーゼクラスの代表でなければならない。例えば、Z-Phe-Arg-AFCがシステインプロテアーゼの代表的な基質であり、Z-Arg-AFCはセリンプロテアーゼの代表的な基質である。このアッセイを行うため、テストするビヒクルはその推定Ki値よりも数倍大きい濃度に設定され、その結果このビヒクルは可能な限り最大阻害（理想的には100％）に近く標的プロテアーゼを阻害する。これはビヒクル／酵素複合体の見かけの結合エネルギーが酵素およびビヒクルそれ自体のエネルギーよりも大きい（従って、[I]＞Ki）と期待される、プロファイルIIの例である。このテストのための基質は、同定した標的プロテアーゼのクラスに基づく。例えば、標的酵素がシステインプロテアーゼである場合、Z-Phe-Arg-AFCがこの最初のテストに使用する適切な基質であろう。
【０１２９】
プロテアーゼ、ビヒクル、および代表的な合成基質添加のための首尾一貫した条件がアッセイ間で維持されるのが好ましい。プロテアーゼはアッセイ混合物に最後に添加される構成成分である。標的プロテアーゼのみを選択的に阻害するビヒクルが注目され、選択性順位が確立される。理想的には、この選択性順位は工程IIIで得られたビヒクル順位と類似する。
いずれにしろ、各ビヒクルは最終阻害因子分子の部分に過ぎず、このペプチドコアに不活性反応物質を付加することはこのビヒクルに選択性を与える可能性をも有しているので、この選択性順位はビヒクルのいずれかを排除するための基準として働かせることを意図したものではない。そうではなく、この工程は、本方法中のこの時点において、ビヒクルについて選択性情報を与える「チェックポイント」として役立つ。
【０１３０】
工程VII.  潜在的に「強力な」遷移状態ビヒクルを形成するビヒクル／プロテアーゼ不活性化因子の合成および収集
工程VIIは任意的であり、一般的なプロトコルは例えば工程IIの後に使用してもよく、全く使用しなくてもよく、または効果的な阻害ペプチドコアの非-ペプチド類似体を用いて行っても良い。
これまでに、１以上の低kcatビヒクルであって、同時に酵素活性部位において基質結合（我々の例においてはP3-P1を使用する）に関する可能な最も低いKi値を有するビヒクルを迅速かつ効率的に決定するために排除基準を採用してきた。従って、これらのビヒクルは、これらがプロテアーゼ結合位置(S3-S1)と複合体を形成した場合に、プロテアーゼ結合位置(S3-S1)について可能な最も低い見かけの結合エネルギー状態を示す。いくらかの選択性情報も他の基質の集団と比較した標的プロテアーゼに対するビヒクルの優先性によって集められている。更に、工程Vにおける遷移状態スコア解析の結果に依存して、これらのビヒクルが非共有結合性かつ部分的な遷移状態特性（酵素機構が多数の中間体遷移状態を含む場合には特に顕著であろう）を有していることさえあるかもしれない。いずれにせよ、これらの基質は低い見かけの結合エネルギー状態[EV]を有する「ビヒクル」であることがここで証明される。これは遷移状態阻害と首尾一貫した様式で活性部位を強力に拘束することのできる反応性中間体（「不活性化反応体」）を設計しデリバリーするために使用し得る特徴である。不活性化反応体は可逆的または不可逆的に標的プロテアーゼに結合することができるが、多くの応用例において不活性化反応体は標的プロテアーゼに不可逆的に結合することが好ましい。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。例えば、システインおよびセリンプロテアーゼの一般的な遷移状態類似体は永久四面体付加体を含む。従って、この工程の焦点は、ビヒクルに遷移状態特性を与えることができ、阻害因子全体が極めて低いKi値によって特徴づけられる様な不活性化反応体を同定することである。単一化合物中のビヒクルと不活性化反応体の組合せを本明細書では「プロテアーゼ不活性化因子」と呼ぶ。遷移状態特性を有するプロテアーゼ不活性化因子は「遷移状態プロテアーゼ不活性化因子」またはTSPIと呼ぶ。
【０１３１】
ビヒクル上のP1アミノ酸のC-末端へどの不活性化反応体を連結させるかの選択は自由裁量的であり、同定したプロテアーゼの機構が保存されていると予測されるか否かに基づく。例えば、四面体付加体が律速段階として重要である場合（例えば、システインおよびセリンプロテアーゼ）、親核性または親電子性攻撃（分子に依存する）によって四面体律速段階を模倣できる分子が好ましい。実施例１において、我々は活性部位と四面体付加体を構成することが期待されるフルオロメチルケトンおよびビニルスルホンを使用した。しかしながら、フルオロメチルケトン、クロロメチルケトン、ジアゾメチルケトン、ビニルスルホン、エポキシド、ケトアミド、クロロメタン、ミカエル受容体、ペプチドアルデヒド、エポキシド、アセトアルデヒド、ニトリル、ヒドロキシメート、シクロプロペノンおよびエポキシスクシンアミドのような、候補上位ビヒクルに結合させるための優れた親核性および親電子性化合物が商業的に入手可能である。これらはEnzyme Systems Products社を含むいくつかの業者から入手できる。
【０１３２】
工程IVにおける強固に結合するビヒクルの選抜は高度に反応性の不活性化反応体の必要性を低減するはずである。高度に反応性の不活性化反応体は生理的な系に毒性効果をもたらすことがあり得るので、これは特に薬剤設計にとって有益である。例えば、フルオロメチルケトン(FMK)は実施例５において標的システインプロテアーゼの阻害のために重要である。しかしながら、FMKはフルオロクエン酸代謝物を遊離するために潜在的毒性を保持していることが知られているので最終的な薬剤化合物の部分としては好ましくない。従って、多様な不活性化反応体（そのいくつかは高度に活性であり、いくつかはそうではない）がビヒクルに連結させるために選択される不活性化反応体の集団に含まれるべきである。強固に結合するペプチドコアがすでに阻害のための機構を提供していることを考慮すれば、高度に反応性ではない不活性化反応体を選択することが好ましい。酵素が存在しない場合に不活性である阻害因子を選択することはより重要である。過剰投与または不適切な診断があった場合の安全性を増すために、可逆的にプロテアーゼを阻害する不活性化反応体を含めることも好ましい。生理的に心配なことは、不可逆的結合のために毒性副作用が競合阻害因子によって逆転できないことである。これは特に骨粗鬆症、アルツハイマー病、癌または関節炎のような疾病および異常の長期治療における阻害因子の使用に関する問題である。
【０１３３】
しかしながら、この分野の何人かの著者（McKerrowら、1999）が、不可逆的阻害から生じる毒性は、微生物感染の場合のように短期治療が必要とされる場合はあまり心配ないと述べている。もちろん、不可逆的阻害因子の利点は、標的活性部位の共有結合修飾は永久的で強力であって、従って、打ち消されることがない点である。さらにまた、言われている不可逆的阻害因子の毒性は、本明細書におけるように、設計モデルが高度に特異的かつ結合性の阻害因子（すなわち、ペプチドコアは極めて選択性で強固に結合する）を作製するように設計されている場合にも問題にはならないであろう。さらに、これらの阻害因子はその強力さ故に、低い、非毒性の用量で有効なはずである。従って、不可逆的薬剤が好ましい場合があり、従って、この決定は疾病の生理および体内における阻害因子の予想される代謝に依存すべきである。これらの毒性に関する懸念は、化合物を後に薬剤発見パイプラインにおいて薬剤へと最適化するときにより切迫したものである。好ましい阻害因子の型（すなわち、可逆的か不可逆的か）に対する単一の答えはないが、科学界における一般的な選択は可逆的阻害因子に対するものである。しかしながら、いずれにしろ、本発明はいかなる特定の不活性化反応体の選択または相対的可逆性に限定されないことは当然である。
【０１３４】
この手順の最初の工程は上位ビヒクルと種々の不活性化反応体を連結させることである。この手順の第２の部分では、各新たに合成したプロテアーゼ阻害因子について、標的プロテアーゼの100％阻害を達成するために必要とされる阻害因子濃度(EC100)を決定し、潜在的な遷移状態プロテアーゼ不活性化因子(TSPI)候補の順位表を作製する。この手順の第３の部分では、これらの候補のどれが実際に遷移状態プロテアーゼ阻害因子(TSPI)であるかを明らかにし、TSPIの最終的な順位表を作製する。プロテアーゼ阻害因子の作用態様が基底状態触媒効果の阻害である場合、最良の基底状態プロテアーゼ阻害因子を選択することになる。
【０１３５】
Ａ．不活性化反応体のビヒクルへの共有結合性連結
ビヒクルへの不活性化反応体の連結は有機合成の分野で報告されているような一般的に行われているアミノ酸結合方法に従う。不活性化反応体は、典型的にはペプチドコアのC-末端に連結させ、前の工程でビヒクルに連結させておいた検出基を置換する。強力なTSPIを作製するために上位ビヒクルに連結させることのできる不活性化反応体の種類には制限がない；実際、テストする不活性化反応体の種類が多いほど、TSPIの開発が成功する可能性が高い。同様に、１以上の上位ビヒクルをテストすることは好結果の「ヒット」の可能性を高める。しかしながら、資源が限られている場合、少数の不活性化反応体を用いた種々のビヒクルの多数の化合物ライブラリーではなく、無数の種々の不活性化反応体に連結させた最上位ビヒクルから成る大きな化合物ライブラリーを作製することが好ましい。
【０１３６】
この時点で、ESBおよびTSBと有利な結合をする、阻害についての最上位ビヒクルが同定される。今度は、焦点はTSR（または、基底状態不安定化が触媒反応の機構である場合はGSR）にもっぱら結合するこのできる不活性化反応体の探索に移行する。従って、ビヒクルの結合部分（すなわち、ペプチドコア）は一定のまま維持されるべきだが、一方不活性化反応体はTSR（またはGSR）への結合に関してスクリーニングされる。
以下の２つの例（状況１および状況２）は例示的なものである。候補上位ビヒクルは工程IIIの基準に従って順位付けされる。図３に示した状況１においては、上位順位のビヒクはアミノ酸組成においてかなり類似している。最も活性なビヒクルの活性部位においては（特に、全8,420アミノ酸をスクリーニングした場合は）有意なホモロジーが予想されるので、これはより一般的な事例である。状況２においては、上位順位ビヒクル間でペプチドアミノ酸コアに大きな変動がある。
【０１３７】
工程IIIの上位順位ビヒクル
2004535560.tif 000004
【０１３８】
Z-LLL-AFCを一次ペプチドコアとして選択する。従って、今度はZ-LLLを非常に多数の不活性化反応体のそれぞれに連結する。その結果は、相同な（すなわち同じ順序の同じアミノ酸）ペプチドコアを有するが異なる不活性化物質を有する化合物の系列である。多くの資源が利用できるのであれば、数ダースの異なる不活性化反応体であって、それぞれがペプチドコアの複製物に連結しているものを得ることが好ましい。場合により、同じ手順を２番目に高い順位のビヒクルに適用して強力なプロテアーゼ不活性化因子を発見する機会を増やすこともできる。５つの異なる不活性化反応体U、V、W、X、YおよびZを使用した状況１に付いての結果は以下の通りである：
【０１３９】
2004535560.tif 000005
【０１４０】
状況２について、所望であれば、２番目に最良のビヒクルペプチドコア(Z-VPR-)を最良のペプチドコア(Z-LLL-)に加えて誘導体化することができる。各上位順位ビヒクルついての置換の総数はテストする不活性化反応体の数を反映する。状況１においてテストすべき組合せの例には、Z-Leu-Leu-Leu-フルオロメチルケトン、Z-Leu-Leu-Leu-ビニルスルホンおよびZ-Leu-Leu-Leu-ケトアミドが含まれる。
【０１４１】
Ｂ．遷移状態プロテーゼ阻害因子候補を決定するための阻害アッセイ
プロテアーゼ阻害因子を合成したならば、標的プロテアーゼの100％阻害を生じさせる濃度(EC100)についてそれらをテストし、それに従って順位付けする。工程IIIにおいて最終的なビヒクル選抜に使用したTOPカクテルを阻害因子の競合のための供給源として使用する。この結果は、遷移状態プロテアーゼ阻害因子候補の順位付けであって、最も上位のプロテアーゼ阻害因子は最も低いEC100値を有する（すなわち、最も低い濃度においてなお効果的である阻害因子が順位表の中で最上位である）。本方法は以下の工程を含む。
【０１４２】
工程１：初期スクリーニング
各プロテアーゼ不活性化因子をまず工程IIIにおいてビヒクルの最終差別化を与えた高kcat基質のTOPカクテルとインキュベーションする。例えば、７％高kcatカクテルを工程IIIの最終スクリーニングに使用したのであれば、それをここでの競合の出発起点として使用するのが便利である。プロテアーゼ不活性化因子をカクテル中の個々の高kcat基質のそれぞれの濃度に等しい濃度にしてインキュベーションする。陽性および陰性対照は実施例５に記載したように設定し、それによって％阻害を計算する。
【０１４３】
工程２：阻害因子希釈実験およびEC100の決定
たった一つのプロテアーゼ不活性化因子が標的プロテアーゼを100％阻害するのであれば（ありそうもないことだが）、阻害因子の順位付けはこの恣意的な出発点で確立することができる。その場合、その阻害因子が最上位の阻害因子であり、より低い阻害能（あるいは最も低いEC100値）を有する阻害因子がそれに続く。しかしながら、多数の阻害因子が選択した濃度で標的プロテアーゼを100％阻害することの可能性がより高い。この場合、これらのプロテアーゼ不活性化因子のそれぞれの濃度をEC100が決定できるまで低下させる。例えば、10倍希釈増分は良好な開始点であるが、希釈の程度は研究者の判断である。このアッセイの結果はプロテアーゼ不活性化因子の順位付けされた候補リストである。この工程における最高順位の阻害因子は最低のEC100を有する阻害因子である。すなわち、それらは最も低い阻害因子濃度においてプロテアーゼの完全な阻害を示す。
【０１４４】
2004535560.tif 000006
【０１４５】
工程３：阻害因子Kiおよび阻害様式の決定、ならびに、Kiによる順位付け
上位に位置づけされるプロテアーゼ不活性化因子（すなわち最低のEC100値を有する）のKiを決定する。これは時間のかかる工程であり、どのくらいの数の候補化合物をこの工程に進めるかは研究者の判断に委ねられる。実際、本方法の最も重要な利点は、Ki計算を本方法の「後の」時点、実質的なスクリーニングが既に行われたときまで延期し、それによってこの計算を行う必要のある候補阻害因子の数を減少させることである。
阻害因子濃度は、Ki値を決定するためには少なくともKiの0.5〜５倍であることが好ましい。阻害因子の酵素に対するKiは基質に依らず一定であるので、高kcatカクテル基質のいずれかまたはカクテルの全体をこの工程で使用することができる。しかしながら、計算の信頼性を得るため、少なくとも３つの別の基質を用いて独立にKiを決定することが推奨される。非線形フィッティグまたはディクソンプロットを利用して上位順位のプロテアーゼ不活性化因子のKiを決定することができる。工程IIIで論じたように、非線形フィッティングに比べて、イーディー‐ホフステー、ヘーンズ、コーニッシュ-ボーデンおよびラインウイーバー バークの２次プロット法はKi値を決定するために推奨しない。直接ラインウイーバー バークプロットはKiの決定には使用すべきではない。時間に制限がないのであれば、時間対残存活性パーセンテージの自然対数プロットの傾きから擬似１次速度定数(Kapp)を評価することが出来る。最後に、イーディー‐ホフステーまたはヘーンズを用いてプロットを作成し、阻害の様式を決定する。
【０１４６】
これらの方法は阻害の型、すなわち、競合阻害、非競合阻害、不競合阻害、または不可逆阻害、を評価するために使用される。これまで実行した手順と矛盾無く、阻害様式は競合的または不可逆的であることが予想されるが、不競合機構または非競合機構によって作用する事があり得る。阻害に好ましい様式に関する決定は、上述したように標的薬剤の生理学的目的（長期間治療は毒性の少ない可逆的阻害因子を必要とするかも知れないが、短期治療にはより強力な不可逆的阻害因子を使用することができる）に基づいて研究者が行う必要がある。従って、この工程はどの型の阻害候補が好ましいかを決定するために有用であろう。不可逆阻害を決定する方法はこの分野でよく知られている。最も低いKiを有するプロテアーゼ不活性化因子が最上位に位置づけられるプロテアーゼ不活性化因子となるようにプロテアーゼ不活性化因子はこの時点で再順位付けされる。大部分の例で、低いEC100値は低いKi値と相関する。従って、得られた順位付けはEC100計算で得られたものと同じであるか、または僅かしか違わないであろう。従って、計算したEC100値から推定できるのでKi値の決定は任意である。稀な事例において、Ki順位はEC100順位と顕著に異なり、その可能性があるのでKi決定と順位付けは好ましい工程である。
【０１４７】
これらのアッセイは種々の不活性化反応体に連結した単一のTOPビヒクルに相当する候補阻害因子（例えば、状況１については「最も好ましい」化合物、すなわちその全てがTOPペプチドコアLLLをペプチドコアとして有する化合物）についてのみ行えばよいことを再度強調する。第２順位に位置づけられるビヒクル（状況１について「次に好ましい」化合物；LLYがペプチドコアである）の調査は任意である。
例示に戻ると、Ki値がEC100リストの上位３つの化合物についてKi値が計算されたと仮定する。実験の典型的な結果、我々は同一のリストを得た。EC100順位がKi順位から外れる可能性は低いが、種々の動力学的変数による複雑化故にこの評価はともかく行うことが好ましい。最上位の阻害因子は最低のKiを有する。
【０１４８】
2004535560.tif 000007
【０１４９】
Ｃ．遷移状態プロテアーゼ不活性化因子(TSPI)の決定
機構的には、上位プロテアーゼ不活性化因子候補は基質遷移状態に対応する酵素配座を阻害するか、または、基質基底状態を相補する酵素幾何学配置において阻害を生じさせる。阻害の機構は理論部で既に論じたように完全に特定の酵素に依存する。候補阻害因子は、まず遷移状態類似体としてのその能力について評価され、それによって上位候補プロテアーゼ不活性化因子のさらなる選抜基準（すわなち、遷移状態特性）が提供される。遷移状態阻害を評価するために「遷移状態スコア」を使用する。遷移状態模倣がそれらの阻害様式であることが判明した場合、候補プロテアーゼ不活性化因子は遷移状態阻害における能力についてさらに詳細に調べられる。従って、この方法は、最も良く遷移状態を模倣し可能な限り律速段階の近くで酵素活性を阻害する阻害因子を明らかにするための分子レベルにおける細かい調整の機会を提供する。好ましくは、酵素を律速段階で阻害するプロテアーゼ不活性化因子が同定される。
【０１５０】
遷移状態特性を評価するため、プロテアーゼ不活性化因子による阻害の強さと相同置換されたビヒクルの同種系列の切断効率との相関を評価する。この相関はこの技術分野において詳細に記載されている。相関が示された場合、酵素リガンド相互作用結合エネルギーは触媒反応を駆動するために使用されるのと類似の様式で阻害を生じさせるため利用できることが示唆される。言い換えると、一方では基質加水分解に関与する機構的特徴であり、一方では阻害因子による酵素不活性化であって、これらは類似しているであろう。
例示的用例中の状況１に戻ると、Z-LLL-XはKi値に基づいて選択した阻害化合物として最も高く順位付けられている。この最高位に位置づけられた化合物を更なる解析のために選択し、「親」化合物とする。目的はZ-LLLに付加した不活性反応物（この例ではX）の遷移状態特性を解析することである。特定の理論又は機構に限定する意図はないが、不活性化反応体は遷移状態において特異的にTSRを上昇させ基底状態においてESRに影響を与えないことが望ましい。ペプチドコアのZ-LLLの相互作用がESBおよびTSBにおいて保存されるという考えと矛盾無く、（低Ki値によって証明されるように）優れた結合能がすでに観察されている。更に、このコアは非触媒反応的に結合し、従ってTSRを低下させる（不活性化反応体の能力を打ち消すであろう）とは予測されないという更なる利点を有している。この事実を確認するため、以下の工程を実行して不活性化反応体(X)が基底状態と相互作用せずに遷移状態(TSR)にて阻害を生じさせるかどうかを決定する。第２および第３順位の不活性化反応体（すなわち、状況１の例ではYおよびZ）のテストも所望であれば行うことができる。
【０１５１】
工程１：遷移状態プロテアーゼ阻害因子の順位付け
１．親阻害因子のKiおよび親ビヒクルのkcat/Km
最上位阻害因子およびその類似ビヒクルはここでは「親阻害因子」および「親ビヒクル」と呼ぶことにする。例えば、例示的事例の状況１においては親ビヒクルはZ-LLL-AFCであり親阻害因子はZ-LLL-Xである。ビヒクルのkcat、KmおよびVmは工程IIIにおいて論じたように伝統的な動力学的方法を用いてすでに決定してある。工程VII(B)においてプロテーアゼ不活性因子のKiを決定した。上述したように、非線形フィッティングはイーディーホフステー、ヘーンズ、コーニッシュ-ボー伝およびラインウィバー-バークの２次プロットよりも好ましく、直接ラインウィバー-バークプロットはkcat、KmおよびVmのいずれを決定するための計算にも推奨されない。例えば、最上位ビヒクルがZ-Leu-Leu-Leu-FMKである場合、Z-Leu-Leu-Leu-AFCのkcat、KmおよびVmを決定する（AFCは同種の蛍光発光基質基であることを考慮する）。A-LLL-FMKのKiは上記工程VII(B)によって確かめられている。
【０１５２】
２．構造的に類似するプロテアーゼ不活性化因子およびそれらのビヒクルのKm/kcat対Kiプロファイル、およびKmプロファイルの作製
適合させながら動力学的プロファイルを作製する。工程IIおよびIIIにおけるアッセイには発色基を含む8420種のビヒクルからなるライブラリーが好ましいが、必要に応じて対応する阻害因子（発色団の代わりに不活性化官能基を含む）のみを合成することがより経済的である。従って、阻害因子の完全な並行「8420ライブラリー」の非存在下において、以下に記載するように進級した最良阻害因子を選抜および作製する。この根本方針は、動力学的データプロットに関する直線回帰分析によってTS-関連特性を明らかにすべきペプチドコアの変異集団を系統的に作製するというものである。
【０１５３】
親阻害因子に対する単一アミノ酸置換によって特徴付けられる阻害因子を同じ置換を受けたビヒクルと共に（それらがまだ存在していないならば）合成する。コア中に一アミノ酸置換を選択するのが好ましいが、より広範な置換もそれが阻害因子とビヒクルで同じである限り許される。阻害因子／ビヒクル対は阻害因子のペプチド部分とビヒクルの同一の位置に置換を含む。例示的事例の状況１においては、最上位ビヒクルに対するXがFMKであって、従ってKi順位付け後の上位プロテアーゼ不活性化因子がZ-Leu-Leu-Leu-FMKであった場合、保存的に置換された阻害因子／ビヒクル対の例にはZ-Leu-Leu-Tyr-FMK/Z-Leu-Leu-Tyr-AFC、Z-Phe-Leu-Leu-FMK/Z-Phe-Leu-Leu-AFC、Z-Leu-Pro-Leu-FMK/ Z-Leu-Pro-Leu-AFCが含まれる。非保存的に置換された阻害因子／ビヒクル対の例には、Z-Leu-Leu-Arg-FMK/Z-Leu-Leu-Arg-AFC、Z-Leu-Lys-Leu-FMK/Z-Leu-Lys-Leu-AFC、Z-Asp-Leu-Leu-FMK/Z-Asp-Leu-Leu-AFCが含まれる。用語「非保存的」とは、親ペプチドコアに比較して、類似ペプチドコアの挙動にかなりの相違を導入するかも知れない交換、例えば親ペプチド中の相対的に非極性のアミノ酸残基をより極性のアミノ酸残基に置換すること、を表す。
【０１５４】
それらを合成した後、これらの類似プロテアーゼ阻害因子について、まだ知られていないのであれば、Kiを決定する。kcat、Kmおよび場合によりVmを関連ビヒクルについて決定する。これらの値は次の工程でプロットし、親阻害因子の遷移状態特性を決定するために使用する。本方法のこの部分の究極的な目的は、親阻害因子（状況１ではZ-LLL-X）が遷移状態に特異的に阻害する（おそらく、TSRを上昇させる）かどうかを決定することである。各不活性化反応体、例えばXについて、充分な数の阻害因子/基質対を合成して直線回帰分析において許容できる直線が構築できるようにしなければならない。
どのアミノ酸置換を作製して最適な阻害因子／ビヒクル類似体対を作製するかを決定する際に、研究者は親阻害因子および関連化合物について前に収集した情報を参考にすることができる。
【０１５５】
事例１：先のビヒクル阻害に基づいて選択を行う
ビヒクル阻害データの結果を検討した結果、阻害の類似の「モチーフ」が見出される可能性がある。最も好ましい例である我々の状況１を用いてこのことを説明する。ここではZ-LLL-Xがプロテアーゼ不活性化因子（親阻害因子）でありZ-LLL-AFCが親ビヒクルである。高位に順序づけられたいくつかのビヒクルは親とただ一つのアミノ酸しか異ならないことがデータにより示されている。これは最良の事例であるが、結合の保存性を考慮すれば起こりそうな事例でもある。類似の対形成をこの表に基づいて作製する。例えば、LLY-AFC、LLW-AFC、LLR-AFC、VLL-AFCおよびLLP-AFCが全て阻害性であってビヒクル表上で高位に順序づけられているならば、それらを置換に利用する。実際、この事例において、LはP2において好ましいようである。
以下の動力学的パラメータはこの工程で決定されるであろう：
2004535560.tif 000008
【０１５６】
事例２：置換を選択するための手がかりを利用する
ビヒクルデータを検討しても唯一のアミノ酸相違のあるリストが生成されないかもしれない。その場合、前のビヒクルデータをより深く調べるべきである。例えば、阻害特性を有する大部分のビヒクルにおいてLがP2で支配的であることが示されたならば、LをP2に使用する。またP1においてVが阻害的効果を有することが示されたならば、これが試みるべき置換であろう（例えば、Z-VLL-AFCおよびZ-VLL-X）。同様に、ビヒクルリストにおいてP3におけるRが阻害を生じさせることが示されたならば、類似の対を使用する（例えば、Z-LLR-AFCおよびZ-LLR-X）。
事例３：ビヒクルリストから手がかりが全く得られない
この場合、置換は完全に研究者の判断の範囲内である。置換は結合性ビヒクルのいずれの位置または全ての位置で行っても良い。これらの置換は保存的であっても非保存できであってもよいが、保存的交換から開始することが好ましい（例えば、疎水性アミノ酸を疎水性アミノ酸へ、あるいは、極性アミノ酸を極性アミノ酸へ）。
事例４：短縮化
ジペプチド阻害因子／ビヒクル対、または単一アミノ酸コアをテストすることも望ましいかも知れない。例えば、Z-LL-AFCおよびZ-LL-Xを例示的事例の状況１において使用することができる。
【０１５７】
３．不活性化反応体が遷移状態において阻害性であるのか基底状態において阻害性であるのかの決定：阻害因子のlog(ki)対ビヒクルのlog(Km/kcat)のプロット、および阻害因子のlog(ki)対ビヒクルのlog(Km)のプロット
特定の不活性化反応体を含む阻害因子化合物（単一の親に由来する）のクラスについて、阻害因子のlog(ki)を関連するビヒクルのlog(Km/kcat)に対してプロットする。場合により、阻害因子のlog(Ki)対ビヒクルのlog(Km)プロットも用意する。好ましくは、これらのプロットのそれぞれを解析した個々の不活性化反応体のそれぞれについて作製する。
例えば、例示的事例の状況１において、Ki順位はZ-LLL-X、Z-LLL-YおよびZ-LLL-Zが、第１位、第２位、第３位の阻害因子であることを示している。従って、これらの各々は親阻害因子として機能する。Z-LLL-Xが調べるべき最初の親阻害因子（Z-LLL-AFCを親ビヒクルとする）であり、類似の阻害因子／ビヒクル対（すなわち、阻害因子／ビヒクル対Z-LLY-X/Z-LLY-AFC、Z-LLW-X/Z-LLW-AFC、Z-LLR-X/Z-LLR-AFC、Z-VLL-X/VLL-AFCおよびZ-LLP-X/Z-LLP-AFC）が上述のように合成され、動力学的定数が計算されたと仮定すると、各組のそれぞれについて阻害因子のlog(Ki)をビヒクルのlog(Km/kcat)に対して同じプロット上にプロットし、Xを不活性化反応体として含む阻害因子の潜在的遷移状態特性に関する情報を生成させる。同様に、log(Ki)対log(Km)もビヒクルについてプロットすることができ、Xを不活性化試薬として含む阻害因子の潜在的基底状態特性を評価することができる。すなわち、不活性化反応体Xについて２つのプロットが作製される：（１）log(Ki)対log(Km/kcat)および（２）log(Ki)対log(Km)。
【０１５８】
場合により、不活性化反応体Yおよび／またはZについて、Z-LLL-Y/Z-LLL-AFCおよび構造的に類似の阻害因子/ビヒクル、並びに、Z-LLL-Z/Z-LLL-AFCおよび構造的に類似の阻害因子/ビヒクルを用いてさらなるプロットを作製して、Yおよび／またはZを含む阻害因子の遷移状態および／または基底状態特性を評価することが出来る。
この時点で、注目する親阻害因子に対する不活性化反応体が遷移状態阻害因子として特異的に阻害的に作用するのか、基底状態阻害因子として特異的に阻害的に作用するのかに関する一般的評価がなされる。前に背景技術の節で考察したように、酵素は基底状態不安定化または遷移状態安定化（またはその組合せ）を利用して触媒反応を駆動することができる。低いKiを有する効果的な阻害因子は、酵素によってどの触媒反応様式が利用されるかに依存して、その酵素の遷移状態または酵素の基底状態に結合するであろう。ここまでで、本発明の方法はプロテアーゼについて触媒反応の様式（遷移状態不安定化、基底状態不安定化、またはその両方）が前もって知られていないことを仮定していることが明らかな筈である。実際、本方法の重要な長所は、本方法を実行する間にこの情報が両方とも得られ、次にその情報が経験的に利用されることである。
【０１５９】
不活性化試薬が作用する機構を決定するために、各プロット上で直線回帰を行い、R値（統計的直線相関基準）の単純な比較を２つのプロット間で行う。R値がlog(Ki)対log(Km/kcat)について大きい場合は、その不活性化反応体を含む阻害因子は遷移状態に作用することによってプロテアーゼを阻害する。反対に、R値がlog(Ki)対log(Km)プロットについて大きい場合は、その不活性化反応体を含む阻害因子は基底状態に作用することによってプロテアーゼを阻害する。log(Ki)対log(Km/kcat)プロットについて相関が大きいと仮定して（すなわち、遷移状態相互作用、典型的な場合である）、直ぐ後に記載したように遷移状態スコアを計算する。そうではなく、R値がlog(Ki)対log(Km)プロットについて相関が大きい場合、基底状態阻害が機能しており、研究者は以下の「工程３」へ飛ばねばならない（基底状態阻害を更に解析する）。
【０１６０】
阻害因子のペプチドコア成分が同一である場合は常に阻害の様式が同じである可能性が高い。例えば、低kcat親阻害因子Z-LLL-YおよびZ-LLL-Xはどちらも典型的には遷移状態阻害因子、または、基底状態阻害因子として作用する。阻害の２つの様式間では遷移状態阻害がより起こりやすい。なぜなら、低Ki値は基底状態阻害よりも頻度高く遷移状態阻害と関連していることが見出されているからである。
可能性は低いが、Xを不活性化反応体として含む阻害因子、例えばZ-LLL-XおよびXを含むその構造的に類似の阻害因子が基底状態プロット（すなわちlog(Ki)対log(Km)）よりも遷移状態プロット（すなわち、log(Ki)対log(Km/kcat)）についてより良好な相関を有しているが、同じビヒクルを含むがYを不活性化反応体として含む阻害因子、すなわちZ-LLL-Yおよびその構造的に類似の阻害因子が遷移状態プロットよりも基底状態プロットについてより良好な相関を有する可能性も残っている。Z-LLL-Xは遷移状態阻害因子として作用すると予測され、以下の次の処理に移される。一方、Z-LLL-Yは基底状態阻害因子として作用すると予測され、以下の「工程３」へ移される。そこで疑問が生じる：ただ一つの不活性化反応体を更に追跡しなければならないとしたら、遷移状態阻害因子Z-LLL-X（またはその類似体）を追跡すべきか、基底状態阻害因子Z-LLL-Y（またはその類似体）を追跡すべきか。一つの見解は、常に遷移状態阻害因子を追跡するというものである。しかしながら、好ましい実践手順は、遷移状態阻害因子であろうが基底状態阻害因子であろうが低いKi値を有する阻害因子を追跡するというものである。Z-LLL-XがZ-LLL-Yよりも低いKiを有しているならばZ-LLL-Xを次に工程に進めるのが好ましい。一方、Z-LLL-XがZ-LLL-Yよりも高いKiを有している場合は、低いKi値を有するが故にZ-LLL-Yを追跡すべきである。単純に阻害の機構に基づいて選択することと対照的に低いKiを有する親化合物を生み出す不活性反応物を追跡することの根本的な理由は、低いKi阻害因子はより強力であるということである。その結果として、薬剤設計との関連において、より低いKi阻害因子はより少ない用量を効果的に使用することを可能にする。さらに、低いKiに反映される強固な結合はあるレベルの選択性も意味する。
【０１６１】
４．不活性化反応体に関する遷移状態スコアの決定
遷移状態阻害を追跡する場合、上記で詳述したような阻害因子およびその構造的類似体に関するlog(Ki)対log(Km/kcat)のプロットに基づいて、阻害因子を特徴付ける不活性化反応体について遷移状態スコア(TSS)を決定することができる。高い遷移状態特性を有する阻害因子は標的プロテアーゼの活性部位に対して高度に特異的で強力であると期待され、少なくとも原理的にはある程度の選択性を示すと期待される。阻害の強さは特定の阻害因子について最終的な「阻害因子スコア」に取り込まれる追加的な特徴であり、後で詳細に説明する。
TSSの式は遷移状態阻害の３つの重要な特性を反映している。第１に、親阻害因子（および同じ不活性化反応体を含む構造的類似体）に良好な遷移状態特性を付与する不活性化反応体は親阻害因子およびその構造的類似体（全て同じ不活性化反応体を含む）のlog(Ki)対log(Km/kcat)について行った直線回帰の高いR値によって特徴付けられる。高いR値は、酵素リガンド相互作用結合エネルギーはそれが触媒反応に利用されるのと同じ機構で阻害を駆動するために使用され得ることを意味する。このことは、有効な「相補性」が阻害因子とそれが結合する遷移状態の間に存在することを意味する。第２に、log(Ki)対log(Km/kcat)のプロットについて行った直線回帰は1.0に近い傾きMを持つ直線を作り出す。このことは、構造的改変が遷移状態において生じるのと同じ結合エネルギーの増大変化を阻害因子内に生み出すことを意味する。従って、log(Ki)対log(Km/kcat)プロット上で1.0に近い傾きの直線に対応する遷移状態阻害因子データ点はより高い遷移状態特性を有する。傾き=1.0である究極的な状況においては、阻害因子は律速段階に対応する酵素立体配座に実際に結合するである。第３に、統計的信頼性を増すため、この直線は可能な限り多くの点を有しているべきである。これらの属性の全てが特定の不活性化反応体Xについての遷移状態スコア(TSSX)に取り込まれており、以下の式によって計算される：
【０１６２】
2004535560.tif 000009
式中、
R=回帰値
M=傾き
P=直線上の点の数
X=選択した不活性化反応体
【０１６３】
阻害機構の評価には重要でないのでPの使用は任意である。
M=1である場合（律速段階阻害が同定されているという非常に可能性の低い場合）は、０による除算を回避するために１の代わりに0.99という値を使用すべきである。
この遷移状態スコアの例として、６点をプロットした場合、これらの点の大部分を用いた最良のフィッティング直線が使用すべき直線である。所望であれば、この最良のフィッティング線を決定するために統計プログラムを使用することができる。この直線を構成するために使用した点は遷移状態プロテアーゼ阻害因子を表す。この線から本質的に外れてスコアを低下させる点は排除し、非-遷移状態阻害因子だと考える。例えば、図３においてZ-LLV-AFC/Z-LLV-Xによって表される点ｅはフローチャート例の左上に外れているので、遷移状態阻害因子とは考えない。従って、遷移状態スコアは特定の不活性化反応体系列に帰属させることができるということに注目することが重要である。言い換えると、不活性化反応体Xはそれぞれのビヒクルの遷移状態に結合する能力についてスクリーニングされてきた。Xに関するlog(Ki) vs. log(Km/ckat)プロット上に反映されている全ての阻害因子は（直線回帰計算において捨てられてないことを条件として）同じ遷移状態スコアTSSXを有することになる。
【０１６４】
例えば、Z-LLV-X、Z-LLL-X、Z-LLY-XはX不活性化反応体系列の一部であるので、これらの阻害因子は全て同じ遷移状態スコアを有する。同様に、Z-LLV-Y、Z-LLL-Y、Z-LLY-YはY不活性化反応体系列の一部であるので、これらの阻害因子は同じ遷移状態スコアTSSYを有する。２以上の不活性化反応体の間の差別化を行ったならば、同じペプチドコアを有するが異なる不活性化反応体を有する親阻害因子を比較することができる。例示を続けると、X系列がY系列よりも高い遷移状態スコアを有するのであれば、親阻害因子Z-LLL-XとZ-LLL-Yの間の比較はZ-LLL-XがZ-LLL-Yよりも高い遷移状態特性を有するという結果を生じるであろう。また、所望であれば下記に記載したように個々の阻害因子スコアを決定することにより各不活性化反応体系列内の個々の阻害因子（すなわち異なるペプチドコアを有するが同じ不活性化反応体を有する阻害因子であって、この定義から、同じTSSによって特徴付けられる阻害因子）を比較することができ、順位付けすることができることにも注目すべきである。
【０１６５】
研究者は遷移状態スコアにおいて望みのストリンジェンシーを調整することができる。TSSのストリンジェンシーが高いほど、不活性化反応体の遷移状態結合能の信頼性が高い。好ましくはTSSは少なくとも約22.5、より好ましくは少なくとも97である。例えば、最小TSSが100であることが必要であると決定された場合、直線回帰は少なくとも100のTSSを生成する点の亜集団のみについて行われる。プロットの遷移状態スコアはプロット上の点を犠牲にして（線から外れるものを排除する）回帰値R（相関値としても知られる）を増加させることによってのみ増大させることができるのは言うまでもない。しかしながら、点の数Pを減少させることは、少しではあるがTSSを低下させることによってこの試みに不利に働く。あまりに多くの点が捨てられるのであれば、Pが少なくなりすぎて直線回帰の信頼性が失われる。その場合、より多くの阻害因子を合成してテストするか、ストリンジェンシーを低くする必要があろう。TSSを計算するための点の数は少なくとも５、より好ましくは少なくとも８である。最終TSSは、非常に多くの点を用いて行った直線回帰（阻害因子の遷移状態結合能における充分な信頼性がある場合）と非常に少ない点を用いて行った直線回帰（直線の統計的信頼性に疑問がある場合）との間の釣り合いを反映したものである。１ダースまたはそれ以上のデータ点が許容でき、かつ好ましいであろう。
【０１６６】
５．次善の不活性化反応体の遷移状態スコアの決定
上述したように、遷移状態プロットを続いて次善の不活性化反応体系列について行うことが好ましい。我々の例で説明すると、Z-LLL-Yが２番目に良好なプロテアーゼ阻害因子である。従って、ここではZ-LLL-Y系列が親として役割を果たし、この主題に関する偏差は上述したように行われる。その結果、遷移状態スコアを親Z-LLL-Yおよびその改変系列に割り当てることができる。このようにして、Z-LLL-Yの遷移状態スコアを前に高位に順位付けられていたZ-LLL-Xの遷移状態スコアと比較することができる。Z-LLL-Yの遷移状態スコアがZ-LLL-Xのスコアよりも高い場合、Z-LLL-YはKiによる順位表ではZ-LLL-Xより低く位置付けられていたにも関わらず、Z-LLL-YはZ-LLL-Xよりも高位に順位付けられるであろう。
【０１６７】
次に、遷移状態プロットを３番目に良好なプロテアーゼ阻害因子について行うことができる。我々の例では、これはZ-LLL-Zである。次にこれを前にスクリーニングしておいた他の不活性化反応体等と比較する。
多数の遷移状態プロットを作製することができる。ここでの目的はどの不活性化反応体（例えば、X、Y、Z）がTSRにおいて非触媒反応性結合ペプチドコア（Z-LLL）と共に効果的に阻害的であるかを決定することである。最終的に遷移状態スコアの大きな表が達成される。テストした親よりも高い遷移状態スコアを有するプロテアーゼ不活性化因子変異体が発見される可能性もある。結果のリストを作製する。最も高いスコアを有する不活性化反応体を最も上位に位置づける。
状況１についてのプロットの作製、好ましい次善のビヒクル
時間と資源に依存して、上述の手順を状況１（図３ａ）の好ましい次善のビヒクルについて行うことができる。我々の事例の場合、この工程はZ-LLY-Vについて行われる。
【０１６８】
６．個々の遷移状態阻害因子スコアの決定
TSSを計算した後、阻害因子スコアＩを任意の阻害因子について決定することができる。阻害因子スコアは任意の阻害因子についてKiに反映されるような阻害因子の「能力」という特徴を取り込み、前に決定した遷移状態スコアを補足する。高い遷移状態スコアは標的プロテアーゼの活性部位に対する高い特異性および選択性を意味するが、この分野では一般的に遷移状態阻害因子が非常に強力でもあるという傾向があるものの、それほど強く阻害の強さを意味するものではない。２つの阻害因子が両方とも高い遷移状態特性を有しているが、それらが必ずしも等価な強さを持っていないということはあり得る。Ｉの値が高いほど、阻害因子は高位に順位付けされる。以下の「工程３」で論じるように、阻害因子スコアＩは基底状態阻害因子についても計算できることに注意する。
遷移状態阻害因子の阻害因子スコア(ITS)は以下のように計算できる：
ITS = log(TSS/(Ki))
【０１６９】
阻害因子スコアＩは阻害因子のいくつかの型を差別化するために使用することができる。例えば、上記のTSS計算の議論中で言及したように、阻害因子スコアは同じ不活性化反応体系列の一部であって従って同じTSSを有する個々の阻害因子間で差異が生じ得る。次に、これらの各々を潜在的TSPI候補として考慮することができる。例えば、Kiが各阻害因子について異なっている限り、ＩをZ-LLL-X、Z-LLY-XおよびZ-LLV-X間で阻害因子能を区別するために使用することができる（TSSはそれぞれについて同じであるので、TSSでは区別不可能である）。さらに、Ｉは同じKi値を有する阻害因子を、それらが異なる遷移状態スコアを有していることを条件として区別することができる。この場合、より高いＩ値を有する阻害因子が（TSSによる決定によれば）より強く遷移状態特性を有している阻害因子であろう。例えば、Z-LLL-XおよびZ-LLL-YのそれぞれがKi=1x10-10を有しているがZ-LLL-Xがより高いTSSを有している場合、Z-LLL-XはZ-LLL-Yよりも高いＩ値を生じさせるであろう。
重要なことに、Ｉは異なるKi値および異なるTSS値を有する阻害因子間を区別するためにも使用できる。明らかに、高い遷移状態特性（優れたプロテアーゼ不活性化因子の顕著な特徴）および低いKi値（優れたプロテアーゼ不活性化因子の別の顕著な特徴）の両方によって特徴付けられる阻害因子を（低い遷移状態特性および高いKi値によって特徴付けられる）他の阻害因子と比較する場合、Ｉを計算するための式は必然的に前者の阻害因子がより高いＩ値を有し後者より高く順位付けられるという結果を生じさせる。この状況の例として、以下の表のZ-LLL-XとZ-LLL-Tを比較されたし。
【０１７０】
例：種々の阻害因子の動力学的パラメーター
2004535560.tif 000010
【０１７１】
一方、一つの阻害因子は高いTSSによって特徴付けられるが高いKi値（緩い結合を示す）によっても特徴付けられ、他の阻害因子が低いKi（強固な結合）によって特徴付けられるが低いTSSによっても特徴付けられることがある。これらの阻害因子のそれぞれについてＩ値を計算することにより、それらを直接比較することが可能となる。それぞれのTSSおよびKi値の大きさに依存してＩは一方の阻害因子について他方よりも高いことがあり得る。例えば、上の表中のZ-LLL-Uは非常に高い遷移状態スコア（990）を有しているが、Z-LLL-Y（TSS=40.9；Ki=10-10）よりも少々高いKi値（10-9）を有している。この例では、Z-LLL-UのＩ値(11.9)はZ-LLL-YのＩ値(11.6)よりも高く、従って、Z-LLL-UはZ-LLL-Yよりも高く順位付けされる。このシステムではKi値の相違が約10のファクターよりも大きくない限り遷移状態特性が支配的であることが分かる。
【０１７２】
従って、Ki値の相違が10のファクターよりも大きい場合、阻害因子能の基準としてKi値が遷移状態特性よりもより重要となる。この事例は、Z-LLL-W(TSS=990；Ki=10-8)とZ-LLL-Y(TSS=40.9；Ki=10-10)の比較よって例示される。Z-LLL-WはZ-LLL-Yの遷移状態スコアよりも有意に大きい遷移状態スコアを有しているが、その高いKi値（Z-LLL-WについてはKi=10-8、Z-LLL-WについてはKi=10-10）のためにZ-LLL-Yよりも低いＩ値を有することになる（Z-LLL-WについてはI=10.9であって、Z-LLL-YについてはI=11.6）。従って、Z-LLL-YはZ-LLL-Wよりも上位に順位付けられる。一般に、２つの阻害因子間でKi値が10より大きなファクターで（10倍以上）相違する場合、Kiが遷移状態スコアよりも支配的になり始める。Ｉを計算するために使用する式は不変ではなく、所望であれば研究者が調整してTSSに対してKiをより重み付けするまたは重み付けを少なくすることができる。例えば、比TSS/Kiの分子(TSS)または分母(Ki)に係数を掛けてこの２つの変数の相対的な重み付けを変えることができる。阻害因子スコアの目的は結合能および遷移状態特性の相違によって特徴付けられる阻害因子を比較するための効果的な定量的差別化手段として役立たせることである。
【０１７３】
最終的な順位付け
先行する手順の結果として、阻害因子の最終的な順位付けが行われる。好ましくは、最も高いＩ値を有する阻害因子が次の工程へ移される。このことの正当性は、Ｉ値は遷移状態特性および強い結合の最適な組合せを有する阻害因子を順位付けするということである。あるいは、研究者は単に遷移状態スコアに基づいて（これはKi値を含まない）阻害因子を順位付けすることができる。これは遷移状態特性が最も望ましい特徴である場合、例えば特定の薬剤設計において行われるかも知れない。もちろん、阻害因子をTSSだけによって順位付けした場合、不活性反応物系列中の個々の阻害因子は全て同じ遷移状態スコアを有し、従って他の特徴も評価しない限りは区別できない。このことは明らかに本発明の方法の範囲内である。
【０１７４】
工程２：遷移状態プロテアーゼ不活性化因子の微調整
この手順は経済的資源と時間がある場合に行うことができる。律速段階にさらに近くで阻害を実現するために上位遷移状態プロテアーゼ不活性化因子を改良する。
１．不活性化反応体の構造的交換
この工程では、TSPIのペプチドコアを変化させずにおくが、不活性化反応体部分の交換を行い、得られる不活性化因子化合物を遷移状態スコアについて解析する。例えば、Z-Leu-Leu-Leu-FMKが最高位のTSPIとして順位付けられている場合、不活性化反応体(FMK)の変異体を使用する。所望であれば、不活性化反応体（この例ではFMK）に基づくコンビナトリアルライブラリーを作製し、最初のFMK構造の多数の交換を遷移状態スクリーニングに使用することができる。コンビナトリアルケミストリーによって導入される構造的変化は微細であることもまたは粗いこともあり得る。例えばFMKの場合、可能な交換にはフッ素原子の塩素原子による置換、またはこの構造の立体化学における変化のような微小変化が含まれる。最も高い遷移状態スコアを生み出す構造を発見することが目的である。原理的にはこの阻害因子は標的プロテアーゼに可能な限り律速段階の近くに結合するはずである。従って、TSPIの新たなライブラリーが得られる。
【０１７５】
２．ビヒクルの構造的改変
この工程では、上記と同じ手順を用いるが、但し遷移状態プロテアーゼ阻害因子のビヒクル部分（即ち、ペプチドコア）を改良する。TSPIの不活性化反応体部分は一定に維持される。従って、コンビナトリアルアプローチはビヒクルを調整するために使用する。これは多数の方法のどれによって行っても良い。改変にはL-アミノ酸に対するD-アミノ酸、他のアミノ酸による置換、および他の構造変化が含まれる。この場合もTSPIの遷移状態スコアを増加させるのが目標である。
【０１７６】
工程３：基底状態プロテアーゼ不活性化因子(GSPI)
上述したように、いくつかのプロテアーゼ阻害因子はプロテアーゼを遷移状態ではなく基底状態において阻害することが見出されることがある。log(Ki)対log(Km/kcat)の相関（Rによって決定される）に比べてlog(Ki)対log(Km)の相関の方が強い阻害因子を次の工程に進める。この手順は、工程VIIで同定された低Kiプロテアーゼ不活性化因子が良好な阻害因子スコアによって決定される合理的な遷移状態阻害因子を生じさせない場合に基底状態プロテアーゼ不活性化因子(GSPI)を解析するものである。
各プロテアーゼは固有の反応機構を持っている。歴史的には低いKi値を有する阻害因子は、ポーリングの古典的協同相互作用が期待される場所なのでプロテアーゼの遷移状態に作用すると考えられていた。しかしながら導入部で述べたように、研究により、いくつかのプロテアーゼによる触媒反応の反応様式について重要な機構は反応の触媒反応自由エネルギーを低下させる手段として基底状態不安定化を含み得ることが示された。ときどきこの機構は遷移状態におけるエネルギーの低下よりも重要ですらあり得る。低いKi値を有する阻害因子は基底状態不安定化が触媒反応の作用態様として働く場合はそれらのプロテアーゼの基底状態を阻害することによって作用することがある。
【０１７７】
従って、先の工程において同定された低Kiプロテアーゼ阻害因子が遷移状態阻害因子でないようならば、それらを本方法に従って基底状態阻害能について評価することが出来る。不活性化反応体Xを含む特定の阻害因子系列について基底状態スコアGSSXは特定の不活性化反応体系列に対しての遷移状態スコアと同じやり方で得られるが、但し、このスコアはlog(Ki)対log(Km/kcat)ではなくlog(Ki)対log(Km)からとられる。従って、基底状態スコアは以下の通りである：
GSSX = R/(ABS(1-M)*1/P)
式中、
R＝相関値
M＝傾き
P＝直線上の点の数
X＝選択した不活性化反応体
ここでPはTSSXについてと同じ理由で任意である。より高い基底状態スコアはより強力な不活性化反応体と等価である。基底状態阻害因子に対する阻害因子スコアＩ（すなわちIGS）も遷移状態阻害状況に関する計算と類似の方法で計算できる。具体的には、基底状態阻害因子スコアは以下の通りである：
IGS = log(GSS/ABS(Ki))
遷移状態スコアに関連する阻害因子スコアについて上述した議論は基底状態スコアにも適用される。この場合も基底状態阻害因子を順位付けする方法として阻害因子スコアを使用するのが一般的に好ましい。
切断性類似体に対する阻害因子スコア付けの適用
上述の式(TSS、GSS、ITSおよびIGS)は高度に切断性の基質と連結した不活性化因子にも適用できる。高度に切断性の基質に不活性化因子を連結させる方法はこの分野でよく知られている。しかしながら、遷移状態または基底状態エネルギーと相互作用する不活性化因子を同定し最適化するために上記のスコア付けシステムを使用することは新規である。
【０１７８】
工程４：基底状態プロテアーゼ不活性化因子の微調整
鋳型プロテアーゼ阻害因子の構造的改変を上述の工程２のように行い、得られた化合物を基底状態スコアの増加について調べる。初めに、ビヒクル部分を一定に維持しながら不活性化反応体を構造的に改変し、最も高い基底状態スコアを生じる不活性化反応体を推定する。次に、プロテアーゼ阻害因子のビヒクル部分を構造的に変化させ、最も高い基底状態スコアを生じさせる。この場合も、この手順は任意的であり、時間と資源が利用可能である場合に行う。
工程５：最終阻害因子の特徴付け
当業者によく知られた種々の方法を用いて最終阻害因子を特徴付けするのが好ましい。これらには、不活性化の時間依存性、飽和動力学の観察、基質保護、不可逆性のテスト、および酵素に接着する阻害部位の数の測定が含まれる。擬似１次速度定数(Kapp)を時間vs.残存活性のlnの傾きから見積もることができる。1/Kapp vs. 1/Iを再プロットしてKiおよびK2を得る。
【０１７９】
工程VIIの理論的長所の検討
この工程の長所は、ビヒクルに加えて反応性部分が同定され、よってその反応性部分がもっぱらTSRにおいて反応するようにみえることである。前に論じたように、結合中心および反応中心はビヒクルによってよく区別され、反応性部分はビヒクルに存在する有利な結合性相互作用を妨害しないと予測される。さらに、ビヒクルは非触媒反応性であるのでTSRの低下には何ら関与しないから、反応性部分によって生じるTSR増加の効果は相当に増強されると予想される。
【０１８０】
警告
いずれかの特定の理論に束縛される意図はないが、上記計算にはいくつかの仮定が為されていることが分かる。この分野で既に知られているように、これらの仮定が有効であることを保証する実験的測定が為される。有効でない場合、この分野で公表されている実行可能な実験方法を利用して妨害された仮定を訂正する。
仮定１．
Kmは実際の基質解離定数Ksに対応する。従って、会合または解離段階は選択した基質について律速とはならないことは重要である。Kmは結合の情報を含むが、その名の示すとおり基本的には定常状態、非平衡条件下で測定される動力学的定数である。Kmは遅い段階がある場合に限って基質の解離定数を近似するであろう。さらに、基質が高いアフィニティーで結合してターンオーバーが非常に速い場合、Kmは真の解離定数を反映せず、遷移状態中間体生成（例えば、システインおよびセリンプロテアーゼにおける四面体中間体）とは別の段階が部分的または完全に律速となるであろう。ビヒクルが非常に強固に結合する場合、その阻害定数は定常状態条件では計算可能ではないかも知れない。また、ビヒクルの加水分解不安定性は結合アフィニティーは平衡条件下では決定することができないことを意味するであろう。なぜなら、酵素の残存活性を許すビヒクル濃度では阻害因子が酵素と会合する速度は加水分解の速度よりも遅いからである。
【０１８１】
仮定２：酵素は阻害因子と平衡に達するに充分な時間にわたって安定である。
仮定３：ビヒクルに導入されるアミノ酸変異は活性部位基質反応中心のエネルギー論とは独立である。
仮定４：kcat/Km値は基質の系列を通して同じ律速段階を反映する。従って、基質の生成物への非-酵素-触媒反応変換の速度定数は系列について変わらず、この同じ化学的段階が対比に使用する各々の基質の遷移状態を含む。
仮定５：動力学的結果を評価する場合に、遅い結合事象を考慮すべきである。
仮定６：ビヒクルがあまりに強固に結合する場合はKiを決定するのが困難なことがある。
仮定７：実験室の問題。工程IIIの警告部で論じたのと同じ誤差の可能性が適用される。
粗プロテアーゼ混合物についての工程VIIは精製プロテアーゼに対するように行うが、但しkcatの代わりにVmを使用する。なぜなら、プロテアーゼの濃度が不明だからである。従って、適切な遷移状態プロットはKi対Km/Vmである。この手順について粗混合物に関する文献がこの分野で全く知られていないので、精製プロテアーゼについての場合より相関関係はもっと散漫かも知れない。この例では、遷移状態スコアは精製プロテアーゼに対してよりも粗混合液については大雑把であることが必要かも知れない。
【０１８２】
工程VIII.  天然基質テスト
所望であれば、リーディング候補TSPIまたはGSPIをその天然の基質の切断を阻害する能力についてin vitro、培養細胞、および／またはin vivoで解析する。この情報は阻害因子を特徴付けるための助けとなるが、最終的な順位付けの選抜基準としての役割を果たすことは意図していない。
特定のプロテアーゼの天然の切断標的であると予想される基質を選択する。例えば、プロテアーゼがリソソームから単離される場合は（例えば、システインプロテアーゼ）、標的基質分子にはアルブミンのようなリソソームに輸送されるものが含まれるであろう。プロテアーゼが細胞膜を分解すると予想される場合は、コラーゲンを天然基質として選択することができる。切断は例えば質量分光分析またはウエスタンブロット解析によって解析することができる。阻害因子の強さは基質の切断を妨げる能力によって決定する。粗混合物は精製したプロテアーゼと同じように取り扱う。
【０１８３】
工程IX.  標的プロテアーゼに対して選択的であるTSPIまたはGSPIを同定するためのディファレンシャル切断テスト
この工程はこれまでに同定された高位に順位付けられるTSPIよびGSPIについて選択性データを提供する。すでに述べたように、選択性はプロテアーゼ阻害薬剤の重要な特徴である。なぜなら、そのような薬剤は病原体の標的プロテアーゼを阻害することができるがヒトまたは非ヒト宿主の一般的プロテアーゼを阻害することができないからである。選択性を評価するための適切な対照およびアッセイ設計は前に工程VIで記載したものと同様である。標的プロテアーゼと同じ機構的クラスに属する宿主のプロテアーゼおよび他の宿主プロテアーゼを阻害する能力について阻害因子を評価する。理想的には、阻害因子は広範な宿主プロテアーゼについてテストされる。好ましいTSPIまたはGSPIは標的プロテアーゼを阻害するが他のプロテアーゼを阻害しない。本方法のこの段階で阻害因子の選択性を評価することは、これらのTSPIおよびGSPI候補がほとんど「最終」化合物を表すので有用である。しかしながら、これらの化合物はさらになお改変されることがあり、それらの後の改変が選択性を変えることもある。従って、この工程を行うことは、重要ではあるが、なお任意的であり、TSPIまたはGSPIリストの再順位付けのための選抜基準として役立つことも立たないこともある。少なくとも、この工程は高位に順位付けられたTSPIまたはGSPIが標的プロテアーゼに対して示す選択性の度合いを確認するための役に立つ。他の事例では、この工程はTSPIまたはGSPIリスト上の化合物を再順位付けするための道具として使用することができる。本工程において粗混合物は精製プロテアーゼと同等に扱われる。
【０１８４】
工程X．高位に順位付けられたTSPIおよびGSPIのさらなる微調整
所望であれば、化合物のさらなる構造的変異体をテストすることによりリードプロテアーゼ阻害化合物を更に改良することができる。TSPIのいかなる種類の構造的改変をこの方法のどの段階で行うこともでき、得られた化合物をテストすることができ、特に限定されないことは当然である。しかしながら、構造的改良は典型的にはこの方法の早い段階で行うよりも後で行う方がより経済的である。更なる改良の例には以下の手順が含まれる。
さらなる酵素基質と相互作用させるための１以上のアミノ酸のペプチドコアへの付加
この方法においては、１以上のアミノ酸をプロテアーゼ阻害因子のN-末端および／またはC-末端位置（PまたはP'サブサイト）に付加し、得られた化合物の活性を親化合物の活性と比較して、この新たな化合物が標的プロテアーゼに対してより強力な（および／または選択的な）阻害因子であるかどうかを決定する。例えば、Leu-Leu-Leu-FMKのようなトリペプチドプロテアーゼ阻害因子の伸長は20種の天然に存在するアミノ酸の１以上を親化合物のP4、さらに所望であればP5に付加することを含む。
立体化学的改変
P-P'サブサイトアミノ酸の立体化学的組成を改変することができる（例えば、D-立体異性体をL-立体異性体に、またはその逆の交換）。所望であれば、不活性反応物のキラル変換も考慮することができる。
【０１８５】
工程XI：リード化合物を足がかりとしたコンビナトリアルライブラリー構築
リードTSPIまたはGSPIが同定されたなら、最終的な分子をコンビナトリアルライブラリーのための足場（スキャフォールド）として使用することができる。コンビナトリアルライブラリー構築はこの分野で標準的な技法であり、参考文献が沢山ある。例えば、Z-LLL-FMKはTaenia soliumシステインプロテアーゼを用いた我々の実験の結果（実施例８）としてリード化合物であることが見出された。従って、阻害効果を増強するためにこの化合物をコンビナトリアル交換のための親分子として使用することができる。さらに、この手順は、生物学的構造／活性関連性によって特徴付けられる阻害因子の部分を同定し最適化することを可能とし、従って、親阻害因子のアミノ酸が最早最終分子の部分でないことがある。アミノ酸は体内で容易に代謝されると予想され、従って、それらが最終的な薬剤化合物となるということはそもそもありそうもないので、これは重要な考慮事項である。
【０１８６】
工程XII：標的プロテアーゼの結晶化およびコンピューターモデリング
阻害因子がプロテアーゼまたは粗混合物について同定された場合、そのプロテアーゼを阻害因子と共に結晶化しコンピューターモデリングアルゴリズムを用いてさらなる薬剤発見改良を行うことが望ましいことがある。この改良処理はこの分野で知られており、リードTSPIまたはGSPIの薬物作用仮説を決定するための、比較分子場解析を含む３次元定量的構造活性相関(QSAR)および分子ホログラムQSARを含む二次元QSARおよび固有値決定、および空間的、格子-ベース、ソフトポテンシャルエネルギー関数を含む標的構造を用いたリードTSPIのドッキング解析、およびモンテ-カルロ、リガンド-パイルアップおよびプローブアルゴリズムを含むドッキングプログラムの利用が含まれるが、これらに限定されない。
工程XIII：デリバリー分子の付加
リード化合物が決定したならば、油-水分配エンハンサーを含むデリバリー分子をその化合物、候補リード化合物に付加することができる。デリバリー分子は薬剤分子の膜透過性を増強する置換基または独立に会合した分子であり、好ましくはその薬剤の他の特性の薬剤様効能を低下させない。
【０１８７】
実施例
本発明は以下の実施例によって説明される。特定の実施例、材料、量および手順は本明細書に記載した発明の範囲および精神に従って広く解釈すべきである。
実施例１：精製したTaenia soliumシステインプロテアーゼおよびTaenia solium粗混合物による切断のための最適環境条件の決定（「工程P」、予備的工程）
精製Taeniaシステインプロテアーゼのための最適条件決定
Taenia soliumの被覆体壁システインプロテアーゼを被覆体壁から精製した。システインプロテアーゼ活性の精製と特徴付けの詳細は特許WO 00/63350（2000年１０月26日公開）に記載されている。この工程ではこのシステインプロテアーゼについて最適な活性部位触媒反応を可能とする正確なpHおよび環境条件が、10mMシステインを必要としpH4.9であることを決定した。活性のための最適インキュベーション温度は37℃であった。
【０１８８】
「粗混合物」調製物のための最適条件決定
Taenia solium被覆体の凍結乾燥混合物を使用した。我々は精製プロテアーゼの最適活性パラメーターを既に知ってはいたが、最適条件がどのようなものであるかを確かめ、類似であるという確信を得るため、新たな「混合物」から再度最適活性を決定することを望んだ。この混合物中の多数のプロテアーゼのため、標的システインプロテアーゼについての最適動作可能触媒反応環境を得るために注意を払うことが特に重要であった。決定された環境がより「微調整」されているほど、その環境領域で活性であるプロテアーゼの数を低減する可能性が大きい。しかしながら、一群の基質の最適切断のための環境条件が決定される場合、そのプロテアーゼのイソ型または１以上のプロテアーゼが与えられた条件で最適である可能性がなお存在する。しかしながら、１以上のプロテアーゼが与えられた条件について最適レベルにある場合であっても、触媒反応における生化学的機構がある保存されたパターンに従うことはあり得ることでまたありそうなことである。これは、活性部位における類似の生化学的機構のみを理由として特定の環境条件下で１以上の種類のプロテアーゼによる切断が最適であろうという事実に基づいている。実際、プロテアーゼの種々のクラスについて活性部位レベルにおける有意な保存が既に報告されている。
【０１８９】
しかしながら、詳しく解析しなければ、２以上の種類が特定の環境下で完全に保存された機構を共通に有するかどうかを評価することは不可能である。それにも関わらずこれらの手順は、与えられた環境で機能する１以上のプロテアーゼの活性部位機構の保存性が確かに存在し、その活性部位に特異的な阻害因子はそれらのプロテアーゼに対して触媒反応事象を排除するはずであるという仮定に直ちに従う。この仮定が完全に満たされない場合であっても、以下に概説する手順は１又は他の、または全ての活性部位に対するいくらかのアフィニティーを有する阻害因子を生成するために仮説として採用される。後の実施例に記載するように、精製プロテアーゼに対して粗混合物に対するのと同じ阻害因子が作製されている。この場合も、先の議論は１以上のプロテアーゼが非常に特異的な環境条件で活性であることを仮定している。しかしながら、この条件で活性なプロテアーゼがただ一つだけ存在したかもしれないという事実を無視してはならない。
【０１９０】
粗混合物の最適環境を決定するために使用した手順は以下の通りである：
１．粗混合物の調製
粗混合物は以下のように調製した。凍結乾燥したTaenia solium（有鉤条虫）の被覆体をメキシコのブタ嚢中症風土病地域の村の６〜１２ヶ月齢の嚢虫症ブタから採取した。メタセストードを注意深く寄生した組織から切り出し、PBSで３回洗浄し、凍結乾燥した。寄生虫抽出物は0.01gの凍結乾燥被覆体を10mlの抽出バッファー（0.4Mクエン酸塩、pH4.9）に懸濁することによって調製した。被覆体を４℃にて断続的にインキュベーション（５分間）しながら５分間隔のヴォルテックスを３回行った。粒子状材料を遠心（20,000xg）によって除去し、得られた溶液画分を濾過した(0.2μM)。
２．最適pHの決定
クエン酸-リン酸(CP)緩衝系（Maniatis）を用いて広範なpH対活性曲線を作製した。このアッセイでは、Z-Phe-Arg-AFC（供給業者Enzyme Systems Products）を使用して活性に対するスクリーニングを行った。なぜなら、この基質はシステインプロテアーゼに対する共通の基質として知られているからである。Z-Phe-Arg-AFCと少量の粗混合物のインキュベーションによりベル型のpH対活性曲線が得られ、最適pHが4.9であり、これは精製プロテアーゼの最適pHと同一であった。
【０１９１】
３．粗混合物活性の最適化
pH最適値および一般的検出基質が明らかになったので、基質切断活性に関する粗混合物濃度用量曲線を作製した。粗混合物を濃度を増加させながら決定したpH最適値にてZ-Phe-Arg-AFCに加えた。続いて、各濃度におけるプロテアーゼの活性を経時的に追跡した。記録した活性を決定した濃度と時間を測定した。我々の結果は、10μlという少量の出発材料で、基質と共に５時間のインキュベーション後も検出可能なタンパク質分解活性を明らかにした。
４．外因性変数および最適インキュベーション温度の決定
Z-Phe-Arg-AFCに対する粗混合物のタンパク質分解活性は10mM L-システインをアッセイバッファーに添加することによって増強された。
これらの結果は粗混合物を続くアッセイにおいてインキュベーションすべき最適変数を与えた。
【０１９２】
実施例２：高kcat基質および低kcat基質の決定（「工程II」）
この工程では、システインプロテアーゼの検出のための最も効果的な基質（高kcat基質）をあまりよく切断されない（低kcat基質）と共に決定した。これ以後、全てのアッセイに以下の条件を使用した：アッセイバッファーは0.4Mクエン酸塩、pH4.9（このプロテアーゼのpH最適値）。インキュベーション時間は37℃にて18時間とした。これらの条件は予備的データによりこのプロテアーゼの動力学的評価には最良であると決定されていた。全ての基質は新たにEnzyme System Products社（Livermore、CA）から購入し、最良の安定状態を保証するため購入から3ヶ月以内に使用した。実験は6x50mMのホウケイ酸微量培養試験管（Fisher Scientic）中で行い、AFC切断の検出には蛍光測定器（Tuner）を用いた。
【０１９３】
A.  合成基質のスクリーニング
全8420アミノ酸の切断可能性は利用できなかったので、代表的な基質を使用した。従って、この実施例は、基質の部分集団だけをこの工程および後続の工程に使用するという状況でどのように本方法が適合させられるかを示すために採用することもできる。この部分集団を選択するため、代表的なアミノ酸（すなわち、酸性、塩基性、極性、非荷電アミノ酸価カテゴリーから選ぶ）を、67の小さなペプチドの組と共にP3-P1位置について可能な多数のカテゴリーのモチーフを作製できるように選択した（図4a、および図4bの表を参照せよ）。Taenia soliumの標的システインプロテアーゼを特許WO 00/63350に記載した精製法を用いて単離した。
およそ１μg（または、タンパク質分解的に検出可能な量）の精製標的システインプロテアーゼを１μgの各入手可能な基質と500μlのアッセイバッファー中で個別にインキュベーションした。この準備の間に、基質をアッセイバッファー中で短時間（20分間）プレインキュベーションして平衡状態に達してからプロテアーゼを加えた。切断評価は前に記載したようにC-末端に7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン（AFC）を連結させた合成基質ペプチドをプロテアーゼが切断する能力に基づいて行った。AFC連結トリペプチド、ジペプチド、およびモノペプチド（P3-P1に種々の置換を有する）はEnzyme Systems Products(Livermore, CA)から入手可能であり、この部分集団の供給源として使用した。酵素調製物とペプチドとをアッセイバッファー（クエン酸塩、pH4.9、0.01Mシステイン添加）中で一晩インキュベーションした後（18h、37℃）、遊離のAFCを蛍光分析的に測定した（励起405nm、放射505nm）。タンパク質分解性切断はAFC基を遊離し、これは標準的な蛍光測定器によって遊離の分子として測定可能であり、従前に確立しておいた標準曲線に基づいてモル量に変換される。蛍光測定器によるAFC検出の単純さはこの手順を促進し単純化する重要な要因である。
このアッセイにおいて１μgのTaeniaシステインプロテアーゼをアッセイバッファー中の飽和量のZ-Phe-Arg-AFC(4x10-5M)に加えた。実験は三つ組で行い少なくとも５回行ってAFC切断の変動が統計的に有意でないことを確認した。
【０１９４】
粗混合物：
Taenia solium「粗混合物」を調製するために、凍結乾燥したTaenia solium被覆体をメキシコのブタ嚢虫症風土病地域の村の６〜12月齢の嚢虫症ブタから採取した。寄生組織からメタセストードを注意深く切り出し、PBSで３回洗浄し、凍結乾燥した。凍結乾燥被覆体0.1gを室温にて10mlの抽出バッファー中（0.4クエン酸塩、pH4.9）に懸濁させて寄生虫抽出物を調製した。被覆体を断続的（５分間）に４℃にてインキュベーションしながら３回５分間隔でボルテックスした。粒子状材料を遠心（20,000 x g、120分間）により除去し、得られた可溶性画分を濾過した（２μM）。アッセイバッファー中で、上述したように検出可能量の粗混合物を使用し、標的基質と共にインキュベーションした。
【０１９５】
Ｂ．初期基質の最適切断に関する動力学的パラメータの評価
精製標的プロテアーゼによる基質切断のVmaxおよび粗混合物プロテーゼによる基質切断のVmaxはこの技術分野で既に記載されている。
C. 高および低Vmax（またはKcat）基質の同定
上述の結果に基づいて、Vmaxについて最高および最低の値を有する基質を同定した。エンドペプチダーゼ基質、Z-Phe-Arg-AFC（Z=C6H5-CH2-O-CO-、N-末端の保護基）が精製システインプロテアーゼによって最適に切断される基質であって、従って、最高のVmaxによって特徴づけられることを明らかにした。Z-FAR-AFC、Z-AAK-AFC、Z-AP-AFCおよびZ-VLR-AFCによる切断がこの順で続く。これらの基質は次の工程で使用する「カクテル」を構成し得る。
【０１９６】
Vmax基質について２つの可能性があると我々は考える：１）これらの基質はターンオーバーされず結合しない、または、２）これらの基質は非触媒反応的に結合し、ターンオーバーせず、おそらくは活性部位に固定される。後者の条件に従う基質は結合はするがターンオーバーに資する生化学的特徴を保持していないので、これらは本方法にとってもっとも関心のある基質である。背景技術の部で論じたように、ペプチドコアに重要な利点を付与するのはこの特徴である。なぜなら、このペプチドコアの目的は（ESBおよびTSBを低下させることによって）最大の有利な結合性相互作用を示すことであって、触媒反応性結合ペプチドコアのようにTSRを低下させることではないからである。
我々の結果に基づいて、多数の非切断性かつ強く結合するT. solium システインプロテアーゼの基質が存在した。それらには、Z-Leu-Leu-Leu-AFC(Z-LLL-AFC)、Z-Leu-Leu-Tyr-AFC(Z-LLY-AFC)、Mu-Leu-Tyr-AFC(M-LY-AFC)、Boc-Val-Pro-Arg-AFC(B-VPR-AFC),Z-Leu-Gly-Arg-AFC(Z-LGR-AFC)その他（図４ａ）が含まれる。典型的には、利用できる全部分集団を用いて、非切断性基質の全ては直ちに次の工程に移されるであろう。この実行によって本手順のこの部分が終了する。
しかしながら、全8420種のペプチドの組合わせ全てが利用できず、従ってどの基質が切断されず、かつ結合するかに関する予測は相互作用検索によってなされなければならないというシナリオもある。従って、我々は、どのアミノ酸が潜在的に酵素サブサイト位置、P1からP3、のそれぞれに「固定」されるかに関する予測を採用し、これらのどのアミノ酸の組み合わせが次の工程に移すのに最良であるかを予測した。この置換検索の例は以下の工程で提供され、全部分集団資源を利用できない研究者はこれを使用することができる。
【０１９７】
１．ターンオーバー基質中のアミノ酸モチーフを最初に同定した。切断された基質は活性部位に結合する特異的なサブサイト位置にアミノ酸モチーフが存在することを示唆する。この情報は注意して使用しなければならないが有用である。このアミノ酸は高Kcat基質中に存在するので、それらはTSBおよびESBにおける結合に関与しているかもしれない。例えば、図4aに見られるように、D-VLR-AFCおよびZ-FR-AFCはどちらも切断された。この例では、P2のLeuまたはPhe（いずれも非極性置換基を有する）が結合することができ、したがって強く阻害的であろうという予測を立てた。そこで我々は仮説の中でP2にLeuまたはPheを「固定」した。さらに、切断されなかった基質を調べた。Mu-LY-AFCおよびMeoSuc-FLF-AFC(MeOS-FLF-AFC)はどちらも切断されなかったことが注目される。従って、LeuがP2に存在したことは興味深い。Leuは切断性基質（例えばD-VLR-AFC）および非切断性基質（例えばMu-LY-AFC）のどちらにおいてもP2に存在していたので、我々はこのアミノ酸が活性部位に結合し、（例えば、最もよく切断された基質Z-FR-AFCを用いた競合アッセイにおいて）強い阻害性であろうという仮説をたてることができた。したがって、Leuはこの仮説ではP2に固定されることが確かめられた。
【０１９８】
２．どのアミノ酸がP2のLと一緒によく作用するかを明らかにするために「相互作用」調査を行った。理解されるように、P1のYが非常によく切断される基質であり、従って、EY-AFCおよびMu-LY-AFCのようによく結合していたのであろう。さらにP3のVおよびP1のRが重要であるらしかった（例えば、D-VLR-AFC、Boc-VPR-AFC）。
３．「独立」非切断性調査を行った。P2におけるLにかかわらず、どのモチーフが非切断性なのかという問題を取り扱う。例えば、EY-AFCは切断されず、従って、P2におけるEは非常に重要なモチーフであったかもしれない。
４．モチーフはビヒクルコア仮説に要約される。T.soliumシステインプロテアーゼの例について、ビヒクルコア中の種々の位置のアミノ酸に関する我々の仮説は以下の通りである：
P1：R、Y
P2：L、F、E
P3：V
【０１９９】
サブサイトのそれぞれにおける予測されるアミノ酸の探索のためのこの型のアルゴリズムは8,420種のアミノ酸の完全な部分集合が入手できない場合にのみおこなわれるということを再度強調する。この仮説は工程IIIの後でも同様に有用になる。
【０２００】
粗混合物による結果
精製プロテアーゼに関する工程と類似の工程をここで使用した。以下に記載するように、粗混合物に対してプロテアーゼ阻害因子の同定に関する類似の結論が得られ、同一の仮説が導かれた（図４ｂ）。最もよく切断された基質はそれぞれ、Z-FR-AFC、Z-FAR-AFC、Z-AAK-AFC、AP-AFC、Z-VLR-AFCであったことは注目に値する。この切断パターンは、他と共に注目されるが、精製プロテアーゼについて得られた切断パターンと非常によく類似していた。これらの結果に基づき、粗混合物と精製プロテアーゼのタンパク質分解性活性は同等であると結論づけた。さらに、切断されない基質も非常に類似していたが、切断されない基質については相対的な切断性に僅かな変動が見られた。しかしながら、蛍光測定器の読取りはバックグラウンド効果のせいで低い読取り値においては僅かな変動を示す傾向があるので、これは予測されることである。
【０２０１】
実施例３：阻害的非触媒反応性結合基質の同定（「工程III」）
この工程の目的は２つあった。第１は工程IIの２つの低Vmax基質のどちらが低いKm値をも示すかを決定することである。この実験は、結合性を欠くために低ターンオーバーを示した低Vmax基質とプロテアーゼの強固な非触媒反応性結合のために低いVmaxを有していた基質、とを差別化する。これらの後者を同定することが目的である。動力学的観点から、TSRを低下させることなく、非常に強固な結合（ESBがESRよりも低下するためにESが低下する；TSBは低下するがTSRは低下しない）によって特徴づけられる酵素／基質対が同定された。第２に、非常に強固に結合するので全ての高Vmax基質の切断を阻害する基質を差別化するためにこの工程を使用した。その結果、最も一般的に結合するトリペプチド、ジペプチドまたは単一アミノ酸の組み合わせ（典型的には高Kcat/Km比を有する）よりも動力学的により有利な様式で活性部位に結合することのできる一連のトリペプチド、ジペプチドまたは単一アミノ酸モチーフが得られた。
【０２０２】
Ａ．高および低Vmax基質の選択
高いVmax値を有する基質の全集団(67のうちから)の上位1.4％の基質を選択して「TOP1.4％カクテル」を作製した。Kcatも使用することができたが、ここでは「Vmax」を採用した。基質の数が少ないので「BOTTOM％」基質についてはパーセンテージを選択しなかった。あるいは、10μM/hr以下という値によって決定したところによれば切断されなかった全ての基質をこの工程で競合能について調べるべく選択した。以下では用語「ビヒクル」はパーセントカクテルの切断を阻害することのできる低Vmax基質を表すこととする。この例では、TOP1.4％カクテルの切断を阻害する「ビヒクル」をテストした（これらは活性部位にデリバリーされた）工程IIの我々の結果に基づき、このTOP1.4％カクテルは最もよく切断された基質Z-Phe-Arg-AFCを含む。
このTOP％基質についてストリンジェンシーレベルを設定するためにいくつかのアッセイを行った。いくつかの実験の過程で、カクテルに１つの基質を補充することによって阻害結果を差別化できることを明らかにした。いいかえると、パーセントカクテルの増加は１つの基質を増加させることによって行った。この増加により阻害の「希釈」という現象が明らかになった。
【０２０３】
B.  初期プールの解析
非切断性低Vmax基質と最も高いVmax基質、Z-Phe-Arg-AFCとの間の競合試験から実験を開始した。「アッセイの改良」のところに記載したように低Vmax基質とZ-Phe-Arg-AFC間の濃度を相対阻害プロファイルが得られるまで変動させた。相対阻害パターンが得られる最適濃度は以下の通りであることが見出された：最終アッセイバッファー中（最終濃度500μｌ）の高Vmax基質は1x10-6Mであることが必要であり、低Kcat基質は最終アッセイバッファー中で8x10-6Mの濃度であることが必要であった。
従って、試験群を用意するため、Z-Phe-Arg-AFCを最初に1x10-6Mの濃度でアッセイバッファー中（10mM L-システイン添加0.2Mクエン酸塩、pH4.9）に加えた。次に各々の非切断性低Vmax基質を個別にそれぞれの試験管に最終濃度8x10-6Mで加えた。この混合物を30分間平衡化させた。最後に、飽和条件を保証するため高および低Vmax基質の各濃度よりも常に50倍低い濃度で、活性な精製酵素をこれらのそれぞれの試験管に加えた。この濃度は精製毎に変動し、量は精製酵素の収率と比活性に依存した。
【０２０４】
陽性対照は試験群と類似の方法で用意したが、低Vmax基質の代わりに（低Vmax添加容量と等しい体積で）溶媒を加えた。全ての基質はジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解することができたので、これを溶媒として選択した。陰性対照は低Vmaxおよび高Vmax基質をプロテアーゼを含まない試験管に添加することによって用意した。従って、非-タンパク質分解的に生じ得るAFCの遊離はこの試験管で管理した（これらの基質が不安定である場合は簡単にAFCを遊離するので、AFC基質の安定性を監視する工夫でもある）。試験管の組をこの陰性対照用に設置した。
全ての対照は三つ組で用意し、実験は少なくとも５回行った。これらのアッセイは37℃、一晩、18時間行った
パーセント阻害は以下のように計算した：
％阻害＝
{("Y"についてAFC陽性―"Y"についてAFC陰性)―(AFC試験−"Y"についてAFC陰性)}/("Y"についてAFC陽性−"Y"についてAFC陰性) x 100
阻害性であった低Vmax基質は標的プロテアーゼの活性部位へ実際にデリバリーされるので、これらを「ビヒクル」と呼ぶことにする。高Vmax基質カクテルおよびビヒクルの上述した濃度はもっとも差別化された阻害プロファイルを生じさせたので、これらを後の使用について「固定」した。
【０２０５】
C-E：ビヒクルのさらなる用量スクリーニング
この工程では、非常に有望な候補ビヒクルの阻害能間でより明瞭な差別化を可能とするため条件をよりストリンジェントにした。これを行うため、ビヒクルをもっともよく切断された基質の増加列と競合させた（各増分は更なる基質の添加を意味する）。
高Vmax基質の2.9％カクテルを作製した。これはZ-FR-AFCおよび次善の切断性基質Z-FAR-AFCからなっていた。上記の初期スクリーニングから移行させたビヒクルを再度この新たなカクテルとの競合阻害能について調べた。これらの濃度は前のプロトコル中で「固定」したのと同じ濃度に設定した。言い換えると、8x10-6Mのビヒクルを1x10-6MのZ-FR-AFCおよび1x10-6MのZ-FAR-AFCを含む試験管に加えた。最後に活性なプロテアーゼを（飽和条件を保証するため）高Vmax基質の濃度の50倍低い濃度で加えた。
【０２０６】
同様な実験方法で、4.4％、5.9％、および7,4％カクテルを有望なビヒクルのそれぞれとテストした。パーセンテージの各増加は高Vmax基質の追加による増加を表す。カクテル中のそれぞれの構成成分は8x10-6Mのビヒクルにそれぞれ1x10-6Mで加えた。カクテル中の組成は以下の通りである：4.4％カクテル：Z-FR-AFC、Z-FAR-AFCおよびZ-AAK-AFC（三番目によく切断された基質）；5.9％カクテル：Z-FR-AFC、Z-AFR-AFC、Z-AAK-AFCおよびAP-AFC（４番目によく切断された基質）；7.4％カクテル：Z-FR-FC、Z-FAR-AFC、Z-AAK-AFC、AP-AFCおよびZ-VLR-AFC。カクテル中の基質の数はここで止めた。なぜなら、ビヒクルの阻害能は「希釈」され得るという確信が得られたからである。
【０２０７】
F,G：Kiおよび最終順位の決定
最後に、取り扱い可能な候補ビヒクルの組を調べた。Ki測定を候補のそれぞれについて行った（データ未提示）。この測定はディクソンプロットによって行い、通常の動力学的モデリング法により補強した。これらは当業者にはよく知られた方法である。この実験においてビヒクルは「阻害因子」として扱われる。ビヒクル濃度は実験的に良好なKi値を得るためKi値の0.5〜５倍に変動させた。高Vmaxカクテル中の種々の基質の全てをKiの決定のために使用し、それによってこれらの基質集団濃度を飽和濃度（Kmの50〜100倍）に維持した。この計算の便利な特徴は、これらのビヒクルについて決定されたKi値はそのビヒクルを基質として用いた場合のKm値にも等しいという点である。
本工程は候補阻害ビヒクルの最終的な順位付けに終わる。Ki値が低いほど、そのビヒクルに割り当てられる順位は高い。Ki決定を最終的な順位付けの唯一の基礎とした。
【０２０８】
結果と考察
この工程における実験計画を通じて、２つの主要な結果を導き出すことができた。第１に、低Vmax基質のどれが精製システインプロテアーゼの阻害を生じさせるかを決定した。これらの低Vmax基質は「ビヒクル」と呼ぶ。第２に、この実験はビヒクル間で阻害能を差別化することができ、これはKi値に基づく最終的な順位付けに至った。
競合プール中の基質の数を増加させれば基質と高Vnax基質との間の競合のストリンジェンシーを増大させ、その結果より阻害性の低いビヒクルの阻害能を「希釈」するであろうという仮説は正しいものであった。これを示すため、Z-FR-AFCをTOP1.4％カクテル中の高Vmax基質として使用し、切断されなかった全ての低Vmax基質に対して競合因子としてテストした。競合により、以下の最も高い阻害能を有するビヒクルから最も低い阻害能を有するものについて（Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFC、Mu-LY-AFC、Boc-VPR-AFC、Z-RR-AFC、Z-SY-AFC、B-LGR-AFC、Z-FLF-AFC、m-PK-AFC、L-W-AFC等）それぞれ図5aに示したようなサンプル相対阻害プロファイルが得られた。これらの基質は、活性部位に「デリバリー」されたはずだという我々の観察の基づき「ビヒクル」と考えられる。われわれはビヒクルの成功を以下の３つのパラメーターによって評価した：阻害の能力、阻害の維持、および阻害の堅牢性。
【０２０９】
これらのパラメーターの最初の２つはビヒクル阻害指数(V)を得るために使用する。
ビヒクル能の最初パラメータはTOP％カクテル存在下におけるパーセント阻害として定義される。言い換えると、1.4％カクテルの存在下におけるパーセント阻害が高いほど、阻害の能力が大きいとした。これらのビヒクルを解析するため、我々は３つの阻害階層を見出した。述べたとおりこれらは、1.4％カクテルの存在下における阻害によって定義した。これらの階層はちょうど「ベル型曲線」が複数に分裂するように現れる筈である。最初の階層は、1.4％カクテルの存在下で50％より高い阻害を生じたビヒクルから構成される。第２階層は、1.4％カクテルの存在下で20〜50％阻害を生じたビヒクルから構成される。第３階層は、1.4％カクテルの存在下で20％より低い阻害を生じたビヒクルから構成される。典型的には、上述したとおり、最高位階層中のビヒクルのみをカクテル％を増大させた次の解析工程に進める。しかしながら、阻害の効果を調べるため全てのビヒクルを次のカクテル工程に進めた。
【０２１０】
阻害の「維持」を調べるため、カクテルの組成を増加させることによってビヒクルを阻害に曝露した。「阻害の維持」は最終％（7.4％）カクテルの存在下におけるビヒクルの阻害能によって決定した。次のカクテル添加を2.9％、4.4％、5.9％および7.4％に上昇させた（2.9％：Z-FR-AFC+Z-FAR-AFC；4.4％：Z-FR-AFC+Z-FAR-AFC+Z-AAK-AFC；5.9％：Z-FR-AFC+Z-FAR-AFC+Z-AAK-AFC+AP-AFC；7.4％：Z-FR-AFC+Z-FAR-AFC+Z-AAK-AFC+AP-AFC+Z-VLR-AFC）。このテストの目的はどのビヒクルが相当の阻害を維持し、どれが「希釈」されることによって阻害能を失うかを決定することである。相当な阻害を維持するため、われわれは最高位階層についてカットオフパラメーターを50％と定義した。従って、7.9％カクテルの存在下で50％以上の阻害によって特徴付けられるビヒクルを阻害を「維持した」と考えた。図4aにみられるように、Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFCおよびmu-LY-AFCのそれぞれの阻害能は最終カクテル(7.4％)で維持され、50％以上の阻害を生じさせた。逆に、第２階層の阻害性ビヒクル、Boc-VPR-AFC、Z-SY-AFC、Z-RR-AFC、Z-FLF-AFCおよびZ-LGR-AFCの阻害能は最終カクテル(7.4％)で希釈され、生じた阻害は20％未満であった。ビヒクルの第３階層は残りの全てのビヒクルを含む：これらは非常に僅かな阻害を生じさせ、従って維持されなかった。
【０２１１】
このデータから、強固に結合したビヒクルはその阻害能をもっともよく「維持」する可能性があると結論付けた。これは強固な様式で真に結合するビヒクルについて予測されることであろう。強い阻害を生じさせるが最終％カクテルでそれを「維持」しないビヒクルは排除されるであろうが、そのような場合は観察されなかった。例えば、Z-LLL-AFCが1.4％カクテルで90％という強い阻害を生じさせるが、最終7.4％カクテルでは20％阻害しか生じさせないのであれば、阻害を維持できなかったので、排除されるであろう。反対に、Mu-LY-AFCが80％の阻害能を示し、7.4％カクテルについて60％で阻害能を維持したならば、Z-LLL-AFCよりも高位に順位付けされるであろう。このように、阻害の維持は重要なパラメーターであると考えた。しかしながら、排除のためのパラメーターは、以下に論じるビヒクル阻害指数に基づく。
【０２１２】
さらに、阻害の「堅牢さ」に注目した。われわれは1.4％および7.9％カクテル間で阻害が僅かしか失われないビヒクルとして、阻害の堅牢さを定義した。第１系階層のビヒクルについての阻害のパーセンテージ低下は典型的には第２および第３階層のビヒクルの阻害のパーセンテージ低下よりも少なかった。例えば、Z-LLL-AFCはB-VPR-AFCよりも顕著に堅牢なビヒクルであった。図５に示したように、Z-LLL-AFCについて1.4％と7.9％カクテル間の阻害のパーセンテージ低下は僅かに25％であったが、B-VPR-AFCの同じ低下は38％であった。しかしながら、「堅牢さ」はアッセイの定性的測定値以上のものとして注目されるが、ビヒクル阻害能決定の最良の態様を与えるものではない。
あるいは、阻害能と維持というパラメーターは直接的なビヒクル阻害指数、V=P * Mを与える。Pはトップカクテルの存在下におけるパーセント阻害に等しく、Mは使用した最後のカクテル存在下におけるパーセンテージ阻害に等しい。V値が高いほど、阻害が大きい。この結果に基づき、以下のV値を計算した（表１）。
【０２１３】
表１．ビヒクルおよびV値順位
2004535560.tif 000011
【０２１４】
我々は、カクテルのパーセンテージを増加させるとカクテルとビヒクル間の阻害のストリンジェンシーが増加することを示した。言い換えると、カクテルの「用量」の増加はもっとも高い阻害能を有する基質の選択を可能とし、一方、あまり能力のない基質の阻害能を「希釈」した。これらの結果は、実験毎に首尾一貫していた。
最後に、I値によって決定した昇格した全ての上位阻害ビヒクルについてKiを決定した。このビヒクルを次にKi値に基づいて順位付けした。この手順に基づく最高位のビヒクルはZ-LLL-AFC、Z-LLY-AFCおよびMu-LY-AFCであった。ビヒクルの阻害能決定において、この実験のいくつかの利点を明らかにしてきた。第１に、この方法は迅速であり、67の基質からなる元のリストから明らかにされた最も高度に切断された基質よりもシステインプロテアーゼの活性部位に対して高い活性を有する阻害的非触媒反応性基質の鍵となるプールを同定するための効率的な「フィルタリング」機構として機能した。第２に、カクテルのパーセンテージを増加させることにより、Ki決定という実験的な重荷を実際には背負うことなくビヒクル阻害能の順位付けが可能となった。あるいは、直接的なV指数を某グラフ中のデータから計算した。次に最上位階層における最も高いV値を有するビヒクルについてKi値を決定した。Kiはこの手順のまさしく最後まで実際には計算しなかった。
【０２１５】
これらの実験から導かれる２つの主要な結果があった：一つは理論的なものであり、もう一つは実践的なものである。第１に、我々は、Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFCおよびMu-LY-AFCはプロテアーゼの活性部位の溝に強固に結合することによって特徴付けられ、ESBを低下させると考えている。ESBにおける結合性相互作用はTSBにて保存されるという仮説に基づき（Menger、1992）、ESBを低下させることによってこの結合性基質はTSBの低下を生じさせる結合性相互作用を生じさせると我々は考えている。このことは結合特性を有するアミノ酸の組合せを明らかにするために利点となった。さらに、このペプチドコアは触媒反応性ではなかったので、TSはターンオーバーを生じさせるに充分なほど低下しなかった（TSRが低下しないので）。よって、このペプチドコアはその強い結合特性故に最終的な阻害分子を助けると予想されただけでなく、理論的にTSRを低下させないであろうから最終的な阻害分子に反作用的には働かないと予想された。実験により、システインプロテアーゼに対して非触媒反応的に結合するビヒクルを明らかにした。その実験では、触媒反応に作用している個々の構成成分を明らかにすることなく、結合を効率的なやり方で決定した。
【０２１６】
この実験からの第２の主要な結果は、後続の阻害性試験工程において使用することのできる上位ビヒクル「仮説」を構築することができたことである。この仮説は後続する（工程VII）不活性化反応体付加物のコンビナトリアル系列のための鋳型を形成する。典型的には、8,420種のビヒクルの完全な組が入手可能であろうし、最低のKi値を有する最上位阻害因子を次の工程に進めるであろう。しかし、我々は阻害因子の全部分集団を持っていなかったので、このスクリーニングからの上位阻害因子、Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFCおよびMu-LY-AFCがトリペプチド、ジペプチドおよびモノペプチドに可能な全8,420アミノ酸組合せの中で上位ビヒクルであるかどうか完全に確信がなかった。
このため、われわれは、阻害に関する他の好ましいZ-LLL-AFCモチーフ上の基質アミノ酸位置に関する他の可能性について有用な予測をおこなうためにこの情報を利用しようと考えた。言い換えると、われわれはP1からP3におけるアミノ酸に関する他の仮説を探索し、新たなビヒクルコア仮説を展開しようとした。典型的には、この情報はテストすべき新たなビヒクルを設定するために等に使用することができる。繰り返すが、この状況は8,420アミノ酸の完全な部分集団が入手できない場合に関するものである。以下の抜粋は、この例によって設計予測がどのように行い得るかを示すものである。
【０２１７】
予測を始めるために、工程IIのコア「ビヒクル」仮説を再検討した。
われわれは戻ってこのコア仮説の成功を検証する：
P1:R,Y
P2：L,F,Q
P3：V
この仮説からのいくつかの結論は正しかった。以下の議論は、ビヒクル阻害に関する潜在的に多くの情報を工程IIによって収集することができ、従って予測のために有用であるという考え方を明瞭にするものである。例えば、P3のLおよびVは予測したように阻害能を明らかにした（例えば、Boc-VPR-AFC、Z-LLL-AFCおよびZ-LLY-AFC）。さらに、P2のLはZ-LLY-AFC、Z-LLL-AFCおよびMu-LY-AFCによるビヒクル阻害によって示されたように確かに有益であった。最後に、P1におけるR（例えばZ-VPR-AFC、Z-RR-AFC）もP1におけるYがそうであるように（例えば、Mu-LY-AFC、Z-EY-AFC）阻害能を示した。しかしながら、カクテル中に使用した最も切断された基質のいくつかもP1にRを有していたので（例えばZ-FR-AFC、Z-VLR-AFC）、P1におけるRは活性化され、従ってTSRの低下におそらく寄与するのであろうと考えた。結果として、P1におけるRは工程IIの仮説の下では好ましくない状況であると結論した。この最後の結論にもかかわらず、これらの結果は工程IIのコアビヒクル仮説は阻害に関して、工程IIIでテストすべき好結果の予測を与えることができたことを証明した。
【０２１８】
競合アッセイを利用したこの工程からの阻害性結果に基づき、新たなビヒクル仮説を導いた。上位ビヒクルが優先される。それらのビヒクルはZ-LLL-AFC、Z-LLY-AFCおよびMu-LY-AFCであった。従って、最上位候補ビヒクルをZ-LLL-AFCとし、２番目の上位ビヒクルをZ-LLY-AFCとした。これらの３つのビヒクルによる阻害はビヒクルのパネルの残りにおけるよりも常に高かったが、実験毎に非常に近似して維持されたことを述べておくのは重要である。診断目的について実験例を以下に示す。しかし、これらの結果に基づいて、新たなビヒクル仮説は以下の通りである：
一次仮説：P3にL、P2にLおよびP1にLまたはY
二次仮説：P3にF若しくはV、または、P1にF
【０２１９】
この仮説は以下の観察によって支持された。P3にLまたはFがある場合は常に1.4％カクテルに対して注目すべき（20％より大きい）阻害が見られた（例えば、Z-FLF-AFC、Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFC、Z-LRR-AFC、Z-LGR-AFC）。さらに、P2におけるLは工程IIコアビヒクル仮説において予測される観察、および最上位阻害ビヒクルの一部であることによって支持された。P2におけるLは、Z-FLF-AFC、Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFCを含む、P2にLを有する基質中で1.4％カクテルで注目すべき阻害（20％よりも大きい）を生じさせた。P1におけるLは補強されなかったが、Z-LLL-AFCによるこの工程における阻害能故にこの仮説の一部である。P1のYはこの工程（例えば、Z-EY-AFCおよびMu-LY-AFC）によって、および工程Iにおける潜在的候補として予測されたことによって支持された。さらに、二次仮説として、P3におけるV（例えば、B-VPR-AFCによる阻害に基づく）およびP3におけるF（Z-FLF-AFCによる阻害に基づく）が有益であろうと仮定した。
【０２２０】
低い阻害能を有するビヒクルについては、「希釈」効果における低い予測性しかなかったことは重要である。言い換えると、阻害能が低下すると、首尾一貫した希釈効果を得るのがより困難であった。これらの非触媒反応性ペプチドコアによる阻害性結合アフィニティーが減少するにつれて動力学の予測性が低くなるのはあり得ることである。結論として、上記の例は、資源が限られている場合に予測アルゴリズムがどのように得られるかを説明したものである。新たなビヒクルはビヒクルの最初のスクリーニング後にテストすることができる。8,420のアミノ酸の完全な部分集団が利用できない場合には、最終結果はビヒクル仮説である。
我々は、この実験から５つの結論を導いた。
１．上位ビヒクルによる阻害は強力で、維持され、かつ堅牢である傾向があった。
２．より下位のビヒクルにより阻害は強力でなく、維持されず、堅牢でなかった。
３．競合アッセイによる阻害は低いKi値を有するビヒクルを予測するために使用することができた。
４．より下位のビヒクルによる阻害は予測性が低く首尾一貫していないが、上位ビヒクルによる阻害はより予測性が高くより矛盾がなかった。
５．この工程に「フィードバック」すべき新たなビヒクルを決定するために予測アルゴリズムを使用することができた。この予測アルゴリズムは工程IIに由来するビヒクルコア仮説、およびこの工程から導かれる結合性および阻害性に関する結論に基づく。
われわれは予測アルゴリズムに基づいて追加のビヒクルを購入しなかった。代わりに、最初のスクリーニングに基づいて、上記で概説した１次仮説および２次仮説を直ちに次の工程へ進めた。１次仮説はZ-LLL-AFC、Z-LLY-AFCおよびMu-LY-AFCによる阻害に基づくものであった。これらのビヒクルの低Ki値（データ未提示）はまたこれらの阻害効力を補強した。
【０２２１】
粗混合物
この実験における最も興味深い発見の一つは、粗混合物を標的プロテアーゼの供給源として使用した場合に極めて類似した阻害パターンが競合アッセイについて得られたことである。阻害希釈の効果にはいくらかの変動があったものの、もっと高位に順位付けられたビヒクルは標的プロテアーゼによるプロファイルと比較して矛盾無く阻害性を維持した。ビヒクルの最高位階層の相対プロファイルおよび組成は同一であった。Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFC、Mu-LY-AFC、Boc-VPR-AFC、Z-SY-AFC、Z-RR-AFC、Z-FLF-AFCおよびZ-LGR-AFCは、それぞれそのV値（表２）に基づいて上位８つのビヒクルとして首尾一貫して現れた（図5b）。これらの結果から、Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFC、およびMu-LY-AFCはここでも最も強力で、維持され、かつ堅牢な阻害を生じさせることが明らかにされた。３つのビヒクルが非常に類似したV値を有していたことは注目に値した。興味深いことに、図5bに示した実験例において、Mu-LY-AFCは最も高いV値を与えていた。述べたように、このビヒクルはZ-LLL-AFCおよびZ-LLY-AFCと共に首尾一貫して最も阻害性のビヒクルであった。最も阻害性のビヒクル階層のV値を以下の表２に示した。ここでも、第１階層および第２階層のビヒクル間でV値に関する明瞭な断絶が認められる。
【０２２２】
表２．ビヒクルとV値順位
2004535560.tif 000012
【０２２３】
述べたように、低い結合能を有するビヒクルにおいて予測性の低さが予想される。同様に、ビヒクルの第３階層について阻害プロファイルに小さな変動が見られた。ここでも、これらの化合物による理想的な結合を予想してはおらず、従って、結合合相互作用はそれほど予測可能でないことを考えれば驚くことではない。
我々の結果は、精製プロテアーゼおよびそれが精製された粗寄生虫混合物の両方から、上位ビヒクルに対する高度に類似したプロファイルが得られることを証明したものである。これらの結果は、精製したシステインプロテアーゼと粗混合物の、10mM外来性L-システインを添加したpH4.9のアッセイバッファー中のタンパク質分解性挙動は類似の活性部位挙動を示すことを明らかにしたものである。これらの結果に基づいて、これらの切断環境条件下で類似の触媒反応機構がこの粗混合物と精製酵素によって使用された筈だと確信した。われわれは以下の仮説にさらに自信を持った：P1におけるLまたはY、P2におけるL、およびP3におけるL、は強力で、維持され、堅牢な様式で活性部位と強固な結合相互作用を与える。精製プロテアーゼおよび粗混合物の上位ビヒクル阻害プロファイル間で顕著な相違が見られたならば、与えられた環境条件下で同じタンパク質分解活性が動作していないかもしれないということに注意することは重要である。
【０２２４】
実施例４．天然阻害テスト（「工程IV」）
ここでは、ヒトIgG（このプロテアーゼの天然の基質であると我々がWO 00/63350特許の開示に示した）の切断を阻害する能力について、機構的クラスの異なる阻害因子との比較においてリード候補ビヒクルを調べた。この天然の基質の同定の基礎は、精製したシステインプロテイナーゼは、pHおよび還元環境がIgG分解アッセイにおいて使用したのと類似しているリソソーム液胞中でIgGを分解するであろうという我々の当然の仮定である。Threadgoldとその共同研究者達は、T.crassicepsの被覆体壁中に酸性液胞を明らかにした（Threadgold、1983）。従前の研究により、電子顕微鏡を用いてT.crassicepsの外被細胞および介在突起のリソソーム液胞中に電子密度の濃いZ-Phe-Arg-メトキシナフチルアミドの切断産物が局在したことが示され、これらが吸着性エンドサイトーシスにもリンクしていたことも示されている（Khalilら、1998）。Z-Phe-Argの加水分解がE-64によって阻止されたので、かれらは関与する酵素をシステインプロテイナーゼであると同定した。変化した宿主IgGがTaenia 被覆体の被覆体液中に見られたという観察（Hayungaら、1989）と併せて、ヒトIgGがこのシステインプロテイナーゼの酸性被覆体壁液胞における天然の基質であろうとわれわれは考えた。IgG加水分解のキネティクスが実際にZ-Phe-Argのキネティクスと類似しているのであれば、この相互作用は高度に特異的で触媒反応的に効率的であろうと仮定した。
【０２２５】
この評価を行うため、ウエスタンブロットを行った。IgG消化は20μlのT. solium精製酵素またはT.solium 抽出物を１μgのヒトIgG（Sigma、St.Louis）と共に最終体積100μlのアッセイバッファー中でインキュベーションして検出した。外来性チオール活性化はこのアッセイをシステインの存在下または非存在下でインキュベーションすることによって評価した。IgGプロテアーゼの触媒反応クラスは以下のプロテイナーゼ阻害因子をその活性な濃度において酵素およびビヒクル、Mu-Leu-Tyr-AFC（10-3M）とプレインキュベーションすることによって決定した：E64（10-6M、システインプロテイナーゼ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)(10-3M、セリンプロテイナーゼ)、ペプスタチンA（10-6M、アスパラギン酸プロテイナーゼ）、および1,10フェナントロリン（10-3M、メタロプロテイナーゼ）。IgGを加えた後、アッセイを一晩（37℃、18hrs）、インキュベーションした。続いて、100μlの混合物を２％の2-メルカプトエタノールを含むドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）サンプルバッファー中で煮沸し、12.5％SDS-PAGEで分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜上にブロットした。0.1％ウシ血清アルブミンおよび0.05％Tween20を含むTris緩衝化生理食塩水（TBS-BSA）を用いて非特異的結合をブロッキングした。このブロットを0.05％Tweenを含むTBS(TBS-Tween)で３回洗滌し、TBS-BSA中で1:1000に希釈したビオチン化抗ヒト重鎖および軽鎖抗体（Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN）とインキュベーションし、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン-アビジン複合体とインキュベーションした。このブロットを次に化学発光（ECLキット、Amersham International, Sweden）およびオートラジオグラフィーにかけた。
【０２２６】
結果と考察
ヒトIgGを精製システインプロテイナーゼとインキュベーションしたところ、重鎖および軽鎖の両方の分解が観察された。一般的なシステインプロテアーゼ阻害因子E64による阻害が見られた。典型的にはIgG分解は最上位ビヒクル、Z-LLL-AFCによる阻害によってテストされるであろう。この実施例については、最高位から３番目の阻害性ビヒクル、LeuではなくSuc（スクシニル）誘導化したMu-Leu-Tyr-AFCを代わりにテストした。重鎖の分解を図６に示した。同一の結果が粗混合物中でも見られたが（データ未提示）、IgG切断の阻害に必要なSuc-Leu-Tyr-AFCの濃度は粗混合物ではより高かった。これは、混合物中の他のプロテアーゼ存在下では阻害が正確でないかも知れないので予測し得る。
【０２２７】
実施例５：潜在的な「強力な」遷移状態または基底状態プロテアーゼ不活性化因子ビヒクルを形成する、ビヒクル／不活性化阻害因子の組合せの合成および収集（「工程VII」）
この時点までで、工程IIIの上位ビヒクル仮説（すなわち、好ましいペプチド残基）はLまたはYとして明らかされた。われわれは8,420のアミノ酸の完全な部分集団を利用していなかったので、最上位ビヒクルというよりも「仮説」を次の工程に進めた。我々の仮説に基づいて、我々はこのビヒクルコアは、付随する阻害因子に不都合なTSRの低下を起こすことなく、ESBおよびTSBのどちらにおいても保存される高結合性相互作用を表すと考えた。従って、この局面における目的はペプチドコアの結合性（このビヒクルについては既に特徴づけられている）からTSRにおける反応エネルギーを増大させ、基底状態ではそうでない不活性化反応体の探索へ関心を移すことである。従って、ビヒクルの結合部分をおそらくは基底状態および遷移状態構造の両方において一定に保ち、一方不活性化反応体を変動させた。次の数工程は本質的に、標的プロテアーゼを遷移状態において阻害する不活性化反応体をスクリーニングしたものである。
【０２２８】
Ａ．不活性化反応体のビヒクルへの共有結合連結
最初は不活性化反応体を上位ビヒクル仮説のP1残基のC末端に連結してプロテアーゼ不活性化因子を構築した。この仮説はZ-LLLおよびZ-LLYのどちらにも有利である。この目的のために選択した不活性化反応体はフルオロメチルケトン(FMK)、ビニルスルホン(VS)、およびエポキシドであった。Z-LLLへのフルオロメチルケトン連結はEnzyme Systems Products社(Livermore, CA)で行い、Z-LLL-ビニルスルホンおよびZ-LLL-エポキシドはJames Powders博士（GA Tech）から親切に供与された。次善の上位ビヒクル仮説、Z-LLYについて、フルオロメチルケトンおよびジアゾメチルケトン連結物はEnzyme Systems Products社によって合成された。不活性化反応体とビヒクルの連結は有機化学の分野でよく知られた、一般に行われるアミノ酸連結法に従った。Z-LLLモチーフに関する他の変異および二次仮説物（P3にFおよび、P1にF、P3にVは利用できなかった）はJames Powders博士（GA Tech）から親切に供与された。これらは図7aに含められている。
【０２２９】
合成産物は非常に高純度で提供された。不活性化反応体の官能基はシステインプロテアーゼの活性部位と四面体付加体を形成するそれらの能力に基づいて選択した。例えば、四面体付加体が律速段階に重要である例では（例えば、システインプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ）、親核性または親電子性攻撃（分子に依存する）によって律速段階の四面体幾何学配置を模倣する能力を持っているであろう不活性化反応体を優先させた。
もちろん、上位ビヒクルに連結できる不活性化反応体の数に関して理論的な限界はなく、研究者が利用できる資源に完全に依存したであろう。しかしながら、プロテアーゼ不活性化因子を作製するための上位ビヒクルへの不活性化反応体連結の数が多くなるほど、遷移状態プロテアーゼ不活性化因子(TSPI)の開発が成功する可能性が大きかった。我々の資源が限られていることを考慮して、少数の不活性化反応体を有するいくつかのビヒクルのライブラリーではなく、最上位ビヒクルについて不活性化反応体の大きなライブラリーを作製することを大きく優先させた。
【０２３０】
Ｂ．候補遷移状態プロテアーゼ不活性化因子決定のための阻害アッセイ
有機化学実験室でプロテアーゼ不活性化因子を合成したら、それらを、標的プロテアーゼの100％阻害を生じさせる効果的な最低濃度（EC100）についてテストすることにした。工程IIIの最終ビヒクル選抜工程で使用した上位パーセントカクテルを阻害のための供給源として使用した。この例では、Z-FR-AFC、Z-FAR-AFC、Z-AP-AFC、Z-AAK-AFCおよびZ-VLR-AFCを含む7.9％カクテルとした。最終結果として、低いEC100値と直接相関した高順位の遷移状態プロテアーゼ不活性化因子候補の順位表が得られた。以下はこのアッセイを説明したものである：
【０２３１】
工程Ａ：初期スクリーニング
テスト群を用意するため、各プロテアーゼ不活性化因子を（工程IIIにおいて最終的なビヒクルの差別化を生じさせた）５％カクテルとまずインキュベーションした。初めに、プロテアーゼ阻害因子を3x10-9Mの濃度にて500μlのアッセイバッファー中（0.2Mクエン酸塩、pH4.9、10mM L-システイン添加）でインキュベーションした。この濃度は、一連の阻害因子希釈によって、阻害能に差別化が見られることが示された最良の阻害因子濃度である。次に、個々のカクテル構成成分のそれぞれについて4x10-5Mに等しい濃度をこの混合物に加えた。これらの構成成分を30分間平衡化させた。最後に、この混合物中の最も低い濃度よりも常に少なくとも50倍低い濃度で、活性な精製酵素を試験管に加えた（飽和条件を満たすため）。この濃度は精製毎に変え、加えた量は精製酵素の収率と比活性に依存させた。
【０２３２】
陽性対照はテスト群について記載したように用意したが、プロテアーゼ不活性化因子に代えて溶媒を（低Kcat体積添加に等しい体積で）添加した。全てのプロテアーゼ不活性化因子はジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解できたので、従って、これを溶媒として選択した。陰性対照はプロテアーゼを加えずにプロテアーゼ不活性化因子とカクテル基質を試験管に加えることによって用意した。非タンパク質分解的に生じ得るAFCの遊離はこの試験管で管理した。
全ての対照は三つ組で用意し、実験は最低限５回繰り返した。このアッセイを37℃にて一晩インキュベーションした。パーセント阻害を以下のように計算した：
％阻害＝
{("SI"についてAFC陽性-"SI"についてAFC陰性)-(AFCテスト−"SI"についてAFC陰性)}／
（"SI"についてAFC陽性-"SI"についてAFC陰性）＊100
【０２３３】
工程Ｂ：阻害因子希釈調査およびEC100値に基づくプロテアーゼ不活性化因子の順位表作成
阻害因子の順位付けは初期スクリーニングだけで確立することができた可能性もあったが、かなりの数のプロテーゼ不活性化因子が100％標的プロテアーゼを阻害することが分かった（図７ａ）。
このため、実用的な順位表を決定するために希釈実験が必要であった。そこで、100％阻害について最も有効な濃度(EC100)が決定できるまで各プロテアーゼ不活性化因子の濃度を用量応答的に低下させた。差別化できるEC100パターンを確立するためには阻害因子はナノモル濃度レベルまで希釈しなければならなかった。このアッセイの最終結果として、プロテアーゼ不活性化因子の順位付けした候補リストが得られた。低いEC100は高い順位に帰属させることができ、その逆も可能であった。
【０２３４】
工程Ｃ．阻害因子Kiおよび阻害の様式の決定、並びに、阻害因子KiによるEC100表の最順位付け
次に、低EC100に基づいて上位に順位付けしたそれぞれのプロテアーゼ不活性化因子のKiは、EC100上位５つの阻害因子について評価した。
Kiを決定するため、高Vmaxカクテル基質の全てをKi測定に使用した（なぜなら酵素に対する阻害因子のKiは基質によらず同じだからである）。最良の正確さを保証するため、少なくとも３つの最小限の高Kcat基質についてKiを決定することとした。非線形フィッティングおよびディクソンプロットを両方とも用いて、上位に順位付けられたプロテアーゼ不活性化因子のKiを決定した。イーディーホフステーおよび／またはヘインズを用いた更なるプロットを行い、阻害の様式を決定した。
この実験において、標的システインプロテアーゼを阻害するいくつかのプロテアーゼ不活性化因子を明らかにした。上位阻害因子はZ-LLL-FMK、Z-LLY-FMK、Z-LLL-エポキシドおよびZ-LLL-VSであることが決定された。次に、上位５つの阻害因子についてKi値を評価し、決定した（データ未提示）。
【０２３５】
これらの結果に基づくと、Z-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMKはそれぞれ最も低いKi値を有していた。これらの阻害因子の顕著に低いKi値はこの阻害様式が遷移状態で生じることを示唆するものであった。なぜなら、この技術分野で明らかにされていたように、この範囲のKi値は遷移状態阻害因子に典型的なものであったからである。確かに、阻害様式が我々が仮定したようなものであるかどうかという疑問は残されていた。この最上位阻害因子のZ-LLL-部分は有意な結合性相互作用を生じさせ、ESBおよびTSBを低下させるがTSRを生じさせないと我々は考えた。さらに、我々は、フルオロメチルケトン部分は特異的に相互作用してTSRを上昇させるであろうという仮説を立てた。この仮説を調べるため、次にフルオロメチルケトン部分（Z-LLLに共役）が遷移状態でシステインプロテアーゼを阻害する能力についてスクリーニングすることにした。
粗混合物による結果
寄生虫抽出物の粗混合物を精製システインプロテアーゼの代わりに使用した場合、非常に類似した阻害系列が見られた。この顕著な類似性は、この粗混合物についてpH4.9にて決定されたタンパク質分解活性は確かに作用可能なシステインプロテアーゼによって生じたものであることを示す。さらに、他のイソ型（異なるタンパク質分解特性を有する）はpH4.9では支配的でなかったことを示すと我々は考えた。
【０２３６】
実施例６：標的プロテアーゼに選択的であるTSPIまたはGSPIを同定するためのディファレンシャル切断性試験（「工程VI」および「工程IX」）
この実施例では、ヒトプロテアーゼに対するビヒクルおよび阻害因子の選択性が調べられる。既に論じたように、選択性はプロテアーゼ阻害薬剤の重要かつ好ましい特徴である。なぜなら、選択性により薬剤はヒトまたは非ヒト宿主の一般的プロテアーゼに影響を与えることなく病原体の標的プロテアーゼを阻害することができるようになるからである。選択性を評価するため、適切な対照およびアッセイ設計を工程VIおよび工程IXの両方におけるのと同様に設定した。
このため、両方の工程をこの一つの実施例中で詳細に記載する。
アッセイを行うため、ビヒクル（工程VIについて）または阻害因子（工程XIについて）を適切な基質と正しいバッファー中でインキュベーションし、平衡化させた。続いて、プロテアーゼを加え、このアッセイを適切な時間、インキュベーションした。この実験に使用した濃度は以下の通りである：ビヒクルは最終アッセイバッファー中4x10-5Mに設定した；阻害因子は最終アッセイバッファー中3x10-10Mに設定した。好ましくは使用する用量は阻害を生じさせるために必要なビヒクルまたは阻害因子の最少量とすべきであった。ここに示した用量は阻害に充分であることが分かっていた量である。基質は特定の酵素の切断のための好ましい基質に基づいて設定した。
【０２３７】
陽性対照はテスト群について記載したのと同様に設定したが、阻害因子またはビヒクルの代わりに溶媒ブランクを（阻害因子またはビヒクル添加体積と等しい体積で）添加した。全ての阻害因子およびビヒクルはジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解できたので、これを溶媒として選択した。陰性対照はプロテアーゼ無しで阻害因子またはビヒクルおよび好ましい基質を試験管に加えることにより用意した。可能性のあるAFCの非-タンパク質分解性遊離はすべてこの試験管で管理した。
全ての対照は三つ組で設定し、実験は最低限５回行った。
パーセント阻害は以下のように計算した：
％阻害＝
{("SI"についてAFC陽性-"SI"についてAFC陰性)-(AFCテスト−"SI"についてAFC陰性)}／
（"SI"についてAFC陽性-"SI"についてAFC陰性）＊100
【０２３８】
この予備テストにおいて、以下のヒト由来酵素を使用した（括弧内に機構的クラスを示した）：カテプシンＢ（システイン）、カテプシンＬ（システイン）、カテプシンＨ（システイン）、カテプシンＤ（アスパラギン酸）、トリプシン（セリン）、精製有鉤条虫(Taenia solium)粗混合物。カテプシンＢは0.4Mクエン酸バッファー、pH6.1中10mM L-システインのバッファー中でZ-ARR-AFCを切断基質として用いて調製した。カテプシンＬは、0.4Mクエン酸バッファー、pH5.5中10mM L-システインのアッセイバッファー中でZ-FR-AFCを切断基質として用いて調製した。カテプシンＨは、0.15M PBSバッファー、pH6.8中10mM L-システインのアッセイバッファー中でL-R-AFCを切断基質として用いて調製した。カテプシンＤは、0.15M PBSバッファー、pH7.1のアッセイバッファー中でZ-RGFFP-AFCを切断基質として用いて調製した。トリプシンは、100mM CaCl2を添加した0.15M PBS、pH8.0のアッセイバッファー中でZ-R-AFCを切断基質として用いて調製した。飽和条件を保証するため、酵素が基質の濃度の少なくとも50倍低くなるようにして酵素をインキュベーションした。
【０２３９】
結果（表３）は、ビヒクルZ-LLL-AFC、A-LLY-AFC、Mu-LY-AFCおよび阻害因子Z-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMKはTaenia soliumシステインプロテアーゼの阻害に関して選択的であったことを示している。他のプロテアーゼの阻害は完全に無視できた。しかしながら、Z-LLL-FMKによるカテプシンＬの阻害がみられたことは注目に値するが、Taenia solium システインプロテアーゼの阻害のほぼ半分であった。この阻害はカテプシンＬとTaenia soliumシステインプロテアーゼ間で共有される、阻害因子結合に関する機構のわずかな類似性を表しているのかも知れないが、明らかに後者のプロテアーゼに対するZ-LLL-FMKの選択性が存在した。
さらに、Z-LLY-FMK(62％)はZ-LLL-FMK（98％）ほど効果的にはTaenia soliumプロテアーゼを阻害しなかったが、カテプシンLを全く阻害しなかった。この発見は、P1におけるYが選択的な結果には好ましいアミノ酸置換であることを表しているのであろう。上記で論じたように、これらの結果をビヒクルの更なる選択のために使用するかどうかは研究者が決定すべきことである。Z-LLL-FMKによるカテプシンＬの少しの、しかし、注目に値する阻害があったということ、および、この阻害はZ-LLY-FMKを基質として使用した場合は存在しなかったという事実に基づき、我々は（Z-LLL-FMKに加えて）Z-LLY-FMKの候補リード化合物としての有効性を更に調べた。現在、Z-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMKの遷移状態評価を行っているところであるが、予備的な結果はどちらも遷移状態特性を有していること示唆している。
【０２４０】
ビヒクルの中で、Mu-LY-AFCはカテプシンＬプロテアーゼの僅かな阻害を生じさせることが見られたが、これはTaenia soliumシステインプロテアーゼ阻害の僅かな割合に過ぎなかった。全てを同じ濃度で使用した場合、Z-LLL-AFCがZ-LLY-AFCおよびMu-LY-AFCよりも僅かに低い阻害を生じさせることが見られた。これは驚くべき発見ではない。上述したように、Z-LLL-AFC、Z-LLY-AFCおよびMu-LY-AFCは類似の阻害プロファイルを生じる傾向があり、それらはかなり似通っていて実験によっては時々区別できなかった。
これらの結果に基づいて、我々は、選択した全ビヒクルおよび阻害因子によるTaenia soliumシステインプロテアーゼの示差的阻害が明白であると結論した。どの阻害因子またはビヒクルも他のテストしたどのシステインプロテアーゼ酵素をどんな実質的程度にも阻害することが無かったことは注目すべきである。
【０２４１】
表３．上位阻害因子およびビヒクルの種々の機構クラスの一群のプロテアーゼに対する阻害選択性
2004535560.tif 000013
【０２４２】
実施例７：BALB/cマウスにおける、タエニア・クラッシセプス（T.crassiceps）システインプロテアーゼ切断低減におけるプロテアーゼ不活性化因子の評価（「工程VIII」）
以下の実験の目的は、遷移状態データを越えて動物モデルにおけるZ-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMKに関する概念を証明する評価を行うことである。この目的のため、ヒト神経嚢虫症(NCC)の動物モデルを使用した。NCCはヒト中枢神経系の最も一般的な寄生虫病であるとして記載され（Del Bruttoら、1993）、第三世界の多くの地域における癲癇型発作の主要な原因であると言われている（Tsangら、1995）。我々は、標的システインプロテアーゼがこの原因である寄生虫、Taenia soliumの宿主における生存を補助すると仮定した。幸運にも、関連寄生虫、Taenia crassicepsはBALB/cマウスを用いて動物モデルにおいて効率的に増殖させることができる。これをZ-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMKに関する概念証明研究の焦点とした。我々は、K-Pyr（Leu-Phe-ケトアミド-ピリジル）を対照として用いることとした。なぜなら、効果が低いが、これがこの標的システインプロテアーゼに対する第３位の阻害因子でもあったからである。
【０２４３】
我々はWO 00/63350に記載したように、Taenia crassicepsにTaenia soliumシステインプロテアーゼと類似するプロテアーゼが存在すること、およびその活性部位がTaenia soliumシステインプロテアーゼの活性部位に類似することを示す重要なデータを過去に提示した。このデータの一部には、ここで見出された上位阻害因子が精製T.crassicepsシステインプロテアーゼを同様に阻害するという発見が含まれており、これはさらに２つの酵素の活性部位の生化学的類似性を証明するものである（データ未提示）。この相同性に基づき、我々の予測は抗-T.soliumシステインプロテアーゼ阻害因子はT.crassicepsシステインプロテアーゼに対して阻害的効果を示し、このシステインプロテアーゼがこの寄生虫に真に重要であるなら被覆体に生物学的問題を生じさせるであろうというものであった。我々の知るところに依れば、このシステインプロテアーゼはこの寄生虫に免疫回避および免疫消費(immune exploitation)機能を与える(WO 00/63350)。我々は、これを阻害すると動物内で免疫応答による被覆体の認識が起こり、それによってその出芽過程および成長を阻害するであろうと予測した。これはテスト可能な仮説である。特異的阻害因子ロイシン-ロイシン-チロシン-フルオロメチルケトンおよびロイシン-ロイシン-ロイシン-フルオロメチルケトンで処置したBALB/cマウスは、それぞれ、代表的な実験において嚢虫症感染からそれぞれ85〜97％、および100％保護された。
【０２４４】
短期研究
被覆体壁システインプロテアーゼがTaenia被覆体の生活環に重大な機能を持ち得るという前提に基づいて、嚢虫症感染からマウスを保護する能力について、最も効果的な阻害因子、LLL-FMKおよびLLY-FMKをテストした（K-Pyrを対照として使用した）。LLY-FMKおよびLLL-FMKをそれぞれ予防薬としてBALB/cマウスを用いた予備試験においてテストした。処置群のマウスに阻害因子（〜1.4x10-2M、150μlの注射体積の0.15M PBSに溶解）を前もって２日間注射し、続いて、マウスあたり10個のT.crassiceps被覆体を感染させた。その後、マウスに毎日同じ濃度を４週間投与した。１ヶ月後、マウスを安楽死させ、被覆体を計数した。LLL-FMKで処置した群のマウスは嚢虫症感染から100％保護されていることが見出された（表４）。LLY-FMKで処置した群のマウスは未処置対照群に比較して、嚢虫症から85〜97％保護されていた（図８、代表的な全調査を示した）。その後の研究において、LLY-FMKを用いて同一の予防実験を繰り返し、同様な保護データ(75％〜90％)が明らかにされた。興味深いことに、この処置を生き延びた被覆体の高いパーセンテージのものが異常な形態を示していた。これらの被覆体の多くが、無極多房性（多葉性の外観）、異常な出芽パターンを示していた。組織学的検査をしたところ、多葉性被覆体は正常な浅裂被覆体に比較して拡張した壁を示した。K-Pyr（Leu-Phe-ケトアミド-ピリジル）で処置した群のマウスは40％保護された。
LLL-FMKを用いた治療研究も行い、マウスをT.crassiceps被覆体による感染から２週間後に阻害因子治療を開始した場合、60％保護されることが明らかになった。全ての群のマウスは顕著な副作用（例えば、毛並みの異常、尾部の引きずりまたは麻痺）なく生存した。
【０２４５】
長期研究
これらの阻害因子が保護効果を持続させる期間を評価するため長期調査も行った。ここに示した代表的な実験において、マウスを処置群および未処置群（５匹のマウス／群）に分けた。処置群の各マウスには２日間阻害因子を前もって腹腔内注射した。続いて、全ての群を200μlの0.15MのPBS中の10個のT.crasices被覆体に曝露した。阻害因子またはプラセボ(0.15M PBS)による処置は毎日、曝露後30日間行った。次に被覆体をおよそ５ヶ月間放置（未処置）し、その後安楽死させた。次に、解剖して視覚検査により被覆体を数えた。パーセント保護は対照（治療を受けなかった）に比較した被覆体の総数の低下に基づく。２つの上位阻害因子、Z-LLY-FMKおよびLLL-FMKはそれぞれ95％および80％マウスを保護し続けた。この研究の結果は、嚢虫症からの動物の保護は、長期にわたって存在し続けるということであって、これはこのモデルにおける阻害因子の有効性に対するさらなる証拠である。Z-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMKによる処置について副作用が全く見られなかったことも注目される。これはおそらく、非常に低用量の阻害因子を使用したためであろう。これに対して、B-FA-CH2FおよびZ-LF-VSPH（VSPHはビニルスルホンフェニル）群のマウスでは甲状腺腫および神経学的な問題を含む副作用がみられた。
【０２４６】
実施例８．システインプロテアーゼがZ-LLY-FMKによる特異的阻害の標的であることの証明
最後に、T.sliumシステインプロテアーゼのin vitro阻害の用量応答性はBALB/cマウスにおけるin vivo保護と相関することは注目に値する。さらに、あまり効果の高くない阻害因子、K-Pyrで処置したマウスから取り出した被覆体は接着性免疫細胞も損傷した被覆も有していなかった。これらの観察は、タエニア属システインプロテアーゼの阻害がこれらの保護結果の作用様式であることを示唆する。
【０２４７】
表４．T.soliumシステインプロテアーゼのin vitro阻害とin vivo保護との相関関係。“n/a”はデータが得られなかったことを意味する。
2004535560.tif 000014
【０２４８】
実施例９．外皮表面の免疫学的残渣を明らかにした、LLY-FMKで処置したマウスから取り出した被覆体の表面の走査型電子顕微鏡検査
図９の実験においてLLY-FMKで処置したマウスから取り出した僅かな生存被覆体のSEM検査により、宿主／寄生虫相互作用におけるシステインプロテアーゼの役割についての我々の理論との一致性が明らかになった。例えば、我々は、システインプロテアーゼは宿主の抗体を切断することによって被覆体を宿主の免疫応答から免れさせる鍵となる寄生虫性分子であるという仮説をたてていた。タエニア属システインプロテアーゼをZ-LLY-FMKで阻害することにより、宿主免疫グロブリンは寄生虫に結合できるようになり、免疫学的応答を開始し（例えば、IgG2aを介した補体）、従って被覆体壁に損傷を与えるという仮説を立てた。SEMの結果により、被覆体壁が破壊を受けている場合に付随して存在する接着免疫細胞の存在が確かめられた（図９）。処置したマウスからの被覆体表面上にマクロファージ、好中球、線維芽細胞、およびコラーゲン沈着が明らかにされ、これに対して、未処置マウスからの被覆体上にはこれらは存在しなかった。一般的な表面萎縮も見られた。未処置マウスから取り出した被覆体に比較して、微小毛（微絨毛）は全領域で脱落するか、一般に有意に短くなっていた。処置マウスから取り出した被覆体について、被覆体表面の完全性の破損も見られた。高倍率により免疫学的細胞近くの外皮侵食も明らかになった。未処置マウスから取り出した被覆体は免疫細胞がないこと、無損傷で長い微小毛、および被覆体表面の均一性によって特徴付けられた。これらの結果は、ブタ筋肉中の生存嚢尾虫および解剖によりヒトから取り出したものがこれを取り囲む宿主の炎症反応がほとんど見られないことを示した我々の別の研究と一致している。
【０２４９】
初めの方に述べたように、阻害因子の別の作用態様が免疫消費の予防であり得る。例えば、阻害因子は、システインプロテアーゼの寄生虫の重要な栄養源かもしれないIgG分解を阻止することによって被覆体を弱らせたのかも知れない（Damian、1987）。その結果、「弱った」被覆体は免疫攻撃を受けやすくなったかもしれないが、処置マウスに副作用が全くなかったので、宿主は控えめな免疫応答を備えていたように見える。これらの過程の結果は、さらなる被覆体の成長および増殖の停止であって、従って、この阻害因子のin vivoにおける保護能力であると我々は考えている。一つの目標としてのヒトNCC治療（他の目的はブタ嚢虫症の予防である）について、阻害因子治療に伴うCNSにおけるin situ免疫学的応答が予想されることはかなりの関心事であり得る。しかしながら、そのような薬剤を抗-炎症性ステロイドと共に使用する、および、おそらくはアルベンダゾールによる現行の治療と併用すれば、そのような応答が実際に起こるとしてもそれらを改善する筈である。
【０２５０】
実施例１０．プロテアーゼ不活性化の毒性の無さ
予備的結果により、LLL-FMKおよびLLY-FMKが正常なBALB/cマウス脾細胞にin vitroで毒性がないことが示されている。これらの実験では、マウス脾細胞を取り出し、阻害因子単独または阻害因子とCon-Aで処置した（図１０）。図から分かるように、阻害因子は（3H-チミジン取り込みによって測定したところ）増殖性応答を生じさせない。さらに、阻害因子は脾細胞のCon-Aに対する応答性に影響を与えない。
さらに、全細胞のトリパンブルー染色により阻害因子存在下でも全マウス細胞は生存していることが示される（図１１）。これらの研究は、特異的阻害因子でin vivo処置した場合、マウスにおいて宿主の副作用は全く観察されなかったという我々の観察（図８ａおよび８ｂ）を更に支持するものである。
【０２５１】
これらのデータは、in vitroで開発された遷移状態レベルプロテアーゼ不活性化因子、Z-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMKがin vivoで作用し得る可能性を示唆する。標的システインプロテアーゼに対するこれらの特異性は動物の保護研究の成功により証明されている。これは、in vitroのシステインプロテアーゼ阻害はin vivo保護と相関しているという観察によって証明されている。さらに、in vitroで最も強力な阻害因子がin vivoで被覆体に対する最も厳格かつ破壊的な免疫応答を示したので、これらの結果はこれらの阻害因子が標的システインプロテアーゼに特異的であって、このシステインプロテアーゼが標的であったことを示唆する。更に、これらの阻害因子は工程VIIIによって示されたように、in vitroで選択性を示した。標的プロテアーゼに対するin vivo選択性はZ-LLL-FMKおよびZ-LLY-FMKで処置した動物において長期または短期にわたって無視できるほどの副作用しか見られなかったという事実によって証明された。
【０２５２】
実施例１１．ホスファターゼ
プロテインホスファターゼはプロテアーゼ以外の切断酵素の範疇に向けた阻害因子および不活性化因子の開発のための本発明の有用性を例示する。各切断酵素について、各工程においてプロテアーゼ阻害因子開発と同様な様式でペプチドコアを使用するが、但し、検出手段はこの酵素によって切断される基に合わせて調整する。従って、プロテインホスファターゼについて、ペプチド末端に連結した発色団を切断の程度を評価するために使用するが、プロテインホスファターゼについては放射ラベルしたリン酸塩部分を検出基（これらの基はシンチレーション計測器によってアッセイできる）として働かせることができる。同様に、この分野で知られているように、蛍光アッセイ系もホスファターゼ検出に使用することができる。糖タンパク質についても同様に、グルコースアッセイを発色団の代わりに切断を測定することができるが、ペプチドコアそれ自体は一定である。
【０２５３】
従って、プロテインホスファターゼを用いた本方法の例示的実施例において、一連のモノホスホトリペプチドを標的プロテインホスファターゼに対して工程IIにおいてアッセイする。この方法のどこでも、プロテアーゼ系において発色団が使用されている各ポイントにおいて、プロテインホスファターゼ系についてホスホロ基を使用することができる。しかしながら、所望であれば、不活性化反応体はホスファターゼ阻害因子についてプロテアーゼ阻害因子についてと同じであってもよい。
多くの場合、プロテアーゼを用いて説明してきた本方法の全体は、改変することなく、他の型の切断酵素に適用可能であり、本発明は切断可能基の選択または切断を検出する方法によって限定されないことは注意すべきである。
【０２５４】
参考文献
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【０２５５】
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【０２５６】
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【０２５７】
本明細書に引用した全ての特許、仮特許出願を含む特許出願、文献、電子的に入手可能な材料（例えばGenBankアミノ酸配列およびヌクレオチド配列寄託物）の全開示は本明細書に引用に取り込まれるものとする。前述の詳細な説明および実施例は理解を明瞭にするためにのみ提供されたものである。本発明は開示され記載された正確な詳細に限定されない；多くの改変は当業者には明らかであろうし請求項によって規定される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１（ａ）】酵素触媒反応の種々のプロファイルおよびシナリオに関する自由エネルギーの図；Murphy、1995、Biochemistry. 34(14):4507-4510より。触媒反応および非触媒反応における種々の濃度の基質Sに関する自由エネルギー図。左パネル：プロファイルI。S<Km、酵素は基質と「緩い」結合立体配座にある。右パネル：プロファイルII。S>Km、酵素は基質と「強固な」結合立体配座にある。図の下の表記はテキスト中で言及されている種々の自由エネルギー定数の導出を示す。触媒反応はプロファイルII様酵素について生じることが知られているため、このプロットは、強固な結合相互作用は、それらが触媒反応に利用される限り、基質ターンオーバーについてどれほど浪費的でないかを示している。
【図１（ｂ）】酵素触媒反応の種々のプロファイルおよびシナリオに関する自由エネルギーの図；Murphy、1995、Biochemistry. 34(14):4507-4510より。TSCが減少する場合のプロファイルIIシナリオに関する、遷移状態安定化によって駆動される触媒反応の自由エネルギー図。このシナリオでは、遷移状態がTSC1からTSC2へ減少し、その結果、状況１から状況２へΔGBの正味の増加が生じる。従って、ΔΔGBの増加が遷移状態効果の顕著な特徴となる。このプロットではΔGESが変化しないので、追加の結合エネルギーの100％が触媒反応に使用される。この特性およびΔGbの増加は遷移状態安定化によって駆動される触媒反応事象の定義であり、後者は特徴的な触媒パラメーターである。
【図１（ｃ）】酵素触媒反応の種々のプロファイルおよびシナリオに関する自由エネルギーの図；Murphy、1995、Biochemistry. 34(14):4507-4510より。ESが減少し、TSCが変化しない場合のプロファイルIIシナリオに関する、基底状態不安定化によって駆動される触媒反応の自由エネルギー図。左パネルから右パネルへ、ESが減少しており、TSは変化しないままである。従って、触媒反応が認められるがΔΔGbは一定のままである（従って酵素／遷移状態結合の自由エネルギーは変化しない）。触媒反応が起こる場合にΔΔGbが一定であることは触媒反応によって駆動される基質ターンオーバーの特徴的な動力学的パラメーターである。
【図１（ｄ）】酵素触媒反応の種々のプロファイルおよびシナリオに関する自由エネルギーの図；Murphy、1995、Biochemistry. 34(14):4507-4510より。均一結合変化に関する自由エネルギー図。左パネルから右パネルへ、ESおよびTSCは並行して同じ量だけ減少している。ΔΔGbは増加しているが触媒反応は見られない。従って、触媒状態と非触媒状態の間に正味の相違はない。このことは均一結合変化の顕著な特徴である。
【図２】酵素／基質結合に関与する残基についての標準的命名法：S、酵素上のアミノ酸残基；P、基質上のアミノ酸残基；切断される切れやすい結合は基質上のP1部位とP1'部位の間にある。
【図３−１】標的プロテアーゼの活性部位阻害因子を同定するための選択した工程の概略図。
【図３−２】図３-１の続き。
【図４（ａ）】一群の基質および精製有鉤条虫（Taenia solium）システインプロテアーゼを用いた基質アッセイ（工程II）の図解。左パネルはAFC-結合トリペプチドおよびジペプチドの精製酵素による切断を示す。右パネルは精製酵素による単一のモノペプチドの切断を示す。それぞれの値は三つ組でおこなったアッセイの平均である。
【図４（ｂ）】Taenia solium粗混合物と一連の基質を用いた基質アッセイ（工程II）の図解。左パネルは粗混合物によるAFC-結合トリペプチドおよびジペプチドの切断を示す。右パネルは粗混合物によるモノペプチドの切断を示す。各値は三つ組で行ったアッセイの平均である。
【図５（ａ）】精製Taenia solium システインプロテアーゼによるカクテルのAFC切断のパーセント阻害を測定した競合アッセイ（工程III）。1.4％カクテル＝Z-FR-AFC、2.9％カクテル＝Z-FR-AFC＋Z-FAR-AFC、4.4％カクテル＝Z-FR-AFC＋Z-FAR-AFC＋Z-AAK-AFC、5.9％カクテル＝Z-FR-AFC＋Z-FAR-AFC＋Z-AAK-AFC＋AP-AFC、7.4％カクテル＝Z-FR-AFC＋Z-FAR-AFC＋Z-AAK-AFC＋AP-AFC＋Z-VLR-AFC。
【図５（ｂ）】Taenia solilum粗混合物によるカクテルのAFC切断のパーセント阻害を測定した競合アッセイ（工程III）。1.4％カクテル＝Z-FR-AFC、2.9％カクテル＝Z-FR-AFC＋Z-FAR-AFC、4.4％カクテル＝Z-FR-AFC＋Z-FAR-AFC＋Z-AAK-AFC、5.9％カクテル＝Z-FR-AFC＋Z-FAR-AFC＋Z-AAK-AFC＋AP-AFC、7.4％カクテル＝Z-FR-AFC＋Z-FAR-AFC＋Z-AAK-AFC＋AP-AFC＋Z-VLR-AFC。
【図６】Taenia soliumの精製システインプロテアーゼによる重鎖IgG分解。ヒトIgGをT.solium精製システインプロテアーゼ(CP)と共に18時間インキュベーションした。次にインキュベーションしたチューブを還元条件下でSDS-PAGEで分画し、PVDF膜にブロッティングし、ビオチン化抗IgG（重鎖／軽鎖）、ビオチン-ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン複合体および増感化学発光を利用して視覚化した。バンドは重鎖を表す。重鎖および軽鎖（軽鎖バンドは示していない）が存在しないことはタンパク質がペプチドに分解されたことを示唆する。
【図７（ａ）】リードビヒクルコア仮説に対して種々の不活性化反応体を利用した阻害因子を用いた、精製Taenia soliumシステインプロテアーゼに対する阻害因子プロファイル。各値は三つ組で行ったアッセイの平均である。Iso7、3,4-ジクロロイソメチルクマリン；iso8、4-クロロ-3-(4-f-ベンジル)オキシイソクマリン；iso9、7-EtNHCONH-4-Cl-3-OMe-イソクマリン；iso10、7-(M-NO2-C6H4)CONH-4-Cl-3-OPr-イソクマリン。
【図７（ｂ）】リードビヒクルコア仮説に対して種々の不活性化反応体を利用した阻害因子を用いた、Taenia solium粗混合物に対する阻害因子プロファイル。各値は三つ組で行ったアッセイの平均である。Iso7、3,4-ジクロロイソメチルクマリン；iso8、4-クロロ-3-(4-f-ベンジル)オキシイソクマリン；iso9、7-EtNHCONH-4-Cl-3-OMe-イソクマリン；iso10、7-(M-NO2-C6H4)CONH-4-Cl-3-OPr-イソクマリン。
【図８（ａ）】タエニア・クラッシセプス（Taenia crassiceps）被覆体の攻撃を受けたBALB/cマウスのZ-LLY-FMK処置の効果を図解したものである。各処置マウスは２日間阻害因子を腹腔内に事前に注射された。処置フェーズのあいだ、各マウスは３週間毎日、および最後の１週間は一日おきに1.48ｘ10-2μg/μlのN2が投与された。各マウスについて注射は150μlのジメチルスルホキシド中で行った。治療群および陽性対照群の両方を初期感染時に200μlの0.15M PBS中の10個のTaenia crassiceps被覆体で腹腔内攻撃した。感染１ヶ月後、両方の群を安楽死させ、滅菌0.15M PBSで洗滌することにより被覆体を取り出した。最低２個の接着した被覆体を多葉性(ML)としてスコアした。視覚的調査により、どのマウスも阻害因子毒性の効果を示さなかった。
【図８（ｂ）】タエニア・クラッシセプス（Taenia crassiceps）被覆体の攻撃を受けたBALB/cマウスのプロテアーゼ阻害因子処置の長期にわたる効果を図解したものである。マウスを処置群と非処置群に分けた（５匹／群）。処置群の各マウスは２日間阻害因子を腹腔内に事前に注射された。続いて、全ての群を200μlの0.15M PBS中の10個のTaenia crassiceps被覆体で腹腔内攻撃した。阻害因子またはプラセボ（0.15M PBS）による処置は攻撃後30日間毎日行った。被覆体を５ヶ月間放置（未処置）し、その後安楽死させた。その後、目視調査により被覆体を計数した。パーセント保護は全く処置を受けなかった対照マウスに比較した全被覆体数の低下に基づく。
【図９】未処置マウスから取り出した被覆体対処置マウスから取りだした被覆体の表面の走査電子顕微鏡写真。各パネルの両方のスライドについて倍率は同一である。パネルＡ（4000x）。SEMによりLLY-FMKで処置した被覆体に対する宿主の激しい免疫応答が示される。未処置マウスから取り出した被覆体上には免疫細胞が見られない。パネルＢ（25,000x）。SEMの結果は、線維芽細胞、処置マウスからの被覆体における被包の孔、抜け落ちた微小毛を示す。未処置被覆体における微小毛は視覚的に長いように見える。認識できるアンカーも未処置群については注目され、これらのアンカーは処置被覆体の微小毛にはみられなかった。
【図１０】Con-Aに対するマウス脾細胞の刺激応答はプロテアーゼ阻害因子Z-LLY-FMKおよびZ-LLL-FMKの存在によって影響を受けないことを図示したものである。ｙ軸は細胞増殖を１分間あたりの計数値で示したものである。
【図１１】96時間インキュベーション後の阻害因子のBALB/c脾細胞に対する効果をトリパンブルー取り込みによる測定で図示したものである。
【図１（ａ）】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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2004535560.tif 000204
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【国際調査報告】
2004535560.tif 000206
2004535560.tif 000207