(57)【要約】分離カラムおよび分離カラムを作製する方法を提供する。分離カラムは分離チャネルおよび分離チャネル内の分離媒体を含む。分離媒体は多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは担体および固定相を含む。担体はフォトポリマーのような金属有機ポリマーを含み、固定相は結合相を含む。分離媒体は、分析物の試料を分離するために用いることができる。
2004538482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離チャネルと、
チャネル中にある分離媒体とを備える分離カラムであって、前記媒体は多孔性マトリックスを備え、前記多孔性マトリックスは担体および固定相を備え、前記担体は金属有機フォトポリマーを備え、前記固定相は結合相を備える分離カラム。
【請求項２】
分離媒体が、フリットをもたない請求項１記載のカラム。
【請求項３】
結合相が、有機官能基を含む請求項１記載のカラム。
【請求項４】
分離チャネルがチャネル壁をもち、媒体がチャネル壁に付着し、チャネルの少なくとも１つのセクションを満たす請求項１記載のカラム。
【請求項５】
多孔性マトリックスが均一であり、クロマトグラフィー粒子を含有しない請求項１記載のカラム。
【請求項６】
フォトポリマーの前駆体が、金属アルコキシドを含む請求項１記載のカラム。
【請求項７】
金属アルコキシドが金属を含み、金属がアルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、およびジルコニウムからなる群から選択される請求項６記載のカラム。
【請求項８】
金属アルコキシドが、少なくとも１つの光活性基を含む請求項６記載のカラム。
【請求項９】
多孔性マトリックスが、分析物に対して親和性を有する請求項１記載のカラム。
【請求項１０】
分離媒体が、均一相を含む請求項１記載のカラム。
【請求項１１】
分離チャネルが、キャピラリー分離チャネルまたは平面構造である請求項１記載のカラム。
【請求項１２】
分離カラム中にモノリスを調製する方法であって、
分離カラムを提供し、
カラム中に混合物を導入し、混合物が金属有機化合物を含むものとし、
混合物を照射し、混合物に光開始重合を経て固体の多孔性マトリックスを生成させ、それによりカラム中に担体を生成し、
カップリング試薬をカラム中に導入し、それによりカラム中に結合相多孔性マトリックスを生成すること、
を含む分離カラム中にモノリスを調製する方法。
【請求項１３】
カップリング試薬を導入することは、官能基と金属を含むカップリング試薬を導入することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
金属が、アルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、およびジルコニウムからなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
カップリング試薬を導入することは、有機カップリング試薬を導入することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
カップリング試薬を導入することは、オルガノクロロシラン、オルガノアルコキシシラン、およびオルガノアミノシランからなる群から選択される試薬を導入することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
カップリング試薬を導入することは、一官能性、二官能性、または三官能性を有する試薬を導入することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
結合相多孔性マトリックスを含むカラム中に有機溶媒を導入することをさらに含む請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
多孔性マトリックスが、クロマトグラフィー粒子を含まない請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
分離媒体が、フリットをもたない請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
混合物が、少なくとも１つの金属有機モノマー、少なくとも１つの細孔形成剤、および光開始剤を含む請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
マトリックス中に細孔を生成するために制御可能に細孔形成剤が選択される請求項１２記載の方法。
【請求項２３】
マトリックス中に細孔を生成するためにモノマーの細孔形成剤に対するモル比を選択することをさらに含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
照射することは、可視光または紫外光で混合物を照射することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
カラム中に有機溶媒を導入し、カラムが固体の多孔性マトリックスを含むようにすることをさらに含む請求項１２記載の方法。
【請求項２６】
分離カラムを提供することは、キャピラリーまたは平面構造を提供することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項２７】
分析物の試料を分離する方法であって、
分離チャネルおよびチャネル中の分離媒体を備え、前記媒体は多孔性マトリックスを備え、前記多孔性マトリックスは担体および固定相を備え、前記担体は金属有機フォトポリマーを備え、前記固定相は結合相を備える分離カラムを提供し、
カラムを通して溶液中に含まれる分析物の試料を導入し、媒体が分析物をカラム上に濃縮し、
カラムを通して溶液を流し、それにより分析物を分離し溶出すること、
を含む分析物の試料を分離する方法。
【請求項２８】
試料を導入することは、カラムに電圧または圧力を加えることを含む請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
試料を導入することは、カラムを通して第１の溶液中に含まれる分析物の試料を導入することを含み、溶液を流すことは第２の溶液をカラムを通して流すことを含み、第１の溶液が第２の溶液と同じ溶液である請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
試料を導入することは、カラムを通して第１の溶液中に含まれる分析物の試料を導入することを含み、第１の溶液が溶出溶媒を含み、溶液を流すことは、第２の溶液をカラムを通して流すことを含み、第２の溶液が溶出溶媒を含み、第１の溶液中の溶出溶媒の濃度が第２の溶液中の溶出溶媒の濃度より低い請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
試料を導入することは、カラムの長さよりも大きな注入プラグ長を有する分析物の試料を導入することを含む請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
試料を導入することは、試料スタッキングを起させることを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
分離カラムを提供することは、クロマトグラフィー粒子をもたない多孔性マトリックスを備える分離媒体を提供することを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
分離カラムを提供することは、キャピラリーまたは平面構造を備える分離カラムを提供することを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
分離カラムを提供することは、フリットをもたない分離媒体を提供することを含む請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に分離カラムに関し、特に、結合相光重合ゾルゲルカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）はキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）の効率性を液体クロマトグラフィーの選択性と結びつけた非常に有望な分析的分離技法とみなされてきた。ＣＥＣは多くの異なる分野で利用されてきたが、充填カラム調製と低検出感度がいまだにこの技法の難点である。小さなシリカ充填物を含有するキャピラリーカラムがＣＥＣの中心であった。制御された細孔サイズ、細孔の長さ、および高度な機械的安定性を有する多孔性フリットの作製が充填カラムの欠点のひとつである。フリットの作製問題に応じ、充填キャピラリーカラムの変形として表面官能基化開管キャピラリーカラムおよびモノリス形キャピラリーが開発されつつある。モノリス形キャピラリーカラムは透過性と表面電荷の制御で得られる優位性のゆえに大いに注目されてきた。
【０００３】
ＣＥＣ技法の１つの大きな問題は、分析物を低濃度で含有する試料の検出である。低濃度での感度の欠如は小さな試料容積とオンライン検出用の短い光路長に起因する。多くの実際の分析で必要な感度を得るために試料注入前に標的分析物を濃縮する専用の試料前処理方式がしばしば必要である。溶媒−溶媒抽出および固相抽出等の方式は、しばしば非常に煩雑で時間を浪費する。
【０００４】
これらの前処理法に代るものがオンライン予備濃縮である。ガスクロマトグラフィーでは、ガスの気流を低温カラム中に通し、後に加熱することにより目的を果す。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、通常、初めの溶媒中では後に続く溶媒中よりも分析物をカラム上にはるかに強く保持するグラジエントＨＰＬＣによりこの過程を行う。オンライン予備濃縮は、電気泳動分離でもある程度成功してきた。例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）での予備濃縮は、等速泳動、試料スタッキング、スイーピング、およびダイナミックｐＨ接合の使用を含む。ＣＺＥでは、エフ・イー・ピー・ミッカーズ，エフ・エム・エヴァラーツ，ピー・イー・エム・フェアヘッゲン著，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー，１６９巻（１９７９年），ｐ．１〜１０ (F. E. P. Mikkers, F. M. Everaerts, P. E. M. Verheggen, J. Chromatogr. 169 (1979) pp. 1-10)（非特許文献１）およびアール・エル・シアン，ディー・エス・ブルギ著，アナリティカル・ケミストリー，６４巻（１９９２年）ｐ．４８９Ａ〜４９６Ａ (R. L. Chien, D. S. Burgi, Anal. Chem. 64 (1992),pp. 489A-496A)（非特許文献２）に、試料およびバックグラウンド溶液のゾーン間の電場強度の変化を用いて荷電種を濃縮（すなわち、スタック）できることを示した。電気力学クロマトグラフィーでは、ジェー・ピー・クイリノ，エス・テラベ著，サイエンス，２８２巻（１９９８年）ｐ．４６５〜４６８ (J. P. Quirino, S. Terabe, Science, 282 (1998), pp. 465-68)（非特許文献３）およびジェー・ピー・クイリノ，エス・テラベ著，アナリティカル・ケミストリー，７１巻８号（１９９９年）ｐ．１６３８〜１６４４ (J. P. Quirino, S. Terabe, Anal. Chem. 71(8) (1999) pp. 1638-44) （非特許文献４）に、ミセルを用いて中性および荷電種を濃縮（すなわち、スイープ）できることを示した。
【０００５】
粒子（例えば、オクタデシルシリカ）充填カラムを用いるＣＥＣでは、グラジエント高速液体クロマトグラフィーの効果に類似の濃縮効果が報告された。これらの濃縮効果は、（１）ステップグラジエント溶出、（２）非溶出溶媒中での試料の調製、または（３）試料注入後の水プラグの注入を用いて達成された。エム・アール・テーラー，ピー・ティール，ディー・ウェストウッド，ディー・ペレット著，アナリティカル・ケミストリー，６９巻（１９９７年）ｐ．２５５４〜２５５８ (M. R. Taylor, P. Teale, D. Westwood, D. Perrett, Anal. Chem. 69 (1997) pp. 2554-58) （非特許文献５）に、ステロイド試料の予備濃縮を目的としたステップグラジエントの使用について１９９７年に最初に報告された。ディー・エー・スティード，アール・ジー・アール・リード，アール・ビー・テーラー著，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＡ，７９８巻（１９９８年）ｐ．２５９〜２６７ (D. A. Stead, R. G. Reid, R. B. Taylor, J. Chromatogr. A 798 (1998) PP. 259-67)（非特許文献６）は、非溶出試料マトリックスを用いて予備濃縮することによりステロイド混合物の検出感度において１７倍の増大を達成した。ワイ・ツァン，ジェー・ツー，エル・ツァン，ダブリュー・ツァン著，アナリティカル・ケミストリー，７２巻（２０００年）ｐ．５７４４〜５７４７ (Y. Zhang, J. Zhu, L. Zhang, W. Zhang, Anal. Chem. 72 (2000) pp. 5744-47)（非特許文献７）もベンゾインとメフェニトインのそれぞれ１３４倍および２１９倍の予備濃縮に非溶出溶媒を用いた。シー・エム・ヤン，ジー・エル・ラッシ著，エレクトロフォレシス，２０巻（１９９９年）ｐ．２３３７〜２３４２ (C. M. Yang, Z. El Rassi, Electrophoresis 20 (1999) pp. 2337-42) （非特許文献８）に、長い試料プラグの後に注入された短い水プラグを用いた殺虫剤の希薄試料の予備濃縮について報告された。エム・ジェー・ヒルホースト，ジー・ダブリュー・ソムセン，ジー・ジェー・デ・ヨング著，クロマトグラフィカ，５３巻（２００１年）ｐ．１９０〜１９６ (M. J. Hilhorst, G. W. Somsen, G. J. de Jong, Chromatographia 53 (2001) pp. 190-96)（非特許文献９）に、非溶出マトリックスおよびステップグラジエント溶出を用いた構造的に関連するステロイド類の予備濃縮を示し、７〜９倍の感度の増大について報告された。同様に、ティー・テゲラー，ジー・エル・ラッシ著，アナリティカル・ケミストリー，７３巻１４号（２００１年）ｐ．３３６５〜３３７２ (T. Tegeler, Z. El Rassi, Anal. Chem. 73(14) (2001) pp. 3365-72) （非特許文献１０）に、非溶出マトリックスおよびステップグラジエント溶出の組合せを用いたカーバメート殺虫剤混合物中の分析物の予備濃縮についてつい最近報告された。最長許容試料プラグ長は〜２０ｃｍであり、カルボフランについて５００倍の感度増大を達成した。ツァンと共同研究者らは、電場促進試料注入を溶媒グラジエント溶出と組み合わせることによりさらなる検出感度の増大を達成した。彼らは、正に帯電した分析物プロパテネンについてピーク高さの１７，０００倍の増大を示した。
【０００６】
改善された特性を有し、しかも作製が容易である分離カラムを提供することが望まれている。
【非特許文献１】
エフ・イー・ピー・ミッカーズ，エフ・エム・エヴァラーツ，ピー・イー・エム・フェアヘッゲン著，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー，１６９巻（１９７９年），ｐ．１〜１０
【非特許文献２】
アール・エル・シアン，ディー・エス・ブルギ著，アナリティカル・ケミストリー，６４巻（１９９２年）ｐ．４８９Ａ〜４９６Ａ
【非特許文献３】
ジェー・ピー・クイリノ，エス・テラベ著，サイエンス，２８２巻（１９９８年）ｐ．４６５〜４６８
【非特許文献４】
ジェー・ピー・クイリノ，エス・テラベ著，アナリティカル・ケミストリー，７１巻８号（１９９９年）ｐ．１６３８〜１６４４
【非特許文献５】
エム・アール・テーラー，ピー・ティール，ディー・ウェストウッド，ディー・ペレット著，アナリティカル・ケミストリー，６９巻（１９９７年）ｐ．２５５４〜２５５８
【非特許文献６】
ディー・エー・スティード，アール・ジー・アール・リード，アール・ビー・テーラー著，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＡ，７９８巻（１９９８年）ｐ．２５９〜２６７
【非特許文献７】
ワイ・ツァン，ジェー・ツー，エル・ツァン，ダブリュー・ツァン著，アナリティカル・ケミストリー，７２巻（２０００年）ｐ．５７４４〜５７４７
【非特許文献８】
シー・エム・ヤン，ジー・エル・ラッシ著，エレクトロフォレシス，２０巻（１９９９年）ｐ．２３３７〜２３４２
【非特許文献９】
エム・ジェー・ヒルホースト，ジー・ダブリュー・ソムセン，ジー・ジェー・デ・ヨング著，クロマトグラフィカ，５３巻（２００１年）ｐ．１９０〜１９６
【非特許文献１０】
ティー・テゲラー，ジー・エル・ラッシ著，アナリティカル・ケミストリー，７３巻１４号（２００１年）ｐ．３３６５〜３３７２
【非特許文献１１】
ディー・ホラク，ジェー・ラブスキー，ジェー・ピラー，エム・ブレハ，ジー・ペルツバウアー，エフ・スヴェク著，ポリマー，３４巻１６号（１９９３年）ｐ．３４８１〜３４８９
【非特許文献１２】
シー・ユー，エフ・スヴェク，ジェー・エム・ジェー・フレシェット著，エレクトロフォレシス，２１巻１号（２０００年）ｐ．１２０〜１２７
【非特許文献１３】
エイチ・ジー・ウー，エル・ワイ・ホン，エス・ワイ・キム，エス・エイチ・パク，エス・ジェー・ソン，エイチ・エス・ハム著，ブレティン・オブ・ザ・コリアン・ケミカル・ソサイエティー，１６巻（１９９５年）ｐ．１０５６〜１０５９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
分離カラムは、分離チャネルおよびチャネル中の分離媒体を含む。媒体は多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは担体および固定相を含む。担体は金属有機ポリマーを含み、固定相は結合相を含む。ポリマーはフォトポリマーであってよい。好ましい実施形態においては、多孔性マトリックスはクロマトグラフィー粒子をまったく含まない。多孔性マトリックスはクロマトグラフィー粒子なしで分析物を予備濃縮することにも分離することにも用いることができる。分離カラムはクロマトグラフィー粒子を用いる分離カラムよりも大きな容積の分析物の濃縮および分離を可能にする。
【０００８】
モノリスを調製する方法を提供する。さらに分離カラムを提供する。混合物を分離カラム中へ導入する。混合物は金属有機化合物を含む。混合物を照射し、光開始重合を経て固体の多孔性マトリックスを生成させる。カラム中へカップリング試薬を導入する。こうして結合相多孔性マトリックスがカラム中に生成される。好ましい実施形態においては、多孔性マトリックスはフリットを有さずクロマトグラフィー粒子をまったく含有しない。クロマトグラフィー粒子を有さずフリットを有さない分離媒体の調製は、フリットまたはクロマトグラフィー粒子をもつ分離媒体を調製するより単純である。多孔性マトリックスは分析物を予備濃縮するためと分離するための両方に使用することができる。
【０００９】
多孔性マトリックスの調製のための光化学的方法には多くの利点がある。すなわち、（１）短い調製時間、（２）細孔サイズの制御、（３）多孔性マトリックスの場所と長さの制御、（４）高い機械的強度、および（５）クラッキングにつながる高温の回避である。結合相の利点のひとつは、クロマトグラフィー分離において多くの条件を変えられる能力があることである。
【００１０】
分析物の試料を分離する方法を提供する。さらに、分離チャネルとチャネル内の分離媒体を含む分離カラムを提供する。媒体は多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは担体と固定相を含む。担体はフォトポリマーのような金属有機ポリマーを含み、固定相は結合相を含む。好ましい実施形態においては、多孔性マトリックスはクロマトグラフィー粒子をまったく含まない。溶液中に含まれる分析物の試料をカラム中に導入する。媒体は分析物をカラム上に濃縮する。溶液はカラムを通して流され、分析物を分離し溶出する。媒体は分析物を予備濃縮しかつ分離する。媒体によって及ぼされる効果に加えて、溶媒グラジエントまたは試料スタッキングによって予備濃縮をさらに強化することができる。
【００１１】
本発明の上述した特徴および他の特徴および態様は、添付する図面とともに後述する詳細な説明を読めばより明らかになる。
【００１２】
説明を簡略化するために、本願における同様または類似の部分については同じ参照記号を用いる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
図１は、本発明の一実施形態による分離カラムの長手方向断面図である。分離カラム１１は、管１２中の分離チャネル１３とチャネル１３中の分離媒体１５を含む。分離カラム１１はキャピラリーまたは平面チップであってもよく、また分離チャネル１３は検出窓を含んでもよい。分離媒体１５は、チャネル１３の少なくとも１つのセクションを満たす。媒体１５は均一であり、好ましくはフリットまたはクロマトグラフィー粒子をもたない。媒体１５は、チャネル１３のチャネル壁１７に付着してもよい。好ましくは、媒体１５は、チャネル壁１７に共有結合的に結合することができる。
【００１４】
管１２は、円形断面等の多くの異なる断面をもつことができる。あるいはまた、管１２は長く伸びた断面をもってもよい。管１２のためにはこのような断面や他の断面も使用可能であり、本発明の範囲内である。管１２は、典型的には溶融シリカ製の円形キャピラリーであってもよい。キャピラリーの内径は、およそ１０μｍ〜およそ１０００μｍであればよく、好ましくはおよそ７５μｍ〜およそ５００μｍであればよい。管１２は、平面チップまたは２枚のシートによって閉じ込められたカラムのような閉空間であってもよい。
【００１５】
媒体１５は多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは担体および固定相を含む。担体はフォトポリマーのような金属有機ポリマーを含み、固定相は結合相を含む。ポリマーの前駆体はシランのような金属アルコキシドであればよい。金属は、アルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、またはジルコニウムであればよい。前駆体は、メタクリレートのような光活性基を含むことができる。一実施形態においては、前駆体は、メタクリロキシプロピルトリメトキシシランとしても知られるメタクリル酸トリメトキシシリプロピルであってもよい。
【００１６】
細孔サイズ、ポリマー電荷密度、および疎水性等の種々の物理的性質をもつ多孔性マトリックスを調製するために種々の官能基化または誘導化モノマーを用いることができる。種々の細孔形成剤を用いて細孔の形状およびサイズを制御して細孔サイズの広い分布（すなわち、細孔サイズグラジエント）をもつ多孔性マトリックスを得ることができる。細孔サイズグラジエントをもつ多孔性マトリックスは、キャピラリー電気泳動およびキャピラリーエレクトロクロマトグラフィーにおいて「分子ソーター」として機能することができる。多孔性マトリックスはサイズ構造または化学組成（例えば、ＤＮＡ断片）が異なり得る大きな分子の混合物を分離することができる。加えて、分離カラム１１は、逆相、サイズ排除、親和性、イオン交換クロマトグラフィー等を目的として設計することができる。
【００１７】
多孔性マトリックスは、モノマーの混合物から調製した混合相多孔性マトリックスであってもよい。例えば、モノマーは、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、ビス（トリエトキシシリル）エタンおよびビス（トリエトキシシリル）オクタンを含んでもよい。混合相多孔性マトリックスは、疎水性等の種々の性質を有してもよい。
【００１８】
多孔性マトリックスの性質は、結合相の使用によっても変えることができる。結合相とは、担体粒子またはカラム配管の内壁に共有結合的に結合している固定相である。例えば、結合相は、金属有機ポリマーの表面に結合した官能基を含んでもよい。官能基は、疎水性または親水性基、荷電基または非荷電基、または有機または無機の基のようないかなる官能基であってもよい。官能基は、多孔性マトリックスの疎水性、電荷、保持因子、相互作用の形、またはキラリティーのような多孔性マトリックスの性質を変えることができる。結合相多孔性マトリックスは、順相、逆相、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、サイズ排除、またはキラルクロマトグラフィーにおいて用いることができる。
【００１９】
結合相は、分析物の分離の分離能を増すことができ、またポリマーの表面をある程度不活性化することができる。不活性化は、遊離ヒドロキシル基のイオン化により存在する負電荷が原因となって、表面活性を減らすものである。そうすると結合相多孔性マトリックスは、カラム中の電気浸透流（ＥＯＦ）を支えることができる。
【００２０】
結合相多孔性マトリックスは、分析物に対する親和性をもち、分析物の試料を予備濃縮するためと分離するための両方に用いることができる。分析物に対する親和性は、分析物の保持因子ｋによって記述することができる。保持因子ｋは、
ｋ  ＝  固定相中の成分の量／移動相中の成分の量    （１）
に等しい。保持因子ｋは、また、
ｋ  ＝  （ｔR −ｔ0 ）／ｔ0                       （２）
と表してもよく、ｔR は分析物の移動時間、ｔ0 は「保持されない」分析物の移動時間である。保持因子は、溶媒の性質、分析物の性質、カラムの長さ、多孔性マトリックスの透過性、多孔性マトリックスの疎水性、金属有機ポリマーに結合している官能基、および多孔性マトリックスの詳細な形態によって影響を受ける。
【００２１】
分離カラム１１は、分析的に用いても半調製的に用いてもよい。分離カラム１１上の予備濃縮によりサブミリグラムからミリグラム量の分析物の分離が可能となる。例えば、分析物の濃度がｍＭレベルにある試料溶液の約１００ｎＬよりも多い量を明らかなオーバーロードをすることなくカラム中に注入することができる。
【００２２】
分離カラム１１中にモノリスを作製する方法を提供する。さらに、分離カラムを提供する。分離カラムは、典型的には溶融シリカで作製した円形のキャピラリーであればよい。キャピラリーの内径はおよそ１０μｍ〜およそ１０００μｍ、好ましくはおよそ７５μｍ〜およそ５００μｍであればよい。
【００２３】
金属有機化合物を含む混合物を分離カラム内に導入する。混合物は、光開始重合を経て固体、多孔性マトリックスを生成する。混合物は、金属有機モノマー、細孔形成剤、および光開始剤を含むことができる。金属有機モノマーは、シランのような金属アルコキシド、または金属アルコキシドの混合物であればよい。金属は、アルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、またはジルコニウムであればよい。金属アルコキシドは、メタクリレートのような光活性基を含んでよい。一実施形態において、前駆体は、メタクリロキシプロピルトリメトキシシランとしても知られるメタクリル酸トリメトキシシリプロピルであってよい。別の実施形態において、前駆体は、メタクリロキシプロピルトリメトキシシランとビス（トリエトキシシリル）エタンまたはビス（トリエトキシシリル）オクタンのようなもう１つの前駆体の混合物であってよい。
【００２４】
前駆体の加水分解のために金属有機モノマーを酸または塩基触媒に加えることができる。触媒は、アルコキシ基をヒドロキシル基へ変換する。例えば、シランは次の加水分解反応をして完全に加水分解したシランを生成する。
Ｓｉ（ＯＲ）4 ＋４Ｈ2 Ｏ→Ｓｉ（ＯＨ）4 ＋４ＲＯＨ    （３）
加水分解反応は、部分的に加水分解したシラン（Ｓｉ（ＯＲ）4-n （ＯＨ）n ）で停止してもよい。金属有機モノマーおよび触媒は、およそゼロ分からおよそ２４時間撹拌すればよい。
【００２５】
細孔形成剤または細孔形成剤の混合物は、金属有機モノマーおよび触媒と混合してよく、混合物はおよそゼロ分から約２４時間撹拌すればよい。この時間の間、金属有機モノマーは縮合反応をしてダイマー、トリマー、および他のオリゴマーを生成する。例えば、部分的に加水分解したシランは、次の縮合反応を行ってもよい。
２（ＲＯ）3 ＳｉＯＨ→（ＲＯ）3 Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ（ＯＲ）3 ＋Ｈ2 Ｏ    （４）
反応の温度を上げることによりさらに大きなオリゴマーを生成してもよい。
【００２６】
細孔形成剤はマトリックス中に細孔を生成するための分子鋳型を提供する。例えば、細孔形成剤はトルエンまたはヘキサンとトルエンとの１：１混合物のような溶媒、ポリマー、または塩化ナトリウム粉末または硫酸ナトリウムのような無機塩であってもよい。ポリマー性細孔形成剤は、ディー・ホラク，ジェー・ラブスキー，ジェー・ピラー，エム・ブレハ，ジー・ペルツバウアー，エフ・スヴェク著，ポリマー，３４巻１６号（１９９３年）ｐ．３４８１〜３４８９ (D. Horak, J. Labsky, J. Pilar, M. Bleha, Z. Pelzbauer, F.Svec, Polymer 34(16) (1993) pp.3481-89)（非特許文献１１）に報告されているようにポリ（メタクリル酸メチル）またはポリスチレンであってよい。マトリックス１５中に細孔を生成するために制御可能に細孔形成剤を選んでもよい。用いる化学物質（すなわち、細孔形成剤）のタイプおよび反応溶液中のその容積または濃度によってマトリックスの多孔度を調節することができる。例えば、混合物中に細孔を生成するために細孔形成剤に対するモノマーのモル比または容積比を選択することができる。モノマーと細孔形成剤のモル比を調整することにより、マトリックスの物理的性質（例えば、細孔サイズ）を制御してもよい。
【００２７】
モノマー上の光開始剤またはメタクリレート等の光活性基は光を吸収して金属有機化合物の重合を触媒する。一実施形態において、光開始剤はニューヨーク州タリータウンのチバ・ガイギー (Ciba Geigy) から入手できるイルガキュア (Irgacure) １８００であってよい。
【００２８】
分離カラムが光源に対して透明でない外側の被膜を有するならば、被膜を最初に除去して照射窓をつくる。被膜の長さが分離カラム内に生成する多孔性マトリックスの長さを決定する。
【００２９】
混合物を分離カラム中に導入する。例えば、混合物は、注射器を用いて分離カラム中に流すこともできる。分離カラムの両端をシールすることもできる。
【００３０】
混合物を照射して、分離カラム内に均一な分離媒体をつくる。例えば、分離カラムは、およそ５分間のような短時間の放射に曝露してよい。放射の波長は、反応中に用いられる光開始剤または光活性基のタイプに依存する。放射は、可視光または紫外光を含んでよい。例えば、光開始剤イルガキュア１８００のために３６５ｎｍの放射を用いてよい。光活性基メタクリレートは、シー・ユー，エフ・スヴェク，ジェー・エム・ジェー・フレシェット著，エレクトロフォレシス，２１巻１号（２０００年）ｐ．１２０〜１２７ (C. Yu, F. Svec, J. M. J. Frechet, Electrophoresis 21(1) (2000) pp. 120-27)（非特許文献１２）およびエイチ・ジー・ウー，エル・ワイ・ホン，エス・ワイ・キム，エス・エイチ・パク，エス・ジェー・ソン，エイチ・エス・ハム著，ブレティン・オブ・ザ・コリアン・ケミカル・ソサイエティー，１６巻（１９９５年）ｐ．１０５６〜１０５９ (H.-G. Woo, L.-Y. Hong, S.-Y. Kim, S.-H. Park, S.-J. Song, H.-S. Ham, Bull. Korean Chem. Soc. 16 (1995) pp. 1056-59) （非特許文献１３）にそれぞれ報告されているように３００ｎｍまたは３６５ｎｍの波長で光重合させてもよい。
【００３１】
混合物が放射に曝露されると光化学反応が起る。モノマー上の光開始剤または光活性基は、光を吸収して金属有機化合物の重合を触媒する。
【００３２】
多孔性マトリックスの調製のための光化学的方法には多くの利点がある。すなわち、（１）短い調製時間、（２）細孔サイズの調節、（３）多孔性マトリックスの場所と長さの制御、（４）高い機械的強度、および（５）クラッキングにつながる高温の回避である。
【００３３】
分離媒体は好ましくはフリットまたはクロマトグラフィー粒子をもたず、それゆえ分離媒体の調製はフリットまたはクロマトグラフィー粒子をもつ通常の分離媒体の調製よりも容易である。
【００３４】
オプションとして、有機溶媒を分離カラム中に導入してもよい。例えば、有機溶媒は、エタノールであってもよい。有機溶媒を用いて多孔性マトリックスを未反応材料、細孔形成剤、光開始剤から洗浄するようにしてもよい。溶媒は、注射器または他の手段を用いて分離カラム中に流してよい。
【００３５】
カップリング試薬は、カラム中に導入されて結合相多孔性マトリックスを生成する。カップリング試薬は、一官能性、二官能性、または三官能性をもってよい。カップリング試薬は、ハロゲン化された芳香族またはハロゲン化アシルのような有機カップリング試薬であってよい。例えば、シアン化ナトリウムおよび塩化アンモニウムは金属有機ポリマー上のケトンと反応することができ、あるいは、ハロゲン化した芳香族またはハロゲン化アシルは縮合反応をすることができる。カップリング試薬は、官能基と金属を含んでよい。金属は、アルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、およびジルコニウムであってよい。例えば、シランカップリング試薬は、オルガノクロロシラン、オルガノアルコキシシラン、オルガノアミノシラン、または他の反応性シランであってよい。シランカップリング試薬は、金属有機ポリマーの表面ヒドロキシル基を官能基で誘導体化するために用いることができる。例えば、金属有機ポリマーと官能基Ｒ′を含むオルガノクロロシランのようなシランカップリング試薬は、次の反応をして結合相多孔性マトリックスを生成するようにしてもよい。
（ＲＯ）3 Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ（ＯＲ）2 （ＯＨ）＋ＳｉＣｌＲ′→
（ＲＯ）3 Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ（ＯＲ）2 −Ｏ−ＳｉＲ′＋ＨＣｌ      （５）
反応の速度を増すために温度を上げる必要はなく、反応は室温で行ってよい。反応の時間は、官能基に依存して変わる。例えば、反応時間を長くするとより大きな官能基では相崩壊が起り得る。官能基が互いに接近しすぎて互いに遮蔽しあうと表面の活性基の数を減らして相崩壊が起こり得る。
【００３６】
オプションとして、結合相多孔性マトリックスを含むカラム中に有機溶媒を導入してもよい。例えば、有機溶媒は、トルエン、ピリジニウムまたはトリエチルアミンであってよい。有機溶媒をカラム中に導入することにより未反応のシランカップリング試薬および塩酸またはアルコールのような反応の副生成物を結合相多孔性マトリックスから除去してもよい。溶媒は、注射器または他の手段を用いて分離カラム中に流してよい。
【００３７】
分離のために使用する前に分離カラムを分離溶液でコンディショニングしてよい。分離溶液は、酢酸アンモニウム水溶液のような緩衝液、およびアセトニトリルのような溶出溶媒を含んでよい。
【００３８】
分析物の試料を分離する方法を提供する。分析物の試料は、試料溶液中で分離カラム１１を通って導入される。分析物は、多環芳香族炭化水素類、アルキルベンゼン類、アルキルフェニルケトン類、およびステロイド類のような中性化学種およびペプチド類のような荷電化学種を含む。試料溶液は、酢酸アンモニウム水溶液のような緩衝液、およびアセトニトリルのような溶出溶媒を含んでよい。
【００３９】
分離カラム１１は、分離チャネル１３とチャネル１３中の均一な分離媒体１５を含む。分離カラム１１は、キャピラリーまたは平面構造であってよい。分離媒体１５は、好ましくはフリットまたはクロマトグラフィー粒子をもたない。いくつかの用途では、クロマトグラフィー粒子（すなわち、非均一分離相）を使用すると好ましくない広がり（すなわち、分離能の欠如）を招くので、均一な分離媒体を使用すると有利である。分離媒体１５はおそらく本質的に同じ多孔性均一固定相を含む２つのセクションを含んでよいと考えられ、２つのセクションは異なる細孔サイズまたは表面電荷を有するモノリスのようなもう１つのセクションによって隔てられてよい。好ましくは、分離媒体１５は連続している。
【００４０】
分離媒体１５は多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは担体および固定相を含む。担体は金属有機フォトポリマーを含み、固定相は結合相を含む。分離媒体１５は、分析物をカラム上に濃縮する。試料は、圧力または電圧をカラム１１に加えて導入してよい。例えば、圧力は２〜１９２０秒間のような時間の０．５ｐｓｉまたは２０ｐｓｉであってよく、またはおよそ４０Ｖ／ｃｍの電場強度をある時間加えてよい。例えば、約２ｃｍより大きな注入プラグ長をカラム１１に注入してよい。
【００４１】
分析物は、カラム１１により濃縮される。予備濃縮の度合いは、保持因子ｋ値だけに依存する。保持因子は、溶媒の性質、分析物の性質、および分離媒体の詳細な形態によって影響を受ける。さらに、流速は予備濃縮の程度にほとんど影響しなかった。
【００４２】
多孔性マトリックスの高度な多孔性の性質によって分析物の物質移動速度が高くなり、予備濃縮効果が機能する。高い物質移動速度は、多孔性構造の結合サイトへの分析物の接近のしやすさが強まることによって生じる。高い物質移動速度ゆえに、分析物−多孔性マトリックス相互作用（すなわち、移動相と固定相との間の分析物の分配）の速度は分離における律速段階ではない。高い物質移動速度は、この分離法を従来の形のクロマトグラフィー的な分離から区別する。この分離法を用いれば、高い物質移動速度ゆえに、通常のクロマトグラフィー的な材料を含むカラム中におけるよりも大量の試料溶液を注入し濃縮することが可能である。
【００４３】
予備濃縮の全体的効果は保持因子に直接比例し、より長い注入プラグ長（例えば、２５ｍｍより大きい）は低いｋ値を有する分析物の深刻なピーク幅の広がりに通じる。この挙動は、ピーク形状が悪化する前に、各分析物の試料プラグの最大長が存在することを意味する。保持因子は、結合相を変えることにより変えられる。
【００４４】
オンライン予備濃縮の一大利点は、与えられた分析物の検出限界を低くすることである。もう１つの利点は、予備濃縮を用いて試料マトリックス中に見いだされる干渉可能化学種から分析物を洗浄することである。
【００４５】
カラム１１中を通して分離液を流し、それにより分析物を分離し溶出する。分離溶液は、カラム１１に対して電圧または圧力を加えて流してもよい。例えば、圧力は２〜１９２０秒間のような時間の０．５ｐｓｉまたは２０ｐｓｉ、または３００Ｖ／ｃｍの電場強度をある時間加えてよい。分離溶液は、酢酸アンモニウム水溶液のような緩衝液およびアセトニトリルのような溶出溶媒を含んでよい。一実施形態において、分離溶液は、試料溶液と同じである。
【００４６】
結合相多孔性マトリックスは溶液から分析物を抽出するように作用するとともに、分析物のクロマトグラフィー的な分離のために固定相を提供する。この方法にこのような効力を生じさせるのはこの抽出体−分離体の組合せである。例えば、試料溶液と同じである分離溶液を用いておよそ２ｃｍを超えるプラグ長の試料溶液をキャピラリー中に取り込み濃縮することができる。
【００４７】
一実施形態において、順相、逆相、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、サイズ排除、またはキラルクロマトグラフィーを行うことにより分析物を分離してよい。
【００４８】
別の実施形態において、多孔性マトリックスにより及ぼされる効果に加えて、分析物の予備濃縮をさらに高めるために溶媒グラジエントを用いてよい。この実施形態において、試料は分離溶液中におけるよりも高い濃度の緩衝液（すなわち、水）を有する溶液中に溶解してよい。試料溶液中の緩衝液の濃度の方が高いため固定相に対する試料の親和性が増す。溶媒グラジエントを用いると、プラグ長をカラムの長さより長くできる。例えば、キャピラリー全長の３倍を超える９１．２ｃｍプラグの注入がわずかな分離能の低下だけで可能であった。グラジエント条件下で得られるピーク高さの改善は一千倍を超え得る。
【００４９】
中性の分析物に対して、多孔性マトリックス上でグラジエントを用いる２つのアプローチがある。第１のアプローチは、分離溶液と試料溶液の間の有機溶媒比を増すことである。第２のアプローチは、分離溶液と試料溶液の間の有機溶媒の妥当な百分率を維持しつつ、分離溶液中の水の百分率を増すことにより分離における保持因子ｋを増すことである。第１のアプローチを用いると分析がより迅速で、第２のアプローチを用いると分離能がよりよい。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、多孔性マトリックスにより及ぼされる効果に加えて、分析物の予備濃縮をさらに高めるために試料スタッキングを用いてよい。試料スタッキングとは、高電場強度区域と低電場強度区域を隔てる濃度境界を分析物が通過するときに起きる荷電分析物の濃縮である。高電場区域とはより多くの溶出溶媒を含む伝導率のより低い試料溶液であり、それに対して低電場区域とは伝導率のより高い分離溶液である。アセトニトリルのような溶出溶媒は、酢酸アンモニウム水溶液のような緩衝液より低い伝導率を有する。かくして、より高い濃度の溶出溶媒は、試料マトリックス伝導率を低下させる。
【００５１】
分離カラムは、分離溶液を用いて調製する。分析物が分離カラム中に導入され、電圧が加えられると、カラムの入口における試料溶液中の分析物は、すでにカラム中にある分離溶液（低電場強度）に向って迅速に加速し、試料溶液と分離溶液の間の境界を通過すると分析物は速度を落して界面における狭い区域中にスタックする。
【００５２】
試料スタッキングは、基本的に濃度境界における電気泳動速度の変化により起きる。電気泳動速度は電気泳動易動度と電場強度の積である。濃度境界において電気泳動速度が低下するとき、濃縮が起きる（試料スタッキング）。試料スタッキングは、等速泳動とコールラウシュ(Kohlrausch)則の基本を用いても説明される。
【００５３】
多孔性マトリックス上で試料スタッキングを行う２つのアプローチがある。第１のアプローチは、アセトニトリルのような有機溶媒の百分率を増すことである。第２は、試料溶液中の緩衝成分の濃度を減らすことである。アセトニトリルまたは他の適当な有機溶媒の百分率を増すことは、高濃度の塩を含有する現実の試料には特に有用である。例えば、注入用に低伝導率溶液をつくるために透析によって脱塩する必要はない。脱蛋白質が試料調製の一部であるときには、有機溶媒の使用もまた生体試料用に有用である。
【００５４】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例は本発明をさらに説明し開示する目的のためにのみ提示するものであり、本発明を制限するものとして解釈されるべきものではない。
【実施例１】
【００５５】
材料および化学薬品。溶融シリカキャピラリー（内径７５μｍ×外径３６５μｍ）は、アリゾナ州フェニックスのポリマイクロ  テクノロジーズ (Polymicro Technologies) から購入した。メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）は、ペンシルベニア州タリータウンのジェレスト(Gelest)とウィスコンシン州ミルウォーキーのシグマ−アルドリッチ (Sigma-Aldrich)から購入し精製することなく使用した。ＨＰＬＣグレードのトルエン、フェナントレン、ピレン、アルキルベンゼン類、アルキルフェニルケトン類、およびステロイド類は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのシグマ−アルドリッチから購入した。イルガキュア１８００は、ニューヨーク州タリータウンのチバから受け取った。
【００５６】
装置類。ＵＶ吸光度検出器を有するベックマン (Beckman)Ｐ／ＡＣＥ２０００キャピラリー電気泳動装置を用いてすべてのＣＥＣ実験を行った。ニューヨーク州ウェストベリーのスペクトロニクス  コーポレイション (Spectronics Corporation)から入手できる主に３６５ｎｍ波長の１５Ｗブラックライト管６個を備えたＸＬ−１５００紫外線架橋装置を用いて反応溶液を照射した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析はオランダのアイントホーフェンから入手できるフィリップス (Philips)ＳＥＭ５０５走査形電子顕微鏡上で行った。
【００５７】
重合手順。使用直前に１００μＬの０．１２ＮＨＣｌに３７５μＬのＭＰＴＭＳを加えることによりモノマー原料溶液を調製した。この溶液を室温で約３０分間撹拌して透明な単相溶液を得た。下の表１に示すように適正な量のトルエン（細孔形成剤）をモノマー原料溶液に加えた。
【表１】
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最初に光開始剤イルガキュア１８００をトルエン／モノマー原料溶液の全重量の５％となるようにトルエンに加えた。それからこの光開始剤溶液を対応する量のモノマー原料溶液に加え、室温で３０分間撹拌して黄色の単相溶液を得た。トルエンの蒸発を最小限にするために、溶液はポリシリコンキャップをしたバイアル中で調製し、溶液で充填するときにはキャピラリーをポリシリコンキャップに挿入した。
【００５８】
キャピラリー表面に４５°の角度であてた剃刀の刃を用いて３０ｃｍ長のキャピラリーのポリイミド被覆から長さ１５ｃｍの筋を除去した。ポリイミド被覆の筋の除去にもかかわらず、キャピラリーの機械的安定性は非常によかった。照射光はこの１５ｃｍ筋を通してのみキャピラリーに入射した。ポリイミド被覆（「マスク」）が無傷で残っている場所ではキャピラリー中にモノリスは生成しなかった。
【００５９】
キャピラリーを溶液で満たす前に、０．５ｍｌ使い捨て注射器を用いて約０．２ｍｌの反応溶液をキャピラリー中に洗い流して壁の表面を十分に濡らした。これによりモノリスはキャピラリーの壁に結合した。モノリスを壁に結合するために、キャピラリー壁の特別な前処理は何も必要なかった。満たしたキャピラリーを紫外線架橋装置中で３６５ｎｍ光を用いて５分間照射（９×１０5 ｍＪ／ｃｍ2 ）して多孔性マトリックスを作製した。
【００６０】
照射後、携帯用の注射器を用いてキャピラリーをエタノールで洗浄して未反応試薬または細孔形成剤を除去した。モノリスは高度に透過性であったので、キャピラリーを通して液体を流すために高い圧力は必要ではなかった。未反応試薬を除去すると、モノリスは不透明になり顕微鏡の助けを借りなくてもキャピラリーを通して明瞭に見ることができた。１００倍の倍率で多孔性マトリックスの均一性を確認した。モノリスのセクションの直後のポリイミド被覆を発煙硫酸で焼き取って検出窓をつくった。
【００６１】
作製したキャピラリーは損傷なくカートリッジ中に首尾よく格納することができた。注射器と手持ち万力を用いて分離緩衝液で約５分間キャピラリーをコンディショニングした。装置中に格納したキャピラリーはさらに分離緩衝液で加圧（２０ｐｓｉ）すすぎ洗いするか、５ｋＶまたは１０ｋＶで３０分間電気力学的にコンディショニングした。
【００６２】
キャラクタリゼーション。ＳＥＭを用いて分離カラムの形態を調べた。キャピラリーを注意深く切り分けてモノリスを露出した。切り分けたキャピラリーの部分をＳＥＭ解析に先立って金でスパッタした。
【００６３】
分析物分離。ＣＥＣ実験時にはグラジエント効果を防止するために移動相中で分析物を調製した。移動相は、種々の比（容積／容積）の５０ｍＭ酢酸アンモニウム、水、およびアセトニトリルからなっていた。試料溶液と移動相のアセトニトリルの濃度を同一に維持するために注入のたびに新しい試料溶液を用いた。
【００６４】
図２Ａは、カラムＢについて吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／３／６）溶液で行った。０．５ｐｓｉの圧力で３秒間試料溶液を注入し、２０℃の温度で１ｋＶの電圧を加え、２１４ｎｍで検出して分離を行った。分離の溶出順序は、（１）チオ尿素、（２）テトラヒドロフラン、（３）ナフタレン、（４）フェナントレン、（５）フルオランテン、（６）ピレン、（７）１，２−ベンゾアントラセン、および（８）１，２，５，６−ベンゾアントラセンであった。
【００６５】
図２Ｂは、カラムＤについて吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／４／５）溶液で行った。０．５ｐｓｉの圧力で３秒間試料溶液を注入し、２０℃の温度で１５ｋＶの電圧を加え２００ｎｍで検出して分離を行った。分離の溶出順序は、（１）ベンゼン、（２）トルエン、（３）エチルベンゼン、（４）プロピルベンゼン、（５）ブチルベンゼン、および（６）ヘキシルベンゼンであった。
【００６６】
カラムの溶出順序は、より大きな分子量またはより疎水性の大きい分析物がより小さな分子量またはより親水性の大きい分析物より遅れて溶出する逆相クロマトグラフィーの溶出順序に類似していた。どちらの図でも分析物の溶出は７分以内に起った。ＣＥＣ実験時の典型的な操作電流は３と１０μＡの間であって泡の生成は問題ではなかった。
【００６７】
典型的なキャピラリーカラムＤについて、保持性の低い化合物であるチオ尿素に対して最高１００，０００段／ｍまでの効率を達成した。３日間（ｎ＝３３）でチオ尿素（０．６５％ＲＳＤ）、ナフタレン（１．１０％ＲＳＤ）、フェナントレン（１．１４％ＲＳＤ）、およびピレン（１．１４％ＲＳＤ）について溶出時間の小さな変動を観測した。
【００６８】
図３は、カラムＤについて吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／３／６）溶液で行った。０．５ｐｓｉの圧力で３秒間試料溶液を注入し、２０℃の温度で１ｋＶの電圧を加え２１４ｎｍで検出して分離を行った。わずか２０ｐｓｉ（装置の最大限界）の加圧でチオ尿素、ナフタレン、フェナントレン、およびピレンの試料を１１０分間以内に分離した。ピレンの場合、多孔性マトリックスとの相互作用がもっとも強かったためピークのテーリングがもっともひどく、カラム上で低くしか保持されないチオ尿素ではテーリングは観測されなかった。
【００６９】
図４Ａは、内径７５μｍのキャピラリーカラム中に８０％（容積／容積）トルエンで作製した金属有機フォトポリマー（キャピラリーＢ）の断面の走査形電子顕微鏡像である。顕微鏡像は、１μｍの球状構造物の相互連結した網目状構造とその中に散在するマイクロメーターサイズのマクロ細孔（もっとも大きいものは５μｍ）を示した。
【００７０】
図４Ｂは、内径７５μｍのキャピラリーカラム中に５０％（容積／容積）トルエンで作製した金属有機フォトポリマーの断面の走査形電子顕微鏡像である。図４Ａに示した多孔性マトリックスとは対照的に、図４Ｂに示した構造は直径２μ以下のマクロ細孔を有する密度の高いフォトポリマーであった。したがって、図４Ｂのマトリックスは透過性がより低く、顕著な背圧を生じた。２００ｐｓｉに近い圧力でもカラム中に液体を流すことはまったくできなかった。
【００７１】
多孔性マトリックスの透過性は、ダーシー (Darcy)の法則で説明されるように透過性に比例する多孔性マトリックスの線形速度により定まる。マクロ細孔サイズの関数としての多孔性マトリックスの透過性は、フォトポリマーを調製するために用いた細孔形成剤の容積と形に強く依存した。９０％（容積／容積）トルエンでつくったカラム（カラムＡ）の線形速度は１２．３ｃｍ／分で、８０％（容積／容積）カラム（カラムＢ）は３．３ｃｍ／分の線形速度を有していたが、７３％（容積／容積）トルエンでつくったカラム（カラムＤ）は０．６ｃｍ／分の線形速度しかなかった。これらの線形速度データは、細孔形成剤濃度の減少と共にマクロ細孔が減少することを示唆した。この挙動は、文献に報告されたものと一致した。
【実施例２】
【００７２】
実施例１で説明したように分離カラムを調製した。細孔形成剤として１：１ヘキサン／トルエンの混合物を用いた。分離カラムは８０／２０のトルエン／反応溶液で作製した分離カラムと類似の分離能を有していた。チオ尿素について６８，０００段／ｍ（ＲＳＤ７．０％、ｎ＝５）のカラム効率と３．７ｃｍ／分の電気浸透流（ＥＯＦ）速度を得た。
【実施例３】
【００７３】
３７５μＬのＭＰＴＭＳと１００μＬの０．１２Ｍ塩酸の混合物を室温で３０分間撹拌した。この混合物２７部をトルエン７３部と合わせて最終溶液２００μＬを得た。最終溶液の５重量％の光開始剤イルガキュア１８００を加え、得られたゾルゲル溶液を使用前に５分間撹拌した。内径７５μｍ×外径３６５μｍの溶融シリカキャピラリーをゾルゲル溶液で満たし、光重合するために分離カラムをスペクトロリンカー (Spectrolinker)Ｘｌ−１５００中で３６５ｎｍの紫外光に露出した。５分間の照射に先立ってキャピラリーのポリイミド被覆を１５ｃｍの幅で取り除いて多孔性マトリックスの重合長さを制御した。未反応試薬をエタノールで洗い流した。キャピラリーの全長は：２５．６ｃｍ（入口から検出窓までは１８．８ｃｍ）であった。作製したカラムは使用前に分離溶液でコンディショニングした。
【００７４】
すべての電気泳動実験は、ベックマンＰ／ＡＣＥ２０００で行った。キャピラリーは、２０℃で温度制御した。圧力（すなわち０．５ｐｓｉおよび２０ｐｓｉ）または電圧（１ｋＶ〜１０ｋＶまで）を用いて注入を行い、２秒〜１９２０秒間の間で変えた。検出は、２１４または２５４ｎｍで行った。データ解析は、ニューハンプシャー州セーラムのギャラクティック  インダストリーズ  コーポレイション (Galactic Industries Corporation)から入手できるＧＲＡＭＳ／３２バージョン４．０２で行った。
【００７５】
図５Ａと図５Ｂは、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。図は、小さな分子のチオ尿素、３つの多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、および８つのアルキルフェニルケトンを含有する混合物のＣＥＣ分離における注入プラグ長の増大にともなう検出感度の増大を示している。溶媒グラジエント効果を除くために、試料は分離溶液中で調製した。試料溶液と分離溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／４／５）であった。図５Ａでは、プラグ長は０．１ｍｍ、６．８ｍｍ、１３．７ｍｍ、２７．４ｍｍ、および３４．２ｍｍであった。０．１ｍｍプラグ長は０．５ｐｓｉの圧力下で、他のすべてのプラグ長は２０ｐｓｉの圧力下であった。分離のために加えた電圧は２０ｋＶ、吸光度は２１４ｎｍで測定した。カラムの溶出順序は、（１）１２．５μＭチオ尿素、（２）５１．０μＭナフタレン、（３）１．０μＭフェナントレン、および（４）１２３μＭピレンであった。
【００７６】
図５Ｂにおいて、カラムを（３，３，３−トリフルオロプロピル）トリクロロシランの連続流によって３０分間室温で後修飾し、続いてトルエンですすぎ洗いしたことを除いては先に説明したカラムと同様にカラムを調製した。プラグ長は０．７ｍｍ、７．２ｍｍ、１０．７ｍｍ、１７．９ｍｍ、および２８．６ｍｍであった。加えた電圧は１５ｋＶ、吸光度は２５４ｎｍで測定した。カラムの溶出順序は、（１）５μＭチオ尿素、（２）アセトフェノン、（３）プロピオフェノン、（４）ブチロフェノン、（５）バレロフェノン、（６）ヘキサノフェノン、（７）ヘプタノフェノン、（８）オクタノフェノン、および（９）デカノフェノンであった。アルキルフェニルケトンのそれぞれの濃度は、分離溶液中０．１μｇ／ｍＬであった。
【００７７】
図５Ａに示したＰＡＨ混合物について、典型的な０．１ｍｍプラグ長の注入ではピークはほとんど見えなかったが、プラグ長を６．８〜３４．２ｍｍへ増大するとピーク高さが増大した。すなわち、本発明の一実施形態である分離カラムは、典型的な分離カラムよりも長いプラグ長の注入を可能とする。同様に、図５Ｂに示したアルキルフェニルケトン混合物について、プラグ長を０．７ｍｍ〜５７．３ｍｍへ増大したとき、ピーク高さが増大した。プラグ長を大きくするにつれて４つのピークはすべて広がりが大きくなったが、後の方で溶出するピークほど、先に溶出するピークよりわずかではあるがより対称形になった。この挙動は、分散効果のために、後の溶出ピークが先の溶出ピークより対称性が悪くなる典型的なクロマトグラフィー分離において観測されるものとは逆である。これらの結果は注入時に分析物が多孔性マトリックスの入口で蓄積し、より保持性の高い化学種は保持性の低いものよりより効果的に局所化されることを示唆している。
【００７８】
図５Ａにおいて、典型的な０．１ｍｍ注入と比較した２７．４ｍｍ注入のピーク高さの改善は、ナフタレン、フェナントレン、およびピレンについてそれぞれ５０、１２５、および１２７倍である。２７．４ｍｍ注入における試料溶液は、典型的な０．１ｍｍ注入における試料の１０倍希釈である。
【実施例４】
【００７９】
実施例３で説明したように分離カラムを調製した。試料および分離溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／３／６）であった。試料は、１ｋＶで注入した。加えた電圧は１５ｋＶ、吸光度は２１４ｎｍで検出した。図６は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離溶液中の３９．０ｍＭのナフタレンを５秒間注入した結果を信号ａによって表し、分離溶液中の３．９ｍＭのナフタレンを８５秒間注入した結果を信号ｂによって表した。１０倍希釈の試料の注入時間を制御することにより双方のエレクトロクロマトグラムの補正ずみピーク面積（ピーク面積／移動時間）がほとんど同じになるようにした。ラインａおよびｂのエレクトロフェログラムの補正ずみピーク面積は、それぞれ０．００２３（％ＲＳＤ＝０．０２％、ｎ＝３）および０．００２５（％ＲＳＤ＝０．００、ｎ＝３）任意単位／分であった。この比較は、注入されるナフタレン分子の量がそれぞれの測定で同じになるようにして行った。
【００８０】
異なる試料濃度にもかかわらず、希釈した試料をより長く注入した方がピーク高さが若干高かったことと補正ずみピーク幅（ピーク幅／移動時間）が両方の実験でほとんど同じであったことにより予備濃縮の証拠が得られた。信号ａとｂにおけるエレクトロクロマトグラムのピーク高さは、それぞれ０．０８６９（％ＲＳＤ＝０．３６％、ｎ＝３）および０．０９３７（％ＲＳＤ＝０．０６％、ｎ＝３）任意単位であった。信号ａとｂにおけるエレクトロクロマトグラムのピーク幅は、それぞれ０．０２５３（％ＲＳＤ＝０．０７％、ｎ＝３）および０．０２４９（％ＲＳＤ＝０．０１％、ｎ＝３）任意単位／分であった。ラインｂ上の移動時間のシフトは、より長い注入時間によって試料プラグの中心が検出窓により近くなったからである。
【実施例５】
【００８１】
５７５μＬのＭＰＴＭＳと１００μＬの０．１２Ｍ塩酸の混合物を室温で３０分間撹拌した。この混合物２０部をトルエン８０部と合わせて最終溶液２００μＬを得た。最終溶液の全容積の１０％の光開始剤を加え、得られたゾルゲル溶液を使用前に５分間撹拌した。上述した実施例３で説明したように分離カラムを調製した。未反応試薬をトルエンで洗い流した。キャピラリーを通してペンタフルオロフェニルトリクロロシランの連続流によって４５分間室温で多孔性マトリックスの表面を修飾し、続いてトルエンですすぎ洗いした。
【００８２】
図７（パネルａおよびｂ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離溶液は、５０ｍＭりん酸／水／アセトニトリル（１／５／４）であった。加えた電圧は１５ｋＶ、吸光度は２１４ｎｍで検出した。図７（パネルａ）は試料ペプチド類の０．１ｍｍプラグ長における０．５ｐｓｉ注入を示し、図７（パネルｂ）は試料ペプチド類の１２ｍｍプラグ長における０．５ｐｓｉ注入を示す。荷電分析物である試料ペプチド類は、（１）ブラジキニン、（２）アンジオテンシンＩＩ、（３）トリペプチドＩ、（４）トリペプチドＩＩ、および（５）メチオニンエンケファリンであった。ペプチド類の濃度は、１６．７μｇ／ｍｌであった。ペプチド類の正極方向速度は、電気泳動流効果と電気浸透流効果の両方によって支配された。分離溶液のｐＨ（ｐＨ＝２）においてペプチド類は正の正味電荷をもっていた。典型的な０．１ｍｍプラグ長の注入と比較したより長い注入のピーク高さの改善は、ブラジキニン、アンジオテンシンＩＩ、トリペプチドＩ、トリペプチドＩＩ、およびメチオニンエンケファリンに対してそれぞれ２１、１９、１６、１８および２２倍であった。この結果は、荷電分析物に対するこの方法の有用性を示している。
【実施例６】
【００８３】
実施例３におけるように分離カラムを調製した。図８（パネルａ、ｂ、およびｃ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。図８は、０．１ｍＭヒドロコーチゾン（ピーク１）、０．３ｍＭプロゲステロン（ピーク２）および０．２ｍＭコーチゾン（ピーク３）でスパイクした尿試料の分析を示す。スパイクまたはスパイクしていない尿の４部をアセトニトリルの６部と混合し、遠心分離して蛋白質を除去した。各上澄みの一部を５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／７／２）の一部と注入前に混合した。図８（パネルａ）は注入プラグ長０．１ｍｍ、図８（パネルｂ）は注入プラグ長２１．４ｍｍを示す。図８（パネルｃ）は、２１．４ｍｍ注入プラグ長の尿ブランクを示す。分離溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／５／４）からなっていた。分離のために加えた電圧は１７ｋＶ、吸光度は２５４ｎｍで測定した。アセトニトリルによる蛋白質沈殿後、これらのステロイドは試料溶液の２１．４ｍｍ注入で検出し定量したが、典型的な０．１ｍｍ注入では弱く検出された。ブランク測定およびスパイク試料測定の比較によると、他の生物分子をまだ含んでいる試料マトリックスは、分離カラム上でステロイドの分析に顕著に干渉しなかった。この結果は、バイオ流体の分析に対するこの技法の有用性を示している。
【実施例７】
【００８４】
実施例３で説明したように分離カラムを調製した。図９（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。試料プラグ長１．１ｃｍを注入した。分離溶液は６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウム、試料溶液は６０％アセトニトリル（パネルａ）、５０％アセトニトリル（パネルｂ）、４０％アセトニトリル（パネルｃ）、３０％アセトニトリル（パネルｄ）、および２０％アセトニトリル（パネルｅ）中の５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。分離のために加えた電圧は１５ｋＶ、吸光度は２５４ｎｍで検出した。溶出順序は、（１）チオ尿素、（２）アセトフェノン、（３）プロピオフェノン、（４）ブチロフェノン、（５）バレロフェノン、（６）ヘキサノフェノン、（７）ヘプタノフェノン、（８）オクタノフェノン、および（９）デカノフェノンであった。各分析物の濃度は、２ｎｌ／ｍｌであった。
【００８５】
アセトフェノン（ピーク２）、プロピオフェノン（ピーク３）、ブチロフェノン（ピーク４）、バレロフェノン（ピーク５）、ヘキサノフェノン（ピーク６）、ヘプタノフェノン（ピーク７）、オクタノフェノン（ピーク８）、およびデカノフェノン（ピーク９）に対して得た保持因子ｋは、それぞれ０．１８、０．２５、０．３２、０．４１、０．５３、０．６７、０．８５、および１．３３であった。この検討では、ｋの決定のための基本的に保持されない中性溶質としてチオ尿素（ピーク１）を用いた。ｋの値と移動時間は、アルキル鎖長の増加に追随した。一般的に、水濃度が４０％から５０％、６０％、７０％、および８０％へと増大したとき、ピーク形状と分離能はそれぞれパネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅによって証明されるように改善した。
【実施例８】
【００８６】
実験条件は実施例７におけるのと同じとした。図１０は、ピーク高さ比（分離溶液に類似した水濃度の試料マトリックスから求めたピーク高さによって、より高い水の濃度の試料マトリックスから求めたピーク高さを除したもの）の対数対試料マトリックス中の水の百分率を示すプロットのグラフ表示である。データは、試料マトリックス中の緩衝液の濃度を増すことによって改善できるピークの高さにはある限界が存在することを示している。予備濃縮は、多孔性マトリックスへの分析物の引力が増すことによって改善された。ピーク高さ比の対数の値が１を下回ったとき、およそ１であったとき、または１より大きかったとき、分離溶液を試料マトリックスとして用いた類似の注入と比較すると、ピーク高さにはそれぞれ減少、無変化、または増大がみられた。すべての試験ＡＰＫに対して、水濃度が４０％〜５０％へ、また５０％〜６０％へ増大したとき、ピーク高さは改善した。水の百分率が６０％〜７０％またはさらに増大したとき、もっとも低いｋの分析物（アセトフェノンおよびプロピオフェノン）２つを除いてピーク高さは改善しなかった。８０％水マトリックス中ではより高いｋ値の分析物（ヘプタノフェノン、オクタノフェノン、およびデカノフェノン）に対するピーク高さは悪化した。ピーク高さの低下の理由は、水性度の高い試料マトリックス中における高いｋ値の分析物の溶解性が減少することにある。オクタノフェノンおよびデカノフェノンについて取り込んだ試料の量の指標である補正ピーク面積は、８０％水マトリックス中では用いた他の試料マトリックスと比較して１０〜６０％低かった。溶解性の問題を回避するために、以降の実験における試験ＡＰＫは少なくとも３０％のアセトニトリルを有するマトリックス中で調製した。
【実施例９】
【００８７】
上述した実施例３で説明したように分離カラムを調製した。図１１（パネルａ、ｂ、およびｃ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離溶液は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムである。プラグ長は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムの試料溶液で０．２ｃｍ（パネルａ）、パネルａで用いたのと同じ試料溶液で２．７４ｃｍ（パネルｂ）、３０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムの試料溶液で２．７４ｃｍ（パネルｃ）であった。他の条件とピークの同定は実施例７におけると同じである。
【００８８】
図１１（パネルｃ）に示したように、グラジエント条件を用いると分離能とピーク形状が改善した。図１１（パネルｃ）に示したグラジエント条件下でのピーク高さの改善は、アセトフェノン、プロピオフェノン、ブチロフェノン、バレロフェノン、ヘキサノフェノン、ヘプタノフェノン、オクタノフェノン、およびデカノフェノンに対してそれぞれ３６、３５、３８、４１、４２、３８、３２、および２４倍であった。測定したピーク高さの％ＲＳＤ（ｎ＝５）は、０．９％〜２．５％の範囲であった。移動時間の％ＲＳＤ（ｎ＝５）は、０．３％〜０．５％の範囲であった。それゆえ、この手順は、単一カラム内で再現可能である。
【実施例１０】
【００８９】
図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。プラグ長は、４０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムの試料溶液で２．７４ｃｍ（図１２Ａ）、３０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムの試料溶液で２．７４ｃｍ（図１２Ｂ）、図１２Ｂにおけるのと同じ試料溶液で５．４８ｃｍ（図１２Ｃ）であった。分離溶液は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウム（図１２Ａ）および５０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウム（図１２Ｂおよび１２Ｃ）であった。他の条件とピークの化合物は、実施例７におけるのと同じである。
【００９０】
図１２Ｂのｋ値は、分離溶液中の水の百分率が高いため、図１２Ａよりも高かった。分析物分子は、高い水の百分率でＰＳＧ相により強くひきつけられた。ｋに直接比例する分布定数Ｋ（分離溶液中の溶質の分子数で除したＰＳＧ相中の溶質の分子数）は、分離溶液中の水の濃度の増大とともに増大した。図１２Ｂで、アセトフェノン、プロピオフェノン、ブチロフェノン、バレロフェノン、ヘキサノフェノン、ヘプタノフェノン、オクタノフェノン、およびデカノフェノンに対するｋ値は、それぞれ０．２９、０．４７、０．６５、０．９２、１．２８、１．７６、２．３７、および４．２５であった。グラジエント効果を一定に維持するために、図１２Ａと１２Ｂで分離溶液と試料マトリックスとの間の有機溶媒比の百分率を同じ値に保った。理由はわからないが、より低いｋ値を有する分析物（アセトフェノンおよびプロピオフェノン）に対して図１２Ａと比較すると、図１２Ｂの結果はピーク高さに若干の増加があることを示した。他の試験溶質については、ピーク高さにいくらか減少がある。
【００９１】
図１２Ｃは、注入プラグを５．４８ｃｍとより長くして分離溶液中の水の百分率をより高くしたときに起きることを示している。アセトフェノン、プロピオフェノン、ブチロフェノン、バレロフェノン、ヘキサノフェノン、ヘプタノフェノン、オクタノフェノン、およびデカノフェノンに対するピーク高さの改善は、それぞれ３１、３３、５５、４４、４４、３７、２９、および１９倍であった。図１１ｃ（パネルｃ）におけるように、ピーク高さの改善は非グラジエント条件下とは異なりｋに追随しなかった。ピーク高さの改善は、分離溶液と試料マトリックスとの間の有機溶媒の百分率がより高いものを用いて得られた改善（図１１、パネルｃ）に匹敵した。図１１（パネルｃ）において、注入プラグ長が図１２Ｃにおけるよりも２倍短いことに留意されたい。
【実施例１１】
【００９２】
図１３（パネルａおよびｂ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。プラグ長は、０．２２ｍｍ（パネルａ）および１９．５ｃｍ（パネルｂ）であった。分離溶液は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。試料溶液は、６０％アセトニトリル中（パネルａ）および３６％アセトニトリル（パネルｂ）中の５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。試料濃度は、１１〜５３μｇ／ｍｌまで（パネルａ）および１．１〜５．３μｇ／ｍｌまで（パネルｂ）であった。加えた電圧は３０ｋＶ、吸光度は２１４ｎｍで測定した。溶出順序は、チオ尿素（ピーク１）、ナフタレン（ピーク２）、フェナントレン（ピーク３）、ピレン（ピーク４）、およびベンゾ［ｅ］アセフェナンチレン（ピーク５）であった。
【００９３】
図１３（パネルｂ）に示したように、溶媒グラジエントによって４つのＰＡＨの検出は改善した。より迅速な分析時間のために、分離溶液中のより高いアセトニトリルの百分率（６０％）、より短いＰＳＧ長（１０ｃｍ）、および高い電場強度（７８１．３Ｖ／ｃｍ）を用いた。図１３（パネルａ）は、分離溶液中に調製した試料の０．２２ｍｍの典型的な注入である。図１３（パネルｂ）は、グラジエントを用いた１９．５ｃｍ注入で、試料は３６％アセトニトリルマトリックス中にあり、試料溶液と分離溶液との間には有機溶媒の百分率が高くなるようにした。１９．５ｃｍより大きなプラグを用いるとナフタレンピークの広がりが起きる。注入長が入口から検出窓までの長さ（１８．８ｃｍ）より長いということは興味深い。実際により速く溶出するチオ尿素区域が試料注入中に観測される。チオ尿素区域は、それゆえ分離電圧の開始時に検出窓にある。
【００９４】
ナフタレン（ピーク２）、フェナントレン（ピーク３）、ピレン（ピーク４）、およびベンゾ［ｅ］アセフェナンチレン（ピーク５）のピーク高さの改善は、それぞれ３４６、４３７、４０９、および３１５倍であった。図１３（パネルｂ）における試料濃度は、図１３（パネルａ）におけるよりも１０倍低かった。ナフタレン、フェナントレン、およびピレンに対しては、上述した値は、先に報告した非グラジエント条件におけるものよりそれぞれ６．９、３．５、および３．２倍優れていた。
【実施例１２】
【００９５】
図１４（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。プラグ長は、０．２３ｍｍ（パネルａ）、７．６ｃｍ（パネルｂ）、２２．８ｃｍ（パネルｃ）、４５．６ｃｍ（パネルｄ）、および９１．２ｃｍ（パネルｅ）であった。分離溶液は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。試料溶液は、６０％アセトニトリル（パネルａ）および４０％アセトニトリル（パネルｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）中の５ｍＭ酢酸アンモニウムである。試料濃度は、９〜５０μｇ／ｍｌまで（パネルａ）、０．９〜５μｇ／ｍｌまで（パネルｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）であった。加えた電圧は２２ｋＶ、吸光度は２５４ｎｍで検出した。溶出順序は、チオ尿素（ピーク１）、デカノフェノン（ピーク２）、およびピレン（ピーク３）であった。
【００９６】
プラグ長が増大するとデカノフェノン（ピーク２）およびピレン（ピーク３）のピーク高さは増大した。注入は、０．２３ｍｍ（パネルａ）〜７．６ｃｍ（パネルｂ）、２２．８ｃｍ（パネルｃ）、４５．６ｃｍ（パネルｄ）、および９１．２ｃｍ（パネルｅ）に増大し、これは、全キャピラリー長の０．１％、３０％、８９％、１７８％、および３５６％に対応する。多孔性マトリックスの多孔度が高いためまたは流れに対する抵抗が低いため、試料溶液長の長いものをむしろたやすく導入することが可能であった。９１．２ｃｍよりさらに長い注入でさえ可能である。ただし、図１４（パネルｅ）にみられるような分離能の低下のため実行しない。パネルｄまたはｅのエレクトロクロマトグラムは、全キャピラリー長より長い試料注入を示すＣＥＣにおける初めての実例であると考えられる。注入された試料の容積もまた１μｌより大きい。パネルａおよびｅで得たピーク高さの比較によると、デカノフェノンおよびピレンに対してそれぞれ１１１８倍および１１０４倍のピーク高さにおける改善が示唆される。これらの値は、ＣＥＣにおける単純なオンライン予備濃縮技法を用いて中性分析物で報告された中の感度改善の最高値である。多孔性マトリックスに対する分析物の強い相互作用および多孔性マトリックス固有の迅速な物質移動特性によってこのような顕著な予備濃縮効果の観測が可能となった。
【００９７】
内径２５０μｍのキャピラリー中のＰＳＧを用いて分離に成功した（データは示していない）。この結果は、長いプラグ注入を用いる半調製的分離を実行する可能性を開くものである。μｌ域の注入容積が容易に実行できた。
【実施例１３】
【００９８】
図１５（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。プラグ長は、０．１ｍｍ（パネルａ）および１．８ｃｍ（パネルｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）であった。注入長を１．８ｃｍに固定したものについては圧力で注入した。試料溶液は、分離溶液と同じ（パネルａとｂ）、２０％アセトニトリル中の１０ｍＭりん酸（パネルｃ）、７０％アセトニトリル中の１０ｍＭりん酸（パネルｄ）、４０％アセトニトリル中の５０ｍＭりん酸（パネルｅ）、４０％アセトニトリル中の０．０５ｍＭりん酸（パネルｆ）であった。分離溶液は、４０％アセトニトリル中の１０ｍＭりん酸であった。ペプチド濃度は各１６．７μｇ／ｍｌ、加えた電圧は１２ｋＶ、吸光度検出は２１４ｎｍにおいてとした。溶出順序は、ブラジキニン（ピーク１）、アンジオテンシンＩＩ（ピーク２）、トリペプチドＩ（ピーク３）、トリペプチドＩＩ（ピーク４）、およびメチオニンエンケファリン（ピーク５）であった。
【００９９】
非グラジエント条件（図１５、パネルｂ）と比較してグラジエント条件（図１５、パネルｃ）下ではピーク形状がよりよくなると予測したが、試料マトリックス中でより高い濃度のアセトニトリル（図１５、パネルｄ）を用いた方が得られるピーク形状がよりよかった。図１５（パネルｄ）中のよりよいピーク形状は、試料スタッキングの結果観測されたものである。ひとたび電圧を加えるとカチオン性ペプチドが直ちに分離緩衝液へ移動し、かくして分離溶液が多孔性マトリックスに到達する前にペプチド区域は既に分離溶液中にあるため、より高い濃度の溶出溶媒を試料溶液中に用いたときの広がり効果（溶出溶媒のより高い濃度に起因する逆グラジエント効果）は観測されない。分離溶液と比較してより低い濃度の緩衝成分および類似の百分率のアセトニトリルを有するマトリックス中で試料を調製した図１５（パネルｆ）中にも試料スタッキングは示される。
【０１００】
デスタッキングから生じる望ましくないピーク形状が図１５（パネルｃ）中でみられる。デスタッキングは、分析物が低い電場強度域と高い電場強度域を隔てる濃度境界を通過するときの荷電分析物の広がりである。低電場区域は、より多くの水を含む高伝導率試料マトリックスである。また、分離溶液と比較してより高い濃度の緩衝成分および類似の百分率のアセトニトリルを有するマトリックス中で試料を調製した図１５（パネルｅ）にもデスタッキングは示される。
【実施例１４】
【０１０１】
図１６（パネルａおよびｂ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。注入は、０．５ｐｓｉ圧力を用いて０．１ｍｍ（パネルａ）および５ｋＶで１５秒間（パネルｂ）であった。試料溶液は、４０％アセトニトリル中の１０ｍＭりん酸（パネルａ）および４０％アセトニトリル中の０．５μＭりん酸（パネルｂ）であった。ペプチド濃度は各１６．７μｇ／ｍｌ（パネルａ）および各１６７ｎｇ／ｍｌ（パネルｂ）であった。分離電圧は、１２ｋＶであった。他の条件は実施例１３におけるものと同じである。
【０１０２】
図１６（パネルｂ）における分析物は、図１６（パネルａ）における分析物より１００倍低濃度であった。ブラジキニン（ピーク１）、アンジオテンシンＩＩ（ピーク２）、トリペプチドＩ（ピーク３）、トリペプチドＩＩ（ピーク４）、およびメチオニンエンケファリン（ピーク５）に対するピーク高さの改善は、それぞれ１０４０、８２０、８１０、９５０、および７１１倍であった。この予備濃縮手順に対するピーク高さの％ＲＳＤ（ｎ＝５）は６．２％〜１６．２％の範囲にあり、移動時間の％ＲＳＤ（ｎ＝５）は０．７％〜１．５％の範囲にあった。ピーク高さの再現性は内部標準の使用により改善されるべきものである。
【０１０３】
試料を低伝導率マトリックス（４０％アセトニトリル中の０．５μＭりん酸）中に溶解し、続いて負電極を検出器端に置いた電圧を用いる注入により、電場促進試料注入を行った。電圧が加えられたとき、低伝導率試料マトリックスは電気浸透流（ＥＯＦ）の作用によってキャピラリーに入り、カチオン性ペプチドはＥＯＦと電気泳動流の両方の作用によってカラムに入る。分離溶液の低いｐＨがＥＯＦを顕著に低下させるため試料マトリックスの非常に小さいプラグだけが導入され、キャピラリー壁におけるシラノール基の解離を妨げた。保持されない中性溶質（チオ尿素）は実際に３０分後に検出された。
【０１０４】
カラム中に導入された試料マトリックス区域中の電場は、分離区域よりはるかに高かった。この効果によりキャピラリー中に入るカチオン性ペプチド類の電気泳動速度は高くなった。流体力学的な注入とは異なり、分析物の電気泳動速度が高いため大量のペプチド類が導入され、取り込まれた試料の容量によって導入される試料の量が決まった。また、分析物の電気泳動速度が高いため試料マトリックスと分離溶液の間の濃度境界においてペプチド類は濃縮されるか予備濃縮された（試料スタッキング）。電気運動的注入前に水プラグを導入することは、電気運動的注入を用いる試料スタッキングにおいて有用であると示唆されているが、ＥＯＦと分析物の電気泳動速度の方向が同様なためピーク高さは改善されなかった。また、キャピラリーに入る低伝導率の試料マトリックスは、注入時にキャピラリーの入口端における電場の増大を維持した。
【０１０５】
図１６における条件で、５ｋＶにおける最適な電気運動的注入時間は１５秒であった。これより長い注入時間はピークの広がりをもたらした。注入後、注入におけるのと同じ極性（検出器側に負電極）で分離電圧を加えた。分析物は正極へ移動し、次に再びＰＳＧカラム上での保持に基づいて予備濃縮された。カチオンはほとんどがキャピラリー中に導入されていたので、この方法はカチオンに対して選択的と考えられた。注入された中性物は、ＥＯＦが非常に遅いため保持されない中性のマーカーおよびカチオンの後で移動した。用いたｐＨにおいて、すべての分析物は正に荷電しているか中性であった。この技法の他のカチオン性試料への適用も可能である。
【実施例１５】
【０１０６】
表２は、前駆体（メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン）に対する酸触媒の比を変えて、または（混合相ＰＳＧモノリスを生成するために）前駆体を補助前駆体と反応させて、種々の前駆体原料溶液をつくるために用いた試薬の形と容積を並べて示す。
【表２】
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【０１０７】
反応溶液中の前駆体の濃度を変えまたは混合相生成用の補助前駆体を用いて元のＰＳＧモノリスの化学的性質を変えた。溶液ＡおよびＪから調製したＰＳＧモノリスのそれぞれＰＳＧ−ＡとＰＳＧ−Ｊは、反応に用いた前駆体の量についてＪはＡよりも高い容積の前駆体を含むということだけが異なる。より高い容積の前駆体を反応に用いるとキャピラリーカラム中の密度がより高いモノリスが得られる。ＰＳＧモノリスのＰＳＧ−Ｋは、前駆体とビス（トリエトキシシリル）エタンを補助前駆体として用いて調製した。ＰＳＧモノリスのＰＳＧ−ＭとＰＳＧ−Ｐは、前駆体と種々の量のビス（トリエトキシシリル）オクタンを補助前駆体として用いて調製した。補助前駆体は、加水分解し前駆体と縮合してハイブリッドゾル（混合相）を生成する。
【０１０８】
溶液ＡとＪについては、適当な容積の前駆体を１００μＬの酸触媒（０．１２Ｍ  ＨＣｌ）に加え、得られた溶液を室温で１５分間撹拌した（暗所で）。溶液Ｋ、ＭおよびＰについては、適当な容積の前駆体を１００μＬの０．１２Ｍ  ＨＣｌに加え、続いて適当な量のビス（トリエトキシシリル）エタンを加えた。得られた溶液を室温で１５分間撹拌した（暗所で）。これらの溶液はすべて調製後２時間以内に使用した。
【０１０９】
同様な手順に従って光開始剤を加えたトルエン／前駆体原料溶液をつくった。トルエン／前駆体原料溶液に加えた光開始剤の量は、トルエン／前駆体原料溶液１００μＬに対して光開始剤１０ｍｇであった。
【０１１０】
先に説明したのと同じようにキャピラリーを調製しコンディショニングした。ＰＳＧキャピラリーカラムコンディショニングは前と同じである。
【０１１１】
アルキルフェニルケトン類（ＡＰＫ）および多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）の２つの試験混合物に対するモノリスの分離因子を決定した。分離因子は、クロマトグラフィー系の分析物分離能力の指標である。分離因子αは、ｋ2 ／ｋ1 で与えられ、ここでｋは特定の分析物の保持因子、ｋ2 とｋ1 は隣り合う分析物のｋ値である。保持因子ｋ＝（ｔR −ｔ0 ）／ｔ0 は通常の方法により定め、ここでｔR は分析物の保持時間、ｔ0 は保持されないマーカーの保持時間であり、ここではマーカーとしてチオ尿素を用いた。表３は、各ＰＳＧモノリスのナフタレンおよびピレンに対する分離因子を列挙する。
【表３】
2004538482.tif 000005
【０１１２】
αの値は、ＰＳＧ−Ｋの２．４３からＰＳＧ−Ｐの２．７６まで変化し、ＰＳＧ−Ｐの分離因子は他のモノリスのそれより若干高い。１より大きい分離因子は、分析物の分離が成功したことを示す。
【０１１３】
図１７（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。チオ尿素（Ｔ）、ナフタレン（Ｎ）、フェナントレン（Ｐｈ）、およびピレン（Ｐｙ）の混合物をＰＳＧ−Ａ（図１７、パネルａ）、ＰＳＧ−Ｋ（図１７、パネルｂ）、ＰＳＧ−Ｊ（図１７、パネルｃ）、ＰＳＧ−Ｍ（図１７、パネルｄ）、およびＰＳＧ−Ｐ（図１７、パネルｅ）上で分離した。すべての場合において、異なる分析物のピークが良好に分かれた。
【０１１４】
分離能は、式ＲS ＝√Ｎ（α−１）ｋ／４α（ｋ＋１）によって定め、ここでＮは効率（理論段数）、αは分離因子、ｋは特定の分析物の保持因子である。ＰＳＧ−Ａはナフタレンとピレンに対して２．４３のもっとも低い分離能を有し、ＰＳＧ−Ｊは同じ２つの分析物に対して４．３５の分離能を有していた。ＰＳＧ−Ａと比較してＰＳＧ−Ｊの調製において用いたより高い容積の前駆体はモノリスの疎水性を増大させた。ＰＳＧ−Ｊ上のナフタレンおよびピレンに対する保持因子はそれぞれ０．３１および０．７９であり、これらの値はモノリスの疎水性の増大を反映していた。これらの値は、それぞれ５５％および５４％の増加を表している。
【０１１５】
補助前駆体、すなわちＰＳＧ−Ｍにおけるビス（トリエトキシシリル）オクタンおよびＰＳＧ−ＫとＰＳＧ−Ｐにおけるビス（トリエトキシシリル）エタンの使用は、ナフタレンとピレンに対してそれぞれ４．３７、４．０９、および９．０３の分離能を生じ、元であるＰＳＧ−Ａ（ＲS ＝２．４３）上での分離能と比較すると最大７３％の増大である。これらの３つのモノリスでの保持因子は、ナフタレン（０．２３）に対してもピレン（０．５６）に対してもＰＳＧ−Ａより６０％高かった。
【実施例１６】
【０１１６】
上述した実施例１５でモノリスＰＳＧ−Ｊについて説明したように分離カラムを調製した。１５ｃｍの長さを有する多孔性マトリックスでは、ナフタレンおよびピレンの保持因子（ｋN およびｋPy）は、８０％トルエンでつくった多孔性マトリックスでそれぞれ０．３１と０．７９であった。１０ｃｍの長さを有する同様な多孔性マトリックスでは、ｋN およびｋPyはそれぞれ０．１０と０．２４であった。長さとｋN （ｒ＝０．９９１）およびｋPy（ｒ＝０．９９１）との間には線形な相関があった。１５ｃｍ、１０ｃｍ、および５ｃｍの多孔性マトリックスでの分離因子は、それぞれ２．５５、２．５２、および２．４０であった。かくして、もっとも短いモノリス長さに対して、高い分離因子が維持され、分析物に対する溶出時間は顕著に短縮された。キャピラリーカラム中の多孔性マトリックスの長さを減らすことは、試験分析物の溶出時間の短縮につながった。この長さを減らすことにはナフタレンおよびピレンに対する保持因子を減らす効果があった。
【実施例１７】
【０１１７】
上述した実施例１５で説明したように分離カラムを調製した。８０％トルエンでつくったＰＳＧ−ＡではｋN は０．１４でｋPyは０．３６であったが、７３％トルエンでつくったＰＳＧ−ＡではｋN は０．３０でｋPyは０．７４であった。８０％トルエンおよび７３％トルエンでつくったＰＳＧ−Ａの分離因子は、それぞれ２．５７（０．１％ＲＳＤ）および２．４７（０．１％ＲＳＤ）であった。モノリスの調製において７３％トルエンを用いたとき、ナフタレンおよびピレンに対するｋの値は５３％および５１％増大した。
【０１１８】
同様な傾向がＰＳＧ−Ｊについて観測され、８０％トルエンでつくったモノリスでは、ｋN は０．３１でｋPyは０．７９であった。トルエンの濃度が８０％〜７３％へ低下したとき、ｋN （０．４９）およびｋPy（１．２３）値は３７％および３６％増大した。８０％トルエンおよび７３％トルエンでつくったＰＳＧ−Ｊの分離因子は、それぞれ２．５５および２．５１であった。
【０１１９】
８０％および７３％トルエンでつくったＰＳＧモノリスを比較するとき、ナフタレンおよびピレンの分離能は顕著に異なった。より低い容積のトルエンを用いることにより細孔サイズが減少するとき、ＰＳＧ表面積は増大し、その結果、同じ分離溶液条件下で保持および分離能が増大した。かくして、多孔性マトリックスの透過性は分析物の保持に影響する。
【実施例１８】
【０１２０】
モノマー、すなわち、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＯＳ）およびシランカップリング試薬、すなわち、ペンタフルオロフェニルジメチルクロロシラン（ＰＦＰＤＭ）、ペンタフルオロフェニルトリエトキシシラン（ＰＦＰ）、３，３，３−トリフルオロプロピルトリクロロシラン（Ｃ3 Ｆ3 ）、ｎ−オクタジメチルクロロシラン（Ｃ8 ）、（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）ジメチルクロロシラン（ＣＦ13）、およびｎ−プロピルアミノトリエトキシシラン（ＮＨ2 ）は、シグマ−アルドリッチ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）またはジェレスト（ペンシルベニア州タリータウン）から購入しそのまま用いた。光開始剤イルガキュア１８００は、チバ（ニューヨーク州タリータウン）から贈られた。溶媒はすべてシグマ−アルドリッチからの分光分析用のものであった。内径７５μｍ×外径３６５μｍの溶融シリカキャピラリーは、ポリマイクロ  テクノロジーズ（アリゾナ州フェニックス）から購入した。チオ尿素、アルキルフェニルケトン類、ナフタレン、フェナントレン、ピレン、ヌクレオシド類、タキソール、タキソール誘導体、およびペプチド類はシグマ−アルドリッチから購入しそのまま用いた。
【０１２１】
エレクトロクロマトグラムのすべては、紫外線吸光度検出器（カリフォルニア州フラトンのベックマン  コールター  インコーポレイテッド (Beckman Coulter Inc.) ）を備えたベックマンＰ／ＡＣＥ２０００キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置を用いて得た。６個の３６５ｎｍ低圧水銀電球を備えたスペクトロリンカーＸＬ−１５００（ニューヨーク州ウェストベリーのスペクトロニクス  コーポレイション (Spectronics Corp.)）を光重合反応に用いた。フィリップス５０５形走査形電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いてキャピラリーカラム中の多孔性マトリックスの物理的構造を解析した。その目的のために、各カラムはデントン真空 (Denton Vacuum)（ニュージャージー州ムアズタウン）のＬＬＣ  ＤｅｓｋＩＩ低温スパッタ／エッチ装置および炭素蒸着アクセサリを用いて厚さ１０ｎｍの金／パラジウムで被覆した。
【０１２２】
５７５μＬのＭＰＴＭＯＳと１００μＬの０．１２Ｍ  ＨＣｌのモノマー原料溶液を用いて室温で１５分間撹拌して金属有機ポリマーを調製した。６０μＬのモノマー原料溶液と２４０μＬのトルエン中に溶解した３０ｍｇの光開始剤とを混合することにより８０／２０（容積／容積）トルエン前駆体溶液を調製した。得られた溶液を室温下、暗所で５分間撹拌した。外面から５または１０ｃｍの筋のポリイミドを除去したキャピラリーカラムを調製した。キャピラリーの全長は２５．６ｃｍ（入口から検出窓まで１８．８ｃｍ）であった。検出窓は多孔性マトリックスより後ろに位置し、ポリイミドを発煙硫酸で焼き切ることによりつくり出した。
【０１２３】
シラン化反応に先立って、トルエンですすぎ洗いしたカラム中の８０／２０金属有機ポリマー上に結合相を調製した。すすぎ洗いしたカラムを次に手持ち万力中の注射器を用いて試薬の純液の連続流によりシランカップリング試薬で処理した。室温で１５、３０、６０、７０および９０分間試薬をポリマーの表面と反応させた。未反応のシランカップリング試薬はすべて結合相多孔性マトリックスから注射器を用いてトルエンで洗い流して除去した。この手順により次の結合相多孔性マトリックスを調製した。すなわち、ＰＳＧ−ＰＦＰ、ＰＳＧ−ＰＦＰＤＭ、ＰＳＧ−Ｃ8 、ＰＳＧ−Ｃ3 Ｆ3 、ＰＳＧ−ＣＦ13およびＰＳＧ−ＮＨ2 である。
【０１２４】
ＰＳＧキャピラリーカラムを注意深くＰ／ＡＣＥカートリッジ中に設置した。カラムにはポリイミドの完全な被覆はないが、それでも良好な機械的強度を維持している。ただし、これらのキャピラリーを取扱うのに際してはキャピラリーカートリッジ中への設置時に壊れないように注意する必要がある。カートリッジ中に設置したらまず注射器を用いてキャピラリーを分離溶液でコンディショニングした。ＣＥ装置中でさらに約２分間２０ｐｓｉでカラムをすすぎ洗いし、続いて５ｋＶで１０分間電気運動的コンディショニングをした。カラムは２０℃で恒温に保った。
【０１２５】
図１８ａおよび１８ｂは、元の（すなわち、非誘導体化）多孔性マトリックス（図１８ａ）およびＣ8 結合相多孔性マトリックス（図１８ｂ）の断面走査形電子顕微鏡像である。キャピラリーカラムのこれらの断面像には、相互に連結する球形およびほぼ球形の形状を有する直径１μｍの構造の多孔性の網目状構造が明らかに示されている。どちらの構造も、より高いモノリス密度のいくつかの領域を含む結合相多孔性マトリックスとほぼ同一（用いた倍率で）である。
【実施例１９】
【０１２６】
上述した実施例１８で説明したように結合相多孔性マトリックスを調製した。５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）／水／アセトニトリル（１／３／６）の溶液中の１．４２μＭアセトフェノン、２５μＭプロピオフェノン、１５μＭブチロフェノン、２０μＭバレロフェノン、５．５μＭヘキサノフェノン、１６．５μＭヘプタノフェノン、１５．３μＭオクタノフェノン、および３．５μＭデカノフェノンでアルキルフェニルケトン試料溶液を調製した。より少ない容積のアセトニトリルを用いると試料の溶解性が低下した。分離溶液は、１／５／４の５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）／水／アセトニトリルであった。注入は１ｋＶで５秒間、分離電圧は２０ｋＶであった。
【０１２７】
図１９（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）は、本発明の実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。エレクトロクロマトグラムは、非誘導体化多孔性マトリックス（パネルａ）、およびＣ3 Ｆ3 （パネルｂ）、ＣＦ13（パネルｃ）、ＰＦＰ（パネルｄ）、Ｃ8 （パネルｅ）、およびＰＦＰＤＭ（パネルｆ）で誘導体化した多孔性マトリックスのＰＳＧキャピラリーカラム上でのチオ尿素およびアルキルフェニルケトン類の分離のものである。ピークは、チオ尿素（ピークＴ）、アセトフェノン（ピーク１）、プロピオフェノン（ピーク２）、ブチロフェノン（ピーク３）、バレロフェノン（ピーク４）、ヘキサノフェノン（ピーク５）、ヘプタノフェノン（ピーク６）、オクタノフェノン（ピーク７）、およびデカノフェノン（ピーク８）である。
【０１２８】
５つの結合相ＰＳＧカラム、すなわち、ＰＳＧ−Ｃ3 Ｆ3 （パネルｂ）、ＰＳＧ−ＣＦ13（パネルｃ）、ＰＳＧ−ＰＦＰ（パネルｄ）、ＰＳＧ−Ｃ8 （パネルｅ）、およびＰＳＧ−ＰＦＰＤＭ（パネルｆ）を元のＰＳＧカラム（パネルａ）と比較すると、特により疎水性のカラムで試験分析物の分離能が改善し、ＰＳＧ−ＰＦＰＤＭで最大の分離能増大が起きていることが明らかである。分離能を式ＲS ＝√Ｎ（α−１）ｋ／４α（ｋ＋１）で定め、ここでＮは効率（理論段数）、αは分離因子、ｋは特定の分析物に対する保持因子を表す。分離因子αは、ｋ2 ／ｋ1 により与えられた。保持因子ｋ＝（ｔR −ｔ0 ）／ｔ0 は通常の方法により定め、ｔR は分析物の保持時間、ｔ0 は保持されないマーカー（そのためにチオ尿素を用いた）の保持時間である。ＰＳＧ−Ｃ3 Ｆ3 、ＰＳＧ−ＣＦ13、ＰＳＧ−ＰＦＰ、ＰＳＧ−Ｃ8 、およびＰＳＧ−ＰＦＰＤＭでのアセトフェノン（ピーク１）およびヘキサノフェノン（ピーク５）の分離能は、それぞれ２．０２、２．１５、２．６４、３．１３、および３．７１であった。この性能は、元のＰＳＧ（ＲS ＝１．８６）から最大５０％の増大であった。すべての場合において、アルキルフェニルケトン類は増大する疎水性の順序、すなわち、アセトフェノン（ピーク１）、プロピオフェノン（ピーク２）、ブチロフェノン（ピーク３）、バレロフェノン（ピーク４）、ヘキサノフェノン（ピーク５）、ヘプタノフェノン（ピーク６）、オクタノフェノン（ピーク７）、デカノフェノン（ピーク８）の順に溶出した。すべてのアルキルフェニルケトン類は、結合相ＰＳＧキャピラリーカラムから比較的高い電場強度（＞１０００Ｖ／ｃｍ）において３０分以内に溶出された。アルキルフェニルケトン類のもっとも低い分離能は元のＰＳＧカラム（パネルａ）で観測される一方、アルキルフェニルケトン類のもっとも高い分離能は、ＰＳＧ−ＰＦＰＤＭ上で達成され、オクタノフェノンは１３分後（パネルｆ）に溶出し、デカノフェノン（図示せず）は２５分後に溶出した。
【０１２９】
芳香環のπ電子と結合相のふっ素原子上の孤立電子対（２ｐ軌道の）との間の静電相互作用に基づいてふっ素化結合相は芳香族化合物と相互作用することが報告された。この挙動は、ふっ素化結合相（ＰＦＰとＰＦＰＤＭ）には該当しない。アルキルフェニルケトン類の分離は、アルキル官能基の炭素の数が増加するにつれて増大する化合物の疎水性によって起きた。溶出順序は、これらの化合物の疎水性の増加に追随した。
【０１３０】
ＰＳＧ−Ｃ8 はアルキルフェニルケトン類に対する良好な分離能を示し、すべての８つのアルキルフェニルケトン類について分析時間が短くなり、デカノフェノンでも２０分以内に溶出する（パネルｅ）。ＰＳＧ−Ｃ8 ではアルキルフェニルケトン類に対する高い分離能および迅速な溶出時間が組み合わさり、他の結合相多孔性マトリックスのＥＯＦ値より１５％高いが、非誘導体化多孔性マトリックスの値と同じ１．７６×１０-4ｃｍ2 ／ＶｓのＥＯＦをもっていた。
【０１３１】
アルキルフェニルケトン類の分離において使用した高電場強度においてさえ泡またはＰＳＧカラムの乾燥は見られなかった。結合相多孔性マトリックスは、非誘導体化多孔性マトリックスよりも酸性の高い条件（ｐＨ２−４）に対して安定であった。各結合相多孔性マトリックスについての電流対電場強度のプロットは線形であった（データは示していない）。この線形性は、ピーク広がりに通じ得るＪｏｕｌｅ加熱が存在しないことを示唆する。各分離において、アルキルフェニルケトン類の効率は増大するｋ値とともに低下した。分析物を緩慢に多孔性マトリックスから溶出させた拡散性の諸効果がこの低い効率の説明になるかもしれない。１５ｃｍの長さを有する結合性多孔性マトリックスを用いてより高い分離能を達成できるが、より長い溶出時間という犠牲のうえである。多孔性マトリックスの長さとｋとの間には線形の関係が存在した。長さ１５、１０、および５ｃｍの結合相多孔性マトリックスの分離因子は、それぞれ２．５５、２．５２、および２．４０であった。
【実施例２０】
【０１３２】
表４は、５ｃｍＰＳＧ−Ｃ8 モノリス上のアセトフェノン（１）およびヘキサノフェノン（５）に対するＰＳＧ−Ｃ8 の保持因子ｋ、分離因子α、および分離能ＲS に対するシラン化反応時間の効果を示す。
【表４】
2004538482.tif 000006
分離因子は、０分と１５分の分離因子が若干だけ異なってはいるものの反応時間の関数として６０分まで増大した。１より大きい分離因子は、分析物の分離が成功したことを示した。７０分と９０分という長い反応時間で分離因子は低下した。反応時間が増大するとアセトフェノンおよびヘキサノフェノンの分離能で同じ傾向が観測された。この２つの分析物の分離能は、０分〜６０分の範囲で反応時間とともに増大（ｒ＝０．９７４）した。１５分、３０分、および６０分の反応時間を用いて調製した結合相ＰＳＧカラムのカラムごとの再現性（ｎ＝３または４）は、３％ＲＳＤよりよかった。７０分と９０分の反応時間で分離能は低下した。
【０１３３】
結合相の崩壊が、７０分と９０分の反応時間に対する分離能の低下を説明すると思われる。シラン化反応時間が長くなると、より多くのｎ−オクチルジメチルシランが金属有機ポリマーのヒドロキシル基と結合することができ、それによりポリマー表面上のｎ−オクチルジメチル基の数が増大する。より多くの結合相がポリマー表面上に結合すると、リガンドはお互いにより接近する。０分〜６０分の反応時間へｋ1 およびｋ5 値がそれぞれ１７％および５８％増大したという事実は、ポリマー表面がより疎水性になりつつある、すなわち、アルキルフェニルケトン類に対してより保持力を増すことを示した。
【実施例２１】
【０１３４】
図２０（パネルａおよびｂ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。エレクトロクロマトグラムは、５ｃｍＰＳＧ−Ｃ8 モノリス上における３０分（パネルａ）および９０分（パネルｂ）の５つから７つのアルキルフェニルケトン類の分離のものである。分離条件とピーク同定は、実施例１９におけるのと同じである。
【０１３５】
図２０は、アルキルフェニルケトン混合物の分離に関するＰＳＧ−Ｃ8 モノリスについて０分の反応時間（図２０、パネルａ）および６０分の反応時間（図２０、パネルｂ）の効果を示している。炭素数１０個の炭素鎖を有するデカノフェノンのｋ値は極度に高かった。３０分間の反応時間でｋは２３．０であったが、６０分の反応時間ではｋは２８．６で２０％の増加であった。多孔性マトリックス上の結合相の表面被覆率を評価するための取り込み量測定は行わなかったが、クロマトグラフィーデータから多孔性マトリックス上の結合相の被覆率は特に１５〜６０分間の反応時間についてより高いと推測され、したがって試験化合物の分離のためのクロマトグラフィーサイトの数が増加していると推測される。
【実施例２２】
【０１３６】
ヌクレオシド試料混合物は、水中各１ｍｇ／ｍｌの濃度のイノシン、ウリジン、グアノシン、およびシチジンからなっていた。分離溶液は、５０ｍＭりん酸塩（ｐＨ８）／水／アセトニトリル（０．５／３．５／６）であった。注入プラグ長は０．１ｍｍ、加えた電圧は−１５ｋＶであった。
【０１３７】
上述した実施例１８で説明したように、１０ｃｍＰＳＧ−ＮＨ2 モノリスを調製した。ｎ−プロピルアミノトリエトキシシランで長さ１０ｃｍの多孔性マトリックスを誘導体化した。得られたモノリス、ＰＳＧ−ＮＨ2 、は我々の実験条件では正に帯電するアミン結合相（ｐＨ９−１０）を有していた。正の電荷は、ＥＯＦの逆転を可能とした。アミン基官能性を有するクロマトグラフィー材料は順相およびイオン交換クロマトグラフィーにおいていくぶんかの用途を見出していたが、ＰＳＧ−ＮＨ2 は我々の条件下では逆相材料のように挙動した。アルキルフェニルケトン類は、上述した他の結合相多孔性マトリックスと比較すると同じ順序（データは示していない）で溶出した。
【０１３８】
図２１は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。ピークは４つのヌクレオシド、イノシン（ピーク１）、ウリジン（ピーク２）、グアノシン（ピーク３）、およびシチジン（ピーク４）のものである。図２１は、逆のＥＯＦを用いた４つのヌクレオシドの混合物の分離を示している。この混合物の分離は、同じ分離溶液中のキャピラリーゾーン電気泳動では可能ではなかった。
【実施例２３】
【０１３９】
上述した実施例１８で説明したように、１５ｃｍＰＳＧ−ＰＦＰモノリスを調製した。カチオン性分析物として短鎖ペプチド類、アンジオテンシンＩ、ブラジキニン、アンジオテンシンＩＩ、グリシン−グリシン−グリシン、バリン−チロシン−バリン、およびメチオニンエンケファリンを用いた。ペプチド類のそれぞれの濃度は、１６μｇ／ｍｌであった。分離溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．３）／水／アセトニトリル（１／４／５）であった。注入は０．５ｐｓｉで３０秒、加えた電圧は１０ｋＶであった。
【０１４０】
図２２は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。ピークは、５つのカチオン性ペプチド類、アンジオテンシンＩ（ピーク１）、ブラジキニン（ピーク２）、アンジオテンシンＩＩ（ピーク３）、グリシン−グリシン−グリシン（ピーク４）、バリン−チロシン−バリン（ピーク５）、およびメチオニンエンケファリン（ピーク６）の分離に対するものであった。図２２は、４つの正に荷電したペプチド類の分離を１５分以内に達成しＰＳＧ−ＰＦＰＤＭカラムの有用性を示している。モノリスのアニオン性の性質にもかかわらず、カチオン性ペプチド類がカラムから溶出された。結合相は基本的にモノリス上に層を形成して、イオン化したヒドロキシル基の負電荷をペプチド類から遮断した。かくして、カチオン性ペプチド類とアニオン性モノリスの間の電荷相互作用は減殺された。
【実施例２４】
【０１４１】
上述した実施例１８で説明したように、１５ｃｍＰＳＧ−Ｃ3 Ｆ8 モノリスを調製した。タキソール、バッカチンＩＩＩ、およびアセチルバッカチンをそれぞれアセトニトリル中１ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。分離溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）／水／アセトニトリル（１／４／５）であった。注入は０．５ｐｓｉで５秒間、加えた電圧は１０ｋＶであった。
【０１４２】
図２３は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。ピークは、バッカチンＩＩＩ（ピーク１）、タキソール（ピーク２）、およびアセチルバッカチン（ピーク３）である。図２３は、８分間以内に達成されるこの混合物の完全な分離を示している。この分離は結合相ＰＳＧカラムの医薬品の分析に対する可能性を示している。
【０１４３】
種々の実施形態を参照することにより本発明を上述したように説明してきたが、本発明の適用範囲から外れることなく変更および修正がなされ得るものと解釈される。参照した上記のすべての参照はそれらの総体としてここに組込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】本発明の一実施形態による分離カラムの長手方向の略図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態を用いた（ａ）あるカラムの吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態を用いた（ｂ）別のカラムの吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図３】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図４Ａ】本発明の実施形態のＳＥＭ顕微鏡像である。
【図４Ｂ】本発明の実施形態のＳＥＭ顕微鏡像である。
【図５Ａ】本発明の実施形態を用いた種々の分析物の吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図５Ｂ】本発明の実施形態を用いた種々の分析物の吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図６】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図７】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａおよびｂ）である。
【図８】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、およびｃ）である。
【図９】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）である。
【図１０】本発明の一実施形態を用いたピーク高さ比の対数対試料中の水の百分率のプロットを示すグラフ表示である。
【図１１】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、およびｃ）である。
【図１２Ａ】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図１２Ｂ】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図１２Ｃ】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図１３】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａおよびｂ）である。
【図１４】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）である。
【図１５】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）である。
【図１６】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａおよびｂ）である。
【図１７】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）である。
【図１８Ａ】本発明の実施形態のＳＥＭ顕微鏡像である。
【図１８Ｂ】本発明の実施形態のＳＥＭ顕微鏡像である。
【図１９】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）である。
【図２０】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａおよびｂ）である。
【図２１】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図２２】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図２３】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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