(57)【要約】本発明は、良性過剰増殖性疾患やがんを治療するための改善された治療法を提供する。放射線応答性であることが長く知られたＥgr-1は、ここで、その多くがそれ自体治療に用いられているＤＮＡ損傷化学剤に誘導性であることがわかった。従って、本発明は、ＤＮＡ損傷化学剤と、Ｅgr-1プロモーター由来の治療的遺伝子を含む発現ベクターとの有利な組合わせを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のタンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）対象の前記タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、前記核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、
（ｂ）前記発現構築物を細胞へ移入するステップと、
（ｃ）前記細胞を少なくとも１種のフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と接触させるステップと
を含み、これにより前記ＤＮＡ損傷化合物が前記Ｅgr-1プロモーターから対象の前記タンパク質の発現を誘導する、前記方法。
【請求項２】
前記フリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物がシスプラチン、ナイトロジェンマスタード、サイトキサン、シクロホスファミド、マイトマイシンｃ、アドリアマイシン、イホスファミド、ブレオマイシン、ドキソルビシン、プロカルバジン、アクチノマイシン、クロラムブシル、カルボプラチナム、ブスルファン、ｂｃｎｕ、ｃｃｎｕ、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、エピルビシン、ダウノルビシン、カンプトテシン、及びミトキサントロンからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フリーラジカル誘導化合物がシスプラチンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）が、前記細胞を少なくとも第二フリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と接触させるステップを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞をがんの化学療法化合物又は電離放射線と接触させるステップを更に含んでいる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記細胞ががん細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記がん細胞が肺がん細胞、前立腺がん細胞、卵巣がん細胞、精巣がん細胞、脳悪性腫瘍細胞、皮膚がん細胞、結腸がん細胞、胃がん細胞、食道がん細胞、気管がん細胞、頭頚部がん細胞、膵がん細胞、肝がん細胞、乳がん細胞、卵巣がん細胞、リンパがん細胞、白血病細胞、子宮がん細胞、又は膣がん細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記発現ベクターが複製起点を更に含んでいる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記発現ベクターが選択可能マーカーを更に含んでいる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記発現ベクターが前記核酸セグメントに作用可能に結合したポリアデニル化シグナルを更に含んでいる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、又はヘルペスウイルスベクターである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが１つ以上のウイルス遺伝子を欠いており、これにより前記ウイルスベクターを非複製にする、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
対象の前記タンパク質が腫瘍サプレッサー、アポトーシスインデューサー、酵素、サイトカイン、又は毒素である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍サプレッサーがＲb、p1６、p５３、ＰＴＥＮ、ＭＤＡ7、ＢＲＣＡ1又はＢＲＣＡ2である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記アポトーシスインデューサーがＢax、Ｂad、Ｂik、ＡdＥ1Ｂ、Ｂim、Ｂc1-Ｘs、Ｂak、ＴＲＡＩＬ、Ｈarakiri又はＢidである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素がチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼである、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記サイトカインがＴＮＦ-αである、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記毒素がシュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、百日ぜき毒素Ａサブユニット、エンテロトキシンＡ、又はリシンＡ鎖である、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が生物体内に位置している、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記生物体がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
患者においてがんを治療する方法であって、
（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、前記核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、
（b）前記発現構築物をフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて該患者に投与するステップと
を含み、これにより前記ＤＮＡ損傷化合物が前記Ｅgr-1プロモーターから前記がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって前記患者において前記がんを治療する、前記方法。
【請求項２４】
前記発現構築物が、前記患者の中に位置する腫瘍に局所的又は局部的に送達される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記発現構築物が全身的に送達される、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記発現構築物が腫瘍内注射によって又は腫瘍血管系へ直接注射することにより送達される、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
前記発現ベクターを投与する前に、前記ＤＮＡ損傷化合物が投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
前記発現ベクターを投与した後に、前記ＤＮＡ損傷化合物が投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
前記発現ベクターと同時に前記ＤＮＡ損傷化合物が投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
前記発現ベクターが少なくとも２回投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ損傷化合物が少なくとも２回投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
前記がん治療タンパク質が腫瘍サプレッサー、アポトーシスインデューサー、酵素、又は毒素である、請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
患者において腫瘍細胞増殖を阻止する方法であって、
（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、
（b）前記発現構築物をフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて前記患者に投与するステップと
を含み、これにより前記ＤＮＡ損傷化合物が前記Ｅgr-1プロモーターから前記がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって前記患者において腫瘍細胞増殖を阻止する、前記方法。
【請求項３４】
該がん治療タンパク質がＴＮＦ-αである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該フリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物がシスプラチンである、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
患者において腫瘍細胞を死滅させる方法であって、
（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、
（b）前記発現構築物をフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて前記患者に投与するステップと
を含み、これにより前記ＤＮＡ損傷化合物が前記Ｅgr-1プロモーターから前記がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって前記患者において腫瘍細胞を死滅させる、前記方法。
【請求項３７】
患者において腫瘍細胞転移を阻止する方法であって、
（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、前記核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、
（b）前記発現構築物をフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて前記患者に投与するステップと
を含み、これにより前記ＤＮＡ損傷化合物が前記Ｅgr-1プロモーターから前記がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって前記患者において腫瘍細胞転移を阻止する、前記方法。
【請求項３８】
患者において腫瘍の負担を軽減させる方法であって、
（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、前記核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、
（b）前記発現構築物をフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて該患者に投与するステップと
を含み、これにより前記ＤＮＡ損傷化合物が前記Ｅgr-1プロモーターから前記がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって前記患者において腫瘍の負担を軽減させる、前記方法。
【請求項３９】
手術不可能な腫瘍を手術可能にする方法であって、
（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、前記核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置しているステップと、
（b）前記発現構築物をフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて前記患者に投与するステップと
を含み、これにより前記ＤＮＡ損傷化合物が前記Ｅgr-1プロモーターから前記がん治療タンパク質の発現を誘導し、前記腫瘍の大きさ又は形を小さくするとともに切除可能にする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本出願は、2001年4月6日出願の同時係属米国特許出願第60/282,040号の優先権を主張する。特に、上記で引用した開示の全文は放棄せずに本願明細書に含まれるものとする。
１．発明の分野
本発明は、一般的には、分子生物学やがん治療の分野に関する。更に詳細には、Ｅｇｒ-１プロモーターの発現を誘導するＤＮＡ損傷化学剤の使用に関する。これにより治療遺伝子の組織特異的発現が可能になり、ＤＮＡ損傷化学剤と組合わせてがんに罹っている患者を治療する。
２．関連技術の説明
放射線治療や化学療法を含むある種のがん治療法には、がん細胞のＤＮＡを損傷させることが必要である。正常ＤＮＡ損傷に対する細胞応答には、ＤＮＡ修復、細胞周期抑制及び致死性の活性化が含まれる(Hall, 1988)。例えば、ＤＮＡ二本鎖切断の誘導により、欠失、二動原体、環、後期架橋を含む致死染色体異常が生じる(Hall, 1994)。
がんを治療する他の方法は、遺伝子治療である。これには、遺伝子の発現に適した条件下で、外来遺伝子をがん細胞へ移入すること、しばしば腫瘍サプレッサー又はアポトーシスインデューサーが必要である。発現するとすぐに、遺伝子産物は、腫瘍細胞の増殖を遅くし、転移の可能性を阻害し、或いは完全に死滅させることにより、腫瘍細胞に対して有益な作用を与える。
１つ以上のこれらの方法を組合わせることは、多くの腫瘍における異質性によって一治療が組合わせよりはるかに効果的でなくなるので強力な手段である。しかしながら、放射線治療、化学療法、遺伝子治療はすべて毒性作用の可能性がある。従って、例えば、投与される放射線/薬剤/ベクター量を減少させることにより、毒性を減少させることは非常に有利である。
【０００２】
例えば、抗腫瘍特性を有する腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)は、第１相試験におけるがんの遺伝子治療の全身系治療として研究されてきたが、毒性がこのサイトカインの治療指数を制限している(Spriggs et al., 1988; Demetri et al., 1989)。また、全身系ＴＮＦ-αと化学療法の組合わせが若干の臨床試験において限られた成功で研究されている(Nakamoto et al., 2000)。
一方、シスプラチンや他の白金類似体のような化学療法剤は、頭頚部のがん、食道がん、肺がん、精巣がん、卵巣がん、膀胱がんを含むいくつかのがんの治療に現在用いられている。更に、シスプラチンは、放射線増感剤としての照射(ＩＲ)と同時に用いられる。シスプラチンの相対効力にもかかわらず、腫瘍耐性が治癒的がん化学療法におけるシスプラチンの役割を制限している(Johnson & Stevenson, 2001)。腫瘍由来のシスプラチン耐性メカニズムには、腫瘍細胞におけるシスプラチン付加物のＤＮＡ修復の増加、フリーラジカルの形成、続いてＤＮＡ損傷を阻害するグルタチオンの増加、耐性細胞によるシスプラチン取込みの相対減少が含まれる(Kartalou & Essigmann, 2001)。シスプラチンと他の化学療法剤の組合わせ、特に5-ＦＵとＶＰ-16は、いくつかのヒト腫瘍において両薬剤の治療指数を高めた(Kucuk et al., 2000)が、シスプラチンの効力を高める他のストラテジーが求められている。
従って、当該技術において遺伝子治療と化学療法の治療法の双方を改善することが求められている。異なる治療法の利点を組合わせると同時に付随する副作用を減少させる治療が求められている。
【０００３】
発明の要約
本発明は、当該技術における欠点を克服し、遺伝子治療と化学療法の治療の効用を高める方法を提供する。治療遺伝子をコードする誘導性発現ベクターが化学療法剤によって誘導される転写ターゲティングストラテジーが開発された。化学療法剤は、特に発現ベクターの誘導性プロモーターを標的にして標的治療を与える。提供される治療法は、腫瘍を標的にするのに特に有効である。
それ故、本発明によれば、対象のタンパク質を発現させる方法であって、(a）対象の該タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥｇｒ-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、（b）該発現構築物を細胞に移入するステップと、(c）該細胞を少なくとも１種のフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と接触させるステップとを含み、これにより該ＤＮＡ損傷化合物がＥｇｒ-1プロモーターから対象の該タンパク質の発現を誘導する、前記方法が提供される。
フリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物は、シスプラチン、ナイトロジェンマスタード、サイトキサン、シクロホスファミド、マイトマイシンｃ、アドリアマイシン、イホスファミド、ブレオマイシン、ドキソルビシン、プロカルバジン、アクチノマイシン、クロラムブシル、カルボプラチナム、ブスルファン、ｂｃｎｕ、ｃｃｎｕ、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、エピルビシン、ダウノルビシン、カンプトテシン又はミトキサントロンのような白金化合物であってもよい。ステップ（c）は、細胞を少なくとも第二フリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と接触させるステップを含んでもよい。本方法は、細胞をがん化学療法化合物又は電離放射線と接触させるステップを更に含んでもよい。細胞は、がん細胞、例えば、肺がん細胞、前立腺がん細胞、卵巣がん細胞、精巣がん細胞、脳悪性腫瘍細胞、皮膚がん細胞、結腸がん細胞、胃がん細胞、食道がん細胞、気管がん細胞、頭頚部がん細胞、膵がん細胞、肝がん細胞、乳がん細胞、卵巣がん細胞、リンパがん細胞、白血病細胞、子宮がん細胞、又は膣がん細胞であってもよい。
発現ベクターは、複製起点、選択可能マーカー、又は核酸セグメントに作用可能に結合したポリアデニル化シグナルを更に含むことができる。発現ベクターは、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、又はヘルペスウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、１つ以上のウイルス遺伝子を欠いてもよいので、ウイルスベクターを非複製にする。細胞は、生物、例えば、ヒトに位置することができる。
【０００４】
対象のタンパク質は、腫瘍サプレッサー、アポトーシスインデューサー、酵素、毒素、サイトカイン、又は抗腫瘍活性を有する他のタンパク質であってもよい。腫瘍サプレッサーの例は、Ｒb、p1６、p５３、ＰＴＥＮ、ＭＤＡ7又はＢＲＣＡ1又はＢＲＣＡ2である。アポトーシスインデューサーの例は、Ｂax、Ｂad、Ｂik、ＡdＥ1Ｂ、Ｂim、Ｂc1-Ｘs、Ｂak、ＴＲＡＩＬ、Ｈarakiri又はＢidである。酵素の例は、チミジン、キナーゼ、シトシン、デアミナーゼ、ヒポキサンチン、グアニン、ホスホリボシルトランスフェラーゼである。毒素の例は、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、百日ぜき毒素Ａサブユニット、エンテロトキシンＡ、又はリシンＡ鎖である。抗腫瘍活性を有する他の分子としては、インターロイキン(IＬ)やサイトカインが含まれ、IＬ-1、IＬ-2、IＬ-3、IＬ-4、IＬ-5、IＬ-6、IＬ-7、IＬ-8、IＬ-9、IＬ-10、IＬ-11、IＬ-12、IＬ-13、IＬ-14、IＬ-15、β-インターフェロン、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ-1、ＭＥＴＨ-2、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ又は腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、例えば、ＴＮＦ-αやＴＮＦ-βによって例示される。当業者は、本発明が抗腫瘍作用を有する限り上で開示されたような対象の具体的なタンパク質によって制限されないことを認識する。
他の実施態様においては、本発明は、患者においてがんを治療する方法であって、（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、(b）該発現構築物をフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて該患者に投与するステップとを含み、これによりＤＮＡ損傷化合物が該Ｅgr-1プロモーターから該がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって該患者において該がんを治療する、前記方法を提供する。発現構築物は、患者に位置する腫瘍の局部に又は局所的に送達することができ、全身的に送達することもでき、腫瘍内注射によって又は腫瘍血管系へ直接注射することにより送達することもできる。
ＤＮＡ損傷化合物は、発現ベクターを投与する前に、発現ベクターを投与した後に、又は発現ベクターと同時に投与することができる。発現ベクター及び/又はＤＮＡ損傷剤は、少なくとも２回投与することができる。がん治療タンパク質は、腫瘍サプレッサー、アポトーシスインデューサー、酵素、毒素、サイトカイン、又は抗腫瘍活性を有するタンパク質であってもよい。
【０００５】
他の実施態様においては、更に、患者において腫瘍細胞増殖を阻止する方法であって、（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、(b）該発現構築物を該患者にフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて投与するステップとを含み、これにより該ＤＮＡ損傷化合物が該Ｅgr-1プロモーターから該がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって該患者において腫瘍細胞増殖を阻止する、前記方法が提供される。そのような一実施態様においては、がん治療タンパク質はＴＮＦ-αである。そのような他の実施態様においては、フリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物はシスプラチンである。
他の実施態様においては、更に、患者において腫瘍細胞を死滅させる方法であって、（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、(b）該発現構築物を該患者にフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて投与するステップとを含み、これにより該ＤＮＡ損傷化合物が該Ｅgr-1プロモーターから該がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって該患者において腫瘍細胞を死滅させる、前記方法が提供される。
他の実施態様においては、更に、患者において腫瘍細胞転移を阻止する方法であって、（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、(b）該発現構築物を該患者にフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて投与するステップとを含み、これにより該ＤＮＡ損傷化合物が該Ｅgr-1プロモーターから該がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって該患者において腫瘍細胞転移を阻止する、前記方法が提供される。
【０００６】
他の実施態様においては、更に、患者において腫瘍の負担を軽減させる方法であって、（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置している、前記ステップと、(b）該発現構築物を該患者にフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて投与するステップとを含み、これにより該ＤＮＡ損傷化合物が該Ｅgr-1プロモーターから該がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって該患者において腫瘍の負担を軽減させる、前記方法が提供される。
他の実施態様においては、更に、手術不可能な腫瘍を手術可能にする方法であって、（a）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備するステップであって、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置しているステップと、(b）該発現構築物を該患者にフリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物と組合わせて投与するステップとを含み、これにより該ＤＮＡ損傷化合物が該Ｅgr-1プロモーターから該がん治療タンパク質の発現を誘導し、よって該腫瘍の大きさ又は形を小さくするとともに切除可能にする、前記方法が提供される。
本明細書に用いられる“名詞”は、１以上を意味するものである。特許請求の範囲に用いられる“含む”という言葉とともに用いられる場合、“名詞”の言葉は１つ又は１つを超えることを意味するものである。本明細書中に用いられる“他の”は、少なくとも２つ目以上を意味するものである。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、次の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明と個々の実施例は、本発明の好適実施態様を示すものであるが、本発明の真意と範囲内の種々の変更や修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、例示によってのみ示されるものであることは理解すべきである。
下記図面は本明細書の一部をなし、本発明のある種の態様を更に示すように含まれる。本明細書に示される個々の実施態様の詳細な説明と組合わせてこれらの図面の１つ以上によって本発明をより良く理解することができる。
【０００７】
例示的実施態様の説明
本発明は、放射線応答要素を含むことが長く知られたＥgr-1プロモーターがＤＮＡ損傷化学剤によって誘導することができる本発明者らの所見から一部生じている。この驚くべき所見は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)のような抗腫瘍剤をコードしているＥgr-1プロモーターを含む発現構築物をＤＮＡ損傷化学剤とともに用いて、がんのような過剰増殖性疾患の以前には試みられていない併用治療を与える。
がん細胞においてＤＮＡ損傷剤と治療遺伝子の誘導発現の併用治療の効果によって、いずれの物質の単独の使用より優れた結果が得られ、各物質の用量が少量であることが可能になる。投与される放射線及び/又は薬剤及び/又はベクターの量を減少させることにより、全身的毒性を減少させることができることは非常に有利である。次の開示は、上記実施態様の詳細な説明と、その態様を示すものである。
転写ターゲティングストラテジーは、抗腫瘍作用をもつ遺伝子をコードしている誘導性発現ベクターとともに化学療法剤が腫瘍を効果的に治療するために用いることができ、該ベクターが該化学療法剤によって誘導されることにより得られる。従って、誘導性Ｅgr-1プロモーターを含み抗腫瘍遺伝子をコードしている発現構築物はＥgr-1プロモーターを誘導し活性化し得る化学療法剤とともに、ＤＮＡ損傷又はＲＯI産生により得られる。
選択的腫瘍ターゲティングベクターにおいては、化学療法剤によって誘導できる抗腫瘍遺伝子を発現させる遺伝子構築物は、化学療法剤と抗腫瘍物質の効果を増強する。化学療法剤と抗腫瘍遺伝子共に、一般的には、異なる腫瘍細胞死滅メカニズムを有するので、一方の物質に対して抵抗する細胞はもう一方に対して感受性であるものである。また、そのような組合わせは化学放射線併用治療又は他の補助剤がん治療の局所作用を増強することができることも企図される。
【０００８】
Ａ．Ｅgr-1プロモーター
Ｅgr-1プロモーターは、作用可能に結合した下流配列のＤＮＡ損傷剤誘導転写を制御するのに必要な５' 調節配列として定義される。Ｅgr-1プロモーターは、放射線やＨ2Ｏ2誘導遺伝子発現に関連して以前に分析された複雑な構造を有する。複数のＥＴＳ結合部位(ＥＴＳは転写調節タンパク質である)を含み、その３つは２つの血清応答要素(ＳＲＥ)、ＳＲＥIとＳＲＥIIの一部として存在する。ＣＡrＧモチーフとして知られるＳＲＥは、多くの増殖因子応答遺伝子の発現を調節するシス要素である。全部で６つのＳＲＥがあり、各々ＣＣ(Ａ＋Ｔリッチ)６ＧＧコンセンサス配列を含んでいる。
本発明者らは、ＴＮＦ-αcＤＮＡに結合した５' Ｅgr-1ＣＡrＧ要素からなるキメラ遺伝子構築物がこの構築物を導入した細胞をIＲに曝した後に高レベルの腫瘍内ＴＮＦ-αを発現させることを以前に証明した。キメラＥgr-ＴＮＦ構築物を導入するとともにIＲで処理した腫瘍は、いずれの物質単独で処理した腫瘍と比較して退縮/治癒が高められ、IＲによるＴＮＦ-α産生の腫瘍内誘導と、腫瘍細胞と腫瘍血管系に対するＴＮＦ-αとIＲの細胞毒性相互作用によると思われる(Weichselbaum et al., 2001; Staba et al., 1998)。本発明においては、本発明者らは、Ｅgr-1プロモーターのＤＮＡ損傷/ＲＯI誘導性ＣＡrＧ要素の制御下にＴＮＦ-αを誘導するために、細胞内ラジカル酸素形成を変化させるとともにＤＮＡを損傷させるシスプラチン、一般に用いられる化学療法剤を用いた。それ故、本発明は、ＤＮＡ損傷を引き起こし及び/又はＲＯIを産生してＥgr-1を誘導し、よって発現ベクター中Ｅgr-1の制御下に遺伝子を発現させるための物質の使用を提供する。
【０００９】
Ｂ．ＤＮＡ損傷化学剤
“ＤＮＡ損傷化学剤”という用語は、ＤＮＡ分子に損傷を直接又は間接に誘導する薬剤を意味する。本発明においてはフリーラジカルを生成する薬剤が特に興味深い。次の部類の化学剤が１以上の経路によってＤＮＡ損傷を与えると考えられる。
Ｉ．アルキル化剤
アルキル化剤は、がん細胞が増殖することを防止するためにゲノムＤＮＡと直接相互作用する薬剤である。この部類の化学療法剤は、細胞周期のすべの相に影響する物質である。即ち、相特異的ではない。アルキル化剤は、例えば、慢性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、乳がん、肺がん、卵巣がんの具体的ながんを治療するためのものであり得る。アルキル化剤は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア又はトリアジンを含めることができるがこれらに限定されない。
ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド(シトキサン)、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロールエタミン(マスタージェン)、メルファランが含まれるがこれらに限定されない。個々の態様においては、トログリタザオンは、これらのアルキル化剤の１種以上と組合わせてがんを治療するために使用し得る。その一部を次に述べる。
ｉ．ナイトロジェンマスタード
ナイトロジェンマスタートは、ホジキン病や非ホジキンリンパ腫に用いられるメクロールエタミン(ＨＮ2)；急性又は慢性リンパ球性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、肺がん、ウィルムス腫瘍、頚部精巣がん、軟組織肉腫のようながんを治療するのに用いられるシクロホスファミド及び/又はイフォスファミド；多発性骨髄腫、乳がん、卵巣がんのようながんを治療するために用いられるメルファラン(Ｌ-サルコリシン)；慢性リンパ管性(リンパ球性)白血病、悪性リンパ腫、例えば、リンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫のような疾患を治療するために用いられてきたクロラムブシルであってもよいが、これらに限定されない。
【００１０】
ａ．クロラムブシル
クロラムブシル(ロイケランとしても知られる)は、選択されたヒト新生物性疾患に対する活性がわかったナイトロジェンマスタード型の二官能性アルキル化剤である。クロラムブシルは、化学的に4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]ベンゼンブタン酸として知られる。
クロラムブシルは、経口投与用錠剤形で入手できる。胃腸管から急速かつ完全に吸収される。例えば、約0.6 mg/kg〜約1.2 mg/kgを１回経口投与した後、１時間以内にピーク血漿クロラムブシルレベルに達し、親薬剤の最終半減期は約1.5時間である。約0.1 mg/kg/日〜約0.2 mg/kg/日又は約3 mg/m2/日〜約6 mg/m2/日或いは約0.4 mg/kgが抗新生物性治療に用いることができる。クロラムブシルは、それ自体では治癒しないが臨床的に有効な軽減を生じることができる。
ｂ．シクロホスファミド
シクロホスファミドは、2Ｈ-1,3,2-オキサザホスホリン-2-アミン、Ｎ,Ｎ-ビス(2-クロロエチル)テトラヒドロ-、2-オキシド、１水和物であり、CytoxanとしてMead Johnsonから入手でき、NeosarとしてAdriaから入手できる。シクロホスファミドは、3-アミノ-1-プロパノールとＮ,Ｎ-ビス(2-クロロエチル)ホスホルアミドジクロリド[(ＣlＣＨ2ＣＨ2)2ＮＰＯＣl2]とをジオキサン溶液中トリエチルアミンの触媒影響下に縮合することにより調製される。縮合は２段であり、ヒドロキシル基とアミノ基双方を含むので、環化が行われる。
他のβ-クロロエチルアミノアルキル化剤と異なり、肝酵素によって活性化されるまで活性なエチレンイモニウム形に容易に環化しない。従って、この物質は胃腸管内で安定であり、経口経路と非経口経路によって十分かつ効果的に許容され、局所発疱疹、壊死、静脈炎又は疼痛までも引き起こさない。
成人に適した経口用量としては、例えば、胃腸の許容量によっては約1 mg/kg/日〜約5 mg/kg/日(通常は組合わせて)；又は約1 mg/kg/日〜約2 mg/kg/日が含まれ；静脈内用量は、例えば、はじめに約2日〜約5日間分割用量で約40 mg/kg〜約50 mg/kg又は約７日毎に約10 mg/kg〜約15 mg/kg又は１週間に２回約3 mg/kg〜約5 mg/kg又は約1.5 mg/kg/日〜約3 mg/kg/日が含まれる。ある態様においては、抗新生物剤として約250 mg/kg/日の用量を投与することができる。胃腸作用が相反することから、静脈内経路が負荷に好ましい。維持中、約3000/mm3〜4000/mm3の白血球数が通常は望ましい。薬剤は、筋肉内に、浸潤によって又は体腔へしばしば投与される。約100 mg、約200 mg、約500 mgの注射用、約25mgと約50 mgの錠剤用の投薬剤形で利用できる。
【００１１】
ｃ．メルファラン
アルケラン、Ｌ-フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、Ｌ-ＰＡＭ、又はＬ-サルコリシンとしても知られるメルファランは、ナイトロジェンマスタードのフェニルアラニン誘導体である。メルファランは、選択的ヒト新生物性疾患に対して活性な二官能性アルキル化剤である。化学的には4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-Ｌ-フェニルアラニンとして知られる。
メルファランはその化合物の活性なＬ-異性体であり、1953年にBergel & Stockにより最初に合成された。メドファランとして知られるＤ-異性体は、ある種の動物腫瘍に対して活性が低く、染色体に対する作用を生じるのに必要とされる用量は、Ｌ-異性体で必要とされる量より大きい。ラセミ(ＤＬ-)体はメルファラン又はサルコリシンとして知られる。メルファランは水に不溶であり、pＫa1は約2.1である。メルファランは、経口投与に錠剤形で入手でき、多発性骨髄腫を治療するために用いられている。有効な証拠から、多発性骨髄腫をもつ患者の約1/3〜1/2が薬剤の経口投与に対して好ましい応答を示すことが明らかである。
メルファランは、上皮性卵巣がんの治療に用いられている。卵巣がんの治療に一般に用いられている一用法は、１回の治療単位として５日間１日約0.2 mg/kgの用量でメルファランを投与している。血液学的許容量によっては４〜５週間毎に治療単位が繰り返される(Smith & Rutledge, 1975; Young et al., 1978)。また、ある種の実施態様においては、用いられるメルファランの用量は、約0.05 mg/kg/日ほど又は約3 mg/kg/日以上ほどであり得る。
【００１２】
ii．エチレニメンとメチルメラミン
エチレニメン及び/又はメチルメラミンには、卵巣がんを治療するために用いられるヘキサメチルメラミンと、膀胱がん、乳がん、卵巣がんを治療するために用いられているチオテーパが含まれるがこれらに限定されない。
iii．アルキルスルホネート
アルキルスルホネートには、慢性顆粒球白血病を治療するために用いられているブスルファンのような薬剤が含まれるがこれに限定されない。ブスルファン(ミレランとしても知られる)は、二官能性アルキル化剤である。ブスルファンは、1,4-ブタンジオールジメタンスルホネートとして知られる。ブスルファンは、経口投与用錠剤形で入手でき、例えば、それぞれの切り込み付き錠剤は約２ mgのブスルファンと不活性成分のステアリン酸マグネシウムと塩化ナトリウムを含有している。
ブスルファンは、慢性骨髄性(骨髄性、骨髄球性、顆粒球性)白血病の対症療法に必要である。治癒的ではないが、ブスルファンは全顆粒球質量を減少させ、疾患の症状を改善し、患者の臨床状態を改善する。慢性骨髄性白血病が以前に治療されていない成人の約90％が、ブスルファンの使用後に臓器巨大の退行又は安定化による血液学的寛解傾向を得る。ブスルファンは、ヘモグロビンレベルの生存時間と維持については脾臓照射より優れ、脾腫制御の照射と同等であることがわかった。
【００１３】
iｖ．ニトロソウレア
アルキル化剤のような仁ニトロソウレアは、ＤＮＡ修復タンパク質を阻害する。脳腫瘍のほかに非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性メラノーマを治療するのに用いられる。ニトロソウレアとしては、カルムスチン(ＢＣＮＵ)、ロムスチン(ＣＣＮＵ)、セムスチン(メチル-ＣＣＮＵ)又はストレプトゾシンが含まれるがこれらに限定されない。セムスチンは、原発性脳腫瘍、胃がん又は結腸がんのようながんに用いられている。ストレプトゾシンは、悪性膵島細胞腫又は悪性カルチノイドのような疾患を治療するのに用いられている。ストレプトゾシンは、悪性メラノーマ、ホジキン病、軟組織肉腫のようながんを治療するために用いられている。
ａ．カルムスチン
カルムスチン(滅菌カルムスチン)は、ある種の新生物性疾患の治療に用いられるニトロソウレアの１種である。1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソウレアである。薄黄色フレーク状物を凍結乾燥するか分子量が214.06の物質を凍結させる。アルコールや脂質に非常に可溶性であり、水に難溶性である。カルムスチンは、推奨されるように再構成した後に静脈内注射により投与される。
カルムスチンはＤＮＡやＲＮＡをアルキル化することが一般的に承知されているが、他のアルキル化剤と交差抵抗しない。他のニトロソウレアとのように、タンパク質中のアミノ酸のカルバモイル化によっていくつかの鍵となる酵素過程を阻害することができる。
カルムスチンは、単一物質としての対症療法として又は他の承認された化学療法剤との確立された併用治療においてグリア芽細胞腫、脳幹神経膠腫、髄芽腫、星状細胞腫、上衣細胞腫、転移脳腫瘍のような脳腫瘍において必要である。また、多発性骨髄腫を治療するためにプレドニゾンと組合わせて用いられている。カルムスチンは、多発性骨髄腫又は悪性骨髄腫のようながんを治療するのに用いられている。カルムスチンは、ホジキン病や非ホジキンリンパ腫の治療に、一次治療で治療したが再発した患者、又は一次治療に応答しない患者に他の承認された薬剤と組合わせて二次治療として有効である。
滅菌カルムスチンは、一般に凍結乾燥物質の100 mgの１回投与のバイアルとして用いうる。以前に治療されていない患者での単一薬剤としてカルムスチンの推奨された用量は、約150 mg/m2〜約200 mg/m2静脈内に６週毎である。これは、１回として投与することができ、２日連続して約75 mg/m2〜約100 mg/m2のように毎日の注射に分けることもできる。カルムシンが他の骨髄抑制剤と組合わせて又は骨髄予備が減損した患者に用いられる場合、用量は適切に調整しなければならない。初回に続く用量は、前の用量に対する患者の血液学的応答に従って調整しなければならない。他の用量、例えば、約10 mg/m2、約20 mg/m2、約30 mg/m2、約40 mg/m2、約50 mg/m2、約60 mg/m2、約70 mg/m2、約80 mg/m2、約90 mg/m2〜約100 mg/m2を本発明に用いることができることが理解されることは当然のことである。
【００１４】
ｂ．ロムスチン
ロムスチンは、ある種の新生物性疾患の治療に用いられるニトロソウレアの１種である。1-(2-クロロエチル)-3-シクロヘキシル-1ニトロソウレアである。実験式がＣ9Ｈ16ＣlＮ3Ｏ2で分子量が233.71の黄色粉末である。ロムスチンは10％エタノール(約0.05 mg/ml)や無水アルコール(約70 mg/ml)に可溶性である。ロムスチンは水(約0.05 mg/ml)に比較的不溶である。生理的pＨに比較的イオン化しない。ロムスチンカプセル中の不活性成分はステアリン酸マグネシウムとマンニトールである。
ロムスチンはＤＮＡやＲＮＡをアルキル化することは一般に承知されているが、他のアルキル化剤と交差抵抗しない。他のニトロソウレアとのように、タンパク質中のアミノ酸のカルバモイル化によっていくつかの鍵となる重要な酵素過程を阻害することができる。
ロムスタチンは、経口投与することができる。約30 mg/m2〜約100 mg/m2の範囲にある用量で放射性ロムスチンを経口投与した後、投与した放射能の約半分が24時間以内に分解生成物の形で排泄される。代謝物質の血清半減期は、約16時間〜約2日の範囲にある。組織レベルは、静脈内投与の15分後に血漿レベルに匹敵する。
ロムスチンは、他の治療法のほかに単一薬剤として、又は他の承認された化学療法剤との確立された併用治療において原発性と転移双方の脳腫瘍に既に適切な手術及び/又は放射線治療を受けた患者に有効であることがわかった。ロムスチンは、小細胞肺がんのようながんを治療するのに用いられている。また、ホジキン病に対して一次治療で治療されたが再発した患者、又は一次治療に応答しない患者に他の承認された薬剤と組合わせて二次治療として有効である。
以前に治療されていない患者における単一薬剤として成人や子供におけるロムスチンの推奨される用量は、６週毎に１回の経口投与として約130 mg/m2である。骨髄機能が妥協された個体においては、６週毎に約100 mg/m2に減少させなければならない。ロムスチンが他の骨髄抑制剤と組合わせて用いられる場合、用量は適切に調整されなければならない。他の用量は、例えば、約20 mg/m2、約30 mg/m2、約40 mg/m2、約50 mg/m2、約60 mg/m2、約70 mg/m2、約80 mg/m2、約90 mg/m2、約100 mg/m2〜約120 mg/m2を用いることができることが理解される。
ｃ．トリアジン
トリアジンは、悪性メラノーマ、ホジキン病又は軟組織肉腫のようながんの治療に用いられるダカバジン(ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド)のような薬剤を含んでいるがこれに限定されない。
【００１５】
II．代謝拮抗物質
代謝拮抗物質は、ＤＮＡとＲＮＡの合成を破壊する。アルキル化剤と異なり、Ｓ相中の細胞周期に特に影響する。乳房、卵巣、胃腸管の腫瘍のほかに慢性白血病と闘うために用いられている。代謝拮抗物質は、種々の部類、例えば、葉酸類似体、ピリミジン類似体又はプリン類似体又は関連阻害化合物に分けることができる。代謝拮抗物質としては、5-フルオロウラシル(5-ＦＵ)、シタラビン(Ａra-Ｃ)、フルダラビン、ゲンシタビン、又はメトレトレキセートが含まれるがこれらに限定されない。
ｉ．葉酸類似体
葉酸類似体としては、急性リンパ球性白血病、絨毛がん、菌状息肉症、乳房、頭頚部、肺、骨形成の肉腫のようながんの治療に用いられているメトトレキセート(アメトプテリン)のような化合物を含むがこれに限定されない。
ii．ピリミジン類似体
ピリミジン類似体は、シタラビン(シトシンアラビノシド)、5-フルオロウラシル(フルオウラシル；5-ＦＵ)やフロキシウリジン(フルオロデオキシウリジン；ＦudＲ)のような化合物が含まれる。シタラビンは、急性顆粒球性白血病や急性リンパ球性白血病のようながんの治療に用いられている。フロキシウリジンや5-フルオロウラシルは、乳房、結腸、胃、膵、卵巣、頭頚部、膀胱又は局所前がん性皮膚の病変のようながんの治療に用いられている。
5-フルオロウラシル(5-ＦＵ)は、5-フルオロ-2,4(1Ｈ,3Ｈ)ピリミジンジオンの化学名を有する。作用機序は、デオキシウリジル酸のチミジル酸へのメチル化反応を阻止することによると考えられる。従って、5-ＦＵは、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)の合成を妨害し、多少はリボ核酸(ＲＮＡ)の形成を阻止する。ＤＮＡとＲＮＡは細胞分裂や増殖に不可欠であるので、5-ＦＵの作用はチミジン欠乏を生じ、細胞死に至るものであると考えられる。従って、5-ＦＵの作用は、転移がんの特徴の急速に分裂する細胞に見られる。
iii．プリン類似体と関連阻害剤
プリン類似体と関連化合物としては、メルカプトプリン(6-メルカプトプリン；6-ＭＰ)、チオグアニン(6-チオグアニン；ＴＧ)又はペントスタチン(2-デオキシコホルマイシン)が含まれ、これらに限定されない。メルカプトプリンは、急性リンパ球性、急性顆粒球性、慢性顆粒球性白血病に用いられている。トリオグアニンは、急性顆粒球白血病、急性リンパ球性白血病又はリンパ急性白血病のようながんの治療に用いられている。ペントスタチンは、ヘアリーセル白血病、菌状息肉症又は慢性リンパ球性白血病のようながんに用いられている。
【００１６】
III．天然産物
天然酸物は、一般的には、天然源から最初に分離され薬理活性をもつことが確認された化合物を意味する。そのような化合物、その類似体、誘導体は、当業者に既知の手法で天然源から分離されてもよく、化学的に合成されてもよく、組換え生産されてもよい。天然産物としては、分裂インヒビター、抗腫瘍抗体、酵素又は生物応答修飾因子のような部類が含まれる。
ｉ．分裂インヒビター
分裂インヒビターとしては、細胞分裂や有糸分裂に必要とされるタンパク質合成を阻止し得る植物アルカロイドや他の天然物質が含まれる。分裂インヒビターとしては、例えば、ドセタキセル、エトポシド(ＶP16)、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、又はビノレルビンが挙げられる。
ａ．エピポドフィロトキシン
エピポドフィロトキシンには、テニポシドやＶP16のような化合物が含まれる。ＶP16はエトポシドとしても知られ、主として精巣腫瘍の治療にブレオマイシンとシスプラチンと組合わせて、肺の小細胞がんにシスプラチンと組合わせて用いられる。テニポシドやＶP16は、精巣、他の肺がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性顆粒球性白血病、急性非リンパ球性白血病、乳がん、又は後天性免疫不全症候群(ＡIＤＳ)に伴うカポジ肉腫のようながんに対しても活性である。
ＶP16は、静脈内投与の溶液(例えば、20 mg/ml)として、経口使用の液体充填カプセル、50 mgとして用いうる。肺の小細胞がんの場合、静脈内用量(併用治療において)は約100 mg/m2程度か又は約2 mg/m2程度であり得る。通常は、約35 mg/m2を毎日約4日間〜約50 mg/m2を毎日約5日間までが用いられている。経口投与した場合、用量は２倍でなければならない。つまり、小細胞肺がんの用量は約200 mg/m2〜250 mg/m2ほどであってもよい。精巣がんの静脈内用量(併用治療において)は、約50 mg/m2〜約100 mg/m2を毎日約5日間、又は約100 mg/m2を１日置きに３回である。治療の周期は、通常は、約３〜４週間毎に繰り返される。薬剤は、製剤中に用いられる溶媒によると思われる低血圧と気管支痙攣を避けるために注入として徐々に投与すべきである(例えば、約30分〜60分)。
【００１７】
ｂ．タキソイド
タキソイドは、トリネコの木、タキサス・ブレビホリア(Taxus brevifolia)の樹皮から単離した関連化合物の一種である。タキソイドは、ドセタキセルやパクリタキセルのような化合物が含まれるがこれらに限定されない。
パクリタキセルは、チューブリンに(ビンカアルカロイドにより用いられるものと異なる部位に)結合し、微小管のアセンブリを促進する。パクリタキセルは、臨床的に評価されている。卵巣の悪性メラノーマやがんに対して活性を有する。ある種の態様においては、最大用量は約30 mg/m2を毎日約５日間又は約210 mg/m2〜約250 mg/m2を約３週間毎に１回投与される。
ｃ．ビンカアルカロイド
ビンカアルカロイドは、薬剤活性を有することが確認された植物アルカロイドの一種である。ビンブラスチン(ＶＬＢ)やビンクリスチンのような化合物が含まれる。
１．ビンブラスチン
ビンブラスチンは、がんや前がんの治療に使用し得る植物アルカロイドの一例である。細胞をビンブラスチンとインキュベートする場合、微小管の溶解が生じる。
ビンブラスチン又はビンクリスチンの経口投与後に予想できない吸収が報告されている。通常の臨床用量で血漿中の各薬剤のピーク濃度は約0.4 mＭである。ビンブラスチンやビンクリスチンは、血漿タンパク質に結合する。血小板では広範囲に濃縮され、白血球や赤血球中では多少しか濃縮されない。
静脈内注射後、ビンブラスチンの血漿からのクリアランスは多相パターンである。分配後、薬剤は約１時間や20時間の半減期で血漿から消える。ビンブラスチンは、肝臓で代謝されて誘導体デスアセチルビンブラスチンを生物学的に活性化する。約15％の投与量が尿中にそのまま検出され、胆汁排泄後に約10％が便に回収される。用量は、肝機能障害をもつ患者には減少しなければならない。血漿中のビリルビンの濃度が3 mg/dl (約50 mＭ)より高い場合には投薬の少なくとも50％減少させることが必要である。
硫酸ビンブラスチンは、注射用製剤に用いうる。薬剤を静脈内で投与する場合、疼痛刺激や潰瘍を生じることがあるので、皮下出血に対して特別に注意しなければならない。薬剤は、循環が損傷した体肢に注射してはならない。0.3 mg/kg体重の１回後、約７日〜約10日で骨髄抑制が最大に達する。中程度の白血球減少症(約3000細胞/mm3)が得られない場合には、毎週の用量を約0.05 mg/kg体重の増加分によって徐々に増加することができる。精巣がんを治癒するように設計された用法においては、ビンブラスチンは血液細胞数又は毒性に無関係に約0.3 mg/kgの用量で約３週毎に用いられる。
ビンブラスチンの重要な臨床使用は、転移精巣腫瘍の治癒的治療でのブレオマイシンとシスプラチンにおいてである。有益な応答は種々のリンパ腫、特にホジキン病において報告され、症例の50〜90％に重要な改善を認めることができる。高割合のリンパ腫におけるビンブラスチンの有効性は、疾患がアルキル化剤に不応である場合に減少しない。カポジ肉腫、精巣がん、神経芽細胞腫、レッテレルシヴェ病(組織球症Ｘ)、女性における乳房や絨毛のがんに活性である。
約0.1 mg/kg〜約0.3 mg/kgの用量を投与することができ、約1.5 mg/m2〜約2 mg/m2も投与することができる。また、約0.1 mg/m2、約0.12 mg/m2、約0.14 mg/m2、約0.15 mg/m2、約0.2 mg/m2、約0.25 mg/m2、約0.5 mg/m2、約1.0 mg/m2、約1.2 mg/m2、約1.4 mg/m2、約1.5 mg/m2、約2.0 mg/m2、約2.5 mg/m2、約5.0 mg/m2、約6 mg/m2、約8 mg/m2、約9 mg/m2、約10 mg/m2、〜約20 mg/m2を投与することができる。
【００１８】
２．ビンクリスチン
ビンクリスチンは、有糸分裂を阻止し、中期停止を生じる。この薬剤のほとんどの生物活性はチューブリンに特異的に結合するとともに微小管に重合するタンパク質の能力を阻止する能力によって説明することができると思われる。分裂装置の微小管の破壊によって、細胞分裂が中期に停止する。分裂中に正しく染色体を分離できないことが細胞死に至ると思われる。
正常な骨髄細胞や上皮細胞に対するビンクリスチンの比較的低い毒性がこの薬剤を抗新生物薬剤の中で特異にし、他の骨髄抑制剤と組合わせてしばしば含まれる。ビンブラスチン又はビンクリスチンの経口投与後に予想できない吸収が報告されている。通常の臨床用量での血漿中の各薬剤のピーク濃度は約0.4 mＭである。
ビンブラスチンとビンクリスチンは、血漿タンパク質に結合する。血小板では広範囲に濃縮され、白血球と赤血球では多少しか濃縮されない。ビンクリスチンの血漿からのクリアランスは多相パターンであり、最終半減期は約24時間である。薬剤は肝臓で代謝されるが、生物活性誘導体は確認されていない。肝機能障害をもつ患者においては用量を減少しなければならない。血漿中のビリルビン濃度が約3 mg/dl(約50 mＭ)より高い場合には、投薬の少なくとも50％の減少が必要である。
硫酸ビンクリスチンは、静脈注射用溶液(例えば、1 mg/ml)として用いうる。コルチコステロイドと共に用いられるビンクリスチンは、現在小児白血病の寛解傾向を誘導するために選択される治療であり、これらの薬剤に最適な投薬はビンクリスチン、静脈内に約２ mg/m2体表面積、毎週と、プレドニゾン、経口で約40 mg/m2、毎日であると思われる。ホジキン病又は非ホジキンリンパ腫をもつ成人患者は、通常複合プロトコルの一部としてビンクリスチンを投与する。ＭＯＰＰ用法で用いられる場合、ビンクリスチンの推奨される用量は約1.4 mg/m2である。高用量のビンクリスチンは、重い神経毒性を受けてしまう成人より子供によって良好に許容されると思われる。薬剤を７日毎よりも頻繁に又は高用量で投与すると応答速度の改善が比例せずに毒性発現を増強すると思われる。ビンクリスチンの静脈内投与中出血を避けるために注意しなければならない。ビンクリスチン(及びビンブラスチン)は、静脈内に投与し得るものより大きい用量で数回腫瘍の動脈血供給部に同じような毒性で注入することができる。
ビンクリスチンは、ホジキン病と他のリンパ腫に効果的である。ホジキン病で単独に用いる場合にビンブラスチンより幾分有益でなくなると思われるが、メクロルエタミン、プレドニゾン、プロカルバジン(いわゆるＭＯＰＰ用法)と用いる場合、この疾患の進行ステージ(IIIとIＶ)に好ましい治療である。非ホジキンリンパ腫においては、特にシクロホスファミド、ブレオマイシン、ドキソルビシン、プレドニゾンと用いる場合、ビンクリスチンは重要な薬剤である。ビンクリスチンは、リンパ球性白血病においてビンブラスチンより有効である。種々の他の新生物、特にウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、脳腫瘍、黄紋筋腫、小細胞肺、乳がん、膀胱がん、男性と女性の生殖系をもつ患者において有益が応答が報告されている。
ビンクリスチンの用量としては、約0.01 mg/kg〜約0.03 mg/kgが含まれ、約0.4 mg/m2〜約1.4 mg/m2を投与することもでき、約1.5 mg/m2〜約2 mg/m2を投与することもできる。また、ある実施態様においては、約0.02 mg/m2、約0.05 mg/m2、約0.06 mg/m2、約0.07 mg/m2、約0.08 mg/m2、約0.1 mg/m2、約0.12 mg/m2、約0.14 mg/m2、約0.15 mg/m2、約0.2 mg/m2、約0.25 mg/m2を一定の静脈内注射として投与することができる。
【００１９】
ｄ．抗腫瘍抗体
抗腫瘍抗体は、抗菌活性と細胞毒性活性双方を有する。これらの薬剤は、酵素や有糸分裂を化学的に阻害するか又は細胞膜を変化させることによりＤＮＡを妨害する。これらの物質は、相特異的ではないので細胞周期のすべての相に働く。従って、種々のがんに広く用いられている。抗腫瘍抗体の例としては、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、プリカマイシン(ミトラマイシン)又はイダルビシンが挙げられるがこれらに限定されない。新生物の治療の臨床において広く用いられるこれらの化合物は、一般的には静脈内ボーラス注射又は経口で投与される。
１．ドキソルビシン
ドキソルビシン塩酸塩、5,12-ナフタセンジオン、(8s-cis)-10[(3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ-a-Ｌ-リキソヘキソピラノシル)オキシ]-7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシ-8-(ヒドロキシアセチル)-1-メトキ塩酸塩(ヒドロキシダウノルビシン塩酸塩、アドリアマイシン)を抗新生物の広範囲スペクトルに用いられる。ＤＮＡに結合し、核酸合成を阻害し、有糸分裂を阻害し、染色体異常を促進させる。
単独で投与されるように、甲状腺腫や原発性肝細胞がんの治療に第一選択される薬剤である。卵巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、乳房腫瘍、気管支原性燕麦細胞がん、非小細胞肺がん、胃がん、性尿器がん、甲状腺がん、胃腺がん、網膜芽腫、神経芽細胞腫、菌状息肉症、膵がん、前立腺がん、膀胱がん、骨髄腫、びまん性組織球リンパ腫、ウィルムス腫瘍、ヒジキン病、副腎腫瘍、骨肉腫、軟組織肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫又は急性リンパ球性白血病を含む疾患の治療の31第一選択組合わせの成分である。島細胞がん、頚部がん、精巣がん又は副腎皮質がんのような他の疾患の治療用代替的薬剤である。免疫抑制剤でもある。
ドキソルビシンは、吸収が悪く、静脈内投与することが好ましい。薬物動態学は多区画である。分布相の半減期は12分と3.3時間である。排除半減期は約30時間であり、約40％〜約50％が胆汁に分泌する。ほとんどの残部は肝臓で部分的には代謝産物(ドキソルビシノール)に代謝されるが、数％は尿に排泄される。肝臓障害があるときは用量を減らさなければならない。
ある実施態様においては、適切な静脈内用量は、成人、約60 mg/m2〜約75 mg/m2を約21日置きに又は約25 mg/m2〜約30 mg/m2を連続２又は３日の各日を約３週〜約４週置きに繰り返し又は約約20 mg/m2を毎週１回である。以前の化学療法又は新生物骨髄侵入により予め骨髄抑制がある場合、又は薬剤が他の造血抑制剤と組合わせた場合、高齢の患者には最少量を用いなければならない。血清ビリルビンが約1.2 mg/dl〜約3 mg/dlである場合には用量を約50％だけ、約3 mg/dlより大きい場合には約75％だけ減らさなければならない。生存期間全体の用量は正常な心機能をもつ患者においては約550 mg/m2を、縦隔照射を受けた人においては約400 mg/m2を超えてはならない。ある実施態様においては、代替的用量用法は、約30 mg/m2を3日間連続の各日に約４週毎に繰り返すを含むことができる。例示的な用量は、約10 mg/m2、約20 mg/m2、約30 mg/m2、約50 mg/m2、約100 mg/m2、約150 mg/m2、約175 mg/m2、約200 mg/m2、約225 mg/m2、約250 mg/m2、約275 mg/m2、約300 mg/m2、約350 mg/m2、約400 mg/m2、約425 mg/m2、約450 mg/m2、約475 mg/m2、〜約500 mg/m2であってもよい。
【００２０】
２．ダウノルビシン
ダウノルビシン塩酸塩、5,12-ナフタセンジオン、(8Ｓ-cis)-8-アセチル-10-[(3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ-a-Ｌ-リキソヘキサノピラノシル)オキシ]-7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシ-10-メトキシ-、塩酸塩はセルビジンとも呼ばれ、Ｗyethから入手できる。ダウノルビシン(ダウノマイシン；ルビドマイシン)は、ＤＮＡにインターカレートし、ＤＮＡ特異ＲＮＡポリメラーゼを遮断し、ＤＮＡ合成を阻害する。核酸合成を妨害しない用量で細胞分裂を阻止することができる。
他の薬剤との組合わせにおいては、例えば、急性顆粒球性白血病、成人の急性骨髄性白血病(寛解傾向の誘導)、急性リンパ球性白血病又は慢性骨髄性白血病のような疾患の第一選択化学療法にしばしば含まれる。経口吸収は悪く、他の方法によって投与されることが好ましい(例えば、静脈内)。分布半減期は45分であり、排除半減期は約19時間である。活性代謝産物、ダウノルビシンの半減期は約27時間である。ダウノルビシンは、肝臓で最も代謝され、胆汁（約40％）に分泌される。肝不全又は腎不全においては用量を少なくしなければならない。
一般的には、適切な静脈内用量(塩基当量)は、60歳より若い成人、約45 mg/m2(60歳より高齢の患者には約30 mg/m2)を約1日、約２日間又は約３日間約３週又は４週毎に又は約0.8 mg/kg/日を約３日間、約４日間、約５日間〜約６日間約３週又は約４週毎にであり、胸部照射を受けた場合の約450 mg/m2だけを除いて生存期間に約550 mg/m2を超えて投与してはならない。年齢が２歳未満、又は体表面が約0.5 ｍ未満でない限り、子供は約25 mg/m2を毎週１回である。この場合、重量に基づく成人の予定が用いられる。約20 mg(約21.4 mgの塩酸塩に等価な塩基として)の注射用剤形で用いうる。例示的な用量は、約10 mg/m2、約20 mg/m2、約30 mg/m2、約50 mg/m2、約100 mg/m2、約150 mg/m2、約175 mg/m2、約200 mg/m2、約225 mg/m2、約250 mg/m2、約275 mg/m2、約300 mg/m2、約350 mg/m2、約400 mg/m2、約425 mg/m2、約450 mg/m2、約475 mg/m2、〜約500 mg/m2であってもよい。
【００２１】
３．マイトマイシン
マイトマイシン(ムタマイシン及び/又はマイトマイシン-Ｃとしても知られる)は、抗腫瘍活性を有することがわかったストレプトマイセス・ケスピトサス(Streptomyces caespitosusu)のブイヨンから分離した抗生物質である。化合物は熱安定であり、高融点であり、有機溶媒に自由に可溶性である。
マイトマイシンは、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)の合成を選択的に阻害する。グアニンとシトシン含量は、マイトマイシン誘導架橋度と相関する。高濃度の薬剤では細胞ＲＮＡとタンパク質合成が抑制される。マイトマイシンは、胃、頚部、結腸、乳房、膵、膀胱、頭頚部のような腫瘍に用いられている。
ヒトにおいては、マイトマイシンは静脈内投与後に血清から急速に清浄される。30 mgボーラス注射後に約50％だけ血清濃度を低下させるのに要する時間は17分間である。30 mg、20 mg、又は10 mgI.Ｖの注射後、最大血清濃度はそれぞれ2.4 mg/ml、1.7 mg/ml、0.52 mg/mlであった。クリアランスは、主として肝臓での代謝によって行われるが、代謝は他の組織でも生じる。クリアランスは、分解経路の飽和のためと考えられることから最大血清濃度に反比例する。マイトマイシン用量の約10％は、尿に変化せずに排泄される。代謝経路が比較的少量で飽和されるので、尿中に排泄される用量％は、用量が増加するにつれて高くなる。子供でも静脈内投与されたマイトマイシンの排出は同じである。
【００２２】
４．アクチノマイシンＤ
アクチノマイシンＤ(ダクチノマイシン)[50-76-0]; Ｃ62Ｈ86Ｎ12Ｏ16(1255.43)はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを阻害する抗新生物剤である。しばしば、例えば、絨毛がん、胎児性横紋菌肉腫、精巣腫瘍、カポジ肉腫又はウィルムス腫瘍のような疾患の治療の第一選択組合わせの一成分である。全身的治療に応答しない腫瘍は、局所潅流にしばしば応答する。ダクチノマイシンは、放射線治療を増強する。二次(遠心性)免疫抑制剤である。
ある種の個々の態様においては、アクチノマイシンＤは、例えば、主手術、放射線治療、又は他の薬剤、特にビンクリスチンやシクロホスファミドのような物質と組合わせて用いられる。抗新生物活性は、ユーイング腫瘍、カポジ肉腫、軟組織肉腫に認められている。ダクチノマイシンは、絨毛がんが進行した症例をもつ女性に効果的であり得る。転移性精巣肉腫をもつ患者にクロラムブシルやメトトレキセートと組合わせて一貫した応答を生じる。応答は、ホジキン病や非ホジキンリンパ腫をもつ患者にもしばしば見ることができる。ダクチノマイシンは、免疫学的応答、特に腎移植片の拒絶を阻止するのに用いられている。
用量の半量が胆汁にそのまま排出され、10％が尿に排泄される。半減期は約36時間である。薬剤は、血液-脳関門を通過しない。アクチノマイシンＤは凍結乾燥末として供給される(各バイアル中0/5 mg)。１日の通常量は、約10 mg/kg〜約15 mg/kgである。これは静脈内に約5日間投与される。毒性症状が現れない場合には、追加治療単位が約３週〜約４週おきに投与することができる。1日約100 mg〜約400 mgの注射が子供に約10日〜約14日間投与されている。他の用法では、約3 mg/kg〜約6 mg/kgが全量約125 mg/kgとして毎週約7.5 mg/kgの維持量が用いられている。静脈内注入管に薬剤を投与することが安全であるが、直接静脈内に注射され、皮下反応を避けるためにバイアルから薬剤を引き抜くために用いられる針を捨てることが注意される。例示的用量は、約100 mg/m2、約150 mg/m2、約175 mg/m2、約200 mg/m2、約225 mg/m2、約250 mg/m2、約275 mg/m2、約300 mg/m2、約350 mg/m2、約400 mg/m2、約425 mg/m2、約450 mg/m2、約475 mg/m2、〜約500 mg/m2であってもよい。
【００２３】
５．ブレオマイシン
ブレオマイシンは、ストレプトマイセス・ベルティシラス(Streptomyces verticillus)株から分離した細胞毒性糖ぺプチド抗生物質の混合物である。ブレオマイシンの正確な作用機序は不明であるが、利用できる証拠は主な作用機序がＤＮＡ合成阻害を示すと思われることであり、ＲＮＡやタンパク質合成阻害が少ないという証拠がある。
マウスにおいて、高濃度のブレオマイシンは皮膚、肺、腎、腹膜、リンパ管に見られる。皮膚と肺の腫瘍細胞は、造血組織に見られる低濃度と対照的に高濃度のブレオマイシンを有することがわかった。骨髄に見られる低濃度のブレオマイシンは、その組織に見られる高レベルのブレオマイシン分解酵素に関係があるものである。
クレアチニンクリアランスが約35 ml/minより多い患者においては、ブレオマイシンの血清又は血漿最終除去半減期は約115分である。クレアチニンクリアランスが約35 ml/minより少ない患者においては、血清又は血漿最終除去半減期はクレアチニンクリアランスが低下するにつれて指数関数的に増加する。ヒトにおいては、投与量の約60％〜約70％が活性ブレオマイシンとして尿中に回収される。個々の実施態様においては、ブレオマイシンは筋肉内、静脈内、又は皮下経路で投与することができる。水に自由に可溶性である。アナフィラキシー様反応の可能性があることから、リンパ腫の患者は最初の２回は２単位以下で治療しなければならない。急性反応が生じない場合には、規則的な投薬予定が行われてもよい。
好適態様においては、ブレオマイシンは、姑息的治療とみなさなければならない。次の新生物の対応に単一薬剤として又は他の承認された化学療法剤と証明された組合わせで頭頚部(口、舌、扁桃腺、鼻咽腔、口腔咽頭、副鼻腔、口蓋、唇、口粘膜、はにく歯肉、喉頭蓋、喉頭を含む)、食道、肺又は性尿器管、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚、陰茎、頚部、又は女性外陰部のような扁平上皮細胞がんに有効であることがわかった。また、りんぱ腫や精巣がんの治療に用いられている。
ホジキン病や精巣腫瘍の改善は速く、２週間以内に認められる。このときまでに改善が見られない場合には、改善はありそうもない。扁平上皮がんは、徐々に応答し、改善が認められる前に３週間程度はしばしば必要である。
【００２４】
IＶ．その他の物質
いくつかの化学療法剤は活性に基づく以前の部類に認定されない。白金配位錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アムサクリン、Ｌ-アスパラギナーゼ、又はトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。併用治療に用いられる本発明の組成物と方法に含まれることが企図される。
ｉ．白金配位錯体
白金配位錯体は、カルボプラチンやシスプラチンのような化合物を含んでいる(cis-ＤＤＰ)。シスプラチンは、例えば、転移精巣又は卵巣がん、進行性膀胱がん、頭頚部がん、子宮頚部がん、肺がん又は他の腫瘍のがんを治療するのに広く用いられている。シスプラチンは、経口吸収されないので、他の経路、例えば、静脈内、皮下、腫瘍内又は腹腔内注射によって送達されなければならない。シスプラチンは、単独で又は他の薬剤と組合わせて用いることができ、ある実施態様においては臨床適用に用いられる効力のある用量は約15 mg/m2〜約20 mg/m2が５日間３週毎に合計３過程として企図されている。用量は、例えば、約0.50 mg/m2、約1.0 mg/m2、約1.50 mg/m2、約1.75 mg/m2、約2.0 mg/m2、約3.0 mg/m2、約4.0 mg/m2、約5.0 mg/m2、〜約10 mg/m2であってもよい。
本発明は、ＲＯI産生を刺激するシスプラチンがＥgr-1プロモーターのＣＡrＧ要素を誘導することがわかった。例えば、Ｅgr-1プロモーターのＣＡrＧ要素をコードしているアデノウイルスベクターに感染したヒトやげっ歯類のがん細胞においてＴＮＦ-αの産生を誘導するシスプラチンは、ＴＮＦ-αをコードしているcＤＮＡの上流に結合した。従って、本発明は、シスプラチンのようなＲＯI又はＤＮＡ損傷を生じる化学療法剤の使用と、抗腫瘍遺伝子を用いた遺伝子治療の一時的制御や空間的制御とを組合わせる新規な方法を提供する。
ii．他の薬剤
ミトキサントロンのようなアントラセネジオンは、急性顆粒球性白血病や乳がんを治療するのに用いられている。ヒドロキシ尿素のような置換尿素は、慢性顆粒球性白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症又は悪性メラノーマを治療するのに用いられている。プロカルバジン(Ｎ-メチルヒドラジン、ＭIＨ)のようなメチルヒドラジン誘導体は、ホジキン病の治療に用いられている。マイトテインのような副腎皮質抑制剤は、副腎皮質がんを治療するのに用いられ、アミノグルテチミドはホジキン病を治療するのに用いられている。
【００２５】
Ｖ．用量
ＤＮＡ損傷剤の用量は、当業者に周知であり(例えば、“Physicians Desk Reference”、Goodman & Gilman's“The Pharmacological Basis of Therapeutics”、“Remington's Pharmaceutical Sciences”、“The Merck Index, 11th Edit.”を参照のこと。これらの記載は適切な部分で本願明細書に含まれている)、その中の開示を考えて本発明と組合わせることができる。治療される患者の症状によって投薬の変更は必ず生じる。いずれにせよ、投与に責任のある人が個々の患者に適切な用量を決定する。個々の化学療法剤と用量の用法の例は本明細書に記載されている。本明細書に記載されるこれらの用量と薬剤のすべては限定するものでなく例示であり、個々の患者又は適用に対して当業者が他の用量又は薬剤を用いることができる。これらの点の中間の用量、又は誘導できる範囲も本発明に用いられると考えられる。
【００２６】
Ｃ．治療的遺伝子
Ｉ．腫瘍サプレッサー
p５３は、現在、腫瘍サプレッサー遺伝子として認められている。高レベルの変異体p５３は、化学発がん、紫外線照射、いくつかのウイルスによってがん化した多くの細胞に見られる。p５３遺伝子は、種々のヒト腫瘍における変異性不活性化のしばしば標的であり、一般のヒトがんにおいて最も頻繁に変異した遺伝子であることが既に証明されている。50％を超えるヒトＮＳＣＬＣ(Hollstein et al., 1991)や広範囲スペクトルの他の腫瘍において変異する。
p５３遺伝子は、ＳＶ40大Ｔ抗原やアデノウイルスＥ1Ｂのようなホストタンパク質と複合体を形成し得る393アミノ酸リンタンパク質をコードする。タンパク質は、正常組織や細胞に見られるががん化細胞又は腫瘍細胞と比べて濃度が極めて低い。おもしろいことに、野生型p５３は細胞増殖や分裂を調節するのに重要であると思われる。野生型p５３の過剰発現は、ヒト腫瘍細胞系において抗増殖性であることがいくつかの例でわかった。従って、p５３は細胞増殖の負の調節剤として働くことができ、制御されない細胞増殖を直接抑制することができ、この増殖を抑制する遺伝子を間接に活性化することもできる。従って、野生型p５３の不在又は不活性化はがん化に寄与することができる。しかしながら、いくつかの研究は、変異体p５３の存在が遺伝子のがん化可能性の十分な発現に必要であることを示している。
野生型p５３は、多くの細胞型において重要な増殖調整剤として認められている。ミスセンス変異はp５３遺伝子に共通であり、がん遺伝子のがん化能力に不可欠である。点変異により促進される単一遺伝子変化は、p５３内の変異が野生型p５３の腫瘍サプレッサー性能を排除することが知られる程度に発がん性p５３を生成し得る。しかしながら、他のがん遺伝子と異なり、p５３点変異は少なくとも３０の異なるコドンで起こることが知られ、同形接合性に減少せずに細胞表現型に移動させる優性対立遺伝子をしばしば生成する。更に、これらの負の優性対立遺伝子の多くは、生物体に許容されると考えられ、生殖系を通過する。種々の変異対立遺伝子は、最少の機能異常から強い浸透までの負の優性対立遺伝子であることがわかってきた(Weinberg, 1991)。
【００２７】
野生型p５３をコードしているＤＮＡを２つのヒト乳がん細胞系にトランスフェクトするとその細胞系での増殖抑制制御が回復することがCasey & Colleaguesによって報告された(Casey et al., 1991)。変異体でない野生型p５３をヒト肺がん細胞系にトランスフェクトすることにより同様の効果が示された(Takahasi et al., 1992)。p５３は変異遺伝子より優性であると思われ、変異遺伝子を細胞にトランスフェクトする場合に増殖に対して選択する。トランスフェクトしたp５３の正常な発現は、内在性p５３をもつ正常細胞又は非悪性細胞の増殖に影響しない。従って、そのような構築物は、逆作用せずに正常細胞によって吸収されるのである。従って、p５３随伴がんを野生型p５３で治療すると悪性腫瘍細胞数又は増殖速度が減少することが提唱される。
真核細胞周期の主な転移は、サイクリン依存性キナーゼ、又はＣＤＫが引き金になる。１種のＣＤＫ，サイクリン依存性キナーゼ４(ＣＤＫ４)によって、Ｇ1による進行が調節される。この酵素活性は、後期Ｇ1でＲbをリン酸化することができる。ＣＤＫ4の活性は、活性化サブユニット、Ｄ型サイクリンや阻害サブユニットp1６INK4によって制御される。p1６INK4は、ＣＤＫ4に特異的に結合し阻害するのでＲbリン酸化を調節することができるタンパク質として生化学的に確認されている(Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995)。p1６INK4タンパク質がＣＤＫ4阻害剤である(Serrano, 1993)ので、この遺伝子の欠失によってＣＤＫ4の活性が高められ、Ｒbタンパク質の高リン酸化が生じる。p1６は、ＣＤＫ6機能を調節することも知られる。
p1６INK4は、p１５INK4B、p２１WAF1、又はp２７KIP1を含むＣＤＫ阻害タンパク質の新たに記載された種類に属する。p1６INK4遺伝子は、９p２１の多くの腫瘍型にしばしば欠失している染色体領域まで地図を形成する。p1６INK4遺伝子の同型接合欠失と変異は、ヒト腫瘍細胞系に多い。この証拠からp1６INK4遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子であることが示される。しかしながら、この解釈は、p1６INK4遺伝子変化の頻度が培養細胞系より培養されていない一次腫瘍において非常に少ないという所見によって挑戦されている(Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995)。しかしながら、多くの一次腫瘍においてはp1６遺伝子は無傷であるが、高割合のある腫瘍タイプではp1６タンパク質発現を阻止する他のメカニズムがあることが後にわかった(Merlo et al., 1995; Herman, 1995; Gonzalez-Zulueta, 1995)。プラスミド発現ベクターでトランスフェクトすることにより野生型p1６INK4機能が回復するとあるヒトがん細胞系によるコロニー形成が減少した(Okamoto, 1994; Arap, 1995)。p1６をアデノウイルスと送達させると、あるヒトがん系の増殖が阻止され、ヒト腫瘍異種移植片の増殖が阻止される。
【００２８】
Ｃ-ＣＡＭは、ほとんどすべての上皮細胞で発現する(Odim & Obrink, 1987)。見掛け上の分子量が105 kＤのＣ-ＣＡＭは、細胞凝集を中和する特異抗体との反応によりラット肝細胞の血漿膜からはじめに分離された(Obrink, 1991)。最近の研究は、構造上Ｃ-ＣＡＭは免疫グロブリン(Iｇ)スーパーファミリーに属し、その配列はがん胎児性抗原(ＣＥＡ)に高度に類似していることを示している(Lin & Guidotti, 1989)。バキュロウイルス発現系を用いて、Cheung et al.(1993)はＣ-ＣＡＭの最初のIｇドメインが細胞接着活性に重要であることを証明した。
細胞接着分子、又はＣＡＭが、臓器発生や細胞分化を調節する分子相互作用の複雑なネットワークに関係していることは既知である(Edelman, 1985)。最近のデータは、ＣＡＭの異常発現がいくつかの新生物の腫瘍発生に関係があることを示している。例えば、上皮細胞で主に発現するＥ-カドヘリンの発現の減少は、数種類の新生物の進行を伴っている(Edelman & Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas et al., 1992)。また、Gianocotti & Ruoslahti(1990)は、遺伝子移入によるα5β1インテグリンが増加するとチャイニーズハムスター卵巣細胞の生体内腫瘍発生が減少し得ることを証明した。ここで、Ｃ-ＣＡＭは、試験管内と生体内で腫瘍増殖を抑制することがわかった。
本発明に使うことができる他の腫瘍サプレッサーとしては、p２1、p1５、ＢＲＣＡ1、ＢＲＣＡ2、IＲＦ-1、ＰＴＥＮ、ＲＢ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ-1、ＮＦ-2、ＷＴ-1、ＭＥＮ-Ｉ、ＭＥＮ-II、zac1、p７３、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＤＢＣＣＲ1、ＤＣＰ4又はp５７が含まれる。
【００２９】
II．アポトーシスインデューサー
アポトーシスインデューサー、例えば、Ｂax、Ｂak、Ｂc1-Ｘs、Ｂad、Ｂim、Ｂik、Ｂid、Harakiri、Ａd Ｅ1Ｂ、Ｂad、IＣＥ-ＣＥＤ3プロテアーゼ、ＴＲＡIＬ、ＳＡＲＰ-2又はアポプチンは、同様に本発明い従って用いることができる。更に、細胞毒性遺伝子の送達と調節発現は、1999年３月11日出願の“Induction of Apoptic or Cytotoxic Gene Expression by Adenoviral Mediated Gene Codelivery”と称する米国特許出願に記載されている(特にこの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする)。
III．酵素
種々の酵素遺伝子は、本発明によれば興味深い。そのような酵素としては、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、又はヒトチミジンキナーゼが含まれる。
IＶ．サイトカイン、ホルモン、増殖因子
本発明のベクターに挿入されるように企図される他の種類の遺伝子としては、インターロイキンやサイトカイン：インターロイキン1、IＬ-2、IＬ-3、IＬ-4、IＬ-5、、IＬ-6、、IＬ-7、、IＬ-8、、IＬ-9、、IＬ-10、、IＬ-11、、IＬ-12、、IＬ-13、、IＬ-14、、IＬ-15、β-インターフェロン、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンギオテンシン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ-1、ＭＥＴＨ-2、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ又は腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)が含まれる。
ＴＮＦ-αは、動物実験において抗腫瘍活性を有するマクロファージや他の造血細胞によって分泌されるサイトカインである(Old, 1985; Fiers,1991)。ＴＮＦ-αは、多くの悪性腫瘍細胞の細胞毒性であり、ウイルス、細菌、寄生虫の感染症に対する防御や自己免疫応答に重要な役割を果たす(Fiers, 1991)。腫瘍細胞に対する直接毒性作用や腫瘍血管系に対する細胞毒性作用や血栓作用は、ＴＮＦ-αの抗腫瘍作用を仲介する(Watanabe et al., 1988; Tartaglia et al., 1993; Robaye et al., 1991; Havell et al., 1988; Obrador et al., 2001; Slungaard et al., 1990; Mauceri et al., 2002)。ＤＮＡを損傷するＴＮＦ-αと化学療法剤、例えば、シスプラチンやアドリアマイシンとの組合わせにより、実験モデルにおいて相乗作用が証明された(Duan et al., 2001; Bonavida et al., 1990)。最近、メルファラン、二官能性アルキル化剤、ＴＮＦ-αによる分離肢潅流が肢肉腫やメラノーマの治療ストラテジーに成功したことが報告された(Thom et al., 1995)。しかしながら、全身的毒性によって、ヒトがん治療にはＴＮＦ-αの使用が制限されている(Spriggs et al., 1988)。
本発明は、ＲＯI、損傷ＤＮＡ、IＲ、化学療法剤によって誘導し得る誘導性Ｅgr-1プロモーターの制御下でＴＮＦ-αの化学誘導を提供する。がんやヒトがん細胞のマウスモデルにおける実験から、ＴＮＦ-α自体の化学誘導が毒性を引き起こさなかったことがわかる。
【００３０】
Ｖ．毒素
種々の毒素は、本発明の発現ベクターの一部として用いられるように企図され、これらの毒素には、リシンＡ鎖(Burbage, 1997)、ジフテリア毒素Ａ(Massuda et al., 1997; Lidor, 1997)、百日咳毒素Ａサブユニット、大腸菌(E. coli)エンテロトキシン毒素Ａサブユニット、コレラ毒素Ａサブユニット又はシュードモナス毒素ｃ末端のような細菌毒素が含まれている。最近、融合タンパク質調節可能ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子を含むプラスミドのトランスフェクションががん細胞の細胞毒性であることが証明された。従って、調節した毒素遺伝子の遺伝子移入をがんの治療に適用することができる(Massuda et al., 1997)。
ＶI．アンチセンス構築物
アンチセンス方法は、核酸が“相補的”配列と対合する傾向があるという事実が有利である。相補的とは、ポリヌクレオチドが標準ワトソン・クリック相補性の法則に従って塩基対合できるものであることを意味する。即ち、大きなプリンは小さなピリミジンと塩基対合してシトシンと対合したグアニン(Ｇ:Ｃ)と、ＤＮＡの場合にはチミンと対合したアデニン(Ａ:Ｔ)、又はＲＮＡの場合にはウラシルと対合したアデニン(Ａ:Ｕ)の組合わせを形成する。配列をハイブリダイズするのにイノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサチン等のような一般的でない塩基が介在しても対合を妨害しない。
二本鎖(ds)ＤＮＡをポリヌクレオチドでターゲティングすると三重らせんの形成になり、ＲＮＡをターゲティングすると二重らせんの形成になる。アンチセンスポリヌクレオチドが標的細胞に導入される場合、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、翻訳及び/又は安定性を妨害する。アンチセンスＲＮＡ構築物、又はそのようなアンチセンスＲＮＡをコードしているＤＮＡは、ホスト細胞、試験管内か生体内、例えば、ヒト患者を含むホスト動物内で遺伝子転写又は翻訳又は双方を阻害するために使うことができる。
【００３１】
アンチセンス構築物は、遺伝子のプロモーターと他の制御領域、エキソン、イントロン又はエキソン-イントロン境界にさえ結合するように設計することができる。最も効果的なアンチセンス構築物はイントロン/エキソンスプライス結合部に相補的な領域を含むことが企図される。即ち、好適実施態様にはイントロン-エキソンスプライス結合部の50〜200塩基内の領域に相補性を有するアンチセンス構築物が含まれていることが提唱されている。いくつかのエキソン配列が標的選択性に重大な影響を及ぼさずに構築物中に含むことができることが見出された。含まれるエキソン物質の量は、用いられる具体的なエキソンとイントロンの配列によって変動する。多すぎるエキソンＤＮＡが含まれているかは単に試験管内構築物を試験して正常な細胞機能が働いているか或いは相補的配列を有する関連遺伝子の発現が働いているかを求めることにより容易に試験することができる。
上述した“相補的”又は“アンチセンス”は、全体の長さにわたって実質的に相補的でありかつ塩基不適正がほとんどないポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、長さが15塩基の配列は、13位又は14位に相補的配列をもつ場合には相補的と呼ぶことができる。完全に相補的な配列が全長全体に相補的でありかつ塩基不適正がない配列である。相同度の低い他の配列も企図される。例えば、高相同領域が限定されるが非相同領域を含むアンチセンス構築物(例えば、リボザイム; 下記を参照のこと)を設計することができる。これらの分子は、相同が50％未満であるが適切な条件下で配列を標的にするように結合する。
特異的構築物を作成するためにゲノムＤＮＡの部分とcＤＮＡ又は合成配列とを組合わせることができることは有利である。例えば、最後の構築物にイントロンが所望される場合、ゲノムクローンを用いることが必要である。cＤＮＡ又は合成ポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分に便利な制限部位を与えることができるので、配列の残りに用いられる。
アンチセンス構築物の標的である具体的ながん遺伝子は、ras、myc、neu、raf、erb、src、fins、jun、trk、ret、hst、gsp、bcl-2、ablである。抗アポトーシス遺伝子と血管形成プロモーターに有効であるように企図される。
【００３２】
ＶII．リボザイム
タンパク質は伝統的に核酸の触媒に用いられてきたが、他の種類の高分子はこの努力に用いられるものとして出てきた。リボザイムは、部位特異的方法で核酸を切断するＲＮＡ-タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する(Kim & Cook, 1987; Gerlach et al., 1987; Foster & Symons, 1987)。例えば、多数のリボザイムは、高度の特異性をもつホスホエステル転移反応を促進させ、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのホスホエステルの１つだけを切断する(Michel & Westhof, 1990; Reinhold-Hurek & Shub, 1992)。この特異性は、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（“IＧＳ”）に特異的な塩基対合相互作用によって結合する要求によるものである。
リボザイム触媒は、主として核酸を含む配列特異的切断/結合反応の一部として見られている(Joyce, 1989; Cook et al., 1981)。例えば、米国特許第5,354,855号には、ある種のリボザイムが既知のリボヌクレアーゼより大きくＤＮＡ制限酵素に近い配列特異性をもつエンドヌクレアーゼとして作用し得ることが報告されている。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム仲介阻害は治療用に特に適しているものである(Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990)。最近、適用したいくつかの細胞系においてリボザイムが遺伝子変化を誘発することが報告され、変化した遺伝子にはがん遺伝子Ｈ-ras、c-fos、ＨＩＶの遺伝子が含まれた。ほとんどのこの研究には、特異的リボザイムによって切断される特異的変異コドンに基づいて標的mＲＮＡの修飾が含まれた。この実施態様の標的は、ＶＥＧＦやアンギオポエチンのような血管形成遺伝子やがん遺伝子(例えば、ras、myc、neu、raf、erb、src、fins、jun、trk、ret、hst、gsp、bcl-2、EGFR、grb2、abl)が含まれる。
【００３３】
ＶIII．単鎖抗体
他の実施態様においては、一遺伝子は単鎖抗体を含むことができる。単鎖抗体の生産方法は当業者に周知である。当業者は、そのような方法の米国特許第5,359,046号(この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする)を参照する。単鎖抗体は、短いぺプチドリンカーを用いて重鎖と軽鎖の可変ドメインを共に融合することにより生成され、よって単分子上に抗原結合部位が再構成される。
一方の可変ドメインのＣ末端が15〜25アミノ酸ぺプチド又はリンカーによってもう一方のＮ末端につながれている単鎖抗体可変断片(scＦv)は、抗原結合又は結合の特異性を有意に破壊せずに生じた(Bedzyk et al., 1990; Chaudhary et al., 1990)。これらのＦvは、未変性抗体の重鎖と軽鎖に存在する一定の領域(Ｆc)を欠いている。
種々の分子、例えば、がん遺伝子、増殖因子、ホルモン、酵素、転写因子又は受容体に対する抗体が企図される。血管形成因子(ＶＥＧＦ/ＶＳＰ; βＦＧＦ; αＦＧＦ)や血管形成に必要な内皮抗原(即ち、Ｖ3インテグリン)に対する血清の標的となる分泌抗体が企図される。トランスフォーミング成長因子や血小板由来増殖因子のような増殖因子が特に企図される。
IＸ．細胞周期調節剤
細胞周期調節剤は、他の遺伝子と組合わせた場合に有利であり得る。そのような細胞周期調節剤としては、p２７、p２１、p５７、p１８、p７３、p１９、p１５、Ｅ2Ｆ-1、Ｅ2Ｆ-2、Ｅ2Ｆ-3、p１０７、p１３０、Ｅ2Ｆ-4が含まれる。他の細胞周期調節剤としては、抗血管形成タンパク質、例えば、可溶性Ｆlt1(主な負の可溶性ＶＥＧＦ受容体)、可溶性Ｗnt受容体、可溶性Ｔie2/Ｔek受容体、メタロプロテアーゼ2の可溶性凝血酵素ドメイン又は他の血管形成サイトカインの可溶性受容体(例えば、ＶＥＧＦＲ1/ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ3/ＦＥＧＦＲ3/Ｆlt4、共にＶＥＧＦ受容体)が含まれる。
Ｘ．ケモカイン
ケモカインをコードする遺伝子は、本発明に用いることができる。ケモカインは、一般的には、ケモカイン発現の部位に免疫エフェクター細胞を補充するために走化性因子として働く。治療部位に他の免疫系成分の補充を強化するために、例えば、サイトカイン遺伝子と組合わせて具体的なケモカイン遺伝子を発現することができることは有利である。そのようなケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭIＰ1-α、ＭIＰ1-β又はIＰ-10が含まれる。当業者は、ある種のサイトカインが走化性因子作用をもつことが既知であるとともにケモカインという言葉によって分類することができることを認識する。
【００３４】
Ｄ．発現構築物
Ｉ．ベクター
“ベクター”という用語は、複製することができる細胞に導入するために核酸配列を挿入することができるキャリヤ核酸分子を示すために用いられる。核酸配列は、ベクターが導入される細胞に外来性であること又は配列がふつうは見られないホスト細胞核酸内の位置を除く細胞内配列に相同であることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルス、植物ウイルス)、人工染色体(例えば、ＹＡＣ)が含まれる。当業者は、標準組換え技術によってベクターを構築するように十分身につけられる(例えば、Goodboun & Maniatis et al., 1988; Ausubel et al., 1994、これらの文献の記載は共に本願明細書に含まれるものとする)。
“発現ベクター”という用語は、転写されることができるＲＮＡをコードする核酸を含む遺伝子構築物の種類を意味する。ときには、ＲＮＡ分子はタンパク質、ポリぺプチド、又はぺプチドに翻訳される。ときには、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子又はリボザイムの生産に翻訳されない。発現ベクターは、種々の“制御配列”を含むことができ、具体的なホスト細胞において作用可能に結合したコーディング配列の転写やおそらく翻訳に必要な核酸配列を意味する。本発明によれば、ベクターは化学誘導性を与えるＥgr-1プロモーターの十分な部分を含んでいる。転写と翻訳を支配する制御配列のほかに、ベクターと発現ベクターは他の機能も働き後に記載される核酸配列を含むことができる。
ｉ．開始シグナルと内部リボソーム結合部位
コード配列の効率のよい翻訳に特定の開始シグナルが必要とすることもできる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを与える必要があってもよい。当業者は、容易にこれを決定し必要なシグナルを与えることができる。開始コドンは全挿入部の翻訳を確実にするために所望のコード配列のリーディングフレームと“インフレーム”でなければならないことは周知である。外因性翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然又は合成であり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素の介在によって増強することができる。
本発明のある種の実施態様においては、多重遺伝子、又は多シストロンメッセージを生じるように内部リボソームエントリー部位(IＲＥＳ)要素の使用が用いられる。IＲＥＳ要素は、５' メチル化Ｃap依存性翻訳のリボソーム走査を迂回し、内部部位で翻訳を始めることができる(Pelletier & Sonenberg, 1988)。ピコルナウイルスファミリー(ポリオや脳心筋炎)の２種からIＲＥＳ要素(Pelletier & Sonenberg, 1988)と哺乳動物メッセージからIＲＥＳ(Macejak & Sarnow, 1991)が記載されている。IＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに結合することができる。多重オープンリーディングフレームは共に転写されることもでき、各々がIＲＥＳによって分けられ、多シトロンメッセージを生じる。IＲＥＳ要素によって、各オープンリーディングフレームは効率のよい翻訳のためにリボソームに近づくことができる。多重遺伝子は単一プロモーター/エンハンサーを用いて効率よく発現させることができ、単一メッセージを転写する(米国特許第5,925,565号及び同第5,935,819号を参照のこと、各々の明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする)。
【００３５】
ii．多重クローニング部位
ベクターは、ベクターを消化するために標準組換え技術とともに使用し得る多重制限酵素部位を含む核酸である多重クローニング部位(ＭＣＳ)を含むことができる(例えば、Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, Cocea, 1997、これらの文献の記載は本願明細書に含まれるものとする)。“制限酵素消化”は、核酸分子内の特定の場所でのみ機能する酵素により核酸分子を触媒切断することを意味する。これらの制限酵素の多くは、市販されている。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。しばしば、外因性配列をベクターに結合することを可能にするＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いてベクターを線状又は断片にする。“結合”は、相互に相接してもしなくてもよい２つの核酸断片間のホスホジエステル結合を形成する方法を意味する。制限酵素と結合反応を含む手法は、組換え技術の当業者には周知である。
iii．スプライシング部位
ほとんど転写された真核ＲＮＡ分子は、一次転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受ける。ゲノム真核配列を含むベクターは、タンパク質発現用転写物の適切な処理を確実にするために供与体及び/又は受容体スプライシング部位を必要とすることができる(例えば、Chandler et al., 1997、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする)。
iv．終結シグナル
本発明のベクター又は構築物は、一般的には、少なくとも１つの終結シグナルを含んでいる。“終結シグナル”又は“ターミネーター”は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特定の終結に関係するＤＮＡ配列を含んでいる。従って、ある実施態様においては、ＲＮＡ転写物の生産を終了する終結シグナルが企図される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを得るために生体内に必要なものである。
真核系においては、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を暴露するように新しい転写物の部位特異的切断を可能にする特定のＤＮＡ配列を含むことができる。これにより、約200 Ａ 残基(ポリＡ)の伸長部を転写物の３' 端に付加するように特殊化した内在性ポリメラーゼの信号が送られる。このポリＡテールで修飾されたＲＮＡ分子は、安定であるようであり、効率よく転写される。従って、真核生物を含む他の実施態様においては、ターミネーターはＲＮＡの切断用シグナルを含むことが好ましく、ターミネーターがメッセージのポリアデニル化を促進することが更に好ましい。ターミネーター及び/又はポリアデニル化部位要素は、メッセージ要素を高めるとともにカセットから他の配列への読み過ごしをできるだけ少なくするために働くことができる。
本発明に用いられるように企図されたターミネーターは、遺伝子の終止配列、例えば、ウシ増殖ホルモンターミネーター又はウイルス終止配列、例えば、ＳＶ40ターミネーターを含むがこれらに限定されない本明細書に記載され当業者に既知でもある既知の転写ターミネーターを含む。ある実施態様においては、終結シグナルは配列切断のためのように転写可能配列又は翻訳可能配列がなくてもよい。
【００３６】
ｖ．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核発現においては、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルは、本発明の成功した実施にほとんど重要でないと思われるが、そのような配列を使うことができる。好適実施態様としては、便利で種々の標的細胞でよく機能することが知られるＳＶ40ポリアデニル化シグナル又はウシ増殖ホルモンポリアデニル化シグナルを含んでいる。ポリアデニル化は、転写物の安定性を高めることができ、細胞質輸送を容易にすることができる。
ｖi．複製起点
ホスト細胞内のベクターを増殖させるために、複製が開始する特定の核酸配列である１以上の複製部位起点を含むことができる。また、ホスト細胞が酵母である場合には、自己複製配列(ＡＲＳ)を使うこともできる。
ｖii．選択可能で篩い分け可能なマーカー
本発明のある種の実施態様においては、発現ベクター内にマーカーを含むことにより本発明の核酸構築物を含む細胞を試験管内又は生体内で同定することができる。そのようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞の簡単な同定を可能にする細胞に同定可能な変化を与える。一般的には、選択可能なマーカーは、選択を可能にする性質を与えるものである。正の選択可能マーカーはマーカーの存在がその選択を可能にするものであり、負の選択可能マーカーはその存在がその選択を阻止するものである。
通常、薬剤選択マーカーの介在は形質転換体のクローニングと同定を援助し、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン又はヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子が有効な選択可能マーカーである。条件の実施形態に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を与えるマーカーのほかに、基準が比色分析であるＧＦＰのようなスクリーン可能なマーカーを含む他の種類のマーカーも企図される。また、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)のようなスクリーニング可能な酵素を使うことができる。当業者は、免疫学的マーカーをおそらくＦＡＣＳ分析とともにどのように使うかを知っている。用いられるマーカーは、遺伝子産物をコードしている核酸により同時に発現することができる限り、重要ではないと考えられる。選択可能で篩い分け可能なマーカーの他の例も当業者に周知である。
【００３７】
ｖiii．プラスミドベクター
ある種の実施態様においては、プラスミドベクターはホスト細胞を形質転換するために用いられるように企図される。一般的には、ホスト細胞と適合する種由来のレプリコン配列と制御配列を含むプラスミドベクターはこれらのホストと関連して用いられる。ベクターは、ふつうは複製部位と、形質転換細胞において表現型選択を与えることができる標識配列を保有する。制限されない例においては、大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミド、pＢＲ322の誘導体を用いてしばしば形質転換される。pＢＲ322はアンピシリンとテトラサイクリン耐性の遺伝子を含むので、形質転換細胞を同定するために簡単な手段を与える。pＢＲプラスミド、又は他の微生物プラスミド又はファージは、例えば、微生物生物体によってそれ自体のタンパク質の発現に使用し得るプロモーターを含まなければならず、含むように修飾されなければならない。
更に、ホスト微生物と適合するレプリコン配列と制御配列を含むファージベクターは、これらのホストと関連した形質転換ベクターとして使用し得る。例えば、ファージλＧＥＭ(登録商標)-11は、例えば、E. coliＬＥ392のようなホスト細胞を形質転換するように使用し得る組換えファージベクターをつくるのに用いることができる。
他の有効なプラスミドベクターとしては、pIＮベクター(Inouye et al., 1985)や精製と分離又は切断のためにグルタチオンS-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)可溶性融合タンパク質を作成するのに用いられるpＧＥＸベクターが含まれる。他の適切な融合タンパク質は、β-ガラクトシダーゼ、ユビキチン等とのものである。
発現ベクターを含む細菌ホスト細胞、例えば、大腸菌は、多くの適切な培養液のいずれか、例えば、ＬＢ中で増殖する。ある種のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、当業者に理解されるように、ホスト細胞とある種のプロモーターに特異的な物質を接触させることにより、例えば、IＰＴＧを培養液に添加することにより又はインキュベーションを高温に切り換えることにより誘導することができる。細菌を更にある期間、通常は2〜24時間培養した後、細胞を遠心分離により集め、洗浄して残留培養液を除去する。
【００３８】
iｘ．ウイルスベクター
受容体仲介エンドサイトーシスによって細胞に感染させるか又は細胞に入れるとともにホスト細胞ゲノムに組込みかつウイルス遺伝子を安定に効率よく発現させるある種ウイルスの能力は、異種核酸の細胞(例えば、哺乳動物細胞)への移入のための魅力のある候補物質になっている。本発明の核酸を送達するための用いることができるウイルスベクターの限定されない例を次に述べる。
ａ．アデノウイルスベクター
核酸を送達するための具体的な方法には、アデノウイルスベクターの使用が必要である。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡに組込むための能力が低いことが既知であるが、この特徴はこれらのベクターによって得られる遺伝子移入の効率が高いことにより相殺される。“アデノウイルス発現ベクター”は、（a）構築物のパッケージングを援助するとともに（b）クローン化された組織又は細胞特異的構築物を最後には発現させるのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。遺伝体制又はアデノウイルスの知識、36 kb、線状、二本鎖ＤＮＡウイルスは、大きなアデノウイルスＤＮＡ片を７kbまでの異種配列で置換することを可能にする(Grunhaus & Horwitz, 1992)。
ｂ．ＡＡＶベクター
核酸は、アデノウイルス援助トランスフェクションを用いて細胞に導入することができる。アデノウイルス結合系を用いた細胞系において高トランスフェクション効率が報告されている(Kelleher & Vos, 1994; Cotten et al., 1992; Curiel, 1994)。アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)は、組込み頻度が高くかつ非分裂細胞に感染させる本発明に従って用いられる魅力的なベクター系であるので、哺乳動物細胞、例えば、組織培養物(Muzyczka, 1992)又は生体内に遺伝子を送達するのに用いる。ＡＡＶの感染能ホスト範囲は広い(Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 1986; Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al., 1988)。
【００３９】
ｃ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、ホストゲノムに遺伝子を組込む能力のために遺伝子送達ベクターとして有望であり、多量の異種遺伝物質を移入し、広範囲スペクトルの種と細胞型、特別の細胞系にパッケージングされているものに感染させる(Miller, 1992)。
レトロウイルスベクターを構築するために、ある種のウイルス配列の代りにウイルスゲノムへ核酸を挿入して複製欠損のあるウイルスを生じる。ビリオンを生じるように、gag、pol、env遺伝子を含むがＬＴＲを含まないパッケージング細胞系とパッケージング成分を構築する(Mann et al., 1983)。cＤＮＡをレトロウイルスＬＴＲとパッケージング配列と共に含む組換えプラスミドが特別な細胞系に導入される(例えば、リン酸カルシウム沈殿により)場合、パッケージング配列は組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージングされることを可能にし、培養液に分泌される(Nicolas & Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983)。次に組換えレトロウイルスを含む培養液を集め、濃縮してもよく、遺伝子移入に用いられる。レトロウイルスベクターは、広範囲の細胞型に感染させることができる。しかしながら、組込みと安定な発現にはホスト細胞の分裂が必要である(Paskind et al., 1975)。
レンチウイルスは、一般のレトロウイルス遺伝子gag、pol、envのほかに調節又は構造機能をもつ他の遺伝子を含む複合レトロウイルスである。レンチウイルスベクターは当該技術において周知である(例えば、Naldini et al., 1996; Zuffery et al., 1997; Blomer et al., 1997; 米国特許第6,013,516号; 同第5,994,136号)。レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス: ＨIＶ-1、ＨIＶ-2又はサル免疫不全ウイルス: ＳIＶが挙げられる。レンチウイルスは、ＨIＶビルレント遺伝子を多重弱毒させることにより作成する。例えば、遺伝子env、vif、vpr、vpu、nefを欠失させ、ベクターを生物学的に安全にする。
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染させることができ、生体内と生体外双方の遺伝子移入と核酸配列の発現に使用し得る。例えば、適切なホスト細胞がパッケージング機能を保有する２つ以上のベクター、即ち、gag、pol、env、また、rev、tatでトランスフェクトした非分裂細胞に感染させることができ組換えレンチウイルスは、米国特許第5,994,136号に記載され、この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。具体的な細胞型の受容体にターゲティング用抗体又は具体的なリガンドを含むエンベロープタンパク質を結合することにより組換えウイルスを標的にすることができる。ウイルスベクターに対象の配列(調節領域を含む)を、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードしている他の遺伝子と共に挿入することにより、ベクターはここでは標的特異的である。
【００４０】
ｄ．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターは、本発明においてはワクチン構築物として用いることができる。ワクシニアウイルス(Ridgeway, 1988; Baichwal & Sugden, 1986; Coupar et al., 1988)、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルス又は単純ヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターを用いることができる。種々の哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を与える(Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal & Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990)。
ｅ．修飾ウイルスを用いた送達
送達すべき核酸は、特定の結合リガンドを発現するように操作された感染ウイルス内に収容することができる。従って、ウイルス粒子は標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、細胞に内容物を送達する。レトロウイルスベクターの特定のターゲティングを可能にするように設計された新規な方法は、ラクトース残基をウイルスエンベロープに化学付加することによるレトロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体によって肝細胞の特定の感染を可能にすることができる。
レトロウイルスエンベロープタンパク質や特定の細胞受容体に対してビオチニル化抗体を用いる組換えレトロウイルスのターゲティングに対する他の方法を設計した。抗体は、ストレプトアビジンを用いることによりビオチン成分によって結合した(Roux et al., 1989)。主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩとクラスII抗原に対する抗体を用いて、エコトロピックウイルスによる表面抗原をもつ種々のヒト細胞の試験管内感染が証明された(Roux et al., 1989)。
【００４１】
II．ベクター送達と細胞トランスフォーメーション
本発明と共に用いられるオルガネラ、細胞、組織又は生物体のトランスフォーメーションに適切な核酸送達法は、本明細書に記載されるように又は当業者に既知であるように、核酸(例えば、ＤＮＡ)をオルガネラ、細胞、組織又は生物体に導入することができる。そのような方法としては、生体外トランスフェクション(Wilson et al., 1989, Nabel et al., 1989)、微量注射(Harlan & Weintraub, 1985; 米国特許第5,789,215号、この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする)を含む注入; エレクトロポレーション(米国特許第5,384,253号、この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984); リン酸カルシウム沈降(Graham & Van Der Eb, 1973; Chen & Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); ＤＥＡＥ-デキストランの次にポリエチレングリコールを用いる(Gopal, 1985); 直接ソニックローディング(Fechheimer et al., 1987); リポソーム仲介トランスフェクション(Nicolau & Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991)や受容体仲介トランスフェクション(Wu & Wu, 1987; Wu & Wu, 1988); 微粒子銃(PCT国際出願第94/09699号、同第95/06128号; 米国特許第5,610,042号; 同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号、同第5,538,880号、各明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする); 炭化ケイ素繊維によるかきまぜ(Kaeppler et al., 1990; 米国特許第5,302,523号、同第5,464,765号、各明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする); アグロバクテリウム仲介トランスフォーメーション(米国特許第5,591,616号、同第5,563,055号、各明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする); プロトプラストのＰＥＧ仲介トランスフォーメーション(Omirulleh et al., 1993; 米国特許第4,684,611号、同第4,952,500号、各明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする); 乾燥/阻害仲介ＤＮＡ取込み(Potrykus et al., 1985)、又はそのような方法の組合わせによるＤＮＡの直接送達が含まれるがそれらに限定されない。これらの手法を用いることによって、オルガネラ、細胞、組織又は生物体は安定に又は一時的に形質転換することができる。
【００４２】
ｉ．生体外トランスフォーメーション
生体外の設定において生物体から取り出した血管細胞や組織をトランスフェクトする方法は既知である。例えば、イヌ内皮細胞は、試験管内でレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変化させ、イヌに移植している(Wilson et al., 1989)。他の例においては、ユカタンミニブタ内皮細胞をレトロウイルスにより試験管内でトランスフェクトし、二重バルーンカテーテルを用いて動脈に移植した(Nabel et al., 1989)。このように、細胞又は組織を取り出し、本発明の核酸を用いて生体外でトランスフェクトすることができることが企図される。具体的な態様においては、移植細胞又は組織は、生物体内に置かれてもよい。好適態様においては、核酸は、移植細胞又は組織内で発現する。
ii．注入
ある種の実施態様においては、核酸は、オルガネラ、細胞、組織又は生物体に１種以上の注射(即ち、針注射)、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内等によって送達することができる。ワクチンの注射方法は、当業者に周知である(例えば、生理食塩水を含む組成物の注射)。本発明の他の実施態様としては、直接微量注射による核酸の導入が含まれる。直接微量注射は、核酸構築物をアフリカツメガエル卵母細胞を導入するために用いられている(Harland & Weintraub, 1985)。
iii．エレクトロポレーション
本発明のある種の実施態様においては、核酸はエレクトロポレーションによりオルガネラ、細胞、組織又は生物体に導入される。エレクトロポレーションには、細胞とＤＮＡの浮遊液を高電圧放電に暴露することが必要である。本方法の変法においては、ペクチン分解酵素のようなある種の細胞壁分解酵素が使われて標的受容細胞を未処理よりもエレクトロポレーションによる形質転換に感受性にする(米国特許第5,384,253号、この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする)。また、受容細胞は、機械的創傷によって形質転換に感受性にすることもできる。
エレクトロポレーションを用いる真核細胞のトランスフェクションは多くが成功している。この方法でマウスプレＢリンパ球はヒトκ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ(Potter et al., 1984)、ラット肝細胞はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされている(Tur-Kaspa et al., 1986)
【００４３】
iｖ．リン酸カルシウム
本発明の他の実施態様においては、核酸はリン酸カルシウム沈降を用いて細胞に導入される。ヒトＫＢ細胞は、この手法を用いてアデノウイルス５ＤＮＡ(Graham & Van Der Eb, 1973)でトランスフェクトされている。またこの方法では、マウスＬ(Ａ9)、マウスＣ127、ＣＨＯ、ＣＶ-1、ＢＨＫ、ＮIＨ3Ｔ3、ヒーラー細胞がネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ(Chen & Okayama, 1987)、ラット肝細胞が種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた(Rippe et al., 1990)。
ｖ．ＤＥＡＥ-デキストラン
他の実施態様においては、核酸はＤＥＡＥ-デキストランに続いてポリエチレングリコールを用いて細胞に送達される。この方法では、リポータープラスミドがマウス骨髄腫や赤白血病細胞に導入された(Gopal, 1985)。
ｖi．音波処理ローディング
本発明の他の実施態様には、直接ソニックローディングによる核酸の導入が含まれる。ＬＴＫ-線維芽細胞はソニックローディングによりチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされている(Fechheimer et al., 1987)。
ｖii．リポソーム仲介トランスフェクション
本発明の他の実施態様においては、核酸は、例えば、リポソームのような脂質複合体にからみつけることができる。リポソームは、リン脂質二分子膜と内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは水性媒体で分かれた多重脂質層を有する。リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁した場合に自然に形成する。脂質成分は、閉鎖構造を形成する前に自己転位を受け、水と、脂質二分子膜間の溶解した溶質をからみつける(Ghosh & Bachhawat, 1991)。リポフェクタミン(Gibco BRL)又はスーパーフェクト(Qiagen)と複合した核酸も企図される。
リポソーム仲介核酸送達と異種ＤＮＡの試験管内発現は、かなり成功している(Nicolau & Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987)。培養したニワトリ胚、ヒーラー、肝がんの細胞における異種ＤＮＡのリポソーム仲介送達と発現の可能性も証明されている(Wong et al., 1980)。
本発明のある種の実施態様においては、リポソームを血球凝集ウイルス(ＨＶＪ)と複合させることができる。これにより、細胞膜との融合を容易にするとともにリポソーム封入ＤＮＡの細胞侵入を促進させることがわかった(Kaneda et al., 1989)。他の実施態様においては、リポソームを核非ヒストン染色体タンパク質(ＨＭＧ-1)と共に複合又は使用することができる(Kato et al., 1991)。他の実施態様においては、リポソームはＨＶＪとＨＭＧ-1双方と共に複合又は使用することができる。他の実施態様においては、送達伝達体はリガンドとリポソームを含むことができる。
【００４４】
ｖiii．受容体仲介トランスフェクション
更にまた、核酸は、受容体仲介送達伝達体によって標的細胞に送達することができる。これらは、標的細胞に生じる受容体仲介エンドサイトーシスによって高分子の選択的取込みを利用するものである。種々の受容体の細胞型特異的分配の観点から、この送達法は本発明の他の特異性の程度を加える。
ある受容体仲介遺伝子ターゲティング伝達体は、細胞受容体特異的リガンドと核酸結合剤を含んでいる。あるものは、送達すべき核酸が作用的に結合した細胞受容体特異的リガンドを含んでいる。いくつかのリガンドは受容体仲介遺伝子移入に用いられ(Wu & Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, 欧州公開明細書第0273085号)、手法の作用可能性が確立している。他の哺乳動物細胞型に関する特異的送達も記載されている(Wu & Wu, 1993; この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする)。本発明のある種の態様においては、リガンドは標的細胞集団上で特異的に発現した受容体に対応するように選ばれる。
他の実施態様においては、細胞特異的核酸ターゲティング伝達体の核酸送達伝達成分は、特定の結合リガンドをリポソームと組合わせて含むことができる。送達すべき核酸はリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドはリポソーム膜に機能的に取込まれる。従って、リポソームは、標的細胞の受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。そのようなシステムは、例えば、表皮増殖因子(ＥＧＦ)がＥＧＦ受容体のアップレギュレーションを示す細胞に核酸を受容体仲介送達するのに用いられるシステムを用いて作用することがわかった。
他の実施態様においては、更に、標的送達伝達体の核酸送達伝達体がリポソーム自体であってもよく、好ましくは、細胞特異的結合を指示する１種以上の脂質又は糖タンパク質を含む。例えば、ラクトシル-セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドがリポソームに取込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込み増加が見られた(Nicolau et al., 1987)。本発明の組織特異的トランスフォーミング構築物は、同様の方法で標的細胞に特異的に送達することができる。
【００４５】
Ｅ．治療遺伝子とＤＮＡ損傷剤の併用投与
Ｉ．投与
本発明で治療し得る腫瘍としては、脳(グリア芽細胞腫、髄芽腫、星状細胞腫、希突起グリオーマ、上衣腫)、肺、肝、脾、腎、リンパ節、小腸、膵、血液細胞、結腸、胃、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頚部、食道、骨髄、血液又は他の組織の腫瘍を含むがこれらに限定されない。腫瘍は、転移と非転移として区別することができる。種々の実施態様としては、皮膚、筋肉、顔、脳、前立腺、乳房、子宮内膜、肺、頭頚部、膵、小腸、血液細胞、肝、精巣、卵巣、結腸、皮膚、胃、食道、脾、リンパ節、骨髄又は腎の腫瘍細胞が含まれる。他の実施態様としては、末梢血、リンパ液、腹水、漿液、胸水、喀痰、脳脊髄液、涙液、便又は尿のような流体試料が含まれる。
本発明によれば、Ｅgr-1推進発現ベクターとＤＮＡ損傷剤の送達が提供される。この組合わせは、例えば、１以上の標的細胞の死滅、１以上の標的細胞におけるアポトーシスの誘導、１以上の標的細胞の増殖速度の低減、転移頻度又は数の減少、腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の増殖の阻止、腫瘍又は１以上の標的細胞への血液供給の減少、１以上の標的細胞又は腫瘍に対する免疫応答の促進、がんの進行の防止又は阻止し、又はがんをもつ患者の寿命の延長により、患者において過剰増殖性疾患(例えば、がん)に影響を及ぼすことができる。
更に一般的には、これらの薬剤は、がん細胞の増殖を死滅又は阻止するのに有効な用量による合計量で与えられる。この方法は、細胞と薬剤を同時に又は薬剤の細胞への別個の投与が所望される治療効果を与える時間内に接触させることを含んでもよい。これは、細胞、組織又は生物体と両薬剤を含む単一組成物又は薬理学的製剤とを接触させることにより、又は細胞と２種以上の異なる組成物又は製剤とを接触させることにより達成することができる。
【００４６】
細胞、組織又は生物体に適用する場合の“接触”や“暴露”という用語は、治療構築物とＤＮＡ損傷剤が標的細胞、組織又は生物体に送達される方法、又は標的細胞、組織又は生物体と直接並べて置かれる方法を記載するように本明細書に用いられる。細胞死滅又は静止を得るために、これらの薬剤は、細胞を死滅させるか又は分裂することを阻止するのに有効な合計量で１以上の細胞に送達される。
発現構築物は、数分〜数週の範囲の間隔でＤＮＡ損傷剤の前でも、同時でも、後でもよい。これらの薬剤が細胞、組織又は生物体に個別に適用される実施態様においては、ＤＮＡ損傷剤が細胞、組織又は生物体においてＥgr-1プロモーターからの発現を誘導することがなおできるように、各送達時間の間にほとんど時間が切れないことを通常は確実にする。例えば、そのような場合、細胞、組織又は生物体と薬剤とをほとんど同時(即ち、約１分未満)に接触させることができることが企図される。他の態様においては、これらの薬剤は、約１分間、約５分間、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４５分間、約６０分間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間、約４８時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約１週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週又は約８週以上離して、又はその中の得られる範囲に投与することができる。
種々の組合わせを用いることができる。そのような組合わせの非限定例を次に示す。Ｅgr-1は“Ａ”であり、ＤＮＡ損傷剤は“Ｂ”である。
Ａ/Ｂ/Ａ Ｂ/Ａ/Ｂ Ｂ/Ｂ/Ａ Ａ/Ａ/Ｂ Ａ/Ｂ/Ｂ Ｂ/Ａ/Ａ Ａ/Ｂ/Ｂ/Ｂ Ｂ/Ａ/Ｂ/Ｂ
Ｂ/Ｂ/Ｂ/Ａ Ｂ/Ｂ/Ａ/Ｂ Ａ/Ａ/Ｂ/Ｂ Ａ/Ｂ/Ａ/Ｂ Ａ/Ｂ/Ｂ/Ａ Ｂ/Ｂ/Ａ/Ａ
Ｂ/Ａ/Ｂ/Ａ Ｂ/Ａ/Ａ/Ｂ Ａ/Ａ/Ａ/Ｂ Ｂ/Ａ/Ａ/Ａ Ａ/Ｂ/Ａ/Ａ Ａ/Ａ/Ｂ/Ａ
他の組合わせも企図される。
【００４７】
本発明の薬剤の投与は、化学療法又は遺伝子治療の投与用一般プロトコルに従ってもよいが、いずれにせよ毒性が考慮される。治療周期は必要なように繰り返されることが予想される。具体的な実施態様においては、種々の追加薬剤を本発明と組合わせて適用することができることが企図される。
“有効な量”は、がん細胞の増殖を減少、低減、阻害或いは阻止する薬剤、アポトーシスを誘導する薬剤、転移を阻止する薬剤、細胞を死滅させる薬剤、細胞内の細胞毒性を誘導する薬剤の量として定義される。
薬剤は、一般的には、静脈内、動脈内、腫瘍内、非経口又は腹腔内投与することができる。特に、すべてのがんをもつ患者にＥgr-1とＤＮＡ損傷剤の局所的、局部的、全身的送達が適した方法が考えられる。局所投与が有効であり、腫瘍塊の直接注射、周辺部注射、又は切除した腫瘍床の注射又は浸潤が含まれる。局部的送達には、腫瘍血管系又は局部血液供給部への投与を含むことができる。また、ＤＮＡ損傷剤とＥgr-1ベクターのいずれか又は双方の全身的送達は、ある場合には、例えば、広範囲の転移が生じた場合に適切である。
【００４８】
II．製剤
薬剤の医薬剤形は、一般的には、注射用溶液又は分散液としての使用に調製される。すべての場合において、剤形は無菌でなければならず、簡単な注入能が存在する程度まで流体でなければならない。製造や保存の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌のような微生物の混入作用に対して保護しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、又は液体ポリエチレングリコール等)、その適切な混合液、又は植物油を含む溶媒又は分散培養液であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合に必要とされる粒子径又は界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤や抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張物質、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を送らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンの組成物中での使用によりもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を上で挙げた種々の他の成分と混合することにより調製され、必要な場合、続いてろ過滅菌される。一般的には、分散液は、種々の滅菌有効成分を分散基本培養液と上記で挙げたものから必要とされる他の成分を含む無菌伝達体に混合することにより調製される。無菌注射用溶液の調製用無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、有効成分と以前に無菌ろ過した溶液からの所望の追加成分の粉末を得る真空乾燥法や凍結乾燥法である。
本明細書に用いられる“薬学的に許容しうる担体”は、溶媒、分散培養液、コーティング、抗菌剤や抗真菌剤、等張剤や吸収遅延剤等のいずれか又はすべてを含んでいる。医薬活性物質用の培養液や薬剤の使用は、当該技術において周知である。慣用の培養液又は薬剤が有効成分と適合しない限りを除いて治療組成物の使用が企図される。補助的有効成分を組成物に混合することもできる。
【００４９】
Ｆ．補助治療
Ｉ．放射線治療物質
放射線治療物質と要素は、例えば、γ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、ラジオアイソトープ等のＤＮＡ損傷を誘導する放射線や波が含まれる。治療は、局部的な腫瘍部位を上記の形の放射線で照射することにより達成することができる。おそらくこれらの要素のすべてがＤＮＡの前駆物質、ＤＮＡの複製と修復、染色体の集合と維持に対して広範囲の損傷ＤＮＡを行う。
Ｘ線の投与量範囲は、一日線量５０〜２００レントゲン、長期間(３〜４週)から１回線量２０００〜６０００レントゲンまでの範囲である。ラジオアイソトープの投与量範囲は広く変動し、同位元素の半減期、放出された放射線の強さとタイプ、新生物細胞による取込みに左右される。
II．手術
がん増殖を除去するための外科治療は、一般的には、腫瘍とがんの治療の標準的方法である。これは、残っている新生物細胞又は悪性腫瘍細胞の破壊を確実にするために他の治療、例えば、化学療法及び/又は放射線療法を組合わせた治療を更に効果的にするためにがん増殖全体を除去するか又は減退させる試みである。従って、手術は、本発明と組合わせて用いることができる。
がんをもつ人の約６０％は、例えば、予防的手術、診断又は進展度診断手術、治癒的手術又は姑息的手術を含むある種の手術を受ける。手術、特に治癒的手術は、他の治療、例えば、本発明や１種以上の他の薬剤とともに用いることができる。
治癒的手術としては、がん組織の全部又は一部が物理的に除去、切除及び/又は破壊される切除術が含まれる。手術が表在性がん、前がん、又は正常組織の偶然量を除去、切除又は破壊することができることも更に企図される。手術による治療としては、例えば、腫瘍切除、レーザ手術、凍結手術、電気手術、顕微鏡的制御手術(モース術)が挙げられる。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを意味する。がん細胞、組織、又は腫瘍の一部又は全部を切除したときに、体内に空洞が生じてもよい。
腫瘍又は手術域の治療は、抗がん治療とともに患者又は手術域の治療を達成することができる。そのような治療は、例えば、約１日毎、約２日毎、約３日毎、約４日毎、約５日毎、約６日毎、約７日毎、又は約１週毎、約２週毎、約３週毎、約４週ごと、約５週毎又は約１ヶ月毎、約２ヶ月毎、約３ヶ月毎、約４ヶ月毎、約５ヶ月毎、約６ヶ月毎、約７ヶ月毎、約８ヶ月毎、約９ヶ月毎、約１０ヶ月毎、約１１ヶ月毎、又は約１２ヶ月毎に繰り返すことができる。これらの治療は、用量が異なってもよい。
【００５０】
III．免疫療法
免疫療法剤は、一般的には、免疫エフェクター細胞やがん細胞を標的にし破壊する分子の使用によるものである。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のあるマーカーに特異的な抗体であってもよい。抗体単独で治療のエフェクターとして働き、細胞死滅を実際に行う他の細胞を強化することもできる。抗体は、薬剤又は毒素(例えば、化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等)に結合することもでき、単にターゲティング剤として働く。そのような抗体結合体は、免疫毒素と呼ばれ、当該技術において周知である(米国特許第5,686,072号、同第5,578,706号、同第4,792,447号、同第5,045,451号、同第4,664,911号、同第5,767,072号を参照のこと、各明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする)。また、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接又は間接に相互作用する表面分子をもつリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞としては、細胞毒性Ｔ細胞又はＮＫ細胞が含まれる。
免疫療法の一態様においては、腫瘍細胞はターゲティングに従うマーカー、即ち、大部分の他の細胞には存在しないあるマーカーをもたなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが本発明に関連したターゲティングに適するものである。一般的な腫瘍マーカーには、がん胎児性抗原、前立腺特異抗原、泌尿器腫瘍随伴抗原、胎児抗原、チロシナーゼ(p９７)、gp６８、ＴＡＧ-72、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭucＡ、ＭucＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbＢ又はp1５５が含まれる。
ｉ．免疫刺激剤
免疫療法の個々の態様においては、免疫刺激分子を一つの物質として、更に好ましくは他の物質、例えば、サイトカイン、例えば、IＬ-2、IＬ-4、IＬ-12、ＧＭ-ＣＳＦ、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、γ；Ｆ42Ｋ又は他のサイトカイン類似体；ケモカイン、例えば、ＭIＰ-1、ＭIＰ-1β、ＭＣＰ-1、ＲＡＮＴＥＳ、IＬ-8；又は増殖因子、例えば、ＦＬＴ3リガンドとともに用いることである。
本発明に用いられる企図された具体的な一サイトカインは腫瘍壊死因子である。腫瘍壊死因子(ＴＮＦ；カケクチン)は、ある種のがん細胞を死滅させ、サイトカイン産生を活性化し、マクロファージや内皮細胞を活性化し、コラーゲンやコラゲナーゼの生産を促進させ、炎症性伝達物質や敗血症の伝達物質であり、異化作用、熱、睡眠を促進させる糖タンパク質である。ある病原体は、ＴＮＦ産生の刺激によって腫瘍退縮を引き起こす。ＴＮＦが有効投与量で単独で用いられる場合は極めて毒性であり得るので、おそらく最適用法は他の薬剤と組合わせて少量で用いるものである。その免疫抑制作用はγインターフェロンによって増強されるので、その併用は潜在的に危険である。ＴＮＦとインターフェロンαのハイブリッドは、抗がん活性を有することがわかった。
特に企図される他のサイトカインは、インターフェロンαである。インターフェロンαは、ヘアリー細胞白血病、カポジ肉腫、メラノーマ、カルチノイド、腎細胞がん、卵巣がん、膀胱がん、非ホジキンリンパ腫、菌状息肉症、多発性硬化症、慢性顆粒球性白血病の治療に用いられている。
【００５１】
ii．受動免疫療法
がんの受動免疫療法には多くの異なる方法が存在する。次の：抗体のみの注射；毒素又は化学療法剤に結合した抗体の注射；放射性同位体に結合した抗体の注射；抗イディオタイプ抗体の注射；更に骨髄における腫瘍細胞の瀉下に広く分類することができる。
好ましくは、ヒトモノクローナル抗体は、患者における副作用がほとんど又は全く生じないので受動免疫療法に使われる。しかしながら、それらの適用は、不足により幾分制限され、これまで病巣内にのみに投与されてきた。例えば、ガングリオシド抗原に対するヒトモノクローナル抗体は、皮膚再発メラノーマに罹患している患者に病巣内に投与されている(Irie & Morton, 1986)。毎日又は毎週病巣内注射した後、６〜10人の患者に退縮が見られた。他の実験では、２種のヒトモノクローナル抗体の病巣内注射から中程度の成功が得られた(Irie et al., 1989)。
２種の異なる抗原に対して１を超えるモノクローナル抗体又は複数の抗原特異性をもつ抗体さえも投与することは好ましい。治療プロトコルには、リンホカイン又は他の免疫増強剤の投与が含まれてもよい(Bajorin et al., 1988)。
iii．能動免疫療法
能動免疫療法においては、抗原ぺプチド、ポリぺプチド又はタンパク質、又は自己又は同種間腫瘍細胞組成物又は“ワクチン”を、一般的には異なる細菌アジュバントと投与する(Ravindranath & Morton, 1991; Morton & Ravindranath, 1996; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993)。メラノーマ免疫療法においては、高IgＭ応答を誘起する患者は、IgＭ抗体を誘起しないか又は低IgＭ抗体を誘起する患者よりしばしば生存する(Morton et al., 1992)。IgＭ抗体は、しばしば一時的抗体であり、その法則の例外は抗ガングリオシド抗体又は抗炭水化物抗体であると思われる。
ｉｖ．養子免疫
養子免疫においては、患者の循環しているリンパ球、又は腫瘍浸潤リンパ球を試験管内で分離し、IＬ-2のようなリンホカインで活性化するか又は腫瘍壊死因子を導入し、再投与する(Rosenberg et al., 1988; 1989)。これを達成するために、免疫学的有効量の活性リンパ球を本明細書に記載されるアジュバント取込み抗原ぺプチド組成物と組合わせて動物、又はヒト患者に投与する。活性化リンパ球は、血液又は腫瘍試料から初期に分離するとともに試験管内で活性化(又は“増殖”)した患者自体の細胞であることが最も好ましい。この形の免疫療法は、メラノーマや腎がんの退縮のいくつかの症例を生じているが、応答者の割合は応答しないものに比べてほとんどない。
【００５２】
Ｇ．治療の有効性のスクリーニングとモニタリング
本発明に関連して治療の進行をモニターするか又は治療の一部としてモニターするために個体から腫瘍細胞、正常細胞又は腫瘍細胞と正常細胞の双方を除去することができることが企図される。そのような細胞を取り出しＤＡＰI染色で処理してクロマチンの縮合レベルを求め、アポトーシスレベルを測定し、中性スフィンゴミエリナーゼ産生レベル又は次のような他の方法を測定することにより治療の有効性をモニターすることができることが予想される。
アポトーシスの誘導を求める具体的な一方法は、ＤＮＡの多能性を測定する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介dＵＴＰビオチンニック末端標識(ＴＵＮＥＬ)分析である(Gorczyca, 1993)。この分析は、酵素末端トランスフェラーゼによる標識ＵＴＰの破壊ＤＮＡ鎖への取込みをモニターすることによりＤＮＡの断片化を測定するものである。取込みは、エレクトロスコピー又は細胞選別法(例えば、ＦＡＣＳ)によってモニターすることができる。
【００５３】
Ｈ．生体外送達
本発明においては、生体外遺伝子治療-動物又は患者から細胞を分離し、細胞を試験管内で処理し、次に修飾細胞を動物又は個体へ戻す-を使うことができる。この方法は、高用量の治療、また、生体内設定では起こり得ない他の要因の追加を可能にする。特に、自己骨髄細胞(ＢＭＣ)移植は、血液又は骨髄を採取し放射線又は化学療法の強化前に保存されるサルベージ法として用いられる。がん細胞の再導入を防止するそのような細胞の処理は非常に有益である。
ヒト単核細胞(ＭＮＣ)を調製する際に、骨髄のアリコートを遠心分離管のような容器に加層する。最初に、ＭＮＣは、骨髄源、例えば、脛骨、大腿骨、脊柱、肋骨、股、胸骨、上腕骨、橈骨、尺骨、脛骨、腓骨から得ることができる。更に、これらの細胞は、臍帯血、末梢血、又はサイトカイン可動末梢血から得ることもできる。ヒト造血幹細胞の他の供給源には、胎児性卵黄嚢、胎児肝、胎児と成人の脾臓、又は血液が含まれる。骨髄層を遠心分離して管の底に赤血球の沈降物を生じ、培養液の透明な層の界面層はＭＮＣと上に血漿培養液層を含んでいる。次に、界面層を、例えば、吸引を用いて除去することができる。この層を1000ｇで遠心分離して最後にＭＮＣ沈降物を得る。次に、この沈降物をＦＡＣＳによる細胞選別用に適した緩衝液に再懸濁することができる。分離したＭＮＣを試験管内でクローン化して免疫学的に活性な細胞を増殖させる。次に、増殖した治療的に活性な細胞を患者に与えて治療効果を得る。
Ｉ．臨床試験
本例は、ａ）がん治療タンパク質をコードしている核酸セグメントを含む発現構築物を準備し、該核酸セグメントがＥgr-1プロモーターの制御下に位置しているステップと、ｂ）フリーラジカルを誘発し得るＤＮＡ損傷化合物と組合わせてヒト患者に該発現構築物を投与するステップとを含む方法によってヒト治療プロトコルの開発に関する。本方法は、他のがん治療化合物、電離放射線及び/又は他の補助がん治療を患者に投与するステップを更に含むことができる。これらの方法は、種々のがん/腫瘍や悪性転換細胞又はがん細胞が役割を果たす疾患の臨床治療に用いられる。そのような治療は、抗腫瘍治療、例えば、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、精巣がん、脳腫瘍、皮膚がん、結腸がん、胃がん、食道がん、気管がん、頭頚部がん、膵がん、肝がん、乳がん、卵巣がん、リンパがん、白血病、子宮がん、又は膣がんをもつ患者の治療に特に有効な手段である。
フリーラジカル誘導ＤＮＡ損傷化合物は、シスプラチン、ナイトロジェンマスタード、シトキサン、シクロホスファミド、マイトマイシンｃ、アドリアマイシン、イホスファミド、ブレオマイシン、ドキソウルビシン、プロカルバジン、アクチノマイシン、クロラムブシル、カルボプラチナム、ブスルファン、bcnu、ccnu、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、エピルビシン、ダウノルビシン、カンプトテシン、又はミトキサントロンのようなプラチナム化合物であってもよい。抗がん特性をもつタンパク質を用いることができ、そのような化合物の例は明細書の他の所に記載される。
患者の治療とモニタリングを含む臨床試験を行う種々の要素は、本開示を考慮して当業者に既知である。次の情報は、本発明の方法を用いた臨床試験を確立するのに用いられる一般ガイドラインとして示されている。
【００５４】
第Ｉ相臨床試験の候補者は、従来のすべての治療が失敗した患者である。本発明の治療製剤は、暫定的に毎週ベースで投与される。治療と病気の過程の有効性は、腫瘍の大きさ、腫瘍マーカーの存在、及び/又はがん細胞の骨髄浸潤のようなモニタリングパラメータによる定期的なベースで評価することができる。患者の進行と治療の有効性をモニターするために用いられる試験には、身体検査、Ｘ線、血液結果又は他の臨床試験法が含まれる。更に、ベクターによって発現された抗がんタンパク質の発現を評価するために末梢血と骨髄の試料が取り出される。第Ｉ相試験に投与される用量は、標準的な第Ｉ相臨床相試験に行われるように増大する。即ち、許容できる最大範囲に達するまで用量が増大する。
臨床応答は、許容できる基準によって区切ることができる。例えば、完全な応答は、少なくとも２ヶ月間がん細胞の証拠の完全な消失によって定義することができる。一方、部分的応答は、少なくとも２ヶ月間がん細胞の５０％減少によって定義することができる。
典型的な治療経過は、個々の患者や当業者に既知の方法で治療される疾患によって異なる。典型的な治療経過は、７〜２１日間にわたって送達した約６回の投与を含むことができる。医師による選択の際に、用法は３週毎に又はより少ない頻度(１ヶ月毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎等)ベースで６回の投与を続けるものである。例えば、肺がんをもつ患者は、８週周期で治療されるが、患者に副作用が見られない場合には長期間用いることができ、患者が希望される治療を許容しない場合には短期間になってもよい。各周期は、等しい間隔をとって２０〜３５回の個々の投与からなるが、これも臨床状態によって異なってもよい。これらは単に例示的な治療回数であり、他の多くの時間経過が可能であることを当業者が容易に認識することは当然のことである。
患者は、予め又は同時に外科治療、化学療法、放射線療法又は遺伝子治療を受けていてもよいが必要ではない。最適には、患者は十分な骨髄機能(末梢絶対顆粒球数＞2,000/mm3、血小板数100,000/mm3として定義される)、十分な肝機能(ビリルビン1.5 mg/dl、十分な腎機能(クレアチニン1.5 mg/dl)を示す。
本発明の治療組成物は、典型的には、所望されるように標準的な周知の非毒性の生理的に許容し得る担体、アジュバント、又は伝達体を含む投薬単位製剤で非経口的に投与される。本明細書に用いられる非経口という用語には、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内、内部又は注入法が含まれる。これらの組成物は、細胞の増殖を死滅又は阻止するのに有効な量で与えられる。
組成物の局部送達は、臨床疾患を妨げるのに治療的に有効な用量を送達する効率のよい方法である。また、全身的送達も適するものである。本発明の治療組成物は、腫瘍の部位に直接患者に投与することができる。組成物の容量は、腫瘍の全面が治療組成物によって接触することを確実にするのに通常は十分でなければならない。一実施態様においては、投与は簡単には腫瘍への治療組成物の注入を必要としている。他の実施態様においては、カテーテルが腫瘍部位に挿入され、空洞に所望時間連続して潅流することができる。
上記治療法は前臨床試験から得られた知識に従って変えることができることは当然のことである。当業者は、本明細書に開示された情報を用いるとともに治療法を最適化することができる。
【００５５】
Ｊ．実施例
本発明の好適実施態様を示すために次の実施例が含まれる。次の実施例に開示された方法が本発明の実施に十分機能するように本発明者によって発見された方法であるので、その実施の好ましい方法を構成するとみなされ得ることは当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して多くの変更が開示された個々の実施態様において行うことができかつ本発明の真意と範囲から逸脱することなく類似の又は同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例１】
【００５６】
方法
細胞及び細胞培養物  細胞系Ｓeg-1、ヒトの食道腺がん(Ｄavid Ｂeer博士、ミシガン大学、アナーバー、ミシガン州)およびＤＨＤ／Ｋ12／ＲＴb(ＰＲＯb)、1,2−ジメチルヒドラジン誘導により同系ＢＤ-ＩＸラットから得られたラット結腸腺がん(Ｆrancois Ｍartin博士、ディジョン大学、フランス)を、ウシ胎仔血清(ＦＢＳ、10％v/v)(Ｉntergen、パーチェス、ニューヨーク州)、ペニシリン(100IＵ/ｍl)、ストレプトマイシン(100μg/ｍl)(ＧibcoＢＲＬ)で補足したダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)(ＧibcoＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨーク州)中に、37℃、7.5％ＣＯ2で維持した。
動物  胸腺欠損ヌードマウス(Ｆrederick Ｃancer Ｒesearch Ｉnstitute、フレデリック、メリーランド州)に食事と水を自由に与えた。実験は、シカゴ大学のガイドラインに従った。
ウイルスベクター  ウイルスベクターＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11ＤとＡd.Ｎull.3511.11Ｄ(GenVec、ゲイザースバーグ、メリーランド州)を-80℃保管し、配合緩衝液中で適当な濃度に希釈した。
ＴＮＦ-α蛋白の試験管内測定  Ｓeg-1とＰＲＯb細胞を、105 細胞／ウエルの割合で12ウェルプレート(Ｂecton Ｄickinson、ベッドフォード、マサチューセッツ州)に播種し、一夜増殖し、無血清培養液中で感染多重度(ＭＯI)100にて2〜3時間Ａd.Ｎull.3571.11Ｄ又はＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄに感染させた。完全培地中のＩＲ処理細胞は、Ｐantak ＰＣＭ1000ｘ線発生装置を用いて細胞に５Ｇyを照射した。シスプラチン群中の細胞は、完全培地中で5μＭのシスプラチンに接触させた。24、48、72時間後に細胞と上清を擦り取って回収し、ヒトＴＮＦ-αの産生物をＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ Ｓystems、ミネアポリス、ミネソタ州)、次に３サイクルの凍結-融解溶解により定量した。分析は、３回行なった。２回処理したプレートを用いてIＲとシスプラチンの細胞毒性を調整した。細胞をベルセン(ＨＢＳＳ中の0.02％ＥＤＴＡ)とトリプシン-ＥＤＴＡ(0.25％トリプシン、1mＭ ＥＤＴＡ・4Ｎa)(GibcoBRL)を用いて回収し、トリパンブルー(0.4％)を除外した血球計(GibcoBRL)を用いて計数した。タンパク質分析は、タンパク質濃度を規格化するために行った(Bio−Rad、ハーキュレス、カリフォルニア州)。
【００５７】
試験管内シフェラーゼリポーター分析  Ｅgr-1構築物pＥ425(全てのＣＡrＧ要素を含む596塩基対、ＡＰ-1部位は含まない)とpＥ660(最小Ｅgr-1プロモーター、ＣＡrＧ要素を含まない115塩基対)(Datta et al., 1993)を配列確認と、酵素制限とライゲーションによるＰＣＲ産物のpＧＬ3基本ホタルルシフェラーゼリポータープラスミド構築物(Ｐromega、マディソン、ウィスコンシン州)への挿入により評価した。ＪＭ109コンピテント細胞(Ｓtratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)をこれらのプラスミドで形質変換し、エンドトキシンを含まないマキシプレップ(Ｑiagen、ヴァレンシア、カリフォルニア州)を調製し、産物確認をＰＣＲ、シークエンシング、酵素制限、電気泳動法により行なった。Ｓeg-1とＰＲＯb細胞を105細胞／ウエルの割合で12ウエルプレートに播種し、トランスファストトランスフェクション試薬(Promega)を用いて、pＧＬ３基本(プロモーターのない負の対照)、pＧＬ3 660（最小Ｅgr-1プロモーター)、又はpＧＬ3 425（全てのＣＡrＧ要素を含むＥgr-1プロモーター)のホタルルシフェラーゼリポータープラスミド構築物でトランスフェクトした。全てのグループをpＲＬ-ＴＫ(ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター)のレニラルシフェラーゼリポータープラスミド構築物で同時トランスフェクションしてトランスフェクション効果を平均化した。48時間後に、細胞をIＲ(20Ｇy)又はシスプラチン(5μＭ)に接触させた。6時間後に細胞を回収し、デュアル-ルシフェラーゼリポーター分析システム(Ｐromega)によりルシフェラーゼ活性を計測した。
ＴＮＦ-αタンパク質の生体内測定  Ｓeg-1又はＰＲＯb細胞(5×106／0.1 ml)をヌードマウスの右後肢に注入した。腫瘍保有マウスを次の４グループ：腫瘍内(IＴ)Ａd.Ｎull.3511.11Ｄ(2×108p.u./10μl)と生理食塩水(ＮＳ)又はシスプラチン(8 mg/kg)による腹腔内(IP)と、IＴ Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ(2×108p.u./10μl)とIＰ ＮＳ又はシスプラチンの１つに無作為化した。IＰ ＮＳ又はシスプラチン処理物をIＴベクター後に投与した。２つの連続したIＴとIＰ注入を行なった。動物を安楽死させ、２度目のIＰ注入の48時間後に異種移植片を回収した。異種移植片を液体窒素中で急速冷凍し、ＲIＰＡ緩衝液(ＮaＣl 15mＭ、トリス10mＭ、pＨ7.5、ＥＤＴＡ5mＭ、pＨ7.5、ＰＭＳＦ100mＭ、ロイペプチン 1μg/ml、アプロチニン 2μg/ml)中でブリンクマンポリトロンホモジナイザー(Kinematica AG、ルツェルン、スイス)を用いてホモジナイズした。３サイクルの凍結-融解溶解後、ホモジェネートを10,000 rpm（Sorvall RC5C SS34ローター)で10分間、4℃で遠心分離した。上清中のＴＮＦ-αレベルをＥＬＩＳＡを用いて測定し、タンパク質分析を行なった(Bio-Rad、ハーキユリーズ、カリフォルニア州)。
生体内増殖実験  Ｓeg-1又はＰＲＯb細胞(5×106/0.1 ml)をヌードマウスの右後肢に注入した。腫瘍保有マウスを次の４グループ：腫瘍内)(IＴ)Ａd.Ｎull.3511.11Ｄ（2×108p.u./10μl)と腹腔内(IＰ)生理食塩水(ＮＳ)又はシスプラチン(3 mg/kg)と、IＴ Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ（2×108p.u./10μl)とIＰ ＮＳ又はシスプラチンの１つに割り当てた。IＰ ＮＳ又はシスプラチン注入をIＴベクター注入後に行ない、４日連続して毎日IＴとIＰ注入を行なった。異種移植片をカリパスを用いて２日毎に測定し、腫瘍体積を(長さ×幅×厚さ)/２で計算した。分数の腫瘍体積(Ｖ/Ｖo、Ｖo=０日目の体積)を計算し、プロットした。
統計分析  統計的有意性は、２端部スチューデントのｔ検定により求めた。
【実施例２】
【００５８】
Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ注入とシスプラチン暴露後のヒトとラットの腫瘍細胞におけるＴＮＦ-αの試験管内誘導
Ｅgr-1はＲＯI及び／又はＤＮＡ損傷によりそのプロモーターのＣＡrＧ要素によって誘導されるために、ＣＡrＧ要素がＴＮＦ-α cＤＮＡ（Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ)の上流にあるアデノウイルスベクターを感染させた腫瘍細胞によるＴＮＦ-α産生を細胞のレドックス状態を変化させるＤＮＡ損傷剤であるシスプラチン接触の後に分析した(Davis et al., 2001)。ＴＮＦ-α産生は、5μＭシスプラチン暴露の後に、ヒトの食道Ｓeg-1細胞とラットの結腸直腸ＰＲＯb細胞中で試験した。ＴＮＦ-α濃度は、ヒトのＴＮＦ-αに特異的なＥＬIＳＡを用いて求めた。Ｓeg-1細胞沈降物又はヌルベクター(Ａd.Ｎull.3511.11Ｄ)で感染させ、IＲ又はシスプラチンで処理した培養物からの上清からはＴＮＦ-αタンパク質は検出されなかった。一方、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクターを感染させ、IＲ(５Ｇy)に24、48、72時間に暴露したＳeg-1細胞の培養物からは、有意水準のＴＮＦ-αタンパク質が検出された(それぞれ768.8±32.6、593.0±27.6、746.0±18.5)。ベクターのみを感染させた比較細胞は(269.3±1.9、167.8±8.4、260.6±14.9；P＜0.001)であった。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋IＲの併用処理の場合は、ＴＮＦ産生が2.9、3.5、2.9倍に増加した。ＴＮＦ-αタンパク質の同様の誘導について、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクターを感染させ、5μＭシスプラチンに接触させたＳeg-1細胞を調べたところ、ベクター感染のみの場合と比較して、24時間(885.3±28.7)、48時間(892.6±21.3)、72時間(901.7±21.7；P＜0.001、図５Ａ＞であった。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチンの併用処理では、このように3.3、5.3となり、ＴＮＦ産生は、3.5倍に増加した。
【００５９】
ＰＲＯb細胞培養物を用いて比較実験を行なった。再び、ＰＲＯb細胞沈降物又はヌルベクター(Ａd.Ｎull.3511.11Ｄ)を感染させ、IＲ又はシスプラチン処理した培養物の上清からはＴＮＦ-αタンパク質は検出されなかった。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクターを感染させ、IＲ(５Ｇy)に24、48、72時間暴露したＰＲＯb細胞の培養物から有意水準のＴＮＦ-αタンパク質が検出された(それぞれ55.1±4.6、440.5±7.0、812.7±8.9)。ベクター感染のみの細胞を比較すると(17.9±1.7、169.7±5.2、522.5±11.3；Ｐ＜0.001)であった。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋IＲとの併用処理の場合、3.1、2.6、1.6倍のＴＮＦ産生の増加が見られた。同様のＴＮＦ-αタンパク質の誘導について、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクターを感染させ、24、48、72時間５μＭシスプラチン暴露を行ったＳeg-1細胞においてベクター感染のみと比較して調べた(52.4±0.6、318.6±30.6、812.2±11.0；Ｐ＜0.001、図５Ｂ)。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチンの併用処理では、2.9、1.9、1.6倍のＴＮＦ産生が増加した。これらのＳeg-1とＰＲＯb細胞系からの知見は、IＲとシスプラチンが、Ｅgr-1プロモーターを活性化することにより、ＴＮＦ‐αの発現を誘導しているということを示している。
選択的腫瘍ターゲッティングベクターにおいては、今回の場合はＴＮＦ‐αによりシスプラチン誘導性遺伝子構築物がシスプラチンの効果を増強する。シスプラチンとＴＮＦ-αは、細胞死滅について異なるメカニズムを持ち、それ故、細胞のシスプラチン耐性はＴＮＦ-αに感受性であり、その逆でもある。また、高腫瘍内濃度のＴＮＦ-αによって微小血管系の腫瘍が損傷されて壊死が誘導される。これは、ＴＮＦ-αとシスプラチン抵抗性腫瘍の治療に有効である可能性がある。シスプラチン/Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄストラテジーは、従って、放射線治療又は外科治療によっては効果的治療ができない局所的な腫瘍に対して効果的な治療である。また、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄは、化学-放射線治療の併用治療において局所的な効果を高めることもできる。
【実施例３】
【００６０】
Ｅgr-1プロモーターのＣＡrＧ要素はシスプラチンによるＴＮＦ-αの誘導を仲介する
Ｅgr-1プロモーターのＣＡrＧ要素がシスプラチンにより誘導性を有するか調べるために、pＧＬ3基本(負の対照)、pＧＬ3 660(最小のＥgr-1プロモーターだけからなり、ＣＡrＧ要素を含まない)、又はpＧＬ3 425(全てのＣＡrＧ要素からなり、ＡＰ-1部位を含まない)のホタルルシフェラーゼリポータープラスミド構築物とpＲＬ-ＴＫのレニラルシフェラーゼレポータープラスミド構築物で同時トランスフェクトしたＳeg-1とＰＲＯb細胞中のルシフェラーゼリポーター遺伝子の活性化を測定することによりＥgr-1プロモーターの活性を評価した。最小ルシフェラーゼ活性（ＬＡ）は、pＧＬ3基本プラスミド構築物でトランスフェクトしたＳeg-1細胞(ＬＡ=0.01−0.02)又はpＧＬ3 660プラスミド構築物でトランスフェクトしたＳeg-1細胞(ＬＡ=0.10−0.18)で検出された。しかしながら、pＧＬ3 425プラスミド構築物でトランスフェクトしたＳeg-1細胞は、IＲ(20Ｇy)暴露の後、未処理の対照細胞（ＬＡ=6.37）と比較して、相対ルシフェラーゼ活性（ＬＡ=15.07）が2.4倍の増加を示し(Ｐ=0.005)、未処理の対照細胞と比較して、シスプラチン(50μＭ)暴露の後、2.0倍のルシフェラーゼ活性(ＬＡ=2.89)の増加が見られた(Ｐ=0.005)(図６Ａ)。
ＰＲＯb細胞系において、同様の結果が得られた。最小ルシフェラーゼ活性は、pＧＬ3基本プラスミド構築物でトランスフェクトしたＰＲＯb細胞(ＬＡ=0.21−0.30)、又はpＧＬ3 660プラスミド構築物でトランスフェクトしたＰＲＯb細胞(ＬＡ=0.76-1.84)において検出された。pＧＬ3 425プラスミド構築物でトランスフェクトしたＰＲＯb細胞は、未処理の対照細胞(ＬＡ=13.69)と比較して、IＲ(20Ｇy)照射の後、ルシフェラーゼ活性(ＬＡ=57.75)が4.2倍の増加を示した(Ｐ=0.004)。また、未処理の対照細胞と比較して、シスプラチン(50μＭ)の暴露の後、ルシフェラーゼ活性(ＬＡ=49.40)は3.6倍の増加(Ｐ=0.01)を示した(図６Ｂ)。これらのデータは、Ｅgr-1プロモーターのＣＡrＧ要素がシスプラチンによる誘導能力を持ち、キメラＥgr-1.ＴＮＦ-α遺伝子の転写活性を仲介していることを示している。
【実施例４】
【００６１】
Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄとシスプラチン処理後のヒトとラットの腫瘍異種移植片におけるＴＮＦ-αの誘導
ヒトと齧歯動物の腫瘍にＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクターを感染させた後に、シスプラチンによるＴＮＦ-α誘導を分析した。胸腺欠損ヌードマウスの後肢を成長させるＳeg-1又はＰＲＯb細胞の異種移植片にＡd.Ｎull.3511.11Ｄ又はＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄを腫瘍内(IＴ)注射した。腫瘍保有マウスは、生理食塩水(ＮＳ)又はシスプラチン(3 mg/kg)をIＰ注射した。腫瘍ホモジェネート中のＴＮＦ-α濃度をＥＬＩＳＡを用いて定量した。
Ａd.Ｎull.3511.11Ｄベクター注射とＮＳ又はシスプラチンによる全身的処理後のＳeg-1腫瘍ホモジェネート中からは、ＴＮＦ-αタンパク質は検出されなかった。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチン(1294.0±438.5 pg/mg)の併用処理後、腫瘍内ＴＮＦ-αタンパク質の顕著な増加(3.5倍)が観測された。ベクターのみの処理と比較すると(366.5±52.6pg/mg、Ｐ＜0.05、図７Ａ)であった。
Ａd.Ｎull.3511.11Ｄベクター注射とＮＳ又はシスプラチンによる全身的処理後のＰＲＯb腫瘍ホモジェネートからはＴＮＦ‐αタンパク質は検出されなかった。しかしながら、ベクターのみの処理の場合(321.4±27.7pg/mg、Ｐ＜0.001、図７Ｂ)と比較して、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチン(878.6±61.9pg/mg)による併用処理後には、腫瘍内ＴＮＦ-αタンパク質の顕著な増加(2.7倍)が見られた。これらの知見は、シスプラチンによるＴＮＦ-αタンパク質の生体内誘導を示し、ＴＮＦ-αタンパク質が腫瘍組織よりもＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクターの産物であるということを実証している。
【実施例５】
【００６２】
シスプラチン誘導性Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄはヒトとラットの異種移植片の処理を増強する
化学誘導性Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄとシスプラチンの潜在的な抗腫瘍細胞用について、Ｓeg-1とＰＲＯb異種移植片中で調べた。Ｓeg-1の実験において、0日目(処理の開始日)の平均腫瘍体積は、381.3±10.8mm3（n=48、12マウス/処理グループ)であった。異種移植片にＡd.Ｎull.3511.11Ｄ又はＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11ＤをIＴに注射した。マウスには、ＮＳ又はシスプラチンをIＰ注射した。対照腫瘍(Ａd.Ｎull.3511.11Ｄ＋ＮＳ)は、4日で2倍のサイズになり、14日で平均腫瘍体積は4.7倍の増加を示した。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクター＋ＮＳ処理の腫瘍で同様の増殖パターンが観察された(4日目に2倍の増加、14日目に平均体積が3.8倍の増加)。ヌルベクター＋シスプラチン処理腫瘍と比較して、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチンの併用処理が施された腫瘍において顕著な腫瘍の減少が見られ、4日目(Ｐ=0.045)、6日目(Ｐ＜0.005)、8日目(Ｐ＜0.002)、10日目(Ｐ＜0.001)、12日目(Ｐ＜0.004)、および14日目(Ｐ＜0.021）であった（図８Ａ）。
ＰＲＯb実験においては、0日目の平均的な腫瘍体積は、244.2±6.2mm3（n=40、10マウス/処理グループ)であった。対照腫瘍(Ａd.Ｎull.3511.11Ｄ＋ＮS)は、4日間で徐々に2倍のサイズに増殖し、14日で平均腫瘍体積は4.4倍の増加を示した。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクター＋ＮSで処理した腫瘍で同様の増殖パターンが観察された(4日目で1.6倍の増加、14日目で平均体積が3.6倍に増加)。ヌルベクター＋シスプラチンにより処理した腫瘍と比較して、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチンの併用処理を施された腫瘍において、顕著な腫瘍の減少が見られ、4日目(Ｐ=0.045)、6日目(Ｐ＜0.001)、8日目(Ｐ=0.048)、10日目(Ｐ＜0.001)、12日目(Ｐ＜0.001）、14日目(Ｐ=0.002）であった(図８Ｂ)。総合すれば、これらのデータは、ヒトと齧歯動物由来の異種移植片におけるシスプラチンとＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ間の抗腫瘍相互作用を支持している。これらの知見は、試験管内と生体内実験において観察されたシスプラチンによるＴＮＦ-α誘導の結果と一致し、また、それらの結果により支持されるものである。シスプラチンによる処理後、毒性が観察されたが、シスプラチンとＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄによる併用処理後に追加毒性は見られなかった。
【００６３】
従って、ＲＯI産生を刺激する一般的に化学療法剤として用いられるシスプラチンは、ＴＮＦ-αをコードしているcＤＮＡの上流にライゲートされたＥgr-1プロモーターのＣＡrＧ要素をコードしたアデノウイルスベクターを感染させたヒトと齧歯動物のがん細胞においてＴＮＦ-α産生を誘導する。ＴＮＦ-αとシスプラチン両方の顕著な抗腫瘍効果は、両方の実験的な腫瘍系において観察された。従って、本発明は、シスプラチンのような化学療法剤の使用と、抗腫瘍遺伝子を用いた遺伝子治療の一時的で空間的な制御とを組み合わせた新規な方法を提供する。
最も一般的なヒト新生物において、肉眼で見える腫瘍は、最も標準的な化学療法剤によっては効果的に治療することができない。Ｅgr1−ＴＮＦ-αとシスプラチンのような転写ターゲッティングストラテジーは、肉眼的腫瘍に注入又は直接注射することが可能なときは、微小転移巣が存在するときでさえ有効である。ベクター/シスプラチンの組み合わせは、肉眼的腫瘍に効果を示し、シスプラチンは、微小転移性疾患に効果を示すからである。腫瘍への直接注射は、例えば、ＣＴ画像再現と組み合わせたＰＥＴスキャンなどの腫瘍のＸ線画像分析の最近の進歩によって向上しているにちがいない。更に、ウイルスベクターのターゲッティングの最近の開発により、転移性がんの化学誘導性遺伝子治療の付加的な特異性が出てくる可能性がある。
本明細書に開示され特許請求請求した組成物と方法の全ては、本開示を考慮すれば過度に実験せずに実施し得る。本発明の組成物と方法は、好適実施態様によって記載されているが、本組成物と方法と、本明細書に記載される方法のステップ又はステップの順序に、本発明の概念、真意、範囲から逸脱せずに当業者により変更されてもよいことは明らかである。更に詳しくは、同様の又は類似した効果が得られるかぎり、化学的と生理学的双方に関連した物質であれば、本明細書に記載された物質の代替として用いることができることも明らかである。このような当業者にとって明らかな全ての同様の代替や変更は、添付された特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の真意、範囲、概念に含まれているものである。
【００６４】
Ｊ．文献
以下の文献は、典型的な手順又はここで示したものに補充して他の詳細を提供する範囲で、参照によってここに具体的に組み込まれる。
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】Ｓeg-1における化学誘導。時間と処理(Ｓeg-1＝食道がん細胞系；ＵＴＣ＝未処理対照；Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ＝Ｅgr-1プロモーターの制御下の腫瘍壊死因子をコードしたアデノウイルス；platnm＝シスプラチナム；ＴＮＦ/Ｐltm＝Ａd.ＴＮＦ＋Ｐlatnm)の関数として分数の腫瘍体積を測定する。
【図２】化学誘導によるＴＮＦ発現。時間(５日間又は１０日間)と処理(utc＝未処理対照；Ａd.ＴＮＦ＝Ｅgr-1プロモーターの制御下の腫瘍壊死因子をコードしたアデノウイルス；Ｐlatnm＝シスプラチナム；ＴＮＦ/Ｐltm＝Ａd.ＴＮＦ＋Ｐlatnm)の関数としてのＴＮＦ産生/ピコグラム/ｍl。
【図３】４ mg/kg白金によるＴＮＦ誘導。時間(５日間又は１０日間)と処理(Ａd.ＴＮＦ＝Ｅgr-1プロモーターの制御下の腫瘍壊死因子をコードしたアデノウイルス；ＴＮＦ/Ｐltm＝Ａd.ＴＮＦ＋シスプラチナム)ＴＮＦ産生/ピコグラム/ｍｇタンパク質。
【図４】Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ処理Ｓeg-1における白金の用量応答。時間と処理(Ｓeg-1＝食道がん細胞系；pbs＝リン酸緩衝生理食塩水；Ａd.ＴＮＦ＝Ｅgr-1プロモーターの制御下の腫瘍壊死因子をコードしたアデノウイルス；Ｐlat1＝シスプラチナム１ mg/kg；Ｐlat3＝シスプラチナム3 mg/kg；Ｐlat6＝シスプラチナム6 mg/kg；Ｐlat1/ＴＮＦ＝シスプラチナム1 mg/kg＋Ａd.ＴＮＦ；Ｐlat3/ＴＮＦ＝シスプラチナム3 mg/kg＋Ａd.ＴＮＦ；Ｐlat6/ＴＮＦ＝シスプラチナム6 mg/kg＋Ａd.ＴＮＦ)の関数として分数の腫瘍体積を測定する。
【図５】ＴＮＦ-αタンパク質の試験管内測定。IＲ(５Ｇy)又はシスプラチン(５μＭ)に曝したＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ感染細胞によるＴＮＦ-α産生をＥＬIＳＡを用いて測定した。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋IＲ(Ｐ＜0.001)とＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチン(Ｐ＜0.001)に曝した24、48、72時間後に有意レベルのＴＮＦ-αタンパク質を検出し、Ｓeg-1培養物(図５Ａ)とＰＲＯb培養物(図５Ｂ)のみのベクターと比較した。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図６】試験管内リポーター分析。ルシフェラーゼリポーター構築物を用いてIＲ又はシスプラチンによるＥgr-1の誘導を評価した。最少ルシフェラーゼ活性が検出可能であった後にpＧＬ3（負の対照)又はpＧＬ3 660プラスミド(最少Ｅgr-1プロモーター)構築物でトランスフェクトした。図６Ａ。Ｓeg-1細胞においては、IＲ(２０Ｇｙ)に曝した後にルシフェラーゼ比活性の2.4倍の増加(Ｐ＝0.005)が見られ、シスプラチン(５０μＭ)に曝した後に4.2倍の増加(Ｐ＝0.004)が見られた。ＰＲＯb細胞においては、IＲ(２０Ｇｙ)に曝した後にルシフェラーゼ比活性の4.2倍の増加(Ｐ＝0.004)が見られ、シスプラチン(５０μＭ)に曝した後に3.6倍の増加(Ｐ＝0.01)が見られた。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図７】ＴＮＦ-αタンパク質の生体内測定。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ注入異種移植片によるＴＮＦ-α産生をＥＬIＳＡにより測定した。Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチンと併用処理した後にＳeg-1（図７Ａ）移植片(3.5倍増加；Ｐ＜0.05)とＰＲＯb（図７Ｂ）異種移植片（2.7倍；Ｐ＜0.001）においてＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄベクターのみによる処理と比較して腫瘍内ＴＮＦ-αタンパク質濃度の著しい増加が見られた。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図８】生体内再増殖実験。シスプラチンを含む又は含まないＡd.Ｎull.3511.11Ｄ又はＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄを注入した異種移植片の体積を測定することによりＡd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄとシスプラチンによる併用処理の効果を評価した。図８Ａ。Ｓeg-1異種移植片においては、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチンによる併用処理により、４日目(Ｐ＝0.045)、６日目(Ｐ＜0.005)、８日目(Ｐ＜0.002)、１０日目(Ｐ＜0.001)、１２日目(Ｐ＜0.004)、１４日目(Ｐ＜0.021)の日にＡd.Ｎull＋シスプラチンで処理した腫瘍と比較して腫瘍の著しい退縮が生じた。ＰＲＯb異種移植片においては、Ａd.Ｅgr.ＴＮＦ.11Ｄ＋シスプラチンによる併用処理を受けた腫瘍が４日目(Ｐ＝0.045)、６日目(Ｐ＜0.001)、８日目(Ｐ＜0.048)、１０日目(Ｐ＜0.001)、１２日目(Ｐ＜0.001)、１４日目(Ｐ＜0.002)の日にＡd.Ｎull＋シスプラチンで処理した腫瘍と比較して腫瘍の著しい退縮が見られた。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532213.tif 000104
【国際調査報告】
2004532213.tif 000105
2004532213.tif 000106
2004532213.tif 000107