(57)【要約】本発明は、p53経路のアポトーシス調節および腫瘍復帰変異に関与する核酸配列、ならびにこの核酸配列によりコードされるタンパク質と同様に、p53の生物学的連鎖(biological chain)における腫瘍抑制制御および／またはアポトーシスの機能不全に関連する、癌および特定の神経変性疾患の治療に使用するための化合物を検出、同定、および／またはスクリーニングするための、TSIP4およびTSIP2間の相互作用に基づく方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列群より選択される核酸配列を含むことを特徴とする、精製されたまたは単離された核酸：
a)配列番号:1；
b)a)に定義される配列と、最適アライメメントの後、少なくとも80％の同一性の割合を示す核酸配列；
c)a)に定義される核酸配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
d)a)、b)、またはc)に定義される配列に対応する相補配列またはRNA配列。
【請求項２】
配列番号:1、配列番号:1に対して相補的な配列、および配列番号:1に対応するRNA配列からなる群より選択される配列を含む、またはこのような配列からなることを特徴とする、請求項1記載の、精製されたまたは単離された核酸。
【請求項３】
以下より選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする、単離されたポリペプチド：
a)配列番号:2に対応するポリペプチド；
b)a)に定義される配列のポリペプチドの変異体であるポリペプチド；
c)a)のポリペプチドと少なくとも80％の相同性を含む、a)またはb)に定義されるポリペプチドに相同なポリペプチド；
d)a)、b)またはc)に定義されるポリペプチドの、少なくとも15個の連続したアミノ酸の断片；
e)a)、b)またはc)に定義されるポリペプチドの生物学的に活性な断片。
【請求項４】
請求項1および2のいずれか一項記載の核酸を含むか、または請求項3記載のポリペプチドをコードする、クローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項５】
請求項4記載のベクターで形質転換されることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項６】
請求項5記載の細胞を含むことを特徴とする、ヒトを除く動物。
【請求項７】
核酸配列を検出するおよび／または増幅するための、請求項1および2のいずれか一項記載の核酸配列の、プローブまたはプライマーとしてのインビトロにおける使用。
【請求項８】
請求項1および2のいずれか一項記載の核酸の、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとしてのインビトロにおける使用。
【請求項９】
組換え型ポリペプチドを産生するための、請求項1および2のいずれか一項記載の核酸配列の使用。
【請求項１０】
請求項5記載の細胞が、ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養されること、および該組換え型ポリペプチドが回収されることを特徴とする、組換え型ポリペプチドを得るための方法。
【請求項１１】
請求項10記載の方法を用いて得られることを特徴とする、組換え型ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項3および11のいずれか一項記載のポリペプチドを選択的に結合することを特徴とする、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
【請求項１３】
以下の段階を含むことを特徴とする、請求項3および11のいずれか一項記載のポリペプチドを検出するための方法：
a)生物学的試料を請求項12記載の抗体と接触させる段階；
b)形成された抗原-抗体複合体を実証する段階。
【請求項１４】
以下を含むことを特徴とする、請求項13記載の方法を実施するための試薬キット：
a)請求項12記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；
b)選択的に、免疫反応に適した培地を構成する試薬；
c)免疫反応の間に産生される抗原-抗体複合体を検出するための試薬。
【請求項１５】
患者由来の生物学的標本を用い、遺伝子に相当する核酸配列の全てまたは一部を分析することにより、配列番号:1に相当する遺伝子の、少なくとも1つの突然変異の存在および／または発現の変化が決定されることを特徴とする、神経変性疾患または癌の診断、および／または予後評価の方法。
【請求項１６】
請求項1および2のいずれか一項記載の核酸配列を含むことを特徴とする、DNAチップ。
【請求項１７】
請求項3および11のいずれか一項記載のポリペプチド、または請求項12記載の抗体を含むことを特徴とする、タンパク質チップ。
【請求項１８】
以下の段階を含むことを特徴とする、生物学的試料中の、請求項1および2のいずれか一項記載の核酸配列を検出するおよび／またはアッセイするための方法：
a)請求項1および2のいずれか一項記載の、標識されたポリヌクレオチドを接触させる段階；
b)該ポリヌクレオチドと生物学的試料の核酸間で形成される雑種を検出するおよび／またはアッセイする段階。
【請求項１９】
請求項1および2のいずれか一項記載の核酸より選択されるプライマーを用いて、生物学的試料の核酸を増幅する段階を含むことを特徴とする、該生物学的試料において、請求項1および2のいずれか一項記載の核酸を検出するおよび／またはアッセイするための方法。
【請求項２０】
請求項3および11のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項5記載の細胞、または請求項6記載の哺乳類を、候補化合物と接触させる段階、ならびに該候補化合物と該ポリペプチド間の複合体形成を検出する段階を含むことを特徴とする、配列番号:2の配列のポリペプチドに付着することができる化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項２１】
請求項1および2のいずれか一項記載の核酸と、インビトロまたはインビボで、相互作用することができる化合物をスクリーニングするための方法であって、請求項1および2のいずれか一項記載の核酸、請求項5記載の細胞、または請求項6記載の哺乳類を、候補化合物と接触させる段階、ならびに該候補化合物と該核酸間の複合体形成を検出する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
神経変性疾患または癌の治療を目的とした医薬品を調製するための、請求項20および21のいずれか一項記載の方法を用いて得られる化合物の使用。
【請求項２３】
医薬品として、以下より選択されることを特徴とする化合物：
a)請求項1および2のいずれか一項記載の核酸;
b)請求項3および11のいずれか一項記載のポリペプチド;
c)請求項4記載のベクター；
d)請求項5記載の細胞；
e)請求項12記載の抗体。
【請求項２４】
配列番号:1に相当する遺伝子の、少なくとも1つの突然変異の存在または発現の変化に関連する、神経変性疾患または癌を予防および／または治療するための、請求項23記載の化合物。
【請求項２５】
以下の段階を有する、TSIP4のTSIP2への結合を阻害する化合物を同定するための方法：
a)該化合物を、TSIP4とTSIP2間の結合をインビトロで決定するための系と接触させる段階；
b)TSIP4とTSIP2間の結合の減少および／または阻害を同定する段階。
【請求項２６】
以下の段階を有する、腫瘍抑制および／または細胞死(アポトーシス)を、減少させるおよび／または阻害する化合物を同定するための方法：
a)化合物を、TSIP4とTSIP2間の結合をインビトロで決定するための系と接触させる段階；
b)TSIP4とTSIP2間の結合の減少および／または阻害を誘導する化合物を同定する段階；
c)段階b)で同定された化合物を、アポトーシスおよび／または腫瘍抑制の現象を測定するためのモデル中で接触させる段階；
d)該モデルにおける腫瘍抑制および／または細胞死の減少および／または阻害を、該化合物を接触させていない対照モデルと比較して同定する段階。
【請求項２７】
以下の段階を有する、腫瘍抑制および／または細胞死(アポトーシス)を増加させる化合物を同定するための方法：
a)化合物を、TSIP4とTSIP2間の結合をインビトロで決定するための系と接触させる段階；
b)TSIP4とTSIP2間の結合の減少および／または阻害を誘導する化合物を同定する段階；
c)段階b)で同定された化合物を、アポトーシスおよび／または腫瘍抑制の現象を測定するためのモデル中で接触させる段階；
d)該モデルにおける腫瘍抑制および／または細胞死の増加を、該化合物を接触させていない対照モデルと比較して同定する段階。
【請求項２８】
以下の段階を含む、TSIP2タンパク質との結合に関与するTSIP4の領域を同定するための方法：
a)TSIP4タンパク質由来のペプチドを、TSIP4とTSIP2間の結合をインビトロで決定するための系において接触させる段階；
b)該系においてTSIP4とTSIP2間の結合の減少を引き起こすペプチドを同定する段階。
【請求項２９】
次の段階を含むことを特徴とする、腫瘍抑制および／またはアポトーシスを増加させる活性を有する生成物を同定するための方法：
a)請求項25および27のいずれか一項記載の方法を実施する段階、
b)特に、化学バックボーン上への残基の接合により、段階a)で選択された生成物を修飾する段階、
c)段階b)で修飾された生成物を、腫瘍抑制および／またはアポトーシスの関連モデルについて、インビトロおよび／またはインビボ法で試験する段階、
d)段階a)で選択された生成物に関して得られた活性より高い、腫瘍抑制活性および／またはアポトーシス活性が得られる生成物を同定する段階。
【請求項３０】
以下の段階を含むことを特徴とする、腫瘍抑制および／またはアポトーシスを減少させるおよび／または阻害する活性を有する生成物を同定するための方法：
a)請求項25および26のいずれか一項記載の方法を実施する段階、
b)特に、化学バックボーン上への残基の接合により、段階a)で選択された生成物を修飾する段階、
c)段階b)で修飾された生成物を、腫瘍抑制および／またはアポトーシスの関連モデルについて、インビトロおよび／またはインビボ法で試験する段階、
d)段階a)で選択された生成物に関して得られた活性と比較して、低下した腫瘍抑制および／またはアポトーシス活性が得られる生成物を同定する段階。
【請求項３１】
請求項25、27および29のいずれか一項記載の方法を用いて同定され、かつ腫瘍抑制および／またはアポトーシスを増加させる活性を有する化合物の、癌の治療を目的とした医薬品を調製するための使用。
【請求項３２】
請求項25、26および30のいずれか一項記載の方法を用いて同定され、かつ腫瘍抑制および／またはアポトーシスを減少させるおよび／または阻害する活性を有する化合物の、神経変性疾患の治療を目的とした医薬品を調製するための使用。
【請求項３３】
請求項28記載の方法を用いて同定され得るTSIP4の領域に相当する、ペプチド配列。
【請求項３４】
請求項33記載のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項３５】
医薬品としての、請求項33記載のペプチド配列、または請求項34記載のヌクレオチド配列。
【請求項３６】
医薬品を調製するための、請求項33記載のペプチド配列、または請求項34記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項３７】
TSIP4タンパク質およびTSIP2タンパク質からなる複合体。
【請求項３８】
以下の段階を含む、インビトロの細胞においてTSIP4-TSIP2結合を阻害するための方法：
a) 該細胞を、請求項25記載の方法を用いて同定された化合物と接触させる段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、p53経路によるアポトーシスのおよび腫瘍復帰変異(tumor reversion)の調節に関与する核酸配列、およびこの核酸配列によりコードされるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスまたは細胞死は、p53タンパク質を含め、多くのタンパク質により調節される複雑な現象である。p53タンパク質は他の多くのタンパク質と相互作用し、かつその発現は、細胞死および腫瘍復帰変異の現象を誘発し、他の細胞遺伝子発現の誘導または抑制と相関する。
【０００３】
従って、本発明の発明者らは、腫瘍抑制および／またはアポトーシスに至るカスケード(「腫瘍サプレッサー活性化経路」を表すTSAP)中で誘導され、かつ活性化される遺伝子、または抑制される遺伝子(「腫瘍サプレッサー阻害経路」を表すTSIP)を証明した。これらの遺伝子は、特に特許出願国際公開公報第97/22695号および国際公開公報第00/08147号の対象であった。
【０００４】
抗腫瘍活性(特に、アポトーシスまたは腫瘍抑制を誘導することができる)を有するか、または神経変性疾患の治療に使用することができる新規化合物を生成することを可能とするため、p53カスケードの機構を正確に理解できることは重要である。実際、本発明の発明者らは、アルツハイマー病においてその役割が示唆されていたプレセニリン1(PS1)が、出願国際公開公報第97/22695号に記載のTSIP2タンパク質と同一であることを証明した。従って、この現象を軽減させるために、アポトーシスを妨害することができ、さらに神経変性疾患において使用することができる医療品を探索することは理にかなっている。
【発明の開示】
【０００５】
本出願の発明者らは、細胞死のモデルにおいてそれ自体、抑制されることが示唆されていたタンパク質と、TSIP2タンパク質(プレセニリン1、PS1)との相互作用を証明した。従って、このタンパク質(配列番号:2)をTSIP4と呼び、これはこのタンパク質をコードする核酸配列と同様、本発明の対象である。「遺伝子」という用語は、調節要素を伴うかまたは伴わない、cDNA配列またはゲノムDNA配列のどちらか一方を示すように意図されうると理解されるので、TSIP4遺伝子が特に好ましい。
【０００６】
従って、本発明の対象は、以下の配列群より選択される核酸配列を含むことを特徴とする、精製されたまたは単離された核酸である：
a)配列番号:1；
b)配列番号:1より選択される配列の、少なくとも15個の連続するヌクレオチド断片の配列；
c)a)またはb)に定義される配列と、最適アライメメントの後、少なくとも80％の同一性の割合を示す核酸配列；
d)a)またはb)に定義される核酸配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
e)a)、b)、c)またはd)に定義される配列に対応する、相補的な配列またはRNA配列。
【０００７】
c)に定義される本発明による核酸配列は、上記のa)またはb)に定義される配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、最も好ましくは98％、または99％の同一性の割合を示す。
【０００８】
「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書中にて差別なく使用され、一連のヌクレオチドを正確に示すことを意図する。これらは核酸の断片または領域を定義することを可能とし、非天然ヌクレオチドを含む可能性があり、修飾されてもまたは修飾されなくてもよく、かつ二本鎖DNA、一本鎖DNAおよびこれらのDNAの転写産物に等しく対応する。従って、本発明による核酸配列にはまた、PNA(ペプチド核酸)なども包含される。
【０００９】
本発明は、天然の染色体環境、すなわち天然の状態にあるヌクレオチド配列には関係しないと理解されるべきである。これらは、単離されたおよび／または精製された配列であり、すなわちそれらは直接的または間接的に採取され、例えば複製により、それらの環境は少なくとも部分的に変更される。従って、化学合成により得られる核酸もまた、意味することを意図する。
【００１０】
本発明の目的上、2つの核酸またはアミノ酸配列間における、「同一性の割合」という用語は、比較する2つの配列間で、最良アライメント後に得られる、同一のヌクレオチドのまたはアミノ酸残基の割合を示すことを意図し、この割合は単純に統計にもとづくものであり、かつ2つの配列間の差異はランダムにそれらの全長に渡って分布する。「最良アライメント」または「最適アライメント」という用語は、下記のように決定される同一性の割合が最高となるアライメントを示すことを意図する。2つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は、従来はこれらを最適に整列させた後、これらの配列を比較することにより行われ、この比較は配列類似性の局所領域を同定して比較するため、セグメントにより、または「比較ウィンドウ(window of comparison)」により行われる。比較に関する配列の最適アライメントは、手動の他、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム(1981)を用いて、NeddlemanおよびWunschの局所的相同性アルゴリズム(1970)を用いて、PearsonおよびLipmanの類似性検索法(1988)を用いて、これらのアルゴリズムを使用したコンピュータープログラム(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTAおよびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Drive、Madison、WI)を用いて行うことができる。最適アライメントを得るため、BLOSUM 62マトリックスを用いたBLASTプログラムが好ましく使用される。PAMまたはPAM250マトリックスも同様に使用することができる。
【００１１】
2つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性の割合は、これら2つが最適にアライメントされた配列を比較することにより決定され、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これら2つの配列間の最適アライメントのための参照配列と比べて、付加または欠失を含む可能性がある。同一性の割合は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基がこの2つの配列間で同一である同一位置の数を決定する段階、この同一位置数を、比較する位置の総数で割る段階、およびこれら2つの配列間における同一性の割合を得るため、得られた結果に100を乗じる段階により算出される。
【００１２】
「参照配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性の割合を示す核酸配列」という表現は、参照核酸配列と比較して、特に欠失、切断、伸張、キメラ融合および／または置換、特に点型置換のような、ある種の改変を示す核酸配列、ならびに参照核酸配列との最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性を示すその核酸配列を表すことを意図する。それらは好ましくは、その相補配列が本発明の配列番号:1の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能な配列である。好ましくは、特異的または高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、この2つの配列のうちの一方と、もう一方に相補的な配列間で、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性を確実にするものである。
【００１３】
高ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、2つの相補DNA断片間のハイブリダイゼーションの維持を可能とするように、温度およびイオン強度の条件を選択することを意味する。例として、上述のポリヌクレオチド断片を規定するための、ハイブリダイゼーションの段階における高ストリンジェントな条件は、下記が有利である。
【００１４】
DNA-DNAまたはDNA-RNA間のハイブリダイゼーションは、2段階で行われる：(1) 5×SSC(1×SSCは0.15M NaCl + 0.015Mクエン酸ナトリウム溶液に相当する)、50％ホルムアミド、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10×デンハルト(Denhardt's)、5％硫酸デキストラン、および1％サケ精子DNAを含有するリン酸緩衝液(20mM、pH7.5)中、3時間、42℃でのプレハイブリダイゼーション；(2) 本質的には20時間、プローブの長さに依存する温度(すなわち：100ヌクレオチドより長いプローブでは42℃)でのハイブリダイゼーション、引き続き2×SSC + 2％SDS中、20℃で、20分間の洗浄を2回、さらに0.1×SSC + 0.1％SDS中、20℃で、20分間の洗浄を1回。最後の洗浄は、100ヌクレオチドより長いプローブに対しては、0.1×SSC + 0.1％SDS中、30分間、60℃にて行う。明確な長さのポリヌクレオチドに対する、上記の高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、1989の教示に従い、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに関して、当業者が調整することができる。
【００１５】
本発明による配列と、最適アライメント後に少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性の割合を示す核酸配列の中で、配列番号:1の、またはその断片の変異体である核酸配列、すなわち、対立遺伝子変異体、すなわち配列番号:1の配列の個々の変異に相当する核酸配列の全てもまた、好ましい。これらの天然の変異型配列は哺乳類、特にヒトに存在する多型性、および特に、例えば、細胞変性のような病的状況の発生に繋がる可能性のある多型性に相当する。好ましくは、本発明は、変異が配列番号:1の正常配列によりコードされる、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその断片のアミノ酸配列の改変に繋がる、変異型核酸配列に関する。
【００１６】
「変異型核酸配列」という表現はまた、ゲノム核酸配列のスプライス部位の突然変異および／または変化から生じる任意のRNAまたはcDNAを示すことを意図し、このcDNAは配列番号:1の配列を有する。
【００１７】
本発明は好ましくは、配列番号:1の配列、その相補配列、もしくは配列番号:1に対応するRNA配列を含むか、またはこのような配列からなることを特徴とする、本発明による、精製されたまたは単離された核酸に関する。
【００１８】
本発明はまた、タンパク質配列番号:2の少なくとも100、より好ましくは150、最も好ましくは200アミノ酸の連続する断片を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする、精製されたまたは単離された核酸に関する。
【００１９】
本発明による核酸の配列を含むことを特徴とする、プライマーまたはプローブはまた、本発明の一部である。
【００２０】
従って本発明はまた、特にPCR法のような増幅法、または関連法を利用して、特に、変異型核酸配列を実証もしくは識別することを可能にし、またはそのcDNA配列が配列番号:1により表される遺伝子のゲノム配列を同定することを可能にしうる、本発明によるプライマーまたはプローブに関する。
【００２１】
本発明はまた、核酸配列を検出、同定、アッセイまたは増幅するための、プローブまたはプライマーとしての、本発明による核酸配列の使用に関する。
【００２２】
本発明によれば、核酸配列を検出、同定、アッセイまたは増幅するための方法における、プローブとしてまたはプライマーとして使用可能なポリヌクレオチドは、その長さが最低15塩基、好ましくは20塩基、またはさらに好ましくは25から30塩基である。
【００２３】
本発明によるプローブおよびプライマーは、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るために、当業者に周知の方法を利用して、放射性または非放射性化合物で直接的または間接的に標識することができる。
【００２４】
本発明による非標識のポリヌクレオチド配列は、プローブまたはプライマーとして直接的に使用することができる。
【００２５】
多数の応用に使用可能な配列を得るため、一般的に配列は標識される。本発明によるプライマーまたはプローブの標識は、放射性元素を用いてまたは非放射性分子を用いて行われる。
【００２６】
使用される放射性同位体の中で、32P、33P、35S、3Hまたは125Iに言及する。非放射性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくはジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素、および放射線発光試薬、化学発光試薬、生物発光試薬、蛍光性試薬またはリン光性試薬のような発光試薬から選択される。
【００２７】
従って、本発明によるポリヌクレオチドは、特に、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法(Rolfsら、1991)を利用する方法において、プライマーおよび／またはプローブとして使用することができる。この技法では、増幅する必要のある断片を組み立てるオリゴヌクレオチドプライマー対の選択が必要となる。例えば、米国特許第4,683,202号に記載の技法を参照してもよい。増幅される断片は、例えば、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、またはゲルろ過もしくはイオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法の後、同定し、次いで配列決定することができる。増幅の特異性は、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列をプライマーとして使用し、かつこれらの配列を含むプラスミド、またはその生成された増幅産物を鋳型として使用することにより調節することができる。増幅されたヌクレオチド断片は、生物学的試料中における、増幅されたヌクレオチド断片の配列に相補的な配列からなる標的核酸の存在を実証するため、ハイブリダイゼーション反応における試薬として使用することができる。
【００２８】
本発明はまた、本発明によるプライマーを用いて増幅により得られる核酸配列にも向けられる。
【００２９】
本発明によるヌクレオチド配列のプライマー対を用い、標的とする核酸を増幅する他の手法を、PCRに対する代替法(PCR様の)として有利に使用できる。「PCR様の」という用語は、核酸配列の直接的もしくは間接的複製物を使用する全ての方法、または標識系が増幅される方法を示すことを意図し、；これらの方法は勿論、公知である。一般的に、それらはポリメラーゼを用いたDNA増幅を伴い；最初の試料がRNAである場合、予め逆転写を行うべきである。この増幅に関して現在、例えば、SDA(鎖置換増幅)法(Walkerら、1992)、Kwohら(1989)により説明されたTAS(転写に基づく増幅系)法、Guatelliら(1990)により説明された3SR(自己維持配列複製)法、Kievitisら(1991)により説明されたNASBA(核酸配列に基づく増幅)法、Landegrenら(1988)により説明されたTMA(転写介在増幅)法、LCR(リガーゼ連鎖反応)法、Segev(1992)により説明されたRCR(修復連鎖反応)法、Duckら(1990)により説明されたCPR(サイクリングプローブ反応)法、およびMieleら(1983)により説明されたQ-β-レプリカーゼ増幅法、のような非常に多くの方法が存在する。これらの方法の幾つかは、その後改善されている。
【００３０】
検出すべき標的ポリヌクレオチドがmRNAである場合、生物学的試料中に含まれるmRNAからcDNAを得るため、本発明によるプライマーを用いた増幅反応を行う前に、または本発明のプローブを用いた検出法を行う前に、逆転写型酵素型の酵素を有利に使用できる。その後、得られたcDNAは、本発明による増幅法または検出法で使用される、プライマーまたはプローブに対する標的として役立つと思われる。
【００３１】
プローブのハイブリダイゼーション法は、種々の方法(Matthewsら、1988)で行うことができる。最も一般的な方法は、種々の組織の細胞からまたは培養細胞から抽出された核酸を、支持体(ニトロセルロース、ナイロンまたはポリスチレンのような)上に固定する段階、および確定した条件下で、固定化された標的核酸をプローブと共にインキュベートする段階である。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去し、形成された雑種分子を適当な方法(プローブに結合している放射能、蛍光または酵素活性を測定すること)により検出する。
【００３２】
本発明による核酸プローブの別の態様によれば、後者は捕捉プローブ(capture probes)として使用することができる。この場合、「捕捉プローブ」と命名されたプローブは支持体上に固定化され、生物学的試料から得られた試験すべき標的核酸を、特異的ハイブリダイゼーションにより、捕捉するために使用され、次いで標的核酸は、容易に検出可能な成分で標識されている「検出プローブ」と命名された第二プローブによって、検出される。
【００３３】
前記の好適な核酸断片の中で、従って特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、その構造が、その標的配列とのハイブリダイゼーションにより、その対応産物の発現を確実に阻害するオリゴヌクレオチド、に言及する必要がある。同じく、その対応産物の発現調節に関与するタンパク質との相互作用により、この発現の阻害または活性化のどちらか一方を誘導する、センスオリゴヌクレオチドにも言及する必要がある。
【００３４】
このようなオリゴヌクレオチドは、アポトーシスのおよび腫瘍抑制の現象を調節する治療薬および医薬品として使用することができる。これらのセンスまたはアンチセンス配列の使用はまた、アポトーシスのモデリングおよび研究の新規手法を明示するために、インビトロで実施することができる。
【００３５】
本発明はまた、以下より選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする、単離されたポリペプチドに関する：
a)配列番号:2の配列のポリペプチド；
b)a)に定義される配列のポリペプチドの変異体であるポリペプチド；
c)a)のポリペプチドとの少なくとも80％の同一性を含む、a)またはb)に定義されるポリペプチドに対する相同ポリペプチド；
d)a)、b)またはc)に定義されるポリペプチドの少なくとも15個の連続したアミノ酸の断片；
e)a)、b)またはc)に定義されるポリペプチドの生物学的に活性な断片。
【００３６】
本発明の目的上、「ポリペプチド」という用語、はタンパク質またはペプチドを示すことを意図する。
【００３７】
「生物学的に活性な断片」という用語は、そのペプチド断片と同じ生物学的活性を有する断片を指すことを意図し、この断片からその活性は好ましくは同じ桁の範囲内(10倍以内)であると推測される。従って、実施例により、TSIP4タンパク質(配列番号:2)がアポトーシス現象に関与する可能性が示される。TSIP4タンパク質の生物学的に活性な断片は従って、配列番号:2に由来するポリペプチドからなり、同じくアポトーシスに関与する。
【００３８】
好ましくは本発明によるポリペプチドは、配列番号:2の配列(TSIP4遺伝子によりコードされるタンパク質に相当)または最適アライメント後、配列番号:2と少なくとも80％の同一性を有する配列からなるポリペプチドである。
【００３９】
ポリヌクレオチドの配列は、最適アライメント後、配列番号:2の配列と少なくとも80％、好ましくは90％もしくは95％、より好ましくは98％、または99％の同一性の割合を示す。
【００４０】
「最適アライメント後、そのアミノ酸が参照配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性の割合を示すポリペプチド」という表現は、参照となるポリペプチドと比較して、特に、1つもしくは複数の欠失および／または切断、伸張、キメラ融合、および／または1つもしくは複数の置換のような、ある種の改変を示すポリペプチドを表すことを意図する。
【００４１】
最適アライメント後、アミノ酸が本発明による、配列番号:2の配列と、またはその断片のうちの1つと、少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは98％の同一性の割合を示すポリペプチドの中で、上記に定義される変異型核酸配列によりコードされる変異型ポリペプチド、特に配列番号:2の配列またはその断片のうちの1つと比較して、アミノ酸配列が特に、切断、欠失、置換に対応する少なくとも1つの変異、および／または少なくとも1つのアミノ酸残基の付加を示すポリペプチド、より好ましくは癌または神経変性疾患のような病的状況に関連する変異を示す変異型ポリペプチドが好ましい。
【００４２】
本発明はまた、本発明による、核酸を含むまたはポリペプチドをコードするクローニングおよび／または発現ベクターに関する。このようなベクターはまた、発現に必要とされる要素、および選択的に、宿主細胞中への／宿主細胞からのポリペプチドの分泌に必要とされる要素を含むことができる。このような宿主細胞はまた、本発明の対象である。
【００４３】
本発明によるプロモーターおよび／または調節配列を含むことを特徴とするベクターはまた、本発明の一部である。
【００４４】
ベクターは好ましくは、プロモーター、翻訳開始および停止シグナル、ならびに転写調節に適した領域を含む。ベクターは細胞中で安定的に維持されることが可能でなければならず、かつそれらは選択的に、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを持つことができる。
【００４５】
これらの種々の制御シグナルは、使用する細胞宿主の機能として選択される。この趣旨で、本発明による核酸配列は、選択した宿主中で自己複製するベクター、または選択した宿主中に組み込むベクター中に挿入することができる。
【００４６】
プラスミドまたはウイルス型の系、ウイルスベクターは、自己複製系の中では宿主細胞に依存して、特に、アデノウイルス(Perricaudetら、1992)、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスもしくはヘルペスウイルス(Epsteinら、1992)において好ましく使用される可能性がある。当業者は、これらの系のそれぞれに対して使用できる方法を認識している。
【００４７】
宿主細胞の染色体への、配列の組込みが望まれる場合、例えば、プラスミドまたはウイルス型の系を使用することができる；このようなウイルスは、例えば、レトロウイルス(Temin、1986)またはAAV(Carter、1993)である。
【００４８】
非ウイルスベクターの中で、VICAL社により開発された手法による、裸のDNAまたは裸のRNAのような裸のポリヌクレオチド、酵母での発現に対しては細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、マウス細胞での発現に対してはマウス人工染色体(MAC)および、好ましくは、ヒト細胞での発現に対してはヒト人工染色体(HAC)が好ましい。
【００４９】
このようなベクターは当業者により共通に使用される方法によって調製され、かつそれにより得られたクローンは、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショック、細胞膜の化学的透過処理後の形質転換、または細胞融合のような標準的方法により、適切な宿主に導入されうる。
【００５０】
本発明にはまた、宿主細胞、特に本発明によるベクターで形質転換した真核または原核細胞、およびその形質転換動物、好ましくは本発明による形質転換細胞の1つを含むヒトを除く哺乳類も含まれる。これらの動物は、炎症および／もしくは免疫疾患、ならびに特に消化管の炎症疾患の病因を研究するための、または癌を研究するための、モデルとして使用することができる。
【００５１】
本発明の目的に使用することができる細胞の中では、細菌細胞(Olins およびLee、1993)だけでなく、酵母細胞(Buckholz、1993)もまた、同じく動物細胞、特に哺乳類の培養細胞(EdwardsおよびAruffo、1993)、特にチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。同じく、昆虫細胞も挙げられ、この細胞では例えば、バキュロウイルス(Luckow、1993)を用いた方法により使用可能である。本発明のタンパク質の発現に対して好ましい細胞宿主は、COS細胞からなる。
【００５２】
本発明による哺乳類の中で、本発明によるポリペプチドを発現している齧歯動物、特にマウス、ラットまたはウサギのような動物が好ましい。
【００５３】
本発明による哺乳類の中では、配列番号:2の配列のタンパク質をコードする遺伝子、またはこれらの動物中の相同遺伝子によりコードされる配列が、機能的でない、ノックアウトされている、または少なくとも1つの突然変異を示すことを特徴とする、マウス、ラットまたはウサギのような動物が好ましい。
【００５４】
これらの形質転換動物は、例えば、胚幹細胞上の相同組換え、これらの幹細胞の胚への導入、生殖系列中で影響を受けたキメラの選別、およびこれらのキメラの発育により得られる。
【００５５】
従って、本発明による形質転換動物は、本発明に基づくタンパク質をコードする遺伝子、もしくはそれらの相同遺伝子を過剰発現することができ、または突然変異が導入されたその遺伝子を発現することができる。これらの形質転換動物、特にマウスは、例えば本質的に偏在性の、もしくは組織種に対して選択性の、強力なプロモーターの制御下にあるこの遺伝子の複製物のトランスフェクションにより、またはウイルスの転写後に得られる。
【００５６】
あるいは、本発明による形質転換動物は、LOXP/CREリコンビナーゼ系(Rohlmannら、1996)、またはこの遺伝子の発現を不活性化する他の系を用いた不活性化により、配列番号:2の配列のポリペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子を欠損され得る。
【００５７】
本発明による細胞および哺乳類は、下記のように、本発明によるポリペプチドを産生するための方法において使用することができ、かつ分析モデルとしても使用することができる。
【００５８】
上記の形質転換された細胞または哺乳類はまた、本発明によるポリペプチドと、本発明によるポリペプチドの活性に直接的にまたは間接的に関与する化合物、またはタンパク質化合物間の相互作用を研究するための、関わりのある種々の機構および相互作用を研究するためのモデルとして使用することができる。
【００５９】
それらは特に、本発明によるポリペプチド、特に配列番号:2の配列のタンパク質、または本発明によるその変異体に、補助因子または阻害因子、特に競合的阻害因子、または本発明によるポリペプチドの活性に関してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するものとして、相互作用する生成物を選択するのに使用することができる。好ましくは、形質転換細胞または形質転換動物は特に、この遺伝子の異常発現に関連する病的状況に対抗する生成物を選択するためのモデルとして使用される。
【００６０】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドと直接的にもしくは間接的に相互作用できる、かつ／またはこれらのポリペプチドの発現もしくは活性を調節できる、化合物または生化学的化合物をスクリーニングするための、本発明による細胞の、哺乳類のまたはポリペプチドの使用に関する。
【００６１】
同様にして、本発明はまた、インビトロまたはインビボで本発明による核酸と相互作用できる化合物をスクリーニングし、本発明による核酸、細胞または哺乳類を使用し、かつその候補化合物と本発明によるその核酸間の複合体形成を検出するための方法に関する。
【００６２】
従って、選択される化合物もまた、本発明の対象である。
【００６３】
本発明によるこのような化合物は、化学構造を有する化合物、脂質、糖、タンパク質、ペプチド、タンパク質-脂質、タンパク質-糖、ペプチド-脂質もしくはペプチド-糖雑種化合物、または化学分岐が付加されたタンパク質もしくはペプチドであってもよい。
【００６４】
想定される化合物の中で、それらは1つまたは複数の環を含んでいてもよく、環は芳香族であってもまたは芳香族でなくてもよく、および任意の種類のいくつかの残基（特に低級アルキル、すなわち1個から6個の炭素原子を示す）でありうる。
【００６５】
本発明はまた、組換え型ポリペプチドを合成するための、本発明による核酸配列の使用に関する。
【００６６】
本発明によるポリペプチドを組換え体として産生するための方法は、それ自体、本発明に含まれるが、形質転換細胞、特に本発明の哺乳類細胞が、本発明による核酸配列によりコードされる組換え型ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養されること、およびこの組換え型ポリペプチドが回収されることを特徴とする。
【００６７】
このような産生方法を用いて得られることを特徴とする組換え型ポリペプチドはまた、本発明の一部である。
【００６８】
上記のように得られた組換え型ポリペプチドは、グリコシル化型でもあり非グリコシル化型でもあってよく、かつその天然の三次構造を示してもまたは示さなくてもよい。
【００６９】
組換え型ポリペプチドの配列はまた、特に水性溶媒中における溶解度を改善するために、改変することができる。
【００７０】
例えば、疎水性領域の除去または疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸による置換のような改変は、当業者に周知である。
【００７１】
これらのポリペプチドは、当業者に周知の、組換え型ポリペプチドの産生法に従い、上記に定義された核酸配列から産生することができる。この場合、使用される核酸配列は、宿主細胞中でその発現を可能とするシグナルの制御下に置かれる。
【００７２】
組換え型ポリペプチドを産生するための効果的な系には、本発明によるベクターおよび宿主細胞が必要となる。
【００７３】
これらの細胞は、上記に定義されるような、ベクター中に挿入された核酸配列を宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクトされた核酸配列の複製および／または発現を可能とする条件下でこの細胞を培養することにより、得られる。
【００７４】
組換え型ポリペプチドの精製に使用される方法は、当業者に周知である。組換え型ポリペプチドは、分画、クロマトグラフィー法、特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いた免疫親和性法等のような方法を、単独でまたは組み合わせて用いることにより、細胞の溶解液および抽出液から、その培地上清から、精製することができる。
【００７５】
本発明によるポリペプチドはまた、多数ある公知のペプチド合成の一つを使用した化学合成、例えば固相を使用した方法(特に、Stewartら、1984を参照)もしくは部分的に固相を使用した方法により、断片縮合により、または溶液中における従来の合成により、得ることができる。
【００７６】
化学合成により得られ、かつポリペプチドおよび対応する非天然型アミノ酸を含むポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００７７】
本発明によるポリペプチドを特異的に認識できることを特徴とする、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらの断片、キメラ抗体、または免疫複合抗体は、本発明の一部である。
【００７８】
特異的ポリクローナル抗体は特に、遺伝子組換えによりまたはペプチド合成により産生される、本発明によるポリペプチドに対して免疫された動物の血清から、通例の手順に従って得ることができる。
【００７９】
本発明による、ある種のポリペプチド、もしくは変異体、またはそれらの免疫原性断片を特異的に認識する抗体の利点が、特に注目される。
【００８０】
配列番号:2の配列のポリペプチドを特異的に認識できることを特徴とする、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらの断片、キメラ抗体、または免疫複合抗体が特に好ましい。
【００８１】
特異的モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein(1975)により説明された、従来のハイブリドーマ培養法により得ることができる。
【００８２】
本発明による抗体は、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、またはFabもしくはF(ab')2断片である。それらはまた、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルを得るため、標識された免疫複合体または抗体の形態でありうる。
【００８３】
本発明はまた、本発明による抗体を使用することを特徴とする、本発明によるポリペプチドを検出するためのおよび／または精製するための方法に関する。
【００８４】
本発明にはまた、本発明による方法を使用して得られることを特徴とする、精製されたポリペプチドが含まれる。
【００８５】
さらに、ポリペプチドを精製するためのそれらの使用のほか、本発明の抗体、特にモノクローナル抗体はまた、生物学的試料中のこれらのポリペプチドを検出するために使用することができる。
【００８６】
従って、それらは本発明によるポリペプチド、特に配列番号:2の配列のポリペプチドまたはその変異体の一つの発現を、特定の組織切片上で、例えば免疫蛍光もしくは金標識により、または酵素免疫複合体を用いて、免疫細胞化学的または免疫組織化学的に分析するための手段を構成することができる。
【００８７】
それらにより特に、組織または生物学的標本中におけるこれらのポリペプチドの異常発現を実証することが可能となる。
【００８８】
より一般的には、本発明の抗体は、本発明による正常型または変異型ポリペプチドの発現が観察されるにちがいない任意の状況で有利に使用できる。
【００８９】
従って、生物学的試料を本発明による抗体と接触させる段階、および形成された抗原-抗体複合体を実証する段階を含む、生物学的試料中の本発明によるポリペプチドを検出するための方法はまた、本発明の対象であり、このような方法を実施するためのキットも同様である。このようなキットは特に、以下を含む：
a)本発明によるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体；
b)選択的に、免疫反応に適した培地を構成する試薬；
c)免疫反応の間に産生される抗原-抗体複合体を検出するための試薬。
【００９０】
TSIP4、PS1、もしくはp53遺伝子、または出願国際公開公報第97/22695号または国際公開公報第00/08147号において、本出願発明者らにより説明されている遺伝子の異常発現が観察される場合、本発明による抗体はまた、ヒトにおいて、神経変性疾患のまたは癌の治療に使用することができる。異常発現とは、過剰発現、過小発現または変異型タンパク質の発現を意味する。
【００９１】
これらの抗体はヒト血清から直接的に得ることができ、または本発明によるポリペプチドで免疫した動物から得ることができ、かつ「ヒト化」され、そのままの状態でまたは上記疾患の治療を目的とした医薬品の調製品として使用することができる。
【００９２】
本発明による核酸配列、ポリペプチド、または抗体を使用することを特徴とする、本発明による遺伝子の、対立遺伝子の変異性、突然変異、欠失、ヘテロ接合性の喪失、または任意の遺伝的異常を検出するための方法はまた、本発明の一部である。
【００９３】
p53誘導型のアポトーシスの間、抑制されているTSIP4遺伝子の配列中の突然変異を検出することは、本発明による核酸および配列(ゲノムDNA、RNAまたはcDNA)の直接的な分析によるだけでなく、本発明によるポリペプチドによっても可能である。特に、突然変異を持つエピトープを認識する本発明による抗体の使用により、「正常な(healthy)」タンパク質と「病的状況に関連する」タンパク質を区別することが可能となる。
【００９４】
従って、TSIP4遺伝子中に観察され得る突然変異の正確な記述により、神経変性疾患および癌、またはアポトーシスを含む任意の疾患に対する分子診断の基礎を形成することが可能となる。遺伝子中の突然変異の探索に基づく、このようなアプローチにより、これらの疾患の診断への寄与が可能となると思われ、かつ選択的に、ある種の補足的な、侵襲的なまたは高額な検査の程度を減らすことが可能となると思われる。本発明は、TSIP4中の突然変異の探索に基づく、このような分子診断の基礎を形成する。
【００９５】
特に、患者由来の生物学的標本を用いて、配列番号:1に相当する遺伝子に相当する核酸配列の全てまたは一部を分析することにより、その遺伝子の、少なくとも1つの突然変異および／または発現の変化、の存在が決定されることを特徴とする、神経変性疾患または癌の診断および／または予後評価の方法が好ましい。
【００９６】
診断および／または予後評価のこの方法は、予防的(神経変性疾患または癌の素因の研究)に、または患者の臨床症状を確立および／または確認する際に役立てるために使用することができる。
【００９７】
好ましくは、神経変性疾患はアルツハイマー病である。
【００９８】
分析は、遺伝子の全てまたは一部を配列決定することにより、または当業者に周知の他の方法により行うことができる。PCRに基づく方法、例えば、点突然変異の検出を可能とするPCR-SSCPを特に使用できる。
【００９９】
分析はまた、配列番号:1の配列の1つに相当する本発明によるプローブの、DNAチップへの付着、およびこれらのマイクロプレート上におけるハイブリダイゼーションにより行うことができる。本発明による配列を含むDNAチップはまた、本発明の対象の一つである。
【０１００】
同様にして、本発明によるアミノ酸配列を含むタンパク質チップもまた、本発明の対象である。このようなタンパク質チップにより、本発明による前記ポリペプチドと他のタンパク質または化合物間の相互作用を調べることが可能となり、従って、本発明によるポリペプチドと相互作用する化合物のスクリーニングに有益である。本発明によるタンパク質チップはまた、患者血清中の、本発明によるポリペプチドに対する抗体の存在を検出するために使用することができる。本発明による抗体を含むタンパク質チップもまた、使用することができる。
【０１０１】
当業者にはまた、例えばmRNAを調べることによる(特に、本発明のプローブまたはプライマーを用いたノーザンブロッティング実験、またはRT-PCR実験による)、または発現したタンパク質を調べることによる、特に本発明の抗体を用いたウェスタンブロッティングによる、遺伝子発現の変化を調べるための方法の使用法は公知である。
【０１０２】
本発明はまた、以下の段階を含む、検出可能な表現型に関連したTSIP4遺伝子の対立遺伝子を得るための方法に関する：
a)検出可能な表現型を発現している個体から核酸試料を得る段階；
b)核酸試料を、TSIP4タンパク質をコードする核酸を特異的に検出できる作用物質と接触させる段階；
c)TSIP4タンパク質をコードする核酸を単離する段階。
【０１０３】
このような方法の後に、TSIP4タンパク質をコードする核酸の全てまたは一部を配列決定することができ、これにより神経変性疾患に対するまたは癌に対する感受性を予測することが可能となる。
【０１０４】
TSIP4タンパク質をコードする核酸を特異的に検出できる作用物質としては、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブが有利であり、これはDNA、RNAまたはPNAからなることができ、修飾されていてもまたはされていなくてもよい。修飾は、放射能標識もしくは蛍光標識を含んでもよく、または塩基間結合中の修飾(例えば、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネート)に起因してもよい。当業者は、特異的DNA配列を単離するための手順を知っている。上述の方法の段階b)はまた、以前に説明されているような増幅段階であってもよい。
【０１０５】
本発明はまた、生物学的試料中の、本発明による核酸を検出および／またはアッセイするための方法に関し、本発明によるプローブを生物学的試料と接触させる段階、ならびにポリヌクレオチドと生物学的試料の核酸との間で形成される雑種を検出および／またはアッセイする段階を含む。
【０１０６】
当業者はこのような方法を実施するための方法を知っており、特に以下を含み、また本発明の対象である試薬キットを使用することができる：
a)プローブとして使用される、本発明によるポリヌクレオチド；
b)このプローブと生物学的試料の核酸間のハイブリダイゼーション反応を行うために必要な試薬；
c)プローブと生物学的試料の核酸間で形成される、雑種を検出および／またはアッセイするために必要な試薬。
【０１０７】
このようなキットはまた、得られた結果の質を確実にするため、陽性または陰性対照を含むことができる。
【０１０８】
しかし、本発明による核酸を検出および／またはアッセイするため、当業者はまた、本発明による配列より選択されるプライマーを用いて、増幅段階を行ってもよい。
【０１０９】
最後に本発明はまた、特に配列番号:1に相当する遺伝子の少なくとも1つの変異の存在に関連する、および／または配列番号:2に相当するタンパク質の異常発現に関連する、神経変性疾患または癌を予防および／または治療するための医薬品としての、本発明による核酸、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞もしくは抗体より選択される化合物、または本発明によるスクリーニング法を用いて得られる化合物に関する。
【０１１０】
本発明はまた、p53カスケードに介入することができ、従って腫瘍復帰変異および／またはアポトーシスを誘導できるか、または逆にアポトーシス現象を減らすことができる生成物を、スクリーニングして同定するための方法に関する。
【０１１１】
本発明のこの側面は、本発明の対象であるTSIP4タンパク質が、特許出願国際公開公報第97/22695号に記載のTSIP2タンパク質と結合し、アルツハイマー病におけるその役割が報告されているという事実に基づいている。
【０１１２】
第一の態様として、本発明は以下の段階を有する、TSIP4のTSIP2への結合を妨害し、減少させるかまたは阻害する化合物をスクリーニングする、選択する、または同定するための方法に向けられる：
a)化合物を、TSIP4とTSIP2間の結合をインビトロで決定するための系と接触させる段階；
b)TSIP4とTSIP2間の結合の減少および／または阻害を同定する段階。
【０１１３】
本発明の対象はまた、特に腫瘍抑制および／または細胞死(アポトーシス)を、減少させるおよび／または阻害するための化合物をスクリーニングする、選択する、または同定するための、以下の段階を有する方法である：
a)化合物を、TSIP4とTSIP2間の結合をインビトロで決定するための系と接触させる段階；
b)TSIP4とTSIP2間の結合の減少および／または阻害を誘導する化合物を同定する段階；
c)アポトーシスおよび／または腫瘍抑制の現象を測定するためのモデルにおいて、段階b)で同定される化合物を調べる段階；
d)このモデル中における腫瘍抑制および／または細胞死の減少および／または阻害を、化合物を接触させていない対照モデルと比較して同定する段階。
【０１１４】
アポトーシスおよび／または腫瘍抑制を調べる／測定するための、幾つかのモデルが既に説明されており、特にTellermanら(1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90、8702-6)、Amsonら(1996、Proc. Natl. Acad. SCI; USA、93、3953-7)またはNemaniら(1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93、9039-42)により記載されたインビトロのモデルからなる。
【０１１５】
腫瘍抑制および／または細胞死(アポトーシス)を増大することができる化合物を決定するため、本発明による種々の方法を組み合わせることもまた、可能である。従って特に、以下の段階を有する、腫瘍抑制および／または細胞死(アポトーシス)において、その機能が増大している化合物をスクリーニングする、選択する、または同定する方法を得ることが可能である：
a)化合物を、TSIP4とTSIP2間の結合をインビトロで決定するための系と接触させる段階；
b)TSIP4とTSIP2間の結合の減少および／または阻害を誘導する化合物を同定する段階；
c)段階b)で選択された化合物を、アポトーシスおよび／または腫瘍抑制の現象を測定するためのモデルにおいて接触させる段階；
d)このモデルにおける腫瘍抑制および／または細胞死の増加を、化合物を接触させていない対照モデルと比較して同定する段階。
【０１１６】
従って、このような方法はまた、本発明の対象である。
【０１１７】
従って本発明は、TSIP4およびTSIP2タンパク質が互いに結合できるという事実を利用するものである。それ故、もう一方のタンパク質と効果的に接触する、各タンパク質の領域を同定するのが有利である。結果として、これにより、完全なタンパク質に対するデコイまたはアゴニストとして同定されたペプチドを利用できるはずである。従って、これにより、TSIP4-TSIP2結合を妨げると考えられ、かつ腫瘍抑制および／もしくはアポトーシスを誘導するか、または逆にこれらの現象を減少させる可能性のある化合物を規定することができるかもしれない。
【０１１８】
より一般的には、以下の段階を含む方法を用い、本発明によりTSIP2タンパク質との結合に関与するTSIP4の領域を同定することが可能となる：
a)TSIP4タンパク質由来のペプチドを、TSIP4とTSIP2間の結合をインビトロで決定するための系と接触させる段階；
b)この系において、TSIP4とTSIP2間の結合の減少を引き起こすペプチドを同定する段階。
【０１１９】
本発明によりまた、上述の方法に類似した方法に従って、TSIP4との結合に関与するTSIP2の領域を決定できること、および腫瘍抑制および／またはアポトーシスを減少させることを意図する場合、これらの領域は特に、デコイとして使用できることは明らかである。
【０１２０】
タンパク質の「領域」という用語は特に、タンパク質の一次配列由来の一次配列からなるペプチドを示すことを意図する。
【０１２１】
こうして同定されたこれらの領域は、腫瘍抑制および／またはアポトーシスの調節に関するそれらの特性に関して、上述の生成物と同様に試験することができる。
【０１２２】
従って本発明により、TSIP4-TSIP2結合と相互作用することを可能とし、それ故、アポトーシスおよび／または腫瘍抑制の調節において価値がある可能性のある生成物を同定することが可能となる。しかしこれらの生成物は、特に癌または神経変性疾患における治療上の処置に対して使用することを可能にするために、より高い活性および／またはより少ない毒性を有することを目的とした、最適化が必要となる。
【０１２３】
特に、医薬品の開発は多くの場合、以下の方針に従って行われる：
-適した方法を用いて所望の活性を有する化合物をスクリーニングすること、
-「規格」を満足する化合物を選択すること、
-選択された化合物の構造(特に、もしそれらがペプチドならばその配列(選択的に３次配列)、もしそれらが化合物ならば化学式およびバックボーン)を決定すること、
-その構造の修飾により(例えば、立体化学的配座の変更(例えば、ペプチド中のアミノ酸について、L体からD体への交換)、ペプチドまたは化学バックボーンへの置換基の付加により、特にバックボーン上への残基の接合、ペプチドの修飾(特に、Gante(「Angewandte Chemie-International Edition Engl.」 1994、33. 1699-1720中の「ペプチド模倣体（Peptidemimetics）」)を参照)により)、選択された化合物を最適化すること、
-こうして得られた化合物を、調べる病変に近いモデルであることが多い、適したモデルにて通過させ(passing)スクリーングすること。この段階では動物モデルは、一般的には齧歯類(マウス、ラット等)またはイヌ、または霊長類においてさえも、特によく使用される。
【０１２４】
使用することができる動物モデルは、例えば癌に対しては、免疫抑制マウスに基づいたモデル(例えば、scid/scid)であり、そのマウスには腫瘍の発達を引き起こすと思われる腫瘍細胞を注入する(特に皮下に)。潜在的抗腫瘍化合物の効果は、例えば形成されたその腫瘍の大きさを測定することにより調べられる。
【０１２５】
神経変性疾患を調べるために、Amsonらにより説明された(2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、97、5346-50)、p53欠損マウスからなるモデル、またはChenら、Janusら、およびMorganら(2000、Nature、408pp. 975-985)に説明されたモデルを使用することができる。
【０１２６】
従って、本発明の目的は特に、腫瘍抑制および／またはアポトーシスを増大させる活性を有するという点で、癌の治療に使用できる可能性のある化合物を同定可能とすることである。本発明の対象の一つは従って、以下の段階を含む方法である：
a)腫瘍抑制および／またはアポトーシスを増大させる特定の活性を有する化合物を同定するために、本発明による方法を実施する段階、
b)段階a)で選択された生成物を修飾する段階、
c)段階b)で修飾された生成物を、腫瘍抑制および／またはアポトーシスの関連モデルについて、インビトロおよび／またはインビボ法で試験する段階、
d)段階a)で選択された生成物に関して得られた活性よりも高い、腫瘍抑制および／またはアポトーシス活性が得られる生成物を同定する段階。
段階d)は、段階d')で置き換えられ、これは以下の通りである：
d') (段階c)で使用されるモデルのうちの1つがインビボである場合)ある動物モデルにおいて毒性がより少なく、所望の生物学的効果が得られる生成物を同定する段階。
【０１２７】
試験がアポトーシスまたは腫瘍抑制のインビトロのモデルに関して行われる場合、例えばTellermanら(1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90、8702-6)により説明されているモデルK256/KSを使用できる。また、Amsonら(1996、Proc. Natl. Acad. SCI; USA、93、3953-7)により説明されているM1-LTR細胞、またはNemaniら(1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93、9039-42)により説明されているU937/US3-US4細胞を使用することができる。
【０１２８】
インビボ試験は、これらの細胞を動物、特に免疫抑制マウスに注入し、試験する種々の化合物の効果を調べることにより行うことができる。
【０１２９】
当業者は、このように同定された生成物により提供される恩典に関して、規制要件(特に、毒物性に関して)に従い、医薬品として使用できる生成物を同定するために必要な、条件および閾値を明確にすることができると思われる。
【０１３０】
同様に、本発明はまた、上述の方法を用いて同定された、腫瘍抑制および／またはアポトーシスを抑制する生成物を最適化するための方法に関し、かつこれにより医薬品として使用できる生成物を同定することが可能となる。
【０１３１】
従って、本発明はまた、以下の段階を含むことを特徴とする、腫瘍抑制および／またはアポトーシスを、減少させるおよび／または阻害する活性を有する生成物を同定するための方法に関する：
a)腫瘍抑制および／またはアポトーシスを減少させる特定の活性を有する化合物を同定するために、本発明による方法を実施する段階、
b)特に、その化学バックボーン上への残基の接合により、段階a)で選択された生成物を修飾する段階、
c)段階b)で修飾された生成物を、腫瘍抑制および／またはアポトーシスの関連モデルについて、インビトロおよび／またはインビボ法で試験する段階、
d)段階a)で選択された生成物に関して得られた活性と比較して、低下した腫瘍抑制および／またはアポトーシス活性が得られる生成物を同定する段階。
段階d)はまた、段階d')で置き換えられ、これは以下の通りである：
d') (段階c)で使用されるモデルのうちの1つがインビボである場合)ある動物モデルにおいて毒性がより少なく、所望の生物学的効果が得られる生成物を同定する段階。
【０１３２】
実際に、これにはまた、(生物学的活性および臨床効果)／(使用に対する潜在的危険性)の最良比率を示す、生成物が得られることが含まれる。
【０１３３】
これらの結果を得るために利用されるパラメーターは全て公知であり、かつ新規医薬品の開発を望む当業者の範囲内であり、かつ例えば、l'Agence du Medicament[フランス薬品局]、欧州委員会または連邦医薬品庁(Federal Drug Agency)のような組織における指令に見出される。
【０１３４】
本発明による方法の使用には、TSIP4とTSIP2間の結合を決定できるモデル、および真核細胞中のTSIP2またはp53タンパク質量の増加または減少の簡易測定が必要となる。
【０１３５】
TSIP2またはp53タンパク質の量は、ウェスタンブロッティングにより調べることができ、このタンパク質に対する抗体を用いて明らかにされる。p53に対するこのような抗体は特に、整理番号OP09Lにて、Calbiochem社に見出される。
【０１３６】
哺乳類細胞に関する研究およびスクリーニングを必要とする、本発明による方法を実施するため、これらの細胞中のTSIP4、TSIP2およびp53タンパク質のうちの一つ、それらのうち2つ、または3つ全てを一度に過剰発現するのが有利でありうる。
【０１３７】
このように、TSIP2またはp53タンパク質量の変化を調べることは、特に、スクリーニングが望まれる化合物が添加されていない細胞に対して、同一細胞を用いて関心対象の化合物を試験した細胞を比較することにより、より容易である。
【０１３８】
2つのタンパク質TSIP4およびTSIP2、ならびにp53の発現は、これらのタンパク質をコードする遺伝子(特にcDNA)の細胞への導入により、ベクター上に配置されるかまたは染色体への導入により、増加することができると理解される。
【０１３９】
エピソーム型発現を選択する場合、該哺乳類細胞を、TSIP4をコードするDNA断片を有するベクター、TSIP2をコードするDNA断片を有するベクター、p53をコードするDNA断片を有するベクター、およびこれらのタンパク質のうち1つより多くをコードするDNA断片を有するベクターより選択される、少なくとも1つのベクターでトランスフェクトする。従って、同一ベクターは全タンパク質を発現することができる；或いは、幾つかのベクターを導入することが可能である。
【０１４０】
例えば原核細胞(大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）等)もしくは真核細胞(サッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）等のような酵母)、哺乳類細胞(HeLa、Cos、Hep-2等)または昆虫細胞(バキュロウイルス系を用いる)において、TSIP4およびTSIP2タンパク質の発現および簡便な精製を可能とするベクターを使用することができる。従って、精製を容易にするため、タンパク質はそのN末端またはC末端にタグを有するのが有利かもしれない。ヒスチジンまたはGSTタグが特に選択される。これらの方法は当業者に周知であり、当業者はStratagene社のような企業のカタログ中で適切なプラスミドを見つける。
【０１４１】
TSIP2とTSIP4間の結合について調べるため、本発明による方法をインビトロのモデルで実施する場合、その手順を実行するための幾つかの方法がある。
【０１４２】
使用できる手順は下記の通りでありうる：
-例えば原核細胞(大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）等)もしくは真核細胞(サッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）等のような酵母)、哺乳類細胞(HeLa、Cos、Hep-2等)または昆虫細胞(バキュロウイルス系を用いる)における、TSIP4およびTSIP2タンパク質の発現および精製。精製を容易にするため、タンパク質はそのN末端またはC末端にタグを有するのが有利かもしれない。ヒスチジンまたはGSTタグが特に選択される。これらの方法は当業者に周知であり、当業者はStratagene社のような企業のカタログ中で適切なプラスミドを見つける；
-適したビーズへのタンパク質の結合。GSTタグを使用する場合、発現したタンパク質はグルタチオンセファロースビーズに結合する；
-インビトロ翻訳によるタンパク質の調製。これは市販されているベクター(例えば、プロメガ社から入手可能)を用いて容易に行うことができる。このベクターにより、市販されているキットを用い、そのメーカーの使用説明書に従って、周知のプロモーター(T7またはT3)の制御下でcDNAをクローンニングし、RNAを産生させるために適したRNAポリメラーゼを使用し、次いでインビトロでタンパク質の発現を達成することが可能となる；
-インビトロ翻訳により得られるタンパク質を、GSTと融合したタンパク質が付着するセファロース-グルタチオンビーズに添加することによる、タンパク質の共沈。十分な時間、接触させた後、ビーズを洗浄し、SDS-PAGEゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより解析を行う。2つのタンパク質に相当するバンドの出現により、それらのタンパク質が結合していることが明確に示される。
【０１４３】
従って、適した対照の使用により、TSIP4およびTSIP2間の結合の減少および／または阻害を明確にでき、これは共沈段階の際に、試験化合物の添加後に解離したタンパク質量を、対照中で解離したタンパク質量と比較することによる。
【０１４４】
同様にして、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)系を用いてタンパク質の結合を調べることも可能であり、それは適した残基で各タンパク質を標識することにあり、前記2つのタンパク質の結合は、前記2つの各残基間の反応および容易に検出可能な蛍光の発光を誘導する。
【０１４５】
本発明の対象はまた、本発明による方法を用いて得られる化合物であり、特に腫瘍抑制および／またはアポトーシスを増大させる活性を有する化合物、TSIP4-TSIP2結合を阻害する活性を有する化合物、ならびに同じく腫瘍抑制および／またはアポトーシスを減少させるおよび／または阻害する活性を有する化合物である。
【０１４６】
本発明はまた、TSIP2タンパク質と相互作用するTSIP4の領域に相当するそのペプチド配列に関し、これは特に、本発明による方法を用いて同定することができる。
【０１４７】
本発明はまた、TSIP4タンパク質と相互作用するTSIP2の領域に相当するペプチド配列に関し、これは特に、本発明による方法を用いて同定することができ、この方法により特に、上述にて明らかにされたインビトロ手順を適応することにより、TSIP4と相互作用するTSIP2のペプチド配列を決定するために適応する可能性がある、TSIP2と相互作用するTSIP4のペプチド配列を同定することが可能になる。
【０１４８】
本発明はまた、このように同定されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に関する。
【０１４９】
「ペプチド配列」または「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」(後者2つの用語は、差別なく使用される)という用語は、単離された、すなわち、それらが天然の状態ではない配列を表すことは明らかであり、それは特に、それらの塩基単位を非天然型単位で置換することにより、または塩基単位間の結合を修飾(例えば、ホスホロチオエート(核酸)またはペプチド核酸)により修飾することができる。
【０１５０】
本発明の目的は、TSIP4およびTSIP2結合を妨害する化合物、特にp53カスケードへの作用を誘導する可能性のある、これらの化合物の幾つかの同定を可能にすることである。従って、本発明による化合物、本発明によるペプチド配列、または本発明によるヌクレオチド配列はまた、医薬品として、本発明の対象である。
【０１５１】
本発明による方法を用いて同定された化合物は、ある化学構造を有する化合物、脂質、糖、タンパク質、ペプチド、タンパク質-脂質、タンパク質-糖、ペプチド-脂質もしくはペプチド-糖雑種化合物、または化学分岐が付加されたタンパク質もしくはペプチドであってもよい。
【０１５２】
想定される化合物の中で、それらは1つまたは複数(特に、2つまたは3つ)の環を含み、これは芳香族であっても芳香族でなくてもよく、3個から8個の炭素原子を有し、かつ任意の種類のいくつかの残基(特に、低級アルキル、すなわち、1個から6個の炭素原子を示す)を含んでいてもよい。
【０１５３】
これらの化合物、核酸配列およびペプチド配列は従って、そのプロ-または抗-アポトーシス／腫瘍復帰変異作用によって、特に癌または神経変性疾患の治療を目的とした医薬品を調製するために使用することができる。
【０１５４】
本出願の発明者らは、まず初めに、TSIP4タンパク質はTSIP2タンパク質に結合するという事実を証明した。従って本発明はまた、TSIP4タンパク質およびTSIP2タンパク質からなる複合体に関する。
【０１５５】
本発明はまた、以下の段階を含む、細胞中におけるTSIP4のTSIP2への結合を阻害するための方法に関する：
a)細胞を、本発明による方法を用いて同定されたTSIP4-TSIP2結合を阻害する化合物と接触させる段階。
【０１５６】
このように想定される化合物はまた、TSIP4タンパク質由来の、またはTSIP2タンパク質由来の、「デコイ」ペプチドとすることもできる。この方法はインビトロまたはインビボで実施することができる。
【０１５７】
本発明はまた、本発明により同定された、アポトーシスおよび／または腫瘍復帰変異を増大させる化合物を患者に投与することを特徴とする、癌の治療のための方法にも向けられる。
【０１５８】
アポトーシスを減少させるまたは阻害する、本発明による化合物を、患者に投与する段階からなる神経変性疾患の治療のための方法もまた、本発明の対象である。
【０１５９】
以下の実施例は、本発明の利点をより明確に理解することを可能とするものであり、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【０１６０】
実施例
実施例1：TSIP4およびTSIP2の結合
TSIP4およびTSIP2間に存在する結合は、ベイト としてプレセニリン1(TSIP2)およびプレイとしてTSIP4を用いる、FinleyおよびBrentにより開発された系(「DNA Cloning, Expression Systems: a practical Approach」におけるInteraction trap cloning with yeast、169-203、1995、Oxford Universal Press、Oxford)に由来するダブルハイブリッド系(double-hybrid system)において観察された。
【０１６１】
TSIP2遺伝子(cDNA)は、その適用が当業者に周知であるプラスミドpEG202にクローニングした(Promoter 67-1511、lexA 1538-2227、ADH Ter 2209-2522、pBR remnants 2540-2889、2μ ori 2890-4785、YSCNFLP 4923-5729、HIS3 7190-5699、TYIB 7243-7707、RAF_part 7635-7976、backbone pBR 7995-10166、bla 8131-8988)。
【０１６２】
TSIP4遺伝子(cDNA)は、同様に当業者に周知のプラスミドpJG4-5にクローンニングした(Promoter GAL 1-528、fusion cassette 528-849、ADH Ter 867-1315、2μ ori 1371-3365、TRP1 3365-4250、backbone pUC 4264-6422、Ap 4412-5274)。
【０１６３】
当業者に周知のレポータープラスミドpSH18-34もまた、使用する。このプラスミドは、特に整理番号V611-20としてInvitrogen社から入手可能であり、同様に既にEGY48株(RFY231とも呼ばれる)に形質転換されたものが、同一業者から入手可能である(参照株のみ：C835-00、pSH18-34で形質転換：C836-00)。
【０１６４】
結合は酵母菌株RFY231において実証された(Finley Jrら，1998、Proc Natl Acad Sci USA、95 14266-71に記載)。この酵母菌株は遺伝子型(MATα trp1Δ::hisG his3 ura3-1 leu2::3Lexop-LEU2)を有し、EGY48に由来する(Gurisら、1993、Cell、75、791-803)。
【０１６５】
レポーター遺伝子はLacZ遺伝子とした。
【０１６６】
研究はガラクトースを含有し、ロイシンを含有しない培地上で行い、これらのディッシュ上の着色したコロニーの存在を調べた。
【０１６７】
このように、TSIP2タンパク質はTSIP4タンパク質に結合すること、およびこの結合はTSIP2タンパク質の204個の C末端アミノ酸上で起こることを示すことができた。
【０１６８】
実施例2：TSIP4タンパク質の解析
TSIP4タンパク質には2つの代替的な形態があり、一方は配列番号:1によりコードされる配列番号:2に相当し、もう一方は配列番号:1の塩基592位から1200位によりコードされる配列番号:2のアミノ酸198位から400位に相当することは明らかである。推定上のシグナルペプチドは配列番号:2のアミノ酸198位から243位(配列番号:1の塩基592位から729位)に相当する。
【０１６９】
上述の配列はまた、本発明の対象である。
【０１７０】
(完全な)TSIP4タンパク質は4つの予測される膜貫通ドメイン(アミノ酸224位から244位、260位から280位、320位から340位、および350位から370位)を有し、そのN末端およびC末端は細胞質に位置している。これらの膜貫通ドメイン、およびまたはその細胞内または細胞外ドメインもまた、本発明の対象であり、それらをコードする配列も同様である。
【０１７１】
実施例3：TSIP4タンパク質の発現
種々のヒト組織のノーザンブロットの、TSIP4の一部の配列に相当するプローブとのハイブリダイゼーションにより、2つの転写産物(約1.8kbおよび6kb)の存在が示される。そのmRNAは主に、心臓、骨格筋および脳で認められる。より少量ではあるが、胎盤、膵臓および腎臓にも存在している。その発現は肺では非常に低く、肝臓には実質的に存在していない(図1)。
【０１７２】
実施例4：K562/KS系におけるTSIP4の示差発現
ノーザンブロットの、TSIP4プローブとのハイブリダイゼーションにより、K562細胞株と比較してシグナルの低下が明らかとなったが、対照のGAPDHプローブでは同程度のシグナルが得られる(図2)。K562/KSモデルはTelermanらにより説明された(1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90、8702-6)。
【０１７３】
TSIP4タンパク質は従って、腫瘍抑制モデルで抑制される。
【０１７４】
実施例5：GST融合タンパク質の発現
GST融合タンパク質を得るため、下記の手順に従うことができる：
【０１７５】
アンピシリン100μg/mlを添加したSB培地中、37℃にて、プラスミドpGEX-P-1-TSIP4またはpGEX-P-1-TSIP2で形質転換した、BL21(DE3)の単一コロニーに由来する前培養を調製。
【０１７６】
前記プラスミドはAmersham Pharmacia Biotech AB社から入手可能である。
【０１７７】
タンパク質は配列番号:1(TSIP4)の配列およびTSIP2の完全な配列(GenBank U50957)に相当する、相補的なcDNAによりコードされる、ヒトタンパク質である。
【０１７８】
翌日、前記の前培養液5mlをSB + Amp 250mlに植菌する。
【０１７９】
増殖は光学濃度が0.5から0.7に達するまで、宿主細菌に対するタンパク質の毒性により、28℃または37℃で行う。
【０１８０】
タンパク質の合成を誘導するため、0.1mM IPTGを添加する。
【０１８１】
増殖は28℃または37℃にて、1時間または1時間30分とする。
【０１８２】
遠心を3000rpmで10分間(1800 g、4℃)行う。
【０１８３】
沈殿物を緩衝液A NP40(1％ NP40; 10mM Tris、pH 7.4; 150mM NaCl; 1mM EDTA; 10％ グリセロール; 1mM DTT; 2μg/ml アプロチニン; 2μg/ml ロイペプチン; 2μg/ml ペプスタチン; 1mM AEBSF) 10mlに再懸濁する。
【０１８４】
氷上で、出力50にて15秒間の超音波処理を3回行う。
【０１８５】
遠心を12000rpmで10分間(18000 g、4℃)行う。
【０１８６】
その上清は-80℃で保管する。
【０１８７】
実施例6:融合タンパク質のセファロース-グルタチオンビーズへの吸着に関して次に行うべき手順
上清2mlにビーズ(PBSで3回すすぎ、緩衝液A NP40で1回すすいだ後、緩衝液A NP40中で50％(w/v)で懸濁、毎回、3000rpmにて遠心後、調製)200μlを添加する。
【０１８８】
グルタチオン-セファロース4B ビーズはAmersham Pharmacia Biotech AB社から、番号17.0756.01.として入手可能である。
【０１８９】
4℃で少なくとも1時間、穏やかに混合する。
【０１９０】
タンパク質分解酵素阻害剤の添加されていない緩衝液A NP40中で、ビーズを3回すすぐ。
【０１９１】
タンパク質分解酵素阻害剤を添加した緩衝液A NP40 1mlに、前記ビーズを懸濁する。
【０１９２】
SDS-PAGE電気泳動による解析のため、20μlから40μlの懸濁したビーズ試料を分取し、5分間遠心する。上清を捨て、ビーズを添加緩衝液X 10μlに懸濁し、97℃で7分間、加熱する。使用する融合タンパク質の量を標準化するため、ゲルにロードし、クーマシーブルーによる暴露後に解析する。
【０１９３】
実施例7:インビトロタンパク質翻訳に関する手順
Promega社が提供しているTNT結合網状赤血球可溶化液系(TNT Coupled Reticulocyte Lysate System)キットは、タンパク質を翻訳および発現するために使用されるベクターに応じて、T7またはT3 RNAポリメラーゼを用いて使用される(AIPIおよびTSIP4に対してはT7、TSIP2に対してはT3)。このキットは製造業者の使用説明書に従って使用する(整理番号L4610)。
【０１９４】
タンパク質はS35-メチオニン(Amersham Pharmacia社)を取り込む。
【０１９５】
インビトロで得られる産物を、SDS-PAGE電気泳動により解析する。
【０１９６】
電気泳動後、ゲルを固定緩衝液(5％メタノール、15％酢酸、80％水)中に、30分間放置する。シグナルは、ゲルをAmersham Pharmacia社由来の増幅製品(整理番号：NAMP100)に浸漬することにより増幅される。
【０１９７】
その後、Kodak Biomax MRフィルムに乾燥させたゲルを接触させて1時間から1週間露光させ、次いで現像する。
【０１９８】
実施例8:タンパク質の共沈に関する手順
GST融合タンパク質に結合したセファロース-グルタチオンビーズ 30μlを、その量を標準化した後、緩衝液B(1％ NP40、50mM Tris-HCl、150mM NaCl、2μg/ml ロイペプチン、1％ アプロチニン、1mM ABESF)ですすぐ。次いで、実施例3で得られるインビトロ翻訳産物を、オートラジオグラフィーで観察されるその産物量に応じ、5μから10μl添加する。
【０１９９】
一晩、接触させた後、ビーズを抗タンパク質分解酵素の添加されていない緩衝液A NP40で10回すすぐ。
【０２００】
SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより解析を行う。
【０２０１】
このように、TSIP4およびTSIP2タンパク質間の結合を明らかにすることが可能である。
【０２０２】
実施例9:TSIP4-TSIP2結合を妨害する化合物のスクリーニング手順
実施例5から8に記載のアッセイを行い、実施例8の段階に、調べたい化合物を添加し、化合物を添加していない場合に得られる結果との比較を行う。
【０２０３】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】種々の組織中におけるTSIP4 mRNAの記載。
【図２】K562／KS系におけるTSIP4の示差発現。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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2004526428.tif 000007
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【国際調査報告】
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