(57)【要約】本発明は、ＤＮＡ複製の工程に関与する細菌遺伝子及びタンパク質、及びＤＮＡ複製に包含される細菌タンパク質と相互作用するバクテリオファージ遺伝子及びそれらのタンパク質生成物に関する。より特定には、本発明は、必須スタフィロコッカス・アウレウス遺伝子及びそのコードされるタンパク質ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９を包含する組成物及び方法に関する。さらに、本発明は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のレベル及び／又は活性を調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、及びそのような化合物にも関する。
2004515251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリオファージポリペプチド配列に対して特異的に結合する、配列番号６のアミノ酸配列、又はその生物学的に活性な変異体を含んで成る生物学的に活性なＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性な化合物の同定方法であって、
候補体化合物とＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドとを接触せしめ、そして
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドへの前記化合物の結合、及びその生物学的活性の１つを検出することを含んで成り、ここで前記候補体化合物の不在下での前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドへの化合物の前記結合、又は前記生物学的活性に対しての、前記候補体化合物の存在下での前記生物学的活性の低下が、前記前記候補体化合物がＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性である化合物であることを示す、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドが、前記バクテリオファージポリペプチド配列と同時に接触せしめられる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記結合、又は前記生物学的活性の低下が、前記候補体化合物の存在又は不在下で行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記バクテリオファージポリペプチド配列が、
ａ）配列番号４；及び
ｂ）配列番号６と特異的に結合するａ）のフラグメント又は変異体から成る群から選択される請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記検出が、前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドへの、直接的に又は間接的に検出できるようラベルされている候補体化合物の結合を測定することを含んで成る請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、及びそれと特異的に結合するバクテリオファージポリペプチドの１つに対して活性な化合物の同定の方法であって、
配列番号６のアミノ酸配列、又はその変異体を含んで成る前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、及び
ａ）配列番号４；及び
ｂ）その生物学的活性を維持する、ａ）のフラグメント又は変異体から成る群から選択される前記バクテリオファージポリペプチドと、候補体化合物とを接触せしめ；そして
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド及び／又は前記バクテリオファージポリペプチドの生物学的活性を検出することを含んで成り、
ここで前記候補体化合物の存在下でのその生物学的活性低下が、前記候補体化合物が前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び／又はバクテリオファージポリペプチドの１つの対して活性である化合物であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項７】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に対して活性な化合物を同定する請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記検出が、前記バクテリオファージポリペプチドへの前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの結合を測定する作用を含んで成り、ここで前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又は前記バクテリオファージポリペプチドが直接的に又は間接的に検出できるようラベルされている請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
生物学的に活性なＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性である化合物の同定方法であって、
候補体化合物と、配列番号６のアミノ酸、又はバクテリオファージポリペプチド配列に対して特異的に結合できるその生物学的活性フラグメントを含んで成る前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを発現する細胞とを接触せしめ、そして
前記細胞におけるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性を検出するこことを含んで成り、ここで前記候補体化合物の存在下での前記細胞における前記活性の低下が前記化合物によるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性の阻害を示すことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法により同定される、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はそのフラグメント、又は前記ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸分子の活性のアゴニスト又はアンタゴニスト。
【請求項１１】
前記検出が、時間−決定された蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＴＲ−ＦＲＥＴ）による測定を含んで成る請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記の検出が、蛍光偏光変化の測定を含む請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記の検出が、表層プラスモン共鳴による測定を含む請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記の検出が、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイによる測定を含む請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記の検出が、バイオセンサー・アッセイを含む請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記検出が、ファージ・ディスプレイによる測定を含む請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
抗菌化合物の製造方法であって、
ａ）配列番号２；
ｂ）バクテリオファージポリペプチド配列に対して特異的に結合できるａ）の生物学的活性フラグメント又は変異体；
ｃ）配列番号；及び
ｄ）バクテリオファージポリペプチド配列に対して特異的に結合できるｃ）の生物学的活性変異体又はそのフラグメントから選択されたアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに対して活性な化合物を同定し；そして
前記ポリペプチド又はそれをコードする核酸を天然に生成する細菌により感染された生物に投与される場合、治療効果を表すのに十分な量の前記候補体化合物を合成し又は精製することを含んで成る方法。
【請求項１８】
細菌の阻害方法であって、前記細菌と、ａ）配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体を含んで成るＳ．アウレウスポリペプチド；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体を含んで成るＳ．アウレウスポリペプチド；及びｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドをコードする核酸の１つに対して活性な化合物とを接触せしめることを含んで成り、ここで前記フラグメント又は変異体がバクテリオファージＯＲＦに結合するその生物学的活性を保持することを特徴とする方法。
【請求項１９】
感染による被害を受けているか又はその危険性を有する動物における細胞感染を処理するか又は予防するための方法であって、ａ）配列番号２、そのフラグメント又は変異体；ｂ）配列番号６、そのフラグメント又は変異体の１つのアミノ酸配列；又はａ）又はｂ）をコードする核酸を含んで成るＳ．アウレウスポリペプチドに対して活性な、治療的又は予防的有効量の化合物を前記動物に投与することを含んで成り、ここで前記フラグメント又は変異体がバクテリオファージＯＲＦに結合するその生物学的活性を保存することを特徴とする方法。
【請求項２０】
哺乳動物体内へ体内留置器具を埋め込む前に、体内留置器具と、バクテリオファージＯＲＦに結合され得る配列番号６のアミノ酸配列を含むＳ．アウレウスポリペプチドに対して活性である化合物とを接触させることを含む、細菌性感染を防ぐための予防的処置の方法であって、このような接触が埋め込み部位におけるＳ．アウレウス感染を防ぐのに十分であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
細菌による動物の感染を防ぐための予防的処置方法であって、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体；配列番号６のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体の１つを含むＳ．アウレウスポリペプチド；又はバクテリオファージポリペプチドと特異的に相互作用できる、前記ポリペプチドをコードする遺伝子に対して活性である化合物を、前記動物組織表面に細菌が吸着するのを軽減するのに十分な量、前記動物に投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記活性化合物が、小分子、ペプチド類似物質、及びバクテリオファージ阻害タンパク質のフラグメント又は誘導体から成る群から選択される請求項１〜９又は１１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化合物が、組換え発現系によって合成され、そして精製され、又は人工的に合成されたペプチドである請求項１〜９又は１１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、
ａ） 配列番号４；及び
ｂ） ａ） のフラグメント又は変異体から成る群から選択され、ここで前記フラグメント又は変異体が配列番号２、６、そのフラグメント又は変異体も１つと相互作用するその特異的結合能力を維持する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記の接触を、インビトロで行う請求項１８、２０、２３又は２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
前記の接触が、動物の生体内で行われる請求項１８、１９、２１〜２３又は２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記接触が、存在する抗微生物剤と組合して行われる請求項１８〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はその生物学的活性フラグメント又は変異体を含んで成る請求項１〜９， １０， １１〜１６， 又は２２〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
単離され、精製され又は富化されたバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８−コードのポリペプチド；及び前記バクテリオファージＯＲＦへの結合においてその生物学的活性を保持する、配列番号６に示されるアミノ酸、そのフラグメント又は変異体を含んで成るＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを含んで成る組成物。
【請求項３０】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、及び前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドと特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦによりコードされるポリペプチドを含んで成る、１対の特異的に相互作用するドメインを含んで成り、ここで前記相互作用するドメインの少なくとも１つが単離され、精製されるか又は富化されていることを特徴とする組成物。
【請求項３１】
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列を含んで成り、そして前記バクテリオファージＯＲＦが配列番号４に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその生物学的活性フラグメント又は変異体を含んで成る請求項３０又は３１記載の組成物。
【請求項３３】
医薬組成物の生成方法であって、ａ）バクテリオファージＯＲＦ由来の第２ポリペプチドと特異的に結合する、配列番号６のアミノ酸配列、又はその生物学的活性フラグメント又は変異体を含んで成るポリペプチドに対して活性な化合物についてのスクリーニングアッセイを行うことによって、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性である化合物を同定し；そしてｂ）ａ）において同定された化合物を、適切な医薬的キャリヤー共に混合物ことを含んで成る方法。
【請求項３４】
前記バクテリオファージＯＲＦが、配列番号４に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドが、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列又はその生物学的フラグメントを含んで成る請求項３３又は３４記載の方法。
【請求項３６】
ａ）配列番号２のアミノ酸配列、その生物学的活性フラグメント又は変異体を含んで成るＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、ここで前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドはバクテリオファージＯＲＦに由来するポリペプチドに対して特異的に結合することができ、ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、その生物学的活性フラグメント又は変異体を含んで成るＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、ここで前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドはバクテリオファージＯＲＦに由来するポリペプチドに対して特異的に結合することができ、ｃ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のポリペプチド、その生物学的活性フラグメント又は変異体、及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦによりコードされるポリペプチドから成る１対の特異的に相互作用するドメインを含んで成る組成物；又はｄ）前記ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、又はｉｉｉ） 前記ｉ）又はｉｉ）の生物学的活性フラグメント又は変異体を含んで成る第１ポリペプチド、及びｉ）〜ｉｉｉ）の１つと特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦによりコードされる第２ポリペプチドを含んで成るアッセイ混合物の１つの、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性である化合物の同定のためへの使用。
【請求項３７】
前記配列番号２の生物学的活性フラグメント又は変異体が、配列番号６に不在である部分において突然変異誘発された配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る請求項１７〜１９， ２１， ２４又は２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記配列番号２の生物学的活性フラグメント又は変異体が、配列番号６に不在である部分において突然変異誘発された配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る請求項３２記載の組成物。
【請求項３９】
前記配列番号２の生物学的活性フラグメント又は変異体が、配列番号６に不在である部分において突然変異誘発された配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
ａ）配列番号２の１−５９９；
ｂ）配列番号２の３５−５９９；
ｃ）配列番号２の２９９−５９９；
ｄ）配列番号２の３８０−５９９；
ｅ）は維列番号２の４４９−５９９；
ｆ）配列番号２の４９０−５９９；
ｇ）配列番号２の５３０−５９９；
ｈ）配列番号２の５６１−５９９；及び
ｉ）上記ａ）〜ｈ）の生物学的活性変異体の１つに示されるようなアミノ酸配列を含んで成る、抗菌性化合物をスクリーンし、そして同定するための単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
前記アミノ酸配列が配列番号６に示される通りである請求項４０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
ａ）配列番号２の１−５９９；
ｂ）配列番号２の３５−５９９；
ｃ）配列番号２の２９９−５９９；
ｄ）配列番号２の３８０−５９９；
ｅ）は維列番号２の４４９−５９９；
ｆ）配列番号２の４９０−５９９；
ｇ）配列番号２の５３０−５９９；
ｈ）配列番号２の５６１−５９９；及び
ｉ）上記ａ）〜ｈ）の生物学的活性変異体の１つに示されるようなアミノ酸配列から成る、抗菌性化合物をスクリーンし、そして同定するための単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
前記アミノ酸配列が配列番号６に示される通りである請求項４２記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４４】
請求項４０， ４１， ４２ 又は４３のいずれか１項記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸配列。
【請求項４５】
請求項４０， ４１， ４２， ４３又は４４のいずれか１項記載の単離されたポリペプチドに対して特異的な、単離され、精製され又は富化された抗体。
【請求項４６】
配列番号６のポリペプチドに対して特異的な請求項４５記載の抗体。
【請求項４７】
前記発現系が細胞に基づかれている請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ＤＮＡ複製に包含される細菌遺伝子及びタンパク質、そしてまた、ＤＮＡ複製の細菌タンパク質と相互作用するバクテリオファージ遺伝子及びそれらのタンパク質に関する。より特定には、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス必須遺伝子及びそのコードされるタンパク質ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９を包含する組成物及び方法に関する。さらに、本発明は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のレベル及び／又は活性を調節する化合物を同定するスクリーニングアッセイ及びそのような化合物に関する。
【０００２】
発明の背景：
スタフィロコッカス（ブドウ状球菌）は、医学的に重要な微生物であり、様々なタイプの人間の病気を引き起こす事が知られている。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）はグラム陽性菌であり、健康なヒト宿主の皮膚にも検出され、そしてそれは多くの菌血症の原因である。
【０００３】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、これまでペニシリン誘導体のメチシリンによる治療が有効であったが、現在、この抗生物質に対する耐性型（ＭＲＳＡ−メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ）が増加しつつある（Ｈａｒｂａｔｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ａｒｃｈ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １５８： １８２−１８９．）。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）による心内膜炎の死亡率は２６−４５％の間で変動し、ベータラクタム系とアミノグルコシダーゼ系薬剤の併用による治療は疾病の完治に効果が無くなりつつある事を示している（Ｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ａｒｃｈ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １５９： ４６２−４６９）。
【０００４】
ほとんどの標準的な抗生物質に耐性を示すスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株が分離されるのはもはや珍しいことではなく、従ってこの微生物に対する新しい抗微生物薬、ワクチン、薬剤スクリーニング法そして診断法に対して未解決な医学的必要性と要求があるのである。抗生物質は、細胞内の驚くべき少数の標的物に対して広い種類の活性に分類され得る。一般的に、標的分子は、必須機能を提供する細胞タンパク質である。必須タンパク質の活性の阻害は、細菌細胞の死、又はその増殖の無能性のいずれかを導く。現在使用される抗生物質に対する決定的な細胞機能は、細胞壁合成、葉酸及び脂肪酸代謝、タンパク質合成及び核酸合成を包含する。
【０００５】
細胞に基づく薬剤発見と区別するために標的物に基づく薬剤発見として言及される新規薬剤の発見における証明されたアプローチは、標的タンパク質を獲得することであり、そしてタンパク質の生物学的機能を妨げるインビトロアッセイを開発することである。核酸代謝は、すべての細胞のために必須である。ＤＮＡ合成装置は、細菌において染色体の急速且つ高い複製を達成するために協調して作用する多くのタンパク質を包含する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ， Ａ．， ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， Ｔ．Ａ． １９９２， ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃａｍｐａｎｙ， ｐｐ． １６５−１９４；Ｂｎｎｋｏｖｉｃ， Ｓ． Ｊ． など．， ２００， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０： １８１−２０８に再考される）。
【０００６】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩについて下記に記載されるように、生物学的装置はしばしば、多タンパク質複合体から構成される。細菌プライモソーム及びレプリソームのタンパク質間での共同作用できる相互作用は、それらの効能に必須である。従って、必須の多タンパク質複合体のいずれかのメンバーが、薬剤開発のための推定的な標的物である。しかしながら、タンパク質が一定の生物学的機能に関連される事実は、それが新規薬剤の開発のための適切な標的物を表すことを必ずしも包含しない（Ｄｒｅｗｓ Ｊ． ２０００， Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７：１９６０−１９６４）。例えば、ＤＮＡ複製は細菌増殖のための良く知られ、そして必須の方法であるが、比較的な少数のＤＮＡ複製タンパク質のみが、現在入手できる抗生物質により標的化される。重要なことには、標的物の機能を阻害するそれらの化合物のスクリーニングは好ましくは、急速且つ選択的であるべきである。
【０００７】
従って、新規細菌標的物及び新規標的物ドメイン、及びより特定には、抗菌剤及びより特定には、抗−Ｓ．アウレウス剤をスクリーンし、そして同定するために使用され得るＳ．アウレウス細菌標的物を同定する必要性が存在する。また、新規抗菌剤、ワクチン、薬剤スクリーニング方法、及び診断及び治療方法を同定する必要性が存在する。
本発明は、それらの及び他の必要性を満たす。
本発明の記載は、多くの証拠資料を言及しており、その内容は、引例により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
発明の要約：
本発明は、新規抗微生物剤、ワクチン、薬剤スクリーニング方法、及び診断及び治療方法に関する。
より特定には、本発明は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と相互作用するタンパク質、及び特に、Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドと相互作用する細菌増殖−阻害（又はインヒビター）バクテリオファージ遺伝子生成物に関する。
【０００９】
本発明はまた、１対の相互作用タンパク質及びその一部又はフラグメントにも関する。より特定には、本発明は、Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９関連タンパク質の相互作用ドメイン、及び前記ドメインと相互作用し、そしてＳＴＡＡＵ＿Ｒ９生物学的活性を阻止するか又は阻害するタンパク質に関する。特定の態様においては、本発明は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のドメインから成る１対の相互作用ドメイン、及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦ、例えばＳ． アウレウス  バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８によりコードされるポリペプチドに関する。本発明の特に好ましい態様においては、それらのドメインの相互作用及びそのモジュレーションは、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９生物学的機能及びより特定には、抗微生物剤のモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイについての基礎を形成する。
【００１０】
本発明はまた、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９をサブユニットとして含むＤＮＡ複製に関与されると思われる多タンパク質複合体のポリヌクレオチド及びポリペプチド、及びその変異体及び一部にも関する。
もう１つの観点として、本発明はそのようなポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用法に関連し、他の微生物による疾病の治療及び診断も含むことがある。
【００１１】
さらなる観点においては、本発明は、この発明が提供する物質を使用した作用物質や拮抗物質の同定法の関する。関連する観点においては、前記方法は、同定された作用物質や拮抗物質により微生物感染やそのような感染に付随する症状の治療法に関連する。
さらなる観点においては、本発明は、微生物感染に関する疾病や感染による随伴症状を検出するための診断アッセイにも関連する。１つの態様においては、診断アッセイはＳＴＡＡＵ＿Ｒ９発現及び／活性を検出する。
【００１２】
本発明の１つの特定の態様においては、配列番号２のアミノ酸配列、その生物学的活性フラグメント又は変異体を含んで成るポリペプチドに対して活性である化合物を同定する方法が提供され、ここで前記配列番号２のアミノ酸配列、その生物学的活性フラグメント又は変異体が、配列番号４の配列、その生物学的活性フラグメント及び変異体から選択された配列を含んで成るポリペプチドと特異的に結合することができ、ここで前記フラグメント又は変異体は、配列番号２、又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）又は変異体に結合するそれらの能力を保持する。好ましい態様においては、配列番号２の生物学的活性フラグメント又はその変異体は配列番号６である。
【００１３】
本発明の１つの好ましい態様においては、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性な化合物の同定は、候補体化合物の存在又は不在下で第１及び第２ポリペプチドを接触せしめ、ここで前記第１ポリペプチドは、配列番号２、そのフラグメント又は変異体と特異的に結合することができるバクテリオファージＯＲＦに由来する第２ポリペプチドに特異的に結合する、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体を含んで成る。１つの特定の態様においては、前記第２ポリペプチドは、ファージＯＲＦ、そのフラグメント又は変異体であり、ここでこの第２ポリペプチドは、その生物学的活性を維持し；そして前記第１及び／又は第２ポリペプチドの生物学的活性を検出する方法により提供され、ここで候補体化合物の不在下での生物学的活性に対してその化合物の存在下での生物学的活性の低下が、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体を含んで成るポリペプチドに対して活性である化合物としてその候補体化合物を同定することを特徴とする。本発明のさらにもう１つの特定の態様においては、前記第１ポリペプチドは配列番号６であり、そして前記第２ポリペプチドは配列番号４である。
【００１４】
１つの特定の態様においては、生物学的活性は、第１及び第２ポリペプチドのお互いへの結合であり、それはａ）配列番号２のアミノ酸配列、その生物学的活性フラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含んで成る第１ポリペプチド、及びｂ）配列番号４、 そのフラグメント及び変異体から成る群から選択された第２ポリペプチドを含んで成るアッセイ混合物と試験化合物とを接触せしめ；候補体化合物の不在下での結合に対して、候補体化合物の存在下での前記第１及び第２ポリペプチドの結合を測定し；そしてＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はその変異体（例えば、配列番号６）と相互作用する候補体化合物の能力を決定することを含んで成る方法により決定され、ここで候補体化合物の不在下での結合に対して、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と相互作用する候補体化合物の存在下での前記第１及び第２ポリペプチドの結合の低下が、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）の対して活性である化合物として前記候補体化合物を同定することを特徴とする。
【００１５】
１つの態様においては、検出の段階は、直接的に又は間接的に標識される、第１及び第２タンパク質の結合を測定する段階を含んで成る。
異なった態様においては、検出段階は、時間−決定された蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光偏光変化、表層プラスモン共鳴による測定、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ、バイオセンサーアッセイ及びファージディスプレイから成る群から選択された方法による測定を含んで成るが、但し、それらだけには限定されない。
【００１６】
１つの態様においては、化合物のライブラリーが使用される。候補体化合物の非制限的な例は、性分子、ペプチド類似化合物、ペプチド、及びバクテリオファージインヒビタータンパク質のフラグメント又は誘導体を包含する。
１つの態様においては、候補体化合物は、発現システムにより合成され、そして精製されるか、又は人工的に合成されたペプチドである。
本発明はまた、試験化合物がＳ．アウレウスポリペプチド、すなわち配列番号２に示されるようなＳＴＡＡＵ＿Ｒ９、又はその一部に対して活性であるかどうかを決定することを含んで成る、抗微生物剤の同定方法を包含する。
【００１７】
さらなる態様においては、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性な化合物の同定が、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含んで成るポリペプチドと候補体化合物とを接触せしめ、ここで前記フラグメント又は変異体はその生物学的活性を保持し（例えば、それは、配列番号４に特異的に結合する）、そしてそれへの前記候補体化合物の結合を検出することを含んで成る方法により提供され、ここで結合の検出は、前記化合物が前記ポリペプチドに対して活性であることの表示である。
【００１８】
異なった態様においては、検出の段階は、時間−決定された蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光偏光変化、表層プラスモン共鳴、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ、バイオセンサーアッセイ及びファージディスプレイを含んで成る方法による、ポリペプチドへの候補体化合物の結合の測定を包含し、ここで前記化合物は、直接的に又は間接的に検出できるよう標識されている。
【００１９】
１つの態様においては、化合物のライブラリーが使用される。候補体化合物の非制限的な例は、性分子、ペプチド類似化合物、ペプチド、及びバクテリオファージインヒビタータンパク質のフラグメント又は誘導体を包含する。
１つの態様においては、候補体化合物は、発現システムにより合成され、そして精製されるか、又は人工的に合成されたペプチドである。
【００２０】
本発明はさらに、候補体化合物（又はそのライブラリー）と、配列番号２を含んで成るポリペプチドを発現する細胞とを接触せしめ；そして細胞におけるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性を検出する段階を含んで成る、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）に対して活性である化合物の同定方法を包含し、ここで候補体化合物と接触されない細胞におけるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性に対しての活性の低下がＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性の阻害の表示である。本発明はまた、配列番号２のフラグメント又は変異体を用いてのそのような方法も包含する。
【００２１】
いうまでもなく、本発明はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法をさらに包含し、ここで候補体化合物と接触されない細胞におけるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性に対する活性を高める化合物が、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性の刺激体である化合物として選択される。
好ましい態様においては、検出段階は、ＤＮＡ合成を調節するＳＴＡＡＵ＿Ｒ９分子の能力を刺激するか又は好ましくは阻害する、候補体、試験化合物又は剤の能力を測定する方法を包含する（そのようなアッセイは下記にさらに詳細に記載される）。
【００２２】
本発明はさらに、細胞フリーのアッセイにおける候補体化合物（又はそのライブラリー）と、天然に存在するか又は組換え起源のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質又はその生物学的活性部分とを接触せしめ；そしてＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性を検出する段階を含んで成る、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、そのフラグメント又は変異体に対して活性である化合物の同定方法を包含し、ここで候補体化合物と接触されない、細胞フリーのアッセイにおけるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性に対しての活性の低下がＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性の阻害の表示である。１つの特定の態様においては、前記フラグメント又は変異体は、配列番号６である。
【００２３】
好ましい態様においては、検出段階は、ＤＮＡ合成を調節するＳＴＡＡＵ＿Ｒ９分子の能力を刺激するか又は好ましくは阻害する、候補体化合物、試験化合物又は剤の能力を測定する方法を包含する（そのようなアッセイは下記にさらに詳細に記載される）。
本発明はさらに、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする核酸又は遺伝子の活性の作用物質又は拮抗物質を包含する。
【００２４】
本明細書に記載されるアッセイは、さらなる開発のための有望な先導化合物を検出するための初期又は一次スクリーンとして使用され得る。その同じアッセイがまた、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対する候補体化合物を測定するために二次スクリーニングアッセイに使用され得る。しばしば、先導化合物は、追加の異なったスクリーンにおいて、さらに評価されるであろう。本発明はまた、Ｓ．アウレウス株又は他の適切な細菌を用いての生物学的アッセイを包含する二次ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９スクリーンを包含する。
【００２５】
三次スクリーンは、動物における前記剤の効果の研究を包含する。従って、適切な動物モデルにおいて、本明細書に記載のようにして同定される剤をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のようにして同定される試験化合物（例えば、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９阻害剤、アンチセンスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９核酸分子、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９特異的抗体又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９結合パートナー）は、そのような剤による処理の効能、毒性又は副作用を決定するために動物において使用され得る。他方では、本明細書に記載のようにして同定される剤は、そのような剤の作用の機構を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。さらに、本発明は、本明細書に記載されるように、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規剤の処理（例えば、細菌感染）への使用に関する。
【００２６】
本発明はさらに、抗菌性化合物を合成するための方法を含む。この方法とはａ）候補体化合物が配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含むポリペプチド、又は前記ポリペプチドをコードする遺伝子に対して活性であるかどうか、ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含むポリペプチドを天然に産生する細菌に感染した生物に投与した際、治療効果を表すのに十分な量の候補体化合物を合成又は精製する段階を含んで成る。
【００２７】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体を含むポリペプチド、又はこのポリペプチドをコードする遺伝子に対して活性である化合物と細菌を接触させることによって細菌を阻害する方法を含む。
一つの具体例としては、この接触の段階はインビトロで行う。
他の具体例としては、この接触の過程は動物の体内で行う。
もう１つの態様においては、細菌は、存在する抗細菌剤と組合して活性化合物と接触せしめられる。従って、本発明はまた、存在する抗細菌剤と組合して、本発明の化合物を含んで成る抗微生物にも関する。もちろん、本発明の１つより多くの活性化合物が、存在する抗細菌剤と共に、又はそれを伴わないで、組み合わされ得る。
【００２８】
本発明はさらに、感染症に苦しむ動物、又は感染症の疑いがある動物の細菌感染症を治療する方法を含む。これは動物に配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含むポリペプチド又はそのポリペプチドをコードする核酸に対して活性のある、治療上有効な量の化合物を投与することを含む。この動物とは望ましくは哺乳動物であるが必ずしもその必要は無く、ヒトであることがより期待される。１つの態様においては、活性化合物は、存在する抗微生物剤と組合して動物に投与される。従って、本発明はまた、存在する抗微生物剤と組合して本発明の化合物を含んで成る抗微生物組成物にも関する。
【００２９】
本発明はさらに、細菌感染症を防ぐための予防法を包む。これは、体内留置器具を哺乳動物の体内へ移植する前に配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含むポリペプチドに対して活性である化合物と接触させることを含む。このような接触は移植箇所におけるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染を防ぐのに充分である。
【００３０】
本発明はさらに、細菌による動物の感染を防ぐための予防法を含み、動物の組織表面に細菌が接着するのを防ぐのに十分な量の、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）、又はそのポリペプチドをコードする遺伝子を含むポリペプチドに対して活性である化合物を、動物に投与することを含む。特定の態様においては、予防的有効量は、哺乳類の組織表面への細菌の付着を減じる。
【００３１】
この発明はさらに、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に感染した動物の診断法を含み、これは配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント、変異体（例えば、配列番号６）、エピトープ又はそれをコードする核酸を含むポリペプチドの動物内における存在を確定する方法を含む。好ましくは、前記ポリペプチドは、９６ ＯＲＦ ７８と特異的に相互作用することができる。好ましくは、動物はヒトである。
【００３２】
１つの態様においては、決定段階は、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含んで成るポリペプチド上に存在するエピトープに対して特異的な抗体と、動物又は個人の生物学的サンプルとを接触せしめることを含んで成る。
本発明はさらに、Ｓ．アウレウスによる感染を、動物又は個人において診断する方法を包含し、ここで前記方法は、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含んで成るポリペプチドをコードする核酸配列の動物又は個人における存在を決定することを含んで成り、ここで前記ペプチドは、９６ ＯＲＦ ７８と特異的に相互作用することができる。
【００３３】
一つの具体例としては、この確認過程は、前記動物又は個体の核酸サンプルと、分離、精製あるいは濃縮した少なくとも１５個のヌクレオチドの長さの核酸プローブを反応させる過程を含み、このプローブは厳しいハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１あるいはこのようなプローブの相補鎖とハイブリダイズする。
本発明は、細菌増殖−阻害（又はインヒビター）バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８遺伝子生成物と相互作用するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る、単離され、精製され又は富化されたポリヌクレオチドを包含する。
【００３４】
１つの特定の態様においては、前記単離され、精製され又は富化されたポリヌクレオチドは、配列番号２に対応するポリペプチド、その補体、フラグメント又は変異体をコードするヌクレオチドを含んで成り、ここで前記コードされるポリペプチドは、９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドと特異的に結合することができる。
１つの好ましい態様においては、前記単離され、精製され又は富化されたポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る、配列番号５として本明細書において言及される、配列番号１のヌクレオチド１６８３−１８００、又はそのようなヌクレオチド配列の補体を含んで成る。もう１つの好ましい態様においては、その単離され、精製され又は富化されたポリヌクレオチドフラグメントは配列番号５から成る。
【００３５】
本発明のもう１つの特定の態様においては、前記単離され、精製され又は富化されたポリヌクレオチドは、配列番号５の配列又はその補体に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％及びより好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成る。
本発明は、バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８遺伝子生成物を含んで成るポリペプチド、又はその一部と特異的に結合することができる、配列番号２のアミノ酸配列、その変異体又はフラグメントを含んで成る、単離され、精製され、又は富化されたポリペプチドを包含する。
【００３６】
本発明はさらに、配列番号６又はその変異体のアミノ酸配列を含んで成る、単離され、精製され又は富化されたポリペプチドを包含し、ここで前記配列番号６又はその変異体はバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８遺伝子生成物への結合においてその生物学的活性を保持する。特定の態様においては、バクテリオファージポリペプチドへの前記ポリペプチドの結合を可能にするアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸配列である。もう１つの態様においては、配列番号６の配列は、キメラタンパク質の一部である。
【００３７】
１つの特定の態様においては、前記単離され、精製され又は富化されたポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、及びより好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸を含んで成るか、又はそのアミノ酸配列から成り、ここで前記ポリペプチドはバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドと直接的に相互作用する。
【００３８】
１つの特定の態様においては、本発明の前記単離され、精製され又は富化されたポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、及びより好ましくは、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸を含んで成るか、又はそのアミノ酸配列から成り、ここで前記ポリペプチドはバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドと直接的に相互作用する。
１つの特定の態様においては、前記単離され、精製され又は富化されたポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含んで成る。もう１つの態様においては、配列番号６の配列はキメラタンパク質の一部である。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号６に示されるアミノ酸配列によりコードされるエピトープに対して特異的な、単離され、精製され又は富化された抗体を包含する。
本発明はさらに、２種のポリペプチド、すなわちバクテリオファージ−コードのポリペプチド、及び配列番号２又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）に対応するＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを含んで成る組成物を包含する。もう１つの態様においては、本発明は、バクテリオファージコードのポリペプチド及びＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド由来の２種の相互作用ポリペプチドを含んで成る組成物を包含する。本発明は、それらの相互作用するポリペプチドをコードする２種の核酸配列を含んで成る組成物を包含する。
【００４０】
本発明はさらに、２種の相互作用するポリペプチド、すなわちバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８−コードのポリペプチド、そのフラグメント又は変異体、及び配列番号２に示される配列、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含んで成るＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを含んで成る組成物を包含する。もう１つの態様においては、本発明は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、及び前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドと特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦによりコードされるポリペプチドを含んで成る、１対の特異的に相互作用するドメインを含んで成る組成物を包含する。
【００４１】
さらに、本発明は、ａ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、その生物学的活性フラグメント又は変異体に対して活性である化合物を目的とする本発明のスクリーニングアッセイを実施し、ここで前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドがバクテリオファージＯＲＦに由来する第二ポリペプチドに対して特異的に結合することができ、そして前記スクリーニングアッセイは、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性である化合物としての候補体化合物の同定を可能にし；そしてｂ）ａ）において同定された化合物を、適切な医薬キャリヤーと共に混合することを含んで成る、医薬組成物を生成する方法を包含する。１つの態様においては、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に活性なフラグメント又は変異体を含んで成る。
【００４２】
医薬組成物のこの生成方法のさらなる態様においては、前記工程は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して活性な同定された化合物の単離のための調製の拡大をさらに包含する。医薬組成物を生成するこの工程のさらにもう１つの態様においては、調製される医薬組成物は、ａ）において同定される化合物の誘導体又は相同体を含んで成る。
【００４３】
また本発明は、ａ）配列番号２のアミノ酸配列、その生物学的活性フラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含んで成るＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、ここで前記ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドは、バクテリオファージＯＲＦに由来するポリペプチドに対して特異的に結合することができ、ｂ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のポリペプチド、その生物学的活性フラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）、及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦによりコードされるポリペプチドから成る１対の特異的に相互作用するドメインを含んで成る組成物；又はｃ）配列番号２のアミノ酸配列、その生物学的活性フラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）を含んで成る第１ポリペプチド、及びお互い特異的に相互作用するバクテリオファージＯＲＦによりコードされる第２ポリペプチドを含んで成るアッセイ混合物の１つの、配列番号２のアミノ酸配列、その生物学的活性又は変異体（例えば、配列番号６）を含んで成るポリペプチドに対して活性である化合物の同定のためへの使用が提供される。
【００４４】
本発明のさらなる特徴や利点は、次に述べる具体例の説明とその図説及び請求項から、より完璧に明らかになる。
【００４５】
好ましい態様の記載：
本発明は、スクリーニング、診断及び治療上有用なスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とその一部の必須遺伝子、その遺伝子にコードされるポリペプチドの発見に関する。本発明は、さらに詳細に後述されるようにスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドとポリヌクレオチドにも関連する。そして、相互作用するポリペプチドのペアをコードするポリヌクレオチドのペアと、ポリペプチドのペアそのもの、あるいはその相互作用ドメインに関連する。
【００４６】
特定の態様において、前記対は、Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はその相互作用ドメイン（例えば、配列番号６）、及び９６ ＯＲＦ ７８又はその相互作用ドメインを包含する。１つの態様においては、本発明は、それぞれ配列番号：１と配列番号：２として開示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列を持つＳＴＡＡＵ＿Ｒ９にとりわけ関係がある。配列番号：１と２として示した配列は、本発明の最適な例を象徴している。なぜならば、これらのありふれた技術が、リボポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド全般において、このような配列を有効に用いることが出来ることを示すからである。
【００４７】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の必須ポリヌクレオチドとポリペプチド配列を分離、特徴づけるために、２つのこれまでの発明（合衆国仮特許出願明細書 ６０／１１０，９９２、１９９９年１２月３日申請、ＰＣＴ国際出願ＷＯ１９９９／ＩＢ９９／０２０４０号、１９９９年１２月３日申請）の方法論を使用した。
【００４８】
従って、本発明の特定の態様においては、本発明は抗微生物活性を持つ化合物を見つけるための薬剤スクリーニング法に使用することが可能な、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のポリペプチドとポリヌクレオチド配列を提供する。前記ポリペプチドとポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されるそれらの方法に類似する方法を用いて、又は他の方法を用いて単離され得る。さらに、そのようなポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、化学的に合成され得る。バクテリオファージのための標的物としてのＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９配列の同定は、細菌標的物を同定するための本発明のアプローチ確認し、そしてまた、抗細菌薬剤開発のためのキー標的物としてのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９、及びそれに基づく診断及び処理方法を確認する。
【００４９】
定義：
本発明の記載に使用される用語の明白且つ一致した理解を提供するために、多くの定義が下記に定義される。
特定の細胞内標的（例えば特定遺伝子の産物）に言及して“活性である”という言い回しは、その標的が、その経路上で機能する標的、物質又は化合物を含む、細胞内経路の重要な部分であることを意味する。従って場合によっては、その物質又は化合物は、述べられた標的の上流又は下流の構成要素に働くこともあり、この要素はその経路の調節物質あるいは構成要素そのものを含む。一般的には、抗微生物因子は必須の細胞機能に対して活性があり、しばしば必須遺伝子の産物に対して活性がある。
【００５０】
用語“活性である”とはまた、それが活性化する標的物に対する化合物の測定できる効果（前記下号物の不在下での標的物の活性に比較して）を言及する。これについて言及する活性とは、本発明のポリペプチドの１つの生物学的活性のいずれか１つである。
【００５１】
ここで使用する用語“阻害する”、“阻害”、“阻害性”及び“インヒビター”は全て生物学的な活性や機能を減じる働きを意味する。このような活性又は機能の減少は、例えば、細胞内構成要素（例えば酵素）、又は細胞内プロセス（例えば特定のタンパク質合成）、又は細胞の全体的なプロセス（例えば細胞増殖）と関連する可能性がある。細胞増殖に関しては、阻害効果は、殺細菌性（細菌細胞の殺害）又は静菌性（すなわち、細菌細胞増殖を止めるか又は少なくとも遅延する）であり得る。後者は、株のより少ない細胞が、所定の期間にわたって、阻害されていない細胞に比較して、生成されるよう、細胞増殖を遅延するか又は妨げる。分子観点によれば、そのような阻害は、特定の細菌標的物の転写及び／又は安定性のレベルの低下又は排除、及び／又は特定の標的物生分子の活性の低下又は排除に等しい。
【００５２】
ここで使用する用語“ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド”又は“ｄｎａＧポリペプチド”は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９由来のポリペプチド、その変異体、又はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性ドメインを含むポリペプチドを意味する。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの非制限例は、配列番号６、配列番号２、その変異体又はフラグメントに示されるようなアミノ酸を含んで成るポリペプチドを包含する。
【００５３】
ここで使用する用語“スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性ドメイン”、“ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の生物学的活性ポリペプチド”、又は同様のものは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の活性を保持するスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のポリペプチドフラグメント又は一部分のことである。用語“ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド”は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９、又は別のポリペプチド、例えば非ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド配列に融合されるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の活性ドメインを含む意味がある。
【００５４】
それらは、配列内の機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なったコドンの置換、欠失又は突然変異により変更される、配列番号１で示されるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９核酸のすべて又は一部を含んで成るヌクレオチド配列を包含するが、但し、それらだけには限定されない。
【００５５】
本発明の特定の態様においては及び例３に示されるように、核酸配列は、配列番号１での核酸配列又はその誘導体の３’末端及び／又は５’末端、及び好ましくは５’末端で少なくとも１つのヌクレオチドの欠失に起因するヌクレオチド配列を含んで成ることができる。従って、当業界において良く知られているように、配列番号１（及びそのコードされるポリペプチド（配列番号２））は、欠失変異体を生成するために使用され得る。従って、例えば本発明は、それらの生物学的活性の少なくとも１つを保持する、配列番号２のアミノ酸３５−５９９、２９９−５９９、３８０−５９９、４４９−５９９、４９０−５９９及び５６１−５９９（配列番号６）を包含する、配列番号２（アミノ酸−５９９）の欠失変異体を提供する。配列番号６の生物学的活性に影響を及ぼさない、配列番号６の少数のアミノ酸の欠失がまた、本発明により包含されることは理解されるべきである。そのような欠失変異体をコードする核酸配列がまた、本発明の範囲内であることがまた、理解されるべきである。
【００５６】
本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又は他のポリペプチドの“ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性”、“アミノ酸配列番号６活性を含んで成るポリペプチド”、“配列番号２活性のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド”、“ｄｎａＮポリペプチド活性”又は“生物学的活性”は、本発明の遺伝子、核酸配列、タンパク質又はポリペプチドの検出できる生物学的活性として定義される。これは、本発明のＳｔＡＡＵ＿Ｒ９、又はファージＯＲＦの生物学的比活性に寄与できるいずれかの生理学的機能を包含する。これは、細胞における又はインビトロでのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のＤＮＡ合成活性の測定を包含する。生物学的活性の非制限的例は、直接的に又は間接的に製造され得る。しかしながら、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９生物学的活性は、ＤＮＡ合成におけるその機能に制限されない。
【００５７】
生物学的活性はまた、他の因子（ポリペプチド又は他のもの）、例えば化合物、基質及びもちろん、興味あるタンパク質に対する単純な結合を包含することができる。従って、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に関しては、生物学的活性は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のいずれかの標準生化学的測定、例えばコンホメーション変化、リン酸化状態、又は当業界において知られている技法により測定され得るタンパク質のいずれかの他の特徴を包含する。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９生物学的活性はまた、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９遺伝子転写又は翻訳に関連する活性、又はそのような転写又は翻訳生成物のいずれかの生物学的活性を包含する。
【００５８】
本発明はまた、本発明の阻害ポリペプチドとのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９相互作用にも関し、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及びそのフラグメントの生物学的活性はまた、それらのポリペプチドの結合及び他の生物学的測定をモニターするアッセイを包含する。さらに、確かに、用語“生物学的活性”とはまた、本発明の相互作用タンパク質のドメイン（すなわち、ファージＯＲＦ又はそのドメイン）の相互作用に基づかれる測定を包含する。“生物学的活性”の非制限例は、１又は複数の次のものを包含する：
【００５９】
ｉ）９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチド又はその一部を包含するバクテリオファージ由来の細菌増殖阻害ＯＲＦへの結合
本発明のポリペプチド間の結合の決定は、直接的な結合を決定するために、下記に記載されるか又は当業界において知られている方法の１つにより達成され得る。自動化及びより特定には、高処理能力を受けやすい結合アッセイを提供することは、本発明の一定の態様においては好都合であるが、本発明はそのようなことに制限されない。本明細書に提供される配列番号２のアミノ酸、又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）を含んで成るポリペプチドと、バクテリオファージタンパク質９６ ＯＲＦ ７８又はその一部との間の結合又は物理的相互作用が、結合のために必要な配列から実質的に成る単離されたポリペプチド間で存在することができ、又は他方では、それぞれのポリペプチド配列が大きなポリペプチド内に含まれ得る。
【００６０】
配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）を含んで成るポリペプチドへのバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８の結合を測定するために本発明において有用な多くの非制限的な方法が下記に記載される。結合は、１つの分子を、表面又は支持体、例えば膜、マイクロタイタープレートウェル、又はマイクロアレイチップに結合せしめ、そしていずれかの数の手段、例えば光学的分光法、蛍光測定法及び放射性ラベル検出により第２分子の結合をモニターすることによって測定され得る。
【００６１】
例えば、時間−決定された蛍光共鳴エネルギートランスファー （ＴＲ−ＦＲＥＴ）法が提供される。この方法では、天然の蛍光アミノ酸残基、例えばトリフトファンの場合におけるように、内在性であるか、又は別々の分子に非共有結合された二つの蛍光基が接近すると、一方の蛍光基の発光スペクトルがもう一方の蛍光基の発光スペクトルとの重複を引き起こす。従って、一方の蛍光基のみに対する励起による二重蛍光は結合を示唆する。さらにこの発明において有用な検査法は、蛍光偏光法である。この方法では、蛍光物質によって標識した既知分子の定量可能な偏光度は、もう一つのタンパク質に結合することによって変化する。表面プラスモン共鳴法は、あるタンパク質が水相からセンサー上に固定化したもう一つのタンパク質に結合することにより引き起こされる、固定化センサー近くの質量変化によって二つの分子間の結合を測る定量法として利用可能である。
【００６２】
シンチレーション・プロキシミティ・アッセイもまた、配列番号２のアミノ酸配列及びそのフラグメントやバクテリオファージＯＲＦ又はそのフラグメントを含むポリペプチドの結合を測るために利用可能であり、ここでシンチラントに対して近位の結合がシンチレーション計数計又は他の検出計により検出される光子シグナルに放射性粒子を転換する。さらに、結合はバイオセンサー法によっても評価できる。この方法は、結合に伴うイオンチャンネルの変化によって誘導されるセンサーの選択透過性の変化に基づく方法である。ファージ・ディスプレイ法は熱量測定ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を用いたタンパク質−タンパク質相互作用を測る、強力な定量法である。
【００６３】
ｉｉ） ＤＮＡ合成の刺激
用語“生物学的活性”はまた、本明細書に提供されるＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９配列、そのフラグメント又は変異体を有するポリペプチド、又はバクテリオファージタンパク質９６ ＯＲＦ ７８と直接的に相互作用するＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、又は９６ ＯＲＦ ７８タンパク質又はその変異体のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−結合フラグメントを含むタンパク質のＤＮＡ合成刺激にも関する。
【００６４】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＤＮＡ合成刺激を測定するために本発明において有用な多くの方法が、下記に記載される。ＤＮＡ合成のレベルは、例えばＳ．アウレウス細胞のＤＮＡ中への放射性−又は蛍光−ラベルされたヌクレオチド導入の測定により、又はプラスミドＤＮＡ複製アッセイにおける二本鎖（ｄｓ） プラスミドＤＮＡに対する一本鎖（ｓｓ）の比により評価され得る。
【００６５】
他方では、ＤＮＡ合成はまた、線状又は環状の一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを包含する種々の異なった合成ＤＮＡ基質の使用に基づいて可溶性インビトロシステムを用いることによって測定され得る。１つの態様においては、複製アッセイは、部分的に生成された細胞タンパク質抽出物又は組換え的に生成されたタンパク質を包含する。もう１つの態様においては、再構成されるタンパク質アッセイは、部分的に精製された又は純粋な形の生来のタンパク質又は融合タンパク質又はそのフラグメントを包含する。
【００６６】
１つの細胞フリーのインビトロアッセイにおいては、Ｓ．アウレウスから調製される抽出物が、外因性の放射性ラベルされたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ， ｄＴＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）、ＭｇＣｌ２及びＡＴＰを包含する反応において、プラスミド基質、例えば環状Ｍ１３ ｓｓＤＮＡ基質に供給される。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性についてアッセイするためのもう１つの手段は、ｓｓＤＮＡ基質及びＳ．アウレウス精製されたタンパク質を用いて、再構成されたインビトロアッセイにおいてＤＮＡ中に組込まれる放射性ラベルされたヌクレオチドのレベルを測定することである（Ｙｕｈａｋａｋｏｖ など．， １９９９， Ｃｅｌｌ ９６： １５３−１６３）。
【００６７】
ｉｉｉ） ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ（プライマーゼ；ＲＮＡプライマー合成）の活性
生物学的活性はまた、本明細書に供給されるＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９配列、そのフラグメント又は変異体を有するポリペプチド、又はバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８タンパク質、又は前記９６ ＯＲＦ ７８タンパク質のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−結合フラグメントと直接的に相互作用するＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はそのフラグメントを含んで成るタンパク質、そのフラグメント又は変異体のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼを包含する。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドのプライマーゼ活性を測定するために本発明において有用な多くの方法が、下記に記載されている。
【００６８】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のＲＮＡプライマー合成活性をアッセイするためには、例えば固相イムノアッセイが使用され得る。このアッセイにおいては、プライマーゼのためのＤＮＡ鋳型が、個体支持体上に固定され、そして次に、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９プライマーゼ及びヌクレオチド三リン酸を含んで成る反応混合物と接触せしめられる。前記混合物に存在するＲＮＡプライマー合成活性は、ＤＮＡ−ＲＮＡへテロ重複体を形成する鋳型に基づいてのリボヌクレオチド三リン酸の重合をもたらす。
【００６９】
典型的には、前記へテロ重複体は、そのようなＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド領域に対して特異的である抗体により（Ｍｏｈａｎｒａｍなど．， アメリカ特許第６，０４３，０３８号）、又はそれ自体、ラベル特異的抗体により容易に検出されるラベル、例えばジゴキゲニンのヘテロ重複体の新しく合成されたＲＮＡ部分中への組込みにより検出される。結合された抗体は、典型的には、発色体酵素又は蛍光ラベルに結合される第２抗体により検出され、結合された抗体の急速な定量化、及び従って、アッセイ混合物内の元のＲＮＡプライマー合成活性の定量化を可能にする。
【００７０】
ｉｖ） ＤＮＡヘリカーゼによるＤＮＡ巻き戻し活性の刺激
生物学的活性はまた、ＤＮＡ（例えば、配列番号６）の巻き戻しにおいてＳ．アウレウスＤｎａＣヘリカーゼ（Ｅ．ステアロサーモフィラスにおいては、またＤｎａＢとして言及される）を刺激するために、本発明に提供されるＳ．アウレウス配列を有するポリペプチド、又はＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、そのフラグメント又は変異体を含んで成るタンパク質の活性を言及する。
【００７１】
ヘリカーゼは、５’側から３’側への巻き戻し極性を伴なって、重複体ＤＮＡを巻き戻すことができる。次のヘリカーゼアッセイが、Ｂ．ステアロサーモフィラスのＤｎａＢヘリカーゼ及びＤｎａＧプライマーによるインビトロアッセイから適合され得る（Ｂｉｒｄ， Ｌ． Ｅ．， Ｐａｎ， Ｈ．， Ｓｏｕｌｔａｎａｓ， Ｐ．， ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｙ， Ｄ． Ｂ． （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９： １７１−１８２）。下記アッセイの条件下で、ヘリカーゼは、ＤｎａＧプライマーゼの不在下で弱いＤＮＡ巻き戻し活性を示す。Ｓ．アウレウスＤｎａＣヘリカーゼの巻き戻し活性に対するＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の効果を決定するために、３’側一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ末端（前もって形成されたフォーク）を有する重複体ＤＮＡ基質が、固定された量の精製されたＤｎａＣヘリカーゼ及び上昇する量の精製されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と共にインキュベートされる。その反応混合物は、ヘリカーゼ活性を支持する条件にゆだねられる。
【００７２】
前記反応は、５０ｍＭのＭａＣｌ、１ｍＭのＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、及びＭＢ ｓｓＤＮＡにアニーリングされる０．２４ｎＭの［３２Ｐ］−ラベルされたオリゴマーを含む。ＤｎａＣヘリカーゼへの上昇する量のＤｎａＧプライマーゼの添加は、放射性ラベルがＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡから分離されるよう、ＤＮＡ重複体の融解をたぶんもたらす。Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡからのオリゴヌクレオチドの分離は、ゲル電気泳動、及びオートラジオグラフィーフィルムへのゲルの暴露により容易に検出される。大きな重複体ＤＮＡから離れて、巻き戻しされた放射性ラベルされたオリゴヌクレオチドの移動が、アッセイ混合物におけるヘリカーゼ巻き戻し−刺激活性の存在を示す。
【００７３】
ｖ） ＤＮＡヘリカーゼＡＴＰアーゼ活性の刺激
生物学的活性はまた、ＤｎａＣヘリカーゼ（例えば、配列番号６）のＡＴＰアーゼ活性の刺激において、本明細書に供給されるＳ．アウレウスプライマーゼＤＮＡ配列に由来するポリペプチド、又はＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、そのフラグメント又は変異体を含んで成るタンパク質の活性を刺激することにも関する。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドのＤｎａＣ ＡＴＰアーゼ刺激活性を測定するために本発明において有用な多くの方法が下記に記載される。
【００７４】
ＤｎａＣヘリカーゼのＡＴＰアーゼ活性を刺激するＤｎａＧプライマーゼの能力は、ＡＴＰ加水分解が定常状態下で測定されるＡＴＰアーゼアッセイにおいて決定され得る。前記アッセイにおいては、ＡＴＰ加水分解は、ＡＴＰアーゼ活性の便利な分光光度決定を提供する、ＮＡＤＨの酸化に連結される。他方では、ＡＴＰアーゼ活性は、ＤｎａＣヘリカーゼによるＡＴＰ加水分解の結果として、無機リン酸塩（Ｐｉ放出アッセイ）の放出を測定することによって、間接的にアッセイされる。
【００７５】
Ｐｉ放出アッセイ混合物は、１００μｌの合計体積を有し、そしてＤｎａＣヘリカーゼ酸素、ＤｎａＧプライマーゼ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、及び１ｍＭの基質（ＡＴＰ）を含む。必要とされるインキュベーション時間の後、等体積のモリブデン酸アンモニウム−孔雀石グリーン試薬が添加され、そして６３０ｎｍでの吸着度が測定される。ＤｎａＣヘリカーゼ及びＤｎａＧプライマーゼの混合物における候補体モジュレーターの存在は、Ｐｉ放出の阻害をもたらし、そして候補体インヒビターを有さないサンプルに対して、モリブデン酸アンモニウム−孔雀石グリーン試薬の添加の後、反応混合物の６３０ｎｍでの吸光度の低下として検出されるであろう。
【００７６】
本明細書において使用される場合、“ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド”又は同等の用語は、この発明におけるポリペプチド、特に細菌性ポリペプチド、さらに厳密には図 １、配列番号２に規定されるアミノ酸配列を持つスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを意味する。この用語は、コーディング又はノン・コーディング配列を含む追加部分と一緒にポリペプチドをコードする、一つの連続した部分又は不連続な部分（例えば、組込みファージ、組込み挿入配列、組込みベクター配列、組込みトランスポゾン配列、あるいはＲＮＡの編集又は染色体ＤＮＡの再構築によって中断されたポリヌクレオチド）も含む。
【００７７】
本明細書において使用される場合、“ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９遺伝子”、“ＤｎａＧ遺伝子”はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを内包する意味を持つ。細胞内又は試験管内のいずれにおいても、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドをコードするＲＮＡの転写を指示するのに必要な全ての付加ヌクレオチド配列を“調節配列”と呼ぶ。これは転写プロモーターやエンハンサー、そして転写ターミネーターを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７８】
本明細書において使用される場合、“ＯＲＦ ７８”又は“ファージ９６ ＯＲＦ ７８”は、図２ （配列番号：３）に提供した配列を持つポリヌクレオチドを含み、この配列は９６ ＯＲＦ ７８遺伝子生成物として知られる遺伝子生成物をコードする。
【００７９】
本明細書において使用される場合、“ポリヌクレオチド”は、修飾されないＲＮＡ又はＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡを含む、全てのポリヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを一般的に意味する。“ポリヌクレオチド”は、無制限に、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖部分の混合したＤＮＡ、あるいは一本鎖、二本鎖そして三本鎖部分の混合したＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖と二本鎖部分の混合したＲＮＡ、おそらく一本鎖から成る、あるいはより典型的には、二本鎖又は三本鎖部分、又は一本鎖と二本鎖部分の混合したＤＮＡとＲＮＡによって構成され得るハイブリッド分子を意味する。
【００８０】
さらに、ここで使用される“ポリヌクレオチド”とは、ＲＮＡ又はＤＮＡあるいはＲＮＡとＤＮＡの両方から成る三本鎖部分を意味することもある。このような部分の鎖は、同じ分子あるいは異なる分子から構成されることがある。この部分は、これらの分子のうち一つ又はそれ以上から成り、しかし大抵は幾つかの分子のほんの一部分を含む。三重螺旋部分を構成する分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。ここで使用する用語“ポリヌクレオチド”は、上に述べたように一カ所又はそれ以上の変更塩基対を含むＤＮＡ又はＲＮＡをも意味する。従って、安定性のために又は他の理由により基幹部分が変更されたＤＮＡ又はＲＮＡも、ここで意味するところの“ポリヌクレオチド”である。
【００８１】
さらに、ちょうど二つの例を挙げると、独特の塩基対、例えばイノシン、あるいは変更された塩基対、例えばトリチル化された塩基対から成るＤＮＡ又はＲＮＡも、ここで意味するところのポリヌクレオチドである。多種多様な修飾がＤＮＡ又はＲＮＡに加えられ、技術的に知られる多くの有益な意図を果たすようになることが期待される。ここで用いられるように、“ポリヌクレオチド”という用語は、例えば、単純な又は複雑な細胞を含む、ウイルスや細胞に特徴的なＤＮＡやＲＮＡの化学的な形状だけでなく、このような化学的、酵素的又は代謝的に修飾されたポリヌクレオチドを含む。“ポリヌクレオチド”は、しばしばオリゴヌクレオチドとして参照される短いポリヌクレオチドも意味する。ポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ及びＲＮＡキメラでもあり得る。
【００８２】
本明細書において使用される場合、“ポリペプチド”は、ペプチド結合あるいは修正ペプチド結合によってお互いに連結した、二つ又はそれ以上のアミノ酸から成る全てのペプチド又はタンパク質を意味する。“ポリペプチド”は、一般的にペプチド、オリゴペプチドやオリゴマーと呼ばれる短い鎖、及び一般的にタンパク質と称されるより長い鎖の、両方を意味する。ポリペプチドは２０の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸も含み得る。“ポリペプチド”は、プロセッシングや他の転写後修飾のような自然に起こる過程によってだけでなく、化学的な修飾技術によって修飾されたポリペプチドも含む。
【００８３】
このような修飾は、基本的な教科書やより詳細な単行書、同様に多くの研究論文に詳細に述べられており、技術的にこれらの方法がよく知られている。特定のポリペプチドにおいて、同じタイプの修飾が同じ場所、あるいは幾つかの場所にさまざまな程度で存在することが効果的だろう。さらに、特定のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含む可能性もある。修飾はポリペプチドのあらゆる場所に生じる可能性があり、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、そしてアミノあるいはカルボキシ末端も含まれる。
【００８４】
修飾は、例えば、フラビンのアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、共有結合化、ヘムの一部分の共有結合化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合化、脂質あるいは脂質誘導体の共有結合化、フォスファチジルイノシトールの共有結合化、架橋結合、環状化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ・カルボキシル化、ＧＰＩアンカーの形成、水酸化、ヨウ化、メチル化、ミリストレイン化、酸化、蛋白分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、糖化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ・カルボキシル化、水酸化、セレン化、硫酸化やアルギニン化やユビキチン化のような転移ＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸の付加などを含む。
【００８５】
参考として、 ＰＲＯＴＥＩＮＳ − ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）； Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， ｐｇｓ． １−１２ ｉｎ ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）； Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６ （１９９０）； ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３： ４８−６２（１９９２）を参照のこと。ポリペプチドは枝分かれした、あるいは枝分かれの有無に関わらず環状の構造をとりうる。環状の、枝分かれした又は枝分かれした環状ポリペプチドは転写後の自然な過程によって生じ、同様に完全な合成法によって生じることもある。
【００８６】
本明細書において使用される場合、“変異体”は、それぞれ基準となるポリヌクレオチド又はポリペプチドから派生した、しかし、本発明の初期の（例えば、非−変異体）のポリヌクレオチド又はポリペプチドの一つあるいはそれ以上の生物学的活性が残っている、ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドを意味する。ポリヌクレオチドの典型的な変異体とは、他の参照ヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、参照されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を、変えることも変えないこともある。
【００８７】
ヌクレオチドの変化は、以下に述べるように、参照された配列によってコードされるポリペプチドにおいて、あるいは融合タンパク質の形成において、アミノ酸の置換、挿入、欠失、切り捨てを生じることがある。一般的に相違は限られ、参照されたポリペプチドの配列と変異体の配列は全長に渡って非常によく似ており、多くの部分において同一である。変異体と参照されたポリペプチドは、一つあるいはそれ以上の置換、挿入、欠失のあらゆるコンビネーションによってアミノ酸配列が異なりうる。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされる場合とされない場合がある。この発明は、本発明の各々のポリペプチドの変異体も含む。
【００８８】
これは、よく似た特徴を持つ他の残基によって置換されたような、保存的なアミノ酸置換によって対象から派生したポリペプチドも含む。典型的には、このような置換はバリン、ロイシンとイソロイシンの間、セリンとトレオニンの間、酸性残基アスパラギン酸とグルタミン酸の間、塩基性残基リシンとアルギニンの間、芳香残基フェニルアラニンとチロシンの間で生じる。特に１−１０、１−５、１−３、２−３あるいは１アミノ酸又は複数のアミノ酸が全ての組合わせで置換、欠失、又は挿入された変異体が好ましい。
【００８９】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように自然に起こることもあるし、自然に起こることが知られていない変異体であることもある。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの自然に起こらない変異体は、突然変異誘発技術、直接的な合成、熟練した技術を要する他の組換え法によって合成できる。本発明の１つの態様においては、従って、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の変異体は、配列番号６においては不在である、配列番号２の配列において異なるその配列を意味する。
【００９０】
本明細書において使用される場合、“フラグメント”は、ポリペプチドを参照して使用される場合、それが由来する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と一部分が全く同じ、しかし全ての部分が同じではないアミノ酸配列を持つポリペプチドのことである。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの場合、フラグメントは「独立した」（「から成る」）、又はそのフラグメントがその一部あるいは領域を形成するようなより大きなポリペプチドの中に含まれることがあり、多くの場合、一つのより大きなポリペプチド内にある一つの連続した領域として含まれる。
【００９１】
核酸に関して“分離”という用語が使用される場合、天然の配列が、その正常な細胞の（例えば、染色体の）環境から取り出された状態、又は非自然環境下で合成された（例えば、人工的に合成された）状態を意味する。従って、その配列は無細胞溶液又は細胞内とは異なる環境下に置かれることがある。この用語は、その配列が唯一のヌクレオチド鎖の存在を意味するわけではないが、自然の状態で結合しているヌクレオチド以外の物質を絶対的に含まない（少なくとも約９０−９５％純粋な）ことを意味する。従って、この用語は分離された染色体とは区別される。
【００９２】
ポリヌクレオチドに関して“富化”という用語が使用される場合、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列が、正常又は異常細胞あるいはその配列がもともと取られた細胞よりも、関心のある細胞内又は溶液中に存在する総ＤＮＡ又はＲＮＡ量の有意に多い画分（２−５倍）を構成することを意味する。これは、他に存在するＤＮＡ又はＲＮＡの量の選択的減少、又は特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列の選択的増加、あるいはこの二つの方法の組合わせによって、人為的に行うことができる。しかしながら、“富化”という用語は他のＤＮＡ又はＲＮＡ配列が全く存在しないことを意味するのではなく、単に関心のある配列の量が相対的に有意に増加している状態を意味することに注目すべきである。
【００９３】
本明細書において使用される場合、“有意に高い画分”とは、富化の程度がこのような富化を行う者にとって有益であることを示唆し、他の核酸との相対的な富化率は少なくとも約２倍、又は５〜１０倍あるいはそれ以上増加していることを示唆する。この用語はまた、他の源からのＤＮＡ又はＲＮＡが存在しないことを包含しない。例えば、ＤＮＡの他の源は、酵母又は細菌ゲノム又はクローニングベクター、例えばｐＵＣ１９からのＤＮＡを含むことができる。この用語は、天然に存在する現象、例えばウィルス感染、又は１つのｍＲＮＡのレベルがｍＲＮＡの他の種に対して天然において高められ得る腫瘍型増殖を識別する。すなわち、この用語は、個人が所望する核酸の割合を高めることに介在したそれらの情況のみを包含することを意味する。
【００９４】
本明細書において使用される場合、核酸を参照してここで使用する用語“精製される”とは、絶対的な純度（均質な調合のような）を必要とするものではない。代わりに、その配列が自然の環境下よりも相対的により純度の高い（自然な状態と較べて、このレベルは例えばｍｇ／ｍｌの単位で少なくとも２−５倍）状態を意味する。染色体又はｃＤＮＡライブラリから分離した個々のクローンは、電気泳動的に均質な状態に精製される。これらのクローンから得られた請求項ＤＮＡ分子は総ＤＮＡ又は総ＲＮＡから直接的に得られるだろう。ｃＤＮＡクローンは天然に生じるものではないが、むしろ、一部純化した天然に生じた物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作を通じて得られる。
【００９５】
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み、純粋な個々のｃＤＮＡクローンはｃＤＮＡライブラリを持つ細胞のクローン選択により合成ライブラリから分離することが出来る。従って、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリ構築と特定のｃＤＮＡクローンの分離を含む過程により、天然細胞内における比率のおよそ１０６倍の天然のメッセージが精製される。従って、少なくとも１回の、できれば２回又は３回の、さらに望ましくは４回又は５回の精製単位で精製されることが特に期待される。染色体ライブラリも同様に使用可能であり、おおよそ同じレベルの精製物を産生する。
【００９６】
上述の核酸に関連して使用される用語“分離される”、“富化される”及び“精製される”とは、相対的なポリペプチドの純度や量を表すために同様に使うことがある。これらも同様に、技術的によく知られている生化学的な手法を使って保存され、増やされ、ふるい分けられ、ライブラリから選択される。このようなポリペプチドは天然の、合成による又はキメラ分子であり、例えば免疫沈降法や、他の“タギング”法、通常のクロマトグラフィやあるいは電気泳動法のような様々な方法を使って抽出できる。上述の幾つかは、一致する核酸配列を利用する。
【００９７】
本明細書において使用される場合、“補体”とは、特定のポリヌクレオチド配列を参照して使われる場合、ヘテロ二本鎖を形成することのできるヌクレオチド配列を意味し、その中で、そのヌクレオチド配列に含まれる全てのヌクレオチドは、ヘテロ二本鎖における反対側のヌクレオチドと水素結合することによって、その特定のポリヌクレオチド配列と塩基対を形成する。この用語は、他のＲＮＡあるいはＤＮＡ配列の補体であるＤＮＡあるいはＲＮＡ配列を意味することもある。ここで用いられる用語“ハイブリダイズ”とは、二つの核酸分子の間で水素結合したヘテロ二本鎖の形成を意味する。一般的に、特定の核酸分子はその補体とハイブリダイズし、あるいはその特定の分子に対して、二つの分子の間で水素結合したヘテロ二本鎖を形成するのに充分な相補性を持つ分子とハイブリダイズする。
【００９８】
本明細書において使用される場合、“プローブ”とは、少なくとも長さ１５ヌクレオチド（ｎｔ）、２０ ｎｔ、３０ ｎｔ、４０ ｎｔ、５０ ｎｔ、７５ ｎｔ、１００ ｎｔ、２００ ｎｔ、５００ ｎｔ、１０００ ｎｔ、さらに最大５０００から１０，０００ ｎｔのポリヌクレオチドを意味する。
本明細書において使用される場合、そして技術用語として使用される場合“同一性”と“類似性”という用語は二つ又はそれ以上のポリペプチド配列あるいはポリヌクレオチド配列の間の関係を意味し、このような場合、配列を比較することによって決定される。
【００９９】
アミノ酸又はヌクレオチド配列の“同一性”や“類似性”は、比較される二つの配列の間の全体的な最適アライメントから決定される。例えば、全体的な最適アライメントの非制限例は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ − Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３）を用いて得られる。“同一性”とは、一番目のポリペプチド又はポリヌクレオチド内の特定の場所で、アミノ酸又はヌクレオチドが、一番目のポリペプチド又はポリヌクレオチドとの全体的な最適アライメントにおける二番目のポリペプチド又はポリヌクレオチドの一致するアミノ酸又はヌクレオチドと、全く同じであることを意味する。同一性とは反対に、“類似性”は保存的に置換されたアミノ酸を含む意味がある。
【０１００】
用語“保存性”置換は、当業界において良く知られており、そして広範には、置換されるアミノ酸の化学−物理学的性質を有意に変更しない置換を言及する。例えば、用語“保存的な”置換とはｂｌｏｓｕｍ６２ 置換マトリックス（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５−１０９１９）において陽性スコアを示す全ての置換のことである。“配列Ａは配列Ｂにｎ％類似する”という記述は、配列ＡとＢの間の全体的な最適アライメントのうちｎ％の部分が同一の残基及び保存性置換から成ると言うことを意味する。“配列Ａは配列Ｂにｎ％同一である”という記述は、配列ＡとＢの間の全体的な最適アライメントのうちｎ％の部分が同一の残基又はヌクレオチドから成ると言うことを意味する。本発明の開示における全体的な最適アライメントには、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアライメント・アルゴリズムにおける以下のパラメーターを用いた。
【０１０１】
ポリペプチドについては：
置換マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ６２
ギャップ・スコアリング・ファンクション：−Ａ −Ｂ＊ＬＧ、Ａ＝１１（ギャップ・ペナルティ）、Ｂ＝１（ギャップ・レングス・ペナルティ）、ＬＧはギャップの長さ
ヌクレオチド配列については：
置換マトリックス：１０は一致、０は不一致
ギャップ・スコアリング・ファンクション：−Ａ −Ｂ＊ＬＧ、Ａ＝５０（ギャップ・ペナルティ）、Ｂ＝３（ギャップ・レングス・ペナルティ）、ＬＧはギャップの長さ。
【０１０２】
配列間での用語“同一性”及び“類似性”とは、それらのフラグメントまで拡張され得る。配列ＡとＢとの間の最適な局部アライメントは、Ａ及びＢのフラグメントの最高の評点アライメントである。表現“配列ＡはＢに対して局部的にｎ％類似する”とは、配列ＡとＢとの間の最適局部アライメントの位置のｎ％が保存性置換から成ることを意味する。表現“配列ＡはＢに対して局部的にｎ％同一である”とは、配列ＡとＢとの間の最適局部アライメントの位置のｎ％が同一の残基又はヌクレオチドから成ることを意味する。最適局部アライメントの非制限例は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ （Ｓｍｉｔｈ， Ｔ． Ｆ． ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ｍ．Ｓ． １９８１， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｊ． ｏｆ Ｍ． Ｂｉｏｌ． １４７：１９５−１９７を用いて行われ得る。
【０１０３】
もちろん、上記に列挙されるパラメーターは、アライメントアルゴリズムパラメーターの１つの特定の例である。多くのアルゴリズム及びパラメーターが利用でき、そして当業者に知られている。
【０１０４】
典型的な保存性置換は、メチオニン、バリン、ロイシンとイソロイシンの間、セリンとトレオニンの間、残基アスパラギン酸、グルタミン酸とアスパラギンの間、残基グルタミン、リシンとアルギニンの間、芳香残基フェニルアラニンとチロシンの間で生じる。二つのポリペプチド配列間の類似性の程度（通常はパーセンテイジ）を計算する場合、その度合いは、二つの分子の全長に渡って、二つのポリペプチド配列において対応するアミノ酸残基の間にみられる同一性及び類似性を示す残基の数とみなされる。
【０１０５】
ここで使用する用語“抗体”とは、抗体の結合（可変）領域や、他の抗体修飾を利用した構造物を含む意味を持つ。従って、本発明で有用な抗体は、完全な抗体、抗体フラグメント、多機能性抗体複合体、又は一般的には抗体由来の一つあるいはそれ以上の特異的結合サイトから成る分子を含みうる。抗体フラグメントは、例えば単鎖可変領域抗体フラグメント（Ｆｖ）のような可変領域抗体フラグメント（Ｆｖ）、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）やＦ（ａｂ’）２フラグメントあるいはその誘導体を含むことがある。
【０１０６】
この抗体又は抗体フラグメントは、非組換え型、組換え型又はヒト型化されたものであることがある。この抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭなどの免疫グロブリン・アイソタイプから構成されることもある。加えて、免疫グロブリンの集合体、重合体、誘導体や共役複合体、あるいはそのフラグメントが、それぞれ適切な場合に使用可能である。本発明によれば、中和抗体は診断、治療、薬剤スクリーニングの方法やドラッグ・デザインに対してとりわけ有用である。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、“スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに存在するエピトープに特異的な”とは、抗体を参照して使用される場合、その抗体は、本発明によるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はそのフラグメント（配列番号６）に存在する抗原決定基を認識し、結合することを意味する。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、用語“抗原的に同等な誘導体”とは、ある種の抗体によって特異的に認識されるようなポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はそのどちらかに同等なものを含む意味を持つ。このある種の抗体とは、本発明に基づくタンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに対して作成された場合、病原体と哺乳類宿主との間の早急な物理的相互作用に干渉する抗体である。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、用語“必須”とは、遺伝子や遺伝子産物と関連づけて使用される場合、機能的産物の無い状態又は枯渇状態において、この遺伝子を持つ宿主がそれ無しでは生存できない、又は有意に増殖が阻害されることを意味する。“必須遺伝子”とは、問題となる特定の遺伝子と一致する野生型対立遺伝子を持つ株の増殖に適切な培養液を用いた試験管内における細胞増殖に対して、有益な、又はむしろ必要不可欠な産物をコードするような遺伝子を意味する。従って、必須遺伝子が不活性化又は阻害されると、その細胞は野生型株に較べて有意にゆっくりと増殖し、又は全く増殖しなくなることが予想される。
【０１１０】
このような遺伝子が不活性化された株の増殖は、増殖培養液中で、野生型の増殖率のできれば２０％以下、さらにできれば１０％、なるべくなら５％以下、又は全くゼロになることが期待される。少なくとも正常な生体内における増殖環境に近い培養条件において、その遺伝子産物の活性が無い状態では、その細胞は全く増殖しないか、又は生存不可能であることが期待される。例えば、細菌性細胞壁の合成に関与するある酵素の生物学的な活性の欠如は、たとえ浸透圧が調節された条件下でプロトプラストが生き続けるとしても、正常な浸透圧条件下において細胞の溶解を引き起こすことが可能である。
【０１１１】
例えば抗菌剤又はファージ産物によってこのような遺伝子が阻害された場合、阻害された細菌の増殖率が阻害されていない細菌の増殖率と較べて、必ずではないができれば５０％、さらにできれば３０％、さらにできれば２０％、最も望ましくは１０％以下になることが期待される。このような熟練した技術によって解るように、増殖阻害の程度は一般的に阻害物質の濃度に依存する。本発明の文脈においては、必須遺伝子とは一般的に抗菌剤の格好な標的になる。必須遺伝子は“標的”分子を直接コードしたり、又は標的分子の産生、修飾あるいは維持に関与する産物をコードすることがある。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、用語“標的物”とは、内因性物質又は化合物が作用しうる生体分子、又は生体分子複合体を意味し、結果的に細菌細胞の増殖又は生存能を調節、むしろ阻害する。標的物は、核酸配列又は分子、又はポリペプチド又はポリペプチドの領域であり得る。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、９６ ＯＲＦ ７８又はそのフラグメント、又は同様のものに対する、配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含んで成るＳ．アウレウスポリペプチドの相互作用により生成される用語“シグナル”とは、結合アッセイにおけるポリペプチド相互作用の測定できるインジケーターを言及し、ここで前記相互作用ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体、及び９６ ＯＲＦ ７８、そのフラグメント又は変異体を含んで成る。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、“配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体を含んで成るＳ．アウレウスポリペプチドの活性化又は阻害により生成される用語シグナル”とは、配列番号２のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体を含んで成るポリペプチドの測定できるインジケーター、すなわちＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性のアッセイにおける活性を言及する。例えば、シグナルは、（ｉ）９６ ＯＲＦ ７８のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドへの結合に起因するシグナル、例えば蛍光シグナル（蛍光共鳴エネルギートランスファーアッセイ；蛍光偏光アッセイ）、比色シグナルの分光光度吸収測定（ファージ・ディスプレーＥＬＩＳＡ）、質量変化測定（表層プラスモン共鳴分析）又は選択培地上での生存生測定（酵母２−ハイブリッド分析）；又は（ｉｉ）放射性ラベルされたシグナルの低下（ＤＮＡ合成分析）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、用語“基準”とは、ポリペプチドの活性に対して使用される場合、候補化合物の無い状態で行ったある特定の検査において（直接又は間接的に）観察又は検出される活性化の値を意味する。“基準”は、候補体化合物のポリペプチドの活性に対する、陽性又は陰性の効果を決定する標準値としての役割を果たす。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、用語“活性の増加”とは、ある特定の試験において、候補体化合物が無い場合の測定可能な活性レベルに較べて、候補体化合物が存在する場合にポリペプチドの測定可能な活性レベルが上昇していることを意味する。本発明によれば、候補体化合物の無い状態に較べて、少なくとも１０％増し、２０％増し、５０％増し、７５％増し、１００％増しあるいはそれ以上、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍あるいはそれ以上の活性があった場合に、活性が増加したとみなされる。
【０１１７】
本明細書において使用される場合、用語“活性の減少”とは、ある特定の試験において、候補体化合物が無い場合の測定可能な活性レベルに較べて、候補体化合物が存在する場合にポリペプチドの測定可能な活性レベルが減少していることを意味する。本発明によれば、候補体化合物の無い状態に較べて、少なくとも１０％の減少、できれば１５％の減少、２０％の減少、５０％の減少、７５％の減少あるいはまさに１００％の減少（例えば、活性無し）があった場合に、活性が減少したとみなされる。
【０１１８】
本明細書において使用される場合、用語“相互作用が可能な条件”とは、配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含んで成るスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチドと候補体化合物に対して使用される場合、この二つの構成要素が両方とも溶液中にあろうと、又は片方がなんらかの方法で固定化又は限局化され、もう一方が溶液中に存在する状態であろうと混合された場合、その溶液のパラメータ（例えば、塩、デタージェント（界面活性剤）、タンパク質又は候補体化合物濃度、温度や酸化還元電位、その他の要素）が配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメントを含んで成るスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチドと候補体化合物が物理的に結合できるような条件であることを意味する。タンパク質と候補体化合物の相互作用が可能な条件とは、例えば、ＴＲ−ＦＲＥＴ、蛍光偏光、表面プラスモン共鳴法、及びファージ・ディスプレイ法についてここに述べられた条件を含む。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、用語“ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９”の測定可能なパラメーターの検出可能な変化”とは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの定量可能な特徴の変化を意味する。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、用語“作用物質”とは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を強化したり増加させるような物質又は化合物を意味する。作用物質は、直接スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はポリヌクレオチドに対して作用するか、あるいは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を強化したり増加を誘導するような経路の一つ又はそれ以上の構成要素に作用しうる。
【０１２１】
本明細書において使用される場合、用語“拮抗物質”とは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を小さくしたり減少させるような物質又は化合物を意味する。拮抗物質は直接スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はポリヌクレオチドに対して作用するか、あるいは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を小さくしたり減少させるような経路の一つ又はそれ以上の構成要素に作用しうる。
【０１２２】
本明細書において使用される場合、用語“抗菌性物質”又は“抗菌性化合物”とは、一つあるいはそれ以上の細菌株に対して殺菌性又は静菌性効果を示す物質又は化合物を意味し、むしろこのような物質又は化合物は少なくともスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して殺菌性又は静菌性を示す。
本明細書において使用される場合、用語“合成”とは、化学的に化合物を合成する過程を意味する。
【０１２３】
細菌感染の治療という文脈で使用される用語“治療に有効な量”、“薬剤的に有効な量”又は“治療効果を現すのに十分な量”とは、治療効果を示す抗菌性物質の量を意味する。これは一般的に、ある程度まで、引き続く細菌感染に必要な細菌性細胞の正常な細胞機能を阻害することを意味する。さらに、ここで使用されるように治療に有効な量とは、臨床試験や又は動物モデルによって判断された場合に望ましい治療効果をもたらすような抗菌性物質の量を意味する。この量はある成熟した技術によって容易に決定することが可能であり、関与する特定の細菌株や使用される特定の物質のような幾つかの因子に依存して変化する。同じ文脈において、細菌の組織又は組織表面への「接着を減らすために充分な量」とは、特定の組織又は組織表面の細菌感染の拡大を予防する、又は減じるような効果を示す抗菌性物質の量を意味する。
【０１２４】
細菌感染の処理の状況に使用される場合、“存在する抗微生物剤と組合して”の本発明の抗微生物剤の接触又は投与は、活性化合物又は抗生物質の個々の殺細菌又は増殖阻害効果以外に殺細菌又は増殖阻害効果を提供するために、抗生物質と活性化合物との同時接触又は投与を言及する。存在する抗生物質とは、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、テトラサイクリン、スルホンアミド、トリメトプリム／スルホンアミド、フルオロキノロン、マクロリド、バンコマイシン、ポリミキシン、クロラムフェニコール及びリコサミドから成る群を言及する。
【０１２５】
本明細書において使用される場合、用語“組織”とは、一つ又はそれ以上のタイプの細胞の集合体を意味し、それらは総合して生体内で一つのあるいはそれ以上の特異的な機能を果たす。ここで使用される“組織表面”とは、特定の組織と他の組織、又は組織周囲との間で境界を形成するような組織の一部分を意味する。組織表面は動物の外表面、例えば皮膚又は角膜を意味することもあるし、あるいは内表面、例えば腸の内面又は創傷や外科手術によって動物周囲の外側に露出した表面を意味することもある。
【０１２６】
本明細書において使用される場合、用語“候補体化合物の結合の測定”とは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、そのフラグメント又は変異体と物理的に結合した化合物の量を定量的に評価できるような検査法の利用を意味する。
“候補体化合物”とは、本明細書において使用される場合、Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの発現又は活性を調節する能力を有するいずれかの化合物である。
【０１２７】
本明細書において使用される場合、用語“同時に”とは、本発明のアッセイに関して使用される場合、特定された成分又は作用が時間的に少なくとも部分的に一致する事実を言及し、そして従って、その開始及び終結点が同一である事実に制限されない。確かに、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドと候補体化合物及びバクテリオファージポリペプチドとの同時接触は、接触期間における部分的一致であるが、しかし後者の２つは正確に同じ時間でアッセイ混合物中に導入される事実を必ずしも表さない。
【０１２８】
本明細書において使用される場合、用語“直接的又は間接的に検出可能な標識”とは、化合物を直接的に検出可能にする（例えば、アイソトープ又はフルオロフォア（蛍光標識試薬））又は間接的に検出可能にする（例えば、適切な基質の存在下で検出可能な酵素活性、又は抗体あるいは他の特定の指示薬を加えることによって検出可能な特異抗原やその他の標識）ような分子の、候補体化合物への付加を意味する。
【０１２９】
“スクリーニング方法”とは、１又は少数の化合物よりもむしろ、多数の化合物の適切な活性又は性質を評価するための方法を言及する。例えば、スクリーニング方法は、便利には、少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００、さらにより好ましくは少なくとも１０，０００及び最も好ましくは少なくとも１００，０００、又はそれ以上の種類の化合物を試験するために使用され得る。特定の態様においては、前記方法は、先導的な開発のための化合物のライブラリーに対する、自動化された、費用効率の良い高処理能力のスクリーニングに従う。
【０１３０】
関連する観点又は好ましい態様においては、本発明は、多くの化合物、好ましくは多くの小分子のいずれかがＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に対して活性であるかどうかを決定することによって、可能性ある抗微生物剤についてのスクリーニング方法を提供する。好ましい態様は、上記観点について記載される態様、例えば１又は複数の試験化合物が細菌標的物に結合するか又はその標的物の活性のレベルを低めるかどうかを決定することを包含する態様、及び上記に記載されるような多くの異なった標的物を使用する態様を包含する。
【０１３１】
用語“化合物”とは好ましくは、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド、例えば阻害ＯＲＦ遺伝子生成物又はその標的物に結合し、そしてそれにより、その活性又は発現を阻害し、消滅し、又は増強する、小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド及び抗体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。有能な化合物は、結合分子、例えばバクテリオファージ遺伝子生成物上の同じ部位を結合し、それにより、バクテリオファージ遺伝子生成物のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドへの結合を妨げる、小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド、例えば密接に関連するタンパク質又は抗体であり得る。
【０１３２】
用語“化合物”は、ポリペプチドの結合部位に結合し、そしてそれを占有し、それにより、正常な生物学的活性が妨げられるよう、細胞結合分子への結合を妨げる小分子をたぶん包含する。小分子の例は、小さな有機分子、ペプチド又はペプチド様分子を包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい可能性ある化合物は、バクテリオファージによりコードされる阻害ＯＲＦ、及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の変異体、及びそのいずれかの相同体及び／又はペプチド類似体及び／又はフラグメントに関連する化合物を包含する。
【０１３３】
可能性あるポリペプチド拮抗物質の他の例は、抗体、又はある場合、ポリペプチドの場合のように、リガンド、基質、受容体、酵素、等に対して密接に関連するオリゴヌクレオチド又はタンパク質、例えばリガンド、基質、受容体、酵素、等のフラグメント；又は本発明のポリペプチドに結合するが、しかしポリペプチドの活性が妨げられるよう、応答を誘発しない小分子を包含する。他の可能性ある化合物は、アンチセンス分子を包含する（Ｏｋａｎｏ， １９９１， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ５６， ５６０； “Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８） を、それらの分子の記載について参照のこと）。
【０１３４】
本明細書において使用される場合、用語“ライブラリー”とは、１００種の化合物、好ましくは１０００、さらにより好ましくは５０００、さらにより好ましくは１０，０００又はそれ以上、及び最も好ましくは５０，０００又はそれ以上の化合物の収集を言及する。
本明細書において使用される場合、用語“小分子”とは、３０００Ｄａ以下、望ましくは２０００又は１５００、さらに望ましくは１０００、最も望ましくは６００Ｄａ以下の分子量の化合物を意味する。必須ではないができれば、小分子はオリゴペプチドでは無いことが望ましい。
【０１３５】
本明細書において使用される場合、用語“類似物質”とは、天然、合成又はキメラ分子である化合物を意味し、この化合物は構造的、機能的に参照化合物に関連する。本発明における用語“ペプチド類似物質”とは、例えば、その活性に関連したペプチド又はポリペプチドの三次元的構造の特徴を類似するようなペプチドではない化合物、例えばファージや細菌のＯＲＦにコードされたポリペプチドのペプチド又は活性部位の構造と類似した化合物のことである。
【０１３６】
本明細書において使用される場合、用語“バクテリオファージ性阻害タンパク質”とは、バクテリオファージの核酸配列にコードされるタンパク質を意味し、このタンパク質は宿主細菌内で細菌性機能を阻害する。従って、これは細菌阻害性ファージ産物である。用語“バクテリオファージ性阻害タンパク質”は、バクテリオファージ性阻害タンパク質のフラグメント、誘導体、又は活性部位を含む。
【０１３７】
本発明の上記アッセイ方法の１つよりも多くの態様においては、タンパク質又はポリペプチドの１つ又は両者の複雑でない形からの複雑な形の分離を促進し、そしてアッセイの自動化を適合するために、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はその標的分子又はリガンドのいずれかを固定することが所望される。候補体化合物の存在及び不在下でＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質（又はそのフラグメント又は変異体）への試験化合物の結合、又は標的分子又はリガンドとのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質の相互作用は、反応体を含むために適切ないずれかの容器において達成され得る。
そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管及び微小遠心分離管を包含する。
【０１３８】
１つの態様においては、１又は両者のタンパク質のマトリックスへの結合を可能にするドメインを付加する融合タンパク質が供給される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的物融合タンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／９６ ＯＲＦ ７８）が、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， ＳＴ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン由来のマイクロタイタープレート上に吸着され、次に、試験化合物、又は試験化合物及び非吸着の標的タンパク質又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質のいずれかと共に組合され、そしてその混合物が複合体形成の助けとなる条件下で（例えば、塩及びｐＨのための生理学的条件下で）、インキュベートされる。インキュベートに続いて、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルが洗浄され、末結合の成分が除去され、ビーズの場合、マトリックスが固定され、複合体が、例えば上記のようにして、直接的に又は間接的に決定される。他方では、複合体はマトリックスから解離され、そしてＳＴＡＡＵ＿Ｒ９結合又は活性のレベルが、標準技法を用いて決定される。
【０１３９】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技法（当業界において良く知られている）はまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用され得る。例えば、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質、又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９標的分子又はリガンドのいずれかが、ビオチン及びストレプタビジンの接合を用いて固定され得る。ビオチニル化されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質、又は標的分子又はリガンドは、当業界において知られている技法（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、そしてストレプタビジン−被覆された９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルに固定される。
【０１４０】
他方では、ＣＩ−ＭＰＲタンパク質、標的分子又はリガンドと反応性であるが、しかしＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質（又はその一部）のその標的分子又はリガンドへの結合を妨げない抗体が、プレートのウェルに誘導体化され、そして末結合の標的物又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質が、抗体接合によりウェルにおいて閉じ込められる。ＧＳＴ−固定された複合体について上記記載される方法の他に、そのような複合体を検出するための方法は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質又は標的分子と反応性の抗体を用いて複合体の免疫検出、及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質と関連する酵素活性の検出に依存する酵素−連結のアッセイを包含する。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、用語“活性部位”とは、バクテリオファージ由来の配列を言及する場合、細菌性標的の阻害の要因となる、又は重要な因子となるバクテリオファージ性阻害タンパク質の抗原決定基、酵素あるいは調節ドメイン、又はフラグメントを意味する。活性部位は隣接する配列から切り離すことが可能で、分離した状態でも阻害に効果があることが期待される。
本明細書において使用される場合、用語“細菌感染の治療”とは、できれば哺乳動物、さらに望ましくはヒトのような宿主において、細菌の増殖や又は代謝活性、あるいは細菌の個体数を阻害又は除去するような処置を意味する。
【０１４２】
本明細書において使用される場合、用語“細菌”とは、単一の細菌の株を意味し、はっきりと異なる意味が示されない限り、その細菌株の一個の細胞及び複数の又は細胞群を含む。細菌又はバクテリオファージを参照した場合、用語“株”とは、特定の遺伝的要素を持つ細菌又はファージを意味する。遺伝的要素は、組換えベクターのような遺伝的要素を含む。従って、例えば、二つのさもなくば同一の細菌性細胞がそれぞれ異なる挿入部位を持つベクター（例えばプラスミド）を含むような場合、異なる株であることを意味する。
本明細書において使用される場合、用語“診断”とは、細菌感染の原因となる微生物又は微生物株の同定を意味する。
【０１４３】
本明細書において使用される場合、用語“スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ａｕｒｅｕｓ）の感染”とは、哺乳動物、望ましくヒトのインビボ又は表面におけるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株細胞の存在、発育又は増殖を意味する。
本明細書において使用される場合、用語”バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８にコードされるポリペプチド“とは、配列番号３によってコードされるポリペプチド、又はそのフラグメントあるいは誘導体を意味し、これは配列番号４に開示した配列のバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８コードされたポリペプチドの活性部位を含む。
【０１４４】
本明細書において使用される場合、用語“ポリペプチド複合体”とは、二つ又はそれ以上のポリペプチドが互いに物理的に会合したまとまりを意味する。このような物理的な会合は、むしろ、このようなポリペプチド複合体において一つ又はそれ以上のポリペプチドが示す活性の幾つかの側面に必要とされることが期待される。
本明細書において使用される場合、用語“物理的な会合”とは、二つの成分の間での接触を含む二つの成分間の相互作用を意味する。
【０１４５】
本明細書において使用される場合、用語“生体試料”とは、個体から得られた試料、又は微生物が感染、侵襲している又は保菌個体から得られた試料を意味する。これは細胞、組織や排出物、例えば骨、血液、血清、脳脊髄液、精液、唾液、筋肉、軟骨、器官組織、皮膚、尿、便又は剖検試料を含むが、これに限るものではない。
本明細書において使用される場合、用語“疾病”とは、細菌株によって引き起こされる、又は感染に関連する全ての疾病を意味し、これは例えば、中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄（脳）膜炎、副鼻腔炎、胸腔蓄膿及び心内膜炎、そして例えば脳脊髄の感染のような最も典型的な髄（脳）膜炎が含まれる。
【０１４６】
本明細書において使用される場合、用語“融合タンパク質”とは、読み枠にあわせて融合した二つ又はそれ以上の個々のタンパク質由来のアミノ酸コーディング配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。このようなタンパク質は個々のタンパク質由来の融合アミノ酸配列を備えている。
本明細書において使用される場合、用語“宿主細胞”とは、形質転換又は形質導入された細胞であり、あるいは外因性ポリヌクレオチド配列により、形質転換又は形質導入の可能な細胞である。
【０１４７】
本明細書において使用される場合、用語“免疫学的に同等な誘導体”とは、脊椎動物において抗体を産生するために適切な処置として使用された場合、結果的に抗体が病原体と哺乳動物宿主の間における迅速な物理的相互作用に干渉するように働くような、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はそのどちらかに同等な物質を含む。
【０１４８】
本明細書において使用される場合、用語“免疫特異的”とは、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに対して、各々他の関連したポリペプチド又はポリヌクレオチド、特に先行技術におけるこれらのポリペプチド及びポリヌクレオチドに対する親和性に較べて、充分により卓越した親和性を有するという抗体の特徴を意味する。
本明細書において使用される場合、用語“個体”とは、多細胞性真核生物を意味し、後生動物、哺乳動物、ヒツジ科動物、ウシ科動物、類人猿、霊長類及びヒトを含むがこれに限るものではない。
【０１４９】
本明細書において使用される場合、用語“生物”とは、（ｉ）原核生物、これは以下のものを含むがこれに限るものではない；ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ファンシゼラ属（Ｆａｎｃｉｓｅｌｌａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エリジペロスリックス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、
【０１５０】
ブランハメラ属（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトバチルス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム属（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エシェリチア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、スピリルム属（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に属するもの、及びさらに以下を含むがこれに限られるものではない；
【０１５１】
以下の種又は属に属するもの、Ａ群ストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｂ群ストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｃ群ストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｄ群ストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｇ群ストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ Ｇ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・フィカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・デュランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、ナイセリア・ガノーリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ナイセリア・メネンジャイティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、
【０１５２】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、ガードネラ・ヴァジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ミコバクテリウムツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、ミコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ミコバクテリウム・レプラ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、アクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｔｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ボルデテラ・ペルチュシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルデテラ・パラペルチュイス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、
【０１５３】
シゲラ・ディゼンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・エジプチウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ドゥクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、シトロバクター・フロンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、セラチア・マルセセン（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｓｅｎｓ）、セラチア・リケファシアン（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、シゲラ・ダイセンテリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉｉ）、
【０１５４】
シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フランシゼラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｓｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・アボーティス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｉｓ）、バチルス・アンソラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、リケッチア・リケッチ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）及び クラミジア・トラコマイティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）、
【０１５５】
（ｉｉ） アーキバクター（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒ）を含むがこれに限らない古細菌（ａｒｃｈａｅｏｎ）及び（ｉｉｉ） プロトゾア（ｐｒｏｔｏｚｏａｎ）、真菌（ｆｕｎｇｕｓ）、及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）又はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の一員、及びサッカロミセス・セリビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓｅａｅ）、クルベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）又はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を含むがこれに限らない単細胞性又は繊維状真核生物。
【０１５６】
本明細書において使用される場合、用語“組換え発現システム”とは、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを産生するために、本発明のポリペプチド又はその一部をコードする配列を含む、あるいは本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主細胞あるいは宿主細胞溶解液に形質転換又は導入するシステムを意味する。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、用語“人工合成”とは、ペプチド、ポリペプチド又はポリペプチドを参照して使用される場合、細胞又は重合酵素を使用しないで、アミノ酸又はヌクレオチドのサブユニットを化学的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド及びペプチド合成の化学反応は、技術的よく知られている。
アミノ酸を表す標準的な１文字及び３文字の略号に加えて、用語“Ｘ”又は“Ｘａａ”が本発明の特定のポリペプチドについての記載中に使用されることがある。“Ｘ”及び“Ｘａａ”とは、天然に生じる２０アミノ酸の全てが、ポリペプチド配列中のこのように指定された位置に置換しうることを意味する。
【０１５８】
二つのポリペプチドの相互作用という文脈において、本明細書において使用される場合、用語“特異的な結合”とは、二つのポリペプチドがポリペプチド上の個々の領域又はドメインを介して物理的に相互作用することを意味し、その相互作用は相互作用するドメインのアミノ酸配列に依存する。一般的に、もう一方に特異的に結合するポリペプチドの平衡結合濃度は、約１μＭ 又はそれ以下、望ましくは１００ ｎＭ 又はそれ以下、１０ ｎＭ 又はそれ以下、１ ｎＭ 又はそれ以下、１００ ｐＭ 又はそれ以下、ちょうど１０ ｐＭ 又はそれ以下の範囲にある。
【０１５９】
本明細書において使用される場合、用語“結合の減少”とは、ある設定条件における二つのポリペプチド間の物理的な会合によって生じるシグナルが、他の基準となる設定条件におけるシグナルに較べて減少していることを意味する。もしシグナルが減少した場合、シグナルは基準となる設定条件におけるレベルよりも少なくとも１０％低く、望ましくは２０％、４０％、５０％、７５％、９０％、９５％あるいはちょうど１００％（例えば検出不可能な相互作用）低くなる。
【０１６０】
本明細書において使用される場合、用語“検出可能なマーカー”とは、酵母ツー・ハイブリッド法の文脈で使用される場合、あるポリペプチドを意味し、これはそのポリペプチドを発現している細胞に、その発現ポリペプチドの存在又は量を表すシグナルを示す特徴を付与するようなポリペプチドのことである。検出可能な標識は、エピソームとして存在することがあり、又は宿主細胞の染色体に組込むことができるプラスミド上にコードされる。検出可能な標識は、比色分析又は蛍光検出が出来るような酵素をコードするポリペプチド（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＬａｃＺ、これは基質類縁物質Ｘ−ｇａｌを青色を示すように変換する触媒作用を持つ）、抗生物質耐性を付与するような酵素をコードするポリペプチド、及びある特定の成分を欠く培養液上で酵母が発育できるような能力を付与する（すなわち、栄養欲求性の解除に決定的な）酵素をコードするポリペプチドを含むが、これに限るわけではない。
【０１６１】
本明細書において使用される場合、用語“結果的な検出可能な標識の発現”とは、検出可能な標識の発現に必要な因子の相互作用（例えば、ツー・ハイブリッド転写促進ドメイン及びＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質）が転写促進を引き起こし、検出可能な標識の検出可能なレベルの転写を促すことを意味する。「検出可能なレベル」とは、一つ又はそれ以上の因子が実質的に存在しない状態で生じるバックグラウンドの発現と、標識の発現に必要な条件における発現レベルが区別しうるという意味である。検出可能なレベルは、検出可能な標識の性質に依存して様々であるが、一般的にその標識のバックグラウンドレベルより、少なくとも約１０％又はそれ以上のレベルになる。
【０１６２】
本明細書において使用される場合、用語“発現の減少”とは、他の基準となる設定条件における発現に較べて、ある設定条件において検出可能な標識の発現が減少することを意味する。もし検出可能な標識の発現が減少した場合、発現は基準となる設定条件におけるレベルよりも少なくとも１０％低く、望ましくは２０％、４０％、５０％、７５％、９０％、９５％あるいはちょうど１００％（例えば、発現しない）低くなる。
【０１６３】
Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９配列の同定：
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを同定するために使用される方法は、１９９８年１２月３日に出願されたアメリカ仮特許出願６０／１１０，９９２号及び１９９９年１２月３日に出願されたｐＣＴ国際出願ＷＯ１９９９／ＩＢ９９／０２０４０号に詳細に記載されている。手短に言及すれば、このＰＣＴ出願は、選択された細菌を感染することができるバクテリオファージに関する。ファージ遺伝子情報の配列決定及び特徴化は、ファージによりコードされるすべての読み取り枠（ＯＲＦ）、例えばそれらの宿主の阻害において必須であるか又は助けに成るそれらの同定を可能にする。
【０１６４】
個々のＯＲＦは、コンピューターソフトウェアを用いて同定され、そして宿主において個々に発現される。次に、宿主生存性に対するこの発現の効果が測定される。宿主細菌を阻害するファージゲノムのＯＲＦの同定は、細菌インヒビター化合物自体（又はさらにインヒビターを得るために誘導体化されているか又は修飾されている）として、及びファージコードのインヒビターによりもたらされる細菌標的物の同定のための手段として使用され得る化合物を供給する。
【０１６５】
例１及び２に詳細に記載される方法論を用いて、細菌増殖阻害９６ファージＯＲＦ ７８タンパク質を特異的に結合するＳ．アウレウスポリペプチドが単離された。手短に言及すれば、９６ ＯＲＦ ７８タンパク質は、Ｓ．アウレウスタンパク質抽出物による親和性クロマトグラフィー結合段階においてリガンドとして使用された。選択されたＳ．アウレウス相互作用性ポリペプチドは、精製され、そしてさらに、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ技法を用いてのトリプシン消化及び質量分光測定により分析された（Ｑｉｎ， Ｊ．，など．， （１９９７） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｒｍ． ６９： ３９９５−４００１）。
【０１６６】
得られる質量スペクトルのコンピューター分析（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏＦｏｕｎｄ）は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｓｔａｐｈ．ｈｔｍｌでのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｓ． アウレウスゲノムデータベースにおけるＳ．アウレウスヌクレオチド配列においてその対応するＯＲＦを同定する。９６ ＯＲＦ ７８と、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はそのフラグメントにおいて言及される候補体標的タンパク質との間の相互作用はまた、酵母ツー・ハイブリッドアッセイにおいて確かめられた。細菌ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はそのフラグメントと９６ ＯＲＦ ７８との間の相互作用は、親和性ブロット及び表面プラスモン共鳴アッセイを用いてさらに、特徴づけられた。
【０１６７】
タンパク質ファミリーの進化的に異なるメンバーの個々のメンバー間の配列類似性は通常、配列の完全な長さにそってランダムに分布されないが、しかししばしば、“ドメイン”中にクラスター化される。それらは、タンパク質のグループの重要な生化学的機能を行う触媒及び／又は調節構造を形成する保存された立体部分に対応する。市販及び公的に入手できるコンピューターソフトウェアプログラムは、新しい疑問においてそのようなモチーフ及びドメインを同定することができ、その疑問の配列についての追加の機能的情報を提供する。そのようなモチーフ及び部分は、直接的にアクセスされ得る公的データベースにそれら自体、寄託されている（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース；ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇでの３Ｄ−ＡＬＩ；Ｐｆｏｍ； Ｂｌｏｃｋｓ： ＰＲＯＳＩＴＥ）。
【０１６８】
ファージ９６ ０ＲＦ ７８結合研究において同定されるＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９が、公的なドメインデータベースにおけるすべての他の配列と比較された。図７Ｂに示されるように、結果は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９が多数の細菌ＤＮＡプライマーゼ、例えばＢ．ステアロサーモフィラス（３４％の同一性）、Ｂ．サブチリス（３６％の同一性）及びＥ．コリ（２７％の同一性）のそれらのプライマーゼに関連することを示した。より特定には、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９は、完全な配列を通してのアミノ酸レベルで、９２％のアミノ酸同一性及び９２％の類似性を伴なって、Ｓ．アウレウス株９１２ＤＮＡプライマーゼ（ｇｉ｜２４９４１４７｜ｓｐ｜Ｏ０５３３８｜ＰＲＩＭ＿ＳＴＡＡＵ ＤＮＡ ＰＲＩＭＡＳＥ）に対して高く関連している。
【０１６９】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９アミノ酸配列のＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ調査分析の結果は、アミノ酸１〜３３９のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９領域における２種の高く関連するＰｆａｍモチーフの存在を示した（図７Ａ）。Ｎ末端ＣＨＣ２亜鉛フィンガードメインはアミノ酸位置３〜１００に及び、そして中央に位置するＴｏｐｒｉｍドメイン（アミノ酸位置２６０〜３３９）は細菌ＤｎａＧ−型プライマーゼにおける保存される触媒ドメインに対応する。
【０１７０】
ＤＮＡプライマーゼの機能：
核酸代謝はすべての細胞のために必須である。ＤＮＡ合成機能は、細菌における染色体の急速且つ高い進行性複製を達成するよう作用する多くのタンパク質を包含する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ， Ａ．， ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， Ｔ．Ａ． １９９２， ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａ．， ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， Ｔ．Ａ． １９９２， ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｇ， ｐｐ． １６５−１９４）。細菌プライモソーム及びレプリソームのタンパク質間での整合された相互作用は、その効能のために必須である。
【０１７１】
ＤＮＡプライマーゼは、リーディング鎖合成の開始の他に、それらはラギング鎖に対して短いＲＮＡプライマーを合成し、そして従って、染色体複製の間、そのラギング鎖の複製を可能にするので、染色体複製において必須の役割を演じる。Ｂ．サブチリス及びＥ．コリの両者のプライマーゼ遺伝子ｄａｎＧが、条件付で致死的な感温性ＤＮＡ複製変異体に関する研究において単離された（Ｒｏｗｅｎ， Ｌ． ａｎｄ ｋｏｍｂｅｒｇ， Ａ． １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３： ７５８−６４； Ａｌｏｎｓｏ， Ｊ． Ｃ． など．， １９８８， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１４： ４８２−４８９）。
【０１７２】
Ｅ．コリＤｎａＧは、ラギング鎖のＤＮＡ合成を促進するために使用されるＲＮＡプライマーの調節された合成を達成するためにプライモソーム内での複製ＤＮＡヘリカーゼＤｎａＢと相互作用する。ＤＮＡヘリカーゼは、重複ＤＮＡを前進的に巻き戻し、そしてＤＮＡ合成のために必要なＤＮＡポリメラーゼＩＩＩハロ酵素の結合を可能にすると思われる。Ｅ．コリのＤｎａＧプライマーゼは、次の２種の機能的ドメインを含んで成る：複製アッセイにおいて鋳型認識及びプライマーゼ活性を保持するＮ−末端の４９ｋＤａドメイン；及びＤｎａＢとの機能的相互作用のために必要とされるＣ−末端の１６ｋＤａドメイン（Ｔｏｕｇｕ， Ｋ． など．， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ４６７６−４６８２； Ｌｕ， Ｙ． Ｂ． など．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １２９０２−１２９０７）。ＤｎａＧプライマーゼのＤｎａＢヘリカーゼ−結合領域のさらなる範囲決定は、ＤｎａＧのＣ−末端の１６個のアミノ酸のみが、Ｅ．コリＤｎａＢとの機能的相互作用のために必要とされることを示した（Ｔｏｕｇｕ， Ｋ． ａｎｄ Ｍａｒｉａｎｓ， Ｋ． Ｊ． １９９６）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ２１３９８−２１４０５）。
【０１７３】
Ｂ．ステアロサーモフィラスのＤｎａＧプライマーゼとＤｎａＢヘリカーゼとの間の相互作用の広範な特徴化（Ｂｉｒｄ， Ｌ． Ｅ． など．， ２０００， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９： １７１−１８２）は、２種のタンパク質がインビトロで安定した複合体を形成する観察に由来した。制限されたタンパク質加水分解及びＰＣＲ突然変異誘発を用いて、続いてのゲル濾過及び生化学アッセイによる、Ｂ．ステアロサーモフィラスプライマーゼ及びヘリカーゼの組織的切断は、プライマーゼのＣ−末端ドメインが、ＤｎａＢと相互作用し、そしてＤｎａＢヘリカーゼのＡＴＰアーゼ及びヘリカーゼ活性を刺激するために十分であることを示した。直接的には試験されていないが、Ｂ．ステアロサーモフィラスプライマーゼのＮ−末端は、特徴的プライマーゼドメインを含み、そして従ってＢ．ステアロサーモフィラスプライマーゼの構成はＥ．コリプライマーゼのそれとたぶん適合する。
【０１７４】
ヘリカーゼとのその相互作用の他に、プライマーゼはまた、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩＩＩハロ酵素（ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ ＨＥ）との物理的相互作用を受ける（Ｗｕ， Ｃ． Ａ． など．， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ４０７４−４０８３）。プライマー合成の間のＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ ＨＥによるプライマーゼの会合は、その触媒活性を調節し、そしてこの調節相互作用は、プライマー末端上のＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ ＨＥの予備開始複合体の形成に関係なく生じる。
【０１７５】
Ｅ．コリＤｎａＧプライマーゼはまた、複製フォーク内の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質ＳＳＢに結合する。プライマーゼ−ＳＳＢ相互作用は、プライマーゼと発生性ＲＮＡプライマーとの間での強い会合のために必要である。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩβサブユニット、すなわち感作された部位上にアセンブリーされるべきスライディングクランプのために、プライマーゼは、最初にそのＲＮＡプライマーから置換されるべきである。この置換機能は、ＳＳＢと共に、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ ＨＥ， ｃｈｉの単一サブユニットにより介在される（Ｙｕｚｈａｋｏｖ，Ａ． など．， １９９９， Ｃｅｌｌ ９６： １５３−１６３）。
【０１７６】
要約すると、Ｅ．コリプライマーゼは、ＤＮＡ複製機械のいくつかのメンバー、すなわちヘリカーゼ、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＨＥ及びＳＳＢと相互作用することが示されている。ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ ＨＥ及びＳＳＢとのその相互作用のためのＤｎａＧ上の結合部位は、現在十分には理解されていない。グラム陽性細菌、たとえばＢ．ステロサーモフィラスにおいては、ＤｎａＧプライマーゼは、次の３種のドメインを含むことが示されている：ａ）鋳型ＤＮＡを認識するその能力の中心である１２ｋＤａのＮ−末端亜鉛結合ドメイン；ｂ）ＤＮＡ鋳型上でリボヌクレオチドを重合するために必須である３６ｋＤａの触媒コアドメイン；及びｃ）ヘリカーゼとの相互作用を可能にするＣ−末端の１５ｋＤａのＤｎａＢ−結合ドメイン。
【０１７７】
細胞機能、及びＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の結合パートナーはまだ不明瞭であり、そして他の細菌プライマーゼとのポリペプチド類似性から最良に提案され得る。配列分析に基づけば、Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９はたぶん、次のものを含む：ａ）鋳型ＤＮＡ認識に包含され得るＮ−末端亜鉛−結合ドメイン；及びｂ）中心の触媒コアドメイン。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−関連タンパク質のアミノ酸配列の最適な全体的アラインメント分析から示されるように、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のＣ−末端領域は、単に、細菌ＤＮＡプライマーゼ間で弱く保存される（図７Ｂ）。
【０１７８】
ＤｎａＧの相同体は、今日まで研究されたすべての原核生物及びいくつかのバクテリオファージにおいて同定されている。比較配列分析に基づけば、それらのプライマーゼは、原始及び真核生物の染色体複製に必須であるプライマーゼとは構造的に異なる。従って、Ｓ．アウレウスＤｎａＧ相互作用の前兆が、存在するなら、プライマーゼ活性、すなわちＤＮＡ鋳型上でのリボヌクレオチド重合、ヘリカーゼ巻き戻し活性の刺激、ヘリカーゼＡＴＰアーゼ活性の刺激、又は他の細胞成分への結合を阻害する化合物により標的化され得ることを予測することは困難である。
【０１７９】
驚くべきことには、インビトロのヘリカーゼ、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ ＨＥ及びＳＳＢとのプライマーゼのタンパク質−タンパク質相互作用の例示にもかかわらず、及びプライモソーム内でのそれらの相互作用がインビボで効果的なプライマーゼ活性及び染色体複製の獲得において決定的である証拠にもかかわらず（Ｌｕ， Ｙ． など．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １２９０２−１２９０７）、プライマーゼに対して方向づけられた薬剤を現在入手できない。
【０１８０】
バクテリオファージが特定の細胞成分又は標的物に対して作用することによって宿主細菌の阻害に適合されたその証拠は、その成分が例えば、治療処理において、抗細菌剤を開発し、そしてそれを用いるための適切な標的物である強い示唆を提供する。本発明は、本発明がインヒビターへの標的物の接近性の表示を提供するので、細菌の必須遺伝子の単なる同定に対してこの追加の案内、及び標的物に対して作用するファージが増殖し、そして持続するので、その標的物が一定の時間にわたって十分に安定している（例えば、高い特前変異高速を受けない）表示を提供する。従って、本発明は、抗菌類剤の開発のための適切な標的物としてＳＴＡＡＵ＿Ｒ９、及びより特定には、配列番号６のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを同定する。
【０１８１】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９上における表面の相互作用の同定：
本発明は、Ｓ．アウレウスバクテリオファージゲノムによりコードされる増殖阻害タンパク質と、必須Ｓ．アウレウスタンパク質との間の特異的相互作用に一部、関する。１つの態様においては、この相互作用は、薬剤スクリーニングアッセイのための基礎を形成する。より特定には、本発明は、Ｓ． アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９によりコードされるタンパク質及びＳ．アウレウスバクテリオファージ９６ ＯＲＴ ７８タンパク質の、スクリーニングアッセイのための基礎を形成する相互作用領域に関する。本発明は、９６ ＯＲＴ ７８， 及びより好ましくは、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ と９６ ＯＲＴ ７８との間の相互作用に包含されるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ ポリペプチドフラグメントの同定方法を提供する。
【０１８２】
当業者に知られているいくつかのアプローチ及び技法は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＴ ７８の相互作用フラグメントを同定し、そして特徴づけられるために使用され得る。それらのフラグメントは、２種のタンパク質のいずれかのアミノ酸配列の一部を有する切断ポリペプチド、又はその変異体、例えばアミノ−及び／又はカルボキシル−末端アミノ酸残基を含む一連の連続した残基を含むことができる。
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＴ ７８のフラグメントが、遺伝子組換え技法によりクローン化され得る。
【０１８３】
溶液におけるタンパク質の部分的タンパク質加水分解は、多ドメインタンパク質におけるドメイン境界を明確に示すための１つの方法である。制限された消化にタンパク質をゆだねることによって、最も接近できる分解部位が選択的に加水分解される。それらの分解部位は、構造ドメイン間の連結アミノ酸に典型的なループ及び高い移動性の領域を含む、低い組織化された領域に存在する。精製されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＴ ７８タンパク質は、部分的タンパク質加水分解にゆだねられ得る。タンパク質加水分解は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又は９６ ＯＲＴ ７８の溶液と共に、低濃度のプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、及びＡｓｐ−Ｎ）により行われ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察されるように、定義されたタンパク質加水分解生成物の生成がもたらされ得る。
【０１８４】
許容できる濃度及び反応時間は、安定したタンパク質加水分解生成物への十分な長さのタンパク質のほぼ完全な転換により定義される。次に、タンパク質加水分解生成物は、相互作用できるタンパク質副−領域を決定するために、相互作用の適切なパートナー（９６ ＯＲＴ ７８又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９精製されたタンパク質）を含む神話性クロマトグラフィーにゆだねられる。相互作用ドメインは、部分的なタンパク質加水分解フラグメント内に含まれるアミノ酸残基を良好に決定するために、損なわれていないフラグメント質量及びトリプシンにより完全に消化された（イン−ゲル消化による）消化物の両者を決定するために質量分光測定により同定される。両組のデータを用いて、部分的タンパク質加水分解フラグメントのアミノ酸配列が正確に決定され得る。
【０１８５】
もう１つのアプローチは、２種のタンパク質間での相互作用を破壊することができる、個々のポリペプチドからの最少ペプチドを同定するために、９６ ＯＲＴ ７８又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の異なった部分を用いてのペプチドスクリーニングに基づかれている。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ と９６ ＯＲＴ ７８との間の相互作用を妨げることができるフラグメントが２種の相互作用タンパク質のいずれかに位置する相互作用のドメインに対応することが仮定される。それらの異なったペプチドフラグメントは、下記に記載されるようなタンパク質結合アッセイにおいて相互作用の競争体としてスクリーンされ得る。タンパク質内の相互作用部位の詳細なマッピングは、タンパク質の全アミノ酸配列を拡張する小さなオーバーラッピングフラグメント又はペプチドにより行われ得る。
【０１８６】
両タンパク質の完全な配列の代表である適切なＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ 及び９６ ＯＲＴ ７８由来のアミノ酸フラグメントは、化学合成により生成され得る。例えば、マルチピンアプローチにおいては、ペプチドは、グリコレート及び４−（ヒドロキシメチル）ベンゾエートに基づいてエステルリンカーにより誘導体化されたプラスチックピン上での少量（約５０ｎモル）のペプチドのアセンブリーにより同時に合成される（Ｍａｅｊｉ， １９９１， Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ， ４： １４２−６）。
【０１８７】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド：
本発明の一つの特徴として、“ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９”及び“ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド”、同様に生物学的に、診断的に、予防的に、臨床又は治療的に有用なその変異体、及びこのようなものから成る複合物としてここに引用されるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のポリペプチドが提供される。
【０１８８】
本発明の具体例の中でもとりわけ強調したい具体例は、天然に生じるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９遺伝子対立遺伝子によってコードされるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの変異体についてである。ここに提出する発明は、（ａ）配列番号２の全長に渡って、その配列と少なくとも同一性４０％、少なくとも同一性５０％、望ましくは少なくとも同一性８０％、さらに望ましくは少なくとも９０％、さらに望ましくは少なくとも９５％、最も望ましくは少なくとも９７−９９％又は全く同一のアミノ酸配列又は（ｂ）配列番号２の全長に渡って、少なくとも類似性６０％、少なくとも類似性７０％、少なくとも類似性８０％、少なくとも類似性９０％、少なくとも類似性９５％、少なくとも類似性９７−９９％又はさらに類似性１００％であるアミノ酸配列を含む、又はこれらから成り立つような分離ポリペプチドを提供する。
【０１８９】
本発明は、（ａ）配列番号６の全長に渡って、その配列と少なくとも同一性３５％、少なくとも同一性４０％、好ましくは少なくとも同一性６０％、より好ましくは少なくとも同一性８０％、さらにより好ましくは少なくとも同一性９５％、最も好ましくは少なくとも同一性９７−９９％又は全く同一のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号６の全長に渡って、少なくとも類似性６０％、少なくとも類似性７０％、少なくとも類似性８０％、少なくとも類似性９０％、少なくとも類似性９５％、少なくとも類似性９７−９９％又はさらに類似性１００％であるアミノ酸配列を含む、又はこれらから成り立つような分離ポリペプチドを提供する。
【０１９０】
本発明のポリペプチドは、図１（配列番号２）のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、及びポリペプチド及びフラグメント、特にＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の生物学的な活性を有するそれら、及び配列番号２のポリペプチド又はその適切な部分の５０又はそれ以上のアミノ酸に渡って少なくとも４０％の同一性、望ましくはポリペプチドの５０又はそれ以上のアミノ酸に渡って少なくとも６０％、７０％又は８０％の同一性、さらに望ましくはポリペプチドの５０又はそれ以上のアミノ酸に渡って少なくとも９０％の同一性、さらに望ましくはポリペプチドの５０又はそれ以上のアミノ酸に渡って少なくとも９５％の同一性９５％、さらにより望ましくはポリペプチドの５０又はそれ以上のアミノ酸に渡って少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを包含する。
【０１９１】
本発明のポリペプチドはまた、配列番号２のポリペプチドの５０又はそれ以上のアミノ酸に渡って、少なくとも類似性６０％、７０％、８０％又は９０％、類似性９５％又はさらに類似性９７−９９％のポリペプチド又はタンパク質も含む。
本発明のポリペプチドはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に由来するのが最も望ましいが、しかしながら、このポリペプチドは他の分類学的同一属の生物から得られることもる。本発明のポリペプチドは、例えば分類学的同一科又は目の生物から得られることもある。
【０１９２】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のフラグメントもまた本発明に含まれる。これらのフラグメントは、例えばアミノ末端及び／又はカルボキシル末端のアミノ酸配列を含む連続した一組の残基のような、図１（配列番号２）のアミノ酸配列、そのフラグメント又は変異体の一部を含む切断ポリペプチド、又はそれらの変異体を含むことがある。宿主細胞、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）によってあるいはその中で産生されるような、本発明の分解型ポリペプチドもまた望ましい。
【０１９３】
さらに望ましいのは構造的又は機能的な特性によって特徴付けられるようなフラグメントであり、例えばアルファ・ヘリックス及びアルファ・ヘリックス形成部位、ベータ・シート及びベータ・シート形成部位、反転及び反転形成部位、コイル及びコイル形成部位、親水性部位、疎水性部位、アルファ両親媒性部位、ベータ両親媒性部位、可塑性部位、表層形成部位、基質結合部位、及び高抗原提示部位があげられる。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９フラグメントは他のタンパク質又はタンパク質フラグメントとの融合タンパク質として発現させることができる。
【０１９４】
望ましいフラグメントはまた、配列番号２のアミノ酸配列から少なくとも１０、１５、２０、３０、３９、５０、１００又は２００の隣接するアミノ酸、又は配列番号６のアミノ酸配列から少なくとも１０、１５、２０、２５又はそれ異常の隣接するアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列から成る単離されたポリペプチドも包含し、ここでそのような好ましいフラグメントはＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持する。
【０１９５】
また、生物学的に“活性である”フラグメントも望ましく、これらはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の活性を仲介するようなフラグメントであり、似たような活性又はより一層の活性をもっていたり、望ましくない活性が減少したフラグメントを含む。さらに動物内、特にヒトインビボで抗原性又は免疫原性のあるフラグメントも含まれる。特に望ましいのはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の生存能力に対して必須の機能を付与するようなドメインを含むフラグメントである。
【０１９６】
本発明のポリペプチドフラグメントは、対応する完全長ポリペプチドをペプチド合成によって産生するために利用されることもある。従って、これらの変異体は本発明の完全長ポリペプチドを産生する中間物質として利用されることもある。
【０１９７】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリヌクレオチド：
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、とりわけここでスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と示されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することが、本発明の一つの目的である。
【０１９８】
本発明の一つの特徴として、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドをコードする部分を含むポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは配列番号１に設計される配列を含む。このようなポリヌクレオチドは完全長ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９遺伝子、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）をコードする。この完全長遺伝子が、この遺伝子を保有する生物、例えばスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖及び／又は生存に必須であるかどうかが検討される。
【０１９９】
本発明のさらなる特徴として、完全長ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド、そのフラグメント又は変異体（例えば、配列番号６）のフラグメントをコードする、又は発現する分離核酸分子が提供される。本発明のさらなる具体例は生物学的に、診断的に、予防的に、臨床的に又は治療的に有用なポリヌクレオチドやポリペプチド、及びその変異体やこれらを含む複合物である。
【０２００】
本発明のポリヌクレオチドは、出発材料としてスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞、配列番号１に開示したこのヌクレオチド配列情報、及び例えば細菌から染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングし配列決定するための標準的なクローニングや配列決定方法を用いることによって得られる。例えば、配列番号：１に開示したポリヌクレオチド配列のような本発明のポリヌクレオチド配列を得るために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）又は他の適当な宿主を用いたスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） 染色体ＤＮＡクローン・ライブラリを、部分的配列から得られた放射性標識オリゴヌクレオチド（望ましくは１７−ｍｅｒ又はそれ以上の）を用いて精査する。
【０２０１】
プローブと全く同じＤＮＡを持つクローンは、緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いることによって識別することが可能である。ここで使用する用語“緊縮条件”及び“緊縮ハイブリダイゼーション条件”とは、配列間の同一性が少なくとも９５％、望ましくは９７％の条件でのみ起こるハイブリダイゼーションを意味する。ハイブリダイゼーション条件の詳細な例は、ハイブリダイゼーション担体を一晩インキュベーションし（例えばナイロン又はニトロセルロース膜を４２℃、以下の溶液中で：１ｘ１０６ ｃｐｍ／ｍｌ 標識プローブ、５０％フォルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ 燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌ 変性、破砕サケ精子ＤＮＡ）、続いて０．１ｘＳＳＣ、約６５℃でハイブリダイゼーション担体を洗浄する。
【０２０２】
ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は技術的にこのような熟練した方法が良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８９）、その中でも特に十一章に例証されている。このようにしてハイブリダイゼーションによって確認された個々のクローンを配列決定することによって、クローンの同一性を確かめることが可能である。
【０２０３】
もう一つの方法として、ポリペプチドを分離するために増幅処理を利用することも可能である。この方法では、配列番号１として開示した配列を二つのオリゴヌクレオチドの標的とし、一つはＡＴＧ開始コドンをコードするＤＮＡ鎖又はその上流の配列と同一のオリゴヌクレオチド、もう一方は反対鎖の停止コドン又はその下流にあるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドを起始部位として、ポリメラーゼ・チェーン・リアクションを用いて完全長翻訳配列遺伝子が得られる。これに相当する技術についてはＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９） に述べられている。
【０２０４】
さらなる特徴として、本発明は（ａ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列と配列番号：１の全長に渡って、少なくとも同一性６０％、望ましくは少なくとも同一性７０％、さらに望ましくは少なくとも同一性８０％、さらに望ましくは同一性９０％、またさらに望ましくは少なくとも９５％、最も望ましくは少なくとも同一性９７−９９％又は全く同じ同一性を持つポリヌクレオチド配列（ｂ）配列番号：２と配列番号：２の全長に渡って又は、少なくとも同一性５０％、望ましくは少なくとも同一性６０％、さらに望ましくは少なくとも同一性７０％、さらに望ましくは少なくとも同一性８０％、さらに望ましくは少なくとも同一性９０％、またさらに望ましくは少なくとも同一性９５％、最も望ましくは少なくとも同一性９７−９９％又は全く同じ同一性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又は上述の（ａ）あるいは（ｂ）の相補配列を含む、又はこれらから成る分離ポリヌクレオチドを提供する。
【０２０５】
もう１つの態様においては、本発明は（ａ）配列番号５のポリヌクレオチド配列と配列番号５の全長に渡って、少なくとも同一性６０％、望ましくは少なくとも同一性７０％、さらに望ましくは少なくとも同一性８０％、さらに望ましくは同一性９０％、またさらに望ましくは少なくとも９５％、最も望ましくは少なくとも同一性９７−９９％又は全く同じ同一性を持つポリヌクレオチド配列（ｂ）配列番号６と配列番号６の全長に渡って又は、少なくとも同一性３５％、望ましくは少なくとも同一性４０％、さらに望ましくは少なくとも同一性５０％、さらに望ましくは少なくとも同一性６０％、さらに望ましくは少なくとも同一性７０％、さらに望ましくは少なくとも同一性８０％、さらに望ましくは少なくとも同一性９０％、またさらに望ましくは少なくとも同一性９５％、最も望ましくは少なくとも同一性９７−９９％又は全く同じ同一性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又は上述の（ａ）あるいは（ｂ）の配列の補体を含む、又はこれらから成る分離ポリヌクレオチドを提供する。
【０２０６】
本発明は、その完全長に渡って配列番号１の翻訳配列と同一のポリヌクレオチドを提供する。また、本発明によって、それらの成熟ポリペプチド又はフラグメントをコードする翻訳配列がそれ自身によって、又は同様に例えばリーダー又は分泌配列、プレ又はプロ、又はプレプロ・タンパク質配列をコードする配列のような、他の翻訳配列の読み枠にある成熟ポリペプチド又はフラグメントの翻訳配列が提供される。
【０２０７】
本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも一つの非翻訳配列を含むこともあるが、少なくとも一つの非翻訳５末端及び３末端配列に限らず、例えば転写されるが翻訳されない配列、終止シグナル（例えばｒｈｏ依存性及びｒｈｏ非依存性終止シグナル）、リボソーム結合サイト、コザック配列、ｍＲＮＡ安定化又は不安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナルのような非翻訳配列も含む。このポリヌクレオチド配列は、付加的なアミノ酸をコードする付加的な翻訳配列を含むことがある。
【０２０８】
例えば、融合タンパク質の精製を容易にする標識配列がコードされることもある。本発明の一部の具体例においてこの標識配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）によって提供され、Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ８２１−８２４ （１９８９）に述べられているような６ヒスチジンペプチド、及びＨＡペプチド・タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３７： ７６７ （１９８４））であり、両方ともこれらに融合したポリペプチド配列を精製するのに有用である。本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子及び遺伝子の発現を調節するそれに天然に関連する配列をも含むが、これに限るわけではない。
【０２０９】
本発明のポリヌクレオチドがスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ａｕｒｅｕｓ）に由来するのが最も望ましいが、しかしながら、他の分類学的同一属の生物から得られることもある。本発明のポリヌクレオチドは、例えば分類学的同一科又は目の生物から得られることもある。
【０２１０】
さらに望ましい具体例は、幾つかの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１又は０個のアミノ酸残基が以下のあらゆる組合わせで置換、修飾、欠失及び／又は付加された、配列番号２のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドのアミノ酸配列を持つようなスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ 変異体をコードするポリヌクレオチドである。さらなる好ましい態様は、いくつかの、少数の、５〜１０、 １〜５、１〜３、 ２、 １又は０個のアミノ酸残基がいずれかの組合せで置換され、修飾され、欠失され、そして／又は付加されている、配列番号２のＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドのアミノ酸配列を有するＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９変異体をコードするポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドの中でも特に望ましいのは、それらがコードするスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの翻訳配列又は活性を変えないような、サイレント・ヌクレオチド変異をコードするポリヌクレオチドである。
【０２１１】
もう１つの好ましい態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号６に示され、そしていくつかの、少数の、５〜１０、 １〜５、１〜３、 ２、 １又は０個のアミノ酸残基が、配列番号６をコードする配列の周囲の配列において、いずれかの組合せで置換され、修飾され、欠失され、そして／又は付加されている配列を有するＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドをコードする。
【０２１２】
望ましい具体例は、配列番号１のＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドと、実質的に同じ生物学的機能又は活性を保持するようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明の一部の望ましい具体例に従って図１に示したポリヌクレオチドのように、特に厳しい条件下でスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするようなポリヌクレオチドを提供する。
【０２１３】
本発明のポリヌクレオチドは、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９遺伝子と高い配列同一性を持つような完全長ｃＤＮＡ及び染色体遺伝子を分離するために、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション・プローブとして有用である。このようなプローブは一般的に少なくとも１５から約１００の残基又は塩基対から成るが、しかし、このようなプローブはむしろ約２０から５０ヌクレオチドの残基又は塩基対であることもある。特に望ましいプローブは、長さ約２０〜約３０のヌクレオチド残基又は塩基対である。
【０２１４】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）以外の細菌種由来のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９関連遺伝子の翻訳部分は、オリゴヌクレオチド・プローブを合成するために、配列番号１に添付のＤＮＡ配列を用いたライブラリのスクリーニングによって分離することができる。次に、ライブラリのどのクローンにプローブがハイブリダイズするかを決定するために、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を持つ標識ヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリのスクリーニングに使用する。
【０２１５】
完全長ＤＮＡを得るため、又は短いＤＮＡを伸長するためには幾つかの方法が利用可能であり、これらは熟練した技術としてよく知られている。例えば、これらの方法はＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）（例：Ｆｒｏｈｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５： ８９９８−９００２， １９８８を参照）の方法に基づく。例えばＭＡＲＡＴＨＯＮ ＴＭ 技術 （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって例証されるように、この技術の最近の改変は、より長いｃＤＮＡの検索を著しく簡略化してきた。ＭＡＲＡＴＨＯＮ ＴＭ 技術において、ｃＤＮＡは選ばれた細胞から抽出したｍＲＮＡから作成され、そして「アダプター」配列が両端に連結される。
【０２１６】
次に、遺伝子特異的及びアダプター特異的オリゴヌクレオチド・プライマーの組合わせを用いて、ＤＮＡの”欠失”５末端を増幅するために、ＰＣＲによって核酸を増幅する。そして「入れ子になった」プライマーを用いてＰＣＲを繰り返す。このプライマーは増幅産物の内側にアニールするようにデザインされている（一般的には、アダプター配列３末端のさらに内側にアニールするアダプター特異的プライマー、及び選択された遺伝子配列５末端のさらに内側にアニールする遺伝子特異的プライマーである）。次に、この反応産物をＤＮＡ配列決定によって解析することが可能であり、完全な配列を得るために既知のＤＮＡに直接連結することによって、又は５末端プライマーをデザインするために新しい配列情報を用いて別個の完全長ＰＣＲを実施することによって、完全長ＤＮＡが構築される。
【０２１７】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、例えばここでさらにポリヌクレオチド・アッセイに関連して論じられているように、疾病、特にヒトの疾病の治療法や診断法を開発するために、特に研究試薬及び試料として利用可能である。
【０２１８】
配列番号１の配列由来オリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオチドは、感染組織の細菌内において、ここに同定されたポリヌクレオチドの全長又は一部が転写されたか否かを決定するために、反応用ＰＣＲプライマーをデザインするのに有用である。これは、本発明のポリヌクレオチドが、これらの配列を持つ細菌株による感染の診断に有用であるということである。このような配列は、感染のステージ及び病原体が獲得してきた感染型の診断において役立つことも知られている。
【０２１９】
本発明は、成熟タンパク質＋付加アミノ又はカルボキシル末端アミノ酸、又は成熟タンパク質内部にあるアミノ酸であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。このような配列は、前駆体から成熟した形へのタンパク質のプロセッシングにおいて機能している可能性があり、中でもタンパク質輸送を可能にし、タンパク質の半減期を長くしたり短くしたり、又は検査又は産生のためのタンパク質操作を容易にする可能性がある。生体内における通例としては、付加アミノ酸は細胞性酵素によって成熟タンパク質から切り取られる。
【０２２０】
一つ又はそれ以上のプロ配列と融合した成熟型ポリペプチドを含む前駆タンパク質は、そのポリペプチドの非活性型であることがある。プロ配列が取り除かれた場合、一般的にこのような非活性前駆体は活性化される。プロ配列の幾つか又は全てが活性化の前に取り除かれることが多い。一般に、このような前駆体はプロタンパク質と呼ばれる。
【０２２１】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質とリーダー配列（これは前駆タンパク質として参照されることもある）、前駆タンパク質のリーダー配列ではないプロ配列を一つ又はそれ以上持つ成熟タンパク質、又はプロタンパク質の前駆体であり一般的に活性のある成熟型ポリペプチドを産生するプロセッシングの段階で取り除かれるようなリーダー配列と、一つ又はそれ以上のプロ配列をもつプレプロタンパク質をコードする可能性がある。
【０２２２】
Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕの標準的なヌクレオチド表示に加えて、用語「Ｎ」が本発明の特定のポリヌクレオチドを示すために使用されることがある。「Ｎ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列においてこのように示された位置に４つのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドのどれでも挿入可能なことを意味する。例外として、Ｎは隣接するヌクレオチドの位置と組合わさって正しい読み枠で読まれた場合に、このような読み枠中に誤った終止コドンを作り出す可能性のあるヌクレオチドではないことが望ましい。
本発明の各々のそして全てのポリヌクレオチドに対して、これに相補的なポリヌクレオチドもまた提供する。
【０２２３】
ベクター、宿主細胞及び発現システム
本発明は、本発明の複数のポリヌクレオチド又は一つのポリヌクレオチドを含むベクターと、組換え技術によって本発明のベクターと共に遺伝子操作され、本発明のポリペプチドの産生を遺伝的に操作した宿主細胞にも関与する。本発明のＤＮＡ構造物由来のＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を産生するためには、無細胞転写システムも利用可能である。
【０２２４】
本発明の組換えＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及びバクテリオファージポリペプチドは、熟練した技術としてよく知られる方法によって遺伝子操作した発現システムを備えている宿主細胞から得ることができる。結果的に、さらなる解釈として、本発明は本発明の一つ又は複数のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はバクテリオファージポリヌクレオチドを含む発現システムに関与しており、このような発現システムによって遺伝子操作した宿主細胞、組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関与する。
【０２２５】
本発明の組換えＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを産生するためには、宿主細胞を遺伝子操作し、発現システム又はその一部、又は本発明のポリヌクレオチドを導入することが可能である。適当な宿主の代表例として細菌性細胞（グラム陽性及びグラム陰性）、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞があげられる。ポリヌクレオチドは、例えば塩化カルシウム処理によってＤＮＡの取り込み能を惹起するような（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 上述）、標準的な化学的処理方法を用いて細菌に導入できる。もし必要であれば、例えば酢酸リチウムを介した形質転換のような標準的な化学的方法によって、真菌（例えば、酵母）宿主細胞にポリヌクレオチドを導入することもできる。
【０２２６】
本発明のポリペプチドを産生するためには、非常に多様な発現システムが有用である。このようなベクターは、中でも染色体、エピソーム、ウイルス由来ベクターを含む。例えば、細菌性プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来、酵母染色体因子由来、ウイルス由来のベクター、及びこれらの組合に由来するベクターが、本発明において有用である。
【０２２７】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は尿素抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、フォスフォセルロース・クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、及びレクチン・クロマトグラフィを含むよく知られた方法によって、組換え細胞培養液（又は細胞体）から回収及び精製される。分離及び／又は精製の過程でポリペプチドが変成した場合、活性のある構造を取り戻すために、タンパク質の再折りたたみに関するよく知られた技術が利用可能である。
【０２２８】
診断、予後診断、血清型、及び変異試験法
本発明はまた、本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチド及びポリペプチドの診断試薬としての使用にも関する。核酸生物、特に哺乳類及び特にヒトにおけるＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの検出は、疾病の診断、疾病の段階又は薬剤への感染性生物の応答についての診断方法を提供するであろう。真核生物、特に哺乳類及び特にヒト、特にＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９遺伝子又はタンパク質を含んで成る生物により感染されるか又は感染されると思われるそれらは、種々のよく知られている技法及び本明細書に提供される方法により核酸又はアミノ酸レベルで検出され得る。
【０２２９】
予後、診断又は他の分析のためのポリペプチド及びポリヌクレオチドは、推定上の感染された及び／又は感染された個人の身体材料から得られる。それらの源、特にＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかからのポリヌクレオチドが、検出のために直接的に使用され得るか、又は分析の前、ＰＣＲ又はいずれか他の増幅技法を用いて酵素的に増幅され得る。ＲＮＡ、特にｍＲＮＡ，ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡはまた、同じ手段で使用され得る。増幅を用いて、個人に存在する感染性又は残留生物の種及び株の特徴化が、生物の選択されたポリヌクレオチドの遺伝子型の分析により行われ得る。欠失及び挿入は、関連する生物、好ましくは同じ属の異なった種又は同じ種の異なった株から選択された対照配列の遺伝子型に比較して、増幅された生成物のサイズの変化により得る。
【０２３０】
点変異は、増幅ＤＮＡをラベルされたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることによって、及び融解温度又は復元カイネティクスの違いを検出することによって確認できる。完全に又は有意に一致する配列は、それぞれＤＮＡ又はＲＮＡについて、ＤＮアーゼ又はＲＮアーゼ消化により、又は溶融温度又は変性動力学における差異を検出することにより、不完全な又はより有意に一致しない二重鎖と区別することが可能である。
【０２３１】
ポリヌクレオチド配列の違いは、基準となる配列と比較したポリヌクレオチドフラグメントのゲル内電気泳動度の違いから検出することもできる。これは変性剤存在下又は非存在下で行われる。ポリヌクレオチドの違いは、直接ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を解読することによっても検出できる（例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ， （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０， １２４２を参照）。特異的な部位における配列の変化は、ＲＮａｓｅ、Ｖ１及びＳ１プロテクション・アッセイのようなヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ、又は化学的切断法によっても明らかになる（例えば、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１参照）。
【０２３２】
他の具体例として、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含むオリゴヌクレオチド・プローブのアレイが、例えば遺伝的変異、血清型、分類学による分類又は同定の効率的なスクリーニングを行うために構築可能である。アレイ技術法はよく知られており、適用範囲が広く、遺伝子発現、遺伝的連鎖、及び遺伝的可変性を含む分子遺伝学における様々な疑問に対処するために利用可能である（例えば、Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， ６１０参照）。
【０２３３】
従って異なる見地からみると、本発明は、（ａ）本発明のポリヌクレオチド、望ましくは配列番号：１のヌクレオチド配列又はそのフラグメント（例えば、配列番号５）；（ｂ）（ａ）の配列に相補的なヌクレオチド配列；（ｃ）本発明のポリペプチド、望ましくは配列番号２のポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）；あるいは（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、望ましくは配列番号２のポリペプチド又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）に対する抗体、を含む診断キットに関与する。
【０２３４】
いずれかのそのようなキットにおいては、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）が実質的な成分であることが理解される。このようなキットは、中でも疾病又は疾病に対する感受性を診断するために使用されるだろう。
【０２３５】
本発明は、本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチドを診断薬として利用することにも関与する。疾病又は病原性に関連するような、本発明の望ましくは配列番号１の突然変異誘発された形のポリヌクレオチドの検出は、診断手段を提供することになる。この診断手段は、そのポリヌクレオチドの低発現、高発現又は発現の変化に起因する疾病の診断、予後診断、ステージの決定、又は疾病に対する感受性診断を規定したり、これらの診断に追加できる。このようなポリヌクレオチドに変異を持つ微生物、特に感染性微生物は、本願書の他の場所で述べる方法のような多様な技術によってポリヌクレオチドのレベルで検出可能である。
【０２３６】
本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ヌクレオチド配列は、微生物の染色体を証明するのにも役に立つ。この配列は、微生物の染色体、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の染色体上の特定の部位を特異的な標的とし、またこれらとハイブリダイズ可能な配列である。本発明に従って染色体に対する該当配列のマップを作成することは、微生物に対するその遺伝子の必然性だけでなく、これらの配列と微生物の病原性及び／又は生態学的地位、及び／又は微生物の薬剤耐性との間の相互関連においても重要なステップとなりうる。一度配列が正確な染色体位置にマップされると、その配列の染色体における物理的位置を遺伝的マップ・データと相関させることができる。このようなデータは、オンラインの配列データベースの中にある。次に、同じ染色体部位にマップされた遺伝子と疾病の間の関係を既知の遺伝的手法を用いて同定する。例えば連鎖解析（物理的に近接する遺伝子の連鎖遺伝）又は例えば交雑のような交配試験を通じて同定する。
【０２３７】
最初の表現型と異なる二番目の表現型を示す微生物間のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド配列の違いもまた、決定可能である。もしある変異が、最初の表現型を示す幾つかの又は全ての微生物に観察されるにも関わらず、二番目の表現型を示す微生物に全く観察されない場合、この変異はおそらく最初の表現型の原因因子であると考えられる。
【０２３８】
予後診断、診断又は他の解析に必要なポリペプチド及びポリヌクレオチドは、感染が予想される及び／又は感染した個々の生体試料から得られる。これらのどの試料から得られたにせよ、特にＤＮＡ又はポリヌクレオチドは検出に直接利用可能であり、又はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のポリヌクレオチド配列由来の増幅オリゴヌクレオチド・プライマーを用いたＰＣＲあるいは他の増幅技術を使用して酵素的に増幅することもできる。ＲＮＡ、特にｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡに逆転写されたＲＮＡも診断に有用である。
試料から得られたスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ 関連ポリヌクレオチドの増幅に続いて、感染又は潜在微生物の種及び株を関連微生物（例えば、既知のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株）由来の基準と比較して、一つ又はそれ以上の参照ポリヌクレオチド、あるいは配列に相関する増幅ポリヌクレオチドの解析によって特徴付けることができる。
【０２３９】
さらに本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）によって引き起こされるような細菌感染の診断方法を提供する。この方法は生体試料のような個体から得られた試料と疾病のない個体から得られた試料を比較して、配列番号１に開示された配列を持つポリヌクレオチドの発現レベルが上昇していることを確認する過程を含む。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチドの発現の上昇又は減少は、ポリヌクレオチドを定量するために例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ・プロテクション、ノーザン・ブロッティングや他のハイブリダイゼーション法、及びスペクトロメトリーのような技術的によく知られている方法のどれか一つを使用して測定可能である。
【０２４０】
加えて、本発明に従う正常コントロール組織試料と比較したＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの高発現を検出するための診断検査は、例えば感染の有無を検出するために使用できる。例えば生体試料のような宿主から得られた試料において、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドのレベルを決定するために使用できる検査技術は、熟練した技術としてよく知られている。このような検査法は、放射免疫測定、結合競合試験、ウェスタン・ブロット解析、抗体サンドウィッチ法、抗体検出及びＥＬＩＳＡ法を含む。
【０２４１】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）染色体配列のグリッディング及びポリヌクレオチド・サブトラクション：
本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド・アレイ、望ましくは高密度アレイ又はグリッドの構成成分として利用することができる。これらの高密度アレイは、診断及び予後診断を目的とする方法として、とりわけ有用である。例えば、個体内に特定のポリヌクレオチド配列又は関連配列が存在するかを確かめるために、各々異なる遺伝子、さらに本発明の一つの又は複数のポリヌクレオチドを含む一組のスポットが、生体試料から得た又は生体試料由来のプローブを使用したハイブリダイゼーション又は核酸増幅のような厳密な調査に使用できる。
【０２４２】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ペプチド又はポリペプチドに特異的な抗体：
本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド及びポリヌクレオチド又はその変異体、あるいはそれらを発現している細胞は、このようなポリペプチド又はポリヌクレオチドに各々免疫特異的な抗体を産生するための抗原として有用である。
本発明のある望ましい具体例として、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドに対する抗体を提供する。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−ポリペプチド又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−ポリヌクレオチドに対する抗体は、感染の治療、特に細菌性感染の治療に有用である。
【０２４３】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに対して産生される抗体は、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド、又はそのどちらか又は両方のフラグメントを持つ抗原決定基、そのどちらか又は両方のアナログ、あるいはそのどちらか又は両方を発現している細胞を、望ましくはヒトではない動物に所定の方法で投与することによって得られる。モノクローナル抗体の調整には、連続継代細胞によって抗体を産生するような技術的に知られるいかなる方法も使用可能である。これは例えばＫｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７ （１９７５）； Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２ （１９８３）；及びＣｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ｐｇ． ７７−９６ ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８５）における技術のように、多様な技術を含む。
【０２４４】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに対する単鎖抗体を産生するために、単鎖抗体を作成するための技術（合衆国特許番号：４，９４６，７７８）が利用できる。また、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに対する免疫特異的ヒト型抗体を発現させるために、遺伝子組換えマウス、又は他の遺伝組換え哺乳動物も有用である。
【０２４５】
抗体が治療的に投与される場合、この抗体又はその変異体は個体内において免疫原性が少なくなるように修飾されることが望ましい。例えば、もしその個体がヒトである場合、その抗体は“ヒト型化された”抗体であることがもっとも望ましく、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６）， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２−５２５ 又は Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９， ２６６−２７３ に述べられているように、このような抗体はハイブリドーマ由来抗体の一つの又は複数の相補性決定領域をヒトモノクローナル抗体に移入して“ヒト型化”される。
【０２４６】
もう一つの方法として、ファージ・ディスプレイ法が本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドに対して結合能を持つ抗体遺伝子を選択するために有用である。一つのアプローチは、繊維状ファージの外殻タンパク質との融合タンパク質を発現する抗体遺伝子の免疫ライブラリからスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） Ｄ ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に対して特異的な抗体フラグメントを選択する方法である。
【０２４７】
もう一つの方法は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に対して特異的な抗体をコードする遺伝子を同定するために、ファージ・ディスプレイ法を用いて未処理のライブラリをスクリーニングする方法である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ， ｅｔ ａｌ．， （１９９０）， Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２−５５４； Ｍａｒｋｓ， ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３； 最近の論文として Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４： １８２１８−１８２３０）。様々な標的に対してナノモーラーの親和性を持つ抗体が回収できれば、免疫化の必要は無い。これらの抗体の親和性は、例えばチェーン・シャッフリングによって改良することもできる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２： ６２８）。
【０２４８】
上述の抗体は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを発現するクローンを分離又は同定するために利用でき、例えば免疫親和性クロマトグラフィによってポリペプチド又はポリヌクレオチドを精製するために利用できる。
【０２４９】
本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの変異型、例えば抗原的に又は免疫的に同等なそのポリペプチドの誘導体あるいは融合タンパク質もまた、マウス、又はラットあるいはニワトリのような他の動物に免役するための抗原として有用である。融合タンパク質は、担体として作用するポリペプチドに安定性を与えたり、又はアジュバントとして作用したり、あるいは両方の作用を付与する。もう一つの方法として、ウシ血清アルブミン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン又はテタヌス類毒素のような免疫原性担体タンパク質を、例えば抱合させることによって抗原と混合する方法がある。別の方法として、抗体が治療的に投与される場合、複数のポリペプチドのコピーを含む複合抗原性ポリペプチド、又はこれらと抗原的あるいは免疫的に同等なポリペプチドが、免疫原性を高めるのに十分な抗原性があると考えられ、従って担体を使う必要はないと考えられる。
【０２５０】
本発明の特徴に従って、治療又は予防の目的、特に遺伝的な免疫に本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチドの利用を提供する。遺伝的な免疫における本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチドの利用は、望ましくは、例えばプラスミドを筋肉へ直接注入するような適切な導入法（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ （１９９２） １： ３６３， Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． （１９８３） ４： ４１９）、ＤＮＡと特異的なタンパク質担体との複合体による導入法（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８９） ２６４： １６９８５）、リン酸カルシウムによるＤＮＡ共沈法（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ＆ Ｒｅｓｈｅｆ， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， （１９８６） ８３： ９５５１）、様々な形のリポソームにＤＮＡをカプセル化する方法（Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８９） ２４３： ３７５）パーティクル・ガン法（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９２） ３５６：１５２， Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ （１９９３） １２： ７９１）又はクローン化されたレトウイルス・ベクターを使用した生体内感染法（Ｓｅｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ （１９８４） ８１： ５８４９）によって実施できる。
【０２５１】
拮抗物質及び作動物質：検査法と分子：
本発明は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９がバクテリオ・ファージ９６ ＯＲＦ ７８阻害性因子の標的であるという発見に一部基づいている。出願人は抗細菌性薬剤の開発過程において、その相互作用の有用性について認識してきた。特に、発明者は１）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ が細菌性の阻害に対して重要な標的であること；２）９６ ＯＲＦ ７８又はその誘導体あるいは機能的類似物質が細菌性の増殖を阻害するのに有用であること；及び３）スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ 又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）と９６ ＯＲＦ ７８の間の相互作用が、医薬品のスクリーニング及び合理的なデザイン又は抗細菌性薬剤に対する標的として使用できるだろうことを認識してきた。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性を直接阻害する方法に加えて、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の発現を阻害する方法も抗細菌性活性という点で興味深い。
【０２５２】
本発明の幾つかの具体例として、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドに結合する、さもなければ相互作用したりその活性又は発現を阻害又は活性化するような化合物を同定するための方法を提供する。これは、化合物との結合又はその他の相互作用を判断するため、化合物とポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドが結合又は相互作用の可能な条件において、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドと化合物の接触をスクリーニングする方法を含み、例えばこのような結合又は相互作用は、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドと化合物の結合又は相互作用に反応して、検出可能なシグナルを示すことのできるもう一つの構成成分と関連していることが望ましい。
【０２５３】
また、化合物とポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの結合又は相互作用によって生じるシグナルの有無を検出することによって、化合物が結合するか、さもなければ相互作用するかポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの活性又は発現を活性化又は阻害するかを決定する方法も含む。
【０２５４】
拮抗物質として見込みのある物質は、中でも、小有機的分子、ペプチド、ポリペプチド及び抗体を含み、これらは本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドに結合し、その結果その活性又は発現を阻害したり失わせたりする。拮抗物質として見込みのある物質はまた、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−誘発された活性を伴なわないで、結合分子上にある他の結合分子が結合するのと同じ部位に結合し、それにより、Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを結合から排除することによりＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの作用又は発現を妨げる、密接に関連したタンパク質、又は抗体のような小有機的分子、ペプチド、ポリペプチドであることがある。
【０２５５】
拮抗物質として見込みのある物質は、ポリペプチドに結合しその結合部位を占有するような小分子も含み、結果として細胞性結合分子の結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる。細胞結合分子は、ＤＮＡ複製に包含されるタンパク質を包含するが、但しそれらだけには限定されない。細胞結合分子の例は、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ及びＳＳＢを包含する。
【０２５６】
小分子の例は、小有機分子、ペプチド又はペプチド様分子を含むが、これに限らない。その他の拮抗物質として見込みのある物質には、アンチセンス分子も含まれる（これらの分子の詳細は以下を参照；Ｏｋａｎｏ， （１９９１） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ５６， ５６０；ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＳ ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ ＯＦ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８） ）。より相応しい拮抗物質として見込みのある物質は、９６ ＯＲＦ ７８及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に関連する化合物及びその変異体を含む。その他の拮抗物質として見込みのあるポリペプチドの例は、抗体、例によっては、リガンド、基質、受容体、酵素などに密接に関連したオリゴヌクレオチド又はタンパク質が含まれる。場合によってはポリペプチドの、例えばリガンド、基質、受容体、酵素などのフラグメント；又は本発明のポリペプチドに結合するが反応を誘導しない、従ってそのポリペプチドの活性を妨げるような小分子も含まれる。
【０２５７】
化合物は、例えば細胞、無細胞製剤、化学的ライブラリ、及び天然産物混合物などの様々なソースから同定可能である。これらの基質及びリガンドは、おそらく天然の基質及びリガンド、又は構造的あるいは機能的な類似物質であると考えられる（例としてＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： Ｃｈａｐｔｅｒ ５ （１９９１）を参照）。ペプチド修飾因子もまた、ある特定長の全可能性ペプチドから成る大きいランダム・ライブラリのスクリーニングによって選択することができる。
【０２５８】
９６ ＯＲＦ ７８それ自身のポリペプチド配列に由来する化合物は、それらのＯＲＦの全アミノ酸配列に渡る小さな重複ペプチドを代表するようなペプチドフラグメントである。９６ ＯＲＦ ７８のフラグメントは、上述したようにによって産生することができる。
【０２５９】
本発明の一部のポリペプチドは、天然のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの生体類似物質（バイオミメティクス）、機能的類似物質である。これらの機能的類似物質は、中でも、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの活性と競合させたり、又は上述の方法に従って抗原又は免疫原として有用である。本発明のポリペプチドの機能的類似物質は、不完全なポリペプチドを含むが、これに限らない。例えば、機能的類似物質として相応しい物質には、５、８、１０、１５、２０、又は２５個のアミノ酸又はカルボキシル末端残基を欠く配列番号６に示したポリペプチド配列を内包するポリペプチドが含まれる。またこのポリペプチドは、一つの又はそれ以上のこれらの不完全配列を内包する融合タンパク質を含む。これらの機能的類似物質をコードするポリヌクレオチドは、それぞれの類似ポリペプチドを発現させるために発現カセットとして使用できる。
【０２６０】
本発明に従うスクリーニング法：
本発明のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能を促進したり、又は阻害したりするような化合物を同定するためのスクリーニング法を考案することは、価値に値する。従って、本発明は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能を修飾するような化合物を同定するためのスクリーニング法を提供する。一般的に、拮抗物質は治療及び予後診断の目的で使用される。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の作動物質は、例えば診断又はその他の目的のために培養した試料における細菌の増殖率を高めるために、有用であると期待される。
【０２６１】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９が阻害因子として作用する、バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８生成物のための標的物であることは決定されている。出願人は、抗細菌剤の開発においてその相互作用の有用性を認識している。ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド標的物、例えばＳＴＡＡＵ＿Ｒ９は細菌阻害のための決定的な標的物である。Ｓ．アウレウスバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８又はその誘導体又は機能的類似体は、細菌増殖を阻害するために有用であり、そしてポリペプチド、例えばＳ．アウレウスのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と９６ ＯＲＦ ７８との間で生じる相互作用、結合、阻害及び／又は活性化は、薬剤又は抗微生物剤のスクリーニング及び合理的企画のために使用され得る。標的物、例えばＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性を直接的に阻害するための方法の他に、標的物、例えばＳＴＡＡＵ＿Ｒ９発現を阻害する方法もまた、抗微生物活性のために好ましい。
【０２６２】
好ましい態様においては、その方法は、阻害ＯＲＦ生成物又はそのフラグメントと、ＯＲＦ生成物又はそのフラグメントとの相互作用を維持するその対応する細菌標的物又はそのフラグメントとの相互作用を包含する。成分間の相互作用の妨害がモニターされ得、そしてそのような妨害は標的物分子の活性を阻害し、活性化し、又は増強することができる化合物の表示である。
【０２６３】
ａ）結合アッセイ
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９、及び配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメント（例えば配列番号６）を含んで成るポリペプチドのような標的タンパク質に対する候補体化合物の結合性を調べる方法は、数多くある。本発明において、標識を候補体化合物に直接又は間接的に結合させることによって、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はポリヌクレオチド、又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを発現する細胞又はその担体、あるいはＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する細胞又はその担体に対する候補体化合物の結合性を測定するスクリーニング法が有用である。
【０２６４】
このスクリーニング法は、９６ ＯＲＦ ７８又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に対する結合能を持つフラグメントのような標識競合物質の結合に競合するような方法も含むことがある。
本発明によるスクリーニングアッセイの非制限例は、次のものを包含する（Ｓｉｔｔａｍｐｏｌａｍなど， １９９７ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３： ３８４−９１において再考される）。
【０２６５】
ｉ）時間−解決された蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＴＲ−ＦＲＥＴ）
二つのタンパク質の結合の阻害を測定する方法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ， １９９９， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いる方法である。ＦＲＥＴは蛍光ドナー（Ｄ）と蛍光アクセプター（Ａ）が非常に近接した状態（通常 ＜１００ Ａ の距離）においてＤの発光スペクトルがＡの励起スペクトルと重複した場合に生じる、二つの分子間の量子力学的現象である。
【０２６６】
ＦＲＥＴでは、タンパク質−タンパク質相互作用を測定するため、発光オワンクラゲ（Ａｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体とポリペプチド又はタンパク質を融合させ、Ｄ−Ａペアとして使用する。シアン（ＣＦＰ：Ｄ）及びイエロー（ＹＦＰ：Ａ）蛍光タンパク質を、それぞれ、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はそのフラグメント、及び９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドと結合させる。十分に近接した条件において、例えばＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はそのフラグメントと９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドとの相互作用は、ＹＦＰ蛍光の増加に伴ってＣＦＰの蛍光強度の減少を引き起こす。
【０２６７】
適切に標識されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドの混合液に候補体修飾物質を添加すると、結果的に、例えば候補体阻害物質を添加しない試料と比較したある特定の９６ ＯＲＦ ７８の濃度におけるＹＦＰ蛍光の減少によって証明されるような、エネルギー転移を阻害する。
【０２６８】
時間−決定されたＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ又はＨＴＲＦ（均質時間―決定されたエネルギートランスファー））と呼ばれるＦＲＥＴ技法の拡張は、高処理量スクリーニングにおいてタンパク質−タンパク質相互作用の同定に特に有用である。手短に言及すれば、ＴＲ−ＦＲＥＴは、希土類クリプタート、例えばユーロピウム（Ｅｕ）の長期生存蛍光、及び適切な受容体、例えばアロフィコシアニン（ＡＰＣ）への非放射性エネルギートランスファーによる増幅に基づいての均質アッセイ方法を構成する。ＴＲ−ＦＲＥＴ原理は、一時的な及びスペクトル選択性を通しての発生されるシグナルの二重識別を可能にする。ＡＰＣ（受容体）からの蛍光発生の寿命は非放射性エネルギートランスファーの存在下でＥｕ（ドナー）寿命に等しい寄与を含むので、長期生存するＡＰＣ受容体シグナルは、エネルギートランスファーの存在下でその天然の迅速な蛍光から分離され得る。
【０２６９】
Ｅｕ及びＡＰＣは、１対の相互作用の分子、例えばポリペプチドを通して接近せしめられる。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はそのフラグメントと９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドとの間の相互作用を示すために、それぞれのポリペプチドが、Ｅｕ又はＡＰＣのいずれかにそれ自体、接合される結合分子により認識されるＮ−又はＣ−末端標識を含むよう組換えＤＮＡ技法によりラベルされる。種々の結合分子、例えば抗体（エピトープに対して方向づけされた）又はストレプタビジン（ビオチンに対して方向づけされた）が使用され得る。他方では、相互作用タンパク質の１又は両者が、Ｅｕ又はＡＰＣのいずれかに直接的に接合される。
【０２７０】
いくつかの可能なアッセイ型の１つにおいては、ＡＴＡＡＵ＿Ｒ９又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）は、ポリヒスチジン標識との融合体として発現され、そして抗−ポリヒスチジンＥｕ抗体接合体により認識され；９６ ＯＲＦ ７８はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合体として発現され、そして抗−ＧＳＴ ＡＰＣ抗体接合により検出される。最適な接近性下で及び抗−ポリヒスチジン及び抗−ＧＳＴ抗体接合体の存在下で、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）と９６ ＯＲＦ ７８との間の相互作用は、６６５ｎｍで最適に検出される、ＥｕからのＡＰＣへの非放射性、時間−決定されたエネルギートランスファーを誘発する。
【０２７１】
適切にラベルされたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドの混合物への候補体モジュレーターの添加は、候補体インヒビターを有さないサンプルに比較し、所定の濃度の９６ ＯＲＦ ７８でのＡＰＣ蛍光の低下により示される、エネルギートランスファーの阻害をもたらすであろう。
【０２７２】
ｉｉ）蛍光偏光法
蛍光偏光の測定はタンパク質−タンパク質結合を定量するのにさらに有用である。蛍光標識した分子の蛍光偏光度は、回転相関時間又は反転率に依存する。例えばスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９フラグメントが、蛍光標識ポリペプチド（例えば、９６ ＯＲＦ ７８又はその結合フラグメント）と結合して形成されるようなタンパク質複合体は、単量の蛍光標識ポリペプチドより高い蛍光偏光度を示す。候補体阻害物質がＳＴＡＡＵ＿Ｒ９とそのポリペプチド結合パートナーとの相互作用を乱したり阻害する場合、候補体阻害物質がこのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９相互作用に含まれると、結果的に候補体阻害物質の含まれない混合液に較べて蛍光偏光度の減少が引き起こされる。この方法はポリペプチド又はタンパク質複合体の形成を乱すような小分子を特徴付ける方法として利用されることが望ましい。
【０２７３】
ｉｉｉ）表面プラスモン共鳴
タンパク質：タンパク質の相互作用に対する阻害剤をスクリーニングする他の強力なアッセイは、表面プラスモン共鳴である。表面プラスモン共鳴は、水相（分析物）から第一のタンパク質又は他の生体分子が、センサー（リガンド）上に固相化した第二のタンパク質又は生体分子に結合することによって生じるセンサー表面付近の質量の変化によって、二つの（又はそれ以上の）分子間の結合を測定する定量的な方法である。この質量の変化は、第二のタンパク質又は生体分子（分析物）の注入又は除去後の時間あたりの共鳴単位として測定され、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ （Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）又は類似する装置を使用して測定される。
【０２７４】
共有結合法（例えば、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム［ｐＨ ４．５］中アミン・カップリング）を用いて、センサー・チップ（例えば、研究用ＣＭ５チップ；Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）上にＳＴＡＡＵ＿Ｒ９、又はそののフラグメント（例えば、配列番号６）を含んで成るポリペプチドを固相化することも可能である。盲検は、タンパク質固相化をしない状態で、センサーを活性化及び不活性化することによって準備する。他方では、リガンド表面は、ペプチド親和性標識、抗体又はビオチニル化により、センサーチップの表面上のリガンドの一共有捕獲により調製され得る。
【０２７５】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はそのフラグメントに対する９６ ＯＲＦ ７８の結合は、チップ表面に精製９６ ＯＲＦ ７８を注入することによって測定する。測定は４℃〜３７℃のいずれかの所望する温度で行なう。アッセイの条件（例えばそれらが結合する条件）は以下の通りである：２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ （ｐＨ ７．６）、１５０ ｍＭ 塩化ナトリウム， １５％ グリセロール、１ ｍＭ ジチオスレイトール、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、流速度 １０μｌ／ｍｉｎ。候補体阻害剤とセンサー・チップのプレインキュベーションにより、９６ ＯＲＦ ７８とＳＴＡＡＵ＿Ｒ９との間の相互作用の減少が予想される。センサーグラム上での低められた応答として検出されそして共鳴単位で測定される、９６ ＯＲＦ ７８の結合低下は、候補体化合物による競合的な結合を示唆する。
【０２７６】
ｉｖ） シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ
シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ（ＳＰＡ）は、配列番号２又は６のアミノ酸配列又はその一部を含んで成るＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチド又はそのフラグメントともう１つのポリペプチドとの間の相互作用を特徴づけるために使用され得る。ＳＰＡは、シンチラントが組み込まれている固相基質、例えばビース又はマイクロタイタープレートのプラスチックに依存する。前記アッセイに関しては、標的タンパク質、例えばＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドは、活性化された表面化学を通して共有的に、又はペプチド親和性標識、抗体又はビオチニル化を通して非共有的に、ビーズ又はプレートの表面に結合される。放射性ラベルされた結合ポリペプチド、例えば［３２Ｐ］−放射性ラベルされた９６ ＯＲＦ ７８の付加は、シンチラントへの放射性源分子の密接した接近性をもたらす。
【０２７７】
結果として、放射能壊変は、ビーズ内ビーズ内に又はプレートのプラスチック内に含まれるシンチラントを励起し、そして検出できる光が発光される。固定されたＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドと放射性ラベルされた９６ ＯＲＦ ７８との間の会合を妨げる化合物は、シンチレーションシグナルを減じるであろう。従って、ＳＰＡは、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−９６ ＯＲＦ ７８相互作用のインヒビターについてスクリーンするための理想的技法の例を表す。なぜならば、それは高処理能力の自動化された型に容易に適合され、そしてμモル〜ｎモルの範囲でのＫＤ値を伴なって、タンパク質−タンパク質相互作用の検出のその感受性のためである。
【０２７８】
ｖ）バイオ・センサー・アッセイ
ＩＣＳバイオセンサーはＡＭＢＩに述べられている（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ； ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ａｍｂｒｉ．ｃｏｍ．ａｕ／）。この技術では、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はそのフラグメントやバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８又はそのフラグメントのような巨大分子の会合は、吊した二重基板におけるグラマシジン作動性イオンチャンネルの閉鎖に連動し、従ってバイオセンサーのアドミッタンス（インペデンスに類似した）の変化に相関する。このアプローチはアドミッタンス変化の大きさ１０６に渡って直線性を示し、小分子のコンビトナリアル・ライブラリの大規模な、ハイ・スループット・スクリーニングに最適である。
【０２７９】
ｖｉ）ファージ・ディスプレイ
ファージ・ディスプレイは、タンパク質：タンパク質相互作用を測定する強力なアッセイ法である。この方法では、タンパク質又はペプチドは、繊維状ファージの外殻タンパク質又は尾部タンパク質との融合タンパク質として発現される。この方法の総合的な論文は、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＰｒｏｔｅｉｎＳａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓである。
【０２８０】
Ｍ１３やｆｄを含むＦｆファミリーのファージの場合、遺伝子ＩＩＩタンパク質や遺伝子ＶＩＩＩタンパク質が外来タンパク質又はペプチドとの融合相手として最もよく使われる。ファージミドはプラスミドとバクテリオファージ両方の複製開始部位を持つベクターである。遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩとの融合タンパク質をコードするファージミドは、ヘルパー・ファージが感染した細菌性宿主から回収することができ、その結果、組換えファージの外殻又は先端に外来配列が提示される。
【０２８１】
単純なアッセイの１つの例においては、例えば精製組換えＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質、又はそのフラグメントをマイクロタイター・プレートのウェル上に固相化し、遺伝子ＩＩＩタンパク質との融合９６ ＯＲＦ ７８配列を提示するファージと共にインキューベトすることなどが考えられる。非結合ファージを除くために洗浄し、ファージ外殻タンパク質（遺伝子ＶＩＩＩタンパク質）に対するモノクローナル抗体を用いて結合ファージを検出する。酵素結合された第２抗体は、蛍光、化学ルミネセント又は比色転換による、結合された融合タンパク質の定量的検出を可能にする。酵素を結合させた二次抗体を用いた染色によって、結合した融合タンパク質の定量的な検出が可能である。ファージを加える前に、固相化した標的と化合物をインキュベートすることによって、阻害剤のスクリーニングを行う。阻害剤の存在は、阻害剤を含まないコントロールに較べて濃度依存的に明らかにシグナルを減少させる。
【０２８２】
タンパク質−タンパク質相互作用のアッセイにおいて留意すべき重要な点は、相互作用を修飾する物質が物理的に相互作用するタンパク質のドメインと、直接的に相互作用するとは限らない点である。さらに修飾物質がタンパク質−タンパク質相互作用のサイトとは無関係の部位で相互作用し、結果的に例えばＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの構造変化を引き起こす可能性もある。このようにして働く修飾物質（阻害物質又は作動物質）は、アロステリックエフェクターと呼ばれ、そしてその変化がＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドの活性の変化を誘導する可能性があることから興味深い。
【０２８３】
インヒビターについての試験は、反応混合物と共に化合物をインキュベートすることによって行われる。インヒビターの存在は特に、インヒビターを有さない対照に比較して、用量−依存性の態様でシグナルを低めるであろう。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−９６ ＯＲＦ ７８間の相互作用を阻害するそれらの能力について選択される化合物はさらに、機能的活性アッセイにおいて試験される。
【０２８４】
ｂ． ＳｔＡＡＵ＿Ｒ９機能的活性のアッセイ
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はそのフラグメント（例えば、配列番号６）、その変異体又は相同体の機能的酵素活性を評価するためのアッセイの非制限例は、インビトロＤＮＡ複製の複製の測定を包含する。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドのＤＮＡ合成刺激を測定する多くの方法が存在する。
【０２８５】
ＤＮＡ複製、プラスミド複製についてのインビボアッセイ
例えば、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性についてのアッセイの１つの例は、細胞ＤＮＡ中に導入される放射性ラベルされた又はヌクレオチドの測定を包含することができる。適切な時間間隔で培養サンプル（０．５ ｍｌ）を回収し、４．５μｌの標識溶液（０．２μＣｉ／ｍｌのトリチウムチミジン（７３ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ） と７０ ｐｍｏｌの非放射性チミジン）と混合する。１５分反応後、０．２％アジ化ナトリウムと５ μＭ の３０μｇ／ｍｌのラベルされていないチミジンを含む溶液を加えることによって取り込みを停止する。サンプルを１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸によって沈殿させ、ガラス・ファイバー・フィルタ（ＧＦ−Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ）を通してフィルタ処理する。
【０２８６】
結果を培養液の光学濃度によって標準化し、取り込み３Ｈ−チミジンのカウントとして表示する。Ｓ．アウレウスの培養物が、培地に直接的に添加される、種々の濃度の候補体化合物の存在下で増殖される。ポリペプチドに対応する化合物に関しては、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、誘発可能プロモーターを含むＳ．アウレウス発現ベクター中にクローン化され得る。前記ポリペプチドの発現は、細胞のトランスフェクションに続いて誘発され得る。１つのアッセイにおいては、誘発性プロモーターの存在下で候補体インヒビターポリペプチド（例えば、９６ ＯＲＦ ７８、そのフラグメント又は変異体）コードの配列を含むプラスミドが、Ｓ．アウレウス中に導入される。９６ ＯＲＦ ７８又は他のインヒビターの存在下での３Ｈ−チミジン組込みの少なくとも１０倍の低下は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性の低下を示す。
【０２８７】
プラスミドｐＣ１９４は、Ｓ．アウレウスにおいて、ローリングサークル型機構により複製する。ＰＣ１９４の一本鎖起源ｓｓｏは、ラギングＤＮＡ鎖の合成に包含される。プラスミドｐＡＤＧ６４０６は、ｓｓｏを欠いているｐＣ１９４の誘導体である。ｓｓｏの不在は、プラスミド一本鎖ＤＮＡの蓄積を誘導する。一本鎖（ｓｓ）開始部位ｓｓｉＡは、ｐＡＭβ１ラギング鎖上に位置し、そしてプライモソームアセンブリーのための部位である。ｓｓｉＡは、プラスミドｐＡＤＧ６４０４中に挿入された。Ｓ．アウレウス担持のプラスミドが、中間対数相まで増殖され、そしてそれらの合計ＤＮＡが抽出され、そしてプローブとして３２Ｐ−ラベルされたプラスミドＤＮＡを用いて、サザンハイブリダイゼーションにより分析される。ｓｓｉＡ を有するｐＡＤＧ６４０６の存在は、ｓｓｉＡを有さないプラスミドのそれに比較して、ｓｓ： ｄｓ ＤＮＡの比の低下に関連する。
【０２８８】
このシステムは、ＤＮＡ合成に対する候補体インヒビター、例えば９６ ＯＲＦ ７８の効果を測定するために使用される。Ｓ．アウレウスの培養物が、培地に直接的に添加される種々の濃度の候補体化合物の存在下で増殖される。ポリペプチドに対応する化合物に関しては、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、誘発可能プロモーターを含むＳ．アウレウス発現ベクター中にクローン化され得る。前記ポリペプチドの発現は、細胞のトランスフェクションに続いて誘発され得る。１つのアッセイにおいては、誘発性プロモーターの存在下で候補体インヒビターポリペプチドコードの配列を含むプラスミドが、ｐＡＤＧ６４０６を有するＳ．アウレウス株中に導入される。ｐＡＤＧ６４０６のｓｓ： ＤＮＡの比は、砒酸ナトリウム（５μＭ）の存在又は不在下で測定される。ｓｓ： ｄｓ ＤＮＡの比の上昇（１０％又はそれ以上）は、候補体モジュレーターの効果を示す。
【０２８９】
インビトロＤＮＡ複製アッセイ
１つの細胞フリーのインビトロアッセイにおいては、Ｓ．アウレウスから調製される抽出物が、外因性の放射性ラベルされたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ， ｄＴＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ）、ＭｇＣｌ２及びＡＴＰを包含する反応において、プラスミド基質、例えば感作された環状ＭＢｓｓＤＮＡ基質に供給される。反応は停止され、そして生成物がトリクロロ酢酸により沈殿され、そして次に濾過される。乾燥されたフィルターのシンチレーション計数が、新たな複製のレベルを付与する。
【０２９０】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性についてアッセイするためのもう１つの例は、感作された環状ｓｓＤＮＡ基質を用いて、再構成されたインビトロアッセイにおいてのＤＮＡ中に組み込まれる放射性ラベルされたヌクレオチドのレベルを測定することである（Ｙｕｈａｋｏｖなど．， １９９９， Ｃｅｌｌ ９６： １５３−１６３）。複製反応は典型的には、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＭｇＣｌ２、ＢＳＡ， ＤＴＴ， ＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＡＴＰ， （α−３２Ｐ）ｄＴＴＰ， ＥＤＴＡ， グリセロール、ｓｓＤＮＡ、精製されたＳ．アウレウスＳＳＢ、ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素及び上昇する量のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを含んだ。反応は３７℃で５分間インキュベートされ、そしてＳＤＳ及びＥＤＴＡの添加に基づいて異なった時点で急冷された。反応生成物がトリクロロ酢酸により沈殿され、そして次に、濾過される。乾燥されたフィルターのシンチレーション計数が、新たな複製のレベルを付与する。
【０２９１】
他方では、複製酵素の活性を測定する急速蛍光定量アッセイが、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性を測定するために開発され得た。蛍光定量アッセイは、一本鎖ＤＮＡ、例えば新たに合成されたＤＮＡへの蛍光色素の選択的結合に基づかれ、そしてそれは記載されている（Ｓｅｖｉｌｌｅなど．， １９９６， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１： ６６４−６７２）。上記に記載されるアッセイに類似する再構成されたインビトロアッセイが、開発され得る。反応は３７℃で種々の時間インキュベートされ、次に急冷される。急冷された反応は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴＭ 色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を添加し、室温で５分間インキュベートし、そしてＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（λＥＸ， ４８５ｎｍ；λＥＭ， ５２５ｎｍ）の蛍光の強度を読み取ることによって、全ＤＮＡ合成について分析される。色素の感度及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイの均質性質は、非放射性定量アッセイ型においての急速なスクリーニングを可能にすべきである。
【０２９２】
インヒビター、例えば９６ ＯＲＦ ７８ についての試験が、反応混合物と共に化合物をインキュベートすることによって行われる。インヒビターの存在は特に、インヒビターを有さない対照に対して、用量−依存性態様でシグナルを低めるであろう。
【０２９３】
ＲＮＡプライマーゼ活性についてのアッセイ
ＤｎａＧ活性を測定するために、プライマーゼ活性のレベルがインビトロアッセイにおいて測定され得る（Ｓｉｖａｒａｊａなど．， アメリカ特許第６，０４３，０３８号）。このアッセイにおいては、ＤｎａＧが、１又は複数のＤＮＡ−ＲＮＡ異種ハイブリッド領域を含んで成る核酸を形成するために鋳型上でリボヌクレオチド三リン酸を重合する。
【０２９４】
得られるＤＮＡ−ＲＮＡ異種ハイブリッド領域の存在は、ＤＮＡ−ＲＮＡ異種ハイブリッド領域に特異的に結合する検出試薬、例えば示される分子を特異的に認識する抗体と核酸とを接触することによって、又はラベル、例えば前記ラベルに特異的に結合する試薬により検出されるビオチン又はジゴキシゲニンを含んで成るリボヌクレオチド三リン酸の反応混合物中への組込みにより定量化される。前記ラベルは、分光計、光化学、免疫化学又は化学的手段により、直接的に又は間接的に検出できる組成物である。有用なラベルは、蛍光色素、酵素及びそれらの基質、ビオチン−ストレプタビジン、ジゴキシゲニン又はヘプテン、及び抗体が入手できるタンパク質を包含する。
【０２９５】
可能性あるインヒビターにより処理されるサンプル又はアッセイが、プライマーゼ活性、すなわちＤＮＡ鋳型上でのＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成の阻害の程度を試験するために、試験化合物を有さない対照サンプルに比較される。対照サンプル（試験インヒビターにより処理されていない）は、１００の相対的プライマーゼ活性値を割り当てられ；ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性の阻害は、対照に対する試験サンプルのプライマーゼ活性値が約７５、より好ましくは５０、最も好ましくは２５である場合、達成される。
【０２９６】
ヘリカーゼ巻き戻し活性についてのアッセイ
グラム陰性細菌Ｅ．コリ（Ｌｕ， Ｙ．など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １２９０２−１２９０７ （１９９６））及びグラム陽性細菌Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂｉｒｄ，Ｌ． Ｅ． など．， ３９： １７１−１８２， Ｂｉｏｃｈｅｍ． （２０００））の両者のＤｎａＧプライマーゼ及びＤｎａＢヘリカーゼタンパク質は、タンパク質−タンパク質複合体を形成するために会合することが知られている。プライマーゼ−ヘリカーゼ複合体の形成は、重要な機能的結果を有する。ＤｎａＧプライマーゼは測定できるヘリカーゼ活性を有さないが、それは、ＤｎａＢを含むヘリカーゼアッセイに添加される場合、ＤｎａＢヘリカーゼのヘリカーゼ活性を刺激する。Ｅ．コリ及びＢ．ステアロサーモフィラスに関しては、Ｓ．アウレウスからのＤｎａＣのヘリカーゼ活性は同様に、Ｓ．アウレウスＤｎａＧプライマーゼとの相互作用により刺激されることが可能である。
【０２９７】
ヘリカーゼは、複製フォークで重複ＤＮＡを巻き戻しするためにＡＴＰ加水分解のエネルギーを使用する。ヘリカーゼ活性についてのアッセイにおいては、ヘリカーゼ反応のためにの基質は、放射性ラベルされたヌクレオチドの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりその５’末端での５０〜１００個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドをラベリングすることによって調製される。ラベルされたオリゴヌクレオチドは、一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ（７．２ｋｂ）にアニーリングされ、５’−及び３’−末端を有する、放射性ラベルされたＤＮＡ重複基質がもたらされる。ＤｎａＣヘリカーゼへの上昇する量のＤｎａＧプライマーゼの添加は好ましくは、放射性ラベルがＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡから分離されるようＤＮＡ重複体の溶解をもたらす。非変性１０％ポリアクリルアミドゲル上での反応混合物の分解は、有意に高い相対的分子質量のために、重複体の低い相対的移動性に対応する位置に移動する、残存するＢ重複体ＤＮＡから離れてラベルされたオリゴヌクレオチドの移動をもたらす。
【０２９８】
ヘリカーゼ活性スクリーンは、ＤｎａＧプライマーゼのヘリカーゼ刺激活性を阻害する候補体インヒビターの能力を確立するために、上昇する量のインヒビター、例えば９６ ＯＲＦ ７８の存在下で行われる。候補体化合物の不在下で、ラベルされたオリゴヌクレオチドの電気泳動移動度の上昇の欠乏は、化合物がＤｎａＣのヘリカーゼ活性を刺激するＤｎａＧプライマーゼの能力に影響を及ぼすことを示す。
【０２９９】
ヘリカーゼＡＴＰアーゼ活性についてのアッセイ
ヘリカーゼの巻き戻し活性は、ＡＴＰの存在に依存する。しかしながら、ＤＮＡ重複体基質の存在下で、ヘリカーゼはＡＴＰアーゼ活性を示す。ＤｎａＧプライマーゼの存在は、バチルス・ステアロサーモフィラスにおいてヘリカーゼ活性及びＤｎａＢヘリカーゼのＡＴＰアーゼ活性の両者を刺激する（Ｂｉｒｄ， Ｌ． Ｅ． など．， （２０００）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３９： １７１−１８２）。ヘリカーゼのＡＴＰアーゼ活性を刺激するＤｎａＧプライマーゼの能力は、ＡＴＰ加水分解が定常状態下で測定されるＡＴＰアーゼアッセイにおいて決定される。このアッセイにおいては、ＡＴＰ加水分解は、ＡＴＰアーゼ活性の便利な分光光度決定を提供する、ＮＡＤＨの酸化に連結される。
【０３００】
ＡＴＰ加水分解−対−ＡＴＰ濃度の比として測定されるＡＴＰアーゼ活性プロフィールは、ＤｎａＧプライマーゼ包含するアッセイにおいて著しく変化し、４〜５倍高い比のＡＴＰアーゼ活性を達成する。
ＡＴＰアーゼ活性を刺激するプライマーゼの能力に対する、９６ ＯＲＦ ７８により例示されるインヒビターの影響は、反応混合物における上昇する濃度のインヒビターの包含により記載されるようなＡＴＰアッセイにおいて測定される。プライマーゼ及び候補体化合物の存在下で、ＮＡＤＨの酸化の低下として、又は孔雀石緑色Ｐｉ放出アッセイにおいての６３０ｎｍでの吸光度の低下として測定される、ヘリカーゼのＡＴＰアーゼ活性の低下は、前記化合物がＤｎａＣヘリカーゼのＡＴＰアーゼ活性を刺激するＤｎａＧプライマーゼの能力に影響を及ぼしたことを示唆する。
【０３０１】
ｃ．細菌増殖阻害
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドと９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドとの間の反応を阻害するそれらの能力、又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９活性を阻害するそれらの能力について選択される化合物がさらに、細胞増殖の機能的アッセイにおいて試験され得る。Ｓ．アウレウスの培養物が、培地に直接的に添加される種々の濃度の候補体化合物の存在下で、又は細胞中への化合物の供給のために適切であるビークルを用いて、増殖される。ポリペプチドに対応する化合物に関しては、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、誘発性プロモーターを含むＳ．アウレウス発現ベクター中にクローン化され得る。ポリペプチドの発現は、トランスフェクションに続いて誘発され得る。例えば、前記ポリペプチドは、異なった９６ ＯＲＦ ７８−由来のフラグメントを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０３０２】
発現の誘発又は化合物の添加に続いて、培養物は３７℃でさらに４時間インキュベートされる。その時間の間、細菌細胞培養に対するインヒビターの効果は、ＣＤ５６５及び培養物におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を測定することによって、４０分間隔でモニターされ得る。ＣＦＵの数は次の通りにして評価される：培養物が連続的に希釈され、そして異なった培養物からのアリコートが寒天プレート上にプレートされる。３７℃での一晩のインキュベーションに続いて、コロニーの数が計数される。Ｓ．アウレウスの処理されていない培養物が負の対照として包含される。
【０３０３】
他の特徴として、本発明は本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドに対する作動物質、拮抗物質、リガンド、受容体、基質、酵素等、また、このようなポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの産生を減少させたり増強したりする化合物を同定するためのスクリーニング・キットに関連する。これらは例えば以下のものを含む。（ａ）本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド；（ｂ）本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現する組換え細胞；（ｃ）本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現する細胞膜；（ｄ）本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドに対する抗体；これらのポリペプチドは配列番号：２のポリペプチド、そしてポリヌクレオチドは配列番号：１のポリヌクレオチドであることが望ましい。
【０３０４】
このような全てのキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は実質的な成分を含むことが期待される。
【０３０５】
本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドが：（ａ）最初の事例としてポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド、又はその複合体の三次元構造の決定；（ｂ）作動物質、拮抗物質又は阻害物質の反応部位、結合部位又はモチーフと思われる三次元構造の推測；（ｃ）結合部位、反応部位、及び／又はモチーフと推定される部位に結合する又は反応することが予想される候補体化合物の合成；及び（ｄ）候補体化合物が実際に作動物質、拮抗物質又は阻害物質であるかどうかの試験によって、構造に基づいてそのポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの作動物質、拮抗物質又は阻害物質をデザインする方法に利用できることは、熟練した技術者にとっても非常に歓迎されるだろう。さらに、通常このような作業は反復作業になるため、自動化やコンピュータ制御のステップを使用して実行することが可能な点が高く評価される。
【０３０６】
本明細書に提供される各々のポリヌクレオチド配列は抗細菌性化合物の発見や開発に使用することができる。コードされるタンパク質は、発現すると抗細菌性薬剤のスクリーニングのための標的として使用可能である。加えて、それぞれのｍＲＮＡにコードされたタンパク質又はそのＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ又は他の転写促進配列は、関心のある翻訳配列の発現をコントロールするためのアンチセンス配列を構築するために使用できる。
【０３０７】
本発明はまた、感染の後遺症の原因となる病原体と真核性むしろ哺乳動物性宿主との間の最初の物理的相互作用に干渉させる目的で、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、作動物質又は拮抗物質の使用も提供する。特に、本発明の分子は：細菌の接着、特にグラム陽性及び／又はグラム陰性細菌が、体内留置器具に接する真核性むしろ哺乳動物性の細胞外マトリックスタンパク質、又は創傷部位の細胞外マトリックスタンパク質に接着するのを防ぐため；組織の損傷を仲介する、真核性むしろ哺乳動物性の細胞外マトリックスタンパク質と細菌性ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質間の細菌性接着を阻害するため、及び／又は；体内留置器具の埋め込み又は他の外科的処置以外の経路によって引き起こされる感染における通常の病原性の進行を阻害するために利用することができるだろう。さらに本発明の他の特徴に従って、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９拮抗物質、望ましくは静菌性又は殺菌性拮抗物質を提供する。
【０３０８】
本発明の拮抗物質は、例えば疾病を予防し、阻害し、そして／又は治療するために使用され得る。
【０３０９】
組成物、キットと投与管理
本発明のさらなる特徴として、細胞又は多細胞性生物に投与するためのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリヌクレオチド及び／又はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０３１０】
本発明は、例えば薬剤として利用可能な担体又は補形剤と組み合わせた、本発明の水溶性型ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド、拮抗ペプチド又は小分子化合物のような治療に有効な量のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。このような担体は、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せを含むが、これに限らない。薬剤成分は、例えば中でも局所、経口、経肛、経膣、経静脈、経腹腔、経筋肉、経皮下、経鼻腔又は経皮内的な投与を含む、効果的で便利な方法によって投与することができる。
【０３１１】
治療又は予防において、この活性のある物質はおそらく、望ましくは等張の滅菌拡散水溶液のように注射可能な成分として個体に投与される。
【０３１２】
他の方法としてその成分は、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、目薬、耳薬、うがい薬、浸漬包帯や縫合糸及びエアロゾルのような形をとる局所使用のために調剤可能であり、例えば防腐剤、薬剤の浸透を助ける溶媒、及び軟膏やクリーム中の軟化剤を含む、適切で従来から使用される添加物を含むこともある。またこのような局所用の調剤は、相性の良いよく使われる担体、例えばクリーム又は軟膏基剤、及びローション用エタノール又はオレイル・アルコールを含むこともある。このような担体は調剤重量の約１％〜約９８％を構成することがあり；さらに通常は調剤重量の約８０％まで構成することが多い。もう一つの全身的投与手段として、胆汁酸塩又はフシジン酸あるいは他の界面活性剤のような浸透剤を用いた経粘膜及び経皮的な投与も含まれる。加えて、本発明のポリペプチド又は他の化合物が腸溶性又はカプセル化調剤として調合可能である場合、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は、局所的な投与、及び／又は軟膏、ペースト、ゲル、及びそれに似た形状の中に局在化される。
【０３１３】
哺乳動物及び特にヒトへの投与では、活性のある物質の毎日投与量は０．０１ ｍｇ／ｋｇから１０ ｍｇ／ｋｇ、一般的に約１ ｍｇ／ｋｇになると予想される。全ての事例において、医師が個々の個体に最も適切な実際の処方量を決定し、それは年齢、体重及び特定の個体の感受性に応じて多様である。上述の処方量は、標準的なケースの模範的な例である。もちろん、例えば個体によってはより多い又は少ない処方量が好都合なこともあり、このような処方量も本発明の適用範囲内にある。
【０３１４】
本明細書において使用される場合、用語“体内留置器具”とは、外科的に埋め込まれるものを意味し、人工的な器具やカテーテル、例えば個体体内に挿入され長期に渡ってその場所にとどまるような器具を意味する。このような器具は、人工関節、耳弁、ペースメーカー、血管移植、血管カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、持続的携帯型腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテーテルを含むがこれに限らない。
【０３１５】
本発明の成分は体内留置器具を挿入する直前に、関連細菌に対する全身的な効果を発揮するために注射によって投与可能である。処置は、術後、器具が体内に存在する間続けられる。加えてこの成分は、細菌性創傷感染、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）創傷感染を防ぐために、全ての外科手技に使われる広範な術中カバーにも使用可能である。
【０３１６】
多くの整形外科医は、人工関節を持つヒトは菌血症を引き起こすおそれのある歯科治療を行う前に、抗菌物質による予防が考慮されるべきだと考えている。重度の感染は深刻な合併症であり、時には人工関節を失うことになったり、著しい疾病率及び死亡率を伴う。従ってこのような状況の際、予防的抗菌物質の代わりにこの活性物質の使用にまで適用範囲を広げることができる。
上述した治療に加えて、本発明の成分は創傷組織において露出したマトリックスタンパク質に細菌が接着するのを防ぐために、創傷治療薬として一般的に使用でき、また抗菌性予防薬の代わり又は併用薬として歯科治療において予防的に使用することもできる。
【０３１７】
もう一つの方法として、本発明の成分は体内留置器具を挿入直前に浸すために使用することもできる。創傷又は体内留置器具を浸すための活性物質濃度は、望ましくは１ ｍｇ／ｍｌ から１０ｍｇ／ｍｌぐらいになるだろう。
ワクチン成分は注射可能な形態をとると都合が良い。従来のアジュバントが免疫反応を増強するために利用できるだろう。ワクチン接種のために適切な投与ユニットは、０．５−５μｇ／ｋｇの抗原であり、この投与量を望ましくは１−３週間間隔で１−３回投与する。ここに示した投与量の範囲では、本発明の成分は適切な個体へ投与できなくなるような毒性のある副作用を示すことは無いと思われる。
【０３１８】
配列データベース、実体のある媒体における配列、及びアルゴリズム
ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、これを用いてさらなる類似相同配列を同定するためだけでなく、二次元及び三次元構造を決定するためにも貴重な情報源となる。これらのアプローチは、コンピュータで読みとり可能な媒体に配列を保存し、保存したデータを既知の高分子構造プログラムに使用したり、ＧＣＣのようによく知られる検索ツールを用いて配列データベースの検索に使用したりすることによって、最も容易に高速化できる。
【０３１９】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、配列解析アルゴリズムにおけるのと同様に検索解析に有用なデータベースの構成要素として特に有用である。“配列データベース、実体のある媒体における配列、及びアルゴリズム”と題するこの章、及びこの章に関連する請求項において使用される用語“本発明のポリヌクレオチド”及び“本発明のポリヌクレオチド配列”とは、本発明のポリヌクレオチド全ての検出可能な化学的又は物理的特徴を意味し、これは変換縮小又は変換縮小される可能性があり、又は実体のある媒体に、望ましくはコンピュータで読みとり可能な形で保存される。
【０３２０】
例えば、クロマトグラフィのスキャン・データ又はピーク・データ、写真データ又はそのスキャン・データ、マス・スペクトログラフィのデータ等があげられる。データベース及びアルゴリズムと題したこの章及びこの章に関連した請求項において使用される用語“本発明のポリペプチド”及び“本発明のポリペプチド配列”とは、本発明のポリペプチド全ての検出可能な化学的又は物理的特徴を意味し、これは変換縮小又は変換縮小される可能性があり、又は実体のある媒体に、望ましくはコンピュータで読みとり可能な形で保存される。例えば、クロマトグラフィのスキャン・データ又はピーク・データ、写真データ又はそのスキャン・データ、マス・スペクトログラフィのデータ等があげられる。
【０３２１】
本発明は本発明のポリペプチド配列及び／又は本発明のポリヌクレオチド配列を保存した、コンピュータで読みとり可能な媒体を提供する。このコンピュータで読みとり可能な媒体とは、例えば市販のフロッピー・ディスク、テープ、チップ、ハードディスク、コンパクトディスク、及びビデオディスクを含み、情報又はデータの保存に使用される全ての記録媒体である。
【０３２２】
本発明の望ましい具体例において、以下を含むグループから選択された一部を保存したコンピュータで読みとり可能な媒体を提供する：配列番号５の配列を含むポリヌクレオチド；配列番号６の配列を含むポリペプチド；配列番号５の配列を含む前述の配列の少なくとも一つの中にある一組のポリヌクレオチド配列；配列番号６の配列を含む前述の配列の少なくとも一つの中にある一組のポリペプチド配列；配列番号５の配列を含むポリヌクレオチド配列に相当する一組のデータ；配列番号６の配列を含むポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列に相当する一組のデータ；配列番号５の配列を含むポリヌクレオチド；配列番号６の配列を含むポリペプチド；配列番号５の配列を含む前述の配列の少なくとも一つの中にある一組のポリヌクレオチド配列；配列番号６の配列を含む前述の配列の少なくとも一つの中にある一組のポリペプチド配列；配列番号５の配列を含む前述の配列の少なくとも一つの中にある一組のポリペプチド配列；配列番号６の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に相当する一組のデータ。
【０３２３】
この明細書に引用した全ての出版物及び参考文献は、特許及び特許出願書を含むがこれに限らず、個々の出版物又は参考文献がここに完全に公なものとして引用されていることが明確かつ個別に示唆されるように、その全体像をここに参考として示す。この出願請求項の優先権に対するいかなる特許出願書もまた、出版物及び参考文献に関する上述の規則に従ってその全体像をここに参考として示す。
【０３２４】
本発明の他の目的、利点及び特徴は、好ましい態様の次の非制限的な記載により容易に明らかになるであろうが、但しそれらは本発明の範囲を制限するべきではない。
本発明は、次の非制限的例によりさらに詳細に例示される。
【０３２５】
実施例
例  １．スタフィロコッカス・アウレウス・バクテリオファージ９６（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ａｕｒｅｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ９６）由来の阻害性ＯＲＦ ７８の同定
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）増殖株９６（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ） Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ， Ｏｔｔａｗａ， Ｏｎｔａｒｉｏから得られたＰＳ９６）を、ＣＤＣから得られたファージ９６増殖宿主として使用した。ファージをＳｗａｎｓｔｏｒｍおよびＡｄａｍｓ（Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９５１） Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐｔｌ． Ｂｉｏｌ． ＆ Ｍｅｄ． ７８： ３７２−３７５）によって述べられた寒天層法を用いて増殖させた。ファージＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹに述べられた方法によって精製したファージから調製した。
【０３２６】
９６ ＯＲＦ ７８（配列番号４）を、ファージゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した（図２）。ＰＣＲ増幅に関しては、センス鎖プライマーは配列番号３の開始コドンで開始し、そしてＢａｍＨＩ制限部位が先に存在し；アンチセンス鎖は配列番号３の最後の停止コドンで開始、そしてＳａｌＩ制限部位が先に存在する。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＳａｌＩにより消化した。その消化されたＰＣＲ生成物を、ＢａｍＨＩ−及びＳａｌＩ−消化されたｐＴＭＳＬａｃ、 すなわちカナマイシン耐性選択マーカーを含むＳ．アウレウスベクターに連結し、そしてそれを用いて、Ｓ．アウレウス株ＲＮ４２２０を形質転換した（Ｋｒｅｉｓｗｉｒｔｈなど．， （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ ３０５： ７０９−７１２）。
【０３２７】
ｐＴＭＳＬａｃベクターを次の通りにして構成した：砒酸塩−誘発性プロモーター及びｐＴＯＯ２１ベクターからのａｓｒＲ遺伝子（Ｔａｕｒｉａｉｎｅｎなど．， １９９７ Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３： ４４５６−４４６１）を、ラクトース−誘発性プライマー及びスタフィロコッカス・アウレウスからのｌａｃＲ遺伝Ｓににより置換した。ｌａｃＲ及びｌａｃオペロンプロモーター領域を包含する２．１８ｋｂのＤＮＡ領域に対応する２種のオリゴヌクレオチドを合成した。センス鎖配列は、（配列番号２３）５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＣＡＧ−３’（ＸｈｏＩクローニング部位を有する）であり；アンチセンス鎖配列は、（配列番号２４）５’−ｃｇｇｇａｔｃｃＡＡＴＡＡＧＡＣＴＣＣＴＴＴＴＴＡＣ−３’（ＢａｍＨＩクローニング部位を有する）である。それらの２種のオリゴヌクレオチドを、スタフィロコッカス・アウレウスＲＮ４２２０ ＤＮＡのＰＣＲ増幅のために使用し、ｐＴＭＳＬａｃベクターを構成した。
【０３２８】
ベクターｐＴＭＳＭＬａｃ ９６０ＲＦ７８（図３Ａ）においては、ファージＯＲＦ発現は、Ｓ．アウレウスｌａｃオペロンプロモーター／オペレーターの制御下に存在する。組換えクローンの選択を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレート上で行った。スタフィロコッカス・アウレウスのラクトース（ｌａｃ）遺伝子は、培養培地へのラクロース又はガラクトースの添加により誘発できることが示されている（Ｏｓｋｏｕｉａｎ ＆ Ｓｔｅｗａｒｔ， １９９０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２： ３８０４−３８１２）。ガラクトース（２％ｗ／ｖ）を用いて、液体アッセイにおいてｌａｃプロモーター／オペレーターからの遺伝子発現を誘発した。
【０３２９】
図３Ｂ−Ｄに示されるように、９６ＯＲＦ７８を有するＳ．アウレウスクローンについて、ＯＤ５８５及びコロニー形成単位（ＣＦＵ）により評価される場合、培養物の密度は、非誘発性条件下で時間にわたって上昇した。類似する増殖速度が、誘発された及び誘発されていない条件下で、非阻害性ＯＲＦ（グラフ上では“非キラー”として標識される）を有する形質転換体により観察された。個々のグラフは、Ｓ．アウレウスの３種の独立した形質転換体から得られた平均を表す。９６ＯＲＦ７８の発現は、誘発された培養物（５．０μＭの亜砒酸ナトリウム）について時間と共にＣＦＵの低下により観察された。
【０３３０】
４時間の誘発で、９６ＯＲＦ７８の発現は、細胞殺害性であり、同じ培養物に初期で存在するＣＦＵの数に比較して、ＣＦＵの数の１対数阻害低下をもたらす（図３Ｄ）。コロニープレートがカナマイシン、すなわち９６ＯＲＦ７８をコードするプライスミドに対して選択圧力を維持するために必要な構成物質の不在下で行われる場合（図３Ｂ）、増殖阻害の程度が低められた。
【０３３１】
例  ２．バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８の標的となるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質の同定
スタフィロコッカス・バクテリオファージの阻害性９６ ＯＲＦ ７８と相互作用するスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質を同定するために、９６ ＯＲＦ ７８のＧＳＴ−融合体を生成した。組換えタンパク質を精製し、そしてＧＳＴ／９６ ＯＲＦ ７８アフィニティー・カラムの作成に使用した。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞から調製された細胞抽出物をアフィニティ・マトリックスとインキュベートし、そしてマトリックスを、上昇する濃度の塩及び異なる界面活性剤をを含む緩衝液を用いて洗浄した。
【０３３２】
タンパク質溶出パターンをＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価した。ＰＴ７２として同定される、約７２ｋＤａの分子質量のタンパク質が、アフィニティ・マトリックスから特異的に溶出され（図４Ａ）、そしてＧＳＴ陰性対照カラムからの溶出液において検出されなかった（図４Ｂ）。下記に詳細を述べたように、相互作用タンパク質の正体を明らかするため、及び９６ ＯＲＦ ７８とそのタンパク質の相互作用を確認するために、さらに溶出タンパク質の特徴を解析した。
【０３３３】
Ａ．ＧＳＴ／９６ ＯＲＦ ７８組換えタンパク質の産生：
バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含むイン−フレーム翻訳融合体のためのｐＧＥＸ ４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローン化した。９６ ＯＲＦ ７８をコードする遺伝子を、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩによるｐＴＭＳＭＬａｃ９６ ＯＲＦ ７８（図３Ａ）の消化により得た。９６ ＯＲＦ ７８を含むＤＮＡフラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋスピン・カラム（Ｑｉａｇｅｎ）によってゲル精製し、ｐＧＥＸ ４Ｔ／９６ ＯＲＦ ７８を作成するために（事前にＢａｍＨＩとＳａｌＩによって消化された）ｐＧＥＸ ４Ｔ−１に連結した。
【０３３４】
組換え発現ベクターをミニプレップ法プラスミドの制限酵素解析によって同定した。Ｑｉａｇｅｎカラムを用いて大容量ＤＮＡ調製を行い、得られたプラスミドを配列決定した。発現プラスミドを含むＥ．コリ細胞における試験発現を、最適タンパク質発現条件を同定するために行った。発現構造体を含むＥ．コリＤＨ５α細胞を、２ＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブイヨンにおいて３７℃で０．４〜０．６のＯＤ６００（１ｃｍの路長）で増殖し、そして最適な時間及び最適な温度（２０℃）で、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＩＰＩＧ）により誘発した。
【０３３５】
Ｂ．融合ＧＳＴ／９６ ＯＲＦ ７８タンパク質の精製：
ＧＳＴ／９６ ＯＲＦ ７８融合タンパク質を含む細胞を、１ リットルの培養細胞に対して１０ ｍｌのＧＳＴ溶解緩衝液（２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．２、５００ ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ ％ グリセロール、１ ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ及び１ ｍＭ ＰＭＳＦ）の割合で懸濁し、フレンチプレスセルを用いてホモジナイズ後、４℃にて２０秒３回超音波破砕機を用いてホモジナイズした。溶解液をＳｏｒｖａｌ ＳＳ３４ローターを用いて４℃、１０，０００回転、３０分間遠心した。
【０３３６】
上清液を、あらかじめ溶解緩衝液で平衡化した４ ｍｌグルタチオン・セファロース・カラムに適用し、重力によって流出させた。カラムをカラム容量の１０倍の溶解緩衝液で洗浄後、ＧＳＴ溶出緩衝液（２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ８．０、５００ ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ ％ グリセロール、１ ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２５ ｍＭ 還元グルタチオン）を用いて４ ｍｌの分画に溶出した。この分画を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ）によって分析し、そしてタンパク質を、溶出されたＧＳＴ／９６ ＯＲＦ ７８タンパク質の量を評価するために、クマシー・ブリリアント・ブルー Ｒ２５０染色により可視化した。
【０３３７】
Ｃ．ＧＳＴ／９６０ＲＦ７８からのＧＳＴの除去：
ＧＳＴ／９６０ＲＦ７８（１．０ｍｇ／ｍｌで２．５ｍｌ）を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．５， １５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭのＥＤＴＡに対して、４℃で３時間、透析した。透析されたタンパク質を、８０単位のウシトロンビンプロテアーゼにより、室温で２時間、２．５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下で消化し、ＯＲＦドメインからＧＳＴドメインを切断し、そして消化の程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色により決定した。
【０３３８】
ＧＳＴ／９６ＯＲＦ７８を、トロンビンの異なった調製物と共に、追加の一晩の消化（１８℃）にゆだね、そして再び、消化の程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色により決定した。消化を、１ｍＭのＰＭＳＦ， １ｍＭのベンズアミジン及びＮａＣｌの添加により１Ｍの最終濃度にすることにより、停止した。消化されたＧＳＴ／９６ＯＲＦ７８を、１．５ｍｌのグルタチオンセファロースカラムに適用し、９６ＯＲＦ７８からのＧＳＴ及び未消化のＧＳＴ／９６ＯＲＦ７８を分解した。
【０３３９】
Ｄ．Ｓ． アウレウス抽出物の調製：
Ｓ．アウレウス抽出物を、細胞ペレットから、リソスタフィン消化、続く音波処理及びヌクレアーゼ消化を用いて調製した。細胞ペレット（２．９ｇ）を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．５， １５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのベンズアミジン、１０００単位のリソスタフィン、０．５ｍｇのＲＮアーゼＡ、７５０単位のミクロコッカス  ヌクレアーゼ及び３７５単位のＤＮアーゼの溶液８ｍｌに懸濁した。
【０３４０】
その細胞懸濁液を、３７℃で３０分間インキュベートし、４℃に冷却し、そして１ｍＭのＥＤＴＡ及び５００ｍＭのＮａＣｌの最終濃度に近づけた。その溶解物を、３回の破裂により、それぞれ２０秒間、氷上で音波処理した。溶解物を、Ｔｉ７０固定角度Ｂｅｃｋｍａｎローターにおいて、２０，０００ｒｐｍで１時間、遠心分離した。上清液を除去し、そして１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのベンズアミジン及び１ｍＭのＰＭＳＦを含む親和性クロマトグラフィー緩衝液（ＡＣＢ；２０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．５， １０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭのＥＤＴＡ）に対して、１０，０００Ｍｒ透析膜において一晩、透析した。透析されたタンパク質抽出物を、透析管から除去し、そして１ｍｌのアリコートで−７０°で凍結した。
【０３４１】
Ｅ． 親和性カラムの調製：
ＧＳＴ及びＧＳＴ／９６ ＯＲＦ ７８を、１ Ｍ 塩化ナトリウムを含むＡＢＣ緩衝液に対して一晩透析した。ＧＳＴ及びＧＳＴ／９６ ＯＲＦ ７８のトロンビン消化から得られた９６ ＯＲＦ ７８タンパク質を、透析しないで使用した。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって決定し、そしてＡｆｆｉｇｅｌ １０ 樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にタンパク質／樹脂濃度０、０．１、０．５、１．０及び２．０ ｍｇ／ｍｌで架橋結合させた。続けて、架橋結合された樹脂をカラムに充填する前に、エタノールアミン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にインキュベートし、１００ ｍＭ 塩化ナトリウムを含むＡＣＢで平衡化した。Ｓ．アウレウス抽出物を、マイクロ遠心分離機において４℃で１５分間遠心分離し、そして１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢにより５ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０３４２】
４００μｌの抽出物アリコートを、０， ０．１， ０．６， １．０及び２．０ｎｇ／ｍｌのリガンドを含む４０μｌをカラムに適用し、そして１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ（４００μｌ）を、２．０ｍｇ／ｍｌのリガンドを含む追加のカラムに適用し、そして続いて、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ（１００μｌ）、１ＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ（１６０μｌ）、及び１％ＳＤＳ（１６０μｌ）により希釈した。さらなる分析のために、個々の溶出物８０μｌを、１６ｃｍの１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （Ｌａｅｍｎｉｌ， Ｕ．Ｋ． （１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７： ６８０−６８５） により分解し、そしてタンパク質を、銀染色により可視化した。
【０３４３】
Ｆ．親和性クロマトグラフィー：
７２ｋＤａの候補体ポリペプチド（ＰＴ７２）を、ＧＳＴ／９６ＯＲＦ７８（図４Ａ）又は９６ＯＲＦ７８（図５）のいずれかを含む親和性カラムから回収した。ＰＴ７２を、１ＭのＮａＣｌ溶出物において、及びＢＳＴ／９６ＯＲＦ７８クロマトグラフィー実験の１％ＳＤＳ溶出物において回収した。ＰＴ７２を、９６ＯＲＦ７８（ＧＳＴ除去された）クロマトグラフィー実験の１％ＳＤＳ溶出液において観察した。ＰＴ７２ポリペプチドは、ＧＳＴ対照親和性クロマトグラフィー実験においては観察されなかった。
【０３４４】
Ｓ．アウレウス抽出物におけるＰＴ７２タンパク質の相対的な多量性の評価は、候補体相互作用タンパク質のほぼ定量的回収が親和性クロマトグラフィー処理の間に生じた仮定に依存する。リガンドＧＳＴ／ＯＲＦ７８を用いての５ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンによる親和性クロマトグラフィー実験は、２．０ｍｇ／ｍｌのカラムの溶出液において約５０ｎｇのＰＴ７２を生成した。銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのタンパク質定量化は単なる近似であるが、抽出物におけるＰＴ７２の推定される多量性は、合計細胞タンパク質の約０．０１％である。
【０３４５】
Ｇ．９６ＯＲＦ７８相互作用タンパク質としてのＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の同定：
候補体タンパク質ＰＴ７２を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの除去し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分光計によるトリプシンペプチド質量決定のために調製した（Ｑｉｎ， Ｊ． など．， （１９９７） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｎ， ６８ｍ ３９９５−４００１）。図６に例示されるように、高品質の質量スペクトルを得た。２種の親和性クロマトグラフィー実験において観察されるＰＴ７２タンパク質（図４及び５において提供される溶出物）は、トリプシンペプチドの質量により決定される場合、同一である。ＰＴ７２を含むゲルスライスは、単一のタンパク質を含むことが見出された。
【０３４６】
ＰＴ７２バンドを、Ｃｌｏｎｉｎｇ ２８６ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａゲノム配列決定プロジェクトデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｅｄｕ／ｓｔａｐｈ．ｈｔｍｌ）に見出される読み取り枠（本明細においては、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９として言及される）として同定した。ＰＴ７２は、同一ではないが、Ｓ．アウレウスＤｎａＧ（ｇｉ｜２４９４１４７｜ｓｐ｜Ｏ０５３３８｜ＰＲＩＭ＿ＳＴＡＡＵ ＤＮＡ ＰＲＩＭＡＳＥ， ｇｉ｜１９４３９９４｜ｄｂｊ｜ＢＡＡ１９４９３．１｜（ＡＢ００１８９６） に非常に類似する。
【０３４７】
図７Ｂに示されるように、記載されるＳ．アウレウスＤｎａＧ（Ｓｗｉｓｓｐｏｒｔ Ｎｏ： Ｏ０５３３８） とのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の最適な全体的アミノ酸配列アラインメントの結果は、２種のポリペプチド間で９２％の同一性を示した。Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔに報告されるような及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｓ． アウレウスゲノム配列決定プロジェクトデータベースに報告されるようなＳ．アウレウスからのＤＮＡプライマーゼの配列間の不一致は、注目すべきである。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９（配列番号２）のＮ−末端配列を、質量スペクトルにおける１１７１．６２３フラグメントの存在に基づいて予測した（図６）。
【０３４８】
このトリプシン消化されたフラグメントは、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の推定されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５〜１４の配列（配列番号２４：ＩＤＱＳＩＩＮＥＩＫ）から推定される質量に応答する。さらに、Ｓ．アウレウス株ＲＮ４２２０のゲノム上のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の５’ＤＮＡ配列を、次のプライマー対によるＰＣＲ及びＤＮＡ配列分析により確かめた：５’−ＧＣＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＣＡＣＧ−３’（配列番号２５）及び５’−ＧＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧ−３’（配列番号２６）。図７Ｂはまた、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９がそれぞれ、３４％、３６％及び２７％の同一性を伴なって、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス及びＥ．コリのＤｎａＧポリペプチドを包含するいくつかの細菌ＤＮＡプライマーゼに類似することを示す。
【０３４９】
図７Ａは、アミノ酸位置１〜３３９のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９領域において２種の高い関連性あるＰｆａｍモチーフを同定する公的に入手できるＰｆａｍデータベースのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ 調査分析の結果を示す。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９は、鋳型ＤＮＡ認識に包含されるＮ−末端亜鉛フィンガー結合ドメイン、及び細菌ＤｎａＧ−型プライマーゼにおける保存された触媒ドメインに対応し、そして中心に位置するＴｏｐｒｉｍドメインを有する。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のＣ−末端領域は、図７Ｂに示される最適な全体的アミノ酸配列アラインメントに例示されるように、細菌ＤＮＡプライマーゼ間で単に弱く保存される。
【０３５０】
例  ３．酵母ツー・ハイブリッド分析によるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と９６ ＯＲＦ ７８との間の相互作用の確認
バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８の相互作用パートナーとしてのＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の確認を行うために、及び相互作用の特定のドメインを同定するために、本発明者はまず、Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の９６ＯＲＦ７８相互作用ドメインを決定した。従って、組換えＳＴＡＡＵ＿Ｒ９タンパク質を、酵母ツー・ハイブリッドシステムを用いての欠失分析にゆだねた。
【０３５１】
Ａ．酵母ツー・ハイブリッド分析のための９６ ＯＲＦ ７８及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９組換えポリペプチドの生成：
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のポリヌクレオチド配列を、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９遺伝子（配列番号１）の予測される翻訳開始及び停止コドンを標的化するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによりＳ．アウレウス株ＲＮ４２２０ゲノムＤＮＡから得た。増幅されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に使用される開始コドン（ロイシンに対応するＴＴＧ）は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の予測される開始コドンに対応する。
【０３５２】
図８Ａに示されるように、センス鎖プライマー（図１１Ａ；配列番号８）は、開始コドンを標的化し、そしてＥｃｏＲＩ制限部位が先に存在し；アンチセンスオリゴヌクレオチド（図１１Ａ：配列番号９）は停止コドンを標的化し、そしてＢｇｌＩＩ制限部位が先に存在する。ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩにより消化した。その消化されたＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩ−及びＢｇｌＩＩ−消化されたｐＧＡＤＴ７ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に連結し、ｐＧＡＤＳＴＡＡＵ＿Ｒ９を生成した。類似する方法を用いて、ｐＧＢＫＴ７ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中にＳＴＡＡＵ＿Ｒ９をクローニングし、ｐＧＢＫＳＴＡＡＵ＿Ｒ９を生成した。
【０３５３】
バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８ （図２；配列番号４）を、酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ 結合ドメイン（ｐＧＢＫＴ７ベクターによりコードされる）のカルボキシル末端に、又は酵母Ｇａｌ４活性化ドメイン（ｐＧＡＤＴ７によりコードされる）に融合した。図８Ｂに示されるように、９６ ＯＲＦ ７８を、ＢａｍＨＩによるｐＴＭＳＭＬａｃ ９６ＯＲＦ７８（図３Ａに記載される）の消化、続いてのヤエナリ豆のヌクレアーゼによる処理及びＳａｌＩによる消化により得た。９６ ＯＲＦ ７８を含むＤＮＡ制限生成物をゲル精製し、そしてＳｍａＩ及びＳａｌＩにより消化されたｐＧＢＫＴ７発現ベクター中に連結した。組換え発現ベクターを、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析により同定した。
【０３５４】
Ｂ．酵母誘発性発現システム中へのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９フラグメントのクローニング：
図１０Ａに示されるように、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９（図１；配列番号２）のポリペプチド配列の１３種の切断されたフラグメントをまた、適切な対のオリゴヌクレオチドプライマー（図１１Ａ及びＢ）を利用し、そしてｐＧＡＤＴ７ベクターにＰＣＲ生成物を連結することによって、Ｓ．アウレウスゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより増幅した。図１１Ｂは、ＰＣＲの間に使用されるプライマー対を同定する。図１０Ａにおける個々のフラグメントの左側及び右側末端での番号はそれぞれ、Ｎ−末端及びＣ−末端アミノ酸残基に対応する（配列番号２におけるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のアミノ酸配列に従って）。
【０３５５】
Ｃ．酵母ツー・ハイブリッド分析：
アミノ酸３５−５９９のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９フラグメントについて図 ９Ａに示されるように、異なる組合せの構築を持つｐＧＡＤ及びｐＧＢＫプラスミド（個々の対のペトリ皿上に示されるような）を、あらかじめＥ． ｃｏｌｉ ＬａｃＺと選択ＨＩＳ３及びＡＤＥ２遺伝子の染色体組込みコピーを持つように遺伝子操作した酵母株（ＡＨ１０９、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に導入した。
【０３５６】
同時形質転換体を、トリプトファン及びロイシン欠失アミノ酸添加（ＴＬ マイナス）酵母用合成培地（ＳＤ）や、トリプトファン、ヒスチジン、アデニン及びロイシン欠失アミノ酸添加（ＴＨＡＬ マイナス）酵母用合成培地上に並べて培養した。９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドを持つ同時形質転換体は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９が存在する選択ＳＤ ＴＨＡＬマイナス培地でのみ増殖した。レポーターＨＩＳ３及びＡＤＥ２遺伝子の誘発は、適切な対照プラスミド（ｐＧＢＫＴ７ＬａｍｉｎＣ又はｐＧＡＤＴ７−Ｔ）を有する同時形質転換体はＳＤ ＴＨＡＬマイナス培地上で生存しないので、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９と９６ ＯＲＦ ７８との相互作用に依存する。唯一の例外は、ＳＤ ＴＨＡＬ−培地上でのｐＧＫＢ ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び対照ｐＧＡＤＴ７−Ｔにより同時形質転換された酵母の増殖である。
【０３５７】
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＦ ７８の相互作用はまた、９６ ＯＲＦ ７８−ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９同時形質転換体におけるβ−ガラクトシダーゼ活性のバックグラウンドレベル以上に観察される１０倍の上昇性により明確に示された（それぞれ、図９Ｂ，サンプル１Ｄ及び４）。それらの結果は、本明細書において同定されたＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９がバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８の宿主標的物である解釈と一致する。
【０３５８】
同目的の実験においては、ＳＴＡＡ＿Ｒ９切断されたフラグメントを有する個々のｐＧＡＤベクターを、９６ＯＲＦ ７８を含むｐＧＢＫベクターと共にＡＨ１０９酵母細胞中に導入した（図１０Ａ）。得られる同時形質転換体を、レポーター遺伝子の発現を誘発するそれらの能力について分析した。図１０Ｂは、９８ ＯＲＦ ７８と個々のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−関連フラグメントとの相互作用の結果を示す。
【０３５９】
アミノ酸残基５６１−５９９のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の部分（本明細書においては、配列番号６又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９９として言及される）は、宿主酵母細胞中への適切なプラスミドの導入がＴＨＡＬ−ＳＤ培地上でのそれらの増殖をもたらすので、バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８と相互作用することが見出された（図１０Ｃ；ペトリ皿の上部対）。この３９個のアミノ酸配列（配列番号６）は、９６ ＯＲＦ ７８との相互作用能力を維持する、酵母ツー・ハイブリッドアッセイにより同定されるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の最少ドメインを表す。このアミノ酸セグメントは、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス及びＥ．コリ間では良好に保存されない（図７Ｂ）。
【０３６０】
例  ４．ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＦ ７８精製された組換えタンパク質及びそのフラグメント間の相互作用の親和性ブロット及び表層プラスモン共鳴アッセイによる特徴化
ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９とＳ．アウレウスバクテリオファージの阻害性９６ ＯＲＦ ７８との間、すなわちＳＴＡＡＵ＿Ｒ９（配列番号２）及びそのフラグメント（配列番号６）と９６ＯＲＦ０７８（配列番号４）との間の相互作用を特徴づけるために、組換えタンパク質を、ＧＳＴ−標識された融合体として発現し、そして精製されたタンパク質を、親和性ブロット（Ｆａｒウェスターン）及び表層プラスモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイに使用した。
【０３６１】
Ａ．細胞株プラスミド構造体：
Ｅ．コリＢＬ２１（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、組換えタンパク質のクローニング及び発現のための宿主株として使用した。Ｎ−末端ＧＳＴ標識及びＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断をコードするｐＧＥＸ−６Ｐ１ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ） を用いて、ＧＳＴ融合構造体を生成した。ｐＧＥＸ−６ＰＫを、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩにより線状化されたｐＧＥＸ−６Ｐ１中に、心筋キナーゼ（ＨＭＫ）リン酸化部位に対応するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド（配列番号２７；５’−ＧＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３’及び配列番号２８；５’−ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＧＡＣＧＡ−３’（Ｋａｅｌｉｎなど．， １９９２， Ｃｅｌｌ ７０： ３５１−３６４）をクローニングすることによって得た。ＤＮＡ複合体の挿入を、配列決定により確かめ、そしてそのプラスミドをｐＧＥＸ−６ＰＫとして言及する。
【０３６２】
ｐＧＥＸ−６ＰＫ ９６ ＯＲＦ０７８の構造を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩによるｐＧＡＤ ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の消化により行い、そしてＳＴＡＡＵ＿Ｒ９に対応する挿入体をゲル精製し、そしてｐＧＥＸ−６ＰＫのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位中に連結した。その挿入体の存在を、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９特異的プライマーを用いてＰＣＲにより確かめた。類似する方法を用いて、アミノ酸位置５６１〜５９９のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のＣ−末端部分をコードするＤＮＡをクローン化した。挿入体を、ｐＧＡＤ  ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９９プラスミドから得、そしてｐＧＥＸ−６ＰＫ中にクローン化し、ｐＧＥＸ＿６ＰＫ＿ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９７を得た。その挿入体の存在を、ＢａｍＨＩ−ＮｏｌＩ制限酵素による消化により確かめた。
【０３６３】
Ｂ．タンパク質発現及び精製：
ＧＳＴ融合タンパク質の過剰発現を、１ｍＭのＩＰＴＧにより２５℃で３時間、対数相培養物を誘発することによって行った。特にことわらない限り、すべての続く段階は４℃で行われた。細胞を、ＪＡ−１０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）上で５，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離することによって収穫し、そして細菌ペレットを、１００ｍｌの氷冷却されたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に再懸濁し、４アリコートに分け、そして上記のようにして遠心分離した。個々のアリコートを、５ｍｌのＳＴＥ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ， １５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌのリゾザイム）に再懸濁した。氷上での１５分間のインキュベーションの後、１０ｍＭのジチオトレイトール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及び１．４％Ｓａｒｋｏｓｙｌ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして細胞溶解を、３サイクルの音波処理（２０秒／サイクル）により達成した。
【０３６４】
細胞溶解物を、ＪＡ−２０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）上で１６，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離し、そして上清液を２０ｍｌの合計体積のでの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｕｍａ）により室温で転倒型回転を伴なって処理した。溶解物を、ＪＡ−２０ローター上で１６，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離し、そして上清液を、１ｍｌの層体積のグルタチオンセファロースー４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に６０分間インキュベートした。結合されたタンパク質を、ＰＢＳにより集中的に洗浄し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、そしてタンパク質を、１０ｍＭの還元されたグルタチオン（Ｓｉｇｍａ）によりＧＳＴ融合体として溶出するか、又は５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのＤＴＴの溶液５００μｌ中、４０単位のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａ）による消化によりＧＳＴ部分から分離した。転倒型回転を伴なっての５時間のインキュベーションの後、サンプルを１３，０００ｇで５分間、遠心分離し、そして上清液を集め、そしてタンパク質を−８０℃で貯蔵した。
【０３６５】
タンパク質濃度を、Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイを用いて決定した。タンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色により可視化した。
【０３６６】
Ｃ．親和性ブロットアッセイ：
タンパク質の放射性ラベリングを、心筋キナーゼ酵素（ＨＭＫ）により、心筋リン酸受容体部位を通して行った。個々のラベルされたプローブを、そのそれぞれの固定された同起源のタンパク質と共にインキュベートし、そしてその相互作用を、集中的な洗浄の後、Ｘ−線フィルムへの照射により検出した。［３２Ｐ］−ＡＴＰによる放射性ラベリングに関しては、５−１０μｇのＧＳＴ−分解された９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチド、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又はＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９９を、２００ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１ＭのＮａＣｌ、１２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ及び５０μＣｉの［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（３００ｃｉ／ｍ モル）（ＮＥＮ／Ｍａｎｄｅｌ）を含む溶液（１００μｌの合計体積）中、５０単位の触媒サブユニットのｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ“Ｈｅａｒｔ Ｍｕｓｃｌｅ Ｋｉｎａｓｅ”（Ｓｉｇｍａ）と共に、室温で３０分間インキュベートした。
【０３６７】
遊離ヌクレオチドを除去するために、タンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ５０ ＮＩＣＫカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、そしてＺ−緩衝液（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．７、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、１００ｍＭのＫＣｌ＆１ｍＭのＤＴＴ）により溶出し、そしてγ３２Ｐ−ＡＴＰの組込みを液体シンチレーションカウンターにより計数することにより決定した。
【０３６８】
上昇する量（５０ｎｇ〜４．５μｇ）のＧＳＴ−分解されたタンパク質を、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で分解し、そしてニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｒ）上にブロットした。固定されたタンパク質を、ＨＢＢ緩衝液（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）中、６Ｍのウレアと共に前記膜を４℃で２０分間インキュベートすることによって変性した。そのタンパク質を、ＨＢＢ緩衝液中、ウレアの連続的希釈により現場再生した。前記膜を、０．０５％のＮＰ−４０により補充されたＨＢＢ中、５％ミルクにより少なくとも１時間、及び０．０５％のＮＰ−４０により補充されたＨＢＢ中、１％ミルクにより４５時間ブロックした。
【０３６９】
ハイブリダイゼーションを、プローブとして約２５０，０００ｃｐｍ／ｍｌの［３２Ｐ］−ＡＴＰラベルされたタンパク質を含むハイブリダイゼーション緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．７、７５ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５％のＮＰ−４０及び１％のミルク）において一晩、実施した。前記膜を、ハイブリダイゼーション緩衝液により１０分間、３度洗浄し、そしてＸ−線フィルムに照射した。
【０３７０】
特定のシグナルが、プローブとして［３２Ｐ］−９６ ＯＲＦ ７８を用いる場合、負の対照として精製されたＧＳＴタンパク質を含むレーンに比較して、固定されたＧＳＴ／ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９、ＧＳＴ−分解されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９、ＧＳＴ／ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９９又はＧＳＴ−分解されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９９に対して観察された（結果は示されていない）。同様に、特定のシグナルが、プローブとして［３２Ｐ］−ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９又は［３２Ｐ］−ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９９を用いる場合、負の対照として精製されたＧＳＴタンパク質を含むレーンに比較して、固定されたＧＳＴ／９６ＯＲＦ７８、又はＧＳＴ−分解された９６ＯＲＦ７８に対して観察された（結果は示されていない）。
【０３７１】
Ｄ．表層プラスモン共鳴アッセイ：
バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８の相互作用パートナーとしてのＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の同定を、精製された組換えポリペプチドを用いて、表層プラスモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００ Ｂｉｏｓａｎｓｏｒ）により確認した。ＧＳＴ／ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９９を、ＣＭ５センサーチップの表面に共有結合された抗−ＧＳＴ抗体によりリガンドとして捕獲し；抗−ＧＳＴ抗体を有し、そして捕獲されたリガンドを有さないブランク表面を、負の対照として使用した。前記２種の表面上への精製された９６ ＯＲＦ ７８タンパク質の注入は、固定されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿５６１＿５９９による９６ ＯＲＦ ７８の特異的捕獲を示した（結果は示されていない）。同様に、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９を、ＣＭ５センサーチップの表面に直接的に、リガンドとして共有結合し；捕獲されたリガンドを有さないブランク表面を、負の対照として使用した。前記２種の表面上への精製された９６ ＯＲＦ ７８タンパク質の注入は、固定されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９による９６ ＯＲＦ ７８の特異的捕獲を示した。
【０３７２】
結論：
阻害性バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９間の相互作用により、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９遺伝子及びその遺伝子生成物は、抗微生物剤のスクリーニング及び同定のために、及びより特定には、抗−Ｓ．アウレウス剤のための新規細胞標的物として同定された。本発明はまた、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び／又はバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８及び／又は本発明従って同定された化合物に基づいての新規診断、予後及び治療方法も提供する。
本発明は好ましい態様により記載されてきたが、それは本発明の範囲内で修飾され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｓ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のヌクレオチド（配列番号１）及びアミノ酸（配列番号２）配列を示す。
【図２】
図２は、Ｓ．アウレウスバクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８のヌクレオチド（配列番号３）及びアミノ酸（配列番号３）配列を示す。
【図３】
図３は、バクテリオファージ９６ ＯＲＦ ７８の細菌阻害能力、及びＳ．アウレウスにおけるそれらの発現を誘発するために使用される発現ベクターを示す。Ａ）Ｓ．アウレウス細胞における９６ ＯＲＦ ７８の発現を誘発するために使用される発現ベクターｐＴＭＳＭＬａｃ／ＯＲＦのための）の図；Ｂ）及びＤ）液体培地において増殖され、続いてプラスミドに対する選択的圧力を維持するために必要な抗生物質（Ｂ）を含むか又は（Ｄ）含まない半固体培地上にプレートすることにより増殖されたＳ．アウレウスにおいて発現される場合、９６ ＯＲＦ ７８の阻害能力についてのコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイの結果；Ｃ） ９６ ＯＲＦ ７８の発現のためのインデュウサーの存在及び不在下で液体培地においてのＳ．アウレウス細胞の増殖。
【図４】
図４は、５．０ｍｇ／ｍｌのＳ．アウレウス抽出物と共にリガンドとしてＡ）ＧＳＴ／９６ ＯＲＦ ７８又はＢ）ＧＳＴを用いての親和性クロマトグラフィーを示す。１ｍｌ樹脂当たり０， ０．１， ０．５， １．０及び２．０ｍｇでリガンドを含む親和性カラムの溶出液を、１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、そしてゲルを硝酸銀により染色した。マイクロカラムを、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥは示されていない）を含む１００ｍＭのＡＣＢ、１ＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ、及び１％ＳＤＳにより連続的に溶出した。個々の分子量マーカーは約２００ｎｇである。ＡＣＢにラベルされたレーンは、１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ緩衝液によってのみ充填された２．０ｍｇ／ｍｌリガンドカラムからの溶出液を示す。ＰＴ７２を示す矢印は、タンパク質同定のために切除されたバンドを示す。
【図５】
図５は、５．０ｍｇ／ｍｌのＳ．アウレウス抽出物と共にリガンドとして９６ ＯＲＦ ７８（ＧＳＴは除去されている）を用いての親和性クロマトグラフィーを示す。１ｍｌ樹脂当たり０， ０．１， ０．５， １．０及び２．０ｍｇでリガンドを含む親和性カラムの溶出液を、１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、そしてゲルを硝酸銀により染色した。マイクロカラムを、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥは示されていない）を含む１００ｍＭのＡＣＢ、１ＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ、及び１％ＳＤＳにより連続的に溶出した。個々の分子量マーカーは約２００ｎｇである。ＡＣＢにラベルされたレーンは、１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＣＢ緩衝液によってのみ充填された２．０ｍｇ／ｍｌリガンドカラムからの溶出液を示す。ＰＴ７２を示す矢印は、タンパク質同定のために切除されたバンドを示す。
【図６】
図６は、９６ ＯＲＦ ７８と相互作用するＰＴ７２タンパク質のトリプシンペプチド質量スペクトルの結果を示す。ＰＴ７２を含むゲルスライスは１つのタンパク質を含んだ。ＰＴ７２バンドは、Ｃｏｎｔｉｇ ２８６ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ ゲノム配列決定プロジェクトデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｕ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｓｔａｐｈ．ｈｔｍｌ）において見出される、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９として本明細書において言及される、読み取り枠として同定された。
【図７】
図７は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のアミノ酸配列分析の結果を示す。Ａ）２種の保存されたＰｆａｍモチーフ：Ｚｆ−ＣＨＣ２及びＴｏｐｒｉｍを同定する公的に入手できるＰｆａｍデータベースのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）調査分析の結果。Ｂ）異なったＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−関連配列のアミノ酸配列の全体的な最適アラインメントの結果。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９は、Ｓ．アウレウスＤＮＡプライマーゼに非常に類似する（ｇｉ｜２４９４１４７｜ｓｐ｜Ｏ０５３３８｜ＰＲＩＭ＿ＳＴＡＡＵ ＤＮＡ ＰＲＩＭＡＳＥ、ＤｎａＧに対して９２％の同一性）。
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔにおいて報告されるような、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｕｌａｈｏｍａ Ｓ． アウレウスゲノム配列決定プロジェクトデータベースから予測されるようなＳ．アウレウスからのＤＮＡプライマーゼの配列間の不一致を注意すること。ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９はまた、次の種々の細菌ＤＮＡプライマーゼタンパク質にも適度に類似する：Ｂ．ステアロサーモフィラスｄｎａｇ（ｇｉ｜９９１０８４１｜ｓｐ｜Ｑ９Ｘ４Ｄ０｜ＰＲＩＭ＿ＢＡＣＳＴ ＤＮＡ ＰＲＩＭＡＳＥに対して３４ ％の同一性）、Ｂ．サブチリスＤｎａＧ（ｇｉ｜１３０９０４｜ｓｐ｜Ｐ０５０９６｜ＰＲＩＭ＿ＢＡＣＳＵ ＤＮＡ ＰＲＩＭＡＳＥに対して３６ ％の同一性），及びＥ．コリＤｎａＧ（ｇｉ｜１３０９０８｜ｓｐ｜Ｐ０２９２３｜ＰＲＩＭ＿ＥＣＯＬＩ ＤＮＡ ＰＲＩＭＡＳＥに対して２７％の同一性）。
【図８】
図８は、Ａ）酵素発現ベクターｐＧＡＤＴ７（ｐＧＡＤＳＴＡＡＵ＿Ｒ９）におけるＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及びＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−関連フラグメントについてのクローニング方法；Ｂ）酵母発現ベクターｐＧＢＫＴ７（ｐＧＢＫ ９６ ＯＲＦ ７８）におけるファージ９６ ＯＲＦ ７８についてのクローニング方法；及びＣ） ＧＡＤＳＴＡＡＵ＿Ｒ９ （上部パネル）、９６ ＯＲＦ ７８ （中間パネル）又はＧＡＤＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＦ ７８ （低部パネル）の両者のいずれかを発現する３種の様式化された細胞における酵母ツー・ハイブリッド・システムの代表図を示す。
【図９】
図９は、配列番号２のアミノ酸３５−５９９を含んで成るＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＦ ７８の相互作用を試験するために企画された酵母ツー・ハイブリッド分析の結果を示す。Ａ）酵母を、ペトリ皿の個々の対の写真上に示されるように１対のベクターにより同時形質転換した。同時形質転換体を、トリプトファン及びロイシンを欠くアミノ酸（ＴＬマイナス）により補充された酵母合成培地（ＳＤ）上に、及びトリプトファン、ヒスチジン、アデニン及びロイシンを欠いているアミノ酸（ＴＨＡＬマイナス）により補充されたＳＤ上に同時にプレートした。９６ ＯＲＦ ７８ポリペプチドを有する同時形質転換体は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿３５の存在下で、選択的ＴＨＡＬマイナス培地上で増殖した（ペトリ皿の上部対）。
非相互作用タンパク質を有する対照ベクター（ｐＧＢＫＬａｍｉｎＣ又はｐＧＡＤＴ７−Ｔ）によるそれらのポリペプチドの同時形質転換は、ＴＨＡＬマイナス培地上での増殖をもたらさない。ＰＧＢＫベクターにおけるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のクローニングは、負の対照の存在下でＴＨＡＬマイナス培地上での増殖をもたらす。Ｂ）示される同時形質転換からのタンパク質抽出物による発光β−ガラクトシダーゼ酵素アッセイの結果。同じ細胞におけるＳＴＡＡＵ＿Ｒ９＿３５及び９６ ＯＲＦ ７８の存在は、非相互作用タンパク質を有する対照ベクターに比較して、β−ガラクトシダーゼ活性の少なくとも１０倍の誘発をもたらす。
【図１０】
図１０は、ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び９６ ＯＲＦ ７８の小フラグメント間の相互作用を試験するために企画された酵母ツー・ハイブリッド分析に結果を示す。Ａ）酵母ｐＧＡＤ及びｐＧＢＫベクターにおいてクローン化されたＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の異なったフラグメントの代表図。酵母は、９６ ＯＲＦ ７８及び異なったＳＴＡＡＵ＿Ｒ９フラグメントにより同時形質転換され、そして同時形質転換体は、ＴＬマイナスＳＤ培地、及びＴＨＡＫマイナスＳＤ培地上で同時にプレートされた。Ｂ） ９６ ＯＲＦ ７８（ラベル下で；“９６ ＯＲＦ ７８との相互作用”）の存在下で異なったＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−関連フラグメントを発現する酵母の選択的ＴＨＡＬマイナスＳＤ培地上での増殖の結果の要約。Ｃ） ＳＴＡＡＵ＿Ｒ９のアミノ酸５６１−５９９を含む、配列番号６のポリペプチドと９６ ＯＲＦ ７８との間の相互作用を示す酵母ツー・ハイブリッド分析に結果。この配列は、酵母ツー・ハイブリッド分析により決定されるように、９６ ＯＲＦ ７８と相互作用するＳＴＡＡＵ＿Ｒ９の最少ドメインを表す。
【図１１】
図１１は、ＰＣＲによる増幅のために、及び酵母ツー・ハイブリッド分析についてのベクターにおけるＳ．アウレウスＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−関連配列のクローニングのために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの列挙を示す。Ａ） 同定されるクローニングのために使用される制限部位を有する個々のプライマーの配列；Ｂ）十分な長さのＳＴＡＡＵ＿Ｒ９及び１３種のＳＴＡＡＵ＿Ｒ９−関連フラグメントをクローン化するために使用されるプライマー対。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図７Ｂ−３】
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【図７Ｂ−４】
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【図７Ｂ−５】
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【図７Ｂ−６】
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【図７Ｂ−７】
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【図７Ｂ−８】
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【図７Ｂ−９】
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【図７Ｂ−１０】
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【図７Ｂ−１１】
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【図７Ｂ−１２】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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2004515251.tif 000193
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004515251.tif 000194
2004515251.tif 000195
【国際調査報告】
2004515251.tif 000196
2004515251.tif 000197
2004515251.tif 000198