(57)【要約】特定の刺激剤が利用する細胞内調節経路を発見するための方法およびベクターが開示される。適切な刺激剤として、サイトカイン、化学薬品、および抗体が挙げられる。薬物候補ライブラリーをスクリーニングして潜在的な治療剤を同定するための細胞株および調節因子が提供される。選択された細胞の標的ゲノム遺伝子座を上方制御もしくは下方制御するのに必要な遺伝子、または選択された細胞の標的ゲノム遺伝子座を上方制御もしくは下方制御することができる遺伝子を同定するための方法および組成物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入し、これにより、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；および
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現が刺激剤により特異的に活性化されている細胞を選択する段階。
【請求項２】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１記載の方法：
（ｉ）刺激剤および陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｉ）陰性の選択薬剤が存在し、該刺激剤が存在しない条件下で該細胞をインキュベートする段階。
【請求項３】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１記載の方法：
（ｉ）陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；
（ｉｉ）陰性の選択薬剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階；
（ｉｉｉ）刺激剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｖ）該刺激剤の存在下でレポーター遺伝子を発現する該細胞を選択する段階。
【請求項４】
ベクターが、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含まない、請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞が、マスト細胞、幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、癌細胞、リンパ球、および肝細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
刺激剤が、サイトカイン、リガンド、ポリペプチド、増殖因子、抗体、および化学薬品からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
刺激剤が、幹細胞因子、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩｇＥ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、およびレプチンからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
レポーター遺伝子が酵素をコードする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
酵素が、分泌型アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ベクターが、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントをさらに含み、核酸が細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
トランス活性化因子ポリペプチドがテトラサイクリン調節タンパク質（ｔＴＡ）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入し、これにより、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントが少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；および
（ｂ）該トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤により特異的に活性化されている細胞を選択する段階。
【請求項１３】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１２記載の方法：
（ｉ）刺激剤および陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｉ）陰性の選択薬剤が存在し、該刺激剤が存在しない条件下で細胞をインキュベートする段階。
【請求項１４】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１２記載の方法：
（ｉ）陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；
（ｉｉ）陰性の選択薬剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階；
（ｉｉｉ）刺激剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｖ）該刺激剤の存在下でレポーター遺伝子を発現する該細胞を選択する段階。
【請求項１５】
ベクターが、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含まない、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを該細胞に挿入し、これにより、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；および
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現が該刺激剤により特異的に不活化されている細胞を選択する段階。
【請求項１７】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１６記載の方法：
（ｉ）陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｉ）刺激剤および陰性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階。
【請求項１８】
ベクターが、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含まない、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
細胞が、マスト細胞、幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、癌細胞、リンパ球、および肝細胞からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
刺激剤が、サイトカイン、リガンド、ポリペプチド、増殖因子、抗体、および化学薬品からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
刺激剤が、幹細胞因子、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩｇＥ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、およびレプチンからなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
レポーター遺伝子が酵素をコードする、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
酵素が、分泌型アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ベクターが、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントをさらに含み、核酸が細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
トランス活性化因子ポリペプチドがｔＴＡである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入し、これにより、該トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントが少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；および
（ｂ）該トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤により特異的に不活化されている細胞を選択する段階。
【請求項２７】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項２６記載の方法：
（ｉ）陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｉ）刺激剤および陰性の選択薬剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階。
【請求項２８】
ベクターが、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含まない、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
以下の段階：
（ｃ）調節エレメントを同定する段階
をさらに含む、請求項１、請求項１２、請求項１６、または請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
陽性の選択マーカーがカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｃ）が以下の段階を含む、請求項２９記載の方法：
（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、該陽性の選択マーカーを含み、該カセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該カセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項３１】
陽性の選択マーカーがカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｃ）が以下の段階を含む、請求項２９記載の方法：
（ｉ）酵母プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、該陽性の選択マーカーを含み、該カセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該カセットに隣接する該セグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項３２】
細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）第１の陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、レポーター遺伝子、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを細胞に挿入する段階であり、ここで、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｂ）該トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第２のカセットを該細胞のゲノムに組み込む条件下で、第２のカセットを含む第２のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、プロモーターが、少なくとも１つの細胞のタンパク質をコードする関心対象の核酸に作動可能に連結され、コードされているタンパク質が調節エレメントの活性を調節する段階；
（ｃ）トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞を選択する段階；および
（ｄ）少なくとも１つの選択された細胞において関心対象の核酸を同定する段階。
【請求項３３】
第２のベクターが第２の陽性の選択マーカーをさらに含み、該第２の陽性の選択マーカーが細胞ゲノムに組み込まれる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
第２の陽性の選択マーカーが、第２のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｄ）が以下の段階を含む、請求項３３記載の方法：
（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第２のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第２のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項３５】
第２の陽性の選択マーカーが、第２のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｄ）が以下の段階を含む、請求項３３記載の方法：
（ｉ）酵母プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第２のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第２のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項３６】
トランス活性化因子ポリペプチドがｔＴＡであり、応答エレメントがテトラサイクリン応答エレメントを含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびリコンビナーゼシグナル配列を含む第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを細胞に挿入する段階；
（ｂ）リコンビナーゼシグナル配列、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメント、およびレポーター遺伝子を含む第２のカセットが少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込まれるように、第２のカセットを含む第２のベクターにおけるリコンビナーゼシグナル配列と該細胞のゲノムに組み込まれた該リコンビナーゼシグナル配列との間で組換えをもたらす条件下で、第２のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｃ）トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第３のカセットを該細胞のゲノムに組み込む条件下で、第３のカセットを含む第３のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、プロモーターが、少なくとも１つの細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸に作動可能に連結される段階；
（ｄ）トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞を選択する段階；および
（ｅ）少なくとも１つの選択された細胞において関心対象の核酸を同定する段階。
【請求項３８】
第３のベクターが第２の陽性の選択マーカーをさらに含み、第２の陽性の選択マーカーが細胞ゲノムに組み込まれる、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
第２の陽性の選択マーカーが、第３のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｅ）が以下の段階を含む、請求項３８記載の方法：
（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第３のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第３のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項４０】
第２の陽性の選択マーカーが、第３のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｅ）が以下の段階を含む、請求項３９記載の方法：
（ｉ）酵母プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第３のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第３のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項４１】
トランス活性化因子ポリペプチドがｔＴＡであり、応答エレメントがテトラサイクリン応答エレメントを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
リコンビナーゼシグナル配列がＬｏｘＰ部位である、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
第１のベクターおよび／または第２のベクターが２つのＬｏｘＰ部位を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、レポーター遺伝子、およびリコンビナーゼシグナル配列を含む第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを細胞に挿入する段階；
（ｂ）リコンビナーゼシグナル配列およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む第２のカセットが少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込まれるように、第２のカセットを含む第２のベクターにおけるリコンビナーゼシグナル配列と該細胞のゲノムに組み込まれた該リコンビナーゼシグナル配列との間で組換えをもたらす条件下で、第２のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｃ）トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第３のカセットを該細胞のゲノムに組み込む条件下で、第３のカセットを含む第３のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、プロモーターが、少なくとも１つの細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸に作動可能に連結される段階；
（ｄ）トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞を選択する段階；および
（ｅ）少なくとも１つの選択された細胞において関心対象の核酸を同定する段階。
【請求項４５】
第３のベクターが第２の陽性の選択マーカーをさらに含み、第２の陽性の選択マーカーが細胞ゲノムに組み込まれる、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
第２の陽性の選択マーカーが、第３のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｅ）が以下の段階を含む、請求項４５記載の方法：
（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第３のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第３のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項４７】
第２の陽性の選択マーカーが、第３のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｅ）が以下の段階を含む、請求項４５記載の方法：
（ｉ）酵母プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第３のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第３のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項４８】
トランス活性化因子ポリペプチドがｔＴＡであり、応答エレメントがテトラサイクリン応答エレメントを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
リコンビナーゼシグナル配列がＬｏｘＰ部位である、請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
第１のベクターおよび／または第２のベクターが２つのＬｏｘＰ部位を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
刺激剤に関連する疾患を治療、予防、または安定化する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入する段階であり、これにより、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現が刺激剤により特異的に調節される細胞を選択する段階；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現に及ぼす該刺激剤の影響を増加または減少させる化合物を選択する段階；および
（ｄ）該刺激剤に関連する疾患を有する哺乳動物に化合物を投与する段階。
【請求項５２】
刺激剤に関連する疾患を治療、予防、または安定化する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入する段階であり、これにより、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントが少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｂ）該トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤により特異的に調節される細胞を選択する段階；
（ｃ）該トランス活性化因子ポリペプチドの発現に及ぼす該刺激剤の影響を増加または減少させる化合物を選択する段階；および
（ｄ）該刺激剤に関連する疾患を有する哺乳動物に化合物を投与する段階。
【請求項５３】
陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含む、核酸。
【請求項５４】
５’から３’の配列において以下を含む、請求項５３記載の核酸：
（ａ）スプライスアクセプター；
（ｂ）任意の順番で陰性の選択マーカーおよび陽性の選択マーカーを含むカセット；
（ｃ）翻訳停止配列、
（ｄ）内部リボソーム挿入部位、ならびに
（ｅ）レポーター遺伝子。
【請求項５５】
５’から３’の配列において以下を含む、請求項５３記載の核酸：
（ａ）スプライスアクセプター；
（ｂ）任意の順番で陰性の選択マーカーおよびレポーター遺伝子を含むカセット；
（ｃ）翻訳停止配列、
（ｄ）プロモーター、
（ｅ）陽性の選択マーカー；
（ｆ）翻訳停止配列；ならびに
（ｇ）ポリアデニル化シグナル。
【請求項５６】
レポーター遺伝子が核酸においてプロモーターに作動可能に連結されていない、請求項５３記載の核酸。
【請求項５７】
トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントをさらに含む、請求項５３記載の核酸。
【請求項５８】
１つまたはそれ以上のリコンビナーゼシグナル配列をさらに含む、請求項５３記載の核酸。
【請求項５９】
陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーターをさらに含む、請求項５３記載の核酸。
【請求項６０】
陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む、核酸。
【請求項６１】
陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびリコンビナーゼシグナル配列を含む、核酸。
【請求項６２】
スプライスアクセプター部位および陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーターを含む、核酸。
【請求項６３】
請求項５３、請求項６０、請求項６１、または請求項６２記載の核酸を含むベクター。
【請求項６４】
レトロウイルスベクターである、請求項６３記載のベクター。
【請求項６５】
組込み配列をさらに含む、請求項６３記載のベクター。
【請求項６６】
請求項６３記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６７】
１つまたはそれ以上の種類の刺激剤に応答する、請求項６６記載の細胞。
【請求項６８】
（ｉ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む第１の核酸、ならびに（ｉｉ）トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第２の核酸を含む、細胞。
【請求項６９】
関心対象の刺激剤の活性を調節する候補化合物を選択するスクリーニング方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）刺激剤に対して特異的な応答を有する請求項６６または請求項６８記載の１つまたはそれ以上の細胞と、１つまたはそれ以上の種類の候補化合物および該刺激剤を接触させる段階；および
（ｂ）該刺激剤に対する応答を調節する候補化合物を選択する段階。
【請求項７０】
候補化合物が刺激剤に対する応答を増加させる、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
候補化合物が刺激剤に対する応答を減少させる、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
候補化合物が関心対象の調節エレメントの活性を調節するかどうかを確かめる方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、レポーター遺伝子、またはトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結された関心対象の調節エレメントを有する請求項６６または６８記載の１つまたはそれ以上の細胞と、１つまたはそれ以上の種類の候補化合物を接触させる段階；
（ｂ）陽性の選択マーカー、レポーター遺伝子、またはトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントの発現を調節する候補化合物を選択し、それにより、該関心対象の調節エレメントの活性を調節する候補化合物を選択する段階。
【請求項７３】
候補化合物が薬物開発から除外される、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
候補化合物の動物モデル試験またはヒト臨床試験の前に行われる、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
試験化合物が真核細胞のＤＮＡを傷つけるかどうかを確かめる方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）レポーター遺伝子と作動可能に結合している調節ＤＮＡを含む真核試験細胞を作成する段階であり、ここで、調節ＤＮＡは、細胞のＤＮＡが傷つけられると細胞において活性化される遺伝子に由来する段階；
（ｂ）試験化合物と該試験細胞を接触させる段階；および
（ｃ）該試験化合物がＤＮＡを傷つける指標としてレポーターを検出する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、細胞から生物学的情報を得るのに使用することができる組成物および方法に関する。このような情報は、様々な特定の細胞タイプおよび組織タイプにおいて遺伝子発現を調節するためにリガンドおよびサイトカインが利用する調節経路および成分を含み、薬物候補の選択およびライブラリースクリーニングのための薬剤ターゲティングストラテジーを最大限にするのに使用することができる。所望の細胞株のゲノム内の調節される遺伝子座に調節遺伝子またはレポーター遺伝子を導入するために、ベクターが改良されている。このようなベクターは、遺伝子の同定および調節される遺伝子座への遺伝子の送達のために陽性の選択マーカーおよび陰性の選択マーカーを利用する。刺激依存的にレポーターマーカーを発現する個々の単離された細胞クローンは、細胞におけるリガンドの機能活性を試験するためのレポーター細胞株として用いられる。これらの細胞クローンは、重要な調節因子（例えば、リガンドおよびリガンドにより調節される遺伝子による刺激に依存するプロモーターおよびエンハンサー）を同定するのに使用することができる。選択された細胞タイプまたは組織タイプにおけるリガンドまたはサイトカインによる刺激に対する調節される遺伝子座の応答を制御することができる遺伝子も同定することができる。
【０００２】
現代の薬物発見法はますますゲノム科学を基礎としてきており、特定のゲノム標的および調節経路の同定に依存している。これらのゲノム標的として、関心対象の特定の遺伝子およびその細胞特異的調節制御エレメント（例えば、エンハンサーおよびプロモーター）が挙げられる。調節因子の発現は様々な特定の細胞タイプおよび組織タイプにおいて起こり、生物における多数の経路を必要とする。ある特定の因子の阻害剤または拮抗薬の複雑さが完全に調査および解決されていない場合、これらの阻害剤または拮抗薬は予期せぬ結果をもたらすことがある。例えば、Ｂ細胞におけるＩＦＮ−α／βおよびＩＦＮ−γを介したＬｙ−６Ｅ遺伝子誘導の異なる調節機構について述べている、コダドウスト（Ｋｈｏｄａｄｏｕｓｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、９２、Ｎｏ．７、２３９９−２４０９頁（１９９８）を参照のこと。欠失分析によって、遺伝子の物理的に共通点のない調節領域間に協力的相互作用が存在することが判明した。これは、ＩＦＮを介した遺伝子調節における細胞タイプ特異性の獲得に関与する複雑さを示し、これらの作用を扱うことに関与する複雑さの一例である。
【０００３】
遺伝子発現の調節は、プロモーターレス選択マーカー遺伝子を細胞の染色体遺伝子座に組み込み、その後に、活発な遺伝子座を同定することによって調べることができる。この種の「誘導トラップ」ストラテジーは、関心対象の遺伝子の特異的なエンハンサー、プロモーター、および他の調節エレメントを同定するのに用いられてきた。誘導遺伝子トラップベクターは、レポーター遺伝子と組込み部位に存在する内因性遺伝子との間でスプライスされた融合転写物を生じさせ、調節される遺伝子座を同定するのに用いられる。このアプローチは、特定の調節経路に関与する遺伝子と、リガンドによる活性化とは関係なくオンにされている「ハウスキーピング」遺伝子を区別するのに使用することができる。リガンドにより調節される遺伝子は、薬物開発において利用することができる関心対象の調節経路に関与している。
【０００４】
遺伝子トラップベクターは、一般的に、レポーター遺伝子の上流に位置するスプライスアクセプター部位からなり、真核生物ゲノムのイントロンを標的とする。レポーターがイントロンに組み込まれると、内因性遺伝子およびレポーター遺伝子配列からのｍＲＮＡを含む融合転写物が生じる。遺伝子トラップベクターのスプライスアクセプターとレポーター遺伝子との間にＩＲＥＳ部位を使用することは、レポーター遺伝子産物および内因性遺伝子産物が融合産物を必要とせず、それにより、ベクターの組込みによってレポーター遺伝子産物が発現する可能性が高まることを意味する。遺伝子エントラップメントベクターすなわち遺伝子トラップベクターは、遺伝子の発見および解明に頻繁に用いられるツールである。これらのベクターは、発生によって調節される遺伝子を同定するのに使用することができる。
【０００５】
米国特許第５，９２２，６０１号は、細胞移行事象が生じた際に調節される遺伝子を同定するのに用いられる誘導遺伝子トラップ構築物について述べている。この構築物は、機能的スプライスアクセプター、翻訳停止配列、内部リボソーム挿入部位（「ＩＲＥＳ」）、ならびに陽性および陰性の選択形質をもたらすポリペプチドをコードするプロモーターレスタンパク質コード配列を含んでいる。陽性および陰性の選択形質は、陽性または陰性の選択形質として発現（または非発現）を検出することができる１つのタンパク質をコードする核酸を使用することによって導入することができる。この種の典型的なタンパク質として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびチミジンキナーゼが挙げられる。この構築物は細胞に導入されるベクターに組み込まれ、移行事象の発生前後の陽性および陰性の選択形質の発現が薬物選択によって検出される。移行事象は、一般的に、未分化細胞から分化細胞への移行である。この参考文献の遺伝子トラップベクターは、トラップされた遺伝子座が細胞移行事象の結果として活性な、または不活性になる細胞集団での遺伝子の選択を可能にする。
【０００６】
マイングイ（Ｍａｉｎｇｕｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、７４６−７４９頁（２０００）は、ホメオタンパク質標的遺伝子を同定する誘導遺伝子トラップとして使用するためのベクターについて述べている。この参考文献において用いられるベクターは、スプライスアクセプター、ＩＲＥＳにより駆動されるチミジンキナーゼ遺伝子、およびホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターの制御下にあるＮｅｏ遺伝子と融合したｌａｃＺ遺伝子を含むＰＴ２バイシストロン性遺伝子を含む。ＰＴ２遺伝子トラップベクターを使用すると、構成的に活性な遺伝子へのベクターの組込みを選択しないためにガンシクロビルを使用することができる。従って、後の活性化によって、調節される遺伝子を選択および単離することができる。このベクターを用いて、胚性幹細胞遺伝子トラップライブラリーが構築され、エングレールド（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）ホメオドメインタンパク質に関する活性についてスクリーニングされた。同様の手順を開示している欧州特許第９０２，０９２号を参照のこと。
【０００７】
米国特許第５，９２８，８８８号は、ゲノムポリヌクレオチドを調節するタンパク質および化合物を同定するために活性のあるゲノムポリヌクレオチドを同定する誘導遺伝子トラップ法について述べている。この参考文献は、β−ラクタマーゼポリヌクレオチドを真核細胞ゲノムに挿入することによって、この結果を達成する。次いで、細胞と、β−ラクタマーゼを活性化する予め決められた量の薬剤を接触させ、β−ラクタマーゼ活性の量を測定する。発現細胞および非発現細胞を分離し、細胞ゲノムにおけるβ−ラクタマーゼ遺伝子の組込みを確かめる。この参考文献は、β−ラクタマーゼレポーターが、ハイスループット形式で薬物を発見するためのゲノム組込みアッセイ法を作成する仕組みをもたらすと述べている。
【０００８】
特定の刺激に応答する細胞クローンおよび遺伝子エレメントを迅速に単離するためのゲノムワイド機能アッセイ法について述べている、ホイットニー（Ｗｈｉｔｎｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、１３２９−１３３３頁（１９９８）も参照のこと。このアッセイ法は、レポータータグ化クローンの生きたライブラリーを作成するために、ヒトＴ細胞株にトランスフェクトされるプロモーターレスβ−ラクタマーゼレポーター遺伝子を使用している。特定の遺伝子に関連する調節パターンを特定するために、フローサイトメトリーおよび蛍光原基質が用いられた。
【０００９】
公開されたＰＣＴ出願である国際公開公報第９９／０２７１９号は、発現が特定の組織または特殊化した細胞タイプに限定される標的真核生物遺伝子の検出および操作に使用することができる方法およびＤＮＡ構築物を開示している。この参考文献によれば、特定の細胞タイプまたは組織タイプにおいて発現を制限するプロモーターの制御下にある第１の成分を含むベクターを用いて、胚性幹細胞が形質転換される。幹細胞はまた、第２の指標成分をコードする遺伝子トラップベクターを用いて形質転換される。この指標は、検出可能なシグナル（例えば、一緒になって完全な酵素を形成するβ−ガラクトシダーゼのω成分およびα成分）を生成するように補完的に働く。検出可能な酵素の測定は、遺伝子トラップベクターの遺伝子が、選択された細胞タイプのゲノムに組み込まれたことを示している。
【００１０】
生物におけるリガンドの活性は、研究中の特定の細胞タイプまたは組織タイプによって決まる多数の調節経路を必要とする。例えば、ある特定の増殖因子（例えば、幹細胞因子（「ＳＣＦ」））は、研究中の細胞タイプに関連しない細胞（例えば、マスト細胞）を活性化することがある。この特異性の欠如、重複、および潜在的な毒性は、これらの因子をタンパク質治療剤として使用する時に、または、例えば、これらの因子に対する阻害剤、拮抗薬、もしくは作用薬を開発する時に面倒な問題をもたらす。なぜなら、これらの因子、阻害剤、または拮抗薬は、好ましくないやり方で関連しない細胞に作用する可能性があるからである。
【００１１】
従って、本発明の目的は、リガンドにより活性化される、特定の細胞および組織の遺伝子および調節機構を同定することによって、リガンドに対する生物の応答を特徴付ける方法を提供することである。本発明の目的はまた、関心対象の潜在的な薬物候補を発見するために化合物ライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる遺伝子、その遺伝子を含む細胞、および遺伝子調節機構を発見することである。
【００１２】
発明の概要
本発明は、大まかに言って、特定のゲノム遺伝子座を調節する関心対象のリガンドが利用する細胞経路の同定、および特定のトランスフェクトされた真核細胞において、調節される遺伝子座に作動可能に連結されるように、誘導遺伝子トラップベクターに組み込むことができるポリヌクレオチドセグメントに関する。１つまたはそれ以上の種類の刺激剤に応答する細胞を選択および同定するために、組み込まれるポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を使用すると、調節機構を詳しく調べるのに使用することができる細胞クローンのパネルが得られる。これらのポリヌクレオチドおよびタンパク質は、薬物候補ライブラリーをスクリーニングして、さらに評価するための見込みのある治療剤を得るのに使用することができる。さらに、ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、遺伝子トラップベクターの発現に影響を及ぼす手段として使用することができる。これは、このような細胞におけるゲノム遺伝子座の上方制御または下方制御に影響を及ぼす遺伝子の単離および同定を可能にする。これらの遺伝子は、治療剤についてライブラリーを直接スクリーニングするのに使用することができる。遺伝子それ自体に、例えば、併用療法または薬物発見における治療的用途があってもよい。
【００１３】
リガンド、サイトカイン、または抗体などのタンパク質治療剤、ならびに薬物治療に使用するための、これらの因子に対する拮抗薬、阻害剤、および作用薬を選択するアプローチの現在の使用は、研究中の調節経路に関する特定の細胞タイプおよび組織タイプのリガンド重複および選択性を考慮に入れていない。このように選択された治療剤は、毒性、ならびに疾患に関与しない細胞および組織の調節に悪影響を及ぼす阻害剤の選択などの予期せぬ結果をもたらすことがある。所望の治療効果を得るために１種類を超えるリガンドを併用療法で使用することが望ましい時に、さらなる複雑さが生じる。複数のリガンドの使用は、互いに異なる細胞タイプにおいて非常に多くの調節経路を伴うことがあり、これもまた、研究中の疾患に関与する細胞の調節に予期せぬ結果をもたらすことがある。しかしながら、現在、この問題の簡単な解決策はない。
【００１４】
本発明のベクターおよび方法は、関心対象の１つまたはそれ以上の種類の刺激剤の調節エレメントの制御下にある細胞のパネルまたはライブラリーを作成するのに使用することができる。次に、この細胞の集まりは、薬物候補ライブラリーをスクリーニングして、高レベルの特異性、安全性、および有効性を有する潜在的な治療剤を同定するための標的として使用することができる。さらに、調節エレメントの制御下にあり、関心対象の特定の刺激剤に応答する遺伝子、およびゲノム遺伝子座を調節し、このような遺伝子座の発現をもたらす遺伝子を同定、単離、および特徴付けることができる。これらの遺伝子またはその調節因子はまた、様々なアッセイ形式（例えば、細胞に基づくアッセイ法）において薬物候補ライブラリーをスクリーニングするのに使用することもできる。関心対象の刺激剤として、インシュリン、幹細胞因子（「ＳＣＦ」）、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩｇＥ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−β、およびＴＮＦ−αが挙げられる。
【００１５】
従って、１つの局面において、本発明は、細胞を感染させ、候補薬物分子ライブラリーをスクリーニングするためのスクリーニングツールとして使用することができる細胞クローンのパネルを作成するための核酸構築物およびこの構築物を含むベクターを含む。
【００１６】
この局面によれば、１つの態様において、細胞のパネルを作成するためのベクターの調製において使用するための核酸構築物は、下流（５’から３’）配列において以下のエレメントを含む：内部リボソーム挿入部位；ポリペプチドをコードするトランス活性化因子ポリペプチドコード配列（このポリペプチドは、関心対象の特定の細胞または細胞タイプのゲノム遺伝子座に含まれる１つまたはそれ以上の調節エレメントに対する調節単位として働き、トランス活性化因子ポリペプチドは、関心対象の細胞のゲノム遺伝子座に含まれる１つまたはそれ以上の調節エレメントに応答する）；翻訳停止配列；内部リボソーム挿入部位；少なくとも１つの刺激剤に応答するレポーターエレメント；および翻訳停止配列を含むカセット。
【００１７】
本発明のこの態様の好ましい特徴において、レポーターエレメントは、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ（商標）、または緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などの酵素でもよく、マーカーポリペプチドは、テトラサイクリン調節単位（ｔＴＡ）などのプロモーターレスタンパク質コード配列でもよい。これらのエレメントを含む核酸カセットは、スプライスアクセプター部位；内部リボソーム挿入部位；選択形質を生じるポリペプチドをコードし、関心対象の特定の細胞または細胞タイプのゲノム遺伝子座に含まれる１つまたはそれ以上の調節エレメントに応答するマーカーポリペプチドコード配列；および翻訳停止配列を含む誘導遺伝子トラップベクターに組み入れることができる。マーカーポリペプチドは、陽性および陰性の選択形質を有する融合タンパク質でもよい。陰性の選択形質は、遺伝子発現が宿主細胞の排除につながる状況で（しばしば、ガンシクロビルなどのヌクレオシド類似体の存在下で）得ることができる。陽性の選択形質は薬物耐性遺伝子によって得ることができる。適切な陰性の選択マーカーとして、例えば、Ｈｐｒｔ、ｇｐｔ、ＨＳＶ−ｔｋ、ジフテリア毒素、リシン毒素、およびシトシンデアミナーゼをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。適切な陽性の選択形質として、例えば、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、ヒスチジノール耐性、キサンチン利用、ゼオシン耐性、およびブレオマイシン耐性をコードするＤＮＡ配列が挙げられる。特に好ましい融合タンパク質は、Ｔｋ−Ｚｅｏをコードする融合タンパク質である。
【００１８】
この核酸構築物をベクター（例えば、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクター）に組み入れて、関心対象の細胞をトランスフェクトすることができる。これは、当業者に周知の技法を用いてベクターを細胞含有培地に導入することによって達成することができる。適切な技法が米国特許第５，９２２，６０１号で述べられており、この開示は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。細胞の全てが首尾よくトランスフェクトされるとは限らず、このことは、ベクターが細胞のゲノム遺伝子座に組み込まれなかったことを意味する。ゼオシンなどの薬物選択化合物を使用して、成功した組込み事象を選択することができる。ベクターがゼオシン耐性遺伝子を含む場合、ゼオシンは、ベクターが細胞ゲノムに首尾よく組み込まれなかった細胞を殺傷するように働く。
【００１９】
細胞が首尾よくトランスフェクトされ、ベクターが細胞ゲノムに作動可能に組み込まれたら、特定の刺激剤に関する活性について細胞が選択される。このような活性は、エンハンサーおよびプロモーターなどの調節因子が刺激剤によってオンにされた細胞ならびに適切な調節因子が刺激剤によってオフにされた細胞を含んでもよい。これらの場合のどちらも異なる選択プロトコールを必要とする。
【００２０】
刺激剤によってオンにされた細胞を選択するために、刺激剤は、陽性の選択薬剤であるゼオシンまたは別の適切な薬物選択薬剤を含む培地に入れられる。刺激剤は、薬物選択薬剤の前、後、または薬物選択薬剤と共に培地に添加することができる。刺激剤は、ベクター内の第１のプロモーターレスマーカーポリペプチドコード配列（これは、薬物選択薬剤に対する薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする）を活性化する。細胞遺伝子座に存在するハウスキーピング遺伝子に存在する調節因子もまた、刺激剤とは関係なく活性化されることがある。しかしながら、ハウスキーピング遺伝子は刺激剤に対して特異的でなく、排除しなければならない。これは、刺激剤に特異的な単離細胞培養物を得るために必須である。これは、例えば、ガンシクロビルなどの陰性の選択薬剤を添加することによって達成することができる。ガンシクロビルは、ＴＫ（チミジンキナーゼ）遺伝子によって、このタンパク質を発現する細胞を排除するように作用する。ガンシクロビル処理後に細胞培養物に残っている細胞は、特定の刺激剤によってオンにされるゲノム遺伝子座にベクターが挿入されたクローンである。刺激剤によってオンにされるレポーター（ＳＥＡＰ）遺伝子の発現は読み取り機構として使用することができ、これにより、細胞は、化合物ライブラリーをスクリーニングするための薬物標的として直接使用することができ、または１種類を超える刺激剤によりオンにすることができるクローンを同定するために前記と同様に他の刺激剤で処理することができる。
【００２１】
刺激剤によりオフにされた細胞を選択するために、まず最初に、ゼオシンを細胞培地に入れて、ベクターが細胞ゲノムに組み込まれていない細胞を排除する。次いで、刺激剤およびガンシクロビルを細胞含有培地に添加し、細胞において活性なハウスキーピング遺伝子を排除する。しかしながら、刺激剤処理によってオフにされた細胞クローンは培養物に残る。これらの細胞はまた薬物標的として使用することができ、または刺激剤によりオンにされる遺伝子の選択について前述したように他の刺激剤で処理することができる。理解されているように、いくつかの刺激剤を用いて細胞選択するための他の可能性のある組み合わせが容易に考えられる。
【００２２】
別の態様において、核酸構築物は、マーカーポリペプチドコード配列の発現を調節するプロモーターを含んでもよい。このプロモーターは、構築物のマーカーポリペプチドコード領域を含むポリヌクレオチド配列の１つに作用する。好ましくは、ポリヌクレオチド配列はゼオシンなどの陽性の選択マーカーをコードする。この態様において、プロモーターはホスホグリセリン酸キナーゼ（「ＰＧＫ」）である。
【００２３】
このベクターはまた、以下に示す方法を用いて、１つまたはそれ以上の種類の関心対象の刺激剤により活性化される調節エレメントの制御下にある細胞のパネルまたはライブラリーを作成するのに使用することができる。
【００２４】
刺激剤によりオンにされた細胞を選択するために、細胞を、選択マーカー用のプロモーターを含むベクターで形質転換する。ゼオシンなどの選択薬物を培地に入れて、ベクターがゲノム遺伝子座に組み込まれていない細胞を排除する。培地を交換し、ガンシクロビルを入れて、活性がありＴｋを発現するハウスキーピング遺伝子を排除する。次いで、刺激剤を培地に添加し、刺激剤に応答する細胞が存在する陽性の指標として分泌型アルカリホスファターゼの量を測定する。ＳＥＡＰを生じ、刺激剤によってオンにされた細胞を選択し、分離し、薬物標的として使用する。
【００２５】
刺激剤によってオフにされた細胞を選択するために、ゼオシンを細胞培地に入れて、ベクターが細胞ゲノムに組み込まれていない細胞を排除する。次いで、刺激剤およびガンシクロビルを細胞含有培地に添加し、細胞において活性があるハウスキーピング遺伝子を排除する。培地を交換し、刺激剤の非存在下で分泌型アルカリホスファターゼを産生する細胞クローンを、産生された分泌型アルカリホスファターゼの量を測定することによって選択する。これらの細胞も薬物標的として使用することができ、または１種類を超える刺激剤に特異的な細胞を調製するために他の刺激剤で処理することができる。
【００２６】
別の局面において、選択された刺激剤に対して特異的な応答を有する細胞の集まりを含む培地から細胞および細胞クローンを選択する方法が提供される。この方法は、真核細胞を誘導遺伝子トラップベクターで形質転換して、ベクターを細胞ゲノムに作動可能に組み込むことを伴う。このベクターは、マーカーポリペプチドコード配列およびレポーターエレメントを含む任意のベクター（例えば、前記のベクター）でよい。選択的に、ベクターはまたトランス活性化因子コード配列を含んでもよい。レポーターポリペプチド（存在すれば、トランス活性化因子）を活性化する１つまたはそれ以上の調節エレメントを有する細胞が選択される。刺激剤により特異的に活性化される細胞が選択される。次いで、これらの細胞は、潜在的な治療剤のライブラリーをスクリーニングするために、細胞に基づくアッセイ法において使用することができる。
【００２７】
さらに別の局面において、選択された刺激剤に対して特異的な応答を有する細胞の集まりを含む培地から細胞および細胞クローンを選択する方法が提供される。この方法は、真核細胞を誘導遺伝子トラップベクターで形質転換して、ベクターを細胞ゲノムに作動可能に組み込むことを伴う。このベクターは、マーカーポリペプチドコード配列およびレポーターエレメントを含む任意のベクター（例えば、前記のベクター）でよい。選択的に、ベクターはまたトランス活性化因子コード配列を含んでもよい。レポーター遺伝子（存在すれば、トランス活性化因子）を活性化する１つまたはそれ以上の調節エレメントを有する細胞が選択される。刺激剤により特異的に不活化される細胞が選択される。次いで、これらの細胞は、潜在的な治療剤のライブラリーをスクリーニングするために、細胞に基づくアッセイ法において使用することができる。
【００２８】
本発明のさらなる局面において、単離された細胞クローンの転写制御につながる遺伝子、または単離された細胞クローンのゲノム遺伝子座を上方制御するもしくは下方制御する遺伝子を同定するために、遺伝子トラップベクターを使用することができる。これらのベクターはウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクターでもよく、細胞のゲノム遺伝子座に組み込まれる。
【００２９】
このベクターは、５’から３’の配列において以下を含む核酸構築物を含む：トランス活性化因子調節エレメント（例えば、テトラサイクリン応答エレメント）を含む最小プロモーター配列；陽性の選択形質を生じるマーカーポリペプチドをコードするタンパク質コード配列（このタンパク質はトランス活性化因子調節エレメントに応答する）；内部リボソーム挿入部位；および機能的スプライスドナー部位。誘導遺伝子トラップベクターにより導入されるテトラサイクリン調節単位は、「オン／オフ」形式でテトラサイクリンにより活性化または抑制されるタンパク質を生じ、遺伝子トラップベクターの最小プロモーター配列内のテトラサイクリン応答エレメントに結合し、それを転写制御する。
【００３０】
細胞が刺激剤と接触すると、テトラサイクリン調節タンパク質がオンにされる。このタンパク質は、テトラサイクリン応答エレメントを含む最小プロモーター配列に結合し、これによりプロモーター（「ＴＲＥＰｃｍｖ」）が活性化され、プロモーター下流の遺伝子の転写が引き起こされる。次に、この遺伝子はゲノム遺伝子座を上方制御または下方制御し、これによりテトラサイクリン調節単位がタンパク質を発現し、さらなる遺伝子コピーを転写するようにＴＲＥＰｃｍｖプロモーター／トランス活性化因子が活性化される（以下同様である）。最終的に、このフィードバックプロセスの結果として、検出および同定するのに十分な遺伝物質が生成される。
【００３１】
このプロセスの最終結果は、１つまたはそれ以上の種類の刺激剤による刺激に応答する細胞の遺伝子座を上方制御または下方制御する遺伝子を単離することである。次いで、これらの遺伝子は、薬物標的または潜在的な治療剤（例えば、遺伝子療法用の構築物またはアンチセンス分子）として使用することができる。遺伝子に含まれる調節エレメント（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）もまた単離し、特徴付けし、薬物発見のために使用することができる。
【００３２】
治療剤として使用するための薬物候補を選択するために本発明の細胞、遺伝子、および調節エレメントを使用することは当技術分野において一般に行われている。例えば、細胞は、選択された治療剤の特異性、毒性、および投与量を評価するのに有効な生細胞スクリーニングアッセイ法において使用することができる。生細胞アッセイ法が利用できなければ、従来のアッセイスクリーニング法を使用することができる。
【００３３】
別の局面において、本発明は、関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法を提供する。この方法は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を有するカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを真核細胞に挿入することを伴う。レポーター遺伝子は、少なくとも１つの細胞の内因性調節エレメントに作動可能に連結される。レポーター遺伝子の発現が刺激剤によって特異的に活性化される細胞が選択される。特定の態様において、この選択段階は、刺激剤および陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすること、ならびに陰性の選択薬剤が存在し、刺激剤が存在しない条件下で細胞をインキュベートすることを伴ってもよい。他の態様において、選択段階は、陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすること、陰性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすること、刺激剤の存在下で細胞をインキュベートすること、および刺激剤の存在下でレポーター遺伝子を発現する細胞を選択することを伴う。さらに他の態様において、ベクターは、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含まない。様々な態様において、ベクターは、細胞ゲノムに組み込まれる、トランス活性化因子ポリペプチド（例えば、ｔＴＡ）をコードする核酸セグメントをさらに含む。トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントは、ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されてもよく、ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されなくてもよい。望ましくは、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸は、内因性調節エレメントの制御下で細胞ゲノムに組み込まれる。選択的に、この方法は、刺激剤により活性化される調節エレメントを同定することを含んでもよい。様々な態様において、陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれるカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結される。この場合、刺激剤により活性化される調節エレメントは、（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、陽性の選択マーカーおよび組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された細菌細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。他の態様において、陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれるカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結される。この場合、刺激剤により活性化される調節エレメントは、（ｉ）酵母プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、陽性の選択マーカーおよび組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された酵母細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。
【００３４】
関連した局面において、本発明は、関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する別の方法を提供する。この方法は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを有するカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを真核細胞に挿入することを伴う。トランス活性化因子ポリペプチドは、少なくとも１つの細胞の内因性調節エレメントに作動可能に連結される。トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤によって特異的に活性化される細胞が選択される。特定の態様において、この選択段階は、刺激剤および陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすること、ならびに陰性の選択薬剤が存在し、刺激剤が存在しない条件下で細胞をインキュベートすることを伴ってもよい。他の態様において、選択段階は、陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすること、陰性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすること、刺激剤の存在下で細胞をインキュベートすること、および刺激剤の存在下でトランス活性化因子ポリペプチドを発現する細胞を選択することを伴う。さらに他の態様において、ベクターは、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含まない。様々な態様において、ベクターは、細胞ゲノムに組み込まれるレポーター遺伝子をさらに含む。レポーター遺伝子は、ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されてもよく、ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されなくてもよい。望ましくは、レポーター遺伝子は、内因性調節エレメントの制御下で細胞ゲノムに組み込まれる。選択的に、この方法は、刺激剤により活性化される調節エレメントを同定することを含んでもよい。様々な態様において、陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれるカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結される。この場合、刺激剤により活性化される調節エレメントは、（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、陽性の選択マーカーおよび組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された細菌細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。他の態様において、陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれるカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結される。この場合、刺激剤により活性化される調節エレメントは、（ｉ）酵母プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、陽性の選択マーカーおよび組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された酵母細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。
【００３５】
関連した局面において、本発明は、関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択するさらに別の方法を提供する。この方法は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を有するカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを真核細胞に挿入することを含む。レポーター遺伝子は、少なくとも１つの細胞の内因性調節エレメントに作動可能に連結される。レポーター遺伝子の発現が刺激剤によって特異的に不活化される細胞が選択される。様々な態様において、この選択は、陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすること、ならびに刺激剤および陰性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすることを伴う。さらに他の態様において、ベクターは、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含まない。様々な態様において、ベクターは、細胞ゲノムに組み込まれる、トランス活性化因子ポリペプチド（例えば、ｔＴＡ）をコードする核酸セグメントをさらに含む。トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントは、ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されてもよく、ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されなくてもよい。望ましくは、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸は、内因性調節エレメントの制御下で細胞ゲノムに組み込まれる。他の態様において、この方法はまた、刺激剤により不活化される調節エレメントを同定することも含む。様々な態様において、陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれるカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結される。この場合、刺激剤により不活化される調節エレメントは、（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、陽性の選択マーカーおよび組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された細菌細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。他の態様において、陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれるカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結される。この場合、刺激剤により不活化される調節エレメントは、（ｉ）酵母プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、陽性の選択マーカーおよび組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された酵母細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。
【００３６】
関連した局面において、本発明は、関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択するさらに別の方法を提供する。この方法は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを有するカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを真核細胞に挿入することを含む。トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントは、少なくとも１つの細胞の内因性調節エレメントに作動可能に連結される。トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤によって特異的に不活化される細胞が選択される。様々な態様において、この選択は、陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすること、ならびに刺激剤および陰性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートすることを伴う。さらに他の態様において、ベクターは、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含まない。様々な態様において、ベクターは、細胞ゲノムに組み込まれるレポーター遺伝子をさらに含む。レポーター遺伝子は、ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されてもよく、ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されなくてもよい。望ましくは、レポーター遺伝子は、内因性調節エレメントの制御下で細胞ゲノムに組み込まれる。選択的に、この方法は、刺激剤により不活化される調節エレメントを同定することを含んでもよい。様々な態様において、陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれるカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結される。この場合、刺激剤により不活化される調節エレメントは、（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、陽性の選択マーカーおよび組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された細菌細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。他の態様において、陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれるカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結される。この場合、刺激剤により不活化される調節エレメントは、（ｉ）酵母プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、陽性の選択マーカーおよび組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された酵母細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。
【００３７】
別の局面において、本発明は、細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定する方法を提供する。この方法は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、レポーター遺伝子、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを有する第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを真核細胞に挿入することを含む。レポーター遺伝子は、少なくとも１つの細胞の内因性調節エレメントに作動可能に連結されるか、または第１のベクターにおいて調節エレメントに作動可能に連結される。トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを有する第２のカセットを細胞ゲノムに組み込む条件下で、第２のカセットを含む第２のベクターも細胞に挿入される。このプロモーターは、少なくとも１つの細胞の調節エレメントの活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）タンパク質をコードする関心対象の内因性核酸に作動可能に連結される。トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞が選択される。望ましくは、少なくとも１つの選択された細胞から関心対象の核酸が同定される。トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下で細胞のレポーター遺伝子発現が増加すれば、関心対象の核酸は、調節エレメントを活性化するタンパク質をコードすることが確かめられる。または、トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下で細胞のレポーター遺伝子発現が減少すれば、関心対象の核酸は、調節エレメントを不活化するタンパク質をコードすることが確かめられる。望ましい態様において、トランス活性化因子ポリペプチドはｔＴＡであり、応答エレメントはテトラサイクリン応答エレメントを含む。様々な態様において、第１のベクターは、関心対象の刺激剤により調節されることが特定された調節エレメントを含む。例えば、本発明の方法は、刺激剤により調節される内因性調節エレメントを同定するのに使用することができ、次いで、この調節エレメントは、標準的な方法を用いて第１のベクターにクローニングし、調節エレメントを調節するタンパク質をコードする内因性核酸を同定するのに使用することができる。他の態様において、第２のベクターは、細胞ゲノムに組み込まれる陽性の選択マーカーをさらに含む。さらに他の態様において、第２のベクターの陽性の選択マーカー（第２の陽性の選択マーカーと呼ぶ）は、真核細胞ゲノムに組み込まれる第２のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結される。この場合、調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする核酸は、（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、第２の陽性の選択マーカーおよび第２の組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された細菌細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。さらに他の態様において、第２のベクターの陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれる第２のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結される。この場合、調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする核酸は、（ｉ）酵母プロモーターの制御下で第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、第２の陽性の選択マーカーおよび第２の組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された酵母細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。
【００３８】
関連した局面において、本発明は、細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定する別の方法を特徴とする。この方法は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびリコンビナーゼシグナル配列を有する第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを真核細胞に挿入することを含む。リコンビナーゼシグナル配列、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメント、およびレポーター遺伝子を含む第２のカセットを含む第２のベクターのリコンビナーゼシグナル配列と、細胞ゲノムに組み込まれたリコンビナーゼシグナル配列との間で組換えをもたらす条件下で、第２のベクターが細胞に挿入される。この組換えは、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結されるように、細胞ゲノムへの第２のカセットの組込みをもたらす。調節エレメントは内因性調節エレメントでもよく、第１のベクターまたは第２のベクターに由来する関心対象の調節エレメントでもよい。トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを有する第３のカセットを含む第３のベクターが細胞に挿入される。この段階は、プロモーターが、少なくとも１つの細胞の調節エレメントの活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）のタンパク質をコードする関心対象の内因性核酸に作動可能に連結されるように、細胞ゲノムへの第３のカセットの組込みをもたらす。トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞が選択される。望ましくは、関心対象の核酸は少なくとも１つの選択された細胞から同定される。トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下で細胞のレポーター遺伝子発現が増加すれば、関心対象の核酸は、調節エレメントを活性化するタンパク質をコードすることが確かめられる。または、トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下で細胞のレポーター遺伝子発現が減少すれば、関心対象の核酸は、調節エレメントを不活化するタンパク質をコードすることが確かめられる。望ましくは、トランス活性化因子ポリペプチドはｔＴＡであり、応答エレメントはテトラサイクリン応答エレメントを含む。例示的なリコンビナーゼシグナル配列として、ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、および本明細書に記載の他の任意のリコンビナーゼシグナル配列が挙げられる。様々な態様において、第１のベクターおよび／または第２のベクターは、２つのリコンビナーゼシグナル配列（例えば、２つのＬｏｘＰ部位）を含む。様々な態様において、第１のベクター、第２のベクター、第３のベクター、または細胞に挿入される別のベクターは、リコンビナーゼシグナル配列を認識するリコンビナーゼをコードする。望ましい態様において、第１のベクターの１つまたはそれ以上のリコンビナーゼシグナル配列は第２のベクターのものと同一である。様々な態様において、第１のベクターまたは第２のベクターは、関心対象の刺激剤により調節されることが特定された調節エレメントを含む。例えば、本発明の方法は、刺激剤により調節される内因性調節エレメントを同定するのに使用することができ、次いで、この調節エレメントは、標準的な方法を用いて第１のベクターまたは第２のベクターにクローニングし、調節エレメントを調節するタンパク質をコードする内因性核酸を同定するのに使用することができる。他の態様において、第３のベクターは、細胞ゲノムに組み込まれる陽性の選択マーカーをさらに含む。さらに他の態様において、第３のベクターの陽性の選択マーカー（第２の陽性の選択マーカーと呼ぶ）は、真核細胞ゲノムに組み込まれる第３のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結される。この場合、調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする核酸は、（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、第２の陽性の選択マーカーおよび第３の組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された細菌細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。さらに他の態様において、第３のベクターの陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれる第３のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結される。この場合、調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする核酸は、（ｉ）酵母プロモーターの制御下で第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、第２の陽性の選択マーカーおよび第３の組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された酵母細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。
【００３９】
関連した局面において、本発明は、細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定するさらに別の方法を特徴とする。この方法は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、レポーター遺伝子、およびリコンビナーゼシグナル配列を有する第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを真核細胞に挿入することを伴う。リコンビナーゼシグナル配列およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む第２のカセットを含む第２のベクターのリコンビナーゼシグナル配列と、細胞ゲノムに組み込まれたリコンビナーゼシグナル配列との間で組換えをもたらす条件下で、第２のベクターが細胞に挿入される。この組換えは、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結されるように、細胞ゲノムへの第２のカセットの組込みをもたらす。調節エレメントは内因性調節エレメントでもよく、第１のベクターまたは第２のベクターに由来する関心対象の調節エレメントでもよい。トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを有する第３のカセットを含む第３のベクターが細胞に挿入される。この段階は、プロモーターが、少なくとも１つの細胞の調節エレメントの活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）のタンパク質をコードする関心対象の内因性核酸に作動可能に連結されるように、細胞ゲノムへの第３のカセットの組込みをもたらす。トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞が選択される。望ましくは、関心対象の核酸は少なくとも１つの選択された細胞から同定される。トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下で細胞のレポーター遺伝子発現が増加すれば、関心対象の核酸は、調節エレメントを活性化するタンパク質をコードすることが確かめられる。または、トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下で細胞のレポーター遺伝子発現が減少すれば、関心対象の核酸は、調節エレメントを不活化するタンパク質をコードすることが確かめられる。望ましくは、トランス活性化因子ポリペプチドはｔＴＡであり、応答エレメントはテトラサイクリン応答エレメントを含む。例示的なリコンビナーゼシグナル配列として、ＬｏｘＰ部位、Ｌｏｘ５１１部位、および本明細書に記載の他の任意のリコンビナーゼシグナル配列が挙げられる。様々な態様において、第１のベクターおよび／または第２のベクターは、２つのリコンビナーゼシグナル配列（例えば、２つのＬｏｘＰ部位）を含む。様々な態様において、第１のベクター、第２のベクター、第３のベクター、または細胞に挿入される別のベクターは、リコンビナーゼシグナル配列を認識するリコンビナーゼをコードする。望ましい態様において、第１のベクターの１つまたはそれ以上のリコンビナーゼシグナル配列は第２のベクターのものと同一である。様々な態様において、第１のベクターまたは第２のベクターは、関心対象の刺激剤により調節されることが特定された調節エレメントを含む。例えば、本発明の方法は、刺激剤により調節される内因性調節エレメントを同定するのに使用することができ、次いで、この調節エレメントは、標準的な方法を用いて第１のベクターまたは第２のベクターにクローニングし、調節エレメントを調節するタンパク質をコードする内因性核酸を同定するのに使用することができる。他の態様において、第１のベクターおよび第２のベクターは両方ともレポーター遺伝子を含む。さらに他の態様において、第３のベクターは、細胞ゲノムに組み込まれる陽性の選択マーカーをさらに含む。さらに他の態様において、第３のベクターの陽性の選択マーカー（第２の陽性の選択マーカーと呼ぶ）は、真核細胞ゲノムに組み込まれる第３のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結される。この場合、調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする核酸は、（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、第２の陽性の選択マーカーおよび第３の組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された細菌細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。さらに他の態様において、第３のベクターの陽性の選択マーカーは、真核細胞ゲノムに組み込まれる第３のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結される。この場合、調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする核酸は、（ｉ）酵母プロモーターの制御下で第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、第２の陽性の選択マーカーおよび第３の組み込まれたカセットに隣接する真核生物ゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入し、（ｉｉ）選択された酵母細胞に挿入された真核生物ゲノムセグメントを増幅し、（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定することによって同定することができる。
【００４０】
さらに別の局面において、本発明は、刺激剤により媒介される疾患または刺激剤に関連する疾患を治療、予防、または安定化する方法を提供する。この方法は、刺激剤により調節される調節エレメントを含む細胞を同定すること、調節エレメントを調節する化合物または調節エレメントを調節するタンパク質を調節する化合物を選択すること、ならびに刺激剤に関連する疾患もしくは状態を有する哺乳動物またはその疾患もしくは状態のリスクが増加している哺乳動物に化合物を投与することを含む。関心対象の刺激剤により調節される細胞は、本発明のどの方法を用いても同定することができる。
【００４１】
前記局面の特定の態様において、前記方法は、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結されるように、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセット有するベクターを真核細胞に挿入することを伴う。レポーター遺伝子の発現が刺激剤によって特異的に調節される細胞が選択される。レポーター遺伝子の発現に及ぼす刺激剤の影響を増加または減少させる化合物が選択され、刺激剤に関連する疾患を有する哺乳動物に投与される。刺激剤が疾患リスクの増加または疾患重篤度の増加と関連していれば、投与される化合物は、好ましくは、刺激剤がレポーター遺伝子発現を調節する能力を阻害する。逆に、刺激剤が疾患リスクの減少または疾患重篤度の減少と関連していれば、投与される化合物は、好ましくは、刺激剤がレポーター遺伝子発現を調節する能力を高める。
【００４２】
前記局面の別の態様において、前記方法は、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントが少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結されるように、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含むカセットを真核生物ゲノムに組み込む条件下で、カセットを有するベクターを真核細胞に挿入することを伴う。トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤によって特異的に調節される細胞が選択される。トランス活性化因子ポリペプチドの発現に及ぼす刺激剤の影響を増加または減少させる化合物が選択され、刺激剤に関連する疾患を有する哺乳動物に投与される。刺激剤が疾患リスクの増加または疾患重篤度の増加と関連していれば、投与される化合物は、好ましくは、刺激剤がトランス活性化因子ポリペプチド発現を調節する能力を阻害する。逆に、刺激剤が疾患リスクの減少または疾患重篤度の減少と関連していれば、投与される化合物は、好ましくは、刺激剤がトランス活性化因子ポリペプチド発現を調節する能力を高める。
【００４３】
さらに別の局面において、本発明は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含む核酸を特徴とする。特定の態様において、核酸は、５’から３’の順番で、スプライスアクセプター、任意の順番で陰性の選択マーカーおよび陽性の選択マーカーを含むカセット、翻訳停止配列、内部リボソーム挿入部位、レポーター遺伝子、翻訳停止配列、ならびにポリアデニル化シグナルを含む。別の態様において、核酸は、５’から３’の順番で、スプライスアクセプター、任意の順番で陰性の選択マーカーおよびレポーター遺伝子を含むカセット、翻訳停止配列、プロモーター、陽性の選択マーカー、翻訳停止配列、ならびにポリアデニル化シグナルを含む。他の態様において、レポーター遺伝子は、核酸においてプロモーターに作動可能に連結されない。この態様において、核酸は、レポーター遺伝子が内因性プロモーターに作動可能に連結されるように細胞に挿入することができる。他の態様において、核酸はまたトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントも含むか、または１つもしくはそれ以上のリコンビナーゼシグナル配列（例えば、ＬｏｘＰ部位）も含む。
【００４４】
さらに別の局面において、本発明は、スプライスアクセプター部位を含み、陽性の選択マーカーまたはレポーター遺伝子に作動可能に連結された細菌プロモーターを含む核酸を特徴とする。様々な態様において、核酸はまた陰性の選択マーカーも含み、陰性の選択マーカーは細菌プロモーターに作動可能に連結されてもよく、作動可能に連結されなくてもよい。他の態様において、核酸はまた、翻訳停止配列、内部リボソーム挿入部位、レポーター遺伝子、翻訳停止配列、およびポリアデニル化シグナルも含む。特定の態様において、核酸は、５’から３’の順番で、スプライスアクセプター、任意の順番で陰性の選択マーカーおよび陽性の選択マーカーを含むカセット（陽性の選択マーカーは細菌プロモーターに作動可能に連結される）、翻訳停止配列、内部リボソーム挿入部位、レポーター遺伝子、翻訳停止配列、ならびにポリアデニル化シグナルを含む。別の態様において、核酸は、５’から３’の順番で、スプライスアクセプター、任意の順番で陰性の選択マーカーおよびレポーター遺伝子を含むカセット、翻訳停止配列、陽性の選択マーカーに作動可能に連結された細菌プロモーター、翻訳停止配列、ならびにポリアデニル化シグナルを含む。他の態様において、陽性の選択マーカーは細菌プロモーターに作動可能に連結され、レポーター遺伝子は、核酸においてプロモーターに作動可能に連結されない。この態様において、核酸は、レポーター遺伝子が内因性プロモーターに作動可能に連結されるように細胞に挿入することができる。他の態様において、核酸はまたトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントも含むか、または１つもしくはそれ以上のリコンビナーゼシグナル配列（例えば、ＬｏｘＰ部位）も含む。さらに別の態様において、核酸は、真核生物ゲノムの領域（例えば、関心対象の遺伝子もしくは調節エレメントの全てもしくは一部を含む領域、または関心対象の遺伝子もしくは調節エレメントに隣接する領域）を含む。本明細書に記載のように、このような核酸を使用すると、トラップされた関心対象の真核生物調節エレメントまたは遺伝子の同定を容易にするために細菌細胞を使用することができる。
【００４５】
関連した局面において、本発明は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む核酸を特徴とする。様々な態様において、核酸はまた、１つまたはそれ以上のリコンビナーゼシグナル配列（例えば、ＬｏｘＰ部位）も含む。他の態様において、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントは、核酸においてプロモーターに作動可能に連結されない。
【００４６】
別の関連した局面において、本発明は、陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、および１つまたはそれ以上のリコンビナーゼシグナル配列（例えば、ＬｏｘＰ部位）を含む核酸を提供する。
【００４７】
さらに別の局面において、本発明は、５’から３’の配列で、内部リボソーム挿入部位、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメント、翻訳停止配列；内部リボソーム挿入部位、レポーター遺伝子；翻訳停止配列、およびポリアデニル化シグナルを含む核酸を特徴とする。核酸はまたリコンビナーゼシグナル配列（例えば、ＬｏｘＰ部位）も含んでもよい。別の局面において、本発明は、機能的スプライスアクセプター、翻訳停止配列、内部リボソーム挿入部位、プロモーターレスの陰性の選択マーカー、翻訳停止配列、ポリアデニル化シグナル、プロモーター、陽性の選択マーカー、翻訳停止配列、およびポリアデニル化シグナルを有する核酸を提供する。他の態様において、核酸はまた、内部リボソーム挿入部位、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメント、翻訳停止配列、内部リボソーム挿入部位、レポーター遺伝子、および翻訳停止配列も含む。さらに他の態様において、核酸はまた、内部リボソーム挿入部位、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメント、および翻訳停止配列も含む。
【００４８】
別の局面において、本発明は、本発明の１つまたはそれ以上の核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルスベクター）を特徴とする。このベクターは、選択的に、組込み配列を含んでもよい。特定の態様において、レトロウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクター（例えば、３’ＬＴＲに変異を含むＳＩＮウイルスウイルスベクター）である。
【００４９】
さらに別の局面において、本発明は、本発明のベクターまたは核酸を含む細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）を特徴とする。この細胞は１種類だけの刺激剤に応答してもよく、１種類を超える刺激剤に応答してもよい。例示的な細胞は、（ｉ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む第１の核酸、ならびに（ｉｉ）トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第２の核酸を含む。特定の態様において、第１の核酸はレポーター遺伝子も含むか、または第２の核酸は陽性の選択マーカーも含む。
【００５０】
関連した局面において、本発明は、本発明のベクターまたは核酸を含む２つまたはそれ以上の細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）からなるライブラリーを特徴とする。特定の態様において、細胞ライブラリーは、トラップされた異なる調節エレメント（例えば、細胞ゲノムに組み込まれた構築物において陽性の選択マーカーもしくはレポーター遺伝子に作動可能に連結された異なる内因性調節エレメント）またはトラップされた異なる遺伝子（例えば、細胞ゲノムに組み込まれた構築物においてプロモーター下流に作動可能に連結された異なる内因性遺伝子）を含む少なくとも５個、１０個、２０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５００００個、またはそれ以上の細胞を含む。望ましくは、ライブラリーは、１つまたはそれ以上の種類の関心対象の刺激剤に応答する細胞を含む。他の態様において、ライブラリーは、それぞれ、異なる関心対象の刺激剤に応答する５個、１０個、２０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５００００個、またはそれ以上の異なる細胞を含む。
【００５１】
さらに別の局面において、本発明は、関心対象の刺激剤の活性を調節する化合物を選択するスクリーニング方法を特徴とする。この方法は、刺激剤に対して特異的な応答を有する本発明の１つまたはそれ以上の細胞と、１つまたはそれ以上の候補化合物および刺激剤を接触させることを含む。刺激剤に対する応答を調節する（すなわち、増加または減少させる）候補化合物が選択される。
【００５２】
さらに別の局面において、本発明は、候補化合物が関心対象の調節エレメントの活性を調節するかどうかを確かめる方法を特徴とする。この方法は、陽性の選択マーカー、レポーター遺伝子、またはトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結された調節エレメントを有する１つまたはそれ以上の本発明の細胞と、１つまたはそれ以上の候補化合物を接触させることを含む。陽性の選択マーカー、レポーター遺伝子、またはトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントの発現を調節する候補化合物が選択され、それにより、関心対象の調節エレメントの活性を調節する候補化合物が選択される。特定の態様において、関心対象の調節エレメントの活性の調節（すなわち、増加または減少）はインビボでの候補化合物の副作用と関連する。この場合、候補化合物は、望ましくは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された時の候補化合物の潜在的な副作用（例えば、薬物毒性）のために薬物開発から除外される。例えば、副作用に関連する経路に関与するｍＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている調節エレメントを活性化する候補化合物は、望ましくは、さらなる薬物開発から除外される。他の態様において、この方法は、２種類またはそれ以上の候補化合物の特定の組み合わせが一緒に（例えば、連続してまたは同時に）哺乳動物に投与された時に副作用に関連する可能性が高いかどうかを確かめるのに用いられる。例えば、副作用に関連する経路に関与するｍＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている調節エレメントを活性化する候補化合物の組み合わせは、望ましくは、さらなる薬物開発から除外される。さらに他の態様において、この方法は、１つまたはそれ以上の候補化合物が副作用に関連する可能性が高いかどうかをさらなる薬物開発の前に確かめるために、候補化合物または候補化合物の組み合わせの動物モデル試験またはヒト臨床試験の前に行われる。
【００５３】
本発明の任意の局面の様々な態様において、細胞は、マスト細胞、幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、癌細胞、リンパ球、および肝細胞である。他の例示的な細胞として、以下の細胞タイプの１つの癌に由来する腫瘍細胞株からの細胞が挙げられる：直腸癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳腺癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、子宮頚癌、舌癌、甲状腺癌、Ｔリンパ球癌、Ｂリンパ球癌、腺癌、小細胞肺癌、バーキットリンパ腫、腺扁平上皮癌、副腎皮質癌、肺胞細胞癌、またはホジキンリンパ腫。真核生物ゲノムの一例は哺乳動物細胞のゲノムである。適切な刺激剤として、サイトカイン、増殖因子、リガンド、ポリペプチド、増殖因子、抗体、および化学薬品が挙げられる。例示的な刺激剤として、幹細胞因子、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＩｇＥ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、レプチン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、エストロゲン、テストステロン、ならびにコロニー刺激因子（ＣＳＦ）が挙げられる。刺激剤が、細胞に挿入された外因性遺伝子の発現を制御することも意図される。例えば、刺激剤（例えば、化学薬品）は、細胞において関心対象の内因性調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする外因性遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを活性化することができる。様々な態様において、タンパク質は、調節エレメントのアクチベーターを誘導するか、または調節エレメントのリプレッサーを阻害することによって関心対象の内因性調節エレメントの活性を活性化する。他の態様において、タンパク質は、調節エレメントのアクチベーターを阻害するか、または調節エレメントのリプレッサーを活性化することによって関心対象の内因性調節エレメントの活性を阻害する。他の態様において、核酸、カセット、ベクター、または細胞は、陽性の選択マーカーまたはレポーター遺伝子に作動可能に連結された原核生物プロモーター（例えば、細菌プロモーター）または酵母プロモーターを含む。
【００５４】
望ましいレポーター遺伝子は、分泌型アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質などの酵素をコードする。前記局面のいずれにおいても、陽性の選択形質および陰性の選択形質を両方とも有する１種類のタンパク質をコードする核酸セグメントを、陽性および陰性の選択マーカーとして使用することができる。他の態様において、陰性の選択マーカーおよび陽性の選択マーカーは異なるタンパク質をコードする。さらに他の態様において、レポーター遺伝子は、陽性の選択マーカーおよび／または陰性の選択マーカーとは異なる。例示的な陰性の選択マーカーとして、Ｈｐｒｔ、ｇｐｔ、ＨＳＶ−ｔｋ、ジフテリア毒素、リシン毒素、またはシトシンデアミナーゼをコードする核酸セグメントが挙げられる。例示的な陽性の選択マーカーとして、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、ヒスチジノール耐性、キサンチン利用、ゼオシン耐性、またはブレオマイシン耐性を付与するタンパク質をコードする核酸セグメントが挙げられる。内部リボソーム挿入部位の例として、哺乳動物、ピコルナウイルス、およびポリオの内部リボソーム挿入部位が挙げられる。
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、薬物候補ライブラリーからの治療剤の選択に有用な細胞株の作成ならびに遺伝子標的および調節エレメントの同定のために、細胞、ベクター、および刺激剤を利用する。
【００５６】
本発明において有用な細胞は真核細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。真核細胞は、植物および動物の細胞および組織を含む特定の細胞タイプまたは組織タイプに分化することができる。幹細胞などの全能細胞ならびにマスト細胞、内皮細胞、上皮細胞、癌細胞、リンパ球、および肝細胞が特に適している。
【００５７】
本発明の核酸構築物およびベクターにおいて有用なレポーターエレメントは、物理的手段、化学的手段、または光学的手段を用いて検出することができる、細胞の指標を発現するエレメントである。検出は、視覚によるものでもよく、計器によるものでもよく、完全に自動化されてもよい。適切なレポーターエレメントとして、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質などの酵素が挙げられる。蛍光を発する酵素は、ルミノメーターを用いて検出することができる。
【００５８】
「誘導遺伝子トラップベクター」は、形質転換および組込みによってトラップベクターがゲノムに導入される当技術分野において周知の技法（例えば、トランスフェクション、形質導入）によって、トラップベクターを選択し、細胞の調節されるゲノム遺伝子座のイントロン配列に作動可能に連結するように挿入することを可能にするエレメントを含むベクターを意味する。誘導遺伝子トラップベクターは、陽性および陰性の選択形質などの選択形質を発現するマーカー遺伝子配列を含む。
【００５９】
誘導遺伝子トラップベクターは「プロモーターレス」でもよい。「プロモーターレス」は、マーカー遺伝子がベクター内でプロモーターの制御下にないことを意味する（だが、このベクターは、これらのエレメントを調節しないプロモーターを含んでもよい）。プロモーターレスベクターの場合、マーカー遺伝子の調節は、細胞に外部から導入される１つまたはそれ以上の種類の外因性刺激剤に応答する、ゲノム内の内因性調節エレメントまたは因子の結果として生じる。
【００６０】
または、ベクターは、マーカー遺伝子配列の少なくとも１つの成分用のプロモーター（例えば、マイングイら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８巻、７４６−７４９頁（２０００）に記載のような、陽性の選択マーカーｎｅｏ用のＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター）を含んでもよい。１つのこのような成分用のプロモーターを含むが、他の選択可能な形質を発現する配列およびレポーター配列用のプロモーターを含まないベクターも本発明の範囲内に含まれる。
【００６１】
ベクター内の「作動可能に連結された」エレメントまたは配列、およびゲノムに「作動可能に組み込まれた」ベクターは、所望の遺伝子産物のｍＲＮＡ転写物をコードするためでも、調節制御のためでも、連結されたヌクレオチド配列を意味する。「作動可能に連結された」はまた、選択マーカー、トランス活性化因子、およびレポーター遺伝子が同じ転写単位によってコードされることも意味する場合がある。
【００６２】
「スプライスアクセプター」（「ＳＡ」）すなわち機能的スプライスアクセプターは、構築物またはベクターを成熟した生物学的に活性なｍＲＮＡに含まれるようにプロセシングすることができるコンセンサス配列を意味する（但し、構築物またはベクターは活発な染色体遺伝子座に組み込まれ、染色体遺伝子座のプレメッセンジャーＲＮＡの連続部分として転写される）。スプライスアクセプターは、一般的に、イントロンの３’末端およびエキソンの５’末端を含むのに対して、スプライスドナー（「ＳＤ」）は、一般的に、エキソンの５’末端およびイントロンの３’末端を含む。これらのエレメントならびに遺伝子トラップベクターを調製するのに用いられる他の遺伝子エレメントの例は、公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ９８／００６６７、アルバーツ（Ａｌｂｅｒｔｓ）ら、「細胞の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ）」、３７３頁（１９９４）、および米国特許第５，９２２，６０１号に見られ、これらの開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００６３】
翻訳停止配列すなわち「停止」は、３つの異なるリーディングフレームで翻訳停止コドンをコードする配列である。停止配列は、染色体遺伝子座にあるベクター上流のエキソンによりコードされるペプチド鎖の切断を引き起こし、翻訳リーディングフレームが選択マーカー遺伝子に続かないようにし、それによりノンセンスリーディングフレームでの翻訳が妨げられる。
【００６４】
本明細書で使用する内部リボソーム挿入部位すなわち「ＩＲＥＳ」は、下流コード領域またはオープンリーディングフレームの翻訳が内部プロモーターの非存在下で開始するように、下流コード領域またはオープンリーディングフレームと細胞質ポリソームのリボソームとの結合を可能にするエレメントである。選択マーカータンパク質コード配列の翻訳を開始するために、構築物にＩＲＥＳが含まれる。脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳが、本発明での使用に適した１つのこのようなＩＲＥＳである。
【００６５】
「マーカー」は、タンパク質を発現する細胞とタンパク質を発現しない細胞を区別するのに使用することができるポリペプチドまたはタンパク質をコードする、ベクター内のヌクレオチド配列または遺伝子を意味する。マーカー遺伝子は様々な手段を用いて検出することができ、選択マーカーおよびアッセイマーカーを含む。選択マーカーは、細胞のゲノムまたはゲノム遺伝子座に組み込まれた時に選択またはスクリーニングすることができる遺伝子エレメントである。選択マーカーとして、薬剤抵抗性マーカー、抗原マーカー、接着マーカーなどの選択形質を有するマーカーが挙げられる。抗原マーカーの例として、蛍光活性化細胞選別において有用な抗原マーカーが挙げられる。接着マーカーの例として、選択的な接着を可能にする接着リガンド受容体が挙げられる。他の選択マーカーとして、マーカー酵素、アミノ酸配列マーカー、細胞表現型マーカー、核酸配列マーカーなどの、実験アッセイプロトコールにおいて検出することができる様々な遺伝子産物が挙げられる。
【００６６】
選択マーカーとして、陰性の選択形質および陽性の選択形質の両方を有するマーカーも挙げられる。一般的に、陽性の選択は、マーカー遺伝子を発現する細胞の単離を意味し、陰性の選択は、マーカー遺伝子を発現しない細胞の単離を意味する。様々な態様において、陰性の選択マーカーの発現は、マーカーを含む細胞の選択的な排除または死につながる。陽性の選択および陰性の選択のために１種類の遺伝子または複数の遺伝子を使用することができる。陽性の選択形質および陰性の選択形質の両方を有する融合タンパク質を発現する遺伝子配列が好ましい。特定の例として、融合タンパク質は、陰性の選択マーカーＴｋ（チミジンキナーゼ）および陽性の選択マーカーｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子配列により発現することができる。陽性の選択形質および／または陰性の選択形質を有する遺伝子マーカーならびに選択マーカーのさらなる例についての詳細は、１９９６年９月１６日に出願され、１９９９年７月１３日に発行された米国特許第５，９２２，６０１号に見られ、この開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。これらのどの選択マーカーも、本発明の核酸構築物および方法において使用することができる。
【００６７】
「トランス活性化因子」および「トランス活性化因子ポリペプチド」は、それぞれ、タンパク質を転写する、またはタンパク質の転写を引き起こす核酸配列およびポリペプチドであり、ゲノム遺伝子座を調節する。トランス活性化因子ポリペプチドの例として転写因子および増殖因子が挙げられる。他の例示的なトランス活性化因子ポリペプチドとしてシグナル伝達経路に関与する分子が挙げられる。トランス活性化因子ポリペプチドは遺伝子の転写を直接的に活性化してもよく、間接的に活性化してもよい。例えば、トランス活性化因子ポリペプチドは調節エレメント（例えば、エンハンサー、転写因子結合部位、またはプロモーター）に直接結合し、調節エレメント下流の遺伝子の転写を活性化してもよい。または、トランス活性化因子ポリペプチドは、遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化する別のポリペプチドを活性化してもよい。
【００６８】
「調節単位または調節タンパク質」は、ゲノム遺伝子座を調節する調節エレメントに結合するトランス活性化因子ポリペプチドである。例えば、トランス活性化因子ポリペプチドは、調節エレメント（例えば、テトラサイクリン応答プロモーター）に結合し、調節エレメント下流の内因性遺伝子の転写を活性化してもよい。次いで、この内因性遺伝子によりコードされるタンパク質は、関心対象の調節エレメント（例えば、本発明の誘導トラップベクターを用いて同定される内因性プロモーターまたは他の調節エレメント）を活性化してもよい。
【００６９】
テトラサイクリン調節単位は、テトラサイクリンにより活性化または抑制されるタンパク質（「ｔＴＡ」）を発現するトランス活性化因子調節配列の一例である。テトラサイクリン調節単位はベクター内に組み入れることができ、相補ベクターに存在するテトラサイクリン応答エレメントを含む最小プロモーター配列すなわち「ＴＲＥＰｃｍｖ」と協力して働く。米国特許第５，４６４，７５８号および米国特許第５，８１４，６１８号を参照のこと（これらの開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。このベクター対は、細胞ゲノムに作動可能に組み込むことができる。細胞と刺激剤が接触すると、テトラサイクリンレギュレーターがオンになり、単位が、テトラサイクリン応答エレメントを含む最小プロモーター配列に結合するタンパク質を生じる。これにより、最小プロモーターはプロモーター下流の遺伝子の転写を活性化および誘導する。これらの転写された遺伝子はゲノム遺伝子座を上方制御または下方制御することができ、テトラサイクリン調節単位はより多くのタンパク質を発現し、これにより、プロモーターはさらなる遺伝子コピーを転写するように活性化される（以下同様である）。最終的に、このフィードバックプロセスの結果として、検出、単離、および配列決定するのに十分な遺伝物質が生成される。
【００７０】
「５’ＲＡＣＥ」クローニングは、その表現が本明細書で用いられるように、ｃＤＮＡ末端の５’迅速ＰＣＲ増幅法（５’ ｒａｐｉｄ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄ：ＲＡＣＥ）を意味する。この手順は、シカルネス（Ｓｋａｒｎｅｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、６、９０３−９１８頁（１９９２）に詳細に述べられており、この開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００７１】
「カセット」は、核酸のセグメントを意味する。
【００７２】
「ポリペプチド」は、２つまたはそれ以上の共有結合した天然アミノ酸または修飾アミノ酸からなる配列を意味する。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は本明細書で同義に用いられる。
【００７３】
本発明の方法およびベクターは、選択された刺激剤からの刺激に応答する細胞株を選択し、調節成分を同定するのに使用することができる。これは、誘導遺伝子トラップベクターを利用して、特定のポリヌクレオチド配列を、選択された刺激に応答するゲノム遺伝子座に導入することによって達成される。ある特定のヌクレオチドよびベクターが本明細書で例示されているが、これは、本発明を理解するためだけに便宜上、例示され、本発明の範囲を限定することが意図されない。他のベクターが当業者により容易に設計され、本明細書に記載の方法を実施するために都合よく用いられる。
【００７４】
一般的に、本発明の誘導トラップベクターは、トランス活性化因子遺伝子もしくはトランス活性化因子ポリペプチドコード配列を含み、および／またはレポーターエレメントもしくはレポーター配列を含む。レポーターエレメントは、好ましくは、検出可能な酵素をコードする配列である。適切な酵素は当技術分野において周知であり、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ルシフェラーゼ（商標）、および緑色蛍光タンパク質が挙げられる。光を発する酵素は、例えば、蛍光活性化セルソーターまたは類似装置を用いて検出することができる。
【００７５】
１つの特定の核酸構築物を図１に示す。この構築物は誘導遺伝子トラップベクターに組み入れ、関心対象の細胞をトランスフェクトするのに使用することができる。図１に示すように、本発明において実施可能な構築物の中には、内部リボソーム挿入部位、トランス活性化因子遺伝子（例えば、テトラサイクリン調節タンパク質をコードするプロモーターレスタンパク質コード配列）、内部リボソーム挿入部位、およびレポーター配列（例えば、分泌型アルカリホスファターゼ）を含むカセットを含むものもある。当然、図１に示した特定の成分の代わりに他のトランス活性化因子遺伝子およびレポーターエレメントを構築物において使用することができる。さらに、テトラサイクリン調節単位とＩＲＥＳ配列との間に翻訳停止配列を挿入することができ、同様に停止配列を構築物末端に使用することができる。この構築物は、細胞のトランスフェクトに使用するためにウイルスベクターなどのベクターに組み入れることができる。
【００７６】
本発明において有用な別のベクターを図２に示す。図２のベクターは、以下の作動可能に連結された成分を含む：機能的スプライスアクセプター；翻訳停止配列；ＩＲＥＳ部位；ならびに陽性および陰性の選択形質を有する融合タンパク質をコードするプロモーターレスタンパク質コード配列（例えば、陰性／陽性の選択ポリペプチドＴｋ−Ｚｅｏ融合タンパク質をコードする遺伝子）；内部リボソーム挿入部位；遺伝子マーカー（例えば、テトラサイクリン調節タンパク質をコードするプロモーターレスタンパク質コード配列）；内部リボソーム挿入部位；レポーター配列（例えば、分泌型アルカリホスファターゼをコードする配列）；ならびにポリアデニル化シグナル。ベクターの特定の用途に応じて、このベクターの成分の中には重複するものがあってもよい。例えば、刺激剤に応答する細胞株を選択するためにベクターが用いられる場合、図６および７に示すように、遺伝子トラップ手順において用いられる特定の選択プロトコールに応じて、レポーターエレメントおよびそれに結合するＩＲＥＳを除去することが可能な場合もある。
【００７７】
図２、図８Ａ、または図９Ａに示したベクターは、図６で概説する手順を用いて細胞株を作成するのに使用することができる。示したように、トランスフェクションまたは形質導入などの適切な技法を用いて、細胞が図２のレトロウイルスベクターで形質転換される。ＩＬ−３などの刺激剤およびゼオシンなどの選択薬物が細胞培地に添加される。培地に残った生細胞は、（１）刺激剤によりオンにされる（活性化される）ゲノム遺伝子座にベクターが組み込まれた細胞および（２）活性化されたハウスキーピング遺伝子を含むゲノム遺伝子座にベクターが組み込まれた細胞である。生細胞は培地から分離され、活性のあるハウスキーピング遺伝子を有する細胞を排除するために新鮮なガンシクロビル含有培地に入れられる。刺激剤によりオンにされる細胞が同定および単離される。
【００７８】
または、図６の細胞は、図２、図８Ａ、または図９Ａのレトロウイルスベクターで形質転換される。選択薬物（ゼオシン）が培地に添加され、残った細胞は、ハウスキーピング遺伝子を含む細胞および刺激剤の非存在下でオンにされる細胞である。ＩＬ−３などの刺激剤およびガンシクロビルが、活性化された細胞を含む新鮮な培地に添加され、活性化されたハウスキーピング遺伝子を含む細胞が排除される。残った細胞は、刺激剤によりオフにされる細胞である。
【００７９】
図２は、細胞株を作成するのに使用することができる別のベクターを示す。このベクターは、下流配列に以下の作動可能に連結された成分を含む：機能的スプライスアクセプター配列、翻訳停止配列、内部リボソーム挿入部位、トランス活性化因子遺伝子（例えば、テトラサイクリン調節タンパク質をコードするプロモーターレスタンパク質コード配列）、内部リボソーム挿入部位、レポーター配列（例えば、分泌型アルカリホスファターゼ）、ＩＲＥＳ部位、ＴＫをコードするコード配列、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（「ＰＫＧ」）、ＰＫＧプロモーターの転写制御下にあるゼオシンコード配列、およびポリアデニル化シグナル（ｐＡ）。
【００８０】
図３、図８Ａ、または図９Ａに示したベクターは、図７で概説する手順を用いて細胞株を作成するのに使用することができる。図７で示したように、細胞が図３、図８Ａ、または図９Ａに示した誘導遺伝子トラップベクターで形質転換され、ベクターがゲノム遺伝子座に組み込まれていない細胞を排除するために選択薬物（例えば、ゼオシン）が培地に添加される。培地を交換し、活性のあるハウスキーピング遺伝子を含む細胞を排除するためにガンシクロビルが添加される。刺激剤が添加され、細胞により産生された分泌型アルカリホスファターゼの量に基づいて、薬剤に応答する細胞が選択される。これらは、刺激剤により活性化される細胞である。
【００８１】
または、図７の細胞は図３のレトロウイルスベクターで形質転換され、ベクターがゲノムに組み込まれていない細胞を排除するために選択薬物（ゼオシン）が培地に添加される。培地を交換し、ハウスキーピング遺伝子を含む細胞を排除するためにガンシクロビルおよび刺激剤が添加される。刺激剤の非存在下で細胞により産生される分泌型アルカリホスファターゼの量を測定することによって、刺激剤によりオフにされる細胞が選択される。
【００８２】
図４は、刺激剤に応答する細胞（例えば、図６または７で同定された細胞）のゲノム遺伝子座を上方制御または下方制御することができる遺伝子を同定するために、図２または図３に示した影付き部分に示した核酸配列を含むベクターと共に使用することができるベクターを示す。図４のベクターは、下流配列において作動可能に連結された以下の成分を含む：テトラサイクリン応答エレメントを含む最小プロモーター配列；Ｎｅｏをコードするプロモーターレスタンパク質コード配列；ＩＲＥＳ配列；およびスプライスドナー。図２または図３の影付き部分は、下流配列において以下の成分を含む：ＩＲＥＳ配列、Ｔｅｔオン／オフ配列、ＩＲＥＳ配列、およびＳＥＡＰ発現配列。または、ＩＲＥＳ配列、Ｔｅｔオン／オフ配列、停止配列、ＩＲＥＳ配列、β−ガラクトシダーゼ発現配列、停止配列、およびポリアデニル化配列を含むベクター５を作成するために、図８Ａの誘導トラップベクターの領域を図８Ｂの交換カセットと取り替えることができる。二次細胞感染手順を図５に示す。
【００８３】
図５に示すように、核２を有する細胞１がベクター４および５でトランスフェクトされ、ベクターはゲノム遺伝子座３に組み込まれる。ベクター４（図４のベクターでもよい）およびベクター５（図２または図３の影付き部分として示す核酸配列を含むベクターでもよい）がトランスフェクトされ、細胞１のゲノム遺伝子座３に組み込まれる。細胞１は、図６または図７に示したタイプの細胞でもよい。組み込まれたベクターは、トランスフェクトされたベクター４の組込み部位の下流にある遺伝子の発現およびベクター５によりコードされるテトラサイクリン調節タンパク質の発現を増加させるように相補的に作用する。これは、テトラサイクリンにより活性化または抑制されるタンパク質であるタンパク質６（ｔＴＡ）を転写するテトラサイクリン調節単位の活性化の結果として起こる。ｔＴＡタンパク質６は、ベクター４のテトラサイクリン応答エレメントを含む最小プロモーター配列に結合し、ＴＲＥＰｃｍｖプロモーターを活性化し、下流遺伝子のさらなるタンパク質７（タンパク質Ｘ）を転写する。下流遺伝子により転写されるタンパク質７はゲノム遺伝子座３を上方制御または下方制御し、ベクター５のテトラサイクリン調節単位の発現を増加させ、それにより、ベクター４のＴＲＥＰｃｍｖプロモーターを活性化して、さらなるタンパク質７を下流遺伝子から転写する。このプロセスは、タンパク質７またはそのｍＲＮＡを収集および同定するのに十分なタンパク質７が転写されるまで、切れ目なくループして同じことが繰り返される。これにより、対応する遺伝子の同定および特徴づけが可能になる。図５に示すように、この遺伝子転写プロセスは、一次遺伝子座３の間接的または直接的な調節に応答するベクター５によるＳＥＡＰ産生（または図８Ｂの交換カセットによるβ−ガラクトシダーゼ産生）によってモニターすることができる。
【００８４】
本明細書に記載のようなトラップされた調節エレメントの単離および同定は、トラップされた調節エレメントに作動可能に連結された遺伝子の同定を可能にし、従って、関心対象の刺激剤により転写が増加または減少する遺伝子の同定を可能にする。これらの遺伝子が様々な細胞タイプで同じように調節されるかどうか、およびこれらの遺伝子の調節がある特定の環境要因または疾患状態の存在下で変化するかどうかを確かめるために、これらの遺伝子の調節は、異なる環境条件下で、および異なる細胞株（例えば、異なる組織、異なる生物、または異なる疾患動物モデルに由来する細胞）において比較することができる。（実施例１０に記載のように）どのタンパク質が遺伝子転写に影響を及ぼすかを確かめるために、またはコードされるタンパク質のインビボでの役割（例えば、疾患状態の阻害、発症、または促進における、コードされるタンパク質の野生型形態もしくは変異形態の役割）を確かめるために、選択された細胞をさらに特徴付けることができる。
【００８５】
選択された細胞はまた、トラップされた調節エレメントまたはトラップされた遺伝子の特徴付けに基づいて分類することができる。例えば、共通点のあるタンパク質クラスのタンパク質（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、同じシグナル伝達系路のタンパク質、または同じ疾患状態に関連するタンパク質）の発現に関連するトラップされた核酸を含む細胞は同じグループに分類することができる。ある細胞グループと候補化合物（例えば、潜在的な候補生成物）を接触させて、それぞれの細胞に及ぼす候補化合物の影響を比較し、それにより、候補化合物の影響が、ある特定のトラップされた核酸に特有のものかどうか、または複数のトラップされた核酸に全体的に影響を及ぼすかどうかが確かめられる。図１０に示すように、異なるリガンドが別々の経路または重複する経路を介して作用するかどうかを確かめるために、細胞を使用することができる。
【００８６】
本発明の細胞はまた、疾患の治療または予防のための新たな遺伝子標的の同定および確認に有用である。例えば、関心対象のトラップされた調節エレメントまたは遺伝子の活性化または阻害が疾患状態に関連する経路を調節するかどうかを確かめるために、細胞を使用することができる。これらの細胞は、薬物開発のための新薬生成物またはリード化合物を同定するためにスクリーニングアッセイ法において使用することができる。挿入されたレポーター遺伝子を含む細胞は、ＴＮＦ−αなどの薬学的に活性な化合物に応答する調節エレメントまたはプロモーターを同定するのに使用することができる。ＴＮＦ−αだけに応答する細胞株または他の炎症性サイトカインにも応答する細胞株を選択することができる。例えば、陽性の選択薬物の存在下でＴＮＦ−α細胞株をＩＬ−１βで処理することによって、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの両方に応答する細胞クローンを選択することができる。従って、それぞれが、調節される遺伝子部位にレポーター遺伝子を組み入れ、標準化された読み取り機構を示す、広範囲の細胞株ライブラリーを樹立することによって、調節経路を標的とする化合物の効力および副作用を容易に試験する能力を有する基盤を組み立てることができる。
【００８７】
次いで、同定された遺伝子に基づく治療剤（例えば、アンチセンス分子、遺伝子アクチベーター、または遺伝子阻害剤）を適切に考案することができる。例えば、この遺伝子は、医療用治療送達ビヒクル中で患者により許容される適切なベクターに処方された場合、遺伝子療法用途において使用することができる。または、化合物ライブラリーから潜在的な治療剤候補を同定するための薬物標的として遺伝子またはその調節エレメント（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）を使用することができる。
【００８８】
以下の実施例は本発明のある特定の態様の例示であり、本発明をさらに説明することを目的とし、これにより本発明は限定されない。本発明の精神または範囲を逸脱することなく、これらの態様にさまざまな変更を加えることができる。
【００８９】
実施例１
核酸構築物の調製
図１に示すインサートを含むレトロウイルスベクターを５段階で調製した。これらの段階は、ＳＥＡＰおよびｔＴＡをコードするｃＤＮＡ断片を、ＩＲＥＳを含む発現ベクターに導入し、次いで、その後に、これらの２つの構築物を合体し、レトロウイルスベクターに導入することを伴う。これらの段階は以下の通りである：
段階１：ｐＳＥＡＰ−２ベクター（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））からのＳｍａＩ−ＸｂａＩ断片を単離し、連結によってベクターｐＩＲＥＳ（クロンテック）のＳｍａＩ−ＸｂａＩ部位に挿入する。
段階２：ｐＴｅｔ−ｏｎプラスミド（クロンテック）からのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、平滑末端連結によってベクターｐＩＲＥＳのＳｍａＩ部位に挿入する。
段階３：段階２で構築したベクターからのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を、平滑末端連結によってベクターＰＢＳＫＳ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＳｍａＩ部位に導入する。
段階４：段階３で構築したベクターのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、段階１で構築したベクターのＥｃｏＲＩ部位に導入する。
段階５：段階４から得たＣｌａＩ−ＣｌａＩ断片を、レトロウイルスベクターｐＳＩＲ（クロンテック）のＣｌａＩ部位に導入する。
【００９０】
実施例２
実施例１の核酸構築物を含むベクターの構築
このベクターは、「ＳＡＴＥＯ」構築物（米国特許第５，９２２，６０１号）のネオマイシン耐性遺伝子をゼオシン耐性遺伝子と交換し、その後に、実施例１に記載のレトロウイルスベクターに導入することを含む２つの段階で構築される。
１．これらの段階は以下の通りである：
段階１：ｐＥＭ７／Ｚｅｏベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））からのＺｅｏ ｃＤＮＡ ＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ断片の単離およびＳＡＴＥＯのＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ部位への連結。
段階２：段階１で作成した構築物からのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片の単離および実施例１に記載のベクターのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位への連結。
【００９１】
レトロウイルスは、ｐＳＩＲベクターについてのクロンテックマニュアルに記載のように、ヘルパー２９３パッケージング細胞株へのトランスフェクションによって作成される。レトロウイルス力価は、感染３ｔ３線維芽細胞におけるＳＥＡＰ活性の量を測定することによって証明される。
【００９２】
実施例３
代替ベクターの構築
このベクターは、最初に、「ＳＡＴＥＯ」構築物（米国特許第５，９２２，６０１号）からネオマイシン耐性遺伝子を欠失させ、結果として得られたインサートを実施例１の段階４で作成されたインサートと共にｐＳＩＲベクターに導入することを含む３つの段階で構築される。これらの段階は以下の通りである：
段階１：「ＳＡＴＥＯ」構築物（米国特許第５，９２２，６０１号）の消化によるＥａｇＩ−ＳａｌＩインサートの除去、その後の平滑末端連結。
段階２：実施例１の段階４で作成した構築物からのＣｌａＩ−ＣｌａＩ断片の、ベクターｐＳＩＲベクターのＥｃｏＲＩ部位への導入。
段階３：段階１で作成した構築物からのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片の単離、および段階２に記載のベクターのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位への連結。
【００９３】
レトロウイルスは実施例２に記載のように作成および力価測定される。
【００９４】
実施例４
遺伝子を同定するための核酸構築物の調製
この構築物は５段階で合成される。第１の段階は、ＩＲＥＳ−ＳＤ断片を合成および導入し、ネオマイシン耐性遺伝子下流に配置することを伴う。次いで、そのインサート全体をｐＴＲＥベクターに導入する。次いで、ｐＴＲＥベクターおよびインサートをレトロウイルスベクターに導入する。これらの段階は以下の通りである：
段階１：ＸｂａＩ−ＮｏｔＩ制限部位に隣接するＳＤ部位を含む以下の２つの相補オリゴヌクレオチドを合成する：
2004528815.tif 000002
段階２：段階１に記載のオリゴヌクレオチドをアニールし、制限酵素で切断した後に、ｐＩＲＥＳベクター（クロンテック）のＸｂａＩ−ＮｏｔＩ部位に連結する。
段階３：ｐｓｖ２ ｎｅｏ構築物（ストラタジーン）からのネオマイシン遺伝子を、平滑末端連結によって、段階２で構築したベクターのＭｌｕＩ部位に連結する。
段階４：段階３からのベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離し、ｐＴＲＥベクター（クロンテック）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に連結する。
段階５：段階４で合成された構築物からのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＳＩＲレトロウイルスベクター（クロンテック）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入する。
【００９５】
実施例５
マスト細胞株ライブラリーの調製
マスト細胞は、喘息などの炎症疾患において主要な役割を果たすことが知られている。幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＩＬ−３などのサイトカインは、マスト細胞の増殖応答および活性化応答に重要であることが知られている。インビボにおいて、これらのサイトカインは気道におけるマスト細胞の蓄積を誘導するだけでなく、細胞を刺激し、細胞の過敏を促進する。このようなサイトカインによるマスト細胞応答を調節することができる調節因子の同定は、阻害薬物を得るための最も重要な目標である。さらに、マスト細胞における１種類を超えるサイトカインの調節に関与する調節因子の同定は、異なる重要な経路の重要な収束点である可能性が高い。従って、このような調節因子を組み入れているマスト細胞株の作成および同定は、阻害剤のハイスループットスクリーニングに、および遺伝子発見の手段として非常に有用であろう。
【００９６】
実験手順
ヒトマスト細胞株ＨＭＣ−１は、ＩＬ−３およびＳＣＦを含む様々なサイトカインに対して増殖応答および活性化応答を示す樹立細胞株である。細胞をサイトカインで処理すると、遺伝子を上方制御または下方制御することができる。この実験において、ＩＬ−３およびＳＣＦにより上方制御される遺伝子を含む細胞株が樹立される（ＨＭＣ−Ｉ細胞は、通常、追加増殖因子を含まない培地において維持される）。
【００９７】
遺伝子のＩＬ−３応答調節領域をトラップするために、ＨＭＣ−１細胞を、増殖因子添加のない培地において一晩（１２時間）培養する。次いで、ＨＭＣ−Ｉ細胞を、ＩＬ−３含有培地において６時間培養する。この後、ウイルス含有培地において細胞を１２時間培養することによって、実施例２に記載の誘導遺伝子トラップベクターを有するレトロウイルスに細胞を感染させる。感染細胞を１回洗浄し、５０００〜１０，０００個／１００μｌ／ウェルの細胞数で９６ウェル培養プレートに再分配する。ゼオシン含有培地を用いて選択を開始する。３日後、生存細胞を収集する。これらの細胞は、レポーターＺＥＯならびにレポーター遺伝子転写物およびタンパク質のプロモーター駆動産生をもたらす１）ハウスキーピング遺伝子または２）ＩＬ−３活性化遺伝子に相当する。生存クローンにおける特異的発現を証明および確認するために、レポーターアッセイ法を行う。
【００９８】
前記培地を、ＩＬ−３を含まないガンシクロビル添加培地に交換することで、ＩＬ−３応答遺伝子の選択によりＩＬ−３誘導の可逆性が証明される。チミジンキナーゼの発現によって、活性なままのハウスキーピング遺伝子が選択され、これらのクローンが排除される。生存クローンはＩＬ−３応答遺伝子に相当する。これを確認するために、レポーターアッセイ法をＩＬ−３除去の１２時間後に繰り返す。レポーター陰性のクローンが同定される。
【００９９】
ＳＣＦ応答性の細胞株を樹立するために前記と同様の実験を行う。ＳＣＦの代わりにＩＬ−３を使用する以外は同様の実験を行う。
【０１００】
単離されたクローンの因子応答性を確かめるために、誘導前後に各クローンについてレポーターアッセイ法を繰り返す。用量応答を定量するために力価曲線を用いて結果をさらに強固にする。
【０１０１】
両サイトカインに応答する細胞株を同定するために、それぞれのＩＬ−３応答細胞株をＳＣＦを用いて試験する。同様に、ＳＣＦ応答細胞株をＩＬ−３を用いて試験する。
【０１０２】
最後の段階において各クローンの遺伝子の同一性を確かめる。トラップされた遺伝子のクローニングおよび配列決定を可能にするために、本発明のベクターを用いた５’ＲＡＣＥにおいて使用するための特異的なプライマーが合成されている。この情報から２種類またはそれ以上の因子に応答するクローンが同定される。
【０１０３】
実施例６
内皮細胞株ライブラリーの調製
血管形成の阻害は、癌組織を除去する有力なアプローチである。現在、単離された「抗血管形成」分子は増加しており、臨床試験中である。しかしながら、ヒトの癌に対する効果はまだ証明されていない。癌増殖を持続的に抑制するのに一種類の血管形成阻害剤が十分であるかどうかも分かっていない。最終的に、治療抑制剤の併用が必要な場合があると考えられる。これは、広範囲にわたる実験データによって、数種類の因子が内皮細胞増殖を誘導し、新しい血管の発生を促進する能力を有すると証明されているので驚くべきことではない。これらの因子は癌細胞およびその周囲の間質成分に由来していた。これらの事象を調節する遺伝子産物は、阻害薬物および阻害低分子の主要な標的である。同様に、１種類を超える因子に応答する遺伝子グループは、異なる重要な経路の重要な収束点である可能性が高い。従って、このような細胞株は、阻害剤のハイスループットスクリーニングにおいて非常に有用なツールであろう。
【０１０４】
実験手順
内皮細胞増殖を誘導する、いくつかの十分に研究された因子が知られている。ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、およびＦＧＦ−２に応答するクローンが樹立されている。他の実験において広範囲にわたって用いられているヒト内皮株ＥＣＶ３０４またはＨＭＥＣ１を使用する。内皮細胞を、サブコンフルエント細胞密度で９６ウェルプレートにプレートする。細胞をＶＥＧＦ含有培地で６時間刺激し、その後に、前記のレトロウイルスベクターを含む培地に感染させ、感染開始の１２時間後に、トラップされた活性な遺伝子を選択するために、培地をゼオシン含有培地と交換する。前記のように、選択の３日〜４日後、生存細胞は、１）ハウスキーピング遺伝子または２）ＶＥＧＦにより誘導された遺伝子に相当する。生存クローンにおけるレポーター遺伝子の特異的発現を証明および確認するために、レポーターアッセイ法を行う。
【０１０５】
遺伝子のＶＥＧＦ応答調節領域を選択するために、前記培地を、ＶＥＧＦを含まないガンシクロビル添加培地に交換することで、ＶＥＧＦ誘導の可逆性が証明される。レポーターアッセイ法をＶＥＧＦ除去の１２時間後に行う。レポーター陰性のクローンが同定される。チミジンキナーゼの発現によって、依然として活発に転写されているハウスキーピング遺伝子に相当するレポーター陽性クローンが選択され、これらのクローンが排除される。３〜４日後に生存しているクローンはＶＥＧＦ応答遺伝子に相当する。
【０１０６】
ＴＧＦ−β応答性またはＦＧＦ−２応答性の細胞株を樹立するために、ＶＥＧＦの代わりにＴＧＦ−βまたはＦＧＦ−２を使用する以外はＶＥＧＦについて前述したものと同様の実験順序を行う。
【０１０７】
単離されたクローンの特異的な因子応答性を確かめるために、誘導前後に各クローンについてレポーターアッセイ法を繰り返す。前述の項で説明した５’ＲＡＣＥ分析のプライマーを用いて、トラップされた遺伝子の同一性を確かめる。このように、３種類全ての刺激剤に応答する内皮細胞遺伝子に相当するクローンが同定される。
【０１０８】
実施例７
選択された遺伝子座を上方制御または下方制御する遺伝子の選択
実施例５および６からの選択されたクローンを、８０％コンフルエンシーに達するまで増殖培地において培養する。次いで、ウイルス含有培地において細胞を１２時間培養することによって、実施例４に記載の遺伝子トラップベクターを有するレトロウイルスに、これらの細胞を感染させる。感染細胞を１回洗浄し、５０００〜１０，０００個／１００μｌ／ウェルの細胞数で９６ウェル培養プレートに再分配する。Ｇ４１８含有培地を用いて選択を開始する。３日後、生存細胞を収集する。これらの細胞は、ウイルスベクターが首尾よく組み込まれた細胞に相当する。実施例５からのクローンを、ゼオシンおよびＧ４１８を含む増殖培地に入れる。これにより、Ｇ４１８に対する耐性を付与する組み込まれた遺伝子トラップベクターに加えて、活発なゲノム遺伝子座を有する細胞の選択が可能になる。生存クローンにおける特異的発現を証明および確認するために、レポーターアッセイ法を行う。
【０１０９】
リガンド非依存性ＳＥＡＰ活性の試験に基づいて実施例６からのクローンを選択する。例えば、ＳＥＡＰコード配列に作動可能に連結された調節エレメントの活性をリガンド非依存的に調節するタンパク質をコードするトラップされた遺伝子を同定するために、これらの細胞を刺激剤の非存在下でインキュベートすることができる。
【０１１０】
リガンド依存的に調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードするトラップされた遺伝子を同定するために、細胞を刺激剤の存在下でインキュベートすることもできる。特に、刺激剤の存在下で活性の高いコードタンパク質は、刺激剤の存在下でＳＥＡＰ活性レベルに対して大きな効果を示す。これらのコードタンパク質は刺激剤により直接活性化されてもよく、刺激剤により直接的または間接的に活性化される別のタンパク質によって活性化されてもよい。または、刺激剤は、トラップされた遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害する別のタンパク質を阻害してもよい。刺激剤の存在下で活性の低いコードタンパク質は、刺激剤の存在下でＳＥＡＰ活性レベルに対して小さな効果を示す。これらのコードタンパク質は刺激剤により直接的に阻害されてもよく、間接的に阻害されてもよい。
【０１１１】
このモデルの有効性は、テトラサイクリン依存的なＳＥＡＰ産生を示すクローンを探すことによって試験される。例えば、関心対象の調節エレメントを活性化するタンパク質をコードするトラップされた遺伝子は、テトラサイクリンの存在下でＳＥＡＰ産生を促進する。逆に、関心対象の調節エレメントを不活化するタンパク質をコードするトラップされた遺伝子は、テトラサイクリンの存在下でＳＥＡＰ産生を阻害する。３’ＲＡＣＥ分析において遺伝子トラップベクターのＳＤ部位上流の配列に対応するプライマーを用いて、トラップされた遺伝子の同一性が証明される。
【０１１２】
実施例８
阻害剤および拮抗薬のスクリーニング
ＳＣＦ活性およびＶＥＧＦ活性の阻害剤および活性化剤について天然産物ライブラリー（エックスアルファ（ＥＸＡＬＰＨＡ））をスクリーニングするために、実施例６および実施例７からの選択された細胞クローンを直接使用する。ＳＣＦを介したシグナル伝達に対する阻害剤をＨＭＣ−１クローンにおいて同定するために、これらの細胞を培養し、１１個の９６ウェルプレートに均一にプレートした。阻害剤および活性化剤を同定するために、天然産物ライブラリーの各ウェルから１ｎＭアリコートを、ＳＣＦの存在下で培養細胞の各ウェルに移した。ＳＥＡＰ活性の量を測定し、ウェルごとに比較する。ＳＣＦ非依存性活性化剤を同定するために、ＳＣＦの非存在下で、このスクリーニングを行う。
【０１１３】
ＶＥＧＦを介したシグナル伝達の阻害剤および活性化剤をＥＣＶ３０４細胞において同定するために、前記と同様の技法を使用する。ＥＣＶ３０４細胞クローンを採取し、９６ウェルプレートにプレートし、１ｎＭの天然産物画分およびＶＥＧＦの存在下で産生されたＳＥＡＰの相対量を各ウェルにおいて比較する。
【０１１４】
実施例９
刺激剤に応答する調節エレメントの同定
関心対象の刺激剤に応答する調節エレメントを同定するために、図８Ａまたは図９Ａに示した誘導遺伝子トラップベクターまたは実施例２に記載のようなＬｏｘＰ部位を１個含むか、もしくは含まない類似ベクターを有するレトロウイルスに、細胞を感染させる。次いで、感染細胞を１回洗浄し、９６ウェル培養プレートに再分配する。
【０１１５】
刺激剤により活性化される調節エレメントの選択
関心対象の刺激剤により活性化される調節エレメント（例えば、エンハンサーまたはプロモーター）を同定するために、細胞を、関心対象の刺激剤および陽性の選択薬物であるゼオシンの存在下でインキュベートする（図６）。この段階は、プロモーターの制御下で構築物がゲノムに安定に組み込まれた細胞を単離する（プロモーターは刺激剤により調節されても、調節されなくてもよい）。刺激剤により調節されないプロモーター（例えば、ハウスキーピング遺伝子プロモーター）の制御下で構築物が発現される細胞を排除するために、刺激剤は存在しないが、ガンシクロビルが存在する条件下で、細胞を培養する。この段階は、陰性の選択マーカーであるチミジンキナーゼを刺激剤の非存在下で発現する細胞を排除し、刺激剤により調節されるプロモーター（または他の調節エレメント）の制御下で構築物がゲノムに安定に組み込まれた望ましい細胞を単離する。本発明をどのようにも限定することを意図しないが、細胞への構築物の組込みは本質的にランダムな事象であり、従って、細胞の全てが、内因性プロモーターの制御下または関心対象の刺激剤により調節される内因性プロモーターの制御下に組み込まれた構築物を含むとは限らないことに留意のこと。
【０１１６】
刺激剤により活性化される調節エレメントを同定するために使用することができる別の方法は、まず最初に、誘導トラップベクターを含む細胞を選択するために細胞をゼオシンとインキュベートすることを伴う（図７）。次いで、選択された細胞を、ガンシクロビルの存在下、刺激剤の非存在下でインキュベートする。この段階は、刺激剤の非存在下で、トラップされた調節エレメントの転写が活性な望ましくない細胞を排除する。残った細胞を刺激剤の存在下でインキュベートする。レポーター遺伝子の転写に基づいて（例えば、ＳＥＡＰ産生の測定により）、刺激剤に応答する望ましい細胞が選択される。従って、誘導トラップベクターのレポーター遺伝子によって、調節エレメントに及ぼす刺激剤の影響を定量することができる。この定量によって、同じ細胞に及ぼす異なる刺激剤の影響を比較することができ、異なる細胞に及ぼす１種類の刺激剤の影響を比較することができる。望ましい態様において、レポーター遺伝子の転写に及ぼす関心対象の刺激剤の影響は、別の刺激剤の影響より少なくとも２倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍大きい。他の態様において、関心対象の刺激剤の影響は、関心対象の調節エレメントを欠く対応する対照細胞または関心対象の調節エレメントのポリヌクレオチド配列と６０％、４０％、３０％、２０％、もしくは１０％未満同一のポリヌクレオチド配列を有する調節エレメントを有する対応する対照細胞に及ぼす刺激剤の影響より少なくとも２倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍大きい。
【０１１７】
刺激剤により阻害される調節エレメントの選択
関心対象の刺激剤により阻害される調節エレメント（例えば、エンハンサーまたはプロモーター）を同定するために、誘導トラップベクターを含む細胞を選択するために、細胞をゼオシンの存在下でインキュベートする（図６）。次いで、選択された細胞を、刺激剤およびガンシクロビルの存在下でインキュベートする。このインキュベーションは、刺激剤の存在下で転写活性のあるトラップされた調節エレメントを含む望ましくない細胞を排除し、トラップされた調節エレメントが刺激剤により不活化される細胞が選択される。刺激剤の非存在下でレポーター遺伝子が転写されて、ＳＥＡＰが産生されることを確かめるために、選択された細胞をアッセイすることができる（図７）。
【０１１８】
トラップされた遺伝子の同定
組み込まれた構築物の上流にあるトラップされた調節エレメントの配列は、実施例５に記載のように標準的な５’ＲＡＣＥ分子生物学法を用いて決定することができる。さらに、組み込まれた構築物の上流および／または下流にあるトラップされた遺伝子のコード配列は、標準的なＤＮＡ増幅および配列決定法を用いて決定することができる。
【０１１９】
または、陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーター（例えば、細菌プロモーター）を含む誘導トラップベクター（例えば、図９Ａに示すベクター）が用いられる場合、トラップされた調節エレメントの同定を容易にするために細菌細胞を使用することができる。この方法において、選択された真核細胞からゲノムＤＮＡを単離し、組み込まれた構築物を１箇所切断し、組み込まれた構築物に隣接する内因性真核生物ゲノムＤＮＡを１つまたはそれ以上の箇所で切断する制限酵素で消化する。または、ＤＮＡを、組み込まれた構築物を切断しないが、内因性真核生物ゲノムＤＮＡを２箇所またはそれ以上で切断する制限酵素で消化する。または、一方の制限酵素が内因性ＤＮＡを切断し、他方の制限酵素が、内因性ＤＮＡの別の部位を切断するか、または組み込まれた構築物を一箇所切断するように、２種類の制限酵素を使用することができる。
【０１２０】
例えば、図９Ａに示したベクターの場合、組み込まれた構築物を予め決められた一箇所で切断し、真核生物ゲノムＤＮＡを１つまたはそれ以上の切断部位で切断するために、ＣｌａＩ制限酵素が用いられている。次いで、制限酵素で消化されたＤＮＡ断片を、制限酵素で消化された細菌プラスミドに連結する。望ましい連結された細菌プラスミドは、選択された真核細胞に組み込まれた構築物の陽性の選択マーカー（例えば、ゼオシン）を有するインサートを含み、組み込まれた構築物に隣接する真核生物ゲノムＤＮＡの領域を含む。これらの望ましいプラスミドを選択するために、プラスミドを使用してコンピテント細菌細胞を形質転換し、形質転換された細菌細胞を、選択薬剤（例えば、ゼオシン）を含むプレート上で増殖させる（選択薬剤に対する耐性がインサート内の陽性の選択マーカーにより付与されている）。内因性の陽性の選択マーカーも含む細菌プラスミド（例えば、アンピシリン薬物耐性遺伝子を含むＰＢＳＫベクター）が用いられる場合、形質転換された細菌を、両方の陽性の選択薬剤（例えば、アンピシリンおよびゼオシン）を含むプレート上でプレートすることができる。選択された細菌は、組み込まれた誘導トラップベクターに隣接する真核生物ゲノムＤＮＡからの領域を含む。この真核生物ゲノムＤＮＡ断片のサイズは、細菌プラスミドに加えられたインサートのサイズに基づいて（例えば、既知分子量の標準の移動と比較したアガロースゲルでの移動に基づいて）計算することができる。この真核生物ゲノムＤＮＡの配列は、プラスミドのある領域に結合するように設計されたプライマー（例えば、インサート上流の原核生物プロモーターに結合するプライマー）を用いて、またはインサートのある領域に結合するように設計されたプライマーを用いて、細菌プラスミド内のインサートをＰＣＲ増幅し、配列決定することによって容易に決定することができる。誘導トラップベクターによりトラップされた真核生物調節エレメントを同定するために、およびこれらの調節エレメントに作動可能に連結されている遺伝子を同定するために、ゲノムＤＮＡの配列を、公的に利用可能なヒトゲノム配列などの既知配列と比較することができる。
【０１２１】
同様に、陽性の選択マーカーに作動可能に連結された酵母プロモーターを含む誘導トラップベクターが用いられる場合、トラップされた調節エレメントの同定を容易にするために酵母細胞を使用することができる。この方法は、酵母細胞が、酵母プロモーターならびに陽性の選択マーカーおよび選択された真核細胞において組み込まれた誘導トラップベクターに隣接する真核生物ゲノムＤＮＡの領域を含むインサートを含むプラスミドで形質転換される以外は本質的に前記のように行われる。望ましいプラスミドを含む酵母細胞が陽性の選択薬剤を用いて選択され、次いで、前記のようにインサートがＰＣＲ増幅および配列決定される。
【０１２２】
実施例１０
調節エレメントを調節するタンパク質をコードする遺伝子の同定
実施例７に記載のように、誘導トラップベクターを用いて同定された調節エレメントの転写活性を調節するタンパク質をコードする遺伝子を同定することができる。１つの可能性のある方法において、トランス活性化因子コード配列（例えば、ｔｅｔ オン／オフ）が、実施例９からの単離された細胞のゲノムに組み込まれた誘導トラップベクター領域に加えられる。このトランス活性化因子コード配列を加えるために、任意の標準的な分子生物学法を使用することができる。
【０１２３】
カセット交換
例えば、ＬｏｘＰ部位に挟まれた実施例９の誘導トラップベクターの領域を取り替えるために、トランス活性化因子コード配列およびレポーター遺伝子がＬｏｘＰ部位に挟まれた交換カセットを含むベクターを使用することができる。ＬｏｘＰ部位は３４塩基対の二本鎖配列からなる。この配列は、８塩基対スペーサー領域によって互いに分けられた２つの１３塩基対逆方向反復配列を含む（ホエス（Ｈｏｅｓｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：３３９８−３４０２、１９８２；サウエル（Ｓａｕｅｒ）、米国特許第４，９５９，３１７号）。ＬｏｘＰ部位の一方の鎖は、配列
2004528815.tif 000003
（配列番号：３）を有し、他方の鎖は、配列
2004528815.tif 000004
（配列番号：４）を有する。または、他のｌｏｘ部位（例えば、Ｌｏｘ５１１部位）またはＣｒｅリコンビナーゼによる認識を妨げないヌクレオチド置換を含むＬｏｘＰ部位を使用することができる（サウエル、「方法：酵素学的手法の手引き（Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」 １４：３８１−３９２、１９９８）。
【０１２４】
このＣｒｅリコンビナーゼを介したカセット交換は、実施例９からの選択された細胞を、ＬｏｘＰに挟まれた交換カセットを含む図８Ｂに示したベクターおよびＣｒｅリコンビナーゼをコードするベクターでトランスフェクトすることによって行うことができる（例えば、フクシゲ（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ）およびサウエル、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７９０５−７９０９、１９９２；フェン（Ｆｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：７７９−７８５、１９９９；米国特許第４，９５９，３１７号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５１６６−５１７０、１９８８を参照のこと）。または、選択された細胞は、ＬｏｘＰに挟まれた交換カセットおよびＣｒｅリコンビナーゼコード配列の両方を含むベクターでトランスフェクトすることができる。Ｃｒｅを介した組換えが生じた細胞は、交換カセットのレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の発現およびゼオシン感受性に基づいて選択することができる。トランス活性化因子ポリペプチドの発現はまたウェスタンブロッティングによって確かめることもできる。ベクターの一方または両方がＬｏｘＰ部位を１つしか含まなくても、前記方法を使用することができる。
【０１２５】
または、カセット交換は、他の任意の部位特異的リコンビナーゼ系に由来するリコンビナーゼシグナル配列およびリコンビナーゼを用いて行うことができる。例えば、ｆｌｐリコンビナーゼ（シュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２０５：６４７−６５８、１９８９；パルソンズ（Ｐａｒｓｏｎｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４５２７−４５３３、１９９０；ゴリク（Ｇｏｌｉｃ）ら、Ｃｅｌｌ ５９：４９９−５０９、１９８９；アミン（Ａｍｉｎ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１４：５５−７２、１９９０）；大腸菌バクテリオファージλの部位特異的組換え系（ウェイスベルグ（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ）ら、λ ＩＩ（ヘンドリクス（Ｈｅｎｄｒｉｘ）ら編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２１１−２５０頁（１９８３）、ＴｐｎＩおよびβ−ラクタマーゼトランスポゾン（レベスクエ（Ｌｅｖｅｓｑｕｅ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：３７４５−３７５７、１９９０）；Ｔｎ３レゾルベース（フラナガン（Ｆｌａｎａｇａｎ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２０６：２９５−３０４、１９８９；スタルク（Ｓｔａｒｋ）ら、Ｃｅｌｌ ５８：７７９−７９０、１９８９）；酵母リコンビナーゼ（マツザキ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６１０−６１８、１９９０）；枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳｐｏＩＶＣリコンビナーゼ（サトウ（Ｓａｔｏ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１０９２−１０９８、１９９０）；Ｈｉｎリコンビナーゼ（グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１００７２−１００８２、１９８９）；免疫グロブリンリコンビナーゼ（マリン（Ｍａｌｙｎｎ）ら、Ｃｅｌｌ ５４：４５３−４６０、１９８８）；またはＣｉｎリコンビナーゼ（ハフテル（Ｈａｆｔｅｒ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．７：３９９１−３９９６、１９８８；フュブナー（Ｈｕｂｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２０５：４９３−５００、１９８９）を使用することができる。これらの代替系はまた、エコールズ（Ｅｃｈｏｌｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４６９７−１４７００、１９９０）、デビラルテイ（ｄｅ Ｖｉｌｌａｒｔａｙ）（Ｎａｔｕｒｅ ３３５：１７０−１７４、１９８８）、クレイグ（Ｃｒａｉｇ）（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：７７−１０５、１９８８）、ポヤルト−サルメロン（Ｐｏｙａｒｔ−Ｓａｌｍｅｒｏｎ）ら（ＥＭＢＯ Ｊ．８：２４２５−２４３３、１９８９）、フンガー−ベルトリング（Ｈｕｎｇｅｒ−Ｂｅｒｔｌｉｎｇ）ら（Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１０７−１１６、１９９０）、およびクレッグ（Ｃｒｅｇｇ）（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１９：３２０−３２３、１９８９）によって議論されている。
【０１２６】
交換カセットに取り替えられる誘導トラップベクターの領域はＩＲＥＳ部位を含んでいる。従って、この領域の下流または上流に交換カセットを加えるのではなく、この領域を交換カセットに取り替えると、このＩＲＥＳ部位が除去される。レポーター遺伝子に近接する複数のＩＲＥＳ部位はレポーター遺伝子の転写を減少させることがあるので、このＩＲＥＳ部位を除去すると、このＩＲＥＳ部位が維持されている場合の対応するレポーター遺伝子発現レベルよりレポーター遺伝子発現が大きくなる可能性がある。交換カセット内のレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ）は、誘導トラップベクターのレポーター遺伝子と同じでもよく、異なってもよい。または、誘導トラップベクターまたは交換カセットのどちらもレポーター遺伝子を含んでもよく、一方がレポーター遺伝子を欠いてもよい。例えば、交換カセットがレポーター遺伝子を含まない場合、細胞ゲノムへの交換カセットの組込みは、コードされるトランス活性化因子ｍＲＮＡのノザンブロッティングまたはトランス活性化因子タンパク質のウェスタンブロッティングによって確かめることができる。
【０１２７】
選択的に、交換カセットまたは誘導トラップベクターは、実施例９に記載のように、組み込まれた構築物の領域および隣接する真核生物ゲノムＤＮＡの領域を細菌プラスミドまたは酵母プラスミドに導入するために、レポーター遺伝子または陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーターまたは酵母プロモーターを含んでもよい。細菌プラスミドまたは酵母プラスミドは、プラスミドで形質転換された細菌または酵母の増殖によって容易に大量生産され、次いで、トラップされた調節エレメントを同定するためにＰＣＲ増幅および配列決定される。
【０１２８】
遺伝子トラップベクターの導入
細胞はまた、このカセット交換を受けることに加えて、最小プロモーターに作動可能に連結されたテトラサイクリン応答エレメント（例えば、ＴＲＥｐｍｉｎＣＭＶ）、陽性の選択マーカー（例えば、Ｎｅｏ）、ＩＲＥＳ配列、およびスプライスドナーを含む遺伝子トラップベクターでトランスフェクトされる。例示的な構築物を図４に示す。遺伝子トラップベクターは、選択的に、陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーターまたは酵母プロモーターを含んでもよい。この構築物を含むトランスフェクトされた細胞は、陽性の選択薬物を用いて選択することができる（陽性の選択薬物に対する耐性が構築物により付与されている）。この陽性の選択マーカーは、トランス活性化因子をコードする誘導トラップベクターの陽性の選択マーカーと同じでもよく、異なってもよい。
【０１２９】
または、陽性の選択マーカーのない遺伝子トラップベクターを使用することができる。例えば、刺激剤により活性化される調節エレメントを含む細胞を、刺激剤の非存在下でインキュベートすることができる。これらの条件下では、陽性の選択マーカーの発現を制御する関心対象の内因性調節エレメントを活性化する刺激剤が存在しないので、誘導トラップベクターの陽性の選択マーカーの発現は全くといってよいくらいない。次いで、遺伝子トラップベクターを細胞に挿入する。細胞の一部または全てにおいて、このベクターのＴＲＥｐｍｉｎＣＭＶプロモーターは、関心対象の調節エレメントを活性化するタンパク質をコードする内因性遺伝子に作動可能に連結されるように細胞ゲノムに組み込まれる。刺激剤非存在下でのＴＲＥｐｍｉｎＣＭＶプロモーターの残存プロモーター活性はトラップされた遺伝子の転写を活性化し、次いで、コードされるタンパク質は陽性の選択マーカーの発現を活性化する。従って、遺伝子トラップベクターを含む細胞は、誘導トラップベクターの陽性の選択マーカーの発現増加に基づいて選択することができる。
【０１３０】
同様に、刺激剤により不活化される調節エレメントを含む細胞を、刺激剤の存在下でインキュベートすることができる。これらの条件下では、陽性の選択マーカーの発現を制御する内因性調節エレメントを刺激剤が阻害するので、誘導トラップベクターの陽性の選択マーカーの発現は全くといってよいくらいない。遺伝子トラップベクターのＴＲＥｐｍｉｎＣＭＶプロモーターが、関心対象の調節エレメントを活性化するタンパク質をコードする内因性遺伝子の上流にある細胞ゲノムに組み込まれれば、コードされるタンパク質は陽性の選択マーカーの発現を活性化し、遺伝子トラップベクターを含む細胞が、陽性の選択マーカーの発現増加に基づいて選択することができる。
【０１３１】
関心対象の調節エレメントを活性化するタンパク質をコードする遺伝子の選択
実施例９において発見された調節エレメントを活性化する遺伝子を同定するために、交換カセットおよび遺伝子トラップベクターを含む細胞を、ｔｅｔ オン／オフ核酸によりコードされるタンパク質と複合体を形成するテトラサイクリンの存在下で培養する。この複合体は、テトラサイクリン応答エレメントを含む最小プロモーター下流の遺伝子の発現を活性化する。従って、遺伝子トラップベクターが、関心対象の調節エレメントを活性化するタンパク質をコードする遺伝子の上流に組み込まれれば、コードされるタンパク質は、関心対象の調節エレメントの下流にあるレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の転写レベルを増加させる。テトラサイクリンの存在下でのこれらの細胞の培養は、テトラサイクリン非存在下での対応するレベルより大きなレポーター遺伝子発現につながる。これらの望ましい細胞は、レポーター遺伝子の発現または活性レベルの増加に基づいて選択される。
【０１３２】
関心対象の調節エレメントを阻害するタンパク質をコードする遺伝子の選択
実施例９において発見された調節エレメントを不活化するタンパク質をコードする遺伝子を同定するために、細胞をテトラサイクリンの存在下で培養する。遺伝子トラップベクターが、関心対象の調節エレメントを阻害するタンパク質をコードする遺伝子の上流に組み込まれた細胞は、テトラサイクリン存在下では、テトラサイクリン非存在下より低いレポーター遺伝子発現レベルを有する。従って、これらの望ましい細胞は、レポーター遺伝子の発現または活性の阻害に基づいて選択することができる。
【０１３３】
トラップされた遺伝子の同定
組み込まれた構築物の下流にあるトラップされた遺伝子の配列は、標準的なＤＮＡ増幅および配列決定法を用いて決定することができる。または、遺伝子トラップベクターが、陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーターまたは酵母プロモーターを含む場合、細菌細胞または酵母細胞は、実施例９に記載のように、トラップされた遺伝子の同定を容易にするのに使用することができる。
【０１３４】
実施例１１
炎症性リガンドに応答する細胞株の選択
関節の再発性および進行性の疼痛および炎症に関連する自己免疫疾患である慢性関節リウマチ（ＲＡ）に関与する炎症性経路のリガンドに応答する細胞株を作成した。慢性関節リウマチ患者の疼痛および炎症の徴候を軽減するために、ＮＳＡＩＤ剤が一般的に用いられている。慢性関節リウマチに関与する細胞として線維芽細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞が挙げられる。慢性関節リウマチにおけるサイトカインおよびケモカインシグナル伝達経路のメンバーとして、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＳＤＦ−１が挙げられる。
【０１３５】
図１１に示すように、ＴＮＦαまたはＩＬ−１βにより活性化されるＥＬ−４またはＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を単離するために、本明細書に記載の方法を使用した。これらの細胞のゲノムに組み込まれたレポーター遺伝子（ＳＥＡＰ）が、ＴＮＦαまたはＩＬ−１βに応答する調節エレメントの制御下で組み込まれたことを確かめるために、選択された細胞をＴＮＦαまたはＩＬ−１βに暴露し、ＳＥＡＰ活性を測定した（図１２Ａ）。予想どおり、ＩＬ−１βに対する応答性について選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＩＬ−１βによって、およびＴＮＦαに対する応答性について選択されたＥＬ４細胞においてＴＮＦαによって、ＳＥＡＰ活性が誘導された。ＳＥＡＰ活性はまた、ＴＮＦαに対する応答性について選択された細胞の一部においてＳＤＦ−１によって誘導された。図１２Ｂに示すように、選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞株の一部における構築物の組込みを確かめるために、組み込まれた構築物のＴＫ／Ｚｅｏ選択マーカーに対するプローブを標準的なサザンブロット分析において使用した。
【０１３６】
ＩＬ−１βに対する応答性について選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、他の炎症性分子にも応答するかどうか確かめるために試験した。図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、７つのクローンがＳＥＡＰ活性に基づいてＩＬ−１βに対して最高レベルの応答性を有した。これらのクローンのＴＮＦαまたはＩＬ−６に対する応答性のレベルは様々であった。３種類全てのリガンドに応答したクローンは、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、およびＩＬ−６により活性化される経路の一部が重複していることを証明している。ＩＬ−１βに応答するが、ＴＮＦαおよびＩＬ−６にごくわずかしか応答しないクローン（例えば、Ｄ５）は、ＴＮＦαおよびＩＬ−６とは無関係のＩＬ−１β特異的経路があることを証明している。
【０１３７】
同様に、ＴＮＦαに対する応答性について選択されたＥＬ−４細胞を、他のリガンドに応答するかどうか確かめるために試験した。２つのクローンが、ＩＬ−１、ＰＭＡ、およびＩＬ−１０にも応答した；応答性が減少する順番（図１４Ａ）。ＩＬ−１０に対する応答性について選択されたＥＬ−４クローンもまたＴＮＦαおよびＩＬ−１に応答した（図１４Ｂ）。これらの結果は、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＰＭＡ、およびＩＬ−１０を含む重複経路があることを示している。ＴＮＦαおよびＳＤＦ−１の両方に応答するＥＬ−４細胞が、陽性の選択薬物の存在下でＴＮＦα細胞株をＳＤＦ−１で処理することによって選択された（図１４Ｃ）。
【０１３８】
実施例１２
Ｃｏｘ−２活性と炎症性シグナル伝達経路の関連の証明
図１５に示すように、特異的Ｃｏｘ−２阻害剤セレコキシブは、選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞のＳＥＡＰレポーター遺伝子活性に対するＩＬ−１βの作用を濃度依存的に阻害することが示された。セレコキシブによるＳＥＡＰ活性阻害のＩＣ５０値は、約０．２μＭであった。対照的に、セレコキシブは、選択されたＥＬ−４細胞のＳＥＡＰレポーター遺伝子活性に対するＴＮＦα作用の阻害に効果がなかった。クローンの中には、ＴＮＦαがＳＥＡＰレポーター遺伝子を増加させたものもあった（図１６）。セレコキシブの影響を受けなかったクローンとして、ＰＤ−５、ＰＡ−６、ＰＡ−５、およびＰＢ−５が挙げられる。セレコキシブの影響を受けたクローンとして、ＰＤ−６およびＣ−５が挙げられる。従って、標的となった細胞タイプの中には、Ｃｏｘ−２阻害剤の影響を受けるクローンもあれば、影響を受けないクローンもある。
【０１３９】
図１７Ａおよび１７Ｂに示すように、異なる選択されたＥＬ−４クローンが、様々なリガンドおよびリガンドの組み合わせに対して異なる応答レベルを有した。これらの結果は、候補薬物生成物が複数の経路において影響を及ぼす可能性があることを示している。場合によっては、１つまたはそれ以上の経路における候補薬物の作用は、薬物が哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された時に副作用につながる。従って、毒作用または疾患状態の促進などの副作用に関連する経路を活性化すると特定された候補薬物は、望ましくは、さらなる薬物開発から除外される。同様に、有益な効果（例えば、副作用の軽減、疾患状態の予防、または疾患状態の進行の阻害）に関連する経路を阻害すると特定された候補化合物は、望ましくは、さらなる薬物開発から除外される。
【０１４０】
実施例１３
薬効を測定するための選択された細胞の使用
ＩＬ−１βに対する応答性について選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６およびシクロスポリンＡの効力を測定するために試験した。図１８Ａに示すように、Ｕ０１２６は、選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞のＳＥＡＰレポーター遺伝子活性に対するＩＬ−１βの作用を濃度依存的に阻害した。ＭＡＰキナーゼ阻害剤Ｕ０１２６およびＰＤ９８０５９によるＳＥＡＰ活性阻害のＩＣ５０値は、約１．０μＭであった。ＳＥＡＰ活性に及ぼすシクロスポリンＡの影響はかなり小さかった（図１８Ｂ）。従って、これらの選択された細胞は、細胞に基づくアッセイ法において候補薬物生成物の活性を測定するのに有用である。
【０１４１】
実施例１４
変異誘発剤バイオアッセイ法の開発
ＤＮＡの遺伝的完全性は数多くのＤＮＡ損傷剤によって絶えず脅かされている。これらのＤＮＡ損傷剤は起源が内因性のものでも外因性のものでもよい。ＤＮＡ損傷による潜在的に変異誘発性または細胞傷害性の結果に対抗するために、細胞修復系が存在する。塩基損傷は直接修復されるか、脱アルキルによって修復されるか、または複数のタンパク質を伴う複雑なかつ協調した経路によって修復される。最後の系として、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、およびヌクレオチド除去修復が挙げられる。さらに、細胞調節経路が損傷ＤＮＡによって活性化され、変異誘発剤の存在についてのレポーター系として働くことができる。
【０１４２】
アルキル化剤などのＤＮＡ損傷剤に細胞が暴露すると活性化される調節経路の活性を報告する細胞株の開発は、このような薬剤に対する初期スクリーニングの開発を可能にし、ＤＮＡ損傷を引き起こす化合物を同定するのに使用することができる。
【０１４３】
このようなアッセイ法を開発するために、ＤＮＡアルキル化剤であるメタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）の存在に応答するＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞株ライブラリーを作成した。これらの細胞を、実施例２に記載のウイルス構築物により作成されたウイルスおよび陽性の選択薬物フレオマイシンの存在下でＭＭＳ（０．２ｎＭ）に暴露した。この選択に生き残った細胞を２日間休ませた後、ＭＭＳの非存在下で陰性の選択マーカーであるガンシクロビルで処理した。ＭＭＳ処理により誘導性ＳＥＡＰレポーター応答を示した細胞クローンを単離した。他のＤＮＡ変異原に対するＳＥＡＰレポーター応答を試験し、このような薬剤に対して変わらぬ応答を示したクローンを選択した。
【０１４４】
陽性の選択薬物および陰性の選択薬物による処理の順序を反対にすることで、ＤＮＡ変異原の存在により下方制御される遺伝子も同定することができる。
【０１４５】
トラップされた遺伝子の同定
組み込まれた構築物の上流にあるトラップされた調節エレメントの配列は、実施例５に記載のように、標準的な５’ＲＡＣＥ分子生物学法を用いて決定することができる。さらに、組み込まれた構築物の上流および／または下流にあるトラップされた遺伝子（ｍＲＮＡ）のコード配列は、標準的なｃＤＮＡ増幅および配列決定法を用いて決定することができる。ＤＮＡ変異原により調節されるｍＲＮＡの同定は、これらの遺伝子の調節配列（プロモーター）の単離を可能にする。レポーター遺伝子を発現するように、これらの調節された遺伝子のプロモーターを用いた構築物を作成することができる。これらの構築物を細胞にトランスフェクトし、この細胞を、ＤＮＡ損傷剤のレポーター細胞として使用することができる。同様に、ＤＮＡ変異原により調節される遺伝子を同定するために、ディファレンシャルディスプレイ、ＰＣＲセレクト（クロンテック）、およびＤＮＡチップなどの他の技法を利用することができる。これらの遺伝子のプロモーター活性に加えて、これらの遺伝子またはその産物の発現のモニタリングは、細胞におけるＤＮＡ損傷剤の存在のマーカーとして直接的または間接的に使用することができる。
【０１４６】
または、陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーター（例えば、細菌プロモーター）を含む誘導トラップベクター（例えば、図９Ａに示すベクター）が用いられる場合、トラップされた調節エレメントの同定を容易にするために細菌細胞を使用することができる。この方法において、選択された真核細胞からゲノムＤＮＡを単離し、組み込まれた構築物を１箇所切断し、組み込まれた構築物に隣接する内因性真核生物ゲノムＤＮＡを１つまたはそれ以上の箇所で切断する制限酵素で消化する。または、ＤＮＡを、組み込まれた構築物を切断しないが、内因性真核生物ゲノムＤＮＡを２箇所またはそれ以上で切断する制限酵素で消化する。または、一方の制限酵素が内因性ＤＮＡを切断し、他方の制限酵素が、内因性ＤＮＡの別の部位を切断するか、または組み込まれた構築物を一箇所切断するように、２種類の制限酵素を使用することができる。これらの構築物は、調節される遺伝子の調節配列（プロモーター）を含み、これらのＤＮＡは配列決定および同定することができる。これらの配列を含むレポーター構築物を設計することができ、真核細胞にトランスフェクトすることができ、この細胞を、ＤＮＡ変異原の存在のアッセイ法として使用することができる。
【０１４７】
他の態様
本願において引用された前述の特許、特許出願、および参考文献はどれも、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。本発明の好ましい態様を説明したが、本発明によれば、本明細書に示した開示を考慮して、他の変更、変化、および修正が当業者に示唆されると考えられる。従って、全てのこのような変化、変更、および修正は本発明の範囲内にあり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義されると考えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】誘導遺伝子トラップベクターの調製において使用するための本発明の核酸構築物の模式図である。模式図において以下の成分が図示されている：内部リボソーム挿入部位（ＩＲＥＳ）、テトラサイクリン調節タンパク質をコードするプロモーターレスタンパク質コード配列（「Ｔｅｔオン／オフ」）、内部リボソーム挿入部位、および分泌型アルカリホスファターゼ（「ＳＥＡＰ」）。
【図２】図１の核酸構築物を含むベクターの模式図である。これは、構築物上流に以下のさらなる成分：機能的スプライスアクセプター（ＳＡ）、翻訳停止配列（「停止」）、ＩＲＥＳ部位、およびＴＫ−ＺＥＯをコードするプロモーターレスタンパク質コード配列；ならびに図１の核酸配列下流にポリアデニル化シグナル（「ｐＡ」）も含む。
【図３】図１の核酸構築物、構築物上流に機能的スプライスアクセプター（ＳＡ）および翻訳停止配列（停止）、ならびに構築物下流にＩＲＥＳ部位、ＴＫコード配列、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（「ＰＫＧ」）、ＰＫＧプロモーターの転写制御下にあるＺＥＯコード配列、およびポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を含む、本発明において使用するための別の代替ベクターの模式図である。
【図４】図２および３の誘導トラップベクターと共にベクターにおいて使用するための本発明の核酸構築物の模式図である。模式図において以下の成分が図示されている：テトラサイクリン応答エレメントを含む最小プロモーター配列（「ＴＲＥＰｃｍｖ」）、ＮＥＯをコードするプロモーターレスタンパク質コード配列、ＩＲＥＳ配列、およびスプライスドナー（「ＳＤ」）。
【図５】ゲノム遺伝子座を直接または間接的に調節する遺伝子を選択するためにゲノム遺伝子座に組み込むことができる、図１の構築物を含むベクターおよび図４の核酸構築物を含むベクターの使用を図示する模式図である。図４の核酸構築物を含むベクターにより転写される推定遺伝子も示す。
【図６】細胞と、図２のトランスフェクションベクター、生理学的刺激、ならびに陽性および陰性の選択薬物との接触による、選択された細胞株からのリガンド依存性細胞の調製を図示する模式図である。生理学的刺激により活性化されるか、またはオンにされる特定の細胞の選択、および生理学的刺激により不活化されるか、またはオフにされる細胞の選択が、それぞれ、図の左分かれおよび右分かれに図示される。
【図７】細胞と、図３のトランスフェクションベクター、生理学的刺激、ならびに陽性および陰性の選択薬物との接触による、選択された細胞株からのリガンド依存性細胞の調製のための別の方法を図示する模式図である。生理学的刺激により活性化されるか、またはオンにされる特定の細胞の選択、および生理学的刺激により不活化されるか、またはオフにされる細胞の選択が、それぞれ、図の左分かれおよび右分かれに図示される。ＳＥＡＰの産生は、刺激に対するベクターの応答の指標として測定される。
【図８】図８Ａは、誘導トラップベクターの模式図である。このベクターは、機能的スプライスアクセプター（ＳＡ）、翻訳停止配列（停止）、ＩＲＥＳ部位、ＴＫコード配列、ＺＥＯコード配列、停止配列、ＬｏｘＰ部位、ＩＲＥＳ部位、ＳＥＡＰコード配列、停止配列、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）、およびＬｏｘＰ部位を含む。本発明の方法において使用することができる他のベクターとして、ＬｏｘＰ部位を１つしか含まない、またはＬｏｘＰ部位が無い対応する誘導トラップベクターが挙げられる。図８Ｂは、実施例１０に記載のような、ＬｏｘＰ部位に挟まれた図８Ａの誘導トラップベクターの領域を取り替えるのに用いられる交換カセットの模式図である。このカセットは、ＬｏｘＰ部位、ＩＲＥＳ部位、テトラサイクリン調節タンパク質をコードするプロモーターレス配列（「ｔｅｔ オン／オフ」）、翻訳停止配列（停止）、ＩＲＥＳ部位、β−ガラクトシダーゼコード配列（ｂ−ｇａｌ）、停止配列、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）、およびＬｏｘＰ部位を含む。本発明の方法において使用することができる他の交換カセットとして、ＬｏｘＰ部位を１つしか含まない対応するカセットが挙げられる。ＬｏｘＰ部位はカセットの任意の部分に位置してよい。
【図９】図９Ａは、本発明のベクターの模式図である。このベクターは、陽性の選択マーカー（例えば、ゼオシン）に作動可能に連結された原核生物プロモーターを含む。この例示的なベクターは、機能的スプライスアクセプター（ＥＮ−２ ＳＡ）、翻訳停止配列（停止）、ＩＲＥＳ部位、原核生物プロモーター、陰性の選択マーカー（例えば、ＴＫコード配列）、陽性の選択マーカー（例えば、ＺＥＯコード配列）、別の停止配列、ＬｏｘＰ部位、ＩＲＥＳ部位、レポーター遺伝子（例えば、ＳＥＡＰコード配列）、停止配列、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）、およびＬｏｘＰ部位を含む。ＣｌａＩ部位は、ベクターにおける独特の制限部位の可能な位置である。当業者は、このベクターの成分が異なる位置または異なる５’から３’の配置で存在してもよいことを容易に理解するだろう。例えば、原核生物プロモーターは、もう一つの選択肢として、第１のＩＲＥＳの上流に位置してもよく、ＴＫコード配列とＺＥＯコード配列との間に位置してもよい。前記で述べたように、ＺＥＯコード配列はまた、ＴＫコード配列の下流ではなく上流に位置してもよい。本発明のある方法において、ベクターは、第１のＬｏｘＰ部位、第２のＩＲＥＳ部位、ＳＥＡＰコード配列、第３の停止配列、および／または第２のＬｏｘＰ部位を欠いてもよい。本発明の他のベクターは、前記の任意のベクターにおいて原核生物プロモーターではなく酵母プロモーターを含む。図９Ｂは、例示的な原核生物プロモーターであるＴ７プロモーターのポリヌクレオチド配列（配列番号：５）である。「ＲＢＳ」はリボソーム結合部位を示す。本発明の核酸、ベクター、細胞、および方法において、他の任意の原核生物プロモーターまたは任意の酵母プロモーターを使用することもできる。
【図１０】リガンド特異的経路、重複経路、およびインビボでの毒性作用に関連する経路を特定するための本発明の細胞の使用の模式図である。この情報は、候補薬物生成物の特徴付けおよびこれらの生成物により引き起こされる副作用の予想に有用である。
【図１１】ＴＮＦαまたはＩＬ−１βにより活性化されるＥＬ４またはＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を単離するための本明細書に記載の方法の使用の模式図である。
【図１２】図１２Ａは、細胞ゲノムに組み込まれるレポーター遺伝子（ＳＥＡＰ）が、ＴＮＦαまたはＩＬ−１βに応答する調節エレメントの制御下に組み込まれたことを確認する表である。図１２Ｂは、選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞株の一部において構築物の組込みを確認するために、組み込まれた構築物内のＴＫ／Ｚｅｏ選択マーカーに対するプローブを用いて作成されたサザンブロット写真である。
【図１３】図１３Ａは、１種類または複数のリガンドに応答する細胞を同定する模式図である。図１３Ｂは、選択された細胞クローンのＩＬ−１β、ＴＮＦα、およびＩＬ−６に対する応答性レベルを図示する棒グラフである。
【図１４Ａ及び図１４Ｂ】選択されたクローンのＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＰＭＡ、およびＩＬ−１０に対する応答性レベルを図示する一組の棒グラフである。
【図１４Ｃ】選択されたクローンのＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−１０に対する応答性レベルを図示する棒グラフである。
【図１５】特異的Ｃｏｘ−２阻害剤セレコキシブが、選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＳＥＡＰレポーター遺伝子活性に対するＩＬ−１βの作用を濃度依存的に阻害する能力を図示するグラフである。
【図１６】セレコキシブが、選択されたＥＬ−４細胞においてＴＮＦαにより誘導されたＳＥＡＰレポーター遺伝子活性を有意に阻害できないことを図示するグラフである。
【図１７】クローンＣ−５およびクローンＰＤ６における様々なリガンドおよびリガンドの組み合わせに対する応答性レベルを図示する一組の棒グラフである。
【図１８】図１８Ａは、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６が、選択されたＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＳＥＡＰレポーター遺伝子活性に対するＩＬ−１βの作用を濃度依存的に阻害する能力を図示するグラフである。図１８Ｂに示すように、シクロスポリンＡは、このアッセイ法においてＳＥＡＰ活性に及ぼす影響がかなり小さい。
【図１】
2004528815.tif 000005
【図２】
2004528815.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
2004528815.tif 000009
【図６】
2004528815.tif 000010
【図７】
2004528815.tif 000011
【図８】
2004528815.tif 000012
【図９】
2004528815.tif 000013
【図１０】
2004528815.tif 000014
【図１１】
2004528815.tif 000015
【図１２】
2004528815.tif 000016
【図１３】
2004528815.tif 000017
【図１４Ａ】
2004528815.tif 000018
【図１４Ｂ】
2004528815.tif 000019
【図１４Ｃ】
2004528815.tif 000020
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年5月7日(2002.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004528815.tif 000127
【図１０】
2004528815.tif 000128
【図１１】
2004528815.tif 000129
【図１２】
2004528815.tif 000130
【図１３】
2004528815.tif 000131
【図１４Ａ】
2004528815.tif 000132
【図１４Ｂ】
2004528815.tif 000133
【図１４Ｃ】
2004528815.tif 000134
【図１５】
2004528815.tif 000135
【図１６】
2004528815.tif 000136
【図１７】
2004528815.tif 000137
【図１８】
2004528815.tif 000138
【手続補正書】
【提出日】平成14年7月25日(2002.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入し、これにより、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；および
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現が刺激剤により特異的に活性化されている細胞を選択する段階。
【請求項２】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１記載の方法：
（ｉ）刺激剤および陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｉ）陰性の選択薬剤が存在し、該刺激剤が存在しない条件下で該細胞をインキュベートする段階。
【請求項３】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１記載の方法：
（ｉ）陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；
（ｉｉ）陰性の選択薬剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階；
（ｉｉｉ）刺激剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｖ）該刺激剤の存在下でレポーター遺伝子を発現する該細胞を選択する段階。
【請求項４】
ベクターが、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含まない、請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞が、マスト細胞、幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、癌細胞、リンパ球、および肝細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
刺激剤が、サイトカイン、リガンド、ポリペプチド、増殖因子、抗体、および化学薬品からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
刺激剤が、幹細胞因子、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩｇＥ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、およびレプチンからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
レポーター遺伝子が酵素をコードする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
酵素が、分泌型アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ベクターが、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントをさらに含み、核酸が細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
トランス活性化因子ポリペプチドがテトラサイクリン調節タンパク質（ｔＴＡ）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入し、これにより、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントが少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；および
（ｂ）該トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤により特異的に活性化されている細胞を選択する段階。
【請求項１３】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１２記載の方法：
（ｉ）刺激剤および陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｉ）陰性の選択薬剤が存在し、該刺激剤が存在しない条件下で細胞をインキュベートする段階。
【請求項１４】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１２記載の方法：
（ｉ）陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；
（ｉｉ）陰性の選択薬剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階；
（ｉｉｉ）刺激剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｖ）該刺激剤の存在下でレポーター遺伝子を発現する該細胞を選択する段階。
【請求項１５】
ベクターが、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含まない、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを該細胞に挿入し、これにより、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；および
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現が該刺激剤により特異的に不活化されている細胞を選択する段階。
【請求項１７】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項１６記載の方法：
（ｉ）陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｉ）刺激剤および陰性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階。
【請求項１８】
ベクターが、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含まない、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
細胞が、マスト細胞、幹細胞、上皮細胞、線維芽細胞、癌細胞、リンパ球、および肝細胞からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
刺激剤が、サイトカイン、リガンド、ポリペプチド、増殖因子、抗体、および化学薬品からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
刺激剤が、幹細胞因子、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＩｇＥ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、およびレプチンからなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
レポーター遺伝子が酵素をコードする、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
酵素が、分泌型アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ベクターが、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントをさらに含み、核酸が細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
トランス活性化因子ポリペプチドがｔＴＡである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
関心対象の刺激剤に対して特異的な応答を有する１つまたはそれ以上の細胞を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入し、これにより、該トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントが少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；および
（ｂ）該トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤により特異的に不活化されている細胞を選択する段階。
【請求項２７】
段階（ｂ）が以下の段階を含む、請求項２６記載の方法：
（ｉ）陽性の選択薬剤の存在下で細胞をインキュベートする段階；および
（ｉｉ）刺激剤および陰性の選択薬剤の存在下で該細胞をインキュベートする段階。
【請求項２８】
ベクターが、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含まない、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
以下の段階：
（ｃ）調節エレメントを同定する段階
をさらに含む、請求項１、請求項１２、請求項１６、または請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
陽性の選択マーカーがカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｃ）が以下の段階を含む、請求項２９記載の方法：
（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、該陽性の選択マーカーを含み、該カセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該カセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項３１】
陽性の選択マーカーがカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｃ）が以下の段階を含む、請求項２９記載の方法：
（ｉ）酵母プロモーターの制御下で陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、該陽性の選択マーカーを含み、該カセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該カセットに隣接する該セグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項３２】
細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）第１の陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、レポーター遺伝子、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを細胞に挿入する段階であり、ここで、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｂ）該トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第２のカセットを該細胞のゲノムに組み込む条件下で、第２のカセットを含む第２のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、プロモーターが、少なくとも１つの細胞のタンパク質をコードする関心対象の核酸に作動可能に連結され、コードされているタンパク質が調節エレメントの活性を調節する段階；
（ｃ）トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞を選択する段階；および
（ｄ）少なくとも１つの選択された細胞において関心対象の核酸を同定する段階。
【請求項３３】
第２のベクターが第２の陽性の選択マーカーをさらに含み、該第２の陽性の選択マーカーが細胞ゲノムに組み込まれる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
第２の陽性の選択マーカーが、第２のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｄ）が以下の段階を含む、請求項３３記載の方法：
（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第２のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第２のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項３５】
第２の陽性の選択マーカーが、第２のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｄ）が以下の段階を含む、請求項３３記載の方法：
（ｉ）酵母プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第２のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第２のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項３６】
トランス活性化因子ポリペプチドがｔＴＡであり、応答エレメントがテトラサイクリン応答エレメントを含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびリコンビナーゼシグナル配列を含む第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを細胞に挿入する段階；
（ｂ）リコンビナーゼシグナル配列、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメント、およびレポーター遺伝子を含む第２のカセットが少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込まれるように、第２のカセットを含む第２のベクターにおけるリコンビナーゼシグナル配列と該細胞のゲノムに組み込まれた該リコンビナーゼシグナル配列との間で組換えをもたらす条件下で、第２のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｃ）トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第３のカセットを該細胞のゲノムに組み込む条件下で、第３のカセットを含む第３のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、プロモーターが、少なくとも１つの細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸に作動可能に連結される段階；
（ｄ）トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞を選択する段階；および
（ｅ）少なくとも１つの選択された細胞において関心対象の核酸を同定する段階。
【請求項３８】
第３のベクターが第２の陽性の選択マーカーをさらに含み、第２の陽性の選択マーカーが細胞ゲノムに組み込まれる、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
第２の陽性の選択マーカーが、第３のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｅ）が以下の段階を含む、請求項３８記載の方法：
（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第３のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第３のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項４０】
第２の陽性の選択マーカーが、第３のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｅ）が以下の段階を含む、請求項３９記載の方法：
（ｉ）酵母プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第３のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第３のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項４１】
トランス活性化因子ポリペプチドがｔＴＡであり、応答エレメントがテトラサイクリン応答エレメントを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
リコンビナーゼシグナル配列がＬｏｘＰ部位である、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
第１のベクターおよび／または第２のベクターが２つのＬｏｘＰ部位を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、レポーター遺伝子、およびリコンビナーゼシグナル配列を含む第１のカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、第１のカセットを含む第１のベクターを細胞に挿入する段階；
（ｂ）リコンビナーゼシグナル配列およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む第２のカセットが少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込まれるように、第２のカセットを含む第２のベクターにおけるリコンビナーゼシグナル配列と該細胞のゲノムに組み込まれた該リコンビナーゼシグナル配列との間で組換えをもたらす条件下で、第２のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｃ）トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第３のカセットを該細胞のゲノムに組み込む条件下で、第３のカセットを含む第３のベクターを該細胞に挿入する段階であり、ここで、プロモーターが、少なくとも１つの細胞の調節エレメントの活性を調節するタンパク質をコードする関心対象の核酸に作動可能に連結される段階；
（ｄ）トランス活性化因子ポリペプチドを活性化する条件下でレポーター遺伝子発現レベルが変化した細胞を選択する段階；および
（ｅ）少なくとも１つの選択された細胞において関心対象の核酸を同定する段階。
【請求項４５】
第３のベクターが第２の陽性の選択マーカーをさらに含み、第２の陽性の選択マーカーが細胞ゲノムに組み込まれる、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
第２の陽性の選択マーカーが、第３のカセットにおいて原核生物プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｅ）が以下の段階を含む、請求項４５記載の方法：
（ｉ）原核生物プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する細菌細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第３のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を細菌細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第３のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項４７】
第２の陽性の選択マーカーが、第３のカセットにおいて酵母プロモーターに作動可能に連結され、段階（ｅ）が以下の段階を含む、請求項４５記載の方法：
（ｉ）酵母プロモーターの制御下で該第２の陽性の選択マーカーを発現する酵母細胞の選択が可能な条件下で、該第２の陽性の選択マーカーを含み、該第３のカセットに隣接するゲノムセグメントを含む核酸を酵母細胞に挿入する段階；
（ｉｉ）該第３のカセットに隣接するセグメントを増幅する段階；および
（ｉｉｉ）増幅されたセグメントを配列決定する段階。
【請求項４８】
トランス活性化因子ポリペプチドがｔＴＡであり、応答エレメントがテトラサイクリン応答エレメントを含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
リコンビナーゼシグナル配列がＬｏｘＰ部位である、請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
第１のベクターおよび／または第２のベクターが２つのＬｏｘＰ部位を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
刺激剤に関連する疾患を治療、予防、または安定化する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入する段階であり、これにより、レポーター遺伝子が少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現が刺激剤により特異的に調節される細胞を選択する段階；
（ｃ）レポーター遺伝子の発現に及ぼす該刺激剤の影響を増加または減少させる化合物を選択する段階；および
（ｄ）該刺激剤に関連する疾患を有する哺乳動物に化合物を投与する段階。
【請求項５２】
刺激剤に関連する疾患を治療、予防、または安定化する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含むカセットを真核細胞ゲノムに組み込む条件下で、カセットを含むベクターを細胞に挿入する段階であり、これにより、トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントが少なくとも１つの細胞の調節エレメントに作動可能に連結される段階；
（ｂ）該トランス活性化因子ポリペプチドの発現が刺激剤により特異的に調節される細胞を選択する段階；
（ｃ）該トランス活性化因子ポリペプチドの発現に及ぼす該刺激剤の影響を増加または減少させる化合物を選択する段階；および
（ｄ）該刺激剤に関連する疾患を有する哺乳動物に化合物を投与する段階。
【請求項５３】
陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびレポーター遺伝子を含む、核酸。
【請求項５４】
５’から３’の配列において以下を含む、請求項５３記載の核酸：
（ａ）スプライスアクセプター；
（ｂ）任意の順番で陰性の選択マーカーおよび陽性の選択マーカーを含むカセット；
（ｃ）翻訳停止配列、
（ｄ）内部リボソーム挿入部位、ならびに
（ｅ）レポーター遺伝子。
【請求項５５】
５’から３’の配列において以下を含む、請求項５３記載の核酸：
（ａ）スプライスアクセプター；
（ｂ）任意の順番で陰性の選択マーカーおよびレポーター遺伝子を含むカセット；
（ｃ）翻訳停止配列、
（ｄ）プロモーター、
（ｅ）陽性の選択マーカー；
（ｆ）翻訳停止配列；ならびに
（ｇ）ポリアデニル化シグナル。
【請求項５６】
レポーター遺伝子が核酸においてプロモーターに作動可能に連結されていない、請求項５３記載の核酸。
【請求項５７】
トランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントをさらに含む、請求項５３記載の核酸。
【請求項５８】
１つまたはそれ以上のリコンビナーゼシグナル配列をさらに含む、請求項５３記載の核酸。
【請求項５９】
陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーターをさらに含む、請求項５３記載の核酸。
【請求項６０】
陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む、核酸。
【請求項６１】
陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、リコンビナーゼシグナル配列、およびスプライスアクセプター部位を含む、核酸。
【請求項６２】
スプライスアクセプター部位および陽性の選択マーカーに作動可能に連結された原核生物プロモーターを含む、核酸。
【請求項６３】
請求項５３、請求項６０、請求項６１、または請求項６２記載の核酸を含むベクター。
【請求項６４】
レトロウイルスベクターである、請求項６３記載のベクター。
【請求項６５】
組込み配列をさらに含む、請求項６３記載のベクター。
【請求項６６】
請求項６３記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６７】
１つまたはそれ以上の種類の刺激剤に応答する、請求項６６記載の細胞。
【請求項６８】
（ｉ）陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、およびトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む第１の核酸、ならびに（ｉｉ）トランス活性化因子ポリペプチドに応答する応答エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む第２の核酸を含む、細胞。
【請求項６９】
関心対象の刺激剤の活性を調節する候補化合物を選択するスクリーニング方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）刺激剤に対して特異的な応答を有する請求項６６または請求項６８記載の１つまたはそれ以上の細胞と、１つまたはそれ以上の種類の候補化合物および該刺激剤を接触させる段階；および
（ｂ）該刺激剤に対する応答を調節する候補化合物を選択する段階。
【請求項７０】
候補化合物が刺激剤に対する応答を増加させる、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
候補化合物が刺激剤に対する応答を減少させる、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
候補化合物が関心対象の調節エレメントの活性を調節するかどうかを確かめる方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）陽性の選択マーカー、レポーター遺伝子、またはトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントに作動可能に連結された関心対象の調節エレメントを有する請求項６６または６８記載の１つまたはそれ以上の細胞と、１つまたはそれ以上の種類の候補化合物を接触させる段階；
（ｂ）陽性の選択マーカー、レポーター遺伝子、またはトランス活性化因子ポリペプチドをコードする核酸セグメントの発現を調節する候補化合物を選択し、それにより、該関心対象の調節エレメントの活性を調節する候補化合物を選択する段階。
【請求項７３】
候補化合物が薬物開発から除外される、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
候補化合物の動物モデル試験またはヒト臨床試験の前に行われる、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
試験化合物が真核細胞のＤＮＡを傷つけるかどうかを確かめる方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）レポーター遺伝子と作動可能に結合している調節ＤＮＡを含む真核試験細胞を作成する段階であり、ここで、調節ＤＮＡは、細胞のＤＮＡが傷つけられると細胞において活性化される遺伝子に由来する段階；
（ｂ）試験化合物と該試験細胞を接触させる段階；および
（ｃ）該試験化合物がＤＮＡを傷つける指標としてレポーターを検出する段階。
【請求項７６】
陽性の選択マーカー、陰性の選択マーカー、ＩＲＥＳ、およびレポーター遺伝子を含む核酸。
【国際調査報告】
2004528815.tif 000139
2004528815.tif 000140