(57)【要約】本発明は新規なジャスモン酸メチル化酵素（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ） 遺伝子と、それから合成される新規なジャスモン酸メチル化酵素の蛋白質と、前記遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された新規な形質転換植物体とを提供する。前記酵素はジャスモン酸とＳ−アデノシルメチオニンを基質としてジャスモン酸メチルエステルを合成するが、この物質は植物体の成長調節及び病害虫の侵入に対する防御反応を媒介する化合物として知られている。花で特異的に発現される前記新規遺伝子を植物体に導入することによって、植物の成長には悪影響を及ぼさずに、各種植物の病害虫及びストレスに対する耐性を示す形質転換植物体を得ることができる。
2004503239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３ で表示されるアミノ酸の配列を有することを特徴とするジャスモン酸メチル化酵素ＪＭＴ 。
【請求項２】
請求項１ に記載のジャスモン酸メチル化酵素をコードすることを特徴とするｃＤＮＡ遺伝子。
【請求項３】
配列番号１ で表示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項２ に記載のｃＤＮＡ遺伝子。
【請求項４】
配列番号２ で表示される塩基配列を有することを特徴とする請求項３ に記載のｃＤＮＡ遺伝子ＪＭＴ（寄託番号：ＫＣＴＣ０７９４ＢＰ） 。
【請求項５】
請求項２ に記載のジャスモン酸メチル化酵素ｃＤＮＡ遺伝子を含むことを特徴とする植物形質転換用の組換えベクター。
【請求項６】
配列番号１ で表示される塩基配列を有するｃＤＮＡ遺伝子を含むことを特徴とする請求項５に記載の植物形質転換用の組換えベクターｐＣａＪＭＴ。
【請求項７】
請求項５ に記載の植物形質転換用の組換えベクターで形質転換された、病虫害及びストレス耐性が増進されたことを特徴とする形質転換植物。
【請求項８】
ジャスモン酸メチル化酵素をコードする遺伝子を含む植物形質転換用の組換えベクターで植物を形質転換させる工程から成る、植物の病虫害及びストレス耐性を増進させる方法。
【請求項９】
ジャスモン酸メチル化酵素をコードする遺伝子は請求項２ に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項８ に記載の方法。
【請求項１０】
ジャスモン酸メチル化酵素をコードする遺伝子は請求項３ または請求項４ に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項９ に記載の方法。
【請求項１１】
病虫害はかび病、細菌病、ウイルス病または害虫被害であることを特徴とする請求項８ に記載の方法。
【請求項１２】
病虫害はイネ稲熱病、白葉枯病、穗枯病及びうんか、麦の赤かび病、トウモロコシの胡麻斑病、豆科植物のモザイク病、ジャガイモのモザイク病、唐辛子の疫病及び炭疽病、白菜とダイコンの軟腐病、根頭癌腫病及び白菜白蛾、胡麻の細菌性の斑點病、イチゴの灰色かび病及び萎黄病、スイカの蔓割病、トマトの青枯病、キュウリのうどんこ病及び露菌病、タバコのタバコモザイク病、トマトの萎黄病、高麗人参の根腐病、綿の角斑病、林檎、梨、桃、キウイ、葡萄及びミカン等の果樹類の炭疽病と灰色かび病、林檎の腐らん病、ナツメ木の天拘巣病、ライグラス、アカクローバー、オーチャードグラス、アルファルファ等の飼料作物のうどんこ病及び銹病、バラ、ガーベラ、カーネーション等の花卉類の灰色かび病と萎黄病、うどんこ病、銹病、菌核病、炭疽病、葉枯病、露菌病、疫病、軟腐病、青枯病、ダニ、キイロハナアザミウマ（ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ ｔｈｒｉｐｓ）、オンシツコナジラミ（Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｗｈｉｔｅｆｌｙ） 、カイガラムシ（ＳＣＡＬＥ ＩＮＳＥＣＴＳ） 及び油虫類、バラの黒斑病、グラジオラス及び蘭類のモザイク病、またはユリの茎枯病であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
形質転換植物体は食糧作物類、野菜作物類、特用作物類、果樹類、花卉類及び飼料作物類から成るグループから選択されることを特徴とする請求項８ に記載の方法。
【請求項１４】
食糧作物類はイネ、小麦、麦、トウモロコシ、豆、イモ、小麦、小豆、燕麦、黍から成るグループから選択され；野菜作物類はシロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、メロン、カボチャ、ネギ、玉ネギ、ニンジンから成るグループから選択され；特用作物類は高麗人参、タバコ、綿、胡麻、砂糖黍、砂糖大根、荏胡麻、ピーナッツ、油菜から成るグループから選択され；果樹類は林檎の木、梨の木、ナツメ木、桃、キウイ、葡萄、ミカン、柿、スモモ、アンズ、バナナから成るグループから選択され；花卉類はバラ、グラジオラス、ガーベラ、カーネーション、菊、ユリ、チューリップから成るグループから選択され；飼料作物類はライグラス、アカクローバー、オーチャードグラス、アルファルファ、トールフェスク、ペレニアルライグラスから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ストレス耐性は耐旱性、耐塩性または耐冷性であることを特徴とする請求項８ に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は新規のジャスモン酸メチル化酵素（ Ｓ−アデノシル　Ｌ−メチオニン：ジャスモン酸カルボキシル基メチル化酵素（ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）） 遺伝子及びそれから合成される新規ジャスモン酸メチル化酵素の蛋白質と、詳細には、前記遺伝子を含む発現ベクターで形質が転換された病虫害及びストレス耐性の植物体に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
ジャスモン酸（ ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＪＡ） とジャスモン酸メチルエステル（ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ；ＪＡＭｅ） は多様な植物に広く存在する成長調節物質であるだけでなく、物理的損傷または害虫による植物の傷または病菌の侵入に対抗する防御反応を媒介する物質として知られている（Ｃｒｅｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；３５５−３８１ 、１９９２） 。そして、この耐性反応は非常に複雑な信号伝達網を構成しているものとして知られている（Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ 、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２：２８０−２８６ 、１９９９） 。
【０００３】
植物がウイルス、細菌及びかび等の病菌に感染された時に、植物中のこの感染を認識して反応する経路はサリチル酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ；ＳＡ） が媒介する経路とＪＡが媒介する経路に大きく分けることができる。これらの経路では、非常に多様な種類の遺伝子と蛋白質が連鎖的に反応するものとして知られている。害虫による傷に対抗する反応経路は主にＪＡ、そしてウイルスに対抗する反応経路は主にＳ Ａ、そして、細菌及びかびに対抗する反応経路はＳＡあるいはＪＡが、病菌の種類によって特異的に媒介するものとして知られているが、このような区分は絶対的なものではない（Ｒｅｙｍｏｎｄ ａｎｄ Ｆａｒｍｅｒ 、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．１；４０４−４１１ 、１９９８） 。このような反応は傷及び感染部位に迅速に生じる局所的な反応（ｌｏｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）だけでなく、植物全体に広がる全身的な反応（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ） を通じて、広範囲な病虫害により生じる刺激を植物体が克服するのに寄与する（Ｄｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２ ；２６６−２７４ 、１９９７） 。
【０００４】
そのような反応において、ＳＡはＰＲ−１（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ 、病原関連蛋白質−１） 、ＰＲ−２、そしてＰＲ−５の遺伝子ら等の一連の遺伝子を刺激して対応する該蛋白質の発現を誘導し、その結果、植物体の全身にわたり獲得性の全身の耐性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ；Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４ ；６４５−６４６ 、１９９２） 反応を起こさせる。ＪＡはＰＤＦ（ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｉｎ１．２ 、植物ディフェンシン１．２） 、ＰＲ−３、ＶＳＰ（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、植物貯蔵蛋白質） 等の一連の遺伝子を刺激して対応する該蛋白質の発現を誘導する（Ｐｅｎｎｉｎｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ　８ ；２３０９−２３２３ 、１９９６） 。最近の報告によれば一部の共生菌はＪＡ合成を通じて誘導性の全身の耐性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ） 反応を示すようになる（Ｐｉｅｔｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０；１５７１−１５８０ 、１９９８） 。ＪＡは害虫または物理的要因で生じた傷部位の信号を伝達し、その結果、植物体が感染部位だけでなく全身にわたり耐性をつけるのを許容する。しかし、そのような反応で誘導される遺伝子の中でも、Ｐｉｎ２（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、プロテイナーゼ阻害剤ＩＩ） 等の一部遺伝子はＳＡとＪＡの両方の物質によって誘導されるために、このような耐性の反応の区別は厳密には絶対的ではない。したがって、この二つの反応を媒介する信号伝達体系の間には何らかの相関があるものとして受入れられている（Ｒｅｙｍｏｎｄ ａｎｄ Ｆａｒｍｅｒ 、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．１；４０４−４１１ 、１９９８） 。
【０００５】
従来技術では、組換えの遺伝子の導入と発現を通じた病菌と害虫（病虫）に対する耐性の植物を得るための分子育種学的な努力として、ＳＡ及びＪＡにより誘導されて耐性の反応に関与する遺伝子のうち１あるいは２種類の遺伝子、例えばＰｉｎ２、ＰＲ３ あるいはＰＲ５ などの使用が試みられた。その結果、植物は病虫害に対して多少の耐性を獲得したが、その獲得抵抗は限定的な数の病虫害でのみ有効であった（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２；８０７−８１２ 、１９９４） 。一方、ＳＡ信号の伝達過程における主要な調節因子のうちの一つとして認識されるＮＰＲ１（ｎｏｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｒ ｏｆ ＰＲ１）遺伝子でシロイヌナズナを形質転換させた時に、べと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）と葉枯病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）に多少の耐性を示した結果が報告されている（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５；６５３１−６５３６ 、１９９８） 。
【０００６】
このような耐性の反応を媒介するＳＡ及びＪＡの役割を明らかにするために、病虫害による損傷を受けた植物の生体内でこれら物質の濃度の変化を定量的に分析するか、または外部からＳＡあるいはＪＡを散布した後、植物体の反応を耐性遺伝子の発現レベルに関して決定するかにより、研究が行われた。しかし、ＪＡは溶解度及び揮発性が非常に低いので、研究はＪＡＭｅを使用して行われていた。ＪＡＭｅは植物体内に浸透された後にＪＡに変換されて作用するものと考えられている（Ｆａｒｍｅｒ ａｎｄ Ｒｙａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７ ；７７１３−７７１６ 、１９９０） 。それだけでなく、植物の組織内のＪＡ及びＪＡＭｅの分布パターンにはあまり互いに差がなく、これら二つの化合物間を区別することはできていない（Ｃｒｅｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；３５５−３８１ 、１９９２） 。さらに、従来技術では、ＪＡからＪＡＭｅを合成するＪＭＴ 酵素が同定されておらず、この物質の代謝及び機能に関する研究は全くなされていない。しかし、より揮発性が高いＪＡＭｅが空気に乗って移動して他の植物の耐病性の反応を誘導することができると報告された（Ｆａｒｍｅｒ ａｎｄ Ｒｙａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７ ；７７１３−７７１６ 、１９９０） 。従って、ＪＡＭｅが、低濃度で作用する、より強力な耐病性の誘導物質である可能性を排除することはできない。
【０００７】
このようにＳＡ及びＪＡの植物体内の濃度と耐病性の反応間の相関関係に着眼して、ＳＡの体内の濃度が増加された突然変異ｌｓｄ６（ｌｅｓｉｏｎｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ６）、ｌｓｄ７、ａｃｄ２（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ２）等に対する研究が行われた。しかし、ＳＡの体内濃度が常時的に増加された突然変異体は耐病性遺伝子の発現レベルが増加して多様な病気に対して耐性を示すことはあったが、突然変異体の背が低くなったり、早期老化の現象を示したりするため、そのような突然変異体は経済作物に適していないことがわかった（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７７ ；５５１−５６３ 、１９９ ４：Ｗｅｙｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７ ：２０１３−２０２２ 、１９９５） 。
【０００８】
しかし、ＪＡの体内濃度が常時的に増加した突然変異体はまだ知られておらず、したがって植物体でのＪＡ生合成の過程の前工程に関与するリポキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ＩＩ、ＬＯＸ ＩＩ） あるいは酸化アレン合成酵素（ａｌｌｅｎ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ 、ＡＯＳ）遺伝子を植物体に導入発現させて病虫害に対する耐性を増加させようとする研究が遂行された。ＡＯＳ 遺伝子を葉緑体で過剰発現させた場合はＪＡの植物体内の濃度は６ 〜１２倍増加したが、Ｐｉｎ２のような耐病性関連遺伝子の発現は増加せず、耐病性も立証されなかった（Ｈａｒｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７；１６４５−１６５４ 、１９９５） 。また、ＡＯＳ 遺伝子を細胞質で過剰発現させた場合は植物体内のＪＡ濃度には変化がなく、傷に対する植物体の反応パターンは野生型植物と異なるところがなかった（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０；７８３−７９３ 、１９９９） 。ＳＡとは別に、ＪＡは植物の発達、分化及び代謝に非常に多様に大きな影響を及ぼすものとして知られている。したがって、ＪＡの過剰発現は、植物の耐病性以外にも多様な反応に関与すると認められており、ＳＡと同様に植物体の発達、分化及び代謝に望ましくない影響を及ぼす可能性が高い。
【０００９】
本発明者らは、ＪＡＭｅが植物に及ぼす影響を精力的に研究する中で、その結果の１つとして、新規のジャスモン酸メチル化酵素の蛋白質及びこれをコードする遺伝子を同定、特徴付けし、前記遺伝子で形質転換された植物体がＪＡＭｅの生産を通じて病虫害への耐性と関連する多数の遺伝子の発現を促進して、結果的に該植物体が多様な病虫害及びストレスに対する耐性を有すると同時に副作用がほとんど無いことを見出し、よって本発明を完成した。
【００１０】
（発明の開示）
本発明の目的は植物の病害虫に対する耐性の反応に関与するＪＡＭｅを合成する新規のジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子と、前記遺伝子がコードする酵素の蛋白質とを提供することである。
【００１１】
さらに本発明の別の目的は、前記酵素の蛋白質を同定、特徴付けし、前記遺伝子を組換えて形質転換植物体を製造し、これを過剰発現させて、多様な病虫害に対する耐性が増進される一方で植物の成長に対する副作用が最小化された形質転換植物と、その製造方法とを提供することである。
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は新規のジャスモン酸メチル化酵素、より詳細にはシロイヌナズナから分離した配列番号３ で表示されるアミノ酸配列を有するＪＭＴ 酵素を提供する。
【００１３】
また、本発明は前記ジャスモン酸メチル化酵素蛋白質をコードする配列番号１ で表示されるｃＤＮＡ遺伝子を提供する。
進んで、本発明は前記遺伝子を植物の形質転換用の発現ベクターに導入して構築した組換えベクターと、前記組換えベクターを利用して植物体の全体でジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子を過剰発現する形質転換植物体を製造する方法と、該形質転換植物体を用いて植物体の病虫害及びストレス耐性を増進させる方法とを提供する。
【００１４】
本発明の上記目的および他の効果は、添付図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態を詳しく説明することでより明らかとなるであろう。
（発明を実施するためのベストモード）
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用語「ジャスモン酸メチル化酵素」は、ＪＡにメチル基を転移してＪＡＭｅを合成する活性を有する酵素を意味する一般名称として使用される。また、用語「ＪＭＴ 酵素」は前記「ジャスモン酸メチル化酵素」のひとつとして本発明で初めて同定されたシロイヌナズナの新規な酵素蛋白質を表し、前記酵素蛋白質をコードする遺伝子は「ＪＭＴ 遺伝子」で表示される。
【００１５】
本発明ではシロイヌナズナから新規のＪＭＴ 酵素の遺伝子を分離し、その塩基配列を決定した結果該遺伝子が３８９ 個のアミノ酸をコードする１，１７０ｂｐ のヌクレオチド配列を有することを確認した。まず、白菜の花から製造したｃ ＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション法を利用して、花蜂蜜のみで特異的に発現されるｃ３８ クローンを選別した。この遺伝子は長さが４１６ｂｐ に過ぎず、花蜂蜜で特異的に発現される遺伝子の部分クローンであることを分かることができたが、その機能は同定できなかった。従って、前記ｃ３８ クローンをプローブとして使用してシロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーからｃ３８ と類似なクローンを選別した。選別されたｃＤＮＡクローンは全体長さが１，４７６ｂｐ であり、３’末端に１３個の連続するアデノシンを有し、５’末端から１５番目のｂｐ地点に翻訳開始コドンＡＵＧ があり、１，１６７ｂｐ にわたり３８９ 個のアミノ酸を連続してコードする。このような構造的な特徴をみて該ｃＤＮＡクローンは全長ｃＤＮＡクローンであることを分かった。このクローンは以下に説明する方法によってその機能を分析した結果、ジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子であることが明らかとなり、従って、クローンの名前をｐＪＭＴとして命名した。このクローンｐＪＭＴは２０００年５ 月２９日付で生命工学研究所の付設の遺伝子銀行に寄託した（ 寄託番号：ＫＣＴＣ０７９４ＢＰ） 。
【００１６】
前記遺伝子によりコードされるＪＭＴ 酵素は配列番号３ で表示される３８９ 個のアミノ酸配列を有し、分子量は４３，３６９Ｄａである。
前記酵素の活性を検定するためにＮＣＢＩ遺伝子のデータベースを検索した結果、ＪＭＴ 遺伝子はＳＡＭＴ（ サリチル酸メチル化酵素） 遺伝子と塩基レベルでは全く類似性がなかったが、ＪＭＴ 酵素の蛋白質はＳＡＭＴ酵素とアミノ酸レベルでは４３％ の相同性を示した。しかし、組換え酵素の蛋白質を使用してＳＡ、ＪＡ及びこれと類似の安息香酸（ＢＡ）をＳＡＭ と反応させてガスクロマトグラフィと質量分析機で確認した結果、前記酵素はＳＡ及びＢＡとはほとんど反応をしない反面ＪＡとは高い活性度を見せ、ＳＡＭＴとは異なる活性を有する酵素であることが確認された。また、前記組換え酵素の蛋白質にＪＡ及びＳＡＭ を基質として使用して反応させた後ガスクロマトグラフィで分析した結果、標準ＪＡＭｅと同一な保持時間（１１．７ 分） 後に生成物質が検出され、生成物質の分子量は標準ＪＡＭｅと同一の２２４ であった。したがって、前記ＪＭＴ 酵素は下記の化学式１ のＳＡＭ と下記の化学式２ のＪＡを基質としてＪＡにメチル（ｍｅｔｈｙｌ）基を転移することにより花の主な香り成分のうちひとつであるＪＡＭｅを合成する、ジャスモン酸メチル化酵素であることを分かる。このようなジャスモン酸メチル化酵素の活性及びその遺伝子はいままで全く発表されたことがない。
【００１７】
【化１】
2004503239.tif 000003
【化２】
2004503239.tif 000004
本発明では、前記新規ＪＭＴ 酵素の特性を明らかにするために酵素の反応速度パラメータを調べ、その結果Ｋｍは６．３ μＭ 、Ｖｍは８４ｎｍｏｌｅ／ｍｉｎ 、Ｋｃａｔは７０ｓ−１ 、Ｋｃａｔ／Ｋｍ は１１．１μＭ／ｓ−１ と決定された。
【００１８】
本発明では、ＪＭＴ 酵素を大量で得るために配列番号４ 及び５ で記載されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用してｃＤＮＡクローンを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を通じてＪＭＴ 遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲ Ｉで切断して同じ制限酵素で処理した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ に挿入した。得られた組換えプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ｐＧＳＴ−ＪＭＴ を入れて大腸菌ＢＬ２１を形質転換させた後、培養して組換え蛋白質を大量生産し、これを以後の実験に利用した。
【００１９】
また、本発明はジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された植物体を提供する。本発明のジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された植物体は、ジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子を植物体全体で常時的に過剰発現することによってウイルス、細菌、かびを含む各種の植物病原菌または害虫に起因する植物病虫害及びストレスに対して強い耐性を示す。
【００２０】
一般的にＪＡ及びＪＡＭｅは植物で傷あるいは病原菌の侵入に対抗する反応を媒介する物質として知られている。本発明のジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子で形質転換された植物体は、植物にＪＡまたはＪＡＭｅを処理した時に誘導される耐性関連遺伝子、例えばＡＯＳ 、ＪＲ２（ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２） 、ＪＲ３（ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、ＤＡＨＰ（３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ ７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＬＯＸ ＩＩ、ＶＳＰ のような多数の遺伝子を常時的に発現する。したがって、ジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子で形質転換された植物体の効果はＪＡまたはＪＡＭｅの外部処理より得られる効果と類似であることを分かる。
【００２１】
ジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子を含む発現ベクターで植物体を形質転換させることによって、植物体は病虫害に対して耐性を有することができ、その病虫害には一般的なかび病、細菌病、ウイルス病または害虫による被害などを挙げることができ、その中でも特に、イネ稲熱病、白葉枯病、穗枯病及びうんか、麦の赤かび病、トウモロコシの胡麻斑病、豆科植物のモザイク病、ジャガイモのモザイク病、唐辛子の疫病及び炭疽病、白菜とダイコンの軟腐病、根頭癌腫病及び白菜白蛾、胡麻の細菌性斑點病、イチゴの灰色かび病及び萎黄病、スイカの蔓割病、トマトの青枯病、キュウリのうどんこ病及び露菌病、タバコのタバコモザイク病、トマトの萎黄病、高麗人参の根腐病、綿の角斑病、林檎、梨、桃、キウイ、葡萄及びミカン等の果樹類の炭疽病と灰色かび病、林檎の腐らん病、ナツメ木の天拘巣病、ライグラス、アカクローバー、オーチャードグラス、アルファアルファ等の飼料作物類のうどんこ病及び銹病、バラ、ガーベラ、カーネーション等の花卉類の灰色かび病と萎黄病、バラの黒斑病、グラジオラス及び蘭類のモザイク病、またはユリの茎枯病等に対して適用することができる。
【００２２】
ジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子で形質転換された植物体はＳＡの植物体内の濃度が常時的に増加された突然変異体で現れる植物の成長に及ぼす悪影響、すなわち植物の背が低くなるか、または早期老化現象を示す等の問題点を生じないために、経済作物等に適用する場合に、ＳＡの植物体内の濃度が増加された突然変異体を利用するか、またはＪＡ生合成の前工程に関与する酵素の遺伝子で形質転換することより効果的である。
【００２３】
また、ＪＡＭｅが多様な植物体に広く存在するという事実から、本発明で初めてクローニングしたＪＭＴ 遺伝子は多様な植物体に広く存在するものとして見なされる。従って、本発明のＪＭＴ 遺伝子を利用して公知の方法により多様な植物体から類似のジャスモン酸メチル化酵素の蛋白質及びこれをコードする遺伝子を探索することに、本発明のＪＭＴ 遺伝子及び酵素の蛋白質が有用に利用され得る。
【００２４】
進んで、形質転換植物体の病虫害に対する耐性はジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子自体によるものであるというよりはジャスモン酸メチル化酵素の活性により生成されたＪＡＭｅが植物体の耐病性反応の媒介体として多くの耐性の遺伝子の発現を促進するためである点と考えられる。このように見ると、このような酵素の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子ならば、本発明の遺伝子に限定されずに、耐性が増大された形質転換の植物体の製造に利用することができるだけでなく、植物の種類に関係なく、前記遺伝子を備えた組換え体を調製した後に植物体を該組換え体で形質転換することにより多様な病虫害に対して似た耐性を付与することができる。
【００２５】
前記ジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子で形質転換された植物体の製造方法は公知の方法によって遂行することができる。すなわち、ジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子を発現する組換えプラスミドは、公知の植物発現用のベクターを基本ベクターとして用いて製造することができ、この目的で、一般的な二元ベクター（ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ） 、コインテグレイションベクター（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）またはＴ−ＤＮＡ 部位を含まないが植物中で発現できるようにデザインされた一般ベクターが使用される。
【００２６】
このうち、二元ベクターとしては植物体の形質転換用のＴ−ＤＮＡ のうち外来遺伝子の感染に関与する約２５０ｂｐ の大きさの左側境界（ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ ）及び右側境界（ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ）を含み、かつその内部に植物体で発現させるためのプロモーター部位とポリアデニル化信号配列を含むベクターを使用することができる。前記二元ベクターはカナマイシン耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。形質転換植物体の選択マーカー遺伝子としては抗生物質耐性遺伝子以外にも除草剤耐性遺伝子、代謝関連遺伝子、発光遺伝子（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、物理的特性に関連する遺伝子、ＧＵＳ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ） またはＧＡＬ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ） 遺伝子などが利用され得る。
【００２７】
本発明の望ましい実施例では、カナマイシン耐性の選択遺伝子とカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ プロモーターを有するｐＢＩ１２１ベクターのＳｍａＩ部位にＪＭＴ 遺伝子を挿入することによって、植物形質転換用の発現ベクターｐＣａＪＭＴを製作して使用した。
【００２８】
二元ベクターまたはコインテグレイションベクターを使用する場合、植物体に前記組換えベクターを導入するための植物形質転換用の菌株としては、アグロバクテリウム株を使用し（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ） 、それには例えば、アグロバクテリウムチュマファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） またはアグロバクテリウムライゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）が含まれる。
【００２９】
その他に、Ｔ−ＤＮＡ 部位を含まないベクターを利用する場合には、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ） 、微粒子銃撃法（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ） 、ポリエチレングリコール取り込み法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ） などが組換えプラスミドを植物体に導入するのに利用され得る。
【００３０】
本発明の１実施例では、カナマイシン耐性の選択遺伝子とＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターを有するｐＢＩ１２１ベクターのＳｍａＩの部位にＪＭＴ 遺伝子が挿入された組換えプラスミドｐＣａＪＭＴを、花軸沈積法（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ） によりアグロバクテリウムＣ５８Ｃ１ に形質転換させた。以後、前記形質転換用の菌株培養液に花軸を１５分間入れた後、暗所で一晩寝かし、その後培養した。それから種子を集めてカナマイシン培地で発芽選別した後、耐性の形質転換体を土壌に移植して第２ 世代の種子を得た。得られた種子を再び選別して、カナマイシン感受性の個体が出てこない第２ 世代の種子を選択し、これを実験に使用した。
【００３１】
まず、外来組換えの遺伝子が正しく挿入されたのかを確認するためにＪＭＴ 遺伝子をプローブとしてゲノムサザンブロットを遂行した。その結果、野生型植物では約６．５ｋｂｐの長さ程度の元来シロイヌナズナに存在した１ 個の遺伝子が確認されたが、形質転換体では約２．０ｋｂｐと０．７ｋｂｐの二つのＤＮＡ 切片がさらに観察された。これらは形質転換に使用したＪＭＴ 遺伝子に由来するものであることを理解することができた（ プロモーターの上流と蛋白質のコード部位の下流にＨｉｎｄ ＩＩＩ部位がある） 。これをプローブとして、再び組換え遺伝子のみにあるＣａＭＶプロモーター部位とハイブリダイゼーションした。その結果、予想通りに形質転換体のみで約２．０ｋｂｐ長の遺伝子配列が存在して、組換え遺伝子１ 個が形質転換体に安定的に挿入されたことを確認することができた。
【００３２】
また、形質転換されたシロイヌナズナでＪＭＴ 遺伝子が過剰発現されているかの可否をノーザンブロット分析で確認した。その結果、形質転換体のみがＪＭＴ 遺伝子を発現し、特に植物体をＪＡまたはＪＡＭｅで外部処理した時に誘導される耐性関連のＡＯＳ 、ＪＲ、ＬＯＸ ＩＩ、ＶＳＰ 等の多数の遺伝子を常時的に発現していることを確認した。これは植物に転入したＪＭＴ 遺伝子の発現により生じる効果がＪＡあるいはＪＡＭｅで外部処理した時に生じる効果と似ていることを示唆している。
【００３３】
本発明のまた他の実施例では、前記形質転換植物体に灰色かびの原因病原菌を接種した結果、噴霧接種後に約４８時間後に野生型転換体は完全に死んだが形質転換体ではほとんど変化が無いことを確認した。しかし、パイティウム（Ｐｈｙｔｉｕｍ） 属の病原菌の場合、１３０ μＭ 濃度のＪＡで処理しても病原菌の増殖には全く影響を及ぼさないと報告されている（Ｖｉｊａｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５ ；７２０９−７２１４ 、１９９ ８） 。従って、ＪＭＴ 遺伝子の形質転換体が病原菌に耐性を示す原理は、植物体で合成されたＪＡＭｅが直接に病原菌の生育を抑制するというよりはＪＭＴ 酵素により生成されたＪＡＭｅが多様な種類の耐性関連遺伝子の発現を誘導するためであることを分かる。このようにＪＭＴ 遺伝子で形質転換された植物体がＪＡＭｅを媒介に多様な防御関連遺伝子の常時発現を示すという事実は、ＪＭＴ 遺伝子が植物病原菌、害虫及びストレスに対する幅広い耐性を植物体に付与することに利用できることを示唆する。
【００３４】
本発明の他の実施例では、上記のＪＭＴ で形質転換したシロイヌナズナを植物病原菌、ウイルス及び害虫で処理したが、一様に耐性を示した。
本発明のさらに他の実施例では、組換えＪＭＴ 遺伝子を利用して、イネ、タバコ、イモ、ミカン、スイカ、キュウリ等の多様な植物体を形質転換させ、稲熱病菌、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ） 、ジャガイモ疫病菌、ミカン灰色かび病菌、スイカ蔓割病菌、キュウリべと病菌等の多様な病原菌で害虫を処理してみたが、組換えＪＭＴ 遺伝子で形質転換したすべての形質転換植物は一様に耐性を示した。
【００３５】
本発明の他の実施例では、上記のＪＭＴ 遺伝子で形質転換したシロイヌナズナを、耐寒性、耐塩性と耐冷性に関して調べた結果、非形質の野生型転換体に比べて顕著な耐性を示した。したがって、ジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子で形質転換された植物体は、各種の病虫害に対する耐性はもちろん、低温、水分不足、高い塩濃度などのストレスに対しても耐性を示すことが理解できる。
また、前記ＪＭＴ 遺伝子で形質転換した植物は、一般的な成長特性の面で、非形質転換体と有意な差を表さなかった。
【００３６】
（実施例）
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲がこれに限定されるものではないことは当業者に自明なことである。
【００３７】
＜ 実施例１＞シロイヌナズナのジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子ｐＪＭＴのクローニング
実験に使用するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｅｃｏｔｙｐｅ Ｃｏｌ−０ ）の種子を温室で裁培して、多様な組織を収集して液体窒素で急速冷凍した後、使用前まで−７０ ℃で保管した。
【００３８】
植物の花で特異的に発現される遺伝子を分離するために、プラスミドｐＵＣ１８（ファルマシア、スウェーデン） を利用して公知の方法によって白菜の花のｃＤＮＡライブラリーを製作した（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３６ ；３１５−３１９ 、１９９３） 。次に、各々花と葉から全体ＲＮＡ をチョムチンスキらの方法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７） によって抽出し、オリゴ（ｄＴ）カラムクロマトグラフィを利用してｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ を分離した後、それよりＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ） で一番目のｃＤＮＡプローブを合成した。花と葉から各々製造した［３２Ｐ］ で標識されたｃＤＮＡプローブを使用した差別化ハイブリダイゼーション法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を利用して白菜の花のｃＤＮＡライブラリーから、花のみに特異的に発現するクローンｃ３８ を選別した。しかし、この遺伝子は長さが４１６ｂｐ に過ぎず白菜の花で特異的に発現される遺伝子の部分クローンであることが分かったが、その機能は同定できなかった。
【００３９】
前記遺伝子の類似遺伝子の特性を研究するために、ｃ３８ クローンをプローブとして使用してシロイヌナズナで類似遺伝子を選別した。シロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーから選別して得たクローンｐＪＭＴは全体長さ１，４７６ｂｐ の配列番号２ で表される塩基配列を有し、３’末端に１３個のアデノシンが連続して存在し、５’末端から１５番目の塩基対に翻訳開始コドンＡＵＧ を有していた。クローンｐＪＭＴは前記翻訳開始コドンから１，１６７ｂｐ にわたり配列番号３ で表示される３８９ 個のアミノ酸（ 分子量４３，３６９） を連続してコードしており、構造的特徴から、その選択されたｃＤＮＡクローンは全長ｃＤＮＡクローンであることが分かった。このクローンは以後に説明する方法によってその機能を分析した結果ＪＭＴ 酵素の遺伝子であることを分かり、したがってクローンの名前をｐＪＭＴで命名した。その構造は図１ のようである。このクローンｐＪＭＴは２０００年５ 月２９日付で生命工学研究所の付設遺伝子銀行に寄託した（ 寄託番号：ＫＣＴＣ０７９４ＢＰ） 。
【００４０】
前記酵素の機能を類推するためにＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ）の遺伝子データベースを検索した結果、寄託番号ＡＦ１３３０５２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１３３０５３；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）のＳＡＭＴ遺伝子の産物と塩基レベルでは全く類似性がなかったが、アミノ酸のレベルで４３％ の相同性を示した（ 図２ 参照） 。
【００４１】
＜ 実施例２＞組換えＪＭＴ 遺伝子の構築及び大腸菌での大量発現
実施例１ でクローニングしたｐＪＭＴクローンの機能を明らかにするためにこのクローンのコード部位を大腸菌発現ベクターに再結合させて大腸菌で大量の発現を誘導した。ＪＭＴ 遺伝子増幅のためのプライマーとしては配列番号４ 及び配列番号５ で記載される塩基配列を各々ＰＣＲ 反応の順方向のプライマー及び逆方向のプライマーとして利用した。
【００４２】
ＰＣＲ の条件は以下の通りである：遺伝子を１０ｍＭトリス（ｐＨ８．３） 、５０ｍＭ塩化カリウム、０．８ｍＭ 塩化マグネシウムを含む緩衝溶液に入れて９４℃で２ 分間放置した後、９４℃１ 分（ 変性） ；５６℃１ 分３０秒（ アニーリング） ；７２℃２ 分３０秒（ 伸長）の反応を３０回反復し、最終工程で７２℃で１０分間追加反応させた（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ） 。得られたＰＣＲ 産物を２％アガロースゲルで電気泳動してジーンクリーンキット（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ、ＢｉｏＲａｄ、米国） を利用して分離した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ で切断し、あらかじめ同じ酵素で切断しておいた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア、スウェーデン） に挿入した（ 図３ 参照） 。前記組換え発現ベクターｐＧＳＴ−ＪＭＴはｔａｃ プロモーターの調節下にＪＭＴ 遺伝子のアミノ末端がＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ）のカルボキシ末端と結合した形態の融合蛋白質を生産する。前記で得られた組換えプラスミドで大腸菌ＢＬ２１を形質転換した後、培養し、０．５ｍＭ イソプロフィル− β−Ｄ− チオガラクトサイド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ− β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ） で処理して発現を誘導した。組換え蛋白質はグルタチオンアガロスクロマトグラフィ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｇａｒｏｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムクロマトグラフィで純粋分離し、ＳＤＳ−電気泳動法（１２．５％） でその純度を検定した（ 図４ 参照） 。その結果、組換えの蛋白質ＧＳＴ−ＪＭＴ が予想した通りの大きさ（ 分子量６７，０００） で純粋分離されたことを確認した。
【００４３】
＜ 実施例３＞組換えＪＭＴ 蛋白質の酵素活性の検定
実施例２ で純粋分離した組換え酵素の蛋白質を基質としてのＪＡとＳＡＭ と反応させて、ガスクロマトグラフィ（ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）と質量分析機（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ） にかけて、ＪＡＭｅの合成を確認した。
【００４４】
試験管内で１００ｍＭ 塩化カルシウム存在下に１ｍＭ のＪＡと１ｍＭ のＳＡＭ を添加して純粋分離したＪＭＴ 酵素の蛋白質１０ｐｍｏｌｅ を混ぜて総反応液の体積を１００ μｌ とした後、２０℃で３０分間反応させた。反応産物を酢酸エチルを用いて抽出した後、酢酸エチル濃縮液３ μｌ をガスクロマトグラフィで分析した結果、反応産物は標準ＪＡＭｅと同じ保持時間（１１．７ 分） 後に検出され、分子量は標準ＪＡＭｅと同様２２４ であった（ 図５ 参照） 。前記結果からｃＤＮ ＡクローンｐＪＭＴはＪＭＴ 酵素の遺伝子であることを確認することができた。
【００４５】
一方、図６ に示されるように基質としてＪＡと［１４Ｃ］ＳＡＭを使用した場合の酵素反応の活性を１００％とすると、基質としてＪＡの代わりにＳＡまたはこれと類似の安息香酸（ＢＡ） に変えた時にはほとんど反応が進行せず、純粋分離したＪＭＴ 酵素の蛋白質がＪＡに特異的に反応することを確認することができた。
【００４６】
また、蛋白質粗抽出物を、１００ｍＭ 塩化カリウム存在下で、基質としての６．４ｍＭ の［１４Ｃ］ＳＡＭと１ｍＭ ＪＡと２０℃で３０分間反応させた後、［１４Ｃ］ＪＡＭｅ 生産の活性を測定した。その結果を図７ に示す。図７ で見ることができるように、形質転換シロイヌナズナの粗抽出物の［１４Ｃ］ＪＡＭｅ 生産活性は野生型植物の活性に比べて多くて２ 倍に達した。
【００４７】
＜ 実施例４＞組換えＪＭＴ 蛋白質の酵素的特徴付け
ＳＡＭ とＪＡを基質としてしようして、基質濃度と反応速度との関係を調べた。これよりＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを通じてＫｍ、Ｖｍ、Ｋｃａｔ及びＫｃａｔ／Ｋｍ を求めた。その結果を下記の表１ に示す。
【表１】
2004503239.tif 000005
【００４８】
＜実施例５＞ＪＭＴ 遺伝子を利用した形質転換植物の製造
植物体にＪＭＴ 遺伝子を移植するために植物形質転換用ベクターにＪＭＴ 遺伝子を再結合した。カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ） 耐性選択遺伝子と基本プロモーターとしてＣａＭＶプロモーターとを有するｐＢＩ１２１ベクター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ 、米国） からＧＵＳ 遺伝子を除去して、ｐＢＩ１２１ベクターのＳｍａＩ部位にＡｆｌＩＩＩで切断したＪＭＴ 遺伝子を挿入して、組換えプラスミドｐＣａＪＭＴを製作した（ 図８ 参照） 。得られた組換えプラスミドを急速冷凍− 解凍法（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ ｍｅｔｈｏｄ 、Ｈｏｌｓｔｅｒ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３ ：１８１−１８７ 、１９７８） を利用してアグロバクテリウムＣ５８Ｃ１（Ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４ ：３８３−３９６ 、１９８６） に導入した。
【００４９】
まず、アグロバクテリウム株を５ｍｌ ＹＥＰ（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ−ｐｅｐｔｏｎｅ）培地で２８℃で２４時間培養した後、４ ℃で５， ０００ｒｐｍで５ 分間遠心分離した。得られた菌株ペレットを２０ｍＭ塩化カリウム溶液１ｍｌ に再懸濁させて、上記のように製造したベクターＤＮＡ を約１ μｇ 程度入れた。混合物を液体窒素で５ 分処理し、３７℃でさらに５ 分間処理し、１ｍｌ ＹＥＰ 培地を添加した。細菌株を２８℃で２ 〜４ 時間培養して回収した後、ｐＣａＪＭＴで形質転換された菌株のみを選別するためにゲンタマイシン（２５ μｇ／ｍｌ） とカナマイシン（５０ μｇ／ｍｌ） を含むＹＥＰ 培地で２８℃で２ 〜３ 日間培養した。
【００５０】
前記で選別された菌株をシロイヌナズナに入れて形質転換させた。形質転換植物の製造は公知のアグロバクテリウム花軸沈積法（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ ｍｅｔｈｏｄ 、Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｅｎｔ 、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１６：７３５−７４３ 、１９９８） を利用した。抗生物質を含むＹＥＰ 培地で一晩培養したアグロバクテリウムを遠心分離した後、ＳｉｌｗｅｔＬ−７７（Ｌｅｈｌｅ Ｓｅｅｄｓ、米国）０．０５％を加えたＭＳ培地にＯＤ６００＝０．８ になるまで懸濁した。この懸濁液に花が咲き始めるシロイヌナズナの花軸部分を逆様にして１５分間入れた後、水気を抜いて涼しい暗所に一晩放置した。翌日植物を培養室に移して培養後、種子を得た。この種子をカナマイシン培地で発芽選別してカナマイシン耐性を示す形質転換体を得、それを土壌に移植して第２ 世代の種子を得た。得られた種子をまたカナマイシン培地で選別してカナマイシン感受性の個体が出てこない第２ 世代の種子を純粋の２ 倍体として選択し、これを以下の実験に使用した。
【００５１】
組換え遺伝子が正しく挿入されたかどうかを確認するためにゲノムサザンブロット（ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ） を遂行した。まず、形質転換及び野生型植物体からゲノムＤＮＡ を分離し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ で切断して０．８％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをフィルターにつけてプローブとしてのＪＭＴ 遺伝子とハイブリダイゼーション反応させて、Ｘ−線フィルムに感光させた結果、予想した通りに野生型植物では約６．５ｋｂｐ長さ程度の元来シロイヌナズナに存在した１ 個の遺伝子が確認されたが、形質転換体では元来の遺伝子に加えて約２．０ と０．７ｋｂｐの切片から成る１ 個の遺伝子がさらに観察された（ プロモーターの上流と蛋白質のコード部位の下流にＨｉｎｄＩＩＩ 部位がある） 。同じフィルムを洗った後、これをプローブとして組換え遺伝子のみにあるＣａＭＶプロモーター部位とハイブリダイゼーションした後に、Ｘ−線フィルムに感光させた。その結果、形質転換体のみで約２．０ｋｂ 長さの遺伝子部位を示し、組換え遺伝子１ 個が形質転換体に安定的に挿入されたことを確認することができた。
【００５２】
＜ 実施例６＞形質転換植物でのＪＭＴ 遺伝子の発現確認
形質転換されたシロイヌナズナでＪＭＴ 遺伝子が過剰発現されているかを確認するためにノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ） を遂行した。
まず、ＪＭＴ 遺伝子が検出された形質転換シロイヌナズナの葉組織を、単一工程ＲＮＡ 分離法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６２１５６−１５９、１９８７） で処理して全体ＲＮＡ を分離した。すなわち、シロイヌナズナの葉組織２ 〜５ｇを液体窒素で微細粉末になるまで磨碎した後、１０ｍｌのＴＲＩ−試薬を入れて１０秒間に力強く揺さぶって、氷上で１５分間に静置させた。その後、２ｍｌ のクロロホルムを入れてよく混ぜた後、混合物を常温で１５分間静置させ、４ ℃で３０００ｒｐｍ で２０分間に遠心分離した。上清を集めて１０ｍｌのイソプロピルアルコールを入れて常温で１０分間に沈殿させた後、再び１０，０００×ｇ で２０分間に遠心分離した。遠心分離した後、上清は捨てて、沈殿したＲＮＡ を７５％ のエタノールで洗った後、ＤＥＰＣ処理した蒸溜水に溶かして、ＯＤ２６０ とＯＤ２８０ の吸光度を測定して定量した後に、使用するまで−７０ ℃で保管した。
【００５３】
上記の通りに分離された全体ＲＮＡ のうち３０μｇ を最終体積４．５ μｌ に濃縮した後に、１０×ＭＯＰＳ［０．２Ｍ ３−（Ｎ− モルフォリオ） プロパンスルホン酸（ｐＨ７．０） 、５０ｍＭ　酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］ 、ホルムアミド、ホルムアルデヒドを１ ：１．８ ：５ の割合で添加して総２０μｌ とした。得られた混合物を６５℃で１５分間に熱処理して２次構造を解いた後に、ホルムアルデヒドゲルローディングの緩衝溶液（５０％　グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） 、０．２５％ ブロモフェノールブルー、０．２５％ キシレンシアノール ＦＦ）２ μｌ とよく混ぜてホルムアルデヒド（２．２Ｍ）を含んだ１．５％アガロースゲルを４Ｖ／ｃｍ でゆっくり電気泳動した。
【００５４】
展開されたＲＮＡ を１ 時間程度ＤＥＰＣ処理した水に浸してホルムアルデヒドを除去した後、毛細管移動方法（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｔｈｏｄ） で約１６時間以上ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ 、 Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移して紫外線照射（２５４ｎｍ、０．１８Ｊ／Ｓｑ・ｃｍ２）で固定させてハイブリダイゼーション反応に使用した。ランダムプライマー標識キット（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ 、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を使用して［ α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ で標識したＪＭＴ 遺伝子を、ハイブリダイゼーション反応のプローブとして利用した。ＲＮＡ が完全結合されたナイロン膜にプレハイブリダイゼーション（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）溶液（５×ＳＣＣ 、５ ×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ、０．１％ＳＤＳ 、１００ μｇ／ｍｌ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）を加え、ハイブリダイゼーション用オーブンに６５℃で２ 時間程放置した後、標識プローブを沸騰水で５ 分間変性させ、プレハイブリダイゼーション溶液に添加して、１８時間反応させた。次の日に２ＸＳＣＣ 、０．１％ＳＤＳ でナイロン膜を１０分間常温で洗って、再び０．２ＸＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ で２０分間洗った後に、ガイガーカウンター（Ｇｅｉｇｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ）で信号を測定しながら温度を６５℃に上げて洗った。ナイロン膜を洗った後、ラップで覆ってＸ−線フィルムを載せて−７０ ℃で感光させた。
【００５５】
その結果、図１０に示されるように形質転換されたシロイヌナズナでＪＭＴ 遺伝子が過剰発現していることを確認した。実施例５ のゲノムブロットで見たようにシロイヌナズナには元来、ＪＭＴ 遺伝子が存在するが、ノーザンブロットによればその遺伝子は花でのみ特異的に発現され葉では発現されない。しかし、移植された外来組換えＪＭＴ 遺伝子は該遺伝子をＣａＭＶプロモーターと再結合させることによって植物体全身にわたりまんべんなく発現されていた。
【００５６】
一方、ＪＡまたはＪＡＭｅを外部から処理した時に誘導されるＡＯＳ 、ＪＲ２ 、ＪＲ３ 、ＤＡＨＰ、ＬＯＸＩＩ 、ＶＳＰ のような遺伝子の発現の可否を調べた結果、ＪＭＴ 遺伝子で形質転換された植物体ではそれらの遺伝子が常時的に発現されることを確認した（ 図１０参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子が移植された時にＪＭＴ 遺伝子により誘導される発現の効果が、ＪＡまたはＪＡＭｅを外部から処理した時の効果と似ていることを示す。
【００５７】
＜ 実施例７＞形質転換植物体のかび病に対する耐病性の確認
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換しシロイヌナズナに灰色かび病原菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）を接種してＪＭＴ 遺伝子が植物体のかび性の病原菌に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換または野生型のシロイヌナズナ各々を７ 週間裁培した後、葉に灰色かび病原菌胞子を１０７／ｍｌ濃度で噴霧接種した。その結果、４８時間後に野生型植物は完全に死んだのに反して、形質転換体はほとんど変化が無いことを確認した（ 図１１参照） 。パイティウム（Ｐｈｙｔｉｕｍ） 属の病原菌の場合は１３０ μＭ レベルのジャスモン酸で処理しても病原菌の増殖には全く影響を及ぼさないと報告されている（Ｖｉｊａｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５ ；７２０９−７２１４ 、１９９８） 。この知見は、ＪＭＴ 遺伝子による形質転換体が病原菌耐性を示す理由が、植物体で合成されたＪＡＭｅが直接病原菌の生育を抑制するためであるというよりは、ＪＡ及びＪＡＭｅにより誘導される多様な種類の耐性関連遺伝子を常時に発現させるためであることを示唆している。しかし、形質転換植物体の一般的な成長特性は、非形質転換野生型植物体と有意な差がない。
【００５８】
＜ 実施例８＞形質転換植物体の細菌病耐性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナに細菌性の黒斑病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ ｔｏｍａｔｏ ＤＣ３０００） を接種してＪＭＴ 遺伝子が植物体の細菌性病原菌に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換または野生型のシロイヌナズナ各々を７ 週間裁培した後に、葉に細菌性の黒斑病菌細胞を１０７／ｍｌ濃度で噴霧接種した。３ 日後に野生型植物体では透明な黄色病斑が葉の縁から現れた反面、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では葉の縁にほんの微細な病斑が観察されたにすぎなかった（ 表２ 参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物が細菌病に耐性があることを示す。
【表２】
2004503239.tif 000006
【００５９】
＜ 実施例９＞形質転換植物体のウイルス病耐性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナにＢＣＴＶ（ｂｅｅｔ ｃｕｒｌｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ）を接種してＪＭＴ 遺伝子が植物体のウイルス病に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換または野生型のシロイヌナズナ各々を４ 週間裁培した後、葉に注射器でＢＣＴＶクローンで形質転換したアグロバクテリウムを接種した。４ 週後に野生型植物体では葉がねじれる現象が現れ始めたが、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では有意な変化が見られなかった（ 表３ 参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物がウイルス病に耐性があることを示す。
【表３】
2004503239.tif 000007
【００６０】
＜ 実施例１０＞ 形質転換植物体の害虫耐性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナに黒翼キノコバエ２０匹を網室で接種してＪＭＴ 遺伝子が植物体の害虫に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換または野生型のシロイヌナズナ各々を６ 週間に裁培した後、黒翼キノコバエ２０匹を網室で接種した。４ 週後にハエは野生型植物の葉をほとんど齧って食べた反面、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では有意な被害を観察することができなかった（ 表４ 参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物が害虫に耐性があることを示す。
【表４】
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【００６１】
＜ 実施例１１＞ 形質転換イネの稲熱病耐性
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたイネに稲熱病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）を接種してＪＭＴ 遺伝子が植物体の病原菌に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換または野生型のイネを各々１０週間に裁培した後、稲熱病菌の胞子を１０６／ｍｌ濃度で噴霧接種して２５℃の相対湿度１００％で一晩置いた後、植物培養器で育てた。５ 日後に野生型植物では葉ごとに５−１０カ所の褐色斑点が現れて病斑の面積率が約８０％ に至ったが、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では２ カ所未満の微細な斑点が観察された（ 表５ 参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子のイネ植物の形質転換植物が稲熱病に耐性があることを示す。
【表５】
2004503239.tif 000009
【００６２】
＜ 実施例１２＞ 形質転換タバコのモザイク病耐性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたタバコにタバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ 、ＴＭＶ）を接種してＪＭＴ 遺伝子が植物体のウイルス病原菌に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換または野生型のタバコを１０週間に裁培した後、カーボランダムと共にＴＭＶ を葉に接種した。一週間後に野生型植物では葉ごとに５０−１００個程度の褐色斑点が現れた反面、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では１０個未満の微細な斑点が観察された（ 表６ 参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物がウイルス病に耐性があることを示す。
【表６】
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【００６３】
＜ 実施例１３＞ 形質転換ジャガイモの疫病菌耐性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたジャガイモに疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）を接種してＪＭＴ 遺伝子がジャガイモのかび病原菌に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換または野生型のジャガイモを１２週間に裁培した後、疫病菌の胞子を１０７／ｍｌ濃度で葉に噴霧接種した。一週間後に野生型植物では葉ごとに５０−１００個程度の褐色斑点が現れた反面、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では１０個未満の微細な斑点が観察された（ 表７ 参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物がジャガイモの疫病菌に耐性があることを示す。
【表７】
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【００６４】
＜実施例１４＞ 形質転換ミカンの灰色かび病耐性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたミカンに灰色かび病原菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）を接種してＪＭＴ 遺伝子がミカンのかび病原菌に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換または野生型のミカンの実に灰色かび胞子を１０７／ｍｌ濃度で噴霧接種した。一週間後に野生型植物では実の表面を灰色かびがほとんど覆ったのに比べてＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では１−２ 個の小さなかびコロニーが稀に観察された（ 表８ 参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物がミカンの灰色かび病原菌に耐性があることを示す。
【表８】
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【００６５】
＜実施例１５＞ 形質転換スイカの蔓割病耐性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたスイカに蔓割病原菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）を接種してＪＭＴ 遺伝子が植物体の蔓割病原菌に対する耐性に及ぼす影響を調べた。蔓割病原菌のかび胞子を１０７／ｍｌ濃度で懸濁した後に土壌に腐った後幼い苗を移植した。３ 週間後に野生型植物では幹部分が分かれて根が腐り始めた反面、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物ではたまたま病症を示したが、比較的に正常な成長姿を示した（ 表９ 参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物がスイカの蔓割病に耐性があることを示す。
【表９】
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【００６６】
＜ 実施例１６＞ 形質転換キュウリの露菌病耐性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたキュウリに露菌病原菌（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）を接種してＪＭＴ 遺伝子がキュウリの露菌病原菌に対する耐性に及ぼす影響を調べた。形質転換および野生型キュウリを１０週間に裁培した後、露菌病に感染されたキュウリの葉を２つに裂いて１ 個の葉ごとに２分の１枚の比で接種した。２ 週間後に野生型植物では葉の縁から黄褐色の斑点が現れて乾き始めたが、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では微細な斑点が観察された（ 表１０参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物が露菌病に耐性があることを示す。
【表１０】
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【００６７】
＜ 実施例１７＞ 形質転換シロイヌナズナの耐旱性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナを２ 週間の間給水を中断することによってＪＭＴ 遺伝子が植物体の耐旱性に及ぼす影響を調べた。形質転換および野生型のシロイヌナズナを６ 週間の間培養した後、２ 週間の間給水を中断した。また、給水を再開しても野生型植物はほとんどが枯れて死んだが、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では約６５％ 程度の生存率を示した（ 表１１参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物が植物の水分ストレスに対して耐性があることを示す。
【表１１】
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【００６８】
＜ 実施例１８＞ 形質転換シロイヌナズナの耐塩性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナを高い塩濃度で裁培することによってＪＭＴ 遺伝子が植物体の耐塩性に及ぼす影響を調べた。形質転換および野生型のシロイヌナズナを３００ｍＭ 濃度の塩を加えたＭＳ培地で発芽させた。一週間後に野生型植物はほとんどが発芽できなかった状態であったが、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物では約８２％ 程度の発芽率を示した（ 表１２参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物が塩分ストレスに対して耐性があることを示す。
【表１２】
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【００６９】
＜ 実施例１９＞ 形質転換シロイヌナズナの耐冷性調査
ＪＭＴ 遺伝子で形質転換させたシロイヌナズナを低い温度で裁培することによってＪＭＴ 遺伝子が植物体の耐冷性に及ぼす影響を調べた。形質転換および野生型のシロイヌナズナを４ ℃の冷蔵庫で１ 週間の処理した後、２３℃で１ 週間後に生存率を測定した。野生型植物はほとんどが回復をすることができなくて枯れて死んだが、ＪＭＴ 遺伝子を常時的に発現する形質転換植物は約７０％ 程度の生存率を示したし、比較的に健康に育った（ 表１３参照） 。これはＪＭＴ 遺伝子の形質転換植物が植物体の温度ストレスに対して耐性があることを示す。
【表１３】
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【００７０】
（産業上の利用可能性）
本発明のジャスモン酸メチル化酵素の遺伝子は植物体の花のみで特異的に発現する新規遺伝子である。前記遺伝子を含む植物形質転換用の発現ベクターにより植物体を形質転換すれば、一般的な成長特性には影響を及ぼさずに、効果的に植物体のかび病、細菌病、ウイルス病及び害虫、その中でも特にイネ稲熱病、白葉枯病、穗枯病及びうんか、麦の赤かび病、トウモロコシの胡麻斑病、豆科植物のモザイク病、ジャガイモのモザイク病、唐辛子の疫病及び炭疽病、白菜とダイコンの軟腐病、根頭癌腫病及び白菜白蛾、胡麻の細菌性の斑點病、イチゴの灰色かび病及び萎黄病、スイカの蔓割病、トマトの青枯病、キュウリのうどんこ病及び露菌病、タバコのタバコモザイク病、トマトの萎黄病、高麗人参の根腐病、綿の角斑病、林檎、梨、桃、キウイ、葡萄及びミカン等の果樹類の炭疽病と灰色かび病、林檎の腐らん病、ナツメ木の天拘巣病、ライグラス、アカクローバー、オーチャードグラス、アルファルファ（ａｌｆａｌｆａ） 等飼料作物のうどんこ病及び銹病、バラ、ガーベラ、カーネーション等の花卉類の灰色かび病と萎黄病、バラの黒斑病、グラジオラス及び蘭類のモザイク病、ユリの茎枯病等に強い耐性を示す。合わせて、前記形質転換植物は低温、水分不足、高い塩濃度等の各種ストレスに対しても高い耐性を示す。したがって、本発明の形質転換植物は農薬などの使用量を減らしながらも植物病に対する耐性を示すために、経済作物などの収穫量の増大等に大きく寄与することができるものと期待される。また、本発明を通じて植物体の病虫害の耐性にＪＡＭｅが主に関与することが明らかになったことによって、本発明のＪＭＴ 遺伝子及び酵素蛋白質は今後病虫害耐性の植物体の開発における新しいジャスモン酸メチル化酵素及びその遺伝子探索等に有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のジャスモン酸メチル化酵素（ＪＭＴ ）酵素の遺伝子がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ に挿入された、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）でクローニングしたジャスモン酸メチル化酵素（ＪＭＴ）のｃＤＮＡクローンｐＪＭＴの構造を示したものである。
【図２】シロイヌナズナからクローニングしたＪＭＴ 酵素のｃＤＮＡ遺伝子に由来する蛋白質のアミノ酸の配列と公知のサリチル酸メチル化酵素の遺伝子のＳＡＭＴに由来する蛋白質（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１３３０５３；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９） のアミノ酸の配列を比較して示す。
ＡｔＪＭＴ ：シロイヌナズナのＪＭＴ 酵素
ＳＡＭＴ：クラキアブルアリ（Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ） のサリチル酸メチル化酵素
【図３】ＪＭＴ 遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ に挿入してグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ酵素の融合蛋白質としてＪＭＴ 遺伝子を発現させるための組換え遺伝子ｐＧＳＴ−ＪＭＴの構造を示したものである。
Ｐｔａｃ：ｔａｃ プロモーター
アンダーライン：融合蛋白質を構成するＪ ＭＴ のアミノ末端の塩基及びアミノ酸配列
【図４】組換え遺伝子ｐＧＳＴ−ＪＭＴを大腸菌ＢＬ２１で大量に発現させた後、融合酵素の蛋白質を純粋分離して融合蛋白質の純度をＳＤＳ−電気泳動法で分析することにより測定した、融合蛋白質の純度を示す。
レーン１ ：蛋白質分子量のマーカー
レーン２ ：大腸菌ＢＬ２１／ｐＧＥＸ−２Ｔの全体蛋白質１５μｇ
レーン３ ：本発明のＪＭＴ 遺伝子を含むｐＧＳＴ−ＪＭＴベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１の全体蛋白質１５μｇ
レーン４ ：グルタチオンアガロースカラムの溶出液５ μｇ
レーン５ ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ カラム溶出液５ μｇ
【図５】純粋に分離した組換え酵素蛋白質ＧＳＴ−ＪＭＴ をジャスモン酸（ＪＡ）とＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ） を基質として反応させた後、ガスクロマトグラフィと質量分析によりジャスモン酸メチルエステル（ＪＡＭｅ ）の合成を確認した結果である。
Ａ ：標準ＪＡＭｅの分析結果
Ｂ ：酵素の反応産物の分析結果
【図６】前記で分離した融合酵素蛋白質ＧＳＴ−ＪＭＴ の種々の物質に対する反応の特異性を調べることにより、前記酵素がＪＡと［１４Ｃ］ＳＡＭを基質として使用してメチル化反応を特異的に促進することを確認したものである。
Ｃｏｎ ：基質としてＪＡを除いて［１４Ｃ］ＳＡＭを用いた酵素反応の結果
ＳＡ：基質でサリチル酸と［１４Ｃ］ＳＡＭを用いた酵素反応の結果
ＪＡ：基質でＪＡと［１４Ｃ］ＳＡＭを用いた酵素反応の結果
ＢＡ：基質で安息香酸と［１４Ｃ］ＳＡＭを用いた酵素反応の結果
【図７】形質転換及び野生型のシロイヌナズナの葉から抽出した蛋白質粗抽出物を利用して［１４Ｃ］ＪＡＭｅ 生産活性を調べた結果を示したグラフである。
●：形質転換植物の蛋白質粗抽出物
○：野生型植物の蛋白質粗抽出物
【図８】ＪＭＴ 遺伝子を植物形質転換用発現ベクターｐＢＩ１２１に挿入して構築した組換えｐＣａＪＭＴ遺伝子の構造を示したものである。
ＣａＭＶ：カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ プロモーター
【図９】形質転換されたシロイヌナズナにＪＭＴ 遺伝子が正しく挿入されたかの可否を確認するためにゲノムサザンブロット分析した結果である。
レーンＷ ：野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ） シロイヌナズナ
レーンＴ ：形質転換体（ｔｒ ａｎｓｇｅｎｉｃ）シロイヌナズナ
ＣａＭＶ：ＣａＭＶプロモーター配列をプローブとして使用した結果
ＡｔＪＭＴ ：ＪＭＴ 遺伝子配列をプローブとして使用した結果
【図１０】形質転換されたシロイヌナズナでＪＭＴ 遺伝子が過剰発現されているかの可否（１，２，３） とジャスモン酸により誘導される植物体の耐性関連遺伝子等の発現可否をノーザンブロット分析で確認した結果である。
レーンＷ ：野生型シロイヌナズナ
レーンＴ ：形質転換体シロイヌナズナ
ＡＯＳ ：酸化アレン合成酵素（ａｌｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ） に対するプローブ遺伝子
ＤＡＨＰ：３−ジオキシ−Ｄ− アラビノ− ヘプロソネイト ７− リン酸合成酵素 （３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ ７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ） に対するプローブ遺伝子
ＪＲ２ ：ジャスモン酸反応蛋白質 ２（ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）に対するプローブ遺伝子
ＪＲ３ ：推定アミノヒドロラーゼ（ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ） に対するプローブ遺伝子
ＬＯＸ ＩＩ：リポキシゲナーゼ ＩＩ（ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ＩＩ）に対するプローブ遺伝子
ＶＳＰ ：植物貯蔵蛋白質（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）に対するプローブ遺伝子
【図１１】形質転換及び野生型のシロイヌナズナに、灰色かび腐敗の原因生物体としての灰色かび病原菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）を接種して、植物体のかび病耐性を調べた結果を示す写真である。
左側：野生型シロイヌナズナ
右側：形質転換シロイヌナズナ
【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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