(57)【要約】病的細胞を標的化し治療するための均質な複合体であって、抗癌剤及び標的化タンパク質を含み、前記抗癌剤が温熱増感剤、光増感剤、及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択される複合体、このような複合体を作製するための方法、複合体を使用するための方法。標的化タンパク質は、トランスフェリンであることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化剤及び生体影響性物質を含む実質的に均質な複合体であって、前記生体影響性物質が光増感剤、温熱増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択され、前記標的化剤がトランスフェリン、ソマトスタチン、上皮成長因子、葉酸及びトランスコバラミンからなる群から選択され、かつ二量体、三量体及び凝集体を実質的に含まない複合体。
【請求項２】
標的化剤がトランスフェリンである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
生体影響性物質が光増感剤である、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
光増感剤がポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸、メタテトラヒドロキシフェニルクロリン及びヘマトポリフィリン誘導体からなる群から選択される、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
生体影響性物質が温熱増感剤である、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
温熱増感剤がヘマトポリフィリン、ベラパミル、ベロマイシン、カルボプラチン、ドキソルビシン、及びシスプラチンからなる群から選択される、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
生体影響性物質がアポトーシス誘導化合物である、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
アポトーシス誘導化合物がデフェロキサミンである、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
所定の薬剤対タンパク質の比を有する複合体を作製するための方法であって、
ａ）薬剤の溶液をモル過剰の連結分子の溶液に一滴ずつ加えて、それぞれの薬剤分子を１つの連結分子に連結させて薬剤／連結分子の組み合わせにする工程であって、前記薬剤分子がデフェロキサミンであるときは、２つの薬剤分子が１つの連結分子に結合する工程と、
ｂ）薬剤／連結分子の組み合わせをタンパク質に加えて、所定の薬剤対タンパク質の比を有する複合体を生成させる工程、を含み、
かつ、前記薬剤は温熱増感剤、光増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択される方法。
【請求項１０】
任意の過剰な連結分子を除去する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
連結分子がグルタルアルデヒド、ベンゾイルヒドラゾン、マレインイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
薬剤がポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸、メタテトラヒドロキシフェニルクロリン、ヘマトポリフィリン誘導体、ヘマトホスフィリン、ベラパミル、ドキソルビシン、シスプラチン、及びデフェロキサミンからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
病的細胞を治療するための試薬キットであって、
鉄含有トランスフェリン及びタンパク質標的化剤及び生体影響性物質を含む複合体を含み、
かつ、前記生体影響性物質が温熱増感剤、光増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択されるキット。
【請求項１４】
抗癌剤に対する腫瘍細胞の感受性を判定するための試薬キットであって、
タンパク質標的化剤及び抗癌剤をそれぞれ含む２つ以上の複合体を含み、前記抗癌剤が温熱増感剤、光増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択され、
かつ前記複合体が異なる抗癌剤を有するキット。
【請求項１５】
温熱療法の影響を受けやすい腫瘍を選択的に治療するための方法であって、
前記抗癌剤が温熱増感剤である、抗腫瘍有効量の請求項１に記載の複合体を前記腫瘍を有する患者に投与すること
及び
前記腫瘍において制御された温度上昇を生み出すことを含む方法。
【請求項１６】
温熱増感剤がヘマトポリフィリン、ベラパミル、ベロマイシン、カルボプラチン、ドキソルビシン、及びシスプラチンからなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
制御された温度上昇が、ＹＡＧレーザー、無線周波数または超音波に腫瘍を曝すことよって生み出される請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
光力学療法の影響を受けやすい病的細胞を選択的に治療するための方法であって、
前記抗癌剤が光増感剤である、抗腫瘍有効量の請求項１に記載の複合体を腫瘍を有する患者に投与すること、及び
前記腫瘍を適切な波長の光に曝して前記光増感剤を活性化させることを含む方法。
【請求項１９】
光増感剤がポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸、メタテトラヒドロキシフェニルクロリン、及びヘマトポリフィリン誘導体からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
鉄摂取制限療法の影響を受けやすい腫瘍を選択的に治療するための方法であって、腫瘍を有する患者に抗腫瘍有効量の請求項１に記載の複合体を投与することを含み、かつ前記抗癌剤が鉄を制限するアポトーシス誘導化合物である方法。
【請求項２１】
遊離鉄またはトランスフェリン結合鉄を患者に投与することをさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
鉄を制限する前記アポトーシス誘導化合物がデフェロキサミンである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
標的細胞を選択的に治療するための方法であって、標的細胞と請求項１に記載の複合体と接触させること、かつ抗癌剤がアポトーシス誘導化合物であることを含む方法。
【請求項２４】
遊離鉄またはトランスフェリン結合鉄を標的細胞に投与することをさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
薬剤耐性標的細胞を選択的に治療するための方法であって、
請求項１に記載の複合体において、前記抗癌剤が光増感剤及び温熱増感剤からなる群から選択される複合体と標的細胞を接触させること、及び
前記標的細胞を制御された温度上昇または適切な波長の光に曝すことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞などの病的細胞の治療において有用な生体影響性物質の分野、より具体的には標的化剤と生体影響性物質の複合体に関するものであり、この生体影響性物質は温熱増感剤、光増感剤またはアポトーシス誘導化合物である。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における２つの最も深刻な問題は、患者を衰弱させる薬剤毒性、及び多量の薬剤用量にも通常は対抗し、薬剤毒性の問題を増幅させ、死をもたらすことが多い薬剤耐性である。薬剤毒性の問題を解決するための１つの方法は、癌細胞にのみ送達させるために薬剤を標的化することである。多くの研究者は、薬剤を標的細胞に送達させるための抗体を開発するために作業しており、この手法は将来性があるが、抗体が問題を伴わないわけではない。例えば、抗体は正常な組織に結合することが多く、血管に損傷を与え（例えば血管漏出症候群）、危険なアレルギー反応（例えばアナフィラキシー）を引き起こす可能性もある。
【０００３】
特許文献１〜４中に記載されたように、トランスフェリンと、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトキセレート、ビンクリスチン、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、及び、放射性ヨウ素の複合体の使用に関する研究も進行している。これらの特許中に記載された発明は、抗体は使用しない。その代りに正常なヒトの血管中で見られるタンパク質を使用する。このタンパク質は、鉄を送達するトランスフェリンである。正常な細胞が鉄を必要とすることは珍しいが、癌細胞は、その病気により増大した代謝速度を維持するために、多量の鉄を必要とする。癌細胞はより一層の鉄を必要とするので、癌細胞はその表面上にほぼ永続的にトランスフェリン受容体を有しているが、一方で正常な細胞は有していない。これらの発明は、トランスフェリンと結合させた抗癌剤を投与することによってこれらの受容体を利用し、これによって実質的に癌細胞の表面のみに薬剤を送達する。
【０００４】
薬剤標的化は正常な細胞に危害を加えることはなく、あまり薬剤を必要とせず、薬剤毒性を大幅に低下させることができる。対照的に、標的化なしで抗癌剤を投与すると、抗癌剤は正常な細胞及び癌細胞を殺傷する。これらは免疫系の細胞、及び血液凝固の原因である系に対して特に毒性がある。従って、感染及び出血が癌患者の化学療法における主な合併症となっている。これらの合併症は、患者にとって不快であり、高価なサービス、入院、集中的なケア、及び生命維持システムを必要とする。標的送達系を使用することによって、これらの問題は大抵防ぐことができる。
【０００５】
薬剤毒性の問題は、多大な医者及び看護婦の時間を消費させ、癌治療の大部分のコストの原因である。例えば、腫瘍研究者への約７０％の問い合わせは、薬剤毒性の問題に関するものであることは一般的に理解されている。今日、少量の薬剤を使用すること以外には、薬剤毒性を治療するための満足の行く方法は存在しない。標的送達を行わない場合、薬剤耐性がある癌に対して少量の薬剤を使用することは無効である。標的送達では少量の薬剤を使用することができる。なぜなら、より多量の投与薬剤が、身体中に非特異的に分配されるのではなく、癌細胞に特異的に送達されるからである。この意味で、標的送達はライフルで射撃するようなものであり、一方従来の送達はショットガンで射撃するようなものである。薬剤毒性の問題の１つの解決策は、癌患者の化学療法を劇的に変えることであろう。化学療法のこのような悪影響を減らすことは、本発明の目的である。
【０００６】
薬剤耐性の問題は、薬剤毒性の問題と同程度に深刻である。この問題は、治療され数ヶ月間続く無症候性の寛解期に、いかなる知られている薬剤にももはや応答しない形であって後に癌の再発が見られる患者において象徴されるものである。薬剤耐性のかかる傾向は非常に一般的であるが、多量のより強力な薬剤を使用すること以外、今日満足の行く解決策は存在せず、従って重大な薬剤毒性の問題を引き起こす可能性があり、死をもたらすことが多い。従って、薬剤耐性の問題のための解決策によって、薬剤毒性の問題が大幅に減少すると思われる。ベラパミルなどのＰ−糖タンパク質阻害物質（非特許文献１）、シクロスポリン（非特許文献２）及びＳＤＺＰＳＣ８３３などのシクロスポリン誘導体（非特許文献３）、及びタモキシフェン（非特許文献４）の使用に、主な尽力が傾けらていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これらの手法は臨床的に満足の行くものとはなっていない。なぜなら、これらによって化学療法剤の薬物動態において新しい問題がもたらされたからである（非特許文献５）。
【０００８】
他の手法は、ＭＤＲ可逆性薬剤の設計（非特許文献６）、Ｐ−糖タンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用（非特許文献７）、抗ＭＤＲリボザイムのレトロウイルス仲介の移動の使用（非特許文献８）、及びＭＤＲまたはＭＲＰポンプによって癌細胞から除去されることがない化学療法剤の設計（非特許文献９）であるが、これらの研究はいずれも、薬剤耐性の臨床的な問題のための解決策は与えていない（非特許文献１０）。
【０００９】
他の手法は、アルブミン（非特許文献１１）、α−フェトプロテイン（非特許文献１２）及びデキストラン（非特許文献１３）などの大きな分子の複合体として抗癌剤を送達することによって、ＭＤＲ／ＭＲＰポンプを回避することである。これらは実験的な薬剤耐性を回避するために色々と有効であるが、これらは患者においては証明されていない。
【００１０】
タンパク質標的型の薬剤送達によって、薬剤耐性の問題を克服することができる。従って、本発明の他の目的は、薬剤耐性がある癌による、痛みを伴う高価な死の問題を解決することである。
【００１１】
生体に影響を与える分子と結合したタンパク質の有効性は実証されてきており、前述の米国特許中に記載されている。しかしながら、癌細胞などのストレスを受けた細胞の治療における、このような複合体の有効性は、凝集した複合体の存在、あるいは、生体に影響を与える分子とタンパク質断片、または２つまたは３つのタンパク質分子の複合体の存在によって低下する。そして、タンパク質と生体に影響を与える分子の比が１：１または１：２に近づくときに、その生体に影響を与える分子に応じて大幅に向上する。これまでは、有効性が高い複合体を得ることは、生体に影響を与える分子とタンパク質の望ましい平均比を有する複合体の分画を、タンパク質断片、複数のタンパク質と結合したこのような分子、及び、複数の生体に影響を与える分子と結合したタンパク質を含む大きなサンプル、から分離させることを必要とし、これらは緩慢、冗長かつ高価なプロセスであった。タンパク質成分は所定数の生体に影響を与える分子を保有しており、均質なタンパク質−薬剤複合体を使用することによって、薬剤耐性及び薬剤感受性癌細胞の両方を、さらに効果的に殺傷することができる。これまでは、このような複合体を商業化することに関して、及び、それらを薬中に広く使用することに関し、有用な体積の有用な複合体を生成させる際の固有の出費及び無効性が問題となってきた。実質的に均質な薬剤−タンパク質複合体に関する必要性、及び有効で、正確で、コストのかからないような複合体を作製する方法に関する必要性が存在する。さらに有効な方法によって作製されるこのような均質な複合体を提供することは、本発明の１つの目的である。
【００１２】
関連技術の説明
ヒト癌細胞のトランスフェリン受容体の最初の報告は、１９８０年のＦａｕｌｋ及びその同僚によるものであった（１）。以下の表中に示すように、異なるタイプのヒトの癌中の、トランスフェリン受容体の多数の報告がこの報告に続いた（２）。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
正常な細胞及び癌細胞上のトランスフェリン受容体
ヒトの癌のすべてが上方制御型トランスフェリン受容体を有しているかどうか、あるいは正常な細胞すべてが下方制御型トランスフェリン受容体を有しているかどうかに関する試験は１つも存在していないが、多くの方面からのデータによって、両方の質問に対する答えはイエスであることが示唆される。例えば、未熟な赤血球（すなわち正赤芽球及び網状赤血球）はその表面上にトランスフェリン受容体を有しているが、成熟した赤血球は有していない（１７）。循環性単球も上方制御型トランスフェリン受容体を有しておらず（１８）、クッパー細胞を含めたマクロファージは、赤血球貪食というトランスフェリン非依存性の方法によって、その鉄の大部分を得る（１９）。実際、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験によって、血漿トランスフェリンから細網内皮系に入る鉄はほとんどないことが示される（概要に関しては、（２０）を参照のこと）。マクロファージのトランスフェリン受容体は、γ−インターフェロンなどのサイトカインによって（２１）、おそらく細胞内寄生虫を殺傷するための鉄摂取制限機構として（２２）下方制御される。
【００１５】
休止状態のリンパ球では、トランスフェリン受容体が下方制御されるだけでなく、トランスフェリン受容体の遺伝子は測定不能である（２３）。対照的に、刺激されたリンパ球では、トランスフェリン受容体がＧ１後期に上方制御される（２４）。受容体の発現は、ｃ−ｍｙｃ原腫瘍遺伝子の発現の後に起こり、ＩＬ−２受容体の上方制御が続き（２５）、鉄摂取制御型のタンパク質結合活性の測定可能な増加が伴い（２６）、トランスフェリン受容体のｍＲＮＡを安定化させる（２７）。これはＴ及びＢリンパ球の両方に当てはまり（２８）、ＩＬ−２依存性の応答である（２９）。
【００１６】
トランスフェリンの受容体の上方制御をもたらす細胞の刺激としては、経験するストレスからのものであること、例えばウイルスまたは原生動物因子によって及び癌細胞によって侵入された細胞によるものであることが知られている。
【００１７】
正常な細胞及び腫瘍細胞のトランスフェリン受容体の上方及び下方制御は、抗原またはレクチン刺激の試験（すなわち受容体の上方制御）、及びレチノイン酸を使用する分化モデルの試験（３０〜３３）（すなわち受容体の下方制御）によって示されてきている。これらの実験モデルからの基準データによって、大部分の正常の、成体の、休止状態のヒト細胞の原形質膜からの、これらの受容体が下方制御されることが示唆される（３４）。例外としては、母胎児関門及びそのトランスフェリン受容体が豊富な合胞体栄養細胞（３５）、血液脳関門及びそのトランスフェリン受容体が豊富な毛細管内皮細胞（３６）、及び血液精巣関門及びそのトランスフェリン受容体が豊富なスルトリ細胞（３７）を含めた、循環関門系である。
【００１８】
実験動物におけるトランスフェリン−薬剤複合体
トランスフェリン−薬剤複合体の有効性は、いくつかの動物モデルにおいて調査されてきている。例えば、トランスフェリンとジフテリア毒素の複合体によって、第１４日にヌードマウス中の異種移植によるグリオーマが９５％減少し、グリオーマは第３０日まで再発することはなかった（７４）。グルタルアルデヒドで調製したトランスフェリン−ドキソルビシン複合体は、ヒト中皮腫細胞による死からヌードマウスを救済すること、ドキソルビシンのみで処理した動物と比較して大幅に寿命が長いことが見出されている（７５）。さらに、トランスフェリンは、ビオチン−ストレプトアビジン技術を使用することによって単純ヘルペスチミジンキナーゼに結合しており、これらの複合体は、転移性Ｋ５６２腫瘍細胞を接種したヌードマウスの寿命を大幅に延ばした（７６）。最後に、ヌードマウスにおけるヒトトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の最大耐量は、複合体に関して２０ｍｇ／ｋｇ（ｉｖ）、遊離薬剤に関してわずか８ｍｇ／ｋｇ（ｉｖ）であることが見出されている（４１）。
【００１９】
ヒト患者におけるトランスフェリン−薬剤複合体
トランスフェリン−薬剤複合体の２つの臨床報告が存在する。１９９０年に発表された１件目の報告は、１日当たり１ｍｇのグルタルアルデヒドで調製したトランスフェリン−ドキソルビシン複合体を用いた静脈内注射によって５日間治療した７人の急性白血病患者の予備試験であった。これらの低い用量によって毒性的な影響はなく、７人の患者の末梢血液中の白血病細胞の数は、治療後１０日以内に８６％減少した（７７）。さらに、治療の前後に骨髄生検を調べることによって評価したように、疾患が拡大することはなかった。
【００２０】
１９９７年にＮＩＨから発表された２件目の報告は、ジフテリア毒素の遺伝的変異体のチオエーテル結合トランスフェリン複合体で治療した再発性の脳癌を有する１５人の患者に関するものであった（４４）。高流量の隙間へのミクロ注入によって複合体が送達され、これによって霊長類の脳内において最小の炎症応答で、放射標識したトランスフェリンの有効な灌流が生み出されることが示されてきている（７８）。磁気共鳴映像法によって、完全に寛解した２症例を含めて、１５人中９人の患者の腫瘍体積が少なくとも５０％減少したことが明らかになった（４４）。
【００２１】
試験群（患者１２人）及びプラシーボ群（患者１１人）に無作為化した、卵巣癌が進行した２３人の患者の、未発表の臨床試験が存在する。試験群には、１ヶ月の治療サイクルの第１５日〜第１９日に、１日当たり１ｍｇのドキソルビシンに等しいトランスフェリン−ドキソルビシン複合体を与えた。診断と無作為化の間の時間が１８ヶ月のとき、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体で治療した患者の生存率のコックス回帰の推定値によって、有意な差が明らかになった。
【００２２】
他の未発表の試験は、従来のプロトコルによって治療しても応答がない右心房の肉腫からの転移性疾患を有する２２才の男性である。彼の肺には転移性病巣が充満しており、このとき彼の内科医である父親は、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体を使用するために、ＦＤＡからＩＮＤを得て、２０００年８月に治療を開始した。１１月までに肺は転移性病巣が実質的に除去され、１月までには腫瘍の放射線による形跡がなかった。彼は現在（２００２年５月）健康であり、トランスフェリン−ドキソルビシンのみが与えられている。
【００２３】
薬剤の標的送達には、少量の薬剤を使用しながら有効性を高め、これによって毒性を低下させ、正常な細胞に対する損傷をあまり引き起こさないという利点があり、これらすべてによってコストが効果的に減少し、患者のケアの質が向上する。標的送達によって、薬剤の細胞への非特異的な侵入によって活性化される、薬剤耐性も回避される（７９）。トランスフェリン−薬剤複合体は、受容体に特異的な経路によって特異的に細胞に侵入することができるので（８０，８１）、これらは耐性細胞中の輸送ポンプなどの、薬剤耐性機構の周辺を通される。
【００２４】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体は、多剤耐性細胞を効果的に殺傷することが１９９２年に報告された（８２）。この発見は１９９３年に確認され（８３）、１９９４（８４）、１９９６（８５）及び２０００（８６）に、いくつかのタイプの薬剤耐性細胞に広がった。興味深いことに、固形担体に固定されたドキソルビシンは、ドキソルビシン耐性細胞に対して有効であることも示されてきている（６０，８７）。実際、いくつかのペプチドベクターの１つを用いたドキソルビシンのベクター化が、多剤耐性を克服する際に有効であるという、概念が生じている（８８）。
【００２５】
トランスフェリン−薬剤複合体の作製。
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体を作製するための方法は、１９８４年に最初に発表され（３８）、その後トランスフェリン−薬剤複合体を作製するための方法の多くの報告が存在しており、そのうちのいくつかを以下の表中に挙げる。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
ドキソルビシンのトランスフェリン複合体は、グルタルアルデヒド仲介のシッフ塩基形成を使用することによって作製されてきており（５６，５７）、これによってトランスフェリンのε−アミノ酸のリジン基とドキソルビシンの３’アミノ酸位置の間に、酸耐性の結合が形成される。このようなドキソルビシンの複合体は、原形質膜仲介の機構によって癌細胞を殺傷することができる（概要に関しては、（５８）を参照のこと）。ＤＮＡ挿入はドキソルビシンによる細胞死の確立された機構であるが、細胞表面上の受容体に結合することができる、タンパク質と結合した固定型ドキソルビシンは、原形質膜仲介の機構を活性化させて、細胞を殺傷する（５９，６０）。従って、ドキソルビシンとトランスフェリン複合体は、ドキソルビシン及びトランスフェリン受容体の両方にと関連がある原形質膜仲介の機構を活性化させることによって、細胞を殺傷するようである。
【特許文献１】
米国特許第５，１０８，９８７号
【特許文献２】
米国特許第５，０００，９３５号
【特許文献３】
米国特許第４，８９５，７１４号
【特許文献４】
米国特許第４，８８６，７８０号
【非特許文献１】
Ｆｏｒｄ，Ｈｅｍａｔｏｌ／Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ  １９９５；９：３３７
【非特許文献２】
Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９４；１２：８３５
【非特許文献３】
Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；８９：１２２０
【非特許文献４】
Ｐｏｍｍｅｒｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９４；１２０：４２２
【非特許文献５】
Ｓｉｋｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９７；４０：Ｓ１３
【非特許文献６】
Ｎａｉｔｏ  ＆  Ｔｓｕｒｕｏ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９７；４０：Ｓ２０
【非特許文献７】
Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １９９５；６：１２４
【非特許文献８】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；１０：１１８５
【非特許文献９】
Ｍａｎｋｈｅｔｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９６；４９：５３２
【非特許文献１０】
Ａｒｃｅｃｉ，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２０００；１１０：２８５
【非特許文献１１】
Ｏｈｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９３；５３：４２３８
【非特許文献１２】
Ｍｏｓｋａｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ  １９９７；２１：７９３
【非特許文献１３】
Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６；１６：３７７３
【非特許文献１４】
Ｂｅｒｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １９９３；３００：３５６
【非特許文献１５】
Ｓａｓｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊａｐ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９３；８４：１９１
【非特許文献１６】
Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  １９９８；８７：３３８
【非特許文献１７】
Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １９９９；１５：３４５；Ｒａａｐｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９９８；５：９７１；Ｍａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；１９：３４０３
【非特許文献１８】
Ｓｕｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄ  Ｂｉｏｌ  １９９９；７５：７３９；Ｈａｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ２０００；８８：１３２
【非特許文献１９】
Ｋｈａｄｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １９９９；３７０：１６３
【非特許文献２０】
Ｓｔｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９９；４３：１０６
【非特許文献２１】
Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １９９７；７９：２１４
【非特許文献２２】
Ｒａａｐｈｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９９８；５：９７１；Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｒｕｒｇｉｅ  １９９９；１２４：３７５
【非特許文献２３】
Ｗｅｓｓａｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １９９９；１５：４５５
【非特許文献２４】
Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｉｎ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  １９９９；２５：８７１
【非特許文献２５】
Ｇｒａｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｙ  １９９９；１０９：４４７
【非特許文献２６】
Ｗｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １９９８；１４：４５９
【非特許文献２７】
Ｆｉｎｇｅｒ，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９９７；１０４：１７９４
【非特許文献２８】
Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １９９８；１４：５０３
【非特許文献２９】
Ｓｈｃｈｅｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａ１．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  １９９７；１３：５４７
【非特許文献３０】
Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９７８；３８：２６２８
【非特許文献３１】
Ｈａｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ  １９８２；８１：２６９
【非特許文献３２】
Ｓｈａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０００；３１９：３７６
【非特許文献３３】
Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ  １９９７；１４８：３８６
【非特許文献３４】
Ｏｃｈｓｎｅｒ，Ｊ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  １９９７；３９：１
【非特許文献３５】
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＆  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ；Ｊ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  １９９２；５５：１４５
【非特許文献３６】
Ｌｕｏ  ＆  Ｋｅｓｓｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍ  １９９６；２２１：７２
【非特許文献３７】
Ｓｔｅｆａｎｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒｏ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０００；１０：３５１
【非特許文献３８】
Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｕｒｇ  ２０００；２６：７６５
【非特許文献３９】
Ｇａｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｅｎｄｏｓｃｏｐ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ  ２０００；１０：４６１
【非特許文献４０】
Ｄａｎｉｌａｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ  ２０００；２４：４２７
【非特許文献４１】
Ｈｏｎｇｃｈａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０００；１１５：１８３
【非特許文献４２】
Ｔａｎｎｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ  ２０００；４１：７４９
【非特許文献４３】
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【非特許文献４４】
Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ  １９９８；４８：２３３
【非特許文献４５】
Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９８；９０：８８９
【非特許文献４６】
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【非特許文献４７】
Ｂｒｏａｄｗｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏ１１９９６，１４２：４７
【非特許文献４８】
Ｍｏｏｓ  ＆  Ｍｏｒｇａｎ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２０００；２０：７７
【非特許文献４９】
Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｔ，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  １９９８；６：５３
【非特許文献５０】
Ｂｅｒｃｚｉ  ｅｔ  ａＬ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９３；２１３：４２７
【非特許文献５１】
Ｆｒｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９２；５２：６１９
【非特許文献５２】
Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９；２７４：２４０６６
【非特許文献５３】
Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ＆  Ｗａｌｋｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ＆  Ｔｈｅｒａｐ  １９９９；８３：６７
【非特許文献５４】
Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊａｐ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９３；８４：１９１
【非特許文献５５】
Ｂａｒａｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２；２６７：９４３７
【非特許文献５６】
Ｌｅａｒｄｉ  ｅｔ  ａ１．，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １９９８；１０２：７４６
【非特許文献５７】
Ｋａｓｓ  ＆  Ｏｒｒｅｎｉｕｓ，Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃ  １９９９；１０７（Ｓｕｐｐｌ  １）：２５
【非特許文献５８】
Ｓａｉｎｔｅ−Ｍａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９７；２５０：６８９
【非特許文献５９】
Ｔｓａｆａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９５；４７：４０３
【非特許文献６０】
Ｔｓａｆａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９７６；１２７：５７４
【非特許文献６１】
Ｙｅｈ  ＆  Ｆａｕｌｋ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９８４；３２：１
【非特許文献６２】
Ｖｉｓｉｔｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９４；５１：２５１５
【非特許文献６３】
Ｓｅｅｔｈｅｒａｍ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  １９９９；１９：１７３
【非特許文献６４】
Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｅｒｆｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  １９９７；７５：５４
【課題を解決するための手段】
【００２８】
標的化剤−薬剤複合体には薬剤の送達法を変える一般的な可能性、ならびに癌患者への薬剤の送達法を変える具体的な可能性があることは明らかである。本発明では、トランスフェリン、セルロプラスミンなどの非抗体タンパク質、トランスコバラミンなどのビタミン結合タンパク質、ホルモン、ソマトスタチン、サイトカイン、低密度リポタンパク質、成長因子、成長因子様分子を、抗癌性化合物と組み合わせて標的化剤として使用する。トランスフェリン及びトランスコバラミンは、薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞に化合物を送達させるための優れた担体であるので、本発明の標的送達系は、温熱増感剤、光増感剤及びアポトーシス誘導化合物からなる群から選択される抗癌性化合物に結合した、トランスフェリンまたはトランスコバラミンからなることが好ましい。
【００２９】
本発明は、標的化剤と抗癌剤の複合体に関する。本発明の標的化剤には、トランスフェリン、セルロプラスミン、ソマトスタチン、ビタミン、トランスコバラミンなどのビタミン結合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、低密度リポタンパク質、成長因子様分子、葉酸様分子及び成長因子があるが、これらだけには限られない。抗癌剤には、ヘマトポルフィリン及び少量のベラパミルなどの温熱増感剤、デフェロキサミンなどのアポトーシス誘導化合物、及びポルフィマーナトリウム（ｐｒｏｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍ）、メタテトラヒドロキシフェニルクロリン、及びヘマトポリフィリン誘導体などの光増感剤があるが、これらだけには限られない。標的化剤は、トランスフェリンまたはトランスコバラミンであることが好ましい。抗癌剤と標的化剤は、連結基によって結合していることが好ましい。適切な連結基には、グルタルアルデヒド（非特許文献１４）、ジスルフィド結合（非特許文献１５）、及びベンゾイルヒドラゾン（非特許文献１６）があるが、これらだけには限られない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
トランスフェリン−温熱増感剤複合体
温熱療法は単独で、あるいは化学療法及び放射線療法と組み合わせて、癌治療において広く使用されている（非特許文献１７）。組み合わせ治療では、温熱療法剤（４１〜４５℃）は、有効な放射線増感剤であることが示されてきている（非特許文献１８）。熱によって、ブレオマイシン（非特許文献１９）、カルボプラチン（非特許文献２０）、ドキソルビシン（非特許文献２１）、及びシスプラチン（非特許文献２２）などの、いくつかの抗癌剤の細胞毒性効果が高まる。温熱療法は、いくつかの療法に耐性がある悪性腫瘍において使用され（非特許文献２３）、高温（５０℃を超える）での温熱療法が、従来の侵襲的手術の代替法として、選択的に組織を破壊するために使用されてきている（非特許文献２４）。
【００３１】
温熱療法の有効性は、療法による温度上昇を局在させ維持するための能力に強く依存する（非特許文献２４）。より良い結果を得るために、いくつかの技法を使用して、組織中での制御された温度上昇が生み出されている。これらの技法のいくつかは、ＹＡＧレーザー（非特許文献２５）、無線周波数（非特許文献２６）、超音波（非特許文献２４）、及びマイクロ波（非特許文献２７）の使用に関するものである。温熱療法は高温においてより有効であるが、熱による損傷から健康な組織を保護するための必要性によって、その使用は制限される。
【００３２】
通常の体温では毒性ではないいくつかの化合物においては、熱は毒性を誘発する。この一例としてはヘマトポルフィリンである。この分子は、４１．５℃では強力な温熱（または温熱療法）増感剤であり、その増感能力は用量依存式に増大する（非特許文献２８）。温熱（または温熱療法）増感剤の他の例は、４２℃での少量のベラパミルの使用である（非特許文献２９）。温熱増感剤が局所の温度を上昇させることはない。熱の存在下で高い局所毒性を生み出すことによって、これらは機能する。
【００３３】
体温より高い温度で毒性を生み出す非毒性化合物、または高温においてその毒性が高まる毒性化合物を癌細胞のみに送達させることができる場合、温熱療法をさらに有効に使用して、癌を治療することができると思われる。このような標的送達系は健康な組織に損傷を与えることはないと思われ、組織は高温の影響のみを受けると思われる。
【００３４】
本発明によって、高温で癌細胞に関する毒性が非常に高い化合物を、選択的に送達させる方法が導入される。この標的送達系は、温熱（または温熱療法）増感剤の担体としての、トランスフェリンの使用を含む。
【００３５】
温熱増感剤の標的送達の使用によって、温熱療法そのもの、あるいは他の治療と組み合わせた温熱療法の結果がさらに有効となると思われる。なぜなら、温熱増感剤の毒は、癌細胞中に濃縮させることができるからである。このようにして、健康な組織の損傷は最小限である。なぜなら、大部分の増感剤は比較的低い温度（例えば４１〜４２℃）で働くことができるからである。
【００３６】
トランスフェリンは、薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞に化合物を送達させるための優れた担体なので、本発明の標的送達系は、温熱増感剤と結合したトランスフェリンからなる。ヒト患者において使用するためのトランスフェリンは市販されている（例えばＦｉｎｎｉｓｈ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓから）。トランスフェリンと他の化合物を結合させるために、グルタルアルデヒド結合（非特許文献１４）、ジスルフィド結合（非特許文献１５）、及びベンゾイルヒドラゾン結合（非特許文献１６）などの、いくつかの結合法が使用されてきている。さまざまな結合手順によって、広範囲の増感剤をトランスフェリンに結合させることができ、増感剤とトランスフェリン分子の永続性または解離性の結合がもたらされる。選択した温熱増感剤にトランスフェリンが結合した後に、例えばクロマトグラフィー及び／または透析技法を使用することによって、非結合成分から複合体を分離しなければならない。適切な温熱増感剤の例には、ドキソルビシン、シスプラチン及びヘマトポリフィリンがあるが、これらだけには限られない。
【００３７】
トランスフェリン−光増感剤複合体
癌の光化学療法は、光力学療法（ＰＤＴ）と呼ばれることが多い。この形の療法は１９７０年代後期に生じ、局在する手術不能な病巣の治療の代替形として登場した（非特許文献３０）。この療法は、代謝的変化を必要とする可能性がある腫瘍を局在させる物質（例えばプロドラッグ）の投与に関するものであり（非特許文献３１）、後に特定の波長の光線によって物質が活性化される（非特許文献３２）。これによって、血栓症（非特許文献３５）及びアポトーシス（非特許文献３６）による、腫瘍壊死（非特許文献３４）を開始させる一重項酸素（非特許文献３３）の生成などの、一連の光化学的及び光生物学的反応の生成がもたらされる。
【００３８】
１９９０年代のＰＤＴの進展には、より長い波長を吸収し活性化のためのエネルギーをあまり必要とせず、より深く透過することができ、さらに有効な光増感剤の開発が含まれている。難しい幾何形状の照明を可能にする、新しい光ファイバーも開発されてきており、小さく、安値でさらに可動的なレーザーがより容易に入手可能になってきている。この研究及び開発によってＰＤＴが、癌の初期治療のため、及び大きな腫瘍の外科的減少法を補助するための、より広く使用される治療用の物理的療法に進化している。
【００３９】
ＰＤＴによる治療は、基底細胞癌（非特許文献３７）、リンパ腫（非特許文献３８）、胃癌（非特許文献３９）、及び白血病（非特許文献４０）を含めた、広範囲のさまざまな癌において使用されてきている。実際、最近の報告では、ＦＤＡに承認された光増感剤Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（ポルフィマーナトリウム）によって治療されてきている６０タイプを超える癌を挙げている。癌治療におけるその使用に加えて、皮膚科学（非特許文献４１）、眼科学（非特許文献４２）においてもＰＤＴが使用されてきており、近年ＰＤＴは、血管形成手順において使用されてきている（非特許文献４３）。
【００４０】
ＦＤＡの承認を得るための最初の光増感剤は、カナダのＱＬＴ  Ｐｈｏｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって製造されたＰｈｏｔｏｆｒｉｎであった。他の広く研究されている光増感剤は、アミノレブリン酸である。臨床試験中の他の分子は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＵｐｊｏｈｎによってＰｕｒｌｙｔｉｎとして製造されたクロリン光増感剤である、ＳｎＥＴ２である。また、他の化合物としては、Ｓｃｏｔｉａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによってＦｏｓｃａｎとして製造された、メタテトラヒドロキシフェニルクロリンである、ｍＴＨＰＣがある。黄斑変性は、ヘマトポリフィリン誘導体である光増感剤Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎを使用することによって阻害されてきている。光増感剤として使用されたこれらの及びいくつかの他の化合物は、Ｓｔｅｗａｒｔ及びその同僚（非特許文献４４）、及び、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びその同僚によって（非特許文献４５）報告されてきている。
【００４１】
トランスフェリン受容体の存在は、Ｆａｕｌｋ及びその同僚によって非特許文献４６中に最初に記載されたように、主に腫瘍細胞の表面に限られるので、光増感剤の担体としてトランスフェリンを使用することによって、薬剤が癌細胞のみを標的とすることがほぼ保証され、従ってＰＤＴの影響を腫瘍に、腫瘍のみに局在させることができる。正常な細胞の付随的な損傷を最小限にすることに加えて、トランスフェリンの複合体としての光増感剤薬剤の標的化によって、低用量の薬剤の使用が可能になり、いくつかの薬剤の副作用は低下するであろう。例えば、Ｐｈｏｔｏｐｒｉｎで治療した何人かの患者が遭遇する太陽光感受性は用量関連の問題である。
【００４２】
トランスフェリンの複合体としての光増感剤薬剤の、癌細胞の表面上のトランスフェリン受容体への送達を標的化する本発明は、担体の生物学的性質に由来する、いくつかの利点を有する。これらの最も重要なものは、血液脳関門を交差するトランスフェリン薬剤複合体の性質である（非特許文献４７）。この性質は、血液脳関門の微小循環をもたらす内皮細胞の管腔表面上のトランスフェリン受容体の通常の存在によって、分子に与えられる（非特許文献４８）。
【００４３】
血液循環からの分子をトランスフェリンの複合体として脳に送達させるために、これらが使用されてきており（非特許文献４９）、これによって脳癌を有する患者におけるＰＤＴの標的型の使用が可能である。
【００４４】
トランスフェリンを光増感剤薬剤の理想的な担体として位置付けているトランスフェリンの他の生物学的性質として、それがトランスフェリン受容体と結合した後に細胞中に貪食されることがある（非特許文献５０）。この性質によって、光増感剤を癌細胞の内部に局在させることができ、これによって薬剤が濃縮され、殺傷が増大する。この点において、トランスフェリンのドキソルビシン複合体は、１０倍高濃度の遊離ドキソルビシンによって殺傷されないドキソルビシン耐性癌細胞を殺傷するために使用されてきていることと関連がある（非特許文献５１）。
【００４５】
以下の検討では、トランスフェリンは標的化タンパク質の例示的なものである。トランスフェリンは正常な血液の血漿から単離させることができ、Ａｍｅｒｉｃａｎ及びＦｉｎｎｉｓｈ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓを含めた任意のいくつかの会社から購入することができ、あるいは組み換え技術から調製することができる（非特許文献５２）。
【００４６】
薬剤とトランスフェリンとの複合体を形成するためには、トランスフェリン分子を、それを光増感剤薬剤に結合させるために調製するような方法で改変しなければならない。例えば、トランスフェリンをチオール化して、薬剤のマレイミド誘導体を形成することができる（非特許文献１６）。結合の正確な方法は、トランスフェリンと結合する光増感剤の化学的性質に依存する。例えば、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎは、エステル及びエーテル結合を含むポリポルフィリンであり、１タイプの担体（非特許文献５３）、グルタルアルデヒド及びその他の二官能性試薬を使用することによってトランスフェリンに結合することができるＮＨ２基を含む他の薬剤が、ジスルフィド結合を必要とすることが示唆されている（非特許文献５４）。広くさまざまな結合手順によって、広範囲の光増感剤薬剤をトランスフェリンに結合させることができ、トランスフェリン分子と薬剤の永続性または解離性の結合がもたらされる（非特許文献５５）。どのような手順を使用しても、結合反応の後には、薬剤−タンパク質複合体を、好ましくはクロマトグラフィーまたは透析技法を使用することによって、非結合薬剤及び／または遊離タンパク質から分離しなければならない。
【００４７】
トランスフェリン−アポトーシス誘導化合物複合体
癌の鉄摂取制限型の細胞毒性に関する機構は、プログラムされた細胞死の増強である。デフェロキサミンは、ヒト骨髄白血病細胞のアラビノシド仲介のアポトーシスを増大させることが見出されている（非特許文献５６）。アポトーシスに関する主用経路は、カルシウム仲介の下流のシグナリング、次にプログラムされた細胞死に関する表面受容体ＣＤ９５のリガンド結合を含むという、重要な証拠が存在している（非特許文献５７）。同様に、トランスフェリン受容体は、細胞内の遊離カルシウム濃度を増大させることによって、それ自体の循環のためにシグナル伝達分子として機能する（非特許文献５８）。総合的に考察すると、これらの一見無関係な観察結果によって、薬剤耐性癌細胞における、カルシウム、鉄、及びトランスフェリン受容体の間の、これまで記載されなかった関係が示される。
【００４８】
カルシウムとトランスフェリン受容体の間の関係を調べるために、トランスフェリン受容体の調節に対するカルシウムチャンネル阻害剤の影響を、薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞の療法において試験した。これらの実験の結果によって、有機（例えばベラパミル）及び無機（ＣｄＣｌ２）カルシウムチャンネル遮断剤の両方が、トランスフェリン受容体の制御に対して特異な影響を引き起こすことが示される。例えば、両タイプのチャンネル遮断剤が受容体の下方制御を開始させたが、薬剤感受性細胞よりも薬剤耐性細胞において、より一層の下方制御が観察された。下方制御の半減期は約８時間であったので、表面受容体の減少はエキソサイトーシスの阻害から生じたわけではなかった。遊離鉄またはトランスフェリン結合鉄を加えることも、トランスフェリン受容体の下方制御に対して特異な影響があった。影響は類似していたがさらに顕著であった。すなわち、鉄で下方制御された受容体が薬剤感受性細胞よりも薬剤耐性細胞上にはるかに多く、カルシウムチャンネル遮断剤とほぼ同じ半減期を生み出した。鉄及びカルシウムチャンネル遮断剤を加えることによって、細胞の生存能力に影響を与えることはなかった。
【００４９】
前述の発見を考慮して、他の実験系を行うことで、デフェロキサミンによって鉄を制限することが薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞に対して特異な影響があるかどうかを検討した。これらの実験の結果、低濃度のデフェロキサミンは、薬剤感受性細胞及び薬剤耐性細胞のトランスフェリン受容体を上方制御したが、高濃度のデフェロキサミンは、薬剤耐性細胞によるトランスフェリン受容体の発現を低下させることが明らかになり、生存能力の実験では、高濃度によって薬剤感受性細胞ではなく薬剤耐性細胞が殺傷されたことが示された。例えば、所与の濃度のデフェロキサミン中での４８時間後に、薬剤感受性細胞は９３％の生存能力を示したが、わずかに１６％の薬剤耐性細胞が生存していた。これら３つの異なるタイプの実験を要約することによって、薬剤耐性細胞中でのトランスフェリン受容体調節の著しい不安定性が明らかになり、鉄が欠乏することによって薬剤耐性細胞の死がすぐに引き起こされたことが示された。
【００５０】
本発明は、癌患者中の薬剤耐性細胞を、標的化し殺傷するための方法である。好ましい実施形態では、鉄キレート剤を薬剤耐性癌細胞に向ける薬剤担体の複合体を作製する。トランスフェリンは、鉄キレート剤を送達するのに充分適合する通常の血液中のタンパク質である。なぜなら腫瘍細胞は、その表面上にトランスフェリン受容体を有しており、通常、成体、休止状態の細胞は有していないからである（非特許文献１４）。トランスフェリンと結合することができ薬剤耐性癌細胞に送達することができる多くの鉄キレート剤が存在するが（非特許文献５９）、デフェロキサミンの化学的性質によって、それはトランスフェリンへの結合に充分適合したものとなっている（非特許文献６０）。グルタルアルデヒド（非特許文献６１）、ジスルフィド結合（非特許文献５４）、及びベンゾイルヒドラゾン結合（非特許文献１６）だけには限られないがこれらを含めた、標的化剤と他の化合物を結合させるための、いくつかの複合または結合手順が考えられる。
【００５１】
広くさまざまな結合手順によって、広範囲の鉄キレート剤を標的化タンパク質に結合させることができ、細胞毒性薬剤とタンパク質分子の永続性または解離性の結合がもたらされる（非特許文献５５）。この結合反応の後に、薬剤−タンパク質複合体を、好ましくはクロマトグラフィーまたは透析手順を使用することによって、非結合薬剤及び遊離タンパク質から分離することができる。
【００５２】
複合手順の技術的な詳細は変わる可能性があるが、複合体は癌細胞に関する結合及び殺傷実験において活性がなければならず、多数の正常な細胞に結合したり、あるいはこれらを殺傷してはならない。これらの実験を考慮すると、本発明の複合体を作製するための好ましい方法は、以下のプロセスである。
【００５３】
所定のモル比を有する多量の均質なトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の合成を、ドキソルビシン（ＤＯＸ）の３’アミノ位置のアミノ基のみを使用して化学量論的に行って、ＤＯＸの生理食塩水溶液を、ＤＭＳＯなどの溶媒を含むグルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の生理食塩水溶液、または他の適切な凍結保存液に一滴ずつ加えることにより、ＧＬＵの２つの反応基の１つと反応させて、ＤＯＸとＧＬＵのモル比１：１の最終濃度にした。生成したＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を、暗所において室温で３時間攪拌した。
【００５４】
遊離ＤＯＸも遊離ＧＬＵも含まないＤＯＸ−ＧＬＵの最終溶液を生成するために、ＤＯＸとＧＬＵのモル濃度は前述の反応と同じであった。しかしながら、１つのＧＬＵが２つのＤＯＸと反応してＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸが生成する場合、溶液中に遊離ＧＬＵが存在する可能性があるが、一価のＤＯＸを二価のＧＬＵの溶液に一滴ずつ加えることによって生じる質量作用動態により、この可能性は最小限になる。これらの反応物の体積は制限されないので、多量の均質なＤＯＸ−ＧＬＵを調製することができる。
【００５５】
トランスフェリン（ＴＲＦ）の生理食塩水溶液に一滴ずつ加えることによって、ＤＯＸ−ＧＬＵを標的化タンパク質と複合させた。トランスフェリンは鉄を含まないか（アポトランスフェリン）、あるいは鉄が飽和していてよい（ハロトランスフェリン）。ＤＯＸとＴＲＦの所望のモル比を、ＴＲＦの体積を適切に調節することによって得た。生成したＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの溶液を、暗所において室温で２０時間攪拌した。ＤＯＸとＧＬＵの反応とは異なり、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦの反応は１つの結合部位に限られない。なぜなら、ＤＯＸ−ＧＬＵのＧＬＵ成分は、ＴＲＦ分子中のいくつかのε−アミノ酸のリジン基の、任意の１つと反応することができるからである。
【００５６】
ＴＲＦに結合するＤＯＸ分子の数を、計算によって決定した。例えば、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５個のＤＯＸ分子を含むと思われる。しかしながら、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４個のＤＯＸ分子を含むと思われる。同様に、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９個のＤＯＸ分子を含むと思われる。このようにして、ＤＯＸとＴＲＦが所定の比である多量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸを必要に応じて与えることができる。
【００５７】
複合体反応における他のステップは、エタノールアミン、または任意の過剰な連結基を除去するのに適した他の物質の添加、次に遠心分離及び透析であった。ＤＯＸとＴＲＦの反応は理論上はＧＬＵをすべて消費するが、エタノールアミンを最終反応混合物に加えて、任意の利用可能なＧＬＵを結合させた。この反応は、暗所において３０分間続けた。最終溶液を２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離にかけ、１００倍過剰の生理食塩水で６時間かけて２回透析し、同じ過剰のＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で３回透析し、生成したＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体が、使用するために用意された。
【００５８】
複合体の生化学的特性：
（３９）に記載されたのと同様にＨＰＬＣ及びポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することによって、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の均質性を検討することができる。（８９）に記載されたのと同様に分光光度法を使用することによっても、ＤＯＸとＴＲＦの分子比を検討することができる。これらの技法によって、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の一貫した均一性が繰り返し明らかになっている。さらにクロマトグラフィーは、これらの複合体の調製では必要とされない。なぜなら、凝集体または断片が存在しないからである。これによって多量の均質なトランスフェリン−薬剤複合体を作製することができ、収率が上がりコストは低下する。
【００５９】
他のタイプのトランスフェリン−薬剤複合体における、ＴＲＦ及びＤＯＸの損失によって引き起こされる犠牲は、それらを使用する障害となっている。例えば、ＤＯＸ及びＴＲＦの収率は、薬剤及び／またはタンパク質を変えるチオール化（４４）などの手法を経由することによって低下する。使用される溶媒系（８６）、又は、酸安定性及び酸不安定性の連結を作製するために使用するクロマトグラフィー（４１）によっても収率は低下する。ＤＯＸとＴＲＦの間に結合したＧＬＵは酸安定性であり（８９）、本発明に従って作製したＴＲＦ−ＤＯＸ複合体中のＤＯＸ及びＴＲＦの収率は高い。実際、他の手順（３８，３９，４０）と比較すると、本発明のＴＲＦの収率はほぼ２倍であり（９０％と５０％）、ＤＯＸの収率は５倍増大する。
【００６０】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体を作製するために知られている手法は、トランスフェリン１分子当たりの薬剤分子の数が所定の割合よなる均質な複合体を多量に生成することができない。さらに、他の手法はクロマトグラフィーを使用して凝集体を除去し、均質な複合体中に豊富な分画を採取する。これらの手順は収率を低下させ、コストを増大させ、分子比を予め決定する能力を欠いている。
【００６１】
他の手順は、１ミリリットルのトランスフェリン（０．５ｍＭ）と１ミリリットルのデフェロキサミン（８．５ｍＭ）を１５０ｍＭの塩化ナトリウム中で４分間混合し、次いで１５０ｍＭの塩化ナトリウム中に２１．５ｍＭのグルタルアルデヒド１ミリリットルを加え、４分間混合することである。前述の反応は結合手順であり、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）の中に３７．２ｍＭのエタノールアミン０．８ミリリットルを加え、４分間攪拌することによって、これを停止させる。次いで混合物（３．８ミリリットル）を透析チューブに移し（分子量カットオフ１２，０００〜１４，０００）、暗所において５℃で３時間かけて、０．５リットルのＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水に対して透析した。この透析は、フレッシュなＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水を用いて、少なくとも１度は繰り返さなければならない。次いで混合物を４℃において１６００ｇで１０分間遠心分離にかけ、その上澄みは、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水中で事前に平衡状態にし、ブルーデキストラン、トランスフェリン及びシトクロムＣに関して５℃で目盛り調整した、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂの２．６×３４ｃｍカラム上で、１時間あたりの流速２２ミリリットルでクロマトグラフィーにかける。カラムからの溶出を２８０ｎｍで監視し、３．８ミリリットルの分画を回収した。それぞれの分画中のトランスフェリン及びデフェロキサミンの濃度は、トランスフェリンに関しては２８０ｎｍ、デフェロキサミンに関しては３６５ｎｍを使用することによって決定した、トランスフェリン及びデフェロキサミンの標準曲線からの逐次近似値によって計算する。わずかな改変によって、この結合手順を使用して、疎水性逆相シデロホアのタンパク質複合体などの、他の鉄キレート剤の標的化タンパク質複合体を作製することができる。
【００６２】
複合体の特性決定
純粋な薬剤−タンパク質複合体を単離した後、それらをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特定し、それらの分子量を決定し、タンパク質１分子あたりの薬剤分子の数を決定する。トランスフェリン１分子あたりの薬剤分子の正確な数は、吸光光度技法だけには限られないがこれを含めた任意の適切な技法を使用して、決定することができる。官能性薬剤とタンパク質の比は、約０．１：１．０と３．０：１．０の間である（非特許文献１４）。複合体を調べて、それらが腫瘍細胞の表面上の受容体に結合するかどうかを決定し、複合体が正常な細胞ではなく癌細胞を殺傷するかどうかを決定する。癌細胞に結合し正常な細胞には結合しない複合体のみを、薬剤感受性及び薬剤耐性癌細胞を使用する毒性試験用に選択する。結合試験はフローサイトメトリーまたは任意の他の適切な方法を使用して行うことができ、殺傷試験はミクロ培養技法を使用して、同数の癌細胞を殺傷するのに必要とされる薬剤−タンパク質複合体中の薬剤の濃度と比較して、癌細胞の培養物５０％を殺傷するのに必要とされる遊離薬剤の濃度を決定することによって行うことができる。温熱増感剤の複合体を試験するときは、ＭＩＴテトラゾリウム非色アッセイ（非特許文献６２）を使用することによって毒性試験を行う。これらの毒性試験によって、薬剤感受性及び薬剤耐性細胞の熱感度を最大にするための、最も有効なトランスフェリン増感剤比及び複合体の最適濃度が決定される。薬剤−タンパク質複合体中の薬剤と比較して、約１０倍を超える遊離薬剤が、同数の細胞を殺傷するために必要とされる。
【００６３】
前述の記載はトランスフェリンが送達可能なタンパク質であることを指すが、細胞上の受容体部位に結合することができる他のタンパク質が、身体中に存在することが知られている。このような受容体部位が癌細胞中において活性化され、正常な細胞中では不活性である場合、このような受容体部位に結合する任意のタンパク質または他の分子（すなわちリガンド）を使用して、本発明で使用する薬剤を送達することができる。このような結合タンパク質の一例はトランスコバラミンであり、これはビタミンＢ１２を、癌細胞を含めた細胞上のトランスコバラミン受容体に送達させる（非特許文献６３）。低密度リポタンパク質は、光増感剤クロリンに結合し、網膜芽腫細胞上の低密度リポタンパク質受容体を標的としている、他のリガンドである（非特許文献６４）。
【００６４】
薬剤−タンパク質複合体を作製し、精製し、特徴付けし、細胞の結合性及び殺傷性を確認した後、かつ結合性及び殺傷性の実験によって、複合体が正常な細胞ではなく癌細胞に結合しそれを殺傷することが示されるとき、次いでその複合体を等分し滅菌する。セシウム照射装置を使用することなどによって照射に曝すこと、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過法を使用することだけには限られないが、これらを含めた任意の適切な方法によって、滅菌法を行うことができる。
【００６５】
本発明の他の態様に従って、鉄含有トランスフェリン、及びトランスフェリンと温熱増感剤、光増感剤またはアポトーシス誘導化合物のいずれかの複合体を含む、腫瘍を治療するための試薬キットを提供する。トランスフェリン受容体を有する患者の正常な細胞は、光増感剤、温熱増感剤またはアポトーシス誘導化合物の複合体を投与する前に、これらの受容体を鉄含有トランスフェリンで飽和させることによって、複合体の影響に対して保護することができる。
【００６６】
本発明は、トランスフェリンといくつかの異なる光増感剤、温熱増感剤及び／またはアポトーシス誘導化合物の複合体を、前記腫瘍細胞の一部分に別々に投与することを含む、抗癌剤に対する腫瘍細胞の感受性を判定するための方法も提供する。いくつかのこのような異なる複合体を含む試薬キットを、この目的のために提供することができる。腫瘍細胞が本発明の複合体を非常に急速に取り込むことが、見出されてきている。これは、患者からの除去の約数時間以内に、一定範囲のトランスフェリンと異なる抗癌剤の複合体に対して、腫瘍細胞を試験することができることを意味する。このような方法によって、腫瘍細胞の単離後できるだけ早く、所与の患者に最も有効な化学療法剤を決定することができると思われる。
【００６７】
本発明の複合体は、有効な量で動物に投与する。癌の治療においては、有効な量とは、腫瘍の大きさを減少させ、腫瘍の増殖を遅らせ、転移を予防または阻害し、あるいは冒された動物の平均余命を延ばす、ための有効な量を含む。本発明は、癌を治療する方法であって、癌が白血病癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、胃腸癌、鼻咽頭部癌、頸部癌、肉腫、メラノーマ、リンパ腫／メラノーマ、グリオーム、または星状細胞腫であってよいが、これらだけには限られない方法を提供する。複合体に関する用量は、患者の年齢、体重、及び状態、及び抗癌剤の薬物動態を考慮して、決定することができる。有効な治療のために必要とされる複合体の量は、抗癌剤を単独で使用するのに必要な量未満であろう。
【００６８】
本発明の薬剤組成物は、経口、局所、直腸、膣内、肺経路、例えばエアロゾルの使用を含めたいくつかの経路によって投与することができ、また、これらによるものだけには限られない。更に、腹腔内、動脈内または静脈内を含めて非経口的に、投与することができ、また、これらによるものだけには限られない。組成物は単独で投与することができ、あるいは標準的な薬剤慣習に従って、薬剤として許容可能な担体または賦形剤と組み合わせることができる。経口形態の投与に関しては、錠剤、カプセル、薬用ドロップ、トローチ、粉末、シロップ、エリキシル、水溶液及び懸濁液などの形で、組成物を使用することができる。非経口投与に関しては、複合体の滅菌溶液を通常作製し、その溶液のｐＨは適切に調整し緩衝させる。静脈内の使用に関しては、溶質の全体濃度を制御して、調製物を等張にしなければならない。眼部の投与に関しては、軟膏または滴眼可能な液体を、アプリケータまたは滴眼びんなどの当分野で知られている、眼部送達系によって送達させることができる。肺への投与に関しては、エアロゾルの形成を可能にするための適切な、希釈剤及び／または担体が選択されるであろう。本発明の複合体は非経口的に、すなわち静脈内または腹腔内に、注入または注射によって投与することが好ましい。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態を、以下に記載する。変更形態及び変形形態が可能であり、それらはすべて本特許請求の範囲内に入ると考えられることは、以下の記載を読んだ後には、当業者には明らかであろう。
【００７０】
実施例１
均質なトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の作製
所定のモル比を有する多量の均質なトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の合成を、ドキソルビシン（ＤＯＸ）の３’アミノ位置のアミノ基のみを使用して化学量論的に行い、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の２つの反応基の１つと反応させた。最初のステップとして、氷冷水浴中においてＧＬＵを一滴ずつＤＭＳＯに加えた。次のステップは、ＤＯＸの生理食塩水溶液を、ＧＬＵ＋ＤＭＳＯの生理食塩水溶液に一滴ずつ加えて、ＤＯＸとＧＬＵのモル比が１：１である最終濃度にした。生成したＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を、暗所において室温で３時間攪拌した。
【００７１】
遊離ＤＯＸも遊離ＧＬＵも含まないＤＯＸ−ＧＬＵの最終溶液を生成するために、ＤＯＸとＧＬＵのモル濃度は前述の反応と同じであった。しかしながら、１つのＧＬＵが２つのＤＯＸと反応してＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸが生成する場合、溶液中に遊離ＧＬＵが存在する可能性があるが、一価のＤＯＸを二価のＧＬＵの溶液に一滴ずつ加えることによって生じる質量作用動態により、この可能性は最小限になる。これらの反応物の体積は制限されないので、多量の均質なＤＯＸ−ＧＬＵを調製することができる。
【００７２】
その後ＤＯＸ−ＧＬＵを、トランスフェリン（ＴＲＦ）の生理食塩水溶液に一滴ずつ加えた。ＴＲＦは鉄を含まないか（アポトランスフェリン）、あるいは鉄が飽和していてよい（ハロトランスフェリン）。ＤＯＸとＴＲＦの所望のモル比を、ＴＲＦの体積を適切に調節することによって得た。生成したＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの溶液を、暗所において室温で２０時間攪拌した。ＤＯＸとＧＬＵの反応とは異なり、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦの反応は１つの結合部位に限られない。なぜなら、ＤＯＸ−ＧＬＵのＧＬＵ成分は、ＴＲＦ分子中のいくつかのε−アミノ酸のリジン基の、任意の１つと反応することができるからである。
【００７３】
ＴＲＦに結合するＤＯＸ分子の数を、第２のステップで決定した。例えば、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５個のＤＯＸ分子を含むと思われる。しかしながら、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４個のＤＯＸ分子を含むと思われる。同様に、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９個のＤＯＸ分子を含むと思われる。このようにして、ＤＯＸとＴＲＦが所定の比である多量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸを、必要に応じて与えることができる。
【００７４】
反応生成物中に残っている任意の過剰なＧＬＵは、エタノールアミンを加え、次に遠心分離及び透析することによって除去することができる。ＤＯＸとＴＲＦの反応は理論上はＧＬＵをすべて消費するが、エタノールアミンを最終反応混合物に加えて、任意の利用可能なＧＬＵを結合させた。この反応は、暗所において３０分間続けた。最終溶液を２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離にかけ、１００倍過剰の生理食塩水で６時間かけて２回透析し、同じ過剰のＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で３回透析し、生成したＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体が、使用するために用意された。
【００７５】
複合体に関する生化学的な特性決定：
ＨＰＬＣ及びポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することによって、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の均質性を決定することができる。分光光度法を使用することによっても、ＤＯＸとＴＲＦの分子比を決定することができる。これらの技法によって、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の一貫した均一性が繰り返し明らかになっている。さらにクロマトグラフィーは、これらの複合体の調製では必要とされない。なぜなら、凝集体または断片が存在しないからである。これによって多量の均質なトランスフェリン−薬剤複合体を作製することができ、収率が上がりコストは低下する。
【００７６】
他のタイプのトランスフェリン−薬剤複合体における、ＴＲＦ及びＤＯＸの損失によって引き起こされる犠牲は、それらを使用する障害となっている。例えば、ＤＯＸ及びＴＲＦの収率は、薬剤及び／またはタンパク質を変えるチオール化（４４）などの手法を経由することによって低下する。使用される溶媒系（８６）、又は、酸安定性及び酸不安定性の連結を作製するために使用するクロマトグラフィー（４１）によっても収率は低下する。ＤＯＸとＴＲＦの間に結合したＧＬＵは酸安定性であり、本発明に従って作製したＴＲＦ−ＤＯＸ複合体中の、ＤＯＸ及びＴＲＦの収率は高い。実際、他の知られている手順と比較すると、ＴＲＦの収率はほぼ２倍であり（９０％と５０％）、ＤＯＸの収率は５倍増大する。
【００７７】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体を作製するための公知の手法は、トランスフェリン１分子当たりの薬剤分子の数が所定の割合である、多量の均質な複合体を生成することができない。さらに、他の手法はクロマトグラフィーを使用して、凝集体を除去し、均質な複合体中に豊富な分画を採取する。これらの手順は収率を低下させ、コストを増大させ、分子比を予め決定する能力を欠いている。
【００７８】
実施例２
トランスフェリン−アポトーシス誘導化合物（デフェロキサミン）複合体の作製
グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）を、氷冷水浴中においてＤＭＳＯに一滴ずつ加え、次にデフェロキサミン（ＤＥＦ）の生理食塩水溶液を、ＧＬＵ＋ＤＭＳＯの生理食塩水溶液に一滴ずつ加えて、ＤＥＦとＧＬＵのモル比が２：１である最終濃度にした。生成したＤＥＦ−ＧＬＵの溶液を、暗所において室温で３時間攪拌した。
【００７９】
ＤＥＦ−ＧＬＵを、トランスフェリン（ＴＲＦ）の生理食塩水溶液に一滴ずつ加えた。ＴＲＦは鉄を含まないか（アポトランスフェリン）、あるいは鉄が飽和していてよい（ハロトランスフェリン）。ＤＥＦとＴＲＦの所望のモル比を、ＴＲＦの体積を適切に調節することによって得た。生成したＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＥＦの溶液を、暗所において室温で２０時間攪拌した。ＤＥＦとＧＬＵの反応とは異なり、ＤＥＦ−ＧＬＵとＴＲＦの反応は１つの結合部位に限られない。なぜなら、ＤＥＦ−ＧＬＵのＧＬＵ成分は、ＴＲＦ分子中のいくつかのε−アミノ酸のリジン基の、任意の１つと反応することができるからである。
【００８０】
ＴＲＦに結合するＤＥＦ分子の数を、ＤＥＦ−ＧＬＵをＴＲＦに加える間に決定した。例えば、ＤＥＦ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＥＦの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５個のＤＥＦ分子を含むと思われる。しかしながら、ＤＥＦ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＥＦの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４個のＤＥＦ分子を含むと思われる。同様に、ＤＥＦ−ＧＬＵとＴＲＦの最初の比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＥＦの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９個のＤＥＦ分子を含むと思われる。このようにして、ＤＥＦとＴＲＦが所定の比である多量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＥＦを、必要に応じて与えることができる。
【００８１】
通常は、エタノールアミンを反応生成物に加えて、次に遠心分離及び透析を行う。ＤＥＦとＴＲＦの反応は理論上はＧＬＵをすべて消費するが、エタノールアミンを最終反応混合物に加えて、任意の利用可能なＧＬＵを結合させる。
【００８２】
この反応は、暗所において３０分間続ける。最終溶液を２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離にかけ、１００倍過剰の生理食塩水で６時間かけて２回透析し、同じ過剰のＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で３回透析し、生成したＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＥＦ複合体は、使用するために用意される。
【００８３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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