(57)【要約】エストラジオール特異的抗体に特異的に結合することができる精製ペプチドミモトープである。また、試料中のエストラジオールの検出のための免疫検定試験装置であって、エストラジオールのペプチドミモトープ、及び該ペプチドミモトープに特異的に結合して検出可能なシグナルを生じることができる抗体を含む免疫検定試験装置も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストラジオール特異的抗体に特異的に結合することができる精製ペプチドミモトープ。
【請求項２】
ミモトープが１２アミノ酸残基以下のコア結合領域を持つ、請求項１に記載の精製ペプチドミモトープ。
【請求項３】
配列番号３、４、６及び１８から７０から成る群より選択されるアミノ酸配列によって表わされるコア結合領域を持つ、請求項１に記載の精製ペプチドミモトープ。
【請求項４】
エストロン−３−グルクロニド特異的抗体に特異的に結合することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の精製ペプチドミモトープ。
【請求項５】
配列番号７から１７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の精製ペプチドミモトープ。
【請求項６】
そのコア結合領域内に、Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ａｓｐ及びＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｘａａの少なくとも１つに従ったトリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の精製ペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の精製ペプチドがその上に固定されている（解除可能にまたは解除不能に）支持体。
【請求項８】
免疫検定試験スティックまたはディップスティック形態の、請求項７に記載の支持体。
【請求項９】
試料中のエストラジオールの検出のための免疫検定試験装置であって、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドミモトープ、及び該ペプチドミモトープに特異的に結合して検出可能なシグナルを生じることができる抗体を含む免疫検定試験装置。
【請求項１０】
試験装置が競合免疫検定試験装置である、請求項９に記載の免疫検定試験装置。
【請求項１１】
ペプチドミモトープが配列番号３、４、６及び１８から７０から成る群より選択されるコア結合領域を持つアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載の免疫検定試験装置。
【請求項１２】
ペプチドミモトープが配列番号７から１７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９、１０または１１のいずれか一項に記載の免疫検定試験装置。
【請求項１３】
ペプチドミモトープがエストロン−３−グルクロニド特異的抗体に特異的に結合することができる、請求項９から１２のいずれか一項に記載の免疫検定試験装置。
【請求項１４】
試験する試料中のエストラジオールの存在及び／または量を検定するための、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドミモトープの使用。
【請求項１５】
請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドミモトープをコードする単離核酸。
【請求項１６】
実施例を参照して、実質的に本文中で説明されるようなペプチドミモトープ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ある種のペプチド分子が、そのような化合物間の有意の構造上の相違にもかかわらず、ある種のステロイド化合物と同様の反応特性を持ち、それ故例えば、ステロイド類の検出のために設計された置換免疫検定法においてステロイド化合物のミモトープとして機能することができるという発見に関する。
【０００２】
（発明の背景）
一般的定義として、エピトープは、免疫に関連する抗体結合応答の引き金を引くために必要な抗原の重要な結合領域を含む、特定抗原の領域である。エピトープはまた、しばしば代替的に抗原決定基とも称される。
【０００３】
エピトープの構造ならびに特定抗体へのそれらの特異的結合反応を理解することは、多くの人々にとって大きな関心であり、理解そのものが製薬、診断及び医薬産業における進歩の基礎を築くことができるであろう。この理解を容易にするために、近年、学術機関と産業界はエピトープライブラリーと称されるものを構築した。
【０００４】
エピトープライブラリーは、例えばバクテリオファージの表面にディスプレイされる、変化しうるアミノ酸配列の膨大なコレクションである。各々の配列は特定抗原の特定エピトープに対応する。しばしば、エピトープライブラリーは何百万ものこれらの短いアミノ酸配列から成り、さらに時としては１億個またはそれ以上の配列から成る。代表的なエピトープライブラリーは、Ｌｕｚｚａｇｏ　Ａ．ら、「Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ　ｏｆ　ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｂｙ　ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｉ．Ｅｐｉｔｏｐｅ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｈ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｐｈａｇｅ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ．（ファージディスプレイされたペプチドによる不連続エピトープの模倣、Ｉ．制約された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドのファージライブラリーを用いたヒトＨフェリチンのエピトープマッピング）」Ｇｅｎｅ　１２８，５１−５７（１９９３）の中で詳細に述べられている。
【０００５】
ひとたびエピトープライブラリーが構築されれば、特定抗体または他の結合タンパク質を利用して特定エピトープを特異的に選択することができる。その後エピトープを、直接にまたは最初に対応するＤＮＡ配列を同定し、次にそのＤＮＡ配列を転写して対応するアミノ酸配列に翻訳することによって配列決定することができる。そのような手法により、抗原化合物及び分子の結合領域を決定することができ、ひとたび特定抗原の結合領域がわかれば、特定エピトープを使用したワクチンの設計のような、強力なバイオテクノロジー応用を実現しうることは容易に想定できる。
【０００６】
エピトープライブラリースクリーニング手法の明白な能力にもかかわらず、それらはこれまで、主として特定抗原の特異的結合領域を同定し、配列決定するためにしか使用されてこなかった。これはおのずから本質的に、このテクノロジーに基礎を置くバイオテクノロジー応用の種類と範囲を限定することになる。
【０００７】
Ｓｃｏｔｔ、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｇａｎｄｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｅｐｉｔｏｐｅ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（エピトープライブラリーを用いたペプチドリガンドの発見）」、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１７、ｐｐ．２４１−２４５（１９９２年７月）の中で、従来のエピトープライブラリー手法の伸展が開示されている。特に、Ｓｃｏｔｔは、エピトープライブラリーを使用して既知の抗原についてのペプチドミモトープを同定し、マッピングすることができると主張している。ミモトープは、特定抗原のエピトープ領域を「模倣する」が、該エピトープを含む特定アミノ酸配列を含まない分子配列である。従って、ミモトープは、特定エピトープを含む抗原に対する抗体の結合クレフト（くぼみ）に同様に結合することができるので機能的には非常に類似するが、エピトープとは構造的に異なる。
【０００８】
ミモトープは、学術的にはエピトープを模倣するいかなる分子または分子の配列でもありうるが、ほとんどの場合、アミノ酸の短い配列を含む小さな低分子量ペプチドである。それらは最も典型的には小さなペプチドであるので、それらが模倣できるものは限定されると考えられてきた。特に、数多くのタンパク質ベースの抗原（すなわちペプチドエピトープを持つ抗原）についてペプチドミモトープを同定することができるが、抗体結合クレフトの複雑な構造と、それに対応する抗体結合反応の複雑な性質―それらの反応のすべてが、ミモトープ−抗体結合を生じるためにはミモトープとエピトープ間の密接な構造類似性を必要すると考えられてきた。ゆえに、非タンパク質ベースの抗原についてのペプチドミモトープの同定は実現が難しいであろう。一般に、いくつかの孤立した例外はあるが、この考え方は正しいことが証明されている。
【０００９】
例えば、「Ｒａｎｄｏｍ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ランダムペプチドライブラリー：特異結合分子のソース）」：Ｄｅｖｌｉｎ　ＪＪ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９、４０４−４０６（１９９０）において、生体細胞におけるある種の酵素的カルボキシル化反応のために必要な、必須ビタミンであるビオチンのペプチドミモトープが同定された。ビオチンは構造上はペプチドではないが、それにもかかわらず大きさと構造においていくつかのアミノ酸（例えばヒスチジン）と類似している。それ故、そのような分子についてのペプチドミモトープが同定されうることは予想外ではなかった。
【００１０】
同様に、「Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｆｏｒ　ａ　ｓｕｇａｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｂｒａｒｙ（ランダムペプチドライブラリーから単離された糖結合タンパク質についてのペプチドリガンド）」：Ｏｄｅｒｎｂｕｒｇ，ＫＲら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、５３９３−５３９７（１９９２）の中で、コンカナバリンＡのマンノピラノシドリガンドについてのペプチドミモトープが同定された。しかし、これに関しても、そのようなミモトープはそれらが模倣するエピトープと同様の大きさと構造立体配置を持ち、それ故それらの同定は意外ではなかった。Ｓｉｂｉｌｌｅら、「Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉ−ＤＮＡ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｐｈａｇｅ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ファージディスプレイされたペプチドライブラリーを用いて同定される多反応性抗ＤＮＡ抗体のミモトープ）」：Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７、１２２１−１２２８（１９９７）に述べられているように、ある種の形態のＤＮＡのミモトープも同定されている。
【００１１】
これらのいくつかの限られた発見にもかかわらず、ステロイド化合物のような複雑な非タンパク質分子についてのエピトープライブラリー（または他の手段）からのペプチドミモトープの同定は行われていない。さらに、そのようなペプチドミモトープとステロイド類のような複雑な非タンパク質分子の間での明らかな構造上の相違により、これらのミモトープの存在についてはこれまでほとんど検討されていなかった。
【００１２】
ＷＯ９６／１６３２２号は、標的リガンドの第一及び第二類似体の使用を含む、特定標的リガンドに高い親和性を持つ特異的結合物質を回収するための、アフィニティーベースの工程を開示している。かかる資料の４ページは、工程で使用される類似体の１つが、エピトープミミック、「すなわち、標的リガンドの結合部位（エピトープ）と同様に挙動する、短いペプチドのような、一般に合成由来の小分子」でありうることを言及している。
【００１３】
資料は、標的リガンドがステロイド（特に、エストロン−３−グルクロニド、「Ｅ３Ｇ」）である工程の実施例を含むが、これらの実施例のいずれもが、ステロイドのペプチドミモトープの使用を含まず、またステロイドのペプチドミモトープの特定例あるいはそれに関するいかなる実験証拠も開示されていない。実際に４ページで、上記で引用した一節のすぐ後に、ＷＯ９６／１６３２２号は、「特に標的リガンドがＥ３Ｇであるとき、該第一類似体はエストロンでありうる。好ましくは該第二類似体はエストリオールグルクロニドである。あるいは、エストラジオール−３−グルクロニドが第二類似体として使用できる、この場合、場合によってはエストリオール−３−グルクロニドを第一類似体として使用しうる」と述べている。
【００１４】
それ故、ＷＯ９６／１６３２２号は標的リガンドのペプチドエピトープミミックの使用に言及し、またステロイド標的リガンドにも言及しているが、ステロイド標的リガンドについてのペプチドミミックの明白な開示または示唆は為されていない。実際に、ステロイド標的リガンドについての特定類似体の唯一の言及は、他の密接に関連するステロイドである。従って、当業者はＷＯ９６／１６３２２号の内容から、ステロイド類似体についてのペプチドミミックが実際に存在するかまたは作製しうることを推論しないであろうし、またそれが存在することを示唆するいかなる証拠もないので、これに関する成功にいかなる合理的な期待も抱かないであろう。
【００１５】
上述したものと同様の短い言及がＷＯ９９／２７３５６号（１０ページ）の中に認められるが、やはり具体例または実験証拠は含まれていない。
【００１６】
Ｓａｖｉｒａｎｔａら（１９９８　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．９、７２５−７３５）は、エストラジオールに特異的なＦａｂフラグメントを使用した、エストラジオールについてのアッセイを開示している。Ｆａｂフラグメントに結合する、エストラジオールのペプチドミモトープに関する言及または示唆は存在しない。
【００１７】
Ｓｌｏｏｔｓｔｒａら（１９９７　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　１０、２１７−２２４）は、エピトープを模倣する合成ペプチドを同定するためのスクリーニング法を述べているが、著者達はタンパク質またはペプチド抗原の模倣に言及しているだけであり、ペプチドミモトープがステロイド化合物に関して利用可能であることの認識または示唆はない。
【００１８】
最後に、米国特許第５，６３５，１８２号（ＭｃＣｏｙ　＆　Ｌｕ）は、本発明とは大きく異なる主題に関するものであり、一般にチオレドキシン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関連する。トリペプチド配列Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐを含む２０量体ペプチドに関する、簡単な開示（その中での配列番号２）がある。
【００１９】
（発明の概要）
本発明は、構造上の有意な相違にもかかわらず、ある種のステロイド化合物についてのペプチドミモトープが実際に存在し、例えば試料中のステロイド類の検出のために設計された競合または置換型免疫検定法において、有利に使用することができるという予想外の発見に基づく。これに関して、本発明は、エストラジオールに特異的な抗体に特異的に結合することができる精製ペプチドミモトープ、及び該精製ペプチドミモトープをコードする単離核酸配列を対象とする。本発明はまた、試料中のエストラジオールの検出のための免疫検定試験装置であって、この免疫検定がペプチドミモトープならびにペプチドミモトープに特異的に結合して検出可能なシグナルを生じることができる抗体を含む、免疫検定試験装置を対象とする。
【００２０】
本発明は数多くの利点を提供する。免疫原として使用することができるペプチドに加えて、ペプチドミモトープは、新しい免疫検定試験方式及び装置を構築し、また古い免疫検定試験方式及び装置を改善するために使用できる。それらは、例えば、エストラジオールの検出のための従来の置換アッセイにおいてシグナルを基本的に「調整する（ｔｕｎｅ）」ために利用できる。さらにそれらは、さもなければエストラジオールと非適合性であって、そのような表面のエストラジオールはもう１つ別の分子（しばしばタンパク質様）と複合することによって表面に結合することを必要とするような、ある種のアッセイ表面に直接結合することができる。他の利点は下記の本発明の説明において容易に明らかになるであろう。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明のペプチドミモトープは、エストラジオールに特異的である、どのような抗体にも特異結合することができる。ここで使用するときエストラジオールは、エストラジオールまたはその代謝産物（例えば、好ましくはエストロン−３−グルクロニド）、ならびに基本的エストロン構造を持つ何らかの関連ステロイド化合物を意味すると解釈される。そのような関連化合物は、エストリオール、１６−エピエストリオール、１７−エピエストリオール、１７−β−エストラジオール３−（β−Ｄ−グルクロニド）、エストリオール３−（β−Ｄ−グルクロニド）、エストロン、１７α−エチニルエストラジオール、及び１６α−ヒドロキシエストロンに例示されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００２２】
特異結合とは、ミモトープが、過剰量の目的ではない他の物質の存在下で選択的に抗体の抗原結合部位に結合することができ、免疫検定法において使用したとき、十分にしっかりと結合する、すなわち十分に高い親和性を持つので、有用な検定結果を提供することを意味する。同様に、「エストラジオールに特異的な」抗体は、過剰量の目的ではない他の物質の存在下で選択的にエストラジオール（または関連化合物）に結合することができ、免疫検定法において使用したとき十分にしっかりと結合するので、有用な検定結果を提供する。
【００２３】
ペプチドミモトープが特異的に結合することができる抗体は、エストラジオールまたはその代謝産物について結合特異性を持つあらゆる抗体、そのフラグメントまたはその構築物でありうる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ等を含みうる、そのような抗体の様々な形態が考えられる。また、次のようなものも考えられる。文献において記述されており、２またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む、（例えば、Ｈａｒｒｉｓらの特許願ＷＯ９４／０９１３１号及びＤａｖｉｓらの特許願ＷＯ９７／１４７１９号参照）多価及び／又は多選択性構築物または「二重ＳｃＦｖ」アプローチに基づく、多価性が、例えばＷｈｉｔｌｏｗら、ＷＯ９３／１１１６１号及びＭｅｚｅｓら、ＷＯ９４／１３８０６号に述べられているように、２またはそれ以上の一価ＳｃＦｖ分子が共に連結して、少なくとも４つの可変ドメインを含む一本鎖分子を提供するときに生じる。
【００２４】
抗体は、免疫検定試験装置においてペプチドミモトープと共に使用するとき、当該技術において既知の方法によって構築することができる。ＶｅｒｈｏｅｙｅｎとＷｉｎｄｕｓｔ，「Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子免疫学における抗体エンジニアリングの進歩：分子生物学のフロンティア）」、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ発行、ｐ．２８３−３２５（Ｏｘｆｏｒｄ，１９９５）及びＰｒｉｃｅら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（免疫検定法の原理と実際）、第２版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ発行（Ｌｏｎｄｏｎ，１９９７）に例示されているもののような手法が適当である。多くの抗体はまた、市販のものが入手できる。エストラジオール代謝産物、エストロン−３−グルクロニドについては、モノクローナル抗体がＬｉｎｓｃｏｔｔ’ｓ　Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（第１０版、１９９８−９）の中に述べられており、ＯＥＭ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　Ｉｎｃ，Ｔｏｍｓ　Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ，ＵＳＡより入手しうる。
【００２５】
付随する実施例において述べるように、本発明のペプチドミモトープは様々なスクリーニング手法によってエピトープライブラリーから同定された。それらはまた、既知の天然に生じるアミノ酸より構築されたペプチドライブラリーからも同定された。
【００２６】
ペプチドミモトープは最小限のコア結合領域を含む。すなわち、それらは、標的抗体に特異結合する能力をミモトープに与えるために必要な最小限の連続アミノ酸配列を含む。好ましくは、該領域は、溶液中での単一抗体結合部位への結合反応についてのミモトープの親和性が１０５Ｌ／ｍｏｌまたはそれ以上である。結合親和性を測定するための方法は当業者には常套的であり、特定抗体についての特定ミモトープの結合親和性は、ここで述べる手法を活用し、当業者の一般知識を用いて容易に測定することができる。
【００２７】
ペプチドミモトープはいかなる大きさでもありうるが、三次構造または球状構造形成が起こりうる大きさよりも小さいことが好ましい。従って、それらは典型的には３０、好ましくは２０アミノ酸以下の長さである。各々のミモトープのコア結合領域は、典型的には１２個アミノ酸未満、好ましくは７アミノ酸未満、至適には３から６アミノ酸の長さである。好ましいミモトープを下記の実施例において同定する。
【００２８】
特に、発明者は、本発明に従った多くのミモトープのコア結合領域が次のように同定される３つのトリペプチド配列の１つを含むことを発見した：Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ；Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ａｓｐ；及びＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｘａａ。それ故、一般に、好ましいミモトープはこれら３つのトリペプチド配列の１つ（典型的にはＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）を含むが、単にそのようなトリペプチドを有するだけでは、ペプチドが適当な特異結合活性を持つためには必ずしも十分でないことに留意すべきである。発明者は、上述したトリペプチド配列の１つを含むが適当な特異結合活性を示さないペプチドのいくつかの例を認めた。本発明の開示を利用して、当業者は容易に候補ペプチドをスクリーニングし、最も望ましい結合特性を持つものを選択することができるであろう。
【００２９】
本発明の開示から、アミノ酸のＤ−異性体を使用した場合、逆配列（すなわちＸａａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ；Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｐｈｅ；及びＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘａａ）が使用しうることは明白であろう。
【００３０】
米国特許第５，６３５，１８２号は、配列ＱＰＦＥＤＦＲＩＳＱＥＨＬＡＤＨＦＤＧＲを持つ、ウシホスホリパーゼＣ−ＩＩから誘導される２０量体ペプチドを開示している。
【００３１】
本発明者は、トリペプチドＦＥＤを含むいくつかのペプチドが本発明に従ったペプチドミモトープとして有用であることを発見した。発明者は、米国特許第５，６３５，１８２号に開示されている２０量体もまた有用であるかどうか（すなわちエストラジオール特異的抗体に特異的に結合することができるかどうか）を検討する実験を実施しなかったが、先行技術のペプチドがそのような特異結合活性を示す場合、発明者はここで条件付きで、アミノ酸配列ＱＰＦＥＤＦＲＩＳＱＥＨＬＡＤＨＦＤＧＲから成るペプチドを放棄する。
【００３２】
ペプチドミモトープの精製は、Ｔｅｎｄｌｅｒら、Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｃｉｎ　ｃｏｒｅ　ｔｙｐｅ　Ｉ　β　ｔｕｒｎｓ（ムチンコアＩ型βターンの安定化におけるアルギニン残基の役割）．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１、３９−４３（１９９４）に述べられているもののような、従来の手法によって実施することができる。好ましくは、ペプチドミモトープを９５％まで、至適には９９％まで精製する。ミモトープは典型的には単一ペプチドとして提供されるが、場合によっては共有ペプチド結合しているかあるいは他の何らかの手段によって標識または固形支持体のような他の成分に連結されていてもよい。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では、ペプチドミモトープは免疫検定試験装置において利用される。そのような装置は様々な形態をとることができ、また実施する検定の的確な性質に応じて変化させうる。
【００３４】
ペプチドミモトープは、しばしば試験の対象となる物質（すなわちエストラジオール）を「模倣する」ので、それらは性質及び機能に関して、基本的に抗原性である。それ故、競合または置換型検定（本文中以下、総合的に競合検定と称する）において利用することが最も好ましい。しかし、従来のサンドイッチ型検定における使用も排除されるわけではなく、個々の方式を容易に設計することができる。
【００３５】
特に、本発明のペプチドミモトープを組み込んだ競合検定では、ミモトープを固体支持体上、典型的にはニトロセルロースまたは他の疎水性多孔物質上に被覆することが想定される。それらはまた、合成プラスチック材料、マイクロタイターアッセイプレート、ラテックスビーズ、セルロースまたは合成ポリマー材料を含むフィルター、ガラスまたはプラスチックスライド、ディップスティック、毛細管充填装置等に被覆することもできる。
【００３６】
これらの表面へのペプチドミモトープの被覆は、当該技術において既知であり、例えばＥＰ−Ｂ−０２９１１９４号に述べられている手法によって実施できる。本発明の特別の利点は、それらが模倣する化合物と異なって、本発明のミモトープはペプチドであり、それ故ニトロセルロースのような一部のアッセイ表面に直接被覆することができるということである。エストラジオールは、これに対して、そのようなセルロース材料と非適合性であり、それ故しばしばもう１つ別の分子と複合体を形成することによって表面に結合する必要がある。典型的にはタンパク質がそのような複合体形成に使用され、しばしばＢＳＡが最も好ましい。
【００３７】
好ましい競合検定では、ひとたび支持体の表面に被覆されたペプチドミモトープは、抗体またはそのフラグメントまたは構築物に特異的に結合する。抗体は上述したとおりであり、エストラジオールに特異結合しうるはずである。ミモトープに結合した抗体を含む領域を超えて移動するエストラジオールを含む液体試料は、支持体の表面から一定量の抗体を置換するであろうと想定される。置換される抗体の量は、試料中のエストラジオールの濃度、及び抗体に対するミモトープとエストラジオールの相対的結合親和性を含めたいくつかの因子に依存するであろう。その後、試料中のエストラジオールの相対濃度を調べる手段として、置換された抗体の量を測定することができる。
【００３８】
また、もう１つの好ましい実施形態では、抗体は表面に結合することができ、ペプチドミモトープは抗体に特異的に結合し、支持体と接触して（例えば支持体を通って）試料中を移動するエストラジオールによって置換されうると想定される。置換は、置換されたペプチドミモトープ量、従って試料中のエストラジオール量の測定可能なシグナルを生じる。
【００３９】
本発明によって考慮される他の免疫検定試験装置は、例えば、液体試料が毛細管作用により適切な比率の毛細管注入口に沿って装置内へと引き込まれる、毛細管充填手段を使用するものを含む。本発明における使用に適応させうる毛細管充填装置は、例えばＳｈａｎｋｓら、米国特許第５，１４１，８６８号、Ｓｈａｎｋｓら、ＥＰ−Ａ−０４２２７０８号、及びＢｉｒｃｈら、ＥＰ−Ｂ−０２７４２１５号に開示されている。
【００４０】
Ｍａｙら、米国特許第５，６２２，８７１号及びＭａｙら、米国特許第５，６５６，５０３号に開示されているもののような装置も、本発明の免疫検定法の実施に適する。使用する場合には、これらの装置は、好ましくは固形支持体が入った中空の細長いケースを含む。支持体は、ケースから突出しているかまたは突出していない、吸収性の液体試料受け入れ部分を通して間接的にケースの外側と連絡しており、支持体と試料受け入れ部分は、液体試料が毛細管作用によってこれら２つの間を移動することができるように連結されている。
【００４１】
試料受け入れ部分から支持体に沿って空間的に離れた部分が試験区域、及び場合によっては、対照区域である。試験区域内で、ペプチドミモトープは支持体に固定された抗体に結合することができる。そのような固定は、例えばＣＮＢｒ、カルボニルジイミダゾール、または塩化トレシルを用いた化学的カップリングを含めて、多くの既知の手段によって実施することができる。あるいは、様々な「プリンティング」手法が使用できる。これらは、マイクロシリンジ、直接プリンティング、インク・ジェットプリンティング等による液体抗体の適用を含む。抗体を適用する前の支持体の化学的または物理的処理も、固定を容易にしうるので特に考慮される。
【００４２】
そのような装置におけるケースは、典型的には、裸眼または電子手段のいずれかによって分析結果を観察することができる少なくとも１つの開口部を組み込んで、不透明または半透明材料で構築される。
【００４３】
そのような装置は、臨床検査室または家庭での使用に適したキットとして提供することができ、そのようなキットは、湿気不透過性包装で個別に包装され、使用者への適切な指示書と共に梱包された１またはそれ以上の装置を含む。
【００４４】
試料受け入れ部分は、速やかに液体を吸収することができる吸収性、多孔性または繊維性の材料で作製することができる。材料の多孔性は一方向性（すなわち孔または繊維が全面的にまたは主として該部分の軸に平行に走っている）または多方向性（全方向性、それ故該部分は無定形海綿様構造を持つ）でありうる。ポリプロピレン、ポリエチレン（好ましくは非常に高分子量の）、フッ化ポリビニリデン、エチレン酢酸ビニル、アクリロニトリル及びポリテトラフルオロ−エチレンのような多孔性プラスチック材料が使用できる。製造の際に界面活性剤で該部分を前処理すると、該部分の固有疎水性を低下させ、それ故湿潤試料を速やかに且つ効率的に取り込み、送達する能力を高めることができるので、これは有益であると考えられる。多孔性試料受け入れ部分はまた、紙またはニトロセルロースのような他のセルロース材料から作製することもできる。好ましくは試料受け入れ部分を構成する材料は、多孔性部分を約数秒以内に液体試料で飽和できるように選択すべきである。液体は、多孔性試料受け入れ部分から支持体内に自由に透過することができなければならない。
【００４５】
そのような装置中の支持体は、好ましくは乾燥多孔性担体である。別個の細長い切れまたはシートで作製することができ、試料受け入れ部分と同様に、好ましくは毛細管作用によって、液体試料をその縦の長さ部分を通して移動させることができるいかなる材料からも構築できる。支持体は、その表面上に抗体及び／またはペプチドミモトープを固定することができなければならず、アッセイを適切に機能させるために必要な結合反応に干渉してはならない。
【００４６】
支持体は、支持体の長さに沿って液体の上方への毛細管作用を促進し、過剰な試料の適用によって試験装置からあふれるのを回避する手段を提供する、吸収剤「シンク」が連結されていてもよい。シンクのための特定材料及び適用は当該技術において慣用的なものであり、本発明の装置に容易に応用することができる。
【００４７】
本発明の免疫検定試験装置では、試料中の検体の量の測定可能なシグナルを提供するために、ペプチドミモトープまたはそれが結合する抗体のいずれかが標識されていることが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、標識は、その存在が容易に検出できる何らかの実体である。好ましくは標識は、Ｍａｙら、米国特許第５，６５６，５０３号に詳述されているもののような直接標識である。直接標識は、それらの自然の状態で、裸眼でまたは光学フィルターを用いて及び／または刺激の適用、例えば蛍光を促進するＵＶ光を用いて、容易に目に見える実体である。例としては、放射性、化学発光、レドックス標識のような電気活性、及び蛍光化合物が含まれる。染料ゾル、金属ゾル（例えば金）及び着色ラテックス粒子のような直接粒子標識も非常に適しており、蛍光化合物と共に好ましい。これらの選択肢のうちで、着色ラテックス粒子と蛍光化合物が最も好ましい。標識を小さな区域または容量に濃縮することにより、容易に検出可能なシグナル、例えば強く着色した領域を生じるはずである。
【００４８】
例えばアルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼなどの、酸素のような間接標識も使用できるが、これらは通常、可視シグナルが検出できる前に、基質のような１またはそれ以上の展開剤を加える必要がある。それ故、それらはあまり好ましくない。そのような添加剤は、液体試料を適用したときにそれらが溶解するかまたは分散するようにアッセイ装置の支持体に組み込むことができる。あるいは、試料を支持体に適用する前に展開剤を試料に加えることができる。
【００４９】
ペプチドミモトープまたは抗体への標識の結合は、共有結合または非共有結合（疎水結合を含む）によって、あるいは吸着によって実施しうる。そのような結合のための手法は、当該技術において一般的であり、使用する個々の試薬に容易に適応させうる。標識が着色ラテックス粒子である、好ましい実施形態では、好ましくは標識を抗体に結合させ、これは吸着により実施される。標識が蛍光化合物である場合には、標識を抗体に結合するかまたは抗体の一部として構築することが好ましい。
【００５０】
試験装置を使用するとき、標識は、既知で従来の手段によって試験及び対照表面から検出できる試験及び／または対照シグナルを提供することができる。これは裸眼による評価、またはより典型的には、厳密な測定を所望するときには適切な計測器による評価を含む。計測器は、対照または試験シグナルを対照または試験表面における複合体の量によって測定するときに特に適する。
【００５１】
本発明の免疫検定試験装置は実質的にいかなる種類の生物学的または非生物学的試料にも適用しうるが、尿または血清から誘導される液体の生物学的試料が好ましい。検定に先立って試料を精製または希釈してもよい。ここで使用するとき「免疫検定試験装置」の語はまた、別個の製品として販売または供給されうる、実用的試験装置を構成するために、他の部品の存在を必要とする免疫検定試験装置の部品を包含することが意図されている。特に、本発明の免疫検定試験装置は、一般に使い捨て製品として提供され、別個の部品として供給されうる、ディップスティック、試験スティック等でありうる。
【００５２】
第二の態様では、本発明は、本発明の第一の態様に従ったペプチドミモトープをコードする単離核酸を提供する。核酸は、配列のライブラリーからまたは生物（例えばファージまたは細菌）からのクローニングによって、あるいは標準的な手法（例えば、多くの販売元から市販されている自動固相オリゴヌクレオチドシンセサイザー）を用いたインビトロ合成によって、あるいは簡便さでは劣るが、異なるソースからの成分核酸配列を一緒にライゲートするライゲーション反応の実施によって調製しうる。典型的には、単離核酸配列はＤＮＡ配列であり（しかし、想定上は、センスＲＮＡ配列でありうる）、最小限９個の塩基を含む。より典型的には、核酸（あるいはむしろ、ペプチドミモトープをコードするその部分）は、１２から９０個の塩基、望ましくは１５から９０個、好ましくは１５から６０個の塩基を含む。核酸は、好都合にはプロモーター、エンハンサー及びターミネーター配列、１またはそれ以上の複製起点等のような他の成分を含みうる。さらに、単離核酸は、ペプチドミモトープが（５’または３’末端のいずれかで）ポリペプチド標識のような他のポリペプチド部分に融合している融合タンパク質をコードしうる。前述したように実施形態では、ミモトープをコードする核酸の部分は一般に上記で規定した範囲内の塩基数を含むが、全体としての核酸はそれよりかなり大きくてもよい。核酸部分は、一部の実施形態では、外来アミノ酸残基を伴わずにペプチドミモトープだけから成るペプチドをコードしうる（例えばミモトープは、それが由来する天然に生じる分子内で隣接配列から孤立している）。
【００５３】
単離核酸分子は、好都合なことにプラスミドまたは他の複製可能な成分の形態をとりうる。
【００５４】
第三の態様では、本発明は、試験する試料においてエストラジオールの存在及び／または量を検定するための、上記で定義した本発明の第一の態様に従ったペプチドミモトープの使用を提供する。
【００５５】
特定の例示的実施例を参照しながら本発明の実施を下記で詳細に述べるが、本発明がそれらに限定されると解釈されるべきではない。
【００５６】
実施例
エストラジオールについてのペプチドミモトープの同定
エストラジオール代謝産物、エストロン−３−グルクロニドのペプチドミモトープの例を同定する方法を下記に述べる。
【００５７】
モノクローナル抗体ＭＡｂ　４１５５を４１５５モノクローナル細胞系から発現させた。Ｇａｎｉら（Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４８、２７７−２８２（１９９４））で述べた方法に従って、４１５５モノクローナル細胞系を調製し、スクリーニングした。Ｇａｎｉらの公表文献は、抗プロゲステロン抗体の開発に関するものであるが、同様の手法をエストロン及びその類似体と反応する抗体を作製する際に使用した。
【００５８】
下記の実施例において使用する比較アミノ酸配列は次の通りである：
2004505638.tif 000002
【００５９】
実施例１
ファージディスプレイによるペプチドミモトープ配列の同定
ｐＶＩＩＩ９ａａ−ｃｙｓノナペプチドファージライブラリー
Ｆｅｌｉｃｉ　Ｆら、Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ　ｏｆ　ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｂｙ　ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＩＩ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｓ　ｒｅｃｏｇｎｉｓｅｄ　ｂｙ　ａ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｔｏｘｉｎ　ｆｒｏｍ　ｐｈａｇｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ファージディスプレイされたペプチドによる不連続エピトープの模倣、ＩＩ．ファージペプチドライブラリーからの百日咳菌毒素に対する防護モノクローナル抗体によって認識されるクローンの選択）．Ｇｅｎｅ　１２８，２１−２７（１９９３）及びＬｕｚｚａｇｏら、Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ　ｏｆ　ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｂｙ　ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｉ．Ｅｐｉｔｏｐｅ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｈ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｐｈａｇｅ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ファージディスプレイされたペプチドによる不連続エピトープの模倣、Ｉ．制約された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドのファージライブラリーを用いたヒトＨフェリチンのエピトープマッピング）．Ｇｅｎｅ　１２８，５１−５７（１９９３）が述べた、ｐＶＩＩＩ９ａａ−ｃｙｓライブラリーファージライブラリーを使用した。ライブラリーは、数百のペプチドが各々のファージ粒子上にディスプレイされるように、主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩに融合したランダムなノナペプチドから成った。
【００６０】
ファージライブラリーのスクリーニング
Ｆｏｌｇｏｒｉ　Ａ．ら、Ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｏｎｌｙ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒａ（ランダムペプチドライブラリーとヒト血清だけを使用して病理学的抗原のミモトープを同定するための一般的戦略）．ＥＭＢＯ　Ｊ　１３，２２３６−２２４３（１９９４）及びＰａｒｍｌｅｙ　Ｓ．Ｆ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｆｄ　ｐｈａｇｅ　ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅｓ（抗体選択性ｆｄファージベクター：標的遺伝子のアフィニティー精製）．Ｇｅｎｅ　７３，３０５−３１８（１９８８）の方法を組合せてファージのアフィニティー選択を実施した。
【００６１】
パニングのために使用するポリスチレンチューブ（ＮｕｎｃからのＩｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（商標）を、被覆緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．０）２ｍｌ中のアフィニティー精製した抗エストロン−３−グルクロニド抗体（２０μｇ）または被覆緩衝液単独のいずれかにより４℃で一晩被覆した。トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗ったあと、両方のチューブをブロッキング緩衝液（１０ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを含むＴＢＳ）４ｍｌと共に室温で４時間インキュベートした。ＶＩＩＩ９ａａ−ｃｙｓライブラリーは、対数的ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｈｏｌｌａｎｄ）の感染により１×１０１３形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）の力価を持つことを示した。供与ファージ懸濁液からのアリコート（１μｌ；１×１０１１ＴＵ）を、各々１ｍｌのＴＢＳと１ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを含む抗体被覆及び非被覆ポリスチレンチューブに加えて、４℃で一晩インキュベートした。室温で、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０（商標）（ＴＴＢＳ）を含むＴＢＳで１５回洗い（各々４ｍｌ）、次にＴＢＳで５回洗って非結合ファージを除去した。洗浄したパニングチューブを室温で１２分間、溶出緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのオボアルブミンを含む０．１Ｍ　ＨＣｌ、ｐＨ２．２、グリシンで調整）１ｍｌと共にインキュベートすることにより、結合ファージを溶出した。溶出したファージを１ｍｌポリスチレンチューブに移し、２Ｍトリス（ｐＨ調整していない）６０μｌで中和した。１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４のアリコート（２００μｌ）を、中和のためにパニングチューブに加えた。溶出した中和ファージ粒子（１ｍｌ）を対数的ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌９ｍｌ（１％（ｗ／ｖ）を含む２ＴＹ中）の感染のために使用した。対数的ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌（４ｍｌ）も中和パニングチューブに直接加えた。感染は、振とうせずに３７℃で３０分間実施した。感染細菌をプールし（総容量１３ｍｌ）、アンピシリンを加えて（１００μｇ／ｍｌ）、培養物を振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。感染細菌細胞の少量のアリコート（１０μｌ）を取り出した後、１％（ｗ／ｖ）グルコースとアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＴＹ寒天上で、力価測定（２ＴＹ／アンピシリン／グルコース中１０−２から１０−６に希釈）のために一晩インキュベートした。ＭＡｂ４１５５抗体で被覆したパニングチューブから溶出したファージで感染させた、一晩培養したＸＬ１−Ｂｌｕｅのアリコート（１５０μｌ）を、１％（ｗ／ｖ）グルコースと１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＴＹ　１５ｍｌに加えて対数期まで増殖させた。次に細胞をＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）（１×１０１１ファージ／ｍｌ）で重感染させ、振とうせずに３７℃で３０分間インキュベートした。この後１８００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ＴＹ　２００ｍｌ中に細胞ペレットを再懸濁した。次に細菌培養物を振とうしながら３７℃で一晩イ��キュベートした。その後細菌細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ；１５分間）によってペレット化し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００を含む２．５Ｍ　ＮａＣｌ）４０ｍｌを加えて氷上で１時間インキュベートして、上清中のファージ粒子を沈殿させた。次にファージ懸濁液を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心して、生じたペレットをＴＢＳ２０ｍｌに再懸濁した。ＰＥＧ／ＮａＣｌ　４ｍｌを加え、氷上でさらに２０分間インキュベートして、さらなるＰＥＧ沈殿を実施した。最終的なファージペレットをＴＢＳ　２ｍｌに溶解して、約１×１０１３ＴＵ／ｍｌのファージ力価を得た。これらのファージ粒子を新鮮パニングチューブに直接加え、パニング手順全体をさらに２回繰り返した。１回目のスクリーニング後、スクリーニングプロトコール全体（３ラウンドのパニング）を繰り返した。
【００６２】
ファージＥＬＩＳＡ
３ラウンドのパニングからの産物を２ＴＹ寒天、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及び１％（ｗ／ｖ）グルコースに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。ランダムな個々の細菌コロニー（〜２００）を採取し、各々２ＴＹ　２００μｌ、１％（ｗ／ｖ）グルコース及びアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む９６穴マイクロタイタープレート（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ（商標））のウエルに加えた。マイクロタイタープレートを振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日各々のウエルからのアリコート（２０μｌ）を、各々２ＴＹ　２００μｌ、１％グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新しいマイクロタイタープレートのウエルに加え、振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。次の段階では、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、１％（ｗ／ｖ）グルコース及び１０９Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを含む２ＴＹ　２５μｌを各ウエルに加えた。プレートを振とうせずに３７℃で３０分間インキュベートし、次に振とうしながら３７℃で１時間さらにインキュベートした。その後プレートを室温で２０分間、１８００ｒｐｍで遠心し、上清を吸引して除去し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含む２ＴＹ　２００μｌに細胞ペレットを再懸濁した。振とうしながら３７℃で一晩インキュベーションを実施した。マイクロタイタープレートのウエルにおいて一晩培養したものの遠心分離を行い（１５００ｒｍｐ；２０分間）、ファージ含有上清（１００μｌ）をヒツジ抗Ｍ１３バクテリオファージ（Ｃ．Ｐ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｉｓｈｏｐｓ　Ｓｔｏｒｆｏｒｄ，ＵＫ）被覆したマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ（商標）、ｈｉｇｈ　ｂｉｎｄ）に加えた。結合緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．０）中４℃で一晩インキュベートして、精製ヒツジ抗Ｍ１３抗体被覆プレートを調製した（１００μｌ／ウエル；１０μｇ／ｍｌ）。１０ｍｇ／ｍｌオボアルブミン（２００μｌ／ウエル）を含むＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで５回洗ってヒツジ抗Ｍ１３抗体被覆プレートから非結合ファージを除去した後、１０ｍｇ／ｍｌオボアルブミン（１００μｌ／ウエル）を含むＰＢＳＴ２ｍｌ中にアフィニティー精製した抗エストロン−３−グルクロニド抗体（２０μｇ）を加えた。室温で２時間インキュベーションを実施した。次にアルカリホスファターゼ複合ウサギ抗マウス免疫グロブリン（１００μｌ／ウエル）を１／１０００の希釈（ＰＢＳＴ、１０ｍｇ／ｍｌオボアルブミン中）で加え、室温でさらに２時間インキュベートした。１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．６中１００μｌ／ウエルのｐ−ニトロフェニルホスフェート（１ｍｇ／ｍｌ）でアッセイを展開し、プレートを４１０ｎｍで読み取った。
【００６３】
ＤＮＡ塩基配列決定
製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ（商標）プラスミド精製キットを使用して、陽性ファージクローンで感染させた細菌培養（５０ｍｌ）から二本鎖ファージミドＤＮＡを精製した。オリゴヌクレオチドプライマー、配列番号１：
５’−ＴＴＴ　ＣＣＣ　ＡＧＴ　ＣＡＣ　ＧＡＣ　ＧＴＴ　Ｇ−３’
（配列番号１）
を用いてＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動シークエンサー（３７３Ａ型、バージョン１．２．０）で配列決定を行った。
【００６４】
ファージＥＬＩＳＡとＤＮＡ塩基配列決定の結果から、次の３つのペプチドミモトープ配列を同定した：
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ
2004505638.tif 000003
【００６５】
リプレイスメント　ネット（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ｎｅｔ）分析によるミモトープコア結合領域の同定
ピン上での固相ペプチド合成
Ｍｕｌｔｉｐｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、ポリエチレンピン頭部での固相ペプチド合成によってＣ末端からペプチドを二組または三組合成した（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ペプチド合成を用いたエピトープ分析のための戦略）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１０２、２５９−２７４（１９８７））。９６穴マイクロタイタープレートの方式でピンをプラスチックホルダーに配置した。
【００６６】
ピン上でのペプチドに関するＥＬＩＳＡ試験
９６穴マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に、分配したピン試薬を低下させることにより、すべてのインキュベーション段階を室温（１８から２５℃）で実施した。ピンのセットをＴｗｅｅｎ　２０（商標）（０．０１％ｖ／ｖ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の槽に入れ、攪拌しながら５分間ずつ４回のサイクルで洗浄を行った。カゼイン（１％ｗ／ｖ、１７５μｌ／ウエル）を含むＰＢＳ中で１時間インキュベートすることによってピンの表面の非特異的結合部位をブロックした。ＭＡｂ４１５５をブロッキング緩衝液中で希釈し、ピンを抗体溶液（１５０μｌ／ウエル）中、４℃で１８時間インキュベートした。洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ，Ｈｉｇｈ　Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ、ブロッキング緩衝液中１／１０００、１５０μｌ／ウエルで１時間）においてインキュベートした。ピンをさらにもう１回洗い、その後ＡＢＴＳ［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）］作用基質中で１５分間インキュベートした（１５０μｌ／ウエル）。ＡＢＴＳは、３３％過酸化水素（１μｌ／ｍｌ）を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中で、０．０３３％（ｗ／ｖ）溶液として調製した。ウエルからピンを取り出して呈色反応を停止させ、Ｍｉｌｅｎｉａ　Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｅｒ（商標）（ＤＰＣ、Ｌｌａｎｂｅｒｉｓ，Ｗａｌｅｓ）を用いて４０５ｎｍで分光光度的に測定した。
【００６７】
コア結合領域の同定
コア結合領域を同定するために、配列番号２に基づいてピンの頭部でペプチドの１セットを合成した。これらは長さが連続的に１アミノ酸ずつ減少するペプチドを含み、最初はＮ末端から始まり、もう１つのシリーズではＣ末端から始まる。さらに、結合事象への各々の残基の寄与を評価するため、リード配列の各々の残基がＡｌａ（Ａｌａが既にその位置に存在する場合はＧｌｙ）によって置換されたペプチドのセットを合成した。ＭＡｂ４１５５をこれらのペプチドとの反応性に関して試験し、その結果を下記の表１に示す。
【００６８】
【表１】
2004505638.tif 000004
【００６９】
データが示すように、試験されたペプチドのうち配列番号６によって示されるコア結合領域を含むアミノ酸配列だけが適切な結合を提供した。配列番号７から１７で表わされるアミノ酸配列は配列番号６のコア結合領域を含み、エストラジオールミモトープとして役立つ適切な結合を提供した。
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号６）
Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　（配列番号７）
Ｇ１ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　　　　　　　（配列番号８）
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　　　　（配列番号９）
Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　（配列番号１０）
2004505638.tif 000005
【００７０】
アミノ酸配列、配列番号８を使用し、さらなるコア結合配列を同定した。また、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｈａｐｅｄ　ＨＭＦＧ１　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｆｉｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｒｅｎｔ　ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（再成形ＨＭＦＧ１抗体の構築及び親マウス抗体とのその高い特異性の比較）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７８、３６４−３７０（１９９３）に例示されるような既知の手法を用いて、他の１９個の天然に生じるアミノ酸による各残基の体系的置換の影響を検討した。
【００７１】
配列番号８と比較して卓越した結合反応性と特異性を持つ配列を次のように同定した。配列番号８を相対結合１００と設定して、ＥＬＩＳＡによって決定したこれらの配列へのＭＡｂ４１５５の結合を下記の表２に示す。
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　（配列番号１８）
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　（配列番号１９）
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　（配列番号２０）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　　（配列番号２１）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ　　（配列番号２２）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ　　（配列番号２３）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ　　（配列番号２４）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ　　（配列番号２５）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　　（配列番号２６）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ　　（配列番号２７）
ＧＩｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ　　（配列番号２８）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　　（配列番号２９）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ　　（配列番号３０）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ　　（配列番号３１）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ　　（配列番号３２）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　　（配列番号３３）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ　　（配列番号３４）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ　　（配列番号３５）
【００７２】
【表２】
2004505638.tif 000006
【００７３】
コア結合領域の逆配列のＤ−異性体
上記の配列番号１から３５はＬ−異性体である。上記で同定したコア結合領域の、逆配列のＤ−異性体が有効なミモトープとして同様に機能することも明らかにされた。例えば、配列番号３７で表わされるようなアミノ酸配列を上述したペプチド合成法によって調製した。上述した試験法により、親配列（配列番号２８）と比較した結合親和性を測定した。結果は、逆配列が親配列と比較して同等の相対結合親和性を持つことを示す。
【００７４】
したがって下記は、エストラジオールについてのミモトープとして機能することができるペプチドのコア結合配列を同定している。各々の配列は、上述したもののうち、１つの逆配列アミノ酸であるＤ−異性体を含む。
【００７５】
注：配列番号３６から５６はＤ−異性体である
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号３６）
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号３７）
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｉｙ　　　　　　　　　（配列番号３８）
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｉｙ　　　　　　　　　（配列番号３９）
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４０）
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４１）
Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　（配列番号４２）
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４３）
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４４）
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４５）
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４６）
Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４７）
Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４８）
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号４９）
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号５０）
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号５１）
Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号５２）
Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　　　　　　　　　（配列番号５３）
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇ１ｙ　　　　　　　　　（配列番号５４）
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【００７６】
実施例２
ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）ライブラリーからのペプチドミモトープ配列の同定
実施例１で述べたようなＭｕｌｔｉｐｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔからのピンを使用して、２０個の天然に生じるアミノ酸のすべての可能なトリマーの組合せを含み、ドデカペプチドのさらなるランダムなセットを追加したペプチド配列のライブラリーを構築した（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａ　ＪＷら、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｓｍａｌｌ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａ　ｎｅｗ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｔｈａｔ　ｍｉｍｉｃ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ（ランダムなペプチドの小セットのスクリーニング：エピトープを模倣する合成ペプチドを同定するための新しい戦略）、Ｊ　Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇ．１０、２１７−２２４（１９９７））。ＭＡｂ４１５５の結合を、実施例１で述べたように結合親和性に関してライブラリーを試験した。これは、エストラジオールミモトープに関するコア結合領域として次のアミノ酸配列（Ｌ−異性体）を同定した。
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ　（配列番号５７）
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ　（配列番号５８）
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ　（配列番号５９）
Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ　（配列番号６０）
Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ　（配列番号６１）
Ａｒｇ−Ｇｌｎ−ｌｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　（配列番号６２）
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ　（配列番号６３）
実施例１と同様に、Ｄ−アミノ酸の下記の逆配列はエストラジオールに関するペプチドミモトープのコア結合領域として機能することができると同定される。
【００７７】
注：配列番号６４から７０はＤ−異性体である
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ　（配列番号６４）
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ　（配列番号６５）
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ　（配列番号６６）
Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ　（配列番号６７）
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ　（配列番号６８）
Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ　（配列番号６９）
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ　（配列番号７０）
【００７８】
実施例３
固相上でのエストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）またはＥ３Ｇのペプチドミモトープを使用したＥ３Ｇに関する競合アッセイの比較
ペプチドリガンド合成
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｕｎｉｔ，ＴＭ　ＱＭＣ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）で合成ペプチドリガンドを調製した。質量分析法とＨＰＬＣによって純度を評価し、純度は９５％以上であった。
【００７９】
オボアルブミン−Ｅ３Ｇ複合体の調製
ＥＤＣ（１−エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、０．１Ｍ）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、０．０２Ｍ）の新鮮調製溶液２ｍｌ中にＥ３Ｇ　２．６ｍｇを再懸濁し、室温で１５分間インキュベートして、エストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）オボアルブミン複合体を調製した。Ｅ３Ｇ溶液にオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌを加え、これを絶えず混合しながら室温で２時間半インキュベートした。次に複合体を、０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水１Ｌに対して１６時間透析した。
【００８０】
ＢＳＡ−ミモトープ複合体の調製
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を清潔なガラスバイアルにおいてピペットチップからの吸引と排出によって混合しながら複合緩衝液（炭酸水素ナトリウム緩衝液、０．１Ｍ、ｐＨ８．４）３ｍｌに溶解した。混合物を１時間ローラーにかけた。配列番号３６によって表わされるようなペプチドミモトープを複合緩衝液に溶解した。ペプチド溶液（１．０ｍｌ、＠１０ｍｇ／ｍｌ）及びグルタルアルデヒド１０μｌ（高市販グレード、Ｓｉｇｍａ）をＢＳＡ溶液に加えた。次に密封したバイアルを室温で４時間、ローラーで攪拌した。その後コンジュゲート溶液を４℃で４８時間、塩化ナトリウム（０．９％ｗ／ｖ）に対して透析した。
【００８１】
アッセイ：
ペプチド−ミモトープ−ＢＳＡ複合体（１０μｇ／ｍｌ）とＥ３Ｇ−オボアルブミン複合体（３μｇ／ｍｌ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の溶液５０μｌから室温で一晩別々にマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）のウエルで乾燥した。ウエルを洗い（４×ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標））、ＰＢＳ１００μｌ中０．１％カゼインで１時間ブロックして、使用前に４回洗った。ＰＢＳ（０−３μＭ）中のＥ３Ｇ２５μｌアリコートを加え、１５分間インキュベートした後、ＰＢＳ中０．６μｇ／ｍｌでＭＡｂ４１５５抗Ｅ３Ｇ抗体２５μｌを加えた。ウエルを攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。４回洗った後、ＰＢＳ中１：１０００希釈のウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ複合体５０μｌ（Ｄａｋｏ，Ｈｉｇｈ　Ｗｙｃｏｍｂ，ＵＫ）を各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。４回洗った後、ＡＢＴＳ［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）］作用基質中で１５分間インキュベートした（１５０μｌ／ウエル）。ＡＢＴＳは、３３％過酸化水素（１μｌ／ｍｌ）を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中０．０３３％（ｗ／ｖ）溶液として調製した。０．５Ｍ硫酸を加えて（１０μｌ／ウエル）呈色を停止させ、Ｍｉｌｅｎｉａ　Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｅｒ（商標）（ＤＰＣ、Ｌｌａｎｂｅｒｉｅｓ，Ｗａｌｅｓ）を用いて４０５ｎｍで分光光度的に測定した。
【００８２】
図１は生じた検定曲線を示す。どちらも、マイクロモルからナノモルの範囲内に中間点を持つ競合免疫検定法に典型的なものである。さらに、ミモトープ含有ＢＳＡ−配列番号３７を用いたアッセイの感受性は、エピトープ含有Ｅ３Ｇ−オボアルブミンを使用するときに得られるものよりも有意に高い。
【００８３】
本発明を、その好ましい実施形態を個々に参照しながら詳述したが、本発明の精神と範囲により変法及び改良を実施しうることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は生じた検定曲線を示す。ミモトープ含有ＢＳＡ−配列番号３７を用いたアッセイの感受性は、エピトープ含有Ｅ３Ｇ−オボアルブミンを使用するときに得られるものよりも有意に高い。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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