(57)【要約】本発明は、増加したコカイン加水分解活性を有する２５個のブチリルコリンエステラーゼ改変体、および対応するコード核酸を提供する。本発明はまた、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリー、およびブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸に対応するライブラリーを提供する。本発明は、コカインベースのブチリルコリンエステラーゼ基質を加水分解する方法、およびコカインにより誘導される状態を処置する方法を、さらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８またはこれらの機能的フラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号２またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号４またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号６またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号８またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号１０またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号１２またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号１４またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号１６またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号１８またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号２０またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号２２またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号２４またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号２６またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号２８またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号３０またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号３２またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号３４またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号３６またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号３８またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号４０またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号４２またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号５２またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号５４またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号５６またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号５８またはその機能的フラグメントである、ポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８またはこれらの機能的フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、５１、５３、５５および５７またはこれらの機能的フラグメントからなる群から選択される核酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が配列番号１である、核酸。
【請求項３０】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号３である、核酸。
【請求項３１】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号５である、核酸。
【請求項３２】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号７である、核酸。
【請求項３３】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号９である、核酸。
【請求項３４】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号１１である、核酸。
【請求項３５】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号１３である、核酸。
【請求項３６】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号１５である、核酸。
【請求項３７】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号１７である、核酸。
【請求項３８】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号１９である、核酸。
【請求項３９】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号２１である、核酸。
【請求項４０】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号２３である、核酸。
【請求項４１】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号２５である、核酸。
【請求項４２】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号２７である、核酸。
【請求項４３】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号２９である、核酸。
【請求項４４】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号３１である、核酸。
【請求項４５】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号３３である、核酸。
【請求項４６】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号３５である、核酸。
【請求項４７】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号３７である、核酸。
【請求項４８】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号３９である、核酸。
【請求項４９】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号４１である、核酸。
【請求項５０】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号５１である、核酸。
【請求項５１】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号５３である、核酸。
【請求項５２】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号５５である、核酸。
【請求項５３】
請求項２８に記載の核酸であって、前記核酸配列が、配列番号５７である、核酸。
【請求項５４】
ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の６８〜８２位（配列番号５９）、１１０〜１２１位（配列番号６０）、１９４〜２０１位（配列番号６１）、２２４〜２３４位（配列番号６２）、２７７〜２８９位（配列番号６３）、３２７〜３３２位（配列番号６４）、または４２９〜４４２位（配列番号６５）、あるいはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの１つ以上の領域に中に少なくとも１つのアミノ酸変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体を含むライブラリーであって、該ライブラリーは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増強されたコカイン加水分解活性を示す少なくとも１つのブチリルコリンエステラーゼ改変体を有するが、但し、単一のアミノ酸変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体が、３２８位にＹを有するヒトブチリルコリンエステラーゼではない、ライブラリー。
【請求項５５】
請求項５４に記載のライブラリーであって、前記ブチリルコリンエステラーゼ改変体が、少なくとも２つのアミノ酸変更を有する、ライブラリー。
【請求項５６】
請求項５４に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の６８〜８２位（配列番号５９）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項５７】
請求項５４に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の１１０〜１２１位（配列番号６０）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項５８】
請求項５４に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の１９４〜２０１位（配列番号６１）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項５９】
請求項５４に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の２２４〜２３４位（配列番号６２）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６０】
請求項５４に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の２７７〜２８９位（配列番号６３）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６１】
請求項５４に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の３２７〜３３２位（配列番号６４）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６２】
請求項５４に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の４２９〜４４２位（配列番号６５）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６３】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸を含むライブラリーであって、各核酸が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の６８〜８２位（配列番号５９）、１１０〜１２１位（配列番号６０）、１９４〜２０１位（配列番号６１）、２２４〜２３４位（配列番号６２）、２７７〜２８９位（配列番号６３）、３２７〜３３２位（配列番号６４）、または４２９〜４４２位（配列番号６５）、あるいはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの１つ以上の領域中で少なくとも１つのアミノ酸変更をコードする少なくとも１つのコドンを有するが、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする該核酸の少なくとも１つは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増強されたコカイン加水分解活性を有し、但し、単一のアミノ酸変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体が、３２８位にＹを有するヒトブチリルコリンエステラーゼではない、ライブラリー。
【請求項６４】
請求項６３に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのコドンによってコードされる前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の６８〜８２位（配列番号５９）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６５】
請求項６３に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのコドンによってコードされる前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の１１０〜１２１位（配列番号６０）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６６】
請求項６３に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのコドンによってコードされる前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の１９４〜２０１位（配列番号６１）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６７】
請求項６３に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのコドンによってコードされる前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の２２４〜２３４位（配列番号６２）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６８】
請求項６３に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのコドンによってコードされる前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の２７７〜２８９位（配列番号６３）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項６９】
請求項６３に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのコドンによってコードされる前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の３２７〜３３２位（配列番号６４）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項７０】
請求項６３に記載のライブラリーであって、前記少なくとも１つのコドンによってコードされる前記少なくとも１つのアミノ酸変更が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸の４２９〜４４２位（配列番号６５）、またはその機能的フラグメントに対応するブチリルコリンエステラーゼの領域中にある、ライブラリー。
【請求項７１】
コカインにより誘導される状態を処置する方法であって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８またはこれらの機能的フラグメントからなる群から選択される有効量のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドを個体に投与する工程を包含し、該ポリペプチドが、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増加したコカイン加水分解活性を示す、方法。
【請求項７２】
請求項７１に記載の方法であって、前記コカインベースの基質がコカインである、方法。
【請求項７３】
請求項７１に記載の方法であって、前記個体がコカイン過剰摂取の症状がある、方法。
【請求項７４】
請求項７１に記載の方法であって、前記個体がコカイン中毒の症状がある、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は一般に、コンピュータ化学および分子モデリングの分野に関し、より詳細には、触媒効率が増大しているブチリルコリンエステラーゼポリペプチド改変体に関する。
【０００２】
コカイン濫用は、推定３６００万人の慢性使用者によって証明されるように、合衆国における重大な社会的および医療的問題である。コカイン濫用はしばしば、長期依存性ならびに生命を脅かす過量をもたらす。しかし、コカインの強化作用および毒性作用と戦う有効なアンタゴニストは、現在入手可能でない。
【０００３】
コカイン濫用を処置するためのアンタゴニストを同定する際の１つの困難は主に、麻薬の作用機構から生じる。特に、コカインは、神経伝達物質の再取り込みを阻害して、報酬経路の過刺激をもたらす。コカインの強化作用の基礎であると提唱されているのは、この過刺激である。さらに、より高濃度では、コカインは、中枢神経系および心臓血管系の両方において複数のレセプターと相互作用して、過量に関連した毒性をもたらす。コカインのこの多種多様な作用機構に起因して、コカインの強化作用および毒性作用の両方を処置するための選択的アンタゴニストを同定することは困難である。さらに、コカインのそのレセプターへの結合をブロックするアンタゴニストは、コカインと同じ有害作用の多くを示す傾向がある。
【０００４】
近年、血流中のコカインを遮断および中和することに基づく、代替的処置ストラテジーが提唱されている。例えば、ドパミンＤ１アンタゴニスト、ドパミンＤ２アンタゴニストおよびドパミンＤ３アンタゴニストは、ラットモデルにおいてコカインの強化効力に影響を与え、これらのアンタゴニストは、狭い範囲の有効用量を示し、そしてコカイン効力の低下程度は極めて小さい。さらに、これらのドパミンアンタゴニストは、用量が、コカイン自己投与行動に効果を示すレベルをわずかに上回っただけで、他の行動の甚大な低下を生じる。
【０００５】
別個の処置ストラテジーは、抗体ベースのアプローチを用いた、コカインの作用に対する部分的防御を含む。免疫アプローチの制限としては、コカイン結合後の抗体の化学量論的枯渇が挙げられる。血流中のコカインを代謝する触媒抗体の使用は、コカインを分解して放出することによって部分的にこの問題を軽減して、さらなるコカインの結合を可能にする。しかし、今日までに同定された最良の触媒抗体は、内因性ヒト血清エステラーゼよりも有意にゆっくりとコカインを代謝する。
【０００６】
インビボでは、コカインは、３つの主な経路によって代謝される：１）ノルコカインを形成する、肝臓中でのＮ−脱メチル、２）エクゴニンメチルエステルを形成する、血清エステラーゼおよび肝臓エステラーゼによる加水分解、ならびに３）ベンゾイルエクゴニンを形成する、非酵素的加水分解。ヒトでは、ノルコカインは、少量の代謝産物であり、一方、ベンゾイルエクゴニンおよびエクゴニンメチルエステルは、与えられた用量の約９０％を占める。コカインの代謝産物は、迅速にクリアランスされ、そしてコカインの毒性作用も強化作用も提示しないようである。低血清レベルのブチリルコリンエステラーゼは、コカイン過量後の有害な生理学的事象と関連付けられており、ブチリルコリンエステラーゼが、血漿中で観察されるコカイン加水分解活性の原因であるというさらなる証拠を提供する。欠損版のブチリルコリンエステラーゼ遺伝子を有する個体から得られたヒト血漿は、コカインをインビトロで加水分解する能力をほとんどまたは全く有さないことが示されており、そして１つの欠損型コピーのブチリルコリンエステラーゼ遺伝子と１つの野生型コピーのブチリルコリンエステラーゼとを保有する個体の血漿中のコカインの加水分解は、正常な速度の半分の速度で進行することが示されている。それゆえ、欠損版のブチリルコリンエステラーゼ遺伝子を有する個体は、コカインに対する生命を脅かす反応に関する危険性がより高いことが示唆されている。近年、ブチリルコリンエステラーゼの投与は、マウスおよびラットにおいてコカイン過量に対する制限された防御を付与することが実証されている。
【０００７】
ブチリルコリンエステラーゼの投与は、インビボでコカイン毒性に対して何らかの効果を提供するが、これは、コカイン加水分解の効率的な触媒ではない。野生型ブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性は低いので、治療のためにひどく高価な多量の精製酵素の使用が必要である。
【０００８】
多数の天然に存在するヒトブチリルコリンエステラーゼならびに種バリエーションが公知であり、これらはいずれも、増大したコカイン加水分解活性を示さない。同様に、種々の組換え調製ブチリルコリンエステラーゼ変異が、増大したコカイン加水分解活性に関して試験されているが、増大したコカイン加水分解活性を示すこのような１つの変異体（Ａ３２８Ｙと称される）しか同定されていない。増大したコカイン加水分解活性をもたらすさらなるブチリルコリンエステラーゼ変異が、ブチリルコリンエステラーゼの臨床評価を可能にするために、同定される必要がある。
【０００９】
従って、野生型ブチリルコリンエステラーゼよりも有意に効率高くコカインを加水分解し得る組換えブチリルコリンエステラーゼポリペプチドについての必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、そして関連する利点をも提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって与えられた助成金番号１Ｒ０１  ＤＡ０１１７０７の下、政府の支援の下でなされた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、天然に存在するヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して増大したコカイン加水分解活性を有する２５個のブチリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）改変体ポリペプチド、ならびにそれらをコードする核酸に関する。本発明はまた、ブチリルコリンエステラーゼの１以上の領域において少なくとも１つのアミノ酸変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体を含み、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増強されたコカイン加水分解活性を示す少なくとも１つのブチリルコリンエステラーゼ改変体をさらに有する、ライブラリーを提供する。本発明はさらに、コカインベースのブチリルコリンエステラーゼ基質を加水分解する方法およびコカイン誘発性状態を処置する方法に関する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、天然に存在するヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して増大したコカイン加水分解活性を有する、２５個のブチリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）改変体ポリペプチド、ならびにこれらをコードする核酸に関する。
【００１３】
本発明はまた、コカインベースのブチリルコリンエステラーゼ基質を加水分解する方法、ならびにコカイン誘発性状態を処置する方法に関する。本実施形態では、本発明は、コカインの毒性に起因する症状（大発作、心停止、発作および血圧上昇を伴う薬物誘発性精神病を含む）に罹っている個体を処置する方法を提供する。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、顕著な臨床的価値を保持する。なぜなら、既知の天然に存在する改変体のいずれよりも、コカインをより速い速度で加水分解する能力のためである。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体を他の処置選択肢とは別のものとする、コカイン毒性の生命を脅かす症状へのかなりより迅速な応答を可能にするのは、コカイン加水分解活性におけるこの増大である。
【００１４】
本発明はまた、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーならびにブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸のライブラリーを提供する。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリーは、コカイン加水分解活性に重要であると決定された領域において１以上のアミノ酸変更を有する。それゆえ、本発明は、増大したコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体についてスクリーニングされ得るライブラリーを提供する。
【００１５】
コリンエステラーゼは、神経伝達物質アセチルコリンおよび多数のエステル含有化合物を加水分解し得る、遍在する、多型カルボキシラーゼＢ型酵素である。２つの主なコリンエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼである。ブチリルコリンエステラーゼは、以下に示すとおりの多数のコリンエステルの加水分解を触媒する：
【００１６】
【化１】
2004535155.tif 000002
ブチリルコリンエステラーゼは、ブチリルコリンおよびベンゾイルコリンを基質として優先的に使用する。ブチリルコリンエステラーゼは、哺乳動物の血漿、肝臓、膵臓、小腸粘膜および中枢神経系の白質に見出される。ブチリルコリンエステラーゼをコードするヒト遺伝子は第３染色体に位置し、ブチリルコリンエステラーゼの３０を超える天然に存在する遺伝的バリエーションが公知である。ブチリルコリンエステラーゼポリペプチドは５７４アミノ酸長であり、そして１，７２２塩基対のコード配列によってコードされる。３つの天然に存在するブチリルコリンエステラーゼバリエーションは、Ａ改変体（配列番号４５）、Ｊ改変体（配列番号４６）およびＫ改変体（配列番号４７）と呼ばれる、典型的でない対立遺伝子である（これらを、図４に整列する）。Ａ改変体は、Ｄ７０Ｇ変異を有し、そして稀であり（０．５％の対立遺伝子頻度）、一方、Ｊ改変体は、Ｅ４９７Ｖ変異を有し、そして１つの家族にしか見出されていない。Ｋ改変体は、ヌクレオチド１６１５に点変異を有し、これは、Ａ５３９Ｔ変異をもたらし、そして白人において約１２％という対立遺伝子頻度を有する。
【００１７】
ブチリルコリンエステラーゼの天然に存在するヒトバリエーションに加えて、多数の種バリエーションが公知である。ネコのブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列は、ヒトブチリルコリンエステラーゼと８８％同一性である（図４を参照のこと）。異なる７０個のアミノ酸のうち、３つは、活性部位ゴージに位置し、そしてＡ２７７Ｌ、Ｐ２８５ＬおよびＦ３９８Ｉと称される。同様に、ウマのブチリルコリンエステラーゼは、ヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して、活性部位に３つのアミノ酸の相違を有し、これらは、Ａ２７７Ｖ、Ｐ２８５ＬおよびＦ３９８Ｉである（図４を参照のこと）。ラットのブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列は、６個のアミノ酸の相違を活性部位ゴージに含み、これらは、Ａ２７７Ｋ、Ｖ２８０Ｌ、Ｔ２８４Ｓ、Ｐ２８５Ｉ、Ｌ２８６ＲおよびＶ２８８Ｉである（図４を参照のこと）。
【００１８】
天然に存在するヒトブチリルコリンエステラーゼバリエーション、種バリエーション、ならびに組換え調製変異は、Ｘｉｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５５：８３−９１（１９９９）によって以前に記載されている。増大したコカイン加水分解活性について試験された組換えヒトブチリルコリンエステラーゼ変異体としては、以下の１つまたは複数の変化を有する変異体が挙げられる：Ｎ６８Ｙ／Ｑ１１９／Ａ２７７Ｗ、Ｑ１１９／Ｖ２８８Ｆ／Ａ３２８Ｙ、Ｑ１１９Ｙ、Ｅ１９７Ｑ、Ｖ２８８Ｆ、Ａ３２８Ｆ、Ａ３２８Ｙ、Ｆ３２９ＡおよびＦ３２９Ｓ。これらの変異体のうち、増大したコカイン加水分解活性を示すと同定された唯一のブチリルコリンエステラーゼ変異体はＡ３２８Ｙ変異体であり、これは、アミノ酸３２８位にアラニン（Ａ）ではなくチロシン（Ｙ）を有し、そしてコカイン加水分解活性においてヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して４倍の増大を示す（Ｘｉｅら，前出，１９９９）。
【００１９】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの機能的フラグメントを提供する。
【００２０】
配列番号２として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における２４倍の増大を有する。配列番号４として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における１０倍の増大を有する。配列番号６として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における１６倍の増大を有する。配列番号８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における８倍の増大を有する。配列番号１０として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における１００倍の増大を有する。配列番号１２として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、１００倍のコカイン加水分解活性を有する。配列番号１４として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、９７倍のコカイン加水分解活性を有する。配列番号１６として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、９１倍のコカイン加水分解活性を有する。配列番号１８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、６８倍のコカイン加水分解活性を有する。配列番号２０として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増大したコカイン加水分解活性を有する。配列番号２２として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、増大したコカイン加水分解活性を有する。配列番号２４として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、増大したコカイン加水分解活性を有する。配列番号２６として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、増大したコカイン加水分解活性を有する。配列番号２８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、４倍のコカイン加水分解活性を有する。配列番号３０として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における４倍の増大を有する。配列番号３２として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における２倍の増大を有する。配列番号３４として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における３倍の増大を有する。配列番号３６として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における２倍の増大を有する。配列番号３８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における２倍の増大を有する。配列番号４０として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における１．５倍の増大を有する。配列番号４２として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における２．５倍の増大を有する。配列番号５２として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における７倍〜１５倍の増大を有する。配列番号５４として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における４倍の増大を有する。配列番号５６として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における２．５倍の増大を有する。配列番号５８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性における２倍の増大を有する。
【００２１】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドは、いずれの公知の天然に存在する改変体よりも速い速度でコカインを加水分解し得る、それらの能力に起因して、有意な臨床的価値を保持する。コカイン毒性の生命に関わる症状により迅速に応答し得るコカイン加水分解活性におけるこの増加が、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドに治療的価値を与える。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドは、コカイン加水分解活性に重要であると決定された領域中に、２つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、用語「ブチリルコリンエステラーゼ」は、配列番号４４として示される天然に生じるヒトブチリルコリンエステラーゼの配列を有するポリペプチドをいうことが意図される。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、用語「ブチリルコリンエステラーゼ改変体」は、構造的にブチリルコリンエステラーゼと類似であるが、配列番号４４として示されるブチリルコリンエステラーゼとは、少なくとも１アミノ酸が異なる分子をいうことが意図される。ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、配列番号４４として示されるブチリルコリンエステラーゼと構造的に類似しているが、増大したコカイン加水分解活性を示す。例えば、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドのコカイン加水分解活性は、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２８、３２、３６、４０、８０、１００またはそれより多い因子によって増大され得る。
【００２４】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、１，２，３，４，５，６またはそれより多いアミノ酸変異を有し得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの特定の例は、３２８位および３３２位に、各々アミノ酸トリプトファンおよびメチオニンを有し、このアミノ酸配列およびコード核酸配列は、各々、配列番号２および配列番号１と命名される。ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドのさらなる例としては、以下が挙げられる：３２８位および３３２位に、各々、アミノ酸トリプトファンおよびプロリンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々、配列番号４および配列番号３と命名される）；３２８位および３３１位に、各々アミノ酸トリプトファンおよびロイシンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号６および配列番号５として命名される）；３２８位および３３２位に、各々アミノ酸トリプトファンおよびセリンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号８および配列番号７として命名される）；１９９位、２２７位、２８７位、３２８位および３３２位に、各々アミノ酸セリン、アラニン、グリシンおよびトリプトファンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号１０および配列番号９として命名される）；１９９位、２２７位、２８７位および３２８位に、各々アミノ酸セリン、アラニン、グリシンおよびトリプトファンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号１２および配列番号１１として命名される）；１９９位、２８７位および３２８位に、各々アミノ酸セリン、グリシンおよびトリプトファンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号１４および配列番号１３として命名される）；２２７位、２８７位および３２８位に、各々アミノ酸アラニン、グリシンおよびトリプトファンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号１６および配列番号１５として命名される）；２２７位および３２８位に、各々アミノ酸アラニンおよびトリプトファンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号１７および配列番号１８として命名される）；３３２位に、アミノ酸セリンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号２０および配列番号１９として命名される）；３３２位に、アミノ酸メチオニンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号２２および配列番号２１として命名される）；３３２位に、アミノ酸プロリンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号２４および配列番号２３として命名される）；３３１位に、アミノ酸ロイシンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号２６および配列番号２５として命名される）；２２７位に、アミノ酸アラニンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号２８および配列番号２７として命名される）；２２７位に、アミノ酸グリシンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号３０および配列番号２９として命名される）；２２７位に、アミノ酸セリンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号３２および配列番号３１として命名される）；２２７位に、アミノ酸プロリンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号３４および配列番号３３として命名される）；２２７位に、アミノ酸トレオニンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号３６および配列番号３５として命名される）；２２７位に、アミノ酸システインを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号３８および配列番号３７として命名される）；２２７位に、アミノ酸メチオニンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号４０および配列番号３９として命名される）；１９９位に、アミノ酸セリンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号４２および配列番号４１として命名される）；３２８位に、アミノ酸トリプトファンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号５２および配列番号５１として命名される）；２８７位に、アミノ酸グリシンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号５４および配列番号５３として命名される）；２８５位に、アミノ酸グルタミンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号５６および配列番号５５として命名される）；２８５位に、アミノ酸セリンを有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド（このアミノ酸配列および核酸配列は本明細書中で記載され、そして、各々配列番号５８および配列番号５７として命名される）。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸が一緒に共有結合をしていることを意味することが意図される。本発明のポリペプチドとしては、少数または数個のアミノ酸を有する小さなポリペプチド、ならびに数百個以上のアミノ酸を有する巨大なポリペプチドが挙げられる。通常、２つ以上のアミノ酸残基間の共有結合は、アミド結合である。しかし、このアミノ酸は、ペプチド分野および化学分野の技術者に公知である種々の他の手段によって、一緒に結合され得る。ゆえに、ポリペプチドは、その全体または一部に、アミノ酸、アミノ酸アナログ、および模倣物間の非アミド結合を有する分子を含み得る。同様に、この用語はまた、環状ペプチドおよび他の立体構造的に制約された構造を含む。ポリペプチドはまた、翻訳後修飾（リン酸化、脂質化、プレニル化、硫酸化、水酸化、アセチル化、炭水化物の付加、置換基または補因子の付加、ジスルフィド結合の形成、タンパク質分解、高分子複合体への構築など）などの天然に生じる改変によって改変され得る。
【００２６】
以下に記載するように、本発明のポリペプチドはまた、このような改変体が、参照ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有し、そして、ほぼ同一のコカイン加水分解活性を示す限り、例えば、天然の生じるアミノ酸（例えば、Ｄ−立体異性体）、天然に生じないアミノ酸および模倣物の改変形態を包含する。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸変異を有し得る。さらに、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドは、そのコカイン加水分解活性は有意に変化しないが、所望の特性（例えば、増大した生物安定性）を与える、１つ以上のさらなる改変を有し得る。
【００２７】
本発明のアミノ酸配列は、類似であるが、同一でない配列を有し得、そして、参照アミノ酸配列によって定義されるポリペプチドに匹敵する機能的活性および生物学的活性を保持することが、理解される。このような類似であり、非同一であるにもかかわらず、実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドは、このようなポリペプチドが、参照ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの生物学的活性を保持する限り、参照アミノ酸配列に関して、少なくとも約７５％、約８０％、約８２％、約８４％、約８６％もしくは約８８％、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％もしくは９４％のアミノ酸同一性；ならびに９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％よりも高いアミノ酸同一性を有し得る。しかし、スプライシング改変体として生じる、記載されたレベルよりも低い配列同一性を含むか、または保存的アミノ酸置換によって改変されたか、または縮重コドンの置換による、ポリペプチド、またはコード核酸配列がまた、本発明の範囲内に包含されるということは、理解される。
【００２８】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体の生物学的活性は、本明細書中で記載されるようなコカイン加水分解活性である。例えば、配列番号２と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約２４倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号４と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｐは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約１０倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号６と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｖ３３１Ｌは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約１６倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号８と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｓは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約８倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号１０と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約１００倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号１２と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約１００倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号１４と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ａ１９９Ｓは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約９７倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号１６と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約９１倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号１８と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗ／Ｆ２２７Ａは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約６８倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号２０と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｙ３３２Ｓは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号２２と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｙ３３２Ｍは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号２４と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｙ３３２Ｐは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号２６と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｖ３３１Ｌは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号２８と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｆ２２７Ａは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約４倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号３０と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｆ２２７Ｇは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約４倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号３２と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｆ２２７Ｓは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約２倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号３４と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｆ２２７Ｐは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約３倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号３６と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｆ２２７Ｔは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約２倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号３８と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｆ２２７Ｃは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約２倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号４０と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｆ２２７Ｍは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約１．５倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号４２と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ１９９Ｓは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約２．５倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号５２と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ａ３２８Ｗは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約７倍〜１５倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号５４と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｓ２８７Ｇは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約４倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号５６と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｐ２８５Ｑは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約２．５倍増加したコカイン加水分解活性を示し；配列番号５８と命名されたブチリルコリンエステラーゼ改変体Ｐ２８５Ｓは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して、約２倍増加したコカイン加水分解活性を示す。
【００２９】
当業者は、検出されたブチリルコリンエステラーゼと比較してコカイン加水分解活性の正確な増大が、選択された特定のアッセイに依存し得るということを理解する。ゆえに、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体の全ては増大したコカイン加水分解活性を有するが、本明細書中に記載した値は、活性を測定するために実施したアッセイに依存して変化し得る近似値である。しかし、当業者は、種々の改変体（これらの全てが増大した活性を有する）のコカイン加水分解活性の相対値を決定するために、適切なコントロールを実施し得る。
【００３０】
一次アミノ酸配列中の低度の改変は、類似で非同一な配列を有するが、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドに匹敵する機能的活性または生物学的活性を保持するポリペプチドを生じ得ることが理解される。これらの改変は、部位特異的変異を介するように意図的であり得るか、または偶発的（例えば、自然突然変異を介して）であり得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの一次構造全体のうち一部のみが、参照ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドのコカイン加水分解活性を保持し得ることが、理解される。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド配列のこのような機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の少なくとも１つの生物学的機能が保持される限り、定義の範囲内に含まれる。種々の分子（例えば、他のポリペプチド、炭水化物、脂質、または化学部分）が、本発明のポリペプチドに結合されることが、理解される。
【００３１】
用語「機能的フラグメント」は、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドに関して使用される場合、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの一部（但し、この一部は、本明細書中で記載されたような生物学的活性を有する）であり、参照ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの特性を有するポリペプチドフラグメントをいう。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの機能的フラグメントのアミノ酸長は、約５アミノ酸〜参照ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの全長タンパク質配列の範囲であり得る。特定の実施形態において、アミノ酸長としては、例えば、以下が含まれる：少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約１５アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約３５アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、少なくとも約４５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約７５アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１５０アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸またはそれより長く、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリヌクレオチド配列の全長までの長さ。この機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの連続したアミノ酸配列であり得、これは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの基質結合ドメインに対応する連続したアミノ酸配列を含む。機能的活性を示す、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの機能的フラグメントは、例えば、少なくとも８アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸または４０アミノ酸を有し得、そして、しばしば、本発明のポリペプチドの、少なくとも５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、２００アミノ酸、３００アミノ酸または４００以上のアミノ酸で、全長ポリペプチド−１アミノ酸まで有し得る。本発明のポリペプチドの機能的フラグメントの適切な長さおよびアミノ酸配列は、この機能的フラグメントの意図された使用に依存して、当業者によって決定され得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の機能的フラグメントは、親ポリペプチドのコカイン加水分解活性のいくらか、またはその全てをなお保持するブチリルコリンエステラーゼ改変体の一部をいうことが意図される。
【００３２】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの機能的フラグメントは、酵素の触媒活性に重要な活性部位残基を含み得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの加水分解活性に重要な領域は、当該分野で公知の種々の方法を介して、決定または予測され得る。高度な配列類似性を共有し、そして、生物学的に類似の触媒特性を有する関連した酵素（例えば、アセチルコリンエステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ）は、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの触媒活性に重要な領域に関する情報を提供し得る。例えば、構造のモデル化は、酵素の活性部位を示し得、これは、三次構造（例えば、一般に、一次構造では互いに離れて位置するアミノ酸残基によって形成される溝）である。ゆえに、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの機能的フラグメントは、コカイン加水分解活性に重要なブチリルコリンエステラーゼ酵素の領域を構成するアミノ酸残基（例えば、活性部位の溝に沿って位置するこれらの残基）を含み得る。
【００３３】
ブチリルコリンエステラーゼ酵素の構造モデル化に加えて、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変更体ポリペプチドの機能的フラグメントを調製する場合、生化学的データを使用してコカイン加水分解活性に重要なブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド領域を決定または予測し得る。この点について、改変されたコカイン加水分解活性を有する天然に生じるブチリルコリンエステラーゼ酵素の特徴付けは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの触媒活性に重要な領域を同定するために有用であり得る。同様に、部位特異的変異の研究は、触媒的に重要なアミノ酸残基に関するデータを提供し得、例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６７：２８３〜３２２（１９９２）（本明細書中に参考として援用される）中で総説される。特に、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの機能的フラグメントは、配列番号１４として示されるブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸８２位、アミノ酸１１２位、アミノ酸１２８位、アミノ酸２３１位、アミノ酸３２９位、アミノ酸３３２位、アミノ酸４３０位およびアミノ酸４４０位に対応する活性部位残基を含み得る。従って、機能的フラグメントは、例えば、３６０アミノ酸長であり得、そして、参照ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの８０残基〜４４０残基を含み得る。
【００３４】
それゆえ、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの機能的フラグメントは、コカイン加水分解活性に重要であると決定または推定される、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の範囲または領域を含み得る。上記のように、領域は、１以上の構造的方法、生化学的方法またはモデリング方法を用いることによって、コカイン加水分解活性に重要であると決定または推定され得、その結果、絶対的境界というよりは、一般的に規定される。領域は、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の、コカイン加水分解活性に重要であると推定される、２以上の連続するアミノ酸位置を含み得る。本発明を実施する際にブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの機能的フラグメントとして有用なブチリルコリンエステラーゼの領域は、約３０アミノ酸長以下であり、そして好ましくは２アミノ酸長と２０アミノ酸長との間、５アミノ酸長と１５アミノ酸長との間である。
【００３５】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドまたはその機能的フラグメントは、基準ブチリルコリンエステラーゼ改変体アミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸置換を有し得る。コードされるアミノ酸の保存的置換としては、例えば、以下の群内に属するアミノ酸が挙げられる：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）；（２）極性の中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）；（３）極性の酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）；および（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓ）。
【００３６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８の、同じかもしくは実質的に同じアミノ酸配列を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントはまた、ポリペプチドが基準ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの生物学的活性を保持する限り、化学的に改変され得る。例えば、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの化学的改変としては、アルキル化、アシル化、カルバミル化およびヨード化が挙げられ得る。さらに、改変されたポリペプチドとしてはまた、遊離アミノ基が、例えば、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように誘導体化されているポリペプチドが挙げられ得る。遊離のカルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルもしくはヒドラジドを形成するように改変され得る。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するように改変され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドはまた、基準ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドの生物学的活性が実質的に影響を受けないままであるならば、当業者に周知の種々の他の改変を含み得る。
【００３７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６もしくは５８の、同じかもしくは実質的に同じアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、またはその機能的フラグメントはまた、２０の標準アミノ酸の１以上のアミノ酸アナログで（例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキリジン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチンまたはカルボキシグルタメート）置換され得、そしてペプチド結合によって連結されていないアミノ酸を含み得る。
【００３８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６もしくは５８の同じかもしくは実質的に同じアミノ酸配列を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチド、またはその機能的フラグメントはまた、ブチリルコリンエステラーゼ酵素の機能を提供する官能基を正しい向きに置く模倣部分を含み得る。それゆえ、模倣物は、ポリペプチドの機能を模倣する化学部分を含む化学物質を包含する。例えば、ポリペプチドが、類似の機能活性を有する類似荷電化学部分を含む場合、模倣物は、類似の荷電化学部分を類似の空間的配向および拘束された構造に配置し、その結果、この荷電部分の化学機能が維持される。例示的模倣物は、ペプチド模倣物、ペプトイド、または他のペプチド様ポリマー（例えば、ポリ−β−アミノ酸）であり、そしてまたペプチドを模倣する官能基が配置されている非ポリマー化合物である。
【００３９】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、当該分野で周知の種々の方法によって調製され得る。所望の場合、ランダム変異誘発を実施して、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体を調製し得る。あるいは、本明細書中に開示されるように、本明細書中に記載される構造的方法、生化学的方法およびモデリング方法から得た情報に基づく部位特異的変異誘発を実施して、コカイン加水分解活性に重要であると予想されるアミノ酸を標的化し得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼの活性部位におけるコカインの分子モデリングを利用して、この酵素とその基質との間のより良好な適合に基づいて、より高度の触媒効率を可能にするアミノ酸変更を推定し得る。本明細書中で記載される場合、コカイン加水分解活性に重要であると推定される残基としては、８つの疎水性ゴージ残基および触媒性３つ組残基が挙げられる。さらに、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の機能的構造に重要な残基（これとしては、鎖内ジスルフィド結合に関与する、システイン残基６５Ｃｙｓ−９２Ｃｙｓ、２５２Ｃｙｓ−２６３Ｃｙｓ、および４００Ｃｙｓ−５１９Ｃｙｓが挙げられる）のアミノ酸変更は一般に、コカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体の調製において変更されないことが理解される。
【００４０】
ブチリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｒｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）またはブチリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｒｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）改変体の変異誘発後、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の発現、精製および機能的特徴付けが、当該分野で周知の方法によって実施され得る。以下に開示されるように、ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、適切な宿主細胞株中で発現され得、続いて精製され得、そしてコカイン加水分解活性について特徴付けられ得る。顕著に増大したコカイン加水分解活性を有すると特徴付けられたブチリルコリンエステラーゼ改変体は、その後、コカインベースの基質を加水分解する方法、ならびに以下に記載のコカイン誘発性状態を処置する方法において用いられ得る。
【００４１】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、コカイン加水分解活性を示す。本明細書中に開示されるように、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増大したコカイン加水分解活性を有し得、そしてコカイン誘発性状態を処置するために用いられ得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体と比較してマイナーな改変を有するポリペプチドは、等価なコカイン加水分解活性が保持される限り、本発明によって包含される。さらに、親のブチリルコリンエステラーゼ改変体のコカイン加水分解活性の一部または全てを依然として保持する、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の機能的フラグメントは、同様に、本発明に包含される。同様に、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体の機能的フラグメントをコードする、核酸の機能的フラグメントは、同様に、本発明によって包含される。
【００４２】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体の機能的フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体またはその機能的フラグメントをコードする核酸分子の発現、続いて本明細書中に記載される慣用的な生化学的方法による、その改変体またはその機能的フラグメントの単離を含む組換え方法によって調製され得る。機能的フラグメントはまた、全長ブチリルコリンエステラーゼ改変体の酵素的切断または化学的切断によって調製され得ることが理解される。酵素的切断および化学的切断についての方法、ならびに得られるペプチドフラグメントの精製についての方法は、当該分野で周知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９０）を参照のこと）。
【００４３】
さらに、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の機能的フラグメントは、化学的合成によって産生され得る。所望の場合、このような分子は、それらの機能的活性、安定性またはバイオアベイラビリティを最適にするために、Ｄ−立体異性体、天然に存在しないアミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよび模倣物を含むように改変され得る。改変されたアミノ酸およびそれらの用途の例は、Ｓａｗｙｅｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９５）ならびにＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）（これらは両方とも、本明細書中に参考として援用される）に提示される。
【００４４】
所望の場合、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のランダムセグメントが調製され、そして本明細書中に記載のアッセイにおいて試験され得る。本発明の基準ブチリルコリンエステラーゼ改変体のアミノ酸配列と比較して、任意の所望の境界および改変を有するフラグメントが調製され得る。あるいは、本明細書中に記載の、構造的方法、生化学的方法およびモデリング方法によって得られた入手可能な情報を用いて、親改変体のコカイン加水分解活性を保持するようである、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のフラグメントのみを調製し得る。本明細書中で記載されるように、コカイン加水分解活性に重要であると推定される残基としては、８個の疎水性ゴージ残基および触媒性３つ組残基が挙げられる。さらに、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の機能的構造に重要な残基としては、鎖内ジスルフィド結合に関与するシステイン残基６５Ｃｙｓ−９２Ｃｙｓ、２５２Ｃｙｓ−２６３Ｃｙｓ、および４００Ｃｙｓ−５１９Ｃｙｓが挙げられる。それゆえ、機能的フラグメントは、等価なコカイン加水分解活性を保持するように、コカイン加水分解活性または機能的構造に重大な残基の大部分または全てを保有するように設計された、基準ブチリルコリンエステラーゼ改変体の短縮型、領域またはセグメントであり得る。同様に、機能的フラグメントは、基準改変体の構造的または機能的に重要な残基を模倣するに役立つ非ペプチド性構造エレメントを含み得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体としてはまた、ブチリルコリンエステラーゼ改変体またはその機能的フラグメントを異種タンパク質（例えば、治療タンパク質）に連結することによって得られる融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードする核酸の融合構築物もまた挙げられる。ブチリルコリンエステラーゼ改変体またはその機能的フラグメントにハイブリダイズし得る核酸フラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であり、そしてまた、本発明によって包含される。
【００４５】
従って、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含む、２５個のブチリルコリンエステラーゼ改変体およびそれらの機能的フラグメントを提供する。本明細書中に記載されるように、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体の各々は、ブチリルコリンエステラーゼと比較してほぼ増大したコカイン加水分解活性を示す。
【００４６】
本発明はまた、それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、５１、５３、５５および５７として示される２５個の核酸、およびそれらのフラグメントを提供する。従って、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸を提供する。
【００４７】
本発明の核酸分子またはそのフラグメントとしては、その核酸分子が、中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下で対象核酸分子と選択的にハイブリダイズする能力を保持する限り、基準配列と実質的に同じであるが、基準配列に関して１以上の付加、欠失または置換を有する配列が挙げられることが理解される。中程度にストリンジェントな条件は、フィルターに結合した核酸の、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中で４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中で５０°での洗浄に等価なハイブリダイゼーション条件である。高度にストリンジェントな条件とは、フィルターに結合した核酸の、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中で４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中で６５°での洗浄に等価な条件をいう。他の適切な、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの緩衝液および条件、ならびに高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの緩衝液および条件は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）に記載される。従って、２つの核酸が、実質的に相補的である配列同一性を示すことは不要であり、これらは、他の類似の配列と検出可能な交叉反応性を有さずに、特異的にハイブリダイズし得るか、または特異的にハイブリダイズするようにされることが可能でありさえすればよい。
【００４８】
一般に、基準配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸分子は、比較される２つの配列の長さにわたって、基準配列に対して、その基準配列と約６０％を超える同一性（例えば、約６５％を超える同一性、約７０％を超える同一性、約７５％を超える同一性）（例えば、約８０％を超える同一性、約８５％を超える同一性、約９０％を超える同一性、約９５％を超える同一性、約９７％を超える同一性または約９９％を超える同一性）を有する。任意の２つの核酸配列の同一性は、例えば、デフォルトパラメータを用いた、ＢＬＡＳＴ  ２．０コンピューターアラインメントに基づいて、当業者によって決定され得る。ＢＬＡＳＴ  ２．０検索は、Ｔａｔｉａｎａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）によって記載されるように、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ．で利用可能である。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「フラグメント」は、本願ポリペプチドをコードする核酸を参照して使用される場合、本発明のポリペプチドまたはそのセグメントをコードする核酸の一部と同じかまたは実質的に同じ配列を有する核酸を意味することが意図される。核酸フラグメントは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体コード核酸またはブチリルコリンエステラーゼ改変体コード核酸に相補的であるヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするに、長さおよび配列が充分である。それゆえ、フラグメントは、配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマー、ならびに核酸ブロットまたは溶液ハイブリダイゼーションのためのプローブを包含することが意図される。
【００５０】
同様に、用語「機能的フラグメント」は、ブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸を参照して用いられる場合、基準改変体ポリペプチドのコカイン加水分解活性の一部または全てを依然として保持する、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の一部をコードするその核酸の一部をいうことが意図される。機能的活性を示す、本発明のポリペプチドの機能的フラグメントは、例えば、このポリペプチド由来の少なくとも６個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸または少なくとも４０アミノ酸を有し得、そしてしばしば、本発明のポリペプチドの少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００以上のアミノ酸から、全長ポリペプチドから１を引いたアミノ酸までを有する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「コカイン加水分解活性」は、代謝産物へのコカイン加水分解の速度によって測定した場合の、ブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ改変体の触媒作用をいうことが意図される。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、コカイン毒性またはコカイン誘発状態の重篤度を低減し得る、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体量を意味することが意図される。重篤度の低減としては、例えば、症状、生理学的指標、生化学的マーカーまたは代謝的指標の休止または低下が挙げられる。コカイン過量の症状としては、例えば、心臓不整脈、癲癇および高血圧性クリーゼが挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「処置する」とは、コカイン誘発性状態の重篤度の低減を引き起こすことを意味することが意図される。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「コカインベースの基質」とは、（−）−コカインまたはブチリルコリンエステラーゼもしくはブチリルコリンエステラーゼ改変体によって加水分解されるに充分に構造が（−）−コカインに類似する任意の分子（例えば、（＋）−コカイン、アセチルコリン、ブチリルチオコリン、ベンゾイルコカインおよびノルコカインが挙げられる）をいう。
【００５４】
配列番号１として示される核酸またはそのフラグメントは、配列番号２として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号１として示される核酸は、図３に示されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸とは、それぞれ、アミノ酸残基３２８および３３２をコードするコドン位置で異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号１３）では、コドンｇｃｔおよびｔａｔは、それぞれ、アミノ酸３２８位のアラニンおよびアミノ酸３３２位のチロシンをコードする。対照的に、配列番号２と称されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸では、コドンｔｇｇおよびａｔｇは、それぞれ、アミノ酸３２８位でトリプトファンを、そしてアミノ酸３３２位でメチオニンをコードする。
【００５５】
本発明はさらに、配列番号４と示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする、配列番号３として示される核酸またはそのフラグメントを提供する。表１に示されるように、配列番号３として示される核酸は、図３に示されてかつ配列番号１３と称されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸とは、アミノ酸残基３２８および３３２をコードするコドンで異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号１３）では、コドンｇｃｔおよびｔａｔは、アミノ酸３２８位でアラニンを、そしてアミノ酸３３２位でチロシンをコードする。対照的に、配列番号４と称されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｐブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸では、コドンｔｇｇおよびｃｃａは、アミノ酸３２８位でトリプトファンを、そしてアミノ酸３３２位でプロリンをコードする。
【００５６】
本発明は、配列番号６として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする、配列番号５として示されるさらなる核酸またはそのフラグメントを提供する。表１に示されるように、配列番号５として示される核酸は、図３に示されて配列番号４３と称される、ヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸とは、アミノ酸残基３２８および３３１をコードするコドン位置で異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）では、コドンｇｃｔおよびｇｔｃは、アミノ酸３２８位ではアラニンを、そしてアミノ酸３３１位ではバリンをコードする。対照的に、配列番号６と称されるＡ３２８Ｗ／Ｖ３３１Ｌブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸では、対応するコドンは、アミノ酸３２８位でトリプトファンを、そしてアミノ酸３３１位でロイシンをコードする。
【００５７】
本発明は、配列番号８として示されるのと同じかまたは実質的に同じアミノ酸配列を含む、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする、配列番号７として示されるさらなる核酸またはそのフラグメントを提供する。表１に示されるように、配列番号７として示される核酸は、図３に示されて配列番号４３と称されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸とは、アミノ酸残基３２８および３３２をコードするコドン位置で異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）では、コドンｇｃｔおよびｔａｔは、アミノ酸３２８位でアラニンを、そしてアミノ酸３３２位でチロシンをコードする。対照的に、配列番号８と称されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｓブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸では、コドンｔｇｇおよびｔｃｇは、アミノ酸３２８位でトリプトファンを、そしてアミノ酸３３２位でセリンをコードする。
【００５８】
本発明は、配列番号９として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号１０として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号９として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基１９９、２２７、２８７、３３２および３２８をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｇｃａ、ｔｔｔ、ｔｃａ、ｇｃｔおよびｔａｔは、アミノ酸位置１９９のアラニン、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニン、アミノ酸位置２８７のセリン、アミノ酸位置３２８のアラニンおよびアミノ酸位置３３２のチロシンをコードする。対照的に、配列番号１０で指定されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｃａ、ｇｃｇ、ｇｇｔ、ｔｇｇ、およびａｔｇは、アミノ酸位置１９９のセリン、アミノ酸位置２２７のアラニン、アミノ酸位置２８７のグリシン、アミノ酸位置３２８のトリプトファンおよびアミノ酸位置３３２のメチオニンをそれぞれコードする。
【００５９】
本発明は、配列番号１１として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号１２として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号１１として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、それぞれ、アミノ酸残基１９９、２２７、２８７、および３２８をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｇｃａ、ｔｔｔ、ｔｃａ、およびｇｃｔは、アミノ酸位置１９９のアラニン、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニン、アミノ酸位置２８７のセリン、およびアミノ酸位置３２８のアラニンをコードする。対照的に、配列番号１２で指定されるＡ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｃａ、ｇｃｇ、ｇｇｔ、およびｔｇｇは、アミノ酸位置１９９のセリン、アミノ酸位置２２７のアラニン、アミノ酸位置２８７のグリシン、およびアミノ酸位置３２８のトリプトファンをそれぞれコードする。
【００６０】
本発明は、配列番号１３として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号１４として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号１３として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、それぞれ、アミノ酸残基１９９、２８７および３２８をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｇｃａ、ｔｃａ、およびｇｃｔは、アミノ酸位置１９９のアラニン、アミノ酸位置２８７のセリン、およびアミノ酸位置３２８のアラニンをコードする。対照的に、配列番号１４で指定されるＡ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ａ１９９Ｓブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｃａ、ｇｇｔ、およびｔｇｇは、アミノ酸位置１９９のセリン、アミノ酸位置２８７のグリシン、およびアミノ酸位置３２８のトリプトファンをそれぞれコードする。
【００６１】
本発明は、配列番号１５として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号１６として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号１５として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、それぞれ、アミノ酸残基２２７、２８７、および３２８をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｔｔ、ｔｃａ、およびｇｃｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニン、アミノ酸位置２８７のセリン、およびアミノ酸位置３２８のアラニンをコードする。対照的に、配列番号１６で指定されるＡ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｇｃｇ、ｇｇｔ、およびｔｇｇは、アミノ酸位置２２７のアラニン、アミノ酸位置２８７のグリシン、およびアミノ酸位置３２８のトリプトファンをそれぞれコードする。
【００６２】
本発明は、配列番号１７として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号１８として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号１７として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、それぞれ、アミノ酸残基２２７および３２８をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、ヌクレオチドにおけるコドンｔｔｔおよびｇｃｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニンおよびアミノ酸位置３２８のアラニンをそれぞれコードする。対照的に、配列番号１８で指定されるＡ３２８Ｗ／Ｆ２２７Ａブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｇｃｇおよびｔｇｇは、アミノ酸位置２２７のアラニン、およびアミノ酸位置３２８のトリプトファンをそれぞれコードする。
【００６３】
本発明は、配列番号１９として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号２０として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号１９として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基３３２をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔａｔは、アミノ酸位置３３２のチロシンをコードする。対照的に、配列番号２０で指定されるＹ３３２Ｓブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｃｇは、アミノ酸位置３３２のセリンをコードする。
【００６４】
本発明は、配列番号２１として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号２２として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号２１として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基３３２をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔａｔは、アミノ酸位置３３２のチロシンをコードする。対照的に、配列番号２２で指定されるＹ３３２Ｍブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンａｔｇは、アミノ酸位置３３２のメチオニンをコードする。
【００６５】
本発明は、配列番号２３として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号２４として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号２３として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基３３２をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔａｔは、アミノ酸位置３３２のチロシンをコードする。対照的に、配列番号２４で指定されるＹ３３２Ｐブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｃｃａは、アミノ酸位置３３２のプロリンをコードする。
【００６６】
本発明は、配列番号２５として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号２６として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号２５として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基３３１をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｇｔｃは、アミノ酸位置３３１のバリンをコードする。対照的に、配列番号２６で指定されるＶ３３１Ｌブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｔｇは、アミノ酸位置３３１のロイシンをコードする。
【００６７】
本発明は、配列番号２７として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号２８として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号２７として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２２７をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｔｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニンをコードする。対照的に、配列番号２８で指定されるＦ２２７Ａブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｇｃｇは、アミノ酸位置２２７のトリプトファンをコードする。
【００６８】
本発明は、配列番号２９として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号３０として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号２９として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２２７をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｔｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニンをコードする。対照的に、配列番号３０で指定されるＦ２２７Ｇブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｇｇｇは、アミノ酸位置２２７のグリシンをコードする。
【００６９】
本発明は、配列番号３１として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号３２として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号３１として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２２７をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｔｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニンをコードする。対照的に、配列番号３２で指定されるＦ２２７Ｓブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンａｇｔは、アミノ酸位置２２７のセリンをコードする。
【００７０】
本発明は、配列番号３３として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号３４として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号３３として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２２７をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｔｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニンをコードする。対照的に、配列番号３４で指定されるＦ２２７Ｐブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｃｃｇは、アミノ酸位置２２７のプロリンをコードする。
【００７１】
本発明は、配列番号３５として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号３６として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号３５として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２２７をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｔｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニンをコードする。対照的に、配列番号３６で指定されるＦ２２７Ｔブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンａｃｔは、アミノ酸位置２２７のトレオニンをコードする。
【００７２】
本発明は、配列番号３７として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号３８として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号３７として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２２７をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｔｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニンをコードする。対照的に、配列番号３８で指定されるＦ２２７Ｃブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｇｔは、アミノ酸位置２２７のシステインをコードする。
【００７３】
本発明は、配列番号３９として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号４０として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号３９として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２２７をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｔｔは、アミノ酸位置２２７のフェニルアラニンをコードする。対照的に、配列番号４０で指定されるＦ２２７Ｍブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンａｔｇは、アミノ酸位置２２７のメチオニンをコードする。
【００７４】
本発明は、配列番号４１として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号４２として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号４１として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基１９９をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｇｃａは、アミノ酸位置１９９のアラニンをコードする。対照的に、配列番号４２で指定されるＡ１９９Ｓブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｃａは、アミノ酸位置１９９のセリンをコードする。
【００７５】
本発明は、配列番号５１として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号５２として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号５１として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基３２８をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｇｃｔは、アミノ酸位置３２８のアラニンをコードする。対照的に、配列番号５２で指定されるＡ３２８Ｗブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｇｇは、アミノ酸位置３２８のトリプトファンをコードする。
【００７６】
本発明は、配列番号５３として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号５４として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号５３として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２８７をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｔｃａは、アミノ酸位置２８７のセリンをコードする。対照的に、配列番号５４で指定されるＳ２８７Ｇブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｇｇｔは、アミノ酸位置２８７のグリシンをコードする。
【００７７】
本発明は、配列番号５５として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号５６として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号５５として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２８５をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｃｃｔは、アミノ酸位置２８５のプロリンをコードする。対照的に、配列番号５６で指定されるＰ２８５Ｑブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｃａｇは、アミノ酸位置２８５のグルタミンをコードする。
【００７８】
本発明は、配列番号５７として示されるさらなる核酸、またはそのフラグメントを提供し、これは、配列番号５８として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする。表１に示されるように、配列番号５７として示される核酸は、図３に示されそして配列番号４３として指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸と、アミノ酸残基２８５をコードするコドン位置において異なる。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）において、コドンｃｃｔは、アミノ酸位置２８５のプロリンをコードする。対照的に、配列番号５８で指定されるＰ２８５Ｓブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸において、コドンｔｃｇは、アミノ酸位置２８５のセリンをコードする。
【００７９】
Ａ３２８Ｗブチリルコリンエステラーゼ改変体（配列番号５２）を、以下の実施例Ｉに記載されるように、ヒトブチリルコリンエステラーゼのＰＣＲ部位指向性変異誘発により得た。このＡ３２８Ｗブチリルコリンエステラーゼ改変体は、ヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性において、少なくとも７倍から１５倍の増加を示す。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５４、５６および５８で指定されるブチリルコリンエステラーゼ改変体を、以下の実施例ＩＩ〜ＶＩに記載されるように得た。これらのブチリルコリンエステラーゼ改変体は、各改変体について本明細書中に記載されるようにヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して、増加したコカイン加水分解活性を示す。
【００８０】
表１．アミノ酸位置１９９、２２７、２８５、２８７、３２８、３３１および３３２に対応するヌクレオチド配列。ヒトブチリルコリンエステラーゼ（配列番号４３）と異なるコドン配列を以下に示す。
【００８１】
【表１−１】
2004535155.tif 000003
【００８２】
【表１−２】
2004535155.tif 000004
従って、本発明は、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、５１、５３、５５および５７として示される２５個の核酸またはそのフラグメントを提供し、これらは、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８として示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列または実質的に同じアミノ酸配列を含む。
【００８３】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、ライブラリーまたは分子のコレクションのスクリーニングによって獲得され得る。ライブラリーは、少数のまたは多数の異なる分子を含有し得、この数は、２分子程度の少数から、１０１３分子以上程度の多数にまで変化する。従って、ライブラリーは、その大きさが２〜１０分子、１０〜１０２分子、１０２〜１０３分子、１０３〜１０５分子、１０５〜１０８分子、１０８〜１０１０分子または１０１０〜１０１３分子にわたり得る。ライブラリーを形成する分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのような核酸分子；改変体ペプチドまたは修飾されたペプチドを含むペプチドまたはポリペプチドあるいは１つ以上のアミノ酸アナログを含有するペプチドであり得る。さらに、ライブラリーを形成する分子は、ペプチドの活性を模倣する本明細書中でペプチド模倣物と呼ばれるペプチド様分子；ペプチドの活性を模倣するペプチド模倣物；または酵素もしくはそのフラグメントのようなポリペプチドであり得る。さらに、ライブラリーは、使用者の意図および必要性に依存して多様化または重複し得る。当業者は、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドを得るために適切なライブラリーの大きさおよび多様性について知識を有する。
【００８４】
本発明はまた、ブチリルコリンエステラーゼまたはその機能的フラグメントのアミノ酸位置６８〜８２（配列番号：５９）、１１０〜１２１（配列番号：６０）、１９４〜２０１（配列番号：６１）、２２４〜２３４（配列番号：６２）、２７７〜２８９（配列番号：６３）、３２７〜３３２（配列番号：６４）または４２９〜４４２（配列番号：６５）に対応するブチリルコリンエステラーゼの１つ以上の領域に少なくとも１アミノ酸の変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーを提供し、ここで、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増強されたコカイン加水分解活性を有する少なくとも１つのブチリルコリンエステラーゼ改変体を有する（但し、単一アミノ酸の変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体は、３２８位にＹを有するヒトブチリルコリンエステラーゼではない）。本発明はさらに、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーを提供し、ここで、上記のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、少なくとも２つのアミノ酸の変更を有する。
【００８５】
さらに、本発明は、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の７つの別個のライブラリーを提供し、改変体の各々は、ブチリルコリンエステラーゼまたはその機能的フラグメントのアミノ酸位置６８〜８２（配列番号：５９）、１１０〜１２１（配列番号：６０）、１９４〜２０１（配列番号：６１）、２２４〜２３４（配列番号：６２）、２７７〜２８９（配列番号：６３）、３２７〜３３２（配列番号：６４）または４２９〜４４２（配列番号：６５）にそれぞれ対応する、ブチリルコリンエステラーゼの領域において少なくとも１つのアミノ酸の変更を有する。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーは、増強されたコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体をスクリーニングするために使用され得る。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、用語「ライブラリー」は、分子の収集物を意味する。ライブラリーは、少数のまたは多数の異なる分子を含有し得、この数は、２分子程度の少数から、１０１３分子以上程度の多数にまで変化する。従って、ライブラリーは、その大きさが２〜１０分子、１０〜１０２分子、１０２〜１０３分子、１０３〜１０５分子、１０５〜１０８分子、１０８〜１０１０分子または１０１０〜１０１３分子にわたり得る。ライブラリーを形成する分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのような核酸分子；改変体ペプチドまたは修飾されたペプチドを含むペプチドまたはポリペプチドあるいは１つ以上のアミノ酸アナログを含有するペプチドであり得る。さらに、ライブラリーを形成する分子は、ペプチドの活性を模倣する本明細書中でペプチド模倣物と呼ばれるペプチド様分子；または酵素もしくはそのフラグメントのようなポリペプチドであり得る。さらに、ライブラリーは、使用者の意図および必要性に依存して多様化または重複し得る。当業者は、特定の用途のために適切なライブラリーの大きさおよび多様性について知識を有する。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「対応する」とは、参照アミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列のことをいう。このアミノ酸配列は、参照ポリペプチド、フラグメントまたはセグメントと比較して同一または異なるアミノ酸位置を占め得る。異なる種由来のブチリルコリンエステラーゼならびに対立遺伝子の改変体は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するが、特定のアミノ酸配列の物理的位置ならびに大きさは、変わり得ることが理解される。従って、ブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ改変体において所定のセグメントを構成するアミノ酸は、同一の物理的位置ではあり得ず、参照のブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ改変体における同一のアミノ酸部位も占め得ない。例えば、異なる種由来のブチリルコリンエステラーゼならびに対立遺伝子の改変体は、実質的に類似のアミノ酸配列を有するが、領域を形成するアミノ酸位置は、配列番号５９〜６５について列挙される位置に対応し得ない。例えば、アミノ酸配列において、配列番号５９と指定された領域に対して実質的に類似する領域は、非ヒトブチリルコリンエステラーゼにおいても任意の種に由来する対立遺伝子の改変体においても、アミノ酸位置６８〜８２を占め得ないが、それにも関わらず、本発明に包含される。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、用語「領域」は、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の範囲のことをいうことが意図され、この範囲は、コカイン加水分解活性のために重要であると決定されるかまたは予測される。以下に記載されるように、領域は、１つ以上の構造的方法、生化学的方法、またはモデリング方法の使用により、コカイン加水分解活性のために重要であると決定されるかまたは予測され、結果として、絶対的な境界ではなく、概略として規定される。領域は、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の２つ以上の連続するアミノ酸位置（これらは、コカイン加水分解活性に重要であると予測される）を包含し得る。本請求の範囲に記載されている発明を実施するために有用なブチリルコリンエステラーゼの領域は、約３０アミノ酸以下の長さであり、そして好ましくは、２〜２０アミノ酸の間の長さ、５〜１５のアミノ酸の間の長さである。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、用語「変更」は、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸位置での改変をいうことが意図される。従って、アミノ酸の変更は、アミノ酸位置での置換、欠失または任意の他の構造的な改変であり得る。アミノ酸変更は、アミノ酸レベルについて直接的に生じ得るかまたは、アミノ酸変更をコードする核酸の翻訳の結果として起こり得る。アミノ酸変更は、アミノ酸の別のアミノ酸とのまたはアミノ酸アナログとの置換を導き得る。アミノ酸の変更の例としては、アラニン（Ａ）のトリプトファン（Ｗ）へのアミノ酸置換を包含し、これは配列番号５２に指定されるブチリルコリンエステラーゼ改変体を生じる；セリン（Ｓ）のグリシン（Ｇ）へのアミノ酸置換は、配列番号：５４に指定されるブチリルコリンエステラーゼ改変体を生じる；プロリン（Ｐ）のグルミン（Ｑ）へのアミノ酸置換は、配列番号：５６に指定されるブチリルコリンエステラーゼ改変体を生じる；そして、プロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）へのアミノ酸置換は、配列番号：５８に指定されるブチリルコリンエステラーゼ改変体を生じる。
【００９０】
増強されたコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体を含む十分に多様なライブラリーは、当該分野で周知の種々の方法によって調製され得る。例えば、約５７３のアミノ酸位置の各々において参照ブチリルコリンエステラーゼ改変体中に見られない１９個のアミノ酸の各々を含む、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーが、調製され得、そして、増強されたコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体について得られた改変体ライブラリーをスクリーニングする。
【００９１】
または、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ポリペプチドは、本明細書中に記載されるブチリルコリンエステラーゼに関する構造情報、生化学的情報およびモデリング情報を利用して調製される集束ライブラリーから得られ得る。ブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性または構造機能について重要な残基または領域の決定または予測に関する任意の情報が、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の集束ライブラリーの設計において有用であり得ることが理解される。従って、ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、コカイン加水分解活性のために重要であると決定されたかまたは予測される領域において位置付けられるアミノ酸位置でのアミノ酸の変更を含むように焦点が合わせられ得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体の集束ライブラリーは、コカイン加水分解活性のために重要であると決定されるかまたは予測される領域にアミノ酸の変更を標的とすることにより、増強されたコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体を同定するためにスクリーニングされ得る。
【００９２】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体のコカイン加水分解活性のために重要な領域は、決定され得るかまたは予測され得る。関連する酵素（高度の配列類似性を共有し、そして生化学的に類似する触媒特性を有する、例えば、アセチルコリンエステラーゼおよびカルボキシルエステラーゼ）は、ブチリルコリンエステラーゼの触媒活性のために重要である領域に関する情報を提供し得る。例えば、構造のモデリングは、酵素の活性部位を明らかにし得、これは、一般に１次構造において互いに離れて位置するアミノ酸残基によって形成される溝（ｃｌｅｆｔ）、のど部（ｇｏｒｇｅ）または裂け目（ｃｒｅｖｉｃｅ）のような３次元構造である。従って、コカイン加水分解活性に重要なブチリルコリンエステラーゼの領域を形成するアミノ酸残基は、活性部位のど部に沿って位置される残基を含み得る。ブチリルコリンエステラーゼの構造モデリングの記述については、例えば、Ｈａｒｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８２７−１０８３１（１９９２）およびＳｏｒｅｑら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７（９）：３５３−３５８（１９９２）を参照のこと（これらは、本明細書中に参考として援用される）。
【００９３】
ブチリルコリンエステラーゼの構造モデリングに加えて、生化学的データは、コカイン加水分解活性のために重要なブチリルコリンエステラーゼの領域を決定または予測するために使用され得る。この点に関して、変更されたコカイン加水分解活性を有する天然に存在するブチリルコリンエステラーゼ改変体の特性付けは、ブチリルコリンエステラーゼの触媒活性のために重要な領域を同定するために有用である。同様に、部位指向性変異誘発研究は、触媒として重要なアミノ酸残基に関するデータを提供し得、総説として、例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６７：２８３−３２２（１９９２）があり、これは本明細書中に参考として援用される。
【００９４】
増強されたコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーを生成するために、別個の型の情報が、単独で、あるいはコカイン加水分解活性のために重要なブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の領域または特定のアミノ酸残基を決定するためもしくは予測するために組み合わせて使用され得る。例えば、構造モデリングおよび生化学的データに基づく情報は、コカイン加水分解活性のために重要なブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の領域または特定のアミノ酸残基を決定するために組み合わされ得る。種々の方法により得られる情報は、触媒として活性な領域を予測するために組み合わされ得、当業者は、厳密な限定ではなく、それ自身が近接する領域を表わすことを理解する。結果として、ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、コカイン加水分解活性のために重要であると決定されるかまたは予測される領域の外側にアミノ酸残基の変更を有し得る。同様に、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、コカイン加水分解活性のために重要であると決定されるかまたは予測される領域の外側にアミノ酸残基の変更を有し得る。さらに、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、そのコカイン加水分解活性を有意には変えない、任意の他の修飾を有し得る。コカイン加水分解活性のために重要であると決定されるかまたは予測される領域の数は、使用される予測方法に基づいて変え得ることが、さらに理解される。
【００９５】
コカインの加水分解のために重要な領域または特定のアミノ酸残基の決定のための適切な任意の方法によって、多くの領域または特定の残基が、一旦、同定されると、各領域内の１つ以上の位置において野生型アミノ酸に加えて他の１９個の天然に存在するアミノ酸のうち１つ以上を含有する改変体のライブラリーを作製するために、いくつかのまたは全てのアミノ酸位置の至るところにおいて、各領域または特定の位置が、ランダム化され得る。表２に要約されるように、コカイン加水分解のために重要なブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の領域は、例えば、配列番号４４に指定されるヒトブチリルコリンエステラーゼに対応する、アミノ酸残基６８〜８２、１１０〜１２１、１９４〜２０１、２２４〜２３４、２７７〜２８９、３２７〜３３２、および４２９〜４４２を含み得る。本発明により提供されるブチリルコリンエステラーゼ改変体の集束ライブラリのために選択されるブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の７つの領域が、表２に示される。
【００９６】
【表２】
2004535155.tif 000005
表２において示されるブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の領域の位置は、ヒトブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列を参照して示される（図２）。各領域についてのブチリルコリンエステラーゼ改変体の数は、ヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して、各位置における１９個のアミノ酸置換の各々に対する１つの改変体を反映し、そして総ライブラリーサイズは、１，５０１改変体を有する。種の多様性は、各領域の中の、ヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して異なる天然に存在するアミノ酸を有する位置の数を示す。本発明のライブラリーに関して、天然に存在するヒトブチリルコリンエステラーゼは、任意の種由来であり得、例えば、ヒト、霊長類、ウマ、またはマウスであり得る。従って、ブチリルコリンエステラーゼは、例えば、哺乳動物のブチリルコリンエステラーゼであり得る。さらに、本発明のブチリルコリンエステラーゼは、天然に存在するブチリルコリンエステラーゼのアイソタイプ改変体、多型または任意の他の対立遺伝子の改変体であり得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸は、天然に存在するブチリルコリンエステラーゼの任意の配列を有するポリペプチドをコードする。従って、ブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸は、任意の種由来のブチリルコリンエステラーゼをコードし得る（例えば、ヒト、霊長類、ウマ、またはマウス）。さらに、ブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸は、任意の天然に存在する対立遺伝子、アイソタイプ、または多型性を包含する。
【００９７】
種々の型の分子（例えば、ペプチド、ペプトイドおよびペプチド模倣物）の多様な集団を含むライブラリーを調製するための方法は、当該分野で周知である（例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１−３６０（１９９５）、およびＢｌｏｎｄｅｌｌｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１４：８３−９２（１９９５）、およびその中で引用された参考文献を参照のこと、これらは本明細書中に参考として援用される；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ｖｏｌ．１（Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ編；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９５）のＰｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、８０３〜８６１ページ、およびＧｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１（１９９４）もまた参照のこと、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。分子が、ペプチド、タンパク質またはそれらのフラグメントの場合、その分子は、インビトロにおいて直接的に産生され得るか、またはインビトロにおいて産生され得る核酸から発現される。合成ペプチド化学の方法は、当該分野で周知である。
【００９８】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーはまた、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸発現ライブラリーを構築しそしてその後に発現することによって、産生され得る。このようなライブラリーを産生するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、１９８９を参照のこと）。核酸のライブラリーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのアナログから構成され得る。ＲＮＡ分子を含むライブラリーは、例えば、ＲＮＡ分子を化学的に合成することによって、構築され得る。
【００９９】
本発明はまた、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸のライブラリーを提供し、核酸の各々は、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸位置６８〜８２（配列番号：５９）、１１０〜１２１（配列番号：６０）、１９４〜２０１（配列番号：６１）、２２４〜２３４（配列番号：６２）、２７７〜２８９（配列番号：６３）、３２７〜３３２（配列番号：６４）または４２９〜４４２（配列番号：６５）に対応するブチリルコリンエステラーゼの１つ以上の領域に少なくとも１アミノ酸の変更をコードするコドンを少なくとも１つ有し、ここで、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸の少なくとも１つは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増強されたコカイン加水分解活性を有する（但し、単一アミノ酸の変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体は、３２８位にＹを有するヒトブチリルコリンエステラーゼではない）。
【０１００】
本発明はさらに、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸の７つの別個のライブラリーを提供し、核酸の各々は、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸位置６８〜８２（配列番号：５９）、１１０〜１２１（配列番号：６０）、１９４〜２０１（配列番号：６１）、２２４〜２３４（配列番号：６２）、２７７〜２８９（配列番号：６３）、３２７〜３３２（配列番号：６４）または４２９〜４４２（配列番号：６５）にそれぞれ対応する、ブチリルコリンエステラーゼの領域において、少なくとも１つのアミノ酸の変更をコードする少なくとも１つのコドンを有する。
【０１０１】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸のライブラリーは、使用者の所望の任意の方法によって得られ得る。当業者は、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸を得るためにどんな方法が使用され得るかを知っている。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、当業者に周知の方法を使用するブチリルコリンエステラーゼをコードする核酸の変異誘発によって産生され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、１９８９）。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、ブチリルコリンエステラーゼの各アミノ酸位置において、できる限り全ての天然に存在するアミノ酸をコードする核酸を含むように十分に多様であるようにランダム化される核酸のライブラリーから得られ得る。あるいは、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、コカイン加水分解活性のために重要であると予測されるかまたは決定される所定の位置に所望のアミノ酸を含むように、核酸のライブラリーから得られ得る。
【０１０２】
１つ以上の変異が、修飾核酸分子を産生するためのブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸分子中に、例えば、部位指向性変異誘発（Ｗｕ（編）、Ｍｅｔｈ．Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７巻、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９０）中、Ｈｉｇｕｃｈｉ，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰＣＲ」、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を使用して導入され得る。このような変異誘発は、特異的な、所望のアミノ酸の変更を導入するために使用され得る。
【０１０３】
オリゴヌクレオチド指向性変異誘発を使用するブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーの効果的な合成および発現は、前述のようになされ得る（Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：６０３７−６０４２（１９９８）；Ｗｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９４：１５１−１６２（１９９９）；およびＫｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８−４９２（１９８５）、これらは本明細書中に参考として援用される）。オリゴヌクレオチド指向性変異誘発は、体系的に変異を導入するための、周知のおよび効果的な手順であり、従って、その表現型とは独立に、タンパク質工学のための指向性の進化アプローチに理想的に適する。オリゴヌクレオチド指向性変異誘発を実施するために、所望の変異をコードする核酸のライブラリーは、野生型配列のウラシル含有１本鎖テンプレートに対し、ハイブリダイズされる。この方法論は、柔軟であり、制限酵素の使用なしに正確な変異が導入されることを可能にし、そして、オリゴヌクレオチドが、コドンに基づく変異を使用して合成される場合、比較的安価である。
【０１０４】
コドンベースの合成または変異誘発は、既知のアミノ酸配列において多数の変更を効率的かつ迅速に生成しながら遺伝的重複性を回避するため、または無作為な配列の広範な集団を作製するための、当該分野で周知の１つの方法を代表する。この方法は、米国特許第５，２６４，５６３号および同第５，５２３，３８８号の主題であり、そしてまた、Ｇｌａｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９：３９０３−３９１３（１９９２）に記載される。手短には、例えば、アミノ酸の遺伝コードを特定する２０個のコドン全ての無作為化のためのカップリング反応は、別々の反応容器で行われ、そして特定のコドン位置についての無作為化は、各反応容器の生成物を混合することにより行われる。混合に続いて、２０個のアミノ酸全ての等価な混合物をコードするコドンに対応する無作為化された反応生成物を、次いで、次の位置における無作為化されたコドンの各々の合成のために別々の反応容器に分割する。所望の場合、２０個のアミノ酸全ての等しい頻度が、２０コドンの等しい部分を含む２０個の容器を用いて達成され得る。従って、ブチリルコリンエステラーゼの配列全体の無作為ライブラリ、またはコカイン加水分解活性に重要であると決定されるかもしくは推定される領域もしくは特定の位置の集中したライブラリを作製するためにこの方法を利用することが可能である。
【０１０５】
上記の合成方法に対する変形もまた存在し、これらとしては、例えば、所望の位置における所定のコドンの合成、およびＷｕら（前出）１９８８に記載されるような１つ以上のコドン位置における所定の配列の偏った合成が挙げられる。偏った合成は、２つの反応容器の使用を包含し、ここで所定のコドンまたは親コドンが、１つの容器で合成され、そして無作為コドン配列が、第２の容器で合成される。この第２の容器は、特定位置における全体として無作為なアミノ酸を特定するコドンの合成のために、上記に記載されるような複数の反応容器に分割され得る。あるいは、縮重コドンの集団は、例えば、ＮＮＧ／ＴヌクレオチドまたはＮＮＸ／Ｘ（ここでＮは、全ての４つのヌクレオチドの混合物である）のカップリングにより、第２の反応容器において合成され得る。所定のコドンおよび無作為なコドンの合成に続いて、２つの反応容器の各々における反応生成物は、混合され、次いで次のコドン位置における合成のためにさらなる２つの容器に再分割される。
【０１０６】
多数の改変体配列を産生するための上記のコドンベースの合成に対する改変は、本明細書中に記載されるブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリの産生のために同様に使用され得る。この改変は、上記の２つの容器の方法に基づき、この方法は、親配列に対する合成を偏らせ、そしてユーザが、無作為なコドン変化を有する特定数のコドン位置を含む集団にこの改変体を分離することを可能にする。
【０１０７】
簡単には、この合成は、各コドン位置の合成後にその反応容器を２つの新しい容器に分割し続けることにより行われる。この分割後に、反応容器の連続した対の各々からの反応生成物は、第２の容器で開始して、混合される。この混合は、無作為変化を有する、同じ数のコドン位置を有する反応生成物を一緒にする。次いで、合成は、第１の容器および最後の容器の生成物ならびに反応容器の各連続対からの新しく混合された生成物を分割し、そして２つの新しい容器に再分割することにより進行する。新しい容器のうちの１つにおいて、親コドンが合成され、そして第２の容器において、無作為コドンが合成される。例えば、第１のコドン位置における合成は、１つの反応容器における親コドンの合成および第２の反応容器における無作為コドンの合成を必然的に伴う。第２のコドン位置における合成のために、第１の２つの反応容器の各々は、２つの容器に分割されて、容器の２つの対を生じる。各対について、親コドンは、１つの容器で合成され、そして無作為コドンは、第２の容器で合成される。線状に配置される場合、第２の容器および第３の容器における反応生成物は、混合されて、単一のコドン位置に無作為なコドン配列を有する生成物を一緒にする。この混合はまた、生成物集団を３つに減らし、これらは、次の回の合成のための開始集団である。同様に、第３の位置、第４の位置および残りの各位置については、前の位置についての各反応生成物集団は、分割され、そして親コドンおよび無作為コドンが合成される。
【０１０８】
コドンベースの合成の上記の改変に続いて、１つ、２つ、３つ、および４つの位置における無作為のコドン変化を含む集団とその他とは、簡便に分離され得、そして個体の必要性に基づいて使用され得る。さらに、この合成スキームはまた、親配列を超えて、無作為化された配列について集団の富化を可能にする。なぜなら、親配列合成のみを含む容器は、同様に無作為コドン合成から分離されるからである。この方法を使用して、コカイン加水分解活性に重要と推測される、ブチリルコリンエステラーゼの１つ以上の領域においてアミノ酸変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸のライブラリを合成し得る。
【０１０９】
あるいは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸のライブラリはまた、遺伝子シャッフリングを使用して生成され得る。遺伝子シャッフリングまたはＤＮＡシャッフリングは、組換えにより多様性を生じる指向された進化のための方法である（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９−３９１（１９９４）；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１（１９９８）；Ｓｔｅｍｍｅｒら、米国特許第５，８３０，７２１号、１９９８年１１月３日発行を参照のこと）。遺伝子シャッフリングまたはＤＮＡシャッフリングは、選択された変異体遺伝子のプールのインビトロにおける相同組換えを使用する方法である。例えば、特定の遺伝子の点変異のプールが使用され得る。これらの遺伝子は、例えば、ＤＮａｓｅを使用して無作為に断片化され、そしてＰＣＲにより再組み立てされる。所望の場合、ＤＮＡシャッフリングは、多様性を生じるために異なる生物由来の相同遺伝子を使用して実行され得る（Ｃｒａｍｅｒｉら（前出）１９９８）。この断片化および再組み立ては、所望の場合、複数回行われ得る。得られる再組み立てされた遺伝子は、本発明の組成物および方法において使用され得るブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリを構成する。
【０１１０】
従って、本発明はまた、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸のライブラリを提供し、各核酸は、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸位置６８〜８２（配列番号５９）、１１０〜１２１（配列番号６０）、１９４〜２０１（配列番号６１）、２２４〜２３４（配列番号６２）、２７７〜２８９（配列番号６３）、３２７〜３３２（配列番号６４）、または４２９〜４４２（配列番号６５）に対応するブチリルコリンエステラーゼの１つ以上の領域において少なくとも１つのアミノ酸変更をコードする少なくとも１つのコドンを有し、ここでこの核酸の少なくとも１つは、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増強されたコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードするが、ただし、単一のアミノ酸変更を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体は、３２８位にＹを有するヒトブチリルコリンエステラーゼではない。
【０１１１】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体およびそのライブラリをコードする本発明の核酸は、種々の真核生物細胞で発現され得る。例えば、この核酸は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、および非酵母真菌細胞において発現され得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸の本発明のライブラリを発現するのに有用な哺乳動物細胞株としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒトＴ２９３細胞株、およびヒトＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株が挙げられる。ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸の本発明のライブラリの発現は、安定細胞トランスフェクションおよび一過性細胞トランスフェクションの両方により達成され得る（実施例ＩＩＩ、表６を参照のこと）。
【０１１２】
ゲノムにおける同一の部位における改変体核酸または異種核酸フラグメントの組み込みは、特定の改変体または異種核酸の発現においてのみ異なる同系細胞株を生成するように機能する。単一の部位での組み込みは、ゲノムにおける複数の部位における組み込みからの位置的影響を最小限にし、この効果は、この核酸によりコードされるｍＲＮＡの転写、および細胞あたり１つより多くの核酸種の多重コピーまたは発現を組み込むことからの複雑さに影響を及ぼす。改変体または異種核酸をゲノム中の特定位置に標的化するために使用され得る、当該分野で公知の技術としては、例えば、相同組換え、レトロウイルス標的化およびリコンビナーゼ媒介標的化が挙げられる。
【０１１３】
ゲノム中の単一の部位に改変体または異種核酸を標的化するための１つのアプローチは、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用して、真核生物ゲノムへの外因性ＤＮＡの挿入を部位特異的組換え配列を含む部位に標的化する（ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５１６６−５１７０（１９８８）；ＦｕｋｕｓｈｉｇｅおよびＳａｕｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７９０５−７９０９（１９９２）；ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２８２８−２８３４（１９９７））。Ｃｒｅリコンビナーゼに加えて、Ｆｌｐリコンビナーゼをまた使用して、ゲノム中の特定部位への外因性ＤＮＡの挿入を標的化し得る（Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：６１９１−６１９６（１９９６））。Ｆｌｐリコンビナーゼの標的部位は、８塩基対のスペーサーで分離された１３塩基対：５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ［ＴＣＴＡＧＡＡＡ］ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’の繰り返しからなる。本明細書中に記載されるように、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８で示されるブチリルコリンエステラーゼを、ヒトブチリルコリンエステラーゼの表２に示される領域に対応する改変体ライブラリを、Ｆｌｐリコンビナーゼおよびヒト２９３Ｔ細胞株を使用して哺乳動物細胞にトランスフェクションすることにより得た。部位特異的リコンビナーゼおよび対応する組換え部位の任意の組み合わせが、ゲノム中の特定部位に核酸を標的化するために本発明の方法において使用され得ることは理解される。
【０１１４】
適切なリコンビナーゼは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸を含むベクターで同時トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）されるベクターにコードされ得る。あるいは、リコンビナーゼの発現エレメントは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸を発現する同じベクター中に組み込まれ得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする核酸と、リコンビナーゼをコードする核酸を同時にトランスフェクトすることに加えて、このリコンビナーゼをコードするベクターは、細胞中にトランスフェクトされ得、そしてこの細胞は、リコンビナーゼの発現について選択され得る。安定にリコンビナーゼを発現する細胞は、続けて、改変体核酸をコードする核酸でトランスフェクトされ得る。
【０１１５】
本明細書中に開示されるように、Ｃｒｅリコンビナーゼにより媒介される正確な部位特異的ＤＮＡ組換えを使用して、ブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードする外因性ＤＮＡの単一のコピーを含む安定な哺乳動物形質転換体を生成し得る。以下に例示されるように、Ｃｒｅ媒介標的化事象の頻度は、改変された二重ｌｏｘストラテジーを使用して実質的に増大され得る。この二重ｌｏｘストラテジーは、ｌｏｘ部位のコア領域内の特定のヌクレオチド変化が、組換えの効率に対してほとんど影響を及ぼさずに、Ｃｒｅ媒介組換えの部位選択特異性を変更するという知見に基づく（Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：２２８７−２３００（１９８６））。標的化ベクターおよび宿主細胞ゲノムの両方における、ｌｏｘＰおよび変更されたｌｏｘＰ部位（ｌｏｘ５１１と称する）の組み込みは、二重交差事象による部位特異的組換えを生じる。二重ｌｏｘアプローチは、部位特異的インテグラント（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）の回収を、単一交差挿入組換えよりも２０倍増加させ、部位特異的組換えの絶対的頻度を増加させ、その結果、不正な組換えの頻度を超える（ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２８２８−２８３４（１９９７））。
【０１１６】
哺乳動物細胞株におけるブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリの発現に続いて、無作為に選択されたクローンは、配列決定され得、そして増加したコカイン加水分解活性についてスクリーニングされ得る。選択されたクローンを配列決定する方法は、当業者に周知であり、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら（前出）２０００に記載される。ブチリルコリンエステラーゼ改変体のコカイン加水分解活性を測定するための適切な方法を選択することは、種々の因子（例えば、利用可能なブチリルコリンエステラーゼ改変体の量）に依存する。ブチリルコリンエステラーゼ改変体のコカイン加水分解活性は、例えば、分光測光法、ポリクローナル抗ブチリルコリンエステラーゼ抗体を利用してブチリルコリンエステラーゼ改変体を均一に捕捉するマイクロタイターベースのアッセイ、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定され得る。
【０１１７】
ブチリルコリンエステラーゼと比較して、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の増大したコカイン加水分解活性は、触媒効率の比較により決定され得る。増加したコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現するクローンは、変異の正確な位置および性質を確かめるために配列決定され得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリが徹底的にスクリーニングされたことを確実にするために、各ライブラリのスクリーニングは、同一のブチリルコリンエステラーゼアミノ酸変更をコードするクローンが複数の機会に同定されるまで続けられ得る。
【０１１８】
増加したコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現するクローンを使用して、より大量のブチリルコリンエステラーゼを精製するのに適切な大規模培養を確立し得る。目的のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、発現ベクターにクローン化され得、そして細胞株をトランスフェクトするために使用され得、これが、続いて増幅され得る。当業者は、どの型の発現ベクターが特定の適用に適切かを理解する。増加したコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体は、例えば、特定の化学因子に対する耐性を付与してトランスフェクトされた細胞の陽性選択を可能にする遺伝子を有する発現ベクターにクローン化され得る。例えば、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切な発現ベクターは、哺乳動物細胞における選択のためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのようなプロモーターを含み得る。本明細書中に記載されるように、ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、哺乳動物発現ベクターにクローン化され得、そしてチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）にトランスフェクトされ得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現するために適切な発現ベクターは、当該分野で周知であり、そして市販されている。
【０１１９】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現するクローンは、選択され得、そしてコカイン加水分解活性について試験され得る。増強されたコカイン加水分解活性を示すクローンを保有する細胞は、慣用の細胞培養系で増殖されて、大量の目的のブチリルコリンエステラーゼを産生し得る。濃縮された組換えブチリルコリンエステラーゼ改変体は、採取され、そして当該分野で周知の方法および例えば、Ｍａｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：２２６６−２２７７（１９９７）（本明細書中で参考として援用される）により記載される方法によって精製され得る。
【０１２０】
インビトロで増加したコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体は、インビボでのコカイン毒性および嗜癖の処置に利用され得る。インビトロでの増加したコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体の、コカイン毒性の処置に対する有効性は、本明細書中に開示されるような急性過剰用量動物モデルを使用して試験され得る（実施例ＶＩＩを参照のこと）。さらに、強化の動物モデルおよび識別の動物モデルは、以下に開示されるように、コカイン嗜癖の処置についてのブチリルコリンエステラーゼ改変体の有効性を推測するために使用される（実施例ＶＩＩを参照のこと）。過剰用量ならびに強化モデルおよび識別モデルに適切な動物被検体は、当該分野で公知であり、これらとしては、例えば、げっ歯類モデルおよび霊長類モデルが挙げられる。１つ以上の動物モデルにおいてコカイン毒性またはコカイン嗜癖のいずれかを低減するのに有効なブチリルコリンエステラーゼ改変体を使用して、有効量のそのブチリルコリンエステラーゼ改変体を個体に投与することによりコカインに誘導された状態を処置し得る。
【０１２１】
増加した血清半減期を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体は、被検体においてブチリルコリンエステラーゼを試験するか、または個体においてコカインに誘導される状態を処置するのに有用であり得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体の血清半減期を増加するために有用な方法としては、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のテトラマーへの変換、合成ポリマーおよび天然ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストラン）を短縮ブチリルコリンエステラーゼ改変体に共有結合すること、リポソーム処方物、あるいはＩｇ融合タンパク質としての酵素の発現が挙げられる。さらに、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のテトラマーへの変換は、宿主細胞株をＣＯＬＱ遺伝子と同時トランスフェクトすること、ならびにポリ−Ｌ−プロリンのトランスフェクトされた細胞の媒体への添加により達成され得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体の血清半減期を増加させるためのこれらの方法および当該分野で公知の他の方法は、動物被検体においてブチリルコリンエステラーゼ改変体を試験するため、または個体においてコカインに誘導される状態を処置するために有用である。
【０１２２】
本発明はまた、コカインベースのブチリルコリンエステラーゼ基質を加水分解する方法を提供し、この方法は、ブチリルコリンエステラーゼ基質を、コカインを代謝物へと加水分解することを可能にする条件下で、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８として示される群から選択されるブチリルコリンエステラーゼ改変体と接触させることを包含し、ここでこのブチリルコリンエステラーゼ改変体は、これらの改変体の各々について本明細書中に記載されるように、ブチリルコリンエステラーゼと比較して増加したコカイン加水分解活性を示す。
【０１２３】
本発明はさらに、コカインに誘導される状態を処置する方法を提供し、この方法は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、５２、５４、５６および５８として示される群から選択される、有効量のブチリルコリンエステラーゼ改変体を、個体に投与することを包含し、ここでこのブチリルコリンエステラーゼ改変体は、これらの改変体の各々について本明細書中に記載されるように、ブチリルコリンエステラーゼ改変体と比較して増加したコカイン加水分解活性を示す。
【０１２４】
本明細書に記載されるように、増加したコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体は、コカインベースのブチリルコリンエステラーゼ基質を、インビトロおよびインビボで加水分解し得る。コカインベースのブチリルコリンエステラーゼ基質は、例えば、この基質を、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリクローンの培養物から単離された上清に加えることにより、インビトロで本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体と接触され得る。あるいは、このブチリルコリンエステラーゼ改変体は、基質と接触される前に精製され得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼとコカインベースの基質を接触させるために適切な培地条件は、当業者により容易に決定される。例えば、ｐＨ７．４で１０ｍＭのＴｒｉｓ中１００μＭのコカインが、３７℃にてブチリルコリンエステラーゼ改変体と接触され得る。以下に記載されるように、培養上清からのブチリルコリンエステラーゼ改変体は、基質と接触される前に捕捉剤（例えば、抗体）を使用してさらに固定化され得、これにより、培養上清成分の除去が可能となり、そして汚染物質の非存在下で基質と、この固定化された改変体とを接触することが可能になる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体をコカインベースの基質と接触させた後、コカイン加水分解活性を、当該分野で公知の種々の方法および本明細書中に記載される方法（例えば、高速液体クロマトグラフィーまたは同位体トレーサーコカイン加水分解アッセイ）により測定し得る。
【０１２５】
本発明はまた、治療有効量のブチリルコリンエステラーゼ改変体を投与することにより、個体においてコカイン過剰用量およびコカイン嗜癖を処置する方法を提供する。有効となるために必要とされるブチリルコリンエステラーゼの投薬量は、例えば、急性過剰用量または慢性嗜癖が処置されているか否か、投与経路および投与形態、投与される分子の効力および生体活性半減期、個体の体重および状態、ならびに以前または現在の治療に依存する。この方法の特定の適用に有効な用量とみなされる適切な量は、本明細書中に適用される教示および手引きを使用して、当業者により決定され得る。例えば、この量は、本明細書中に記載されるインビトロまたはインビボでのブチリルコリンエステラーゼアッセイから推定され得る。当業者は、個体の状態が、処置の経過全体を通してモニタリングされる必要があること、および投与される組成物の量が、それに従って調節され得ることを認識する。
【０１２６】
コカイン過量の処置のための、本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体の治療有効量は、処置レジメンに依存して、例えば、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約０．１５ｍｇの間、例えば、体重１ｋｇあたり約０．１５ｍｇ〜約０．３ｍｇの間、体重１ｋｇあたり約０．３ｍｇ〜約０．５ｍｇの間、好ましくは体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜約５ｍｇの間であり得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ改変体が、コカイン過量の個々の症状に投与される場合、単回のより高用量が適切である一方、慢性コカイン嗜癖の個々の症状には、１日あたり１回〜複数回、１週間あたり１回〜複数回、１月あたり１回〜複数回またはそれより頻繁でないより低用量で投与され得る。同様に、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の徐放を可能とする処方物は、慢性コカイン嗜癖の処置をされる個体への、より少ない量のブチリルコリンエステラーゼ改変体の連続的な放出を提供する。ブチリルコリンエステラーゼ改変体の投与量は、より低いコカイン加水分解活性を有する改変体について必要な投与量と比較して、有意に増強されたコカイン加水分解活性を示す低用量の改変体が投与され得るように、この改変体の触媒活性に基づいて調整されなくてはならないことが理解される。
【０１２７】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、全身に（例えば、静脈内または動脈内で）送達され得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、当業者に公知の処方法を用いた薬学的に受容可能な処方物中のポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントの単離形態および実質的に精製された形態で提供され得る。これらの処方物は、例えば、局所的経路、経皮経路、腹腔内経路、頭蓋内経路、脳室内経路、大脳内経路、膣内経路、子宮内経路、経口経路、直腸経路、または非経口経路（例えば、静脈内経路、脊髄内経路、皮下経路または筋内経路）を含む、標準的な経路を介して投与され得る。さらに、ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、個々のコカイン嗜癖の症状を処置するために有用な化合物の徐放を可能とする生分解性ポリマー中に組み込まれ得る。生分解性ポリマーおよびこれらの使用は、例えば、Ｂｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１−４４６（１９９１）（本明細書中に参考として援用される）に詳述される。
【０１２８】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、薬学的に受容可能な媒体と一緒に、溶液または懸濁液として投与され得る。そのような薬学的に受容可能な媒体は、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、通常の生理食塩水もしくはリンガー液または他の生理学的に緩衝化された生理食塩水、あるいは他の溶媒もしくはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、油状物（例えば、オリーブオイル）または注射可能な有機エステル）であり得る。薬学的に受容可能な媒体は、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の吸収を安定化または増加させるように作用する生理学的に受容可能な化合物をさらに含み得る。そのような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロースまたはデキストラン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）（これは、微生物の膜を破壊する）；二価金属イオン（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）；低分子量タンパク質；脂質またはリポソーム；あるいは、他の安定化剤または賦形剤が挙げられる。
【０１２９】
非経口投与に適する処方物としては、上記の薬学的に受容可能な媒体のような水性および非水性滅菌注射溶液が挙げられる。この溶液は、例えば、処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする緩衝液、静菌薬および溶質をさらに含み得る。他の処方物としては、例えば、懸濁剤および濃化剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。この処方物は、単位用量または複数用量の容器（例えば、密封されたアンプルまたはバイアル）で提供され得、そして例えば、使用直前に滅菌液体キャリアの添加を必要とする凍結乾燥条件で保存され得る。即座の注射溶液および懸濁液は、上記の種類の滅菌散剤、顆粒および錠剤から調製され得る。
【０１３０】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体は、さらに、他の治療薬剤との組み合わせ治療に使用され得る。ブチリルコリンエステラーゼ改変体を含む組み合わせ治療は、夫々適切な処方で改変体および追加の治療薬剤を含む処方物からなり得る。あるいは、組み合わせ治療は、融合タンパク質をからなり得、ここでこのブチリルコリンエステラーゼ改変体は、異種タンパク質（例えば、治療タンパク質）に連結されている。
【０１３１】
本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体はまた、このペプチドまたは改変体のコード核酸を投与することによって個体に送達され得る。本発明のブチリルコリンエステラーゼ改変体のコード核酸は、治療的有効量のポリペプチドまたは改変体を送達するための当該分野において公知の広範な種々の遺伝子治療法との組み合わせに、有用である。本明細書中に提供される教示および手引きを用いて、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のコード核酸は、当該分野において公知のベクターまたは送達系に組み込まれ得、そしてコード配列の送達および発現のために用いられて、その治療有効量を達成する。当該分野において公知の適用可能なベクターおよび送達系としては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、標的化のためのリガンド結合化粒子および核酸、単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ、リポソーム、ポリリジン、ならびにブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現するように改変された細胞の移植を使用する血液細胞治療を含む、細胞治療（肝細胞治療を含む）、ならびに当業者に公知の種々の他の遺伝子送達方法およびその改変方法（例えば、Ｓｈｅａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：５５１−５５４（１９９９）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるもの）が挙げられる。
【０１３２】
そのコード核酸配列を発現させることによりブチリルコリンエステラーゼ改変体を送達する方法の特定の例は、当該分野において周知であり、そして例えば、米国特許第５，３９９，３４６号；同第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，４６０，９５９号；同第５，６５６，４６５号；同第５，６４３，５７８号；同第５，６２０，８９６号；同第５，４６０，９５９号；同第５，５０６，１２５号；欧州特許出願ＥＰ  ０  ７７９  ３６５  Ａ２；ＰＣＴ番号ＷＯ  ９７/１０３４３号；ＰＣＴ番号ＷＯ  ９７/０９４４１号；ＰＣＴ番号ＷＯ  ９７/１０３４３号（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載される。当業者に公知の他の方法もまた存在し、そのコード核酸配列を発現することによるブチリルコリンエステラーゼ改変体の送達に同様に適用可能である。
【０１３３】
コカイン誘導性の状態（例えば、コカイン過量またはコカイン嗜癖）の処置に加えて、ブチリルコリンエステラーゼはまた、血流へのコカインの後の進入の際のコカイン過量の開始を予防的に防ぐためにも投与され得る。本発明の増加したコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体が、媒体中のコカイン誘導性物質の存在および量を効率的に決定するためのツールを提供することにより、診断のための価値を有し得る。
【０１３４】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響しない改変もまた本明細書中に提供される発明の定義の中に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１３５】
（実施例Ｉ）
（増加したコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体）
本実施例は、配列番号５２で示されるブチリルコリンエステラーゼ改変体（ヒトブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸位置３２８のアラニン（Ａ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されている）の発見および特徴付けを記載する。配列番号５２で示されるＡ３２８Ｗブチリルコリンエステラーゼ改変体は、ヒトブチリルコリンエステラーゼと比較して、コカイン加水分解活性の１５倍の増加を示す。
【０１３６】
（ヒトブチリルコリンエステラーゼの活性部位におけるコカインの構造モデリング）
コカイン加水分解活性のために重要なアミノ酸残基を決定するために、Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｏｃｔａｎｅコンピューター上のＳｙｂｙｌ  ６．４ソフトウェア中でＦｌｅｘｉＤｏｃｋプログラム（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、ブチリルコリンエステラーゼの活性部位にコカインをドッキング（ｄｏｃｋ）した。Ｆｌｅｘｉｄｏｃｋは、タンパク質活性部位へのリガンドのドッキングを可能とし、このドッキング工程の間、ユーザーが、可撓性である結合を決定することを可能とする。ユーザーは、このタンパク質−リガンドの相互作用面の開始コンホメーションおよび開始位置を同定しなくてはならない。
【０１３７】
（−）−コカインおよび（＋）−コカインの構造を、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅから検索した（ここで、そのコードネームは、ＣＯＣＡＩＮ１０およびＣＯＣＨＣＬである）。全ての計算がコカインの塩基性形態を用いて行われるように、ＣＯＣＨＣＬからＨＣｌ分子を除去した。このＦｌｅｘｉＤｏｃｋプログラムを実行する前に、Ｈａｒｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０８２７−１０８３１（１９９２）により記載されるようなヒトブチリルコリンエステラーゼのモデルにおいて、コカインを、ブチリルコリンに手動でアラインした。コカインのトロパン環が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸位置８２のトリプトファン残基（Ｗ）に面し、コカインのベンズエステルのカルボキシル基が、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸位置１９８のセリン残基（Ｓ）の１．５Å以内にあり、そしてコカインのベンゼン環が、ブチリルコリンエステラーゼのアシル結合ポケット中にあるように、手動でのアラインメントを実施した。このＦｌｅｘｉＤｏｃｋにおいて、結合ポケットを、全てのアミノ酸がブチリルコリンの４Å内にあるように規定した。この結合ポケットを規定した後に、このブチリルコリン分子を抽出した。環の中の原子および二重結合された原子を除く、この結合ポケット中の全ての原子を、回転可能として規定し、従って、ブチリルコリンエステラーゼ中に１２４個の回転可能な結合を生じ、コカイン中に７個の回転可能な結合を生じた。
【０１３８】
（ヒトブチリルコリンエステラーゼの変異誘発およびブチリルコリンエステラーゼ改変体の発現）
ヒトブチリルコリンエステラーゼ分子の活性部位へのコカインのＦｌｅｘｉＤｏｃｋモデリングに基づき、結合を妨害するアミノ酸を変異誘発のために選択した。
【０１３９】
Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて実施されるヒトブチリルコリンエステラーゼＤＮＡのＰＣＲ部位指向性変異誘発を用いて３４個の改変体を調製した。３つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、変異誘発を実施した。この変異誘発プライマーを、ブチリルコリンエステラーゼｃＤＮＡの一端を増幅するための一般的なプライマー（例えば、ＳＰ６プロモーターシーケンスプライマー（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ））と同時に用いた。以下のプライマーを用いて、Ａ３２８Ｗ変異体を調製した：Ａ３２８Ｗアンチセンス
５’ＡＴＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＴＴＣＡＴＣ３’；Ｔ７  ｏｌｄセンス
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’；およびＳＰ６アンチセンス
５’ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ３’。Ａ３２８Ｗプライマーは、２７ヌクレオチドにわたり、このプライマーの中央に、Ａ３２８Ｗ変異を含む。このＰＣＲ反応産物（メガプライマー）を、ＱｕｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）上で、過剰なプライマーを除去するための製造業者のプロトコルに従い、クリーンアップした。クリーンアップしたメガプライマーを、第二のＰＣＲ反応で伸張して、３４個の改変体の各々の、完全な１．８ｋｂコード配列を作製した。
【０１４０】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体を構成する１．８ｋｂフラグメントを、プラスミドｐＧＳへとクローニングし、そして所望の変異が存在することを確実にするために再び配列決定した。プラスミドｐＧＳは、Ｎｅｏ遺伝子がラットグルタミンシンテターゼ（ｓｙｎｔｈｅｓａｓｅ）によって置換されていることを除いてｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と同一である。
【０１４１】
哺乳動物細胞株における３４個のブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現するために、ブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現する３４個の安定なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を作製した。リン酸カルシウム沈殿によるＣＨＯ−ＫＩ（Ｎｏ．ＣＣＬ６１；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）細胞のトランスフェクションの後、５０μＭメチオニンスルホキシミンを含むグルタミン、血清を含まない培地であるＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中でのコロニーの選択を続けた。最も高いレベルのブチリルコリンエステラーゼ活性を発現するコロニーを拡大した。ＣＯＬＱ遺伝子（プロリンリッチ結合ドメインをコードする）を保有する第二のプラスミドを、各々のＣＨＯ−ＫＩ細胞株にトランスフェクトしてブチリルコリンエステラーゼがより安定な四量体を形成することを可能とした。
【０１４２】
分泌されたブチリルコリンエステラーゼ改変体を、拡大した細胞株から回収した。大容量の各々の分泌されたブチリルコリンエステラーゼ改変体の回収のために、１Ｌのローラーボトルに、２〜３日毎に、２５μＭのメチオニンスルホキシミンを含有する１００ｍｌのＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅを供給し、続いてＬ−グルタミンを含まない１００ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２の５０：５０の混合物（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を供給した。分泌されたブチリルコリンエステラーゼ改変体の量は、約１ｍｇ／Ｌである。２０Ｌの培養培地を、数ヶ月の期間にわたり各々の３４個の改変体について回収し、そして回収期間の間、４℃で滅菌状態で保存した。
【０１４３】
（ブチリルコリンエステラーゼ改変体の精製および特徴付け）
ブチリルコリンエステラーゼ改変体を精製するために、各々の改変体に対応する培養培地を、Ｗｈａｔｍａｎ  ＃１フィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）を通して、ブフナー漏斗上でろ過した。この濾液を、１００ｍｌのアフィニティーゲルプロカインアミド−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂで充填したクロマトグラフィーカラム（ＸＫ５０／３０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗｙ、ＮＪ）を通して注いだ。充填の間、ブチリルコリンエステラーゼ改変体を、アフィニティーゲルに保持し、その結果、予め２０Ｌ中にあった２０ｍｇの酵素を、１００ｍｌのアフィニティーゲルに濃縮した。続けて、このアフィニティーゲルを、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）および１ｍＭのＥＤＴＡ中の０．３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄して、夾雑タンパク質を溶出した。次に、このアフィニティーゲルを、２０ｍＭのリン酸カリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を含む緩衝液で洗浄して、イオン強度を減少させた。最後に、このブチリルコリンエステラーゼ改変体を２５０ｍｌの緩衝液中の０．２Ｍプロカインアミドを用いて溶出した。
【０１４４】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体をさらに精製し、そしてプロカインアミドを除去するために、第二の精製工程を実施した。第一の精製工程において回収したブチリルコリンエステラーゼ改変体を、緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）で１０倍に希釈して、イオン強度を約０．０２Ｍまで減少させた。この希釈した酵素を、４００ｍｌの弱アニオンｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ＤＥ５２（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）を含むカラムに充填した。この低いイオン強度で、ブチリルコリンエステラーゼ改変体は、このイオン交換ゲルに保持される。充填を完了した後、このカラムを、２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含む２Ｌの緩衝液で、２８０ｎｍでの溶離物の吸光度がほぼ０になり、プロカインアミドが洗浄されたことを示すまで洗浄した。次いで、このブチリルコリンエステラーゼ改変体を、２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）中の０〜０．２ＭのＮａＣｌの塩の勾配を用いてカラムから溶出した。このブチリルコリンエステラーゼ改変体の溶出の後、フラクションコレクターを用いて、各々の改変体について１０ｍｌの画分を回収した。活性アッセイを実施して、ブチリルコリンエステラーゼ改変体を含むピークを同定した。各々のブチリルコリンエステラーゼ改変体の純度を決定するためにＳＤＳゲル電気泳動を実施して、その純度が約９０％であると決定した。
【０１４５】
この３４個の精製されたブチリルコリンエステラーゼ改変体を、コカインを加水分解するそれらの能力についてアッセイした。このアッセイにより、ブチリルコリンエステラーゼ改変体についての（−）−コカインのアフィニティーおよび各々の改変体についての（−）−コカイン加水分解の最大の速度を測定した。酵素に触媒されたコカインの加水分解を、温度平衡化Ｇｉｌｆｏｒｄ分光光度計で２４０ｎｍで記録した。ここで、基質と生成物との間のモル吸光率の差異は、Ｇａｔｌｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１２４９−１２５４（１９９１）に記載されるように、ΔＥ＝６，７００Ｍ−１ｃｍ−１であった。Ｋｍ値を、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、３０℃で、（−）−コカインについて決定した。Ｖｍａｘ値およびＫｍ値を、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  ｆｏｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ）を用いて算出した。
【０１４６】
一旦Ｖｍａｘ値およびＫｍ値を算出すれば、各々のブチリルコリンエステラーゼ調製物中の活性部位の数を決定した。活性部位の滴定を、クロルピリフォスオキソン（ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ  ｏｘｉｏｎ）（ＭＥＴ−６７４Ｂ、Ｃｈｅｍ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）（ブチリルコリンエステラーゼのインヒビター）を用いて実施した。１分子のクロルピリフォスオキソンは、１分子のブチリルコリンエステラーゼと結合してこれを阻害し、このことは、活性部位の数の算出を可能とする。活性部位の数に基づいて、各々の改変体についてのｋｃａｔ値を算出した（表３）。３４個の改変体を、コカイン結合またはコカイン加水分解について試験した（表４）。１つの改変体（Ａ３２８Ｗ）が、野生型のブチリルコリンエステラーゼと比較して１５倍速いコカイン加水分解活性を有することを決定した。
【０１４７】
【表３】
2004535155.tif 000006
【０１４８】
【表４】
2004535155.tif 000007
（実施例ＩＩ）
（コカイン加水分解アッセイの開発）
この実施例は、数百のブチリルコリンエステラーゼ改変体の効率的分析を同時に行うことを可能にする、コカイン加水分解アッセイの開発を記載する。
【０１４９】
（同位体トレーサーコカイン加水分解アッセイの開発）
新しいコカイン加水分解アッセイを確認する目的のために、コカインのブチリルコリンエステラーゼ加水分解を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、以前に記載されたように（Ｘｉｅら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：８３−９１（１９９９））最初に測定した。手短には、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中に１００μＭのコカインを含有する反応を、ウマブチリルコリンエステラーゼ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）の添加により開始し、そして３７℃で２〜４時間インキュベートした。インキュベーション後、ｐＨを３に調節し、そしてこのサンプルを濾過した。続いて、このサンプルを、０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ３．０）およびアセトニトリルの８０：２０混合物で予め平衡化したＨｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ−Ｃ  １８逆相カラム（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）に適用した。コカイン、ベンゾイルエコグニン（ｅｃｏｇｎｉｎｅ）、および安息香酸のアイソクラティック溶出を、２００ｎｍで定量した。エコグニンメチルエステルおよび安息香酸の形成の測定は，反応系中のブチリルコリンエステラーゼの量および反応時間の両方に依存した。
【０１５０】
同位体トレーサーアッセイの結果において、反応混合物のアリコートを、生成物と基質との間のｐＨ３．０における溶解度の差を利用するために酸性化した。ｐＨ３．０において、［３Ｈ］−安息香酸（ｐＫａ＝４．２）は、２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）および［１，４−ビス−２−（４−メチル−５−フェニルオキサゾリル）−ベンゼン］（ＰＯＰＯＰ）からなるシンチレーションカクテル（ＰＰＯ−ジメチル−ＰＯＰＯＰ  シンチレーション蛍石、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｔ．ｐｒｏｓｐｅｃｔ，ＩＬ）に可溶であるが、［３Ｈ］−コカインは不溶である。酵素ブランクから酸性化された反応混合物により生成されるシグナルは、蛍石中の総ｄｐｍの２％未満であり、これは、ＰＰＯ−ジメチル−ＰＯＰＯＰ中に不溶であるコカインと一致していた。
【０１５１】
同位体トレーサーコカイン加水分解アッセイを、確立されたＨＰＬＣアッセイと直接比較することにより有効性を確認し、そして同位体アッセイの精度を、ウマブチリルコリンエステラーゼのＫｍ値を決定することにより実証した。コカイン加水分解速度（安息香酸の形成速度を測定することにより決定される）を、可変量のブチリルコリンエステラーゼを含有する反応において、ＨＰＬＣおよび同位体トレーサーアッセイの両方により定量した。［３Ｈ］−安息香酸の形成は、アッセイインキュベーションの長さおよび添加されるブチリルコリンエステラーゼの量に依存していた。ＨＰＬＣによって測定された安息香酸形成の定量値（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）を、同位体アッセイで測定された安息香酸形成に対してプロットすることにより実証した場合に、確立されたＨＰＬＣアッセイと同位体トレーサーアッセイとの間に良好な相関が観察された（図５Ａを参照のこと、ｒ２＝０．９７９）。同位体アッセイの精度および感度を実証するために、コカインの量を変化させ、そしてＫｍを、図５Ｂに示される、ウマブチリルコリンエステラーゼによるコカイン加水分解のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ両逆数プロット（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｐｌｏｔ）を使用して決定した。速度を、３７℃での２時間のインキュベーション後に形成された安息香酸ｃｐｍ×１０−５として計算した。これらのデータに基づいて、コカイン加水分解についてのＫｍは、約３７．６μＭ（×切片＝−１／Ｋｍ）であり、これは、ウマブチリルコリンエステラーゼについては、以前に公開された３８μＭという値（Ｇａｔｌｅｙ、前出、１９９１）および４５±５μＭ（Ｘｉｅら、前出１９９９）という値にほぼ一致している。
【０１５２】
（活性ブチリルコリンエステラーゼの固定化）
ブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリのクローンの各々から単離された上清は、種々の濃度のブチリルコリンエステラーゼ酵素を含んでいる。結果として、別々のブチリルコリンエステラーゼ改変体クローンからの等容量の培養上清から測定されたコカイン加水分解活性は、発現レベルおよび酵素活性を反映している。等しい酵素濃度を比較して、所望の活性を有する改変体をより迅速に同定することができるように、培養上清からのブチリルコリンエステラーゼが、捕捉試薬（例えば、抗体）を使用して固定され、この捕捉試薬は、以前にＷａｔｋｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：３７−４５（１９９７）により記載されたように、低いブチリルコリンエステラーゼ濃度で飽和される。結果として、希釈サンプルからのブチリルコリンエステラーゼは、濃縮され、そして培養上清中のブチリルコリンエステラーゼの初期濃度に関わらず、均一な量の異なるブチリルコリンエステラーゼ改変体クローンが固定化される。続いて、結合していないブチリルコリンエステラーゼおよび潜在的にアッセイを妨害する他の培養上清成分（例えば、有意なエステラーゼ活性を有する無関係の血清または細胞由来のタンパク質）を、洗い流し、そして固定化されたブチリルコリンエステラーゼの活性を、上記のように安息香酸の形成を測定することにより決定する。
【０１５３】
上記のアッセイの効率を評価するために、ヒトブチリルコリンエステラーゼ、およびヒトブチリルコリンエステラーゼの短縮型可溶性モノマー形態（Ｂｌｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２７：７４７−７５７（１９９７））の効率的な捕捉を、マイクロタイター形式で、市販のウサギ抗ヒトコリンエステラーゼポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して実証した（図６）。ブチリルコリンエステラーゼを捕捉するために最適な条件を決定するために、マイクロタイタープレートを、漸増する量のウサギ抗ブチリルコリンエステラーゼでコーティングし、ブロックし、そして種々の量の培養上清と共にインキュベートした。捕捉された活性ブチリルコリンエステラーゼの量を、ジチオビスニトロ安息香酸の存在下で４０５ｎｍにてブチリルチオコリン加水分解を測定するアッセイ（Ｘｉｅら、前出、１９９９）を使用して、測色法により（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）決定した。その後、野生型ヒトブチリルコリンエステラーゼまたはモノマーの短縮型バージョンのいずれかを発現している細胞由来の培養上清の希釈物から捕捉されたブチリルコリンエステラーゼ活性を、測定した。ウサギ抗ブチリルコリンエステラーゼ捕捉抗体を、２５μｌの培養上清中に存在するブチリルコリンエステラーゼにより飽和させた。より大きなブチリルコリンエステラーゼ活性が、その酵素の全長野生型形態を含有する上清から捕捉された（図６、黒丸と白丸を比較）。結合していない材料を、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）で洗浄することにより除去し、そして捕捉された活性ブチリルコリンエステラーゼの量を、ブチリルチオコリン加水分解を測定することにより定量した。ブチリルコリンエステラーゼは、培養培養上清中で、マイクロタイタープレート上のポリクローナル抗ブチリルコリンエステラーゼ抗体を飽和するのに十分な量で発現される。さらに、捕捉された酵素は、ブチリルチオコリンの加水分解により実証されたように活性である。
【０１５４】
（同位体トレーサーアッセイおよび固定化ブチリルコリンエステラーゼを用いたコカイン加水分解の測定）
活性ブチリルコリンエステラーゼの固定化に最適な条件を、コカイン同位体トレーサーアッセイと共に使用して、マイクロタイター形式でコカイン加水分解活性を測定する。このアッセイは、上記のように、コカイン加水分解活性についてＫｍを決定することにより特徴付けられる。少なくとも３つのアプローチを使用して、アッセイ感度またはアッセイシグナルのいずれかを増大させる。
【０１５５】
第１に、比例してシグナルを増加させるより長いアッセイインキュベーション時間が、使用され得る。第２に、アッセイの感度は、放射標識されたコカイン基質の比活性を増加させることにより増強される。第３に、以前に同定されたブチリルコリンエステラーゼ変異体（コカイン加水分解について４倍効率が良い）が使用され得（Ｘｉｅら、前出、１９９９）、これは、アッセイインキュベーション時間を二倍にすることおよびコカインの特異的活性を１０倍増加させることと組み合わせて、アッセイシグナルを約８０倍増加させ得る。
【０１５６】
（実施例ＩＩＩ）
（ブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリの合成および特徴づけ）
この実施例は、哺乳動物細胞で発現されるブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリの合成および特徴づけを記載する。
【０１５７】
ブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリの合成を容易にするために、野生型ヒトブチリルコリンエステラーゼ、短縮型の酵素的に活性なモノマーバージョンのヒトブチリルコリンエステラーゼ、およびＡ３２８Ｙ変異体（４倍増加したコカイン加水分解活性を示す）をコードするＤＮＡを、固有の制限部位を使用して、改変された二重ｌｏｘ標的化ベクター中にクローン化する。予備的アッセイにおいて、野生型ヒトブチリルコリンエステラーゼは、より効率的に捕捉された。従って、この野生型ヒトブチリルコリンエステラーゼは、ブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリの合成のための最初のＤＮＡテンプレートとして役立つ。
【０１５８】
（コドンベースの変異誘発によるブチリルコリンエステラーゼ改変体の集中したライブラリの合成）
種々の情報を使用して、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の最初のライブラリの合成を別個の（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）領域に集中し得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼおよびＴｏｒｐｅｄｏアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、高度の相同性（５３％同一性）を共有する。さらに、Ｔｏｒｐｅｄｏ  ＡｃｈＥの残基４〜５３４は、欠失も挿入も無くブチリルコリンエステラーゼの残基２〜５３２と整列し得る。触媒の３つ組残基（ブチリルコリンエステラーゼ残基  Ｓｅｒ１９８、Ｇｌｕ３２５、およびＨｉｓ４３８）および鎖間ジスルフィドは、全て同じ位置にある。これらのタンパク質間の高度の類似性に起因して、Ｔｏｒｐｅｄｏ  ＡｃｈＥの精密化された２．８ÅＸ線構造（Ｓｕｓｓｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：８７２−８７９（１９９１））が、ブチリルコリンエステラーゼ構造をモデリングするために使用されている（Ｈａｒｅｌら、前出、１９９２）。
【０１５９】
コリンエステラーゼを用いた研究により、リガンド結合に関与する触媒の３つ組（ｔｒｉａｄ）残基および他の残基は、深くて狭い活性部位の溝（ｇｏｒｇｅ）内に疎水性残基がリッチな状態で位置することが分かった（Ｓｏｒｅｑら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３５３−３５８（１９９２）に概説される）。ブチリルコリンエステラーゼ改変体の７つの集中したライブラリの部位（図２、下線を付した残基）を、活性部位の溝の内側を覆っていると決定されたアミノ酸を含むように選択した（図２、疎水性活性部位の溝の残基に影をつける）。
【０１６０】
ブチリルコリンエステラーゼの構造モデリングに加えて、ブチリルコリンエステラーゼの生化学的データを、ライブラリ設計プロセスに組み込んだ。例えば、コカイン加水分解活性を変更された天然に存在するブチリルコリンエステラーゼの特徴づけおよび部位特異的変異誘発研究により、コカイン加水分解活性に重要なアミノ酸の位置およびセグメントに関する情報が提供される（Ｓｃｈｗａｒｔｚらによる総説、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６７：２８３−３２２（１９９５））。さらに、異なる種由来のブチリルコリンエステラーゼの配列およびコカイン加水分解データの比較はまた、これらのブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性の比較に基いて、コカイン加水分解活性に重要なその分子の領域に関する情報を提供し得る。以前に同定されたＡ３２８Ｙ変異体は、領域６に対応するライブラリに存在し、そしてライブラリ合成の品質および哺乳動物細胞における発現の性質ならびにマイクロタイターベースのコカイン加水分解アッセイの感度を実証するためのコントロールとして役立つ。
【０１６１】
（表５．触媒効率に重要であると予測されるブチリルコリンエステラーゼの領域）
【０１６２】
【表５】
2004535155.tif 000008
集中したライブラリ合成のために選択されたブチリルコリンエステラーゼの７つの領域は、８つの芳香族活性部位の溝の残基（Ｗ８２、Ｗ１１２、Ｙ１２８、Ｗ２３１、Ｆ３２９、Ｙ３３２、Ｗ４３０およびＹ４４０）および触媒３つ組残基のうちの２つを含む残基にわたる。鎖内ジスルフィド結合（６５Ｃｙｓ−９２Ｃｙｓ、２５２Ｃｙｓ−２６３Ｃｙｓ、および４００Ｃｙｓ−５１９Ｃｙｓ間に位置する）は、機能的ブチリルコリンエステラーゼ構造を確実にするために維持される。さらに、残基１７、５７、１０６、２４１、２５６、３４１、４５５、４８１、４８５、および４８６に位置する推定グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）もまた、ライブラリ合成において避ける。全体として、７つの集中したライブラリは、７９残基（これは、ブチリルコリンエステラーゼの線状配列の約１４％を示す）にわたり、そして約１５００個の異なるブチリルコリンエステラーゼ改変体の発現を生じる。
【０１６３】
変異されるヒトブチリルコリンエステラーゼの７つの領域に対応する核酸のライブラリを、上記のように、そして図７に図示されるように、コドンベースの変異誘発により合成する。手短には、多重ＤＮＡ合成カラムを、以前にＧｌａｓｅｒら、前出、１９９２により記載されたように、β−シアノエチルホスホルアミダイト化学によりオリゴヌクレオチドを合成するために使用する。第１の工程において、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸をコードするトリヌクレオチドを、１つのカラム上で合成しながら、第２のカラムを、トリヌクレオチドＮＮ（Ｇ／Ｔ）（ここでＮは、ｄＡシアノエチルホスホルアミダイト、ｄＧシアノエチルホスホルアミダイト、ｄＣシアノエチルホスホルアミダイト、およびｄＴシアノエチルホスホルアミダイトの混合物である）を合成するために使用される。トリヌクレオチドＮＮ（Ｇ／Ｔ）を使用することにより、全ての位置における２０アミノ酸全ての系統的発現により達成される、最小の縮重を伴う徹底的な変異誘発を生じる。
【０１６４】
第１のコドンの合成後、２つのカラムからの樹脂を、一緒に混合し、分割し、そして４つのカラムに入れ替える。各コドンについてさらなる合成カラムを加え、そしてこれらのカラム樹脂を図７に図示される様式で混合することにより、縮重したオリゴヌクレオチドのプールは、変異誘発の程度に基づいて沈降される。コドンベースの変異誘発のこの樹脂混合局面は、このプロセスを、迅速にし、かつ費用効率を良くする。なぜなら、この局面は、複数のオリゴヌクレオチドを合成する必要性を排除するからである。この研究において、単一のアミノ酸変異をコードするオリゴヌクレオチドプールが、集中したブチリルコリンエステラーゼライブラリを合成するために使用される。
【０１６５】
単一アミノ酸変異を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードするオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、前出、１９８５）を使用して、二重ｌｏｘ標的化ベクターにクローン化する。変異誘発効率を改善するため、そして野生型ブチリルコリンエステラーゼを発現するクローンの数を減らすために、ライブラリを、２工程プロセスで合成する。第１の工程において、各ライブラリ部位に対応するブチリルコリンエステラーゼＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーション変異誘発により欠失される。第２の工程において、各欠失変異体に対するウラシル含有一本鎖ＤＮＡ（各ライブラリに対応する一欠失変異体）を単離し、そしてオリゴヌクレオチド指向性変異誘発によるライブラリの合成のためのテンプレートとして使用する。このアプローチは、抗体ライブラリの合成のために慣用的に使用されており、そして変異原性オリゴヌクレオチドの種々のＤＮＡ配列から潜在的に生じるアニーリングの偏りを除去することにより、より均一な変異誘発を生じる。さらに、この２工程プロセスは、ライブラリにおける、改変体に対する野生型配列の頻度を低減し、そして結果的に、野生型ブチリルコリンエステラーゼをコードするクローンの反復スクリーニングを排除することにより、ライブラリスクリーニングをより効率的にする。
【０１６６】
ライブラリの質および変異誘発の効率は、各ライブラリから無作為に選択された約２０のクローンからＤＮＡ配列を得ることにより特徴付けされる。このＤＮＡ配列は、変異誘発が、各ライブラリ内の複数の位置で起きること、および複数のアミノ酸が各位置で発現されたことを実証する。さらに、無作為に選択されたクローンのＤＮＡ配列は、そのライブラリが多様なクローンを含み、そして少数のクローンにより優勢ではないことを実証する。
【０１６７】
（部位特異的組込みのためのトランスフェクションパラメータの最適化）
Ｃｒｅ媒介部位特異的組込みのためのトランスフェクションパラメータの最適化を、モデル系としてブレオマイシン耐性タンパク質（ＢＲＰ）ＤＮＡを利用して達成した。
【０１６８】
Ｃｒｅリコンビナーゼは、十分に特徴付けされた３８ｋＤａのＤＮＡリコンビナーゼであり（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ３２：１３０１−１３１１（１９８３））、バクテリオファージＰ１おける配列特異的組換えにおいて必要かつ十分である。組換えは、２つの３４塩基対ｌｏｘＰ配列間で起こり、これらの３４塩基対ｌｏｘＰ配列は、それぞれ、コア領域を取り囲む２つの逆方向１３塩基対リコンビナーゼ認識配列からなる（ＳｔｅｒｎｂｅｒｇおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：４６７−４８６（１９８１ａ）；ＳｔｅｒｎｂｅｒｇおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：４８７−５０７（１９８１ｂ））。ＤＮＡ切断および鎖交換は、コア領域の縁部において上側の鎖または下側の鎖において起こる。Ｃｒｅリコンビナーゼはまた、真核生物（酵母細胞（Ｓａｕｅｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７；２０８７−２０９６（１９８７））および哺乳動物細胞（ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５１６６−５１７０（１９８８）；ＦｕｋｕｓｈｉｇｅおよびＳａｕｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７９０５−７９０９（１９９２）；ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２８２８−２８３４（１９９７））の両方を含む）における部位特異的組換えを触媒する。
【０１６９】
１３−１細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションは、プレーティングされた生存細胞のうち１％において標的化組込みを生じることが以前に実証された（ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２８２８−２８３４（１９９７））。従って、最初の研究を、４μｇのｐＢＳ１８５および１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、または４０μｇのｐＢＳ３９７−ｆｌ（＋）／ＢＲＰを用いて１３−１細胞をトランスフェクトするためにリン酸カルシウムを使用して行った。１トランスフェクションあたりのＤＮＡレベルを、無関係のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ  ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して一定に保ち、そして形質転換体を、４００μｇ／ｍｌのジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を含有する培地に再プレーティングすることにより、４８時間後に選択した。１０日後にコロニーを計数して、標的化された組み込みの効率を決定した。最適な標的化組込みを、代表的には、３０μｇの標的化ベクターおよび４μｇのＣｒｅリコンビナーゼベクターｐＢＳ１８５、２０μｇの標的化ベクターおよび５μｇのｐＢＳ１８５と一致する）を使用して観察した（以前に報告された（ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２８２８−２８３４（１９９７））。観察された標的化組込みの頻度は、一般的には１％未満であった。使用されたＤＮＡの量および緩衝液ｐＨに対するリン酸カルシウム法の感度にもかかわらず、観察された標的化組込み効率は、タンパク質ライブラリを発現するのに十分であった。
【０１７０】
表６に示されるように、いくつかの細胞株および他のトランスフェクション方法もまた特徴付けされた。本明細書中に開示されるように、Ｆｌｐリコンビナーゼもまた使用して、Ｄｙｍｅｃｋｉ、前出、１９９６により記載されたように、ゲノム中の特定部位への外因性ＤＮＡの挿入を標的化し得る。Ｆｌｐリコンビナーゼについての標的部位は、８塩基対のスペーサーで分離された１３塩基対：
５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ［ＴＣＴＡＧＡＡＡ］ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’
の繰り返しからなる。簡単には、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸３２７〜３３２に対応するブチリルコリンエステラーゼの領域に対応する改変体ライブラリ（表２において領域６として示される）を、ｆｌｐリコンビナーゼおよび２９３Ｔ細胞株を使用して哺乳動物細胞にトランスフェクトした。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５４、５６および５８で示されるブチリルコリンエステラーゼ改変体を、Ｆｌｐリコンビナーゼおよび２９３Ｔヒト細胞株を利用して、本明細書中に記載される方法を使用して同定し、そして特徴付けした。
【０１７１】
一般的に、脂質媒介トランスフェクション方法は、化学的環境を変化する方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクションおよびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション）よりもより効果的である。さらに、脂質媒介トランスフェクションは、ＤＮＡ調製物中の汚染物、塩濃度およびｐＨよって影響されにくく、従って、一般により再現性のある結果を提供する（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７））。従って、中性脂質ジオレイオイルホスファチジルエタノールアミンおよび陽イオン性脂質の処方物（ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれる）は、代替のトランスフェクションアプローチとして評価されていた。手短に言えば、内毒素を含まないＤＮＡを、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて標的化ベクターｐＢＳ３９７−ｆｌ（＋）／ＢＲＰおよびＣｒｅ組換えベクターｐＢＳ１８５の両方から調製した。次に、５μｇのｐＢＳ１８５および様々な量のｐＢＳ３９７−ｆｌ（＋）／ＢＲＰを、無血清培地で希釈し、そしてＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬と混合した。次いで、ＤＮＡ／脂質混合物を、約５×１０５細胞／１００−ｍｍディッシュからなる１３−１細胞の６０〜７０％のコンフルエントな単層に添加し、そして３７℃にてインキュベートした。５時間後、ウシ胎仔血清を、１０％添加し、そして次の日にトランスフェクション培地を、取り除きそして新しい培地に配置した。
【０１７２】
様々な量の標的化ベクターを用いる細胞のトランスフェクションは、０．１％から１．０％の範囲の標的組込み効率を得、５μｇのそれぞれの標的化ベクターおよびＣｒｅ組換えベクターを用いて、最適な標的組込み効率を観察した。最適条件下での１３−１宿主細胞の脂質ベースのトランスフェクションは、一貫して観察される０．５％の標的組込み効率を生じた。０．５％の標的組込み効率は、以前に報告された１．０％の効率（ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２８２８−２８３４（１９９７））よりもわずかに少なく、そして大きなタンパク質ライブラリーを発現するために十分であり、哺乳類細胞中のタンパク質改変体のライブラリーの発現を可能にする。
【０１７３】
【表６】
2004535155.tif 000009
これらの結果は、ＮｌＨ３Ｔ３  １３−１細胞での標的挿入のためのトランスフェクション条件の最適化を示す。少量のＤＮＡを必要とし、そして再現可能な０．５％標的化効率を生じた、単純な脂質ベースのトランスフェクション方法のための条件が、確立された。
【０１７４】
（哺乳類細胞でのブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリーの発現）
ブチリルコリンエステラーゼ改変体の７つのライブラリーの各々を、ダブルｌｏｘ（ｄｏｕｂｌｅｌｏｘ）標的化ベクターおよび上記の最適なトランスフェクション条件を用いて、宿主哺乳類細胞株へと形質転換する。Ｃｒｅ媒介形質転換の後、宿主細胞を、限界希釈でプレートし、９６ウェル形式で異なるクローンを単離する。Ｃｒｅ／ｌｏｘ標的化部位に組み込まれたブチリルコリンエステラーゼ改変体を有する細胞をジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を用いて選択する。続いて、各ライブラリーからランダムに選択した２０〜３０のクローン由来のブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードするＤＮＡを、配列決定し、そして上記のように分析する。手短に言えば、全細胞ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、約１０４細胞個の目的の各クローンをから単離する。次に、ブチリルコリンエステラーゼ遺伝子を、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて増幅し、次いでＰＣＲ産物のアリコートを使用して、ネスト化したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、蛍光ジデオキシヌクレオチド末端方法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）によって、ランダムに選択したクローンからブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードするＤＮＡの配列決定した。
【０１７５】
以前に記載したように、配列決定は、ライブラリーの均一な導入を示し、そして哺乳類形質転換の多様性は、細菌の形質転換後の、ダブルｌｏｘ標的化ベクターのライブラリーの多様性に似ている。
【０１７６】
【表７】
2004535155.tif 000010
＊このアッセイにおいて、Ａ２８Ｗ変異体は、実施例Ｉに記載されるように検出された１５倍の増加よりむしろ、野生型に対して７倍の増加を有することが検出された。
【０１７７】
本明細書中に記載されるように、ブチリルコリンエステラーゼの領域５に対応するライブラリーを発現し、そして個々の改変体を、マイクロタイターアッセイを用いて［３Ｈ］−コカインの加水分解測定することによってスクリーニングした。増強された活性を有する改変体の触媒効率（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）を、マイクロタイターアッセイを用いて特徴付け、これらの相対的ＫｍおよびＶｍａｘを決定した。２４個のブチリルコリンエステラーゼ改変体を、増強されたコカイン加水分解酵素活性を有すると同定した：Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ（配列番号２）、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｐ（配列番号４）、Ａ３２８Ｗ／Ｖ３３１Ｌ（配列番号６）およびＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｓ（配列番号８）、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓ（配列番号１０）、Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓ（配列番号１２）、Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ａ１９９Ｓ（配列番号１４）、Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ（配列番号１６）、Ａ３２８Ｗ／Ｆ２２７Ａ（配列番号１８）、Ｙ３２２Ｓ（配列番号２０）、Ｙ３３２Ｍ（配列番号２２）、Ｙ３３２Ｐ（配列番号２４）、Ｖ３３１Ｌ（配列番号２６）、Ｆ２２７Ａ（配列番号２８）、Ｆ２２７Ｇ（配列番号３０）、Ｆ２２７Ｓ（配列番号３２）、Ｆ２２７Ｐ（配列番号３４），Ｆ２２７Ｔ（配列番号３６）、Ｆ２２７Ｃ（配列番号３８）、Ｆ２２７Ｍ（配列番号４０）、Ａ１９９Ｓ（配列番号４２）；Ｓ２８７Ｇ（配列番号５４）；Ｐ２８５Ｑ（配列番号５６）；Ｐ２８５Ｓ（配列番号５８）。
【０１７８】
（実施例ＩＶ）
（増強されたコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体の特徴付け））
この実施例は、以下に記載されるマイクロタイターアッセイにおいて増強されたコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体の分子特徴を記載する。マイクロタイターアッセイ形式で測定されるコカイン加水分解活性を、より多量の目的のブチリルコリンエステラーゼ改変体を用いてさらに確認する。マイクロタイターベースアッセイに加えて、クローンの活性を、産物の形成をＨＰＬＣアッセイによって測定して、溶液相中で示し、ブチリルコリンエステラーゼ改変体の増大したコカイン加水分解活性を確認し、そして増強された加水分解がベンゾイルエステル基にあることを確認した。
【０１７９】
野性型ブチリルコリンエステラーゼおよび最も良い改変体の動力学的定数を測定し、そしてこれらを用いて野性型ブチリルコリンエステラーゼに対して改変体の触媒効率を比較した。（−）−コカインのＫｍ値を、３７℃にて測定した。Ｖｍａｘ値およびＫｍ値を、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）を用いて計算した。Ｍａｓｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：２２６６−２２７７（１９９７））によって以前に記載されたようにブチリルコリンエステラーゼの活性部位の数を、滴定液としてのヨウ化エコチオパートまたはジイソプロピルフルオロホスフェートを用いる残効性の方法によって、測定する。あるいは、ブチリルコリンエステラーゼ活性部位の数は、ＥＬＩＳＡを用いて評価されて、培地上清中に存在するブチリルコリンエステラーゼまたはブチリルコリンエステラーゼ改変体の質量を定量する。精製されたヒトブチリルコリンエステラーゼを、ＥＬＩＳＡ定量アッセイのための標準として使用する。触媒速度定数（ｋｃａｔ）を、Ｖｍａｘを活性部位の濃度で割ることで計算する。最後に、最も良い改変体の触媒効率を、それぞれのブチリルコリンエステラーゼ改変体についてｋｃａｔ／Ｋｍを測定することによって野性型のブチリルコリンエステラーゼと比較する。
【０１８０】
増大したコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現する全てのクローンローンのより良い特徴付けのために、改変体をコードするＤＮＡを、配列決定する。ＤＮＡ配列決定は、正確な位置および変異体の性質を示し、従って、同定された別個のブチリルコリンエステラーゼ改変体の総数を定量化する。同一のブチリルコリンエステラーゼ変異体をコードするクローンが、複数の場合で同定されるとき、それぞれのライブラリーの配列のスクリーニングが完了する。このことは、ライブラリーが徹底的にスクリーニングされていることを示す。
【０１８１】
（実施例Ｖ）
（コンビナトリアルブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリーの合成および特徴付け）
この実施例は、哺乳類細胞中で発現されたブチリルコリンエステラーゼ改変体のコンビナトリアルライブラリーの合成および特徴付けを示す。
【０１８２】
単一アミノ酸変異を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体のライブラリーをスクリーニングすることにより同定された有益な変異を、インビトロで組み合わせ、ブチリルコリンエステラーゼコカイン加水分解活性をさらに改善する。生化学的相加性（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ）を指定した有益な変異のポジティブな組み合わせは、複数の場合で観察されている。例えば、蓄積および引き続く有益な変異の組み合わせを介して、段階的な様式で、抗体の親和性を増大する反復プロセスは、２５００未満の異なる変異体を含む改変体ライブラリーを用いて、５００倍に増強された親和性を示す抗体の同定をもたらした。重要なことは、生物学的相加性の原理は、抗体の親和性を改善するために制限されず、そして他の物理的性質（例えば、熱安定性、触媒効率または殺虫剤に対する増強された耐性）における改善を達成するように開発されている。
【０１８３】
焦点を合わせた７つのブチリルコリンエステラーゼライブラリーをスクリーニングすることにより同定された最良の変異を使用して、コンビナトリアルライブラリーを合成する。コンビナトリアルライブラリー中の異なる改変体の数は、少なく予想され、代表的には、最初のライブラリーからの異なる改変体の数のうちのわずかである。例えば、８つの異なる部位での単一の変異のコンビナトリアル分析は、２８または２５６の特有の改変体を含むライブラリーを必要とする。コンビナトリアルライブラリーを、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発により合成し、特徴付し、そして哺乳類宿主細胞株中で発現させる。改変体を、スクリーニングし、そして上記のように特徴付ける。ＤＮＡ配列決定は、相加的変異を示す。
【０１８４】
（実施例ＶＩ）
（ブチリルコリンエステラーゼ改変体の発現および精製）
この実施例は、哺乳類細胞株での発現および引き続くブチリルコリンエステラーゼ改変体の精製を示す。
【０１８５】
最も高い触媒活性のブチリルコリンエステラーゼ改変体および野性型ブチリルコリンエステラーゼを発現するクローンを用いて、インビボ研究に必要な酵素量を精製するためにラージスケール培養を確立する。それぞれ約１００ｍｇの野性型のブチリルコリンエステラーゼおよび最適な改変体が、以下に記載されるようなラットにおけるインビボでの毒性研究および中毒研究を完了するために必要とされる。
【０１８６】
目的のブチリルコリンエステラーゼ改変体を、固有の制限部位を用いて、ｐＣＭＶ／Ｚｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローン化する。改変体のクローニングを、制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列決定を用いて確認する。続いて、改変体を、トランスフェクトしたＣｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ卵巣細胞ＣＨＯ  Ｋｌ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）中で発現させる。ブチリルコリンエステラーゼは、糖タンパク質であるので、ＣＨＯ細胞を、発現のために選択した。そしてこれらの細胞は、組換えヒト治療用糖タンパク質（Ｇｏｏｃｈｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３４７−１３５５（１９９１）；ＪｅｎｋｉｎｓおよびＣｕｒｌｉｎｇ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：３５４−３６４（１９９４））および完全な活性な組換えブチリルコリンエステラーゼ（Ｍａｓｓｏｎら、ｓｕｐｒａ，１９９７）の発現のために以前から使用されている。最初に、ＣＨＯ細胞を、全てのブチリルコリンエステラーゼ改変体を用いて一過性トランスフェクトして、機能的なブチリルコリンエステラーゼの発現を確認する。続いて、細胞を、安定にトランスフェクトし、そしてブチリルコリンエステラーゼ改変体を発現するクローンを、抗生物質のＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて選択する。クローンを、滅菌したコットンチップスティック（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｃｏｔｔｏｎ−ｔｉｐｐｅｄ  ｓｔｉｃｋ）で採取し、２４ウェルプレートに移す。ブチリルコリンエステラーゼ発現を測定し、そして高活性を有するコロニーを、さらに増殖させる。ブチリルコリンエステラーゼ改変体の動力学的定数を、決定して、ＣＨＯ細胞での発現が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現したブチリルコリンエステラーゼ改変体と比較して酵素活性を低下させないことを保証する。
【０１８７】
この細胞を、Ｔ１７５フラスコ中で増殖させ、そして複数の３Ｌスピナフラスコで、約５×１０８細胞個が得られるまで、さらに増殖させる。続いて、細胞株を、ブチリルコリンエステラーゼの生成および連続した回収のためにＣＥＬＬ−ＰＨＡＲＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２０００中空繊維細胞培養システム（Ｕｎｉｓｙｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）へ移す。６０〜１２０ｍｌの濃縮されたブチリルコリンエステラーゼが毎日回収される中空繊維システムは、高細胞密度（１０８／ｍｌ）を得ることが可能である。さらなる評価のためのブチリルコリンエステラーゼの十分な量を生じるまで１ヶ月を、必要とすることが予測される。
【０１８８】
中空繊維システムから回収された濃縮された組換えブチリルコリンエステラーゼを、基本的に以前に記載されたように（Ｍａｓｓｏｎら、前出、１９９７）、精製する。無血清培地を、遠心分離して、粒子を除去する。そのイオン強度を、２容積の水での希釈によって減少し、続いて、このサンプルを、プロカインアミドＳｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティーカラムにロードする。ブチリルコリンエステラーゼをプロカインアミドと共に溶出し、さらにイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、そして濃縮する。ＣＨＯ細胞で発現した組換えブチリルコリンエステラーゼ変異体は、以前にこの精製アプローチを用いて５０％を超える収率で９９％の純度に高められている（Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：７８６−７９５（１９９７））。この酵素を、０．２２−μｍメンブランに通してフィルター滅菌し、そして４℃にて保存する。これらの条件下で、ブチリルコリンエステラーゼは、１８ヶ月後に、その元々の活性の９０％より多くを保持する（Ｌｙｎｃｈら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：８３−９１（１９９９））。
【０１８９】
（実施例ＶＩＩ）
（野性型ブチリルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼ改変体の評価）
この実施例は、ラットコカイン毒性モデルおよび強化モデルにおける野性型ブチリルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼ改変体の評価を記載する。
【０１９０】
インビトロで、増大したコカイン加水分解活性を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体は、インビボでコカイン毒性およびコカイン中毒の処置のためのより大きい効力を示す。インビボでのブチリルコリンエステラーゼ改変体の特徴付けのために、急性の過剰摂取モデルを使用して、毒性に対するブチリルコリンエステラーゼ改変体の効力を測定する一方、強化モデルおよび識別モデルを使用して、中毒の処置に対するブチリルコリンエステラーゼ改変体の効力を予測する。ヒトブチリルコリンエステラーゼ改変体の薬物動力学は、このモデルに最適であると予測されないが、ラットコカインモデルは、十分特徴付けられ、そして霊長類モデルより有意に少ない量の精製されたブチリルコリンエステラーゼを必要とする。野性型ブチリルコリンエステラーゼおよび増大したコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ改変体の両方は、用量依存反応を示すことが予測される。さらに、コカイン加水分解活性に対して最適化されたブチリルコリンエステラーゼ改変体は、野性株ブチリルコリンエステラーゼよりも実質的に少ない用量で有効である。
（コカインの毒性変化）
コカイン毒性に対するブチリルコリンエステラーゼ改変体の効果を、Ｍｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０１７６−１０１８１（１９９８）による過剰用量のラットモデルにおける先の記述のように、評価した。可変性の内因性カテコールアミンレベルが、コカイン毒性に影響することが示されている（Ｍｅｔｓら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５９：２０２１−２０３１（１９９６））ので、このモデルを、カテコールアミンの同時注入に利用する。カテコールアミンのレベルを標準化する場合、１ｍｇ／ｋｇ／分でのコカインの注入により、ＬＤ５０＝１０ｍｇ／ｋｇおよびＬＤ９０＝１６ｍｇ／ｋｇとなる。
【０１９１】
本研究では、６つの群で各々６匹を用いる。このラットは、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットであり、動物施設に収容された際は２５０〜２７５ｇの重さであり、これらは、暗明１２時間のサイクルで維持される。これらのラットは、いつでも自由に餌と水を摂取できる。処置前に、ラットに、大腿動脈カテーテルおよび大腿動脈カテーテルを取り付け、回復させる。続いて、これらのラットを、カテコールアミンとコカイン（１ｍｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の同時注入より１５分前に、変化する量のブチリルコリンエステラーゼ改変体（０．３５、１．７６、または１１．８ｍｇ／ｋｇ）または等容量の食塩水を処置する。この注入は、動物がすぐに死なない限り、１６分間かけてＬＤ９０のコカインを送達する。野生型ブチリルコリンエステラーゼおよび先に記述の触媒抗体（Ｍｅｔｓら、前出、１９９８）の相対的触媒有効性に基づき、ブチリルコリンエステラーゼ容量の増加は、食塩水コントロールに比して、ラットに生存率の増加を与え、そして最も高用量のブチリルコリンエステラーゼ（１１．８ｍｇ／ｋｇ）は、動物全てを保護することが予測される。インビトロでコカインを１０倍以上効果的に加水分解するブチリルコリンエステラーゼ改変体は、低用量（例えば、１ｍｇ／ｋｇ）で、動物全てに保護作用を与えることが期待される。
（コカイン乱用の変化）
コカインの、識別可能かつ増強される薬学的効果は、コカインの作用（薬物の乱用の例である）に最も密接に反映されると考えられる。従って、ブチリルコリンエステラーゼ改変体を、ラットでのコカイン増強モデルおよびコカイン識別モデルの両方において評価する。
【０１９２】
コカインの効果を増強するラットモデルを広範にわたって使用して、コカインについての他の潜在的な治療（Ｋｏｏｂら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．７９：３１５−３２０（１９８７）；Ｈｕｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｅｔｏｎ，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １０５：１５１−１５６（１９９１）；Ｃａｉｎｅ  ａｎｄ  Ｋｏｏｂ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７０：２０９−２１８（１９９４）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６１９：１５−２１（１９９３））を評価した。
【０１９３】
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを上記のように維持する。室内の明かり、格納式（ｒｅｔｒａｃｔａｂｌｅ）レバー、ディッパー機構、赤色、黄色および緑色の刺激光、ならびに薬物送達のための含気性（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ）シリンジを駆動するポンプ装置（ＩＩＴＣ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄ  Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）を備えた、６個のオペラントチャンバー（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ，ＶＴ）を、入力カードおよび出力カード（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ，ＶＴ）を介して、ＩＢＭ互換コンピューターと連動させる。このチャンバーを、空調設備のある、防音（ｓｏｕｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ）された小部屋（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）に収容した。オペラントチャンバー内での特別な自己投与プログラム（Ｃｕｓｔｏｍ  ｓｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）、予定された偶然性の制御および刺激アレイを、ＤＯＳ用のＭｅｄ−ＰＣプログラム言語を用いて書く。
【０１９４】
コカインの増強効果を、モデルにおいて、静脈内投与が動物によって引き起こされる応答を条件とする条件下で、ラットが必要とした注入の回数を数えて評価した（Ｍｅｔｓら、前出、１９９８）。ラットを、オペラント条件付けチャンバー内で、０．５ｍｌの甘くした牛乳溶液を得るためにレバーを押すように訓練する。ラットが、増強の固定割合１（ＦＲ１）のスケジュールでレバーを押す応答を身につけた後、この応答必要条件を、ＦＲ５のスケジュールまでしだいに増加させる。ラットが、牛乳維持応答の安定した割合を、このスケジュールで連続して３日間以上示す（１時間にわたる強化因子送達のセッションにおいて１０％未満の変動性）場合、カテーテルを外科的に左内頸静脈に導入し、そしてラットに、手術から回復させるために最低の２日間を与える。
【０１９５】
手術後最初のオペラント訓練セッション（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｓｓｉｏｎ）で、１時間のセッションにおいて、ラットを、牛乳と、コカイン（０．１２５ｍｇ／ｋｇ／注入）の静脈内ボーラスの両方の５秒間の同時送達のために、レバーに応答可能にする。次いで、牛乳を、チャンバーから除去し、そして次の３日間、連続して６時間の自己投与セッションにおいて、ラットに、１時間に１回３用量のコカイン（０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ／注入）のうち１つへの接近を許可する。従って、ラットに、１セッションにつき各用量に２回の接近を許可し、そして、この用量を、繰り返し、上昇する順に（すなわち、０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ／注入）差し出す。各１時間長の用量成分の範囲内で、１０秒の小休止（ｔｉｍｅｏｕｔ）を伴う最初のＦＲ５スケジュールを、維持する。さらに、１０分の小休止周期は、個々の１時間セッションに渡る持ち越し効果（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）を最小にしようとして、各用量成分の後に、実施した。
【０１９６】
ラットが、３日間以上連続して、コカインの一貫した自己投与（１５％未満の可変性を有して、６時間のセッションにつき１６０回を越える注入）を示す場合、それらのラットは、より少ない用量ならびに生理食塩水が、たった１日のセッション中に利用可能であるスケジュールに載せられる。各セッションは、各成分中に生理食塩水および利用可能なコカインの３つの用量を含む、２つの成分に分けられる。各セッションの第１の成分は、一連の低用量（０〜０．０６２５ｍｇ／ｋｇ／注入）へのアクセスを提供し、他方、第２の成分は、より広範な用量（０〜０．５ｍｇ／ｋｇ／注入）へのアクセスを提供する。
【０１９７】
コカインの自己投与割合（ｒａｔｅ）が安定化した後、ラットを６つのグループ間で分け、そして毎日の自己投与セッションを始める３０分前に、各グループ（ｎ＝６匹のラット）に、野生型ブチリルコリンエステラーゼ、最適化ブチリルコリンエステラーゼ改変体、または等用量の生理食塩水のいずれかを０．３５ｍｇ、１．７６ｍｇ、または１１．８ｍｇ／ｋｇ投与した。この前処置の効果を、ラットのコカイン自己投与行動がベースラインに戻るまで、数日間観察した。
【０１９８】
固定した割合（ＦＲ）のスケジュールを用いて、注入の回数を、セッションの持続時間によってのみ制限し、そして結果的に、注入の回数を、依存性変数として用いて、最適化ブチリルコリンエステラーゼの効力を野生型ブチリルコリンエステラーゼの効力と比較する。変動する濃度での野生型ブチリルコリンエステラーゼまたは最適化ブチリルコリンエステラーゼ改変体の投与に従って、その用量応答曲線を、混合因子ＭＡＮＯＶＡを用いて分析する。このブチリルコリンエステラーゼ濃度（０．３５ｍｇ、１．７６ｍｇ、または１１．８ｍｇ／ｋｇ）を、被験体間の因子として装填し、そしてコカイン用量（０ｍｇ、０．０１５ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ／注入）を、被験体内の因子として装填する。個々のコカイン用量でのブチリルコリンエステラーゼ処置グループにわたる、個体全ての比較は、Ｔｕｋｅｙ  ＨＳＤ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ手順（Ｇｒａｖｅｔｔｅｒ，Ｆ．Ｊ．およびＷａｌｌｎａｕ，Ｌ．Ｂ．，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第５版、２０００，Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）を参照のこと）を使用し、そして統計学的有意性についての基準を、ｐ＜０．０５に設定する。より高いブチリルコリンエステラーゼ用量（１１．８ｍｇ／ｋｇ）では、ラットにより摂取される注入の回数は、未処置の（生理食塩水）コントロールグループよりも低いと予想される。さらに、コカイン加水分解の増大を示す、ブチリルコリンエステラーゼ改変体で処置されたラットでは、低用量（０．３５ｍｇ／ｋｇ）での注入回数が、野生型ブチリルコリンエステラーゼで処置した動物よりも減少すると予想される。
【０１９９】
薬物の識別は、臨床的状態にけるコカインの本質的効果に関連し、そして前処置後のコカイン識別の拮抗作用を、治療可能性の明らかな証拠とみなす（Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｍｏｄｅｒｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ａｂｕｓｅ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０）；Ｓｐｅａｌｍａｎ，ＮＩＤＡ  Ｒｅｓ．Ｍｏｎ．１１９：１７５−１７９（１９９２））。薬物の識別可能な刺激効果を確立し、そしてその効果を評価するために最も頻繁に使用される手順は、注入された薬物を刺激として使用して２つのレバーに応答する分布を制御する、制御されたオペラント手順で動物を訓練することである。薬物用量の関数としての「薬物に関連する」レバーに対する応答の分布からなる用量−効果曲線は、容易に作成される。これらのコカインの用量−効果曲線は、競合的アンタゴニストの投与により変化され得る。動物本来のコカインに対する感受性を回復するために必要とされる曲線の変更量および時間は、野生型ブチリルコリンエステラーゼおよび最適化改変体の潜在的な治療上の使用を評価するための有用なデータである。ラットモデルにおけるこの識別可能なコカインの刺激効果は、ドパミン再摂取のインヒビターならびにドパミンレセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストの治療有効性を評価するために使用されている（Ｗｉｔｋｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５７：７０６−７１３（１９８９）；Ｋａｎｔａｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７４：６５７−６６５（１９９５）；ＢａｒｒｅｔおよびＡｐｐｅｌ，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ９９：１３−１６（１９８９）；Ｃａｌｌａｈａｎら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １０３：５０−５５（１９９１））。
【０２００】
訓練し、そして識別可能な刺激としてコカインを試験する複数の試行手順を使用して、Ｂｅｒｔａｌｍｉｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：２８９−２９９（１９８２）およびＳｃｈｅｃｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２６：１１３−１１８（１９９７）に前述されるように、ラットにおけるブチリルコリンエステラーゼの効力を評価する。コカインについての用量−コカインに対する応答の曲線は、ブチリルコリンエステラーゼまたは最適化ブチリルコリンエステラーゼ改変体の存在下での単一のセッションにおいて得られる。続いて、ラットのコカインに対する本来の感受性の回復を、ブチリルコリンエステラーゼの作用の持続期間を評価するために、週２回制で追跡する。
【０２０１】
ラットから、飼料強化オペラント手順でラットを訓練するために、実験の最初に、自由摂取の重量の８０％までを奪う。各々のラットを、２つの光線刺激および２つの格納式レバー、いずれか一方の側に牛乳送達系を装備したオペラント条件付けチャンバーに配置し、そして、０．５ｍｌの加糖練乳へのアクセスを受容するレバーの１つを押すように訓練する。一旦、ラットがこのレバーに応答することを学ぶと、多くの試行手順が開始される。各セッションは、６つの試行（各試行が１５分間持続する）からなる。各試行の最初の１０分は、停電時間であり、この間、明かりのない状態であり、そして応答が帰結しない。この１０分間は、後に続く研究の試験期において、薬物吸収を可能にする。各試行の最後の５分は、牛乳を強化する時間（ＦＲ５）である。一旦、ラットが、５分間の応答時間（シグナル伝達時間）の間、一貫してかつ迅速に応答すると、コカインが、その手順に導入される。
【０２０２】
最初に、６回の１週に１回のセッションの３回について開始１０分前に、１０ｍｇ／ｋｇのコカインを与える。これらのセッションの間、事前に延長された「非コカイン」レバー（生理食塩水）を引っ込め、そして他方の「コカイン関連」レバーを牛乳送達カップの別の側に延長する。この第２のレバーでの応答（最初は、単一の応答のみ；最終的に５つの応答）は、セッション前にコカインを投与した場合、牛乳の提示を生じる。このラットは、投与されたコカインの内受容性効果を感知する場合、第２のレバーに応答するように訓練されている。コカインの識別可能な効果は、３０分を越えて拡大されないと考えられるので、コカイン投与に続くセッションは、２つの試行（各１５分）しか続かない。この場合、一週間のうち３日間、ラットはコカイン注入を受容せず、そしてそれらの日には、６つの試行のシグナル伝達期間の間、利用可能な非コカインレバーに対して応答させるために牛乳を（ＦＲ５）で補強する。週の残りの３日間には、セッションの開始前に、ラットに１０ｍｇ／ｋｇのコカインを与え、そして各々の２つの試行のシグナル伝達期間の間、利用可能なコカインレバーに対する応答を補強する。
【０２０３】
続いて、各毎日のセッションを、コカイン投与のない、１〜４つの試行で始め、後に１０ｍｇ／ｋｇのコカイン投与を続ける。従って、各セッションは、コカインに当たるレバーに対する応答が食事送達に必要とする２つの試行で終了する。この段階中は、「正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ）」レバーのみが延長されるが、セッション全体の間、両方のレバーを利用可能にする臨界的工程を、毎日のセッションにおいて、動物が非コカインレバーからコカインレバーに移ることを学び次第、実施する。続いて、各セッションを１０分の停電時間で始め、５分間、両方のレバーを提示する。毎日のセッションの最初の１〜４つの試行の間はコカインを与えず、そして非コカインレバーに対する５つの連続する応答の結果として、この５分間の間に、餌を与える。ラットが、１つのレバーから他方のレバーに移るか、または、正しくないレバーに応答する場合、ラットは加勢を受けず、そして両方のレバーは、１０秒間引っ込められる。その時点で、レバーは再び提示され、そして試行が再開される。その第２、第３、または第４の試行の開始時に、１０ｍｇ／ｋｇのコカインを与え、ラットを試験箱に戻す。光線が停電され、そしてレバーが次の２つの試行で提示される場合、コカインレバーに対する５つの連続する応答は、ラットが、与えられた試行に対してどのレバーが正しいかをラットに伝える合図として、コカインの識別可能な効果を用いて、非コカインレバーからコカインレバーに応答を切り替えることを学ぶことを立証するために、牛乳の提示を必要とする。
【０２０４】
コカイン用量−効果曲線は、ラットが、３つの連続するセッションで、正しいレバー選択を８０％の基準で達成した途端に得られる。試験セッションの第１の試行で、生理食塩水を与える。続く試行で、０．１ｍｇ、０．３ｍｇ、１．０ｍｇ、３．２ｍｇ、および１０ｍｇ／ｋｇのコカインを投与し、各々、１０分の停電での開始で、各試行を開始する。これらの試験試行の間、いずれかのレバーに対する５つの連続する応答は、牛乳の提示を生じるが、ＦＲを終了する前の１つのレバーから他方のレバーへの切り替えは、１０秒間のレバー後退を生じる。動物は、非コカインレバーに対する応答によりこのセッションを開始し、そして応答全てがコカインのレバーで行われるまで、そのコカインのレバーで行われる応答の割合を徐々に増加させることを、予想する。従って、投与されたコカインの用量に対するレバー選択の、用量−応答曲線は、各試験セッション中に確立される。
【０２０５】
一旦、コカインが、識別可能な刺激として確立されると、ラットを、野生型ブチリルコリンエステラーゼまたは最適化改変体のいずれかを０．３５ｍｇ、１．７６ｍｇ、または１１．８ｍｇ／ｋｇ受容する、別個のグループ（１グループにつき、ｎ＝６匹）に配置する。コカインの識別可能な刺激効果は、酵素投与後３０分、およびそれからは１日１回コカインに対する感受性が再確立されるまで決定される。ブチリルコリンエステラーゼの投与後の最初の試験セッションにおいて、より少量のコカイン用量のいずれの後にもコカインレバーを選択しない場合、より多くの用量のコカインを与える。動物が、１０ｍｇ／ｋｇまたは３２ｍｇ／ｋｇのコカインの投与後にもコカインに当たるレバーを選択し得ない場合、１００ｍｇ／ｋｇもの多くの用量のコカインを与える。コカインに対する用量−応答曲線が、単一のセッションで得られるので、このプロトコル（コカインの乱用障害（ａｂｕｓｅ  ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）に関連する局面である）は、２つの型のブチリルコリンエステラーゼが、識別可能な刺激としてのコカインの能力を減少させる相対的な能力についての情報を提供する。インビトロでコカイン加水分解活性の増大を示すブチリルコリンエステラーゼ改変体は、より強力である。
【０２０６】
この明細書の至る所で、種々の刊行物が、括弧内に参照されている。それらの内容におけるこれらの刊行物の開示は、本発明が属する技術分野の水準をより完全に記載するために、ここで、本出願において参考として援用される。
【０２０７】
本発明は、開示される実施形態に関連して記載されているが、当業者は、詳述した特定の実験が本発明の一例にすぎないことを、容易に理解する。種々の改変は、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが、理解されるべきである。従って、本発明は、特許の請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１Ａ】図１Ａは、（Ａ）配列番号５３と称される核酸配列および（Ｂ）配列番号５２と称されるブチリルコリンエステラーゼ改変体の推定アミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、（Ａ）配列番号５３と称される核酸配列および（Ｂ）配列番号５２と称されるブチリルコリンエステラーゼ改変体の推定アミノ酸配列を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、（Ａ）配列番号５３と称される核酸配列および（Ｂ）配列番号５２と称されるブチリルコリンエステラーゼ改変体の推定アミノ酸配列を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、（Ａ）配列番号５３と称される核酸配列および（Ｂ）配列番号５２と称されるブチリルコリンエステラーゼ改変体の推定アミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ヒトブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。
【図３】図３は、ヒトブチリルコリンエステラーゼの核酸配列（配列番号４３）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ヒト野生型（配列番号４４）、ヒトＡ改変体（配列番号４５）、ヒトＪ改変体（配列番号４６）、ヒトＫ改変体（配列番号４７）、ウマブチリルコリンエステラーゼ改変体（配列番号４８）、ネコブチリルコリンエステラーゼ改変体（配列番号４９）およびラットブチリルコリンエステラーゼ改変体（配列番号５０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒト野生型（配列番号４４）、ヒトＡ改変体（配列番号４５）、ヒトＪ改変体（配列番号４６）、ヒトＫ改変体（配列番号４７）、ウマブチリルコリンエステラーゼ改変体（配列番号４８）、ネコブチリルコリンエステラーゼ改変体（配列番号４９）およびラットブチリルコリンエステラーゼ改変体（配列番号５０）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＰＬＣアッセイおよび同位体トレーサーアッセイの両方の方法による安息香酸形成の定量をプロットすることによって実証した場合の、ＨＰＬＣアッセイと同位体トレーサーアッセイとの間の相関を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ二重逆数プロットを用いたウマブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性についてのＫｍを示す。
【図６】図６は、コカイン加水分解活性を測定するための、野生型（黒丸）および短縮型（白丸）のブチリルコリンエステラーゼの固相固定化を示す。
【図７】図７は、焦点を当てたライブラリーの合成のための複数の合成カラムおよびコドンベースの変異誘発の使用を示す。
【図８】図８は、ヒトブチリルコリンエステラーゼのそれらのそれぞれの領域における全てのブチリルコリンエステラーゼ改変体変更についてのアミノ酸配列および核酸配列のアラインメントを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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