(57)【要約】イソプロピルアルコールでの処理によるエシェリキア・コリＫ５多糖の精製及び親油性物質の除去を開示する。精製された生成物は、Ｎ−脱アセチル化後、高硫酸化度をもつ新規なＮ,Ｏ−硫酸化多糖を調製するために使用される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３.２以上の硫酸化度を有するＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を製造する方法であって、(ａ)高濃度塩水溶液中において、発酵からのＫ５をイソプロパノールにて処理し；(ｂ)このようにして精製したＫ５を、Ｎ−脱アセチル化、及び続くＮ−硫酸化剤での処理によるＮ−硫酸化に供し；(ｃ)このようにして得られたＮ−硫酸Ｋ５のアンモニウム塩を、Ｏ−過硫酸化条件下、Ｏ−硫酸化剤にて処理し；及び(ｄ)必要であれば、このようにして得られた生成物をＮ−硫酸化に供し、Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を単離することを包含することを特徴とするＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５の製法。
【請求項２】
原料のＫ５が、約1,500〜約15,000の分布をもつ分子量を有するものである請求項１記載の製法。
【請求項３】
分子量分布が約2,000〜約9,000であり、平均分子量が約5,000である請求項２記載の製法。
【請求項４】
原料のＫ５が、約10,000〜約50,000の分布をもつ分子量を有するものである請求項１記載の製法。
【請求項５】
分子量分布が約20,000〜約40,000であり、平均分子量が約30,000である請求項４記載の製法。
【請求項６】
原料のＫ５が、約2,000〜約50,000の分布をもつ分子量を有し、平均分子量が20,000〜25,000であるものである請求項１記載の製法。
【請求項７】
工程(ｂ)において、アルカリ加水分解を、水酸化ナトリウムを使用して行う請求項１〜６のいずれかに記載の製法。
【請求項８】
Ｎ−硫酸化剤として、ピリジン・三酸化イオウ又はトリメチルアミン・三酸化イオウ付加物を使用する請求項１〜７のいずれかに記載の製法。
【請求項９】
工程(ｃ)において、アンモニウム塩として、テトラブチルアンモニウム塩を使用する請求項１〜８のいずれかに記載の製法。
【請求項１０】
工程(ｃ)において、硫酸化剤として、ピリジン・三酸化イオウ付加物を使用する請求項１〜９のいずれかに記載の製法。
【請求項１１】
Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５をナトリウム塩として単離する請求項１〜１０のいずれかに記載の製法。
【請求項１２】
ナトリウム塩を他の塩に変換する請求項１１に記載の製法。
【請求項１３】
他の塩が、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム及び亜鉛の塩でなる群から選ばれるものである請求項１２記載の製法。
【請求項１４】
実質的に親油性物質を含有しない純粋なＫ５多糖又はその塩。
【請求項１５】
1H-NMRスペクトルの１.５ppm以下の領域にシグナルを示さない請求項１４記載の純粋なＫ５。
【請求項１６】
ＵＶスペクトルにおいて260nmで核酸が検知不能であり、タンパク質含量が０.５％以下である請求項１５記載のＫ５多糖。
【請求項１７】
(a1)４℃の４Ｍ塩化ナトリウム溶液に溶解した発酵からのＫ５を、イソプロパノール１容にて処理し；(a2)算定した量の塩化ナトリウムを添加することによって、塩溶液を濃度３Ｍとし；(a3)溶液を４℃に一夜維持し；及び(a4)遠心分離によって生成物を単離し及び限外濾過によって塩を除去する方法に従って得られる、実質的に親油性物質を含有しないＫ５多糖。
【請求項１８】
(ａ)高濃度塩水溶液中において、発酵からのＫ５をイソプロパノールにて処理し；(ｂ)このようにして精製したＫ５を、Ｎ−脱アセチル化、及び続くＮ−硫酸化剤での処理によるＮ−硫酸化に供し；(ｃ)このようにして得られたＮ−硫酸Ｋ５のアンモニウム塩を、Ｏ−過硫酸化条件下、Ｏ−硫酸化剤にて処理し；及び(ｄ)必要であれば、このようにして得られた生成物をＮ−硫酸化に供し、ナトリウム塩形のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を単離し、必要であれば、これを他の塩に変換することを包含する方法に従って得られる、硫酸化度３.２以上を有するＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項１９】
硫酸化度３.２以上を有するＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖又はその塩。
【請求項２０】
硫酸化度３.５〜４を有する請求項１９記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項２１】
硫酸化度３.７〜４を有する請求項２０記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項２２】
約2,000〜約16,000の分布をもつ分子量を有するものである請求項１９〜２１のいずれかに記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項２３】
分子量分布が約2,500〜約10,000であり、平均分子量が約6,500である請求項２２記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項２４】
約13,000〜約65,000の分布をもつ分子量を有するものである請求項１９〜２１のいずれかに記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項２５】
分子量分布が約25,000〜約50,000であり、平均分子量が約40,000である請求項２４記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項２６】
約2,000〜約65,000の分布をもつ分子量を有し、平均分子量が25,000〜30,000である請求項１９〜２１のいずれかに記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項２７】
平均分子量2,000〜5,000を有する、解重合によって得られた請求項１９〜２１のいずれかに記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖。
【請求項２８】
請求項１９〜２７のいずれかに記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５の薬学上許容される塩。
【請求項２９】
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム及び亜鉛の塩でなる群から選ばれる請求項２８記載の塩。
【請求項３０】
鎖の混合物で構成され、前記鎖の少なくとも９０％が、式(Ｉ)
【化１】
2004529227.tif 000005
（ここで、ｎは３〜100であり；Ｒ及びＲ'は水素又SO3-であって、Ｒ及びＲ'の少なくとも１つは水素以外であり、ただし、ｎ単位の６０〜100％において、Ｒ及びＲ'は共にSO3-であり、ｎ単位の０〜４０％において、Ｒ及びＲ'の１つは水素であって、他はSO3-であり；硫酸化度は３.２〜４であり、及び対応するカチオンは化学的又は薬学上許容されるものである）で表されるものであることを特徴とするＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５。
【請求項３１】
カチオンが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム及び亜鉛のイオンでなる群から選ばれる請求項３０記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５。
【請求項３２】
活性成分として、薬理的に活性な量の、請求項１９〜３１のいずれかに記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を、製薬上の賦形剤又はビヒクルとの混合物として含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３３】
活性成分として、化粧品として有効な量の、請求項１９〜３１のいずれかに記載のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を、化粧品の賦形剤又はビヒクルとの混合物として含有する化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
イソプロピルアルコールでの処理によるエシェリキア・コリ（E. coli）Ｋ５多糖の精製及び親油性物質の除去を開示する。精製された生成物は、Ｎ−脱アセチル化後、高硫酸化度をもつ新規なＮ,Ｏ−硫酸化多糖を調製するために使用される。
【背景技術】
【０００２】
W.F. Vannらによって  Eur. J. Biochem., 116, (1981), 359-364に記載されたエシェリキア・コリの菌株から単離された被膜多糖Ｋ５（以下、単に「Ｋ５」と表示する）は、ヘパリン及びヘパラン硫酸（Ｎ−アセチルヘパロサン（N-acetylheparosan））の生合成前駆体と同じシーケンスを示し、化学的には、α１−４結合したＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンによって形成された繰り返し多糖単位によって構成され、一方、多糖単位Ｄ−グルクロニル−Ｎ−アセチルグルコサミンはβ１−４結合していることが知られている。ヘパリン前駆体Ｎ−アセチルヘパロサンとＫ５多糖との間におけるわずかな差異（Ｋ５及びその誘導体の生物学的活性にとっては重要ではない）は、例えば、ヨーロッパ特許第489,647号及びヨーロッパ特許第544,592号に開示されているように、ポリマーのいくつかの鎖の非還元末端における４（５）位の二重結合の存在である。
【０００３】
この第１の発表の後、他の論文及び特許出願において、数千から数十万ダルトンの範囲の分子量を有するエシェリキア・コリＫ５多糖の製法が開示された。例えば、ヨーロッパ特許第333,234号、イタリー国特許第1,230,785号、ヨーロッパ特許第489,647号、ヨーロッパ特許第544,592号、国際公開第WO 92/17507号、国際公開第WO 01/02597号、及びM. Manzoniら, Journal Bioactive Compatible Polymers, 11, (1996), 301-311が挙げられる。
【０００４】
文献によれば、エシェリキア・コリの菌株の発酵からのＫ５は、例えば、内毒素、発熱物質又は一般的にタンパク質を除去するために、各種の方法によって精製されている。
【０００５】
例えば、W.F. Vannらは、初めて単離されたＫ５を、第４級アンモニウム塩での沈澱の後、８０％エタノールでの３回の沈澱処理を使用して精製した（1981）。ヨーロッパ特許第333,243号では、精製は、第４級アンモニウム塩での沈澱、Ｋ５の抽出及び単離によって行われている。ヨーロッパ特許第489,647号及びヨーロッパ特許第544,598号では、Ｋ５は、エタノールでの沈澱及び排除及び／又はイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。国際公開第WO 92/17507号によれば、精製は、エタノールでの沈澱、透析、及び透析された溶液の遠心分離及び固体の除去後における得られた溶液の凍結乾燥によって行われる。M. Manzoniら（1996）及びWO 01/02597号（これらは、脱脂大豆、塩及びグルコースを含有する培養培地における発酵によるＫ５の製法を開示する）によれば、Ｋ５の精製は、１Ｍ NaCl溶液を使用し、エタノール発酵によって得られたＫ５を含有する溶液の限外濾過及びイオン交換クロマトグラフィーを使用して行われる。
【０００６】
さらに、発酵からのＫ５は、ヘパリン様生成物を得るために、化学的に変性されている。このように、上記のドキュメントの中でも、国際公開第WO 92/17507号、ヨーロッパ特許第489,647号及びヨーロッパ特許第544,592号は、抗凝血活性及び抗血栓活性を有する低分子量及び高分子量のＮ,Ｏ−硫酸化Ｋ５を開示し、イタリー国特許第1,230,785号及びWO 92/17507号は、イズロン酸単位にエピマー化される特定の数のグルクロン酸単位を有するＫ５のＮ−脱アセチル化−Ｎ,Ｏ−硫酸化誘導体を開示し、国際公開第WO 98/09636号は、抗ガン転移活性を有するＮ−脱アセチル化−Ｎ,Ｏ−硫酸化Ｋ５を開示している。
【０００７】
最後に、Ｎ−硫酸Ｋ５のＯ−硫酸化については、文献は、二糖単位のヒドロキシ基に導入される多数の硫酸基の変性の仕方を教示している。特に、Casuら, Carbohydrate Reserach, 263, (1994), 271-284は、Ｋ５のＮ−脱アセチル化、Ｎ−硫酸化、及び３種のＯ−硫酸化法（Ｂ、Ｃ及びＡＣとして表示される）を開示している。方法Ｃ（Ｎ−硫酸Ｋ５の硫酸化が、遊離のヒドロキシ基当たり硫酸化剤１０モル当量を使用して、温度２５〜５５℃において、１〜２４時間の範囲の時間で行われる）によれば、さらにＮ−硫酸化した後、硫酸基／カルボキシル基比の最高値３.１を有するポリ硫酸化化合物（以下、Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５と表示する）が得られる。
【０００８】
以下に記載する他のＫ５誘導体も、次のように表示される：「Ｎ−脱アセチル化Ｋ５」＝Ｎ−脱アセチル化Ｋ５多糖；「Ｎ−硫酸Ｋ５」＝Ｎ−脱アセチル化−Ｎ−硫酸化Ｋ５多糖；「Ｎ,Ｏ−硫酸Ｋ５」＝Ｎ−脱アセチル化−Ｎ,Ｏ−硫酸化Ｋ５多糖；及び「Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５」＝例えば、Casuら（1994）によって開示された上記方法Ｃに従って得られた高硫酸化度をもつＮ−脱アセチル化−Ｎ,Ｏ−硫酸化Ｋ５多糖。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
方法Ｃに従ってＮ−硫酸Ｋ５のＯ−硫酸化を行う場合、ヘパリン様化合物（すなわち、特定のウロン酸単位（イズロン酸として）百分率を有する）の場合及びＫ５の場合には、高硫酸化度が達成されるが、Ｎ−硫酸Ｋ５の場合には、得られるＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５は、二糖単位当たり３.２硫酸基には達しない硫酸化度を示すことが観察された。これは、二糖単位当たり３.２硫酸基以上を有するＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５（この生成物は、その高アニオン度のため、潜在的に興味深い）に関する文献がないことを示す証拠である。
【００１０】
発明者らは、新たに、発酵によって得られたＫ５を、高濃度塩溶液中において、イソプロパノールで処理することによって精製することにより、特に、親油性物質を実質的に含有しない（以下の記載では、「親油性物質フリー」と表示する）純粋なＫ５多糖が得られるとの知見を得た。
【００１１】
さらに、このようにして得られた親油性物質フリーのＫ５を、Ｎ−脱アセチル化、Ｎ−硫酸化、方法ＣによるＯ−硫酸化、及び任意に、他のＮ−硫酸化に供することによって、３.２以上及び一般に３.５以上の高硫酸化度を有する新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５が得られるとの知見を得た。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
その態様の１つによれば、本発明は、３.２以上の硫酸化度を有する新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を製造する方法であって、(ａ)高濃度塩水溶液中において、発酵から得られたＫ５をイソプロパノールにて処理し；(ｂ)このようにして得られたＫ５を、アルカリ加水分解によるＮ−脱アセチル化、及び続くＮ−硫酸化剤での処理によるＮ−硫酸化に供し；(ｃ)このようにして得られたＮ−硫酸Ｋ５のアンモニウム塩を、Ｏ−過硫酸化条件下、Ｏ−硫酸化剤にて処理し；及び(ｄ)必要であれば、このようにして得られた化合物をＮ−再硫酸化に供し、Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５をナトリウム塩として単離し、任意に、これを他の塩に変換することを包含する新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５の製法を提供する。
【００１３】
用語「硫酸化度」は、二糖単位当たりの硫酸基の数（硫酸基／カルボキシル基比として表示される）を表す。
【００１４】
用語「Ｏ−過硫酸化」は、例えば、方法Ｃに従って達成されるＮ−硫酸Ｋ５の過硫酸化を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
工程(ａ)において、原料物質として使用されるＫ５は、Ｋ５を生産する野生又はクローン化エシェリキア・コリの菌株の発酵によって得られる生産物の１つである。特に、上記の文献に記載されたＫ５、好適には、M. Manzoniら（Journal Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311）によって記載されたもの、及び後述の調製法Ｉに記載のものを使用できる。
【００１６】
さらに好適には、Ｋ５原料物質は、低分子量を有し、特に、分布約1,500〜約15,000、好ましくは約2,000〜約9,000及び平均分子量約5,000をもつもの、又はより大きい分子量を有し、特に、分布約10,000〜約50,000、好ましくは約20,000〜約40,000及び平均分子量約30,000をもつものである。好ましくは、Ｋ５原料物質は、分子量分布約1,500〜約50,000を有し、平均分子量20,000〜25,000をもつ。
【００１７】
Ｋ５及びここに記載のその誘導体の分子量は、標準として、既知の分子量をもつヘパリンのフラクションを使用して算定したものである。本発明に関する分子量は、全て、ダルトンで表される。
【００１８】
原料物質は、例えば、内毒素、発熱物質又は他の不純物を公知の方法で除去した予め精製したＫ５である。
【００１９】
同様に、処理後に得られるＫ５が、製薬の目的に、又は医薬の用途のためのＮ,Ｏ−硫酸Ｋ５の調製に使用されるものである場合には、Ｋ５は、発熱物質及び内毒素を除去するよう精製される。
【００２０】
実際には、Ｋ５原料物質を、好ましくは塩化ナトリウムの２〜５Ｍ溶液に、濃度０.５〜１０％で溶解し、温度０〜８℃においてイソプロパノール１〜３容にて処理し、このようにして得られた溶液を、さらに、塩、好ましくは塩化ナトリウムを添加することによって２〜４Ｍとする。
【００２１】
同じ温度に１〜１８時間維持した後では、工程(ａ)の生成物は完全に沈殿しており、濾過又は遠心分離によって単離する。生成物の純度が満足できるものではない場合には、工程(ａ)を繰り返す。このようにして得られた固体生成物を、水に再度溶解し、限外濾過によって膜にて回収する。
【００２２】
工程(ａ)の終了時、原料物質のものと同じ特性を有しているが、実質的に親油性物質フリーであるＫ５が得られる。
【００２３】
実際には、(a1)４℃の４Ｍ塩化ナトリウム溶液に溶解した発酵からのＫ５をイソプロパノール１容にて処理し；(a2)算定した量の飽和塩化ナトリウム溶液を添加することによって、塩溶液を３Ｍとし；(a3)溶液を４℃に一夜放置し；及び(a4)遠心分離によって生成物を単離し及び限外濾過によって塩を除去することを包含してなる方法によって、親油性物質フリーのＫ５が得られる。
【００２４】
イソプロパノールでの精製によって、このように、９９％より大の純度を有する親油性物質フリーのＫ５を得ることができる。このＫ５は、次の工程(ｃ)において高Ｏ−硫酸化を得ることを可能にする。
【００２５】
工程(ｂ)では、Ｎ−脱アセチル化は、例えば、ヒドラジン中の硫酸ヒドラジンによる又は水中のアルカリ水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム又はカリウム）によるアルカリ加水分解の公知の方法に従って行われる。好ましくは、反応は、水酸化ナトリウム水溶液中、温度４０〜８０℃において、反応の進行を制御することによって行われる。一般に、最高３０時間後（実際には、１２〜２４時間後）、Ｎ−脱アセチル化は完了し、媒質のアルカリ性を、酸、好ましくは塩酸での処理によって中和する。
【００２６】
Ｋ５及び塩を含有する溶液を、続いて、アルカリ炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム）の存在下、Ｎ−硫酸化剤［例えば、ピリジン・三酸化イオウ（C5H5N・SO3）又はトリアルキルアミン・三酸化イオウ（例えば、トリメチルアミン・三酸化イオウ）の如き第３級有機塩基の無水硫酸（三酸化イオウ）付加物］にて処理する。反応は室温（２０〜３０℃）で行われるが、反応時間を短縮するため、より高い温度（約６５℃まで）で操作することも可能である。アルカリ炭酸塩及び硫酸化剤の添加は同時的に実施されるか、又は、アルカリ炭酸塩を一度に導入し、続いて、硫酸化剤を、５分〜１２時間の時間で徐々に添加してもよい。反応の終了時、混合物を、室温にて、酸、好ましくは塩酸によってｐＨ７.５〜８とし、例えば、ダイアフィルトレーションによって塩を除去する。Ｎ−硫酸Ｋ５をアルカリ塩として含有する得られた溶液を、続く工程(ｃ)に送るか、又はこれを濃縮し、常法に従って、Ｎ−硫酸Ｋ５をナトリウム塩として単離することができる。このようにして得られたＮ−硫酸Ｋ５は、９０〜100％硫酸化されている。
【００２７】
工程(ｃ)では、工程(ｂ)において得られたアルカリＮ−硫酸Ｋ５を含有する溶液を、例えば、ＩＲ 120 Ｈ+のようなカチオン交換樹脂上を通過させることによって、酸性ｐＨとなるまで中和させる。このようにして得られた酸性溶液を、第３級又は第４級有機塩基にて、例えば、トリアルキルアミン（例えば、トリブチルアミン）にて、又はテトラアルキルアンモニウムの水酸化物、好ましくはテトラブチルアンモニウム水酸化物にて処理して、最少容積に減少させ、凍結乾燥する。このようにして単離したＮ−硫酸Ｋ５のアンモニウム塩を、極性の非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド）中に懸濁化させ、Ｏ−硫酸化剤にて、例えば、付加物C5H5N・SO3にて処理する。付加物C5H5N・SO3は、固体状態で又は同じ極性の非プロトン性溶媒溶液として使用される。硫酸化は、室温（２０〜３０℃）〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃で変動する温度において、２〜２４時間の時間で行われる。
反応の終了時、室温の溶液を、沈澱が完了するまで、塩化ナトリウム飽和アセトンにて処理する。濾過によって、沈殿物を溶媒から分離し、少量（例えば、100ml）の脱イオン水に溶解し、０.２Ｍの濃度となるまで、溶液に塩化ナトリウムを添加する。溶液を、２Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨ７.５〜８とし、沈澱が完了するまで、アセトンにて処理する。濾過後、固体を脱イオン水100mlに溶解し、工程(ｂ)において記載したように、限外濾過によって残留塩から精製する。
このようにして得られた生成物の凍結乾燥サンプルの13C-NMRによる分析から、過硫酸化の間に部分的なＮ−脱硫酸化が生じていることが判明した場合には、生成物を工程(ｄ)に供する。
工程(ｄ)では、Ｎ−硫酸化が完了するまで、工程(ｃ)の終了時に得られた生成物を、工程(ｂ)の条件下で操作することによってＮ−硫酸化剤にて処理し、Ｎ−硫酸化が完全でない場合には、操作を繰り返し行う。
このようにして得られたＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５をナトリウム塩として単離する。この塩は、公知の方法を使用して、例えば、好適な樹脂によるイオン交換によって、溶媒による沈澱によって、又は膜による限外濾過によって、他の塩、例えば、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛の塩又は複合塩に変換される。
【００２８】
その態様の他の形態によれば、本発明は、実質的に親油性物質フリーの発酵からの純粋なＫ５を提供する。
【００２９】
新規な発酵からの精製Ｋ５の純度は、1H-NMRスペクトル、ＵＶスペクトル、カルバゾール反応又はタンパク質測定用キットによって検定される。これらの検定によって、工程(ａ)の終了時に得られたＫ５は、本質的な特性として、１.５ppm以下の領域においてシグナルが不在である1H-NMRスペクトルを有することが示された。さらに、核酸は検知不能であり（標準ＵＶ分光光度計にて測定して、260nmにおける吸収０）、タンパク質は、BioRadキットに従って、０.５％以下、有利には0.25％以下、さらに有利には０.１％以下、好ましくは0.03％以下である。
【００３０】
事実、工程(ａ)の終了時に得られた純粋なＫ５は、親油性物質及び核酸を含有していない。親油性物質の不在に関連する用語「実質的」の使用及び核酸に関連する用語「検知不能」の使用は、使用した機器（前記不純物の存在を示さなかった）の感度を考慮するものである。
【００３１】
このように、このようにして得られた純粋なＫ５多糖の1H-NMRスペクトルは、親油性物質のメチル基の特性である＜１.５ppmにおけるシグナルが欠けていることが証明された。
【００３２】
このように精製した新規なＫ５化合物（高硫酸化度をもつＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５の調製を可能にする）は、好ましくは低分子量を有し、特に、約1,500〜約15,000、好ましくは約2,000〜約9,000の分布、約5,000の平均分子量をもつか、又はより高い分子量を有し、約10,000〜約50,000、好ましくは約20,000〜約40,000の分布、約30,000の平均分子量をもつ。好ましくは、Ｋ５原料物質は、約1,500から約50,000の分子量分布、20,000〜25,000の平均分子量を有する。
【００３３】
その態様の他の形態によれば、本発明は、３.２以上の硫酸化度を有する新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５化合物及びその塩を提供する。有利には、新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖は、３.２〜４、さらに有利には３.５〜４、好ましくは３.７〜４を有する。好ましくは、新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５の塩は薬学上許容されるものである。
【００３４】
有利には、上記Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５は、低分子量を有し、特に、約2,000〜約16,000、好ましくは約2,500〜約10,000の分布、約6,500の平均分子量をもつか、又は多少高い分子量を有し、約13,000〜約65,000、好ましくは約25,000〜約50,000の分布、約40,000の平均分子量をもつ。好ましくは、本発明のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５は、約2,000から約65,000の分子量分布、25,000〜30,000の平均分子量を有する。また、解重合によって得られる非常に低い平均分子量、例えば、約2,000〜5,000を有するＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５化合物も、非常に興味深い生成物を構成する。
【００３５】
2,000〜5,000の平均分子量をもつＮＯ−過硫酸化Ｋ５の調製を可能にする解重合は、上述の方法の工程(ｂ)〜(ｄ)の１つの終了時、好ましくは工程(ｃ)の終了時、又は最終のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５について実施される。
【００３６】
解重合は、ヘパリンの解重合に関する公知の方法の１つに従って、例えば、亜硝酸によって及び続いてナトリウムボロヒドリッドでの還元を行って（ヨーロッパ特許第37,319号）、過ヨウ素酸塩によって（ヨーロッパ特許第287,477号）、フリーラジカルによって（ヨーロッパ特許第121,067号）、又はβ−除去によって（ヨーロッパ特許第40,144号）行われる。好適な具体例によれば、解重合は、工程(ｂ)の終了時に得られたＮ−硫酸Ｋ５について、ヨーロッパ特許第544,592号に詳述されているように、亜硝酸によって及び続いてナトリウムボロヒドリッドでの還元を行うことによって実施される。解重合及び還元の終了時、このようにして得られた低分子量生成物を、工程(ｃ)及び任意に工程(ｄ)に供し、Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を単離する。
【００３７】
別法として、同じ解重合及び還元方法を、高分子量をもつＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５にも適用することができ、簡単に、相当する低分子量生成物が得られる。
【００３８】
上記Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５化合物の塩の中でも、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム及び亜鉛の塩が好適である。
【００３９】
他の態様によれば、本発明は、(ａ)高濃度塩水溶液中において、発酵からのＫ５をイソプロパノールにて処理し；(ｂ)このようにして得られたＫ５を、アルカリ加水分解によるＮ−脱アセチル化、及び続くＮ−硫酸化剤での処理によるＮ−硫酸化に供し；(ｃ)このようにして得られたＮ−硫酸Ｋ５のアンモニウム塩を、Ｏ−過硫酸化条件下、Ｏ−硫酸化剤にて処理し；及び(ｄ)必要であれば、このようにして得られた化合物をＮ−硫酸化に供し、ナトリウム塩形のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を単離し、必要であれば、これを他の塩に変換することを包含する方法によって得られる、３.２以上、特に３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.７〜４の硫酸化度を有する新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖を提供する。
【００４０】
上記方法によって得られるＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５は、３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.７〜４の硫酸化度を有する。本発明の方法に従って得られた新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５化合物、特にその塩は、化粧品工業では、脱け毛に対する補助薬として、及び医薬品工業では、フリーラジカルを補足できる生成物として有用な高度にアニオン性の生成物である。
【００４１】
前記Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５化合物は、グルコサミン単位の６−Ｏ−位及び２−ＮＨ−位において完全に硫酸化され、一方、グルクロン酸単位では、２,３−Ｏ−二硫酸化又は（２−Ｏ−又は３−Ｏ−）モノ硫酸化され、グルクロン酸単位における硫酸基の割合は硫酸化度に左右される。
【００４２】
このように、本発明の他の目的は、鎖の混合物で構成され、前記鎖の少なくとも９０％が下記の式(Ｉ)で表される新規なＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５を提供することにある。
【００４３】
式(Ｉ)
【化１】
2004529227.tif 000003
（ここで、ｎは３〜100であり；Ｒ及びＲ'は水素又SO3-であって、Ｒ及びＲ'の少なくとも１つは水素以外であり、ただし、ｎ単位の６０〜100％において、Ｒ及びＲ'は共にSO3-であり、ｎ単位の０〜４０％において、Ｒ及びＲ'の一方は水素であって、他はSO3-であり；硫酸化度は３.２〜４であり、及び対応するカチオンは化学的又は薬学上許容されるものである。）
【００４４】
この明細書において、「化学的に許容される」との表現は、見込まれるさらなる合成に有用なカチオン（例えば、アンモニウム又は（Ｃ1〜Ｃ4）トリアルキルアンモニウムイオン）又は生成物の精製に有用なカチオン（好適なカチオンは、上記のナトリウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム及び亜鉛のイオンである）に関する。
【００４５】
前記の鎖の混合物における残りの１０％未満の鎖において、特定の硫酸化度について、グルコサミン単位の特定量のSO3-基は、２位から分割されて、前記グルコサミン単位の３−ＯＨ基に移動されていてもよい。
【００４６】
アニオン含量が高いことにより、本発明のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖は、フリーラジカルに対する良好な活性が付与されている。また、その低毒性のため、本発明のＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖は、医薬組成物及び化粧品組成物を調製するための有用な活性成分である。
【００４７】
このように、本発明は、活性成分として、薬理的に活性な量の、３.２以上、有利には３.２〜４、さらに有利には３.５〜４、好ましくは３.７〜４の硫酸化度を有するＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５多糖又はその薬学上許容される塩を、製薬上の賦形剤との混合物として含有する医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明による経口、皮下、静脈内、筋肉内、経皮又は局所投与用の医薬組成物では、活性成分は、好ましくは容量単位で、伝統的な製薬上のキャリヤー又はビヒクルとの混合剤として投与される。
【００４９】
用量は、患者の年齢、体重及び健康状態を関数として変動する。この用法は、１日当たり１〜３回、静脈、皮下、経口、筋肉内、経皮又は局所ルートによる薬用量１〜1,000mg、有利には１０〜750mg、好ましくは250〜500mgの投与を含む。
【００５０】
その態様の他の形態によれば、本発明は、その活性成分の１つとして、３.２以上、有利には３.２〜４、さらに有利には３.５〜４、好ましくは３.７〜４の硫酸化度を有するＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５、又はその薬学上許容される塩の１つを、化粧品の賦形剤との混合物として含有する化粧品組成物に関する。
【００５１】
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム及び亜鉛の塩でなる群から選ばれる塩は、本発明の組成物の有効な活性成分を構成する。
【００５２】
最後に、他の態様によれば、本発明は、活性成分として、本発明の新規な精製Ｋ５を含有する医薬組成物及び化粧品組成物も提供する。
【００５３】
調製例１
エシェリキア・コリからのＫ５多糖の調製
初めに、下記の培地を使用して、フラスコ内での発酵を行う。
2004529227.tif 000004
【００５４】
培地を120℃において２０分間殺菌処理する。別に、グルコースを溶液として調製し、これを120℃において３０分間殺菌処理し、殺菌条件下で培地に添加する。フラスコに、Tryptic soy agarの斜面培地からエシェリキア・コリの細胞Bi 8337/41（O10:K5:H4）の懸濁物を接種し、制御した撹拌下（160rpm、ラン６cm）、３７℃において２４時間培養する。その後の工程では、上記と同じ培地を収容するChemap-Braun発酵装置（容積１４Ｌ）に、上記フラスコ培養物０.１％を接種し、発酵を、通気１vvm（vvm＝分当たり、液体の容積当たりの空気の容積）、撹拌速度400rpm及び温度３７℃において１８時間行った。発酵の間に、ｐＨ、酸素、残留グルコース、生成したＫ５多糖及び細菌の成長を測定する。発酵の終了時、温度を８０℃に１０分間上昇させる。10,000rpmでの遠心分離によって細胞を培地から分離し、上澄みを、公称カットオフ800〜10,000Ｄをもつ膜を具備するSS 316（MST）モジュールを介して限外濾過して、容積を１／５に減ずる。ついで、Ｋ５多糖を、４℃のアセトン４容を添加することによって沈殿させ、４℃において一夜静置し、最後に、10,000rpmにおいて２０分間遠心分離するか、又は濾過する。ついで、除タンパク質処理を、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus orizae）からのタイプIIのプロテアーゼを使用して、０.５％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)(１０mg/濾液L）を含有するｐＨ８の０.１Ｍ NaCl及び0.15Ｍエチレンジアミン四酢酸（EDTA）中、３７℃において、９０分間で行う。10,000Ｄの公称カットオフ膜を具備するSS 316モジュールにおいて、溶液を限外濾過し、１Ｍ NaClで２回抽出処理し、限外濾液において吸収が消失するまで水で洗浄する。ついで、Ｋ５多糖をアセトンにて沈殿させ、850mg／発酵装置１Ｌの収率が達成される。多糖の純度を、ウロン酸測定（カルバゾール法）、プロトン及び炭素NMR、ＵＶ及びタンパク質含量によって測定する。純度は８０％以上である。このようにして得られる多糖は、異なる分子量、それぞれ、30,000及び5,000Ｄ（75 HR Pharmaciaカラムを使用するHPLCから得られる）をもつ２つのフラクション及び直列の２個のBio-sil SEC 250（BioRad）カラム及び移動相としてNa2SO4を使用し、室温において、流速０.５ml/分で測定して保持時間約９分をもつ１つのシングルフラクションでなる。測定を、既知の分子量をもつヘパリンを使用して得られた曲線に対して実施する。
【００５５】
このようにして得られた精製Ｋ５の1H-NMRを図１に示す。
【００５６】
図から理解されるように、１.５ppm以下の領域には、親油性物質のメチル基に帰属する多数のシグナルが存在する。
【実施例１】
【００５７】
Ｋ５の精製
４℃に維持した４Ｍ塩化ナトリウム水溶液100 mlに、上記調製例Ｉの終了時に得られたＫ５ ５ｇを溶解し、このようにして得られた溶液に、冷たいイソプロパノール１容を添加する。溶液の塩濃度を、算定量の塩化ナトリウム飽和溶液を添加することによって３Ｍとし、冷却した溶液を、冷たい温度（約４℃）に一夜維持する。生成した沈澱を、10,000rpmにおける２０分間の遠心分離によって分離し、生成物の純度を、一夜の透析、及び続く1H-NMR分析（分析結果として、１.５ppm以下の領域におけるシグナルは不在でなければならない）によって制御する。必要であれば、４Ｍ NaClを含有する水中への溶解及びイソプロパノールでの沈澱の操作を繰り返し行う。沈殿物を水に溶解し、10,000ＤカットオフをもつMiniplate膜 Milipore上において、塩が消失するまで限外濾過を行う。純度少なくとも９９％を有し、その1H-NMRスペクトルが図２に示すものであるＫ５が得られた。
【００５８】
図から理解されるように、１.５ppm以下の領域には、痕跡量の親油性不純物も存在しない。
【００５９】
BioRadキットを使用することによって算定したタンパク質含量は0.02％であり、核酸は検知不能であった（260nmにおける吸収０）。
【実施例２】
【００６０】
Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５の調製
(ｉ)Ｎ−脱アセチル化
実施例１に記載のごとくして調製した純粋なＫ５ １０ｇを、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液1,000 mlに溶解し、このようにして調製した溶液を、６０℃に２４時間維持する。溶液を室温とし、ついで、６Ｎ塩酸にて中性ｐＨとする。
【００６１】
(ii)Ｎ−硫酸化
脱アセチル化したＫ５を含有する溶液を４０℃に維持し、この溶液に、炭酸ナトリウム１６ｇ、ついで、ピリジン・三酸化イオウ１６ｇを４時間で添加する。反応終了時（２４時間後）、溶液を室温とし、ついで、５％塩酸溶液にてｐＨ７.５〜８とした。1,000Ｄのスパイラル膜（Prepscal Cartridge, Milipore）を使用するダイアフィルトレーションによって、生成物を塩から精製する。透過物の伝導度が1,000μS以下、好ましくは100μS以下となった時点で、操作を終了する。濃縮において同じ透析システムを使用して、多糖の濃度が１０％となるまで内方透析（intradialysis）を低減する。濃縮した溶液を凍結乾燥する。13C-NMRの分析では、Ｎ−アセチル又はＮＨ2残基を示さない
【００６２】
(iii)Ｏ−過硫酸化
工程(ii)の終了時に得られた凍結乾燥生成物を、脱イオン水100 mlに溶解し、冷却浴にて溶液を１０℃とし、ついで、カチオン交換樹脂ＩＲ 120 Ｈ+（100 ml）上を通過させる。カラム及びリザーバーの両方を１０℃に維持する。サンプルを含有する溶液を通過させた後、樹脂を、透過液のｐＨが６以上となるまで脱イオン水にて洗浄する（脱イオン水約３容）。酸性溶液を、水酸化テトラブチルアンモニウム（１５％水溶液）にて中性（ｐＨ７）とし、ついで、最少容積に減少させ、凍結乾燥する。テトラブチルアンモニウム塩をジメチルホルムアミド400 mlに溶解し、これに、固状のC5H5N・SO3３５ｇを添加する。溶液を５０℃に２４時間維持する。反応終了時、溶液を室温に冷却し、これに塩化ナトリウム飽和アセトン３容を添加し、沈澱が完了するまで（１２時間）４℃に冷却する。濾過によって、沈殿物を溶媒から分離し、最少量の脱イオン水（約100 ml）にて溶解し、濃度が０.２Ｍとなるまで、溶液に塩化ナトリウムを添加する。
【００６３】
２Ｎ水酸化ナトリウム溶液にて、溶液をｐＨ７.５〜８とし、沈澱が完了するまで、アセトン２容にて処理する。濾過によって、沈殿物を溶媒から分離する。得られた固体を、脱イオン水100 mlにて溶解し、工程(ii)において記載したように、1,000Ｄのスパイラル膜（Prepscale Cartridge, Milipore）を使用する限外濾過によって残留塩から精製する。
【００６４】
(iv)Ｎ−硫酸化
このようにして得られたＯ−硫酸化生成物を含有する溶液を、Ｎ−硫酸化に関する工程(ii)において既に記載したように処理する。生成物は、平均分子量15,000Ｄ及び硫酸基／カルボキシル基比3.84を示す。硫酸基の分布は、13C-NMRによって測定して、次のとおりである：構成二糖のグルコサミン単位は100％Ｎ−硫酸化及び６−Ｏ−硫酸化され、一方、グルクロン酸単位については、３０％がモノ硫酸化され、７０％が二硫酸化されている。
【実施例３】
【００６５】
Ｎ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５の調製
原料物質として、M. Manzoniら（1996）によって開示されたようにして得られかつ特性表示されたＫ５を使用する。このようにして調製したＫ５を、実施例１に記載のように精製したところ、１.５ppm以下においてシグナルが不在であり、核酸を含有せず、タンパク質含量０.５％をもつ純粋なＫ５が得られる。実施例２に記載したように操作することによって、平均分子量13,000及び硫酸基／カルボキシル基比3.54を有するＮ,Ｏ−過硫酸化Ｋ５が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】純度８０％をもつ発酵から得られたＫ５の1H-NMRスペクトルを示す。
【図２】純度＞９９％をもつ発酵から得られた親油性物質フリーのＫ５の1H-NMRスペクトルを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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