(57)【要約】本発明は、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター、および遺伝子治療の方法におけるその使用に関する。アデノウイルス核酸骨格を含む組み換えウイルスベクターが提供される。ここで、この核酸骨格は、順番に以下を含む：左側のＩＴＲ、終結シグナル配列、この組み換えウイルスベクターの複製に必須の遺伝子に作動可能に連結されるＥ２Ｆ応答性プロモーター、アデノウイルスパッケージングシグナル、および右側のＩＴＲ。
2004529627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルス核酸骨格を含む組み換えウイルスベクターであって、ここで該核酸骨格は、順番に以下：左側のＩＴＲ、終結シグナル配列、該組み換えウイルスベクターの複製に必須の遺伝子に作動可能に連結されるＥ２Ｆ応答性プロモーター、アデノウイルスパッケージングシグナル、および右側のＩＴＲ、を含む、該組み換えウイルスベクター。
【請求項２】
前記終結シグナル配列が、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列である、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３】
前記Ｅ２Ｆ応答性プロモーターがヒトＥ２Ｆ−１プロモーターである、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項４】
前記アデノウイルス核酸骨格が、アデノウイルスの血清型５型（Ａｄ５）または血清型３５型（Ａｄ３５）に由来する、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項５】
複製に必須の前記遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子である、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項６】
終結シグナル配列の上流に欠失をさらに含む、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項７】
アデノウイルス５型骨格のヌクレオチド１０３と５５１との間の欠失、または他のアデノウイルス血清型の他の対応するｂｐｓの間の欠失をさらに含む、請求項６に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項８】
Ｅ３領域中に変異または欠失をさらに含む、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項９】
Ｅ４に対して作動可能に連結された組織特異的プロモーターをさらに含む、請求項５に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１０】
前記組織特異的プロモーターが、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターに由来する、請求項９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１１】
前記組織特異的プロモーターが、配列番号９４のＴｒｔｅｘプロモーター、または配列番号９３のＴＥＲＴプロモーターである、請求項９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１２】
Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘベクターである、請求項９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１３】
前記組織特異的プロモーターが、オステオカルシンプロモーター由来である、請求項９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１４】
前記Ｅ３領域が前記骨格から欠失されている、請求項８に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１５】
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクター、またはＡｒ３５Ｅ２ＦＥ１ａベクターである、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１６】
Ｅ１ｂ遺伝子中に変異または欠失をさらに含む、請求項１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１７】
前記変異または欠失が、野生型Ｅ１ｂ遺伝子によって発現される活性１９ｋＤタンパク質の損失を生じる、請求項１６に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１８】
治療用遺伝子をさらに含む、請求項１〜１７に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項１９】
前記治療用遺伝子が、Ｅ３領域に挿入される、請求項１８に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２０】
前記治療用遺伝子が、１９ｋＤまたは１４．７ｋＤのＥ３遺伝子の代わりに挿入される、請求項１９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２１】
前記治療用遺伝子が、免疫刺激遺伝子である、請求項１８に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２２】
前記免疫刺激遺伝子が、サイトカインである、請求項２１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２３】
前記免疫刺激遺伝子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびｆｌｔ３からなる群より選択される、請求項２１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２４】
前記免疫刺激遺伝子が、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ３α、ＣＣＲ７リガンド、カルレティキュリン、Ｂ７、ＣＤ２８、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、およびＴＡＰからなる群より選択される、請求項２１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２５】
前記免疫刺激遺伝子が、腫瘍関連抗原である、請求項２１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２６】
前記腫瘍関連抗原が、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００（ｐｍｅｌ−１７）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、チロシナーゼ関連タンパク質２、メラニン細胞刺激ホルモンレセプター、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ８、ＫＩＡ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２Ｒ１７０１、α−フェトプロテイン、テロメラーゼ触媒性タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、癌胎児性タンパク質、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴからなる群より選択される、請求項２５に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２７】
前記免疫刺激遺伝子が、阻害性シグナルをブロックする抗体である、請求項２１に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２８】
前記阻害性シグナルが、ＣＴＬＡ４の発現に起因する、請求項２７に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項２９】
前記治療遺伝子が、血管新生阻害遺伝子である、請求項１８に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３０】
前記血管新生阻害遺伝子が、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、アンギオポエチン／Ｔｉｅアンタゴニスト、Ｅｐｈｒｉｎ／Ｅｐｈアンタゴニスト、およびＦＧＦ／ＦＧＦＲアンタゴニストからなる群より選択される、請求項２９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３１】
前記血管新生阻害遺伝子が、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、またはＩＧＦ−１のインヒビターである、請求項２９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３２】
前記血管新生阻害遺伝子が、細胞外マトリックスタンパク質のフラグメントである、請求項２９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３３】
前記細胞外マトリックスタンパク質が、アンギオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲンＥ、トロンボスポンジン、タムスタチン、カンスタチン、およびレスチンからなる群より選択される、請求項３２に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３４】
前記血管新生阻害遺伝子が、ＴｒｐＲＳのフラグメントである、請求項２９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３５】
前記血管新生阻害遺伝子が、ｓＦｌｔ−１、ｓＦｌｋ、ｓＮＲＰ１、ｓＴｉｅ−２、ＩＰ−１０、ＰＦ−４，Ｇｒｏ−β、ＩＦＮ−γ（Ｍｉｇ）、ｓＥｐｈＢ４、セフリンＢ２、バソスタチン、ＰＥＤＦ、プロラクチンフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、ＭＥＴＨ−１、およびＭＥＴＨ−２からなる群より選択される、請求項２９に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３６】
前記治療用遺伝子が、自殺遺伝子である、請求項１８に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３７】
前記自殺遺伝子が、ＣＰＧ２、ＣＡ、ＣＤ、ｃｙｔ−４５０、ｄＣＫ、ＨＳＶ−ＴＫ、ＮＲ、ＰＮＰ、ＴＰ、ＶＺＶ−ＴＫ、およびＸＧＰＲＴからなる群より選択される、請求項３６に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３８】
前記組み換えウイルスベクターが、Ｒｂ経路欠損細胞中において選択的に複製し得、かつ該細胞を溶解し得る、請求項１〜３７に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項３９】
Ｅ１Ａ  ＲＮＡレベルによって測定される場合、腫瘍選択性が、非腫瘍細胞に対して、感染した腫瘍においては、少なくとも約３倍である、請求項３８に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項４０】
Ａｄ５核酸骨格を含む組み換えウイルスベクターであって、ここで該骨格は、順番に以下を含む、組み換えウイルスベクター：左側のＩＴＲ、ＳＶ４０初期ポリＡ部位、Ｅ１Ａ遺伝子に作動可能に連結されたヒトＥ２Ｆ−１プロモーター、アデノウイルスパッケージングシグナル、および右側のＩＴＲ。
【請求項４１】
アデノウイルス骨格のヌクレオチド１０３と５５１との間に欠失をさらに含む、請求項４０に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項４２】
請求項４０に記載の組み換えウイルスベクターであって、Ｅ１ｂ遺伝子中に変異または欠失をさらに含み、ここで該変異または欠失が、野生型Ｅ１ｂ遺伝子によって発現される活性１９ｋＤタンパク質の損失を生じる、組み換えウイルスベクター。
【請求項４３】
Ｅ４に対して作動可能に連結された組織特異的プロモーターをさらに含む、請求項４０に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項４４】
前記組織特異的プロモーターが、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターに由来する、請求項４３に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項４５】
前記組織特異的プロモーターが、Ｔｒｔｅｘプロモーターである、請求項４３に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項４６】
Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘベクターである、請求項４３に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項４７】
前記組織特異的プロモーターが、オステオカルシンプロモーター由来である、請求項４３に記載の組み換えウイルスベクター。
【請求項４８】
請求項１〜４７に記載のウイルスベクターを含む、アデノウイルスベクター粒子。
【請求項４９】
前記粒子のキャプシドタンパク質に含まれる標的化リガンドをさらに含む、請求項４８に記載のアデノウイルスベクター粒子。
【請求項５０】
前記キャプシドタンパク質がファイバータンパク質である、請求項４９に記載の粒子。
【請求項５１】
前記リガンドが、前記ファイバータンパク質のＨＩループ中にある、請求項５０に記載の粒子。
【請求項５２】
細胞集団中の新生細胞を選択的に殺傷する方法であって、該方法は、請求項４８〜５１に記載のアデノウイルスベクター粒子の有効量と該細胞集団とを、該組み換えウイルスベクターが該細胞集団の細胞を形質導入し得る条件下で接触させる工程を包含する方法。
【請求項５３】
前記新生細胞がＲｂ経路に欠損を有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項４８〜５１に記載のアデノウイルスベクター粒子、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項５５】
新生物状態を有する宿主生物体を処置する方法であって、請求項５４に記載の組成物の治療上有効な量を該宿主生物体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５６】
前記宿主生物体がヒト患者である、請求項５５に記載の処置の方法。
【請求項５７】
前記新生物状態が、肺癌、乳癌、前立腺癌、または結腸癌である、請求項５５に記載の処置の方法。
【請求項５８】
前記骨格が、Ｅ３コード領域の遺伝子を含む、請求項１〜４２に記載のベクター。
【請求項５９】
前記遺伝子が、Ｅ３−６．７ＫＤａ、ｇｐ１９ＫＤａ、１１．６ＫＤａ（ＡＤＰ）、１０．４ＫＤａ（ＲＩＤα）、１４．５ＫＤａ（ＲＩＤβ）、およびＥ３−１４．７Ｋｄａからなる群より選択される、請求項５８に記載のベクター。
【請求項６０】
請求項５５に記載の処置の方法であって、ここで投与が、請求項５４に記載の組成物の治療上有効な量の腫瘍内注射である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年２月２３日出願、米国特許第６０／２７０，９２２号；２００１年６月１日出願、米国特許出願第６０／２９５，０３７号；および２００２年１月１４日出願、米国特許出願第６０／３４８，６７０号（それらは、本明細書において参考として援用される）の利益を請求する。
【０００２】
本発明は該して、腫瘍性疾患の処置に有用な物質および方法に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター、および遺伝子治療の方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍細胞において選択的に複製するアデノウイルスは、抗癌剤として（「腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」）開発されている。このような腫瘍崩壊性ベクターは、腫瘍中におけるウイルス複製に起因して、入ったウイルスの量を増幅し、この腫瘍塊全体へのこのウイルスの伝播をもたらす。アデノウイルスのインサイチュの複製は、細胞溶解を導く。このインサイチュの複製によって、比核的低い非毒性の用量が、腫瘍細胞の選択的排除に非常に有効であることが可能になり得る。
【０００４】
選択性を達成するための１つのアプローチは、非標的細胞における増殖には必須であるが、腫瘍細胞においては必須でない、ウイルス遺伝子における機能喪失性の変異を誘導することである。この戦略は、Ｅ１ｂ−５５ｋＤ遺伝子において欠失を有する、Ａｄｄ／１５２０の使用によって、例証される。正常細胞において、このアデノウイルスＥ１ｂ−５５ｋＤタンパク質は、アポトーシスを防止するためにｐ５３に結合される必要がある。ｐ５３欠損腫瘍細胞において、ｐ５３に結合するＥ１ｂ−５５Ｋは、不必要である。従って、Ｅ１ｂ−５５ｋＤの欠失は理論的には、ベクター複製を、ｐ５３欠損腫瘍細胞に対して限定するはずである。
【０００５】
別のアプローチは、複製に必要な初期ウイルス遺伝子の発現を制御するための腫瘍選択性プロモーターの使用である（米国特許第５，９９８，２０５号（Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋら、１９９９））。従って、このアプローチにおいては、アデノウイルスベクターは、複製に必須である遺伝子が、プロモーターまたは他の転写調節エレメント（腫瘍特異的である）の制御下で排他的である場合、特異的に複製し、かつ腫瘍細胞を溶解する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腫瘍性疾患の処置のための新規な腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを提供することが本発明の目的である。このベクターは、宿主生物体に投与された場合、高い程度の腫瘍選択性、治療効率、および安全性を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、新規な、かつ改良された腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター、および遺伝子治療の方法におけるそれらのアデノウイルスベクターの用途を提供する。好ましい実施形態において、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ遺伝子に作動可能（機能的に：operably）に連結されたＥ２Ｆプロモーターを有する。特に好ましい実施形態において、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ遺伝子に作動可能に連結されたＥ２Ｆプロモーター、およびＥ４遺伝子に作動可能に連結されたヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターを有する。
【０００８】
従って、１つの局面において、本発明は、アデノウイルス核酸骨格を含む組み換えウイルスベクターを提供する。ここでこの核酸骨格は、以下を順番に含む：左側ＩＴＲ、終結シグナル配列、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（これは、組み換えウイルスベクターの複製に必須の第一遺伝子に作動可能に連結される）、アデノウイルスパッケージングシグナル、および右側ＩＴＲ。
【０００９】
第二の局面において、本発明は、アデノウイルス核酸骨格を含む組み換えウイルスベクターを提供する。ここでこの核酸骨格は、以下を順番に含む：左側ＩＴＲ、終結シグナル配列、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（これは、組み換えウイルスベクターの複製に必須の第一遺伝子に作動可能に連結される）、複製に必須の第二の遺伝子に作動可能に連結されたテロメラーゼプロモーター、アデノウイルスパッケージングシグナル、および右側ＩＴＲ。
【００１０】
別の局面において、本発明は、これらのベクターを含むアデノウイルス粒子を提供する。好ましくは、この粒子はさらに、この粒子のキャプシドタンパク質に含まれる標的化リガンドを含む。
【００１１】
別の局面において、アデノウイルス粒子は、少なくとも１つの治療用導入遺伝子を運ぶ。好ましくは、この粒子は、腫瘍細胞に対する全身性免疫応答を刺激し得るサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００１２】
別の局面において、細胞集団において新生細胞を選択的に殺傷する方法が提供される。この方法は、本発明の組み換えウイルスベクターの適切な量を、この組み換えウイルスベクターが、この細胞集団の細胞を形質導入（transduce）し得る条件下で、この細胞集団と接触させる工程を包含する。
【００１３】
さらなる局面において、本発明の組み換えウイルスベクター、および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００１４】
なお別の局面において、新生物状態(neoplastic condition)を有する宿主生物体を処置する方法が提供される。この方法は、本発明の組成物の治療上有効な量をこの宿主生物体に投与する工程を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋらに対して、１９９９年１２月７日に発行された米国特許第５，９９８，２０５号（その開示は、その全体が参考として本明細書において援用される）に記載される腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターの戦略に基づく新規なウイルスベクターを提供する。詳細には、複製に必須であるアデノウイルス遺伝子の発現が、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（ガン細胞において選択的にトランス活性化される）によって制御される、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターが開示されている。Ｅ２Ｆ−応答性プロモーターの例は、１９９８年４月２日公開、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１３５０８に開示される。
【００１６】
理論によって束縛されないが、本発明者らは、作用機序は以下のとおりであると考えている。Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（本明細書において以降では、時に、Ｅ２Ｆプロモーターと呼ぶ）の選択性は、Ｒｂ経路欠損性腫瘍細胞におけるＥ２Ｆプロモーター／トランス活性化因子の抑制に基づく。静止期の細胞では、Ｅ２Ｆは、３つの複合体中の腫瘍サプレッサータンパク質ｐＲＢに結合する。その複合型において、Ｅ２Ｆは、Ｅ２Ｆ結合部位を有するプロモーター（これは、Ｅ２Ｆ−１プロモーター自体を含む）からの転写活性を抑制するように機能する（Ｚｗｉｃｋｅｒ  Ｊ，およびＭｕｌｌｅｒ  Ｒ．Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｍ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｇ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅｓ  １９９５；１：９１〜９９）。従って、Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、休止期の細胞では、転写的に不活性である。正常な周期中の細胞では、ｐＲＢ−Ｅ２Ｆ複合体は、調節された様式で解離され、これによって、Ｅ２Ｆの制御された抑制、および引き続く細胞周期が可能になる（Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ２Ｆ  ｂｙ  ｐＲＢ−ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９８；１２：２２４５〜２２６２）。
【００１７】
大部分のタイプの腫瘍では、Ｒｂ細胞周期調節経路が、破壊されており、このことは、Ｒｂ経路の調節解除が、腫瘍形成にとって必須であることを示唆する（Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｍ，Ｌｕｋａｓｓ  Ｊ、およびＢａｒｔｅｋ  Ｊ．Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９５；１２：１２４５〜１２４６）。これらの変異は、Ｒｂ自体に、またはｐＲＢの上流調節因子に対して影響を有する他の因子（例えば、サイクリン依存性キナーゼｐ１６）にあり得る（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＲＡ．Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９９５；８１：３２３〜３３０）。これらの変異の結果の１つは、Ｅ２Ｆ−ｐＲＢ結合の崩壊、および腫瘍細胞における遊離のＥ２Ｆの増大である。遊離のＥ２Ｆが豊富になれば、次に、腫瘍細胞においてＥ２Ｆ反応性遺伝子の高レベルの発現が生じ、これによって腫瘍細胞はＳ期に進む。ここで用いたＥ２Ｆ−１プロモーターは、げっ歯類の腫瘍モデルにおいてアデノウイルスベクター中のマーカー遺伝子の発現を上方制御するが、インビボにおいて正常な増殖中の細胞においてはそうしないことが示されている（Ｐａｒｒ  ＭＪら、Ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  Ｅ２Ｆ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １９９７；Ｏｃｔ；３（１０）：１１４５〜１１４９）。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、ここで、アデノウイルス核酸骨格を含む組み換えウイルスベクターを提供する。ここでは、この核酸骨格は、以下を順番に含む：左側ＩＴＲ、終結シグナル配列、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（これは、組み換えウイルスベクターの複製に必須の第一遺伝子に作動可能に連結される）、アデノウイルスパッケージングシグナル、および右側ＩＴＲ。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ここで、アデノウイルス核酸骨格を含む組み換えウイルスベクターを提供する。ここでこの核酸骨格は、以下を順番に含む：左側ＩＴＲ、終結シグナル配列、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（これは、組み換えウイルスベクターの複製に必須の第一遺伝子に作動可能に連結される）、複製に必須の第二の遺伝子に作動可能に連結されたテロメラーゼプロモーター、アデノウイルスパッケージングシグナル、および右側ＩＴＲ。
【００２０】
本発明の組み換えウイルスベクターは、ガンの治療のための治療薬として有用である。詳細には、本発明のベクターは、Ｒｂ経路において欠損のない細胞に比べた場合、Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞を優先的に殺傷する。さらに、このようなベクターは、処置されるべき状態に臨床的に受容可能である、好ましい毒性プロフィールを示す。理論的な考察によって限定されることを望まないが、Ｅ２プロモーターによるウイルス複製の特定の調節（これは、上流の終結シグナル配列によって、リードスルー転写から、好ましくは遮断される）によって、そのウイルスが非標的組織において複製される場合に生じる毒性が回避され、好適な有効性／毒性のプロフィールが可能になる。好ましくは、Ｅ２Ｆプロモーターによるウイルス複製の調節の特異性はさらに、本発明のベクターにおいて増強され得る。この理由は、複製に必須のＥ２Ｆ連結遺伝子の下流のパッケージングシグナルの位置決めによる。この位置決めによって、Ｅ２Ｆ連結遺伝子の上流に配置され、その野生型位置にパッケージングシグナルを含む、このアデノウイルス骨格の配列を欠失させる可能性がもたらされる。このような欠失によってさらに、Ｅ２Ｆプロモーターによるウイルス複製の調節の特異性が改善される。従って、本発明のベクターにおいて使用される遺伝的エレメントの組み合わせおよび配列の位置決めによって、このベクターの治療の有効性が提供され、このとき同時に、患者の毒性および副作用が相乗作用的に最小化される。本発明の組み換えウイルスベクターはさらに、Ｅ４遺伝子に作動可能に連結されたテロメラーゼプロモーターを含み得る。
【００２１】
本発明は、全てのアデノウイルス血清型の使用を意図する。好ましい実施形態において、このアデノウイルス核酸骨格は、アデノウイルス血清型２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５），または３５（Ａｄ３５）に由来する。好ましいベクターは、Ａｄ５核酸骨格を含み、ここでこの骨格は、以下を順番に含む：左側ＩＴＲ、ＳＶ４０初期ポリＡ部位、Ｅ１Ａ遺伝子に作動可能に連結されたヒトＥ２Ｆ−１プロモーター、Ｅ４遺伝子に作動可能に連結されたテロメラーゼプロモーター、アデノウイルスパッケージングシグナル、および右側ＩＴＲ。
【００２２】
好ましいベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦである。このベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターのフラグメントを用いるアデノウイルスベクターであり、Ｅ１Ａ発現を、従って腫瘍細胞におけるアデノウイルス複製を、選択的に調節する。インビトロにおけるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの特徴づけによって、このベクターが、正常な初代細胞よりも、Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞を選択的に殺傷することが示される。同様に、このベクターは、正常な初代細胞に対して、ヒト腫瘍細胞株において優先的に複製されることが示される。インビボ研究によって、このベクターは、ＳＣＩＤマウスに静脈内投与された場合、非選択性の複製コンピテントウイルスであるＡｄｄ／３２７に対して優れた初期毒性プロフィールを有することが示される。ヌードマウスにおける皮下異種移植片モデルにおいて、さらなるインビボ研究によって、異なる腫瘍、特に肝臓および肺の腫瘍に対する有効性が示される。さらに、２つの独立したヒト異種移植片モデルにおけるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内投与によって、腫瘍の増殖および進行に対して用量依存性の効果が惹起された。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターＡｄｄ／１５２０に比べて、有効性、選択性、および安全性において利点を提供することが示される。
【００２３】
特に好ましいベクターは、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘである。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、広範なガンの指標の処置のために設計された腫瘍選択性の腫瘍崩壊性アデノウイルスである。理論によって束縛はされないが、本発明者らは、ヒトのガンにおける最も通常の２つの変更（すなわち、Ｒｂ経路の欠損（全てのガンのうち約８５％）およびテロメラーゼの過剰発現（全てのガンのうち約８５％））の存在に依存するようにＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを操作した。腫瘍内の腫瘍崩壊性アデノウイルスＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦと同様に、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、Ｅ２Ｆ−１プロモーターを利用して、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子の発現を制御する。全身送達のために適切な腫瘍選択性を増大するために、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ中のアデノウイルスＥ４遺伝子を、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）プロモーターによって制御する。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、ほとんどのガン細胞中で複製し、毒性ウイルスタンパク質の腫瘍選択的発現、細胞溶解、ならびに化学療法、サイトカイン、および細胞傷害性Ｔリンパ球に対する選択性の増強をもたらすことが期待される。
【００２４】
本明細書において用いられる場合、「ウイルスベクター」という用語は、それが当該分野で認識される意味に従って用いられる。これは、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子中にパッケージングされ得る核酸ベクター構築物をいう。このウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、ＤＮＡを細胞に移入する目的で利用され得る。
【００２５】
核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、「作動可能に連結され（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」ている。例えば、プロモーターは、それが遺伝子の転写に影響する場合、この遺伝子に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、代表的には連続的である。
【００２６】
本発明の意味に包含される終結シグナル配列は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終わらせる任意の遺伝因子（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えば、ポリアデニル化シグナル配列）であり得る。ポリアデニル化シグナル配列は、ＲＮＡ転写物のエンドヌクレアーゼ切断に必須の認識領域であり、その後ろにポリアデニル化コンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡが続く。ポリアデニル化シグナル配列は、「ポリＡ部位」、すなわち、アデニン残基が転写後のポリアデニル化によって付加される、ＲＮＡ転写物上の部位を提供する。ポリアデニル化シグナル配列は、真核生物細胞および真核生物のウイルス内の転写単位のための有用な遮断配列である。概して、ポリアデニル化シグナル配列は、コアのポリ（Ａ）シグナルを含み、これは切断−ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識エレメントからなる（図１）。代表的には、ほとんど不変のＡＡＵＡＡＡヘキサマーが、ＵまたはＧＵ残基に富む、より可変性のエレメントの２０〜５０ヌクレオチド上流に位置する。これらの２つのエレメントの間の切断は、通常、Ａ残基の３’側であり、そしてインビトロでは、大型の複数の成分のタンパク質複合体によって媒介される。適切なポリアデニル化シグナル配列の選択は、ポリアデニル化シグナル配列の強度を考慮する。なぜなら、ポリアデニル化プロセスの終了は、ポリ（Ａ）部位の強度に関係しているからである（Ｃｈａｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ，１９９９、ｐｐ５５８８〜５６００）。例えば、強力なＳＶ４０後期ポリ（Ａ）部位は、弱いＳＶ４０初期ポリ（Ａ）部位よりも迅速に切断に委ねられる。特定のベクター構築物において、非特異的な転写のより実態的な減少が、必要である場合、当業者は、より強力なポリアデニル化シグナル配列を選択することを考慮する。原則的に、本発明の目的には、任意のポリアデニル化シグナル配列が有用であり得る。しかし、本発明の好ましい実施形態において、終結シグナル配列は、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列、またはＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列のいずれかである。好ましくは、この終結シグナル配列は、その遺伝子供給源から単離されて、このウイルスベクター中へ、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターの上流の適切な位置に挿入される。
【００２７】
この終結シグナル配列は、治療効果を増大する。なぜなら、この配列は、非標的細胞内の腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターの複製および毒性を低減するからである。Ｅ１Ａコード領域の上流に挿入されたポリアデニル化シグナルを有する、本発明の腫瘍崩壊性ベクターは、改変されていない対応物よりも優れている。なぜなら、それらのベクターは、非標的細胞における最低レベルのＥ１Ａ発現を実証したからである。従って、左側のＩＴＲからの非特異的な転写を終わらせるポリアデニル化シグナル配列の挿入によって、応答性プロモーターからのＥ１Ａ発現の特異性が改善される。ポリアデニル化シグナル配列の挿入は、非標的細胞における腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターの複製を減少させ、従って毒性を減少させる。終結シグナル配列はまた、このベクター中の任意のプロモーターの前（５’）に配置されてもよい。１つの実施形態において、末端のシグナル配列は、Ｅ４遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターの前に配置される。
【００２８】
Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは、少なくとも１つのＥ２Ｆ結合部位を有する。好ましくは、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは、哺乳動物のＥ２Ｆプロモーターであり、より好ましいのは、ヒトＥ２Ｆプロモーターである。本発明の好ましい実施形態において、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターであり、特に好ましいのは、図３に記載されるような配列を有するヒトＥ２Ｆ−１プロモーターである。
【００２９】
Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは、全長の野生型プロモーターである必要はないが、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも１０倍、少なくとも３０倍、またはさらに少なくとも３００倍の腫瘍選択性を有していなければならない。腫瘍選択性は、実施例４において試用される技術のような、公知の技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、多数のアッセイによって決定され得る。好ましくは、アデノウイルスベクターの腫瘍選択性は、実施例４にさらに記載されるように、Ｅ１Ａ  ＲＮＡレベルによって定量され、そして好ましくは、Ｈ４６０細胞において得られたＥ１Ａ  ＲＮＡレベルは、ＰｒＥＣ細胞において得られたＥ１Ａ  ＲＮＡレベルと比較され、本発明の目的のための腫瘍選択性が決定される。実験の関連する条件は、実施例４に記載の条件に従うべきである。例えば、実施例４のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、２６６５／８倍（すなわち、約３３２倍）の腫瘍選択性を示す。
【００３０】
Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは代表的に、そのＥ２Ｆ部位（これは、頻繁に転写開始部位付近に配置され、そして認識可能なＴＡＴＡボックスを欠く）の近位のＳｐＩ部位、および／またはＡＴＴ７部位のような共通の特徴を共有する。Ｅ２Ｆ応答性プロモーターとしては、Ｅ２Ｆ−１プロモーターのようなＥ２Ｆプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、ＤＮＡポリメラーゼＡ（ＤＰＡ）プロモーター、ｃ−ｍｙｃプロモーター、およびＢ−ｍｙｂプロモーターが挙げられる。Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、血清枯渇細胞において転写抑制エレメントとして作用する、４つのＥ２Ｆ部位を含む。好ましくは、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは、少なくとも２つのＥ２Ｆ部位を有する。
【００３１】
理論によって束縛されないが、ガンにおける選択的なｈＴＥＲＴ発現の理解は、腫瘍形成に関与する分子基盤の現在の知識に基づく。ｈＴＥＲＴは、複数成分のリボ核タンパク質酵素であるテロメラーゼ（これはまた、ヒトのガンの約８５％では活性であるが、正常な体細胞では活性ではないことが示されている）の律速の触媒性サブユニットである（Ｋｉｌｉａｎ  Ａら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７  Ｎｏｖ；６（１２）：２０１１−９；Ｋｉｍ  ＮＷら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４  Ｄｅｃ  ２３；２６６（５１９３）：２０１１〜５；Ｓｈａｙ  ＪＷら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９７；５、７８７〜７９１；Ｓｔｅｗａｒｔ  ＳＡら、Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ｄｅｃ；１０（６）：３９９−４０６）。テロメラーゼは、テロメアのＤＮＡを合成して、細胞が老化せずに増殖できるようにする。ヒトにおいては、この活性は、生殖細胞系の細胞、幹細胞、ならびに活性化されたＢ細胞およびＴ細胞に限定され、これらの細胞が再定着するのに必要な属性によって、細胞集団は減じるかまたは、免疫応答が媒介される（Ｋｉｍ  ＮＷら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４  Ｄｅｃ  ２３；２６６（５１９３）：２０１１〜５；Ｈｉｙａｍａ  Ｋら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  Ｊｕｎ  ２１；８７（１２）：８９５〜９０２）。しかし、ほとんどの他の正常なヒト細胞は、テロメラーゼの欠失に起因して限定された寿命を有する（Ｐｏｏｌｅ  ＪＣら、Ｇｅｎｅ．２００１  Ｍａｙ  １６；２６９（１−２）：１−１２；Ｓｈａｙ  ＪＷら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００１  Ａｐｒ；１０（７）：６７７−８５）。ガン細胞は、腫瘍形成のために不死化を必要とすると考えられ、そしてテロメラーゼ活性は不死化にはほとんど常に必要である（Ｋｉｍ  ＮＷら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４  Ｄｅｃ  ２３：２６６（５１９３）：２０１１〜５；Ｋｉｙｏｎｏ  Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；３９６：８４）が、わずかな割合の腫瘍においては、テロメア長を維持するテロメラーゼに関与しない別の経路がある（Ｂｒｙａｎ  ＴＭら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９７  Ｎｏｖ；３（１１）：１２７１〜４）。興味深いことに、不死化は、Ｒｂ経路の欠損を必要とすると考えられる（Ｋｉｙｏｎｏ  Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９８：３９６：８４）。従って、ほとんどの腫瘍は、Ｒｂ経路の欠損、および調節されていないテロメラーゼの両方（２つの経路はＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘによって特異的に標的された）を有する。
【００３２】
ＴＥＲＴプロモーターという用語は、ネイティブなＴＥＲＴプロモーター、ならびにその機能的なフラグメント、変異体、および誘導体をいう。このＴＥＲＴプロモーターは、全長の野生型プロモーターである必要はない。当業者には、ＴＥＲＴプロモーターからフラグメントを誘導する方法、および所望の特異性についてそれらを試験する方法は、公知である。好ましくは、本発明のＴＥＲＴプロモーターは、哺乳動物のＴＥＲＴプロモーター、より好ましくはヒトＴＥＲＴプロモーター（ｈＴＥＲＴ）である。本発明の１つの実施形態において、このＴＥＲＴプロモーターは本質的に、ｈＴＥＲＴプロモーターの３９７フラグメントである配列番号９３からなる。本発明の好ましい実施形態において、ＴＥＲＴプロモーターは本質的に、ｈＴＥＲＴプロモーターの２４５ｂｐのフラグメントである、配列番号９４からなる。好ましい実施形態において、ＴＥＲＴプロモーターは、アデノウイルスＥ４領域に作動可能に連結される。
【００３３】
【化１】
2004529627.tif 000003
【００３４】
【化２】
2004529627.tif 000004
【００３５】
この組み換えウイルスベクターは、複製に必須の遺伝子を含む。「複製に必須の遺伝子」という用語は、核酸配列であって、その転写が、標的細胞において複製するためにベクターにとって必要である核酸配列をいう。例えば、本発明のベクター構築物が、アデノウイルスベクターである場合、複製に必須の遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１ｂ、およびＥ４をコードする配列からなる群より選択され得る。最も好ましくは、複製に必須の遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１ｂ、およびＥ４をコードする配列からなる群より選択され得る。複製に必須の遺伝子として特に好ましいのは、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子である。
【００３６】
好ましい実施形態において、この組み換えウイルスベクターはさらに、終結シグナル配列の上流の欠失を含む。好ましいのは、アデノウイルス５型骨格の１０３ヌクレオチドと５５１ヌクレオチドとの間の欠失、または他の血清型の対応する位置の欠失である。詳細には、ヌクレオチド１８９とヌクレオチド５５１との間の欠失、または他の血清型の対応する位置の欠失が好ましい。
【００３７】
終結シグナル配列に対して５’側のパッケージングシグナルにおける欠失は、このパッケージングシグナルが非機能性になるような欠失であってもよい。１つの実施形態において、この欠失は、終結シグナル配列に対して５’側の欠失を含み、ここでこの欠失は、少なくともヌクレオチド１８９〜５５１にまたがる。別の実施形態において、この欠失は、終結シグナル配列に対して５’側の欠失を含み、ここでこの欠失は、少なくともヌクレオチド１０３〜５５１にまたがる（図２）。これらの状況において、このパッケージングシグナルは、終結シグナル配列の３’側で、かつ複製に必須のＥ２Ｆ結合遺伝子の下流の位置に配置され（すなわち、再挿入され）る。
【００３８】
アデノウイルスベクターの状況において、「５’」という用語は、「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」と交換可能に用いられ、かつ左側ＩＴＲの方向を意味する。アデノウイルスベクターの状況では、「３’」という用語は、「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」と交換可能に用いられ、かつ右側ＩＴＲの方向を意味する。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明はさらに、Ｅ３領域における変異または欠失を含む。しかし、代替的に、好ましい実施形態は、Ｅ３領域の全てまたは一部が、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターにおいて保存されても、または再挿入されてもよい。Ｅ３領域の全てまたは一部の存在は、アデノウイルスベクターの免疫原性を低下させ得る。これはまた、腫瘍細胞における細胞変性性効果を増大し、そして正常細胞に対する毒性を低下させる。好ましくは、このベクターは、Ｅ３タンパク質の半分以上を発現する。
【００４０】
別の実施形態において、本発明はさらに、Ｅ１ｂ遺伝子における変異または欠失を含む。好ましくは、Ｅ１ｂ遺伝子における変異または欠失は、Ｅ１ｂ−１９ｋＤタンパク質が、非機能性になるような欠失である。Ｅ１ｂ領域の改変は、Ｅ３領域の全てまたは一部が存在するベクターと組み合わせられ得る。
【００４１】
好ましい実施形態において、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターはさらに、少なくとも１つの治療用遺伝子を含む。この治療用遺伝子は、好ましくはｃＤＮＡの形態であり、このベクターの感染性にも複製にも有害に影響しない任意の位置に挿入され得る。好ましくは、この治療用遺伝子は、Ｅ３タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に代わって、Ｅ３領域に挿入される。最も好ましくは、この治療用遺伝子は、１９ｋＤまたは１４．７ｋＤのＥ３遺伝子に代わって挿入される。
【００４２】
治療用遺伝子は、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルでその効果を発揮する遺伝子であり得る。アデノウイルスに挿入され得る治療用遺伝子としては、以下が挙げられる：アポトーシスを開始し得る因子、アンチセンスまたはリボザイム（他の能力のなかでも、増殖に必須のタンパク質（例えば、構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼなど）をコードするｍＲＮＡに指向され得る）、細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＡ）、もしくはプロテアーゼ（例えば、トリプシン、パパイン、プロテイナーゼＫ、カルボキシペプチダーゼなど）の操作された細胞質改変体をコードする遺伝子、またはＦａｓ遺伝子をコードする遺伝子、など。
【００４３】
目的の他の治療用遺伝子としては、免疫刺激遺伝子、血管新生阻害遺伝子、および自殺遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。免疫刺激遺伝子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびｆｌｔ３）、免疫細胞との相互作用を刺激するタンパク質（Ｂ７、ＣＤ２８、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＡＰ）、腫瘍関連抗原（以下由来の免疫原性配列：ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００（ｐｍｅｌ−１７）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、チロシナーゼ関連タンパク質２、メラニン細胞刺激ホルモンレセプター、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、βカテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ８、ＫＩＡ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２Ｒ１７０１、αフェトプロテイン、テロメラーゼ触媒性タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、癌胎児性タンパク質、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、テロメラーゼ逆転写酵素、およびＰＳＭＡ）、阻害性シグナルをブロック（ＣＴＬＡ４遮断）する抗体のｃＤＮＡ、ケモカイン（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ３α、ＣＣＲ７リガンド、およびカルレティキュリン）、および他のタンパク質。血管新生阻害遺伝子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＴｒｐＲＳフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、ＰＥＤＦ、バソスタチン、細胞外マトリックスタンパク質の種々のフラグメント、および増殖因子／サイトカインインヒビター。細胞外マトリックスタンパク質の種々のフラグメントとしては、アンギオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲンＥフラグメント、トロンボスポンジン、ツムスタチン、カンスタチン、およびレスチンが挙げられるがこれらに限定されない。増殖因子／サイトカインのインヒビターとしては、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、ｓＦｌｔ−１、ｓＦｌｋ、ｓＮＲＰ１、アンギオポイエチン／ｔｉｅのアンタゴニスト、ｓＴｉｅ−２、ケモカイン（ＩＰ−１０、ＰＦ−４、Ｇｒｏ−β、ＩＦＮ−γ（Ｍｉｇ）、ＩＦＮα、ＦＧＦ／ＦＧＦＲアンタゴニスト（ｓＦＧＦＲ）、エフリン／Ｅｐｈのアンタゴニスト（ｓＥｐｈＢ４およびセフリンＢ２）、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、およびＩＧＦ−１が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４４】
「自殺遺伝子」は、ジフテリアＡ毒素の発現のように、それ自体で細胞死をもたらし得るタンパク質、またはこのタンパク質の発現が、細胞を、特定の薬物に選択的に感受性にし得るタンパク質（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）の発現は、細胞を、抗ウイルス化合物（例えば、アシクロビル、ガンシクロビル、およびＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル））に対して感受性にし得る）をコードする。他の自殺遺伝子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＡ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、チトクローム  Ｐ４５０（ｃｙｔ−４５０）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶ−ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコードする遺伝子。あるいは、治療用遺伝子は、ＲＮＡのレベルで、例えば、アンチセンスのメッセンジャーまたはリボザイム、スプライシングもしくは３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響するタンパク質、または細胞内の別の遺伝子の発現のレベルに影響するタンパク質をコードすることによって、例えば、ｍＲＮＡの蓄積の速度の変更、ｍＲＮＡ輸送の変更、および／または転写後調節における変化を媒介することによって、その効果を発揮し得る。ウイルスに対する治療用遺伝子の付加によって、さらなる抗腫瘍の作用機序を有するウイルスが生じる。従って、単一の実体（すなわち、治療用遺伝子を担持するウイルス）が、複数の抗腫瘍機構を誘導し得る。
【００４５】
治療用遺伝子をコードするＤＮＡ配列は好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、Ｎｏｓ、ＦａｓＬ、またはｓＦａｓＲ（可溶性Ｆａｓレセプター）から選択され得る。特に好ましい実施形態において、この治療用遺伝子は、ＧＭ−ＣＳＦである。
【００４６】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、Ｔ細胞、マクロファージ、線維芽細胞、および内皮細胞によって生産される多機能性の糖タンパク質である。ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）および単球系列の細胞（単球、マクロファージ、および樹状細胞を含む）の産生を刺激する（Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＪＯら、Ｂｌｏｏｄ  １９９８  Ｄｅｃ  １５；９２（１２）：４４９１〜５０８に概説される）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、これらの細胞のエフェクター機能を活性化し、またＢ細胞の分化を刺激すると考えられる。１９９０年代の初頭から、多数のグループが、癌の処置のための組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦの臨床的使用を検討している。
【００４７】
腫瘍学の状況における中心的な重要性は、強力な抗腫瘍応答を刺激し得る樹状細胞（ＤＣ）のサブクラスの抗原提示能を、ＧＭ−ＣＳＦが増強する能力である（Ｇａｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １９９１  Ｍａｒ  １５：７７（６）：１１３１〜４５；Ｍａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  Ｊｕｎ  １５：６０（１２）：３２３９〜４６；（ＭａｃｈおよびＤｒａｎｏｆｆ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｏｃｔ；１２（５）：５７１−５で概説された）。ワクチンの状況では、ＧＭ−ＣＳＦによってワクチン部位に補充されるＤＣは、腫瘍タンパク質を捕獲すると推測される。とりわけ、ＤＣによって捕獲されるタンパク質は、腫瘍抗原である（すなわち、腫瘍によって特異的に発現されるタンパク質、ＢｏｏｎおよびＯｌｄ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  Ｏｃｔ  １；９（５）：６８１−３）。流入領域リンパ節におけるＴ細胞に対する腫瘍抗原エピトープの提示は次に、腫瘍転移に対する全身性免疫応答を生じることが期待される。また、ＧＭ−ＣＳＦを発現する照射された腫瘍細胞は、腫瘍チャレンジに対して強力なワクチンとして機能する（Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９９３；９０：３５３９−３５４３；Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；１９：１４５〜１５６：（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５：１３：３９９〜４１５において概説された）。このようなデータによって、とりわけ黒色腫、ならびに前立腺癌、腎臓癌、および膵臓癌において、多数の臨床試験が促進された（Ｓｉｍｏｎｓ  ＪＷら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：５１６０〜５１６８；Ｓｉｍｏｎｓ  ＪＷら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７：５７：１５３７〜１５４６；Ｓｏｉｆｆｅｒ  Ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８；９５：１３１４１〜１３１４６；Ｊａｆｆｅｅら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；１９：１４５−１５６）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ発現は、プラスミノーゲンを切断してアンギオスタチン（公知の血管新生阻害タンパク質）を生成するプロテアーゼを惹起することが前臨床的に示されている（Ｄｏｎｇ  Ｚら、Ｃｅｌｌ．１９９７  Ｍａｒ  ２１：８８（６）：８０１−１０；Ｄｏｎｇ  Ｚら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９８：１８８：７５５−７６３）。
【００４８】
治療用遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、および／またはＥ３プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；およびＡｐｏＡＩプロモーター。好ましい実施形態において、このプロモーターは、Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋらに対して、１９９９年１２月７日に発行された米国特許第５，９９８，２０５号に開示されるような組織特異的プロモーターである。Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（例えば、ヒトＥ２Ｆ−１）が、特に好ましい。
【００４９】
本発明はさらに、相乗的、補完的、かつ／または重複しない毒性、および作用機序を有する２つ以上の導入遺伝子の併用を含む。得られた腫瘍崩壊性アデノウイルスは、ウイルスの腫瘍崩壊性機能を保持し、そしてさらに、例えば、免疫応答および血管新生阻害応答などを誘導する能力を与えられる。
【００５０】
本発明はさらに、本発明のウイルスベクターを含む、アデノウイルスベクター粒子を含む。好ましくは、このウイルス粒子はさらに、この粒子のキャプシドタンパク質に含まれた標的化リガンドを含む。好ましくは、このキャプシドタンパク質は、ファイバータンパク質であり、最も好ましくはこのリガンドは、このファイバータンパク質のＨＩループ中にある。
【００５１】
本発明のアデノウイルスベクターは、当業者に公知の標準的な技術によって作製される。このベクターは、当業者に公知の技術によってパッケージング細胞に移入される。パッケージング細胞は、アデノウイルス粒子中にパッケージングされるべきアデノウイルスゲノム中の遺伝子によって提供された機能に対して、補完する機能を提供する。このような粒子の生成には、このベクターが複製されること、および感染性ウイルスを構築するために必要なタンパク質が産生されることが必要である。パッケージング細胞は、所望のウイルスベクター粒子の生成を可能にする条件下で培養される。この粒子は標準的な技術によって回収される。好ましいパッケージング細胞は、野生型アデノウイルス粒子をもたらし得る相同組み換えを制限するように設計された細胞である。このような細胞は、Ｆａｌｌａｕｘらに対して１９９９年１１月３０日に発行された米国特許第５，９９４，１２８号、およびＢｏｕｔらに対して２０００年３月７日に発行された米国特許第６，０３３，９０８号に開示される。これらの特許において開示される、ＰＥＲ．Ｃ６として公知のパッケージング細胞が、特に好ましい。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、この組み換えウイルスベクターおよび粒子は、選択的に、Ｒｂ経路欠損細胞において複製し、この細胞を溶解する。ほとんどの腫瘍タイプにおいて、Ｒｂ／細胞の周期調節経路は破壊されており、このことは、Ｒｂ経路の調節解除が腫瘍形成に必須であり得ることを示唆する（Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｍ、Ｌｕｋａｓｓ  Ｊ、およびＢａｒｔｅｋ  Ｊ．Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９５；１２：１２４５〜１２４６）。Ｒｂ自体は、同じ腫瘍タイプにおいて変異しており、他の主要タイプにおいては、Ｒｂの上流の因子が調節解除されている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＲＡ．Ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９９５；８１：３２３〜３３０）。腫瘍におけるこれらのＲｂ経路変化の効果の１つは、Ｅ２Ｆに対するｐＲＢ結合の消失、および腫瘍細胞における遊離のＥ２Ｆの明らかな増大である。遊離のＥ２Ｆが豊富になれば、次に腫瘍細胞におけるＥ２Ｆ反応性遺伝子（Ｅ２Ｆ−１遺伝子を含む）の高レベルの発現が生じる。従って、「Ｒｂ−経路欠損細胞（Ｒｂ−ｐａｔｈｗａｙ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）」という用語は、ゲル移動度シフトアッセイによって、またはクロマチン免疫沈降によって測定される場合、豊富な「遊離（ｆｒｅｅ）」のＥ２Ｆを示す細胞として機能的に規定される（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｒａｙｍａｎ  ＪＢ、Ｄｙｎｌａｃｈｔ  ＢＤ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅ２Ｆ  ａｎｄ  ｐＲＢ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｅ２Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２０００  Ａｐｒ  １；１４（７）：８０４〜１６）。
【００５３】
詳細には、ｐＲＢをリン酸化する因子をコードする遺伝子における変異を有する細胞は、本発明の意図に包含されるＲｂ経路欠損細胞であり得る。ｐＲＢは、細胞周期の間のリン酸化によって一時的に調節される。中でもとりわけｐＲＢをリン酸化する因子は、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）およびその調節性サブユニットであるＤ型サイクリン（ＣｙｃＤ）の複合体である。ＣＤＫ４は次に、ｐ１６低分子量ＣＤＫインヒビターによって調節される。ＣＤＫによるリン酸化はｐＲＢを可逆的に不活性化し、これによってＥ２Ｆ−ＤＰ−１二量体による転写活性化、および細胞周期のＳ期への進入がもたらされる。有糸分裂後のｐＲＢの脱リン酸化は、Ｇ１期への再進入を生じる。腫瘍細胞においては、細胞周期チェックポイントタンパク質の任意の１つまたはいくつかが、改変され得、これが細胞の調節解除および無制限の細胞周期をもたらす。ｐＲＢ−Ｅ２Ｆ−ＤＰ１相互作用の消失、または「遊離のＥ２Ｆ（ｆｒｅｅ  Ｅ２Ｆ）」の富化によって、Ｅ２Ｆ部位を有するプロモーターの抑制解除／活性化が生じる。本発明者らは、これらの理論的な考察によって限定されることを望まないが、本発明者らは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦにおけるＥ２Ｆ−１プロモーターの抑制解除が、Ｅ１Ａの転写、ウイルス複製、および腫瘍崩壊をもたらすと考えている。
【００５４】
従って、別の局面において、細胞集団中の新生細胞 (neoplastic cell) を選択的に殺傷する方法が提供される。この方法は、本発明のウイルスベクターまたはウイルス粒子の有効量を、このウイルスベクターまたは粒子が、細胞集団中の新生細胞を形質導入し、複製し、かつこの新生細胞を殺傷し得る条件下で、この細胞集団と接触させる工程を含む。好ましくは、新生細胞は、Ｒｂ経路を欠損している。
【００５５】
本発明のウイルスベクターは、インビトロまたは動物モデルにおいて、新生細胞を殺傷する方法を研究するのに有用である。好ましくは、この細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、この哺乳動物細胞は、霊長類細胞である。最も好ましくは、この霊長類細胞はヒト細胞である。
【００５６】
本発明のさらなる局面において、本発明の組み換えウイルスベクターおよび粒子、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物が提供される。このような組成物（薬学的に受容可能なキャリア中に、本発明のアデノウイルスベクターおよび粒子の有効量を含み得る）は、単位投薬形態、滅菌の非経口溶液もしくは懸濁液、滅菌の非経口ではない溶液または経口の溶液もしくは懸濁液、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンなどの形態での、個体に対する局所的投与または全身的投与に適切である。非経口の薬物送達および非経口ではない薬物送達のための処方物は、当該分野で公知である。組成物はまた、本発明のアデノウイルスベクターおよび粒子の凍結乾燥型、および／または再構成型を含み得る。受容可能な薬学的キャリアとは、例えば、生理食塩水、硫酸プロタミン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）、水、水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液）、またはポリブレン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）およびリン酸緩衝化生理食塩水およびスクロースである。適切な薬学的キャリアの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明白であると考えられる。これらの溶液は、無菌であり、かつ一般に、所望のアデノウイルス粒子（ビリオン）以外の粒子を含まない。この組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、毒性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）のような、適切な生物学的条件に必要とされる薬学的に受容可能な補助物質を含み得る。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤が含まれてもよい。
【００５７】
ウイルスベクターは、腫瘍細胞におけるウイルスベクターの複製を通じて腫瘍細胞の増殖を阻害、防止、または破壊するのに有効な量で宿主に投与される。このような投与は、本明細書中において上記されるような全身投与によってもよいし、またはこのベクターの腫瘍への直接注射であってもよい。概して、このベクターは、体重１ｋｇあたり少なくとも５×１０９粒子の量で全身に投与されるが、一般に、この量は、体重１ｋｇあたり２．５×１０１２粒子を超えない。このベクターは、少なくとも２×１０１０粒子の量で腫瘍内に投与されるが、一般に、この量は、２×１０１３粒子を超えない。投与されるべき正確な投与量は、患者の年齢、体重、および性別、ならびに処置される腫瘍の大きさおよび重篤度を含む、種々の因子に依存する。このウイルスは、宿主の免疫応答能次第で、１回以上投与されてもよい。この組成物の単回投与または複数投与は、処置する医師によって選択されている用量のレベルおよびパターンを用いて実行され得る。必要に応じて、強力な免疫応答なしに、反復投与を可能にするために、種々の免疫抑制剤を使用することによって、免疫応答が減弱されてもよい。本発明の抗腫瘍性療法は、他の抗腫瘍性プロトコールと併用されてもよい。
【００５８】
送達は、リポソーム、直接注射、カテーテル、局所適用などを使用する、種々の方法で達成され得る。
【００５９】
なお別の局面において、新生物状態を有する宿主生物体を処置する方法が提供される。この方法は、この宿主生物体に対して、本発明の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態において、新生物組織は、異常に増殖しており、そして好ましくは悪性腫瘍組織である。好ましくは、このウイルスベクターは、腫瘍組織における選択的な複製の能力に起因して、その組織または腫瘍塊の本質的に全体にわたって分布される。
【００６１】
全ての新生物状態は、本発明の方法を用いて、処置することが潜在的に可能である。腫瘍のタイプとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：造血系の腫瘍、膵臓の腫瘍、神経学的腫瘍、肝臓の腫瘍、胃腸管の腫瘍、内分泌の腫瘍、胆道の腫瘍、気道の腫瘍、頭頸部の腫瘍、軟部組織肉腫および癌腫、皮膚科的腫瘍、生殖器官の腫瘍など。処置の好ましい腫瘍は、正常組織に対して高い分裂指数を有する腫瘍である。好ましい腫瘍は、固形腫瘍（充実性腫瘍）である。
【００６２】
処置の方法の好ましい実施形態において、新生物状態とは、肺癌、結腸癌、乳癌、または前立腺癌である。
【００６３】
好ましい実施形態において、宿主生物体はヒト患者である。ヒト患者については、ある治療用遺伝子がベクターに含まれる場合、この治療用遺伝子は、一般に、ヒト起源の遺伝子であるが、ヒトにおいて高い相同性、および生物学的に同一または等価な機能を示す密接に関連した種の遺伝子は、この遺伝子が、このレシピエントにおいて有害な免疫反応を生じない場合は用いられてもよい。核酸配列または治療用遺伝子の治療上有効な量とは、所望の結果を達成するのに必要な投与量および時間において有効な量である。この量は、被験体の性別、年齢、体重などを含むがこれに限定されない種々の因子によって変化し得る。
【００６４】
本発明は、以下の実施例に関してここで記載される；しかし、本発明の範囲は、それによって限定されるとは意図されないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【００６５】
実施例１：複製選択性アデノウイルスＡｒ６Ｆ、Ａｒ６ｐＡＦ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの構成および分子特徴
Ｅ１Ａ遺伝子の非特異的な活性化を最小にするように設計された２つのアデノウイルス骨格を開発した。Ａｒ６Ｆアデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａコード領域（配列番号５）に直接連結された左側ＩＴＲを含み、欠失し（Ａｄ５配列におけるヌクレオチド１０４〜５５１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０）、かつマルチクローニング部位で置換されたヌクレオチドの介在を有する（図４）。このＡｒ６ｐＡＦアデノウイルスベクターは、左側ＩＴＲとＥ１Ａコード領域（配列番号６、図５）との間に挿入された１４５ヌクレオチドのＳＶ−４０初期ポリ（Ａ）シグナルを含むこと以外は、Ａｒ６Ｆと同一である。これらのベクターの両方において、左側ＩＴＲの付近に正常に存在するパッケージングシグナルは、右側ＩＴＲに移動された（図３、パネルＢ；配列番号４）。これは、左側ＩＴＲおよびパッケージングシグナルを含む、Ａｄ５の最初の３９２ｂｐの逆相補配列を用いて右側ＩＴＲを置換することによって実施された。最終的に、アデノウイルスベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦを生成するために、ＳＶ−４０初期ポリ（Ａ）シグナルとＥ１Ａコード領域（Ａｒ６ｐＡＦに存在する）との間に、腫瘍選択性プロモーターＥ２Ｆ−１を、挿入した（図３、パネルＡ；配列番号３）。
【００６６】
アデノウイルスベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの最初の１８０２ヌクレオチド（ＩＴＲ、ポリ（Ａ）、Ｅ２Ｆ−１プロモーター、およびＥ１Ａ遺伝子を含む）を、ＤＮＡ配列決定によって確認した（配列番号３）。さらに、このベクターの右側の最後の５３１ヌクレオチド（パッケージングシグナルおよび右側のＩＴＲを含む）を、配列決定によって確認した（配列番号４、図３）。
【００６７】
これらの改変を含むアデノウイルスゲノムを、細菌のプラスミドにおいて標準的な方法によってクローニングした。Ａｄゲノムのフラグメントを含有するこれらの細菌のシャトルプラスミドの間で、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて相同組み換えを実施しして、全長の感染性ウイルスゲノムを含有するプラスミド（ｐＡｒ６Ｆ、ｐＡｒ６ｐＡＦ、およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ）を生成した（Ｈｅら、１９９８．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．ＰＮＡＳ  ９５，２５０９−２５１４）。全長アデノウイルスゲノムを含有するこれらのプラスミドを、制限酵素を用いて直線化して、細菌プラスミド配列からアデノウイルスゲノムＤＮＡを放出させた。次いで、このアデノウイルスＤＮＡを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａＡＭＩＮＥ−ＰＬＵＳ試薬システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、補完する細胞株ＡＥ１−２ａ中に移入した（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９６．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ２ａ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６，４１７３−４１７８）。この細胞を３７℃で約５〜７日間インキュベートした。記載のとおり、アデノウイルスを増幅して、ＣｓＣｌ勾配によって精製した（Ｊａｋｕｂｃｚａｋら、２００１．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５  ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａａｅｎｉｚｅｄ  ｆｉｂｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｈｏｗ  ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ｂ−Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７５：２９７２〜２９８１）。ウイルス粒子濃度を分光光度計的な分析によって決定した（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、１９９６．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７０，７４９８〜７５０９）。
【００６８】
１．２  ウイルスＤＮＡの単離およびサザン分析
記載のとおり（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｋｉｔ，Ｇｅｎｔｒａ）、ＣｓＣｌ精製したウイルス調製物からＤＮＡを単離した。示した制限酵素を用いてウイルスＤＮＡを消化して、臭化エチジウムを含有する１％アガロース／ＴＡＥゲル上で分析した。各々のＤＮＡサンプルの総量１μｇをＣｌａＩ、ＸｂａＩ、ＨｐａＩ、ＳａｌＩ、およびＢａｍＨＩを用いて消化して、標準的な手順に従ってサザン分析に供した。このプローブをランダムなオリゴヌクレオチドプライミングによって調製したが、これにはＥ２Ｆ−１プロモーターを含んだ。
【００６９】
図６は、Ａｒ６ｐＡＦベクターおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのクローニングおよび構造をまとめる。多数のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの研究によるＤＮＡ構造をサザン分析によって確認した。５つの独立した制限エンドヌクレアーゼを用いて、予想される左側ＤＮＡ領域フラグメントを得た。Ｅ２ＦプロモーターＤＮＡプローブを用いたサザンブロット分析によって、全ての制限エンドヌクレアーゼについての予想されるハイブリダイゼーションを実証した。従って、これらの結果によって、Ｅ２Ｆ−１プロモーターの正しい位置における存在が確認され、かつウイルスＤＮＡの完全性が検証された。
【００７０】
１．３  ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの限界希釈クローニング
多数のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのシードをさらなる評価のために生成した。純粋なシードの多数のウイルスを得るためには、単一のウイルス粒子由来のクローンを単離することが必要である。以下に記載のようなウイルスの限界希釈を通じて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦウイルスのクローニングを達成した。
【００７１】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞の１０の９６ウェルプレート（Ｆａｌｌａｕｘら、１９９８．Ｎｅｗ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  １−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍａｎ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９，１９０９〜１９１７）を、０．０４ｍｌ容積／ウェルで５×１０３細胞／ウェルにプレートした。１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加したＤＭＥＭ中で、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を増殖させた。１×１０−２粒子／μｌを含有する１０μｌのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦを、各ウェルに添加して、０．１粒子／ウェルの最終感染を得た。感染した細胞を３７℃でかつ５％ＣＯ２において４時間インキュベートして、その後、１５０μｌの培地を添加した。ウイルス感染細胞を、３７℃でかつ５％ＣＯ２において１２日間インキュベートして、その後、ＣＰＥについてスコア付けした。１３日目に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞から０．１粒子／細胞のクローン７〜９を回収した。３つのクローン７〜９は、ＣＰＥを示し、そしてこれを５回凍結融解させ、そして６ウェルディッシュにプレートしたＰＥＲ．Ｃ６細胞上で増幅させた。３日目に、クローン７〜９からＣＶＬを調製して、クローン７をＰＥＲ．Ｃ６細胞のＴ１５０中でさらに増幅した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦのクローン７  Ｔ１５０を感染２日後に回収した。この時点でこの細胞は、完全ＣＰＥに達していた。このＣＶＬを５回凍結融解させて、細胞破片をスピンアウトした。ＰＥＲ．Ｃ６細胞のＴ７５フラスコをプレートして、上記ＣＶＬの０．５ｍｌを用いて感染させた。
【００７２】
０．１粒子／細胞で感染した９６０ウェルのうち、３つのウェルがＣＰＥを示した。これらの３つのクローンは、予期されるクローンの理論上の数の範囲であった。統計学的に、１０のプレートのうち４つのウェルのみがＣＰＥを生じるはずである。これは、１：２５００のオッズを与える。このオッズは、２５の粒子：ｐｆｕ比を仮定した場合、２以上の（１つより多い）感染性粒子／ウェルが存在するということである。この３つのクローンをＰＥＲ．Ｃ６細胞中で増幅させた。そしてクローン７のゲノムは、ＨｐａＩ、ＸｈｏＩ，およびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて分析した場合、予期されたサイズのＤＮＡフラグメントを示した。
【００７３】
１．４  配列分析
プラスミドｐＤＬ６ｐＡＥ２ｆ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（クローン７）の５’末端の最初の１８０２ヌクレオチド、および最後の３’末端ヌクレオチド（３３８８１ｂｐ〜３４４１２ｂｐ）を、直接配列決定した（配列番号３、図３Ａ）。
【００７４】
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの領域をＤＮＡ配列決定によって確認した。最初の１８０２ヌクレオチドの領域は、ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１０３）、ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１１６〜２６１）、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーター（ヌクレオチド２８３〜５５５）、Ｅ１Ａ遺伝子（ヌクレオチド５７４〜１６４７）、およびＥ１ｂ遺伝子の一部（ヌクレオチド１６４８〜１８０２）であり、これが示されている（配列番号３、図３Ａ）。最後の５３１ヌクレオチドの領域は、ＰａｃＩ制限部位（ヌクレオチド３３９６７〜３３９７４）（下線を付した）、パッケージングシグナル（ヌクレオチド３４０２０〜３４２１７）、およびＩＴＲ（３４３１０〜３４４１２）（配列番号４、図３Ｂ）である。
【実施例２】
【００７５】
実施例２：ＦＡＣＳによる、Ｅ１Ａ発現の特徴づけ
エンハンサーエレメントの欠失およびポリＡシグナルの挿入が、有効な転写終結に十分であるか否かを決定するため、定量的なＥ１Ａ  ＦＡＣＳアッセイを用いて、非補完的なＡ５４９細胞バッククラウンド（ｐ１６−ｐ５３＋Ｒｂ＋）におけるＥ１Ａ発現を評価した。本発明者らは、Ａｄｄ／３２７、Ａｄｄ／３１２、Ａｒ６Ｆ、Ａｒ６ｐＡＦ、またはＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦを、１０、５０、２５０、および１２５０ウイルス粒子／細胞（ＶＰＣ）の用量で用いて感染した細胞からのＥ１Ａ発現を比較した（表１）。Ａｄｄ／３２７を用いて、全ての用量の範囲で、最高レベルのＥ１Ａ発現を観察した。対照的に、Ｅ１Ａ欠失変異体Ａｄｄ／３１２は、Ｅ１Ａ発現を示さなかった。この実験で用いた条件下（１０〜１２５０ＶＰＣ）では、Ａｄｄ／３２７で形質導入した細胞よりもＡｒ６Ｆで形質導入した細胞において、Ｅ１Ａの欠失は、約８０％〜２２％少なかった。Ａｒ６ｐＡＦで形質導入した細胞におけるＥ１Ａ発現は、Ａｄｄ／３２７を用いて感染した細胞からの発現に比べて、全ての用量において、有意に約１００％〜９６％低下した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ腫瘍崩壊性ベクターを用いて感染させた細胞からのＥ１Ａ発現は、５０ＰＶＣの用量のＡｄｄ／３２７ウイルスに比べた場合、５０％低下した。
【００７６】
結論として、Ａｒ６ｐＡＦベクターへのポリ（Ａ）シグナルの挿入によって、Ａ５４９細胞におけるＥ１Ａ発現は低下した。対照的に、Ｅ２Ｆ−１プロモーターの挿入は、Ｅ１Ａ発現を再確立し、これによって、Ｅ１Ａ発現は、挿入されたプロモーターに起因して独占的であることが実証された。
【００７７】
表１．Ａ５４９非補完性細胞
(noncomplementing cells) におけるＥ１Ａ発現
【００７８】
【表１】
2004529627.tif 000005
【００７９】
ベクターを、１０、５０、２５０および１２５０ＶＰＣのいずれかで用いて、非補完性Ａ５４９細胞を感染させた。Ｅ１Ａ発現は、感染の２４時間後、ＦＡＣＳによって決定した。
【００８０】
Ｅ１ＡのＦＡＣＳアッセイについてのプロトコール
１２ウェルのプレートにおける感染の前日に細胞をプレートした。翌日、細胞から培地を吸引した。１細胞あたりの粒子（ｐｅｒｔｉｃｌｅ  ｐｅｒ  ｃｅｌｌ）（ｐｐｃ）中のウイルス用量の処方物を、このウェルに添加し、そしてそのプレートを３７℃で４時間ロッキングした。ウイルス／培地を吸引し、１回洗浄し、次いで完全増殖培地と交換して、３７℃で２０時間インキュベートした。トリプシン−ＥＤＴＡ消化によって細胞を回収して、７０％エタノール中で室温において２０分間固定した。次いでこの細胞を１回洗浄して、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％  ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ３）中に再懸濁した。１０μｌの１：１０希釈した非結合型抗Ｅ１Ａ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、抗アデノウイルス２Ｅ１Ａ、ヒト（Ａｂ−１））またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（Ｓｉｇｍａ  Ｍ５４０９）を添加して、室温で３０分間、インキュベートした。この細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで、５０μｌの１：４０希釈したＧＡＭ  ＰＥ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−９６７０）を添加して、室温で３０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄して、２００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、そしてＦＡＣＳＣＡＮ上で２０，０００事象を得た。
【実施例３】
【００８１】
実施例３：アデノウイルスベクターの毒性
Ｂａｌｂ／ｃ  ＳＣＩＤ雄性マウスにおける急性肝毒性を用いて、異なるレベルのＥ１Ａ活性を有するアデノウイルスベクターの間を識別した。野生型Ｅ１Ａ発現を有するベクターと、最小またはサイレントなＥ１Ａ発現を有するベクターとの間で、血清中の肝臓酵素の上昇の顕著な差異を観察した。
【００８２】
１群あたり１０匹の動物を用いて研究をデザインした。コントロール群は、ＨＢＳＳビヒクル単独、陰性コントロール群は、Ｅ１Ａ欠失Ａｄｄ／３１２、そしてＥ１Ａ含有陽性コントロールは、Ａｄｄ／３２７とした。ウイルスを、１０ｍｇ／ｋｇの容積で、６．２５×１０１１粒子／ｋｇの用量で、尾静脈内に静脈内注射した；等価な用量容積のＨＢＳＳ（１０ｍＬ／ｋｇ）をビヒクルコントロール群に注射した。研究の１日目に動物に注射し、研究の４日目に各々の群の半分を中間的に屠殺して、研究の１５日目に残りの動物を最終的に屠殺した。研究の４日目および１５日目には、全てのマウスから血清を収集して、屠殺を予定している動物からは肝臓を取り出した（５匹／群）。さらに、研究の−３、１、３、４、８、および１５日目に、全ての生存しているマウスで体重を測定した。
【００８３】
表２．アデノウイルスベクターを含有するＥ１Ａの急性毒性
【００８４】
【表２】
2004529627.tif 000006
【００８５】
＊Ａｒ６Ｆに対して有意差（ｐ＜０．０５）。骨格Ａｒ６Ｆ、Ａｒ６ＰＡＦ中のＥ１Ａ含有アデノウイルスベクターの急性毒性を比較した。実施例１に記載のとおり、ウイルスを調製した。体重変化（図７、対応する構築物のマップ、図８を参照のこと）、および血清のＡＬＴ、およびＡＳＴのレベル（表２）に基けば、Ａｒ６Ｆの肝毒性は、Ａｒ６ｐＡＦよりも高かった。
【実施例４】
【００８６】
実施例４：腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦによる、腫瘍細胞中のＥ１Ａ遺伝子発現の選択的調節（定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ）
本研究においては、腫瘍細胞対、非腫瘍細胞における、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦにおけるＥ１Ａ遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて比較した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦにおけるＥ１Ａ  ＲＮＡのレベルを、Ａｒ６ｐＡＦ（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦと同一であるが、Ｅ２Ｆ−１プロモーターを欠くアデノウイルス）におけるレベルと比較することによって、Ｅ１Ａ発現のＥ２Ｆ−１プロモーター依存性を、評価した。ウイルスＤＮＡのコピー数によって、アデノウイルスの形質導入を決定した。アデノウイルス複製に対する選択的Ｅ１Ａ遺伝子の影響をまた、特定の細胞タイプにおいて試験した。Ｅ１Ａ遺伝子発現は、腫瘍細胞において選択的であった。この腫瘍選択性は、Ｅ２Ｆ−１プロモーターのトランス活性化に依存していた。Ｅ１Ａ遺伝子発現と一致して、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの選択的アデノウイルスＤＮＡ複製がまた、初代肝細胞に対して、Ｈｅｐ３Ｂにおいて観察された。
【００８７】
実施例１に記載のとおり、ウイルスを調製した。
【００８８】
４．１  方法
４．１．１  ヒトの腫瘍細胞株および正常細胞
アデノウイルスベクターによるＥ１Ａ遺伝子発現の選択性を、ｐＲＢ／ｐ１６経路欠損のヒト腫瘍細胞株において、およびヒトの正常な非腫瘍細胞において評価した。腫瘍細胞は全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓａｓｓ  ＶＡ）から入手した。この腫瘍細胞としては、肝細胞癌（Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７；ＡＴＣＣ  ＃ＨＢ−８０６４）、非小細胞肺癌（ＮＣＩ−Ｈ４６０；ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１７７、およびＮＩＨ−Ｈ１２９９；ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８０３）、および膵臓の類上皮細胞癌（Ｐａｎｃ−１；ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４６９）が挙げられる。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、１０％ＦＢＳ含有、ＥＭＥＭ中で、Ｐａｎｃ−１は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で、Ｈ４６０は、１０％ＦＢＳ、４．５ｇ／Ｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、０．７５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，および２ｍＭ  Ｌグルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０中で、そしてＨ１２９９は、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。非腫瘍ヒト細胞には、末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓカタログ番号ＣＣ２５４７）、および前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓカタログ番号ＣＣ２５５５）を含んだ。これらの細胞を、単一のドナーから単離して、凍結保存形態の受け取り次第、初期培養によって継代した。それらの細胞は、それぞれ、末梢気道上皮細胞増殖培地（Ｓｍａｌｌ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳＡＧＭ）および前立腺上皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＰｒＥＧＭ）（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で増殖した場合、１５倍まで増殖し得るので、ＳＡＥＣおよびＰｒＥＣは、継代培養に供されていない初代肝細胞から、それらを分化させるための「正常な（ｎｏｒｍａｌ）」細胞株であるとみなされる（Ｆｒｅｎｓｈｎｅｙ  ＲＩ（編）、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，第９〜１９頁、第３版、１９９４、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。初代ヒト肝細胞は、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、およびピッツバーグ大学（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）のＳｔｅｖｅｎ  Ｓｔｏｍ博士から、ＨＣＧＭ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｄｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中の初代培養物として、購入した。供給業者によって試験した、これらの初代肝細胞は、ＨＩＶ，Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスが陰性であった。培養の１日後以内に、この肝細胞で実験を実施した。
【００８９】
４．１．２  増殖および静止期培養のための条件、ならびに細胞周期分析
Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、腫瘍細胞において非常に活性であるが、正常な増殖している細胞では比較的不活性である（Ｐａｒｒ  ＭＪら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７  Ｏｃｔ；３（１０）１１４５〜９）。予備的研究では、本発明者らは、細胞周期状況に関連して、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦにおいてＥ２Ｆ−１プロモーターが駆動したＥ１Ａ発現に取り組むことを企図した。腫瘍細胞は、培養物中で持続的に増殖されると予測された。ウイルス感染の際、５０〜６０％コンフルエントな細胞を得るために、ウイルス感染の１日前に６ウェルプレート中に４×１０５／ウェルで腫瘍細胞を播種した。非腫瘍細胞は、増殖について比較的低い播種密度を必要とし（Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、従って、ＳＡＥＣおよびＰｒＥＣを、感染の１日前に２×１０５／ウェルでプレートした。この細胞は、ウイルス感染の際、４０〜５０％コンフルエントであった。Ｅ１Ａ  ＲＴ−ＰＣＲ、アデノウイルスＤＮＡ  ＰＣＲ、および細胞周期状況の分析のために、同じ細胞培養実験を用いた。
【００９０】
非腫瘍細胞増殖が、停止され得るか否かを試験するために、ＳＡＥＣについて静止培養を行って、細胞周期分析のために用いた。細胞を６ウェルプレート中に１×１０５／ウェルで播種して、ＳＡＧＭ中で１００％コンフルエンシーまで増殖させた。次いで、アデノウイルスベクターを用いた感染の前に、末梢気道細胞基本培地（Ｓｍａｌｌ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＳＡＢＭ、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中での、２４時間のインキュベーションによって、コンフルエントなＳＡＥＣを枯渇させた。ＳＡＢＭは、ＳＡＧＭであるが、ただし以下の増殖栄養物を欠いている：ウシ下垂体抽出物、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮増殖因子、エピネフリン、トランスフェリン、インスリン、レチノイン酸、トリヨードチロニン、ウシ血清アルブミン（脂肪酸なし）、ならびにゲンタマイシンおよびアンホテリシンＢ（Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）。初代肝細胞が、本研究における静止期培養のための陽性コントロールであった。
【００９１】
上記の培養条件における細胞周期状況を、感染の時点で試験した。感染していない細胞においてＤＮＡ合成を受けている（Ｓ期）相対的な細胞集団を、ＢＤ  ＰｈａｒｍＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入したＢｒｄＵ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔを用いて分析した。最初にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（ＤＮＡ前駆体チミジンの類似体）を用いて、以下のように細胞を標識した：６ウェルプレート中で増殖した細胞を、総量３ｍｌの培養倍地中で、１０μｌ／ｍｌ  １ｍＭ  ＢｒｄＵ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）によって３７℃で４時間パルスした。次いで、トリプシンＥＤＴＡを用いて細胞を回収し、固定し、浸透させて、−７０℃で凍結させた。次いで、製造業者のマニュアル（ＢＤ  ＰｈａｒｍＭｉｎｇｅｎ）に従って、総ＤＮＡについて、免疫蛍光抗ＢｒｄＵ抗体、および７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）によって細胞を同時染色した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを備えるＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎによって製造されたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いるフローサイトメトリー分析によって、ＢｒｄＵ標識した細胞集団を定量した。総ＤＮＡおよび組み込まれたＢｒｄＵレベルの相関した発現を分析することによって、細胞周期位置を決定した。抗ＢｒｄＵおよび７−ＡＡＤを用いて同時染色した細胞のＦＡＣＳ分析によって、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、またはＧ２期にある細胞サブセットを識別する（ＢＤ  ＰｈａｒｍＭｉｎｇｅｎ）。細胞周期状況を、各々の細胞周期にある細胞の％として表した（表３）。各々のサンプルについて、８，０００〜１９，０００の事象を収集した。このＢｒｄＵパルスおよびＦＡＣＳ分析を、２つの細胞サンプルにおいて実施して、この平均値を記録する。フローサイトメトリーにおけるバックグラウンドの設定のために、染色されなかった細胞を用いた。
【００９２】
表３．感染していない腫瘍細胞および正常細胞における細胞周期
【００９３】
【表３】
2004529627.tif 000007
【００９４】
感染していない細胞を、ＢｒｄＵによって、続いて抗ＢｒｄＵおよび７−ＡＡＤの同時染色によって染色して、方法の項に記載されるとおり、総ＤＮＡの相関した発現および組み込まれたＢｒｄＵを分析することによって、その細胞周期位置を決定した。腫瘍細胞株：Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈ４６０、Ｈ１２９９およびＰａｎｃ−１；正常な非腫瘍細胞：ＳＡＥＣおよび初代肝細胞
(Primary hepatocytes)。Ｑ，休止細胞培養条件；Ｐ、増殖する細胞培養条件。データは、２つの細胞サンプルの平均を表す。腫瘍細胞におけるＲｂ／ｐ１６およびｐ５３の状況は、Ｆａｒｓｈｉｄら、Ｊ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ  １９９４；１（１）：４５〜５３、Ｋａｉｎｏ  Ｍ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １９９７  Ｆｅｂ；３２（１）：４０〜６、Ｋａｔａｏｋａ  Ｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０００  Ｍａｒ  １６；１９（１２）：１５８９〜９５、Ｓｐｉｌｌａｒｅ  ＥＡら、Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  １９９６  Ｍａｙ；１６（１）：５３〜６０によって報告された。
【００９５】
４．１．３  Ｅ１Ａ転写研究のための細胞感染
Ｅ１Ａ遺伝子転写は、宿主細胞の感染後のアデノウイルスのライフサイクルの初期段階および後期段階の両方で生じる。培養中の細胞集団は、アデノウイルスによって同時に感染され得ないので、Ｅ１Ａ遺伝子転写は、各々の細胞において異なる時点で生じ得、従って初期Ｅ１Ａ遺伝子転写のレベルは不明瞭であり得る。Ｅ１Ａ遺伝子転写の開始の時間を制御するため、細胞へのウイルス内部移行のために感染を同期化した。０．５ｍｌ／ウェルの感染培地（２％ＦＢＳ含有、基本培地）中で４℃で感染を実行し、１時間ロッキングして、細胞膜へのウイルスの付着を可能にさせた。ウイルスの付着は、低温では効率的であったが、感染プロセスにおけるその後の工程は、エネルギーを必要とする。従って、ウイルス付着後、そのウイルス培地を除去し、その細胞を冷ＰＢＳで洗浄して、増殖培地中で３７℃で種々の時間インキュベートして、ウイルスの内部移行および遺伝子転写を可能にさせた。Ｅ１Ａ遺伝子転写の時間経過を、４、８、および１６時間、１、１０、１００粒子／細胞のＡｄｄ／３２７を用いて、感染させたＨｅｐ３Ｂ細胞中で試験した。経時的な研究からの結果に基づいて、他の全ての実験に関する感染を、１０および１００ｐｐｃのウイルス濃度で、ウイルス付着については４℃で１時間のインキュベーションを用いて、そしてウイルス内部移行については３７℃で４時間のインキュベーションを用いて実行した。１０ｐｐｃおよび１００ｐｐｃを選択する理由は、Ｅ１Ａ発現のレベルが、異なるベクターで感染された全ての細胞タイプで検出され得ることを確認するためである。
【００９６】
４．１．４  リアルタイムＥ１Ａ  ＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｅ１Ａ  ＲＴ−ＰＣＲ分析のために約４×１０５細胞からＲＮＡサンプルを収集した。この細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌ  ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ中で溶解して、ＲＮＡの単離まで−７０℃の冷凍庫に貯蔵した。細胞溶解物由来の総ＲＮＡをＲＮＡｚｏｌ  Ｂ法（Ｔｅｌ−ＴＥＳＴ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いて単離した。分光光度的に（Ａ２６０およびＡ２８０）ＲＮＡ濃度を決定した。Ｔａｑｍａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、１００ｎｇのＲＮＡから、第一鎖ｃＤＮＡを生成した。アデノウイルスＥ１Ａ配列に特異的なプライマーは以下であった：
Ｅ１Ａフォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号２２）
Ｅ１Ａリバースプライマー：３’−ＧＣＴＣＧＴＴＡＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴＣＧＡ−３’（配列番号２３）
Ｅ１Ａプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号２４）
【００９７】
５０μｌの反応容積中で以下の条件下で増幅を実施した：２０μｌのサンプルｃＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、および１００ｎＭ  Ｅ１Ａプローブ。サーマルサイクリングの条件は以下であった：５０℃での２分のインキュベーション、Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄのための１０分９５℃の活性化、その後の９５℃１５秒間、および６０℃１分間の連続的インキュベーションの３５サイクル。７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてサーマルサイクリングを実行した。ＲＮＡインプット（内部コントロール）を評価するため、製造業者の指示に従って、Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １８Ｓキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、各々のｃＤＮＡの１０μｌの１：１０００希釈を増幅した。データを収集して、７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア  ｖ．１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。１，５００，０００〜１５コピーの希釈を用いるＥ１Ａプラスミドの曲線に基づいてＥ１Ａの相対的レベルを決定した。
【００９８】
４．１．５  ヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲ分析
ウイルスＤＮＡのコピー数分析のために、１０ｐｐｃのアデノウイルスベクターを用いて細胞を感染させた。感染後に、この細胞をＰＢＳで洗浄して、トリプシンＥＤＴＡを用いて回収した。細胞ペレットをドライアイス上で凍結して、ＤＮＡの単離まで−７０℃の冷凍庫に保管した。製造業者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて、３×１０６〜５×１０６個の細胞からＤＮＡを単離した。２７５μｌの水中でＤＮＡの溶出を行い、分光光度的（Ａ２６０およびＡ２８０）に濃度を決定した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ．１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、アデノウイルスヘキソン配列に特異的なＰＣＲプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを設計した。プライマーおよびプローブの配列は以下であった：
ヘキソンフォワードプライマー：５’−ＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号２５）
ヘキソンリバースプライマー：３’−ＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号２６）
ヘキソンプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号２７）
【００９９】
５０μｌの反応容積中で以下の条件下で増幅を実施した：１０ｎｇのサンプルＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、６００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、および１００ｎＭ  ヘキソンプローブ。サーマルサイクリングの条件は、以下であった：５０℃での２分のインキュベーション、９５℃１０分、その後の９５℃１５秒間、および６０℃１分間の連続的インキュベーションの３５サイクル。データを収集して、７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアｖ．１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した。１０ｎｇヒトＤＮＡにおける１，５００，０００コピー〜１５コピーのアデノウイルスＤＮＡの希釈物からなる標準曲線を用いて、アデノウイルスのコピー数の定量を実施した。インプットしたＤＮＡの重量および６×１０９ｂｐのゲノムサイズに基づいて、総コピー数の平均数を、１細胞あたりのコピー数に正規化した。
【０１００】
４．２  結果
４．２．１  Ｅ１Ａ遺伝子発現の時間経過
本発明者らの目的は、プロモーター転写活性の評価のためにＥ１Ａ  ＲＮＡのレベルを定量することであった。Ｅ１Ａ遺伝子転写は、宿主細胞の感染の直後に生じて、約６〜８時間続き、その後、ウイルスＤＮＡ複製が最初に検出される（Ｓｈｅｎｋ  Ｔ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．１９９６；ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ、およびＨｏｗｌｅｖ  ＰＭ，編．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）第２１１１〜２１４８頁；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＷＣ．Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌ  ２０００：８１：２５７３−２６０４）。アデノウイルス感染後にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイによってＥ１Ａ  ＲＢＡが検出され得る最も早い時点を決定するため、本発明者らは、１、１０、および１００ｐｐｃのＡｄｄ／３２７を用いて感染させたＨｅｐ３Ｂ細胞においてＥ１Ａ  ＲＮＡレベルの時間経過を実施した。方法の項において記載したとおり、感染後０、４、８、および１６時間で、細胞性Ｅ１Ａ  ＲＮＡを定量した。用量依存性の様式で、３つのウイルス用量の全てにおいて、感染の４時間後に、Ｅ１Ａ  ＲＮＡを検出した（表４）。本研究で用いた感染後の最終時点（１６時間）まで、Ｅ１Ａ  ＲＮＡのレベルは、継続して増大した。感染の４時間後に検出したＥ１Ａ  ＲＮＡは、ウイルス感染サイクルの初期段階での遺伝子転写の結果である可能性が極めて高い。なぜなら、後期段階におけるＥ１Ａ転写は、ウイルスＤＮＡ複製と結び付いており、感染後６〜８時間で生じるからである（Ｓｈｅｎｋ  Ｔ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．１９９６；ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ、Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ、およびＨｏｗｌｅｙ  ＰＭ編（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）第２１１１〜２１４８頁）。感染後４時間のＥ１Ａ  ＲＮＡレベルの急激な上昇によって、Ｅ１Ａ遺伝子発現は、宿主の細胞性因子によって限定されないことが示され、このことはウイルス感染サイクルが、複製段階に進行していることを示す。
【０１０１】
表４．Ａｄｄ／３２７におけるＥ１Ａ遺伝子発現の時間依存性および用量依存性
【０１０２】
【表４】
2004529627.tif 000008
【０１０３】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を感染させて、Ｅ１Ａ  ＲＮＡ発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。示した＊Ｅ１Ａ  ＲＮＡレベルは、総量２８．５ｎｇのインプットＲＮＡにおけるＥ１Ａプラスミド標準曲線に対するＲＴ−ＰＣＲ産物の単位である。ｐｐｃは、１細胞あたりのＡｄｄ／３２７の粒子数。
【０１０４】
４．２．２  アデノウイルスＤＮＡコピー数
感染後４時間のアデノウイルスＤＮＡコピー数
感染後４時間で検出されたＥ１Ａ  ＲＮＡは、ウイルス感染サイクルの初期段階における遺伝子転写の結果である。ウイルスＤＮＡ複製は、ウイルス感染サイクルの後期段階を特徴付けるので、本発明者らは、感染後４時間のウイルスＤＮＡコピー数を試験して、ウイルス感染サイクルの初期段階を確認した。全てのタイプのアデノウイルスが、ウイルス形質導入について同様の動態を示すことが報告されている（Ｋａｓａｍａｔｓｕ  Ｈ、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ａ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９８；５２：６２７〜８６）。複製コンピテントなＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、複製欠損Ａｄｄ／３１２と同一のキャプシドタンパク質をコードする。従って、ウイルスＤＮＡ複製のための陰性コントロールとしてＡｄｄ／３１２を用いた。１０ｐｐｃのＡｄｄ／３１２またはＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦを用いて４時間、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を感染させて、アデノウイルスＤＮＡコピー数をＰＣＲによって分析した。本発明者らは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞においては、平均０．４のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ  ＤＮＡコピー／細胞に比べて、平均０．５のＡｄｄ／３１２  ＤＮＡコピー／細胞を検出した（表５）。このことは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染したＨｅｐ３Ｂ細胞では感染の４時間後に明白なアデノウイルスＤＮＡ複製が生じなかったことを示す。この観察はやはり、感染の６〜８時間後のアデノウイルスＤＮＡ複製と一致している。この結果をＲＴ−ＰＣＲアッセイによってＥ１Ａ転写物を検出する能力と組み合わせれば、本発明者らは、感染後４時間でＥ１Ａ遺伝子の転写制御を評価することができる。
【０１０５】
表５．細胞のアデノウイルスベクター形質導入
【０１０６】
【表５】
2004529627.tif 000009
【０１０７】
方法の項に記載のとおり、細胞を１０ｐｐｃの適切なアデノウイルスベクターで感染させて、ヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲアッセイによって、アデノウイルスＤＮＡコピー数を測定した。腫瘍細胞株：Ｈ４６０、Ｈ１２９９、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＰａｎｃ−１；非腫瘍細胞：ＳＡＥＣおよび初代肝細胞。ＮＡは、利用不能（ｎｏｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ）。ＳＡＥＣおよび初代肝細胞についてのデータは、異なるドナーを用いた２つの別の実験由来であった。全ての腫瘍細胞株について、Ｈ１２９９およびＰａｎｃ−１以外は、データは２つの実験に由来した。
【０１０８】
細胞株のアデノウイルス形質導入
ウイルスの付着、内部移行、および核移入は、宿主細胞の要因に依存するので、それらの効率は、異なる細胞タイプの間で変化することが予想された。異なる細胞タイプにおけるＥ１Ａ遺伝子発現のレベルに対する形質導入の効果について制御するために、本発明者らは、同じ用量での感染後の４つの腫瘍細胞株および２つの腫瘍細胞タイプにおいて、アデノウイルスＤＮＡコピー数を決定した。表５は、１０ｐｐｃを用いて感染させた細胞中で測定したウイルスのＤＮＡコピー数を示す。このデータは、Ｈｅｐ３Ｂが、アデノウイルスＤＮＡの最高量を有し、Ｈ１２９９、Ｐａｎｃ−１および初代肝細胞が、中間の量を有し、そしてＨ４６０およびＳＡＥＣが最低量を有したことを示す。このことは、ウイルス形質導入において異なる細胞タイプの中における５０倍までの変動を示す。この知見は、該して、異なる腫瘍細胞株の間の取り込み効率において報告された（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ）２０倍の差異と、一致している。本発明者らの結果において、細胞タイプの間の高い形質導入の変動は、本研究においてカバーされる、広範な細胞タイプ（正常細胞を含む）に関連し得る。さらに、表５のデータは、比較的予備的なものである。なぜなら、２つの実験しか実施していないからである（ただし、Ｈ１２９９およびＰａｎｃ−１は除く）。しかし、同じ細胞タイプ内の２つの実験の間のウイルスＤＮＡコピー数における変動は小さい（表５）ので、この値を、異なる細胞タイプにおけるＥ１Ａ  ＲＮＡレベルの正規化に用いた。
【０１０９】
４．２．３  腫瘍細胞における選択的Ｅ１Ａ遺伝子発現
選択的なＥ１Ａ遺伝子発現は、腫瘍細胞におけるウイルスＤＮＡ複製に限定されることが重要である。本発明者らは、腫瘍選択性Ｅ２Ｆ−１プロモーターを通じて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦが、選択的なＥ１Ａ遺伝子発現を媒介する能力を試験した。方法の項に記載したとおり、１０ｐｐｃおよび１００ｐｐｃのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦまたはＡｒ６ｐＡＦを用いて、腫瘍細胞および非腫瘍細胞を４時間感染させた。アデノウイルスゲノム取り込みにおける細胞タイプの変動を識別するため（表５）、１細胞あたりのアデノウイルスＤＮＡコピー数に対して、Ｅ１Ａ  ＲＮＡレベルを正規化して、１つのＡｄゲノムあたりのＥ１Ａ  ＲＮＡレベルとして表す（表６）。表６に示されるとおり、２つのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染非腫瘍細胞から発現されたレベル（５７〜１２３単位／Ａｄゲノム）よりも、４つ全てのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染腫瘍細胞から発現されたＥ１Ａ  ＲＮＡ（３８１〜２６５５単位／Ａｄゲノム）の方が明らかに高い傾向であり、このことは、腫瘍選択性のＥ１Ａ遺伝子発現を示唆する。各々の腫瘍細胞タイプにおいて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、Ａｒ６ｐＡＦによって媒介されるよりも高いレベルのＥ１Ａ  ＲＮＡを媒介する傾向であった（表６）。高用量での、Ａｒ６ｐＡＦ感染細胞のＥ１Ａレベルに対する、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染細胞のＥ１Ａレベルの間の明白な差異は、約１０〜１００倍であった。このことは、腫瘍選択性のＥ１Ａ遺伝子発現が、Ｅ２Ｆ−１プロモーター依存性であることを示す。
【０１１０】
表６．腫瘍細胞および初代細胞におけるＥ１Ａ遺伝子発現
【０１１１】
【表６】
2004529627.tif 000010
【０１１２】
Ｅ１Ａプラスミド標準曲線に対する、感染後４時間のＥ１Ａ  ＲＮＡレベルを、ＲＴ−ＰＣＲによって定量した。次いで、Ｅ１Ａ  ＲＮＡレベルを、表８において決定された１細胞あたりのアデノウイルスＮＡコピー数に対して正規化した。データは２つの実験の平均を表す。ｐｐｃは、１細胞あたりの粒子数（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｅｒ  ｃｅｌｌ）。ＳＡＥＣは、末梢気道上皮細胞（ｓｍａｌｌ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）。
【０１１３】
細胞株は、特定のプロモーターをトランス活性化する能力においてお互いに異なる。この相違には、基本的な転写機構の細胞性因子および有効性の存在を含む。Ｅ２Ｆ−１プロモーター活性を評価するために、１００ｐｐｃのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染細胞から発現されたＥ１Ａ  ＲＮＡのレベルを、Ａｄｄ／３２７感染細胞から発現されたＥ１Ａ  ＲＮＡのレベルに対して分析した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦおよびＡｄｄ／３２７の両方とも腫瘍細胞におけるＥ１Ａ遺伝子発現を媒介した（表７）；従って、Ｅ２Ｆ−１プロモーターおよびＥ１Ａプロモーターの両方が、試験した腫瘍細胞において活性である。Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、腫瘍細胞において、野生型Ｅ１Ａプロモーターの１０〜８４％程度活性であった（表７）。対照的に、Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、非腫瘍細胞において、野生型プロモーターの０．２〜０．７％程度の活性であった（表７）。非腫瘍細胞由来の低Ｅ２Ｆ−１プロモーター活性は、選択性である。なぜなら、これらの細胞における野生型プロモーター（Ｅ１Ａ  ＲＮＡ  ４４９１〜１６４７５単位／Ａｄゲノム）は、腫瘍細胞におけるのと同程度活性であったからである（Ｅ１Ａ  ＲＮＡ  １４６４〜２６４７１単位／Ａｄゲノム、表７）。これらのデータによって、Ｅ２Ｆ−１プロモーターによる野生型プロモーターの置換が、腫瘍選択性Ｅ１Ａ発現を誘導すること、およびＥ２Ｆ−１プロモーターが腫瘍細胞においては実質的な転写活性を運搬するが、非腫瘍細胞においては運搬しないことが示された。
【０１１４】
Ｅ２Ｆ−１プロモーターを欠くウイルスベクターにおけるＥ１Ａ遺伝子発現は、Ｅ２Ｆ−１プロモーターのＥ１Ａ遺伝子発現依存性の指標である。本発明者らは、高用量のＡｒ６ｐＡＦ感染細胞から発現された２〜６０単位／ＡｄのゲノムＥ１Ａ  ＲＮＡを観察した（表６）が、陰性コントロールのＡｄｄ／３１２感染細胞では、Ｅ１Ａ  ＲＮＡはほとんど検出されなかった（表６）。選択性Ｅ２Ｆ−１プロモーターによって発現された３８１〜２６５５単位／Ａｄのゲノム  Ｅ１Ａ  ＲＮＡに比べて、Ｅ２Ｆ−１プロモーターを欠くＡｒ６ｐＡＦによって発現されたＥ１Ａ  ＲＮＡのレベルは極めて低かった。ＦＡＣＳ分析によるＥ１Ａタンパク質レベルの研究において、５０ｐｐｃのＡｒ６ｐＡＦで感染したＡ５４９細胞において、０．１％のＥ１Ａ陽性細胞集団を検出した。Ｅ１Ａ  ＲＮＡ分析は、Ｅ１Ａタンパク質分析と一致しており、そしてアデノウイルス骨格中の非選択性のプロモーターによって潜在的に転写された微量のＥ１Ａ遺伝子を示す。
【０１１５】
表７．Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染細胞における相対的Ｅ１Ａ遺伝子発現
【０１１６】
【表７】
2004529627.tif 000011
【０１１７】
１００ｐｐｃ  Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを用いて細胞を感染させて、腫瘍細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、およびＰａｎｃ−１）対、正常な非腫瘍細胞（初代肝細胞(Primary
hepatocytes)、ＳＡＥＣ，およびＰｒＥＣ）における、相対的なＥ１Ａ発現を比較した。データは２つの実験の平均を示す。
【０１１８】
４．２．４  腫瘍細胞および正常細胞における細胞周期
細胞周期制御の調節解除によって、遊離のＥ２Ｆタンパク質（Ｅ２Ｆ−１プロモーターのトランス活性化に必要である）を上方制御する。本研究においては、細胞周期分析によって、培養中の腫瘍細胞が非常に増殖しており（３９〜５９％、Ｓ期）、非腫瘍ＳＡＥＣが増殖しており（２２％、Ｓ期）、そして初代肝細胞が静止していた（０．３％、Ｓ期、表３）ことが示された。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染腫瘍細胞におけるＥ２Ｆ−１プロモーター活性（１０〜８４％、相対的Ｅ１Ａ  ＲＮＡ）は、増殖しているＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染ＳＡＥＣにおいて、より高かった（０．７％相対的、Ｅ１Ａ  ＲＮＡ、表７）。このことは、Ｅ２Ｆ−１プロモーターのトランス活性化が、増殖している非腫瘍細胞においてよりも腫瘍細胞において、より有効であることを示唆するが、統計学的有意性は、依然として未定のままである。
【０１１９】
４．２．５  Ｈｅｐ３Ｂおよび初代肝細胞におけるアデノウイルスの複製
Ｅ１Ａ発現のレベルが、ウイルスのライフサイクルの後期段階に影響を有したか否かという疑問は依然として残った。本発明者らは、Ａｄｄ／１５２０（原型の複製ベースの選択的腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター）と比較し、そして現在の臨床試験において、ＡＲ６ｐＡＥ２ｆＦ  ＤＮＡ複製を測定した（Ｈｅｉｓｅ  ＣＣら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｊｕｎ  １；５９（１１）：２６２３〜８、Ｇａｎｌｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００  Ｍａｒ；６：７９８〜８０６）。Ａｄｄ／３２７、およびＡｄｄ／３１２は、陽性および陰性の複製コントロールとして含まれた。予備的研究として、Ｈｅｐ３Ｂおよび初代肝細胞において比較を行った。これらの２つの細胞タイプの間のウイルス形質導入における５倍の差異のせいで（表５）、表８におけるアデノウイルスＤＮＡコピー数は、お互いに直接比較することはできない。従って、２つの細胞タイプにおけるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ  ＤＮＡコピー数を、Ａｄｄ／３２７  ＤＮＡコピー数と比較した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを用いた感染後２４時間で、Ｈｅｐ３ＢにおけるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの相対的複製能力（４４％）は、初代肝細胞における相対的複製能力（５％）よりも約１０倍高かった。選択的なウイルスＤＮＡ複製がまた、Ｈｅｐ３Ｂ（２９％）および初代肝細胞（５％）においてＡｄｄ／１５２０を用いて観察された。これらのデータは、Ｈｅｐ３Ｂにおける選択的Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ  ＤＮＡ複製が、Ｈｅｐ３Ｂにおける選択的Ｅ１Ａ遺伝子発現と一致することを示す（表６）。Ａｄｄ／１５２０の選択的複製のレベルに比べて、ＡＲ６ｐＡＥ２ｆＦの選択的複製のレベルが同様であることによって、Ｅ２Ｆ−１プロモーター依存性Ｅ１Ａ発現が、腫瘍殺傷活性に潜在的に十分であるウイルスＤＮＡ複製を媒介し得ることが示される。
【０１２０】
表８．Ｈｅｐ３Ｂおよび初代肝細胞
(Hepatocytes) におけるアデノウイルスＤＮＡ複製
【０１２１】
【表８】
2004529627.tif 000012
【０１２２】
示したベクターを用い、１細胞あたり１０粒子を用いて細胞を２時間感染させ、洗浄して、３７℃で２４時間インキュベートした。アデノウイルスのヘキソンＤＮＡについての定量的ＰＣＲアッセイによって、アデノウイルスＤＮＡコピーを測定した。数は、２重のサンプルの平均を表す。
【実施例５】
【０１２３】
実施例５：Ｈ４６０モデル（ヌードマウスにおける異種移植片モデル）におけるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ腫瘍崩壊性ベクターの腫瘍内投与の有効性
本研究において、本発明者らは、ヌードマウスにおける皮下の異種移植片モデルにおいて、腫瘍崩壊性ベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦが、あらかじめ樹立されたヒト非小細胞肺癌腫瘍の増殖および進行を阻害する能力を試験した。結果として、ヌードマウスにおけるＨ４６０異種移植片腫瘍に対する、５×１０８、５×１０９、または５×１０１０粒子／用量／日の用量での、５日間毎日のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内注射が、腫瘍増殖において、用量依存性の阻害をもたらすことが示された。さらに、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、全ての処置群における動物の中央生存時間を、ＨＢＳＳ処理したコントロール群と比べた場合、有意に増大させた。任意の処置群またはコントロール群の間の平均体重変化において有意な差異はなく、そして腫瘍崩壊性ベクター処置の結果として死亡も無かった。インビボにおける崩壊性ベクター機能のアセスメントによって、Ｅ１Ａ−ＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した場合、全てのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの用量群において、Ｅ１Ａが腫瘍内で発現されることが明らかになった。アデノウイルスのヘキソン遺伝子特異的ＰＣＲによって、肝臓および肺における予備的なベクターの組織分布を決定した。結果として、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを５×１０１０粒子／用量／日で腫瘍内で用いて処置した動物は、肝臓（１．７３±０．７７コピー／細胞）、および肺（１．２５±０．７９コピー／細胞）の両方にベクターＤＮＡが存在したことが示された。それにもかかわらず、Ｅ１Ａ発現は、それらの同じ組織では最小であった。これらの結果によって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内注射が、有意な用量依存性腫瘍増殖阻害および腫瘍特異的Ｅ１Ａ発現をもたらすことが示される。
【０１２４】
５．１  方法
５．１．１  ウイルスおよび腫瘍細胞株
腫瘍崩壊性ベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、Ｅ３欠失アデノウイルスベクターであって、ネイティブなＥ１ＡプロモーターがＥ２Ｆ−１プロモーターで置換されており、パッケージングシグナルは、左側ＩＴＲから右側ＩＴＲに移動されており、そしてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが、左側ＩＴＲとＥ２Ｆ−１プロモーターとの間に挿入されている。Ａｄｄ／３２７は、Ｅ３のＸｂａｌＤフラグメント（ｂｐ  ２８，５９２〜３０，４７０）が欠失している（これによって、Ｅ３−１２．５Ｋ遺伝子以外の全てのＥ３遺伝子の欠失が生じる）複製コンピテントな血清型５型のアデノウイルスである（Ｔｏｌｌｅｓｆｏｎ  ＡＥら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９６  Ａｐｒ；７０（４）２２９６〜３０６，Ｙｏｕｎｇ  ＣＳＨら、Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｎｅｓｂｅｒｇ  ＨＳ編、Ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｖｉｌｏｌｏｇｙ  第４巻、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ．１９８４：１２５〜１７２））。このウイルスは、複製コンピテントな陽性コントロールＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦとして用いられ、そしてＡｄｄ／３２７は、標準的なＣｓＣｌ勾配精製法を用いて調製された。ベクター濃度を、光学的な粒子タイター（滴定）によって決定した（Ｍｉｔｔｅｒｄｅｒ  Ｎ，Ｍａｒｃｋ  ＫＬ、およびＴｒａｐｎｅｌｌ  ＢＣ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９６；７０：７４９８〜７５０９）。
【０１２５】
ヒトの非小細胞肺癌株Ｈ４６０（大細胞肺癌、ＮＣＩ−Ｈ４６０；ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１７７  ロット番号９４５７７８）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得て、マイコプラズマ汚染がないことを確認した。Ｈ４６０細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地（１０％ＦＢＳ、４．５ｇ／Ｌグルコース、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１．５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウムを含有）中で培養する。
【０１２６】
５．１．２  マウス腫瘍モデルの研究
雌性の胸腺欠損非近交系ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）（６〜８週齢）に、３×１０６個の細胞（０．１ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁した）を、右脇腹に皮下に移植した。ノギスを用いて腫瘍測定値を（２つの次元で）週に２回記録した。腫瘍容積を、以下の式［（Ｗ×Ｌ）／４］３πによって算出した。体重を、この研究の期間中、週に１回記録した。腫瘍容積が、１００〜２５０ｍｍ３に達した場合、動物を無作為に群に分けて、５日連続して、５０μｌの容積中で、５×１０８粒子／用量／日（ｎ＝１３）、５×１０９粒子／用量／日（ｎ＝１３）、または５×１０１０粒子／用量／日（ｎ＝１２）を用いて腫瘍内に注射した。陰性コントロール群には、ＨＢＳＳ（ｎ＝１３）を、そして陽性コントロール群には、Ａｄｄ／３２７（ｎ＝１２）を５×１０１０粒子／用量／日で、これも５日連続して注射した。最後の腫瘍内注射の４日後（研究９日目）、１群あたり５匹の動物を安楽死させて、全体の検死を実施した。腫瘍のサンプルを分けて、肝臓および肺をＥ１Ａ  ＲＴ−ＰＣＲ、およびヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲ分析のために収集した。Ｅ１Ａ  ＲＴ−ＰＣＲサンプルを、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）に入れて、４℃に２４時間保ち、次いで処理するまで−２０度で保管した。ヘキソンＰＣＲサンプルを急速凍結させて、処理するまで−７０℃で保管した。
【０１２７】
５．１．３  分子分析
アデノウイルスＤＮＡ定量
Ｑｉａｇｅｎ  ＢｌｏｏｄおよびＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉ、またはＭｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて、組織からＤＮＡを単離した。凍結した組織を部分的に融解して、滅菌のディスポーザブル外科用小刀メスを用いてミンスした。次いで、０．２ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅＡおよび０．１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼを含有するＱｉａｇｅｎ緩衝液Ｇ２中での一晩のインキュベーションによって組織を溶解した。溶解物を短時間ボルテックスし、次いでＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ  １００またはＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ２５カラムに付与した。製造業者の指示に記載のとおり、カラムを洗浄して、ＤＮＡを溶出させた。沈殿後、水にＤＮＡを溶解して、濃縮物を分光光度的に（Ａ２６０およびＡ２８０）決定した。実施例４に記載のように、ヘキソン遺伝子の定量的ＰＣＲ検出によって、アデノウイルスコピー数の定量を決定した。
【０１２８】
アデノウイルスＥ１Ａ  ＲＮＡ定量
組織サンプルを収集し、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｏｎ，ＴＸ）中に直接入れて、４℃で保管した。ＲＮＡ単離のために、滅菌外科用小刀を用いて、組織を約１００〜２００ｍｍ３の小片に切断した。ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ中での破壊後、サンプルを、０．１容積のクロロホルムで抽出した。１容積のイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、７５％エタノールを用いて洗浄し、ヌクレアーゼを含有しない水に再懸濁した。次いで、１０単位のＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、室温でＲＮＡサンプルを処理して、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製した。ＲＮＡ濃度を、分光光度的に（Ａ２６０およびＡ２８０）決定した。逆転写およびＰＣＲ分析を実施例４に記載のとおり、実施した。
【０１２９】
５．１．４  統計的分析
ＳｉｇｍａＳｔａｔプログラムを用いて、統計的試験を行った。多重比較のために用いたチューキーの検定による反復測定一元分散分析によって、平均腫瘍容積を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを用いるマンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）ログランク検定によって動物の生存を分析した。
【０１３０】
５．２  結果
５．２．１  腫瘍容積
非小細胞肺癌の皮下異種移植片モデルを用いて、腫瘍崩壊性アデノウイルスＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの有効性を評価した。ヌードマウスへの皮下注射後１週から２週の間に、Ｈ４６０細胞は、１００〜２５０ｍｍ３の腫瘍を形成した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの、５×１０８（ｎ＝１３）、５×１０９（ｎ＝１３）、または５×１０１０（ｎ＝１２）の粒子／用量／日の用量での、５日連続の腫瘍内注射は、全てが、ＨＢＳＳ（ｎ＝１３）注射したコントロールに比べて、研究の１６日目までの腫瘍増殖の有意な阻害を示した（ｐ＜０．０５  ＲＭ  ＡＮＯＶＡ）（図９、表９）。高用量群（５×１０１０）における１６日目の腫瘍容積は、低用量群（５×１０８）における腫瘍容積とは有意に異なった。このことは、用量依存性の抗腫瘍応答（ｔ検定によって、ｐ＝０．００７）を実証する。陽性コントロールウイルスＡｄｄ／３２７の腫瘍内注射（ｎ＝１２）もまた、有意な腫瘍増殖阻害をもたらした（ｐ＜０．０５）。
【０１３１】
表９．Ｔ／Ｃ値
【０１３２】
【表９】
2004529627.tif 000013
【０１３３】
Ｔ／Ｃ（％）＝ＨＢＳＳコントロール群を上回る処置群についての平均腫瘍容積（％）（研究の１６日目に決定）。
【０１３４】
５．２．２  生存
長期生存の比較（図１０）によって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの全ての用量を用いた腫瘍の処置が、陰性コントロール動物を上回って生存を有意に増大させた（５×１０１０粒子／用量／日、５×１０９粒子／用量／日、および５×１０８粒子／用量／日について、それぞれ、ｐ＝０．０００２、ｐ＝０．００９、およびｐ＝０．０１１１）ことが示される。中央生存時間は、ＨＢＳＳ処置した動物についての１６日目から、５×１０８粒子／用量／日、および５×１０９粒子／用量／日で処置したＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦについての２２日目へ、そして５×１０１０粒子／用量／日のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦで処置した動物の２９日目へ増大した。陽性コントロールウイルスであるＡｄｄ／３２７で処置したマウスの長期生存は、陰性コントロール動物をこえて、有意に増大し（ｐ＜０．００１）、そして８０％のＡｄｄ／３２７処置マウスが、この研究の最後まで生存した。
【０１３５】
５．２．３  体重
この研究の期間中、全ての群について体重は増大した。平均体重の比較は、全ての処置群とコントロール群との間で有意な差異を示さなかった（表１０）。
【０１３６】
表１０．Ｈ４６０腫瘍保有マウスからの平均体重
【０１３７】
【表１０】
2004529627.tif 000014
【０１３８】
示した研究日に体重を測定した。研究の１日目にマウスを処置した。値は、平均±ＳＥを表す。
【０１３９】
５．２．４  腫瘍中のＥ１Ａ発現
各々の用量群由来の５匹の動物から研究の９日目に単離した腫瘍サンプルを、Ｅ１Ａの発現について分析することによって、インビボにおける腫瘍崩壊性ベクターの機能の評価を決定した。Ｅ１Ａ  ＲＮＡの逆転写と、その後のＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによって、Ｅ１Ａ発現の検出および相対的定量を実行した。総ＲＮＡの１ｎｇあたりの平均Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位±標準誤差として、データを記録した（表１１）。陽性コントロールウイルスであるＡｄｄ／３２７（５×１０１０粒子／用量／日）を用いて処置したサンプルは、６３５１±８７１  Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ）の、最高の相対的Ｅ１Ａを有することが見出された。全てのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ処置した腫瘍サンプルは、それぞれ５×１０１０粒子／用量／日、５×１０９粒子／用量／日、および５×１０８粒子／用量／日の用量群について、５０６４±１９６９、３２９１±１４７、および３９９３±１９５１のＥ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ）の相対的Ｅ１Ａ  ＲＮＡ値を有するＥ１Ａメッセンジャーを発現した。ＨＢＳＳで処置した腫瘍サンプルは、わずかに検出可能なレベルのＥ１Ａ  ＲＮＡ存在を有することが見出された。
【０１４０】
表１１．腫瘍および遠位組織におけるＥ１Ａ発現
【０１４１】
【表１１】
2004529627.tif 000015
【０１４２】
研究の９日目に単離した組織サンプルからの平均のＥ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ）±ＳＥ。Ｅ１Ａプラスミドコピー数コントロールに対して、ＲＮＡ単位を決定する。ＮＤは、未決定（未検）（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）。
【０１４３】
５．２．５  ベクター組織分布およびＥ１Ａ発現
Ｅ１Ａ  ＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（５×１０１０粒子／用量／日）を用いて腫瘍内処置した動物由来の肝臓および肺を、Ｅ１Ａの発現について分析することによって、予備的なベクター組織分布を評価した（表１１）。さらに、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターＤＮＡが、Ｅ１Ａ発現の非存在下でさえ存在するか否かを確認するために、同じ肝臓および肺において、ヘキソン遺伝子ＤＮＡ  ＰＣＲアッセイによって、ベクターゲノムコピー数を評価した（表１２）。ヘキソンＤＮＡコピー数によって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターＤＮＡは、肝臓（１．７３±０．７７コピー／細胞）、および肺（１．２５±０．７９コピー／細胞）の両方において存在することが示された。Ａｄｄ／３２７ベクターＤＮＡはまた、肝臓および肺において検出された（それぞれ、０．６２±０．５１、および０．０６±０．０７）。
【０１４４】
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ処置マウスについて、Ｅ１Ａ発現は、肝臓（０．０２９±０．０１４  Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ））および肺（０．２０９±０．０７７  Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ））においてわずかに検出可能であった。Ｅ１Ａ発現は、Ａｄｄ／３２７処置マウスの肝臓（２．４９±１．５７）において高く、そして肺（０．３２±０．２１）において同様であった（表１１）。
【０１４５】
表１２．ヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲの結果
【０１４６】
【表１２】
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【０１４７】
研究９日目に単離したサンプル由来のヘキソン遺伝子特異的ＰＣＲアッセイによって決定したウイルスゲノムコピー。平均ヘキソンＤＮＡコピー／細胞±ＳＥを列挙している。ＮＤ−未決定（未検）（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）。
【実施例６】
【０１４８】
実施例６：Ｈｅｐ３Ｂモデル（ヌードマウスにおける異種移植片）におけるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ腫瘍崩壊性ベクターの腫瘍内投与の有効性
本研究において、本発明者らは、ヌードマウスにおける皮下の異種移植片モデルにおいて、予め樹立されたヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）腫瘍の増殖および進行を、腫瘍崩壊性ベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦが阻害する能力を試験した。結果として、ヌードマウスにおけるＨｅｐ３Ｂ異種移植片へのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの、５×１０８粒子／用量／日、５×１０９粒子／用量／日、または５×１０１０粒子／用量／日の用量での、５日毎日の腫瘍内注射が、腫瘍増殖において用量依存性の阻害をもたらすことが示された。さらに、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、全ての処置群において、ＨＢＳＳ処置したコントロール群と比べて、動物の中央生存時間を有意に増大させた。任意の処置群またはコントロール群の間で平均体重変化において有意な差異は無く、そして腫瘍崩壊性ベクター処置の結果としての死亡もなかった。インビボにおける崩壊性ベクター機能のアセスメントによって、Ｅ１Ａ−ＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した場合、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（５×１０１０粒子／用量／日）の用量群において、Ｅ１Ａが腫瘍内で発現されることが明らかになった。アデノウイルスヘキソン遺伝子特異的ＰＣＲによって、肝臓および肺における予備的なベクターの組織分布を決定した。結果として、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを５×１０１０粒子／用量／日で、腫瘍内で用いて処置した動物は、肝臓（０．５０±０．６２コピー／細胞）、および肺（０．８０±０．９３コピー／細胞）の両方にベクターＤＮＡが存在したことが示された。それにもかかわらず、Ｅ１Ａ発現は、それらの同じ組織では最小であった。これらの結果によって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内注射が、有意な用量依存性腫瘍増殖阻害および腫瘍特異的Ｅ１Ａ発現をもたらすことが示される。
【０１４９】
ヒトの肝細胞癌株Ｈｅｐ３Ｂ（Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７；ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４、バッチ番号Ｆ−９４６２）を、Ａｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得て、マイコプラズマ汚染がないことを確認した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、Ｅａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ）（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有）中で培養する。
【０１５０】
６．１  方法
６．１．１  マウス腫瘍モデル研究
雌性の胸腺欠損非近交系ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）（６〜８週齢）に、１×１０７個のＨｅｐ３Ｂ細胞（０．１ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁した）を、右脇腹に皮下に移植した。ノギスを用いて腫瘍測定値を（２つの次元で）週に２回記録した。腫瘍容積を、以下の式［（Ｗ×Ｌ）／４］３πによって算出した。体重を、この研究の期間中、週に１回記録した。腫瘍容積が、１００〜２５０ｍｍ３に達した場合、動物を無作為に群に分けて、５日連続して、５０μｌの容積中で、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを、５×１０８粒子／用量／日（ｎ＝１１）、５×１０９粒子／用量／日（ｎ＝１１）、または５×１０１０粒子／用量／日（ｎ＝１０）で用いて腫瘍内に注射した。陰性コントロール群には、ＨＢＳＳ（ｎ＝１０）を、そして陽性コントロール群には、Ａｄｄ／３２７（ｎ＝１１）を５×１０１０粒子／用量／日で、これも５日連続して注射した。ベクター分布およびＥ１Ａ発現の分子分析のために、上記のとおり、１群あたりさらに５匹の動物を処置した。最後の腫瘍内注射の４日後（研究９日目）、１群あたり５匹の動物を安楽死させて、全体の検死を実施した。Ｅ１Ａ  ＲＴ−ＰＣＲ、およびヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲ分析のために、腫瘍、肝臓および肺の別々のサンプルを収集した。Ｅ１Ａ  ＲＴ−ＰＣＲサンプルを、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）に入れて、４℃に２４時間保ち、次いで処理するまで−２０度で保管した。ヘキソンＰＣＲサンプルを急速凍結させて、処理するまで−７０℃で保管した。
【０１５１】
６．１．２  分子分析
分子分析；組織からのＤＮＡ単離；ヘキソンＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイ；組織からのＲＮＡ単離；ｃＤＮＡ合成；ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲおよび統計的分析によるＥ１Ａ発現の検出および相対的定量を、実施例５に記載のように実施した。
【０１５２】
６．２  結果
６．２．１  腫瘍容積
肝細胞癌の皮下異種移植片モデルを用いて、腫瘍崩壊性アデノウイルスＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの有効性を評価した。ヌードマウスへの皮下注射後１週から２週の間に、Ｈ４６０細胞は、１００〜２５０ｍｍ３の腫瘍を形成した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの、５×１０８（ｎ＝１１）、５×１０９（ｎ＝１１）、または５×１０１０（ｎ＝１０）の粒子／用量／日の用量での、５日連続の腫瘍内注射は、全てが、ＨＢＳＳ（ｎ＝１０）注射したコントロールに比べた場合、研究の２５日目までの腫瘍増殖の有意な阻害（ＲＭ  ＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０５）を示した（図１１）。高用量群および中用量群（５×１０１０および５×１０９粒子／用量／日）における３２日目の腫瘍容積は、低用量群（５×１０８）における腫瘍容積とは有意に異なった。このことは、用量依存性の抗腫瘍応答（ｔ検定によって、ｐ＝０．０５）を実証する。陽性コントロールウイルスであるＡｄｄ／３２７の腫瘍内注射（ｎ＝１１）もまた、ＨＢＳＳ注射したコントロールに比べて、有意な腫瘍増殖阻害をもたらした（ｐ＜０．０５）。
【０１５３】
処置／コントロール（Ｔ／Ｃ）パーセントとして表した研究の２５日目の腫瘍容積データを、表１３に示す。これらの結果は、用量依存性の抗腫瘍応答を示す。このとき、Ｔ／Ｃは、低用量については２９．５、そして高用量群については１２．８である。
【０１５４】
表１３．Ｔ／Ｃ値
【０１５５】
【表１３】
2004529627.tif 000017
【０１５６】
Ｔ／Ｃ（％）＝ＨＢＳＳコントロール群を上回る処置群についての平均腫瘍容積（％）（研究の２５日目に決定）。
【０１５７】
６．２．２  生存
生存の比較（図１２）によって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦまたはＡｄｄ／３２７の全ての用量を用いた腫瘍の処置が、ＨＢＳＳ処置したコントロール動物よりも生存を有意に増大させた（全ての群について、マンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）ログランク検定によって、ｐ＝０．０００１）ことが示される。中央生存時間は、ＨＢＳＳ処置した動物について３２日目であって、他全ての処置群については不明確であった。なぜなら、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ処置した動物の１００％が、この研究の最後（３２日目）まで生存していたからである。陽性コントロールウイルスであるＡｄｄ／３２７で処置したマウスの長期生存は、陰性コントロール動物をこえて、有意に増大し（ｐ＜０．０００１）、そして１００％のＡｄｄ／３２７処置マウスが、この研究の最後まで生存した。
【０１５８】
６．２．３  体重
平均体重の比較によって、全ての処置群とコントロール群との間で有意な差異は示されなかった（表１４）。
【０１５９】
表１４．Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍保有マウスからの平均体重
【０１６０】
【表１４】
2004529627.tif 000018
【０１６１】
示した研究の週に体重を測定した。値は、平均±ＳＥを表す。
【０１６２】
６．２．４  ベクターの組織分布、およびＥ１Ａ発現
ＨＢＳＳ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（５×１０１０粒子／用量／日）、およびＡｄｄ／３２７（５×１０１０粒子／用量／日）を用いた腫瘍内処置した動物由来の、腫瘍、肝臓、および肺を、Ｅ１Ａの発現について、Ｅ１Ａ  ＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、分析することによって、予備的なベクター組織分布を評価した（表１５）。Ｅ１Ａ  ＲＮＡの逆転写と、その後のＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによって、Ｅ１Ａ発現の検出および相対的定量を実行した。総ＲＮＡの１ｎｇあたりの平均Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位±標準誤差として、データを報告した。陽性コントロールウイルスであるＡｄｄ／３２７（５×１０１０粒子／用量／日）を用いて処置した腫瘍サンプルは、７２３±３５３（Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ））の、相対的Ｅ１Ａを有した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（５×１０１０粒子／用量／日）処置した腫瘍サンプルはまた、８６９±２３５（Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ））の相対的Ｅ１Ａ  ＲＮＡ値を有するＥ１Ａメッセンジャーを発現した。ＨＢＳＳで処置した腫瘍サンプルは、Ｅ１Ａ  ＲＮＡがほとんど、または全く存在しないことが見出された（０．０１±０．０１単位／総ＲＮＡ（ｎｇ））。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ処置したマウスの遠位組織のＥ１Ａ発現は、肝臓（０．１８±０．１４  Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ））、および肺（０．４５±０．４０  Ｅ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ））においては、かろうじて検出可能であった。Ｅ１Ａ発現は、Ａｄｄ／３２７処置したマウスの肝臓（０．０７±０．０４）、および肺（０．１４±０．０７）において同様であった。
【０１６３】
表１５．腫瘍および遠位組織におけるＥ１Ａ発現
【０１６４】
【表１５】
2004529627.tif 000019
【０１６５】
研究の９日目に単離したサンプルからの平均のＥ１Ａ  ＲＮＡ単位／総ＲＮＡ（ｎｇ）±ＳＥ。Ｅ１Ａプラスミドコピー数コントロールに対して、ＲＮＡ単位を決定する。
【０１６６】
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターＤＮＡが、存在するか否かを確認するために、同じ腫瘍、肝臓および肺において、ヘキソン遺伝子ＤＮＡ  ＰＣＲアッセイによって、ベクターゲノムコピー数を評価した（表１６）。ヘキソンＤＮＡコピー数によって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターＤＮＡは、腫瘍（３１１±１５０）、肝臓（０．５０±０．６２コピー／細胞）、および肺（０．８０±０．９３コピー／細胞）において存在することが示された。Ａｄｄ／３２７ベクターＤＮＡはまた、腫瘍（２９１．４０±８９．３６）、肝臓（０．３４±０．１５）、および肺（０．１７±０．１４）において検出された。
【０１６７】
表１６．ヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲの結果
【０１６８】
【表１６】
2004529627.tif 000020
【０１６９】
研究９日目に単離したサンプル由来のヘキソン遺伝子特異的ＰＣＲアッセイによって決定したウイルスゲノムコピー。平均ヘキソンＤＮＡコピー／細胞±ＳＥを示す。
【実施例７】
【０１７０】
実施例７：Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのゲノムにおける、Ｅ３領域の再構築、Ｅ１Ｂ−１９ｋＤ遺伝子の欠失、ならびにＥ３領域の再構築、およびＥ１Ｂ−１９ｋＤ遺伝子の欠失の組み合わせ。
７．１  ベクター構築
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ骨格中で改変した腫瘍崩壊性ベクターを生成して、野生型Ｅ３領域を再構築させるか、Ｅ１Ｂ−１９ｋＤ遺伝子を欠失させるか、またはＥ３およびＥ１Ｂ−１９ｋＤ改変を組み合わせた。
【０１７１】
７．１．１  Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦＥ３Ｆの構築
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、Ａｄｄ／３２７骨格に基づき、これは、Ｅ３領域の１８７８ヌクレオチドＸｂａＩフラグメントを欠き、Ｅ３中に固有のＸｂａＩ部位を残している（Ａｄ５におけるヌクレオチド２８５９２，ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０）。Ａｒ６ｐＥ２ｆＦベクター中のＥ３領域全体を再生成するため、Ｅ３領域の欠失部分を含む、アデノウイルス５型（ヌクレオチド２８５９３〜３０４７０）由来の１８７８ヌクレオチドのＸｂａＩフラグメントを、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ右アームシャトル中の単一のＸｂａＩ部位に挿入した。感染性のアデノウイルスプラスミドを、記載のとおり（Ｈｅら、１９９８．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＰＮＡＳ  ９５，２５０９〜２５１４）相同組み換えによって細菌中で生成した。このウイルスは、実施例１において上記したとおりに生成した。このベクターをＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆと命名した。
【０１７２】
７．１．２  Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｄＩ１９Ｋの構築
Ａｒ６ｐＡＥ２Ｆ骨格からＥ１ｂ  １９Ｋタンパク質を取り除くため、ヌクレオチド１７１６〜２０１０（Ａｄ５において番号付けした、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０）を、左末端Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦシャトルプラスミドから欠失させた。感染性アデノウイルスプラスミドを、記載のとおり（Ｈｅら、１９９８．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＰＮＡＳ  ９５，２５０９〜２５１４）相同組み換えによって細菌中で生成した。このウイルスは、実施例１において上記したとおりに生成した。このベクターをＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦｄＩ１９Ｋと命名した。
【０１７３】
７．１．３  Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３ｄＩ１９Ｋの構築
Ｅ３付加（７．１．１の節に記載）、およびＥ１ｂ  １９ｋの欠失（７．１．２の節に記載）の両方を含む感染性アデノウイルスプラスミドを、記載のとおり（Ｈｅら、１９９８．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＰＮＡＳ  ９５，２５０９〜２５１４）相同組み換えによって細菌中で生成した。このウイルスは、実施例１において上記したとおりに生成した。このベクターをＡｒ６ｐＡＥ２ｆｄＩ１９ＫＥ３Ｆと命名した。
【０１７４】
７．２  インビトロの細胞毒性
腫瘍細胞および初代の非腫瘍細胞において、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ対、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｄＩ１９ｋ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３ｄＩ１９Ｋの腫瘍崩壊性ベクターの細胞毒性を比較するため、細胞殺傷のための定量的方法を利用した（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによる、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＡｓｓａｙ、または「ＭＴＳアッセイ」）。
【０１７５】
試験した腫瘍細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な、Ｈ４６０（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１７７）、Ｈ１２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８０３）、およびＰＡＮＣ−Ｉ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ＃１４６９）、ならびに初代非腫瘍細胞ＰＲＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ＃ＣＣ２５５５）であった。ウイルス感染の１日前に、９６ウェルディッシュに細胞をプレートした。１ウェルあたりの細胞の数を、それらが、ウイルス感染の時点で６０〜８０％コンフルエントであるように、各細胞タイプについて実験的に決定した。
【０１７６】
翌日、アデノウイルスベクターを用いて細胞を感染させた。試験されるべきアデノウイルスを、シグモイドの用量応答曲線を生じた用量範囲にわたって、増殖培地中で４倍連続希釈した。各々のウイルスの９連続希釈を、最高用量で開始して、このプレートにまたがって、１０μｌ中に添加した。ブランクウェルおよびコントロールウェルに対して、感染の時点で、ウイルスなしの１０μｌの培地を添加して、全てのウェルの総容積を１００μｌにさせた。次いで、このプレートを、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で７日間インキュベートさせた。
【０１７７】
製造業者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＡｓｓａｙ）に従って、ＭＴＳアッセイを実施した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＡｓｓａｙは、新規なテトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−フルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；ＭＴＳ）および電子共役試薬フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を用いる。
【０１７８】
７．２．１．結果
腫瘍細胞株において、試験した改変ＡＲ６ｐＡＥ２ｆＦ腫瘍崩壊性ベクターの全て（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦｄＩ１９Ｋ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦＥ３ｄＩ１９Ｋ）が、平均ＬＤ５０値によって実証されるとおり、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦウイルスよりも良好な殺傷活性を示した（表１７）。Ｈ４６０細胞において、３つの改変したＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ腫瘍崩壊性ベクターについて算出した平均ＬＤ５０値は、１４．７〜３４．２に及んだ。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦについて、平均ＬＤ５０値は、１５９であった。このことは、この改変された腫瘍崩壊性ベクターについての細胞殺傷活性の１０〜４．６倍の増大を示す。ＰＡＮＣ１細胞においては、３つの改変された腫瘍崩壊性ベクターについての平均ＬＤ５０値は、９．６〜２０．７に及んだが、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦについての平均ＬＤ５０値は、８７であった。このことは、この改変された腫瘍崩壊性ベクターについての細胞殺傷活性の９〜４．２倍の増大を表す。Ｈ１２９９細胞においては、この改変された腫瘍崩壊性ベクターについての平均ＬＤ５０値は、２３〜５３に及んだが、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦについてのＬＤ５０値は、７９であって、この改変された腫瘍崩壊性ベクターについての細胞殺傷活性の３．４〜１．４倍の増大であった。
【０１７９】
正常のＰＲＥＣ細胞においては、対照的に、この３つの改変された腫瘍崩壊性ベクターについて算出された平均ＬＤ５０値は、９８．４〜１５８に及んだが、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦについての平均ＬＤ５０値は、３９であって、このことは、この３つの改変された腫瘍崩壊性ベクターについての殺傷活性の２．５〜４．１分の１の減少を表す。
【０１８０】
表１７．腫瘍細胞株および正常細胞における腫瘍崩壊性ベクターの細胞毒性
【０１８１】
【表１７】
2004529627.tif 000021
【０１８２】
ＭＴＳアッセイにおいて算出したＬＤ５０値を示す。吸光度単位を、感染していないコントロール値のパーセントに転換して、対数スケール上にベクター用量に対してプロットした。シグモイド用量応答曲線を、このデータにあてはめて、各々のベクターについてのＬＤ５０値を決定した。＊は、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦに対するｐ＜０．０５（Ｔ検定による）。ｎ＝複製の数。
【０１８３】
７．２．２  まとめ
３つの改変した腫瘍崩壊性ベクターの細胞変性の効果は、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターに対してよりもお互いに対して、より密接に関連していた。親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦゲノムにおけるアデノウイルスＥ３領域の挿入、またはＥ１ｂ−１９ｋ遺伝子の欠失は、腫瘍細胞株の殺傷を効率的に増大するが、正常な初代細胞培養物の殺傷を低下させる。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦゲノムにおける、Ｅ３挿入、およびＥ１ｂ−１９Ｋ欠失の組み合わせは、細胞殺傷活性において相乗的な効果を提供しないと考えられた。
【０１８４】
７．３  インビトロのベクター複製
腫瘍対、初代細胞培養物における腫瘍崩壊性ベクター産物の選択性を決定した。要するに、腫瘍細胞株Ｈ４６０および初代非腫瘍細胞ＰＲＥＣを、同一用量のアデノウイルスベクターで感染させた。３日後、および６日後、細胞を回収して、粗溶解物を、ＡＥ１２ａ指標細胞上でのＴＣＩＤ５０アッセイによってタイター（力価測定）した（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９６．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ２ａ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６，４１７３〜４１７８）。
【０１８５】
７．３．１  結果
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｄＩ１９ｋＥ３Ｆ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆｓＩ１９ｋＦによるベクターの力価は、感染後６日時点で、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦについて観察されたレベルよりも、それぞれ１０倍、３倍、および２．４倍高かった（表１８）。Ｅ３領域全体、もしくはＥ１Ｂ−１９ｋ欠失、または両方の改変を含む腫瘍崩壊性ベクターについて、６日目の力価は、３日目の力価と比べて、＞２５０倍に増大した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターについて、３日目と６日目との間の力価における差異は、わずか２５倍であった。初代非腫瘍細胞について、３つの新しい腫瘍崩壊性ベクターが生成したベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターが生成したよりもわずかに少なかった。
【０１８６】
表１８．腫瘍細胞株および正常細胞におけるベクター産生
【０１８７】
【表１８】
2004529627.tif 000022
【０１８８】
示した細胞を、１粒子／細胞の用量で感染させた。示されるデータは、感染後の示された日に、ＴＣＩＤ５０によって決定したプラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌである（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ＤＲら、１９９４  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ６  Ｉｎ：Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，第１３２〜１３４頁）。
【０１８９】
７．３．２  まとめ
試験した腫瘍細胞株において、Ｅ３領域の再構築、もしくはＥ１Ｂ−１９ｋ遺伝子の欠失、または両方の組み合わせは、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターよりも多い量のウイルスの産生を生じた。初代非腫瘍細胞において、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ誘導性ベクターは、親のベクターよりも低い効率で複製した。
【実施例８】
【０１９０】
実施例８：マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｍＧＭ−ＣＳＦ）を発現する腫瘍選択性アデノウイルスベクター（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ）
８．１．１  ｐＡＲ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦの構築
ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、Ｅ３領域における主な欠失の部位に配置されたＸｂａＩ部位中にクローニングし、その結果、残りのＥ３産物は、１２．５ｋＤａのタンパク質だけとなる。ＧＭ−ＣＳＦが、種特異性を示すことが実証されたので、マウスＧＭ−ＣＳＦベクターを調製して、インビボのマウスモデル研究を容易にした。
【０１９１】
ｐＤＲＦ２プラスミド（図１３）を用いて、アデノウイルス右ドナープラスミドであるｐＤＲ２ｍＧｍＦ（図１４）を構築した。このプラスミドは、ｐＤＲ２ＦプラスミドのＸｂａＩ部位でｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡの挿入物を含む。マウスＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、プラスミドｐＸＭＴ２−ｍｕＣＳＦにおいて、１９９２年にＧｅｒａｌｄ  ＭｃＭａｈｏｎ（Ｓａｎｄｏｚ，Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）から入手した。プラスミドｐＸＭＴ２−ｍｕＣＳＦは、１９９６年１０月３１日に公開された、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／３３７４６に記載される。ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、ｐＸＭＴ２−ｍｕＣＳＦから切り出して、これを用いてｐＧ１ｍＧｍＳｖＮａプラスミドを作製した（図１５）。プラスミドｐＧ１ｍＧｍを、ｐＧ１（４６４０ｂｐ、ＣＰＩでさらに処理）、およびｐＧ１ｍＧｍＳｖＮａ（６３４ｂｐ、ｍＧＭ−ＳＣＦ  ｃＤＮＡを担持する）のＮｏｔＩ／ＳａｌＩフラグメントの直接ライゲーションから構築した。ｐＧ１プラスミドは、米国特許第５，６７２，５１０号に記載される。以下のとおり、ｐＧ１ｍＧｍプラスミドを用いてプラスミドｐＫＳｍＧｍを生成した：
Ｉ．ベクターｐＢＣＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、ＥｃｏＲＶを用いて消化し、ＣＩＰを用いて処置して、ゲル精製した。
ＩＩ．マウスＧＭ−ＣＳＦ（６３４ｂｐフラグメント）を、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩでの消化によってプラスミドｐＧ１ｍＧｍから遊離させ、ｄＮＴＰの存在下で、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて充填して、ゲル精製した。
ＩＩＩ．このインサートおよびベクターＤＮＡを平滑末端化ライゲーションして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞中に形質導入して、ｐＫＳｍＧｍを生成した。
【０１９２】
ｐＤＲ２Ｆプラスミドは、右ＩＴＲ、それに続くＳｗａＩ部位においてアデノウイルスパッケージングシグナルを含む。ネイティブのＡｄ４配列の３９３塩基対にわたる左ＩＴＲおよびパッケージングシグナルを増幅するように設計したＰＣＲプライマー（ＩＴＲＦ−２／ＰｋｇＲ３）を用いて、このパッケージングシグナルを、左ＩＴＲから右ＩＴＲに移動させた。ＰＣＲ産物は、５’末端でＣｌａＩ−ＳｗａＩ制限部位に隣接し、そして３’末端でＰａｃＩ制限部位に隣接した。このＰＣＲ産物を、ＰａｃＩ／ＣｌａＩを用いて消化して、ｐ５ＦｌｏｘＨＲＬ（誘導体ｐｒｅＰａｃである））中にクローニングした（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ３、ａｎｄ  ａｌｌ  ｏｆ  Ｅ４  ｅｘｃｅｐｔ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ３，」Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３（７）：６０４８〜６０５５（１９９９）。ｐＤＲ２Ｆは、アデノウイルスゲノム全体を含むプラスミドを生成するために利用された右末端ドナープラスミドである。ｐＤＲ２Ｆは、ＸｂａＩ部位内にｌｏｘＰ部位を有し、これは、３’Ｅ３  １４．７ｋＤａタンパク質アミノ酸配列を部分的に変更する。
【０１９３】
プラスミドｐＤＲ２ｍＧｍＦを、以下のとおり構築した：
Ｉ．ＸｂａＩでの消化によって、プラスミドｐＤＲ２Ｆを調製し、ｄＮＴＰの存在下でＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて充填して、ＣＩＰで処理して、５’リン酸基を取り除いた。切断物を０．８％アガロースゲル中で電気泳動して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（ＢＩＯ１０１、Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて、１０８７７ｂｐのフラグメントを精製した。
ＩＩ．マウスＧＭ−ＣＳＦインサートｃＤＮＡを、ＡｖａＩを用いた消化によってｐＫＳｍＧｍから単離して、ｄＮＴＰの存在下で、ＫｌｅｎｏｗフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩを用いて充填した。６４１ｂｐフラグメントをアガロースゲルから回収して、ＧｅｎＣｌｅａｎＩＩを用いて精製した。
ＩＩＩ．インサートおよびベクターＤＮＡを連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞中に形質導入して、ｐＤＲ２ｍＧｍＦを生成した。
制限酵素消化を用いて、プラスミドクローンをスクリーニングした。７８７８〜８８２６塩基対について得られた配列（図１７）（ｐＤＲ２ｍＧｍＦ中にｍＧＭ−ＣＳＦインサートを含む）は、予想どおりであった。
【０１９４】
ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦプラスミド（図１８）を以下のとおり生成した。ＦｓｐＩおよびＳｐｅＩを用いて、プラスミドｐＤＲ２ｍＧｍＦを消化した；ｍＧＭ−ＣＳＦ挿入物を含有する９２８４ｂｐのフラグメントを、アガロースゲルから回収して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキットを用いて精製した。５０〜１００ｎｇのＤＮＡフラグメントを、１００ｎｇのＳｒｆＩ／ＰａｃＩで消化したｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦプラスミドＤＮＡとともに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３コンピテント細胞中に同時形質導入した（図１８）。形質導入したＢＪ５１８３細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上にプレートして、３７℃で一晩増殖させた。コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｍｌ  ＬＢ培地中に接種して、３０℃で４〜５時間２５０ｒｐｍでインキュベートした。次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって記載されるアルカリ溶解法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，ｐｐ９．３１〜９．５２，１９８９）をわずかに改変して用いて、このプラスミドＤＮＡを、ＢＪ５１８３培養物から単離した。要するに、１．５ｍｌのＢＪ５１８３培養物を、微量遠心分離管に入れて、室温で１分間の１４，０００ｒｐｍの遠心分離後、その培地を吸引して、細菌ペレットを、１００μｌの氷冷ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ（ＱｉａｇｅｎからのプラスミドＤＮＡ  Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ  Ｋｉｔに提供される）に再懸濁させた。１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を各々のチューブに添加して、５分間反転させて混合した。室温での３分間のインキュベーション後、１００μｌのＮ３緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を各々のチューブに添加した。サンプルを５分間反転させることによって混合して、直ちに１４，０００ｒｐｍで室温で１０分間、遠心分離した。その上清を新しいチューブに移して、１μｌのグリコーゲン（１μｇ／μｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および６００μｌのエタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。サンプルを−２０℃に少なくとも１時間保ち、そしてプラスミドＤＮＡを、室温での１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収した。プラスミドＤＮＡを１５μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁して、臭化エチジウムを含有する０．８％アガロースゲルに、１０μｌを供した。大型のプラスミド（すなわち＞３０ｋｂｐ）を含んだ１μｌのミニプレップを用いて、１００μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を形質導入させた。相同組み換えの効率は、形質導入がこのミニプレップの単離の直後に実行された場合、より高かったことが、観察された。二番目の形質導入から得られたプラスミドＤＮＡを、制限酵素消化によって分析して、正しい制限フラグメントを含有するプラスミドを、ウイルスベクターの産生のために選択した。
【０１９５】
８．１．２  Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦのウイルスベクター生成
ＡＥ１−２ａクローンＳ８細胞（Ｓ８細胞）（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９６．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ２ａ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６，４１７３−４１７８）を、１０％の熱不活化ＦＢＳを含有するＩＭＥＭ中で培養した。２μｇのＳｗａＩ−消化したプラスミドｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（図１８）を、Ｓ８細胞に形質導入させて、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ−ＰＬＵＳ試薬系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて６ウェルプレート中で培養した。３７℃、５％ＣＯ２、加湿の７日間のインキュベーション後、ウイルスベクターをさらに増幅させて、ＣｓＣｌ勾配によって精製した。分光光度学的分析によって、ウイルスベクター濃度を決定した（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：７４９８〜７５０９（１９９６））。
【０１９６】
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦのウイルスゲノムＤＮＡを、１００□ｌのウイルスベクター溶液（４×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）と、５μｌの１０％ＳＤＳおよび２０μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）とともに３７℃で一晩インキュベーションして、続いて、フェノール／クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿することによって、単離した。制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩに加えて、ＢａｎＨＩまたはＢｓｐｅＩを用いて、ウイルスゲノムＤＮＡを消化して、０．８％アガロースゲルにロードした。次いで、制限エンドヌクレアーゼ消化からのＤＮＡフラグメントを、ニトロセルロース膜（ＶＷＲ、＃２８１５１−１１３）に転写すること、および標準的な手順を用いて３２Ｐ標識したｍＧＭ−ＣＳＦプローブとハイブリダイズさせることによって、ウイルスゲノムのサザンブロット分析を実行した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第二版、９．３．１〜９．５２頁，１９８９）。ＤＮＡプローブを生成するために、テンプレートとしてｐＤＲ２ｍＧｍＦプラスミドＤＮＡを用い、以下の１対のプライマーを用いて、５０９ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ増幅させた：５’−ＣＡＣＣＣＴＴＧＣＧＴＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣ−３’（配列番号２５）、および５’−ＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣ−３’（配列番号２６）。得られた５０９ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ｍＧＭ−ＣＳＦの４６１ｂｐのコード配列と、５’末端に２６ｂｐのアデノウイルスＥ３配列と、３’末端に２２ｂｐのアデノウイルスＥ２配列とを含む。ランダムプライマー伸長法および３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いて、３２Ｐ標識したＤＮＡプローブを合成した。プローブの比活性は、約１００μＣｉ／５０ｎｇテンプレートＤＮＡであった。
【０１９７】
８．２  インビトロ細胞毒性（ＭＴＳアッセイ）
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターが、細胞を殺傷する能力を評価するため、ＭＴＳアッセイを実施した。
【０１９８】
８．２．１  １日目、プレートの準備
ウイルス感染の１日前に、マルチチャネルピペッターを用いて９０μｌの容積の増殖培地中を含有する９６ウェルディッシュに細胞をプレートする。１ウェルあたりの細胞の数を、それがウイルス感染の時点で６０〜８０％コンフルエントであるように、各々の細胞タイプについて実験的に決定する。これは代表的に１ウェルあたり５，０００〜１０，０００細胞である。Ｈ４６０細胞については、１ウェルあたり１０，０００細胞を播種した。最も外側のウェルを、２００μｌのｄＰＢＳで充填して、培地の蒸発を防いで周辺効果を得た；内側の６０ウェルのみをこのアッセイに用いる。３つのウェルを９０μｌの培地のみで充填して（ブランク）、３つのウェルを感染なしのコントロールとして用いる。
【０１９９】
８．２．２．  ０日目のウイルス感染
翌日、細胞をアデノウイルスベクターで感染させる。試験されるべきアデノウイルスを、用量範囲をこえて、増殖倍地中で４倍段階希釈させて、シグモイド用量応答曲線を得る。この用量範囲は、細胞特異的かつベクター特異的であり、そして通常、１００ＰＰＣ〜１０，０００ＰＰＣの間である。各々のウイルスの９段階希釈を、Ｂ列、３行で最高用量で開始して、このプレートにまたがって１０μｌ容積で添加する。１列あたりに、時には、２列あたりに、１つのウイルスを添加して、これによって１つのプレート上で３〜６ウイルスを試験する。すべての実験において、陽性コントロールウイルスＡｄｄ／３２７を試験する。ブランクウェルおよびコントロールウェルに対して、感染の時点で、ウイルスなしの１０μｌの培地を添加して、全てのウェルの総容積を１００μｌにさせる。次いで、このプレートを、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で、７日間インキュベートする。
【０２００】
８．２．３  ７日目、ＭＴＳアッセイ
製造業者の指示に従って、ＭＴＳアッセイを実施する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙは、テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；ＭＴＳ）および電子共役試薬フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を用いる。これらの試薬は、供給業者から、それぞれ１００ｍｌおよび５ｍｌの溶液で提供される（カタログ＃Ｇ５４３０）。このＭＴＳ溶液およびＰＭＳ溶液を、室温で（約９０分）、または３７℃水浴で（約１０分）融解させる。試験されるべき各々の９６ウェルディッシュについて、２ｍｌのＭＴＳ溶液をディズポーザブルの試験管に移す。細胞を含有する培養プレートへの添加の直前に、このチューブに、２ｍｌのＭＴＳ溶液あたり１００μｌのＰＭＳ溶液を添加する。このチューブを穏やかに回旋させて、合わせたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液の完全な混合を確実にさせる。反復ピペッターを用いて、９６ウェルアッセイプレートの各々のウェルにおける培地中に、合わせたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液の２０μｌのアリコートをピペッティングする。このプレートを、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で１〜４時間インキュベートする。測定した吸収レベルによって、必要な総時間を決定する。これは、細胞タイプおよび播種密度によって異なる。約０．１〜０．２の吸光度単位のバックグラウンドレベルを伴う約０．５〜１．５の間の吸光度単位が望ましい。マイクロタイタープレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４９０ｎｍで吸光度を記録する。時間にわたって、発色が継続するので、全てのプレートを迅速に連続して読み取らねばならなず、かつ４時間を越えてインキュベートしてはならない。
【０２０１】
８．２．４  データ分析
プレートリーダーからの生の吸光度単位（ＡＵ）のデータを、タブ区切りデキストファイルとして出力し、そしてさらなる操作のために６列×１０行の集計表としてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌに入力する。このバックグラウンドは、３つのブランクウェル（培地のみ）からの吸光度単位（ＡＵ）の平均を算出することによって決定する。３つの「セルのみ」のウェルの平均ＡＵを決定して、これからバックグラウンド値を差引きし、コントロール値を得る。このバックグラウンド値を各々のサンプルのＡＵから差引きする。次に、正味のサンプルＡＵ値を、コントロール値で割り、１００を掛けて、各サンプルウェルについてコントロール値（％）を得る。二連で行った場合は、コントロール値（％）の平均を算出する。
【０２０２】
バックグラウンド＝平均（ブランクＡＵ）
コントロール＝平均（ＡＵのみのセル）−バックグラウンド
コントロール（％）＝［（サンプルＡＵ−バックグラウンド）／コントロール］×１００
【０２０３】
ウイルスの用量（１細胞あたりの粒子）（Ｘ値）を、対応するコントロール（％）（Ｙ値）に対して、片対数スケールで、プロットする。このデータが、シグモイド用量応答曲線を形成する場合、このデータを用いてＬＤ５０を算出し得る。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ３．０プログラムを用いて、ＬＤ５０を算出した。
【０２０４】
ＬＤ５０を、ベクターの用量（１細胞あたりの粒子）として規定する。ＬＤ５０は、最大応答（ＬＤ１００プラトー）と、最小応答（ＬＤ０プラトー）との間の差異の１／２に相当する。コントロール値（％）に対するベクター用量を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０プログラム中のテンプレートに入力する。このテンプレートにおいて、シグモイド用量応答（可変勾配）式を用いて、曲線をデータポイントにあてはめる。
Ｙ＝ボトム（Ｂｏｔｔｏｍ）＋（トップ（Ｔｏｐ）−ボトム）／（１＋１０  ｌｏｇＥＣ５０−Ｘ・ヒルスロープ（ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））
【０２０５】
この式では、可変性のボトムは、ボトムプラトーにおけるＹ値であり、そして可変性のトップは、トッププラトーのＹ値である。ＬｏｇＥ５０（有効濃度、５０％）は、応答が、ボトムとトップとの間の中間であるときのＸ値である（ＬｏｇＬＤ５０）。可変性のヒルスロープ（ＨｉｌｌＳｌｐｏｅ）は、この曲線の勾配を表現する。この変数は、ヒルスロープ、勾配係数（ｓｌｏｐｅ  ｆａｃｔｏｒ）、またはヒル係数（Ｈｉｌｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）と呼ばれ、Ｘが増大するにつれて曲線が低下するときに負である。標準的なシグモイド用量応答曲線は、１．０のヒルスロープを有する。ヒルスロープが、１．０未満である場合、この曲線は、より浅い。ヒルスロープが１．０より大きい場合、この曲線は、より急勾配である。ヒルスロープには単位はない。一旦、曲線が、入力データにあてはめられれば、各々の用量応答曲線についてのＬＤ５０値は、Ｐｒｉｓｍプログラムからの出力データとして提供される。３つ以上の複製の平均ＬＤ５０値±標準偏差として、ＭＴＳアッセイ結果を報告する。各々の複製は、別々の９６ウェルディッシュを表す。
【０２０６】
８．２．５  試験した細胞株およびウイルス
いくつかのヒトおよびげっ歯類の腫瘍細胞株を試験した。この腫瘍細胞株としては、以下が挙げられる：ヒト腫瘍細胞株Ｈ４６０（非小細胞肺癌、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１７７）、およびＨｅｐ３Ｂ（肝細胞癌、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４）、マウス腫瘍細胞株ＲＭ−１（前立腺癌、Ｎａｓｕら、１９９９）、およびラット腫瘍細胞株ＭｃＡ−ＲＨ−７７７７（肝細胞腫、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６０１）。ｍＧＭ−ＣＳＦを装備されたベクターである、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（５．２×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）、Ｅ１Ａ陽性コントロールベクターＡｄｄ／３２７（４．７×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）、Ｅ１Ａ陰性コントロールベクターＡｄｄ／３１２（５．６×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）、および装備されていない腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター（ＯＡＶ）Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（５．０×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）（ここでＥ１Ａ発現は、ｍＧＭ−ＣＳＦを装備されたベクターにおいてと同様、Ｅ２Ｆ−１プロモーターによって駆動される）を、ＭＴＳアッセイに含ませた。
【０２０７】
８．３  結果
前臨床の有効性および毒性モデリングのために、腫瘍複製選択性アデノウイルスベクターである、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｍＧＭ−ＣＳＦ）を発現する）を、構築して、その細胞毒性特性をインビトロで特徴付けた。このベクターは、大きなＥ３欠失を保持しており、それによって残りのＥ３遺伝子のみが、Ｅ３  １２．５ｋＤａタンパク質をコードする。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ腫瘍崩壊性ベクター（腫瘍においてＧＭ−ＣＳＦを生成する能力を「装備された（ａｒｍｅｄ）」）を、実施例１由来のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦにおけるＥ３欠失領域中に、ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡをクローニングすることによって生成した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦにおいて、ｍＧＭ−ＣＳＦの発現は、Ｅ３プロモーターによって駆動され、それが次にアデノウイルスＥ１Ａタンパク質によって制御される。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの両方におけるＥ１Ａ発現は、Ｒｂ経路が調節解除された細胞において活性な腫瘍選択性Ｅ２Ｆ−１プロモーターによって駆動される。ＭＴＳ細胞毒性アッセイのデータは、ｍＧＭ−ＣＳＦを装備されたＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦウイルスベクターが、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのインビトロにおける腫瘍崩壊性特性を保持していることを実証した。このＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦウイルスベクターは、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのＬＤ５０値に極めて近い値で、ヒトおよびマウスの細胞株を殺傷することが示された（図１９）。マウスおよびラットの腫瘍細胞は、ヒトＡｄ５由来腫瘍崩壊性ベクターによる殺傷に対して、ヒト腫瘍細胞株よりも感受性が低い。
【０２０８】
８．４  まとめ
腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（マウスＧＭ−ＣＳＦを発現する）を構築した。ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、アデノウイルスＥ３領域の大きい欠失の部位に配置されたＸｂａＩ配列中に挿入した。得られたベクターは、以下を欠失する：Ｅ３−６．７ｋＤａ、ｇｐ１９ｋＤａ、１１．６ｋＤａ（ＡＤＰ）、１０．４ｋＤａ（ＲＩＤα）、１４．５ｋＤａ（ＲＩＤβ）、および１４．７ｋＤａのタンパク質（「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  Ｉ」Ｗ  ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＰ  Ｂｏｈｍ編、２３７〜２７４頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ．１９９５における、Ｗｏｌｄら、Ｅ３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓに概説された、Ｅ３領域）。ｐＤＲ２ｍＧｍＦプラスミドはまた、ＸｂａＩ部位内にｌｏｘ  Ｐ部位を有し、これは３’Ｅ３  １４．７ｋＤａタンパク質のアミノ酸配列を部分的に変更する。１２．５ｋＤａのオープンリーディングフレームのみが、このベクター中で保持されている。制限消化、および配列決定によって、アデノウイルス右末端ｐＤＲ２ｍＧｍＦプラスミドに含まれるｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡインサートの完全性および方向を確認した。このプラスミドを、リコンビナーゼ陽性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３に同時形質導入して、ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ  ３７．８ｋｂプラスミドを生成し、これを次にＡＥ１−２ａクローンＳ８細胞に形質導入してＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを生成した。このベクターの制限消化によって、予想されたパターンが得られた。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターは、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのインビトロ腫瘍崩壊性特性を保持していた。さらなる研究によって、腫瘍細胞の感染後の生物学的に活性なｍＧＭ−ＣＳＦの産生の実質的な量を確認した（表１９）。
【０２０９】
表１９．マウスＧＭ−ＣＳＦ総タンパク質に対するマウスＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性（増殖）の比較（ＥＬＩＳＡ）
【０２１０】
【表１９】
2004529627.tif 000023
【０２１１】
１細胞あたり示した粒子のＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦを用いて感染させたＨ４６０細胞からの無血清の上清を、それが、マウスＭＣ／９細胞の増殖を誘導する能力についてアッセイするか、またはＥＬＩＳＡにおいてマウスＧＭ−ＣＳＦを検出した。各々のアッセイにおいて、組み換えマウスＧＭ−ＣＳＦを用いて標準曲線を生成して、標準曲線から未知の値を算出した。直接比較を容易にするために、同一の単位を用いてデータを報告する。
【実施例９】
【０２１２】
実施例９：ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）を発現する腫瘍選択性アデノウイルスベクター（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ）
９．１．１  ｐＡＲ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦの構築
アデノウイルス右ドナープラスミドであるｐＤＲ２ｈＧｍＦ（ｐＤＲ２ＦプラスミドのＸｂａＩ部位にヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを含有する）を構築した。
【０２１３】
プラスミドｐＤＲ２ｈＧｍＦを以下のとおり構築した：
Ｉ．プラスミドｐＧ１ＮａＳｖＧｍを以下のとおり構築した：テンプレートとしてプラスミドｐＧＭＣＳＦを用いてＰＣＲ増幅した、ＤＮＡフラグメントのＢｇｌ  ＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって、４６６塩基対のヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを誘導した。ｐＧＭＣＳＦは、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミドであり、これはヒトＧＭ−ＣＳＦを含む。プラスミドｐＧ１ＮａＳｖＧｍを、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ（４６６ｂｐ）、およびｐＧ１ＮａＳｖＢｇ（図１６、ＣＩＰ処理、５８４４ｂｐ）のＢｇｌ  ＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの直接ライゲーション後に単離した。プラスミドｐＧ１ＮａＳｖＢｇは、米国特許第５，６７２，５１０号に記載されている。
ＩＩ．ヒトＧＭ−ＣＳＦ（４６６ｂｐのフラグメント）（図２０）を、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化によって、プラスミドｐＧ１ＮａＳｖＧｍから遊離させ、ｄＮＴＰの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ  Ｌａｒｇｅフラグメントを用いて充填させた。４６６ｂｐのフラグメントをアガロースゲルから回収して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて精製して、工程ＩＶにおけるライゲーション反応においてインサートＤＮＡとして用いた。
ＩＩＩ．プラスミドｐＤＲ２Ｆ（実施例８（セクション８．１．１）において記載）を、ＸｂａＩを用いた消化によって調製して、ｄＮＴＰの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ  Ｌａｒｇｅフラグメントを用いて充填して、ＣＩＰで処理して、５’リン酸基を取り除いた。消化物を、０．８％アガロースゲル中で電気泳動させて、１０８７７ｂｐのフラグメントを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  ＩＩキットを用いて精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、工程ＩＶにおけるライゲーション反応においてベクターＤＮＡとして用いた。
ＩＶ．インサートおよびベクターＤＮＡを連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞中に形質導入して、ｐＤＲ２ｈＧｍＦを生成した（図２１）。
【０２１４】
ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦプラスミドを以下のとおり生成した。プラスミドｐＤＲ２ｈＧｍＦを、ＦｓｐＩおよびＳｐｅＩを用いて消化した；ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを含有する９１０９ｂｐのフラグメントを、アガロースゲルから回収して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキットを用いて精製した。５０〜１００ｎｇのＤＮＡフラグメントを、ＳｒｆＩ／ＰａｃＩで消化した１００ｎｇのｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦプラスミドＤＮＡとともに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３コンピテント細胞中に同時形質導入した（図２１）。形質導入したＢＪ５１８３細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上にプレートして、３７℃で一晩増殖させた。コロニーをスクリーニングして、正しいプラスミドを実施例８（セクション８．１．１）に記載のとおり単離した。
【０２１５】
９．１．２  Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦのウイルスベクター生成
リポフェクタミンプラス試薬システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、ＳｗａＩ消化した２μｇのプラスミドｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦを、Ｓ８細胞中にトランスフェクトすることによって、ウイルスベクターを産生させて、６ウェルプレート中で培養した。ウイルスを増殖させて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦのウイルスゲノムＤＮＡを、実施例８（セクション８．１．２）に記載のように分析した。ウイルスゲノムＤＮＡを制限酵素であるＥｃｏＲＶ，ＳａｌＩ、ＸｂａＩに加えて、ＢａｎＨＩ，またはＢｓｐｅＩを用いて消化して、０．８％アガロースゲルにロードした。ニトロセルロースメンブレン（ＶＷＲ、＃２８１５１−１１３）へ、制限エンドヌクレアーゼ消化物由来のＤＮＡフラグメントを転写すること、および標準的な手順を用いて３２Ｐ標識したｈＧＭ−ＣＳＦプローブとハイブリダイズさせることによって、ウイルスゲノムのサザンブロット分析を実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第二版、９．３１〜９．５２頁，１９８９）。ＤＮＡプローブを生成するために、テンプレートとしてｐＤＲ２ｈＧｍＦプラスミドＤＮＡを用い、以下の１対のプライマーを用いて、４８２ｂｐのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した：
５’−ＣＡＣＣＣＴＴＧＣＧＴＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２７）
５’−ＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２８）。
得られた４８２ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ヒトＧＭ−ＣＳＦの４３４ｂｐのコード配列と、５’末端に２６ｂｐのアデノウイルスＥ３配列と、３’末端に２２ｂｐのアデノウイルスＥ２配列とを含む。ランダムプライマー伸長法および３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いて、３２Ｐ標識したＤＮＡプローブを合成した。プローブの比活性は、約１００μＣｉ／５０ｎｇテンプレートＤＮＡであった。
【０２１６】
９．１．３  結果
コロニー形成後、ｐＤＲ２ｈＧｍＦプラスミドの方向を、ＳａｌＩ消化を用いてスクリーニングした。この構造を、さらなる制限酵素分析によって確認し、これによって、予想されたパターンが示された。ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ大型プラスミドのクローニングスキームおよび構造を、図２１にまとめている。ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦの完全性をＳａｌＩ消化によって確認した。ＳｗａＩ消化したｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦプラスミドＤＮＡを用いたＳ８細胞のトランスフェクション後、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦウイルスベクターを単離して、増幅した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦのウイルスゲノムＤＮＡを単離して、制限酵素によって消化した。制限酵素消化によって、予想されたパターンが示された。図２０に示されるように、ｂｐ２８５３６〜２９２７３を配列決定することによって、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡインサートの完全性を確認した（配列番号１９）。
【０２１７】
９．２  インビトロ細胞毒性
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターが細胞を殺傷する能力を評価するため、実施例８に記載のとおり、ＭＴＳアッセイを実施した。いくつかのヒト腫瘍細胞株およびげっ歯類腫瘍細胞株を試験した。この腫瘍細胞株としては、以下が挙げられる：ヒト腫瘍細胞株Ｈ４６０（非小細胞肺癌、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１７７）、およびＨｅｐ３Ｂ（肝細胞癌、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４）、マウス腫瘍細胞株ＣＭＴ−９３（直腸癌、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２３）、およびＫＬＮ２０５（マウス扁平上皮細胞癌、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４５３）。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ（ヒトＧＭ−ＣＳＦを装備したベクター、２．４×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）、Ａｄｄ／３２７（Ｅ１Ａ陽性コントロールベクター、４．７×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）、Ａｄｄ／３１２（Ｅ１Ａ陰性コントロールベクター、５．６×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（装備されていないＯＡＶ、５．０×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（マウスのＧＭ−ＣＳＦ装備したベクター、５．０×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ）を、ＭＴＳアッセイに含ませた。ＭＴＳアッセイから得た結果を、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いてシグモイド用量応答曲線あてはめ分析に供した。実施例８に記載のとおり、ＬＤ５０（感染の７日後、未処理のコントロール細胞と比べて細胞の５０％が死んだ有効濃度）を算出するために、このプログラムを用いた。
【０２１８】
９．２．１  結果
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦウイルスベクターは、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのＬＤ５０値に極めて近い値で、ヒトおよびマウスの細胞を殺傷することが示された（図２２）。マウスおよびラットの腫瘍細胞は、ヒトＡｄ５由来腫瘍崩壊性ベクターによる殺傷に対して、ヒト腫瘍細胞株よりも感受性が低い。さらなる研究によって、腫瘍細胞の感染後の生物学的に活性なｈＧＭ−ＣＳＦの産生の実質的な量を確認した（表２０）。
【０２１９】
表２０．ヒトＧＭ−ＣＳＦ総タンパク質に対する、ヒトＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性（増殖）の比較（ＥＬＩＳＡ）
【０２２０】
【表２０】
2004529627.tif 000024
【０２２１】
１細胞あたり示した粒子のＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦを用いて感染させたＨ４６０細胞からの無血清の上清を、それが、ヒトＴＦ−１細胞の増殖を誘導する能力についてアッセイするか、またはＥＬＩＳＡにおいてヒトＧＭ−ＣＳＦを検出した。各々のアッセイにおいて、組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦを用いて標準曲線を生成して、標準曲線から未知の値を算出した。直接比較を容易にするために、同一の単位を用いてデータを報告する。
【０２２２】
９．２．２  まとめ
腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ（ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現する）を構築した。ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、アデノウイルスＥ３領域の大きい欠失の部位に配置されたＸｂａＩ配列中に挿入した。得られたベクターは、以下を欠失する：Ｅ３−６．７ｋＤａ、ｇｐ１９ｋＤａ、１１．６ｋＤａ（ＡＤＰ）、１０．４ｋＤａ（ＲＩＤα）、１４．５ｋＤａ（ＲＩＤβ）、および１４．７ｋＤａのタンパク質（Ｗｏｌｄら、１９９５に概説された、Ｅ３領域）。Ａｒ６ｐＡ２ｆｈＧｍＦはまた、ＸｂａＩ部位内にｌｏｘ  Ｐ部位を有し、これは３’Ｅ３  １４．７ｋＤａタンパク質のアミノ酸配列を部分的に変更する。１２．５ｋＤａのオープンリーディングフレームのみが、このベクター中で保持されている。制限酵素消化によって、アデノウイルス右末端ｐＤＲ２ｈＧｍＦプラスミドに含まれるｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡインサートの完全性および方向を確認した。このプラスミドは、リコンビナーゼ陽性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３に同時形質導入されて、ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ  ３７．６ｋｂプラスミドを生成し、これを次にＡＥ１−２ａクローンＳ８細胞に形質導入してＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを生成した。このベクターの制限消化および部分的配列決定によって、予想されたパターンが得られた。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターは、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのインビトロ腫瘍崩壊性特性を保持しており、かつ生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦの実質的な量の産生を誘導した。
【０２２３】
９．３  Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦのインビトロ抗腫瘍効率
９．３．１  Ｈ４６０非小細胞肺癌異種移植片モデルを用いる研究
Ｈ４６０（Ｒｂ＋、ｐ１６−、ｐ５３＋、Ｋａｔａｏｋａら、「Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｌ−２  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐ１６ＩＮＫ４  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｏｔｐｓｉｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（１２）：１５８９〜１５９５（２０００））ヒト非小細胞肺癌細胞株は、腫瘍崩壊性ベクター機能のインビボ試験において厳密性を提供する。これらの腫瘍細胞は、試験した任意のヒト腫瘍細胞株のＭＴＳアッセイにおいて、最高のＬＤ５０値（３７０±１０８ｐｐｃ）のうちの１つを有する。この細胞株を用いて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（ＮＶＰ−ＯＧＭ５２７のマウスバージョン）におけるマウスＧＭ−ＣＳＦの追加が、既存の腫瘍の処置に対して追加の利点を付与するか否かを試験した。Ｔ細胞欠失ヌードマウスにおいてこれらの研究を実施した。従って、任意の追加の利点は、非免疫の抗腫瘍機構（例えば、血管新生阻害、および／または炎症）の刺激に起因する。ヌードマウスの脇腹で増殖する、予め樹立されたＨ４６０腫瘍（平均９２±５０ｍｍ３）に、１０、１２、１４、１７、および１９日目に５回、２×１０１０もしくは１×１０１１の示したウイルス粒子またはＰＢＳ（ｎ＝１０／群）を注射した。４９日間に週に２回腫瘍を測定して、チューキーの検定
(Turkey’s test) を用いて、反復測定１元分散分析（ＲＭ−ＯＷ−ＡＮＯＶＡ）によって、群の腫瘍値を比較した。
【０２２４】
９．３．１．１  結果
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターおよびＡｒ６ｐＡ２ｆｍＧｍＦベクターの両方の用量とも、生理食塩水で処置した腫瘍に比べて、Ｈ４６０腫瘍の増殖を有意に阻害した。そしてこのベクターは、２×１０１０粒子用量のＥ１Ａ陰性コントロールベクターＡｄｄ／３１２に比べて、腫瘍増殖を有意に阻害した。高用量（１×１０１１粒子／注射）では、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターのみが、Ａｄｄ／３１２ベクターと比べて、腫瘍増殖を有意に阻害した（このベクターによる種関連ＧＭ−ＣＳＦ発現に起因する追加の利点の証拠）（図２３）。
【０２２５】
ベクターの抗腫瘍効力を、表２１に示されたようなＴ／Ｃ（処置／コントロール）比を算出することによって、評価した。このデータによって、全てのアデノウイルスベクターは、生理食塩水で処置した腫瘍に比べて、両方の用量で有意な抗腫瘍活性を惹起したことが示される。さらに、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターは、分母としてＡｄｄ／３１２コントロールベクターを用いて、低用量および高用量の両方で、有意な抗腫瘍活性を惹起したが、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクター処置は、低用量でのみ有意であった。予期されなかったことに、免疫欠損ヌードマウスにおいて、このデータによって、マウスＧＭ−ＣＳＦを発現するＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターが、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターに比べて、インビボでより有効な抗腫瘍活性を誘導したことが実証される。さらに、腫瘍のない生存が増強され、これによって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦで処置した動物の５０％が４９日目に、腫瘍がなかった。
【０２２６】
表２１．Ｈ４６０を保有するマウスのＴ／Ｃ値、および腫瘍なしの生存（％）
【０２２７】
【表２１】
2004529627.tif 000025
【０２２８】
Ｔ／Ｃ＝ＰＢＳについては、研究の２１日目のコントロール群の腫瘍容積で割った処置した腫瘍容積の平均、またはＡｄｄ／３１２処置群については研究３１日目に対する値（それぞれ、２列目、３列目）。アスタリスクは、ＲＭ−ＯＷ−ＡＮＯＶＡによる、相対的コントロールと比べた、有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。ｎａ；該当なし（ｎｏｔ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ）。４９日目の腫瘍なしの動物の割合を、最後の列において比較した。Ａｄｄ／３１２処置群に比べて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（マウスＧＭ−ＣＳＦを装備した）で処置したマウスでは、腫瘍なしの生存の有意な増大が観察された（ｐ＜０．００１、フィッシャーの直接確率検定）。対照的に、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦまたはＡｄｄ／３２７群における腫瘍なしの生存は、Ａｄｄ／３１２群よりも有意に大きかった。ｎｓ；有意差なし。
【０２２９】
９．３．２  Ｈｅｐ３Ｂ肝細胞癌異種移植片モデルを用いる研究
Ｈｅｐ３Ｂ（Ｒｂ−、ｐ１６＋、ｐ５３＋、Ｓｐｉｌｌａｒｅら、「Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｐ１６ＩＮＫ４」Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １６  （１）：５３〜６０（１９９６）；Ｆａｒｓｈｉｄら、「Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＢ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｐ５３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」Ｊ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ  １（１）：４５〜５３（２０００））ヒト肝細胞癌細胞株をまた用いて、インビボにおける腫瘍崩壊性ベクター機能を試験する。Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞は、腫瘍崩壊性アデノウイルスのインビトロの腫瘍崩壊性効果に対して、Ｈ４６０よりもかなり感受性である（ＬＤ５０値  ０．０１３４±０．０１９９ｐｐｃ）。Ｈ４６０腫瘍と同様に、既存の異種移植片のＨｅｐ３Ｂ腫瘍を分析して、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦにおけるマウスＧＭ−ＣＳＦの追加が、インビボにおいて追加の利点を付与するか否かを決定する。Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍の緩徐な増殖によって、極めて低用量のウイルスで開始する用量応答研究を実施する機会が提供される。ヌードマウスの脇腹で増殖する、予め樹立されたＨｅｐ３Ｂ腫瘍（平均１３５±５１ｍｍ３）に、１５、１８、２０、２２、および２５日目に５回、２×１０７、２×１０８もしくは２×１０９粒子の示したウイルスベクター、またはＰＢＳ（ｎ＝１０／群）を注射した。４７日間に週に２回腫瘍を測定して、チューキーの検定を用いて、反復測定１元分散分析（ＲＭ−ＯＷ−ＡＮＯＶＡ）によって群の容積を比較した。
【０２３０】
９．３．２．１  結果
装備していないＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターおよびヒトＧＭ−ＣＳＦを装備したＡｒ６ｐＡ２ｆｈＧｍＦベクターは、試験した各々のベクター用量で同様の抗腫瘍効果を示した。このことは、ヒトＧＭ−ＣＳＦが、予想どおり、マウスにおいて生理活性でないが、このベクターは、親のベクターの選択的な腫瘍崩壊性活性を残していることを示す。これらの２つのベクターの間に有意な差異は、いずれの用量でも時点でも観察されなかった。
【０２３１】
予期せぬことに、３４日目に開始する、マウスＧＭ−ＣＳＦを未装備のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクター（低い２×１０７ベクター粒子用量）と比べて、マウスＧＭ−ＣＳＦを分泌するＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターを用いて、抗腫瘍活性の有意な増大があった。このことは、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍保有マウスにおけるマウスＧＭ−ＣＳＦの筋肉内発現が、未装備の腫瘍崩壊性ベクターよりも強力な抗腫瘍効果を誘導したことを示す。これによってＧＭ−ＣＳＦを装備したＯＡＶは、未装備のベクターよりも低用量で患者に投与され得る可能性が示される。さらに、ヌードマウスは免疫欠損であるので、ヒトＧＭ−ＣＳＦを発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスは、癌患者（その免疫系は、化学療法または放射線療法によって損なわれている）において、ＧＭ−ＣＳＦに起因して活性を有し得る。これらのデータによって、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦは、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの腫瘍崩壊能を保持すること、および適切な種において測定した場合、ＧＭ−ＣＳＦは、免疫欠損ヌードマウスにおいてさえ、腫瘍崩壊性ベクターに対して有意な利点を付与することが示される（図２４）。
【０２３２】
Ｈ４６０モデルにおいて行ったように、Ｈｅｐ３Ｂモデルにおけるベクターの抗腫瘍効力を、Ｔ／Ｃ（処置／コントロール）比を算出することによって評価した（表２２）。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ、またはＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターの各々の用量を用いたＨｅｐ３Ｂ腫瘍の処置によって、比較対象としてＰＢＳまたはＡｄｄ／３１２コントロールアデノウイルスのいずれかを用いて、２×１０７粒子／注射のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦで処置したマウス（Ｔ／Ｃ＝０．５３）以外は、０．５未満のＴ／Ｃ比が得られた。このデータは、腫瘍崩壊性ベクターでの処置後の治療の利点を実証する。未装備のベクターであるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦを、比較対象として用いる場合、このデータは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターの全ての用量について＞０．５のＴ／Ｃ値を示したが、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターの全ての用量は、＜０．５のＴ／Ｃ値を生じた。この評価によって、未装備の腫瘍崩壊性ベクターと比べたＧＭ−ＣＳＦを装備した腫瘍崩壊性ベクターでの処置に由来する優れた治療の利点が実証される。
【０２３３】
表２２．Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍を保有するマウスのＴ／Ｃ値、および腫瘍なしの生存（％）
【０２３４】
【表２２】
2004529627.tif 000026
【０２３５】
Ｔ／Ｃ比は、研究２７日目のＰＢＳコントロール群と比べた処置群についての平均腫瘍容積；または研究３１日目に決定したＡｄｄ／３１２ベクターコントロール群と比べた処置群についての平均腫瘍容積；または研究の３４日目に決定したＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクター処置群と比べた処置群についての平均腫瘍容積（それぞれ、２列目、３列目、および４列目）。アスタリスクは、ＲＭ−ＯＷ−ＡＮＯＶＡによる、各々のコントロール群と比べた、ｐ＜０．０５を示す。ｎａ；該当なし（ｎｏｔ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ）。
４７日目の腫瘍なしの動物の割合を、５列目において比較した。Ａｄｄ／３１２処置群に比べて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（マウスＧＭ−ＣＳＦを装備した）で処置したマウスでは、腫瘍なしの生存の有意な増大が観察された（ｐ＜０．０５、フィッシャーの直接確率検定）。対照的に、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ群またはＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ群における腫瘍なしの生存は、Ａｄｄ／３１２群よりも有意に大きくはなかった。ｎｓ；有意差なし。
【実施例１０】
【０２３６】
実施例１０：アデノウイルスＥ３−ｇｐ１９遺伝子の位置にＧＭ−ＣＳＦが挿入されたＥ３含有腫瘍崩壊性アデノウイルスの構築および特徴づけ
１０．１．１  ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆの構築
開始コドンから終止コドンに、ＧＭ−ＣＳＦを用いて、アデノウイルスＥ３−ｇｐ１９遺伝子を正確に置換するために、ＰＣＲ増幅を実施した。各々のベクターについて３つのＤＮＡフラグメントを生成して、３フラグメントの重複ＰＣＲを一緒にＳＯＥ（部位重複伸長）（Ｓｉｔｅ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）に使用して、これによって単一のＤＮＡフラグメントを生成した。次いで、このＤＮＡフラグメントをＢｓｉＷＩおよびＮｏｔＩで消化して、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３ＦベクターのＥ３−ｇｐ１９遺伝子を含有するＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩ領域を置換するのに用いた（図２５）。
【０２３７】
ネイティブのアデノウイルスにおいて、Ｅ３−６．７遺伝子のリーディングフレームは、Ｅ３−ｇｐ１９遺伝子に重複する（図２６ａ）。Ｅ３−ｇｐ１９遺伝子の位置からのＧＭ−ＣＳＦの発現を最適化するため、Ｅ３−６．７遺伝子とＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡとの間に別の接合部を有するウイルスベクター（図２６ｂ）を生成して、ＧＭ−ＣＳＦ発現について試験した。これらの代替物としては、以下が挙げられる：
Ｉ．Δｇｐ１９ａ：ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ（ＡＴＧ〜ＴＧＡ）を、Ｅ３−６．７終止コドンへの影響を無視して、Ｅ３−ｇｐ１９コード配列（ＡＴＧ〜ＴＧＡ）に直接入れ換える。このクローニングの結果として、Ｅ３−６．７と、ＧＭ−ＣＳＦとの間の融合タンパク質が予想され得る。Δｇｐ１９ａヒトＧＭ−ＣＳＦベクターについて、融合タンパク質は、カルボキシル末端にさらに３３ａａ（アミノ酸）を有する全長Ｅ３−６．７ｋＤａタンパク質を含むようである。Δｇｐ１９ａマウスＧＭ−ＣＳＦベクターについては、この融合タンパク質は、そのカルボキシル末端にさらに９ａａ（アミノ酸）を含む。
ＩＩ．Δｇｐ１９ｂ：Ｅ３−６．７遺伝子の終止コドン（ＴＡＡ）を、ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡの開始コドン（ＡＴＧ）に対して５’側に挿入して、Ｅ３−６．７ｋＤａタンパク質の正しい終結を確実にした。Ｋｏｚａｋ配列をまた、ＧＭ−ＣＳＦの発現を増強するために、Ｅ３−６．７遺伝子の終わりとＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡの始まりとの間に含んだ。
ＩＩＩ．Δｇｐ１９ｃ：Ｅ３−６．７終止コドン（ＴＧＡ）を、ＧＭ−ＣＳＦの４番目のヌクレオチドをＡに変異することによって回復し、これによって、ネイティブの重複するＡＴＧコドンおよびＴＧＡコドンに似る。この単一ヌクレオチドの変異によって、ｈＧＭ−ＣＳＦおよびｍＧＭ−ＣＳＦの両方の単一のペプチドにおいて単一のａａ（アミノ酸）変異が生じる。ｈＧＭ−ＣＳＦについて、２番目のａａ（アミノ酸）は、トリプトファンからアルギニンに変異している。ｍＧＭ−ＣＳＦについては、２番目のａａ（アミノ酸）は、アラニンからトレオニンに変異している。ＧＭ−ＣＳＦが分泌され得る場合、変異が、ｈＧＭ−ＣＳＦ、またはｍＧＭ−ＣＳＦのいずれかの生物学的活性に影響する可能性は低い。
ＩＶ．Δｇｐ１９ｄ：ＧＭ−ＣＳＦの５’末端に付加されたＡＴＧＡＣＣ配列との重複によって、Ｅ３−６．７終止コドン（ＴＧＡ）を修復した。この構築物は、マウスＧＭ−ＣＳＦおよびヒトＧＭ−ＣＳＦの両方の単一の配列のアミノ末端に対して、２つのアミノ酸（メチオニンおよびトレオニン）を付加する可能性が高い。
Ｖ．Δｇｐ１９ＩＲＥＳ：重複ＰＣＲを用いて、ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、５７３ｂｐ  ＥＭＣ  ＩＲＥＳのＡＴＧ（Ｇｈａｔｔａｓら．  Ｔｈｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  ａｌｌｏｗｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：  ５８４８−５８５９．１９９１）に結合させて、ＩＲＥＳ／ＧＭ−ＣＳＦを、Ｅ３−６．７のネイティブの終止コドン（ＴＧＡ）の３’側に挿入した。
【０２３８】
アデノウイルス右ドナープラスミドを、各々のΔｇｐ１９ベクターについて構築した（表２３および２４）。これらのドナープラスミドは、ｐＤＲ２ＦＥ３プラスミドのＥ３−ｇｐ１９遺伝子の位置にｈＧＭ−ＣＳＦ、ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ、またはＩＲＥＳ／ｍＧＭ−ＣＳＦを含む。表２３はまた、各々のＰＣＲ産物を生成するのに用いたプライマー対を示す。このプライマーの正確な配列を表２５に示す。
【０２３９】
表２３．Δｇｐ１９ウイルスベクターの構築のためのプライマー
【０２４０】
【表２３】
2004529627.tif 000027
【０２４１】
＊ＩＲＥＳおよびｍＧＭ−ＣＳＦを、ＰＣＲによってまず結合させて、ＩＲＥＳｍＧｍ  ＤＮＡフラグメント（上記の最後の行に示されるような）を生成し、次いでこれを、プライマーＥ３ＩＭ−１、およびＥ３ｍ．２を用いるＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いた。
【０２４２】
表２４．Δｇｐ１９構築物のためのウイルスベクター (Virus Vector)、ドナープラスミド (Donor Plasmid)、および大型プラスミド (Large Plasmid)
【０２４３】
【表２４】
2004529627.tif 000028
【０２４４】
表２５．ＰＣＲプライマーの配列
【０２４５】
【表２５】
2004529627.tif 000029
【０２４６】
野生型Ａｄ５ウイルスのゲノムＤＮＡ由来の１．９ｋｂ  ＸｂａＩフラグメント（Ｅ３遺伝子のほとんどを含む）を、ｐＤｒ２ＦのＸｂａＩ部位に連結することによって、プラスミドｐＤｒ２ＦＥ３を、クローニングした。プラスミドｐＤＲ２Ｆは、実施例８（セクション８．１．１）において前に記載した。ｐＤｒ２Ｆは、ＸｂａＩ部位内にｌｏｘＰ部位を有し、それが３’Ｅ３  １４．７ｋＤａタンパク質のアミノ酸配列を部分的に変更する。
【０２４７】
ドナープラスミドを、以下のとおり構築した：
Ｉ．ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅：図２５に示されるように、表２３に示されるプライマー対を用いて、各々のドナープラスミドについて、３つのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した（ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子を欠くコントロールドナープラスミドΔｇｐ１９ａおよびΔｇｐ１９ｂについて、２つのフラグメントのみを生成した）。ＩＲＥＳ含有ｐＤＲ２（Ｅ３＋、ＩｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆプラスミドは、ＩＲＥＳｍＧｍフラグメントを生成するために、２回のＰＣＲ増幅、その後の２フラグメント重複ＰＣＲ増幅を必要とした。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＣＡＴ＃１１３０４−０１１）を用いて全てのＰＣＲ増幅を実行した。その条件は、製造業者が提案したとおりであった。
ＩＩ．重複ＰＣＲ：ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＣＡＴ＃４００７７１）を用いて、工程Ｉ由来のＰＣＲ産物を精製した。次いで、テンプレートとして、３つの精製したＤＮＡフラグメント（コントロールプラスミドについて２）、ならびにプライマーとしてプライマー１（プライマーＥ３．１）およびプライマー６（プライマーＥ３ａ．４）の混合物を用いて、各々のベクターについて、重複ＰＣＲ増幅を実施した。重複ＰＣＲは、単一のＤＮＡフラグメントを生成し、ここでは、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＲＥＳ／ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、Ｅ３領域内に組み込んでいる。コントロールプラスミドについて、このフラグメントは、Ｅ３ｇｐ１９遺伝子の欠失を伴うＥ３領域を含む。工程１においてと同様、全てのＰＣＲ増幅を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、および製造業者が提案した条件を用いて実行した。
ＩＩＩ．インサートの調製：工程ＩＩ由来のＰＣＲ産物を、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製して、ＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩの二重消化に供した。この消化物をアガロースゲルから回収し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  ＩＩキット（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて精製して、工程Ｖの連結反応においてインサートＤＮＡとして用いた。
ＩＶ．プラスミドｐＤＲ２ＦＥ３を、ＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩを用いて消化し、ＣＩＰで処理して、５’リン酸基を取り除いた。この消化物を、０．８％アガロースゲル中で電気泳動させ、１１６３５ｂｐのフラグメントをＧｅｎｅＣｌｅａｎ  ＩＩキットを用いて精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、工程Ｖのライゲーション反応においてベクターＤＮＡとして用いた。
Ｖ．インサートＤＮＡおよびベクターＤＮＡを連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞中に形質導入して、ドナープラスミドを生成した。制限酵素消化を用いて、プラスミドクローンをスクリーニングした
【０２４８】
ドナープラスミドを、ＦｓｐＩおよびＳｐｅＩを用いて消化した；ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを含有する大きいフラグメントをアガロースゲルから回収して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  ＩＩキットを用いて精製した。５０〜１００ｎｇのＤＮＡフラグメントを、１００ｎｇのＳｒｆＩ／ＰａｃＩ消化したｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦプラスミドＤＮＡとともに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３コンピテント細胞中に同時形質導入した（それぞれ、図２７ａおよび２７ｂに示される、ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）ＦおよびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆの生成）。形質導入されたＢＪ５１８３細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上にプレートして、３７℃で一晩増殖させた。コロニーをスクリーニングして、正しいプラスミドを、実施例８（セクション８．１．１）に記載のとおり単離した。表２４は、各々のウイルスベクターを生成するのに用いたプラスミド（ドナープラスミドおよび大型プラスミド）を示す。
【０２４９】
１０．１．２  ウイルスベクターである、ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）ＦおよびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆの生成
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ−ＰＬＵＳ試薬システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、Ｓ８細胞中にＳｗａＩ消化した２μｇの大型プラスミドをトランスフェクトすることによって、ウイルスベクターを生成して、６ウェルプレート中で培養した。実施例８（セクション８．１．２）に記載のように、ウイルスを増殖させて、ウイルスのゲノムＤＮＡを単離した。ウイルスのゲノムＤＮＡを、制限酵素であるＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩに加えて、ＢａｍＨＩまたはＢｓｐｅＩを用いて消化して、０．８％アガロースゲルにロードした。制限パターンは予想どおりであった。そのＧＭ−ＣＳＦインサートおよびクローニング接合部の配列を確認した。
【０２５０】
１０．２  インビトロ細胞毒性
Δｇｐ１９ウイルスベクターが細胞を殺傷する能力を評価するために、実施例８（セクション８．２）に記載のとおりＭＴＳアッセイを実施した。ヒト腫瘍細胞株Ｈ４６０（非小細胞肺癌、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１７７）、およびＨｅｐ３Ｂ（肝細胞癌、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４）を、ＭＴＳアッセイに含ませた。全てのΔｇｐ１９ベクター骨格を、ＭＴＳアッセイに含ませた。このアッセイにおいて用いた実験的なΔｇｐ１９ウイルスとしては、以下を含んだ：Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ａ）Ｆ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｃ）Ｆ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｄ）Ｆ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ＩｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ａ）Ｆ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｃ）Ｆ。コントロールウイルスとしては、以下を含んだ：Ａｄｄ／３１２（Ｅ１Ａ陰性コントロール）、Ａｄｄ／３２７（Ｅ１Ａ陽性コントロール）、Ａｒ６ｐＡＥ２Ｆ（Ｅ２Ｆ−１プロモートされるか、またはＥ３欠失された骨格ベクター）、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（Ｅ２Ｆ−１プロモートされた、Ｅ３欠失した、ｍＧｍ−ＣＳＦを有する骨格ベクター）。
【０２５１】
Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて、ＭＴＳアッセイから得た結果（図２８）を、シグモイド用量応答曲線あてはめ分析に供した。このプログラムを用いて、ＬＤ５０（感染の７日後、未処理のコントロール細胞と比べて細胞の５０％が死んだ有効濃度）を算出した。試験した細胞株の全てにおいて、Δｇｐ１９ベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの腫瘍崩壊能を保持していた。
【０２５２】
１０．３  ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子発現
Δｇｐ１９ウイルスベクター（ＭＴＳアッセイにおいてと同じロットを用いる）を用いたＨ４６０細胞の感染後のｍＧＭ−ＣＳＦおよびｈＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子の発現を確認するためのスクリーニングとして、マウスおよびヒトのＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡを用いた。２ｍｌ／ウェルの無血清培養培地を用いて、２．５×１０５細胞／ウェルの密度で、Ｈ４６０細胞を６ウェルプレート中にプレートした。翌日、その培地を取り除いて、培養した細胞を、５００μｌの無血清培地中で、１細胞あたり、１０、１００、および１０００粒子のウイルスベクターを用いて、二連で、形質導入させた。５％ＣＯ２インキュベーター中の３７℃でのインキュベーションの２時間後、ウイルスを吸引して、２ｍｌの新鮮な完全培養培地を、各々のウェルに添加した。感染後２４時間または４８時間で、ＥＬＩＳＡのために上清を収集した。結果を図２９に示す。
【０２５３】
１０．４  Ｈ４６０細胞／ヌードマウス異種移植片腫瘍モデル
Ｈ４６０異種移植片ヌードマウス腫瘍モデルを利用して、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆベクターのインビボにおける抗腫瘍効率を評価した。Ｈ４６０異種移植片モデルにおいて、２×１０６個のＨ４６０細胞を、雌性ヌードマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍接種の約８日後、腫瘍は、電子ノギスを用いて二次元で測定可能であって、この値は、６０〜１５０ｍｍ３（以下の式を用いる：Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）π／６；Ｖは、容積；Ｗは、幅；Ｌは、長さ）に及んだ。腫瘍を有するマウスを無作為に処置群に分けて、月曜、水曜、金曜、月曜、および水曜のスケジュールで、Ａｄｄ／３１２、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ、もしくはＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、またはＰＢＳの５回の腫瘍内注射を行った。２×１０１０、または１×１０１１のウイルス粒子／注射を用いて、腫瘍を処置した。３４日間、週に２回、腫瘍容積を測定し、群の平均を算出して、反復測定一元ＡＮＯＶＡによってデータを解析した（図３０）。マウスが瀕死になるか、または腫瘍容積が２０００ｍｍ３を超えた場合、マウスを屠殺した。
【０２５４】
１０．５  結果および考察
ｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）およびｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆの構造およびクローニングを記載した。クローニング後、ドナープラスミドの方向を、ＳａｌＩ消化を用いてスクリーニングして、ＳｐｅＩおよびＦｓｐＩ消化、またはＳｐｅＩおよびＣｌａＩ消化を用いる消化によって、その構造をさらに確認した（データ示さず）。例として、ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）ＦおよびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）を用いて、このクローニングスキームおよび大型プラスミドの構造を図２７にまとめる。ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）ＦおよびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）の完全性を、ＥｃｏＲＶ、ＢｓｒＧＩ、ＮｏｔＩ、およびＭｌｕＩの消化によって確認した。ＳｗａＩ消化した大型プラスミドＤＮＡを用いたＳ８細胞のトランスフェクション後、Δｇｐ１９ウイルスベクターを単離して、増幅させた。ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）ＦおよびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ由来のゲノムＤＮＡを単離して、制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＢｓｒＧＩ、およびＮｏｔＩを用いて消化した。この制限酵素消化物は、予想したパターンを示した。マウスＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡインサートおよびウイルス隣接配列の完全性を、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆの２８３８１〜２９５５０ｂｐを配列決定することによって確認した。同様に、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆベクターの２８３８１〜２９５４０ｂｐから配列決定した。ヒトＧＭ−ＣＳＦベクターにおいて、ＧＭ−ＣＳＦの３’非翻訳配列における、塩基対位置２９２４０のＴからＣへの単一変異を検出した。この変異は、ＧＭ−ＣＳＦのオープンリーディングフレームにもいずれのウイルスコード配列にも影響しない。
【０２５５】
Δｇｐ１９ウイルスベクターは、インビトロにおいて、親のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのＬＤ５０値に極めて近いＬＤ５０値で、ヒト腫瘍細胞株を殺傷することが示された（図２８）。このように、このベクターの腫瘍崩壊性機能は、ｇｐ１９遺伝子の改変後に維持された。対照的に、種々の構築物が、Ｈ４６０細胞によるＧＭ−ＣＳＦの分泌を誘導する能力において明らかな差異が証明された。この差異は、ベクター改変の機能であって、導入遺伝子ではなく、この結果、所定の改変について、同様のレベルのヒトＧＭ−ＣＳＦおよびマウスＧＭ−ＣＳＦが上清中で検出された。Δｇｐ１９ａベクターは、ＭＴＳアッセイで測定した場合、腫瘍崩壊性であったが、驚くべきことに、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  Δｇｐ１９ａベクターもマウスＧＭ−ＣＳＦ  Δｇｐ１９ａベクターも、培養上清に検出可能なレベルのＧＭ−ＣＳＦを産生しなかった。対照的に、Δｇｐ１９ｂベクターおよびΔｇｐ１９ｃベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＧｍＦベクターによって産生されたＧＭ−ＣＳＦに匹敵するレベルでＧＭ−ＣＳＦを産生した。マウスＧＭ−ＣＳＦ分泌Δｇｐ１９ｄベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＧｍＦの約半分程度の多さでＧＭ−ＣＳＦを産生するようであった（図２９）。
【０２５６】
ＭＴＳ細胞毒性およびＧＭ−ＣＳＦ産生アッセイによって、Δｇｐ１９ｂおよびΔｇｐ１９ｃ構築物に対するさらなる研究の考慮に基づいてウイルスを狭めた。図２６ｂに示されるように、Δｇｐ１９ｃベクターは、Ｅ３−６．７終止コドンと、すぐ下流の遺伝子の最初のメチオニンとの間の重複を修復する。これを達成するために、引き続く変異を用いて、アミノ酸レベルでも同様に、ヒトおよびマウスの両方のＧＭ−ＣＳＦの４番目のヌクレオチドを変異させる必要があった。Δｇｐ１９ｂ構築物において、Ｅ３−６．７終止コドンを、ネイティブのＴＧＡからＴＡＡに変更した。この変化の結果は、Ｅ３−６．７遺伝子の最後の４つのヌクレオチドが、ネイティブのＡＴＧＡでなくＡＴＡＡであり、そしてＥ３−６．７の下流の遺伝子（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）が、この部位で翻訳を開始できないということである。ＧＭ−ＣＳＦ発現を最適化するために、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を、ネイティブなＧＭ−ＣＳＦ配列のすぐ上流においた。結果として、Δｇｐ１９ｂウイルスによって産生されたＧＭ−ＣＳＦは、Δｇｐ１９ｃウイルスと対照的に、ネイティブなアミノ酸配列を有することが予期される。従って、Δｇｐ１９ｂベクター（すなわち、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、Ｇｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ）をさらなる分析のために選択した。
【０２５７】
Ｈ４６０およびＨｅｐ３Ｂ異種移植片ヌードマウスモデルを用いて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）ベクターのインビボの抗腫瘍効果を、既存の腫瘍中で評価した。図３０は、１つのＨｅｐ３Ｂ異種移植片抗腫瘍実験からのデータを示す。５回の腫瘍内ベクター注射後、ＰＢＳ処置した腫瘍、およびＡｄｄ／３１２コントロールベクターで処置した腫瘍に比べて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ腫瘍崩壊性ベクターの両方の有意な抗腫瘍活性が観察された。Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍モデルを用いたこのベクター用量（２×１０９粒子／注射）で、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの未装備のベクターコントロールはまた、有意な抗腫瘍活性を実証した。しかし、本研究においては、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆベクターを用いて処置したＨｅｐ３Ｂ腫瘍は、注射の開始時点で、２９０ｍｍ３であったが、他のベクターで処置した腫瘍は、ベクター注射の開始時点で、平均１７５ｍｍ３（または６５％大きい）であったことに注意することが重要である。このように、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆベクターは、比較的大きい腫瘍の増殖を阻害し得る抗腫瘍活性を示した。この実験におけるＨｅｐ３Ｂ細胞は、極めて少量のＥ１Ａ発現細胞で汚染された。これらのデータの解釈には適切な注意が払われなければならないが、Ｅ１Ａ欠失Ａｄｄ／３１２コントロールベクターの効果は、実験ベクターの効果から容易に識別され得ることがあきらかである。図３１は、１つのＨ４６０異種移植片抗腫瘍実験からのデータを示す。ここでは、２つのベクター用量を用いて、ベクター注射の開始時に、ほぼ等しい容積（１２０〜１６０ｍｍ３）であったＨ４６０腫瘍を処置した。図３１におけるデータ、パネルＡによって、１×１０１０粒子／注射のＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆを用いて処置したＨ４６０腫瘍は、ＰＢＳ処置した腫瘍、またはコントロールのＡｄｄ／３１２処置した腫瘍（２×１０１０粒子／注射で処置）に比べて、この攻撃的な腫瘍の増殖を有意に遅らせたことが示される。５倍高用量のベクターを用いて処置したＨ４６０腫瘍は、ＰＢＳ処置した腫瘍に比べて、有意な増殖阻害を実証した。より低いベクター用量で観察した場合、２９日目には、Ａｄｄ／３１２コントロールベクターで処置した腫瘍に比べて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆベクターについて有意な差異が注目された。
【実施例１１】
【０２５８】
実施例１１：アデノウイルスＥ３−ｇｐ１９遺伝子の位置に挿入されたＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを有し、かつ修復されたＥ３−１４．７遺伝子を有する、Ｅ３含有腫瘍崩壊性アデノウイルスの構築および特徴づけ
Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦのウイルスベクターの構築を記載する。これらのウイルスベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）ＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆに極めて似ているが、修復されたＥ３−１４．７遺伝子を有し、そしてｌｏｘＰ部位が除かれている。
【０２５９】
１１．１．１  ｐＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦおよびｐＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦの構築
ドナープラスミドｐＤｒ５ｈＧｍＦおよびｐＤｒ５ｍＧｍＦの生成
ｐＤＲ２プラスミドからｌｏｘＰ部位を取り除くことによって、それぞれ、プラスミドｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、およびｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆから、ドナープラスミドｐＤｒ５ｈＧｍＦおよびｐＤｒ５ｍＧｍＦを生成した。図３２は、ドナープラスミドｐＤｒ５ｈＧｍＦおよびｐＤｒ５ｍＧｍＦの構造を示す。
【０２６０】
ドナープラスミドｐＤｒ５ｈＧｍＦおよびｐＤｒ５ｍＧｍＦを以下のとおり構築した：
Ｉ．インサートの調製：Ａｄ５ゲノムＤＮＡを、ＮｏｔＩ／ＳｐｈＩで消化し、０．８％アガロースゲル中で電気泳動し、そして１７１４ｂｐフラグメントを回収して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて精製した。１７１４ｂｐのフラグメントを、工程ＩＩＩのライゲーション反応においてインサートＤＮＡとして用いた。
ＩＩ．プラスミドｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、およびｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆを、ＮｏｔＩ／ＳｐｈＩを用いて消化した。この消化物を、０．８％アガロースゲル中で電気泳動して、１０９６０ｂｐのフラグメント（ｈＧＭ−ＣＳＦについて）、および１０９８７ｂｐのフラグメント（ｍＧＭ−ＣＳＦについて）を、このゲルから単離して、ＧｅｎＣｌｅａｎＩＩキットを用いて精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、工程ＩＩＩのライゲーション反応においてベクターＤＮＡとして用いた。
ＩＩＩ．この挿入物およびベクターＤＮＡを連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞に形質導入して、ドナープラスミドｐＤｒ５ｍＧｍＦ、およびｐＤｒ５ｈＧｍＦを生成した。制限酵素消化を用いて、プラスミドクローンをスクリーニングし、正しいパターンを示すプラスミドを、大型のプラスミドの生成において用いた。
【０２６１】
大型のプラスミドｐＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ、およびｐＡＲ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦの生成
ドナープラスミドｐＤｒ５ｈＧｍＦ（図３２Ａ）、およびｐＤｒ５ｍＧｍＦ（図３２Ｂ）を、ＦｓｐＩおよびＳｐｅＩを用いて消化した。ｈＧＭ−ＣＳＦまたはｍＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを含有する大きいフラグメントを、アガロースゲルから回収して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  ＩＩキットを用いて精製した。５０〜１００ｎｇのＤＮＡフラグメントを、ＳｒｆＩ／ＰａｃＩ消化した１００ｎｇのｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦプラスミドＤＮＡとともにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３コンピテント細胞中に同時形質導入した（図３３および３４）。形質導入されたＢＪ５１８３細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレートにプレートして、３７℃で一晩増殖させた。実施例８（セクション８．１．１）に記載のとおり、コロニーをスクリーニングして、正しいプラスミドを単離した。
【０２６２】
１１．１．２  Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦウイルスベクター、およびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦウイルスベクターの生成
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ−ＰＬＵＳ試薬システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、Ｓ８細胞中に、ＳｗａＩ消化した２μｇの大型プラスミドをトランスフェクトすることによって、ウイルスベクターを生成して、６ウェルプレート中で培養した。実施例８（セクション８．１．２）に記載のように、ウイルスを増殖させて、ウイルスのゲノムＤＮＡを単離した。ウイルスのゲノムＤＮＡを、制限酵素であるＥｃｏＲＶ、ＢｓｒＧＩ、ＮｏｔＩ、またはＭｌｕＩを用いて消化して、０．８％アガロースゲルにロードした。制限パターンは予想どおりであった。そのＧＭ−ＣＳＦインサートおよびクローニング接合部の配列を確認した。
【０２６３】
１１．２  インビトロ細胞毒性
Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦウイルスベクター、およびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦウイルスベクターが細胞を殺傷する能力を評価するために、実施例８（セクション８．２）に記載のとおりＭＴＳアッセイを実施した。ヒト腫瘍細胞株Ｈ４６０（非小細胞肺癌、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１７７）、およびＨｅｐ３Ｂ（肝細胞癌、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４）を、ＭＴＳアッセイに含ませた。コントロールウイルスとしては、以下を含んだ：Ａｄｄ／３１２（Ｅ１Ａ陰性コントロール）、Ａｄｄ／３２７（Ｅ１Ａ陽性コントロール）、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（Ｅ２Ｆ−１プロモートされた、Ｅ３欠失した、ｍＧＭ−ＣＳＦを有する骨格ベクター）、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ（実施例１０に記載）、およびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆＦ（ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子を欠き、Ｅ３−１４．７  ｌｏｘＰ修正およびＥ３＋（ｇｐ１９以外）を有するＡｒ１５骨格）。Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて、ＭＴＳアッセイから得た結果（図３５）を、シグモイド用量応答曲線あてはめ分析に供した。このプログラムを用いて、ＬＤ５０（感染の７日後、未処理のコントロール細胞と比べて細胞の５０％が死んだ有効濃度）を算出した。試験した細胞株の全てにおいて、Ａｒ１５ベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの腫瘍崩壊能を保持していた。
【０２６４】
１１．３  ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子発現
Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦウイルスベクター、およびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦウベクターを用いたＨ４６０細胞、およびＨｅｐ３Ｂ細胞の感染後のヒトおよびマウスのＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子の発現を確認するためのスクリーニングとして、マウスおよびヒトのＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡを用いた。２ｍｌ／ウェルの無血清培養培地を用いて、２．５×１０５細胞／ウェルの密度で、Ｈ４６０細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞を６ウェルプレート中にプレートした。翌日、その培地を取り除いて、培養した細胞を、５００μｌの無血清培地中で、１細胞あたり、１０、１００、および１０００粒子のウイルスベクターを用いて、二連で、形質導入させた。５％ＣＯ２インキュベーター中の３７℃でのインキュベーションの２時間後、ウイルスを吸引して、２ｍｌの新鮮な完全培養培地を、各々のウェルに添加した。感染後２４時間または４８時間で、ＥＬＩＳＡのために上清を収集した。結果を図３６に示す。
【０２６５】
１１．４  結果および考察
Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ（ＧＭ−ＣＳＦを装備された腫瘍崩壊性アデノウイルス）を構築した。このベクターは、実施例１０のＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、Ｇｍ、Ｄｇｐ１９）Ｆシリーズと同じｇｐ１９の欠失を有するが、ｌｏｘＰ部位は除かれており、かつＥ３−１４．７遺伝子は修復されている。Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターは、Ｅ３−ｇｐ１９遺伝子のみを欠き、そして他のＥ３タンパク質の全てを保持する。このＥ３タンパク質としては、Ｅ３−１２．５、Ｅ３−６．７、Ｅ３−１１．６（ＡＤＰ）、Ｅ３−１０．４（ＲＩＤ□）、Ｅ３−１４．５（ＲＩＤ□）、およびＥ３−１４．７タンパク質（Ｗｏｌｄら、１９９５に概説されたＥ３領域）が挙げられる。このベクターの制限消化および部分的配列決定によってウイルスの構造を確認した。ＭＴＳアッセイで示されるとおり、Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターは、親のベクターのインビトロにおける腫瘍崩壊性特性を保持していた。ヒトおよびマウスのＧＭ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡによって、腫瘍細胞の感染後のｈＧＭ−ＣＳＦまたはｍＧＭ−ＣＳＦの実質的な量の産生を確認した。
【実施例１２】
【０２６６】
実施例１２：アデノウイルスＥ３−ｇｐ１９遺伝子の位置にＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを挿入された、Ｅ３含有腫瘍崩壊性アデノウイルスの構築および特徴づけ
１２．１  ｐＡｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦの構築
Ｅ３−１４．５遺伝子上流の終止コドンをインタクトに保ったまま、開始コドンから終止コドンまで、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを用いて、アデノウイルスＥ３−１４．７オープンリーディングフレームを正確に置換するため、ＰＣＲ増幅を実施した。３つのＤＮＡフラグメントを生成して、３フラグメント重複ＰＣＲを使用して、これらのフラグメントを重複伸長部位に結合させ、これによって単一ＤＮＡフラグメントを生成する（図３７）。このＤＮＡフラグメントをＸｈｏＩおよびＳｐｈＩを用いて消化して、ｐＤＲ４ＦプラスミドのＥ３−１４．７遺伝子を含有するＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ領域を置換するのに用いた（ｐＤＲ４Ｆプラスミドは、野生型Ａｄ５  Ｅ３領域の全体が含まれたことを除けば、ｐＤＲ２Ｆプラスミドに極めて似ている）。
【０２６７】
ネイティブのアデノウイルスにおいて、Ｅ３−１４．５遺伝子のリーディングフレームは、Ｅ３−１４．７遺伝子に重複する（図３８ａ）。Ｅ３−１４．５遺伝子と、挿入されたＧＭ−ＣＳＦとの間の接合部を、Ｅ３−１４．５遺伝子の完全性を維持しながら、ＧＭ−ＣＳＦ発現を最適化するように、設計した（図３８ｂ）。Ｅ３−１４．５ｋＤａタンパク質のカルボキシ末端アミノ酸配列が変更されず、かつＫｏｚａｋ配列が、Ｅ３−１４．５遺伝子の末端とＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡの開始との間に挿入されてＧＭ−ＣＳＦの発現を強化するように、Ｅ３−１４．７遺伝子についての本来のＡＴＧ開始コドンにおけるＴからＣへの単一の変異を行った。この戦略は、Ｅ３−ｇｐ１９位置（これはまた開始コドン／終止コドンとＥ３−６．７遺伝子上流との重複を有する）へのＧＭ−ＣＳＦの挿入において以前に成功した（実施例１０を参照のこと）。
【０２６８】
Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆＧｍＦベクターについて、アデノウイルス右ドナープラスミドｐＤＲ６ｈＧｍＦ（図３９）を構築した（表２６および２８）。このドナープラスミドは、ｐＤＲ４ＦのＥ３−１４．７遺伝子の位置に、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを含む。表２６にはまた、各々のＰＣＲ産物を生成するのに用いたプライマー対を示す。そしてこのプライマーの正確な配列を表２７に示す。
【０２６９】
ドナープラスミドを以下のとおり構築した：
Ｉ．ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅：図３７に示すとおり、表２６に示すプライマー対を用いて、各々のドナープラスミドについて３つのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した（ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子を欠くコントロールのドナープラスミドｐＤＲ６Ｆについては、２つのフラグメントのみを生成した）。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＣＡＴ＃１１３０４〜０１１）、および製造業者によって提案された条件を用いて、全てのＰＣＲ増幅を実行した。
ＩＩ．重複ＰＣＲ：工程ＩからのＰＣＲ産物を、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＣＡＴ＃４００７７１）を用いて精製した。テンプレートとして３つの精製したＤＮＡフラグメント（ｐＤＲ６Ｆプラスミドについて２）、ならびにプライマーとしてプライマー１（プライマー１４７Ａ）、およびプライマー６（プライマー１４７Ｆ）の混合物を用いて、各々のベクターについて重複ＰＣＲ増幅を実施した。重複ＰＣＲによって、単一のＤＮＡフラグメント（ここでは、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡが、Ｅ３−１４．７領域内に組み込まれている）を生成した。コントロールプラスミドについては、このフラグメントは、Ｅ３−１４．７遺伝子の欠損を伴うＥ３領域を含む。工程Ｉと同様に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、および製造業者によって提案された条件を用いて、全てのＰＣＲ増幅を実行した。
ＩＩＩ．インサートの調製：工程ＩＩ由来のＰＣＲ産物を、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製して、ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩの二重消化に供した。この消化物を、アガロースゲルから回収して、ＧｅｎＣｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて精製して、工程Ｖのライゲーション反応においてインサートＤＮＡとして用いた。
ＩＶ．ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩを用いてプラスミドｐＤＲ４Ｆを消化して、ＣＩＰで処理して、５’リン酸基を除去した。この消化物を、０．８％アガロースゲル中で電気泳動して、ＧｅｎＣｌｅａｎＩＩキットを用いて、１１６３５ｂｐのフラグメントを精製した。精製したＤＮＡフラグメントを、工程Ｖのライゲーション反応においてベクターＤＮＡとして用いた。
Ｖ．インサートＤＮＡおよびベクターＤＮＡを連結して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞中に形質導入してドナープラスミドｐＤＲ６ｈＧｍＦを生成した。制限酵素消化を用いて、プラスミドクローンをスクリーニングした。
図３９は、ドナープラスミドｐＤＲ６ｈＧｍＦの構造を示す。
【０２７０】
表２６．Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆＧｍウイルスベクターの構築のためのプライマー
【０２７１】
【表２６】
2004529627.tif 000030
【０２７２】
表２７．ＰＣＲプライマーの配列
【０２７３】
【表２７】
2004529627.tif 000031
【０２７４】
表２８．Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆＧｍＦ構築物のためのウイルスベクター、ドナープラスミド、および大型プラスミド
【０２７５】
【表２８】
2004529627.tif 000032
【０２７６】
ＦｓｐＩおよびＳｐｅＩを用いてドナープラスミドを消化した；ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを含有する大型フラグメントを、アガロースゲルから回収して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキットを用いて精製した。５０〜１００ｎｇのＤＮＡフラグメントを、ＳｒｆＩ／ＰａｃＩ消化した１００ｎｇのｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦプラスミドＤＮＡとともにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３コンピテント細胞中に同時形質導入した（ｐＡｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦの生成は、図４０に示す）。形質導入されたＢＪ５１８３細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレートにプレートして、３７℃で一晩増殖させた。実施例８（セクション８．１．１）に記載のとおり、コロニーをスクリーニングして、正しいプラスミドを単離した。表２８は、Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆＧｍＦウイルスベクターの生成において用いたプラスミド（ドナープラスミドおよび大型プラスミド）を示す。
【０２７７】
１２．２  ウイルスベクターＡｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦの生成
表２８に詳細に示されるプラスミドを用いて、実施例１０に記載のとおり、アデノウイルスベクターの生成を実施した。ＡＥ１−２ａクローンＳ８細胞（Ｓ８細胞）を、１０％熱不活性化ＦＢＳを含有するＩＭＥＭ中で培養した。ＳｗａＩ消化した大型プラスミド（２μｇ）を、Ｓ８細胞中にトランスフェクトして、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＭ−ＰＬＵＳ試薬システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、６ウェルプレート中で培養した。３７℃、５％ＣＯ２、加湿下の７日間のインキュベーション後、このウイルスベクターを、ＣｓＣｌ勾配によって増幅して精製した。分光光度的分析によって、ウイルスベクターの濃度を決定した（Ｍｉｔｔｅｒｄｅｒら、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ｊ  Ｖｉｔｏｌ  ７０：７４９８〜７５０９（１９９６））。Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦの構造を確認するため、Ｇｅｎｔｒａ  ＳｙｓｔｅｍｓのＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、以下のように、ウイルスのゲノムＤＮＡを単離した：１５０μｌのウイルスベクター溶液を、５６℃で４時間〜一晩、撹拌しながら、３００μｌの細胞溶解溶液（Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ｋｉｔが供給）、および２０μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ）と混合した。インキュベーションの終了時に、１分間、氷上の試験管に入れることによってサンプルを室温まで冷却した。５，０００μｌのタンパク質沈殿溶液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をこのサンプルに添加し、２０秒間高速で激しくボルテックスして、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ウイルスＤＮＡを含む上清（沈殿したタンパク質は、試験管の底に堅いペレットを形成する）を、新しい１．５ｍｌの微量遠心管（４５０μｌの１００％イソプロパノール（２−プロパノール）を含有する）に移した。このサンプルを、穏やかに５０回反転させることによって混合し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、その上清を廃棄して、４５０μｌの７０％エタノールを用い、続いて、１４，０００ｒｐｍ１分間の遠心分離をすることによって、ＤＮＡペレットを洗浄した。この上清を回収して、ＤＮＡペレットを１０分間風乾させた。５０μｌのＤＮＡ水和溶液（ＤＮＡ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ｋｉｔから供給）を各々の試験管に添加して、そのＤＮＡを６５℃で１時間再水和させた。ウイルスのゲノムＤＮＡを、制限酵素（ＲＥ）であるＥｃｏＲＶ、ＢｓｒＧＩ、ＮｏｔＩ、およびＭｌｕＩを用いて消化して、０．８％アガロースゲル上で電気泳動した。アガロースゲルにおいて観察されたＡｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦウイルスベクターの制限酵素パターンは、予想されたパターンに合致した。
【０２７８】
１２．３  インビトロ細胞毒性アッセイ（ＭＴＳアッセイ）
Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦが細胞を殺傷する能力を評価するために、ヒトＨ４６０腫瘍細胞を用いて、実施例１０に記載のとおり、ＭＴＳアッセイを実施した。Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦに起因する細胞毒性を、コントロールウイルスである、Ａｄｄ／３１２、Ａｄｄ／３２７、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Δｇｐ１９）Ｆと比較した。Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて、ＭＴＳアッセイスクリーニングから得た結果（図４１）を、シグモイド用量応答曲線あてはめ分析に供した。このプログラムを用いて、ＬＤ５０（感染の７日後、未処理のコントロール細胞と比べて細胞の５０％が死んだ有効濃度）を算出した。Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの腫瘍崩壊能を保持していた。
【０２７９】
１２．４  Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦによって誘導されたインビトロにおけるＧｍ−ＣＳＦ産生
ヒトＧＭ−ＣＳＦについてのＥＬＩＳＡを用いて、ＭＴＳアッセイと同じロットを用いる、Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦウイルスベクターでのＨ４６０細胞の感染後に、ｈＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子の発現を確認した。この感染、培地収集、ＥＬＩＳＡおよび分析を、実施例１０に記載のとおり実施して、その結果を図４２にプロットする。Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦを用いたＨ４６０細胞の感染後のヒトＧＭ−ＣＳＦ産生は、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Δｇ１９）Ｆでの感染後のＧＭ−ＣＳＦ産生と極めて類似していた。
【０２８０】
１２．５  まとめ
Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターにおいて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Δｇ１９）Ｆのクローニングにおいて成功したスキームを用いて、ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子をクローニングした。このベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Δｇ１９）Ｆと同様のレベルでＧＭ−ＣＳＦを産生し、かつアデノウイルス骨格の腫瘍崩壊能を保持しており、これによってクローニングスキームの一般性が例示された。
【０２８１】
合わせたＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Δｇ１９）ＦおよびＡｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦのデータによって、導入遺伝子発現レベルが、特定の適用の要件に従って微調整され得るという概念が例示される。２つの異なる導入遺伝子が、２つの異なる領域に（例えば、Ｅ３−ｇｐ１９位置およびＥ３−１４．７位置に）挿入されて、２つの異なる導入遺伝子を同時に発現するベクターが作製され得る。これは、免疫活性化サイトカインの同時産生、または自殺遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ、またはシトシンデアミナーゼ）と一緒の免疫活性化サイトカインの産生に有用であり得る。適切なプロドラッグを用い、免疫系の刺激および自殺遺伝子の産生後と仮定すると、この感染した細胞は、免疫学的に活性化されたミリエアム（ｍｉｌｌｉｅａｕ）において除去され得る。除去された腫瘍細胞から得られた破片は、抗腫瘍免疫応答（サイトカインの存在によってさらにブーストされる）の生成のための抗原の優れた供給源として役立つ（Ａｌｂｅｒｔ  ＭＬら．，「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｃｑｕｉｒｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｒｏｍ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＴＬｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：８６〜８９（１９９８））。さらに、Ｅ３領域の他の領域における導入遺伝子の配置は、さらに広範な発現レベルを生じ、これは異なる動態を有する（Ｗｏｌｄら、「Ｅ３  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ」Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９：２３７〜２７４（１９９５））。詳細には、アデノウイルス死亡タンパク質（ＡＤＰ）の位置における導入遺伝子の追加によって、ウイルスのサイクルの後期に導入遺伝子を発現するベクターを生じることが期待される。これを、Ｅ３−ｇｐ１９またはＥ３−１４．７位置における同じかまたは異なる導入遺伝子の挿入と組み合わせて、導入遺伝子の長期発現を伴うベクター、またはウイルスのライフサイクルの間に連続して２つの導入遺伝子を発現するベクターを作製し得る。導入遺伝子が同じである場合、ＯＲＦは、インサートの間の相同組み換えを最小化するかまたは排除するために記録される必要があり得る。記録されたＯＲＦは、もとのＤＲＦと同じタンパク質を産生する。Ｅ３−ｇｐ１９またはＥ３−１４．７位置からの、免疫応答の初期段階を刺激するサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ｆｌｔ−３、ＭＩＰ１−α）の早期発現には、免疫の後期段階（例えば、ＩＬ−２、またはＩＬ−５）を刺激する、ＡＤＰ位置からのサイトカインの遅れた発現を伴い得る。結局、Ｅ３オープンリーディングフレームの任意の位置から３つ以上の導入遺伝子を発現し得るベクターがまた、想定され得る。
【実施例１３】
【０２８２】
実施例１３：Ｅ２Ｆ−１プロモーターによって制御される腫瘍崩壊性ベクターによる腫瘍細胞中のヒトＧＭ−ＣＳＦの選択的産生
１３．１  アデノウイルスベクター
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターであって、Ｅ１Ａプロモーターが、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターで置換されている、アデノウイルスベクターである。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの欠失したＥ３領域中にクローニングされたヒトＧＭ−ＣＳＦを用いて生成された腫瘍崩壊性ベクターである。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ，Ｄｇ１９ｂ）Ｆは、Ｅ３領域中のほとんどの遺伝子を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターであって、ただしヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が、ｇｐ１９領域中にクローニングされており、かつＥ３−１４．７遺伝子を分断するｌｏｘＰ部位を含む、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターである（実施例１０を参照のこと）。Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆＦおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９）Ｆと同様であって、ただしｌｏｘＰ部位を欠き、かつＥ３−１４．７領域が修復されている。
【０２８３】
１３．２  細胞株
ヒト胚の肺線維芽細胞株Ｗｉ３８（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−７５）、およびそのＳＶ４０形質導入改変体、Ｗｉ３８−ＶＡ１３（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−７５．１）を、１０％ＦＢＳを含有するＥＭＥＭ（１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌグルタミン、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、および１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを補充した）中で培養した。
【０２８４】
１３．３  Ｅ２Ｆ−１  ノーザン分析
６％ホルムアルデヒド−０．８％アガロースゲル上で、ＲＮＡサイズマーカーと一緒に、１×ＮｏｒｔｈｅｒｎｍａｘＴＭ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版、９．３１〜９．５２頁、１９８９）中で、分離した２０μｇの総ＲＮＡを用いてノーザン分析を実施した。製造業者によって特定されたとおりＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ＋ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＫ）にこのＲＮＡを転写した。Ｅ２Ｆ−１転写物に特別なＤＮＡプローブを生成するために、Ｅ２Ｆ遺伝子ファミリーの６つのメンバーの全長ｃＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから取り出して、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔソフトウェアを用いて整列させた。Ｅ２Ｆ−１遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、他のＥ２Ｆ遺伝子ファミリーのメンバーと共有されない配列を含む。１対のオリゴヌクレオチドプライマー、フォワード５’−ＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＣＡＴＡＣ−３’（配列番号６５）、およびリバース：５’−ＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＡＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号６６）を設計した。オリゴプライマーを用いてプライムしたテンプレートとして、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いてＰＣＲを実施した。エキソン６中に配置されたＥ２Ｆ−１  ３’−ＵＴＲから３５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離するために、ＰＣＲ条件は、１分の９５℃、６０℃、および７２℃を、３５サーマルサイクルであった。３２Ｐ−ｄＣＴＰの無作為な取り込みによって、総量１００ｎｇのプローブＤＮＡを標識した。特定のＤＮＡプローブを用いてＲＮＡをハイブリダイズするために、ＮｏｒｔｈｅｒｍａｘＴＭ  Ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ／ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて、４２℃で少なくとも２時間、フィルターをプレハイブリダイズした。放射線標識したプローブを添加して、ハイブリダイゼーションを約１６時間継続した。ブロットを２×ＳＳＣ／０．０１％  ＳＤＳ中で、室温で３０分間、０．１×ＳＳＣ／０．０１％  ＳＤＳ中で５５℃で２０分間、次いで６８℃で３０分間洗浄した。オートラジオグラフィーによってシグナルを可視化した。文献中に報告されるとおり（Ｓｌａｎｓｋｙら、Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｅ２Ｆ１  ｍＲＮＡ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９３  Ｍａｒ；１３（３）：１６１０−８：Ｎｅｕｍａｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ａｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｅ２Ｆ１  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ．１９９６  Ｓｅｐ  １６；１７３（２）：１６３−９）、Ｅ２Ｆ−１のメッセンジャーは、２．５ｋｂの転写物として可視化された。ハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子のプローブを、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入し、放射性標識して、各々のレーンにロードしたｍＲＮＡの量の内部コントロールとして用いた。
【０２８５】
１３．３．１  結果：ＲＢ−経路欠損Ｗｉ３８−ＶＡ１３細胞およびＷｉ３８細胞におけるＥ２Ｆ−１発現
Ｗｉ３８−ＶＡ１３は、正常なヒト線維芽細胞Ｗｉ３８のＳＶ４０形質導入改変体である。ＳＶ４０由来のＴ−Ａｇは、正常なｐＲｂ経路に結合し、かつこれを破壊して、より高レベルの遊離Ｅ２Ｆを生じ、これが次に、それ自体のプロモーターを活性化する。細胞株におけるＥ２Ｆ発現を、ノーザンブロット分析によって試験した。正常な親のＷｉ３８細胞と比べて、Ｗｉ３８−ＶＡ１３細胞におけるＥ２Ｆ−１発現の上方制御を確認した（データ示さず）。
【０２８６】
１３．４  細胞の感染
Ｗｉ３８またはＷｉ３８−ＶＡ１３細胞を、ウイルス感染の１日前に、６ウェルプレートに１ウェルあたり４×１０５で播種して、ウイルス感染の際に５０〜６０％コンフルエンシーを得た。Ｅ１Ａ遺伝子転写の開始の時間を制御するため、細胞へのウイルスの内在化について感染を同期化した。穏やかにロッキングしながら、０．５ｍｌ／ウェル培地（２％ＦＢＳ含有）中で、アデノウイルスベクターを１００ｐｐｃおよび１０００ｐｐｃで用いて、細胞を、４℃で１時間、感染させた。低温によって、細胞に入れることなく、細胞膜にウイルスを付着させる（Ｓｈｅｎｋ  Ｔ．  Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．１９９６；ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ、およびＨｏｗｌｅｖ  ＰＭ，編（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）第２１１１−２１４８頁）。ウイルス含有培地を取り出して、冷ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、次いで増殖培地（１０％ＦＢＳを含有する基本培地）中で、種々の時間、３７℃でインキュベートした。
【０２８７】
１３．５  リアルタイム定量的ＰＣＲによるＥ１Ａ転写レベルの決定
４℃での１時間のウイルスを用いた感染後、完全倍地中で３７℃で４時間細胞を培養して、ウイルスの内在化および遺伝子転写をさせた。インキュベーションの終わりの時点で、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌ  ＲＮＡｚｏｌＢ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ  Ｉｎｃ，Ｆｒｉｎｄｗｏｏｄ，ＴＸ）中で溶解して、ＲＮＡの単離まで−７０℃で保管した。この細胞溶解物を０．１容積のクロロホルムを用いて抽出した。１容積のイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、７５％エタノールで洗浄して、ヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。５単位のＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて、室温で１５分間、各々のサンプルを処理した。ＥＤＴＡの添加（２．５ｍＭの最終濃度）によってＤＮａｓｅＩを不活性化して、６５℃で１０分間インキュベートした。ＲＮＡサンプルを２容積のエタノール／０．１容積３Ｍ酢酸ナトリウムで再沈殿させ、７５％エタノール中で洗浄して、ヌクレアーゼを含まない水中に再懸濁した。ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＰＬＵＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、ＲＮＡ濃度を分光光度的に（Ａ２６０およびＡ２８０）決定した。Ｔａｑｍａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、１００ｎｇの試験サンプルＲＮＡから、第一鎖ｃＤＮＡを生成した。以下の条件下で、７０μｌの反応容積中で、逆転写を実施した：１×ＴａｑＭａｎ  ＲＴ緩衝液、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．８ｍＭ  デオキシＮＴＰ混合物（各々０．９６ｍＭののデオキシＮＴＰ）、２．５μＭ  ランダムヘキサマー、１単位のＲＮａｓｅインヒビター、および２．５単位のＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ。この反応物を２５℃で１０分間、４８℃で３０分間、９５℃で５分間インキュベートして、４℃に保った。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ．１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、アデノウイルスＥ１Ａ配列に特異的なプライマーを設計した。プライマーおよびプローブの配列は以下であった：
Ｅ１Ａフォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号６７）
Ｅ１Ａリバースプライマー：３’−ＧＣＴＣＧＴＴＡＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴＣＧＡ−３’（配列番号６８）
Ｅ１Ａプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号６９）
以下の条件下で、５０μｌの反応容積中で増幅を実施した：２０μｌのサンプルｃＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、および１００ｎＭ  Ｅ１Ａプローブ。サーマルサイクリング条件は、以下であった：５０℃で２分インキュベーション、Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄのために１０分９５℃活性化工程、続いて９５℃１５秒間、および６０℃１分間の連続的インキュベーションの３５サイクル。７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、サーマルサイクリングを実行した。データを収集して、７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアｖ１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、分析した。Ｅ１Ａの相対的レベルを、Ｅ１Ａプラスミドの曲線（バックグラウンドのＲＴ反応に入れた１，５００，０００〜１５コピーの希釈による）に基づいて決定した。内因性コントロール：各プレート上の標準物質（較正用）ＲＮＡサンプルを用いることによって、インプットＲＮＡを評価した。次いで、各サンプルについての閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）（Ｃｔ）を、以下の式を用いてこの標準物質の閾値サイクルと比べた：２−ΔＣｔ（ここで、ΔＣｔ＝サンプル１８ＳのＣｔ値−標準物質のＣｔ値）。Ｅ１Ａおよび１８Ｓ  ＲＮＡについての逆転写反応を、二連で実施して、各々についての平均値を報告した。
【０２８８】
１３．５．１  結果：感染後４時間のＷｉ３８−ＶＡ１３細胞におけるＥ１Ａ遺伝子発現
Ｅ１Ａ遺伝子転写は、宿主細胞感染の直後に開始する。Ｅ１Ａ遺伝子発現の時間経過によって、Ｅ１Ａ転写物が、感染後４時間で有意なレベルに達したことが示される（データ示さず）。従って、記載したように、１０００ｐｐｃのＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、またはＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦを用いて、Ｗｉ３８−ＶＡ１３細胞およびＷｉ３８細胞を、４時間感染させた。この結果を、感染後４時間のヘキソンＤＮＡコピー数に対して正規化した。ＳＶ４０で形質導入したＷｉ３８−ＶＡ１３細胞中のＥ１Ａ  ＲＮＡコピーは、異なるアデノウイルスで感染した正常なＷｉ３８細胞におけるコピー数よりも高かった。このことは、Ｅ２Ｆレベルが上昇した、Ｔ−Ａｇで形質導入された細胞において、Ｅ１Ａが選択的に発現されることを示した。
【０２８９】
１３．６  ヘキソン  ＤＮＡ  ＰＣＲ
細胞中のアデノウイルスのコピーを、ヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲによって測定した。各々の感染について複数のウェルを、プレートして、ＤＮＡ  ＰＣＲに必要な３×１０６個の細胞を得た。感染後に細胞を洗浄してトリプシン処理し、遠心分離して、その細胞ペレットをドライアイス上で急速に凍結させて、後のＤＮＡ抽出のために−７０℃で保存した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いて、製造業者の指示に従って、約３×１０６細胞からＤＮＡを単離した。２５０〜３００μｌの水中でＤＮＡの溶出を行い、そしてＳＰＥＣＴＲＡｍａｘＰＬＵＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で、分光光度測定（Ａ２６０およびＡ２８０）によって、濃度を決定した。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、アデノウイルスヘキソン配列に特異的なＰＣＲプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを設計した。プライマーおよびプローブの配列は以下であった：
ヘキソンＥ１Ａフォワードプライマー：５’−ＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号７０）
ヘキソンリバースプライマー：３’−ＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号７１）
ヘキソンプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号７２）
以下の条件下で、５０μｌの反応容積中で増幅を実施した：１０ｎｇのサンプルＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、６００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、および１００ｎＭヘキソンプローブ。サーマルサイクリング条件は、以下であった：５０℃で２分インキュベーション、９５℃で１０分、続いて９５℃１５秒間、および６０℃１分間の連続的インキュベーションの３５サイクル。データを収集して、７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアｖ１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、分析した。アデノウイルスコピー数の定量を、標準曲線（１０ｎｇの細胞のゲノムＤＮＡ中の１，５００，０００〜１５コピーのアデノウイルスＤＮＡの希釈からなる）を用いて、実施した。インプットＤＮＡの量、および６×１０９ｂｐのゲノムサイズに基づいて、総コピーの平均数を、１細胞あたりのコピーに正規化した。
【０２９０】
１３．６．１  結果：感染後４時間のアデノウイルスヘキソンＤＮＡコピー数
Ｅ１Ａ遺伝子転写は、宿主細胞へのアデノウイルスの進入後に生じて、約６〜８時間継続し、その後、ウイルスＤＮＡ複製がまず検出される（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１（ｐｔ．１１）：２５７３〜２６０４（２０００））。従って、感染後４時間では、アデノウイルスＤＮＡ複製は、宿主細胞においてはまだ開始しておらず、その結果、この時点での１細胞あたりのＤＮＡコピーの検出は、感染期間中に細胞に進入したアデノウイルス粒子（すなわち、形質導入効率）を反映するはずである。ヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲを、感染後４時間で実施して、Ｗｉ３８細胞およびＷｉ３８−ＶＡ１３細胞によって内在化されたアデノウイルス粒子の数を決定した。アデノウイルスの形質導入機構の全ての公知の成分が、ここで用いたベクターの必須の成分であり、これらのベクターの間で形質導入効率が変動するとは予想されなかったので、平均形質導入効率は、用いた各々の細胞タイプおよびｐｐｃについて決定した。１００ｐｐｃでは、Ｗｉ３８細胞において平均０．１３のアデノウイルスＤＮＡコピー／細胞であり、そしてＷｉ３８−ＶＡ１３細胞において平均０．２のＤＮＡコピー／細胞であった。１０００ｐｐｃでは、Ｗｉ３８細胞において平均０．８のＤＮＡコピー／細胞であり、そしてＷｉ３８−ＶＡ１３細胞において平均１．９のＤＮＡコピー／細胞を検出した（表２９）。形質導入効率としてこれらの平均を用いて、Ｗｉ３８とＷｉ３８−ＶＡ１３との間のｈＧＭ−ＣＳＦ産生において観察された差異を正規化した。
【０２９１】
表２９．感染後４時間でのＷｉ３８−ＶＡ１３およびＷｉ３８における１細胞あたりのヘキソンＤＮＡコピー
【０２９２】
【表２９】
2004529627.tif 000033
【０２９３】
１００または１０００ｐｐｃのアデノウイルスベクターを用いて、細胞を４℃で１時間、感染させ、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２、加湿したインキュベーター）に移して、ＰＣＲによって、ヘキソンＤＮＡコピー数を測定した。平均は、示した３回の決定の平均±ＳＤである。
【０２９４】
１３．７  ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ
アデノウイルスでの感染の２４時間後、Ｗｉ３８細胞およびＷｉ３８−ＶＡ１３細胞から馴化培地を収集した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入したキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＨＳ  Ｈｕｍａｎ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＨＳＧＭ０、およびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＤＧＭ００）を用いて、この上清中のヒトＧＭ−ＣＳＦの量を、ＥＬＩＳＡによって決定した。要するに、マイクロチャネルピペッターを用いて、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ９６ウェルマイクロプレートの各々のウェルに、１００μｌのアッセイ希釈液をロードした。５０，０００μｌのサンプルまたはｈＧＭ−ＣＳＦ標準物質を各々のウェル（抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体で事前にコーティングした）に添加した。このプレートを室温で３時間インキュベートして、その溶液を吸引して、そのウェルを洗浄緩衝液で５回洗浄した。２００μｌのｈＧＭ−ＣＳＦ共役溶液を、各々のウェルに添加して、室温で２時間インキュベートした。このプレートを５回洗浄し、５０μｌのＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに添加して、そのプレートを室温で１時間インキュベートした。５０μｌの増幅溶液を、各々のウェルに添加し、さらに３０分間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、５０μｌの停止溶液を添加して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  １９０マイクロプレートリーダーを、４９０ｎｍのＯＤを読むように波長を設定して用いて、光学密度を測定した。標準曲線から、ＯＤ４９０値に基づいて、希釈した未知のサンプル中のｈＧＭ−ＣＳＦの濃度を算出した。サンプル希釈によってプレートリーダーから読み出して得たｈＧＭ−ＣＳＦ濃度を掛けることによって、もとの（ニートな）試験サンプルにおけるｈＧＭ−ＣＳＦの濃度を算出した。
【０２９５】
１３．７．１  結果：培養上清におけるヒトＧＭ−ＣＳＦレベル
腫瘍崩壊性ベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦおよびその誘導体は、Ｅ１Ａ発現を制御するためにＥ２Ｆ−１プロモーターを利用する。次いで、Ｅ１Ａタンパク質は、Ｅ３プロモーターをトランス活性化して、ｈＧＭ−ＣＳＦの発現を誘導する。Ｗｉ３８−ＶＡ１３細胞は、ＳＶ４０で形質導入したＷｉ３８の誘導体である。Ｗｉ３８−ＶＡ１３細胞において、Ｔ−Ａｇは、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体に結合して、Ｅ２Ｆタンパク質を放出する。次いで、これらの遊離のＥ２Ｆタンパク質は、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ中のＥ２ＦプロモーターのＥ２Ｆ結合部位に結合し、これがＥ１Ａの転写、次にｈＧＭ−ＣＳＦの転写を導く。腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターであるＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、またはＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦを、１００ｐｐｃおよび１０００ｐｐｃで用いて、Ｗｉ３８−ＶＡ１３細胞およびＷｉ３８細胞を感染させた。感染後２４時間で回収した培養上清を、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現についてＥＬＩＳＡによって分析した。２つの細胞株を形質導入するウイルスの数は変動するので、ＧＭ−ＣＳＦ産生における差異は、異なる形質導入効率を反映するものであり得る。この可能性を排除するため、ＥＬＩＳＡによって検出したｈＧＭ−ＣＳＦ産生を、細胞中のウイルスコピーの数に対して正規化した。感染後４時間のヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲがこの目的を果たした。３つ全てのアデノウイルスベクターで感染したＷｉ３８−ＶＡ１３細胞におけるｈＧＭ−ＣＳＦの正規化したレベルは、正常なＷｉ３８細胞によって産生されたレベルと比べて実質的に高かった。さらに、３つのベクターによってＷｉ３８−ＶＡ１３細胞において産生されたｈＧＭ０ＣＳＦの量は、匹敵するレベルであり、このことは、ベクター間の構造的な差異は、インビトロにおいてＧｍ−ＣＳＦ転写のレベルに明白な影響を有さないことを示す。これらの結果によって、Ｅ２Ｆプロモーターが、Ｗｉ３８細胞においてよりもＷｉ３８−ＶＡ１３細胞において実質的により活性であり、そしてこのプロモーターは細胞中のＥ２Ｆのレベルによって調節されることが示唆される。
【０２９６】
１３．８  ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ＦＡＣＳ分析
１３．８．１  モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）：
ＧＭ−ＣＳＦ特異的モノクローナル抗体は、ＢＤ／ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。フィコトリエン（ＰＥ）結合体化ラット抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ、カタログ番号＃１８５９５Ａ，クローンＢＶＤ２−２１Ｃ１１）を用いて、アデノウイルスベクターに感染した細胞を染色した。ＰＥ結合体化ラットＩｇＧ２ａ、κモノクローナル抗体（カタログ番号２０６２５Ａ、クローンＲ３５−９５）を、アイソタイプのコントロールとして用いた。
【０２９７】
１３．８．２  ヒトＧＭ−ＣＳＦの細胞内染色およびＦＡＣＳ分析
２５０μｌ／チューブ（試験管）のｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ（細胞固定）溶液（ＢＤ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カタログ番号＃５５４７２２）中で、４℃で２０分間、細胞を固定して透過化処理させた。細胞を洗浄して、２μｌの抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体を用いて、暗野において４℃で３０分間、インキュベートさせた。細胞を１×ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ（固定／洗浄）溶液（ＢＤ／ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５２７２３）中で２回洗浄して、フローサイトメトリー分析の前にＰＢＳ中に再懸濁した。
【０２９８】
１３．８．３  データの取得および分析
細胞を取得して、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍ上でＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアの使用によって分析した。アイソタイプコントロールの染色した細胞を用いて、光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧を設定した。アイソタイプコントロール抗体染色した細胞を用いて、相同な細胞集団を、前方散乱（ＦＳＣ）上にゲートして、側方散乱（ＳＳＣ）ドットプロットおよびマーカーを、細胞の２％未満が陽性の範囲におさまる位置に設定した。ほとんどの場合、１０，０００のゲートされた事象を収集して分析した。データをヒストグラムに示し、ＧＭ−ＣＳＦを発現する細胞の割合を決定した。
【０２９９】
１３．８．４  結果：Ｗｉ３８−ＶＡ１３細胞におけるヒトＧＭ−ＣＳＦの細胞内検出
ｈＧＭ−ＣＳＦを装備した腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターで感染した細胞の上清におけるバルクＧＭ−ＣＳＦ産生を測定することに加えて、フローサイトメトリーによって単一細胞レベルで、ＧＭ−ＣＳＦ産生を評価した。これは、ｈＧＭ−ＣＳＦを産生している培養中の細胞の割合についての情報を提供する。感染後２４時間で、ｈＧＭ−ＣＳＦを装備したベクターを１０００ｐｐｃ用いて感染したＷｉ３８−ＶＡ１３細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ発現について４０％まで陽性であったが、Ｗｉ３８細胞では、約２％（バックグラウンドレベル）のみが陽性であった。これらのデータはさらに、細胞のＥ２Ｆ−１レベルとＧＭ−ＣＳＦ発現の調節との間の相関を実証する。
【０３００】
１３．９  まとめ
癌の治療において、複製コンピテントなアデノウイルスは、複製欠損ウイルスを上回る大きな利点を有する。なぜなら、注射されたウイルスの治療効果は、腫瘍内のウイルス複製によって増強されることが期待されるからである。腫瘍選択性Ｅ２Ｆ−１プロモーターを、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦにおいて用いて、野生型アデノウイルスＥ１プロモーターを複製する。Ｅ２Ｆ−１プロモーターの選択性は、ｐＲｂ経路が破壊された腫瘍細胞におけるＥ２Ｆ−１プロモータートランス活性化因子の抑制に基づく可能性が最も高い。
【０３０１】
同系のＷｉ３８−ＶＡ１３細胞系およびＷｉ３８細胞系を、本研究において用いた。Ｗｉ３８は、インタクトなＲｂ経路を有する胚性肺組織由来の正常な線維芽細胞である。Ｗｉ３８−ＡＶ１３細胞株は、Ｗｉ３８由来のＳＶ４０形質導入細胞であって、ここではＳＶ４０  Ｔ−ＡｇがｐＲｂ−Ｅ２Ｆ経路を破壊しており、結果として高レベルの遊離のＥ２Ｆ転写因子が生じる。このモデルを用いて、腫瘍崩壊性アデノウイルス（ここでは、Ｅ１Ａ発現は、Ｅ２Ｆ−１プロモーターの制御下である）におけるＥ３プロモーター駆動ＧＭ−ＣＳＦ産生に対する細胞性Ｅ２Ｆレベルの影響を評価した。
【０３０２】
感染したＷｉ３８−ＶＡ１３細胞において、高いｈＧＭ−ＣＳＦ産生が観察され、そしてＷｉ３８細胞において最小の産生が観察された。これらのデータによって、Ｅ２Ｆ−１プロモーターが、豊富なＥ２Ｆレベルを有する細胞において選択的に活性化され、これがＧＭ−ＣＳＦの腫瘍選択性産生を生じることが示唆される。腫瘍に対するＧＭ−ＣＳＦの産生の限定によって、ＧＭ−ＣＳＦの全身的発現の結果による毒性の可能性が低下するはずである（Ｅｍｅｎｅｓら、「Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｆｒｉｅｎｄ  ｏｒ  ｆｏｅ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ？」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，３（１）：７７〜８４（２００１））。分析した２４時間の時点で、Ｗｉ３８細胞とＷｉ３８−ＶＡ細胞との間のＧＭ−ＣＳＦ産生の差異は、Ｅ２Ｆ−１プロモーターの異なる活性によって開始された分子事象のカスケードの総計であり、これがＥ１Ａの転写／翻訳、ウイルス複製の開始、およびＥ３プロモーターの活性化を生じる。これらの事象は、Ｗｉ３８−ＶＡ１３細胞において選択的に増幅され、これによって、３つのウイルスベクターによるＧＭ−ＣＳＦ産生は、Ｅ２Ｆ−１低Ｗｉ３８細胞における産生よりも１３〜６０倍高い。
【０３０３】
まとめると、本発明者らは、Ｗｉ３８−ＶＡ１３モデル系を用いる証拠を提供した。このモデル系では、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ中のＥ２Ｆ−１プロモーターおよび関連のベクターが、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子転写を選択的に調節し得、そして下流のＥ３プロモーターが、ｐＲｂ経路欠損細胞におけるｈＧＭ−ＣＳＦ発現を調節した。
【実施例１４】
【０３０４】
実施例１４：腫瘍全体におよび腫瘍崩壊性アデノウイルスのインビボ伝播
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、複製コンピテントな腫瘍崩壊性アデノウイルスであって、ここではＥ２Ｆ−１腫瘍選択性プロモーターが、アデノウイルスＥ１Ａの発現を調節する。効率を改善するために、別のアデノウイルスであるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ（アデノウイルスＥ３領域全体を含む）を構築した。Ｅ３領域は、インビトロにおけるアデノウイルスの複製には必要でないと長く考えられており、アデノウイルス遺伝子治療構築物からは頻繁に欠失している。Ｅ３領域は、宿主の抗ウイルス応答を相殺するように設計された７つのタンパク質をコードすることが公知である（Ｗｏｌｄら、１９９５；１９９９）。免疫調節遺伝子をコードすることに加えて、Ｅ３領域はまた、１１．６ｋＤａのアデノウイルス死亡タンパク質（ＡＤＰ）を含む。このタンパク質は、感染した細胞の効率的な溶解、および感染性ビリオンの放出を媒介する。同様に、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＧｍＦおよびそのＥ３含有改変体Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、Ｇｍ、Ｄｇ１９）Ｆ（ｇｐ領域のみを欠く）を構築して、試験した。この実施例において、Ｈ４６０およびＨｅｐ３Ｂの腫瘍異種移植片へのウイルスベクターのインビボ投与後の、ヘキソン陽性細胞の割合の変化を検出することによって、固形腫瘍におけるウイルスの伝播を評価した。
【０３０５】
１４．１  アデノウイルスベクター
腫瘍崩壊性ベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、Ｅ３欠失アデノウイルスベクターであって、ここでＥ１Ａプロモーターは、腫瘍選択性ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターで置き換えられ、腫瘍細胞における選択的なウイルス複製が得られる。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆは、Ｅ３遺伝子のほとんどを含むことを除けば、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦと同様の腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターである。Ａｄｄ／３１２は、Ｅ１Ａ領域の欠失を有し、かつ陰性コントロールベクターとして用いられる、複製欠損アデノウイルスである。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦと同じＥ３欠失を有し、かつＥ３プロモーターの制御下のヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを担持する腫瘍崩壊性ベクターである。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、Ｇｍ、Ｄｇ１９）Ｆは、Ｅ３−ｇｐ１９位置にヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを担持し、かつ残りのＥ３遺伝子のほとんどを発現する腫瘍崩壊性ベクターである。
【０３０６】
１４．２  腫瘍細胞株
ヌードマウス異種移植片モデルにおいて、２つの腫瘍細胞株を用いた。ヒト非小細胞肺癌細胞株Ｈ４６０（ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７７）、およびヒト肝細胞癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７、ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６４）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。Ｈ４６０細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ  Ｌグルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、１０％ＦＢＳを含有する改変イーグル培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。
【０３０７】
１４．３  異種移植片ヌードマウス腫瘍モデル
両方のモデルで、６〜８週齢の雌性無胸腺近交系ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）を用いた。Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．の動物施設規則（ＡＡＡＬＡＣ−認定）に従って、全ての研究を行った。
【０３０８】
Ｈ４６０  腫瘍モデル：
２百万個のＨ４６０腫瘍細胞（０．１ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁した）を、マウスの右脇腹に皮下移植した。腫瘍接種の７〜９日後、腫瘍容積が、約２００ｍｍ３（以下によって算出した：Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）π／６；Ｖ、容積；Ｗ、幅；Ｌ、長さ）に到達したとき、動物を同様の腫瘍サイズの群に分布させて、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ、Ａｄｄ／３１２のアデノウイルス、またはＨＢＳＳの腫瘍内投与を開始した。マウス１匹あたり３０μｌの容積で２×１０１０ウイルス粒子の単回注射を投与した。ヘキソンＦＡＣＳ分析のために、注射後１、４、または７日目に、腫瘍を切り出した。
【０３０９】
Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍モデル：
１千万個のＨｅｐ３Ｂ腫瘍細胞を、０．１ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁して、マウスの右脇腹に皮下移植した。腫瘍接種後、１２〜１４日で、腫瘍容積が、約２００ｍｍ３に到達したとき、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＧｍＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、Ｇｍ、Ｄｇ１９）Ｆ、Ａｄｄ／３１２アデノウイルス、またはＨＢＳＳの腫瘍内投与を開始した。マウス１匹あたり２×１０８ウイルス粒子の単回注射を投与した。ヘキソンＦＡＣＳ分析のために、注射後１、４、または７日目に、腫瘍を切り出した。
【０３１０】
１４．４  腫瘍からの単一細胞懸濁物の調製
腫瘍内ウイルス注射後、１日、４日、または７日に、各々の群から１０匹のマウスを屠殺して、皮下の腫瘍を切り出した。腫瘍を小片に切り分けて、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，カタログＣ５１３８）処理を用いて、２ｍｇ／ｍｌ／１００ｍｇ組織で、３７℃で１時間分離させた。次いで細胞をＰＢＳで洗浄して、１００μｍのナイロン細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，カタログ３５２３６９）を通過させ、洗浄してＰＢＳに再懸濁させた。
【０３１１】
１４．５  腫瘍細胞の免疫蛍光染色
腫瘍細胞表面ＭＨＣクラスＩ染色
各々の細胞由来の腫瘍細胞を、スピンダウンして、精製したラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩレセプター）ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ０１２４０Ｄ、クローン２．４Ｇ２）とともにインキュベートして、Ｆｃレセプター結合によって生じる非特異的バックグラウンドを減少させた。次いで、ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合体化ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣｍＡｂ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  ３２２９８Ｘ、ＩｇＧ１、κ、クローンＧ４６−２．６）（汎ヒトＭＨＣクラスＩ抗体）を用いて、暗野において４℃で３０分間、細胞を染色した。アイソタイプコントロールｍＡｂとして、ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅで標識したマウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  ３３８１８Ｘ、ＩｇＧ１、κ、クローンＭＯＰＣ−２１）を用いた。固定および透過化処理の前にＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。
【０３１２】
細胞の固定および透過化処理
２５０μｌ／チューブ（試験管）のｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（細胞固定溶液）（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  ５５４７２２、ロットＭ０６５５８５）中に細胞を再懸濁して、４℃で２０分間インキュベートした。１ｍｌの１×ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ（固定／洗浄）緩衝液（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  ５５２７２３、ロットＭ０６５５８５）中で細胞を洗浄して、スピンダウンした。
【０３１３】
アデノウイルスヘキソンの細胞内染色
細胞を５０μｌのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ（固定／洗浄）溶液に再懸濁した。ＦＩＴＣ標識した抗ヘキソンｍＡｂ（０．５μｇ／１０６細胞、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．Ｍａｂ８０５２（ＦＩＴＣと特注で結合体化した）クローン２０／１１、ＩｇＧ１、κ）を、添加して、暗野において４℃で３０分間、染色を実行した。ＦＩＴＣ標識したマウスＩｇＧ１、κｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号２０６０４Ａ、クローンＭＯＰＣ−２１）をアイソタイプコントロールとして用いた。
【０３１４】
１４．６  フローサイトメトリーのデータの取得および統計学的分析
細胞を獲得して、２つのレーザーおよび４色の蛍光能を備えたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍでの、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアの使用によって、分析した。未染色のコントロール細胞またはアイソタイプのコントロール細胞を用いて、細胞の２％未満が陽性であるように、光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧を設定した。そのゲートを、ＳＳＣ対、ＦＳＣのドットプロット上の大きい（腫瘍）細胞集団に設定して、単一のｃｙ−ｃｈｒｏｍｅまたは単一のＦＩＴＣ陽性細胞を用いて補償を設定した。通常、１０，０００のゲートされた事象を収集して、分析した。そのデータを、ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ／ＦＩＴＣ二色ドットプロット上に提示して、ヘキソン陽性ヒト腫瘍細胞を決定した。ＳｉｇｍａＳｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、統計学的分析を実施した。群間のヘキソン陽性細胞の割合を、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ（ＳＮＫ）検定を用いる反復測定の１元分散分析（ＡＮＯＶＡ）で比較した。
【０３１５】
１４．７  結果および考察
１４．７．１  Ｈ４６０腫瘍において伝播したウイルス
腫瘍崩壊性アデノウイルスＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（Ｅ３領域を欠く）は、そのＥ２Ｆ−１腫瘍選択性プロモーターに起因して、インビトロおよびインビボで、腫瘍細胞中で選択的に複製し、かつ腫瘍細胞を溶解することが示された。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦにさもなければ同一のベクター）は、Ｅ３領域のほとんど（効率的な宿主細胞溶解のためのＡＤＰタンパク質を含む）を含む。本実施例において、異種移植片Ｈ４６０腫瘍において、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆの伝播を比較した。ヌードマウスにおいて皮下で増殖したヒトＨ４６０腫瘍に、１用量のウイルス（２×１０１０粒子／マウス）を、腫瘍内注射によって投与した。ウイルス注射後、１、４、または７日目に、マウス（ｎ＝１０）を屠殺した。各々のマウス由来の腫瘍を、ヘキソン特異的なＦＡＣＳによって細胞内ヘキソン発現について分析した。抗ヒトＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ  ｍＡｂを用いて、マウス細胞からヒト腫瘍細胞を識別し得る。腫瘍由来の細胞の９０％より多くが、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ陽性であった。ウイルス注射の１日後、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆを注射した腫瘍においてヘキソン発現は検出可能であった（図４３Ａ）。注射後４日で、ヘキソン陽性細胞の割合は、陰性コントロール群においてよりも、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆを注射した腫瘍において、有意に高かった（図４３Ｂ）。さらに、Ｅ３含有ベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆを感染させた腫瘍においては、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを感染させた腫瘍においてよりも、ヘキソン陽性細胞の割合が有意に高かった。同様に、７日目には、Ａｒ６ｐＡＥｆＦを注射した腫瘍およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆを注射した腫瘍の両方において、コントロール群よりもヘキソン陽性細胞が有意に高く、そしてＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆを感染させた腫瘍においては、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを感染させた腫瘍においてよりも、ヘキソン陽性細胞が有意に多かった（図４３Ｃ）。これらの結果によって、ベクターのＥ３の状況にかかわらず、腫瘍崩壊性アデノウイルスは、腫瘍中で効率的に伝播することが示唆される。さらに、開始１日目のレベルが同様であったにもかかわらず、Ｅ３含有アデノウイルスは、Ｅ３欠失ウイルスにおいてよりもＨ４６０固形腫瘍において有意に速く伝播した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆベクターは、ネイティブなＥ３−１４．７遺伝子を欠くので、この遺伝子は、インビボにおいて腫瘍にわたって効率的に伝播するには必要でなかった。
【０３１６】
１４．７．２  Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍におけるウイルス伝播
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦは、Ｅ３プロモーターの制御下にヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを担持するＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦと同様のＥ３欠失を有する腫瘍崩壊性アデノウイルスである。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆは、これもまた、ヒトＧＭ−ＣＳＦを担持し、かつｇｐ１９およびＥ３−１４．７を除いて、Ｅ３領域のほとんどの遺伝子を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターへのＧＭ−ＣＳＦの追加は、腫瘍保有宿主において、特定の抗腫瘍免疫応答（例えば、腫瘍特異的ＣＴＬ）を誘導する能力を有する。ヌードマウスにおけるヒトＨｅｐ３Ｂ腫瘍に、腫瘍内注射によって単一のウイルス用量（２×１０８粒子／マウス）を投与した。注射後１日目、４日目、および７日目にマウス（ｎ＝１０）を屠殺して、各々のマウス由来の腫瘍細胞を、フローサイトメトリーによって、細胞内ヘキソン発現について分析した。Ｈ４６０腫瘍と対照的に、ヌードマウスから採取したＨｅｐ３Ｂ異種移植片腫瘍は、低レベルのＭＨＣクラスＩ抗原を発現したが、Ｈｅｐ３Ｂは、インビトロで高レベルのＭＨＣクラスＩ抗原を発現した（データ示さず）。腫瘍細胞を、異常に大きいサイズの腫瘍細胞によってマウス細胞から識別した。Ｈ４６０研究においてと同様、腫瘍崩壊性アデノウイルスは、ベクターのＥ３の状況にかかわらず、腫瘍中で効率的に伝播し、そしてＥ３含有アデノウイルスは、Ｅ３欠失ウイルスよりもＨｅｐ３Ｂ固形腫瘍中で有意に速く伝播する（図４４）。Ａｄｄ／３１２で処置した腫瘍におけるヘキソン染色では、ＰＢＳ処置後のバックグラウンドの染色以上には上昇しなかった。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆベクターは、ネイティブのＥ３−ｇｐ１９およびＥ３−１４．７遺伝子を欠くので、これらの遺伝子は、インビボにおいて腫瘍全体にわたる効率的な腫瘍崩壊および伝播には必要でなかった。
【０３１７】
現在の癌の遺伝子治療アデノウイルスのほぼ全体についての限界の１つは、腫瘍部位に対するインビボでの治療遺伝子の送達の低い効率である。この問題を克服するための１つのアプローチは、複製コンピテントなアデノウイルスを使用することである。第一に、このアプローチは、腫瘍細胞を溶解し、かつ抗腫瘍効率に寄与するための、感染のウイルスの溶解性の性質を利用する。第二にこのウイルスに担持される治療用遺伝子は、このウイルスの局所的な伝播を通じて、より腫瘍細胞に対して複製されかつ送達され得る。この腫瘍崩壊性アデノウイルスＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦは、腫瘍選択性プロモーターＥ２Ｆ−１を用いて、腫瘍選択性複製を達成する。このＥ３領域は、アデノウイルスの複製には必須ではないと考えられるので、その領域をＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦから欠失させて、潜在的な治療用遺伝子に適合させた。しかし、Ｅ３領域にコードされる多くの遺伝子は、ウイルスによる免疫回避を補助する免疫調節遺伝子である。この特徴によって、このウイルスに担持された治療用遺伝子を長期間発現することが可能になり得る。さらに、Ｅ３領域によってコードされるＡＤＰは、感染した細胞の溶解、および細胞から細胞へのウイルスの伝播を促進することが示されている。本実施例で報告された研究によって、Ｅ３領域のほとんどの部分（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦにおけるような）または特定の部分（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３ＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ）におけるような）が欠失され得るような、インタクトなＥ３領域に完全に依存しない腫瘍崩壊性アデノウイルスの単回投与後の、インビボにおける驚くべき高レベルの形質導入が実証される。
【０３１８】
それにもかかわらず、Ｅ３含有ウイルスＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３ＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３、Ｇｍ、Ｄｇ１９）Ｆは、それらのＥ３欠失対応物であるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＧｍＦよりも効率的に腫瘍全体にわたって伝播する（図４３、および４４）。このＥ３領域は、免疫調節性機能を有するいくつかのタンパク質をコードする。Ｅ３−ｇｐ１９ｋＤａタンパク質は、表面ＭＨＣクラスＩ分子を下方制御することが示されており、そしてＲＩＤαおよびβは、感染した細胞の表面上のＴＮＦファミリーレセプターを下方制御することが示されている（Ｈｏｒｗｉｔｚ，ＭＳ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７９：１〜８，２００１に概説された）。しかし、これらの免疫調節性Ｅ３機能が、異種移植片モデルにおいてみられた腫瘍抑制に対していかに関連するかは、免疫無防備状態のヌードマウスでは識別され得ない。異種移植片腫瘍モデルにおいて報告された効果は、このベクターに対するＡＤＰ機能の追加の効果によって最も良く説明され得る。
【０３１９】
まとめると、フローサイトメトリーによる、細胞内ヘキソン発現の検出を考慮すれば、腫瘍崩壊性アデノウイルスは、ベクターのＥ３の状況にかかわらず、腫瘍に効率的に伝播する。それにもかかわらず、Ｅ３含有アデノウイルスは、Ｈ４６０およびＨｅｐ３Ｂ固形腫瘍の両方において、Ｅ３欠失したウイルスよりも有意に速く伝播する。これらの研究において用いたヌードマウスにおいては、Ｅ３含有アデノウイルスの伝播の増大は、ＡＤＰタンパク質の溶解機能に起因し得る。
【実施例１５】
【０３２０】
実施例１５：二重プロモーター制御のベクターの構築
１５．１  プラスミド生成：
クローニングスキーム全体は、下記しており、図４５に概要を記載している。シャトルプラスミドｐＤｒ１７ＴｒｔｅｘＦの図解、およびウイルスゲノム全体を含有する大型プラスミドｐＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、図４６に記載している。各々の工程において、確証的な制限消化および配列決定を実施した。
【０３２１】
１５．１．１  Ｅ４プロモーター配列の除去：
Ｅ４プロモーターの欠失は、Ａｄ５野生型配列の３５５７５〜３５７８６を包含する（全ての数は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列登録番号Ｍ７３２６０において割り当てられたとおり野生型Ａｄ５配列をいう；Ｆａｎｇ  Ｂ、Ｋｏｃｈ  Ｐ、およびＲｏｔｈ  ＪＡ．Ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７；７１：４７９８〜４８０３）。これを作製するための出発プラスミドは、ｐＤｒ２ＦＥ３（２２８６〜２４９６位置において、プラスミドマップにおける等価な領域）であった。プラスミドｐＤｒ２ＦＥ３は、実施例１０（セクション１０．１．１）に記載されている。Ａｄ  ｂｐ  ３５５７５に挿入されたＰａｃＩ部位が存在する。この部位は、野生型Ａｄ配列にはないが、以前にこのプラスミド中に操作されている。プライマーＯＶ２０およびＯＶ２１（表３０）を用いて、Ａｄ配列の３５２１３〜３５５７４ｂｐに相当するＤＮＡのフラグメントに加えて、さらなる制限部位ＢａｍＨＩおよびＰａｃＩを、３５５７４の末端まで、ＰＣＲ増幅した。プラスミドｐＤｒ２ＦＥ３およびＰＣＲ増幅したフラグメントを、酵素ＢｓｔＥＩＩおよびＰａｃＩを用いて消化した。このプラスミドの大きいフラグメント、および予期されるＰＣＲフラグメントをゲル精製して、一緒に連結した。この連結物を形質導入して、ミニプレップを増殖させて、制限消化によってスクリーニングした。正しいクローンであるｐＤｒ１２ＦＥ３は、Ａｄの３５５７４〜３５７８６ｂｐを欠失しており、Ｅ４プロモーターを欠き、そしてＰａｃＩ部位に並列した新しく操作されたＢａｍＨＩ部位を追加されている。外因性のプロモーター、および／またはエンハンサーを挿入するために、これらの部位のいずれかまたは両方を用い得る。
【０３２２】
表３０．Ｅ４プロモーター欠失を作製するために用いたプライマー
【０３２３】
【表３０】
2004529627.tif 000034
【０３２４】
１５．１．２  Ｅ４プロモーターへのＴｒｔｅｘのクローニング：
酵素ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ（２５２ｂｐのフラグメントを放出した）を用いて、ＧｅｒｏｎプラスミドであるｐＧＲＮ３１６（ＭＴＡによってＧｅｒｏｎから入手）からＴｒｔｅｘプロモーターフラグメントを切り出した。このフラグメントは、Ｔｅｒｔコード配列の翻訳開始部位の２５２塩基上流に相当する（Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｍ、Ｋｙｏ  Ｓ，Ｋａｎａｙａ  Ｔ、Ｈｉｒａｎｏ  Ｈ、Ｔａｋｅｄａ  Ｊ，Ｙｕｔｓｕｄｏ  Ｍ、およびＩｎｏｕｅ  Ｍ．１９９９；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：５５１〜５５７）。これを精製して、重複する末端をＫｌｅｎｏｗで充填した。上記で生成したプラスミドであるｐＤｒ１２ＦＥ３を、ＢａｍＨＩを用いて消化し、その末端を充填して、脱リン酸化し、次いでプロモーターフラグメントとのライゲーションのために用いた。コロニーを生成して、制限消化および配列決定によって、挿入および方向付けのためにスクリーニングした。このプラスミドをｐＤｒ１２ＴｒｔｅｘＦＥ３と呼んだ。
【０３２５】
１５．１．３  ｐＤｒ１２ＴｒｔｅｘＦ中のＥ３の再構成
プラスミドｐＤｒ２ＦＥ３は、Ｅ３領域を含むが、さらなる外来の配列であるｌｏｘＰ部位（１４．７Ｋ遺伝子のＮ末端中のフレームにインサートされた）が存在する。この部位は、１４．７Ｋタンパク質の最初の６つのアミノ酸における変化を作製する。Ｅ３領域の完全に野生型バージョンのベクターを作製するため、Ａｄ５ウイルスＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＳｐｈＩ（２９５１０〜３１２２５）で消化して、１７１５ｂｐのフラグメントを単離した。プラスミドｐＤｒ２ＦＥ３を、ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化して、そのウイルスフラグメントをこの領域に挿入した。得られたプラスミドであるｐＤｒ４Ｆを、配列決定によってスクリーニングした。ＰＤｒ４Ｆは、ここで、ＩＴＲの上流のウイルスの右末端で、完全に野生型のＥ３領域およびパッケージングシグナルを含む。
【０３２６】
次のクローニング工程を実施して、プラスミドｐＤｒ１２ＴｒｔｅｘＦＥ３中に野生型Ｅ３領域を追加した。ＰＤｒ４ＦをＣｌａＩおよびＳｔｕＩで消化して、８．４ｋｂのフラグメントを単離した。ｐＤｒ１２ＴｒｔｅｘＦＥ３をＣｌａＩおよびＳｔｕＩで消化して、４．３ｋｂのフラグメントを単離した。これらのフラグメントをいっしょに連結して、プラスミドを生成し、かつスクリーニングした。図４６に示した最終構築物を、Ｅ３領域中で配列決定して、ｐＤｒ１７ＴｒｔｅｘＦと命名した；これは、Ｅ４転写単位を駆動するＴｒｔｅｘプロモーター、右ＩＴＲにおけるパッケージングシグナル、および完全に野生型のＥ３領域を含む。
【０３２７】
１５．１．４  大型プラスミドの生成：
ウイルスを作製するために用いた最終のプラスミドは、上記のように、細菌中の相同組み換えによってプラスミドｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦおよびｐＤｒ１７ＴｒｔｅｘＦから生成した。制限消化によって、および関連領域の配列決定によって、最終の大型プラスミド（ｐＤｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘと命名）（図４６）を確認した。
【０３２８】
１５．２  腫瘍崩壊性ベクター生成：
プラスミドｐＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いて、上記のように、腫瘍崩壊性ベクターを生成した。
【０３２９】
１５．２．１  制限消化および配列の確認：
クローニングプロセスにおける各工程において、ＤＮＡを消化し、配列決定してその構造を確認した。ウイルスを作製するために用いたプラスミドｐＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、制限酵素であるＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ、ＳｗａＩ、およびＥｃｏＲＶで消化した。ウイルスの生成後、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ由来のウイルスＤＮＡを抽出して、示した酵素を用いて消化した。全ての消化物が、予想されたフラグメントを生じた。このウイルスをまた、重要な領域である、いわゆるＥ３、Ｔｒｔｅｘプロモーター、およびパッケージングシグナル（右末端）、ならびにＥ２Ｆ−１プロモーター（左末端）について配列決定した。右末端の配列を図４７に示す。
【０３３０】
１５．３  まとめ：
腫瘍崩壊性ベクターＡｒ１７Ｅ２ｆＦＴｒｔｅｘを、上に詳細に記載したように消化しかつ構築して、図４８に図示した。
【０３３１】
このベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦに記載されたのと同じ左末端を有する（図６を参照のこと）。要するに、このパッケージングシグナルは、このウイルスの右末端に再配置されている。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、左ＩＴＲのすぐ下流に挿入されている。Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、Ｅ１ａ転写単位の上流に挿入されている。このベクターにおいて、Ｅ３領域は、完全に野生型であるように再構成されている。内因性Ｅ４プロモーターおよび転写開始部位は、欠失しており、そしてＴｒｔｅｘ（ｈＴＥＲＴ翻訳開始部位に対して、−２５２〜＋１のｈＴＥＲＴプロモーターフラグメント）が挿入されている。残りは、最初のＥ４翻訳開始部位（Ｅ４  ｏｒｆ１）の上流で、かついまは、Ｔｒｔｅｘプロモーター挿入部の下流の内因性Ａｄ５配列の７４ｂｐである。制限消化および配列決定によって、全てのプラスミドおよび最終ベクターが正しいことを確認した。
【実施例１６】
【０３３２】
実施例１６．関連する生物学的標的に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのインビトロ活性
アデノウイルス感染は、複雑な生物学的プロセスであって、宿主とウイルスのプロセスの間の相互作用（例えば、ウイルス−細胞結合、内在化、エンドソームからの放出、核への移動、ＤＮＡ複製、ウイルスパッケージング、および溶解）に関する（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＷＣ．Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２０００；８１：２５７３〜２６０４）。細胞株は、Ａｄ感染に対するその許容度において、お互いに劇的に異なり得る。本明細書に記載されるインビトロ研究は、Ｒｂ経路の欠損およびｈＴＥＲＴ活性化を伴う、腫瘍細胞様の多様なパネルを使用する（表３１）。さらに、初代ヒト細胞培養物を、正常な細胞コントロールとして用いた。各細胞タイプにおけるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの適切な選択性機能に集中するために、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、野生型Ａｄ５ウイルスと直接比較するか、または１細胞あたりのアデノウイルスゲノムの数に対して正規化した。Ａｄ５とＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘとの間の重要な差異は、野生型Ｅ１ａおよびＥ４プロモーターが、それぞれ腫瘍選択性Ｅ２Ｆ−１およびｈＴＥＲＴプロモーターで置換されていることである。従って、Ａｄ５を、非選択性の陽性コントロールとして用いて、Ｅ２Ｆ−１およびｈＴＥＲＴプロモーターによる野生型Ｅ１ａおよびＥ４プロモーターの置換が、腫瘍細胞株選択性の早期遺伝子発現、ウイルス産生、および細胞殺傷を付与するのに十分であるか否かを決定する。
【０３３３】
表３１．細胞株のＲｂ経路およびｈＴＥＲＴの状況
【０３３４】
【表３１】
2004529627.tif 000035
【０３３５】
ＲＮＡ発現によって、ｈＴＥＲＴの状況を決定した。＋は、野生型の状況を示す、−は、Ｒｂ経路の欠損またはｈＴＥＲＴが発現されていることを示す。＊は、Ｈｅｐ３ＢのｈＴＥＲＴ状況は未知であるが、発現されている可能性は高いことを示す。その理由は、ｃ−ｍｙｃ（ｈＴＥＲＴの公知の転写活性化因子）（Ｏｈ  Ｓ，Ｓｏｎｇ  ＹＨ、ＫｉｍＵＪ、Ｙｉｍ  Ｊ，Ｋｉｍ  ＴＫ、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｍｙｃ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ａｃｉｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９  Ｓｅｐ  ２４；２６３（２）：３６１〜５）が上方制御されているからである。＊＊ＳＷ４８０細胞は、ｐ１６欠損の可能性の指標として、より高いリン酸化Ｒｂおよびより少ないＤＮＡ結合を有することが報告されている（Ｇｏｐｅ  Ｒ，Ｇｏｐｅ  ＭＬ、Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２  Ｍａｒ  ２５；１１０（２）：１２３〜３３）。
【０３３６】
１６．１  インビトロにおける腫瘍および正常細胞の形質導入
１６．１．１  理論的根拠
腫瘍崩壊性アデノウイルスによってヒト細胞を形質導入する能力が、腫瘍溶解に必要である。本発明者らは、形質導入後の１細胞あたりのウイルスコピー数を測定することによって、本発明者らのインビトロ系において用いた細胞株の形質導入能を評価した。
【０３３７】
１６．１．２  方法
複製の開始前に測定した場合、１細胞あたりのアデノウイルスＤＮＡコピー数を、ウイルス形質導入の指標として用い得る。感染後４時間の１細胞あたりの平均のアデノウイルスヘキソン遺伝子ＤＮＡコピー数を、実施例４および１３に記載のとおり、リアルタイム定量的ＰＣＲによって算出した。
【０３３８】
１６．１．３  結果および結論
Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのような腫瘍崩壊性ベクターによる細胞株の効率的な感染は、アデノウイルスレセプターのレベルに依存する。これらのレベルは、細胞タイプの間で変動するので、細胞株の形質導入効率は異なり得る。本明細書において用いた細胞培養物は、全てＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘによって形質導入可能である（表３２）。Ｈｅｐ３Ｂ、ＬＮＣａＰ、およびＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６細胞は、アデノウイルス感染に最も感受性であって、続いてＳＷ４８０および初代ヒト肝細胞であった。細胞株のこのパネルにおいて、ＨＣＴ１１６およびＷＩ−３８細胞は、感染に対して最も感受性が低い細胞であった。
【０３３９】
表３２．Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの１細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数
【０３４０】
【表３２】
2004529627.tif 000036
【０３４１】
実施例４および１３に記載のとおり、Ａｄヘキソン遺伝子の欠失について、リアルタイムＰＣＲを用いて、各々の細胞株の形質導入を測定した。１細胞あたり１００粒子で細胞を二連で感染させて、感染後４時間でＤＮＡを単離した。１細胞あたりのヘキソンコピー値は、二連のサンプルの平均を表す。
【０３４２】
１６．２  選択性Ｅ１ａおよびＥ４の発現
１６．２．１  理論的根拠
腫瘍細胞中で腫瘍崩壊性ベクターが複製する能力が、それらのベクターの治療効果には必須である。ウイルス複製の効率を測定するために有用なパラメーターの１つは、ウイルス遺伝子の転写である。Ｅ１ａおよびＥ４  ＲＮＡレベルの発現を、リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）によって定量して、Ｅ２Ｆ−１およびｈＴＥＲＴプロモーター媒介発現の選択性を決定した。
【０３４３】
１６．２．２  方法
ヒト腫瘍細胞株および正常な非腫瘍細胞株の培養物をＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いて感染することによって、選択性のＥ１ａおよびＥ４発現（腫瘍崩壊能および選択性のパラメーター）を測定した。要するに、腫瘍細胞株および正常細胞の培養物のパネルを、１００粒子／細胞（ｐｐｃ）のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ、Ａｄ５（野生型陽性コントロールとして）、およびＡｄｄ／３１２（複製欠損陰性コントロールとして）を用いて感染させた。感染４時間後、ＲＮＡおよびＤＮＡを単離した。４時間の時点で、ウイルスＤＮＡの複製なしにウイルスＥ１ａおよびＥ４のｍＲＮＡの発現を検出するために十分な時間が可能である。実施例４および１３に記載のとおり、Ｅ１ａおよびＥ４の発現レベルについて、定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、そしてアデノウイルスＤＮＡコピー数について、定量的なＤＮＡ  ＰＣＲアッセイを用いた。
【０３４４】
１６．２．３  結果
形質導入後４時間でのＥ１ａおよびＥ４の発現レベルについての平均値を、表３３に示す。
【０３４５】
表３３．１ウイルスゲノムあたりのＥ１ａおよびＥ４のレベル
【０３４６】
【表３３】
2004529627.tif 000037
【０３４７】
実施例１３に記載のとおり、二連のサンプルから感染後４時間で、１つのＡｄゲノムあたりのＥ１ａおよびＥ４の転写物単位の平均を決定した。Ｗｉ３８は、検出不能。
【０３４８】
腫瘍細胞株の選択性が存在するか否かをさらに良好に定量するため、本発明者らは、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘによる早期遺伝子発現についての「選択性指数（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）」を算出した。インビトロにおける腫瘍崩壊性ベクターの選択性を評価するのにおいて、Ａｄ５のような野生型コントロールとの比較によって、細胞株の間の形質導入効率における差異についてのコントロールが補助され得る。腫瘍細胞株の選択性は、「選択性指数」値によって数字的に表され得る。あるベクターについての選択性指数値とは、初代細胞および腫瘍細胞上のＡｄ５に比べた、ある腫瘍崩壊性ベクターによる特定の早期遺伝子の単なる発現である。「１」を超える選択性指数値は、腫瘍細胞選択性を示す。例えば、１ウイルスゲノムあたりのＥ１ａ発現についての選択性指数（ＳＩＥ１ａ）は、以下の等式によって算出され得る：
【０３４９】
【数１】
2004529627.tif 000038
【０３５０】
Ｅ１ａおよびＥ４の発現レベル、ならびにヘキソンＤＮＡコピー数についての平均値を用いて、選択性指数を算出した（表３４）。この場合、用いた正常な細胞値は、ＰＨＨ由来であった。
【０３５１】
表３４．Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いて感染させた細胞におけるＥ１ａおよびＥ４の選択性発現
【０３５２】
【表３４】
2004529627.tif 000039
【０３５３】
Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、１００ｐｐｃで用いて細胞を感染させて、感染後４時間でＲＮＡおよびＤＮＡを回収した。Ｅ１ａおよびＥ４のＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲによって決定して、その値を１細胞あたりのベクターコピー数に対して、次いでＡｄ５レベルに対して正規化した。この値を、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）について得た同じ値で割り、選択性指数（ＳＩ）を得た。この値が１を超える場合、このベクターは選択性であると決定される。
【０３５４】
Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘについて、腫瘍細胞株についてのＥ１ａ発現における選択性は、Ｅ２Ｆ−１プロモーター依存性であった。なぜなら、相対的なＥ１ａ発現は、正常細胞においてよりも腫瘍細胞において大きかったからである。選択性指数は、ＳＷ４８０細胞についての４９．６から、ＨＣＴ１１６細胞についての１８４．６に及んだ。選択性はまた、Ｅ４発現を用いてみられた。全ての場合において、選択性は１を超え、Ｈｅｐ３Ｂについての１．９６からＬＮＣａＰ細胞についての２９．６２に及んだ。Ｅ４の転写のために腫瘍選択性プロモーターの置換が所望される。なぜなら、Ｅ４は、Ｅ１ａの非存在下で発現され得るからである。本発明者らは、Ａｄｄ／３１２感染細胞において、Ｅ１ａ転写単位が欠失されている場合、Ｅ４  ＲＮＡの依然としてある程度の発現が存在したことを示した。これは比較的低レベルであったが、インビボにおいて望ましくない毒性を生じ得る。
【０３５５】
腫瘍細胞における転写物の発現についての選択性が存在するが、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ由来のＲＮＡのレベルは、Ａｄ５およびそのネイティブなプロモーター由来のレベルよりも依然としてかなり低かった。これらの差異は、腫瘍崩壊性ベクターから得られた発現からＡｄ５によって得られた発現の間の差異の数倍〜数対数に及ぶ。これは、プロモーターの相対的強度を反映し得、そして子孫の生成のような下流のウイルスプロセスに影響し得る。
【０３５６】
１６．３  ウイルスの選択的産生
１６．３．１  理論的根拠
本アッセイの目的は、種々の腫瘍および正常な細胞上で、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いて、ウイルス子孫の生成を測定することである。生成されたベクターの量は、ある特定の細胞タイプがベクターの複製を可能にする能力を反映し、かつＥ１ａおよびＥ４領域にコードされたタンパク質の発現によって影響される。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、これらの遺伝子の転写を駆動する腫瘍選択性プロモーターを有するので、正常なウイルスのライフサイクルに対する、選択性、およびこれらの変更の効果の両方を決定することが重要である。
【０３５７】
１６．３．２  方法
５つのヒト腫瘍細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＣＴ１１６、ＬＮＣａＰ、ＳＷ４８０、およびＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６）、１つの正常な細胞株（ＷＩ−３８）、および１つの初代細胞培養物（ＰＨＨ）においてベクター産生を決定した。Ａｄ５、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ、またはＡＤｄ／３１２を、１ｐｐｃまたは１０ｐｐｃの用量で用いて、最初の感染を実施して、感染後３日または６日で回収した。次いで、限界希釈によって、その力価（タイター）を、決定した。その手順は以下のとおりである：
【０３５８】
１日目；プレートのセットアップ（準備）
感染の２４時間前に、アデノウイルス産生を測定する細胞をカウントして、１９０μｌの容積の適切な細胞培養培地中に、１ウェルあたり１×１０４細胞で、９６ウェルプレート中に、プレートした。
【０３５９】
０日目：一次感染
各々のアデノウイルスベクターを適切な培地中で希釈して、１０μｌ容積中に、１細胞あたりの粒子（ｐｐｃ）として、所望の用量範囲を得た。各々の細胞株上の各々のベクターについて、細胞を含む三連のウェルに対して、適切な用量を１０μｌ容積で与え、そして１９０μｌの培地を与えて、総感染容積２００μｌとした。加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中において３７℃で、感染した細胞をインキュベートした。
【０３６０】
３日目：粗ウイルス溶解物の回収、およびプレート調製物の力価
３日目または６日目に、マルチチャネルピペットを用いることによってウイルス感染培地を吸引して、２５０μｌの１×ＴＨＰ緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を、この細胞上に入れた。粗ウイルス溶解物（ｃｒｕｄｅ  ｖｉｒａｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）（ＣＶＬ）を生成するため、この９６ウェルプレートを、ドライアイスと、３７℃上との間で、このプレートを交互にインキュベーションすることによって、５回の凍結−融解サイクルに供した。
アデノウイルス感染のために、ＡＥ１−２ａ細胞を指標細胞株として用いた。それらの細胞は、Ａ５４９細胞由来であり、かつ糖質コルチコイド応答性プロモーターの制御下でＥ１ａおよびＥ２ａ遺伝子の産物を発現する（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９６．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ２ａ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６，４１７３〜４１７８）。Ｅ１ａおよびＥ２ａの発現は、０．３μＭのデキサメタゾンの存在下で誘導される。ＣＶＬでの二次感染の２４時間前に、２００μｌの容積のリヒター（Ｒｉｃｈｔｅｒ）の５％ＦＢＳおよび０．３μＭデキサメタゾン中で、ＡＥ１−２Ａ細胞を、１ウェルあたり１×１０４細胞で、９６ウェルプレート中にプレートした。ＴＣＩＤ５０アッセイのためには、１つのウイルス複製に対して、少なくとも１つの９６ウェルプレートが、必要である。このプレートを、二次感染まで、３７℃かつ５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０３６１】
４日目：二次感染
５％ＦＢＳを補充したリヒターの培地中でＣＶＬを１：１０または１：１００のいずれかに希釈した。希釈したＣＶＬの２０μｌ容積を、ＡＥ１−２Ａ細胞のこのプレートにまたがる上部の列において、各ウェルに添加した。マルチチャネルピペットを用いて、ある列の各々のウェルから２２μｌを取り出し、それをその下の列の２００μｌの容積に添加することによって、この９６ウェルプレートを１０倍段階希釈した。これを各列からＧ列について繰り返し、その結果、各列は、各々の希釈について１２の培養物を表す。Ｈ列は、コントロールとして感染させなかった。マルチチャネルピペットの先端を、各列の希釈の間、交換した。感染した細胞を３７℃でかつ５％ＣＯ２で、１０〜１４日間インキュベートした。
【０３６２】
１０〜１４日目：細胞変性効果についてのスコアリング
１０日〜１４日目、生産的なウイルス感染によって生じる細胞変性効果（ｃｐｅ）について、ＡＥ１−２Ａ細胞のタイタープレートを、視覚的に試験した。細胞のいずれかが丸まったか、またはウェルのいずれかの部分でプラーク／病巣が形成された場合、そのウェルをｃｐｅが陽性であるとスコア付けする。ｃｐｅが陽性であった、ある列におけるウェルの数を記録した。
【０３６３】
ＴＣＩＤ５０算出
次いで、ｃｐｅが陽性であった、ある列におけるウェルの数を、ＴＣＩＤ５０算出に入れた。ＴＣＩＤ５０算出の背景の数学の詳細な説明は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ＤＲ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＬＫ，Ｌｕｃｋｏｗ  ＶＡ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ６．Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４：１３２〜１３４に示される。
ウイルス産生選択性指数（ＳＩｐｒｏ）を以下の式によって決定した：
【０３６４】
【表３５】
2004529627.tif 000040
【０３６５】
１を上回る値は、このベクターが腫瘍細胞中で選択的に産生されることを示す。
【０３６６】
１６．３．３  結果
この分析の目的は、腫瘍および正常細胞上の腫瘍崩壊性ベクターのベクター生成を、Ａｄ５のベクター生成と比較して評価することであった。ウイルス産生の選択性を決定して、表３６に示した。この数は、ウイルス産生選択性指数（ＳＩｐｒｏ）と呼ばれ、そのベクターは、この数が１を超える場合に選択性であるとみなされる。これは、各細胞株または培養におけるベクターの形質導入効率を正規化するので、ＳＩｐｒｏは、種々の細胞株の間で比較され得る。ＳＩｐｒｏは、可能性としては、その癌タイプが腫瘍崩壊性ベクターの複製を支持する能力を反映する。ＳＩｐｒｏは、正常細胞培養物ＰＨＨまたはＷＩ−３８に対して決定された。示されたデータは、１０ｐｐｃで感染され、かつ感染後６日で回収された細胞から算出された。ＰＨＨまたはＷＩ−３８のいずれかに対してこれらの腫瘍細胞を比較して、量的に同様の結果が得られた。両方の場合とも、ＳＩは、ＬＮＣａｐおよびＨｅｐ３Ｂ細胞について最高であって、ここでＳＷ４８０は、ＷＩ−３８に比べてある程度の選択性を示した。ＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６およびＨＣＴ１１６は、選択性を示さなかった。
【０３６７】
表３６．ベクター産生についての選択性指数
【０３６８】
【表３６】
2004529627.tif 000041
【０３６９】
Ａｄ５およびＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを１０のＭＯＩで用いて細胞株を感染させて、感染後６日で回収し、ベクター産生（ｐｆｕ／ｍｌ）を決定した。選択性指数（ＳＩ）は、本明細書に記載のとおり、算出した。正常細胞は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）またはＷＩ−３８のいずれかであった。１を上回る値は、腫瘍細胞についての選択性を示す。
【０３７０】
１６．４  インビトロにおける選択性の殺傷
１６．４．１  理論的根拠
インビトロにおける腫瘍細胞株対、初代細胞培養物でのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの細胞毒性を評価して、細胞殺傷の腫瘍選択性を決定した。
【０３７１】
１６．４．２  方法
この細胞毒性（傷害性）アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＮｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙに基づいており、前に実施例８に記載したとおり実施した。
【０３７２】
１６．４．３  結果
細胞毒性は、腫瘍崩壊性ベクターの効力の別の指標である。用量応答曲線からＬＤ５０値を算出することによって、アデノウイルスベクターの相対的な細胞毒性の定量的な評価を、実施し得る。各々の細胞培養物に対する、二重のプロモーター制御されたＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ、単一プロモーター制御されたベクターＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦ、および陽性コントロールの複製コンピテントなウイルスＡｄ５についての平均ＬＤ５０値、を表３７に報告する。Ａｒ１３ｐＡＥ２ｆＦは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３ＦのＥ３領域に存在するｌｏｘＰ部位がとり除かれていること以外は、実施例７に記載されたＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆと同一である。ＡＲ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのＬＤ５０値は、Ｈｅｐ３Ｂ、ＬＮＣａｐ、およびＳＷ４８０腫瘍細胞株に対するＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦのＬＤ５０値と同様であった。ＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６およびＨＣＴ１１６細胞に対して、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのＬＤ５０値は、Ａｒ１３ｐＡＥ２ｆＦのＬＤ５０値よりも有意に高かった。初代細胞培養において、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのＬＤ５０値は、ＷＩ−３８細胞に対して有意に高かった。これらの結果によって、腫瘍細胞株に対して、二重プロモーター制御されたＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、単一プロモーター制御のＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦの効力以下の効力を有するが、そのベクターはまた、初代細胞培養物においては、それ以下の効力を有することが示唆される。
【０３７３】
表３７．初代細胞培養物および腫瘍細胞培養物に対するＬＤ５０値：Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ対、Ａｒ１３ｐＡＥ２ｆＦ
【０３７４】
【表３７】
2004529627.tif 000042
【０３７５】
略号：ｎは、平均した複製の数。＊ｐ＜０．０５、対Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（ｌｏｇ１０の形質導入データにおける１元ＡＮＯＶＡ）。
【０３７６】
このＬＤ５０のデータによって、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦのＬＤ５０値は、腫瘍細胞株および初代細胞株の両方についてＡｄ５よりも高かったが、ＬＤ５０値は、腫瘍細胞株においては野生型レベルにより近かったことが示される。腫瘍細胞株選択性をさらに容易に比較するため、「選択性指数」を、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦの両方について算出した。インビトロにおける腫瘍崩壊性ベクターの選択性を評価するのにおいて、Ａｄ５のような野生型コントロールとの比較を用いて、細胞株の間の形質導入効率の差異について正規化し得る。腫瘍細胞株についての細胞毒性選択性は、「選択性指数」（ＳＩＬＤ）値によって数的に表され得る。あるベクターについてのＳＩＬＤ値は単に、初代細胞および腫瘍細胞に対してＡｄ５と比較した腫瘍崩壊性ベクターのＬＤ５０値である。選択性指数は２つの成分を有する。第一に、腫瘍細胞に対する、腫瘍崩壊性ベクターと野生型ウイルスとの間のＬＤ５０値は、腫瘍細胞に対する「効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）」の指標を示す。第二に、初代細胞培養物に対する、腫瘍崩壊性ベクターと野生型ウイルスとの間のＬＤ５０値は、正常細胞に対する「安全性（ｓａｆｅｔｙ）」の指標を示す。腫瘍細胞選択性ベクターについて、そのベクターと野生型ウイルスとの間の比は、腫瘍細胞株に対するよりも初代細胞培養物に対して大きい。ＬＤ５０「効力」比を「安全性」比によって割ることによって、ＳＩＬＤ値が得られる。「１」を超えるＳＩＬＤ値は、腫瘍細胞選択性を示す。ベクターの選択性は、以下の等式によって定量され得る：
【０３７７】
【数２】
2004529627.tif 000043
【０３７８】
腫瘍細胞株対、ＷＩ−３８初代細胞培養物におけるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦの選択性指数を算出して、評８に表す。５つの腫瘍細胞株の全てにおいて、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの選択性指数は、単一プロモーター制御されたＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦの選択性指数よりも高かった。このことによって、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘとＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦとの間の腫瘍細胞に対する「効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）」の低下が、「安全性（ｓａｆｅｔｙ）」における、なお大きい増大によって相殺されたことが示唆される。
【０３７９】
表３８．ＷＩ−３８に対する細胞毒性選択性指数（ＳＩＬＤ）
【０３８０】
【表３８】
2004529627.tif 000044
【０３８１】
ＳＩＬＤは、以下の式に従って、ＷＩ−３８初代細胞に対して、示した腫瘍細胞株について算出する：Ａｄ５のＬＤ５０／腫瘍細胞株に対する試験ベクターのＬＤ５０／Ａｄ５のＬＤ５０／Ｗｉ−３８初代細胞に対する試験ベクターのＬＤ５０
【０３８２】
１６．５  ｈＴＥＲＴプロモーターに対するＥ４発現の依存性
１６．５．１  理論的根拠
Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ感染細胞におけるＥ４転写物を特徴づけて、ｈＴＥＲＴプロモーターを用いたネイティブＥ４プロモーターの置換が、ｈＴＥＲＴプロモーター依存性の様式で、Ｅ４領域を発現する能力を媒介するか否かを決定した。
【０３８３】
１６．５．２  方法：半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘまたは野生型Ａｄ５で感染したＨｅｐ３Ｂ細胞に対して、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。上流の潜在性の開始部位からの開始に対する、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのｈＴＥＲＴプロモーターにおける転写開始を識別するために、プライマーセットを設計した。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘについてのＥ４転写開始部位を、プライマー伸長分析によってマッピングした。
【０３８４】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、カタログ番号１０９２８〜０３４）を備えるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＯｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲにおいて、Ｅ４  ｃＤＮＡ産生のために、総ＲＮＡおよび遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた。製造業者の方法をわずかに改変して用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。１０ｐｐｃベクターに感染させたＨｅｐ３Ｂ細胞から単離した総ＲＮＡの０．４〜０．６μｇを用いて反応を行った。１×反応緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）に含有される０．２μＭの特異的プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ｍｉｘの存在下で、逆転写およびＰＣＲを、５０℃で３０分間、続いて、９４℃、１５秒；６０℃、３０秒；および７０℃、３０秒の３５サイクルで実行した。増幅産物を、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに、臭化エチジウム染色した１．２％のアガロースゲル上で分析した。
【０３８５】
Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）によって、オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびＡｄ５ベクターゲノムに基づいて、プライマーを設計し、そしてその配列を表３９に挙げる。このゲノムにおける各プライマーの相対的位置を図４９に概略的に示す。フォワードプライマー（ＰＣＲ１．ｆおよびＰＣＲ２．ｆ）は、Ｅ４コード配列の異なる領域を含んでおり、そしてこれをＲＴおよびＰＣＲ分析の両方に用いた。リバースプライマーＰＣＲ３．ｒは、Ｅ４遺伝子の５’非コード配列を含んだ。ＰＣＲ４．ｒは、ｈＴＥＲＴ転写物の５’非コード配列を含んだ。このフラグメントは、図４９に概略的に示されるようなクローニングによってＥ４転写物に対して連結され、従ってＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘにおけるＥ４転写物に特異的であった。ＰＣＲ５．ｆは、非コード配列（ｈＴＥＲＴの５’側で）、またはＥ４プロモーター、および右ＩＴＲ配列の３’側（およびパッケージングシグナル（もしあれば））を含む（図４９）。そして、このＰＣＲ産物を用いて、特定のＥ４遺伝子転写および転写の起点を評価した。
【０３８６】
表．３９．プライマー配列
【０３８７】
【表３９】
2004529627.tif 000045
【０３８８】
１６．５．３  方法：プライマー伸長
プライマー伸長分析は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｉｎ  ＣＵｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，第４．８．１〜４．９．１頁、１９９５）の方法を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の緩衝液成分に適合するように改変した方法に基づいた。ＥｘｔＰ１は、Ｅ４遺伝子の５’非コード配列を含んでおり、そしてこれを、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびＡｄ５で感染したＨｅｐ３Ｂ  ＲＮＡテンプレートにおけるＥ４転写物の５’末端をマッピングするためのプライマーとして用いた（表３９、図５１）。このプライマーを、その５’末端で［□−３２Ｐ］ｄＡＴＰを用いて標識して、伸長産物の検出を可能にした。１ｐｐｃおよび１０ｐｐｃのウイルスで感染させたＨｅｐ３Ｂ細胞から単離した総ＲＮＡのうち３０μｇを、ハイブリダイゼーション緩衝液（１５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に含有される２×１０５ｃｐｍの放射性標識したＥｘｔＰ１と、６５℃で９０分間ハイブリダイズさせた。加熱ブロックにおいて室温までサンプルを徐々に冷却させることによって、プライマーアニーリングを実行した。ＲＴ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；７５ｍＭ  ＫＣｌ；１３ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＤＴＴ；０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ）に含有されたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素によってプライマー伸長を、４２℃で２時間、実施した。次いで、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を用いてサンプルを精製した。プライマー伸長産物を、７Ｍ尿素６％ポリアクリルアミドゲル配列決定ゲル上で単離した。Ｅ４転写物の５’末端の位置を、ベクター配列と同様に配列分析によって決定し、次いでＥ４転写開始部位として規定した。陰性コントロールとして、同じ条件でＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素の非存在下で、プライマー伸長反応を実行し、その反応物を、上記の実験と同様に分析した。
【０３８９】
１６．５．４  結果
Ｅ４転写物は、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘで感染したＨｅｐ３Ｂ細胞において容易に検出された。潜在性の転写開始部位からの読みとり（リードスルー）を検出するために設計したＰＣＲプライマーは、このｈＴＥＲＴプロモーターの上流の発現開始を検出できなかった。このことは、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘにおけるＥ４発現が、このｈＴＥＲＴプロモーターに依存することを示唆する。これをさらに確証するため、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘで感染した細胞におけるＥ４転写開始部位を、プライマー伸長分析によってマッピングした。３つの主な転写開始部位を同定し、その全てが、ｈＴＥＲＴプライマーにマッピングされた（図５０）。
【実施例１７】
【０３９０】
実施例１７．Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのインビトロにおける効力
マウス異種移植片モデルを用いて、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３つの用量、１．５×１０１２粒子／ｋｇ、３．０×１０１２粒子／ｋｇ、および４．５×１０１２粒子／ｋｇ）の単回静脈内注射後の効力、および選択された毒性学的エンドポイントの両方を評価した。腫瘍容積および生存の測定によって効力を評価した。腫瘍および正常組織における、ヘキソン遺伝子特異的定量的ＰＣＲによるベクター含量の分析、ならびにＥ１ａおよびＥ４領域のＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の分析を、ベクター投与の３日後に行った。臨床的病理学および解剖的病理学のエンドポイントを、ベクター投与後１週および１ヶ月で評価した。
【０３９１】
１７．１  方法
１７．１．１  ウイルスおよび腫瘍細胞株
標準的な塩化セシウム勾配精製法を用いて、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（ネイティブのＥ１ａプロモーターがＥ２Ｆ−１プロモーターで置換されており、かつネイティブのＥ４プロモーターがヒトテロメラーゼプロモーター（ｈＴｒｔ）で置換されている腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター）を調製した。光学的な粒子タイター（力価測定）によって、ベクター濃度を決定した。非複製Ｅ１ａ欠失アデノウイルスであるＡｄｄ／３１２を、陰性コントロールとして本研究に含めた（Ｙｏｕｎｇ  ＣＳＨ、Ｓｈｅｎｋ  Ｔ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＨＳ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＨＳ編、Ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４巻、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ．１９８４：１２５〜１７２）。ヒト肝臓肝細胞癌株Ｈｅｐ３Ｂ（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７；ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４、バッチ番号Ｆ−９４６２）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手して、マイコプラズマ汚染がないことを確認した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するイーグル（Ｅａｇｌｅ）の最小基本培地（ＥＭＥＭ）中でＨｅｐ３Ｂ細胞を培養する。
【０３９２】
１７．１．２  マウス腫瘍モデル研究のデザイン
Ｈｅｐ３Ｂ異種移植片マウス腫瘍モデルを用いて、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの３用量の単回静脈内注射後の効果を評価した（表４０）。Ｈｅｐ３Ｂ細胞（１×１０７細胞／１００μｌのＨＢＳＳ）を、雌性の無胸腺近交系ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ、６〜８週齢）の右脇腹に皮下移植した。腫瘍測定を、ノギスを用いて週に２回２次元で記録した。式：長さ×幅２×π／６を用いて、腫瘍容積を算出した。最初の２週間は、１週あたり２回、次いで研究期間中、１週に１回、体重を記録した。８９匹のマウスの効力のコホート（ｎ／群＝１７−１８；群の平均腫瘍容積１４７．７３〜１５１．９３ｍｍ３）、および６０匹のマウスの予備的な毒性コホート（ｎ／群＝１５；群の平均腫瘍容積１４７．４５〜１４８．１９ｍｍ３）を、選択して、腫瘍容積によって、５つの用量群に一様に分配させた。ベクター投与日に記録した個々の体重によってマウスに投与した。最終容積１０ｍｌ／ｋｇに含有される、１．５×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ（ｎ＝３３）、３．０×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ（ｎ＝３２）、または４．５×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ（ｎ＝３３）のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘを用いて、尾静脈を介してマウスに静脈内注射した。複製欠損ベクターコントロール群は、最終容積１０ｍｌ／ｋｇに含有される、４．５×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ（ｎ＝１８、予備的毒性なし）のＡｄｄ／３１２を用いて、注射した。そして希釈コントロール群は、ＨＢＳＳ（ｎ＝３３）１０ｍｌ／ｋｇを注射した。ベクター分布、ならびにＥ１ａおよびＥ４遺伝子の発現の予備的分析のために、ベクター注射の３日後、マウスのサブセット（ｎ＝３）を、屠殺した。臨床的および解剖的な病理学評価のために、ベクター注射後１週および１月で、マウスの残りのサブセット（ｎ＝５〜６）を屠殺した。
【０３９３】
表．４０．研究デザイン
【０３９４】
【表４０】
2004529627.tif 000046
【０３９５】
１７．１．３．生存の基準および分析
２０００ｍｍ３を超える腫瘍を有するマウス、死亡が確認されたマウス、および瀕死のマウス（人道的に屠殺された）を、研究による死亡としてスコア付けした。静脈内注射後２４時間未満で生じる死亡を、注射関連であるとみなして、研究から除外した（ｎ＝１）。このデータ（腫瘍関連死亡およびベクター関連死亡の両方を含む）のマンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）ログランク検定を実施した。
【０３９６】
１７．１．４．一次ベクター分布および発現
腫瘍および正常組織（肝臓、腎臓、肺、骨髄、脳、脾臓、および卵巣を含む）を、２群を除いて、３匹マウス／群から、ベクター投与の３日後に収集した。各組織からＤＮＡを抽出し、ヘキソン遺伝子について定量的ＰＣＲを実施した。ヘキソンＤＮＡについて陽性であった組織を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、Ｅ１ａおよびＥ４の発現について評価した。
【０３９７】
１７．１．５  組織からのＤＮＡ単離
Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ、およびＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉ、またはＭｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて、組織からＤＮＡを単離した。凍結した組織を部分的に融解して、滅菌のディスポーザブル小刀メスを用いてミンス（切り刻む）した。次いで、Ｑｉａｇｅｎ緩衝液Ｇ２（０．２ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡおよび０．１ｍｇ／ｍｌプロテアーゼを含有）中での５５℃一晩のインキュベーションによって、この組織を溶解した。溶解物を短時間ボルテックスし、次いで、Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ  １００カラム、またはＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ  ２５カラムに入れた。製造業者の指示に記載のとおり、カラムを洗浄して、ＤＮＡを溶出させた。沈殿後、ＤＮＡを水に溶解して、ＤＵ−６００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、またはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）分光光度計で、濃度を分光光度的に（Ａ２６０およびＡ２８０）決定した。
【０３９８】
１７．１．６  ヘキソンＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ．１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、アデノウイルスのヘキソン配列に特異的なＰＣＲプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを設計した。プライマーおよびプローブの配列は以下であった：
ヘキソンフォワードプライマー：５’−ＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号８１）
ヘキソンリバースプライマー：５’−ＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号８２）
ヘキソンプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号８３）
以下の条件下で、５０μｌの反応容積中で増幅を実施した：１０ｎｇ（腫瘍）または１μｇ（肝臓および肺）のサンプルＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、６００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、および１００ｎＭヘキソンプローブ。サーマルサイクリング条件は以下であった：５０℃で２分のインキュベーション、９５℃で１０分、続いて、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間の連続的インキュベーションの３５サイクル。
【０３９９】
データを収集して、７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアｖ．１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。細胞ゲノムＤＮＡの適切なバックグラウンドにおいて１，５００，０００コピー〜１５コピーのアデノウイルスＤＮＡの希釈からなる標準曲線を用いて、アデノウイルスコピー数の定量を実施した。腫瘍組織の分析のために、１０ｎｇのヒトＤＮＡのバックグラウンド中の標準曲線を作成した。マウスの肝臓および肺の組織の分析のために、１μｇのＣＤ−１マウスゲノムＤＮＡのバックグラウンド中の、同じアデノウイルスＤＮＡ希釈からなる標準曲線を作成した。サンプルを三連で増幅して、インプットしたＤＮＡの重量および６×１０９ｂｐのゲノムサイズに基づいて、総コピーの平均数を１細胞あたりのコピーに正規化した。
【０４００】
１７．１．７  組織からのＲＮＡ単離
組織サンプルを収集して、直接ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に入れて、４℃で保管した。製造業者の指示に従って、４℃での最初のインキュベーション後、１週より長く保管した組織を、−２０℃においた。滅菌小刀メスを用いて、組織を約１００〜２００ｍｍ３の小片に切断した。組織の各小片をＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｔｕｂｅ（Ｂｉｏ１０１，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に入れた。製造業者の指示に従って、１ｍｌのＲＮＡｚｏｌＢ（Ｔｅｌ−ＴＥＳＴ、Ｆｒｉｅｎｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を添加して、Ｆａｓｔ  Ｐｒｅｐ  ＦＰ１２０装置（Ｂｉｏ１０１）を用いて組織を直ちに破壊した。ＲＮＡｚｏｌＢにおける破壊後、０．１容積のクロロホルム中でサンプルを抽出した。１容積のイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、７５％エタノールを用いて洗浄して、ヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。次いで、ＲＮＡサンプルを、室温で１０単位のＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて処理して、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製した。ＤＵ−６００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、またはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）分光光度計で、ＲＮＡ濃度を分光光度的に（Ａ２６０およびＡ２８０）決定した。
【０４０１】
１７．１．８  ｃＤＮＡ合成
Ｔａｑｍａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、１００ｎｇの試験サンプルＲＮＡから、第一鎖ｃＤＮＡを生成した。以下の条件で、７０μｌの反応容積中で逆転写を実施した：１×ＴａｑＭａｎ  ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ，５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．８ｍＭ  デオキシＮＴＰ混合物（各々のデオキシＮＴＰの０．９６ｍＭ）、２．５μＭランダムヘキサマー、１単位のＲｎａｓｅインヒビター、および２．５単位のＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ。この反応物を２５℃で１０分間、４８℃で３０分間、９５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃に保持した。各試験サンプルについて、非ＲＴのコントロール反応を実施した。上記に挙げた成分からＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを省略することによって、非ＲＴ反応混合物を調製した。
【０４０２】
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ．１０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、アデノウイルスのＥ１ａおよびＥ４の配列に特異的なプライマーを設計した。プライマーおよびプローブの配列を以下に示す。各オリゴヌクレオチドの末端の数は、プラスミドｐＡＲ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘにおいて見出されたヌクレオチド位置を示す（図４６）：
Ｅ１ａフォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＴ−３’（１３８８〜１４０８）（配列番号８４）
Ｅ１ａリバースプライマー：５’−ＧＣＴＣＧＴＴＡＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴＣＧＡ−３’（１５２３〜１５０３）（配列番号８５）
Ｅ１ａプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（１４３４〜１４５６）（配列番号８６）
Ｅ４  ｏｒｆ６３フォワードプライマー：５’−ＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＣＧＡ−３’（３３９９３〜３４０１６）（配列番号８７）
Ｅ４  ｏｒｆ６３リバースプライマー：５’−ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＧＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴＧＴ−３’（３４０６２〜３４０４２）（配列番号８８）
Ｅ４  ｏｒｆ６３プローブ：５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＴＡＣＴＧＴＡＣＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（３４０１８〜３４０４０）（配列番号８９）。
【０４０３】
Ｅ４のプローブおよびプライマーのセットをＥ４  ｏｒｆ６領域に標的する。
以下の条件下で５０μｌの反応容積中で増幅を実施した：２０μｌのサンプルｃＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、３００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、および１００ｎＭのＥ１ａまたはＥ４のプローブ。サーマルサイクリング条件は、以下であった：５０℃で２分インキュベーション、Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄのために１０分９５℃の活性化工程、続いて９５℃１５秒間、および６０℃１分間の連続的インキュベーションの３５サイクル。７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、サーマルサイクリングを実行した。ＲＮＡインプット（内因性コントロール）を評価するため、製造業者の指示に従って、Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １８Ｓキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、各ｃＤＮＡの１：１０００希釈の１０μｌを増幅した。
【０４０４】
データを収集して、７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアｖ１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、分析した。Ｅ１ａおよびＥ４の相対的レベルを、１，５００，０００〜１５コピーの希釈を用いて作成したプラスミド曲線に基づいて決定した。内因性コントロールのために、ＲＮＡ標準曲線を用いることによってインプットＲＮＡを評価した。細胞（本研究では、Ｈ４６０を選択した）のＲＮＡの１μｇ〜１ｎｇの１０倍希釈からなる標準曲線を、試験サンプルの各々のセットとともに逆転写した。各々の標準曲線ポイントｃＤＮＡの１：１０００希釈物の１０μｌを、製造業者の指示に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ｔａｑｍａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １８Ｓキットを用いて増幅した。Ｅ１ａ、Ｅ４、および１８Ｓ  ＲＮＡの増幅を二連で実施して、各々についての平均値を報告した。
【０４０５】
１７．１．９  予備的な毒性評価
１７．１．１０  生存中の観察および測定
死亡率および瀕死の状態についての毎日の観察を実施した。急性効果を評価するために、この試験の期間中、投与後、１日および３日（それぞれ、ＳＤ２、およびＳＤ４）で、次いで、毎週、体重を集積した。ＡｎｉＬｙｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって、臨床的な病理分析を実施した。ＳＤ２、４、８、１５、および２９で、５匹マウス／群から眼窩採血によって血液を収集して、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ，ＣＰＫ、およびクレアチニンの測定のために血清を処理した。ＳＤ４、８、１５、および２９で、５匹マウス／群から収集した、凝固していない全血で、全血球計算値（ＣＢＣ）を実施した。
【０４０６】
１７．１．１１  死後の観察および測定
ＳＤ８およびＳＤ２９において、５〜６匹マウス／群で、剖検を実施した。組織を収集して１０％中性緩衝化ホルマリン中に入れ、パラフィンに包埋して、スライドに処理した。Ｈ＆Ｅを用いてスライドを染色して、病理学者による顕微鏡的評価のためにＥＰＬ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）に送達した。評価した組織は、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、脳、および脾臓であった。
【０４０７】
１７．１．１２  統計学的分析
全ての定量的データを正規性および分散について試験した。ＳｉｇｍａＳｔａｔ２．０３を用い、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、処置群の間に統計学的有意差が存在するか否かを決定した。統計学的に有意な差が示されれば、Ｄｕｎｎｅｔｔのｔ検定（パラメトリックデータ）またはＤｕｎｎの検定（ノンパラメトリックデータ）を実施して、コントロール群からの有意な差異を識別した。差異のレベルを、全ての検定について、ｐ＜０．０５に設定した。生存曲線については、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン３．０を用いて、マンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）ログランク検定を実施した。
【０４０８】
１７．２  結果
１７．２．１  腫瘍容積
肝細胞癌の異種移植片モデルを用いて、全身投与後のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｅｘの効力を評価した。雌性ヌードマウスのあるコホートは、右脇腹へのＨｅｐ３Ｂ細胞の皮下注射後、２週で腫瘍を形成した（９１．６〜２１８．５ｍｍ３）。最終容積１０ｍｌ／ｋｇに含有される、１．５×１０１２（ｎ＝１８）ウイルス粒子／ｋｇ、３．０×１０１２（ｎ＝１７）ウイルス粒子／ｋｇ、または４．５×１０１２（ｎ＝１８）ウイルス粒子／ｋｇの単回静脈内注射によって、ＨＢＳＳ（ｎ＝１８）を注射したコントロールと比べて、研究１８日目に開始する腫瘍増殖の有意な阻害（ｐ＜０．０５）が示された（図５１）。３つの用量全てが、Ａｄｄ／３１２（ｎ＝１８）を注射したコントロールと比べて、研究２５日目に腫瘍増殖の有意な阻害（ｐ＜０．０５）を示した（図５１）。しかし、この比較的狭い用量範囲を超えるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘについての用量応答は観察されなかった。
【０４０９】
処置／コントロールのパーセント比（Ｔ／Ｃ（％））として表された腫瘍容積データを、研究の１８、２１、および２５日目について表４９に示す。ＨＢＳＳコントロールに対する処置群の低い腫瘍増殖速度は、３つの処置群全てについてのＴ／Ｃ（％）値における減少傾向に反映される。１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ、３．０×１０１２ｖｐ／ｋｇ、および４．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘは、ＳＤ２５（ＨＢＳＳ群がインタクトである最終日）において、それぞれ、約５５、５６、および５５のＴ／Ｃ（％）を有する。
【０４１０】
表．４９  Ｔ／Ｃ（％）値
【０４１１】
【表４１】
2004529627.tif 000047
【０４１２】
Ｔ／Ｃ（％）＝処置群の平均腫瘍容積／ＨＢＳＳコントロール群の平均腫瘍容積×１００。
【０４１３】
１７．２．２  生存
生存曲線によって、ＨＢＳＳコントロールに比べて、各ベクター用量で処置したマウスについて有意な生存の強化が実証された（図５２）。ＨＢＳＳコントロール群についての平均生存は２８日であったが、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘの１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇでの中央生存は、４２日であり、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘの３．０×１０１２ｖｐ／ｋｇでの中央生存は、４２日であり、そしてＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘの４．５×１０１２ｖｐ／ｋｇでの中央生存は、３５日であった（ＨＢＳＳコントロールに対して、それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００１、およびｐ＜０．０００４）。
【０４１４】
１７．２．３  一次ベクター分布および発現
静脈内投与後３日（ＳＤ４）で選択した組織中でのアデノウイルスヘキソン遺伝子について、ＰＣＲによってベクターを定量した。ＨＢＳＳ処置したコントロール動物由来の組織は、ベクターＤＮＡについて陰性であった。全てのベクター用量について、腫瘍は、１細胞あたり高レベルのベクターコピーを含んだ（表５０）。腫瘍中のベクターコピー数は、用量依存性であるとは考えられなかった。このことは、抗腫瘍効力において観察された用量依存性の欠失とも一致している（図５１）。試験した正常な組織のうち、肝臓は最高レベルのベクターコピーを有し、これは最高の用量で顕著な増大を伴った（表５０）。腫瘍中のベクターコピー数と、肝臓中のベクターコピー数との間の統計学的差異は、おそらく、群内の小さいサンプルサイズおよび高い可変性に起因して、任意のベクター用量で決定され得る。分析した他の組織の全てが、低いけれども測定可能なレベルのベクターＤＮＡを含んだ（表５０）。
【０４１５】
表１７−３．選択された組織における１細胞あたりのベクターコピー（ヘキソンＰＣＲ）
【０４１６】
【表４２】
2004529627.tif 000048
【０４１７】
ＨＢＳＳ、またはＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの低用量（１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ）、中用量（３．０×１０１２ｖｐ／ｋｇ）、もしくは高用量（４．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ）を用いた処置後のマウス（ｎ＝３）から収集した組織中の１細胞あたりのベクターＤＮＡコピー。ＨＢＳＳ処理マウスを陰性コントロールとして用いた。アデノウイルスヘキソンＤＮＡに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって分子分析を行った。結果は、１細胞あたりの平均ヘキソンコピー数（±ＳＤ）である。（ｎａ＝適用不能（ｎｏｔ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ））。
【０４１８】
ベクターＥ１ａおよびＥ４の遺伝子の発現を、ＳＤ４に収集した腫瘍および肝臓において分析した（表５１）。肝臓におけるＥ１ａおよびＥ４の発現は、高用量で最高であった。群内の高い可変性のせいで、いずれのベクター用量でも、腫瘍および肝臓におけるＥ１ａまたはＥ４のレベルのいずれにおいても統計学的な差はなかった。
【０４１９】
表．５１  腫瘍および肝臓におけるＥ１ａおよびＥ４発現レベルの平均
【０４２０】
【表４３】
2004529627.tif 000049
【０４２１】
結果は、平均ＲＮＡレベル±ＳＤである。（ｎａ＝適用不能（ｎｏｔ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ））。
【０４２２】
１７．２．４  予備的な毒性評価
１７．２．５  体重
全ての処置群において注射後１日目に体重減少の一般的な傾向があったが、これは統計学的に有意ではなかった（図５３）。最高用量のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘで、体重の６％の減少があった。非複製コントロールウイルスであるＡｄｄ／３１２の等価な用量では、体重の３％の減少があった。全ての群において１週間後、体重は回復した；２週間後、最高用量のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを除く全ての群が、処置前の体重からの増加を示した。本研究の進行につれて、おそらく腫瘍の進行に起因する条件の全般的な悪化の結果として、全ての群において、体重減少が一般化したようであった。
【０４２３】
１７．３  インビボにおけるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの反復効力の効力
本研究において、本発明者らは、全身投与によって送達された腫瘍崩壊性ベクターＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘが、ヌードマウスにおける皮下異種移植片において予め樹立されたヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）腫瘍の増殖および進行を阻害する能力を試験した。その結果によって、Ｈｅｐ３Ｂ異種移植片腫瘍を保有するヌードマウスへの、３×１０１２または４．５×１０１２粒子／ｋｇの用量のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの、単回静脈内注射が、研究の１２日までの腫瘍増殖において有意な阻害をもたらすことが示された。研究の１９日目の腫瘍容積データは、処置／コントロール（Ｔ／Ｃ）のパーセントとして表しているが、このデータは、低用量について５５％、そして高用量群について４６％に等しい抗腫瘍応答を示す。さらに、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、両方の用量で、ＨＢＳＳまたはＡｄ／３１２で処理したコントロール群と比べて、両方の処置群における動物の中央生存時間を有意に増大させた。いずれの処置群またはコントロール群の間でも平均体重変化に有意な差はなく、腫瘍崩壊性ベクター処置の結果としての死亡率にも有意な差はなかった。しかし、４．５×１０１２粒子／ｋｇのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いて処置した用量群について研究１６日目の平均体重にはわずかな減少があった。これらの結果によって、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの単回静脈内注射が、腫瘍増殖において有意な阻害をもたらすことが示される。
【０４２４】
１７．３．１  方法
１７．３．１．２  ウイルスおよび腫瘍細胞株
Ａｄｄ／３１２は、Ｅ１ａ領域（ｂｐ４４８〜１３４９）を欠失する複製欠損アデノウイルスであって、陰性コントロールとして用いられる（Ｙｏｕｎｇ  ＣＳＨ、Ｓｈｅｎｋ  Ｔ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＨＳ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＨＳ編、Ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９８４；４：１２５〜１７２）。ＧＴＩ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｒｅ（４．０×１０１２粒子／ｍｌ）によって、Ａｄｄ／３１２を生成した。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターであって、ここでＥ１ａプロモーターは、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターで置換されており、Ｅ４プロモーターは、ヒトテロメラーゼ触媒性サブユニットプロモーター（ｈＴＥＲＴ）で置換されているＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを生成した（４．７×１０１２粒子／ｍｌ）。光学的粒子タイターによってベクター濃度を決定した（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９６；７０：７４９８〜７５０９）。ヒト肝細胞癌株Ｈｅｐ３Ｂ（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７；ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４，バッチ番号Ｆ−９４６２）を、Ａｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、マイコプラズマ汚染がないことを確認した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するイーグル（Ｅａｇｌｅ）最小基本培地（ＥＭＥＭ）中でＨｅｐ３Ｂ細胞を培養する。
【０４２５】
１７．３．１．３  マウス腫瘍モデル研究
１×１０７個のＨｅｐ３Ｂ細胞（０．１ｍｌのＨＢＳＳに懸濁した）を、雌性無胸腺近交系ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）（６〜８週齢）の右脇腹に皮下移植した。腫瘍測定を、ノギスを用いて２次元で、週に２回記録した。式：長さ×幅２×π／６によって、腫瘍容積を算出した。研究期間中、１週に１回、体重を記録した。腫瘍容積が１００〜２００ｍｍ３に達したとき、動物を無作為に群に割り付けて、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、３×１０１２粒子／ｋｇ（ｎ＝１６）、または４．５×１０１２粒子／ｋｇ（ｎ＝１６）を用いて、静脈内注射した。用量容積を、体重の１０ｍｌ／ｋｇに調整した。コントロール群には、ＨＢＳＳ（ｎ＝１６）、またはＡｄｄ／３１２（ｎ＝１６）を４．５×１０１２粒子／ｋｇで用いて注射した。腫瘍容積が２０００ｍｍ３に達したとき、動物を屠殺した。
【０４２６】
１７．３．２  結果
１７．３．２．１  腫瘍容積
肝細胞癌の皮下の異種移植片モデルを用いて、腫瘍崩壊性アデノウイルスＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの効力を評価した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、ヌードマウスへの皮下注射後約２週で１００〜２００ｍｍ３の腫瘍を形成した。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの３×１０１２粒子／ｋｇ（ｎ＝１６）、または４．５×１０１２粒子／ｋｇ（ｎ＝１６）での静脈内注射は両方とも、ＨＢＳＳ（ｎ＝１６）またはＡｄｄ／３１２（ｎ＝１６）を注射したコントロールと比べた場合、研究の１２日目に開始する腫瘍増殖の有意な阻害（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡによる）を示した（図５４）。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、４．５×１０１２粒子／ｋｇで用いた効力は、３×１０１２粒子／ｋｇの用量群と比べた場合、わずかな増大であると考えられたが、この差は、統計学的に有意ではなかった。
【０４２７】
処置／コントロール（Ｔ／Ｃ）のパーセントで表した研究の１９日目の腫瘍容積データを、表５２に示す。これらの結果は、Ｔ／Ｃが、低用量について５５％、そして高用量群について４６％に等しい、抗腫瘍応答を示す。
【０４２８】
表５２．Ｔ／Ｃ値
【０４２９】
【表４４】
2004529627.tif 000050
【０４３０】
Ｔ／Ｃ（％）＝ＨＢＳＳコントロール群を超える処置群についての平均腫瘍容積（％）；研究１９日目に決定。
【０４３１】
１７．３．２．２  生存
生存曲線の比較によって（図５５）、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いた腫瘍の処置は、全ての用量において、ＨＢＳＳおよびＡｄｄ／３１２で処置したコントロール動物を上回って生存を有意に増大させたことが示される（ｐ＜０．０１、全ての群について、マンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）ログランク検定による）。中央生存時間は、ＨＢＳＳおよびＡｄｄ／３１２で処置した動物について２６日であった。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘで処置した動物についての中央生存時間は、３×１０１２粒子／ｋｇの用量群について４３日、そして４．５×１０１２粒子／ｋｇの用量群について５６日であった。研究の５８日目まで生存している動物を観察した。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置した群の間に生存において有意な差はなかった。ＨＢＳＳ群とＡｄｄ／３１２群との間の生存において有意な差は無かった。
【０４３２】
１７．３．２．３  体重
体重変化の平均パーセントの比較は、全ての処置群とコントロール群との間で有意な差
を示さなかったが（図５６）、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ４．５×１０１２粒子／ｋｇの用量群の１２日目では、他の群と比べて、一過性の減少があった。
【０４３３】
１７．４  インビボ用量応答におけるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの反復効力
肝細胞癌の皮下異種移植片モデルを用いて、腫瘍崩壊性アデノウイルスＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの単回静脈内投与の４つの異なる用量の効力の用量依存性を評価した。
【０４３４】
１７．４．１  方法
ヒト肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、雌性ヌードマウスの脇腹に接種した。腫瘍容積が９０〜２１５ｍｍ３に達したとき、動物を無作為に群（１群あたり、ｎ＝１２）に割り付けて、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、３×１０１１粒子／ｋｇ、６×１０１１粒子／ｋｇ、１×１０１２粒子／ｋｇ、または３×１０１２粒子／ｋｇ（ｎ＝１２）で用いて静脈内注射した。用量容積を１０ｍｌ／ｋｇに調整した。コントロール群には、１０ｍｌ／ｋｇ  ＨＢＳＳを注射した（ｎ＝１２）。腫瘍容積を週に２回測定した。
【０４３５】
１７．４．２  統計学的分析
コンピューターベースの統計学的プログラムである、ＸＬｆｉｔモジュールおよびＳｉｇｍａＳｔａｔ，２．０３を備えたＥｘｃｅｌによって、統計学的有意差について、腫瘍容積を分析した。研究の３〜２２日の腫瘍容積の自然対数変換によって、時間に対してプロットした場合、直線が得られた。線形回帰分析を用いて、個々のマウスについての傾斜を算出し、次いで群の傾斜を、スチューデントのｔ検定によって比較した（独立、両側分析）。生存曲線の比較のために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０において、マンテル・ヘンツェルログランク検定を実施した。体重分析のために、クラスカルワリスの順位１元分散分析を実施した。有意差のレベルを、全ての検定についてｐ＜０．０５に設定した。
【０４３６】
１７．４．３  結果
１７．４．３．１  腫瘍容積
全身投与後のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘについての用量応答を。肝細胞癌の異種移植片モデルにおいて評価した。６０匹の雌性ヌードマウスのコホートは、右脇腹へのＨｅｐ３Ｂ細胞の皮下注射後２週間で腫瘍を形成した（９０〜２１５ｍｍ３）。最終容積１０ｍｌ／ｋｇに含有する、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘの３×１０１１ウイルス粒子／ｋｇ、６×１０１１ウイルス粒子／ｋｇ、１×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ、または３×１０１２ウイルス粒子／ｋｇでの単回静脈内注射を、研究の１日目に投与した。最高の２つの用量を投与された群は、ＨＢＳＳ（ｎ＝１２）を注射したビヒクルコントロールに比べた場合、研究の２２日目に腫瘍の進行において有意な阻害（ｐ＜０．０５）を示した（図５７）。２つの低用量についての傾向は、腫瘍の進行を遅らせる傾向であったが、この差は、統計学的に有意ではなかった。
【０４３７】
腫瘍容積のデータは、処置／コントロールの比のパーセント（Ｔ／Ｃ（％））で表し、これを研究の１６日目、および２２日目について表５３に示す。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘの３×１０１１ｖｐ／ｋｇ、６×１０１１ｖｐ／ｋｇ、１×１０１２ｖｐ／ｋｇ、および３×１０１２ｖｐ／ｋｇは、ＳＤ２２（ＨＢＳＳ群がインタクトであった最終日）において、それぞれ約８５、６８、６０、および５５のＴ／Ｃ（％）を有する。用量応答への傾向は、４つの処置群についてのＴ／Ｃ（％）値の順位に反映された。
【０４３８】
表５３．Ｔ／Ｃ（％）値
【０４３９】
【表４５】
2004529627.tif 000051
【０４４０】
Ｔ／Ｃ（％）＝処置群の平均腫瘍容積／ＨＢＳＳコントロール群の平均腫瘍容積×１００。
【０４４１】
２２日目に観察されたベクター用量に対する効力応答の順位（図５７、表５３）は、用量応答と一致していた。なぜなら用量の増大は、効力の増大と一致していたからである。研究の２２日目の平均腫瘍容積の統計学的分析によって、用量間の統計学的差異を特定することはできなかったが、図５８における平均腫瘍容積に対して寄与する個々のマウスについての腫瘍容積進行をプロットすることで、用量応答が生じたことが強力に示唆された。従って、腫瘍進行の動態を分析した。腫瘍容積を自然対数変換させて、次いで腫瘍進行曲線（変換していないデータよりも一次方程式によく適合する）を生じる研究日数の関数としてプロットした（図５８）。ＨＢＳＳ（図５８Ａ）群、およびＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３×１０１１ｖｐ／ｋｇ）（図５８Ｂ）群は、個々の腫瘍進行曲線を有し、この曲線は、腫瘍容積の経時的な一定の増大を示す。対照的に、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘの６×１０１１ｖｐ／ｋｇ（図５８Ｃ）、１×１０１２ｖｐ／ｋｇ（図５８Ｄ）、および３×１０１２ｖｐ／ｋｇ（図５８Ｅ）の３つの高用量は、腫瘍進行におけるさらに大きい変動、および進行の速度が遅い複数の腫瘍を有する。線形回帰分析を用いて、研究の３日目と２２日目との間の腫瘍増殖の勾配を決定した（表５４）。スチューデントのｔ検定によって勾配を比較して、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘの３×１０１１ｖｐ／ｋｇ（図５８Ｂ）、対、１×１０１２ｖｐ／ｋｇ（図５８Ｄ）について統計学的有意差を観察した。
【０４４２】
表５４．平均腫瘍容積の勾配
【０４４３】
【表４６】
2004529627.tif 000052
【０４４４】
自然対数（Ｌｎ）変換した腫瘍容積を、時間の関数としてプロットした。Ｅｘｃｅｌでの線形回帰分析を用いて、ＳＤ３とＳＤ２２との間の個々のマウスについてのラインの勾配を決定した。各々の群についての平均勾配を、スチューデントのｔ検定によって比較した（＊ｐ＝０．０４４、対ＨＢＳＳ、０．０１４、対Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３×１０１１ｖｐ／ｋｇ））。
【０４４５】
１７．４．３．２  生存
ＨＢＳＳコントロールに比べて、全てのベクター用量について生存の有意な増強があった（図５９）。ＨＢＳＳコントロール群についての中央生存は２５日であったが、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ（３×１０１２ｖｐ／ｋｇ）についての中央生存は、２８日、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ（６×１０１２ｖｐ／ｋｇ）についての中央生存は、２９．５日、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ（１×１０１２ｖｐ／ｋｇ）についての中央生存は、４１日、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ（３×１０１２ｖｐ／ｋｇ）についての中央生存は、３７．５日であった（それぞれ、ｐ＝０．０１０、０．０１６、０．００２、および０．００１）。用量の増大にともなって、生存が増大する傾向があったが、統計学的に有意な用量応答関係は、実証されなかった。
【０４４６】
１７．４．３．３  体重
処置群の間の体重変化の割合の比較によって、研究の１５、１８、および２２日目において、ＨＢＳＳ、およびＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ（３×１０１１ｖｐ／ｋｇ）で処置したマウスについて有意な低下が示された（図６０）。他のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ処置群は、ベクター投与後体重の統計学的に有意な変化を有さなかった。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ（６×１０１１ｖｐ／ｋｇ）で処置したマウスの体重は、研究の１日目から２２日目、相対的に未変化であった。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ（１×１０１２ｖｐ／ｋｇ）で処置したマウスは、研究の４日目までにわずかに体重を損失し、その体重を研究の１８日目まで維持し、次いで研究の２２日目までさらなる体重損失を被った。結局、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈｔｒｔｅｘ（３×１０１２ｖｐ／ｋｇ）で処置したマウスは、研究の４日目までにわずかに体重を損失し、研究の１８日目まで一貫して体重を増加させ、次いで研究の２２日目までさらなる体重損失を被った。ＳＣＩＤマウスを用いた以前の研究では、急性耐性用量以上の腫瘍崩壊性ベクターをマウスに投与した場合、体重の劇的な低下が観察された。本研究においては、体重損失の速度および大きさは、ＳＣＩＤ研究での観察とは非常に異なっており、このことはこれらの任意のベクター用量に関連する明らかな毒性はないことを示す。実際、用量と体重との間に反比例が存在する。なぜなら、最高用量では、最もよく体重を維持したが、ＨＢＳＳコントロールは、最大の体重損失を被ったからである。
【実施例１８】
【０４４７】
実施例１８：単回静脈内注射後のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ  ＤＮＡ複製のレベルおよび持続期間
本研究は、２８日の時間経過にわたって異種移植片腫瘍およびマウス肝臓におけるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ  ＤＮＡのレベルおよび持続期間の両方を評価した。ヒト異種移植片腫瘍を保有する動物に、Ａｒ１７ｐＡＥ３ｆＦＴｒｔｅｘの単回静脈内注射を投与した。ベクター投与後種々の時間で、動物を屠殺して、ベクターＤＮＡの定量的分子分析のために腫瘍および肝臓を収集した。分子評価によって、有意なベクターＤＮＡ複製が、注射後４時間での１細胞あたり平均０．２５ベクターコピー数から、注射後１４日での１細胞あたり平均６６６．８ベクターコピー数まで増大したベクターレベルとして、腫瘍において生じたことが示された。ベクターＤＮＡレベルの上昇は、注射後２８日持続した。腫瘍中のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘレベルの動態および持続期間によって、３×１０１２ｖｐ／ｋｇの用量でのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの単回静脈内注射の効力および耐容性の両方を実証する以前の検討と一致して、有意なＤＮＡ複製が生じていることが示唆される。分子評価によってまた、ベクター投与後４時間での１細胞あたり７３．６のベクターコピー数の最初レベルから、注射後２４時間での１細胞あたり約１０のベクターコピー数への低下という、肝臓におけるベクターＤＮＡの有意な損失が存在したことが示された。このレベルのベクターＤＮＡが、本研究の残りの期間、肝臓中で持続した。肝臓中でのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘレベルの動態および持続期間によって、この同じ用量で以前に観察された耐容性と一致して、ベクターＤＮＡ複製が有意なレベルで生じないことが示唆される。
【０４４８】
１８．１  方法
１８．１．１  ウイルスおよび腫瘍細胞株
標準的な塩化セシウム勾配精製法を用いて、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（ネイティブなＥ１ａプロモーターがＥ２Ｆ−１プロモーターで置換されており、ネイティブなＥ４プロモーターが、ヒトテロメラーゼプロモーター（ｈＴｒｔ）で置換されている、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター）を、調製した。光学的粒子タイターによってベクター濃度を決定した（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９６；７０：７４９８〜７５０９）。
【０４４９】
ヒト肝細胞癌株Ｈｅｐ３Ｂ（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７；ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４，バッチ番号Ｆ−９４６２）を、Ａｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、病原体がないことを確認した（ＩＭＰＡＣＴ  ＩＩ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｆｉｌｅ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２８４５〜２００１）。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するイーグル（Ｅａｇｌｅ）の最小基本培地（ＥＭＥＭ）中でＨｅｐ３Ｂ細胞を培養する。
【０４５０】
１８．１．２  研究デザイン
Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの投与によってインビトロおよびインビボで殺傷され得るヒト肝細胞癌細胞株である。Ｈｅｐ３Ｂ細胞（１×１０７細胞／ＨＢＳＳの１００μｌ）を、雌性無胸腺近交系ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ、６〜８週齢）の右脇腹に皮下に移植した。研究デザインを表５５に示す。皮下のＨｅｐ３Ｂ腫瘍を有する３３匹のマウス（１４９．１ｍｍ３の平均腫瘍容積；範囲８９．６〜２１２．５ｍｍ３）を選択して、バイアスを除くために、腫瘍容積に基づいてサンプル収集時点に分布させた。投与の直前にＨＢＳＳを用いてベクターを適切な濃度に希釈し、次いで尾静脈側方から静脈内に投与した。
【０４５１】
表．５５．研究のデザイン
【０４５２】
【表４７】
2004529627.tif 000053
【０４５３】
１８．１．３  ベクターのレベルおよび持続期間
ベクター注射（予備試験）なしに３匹のマウスから腫瘍および肝臓を収集した。ベクター投与後、４時間、２４時間、３日、（Ｄ４）、７日（Ｄ８）、１４日（Ｄ１５），および２８日（Ｄ２９）に、５匹のマウスから腫瘍および肝臓を収集した。各組織からＤＮＡを抽出して、ベクターのヘキソン遺伝子について定量的ＰＣＲを実施した。
【０４５４】
１８．１．３．１  組織からのＤＮＡ単離
Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ、およびＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉ、またはＭｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて、組織からＤＮＡを単離した。凍結した組織を部分的に融解して、滅菌のディスポーザブル小刀メスを用いてミンス（切り刻む）した。次いで、Ｑｉａｇｅｎ緩衝液Ｇ２（０．２ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡおよび０．１ｍｇ／ｍｌプロテアーゼを含有）中での５５℃一晩のインキュベーションによって、この組織を溶解した。溶解物を短時間ボルテックスし、次いで、Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ  １００カラム、またはＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ  ２５カラムに入れた。製造業者の指示に記載のとおり、カラムを洗浄して、ＤＮＡを溶出させた。沈殿後、ＤＮＡを水に溶解して、ＤＵ−６００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）、またはＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）分光光度計で、濃度を分光光度的に（Ａ２６０およびＡ２８０）決定した。
【０４５５】
１８．１．３．２  ヘキソンＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲアッセイ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ．１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、アデノウイルスのヘキソン配列に特異的なＰＣＲプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブを設計した。プライマーおよびプローブの配列は以下であった：
ヘキソンフォワードプライマー：５’−ＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号９０）
ヘキソンリバースプライマー：５’−ＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号９１）
ヘキソンプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号９２）
【０４５６】
以下の条件下で、５０μｌの反応容積中で増幅を実施した：１０ｎｇ（腫瘍）または１μｇ（肝臓および肺）のサンプルＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、６００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、および１００ｎＭヘキソンプローブ。サーマルサイクリング条件は以下であった：５０℃で２分のインキュベーション、９５℃で１０分、続いて、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間の連続的インキュベーションの３５サイクル。
【０４５７】
データを収集して、７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアｖ．１．６．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。細胞ゲノムＤＮＡの適切なバックグラウンドにおいて１，５００，０００コピー〜１５コピーのアデノウイルスＤＮＡの希釈からなる標準曲線を用いて、アデノウイルスコピー数の定量を実施した。腫瘍組織の分析のために、１０ｎｇのヒトＤＮＡのバックグラウンド中の標準曲線を作成した。マウスの肝臓および肺の組織の分析のために、１μｇのＣＤ−１マウスゲノムＤＮＡのバックグラウンド中の、同じアデノウイルスＤＮＡ希釈からなる標準曲線を作成した。サンプルを三連で増幅して、インプットしたＤＮＡの重量および６×１０９ｂｐのゲノムサイズに基づいて、総コピーの平均数を１細胞あたりのコピーに正規化した。
【０４５８】
１８．１．４  統計学的分析
全ての定量的データを正規性および分散について試験した。ＳｉｇｍａＳｔａｔ２．０３を用い、スチューデントのｔ検定を用いて、処置群の差の統計学的有意性を評価した。有意性のレベルを、ｐ＜０．０５に設定した。
【０４５９】
１８．２  結果
１８．２．１  ベクターコピー数
静脈内投与後種々の時点でのヘキソンＤＮＡのＰＣＲによって、腫瘍および肝臓におけるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘベクターコピー数を定量した。未処置の動物由来の予備試験サンプルは、予想どおり、ベクターＤＮＡについて陰性であった。腫瘍において、ベクターコピー数は、低かったが、早期時点で検出可能であり、次いで２４時間後の時点で有意に増大する。このことは、この腫瘍におけるベクターＤＮＡ複製を示唆する（表５６、図６１）。４時間（１細胞あたりベクターコピー０．２５±０．０７）から２４時間（１細胞あたりベクターコピー１．３１±１．０１）へのベクターＤＮＡの増大は統計学的に有意であった（ｐ＝０．０３２）が、２４時間と、Ｄ４（１細胞あたりベクターコピー１１８．５±１１８．０）またはＤ８（１細胞あたりベクターコピー１６８．５±１８１．６）のいずれかとの間の劇的な差異は、それらの時点での個々の高い変動性のせいで統計学的には相違しなかった。Ｄ１５で観察されたピーク（１細胞あたりベクターコピー６６６．８±１９９．３）は、Ｄ８とは統計学的に異なった（ｐ＝０．００６）が、Ｄ１５からＤ２９（１細胞あたりベクターコピー４２９．９±１２７．４）へのわずかな低下は有意ではなかった。
【０４６０】
肝臓においては、評価した最速の時点である４時間において（１細胞あたりベクターコピー７３．６±１７．７）最高のベクターコピー数が検出される。肝臓におけるベクターコピー数は、２４時間までに７分の１に低下した（１細胞あたりベクターコピー１０．７±、ｐ＝＜０．００１）。２４時間後、肝臓におけるベクターコピー数は、Ｄ４、Ｄ８、Ｄ１５、およびＤ２９において、２４時間のレベルから統計学的に識別不能なレベルで持続する。
【０４６１】
腫瘍および肝臓におけるベクターの相対的レベルは、研究の経過を通じて劇的に変化した。４時間および２４時間では腫瘍に対して肝臓において、より高いベクターコピー数であり（ｐ＝＜０．００１）、Ｄ４およびＤ８では肝臓に対して腫瘍において１０倍より高いレベル（統計学的には相違しない）であって、そしてＤ１５およびＤ２９では腫瘍において２５倍より高いレベル（統計学的に有意）であった（それぞれ、ｐ＝０．０１５およびｐ＜０．００１）。
【０４６２】
表．５６  腫瘍および肝臓におけるベクターコピー数の平均
【０４６３】
【表４８】
2004529627.tif 000054
【０４６４】
処置前（ｎ＝３）、および示した時間、およびＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの３．０×１０１２ｖｐ／ｋｇ（ｎ＝５）の静脈内注射後にマウスから収集した腫瘍および肝臓における１細胞あたりのベクターＤＮＡコピー。アデノウイルスヘキソンＤＮＡに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって分子分析を行った。結果は、１細胞あたりの平均ヘキソンコピー数（±ＳＤ）である。＊は、ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定によって、前の時点で適合した組織に対して比較）。
【実施例１９】
【０４６５】
実施例１９：Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの評価のためのインビボＳＣＩＤモデル
１９．１  理論的根拠
ＳＣＩＤマウスモデルは、腫瘍崩壊性ベクターについてのスクリーニングとして前に記載している（実施例３を参照のこと）。このモデルを選択する理論的根拠は、ウイルスＥ１ａ領域の発現に関連する毒性に基づく。このＳＣＩＤスクリーニングモデルは、もともと、腫瘍崩壊性ベクターの間を識別するために開発された。このモデルでは、実施例３と同様に、Ｅ１ａ発現のみが制御され、かつ６．２５×１０１１粒子／ｋｇのベクター用量が用いられた。腫瘍崩壊性ベクターは、改良された腫瘍選択性プロモーターによって構築されたので、候補物はもはや、お互いからも陰性コントロールからも識別できなかった。なぜならそれらは、毒性の明らかな兆候を生じなかったからである。従って、より多いベクター用量を投与することによって、このモデルをこの実施例に対して改変した。この結果、選択されたパラメーター（例えば、体重および肝臓酵素レベル）に対する効果を用いて、より選択性のベクターの間を識別し得る。さらに、Ｅ１ａおよびＥ４  ｍＲＮＡのレベル、ならびにアデノウイルスＤＮＡコピー数が、インビボにおける非腫瘍細胞において腫瘍崩壊性ベクターの複製のためのエンドポイントとして用いられ得る。本発明者らは、二重プロモーター制御されたＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ、単一プロモーター制御されたＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ（実施例７に記載）、およびＥ１ａ欠失Ａｄｄ／３１２を比較して、インビボでの正常組織におけるＤＮＡ複製の制御に対するＥ１ａおよびＥ４の転写の効果を決定した。
【０４６６】
１９．２  方法
各々の動物を投薬（研究日ＳＤ１）の朝に秤量した。個々の体重に基づいて用量容積を調整して、１０ｍｌ／ｋｇの用量容積中に含有される各々の試験ベクターの４×１０１２粒子／ｋｇの用量を得た。この用量を側方の尾静脈中に静脈内投与した（ｎ＝１０／群）。コントロール群の動物（ｎ＝１０）に、等価な用量容積（１０ｍｌ／ｋｇ）のＨＢＳＳを注射した。選択した臨床病理学パラメーターの臨床的観察および評価を実施した。さらに、実施例４および１３に記載のように、ＳＤ４に肝臓を収集し、ＳＤ１５に剖検を予定し、その一部を、その後のアデノウイルスヘキソンＤＮＡ  ＰＣＲ、Ｅ１ａ  ＲＴ−ＰＣＲ、およびＥ４  ＲＴ−ＰＣＲのためにドライアイス上で凍結させた。
【０４６７】
１９．３  結果および結論
示したベクターの４×１０１２粒子／ｋｇの用量での単回投与後の体重に対する効果を図６２に示す。全ての処置群におけるＳＤ２での体重の初めの損失後、ＨＢＳＳおよびＡｄｄ／３１２で処置した動物は、研究の経過中にわたって体重を増加させた。Ａｒ６ｐＡＥＦ２ｆＥ３Ｆで処置した動物は、ＳＤ１とＳＤ４との間で一貫して体重を減じ、この時、それらの動物は瀕死になって屠殺された。この群における平均体重変化は、ＳＤ２、ＳＤ３、およびＳＤ４では、ＨＢＳＳ群の平均体重変化と有意に異なった（ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。対照的にＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置群は、本研究の経過にわたって平均体重を維持した。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置群とＨＢＳＳ処置群との間の体重変化の差異は、本研究中のいずれの時点でも有意でなかった。
【０４６８】
ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＰＫ、およびＣＲＥＡＴの血清レベルをＳＤ４、およびＳＤ１５で測定した。ＣＰＫおよびＣＲＥＡＴのレベルは、ＳＤ４またはＳＤ１５でいずれの処置群の間でも相違しなかった。このことは、骨格近、心筋、脳または腎臓にはほとんど毒性がなかったことを示す。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘで処置した群は、ＨＢＳＳで処置したマウスに比べて、ＳＤ４でＡＳＴおよびＡＬＴのレベルが上昇していた（ｐ＜０．０５、ｔ検定）が、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘで処置した群は、単一のプロモーターで制御したベクターであるＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆよりも有意に低レベルであった（ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。表５７は、ＡＳＴのレベルについてのデータを示す；ＡＬＴレベルの結果は同様であった。従って、単一のプロモーターで制御したＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆに対して、二重のプロモーターで制御したＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘにおけるＥ４発現のさらなる制御は、毒性の減少に関連していた。
【０４６９】
表５７．ＳＣＩＤマウスにおける血清ＡＳＴレベル
【０４７０】
【表４９】
2004529627.tif 000055
【０４７１】
ＨＢＳＳを用いて、または示したベクターの４×１０１２粒子／ｋｇを用いて、ＳＤ１に動物に投薬した。血清をＳＤ４（ｎ＝１０）およびＳＤ１５（ｎ＝５）に収集した。各処置群における平均ＡＳＴ値（＋ＳＤ）を示す。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３ＦについてはＳＤ１５は決定しなかった。なぜなら、この群の動物は、ＳＤ１５前に屠殺されたからである。＊ｐ＜０．０５、対ＨＢＳＳ（ｌｏｇ１０変換したデータにおけるｔ検定）。†ｐ＜０．０５、対Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ（ｌｏｇ１０変換したデータにおけるｔ検定）。ＮＤ、実施せず（ｎｏｔ  ｄｏｎｅ）。
【０４７２】
複製欠損ベクターＡｄｄ／３１２を用いて処置したマウスは、単回静脈内注射の３日後に肝臓１細胞あたり平均１９コピーのベクターＤＮＡであった。対照的に単一プロモーター制御したベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆを用いて処置したマウスは、１細胞あたり平均１５２２コピーであった（表５８）。ベクターコピー数におけるこの８０倍の差異によって、この用量のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆで処置したマウスの肝臓において、ベクター複製が生じ得ることが示唆される。しかし、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置群は、１細胞あたり２３２コピーという有意に低い平均であった（ｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。このように、同様の入力用量にかかわらず、Ｅ１ａ制御のベクターと、Ｅ１ａおよびＥ４の両方の転写制御のベクターとの間のウイルスＤＮＡレベルには７分の１の低下があった。
【０４７３】
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３ＦとＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘとの間のＤＮＡコピー数において本発明者らが確認した差異が、Ｅ４領域におけるｈＴＥＲＴプロモーター制御に関連していたか否かを決定するため、本発明者らは、これらの同じ処置群において早期の遺伝子発現レベルを評価した（表５８）。１つのＡｄゲノムあたりに基づくＥ１ａのレベルは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ処置マウス、およびＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置マウスの両方において同様で、１．５倍以内であった。両方のベクターとも、Ｅ１ａ領域は、Ｅ２Ｆ−１プロモーターの制御下であるので、この結果は予想された。
【０４７４】
Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置マウスとＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ処置マウスとの間のＥ１ａ  ＲＮＡレベルにおけるこの類似性によって、本発明者らがＤＮＡコピー数において確認したこの差異が、Ｅ４領域におけるｈＴＥＲＴプロモーター制御に関連し得ることが示唆される。従って、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ、およびＡｄｄ／３１２を用いて処置したマウスにおいて、Ｅ４発現レベルを測定した（表５８）。Ｅ１ａの非存在下においてさえ、Ａｄｄ／３１２においてと同様、Ｅ４プロモーターの残りの活性化が存在する（Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ  ＭＩ，Ｌａｐｃｅｖｉｃｈ  Ｃ，Ｒｏｙ  Ｓ，Ｋａｎｇ  Ｑ，Ｋａｄａｎ  Ｍ，Ｗｕ  Ｖ，Ｐｅｃｈａｎ  Ｐ、Ｋａｌｅｋｏ  Ｍ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｅ１，ｅ２ａ、Ｅ３、ａｎｄ  ａｌｌ  ｏｆ  Ｅ４  ｅｘｃｅｐｔ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ３．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９９  Ｊｕ１：７３（７）：６０４８−５５）。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ、およびＡｄｄ／３１２は両方とも野生型Ｅ４プロモーターを有する；これらのベクターを用いて処置したマウスは、１ゲノムあたりのＥ４発現レベルにおいて差異を示さなかった。しかし、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘで処置したマウス（ここでＥ４は、ｈＴＥＲＴプロモーターの制御下である）は、Ｅ４  ＲＮＡレベルにおいて有意な減少を示した。この減少は、ウイルスＤＮＡコピー数の減少に関連している。これらのデータによって、第二の腫瘍選択性プロモーターの制御下にＥ４領域を配置することが、単一プロモーター制御されたＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆに対して、正常な組織においてＤＮＡ複製の減少をもたらすことが示唆される。
【０４７５】
表５８．ｉｖ投与後（ＳＤ４）のＳＣＩＤ肝臓におけるＡｄ  ＤＮＡ、およびＥ１ａ／Ｅ４  ＲＮＡのレベル
【０４７６】
【表５０】
2004529627.tif 000056
【０４７７】
総ＲＮＡの抽出のためにＳＤ４において１群あたり５匹のマウスから肝臓を収集した。分子分析を行って、ヘキソン遺伝子についての定量的ＤＮＡ  ＰＣＲによって、１細胞あたりのアデノウイルスゲノムコピー数を決定した。Ｅ１ａおよびＥ４遺伝子の発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定して、アデノウイルス１ゲノムあたりに基づいて正規化した。結果を平均値±ＳＤとして表す。＊ｐ＜０．０５、対Ａｄｄ／３１２、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆ（一元ＡＮＯＶＡ）。†ｐ＜０．０５、対Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（一元ＡＮＯＶＡ）。
【０４７８】
これらの検討によって、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、単一プロモーター制御Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆに対して、有意に低いレベルのＥ１ａ関連肝毒性、Ｅ４発現、およびヘキソンＤＮＡコピー数と関連することが示された。これらの２つのベクター間の有効な差異は、Ｅ４領域の転写制御である。これらの結果によって、Ｅ１ａの単一プロモーター制御で達成された正常肝臓における複製の減弱が、Ｅ４領域のさらなるコントロールによって強化されたことが示唆される。マウス肝臓におけるＥ１ａ  ＲＮＡレベルは、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘとＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆとの間で同様のままであったが、本発明者らは、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘにおいて、野生型Ｅ４プロモーターをｈＴＥＲＴプロモーターで置換した場合、より低いレベルのＥ４発現を観察した。これは、Ａｄ  ＤＮＡコピー数の低下、および肝毒性の減少と関連していた。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置したマウスにおけるｈＴＥＲＴプロモーターによる低レベルのＥ４発現は、ｈＴＥＲＴプロモーターが、マウスの転写機構を使用することができないことには帰せられなかった。なぜなら、ｈＴＥＲＴプロモーターＬａｃＺレポーターの発現が、マウス肺癌細胞株Ｍ１０９において見られたからである（Ｇｕ  Ｊ，Ｋａｇａｗａ  Ｓ，Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｍ，Ｋｙｏ  Ｓ，Ｉｎｏｕｅ  Ｍ，Ｒｏｔｈ  ＪＡ．Ｆａｎｇ  Ｂ．Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｘ  Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  ６０：５３５９−５３６４）。
【実施例２０】
【０４７９】
実施例２０：腫瘍崩壊性アデノウイルスと化学療法の併用の相乗効果
腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘと化学療法剤との併用の相乗効果を、インビトロおよびインビボにおいて試験した。異なる機能を有する化学療法剤、ドキソルビシン、パクリタキセル、およびＥｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  Ｂ（エポシロンＢ）を、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘと併用して、肝臓および前立腺の癌細胞に対して、細胞殺傷アッセイによって試験した。イソボログラムによって、併用効果を分析する。特定の併用で、インビトロにおいて強力な相乗効果がみられる。インビボにおいては、ドキソルビシンの２つの処方物である、遊離のドキソルビシン、および長時間循環性リポソームに取り込まれたドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））を、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘと併用して、肝細胞癌異種移植片モデルにおいて、腫瘍増殖を評価することによって試験した。両方の組み合わせとも、腫瘍崩壊性ベクター、または化学療法単独よりも、腫瘍増殖を抑制する、より高い効力を有した。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の併用は、インビボにおいてドキソルビシン併用よりも強力な相乗作用を示した。
【０４８０】
２０．１  インビトロにおける化学療法との併用
２０．１．１  方法
２０．１．１．１  細胞培養およびウイルス
前立腺癌細胞株ＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６（ＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６としても公知）を、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターであるｐＧＬ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いたトランスフェクションによって、ＰＣ−３Ｍヒト前立腺癌細胞株から得た。ＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６と命名したクローンを、細胞毒性薬物の抗増殖活性に対するインビトロの感受性の特別な高出力および保持に基づいて選択した。ＰＣ−３Ｍ２ＡＣ６細胞株をＸｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）で生成した。この細胞株を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０中で維持する。肝細胞癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７  ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４）を、１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ中で培養する。ウイルスＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、実施例１５に記載のとおり調製した。
【０４８１】
２０．１．１．２  化学療法の薬物
Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、およびドキソルビシンを、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｗｈｏｌｅｓａｌｅ  Ｄｒｕｇ（Ｓａｖａｇｅ，ＭＤ）から購入した。タキソールは、Ｍｅａｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ａ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ  ０８５４３）の製品である。１ｍｌあたり、６ｍｇのパクリタキセル、５２７ｍｇの精製されたＣｒｅｍｏｐｈｏｒ＠ＥＬ（ポリオキシエチル化キャスターオイル）および４９．７％（Ｖ／Ｖ）の脱水されたアルコール（ＵＳＰ）を含む。ドキソルビシンはＧｅｎｓｉａ  Ｓｉｃｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）の製品である。１ｍｌあたり、ドキソルビシンＨＣｌ  ２ｍｇ、塩化ナトリウム０．９％を含み、ｐＨは、２．５〜４．５である。
【０４８２】
エポシロンＢ（ＷＯ  ９９／４３３２０）（ＣＧＰ  ４７９０６またはＥＰＯ９０６とも呼ばれる）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。その分子構造および物理的特徴は、Ａｌｔｍａｎｎ  Ｋ，Ｗａｒｔｍａｎｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  Ｔ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１４７０：Ｍ７９−Ｍ９１によって記載される。
【０４８３】
２０．１．１．３  インビトロにおける細胞殺傷アッセイ併用
化学療法薬物の併用の間の相乗効果を評価するために用いたイソボログラム法は、詳細に記載されている（Ｔａｌｌａｒｉｄａ  ＲＪ.１９９２；Ｐａｉｎ，４９：９３〜９７）。この方法を、腫瘍崩壊性ベクターと化学療法との間の併用（以下の改変を伴う）のインビトロにおける相乗効果を評価するように適合させた。要するに、ウイルス感染の１日前に９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０００細胞をプレートした。ウイルス感染の１日後、細胞に化学療法薬物を添加した。各々の９６ウェルプレートを用いて、２つの単一薬物の用量応答曲線、および１列について化学療法薬物に対する固定された混合比でのウイルスの４つの組み合わせを試験することができる。ウイルス感染の７日後（化学療法薬物での処置の６日後）、ＭＴＳアッセイを用いて、細胞死の割合を決定する。シグモイドの用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムによってあてはめて、異なる効果パーセントまたは応答レベルでの有効濃度（ＥＣ）を、Ｐｒｉｓｍプログラムからの出力パラメーターを用いて算出する。併用指数ＣＩ＝ｄＡ／ＤＡ＋ｄＢ／ＤＢ；ＤＡは、ウイルス単独での処置のＥＣ５０である；ＤＢは、化学療法薬物単独処置のＥＣ５０である；ｄＡは、併用療法におけるウイルスのＥＣ５０である；ｄＢは、併用療法における化学療法薬物のＥＣ５０である。同様に、３０％、７０％、および９０％細胞死のＣＩ（ＣＩ３０、ＣＩ７０、およびＣＩ９０）を、それぞれ適切なＥＣ３０、ＥＣ７０、およびＥＣ９０を用いて算出する。
【０４８４】
加算性のエンベロープを用いた改良型イソボログラムを、５０％細胞死において構築して、加算性から相乗作用および拮抗作用をさらによく識別した（Ｓｔｅｅｌ  ＧＧ、およびＰｅｃｋｈａｍ  ＭＪ．１９７９；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．，５：８５〜９１）。モードＩは、異種追加（ｈｅｔｅｒｏａｄｄｉｔｉｏｎ）を表す。ここでは、２つの薬剤が、独立した機構で相加的に作用する。モードＩＩは、同種追加（ｉｓｏａｄｄｉｔｉｏｎ）を表す。ここでは、２つの薬剤が、同様の機構によって相加的に作用する。モードＩＩａは、Ａ薬剤が最初に作用することを示し、そしてモードＩＩｂは、Ｂ薬剤が最初に作用することを示す。
【０４８５】
ＣＩが、１未満であるか、または併用の等価効果点（ｉｓｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｉｎｔ）が、エンベロープの加算性の左におさまる場合、この併用は相乗作用的である。ＣＩが、１に等しいか、または併用の等価効果点が、加算性のエンベロープの内側におさまる場合、この併用は相加的である。ＣＩが、１より大きいか、または併用の等価効果点が、エンベロープの加算性の右におさまる場合、この併用は拮抗作用的である。
【０４８６】
２０．１．２  結果
２０．１．２．１  Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールの併用
Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞において試験したＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールの併用の結果を、それぞれ表６４および６５に示す。Ｈｅｐ３Ｂ細胞について、ＣＩ５０−９０は、試験した混合比の全てについて１未満であった。３．３３×１０−４ｐｐｃ／ｎＭ、および５．３３×１０−３ｐｐｃ／ｎＭ混合比でのＣＩ３０のみが、１より大きかった。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールを、３．３３×１０−４ｐｐｃ／ｎＭの比で混合した場合、ＣＩ９０は、０．０８程度の低さであり、そしてＣＩ５０は、０．２３８程度の低さであった。試験した全ての比で、応答レベル（細胞死％）の増大とともにＣＩは低下した（表５９）。このことは、この相乗作用が、低い応答レベルよりも、高い応答レベルでより強力であることを示す。ＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞については、０．２および２ｐｐｃ／ｎＭの比で、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールを混合した場合、ＣＩ３０−９０は、１未満であって、やはり応答レベルの増大とともに低下した。混合比が０．０２または２０であった場合、ＣＩ３０−７０、およびＣＩ７０−９０は、１より大きく、このことは、拮抗作用を示した（表６０）。
【０４８７】
エンベロープの加算性を用いる改良型イソボログラム法によって、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対する全ての試験した混合比でのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールの相乗作用的併用、ならびにＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞に対する０．２および２の混合比でのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールの相乗作用的併用を確認した（図６３）。併用の全ての時点は、図６３におけるＹ軸に対してよりもＸ軸に対して近かった。このことは、このウイルスによる化学感作が優勢であることを示す。相乗作用的併用において、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対して、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、ＥＣ５０の１．１〜４．３分の１の低下を有し、Ｔａｘｏｌは、ＥＣ５０の２３２〜３７５３分の１の低下を有した。同様に、ＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞を試験した場合、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘは、ＥＣ５０の１．３〜１．４分の１の低下を有し、Ｔａｘｏｌは、ＥＣ５０の３５〜２５９２分の１の低下を有した。これらのデータは、この相乗作用的効果が、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの投薬においてよりも、タキソール投薬において大きい低下をもたらすことを示す。これによって、この腫瘍崩壊性ベクターが、試験した混合比でタキソールに対する両方の細胞株の感作に関与することが示される。
【０４８８】
表５９．Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールの併用
【０４８９】
【表５１】
2004529627.tif 000057
【０４９０】
表６０．ＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールの併用
【０４９１】
【表５２】
2004529627.tif 000058
【０４９２】
２０．１．２．２  Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびドキソルビシンの併用
Ｈｅｐ３Ｂ細胞において試験したＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびドキソルビシンの併用の結果を、表６１に示す。混合比が１．２５×１０−５〜８×１０−４ｐｐｃ／ｎＭであったとき、ＣＩ３０−９０は、１未満であった。また、１．２５×１０−５ｐｐｃ／ｎＭの混合比以外では、試験した混合比における効果の増大に伴って、ＣＩは低下した。換言すれば、この相乗作用は、低いレベルよりも、高いレベルの細胞殺傷でより強力である。さらに、改良したイソボログラム（図６４）によって、１．２５×１０−５〜８×１０−４の混合比での併用が相乗的であったことを確認した。ウイルスのＥＣ５０の低下（９〜３５８分の１）は、試験した併用におけるドキソルビシンのＥＣ５０の低下（１．７〜２．８分の１）よりもかなり大きかった。このことによって、タキソールと異なり、ドキソルビシンは、試験した混合比でＨｅｐ３Ｂ細胞を腫瘍崩壊性ベクターに対して感作することが示唆される。
【０４９３】
ＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞を処置した場合、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびドキソルビシン（１０、１００、および１０００ｐｐｃ／ｎＭで混合）について、ＣＩ３０−７０は、１未満であり、ＣＩ９０は、１より大きかった（表６２）。１ｐｐｃ／ｎＭの混合比について、ＣＩ３０−５０は、１より大きく、ＣＩ７０−９０は、１未満であった。改良したイソボログラムによって、１０〜１０００の混合比での併用が、相乗作用的であって、１の混合比が拮抗作用的であったことが確認された（図６４）。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘについてのＥＣ５０の１．１〜３．２分の１の低下、およびドキソルビシンについてのＥＣ５０の６８〜４７０，０００分の１の低下によって、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘが、試験した混合比で、ドキソルビシンに対してＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞を感作することが示される。
【０４９４】
表６１．Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびドキソルビシンの併用
【０４９５】
【表５３】
2004529627.tif 000059
【０４９６】
表６２．ＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびドキソルビシンの併用
【０４９７】
【表５４】
2004529627.tif 000060
【０４９８】
２０．１．２．３  Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびエポシロンＢの併用
エポシロンＢは、タキソールと同様の機能（すなわち、微小管の組み立て阻害）を有するが、さらに強力である。ＡＲ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびエポシロンＢを、３．１３×１０−６、または１．２５×１０−５ｐｐｃ／ｎＭの比で混合した場合、その併用は、効果の全てのレベルで相乗作用的であった（図６３）。ＣＩ３０〜５０は、５×１０−５、および１．２８×１０−２ｐｐｃ／ｎＭの混合比では１未満であった。改良したイソボログラム分析によって、３．１３×１０−６、１．２５×１０−５、および５×１０−５ｐｐｃ／ｎＭの混合比での併用は、５０％応答レベルで相乗作用的であったが、１．２８×１０−２ｐｐｃ／ｎＭの混合比での併用は、相乗的でしかなかったことが確認された（図６５）。相乗作用的併用の位置は、Ｘ軸よりもＹ軸に近く、このことは、エポシロンＢが、この細胞をウイルスに対して感作することを示唆する。相乗作用的併用におけるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ  ＥＣ５０の低下は、１１９〜２８５１分の１であったが、エポシロンＢのＥＣ５０の低下は、１．１〜１．６分の１でしかなかった。このことは、エポシロンＢが、試験した混合比では、Ｈｅｐ３Ｂ細胞をＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘに対して感作するという結論と一致する。
【０４９９】
表．６３  Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびエポシロンＢの併用
【０５００】
【表５５】
2004529627.tif 000061
【０５０１】
２０．２  インビボにおける化学療法との併用
ここでは、２つのインビボにおける併用研究を示す。両方とも、化学療法が、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの効力を増強したことを示した。第一の研究は、ドキソルビシンと併用したＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３×１０１２粒子／ｋｇ）であった。第二の研究は、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）と併用したＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（１×１０１２粒子／ｋｇ、および６×１０１１粒子／ｋｇ）であった。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）は、長時間循環型ＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソームに中にカプセル化されたドキソルビシンＨＣｌ（塩酸ドキソルビシン）である。このステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）リポソームは、表面上にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。このポリエチレングリコールが、循環中のマクロファージによる最初の取り込みからリポソームを遮蔽し得る。これによって、リポソーム処方物は、比較的長時間、循環中に留まる。より重要なことに、これらの長時間循環型リポソームは、従来のリポソーム（ＰＥＧなし）および遊離の薬物に比べて、固形腫瘍中で有意に大きい蓄積を示す。
【０５０２】
２０．２．１  方法
２０．２．１．１  材料
Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射）は、ＡＬＺＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の製品である。１ｍｌあたりに以下を含有する：２ｍｇのドキソルビシンＨＣｌ、３．１９ｍｇのＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２，ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、９．５８ｍｇの完全水素化ダイズフォスファチジルコリン、３．１９ｍｇのコレステロール、２ｍｇの硫酸アンモニウム、スクロース、ヒスチジン、塩酸、および／または水酸化ナトリウム。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）を、マウスへの投与の前に５％グルコース中に適当に希釈した。
【０５０３】
２０．２．１．２  Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘとドキソルビシンとの併用
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（１×１０７細胞／ＨＢＳＳの１００μｌ）を、雌性の無胸腺近交系ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，６〜８週齢）の右脇腹に皮下移植した。腫瘍測定を、ノギスを用いて２次元で、週に２回記録した。式：長さ×幅２×π／６を用いて、腫瘍容積を算出した。腫瘍容積が８９〜２８０ｍｍ３に達したとき、動物を選択して、以下の４つの群（ｎ＝１０）に均等に分布させた：Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのみ、ドキソルビシンのみ、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘとドキソルビシンとの併用、および陰性コントロールＨＢＳＳ。研究の１日目における平均腫瘍容積は、１８３±１８．３ｍｍ３であった。研究の１日目に、尾静脈を介してＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３．０×１０１２粒子／ｋｇ）のみを静脈内に（ｉ．ｖ．）、ドキソルビシン単独（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）に、またはＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３．０×１０１２粒子／ｋｇ）およびドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の両方を用いて（ｉ．ｐ．）マウスに注射した。陰性コントロール群には、ＨＢＳＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を用いて静脈内に注射した。
【０５０４】
２０．２．１．３  Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘとＤｏｘｉｌ（登録商標）（ＯＮ１−０２９ｙ）との併用
皮下に移植したＨｅｐ３Ｂ腫瘍が、１７３〜３２１ｍｍ３の容積に達したとき、マウスを選択して、４つの処置群（ｎ＝１０）、および１つのビヒクルコントロール群（ＨＢＳＳ，ｎ＝９）に均等に分布させた。４つの処置群とは以下であった：Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのみ（３×１０１２粒子／ｋｇ）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）のみ、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（１×１０１２粒子／ｋｇ）とＤｏｘｉｌ（登録商標）との併用、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（６×１０１１粒子／ｋｇ）とＤｏｘｉｌ（登録商標）との併用。研究の０日目での平均腫瘍容積は、２５０±１３ｍｍ３であった。
【０５０５】
研究１日目、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（９ｍｇ／ｋｇ）を用いて、尾の静脈を介してマウスに静脈内注射した。研究２日目、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを、１×１０１２粒子／ｋｇ、または６×１０１１粒子／ｋｇで用いて、マウスをｉ．ｖ．注射した。研究の１日目に、ＨＢＳＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を用いてコントロール群にｉ．ｖ．注射した。
【０５０６】
２０．２．１．４  統計学的分析
コンピューターによる統計学的プログラムであるＳｉｇｍａＳｔａｔ、バージョン２．０、またはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン３．０によって、処置群の間の差異を、統計学的有意性について分析した。腫瘍容積について、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いるスチューデントのｔ検定によってｔ検定を実施した。
【０５０７】
２０．２．２  結果
２０．２．２．１  ドキソルビシン併用の効力
肝細胞癌の異種移植片モデルを用いて、全身投与後、化学療法化合物であるドキソルビシンと併用したＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの効力を評価した。最終容積１０ｍｌ／ｋｇに含有するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３．０×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ）の単回静脈内注射（ｎ＝１０）によって、ＨＢＳＳ注射したコントロールと比較した場合、研究の１６日目に開始する腫瘍増殖における有意な阻害が示された（ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）（図６６）。ドキソルビシン処置単独では、研究１３日目におけるＨＢＳＳに比較して、有意な腫瘍阻害が示された（スチューデントのｔ検定によって、ｐ＜０．００１）。ドキソルビシンと腫瘍崩壊性ベクター処置との併用によって、いずれかの処置単独を有意に上回って効力が改善された（研究２０日目のスチューデントｔ検定によって、ｐ＜０．００１）。本研究においては、ベクターのみで処置した群では、１例の腫瘍の完全消失（退縮）が認められた。
【０５０８】
処置／コントロール（Ｔ／Ｃ）の比として表した腫瘍容積データを、研究の１３、１６、および２０日目について表６４に示す。ＨＢＳＳコントロール群に対する、処置群の低い腫瘍増殖速度は、３つの処置群全てについてのＴ／Ｃ値における低下傾向に反映される。併用群は、研究２０日目（全ての群がインタクトである最終日）に２０％の最低値を有する。
【０５０９】
表６４．ドキソルビシン併用研究Ｔ／Ｃ容積（％）
【０５１０】
【表５６】
2004529627.tif 000062
【０５１１】
Ｔ／Ｃ（％）＝処置群の平均腫瘍容積／ＨＢＳＳコントロール群の平均腫瘍容積×１００。
【０５１２】
２０．２．２．２  Ｄｏｘｉｌ（登録商標）併用の効力
Ｄｏｘｉｌ（登録商標）単独を用いた処置によって、研究の２１日目に３７％のＴ／Ｃ容積を有する有意な効力（研究の２１日目、ｐ＜０．００１）がもたらされる（図６９、表７０）。１×１０１２ｖｐ／ｋｇのみを用いたベクターでの処置によっても、ＨＢＳＳコントロールに比べて、有意な腫瘍阻害がもたらされる（図２５、研究の２１日目、ｐ＜０．００５）。ベクター単独では、研究の２１日目にＴ／Ｃ＝６５％であって、本研究では、効力が乏しかった（図６７、表６５）。開始時点の平均腫瘍容積は、大きく（２５０±１３ｍｍ３）、これはベクター処置単独後の、より穏やかな効果の原因であり得る。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）との併用における効力は、いずれか単独の処置に比べて有意に改善された（研究２１日目のｔ検定によってｐ＜０．０１）。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）と併用した低用量のベクター（６×１０１１ｖｐ／ｋｇ）は、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）と併用した高用量１×１０１２ｖｐ／ｋｇと同様の効力を生じ、これらの研究２１日目のＴ／Ｃ値は、それぞれ１７％、および１８％であった（表６５）。高用量ベクターに追加して、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）併用処置した群では、１０匹のマウスのうち５匹が、研究の２８日目までに腫瘍の完全消失（退縮）を有した。低用量に追加してＤｏｘｉｌ（登録商標）を併用した群では、１０匹のマウスのうち３匹が、研究の２８日目までに腫瘍の完全消失（退縮）を有した。本研究では、他の処置群にもコントロール群にも腫瘍の完全消失（退縮）はなかった。
【０５１３】
表６５．Ｄｏｘｉｌ（登録商標）併用研究のＴ／Ｃ値（％）
【０５１４】
【表５７】
2004529627.tif 000063
【０５１５】
Ｔ／Ｃ（％）＝処置群の平均腫瘍容積／ＨＢＳＳコントロール群の平均腫瘍容積×１００。
【０５１６】
２０．２．２．３  体重
毎週の体重測定によって、ドキソルビシン併用処置の耐容性をモニターした（表６６）。ベクター処置単独は、体重の減少を生じなかった。ドキソルビシン処置は、研究の２７日目に４．８％の最大体重損失をもたらし、そして併用処置群は、研究の１３日目に８．４％の最大体重損失をもたらした。ドキソルビシン併用処置群においては２７日目に１例の死亡が認められた。第二の研究において、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）処置単独では、研究の７日目に７．５％の最大体重損失がもたらされた。高用量（１×１０１２ｖｐ／ｋｇ）のベクター処置単独では、研究の７日目に体重の４．２％の減少が生じた。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）と高用量ベクターとの併用処置では、研究の７日目に６．３％の体重損失が生じ、低用量ベクターの併用は、体重の６．４％の減少を生じた（表６７）。
【０５１７】
表６６．平均体重変化（％）に対するドキソルビシン併用の効果
【０５１８】
【表５８】
2004529627.tif 000064
【０５１９】
処置後の体重変化の平均（％）の分析。示した研究日の各々のマウスの体重を、研究の１日目のその体重（１００％とした）と比較した。体重は、週に１回測定した。データは、ＳＤ１に対する体重の平均パーセント±ＳＥＭとして表す。ｎｄは、秤量前にマウスが死亡したせいで決定されなかった平均体重を意味する。
【０５２０】
表６７．平均体重変化（％）に対するドキソルビシン併用の効果
【０５２１】
【表５９】
2004529627.tif 000065
【０５２２】
処置後の体重変化の平均（％）の分析。示した研究日の各々のマウスの体重を、研究の０日目のその体重（１００％とした）と比較した。体重は、週に１回測定した。データは、ＳＤ１に対する体重の平均パーセント±ＳＥＭとして表す。ｎｄは、測定なしを意味する。
【０５２３】
２０．２．２．４．インビボ併用効果
本発明者らのインビトロ研究は、前立腺癌細胞株ＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６、および肝細胞癌株Ｈｅｐ３Ｂに対する、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｅｘと、パクリタキセル、エポシロンＢ、およびドキソルビシンとの間の強力な相乗作用的関係を測定した。このインビトロ方法は、相乗作用の程度を定量するためのイソボログラフィック分析を用いる。インビボの相乗作用効果の定量は、さらに問題があるが、１つの方法は、この併用において期待されたＴ／Ｃ値と観察されたＴ／Ｃ値とを比較することである。この期待されたＴ／Ｃ値は、各々の処置単独について観察されたＴ／Ｃ値をかけることによって決定される。期待されたＴ／Ｃ値を観察されたＴ／Ｃ値で割った比は、その値が１より大きい場合は、相乗作用を、そして１未満であれば拮抗作用を示す。このタイプの分析に基づいて、表６８に示すように、ドキソルビシンとＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｅｘとの併用の抗腫瘍効果は、わずかに相乗作用的である。２日目に、相乗作用の証拠は、より強力になり、期待値／観察値の比は、研究２１日目に１．３４である（表７４）。低用量のベクターは、本実験では試験しなかったため、この分析は、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）と、高用量のベクターとの併用について行われた。それにもかかわらず、低用量のベクター（６×１０１１ｖｐ／ｋｇ）とＤｏｘｉｌ（登録商標）との併用の効果は、高用量のベクター（１×１０１２ｖｐ／ｋｇ）との併用とちょうど同程度有効であった。本発明者らは単に、低ベクター用量について算出した相乗作用的効果がさらに大きいことを推測し得る。
【０５２４】
表６８．ドキソルビシン併用処置についての期待されるＴ／Ｃ値、および観察されるＴ／Ｃ値
【０５２５】
【表６０】
2004529627.tif 000066
【０５２６】
Ｔ／Ｃは、ＨＢＳＳコントロール群の平均腫瘍サイズで割った処置群の平均腫瘍サイズである。ａＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの平均Ｔ／Ｃと、ドキソルビシンの平均Ｔ／Ｃをかけることによって得た期待されるＴ／Ｃ。ｂ期待されるＴ／Ｃを、観察されたＴ／Ｃで割って決定した比。＞１の比は、相加(additive)作用的効果  を示す；＜１の比は、拮抗作用の効果を示す；＝１の比は、相乗的(synergistic)効果を示す。
【０５２７】
表６９．ドキソルビシン（登録商標）併用処置についての期待されるＴ／Ｃ値、および観察されるＴ／Ｃ値
【０５２８】
【表６１】
2004529627.tif 000067
【０５２９】
Ｔ／Ｃは、ＨＢＳＳコントロール群の平均腫瘍サイズで割った処置群の平均腫瘍サイズである。ａＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（１×１０１２ｖｐ／ｋｇ）の平均Ｔ／Ｃと、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の平均Ｔ／Ｃをかけることによって得た期待されるＴ／Ｃ。ｂ期待されるＴ／Ｃを、観察されたＴ／Ｃで割って決定した比。＞１の比は、相乗作用的効果を示す；＜１の比は、拮抗作用の効果を示す；＝１の比は、相加的効果を示す。分析した併用群は、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（１×１０１２ｖｐ／ｋｇ）とＤｏｘｉｌ（登録商標）（９ｍｇ／ｋｇ）とである。
【実施例２１】
【０５３０】
実施例２１：初代ヒト肝細胞を用いるＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのインビトロ毒性評価
本研究は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）系の腫瘍崩壊性ベクターＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（Ｅ１ａ転写のＥ２Ｆ−１プロモーター制御、およびＥ４転写のｈＴｅｒｔプロモーター制御）のインビトロ細胞毒性を決定することであった。このベクターによる細胞毒性の減少を、単一のプロモーター制御ベクターＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦ（Ｅ１ａ転写のＥ２Ｆ−１プロモーター制御）由来の細胞毒性に対して比較することによって評価した。本発明者らの結果によって、ＰＨＨの形質導入後５日では、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦから明白な細胞毒性が検出されなかったことが示された。しかし、形質導入後７日では、Ａｒ１３ｐＡＥ２ｆＦは、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘベクターおよびＡｄｄ／３１２ベクターの細胞毒性の２倍の細胞毒性を有した。これらの結果によって、Ｅ１ａ遺伝子のＥ２Ｆ−１単一プロモーター制御が、細胞毒性を効率的に低下したこと、およびＥ１ａおよびＥ４遺伝子のＥ２Ｆ−１／ｈＴＥＲＴ二重プロモーター制御が、この細胞毒性をさらに低下したことが示唆される。
【０５３１】
２１．１  方法
２１．１．１  初代ヒト肝細胞培養物
初代ヒト肝細胞を、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から購入した。増殖培地は、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ（ＨＣＭＴＭ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であった。汚染を防止するために、アンホテリシンＢ（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンを、それぞれ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１０単位／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌの最終濃度でＨＣＭに添加した。細胞の到着の際、培地をウェルから吸引して、新鮮なＨＣＭと置換した。５％ＣＯ２を用いて、加湿されたインキュベーター中で３７℃において細胞を維持した。そして培地を２日毎に置換した。
【０５３２】
２１．１．２  細胞感染およびＬＤＨ分析
１２ウェルのコラーゲンコーティングプレート中に、約１．５〜１．８×１０５細胞／ウェルの濃度で含まれる初代ヒト肝細胞を、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ、Ａｒ１３ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｄ５、またはＡｄｄ／３１２のアデノウイルスベクターで感染させた。２００μｌの感染培地（２％ＦＢＳ含有ＨＣＭ）中に含有する０．１、１．０、１０、および５０ｐｐｃのアデノウイルス用量を用いて細胞を処置した。感染のために、培養プレートを３７℃で１時間ロッキングした。次いで、２ｍｌの増殖培地を各々のウェルに添加して、その細胞を、加湿されたインキュベーター中で、５％ＣＯ２を用いて、３７℃においてインキュベートさせた。感染後５日および７日目に、増殖培地を収集して、上清中のＬＤＨを測定して、細胞から放出されたＬＤＨの量を決定した。最大の細胞ＬＤＨの決定のための細胞溶解物を、３サイクルの凍結融解によって同時に収集した。
【０５３３】
細胞によって放出されたＬＤＨの定量のために、ＣｙｔｏＴｏｘ（登録商標）９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ１７８０）を用いた。細胞毒性を、この細胞から放出されたＬＤＨのレベルによって規定して、以下の式によって算出した：
【０５３４】
【数３】
2004529627.tif 000068
【０５３５】
各々の用量および時点での細胞毒性を、示したウェル以外では、三連のウェルで決定した。ｔ検定を用いて統計学的分析を実施した。
【０５３６】
２１．２  結果および考察
示したベクターの１、１０、および５０ｐｐｃを用いてＰＨＨを形質導入して、ＬＤＨ放出アッセイによって感染後５日および７日で細胞毒性を測定した（図７０）。１ｐｐｃおよび１０ｐｐｃの用量では、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘまたはＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦの形質導入に関連した細胞毒性のレベルは、低いままであって、Ａｄｄ／３１２で形質導入したＰＨＨにおけるレベルに匹敵した。対照的に、５０ｐｐｃの用量では、単一のプロモーター制御のベクターであるＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦは、１４％の細胞毒性を惹起した。この細胞毒性は、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘで形質導入した細胞中で測定した８％の細胞毒性よりも有意に高かった。
【０５３７】
単一プロモーター制御腫瘍崩壊性ベクターと二重プロモーター制御の腫瘍崩壊性ベクターとの間のベクター媒介性細胞毒性における差異は、感染の７日後にさらに顕著であった。低いレベルでは、単一プロモーター制御ベクターであるＡｒ１３ｐＡＥ２ｆＦを用いた細胞毒性のレベルは、１６〜２５％に増大した。感染後５日目に対するこの７日目の、より大きい程度のこの細胞毒性は、ベクター複製の結果であり得る。対照的に、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いた細胞毒性（８〜１１％）は、感染後５日でみられるレベルのまま残っており、これは、Ａｄｄ／３１２で形質導入したＰＨＨにおけるレベルに匹敵した。興味深いことに、５０ｐｐｃという高用量では、Ａｄｄ／３１２に関連する細胞毒性は、３０％であって、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘに関連する細胞毒性は１６％であった。Ａｄｄ／３１２のようなＥ１ａ欠失ベクターはＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘよりも細胞毒性が低くあり得ることは、他のウイルス遺伝子（例えば、Ｅ４）が、インビトロにおいてこの系における細胞毒性に寄与し得るということを示す。Ｅ１ａ遺伝子およびＥ４遺伝子の両方の制御発現によって、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの場合と同様に、インビトロの細胞毒性は、有意に低下され得る。
【実施例２２】
【０５３８】
実施例２２：Ａｄ３５腫瘍崩壊性ベクター、Ａｒ３５ＯｓｃＥ１ＡおよびＡｒ３５Ｅ２ＦＥ１Ａの構築および生成
標準的な方法によって、Ａｄ３５ウイルス（ＡＴＣＣ：カタログ番号ＶＲ−７１８，指定：Ｈｏｌｄｅｎ，Ｓｔａｌｄｅｒ  Ｈ．ら、１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２５７〜２６５）からＡｄ５ゲノムＤＮＡを単離した。Ａｄ３５ゲノムＤＮＡのＰｓｔＩ消化によって生成した左側の末端制限酵素フラグメント（ｎｔ  １〜９８５）、および右側の末端制限酵素フラグメント（ｎｔ  ２９３８７〜３４７９４）を、改変ｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に最初にクローニングして、それぞれ、ｐＧＥＭ３Ｓ−Ａｄ３５Ｌ、およびｐＧＥＭ３Ｓ−Ａｄ３５ＲＴＦを生成した。ＳｍａＩ制限部位とＫｐｎＩ制限部位との間のＩ−ＳｃｅＩのために制限酵素認識部位の挿入によって、改変したｐＧＥＭ−３ＺをｐＧＥＭ−３Ｚから生成した。次に、クローニングされた左側末端フラグメントおよび右側末端フラグメントを、単一のプラスミドであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に合わせて、ｐＢＳＭＡｄ３５Ｌ＆ＲＴＦを生成した。末端フラグメントを合わせて、それによって、左側ＩＴＲおよび右側ＩＴＲをプラスミド配列によってお互いから分離させた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３  ｒｅｃＢＣ  ｓｂｃＢＣ中へのＰｓｔＩ−直線化ｐＢＳＭＡｄ３５Ｌ＆ＲＴＦおよびＡｄ３５ゲノムＤＮＡの同時形質導入によって、総Ａｄ３５ゲノムを含有するプラスミドｐＦＬＡｄ３５を得た。ｐＦＬＡｄ３５において、左ＩＴＲのすぐ上流かつ右ＩＴＲの下流の２つの特有のＩ−ＳｃｅＩ部位が存在する。Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位は、Ａｄ３５ゲノムＤＮＡに存在しないので、Ｉ−ＳｃｅＩ消化によって、ｐＦＬＡｄ３５から全長Ａｄ３５ゲノムの遊離が可能になった。ｐＦＬＡｄ３５由来のＡｄ３５ゲノムの感染性は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）トランスフェクションによって実証された。得られた回収されたウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞上で増幅して、制限酵素分析によってゲノムＤＮＡを分析した。制限酵素分析によっては、ｐＦＬＡｄ３５由来Ａｄ３５は、野生型Ａｄ３５から識別できなかった。
【０５３９】
ＳｐｈＩ消化によって生成された左側の末端制限酵素フラグメント（ｎｔ  １〜３０９８）、および右側の末端制限酵素フラグメント（ｎｔ  ３２６８３〜３４７９４）を、ｐＦＬＡｄ３５からサブクローニングして、プラスミドｐＡｄ３５Ｌ＆ＲＳｐｈを生成した。ｎｔｓ３３９とｎｔｓ５４２との間のＥ１Ａプロモーター領域を、ＰＣＲアプローチを用いて欠失させて、ｐＡｄ３５Ｌ＆ＲＳｐｈでｌＥ１Ｐ（Ｌ）を作製するために、この領域内に特有のＰｍｅＩ部位を操作した。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルおよびマウスオステオカルシンプロモーター（ｐＤＬ６ｐＡＯｓｃから得た）を含有する８７２ｂｐのフラグメントを、ｐＡｄ３５Ｌ＆ＲｓｐｈｄｅｌＥ１Ｐ（Ｌ）のＰｍｅＩ部位に挿入して、ｐＡｄ３５ＯＳＯＣＰ（Ｌ）を生成した。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを、オステオカルシンプロモーターの上流に挿入して、左ＩＴＲに存在するプロモーター様エレメントおよびパッケージングシグナルから読み取った潜在的な転写を防止し、これによって特定の組織中のオステオカルシンプロモーター活性の厳密な調節を可能にした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３へのＳｐｈＩ直線化ｐＡｄ３５ＯＳＯＣＰ（Ｌ）およびＡｄ３５ゲノムＤＮＡの同時形質導入によって、プラスミドｐＦＬＡｄ３５ＯｓｔｐＥ１Ａ（Ｌ）が得られた。
【０５４０】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞への、Ｉ−ＳｃｅＩ消化したｐＦＬＡＤ３５ＯｓｔｐＥ１Ａ（Ｌ）のトランスフェクション後、所望のＡｄ３５組み換えウイルスであるＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａを生成した。回収した子孫のウイルスを増幅して、ウイルスＤＮＡの左末端の制限酵素消化および配列決定によってウイルスＤＮＡを分析した。
【０５４１】
Ａｒ３５ＯｓｃＥ１Ａの様式と同様の様式で、Ａｄ３５腫瘍崩壊性ベクターであるＡｄ３５Ｅ２ＦＥ１Ａを生成した。ただし、オステオカルシンプロモーターを、Ｅ２Ｆプロモーターで置換した。Ａｒ３５ＯｓｃＥ１ａのウイルスＤＮＡを制限消化によって分析したが、その消化パターンは予想どおりであった。Ａｄ３５ＯｓｃＥ１ＡおよびＡｄ３５Ｅ２ＦＥ１Ａの概略図を図６９に提示する。
【実施例２３】
【０５４２】
実施例２３：ヌードマウスにおけるＰＣ３異種移植片腫瘍モデルのＡｒ２５ＯｓｃＥ１ａの腫瘍崩壊能の評価
本研究の目的は、ＰＣ３異種移植片モデルにおいて、Ａｄ５ベースのベクターであるＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆと比べて、Ａｒ３５ＯｓｃＥ１Ａの腫瘍崩壊活性を評価することであった。各々動物１０匹の群を、ビヒクル（ＨＢＳＳ）、Ａｄ３５０．５（Ｅ１ａ欠損Ａｄ３５ベースのベクター）、Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆ（Ｅ１ａの発現を駆動するオステオカルシンプロモーターを含むＡｄ５−ベースの腫瘍崩壊性ベクター）、Ａｄ３５（ｗｔウイルス）、およびＡｒ３５ＯｓｃＥ１ａ（Ｅ１ａの発現を駆動するオステオカルシンプロモーターを含むＡｄ３５ベースの腫瘍崩壊性ベクター）で処置した。２×１０１１粒子／マウス（１×１０１３粒子／ｋｇ）の単回用量を用いて、全てのベクターを腫瘍内に（ＩＴ）送達した。
【０５４３】
研究０日目に１００〜２００ｍｍ３のサイズにおよぶ腫瘍を有する動物を、示したベクター、またはＨＢＳＳのＩＴ送達によって処置した。ベクター送達後、５６日目まで週に２回腫瘍サイズをモニターし、５６日目に研究を終了した。腫瘍測定を２次元で行い、腫瘍容積は、Ｗ×（Ｌ）２π／６として算出した。２０００ｍｍ３より大きい腫瘍を有する動物、および瀕死の動物を、研究の終了前に屠殺した。
【０５４４】
各々の群についての平均腫瘍サイズを図７０に示す。これらのデータによって、Ａｄ３５ＯｓｃＥ１Ａベクター、およびＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆベクターが、１０日目〜３８日目の間の時点で、ＨＢＳＳで処置したコホートに比べて、腫瘍増殖の有意な阻害を示したことが実証される。しかし、Ａｒ３５ＯｓｃＥ１Ａの効果は、１０〜３８日目には明白であったが、Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆの効果は、１７〜３１日目に明白であった。これらのデータによって、Ａｄ３５ベースのベクター系の腫瘍崩壊性能が実証される。
【０５４５】
統計学的分析（ＡＮＯＶＡ、およびＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｅｓｔ（ニューマン−クールズ多重比較試験））によって、以下のコホートの間の差異が明らかになった：１０日目の、ＨＢＳＳとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（ｐ＜０．００１）、およびＡｒ３５ＯｓｃＥ１ＡとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．００１）、およびＡｄ３５  ｗｔとＨＢＳＳとの間の差異（Ｐ＜０．０５）、およびＡｄ３５  ｗｔとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．０５）。１４日目に以下のコホートの間の差異が検出された：ＨＢＳＳとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（ｐ＜０．０１）、およびＡｒ３５ＯｓｃＥ１ＡとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．０５）、およびＡｄ３５  ｗｔとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（Ｐ＜０．０５）。１７日目には、以下のコホートの間の差異が検出された：ＨＢＳＳとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（ｐ＜０．００１）、およびＡｒ３５ＯｓｃＥ１ＡとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．０１）、およびＨＢＳＳとＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆとの間の差異（Ｐ＜０．０１）、およびＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３ＦとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．０５）、およびＨＢＳＳとＡｄ３５  ｗｔとの間の差異（Ｐ＜０．０１）。２４日目には、以下のコホートの間の差異が検出された：ＨＢＳＳとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（ｐ＜０．０００１）、およびＨＢＳＳとＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆとの間の差異（Ｐ＜０．０１）、およびＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３ＦとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．０５）、およびＨＢＳＳとＡｄ３５  ｗｔとの間の差異（Ｐ＜０．０５）。２８日目には、以下のコホートの間の差異が検出された：ＨＢＳＳとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（ｐ＜０．００１）、およびＡｒ３５ＯｓｃＥ１ＡとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．０１）、およびＨＢＳＳとＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆとの間の差異（Ｐ＜０．０５）、およびＨＢＳＳとＡｄ３５  ｗｔとの間の差異（Ｐ＜０．０１）。３１日目には、以下のコホートの間の差異が検出された：ＨＢＳＳとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（ｐ＜０．０１）、およびＡｒ３５ＯｓｃＥ１ＡとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．０１）、およびＨＢＳＳとＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆとの間の差異（Ｐ＜０．０５）。３５日目には、以下のコホートの間の差異が検出された：ＨＢＳＳとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（ｐ＜０．０１）、およびＡｒ３４ＯｓｃＥ１ＡとＡｄ３５０．５との間の差異（Ｐ＜０．０１）。３８日目には、以下のコホートの間の差異が検出された：ＨＢＳＳとＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａとの間の差異（ｐ＜０．０１）、およびＨＢＳＳとＡｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆとの間の差異（Ｐ＜０．０５）、およびＨＢＳＳとＡｄ３５  ｗｔとの間の差異（Ｐ＜０．０５）。
【０５４６】
本明細書に言及された全ての特許、特許出願、公開（公開特許出願を含む）、およびデータベース登録番号の開示は、各々のこのような個々の特許、特許出願、公開、およびデータベース番号が、その全体が参考として援用されることが詳細かつ個々に示されたのと同じ程度まで、その全体が参考として本明細書において詳細に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０５４７】
【図１】ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）部位（配列番号１）についての切断およびポリアデニル化プロセス。
【図２】Ｅ１Ａ転写制御領域（配列番号２）。
【図３−１】ウイルスＤＮＡの左末端および右末端からのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの配列。ＤＮＡ配列決定によって確認したＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの領域。パネルＡ．最初の１８０２ヌクレオチドにおける領域は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）（ヌクレオチド１〜１０３）、ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１１６〜２６１）、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーター（ヌクレオチド２８３〜５５５）、Ｅ１Ａ遺伝子（ヌクレオチド５７４〜１６４７）、およびＥ１ｂ遺伝子の一部分（ヌクレオチド１６４８〜１８０２）であり、そしてこれが、示されている（配列番号３）。パネルＢ。最後の５３１ヌクレオチドの領域は、ＰａｃＩ制限部位（ヌクレオチド３３９６７〜３３９７４）（下線を付した）、パッケージングシグナル（ヌクレオチド３４０２０〜３４２１７）、およびＩＴＲ（３４３１０〜３４４１２）である。
【図３−２】ウイルスＤＮＡの左末端および右末端からのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの配列。ＤＮＡ配列決定によって確認したＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの領域。パネルＡ．最初の１８０２ヌクレオチドにおける領域は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）（ヌクレオチド１〜１０３）、ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１１６〜２６１）、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーター（ヌクレオチド２８３〜５５５）、Ｅ１Ａ遺伝子（ヌクレオチド５７４〜１６４７）、およびＥ１ｂ遺伝子の一部分（ヌクレオチド１６４８〜１８０２）であり、そしてこれが、示されている（配列番号３）。パネルＢ。最後の５３１ヌクレオチドの領域は、ＰａｃＩ制限部位（ヌクレオチド３３９６７〜３３９７４）（下線を付した）、パッケージングシグナル（ヌクレオチド３４０２０〜３４２１７）、およびＩＴＲ（３４３１０〜３４４１２）である。
【図３−３】ウイルスＤＮＡの左末端および右末端からのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの配列。ＤＮＡ配列決定によって確認したＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの領域。パネルＡ．最初の１８０２ヌクレオチドにおける領域は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）（ヌクレオチド１〜１０３）、ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１１６〜２６１）、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーター（ヌクレオチド２８３〜５５５）、Ｅ１Ａ遺伝子（ヌクレオチド５７４〜１６４７）、およびＥ１ｂ遺伝子の一部分（ヌクレオチド１６４８〜１８０２）であり、そしてこれが、示されている（配列番号３）。パネルＢ。最後の５３１ヌクレオチドの領域は、ＰａｃＩ制限部位（ヌクレオチド３３９６７〜３３９７４）（下線を付した）、パッケージングシグナル（ヌクレオチド３４０２０〜３４２１７）、およびＩＴＲ（３４３１０〜３４４１２）である。
【図４】ウイルスＤＮＡの左末端からのＡｒ６Ｆの配列（配列番号４）。Ａｒ６Ｆの左末端の最初の６６０ヌクレオチド。ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１０３）、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）（ヌクレオチド１０４〜１３４）、およびＥ１Ａ遺伝子の一部（ヌクレオチド１３５〜６６０）を示す。
【図５】ウイルスＤＮＡの左末端からのＡｒ６ｐＡＦの配列。Ａｒ６ＡＦの左末端の最初の６６０ヌクレオチド。ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１０３）、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル（ヌクレオチド１０４〜１３４）、およびＥ１Ａ遺伝子の一部（ヌクレオチド２９８〜６６０）を示す。
【図６】Ａｒ６ｐＡＦベクターおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの概略図。骨格のアデノウイルス配列は、Ａｒ６ｐＡＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの感染プラスミドに由来する。中間のベクター骨格のアデノウイルス配列は、Ｅ３欠失５型アデノウイルスであるＡｄｄ／３２７（ここでは、パッケージングシグナルは、右側のＩＴＲのすぐ上流に配置されている）に由来する。Ａｒ６ｐＡＦベクター骨格は、Ｅ１Ａプロモーターを欠いており、そしてＳＶ−４０ポリ（Ａ）シグナルは、左側ＩＴＲの後ろに挿入されている。このＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクター骨格は、ＳＶ−４０ポリ（Ａ）シグナル配列の後ろに、Ｅ２Ｆ−１プロモーター（ｂｐ−２１２〜＋５１）、４つのインタクトＥ２ＦのＤＮＡセグメント、１つのＮＦ−ｋＢ、および４つのＳｐ−１コンセンサス配列を含む。
【図７】ベクターＡｄｄ／３２７、ＡｖＰＡＥ１Ａ０９ｉ、Ａｒ６Ｆ、Ａｒ６ｐＡＦ、Ａｄｄ／３１２の投与後の体重変化の比較。
【図８】ベクターＡｄｄ／３２７、ＡｖＥ１Ａ０９ｉ、ＡｖＰＡＥ１Ａ０９ｉ、Ａｒ６Ｆ、Ａｒ６ｐＡＦ、Ａｄｄ／３１２の骨格。
【図９】Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内注射後の平均Ｈ４６０腫瘍容積。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの５×１０８（ｎ＝１３）、５×１０９（ｎ＝１３）、または５×１０１０（ｎ＝１２）粒子／用量／日の５日連続（研究日１〜５日目）の毎日の腫瘍内注射後のＨ４６０腫瘍のインビボ増殖の比較。ＨＢＳＳ（ｎ＝１３）、またはＡｄｄ／３２７（ｎ＝１２、５×１０１０粒子／用量／日）を用いて、これも５日連続で、コントロール動物を、ＩＴ処置した。データは、平均腫瘍容積＋ＳＥで表す。＊ｐ＜０．０５は、多重比較のためのテューキー検定を用いた一元ＲＭ  ＡＮＯＶＡを用いて、ＨＢＳＳで処理したコントロールと比較した。
【図１０】Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内注射後の、腫瘍を保有する動物の生存。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを用いた処置後の、腫瘍保有動物の生存。研究の３２日目まで動物を観察した。各々の処置群における動物の数は、以下のとおりであった：ＨＢＳＳ、ｎ＝１３；Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（５×１０８粒子／用量／日）、ｎ＝１３；（５×１０９粒子／用量／日）、ｎ＝１３；そして（５×１０１０粒子／用量／日）、ｎ＝１２；そしてＡｄｄ／３２７（５×１０１０粒子／用量／日）、ｎ＝１２。マンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）ログランク検定によって、動物の生存を分析した。
【図１１】Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内注射後の平均Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍容積。５日連続毎日の（研究１〜５日目）の、５×１０８（ｎ＝１１）、５×１０９（ｎ＝１１）、５×１０１０（ｎ＝１０）粒子／用量／日数でのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内注射後のＨｅｐ３Ｂ腫瘍のインビボ増殖の比較。ＨＢＳＳ（ｎ＝１０）、またはＡｄｄ／３２７（ｎ＝１１、５×１０１０粒子／用量／日）を用いて、これも５日連続で、コントロール動物を、ＩＴ処置した。データは、平均腫瘍容積＋ＳＥで表す。＊ｐ＜０．０５は、多重比較のためのテューキー検定を用いた一元ＲＭ  ＡＮＯＶＡを用いて、ＨＢＳＳで処理したコントロールと比較した。
【図１２】Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦの腫瘍内注射後の、腫瘍を保有する動物の生存。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを用いた処置後の、腫瘍保有動物の生存。研究の３２日目まで動物を観察した。各々の処置群における動物の数は、以下のとおりであった：ＨＢＳＳ、ｎ＝１１；Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ（５×１０８粒子／用量／日）、ｎ＝１１；（５×１０９粒子／用量／日）、ｎ＝１１；そして（５×１０１０粒子／用量／日）、ｎ＝１０；そしてＡｄｄ／３２７（５×１０１０粒子／用量／日）、ｎ＝１１。マンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）ログランク検定によって、動物の生存を分析した。
【図１３】アデノウイルス右ドナープラスミドであるｐＤＲ２Ｆの概略図。
【図１４】アデノウイルス右ドナープラスミドであるｐＤＲ２ｍＧｍＦの概略図。アデノウイルス右ドナープラスミドであるｐＤＲ２ｍＧｍＦは、１１５２ｂｐの環状分子である。ｍＧｍ−ｃＤＮＡは、８０５９〜８５２０の位置である。
【図１５】プラスミドｐＧ１ｍＧｍＳｖＮａの概略図。
【図１６】プラスミドｐＧ１ＮａＳｖＢｇの概略図。
【図１７】マウスＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ（配列番号７）およびタンパク質（配列番号８）の配列。ｐＤＲ２ｍＧｍＦプラスミドの７８７８〜８８２６領域の配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認された。この領域は、マウスＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡインサートを含む。
【図１８】ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦプラスミドを生成するために用いた経路。３７７６３ｂｐのＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦという大型プラスミドを、Ｅ  ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３細胞におけるｐＤＲ２ｍＧｍＦ／ＦｓｐＩ＋ＳｐｅＩフラグメント（９２８４塩基対）、およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ／ＰａｃＩ＋ＳｒｆＩフラグメント（３０６９５塩基対）の相同組み換えを通じて生成した。このプラスミドにおいては、ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、アデノウイルスＥ３領域のＸｂａＩ部位にクローニングした。
【図１９】異なる腫瘍細胞株に対する腫瘍崩壊性ベクターのＭＴＳアッセイ。
【図２０】ウイルスゲノムの２８５３６〜２９２７３のＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ領域の配列。これには、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡインサート（配列番号１９）、およびヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質配列（配列番号２０）を含む。
【図２１】ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦを生成するために用いた経路。３７５８７ｂｐのｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦという大型プラスミドを、Ｅ  ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３細胞におけるｐＤＲ２ｍＧｍＦ／（ＦｓｐＩ＋ＳｐｅＩ）フラグメント（９２８４塩基対）、およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ／（ＰａｃＩ＋ＳｒｆＩ）フラグメント（３０６９５塩基対）の相同組み換えを通じて生成した。このプラスミドにおいては、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、アデノウイルスＥ３領域のＸｂａＩ部位にクローニングした。
【図２２】異なる腫瘍細胞株に対する腫瘍崩壊性ベクターのＭＴＳアッセイ。
【図２３】Ｈ４６０非小細胞肺癌腫瘍モデルにおける、ＧＭ−ＣＳＦを装備した腫瘍崩壊性ベクターの効力。予め樹立した腫瘍を腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを用いて処置した後に、Ｈ４６０ヒト異種移植片腫瘍の容積を定期的に測定した。ＰＢＳ、またはＡｄｄ／３１２、Ａｄｄ／３２７、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、またはＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦの２×１０１０粒子／注射（パネルＡ）もしくは１×１０１１粒子／注射（パネルＢ）の５回の腫瘍内注射後のＨ４６０腫瘍のインビボ増殖の比較。各々の処置群は、グラフの凡例に挙げた記号によって特定される。Ｘ軸にそって矢印で示したとおり、研究日の１０、１２、１４、１７、および１９日目にベクターを注射した。データは、平均腫瘍容積＋ＳＥＭで表す。アスタリスクは、Ａｄｄ／３１２陰性コントロールベクターで処理した腫瘍と比べた有意な差異を示す（ｐ＜０．０５，テューキー検定を用いる、ＲＭ−ＯＷ−ＡＮＯＶＡ）。低用量（パネルＡ）では、Ａｄｄ／３１２に比べて、Ａｄｄ／３２７、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、およびＡｒ６ｐＡ２ｆｍＧｍＦでは差異が有意であった。高用量（パネルＢ）では、Ａｄｄ／３１２に比べた差異は、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターを含有するマウスＧＭ−ＣＳＦについてのみ有意であった。
【図２４】Ｈｅｐ３Ｂ肝細胞癌腫瘍モデルにおける、ＧＭ−ＣＳＦを装備した腫瘍崩壊性ベクターの有効性。Ａｄｄ／３１２、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍｆ、またはＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦの２×１０７粒子／注射（パネルＡ）、２×１０８粒子／注射（パネルＢ）、または２×１０９粒子／注射（パネルＣ）（ｎ＝１０／群）の腫瘍内注射後のＨｅｐ３Ｂ腫瘍のインビボ増殖を分析した。Ｘ軸にそって矢印で示したとおり、研究日の１５、１８、２０、２２、および２５日目にベクターを注射した。コントロール動物は、ＰＢＳで処置した（ｎ＝１０）。データは、群平均＋ＳＥＭで表す。アスタリスクは、用量の合致したＡｄｄ／３１２で処置した腫瘍と比べたｐ＜０．０５を示す。十字の印は、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターに比べたｐ＜０．０５を示し、そしてポンド記号は、ＰＢＳ処置した腫瘍に比べた、Ａｄｄ／３１２処理腫瘍のｐ＜０．０５を示す。Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞の接種後４７日間、腫瘍を測定した。
【図２５】Δｇｐ１９ドナープラスミドについてのＰＣＲおよび重複ＰＣＲの概略図。ＰＣＲ増幅の２つの工程を用いて、Ｅ３−ｇｐ１９のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の代わりにＥ３領域中に、ｍＧＭ−ＣＳＦまたはｈＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを挿入した。第一の工程において、３対のプライマーおよび対応するＤＮＡテンプレートを用いて、３つの個々のＰＣＲ増幅を実行した。第二の工程においては、プライマーとしてプライマー１およびプライマー６を用いる重複ＰＣＲ増幅のためのテンプレートＤＮＡとして、第一の工程で生成した３つのＤＮＡフラグメントを混合した。次いで、重複ＰＣＲ産物をＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩで消化して、Ｅ３−ｇｐ１９オープンリーディングフレームを含有するアデノウイルスＥ３のＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩ領域を置き換えた。
【図２６】Δｇｐ１９ベクターの概略図。
【図２７ａ】ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆという大型プラスミドを生成するために用いた経路。Ｅ  ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３細胞における、ｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ／（ＦｓｐＩ＋ＳｐｅＩ）フラグメント（９２８４塩基対）およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ／（ＰａｃＩ＋ＳｒｆＩ）フラグメント（３０６９５塩基対）の相同組み換えを通じて、３８９７７ｂｐ  ｐＡｒ６ｐＡＥ２（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ大型プラスミドを生成した。このプラスミドにおいて、アデノウイルスＥ３領域のＥ３  ｇｐ１９ｋＤ  ＯＲＦ中に、ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを入れ替えた。
【図２７ｂ】ｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆという大型プラスミドを生成するために用いた経路。Ｅ  ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３細胞における、ｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ／（ＦｓｐＩ＋ＳｐｅＩ）フラグメント（９２８４塩基対）およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ／（ＰａｃＩ＋ＳｒｆＩ）フラグメント（３０６９５塩基対）の相同組み換えを通じて、３８９５０ｂｐのｐＡｒ６ｐＡＥ２（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ大型プラスミドを生成した。このプラスミドにおいて、アデノウイルスＥ３領域のＥ３  ｇｐ１９ｋＤ  ＯＲＦ中に、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを入れ替えた。
【図２８】Ｈ４６０およびＨｅｐ３Ｂ腫瘍細胞株に対するΔｇｐ１９  ｍＧＭ−ＣＳＦベクターのＭＴＳアッセイ。２つのヒト腫瘍細胞株であるＨ４６０（非小細胞肺癌）およびＨｅｐ３Ｂ（肝細胞癌）を用いた。各々の細胞株について、全てのベクターに関して、２つのＭＴＳアッセイを実施した。各々の細胞株からの１つの代表的なＭＴＳアッセイを示している。
【図２９】感染したＨ４６０細胞においてΔｇｐ１９  ＧＭ−ＣＳＦベクターによって媒介されたＧＭ−ＣＳＦ発現（ＥＬＩＳＡによって検出）。このΔｇｐ１９ｋＤベクターを、ウイルスベクターに感染したＨ４６０細胞の培養培地において、それらのベクターが、ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子発現を媒介する能力についてアッセイした。
【図３０】Ｈｅｐ３Ｂ異種移植片皮下腫瘍モデルにおける腫瘍崩壊性アデノウイルスの抗腫瘍活性。ＰＢＳ、または２×１０９粒子／注射のＡｄｄ／３１２、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ、もしくはＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ（１群あたりｎ＝１０）の５回の腫瘍内注射後のＨｅｐ３Ｂ腫瘍のインビボ増殖の比較。異なる処置群を示す記号を、グラフの凡例に示す。Ｘ軸に沿った矢印によって示すとおり、１１、１３、１５、１７、および１９日目にベクター注射を行った。腫瘍の容積は、ベクター注射を開始したとき、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆベクターで処置した腫瘍（ここでは開始腫瘍容積が２９０ｍｍ３であった）以外は、全ての群について１７５ｍｍ３であった。アスタリスクは、Ａｄｄ／３１２ベクターで処置した腫瘍に比べて、ｐ値＜０．０５であることを示す（反復測定、一元ＡＮＯＶＡによる）。
【図３１】Ｈ４６０異種移植片皮下腫瘍モデルにおける腫瘍崩壊性アデノウイルスの抗腫瘍活性。コントロールまたは腫瘍崩壊性ベクターの５回の腫瘍内注射後のＨ４６０腫瘍のインビボ増殖の比較。パネルＡは、２×１０１０粒子／注射のＡｄｄ／３１２、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、もしくはＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ、または１×１０１０粒子／注射のＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ（１群あたり、ｎ＝１０）を用いて注射したＨ４６０腫瘍。パネルＢは、１×１０１１粒子／注射のＡｄｄ／３１２、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、もしくはＡｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ、または５×１０１０粒子／注射のＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ（１群あたり、ｎ＝１０）を用いて注射したＨ４６０腫瘍。異なる処置群を示す記号を、グラフの凡例に示す。Ｘ軸に沿った矢印によって示すとおり、１２、１４、１６、１９、および２１日目にベクター注射を行った。腫瘍の容積は、ベクター注射を開始したとき、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆベクターで処置した腫瘍（ここでは開始腫瘍容積が１２０ｍｍ３であった）以外は、全ての群について１６０ｍｍ３であった。アスタリスクは、Ａｄｄ／３１２ベクターで処置した腫瘍に比べて、ｐ値＜０．０５であることを示す（反復測定、一元ＡＮＯＶＡによる）。
【図３２】アデノウイルスｐＤｒ５ｈＧｍＦおよびｐＤｒ５ｍＧｍＦの右ドナープラスミドの概略図。このアデノウイルスの右ドナープラスミドであるｐＤｒ５ｈＧｍＦおよびｐＤｒ５ｍＧｍＦは、それぞれ１２６７４ｂｐおよび１２７０１ｂｐの大きさの環状分子である。野生型Ａｄ５由来のＮｏｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントを用いて、ＮｏｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントを置換することによって、ｌｏｘＰ部位を、その親プラスミドであるｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆ、およびｐＤＲ２（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）Ｆから除いた。
【図３３】ｐＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦプラスミドを生成するために用いた経路。Ｅ  ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３細胞における、ｐＤｒ５ｈＧｍＦ／（ＦｓｐＩ＋ＳｐｅＩ）フラグメント（１０４３２塩基対）、およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ／（ＰａｃＩ＋ＳｒｆＩ）フラグメント（３０６９５塩基対）の相同組み換えを通じて、３８９１０ｂｐのｐＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ大型プラスミドを生成した。このプラスミドにおいて、アデノウイルスＥ３領域のＥ３  ｇｐ１９ｋＤ  ＯＲＦ中に、ｈＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを入れ替え、そしてｌｏｘｐ部位をＥ３領域から除いた。
【図３４】ｐＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦプラスミドを生成するために用いた経路。Ｅ  ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３細胞における、ｐＤｒ５ｈＧｍＦ／（ＦｓｐＩ＋ＳｐｅＩ）フラグメント（１０４５９塩基対）、およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ／（ＰａｃＩ＋ＳｒｆＩ）フラグメント（３０６９５塩基対）の相同組み換えを通じて、３８９３８ｂｐのｐＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ大型プラスミドを生成した。このプラスミドにおいて、アデノウイルスＥ３領域のＥ３  ｇｐ１９ｋＤ  ＯＲＦ中に、ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを入れ替え、そしてｌｏｘｐ部位をＥ３領域から除いた。
【図３５】Ｈ４６０およびＨｅｐ３Ｂ腫瘍細胞株に対するＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターのＭＴＳアッセイ。ＭＴＳアッセイは、Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターの腫瘍崩壊能を評価するために実施した。２つの腫瘍細胞株Ｈ４６０（非小細胞肺癌）、およびＨｅｐ３Ｂ（肝細胞癌）を用いた。各々の細胞株について、全ての示したベクターを用いて、２つのＭＴＳアッセイを実施し、そして各々の細胞株からの代表的なＭＴＳアッセイの１つを示す。「装備した（ａｒｍｅｄ）」ベクター対、「未装備（装備していない）（ｕｎａｒｍｅｄ）」ベクターのＬＤ５０の比較のために、Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆＦを用いた。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｍＧｍ、Ｄｇ１９ｂ）もまた含まれる。さらに、コントロール対、Ａｄｄ／３２７（複製コンピテントなＡｄ５陽性コントロールウイルス）、およびＡｄｄ／３１２（Ｅ１ａ欠損の陰性コントロール）をまた、ＭＴＳアッセイに含む。Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターは、試験した両方の細胞株においてＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの腫瘍崩壊能を保持した。
【図３６】感染したＨ４６０細胞において、Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターおよびＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｍＧｍＦベクターによって媒介されたＧＭ−ＣＳＦ発現（ＥＬＩＳＡによって検出）。このＡｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターを、ウイルスベクターに感染したＨ４６０細胞、およびＨｅｐ３Ｂ４６０細胞の培養培地において、それらのベクターが、ヒトまたはマウスのＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子発現を媒介する能力についてアッセイした。Ａｒ１５ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターは、Ｅｄ欠失したＡｒ６ｐＡＥ２ｆＧｍＦシリーズと同様のレベルでＧＭ−ＣＳＦのインビトロ生成を誘導する。
【図３７】ΔＥ３−１４．７プラスミドについてのＰＣＲおよび重複ＰＣＲの概略図。２工程のＰＣＲ増幅を用いて、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、Ｅ３領域に挿入して、Ｅ３−１４．７  ＯＲＦを置換した。第一の工程において、表２および３にまとめたように、３対のプライマーおよび対応するＤＮＡテンプレートを用いて、３つの個々のＰＣＲ増幅を実行した。第二の工程において、プライマー１および６を用いて、重複ＰＣＲ増幅のために、テンプレートＤＮＡとして、第一の工程で生成した３つのＤＮＡフラグメントを混合した。次いで、この重複ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩで消化して、これを用いて、Ｅ３−１４．７オープンリーディングフレームを含有するプラスミドｐＤＲ４ＦのＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ領域を置き換えた。
【図３８】ΔＥ３−１４．７ベクターの概略図。
【図３９】アデノウイルス右ドナープラスミドｐＤｒ６ｈＧｍＦの概略図。このアデノウイルス右ドナープラスミドｐＤ６ｈＧｍＦは、１２７７４ｂｐの環状分子である。ＰＣＲ増幅および重複ＰＣＲ増幅、その後の制限酵素消化（ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ）およびライゲーションを用いて、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｈＧｍ）ｃＤＮＡを、ｐＤＲ４Ｆプラスミド中のＥ３−１４．７ＯＦＲの位置に入れ替えた。
【図４０】ｐＡｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ大型プラスミドを生成するために用いた経路。Ｅ  ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３細胞における、ｐＤＲ６ｈＧｍＦ／（ＦｓｐＩ＋ＳｐｅＩ）フラグメント（１０５３２塩基対）、およびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ／（ＰａｃＩ＋ＳｒｆＩ）フラグメント（３０６９５塩基対）の相同組み換えを通じて、３９０１１ｂｐのｐＡｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ大型プラスミドを生成した。このプラスミドにおいて、アデノウイルスＥ３領域のＥ３−１４．７  ＯＲＦ中に、ｈＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを入れ替えた。
【図４１】Ｈ４６０腫瘍細胞に対するΔＥ３−１４．７ｈＧＭ−ＣＳＦベクターのＭＴＳアッセイ。Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターの腫瘍崩壊能を評価するため、ＭＴＳアッセイを実施した。ヒト腫瘍細胞株Ｈ４６０（非小細胞肺癌）を用いた。２つのＭＴＳアッセイを全てのベクターについて行い、そのアッセイによって各々のベクターについて類似のＬＤ５０値を得た。Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦの腫瘍崩壊能を、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９）Ｆと比較する。さらに、コントロールウイルスであるＡｄｄ／３２７（複製コンピテントなＡｄ５陽性コントロールウイルス）、およびＡｄｄ／３１２（Ｅ１Ａ欠損の陰性コントロール）をこのＭＴＳアッセイに含んだ。Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターは、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの腫瘍崩壊能を保持した。
【図４２】感染後２４時間の感染したＨ４６０細胞における、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ、およびＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９）Ｆと比較した、ΔＥ３−１４．７ｈＧＭ−ＣＳＦベクター（Ａｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦ）によって媒介されたＧＭ−ＣＳＦ発現。このＡｒ１６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターを、ウイルスベクターに感染したＨ４６０細胞の培養培地において、それらのベクターが、ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子発現を媒介する能力についてアッセイした。Ｈ４６０細胞を、２．５×１０５細胞／ウェルの密度で２ｍｌ／ウェルの培養培地を用いて６ウェルプレートにプレートした。翌日、その培地を除去して、５００μｌの無血清培地に含有する１０、１００、および１０００粒子／細胞のウイルスベクターを用いて、その培養された細胞を、二連で形質導入入した。５％ＣＯ２インキュベーター中での３７℃、２時間のインキュベーション後、ウイルスを吸引して、２ｍｌの新鮮な完全培地を各々のウェルに添加した。感染後２４時間で、ｈ−ＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡのために上清を回収した。
【図４３】ＦＡＣＳによって検出した、Ｈ４６０異種移植片腫瘍におけるアデノウイルスの伝播。ウイルスまたはＰＢＳの感染の１、４、および７日後、細胞内フローサイトメトリーを用いるヘキソン染色について、腫瘍を分析した。各々のマウス由来のヘキソン陽性細胞の割合を、平均（ｎ＝１０）として、バーを用いて、グラフに示した。ＰＢＳの陰性コントロール群は、２〜３匹のマウスであった。＊：ｐ＜０．０５（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦまたはＡｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆと、Ａｄｄ／３１２との間、ＡＮＯＶＡ）◆：ｐ＜０．０５（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターと、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＥ３Ｆベクターとの間、ＡＮＯＶＡ）
【図４４】ＦＡＣＳによって検出した、Ｈｅｐ３Ｂ異種移植片腫瘍におけるアデノウイルスの伝播。ウイルスまたはＰＢＳの感染の１、４、および７日後、フローサイトメトリーを用いるヘキソン染色について、腫瘍を分析した。各々のマウス由来のヘキソン陽性細胞の割合を、平均（ｎ＝１０）として、バーを用いて、グラフに示した。ＰＢＳの陰性コントロール群は、２〜３匹のマウスであった。＊：ｐ＜０．０５（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦまたはＡｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９）Ｆと、Ａｄｄ／３１２との間、ＡＮＯＶＡ）◆：ｐ＜０．０５（Ａｒ６ｐＡＥ２ｆｈＧｍＦベクターと、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆ（Ｅ３＋、ｈＧｍ、Ｄｇ１９）Ｆベクターとの間、ＡＮＯＶＡ）
【図４５】ｐＡＲｐＡＥ２ｆＴｒｔｅｘの構築のためのＦｌｏｗｃｈａｒｔ。腫瘍崩壊性ベクターＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのための大型プラスミドの構築のために用いたプラスミドを示す。特定の変更を注記して、さらに詳細に本明細書中に記載している。
【図４６】ここでは、腫瘍崩壊性ベクターＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを作製するために用いた最も右末端のシャトルプラスミド（ｐＤＲ１７ＴｒｔｅｘＦ）および大型プラスミド（ｐＡＲ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ）を示す。
【図４７】Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの右末端の配列（配列番号１７）：このベクターの右末端を配列決定して、ここに示す。ウイルスのＩＴＲおよびパッケージングシグナルは、３６３０５〜３６２０３である。Ｔｒｔｅｘプロモーターは、３５８４３〜３５６０６に配置される。Ｅ３領域およびこのウイルスの左末端を含むさらなる領域も配列決定する。
【図４８】Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの図解：最終ベクターの図解をこの図に模式的に示す。各々の追加したプロモーターの上に、公知の転写因子結合部位を示す。要するに、Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、Ｅ１ａ転写ユニットを駆動しており、そしてテロメラーゼ逆転写酵素（Ｔｅｒｔ）プロモーターは、Ｅ４転写ユニットを駆動している。Ｅ３領域は完全に野生型である。
【図４９】半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定されたアデノウイルスＥ４発現。このＥ４領域は、このウイルスゲノムにおける反対の鎖にコードされる。１０ｐｐｃのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いた感染の２４時間後、Ｈｅｐ３Ｂ細胞から、総ＲＮＡを単離した。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘウイルスゲノムの右末端の模式図を示しており、これには、適切なサイズの産物とともに、ＲＴ−ＰＣＲで用いたプライマーの相対的位置を示す。全てのＥ４転写物を検出するために、ＰＣＲ  ３．ｒ、またはＰＣＲ  ４．ｒと対になったＰＣＲ  ２．ｆを設計した。Ｅ４領域の上流の任意の潜在性の開始部位から開始した転写物を検出するために、ＰＣＲ  ５．ｒと対になったＰＣＲ  ２．ｆを用いた。＋１は、ネイティブのｈＴＥＲＴプロモーターの転写開始部位の近似位置を示す。
【図５０】Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘのｈＴＥＲＴプロモーターおよびＥ４領域の一部の配列を示す（配列番号２１）。Ａｄゲノムにおいて、Ｅ４遺伝子は、逆方向に向けられる。ｈＴＥＲＴプロモーター配列を、二重の下線で示す。「ＥｘｔＰ１」と記したワク囲みの配列は、プライマー伸長アッセイにおいて用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを示しており、Ｅ４領域のための転写開始部位をマッピングする。影付きの枠で示したヌクレオチドは、本発明者らの決定した３つの転写開始部位である。この開始部位（内因性ｈＴＥＲＴ遺伝子中で、Ｈｏｒｉｋａｗａ  Ｉ、Ｃａｂｌｅ  ＰＬ、Ａｆｓｈａｒｉ  Ｃ、Ｂａｒｒｅｔｔ  ＪＣ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｆｅｂ  １５；５９（４）：８２６−３０、およびＴａｋａｋｕｒａ  Ｍ，Ｋｙｏ  Ｓ、Ｋａｎａｙａ  Ｔ、Ｈｉｒａｎｏ  Ｈ、Ｔａｋｅｄａ  Ｊ、Ｙｕｔｓｕｄｏ  Ｍ、Ｉｎｏｕｅ  Ｍ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ｈＴＥＲＴ）ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｆｅｂ  １；５９（３）：５５１〜７、によって以前に同定された）を、太実線の下線によって示す。
【図５１】６〜８週齢の雌性ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）の右脇腹に１×１０７Ｈｅｐ３Ｂ細胞を皮下的に注射することによって、腫瘍を樹立した。移植後２週間で、９１．６〜２１８．５ｍｍ３の範囲の腫瘍を有するマウスを選択して、無作為に群に分配した（ｎ＝１７〜１８）。静脈内注射の前に、各々のマウスを秤量した。コントロール群は、ＨＢＳＳまたはＡｄｄ／３１２を、４．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ投与した（ｎ＝１８）。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置群には、１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ（ｎ＝１８）、３．０×１０１２ｖｐ／ｋｇ（ｎ＝１７）、または４．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ（ｎ＝１８）を投与した。全ての用量容積は、１０ｍｌ／ｋｇであった。群の平均＋ＳＥＭを表す。＊は、ＨＢＳＳコントロールに対してｐ＜０．０５である（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。
【図５２】ＨＢＳＳ、Ａｄｄ／３１２（４．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ）、またはＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ、３．０×１０１２ｖｐ／ｋｇ、４．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ）を用いた処置後の、腫瘍保有動物の生存。研究の４２日目まで動物を観察した（１群あたり、ｎ＝１７〜１８）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて生存曲線をプロットし、そしてマンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚａｌ）ログランク検定によって分析した（ＨＢＳＳに比べて、全ての処置用量について、ｐ＜０．００４）。
【図５３】示した試験物の単回静脈内注射後の、群の平均体重を示す。各々の予定のデータ収集時点において評価した動物の数は、ＳＤ２９（ｎ＝９〜２２）を除いて、１８〜３３であった。投薬の日の個々の動物の体重に基づいて、ベクター用量を調整した。Ｌｏ（低）用量：１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ；Ｍｉｄ（中）用量：３．０×１０１２ｖｐ／ｋｇ；Ｈｉ（高）用量：４．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ。群の平均＋ＳＤを示しており、これには群間で統計学的に有意な差はない。
【図５４】Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの、３×１０１２粒子／ｋｇ（ｎ＝１６）、または４．５×１０１２粒子／ｋｇ（ｎ＝１６）での単回ｉｖ注射後のＨｅｐ３Ｂ腫瘍のインビボ増殖の比較。コントロール群には、ＨＢＳＳ（ｎ＝１６）、またはＡｄｄ／３１２（ｎ＝１６）を、４．５×１０１２粒子／ｋｇ（ｎ＝１６）で用いて注射した。データは、平均腫瘍容積＋ＳＥとして表す。（＊ｐ＜０．０５）多重比較のためのＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定による一元ＡＮＯＶＡを用い、ＨＢＳＳ処置コントロールと比べて、両方のＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置群について。
【図５５】Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを用いた処置後の腫瘍保有動物の生存。研究の５８日目まで動物を観察した。各々の処置群における動物の数は以下のとおりであった：ＨＢＳＳ、ｎ＝１６；Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３×１０１２粒子／ｋｇ）、ｎ＝１６；およびＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（４．５×１０１２粒子／ｋｇ）、ｎ＝１６；およびＡｄｄ／３１２（４．５×１０１２粒子／ｋｇ）、ｎ＝１６。動物の生存を、マンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）ログランク検定によって分析した。
【図５６】腫瘍崩壊性アデノウイルスベクター、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ、Ａｄｄ／３１２、またはＨＢＳＳで処置したＨｅｐ３Ｂ腫瘍保有動物からの体重変化の平均％の分析。１週間あたり１回、体重を測定した。平均腫瘍溶液＋ＳＤとしてデータを表す。
【図５７】６〜８週齢の雌性ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）の右脇腹に１×１０７Ｈｅｐ３Ｂ細胞を皮下的に注射することによって、腫瘍を樹立した。移植後２週間で、９０〜２１５ｍｍ３の範囲の腫瘍を有するマウスを選択して、無作為に群に分配した（ｎ＝１２／群）。静脈内注射の前に、各々のマウスを秤量した。コントロールマウスには、ＨＢＳＳを投与した。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ処置群には、３×１０１１ｖｐ／ｋｇ（ｎ＝１２）、１×１０１２ｖｐ／ｋｇ（ｎ＝１２）、または３×１０１２ｖｐ／ｋｇ（ｎ＝１２）を投与した。全ての用量容積は、１０ｍｌ／ｋｇであった。群の平均（＋ＳＥＭ）を表す。＊は、ＨＢＳＳコントロールに対してｐ＜０．０５である（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。
【図５８】研究の３日目〜２２日目の個々の腫瘍容積を示す。全ての用量容積は、１０ｍｌ／ｋｇであった。Ａ）ＨＢＳＳを用いて処置したコントロール群。処置群には、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘを以下のように投与した：Ｂ）３×１０１１ｖｐ／ｋｇ、Ｃ）６×１０１１ｖｐ／ｋｇ、Ｄ）１×１０１２ｖｐ／ｋｇ、またはＥ）３×１０１２ｖｐ／ｋｇ（ｎ＝１２／群）。
【図５９】ＨＢＳＳまたはＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３×１０１１ｖｐ／ｋｇ、６×１０１１ｖｐ／ｋｇ、１×１０１２ｖｐ／ｋｇ、または３×１０１２ｖｐ／ｋｇ）を用いた処置後の腫瘍保有動物の生存。研究の３９日目まで動物を観察した（１群あたり、ｎ＝１２）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、生存曲線をプロットし、マンテル・ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚａｌ）ログランク検定によって分析した。
【図６０】示した用量の単回静脈内注射後の、研究１日目からの体重変化パーセントを示す（ｎ＝１２）。ベクター用量は、投薬の日の個々の動物の体重に基づいて調整した。１０ｍｌ／ｋｇの最終容積中に、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦｈＴｒｔｅｘを、３×１０１１ウイルス粒子／ｋｇ（ｎ＝１２）、６×１０１１ウイルス粒子／ｋｇ（ｎ＝１２）、１×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ（ｎ＝１２）、または３×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ（ｎ＝１２）で含有する単回静脈内注射を、研究の１日目に投与した。＊は、ｐ＜０．０５、研究１日目に対する体重変化のパーセント（クラスカルワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）の１元ＡＮＯＶＡ（順位））。
【図６１】Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘの静脈内注射（３．０×１０１２ｖｐ／ｋｇ）の処置前（ｎ＝３）、および示した時点、および静脈内注射後（ｎ＝５）に、マウスから収集した、腫瘍および肝臓における１細胞あたりのベクターＤＮＡコピー数。アデノウイルスヘキソンＤＮＡに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって、分子分析を行った。結果を、１細胞あたりのヘキソンコピー数として表す。
【図６２】ＳＤ１体重のパーセント＋標準偏差としての平均体重変化は、各々の処置群における５匹のマウスのコホートについてであった。動物には、ＳＤ１において示したベクターの単回静脈投与を注射した。＊は、ＨＢＳＳに対してｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）である。
【図６３】Ｈｅｐ３ＢおよびＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびタキソールの加算性のエンベロープを用いて改良されたアイソボログラム。この表では、ウイルスまたは化学療法の単回処置のＥＣ５０を１とした。併用のウイルスまたは化学療法剤のＥＣ５０を、単回処置のＥＣ５０で割った。
【図６４】Ｈｅｐ３ＢおよびＰＣ３Ｍ．２ＡＣ６細胞に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびドキソルビシンの加算性のエンベロープを用いて改良されたアイソボログラム。この表では、ウイルスまたは化学療法の単回処置のＥＣ５０を１とした。併用のウイルスまたは化学療法剤のＥＣ５０を、単回処置のＥＣ５０で割った。
【図６５】Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対するＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘおよびエポシロンＢの加算性のエンベロープを用いて改良されたアイソボログラム。この表では、ウイルスまたは化学療法の単回処置のＥＣ５０を１とした。併用のウイルスまたは化学療法剤のＥＣ５０を、単回処置のＥＣ５０で割った。
【図６６】ドキソルビシン併用研究における腫瘍増殖曲線。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（３×１０１２粒子／ｋｇ）単独（ｎ＝１０）の単回ｉ．ｖ．注射、またはドキソルビシンのｉ．ｐ．投与（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用後の、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍のインビボ増殖の比較。１つの群には、ドキソルビシン単独（ｎ＝１０）ｉ．ｐ．（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。コントロール群には、ＨＢＳＳ（ｎ＝１０）を注射した。他の詳細は、本明細書に記載する。＊は、試験２０日目の他の全ての群と比較した、ｔ検定によるｐ＜０．００１を意味する。併用群では研究の２７日目に１匹のマウスの死亡が見られたので、研究の終了はｎ＝９である。データは、平均腫瘍容積＋ＳＥＭとして表す。
【図６７】Ｄｏｘｉｌ（登録商標）の併用研究における腫瘍増殖曲線。Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ（１×１０１２ｖｐ／ｋｇ）単独（ｎ＝１０）の単回ｉ．ｖ．注射、または、１×１０１２ｖｐ／ｋｇもしくは６×１０１１ｖｐ／ｋｇのＡｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘと、９ｍｇ／ｋｇのＤｏｘｉｌ（登録商標）のｉ．ｖ．投与との併用後の、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍のインビボ増殖の比較。１つの群には、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）単独（ｎ＝１０）ｉ．ｖ．を９ｍｇ／ｋｇで投与した。他の詳細は、本明細書に記載する。陰性コントロール群には、ＨＢＳＳ（ｎ＝９）を注射した。＊は、研究２１日目の他の全ての群と比較した、ｔ検定によるｐ＜０．０１を意味する。データは、平均腫瘍容積＋ＳＥＭとして表す。
【図６８】初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるＡｒ１９ｐＡＥ２ｆＦＴの毒性。示したベクターを、１、１０、および５０ｐｐｃで用いてＰＨＨを形質導入した。パネルＡ：ＬＤＨ放出によって測定した細胞毒性は、形質導入の５日後に測定した。三連のウェル由来の平均±ｓｄを示す。＊は、ｐ＜０．０５であって、Ａｒ１７ｐＡＥ２ｆＦＴｒｔｅｘ対、Ａｒ１３ｐＡＥ２ｆＦ（ｔ検定による）である。パネルＢ：形質導入の７日後に測定した細胞毒性。１〜３のウェル由来の平均±範囲を示す。複製数が小さいせいで、パネルＢでは、データに関する統計学的比較は不能である。
【図６９】Ａｄ３５に基づく腫瘍崩壊性ベクター。Ａｒ３５ＯｓｃＥ１ＡおよびＡｒ３５Ｅ２ＦＥ１Ａは両方とも、それぞれ、腫瘍特異的プロモーターであるオステオカルシンプロモーターまたはＥ２Ｆプロモーターの制御下に、Ｅ１ａ領域を含む。Ａｒ３５Ｅ２Ｆ＋Ｅ１Ａはさらに、ある腫瘍特異的プロモーターの制御下にＥ４領域を含む。
【図７０】ヌードマウスにおける皮下ＰＣ３腫瘍に対するＡｒ３５ＯｓｃＥ１Ａの効果。各々１０匹の動物の群を、以下で処置した：ビヒクル（ＨＢＳＳ）、Ａｄ３５ｖ０．５（Ｅ１ａ欠失Ａｄ３５に基づくベクター）、Ａｒ６ｐＡＯｓｃＥ３Ｆ（Ｅ１ａの発現を駆動するオステオカルシンプロモーターを含有するＡｄ５に基づく腫瘍崩壊性ベクター）、Ａｄ３５（野生型ウイルス）、およびＡｒ３５ＯｓｃＥ１ａ（Ｅ１ａの発現を駆動するオステオカルシンプロモーターを含有するＡｄ５に基づく腫瘍崩壊性ベクター）。２×１０１１粒子／マウス（１×１０１３粒子／ｋｇ）の単回用量を用いて、全てのベクターを、腫瘍内に送達した。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529627.tif 000368
2004529627.tif 000369
【国際調査報告】
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