(57)【要約】ヒトミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、超変異性細胞および生物体を作製するために使用できる。これらの遺伝子を細胞およびトランスジェニック動物内に導入することにより、新規で有用な性質を有する新規の細胞系統および動物変種が、天然の変異速度に依存するよりもさらに効率的に作製できる。これらの方法は、増強された生化学的活性を有する改変された抗体を産生するための関係する抗原に対して指向する免疫グロブリン遺伝子内で遺伝子多様性を生成するために有用である。さらに、これらの方法は、抗体産生の増加したレベルを有する抗体産生細胞を作製するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを抗体産生可能な細胞内に導入することを含んでなる、超変異性抗体産生細胞を作製するための方法。
【請求項２】
該ポリヌクレオチドが生体外での細胞の懸濁液のトランスフェクションにより導入される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該ミスマッチ修復遺伝子がＭＬＨ１である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ１である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該ミスマッチ修復遺伝子がＭＳＨ２である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該ミスマッチ修復遺伝子がＭＳＨ２である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該対立遺伝子が末端短縮変異を含んでなる、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
該対立遺伝子がコドン１３４における末端短縮変異を含んでなる、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
該末端短縮変異が野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４におけるチミジンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該ポリヌクレオチドが動物の受精卵内に導入される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
受精卵が次いで擬妊娠雌内に移植され、これにより受精卵が成熟トランスジェニック動物に発育する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＭＬＨ１である、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ１である、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトｍｕｔＬ同族体である、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
該対立遺伝子が末端短縮変異を含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
該対立遺伝子がコドン１３４における末端短縮変異を含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
該末端短縮変異が野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４におけるチミジンである、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
該能力が、該細胞内への免疫グロブリン遺伝子の同時導入による、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
該細胞がミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなる、超変異性哺乳動物細胞の均質培養物。
【請求項２４】
ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項２３記載の超変異性哺乳動物細胞の培養物。
【請求項２５】
ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項２４記載の超変異性哺乳動物細胞の培養物。
【請求項２６】
ミスマッチ修復遺伝子がＭＬＨ１である、請求項２３記載の超変異性哺乳動物細胞の培養物。
【請求項２７】
ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ１である、請求項２３記載の超変異性哺乳動物細胞の培養物。
【請求項２８】
ミスマッチ修復遺伝子がｍｕｔＬ同族体である、請求項２３記載の超変異性哺乳動物細胞の培養物。
【請求項２９】
細胞がｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸より成るタンパク質を発現する、請求項２３記載の超変異性哺乳動物細胞の培養物。
【請求項３０】
該遺伝子およびミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなる該細胞を培養し、そして
関係する該遺伝子が変異を包含するかどうかを決定するために細胞を試験する
ことを含んでなる抗体産生細胞内の抗体産生に影響を及ぼす遺伝子内の変異を生起するための方法。
【請求項３１】
試験の段階が、該遺伝子のヌクレオチド配列を分析することを含んでなる、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
試験の段階が、該遺伝子より転写されたｍＲＮＡを分析することを含んでなる、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
試験の段階が、関係する遺伝子によりコードされるタンパク質を分析することを含んでなる、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
試験の段階が、該遺伝子の表現型を分析することを含んでなる、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
試験の段階が、抗体の結合活性を分析することを含んでなる、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
ミスマッチ修復遺伝子の対立遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入するプロセスにより哺乳動物をＭＭＲ欠陥性とし、これにより細胞が超変異性となる方法。
【請求項３７】
試験の段階が該遺伝子のヌクレオチド配列を分析することを含んでなる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
試験の段階が、該遺伝子より転写されたｍＲＮＡを分析することを含んでなる、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
試験の段階が、該遺伝子によりコードされるタンパク質を分析することを含んでなる、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
試験の段階が、該遺伝子の表現型を分析することを含んでなる、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
試験の段階が、抗体の結合活性を分析することを含んでなる、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
該遺伝子およびミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる該細胞を培養し、そして
該遺伝子の産物に新規の生化学的特性を与えて該遺伝子内の少なくとも１つの変異を該細胞が包含するかどうかを決定するために該細胞を試験する（その際、該新規生化学的特性が該産物の過剰発現、該産物の増強された分泌、抗原に対する該産物の増強された親和性、およびそれらの組み合わせよりなる群より選ばれる。）
ことを含んでなる、抗体産生細胞内の抗体産生に影響する遺伝子内に変異を生成するための方法。
【請求項４３】
試験の段階が、該細胞の免疫グロブリン遺伝子の定常状態発現を分析することを含んでなる、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
試験の段階が、該細胞の免疫グロブリン遺伝子より転写された定常状態ｍＲＮＡを分析することを含んでなる、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
試験の段階が、該細胞の免疫グロブリン遺伝子によりコードされた分泌タンパク質の量を分析することを含んでなる、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
ＤＮＡ変異原の存在下で細胞内にミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを導入するプロセスにより細胞が作製される、請求項３６記載の方法。
【請求項４７】
試験の段階が、該細胞の免疫グロブリン遺伝子のヌクレオチド配列を分析することを含んでなる、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
試験の段階が、該細胞の免疫グロブリン遺伝子より転写されたｍＲＮＡを分析することを含んでなる、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
試験の段階が、該遺伝子によりコードされる免疫グロブリンタンパク質を分析することを含んでなる、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
試験の段階が、該遺伝子によりコードされるタンパク質の生化学的活性を分析することを含んでなる、請求項４６記載の方法。
【請求項５１】
請求項４２の方法により作製された超変異性トランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項５２】
該細胞が霊長類由来である、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項５３】
該細胞がげっ歯類由来である、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項５４】
該細胞がヒト由来である、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項５５】
該細胞が真核動物由来である、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物細胞。
【請求項５６】
該細胞が原核動物由来である、請求項５１細胞内に誘導可能なニック哺乳動物細胞。
【請求項５７】
細胞内に誘導性ベクターを導入し、その際、該誘導性ベクターが誘導性プロモーターに操作可能に連結したミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなり、そして該優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子を発現するように該細胞を誘導することを含んでなる、抗体産生細胞の超変異性を可逆的に改変する方法。
【請求項５８】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
該ミスマッチ修復遺伝子がＭＬＨ１である、請求項５７記載の方法。
【請求項６１】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ１である、請求項５７記載の方法。
【請求項６２】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトｍｕｔＬ同族体である、請求項５７記載の方法。
【請求項６３】
該細胞が、ｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸より成るタンパク質を発現する、請求項５７記載の方法。
【請求項６４】
該抗体産生細胞により発現された免疫グロブリンタンパク質を分析することをさらに含んでなる、請求項５７記載の方法。
【請求項６５】
該細胞の導入を停止し、これにより該細胞の遺伝的安定性を回復することをさらに含んでなる、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
免疫グロブリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内にトランスフェクションし（その際、該細胞が優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子を含んでなる。）、
細胞を培養し、これにより超変異性免疫グロブリンタンパク質をコードする超変異性ポリヌクレオチドを産生し、
該超変異性免疫グロブリンタンパク質の所望の性質に関してスクリーニングし、該超変異性ポリヌクレオチドを単離し、そして
該超変異性ポリヌクレオチドを遺伝的に安定な細胞内にトランスフェクションし、これにより超変異性抗体産生性で遺伝的に安定な細胞を産生する
ことを含んでなる遺伝的に改変された抗体を産生する方法。
【請求項６７】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ２である、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトＰＭＳ２である、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
該ミスマッチ修復遺伝子がＭＬＨ１である、請求項６６記載の方法。
【請求項７０】
該ミスマッチ修復遺伝子がＰＭＳ１である、請求項６６記載の方法。
【請求項７１】
該ミスマッチ修復遺伝子がヒトｍｕｔＬ同族体である、請求項６６記載の方法。
【請求項７２】
該細胞が、ｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸より成るタンパク質を発現する、請求項６６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の技術分野］
本発明は、抗体成熟および細胞産生の分野に関連する。具体的には、変異誘発の分野に関連する。
【０００２】
［発明の背景］
外来および／または内因性ポリペプチドの活性をブロックするための抗体の使用は、疾患の根本原因を治療するための有効で選択的な戦略を提供する。具体的には、有効な治療剤としてのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、例えばＦＤＡが承認したレオプロ（ＲｅｏＰｒｏ， Ｇｌａｓｅｒ， Ｖ．（１９９６） Ｃａｎ ＲｅｏＰｒｏ ｒｅｐｏｌｉｓｈ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ？ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：１２１６−１２１７）、セントコール（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）からの抗血小板ＭＡｂ、ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ， Ｗｅｉｎｅｒ， Ｌ．Ｍ．（１９９９） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ， Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２６：４３−５１） 、ジェネンテク（Ｇｅｎｔｅｃｈ） からの抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＭＡｂ、およびシナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ，Ｓａｅｚ−Ｌｌｏｒｅｎｓ， Ｘ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｙｓｐｌａｓｉａ． Ｐｅｄｉａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ．１７：７８７−７９１）、すなわちメジミュン（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ） により生産される抗呼吸器合胞性ウイルスＭＡｂの使用である。
【０００３】
候補タンパク質標的に対するＭＡｂを作製するための標準的方法は、当該技術分野の熟練者には既知である。要約すると、アジュバントの存在下で精製した抗原を注入したげっ歯類、例えばマウスまたはラットに注入して、免疫反応を発生させる（Ｓｈｉｅｌｄ， Ｃ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ａ ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯＫＴ３ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃａｄａｖｅｒｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ａｍ． Ｊ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ． ２７：８５５−８６４） 。正の免疫血清を有するげっ歯類を屠殺しそして脾臓細胞を単離する。単離された脾臓細胞をメラノーマに融合して不死化細胞系統を作製しこれを次いで抗体産生のためにスクリーニングする。陽性系統を単離しそして抗体産生に関して特性を試験する。ヒト治療剤としてのげっ歯類ＭＡｂの直接使用は、げっ歯類抗体を用いて処置した患者のかなりの人数内にヒト抗−げっ歯類抗体（ＨＡＲＡ）反応が発生する事実により困惑される（Ｋｈａｚａｒｌｉ，Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． １５：４２−５２） 。ＨＡＲＡの問題を回避するために、抗原結合ドメインを構成する免疫グロブリン（Ｉｇ）サブユニットの重鎖および軽鎖可変領域内にみいだされる重要なモチーフである相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体骨格上にグラフトすると、ＨＡＲＡ反応を起こさないでこれらのキメラ分子が抗原へのそれらの結合活性を維持できることがみいだされた（Ｅｍｅｒｙ， Ｓ．Ｃ．， ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， Ｗ．Ｊ．，”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” Ｉｎ：ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ Ｃ．Ａ．Ｋ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ （Ｅｄ．） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． １９９５， ｐｐ １５９−１８３） 。げっ歯類誘導ＭＡｂの「ヒト化（ｈｕｍａｉｚａｔｉｏｎ） 」（以後本明細書中でＨＡｂと呼ぶ）の間に存在する共通の問題は、ヒトＩｇ骨格上へのグラフトの際のＣＤＲドメインの三次元構造内のコンフォーメション的変化による結合親和性の低下である（Ｑｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１ 号）。この問題を克服するには、高い親和性ＨＡｂを再創成するためにフレームワーク操作内および／またはＣＤＲコーディング領域自体内に追加のアミノ酸残基を挿入するかかまたは除くことにより追加のＨＡｂベクターを操作することが通常必要である（Ｑｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１ 号）。この方法は、高親和性ＨＡｂに導くことができる変化を予測するためにコストがかかるコンピューターモデリングプログラムに使用を含む著しく時間を要する手順である。ある場合には、ＨＡｂの親和性はＭＡｂのものに決して回復されず、これらに殆ど治療的な用途を与えない。
【０００４】
抗体操作に存在する別の問題は、臨床物質のための分子の製造のために必要な安定で高収率の産生細胞系統の作製である。この問題を回避するために当該技術分野の熟練者により標準手順内に数種の戦略が採用されている。一つの方法は、全抗体または単鎖抗体を産生するグラフトされたヒト軽鎖および重鎖を含む外因性Ｉｇ融合遺伝子をトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の使用であり、これは抗原結合性ポリペプチドを形成する軽鎖および重鎖双方を含むキメラ分子である（Ｒｅｆｆ， Ｍ．Ｅ．（１９９３） Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４：５７３−５７６） 。別の方法は、ヒトのグラフトした免疫系を含むトランスジェニックマウスまたはヒトＩｇ遺伝子レパートリーを含むトランスジェニックマウスより誘導されたヒトリンパ細胞の使用を用いる。さらに別の方法は、ヒト抗−サル反応を欠失すると報告された霊長類ＭＡｂを産生するサルの使用を用いる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｇｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ， Ｍ． （１９９７） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｍｉｃｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ａ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ， Ｎａｔｕｒｅ ３８６； ２５−２６）。すべての場合に、高い親和性抗体の十分な量を生成できる細胞系統の作製は、臨床研究のために十分の材料を産生するための重要な限界となる。これらの限界のために、他の組換え系、例えば植物の使用が、ヒト化抗体の安定で高レベル産生に導くであろう系として現在開発されている（Ｆｉｅｄｌｅｒ， Ｕ． ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ， Ｕ （１９９５） Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｓ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３： １０９０−１０９３） 。
【０００５】
抗原に高い結合親和性を有するＨＡｂおよびＭＡｂをもたらす可変ドメイン内に多様な抗体配列を生成するための方法は、さらに強力な治療および診断試薬をそれぞれ創成するために有用であろう。その上、全抗体分子を通じてランダムに改変されたヌクレオチドおよびポリペプチド残基の生成は、抗原性がより低いおよび／または有用な薬動力学的性質を有する新規の試薬をもたらすであろう。本明細書中に記載される本発明は、生化学的活性抗体をコードする免疫グロブリンを産生する宿主細胞の内因性ミスマッチ修復（ＭＭＲ）活性をブロックすることにより生体内の抗体構造を通じてランダムな遺伝子変異の使用を指向する。本発明は、反復された生体内遺伝子改変のための方法および増強された結合および薬動力学的プロフィールを有する抗体の選択にも関する。
【０００６】
さらに、抗体の増加した量を分泌できる遺伝的に改変された宿主細胞を開発する能力は、製品開発のための細胞宿主を創成するための価値ある方法も提供するであろう。本明細書中に記載される本発明は、ＭＭＲのブロックを介する増加した抗体産生を有する遺伝的に改変細胞宿主の創成を指向する。
【０００７】
本発明は、高親和性抗体の生成および抗体産生の高いレベルを有する細胞系統の生成を容易とする。本発明の別の利点は、本明細書中に記載される実施例および図面中に記載される。
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、遺伝的に改変された抗体（単鎖分子を含む）および生体外および生体内で後代産生細胞宿主を生成するための方法を提供し、これにより抗体は、所望の生化学的性質、例えば増加した抗原結合、増加した遺伝子発現、および／または宿主細胞による増強された細胞外分泌を有するが、これらに限定はされない。増加した結合活性を有する抗体または増加した抗体産生を有する細胞を同定するための一つの方法は、増強された結合性質を有する分子を産生するＭＭＲ欠陥抗体産生細胞クローンまたは抗体産物の増加した量を産生するように遺伝的に改変されたクローンのスクリーニングを介する。
【０００９】
本発明中で使用するために適する抗体産生細胞は、げっ歯類、霊長類、またはヒトハイブリドーマまたはリンパ芽球；トランスフェクションされそして外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子を発現する哺乳動物細胞；トランスフェクションされそして外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子を発現する植物細胞、酵母または細菌を含み、しかしこれらに限定はされない。
【００１０】
このように、本発明は、ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを、抗体産生可能な細胞内に導入することによる超変異性（ｓｕｐｅｒｍｕｔａｂｌｅ）抗体産生細胞を作製するための方法を提供する。抗体産生が可能な細胞には、天然に抗体を産生する細胞、および免疫グロブリンをコードする配列の導入を介して抗体を産生するように操作された細胞が含まれる。好都合には、細胞内へのポリヌクレオチド配列の導入はトランスフェクションにより達成される。
【００１１】
本発明は、優性ネガティブミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子、例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２、またはＭＳＨ２を抗体産生可能な細胞内に導入することにより超変異性抗体産生細胞を作製する方法も提供する。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の末端短縮変異体であってもよい（好ましくはコドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４におけるチミジンにおける末端短縮変異体）。本発明は、ミスマッチ修復遺伝子活性が抑制されている方法も提供する。これは、例えばミスマッチ修復遺伝子または転写体に対して指向するアンチセンス分子を用いて達成されてもよい。
【００１２】
本発明の別の態様は、ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを動物の受精卵内に導入することによる超変異性抗体産生細胞を作製するための方法を提供する、これらの方法は、引き続いて卵を擬−妊娠雌内に移植し、これにより受精卵を成熟したトランスジェニック動物に生育させることを含んでもよい。ミスマッチ修復遺伝子は、例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２、またはＭＳＨ２を含んでもよい。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の末端短縮変異体であってもよい（好ましくはコドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４におけるチミジンにおける末端短縮変異体）。
【００１３】
本発明は、抗体産生可能でありそしてミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含む培養された超変異性哺乳動物細胞の均質組成物をさらに提供する。ミスマッチ修復遺伝子は、例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２、またはＭＳＨ２を含んでもよい。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の末端短縮変異体であってもよい（好ましくはコドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４におけるチミジンにおける末端短縮変異体）。カルチャーの細胞はＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１またはＰＭＳ１を含んでもよく、またはヒトｍｕｔＬ同族体、またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現してもよい。
【００１４】
本発明は、さらに、細胞がミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含む関係する免疫グロブリンに関して選択された免疫グロブリン産生細胞を培養することにより関係する免疫グロブリン遺伝子内に変異を生成するための方法を提供する。細胞より産生される免疫グロブリンの性質は、免疫グロブリン遺伝子が変異を包含するかどうかを確認してアッセイできる。このアッセイは、免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを分析するように向けられてもよく、または免疫グロブリンポリペプチド自体に向けられてもよい。
【００１５】
本発明は、ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を発現する細胞を培養することにより抗体産生細胞内での抗体産生に影響する遺伝子内に変異を生成し、そして関係する遺伝子内の変異を細胞が包含する、例えば新規の生化学的特徴（例えば免疫グロブリン産物の過剰発現および／または分泌）が生成するかどうかを決定するために細胞を試験するための方法も提供する。試験は、関係する免疫グロブリン遺伝子の定常状態発現の分析、および／または関係する免疫グロブリン遺伝子によりコードされる分泌されたタンパク質の量の分析を含んでもよい。本発明は、げっ歯類、非−ヒト霊長類およびヒトよりの細胞を含み、この方法により作製された原核および真核トランスジェニック細胞も包含する。
【００１６】
本発明の他の特徴は、誘導性プロモーターに操作可能に連結するミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を含む誘導性ベクターが抗体産生細胞内に導入されている抗体産生細胞の超変異性を可逆的に改変する方法を包含する。細胞は、優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子（これはＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１であることができる）を発現を誘導する誘導性薬剤を用いて処理される。あるいは、細胞はヒトｍｕｔＬ同族体またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現するように誘導されてもよい。他の態様では、細胞は事前選択された関係する免疫グロブリン遺伝子を同時トランスフェクションすることにより抗体産生可能性を付与されてもよい。超変異性細胞の免疫グロブリン遺伝子、またはこれらの方法により産生されたタンパク質は、所望の性質に関して分析されてもよく、そして誘導は宿主細胞の遺伝的安定性が回復されるように停止されてもよい。
【００１７】
本発明は、優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子を含む細胞（天然または細胞内に優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子が導入されたかのいずれか）内に免疫グロブリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクションし、免疫グロブリン遺伝子が変異されそして変異免疫グロブリンを産生させるように細胞を培養し、該変異免疫グロブリンタンパク質の所望の性質に関してスクリーニングし、所望の性質を有する選択された変異免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド分子を単離し、そして変異抗体がそれ以上の遺伝的な改変を持たずに一定して産生されるように遺伝的に安定した細胞内に該変異ポリヌクレオチドをトランスフェクションすることによる遺伝改変抗体を産生する方法も包含する。優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子は、ＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１であってもよい。あるいは、細胞はヒトｍｕｔＬ同族体またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現してもよい。
【００１８】
本発明は、さらに、抗原結合ポリペプチドの増強された量を発現する遺伝的改変細胞系統を生成するための方法も提供する。これらの抗原結合ポリペプチドは、例えば免疫グロブリンであってもよい。本発明の方法は、抗原結合ポリペプチドの増強された量を分泌する遺伝的改変細胞系統を生成するための方法も包含する。細胞系統は、抗原結合ポリペプチド、例えば抗体を産生する細胞内に遺伝子超変異の増強された割合を与える優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子により超変異性を与えられる。かかる細胞にはハイブリドーマが含まれ、しかしそれに限定はされない。抗原結合ポリペプチドの増強された量の発現は、抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの増強された転写または翻訳を介して、または例えば抗原結合ポリペプチドの増強された分泌を介してでもよい。
【００１９】
細胞宿主のＭＭＲ活性をブロックすることにより、またはＭＭＲ欠陥細胞宿主内に免疫グロブリンをコードする遺伝子をトランスフェクションすることにより生体内で遺伝的改変抗体を創成するための方法も提供される。
【００２０】
可変ドメイン内の遺伝子変化により抗原への増加した結合性質を有する抗体が、細胞宿主の内因性ＭＭＲをブロックする本発明の方法で提供される。軽鎖および／または重鎖内のＣＤＲ領域内の遺伝子変化による抗原への増加した結合性質を有する抗体も、細胞宿主の外因性ＭＭＲをブロックする本発明の方法で提供される。
【００２１】
本発明は、げっ歯類、霊長類、およびヒトを含みこれらに限定はされない宿主生物体内の増強された薬動力学的性質を有するＭＭＲ欠陥Ａｂ産生細胞系統内の遺伝子改変抗体を創成する方法を提供する。
【００２２】
本発明のこれらおよびその他の性質は、以下に記載する態様の１種またはそれ以上により提供される。本発明の一つの態様において、抗体産生細胞系統を超変異性とするための方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを抗体産生細胞内に導入する。細胞は、遺伝子の導入の結果として超変異性となる。
【００２３】
本発明の別の態様では、免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする内因性遺伝子内に変異を導入するための方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入する。ＭＭＲ遺伝子対立遺伝子の導入および発現の結果として細胞は超変異性となる。細胞はさらに関係する免疫グロブリン遺伝子を含んでなる。細胞を培養しそして免疫グロブリンまたは関係する単鎖抗体をコードする遺伝子が変異を包含するかどうかを決定するために試験する。本発明の別の態様では、変異免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする遺伝子を単離しそして遺伝的に安定な細胞内に発現してもよい。好ましい態様では、改変された抗体は、少なくとも一種の望ましい性質、例えば、これに限定はされないが増強された結合性に関してスクリーニングされる。
【００２４】
本発明の別の態様では、Ｉｇ軽鎖および重鎖またはそれらの間の組み合わせをコードする遺伝子または遺伝子の組が、ＭＭＲ欠陥である哺乳動物細胞宿主内に導入される。細胞を培養し、そして増強された結合性を有する抗体に関してクローンを分析する。
【００２５】
本発明の別の態様では、細胞の新規の表現型を生成すための方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入する。遺伝子の導入の結果として細胞は超変異性となる。細胞を培養する。表現型がポリペプチドの増強された分泌である新規の表現型に関して細胞を試験する。
【００２６】
本発明のこれらおよびその他の態様は、細胞および動物内に増強された変異性を生成できる方法ならびに有利な薬動力学的プロフィールを有する高親和性抗体の大規模生産のために潜在的に有用な変異を包含する細胞よび動物を当該技術分野に提供する。
【００２７】
宿主細胞の保存されたミスマッチ修復（ＭＭＲ）プロセスを利用して超変異性抗体産生細胞を開発するための方法を発見した。細胞またはトランスジェニック動物内に導入された場合に、かかる遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、ＤＮＡ修復の有効性を低下することにより自発変異の割合を増加し、そしてこれにより細胞または動物に超変異性を与える。次いで、超変異性細胞または動物は、関係する遺伝子内に新規の変異を展開するために利用できる。抗体産生細胞、例えば、これらに限定はされないが、ハイブリドーマ、Ｉｇ軽鎖および重鎖をコードする遺伝子を用いてトランスフェクションされた哺乳動物細胞、単鎖抗体をコードする遺伝子を用いてトランスフェクションされた哺乳動物細胞、Ｉｇ遺伝子を用いてトランスフェクションされた真核細胞中のＭＭＲのブロッキングは、増強された抗体産生を有するクローンに導く細胞および／または増強された生化学的性質、例えば増加した抗原結合を有する遺伝子改変抗体を含む細胞内の変異割合を増強できる。ミスマッチプルーフリーディングとも呼ばれるＭＭＲのプロセスは、細菌から哺乳動物におよぶ細胞内のタンパク質複合体により行われる。ＭＭＲ遺伝子はかかるミスマッチ修復複合体のタンパク質の一つをコードする遺伝子である。作用機構のいかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、ＭＭＲ複合体は、ヌクレオチド塩基の非−相補的対形成よりもたらされるＤＮＡらせんの乱れを検出すると考えられる。より新しいＤＮＡ鎖上の非相補塩基を切除し、そして切除した塩基を以前のＤＮＡ鎖に相補的である適当な塩基と置換する。この方法で、細胞はＤＮＡ複製における過誤の結果として起きる多数の変異を排除する。
【００２８】
優性ネガティブ対立遺伝子は、同じ細胞内の野生型対立遺伝子の存在下でもＭＭＲ欠陥表現型を起こさせる。ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子の例はヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４であり、これはコドン１３４において末端短縮変異を有する（配列番号１５）。この変異は、１３４番目のアミノ酸の位置で異常な終止をこの遺伝子産物に起こさせ、Ｎ−末端１３３アミノ酸を含む短縮されたポリペプチドをもたらす。かかる変異は、変異の割合を上昇させ、これはＤＮＡ複製の後に細胞中に蓄積する。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子の発現は、野生型対立遺伝子の存在下であってもミスマッチ修復活性の障害をもたらす。かかる効果を生成するあらゆる対立遺伝子が本発明に使用できる。ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、ヒト、動物、酵母、細菌、またはその他の生物体の細胞より得ることができる。かかる対立遺伝子は、欠陥ＭＭＲ活性に関して細胞をスクリーニングして同定できる。ガンを有する動物またはヒトからの細胞を欠陥ミスマッチ修復遺伝子に関してスクリーニングできる。結腸ガン患者からの細胞が特に有用であろう。ＭＭＲタンパク質をコードするいかなる細胞からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡも、野生型配列からの変動に関して分析できる。ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子は、例えばｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子またはその他のＭＭＲ遺伝子の変種を作製することにより人工的に創成もできる。部位指定変異誘導の種々の技術が使用できる。天然でも人工であっても、超変異性細胞または動物の生成に使用するためのかかる対立遺伝子の適合性は、１種またはそれ以上の野生型対立遺伝子の存在下でで対立遺伝子により起こるミスマッチ修復活性を、これが優性ネガティブ対立遺伝子であるかどうかを決定するために試験して評価できる。
【００２９】
ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子がその中に導入された細胞または動物は、超変異性となる。これは、かかる細胞または動物の自発変異割合がかかる対立遺伝子を持たない細胞または動物と比較して高いことを意味する。自発変異割合の上昇の程度は、正常の細胞または動物のものの少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍であることができる。化学変異原、例えば、これらに限定はされないが、スルホン酸メタン、スルホン酸ジメチル、Ｏ６−メチルベンザジン、ＭＮＵ、ＥＮＵなどの使用は、それ自体がＭＭＲ欠陥のもののさらに１０〜１００倍の割合に増加するためにＭＭＲ欠陥細胞内で使用できる。
【００３０】
本発明の一つの局面によると、ＭＭＲタンパク質の優性ネガティブ形をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入する。遺伝子は、ＭＭＲ複合体の一部分、例えばＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１、またはＭＳＨ２であるタンパク質をコードするいかなる優性ネガティブ対立遺伝子であることができる。優性ネガティブ対立遺伝子は、天然に存在するかまたは実験室内で作製できる。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学的に合成されたポリヌクレオチドの形であることができる。
【００３１】
ポリヌクレオチドは、構成的活性プロモーターセグメント（例えば、これらに限定はされないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子またはＬＴＲ配列）を含む発現ベクター内に、または誘導性プロモーター配列、例えばステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローンでき、ここで、優性ネガティブＭＭＲ遺伝子の発現は調節できる。ポリヌクレオチドはトランスフェクションにより細胞内に導入できる。
【００３２】
本発明の別の局面によると、Ｉｇ遺伝子、Ｉｇ遺伝子の組またはＩｇ遺伝子の全体または一部分を含むキメラ遺伝子の組である免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子は、ＭＭＲ欠陥細胞宿主内にトランスフェクションでき、細胞を培養しそして新規の生化学的特徴を有する遺伝子改変Ｉｇ遺伝子を含むクローンに関してスクリーニングできる。ＭＭＲ欠陥細胞は、ヒト、霊長類、哺乳動物、げっ歯類、植物、酵母または原核分野のものであってもよい。新規の生化学的特徴を有するＩｇをコードする変異遺伝子をそれぞれのクローンより単離しそして遺伝的に安定な細胞（例えば正常のＭＭＲを有する細胞）内に導入して、新規の生化学的特徴を有するＩｇを一定して産生するクローンを提供してもよい。新規の生化学的特徴を有するＩｇをコードするＩｇ遺伝子を単離する方法は、当該技術分野で既知のいかなる方法であってもよい。新規の生化学的特徴を有するＩｇをコードする単離されたポリヌクレオチドの導入も当該技術分野では既知のいかなる方法を用いて行ってもよく、これには、新規の生化学的特徴を有するＩｇをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターのトランスフェクションを含み、これに限定はされない。Ｉｇ遺伝子、Ｉｇ遺伝子の一組またはＩｇ遺伝子の全体または一部分を含むキメラ遺伝子をＭＭＲ欠陥宿主細胞内にトランスフェクションする別の方法として、かかるＩｇ遺伝子を優性ネガティブミスマッチ修復遺伝子をコードする遺伝子と同時に遺伝的に安定な細胞内にトランスフェクションして細胞に超変異性を与えてもよい。
【００３３】
トランスフェクションは、ポリヌクレオチドを細胞内に導入するあるプロセスである。トランスフェクションのプロセスは、生きている動物内、例えば遺伝子治療のためのベクターを用いて行うことができ、または生体外で、例えばカルチャー内の１種またはそれ以上の単離された細胞の懸濁液を用いて行うことができる。細胞は、例えばヒトまたはその他の霊長類、哺乳動物またはその他の脊椎動物、非脊椎動物より単離された細胞を含む真核生物細胞、および単細胞生物体、例えば原生動物、酵母、または細菌のいかなるタイプであってもよい。
【００３４】
一般に、トランスフェクションは細胞の懸濁液または単細胞を用いて行われるが、しかし処理された細胞または組織の十分なフラクションが、トランスフェクション細胞が培養および利用できるようにポリヌクレオチドを組み込んでいる限り、他の方法も適用できる。ポリヌクレオチドのタンパク質産物は、一時的または安定に細胞内に発現されてもよい。トランスフェクションの技術は周知である。ポリヌクレオチドを導入するめに利用できる各種技術は、エレクトロポレーション、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの利用、関係する細胞との融合のために脂質と一緒のポリヌクレオチドのパッケージングを含み、これらの限定はされない。細胞がＭＭＲ遺伝子を用いてトランスフェクションされると、細胞は培養されカルチャー内に再生成できる。遺伝子が多数の細胞世代にわたって一定のレベルで発現されるようにトランスフェクションが安定である場合には、細胞系統がもたらされる。
【００３５】
単離された細胞は、個別の細胞を機械的に分離して取り出しそして酵素、例えばコラゲナーゼまたはトリプシンを用いる組織の前処理を行うかまたは行わないかのいずれかでこれらの適当な細胞カルチャー媒体に移した、ヒトまたは動物の組織から得られた細胞である。かかる単離された細胞は、典型的には細胞の他のタイプの非存在下で培養される。ミスマッチ修復遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子の導入のために選定された細胞は、一次細胞カルチャーまたは不死化細胞系統の形の真核生物体から誘導してもよく、または単細胞生物体の懸濁液から誘導してもよい。
【００３６】
ＭＭＲタンパク質の優性ネガティブ形をコードするポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物を産生するこにより動物のゲノム内に導入できる。動物は、適当な技術がトランスジェニック動物を作製するために利用できるいかなる種であってもよい。例えば、トランスジェニック動物は、家畜、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどより、組換えタンパク質の産生のために使用される動物、例えばそれらの乳中に組換えポリペプチドを発現するウシ、ブタ、またはヤギより、研究または産物試験のための実験用動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビットなどより作製できる。次いで、ＭＭＲ欠陥であると決定された細胞系統は、全体で不変の免疫グロブリン遺伝子および／またはＭＭＲ欠陥動物のあらゆる組織からのＭＭＲ欠陥細胞内に単鎖抗体をコードするキメラ遺伝子を導入して、生体外で遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子を産生するための起源として使用される。
【００３７】
トランスフェクションされた細胞系統またはトランスジェニック動物のコロニーが産生されると、関係する１種またはそれ以上の遺伝子内に新規の変異を生成するために使用できる。関係する遺伝子は、細胞系統またはトランスジェニック動物により天然に所有されるかまたは細胞系統またはトランスジェニック動物内に導入されたあらゆる遺伝子であることができる。変異誘導のためにかかる細胞または動物を使用する一つの長所は、細胞または動物を変異原性薬品または放射線に暴露しなくてもよいことであり、これらは暴露の対象物および実験者の双方に二次的な有害作用を有することがある。しかし、化学的変異原はＭＭＲ欠陥と組み合わせて使用してもよく、これはかかる変異原に未決定機構により低い毒性を与える。次いで、超変異性動物を養育しそして遺伝子可変性細胞を産生するために有用である新規の細胞系統を同定するために単離およびクローニングされてもよい遺伝子可変Ｂ細胞を産生するものに関して選択することができる。新しい形質が同定されると、優性ネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子は、当該技術分野の熟練者により使用される技術により対立遺伝子を直接ノックアウトするか、または優性ネガティブ対立遺伝子を欠失するメイトに培養して所望の形質および安定なゲノムを有する後代を選択することにより除去できる。別の方法は、ＣＲＥ−ＬＯＸ発現系を用いる方法であり、これにより優性ネガティブ対立遺伝子は、遺伝的に異なる免疫グロブリンプロフィールを含む動物が確立されると、動物ゲノムより切除される。さらに別の方法は、コルチコステロイドの存在下で外因性遺伝子を発現する誘導性ベクター、例えばステロイド誘導ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ベクターの使用である。
【００３８】
変異は、細胞または動物の遺伝型における改変を分析、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡの配列、または関係する遺伝子と関連するアミノ酸を検討して検出できる。変異は、抗体力価の生成をスクリーニングしてでも検出できる。変異ポリペプチドは、変異遺伝子によりコードされるタンパク質の電気泳動移動度、分光分析特性、またはその他の物理的または構造的特定における改変を同定して検出できる。現場で、単離された形で、またはモデル系内でタンパク質の改変された機能もスクリーニングできる。関係する遺伝子の機能と関連する細胞または動物のあらゆる性質、例えば、これに限定はされないがＩｇ分泌の改変をスクリーニングできる。
【００３９】
ミスマッチ修復タンパク質および核酸配列の例は、下記を含む。
【００４０】
【表１】
2004529613.tif 000002
【００４１】
【表２】
2004529613.tif 000003
【００４２】
【表３】
2004529613.tif 000004
【００４３】
【表４】
2004529613.tif 000005
【００４４】
【表５】
2004529613.tif 000006
【００４５】
【表６】
2004529613.tif 000007
【００４６】
【表７】
2004529613.tif 000008
【００４７】
本発明の背景に関するさらなる情報として、下記の参考文献を参照してもよく、これらのそれぞれはその全体を引用することにより本明細書中に編入される。
【００４８】
【表８】
2004529613.tif 000009
【００４９】
【表９】
2004529613.tif 000010
【００５０】
【表１０】
2004529613.tif 000011
【００５１】
上記の開示は一般的に本発明を説明するものである。さらに完全な理解は、下記の特定の実施例を参照して得ることができ、これらは本明細書中に説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲を制限することは意図しない。
【００５２】
実施例１：ハイブリドーマ細胞内の優性ネガティブＭＭＲ遺伝子の安定発現
ニコライデスら（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１） により、別の場合にＭＭＲに慣れた細胞中の優性ネガティブ対立遺伝子の発現がこれらの宿主細胞ＭＭＲ欠陥に導くことがこれまで知られている。ＭＭＲ欠陥細胞の創成は、宿主生物体子孫の全ゲノムを通じて遺伝子改変の生成に導き、改変された性質の生化学物を産生するであろう遺伝子改変子孫または同胞の集団を得ることができる。本特許出願は、げっ歯類ハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、ヒト免疫グロブリン遺伝子産物を産生するキメラげっ歯類細胞、免疫グロブリン遺伝子を発現するヒト細胞、単鎖抗体を産生する哺乳動物細胞、および哺乳動物免疫グロブリン遺伝子またはキメラ免疫グロブリン分子、例えば単鎖抗体内に含まれるものを産生する原核細胞を含み、これらに限定はされない抗体産生細胞内の優性ネガティブＭＭＲ遺伝子の使用を教示する。抗体産生のために使用される上記の細胞発現系は、抗体治療の当該技術分野の熟練者には周知である。
【００５３】
ＭＭＲ遺伝子の優性ネガティブ対立遺伝子を用いるＭＭＲ欠陥ハイブリドーマを創成するための能力を実証するために、我々は、最初にヒトＩｇＥタンパク質に対して指向する抗体を産生することが知られているマウスハイブリドーマ細胞系統を、本明細書中では、ヒトＰＭＳ２（ＨＢＰＭＳ２と呼ばれる細胞系統）、ＰＭＳ１３４（ＨＢ１３４と呼ばれる細胞系統）と呼ばれる以前に公開された優性ネガティブＰＭＳ２であるを含む発現ベクターを用いて、または挿入なし（ＨＢｖｅｃと呼ばれる細胞系統）でトランスフェクションした。その結果は、ＰＭＳ１３４変異体が実際に強固な優性ネガティブ効果を発揮できたこと示し、ＭＭＲ欠陥の生化学的および遺伝的徴候もたらすことを示した。意外にも、全長ＰＭＳ２も低いＭＭＲ活性をもたらし、一方空ベクターを含む細胞内では効果が見られないという知見が得られた。本方法の簡単な説明を以下に記載する。
【００５４】
ＭＭＲ活性を評価するために、ＭＭＲに慣れたマウスＨ３６ハイブリドーマ細胞系統を種々のｈＰＭＳ２発現プラスミド細胞系統にレポーター構築物を加えて用いてトランスフェクションした。クローニング部位の上流に延伸因子プロモーター、その後に哺乳動物ポリアデニル化シグナルを含むｐＥＦ発現ベクター内にＭＭＲ遺伝子をクローニングした。このベクターは、このプラスミドを保持する細胞の選択を可能とするＭＥＯｒ遺伝子も含んでいる。要約すると、製造者のプロトコールに従い（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） 、ポリリポソームを用いてそれぞれのベクター１μｇで細胞をトランスフェクションした。次いで、Ｇ４１８の０．５ｍｇ／ｍｌ中で１０日間細胞を選択し、そしてＧ４１８耐性細胞を遺伝子発現を分析するために一緒にプールした。ｐＥＦ構築物は、ＥＦ遺伝子のエキソン１をエキソン２から分離するイントロンを含み、これをポリリンカークローニング部位の５’末端に近接している。これはスプライスされた産物を発現する細胞に関して迅速な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）スクリーニングを可能とする。１７日目に、細胞１００，０００個を単離しそしてこれらのＲＮＡを以前に記載されたトリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）法を用いて抽出した（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ Ｎ．Ｃ．， Ｋｉｎｚｌｅｒ， Ｋ．Ｗ． ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ． （１９９５） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳ２ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：３２９−３３４）。スーパースクリプトＩＩ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡを逆転写しそして、公開されたヒトＰＭＳ２  ｃＤＮＡのｎｔ２８３に中心があるＥＦ遺伝子のエキソン１内に位置するセンスプライマー（５’−ｔｔｔ ｃｇｃ ａａｃ ｇｇｇ ｔｔｔ ｇｃｃ ｇ−３’） およびアンチセンスプライマー（５’−ｇｔｔ ｔｃａ ｇａｇｔｔａ ａｇｃ ｃｔｔ ｃｇ−３’）を用いてＰＣＲ増幅し、これは全長ならびにＰＭＳ１３４遺伝子発現の双方を検出した。反応は、以前に記載した緩衝液および条件を用いて行い（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ， Ｎ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＰＭＳ２ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６）、下記の増幅パラメーターを使用した：９４℃で３０秒間、５２℃で２分間、７２℃で２分間を３０サイクル。反応はアガロースゲル上で分析した。図１は、安定に形質導入されたＨ３６細胞内のＰＭＳ発現の代表的な例を示す。
【００５５】
これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は、以前に記載された方法に従ってタンパク質のＮ−末端中に位置する最初の２０アミノ酸に指向するポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットを介して確認した（データは記載せず）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＣａｎＣｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８：１６３５−１６４１）。
【００５６】
実施例２：ｈＰＭＳ１３４はハイブリドーマ細胞中にＭＭＲ活性欠陥および超変異性を起こす
ＭＭＲ欠陥の特質は、宿主細胞ゲノム内の不安定なマイクロサテライト反復の生成である。この表現型は、マイクロサテライト不安定性（ＭＩ）と呼ばれる（Ｍｏｄｒｉｃｈ， Ｐ． （１９９４） Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ， ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１９５９−１９６０； Ｐａｌｏｍｂｏ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ ３６：４１７） 。ＭＩは、宿主細胞の全ゲノムを通じて反復的モノ−、ジ−および／またはトリ  ヌクレオチド反復配列内の欠失および／または挿入より成る。真核細胞の広範な遺伝子分析は、ＭＩ産生が可能な生化学的欠陥のみが欠陥ＭＭＲであることを見いだした（Ｓｔｒａｎｄ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ  Ｎａｔｕｒｅ ３６５：２７４−２７６； Ｐｅｒｕｃｈｏ， Ｍ． （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ， Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ３７７：６７５−６８４； Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ．， ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ， Ｓ．Ｄ．（１９９６） Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｈｕｍ．Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ５： １４８９−４９４）。欠陥ＭＭＲがＭＩ促進に対して有するこの独特の特徴を考慮して、宿主細胞内のＭＭＲ活性の欠失に関して研究するための生化学的マーカーとしてこれが今では使用されている（Ｐｅｒｕｃｈｏ， Ｍ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７７：６７５−６８４）； Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ． ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ， Ｓ．Ｄ．（１９９６） Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ５：１４８９−４９４；Ｌｉｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２７：１７−２５）。
【００５７】
真核細胞中のＭＭＲ欠陥を検出するために使用される方法は、フレームシフトによりそのリーディングフレームを破壊するコーディング領域内に挿入されたポリヌクレオチド反復を有するレポーター遺伝子を使用するものである。ＭＭＲが欠陥性である場合に、レポーター遺伝子は、オープンリーディングフレームを有するレポーターを含むクローンを生成するポリヌクレオチド反復内にランダム変異（すなわち挿入および／または欠失）を取得する。我々は、ＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２、およびＨＢＰＭＳ１３４細胞内のＭＭＲ活性を測定するためにＭＭＲ−感受性レポーター遺伝子の使用を利用した。レポーター構築物は、ハイグロマイシン耐性（ＨＹＧ）遺伝子およびそのコーディング領域の５’末端に２９ｂｐのアウトオブフレーム（ｏｕｔ−ｏｆ ｆｒａｍｅ）ポリ−ＣＡ領域を含むβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むｐＣＡＲ−ＯＦを用いた。ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターは、フレーム回復変異（すなわち挿入または欠失）がトランスフェクションの後に起きない限り、β−ガラクトシダーゼ活性を生成しない。実施例１記載のプロトコールに従い、複製反応においてｐＣＡＲ−ＯＦベクターを用いてＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２、およびＨＢＰＭＳ１３４細胞をトランスフェクションした。ＭＭＲエフェクターおよびｐＣＡＲ−ＯＦレポータープラスミドの双方を保持する細胞を選択するために０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４８１および０．５ｍｇ／ｍｌ  ＨＹＧ中で細胞を選択した。ｐＣＡＲベクターを用いてトランスフェクションしたすべてのカルチャーは、同様の数のＨＹＧ／Ｇ４８１耐性細胞をもたらした。次いでカルチャーを増大しそしてその場（ｉｎ ｓｉｔｕ） および／または細胞抽出液の生化学的分析によりβ−ガラクトシダーゼ活性を試験した。その場での分析のために、細胞１００，０００個を採取しそして１％グルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）中に固定し、リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、２４−ウエルプレート中のＸ−ｇａｌ基質溶液〔０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．３ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、３．３ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．２％Ｘ−ｇａｌ〕１ｍｌ中で２時間、３７℃でインキュベーションした。５００ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液中で反応を停止しそして分析のために顕微鏡スライドに移した。それぞれ細胞２００個の３視野で青色（β−ガラクトシダーゼ陽性細胞）または白色（β−ガラクトシダーゼ陰性細胞）を計数してＭＭＲ不活性化を評価した。表１は、これらの研究よりの結果を示す。β−ガラクトシダーゼ陽性細胞がＨＢｖｅｃ細胞中では観察されなかったが、視野あたりに細胞の１０％がＨＢ１３４カルチャー中でβ−ガラクトシダーゼ陽性でありそして視野あたりに細胞の２％がＨＢＰＭＳ２カルチャー中でβ−ガラクトシダーゼ陽性であった。
【００５８】
細胞抽出液を上記のカルチャーより調製して、以前の記載のようにして定量的生化学アッセイを用いてβ−ガラクトシダーゼを測定した（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ（１９９８） Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ ＮｅｇａｔｉｖｅＭｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８：１６３５−１６４１； Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ， Ｎ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｔｈｅ Ｊｕｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ， ｃ−ＪＵＮ ａｎｄ ＪＵＮＤ， ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｈｕｍａｎｃ−ｍｙｂ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｉａ ａｎ Ａｐ１ ｌｉｋｅ ｅｌｅｍｅｎｔ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１９６６５−１９６７２）。要約すると、細胞１００，０００個を採取、遠心分離しそして０．２５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ８．０の２００μｌ中に再懸濁した。細胞を３回冷凍／解凍して溶解しそして上清を１４，０００ｒｐｍでミクロ遠心分離して採取して細胞残差を除いた。タンパク質含有量は、ＯＤ２８０ での分光分析により決定した。生化学的アッセイのために、４５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＰＯ４、および０．６ｍｇ／ｍｌクロロフェノール  レッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ 、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） を含む緩衝液にタンパク質２０μｇを加えた。反応物を１時間インキュベーションし、０．５ＭＮａ２ＣＯ３を加えて停止し、そして５７６ｎｍで分光法により分析した。Ｈ３６細胞溶解液をバックグラウンドを差し引くために使用した。図２は、種々の細胞系統からの抽出液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。図示のように、ＨＢ１３４細胞が最高量のβ−ガラクトシダーゼを産生し、一方ｐＣＡＲ−ＯＦを含むＨＢｖｅｃ細胞内には活性が認められなかった。これらのデータは、優性ネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子を用いるＭＭＲ欠陥ハイブリドーマ細胞生成の能力を実証する。
【００５９】
表１．ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターベクターを用いてトランスフェクションされたＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２、およびＨＢ１３４細胞のβ−ガラクトシダーゼ発現。細胞はｐＣＡＲ−ＯＦβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドを用いてトランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞をハイグロマイシンおよびＧ４１８中で選択しそしてＸ−ｇａｌ溶液を用いて染色してβ−ガラクトシダーゼ活性（青色細胞）を測定した。それぞれ細胞２００個の３視野で、顕微鏡により分析した。下の結果は、これらの実験の＋／−標準偏差を示す。
各クローンにより産生。５００ｍＭ重炭酸ナトリウム５０μｌを加えて反応を停止しそしてバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）プレートリーダーを用いて４１５ｎｍにおけるＯＤにより分析した。次いでバックグラウンド細胞（Ｈ３６対照細胞）を越える強いシグナルを示すクローンを単離しそして特性検討およびＥＬＩＳＡデータの追加の確認のために３回の実験において１０ｍｌカルチャーに増大した。ＥＬＩＳＡは、同じクローンよりの条件調整（ＣＭ）に基づいても行い、それぞれのウエルの条件調整した媒体内での全Ｉｇ産生を測定した。次いで増加したＥＬＩＳＡシグナルを生成しそして増加した抗体レベルを有するクローンをさらに実施例４に記載のようにして抗体を過剰発現および／または過剰分泌する変種に関して分析した。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４細胞からのそれぞれの５個の９６−ウエルプレートの分析は、ＨＢｖｅｃ対照と比較して、さらに高い光学密度（ＯＤ）値を有するクローンの著しい数が、ＭＭＲ欠陥ＨＢ１３４細胞中に観察されることを見いだした。図４は、さらに高い親和性で特定の抗原（この場合にはＩｇＥ）に結合する抗体を産生するＨＢ１３４クローンの代表的な例を示す。図４は、１）ＩｇＥ抗原への増加した結合に導く抗体可変ドメインの遺伝子改変、または２）抗体分子の過剰産生／分泌に導く細胞宿主の遺伝子改変による、さらに高いＯＤ読みを有するＨＢ１３４プレートよりの２クローンを示すＨＢｖｅｃ（左図）またはＨＢ１３４（右図）の９６ウエルの分析からの粗データを示す。抗−Ｉｇ  ＥＬＩＳＡは、図４に示す２種のクローンが、より低いＯＤ値を示す周囲のウエルと同様にそれらのＣＭ内でＩｇレベルを有することを見いだした。これらのデータは、抗体の抗原結合ドメイン内に遺伝子改変が起こり、これらはさらにより高い抗原への結合を可能とすることを示唆する。
【００６０】
ＥＬＩＳＡにより決定されたより高いＯＤ値を生成するクローンをさらに遺伝子レベルに関して分析して、軽鎖または重鎖可変領域内の変異が起き、これはより高い結合親和性に導き、これによりより強いＥＬＩＳＡシグナルを生成することを確認した。要約すると、細胞１００，０００個を採取しそして上記のトリアゾール法を用いてＲＮＡを抽出した。製造者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） の示唆のようにしてスーパースクリプトＩＩを用いてＲＮＡを逆転写しそして可変軽鎖および重鎖内に含まれる抗原結合部位に関してＰＣＲ増幅した。これらの遺伝子の異質性のために、親Ｈ３６株から軽鎖および重鎖対立遺伝子を増幅するために下記の縮重プライマーを使用した。
軽鎖センス：５’−ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ−３’（配列番号１）
軽鎖アンチセンス：５’−ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ
ＧＧＡ−３’（配列番号２）
重鎖センス：５’−Ａ（Ｇ／Ｔ）ＧＴＮ（Ａ／Ｃ）ＡＧ  ＣＴＮ  ＣＡＧ  （Ｃ／Ｇ）ＡＧ  ＴＣ−３’（配列番号３）
重鎖アンチセンス：５’−ＴＮＣ  ＣＴＴ  Ｇ（Ａ／Ｇ）Ｃ  ＣＣＣ  ＡＧＴ
Ａ（Ｇ／Ａ）（Ａ／Ｔ）Ｃ−３’（配列番号４）
縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間、５２℃で１分間、および７２℃で１分間の３５サイクルで行う。産物はアガロースゲル上で分析する。予想した分子量の産物をジーンクリーン（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ， Ｂｉｏ １０１） によりゲルより精製し、Ｔ−末端ベクター中にクローニングし、そして可変軽鎖および重鎖の野生型配列を同定するために配列決定した。野生型配列が決定されると、非縮重プライマーを陽性ＨＢ１３４クローンのＲＴ−ＰＣＲ増幅のために作製した。軽鎖および重鎖の双方を増幅、ゲル精製しそして相当するセンスおよびアンチセンスプライマーを用いて配列決定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定は、内因性免疫グロブリン遺伝子の代表的な配列データを与えそしてＰＣＲ誘導変異によるものではなかった。次いでクローンからの配列を配列比較のための野生型配列と比較した。免疫グロブリン軽鎖または重鎖内に生体内変異を創成するための能力の例を図５に示し、ここでＨＢ１３４クローン９２がｈＩｇＥの高いシグナルを有することがＥＬＩＳＡにより特定された。軽鎖を特異性センスおよびアンチセンスプライマーを用いて増幅した。軽鎖をＲＴ−ＰＣＲ増幅しそして得られた産物を精製しそして自動化ＡＢＩ３７７配列決定装置により分析した。クローンＡで示されるように、ＣＤＲ領域３の−４上流の残基は、ＡＣＴからＴＡＴへの遺伝子変化を有し、これはＣＤＲ＃３の直前のフレームワーク領域内でＴｈｒからＳｅｒへの変化をもたらす。クローンＢでは、ＣＤＲ領域の−６上流の残基はＣＣＣからＣＴＣへの変化を有し、これはＣＤＲ＃２の前のフレームワーク領域内でＰｒｏからＨｉｓへの変化をもたらす。
【００６１】
免疫グロブリン遺伝子またはキメラ免疫グロブリン遺伝子内にランダム変異を生成する能力は、ハイブリドーマに限定はされない。ニコライデスら（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８：１６３５−１６４１）は、以前に、超変異性ハムスター細胞を生成し、内因性遺伝子内に変異を生成する能力を示した。ヒト化抗体を産生するための共通の方法は、ヒトＩｇ骨格上にＭＡｂ（げっ歯類宿主を免疫化して作製）からのＣＤＲ配列をグラフトし、そしてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内にキメラ遺伝子をトランスフェクションし、これは一方ではＣＨＯ細胞による分泌される機能性Ａｂを産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ， Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０７：４１２−４１３） 。本応用内で記載された方法は、宿主細胞、例えばげっ歯類細胞系統、植物、酵母および原性生物内にトランスフェクションされたＩｇ遺伝子またはキメラＩｇ内に遺伝子改変を生成するためにも有用である（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ａｓｓｅｍｂｌｙ， ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ， ａｎｄ ｖａｃｕｏｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ， Ｐｌｎａｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３：１４８３−１４９４）。
【００６２】
これらのデータは、超変異性ハイブリドーマ、または培養および選択できるその他のＩｇ産生宿主細胞を生成し、増強された生化学的性質を有する抗体を得る構造的に改変された免疫グロブリンを同定し、増加した抗原結合親和性を含み、これらに限定はされない能力を実証する。さらに、アミノ酸変化または多数の変化をもたらす免疫グロブリン遺伝子内のミスセンス変異を含む超変異性クローンは、次いでさらに生体内安定性、抗原クリアランス、抗原へのオン−オフ結合などを特徴とすることができる。クローンは、生体内変異の続くラウンドのためにさらに増大できそして以上に表記した戦略を用いてスクリーニングできる。
【００６３】
細胞または全生体内に遺伝子変異を生成するための化学的変異原の使用は、これらの薬剤が「正常」の細胞上に有する毒性効果により限定される。化学的変異原、例えばＭＮＵのＭＭＲ欠陥生物体内での使用はさらに許容性であり、ＭＭＲ欠陥単独よりも遺伝子変異において１０〜１００倍増加を得る（Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ， （２０００）Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ： ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ． Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．４６２：７１−８２）。この戦略は、改変された生化学的性質、例えば抗原への増強された結合親和性などを有する機能性Ａｂを得る免疫グロブリン遺伝子またはキメラ中の追加的な変異を増加するための方法として、ＭＭＲ−欠陥Ａｂ産生細胞内に使用される化学変異原の使用を許容する。
【００６４】
実施例４：増強された抗体産生を有する抗体産生細胞の作製
上記に表記したスクリーニング戦略の後のＨ３６およびＨＢ１３４よりのクローンの分析は、増強された量の抗体を媒体内に産生する著しい量のクローンを同定した。可変領域内に含まれる抗原結合ドメイン内の変異の結果として、これらのクローンのサブセットは、ＥＬＩＳＡにより測定してより高いＩｇ結合データを与えたが、他のものは「増強された」抗体産生を含むことが見いだされた。分泌されたＭＡｂの増強された量を産生するクローンの纏めを表２に示し、この表で、Ｈ３６対照細胞と比較して、ＨＢ１３４細胞からのクローンのかなりの数が、条件調整した媒体内で増強されたＡｂ産生を生成することが見いだされた。
【００６５】
表２．抗体の高いレベルを産生するハイブリドーマ細胞の作製。上昇したＩｇレベルがＥＬＩＳＡによりＨＢ１３４クローンでアッセイされた。４８０クローンの分析は、クローンのかなりの数がこれらのＣＭ中で上昇したＭＡｂ産生を有することを示した。定量すると、増強された発現または分泌のいずれかにより、Ｈ３６細胞系統からのクローンと比較して、これらのクローンの数種がＭＡｂの５００ｎｇ／ｍｌ以上を産生したことを示した。
【００６６】
【表１１】
2004529613.tif 000012
【００６７】
増加した産生が、単に抗体を形成するポリペプチドの過剰発現に導くであろうＩｇ座における遺伝子改変によるのか、または分泌経路機構に影響する遺伝子改変による増強された分泌によるものかを決定するために、条件調整した媒体（ＣＭ）内のより高いＭＡｂレベルを有するＨＢ１３４クローンの細胞分析を解析した。この問題に取り組むために、我々はそれらのＣＭ内に抗体の増加したレベルを有する３種のＨＢ１３４クローンを増大した。１０，０００個の細胞をウエスタンブロット分析のために調製して、細胞内定常状態Ｉｇタンパク質レベルをアッセイした（図６）。さらに、Ｈ３６細胞を標準基準として使用し（レーン２）そしてげっ歯類繊維芽細胞（レーン１）をＩｇ陰性対照として使用した。要約すると、細胞を遠心分離によりペレット化し、そしてＳＤＳ溶解緩衝液（６０ｍＭトリス、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）３００μｌ中で直接溶解しそして５分間煮沸した。溶解タンパク質を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル上で電気泳動により分離した（Ｉｇ重鎖の分析のため）。４８ｍＭトリス塩基、４０ｍＭグリシン、０．０３７５％ＳＤＳ、２０％メタノール中のインモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ） −Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ） 上にゲルをエレクトロブロットし、そして０．０５％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ） −２０および５％濃縮牛乳を加えたトリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中、室温で１時間ブロックした。ＴＢＳ緩衝液中のヒツジ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ共役モノクローナル抗体の１：１０，０００希釈液を用いてフィルターをプローブしそしてスーパーシグナル（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ）基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて化学発光法により検出した。実験を２回繰り返して再現性を確認した。図６は代表的な再現性試験を示し、ここで、クローンのサブセットは増加したＡｂ産生を示す増強されたＩｇ産生を有し（レーン５）一方他のものは対照試料と同様の定常状態レベルを有していたが、しかしＣＭ内でＡｂのさらに高いレベルを有していた。これらのデータは、ＨＢ１３４クローンのサブセットが遺伝子改変を含み、これは一方で抗体の高い分泌を生成する機構を示唆する。
【００６８】
細胞または全生体内に遺伝子変異を生成するための化学的変異原の使用は、これらの薬剤が「正常」の細胞上に有する毒性効果により限定される。化学的変異原、例えばＭＮＵのＭＭＲ欠陥生物体内での使用はさらに許容性であり、ＭＭＲ欠陥単独よりも遺伝子変異において１０〜１００倍増加を得る（Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ， （２０００）Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ： ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ． Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．４６２：７１−８２）。この戦略は、改変された生化学的性質、例えば抗原への増強された結合親和性などを有する機能性Ａｂを得る免疫グロブリン遺伝子またはキメラ中の追加的な変異を増加するための方法として、ＭＭＲ−欠陥Ａｂ産生細胞内に使用される化学変異原の使用を許容する。
【００６９】
実施例５：新規のアウトプット形質を有するハイブリドーマ細胞内の遺伝子安定性の確立
ＭＭＲの最初の段階は、ＭｕｔＳαおよびＭｕｔＬαと呼ばれる２種のタンパク質複合体に依存する（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８：１６３５−１６４１） 。優性ネガティブＭＭＲ対立遺伝子は、「修正」されたヌクレオチドを含んでなるヌクレオチドの切除および重合に関与する下流生化学物質とのこれら複合体の形成を攪乱することができる。この用途からの実施例は、ハイブリドーマ細胞系統内に発現された場合の末端短縮したＭＭＲ対立遺伝子（ＰＭＳ１３４）ならびに全長ヒトＰＭＳ２の能力が、細胞分裂あたりのその全ゲノムを通じて遺伝的改変を獲得する超変異性細胞系統をもたらすＭＭＲをブロックすることができることを示す。抗体、単鎖抗体、免疫グロブリン遺伝子の過剰発現および／または抗体の増強された分泌をコードする遺伝子内に遺伝的改変を含む細胞系統が一旦産生されると、細胞宿主のゲノムの原状を回復することが望ましい。これは、誘導性ベクターの使用により達成され、これにより優性ネガティブＭＭＲ遺伝子がかかるベクター内にクローンされ、Ａｂ産生細胞内に導入されそして細胞はインデューサー分子および／または条件の存在下で培養される。誘導性ベクターには、化学調節されたプロモーター、例えばステロイド誘導性ＭＭＴＶ、テトラサイクリン調節されたプロモーター、温度感受性ＭＭＲ遺伝子対立遺伝子、および温度感受性プロモーターが含まれ、これらに限定はされない。
【００７０】
上記の結果は、いくつかの結論に導く。第一に、ｈＰＭＳ２およびＰＭＳ１３４の発現は、ハイブリドーマ細胞内のマイクロサテライト不安定性の増加をもたらす。この上昇したマイクロサテライト不安定性がＭＭＲ欠陥によることは、安定に導入された細胞からの抽出液の評価により証明された。ＰＭＳ１３４の発現は、ＭＭＲ中の極性欠陥をもたらし、これは５’方向からの修復を試験するために設計されたヘテロ二本鎖を用いてのみ観察された（同じ抽出液中で３’方向からの修復に著しい欠陥は観察されなかった）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８：１６３５−１６４１） 。興味あることに、ｈＭＬＨ１中の細胞欠陥もＭＭＲ内の極性欠陥を有するが、しかしこの場合には３’方向からの修復に優先的に影響する（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ， Ｊ．Ｔ， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｅｔＬａ ａｎｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：９６４５−１９６４８） 。原核および真核生物双方における以前の研究より、分離された酵素成分が２種の方向からの修復を媒介することが知られている。我々の研究は、ドルモンドらのものと組み合わせて（Ｓｈｉｅｌｄｓ， Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０７：４１２−４１３）、５’修復がｈＰＭＳ２に主として依存し、一方３’修復はｈＭＬＨ１に主として依存するモデルを強く示唆する。ＰＭＳ２とＭＬＨ１の間の二量複合体がこの方向性をどのように設定するかは容易に想像される。この組み合わせた結果は、方向性ＭＭＲにおける欠陥が、ＭＭＲ欠陥表現型を生成するために十分であることを実証しそしてあらゆるＭＭＲ遺伝子対立遺伝子が、遺伝子改変ハイブリドーマ細胞、またはＩｇ遺伝子産物を産生する細胞系統を生成するために有用であることを示唆する。さらに、かかるＭＭＲ対立遺伝子の使用は、改変された生化学的性質を有する遺伝的改変Ｉｇポリペプチドならびに抗体分子の増強された量を産生する細胞宿主を生成するために有用であろう。
【００７１】
本応用で教示される他の方法は、ＭＭＲをブロックするために使用されるあらゆる方法が、増強された生化学的特徴、例えば、これらに限定はされないが、増加した抗原結合、増強された薬動力学的プロフィールなどを有する遺伝子改変抗体に導くことができる抗体産生細胞内に超変異性を生成するように挙動できる。これらのプロセスは、実施例４、図６に示した増加したＩｇ発現および／または表２に示した増加した抗体分泌を有する抗体産生細胞を作製するためにも使用できる。
【００７２】
さらに、我々は、改変された生化学的特徴、例えば、これらに限定はされないが、増加した抗原結合親和性（図５Ａおよび５Ｂ）に導くであろうＩｇ遺伝子内の遺伝的改変を増加するために抗体産生細胞内のＭＭＲをブロックする利用法を実証する。かかる細胞内のＭＭＲのブロックは、細菌、酵母、原生動物、昆虫、げっ歯類、霊長類、哺乳動物細胞、およびヒトを含むあらゆる種よりの優性ネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子の使用を介して可能である。ＭＭＲのブロックは、ＭＭＲ生化学経路内に含まれるいずれかの遺伝子に指向するアンチセンスＲＮＡまたはデオキシヌクレオチドの使用を介してでも生成できる。ＭＭＲのブロックは、抗体を含みこれに限定はされないＭＭＲ複合体のサブユニットを用いて干渉するポリペプチドの使用を介して可能である。最後に、ＭＭＲのブロックは、ＭＭＲをブロックすることが知られている化学薬品、例えば、これらに限定はされないが、非加水分解性ＡＴＰ類似体の使用を介してでもよい（Ｇａｌｉｏ，Ｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） ＡＴＰ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｔｅｒｎａｒｙ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ＭｕｔＳ ａｎｄ ＭｕｔＬ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：２３２５−２３２３１） 。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰＭＳ２およびＰＭＳ１３４  ＭＭＲ遺伝子を安定に発現するハイブリドーマ細胞。げっ歯類ハイブリドーマ細胞系統内にトランスフェクションしたＭＭＲ遺伝子の定常状態ｍＲＮＡ発現を示す。安定な発現は、３カ月の連続成長後に見いだされた。（−）レーンは、逆転写酵素が添加されなかった陰性対照を示し、そして（＋）レーンは逆転写されそしてＭＭＲ遺伝子についてＰＣＲ増幅された試料および対照として内部ハウスキーピング遺伝子を示す。
【図２】
遺伝的超変異性ハイブリドーマ細胞の創成。優性ネガティブＭＭＲ遺伝子対立遺伝子をＭＭＲ−感受性レポーター遺伝子を発現する細胞内に発現した。優性ネガティブ対立遺伝子、例えばＰＭＳ１３４および他の種よりのＭＭＲ遺伝子の発現は、増強された生化学的特徴を有する遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子を産生するために使用できる超変異性表現型を有する抗体産生細胞ならびに増加したＩｇ発現および／または分泌を有する系統をもたらす。図示の値は、ｐＣＡＲ−ＯＦレポーター遺伝子内の遺伝子改変よりの細胞内に含まれる機能性□−ガラクトシダーゼの量を反映する変換されたＣＰＲＧ基質の量を示す。β−ガラクトシダーゼ活性の高い量は、欠陥ＭＭＲによるさらに高い変異速度を反映する。
【図３】
増加した結合活性および／または増加した発現／分泌を有する抗体を含む抗体産生細胞を同定するためのスクリーニング法。
【図４】
増加した結合活性を有する遺伝子改変抗体の生成。ｈＩｇＥに特異性の抗体についてスクリーニングした９６ウエルプレートよりのＥＬＩＳＡ値を示す。高い結合値を有するクローン２個がＨＢ１３４カルチャー内で見いだされた。
【図５】
抗体の可変鎖内の配列改変（ＭＭＲ欠陥ＨＢ１３４抗体産生体細胞内の軽鎖可変領域内の変異）。矢印は、ＨＢ１３４細胞より誘導されたクローンからの細胞のサブセット内で変異が起きたヌクレオチドを示す。パネルＡ：変化は軽鎖可変領域内でＴｈｒからＳｅｒへの変化をもたらす。コード配列はアンチセンス方向である。パネルＢ：変化は、軽鎖可変領域内でＰｒｏからＨｉｓへの変化をもたらす。
【図６】
増強された定常状態Ｉｇタンパク質レベルを有するＭＭＲ−欠陥クローンの生成。条件調製媒体内でのＭＡｂの高いレベル（＞５００ｎｇ／ｍｌ）を有するＨＢ１３４クローンからの重鎖免疫グロブリンのウエスタンブロットは、クローンの一つのサブセットが免疫グロブリン（Ｉｇ）のさらに高い定常状態レベルを発現することを示す。Ｈ３６細胞系統は、親株内の定常状態レベルを測定するための対照として使用した。レーン１：繊維芽細胞（陰性対照）、レーン２：Ｈ３５細胞、レーン３：高いＭＡｂレベルを有するＨＢ１３４クローン、レーン４：高いＭＡｂレベルを有するＨＢ１３４クローン、レーン５：高いＭＡｂレベルを有するＨＢ１３４クローン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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