(57)【要約】本発明は、腸の炎症過程およびこれに関連する症状を経口的または直腸的に治療するための、ＬＰＳまたはその誘導された変異体、特にＥ．ＣｏｌｉｌからのＬＰＳの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸の炎症過程を経口的または直腸的に治療するための、ＬＰＳおよび／またはその誘導された変異体の使用。
【請求項２】
アゴニストＬＰＳを使用する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｅ．ＣｏｌｉからのＬＰＳを使用する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
血清型  Ｏ２：Ｋ１：Ｈ６のＥ．ＣｏｌｉからのＬＰＳを使用する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
血清型  Ｏ２：Ｋ１：Ｈ６のＥ．ＣｏｌｉからのＬＰＳとして、ラベス株１９３１を使用する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
経口投与の際の投与量が、０．０５ｎｇ／ｋｇ／ｄ〜１００μｇ／ｋｇ／ｄであり、好ましくは１ｎｇ／ｋｇ／ｄ〜１０μｇ／ｋｇ／ｄである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
感染反応による腸の炎症過程の際におこなわれる、請求項１から６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
毒性作用、特に化学的毒素による腸の炎症過程の際におこなわれる、請求項１から６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
自己免疫疾患による腸の炎症過程の際におこなわれる、請求項１から６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
種々の原因による大腸炎または腸の炎症によるアレルギー反応の際におこなわれる、請求項１から６までのいずれか１項の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腸の炎症過程を治療するためのＬＰＳの使用に関する。本明細書中において以下のＬＰＳは、天然由来のものおよび合成的または半合成的に製造された変異体であると解される。
【０００２】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、脂質成分であるリピドＡおよびこれらの膜ドメインと共有結合した多糖体部分とから成る。この多糖体領域は、下部構造が、多くとも２〜８個のモノマーからの反復するオリゴ糖単位  ５０個までから成る、末端Ｏ−特異鎖と、リピドＡに結合するコア領域との組み合わせからなる：
Ｏ鎖−コア領域−リピドＡ
このＯ−特異鎖は、異なる種における極めて高い構造多様性によって特徴付けられる。このリピドＡ部分は、以下に記載された生物学的作用のために重要である。リピドＡのアシル化パターンのバリエーションによって、生物学的作用が調節される。これは、主に天然由来のＬＰＳ−変異株（たとえば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｆｒｉｅｄｅｎａｕまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉ）で生じるようなアゴニスト作用から、植物共生細菌微生物のＬＰＳ−変異体または合成された誘導体のアンタゴニスト作用までに達する（Ｃ． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｕｎｄ Ｅ． Ｔｈ． Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ， Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ ４，９９５ Ｊａｈｒｇａｎｇ １９９９， Ｓ． ２７５−２８１）。さらにＬＰＳの広範な記載は、Ｗｉｅｓｅ，Ａ；Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｋ．；Ｕｌｍｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｓｅｙｄｅｌ，Ｕ．；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｌｅｏｅｎｎｉｅｓ，Ｓ．Ｔｈｅ  ｄｕａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒａｉｄｅ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０，Ｓ．７６７−７８４でみられる。
【０００３】
リポ多糖は、グラム陰性細菌によって形成される、先天性免疫の高ポテンシャル刺激物質である。これは、ヒト単核細胞上のＴＬＲ４−／ＣＤ１４−レセプターに結合し、かつ、
前炎症性サイトカイン、たとえば、ＴＮＦα、ＭＩＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８
種々のコロニー刺激因子
種々の脂質伝達物質および
還元酸素群
の形成または分泌を誘発する。
【０００４】
さらに、ＬＰＳは、アナフィラトキシン  Ｃ５ａおよびＣ３ａの遊離下で、補体カスケードの、迅速に開始される、抗体非依存的活性化を生じる。ヒト  Ｔ−リンパ球は、ＩＬ−２およびＩＦＮの増殖および産生を刺激する（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ， １９９９）。炎症反応のさらなる経過において、急性期タンパク質の形成が誘発される。
【０００５】
これらの機序によって、リポ多糖は、非特異的免疫応答を活性化させ、微生物、細菌および腫瘍細胞を良好に減少させることができる。サイトカインおよび脂質伝達物質のＬＰＳ誘発的産生の結果として、さらに、炎症、発熱および敗血症といった現象が誘導される。敗血症の場合にはＬＰＳの毒性作用から、アゴニストＬＰＳはまたエンドトキシンと呼称される。
【０００６】
敗血症を治療するためのＬＰＳ−アンタゴニストおよび免疫学的腫瘍根絶を強化するためのＬＰＳ−アゴニストの使用は、種々の刊行物の対象となっている（Ｇｒｉｍｍｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎｉｓｔ ３８， ５４１−５５２， １９９７， Ｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １４， １１９５−１２０１， １９５４）。
【０００７】
炎症は、機械的または化学的刺激による組織障害の結果として、感染による反応として、さらには免疫不全反応（自己免疫障害／慢性炎症性障害）の結果として生じうる。急性炎症は、触発因の排除、すなわち、組織障害の際の細胞または感染の際の病原菌を溶解することによって停止させることができる。慢性炎症は、触発された病原体を排除することができない場合か、または免疫応答が独立し、すなわち、生体固有の抗原（ｋｏｅｒｐｅｒｅｉｇｅｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎｅ）かまたは至る所に存在する腸内フローラでの攻撃を含む自己免疫疾患を生じる場合に引き起こされる。
【０００８】
すべての炎症反応の中心的な出来事は、炎症源への白血球の移行である。この補充された白血球は、前炎症性物質、透過性増加物質および有害物質を放出するかまたは他の細胞（サイトカイン、酵素、伝達物質、プロスタグランジン、酸素ラジカル）によってこれらの物質の拡散を触発する。これらは高められた血流量ならびに免疫細胞の活性化および高められた流量を導き、この場合、これは、病原体の排除および分解生成物の運搬に関与する。種々の成長因子、その中でもサイトカインは、組織細胞の増殖を促進し、したがって治療経過を促進させる。
【０００９】
しかしながら炎症過程が進行するにつれて、さらに健康な細胞が攻撃され、これによって組織障害が引き起こされ、慢性の炎症になった場合には、結果として組織の変性が生じる［Ｇｅｍｓａ ｕｎｄ Ｒｅｓｃｈ， １９９７］。腸粘膜の炎症は、さらに腸壁でのアレルゲンおよび食物抗原の増殖を引き起こす。その結果、これらのエピトープに対して過度に高められた免疫応答が生じる。これによって活性化されたＴ−リンパ球は、リンパ系を循環し、粘膜および皮膚領域に戻る［Ｋａｎｔｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８６］［Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７］［Ｗｅｎｎｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４］［Ｈｏｌｍｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９］［Ｓｚｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４］［Ｋａｎｔｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。ここで、同様のエピトープまたは交差反応性エピトープが出会った場合には、局所的かまたは全身的なアレルギー反応、たとえば、蕁麻疹を伴う食物アレルギー、喘息、アレルギー性鼻炎または神経皮膚炎を生じる。したがって、腸の炎症、高い透過性およびアレルギー疾患において直接的な関連性が存在する［Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ， １９９９］［Ｍａ， １９９７］［Ｆｉｎｋ， ２００１］［Ｎｅｋａｍ， １９９８ａ］［Ｎｅｋａｍ， １９９８ｂ］［Ｐｅｎａ， １９９８］［Ｓａｌｍｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６］［Ｍａｊａｍａａ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｕｒｉ， １９９７］［Ｄｕｐｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９８９］［Ｍａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６］。詳細に関してはこれらの文献中に教示されている。したがって、根本的治療のために、腸の炎症の排除は、腸の炎症反応が病原性アレルギー疾患にかかわる場合にはより重要になる。
【００１０】
グラム陰性細菌による感染の場合に、リポ多糖は急性炎症の重要な触発因である。したがって、これまで、ＬＰＳは炎症過程を増強させるものであるとされてきた。
【００１１】
しかしながら、今日では全く異なり、微生物から抽出されたＬＰＳまたは合成的または半合成的に製造されたＬＰＳが、腸の炎症過程を治療するための優れた薬剤であることが確認された。
【００１２】
ＬＰＳはすべてのグラム陰性微生物から抽出され、かつ合成的に誘導することができる。
【００１３】
この物質の有効投与量は、０．０５ｎｇ／ｋｇ／ｄから約１００μｇ／ｋｇ／ｄであり、経口投与の場合には好ましい投与量は約１ｎｇ／ｋｇ／ｄ〜１０μｇ／ｋｇ／ｄである。したがって、経口投与におけるＬＰＳは、非経口的投与とは対照的に毒性がごくわずかであることにより優れており、これによって大きい治療の幅が提供される。さらに高い投与量での経口投与の場合であっても今日まで副作用は確認されていない。
【００１４】
ＬＰＳの使用は、好ましくは経口的または直腸的に、たとえば、溶液、粉末、顆粒、ペレット、カプセル剤、糖衣錠、坐剤または浣腸の形でおこなわれる。さらにＬＰＳは、ＬＰＳを産生するかまたは過剰に産生する、非病原性の腸内細菌を経口的に投与することによって、作用部位である粘膜に運搬することができる。経皮的、局所的または腸管外的の使用も可能であるが、この場合には、治療の幅は明らかに制限される。
【００１５】
溶剤として使用する場合には、ペプトンに類似する、両親媒性の水溶性物質、たとえば、脂肪酸誘導体および脂質誘導体を有する水性溶剤を、ベースとして選択することは容易に考えられ、特に親油性成分を有する水溶性物質によって、溶解性の条件としての良好なミセル化が得られる。同様に、腸粘膜中での十分な溶解性および生物学的利用性を保証するために、固体の適用形が考えられる。製薬学的適用形の製造は、通常の当業者に公知の方法で、技術水準に応じておこなわれる。
【００１６】
使用されるＬＰＳは、エシェリキア・コリ、好ましくはラーベス株（Ｓｔａｍｍ Ｌａｖｅｓ）１９３１からのアゴニストＬＰＳであり、この場合、これは、単核細胞中でのＴＮＦ−α−シンターゼの刺激といった意味において、サルモネラ  フリーデナウ（Ｓａｋｍｏｎｅｌｌａ ｆｒｉｅｄｅｎａｕ）由来の参考のためのＬＰＳと比較可能な活性を示すものである。以下に示した炎症抑止作用の詳細な機序についてはなおも知られていない。
【００１７】
しかしながら、ＬＰＳの薬理学的作用は、文献からも明らかであるように、リピドＡ−部分、特にこれらのアシル化に依存するものであり、Ｏ−鎖またはコア領域に依存するものではないので（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｗｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．）、同一かまたは類似のリピドＡ−アシル化パターンを有し、かつ相当するアゴニストの薬理学的作用を有するすべてのＬＰＳが、同様の方法で効果的であるといえる。
【００１８】
経口的に投与されたＬＰＳは、著しい範囲で、炎症の抑止に作用する。
【００１９】
免疫不全に基づき特徴的に腸の炎症が生じるマウス（ＩＬ−１０−／−ノックアウト）［ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｔ．Ｔ．， １９９４］での試験によって、ＬＰＳが炎症を抑止することが、臨床的ならびに組織学的に証明された。
【００２０】
化学的毒素に基づく腸の炎症反応を示すマウスでの試験によって、ＬＰＳがこれらの炎症反応を抑止することが、臨床的ならびに組織学的に証明された。
【００２１】
本発明は、以下の実施例によってより詳細に説明される：
例１：
ＬＰＳの準備のための単離
ＬＰＳは、グラム陰性細菌からの種々の方法によって抽出することができる。
好ましい方法は以下に示す：
Ｅ．ＣｏｌｉからＬＰＳ含有作用物質を獲得するために、好ましくは、血清型０２：Ｋ１：Ｈ６のＥ．Ｃｏｌｉ（好ましくはラーベス株１９３１）を、５日間に亘って、３７℃で、新鮮なペプトンベースの培養液１ｍｌ当たり、３×１０８コロニー形成単位の成長密度にまで増殖させた。しかしながら、他の栄養媒体、他のグラム陰性微生物および他の増殖密度を使用することも可能である。増殖させたカルチャーから公知の方法で、熱的溶解および多段階濾過（ｍｅｈｒｆａｃｈｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって、タンパク質および細胞を含まないエキストラクトを獲得し、これを１ｋＤ−メンブレンを用いて水に対して透析することで濃縮し、かつ凍結乾燥させる。二者択一的に、熱的に溶解されたバイオマスを、３９００ｇで２０分間に亘って遠心分離し、上清を凍結乾燥させることもできる。１ｋＤ−メンブレンを用いての水に対しての厳密な透析の後にこの留分を濃縮し、かつ凍結乾燥させる。
【００２２】
リポ多糖を単離するために使用された方法は、Ｗｅｓｔｐｈａｌらの方法に相当する［Ｗｅｓｔｐｈａｌ ｅｔ ａｌ．， １９５２］。この凍結乾燥物は、水−フェノール混合物（５５％〜４５％）中に懸濁し、ホモジナイズし、相を２０００ｇでの遠心分離によって分離する。
【００２３】
この水相を、前記に示したように水に対して透析し、濃縮しかつ凍結乾燥させる。
【００２４】
この凍結乾燥物は、水中に１０〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、かつ、５５０００ｇで３回、２２時間に亘って超遠心する。堆積物の凍結乾燥によって、ＬＰＳ−Ｌ３１が得られ、これをさらに精製することもできる（たとえば、ゲル濾過）。
【００２５】
例２：
自己免疫疾患による腸内炎症反応の抑止
以下の試験は、インターロイキン１０−／−ノックアウトマウスを用いての二重盲試験の条件下でおこなった［ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｔ．Ｔ．， １９９４］。それぞれ５個体の４週齢マウスの２つの群について、プラセボ（ウシペプトン）かまたはプラセボ＋溶解されたＥ．Ｃｏｌｉ  ラーベス株１９３１からのリポ多糖  １４ｎｇ／ｍｌ（ＬＰＳ−Ｌ３１  試験対象物）を、２１日間に亘って服用させた。治療の経過において体重増加がみられた。この体重の増加は、プラセボ群よりも試験対象群（Ｖｅｒｕｍｇｒｕｐｐｅ）においてかなり著しいものであった。さらに、プラセボ群では、たとえば、肛門の紅潮（ａｎｕｓｒｏｅｔｕｎｇ）、軟便および肛門内の出血（ｔｒａｎｓａｎａｌｅｒ Ｂｌｕｔａｂｇａｎｇ）のような大腸炎の臨床的徴候が高い頻度で観察された。
【００２６】
３週間に亘っての治療の後に、腸を保存し（ａｓｓｅｒｖｉｅｒｔ）、かつクリプトインデックス（Ｋｒｙｐｔｅｎｉｎｄｅｘ）を測定した。このクリプトインデックスは、腸壁の変性または肥厚の尺度、すなわち炎症の尺度を示すものであり：したがって、数が大きくなればなるほど、炎症が強いとされる。試験群のマウスは、クリプトインデックス４．７５、プラセボ群のマウスは８．０を有していた。これは、結果として、ＬＰＳ−Ｌ３１で処理されたマウスが、プラセボ群のマウスと比較して著しく少ない炎症を示すということになる。ＩＬ−１０−／−ノックアウトマウスについては、ヒト慢性炎症性腸疾患の認知されたモデルである。
【００２７】
この結果は、ＬＰＳ−Ｌ３１が、免疫不全（自己免疫性疾患）に基づく炎症を減少させることを示した。
【００２８】
例３：
毒性作用に基づく腸内炎症反応の抑止
他の試験において、それぞれ６個体のＢａｌｂ−Ｃマウスの２つの群（２ヶ月齢）を、二重盲試験の条件下で、１週間に亘って、プラセボ（ウシのペプトン）かまたはプラセボ＋１４ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ−Ｌ３１（試験対象物）を服用させた。１週間に亘っての処理の後に、すべてのマウスに５日間に亘って、２．５％ＤＳＳを与え、これによって化学的毒性による炎症を誘発させた。その後に、再度プラセボまたは対象となる薬剤を用いて、６日間に亘って処置した。体重増加は、プラセボ群よりも試験対象物群において著しいものであった。試験対象物群におけるクリプトインデックスは、プラセボ群よりもかなり少なく、すなわち、ＬＰＳ−Ｌ３１によって、腸内炎症が減少した。さらに、プラセボ群においては、高い頻度で大腸炎の臨床的徴候、たとえば、肛門の紅潮、軟便および肛門内の出血が観察された。
【００２９】
例４：
ＴＮＦα形成におけるＬＰＳ作用の測定
単核細胞中でのＴＮＦα−分泌刺激の試験に関しては、以下の刊行物のようにしておこなわれた［Ｔｈｏｍｓｅｎ ａｎｄ Ｌｏｐｐｎｏｗ， １９９５］：単核細胞を、健康な提供者の血液から、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｒ）を用いての密度匂配遠心分離によって単離し、洗浄し、かつ栄養培地（ＲＰＭＩ）１６４０）中でインキュベートした。この細胞を、ＬＰＳでかまたはコントロールのための溶剤で、２４時間に亘ってインキュベートし、ハーベストし、２％ウシ胎児血清を添加し、かつ、サイトカイン分析のために−２０℃で保存した。ＴＮＦαの測定は、抗−ＴＮＦα抗体を用いての市販のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫検査法）を用いておこなった。この場合、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ−Ｌ３１を添加して２４時間後に１８５１ｐｇ／ｍｇのＴＮＦ−α濃度が測定され、サルモネラ  フリードナウ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｆｒｉｅｄｅｎａｕ）由来の参考のためのＬＰＳ  １μｇ／ｍｌは、同期間において、１９７６ｐｇ／ｍｌのＴＮＦαを誘導した。これらの結果から、ＬＰＳ−Ｌ３１はその活性において、公知のＬＰＳの形と異なることなく、アゴニストＬＰＳを示すことが明かになった。したがって、腸の炎症の際にすべてのアゴニストＬＰＳの形が効果的であると期待される。特に、効果を証明するために、アンタゴニスト作用は必要ではなく、それというのも、これは従来公知文献から予想されるものであるためである（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｗｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．）。
【００３０】
【外１】
2004519522.tif 000002
【００３１】
【外２】
2004519522.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2004519522.tif 000004
2004519522.tif 000005
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2004519522.tif 000017
2004519522.tif 000018
【国際調査報告】
2004519522.tif 000019
2004519522.tif 000020
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