(57)【要約】本発明はＥＥＲ−７という新規リシルオキシダーゼ遺伝子に関する。本発明はタンパク質およびタンパク質をコードする核酸に関する。本発明はさらにエストロゲンレセプターとの相互作用によりＥＥＲ−７タンパク質活性を選択的に変調する化合物を同定するためのアッセイシステムに関する。
2004505631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表される配列からの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するか、または配列番号２と少なくとも６０％の配列類似性を有する単離されたＥＥＲ−７タンパク質であって、ＥＥＲ−７タンパク質は（ｉ）リシルオキシダーゼ活性を有し、（ｉｉ）配列番号３、４、５および６からなる群から選択される配列に８０％を超えて類似する配列を有するＳＲＣＲドメインの４個のコピーを含み、（ｉｉｉ）配列番号７で表される配列を有するリシルオキシダーゼ酵素の保存触媒性ドメインを含む、単離されたＥＥＲ−７タンパク質。
【請求項２】
タンパク質が抗ＥＥＲ−７抗体と特異的結合活性を有する請求項１に記載のＥＥＲ−７タンパク質。
【請求項３】
ヒトＥＥＲ−７タンパク質である請求項１に記載のＥＥＲ−７タンパク質。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載のＥＥＲ−７タンパク質。
【請求項５】
配列番号１で表される配列を有する核酸によりコードされる請求項３に記載のＥＥＲ−７タンパク質。
【請求項６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するヒトＥＥＲ−７タンパク質に少なくとも６０％の配列同一性を有する請求項１に記載のＥＥＲ−７タンパク質。
【請求項７】
ＥＥＲ−７タンパク質のポリペプチドフラグメントであって、前記フラグメントが、
ａ）配列番号３、４、５および６からなる群から選択される配列に８０％を超えて類似する配列を有するＳＲＣＲドメインの１から４個のコピーを含むことと、
ｂ）配列番号７で表される配列を有するリシルオキシダーゼ酵素の保存触媒性ドメインと、
ｃ）抗ＥＥＲ−７抗体との特異的結合活性と、
ｄ）それらのいずれかの組み合わせと、
からなる群から選択される特性を有するＥＥＲ−７タンパク質のポリペプチドフラグメント。
【請求項８】
請求項１に記載のＥＥＲ−７タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項９】
ｃＤＮＡである請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
ＥＥＲ−７タンパク質がヒトＥＥＲ−７タンパク質である請求項８に記載の核酸。
【請求項１１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する請求項１０に記載のＥＥＲ−７タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含む請求項８に記載の核酸。
【請求項１３】
発現制御配列に機能的に作用するように結合したＥＥＲ−７タンパク質のフラグメントをコードする核酸を含むベクターであって、前記フラグメントが、
ａ）配列番号３、４、５および６からなる群から選択される配列に８０％を超えて類似する配列を有するＳＲＣＲドメインの１から４個のコピーを含むことと、
ｂ）配列番号７で表される配列を有するリシルオキシダーゼ酵素の保存触媒性ドメインと、
ｃ）抗ＥＥＲ−７抗体との特異的結合活性と、
ｄ）それらのいずれかの組み合わせと、
からなる群から選択される特性を有する、前記ベクター。
【請求項１４】
ＥＥＲ−７タンパク質のフラグメントがＥＥＲ−７タンパク質全長である請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１６】
動物がエストロゲンに応答して検出可能なレベルでＥＥＲ−７タンパク質を発現する、請求項１４のベクターで形質転換されたヒト以外の動物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の宿主細胞により生成されたＥＥＲ−７タンパク質を単離することを含むＥＥＲ−７タンパク質を生成する方法であって、ベクターによりＥＥＲ−７タンパク質の発現のために提供される条件下で前記宿主細胞が培養されるＥＥＲ−７タンパク質を生成する方法。
【請求項１８】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有する核酸と緊縮性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）の条件下でハイブリダイズする少なくとも２０個の塩基の単離された核酸。
【請求項１９】
少なくとも１０個のヌクレオチドが配列番号１で表される核酸配列からの隣接するヌクレオチドである請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
検出可能に標識された請求項１８に記載の核酸。
【請求項２１】
請求項１に記載のＥＥＲ−７タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項２２】
ＥＥＲ−７タンパク質を含有することが疑われるサンプルにおいて、分子に対する請求項２１に記載の抗体の結合を検出することを含むＥＥＲ−７タンパク質を検出する方法であって、サンプル中に存在するいずれかのＥＥＲ−７タンパク質と特異的に結合することが可能になる条件下で抗体をサンプルと接触させ、サンプル中の分子に対する抗体の結合がＥＥＲ−７の存在を示すＥＥＲ−７タンパク質を検出する方法。
【請求項２３】
ＥＥＲ−７の発現が疑われる細胞からのサンプル中においてＥＥＲ−７をコードするｍＲＮＡを検出することを含むＥＥＲ−７の発現を検出する方法。
【請求項２４】
ＥＥＲ−７をコードするｍＲＮＡがＥＥＲ−７特異的核酸にハイブリダイズすることにより検出される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＥＥＲ−７特異的核酸が少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、配列番号１の同一数の塩基の配列と同一の配列、またはその相補配列を有する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
異なる機能のエストロゲンレセプターを発現する形質転換細胞を含む選択的エストロゲンレセプターリガンドを同定するアッセイシステムであって、細胞数がＥＥＲ−７をコードするｍＲＮＡの検出可能な量を転写するのに十分である前記アッセイシステム。
【請求項２７】
エストロゲンレセプターがヒトエストロゲンレセプターである請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項２８】
内皮細胞である請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項２９】
ヒト臍帯血管細胞である請求項２８に記載のアッセイシステム。
【請求項３０】
エストロゲンレセプターによりＥＥＲ−７ｍＲＮＡ転写を選択的に調節する化合物を同定する方法であって、前記方法は被験化合物と接触させた請求項２６に記載のアッセイシステムにおいてＥＥＲ−７ｍＲＮＡのレベルの差を検出することを含み、ＥＥＲ−７ｍＲＮＡのレベルの差が、被験化合物が選択的にエストロゲンレセプターを調節することを示す前記方法。
【請求項３１】
被験化合物がエストロゲンまたはエストロゲンアナログである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験化合物がエストロゲンレセプター選択的アゴニストまたはアンタゴニストである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
エストロゲンレセプターにより発現を調節する被験化合物と接触させると、ｍＲＮＡレベルが低下する請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
エストロゲンレセプターにより発現を調節する被験化合物と接触させると、ｍＲＮＡレベルが上昇する請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
エストロゲンレセプターがヒトエストロゲンレセプターである請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
第１のエストロゲンレセプターがＥＲαである請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
第２のエストロゲンレセプターがＥＲβである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が内皮細胞である請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
細胞がヒト臍帯血管細胞である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＳＲＣＲドメインの４個のコピーが配列番号３から６で表される配列を含む請求項７に記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項４１】
配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するリシルオキシダーゼ酵素の触媒性ドメインに少なくとも４６％の配列類似性を有する請求項７に記載のポリペプチドフラグメント。
【請求項４２】
形質転換細胞が２つの異なる集団を含む請求項２６に記載のアッセイシステム。
【請求項４３】
１つの集団がＥＲαエストロゲンレセプターを発現する請求項４２に記載のアッセイシステム。
【請求項４４】
もう１つの集団がＥＲβエストロゲンレセプターを発現する請求項４３に記載のアッセイシステム。
【請求項４５】
内因性ＥＥＲ−７発現が動物において抑制されるヒト以外のＥＥＲ−７ノックアウト動物。
【請求項４６】
ＥＥＲ−７発現を調節するタンパク質をコードする核酸を含むベクターで形質転換されているヒト以外の動物であって、前記タンパク質は発現制御配列に機能的に作用するように結合しており、前記動物はエストロゲンに応答して検出可能なレベルでＥＥＲ−７タンパク質を発現するヒト以外の動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リシルオキシダーゼファミリーの新規メンバーであるＥＥＲ−７、タンパク質のポリペプチドフラグメント、並びにＥＥＲ−７タンパク質およびフラグメントをコードする核酸に関する。本発明は、また、ＥＥＲ−７ｍＲＮＡ転写を調節する能力に関してエストロゲンレセプター結合化合物を試験するためのアッセイシステムおよび方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）は米国およびその他の先進国では重要な血管症状であり、過去３０年間に発生の累進的な増加が観察されている（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｓｕｒｇｅｒｙ、第４版、１０３２−１０６０（１９９５））（非特許文献１参照。）。大部分のＡＡＡは、５５歳以上の男性に影響を与えるが、発生の着実な増加は女性にも観察されている（Ｃｏｌｅら、Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｄｉｓ．　Ｃａｎａｄａ　１５：Ｓ１−Ｓ６４（１９９４）；Ｋｒｕｐｓｋｉら、Ｓｅｍｉｎ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．８：８３−１６７（１９９５））（非特許文献２および３参照。）。
【０００３】
エラスチンおよびコラーゲン（ＩおよびＩＩＩ型）は大動脈の主要な構造タンパク質である。これらの細繊維性タンパク質は、拍動性の動脈圧のストレスに継続的にさらされている間、大動脈壁に強度および弾性力の両方を付与する。ＡＡＡではエラスチン濃度の低下並びに弾性薄層板が破砕および分解される組織病理学的変化を呈するので、エラスチンの損失およびその生物物理学的特性が本質的な特徴であると考えられている（Ｃａｍｐａら、Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　６５：１３−２１（１９８７）；Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１７：３７１−３８１（１９９３）；Ｈａｌｌｏｒａｎら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８：８５−９２（１９９５））（非特許文献４、５および６参照。）。たいていの動脈瘤が腎臓下動脈で生じるという事実は、この領域では大動脈エラスチン含量および弾性薄層板の数が共に大動脈のさらに近位の部分よりも通常低いという事実に起因している。従って、腎臓下大動脈は、加速度的なエラスチン分解を引き起こすいずれかの過程により誘発される動脈瘤を生じやすいようである。
【０００４】
リシルオキシダーゼ（ＬＯ，Ｅ．Ｃ．１．４．３．１３）はエラスチンおよびコラーゲンの分子ユニット間および内で、これらのタンパク質のペプチジルリシンをペプチジルα−アミノアジピック−δ−セミアルデヒドに酸化することにより共有結合性架橋を開始する。次いでペプチジルアルデヒドは隣接するアミノ基またはペプチジルアルデヒドと縮合して、細繊維性コラーゲンおよびエラスチンで見出される共有結合性架橋を形成することができる（Ｋａｇａｎ、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　３２１−３９８（１９８６））（非特許文献７参照。）。ＬＯは、酵素活性の最大発現に相関する３２ｋＤａの精製された酵素のモルあたり１モルの強く結合した銅（ＩＩ）コファクターを含む。銅コファクターは、四角形にゆがんだ、八角形に配位したリガンドフィールドで結合する（Ｇａｃｈｅｒｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１９０２２−１９０２７（１９９０））（非特許文献８参照。）。４０９個のアミノ酸（４６ｋＤａ）のタンパク質をコードすると予測されるｃＤＮＡの全長は、抗ウシリシルオキシダーゼ抗血清を用いて、新生児ラット大動脈ｃＤＮＡ　λｇｔ１１発現ライブラリー内において、はじめて同定された。現在、ヒト（Ｈａｍａｌａｉｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１７：５４４−５４８（１９９１）；Ｍａｒｉａｎｉら、Ｍａｔｒｉｘ　１２：２４２−２４８（１９９２））、ニワトリ（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４１９９−２４２０６（１９９２））およびマウス（Ｋｅｎｙｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３：８０２（１９９１））のＬＯ　ｃＤＮＡは、クローン化され、配列決定され、４個の予測されるＬＯタンパク質配列の中で保存および分岐配列の両方の存在が示されている（非特許文献９、１０、１１および１２参照。）。
【０００５】
予測されるリシルオキシダーゼ様（ＬＯＬ）タンパク質をコードするヒトｃＤＮＡ種は、クローン化され、染色体１５ｑ２４−ｑ２５にマッピングされている。このＬＯＬ遺伝子のＬＯに対する相同性は、マウスＬＯ遺伝子のエクソン１−２境界で始まる（Ｋｅｎｙｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８４３５−１８４３７（１９９３））（非特許文献１３参照。）。より最近では、予測されるタンパク質配列がＬＯおよびＬＯＬに４８％相同性を示す新規ｃＤＮＡが、老齢ヒト繊維芽細胞で同定されている（Ｓａｉｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：８１５７−５１６０（１９９７））（非特許文献１４参照。）。この一連の高度に相関する遺伝子の存在は、リシルオキシダーゼ遺伝子ファミリーの存在、すなわちまだ同定されるかもしれない別のメンバーの存在を意味する。しかし、これらの遺伝子の発現されたタンパク質生成物の特性および触媒機能は、結合組織の既知のリシルオキシダーゼ酵素種をコードするものに関してしか文献化されていない。最近の研究ではＬＯ活性がエストロゲンレセプターにより変調され得ることが示されている（Ｏｚａｓａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１０９：６１８−６２１（１９８１）；Ｓａｎａｄａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５４１：４０８−４１３（１９７８））（非特許文献１５および１６参照。）。
【０００６】
【非特許文献１】
ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ほか著、「血管外科学（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｓｕｒｇｅｒｙ）」、第４版、１９９５年、ｐ．１０３２−１０６０
【非特許文献２】
コウル（Ｃｏｌｅ）ほか著、「クロニック　ディス（Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｄｉｓ．）」、（カナダ）、１９９４年、１５、ｐ．Ｓ１−Ｓ６４
【非特許文献３】
クルプスキー（Ｋｒｕｐｓｋｉ）ほか著、「セミナー血管外科学（Ｓｅｍｉｎ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．）」、１９９５年、８、ｐ．８３−１６７
【非特許文献４】
キャンパ（Ｃａｍｐａ）ほか著、「関節硬化症（Ａｒｔｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」、１９８７年、６５、ｐ．１３−２１
【非特許文献５】
ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ほか著、「定期刊行物血管外科学（Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．）」、１９９３年、１７、ｐ．３７１−３８１
【非特許文献６】
ハロラン（Ｈａｌｌｏｒａｎ）ほか著、「定期刊行物外科学研究（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．）」、１９９５年、８、ｐ．８５−９２
【非特許文献７】
カガン（Ｋａｇａｎ）著、「細胞外マトリックスの生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ）」、１９８６年、ｐ．３２１−３９８
【非特許文献８】
ガチェル（Ｇａｃｈｅｒｕ）ほか著、「定期刊行物生物化学（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９０年、２６５、ｐ．１９０２２−１９０２７
【非特許文献９】
ハマライネン（Ｈａｍａｌａｉｎｅｎ）ほか著、「遺伝子学（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、１９９１年、１７、ｐ．５４４−５４８
【非特許文献１０】
マリアニ（Ｍａｒｉａｎｉ）ほか著、「マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）」、１９９２年、１２、ｐ．２４２−２４８
【非特許文献１１】
ウー（Ｗｕ）ほか著、「定期刊行物生物化学（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９２年、２６７、ｐ．２４１９９−２４２０６
【非特許文献１２】
ケニオン（Ｋｅｎｙｏｎ）ほか著、「科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９１年、ｐ．２５３−８０２
【非特許文献１３】
ケニオン（Ｋｅｎｙｏｎ）ほか著、「定期刊行物生物化学（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９３年、２６８、ｐ．１８４３５−１８４３７
【非特許文献１４】
サイトウ（Ｓａｉｔｏ）ほか著、「定期刊行物生物化学（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９７年、２７２、ｐ．８１５７−５１６０
【非特許文献１５】
オザサ（Ｏｚａｓａ）ほか著、「内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）」、１９８１年、１０９、ｐ．６１８−６２１
【非特許文献１６】
サナダ（Ｓａｎａｄａ）ほか著、「生化学、生物物理学、公式記録（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．）」、１９７８年、５４１、ｐ．４０８−４１３
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＥＥＲ−７という新規ＬＯタンパク質を提供する。核酸配列、タンパク質配列、核酸およびタンパク質フラグメント、オリゴヌクレオチド、ベクター、形質転換された宿主細胞、および特異的ＥＥＲ−７抗体もまた本発明により企図される。形質転換された宿主細胞からＥＥＲ−７タンパク質を製造し、サンプル中のＥＥＲ−７タンパク質を検出する方法もまた企図される。好ましい実施形態では、タンパク質は哺乳動物のものである。更なる実施形態では、タンパク質はヒトである。
【０００８】
また別の実施形態では、リシルオキシダーゼ保存触媒性ドメインであるＳＲＣＲドメインの１から４個のコピーから成るＥＥＲ−７たんぱく質のポリペプチドフラグメントは、抗ＥＥＲ−７抗体またはいずれかのその組み合わせで特異的に認識される。
【０００９】
本発明は、また、異なるエストロゲンレセプターを発現する形質転換細胞が存在し、前記細胞数がＥＥＲ−７ｍＲＮＡの検出可能な量を製造するのに十分である選択的エストロゲンレセプターリガンドを同定するためのアッセイシステムも提供する。好ましい実施形態では、形質転換細胞は２つの異なる集団を含む。このアッセイシステムを用いて選択的エストロゲンレセプターリガンドを同定する方法もまた企図される。
【００１０】
内因性ＥＥＲ−７発現が動物内で抑制されているヒト以外のＥＥＲ−７ノックアウト動物が本発明により企図される。加えて、さらに本発明は、ＥＥＲ−７発現を調節するタンパク質をコードする核酸を含むベクターで形質転換されたヒト以外の動物を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、発現がエストロゲンにより調節される新規ｃＤＮＡ（ＥＥＲ−７；配列番号１）の発見に部分的に基づく。ヒト臍帯静脈細胞、すなわちＨＵＶＥＣは、ヒトＥＲ発現ベクターで形質転換された。マルチウェルプレート中の形質転換細胞は、エストロゲンまたは被験化合物と反応させ、ＥＥＲ−７ｍＲＮＡ発現は、ノーザン分析およびリアルタイムＰＣＲで決定した。ＥＥＲ−７ｍＲＮＡ発現の変調はＥＲおよびリガンドの両方に依存的である。ＥＥＲ−７の核酸配列は既知リシルオキシダーゼ遺伝子に相同性を示す。全ての以前に同定されたリシルオキシダーゼ触媒性ドメインは、ＥＥＲ−７タンパク質に存在する。ＥＥＲ−７タンパク質の触媒性ドメインは、ほぼアミノ酸５３０からほぼアミノ酸７５６に位置する。さらに、ＥＥＲ−７は、タンパク質−タンパク質相互作用において役割を果たすと提唱されているスカベンジャー・レセプター・システイン・リッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン（ＳＲＣＲ−１からＳＲＣＲ−４と命名される）の４個のコピーを含む。ＥＥＲ−７のＳＲＣＲドメインを定義するアミノ酸は、ＳＲＣＲ−１：約３２から約１３４、ＳＲＣＲ−２：約１６３から約２８７、ＳＲＣＲ−３：約３１１から約４１１、およびＳＲＣＲ−４：約４２１から約５２９である。ＥＥＲ−７は、ＬＯ、ＬＯＬ、ＷＳ９１４（ワーナー症候群と診断された患者から単離された新規ＬＯＬタンパク質）および別の種（例えばウサギ）からの新規ＥＥＲ−７タンパク質と配列同一性を共有する。配列比較により約１０％から約５１％の全体的な配列同一性が示される。ＳＲＣＲドメインの比較によりＷＳ９１４に対して約３４％から約６４％の配列類似性が示される。ヒトＥＥＲ−７は、ヒトＬＯおよびＬＯＬの触媒性ドメインと約４５％の触媒ドメインの配列同一性を共有する。
【００１２】
本発明は、また、ＥＥＲ−７発現に及ぼす被験化合物の影響を評価することによりＥＲの特異的イソ体を選択的に調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイも提供する。本発明のアッセイシステムは、高速大量処理スクリーニング、例えばアッセイあたり数千の化合物をスクリーニングするのに適している。
【００１３】
本発明は、被験化合物と接触したときの、異なるＥＲイソ体でトランスフェクトされた２個の細胞集団のＥＥＲ−７応答を比較することを企図する。集団の応答における差異は、被験化合物が異なるＥＲイソ体を差別的に作動または拮抗することを示している。そのような化合物は、非雌性化エストロゲン化合物などのＥＲに基づいた治療法のための良好なリードまたは候補物質である。
【００１４】
従って、本発明は、ＥＥＲ−７のフラグメント、誘導体およびアナログを含むＥＥＲ−７タンパク質、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含むＥＥＲ−７核酸およびＥＥＲ−７調節配列、ＥＥＲ−７特異的抗体、並びにＥＥＲ−７タンパク質または核酸、ＥＥＲ−７結合パートナーの存在を検出するためのこれらの物質の使用に関連する方法、およびＥＥＲ−７のアゴニストおよびアンタゴニストに関するスクリーニングにおけるこれらの物質の使用に関連する方法を有利に提供する。本願の以下のセクションは、標題（太字）および副題（太字イタリック）で記載されており、本発明のこれらの３つの構成要件を包含し、明確にするために提供されるものであって、限定する目的ではない。
【００１５】
一般的な定義
本明細書で用いる「単離された」という文言は、参照されている物質が通常見出される環境から除去されていることを意味する。従って、単離された生物学的物質は、細胞成分、すなわち物質が見出されるかまたは生成される細胞の成分、から遊離されている。核酸分子の場合、単離された核酸としては、ＰＣＲ生成物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または制限フラグメントなどが挙げられる。別の実施形態では、単離された核酸は、好ましくはそれが見出され得る染色体から切除され、より好ましくは染色体に見出される場合、単離された核酸分子に含まれる遺伝子の上流または下流に位置する非調節、非コード領域、または他の遺伝子にもはや結合しない。さらに別の実施形態では、単離された核酸は、１個またはそれ以上のイントロンを欠く。単離された核酸酸分子としては、プラスミド、コスミド、人工染色体等に挿入された配列が挙げられる。従って、特定の実施形態では組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞内で結合する他のタンパク質もしくは核酸、または双方と、またはそれが膜結合タンパク質である場合、細胞膜と結合していてもよい。単離されたオルガネラ、細胞または組織は、生物内で見出される解剖学的部位から除去される。単離された物質は、精製されていてもよいが、精製されている必要はない。
【００１６】
本明細書で用いる「精製された」という文言は、天然の物質から目標物質を入手する該天然の物質を含む無関係の物質、すなわち混入物の存在を低減または排除する条件下で単離された物質を意味する。例えば、精製されたタンパク質は、好ましくは細胞内でそれが結合するタンパク質または核酸を実質的に含まない。精製された核酸分子は、好ましくは細胞内でそれが共に見出され得るタンパク質または他の無関係の核酸分子を実質的に含まない。本明細書で用いる「実質的に含まない」という文言は、物質の分析試験に関連して操作上用いられる。好ましくは実質的に混入物を含まない精製された物質は、少なくとも純度５０％であり、より好ましくは少なくとも純度９０％であり、より好ましくはさらに少なくとも純度９９％である。クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成物分析、生物学的アッセイ、および当該技術で既知の他の方法により純度を評価できる。
【００１７】
精製方法は、当該技術でよく知られている。例えば沈殿、クロマトグラフィー（調製用固相クロマトグラフィー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および三重らせんクロマトグラフィーを含む）、超遠心およびその他の手段により核酸を精製することができる。調製用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出並びに向流分配を含むが、これらに限定されない、種々の方法によりポリペプチドおよびタンパク質を精製することができる。ある目的では、タンパク質が精製を促進する付加配列タグ、ポリヒスチジン配列、またはＦＬＡＧおよびＧＳＴなどの抗体に特異的に結合する配列などを含むが、これらに限定されない、組換えシステムでポリペプチドを生成するのが好ましい。次いで適切な固相マトリックスでクロマトグラフィーにより宿主細胞の粗製ライゼートからポリペプチドを精製することができる。また別にタンパク質またはそれから誘導されるペプチドに対して生成された抗体を精製試薬として使用することができる。遠心、マトリックス分離（例えばナイロンウール分離）、パニングおよびその他の免疫選択技術、枯渇（例えば混入細胞の補体枯渇）、および細胞分類（例えば蛍光活性化細胞分類［ＦＡＣＳ］）などの種々の技術により細胞を精製することができる。その他の精製方法が可能である。精製された物質は、元来それが結合していた細胞成分を約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最も好ましくは約９０％未満含んでいてもよい。「実質的に純粋」というのは、当該技術で既知の通常の精製技術を用いて達成できる最も高度な純度を示す。
【００１８】
特定の実施形態では、「約」または「およそ」という文言は、値が規定の値または範囲の、例えば２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内であるかまたはそのように測定され得る精度に対する規定の値に関する科学的に許容できる誤差範囲内であることを意味する。また別に、特に生物学的系では、用語は規定の値の好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の大きさの規模以内であることを意味する。
【００１９】
本明細書で用いる「サンプル」とは、ＥＥＲ−７タンパク質またはＥＥＲ−７核酸の存在に関して試験できる生物学的物質をいう。そのようなサンプルは、ヒトおよびヒト以外の動物などの動物対象から入手でき、組織、特に筋肉、生検材料、血液および血液生成物、複数の浸出液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腹水、並びに細胞培養物から入手できる。
【００２０】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット等の実験動物、イヌおよびネコなどの家庭用動物、並びにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマおよびウシなどの家畜が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
イタリックの使用は、核酸分子を示し（例えばＥＥＲ−７ｃＤＮＡ、遺伝子等）、通常の文字は、ポリペプチドまたはタンパク質を示す。
【００２２】
「選択的」という文言は、ＥＲリガンドが異なるＥＲイソ体から異なる応答を引き出す能力をいう。別の言い方をすれば、選択的ＥＲリガンドは、ＥＲαなどの１つのＥＲイソ体に対して強力なアゴニストでよいが、例えばＥＲβなどのもう１つのＥＲイソ体にはあまり作動しないか、または全く作動しない。逆に、ある化合物は、強力なＥＲβアゴニストであり得るが、ＥＲαアゴニストとしては不十分である。同様に、ＥＲリガンドは差別的にＥＲイソ体を拮抗し得る。本発明によれば、これらの活性を有利に詳細な分析をすることが可能になる。
【００２３】
「応答を引き出す能力」という文言は、ＥＲリガンドがＥＲ活性を作動または拮抗する能力をいう。
【００２４】
本明細書で用いる「形質転換細胞」という文言は、エストロゲンレセプターをコードするベクターから発現される機能的なエストロゲンレセプターを発現し、ＥＥＲ−７を発現できる修飾された宿主細胞をいう。いずれかの細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは内皮細胞を用いることができる。特定の実施形態では、細胞はヒト臍帯静脈細胞である。
【００２５】
「機能的エストロゲンレセプター」は、エストロゲンまたはエストロゲンアナログに結合し、そのような結合時にシグナルを変換するレセプターである。好ましくは、ＥＲはヒトＥＲ（ｈＥＲ）、例えばＥＲαまたはＥＲβである。エストロゲンレセプターは、哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ブタおよびイヌ、並びに鳥類を含む種々の供給源に由来してよい。
【００２６】
本発明の細胞は、特にＥＥＲ−７ｍＲＮＡ発現を変調するエストロゲンレセプターリガンドのためのアッセイシステムに適している。「アッセイシステム」は、例えばマイクロウェルプレートまたはいくつかのその他の培養系でのそのような細胞の１つまたはそれ以上の集まりである。細胞に及ぼす被験化合物の影響の評価を可能にするために、単一のアッセイシステムにおける細胞数は、少なくとも最大ＥＥＲ−７ｍＲＮＡ発現の条件下で、調節されたＥＥＲ−７ｍＲＮＡの検出可能量を発現するのに十分である。
【００２７】
「被験化合物」は、本明細書で記載されているように、ＥＲによりＥＥＲ−７発現を変調するその能力に関して試験され得るエストロゲン化合物などのいずれかの分子である。
【００２８】
本明細書で用いる「提供する」という文言は、本発明の化合物または医薬用組成物を動物、好ましくはヒトにいずれかの形態で供給することをいう。例えば化合物のプロドラッグの形態を対象に適用でき、次いでこれは体内で化合物に代謝される。
【００２９】
ＥＥＲ−７
本明細書で定義されるＥＥＲ−７タンパク質は、約７５６アミノ酸を有するポリペプチドをいう。特定の実施形態では、ヒトＥＥＲ−７は７４０個のアミノ酸を有する。ＥＥＲ−７は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定されているように、約８２．６キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有し得る。ＥＥＲ−７遺伝子は、他のＬＯオキシダーゼ遺伝子と有意な相同性を有する。従って、ＥＥＲ−７は、配列番号２に対して約６０％以上、好ましくは８０％を超えて、より好ましくはさらに９０％を超えて、なおさらに好ましくは９５％を超えて全体配列同一性を有するタンパク質をいう。特定の実施形態では、ＥＥＲ−７は、配列番号２に示めされているアミノ酸配列を有する。ＥＥＲ−７は分泌リーダー配列を含有し、確認される膜貫通領域を含有しないので、ＥＥＲ−７は分泌されたタンパク質であると提唱される。ＥＥＲ−７は、４個のＳＲＣＲドメインおよび触媒性ドメインを含む。ＳＲＣＲドメインは、タンパク質を特異的細胞外標的としている。
【００３０】
ヒトＥＥＲ−７タンパク質と他の種からのＬＯ、ＬＯＬ、ＷＳ９１４、およびＥＥＲ−７タンパク質との間の配列比較研究により配列類似性が７％から５１％にわたる値であることが示されている（図１参照）。ヒトＥＥＲ−７タンパク質は、ヒトＬＯタンパク質に対して全体で１８％の配列類似性パーセントを共有する。ＬＯは、ＳＲＣＲドメインを含んでいないので、ＥＥＲ−７（配列番号７）およびＬＯの触媒性ドメインのみの比較は４６％の配列類似性を示す（図２参照）。ＥＥＲ−７の触媒性ドメインはまたヒトＬＯＬおよびＷＳ９１４の触媒性ドメインに対して各々４６％および６６％の配列類似性を共有する。ＥＥＲ−７の４個のＳＲＣＲドメインの、ＷＳ９１４に存在するこれらのドメインとの比較により、ドメイン間で配列類似性が変化することが示される。ＥＥＲ−７のＳＲＣＲドメイン１、３、および４（配列番号３、４および６）はＷＳ９１４の同一のドメインに対して約６０％の配列類似性を共有するが、ＳＲＣＲ−２（配列番号５）は約３４％の配列類似性を共有する。
【００３１】
ＥＥＲ−７は、銅アミノオキシダーゼのリシルオキシダーゼ酵素クラスの他のメンバーと同様、エラスチンおよびコラーゲンのユニット間およびユニット内で架橋を開始する。ＥＥＲ−７のリシルオキシダーゼ酵素活性の刺激は、ＡＡＡおよび心筋梗塞の治療のための目標とすることができる。トロポエラスチンは、リシルオキシダーゼの基質であり、増強されたＥＥＲ−７リシルオキシダーゼ活性によりエラスチン架橋が増加する。内部の弾性薄層板において増加したエラスチン架橋により動脈瘤の進展が防御される。増強されたＥＥＲ−７リシルオキシダーゼ酵素活性は、また、コラーゲン架橋の数をも増加させ、従って血管壁の引張強さが増強され、またこれによっても動脈瘤が防御され得る。冠状血管においてプラークを被う繊維性のキャップの破裂を阻止することにより心筋梗塞を阻止することができる。増強されたキャップの引張強さはリシルオキシダーゼ活性の増強に起因し、梗塞の防止を補助し得る。加えて、ＬＯ活性の阻害は、繊維症の治療に関係があるとされている。
【００３２】
ＥＥＲ−７フラグメント、誘導体およびアナログは、ＥＥＲ−７タンパク質の１つまたはそれ以上の特徴により特徴付けることができる。例えば、ＥＥＲ−７フラグメントは、本明細書ではＥＥＲ−７ペプチドまたはポリペプチドともいい、リシルオキシダーゼタンパク質の相同性領域に対応するアミノ酸配列、特に配列番号３から７を有するフラグメントの１つを有し得る。特定の実施形態では、特異的Ｃ末端およびＮ末端ＥＥＲ−７抗体を発達させるために、２個の半分のＥＥＲ−７タンパク質のうちのいずれか、または各半分の抗原性ペプチドに対して抗体を育成することができる。
【００３３】
本発明のＥＥＲ−７のアナログおよび誘導体は、前記に記載したＥＥＲ−７と同一または相同な特徴を有する。例えば、ＥＥＲ−７の切断型の形態を提供することができる。そのような切断型の形態には、Ｎ末端、Ｃ末端または内部欠失を有するＥＥＲ−７が含まれる。特定の実施形態では、誘導体は機能的に活性である、すなわち本発明の野生型ＥＥＲ−７全長に関係づけられる１つまたはそれ以上の機能的活性を呈することができる。そのような機能には、コラーゲンおよび／またはエラスチンにおける共有結合性架橋の形成に加わることが含まれる。また別に、融合タンパク質のＥＥＲ−７部分が１つまたはそれ以上のＥＥＲ−７の特徴を有しているＥＥＲ−７キメラ融合タンパク質を調製することができる。そのような融合タンパク質としては、ＦＬＡＧ、ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのマーカーポリペプチドとＥＥＲ−７ポリペプチドとの融合が挙げられる。また別に、ＥＥＲ−７は、酵母α−接合因子、異種性シグナルペプチド、または発現時にＥＥＲ−７にさらなる安定性を付与するペプチドなどの発現関連ペプチドと融合させることもできる。またＥＥＲ−７を標識用に特有なリン酸化部位と融合することもできる。別の実施形態では、ＥＥＲ−７は、β−ガラクトシダーゼなどの細菌性タンパク質との融合体として発現させることもできる。
【００３４】
ＥＥＲ−７アナログは、機能的に類似する分子、すなわち１つまたはそれ以上のＥＥＲ−７機能を果たす分子を提供する置換、付加または欠失により核酸配列のコードを変化させることにより作製することができる。特定の実施形態では、ＥＥＲ−７のアナログはＥＥＲ−７の配列保存変種である。別の実施形態では、ＥＥＲ−７のアナログは、機能保存変種である。さらに別の実施形態では、ＥＥＲ−７のアナログは、別の種のアレレ変種または相同変種である。特定の実施形態では、ＥＥＲ−７のヒト変種が記載される。
【００３５】
ＥＥＲ−７誘導体のとしては、リン酸化ＥＥＲ−７、ミリスチル化ＥＥＲ−７、メチル化ＥＥＲ−７、および、それとは別に、化学的に修飾された他のＥＥＲ−７タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＥＥＲ−７誘導体としては、また、標識された変種、例えばヨウ素（または前記で示したようにリン）で放射性標識したもの；ビオチン、金属イオンと複合されたキレート基、発色体もしくは蛍光体、金コロイド、またはラテックスビーズなどの粒子などの検出可能な分子；または水溶性重合体に結合したものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
ＥＥＲ−７の生物学的に活性な成分または複数の成分の化学的修飾により、成分または複数の成分の安定性および循環時間の増加並びに免疫原性の低減などの、ある環境下でのさらなる利点が提供され得る（米国特許第４１７９３３７号、Ｄａｖｉｓら、１９７９年１２月１８日発行を参照；点検のためにはＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕｇｓ（Ｊ．Ｓ．ＨｏｌｃｅｒｂｅｒｇおよびＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編）１９８１年３６７−３８３頁参照）。概説文献では、タンパク質修飾および融合タンパク質について記載されている（Ｆｒａｎｓｉｓ、Ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　３：４−１０（１９９２）、メディスクリプト：マウントビュー・コート、フリアーン・バーネット・レーン、ロンドン　Ｎ２０、ＯＬＤ、英国）。
【００３７】
誘導体化に適した化学基を水溶性重合体の中から選択してもよい。選択された重合体は、それが結合する成分が生理的環境などの水性環境中で沈殿しないように水溶性であるべきである。好ましくは、最終生成調製物を治療用に使用するために、重合体は医薬上許容されるものであるであろう。当業者は、重合体／成分抱合体が治療上使用されるかどうか、そしてその場合望ましい用量、循環時間、タンパク質溶解に対する抵抗性、およびその他の考慮すべき点に基づいて望ましい重合体を選択できるであろう。本発明の成分または複数の成分として、これらは、本明細書で提供されるアッセイを用いて確認できる。
【００３８】
水溶性重合体は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオクソラン、ポリ−１，３，６−トリオクサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体またはランダム共重合体）およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモ重合体、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール並びにポリビニルアルコールからなる群から選択することができる。水中の安定性によりポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが製造において有利である。タンパク質ＰＥＧ化は、インビボで半減期を増すために十分に確立された技術であり、生物学的活性を確実にする。
【００３９】
ＥＥＲ−７のクローニングおよび発現
本発明は、ＥＥＲ−７の全長、または天然発生形態を含む機能的または変異体ＥＥＲ−７、およびいずれかの供給源、好ましくはヒトからのいずれかの抗原性フラグメントをコードする遺伝子の分析および単離を企図する。さらに評価、診断、または治療のための機能的または変異体ＥＥＲ−７タンパク質の発現を企図する。
【００４０】
本発明によると、当該技術の技術内の通常の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ　および　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８９）第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）」という）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編（１９８５））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編（１９８４））；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ　および　Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ　および　Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　Ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬプレス（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョーン・ウィレイ・アンド・サンズ・インコーポレーティッド（１９９４）参照。
【００４１】
分子生物学−定義
本明細書で用いる「ＤＮＡの増幅」とは、ＤＮＡ配列の混合物内で特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を示す。ＰＣＲの記載に関しては、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７（１９８８）参照。
【００４２】
本明細書で用いる「配列特異的オリゴヌクレオチド」とは、ＥＥＲ−７遺伝子のアレレ変種または変異体を検出するために用いることができる関連するオリゴヌクレオチドのセットをいう。
【００４３】
「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル重合体形態、または一本鎖または二本鎖のいずれかのらせん形態のホスホロチオエートおよびチオエステルなどのいずれかのそのリン酸エステルアナログをいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という文言は、分子の１次および２次構造のみをいい、いずれかの特定の３次形態に限定するものではない。従って、この用語には、特に直鎖状（例えば制限フラグメント）または環状ＤＮＡ分子、プラスミドおよび染色体で見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造に関して論じる場合、本明細書では、転写されていないＤＮＡ鎖（すなわちｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向の配列のみを与える常法に従って配列を記載できる。「組み替え型ＤＮＡ分子」は、分子が生物学的に操作されているＤＮＡ分子である。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡおよびＲＮＡの一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」ともいう）であり、２つまたはそれ以上のヌクレオチドのいずれかの鎖を意味する。典型的にはヌクレオチド配列がタンパク質および酵素を作製するために細胞メカニズムにより用いられる情報を含む遺伝情報を担持する。これらの用語には二本または一本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、いずれかの合成および遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、並びにセンスおよびアンチセンスの両方のポリヌクレオチドが含まれる（しかしながら本明細書ではセンス鎖のみを表現する）。これは一本および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにアミノ酸バックボーンに塩基を結合させることにより形成された「タンパク質核酸分子（ＰＮＡ）」を含む。これはまた修飾された塩基、例えばチオウラシル、チオグラニンおよびフルオロウラシルなども含む。
【００４５】
本明細書におけるポリヌクレオチドは、天然の調節（発現調節）配列によりフランキングされていてよいか、またはプロモーター、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）およびその他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’および３’非コード領域等を含む異種の配列に結合していてよい。また当該技術で既知の多くの手段により核酸を修飾することもできる。そのような修飾の非限定例としては、メチル化、「キャップ」、１つまたはそれ以上の天然発生ヌクレオチドのアナログでの置換、および、例えば非電荷結合を有するもの（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート等）、および荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するものなどのヌクレオチド内修飾がある。ポリヌクレオチドは、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレーター（例えばアクリジン、プソラレン等）、キレーター（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化金属等）、およびアルキレーターなどの１つまたはそれ以上の付加的な共有結合部分を含有できる。ポリヌクレオチドは、メチルまたはエチルリン酸トリエステルまたはアルキルホスホラミデート結合の形成により誘導体化することができる。さらに、本明細書におけるポリヌクレオチドは、また直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを提供できる標識を用いて修飾することもできる。標識の例としては、放射性アイソトープ、蛍光分子、ビオチン等が挙げられる。
【００４６】
「宿主細胞」という文言は、細胞による物質の製造のために、例えば細胞による遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の発現のために、選択され、修飾され、形質転換され、成長し、またはいずれかの方法で使用もしくは操作されるいずれかの生物のいずれかの細胞を意味する。さらに以下で記載するスクリーニングまたは別のアッセイに宿主細胞を用いることもできる。
【００４７】
タンパク質および酵素は、遺伝コードに従ってＤＮＡおよびＲＮＡの指令を用いて宿主細胞において作製される。一般に特定のタンパク質または酵素のための指令を有するＤＮＡ配列は、対応するＲＮＡの配列に「転写」される。次いでＲＮＡ配列がタンパク質または酵素を形成するアミノ酸の配列に「翻訳」される。「アミノ酸配列」は２つまたはそれ以上のアミノ酸のいずれかの鎖である。各々のアミノ酸は、ヌクレオチドの１つまたはそれ以上のトリプレットによりＤＮＡまたはＲＮＡにおいて表される。各トリプレットはアミノ酸に対応するコドンを形成する。例えばアミノ酸リジン（Ｌｙｎ）は、ヌクレオチドトリプレットもしくはコドンＡＡＡにより、またはコドンＡＡＧによりコードされる。（遺伝コードは、いくつかの重複性（縮合ともいう）を有し、たいていのアミノ酸が１つ以上の対応するコドンを有することを意味している。）ＤＮＡおよびＲＮＡ配列におけるヌクレオチドがタンパク質製造のために３つからなるグループで解読されるので、正確なアミノ酸で配列解読を開始することが重要であり、よって正確なトリプレットが解読される。ヌクレオチド配列がコドンにグループ分けするやり方を「読み枠」という。
【００４８】
「コード配列」または、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素などの発現タンパク質を「コード」する配列は、発現された場合、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の生成をもたらす、すなわちヌクレオチド配列はポリペプチド、タンパク質または酵素のためのアミノ酸をコードする。タンパク質のコード配列は、開始コドン（通常ＡＴＧ）および停止コドンを含む。
【００４９】
「遺伝子」という文言は、「構造遺伝子」ともいい、１つまたはそれ以上のタンパク質または酵素の全てまたは一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードするか、またはこれに対応するＤＮＡ配列を意味し、イントロンおよび例えば遺伝子が発現される条件に影響するプロモーター配列などの調節ＤＮＡ配列、５’−非翻訳領域、または３’非翻訳領域を含んでいても含んでいなくてもよい。構造遺伝子ではないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写することができるが、アミノ酸配列には翻訳されない。別の遺伝子は、構造遺伝子のレギュレーターまたはＤＮＡ転写のレギュレーターとして機能し得る。
【００５０】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを超えて検出され得るレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内に転写開始部位（便宜的には例えばヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより定義される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合に寄与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００５１】
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこれがトランス−ＲＮＡスプライシング（該コード配列がイントロンを含有する場合）され、ｍＲＮＡの場合、コード配列によりコードされるタンパク質に翻訳されると、コード配列は、細胞の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある、すなわち細胞の転写および翻訳制御配列に「機能的に作用するように結合している」。
【００５２】
「発現する」または「発現」という文言は、遺伝子またはＤＮＡ配列における情報を明らかにすることを可能にすること、またはこれを引き起こすこと、例えば対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関する細胞機能を活性化することによりタンパク質を製造することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞で、または細胞により発現され、タンパク質などの「発現生成物」を形成する。発現生成物自体、例えば生じたタンパク質も、また、細胞により「発現された」ということができる。発現生成物は、細胞内にある、細胞外にあるまたは分泌されるものとして特徴づけすることができる。「細胞内」という文言は、細胞内にある物を意味する。「細胞外」という文言は、細胞外にある物を意味する。物質が細胞外で有意な測定値で現れる場合、細胞上または細胞内のある場所から細胞により「分泌される」。
【００５３】
「トランスフェクション」という文言は、外来の核酸の細胞への導入を意味する。「形質転換」という文言は、「外来」（すなわち外部からのまたは細胞外の）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味し、これにより宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、導入された遺伝子または配列によりコードされる望ましい物質、典型的にはタンパク質または酵素を生成する。導入された遺伝子または配列は、また「クローン化された」または「外来の」遺伝子または配列ともいい、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌、または細胞の遺伝メカニズムにより用いられる他の配列などの調節もしくは制御配列を含んでいてもよい。遺伝子または配列は、非機能的配列または未知の機能を有する配列を含んでいてもよい。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け入れるかまたは発現する宿主細胞は、「形質転換されて」おり、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同一の属または種の細胞、または異なる属または種の細胞を含むいずれかの供給源に由来し得る。
【００５４】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という文言は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入できるビヒクルを意味し、これにより宿主細胞を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進する。ベクターにはプラスミド、ファージ、ウイルス等が含まれ、これらは以下でより詳細に論じる。
【００５５】
ベクターは、典型的には伝達の役割を果たすＤＮＡを含み、該ＤＮＡに外来ＤＮＡが挿入される。ＤＮＡの１つのセグメントをＤＮＡの別のセグメントに挿入する一般的な方法は、制限部位という特異的部位（ヌクレオチドの特異的な基）でＤＮＡを切断する制限酵素という酵素の使用に関係する。「カセット」とは、定義された制限部位でベクターに挿入できる発現生成物のためにコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントをいう。カセット制限部位は、適切なリーディングフレームでカセットを確実に挿入できるように設計されている。一般的に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたはそれ以上の制限部位において挿入され、次いでベクターにより伝達性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞に運ばれる。発現ベクターなどの挿入されたまたは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列は、「ＤＮＡ構築物」ということができる。ベクターの共通の型は、付加的な（外来の）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、好適な宿主細胞に容易に導入できる、一般的には二本鎖ＤＮＡの自己充足分子（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である、通常細菌起源の「プラスミド」である。プラスミドベクターはしばしばコードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡの挿入に適した１つまたはそれ以上の制限部位を有する。コードＤＮＡは特定のタンパク質または酵素のための特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始、調節、またはそうでなければ媒介、または制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同一の遺伝子または異なる遺伝子に由来してよく、同一または異なる生物に由来してよい。プラスミドおよび菌類ベクターを含む多くのベクターは、種々の真核および原核細胞宿主における複製および／または発現のために記載されている。非限定例としては、開示されたもしくは本明細書にて引用された、またはそうでなければ当該技術の技術者に既知の方法を用いる、ｐＫＫプラスミド（クロンテック）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（ノバゲン、インコーポレーティッド、マディソン、ウィスコンシン州）、ｐＲＳＥＴまたはｐＲＥＰプラスミド（インビトローゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）、またはｐＭＡＬプラスミド（ニューイングランド・バイオラボズ、ベバリー、マサチューセッツ州）、および多くの適切な宿主細胞などがある。組換えクローニングベクターは、しばしばクローニングまたは発現のための１つまたはそれ以上の複製システムを含み、宿主における選別のための１つまたはそれ以上のマーカー、例えば抗生物質抵抗性、および１つまたはそれ以上の発現カセットを含む。
【００５６】
「発現システム」という文言は、例えばベクターにより担持される外来ＤＮＡによりコードされ、宿主細胞に導入されるタンパク質を発現するための、好適な条件下での宿主細胞および適合するベクターを意味する。共通の発現システムとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、並びに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
【００５７】
「異種性」という文言は天然発生ではないエレメントの組み合わせをいう。例えば、異種性ＤＮＡは、細胞において、または細胞の染色体部位において天然には見出せないＤＮＡをいう。好ましくは、異種性ＤＮＡは、細胞に対して外来の遺伝子を含む。異種性発現調節エレメントは、エレメントが天然で機能的に作用するように結合されている遺伝子とは異なる遺伝子に機能的に作用するように結合されるようなエレメントである。本発明に関連して、ＥＥＲ−７遺伝子は、クローニングまたは発現のために該遺伝子が挿入されたベクターＤＮＡに対して異種性であり、該遺伝子が発現される、そのようなベクターを含む宿主細胞、例えばＨＵＶＥＣ細胞に対して異種性である。
【００５８】
「変異体」および「変異」という文言は、遺伝物質、例えばＤＮＡにおけるいずれかの検出可能な変化、またはそのような変化のいずれかの過程、メカニズムまたは結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変化している遺伝子変異、変異の過程から生じるいずれかの遺伝子またはＤＮＡ、並びに修飾された遺伝子またはＤＮＡ配列により発現されるいずれかの発現生成物（例えばタンパク質または酵素）などが含まれる。「変種」という文言は、修飾されたまたは変化した遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞等、すなわち変異体のいずれかの種類を示すためにも用いることができる。
【００５９】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存変種」は、規定のコドン位置の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの変化がその位置においてコードされるアミノ酸の変化をもたらさない変種である。
【００６０】
「機能保存変種」は、タンパク質または酵素における規定のアミノ酸残基が、ポリペプチドのコンフォメーションおよび機能全体を変えることなく、類似の特性（例えば極性、水素結合能力、酸性、塩基性、疎水性、芳香性等）を有するアミノ酸でアミノ酸置換をすることなどを含むが、これに限定されないで、変化している変種である。類似の特性を有するアミノ酸は、当該技術でよく知られている。例えばアルギニン、ヒスチジンおよびリジンは親水性アミノ酸であり、互換性がある。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンはロイシン、メチオニンまたはバリンで置換できる。このような変化によりタンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量または等電点にはほとんどまたは全く影響しないと予測される。保存性として示されるもの以外のアミノ酸は、類似の機能の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列類似性パーセントは変化し、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法によるアラインメントスキームに従う決定で７０％から９９％になるようにタンパク質または酵素において変化するかもしれない。「機能保存変種」は、またＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定された少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらになお好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、それが比較される元来のまたは親タンパク質または酵素と同一または実質的に類似する特性または機能を有するポリペプチドまたは酵素も含む。
【００６１】
本明細書で用いる「相同性」という文言は、全てのその文法的形態およびスペリングの変化において、スーパーファミリーからのタンパク質（例えば免疫グロブリンスーパーファミリー）および異なる種からの相同タンパク質（例えばミオシン軽鎖等）（Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ　５０：６６７（１９８７））などの「共通の進化の起源」を有するタンパク質間の関係をいう。そのようなタンパク質（およびそのコード遺伝子）は、類似性パーセントまたは保存位置での特異的残基またはモチーフの存在のいずれに関しても、配列類似性に反映するような配列相同性を有する。
【００６２】
従って、「配列類似性」という文言は、全てのその文法的形態において、共通の進化起源を共有していてもいなくてもよい核酸またはタンパク質のアミノ酸間の同一性または一致の程度をいう（Ｒｅｅｃｋら、前出参照）。しかしながら、一般的な使用および本願において、「相同の」という文言は、副詞例えば「高度に」で修飾されている場合、配列類似性を意味し、共通の進化起源には関係するかもしれないか、または関係しないかもしれない。
【００６３】
特定の実施形態において、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡストライダー等の配列比較アルゴリズムによる決定で、ＤＮＡ配列の規定の長さにわたるヌクレオチド対合が少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％である場合、２個のＤＮＡ配列は「実施的に相同である」または「実質的に類似する」。そのような配列の例は、本発明の特定のＥＥＲ−７遺伝子のアレレまたは種変種である。配列データバンクにおいて、または例えば特定のシステムのために定義されるような緊縮な条件下でのサザンハイブリダイゼーションにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することにより実質的に相同である配列が同定できる。
【００６４】
同様に、特定の実施形態では、２個のアミノ酸配列は、８０％を超えるアミノ酸が同一であるか、または約９０％を超えて類似性がある（機能的に同一である）場合、「実質的に相同である」かまたは「実質的に類似である」。好ましくは、類似のまたは相同な配列は、例えばＧＣＧ（ジェネティックス・コンピューター・グループ、ＧＣＧパッケージに関するプログラムマニュアル、バージョン７、マディソン、ウィスコンシン州）パイルアッププログラム、または前記のいずれかのプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を用いるアラインメントにより同定される。
【００６５】
温度および溶液イオン強度の適切な条件下、核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子にアニーリングできる場合、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどのもう１つの核酸分子、に「ハイブリダイズできる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「緊縮性」を決定する。相同な核酸のための予備的なスクリーニングを行う場合、５５℃のＴｍ（溶融温度）に相当する低緊縮ハイブリダイゼーション条件、例えば５ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、０．２５％　ミルク、およびホルムアミド含まない；または３０％　ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳを用いることができる。中程度の緊縮ハイブリダイゼーション条件は、より高温のＴｍ、例えば４０％　ホルムアミドで、５ｘまたは６ｘＳＳＣに相当する。高度な緊縮ハイブリダイゼーション条件は、最も高温のＴｍ、例えば５０％　ホルムアミド、５ｘまたは６ｘＳＳＣに相当する。ＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム溶液である。ハイブリダイゼーションには２個の核酸が相補的な配列を含むことが必要とされるが、ハイブリダイゼーションの緊縮性に依存して塩基間のミスマッチも起こり得る。核酸をハイブリダイズするのに適切な緊縮性は核酸の長さ、および相補性の程度、当該技術で既知の変動値に依存する。２個のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高温のＴｍに相当する）は以下の順で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００を超える長さのヌクレオチドのハイブリッドに関しては、Ｔｍを算出するための等式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、９．５０−９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１１．７−１１．８参照）。ハイブリダイズできる核酸の最も短い長さは少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは、長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００６６】
特定の実施形態では、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という文言は、５５℃のＴｍをいい、前記で示した条件を利用する。好ましい実施形態では、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい実施形態では、Ｔｍは６５℃である。特定の実施形態では、「高度な緊縮性」とは、０．２ｘＳＳＣ中６８℃で、５０％　ホルムアミドおよび４ｘＳＳＣ中４２℃で、またはこれらの２つの条件のいずれかで観察されるレベルに等価なハイブリダイゼーションレベルを維持できる条件下のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件をいう。
【００６７】
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」という文言は、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはその他の目的の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズできる、一般に少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは１００以下のヌクレオチドの核酸をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば３２Ｐ−ヌクレオチド、または、ビオチンなどの標識が共有結合したヌクレオチドで標識できる。１つの実施形態では、標識したオリゴヌクレオチドは、プローブとして用いて核酸の存在を検出することができる。オリゴヌクレオチド（標識され得る１つまたは双方）は、別の実施形態では、ＥＥＲ−７の全長もしくはフラグメントのいずれかをクローニングするためか、またはＥＥＲ−７をコードする核酸の存在を検出するためにＰＣＲプライマーとして用いることができる。さらなる実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＥＥＲ−７　ＤＮＡ分子と三重らせんを形成できる。一般にオリゴヌクレオチドを合成的に、好ましくは核酸合成器で調製できる。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合等の非天然リン酸エステルアナログ結合で調製することができる。
【００６８】
本発明は、アンチセンス核酸（リボザイムを含む）を提供し、これを用いて本発明のＥＥＲ−７の発現を阻害でき、特にコラーゲン架橋に及ぼすＥＥＲ−７影響を抑制することができる。「アンチセンス核酸」は、細胞質条件下でＲＮＡまたはＤＮＡ分子の相補性塩基とハイブリダイズするときに、後者の役割を阻害する一本鎖核酸分子である。ＲＮＡがメセンジャーＲＮＡ転写である場合、アンチセンス核酸は、逆転写体または相補性核酸に干渉するｍＲＮＡである。現在用いられる「アンチセンス」は、広くＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、リボザイムおよびＲＮアーゼ−Ｈに媒介される阻害を含む。アンチセンス核酸分子は、細胞での発現のために組換え遺伝子によりコードすることができる（例えば米国特許第５８１４５００号；米国特許第５８１１２３４号）か、また別に、合成的に調製することができる（例えば米国特許第５７８０６０７号）。
【００６９】
本発明で想定される合成オリゴヌクレオチドの具体的に限定しない例としては、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル、またはシクロアルキル糖内結合または短鎖ヘテロ芳香性もしくはヘテロ環式糖内結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。最も好ましいのは、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２バックボーン（ここでリン酸ジエステルはＯ−ＰＯ２−Ｏ−ＣＨ２である）を有するものである。米国特許第５６７７４３７号はヘテロ芳香性オリゴヌクレオチド結合について記載している。窒素リンカーまたは窒素を含む基を用いてオリゴヌクレオチド擬似物質を調製することもできる（米国特許第５７９２８４４号および第５７８３６８２号）。米国特許第５６３７６８４号はホスホラミデートおよびホスホロチオアミデートオリゴマー化合物について記載している。モルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた想定されている（米国特許第５０３４５０６号）。他の実施形態では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）バックボーンのようなオリゴヌクレオチドのリン酸ジエステルバックボーンをポリアミドバックボーンで置換でき、塩基はポリアミドバックボーンのアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：１４９７（１９９１））。他の合成オリゴヌクレオチドは、２‘位置で以下の１つを含む、置換された糖部分を含んでいてもよい：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２もしくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここでｎは１から約１０である）；Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリールもしくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−；Ｓ−；もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；蛍光部分；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基および類似の特性を有する別の置換体。オリゴヌクレオチドは、また、糖擬似物質、例えばペントフラノシル基の代わりにシクロブチルまたはその他の炭素環を有してもよい。アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンとは別のイノシンなどのヌクレオチドを有するヌクレオチドユニットをオリゴヌクレオチド分子において用いてもよい。
【００７０】
ＥＥＲ−７核酸
ＥＥＲ−７をコードする遺伝子は、ゲノムＤＮＡであってもｃＤＮＡであっても、いずれかの供給源、特にヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから単離することができる。ＥＥＲ−７遺伝子を入手する方法は、前記で記載したように（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出（１９８９）参照）当該技術でよく知られている。ＤＮＡは、当該技術で既知の標準的な手順によりクローン化されたＤＮＡ（例えばＤＮＡ「ライブラリー」）から得られ、好ましくは化学的合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、またはゲノムＤＮＡのクローニングにより、タンパク質を高レベルで発現する組織から調製され、望ましい細胞から精製されたｃＤＮＡライブラリーから得られる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出（１９８９）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編）ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＭＲＬプレス・リミテッド、オックスフォード、英国、Ｉ、ＩＩ巻（１９８５）参照）。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンはコード領域に加えて、調節およびイントロンＤＮＡ領域を含んでいてもよい。ｃＤＮＡから誘導されたクローンはイントロン配列を含まない。どの供給源であっても、遺伝子は遺伝子の増殖に適したベクターに分子的にクローン化されるべきである。望ましいＥＥＲ−７遺伝子を含む特定のＤＮＡフラグメントの同定は、多くの方法で達成できる。例えば以下で例示するＥＥＲ−７遺伝子の一部を精製し、標識して標識されたプローブを調製でき、標識したプローブへの核酸ハイブリダイゼーションにより生じたＤＮＡをスクリーニングすることができる（ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０（１９７７）；ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３９６１（１９７５））。別の個体からのアレレ変種などのプローブに対して実質的に相同性を有するこれらのＤＮＡフラグメントをハイブリダイズする。特定の実施形態では、最も高度な緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いて相同性ＥＥＲ−７遺伝子を同定する。
【００７１】
例えば遺伝子が本明細書で開示するＥＥＲ−７タンパク質の等電性電気泳動アミノ酸組成物、部分的もしくは完全なアミノ酸配列、抗体結合活性、またはリガンド結合プロファイルを有するタンパク質をコードする場合、遺伝子の特性に基づいてさらなる選別を実施できる。従って、遺伝子の存在をその発現生成物の物理学的、化学的、免疫学的または機能的特性に基づくアッセイにより検出することができる。
【００７２】
ＥＥＲ−７遺伝子と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を本発明の実施において使用することができる。これらには、非限定例としてはアレレ変種、種変種、配列保存変種、および機能的変種などがある。
【００７３】
アミノ酸置換体を導入してアミノ酸を特定の好ましい特性と置換することもできる。例えば、Ｃｙｓは、別のＣｙｓを有するジスルフィドブリッジの可能性のある部位に導入することができるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
本発明のＥＥＲ−７誘導体およびアナログをコードする遺伝子を当該技術で既知の種々の方法により製造することができる。これらの製造をもたらす操作を遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、当該技術で既知の多くの戦略のいずれかによりクローン化ＥＥＲ−７遺伝子配列を修飾することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出（１９８９））。（複数の）制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な部位で配列を切断し、続いて望む場合、さらに酵素修飾し、単離、およびインビトロでライゲートすることができる。ＥＥＲ−７の誘導体またはアナログをコードする遺伝子の製造においては、修飾された遺伝子が、望ましい活性がコードされている遺伝子領域において、翻訳停止シグナルにより干渉されずに、ＥＥＲ−７遺伝子と同一の翻訳読み枠内に残っていることを確認するのに注意を払うべきである。
【００７５】
加えて、ＥＥＲ−７コード核酸配列がインビトロまたはインビボで変異して翻訳、開始、および／もしくは終止配列を作製または破壊するか、またはコード領域で変種を作製し、および／もしくは新規制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するかもしくは先在するものを破壊して、さらなるインビトロ修飾を促進することができる。そのような修飾を作製して制限部位を導入し、ＥＥＲ−７遺伝子を発現ベクターにクローニングするのを促進することができる。インビトロ位置指定変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１（１９７８）；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、ＤＮＡ　３：４７９−４８８（１９８４）；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、Ｇｅｎｅ　４４：１７７（１９８６）；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１０（１９８６））、ＴＡＢ“リンカー（ファルマシア）の使用等の当該技術で既知のいずれかの変異誘発技術を用いることができるが、これらに限定されるものではない。位置指定変異誘発にはＰＣＲ技術が好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ、「ＤＮＡを操作するためのＰＣＲの使用」ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編、ストックホルムプレス、第６章、６１−７０頁（１９８９）参照）。
【００７６】
次いで同定および単離された遺伝子は、適切なクローニングベクターに挿入することができる。当該技術で既知の非常に多くのベクター−宿主系を使用することができる。可能なベクターとしては、プラスミドまたは修飾されたウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ベクターシステムは用いる宿主に適合しなければならない。ベクターの例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２誘導体などのプラスミドまたはｐＵＣプラスミド誘導体、例えばｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。クローニングベクターへの挿入は、例えば相補的付着末端を有するクローニングベクターにＤＮＡフラグメントをライゲートすることにより達成できる。しかし、ＤＮＡフラグメントに用いた相補的な制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素を用いて修飾することができる。また別に、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲートすることにより、いずれかの望ましい部位を作ることができ、これらのライゲートされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。加えて、単純なＰＣＲまたは重複ＰＣＲを用いてフラグメントをクローニングベクターに挿入することができる。
【００７７】
遺伝子配列の多くのコピーを作製するように形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等により組換え分子を宿主細胞に導入することができる。好ましくは、クローン化された遺伝子は、シャトルベクタープラスミド上に含まれ、望まれる場合、これによりクローニング細胞、例えば大腸菌において伸長され、続いて適切な発現細胞系に挿入するための精製が容易になる。例えば、１を超える生物で複製できるベクターであるシャトルベクターは、大腸菌およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の双方における複製のために、大腸菌プラスミドからの配列を酵母２μプラスミドからの配列と結合させることにより調製できる。
【００７８】
ＥＥＲ−７調節核酸
ＥＥＲ−７開始部位の上流のヒトゲノム領域をスキャニングすることにより、例えば欠失変異体を作製し、発現を検査することにより、またはＴＲＡＮＳＦＡＣアルゴリズムでＥＥＲ−７プロモーターのエレメントを同定することができる。約６から約１０キロ塩基（ｋｂ）まで、またはＥＥＲ−７開始部位からさらに上流の配列が組織特異的制御エレメントを含有できる。
【００７９】
「ＥＥＲ−７プロモーター」という文言は、人工プロモーターを包含する。そのようなプロモーターは、ＥＥＲ−７プロモーターの上流の領域からの非必須の介在配列を欠失することにより、またはＥＥＲ−７プロモーターから上流の制御エレメントをＣＭＶ即時型プロモーターなどの異種性最小プロモーターと結合することにより調製することができる。
【００８０】
ＥＥＲ−７プロモーターは、例えば構築物におけるレポーター遺伝子（ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質はレポーター遺伝子の例である）のための異種性コード配列と機能的に作用するように結合させることができる。この構築物は、ＥＥＲ−７プロモーターの制御下で異種性コード配列の発現をもたらし、例えば通常の条件下でＥＥＲ−７発現を誘発する条件下でレポーター遺伝子を発現することができる。この構築物を以下に記載する、エストロゲンレセプターアゴニストおよびアンタゴニストのためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【００８１】
ＥＥＲ−７ポリペプチドの発現
ＥＥＲ−７、またはその抗原性フラグメント、誘導体もしくはアナログ、またはキメラタンパク質を含むその機能的に活性な誘導体をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入することができる。従って、本発明のＥＥＲ−７をコードする核酸は、本発明の発現ベクターのプロモーターと機能的に作用するように結合させることができる。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の双方は、クローン化され、そのような調節配列の制御下で発現させることができる。そのようなベクターを用いて機能的なまたは機能的に不活性化されたＥＥＲ−７ポリペプチドを発現することができる。
【００８２】
必要な転写および翻訳シグナルは、組換え発現ベクター上に提供されるか、またはこれらはＥＥＲ−７をコードする元来の遺伝子および／またはそのフランキング領域により供給される。
【００８３】
可能性のある宿主−ベクター系としては、発現プラスミドでトランスフェクトされたか、またはウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス等）で感染された哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母などの微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターの発現エレメントは、その長さおよび特異性において変化する。利用する宿主−ベクター系に依存して、多くの適切な転写および翻訳エレメントのいずれか１つを使用することができる。
【００８４】
ＥＥＲ−７タンパク質の発現は、当該技術で知られているいずれかのプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御されるが、これらの調節エレメントは発現のために選択された宿主において機能的でなければならない。ＥＥＲ−７遺伝子発現を制御するために用いることができるプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５３８５８３９号および第５１６８０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれているプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ　２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２（１９８２））；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核細胞発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１（１９７８））、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５（１９８３））；また「組換え細菌からの有用なタンパク質」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　２４２：７４−９４（１９８０）参照；Ｇａｌ４プロモーターなどの酵母またはその他の菌類からのプロモーターエレメント；ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスフォグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター；および組織特異性を呈する転写制御領域、特に内皮細胞特異的プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
また別に、タンパク質発現は、転写アクチベーターを提供することにより制御することができる（米国特許第６０１５７０９号参照）。アクチベーターを用いて天然発生、またはそうでなければ遺伝的に組み込まれた遺伝子から高レベル転写を誘導することができる。本発明のキメラアクチベーターは、組み込まれた単一のコピー遺伝子の転写を活性化するのに特に有用であり、これは過去には適切なレベルで成功裏にトランス活性化されなかった。
【００８６】
タンパク質の可溶性形態は、培養液を収集することによりまたは封入体を可溶化することにより、例えば前記に記載したように界面活性剤で、望まれる場合、超音波処理またはその他の機械的な方法で処理することにより得ることができる。可溶化されたまたは可溶性タンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティ、イムノアフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解性、免疫沈澱を用いて、またはタンパク質の精製のためのいずれかの他の標準的な技術などの種々の技術により単離することができる。
【００８７】
ベクター
本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに広範な宿主／発現ベクターの組み合わせを用いることができる。有用な発現ベクターは例えば染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントから構成されていてよい。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０（１９８８））、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡＳ、例えばファージ１の多くの誘導体、例えばＮＭ９８９、およびその他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および繊維性一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミドまたはその誘導体などの酵母プラスミド；昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクターなどの真核細胞で有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクター、ファージＤＮＡまたはその他の発現制御配列を用いるように修飾されているプラスミド；等が挙げられる。
【００８８】
レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシナウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルスおよび望ましい細胞親和性を有するその他の組換えウイルスなどのウイルスベクター。従って、その機能的または変異体ＥＥＲ−７タンパク質またはポリペプチドドメインフラグメントをコードする遺伝子は、インビボ、エクソビボ、またはインビトロでウイルスベクターを用いて、またはＤＮＡの直接導入により導入できる。標的にされた組織における発現は、ウイルスベクターまたはレセプターリガンドなどのトランスジェニックベクターを特異的細胞に対して標的にすることにより、または組織特異的プロモーターを用いることにより、またはその双方により行うことができる。目的の遺伝子運搬（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）については、１９９５年１０月に公開された国際特許公開ＷＯ９５／２８４９４に記載されている。
【００８９】
インビボまたはエクソビボでの標的化および治療手順に一般に用いられるウイルスベクターは，ＤＮＡ基盤のベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築および使用する方法は当該技術で既知である（例えばＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：９８０−９９０（１９９２）参照）。好ましくは、ウイルスベクターは，複製欠損であり、すなわち目的の細胞において自発的に複製することができない。一般的に、本発明の範囲内で用いられる複製欠損ウイルスベクターのゲノムは、感染された細胞におけるウイルスの複製に必要な少なくとも１つの領域を欠いている。当業者に知られているいずれかの技術によりこれらの領域を排除するかまたは非機能性を付与することができる。これらの技術には（複製に）必須の領域への１つまたはそれ以上の塩基の、完全な除去、置換（別の配列による、特に挿入された核酸による）、部分的欠失または付加などが含まれる。そのような技術は、インビトロで（単離されたＤＮＡ上に）またはインシトゥで、遺伝子操作の技術を用いてまたは変異誘発剤で処理することにより、実施することができる。好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子がキャプシッドで包まれるのに必要とされるそのゲノムの配列を保持する。
【００９０】
ＤＮＡウイルスベクターとしては、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）等の弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。全てまたはほとんど全てのウイルス遺伝子を欠失している欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞に導入した後、感染力をもたない。欠損ウイルスベクターを使用することにより、ベクターが他の細胞に感染し得るという懸念なしに特定の局在した部分で細胞に投与することが可能になる。従って、特定の組織は、特異的に標的にすることができる。特定のベクターの例としては、欠損ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０（１９９１））、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠失する欠損ヘルペスウイルスベクター（特許公開ＲＤ３７１００５Ａ）、またはその他の欠損ヘルペスウイルスベクター（１９９４年９月２９日公開の国際特許公開番号ＷＯ９４／２１８０７；１９９４年４月２日公開の国際特許公開番号ＷＯ９２／０５２６３）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔらにより記載されたベクターなどの弱毒化されたアデノウイルスベクター（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０（１９９２）；Ｌａ　Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：９８８−９９０（１９９３）も参照）；欠損アデノ関連ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６１：３０９６−３１０１（１９８７）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６３：３８２２−３８２８（１９８９）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６（１９８８））；およびシンビディスウイルスベクター（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０６２３７；米国特許第５０９１３０９号）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
種々の会社が商業用のウイルスベクターを製造しており、限定するものではないが、アビゲン・インコーポレーティッド（アラメダ、カリフォルニア州；ＡＡＶベクター）、セル・ジェネシーズ（フォスター・シティー、カリフォルニア州；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、クロンテック（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、ゲノボ・インコーポレーティッド（シャロン・ヒル、ペンシルバニア州；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、ゲンベック（アデノウイルスベクター）、イントロジーン（レイデン、オランダ；アデノウイルスベクター）、モレキュラー・メディスン（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶおよびヘルペスウイルスベクター）、ノルゲン（アデノウイルスベクター）、オックスフォード・バイオメディカ（オックスフォード、英国；レンチウイルスベクター）、およびトランスジーン（ストラスボーグ、フランス；アデノウイルス、ワクシナ、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）などがある。
【００９２】
好ましくは、インビボ投与用に、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターと共に適切な免疫抑制処置を行い、ウイルスベクターおよびトランスフェクトされた細胞の免疫不活性化を避ける。例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、または抗ＣＤ４抗体などの免疫抑制性サイトカインを提供してウイルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答を遮断することができる（例えばＷｉｌｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５）参照）。この点で、最低数の抗原を発現するように操作されているウイルスベクターを用いるのが有利である。
【００９３】
別の実施形態では、ベクターを裸のＤＮＡとして、または別のトランスフェクション促進物質（ペプチド、重合体等）と共にリポフェクションによりインビボで導入することができる。合成カチオン性脂質を用いてマーカーをコードする遺伝子をインビボでトランスフェクションするためのリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ＞８４：７４１３−７４１７（１９８７）；ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３７：３８７−３８８（１９８９）；Ｍａｃｋｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１（１９８８）Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１７４５−１７４８（１９９３））。核酸の伝達に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、および米国特許第５４５９１２７号に記載されている。標的にする目的で脂質を化学的に他の分子に結合することができる（Ｍａｃｋｅｙら、前出参照）。標的化ペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質例えば抗体、または非ペプチド分子をリポソームに化学的に結合させることができる。
【００９４】
核酸のインビボでのトランスフェクションを促進するための他の分子としては、例えばカチオン性オリゴペプチド（例えば国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質から誘導されるペプチド（例えば国際特許公開ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性重合体（例えば国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）もまた有用である。
【００９５】
また別に、当該技術で既知の方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用（バリスティックトランスフェクション；例えば米国特許第５２０４２５３号、米国特許第５８５３６６３号、米国特許第５８８５７９５号、および米国特許第５７０２３８４号並びにＳａｎｆｏｒｄ、ＴＩＢ−ＴＥＣＨ、６：２９９−３０２（１９８８）；Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１４７８−１１４８２（１９９３）；およびＹａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１５６８−９５７２（１９９０）参照）、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用（例えばＷｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２０１２３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：２７２６−２７３０（１９９１）参照）により遺伝子治療用の非ウイルス性ＤＮＡベクターを望ましい宿主細胞に導入することができる。レセプター媒介ＤＮＡ運搬法を用いることもできる（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７））。米国特許第５５８０８５９号および第５５８９４６６号は、哺乳動物においてトランスフェクション促進物質のない外来ＤＮＡ配列の運搬について開示している。最近では、エレクトロトランスファーという、相対的に低い電圧で効率の高いインビボＤＮＡ転移技術について記載されている（Ｍｉｒら、Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３２１：８９３（１９９８）；ＷＯ９９／０１１５７；ＷＯ９９／０１１５８；ＷＯ９９／０１１７５）。
【００９６】
ＥＥＲ−７結合パートナーおよび基質
本発明は、さらにＥＥＲ−７の生理学的結合パートナーおよび基質の同定を可能にする。４個のＳＲＣＲドメインの存在は、ＥＥＲ−７がタンパク質−タンパク質相互作用により標的にされることを強く示している。ＥＥＲ−７結合パートナーを評価し、同定するための１つの方法は、酵母２ハイブリッドスクリーニングである。好ましくは、組換えＥＥＲ−７で形質転換された酵母と共に内皮細胞ライブラリーを用いて酵母２ハイブリッドスクリーニングを実施する。また別に、ＥＥＲ−７を捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）または親和（ａｆｆｉｎｉｔｙ）精製試薬として用いることができる。さらにまた別に、標識ＥＥＲ−７を例えば免疫沈澱またはウェスタン分析による結合のためのプローブとして用いることができる。
【００９７】
一般に、ＥＥＲ−７といずれかのその結合パートナーまたは基質との結合相互作用は、細胞外マトリックスで見出される条件に近い条件、すなわち生理的条件のイオン強度、ｐＨおよび温度において最も強力である。これらの条件の混乱は、結合相互作用の安定性を崩壊する傾向がある。
基質候補物質としては、コラーゲン、エラスチンおよびその他の細胞外マトリックスタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
ＥＥＲ−７に対する抗体
ＥＥＲ−７に対する抗体は、特に以下で示すＥＥＲ−７活性の診断および細胞内調節に有用である。本発明によると、組換えによりまたは化学合成により製造されたＥＥＲ−７ポリペプチド、およびそのフラグメントまたは融合タンパク質を含む他の誘導体もしくはアナログを免疫原として用いてＥＥＲ−７ポリペプチドを認識する抗体を生成することができる。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような抗体はヒトＥＥＲ−７に特異的であるのが好ましく、これはＥＥＲ−７の変異体または野生型ＥＥＲ−７のいずれか、または両方を認識できる。
【００９９】
ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）により論じられているように、あるアミノ酸を類似の疎水性親水性指標を有する他のアミノ酸と置換することができ、なお類似の生物学的活性を保持することが確定されているが、アミノ酸の疎水性親水性指標を用いてエピトープ領域を決定することができる。特に作製されるポリペプチドに望ましい生物学的機能が免疫学的実施形態において使用されることを意図する場合、親水性に基づいて類似のアミノ酸の置換を行うことができる。例えば、その隣接するアミノ酸の親水性により支配される「タンパク質」の最大局所平均親水性は、その免疫原性に相関することを述べている米国特許第４５５４１０１号を参照。従って、各アミノ酸に割り当てられた親水性に基づいて置換を行うことができるということが示されている。各アミノ酸に割り当てられた親水性指標または疎水性親水性指標のいずれかの使用において、これらの値が±２であるアミノ酸の置換を導入するのが好ましく、±１が特に好ましく、±０．５内であるのが最も好ましい置換である。
【０１００】
当該技術で知られている種々の手順は、ＥＥＲ−７ポリペプチドまたはその誘導体もしくはアナログに対するポリクローナル抗体の製造に用いることができる。抗体の製造に関しては、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等を含むが、これらに限定されない種々の宿主動物をＥＥＲ−７ポリペプチドまたはその誘導体（またはフラグメントまたは融合タンパク質）の注射により免疫できる。１つの実施形態では、ＥＥＲ−７ポリペプチドまたはそのフラグメントを免疫原性キャリヤ、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と抱合させることができる。宿主の種に依存して、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌（ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウム　パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）などの有用な可能性のあるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない、種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増強させることができる。
【０１０１】
ＥＥＲ−７ポリペプチドまたはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体を指向するモノクローナル抗体を調製するために、培養における連続細胞系による抗体分子の製造のために提供されるいずれかの技術を用いることができる。これには、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５））により独自に開発されたハイブリドーマ技術、およびトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０（１９８３））、並びにヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、アランＲリス・インコーポレーティッド、７７−９６頁（１９８５））などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のさらなる実施形態では、モノクローナル抗体を無菌動物において製造することができる（国際特許公開番号ＷＯ８９／１２６９０）。実際に、本発明によれば、ＥＥＲ−７ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることにより、「キメラ抗体」の製造のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：８７０（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４５２−４５４（１９８５））を用いることができる。そのような抗体は本発明の範囲内である。ヒトのまたはヒト化キメラ抗体は、異種性抗体ほど免疫応答、特にアレレギー性応答そのものを誘発する可能性がそれほど高くないので、そのようなヒトのまたはヒト化キメラ抗体をヒト疾患または障害の治療に使用するのが好ましい。
【０１０２】
抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、既知の技術により生成できる。例えば、そのようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により製造できるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより生成できるＦａｂ’フラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成できるＦａｂフラグメントなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
本発明によれば、一本鎖抗体の製造のために記載された技術（米国特許第５４７６７８６号、５１３２４０５号および米国特許第４９４６７７８号）をＥＥＲ−７ポリペプチド特異的一本鎖抗体の製造に適合させることができる。本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために記載された技術（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１（１９８９））を利用して、ＥＥＲ−７ポリペプチド、またはその誘導体もしくはアナログに望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能にする。
【０１０４】
抗体の製造および使用において、望ましい抗体のためのスクリーニングまたは望ましい抗体に関する試験は、当該技術で知られている技術、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インシトゥイムノアッセイ（例えば金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等により達成することができる。１つの実施形態では、抗体結合を１次抗体の標識を検出することにより検出する。別の実施形態では、２次抗体または試薬の１次抗体への結合を検出することにより１次抗体を検出する。さらなる実施形態では、２次抗体が標識されている。イムノアッセイにおける結合の検出のために多くの手段が当該技術で知られており、本発明の範囲内である。例えば、ＥＥＲ−７ポリペプチドの特異的エピトープを認識する抗体を選別するために、そのようなエピトープを含有するＥＥＲ−７ポリペプチドフラグメントに結合する生成物のために作製されたハイブリドーマをアッセイすることができる。特定の種の動物からのＥＥＲ−７ポリペプチドに特異的な抗体を選別するために、その動物種の細胞により発現されたかまたはその細胞から単離されたＥＥＲ−７ポリペプチドとの正の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）結合に基づいて選別することができる。
【０１０５】
前記の抗体は、上記に記載したかまたは当該技術で知られているいずれかの検出技術を用いて、例えばウェスタンブロッティング、ＥＥＲ−７ポリペプチドのインシチュウイメージング、適切な生理学的サンプル中のそのレベルの測定等のためのＥＥＲ−７ポリペプチドの局在および活性に関する、当該技術で知られている方法において使用できる。例えば、米国特許第５６７９５８２号に記載されているように、リガンド結合のためのアッセイにおいて、そのような抗体を用いることができる。一般に、生理的条件、例えば約７から８の間のｐＨ、および生理的イオン強度の下で抗体結合が最も容易に生じる。バッファー溶液中のキャリヤータンパク質の存在がアッセイを安定化する。最適な条件の混乱、例えばイオン強度、温度、もしくはｐＨの増強または低減、またはデタージェントもしくはカオトロピック塩の添加に対していくらか耐性はあるが、そのような混乱により結合安定性は低下するであろう。
【０１０６】
特定の実施形態では、ＥＥＲ−７ポリペプチドの活性を作動または拮抗する抗体を作製することができる。特に細胞内の一本鎖Ｆｖ抗体を用いてＥＥＲ−７を調節（阻害）することができる（Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８８４−７８９３（１９９３）；Ｃｈｅｎ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ　３：１６０−１６７（１９９７）；Ｓｐｉｔｚら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１６：３４１５−３４２２（１９９６）；Ｉｎｄｏｌｆｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：６３４−６３５（１９９６）；Ｋｉｊｉｍａら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６８：２４７−２６７（１９９５））。そのような抗体は、リガンドを同定するための下記に記載したアッセイを使用して試験することができる。
【０１０７】
スクリーニングおよび化学
本発明によれば、ＥＥＲ−７をコードする遺伝子から誘導されるヌクレオチド配列、およびＥＥＲ−７から誘導されるペプチド配列は、エストロゲン調節過程に関連する疾患の処置に有効である薬物を同定するための有用な標的である。薬物標的としては、（ｉ）ＥＥＲ−７をコードする遺伝子から誘導される単離された核酸；（ｉｉ）ＥＥＲ−７ポリペプチドから誘導される単離されたペプチドおよびポリペプチド；並びに最も重要な（ｉｉｉ）ＥＥＲ−７発現を選択的に調節する異なるエストロゲンレセプターなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。
【０１０８】
特に、例えば天然の供給源から単離できるものよりも大量のＥＥＲ−７発現を可能にすることにより、または細胞のトランスフェクションもしくは形質転換の後に発現されるＥＥＲ−７の活性を示すように特別に操作されたインジケーター細胞において、ＥＥＲ−７を同定および単離することにより、特にＥＥＲ−７の活性を上方または下方調節する分子の高速大容量スクリーニングのためのスクリーニングアッセイが開発される。従って、本発明は、当該技術で既知の種々のスクリーニングアッセイを用いて、ＥＥＲ−７発現を変化させる特異的エストロゲンレセプターリガンドおよびＥＥＲ−７に直接作用する分子を同定するための方法を企図する。
【０１０９】
当該技術で既知のいずれかのスクリーニング技術を用いてＥＥＲ−７アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることができる。本発明は、小型分子リガンドまたはリガンドアナログおよび擬似物質のスクリーニングおよびインビボで結合してＥＥＲ−７発現活性を作動または拮抗する天然リガンドのためのスクリーニングを企図する。例えば、本発明のアッセイを用いて、ＥＥＲ−７発現または活性を作動または拮抗する分子のための天然の生成物ライブラリーをスクリーニングできる。
【０１１０】
別の研究法では大きなライブラリーを製造するための組換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｄａｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　４９：４０４−４０６（１９９０））を用いて、非常に大きなライブラリーを構築することができる（化学物質１０６−１０８）。第２の方法は、主に化学的方法を用い、Ｇｅｙｓｅｎ法（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２３：７０９−７１５（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ　１０２：２５９−２７４（１９８７）；およびＦｏｒｄｏｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：７６７−７７３（１９９１）））がその例である。Ｆｕｒｋａら（第１４回国際生化学学会、第５巻（１９８８）、アブストラクトＦＲ：０１３；Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１））、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（米国特許第４６３１２１１号）およびＲｕｔｔｅｒ（米国特許第５０１０１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験できるペプチドの混合物を製造する方法について記載している。
【０１１１】
別の実施形態では、合成ライブラリー（Ｎｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０７００−１０７０４（１９９３）；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）；Ｌａｍら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／００２５２；Ｋｏｃｉｓら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４２８０２８）等を用いて、本発明によるＥＥＲ−７を調節するリガンドのためのスクリーニングをすることができる。合成または天然化合物の大きなライブラリーから被験化合物をスクリーニングする。現在、糖類、ペプチドおよび核酸基盤の化合物の無作為の合成および方向性をもった合成のための多くの手段を用いる。合成化合物ライブラリーは、メイブリッジ・ケミカル・カンパニー（トレビレット、コーンウォール、英国）、コムゲネックス（プリンストン、ニュージャージ州）、ブランドンアソシエーツ（メリマック、ニューハンプシャー州）、およびマイクロソース（ニューミルフォード、コネチカット州）から市販により入手可能である。希少化学物質ライブラリーは、アルドリッヒ（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）より入手可能である。また別に、細菌、菌類、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーは、例えばパンラボラトリーズ（ボーテル、ワシントン州）またはマイコサーチ（ノースカロライナ州）から入手可能であるか、または容易に製造できる。加えて、天然の、および合成により製造されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理学的および生化学的手段により容易に修飾される（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、Ｔｉｂ　Ｔｅｃｈ　１４：６０（１９９６））。
【０１１２】
ＥＥＲ−７の１次配列の知識およびその配列と既知の機能のタンパク質との類似性は、タンパク質のインヒビターまたはアンタゴニストとして最初の手掛かりを提供できる。例えば、Ｘ線結晶学、ニュートロン回折、核磁気共鳴分光法、および構造決定のためのその他の技術を用いて、タンパク質の構造上の特徴を決定することによりアンタゴニストの同定およびスクリーニングがさらに容易になる。これらの技術によりアゴニストおよびアンタゴニストが合理的に設計または同定される。
【０１１３】
インビボスクリーニング法
ＥＥＲ−７をコードする遺伝子を発現する無傷の細胞または動物全体をスクリーニング方法において使用して候補薬物を同定できる。
一連の実施形態では、永久細胞系を確立する。また別に、適当なＤＮＡまたはｍＲＮＡの導入によりＥＥＲ−７遺伝子を発現するように細胞（限定することなく、哺乳動物、昆虫、酵母または細菌細胞を含む）を一時的にプログラムする。いずれかの適当なアッセイ、限定することなく、（ｉ）被験物質のＥＥＲ−７への選択的結合を測定するアッセイ、（ｉｉ）測定可能なＥＥＲ−７の活性または機能を修飾する（すなわち阻害または増強する）被験化合物の能力を測定するアッセイ、および（ｉｉｉ）ＥＥＲ−７遺伝子のプロモーター（すなわち調節）領域から誘導される配列の転写活性を修飾する（すなわち阻害または増強する）化合物の能力を測定するアッセイなどを用いて候補化合物の同定を行うことができる。
【０１１４】
ＥＥＲ−７の分子メカニズム、特にヒトＥＥＲ−７に誘発されるシグナル発生を評価するためにトランスジェニック哺乳動物を準備できる。そのような哺乳動物は薬物候補物質をスクリーニングまたは試験するための優れたモデルを提供する。従って、ヒト対象で可能なものよりも非常に詳細にこの系の分子生物学を評価するためにヒトタンパク質ＥＥＲ−７「ノック・イン」哺乳動物を準備できる。例えばＥＥＲ−７活性の欠損を補うことができる化合物を同定するために、「ノックアウト」動物において化合物または疾患を評価することも可能である。両方の技術により細胞ゲノムにおける天然の位置で遺伝情報の単独のユニットの操作が可能になり、末端分化生物のバックグラウンドでその操作の結果を試験できる。胚幹細胞の修飾および芽細胞への異核注入を含むが、これらに限定されない、いずれかの方法によりトランスジェニック動物を準備することができる。
【０１１５】
「ノック・イン」哺乳動物は、内因性遺伝子が異種性遺伝子で置換されている哺乳動物である（Ｒｏｅｍｅｒら、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．３：３３１（１９９１））。好ましくは、同種遺伝子の発現または機能の評価の対象（この場合、遺伝子はレポーター遺伝子でよい；Ｅｌｅｆａｎｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１１８９７（１９９８）参照）となる目的の遺伝子座に異種性遺伝子が「ノック・イン」されており、それにより異種性遺伝子発現が適切なプロモーターからの転写に連結される。これは、変異組換え部位（Ａｒａｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：８６８（１９９７））またはＰＣＲ（ＺｈａｎｇおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２５：７８４（１９９８））を用いて、同種組換え、トランスポゾン（ＷｅｓｔｐｈａｌおよびＬｅｄｅｒ、Ｃｕｒｒ．　Ｂｉｏｌ．７：５３０（１９９７））により達成できる。
【０１１６】
ヒト対象において可能であるよりも非常に詳細にこの欠損の分子病理学を評価するためにＥＥＲ−７ノックアウト哺乳動物を準備できる。そのような動物はまた薬物候補物質をスクリーニングするための優れたモデルも提供する。「ノックアウト哺乳動物」は、そのゲノム内に不活性化されている特異的遺伝子を含有する哺乳動物（例えばマウス、ウサギ）である。遺伝子に非機能性を付与するかまたは発現されないようにすることができる当該技術で既知の方法を用いることができる。そのような方法の非限定例は、遺伝子標的化（例えば米国特許第５７７７１９５号および第５６１６４９１号参照）である。ノックアウト動物には、ヘテロ接合体ノックアウト（すなわち１つの欠損アレレおよび１つの野生型アレレ）およびホモ接合変異体（すなわち２つの欠損アレレ；ＥＥＲ−７発現の欠損が致命的である場合、ヒトＥＥＲ−７などのＥＥＲ−７発現のための異種性構築物を挿入してノックアウト動物を生存させることができる）の両方が含まれる。ノックアウト哺乳動物の準備には、第１に特定の遺伝子の発現を抑制するために使用される核酸構築物を胚幹細胞という未分化細胞型に導入することが必要である。次いで、この細胞を哺乳動物胚に注入する。次いで、組み込まれた細胞を有する哺乳動物胚を妊娠期間中の養母に移植する。Ｚｈｏｕら、（Ｇｅｍｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｅｌｏｐｍｅｎｔ　９：２６２３−２６３４（１９９５））は、ＰＰＣＡノックアウトマウスについて記載している。
【０１１７】
「ノックアウト」という文言は、細胞における内因性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現の部分的または完全な抑制を意味する。「ノックアウト構築物」という文言は、細胞における内因性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の発現を低減するかまたは抑制するように設計された核酸配列をいう。ノックアウト構築物として用いられる核酸配列は、典型的には（１）抑制すべき遺伝子のある部分からのＤＮＡ（エクソン配列、イントロン配列、および／またはプロモーター配列）および（２）細胞におけるノックアウト構築物の存在を検出するのに用いられるマーカー配列から成る。ノックアウト構築物は、細胞に挿入され、元来のＤＮＡ配列の転写を防止または妨害するような位置で細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。通常、そのような挿入は、同種組換えにより生じる（すなわち、ノックアウト構築物が細胞に挿入されると、内因性ＤＮＡ配列に相同であるノックアウト構築物の領域が互いにハイブリダイズし、再結合する。ノックアウト構築物が内因性ＤＮＡの対応する位置に組み込まれるように）。ノックアウト構築物核酸配列は、（１）抑制すべき遺伝子の１つまたはそれ以上のエクソンおよび／またはイントロンの配列全長または一部、（２）抑制するべき遺伝子のプロモーター配列の全長または一部、または（３）その組み合わせを含んでいてよい。典型的には、通常、同種組換えの方法によりノックアウト構築物を胚幹細胞（ＥＳ細胞）に挿入し、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡに組み込む。このＥＳ細胞を次いで成長中の胚に注入し、それに組み込む。
【０１１８】
「遺伝子の崩壊」および「遺伝子崩壊」という文言は、遺伝子の野生型または天然発生配列に比較して細胞におけるその遺伝子の発現を低減するか防止するように元来のＤＮＡ配列の１つの領域（通常１つまたはそれ以上のエクソン）および／または遺伝子のプロモーター領域への核酸配列の挿入をいう。例としては、核酸構築物は、崩壊すべきＤＮＡ配列（プロモーターおよび／またはコード領域）に相補的であるＤＮＡ配列に挿入される抗生物質抵抗性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含めることにより調製できる。次いで、この核酸構築物を細胞にトランスフェクトすると、構築物はゲノムＤＮＡに組み込まれるであろう。従って、今やＤＮＡは抗生物質抵抗性遺伝子により崩壊されているので、細胞の多くの子孫は、少なくともいくつかの細胞では、もはや遺伝子を発現しないか、または低下したレベルで発現する。
【０１１９】
一般に、ＤＮＡは、少なくとも約１ｋｂの長さ、好ましくは３から４ｋｂの長さであり、ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡにノックアウト構築物を導入すると、それにより組換えに十分相補的である配列が提供される（以下で論じる）。
【０１２０】
２つまたはそれ以上の遺伝子がノックアウトされている哺乳動物は、本発明の範囲内に包含される。各ノックアウト構築物を作製するための本明細書にて前記に記載した手順を繰り返すことにより、または各々が単一のノックアウトされた遺伝子を有している哺乳動物を互いに飼育することにより、および二重のノックアウトゲノタイプを有するものをスクリーニングすることにより、そのような哺乳動物を作製できる。
【０１２１】
ｔｅｔレプレッサー系（米国特許第５６５４１６８号参照）またはクレ・ロックス系（米国特許第４９５９３１７号および第５８０１０３０号参照）などの種々の系を用いて調節されたノックアウト動物を準備できる。
【０１２２】
別の一連の実施形態では、（ｉ）ヒトＥＥＲ−７がトランスジェニック動物のゲノムに安定して挿入されていて、かつ／または（ｉｉ）内因性ＥＥＲ−７遺伝子が不活性化され、ヒトＥＥＲ−７遺伝子で置換されているトランスジェニック動物を創る。例えばＣｏｆｆｍａｎ、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１７：４０４（１９９７）；Ｅｓｔｈｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：９５３（１９９６）；Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｂｌｏｏｄ　Ｐｒｅｓｓ．Ｓｕｐｐｌ．２：３６（１９９６）参照。
【０１２３】
別の実施形態では、内因性ＥＥＲ−７発現を変調する配列が動物のゲノムに安定して挿入されている。例えば、ＥＥＲ−７発現を刺激する（転写因子など）かまたは下方調節因子と相互作用して阻害する配列を使用することができる。
【０１２４】
ＥＲ活性化アッセイ
エストロゲンレセプターイソ体アゴニストおよびアンタゴニストの差別的かつ／または選択的機能活性の算定が可能になるいずれかの細胞アッセイシステムが本発明により定義される。特定の実施形態では、下記で例を示すように、アッセイを用いてＥＲの特異的イソ体と差別的に相互作用する化合物を同定でき、該化合物は、ＥＥＲ−７ｍＲＮＡ転写を変調する被験化合物と接触させたエストロゲンリガンドの影響を算定することにより評価できる。従って、アッセイシステムを用いて１つのエストロゲンレセプターにより機能的影響を選択的に生み出す化合物を同定できる。ＥＥＲ−７ｍＲＮＡ転写を増強する化合物は、結果的にＥＥＲ−７タンパク質の生成を増加させることができ、腹部大動脈瘤および心筋梗塞の予防における新規の治療薬として有用である。好ましい実施形態では、アッセイシステムは異なるエストロゲンレセプターを発現する細胞の２つの異なる集団からなる。好ましくは、各実験を化合物の複数の異なる希釈で３検体ずつ実施する。
【０１２５】
アンタゴニストスクリーニングは、ＥＥＲ−７調節エストロゲンと接触させた場合に宿主細胞によるレポーター遺伝子の発現を検出することを含む。ＥＥＲ−７発現が低下した場合、被験化合物は、核ホルモンレセプターシグナル発生のアンタゴニスト候補物質である。レポーター遺伝子の発現に変化がない場合、被験化合物は、有効なＥＲリガンドではない。
【０１２６】
記載したアッセイシステムを用いて、異なるエストロゲンレセプターによる被験化合物の影響を比較することができる。異なるエストロゲンレセプターを発現する、形質転換細胞の異なる集団におけるＥＥＲ−７転写に及ぼす被験化合物の影響を比較して、化合物がエストロゲンレセプターアゴニスト／アンタゴニストのクラスに属するかどうかを評価する（以下を参照）。
【０１２７】
いずれかの都合のよい方法により発現された生成物の検出が可能になる。例えば、本発明はＥＥＲ−７ｍＲＮＡ生成物を検出するためのノーザンブロット分析を提供する。方法は、アガロースゲル状で全細胞性ＲＮＡを分画化し、ＲＮＡを固体支持膜に移し、標識ＤＮＡプローブを有するＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を検出する工程からなり、この場合、サンプル中のＤＮＡプローブおよびＲＮＡ成分間で安定した複合体を形成できる条件下で、ＤＮＡプローブは特定のＥＥＲ−７の核酸配列に特異的である。当該技術で既知のいずれかの適切な手段を用いることによりそのような複合体を検出でき、この場合、複合体の検出はサンプル中のＥＥＲ−７の存在を示す。ＥＥＲ−７発現制御エレメントの制御下また別のレポーター遺伝子をＥＲ活性アッセイにおいて使用することができる。
【０１２８】
典型的には、イムノアッセイは、標識抗体または標識抗原成分のいずれかを使用する（例えば、これは抗体との結合に対してサンプル中の抗原と競合する）。適切な標識としては、限定することなく、酵素基盤、蛍光、化学ルミネセンス、放射活性、または色素分子などが挙げられる。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた既知であり、例えばビオチンおよびアビジンを利用するもの、並びにＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識イムノアッセイなどがある。
【０１２９】
本明細書で記載したアッセイシステムは、アゴニストおよびアンタゴニストのための高速大容量１次スクリーニングにおいても使用することができるか、または異なる１次スクリーニング、例えばレセプターと相互作用し、ＥＥＲ−７転写に影響を及ぼす化合物を同定する結合アッセイスクリーニングにより同定される候補化合物のための２次機能スクリーニングとして用いることができる。
【０１３０】
エストロゲン化合物
「エストロゲン化合物」は、ステラロイズ・インコーポレーティッドの「Ｓｔｅｒｏｉｄｓ」第１１版、Ｗｉｌｔｏｎ　Ｎ．Ｈ．（参照により本明細書に組み入れる）に記載されているいずれかの構造として定義される。前記の参考文献において記載されている非ステロイドエストロゲンはこの定義に含まれる。この定義に含まれる他のエストロゲン化合物は、エストロゲン誘導体、エストロゲン代謝体、およびエストロゲン前駆体である。エストロゲン選択的レセプターアゴニストアンタゴニスト（ＥＳＲＡＡ）は、ＥＲαレセプターでアゴニストとして、およびＥＲβレセプターではアンタゴニストとして機能するエストロゲン化合物である。ＥＲβレセプターで作動し、ＥＲαレセプターで拮抗するエストロゲン化合物もまたこのアッセイシステムで同定することができる。この文言は、ＥＥＲ−７転写を調節する、本明細書に記載したエストロゲン効果を特異的に誘発する分子も包含する。１つ以上のエストロゲンまたはエストロゲン化合物の混合物もまた含まれる。そのような混合物の例は、米国特許第５５５４６０１号の表ＩＩに提供される（コラム６参照）。単独または他の物質との組み合わせのいずれかで有用性のあるエストロゲンの例は、例えば米国特許第５５５４６０１号において提供されている。
【０１３１】
βエストロゲンはエストロゲン化合物のβ異性体である。αエストロゲンはエストロゲン成分のα異性体である。「エストラジオール」という文言は、特記しない場合αまたはβエストラジオールのいずれかである。
【０１３２】
「Ｅ２」という文言はβエストラジオール、１７βエストラジオール、およびβ−Ｅ２と同義である。αＥ２およびαエストラジオールはβＥ２エストラジオールのα異性体である。
【０１３３】
好ましくは、非雌性化エストロゲン化合物を使用する。そのような化合物は、子宮肥大およびその他の望ましくない副作用を引き起こさないという利点を有し、従って、より高い有効量で使用することができる。非雌性化エストロゲンの例としては、ラロキシフェン（エビスタ；イーライ・リリー）、タモキシフェン（ノルバデックス；アストラ・ゼネカ）、およびその他の選択的エストロゲンレセプターモデュレーターなどが挙げられる。
【０１３４】
加えて、アンドロゲン、テストステロンなどのある化合物は、アロマターゼ酵素を用いる変換によりテストステロンをインビボでエストロゲンに変換できる。アロマターゼ酵素は、限定することなく、脳などのいくつかの領域に存在する。アンドロゲンにはアロマターゼの基質であって、変換できるものと、基質になれないものがある。アロマターゼの基質であるこれらのアンドロゲンをアロマタイズ可能なアンドロゲンといい、アロマターゼの基質でないものをアロマタイズ不可能なアンドロゲンという。例えば、テストステロンはアロマタイズ可能なアンドロゲンであり、ジヒドロテストステロンはアロマタイズ不可能なアンドロゲンである。従って、本発明は、明らかに、アンドロゲンからエストロゲンに変換され、インビボでのアミロイドレベルを低下させる、本明細書に記載された効果を生み出すこれらの化合物にまで（および以下に記載するように、精巣が除去されたかまたは不活性化されている動物を実験動物として使用することまで）拡大される。
【０１３５】
高速大量処理スクリーニング
本発明による物質は、限定することなく、細胞基盤アッセイまたは細胞なしのアッセイを含む高速大量処理アッセイでのスクリーニングにより同定できる。異なる型のアッセイを用いて異なる型の物質を検出できることは当業者に理解されよう。自動化されたアッセイのいくつかの方法が近年開発され、短時間で数万の化合物のスクリーニングが可能になった。そのような高速大量処理スクリーニング法が特に好ましい。本発明により提供されるように、大量の精製されたポリペプチドの利用性により、物質を試験するための高速大量処理スクリーニングアッセイの使用が大いに促進される。
【０１３６】
診断方法
本発明によれば、ＥＥＲ−７の遺伝的変種を検出して、腹部大動脈瘤または心筋梗塞になりやすさの増大などのＥＥＲ−７に関連する疾患を診断できる。そのような変種を検出するための種々の方法を本明細書に記載する。変異したアミノ酸配列の結果としてか、すなわち変異体により結果的にトランケートされたタンパク質が発現されるためか、または全く発現されない結果としてそのような変種がＥＥＲ−７機能に影響する場合、コラーゲンおよびエラスチン架橋の調節不能をもたらすと予測される。
【０１３７】
核酸アッセイ
どの細胞供給源からでもＤＮＡを入手できる。当該技術で標準的な多くの方法のいずれかを用いて細胞供給源または体液からＤＮＡが抽出される。ＤＮＡを抽出するのに用いられる特定の方法は、供給源の性質に依存することは理解されよう。一般に、本発明で使用するために抽出すべきＤＮＡの最低量は、約２５ｐｇである（４×１０９塩基対のゲノムサイズの約５個の細胞等価物に相当する）。
【０１３８】
また別の代替の実施形態では、グアニジウムチオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出などの、当業者によく知られている標準的な方法を用いて生検組織からＲＮＡを単離する（Ｃｈｏｍｏｃｙｚｎｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６（１９８７））。次いで、選択された部位に特異的な特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、共役逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応による増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）に単離されたＲＮＡを供する。特異的逆転写および増幅を確実にするようにプライマーアニーリングの条件を選択する。従って、増幅産物の出現が特定の遺伝的変種の存在の診断になる。別の実施形態では、ＲＮＡを逆転写および増幅し、その後増幅された配列を例えば直接シークエンシングにより同定する。さらに別の実施形態では、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡをクローン化し、シークエンシングして変異体を同定する。
【０１３９】
タンパク質アッセイ
代替の実施形態では、生検組織を対象から入手する。ＥＥＲ−７に特異的に結合できる抗体は、次いで、組織のサンプルと接触させて、抗体により特定されたＥＥＲ−７ポリペプチドの有無を決定する。抗体は、ポリクローナルであってもよいし、またはモノクローナルであってもよく、モノクローナルが好ましい。細胞に結合する特異的抗体の測定は、いずれかの既知の方法、例えば定量用フローサイトメトリー、酵素結合または蛍光結合イムノアッセイ、ウェスタン分析等により行うことができる。
【０１４０】
治療的用途
本発明によれば、ＥＥＲ−７タンパク質発現の刺激をエストロゲン関連疾病状態の患者における処置選択肢として用いることができる。ＥＥＲ−７タンパク質発現の刺激は、（ｉ）ＥＥＲ−７タンパク質をコードする核酸を提供すること、および（ｉｉ）ＥＥＲ−７遺伝子の転写および／または翻訳を刺激する化合物を提供することなどの方法、これらの方法に限定されないが、により刺激することができる。
【０１４１】
遺伝子治療
特定の実施形態では、ＥＥＲ−７全長を含む、これに限定されないが、タンパク質をコードする配列を含むベクターを提供して、心臓血管機能におけるＥＥＲ−７の機能に関連する疾病または障害を治療または予防する。本発明のこの実施形態では、治療用ベクターは本発明のタンパク質を生成する配列をコードする。
【０１４２】
当該技術で利用可能な遺伝子治療のいずれかの方法を本発明に従って用いることができる。例となる方法を以下に記載する。
【０１４３】
遺伝子治療の方法の一般的な概説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　１２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ　３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０：９２６−９３２（１９９３）；並びにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：１５５−２１５（１９９３）参照。使用できる組換えＤＮＡ技術の当該技術で一般に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３）、ジョーン・ウィレイ・アンド・サンズ、ニューヨーク州；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、ストックトン・プレス、ニューヨーク州；およびＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）、第１２および１３章、ジョーン・ウィレイ・アンド・サンズ、ニューヨーク州に記載されている。遺伝子治療に適したベクターは前記に記載されている。
【０１４４】
１つの態様では、治療用ベクターは、適切な宿主で本発明のタンパク質を発現する核酸を含む。特に、そのようなベクターは、タンパク質のためのコード配列に機能的に作用するように連結されたプロモーターを有する。プロモーターは、誘導型でも構成型でもよく、任意に、組織特異的であってもよい。別の実施形態では、タンパク質コード配列およびその他の望ましい配列が、ゲノムの望ましい部位で相同組換えを促進する領域によりフランキングされている核酸分子を使用しており、従ってタンパク質の染色体内発現を提供する。（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０１４５】
ベクターの患者への運搬は、直接的、この場合、患者が直接ベクターもしくは分配複合体にさらされる、または間接的、この場合、細胞が最初インビトロでベクターで形質転換され、次いで患者に翻訳される、のいずれかでよい。これらの２つの方法は、各々インビボおよびエクソビボ遺伝子治療として知られている。
【０１４６】
特定の実施形態では、ベクターはインビボで直接提供され、その場合ベクターは生物の細胞に侵入し、タンパク質の発現を媒介する。これは、適切な発現ベクターの一部としてベクターを構築し、それを投与して細胞内のものになるようにすることにより、例えば欠損または弱毒化レトロウイルスまたはその他のウイルスベクターを用いる感染により（米国特許第４９８０２８６号参照）、もしくは裸のＤＮＡの直接注入により、もしくはマイクロ粒子ボンバードメントにより（例えば遺伝子ガン；バイオリスティック、デュポント）；または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト物質、バイオポリマー中へのカプセル化（例えばポリ−Ｓ−１−６４−Ｎ−アセチルグルコサミン多糖類、米国特許第５６３５４９３号参照）、リポソーム、マイクロ粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化、核に侵入することが解っているペプチドまたはその他のリガンドへの連結にそれを投与すること、またはレセプター媒介のエンドサイトーシスに供されるリガンドへの連結にそれを投与すること（例えばＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）等、当該技術で知られている多くの方法のいずれかにより達成できる。別の実施形態では、リガンドが融合誘導性ウイルスペプチドを含み、エンドソームを崩壊し、核酸がリソソーム分解を避けることが可能になる核酸リガンド複合体を形成することができる。さらに別の実施形態では、特異的レセプターを標的にすることにより、核酸はインビボで細胞特異的取り込みおよび発現のために標的にされる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０６１８０、ＷＯ９２／２２６３５、ＷＯ９２／２０３１６およびＷＯ９３／１４１８８参照）。また別に、相同組換えによる発現のために核酸を細胞内に導入し、宿主細胞ＤＮＡ内に組み入れることができる（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：８９３２−８９３５（１９８９）、Ｚｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８（１９８９））。これらの方法は「ウイルスおよび非ウイルスベクター」に関連して前記に記載したものに加えられる。
【０１４７】
また別に、例えばＭａｒａｓｃｏら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８８９−７８９３（１９９３））に記載されたものなどの技術を用いて、例えば標的細胞集団内で一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することにより抗体分子を投与することもできる。
【０１４８】
使用するために想定される治療用核酸の形態および量は疾病の型および望まれる効果の重篤度、患者の状態等に依存し、当業者により決定され得る。
【０１４９】
タンパク質合成の刺激
遺伝子転写およびタンパク質翻訳は、外因性化合物の投与により阻害または刺激され得る。外因性化合物は、アデノシン三リン酸、酸化窒素、およびグアノシン三リン酸などの、これらに限定されないが、細胞外および／または細胞内メッセンジャー系と相互作用し、タンパク質合成を調節することができる。この実施形態では、ＥＥＲ−７タンパク質合成を刺激する外因性化合物を心筋梗塞および大動脈瘤を含む心臓血管障害の予防および／または治療に使用できる。特定の実施形態では、ＥＥＲ−７タンパク質発現を刺激する外因性化合物は、エストロゲンレセプターリガンドである。
【０１５０】
治療用に示唆される化合物は、当該技術で知られている処方で患者に提供され、賦形剤、滑沢剤、希釈剤、着香剤、着色剤、および崩壊剤などの医薬上許容される添加物を含有できる。処方は、錠剤、キャプレット、カプセル、液体または注射などの有用な投与単位で製造することができる。
【０１５１】
使用するために想定される治療用化合物の形態および量は、疾病のタイプおよび望まれる効果の重篤度、患者の状態等に依存し、当業者により決定され得る。
【０１５２】
実施例
本発明は、限定する目的ではなく例示する目的で提供される以下の実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【０１５３】
実施例１：ＥＥＲ−７の発見
ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ＲＮＡを用いて、ディファレンシャルディスプレイによりＥＥＲ−７を同定した。０日目に、ＨＵＶＥＣを１５０ｍｍ２プレートあたり約３×１０６セルで維持培地（１０ｐｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ、３μｇ／ｍｌのウシ脳抽出物、および２（容量／容量）％のウシ胎児血清）を補充した、クロンテック（サンディエゴ、カリフォルニア州）のＥＢＭ）にプレートした。１日目に、２（容量／容量）％チャコール／デキストラン処理したウシ胎児血清（ハイクローン；ローガン、ユタ州）を補充し、およそ３００の感染多重度の複製欠損アデノウイルス発現ヒトＥＲβ（Ａｄ５ＥＲβ）を含有するフェノール・レッドなしのＥＢＭを細胞に供給した。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、ＥＢＭ／ＢＳＡ（０．２５（重量／容量）％のウシ血清アルブミン、１０Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２５ｎｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢを補充したＥＢＭ）を再供給した。３７℃でおよそ６時間のさらなるインキュベーションの後、細胞に１００ｎＭの１７β−エストラジオールまたはＤＭＳＯビヒクルのいずれかを含有するＥＢＭ／ＢＳＡを再供給した。およそ１６時間のインキュベーションの後、細胞に３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βおよび１００ｎＭの１７β−エストラジオールまたはＤＭＳＯビヒクルのいずれかを含有するＥＢＭ／ＢＳＡを再供給した。３７℃で５時間インキュベートした後、トリゾール（ライフテクノロジーズ）を用いて細胞を収穫した。製造者のプロトコルに従ってＲＮＡを調製した。精製された全ＲＮＡを３７℃で１時間、１０ＵのデオキシリボヌクレアーゼＩと反応させ、Ｒｎイージー・スピンカラム（キアゲン；チャッツウォース、カリフォルニア州）により再精製した。
【０１５４】
デオキシリボヌクレアーゼＩ処理の後、６μｇの全ＲＮＡを１ｘＲＴバッファー（２５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７．６ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＤＴＴ、ゲンハンター、ナッシュビル、テネシー州）、２０μＭのｄＮＴＰ（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴＴＰ　２‘−デオキシヌクレオシド５’トリホスフェート、ギブコ／ＢＲＬ）、０．２μＭのＨＴ１１Ｃ（オリゴヌクレオチド：ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ；配列番号８）と共に最終容量６００μＬでインキュベートした。この反応混合物を６５℃で５分間インキュベートし、２次構造を変性させ、続いて３７℃で１０分間インキュベートした。次いで，スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ、ギブコ／ＢＲＬ）３０μｌを反応物に加え、３７℃で１時間インキュベーションを行った。７５℃で５分間加熱することにより酵素を不活性化した。次いで，この反応物のアリコートをＰＣＲによる第２鎖合成に用いた。反応物２μｌに，１ｘＰＣＲバッファー（１０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ８．４、１００ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．００１％のゼラチン）、２μＭのｄＮＴＰ、１５ｎＭの３３ＰｄＡＴＰ（ＮＥＮ）、１単位のアンプリタックＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー）および１μＭの任意のプライマー５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号９）を全反応物容量２０μｌで添加した。次いで，反応混合物を以下のパラメーターを用いて熱循環に供した。
９２℃で２分間、１サイクル
９２℃で１５秒間、４０℃で２分間、７２℃で３０秒間、４０サイクル
７２℃で５分間
【０１５５】
１ｘＴＢＥバッファー（０．１Ｍのトリス、０．０９Ｍのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ）中２０００ボルトで３時間、６％　変性ポリアクリルアミドゲル（５．７％のアクリルアミド、０．３％のビスアクリルアミド、４２％の尿素および５１％のＨ２Ｏ）でのゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分離した。次いで、ゲルを濾紙（シュライッヒャー・アンド・シュエル）に移し、真空下８０℃で１時間乾燥し、Ｘ線フィルムに２４時間さらした。次いで、現像したフィルムを乾燥ゲルに重ね合わせ、目的のバンドを同定した。バンドの隅を２２ゲージシリンジ針を用いてマークし、これらの境界内のゲルスライスをかみそりの刃で切除し、Ｈ２Ｏ１００μｌに浸した。サンプルを水浴中で１５分間沸騰させ、２分間遠心分離し、上澄溶液を新しいチューブに移した。このサンプルに、１０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン５μｌ、３Ｍの酢酸ナトリウム１０μｌおよび１００％のエタノール４５０μｌを添加した。サンプルを混合し、−２０℃で一晩沈殿させ、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上澄溶液を除去し、ペレットを８５％のエタノール２００μｌで洗浄し、Ｈ２Ｏ１０μｌに再懸濁した。１ｘＰＣＲバッファー、２０μＭのｄＮＴＰ、０．２μＭの任意のプライマーおよび０．２μＭのオリゴヌクレオチドＨＴ１１Ｃおよび２単位のアンプリタックポリメラーゼの存在下、前記のＰＣＲ反応と同一の循環パラメーターを用いて、再増幅ＰＣＲ反応にこの３μｌアリコートを使用した。
【０１５６】
同定された調節されたバンドの中で、およそ３２０塩基対の大きさの＃７が１７β−エストラジオール処理による非常に強力な誘導が示され、これを内皮エストロゲン調節遺伝子（ＥＥＲ−７）と称した。ＥＥＲ−７フラグメントをＴＡクローニングによりベクターｐＣＲＩＩ（インビトローゲン）にクローン化した。ノーザンブロット分析のためにＨＵＶＥＣ細胞からの全ＲＮＡを１（重量／容量）％のアガロースゲル上で約２００Ｖで２時間の電気泳動により分画化した。毛細管現象により一晩ＲＮＡをナイロン膜に移した。オリゴヌクレオチド標識キット（ファルマシア）を用いて、ゲル精製したＥＥＲ−７の３２０ｂｐフラグメントから調製した３２Ｐ標識ＥＥＲ−７フラグメントｃＤＮＡプローブでナイロン膜をハイブリダイズした。ノーザンの結果は、ＥＥＲ−７全長メッセージはおよそ４．０ｋｂであることを示した。
【０１５７】
ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ；非冗長およびＥＳＴデータベース）を用いた３２０ｂｐ配列の分析は、既知遺伝子に対してなんら相同性を同定しなかったが、相同性を有するＥＳＴ配列（Ｗ４２６０３、Ｗ４４９２０、Ｈ２５２３７およびＡＡ１６６６２０）を表した。これらのＥＳＴをリサーチ・ジェネティックスから入手し、その全体をシークエンシングした。およそ１．２ｋｂの得られた配列は、既知の同定された遺伝子に対する相同性を有しなかったが、同定可能なコード領域を含有していた。
【０１５８】
ＥＥＲ−７遺伝子を単離するために、ＰＣＲスクリーニング法（オリジーン・ラピッド−スクリーン）をヒト胎盤ライブラリーと共に利用した。ＥＥＲ−７の既知配列から誘導されるオリゴプライマー（５’−ＴＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴ−３’および５’−ＴＡＡＧＡＴＡＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＣＡＣＴＡ−３’；各々配列番号１０および１１）をヒト胎盤全ＲＮＡと共にはじめてＲＴ−ＰＣＲ反応で使用した。１．２％のアガロースゲルでの電気泳動の後、予測された３４０ｂｐバンドが観察された。次いで、これらのオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによりオリジーン９６ウェルヒト胎盤ライブラリーをスクリーニングした。５個のウェルは、３４０ｂｐバンドを生じた。これらのウェルに対応するサブプレートをオリジーンから得て、ＰＣＲの第２ラウンドを実施して各サブプレートから陽性のウェルを同定した。陽性のサブウェルをＬＢ＋アンピシリンプレートにプレートして個々のコロニーを得た。３２Ｐ標識１ｋｂのＥＳＴ配列をプローブとして用いて、これらのコロニーをコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）。膜を４８℃で一晩ハイブリダイズし、次いで室温で２ｘＳＳＣ／０．５％　ＳＤＳで２回、６０℃で０．１ｘＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳで２回洗浄した。陽性コロニーをＬＢ＋アンピシリン中で成長させ、プラスミドＤＮＡを得た（キアゲン）。プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化させ、ｃＤＮＡインサートを遊離させた。反応物をコロニーハイブリダイゼーションプロトコルのために記載された電気泳動およびサザン分析に供した。Ｄ３Ｅ１１というクローンは、ＥＥＲ−７クローン全長で予測される大きさのｃＤＮＡインサートを生じ、その全てがシークエンシングされた。この配列を用いるＢＬＡＳＴ分析により遺伝子のリシルオキシダーゼファミリーの既知のメンバーに対する類似性が同定された（図１および２）。
【０１５９】
実施例２：ＥＥＲ−７発現の調節
ヒト臍帯血管細胞（ＨＵＶＥＣ）を凍結貯蔵物（クロンテックス、サンディエゴ、カリフォルニア州）として２または３継代で得た。細胞を維持した。１０ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、１ｍｇ／ｍｌのハイドロコルチゾン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ、３ｍｇ／ｍｌのウシ脳抽出物および２容量％のウシ胎児血清を補充したＥＢＭ培地中で細胞を維持した。４から７継代の実験のための細胞を使用した。
【０１６０】
０日目に、ＨＵＶＥＣを１５０ｍｍ２プレートあたり約３×１０６セルで維持培地にプレートした。細胞を３７℃で約２４時間インキュベートした。１日目に、２（容量）％チャコール／デキストラン処理したウシ胎児血清（ハイクローン；ローガン、ユタ州）を補充し、およそ３００の感染多重度の複製欠損アデノウイルス発現ヒト全長野生型ＥＲα（Ａｄ５ＥＲα）またはＥＲβ（Ａｄ５ＥＲβ）を含有するフェノール・レッドなしのＥＢＭ培地を細胞に供給した。感染の後、細胞を洗浄し、２容量％のチャコール／デキストランで処理したウシ胎児血清を補充したフェノール・レッドなしのＥＢＭ培地を再供給した。細胞を約３７℃で約２０時間インキュベートした。３日目に、シリカゲルカラム（キアゲン；チャッツウァース、カリフォルニア州）で細胞から全ＲＮＡを抽出した。１％のアガロースゲル上で約１５０Ｖで約２時間電気泳動するにより全ＲＮＡを分画化した。２０ｘＳＳＣを用いて毛細管移動によりＲＮＡを移動させた。ナイロン膜を３２Ｐ標識ＥＥＲ−７ｃＤＮＡプローブ（ファルマシアのオリゴラベリングキットを用いて作製）でハイブリダイズした。結果を図３にまとめる。
【０１６１】
ＥＥＲ−７の配列分析は、タンパク質がＬＯおよびＬＯＬタンパク質ファミリーに属する他のタンパク質に構造的に類似することを示している（図１参照）。ドメインの比較は、ＥＥＲ−７はＬＯおよびＬＯＬタンパク質に関連する特徴的な触媒性ドメインを共有し、ＷＳ９１４に存在するＳＲＣＲドメインをも含有することを示している。組み合わせて、これは、ＥＥＲ−７タンパク質がＳＲＣＲドメインにより媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用により細胞性シグナル発生経路において重要な役割を果たすことを示している。
【０１６２】
発現研究によりＥＥＲ−７発現がＨＵＶＥＣ細胞のＥＲαおよびＥＲβの両方により制御されることが示された。原型のエストロゲンアゴニスト１７βエストラジオールは、双方のレセプターとの相互作用によりＥＥＲ−７発現を刺激した。加えて、この効果は、非選択的エストロゲンレセプターアンタゴニストＩＣ１８２７８０により遮断された（図３、右のバンドパネル参照）。ＥＲαアゴニストおよびＥＲβアンタゴニストである化合物２および８（図４）は共にＥＲαによるＥＥＲ−７発現を刺激し、ＥＲβレセプターでの１７βエストラジオールの効果を遮断した。これらの研究は、ＥＥＲ−７発現および活性が双方のエストロゲンレセプターにより変調されることを示している。従って、ＥＥＲ−７のエストロゲン媒介変調は、ＡＡＡおよび心筋梗塞に対する治療戦略のための新規開発方法を表している。
【０１６３】
本発明は、本明細書にて記載された特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書において記載されたものに加えて本発明の種々の変更は、前記の記載および添付の図面から当業者に明らかになろう。そのような変更は、添付の請求の範囲の範囲内になるように意図されている。
【０１６４】
全ての値は概数であり、記載のために提供されていることはさらに理解される。
【０１６５】
本明細書で引用された全ての特許、特許出願、出版物およびその他の資料は、その全体として参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰＡＭ２５０残基重量表と共にクラスタール法を使用した、ウサギＥＥＲ−７タンパク質フラグメント、ＥＥＲ−７コンセンサスタンパク質、ヒトおよびマウスＷＳ９１４、ヒトおよびマウスＬＯＬ、ヒトおよびマウスＬＯ、並びにヒトおよびマウスＥＳＴに関するタンパク質アラインメントの配列対距離。
【図２】
ＥＥＲ−７タンパク質とＷＳ９１４、ＬＯＬ、およびＬＯタンパク質との間のＳＲＣＲおよび触媒性ドメインの配列類似性の概略的表現。
【図３】
ＨＵＶＥＣ細胞におけるＥＲαおよびＥＲβレセプターの活性化後のＥＥＲ−７およびグリコールアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼＲＮＡレベルを示すノーザンブロット。
【図４】
化合物２および８の構造。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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2004505631.tif 000074
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004505631.tif 000075
【国際調査報告】
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2004505631.tif 000077
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