(57)【要約】本発明はＲＮＡ転写物の検出および解析に関し、特に、所与の細胞または組織中で産生される一次ＲＮＡ転写物の数およびタイプを特徴づける方法に関する。
2004526443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物を解析する方法であって、
（i）上記細胞または細胞集団中で転写されるＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識する工程、
（ii）標識された転写物を精製する工程、
（iii）標識された転写物の第１鎖ｃＤＮＡコピーを合成する工程、および
（iv）結果として得られたｃＤＮＡを解析して、上記細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物の性質を決定する工程、
を含む方法。
【請求項２】
工程（iv）が、結果として得られたｃＤＮＡを解析して、上記細胞または細胞集団中で産生される一次ＲＮＡ転写物の性質を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ii）で精製した標識された転写物の３’末端に一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをライゲーションし、そのオリゴヌクレオチドリンカーに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使って工程（iii）における第１鎖ｃＤＮＡの合成を行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヌクレオチド類似体が特異的抗体によって認識され得る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチド類似体がビオチン−ＣＴＰまたはＢｒ−ＵＴＰである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヌクレオチド類似体が蛍光部分を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヌクレオチド類似体がフルオレセイン−ＵＴＰである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
結果として得られたｃＤＮＡを解析して上記細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物の性質を決定する工程が、
第１鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを形成させること、
二本鎖ｃＤＮＡをクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを形成させること、および
ｃＤＮＡライブラリー中に存在する個々のクローンを解析すること、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｃＤＮＡライブラリー中に存在する個々のクローンを解析する工程が、ライブラリー中に存在するクローンのｃＤＮＡインサートの一部分を配列決定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ライブラリー中に存在する実質上的全クローンのインサート部分を配列決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結果として得られたｃＤＮＡを解析して上記細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物の性質を決定する工程が、ｃＤＮＡをマイクロアレイにハイブリダイズさせることを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
結果として得られたｃＤＮＡを解析して上記細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物の性質を決定する工程が、各ｃＤＮＡの所定の部分のヌクレオチド配列を決定することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
各ｃＤＮＡの所定の部分のヌクレオチド配列が、遺伝子発現の連続解析を行うことによって決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞または細胞集団中で産生される一次ＲＮＡ転写物の解析に用いられる請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、工程（i）が、上記細胞または細胞集団中で転写される新生ＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識することを含む方法。
【請求項１５】
ＲＮＡ転写物の集団を解析する方法であって、
（i）認識部位から所定の距離だけ離れた部位でのＤＮＡ切断を可能にする酵素認識部位を含む一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを、ＲＮＡ転写物の３’末端にライゲーションして、連結ＲＮＡを形成させる工程、
（ii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに相補的なプライマーを第１ｃＤＮＡ鎖の合成に使用して、連結ＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡコピーを合成する工程、
（iii）工程（ii）で合成されたｃＤＮＡを前記酵素認識部位を認識する酵素で切断して、所定の長さのｃＤＮＡタグを生成させる工程、および
（iv）複数のｃＤＮＡタグの配列を決定し、それによって元のＲＮＡ転写物の集団を解析する工程、
を含む方法。
【請求項１６】
工程（i）に先立ってＲＮＡ転写物の集団を２つのほぼ等しい転写物のプールに分割し、その後、工程（i）が、
第１一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを第１転写物プールの３’末端にライゲーションして第１連結ＲＮＡプールを形成させること、および第２一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを第２転写物プールの３’末端にライゲーションして第２連結ＲＮＡプールを形成させることを含み、第１および第２オリゴヌクレオチドリンカーはそれぞれ、認識部位から所定の距離だけ離れた部位でのＤＮＡ切断を可能にする酵素認識部位を含み、
工程（ii）が、
第１オリゴヌクレオチドリンカーに相補的なプライマーを第１ｃＤＮＡ鎖の合成に使用して、第１連結ＲＮＡプールから第１二本鎖ｃＤＮＡプールを合成すること、および第２オリゴヌクレオチドリンカーに相補的なプライマーを第１ｃＤＮＡ鎖の合成に使用して、第２連結ＲＮＡプールから第２二本鎖ｃＤＮＡプールを合成することを含み、
そして工程（iii）が、
第１および第２ｃＤＮＡプールを、前記酵素認識部位を認識する酵素で切断して、所定の長さのｃＤＮＡタグを生成させることを含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（iii）で形成されたｃＤＮＡタグをライゲーションしてジタグを形成させる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列決定に先立ってジタグを増幅する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列決定に先立って、連結されたジタグのコンカテマーを形成させる工程をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＮＡ転写物の集団が新生ＲＮＡプールを含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞または細胞集団中で産生される一次転写物を解析する方法であって、
上記細胞または細胞集団中で転写される新生ＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識する工程、
標識された転写物を精製する工程、および
標識された転写物を、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法を使って解析する工程、
を含む方法。
【請求項２２】
少なくとも１つのジタグを含む、ある細胞または細胞集団に由来する核酸修飾物であって、各ジタグは２つの共有結合した反対向きの核酸タグを含み、各タグが前記細胞または細胞集団中で発現される一次ＲＮＡ転写物の最３’末端に相当する、前記核酸修飾物。
【請求項２３】
あるＲＮＡ転写物の集団内の特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づける方法であって、
（i）ＲＮＡ転写物に一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをライゲーションして、連結ＲＮＡを形成させる工程、
（ii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに相補的な第１鎖合成プライマーを使って、連結ＲＮＡの第１鎖ｃＤＮＡコピーを合成する工程、
（iii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに対応する第１プライマーと、上記特定転写単位の一領域に相補的な第２プライマーとを使って、第１鎖ｃＤＮＡの一領域を増幅する工程、
（iv）結果として得られた増幅産物を解析し、それによって上記ＲＮＡ転写物の集団内に存在する上記特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づける工程、
を含む方法。
【請求項２４】
ＲＮＡ転写物の集団が新生ＲＮＡプールである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
所与の細胞または細胞タイプに由来する新生ＲＮＡのプール内の特定転写単位に関係する一次転写物を検出し、特徴づける方法であって、
上記細胞または細胞集団中で転写される新生ＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識する工程、
標識された転写物を精製する工程、および
請求項２３に記載の方法を使って、標識された転写物内の特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づける工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明はＲＮＡ転写物の検出および解析に関し、特に、所与の細胞または組織中で産生される一次ＲＮＡ転写物の数およびタイプを特徴づける方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝情報は、遺伝子から、メッセージにプロセシングされる一次転写物を経由して、タンパク質に流れる。現在ではヒトゲノムの全配列がわかっており、細胞集団中の全成熟メッセージおよびタンパク質の総数ならびにタイプを決定するために利用できる技術がある。しかし、一次転写物の数およびタイプについてわかっていることは比較的少ない。本発明は、情報移動の階層構造にあって欠落しているレベルの解析、つまり新生転写物（すなわち会合したポリメラーゼがまだ結合している転写物）の数およびタイプの解析を可能にする方法を、ここに提供する。この方法は、１つまたは複数の細胞集団における遺伝子転写物および非遺伝子転写物の両方を定量的にカタログ化するための一般技術である。この技術の有用な応用例には、細胞が分化もしくは悪性化する時または細胞が外来因子（例えばウイルス、化学物質、発癌物質、γ線、ＵＶ光）にばく露された時に起こる変化の監視が含まれる。異なる転写物プロファイル（例えばガン細胞およびその正常前駆細胞の転写物プロファイル）を比較することにより、どの転写単位が（例えば腫瘍形成時に）抑制または活性化されているかを同定することができるはずであり、結果としてそれは、診断プローブの開発および治療的介入の標的候補の同定につながるはずである。
【０００３】
ある細胞中の異なるメッセージの相対数を決定するには、ＳＡＧＥ（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，  １９９５；Ｋｉｎｚｌｅｒら，  米国特許第５，６９５，９３７号）および「マイクロアレイ」（Ｂｒｏｗｎら，  １９９８；Ｉｙｅｒら，  １９９９；ＬｏｃｋｈａｒｔおよびＷｉｎｚｅｌｅｒ，  ２０００）に基づく方法を含む種々のハイスループット法が使用されている。これらの方法により、成熟メッセージのカタログは得られるが、新生転写物のカタログは得られない。その理由は２つある。第１に、解析のために選択されるＲＮＡはポリ（Ａ）尾部を含み、それゆえ一次転写物は含まれない。この偏りが生じる理由は、解析されるポリ（Ａ）＋転写物が必然的に遺伝子転写物であること、および非遺伝子標的は通常はマイクロアレイにもＳＡＧＥデータベースにも配置されないことである。しかし、最近の研究により、非遺伝子転写物は一次転写物のかなりの部分を占めること、またそれらは遺伝子発現の制御に決定的な役割を果たしうることが示されている（Ｅｒｄｍａｎｎら，  １９９９）。第２に、新生転写物の数を成熟メッセージの数から推定することは不可能であることがわかる。なぜなら両者の関係は、転写物プロセシングの速度、ＲＮＡの核外輸送、およびメッセージの代謝回転などといった様々な（未知の）因子による影響を受けるからである（Ｒｏｓｓ，  １９９５に概説されている）。細胞質における成熟メッセージの安定性という一因子だけを考察してみよう。哺乳類メッセージの安定性には４０倍を超えるばらつきが生じうるので、メッセージプロファイルの変化が、転写プロファイルの根本的変化の不完全像を与えることは避けられない。その結果、あるヒト細胞における異なる遺伝子の転写の相対頻度については、ほとんどなにもわからず、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される最も活性な遺伝子が何であるかさえ我々にはわからない。
【０００４】
任意の瞬間にどの遺伝子が転写されつつあるかのスナップショットを与えることができるハイスループット技術はまだない。したがって、ある細胞または細胞集団中で産生される一次転写物の解析を可能にするハイスループット技術が必要とされている。
【０００５】
（発明の概要）
本発明の第１の態様によれば、ある細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物を解析する方法であって、
（i）上記細胞または細胞集団中で転写されるＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識する工程、
（ii）標識された転写物を精製する工程、
（iii）標識された転写物の第１鎖ｃＤＮＡコピーを合成する工程、および
（iv）結果として得られたｃＤＮＡを解析して、上記細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物の性質を決定する工程、
を含む方法が提供される。
【０００６】
さらに本発明は、ＲＮＡ転写物の集団を解析する方法であって、
（i）ＲＮＡ転写物の３’末端を、認識部位から所定の距離だけ離れた部位でのＤＮＡ切断を可能にする酵素認識部位を含む一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションして、連結ＲＮＡを形成させること、
（ii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに相補的なプライマーを第１ｃＤＮＡ鎖の合成に使用して、連結ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換すること、
（iii）結果として得られたｃＤＮＡを前記酵素認識部位を認識する酵素で切断して、所定の長さのｃＤＮＡタグを生成させること、および
（iv）複数のｃＤＮＡタグの配列を決定し、それによって元のＲＮＡ転写物の集団を解析すること、
を含む方法に関する。
【０００７】
さらに本発明は、少なくとも１つのジタグを含む、ある細胞または細胞集団に由来する核酸修飾物（nucleic acid composition）であって、各ジタグは２つの共有結合した反対向きの核酸タグを含み、各タグが前記細胞または細胞集団中で発現される一次ＲＮＡ転写物の最３’末端に相当する核酸修飾物を提供する。
【０００８】
さらに本発明は、あるＲＮＡプール内の特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づける方法であって、
（i）ＲＮＡ転写物の一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをライゲーションして、連結ＲＮＡを形成させる工程、
（ii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに相補的な第１鎖合成プライマーを使って、連結ＲＮＡの第１鎖ｃＤＮＡコピーを合成する工程、
（iii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに対応する第１プライマーと、上記特定転写単位の一領域に相補的な第２プライマーとを使って、第１鎖ｃＤＮＡの一領域を増幅する工程、
（iv）結果として得られた増幅産物を解析し、それによって上記ＲＮＡ転写物の集団内に存在する上記特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づける工程、
を含む方法を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
第１の態様として、本発明は、以下の工程を用いて行われる、ある細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物の検出および解析に関する：
（i）上記細胞または細胞集団中で転写されるＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識する工程、
（ii）標識された転写物を精製する工程、
（iii）標識された転写物の第１鎖ｃＤＮＡコピーを合成する工程、および
（iv）結果として得られたｃＤＮＡを解析して、上記細胞または細胞集団中で産生されるＲＮＡ転写物の性質を決定する工程。
【００１０】
本方法は一次ＲＮＡ転写物の解析に特に適しており、その実施形態では、工程（iv）に、結果として得られたｃＤＮＡを解析して、上記細胞または細胞集団中で産生される一次ＲＮＡ転写物の性質を決定することが含まれる。この実施形態では、細胞または細胞集団中で転写される新生ＲＮＡ転写物が、工程（i）において、ヌクレオチド類似体で標識される。本方法の好ましい応用例は一次転写物の研究への応用であるが、ＲＮＡプロセシング経路のもっと後の段階での転写物（成熟ｍＲＮＡを含む）の解析にも本方法を使用しうることは、当業者には明らかだろう。
【００１１】
標識されたヌクレオチド類似体の存在下で、ＲＮＡポリメラーゼに活性に会合しているＲＮＡ転写物の制御された伸長を許すことによって、細胞内の新生ＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識することは知られている（Ｉｂｏｒｒａら，  １９９６および１９９８；Ｊａｃｋｓｏｎら，  １９９８）。標識されたヌクレオチドの新生ＲＮＡ鎖への取り込みは、新生転写物をその細胞内に見いだされるＲＮＡ残部から単離するための有用な手段になる。例えば、標識された新生ＲＮＡは、そのヌクレオチド類似体に特異的な抗体を使って全細胞ＲＮＡから分離することができ、ビオチン化ヌクレオチド類似体で標識された新生ＲＮＡはストレプトアビジン磁気ビーズを使って精製することができる。
【００１２】
本発明者らは、予想外にも、標識されたヌクレオチド類似体を取り込んだＲＮＡ転写物は逆転写酵素によって忠実に複写されてｃＤＮＡを形成できることを確認した。標識された類似体ヌクレオチドを取り込んだ転写物をｃＤＮＡに複写することができるという発見は、ｃＤＮＡ集団のハイスループット解析に利用可能な強力な技術を、新生ＲＮＡ転写物の集団の解析に使用できる可能性をもたらした。
【００１３】
本発明の方法はＲＮＡ転写物の標識化に決定的に依存する。本方法を使って一次ＲＮＡ転写物の集団を解析する場合は、新生ＲＮＡ分子の標識化により、それらを全細胞ＲＮＡから精製することが可能になる。標識化は新生転写物へのヌクレオチド類似体の取り込みによって達成される。ヌクレオチド類似体は以下の性質を持つヌクレオチド類似体であれば本質的にどれでもよい：
１）ＲＮＡ鎖に取り込まれうること、
２）標識されていない転写物に対して標識された転写物の選択が可能であること、
３）標識された転写物を忠実に複写して第１鎖ｃＤＮＡを形成させることが可能であること。
【００１４】
適切なヌクレオチド類似体には、例えば、特異的抗体によって認識され得る類似体（例えばＢｒ−ＵＴＰ）、高特異性結合反応（すなわちビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン結合）によって認識され得るビオチン−ＣＴＰなどの類似体、および蛍光、発光などの何らかの性質により、直接検出することができる類似体、例えばフルオレセイン−ＵＴＰなどがあるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００１５】
新生転写物の標識化は当技術分野で知られている技術を使って達成することができる。適切なアプローチは、例えばＩｂｏｒｒａら，  １９９６およびＪａｃｋｓｏｎら，  １９９８などに記載されている。一つのアプローチとして、細胞を短時間、典型的には１．２５分より短い時間、ヌクレオチド類似体を含む培地中で生育させて、類似体が新生ＲＮＡに取り込まれるようにする。次に、結果として生じる標識されたＲＮＡは、例えば標識されたＲＮＡと特異的に反応する抗体などを使って、標識されていない（例えば完成している）転写物を含まないように精製することができる。別のアプローチでは、細胞をサポニンで透過処理し、まだ会合しているポリメラーゼに標識ヌクレオチドの存在下で新生転写物の伸長を許容させた後、標識されたＲＮＡを上述のように選択する。本発明者らは、対照実験で以下のことを観察した。すなわち、
（i）（ＲＮアーゼおよび様々なＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を使用して）ヌクレオチド類似体がＲＮＡに取り込まれる、
（ii）インビボで活性なポリメラーゼは本質的にすべて、サポニンの存在下で溶解した後も会合した状態を保ち、標識されたヌクレオチドの存在下で「ラン・オン（ｒｕｎ−ｏｎ）」できる、
（iii）様々な類似体が［３Ｈ］シチジンとして同じ新生転写物に取り込まれる。
【００１６】
したがってこれらの方法は、新生転写物を標識化し、次に、他のＲＮＡ分子を含まないようにそれらを精製する、強力で簡単な方法になる。実際面では、細胞を透過処理し、新生転写物をヌクレオチド類似体の存在下で約２５ヌクレオチドまで伸長させることが、最も好ましい（そのような伸長を達成し監視する方法についてはＪａｃｋｓｏｎら（１９９８）を参照されたい）。この伸長度合いは、ほとんどの新生転写物にタグが付加されることを保証し、かつ結果として生じる標識されたＲＮＡを容易に精製できることを保証するには十分な長さであるが、標識化中に終結する転写物はほとんどないほどに十分に短いので（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって作られる多くの転写物は約１００ヌクレチドしかない）、新生転写物の望ましくない断片化によって精製の対象となりうる２断片が生じることも少なくなる（標識されたヌクレオチドを欠く５’断片は選択されない）。ＲＮＡプロセシング経路のもっと後の段階で標識された転写物を生成させるため、またさらには標識された成熟ｍＲＮＡを生成させるために、ヌクレオチド類似体の存在下で細胞を生育する時間を延長してもよい。そうすれば、標識された転写物の一部が成熟ｍＲＮＡに加工されて、細胞質に運ばれるだろう。
【００１７】
標識されたＲＮＡ転写物を精製（すなわち全細胞ＲＮＡのプールから選択）した後、第１鎖ｃＤＮＡに変換する。好ましい一実施形態として、標識された転写物の３’末端に一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをライゲーションすることによって、第１鎖ｃＤＮＡ合成を容易にすることができる。その場合、第１鎖合成は、そのリンカーに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使って開始させることができる。酵素Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを使って、効率のよい反応で、一本鎖ＤＮＡリンカーの供与５’−リン酸基をＲＮＡの３’末端に結合させることができる（ＵｈｌｅｎｂｅｃｋおよびＧｕｍｐｏｒｔ，  １９８２を参照されたい）。このオリゴヌクレオチドリンカーの主な機能は、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが結合するためのアンカー配列になることである。したがってオリゴヌクレオチドリンカーのヌクレオチド配列の詳細は、一般に本発明にとっては重要ではない。
【００１８】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｂｒ−Ｕなどの類似塩基を含むＲＮＡ鎖が、逆転転写酵素を使って、第１鎖ｃＤＮＡに忠実に複写され得ることを明らかにした。実際、ヌクレオチド類似体を含む転写物の複写は、通常の標識されていない転写物の複写と同じ程度に効率よく進行する。ヌクレオチド類似体で標識された転写物の複写によって得られる第１鎖ｃＤＮＡは、逆転写酵素を使って、二本鎖ｃＤＮＡに変換することもできる。
【００１９】
標識されたＲＮＡ転写物をｃＤＮＡに変換し終えたら、そのｃＤＮＡが由来するＲＮＡ集団の組成を決定する目的で、結果として得られたｃＤＮＡ集団を解析することができる。ＲＮＡからｃＤＮＡへの変換によって得られる明確な利点がある。つまり、（i）ｃＤＮＡはＲＮＡよりはるかに安定であり（すなわち分解されにくく）、（ii）ｃＤＮＡの特徴づけるためのハイスループット技術は、当技術分野では数多く知られている。
【００２０】
ｃＤＮＡ集団を解析するため、そして特に、結果として生じるｃＤＮＡ集団中にどの配列が存在するかを決定するためには、多種多様な技術を使用することができる。適切な技術の非網羅的なリストを以下に記載する。このリストは例示のために記載するに過ぎず、本発明の限定を意図するものではない。
【００２１】
（i）インサートの直接配列決定
標識されたＲＮＡ転写物から得た二本鎖ｃＤＮＡのプールを適切なベクターにクローニングして、ｃＤＮＡクローンのライブラリーを形成させることができる。このベクターはｃＤＮＡインサートの直接配列決定を容易にするものであることが、最も好ましい。その場合、ライブラリーに含まれる各クローンのインサートを配列決定することは、日常的作業である。結果として生じる配列データは、そのライブラリー中に存在するｃＤＮＡクローンの数およびタイプを決定するために、利用可能なデータベースと比較することができる。ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡから得られる発現配列タグまたはＥＳＴに対して、出発物質が標識された新生ＲＮＡ転写物である場合には、各クローンから得られる配列の断片を「新生転写物タグ（ｎａｓｃｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｔａｇ）」またはＮＴＴと呼ぶ。
【００２２】
新生ＲＮＡから得られるｃＤＮＡライブラリーは、ＥＳＴを与えるポリ（Ａ）＋  ＲＮＡから作製された従来のライブラリーよりも複雑である。これらはすべての転写単位に由来するｃＤＮＡを含み、会合したポリメラーゼは転写単位のあらゆる地点に見いだされるだろうから、各転写単位からは長さが１ヌクレオチドづつ相違する３’末端を持つ複数の標本が生じるだろう。これに対して、従来のｃＤＮＡライブラリーはそのような不完全な転写物の見本を含まず、同じ３’末端を持つ多数の同じｃＤＮコピーを含みうるので、多数の同じＥＳＴコピーを含みうる。結果として、新生転写物に由来するｃＤＮＡライブラリー中の一転写単位は、異なる３’末端を持つ１００個のＮＴＴによって表される可能性があり、一方、従来のライブラリーは同じ３’末端を持つ１００個のＥＳＴを含む可能性がある。さらに、一部の３’末端は非翻訳領域中（５’末端、３’末端、およびイントロン中）にあるだろうが、そのような末端は従来のｃＤＮＡライブラリーには見つからないだろう。したがって、ＮＴＴの解析により、すべての会合したＲＮＡポリメラーゼがゲノム上のどこに位置するかのスナップショットが得られる。これにより、全転写単位の相対活性に関する情報、およびポリメラーゼがそれらの中で「停止（ｐａｕｓｅ）」している場所に関する情報が得られる。
【００２３】
直接配列決定にはいくつかの利点がある。すなわち、直接配列決定は端的であり、確立されたアプローチを使用し、ゲノム中に比類なく同定するのに十分な長さのＮＴＴを与える。あるレベルでは冗長性も得られ、いくつかのＮＴＴが同じ転写単位に由来する配列を共有するだろう。しかし別のレベルでは、同じ転写単位に由来するこれらのＮＴＴが同じ３’末端を持つことはまれにしかないだろう。
【００２４】
（ii）マイクロアレイの使用
標識された転写物のｃＤＮＡコピーに蛍光タグを結合させ、そのタグ付きｃＤＮＡを「マイクロアレイ」にハイブリダイズさせることができる。ｃＤＮＡ集団を完全に特徴づけるには、イントロン、５’領域および３’領域を持つ全転写単位ならびに非遺伝子転写単位を含む全ヒトゲノムをカバーするアレイに、タグ付きｃＤＮＡをハイブリダイズさせることが最も好ましい。
【００２５】
（iii）ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（遺伝子発現の連続解析）の使用
ある細胞中の異なるメッセージ（または上述のように作製したｃＤＮＡ）の数および存在比はＳＡＧＥを使って迅速にカタログ化することができる（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，  １９９５；Ｚｈａｎｇら，  １９９７；Ｋｉｎｚｌｅｒら，  米国特許第５，６９５，９３７号）。ＳＡＧＥは２つの原理に基づいている。第１に、数多くの転写物を同定するのに十分な情報を含む９〜１５ヌクレオチドの短い配列タグを作製する。第２に、自動シークエンサーを使って配列決定される１つの分子中に数多くの転写物タグを集結させることができ、これにより１回の配列決定操作で、複数のタグの素性を明らかにすることができる。個々のタグの存在比を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することにより、任意の転写物集団の発現パターンを、定量的に評価することができる。現在、ＳＡＧＥプロファイルは、正常ヒト膵臓、結腸直腸上皮、および非小細胞肺癌由来の細胞のプロファイルを含めて、様々な細胞タイプについて入手することができる（例えばＨｉｂｉら，  １９９８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥも参照されたい）。
【００２６】
ＳＡＧＥは、一例として図１に図解するように、新生ＲＮＡに由来するｃＤＮＡの解析に直接応用することができる。図１に示す反応スキームでは、データベースをスクリーニングするために使用することができる最大１５ヌクレオチド／タグが得られる。ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡに由来する従来のＳＡＧＥタグは、遺伝子の３’末端にあるＮｌａＩＩＩ部位の隣に見いだされるが、新生ＲＮＡに由来するＳＡＧＥタグは転写単位中のあらゆる部分にあるＮｌａＩＩＩ部位の隣に見いだされるので、バイオインフォマティクスの当業者には理解されるように、タグ配列の解析に使用するＳＡＧＥソフトウェアを適合させる必要がありうる。図１に示すように酵素ＢｓｍＦＩを使用すると、最大１５ヌクレオチドの長さのタグが生成する。他のタイプのＩＩＳ制限酵素を使用すれば、より長いタグを生成させることができる。より長いタグの生成には一定の利点がある。特に、タグが長ければゲノム内でその位置を明確に特定することが容易になる。
【００２７】
（iv）変形ＳＡＧＥの使用
本発明者らは、転写物の最３’末端からの配列タグの生成をもたらす変形ＳＡＧＥ技術を開発した。以下に詳述するこの方法は、新生ＲＮＡ転写物の解析には特に有用である。
【００２８】
従来のＳＡＧＥを使って得られるゲノムワイドプロファイルは、転写単位内の最も３’側にあるＮｌａＩＩＩ部位に隣接するタグを与える。しかし、新生転写物の実際の３’末端に関する詳細な情報は失われる（図２、上）。本発明者らは、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ集団を特徴づけるための方法であって、ＳＡＧＥと類似しているが、新生転写物の３’末端に関する情報が保持される方法を開発した。一例として図３に図解するこの方法を使用すると、各転写単位から多くの（時にはオーバーラップする）ＮＴＴが得られるだろうから、活性な転写単位を比類なく同定することができる（図２、下）。
【００２９】
したがって、本発明の第２の態様によれば、ＲＮＡ転写物の集団を解析する方法であって、
（i）ＲＮＡ転写物の３’末端を、認識部位から所定の距離だけ離れた部位でのＤＮＡ切断を可能にする酵素認識部位を含む一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションして、連結ＲＮＡを形成させること、
（ii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに相補的なプライマーを第１ｃＤＮＡ鎖の合成に使用して、連結ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換すること、
（iii）結果として得られたｃＤＮＡを前記酵素認識部位を認識する酵素で切断して、所定の長さのｃＤＮＡタグを生成させること、および
（iv）複数のｃＤＮＡタグの配列を決定し、それによって元のＲＮＡ転写物の集団を解析すること、
を含む方法が提供される。
【００３０】
上記の方法は、ＲＮＡ転写物の最３’末端に由来する短いヌクレオチド配列タグの同定をもたらす点で、先行技術で知られている従来のＳＡＧＥ技術とは異なる、変形ＳＡＧＥ技術である。これは、タギング酵素（すなわちその認識部位から所定の距離で切断する酵素）の認識部位を含むオリゴヌクレオチドリンカーを、ＲＮＡ転写物の３’末端に直接ライゲーションすることによって達成される。これは、タギング酵素の認識部位を含むリンカーが、アンカー酵素を使った切断によって生成するｃＤＮＡ断片の５’末端に結合される従来のＳＡＧＥとは、著しく相違している。この根本的相違を、添付の図面を参照して、さらに詳しく説明する。
【００３１】
本発明の方法の好ましい一実施形態では、まず、解析対象であるＲＮＡの試料を、ほぼ同じサイズを持つ２つのプールに分割する。これらのＲＮＡプールのうち、第１プールを、リンカーの５’末端がＲＮＡ転写物の３’末端に結合されるような形で、第１オリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションすることにより、連結された転写物の第１プールを形成させる。第２のＲＮＡプールも同様に第２オリゴヌクレチドリンカーにライゲーションして、連結された転写物の第２プールを形成させる。ＲＮＡ転写物の３’末端への一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーのライゲーションは、標準的な分子生物学プロトコールに従って、酵素Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを使って行うことができる。
【００３２】
第１オリゴヌクレオチドリンカーと第２オリゴヌクレオチドリンカーは、どちらも、タギング酵素（すなわちその認識部位の下流を所定の距離で切断する制限酵素）の認識部位を含んでいる。これらのリンカーは、好ましくは、第２の制限酵素認識部位を含むべきであり、その第２制限部位は、最も好ましくは、タギング酵素の認識部位とオーバーラップするだろう。第２制限部位は、以下に説明するように、ジタグを鎖状につなぐ操作を容易にするために付加され、好都合な制限部位をどれでも使用することができる。好ましい一実施形態では、ＸｍａＩ部位を、ＢｓｍＦＩタギング酵素部位と組み合わせて使用する。第１リンカーおよび第２リンカーは、好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、同一のヌクレオチド配列を持つものであってもよいし、異なる配列を持っていてもよい。配列の詳細は、タギング酵素部位に関する要件以外は、本発明にとっては重要でない。同じ配列を持つリンカーを使用する場合は、もちろん、最初にＲＮＡを２つの独立したプールに分割しなくても、本方法を実行することができる。異なる配列を持つリンカーを使用する場合には、リンカーのライゲーションに先立って、ＲＮＡを２つのプールに分割する必要がある。次に、連結ＲＮＡの２つのプールは、ｃＤＮＡ合成、タギング酵素による切断およびライゲーションによるジタグの形成という後続の工程を行うために一つに混合してもよいし、ライゲーション工程までは別々にしておいてもよい。本方法の本質的特徴から逸脱することなくそのような変更を行いうることは、当業者にはすぐに理解されるだろう。
【００３３】
ＲＮＡ転写物の３’末端へのオリゴヌクレオチドリンカーのライゲーションに続いて、連結ＲＮＡを、二本鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして使用する。第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、上記オリゴヌクレオチドリンカーに相補的な第１鎖合成プライマーによってプライミングされる。ｃＤＮＡ鎖の特異的捕獲を可能にするであろう捕獲標識に第１鎖合成プライマーを連結すると有利である。好ましい一実施形態では、第１鎖合成プライマーを、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン結合によるｃＤＮＡの捕獲を可能にするビオチン捕獲標識と結合させる。他のタイプの捕獲標識を使っても同等の効果が得られる。
【００３４】
テンプレートＲＮＡの３’末端に付加したリンカー配列に含まれるその認識部位の下流を所定の距離で切断するタギング酵素を使って、二本鎖ｃＤＮＡを切断する。上述のように、最も好ましいタギング酵素は、その認識部位から約１０〜約１４ヌクレオチド離れた位置を切断するＢｓｍＦＩである。ＢｓｍＦＩで処理するとｃＤＮＡ断片が遊離し、各ｃＤＮＡ断片はリンカーの他に一つの一次転写物の最３’末端に由来する１０〜１４ヌクレオチドを含む。本発明は、タギング酵素としてのＢｓｍＦＩの使用に限定されない。認識部位から所定の距離だけ離れた位置を切断するという特徴を共有する他の酵素、特に他のタイプのＩＩｓ制限酵素を使用してもよいことは、当業者には理解されるだろう。従来のＳＡＧＥの場合と同様に、より長いタグの生成をもたらす他のタギング酵素を使用してもよい。一般に、タグが長いほど、それらをゲノム内の明確な位置に割り当てることが容易になる。
【００３５】
タギング酵素による切断に続いて、タギング酵素によって切り離されたｃＤＮＡ断片からタグを分離するために、精製工程または捕獲工程を含めることができる。第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーに捕獲標識を含める好ましい実施形態の場合は、その捕獲標識に特異的な結合剤を使って精製工程を容易に行うことができる。例えば、ビオチンを捕獲標識として使用する場合は、アビジンまたはストレプトアビジン被覆ビーズを使って、標識されたタグを標識されていないｃＤＮＡ断片から分離することができる。
【００３６】
ＲＮＡ転写物中の所定の位置からヌクレオチドタグを生成させ、それらを精製／捕獲し終えたら、元のＲＮＡ転写物を解析するために、それらのタグを配列決定する。「従来型」ＳＡＧＥの場合と同様に、１回の配列決定操作で数多くのタグのハイスループット配列決定が可能になるように、複数のタグを一つの分子中に集結させることが好ましい。第１工程として、ｃＤＮＡタグの対をそれぞれ一つにライゲーションしてジタグを形成させる。タグを生成させるために使用したタギング酵素が３’または５’突出末端を生成させる酵素である場合は、ライゲーションに先立って、その突出末端を埋め込んで平滑末端を生成させなければならない。この「埋め込み（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｉｎ）」反応は、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使って行うことができ、これは分子生物学で日常的に使用される標準的技術である。タグの末端を平滑化し終えたら、ＤＮＡリガーゼを使用し、標準的な分子生物学プロトコールに従って、ジタグを形成させるためのライゲーション反応を行うことができる。
【００３７】
ジタグを形成させるためのライゲーションに続いて、ジタグのコピー数を増加させるための増幅工程を含めることが好ましい。増幅は、この手順の初めにＲＮＡ転写物の３’末端に付加したオリゴヌクレオチドリンカーの領域に対応する一対の増幅プライマーを使って、通常のＰＣＲによって行うことができる。
【００３８】
配列決定に先立って、さらに、複数のタグを一つの分子に集結させるために、個々のジタグを鎖状につないでジタグの鎖にすることができる。これはまず、一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーに由来するジタグの領域内の制限部位（上述の第２制限部位）で切断する制限酵素を使って、ジタグを切断することによって達成される。ジタグのプールを増幅工程にかけた場合は、その増幅産物を適当な酵素で切断する。切断されたジタグは、次に、通常のＤＮＡライゲーション反応を使って、鎖状につなぐことができる。
【００３９】
ＤＮＡ配列決定を容易にするために、ジタグのコンカテマーを標準的なクローニングベクターにクローニングし、通常のＰＣＲによって増幅することが好ましい。次に、そのＰＣＲ産物は直接配列決定することができ、コンカテマー中に存在するジタグの数の指標を得るために、ゲル電気泳動によってサイズ分画することもできる。
【００４０】
本発明の変形ＳＡＧＥ技術は広い利用可能性を持ち、本質的に、任意の細胞、細胞集団または組織から単離されたＲＮＡの任意のプールを特徴づけるために使用することができる。この技術は新生ＲＮＡ転写物の解析での使用には特に適している。したがって、好ましい一実施形態として、本発明は、ある細胞または細胞集団中で産生される一次転写物を解析する方法であって、
上記細胞または細胞集団中で転写される新生ＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識する工程、
標識された転写物を精製する工程、および
本発明の第２の態様による変形ＳＡＧＥ法を使って、標識された転写物を解析する工程、
を含む方法を提供する。
【００４１】
新生ＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識し、標識された転写物を精製する工程は、本発明の第１の態様に関して説明したとおりに行うことができる。
【００４２】
さらに本発明は、少なくとも１つのジタグを含む、ある細胞または細胞集団に由来する核酸修飾物であって、各ジタグは２つの共有結合した反対向きの核酸タグを含み、各タグが前記細胞または細胞集団中で発現される一次ＲＮＡ転写物の最３’末端に相当する核酸修飾物を提供する。
【００４３】
本発明の核酸修飾物は、本発明の変形ＳＡＧＥプロトコールを使って、例えば本発明の第１の態様に関して説明したように新生ＲＮＡの選択的標識化および精製などによって、ある細胞または細胞集団から単離した新生ＲＮＡのプールより出発し、タグの対をライゲーションしてジタグを形成させる工程まで行うことによって、合成することができる。本発明は、鎖状につながったジタグを含む核酸修飾物も包含する。
【００４４】
第３の態様として、本発明は、あるＲＮＡプール内の特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づける方法であって、
（i）ＲＮＡ転写物に一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーをライゲーションして、連結ＲＮＡを形成させる工程、
（ii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに相補的な第１鎖合成プライマーを使って、連結ＲＮＡの第１鎖ｃＤＮＡコピーを合成する工程、
（iii）上記オリゴヌクレオチドリンカーに対応する第１プライマーと、上記特定転写単位の一領域に相補的な第２プライマーとを使って、第１鎖ｃＤＮＡの一領域を増幅する工程、
（iv）結果として得られた増幅産物を解析し、それによって上記ＲＮＡ転写物の集団内に存在する上記特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づける工程、
を含む方法を提供する。
【００４５】
ネストＰＣＲプライマーまたは半ネストＰＣＲプライマーを使用する２回目のＰＣＲ増幅を、必要に応じて工程（iii）と工程（iv）の間に含めてもよい。
【００４６】
工程（iv）では、ＰＣＲ増幅産物の検出に関して当技術分野で知られている多くの技術を、どれでも使用することができる。例えば、ＰＣＲ産物のサザンブロットを望ましい標的配列の一領域に対応するプローブでプロービングすることによって、特定の配列を検出することができる。
【００４７】
本発明の特異的方法は、ＲＮＡ転写物の集団の中の本質的に任意の転写単位に由来する特定転写物の検出および特徴づけに、広く利用可能であるが、この方法は、新生ＲＮＡの集団内の特定転写物の検出および／または特徴づけには特に適している。したがって本発明は、所与の細胞または細胞タイプに由来する新生ＲＮＡのプール内の特定転写単位に関係する一次転写物を検出し、特徴づける方法であって、
上記細胞または細胞集団中で転写される新生ＲＮＡ転写物をヌクレオチド類似体で標識すること、
標識された転写物を精製すること、および
本発明の第３の態様による方法を使って、標識された転写物内の特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づけること、
を含む方法を提供する。
【００４８】
新生転写物の３’末端は、その定義上、ある特定の時点でＲＮＡポリメラーゼが遺伝子中のどのあたりに位置するかに依存して極めて変わりやすいので、目的の転写物に特異的な２つのプライマーに依拠するＲＴ−ＰＣＲや、遺伝子特異的プライマーとポリ（Ａ）＋尾部に相補的なプライマーとを利用する通常の３’ＲＡＣＥなどといった既知の方法は、新生ＲＮＡ転写物を特徴づけるのには適していない。これに対して、本発明の特異的方法は、転写物の３’末端にリンカーをライゲーションする工程があるため、この目的に使用することができる。
【００４９】
本発明を限定しない以下の実験例および添付の図面を参照することにより、本発明の理解が深まるだろう。
【００５０】
実施例
本発明を実施する際に使用され得る分子生物学技術は、例えばＦ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９４）や、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク）などの標準的参考書に記載されている。
【００５１】
実施例１−ヌクレオチド類似体を含む転写物が逆転写酵素によってｃＤＮＡに複写されることを例証する
以下の実験は、転写物中のどのヌクレオチド類似体が逆転写酵素によってｃＤＮＡに複写され得るかを知るために行った（Ｈ．  ＫｉｍｕｒａおよびＰ．Ｒ．  Ｃｏｏｋ，  未公表）。まず最初に、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰならびにＵＴＰまたはＢｒ−ＵＴＰの存在下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに直線状テンプレートを転写させることにより、通常の転写物と、あらゆるＵがＢｒ−Ｕに置換されている転写物とを作製した［直線状テンプレート（約４．４ｋｂｐ）は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの制御下に置かれたルシフェラーゼ遺伝子（１．８ｋｂｐ）と、３０ｂｐのポリ（ｄＡ）とをコードしていた］。ここで、取り込まれなかったヌクレオチドを含まないように、転写物およびテンプレートを精製した。次に、アガロースゲルで電気泳動を行ったところ、ＵＴＰとＢｒ−ＵＴＰはどちらも約１．８ｋｂの「ラン・オフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）」転写物の合成を支えることがわかった（図５Ａ；レーン２をレーン３と、またレーン７をレーン８と比較されたい）。
【００５２】
結果として生じた、３’末端にポリ（Ａ）を持つＲＮＡまたはＢｒ−ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１５、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰならびに［３２Ｐ］ｄＣＴＰの存在下で、逆転写酵素と共に、または逆転写酵素なしで、インキュベートした。次に、試料を変性し、取り込まれなかったヌクレオチドおよびプライマーから産物を分離した。逆転写酵素による複写は、結果として生じるｃＤＮＡ鎖をアガロースゲルでサイズ分画することによって監視した。エチジウムによる染色後に、ＲＮＡおよびＢｒ−ＲＮＡはよく似たｃＤＮＡ鎖の分布を示した。これらの分布は、完全なコピーの長さである約１．８ｋｂまでのサイズに及び（図５Ｂ、レーン２、４）、逆転写酵素を反応から省いた場合には、それらは認められなかった（図５Ｂ、レーン３、５）。この結果はオートラジオグラフィーによって裏付けられた（図５Ｃ、レーン２〜５）。反応にはほぼ同じ量のＲＮＡおよびＢｒ−ＲＮＡを添加したこと（図５Ａ、レーン７、８）、および結果として生じたｃＤＮＡ鎖のパターンがほぼ同等であったことから、逆転写酵素はＢｒ−ＲＮＡをｃＤＮＡに複写するに違いない。しかし、Ｂｒ−ＲＮＡから生じるｃＤＮＡはＲＮＡから生じるｃＤＮＡの約５０％だった（図５Ｃ、レーン２、４）。またＢｒ−ＲＮＡは、酸不溶物への［３２Ｐ］ｄＣＴＰの取り込み（シンチレーション計数によって測定）を、天然ＲＮＡによる場合の５３％の速度（３０分間にわたって測定）で支えた（図なし）。
【００５３】
同じアプローチを使ってビオチン−ＲＮＡおよびフルオレセイン−ＲＮＡを作製し、逆転写酵素がこれらのテンプレートをｃＤＮＡに複写できるかどうかを見た。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ビオチン−ＣＴＰをＲＮＡ中に効率よく取り込んだ（図５Ａ；レーン２をレーン４と、またレーン７をレーン９と比較されたい）。逆転写酵素は、結果として生じたビオチン−ＲＮＡをｃＤＮＡに複写することができたが、結果として生じたＤＮＡの大半は、１．８ｋｂより短かった（図５Ｂ、レーン６；図５Ｃ、レーン６）。またビオチン−ＲＮＡは、酸不溶物への［３２Ｐ］ｄＣＴＰの取り込みを、天然ＲＮＡによる場合の１０％の速度で支えた（図なし）。これは、逆転写酵素はすべてのＣがビオチン−Ｃで置換されているテンプレートを複写することができるが、その効率は高くないことを示している。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはフルオレセイン−ＵＴＰを低い効率でＲＮＡ中に取り込み、検出可能な１．８ｋｂのＲＮＡをほとんど与えなかった（図５Ａ；レーン２をレーン５と、またレーン７をレーン１０と比較されたい）。結果として生じたフルオレセイン−ＲＮＡを逆転写酵素のテンプレートとして使用したところ、エチジウム染色によって検出できるｃＤＮＡはほとんどなかったが（図５Ｂ、レーン８）、オートラジオグラフィーでは短い鎖が認められた（図５Ｃ、レーン８）。フルオレセイン−ＲＮＡテンプレートは、酸不溶物への［３２Ｐ］ｄＣＴＰの取り込みを、天然ＲＮＡによる場合の０．７％の速度で支えた（図なし）。オリゴ（ｄＴ）１５はポリ（Ａ）を３’末端に持つ完全長転写物を利用するｃＤＮＡ合成だけをプライミングするだろうから、この取り込みは、わずかではあるものの、逆転写酵素がフルオレセイン−ＲＮＡを、それなりの効率で、ｃＤＮＡに複写できることを示唆している（ごくわずかな完全長転写物が存在するからである）。
【００５４】
逆転写酵素は、Ｕの一部だけがＢｒ−Ｕ（またはフルオレセイン−Ｕ）で置換されているＢｒ−ＲＮＡ（またはフルオレセイン−ＲＮＡ）テンプレートを、すべてのＵが置換されているものよりも効率よく複写すると予想される。同様に、逆転写酵素は、一部のＣだけがビオチン−Ｃで置換されているビオチン−ＲＮＡテンプレートを、すべてのＣが置換されているものよりも効率よく複写するだろう。部分的に置換されたＲＮＡテンプレートは、細胞をＢｒ−Ｕの存在下でインキュベートした場合がそうであるように、ＵＴＰとＢｒ−ＵＴＰの両方が存在する状態で転写を進行させると生成する。
【００５５】
方法
（Ａ）標識された転写物の生成
種々のヌクレオチド類似体を含む転写物を、ＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って生成させた。表示した様々なヌクレオチド三リン酸の存在下でＴ７ポリメラーゼに１μｇの直線状テンプレートを転写させた。各ＮＴＰが１ｍＭの濃度で存在した点以外は、製造者の条件を使用した。図５Ａのレーン７〜１１に適用した試料の場合は、反応後に、取り込まれなかったヌクレオチドが含まれないように、テンプレートおよび結果として得られた転写物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲル濾過によって精製した。試料（濾過していない試料および濾過した試料について、それぞれ１μｌおよび２μｌ）を１．２％アガロースに適用し、電気泳動にかけ、エチジウムで染色し、ＵＶ光の下で写真撮影した（図５Ａ）。
【００５６】
（Ｂ）ｃＤＮＡ合成およびオートラジオグラフィー
（Ａ）で生成した転写反応からの試料２μｌを、２０μｌの液量で、１μｇのオリゴ（ｄＴ）１５、１ｍＭ  ｄＡＴＰ、１ｍＭ  ｄＧＴＰ、１ｍＭ  ｄＴＴＰ、１ｍＭ  ［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３７ＴＢｑ／ｍｌ）、５０μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤと共に、そしてまた、表示のとおり３０単位の逆転写酵素（ＲＴ；Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に、または逆転写酵素なしで、インキュベートした（４２℃；３０分）。９９℃でのインキュベーション（５分）および４℃で５分間の冷却によって反応を停止した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ＨＲで、取り込まれなかったヌクレオチドおよびプライマーから生成物を分離した後、生成物を１．２％アガロースゲルで泳動し、エチジウムで染色し、ＵＶ光の下で写真撮影した（図５Ｂ）。
【００５７】
アガロースゲル中の核酸を陽性荷電ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にブロットし、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを使って放射能検出した（図５Ｃ）。
【００５８】
（参考文献）
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Ｉｂｏｒｒａ，  Ｆ．Ｊ．，  Ｐｏｍｂｏ，  Ａ．，  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｄ．Ａ．およびＣｏｏｋ，  Ｐ．Ｒ．（１９９６）「活性ＲＮＡポリメラーゼはヒト核中の離散した転写『工場』内に局在している（Ａｃｔivｅ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ａｒｅ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ’ｆａｃｔｏｒｉｅｓ’ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅｉ）」Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １０９，  １４２７−１４３６．
Ｉｓｈｉｉ，  Ｍ．，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｓｉ，  Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，  Ｓ．，  Ｗａｄａ，  Ｙ．，  Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ．，  Ｋ．，  Ｋｏｄａｍａ，  Ｔ．およびＡｂｕｒａｔａｎｉ，  Ｈ．（２０００）「転写物プロファイリング解析における定量精度に関するＧｅｎｅＣｈｉｐとＳＡＧＥの直接比較（Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ａｎｄ  ＳＡＧＥ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔivｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６８，  １３６−１４３．
Ｉｙｅｒ，  Ｖ．Ｒ．，  Ｅｉｓｅｎ，  Ｍ．Ｂ．，  Ｒｏｓｓ，  Ｄ．Ｔ．，  Ｓｃｈｕｌｅｒ，  Ｇ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｔ．，  Ｌｅｅ，  Ｊ．Ｃ．Ｆ．，  Ｔｒｅｎｔ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｓｔａｕｄｔ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｊ．，  Ｂｏｇｕｓｋｉ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｓｈａｌｏｎ，  Ｄ．，  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，  Ｄ．およびＢｒｏｗｎ，  Ｐ．Ｏ．（１９９９）「血清に対するヒト線維芽細胞の応答における転写プログラム（Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｓｅｒｕｍ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３，  ８３−８７．
Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｄ．Ａ．，  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，  Ｊ．およびＣｏｏｋ，  Ｐ．Ｒ．（１９９６）「ヒト細胞において基礎構造に核およびミトコンドリアＤＮＡのループを付加する配列：転写単位の役割（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｔｔａｃｈｉｎｇ  ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ）」Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４，  １２１２−１２１９．
Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｄ．Ａ．，  Ｉｂｏｒｒａ，  Ｆ．Ｊ．，  Ｍａｎｄｅｒｓ，  Ｅ．Ｍ．Ｍ．およびＣｏｏｋ，  Ｐ．Ｒ．（１９９８）「ＨｅＬａ核におけるＲＮＡポリメラーゼ、新生転写物および転写単位の数および構成（Ｎｕｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，  ｎａｓｃｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ＨｅＬａ  ｎｕｃｌｅｉ）」Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ９，  １５２３−１５３６．
Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｄ．Ａ．，  Ｐｏｍｂｏ，  Ａ．，  Ｉｂｏｒｒａ，  Ｆ．Ｊ．（２０００）「転写のバランスシート：哺乳類細胞における核ＲＮＡ代謝の解析（Ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｓｈｅｅｔ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：  ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）」ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １４，  ２４２−２５４．
Ｋｅｎｚｅｌｍａｎｎ，  Ｍ．およびＭｕｈｌｅｍａｎｎ，  Ｋ．（１９９９）「オリジナルのプロトコールに加熱工程を加えることによって大きく向上するＳＡＧＥのクローニング効率（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＳＡＧＥ  （Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）  ｂｙ  ａｄｄｉｎｇ  ａ  ｈｅａｔｉｎｇ  ｓｔｅｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７，  ９１７−９１８．
Ｌｉｕ，  Ｘ．およびＧｏｒｏｖｓｋｙ，  Ｍ．Ａ．（１９９３）「ＲＬＭ−ＲＡＣＥ法によるテトラヒメナ・サーモフィラｍＲＮＡの５’および３’末端のマッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ５’ａｎｄ  ３’ｅｎｄｓ  ｏｆ  Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ｍＲＮＡｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ  （ＲＬＭ−ＲＡＣＥ））」Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１，  ４９５４−４９６０．
Ｌｏｃｋｈａｒｔ，  Ｄ．Ｊ．およびＷｉｎｚｅｌｅｒ，  Ｅ．Ａ．  （２０００）「ゲノミクス、遺伝子発現およびＤＮＡアレイ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４０５，  ８２７−８３６．
Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，  Ａ．Ｅ．ら（２０００）「ｌｅｔ−７異時性調節ＲＮＡの配列の保存および一時的発現（Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｔ−７  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＲＮＡ）」Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，  ８６−８９．
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Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｊ．（１９９８）「強化されたコンカテマークローニング：ＳＡＧＥ技術の改変（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＳＡＧＥ  （Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６，  ３４４５−３４４６．
Ｒｅｉｎｈａｒｔ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｓｌａｃｋ，  Ｆ．Ｊ．，  Ｂａｓｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，  Ａ．Ｅ．，  Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｒｏｕｇｖｉｅ，  Ａ．Ｅ．，  Ｈｏｒｖｉｔｚ，  Ｈ．Ｒ．およびＲｕｖｋｕｎ，  Ｇ．（２０００）「２１ヌクレオチドｌｅｔ−７  ＲＮＡはカエノラブディティス・エレガンスにおける発生タイミングを調節する（Ｔｈｅ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｅｔ−７  ＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｔｉｍｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）」Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，  ９０１−９０６．
Ｒｏｓｓ，  Ｊ．（１９９５）「哺乳類細胞におけるｍＲＮＡの安定性（ｍＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖｓ．  ５９，４２３−４５０．
Ｓｃｈａｅｆｅｒ，  Ｂ．Ｃ．（１９９５）「ＲＡＣＥ法における革命：完全長ｃＤＮＡ末端のポリメラーゼ連鎖反応クローニングに関する新しい戦略（Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ：  ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）」Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２７，  ２５５−２７３．
Ｓｔｏｌｌｂｅｒｇ，  Ｊ．，  Ｕｒｓｃｈｉｔｚ，  Ｊ．，  Ｕｒｂａｎ，  Ｚ．およびＢｏｙｄ，  Ｃ．Ｄ．（２０００）「ＳＡＧＥの定量的評価（Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔivｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＧＥ）」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０，  １２４１−１２４８．
Ｔｈｏｒｅｙ，  Ｉ．Ｓ．，  Ｃｅｃｅｒａ，  Ｇ．，  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｗ．およびＯｓｈｉｍａ，  Ｒ．Ｇ．（１９９３）「トランスジェニックマウスにおけるケラチン１８遺伝子の転写遮蔽へのＡｌｕ配列の関与（Ａｌｕ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｅｒａｔｉｎ  １８  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）」Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３，  ６７４２−６７５１．
Ｔｒａｃｙ，  Ｒ．Ｂ．およびＬｉｅｂｅｒ，  Ｍ．Ｒ．（２０００）「哺乳類クラススイッチ配列における転写依存的Ｒループ形成（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒ−ｌｏｏｐ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９，  １０５５−１０６７．
Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，  Ｖ．Ｅ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ．およびＫｉｎｚｌｅｒ，  Ｋ．Ｗ．（１９９５）「遺伝子発現の連続解析（Ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，  ４８４−４８７．
Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，  Ｏ．Ｃ．およびＧｕｍｐｏｒｔ，  Ｒ．Ｉ．（１９８２）「Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｔ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）」「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ＸＶ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐａｒｔ  Ｂ」（Ｂｏｙｅｒ，  Ｐ．Ｄ．編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク）のｐ．３１−５８．
Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｈ．Ｆ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｊ．，  Ｘｉｎｇ  Ｙ．，  Ｌａｆｒｅｎｉｅｒｅ  Ｒ．Ｇ．，  Ｒｕｐｅｒｔ  Ｊ．Ｌ．，  Ｈｅｎｄｒｉｃｈ  Ｂ．Ｄ．およびＢｒｏｗｎ  Ｃ．Ｊ．（１９９２）「ヒトＸＩＳＴ遺伝子：保存された繰り返し配列を含み核内に強く局在している１７ｋｂ不活性Ｘ特異的ＲＮＡの解析（Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＸＩＳＴ  ｇｅｎｅ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  １７  ｋｂ  ｉｎａｃｔivｅ  Ｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｐｅａｔｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ）」Ｃｅｌｌ  ７１，  ５１５−５２９．
Ｗｉｎｋｌｅｓ，  Ｊ．Ａ．（１９９８）「マウス線維芽細胞における血清誘導性およびポリペプチド成長因子誘導性遺伝子発現（Ｓｅｒｕｍ−  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）」Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５８，  ４１−７８．
Ｗｕａｒｉｎ，  Ｊ．およびＳｃｈｉｂｌｅｒ，  Ｕ．（１９９４）「ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される新生ＲＮＡ鎖の物理的単離：同時転写的スプラインシングの証拠（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ＲＮＡ  ｃｈａｉｎｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４，  ７２１９−７２２５．
Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｗ．，  Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，  Ｖ．Ｅ．，  Ｋｅｒｎ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｈｒｕｂａｎ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ．およびＫｉｎｚｌｅｒ，  Ｋ．Ｗ．（１９９７）「正常細胞および癌細胞における遺伝子発現プロファイル（Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６，  １２６８−１２７２．
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明に従って一次ＲＮＡ転写物を解析する方法の一具体例を表す図である。この具体例では、ヌクレオチド類似体としてＢｒ−ＵＴＰを使用し、標識された新生ＲＮＡ転写物に由来する二本鎖ｃＤＮＡを従来のＳＡＧＥ法によって特徴づける。
【図２】従来のＳＡＧＥ法（アプローチ（i））または本発明の変形ＳＡＧＥ法（アプローチ（iii））を使って、様々な長さを持つ４つのＲＮＡ転写物から生成させうる配列タグのタイプを表す図である。
【図３】本発明の変形ＳＡＧＥ法の一具体例を表す図である。この具体例では、Ｂｒ−ＵＴＰを標識されたヌクレオチド類似体として使用し、ｃＤＮＡ合成プライマーをビオチン捕獲標識（ｂｉｏ）に結合し、ＢｓｍＦＩをタギング酵素として使用する。
【図４】本発明に従って特定転写単位に関係する転写物を検出し、特徴づける方法の一具体例を表す図である。この具体例はネストＰＣＲ工程を含み、最終増幅産物はサザンブロット法で検出される。
【図５】逆転写酵素がＢｒ−ＲＮＡ、ビオチン−ＲＮＡおよびフルオレセイン−ＲＮＡをｃＤＮＡに複写できることを証明する図である。
【００６０】
（Ａ）は、Ｔ７ポリメラーゼ、直線状ＤＮＡテンプレート、および以下に挙げる種々のヌクレオチド三リン酸を使った、種々のヌクレオチド類似体を含む転写物の生成を表す：
レーン１：マーカー−ＨｉｎｄＩＩＩで切断したλＤＮＡ
レーン２、７：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
レーン３、８：ＡＴＰ、ＣＴＰ，ＧＴＰ、Ｂｒ−ＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ）
レーン４、９：ＡＴＰ、ビオチン−１１−ＣＴＰ（ＮＥＮ）、ＧＴＰ、ＵＴＰ
レーン５、１０：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ（ＮＥＮ）
レーン６、１１：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ
レーン１２：マーカー−１００ｂｐラダー。
【００６１】
レーン７〜１１に適用した反応産物は、取り込まれなかったヌクレオチドを除去するために、ゲル濾過にかけてある。レーン２〜６は濾過していない。
【００６２】
レーン２〜１１には二本鎖ＤＮＡテンプレート（約４．４ｋｂ）が見える。レーン２〜５およびレーン７〜９には様々な量のＲＮＡ産物が認められるが、レーン６、１０、１１ではＲＮＡが（仮にあったとしても）ほとんど認められない。レーン５の最下部には取り込まれなかったフルオレセイン−ＵＴＰが見えるが、これはゲル濾過によって除去される（レーン１０）。
【００６３】
（Ｂ）は、逆転写酵素が種々の類似体を含むＲＮＡ転写物を複写できることを例証するエチジウム染色ゲル像である。
レーン１、１２：上記と同じマーカー。
レーン２、３：普通のＲＮＡテンプレート（Ａ、レーン７）
レーン４、５：Ｂｒ−ＲＮＡテンプレート（Ａ、レーン８）
レーン６、７：ビオチン−ＲＮＡテンプレート（Ａ、レーン９）
レーン８、９：フルオレセイン−ＲＮＡテンプレート（Ａ、レーン１０）
レーン１０、１１：ＲＮＡテンプレートなし（Ａ、レーン１１）。
【００６４】
レーン２〜１１には変性したテンプレート鎖（約４．４ｋｂ）が見える。レーン２および４には約１．８ｋｂのｃＤＮＡバンドが見える（しかし逆転写酵素を欠く試料３および５では見えない）。レーン２、４、６では、１．８ｋｂ未満にもｃＤＮＡスメアが見える。
【００６５】
（Ｃ）は、５Ｂのエチジウム染色ゲルに対応するオートラジオグラフを表す。
【００６６】
矢印は約１．８ｋｂのｃＤＮＡを示す。逆転写酵素が存在する場合（レーン２、４、６、８）はすべてのＲＮＡテンプレートが１．８ｋｂ未満のｃＤＮＡスメアを与える。約４．４ｋｂのバンド（レーン２、４、６）はおそらく、標識された短いｃＤＮＡが約４．４ｋｂの変性したＤＮＡ鎖にハイブリダイズしたものを表すと思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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