(57)【要約】組換え植物受容体蛋白質およびこれらの蛋白質をコードするヌクレオチド配列が提供される。本発明はまた、蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供する。さらに組換えベクターを含む植物宿主細胞、植物を処理する方法を含む、トランスジェニック植物および本明細書に記載されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を使用する方法、本明細書に記載された蛋白質を発現する方法、植物の受容体活性を改変する方法および植物代謝を調節する方法が提供される。本発明の植物受容体蛋白質はＧＡＢＡの作用の効果的な調節物質として機能すると考えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列を持つ植物蛋白質をコードするヌクレオチド配列をもつ核酸分子を植物細胞に導入することを含み、前記核酸分子が前記ヌクレオチド配列の５′末端に操作可能に結合した外来プロモータを有する、植物を形質転換する方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約８０％の同一性を有する請求項１の方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約９０％の同一性を有する請求項２の方法。
【請求項４】
前記プロモータが構成的プロモータ、誘導性プロモータおよび細胞特異的プロモータからなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性を有する核酸配列を持つ核酸プローブを植物核酸にハイブリダイズすることを含む、植物蛋白質を同定する方法。
【請求項６】
前記プローブが約２５から約５００ヌクレオチドの長さである、請求項５の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、植物を処理する方法：
（ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を持つ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持つ、導入された核酸分子を植物に提供する工程；および
（ｂ）ＧＡＢＡの有効量で植物を処理する工程。
【請求項８】
前記方法が前記処理する工程より前に前記核酸配列を発現する工程を含む請求項７の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項７の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約９０％の同一性を有する請求項９の方法
【請求項１１】
前記植物がＧＡＢＡおよびＧＡＢＡアゴニストを含む組成物で処理される請求項７の方法。
【請求項１２】
前記アゴニストがバクロフェン、ｃｉｓ‐４‐アミノペント‐２‐エン酸、イミダゾール‐４‐酢酸および４，５，６，７‐テトラヒドロイソキサゾール［５，４‐ｃ］ピリジン‐３‐オールからなる群から選択される請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記の導入された核酸分子がさらに前記ヌクレオチド配列の５′末端に操作可能に結合した異種プロモータを含む請求項７の方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む植物代謝を調節する方法：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約７０％の同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、あるいは前記配列から転写されたＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸分子を植物細胞に導入する工程
（ｂ）前記植物の核酸への前記アンチセンスヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに効果的な条件下で前記植物細胞を培養する工程。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列のどちらも長さが約３０から約１００ヌクレオチドである請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド配列のどちらも長さが約３０から約４００ヌクレオチドである請求項１４の方法。
【請求項１７】
植物蛋白質を発現する方法であって、以下の工程を含む前記方法：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列を持つ植物蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持つ、単離核酸分子を植物細胞に導入する工程；および
（ｂ）前記蛋白質を発現させるための条件下で培養する工程。
【請求項１８】
前記核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を持つ請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記導入する工程の前に前記ヌクレオチド配列をベクターに挿入する工程をさらに含む請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記ベクターがプラスミドベクターである請求項１９の方法。
【請求項２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列を持つ植物蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持つ核酸分子を植物細胞に導入することを含む、植物の受容体活性を改変する方法。
【請求項２２】
本質的に蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子を含む単離核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列を持つ植物蛋白質をコードし、前記核酸分子が前記ヌクレオチド配列の５′末端に操作可能に結合した外来プロモータを持つ前記核酸分子。
【請求項２３】
前記ヌクレオチド配列が本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約７０％の同一性を有する、蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる、請求項２２の分子。
【請求項２４】
前記ヌクレオチド配列が本質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列に少なくとも約８０％の同一性を有する、蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる、請求項２３の分子。
【請求項２５】
前記蛋白質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたアミノ酸配列に少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２の分子。
【請求項２６】
以下のものを含む組換え核酸分子：
（ａ）本質的に蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つ植物蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列；および
（ｂ）前記ヌクレオチド配列の５′末端に操作可能に結合した外来プロモータ。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡ配列である請求項２６の分子。
【請求項２８】
前記蛋白質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項２６の分子。
【請求項２９】
前記プロモータが構成的プロモータ、誘導性プロモータおよび細胞特異的プロモータからなる群から選択される請求項２６の分子。
【請求項３０】
以下のものを含む植物細胞：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つ植物蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持つ、導入された核酸分子；および
（ｂ）前記ヌクレオチド配列の５′末端に操作可能に結合した外来プロモータ。
【請求項３１】
前記蛋白質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０の植物細胞。
【請求項３２】
前記蛋白質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３１の植物細胞。
【請求項３３】
以下のものを含むトランスジェニック植物：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を持つ植物蛋白質をコードする、導入された核酸分子；および
（ｂ）前記ヌクレオチド配列の５′末端に操作可能に結合した外来プロモータ。
【請求項３４】
前記蛋白質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３のトランスジェニック植物。
【請求項３５】
前記蛋白質がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３３のトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連した特許出願についての参考文献
本特許出願は２００１年６月２０日に出願された米国仮出願第６０／３０６，８１９号の利益を主張し、それをそのまま参照として本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アミノ酸γ‐アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は哺乳動物中枢神経系における主要な神経伝達物質である。そのような神経伝達物質は一般に、ニューロンの膜を横切るイオンのコンダクタンス調節、具体的には細胞へのイオン流入の調節を行う。たとえば、ＧＡＢＡは脊椎動物および非脊椎動物両方の神経系においてシナプス伝達を阻害する抑制性神経伝達物質であると考えられる。別の例としては、グルタミン酸はシナプス後膜を脱分極し、シナプス伝達を促進する興奮性神経伝達物質である。ＧＡＢＡおよびグルタミン酸は共に、リガンド開閉イオンチャネルとしても知られるそれぞれの受容体に結合することにより、シナプス伝達に影響を与える。
【０００３】
これらのリガンド開閉イオンチャネルは昆虫および動物のニューロンに存在する。動物ニューロンには３種の一般的なＧＡＢＡ受容体のクラス、ＧＡＢＡA、ＧＡＢＡBおよびＧＡＢＡCが存在する。ＧＡＢＡ受容体は不安、けいれん、認識機能、耽溺性障害、睡眠障害および中枢神経系の他の障害の媒介に関連している。ＧＡＢＡ受容体はバルビツール酸類およびベンゾジアゼピン類を含む、中枢神経系に作用する多くの薬物の標的であり、したがって臨床的に重要である。さらに、昆虫ＧＡＢＡ受容体の機能に影響を与える化合物は殺虫剤として商業的に有用である。
【０００４】
ＧＡＢＡ受容体は昆虫および動物界で見出されている。最近、植物界においてＧＡＢＡの作用を媒介し、ＧＡＢＡ受容体として機能すると考えられる蛋白質、または別の分子が発見されている（米国特許出願番号第０９／５１７，４３８号，２０００年３月２日出願）。
【０００５】
ＧＡＢＡは植物に確かな有益作用を及ぼすことが示されている。たとえば、ＧＡＢＡはＫｉｎｎｅｒｓｌｅｙの米国特許第５，４３９，８７３号に示されるように、植物の生長および生産性を促進することが示されている。さらに、ＧＡＢＡがコハク酸のような容易に代謝される炭素源と共に適用される場合、そのような有益な作用は促進されている（米国特許第５，６０４，１７７号）。さらに、Ｋｉｎｎｅｒｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８４０，６５６号に記載されたように、ＧＡＢＡはグルタミン酸と共に適用される場合、肥料効率を促進することが見出されている。
【０００６】
植物における上記のＧＡＢＡの有益な作用の機序はいまだ確認されていない。ＧＡＢＡ媒介植物生長および生産性の機序、ならびにＧＡＢＡが関与する他の機序をよりよく理解することは植物の生長、生産性および他の有益な作用を改善するための別の方法に役立つと考えられる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は動物ミトコンドリアＧＡＢＡ受容体蛋白質に作用することが公知の化合物に植物が反応するという新しい発見、およびこれらの化合物に反応する受容体蛋白質を植物が発現するという関連した発見に関する。この点に関して、本発明は植物において発見されているヌクレオチド配列を提供し、それらはベンゾジアゼピンに有意な感受性を有する、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジアゼピン様受容体をコードすると考えられている。本明細書に提示されたデータを基に、そのような蛋白質はＧＡＢＡ作用の調節物質として、とりわけリガンド開閉イオンチャネルのようなイオンチャネルとして機能すると考えられる。さらに、かかる蛋白質は植物のストレスに関連した生理的反応に関与すると考えられ、かかる蛋白質をコードする核酸分子の植物への取込はストレスに耐える植物の能力を促進すると考えられる。したがって、本発明は組換え蛋白質を含む精製した蛋白質、蛋白質をコードするヌクレオチド配列、ならびにヌクレオチド配列および蛋白質を使用する方法を提供する。
【０００８】
本発明の一側面において、植物を形質転換する方法が提供される。本発明の一側面において、方法は本明細書に記載された植物蛋白質をコードする核酸分子を植物細胞に導入することを包含する。
【０００９】
本発明の第２の側面において、本明細書に記載された植物蛋白質をコードする導入されたヌクレオチド配列を有する植物を提供すること、および有効量のＧＡＢＡで植物を処理することを包含する、植物を処理する方法が提供される。代わりの態様では、植物はＧＡＢＡおよびＧＡＢＡアゴニストを含む組成物で処理されるか、またはＧＡＢＡアンタゴニストもしくはＧＡＢＡアゴニストでだけ処理される。別の態様では、植物は動物の末梢ベンゾジアゼピン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを含む、動物ベンゾジアゼピン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストにより処理される。
【００１０】
本発明の第３の側面において、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを利用して植物蛋白質またはＲＮＡ転写物、たとえばｍＲＮＡの形成を減少させることを含む、植物代謝を調節する方法が提供される。一態様において、かかる方法は本明細書に記載のコーディングヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその一部を有するアンチセンス核酸分子を植物細胞に導入することを包含する。あるいは、アンチセンス核酸分子は本明細書に記載の配列から転写されたＲＮＡ配列、好ましくはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を包含する。アンチセンスヌクレオチド配列は、植物の鋳型鎖またはＲＮＡ転写物のいずれかを含む核酸にハイブリダイズし、本明細書に記載の植物蛋白質の形成を減少させる。
【００１１】
本発明の第４の側面では、潜在的植物受容体を同定する方法が提供され、それらは本明細書に記載の蛋白質をコードするヌクレオチド配列、またはその一部を有するプローブを植物核酸にハイブリダイズすることを含む。
【００１２】
本発明の第５の側面において、本明細書に記載の植物蛋白質を発現する方法が提供される。一態様において、方法は本明細書に記載の植物受容体蛋白質をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、受容体蛋白質を発現させることができる条件下で培養することを包含する。
【００１３】
別の態様では、組換え核酸分子を含む単離核酸分子が提供され、かかる分子は本明細書に記載の植物蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含する。本明細書に記載の植物蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含する植物宿主細胞およびトランスジェニック植物も提供される。かかる分子、植物細胞およびトランスジェニック植物はさらに本明細書に記載の植物ヌクレオチド配列の５′末端に操作可能に結合した外来プロモータ配列を含んでいてもよい。
【００１４】
好ましい態様の説明
本発明の原理の理解を深めるために、ここで好ましい態様について述べ、具体的な用語を使用してそれらを説明する。しかし、それによって本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明のそのような修正およびそれ以上の改変、ならびに本明細書に記載された本発明の原理のそのような別の適用は、当業者がふつうに考えつくものとして企図される。
【００１５】
本発明は、動物ミトコンドリアＧＡＢＡ受容体蛋白質に作用することが公知の化合物に植物が反応するという発見、およびこれらの化合物に反応する受容体蛋白質を植物が発現するという関連した発見に関する。本発明はさらに、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における植物ベンゾジアゼピン、および／またはベンゾジアゼピン様受容体蛋白質（以後まとめて“受容体蛋白質”と呼ぶ）をコードすると考えられるヌクレオチド配列の発見に関する。本発明はまた他の種における類似した受容体蛋白質をコードし、そして本明細書に示された代表的なシロイヌナズナ配列に類似した機能を示し、配列同一性を有するヌクレオチド配列に関する。したがって、本発明は精製された受容体蛋白質、および植物受容体蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を提供する。さらに、植物受容体蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子、植物宿主細胞およびトランスジェニック植物が提供される。本発明の他の側面では、さらに本明細書に記載の受容体蛋白質を発現する方法、ならびにヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用する方法が提供される。
【００１６】
本発明の一側面では、精製されたベンゾジアゼピンまたはベンゾジアゼピン様受容体蛋白質が提供される。本発明がその好都合な結果を獲得するようなどのような理論によっても本発明が限定されることを意図しないが、本明細書に記載の植物受容体蛋白質は植物におけるリガンド開閉イオンチャネル蛋白質として機能し、したがって細胞のイオン流入および／または細胞内のイオン輸送を調節する能力を有すると考えられる。流入を調節することができる候補イオンには、クロリドのようなアニオン、ならびにカルシウム、ナトリウムおよびカリウムのようなカチオンが挙げられる。たとえば、受容体は細胞内ストアからサイトゾルへカルシウムイオンを放出することができる。本発明のこの側面にしたがって、実質的に純粋な受容体蛋白質が提供される。本明細書で使用する“実質的に純粋”とは、受容体蛋白質が天然でそれらと共に存在する他の蛋白質を少なくとも約９５％含まないことを意味する。
【００１７】
一態様では、本発明に記載のシロイヌナズナ受容体蛋白質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列を有する。本発明はシロイヌナズナアミノ酸配列に関して記載されるが、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示された具体的なアミノ酸配列に限定されないと理解すべきである。当業者は、突然変異および／または進化の過程を通じて、異なる長さおよび異なる構成成分を有する、たとえばアミノ酸挿入、置換、欠失などがあるポリペプチドが生じてもよいことを認識し、かかるポリペプチドはアミノ酸配列相同性に基づいて本明細書に記載の配列および本明細書に記載の好都合な機能に関連するか、または十分に類似する。“ベンゾジアゼピン受容体蛋白質”および“ベンゾジアゼピン様受容体蛋白質”という用語は、一般に本明細書に記載の特徴を有する蛋白質を表すために本明細書で使用され、それらの一例はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。さらに、本明細書に記載の構造の特徴を有し、機能を示すポリペプチドの変異体はこの定義内、および本発明の範囲内に包含される。
【００１８】
広範な種の植物が一般的に相同性蛋白質を発現し、利用することは公知であり、それらには先に説明した挿入体、置換体および／または欠失体が挙げられ、さらにそれらは事実上類似した機能を提供する。たとえば、別の種から単離されたアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示された配列とある程度異なっていてもよいが、当業者はそれを類似した機能を有すると考えられる類似した蛋白質として、容易に認識することができる。そのような変異を含み、類似した機能を持ち、一定の同一性を有するアミノ酸配列は本発明の範囲内に包含される。本発明は、理論によってその好都合な結果を得るような、どんな理論にも限定されることを意図しないが、適切な機能を維持するために必要なアミノ酸配列間の同一性がポリペプチドの三次元構造の維持に関連し、その結果具体的な相互作用性配列が適切に配置され、所望する活性を持つことになると考えられる。適切な空間環境においてこれらの相互作用性配列を含むポリペプチドは、それの他の部分が改変されていても、十分な活性を持つことになると企図される。この点に関して、本明細書に記載の蛋白質の変異体は、たとえばそれが各種植物種間で保存されたアミノ酸を含むか、またはそれが本明細書に記載の蛋白質を発現する別の植物種の一定の位置に存在する保存されないアミノ酸を含む場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示された蛋白質に機能的に類似すると考えられる。
【００１９】
２つのアミノ酸配列間に類似性が存在してもよい別の様式は、１群（たとえば、非極性アミノ酸、非荷電極性アミノ酸、荷電極性アミノ酸または荷電極性塩基性アミノ酸）の一定のアミノ酸が、同じアミノ酸群由来の別のアミノ酸により置換される場合である。たとえば、非荷電極性アミノ酸セリンは一般に、実質的にポリペプチドの機能を変化させずにポリペプチドの非荷電極性アミノ酸トレオニンと置換することができる。一定の置換が酵素の機能に影響するかどうかは、不適切な実験をせずに、以下の実施例で示された方法を使用したスクリーニングを含む、当技術分野で公知の合成技術およびスクリーニングアッセイを使用して確認することができる。
【００２０】
一態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約６０％同一性を有し、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に類似した機能を示すアミノ酸配列を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一性を有し、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に類似した機能を示すアミノ酸配列を有する受容体蛋白質を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約８０％同一性を有し、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に類似した機能を示すアミノ酸配列を有する受容体蛋白質を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約９０％同一性を有し、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に類似した機能を示すアミノ酸配列を有する受容体蛋白質を提供する。
【００２１】
同一性の割合は、たとえば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．（Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）のＭａｃＶｅｃｔｏｒコンピュータプログラム、６．０．１版を使用して配列情報を比較することにより決定することができる。手短に述べると、ＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムは、２つの配列の短いほうの配列の記号の総数で同一の配列記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割ったものとして同一性を定義する。プログラムは比較される蛋白質の全長にわたる同一性の割合を決定するために使用することができる。ＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムの好ましいデフォルトパラメータには以下のものが挙げられる：１対のアラインメントでは：（１）マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ３０；（２）アラインメントスピード‐速；（３）Ｋｔｕｐｌｅ＝１；（４）ギャップペナルティー＝１；トップダイアゴナル＝５；ウィンドウサイズ＝５；多重アラインメントでは：マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭシリーズ、オープンギャップペナルティー＝１０；拡大ギャップペナルティー＝０．１、遅延発散＝４０％；蛋白質ギャップパラメータ：ギャップ隔離距離＝８；残基特異的ペナルティー＝イエスまたはオン；親水性残基＝ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。
【００２２】
本発明の別の側面では、本明細書に記載の蛋白質をコードする単離核酸分子が提供される。一態様では、本発明は本来シロイヌナズナから単離された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列を提供する。さらに、その中に示された具体的な配列に相補的な配列も本発明に包含されると理解すべきである。本発明の一態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約６０％同一性を有するアミノ酸配列を持つ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持ち、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に類似した機能を示す単離核酸分子が提供される。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一性を有するアミノ酸配列を持つ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持ち、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に類似した機能を示す、単離核酸分子を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約８０％同一性を有するアミノ酸配列を持つ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持ち、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に類似した機能を示す、単離核酸分子を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に少なくとも約９０％同一性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持ち、そしてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列に類似した機能を示す単離核酸分子を提供する。
【００２３】
本発明は、これらの代表的なヌクレオチド配列に限定されないが、それに実質的に類似性を有する配列および先に説明し、そして以下でさらに説明する本明細書に記載の植物受容体蛋白質の変異体をコードする配列を包含することを意図する。
【００２４】
本明細書で使用する“単離核酸”という用語は、その本来の環境にない核酸を表すことを意図する。たとえば、この用語は本来それに付随する他の混在物、たとえば蛋白質、脂質および他の核酸配列から分離された核酸を表す。かかる用語はその本来存在する環境またはクローンライブラリーから除去されるか、または精製されている核酸を包含し、そしてさらに組換えまたはクロー化核酸単離物および化学的に合成された核酸を包含する。
【００２５】
本明細書で使用する“ヌクレオチド配列”という用語は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドの天然または合成の線状および連続アレイを表し、デオキシリボ核酸、リボ核酸、およびそれらの誘導体を包含することを意図する。“エンコーディング”および“コーディング”という用語は、ヌクレオチド配列が転写および翻訳の機序により細胞に情報を提供する過程を表し、それによって一連のアミノ酸は具体的なアミノ酸配列に会合し、機能的ポリペプチド、たとえば具体的な機能を有する活性酵素または他の蛋白質を産生することができる。具体的なアミノ酸配列をコードする過程は、コードされたアミノ酸に変化を引き起こさない１以上の塩基変化（すなわち、挿入、欠失、置換）を有するＤＮＡ配列を含んでいてもよく、またはそれは１以上のアミノ酸を変化させることができるが、ＤＮＡ配列によりコードされたポリペプチドの機能的性質を失わない塩基変化を含んでいてもよい。
【００２６】
したがって、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された具体的な代表的ヌクレオチド配列以上を包含すると理解すべきである。たとえば、先に説明した変異体アミノ酸配列をコードする核酸配列は本発明の範囲内である。得られたポリペプチド分子の機能的性質に実質的に影響を与えない、“サイレント”な変化を生じる欠失、挿入、または置換のような配列の改変は明白に本発明により企図される。たとえば、遺伝コードの縮退を反映するか、または一定の部位に化学的に等価のアミノ酸を産生させるヌクレオチド配列の改変が企図されると理解すべきである。したがって、疎水性アミノ酸である、アミノ酸アラニンのコドンは別の疎水性がより低い残基、たとえばグリシン、または疎水性がより高い残基、たとえばバリン、ロイシン、もしくはイソロイシンをコードするコドンによって置換することができる。同様に、そのように変化したヌクレオチド配列が生物学的に等価な産物を産生すると考えられる場合、グルタミン酸からアスパラギン酸への置換のような、他の残基から負に荷電した１残基への置換、またはアルギニンからリジンへの置換のような、他の残基から正に荷電した１残基への置換のような改変も本発明により企図される。
【００２７】
また、コードされたポリペプチド分子のＮ末端およびＣ末端部分が変化するようなヌクレオチド変化は、通例ポリペプチドの活性を変化させないと考えられる。そのような場合には、配列を変異させて、実際上ポリペプチドの生物学的活性に対する改変の作用を調べることが望ましい。提案された改変はそれぞれ十分に当技術分野の日常業務の範囲内である。
【００２８】
好ましい一態様において、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された全配列に実質的な類似性を有するヌクレオチド配列、および本明細書に記載の変異体を提供する。“実質的な類似性”という用語はヌクレオチド配列に関して本明細書で使用し、かかるヌクレオチド配列が、適度にストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズすることになる参照ヌクレオチド配列に十分に類似した配列を有することを示す。類似性を確認するためのこの方法は、本発明が属する技術分野で公知である。手短に述べると、適度にストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、１巻、ｐｐ．１０１〜１０４、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）で説明され、５Ｘ  ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム溶液）、０．５％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１．０ｍＭ  エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０）の予洗溶液およびハイブリダイゼーションならびに５５℃、５Ｘ  ＳＳＣの洗浄条件の使用が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドの別の必要要件は、本明細書に記載の植物蛋白質に類似した機能を有するポリペプチドをコードしなければならないことである。
【００２９】
さらに別の態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列の具体的な領域に選択された同一性の割合を有するヌクレオチド配列が提供される。本発明の一態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド内の実質的な長さのヌクレオチド配列に少なくとも約５０％同一性を有するヌクレオチド配列が提供される。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド内の実質的な長さのヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド内の実質的な長さのヌクレオチド配列に少なくとも約７０％同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド内の実質的な長さのヌクレオチド配列に少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド内の実質的な長さのヌクレオチド配列に少なくとも約９０％同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。
【００３０】
一態様では、“実質的な長さ”は少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを表す。別の態様では、実質的な長さは少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである。別の態様では、実質的な長さは少なくとも約２００ヌクレオチドの長さである。別の態様では、実質的な長さは少なくとも約３００ヌクレオチドの長さである。別の態様では、実質的な長さは少なくとも約４００ヌクレオチドの長さである。別の態様では、実質的な長さは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さである。別の態様では、実質的な長さはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された全配列である。
【００３１】
同一性の割合は、たとえばアミノ酸同一性に関して先に記載の、ＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムを使用して配列情報を比較することにより決定することができる。好ましいデフォルトパラメータには以下のものが挙げられる：（１）１対のアラインメントパラメータ：（ａ）Ｋｔｕｐｌｅ＝１；（ｂ）ギャップペナルティー＝１；（ｃ）ウィンドウサイズ＝４；および（２）多重アラインメントパラメータ：（ａ）オープンギャップペナルティー＝１０；（ｂ）拡大ギャップペナルティー＝５、（ｃ）遅延発散＝４０％；および（ｄ）遷移＝重み付き。本発明に記載のヌクレオチド配列の別の必要要件は、本明細書に記載のように機能する蛋白質をコードすることである。
【００３２】
本発明に記載の適切なＤＮＡ配列は、シロイヌナズナまたは他の種のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを使用してクローニング技術により得ることができ、それらは市販品を入手できるか、または当技術分野で公知の標準法を使用して構築することができる。適切なヌクレオチド配列は、プローブまたはプライマーとして本発明に従って選択されたヌクレオチド配列、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたもの；それに実質的な類似性を有するヌクレオチド配列、またはその一部を使用して、核酸ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、多様な種から得られたＤＮＡライブラリーから単離することができる。本発明の好ましい態様において、本明細書に提供されたヌクレオチド配列はｃＤＮＡ配列である。
【００３３】
あるいは、適切な配列は当技術分野で公知の技術により作製することができる。たとえば、本明細書に記載の植物蛋白質をコードする核酸配列は、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを使用して、組換えＤＮＡ技術、たとえば核酸の切断またはスプライシングにより構築することができる。さらに、核酸配列は化学合成、たとえば固相ホスホロアミダイト技術、またはＰＣＲを使用して構築することができる。ＰＣＲはまた、産生された核酸の量を増やすために使用することができる。さらに、具体的な核酸配列が全長の化学合成を不可能にさせる長さのものである場合、配列を小部分に分割して、当技術分野で公知の方法により合成し、一緒に連結して所望する完全な配列を形成することができる。
【００３４】
本発明の別の態様では、組換え核酸分子、または組換えベクターが提供される。一態様では、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。ヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアミノ酸配列、または先に記載のその変異体を有する。
【００３５】
本発明において使用される多様なベクターは公知である。たとえば、本発明の用途に理想的に適した各種プラスミドおよびファージは公知であり、それらにはλＺａｐおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔが挙げられる。好ましい態様では、ベクターはＴ−ＤＮＡベクターであってもよい。代表的なＴ−ＤＮＡベクター系は以下の刊行物で説明される：Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２７７；Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７；Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．６３。
【００３６】
一態様では、望ましい組換えベクターは、当技術分野で公知のように望ましいヌクレオチド挿入物の５′および３′末端にＤＮＡリンカー配列を連結し、リンカー配列および望ましいベクターに存在する配列を明確に認識する制限酵素で挿入物を開裂し、同じ制限酵素でベクターを開裂し、開裂したベクターと開裂した挿入物を混合し、そしてＤＮＡリガーゼを使用してベクターに挿入物を取り込ませることにより構築することができる。
【００３７】
ベクターは他のヌクレオチド配列、たとえば抗生物質耐性または色選択のためのマーカーを含む、選択マーカーをコードする配列を含むことができる。ベクターはまた、好ましくはプロモータヌクレオチド配列を含む。望ましい核酸挿入物は好ましくはプロモータに操作可能に結合する。核酸は他の核酸配列と具体的に機能的に関連して配置される場合、プロモータ配列のような別の核酸配列に“操作可能に結合”する。プロモータと望ましい核酸挿入物間の機能的関連には一般に、核酸配列の転写が促進されるように核酸とプロモータ配列が隣接することが挙げられる。２つの核酸配列間の結合の性質が：（１）フレームシフト突然変異を導入させる；（２）所望するヌクレオチド配列を転写させるプロモータ領域配列の能力を妨害する、または（３）プロモータ配列領域により転写される所望するヌクレオチド配列の能力を妨害するような性質でない場合、２つの核酸配列はさらに操作可能に結合すると言われている。典型的には、プロモータエレメントは一般に核酸挿入物コーディング配列の上流（すなわち５′末端）にある。
【００３８】
当技術分野では多様なプロモータが公知であり、それらには細胞特異的プロモータ、誘導性プロモータ、および構成的プロモータが挙げられる。植物細胞では転写に関するプロモータを使用することができる。プロモータはウイルス、細菌または真核細胞起源のものであってもよく、植物および植物ウイルス起源のものを含む。たとえば、ある好ましい態様では、プロモータはウイルス起源のものであってもよく、それらにはカリフラワーモザイクウイルスプロモータ（ＣａＭＶ）、たとえばＣａＭＶ３５Ｓまたは１９Ｓ、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモータ（ＦＭＶ３５Ｓ）、またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のコート蛋白質プロモータが挙げられる。さらに、プロモータはたとえば、リブロース‐１，３‐ビスりん酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモータであってもよい。細菌起源のプロモータにはＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、３０３：２０９−２１３（１９８３）に記載された天然のＴｉプラスミド由来のオクトパインシンターゼプロモータ、ノパリンシンターゼプロモータおよび他のプロモータが挙げられる。
【００３９】
さらにプロモータは、各種形状の環境ストレス、または他の刺激に反応するものであってもよい。たとえば、プロモータは非生物的ストレス、たとえば外傷、寒冷、乾燥、紫外線‐Ｂ［ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１：１１５３−１１６２］、熱ショック［Ｓｈｉｎｍｙｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８：３２９−３３２］もしくは他の熱ストレス、乾燥ストレス、または水ストレスにより誘発されるものであってもよい。
【００４０】
さらに、プロモータは生物的ストレスにより誘発されるものであってもよく、それらには、病原体ストレス、たとえばウイルス［Ｓｏｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：７５−８７］もしくは真菌［Ｅｕｌｇｅｒｍ（１９９９）ＥＭＢＯ．Ｊ．１８：４６８９−４６９９］により誘導されるストレス、植物防御経路の一部として［Ｌｅｂｅｌ（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６：２２３−２３３］、もしくは他の環境シグナル、たとえば光［Ｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２：１０２１−１０３４；Ｓｏｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４１：７５−８７］、二酸化炭素［Ｋｕｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２１：１３２９−１３３８］、ホルモンまたは他のシグナル伝達分子、たとえばオーキシン、過酸化水素およびサリチル酸［Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９：６６７−６７７］、糖およびジベレリン［Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０１２０−１０１３１］またはアブシジン酸およびエチレン［Ｌｅｕｂｎｅｒ−Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：７８５−７９５］により誘発されるストレスが挙げられる。
【００４１】
さらに、プロモータが当技術分野で公知の他のエレメントによる活性化を必要とするようにそれらを選択してもよく、その結果核酸配列挿入物によりコードされた蛋白質の産生を望み通りに調節することができる。一態様において、プロモータは外来プロモータである。本明細書では、“外来プロモータ”は１本のＤＮＡの転写を促進する、固有、または天然のプロモータ以外のプロモータを意味すると説明される。
【００４２】
さらに、ベクターはエンハンサー配列のような他の調節エレメントを含んでいてもよく、それらはプロモータと協力して核酸挿入物コーディング配列の転写を行う。“エンハンサー”という用語により、植物宿主細胞のような細胞におけるプロモータ活性を刺激することができるヌクレオチド配列エレメントを意味する。ベクターはさらに、たとえば転写されたＲＮＡの安定性を増大させるような、当技術分野で公知の３′調節配列エレメントを含んでいてもよい。
【００４３】
さらに、ベクターは別のヌクレオチド配列挿入物を含んでいてもよく、かかる挿入物は所望するヌクレオチド配列によりコードされた所望する蛋白質の精製を補助するためのタグとして使用されるペプチドまたはポリペプチドをコードするか、または別の機能的蛋白質をコードする。タグの包含に関しては、付加的なヌクレオチド配列をベクターに配置して、融合、またはキメラ蛋白質を得ることができる。たとえば、Ｃ末端にリンカーアミノ酸を有し、タグとして作用する別の蛋白質に結合した、本明細書に記載の蛋白質は、当技術分野で公知のように製造することができる。当業者に公知の精製手順の後、付加的なアミノ酸配列は適切な酵素により開裂される。その後、蛋白質は当技術分野で公知の方法により他の蛋白質、またはそのフラグメントから単離することができる。
【００４４】
別の態様において、ベクターは第２のヌクレオチド配列を含み、かかる配列は別の機能的蛋白質、たとえば本発明者らの同時係属中の米国特許出願番号、第１０／００６，８５２号に記載の植物ＧＡＤ酵素をコードする。あるいは、植物は２種のベクター、例としてはＧＡＤ酵素発現のためのＤＮＡ構築物を含むもの、および本明細書に記載の植物受容体蛋白質の発現のためのものにより、本発明に従って形質転換することができる。ある植物中におけるＧＡＤ酵素と受容体蛋白質の過剰発現は、たとえば強いストレス抵抗性のような、優れた特徴を持つ植物を生むことになると考えられる。
【００４５】
本発明の組換えベクターは、宿主細胞を形質転換するために使用することができる。したがって、本発明のヌクレオチド配列を有する核酸分子を植物細胞に導入することを含む、細胞または植物を形質転換する方法が提供される。細胞または植物を形質転換する多様な方法が当技術分野で公知であり、たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編（１９９８）を含む参考文献中に見出すことができる。植物遺伝子導入技術はまた、以下のものを含む参考文献中に見出すことができる：Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５８２４−５８２８（リポフェクション）；Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：１７９（マイクロインジェクション）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：７６３−７６４）（単子葉植物のＴ−ＤＮＡ媒介形質転換）；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１８：６２７−６４１（双子葉植物のＴ−ＤＮＡ媒介形質転換）；Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３５７−３８４）（双子葉植物のＴ−ＤＮＡ媒介形質転換）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（パーティクルガン法）；およびＦｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１−７９３（エレクトロポレーション）。適切なベクターにおいて、導入されたポリヌクレオチドは都合よく植物ゲノムに統合されるが、本発明の他の態様ではエピゾームのままであることも可能である。いったん所望する核酸が宿主細胞または宿主植物に導入されれば、宿主細胞は蛋白質を発現する。したがって、本発明のさらに別の態様では、先に記載の本発明の組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００４６】
本発明では、原核および真核宿主細胞を含む多様な宿主細胞を使用することができる。好ましい宿主細胞は真核細胞であり、そしてさらに好ましくは、たとえば以下のような植物に由来する植物細胞である：単子葉植物、たとえばウキクサ、トウモロコシ、シバ（たとえばライグラス、ギョウギシバ、イチゴツナギ、ウシノケグサ）、双子葉植物、たとえばレタス、コムギのような穀類、十字花植物（たとえばナタネ、ダイコンおよびキャベツ）、ナス科植物（たとえばピーマン、ジャガイモおよびトマト）、およびマメ科植物（たとえばダイズおよびインゲンマメ）。本発明の別の側面では、宿主細胞を当技術分野で公知のように培養してトランスジェニック植物を作製することができる。形質転換植物は、たとえば本発明の核酸分子により宿主植物由来の細胞、組織または器官を形質転換し；核酸分子を含む、形質転換細胞、細胞カルス、体細胞胚、または種子を選択し；選択された形質転換細胞、細胞カルス、体細胞胚、または種子から全草を再生し；そして核酸配列を発現する再生全草を選択することにより作製することができる。
【００４７】
本発明の別の側面では、植物蛋白質、たとえばベンゾジアゼピンまたはベンゾジアゼピン様受容体であると考えられる蛋白質を同定する方法が提供される。これらの方法では、別のベンゾジアゼピンまたはベンゾジアゼピン様受容体をコードすることができる別の類似したヌクレオチド配列を発見するためのプローブとして、先に記載のヌクレオチド配列、またはその一部が使用される。ＤＮＡまたはＲＮＡ試料における選択されたヌクレオチド配列をスクリーニングするための一般的方法は、当技術分野で公知である。たとえば、ＤＮＡは選択された植物から単離し、各種制限酵素で処理し、そして放射または蛍光標識された興味のあるプローブを使用して、サザンブロット法により分析することができる。ＲＮＡフラグメントはノーザンブロット法により同様に分析することができる。あるいは、市販のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００４８】
一態様では、プローブとして使用される核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列内の長さ約２５から約１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性を有するヌクレオチド配列を持つ。別の態様では、プローブとして使用される核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列内の長さ約２５から約４００ヌクレオチドのヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性を有するヌクレオチド配列を持つ。別の態様では、プローブとして使用される核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列内の長さ約２５から約５００ヌクレオチドのヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性を有するヌクレオチド配列を持つ。別の態様では、プローブとして使用される核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチドの全長に少なくとも約６０％同一性を有するヌクレオチド配列を持つ。別の態様では、プローブは、すぐ上に示した長さのヌクレオチドに少なくとも約７０％同一性を有するヌクレオチド配列を持つ。別の態様では、プローブは、すぐ上に示した長さのヌクレオチドに少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列を持つ。別の態様では、プローブは、すぐ上に示した長さのヌクレオチドに少なくとも約９０％同一性を有するヌクレオチド配列を有する。プローブは、たとえばポリヌクレオチドキナーゼおよび32Ｐでその５′末端を放射標識し、単離核酸フラグメントにハイブリダイズすることができる。
【００４９】
本発明の別の側面では、植物を処理する方法が提供される。一態様では、方法は本明細書に記載の導入された核酸分子を持ち、コードされた受容体蛋白質を発現する植物を提供すること、および有効量のＧＡＢＡで植物を処理することを包含する。そのように植物を処理することは、好都合には植物の生長を刺激し、植物ストレスの作用を軽減することを含む他の有益な結果を提供すると考えられる。
【００５０】
一態様では、トランスジェニック植物を上記のように作製し、そして有効量のＧＡＢＡで処理する。本明細書で使用する“有効量”は、たとえば植物の生長の刺激および／または植物ストレスの軽減のような、植物に１以上の利益を提供するＧＡＢＡの量を表す。量は、たとえば植物に提供される具体的な利益、導入されたヌクレオチド配列の発現量、植物の型、処理される植物の数および環境状態を含む多様な因子に依存して変化してもよい。一態様では、植物は約１ｐｐｍから約２４，０００ｐｐｍ［約０．０１３ｏｚ／エーカー（ｏｚ／Ａ）から約２０ｌｂｓ／Ａ］［約０．９３ｇ／ヘクタール（ｇ／ｈａ）から約２２ｋｇ／ｈａ］ＧＡＢＡで処理される。別の態様では、植物は約１ｐｐｍから約１２，０００ｐｐｍ［約０．０１３ｏｚ／Ａから約１０ｌｂｓ／Ａ］［約０．９３ｇ／ｈａから約１１ｋｇ／ｈａ］ＧＡＢＡで処理される。別の態様では、植物は約１ｐｐｍから約７，５００ｐｐｍ［約０．０１３ｏｚ／Ａから約６．３ｌｂｓ／Ａ］［約０．９３ｇ／ｈａから約７．１ｋｇ／ｈａ］ＧＡＢＡで処理される。別の態様では、植物は約１ｐｐｍから約５．０００ｐｐｍ［約０．０１３ｏｚ／Ａから約４．２ｌｂｓ／Ａ］［約０．９３ｇ／ｈａから約４．８ｋｇ／ｈａ］ＧＡＢＡで処理される。植物生長刺激に関しては、Ｋｉｎｎｅｒｓｌｅｙの米国特許第５，４３９，８７３号に記載のように、約１ｐｐｍから約５，０００ｐｐｍの濃度を好都合に使用することができる。植物ストレスの軽減を所望する場合、約１ｐｐｍから約２，５００ｐｐｍ［約０．０１３ｏｚ／Ａから約２．１ｌｂｓ／Ａ］［約０．９３ｇ／ｈａから約２．４ｋｇ／ｈａ］のＧＡＢＡ濃度を好都合に使用することができる。本発明の一態様では、約１５０〜６００ｐｐｍ［約１／８ｌｂ／Ａから約１／２ｌｂ／Ａ］［約０．１４ｋｇ／ｈａから約０．５６ｋｇ／ｈａ］が使用される。ｐｐｍで表すすべての量は、重量／容量（ｇ／ｍｌ）である。さらに、上記の括弧中の適用の割合は、１エーカーにわたり散布される具体的な溶液の標準量１００ガロンを使用する処理に関して求められている。
【００５１】
さらに別の態様では、植物はＧＡＢＡにより処理されることに加え、ＧＡＢＡおよびＧＡＢＡアゴニストを含む組成物により処理されてもよい。たとえば、植物はバクロフェンおよび当技術分野で公知のＧＡＢＡアゴニスト、たとえばｃｉｓ‐４‐アミノペント‐２‐エン酸（ＣＡＣＡ）、イミダゾール‐４‐酢酸（ＩＡＡ）および４，５，６，７，‐テトラヒドロイソキサゾロ［５，４‐ｃ］ピリジン‐３‐オール（ＴＨＩＰ）により処理してもよい。また、植物をＧＡＢＡアンタゴニスト、たとえばピクロトキシンまたはビククリンだけ、またはＧＡＢＡアゴニストだけで処理し、所望したとおりに植物代謝を調節することができる。植物は、動物末梢ベンゾジアゼピン受容体のようなベンゾジアゼピン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストでだけ処理することもできる。そのような化合物には、キニーネおよびスペルミン、ならびに本明細書に記載の他のベンゾジアゼピン受容体アンタゴニストおよびアゴニストが挙げられる。
【００５２】
ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡアゴニストまたはアンタゴニストならびに本明細書に記載の他のアゴニストおよびアンタゴニストは一般に植物の葉に適用するが、土壌ドレンチとして適用してもよい。さらに、植物を水耕栽培する場合、化合物および組成物は植物が栽培される水溶液に適用することができる。組成物はさらに、好ましくは噴霧により適用される。さらに、化合物および組成物は種子処理剤として適用することもできる。
【００５３】
ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡアゴニストまたはアンタゴニストならびに本明細書に記載の他のアゴニストおよびアンタゴニストは、好ましくは当技術分野で公知のキャリア媒体と組み合わせる。化合物および組成物はたとえば、水道水のような水または選択された無機物が添加されている蒸留水と組み合わせることができる。あるいは、本発明の組成物は固体として適用することができる。そのような形状では、固体は好ましくは土壌に適用される。さらに、組成物は当業者に公知の農業添加剤または製剤補助物を含むことができる。そのような添加剤または補助物は組成物が噴霧器中で十分に分散し、植物表面（とりわけ葉または他の葉状表面）に付着または浸透することを確実にし、そして植物に他の利益を提供するために使用することができる。たとえば、界面活性剤、分散剤、湿潤剤、および結合剤を使用して、本明細書に記載の噴霧器中の化合物または組成物を分散させ、化合物または組成物を植物表面に付着および／または浸透させることができる。
【００５４】
さらに、植物代謝を調節する方法が本発明により提供される。植物代謝の調節には、窒素同化のような栄養利用、植物生長、植物生産性および植物ストレスの作用への植物の抵抗性に正、または負の影響を与えることが挙げられる。たとえば、一態様では、植物生産性に負の影響を与えることができる本発明の方法としては、本明細書に記載のコーディングヌクレオチド配列に相補的な配列を有するアンチセンスヌクレオチド配列を植物細胞に導入することが挙げられる。
【００５５】
したがって、本発明はまた、植物受容体蛋白質産生に関与する遺伝子を操作するための方法を提供し、したがって細胞ストレスおよび／または生長過程のさらなる研究のために非常に貴重な手段である。たとえば植物受容体蛋白質遺伝子の操作は、代謝フラックス、栄養素利用および貯蔵、細胞分化、生長、老化、ならびにシグナル伝達に対するＧＡＢＡ関連過程の役割に関する定量的な情報を提供することができる。さらに、そのような操作は生物的および非生物的ストレスに対する作物の抵抗性を高めることにより作物生産性を向上させる方法を提供する。作物の質および収量は、作物植物の光合成および窒素効率を低下させ、収量を減少させるような、病気を含む各種環境ストレスに対する抵抗性を高めることにより改善される。
【００５６】
一態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列内の特定のヌクレオチドに少なくとも約５０％同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列内の特定のヌクレオチドに少なくとも約６０％同一性を有するヌクレオチド配列に相補的な、アンチセンスヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列内の特定のヌクレオチドに少なくとも約７０％同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列内の特定のヌクレオチドに少なくとも約８０％同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列内の特定のヌクレオチドに少なくとも約９０％同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスヌクレオチド配列を提供する。
【００５７】
一態様では、アンチセンスヌクレオチドは長さ約３０から約１００ヌクレオチドである。別の態様では、アンチセンスヌクレオチドは長さ約３０から約２００ヌクレオチドである。別の態様では、アンチセンスヌクレオチドは長さ約３０から約３００ヌクレオチドである。別の態様では、アンチセンスヌクレオチドは長さ約３０から約４００ヌクレオチドである。別の態様では、アンチセンスヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列の全長と同じ長さである。アンチセンスヌクレオチド配列はＲＮＡが産生される鎖としての役割を果たす鋳型鎖にハイブリダイズ可能であり、その結果転写が阻害される。あるいは、アンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書に記載のヌクレオチド配列から転写されたｍＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列に相補的で、したがってハイブリダイズ可能であるため、コードされた蛋白質を発現するためのｍＲＮＡ配列の転写が阻害されることになる。アンチセンスヌクレオチド配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、具体的なポリヌクレオチドのコーディング領域に相補的であるが、さらに配列は非コーディング領域の選択された配列に結合することができる。本発明のさらに好ましい態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＡＴＧ開始コドンに隣接したヌクレオチドに結合する。
【００５８】
本発明の別の態様では、本明細書に記載の植物受容体蛋白質の活性を変化させるために、それをコードする植物ゲノムに存在する遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ変異誘発により植物代謝を調節する方法を提供し、先に記載の所望する正または負の結果を提供する。植物は当業者に公知の方法、たとえば化学的方法およびＤＮＡ挿入物活性化標識変異誘発により変異させることができる。
【００５９】
本発明の別の側面では、植物の受容体活性を改変する方法が提供される。本発明の一態様では、方法は本明細書に記載の植物蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を植物細胞に導入することを含む。
【００６０】
本発明のさらに別の側面では、上記のベンゾジアゼピン受容体として機能すると考えられる植物蛋白質を発現させる方法が提供される。一態様では、方法は本明細書に記載の蛋白質をコードする、先に記載のヌクレオチド配列またはその変異体を提供し、そして先に記載のように宿主細胞にヌクレオチド配列を導入することを包含する。所望するヌクレオチド配列は都合よくベクターに導入され、組換えベクターを形成することができる。その後当技術分野で公知の手順に従って、組換えベクターを宿主細胞に導入することができる。そのような宿主細胞はその後当業者に公知の、植物蛋白質の発現に有効な条件下で培養する。次に蛋白質は、慣用の技術を使用して精製することができる。
【００６１】
多様な標的植物が本発明に従って企図される。一態様では、標的植物は以下の植物からなる群から選択される：ウキクサ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、ギョウギシバ、イチゴツナギ、ウシノケグサ、ナタネ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、ソラ豆、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、トウガラシ、セロリ、スクワッシュ、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、インゲンマメ、タバコ、トマト、ピーマン、モロコシおよびサトウキビ。
【００６２】
本明細書に提供されるどんな実験、実施例、または実験結果も本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定または制限するものであると見なすべきではない。さらに、本発明に記載されたどんな理論、作用機序、または発見も本発明の理解をさらに深めるためのものであって、そのような理論、機序または発見へのどんな道筋においても本発明を限定することを意図しない。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの刊行物、特許、または特許出願が明確に、そして個々にまるで参照として援用されることを必要とされていたかのように、参照として本明細書に援用し、そのまま本明細書に示す。本発明は図面および先の説明で詳細に説明され、記載されているが、同じものは特徴を説明するものであって、制限するものではないと見なすべきであり、選択された態様だけが示され、そして記載されていること、および本明細書に記載されるか、または以下の特許請求の範囲により説明される、本発明の意図に含まれるすべての変更、等価物、および改変は保護されることが望ましいと理解すべきである。
【００６３】
ここで、先に記載の本発明を説明する具体的な実施例を参照する。実施例は好ましい態様を説明するために提供され、それによって本発明の範囲の限定を意図しないことを理解すべきである。
【実施例１】
【００６４】
ウキクサのＧＡＢＡ媒介生長促進に対する動物ミトコンドリアベンゾジアゼピン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの作用
ベンゾジアゼピン受容体はアゴニストジアゼパムおよびアンタゴニストＰＫ１１１９５（イソキノリンカルボキサミド）、スペルミン、キニーネおよびシクロスポリンＡに感受性がある。
【００６５】
Ｋｉｎｎｅｒｓｌｅｙの米国特許第５，４３９，８７３号で説明したように培地は水道水に１ｇ／ｌで溶かしたＳｏｌｕ−Ｓｐｒａｙ  ２０−２０−２０肥料であり、ｐＨは５．５に調整したこと以外は、ウキクサ（コウキクサＬｅｍｎａ  Ｍｉｎｏｒ  Ｌ）はＫｉｎｎｅｒｓｌｅｙにより記載された一般的手順（米国特許第４，８１３，９９７号）に従って育てた。ウキクサはＧＡＢＡおよびシクロスポリンＡ、スペルミン、キニーネ、ジアゼパムまたはＰＫ１１１９５のいずれかの示された濃度で、別々に処理した。
【００６６】
図２、３および４で見られるように、培地中ＧＡＢＡ存在下で別々にシクロスポリンＡ、スペルミン、またはキニーネで処理した場合、生長に対する阻害作用が見られた。シクロスポリンＡは免疫抑制剤であり、動物ミトコンドリアＰＴＰの最も強力な薬理学的阻害剤であることが示されている。シクロスポリンの阻害活性は、ミトコンドリア内膜のミトコンドリアシクロフィリンへの結合に起因している。ウキクサの実験では、３μＭ  シクロスポリンＡは１０ｍＭ  ＧＡＢＡを含む培養物中の植物生長を有意に阻害した。それぞれの対照に比べ、シクロスポリンＡ（図２）、スペルミン（図３）およびキニーネ（図４）によるＧＡＢＡ媒介生長の阻害は、逆説的に最高レベルのＧＡＢＡにおいて最も強かった。このことは図３において最も明確に見られ、そこでは１０ｍＭ  ＧＡＢＡおよび１５０μＭ  スペルミンによる培養物の乾燥重量が、ＧＡＢＡを含まずに１５０μＭ  スペルミンを含む培養物より有意に少なかった。培養物にベンゾジアゼピン類のジアゼパムを３μＭ添加するとＧＡＢＡ媒介生長を促進した（図５）。生長の促進はＰ＜０．０５で有意であった。また、植物におけるＧＡＢＡ活性に対するジアゼパムの作用は、動物および植物におけるＧＡＢＡ受容体構造の類似性のさらなる証拠である。
【００６７】
さらに、ＧＡＢＡの非存在下でＰＫ１１１９５によりウキクサを処理した場合、以下の表１に示すように、生長に対する阻害作用が見られた。ＰＫ１１１９５は末梢ベンゾジアゼピン受容体の特徴的なリガンドであり、動物ミトコンドリアにおいてＰＴＰに関連する。ＰＫ１１１９５はＧＡＢＡ媒介生長反応を５０μＭで阻害した（図５）。
【００６８】
【表１】
2004535810.tif 000002
【００６９】
表１のデータは内因性ＧＡＢＡレベルのような、低レベルのＧＡＢＡが植物中に存在する場合、作用を確認するためには高濃度のＰＫ１１１９５が必要であることを示唆する。
図５に示すように、上記のように生長したウキクサをジアゼパムで独立して処理した場合、培地中のＧＡＢＡの存在下で生長促進作用が見られた。ウキクサをＰＫ１１１９５で独立して処理した場合、培地中のＧＡＢＡの存在下で生長阻害作用が見られた。
【００７０】
初期の研究は、ウキクサ生長に対する動物ＧＡＢＡ受容体アンタゴニストの作用を報告した；しかし、以下の表２で報告されたＧＡＢＡ生理活性の阻害剤は、初期の研究で使用されたＧＡＢＡ受容体アンタゴニストより最高で１０００倍まで活性が高かった。このことは、異なるクラスのＧＡＢＡ受容体に作用していること、および動物と同様に、植物も多様なＧＡＢＡ受容体を有することを示唆する。
【００７１】
【表２】
2004535810.tif 000003
【００７２】
動物のベンゾジアゼピン受容体の活性を促進または阻害する薬剤を用いた実験が、植物でも類似した結果であったことから、上記の結果と合わせて、植物におけるベンゾジアゼピン、またはベンゾジアゼピン様受容体の証拠を提供する。
【実施例２】
【００７３】
全長ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの単離
プロトコール
シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ−０）の種子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）から得ることができる。シロイヌナズナの苗は回転振とう機（１５０ｒｐｍ）上のＭＳ培地［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｋ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５：４８５（１９６２）］を含むフラスコ中で無菌的に育てる。２日目の苗を総ＲＮＡ単離のために回収する。総ＲＮＡはＴｕｒａｎｏ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：３７４に記載のように単離する。合成されたプライマー
【００７４】
【化１】
2004535810.tif 000004
【００７５】
および
【００７６】
【化２】
2004535810.tif 000005
【００７７】
（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４）（ＧｅｎＢａｎｋ，未知蛋白質、遺伝子＃Ａｔ２ｇ４７７７０，蛋白質 ｉｄ＝ＡＡＣ６３６３２．１，ｄｂ ｘｒｅｆ＝ＧＩ：３７３８２９０）は市販（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）され、ＲＴ‐ＰＣＲ反応に使用される。ＲＴ‐ＰＣＲでは、５′ＲＡＣＥ系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、全長ｃＤＮＡクローンを同定する。プライマー３′ＥｃｏＰＢＲを使用して、取り扱い説明書に従い、２日目の植物から単離したポリ（Ａ+）ＲＮＡ１μｇ由来の第１鎖ｃＤＮＡを合成する。第１鎖ｃＤＮＡ合成物の１／５を、両プライマー、５′ＥｃｏＰＢＲおよび３′ＥｃｏＰＢＲによる遺伝子増幅反応における鋳型として使用する。増幅の前に、成分を９５℃で４分間インキュベートする。遺伝子増幅反応は、９４℃で１分間、６８℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間延長して行う。
【００７８】
ゲノムＤＮＡはＴｕｒａｎｏ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｌｏ．１００：３７４に記載のように、２４日目のシロイヌナズナの葉から単離する。ＰＣＲ反応では、それぞれのプライマー（５′ＥｃｏＰＢＲおよび３′ＥｃｏＰＢＲ）  ２５０ｎｇとゲノムＤＮＡ  ５００ｎｇを使用する。増幅反応の前に、成分を９５℃で１０分間インキュベートする。遺伝子増幅反応は、９４℃で１分間、７０℃で１分間および７２℃で３分間を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間延長して行う。
【００７９】
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡフラグメントは別々にＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングし、Ｔａｑ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）法により配列決定する。データはＰｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  ６５００／２５０上でＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェアにより解析する。
【実施例３】
【００８０】
トランスジェニック植物の構築
植物受容体蛋白質を過剰発現するトランスジェニック植物、またはアンチセンス受容体蛋白質を過剰発現するものは以下のように作製する。ＰＣＲ、ＲＴ‐ＰＣＲまたはアンチセンス構築物を作製するための慣用のクローニング法を使用して、受容体蛋白質のセンス（過剰発現）またはアンチセンス（不十分な発現）の全（５９１塩基対）オープンリーディングフレーム、または約２５塩基対の大きさのその一部（アンチセンスまたはＲＮＡｉだけのための）をｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のようなベクターにクローニングする。合成された遺伝子特異的プライマー、
【００８１】
【化３】
2004535810.tif 000006
【００８２】
および
【００８３】
【化４】
2004535810.tif 000007
【００８４】
（ＧｅｎＢａｎｋ，未知蛋白質、遺伝子＃Ａｔ２ｇ４７７７０，蛋白質 ｉｄ＝ＡＡＣ６３６３２．１，ｄｂ ｘｒｅｆ＝ＧＩ：３７３８２９０に対応する）は市販（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）され、ＲＴ‐ＰＣＲ反応に使用される。たとえば、ＰＣＲ反応はそれぞれのプライマー  ２５０ｎｇとゲノムＤＮＡ  約５００ｎｇを使用する。増幅反応の前に、成分を９５℃で２分間インキュベートする。遺伝子増幅反応は、９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクル行い、その後７２℃で４分間延長して行う。
【００８５】
ＲＴ‐ＰＣＲでは、５′ＲＡＣＥ系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）またはより簡単な逆転写酵素（ＲＴ）を使用して全長ｃＤＮＡクローンを同定する。プライマー３′ＥｃｏＰＢＲを使用して、取り扱い説明書に従い、２日目の植物から単離したポリ（Ａ+）ＲＮＡ１μｇ由来の第１鎖ｃＤＮＡを合成する。第１鎖ｃＤＮＡ合成物の１／５を、両プライマー、５′ＥｃｏＰＢＲおよび３′ＥｃｏＰＢＲによる遺伝子増幅反応における鋳型として使用する。増幅の前に成分を９５℃で２分間インキュベートする。遺伝子増幅反応は、９４℃で１分間、５８℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間を延長して行う。
【００８６】
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントは、所望する結果に合わせて、センス（順方向）またはアンチセンス（逆方向）方向で植物形質転換ベクターにクローニングする。ベクターは構成的プロモータ、たとえばＣａＭＶ３５Ｓプロモータおよびノパリンシンターゼターミネータ、または本明細書に記載され、そして当技術分野で公知の他のプロモータを含むことができる。ベクターは改変されて生物的［Ｓｏｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：７５−８７］または非生物的ストレス［Ｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２：１０２１−１０３４；ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１：１１５３−１１６２；Ｋｕｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２１：１３２９−１３３８］、および／またはホルモンまたは他のシグナル伝達分子［Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９：６６７−６７７；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０１２０−１０１３１］；Ｌｅｕｂｎｅｒ−Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：７８５−７９５］により誘導することができるプロモータを含んでいてもよい。クローニングされた構築物の配向は、制限エンドヌクレアーゼおよびＰＣＲ解析により確認する。
【００８７】
クローニングが完了すると、バイナリーベクターは、一部改変（すなわち、浸潤液への０．０２％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔの添加）した減圧浸潤法［Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，Ｎ．ａｎｄ  Ｂｏｕｃｈｅｚ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ編．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ｐｐ１９−２３］を使用して、アグロバクテリウム‐ツメファシエンスの無害化系統、たとえばＥＨＡ１０５、続いてシロイヌナズナ（Ｗｓエコタイプ）に導入した。形質転換された植物から集めた種子を発芽させて、カナマイシン耐性に対して選択する。
【００８８】
本発明は図面および先の説明で詳細に説明され、記載されているが、同じものは特徴を説明するものであって、制限するものではないと見なすべきであり、好ましい態様だけが示され、そして記載されていること、および本発明の意図に含まれるすべての変更、および改変は保護されることが望ましいことを理解すべきである。さらに、本明細書に引用されたすべての参考文献は、当技術分野のレベルを表すものであって、参照としそのまま本明細書に援用する。
【００８９】
本発明の具体的な態様は特許請求の範囲においてとりわけ指摘されることになるが、発明自体、およびそれが作製され、使用される様式は本発明の一部を形成する添付の図面についての以下の説明を参照することにさらによく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】植物ストレス反応において提案されたＧＡＢＡの役割を示した図である（ＧＡＢＡが環境ストレスシグナルの細胞バロメータおよびトランスジューサとして機能する仮説経路）。
【図２】ウキクサにおけるＧＡＢＡ‐媒介成長促進に対するシクロスポリンＡの作用を示すグラフであり、実施例１でより詳しく説明される。
【図３】ウキクサにおけるＧＡＢＡ‐媒介成長促進に対するスペルミンの作用を示すグラフであり、実施例１でより詳しく説明される。
【図４】ウキクサにおけるＧＡＢＡ‐媒介成長促進に対するキニーネの作用を示すグラフであり、実施例１でより詳しく説明される。
【図５】ウキクサにおけるＧＡＢＡ‐媒介成長促進に対するジアゼパムおよびＰＫ１１１９５（イソキノリンカルボキサミド）の作用を示すグラフであり、実施例１でより詳しく説明される。
【図１】
2004535810.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004535810.tif 000060