(57)【要約】本発明は、アミノ酸配列ＹＬＳＧＡＤＬＮＬを含む修飾エピトープを含む免疫原性ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸、前記核酸を包含するベクターおよび／または細胞、ならびにそれらの混合物および／または組成物について開示する。前記物質を用いてＣＥＡ特異的免疫反応を誘導する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＡの修飾エピトープを含むＣＥＡアゴニストポリペプチドであって、前記修飾エピトープがアミノ酸配列ＹＬＳＧＡＤＬＮＬを含むことを特徴とするＣＥＡアゴニストポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項４】
配列番号２に示す配列を含むことを特徴とする請求項３記載の核酸。
【請求項５】
配列番号２に示す配列を有することを特徴とする請求項３記載の核酸。
【請求項６】
ウイルス核酸、細菌ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸の／フリーＤＮＡ、およびＲＮＡより成る群から選択されることを特徴とする請求項３から５何れか１項記載の核酸。
【請求項７】
アデノウイルス核酸、アルファウイルス核酸、およびポックスウイルス核酸より成る群から選択されることを特徴とする請求項６記載の核酸。
【請求項８】
アビポックスウイルス核酸、オルソポックスウイルス核酸、およびスイポックスウイルス核酸より成る群から選択されることを特徴とする請求項７記載の核酸。
【請求項９】
ワクシニアウイルス核酸、鶏痘ウイルス核酸、カナリア痘ウイルス核酸、および豚痘ウイルス核酸より成る群から選択されることを特徴とする請求項７記載の核酸。
【請求項１０】
ＴＲＯＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＭＶＡ、Ｗｙｅｔｈ、およびＰｏｘｖａｃ−ＴＣより成る群から選択されることを特徴とする請求項７記載の核酸。
【請求項１１】
サイトカイン、リンホカイン、および補助的刺激分子より成る群から選択される少なくとも１つの物質をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項３から１０何れか１項記載の核酸。
【請求項１２】
請求項３から１１何れか１項記載の核酸を包含するベクター。
【請求項１３】
組換えウイルスおよび細菌より成る群から選択されることを特徴とする請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
アデノウイルス、アルファウイルス、およびポックスウイルスより成る群から選択されることを特徴とする請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
アビポックスウイルス、オルソポックスウイルス、およびスイポックスウイルスより成る群から選択されることを特徴とする請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、および豚痘ウイルスより成る群から選択されることを特徴とする請求項１４記載のベクター。
【請求項１７】
ＴＲＯＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＭＶＡ、Ｗｙｅｔｈ、およびＰｏｘｖａｃ−ＴＣより成る群から選択されることを特徴とする請求項１４記載のベクター。
【請求項１８】
サイトカイン、リンホカイン、および補助的刺激分子より成る群から選択される少なくとも１つの物質をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１２から１７何れか１項記載のベクター。
【請求項１９】
請求項３から１１何れか１項記載の核酸を包含する、ＣＥＡアゴニストポリペプチドを発現する細胞。
【請求項２０】
ＭＨＣ ＨＬＡクラスＩ分子をさらに発現することを特徴とする請求項１９記載の細胞。
【請求項２１】
抗原提示細胞であることを特徴とする請求項１９記載の細胞。
【請求項２２】
樹状細胞であることを特徴とする請求項２１記載の細胞。
【請求項２３】
請求項３から１１何れか１項記載の核酸と、サイトカイン、リンホカイン、補助的刺激分子、およびそれらをコードする核酸より成る群から選択される少なくとも１つの物質とを含んで成る混合物。
【請求項２４】
請求項１２から１８何れか１項記載のベクターと、サイトカイン、リンホカイン、補助的刺激分子、およびそれらをコードする核酸より成る群から選択される少なくとも１つの物質とを含んで成る混合物。
【請求項２５】
請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチドと、サイトカイン、リンホカイン、補助的刺激分子、およびそれらをコードする核酸より成る群から選択される少なくとも１つの物質とを含んで成る混合物。
【請求項２６】
請求項１９から２２何れか１項記載の細胞と、サイトカイン、リンホカイン、補助的刺激分子、およびそれらをコードする核酸より成る群から選択される少なくとも１つの物質とを含んで成る混合物。
【請求項２７】
請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチドと、薬剤的に許容される希釈剤または担体とを含んで成る薬剤組成物。
【請求項２８】
請求項３から１１何れか１項記載の核酸と、薬剤的に許容される希釈剤または担体とを含んで成る薬剤組成物。
【請求項２９】
請求項１２から１８何れか１項記載のベクターと、薬剤的に許容される希釈剤または担体とを含んで成る薬剤組成物。
【請求項３０】
請求項１９から２２何れか１項記載の細胞と、薬剤的に許容される希釈剤または担体とを含んで成る薬剤組成物。
【請求項３１】
請求項２３から２６何れか１項記載の混合物と、薬剤的に許容される希釈剤または担体とを含んで成る薬剤組成物。
【請求項３２】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項２７から３１何れか１項記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
（ｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片；
（ｉｉ）請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＣＥＡエピトープ；
（ｉｖ）修飾ＣＥＡエピトープ；
（ｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを発現する細胞；および
（ｖｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを結合した細胞；より成る群から選択される物質に対する免疫反応を動物において誘導する方法であって、
免疫反応を誘導するのに十分な量で請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチドまたはその断片を前記動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項３４】
（ｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片；
（ｉｉ）請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＣＥＡエピトープ；
（ｉｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを発現する細胞；および
（ｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを結合した細胞；より成る群から選択される物質に対する免疫反応を動物において誘導する方法であって、
免疫反応を誘導するのに十分な量で請求項３から１１何れか１項記載の核酸を前記動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項３５】
（ｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片；
（ｉｉ）請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＣＥＡエピトープ；
（ｉｖ）修飾ＣＥＡエピトープ；
（ｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを発現する細胞；および
（ｖｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを結合した細胞；より成る群から選択される物質に対する免疫反応を動物において誘導する方法であって、
免疫反応を誘導するのに十分な量で請求項１２から１８何れか１項記載のベクターを前記動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項３６】
（ｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片；
（ｉｉ）請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＣＥＡエピトープ；
（ｉｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを発現する細胞；および
（ｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを結合した細胞；より成る群から選択される物質に対する免疫反応を動物において誘導する方法であって、
免疫反応を誘導するのに十分な量で請求項１９から２２何れか１項記載の細胞を前記動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項３７】
（ｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片；
（ｉｉ）請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＣＥＡエピトープ；
（ｉｖ）修飾ＣＥＡエピトープ；
（ｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを発現する細胞；および
（ｖｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを結合した細胞；より成る群から選択される物質に対する免疫反応を動物において誘導する方法であって、
免疫反応を誘導するのに十分な量で請求項２３から２６何れか１項記載の混合物を前記動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項３８】
（ｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片；
（ｉｉ）請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＣＥＡエピトープ；
（ｉｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを発現する細胞；および
（ｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチド、ＣＥＡエピトープ、あるいは修飾ＣＥＡエピトープを結合した細胞；より成る群から選択される物質に対する免疫反応を動物において誘導する方法であって、
免疫反応を誘導するのに十分な量で請求項２７から３２何れか１項記載の組成物を前記動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項３９】
効果量の請求項１または２記載のＣＥＡアゴニストポリペプチドを患者に投与することを含んで成る、患者においてＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する方法。
【請求項４０】
効果量の請求項３から１１何れか１項記載の核酸を患者に投与することを含んで成る、患者においてＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する方法。
【請求項４１】
効果量の請求項１２から１８何れか１項記載のベクターを患者に投与することを含んで成る、患者においてＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する方法。
【請求項４２】
効果量の請求項１９から２２何れか１項記載の細胞を患者に投与することを含んで成る、患者においてＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する方法。
【請求項４３】
効果量の請求項２３から２６何れか１項記載の混合物を患者に投与することを含んで成る、患者においてＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する方法。
【請求項４４】
効果量の請求項２７から３２何れか１項記載の組成物を患者に投与することを含んで成る、患者においてＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する方法。
【請求項４５】
前記癌細胞が、胃腸癌細胞、乳癌細胞、膵癌細胞、膀胱癌細胞、卵巣癌細胞、肺癌細胞、または前立腺癌細胞であることを特徴とする請求項３９から４４何れか１項記載の方法。
【請求項４６】
請求項３９から４５何れか１項記載の方法を含んでなる、癌の治療方法。
【請求項４７】
癌治療のための薬剤を製造するための、請求項１記載のＣＥＡアゴニストポリペプチドの使用。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４７記載の使用。
【請求項４９】
癌治療のための薬剤を製造するための、配列番号２の配列を有する単離核酸配列、精製核酸配列、または組換え核酸配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫学、詳細には、修飾エピトープを含む新規な生物活性修飾ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸、前記核酸を包含するベクターおよび／または細胞、前記のものの混合物および／または組成物、ならびに免疫原としておよび／または癌治療におけるそれらの使用に関する。
発明の背景
本明細書を通して、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために様々な引例が括弧内に挙げられている。それら引例の開示内容は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
癌免疫療法の期待は、免疫系によって認識され得る腫瘍関連抗原の同定に基づくものである。特に、Ｔ細胞介在反応を誘導する標的抗原に高い関心がもたれている。このことは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が動物モデル（Ｋａｓｔ Ｗ． ｅｔ ａｌ（１９８９） Ｃｅｌｌ ５９： ６０３５； Ｇｒｅｅｎｄｌｂｅｒｇ Ｐ． （１９９１） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４９： ２８１）およびヒト（Ｂｏｏｎ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：３３７）の両方において腫瘍の緩解を誘導し得るという証拠に基づくものである。
【０００３】
ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、結腸癌、直腸癌、胃癌、および膵癌の大部分（Ｍｕａｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５：５７６９）、乳癌のおよそ５０％（Ｓｔｅｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９７４） Ｃａｎｃｅｒ ３３： １２４６）、および肺癌の７０％（Ｖｉｎｃｅｎｔ， Ｒ．Ｇ．， Ｃｈｕ， Ｔ．Ｍ．（１９７８） Ｊ． Ｔｈｏｒ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓ． Ｓｕｒｇ． ６６：３２０）において発現されている１８０ｋＤの糖タンパク質である。ＣＥＡは胎児の消化管組織、およびより少ない程度で正常結腸上皮組織においても発現される。ＣＥＡの免疫原性は曖昧であり、いくつかの研究が患者における抗ＣＥＡ抗体の存在を報告している（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３９： ６０； Ｐｏｍｐｅｃｋｉ， Ｒ． （１９８０） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １６： ９７３； Ｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ２５： ２８３； Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２６： １８０）が、他の研究はその存在を報告していない（ＬｏＧｅｒｆｏ ｅｔ ａｌ． （１９７２） Ｉｎｔ． Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９：３４４； ＭａｃＳｗｅｅｎ， Ｊ．Ｍ．（１９７５） Ｉｎｔ Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １５： ２４６； Ｃｈｅｓｔｅｒ Ｋ．Ａ．， Ｂｅｇｅｎｔ， Ｈ．Ｊ．（１９８４） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ５８： ６８５）。ＣＥＡは、ヒト消化管の腺癌における癌特異的胎児性抗原として１９６５年に初めて報告された（Ｇｏｌｄ， Ｐ．， Ｆｒｅｅｍａｎ， ５．０（１９６５） Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １２１； ４３９）。それ以来、ＣＥＡは、ヒト胃腸管のほぼ全ての固形癌において過剰に産生される細胞表面抗原として特徴付けられた。ヒトＣＥＡタンパク質の遺伝子はクローン化されている（Ｏｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ（１９８７） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． １４２：５１１−５１８； 欧州特許出願第０３４６７１０号明細書）。
【０００４】
前記のようなＣＥＡの免疫原性の曖昧な証明にも関わらず、ワクシニア−ＣＥＡワクチン（「ｒＶ−ＣＥＡ」）を用いた第Ｉ相臨床試験は、ＣＥＡ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応がヒトにおいて誘導され得ることを実証した（Ｔｓａｎｇ， Ｋ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ ８７： ９８２−９９０； Ｔｓａｎｇ Ｋ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３：２４３９−２４４９）。その試験の結果として、ＣＥＡ主要（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）ＣＴＬエピトープが同定された。その９マー（すなわち、ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ）はＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子に結合することが示され、癌胎児性抗原ペプチド−１（「ＣＡＰ−１」）と命名された。その後のいくつかの試験も、ＣＡＰ−１エピトープ／ペプチド自体がＣＥＡ特異的ヒトＣＴＬ反応を誘導する能力を証明した（Ａｌｔｅｒｓ， Ｓ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２１： １７−２６； Ｔｓａｎｇ， Ｋ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｕｐｒａ； Ｚａｒｅｍｂａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７： ４５７０−４５７７）。さらに、ＣＡＰ−１およびインターロイキン（ＩＬ）−２でｒＶ−ＣＥＡワクチン接種した患者由来の抹消血単核球（ＰＢＭＣ）の培養によって誘導された安定なＣＴＬ株が最近報告されている（Ｔｓａｎｇ， Ｋ．Ｙ．（１９９７） Ｓｕｐｒａ）。
【０００５】
免疫原性ペプチドが保存態様（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍａｎｎｎｅｒ）で修飾された場合（すなわち、疎水性アミノ酸が疎水性アミノ酸で置換された場合）、その修飾ペプチドは、分子形状、電荷、および疎水性の維持に基づいて、類似の免疫活性を有する傾向があるという理論が受け入れられている。さらに詳細には、Ｍａｄｄｅｎによる研究（Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５： ６９３）は、Ｔ細胞認識の前駆工程であるＭＨＣ−複合体形成に関して、ペプチドにおける特定アミノ酸選択を同定した。Ｍａｄｄｅｎならびに他の研究者（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１： １７８）は、ペプチド中の特定アミノ酸位置がＴ細胞認識に利用可能であると主張した。
【０００６】
Ｓｋｉｐｐｅｒらは、ペプチド配列がＤＮＡから予測されるものとは異なっているチロシナーゼの天然ペプチドエピトープの同定および特徴付けについて記載している（（１９９６） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３：５２７）。その修飾ペプチドは、直接の翻訳産物よりも効率的にチロシナーゼ特異的ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）によって認識され、ＨＬＡ−Ａ２．１分子によって細胞表面上に提示されるべき２つのペプチドのうちの１つであった。その修飾は、アスパラギン酸によるアスパラギンの置換であった。著者は、タンパク質合成の間に小胞体でＮ−グリコシル化され、続いて、翻訳後に脱アミノ化されると提案した。
【０００７】
ＣＥＡエピトープＣＡＰ−１に関して、（エピトープの）位置２、９、および１でのＨＬＡ結合のための第１および第２アンカー位置は好ましいアミノ酸によって既に占有されている。従って、Ｓｃｈｌｏｍおよび同僚達は、ＣＡＰ−１特異的ＣＴＬのＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）と相互作用すると予測される残基に対する単一アミノ酸置換を含むエピトープアナログを作成することによって、ＣＡＰ−１の免疫原性を高める試みを行った。天然エピトープの免疫原性よりも高められた免疫原性を示すが、付随するＭＨＣ結合自体の上昇を示さない（すなわち、アゴニストとして作用する；Ｚａｒｅｍｂａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ（１９９７） Ｓｕｐｒａ）、１つのそのようなアナログエピトープ（ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ；ＣＡＰ−１−６Ｄと命名された）が同定された。
【０００８】
本発明は、修飾エピトープを含む新規な修飾ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸、前記核酸を包含するベクター、前記のものの混合物および／または組成物、ならびにＣＥＡ特異的免疫反応の誘導および／または癌治療におけるそれらの有利な使用について開示する。
【０００９】
発明の概要
本発明は、配列ＹＬＳＧＡＤＬＮＬを含む修飾エピトープを含む新規な修飾ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸、前記核酸を包含するベクター（例えば組換えウイルスおよび／または細菌）および／または細胞（例えば抗原提示細胞）、ならびに前記のものの混合物および／または組成物を含む。それら前記の全ての物質、混合物、および組成物は、ＣＥＡタンパク質またはその断片；前記修飾エピトープを含むＣＥＡアゴニストポリペプチド；正常または修飾ＣＥＡエピトープ；あるいは前記のＣＥＡタンパク質またはその断片、ＣＥＡアゴニストポリペプチド、または正常／修飾ＣＥＡエピトープを結合または発現する細胞；に対する免疫反応を誘導する能力によって特徴付けられる。
【００１０】
従って、本発明の１つの実施形態において、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質は、修飾ＣＥＡエピトープを含むように提供され、その修飾エピトープは配列ＹＬＳＧＡＤＬＮＬを含む。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質は、配列番号１（図１）のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
先に述べたように、本発明の実施形態は、前記のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸を含む。従って、本発明の実施形態は、配列番号２（図１）の核酸配列を含む。本発明のさらに別の実施形態において、核酸は、ウイルス核酸、プラスミド、細菌ＤＮＡ、裸の／フリーＤＮＡ、およびＲＮＡより成る群から選択されるＤＮＡである。さらに別の実施形態において、ウイルス核酸は、アデノウイルス、アルファウイルス、およびポックスウイルスより成る群から選択される。さらに別の実施形態において、ポックスウイルスは、アビポックスウイルス、スイポックスウイルス、およびオルソポックスウイルスより成る群から選択される。さらに別の実施形態において、ポックスウイルス核酸は、ＴＲＯＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＭＶＡ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、Ｗｙｅｔｈ、およびＰｏｘｖａｃＴＣより成る群から選択される。
【００１３】
本発明の追加の実施形態は、サイトカイン、リンホカイン、および補助的刺激分子より成る群から選択される少なくとも１つの物質をコードする第２配列に加えて、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする配列を含む核酸を含むことが考えられている。
【００１４】
本発明の実施形態は、本発明の核酸を包含するベクターも提供する。特定実施形態において、それらベクターは、組換えウイルスまたは細菌の何れかである。別の実施形態において、組換えウイルスは、アデノウイルス、アルファウイルス、およびポックスウイルスより成る群から選択される。さらに別の実施形態において、ポックスウイルスは、アビポックスウイルス、スイポックスウイルス、およびオルソポックスウイルスより成る群から選択される；特定実施形態は、ＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＭＶＡ、Ｗｙｅｔｈ、およびＰｏｘｖａｃ−ＴＣを含む。
【００１５】
本発明は、本発明の前記核酸を包含する、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質を発現する細胞をさらに提供する。さらに別の実施形態において、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質を発現する細胞は、ＭＨＣ ＨＬＡクラスＩ分子も発現する。さらに別の実施形態において、ポリペプチドを発現する細胞は抗原提示細胞である。
【００１６】
本発明の実施形態は、前記のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、核酸、ベクターおよび細胞の混合物および／または組成物を含む。それら混合物および／または組成物は、必要に応じてアジュバントを含んでいて差し支えない。
【００１７】
本発明は、
（ｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片；および／または
（ｉｉ）本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質；および／または
（ｉｉｉ）ＣＥＡエピトープ；および／または
（ｉｖ）修飾ＣＥＡエピトープ；および／または
（ｖ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、ＣＥＡエピトープ、修飾ＣＥＡエピトープを発現する細胞；および／または
（ｖｉ）ＣＥＡタンパク質またはその断片、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、ＣＥＡエピトープ、修飾ＣＥＡエピトープを結合する細胞；に対する免疫反応を動物において誘導する方法であって、免疫反応を誘導するのに十分な量で本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、核酸、ベクター、細胞、あるいは混合物および／または組成物を投与することを含んで成る方法をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、核酸、ベクター、細胞、あるいは混合物および／または組成物を患者に投与することを含んで成る、患者においてＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する方法をさらに提供する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、免疫反応を誘導しおよび／またはＣＥＡエピトープを発現する癌細胞を阻害するための前記方法の何れか１つを含む、癌の治療方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の特定実施形態を示唆する詳細な説明および特定実施例は、単に例示の目的で与えられており、本発明の精神および範囲内に含まれる様々な変更および改変がその詳細な説明から当業者に明らかになるであろうことを理解すべきである。
【００２１】
本発明は、図面の説明によってさらに理解されるであろう。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、配列ＹＬＳＧＡＤＬＮＬを含む修飾ＣＥＡエピトープを含むＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸、前記核酸を包含するベクターおよび／または細胞（総称して、本発明の「物質」と称される）、および前記のものの混合物／組成物について開示する。本発明の前記の物質および混合物／複合体の全てが、ＣＥＡタンパク質またはその断片、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、ＣＥＡエピトープおよび／または修飾ＣＥＡエピトープ、および／または前記のものを結合または発現する細胞に対する免疫反応を誘導する能力を有する。「免疫反応」は、例えば細胞性免疫（すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球介在）または液性免疫（すなわち抗体介在）の何れかのような、免疫系の任意の反応として定義される。当業者に公知であるように、免疫反応の評価および／またはモニタリングのための様々な測定法／方法論が存在する。
【００２３】
細胞性免疫反応において、腫瘍関連抗原タンパク質（例えばＣＥＡ）は、細胞内プロテアーゼによってより小さなエピトープペプチドにプロセシングされ、続いてそのエピトープペプチドは細胞表面に輸送され、ＭＨＣ ＨＬＡクラスＩ分子上の収容溝（ｃｌｅｆｔ）にしっかりと結合する。Ｔ細胞は、それら小さなエピトープペプチドがＭＨＣ ＨＬＡクラスＩ分子と結合して適切な細胞の表面上に提示された場合にのみそのエピトープペプチドを認識する。同様に、液性免疫反応において、タンパク質はより小さなエピトープペプチドにプロセッシングされ、続いてそのエピトープペプチドはＭＨＣ ＨＬＡクラスＩＩ分子と結合して細胞表面（すなわち抗原提示細胞）上に提示されるであろう。そのような複合体は、液性免疫系の適切な細胞によって認識される。
【００２４】
当業者に公知であるように、抗原由来の約８から１２アミノ酸のアミノ酸配列から成る短いペプチド（すなわちエピトープ）は、細胞内プロセッシング無しにＨＬＡクラスＩ分子の収容溝内に直接結合することができる。先に述べたように、ＣＥＡ由来の多くのそのようなエピトープが同定されている。さらには、それらＣＥＡ−特異的抗原エピトープは免疫反応を誘導する能力を示しており、適当なＣＥＡを発現する標的細胞がそれによって融解される。本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質（修飾ＣＥＡエピトープを含む）は、正常な／非修飾ＣＥＡ（正常エピトープを含む）が免疫原として用いられた場合に観察される免疫反応と比べて、改善された免疫反応を誘導する（従って、ＣＥＡ「アゴニスト」と思われる）。
【００２５】
本発明に含まれるＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質は、アミノ酸配列ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ（「ＣＡＰ１６Ｄ」と称される）を含む修飾エピトープを含む。非修飾ＣＥＡにおける天然エピトープの対応配列は、ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（「ＣＡＰ−１」と称される；Ｚａｒｅｍｂａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：４５７０）である。本発明の特定実施形態において、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質は、配列番号１（図１）のアミノ酸配列を有する。本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質は、ポリペプチド／タンパク質の前駆体および／成熟形態の両方を含むと理解されている（例えば、Ｏｉｋａｗａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １４２：５１ １−５１８）。
【００２６】
本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質は、当業者に公知である様々な方法を用いて調製される。従って、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、そのようなポリペプチドを提供することができる。公知のやり方で、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を、適当な発現ベクター（すなわち組換え発現ベクター）中に組み込ませることができる。可能性のある発現ベクターとして（限定はされないが）、そのベクターが用いられる宿主細胞に適合する限り、コスミド、プラスミド、または修飾ウイルス（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）が含まれる。「ベクターが宿主細胞に適合する」という表現は、その発現ベクターが、本発明の核酸分子（下記に説明）および発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された付随調節配列を包含し、前記調節配列が核酸分子に作動可能に結合していることを意図するように定義される。「作動可能に結合」は、核酸の発現をもたらすような態様で核酸が調節配列に結合していることを意味することが意図されている。適切な調節配列は、細菌、真菌、またはウイルス遺伝子等を含む様々な供給源に由来するものであって差し支えない（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）に記載の調節配列を参照）。適切な調節配列の選択は選択された宿主細胞に依存し、当業者によって容易になし得ることである。そのような調節配列の例として以下のものが含まれる：転写プロモーターおよびエンハンサー、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列、またはリボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）。選択された宿主細胞および用いられる発現ベクターに基づいて、他の付加的配列（例えば複製起点、付加的ＤＮＡ制限酵素部位、エンハンサー、および転写誘導性をもたらす配列）を発現ベクター中に組み込んで差し支えない。
【００２７】
前述した本発明の発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞の選択を容易にする選択性マーカー遺伝子も包含していて差し支えない。選択性マーカー遺伝子の例は、例えばＧ４１８およびハイグロマイシン（特定薬剤に対する耐性をもたらす）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼのようなタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２８】
例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼのような選択性マーカータンパク質の濃度の変化によって、選択性マーカー遺伝子の転写をモニタリングする。選択性マーカー遺伝子が抗生物質耐性をもたらすタンパク質（例えばネオマイシン耐性におけるＧ４１８）をコードする場合、適切な選択分子を用いて形質転換細胞を選択することができる。当業者に公知であるように、選択性マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存するが、そのような何れの選択性マーカーも組み込まれていない細胞は死ぬであろう。このことは、本発明の組換え発現ベクターからの発現を可視化および測定することを可能にする。関心核酸とは別個のベクターに選択性マーカーを導入できることも理解されるであろう。
【００２９】
組換え発現ベクターは、本発明のポリペプチドの高められた発現を提供し；本発明のポリペプチドの高められた溶解性を提供し；および／またはアフィニティー精製においてリガンドとして働くことによって標的組換えタンパク質の精製を助けるような、融合部分をコードする遺伝子も包含していて差し支えない。例えば、タンパク質分解切断部位を標的組換えポリペプチドに付加して、融合タンパク質の精製に続く融合部分からの組換えポリペプチドの分離を可能にすることができる。
【００３０】
固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ａｓｓｏｃ． ６５： ２１４９）または均質溶液中での合成（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｅ． Ｗａｎｓｃｈ（Ｅｄ．） Ｖｏｌ． １５， ｐｔｓ． Ｉ， ＩＩ， Ｔｈｉｅｍｅ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９８７））のような、タンパク質化学において周知の技術を用いて、化学合成によって本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質を調製することができる。
【００３１】
本発明の付加的な実施形態は、前記のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸を含む。この中に記載のように、「核酸」は（限定はされないが）、ウイルス核酸、プラスミド、細菌ＤＮＡ、裸の／フリーＤＮＡおよびＲＮＡを含む。核酸は、一本鎖および二本鎖形態の両方を含む。従って、それら核酸は、前記のポリペプチドをコードする関連塩基配列を含む。定義の目的で、「前記のポリペプチドをコードする関連塩基配列」は、相補核酸配列をさらに含む。
【００３２】
本発明の１つの実施形態において、核酸は配列番号２（図１）によって示される配列を有する。本発明の別の実施形態では、核酸はその配列（すなわち配列番号２（図１）の配列）を含む。本発明の付加的な実施形態は、前駆体または成熟ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸配列から成るおよび／またはそれらを含む。
【００３３】
本発明の実施形態において有用である細菌ＤＮＡは当業者に公知である。それら細菌として、例えば、シゲラ属、サルモネラ属、コレラ菌、乳酸桿菌、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、および連鎖球菌属が上げられる。本発明の細菌ＤＮＡの実施形態において、本発明の核酸を、細菌ゲノム中に挿入しても、フリー状態に維持しても、またはプラスミド上に含んでいても差し支えない。
【００３４】
本発明のウイルス核酸の実施形態は、ポックスウイルス、あるいは例えばアデノウイルスまたはアルファウイルスのような他のウイルスに由来するものであって差し支えない。好ましくは、ウイルス核酸は、レシピエント動物細胞中に一体化する能力が無いものである。前記核酸の発現のための要素として、レシピエント動物細胞中での発現に適したプロモーターを含んでいて差し支えない。
【００３５】
本発明の実施形態は、アビポックスウイルス、オルソポックスウイルス、およびスイポックスウイルスの核酸より成る群から選択されるポックスウイルス核酸を含む。特定実施形態は、ワクシニアウイルス核酸、鶏痘ウイルス核酸、カナリア痘ウイルス核酸、および豚痘ウイルス核酸より成る群から選択されるポックスウイルス核酸を含み；特定実施例は、ＴＲＯＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＭＶＡ、Ｗｙｅｔｈ、およびＰｏｘｖａｃ−ＴＣを含む（より詳細に以下に説明する）。
【００３６】
本発明の核酸は、サイトカイン、リンホカイン、および補助的刺激分子より成る群から選択される少なくとも１つの物質をコードする核酸配列をさらに含んでいて差し支えない。例として（限定はされないが）、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン６、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、およびＣｄ７２が含まれる。
【００３７】
当業者に周知である核酸を調製および精製するための分子生物学の標準技術を本発明の態様の調製に用いることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ， Ｎ．Ｙ．， Ｕ．Ｓ．Ａ （１９９８）， Ｃｈｐｔｓ． １， ２ ａｎｄ ４； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９８９）， Ｃｈｐｔｓ． １，２，３ ａｎｄ ７を参照）。
【００３８】
本発明の態様は、前記の核酸を包含するベクターをさらに含む。特定実施形態において、前記のベクターは組換えウイルスまたは細菌であって差し支えない。
【００３９】
それらの構築のためのアデノウイルスベクターおよび方法が記載されている（例えば、米国特許第５９９４１３２号、第５９３２２１０号、および第６０５７１５８号明細書、ならびに国際公開第９８／１７７８３号、第９７／４４４７５号、第９９／６１０３４号、第９９／５０２９２号、第９９／２７１０１号、第９７／２０５７５号、第９６／４０９５５号、および第９６／３９５３４号パンフレット（参照によってそれらの全てがこの中に組み込まれる）を参照）。アルファウイルスベクターも当業界で公知であり、本発明の実施形態において用いることができる（例えば、米国特許第５７９２４６２号、第５７３９０２６号、第５８４３７２３号、および第５７８９２４５号明細書、ならびに国際公開第９２／１０５７８号、第９５／２７０４４号、第９５／３１５６５号、および第９８／１５６３６号パンフレット（参照によってそれらの全てがこの中に組み込まれる）を参照）。また、レンチウイルスも記載されている（例えば米国特許第６０１３５１６号および第５９９４１３６号明細書、ならびに国際公開第９６／１７８１６号、第９７／１２６２２号、第９８／１７８１５号、第９８／３９４６３号、第９８／４６０８３号、第９９／１５６４１号、第９９／１９５０１号、第９９／３０７４２号、第９９／３１２５１号、第９８／５１８１０号、および第００／００６００号パンフレット（参照によってそれらの全てがこの中に組み込まれる）を参照）。用いることができるポックスウイルスベクターとして、例えば、アビポックスウイルス、オルソポックスウイルス、またはスイポックスウイルスが挙げられる（米国特許第５３６４７７３号、第４６０３１１２号、第５７６２９３８号、第５３７８４５７号、第５４９４８０７号、第５５０５９４１号、第５７５６１０３号、第５８３３９７５号、および第５９９００９１号明細書（参照によってそれらの全てがこの中に組み込まれる）を参照）。例えば、哺乳類細胞における発現に適した条件下でＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸をウイルスゲノム中に挿入する等（以下に記載）、当業者に公知である相同的組換えによって、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸を包含するポックスウイルスベクターを得ることができる。
【００４０】
本発明の１つの実施形態において、ポックスウイルスベクターはＡＬＶＡＣ（１）またはＡＬＶＡＣ（２）（それらの両方がカナリア痘ウイルスに由来する）である。ＡＬＶＡＣ（１）（またはＡＬＶＡＣ（２））は、鳥類以外の宿主において生産的に複製せず、その安全プロフィールが改善されていると考えられる特性を有する。ＡＬＶＡＣ（１）は、認可されたカナリア痘ワクチンであるカナポックス（Ｋａｎａｐｏｘ）のプラーククローン派生体である、弱毒化カナリア痘ウイルスベースのベクターである（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８： ２１７； 米国特許第５５０５９４１号、第５７５６１０３号、および第５８３３９７５号明細書（参照によってそれらの全てがこの中に組み込まれる））。ＡＬＶＡＣ（１）は、カナポックスのいくつかの一般特性と同じ一般特性を有する。外来抗原を発現するＡＬＶＡＣベースの組換えウイルスもワクチンベクターとして有効であることが示されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ （ｖｏｌ．３） Ｋｏｆｆ Ｗ．， Ｗｏｎｇ−Ｓｔａｏｌ Ｆ． ａｎｄ Ｋｅｎｅｄｙ Ｒ．Ｃ． （ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ ＮＹ， ｐｐ．３６１−３７８ （１９９３ａ）； Ｔａｒｔａｇｌｉａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９３ｂ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７： ２３７０）。例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣ（１）組換え体で免疫したマウスは、狂犬病ウイルスの致死的な攻撃接種に対して防御され（Ｔａｒｔａｇｌｉａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９９２） ｓｕｐｒａ）、ワクチンベクターとしてのＡＬＶＡＣ（１）の可能性を示している。ＡＬＶＡＣベースの組換え体は、イヌジステンパーウイルス（Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８７： ３２１）、および狂犬病ウイルス（Ｐｅｒｋｕｓ， Ｍ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９４））を攻撃接種されたイヌにおいて、ならびにネコの白血病ウイルスを攻撃接種されたネコにおいて（Ｔａｒｔａｇｌｉａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９９３ｂ） ｓｕｐｒａ）、さらに、ウマのインフルエンザウイルスを攻撃接種されたウマにおいて（Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ｐｐ． ３３１−３３５ （１９９３））、有用であることも証明されている。
【００４１】
ＡＬＶＡＣ（２）は、第二世代のＡＬＶＡＣベクターである、ワクシニア転写要素Ｅ３ＬおよびＫ３ＬがＣ６遺伝子座に挿入されている（米国特許第５９９００９１号明細書、参照によってこの中に組み込まれている）。Ｅ３Ｌは、ｄｓＲＮＡに特異的に結合できるタンパク質をコードする。Ｋ３Ｌ ＯＲＦは、Ｅ１ Ｆ−２にかなりの相同性を有する。ＡＬＶＡＣ（２）内において、Ｅ３Ｌ遺伝子は天然プロモーターの転写制御下にあるのに対して、Ｋ３Ｌは初期／後期ワクチンＨ６プロモーターの制御下に置かれている。Ｅ３ＬおよびＫ３Ｌ遺伝子は、ＡＬＶＡＣ（２）を感染させた細胞においてＰＫＲ活性を阻害する働きを有し、外来遺伝子発現のレベルおよび継続性の増強をもたらす。
【００４２】
別のウイルスベクター系は、天然の宿主制限ポックスウイルスの使用に関連する。鶏豆ウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のアビポックスウイルス属の原型的ウイルスである。アビポックスウイルスの複製は鳥類に限定され（Ｍａｔｔｈｅｗｓ， Ｒ．Ｅ．Ｆ． （１９８２） Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ， １７： ４２−４４）、アビポックスウイルスが、ヒトを含む鳥類以外において増殖的感染を生じることの文献での報告は無い。その宿主制限は、ウイルスの他の種への伝染に対する固有の安全バリアを提供し、家畜およびヒトでの応用におけるアビポックスウイルスベースのベクターの使用を魅力的なものにする。
【００４３】
ＦＰＶは、家禽の病原体由来の免疫原を発現するベクターとして好都合に利用されている。毒性の鳥類インフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換え体において発現された。その組換え体をニワトリおよび七面鳥に接種した後、同種または異種の毒性インフルエンザウイルスの攻撃接種に対する防御免疫反応が誘導された（Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ． ｅｔ （１９６８）  Ｖａｃｃｉｎｅ ６： ５０４）。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質を発現するＰＦＶ組換え体も開発された（Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４： １４４１−１４５０； Ｅｄｂａｕｅｒ， Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９： ９０１； 米国特許第５７６６５９９号明細書（参照によってこの中に組み込まれる））。
【００４４】
ＭＶＡと称される、非常に弱毒化されたワクシニア株も、ポックスウイルスベースワクチンのためのベクターとして用いられている。ＭＶＡの使用は、米国特許第５，１８５，１４６号明細書に記載されている。
【００４５】
他の弱毒化ポックスウイルスベクターは、ウイルスの野生型株の遺伝子組換えによって調製された。例えば、ＮＹＶＡＣベクターは、ワクシニアのコペンハーゲン株から、特定のビルレンス遺伝子および宿主域遺伝子を欠失させることによって誘導され（Ｔａｒｔａｇｌｉａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９２）， ｓｕｐｒａ； 米国特許第５３６４７７３号および第５４９４８０７号明細書（参照によってこの中に組み込まれている））、発現された外来抗原に対する防御的免疫反応を誘導するのに組換えベクターとして有用であることが分かっている。
【００４６】
組換えウイルスは、当業界で公知である方法によって構築することができる（例えば、ワクシニアウイルスおよびアビポックスウイルスについて、米国特許第４７６９３３０号；第４７２２８４８号；第４６０３１１２号；第５１１０５８７号；および第５１７４９９３号明細書−それら全てが参照によってこの中に組み込まれている−に記載されている）。
【００４７】
本発明の別の実施形態において、生きたおよび／または弱毒化された細菌もベクターとして用いることができる。例えば、ビブリオ・コレラ変異体株は本発明の実施形態における細菌ベクターとして有用であろう；米国特許第４，８８２，２７８号明細書（機能的コレラ毒素が産生されないように、２つのｃｔｘＡ対立遺伝子のそれぞれのコード配列の相当量が欠失されている菌株を開示する）、国際公開第９２／１１１３５４号パンフレット（突然変異によってｉｒｇＡ遺伝子座が不活化されている菌株；単一菌株において、その突然変異をｃｔｘＡ突然変異と組み合わせて差し支えない）、および国際公開第９４／１５３３号パンフレット（機能的ｃｔｘＡおよびａｔｔＲＳ１ ＤＮＡ配列を欠いている欠失変異体）に記載されている。国際公開第９４／１９４８２号パンフレットに記載されているように、異種抗原を発現するようにそれら菌株を遺伝子操作することができる（前記の全ての特許／特許出願が参照によってこの中に組み込まれている）。異種抗原の組換え発現のために遺伝子操作された弱毒化サルモネラ・タイフィムリウム（ネズミチフス菌）株、および経口免疫原としてのその使用について、国際公開第９２／１１３６１号パンフレットに記載されている。
【００４８】
本発明の実施形態において細菌ベクターとして有用な他の細菌株として（限定はされないが）、シゲラ・フレキシネリー、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、およびカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）が挙げられる（国際公開第８８／６６２６号、第９０／０５９４号、第９１／１３１５７号、第９２／１７９６号、および第９２／２１３７６号パンフレットに記載されており、それらの全てが参照によってこの中に組み込まれている）。本発明の細菌ベクターの実施形態において、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸は、細菌ゲノム中に挿入されていても、フリー状態のままであっても、あるいはプラスミド上に含まれていても差し支えない。
【００４９】
本発明は、サイトカイン、リンホカイン、および補助的刺激分子より成る群から選択される少なくとも１つの物質をコードする核酸を包含するベクターを含むことをさらに考えている。前記核酸は、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする配列と隣接していても、あるいは別個の核酸上にコードされていても差し支えない。
【００５０】
ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする前記核酸を包含する細胞も本発明の別の実施形態に含まれる。それら細胞は、前記の核酸を導入および／またはトランスフェクトすることができる任意の可能性のある細胞を含む（例えば、細菌、ＣＯＳ細胞、ベロ細胞、鶏胚繊維芽細胞、腫瘍細胞、および抗原提示細胞）。細胞中に導入および／またはトランスフェクトする方法の選択は、核酸の固有の性質（すなわちフリーＤＮＡ、プラスミド、組換えウイルス中に組み込まれたもの）に依存し、当業者に公知であろう（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．， Ｕ．Ｓ．Ａ （１９９８）， Ｃｈｐｔ．９； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ）， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８９）， Ｃｈｐｔ’ｓ． １，２，３ ａｎｄ １６に教示されている）。
【００５１】
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質は、免疫系のＴ−リンパ球（すなわちＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔリンパ球）を集めるのに中心的免疫機能を果たす。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ヒトの体全体に亘り、ほぼ全ての有核細胞型において発現されている；ＭＨＣクラスＩＩ分子は、主に抗原提示細胞（ＡＰＣ；すなわち、単核食細胞、ランゲルハンス−樹状細胞、およびＢリンパ球）において発現されている。それら別個のクラスの細胞表面分子（すなわちクラスＩおよびクラスＩＩ）が、ペプチド／エピトープ（タンパク質抗原の細胞内プロセッシングから生じる）をＴリンパ球（それぞれＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔリンパ球）に提示し、それによって細胞性および液性免疫反応の両方を開始させる。通常、アロ抗原、腫瘍抗原、またはウイルス由来のエピトープ／ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示されるであろう；細胞外抗原／タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して提示されるであろう。しかしながら、ある状況では、内因性抗原もＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して提示され得る（そのような一般的な免疫学的原理は、例えば、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｐｅｔｅｒ Ｊ． Ｄｅｌｖｅｓ （Ｅｄ．−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ｐｐ．１７４−８， １９１−８， １１０８−１３， １６９０−７０９（１９９８）に記載されている）。
【００５２】
従って、本発明の実施形態は、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸を導入／トランスフェクトされ、そのポリペプチド／タンパク質を発現する細胞を考えている。
【００５３】
さらにこの中で考えられているように、本発明の実施形態は、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸を導入／トランスフェクトされた細胞であって、ＭＨＣ ＨＬＡ分子（すなわち、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ）も発現する細胞を考えている。別の実施形態において、それら細胞は、おそらく単核食細胞、ランゲルハンス樹状細胞（「樹状細胞」）、およびＢリンパ球より成る群から選択されるような、抗原提示細胞である。
【００５４】
本発明の態様は、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸、前記核酸を包含するベクターまたは前記核酸を包含する細胞、ならびに、サイトカイン、リンホカイン、補助的刺激分子、およびそれらをコードする核酸より成る群から選択される少なくとも１つの物質の混合物を考えている。本発明の付加的実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与するのに適した生物学的適合形態で被験者に投与するための、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸、ベクター細胞または混合物を含む薬剤組成物をさらに含む。「ｉｎ ｖｉｖｏで投与するのに適した生物学的適合形態」は、治療効果が任意の毒性効果を上回るような、投与されるべき物質の形態を意味する。治療的活性量の本発明の薬剤組成物の投与、すなわち「効果量」は、ヒトにおいて免疫反応を誘導する所望の結果を達成するのに必要な用量および期間で効果的である量として定義される。物質の治療的効果量は、例えばレシピエントの疾患状態／健康、年齢、性別、および体重、ならびに特定ポリペプチド、それをコードする核酸、または組換えウイルスの所望の反応を誘導する能力等の因子によって変化する。最適な治療反応をもたらすように投薬計画を調整する。例えば、数回に分けた用量を毎日または定期に投与しても、および／または治療状況の緊急性に基づいて、比例的に用量を減らしても差し支えない。
【００５５】
効果量の活性物質（すなわちＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸）を薬剤的に許容される媒体との混合物中に混ぜ合わせるように、被験者に投与することができる薬剤組成物の調製方法（それ自体公知である）によってこの中に記載の組成物を調製することができる。適切な媒体は、例えば、”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ”（Ｍｉｃｈａｅｌ ａｎｄ Ｉｒｅｎｅ Ａｓｈ， Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ａｌｄｅｒｓｈｏｔ， Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９５））に記載されている。これに基づき、排他的ではないが、本組成物は、１つ以上の薬剤的に許容される媒体または希釈剤と物質の溶液を含み、適当なｐＨの緩衝液中に含まれおよび／または生体液と等張であって差し支えない。これに関して、米国特許第５，８４３，４５６号明細書を参照することができる。それら組成物は、アジュバントをさらに含んでいて差し支えない（以下に記載）。
【００５６】
ＣＥＡタンパク質またはその断片；および／または
本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質；および／または
ＣＥＡエピトープ；および／または
修飾ＣＥＡエピトープ；および／または
ＣＥＡタンパク質またはその断片、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、ＣＥＡエピトープ、修飾ＣＥＡエピトープを発現する細胞；および／または
ＣＥＡタンパク質またはその断片、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、ＣＥＡエピトープ、修飾ＣＥＡエピトープを結合する細胞；に対する免疫反応を動物において誘導する方法であって、ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質またはその断片、それをコードする核酸、前記核酸を包含するベクターまたは細胞、それらの混合物または前記のものの組成物（以下、「免疫物質」と総称する）を前記動物に投与することを含んで成る方法も本発明の範囲内に含まれる。先に述べたように、「免疫反応」は、例えば、細胞性免疫（すなわち細胞傷害性Ｔ−リンパ球介在）または液性免疫（すなわち、抗体介在）の何れかの免疫系の任意の反応として定義される。多くの当業者に周知のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法によって、それら免疫反応を評価することができる（例えば（限定はされないが）、抗原特異的細胞傷害性試験、細胞毒素の産生、ＣＥＡ／ＣＥＡ−エピトープを発現する腫瘍の緩解、ＣＥＡ／ＣＥＡ−エピトープを発現する癌細胞の阻害等）。
【００５７】
本発明の別の実施形態は、効果量の本発明の免疫原を患者に投与することを含んで成る、患者においてＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する方法を提供する。ＣＥＡ（またはそのエピトープ）を発現する固形癌を有する患者として（限定はされないが）、結腸癌、肺癌、膵癌、子宮内膜癌、乳癌、甲状腺癌、メラノーマ、口腔癌、咽頭癌、精上皮腫、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮癌、および前立腺癌に罹っている患者が挙げられる。従って、免疫反応を誘導しおよび／またはＣＥＡエピトープ発現癌細胞を阻害する前記の方法を含む、癌を有する患者を治療する方法自体も本発明の態様／実施形態に含まれる。
【００５８】
当業者に公知であるように、任意の従来の経路を介して本発明の免疫原によって動物を免疫することができる。例えば、粘膜（例えば眼、鼻腔内、口腔、胃、肺、腸、直腸、膣、尿路）表面を介する、あるいは非経口経路（例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内）を介する免疫が挙げられる。好ましい経路は、免疫原（すなわちポリペプチド／核酸、組換え体／ウイルス、組成物等）の選択に依存する。単回投与で、あるいは間隔をあけて繰り返し投与することによって、投与を行うことができる。適切な用量は、例えば免疫原自体（すなわち、ポリペプチド／核酸（およびさらにそれらの特定タイプ）、投与経路、およびワクチン接種される動物の状態（体重、年齢等）のような、当業者に理解される様々なパラメーターに依存する。
【００５９】
従って、本発明の組成物は、効果量の本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質、それをコードする核酸、前記核酸を包含するベクターまたは細胞または組換えウイルス、それらの混合物、前記のものの薬剤組成物を投与することを含んでなる、動物において免疫反応を誘導する方法を提供する。
【００６０】
先に述べたように、免疫反応を誘導する目的で、核酸（詳細には、本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードするプラスミドおよび／またはフリーの／裸のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を動物に投与して差し支えない（例えば、米国特許第５５８９４６６号、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ａｓｋａｒｉ， ＮＥＪＭ ３３４： ４２−４５ （１９９６）； Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ ａｎｄ Ｅｒｔｌ， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５５： ７５１−７７０ （１９９９））。通常、その核酸は標的動物細胞において複製できず、かつその動物ゲノム中に組み込まれない形態である。ＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードするＤＮＡ／ＲＮＡ分子は、通常、動物細胞における発現に適したプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターは、偏在的に機能してもまたは組織特異的に機能しても差し支えない。組織非特異的プロモーターの例として、初期サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４，１６８，０６２号明細書に記載されている）、およびラウス肉腫ウィルスプロモーターが挙げられる。デスミンプロモーターは組織特異的であり、筋肉細胞において発現をもたらす。より広く有用なベクターが記載されている（すなわち国際公開第９４／２１７９７号パンフレット）。
【００６１】
本発明のＣＥＡアゴニストポリペプチド／タンパク質をコードする核酸の投与に関して、その核酸は前記ポリペプチド／タンパク質の前駆体または成熟形態をコードしていて差し支えない。核酸が前駆体をコードする場合、その前駆体は同種（例えば、Ｏｉｋａｗａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｓｕｐｒａ）であっても異種であっても差し支えない。後者（異種）の場合、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のリーダー配列のような、真核生物のリーダー配列を用いることができる。
【００６２】
免疫原として使用するため、当業者に公知である様々な方法に基づいて本発明の核酸を製剤化することができる。第一に、任意の輸送媒体（例えば陰イオンリポソーム、陽イオン脂質、微粒子（例えば金微粒子）、沈殿剤（例えばリン酸カルシウム）、あるいは任意の他のトランスフェクション−促進物質）無しで、裸の／フリーの形態の核酸を用いて差し支えない。その場合、担体の有無に関係無く、生理学的に許容される溶液（例えば滅菌生理食塩水または滅菌緩衝生理食塩水）で単に核酸を希釈するのみでよい。担体が存在する場合、担体は、好ましくは、等張、低張、または僅かに高張であり、比較的低いイオン強度を有する（例えば、２０％スクロース含有溶液のような、スクロース溶液によってもたらされる）。
【００６３】
あるいは、細胞取込みを助ける物質と核酸とを組み合わせて差し支えない。例えば以下の方法が挙げられる：（ｉ）細胞透過性を変化させる化学物質（例えばブピバカイン；例えば国際公開第９４／１６７３７号パンフレットを参照）を補足し、（ｉｉ）リポソーム中に封入し、あるいは（ｉｉｉ）陽イオン脂質、あるいはシリカ、金またはタングステン微粒子と結合させる。
【００６４】
陽イオン脂質は当業界で周知であり、一般的に遺伝子輸送に用いられる。そのような脂質として、リポフェクチン（ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイロキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシル−臭化アンモニウム）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）、および例えばＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）のようなコレステロール誘導体が挙げられる。それら陽イオン脂質の記載は、欧州特許第１８７，７０２号明細書、国際公開第９０／１１０９２号パンフレット、米国特許第５，２８３，１８５号明細書、国際公開第９１／１５５０１号および第９５／２６３５６号パンフレット、ならびに米国特許第５，５２７，９２８号明細書において見ることができる。遺伝子輸送のための陽イオン脂質は、好ましくは、例えばＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）のような中性脂質と組み合わせて用いられる（例えば、国際公開第９０／１１０９２号パンフレット）。
【００６５】
陽イオンリポソーム含有製剤に、他のトランスフェクション−促進化合物を加えて差し支えない。それらの多くが、例えば国際公開第９３／１８７５９号、第９３／１９７６８号、第９４／２５６０８号、および第９５／２３９７号パンフレットに記載されている。例えば、核膜を介したＤＮＡの輸送を促進させるのに有用なスペルミン誘導体（例えば国際公開第９３／１８７５９号パンフレットを参照）および例えばＧＡＬＡ、グラミシジンＳ、および陽イオン性胆汁酸塩のような膜−透過化合物（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）（例えば国際公開第９３／１９７６８号パンフレットを参照）が挙げられる。
【００６６】
金またはタングステン微粒子も遺伝子輸送に用いることができる（国際公開第９１／３５９号および第９３／１７７０６号パンフレットに記載）。その場合、例えば米国特許第４，９４５，０５０号および第５，０１５，５８０号明細書、ならびに国際公開第９４／２４２６３号パンフレットに記載のような、針無しの注射装置（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）（「遺伝子銃」）を用いて皮内または表皮内経路で、微粒子被覆ポリヌクレオチドを注射することができる。
【００６７】
陰イオンおよび中性リポソームも当業界で周知であり（例えば、リポソームを作成する方法の詳述に関してＬｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＲＰＣ Ｎｅｗ Ｅｄ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９０）を参照）、ポリヌクレオチドを含む広範囲の産物を輸送するのに有用である。
【００６８】
前記の方法（すなわち、免疫反応を誘導しおよび／または患者においてＣＥＡエピトープを発現する癌細胞を阻害する方法）の特定実施形態は、本発明の免疫原を投与するためのプライム−ブーストプロトコルを含む。より詳細には、そのプロトコルは（限定はされないが）、特定の／別個の形態の免疫原（すなわち、免疫原をコードする核酸（例えばプラスミド、細菌／ウイルス／フリーまたは裸の）、あるいは前記核酸を包含するベクター（すなわち組換えウイルス、細菌））を用いた「プライミング」工程、それに続く、代わりの（すなわち、「プライミング」に用いられたものとは異なる）形態の免疫原（すなわち、タンパク質またはその断片（例えばエピトープペプチド）、免疫原（またはその断片）をコードする核酸、または前記核酸を包含するベクター）の投与を含む少なくとも１回の「ブースト（追加免疫）」工程を含む。「プライム−ブースト」方法論は当業者に公知である（例えば、国際公開第００／００２１６号、第９８／５８９５６号、第９８／５６９１９号、および第９７／３９７７１号パンフレットに教示されている）。前記プロトコルの１つの利点は、免疫原またはその断片をコードする核酸を挿入されたウイルスベクター自体に対する中和免疫反応が誘導されるという問題を回避できることである（例えば、Ｒ．Ｍ． Ｃｏｎｔｙ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６：３４−４１）。
【００６９】
当業者に周知であるように、投与形態（すなわち組換えウイルス、核酸、ポリペプチド）に関わらず、アジュバントと共に共免疫した場合、免疫原の免疫反応を誘導する能力が改善される。アジュバントは、”Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ， ｅｄｓ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ｐｐ．６１−７９ ａｎｄ １４１−２２８（１９９５）に記載されている。アジュバントは通常、免疫原の免疫原性を高めるが、それ自体が必ずしも免疫原性である必要はない。アジュバントは、投与部位近くに局所的に免疫原を保持して、免疫系の細胞に対する抗原の緩慢な徐放を容易にする貯留効果をもたらすように作用する。また、アジュバントは、免疫系細胞を免疫原の貯留部位に引き付けて、それら細胞を刺激して免疫反応を誘導する。従って、本発明の実施形態はアジュバントをさらに含む組成物を提供する。
【００７０】
理想的なアジュバントの望ましい特性として、以下の特性が挙げられる：
１）毒性が無いこと；
２）長期間、免疫反応を刺激できること；
３）製造が容易であり、かつ長期間の保存において安定であること；
４）必要であれば、様々な経路によって投与された抗原に対して細胞性免疫反応および液性免疫反応の両方を誘導できること；
５）他のアジュバントとの相乗効果を有すること；
６）抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団と選択的に相互作用できること；
７）適切なＴＨ１またはＴＨ２細胞特異的免疫反応を特異的に誘導できること；
８）抗原／免疫原に対して、適切な抗体アイソタイプ（例えばＩｇＡ）のレベルを選択的に上昇させることができること。
【００７１】
しかしながら、多くのアジュバントは毒性であり、ヒトおよび多くの動物におけるそれらの使用を不適当なものとするような望ましくない副作用を生じる。例えば、いくつかのアジュバントは肉芽腫、急性および慢性の炎症（フロイント完全アジュバント、ＦＣＡ）、細胞融解（サポニンおよびプルロニック重合体）、発熱、関節炎、および前部ブドウ膜炎（ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ））を誘発する。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（総称してミョウバンと称される）のみが、ヒトおよび家畜のワクチンにおけるアジュバントとして日常的に用いられている。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに対する抗体反応を高めるミョウバンの効果はかなり確立されている。それにも関わらず、ミョウバンは限界を有する。例えば、ミョウバンはインフルエンザワクチンに対して効果がなく、さらに他の免疫原での細胞性免疫反応を一貫性無く誘導する。ミョウバン補助抗原によって誘導される抗体は、マウスにおいて主にＩｇＧ１アイソタイプであり、それはワクチン物質による防御に最適ではない。
【００７２】
アジュバントは、「本質的（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）」または「非本質的（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ）」なものとして特徴付けられる。本質的アジュバント（例えばリポ多糖類）は、それ自体がワクチンとして用いられる物質（すなわち、死菌または弱毒化細菌）の全体および正常成分である。非本質的アジュバントは、通常、抗原に対して非共有結合し、さらに宿主免疫反応を増強するように製剤化された免疫調整剤である。
【００７３】
本発明の実施形態において、アジュバントは、サイトカイン、リンホカイン、および補助的刺激分子より成る群から選択される１つ以上の物質であって差し支えない。例として（限定はされないが）、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン６、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、ＧＭ−ＣＳＦ、８７．１、８７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２が挙げられる。特定実施例は、アジュバントとしてＧＭ−ＣＳＦを特に含む（例えば、米国特許第５６７９３５６号、第５９０４９２０号、第５６３７４８３号、第５７５９５３５号、および第５２５４５３４号明細書、欧州特許出願第２１１６８４号明細書、ならびに国際公開第９７／２８８１６号パンフレット（その全てが参照によってこの中に組み込まれる）に教示されている）。
【００７４】
アジュバントとしてのサポニン自体の使用も周知である（Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ， Ｍ． ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， Ｈ（１９９６） Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：３６３）。例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（南アメリカの木、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来する）、およびその画分について広く記載されている（すなわち、米国特許第５０５７５４０号明細書；Ｋｅｎｓｉｌ， Ｃ．Ｒ． （１９９６） Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １２：１； 欧州特許第３６２２７９号明細書）。溶血性サポニンＱ５２１およびＱＳＩ７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分）が強力な全身アジュバントとして記載されている（米国特許第５０５７５４０号明細書；欧州特許第３６２２７９号明細書）。全身ワクチンのための強力なアジュバントとして働くＱＳ７（Ｑｕｉｌ Ａの非溶血性画分）の使用もそれら引例中に記載されている。ＱＳ２１の使用もさらに記載されている（Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １４６：４３１）。Ｑ５２１とポリソルベートまたはシクロデキストリンとの組合せも公知である（国際公開第９９／１０００８号パンフレット）。Ｑｕｉｌ Ａの画分（例えばＱＳ３ＩおよびＱＳ７）を含む特定アジュバント系が国際公開第９６／３３７３９号および第９６／１１７１１号パンフレットに記載されている。
【００７５】
別の好ましいアジュバント／免疫賦活剤は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（「ＣｐＧ」）を含む免疫賦活オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。ＣｐＧは、全身経路および粘膜経路の両方によって投与される際のアジュバントとして当業界で公知である（国際公開第９６０２５５５号パンフレット；欧州特許第４６８５２０号明細書；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： ８７； ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（１９９８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１： ４４６３）。多くの研究において、ＢＣＧ遺伝子配列から派生した合成オリゴヌクレオチドも免疫賦活効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方； Ｋｒｉｅｇ， （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６）を誘導できることが示されている。免疫賦活オリゴヌクレオチド配列の詳細な解析は、ＣＧモチーフが特定配列中になければならず、そのような配列は細菌ＤＮＡにおいて共通であるが、脊椎動物ＤＮＡでは稀であることを示した（例えば、免疫賦活配列はしばしば：プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジンであり、ＣＧモチーフはメチル化されていない；しかしながら他の非メチル化ＣｐＧ配列も免疫賦活性であることが分かっており、それ自体も本発明において用いることができる）。当業者に明らかであるように、前記ＣＧモチーフ／配列を本発明の核酸自体に組み込ませて差し支えなく、または別個の核酸上に存在していても差し支えない。
【００７６】
様々な他のアジュバントも教示されており、それらも本発明の実施形態に含まれる。Ｌｏｃｋｈｏｆｆらに特許付与された米国特許第４，８５５，２８３号（参照によってこの中に組み込まれる）は、それぞれアミノ酸によって糖残基が置換されている、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素、およびＮ−グリコシルカルバメート等の糖脂質アナログを、免疫調節剤またはアジュバントとして教示している。さらには、Ｌｏｃｋｈｏｆｆらは、例えばリン糖脂質およびグリセロ糖脂質のような天然の糖脂質に構造類似性を有するＮ−結合糖脂質アナログが、単純ヘルペスウイルスワクチンおよび仮性狂犬病ウイルスワクチンの両方において強い免疫反応を誘導し得ることを報告した（Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３０： １６１１−１６２０ （１９９１））。
【００７７】
Ｍｏｌｏｎｅｙに特許付与された米国特許第４，２５８，０２９号（参照によってこの中に組み込まれる）は、オクタデシルチロシン塩酸（ＯＴＨ）が、破傷風トキソイド、およびホルマリン不活性化Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型ポリオウイルスワクチンと複合体を形成した場合に、アジュバントとして機能することを教示している。Ｎｉｘｏｎ−Ｇｅｏｒｇｅらは、組換えＢ型肝炎表面抗原と複合体を形成した芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ型肝炎ウイルスに対する宿主免疫反応を増強することを報告した（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４： ４７９８ （１９９０））。
【００７８】
アクリル酸またはメタクリル酸の重合体、ならびに無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体から、アジュバント化合物を選択しても差し支えない。アジュバント化合物は、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエステルと、架橋しているアクリル酸またはメタクリル酸の重合体である。それら化合物はカルボマーの用語によって知られている（Ｐｈａｒｍｅｕｒｏｐａ Ｖｏｌ． ８， Ｎｏ．２， Ｊｕｎｅ １９９６）。好ましくは、本発明のアジュバント溶液、特にカルボマーは、好ましくは食塩の存在下、蒸留水中において調製され、得られる溶液は酸性ｐＨである。（所望の最終濃度を得るための）所望の量の、あるいはそのかなりの部分のＮａＣｌを含む水、好ましくは生理食塩水（９ｇ／ｌ ＮａＣｌ）を添加することによって保存溶液を希釈し、好ましくはＮａＯＨで同時にまたは続いて中和を行う。生理的ｐＨのその溶液は、特に凍結乾燥、液体、または凍結形態で保存されるワクチンと混合するために用いられる。
【００７９】
当業者は、３つ以上（好ましくは８つ以下）のヒドロキシル基を有し、少なくとも３つのヒドロキシル基の水素原子が２つ以上の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置換されているポリヒドロキシ化合物と架橋したアクリル重合体について記載している米国特許第２，９０９，４６２号明細書（参照によってこの中に組み込まれている）も参照できる。好ましいラジカルは、２つから４つの炭素原子を有するラジカル（例えばビニル、アリル、および他のエチレン不飽和基）である。不飽和ラジカルは、それ自体、例えばメチル等の他の置換基を含んでいて差し支えない。カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）の名前で販売されている製品（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ， Ｏｈｉｏ， ＵＳＡ）は特に好ましい。その製品は、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋している。それらの中で、カルボポールについて言及している（例えば、９７４Ｐ、９３４Ｐ、および９７１Ｐ）。無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体の中で、共重合ＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ； 無水マレイン酸とエチレンとの共重合体であり、直鎖結合また架橋している（例えばジビニルエーテルと架橋している））が好ましい。それら化学物質に関するさらなる説明のために、Ｊ． Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ，１９６０，１８６：７７８を参照する（参照によってこの中に組み込まれている）。
【００８０】
本発明の別の態様において、免疫物質の非経口投与に有用なアジュバントとして、アルミニウム化合物（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびリン酸水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））が挙げられる；しかしながら、カルシウム、鉄、または亜鉛のような塩であっても差し支えなく、あるいは、アシル化チロシンまたはアシル化糖、陽イオン性または陰イオン性に誘導体化された多糖類、あるいはポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）の不溶性懸濁液であっても差し支えない。当業者に周知の標準的プロトコルに基づいて、抗原をアルミニウム化合物で沈殿させまたはアルミニウム化合物に吸着させて差し支えない。
【００８１】
本発明の実施形態に含まれる他のアジュバントとして、リピドＡ（特に３−デ−ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。３Ｄ−ＭＰＬは、Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ， Ｍｏｎｔａｎａによって製造されている周知のアジュバントである。化学的に、そのアジュバントは、３−デ−ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５、または６アシル化鎖との混合物としてしばしば提供される。そのアジュバントは、英国特許第２１２２２０４８号明細書に教示の方法によって調製できる。３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２ｐｍ未満の粒子径を有する粒子製剤の形態である（欧州特許第６８９４５４号明細書）。
【００８２】
粘膜免疫用のアジュバントとして、細菌毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ、および百日咳毒素（ＰＴ）、あるいはそれらの組合せ、サブユニット、トキソイド、または変異体）が挙げられる。例えば、天然のコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）の精製調製物は有用であろう。それら任意の毒素の断片、相同物、誘導体、および融合物も、アジュバント活性を保持している限り適している。低下した毒性を有する変異体を用いても差し支えない。変異体が記述されている（例えば国際公開第９５／１７２１１号（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ ＣＴ変異体）、第９６／６６２７号（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ ＬＴ変異体）、および第９５／３４３２３号（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ ＰＴ変異体）明細書）。別のＬＴ変異体として、例えばＳｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−１ １０−Ａｓｐ、およびＧｌｕ−１ １２−Ａｓｐ変異体が挙げられる。他のアジュバント（例えば様々な起源（例えば大腸菌、サルモネラ・ミネソタ、サルモネラ・タイフィムリウム、あるいはシゲラ・フレキシネリー）の細菌モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）も免疫物質の粘膜投与において用いることができる。
【００８３】
粘膜免疫および非経口免疫の両方に有用なアジュバントとして、ポリホスファゼン（例えば国際公開第９５／２４１５号パンフレット）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール（例えば米国特許第５，２８３，１８５号明細書および国際公開第９６／１４８３１号パンフレット）、ならびにＱＳ−２１（例えば国際公開第８８／９３３６号パンフレット）が挙げられる。
【００８４】
例えばリポソーム、水中油型エマルジョン、および／またはアルミニウム塩を含む金属塩（例えば水酸化アルミニウム）のような担体と共に、この中に記載されているアジュバント／免疫賦活剤を製剤化して差し支えない。例えば、３Ｄ−ＭＰＬを水酸化アルミニウム（欧州特許第６８９４５４号明細書に記載）、または水中油型エマルジョン（国際公開第９５／１７２１０号パンフレットに記載）と共に製剤化することができ；あるいはＱＳ２１を、コレステロール含有リポソーム（国際公開第９６／３３７３９号パンフレットに記載）、水中油型エマルジョン（国際公開第９５／１７２１０号パンフレットに記載）、またはミョウバン（国際公開第９８／１５２８７号パンフレットに記載）と共に有利に製剤化することができる。ワクチンに製剤化される場合、免疫賦活オリゴヌクレオチド（すなわちＣｐＧ）は通常、フリーの抗原と共に（国際公開第９６／０２５５５号パンフレット；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（１９９８） Ｓｕｐｒａ）、抗原に共有結合して（国際公開第９８／１６２４７号パンフレットに記載）、あるいは例えば水酸化アルミニウムまたはミョウバンのような担体と共に製剤化して（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ Ｓｕｐｒａ； Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ（１９９８） Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９５：１５５５３に記載）、遊離溶液中に含まれて投与される。
【００８５】
アジュバント／免疫賦活剤の配合物も本発明の範囲内に含まれる。例えば、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との配合物（国際公開第９４／００１５３号、第９５／１７２１０号、第９６／３３７３９号、第９８／５６４１４号、第９９／１２５６５号、および第９９／１１２１４号パンフレットに記載）、あるいはさらに詳細には、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの配合物（国際公開第９４／００１５３号に記載）を用いることができる。免疫賦活オリゴヌクレオチドとサポニンとの配合物、またはモノホスホリルリピドＡ（好ましくは３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との配合物も本発明において使用するための強力なアジュバントを形成する。
【００８６】
以下の非限定的実施例は本発明を例示する。
【００８７】
実施例
実施例１：修飾ＣＥＡ遺伝子の作成
天然ＣＥＡタンパク質内のＴ−細胞エピトープはＣＡＰ−１を含む；そのエピトープはアミノ酸配列ＹＬＳＧＡＮＬＮＬを含む（Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８７： ９８２−９９０）。先に述べたように、そのエピトープ（ペプチドの形態）の免疫原性は、ＣＡＰ−１エピトープの６番目のアミノ酸位置をＮ（アスパラギン）からＤ（アスパラギン酸）に代えることによって高められる（Ｚａｒｅｍｂａ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：４５７０−４５７７）。ｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発の標準的技術（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｌｏｔ）を用いて、コドンＡＡＣ（アスパラギンをコードする）のＧＡＣ（アスパラギン酸をコードする）への突然変異によって完全長ＣＥＡ遺伝子に修飾を導入した。得られた修飾ＣＥＡ遺伝子は修飾エピトープＹＬＳＧＡＮＬＮＬを含む（ＮからＤへの変化を強調文字で示す）。ＣＡＰ−１エピトープの６番目のアミノ酸位置においてアスパラギン（Ｎ）に代えてアスパラギン酸（Ｄ）を有するタンパク質をコードするその修飾ＣＥＡ遺伝子はＣＥＡ（６Ｄ）と称される（例えば配列番号１（図１）を参照）。
【００８８】
実施例２：組換え鶏痘、ワクシニア、およびＭＶＡ構築体の作成
組換えポックスウイルスの作成は、ポックスウイルスゲノムＤＮＡと、挿入されるべき相同配列を担持するプラスミドベクターとの間の相同組換えによって達成される。ポックスウイルスへの外来配列の挿入のためのプラスミドベクターは、組換えＤＮＡ技術の標準的方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ）によって構築される。プラスミドベクターは、１つ以上のキメラ遺伝子を包含し、そのキメラ遺伝子の各々は、ポックスウイルスゲノムの非必須領域からのウイルス配列によって挟まれたタンパク質コード配列に結合したポックスウイルスプロモーターを含む。親ポックスウイルスを感染させた細胞にプラスミドをトランスフェクトさせ、プラスミド上のポックスウイル配列とウイルスゲノム中の対応ＤＮＡとの間の組換えによって、プラスミド上のキメラ遺伝子がウイルスゲノムに挿入される。任意の様々な選択またはスクリーニング（Ｍａｚｚａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７： ５５７−５８１； Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ７： ９９１−９９８； Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｖａｃｃｉｎｅ １２： １０３２−１０４０）を用いて組換えウイルスを選択および精製する。ワクシニアゲノムへの外来遺伝子の挿入は、通常、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によって確認される。外来遺伝子の発現は、発現産物のウェスタン分析および／または免疫沈降によって証明される。
【００８９】
組換えポックスウイルスの作成
組換え鶏痘ウイルスｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）を作成するために、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域に外来配列の挿入を導くようにｐＴ５０７１と称されるプラスミドベクターを構築した。ＣＥＡ（６Ｄ）遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーター （Ｇｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４： ５９４８−５９５７） の制御下にある。さらには、鶏痘ウイルスＣ１プロモーター（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ７： ９９１−９９８）の制御下にある大腸菌ｌａｃＺ遺伝子が組換え子孫のスクリーニングのために含まれる。それら外来配列は鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域からのＤＮＡ配列によって挟まれている。鶏痘ウイルスのＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ株からのプラーク精製単離体を組換えワクチンのための親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの作成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列と、ｐＴ５０７１をトランスフェクトさせた鶏痘ウイルス感染初代鶏胚皮膚細胞中のｐＴ５０７１における対応配列との間の相同組換えによって達成される。組換えウイルスは、ｉｎ ｓｉｔｕで、ウイルスプラークにおいて実施される発色法（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ）を用いて同定された。その測定法は、ハロゲン化インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ３４０３−３４０９）の存在下、ｌａｃＺ遺伝子産物の発現を検出する。透明な背景に対して、ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは青色に見える。陽性プラーク（ｖＴ２３３と命名）を単層の細胞から採り、その子孫を再びプレートに播いた。７回のプラーク単離およびＢｌｕｏ−Ｇａｌ存在下での再播種によって、所望の組換え体の精製が行われた。ｖＴ２３３のゲノム構造の略図が図２（Ａ）に示されている。
【００９０】
組換えワクシニアｒＶ−ＣＥＡ（６Ｄ）を作成するために、チミジンキナーゼ遺伝子（ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｊ領域に位置する）に外来配列の挿入を導くようにｐＴ２１４６と称されるプラスミドベクターを構築した。ＣＥＡ（６Ｄ）遺伝子はワクシニア４０Ｋプロモーター の制御下にあり、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子は鶏痘ウイルスＣ１プロモーターの制御下にある。それら外来配列はワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｊ領域からのＤＮＡ配列によって挟まれている。ワクシニアウイルスのＷｙｅｔｈ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）株からのプラーク精製単離体を組換えワクチンのための親ウイルスとして用いた。組換えワクシニアウイルスの作成は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列と、ｐＴ２１４６をトランスフェクトさせたワクシニアウイルス感染細胞中のｐＴ２１４６における対応配列との間の相同組換えによって達成される。組換えウイルスは、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する発色法（先に記載）を用いて同定された。陽性プラーク（ｖＴ２３７と命名）を単層の細胞から採り、その子孫を再びプレートに播いた。５回のプラーク単離およびＢｌｕｏ−Ｇａｌ存在下での再播種によって、所望の組換え体の精製が行われた。ｖＴ２３７のゲノム構造の略図が図２（Ｂ）に示されている。
【００９１】
ＣＥＡ（６Ｄ）を発現する組換えＭＶＡを作成するために、ＭＶＡゲノム中に外来配列の挿入を導くようにプラスミドベクターを構築した。ＣＥＡ（６Ｄ）遺伝子および大腸菌ｌａｃＺ遺伝子はそれぞれ、ポックスウイルスプロモーターの制御下に置かれた。それら外来配列は、外来配列が挿入されるＭＶＡゲノムからのＤＮＡ配列によって挟まれている（例えば、ｄｅｌｅｔｉｏｎ ＩＩＩ （Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｖａｃｃｉｎｅ １２： １０３２−１０４０））。組換えＭＶＡの作成は、ＭＶＡゲノム中のＭＶＡ配列と、プラスミドペクターをトランスフェクトさせたＭＶＡ感染細胞中のプラスミドベクターにおける対応配列との間の相同組換えによって達成される。選択条件下で組換えプラークを単層の細胞から採り、その子孫を再びプレートに播いた。さらなるプラーク単離および再播種によって、所望の組換えウイルスの精製が行われた。ＭＶＡ組換え構築体のゲノム構造の略図が図２（Ｃ）に示されている。
【００９２】
実施例３：ａｎＡＪ ＶＡＣ（２）−修飾ＣＥＡ−Ｂ７．１（ヒト）組換え構築体（ｖＣＰ１５８６）の作成
ＡＬＶＡＣ（２）−ＣＥＡｍｏｄ／ｈＢ７．１を作成するために、Ｃ５挿入部位（以下を参照）に特異的なＡＬＶＡＣ（総称）ドナープラスミド中に、Ｈ６（Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２９−３９３６）−プロモート修飾ＣＥＡを含むコード配列およびヒト６７．１遺伝子（合成初期／後期プロモーターの制御下にある）をサブクローニングした。次に、ドナープラスミドを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 組換え（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３： ５４５）によってＡＬＶＡＣ（２）ゲノム中のＣ５挿入遺伝子座に発現カセットを挿入した。
【００９３】
ＡＬＶＡＣ（２）ベクターへの修飾ＣＥＡおよびヒトＢ．７．１コード配列の挿入のためにＣ５と称される遺伝子座を用いた。ウイルスゲノムの広範囲に亘る逆方向末端反復（ＩＴＲ）内に存在するＣ５遺伝子座によって、その遺伝子座への挿入は挿入配列の２つのコピーを生じさせる。組換え構築体の略図が図３に示されている。［好ましくは、Ｃ５がコードするポリペプチドは全く機能を持たず、またその領域においてコードされる推測アミノ酸読取り枠は既存のタンパク質データベース中の何れのタンパク質とも顕著な相同性を共有しない］。
【００９４】
ｖＣＰ１５８６ ＡＬＶＡＣ組換え体の作成の詳細
（ｉ）修飾ＣＥＡ：
以下のＰＣＲプライマーを用いた、プラスミドｐＴ２１４７（修飾ＣＥＡ（６Ｄ）の完全長配列を含む）からのＰＣＴ増幅によって得られる配列（Ｂｇ／ＩＩ部位まで）：
ＨＭ１０２：  ５’−ＴＴＧ−ＴＣＣ−ＧＡＧ−ＣＴＣ−ＴＣＧ−ＣＧＡ−ＴＡＴ−ＣＣＧ−ＴＴＡ−ＡＧＴ−ＴＴＧ−ＴＡＴ−ＣＧＴ−ＡＡＴ−ＧＧＡ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＣＴＣ−ＧＧＣ−ＣＣＣ−３’（配列番号３）
ＨＭ１０３：  ５’−ＣＣＧ−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−ＧＡＴ−ＣＴＧ−ＡＣＴ−ＴＴＡ−ＴＧＡ−Ｃ−３’（配列番号４）。
【００９５】
ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、およびエビ由来アルカリホスファターゼによって消化されたｐＢＳＫ＋ベクター（ＤＨ５α細胞）中へのクローニングに適した適合末端を作成した。得られたプラスミド（ｐＦ１０２．１０３）をシークエンシングして、挿入の忠実性を確認した。ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩでのプラスミドｐＴ２１４７の消化によって、ＣＥＡ（６Ｄ）配列の残りを単離した。得られた１．７Ｋｂｐ断片はＣＥＡ（６Ｄ）の３’末端を含んでいた。その断片をＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩ、およびエビ由来アルカリホスファターゼによって消化されたｐＦ１０２．１０３プラスミドに連結させ、さらにＤＨ５α細胞中に導入した。得られたプラスミドをｐ３’Ｈ６ＭＣＥＡと命名した。
【００９６】
ｐ３’Ｈ６ＭＣＥＡからＡＬＶＡＣ挿入プラスミドＮＶＱＨ６ＭＣ５にｐ３’Ｈ６−修飾ＣＥＡ配列断片を転移させることによって、ＡＬＶＡＣドナープラスミドを構築した。ＮＶＱＨ６ＭＣ５は、Ｃ５ドナープラスミドＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ−１８をＢａｍＨＩによってそのポリリンカー領域内において消化することによって最初に作られた。次にそれをアルカリホスファターゼで処理し、さらにキナーゼ処理されかつアニーリングされたオリゴヌクレオチドＳＰＣ５ＰＬ１（５’−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＣＧＡ−ＣＧＡ−ＧＣＴ−ＣＧＡ−ＡＴＴ−ＣＧ−３’）（配列番号５）およびＳＰＣ５ＰＬ２（５’−ＧＡＴ−ＣＣＧ−ＡＡＴ−ＴＣＧ−ＡＣＣ−ＴＣＧ−ＴＣＧ−ＡＣ−３’）（配列番号６）に連結させ、それによってプラスミドＮＶＱＨ６ＭＣ５を作成した。
【００９７】
プラスミドｐ３’Ｈ６ＭＣＥＡをＮｒｕＩおよびＳａｌＩで消化し、３’Ｈ６修飾ＣＥＡ配列を含む断片を精製し、その後、ＮｒｕＩ、ＸｈｏＩおよびエビ由来のアルカリホスファターゼで消化したＮＶＱＨ６ＭＣ５ベクターに連結させた。完全長のＨ６プロモーターの制御下に修飾ＣＥＡコード配列を含む得られたドナープラスミドを、ｐＡＨ６ＭＣＥＡと命名した。
【００９８】
（ｉｉ）Ｂ７．１
以下のプラスミドを用いて、４２Ｋプロモーターを融合させ、かつプラスミドｐＴ２１４７からの完全Ｂ７．１遺伝子をＰＣＲ増幅させた：
ＨＭＩ０４：  ５’−ＴＴＧ−ＴＣＣ−ＧＡＧ−ＣＴＣ−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−ＡＴＴ−ＧＧＧ−ＡＡＧ−ＡＡＴ−ＡＴＧ−ＡＴＡ−ＡＴＡ−ＴＴＴ−ＴＧＧ−ＧＡＴ−ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＡＴＴ−ＧＡＡ−ＡＡＴ−ＡＴＡ−ＴＡＡ−ＴＴＡ−ＣＡＡ−ＴＡＴ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−ＧＧＣ−ＣＡＣ−ＡＣＡ−ＣＧＧ−ＡＧＧ−ＣＡＧ−３’（配列番号７）
ＨＭＩ０５：  ５’−ＡＣＧ−ＧＣＡ−ＧＴＣ−ＧＡＣ−ＴＴＡ−ＴＡＣ−ＡＧＧ−ＧＣＧ−ＴＡＣ−ＡＣＴ−３’（配列番号８）。
【００９９】
プライマーＨＭＩ０４は４２Ｋプロモーターの完全配列を含んでいた。得られたＰＣＲ産物（Ｆ１０４．１０５と命名）をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化して、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、およびエビ由来アルカリホスファターゼによって消化されたｐＢＳＫ＋ベクター（ＳＵＲＥ細胞）中に連結させた。得られたプラスミドをｐＦ１０４．１０５と命名し、シークエンシングして、挿入の忠実性を確認した。
【０１００】
（ｉｉｉ）ドナープラスミドｐＡ２１４７
ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩでの消化によってｐＦ１０４．１０５から４１Ｋ−６７．１コード配列を含む断片を切り出し、続いて精製した。その断片を、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、およびエビ由来アルカリホスファターゼによって消化されたｐＡＨ６ＭＣＥＡプラスミドに連結させ、ＳＵＲＡ細胞中に導入した。得られたドナープラスミドをｐＡ２１４７と命名した（ＡＬＶＡＣへの挿入のためのｐＡ２１４７のＨ６−プロモートヒト修飾ＣＥＡ／４２ＫプロモートＢ７．１カセットの配列に関して図４を参照）。
【０１０１】
（ｉｖ）ｖＣＰ１５８６の作成
ドナープラスミドｐＡ２１４７とＡＬＶＡＣ（２）レスキューウイルス（ｒｅｓｃｕｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）との間の組換えによって組換えウイルスｖＣＰ１５８６が作成された。その組換えウイルス構築体は、Ｃ５遺伝子座に、ワクシニアＨ６プロモート修飾ヒトＣＥＡ遺伝子配列および４２Ｋプロモートヒト６７．１遺伝子配列を含む（ＡＬＶＡＣ挿入および挿入ＤＮＡ配列の詳細に関して、図３および４を参照）。刊行物に記載されておりかつ当業者に公知である方法を利用して組換えを実施した（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７）， ｓｕｐｒａ；上記のおよび／または、例えば、米国特許第４７６９３３０号、第４７２２８４８号、第４６０３１１２号、第５１７４９９３号、および第５１１０５８７号明細書（参照によってそれらの全てがこの中に組み込まれる）に記載の他の方法も利用できる）。
【０１０２】
挿入の確認
（ｉ）制限酵素分析
当業者に周知の方法に従って、ｖＣＰ１５８６を感染させた細胞からウイルスゲノムＤＮＡを単離した（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９９８）； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９９８）に教示されている）。ウイルスゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐｓｔ Ｉ、ＢａｍＨＩ、またはＸｈｏｌ）で消化した。アガロースゲルを用いる電気泳動によって、得られたＤＮＡ断片を分画し、臭化エチジウム染色によって可視化した。Ｃ５遺伝子座への修飾ＣＥＡおよびＢ７．１発現カセットの挿入を確認した（例えば、ｖＣＰ１５８６のＸｈｏｌ制限酵素地図の略図に関して図３を参照）。
【０１０３】
（ｉｉ）免疫沈降
以前述べたように、非感染ＨｅＬａ細胞、あるいは、ＡＬＶＡＣ（２）親ウイルス（ｖＣＰ１４６８）、ＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ／Ｂ７（ｖＣＰ３０７）、ＡＬＶＡＣ−ｈＢ７．１（ｖＣＰ１１３３４）、ＡＬＶＡＣ−ＣＥＡｍｏｄ／ｈＢ７．１（ｖＣＰ１５８５）、またはＡＬＶＡＣ（２）−ＣＥＡｍｏｄ／ｈＢ７．１（ｖＣＰ１５８６）の何れかを感染させたＨｅＬａ細胞由来の放射性標識溶解物を用いて、免疫沈降分析を実施した（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：１４４１−１４５０）。簡単に説明すると、［３５Ｓ］−メチオニン／システイン（３０μＣｉ／ｍｌ）を補足したメチオニンおよびシステインフリーの培養液中において、１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で培養ＨｅＬａ細胞に感染させた。感染の１８時間後に、細胞を溶解させた。Ｂ７．１特異的モノクロナール抗体（ＨＢ７１；ＡＴＣＣ＃８０９９１）を用いて免疫沈降を実施した。免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分画した。ゲルを固定し、フルオログラフィーのために１Ｍ サリチル酸ナトリウムで３０分間処理した。抗ｈＢ７．１抗体を用いた結果は、ＡＬＶＡＣ（２）−ＣＥＡｍｏｄ／ｈＢ７．１（ｖＣＰ１５８６）およびｈＢ７．１を発現する他のＡＬＶＡＣベースの組換え体を感染させたＨｅＬａ細胞におけるヒトＢ７の発現を示したが、親ウイルスを感染させた細胞では発現は認められなかった（図５）。
【０１０４】
（ｉｉｉ）ウェスタンブロット分析
親ウイルス（ｖＣＰ１４６８）、ＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ／Ｂ７（ｖＣＰ３０７）、ＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ（ｖＣＰ２４８）、ＡＬＶＡＣ−ＣＥＡｍｏｄ／ｈＢ７．１（ｖＣＰ１５８５）、またはＡＬＶＡＣ（２）−ＣＥＡｍｏｄ／ｈＢ７．１（ｖＣＰ１５８６）の何れかを、１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で１８時間、ＨｅＬａ細胞に感染させた。標準的技術を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解物を分離し、ニトロセルロース膜に転写させた。そのブロットを抗ＣＥＡモノクロナール抗体Ｃｏｌ−１（１／１０００希釈）、続いて、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウス抗体と共にインキュベートし、ＤＡＢ／Ｍｅｔａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いたＨＲＰ過酸化物基質を利用して発色させた。得られた結果は、ＡＬＶＡＣ（２）−ＣＥＡｍｏｄ／ｈＢ７．１（ｖＣＰ１５８６）およびＣＥＡを発現する他のＡＬＶＡＣベースの組換え体を感染させたＨｅＬａ細胞における完全長ＣＥＡの発現を示した。
【０１０５】
特定のおよび／または好ましい実施形態において本発明の原理を例示および説明したが、そのような原理から逸脱することなく、本発明の配列および詳細に変更を加え得ることを当業者は理解すべきである。我々は、以下の請求項の範囲に含まれる全ての変更を請求する。この中で参照された全ての刊行物、特許および特許出願は、各刊行物、特許または特許出願のそれぞれが特別かつ個別的に参照によってその全てが組み込まれることが指示されているのと同様にそれらの全てが参照によってこの中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、修飾ＣＥＡを含む本発明の実施形態の核酸配列およびアミノ酸配列を示す
【図２】
図２は、修飾ＣＥＡを発現する、特定の組換え鶏痘ウイルス、ワクシニアウイルス、およびＭＶＡ構築体のゲノム構造を含む３つの略図を示す
【図３】
図３は、ＡＬＶＡＣ（２）−ＣＥＡ（修飾）／ヒトＢ７．１構築体のＸｈｏＩ制限酵素地図プロフィールの略図を示す
【図４】
図４は、図３の構築体の作成に用いられるＨ６−プロモートＣＥＡ（修飾）／ヒトＢ７．１挿入カセットの核酸配列を示す
【図５】
図５は、様々なＡＬＶＡＣ組換え構築体を感染させたＨｅＬａ細胞の免疫沈降分析の結果を示す
【図６】
図６は、様々なＡＬＶＡＣ組換え構築体を感染させたＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット分析の結果を示す
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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