(57)【要約】本発明は、患者からのサンプルにおける異常を検出する方法であって、患者の細胞のサンプルを入手するステップと；上記細胞を、少なくとも１つの分子が乳頭腫ウイルス関連抗原に結合することができ、少なくとも１つの分子が細胞増殖マーカーに結合できることを特徴とする２つ以上の分子と接触させるステップと、上記結合をモニタリングするステップとを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からのサンプルにおける異常を検出する方法であって、
（ａ）患者の細胞のサンプルを入手するステップと、
（ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの分子が乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原に結合でき、且つ少なくとも１つの分子が細胞増殖マーカー又はウイルス活性マーカーに結合できることを特徴とする２つ以上の分子と接触させるステップと、
（ｃ）前記結合をモニタリングするステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記サンプルが子宮頚部細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが子宮頚部スメアから回収した細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞を、前記２つ以上の分子と同時に接触させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記乳頭腫ウイルスがヒト乳頭腫ウイルスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト乳頭腫ウイルスが、ＨＰＶ１６型、１８型、３３型、３５型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型及び６１型からなる群から選択される１つ以上の型を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの分子が、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の一部に特異的に結合する分子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの分子が、乳頭腫ウイルスＥ４タンパク質に結合できる分子であり、且つＥ４配列の親水性領域内で結合できる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞増殖マーカーが、ＤＮＡ複製の開始前複合体のメンバーである１つ以上のポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの分子が、乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原に結合でき、且つ少なくとも１つの分子がウイルス活性マーカーに結合できる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルス活性マーカーが、ｐ１６又はサイクリンＢである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの分子が乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原に結合でき、且つ少なくとも１つの分子が細胞増殖マーカーに結合できる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞増殖マーカーが、ＣＤＣ６、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、Ｃｄｃ７プロテインキナーゼ、Ｄｂｆ４、Ｃｄｃ１４プロテインホスファターゼ、Ｃｄｃ４５、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７、ＫｉＳ１、サイクリンＡ及びＭＣＭ１０からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞増殖マーカーが、ＭＣＭポリペプチドではない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞増殖マーカーが、サイクリンＡ、Ｋｉ６７及びＰＣＮＡからなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＰＶ又は細胞増殖もしくはウイルス活性マーカー、又はそれらの両方が、ｍＲＮＡの段階で検出される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
乳頭腫ウイルス関連の核酸もしくは抗原に結合できるか、又は細胞増殖もしくはウイルス活性のマーカーに結合できる前記分子が、抗体又は抗原に結合できるそのフラグメントである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞増殖マーカー又はウイルス活性のマーカーが、Ｅ６およびＥ７またはそれらの一方により誘導される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
患者からのサンプルにおける異常を検出する方法であって、
（ａ）患者の細胞のサンプルを入手するステップと、
（ｂ）前記細胞を、少なくとも１つの分子が１の乳頭腫ウイルス関連の抗原又は複数の乳頭腫ウイルス関連の抗原に結合でき、且つ少なくとも１つの分子が１の細胞増殖もしくはウイルス活性マーカー又は複数の細胞増殖もしくはウイルス活性マーカーに結合できることを特徴とする２つ以上の分子と接触させるステップと、
（ｃ）前記結合をモニタリングするステップと、
を含む方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの分子が乳頭腫ウイルス関連抗原に結合でき、且つ少なくとも１つの分子が細胞増殖又はウイルス活性のマーカーに結合できる２つ以上の分子と、前記分子を請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法で使用するための説明書とを含むキット。
【請求項２１】
サンプルにおける異常を検出する際に、同時使用、同時の別々の使用、または逐次使用をするために、ある分子は、乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原に結合でき、また別の分子は細胞増殖マーカーに結合できる。
【請求項２２】
患者のサンプルにおける細胞の異常と関連したリスクを評価する方法であって、患者の細胞サンプルを入手するステップと；前記細胞を、少なくとも１つの分子が乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原に結合でき、且つ少なくとも１つの分子が１の細胞増殖マーカーもしくは複数の細胞増殖マーカーならびにウイルス活性のマーカーまたはそれらのいずれかに結合できることを特徴とする２つ以上の分子と接触させるステップと；（ａ）細胞増殖マーカーの存在、及び（ｂ）ハイリスク又はローリスクリスクＨＰＶウイルス感染の検出に基づいて、前記リスクを分類するステップと；を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、子宮頚部悪性腫瘍（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）を示す、又は子宮頚部悪性腫瘍につながる可能性がある異常を同時にスクリーニングする方法に関する。従って、本発明は、ＨＰＶ感染及び前兆病変、又は子宮頚部悪性腫瘍に先行するもしくは共に発生する他の状態を、同時にスクリーニングする方法、ならびに上記方法で有用な試薬に関する。
【０００２】
［発明の背景］
集中的で高価な国家的スクリーニングプログラムにもかかわらず、子宮頚部の癌は、英国女性の８番目に多い悪性腫瘍であり、３５才未満の女性では最も多い悪性腫瘍である（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃａｍｐａｉｇｎ，Ｃａｎｃｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｒｖｉｘ　ｕｔｅｒｉ．１９９４，ＣＲＣ：Ｌｏｎｄｏｎ）。開発途上世界では、子宮頚部の癌は最も多い悪性腫瘍であり、また、３５〜４５才の女性の死因につながり、毎年の新たな症例は４３７，０００人と推定される（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃａｍｐａｉｇｎ，Ｃａｎｃｅｒ−ｗｏｒｌｄ　ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．１９９５，ＣＲＣ：Ｌｏｎｄｏｎ）。
【０００３】
乳頭腫ウイルス（ＰＶ：ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）は、感染部位及び関与するＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）型によって、重症度が様々な上皮腫瘍をヒトで引き起こす（Ｌａｉｍｉｎｓ，１９９３；Ｖｉｌｌｉｅｒｓｄｅ，１９９４）。ＨＰＶ１又はＨＰＶ６３等のローリスク型（Ｅｇａｗａら、１９９３ａ；Ｅｇａｗａら、１９９３ｂ）は、稀に悪性腫瘍に進行するに過ぎない良性の皮膚のいぼを引き起こすが、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３１等のハイリスクウイルスは、粘膜部位に扁平いぼを引き起こし、高度の子宮頚部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）及び癌を伴う（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９９４）。ＨＰＶ誘導性の腫瘍の形成は、上皮基底細胞の感染、及び細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を刺激するためにウイルスの初期タンパク質の発現を必要とすると考えられる。最終的に感染性ビリオンの産生を来たすウイルス生活環の後期は、感染した細胞が、上皮系の上方の分化した層を通過して移動するときに限って開始される。
【０００４】
ＨＰＶ感染と子宮頚癌発生との間に非常に強い相関関係があることは周知であり、子宮頚癌を有する女性の９９％が子宮頚部のＨＰＶ感染の証拠を示す（Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ　１８９：１２−１９）。従って、従来の子宮頚部スメア（ｓｍｅａｒ）の組織病理学的検査に代わる１つの可能な方法は、ＨＰＶ感染の証拠の有無についてサンプルを検査することである。たとえば、ＨＰＶ配列に特異的な核酸プローブを使用して、サンプルにＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを実施することにより、子宮頚癌をスクリーニングする多数の提案がなされてきた。つい最近、ＨＰＶポリペプチドの発現を分析することによりＨＰＶ感染の証拠をスクリーニングする方法が、たとえばＷＯ　９８／２５１４５号に、記述された。
【０００５】
関係のないアプローチでは、ＤＮＡ複製の開始前複合体（ｐｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）の特定のタンパク質に向けられた分子を使用して、細胞の異常を検出することが可能であった。特に有用なのは、Ｃｄｃ６に向けられた結合性分子、及びＭＣＭタンパク質、たとえば、ＭＣＭ５に向けられた結合性分子である。これらは、ＷＯ　９９／２１０１４号に記載されている。Ｃｄｃ６に向けられた結合性分子およびＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６又はＭＣＭ７に向けられた結合性分子は、ＰＣＮＡに対する抗体及びＫｉ６７又はＫｉ５１３４に対する抗体と同様に、細胞増殖異常を示すのに有効である（たとえばＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｓ．Ａ．＆　Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｓ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５８，２９４１−２９４５又はＦｏｌｌｅｎ　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　２１，１７−２５参照）。全てのこうしたタンパク質全部を、「増殖マーカー」と考えることができる。スクリーニングとの関連で特に興味深いことは、異常細胞の高水準の染色を示す抗Ｃｄｃ６結合性分子又は抗ＭＣＭ結合性分子を使用した子宮頚部サンプルの評価である。細胞が既に患者で増殖していれば、このアプローチは、ずっと後のステージの異常を検出する。
【０００６】
多くの国々には、早期の子宮頚癌の存在を検出するためのスクリーニングプログラムがある。概して、このようなプログラムは、潜在的に子宮頚部癌が発生する危険性がある女性から子宮頚部スメアを入手し、得られたスメアを、従来の組織病理学的技術で日常的に検査することによって機能する。こうした技術は、労力を要し、且つ多くの時間がかかり、結果を正確に解釈するためにはかなりの経験が必要であり、しばしば比較的大きい割合の擬陽性成績を生じさせ、不必要な不安を引き起こす。擬陰性は、経験が浅い職員によってスクリーニングが実行されるとき発生する可能性があり、前癌病変又は他の異常を正常と分類することになる可能性がある。
【０００７】
ウイルスのポリペプチドに基づく方法も、細胞分裂のマーカーのスクリーニングに基づく方法も、擬陽性成績及び擬陰性成績という難点がある。従って、改良された子宮頚部癌スクリーニング方法が必要である。
【０００８】
［発明の概要］
意外なことに、ウイルス感染及び細胞分裂のマーカーのスクリーニングに基づく２つの先行技術の技法を組合せることにより、子宮頚部スクリーニングにおける不正確な成績の発生率が減少することが確認されている。両原理に基づいた１つのテストは、２つの検出システム間の相乗効果を利用して、最小限の不正確な成績しか伴わない合理化された能率的なテストを提供する。加えて、本テストは、子宮頚部病変の重症度を評価して階層化することが可能な手段を提供する。
【０００９】
ＨＰＶ感染と、子宮頚部癌の発生との間に関連性があるにもかかわらず、細胞増殖に関与するウイルスの遺伝子産物、たとえばＥ６及びＥ７は、発現が低レベルであるため、一般に、子宮頚部腫瘍形成の有用なマーカーとみなされない。対照的に、Ｅ４及びＬ１遺伝子産物は非常に高いレベルで発現され、且つＣＩＮの表層で容易に検出できる（Ｄｏｏｒｂａｒ，Ｊ．，Ｆｏｏ，Ｃ．，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｎ．，Ｍｅｄｃａｌｆ，Ｅ．，Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｏ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ，Ｔ．，Ｎａｐｔｈｉｎｅ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｊ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．＆　Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３８，４０−５２）。Ｅ４発現は、増殖型（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ）ウイルスゲノム増幅の開始を示し、Ｅ４陽性細胞の一部におけるＬ１の出現は、ウイルス合成の開始を示す。
【００１０】
本発明によれば、Ｅ７により誘導される（Ｈｕａｎｇ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｄ．Ｒ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｇ．，Ｇｏｏｄｈａｒｔ，Ｐ．Ｊ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｍｉｌｅｓ，Ｌ．，Ｇａｒｓｋｙ，Ｖ．Ｍ．，Ｏｌｉｆｆ，Ａ．＆　Ｈｅｉｍｂｒｏｏｋ，Ｄ．Ｃ．（１９９３）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３，９５３−９６０；Ｚｅｒｆａｓｓ，Ｋ．，Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ａ．，Ｓｐｉｔｋｏｖｓｋｙ，Ｄ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｖ．，Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｂ．＆　Ｊａｎｓｅｎ−Ｄｕｒｒ，Ｐ．（１９９５）Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６９，６３８９−６３９９）、たとえば、ＰＣＮＡ、サイクリンＡ（ＤｅＧｒｅｇｏｒｉ，Ｊ．，Ｋｏｗａｌｉｋ，Ｔ．＆　Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９５）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１５，４２１５−４２２４）及びＭＣＭ５（Ｏｈｔａｎｉ，Ｋ．，Ｉｗａｎａｇａ，Ｒ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｉｋｅｄａ，Ｍ．，Ｙａｂｕｔａ，Ｎ．，Ｔｓｕｒｕｇａ，Ｈ．＆　Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８，２２９９−２３０９）等のＥ２Ｆ制御細胞タンパク質を染色することにより、Ｅ７遺伝子産物を発現する細胞を同定することが可能である。非感染子宮頚部では、このようなタンパク質の発現は、分裂中の基底細胞に限定されるが、子宮頚部新形成の場合、それらの発現は、Ｅ７発現の結果として、より高い層内に及ぶ。Ｅ７活性の代理マーカーの検出と、ＨＰＶ　Ｅ４及びＬ１タンパク質の検出とを組み合わせることにより、上級及び低級の子宮頚部腫瘍形成における、ウイルス生活環の３つの主要な期を迅速に区別することが可能になっている。コンジローム及び検査した全ての増殖性感染（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）において、細胞増殖、ウイルスゲノム増幅及びウイルス合成は、極めて秩序正しいパターンに従い、Ｅ４及びＥ４／Ｌ１発現細胞のみが表層内に存続する。しかし、ＨＳＩＬ等の不稔性感染の場合、ウイルスの生活環は不完全であり、また、Ｅ７活性の代理マーカーを発現する細胞が表層に存続する可能性がある。子宮頚部新形成の表層における、これらの３つのマーカーの発現パターンは、ウイルス生活環が乱されている程度を表す。これは、下にある上皮系における子宮頚部腫瘍形成の程度と精確に相関関係がある。このようなマーカーを使用することにより、子宮頚部疾患のより正確な評価が可能になる。
【００１１】
本発明によれば、ＨＰＶポリヌクレオチド又はポリペプチドに結合する分子、及び開始前ＤＮＡ複合体のメンバー又はウイルス活性の細胞マーカーに結合する分子を使用することにより、患者から採取したサンプルにおける異常を検出できることが証明されている。特に、本発明は、ＨＰＶポリヌクレオチド又はポリペプチドに結合する分子、及び開始前ＤＮＡ複合体のメンバー又はウイルス活性の細胞マーカーに結合する分子を使用して、子宮頚部病変サンプルをスクリーニング方法を提供する。
【００１２】
第１の態様において、本発明は、患者からのサンプルにおける異常を検出する方法であって、患者の細胞のサンプルを入手するステップと、上記細胞を、少なくとも１つの分子が、乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原を結合することができ、且つ少なくとも１つの分子が細胞増殖マーカー又はウイルス活性のマーカーを結合できることを特徴とする２つ以上の分子と接触させるステップと、上記結合をモニタリングするステップとを含む方法を提供する。
【００１３】
細胞増殖マーカー又はウイルス活性のマーカーは、Ｅ６および／またはＥ７によって誘導されることが好ましい。
【００１４】
細胞は、無傷であることが好ましい。しかし、細胞溶解産物、ホモジネート又は他の方法で破壊した細胞を本発明用の基質として使用してもよく、また、用語「細胞」の定義に含めてもよい。
【００１５】
異常は、生物における、粘膜乳頭腫ウイルス感染によって生じる前癌病変等の病変であってもよく、悪性か又はそうでない異常に増殖している細胞であってもよい。
【００１６】
用語「分子」は、上述した所望の結合特性を有する分子を指すのに使用され、さらに詳細に後述する。都合がよいことに、分子は抗体であってもよく、抗原に結合できるそのフラグメントであってもよい。
【００１７】
この分子の結合は、適当な方法、たとえば、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、又は任意の他の標識を使用することによって評価してもよく、任意の他の適当な方法、たとえば、表面プラスモン共鳴で評価してもよい。分子の結合は、蛍光標識で評価することが好ましい。
【００１８】
「サンプル」は、適量の子宮頚部材料、特に子宮頚部細胞（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ）を意味する。サンプルは、生検、スワブからの細胞、スメア又は子宮頚部細胞を入手する他の手段の形をとることも可能である。サンプルは、子宮頚部細胞を含むことが好ましい。さらに好ましくは、サンプルは、子宮頚部スメアから回収される細胞である。
【００１９】
「同時に」は、実質的に同時を意味する。これに関連して、同時には、それ自体、長時間におよぶことがある、同一の実験テストにおける手順内を意味することもある。２つのテストは、同一サンプルの全部又は一部に対する継続的な一連の操作の一部として実行される場合、同時に実施されると考えられる。記載の幾つかのテストが、サンプルに対して同時に実施されることは、本発明の好ましい実施形態である。
【００２０】
ヒト乳頭腫ウイルスポリヌクレオチド又はポリペプチドに結合する分子は、他の乳頭腫ウイルスポリヌクレオチド又はポリペプチドにも結合してもよく、または他の乳頭腫ウイルスポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して生じさせておいてもよい。本明細書で言及する乳頭腫ウイルスは、他の乳頭腫型ウイルスを含んでもよい。好ましくは、ウイルスは、ヒト乳頭腫ウイルスである。さらに好ましくは、ウイルスはヒト乳頭腫ウイルスであり、ＨＰＶ１６型、１８型、３３型、３５型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型及び６１型からなる群から選択される１つ以上の型を含む。本発明による分子は、多数のウイルスのポリヌクレオチド又はポリペプチドに結合できる。
【００２１】
有利には、本発明による分子は、ＨＰＶポリペプチドに結合する。ＨＰＶ　ＤＮＡは、明白なウイルス感染又は病状がない子宮頚部スメアのある割合でみられる。従って、ＨＰＶポリペプチドに結合する分子を使用することにより、ＨＰＶ核酸をテストするための優れた分析方法が得られる。好ましくは、少なくとも１つの分子は、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の一部（ｓｕｂｓｅｔ）に特異的に結合する分子である。さらに好ましくは、少なくとも１つの分子は、乳頭腫ウイルスＥ４タンパク質に結合することができ、且つＥ４配列の親水性領域内に結合できる分子である。
【００２２】
本発明は、ＨＰＶタンパク質及び細胞増殖のマーカー、又はｐ１６等のウイルス遺伝子産物が存在する結果として細胞で発現されるタンパク質の検出を含むことが好ましい（Ｓａｎｏ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３，１７４１−１７４８；Ｓａｎｏ，Ｔ．，ｅｔ　ａｌ（１９９８）Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．４８，５８０−５８５；Ｌｕｋａｓ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ（１９９４）Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１２５，６２５−６３８参照）。細胞増殖マーカーに結合する分子は、本発明の方法で都合よく使用することが可能である。細胞増殖マーカーは、活発に分裂している細胞、又は細胞周期に関連した又は細胞周期に入っている細胞で発現される遺伝子産物である。こうしたマーカーは、概して、静止状態、休眠中、静止期中又は一時的に又は永久的に停止しており、細胞周期に関与しない細胞には欠けている。好ましくは、本発明による細胞増殖マーカーは、ＤＮＡ複製の開始前複合体のメンバーである１つ以上のポリペプチドを含む。さらに好ましくは、この増殖マーカーは、ＣＤＣ６、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、Ｃｄｃ７プロテインキナーゼ、Ｄｂｆ４、Ｃｄｃ１４プロテインホスファターゼ、サイクリンＡ、Ｃｄｃ４５、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７、ＫｉＳ１、及びＭＣＭ１０からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドを含む。細胞増殖マーカーは、ｍＲＮＡの段階で検出することが可能である。細胞増殖マーカーは、ポリペプチドとして検出されることが好ましい。
【００２３】
好ましい態様では、細胞増殖マーカーは、ＭＣＭ分子ではない。有利には、この細胞増殖マーカーは、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７及びサイクリンＡである。
【００２４】
さらに、この細胞増殖マーカーは、サイクリンＢ又はｐ１６等の、ウイルス活性に関するマーカーに取り替えることが可能である。
【００２５】
本発明の方法で使用するのに適した分子は、１つより多い標的ポリペプチドに結合することが可能である。従って、本発明は、患者からのサンプルにおける異常を検出する方法であって；患者の細胞のサンプルを入手するステップと；上記細胞を、少なくとも１つの分子が１の乳頭腫ウイルス関連の核酸もしくは抗原又は複数の乳頭腫ウイルス関連の核酸もしくは抗原を結合することができ、且つ少なくとも１つの分子が１の細胞増殖マーカー又は複数の細胞増殖マーカーを結合できることを特徴とする２つ以上の分子と接触させるステップと、上記結合をモニタリングするステップとを含む方法を提供する。
【００２６】
本明細書に記載され、言及されている試薬は、キットの形で本発明が機能するために、説明書が都合よく供給される。従って、本発明は、少なくとも１つの分子が乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原を結合することができ、且つ少なくとも１つの分子が細胞増殖マーカーを結合できることを特徴とする２以上の分子と、本明細書に記載の方法で上記分子を使用するための説明書とを含むキットを提供する。
【００２７】
本発明はさらに、サンプルにおける異常を検出する際に、同時使用（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｕｓｅ）、同時の別々の使用（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｅｐａｒａｔｅ ｕｓｅ）、又は逐次使用（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ）するための、乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原を結合できる分子、及び細胞増殖マーカーを結合できる分子を提供する。
【００２８】
本発明が、子宮頚部腫瘍につながる可能性がある細胞異常の２つの別々の指標を評価できることにより、患者に起きる病変をリスクの重大さに従って分類することが可能になり、従って、臨床医は、より重篤な症例における緊急の治療を優先させることができる。
【００２９】
ウイルス生活環の完結に必要な事象のパターンを本明細書に提示する。ＨＰＶ１、２及び１１によって生じるものを含む全ての増殖性感染の下層では、ＰＣＮＡ又はＭＣＭ等のＥ２Ｆ活性化遺伝子の染色が一般的である。こうした細胞が上層内に達する程度は、感染性のＨＰＶ型によって異なるが、増殖性感染の場合、このようなタンパク質は、表層で決して認められない。Ｅ４発現がゲノム増幅の開始と同時に起こることを示す以前の研究から予測されたかもしれないが、Ｅ４発現は、こうした複製適格細胞で開始する（Ｄｏｏｒｂａｒ，Ｊ．，Ｆｏｏ，Ｃ．，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｎ．，Ｍｅｄｃａｌｆ，Ｅ．，Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｏ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ，Ｔ．，Ｎａｐｔｈｉｎｅ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｊ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．＆　Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３８，４０−５２）。異なるＨＰＶ型で得られる結果によって、増殖型ウイルスＤＮＡ複製、Ｅ４発現との間の密接な関係が裏付けられる。これらのＥ４陽性細胞におけるＰＣＮＡ染色及びＭＣＭ染色の最終的な喪失は、ウイルスＤＮＡ複製の完結、及び感染性ビリオン内へのＨＰＶゲノムのパッケージングが起こり得ることを示す。ウイルス生活環の、この最終ステージを制御する分子事象は十分に理解されていないが、他のＤＮＡウイルスの場合と同様、パッケージングがゲノム増幅の完了と連関している可能性がある（Ｗｉｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｋｒａｕｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｚｕｏ，Ｆ．Ｇ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．Ｅ．，Ｌｏｒｉｔｚ，Ｋ．＆　Ｍｅｒｔｚ，Ｊ．Ｅ．（１９９３）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．７，２２０６−２２１９）。本研究から生じる最も特筆すべき観察結果は、増殖性感染を支持するどの細胞も、こうしたタンパク質の１つ以上を発現することである。特定の細胞に存在するタンパク質の特定の組合せによって、ウイルス生活環における、ある特定のステージが同定される。
【００３０】
本発明は、上方上皮層内の細胞における、適正な３つのタンパク質（Ｅ４＾Ｌ１、増殖マーカー又はウイルス感染マーカー）の発現パターンから、子宮頚部の組織学的状態を予測できることを示す。上皮の表層内の細胞におけるこれら３つのマーカーの異なる組合せは、疾患の等級を示す。細胞の異常と関連したリスクは、以下の通りに層化される。
【００３１】
Ａ．ハイリスク；即座の治療を必要とする。細胞増殖マーカー陽性；ＨＰＶ感染について陽性又は陰性。ハイグレード病変（癌、ＨＳＩＬ、ＣＩＮ３又はＣＩＮ２）を示す。
【００３２】
Ｂ．中程リスク；早期フォローアップを必要とする。ハイリスクＨＰＶ型陽性、しかし増殖マーカー陰性。中程度リスクウイルスによって生じる下級病変（コンジローム、ＬＳＩＬ又はＣＩＮ１）を示す。
【００３３】
Ｃ．ローワーリスク（ｌｏｗｅｒ ｒｉｓｋ）；早期フォローアップが推奨される。中程度リスクＨＰＶ陽性、しかし、増殖マーカー陰性。ローリスクウイルスによって生じる下級病変（コンジローム、ＬＳＩＬ又はＣＩＮ１）を示す。
【００３４】
Ｄ．ローリスク；標準フォローアップ。ローリスクＨＰＶ陰性；増殖マーカー陰性。
【００３５】
従って、本発明は、さらに、患者サンプルにおける細胞の異常と関連したリスクを評価する方法であって、患者の細胞のサンプルを入手するステップと；上記細胞を、少なくとも１つの分子が乳頭腫ウイルス関連の核酸又は抗原を結合することができ、且つ少なくとも１つの分子が１の細胞増殖マーカー又は複数の細胞増殖マーカーおよび／またはウイルス感染マーカーを結合できることを特徴とする２つ以上の分子と接触させるステップと；（ａ）細胞増殖マーカーの存在、及び（ｂ）ハイリスク又はローリスクＨＰＶウイルス感染の検出、に従ってリスクを分類するステップとを含む方法を提供する。Ｅ４を使用することにより、活性なウイルス感染の検査が可能になるが、ＤＮＡプローブは、活性なウイルス感染と潜在的な感染とを区別しないため、マーカーとしてのＥ４の使用は、核酸の使用より極めて好ましい。ＨＰＶ　ＤＮＡは、正常な子宮頚部形態を有する女性のおよそ３０％で認められ、従って、ＤＮＡの存在によって、疾患状態の指標は得られない。Ｅ４発現は、子宮頚部疾患の重症度と逆相関関係にある。正常な組織構造を有する組織で、Ｅ４は決して発現されない。
【００３６】
［発明の詳細な説明］
＜子宮頚＞
子宮頚上皮は、本質的に、２つの異なる細胞型である扁平上皮および円柱上皮からなり、それぞれ、組織の解剖学的に異なる領域に位置する。扁平上皮は、子宮頚管開口部（ｏｓ）の外側（子宮膣部）に位置し、円柱上皮は、子宮頚管内（子宮内膜）に及ぶ。これらの２つの異なる上皮細胞型は、子宮頚管開口部付近（扁平円柱上皮接合部）で接触する。扁平円柱上皮接合部は、悪性腫瘍の大半が発生する領域であるため、臨床的に重要である。診断が妥当であるためには、子宮頚部スメアサンプルは、この領域からの細胞を含まなければならない。これが確実に達成されるためには、スメアは、円柱上皮細胞ならびに扁平上皮細胞の両者を含まなければならない。
【００３７】
ほとんどの子宮頚部腫瘍は、絶えず再生されている重層的動的幹細胞系である、扁平上皮から扁平円柱上皮接合部に発生する。幹細胞画分それ自体は、基底層内の基底膜近くに位置する。幹細胞分裂によって、傍基底細胞、中層細胞および表層細胞が生じる。これらは、従来、特徴的な形態学および扁平上皮内の位置の両者に関して明確に定められている。扁平上皮の最も深層に位置する基底細胞から、その表面における表層細胞までの変化は、漸進的分化を伴い、また子宮頚部表面の表層扁平上皮細胞までの増殖喪失は、最終的に分化していることを示す。
【００３８】
異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ）の場合、細胞が扁平上皮の中を通って進むにつれて、細胞分化の低減を伴う細胞増殖の増加が認められる。一般に、便宜上、初回には、子宮頚部スクリーニングは、異形成の結果として低減した分化を代表する表面の異常を探す、上皮の表面から採取したスメアの評価を含む。
後期胎児期、思春期および妊娠中に、円柱上皮は、接合部において、化生のプロセスにより、扁平上皮と入れ替わる。円柱細胞に取って代わる化生性扁平上皮細胞は、特に発癌物質に弱い。正常な化生を、扁平上皮内の、異常な異形成と混同してはならない。子宮頚部悪性腫瘍の症例の大半は扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）を呈し、「ハイリスク」型ヒト乳頭腫ウイルス、たとえば、１６、１８および３１による感染と強い関連性がある（Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９５，７６（１０　補遺）：１９０２〜１３頁）。子宮頚癌は、明確な非侵襲的「上皮内」ステージを経て進行するため、集団スクリーニングによる予防が容易にできる（Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ　女性の生殖器官の病理学中の、Ｗｒｉｇｈｔら、子宮頚部の前癌病変、Ｒ．Ｊ．Ｋｕｒｍａｎ編、１９９４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。２２９〜７８頁）。扁平上皮の上皮内異常は、３段階（ＣＩＮ）又は２段階（ベセスダ）システムを使用して分類することができる。異なる組織学的異常は、感染性ＨＰＶの型及び病変のＤＮＡ倍数性、クローン性及び自然史と広く関連している。ベセスダシステムにより分類するとき、ＣＩＮ１及び子宮頚部ＨＰＶ感染（ＨＰＶＩ）に対応する下級扁平上皮上皮内病変（ＬＳＩＬ：ｌｏｗ ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ）は、一般に、増殖性ＨＰＶ感染を表し、侵襲的疾患に進行するリスクが比較的低い（Ｗｒｉｇｈｔａｎｄ　Ｋｕｒｍａｎ。子宮頚部の侵襲前病変の形態学的分類システムの批判的批評：乳頭腫ウイルス再検討における、パラダイムを変える科学的根拠：乳頭腫ウイルスに関する最新の調査研究、Ｃ　Ｌａｃｅｙ編、１９９６，Ｌｅｅｄｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ：Ｌｅｅｄｓ）。ハイグレード扁平上皮上皮内病変（ＨＳＩＬ：ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ）は、ＣＩＮ２及びＣＩＮ３に対応し、両者ともに、悪性腫瘍の潜在的前兆を示すとみなされるが、ＨＳＩＬは、ＣＩＮ１（ＬＳＩＬ）より高い進行のリスクを示す。上皮内病変の各カテゴリーについて、悪性腫瘍のおおよそのリスクを推定することはできるが、現在、個々の症例について、進行のおおよその可能性を決定することは不可能である。
【００３９】
細胞学的スクリーニングにより、時に子宮頚癌を検出できないことがある主な理由は、テストとテストとの間隔が長いこと、また、擬陰性成績が多数であることである（１０〜３０％）（Ｐａｐ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：利益の大部分を享受したか？ＷＨＯ及びＥＵＲＯＧＩＮは、子宮頚癌コントロールに関するレポートを公開する。Ｐｒｅｓｓ　Ｒｅｌｅａｓｅ　ＷＨＯ／２２５，１９９７年３月）。
【００４０】
多数の擬陰性成績は、Ｐａｐスメア判定は、形態学的演習が最も難しいものの１つであることを表す。スメア上にある混合細胞集団は複雑且つ変化に富み、また広範囲の炎症及び修復過程が子宮頚部で起こるため、Ｐａｐスメアの結果は、細針吸引、体液細胞学的検査又は生検より解釈が難しい。細胞集団の周期的変化、妊娠誘導性変化及び閉経後期間に起こる変化もある。婦人科学的細胞学は非常に難しいため、細胞検査技師のためのトレーニング期間が長く、教育を受けた学生及び上級の練習及びパターン認識技能を必要とする。十分なトレーニングプログラムを終了した後でも、Ｐａｐスメア成績が正常か又は異常かについて常に正確な判断を下すまでに、細胞検査技師は数年の実践経験を要する。同様に、病理学者は、組織学的薄片を解釈するためのトレーニングを受けることができるが、細胞学研究室を組織して管理するのに十分な技能を有するためには、また、異常なスメアに関して適切な診断を下すためには、細胞病理学における専門のトレーニングをさらに必要とする。
【００４１】
現在のスクリーニングプログラムに関連した２つの重大な問題は、一見不可避と思われる擬陰性率（１０〜３０％）及び比較的高いスクリーニング費用である。従って、子宮頚部スクリーニングに代わるアプローチが現在検討されている。２つの最もよく検討された提案は、一次スクリーニング法として又はＰａｐスメアの補足として、ＨＰＶ　ＤＮＡテスト及び型別を使用すること、及び定型的に採取したＰａｐスメアを自動的にスクリーニングすることができる機器を使用して、比較的高給の細胞検査技師及び細胞病理学者の必要性を減少させることである（Ｒｉｃｈａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，１９９５，７６（１０）：１９１９−１９２７；Ｂｉｒｄｓｏｎｇ，ＨｕｍａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９６，２７（５）：４６８−４８１）。
【００４２】
現在、多数の企業が、自動スクリーニング機器を開発し、上市している。一般に、このような機器は高解像度ビデオスキャナーを使用して画像をとらえ、次いで、これをデジタル化し、一連のアルゴリズムを用いて分析し、次いで、このデータを、機械が正常な細胞成分と異常な細胞成分とを区別するようにトレーニングされている干渉ネットワークを通過させる。さらなるソフトウェア及びハードウェアを開発することにより、一次スクリーニング用の自動スクリーニングを考えることが望まれるが、現在のところ、ＵＳＦＤＡにより、Ｐａｐスメアのプレスクリーニング又は独立したスクリーニング用に認可された装置はない。従来のＰａｐスメアテストに関連した問題を克服しようとして、企業が、高価で複雑なアプローチに投資する用意があることは、問題の重大性及び長い間の切実な解決の必要性を表す。
【００４３】
＜細胞増殖マーカー＞
たとえば、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７等の細胞増殖マーカーを使用した細胞増殖のパラメーターは、腫瘍に関する客観的な情報を提供する。最も広範に研究された増殖マーカーは、Ｋｉ６７及びＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）である（Ｙｕ　ａｎｄ　Ｆｉｌｉｐｅ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃｉａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９３，２５：８４３−８５３）。ＰＣＮＡは、ＤＮＡ複製の伸長及びＤＮＡ修復機構に関与している。従って、ＰＣＮＡは、複製又は修復による実際のＤＮＡ合成中に存在する。
【００４４】
ＤＮＡ複製の早期開始段階に関与する有用なマーカーもある。この中には、Ｃｄｃ６及びＭＣＭ２〜７ファミリー（ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６及びＭＣＭ７）のタンパク質が含まれる。Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４：１４２−１４７）は、培養中のヒトＨｅＬａ細胞は、増殖細胞周期を通して、Ｃｄｃ６を発現するが、Ｗ１３８ヒト二倍体線維芽細胞は、血清飢餓によって静止状態にされたとき、Ｃｄｃ６の発現をやめると報告している。こうした観察結果は、他の細胞系及び他の種に及ぶことを、本明細書に示す。ＭＣＭは、Ｇ１期核内に存在し（ＤＮＡ合成前）、ＤＮＡ合成中に、クロマチンから可溶性核原形質内に次第に移動する。静止状態の間、ＭＣＭは、クロマチンに存在しないことが証明されている。ＭＣＭ５は、子宮頚部及び乳房の分化した細胞に存在しないことも分かっている。Ｃｄｃ６抗体又はＭＣＭ（たとえばＭＣＭ５）抗体は、子宮頚部のＬＳＩＬ（ＨＰＶＩ／ＣＩＮ１）病変を検出することが知られている。さらに、ＬＳＩＬ（ＨＰＶＩ／ＣＩＮ１）又はＨＳＩＬ（ＣＩＮ２／３）病変の本質的に全ての細胞が染色される。このことから、ＤＮＡ複製の開始前複合体のタンパク質に向けた特異的結合性分子、特にＣｄｃ６又はＭＣＭタンパク質（たとえば、ＭＣＭ５、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６２０及びＭＣＭ７）は、異型細胞又は新生物細胞の検出に有用なことがわかる。
【００４５】
有用な細胞増殖マーカーは、ＯＲＣ２等の複製因子と同様に、Ｃｄｃ７プロテインキナーゼ（Ｃｈａｐｍａｎ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．，１９８９，１８０　４１９−４２８　（酵母）、Ｓａｏ　ｅｔ　ａｌ．１９９７，ＥＭＢＯ　Ｊ，１６，４３４０−４３５１（静止状態における、ヒト　ダウンレギュレート））、Ｃｄｃ７プロテインキナーゼの調製サブユニットであるＤｂｆ４（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１３　２８９９−２９０８（酵母）、Ｍａｓａｉら、真核生物ＤＮＡ複製に関するＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ大会、１９９７年９月３〜７日（ヒト））、Ｃｄｃ１４プロテインホスファターゼ（Ｈｏｇａｎ　ａｎｄ　Ｋｏｓｈｌａｎｄ　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ，１９９２，８９，３０９８−３１０２（酵母））、ＭＣＭと関連があり且つＭＣＭに類似した表現型を有するＣｄｃ４５（Ｚｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７，５５３−５６３　３０（酵母）、Ｔａｋｉｓａｗａら、真核生物ＤＮＡ複製に関するＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ大会、１９９７年９月３〜７日（ゼノプス））、ＭＣＭと関連があり且つＭＣＭに類似した表現型を有するＭＣＭ１０（Ｍｅｒｃｈａｎｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＭｏＬ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１７　３２６１−３２７１）等の酵母成分のヒト相同体を含んでもよい。本発明の標的ポリペプチドは、ＤＮＡ複製前複合体の成分、ＤＮＡ複製を細胞周期当たり１回に制限することに関与する複製可能なクロマチンの成分、クロマチンに１ラウンドのＤＮＡ複製を許可することに関与し且つＤＮＡ複製の開始前に複製開始点に集められる複製許可の成分のいずれかであると、様々に言われることがある。
【００４６】
さらに、サイクリンＡもウイルス活性マーカーサイクリンＢも、ｐ１６と同様、本発明で有用なマーカーである。
【００４７】
ヒトサイクリンＢ　ｍＲＮＡの配列は、Ｊａｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４（８），１６４６−１６５４（１９９５）に開示されており、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＭ−００４７０１．２　ＧＩ：１０９３８０１７号を参照されたい。
【００４８】
ヒトサイクリンＡ　ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＸＭ−００３３２５．１　ＧＩ：１１４４６０７９号で入手できる。
【００４９】
ヒトｐ１６の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＸＭ−００５６５６．１　ＧＩ：１１４２９６６２号で入手できる。
【００５０】
ヒトＣｄｃ６アミノ酸配列は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　９４：１４２−１４７，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｕ７７９４９号に開示されている。
【００５１】
ヒトＭＣＭ２配列は、Ｔｏｄｏｒｏｖ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．，１０７，２５３−２６５，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｘ６７３３４に開示されている。
【００５２】
ヒトＭＣＭ３配列は、Ｔｈｏｍｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２０，１０６９−１０７４，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｐ２５２０５号に開示されている。
【００５３】
ヒトＭＣＭ４配列は、Ｉｓｈｉｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２４１１５−２４１２２，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｘ７４７９４号に開示されている。
【００５４】
ヒトＭＣＭ５配列は、Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１，５２８９−５２９３，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｘ７４７９５号に開示されている。
【００５５】
ヒトＭＣＭ６配列は、Ｈｏｌｔｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｎｉｉｃｓ，３７，１３１−１３４，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｘ６７３３４号に開示されている。
【００５６】
ヒトＭＣＭ７配列は、Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１，５２８９−５２９３に開示されている。
【００５７】
ヒトＣｄｃ６は、Ｗｉｌｌｉａｍｓらによってクローニングされており、氏の論文（ＰＭＡＳ　ＵＳＡ　９４：１４２−１４７，１９９７）には、全アミノ酸配列が記載されている。抗Ｃｄｃ６結合性分子は、様々な組織、特に子宮頚部サンプル、好ましくはスメアにおける、異常を示すに非常に有効である。これは、スメアサンプルにおける正常な子宮頚部組織には、全く結合しないのと同等であると見られる。
【００５８】
ヒトＭＣＭ５に関するアミノ酸配列は、Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１，５２８９−５２９３，ＧｅｎＢａｎ寄託番号第Ｘ７４７９５号に開示されている。ヒトＭＣＭ５に向けられた結合性分子は、Ｃｄｃ６と同様、様々な組織、特に子宮頚部サンプル、好ましくはスメアにおける、異常を示すのに非常に有効である。
【００５９】
ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６又はＭＣＭ７結合性分子に向けられた結合性分子も、子宮頚部スメア等の組織サンプルにおける、異常を示すのに有効である。
【００６０】
従って、（たとえば）抗Ｃｄｃ６又は抗ＭＣＭ特異的結合メンバーのサンプルへの結合を使用して、サンプルが由来する組織を、異常、潜在的に又は実際に前癌、異形成又は新生物であると分類することができる。本発明の実施に従えば、Ｐａｐテストを使用して陽性成績を得た際に、検査成績が陽性の者を、たとえば、生検および／または反復スクリーニングを用いて、さらに調査研究することが可能である。前癌の可能性が、実際には癌状態に至らないことはよくある。６ヶ月毎のスクリーニングは、一般に使用される。異形成の進行又は退行を追跡し、必要に応じて、適切且つタイムリーな治療的介入を可能にする。
【００６１】
本発明を使用してサンプルをプレスクリーニングしてから、もっと程度の進んだ分析を行うことが可能である。本発明は、以前は、Ｐａｐスメアテスト又はＴｈｉｎＰｒｅｐ　２０００テスト等の、利用できる技術を使用して、これまでにテストしたサンプルのスクリーニング又は分析に使用することができる。従って、頚部スメアを、たとえば、従来のＰａｐスメアテスト及び本発明によるテストの両者を使用して、テストすることが可能である。
【００６２】
さらなる態様において、本発明は、組織又はそのサンプルにおける異常細胞の増殖、細胞増殖異常、異形成、腫瘍形成の有無、あるいは潜在的に又は実際に前癌状態又は癌状態を、決定、評価、又は診断する方法を提供する。
【００６３】
＜キット＞
結合性分子は、本発明に従って使用するための説明書を含んでもよい、キットで提供することが可能である。このようなキットは、本発明のさらなる態様として提供される。標識用分子等の、１つ以上の他の試薬が含まれてもよい（以下参照）。試薬は、密封バイアル等の、試薬を外部環境から守る容器内で提供することができる。キットは、関心のある組織に応じて、テストサンプルそれ自体を提供するための１つ以上の物品、たとえば、頚部スメアを採取するためのスパーテルを含んでもよい（このような成分は、一般に無菌である）。キットは、非特異的染色を減少させるための遮断剤、保存中、結合性分子活性を維持するための保存用緩衝液、抗体染色中に使用するための染色用緩衝液および／または洗浄用緩衝液、陽性対照、陰性対照のいずれか、いずれかの組合せ、又は全部を含んでもよい。対照のデザイン及び使用は標準であり、十分に、当業者の日常業務の可能性の範囲内である。
【００６４】
＜サンプル＞
サンプルは、便利な手段及び技術を使用して、身体から採取することが可能である。子宮頚部スクリーニングの場合、標準スメアサンプルを使用することが可能である。あるいは、ＴｈｉｎＰｒｅｐ　２０００テクノロジー（Ｃｙｔｅｃ　Ｃｏｒｐ，Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）を使用してもよい。これは、Ｐａｐスメア標本という従来の方法の代替として、ＵＳ　ＦＤＡにより承認されていると明確にされている。スライドガラス上に細胞を塗付ける代わりに、サンプルを液体媒体中に回収する。その後、自動プロセッサー（ＴｈｉｎＰｒｅｐ　２０００機械）を使用して、細胞を液体から回収し、分析用スライドガラス上の薄層に付着させる。スパーテル又はスワブを使用して、子宮頚部から内皮細胞を採取してもよい。
【００６５】
抗体等の分子の、サンプルへの結合は、任意の適切な方法で決定することができる。個々のレポーター分子で標識することは、１つの可能性である。レポーター分子は、直接的に又は間接的に、検出可能な、好ましくは測定可能な、シグナルを生成することが可能である。レポーター分子の連結は、直接的であっても間接的であってもよく、たとえばペプチド結合を介した共有であってもよく、又は非共有であってもよい。ペプチド結合を介した連結は、結合性分子（たとえば抗体）及びレポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え発現の結果としてであってもよい。
【００６６】
１つの好都合な方式は、各結合メンバーと、スペクトル的に単離された吸収又は発光特性を有する個々の蛍光色素、燐光体又はレーザー色素との共有結合による。適当な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン及びテキサスレッド等がある。適当な発色性色素としては、ジアミノベンジジンなどがある。
【００６７】
他のレポーターとしては、着色されている、磁性又は常磁性の、ラテックスビーズ等の高分子コロイド粒子又は粒状材料、及び視覚的に観察され、電子工学的に又は他の方法で記録される、検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に生じさせることができる生物学的に又は化学的に活性な作用物質等がある。こうした分子は、発色又は変色させる、又はたとえば、電気的特性を変化させる反応を触媒する酵素であってもよい。上記分子は、エネルギー状態間の電子遷移が、独特のスペクトルの吸収又は発光を来たすように、分子的に刺激することが可能である。上記分子は、バイオセンサーと一緒に使用される化学的構成要素を含んでもよい。
【００６８】
ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ検出システムを使用してもよい。さらなる例は、西洋わさびペルオキシダーゼ及びケミルミネセンスである。
【００６９】
当業者は、好み及び一般知識に従って、結合を決定する適当な方式を選択することができる。たとえば、西洋わさびペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼを使用してもよい。
【００７０】
＜乳頭腫ウイルス＞
自然に発生するいぼに関する研究で、このウイルスは、ビリオンコートタンパク質であるＬ１及びＬ２（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９８７）、及び機能が不明な非構造的後期タンパク質であるＥ１＾Ｅ４（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９８６）という３つの後期タンパク質をコードすることが明らかになった。ＨＰＶＩ誘導性のいぼでは、Ｅ１＾Ｅ４タンパク質が先ず下有棘層の細胞で発現され、独特の細胞質封入体及び核封入体に組立てられる。最終分化の間に、リン酸化（Ｇｒａｎｄら、１９８９）及びＮ−末端からの配列の除去（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９４）によって、転写後修飾される。ハイリスクウイルスのＥ１＾Ｅ４タンパク質は、たとえば、ＷＯ　９８／２５１４５号で特性決定されている。これらのウイルスタンパク質の中で、Ｅ１＾Ｅ４は、推定されているＬ１又はＬ２のいずれよりもはるかに豊富に存在することがわかる（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９８７）。さらに、Ｅ１＾Ｅ４は、Ｌ１及びＬ２の両者に先行して発現し、且つその発現は、Ｌ１がなくなったときでも、ハイグレードの病変中に保存される。
【００７１】
患者の細胞サンプルは、皮膚細胞（たとえば、皮膚のＨＰＶ感染によって生じるいぼ、疣贅等々）を含んでもよい。皮膚の病変、たとえば、ＨＰＶ５型、８型、１４型、１７型、２０型によって誘発されるものは、臨床的に管理することが難しく、免疫抑制患者ではしばしば悪性腫瘍を伴う（Ｂｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　３，２３−２６，１９９２）。あるいは、尿生殖管のＨＰＶ感染の場合、サンプルは、粘膜細胞、特に子宮頚部細胞を含んでもよい。本発明の方法で使用するためのこのようなサンプルを入手して作成する方法は、当業者に周知であるか、又は本開示内容から明白になるであろう。
【００７２】
用語「前癌子宮頚部病変」は、臨床的に「前悪性」状態と説明することができ、治療しなければ、完全な悪性腫瘍に進行する可能性がある異常を指すことを意図する。上述の通り、このような病変は、たとえば、子宮頚部スメアテスト等によって日常的にスクリーニングされる。本発明を使用することにより、悪性腫瘍のより後期のためのテストと同時にＨＰＶ感染について、子宮頚部スメア等の方法で患者から入手した細胞を、より正確且つより迅速にテストすることが可能になる。
【００７３】
＜核酸スクリーニング＞
ＨＰＶ由来の核酸について細胞をスクリーニングする方法は、当技術分野で周知である。たとえば、ＨＰＶを包含する多数の生物を検出するための「Ｈｙｂｒｉｄ　Ｃａｐｔｕｒｅ」として知られるテストは、Ｄｉｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ｄｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ）から入手できる。最新の「Ｈｙｂｒｉｄ　Ｃａｐｔｕｒｅ　２」技術は、Ｄｉｇｅｎｅから入手可能な文献に説明されている。ハイブリッド捕獲技術は、感染した細胞中に存在する標的ＤＮＡにハイブリダイズするＲＮＡプローブに頼る。このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、アルカリホスファターゼ複合抗体及びケミルミネセント基質を使用して検出される。
【００７４】
ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブを使用した核酸ハイブリダイゼーションは、一般に、ＨＰＶの検出に適用できる。代替システムは、たとえば、適切なプライマーを使用したＨＰＶ核酸のＰＣＲに頼ることが可能である。
【００７５】
＜抗体＞
好ましくは、本発明によるタンパク質分子は、抗体分子又はその抗原結合変異形、たとえば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、「二重特異性抗体」等々を含む。この分子は、ノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、又は（たとえばファージ提示技術を使用した）スクリーニングによってライブラリーから選択される抗体の抗原−結合部分を含んでもよい。あるいは、分子は、他のポリペプチド、ペプチド、合成化合物又はＳＥＬＥＸ等の手順によって生成されるＲＮＡアプタマー又はＤＮＡアプタマーを含んでもよい。一部の好ましい実施形態では、分子のＥ４タンパク質への結合をモニタリングしやすくするために、この分子は、フルオロフォア、発色団、酵素又は放射標識等の標識部分を含む。このような標識は当業者に周知であり、たとえば、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、Ｐ−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、３５Ｓ又は１２５Ｉなどがある。他の例は、当業者に明白になるであろう。この標識は、場合によっては、抗体又は抗原結合変異形に複合化していてもよく、又は（標識がペプチド又はポリペプチドである場合）融合タンパク質として存在してもよい。
【００７６】
本発明の方法で使用される分子の少なくとも一部は、ある一定のＨＰＶ型のＥ４タンパク質に選択的に結合するが、他のＨＰＶ型のＥ４タンパク質に結合しないことが好ましい。従って、１つの実施形態において、本発明を使用して、患者を感染するＨＰＶの型を決定することができる。悪性疾患への進行（及び、従って臨床予後）は、ＨＰＶ型に大きく左右されるため、これは非常に意味深い。従って、本発明は、患者におけるＨＰＶ感染の型を決定する方法であって、患者の細胞のサンプルをＨＰＶ感染部位から入手するステップと；この細胞を、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の対象に特異的に結合する分子と接触させるステップと；上記結合をモニタリングするステップとを含むことを特徴とする方法を提供する。上記分子は、Ｅ４ポリペプチドに型特異的に結合し、ハイリスクＨＰＶ型を同定できることが好ましい。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質のアミノ酸残基ＲＰＩＰＫＰＳＰＷＡＰＫＫＨＲＲＬＳＳＤＱＤＳＱＴＰの領域内、又は他のＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の対応する親水性、酸／塩基に富む領域内の、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質に特異的に結合する、抗体分子、又はその抗原結合変異形の使用を教示する。
【００７８】
本発明による方法では、少なくとも１つの分子が結合するＥ４タンパク質の一部は、単一のＨＰＶ型Ｅ４タンパク質で構成されてもよく、異なる型の複数のＥ４タンパク質で構成されてもよい。この分子が結合するＥ４タンパク質が、全ての既知のＨＰＶ型のＥ４タンパク質は含まない場合、この分子の、細胞サンプル中に存在するＥ４タンパク質への結合又は非結合（場合に応じて）によって、研究者は、患者を感染するＨＰＶ型の同一性について推論することが可能になる。
【００７９】
実施に際して、異なるＨＰＶタンパク質に結合する複数の異なる分子を使用することが有利なことがある。このことは、患者に感染するＨＰＶの型の同定に役立つが、予後の指標として不可欠ではない。たとえば、感染性ＨＰＶ型をある特定のサブセットに限定できる（又はこのようなサブセットを除外できる）ことが有利なこともある。例として、粘膜ＨＰＶ６型、１１型、４２型、４３型及び４４型は、癌に進行するリスクは低いが、根治が困難なため、患者の人生に混乱を生じさせる外性器乳頭腫（尖圭コンジローム）と関連していることが判明している。よりハイリスクの粘膜１型、３３型、３５型、５１型、５２型、５８型、６１型及び１６型、１８型、４５型、５６型は、ハイグレードの子宮頚部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）及び癌に進行する可能性がある、無症候性の扁平ないぼ（扁平コンジローム）を引き起こす。悪性腫瘍に進行する最高のリスクは、ＨＰＶ１６、１８、４５及び５６型によって生じる病変に伴う。
【００８０】
ＨＰＶの異なるサブタイプに特異的な異なるプローブを、異なる標識で標識することが可能である。たとえば、ハイリスクＨＰＶ特異的プローブ全てを、単一の標識で標識し、ローリスクＨＰＶ特異的プローブは、単一であるが異なる標識で標識してもよい。このとき、テストオペレーターは、この標識に従って、サンプルと関連したリスクを容易に決定することができるであろう。蛍光標識は、このような環境で特に都合よく使用できるであろう。
【００８１】
標識に従って、細胞をリスクカテゴリーに分類することは、様々な方法で行うことができ、また、蛍光周波数および／または強度等の、標識発光の差に敏感な検出装置を使用して、自動化することができる。特に好都合な実施形態では、細胞をＦＡＣＳにより分類することが可能である。すなわち、細胞がハイリスク群に支配的に分類されることは、ハイリスクＨＰＶによる感染の存在を示す。
【００８２】
特定のＨＰＶ型に結合するが、他のＨＰＶ型に結合しない分子は、たとえば、無作為化技術及び選択技術によって作成することができる。こうした技術としては、ファージ提示、及び抗体又は他のポリペプチドを提示するのに適した他の技術；及び核酸結合性分子を作成する手順、たとえばＳＥＬＥＸ等のＲＮＡアプタマーなどがある。これらの手順は、当業者に周知であり、例を挙げて説明するために後述する。従って、本発明は、本明細書に記載の方法で有用な、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質を標的とするＨＰＶ−結合性分子を提供する。
【００８３】
本発明によれば、ＨＰＶ結合性分子は、ＨＰＶ　Ｅ４ポリペプチドの細胞外部分を標的とすることが好ましい。このような部分は、親水性の性質を有する傾向がある。従って、本発明による分子の少なくとも一部が、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の親水性部分に特異的に結合することが好ましい。
【００８４】
さらに、本発明は、分子（特に抗体分子又はその変異形）がかなり特異的に結合するＥ４タンパク質の特定の領域について説明する。相同の領域は全てのＨＰＶ　Ｅ４タンパク質に存在するが、この領域は、異なる型のＨＰＶ間でアミノ酸配列が異なる。この領域は、Ｅ４タンパク質における親水性のピークに相当し、多分、表面に露出している。この領域は、高度に帯電している（酸／塩基に富む）。ＨＰＶ１６型では、この領域のアミノ酸配列は（Ｎ末端からＣ末端まで）、ＲＰＩＰＫＰＳＰＷＡＰＫＫＨＲＲＬＳＳＤＱＤＳＱＴＰである。明らかに、他のＨＰＶ型のＥ４タンパク質のアミノ酸配列は、必ずしも１６型のものと同一ではないが、当業者は、従来のアラインメント及び配列比較用コンピュータープログラム（７０ぐらいの既知のＨＰＶゲノムうち約６５がクローニングされ、配列決定されている）を使用して他のＥ４タンパク質における対応する領域を容易に同定することができる。
【００８５】
従って、本発明は、ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質のＲＰＩＰＫＰＳＰＷＡＰＫＫＨＲＲＬＳＳＤＱＤＳＱＴＰのアミノ酸残基の領域、又は、好ましくはＤｏｏｒｂａｒら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８７，３５３−３５９，１９９２）によって同定された抗体ＴＶＧ　４０２以外の、他のＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の、対応する親水性の、酸／塩基に富む領域における、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質に特異的に結合する抗体分子、又はその抗原−結合変異形も含む。
【００８６】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質のアミノ酸残基ＲＰＩＰＫＰＳＰＷＡＰＫＫＨＲＲＬＳＳＤＱＤＳＱＴＰの領域、又は、他のＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の、対応する親水性の、酸／塩基に富む領域における、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質に特異的に結合する抗体分子、又はその抗原−結合変異形の、本発明に記載のＨＰＶ感染を検出するための使用を含む。
【００８７】
多数の異なるＨＰＶ型の、対応する親水性の酸／塩基に富む領域を図９に示す。図９には、コンセンサス型アミノ酸配列（「可能性が最も高い（ｍｏｓｔ−ｌｉｋｅｌｙ）」）を最上列に示し、ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の配列を下に示す。点はアラインメントを容易にするために導入したギャップを示し、ダッシュはコンセンサス配列と適合するアミノ酸残基を示す。図の右側の付番は、実際の又は予想されるＥ１＾Ｅ４スプライス部位からのアミノ酸残基の数を示す。この領域の親水性は異なるＨＰＶ型の間で保存されるが、実際のアミノ酸配列はかなり異なり、この領域に結合する試薬は極めてＨＰＶ型特異的であると考えられることを、当業者はアラインメントから理解するであろう。
【００８８】
好ましくは、本発明で使用するのに適した抗体は、領域ＲＲＩＰＫＰＳＰＷＡＰＫＫＨＲ（又は他のＨＰＶ型由来の対応するアミノ酸配列）内に、ＳＰＯＴＳエピトープマッピングシステムで同定される、結合部位を有する。特に好ましい分子は、極めて高いアフィイティを有するエピトープＰＫＰＳＰＷＡＰＫＫＨ（Ｒ）に結合し、且つ上述した本発明の方法で特に有用なＦａｂフラグメントＴＶＧ４０５である。
【００８９】
ＴＶＧ４０５エピトープのＣ末端における括弧内に示すアルギニン残基は、高いアフィニティ結合に不可欠ではない。
【００９０】
ＦａｂフラグメントＴＶＧ４０５は、発明者が、後述するファージ提示技術を使用して単離した。類似したファージ提示技術（及び適切なポリペプチド類又はその一部を用いたスクリーニング）を使用することにより、又は（周知のＭｉｌｓｔｅｉｎらのハイブリドーマ技術を使用して）ポリクロナール抗血清又はモノクロナール抗体を得るためのより旧来の免疫化技術（たとえばマウス、ウサギ、ラット等を、ＨＰＶ又は細胞増殖タンパク質、又はこのようなポリペプチド類の一部に対応するペプチド類で免疫化する）を使用することにより、異なる抗体又はＦａｂフラグメントを容易に得られることを、当業者は理解するであろう。競合抗体分子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）により記載されている、適切なＤＮＡ配列を接合するための標準ＤＮＡ操作技術を使用して、（たとえば、ファージ提示技術で単離された）Ｆａｂコード配列から容易に調製することができる。
【００９１】
同様に、標準ＤＮＡ操作技術を使用して、抗体又はその抗原結合変異形をコードするＤＮＡ配列を修飾することができる。異なる結合特異性又はアフィニティを有する修飾された抗ＨＰＶ又は抗細胞増殖マーカー抗体を産生するために、特に部位指定突然変異誘発又はＰＣＲを使用して、コード配列を使用することができる。あるいは、Ｆａｂ、Ｆｖ又は抗体等々の結合部位を含む融合タンパク質を調製することが可能である。
【００９２】
ＨＰＶポリヌクレオチド類又はポリペプチド類を結合できる分子又は細胞増殖マーカーを、抗ウイルス剤又は抗癌剤、又はこのような薬剤の一部として使用することができる。たとえば、上述の抗体分子又はＥ４結合ペプチドを、この目的に使用することができる。しかし、好ましくは、Ｅ４タンパク質および／またはそれに結合できる分子を使用し、合理的な薬剤デザインによって、Ｅ４結合性分子、好ましくは小さい分子をデザインすることができる。本発明は、さらに、乳頭腫ウイルスおよび／または乳頭腫ウイルスに感染した細胞を破壊することができる抗ウイルス剤を目標とする、Ｅ４に結合できる分子の使用に関する。このような分子は、抗癌剤又は抗ウイルス剤に任意に複合化された、上述し、本明細書に例をあげて説明した、抗体またはペプチドであってもよい。
【００９３】
このような方法は、それに結合できる適切なポリペプチド又は分子の結晶化を含むことが好ましい。さらに好ましくは、このような方法は、ポリペプチド及びバインダーの共結晶化を含む。このような手順は、ポリペプチドと結合性分子との間の相互作用に関する情報を与え、これを使用して、結合相互作用を真似ることができる小さい分子をデザインすることができる。
【００９４】
結晶化は、たとえば、ペプチド又はペプチド複合体の溶液を、低濃度の、結晶形成に必要な沈澱剤を含む「リザーバー緩衝液」と、好ましくは１：１の比率で混合することによる、結晶化緩衝液の調製を含む。結晶形成の場合、たとえば、沈澱剤の添加により、たとえば滴定により、又は結晶化緩衝液とリザーバー緩衝液との間の拡散によって沈澱剤の濃度の均衡を保つことにより、沈澱剤の濃度を上昇させる。適当な条件では、沈澱剤のこのような拡散は、沈澱剤の勾配に沿って、たとえば、より高濃度の沈澱剤を有するリザーバー緩衝液から、より低濃度の沈澱剤を有する結晶化緩衝液中に起こる。拡散は、たとえば、共通の気相で拡散させることができる蒸気拡散技術によって実現することができる。既知の技術は、たとえば、「ハンギングドロップ」方法又は「シッティングドロップ」方法等の蒸気拡散法である。蒸気拡散方法では、タンパク質を含有する結晶化緩衝液の滴を、はるかに大きいリザーバー緩衝液のプールの上に懸垂するか、又は側に置く。あるいは、結晶化緩衝液とリザーバー緩衝液とを隔て、また、タンパク質のリザーバー緩衝液中への希釈を防止する半透膜を介して、沈澱剤の均衡を達成することができる。
【００９５】
結晶化緩衝液では、ペプチド又はペプチド／結合パートナー複合体は、３０ｍｇ／ｍｌまで、好ましくは約２ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌの濃度を有することが好ましい。
【００９６】
結晶の形成は、以下のパラメーターによって本質的に決定される様々な条件で達成される：ｐＨ、塩類及び添加物の存在、沈澱剤、タンパク質濃度及び温度。ｐＨは、約４．０〜９．０の範囲であってもよい。緩衝液の濃度及びタイプは、どちらかといえば重要ではなく、従って、所望のｐＨに応じて調節可能である。適当な緩衝液系としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液及びＨＥＰＥＳ緩衝液などがある。有用な塩類及び添加物としては、たとえば塩化物、硫酸塩及び実施例１に明記されているさらなる塩類などがある。緩衝液は、水混和性有機溶剤、好ましくは、１００〜２００００、優先的に４０００〜１００００の分子量を有するポリエチレングルコール、又は適当な塩、たとえば、硫酸塩、特に硫酸アンモニウム、塩化物、クエン酸塩又は酒石酸塩からなる群から選択される沈澱剤を含有する。
【００９７】
本発明による関心のあるペプチド、又はペプチド／結合パートナー複合体の結晶は、たとえば、重原子誘導体化により、化学的に修飾することが可能である。簡単に記載すると、このような誘導体化は、結晶及び結合を通ってタンパク質の表面に拡散することができる、重金属原子塩類、又は有機金属の化合物、たとえば塩化鉛、チオリンゴ酸金、チメロサール又は酢酸ウラニルを含有する溶液に、結晶を浸漬することによって達成できる。結合した重金属原子の位置は、浸漬した結晶のＸ線回折分析で決定することができ、この情報は、たとえば、ペプチドの３次元モデルの構築に使用することができる。
【００９８】
三次元モデルは、たとえば、結晶の重原子誘導体および／または結晶化によって与えられる構造データの全部又は一部から得られる。このようなモデルの組立ては、相同モデル化および／または分子置換を含むことが好ましい。
【００９９】
予備的相同モデルは、配列アラインメントと、配列が判明しているタンパク質、二次構造の予測及び構造ライブラリーのスクリーニングのいずれかとの組合せによって作成することができる。たとえば、ＨＳＶ　１６及び３４　Ｅ４の配列を、本明細書に記載の通りに整列させることができる。
【０１００】
計算ソフトウェアを使用して、ペプチド又はペプチド複合体の二次構造を予測することができる。このペプチド配列を、構造に組み込むことができる。構造的非干渉性、たとえば、挿入物／欠失を取り巻く構造フラグメントは、所望の長さ及び適当なコンフォメーションを有するペプチドの構造ライブラリーをスクリーニングすることによってモデル化することができる。側鎖コンフォメーションを予測するためには、側鎖回転異性体ライブラリーを使用してもよい。
【０１０１】
最終的な相同モデルは、適当なコンピューターソフトウェアを使用した分子置換によるペプチドの結晶構造の解明に使用される。この相同モデルは、分子置換の結果に従って配置され、分子力学計算及び結晶化に使用されるインヒビターの電子密度への組み入れを含むさらなる洗練に付される。
【０１０２】
同様のアプローチを使用して、抗体及び抗体フラグメント、たとえば本発明で使用されるものを含む、ＨＰＶ結合性ポリペプチド、又は細胞増殖結合性ポリペプチド結晶化し、その構造を決定することが可能である。
【０１０３】
意外なことに、Ｅ４発現は、ＨＰＶ感染細胞における増殖型ＤＮＡ複製と強い相関関係があることが確認されており、そのため、Ｅ４発現の検出は、ＨＰＶ感染の特に適切な指標となり、従って、前癌子宮頚部病変のスクリーニングで特に有用である。
【０１０４】
ＨＰＶ検出による、他の利用できる子宮頚部スクリーニング方法は、ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく。この方法は、細胞溶解又は透過処理を含み、ＥＬＩＳＡ−型９６ウェルフォーマットで実施される。ハイブリダイゼーションは、ウェルの１つの変色として最終的に可視化される。
【０１０５】
本発明の抗体は、類似した方法で使用できる（すなわち、細胞溶解後）が、組織病理学研究所で、より容易に日常的に実行されるであろう、より迅速な手順で容易に実施できる。子宮頚部細胞を含むサンプルは、通常通りに採取してもよい。たとえば、本明細書に例を挙げて説明されている、当技術分野で周知の技術を使用して、サンプルを、たとえば顕微鏡スライド上又は他の支持体上に広げ、たとえば、抗Ｅ４　Ｆａｂで染色する。検出は、二次抗体−酵素複合体（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）を用いて実施してもよく、又はＦａｂを、たとえばＦＩＴＣ等のフルオロフォアに、直接複合化させてもよい。このアプローチは、抗体検出の感度を高めるために現在利用できるシステムと一緒に使用できるように改変することが可能である。現在、子宮頚部スメアは、日常的に顕微鏡で検査している。提案するアプローチは、新しい設備を必要とせず、既存の方法と容易に適合できるであろう。
【０１０６】
＜子宮頚部スメアの染色＞
子宮頚部スメアの抗体染色に関する１つのプロトコールは以下の通りである。　用時調製したスメアを５０：５０アセトン：メタノールで５分間固定する。（スメアを「Ｃｙｔｏｆｉｘ」で予め固定しておいた（スクリーニングセンターに安全に輸送できるように、採取したときに、ＵＫにおける標準用法で、スメアサンプルを処理するアルコール処理及びワックス処理）場合の代替開始点は、メチレーテッド・スピリットに１０分間浸漬することによるＣｙｔｏｆｉｘの除去であることに留意されたい。スメアが他の保護層で被覆されているのであれば、任意の適切な処理を用いて、サンプルを抗体染色に曝露してもよい）。
Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水（ＴＢＳ）で５分間洗浄する。
ＴＢＳ中４ｍＭデオキシコール酸ナトリウムで１５分間、洗浄して透過処理する。
ＴＢＳ＋０．３％　トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ１００で５分間洗浄する。
ステップ４を繰り返す。
ＴＢＳ＋０．０２５％　トリトン　Ｘ１００で５分間洗浄する。
組織を乾燥させずに、余分の液体を排出する。
スライドを加湿チャンバ内に移し、ＴＢＳ中１０％のヤギ血清試薬２００μｌを、各スライド上に最低限２時間（又は一晩）載せる。
組織を乾燥させずに、余分の液体を排出する。
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ及び１％ＢＳＡを含有するＴＢＳで希釈した一次抗体２００μｌを、各スライド上に載せ、軌道式シェーカー上、４℃で一晩放置する。スライドをラックに移し、ＴＢＳ＋０．３％トリトン　Ｘ１００で５分間洗浄する。
ＴＢＳ＋０．０２５％トリトン　Ｘ１００で５分間洗浄する。
ステップ１２を繰り返す。
組織を乾燥させずに、余分の液体を排出する。
スライドを加湿チャンバ内に移し、各スライド上に、２００μｌのビオチニル化ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｄａｋｏ）（１：５００、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ中）を１時間載せる。
スライドが二次抗体中にある間に、ＳＡＢＣ溶液を準備する。
スライドをラックに移し、ＴＢＳで５分間洗浄する。
スライドを、０．６％過酸化水素を含む内因性ペルオキシダーゼ遮断剤中に１０分間浸漬する。
ＴＢＳで５分間洗浄する。
ステップ１９を２回繰り返す。スライドを加湿チャンバ内にいれ、各スライド上に、ＳＡＢＣ溶液２００μｌを、３０分間載せる。
スライドをラックに移し、ＴＢＳで５分間洗浄する。
ステップ２２を繰り返す。
ＤＡＢ溶液中で１０分間現像する。
流水で５分間洗浄する。
スライドを、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン溶液に６秒間浸漬する。
流水で１分間洗浄する。
０．５％塩酸で１〜２秒間分別する。
流水で５分間洗浄する。
５０％メタノールで２分間すすぐ。
７０％メタノールで２分間すすぐ。
９０％メタノールで２分間すすぐ。
１００％メタノールで２分間すすぐ。
Ｏｒａｎｇｅ　Ｇ使用液に２分間浸漬する。
１００％メタノールで７秒間すすぎ、穏やかにかき混ぜる。
ステップ３５を繰り返す。
ＥＡ５０溶液に２分間浸漬する。
１００％メタノールで７秒間すすぎ、穏やかにかき混ぜる。
ステップ３８を繰り返す。
スライドをキシレンに浸漬し、５分間透徹する。
ステップ４０を２回繰り返す。
ＤＥＰＥＸマウンタント（ｍｏｕｎｔａｎｔ）を使用して、カバーグラスをかける。
【０１０７】
類似した様式で免疫蛍光用スメアを作製する。二次抗体の後、スメアを、ストレプトアビジンＦＩＴＣ複合抗体中で１時間インキュベートし、ヨウ化プロプジウム（ｐｒｏｐｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ）／ＲＮＡｓｅ　Ａ（両者ともＳｉｇｍａ、５０ｎｇ／ｍｌ）でＤＮＡを対比染色し、次いで洗浄し、グリセロール／ＰＢＳ／フェニレンジアミンでマウントする。
【０１０８】
本発明の態様で使用するための好ましい結合性分子としては、抗体、標的の天然リガンド及びＴ−細胞受容体結合ドメインなどがある。
【０１０９】
本発明は、子宮頚部異常をスクリーニングするための新しいアプローチを提供する。
【０１１０】
この分野の先行技術は、以前に我々が開発した乳頭腫ウイルスの存在に関する診断テスト（例えば、ＷＯ　９８／２５１４５号）を含む。こうしたテストは、主として抗体を使用したウイルス成分の検出に頼り、ウイルス感染の状態に関するこの情報を、よりハイグレードの病変又は子宮頚癌に先行する悪性腫瘍が発生する可能性の指標としてとして使用する。
【０１１１】
異なる、関係のない先行技術文書では、異常増殖細胞用の、子宮頚部サンプルを含む、血液、生検、体液の組織サンプル検査することにより、悪性腫瘍についてスクリーニングするアプローチを教示している（ＷＯ　９９／２１０１４号）。このアプローチは、通常は細胞内にある、ヒト細胞周期滲出ポリペプチドの検出に頼り、異所的に増殖しているヒト細胞系統の存在の指標を提供する。
【０１１２】
明らかに、上記２つのアプローチは、免疫学的試薬の使用等の、幾つかの生物学的エレメントを共有するが、両者は原則として、また実際に、非常に異なる。前者は、ウイルスの生活環、及びウイルス感染の特定のサブタイプの特性決定に関する情報の収集に基づき、この情報をより重篤な病変が発生する可能性に関連付ける。これにひきかえ、後者のテストは、様々なソースからのヒト細胞の細胞分裂状態のモニタリングと厳密に関連し、この情報をサンプル中の悪性腫瘍の有無に関連づけることを目的とする。
【０１１３】
本発明は、こうした２つの異なるテストを合併して、従来のＰａｐスメアテストプログラムより、又は個々に適用したいずれのテストより、多くの情報をより迅速にもたらす、はるかに簡単なアプローチを提供する。
【０１１４】
本発明は、Ｅ７によって誘導されるため子宮頚部病変に存在するＰＣＮＡ、ＭＣＭ及びサイクリンＡ等の遺伝子に対する抗体と、Ｅ４に対する抗体とが結び付けられているダブル染色及びトリプル染色に基づく。従って、これらのタンパク質は、Ｅ７活性の代理マーカーであると考えられる。先行技術は、子宮頚部病変におけるＭＣＭの発現を、このような遺伝子が事実上Ｅ７活性のマーカーであることと関連させていない。ＨＰＶ１、ＨＰＶ２及びＨＰＶ１１によって生じる増殖性感染におけるＥ４及びＭＣＭの分析により、ＨＰＶ１６によって生じる不稔感染（ａｂｏｒｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）にあっては変化する発現パターンが、増殖性感染にあっては共通の発現パターンであることを明らかにする。このことは、ダブル染色アプローチを使用しなかった今までの研究からは、予測できないであろう。
【０１１５】
同一サンプルを使用して、単独の個々のテストよりはるかい多い情報を提供できることは、本発明の利点である。
【０１１６】
ウイルス感染及びよりハイグレードの悪性腫瘍を同一テストでスクリーニングすることによって、１つのサンプルを入手しさえすれば、患者のはるかに広い状態像が得られる。
【０１１７】
子宮頚部病変につながる「早期」事象（すなわちＨＰＶ感染）をスクリーニングし、その間に、悪性腫瘍のその後のステージについてサンプルを同時に検査することによって、より良好な予後を得ることが可能である。
【０１１８】
さらに、従来のスメアテストが、高率の擬陰性をもたらすことは周知であるが、２の全く異なるテストを、本発明の唯一の手順に組み合わせることにより、このような擬陰性が発生する機会がはるかに減少する。
【０１１９】
本発明のさらなる利点は、同量の情報を得るために、より少ないサンプルしか必要としないことである。たとえば、患者がＨＰＶ感染に罹っていることが分かった場合、医師は、さらなる検査のためにその患者を呼び戻す必要があるが、本発明の方法を使用することによって、より多くの情報が最初の段階で得られ、その結果、テストを実施するスタッフ、及びそれらを解釈する者の負担が軽減する。
【０１２０】
さらに、患者は、概して、スメアテスト手順は快適でないことを知る。多くの患者は、スメアテスト手順は厄介で不愉快なことが分かり、従って、多少の繰り返し又はさらなるテストの必要性を軽減することが可能な本発明の方法を使用することによって、より少ないサンプルを回収すればよいことにより、患者の苦痛を直接減少させることが可能である。
【０１２１】
１つより多い状態について同一サンプルを同時にテストすることによって、テスト間を交差比較するための強力な手段が手順に導入される。たとえば、テストが異なるサンプルで独立に実施されたのであれば、比較されなかったであろう、相対的染色強度が有意義に比較される。これは、本発明の方法によって提供される相乗作用をもたらす利点のもう１つの例である。
【０１２２】
子宮頚部スクリーニングにおける問題の１つは、特に先進諸国では、一部の女性で、テストとテストの間の期間がしばしば長いことである。これは、疾患の早期専用のテストでは、サンプルを検査するときまでに、これらが既に見過ごされてしまった可能性があり得ることを意味する。同様に、疾患の後期のみをモニタリングするのであれば、患者は陰性テストを間違いなく与えられるが、介在期間中に疾患が発生し、およそ５年以上後の次のテストでは、危険な進行した状態にある可能性がある。
【０１２３】
従って、ＨＰＶ感染等の先行する状態と、異常な細胞増殖等のその後のステージの両者の同時アッセイを可能にする本発明の方法を使用することは、明らかに有利である。この方法の場合、本発明によれば、疾患が初期の段階であれ、より危険な進行した状態であれ、患者がテストのためにやってくる時はいつでも、疾患が検出されるはずである。
【０１２４】
さらに、本発明によるテスト手順を組み合わせることにより、医師は、患者の状態のよりよい全体像が与えられる。ＨＰＶ感染のみを有すること、又は孤発的な進行病変を有すること、又は異なる発生ステージにある多数の異なる異常を有することがあり得る。本発明によるテストを組み合わせることにより、患者の状態を認識すること、及び適切に治療計画を立てることが実質的に容易になる。
【０１２５】
加えて、組織学的サンプルの複雑な解釈の必要性が著しく軽減されることは、本発明の利点である。本発明の方法は、高度な訓練を受けた技術者が、細胞の状態をその外見で判断する必要がある従来のスメアテストより、採点することが容易な分子テストを使用する。本発明による分子テストは、単純な陽性又は陰性様式で採点することができ、難しい判断を下す必要はほとんどない。それどころか、簡単な自動化の役に立つことは、本発明の利点である。２つ以上の異なる波長を読み取るようにプログラムすることが可能な蛍光読取装置を又は類似した装置を使用して、テストを採点すること、従って、先行技術の方法が提供する１つの状態とは対照的に、サンプルの様々な有り得る状態に関する情報を提供することが可能であろう。
【０１２６】
検出の標準方法は改変できると考えられる。細胞が懸濁状態の間に抗体結合を実行し、分析前に細胞を遠沈することが可能である。こうすることにより、スクリーニングの質が向上する。
【０１２７】
診断における多大な尽力は、スクリーニング方法を自動化するためである。ＨＰＶ又は細胞増殖マーカー検出のための抗体又はその抗原結合変異形の使用により、自動化が大幅に促進される。
【０１２８】
次に、実例を挙げて本発明を説明する。
【０１２９】
［実施例１］
＜抗Ｅ４モノクロナールおよびポリクロナール免疫グロブリンの作製＞
ＨＰＶ１６　Ｅ１＾Ｅ４に対するモノクロナール抗体（Ｍａｂ）については、今までに記述されており（ＴＶＧ４０１、４０２、４０３；Ｄｏｏｒｂａｒら、１９９２）、これらの試薬は、Ｅ４の主要抗原部位における１つの重複エピトープを認識し、永久保存用組織生検（ａｒｃｈｉｖａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ）でタンパク質を検出しないと報告されている（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９９２）。
【０１３０】
こうした結果から、Ｅ４は、ＨＰＶを免疫学的に検出するための候補ではないと考えられるが、ＨＰＶ１６　Ｅ４のＮ末端およびＣ末端を標的とするさらなる抗体を作成する。
【０１３１】
標準ハイブリドーマ技術によってさらなるモノクロナール抗体を作成すことにより、ＴＶＧ４０４（タンパク質のまさにそのＣ−末端におけるエピトープを認識するＩｇＭである）を単離する。
【０１３２】
この試薬を完全にするために、タンパク質のＮ−末端に対するポリクロナール抗血清を、Ｎ末端合成ペプチド（Ｅ４　Ｎ　ｔｅｒｍ）に対して生じさせる。マルトース結合性タンパク質Ｅ４融合タンパク質（ＭＢＰ−Ｅ４）でウサギを免疫化することにより、（ＨＰＶ１６及びＨＰＶ６３　Ｅ４タンパク質に対する）ポリクロナール抗体を作製する。精製グルタチオンＳトランスフェラーゼＥ４融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｅ４）を使用して、ＥＬＩＳＡで、抗体価をモニタリングする。
【０１３３】
Ｃ末端のシステイン残基を介してチログロブリン又はキーホールリンペットヘモシアニンに結合させた後、タンパク質のＮ−末端に対する抗体を、合成ペプチドＭＡＤＰＡＡＡＴＫＹＰＬＣに対して生じさせる。結合は、Ｇｒｅｅｎら（１９８２）により記載されている通りに、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を使用して実行する。
【０１３４】
抗体特異性は、以下の通りに、エピトープマッピングによって確認する：ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質は、ＳＰＯＴＳエピトープマッピングシステム（Ｇｅｎｏｓｙｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して、固相ｆｍｏｃ化学により、一連の８５重複オクタマーとして合成する（単一アミノ酸の重複）。合成の精確さは、タンパク質の主要抗原部位を結合するＨＰＶ１６　Ｅ１＾Ｅ４モノクロナールＴＶＧ４０２を使用して確認する（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９９２）。製造会社による記載通りにフィルターを再生し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で、抗体結合を可視化する。ポリクロナール血清は、１／２５０希釈、精製Ｆａｂはおよそ１ｇ／ｍｌ、ハイブリドーマ上澄は１／１０希釈で、使用する。
【０１３５】
図１Ａでは、８５重複Ｅ４合成ペプチドの配列を図の上方に示し、エピトープマッピング実験結果を下方に示す。濃いスポットは、その上に示されている合成ペプチドへの抗体の結合を示す。各抗体と反応するペプチドを含有するフィルターの部分のみを表示する。
【０１３６】
図１Ｂでは、Ｅ１＾Ｅ４アミノ酸配列上のエピトープの位置を、ＨＰＶ１６　配列の上にまとめてある。７０の想定されるＥ１＾Ｅ４配列の比較によって作製されたコンセンサスＥ４配列によるアラインメント（Ｄｏｏｒｂａｒ　ａｎｄ　Ｍｙｅｒｓ，１９９６ｂ）を、ＨＰＶ１６　Ｅ１＾Ｅ４配列の下に示し、ＨＰＶ１　Ｅ１＾Ｅ４タンパク質の配列をこの下に示す。既存のＨＰＶ１　Ｅ１＾Ｅ４Ｍａｂ（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９８８）の結合部位を、ＨＰＶ１配列の下に示す。ＨＰＶ１のＥ１＾Ｅ４タンパク質における、１６Ｋ及び１０／１１Ｋ遺伝子産物を生じさせるタンパク質分解的切断部位（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９４）を、ＨＰＶ１配列の下に示し、ＨＰＶ１６のＥ１＾Ｅ４配列における、想定される部位の予測を可能にする。
【０１３７】
［実施例２］
＜合成免疫グロブリンの作製＞
後述の通り、ｆｄバクテリオファージ上に提示された合成抗体からＦａｂを単離する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４）。イムノチューブ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を、濃度０．１ｇ／ｍｌのＭＢＰ−Ｅ４又はＧＳＴ−Ｅ４のいずれかで、４℃にて一晩被覆する。次に、これらを、ＰＢＳ／２％ｍａｒｖｅｌ（登録商標）中、３７℃にて１時間ブロックしてから、１０１１ファージの存在下、血液チューブ回転装置（３７℃）上でインキュベートする。未結合のファージを流し出し、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０でチューブを洗浄する（１０×）。１００ｍＭトリエチルアミンｐＨ１１．０（１ｍｌ）でバインダーを溶離し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で直ちに中和した後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＧ１細胞に再導入する。濃縮ライブラリーを成長させ、選択手順をさらに３回繰り返す。
【０１３８】
ＭＢＰタンパク質又はＧＳＴタンパク質に対する抗体を単離しないために、６．５×１０１０の範囲を使用して、ＧＳＴ　１６　Ｅ１＾Ｅ４及びＭＢＰ　１６　Ｅ１＾Ｅ４に対してファージ選択を交互に実行する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４）。ＭＢＰ　１６　Ｅ４は、ＧＳＴ融合（およそ５ｍｇ／リットルの細菌）より高レベル（＞５０ｍｇ／リットルの細菌）で発現されるが、いずれにしても、抗体単離には１ｇという僅かな抗原を必要とする（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２）。Ｅ４に対するアフィニティを有する抗体提示ファージを（ＧＳＴ−Ｅ４、ＭＢＰ−Ｅ４、ＧＳＴ及びＭＢＰに対する）ＥＬＩＳＡで同定し、活性をファージウエスタンブロッティングで確認する。免疫グロブリン遺伝子を、単離ファージから、細菌発現ベクターｐＵＣ１１９．Ｈｉｓ．ｍｙｃに移行し（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４）、ニッケル−ＮＴＡクロマトグラフィ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ　ＵＫ）で誘導される細菌の細胞膜周辺腔から可溶性Ｆａｂを精製する。抗体価をＥＬＩＳＡで確定する。
【０１３９】
４ラウンドの選択後、Ｅ１＾Ｅ４、非融合ＧＳＴ又はＭＢＰ、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかに結合できる能力について、各クローンを試験する。（１００中）４７クローンが、ＭＢＰ　１６　Ｅ１＾Ｅ４に結合することができ、そのうち３９が、ＧＳＴ　１６　Ｅ４も結合できる。こうしたクローンの中で、ＢＳＡ、ＧＳＴ又はＭＢＰと相互に作用するものはなかった。ＢｓｔＮＩフィンガープリント（Ｍａｒｋｓら、１９９２：Ｎｉｓｓｉｍら、１９９４）で、これらのクローンの中の３つの異なるＦａｂｓが明らかにされ、可溶性抗Ｅ４　Ｆａｂの産生を可能にするために（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４）、それらの免疫グロブリン遺伝子を原核生物発現ベクターｐＵＣ１１９Ｈｉｓ．６ｍｙｃにサブクローニングした。およそ５ｍｇ（細菌１リットル当たり）の抗Ｅ４　Ｆａｂ（ＴＶＧ４０５、４０６及び４０７）を誘導細菌の細胞膜周辺腔から抽出することができ、全てが、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロッティングでＥ１＾Ｅ４を特異的に検出する。Ｆａｂ　ＴＶＧ　４０７は、ハイブリドーマ−由来のＭａｂであるＴＶＧ　４０９によって認識されるものと同一のエピトープを結合する（図１）。残りの合成のＦａｂは、Ｅ４のこの主要抗原領域の上流（ＴＶＧ　４０５）又は下流（ＴＶＧ　４０７）にある新規なエピトープを認識し、その結果を図１に示す。
【０１４０】
ＴＶＧ４０５Ｆａｂ及びＴＶＧ４０７ＦａｂのＣＤＲ３ループのアミノ酸配列は以下の通りである：
（ＴＶＧ４０５）
重鎖ＣＤＲ３配列：ＬＬＲＧＡＦＤＹ
軽鎖ＣＤＲ３配列：ＮＳＲＤＳＳＧＧＮＡＶ
（ＴＶＧ４０７）
重鎖ＣＤＲ３配列：ＬＶＱＧＳＦＤＹ
軽鎖ＣＤＲ３配列：ＱＡＤＳＳＴＨＶ
【０１４１】
＜抗体アフィニティの測定＞
ＢＩＡｃｏｒｅ　２０００機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ，ＵＫ）を使用し、製造会社による記載通りに、表面プラスモン共鳴で、合成Ｆａｂ（ＴＶＧ４０５、ＴＶＧ４０６及びＴＶＧ４０７）、及びハイブリドーマ由来のＦａｂ（ＴＶＧ４０２）のアフィニティを分析する。０．５％ＳＤＳ、１ｍＭメルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）中、還元条件で、ＭＢＰ−Ｅ４凝集体を解離させ、６：１のビオチン：タンパク質モル比でＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ；ＤＭＳＯ中２５ｍｇ／ｍｌ）を使用して、ビオチニル化する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９１）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ２００　ＨＲ１０／３０カラムを使用し、６Ｍ　尿素／１ｍＭメルカプトエタノール／ＰＢＳ／０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）で作動するＦＰＬＣクロマトグラフィで単量体ＭＢＰ−Ｅ４を回収してから、ストレプトアビジン−被覆センサーチップに結合させ、ＰＢＳ／０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ／０．１ｍｇ／ｍｌ無プロテアーゼＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）中、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで「リフォールディング」させる。Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ　Ｆａｂキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用して、精製ＴＶＧ　４０２からＦａｂを単離し、ＦＰＬＣゲルクロマトグラフィ（ＰＢＳ／０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）で作動するＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ２００　ＨＲ１０／３０カラム）で、単量体調製物を得る。６Ｍ尿素カラム緩衝液（上述の通り）を使用して、センサーチップ表面を再生する。専用の「ＢＩＡａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアを使用して、非線形曲線フィッティングによりオンレートおよびオフレートを導出する。
【０１４２】
結合活性は、細菌誘導性抗体では総タンパク質レベルの２０％程度であり、ハイブリドーマ培養上澄から誘導されるＦａｂでは５０％である。ＴＶＧ４０５及びＴＶＧ４０２のアフィニティは、ＢＩＡｃｏｒｅ結合曲線セットへの非線形曲線フィッティングで得られるオンレートおよびオフレートから算出する。
【０１４３】
図２Ａは、上述のＭＢＰ−Ｅ４融合タンパク質で被覆されたＢＩＡｃｏｒｅチップ上を、Ｆａｂ　ＴＶＧ４０５を通過させた後で得られる結合曲線（センサーグラム）のオーバーレイを示す図である。Ｆａｂ濃度は、１０ｍＭ（一番下の曲線）から、５つの中間希釈を経て、３００ｎＭ（上方の曲線）までの範囲である。結合の程度は、Ｙ軸上の時間（秒）に対するＸ軸上の共鳴単位で表示する。およそ１００秒に、精製Ｆａｂを注入し、７００秒に洗浄を開始する。ＴＶＧ４０５のアフィニティ（Ｋｄ）は、ソフトウェア（Ｐｈａｎｎａｃｉａ，ＵＫ）を使用した会合曲線及び解離曲線の分析で、０．３〜１．２５ｎＭであると算出される。
【０１４４】
図２Ｂは、濃度範囲１００ｎＭ〜１Ｍの、ハイブリドーマ由来のＦａｂ　ＴＶＧ４０２に関する結合曲線（上述の通り）のオーバーレイを示す図である。Ｋｄは７０ｎＭであると推定される。
【０１４５】
ＴＶＧ４０５は、会合速度定数（ｋｏｎ）１．８×１０６Ｍ−１．ｓ−１及びおよそ１ｎＭのモル解離（Ｋｄ）を示すオフ速度（ｋｏｆｆ）２×１０３ｓ−１を有する。最も優れたハイブリドーマ−由来の抗体（ＴＶＧ４０２）は、僅か７０ｎＭというアフィニティを有し、４．２×ｌ０４Ｍ−１．ｓ−１というｋｏｎ及び３×ｌ０３Ｓ−１というｋｏｆｆ値を有していた。ＴＶＧ４０６及び４０７は急速な動態を示すため、ＴＶＧ４０７について示した平衡結合データの分散分析で検査する。
【０１４６】
図２Ｃは、急速な動態を示すＦａｂ　ＴＶＧ４０７の平衡結合曲線を示す図である。図２Ｄは、ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用した、図２Ｃに示すデータの分散分析を示す図である。ビオチンでブロックした表面からの値を、図２Ｃに示す値から減算することにより、平衡値を、バルク屈折率変化について補正する。表示のプロットで、勾配は−Ｋｄであり、Ｙ軸切片は「Ｒｍａｘ」、すなわち、Ｆａｂ飽和における結合レベルである。ＴＶＧ４０７及びＴＶＧ４０６に関する未補正のＫｄ値は２５０ｎＭ及び１４０ｎＭであり、これは、Ｆａｂ調製物の活性を考えるとき、５０ｎＭ及び２８ｎＭという事実上のアフィニティを示す。
【０１４７】
ＴＶＧ４０７は、生物学的活性について補正した後、５０ｎｍというアフィニティ（Ｋｄ）を有し、ＴＶＧ４０６は、２８ｎＭというアフィニティ（Ｋｄ）を有する。重鎖ＣＤＲ３ループ及び軽鎖ＣＤＲ３ループのアミノ酸配列を、ＤＮＡシークエンシングで確定し、さらに、３抗体が異なることを確認する。
【０１４８】
［実施例３］
＜抗Ｅ４ペプチドの作製＞
市販の２−ハイブリッドスクリーニングキットをＣｌｏｎＴｅｃｈから購入し、製造会社の説明書に従って、天然のＥ４−結合性ペプチドの同定に使用した。同供給者から入手したＨｅＬａ　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。この方法で、Ｅ４−結合ポリペプチドをコードする７つのＤＮＡ配列を単離し、シークエンシング後、その中の３つを同定した。
【０１４９】
第１のペプチドはフェリチンである。
【０１５０】
第２のペプチドはケラチンフィラメント結合タンパク質であり、配列番号２に記載の配列を有する。
【０１５１】
第３のポリペプチドは、独特の配列モチーフＤＥＡＤを含有するＤＥＡＤｂｏｘファミリーのタンパク質のメンバーとして認識される新規なポリペプチドである。第３のポリペプチドの配列を、配列番号３で示す。
【０１５２】
これらのポリペプチドとＥ４との間の相互作用の部位を同定するために、１０〜２０アミノ酸の長さの一連の重複ペプチドをＰＣＲで作製し、上述の通り、ファージ上に提示した。次に、スクリーニング剤としてバインダーを使用して、粘膜病変におけるＨＰＶ１６を同定した。
【０１５３】
［実施例４］
＜抗Ｅ４　ＲＮＡオリゴヌクレオチドの作製＞
標的分子に特異的に結合することできる、アプタマーとして知られるＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＳＥＬＥＸ等の選択手順で作製することができる。ＳＥＬＥＸ方法は、所望の標的に結合できる１本鎖核酸である、核酸アプタマーを、オリゴヌクレオチド類のライブラリーから選択することを含む。ＳＥＬＥＸ方法は、好ましくは、無作為配列のセグメントを含む、核酸類のライブラリーから出発し、結合に適した条件でライブラリーを標的と接触させるステップと、未結合の核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸から分離するステップと、核酸−標的複合体を解離させるステップと、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸類のリガンド濃縮ライブラリーにするステップと、次いで結合ステップ、分離ステップ、解離ステップ及び増幅ステップまでを、標的分子に対する、極めて特異的な高アフィニティ核酸リガンドを生成するのに必要なだけ多くのサイクルを何度も繰り返すステップとを含む。
【０１５４】
＜ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリー＞
２６塩基の無作為化部分を有する、７３塩基の長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｅ４を結合できるアプタマーの開発に使用した。以下の構造：
５’ ＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡ（２６Ｎ）ＴＴＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣ ３’
を有する合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーを作製した。
【０１５５】
ここで、Ｎは、ランダム領域における任意の可能な塩基を示す。オリゴヌクレオチドライブラリーの伸長における各ヌクレオチドの合成中に、４つのヌクレオチド全ての混合物（カップリング効率の差を考慮に入れて、６：５：５：４のＡ：Ｃ：Ｇ：Ｔ比）を使用することにより、ランダム領域を作製した。結果として生じる複雑度は、理論上４２６分子である。ゲル精製が後続する合成規模（０．１μｍｏｌ）で、８．８ｎｍｏｌが生じ、これは、実際に存在する異なる分子数に、およそ５×１０１５という絶対上限を課す。
【０１５６】
Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼに対する認識部位を導入する５′プライマー（５’ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡ ３’）及び（５’ ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡ ３’）を用いたＰＣＲ増幅で、以下の転写用鋳型が生じた：
５’ ＴＡＡＴＡＧＣＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡ（２６Ｎ）ＴＴＣＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣ ３’
【０１５７】
ＲＮＡ転写物それ自体は、以下の配列を有する：
５’ ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＵＡＡＡＣＧＣＵＣＡＡ（２６Ｎ）ＵＵＣＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＵＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣ ３’
【０１５８】
米国特許第５，２７０，１６３号に記載の従来のＳＥＬＥＸ手順を使用して、抗Ｅ４アプタマーを選択した。各ラウンドは、以下のステップからなる：
１）選択：ＲＮＡ及びＥ４タンパク質を混合し、３７℃でインキュベートし、ニトロセルロースフィルターを通過させて洗浄し、このフィルターからＲＮＡを溶離させる。
２）増幅：５０μｌの反応中に５０ピコモルの３′プライマーの存在下、Ｇａｕｓｓら（１９８７）に記載の条件で、ＡＭＶ逆転写酵素を用いて、フィルターから溶離したＲＮＡを伸長させる。このようにして得られるｃＤＮＡ合成に、５０ピコモルの５′プライマーを加え、１００μｌの反応体積で、Ｉｎｎｉｓ（１９８８）に記載の通りに、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて３０サイクル増幅する。
３）転写：Ｍｉｌｌｉｇａｎら（１９８７）に記載の通りに、選択された増幅鋳型にｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を実施し、その後、ＤＮａｓｅＩを加えて、ＤＮＡ鋳型を除去する。次いで、結果として生じる選択されたＲＮＡ転写物を、次のラウンドのステップ１で使用する。選択の歴史を追跡できるように、サイクルの各ステップで生成した生成物の１２分の１だけを、次のサイクルで使用する。選択方法の推移を、各ＰＣＲ反応からの標識転写物のフィルター結合アッセイでモニタリングする。第４ラウンドの選択及び増幅の後、選択して標識したＲＮＡ生成物は、Ｅ４への結合を生じさせる。このバインダーを、子宮頚部スメアに由来する細胞におけるＨＰＶの検出に使用する。
【０１５９】
［実施例５］
＜皮膚及び粘膜の病変におけるＨＰＶの検出＞
全ての合成Ｆａｂが、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織中のＨＰＶ１６　Ｅ１＾Ｅ４タンパク質を検出するが、ＴＶＧ４０５は、一貫して最高レベルの染色を示した（図３）。
【０１６０】
図３は、ＨＰＶ１６　Ｅ４に対する反応性を持たない（図３Ａ）Ｆａｂ　ＮＩＰ−Ｃ１１（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４）、及び本明細書に記載のＥ４特異的Ｆａｂ　ＴＶＧ４０５（図３Ｂ、Ｃ、Ｄ）によるローグレードＨＰＶ１６ＣＩＮ　Ｉの免疫染色で、ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質をｉｎ　ｖｉｖｏで定位するための合成Ｆａｂの使用を示す図である。Ｆａｂは、二次抗体として９Ｅ１０を使用し、続いて抗マウスＦＩＴＣ複合物を使用して検出される。Ｅ４は上皮系の上層で検出可能であるが、異なる病変間でレベルが大きく異なり、しばしば、ある程度の陽性細胞が認められるに過ぎない（Ｃ、Ｄ）。Ｃ及びＤでは、基底層の位置を矢印で示す。倍率は２００×である。
【０１６１】
マイクロ波処理によるエピトープ曝露は、Ｅ４検出の感度を高め、ＴＶＧ４０２を使用した染色さえ可能にする（Ｄｏｏｒｂａｒら、１９９２）。Ｅ４発現の程度は、異なる病変間で大きく異なり（Ｓ　ＨＰＶ１６関連ＣＩＮ１生検を試験する）、生検の全体にわたって散在するまばらな細胞のみでの発現（図３）から、感染性ビリオンの産生も高い（図４）ＨＰＶ１及びＨＰＶ６３によって生じる皮膚のいぼにおけるＥ４の分布に匹敵する、上皮系の最も分化した層の全体にわたって広範囲に及ぶ分布（図４）までの範囲である。ＨＰＶ１６によって生じるローグレード子宮頚部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ１）では、Ｅ４及びＬ１レベルは密接な相関関係があるが、以前に示唆された（Ｂｒｏｗｎら、１９９４）通り、２つのタンパク質の発現は同時に起こらないことが判明している。Ｅ４発現は、幾つかの細胞層による主要キャプシドタンパク質の合成に先行し（ダブル染色によって明らかである、図４参照）、ハイグレード子宮頚部病変（ＣＩＮ２／ＣＩＮ３）では、Ｌ１の発現がもはや裏付けられなくても、しばしばＥ４は多い（図４）。Ｅ４合成の開始と感染性ビリオンの組立てとの間の、この時間遅延は、Ｅ４発現が、感染した基底細胞の傍基底層への移動と同時に起こるが、Ｌ１の発現が、上方の顆粒層内の狭い１条の細胞に制限される、ＨＰＶ６３で最も明白である。
【０１６２】
図４から、ハイグレードＨＰＶ１６病変、ローグレードＨＰＶ１６病変、及び良性のいぼで、Ｅ４の合成が、キャプシドタンパク質の発現に直接連関していないことが分かる。図４は、抗Ｌ１抗血清（図４Ａ、Ｄ、Ｇ）、ＨＰＶ１６　Ｅ４　Ｆａｂ　ＴＶＧ４０５（図４Ｂ及び４Ｅ）、ＨＰＶ６３　Ｅ４に対するポリクロナール抗血清（図４Ｈ）、及びＤＡＰＩ（図４Ｃ、Ｆ、Ｉ）を使用したトリプル染色の結果を示す図である。Ａ、Ｂ及びＣは、ローグレードＨＰＶ１６誘導性病変（ＣＩＮ１）を示す。Ｄ、Ｅ及びＦは、ハイグレードのＨＰＶ１６誘導性病変（ＣＩＮ　ＩＩ／ＩＩＩ）を示す。Ｇ、Ｈ及びＩは、ＨＰＶ６３によって生じる疣贅を通る切片を示す。全ての場合に、Ｅ４発現はＬ１発現に先行するが、ＣＩＮ１における２〜３細胞層のみである（Ａ、Ｂ）。ＣＩＮ　ＩＩ／ＩＩＩでは、最終分化は、ビリオン構造タンパク質の合成を支持するのに不十分である（Ｄ）が、Ｅ４発現は豊富である（Ｅ）と、我々は推定した。Ｅ４発現の開始と、ウイルス構造タンパク質の検出との間の差異は、ＨＰＶ６３によって生じる皮膚の疣贅で最も明白であった（Ｇ、Ｈ）。基底層を、ＤＡＰＩ染色画像上の矢印で示す。倍率は１００×である。
【０１６３】
＜増殖型ウイルスＤＮＡ複製の開始及びＥ４の発現は同時に起こる＞
増殖型ウイルスＤＮＡ複製は、中有棘層の細胞で始まり、Ｅ４発現の開始と厳密な相関関係があることが分かる（図５）。
【０１６４】
図５から、増殖型ウイルスＤＮＡ複製の開始は、ローグレードＨＰＶ１６病変及び良性の皮膚のいぼにおけるＥ４発現と同時に起こることが分かる。この図は、ＨＰＶ１６　Ｅ４抗体ＴＶＧ４０２、４０５及び４０６（図５Ａ）及びＨＰＶ１Ｅ４抗体４．３７及び９．９５（図５Ｄ）、ビオチニル化ＤＮＡプローブ（図５Ｂ−ＨＰＶ１６、図５Ｅ−ＨＰＶ１）、又はＤＡＰＩ（図５Ｃ及びＦ）を使用した、トリプル染色を示す図である。Ａ、Ｂ及びＣは、ＨＰＶ１６誘導性ＣＩＮ　１を通る切片を示し、Ｄ、Ｅ及びＦは、ＨＰＶ１誘導性疣贅を通る切片を示す。ＨＰＶ１６　ＣＩＮ　１の場合、上皮系の中層および上層における増殖型ウイルスＤＮＡ複製及びＥ４合成は、相互に関連している（Ａ、Ｂ）。皮膚の病変の場合、感染した細胞が基底層を離れると間もなく２つの事象が開始される。（Ｄ、Ｅ）。基底細胞を、ＤＡＰＩ対比染色画像に示す（Ｆ）。倍率は２００×である。
【０１６５】
ＨＰＶ１誘導性いぼの場合、増殖型ウイルスＤＮＡ複製及びＥ４合成開始ははるかに早く、感染した基底細胞が表面の層内に移動した直後に明白である（図５）。分化している細胞の一部のみが増殖型ウイルスＤＮＡ複製を許容し、これらの細胞のみで、Ｅ４が検出可能である。隣接する細胞は、後期遺伝子発現も増殖型ウイルスＤＮＡ複製も示さず、２つの事象の開始が密接に連関していることが分かる。ＤＮＡ及びＥ４検出の感度は確立されていないが、こうした「正常な」細胞は、ウイルスの複製を許容しないか、又は感染していない可能性がある。Ｅ４発現と増殖型ウイルスＤＮＡ複製の開始との間の、この厳密な相関関係は、ＨＰＶ６３及び６５によって生じる皮膚のいぼ、及びＨＰＶ２によって生じる普通のいぼでもみられる。
【０１６６】
＜後期遺伝子発現中の細胞は、非許容細胞又は非感染細胞と比較したとき、異常なパターンの最終分化を示す＞
ＨＰＶ感染の後期を支持する細胞は、Ｆａｂ　ＴＶＧ４０５（ＨＰＶ１６の場合）、Ｍａｂ　４．３７（ＨＰＶ１の場合）又はＥ４に対するポリクロナール抗血清（ＨＰＶ６３）で免疫染色することによって、同定することができる。ＨＰＶ１によって生じるいぼでは、Ｅ４−陽性細胞は、検出可能なレベルのフィラグリン又はインボルクリンを欠く（図６（ｉ））。Ｅ４発現も増殖型ウイルスＤＮＡ複製も示さない同一病変における非許容（又は非感染）細胞は、周囲の上皮系と区別できないレベルのフィラグリン及びロリクリンを発現する。Ｅ４合成と分化特異的ケラチン類Ｋ４及びＫ１３との相関関係から、同一阻害パターンが明白になった。Ｋ４染色及びＫ１３染色の強度は、Ｅ４陽性細胞では、Ｅ４を発現しない隣接細胞より常に低い（図６（ｉｉ））。基底細胞及び下方の傍基底細胞に存在するＫ５及びＫ１４は、影響を受けなかった。この、分化特異的ケラチン類の発現（Ｋ１及びＫ１０皮膚）の検出は、ＨＰＶ１によって生じる皮膚のいぼでも明白である（図６（ｉｉ））が、ＨＰＶ６３によって生じるいぼでは明白ではない（図６（ｉｉ））。ＨＰＶ６３のＥ４タンパク質は、ＨＰＶ１のそれと最も密接に関連している。
【０１６７】
図６は、増殖性感染が、ローグレードＨＰＶ１６病変及び良性の皮膚のいぼにおける正常な上皮の最終分化を妨害することを説明するのに役立つ図である。図６（ｉ）（ケラチン発現）は、分化特異的粘膜ケラチン４及び１３（Ｂ）又は皮膚ケラチン類１及び１０（Ｅ、Ｈ）に対する抗体と併せて、ＨＰＶ１６　Ｅ４　Ｆａｂ　ＴＶＧ４０５／ＴＶＧ４０６（図６（ｉ）Ａ）、ＨＰＶ１Ｅ４モノクロナール４．３７／９．９５（Ｄ）、及びＨＰＶ６３Ｅ４ポリクロナール抗体（Ｇ）を使用したトリプル染色を示す。図６（ｉ）Ｃ、Ｆ及びＩは、ＤＡＰＩ対比染色を示す図である。Ａ、Ｂ及びＣは、ＨＰＶ１６誘導性ＣＩＮ１を通る切片を示し、Ｄ、Ｅ及びＦは、ＨＰＶ１誘導性疣贅の縁を通る切片を示し、図６（ｉ）Ｇ、Ｈ及びＩは、ＨＰＶ６３誘導性いぼを通る切片を示す。ＨＰＶ１６誘導性病変及びＨＰＶ１誘導性病変の場合、化特異的ケラチン類は、Ｅ４陽性細胞では、隣接細胞（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）でほど明白ではないが、このことは、ＨＰＶ６３の場合にも当てはまる（Ｇ、Ｈ）。核退行変性（ＤＡＰＩ対比染色で可視化）は、Ｅ４発現細胞で遅延する（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）。倍率は２００×である。
【０１６８】
図６（ｉｉ）は、フィラグリン発現に関する図である。この図は、図６（ｉｉ）Ｂ及びＥが、フィラグリン染色を示すこと以外は、上述通りのトリプル染色を示す図である。Ｅ４染色を図６（ｉｉ）Ａ及びＤに示し、ＤＡＰＩ対比染色を図６（ｉｉ）Ｃ及びＦに示す。Ａ、Ｂ及びＣは、正常な皮膚（図の左手側）が、良性の腫瘍（図の右手側）と出会うＨＰＶ６３誘導性いぼの縁を示す。Ｄ、Ｅ及びＦは、ＨＰＶ１誘導性いぼの顆粒層を示す。Ｅ４陽性細胞は、検出可能なレベルの分化特異的マーカーフィラグリンを発現せず、また、隣接する非感染細胞又は非許容細胞と比較するとき、著明な核保存を示す。倍率は２００倍である。
【０１６９】
＜ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質の細胞内分布は、ＨＰＶ１及びＨＰＶ６３によって生じる皮膚病変におけるＥ４の分布と全く異なる＞
ＨＰＶ１のＥ１＾Ｅ４タンパク質は主に細胞質であって封入体に集合し、この細胞が皮膚の表面に向かって移動するにつれて、癒合してサイズが増加する。ＨＰＶ６３のＥ１＾Ｅ４タンパク質は、繊維性の顆粒分布を有することが確認されている。対照的に、ＨＰＶ１６　Ｅ４は、下上皮層の細胞中にフィラメント状の核周囲分布を有し（図７）、より分化した細胞層のみで顕著な構造に組立てられる。こうした「封入体」は、常に１細胞当たり１つ見出され（ほとんどの皮膚病変で見出される多数の封入体と比較）、核付近に位置し、ほとんど常に上皮系の表面に最も近い核側で検出される。Ｅ４／中間径フィラメント束（ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、ＨＰＶ１６　Ｅ１＾Ｅ４タンパク質が上皮細胞で発現した後に生じる）に外見が似ているが、我々は、ケラチン類の存在を、ｉｎ　ｖｉｖｏで、こうした構造で、検出したことはない。ＨＰＶ１６　Ｅ１＾Ｅ４のまさにこのＮ−末端に対する抗体は、Ｃ末端エピトープに対する抗体（ＴＶＧ４０４，ＴＶＧ４０５，ＴＶＧ４０６）より、この構造を染色するのがはるかに困難であり、Ｎ末端領域は隠されているか又は失われた可能性があることが示唆される。
【０１７０】
図７は、ｉｎ　ｖｉｖｏでの、ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質と核周囲の束及びフィラメント構造との会合、特に、Ｆａｂ　ＴＶＧ４０５及びＴＶＧ４０６の混合物を使用したＨＰＶ１６ＣＩＮ　１の上層（図７Ａ、Ｂ）及び下層（図７Ｃ、Ｄ）におけるＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質の検出を示す図である。上層では、Ｅ４が細胞質の全体にわたって散在しているが、顕著な核周囲パターンを有する。こうした細胞では、Ｅ４の核周囲束への集中（図７Ｂの矢印）が明白である。下層では、Ｅ４は主に核周囲及びフィラメント状の外観を有する（図７Ｃ、Ｄ）が、核周囲束に集中していない。図７Ａ及びＣの倍率は２００×であり、Ｂ及びＤの倍率は４００×である。
【０１７１】
Ｎ末端抗体は主としてＥ４構造の縁に限局化するが、抗Ｃ末端染色は中心で最強である（データ示さず）ことが、共焦点イメージングで明白にされた。ＴＶＧ４０５及びＴＶＧ４０６で見られる分布と比較するとき、ＨＰＶ１６　Ｅ１＾Ｅ４は、細胞において、より拡散した分布を有することが、抗Ｎ末端試薬で明白にされた（図８）。
【０１７２】
ＴＶＧ４０５、４０６、４０７及びＣ末端抗体の染色パターンの間の有意差は認められない。
【０１７３】
図８は、ｉｎ　ｖｉｖｏでの、ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質のプロセッシングに関する証拠を提供し、また、Ｅ４タンパク質のＣ末端の半分におけるエピトープを認識するＨＰＶ１６　Ｅ４　Ｆａｂ　ＴＶＧ４０６（図８Ａ）、ＨＰＶ１６　Ｅ１＾Ｅ４タンパク質のＮ末端の１２アミノ酸に対する抗体（図８Ｂ）及びＤＡＰＩ（図８Ｃ）を使用した、ＨＰＶ１６ＣＩＮの上層におけるトリプル染色を示す図である。ＴＶＧ４０２、４０３、４０４、４０５及び４０７により、ＴＶＧ４０６のものと有意に異ならない染色パターンが生じた。ＴＶＧ４０６を用いた場合には明白な（８Ａに矢印で示す）核周囲束を、抗Ｎ末端抗体は効果的に染色せず（８Ｂ）、ＨＰＶ１で、異なる形のタンパク質は、異なる細胞内の場所を有することが示唆される。倍率は４００×である。
【０１７４】
［実施例６］
＜子宮頚部病変から単離された細胞におけるＨＰＶの検出＞
抗Ｅ４抗体を使用して染色した、子宮頚部スメアに由来する細胞のイメージングに適したスライドを、ＵＳ　５，３４６，８３１号に記載の方法で作製する。従来の手順に従って、細胞を患者から単離し、アルコール／食塩緩衝液１０ｍｌに溶解する。サンプルバイアル中の細胞凝集塊又は細胞集団を渦巻攪拌で構成要素に分解することにより、遠心分離用のサンプルを調製する。構成要素に分解した後、サンプルを完全に排水し、１２ｍｌの円錐形遠沈管内の密度勾配上に重層するが、この密度勾配は、ＮＰＢＩ，Ｅｍｍｅｒ−Ｃｏｍｐａｓｃｕｕｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄで製造される商品名「Ｈｅｓｐａｎ」としても知られる、６％βデンプン溶液、及び０．９％生理食塩水を含む血漿増量材料を用いて作られる。
【０１７５】
密度勾配及びサンプル細胞が入っている１２ｍｌ円錐形遠沈管を遠心分離機のバケットに入れ、釣り合わせ、約６００Ｇの力で５分間遠心分離する。次いで、円錐形遠沈管上の５ｍｌの印まで液体を吸引する。遠心分離機バケットを取り出し、残りの液体が入っている１２ｍｌ円錐形遠沈管を８００Ｇで１０分間遠心分離する。遠沈管から上澄を出し、４５°の角度で軽く２〜３回たたく。このとき、この遠沈管には、さまざまな体積の圧縮細胞が入っている。均一になるまで混合するとき、ペレットは、一般に、単位体積の液体当たり同濃度の細胞を含む。
【０１７６】
脱イオン水５０μｌを加え、０．０４２インチのチップを通してシリンジ操作を５回行うことにより、サンプルを混合する。混合完了後、ポリ−Ｌリシン（１％、Ｓｉｇｍａ）で従来通りに被覆しておいたスライドに取り付けられた沈降容器に、サンプル１５０μｌに続いて脱イオン水５００μｌを分配する。移したサンプルを、容器内でおよそ１０分間沈降させる。余分のサンプルを吸引除去し、チャンバを、脱イオン水２ｍｌで２回すすぐ（各添加の間に吸引）。
【０１７７】
次いで、既知の手順に従って、ＦＩＴＣ標識Ｆａｂを細胞に適用し、蛍光顕微鏡法で結合を可視化する。
【０１７８】
［実施例７］
＜抗ＭＣＭ及び抗ＨＰＶ抗体を用いた、切片のダブル染色＞
プロトコール
マイクロ波処理による抗原曝露の後に続く蛍光免疫染色
パラフィン包埋切片をキシレンで脱蝋し（４×５分）、ＩＭＳで水和し（３×５分）、脱イオン水で２×５分間すすいだ。切片を、５００ｍｌの抗原回収緩衝液（１０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０）中、強力（８００Ｗ）で１５分間、マイクロ波処理し、この緩衝液中で２０分間冷却させた。ＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄した後、スライドを、ＰＢＳ、１０％血清、１％ＢＳＡ（ｖ／ｖ）で、室温にて２時間ブロックした。一次抗体をＰＢＳ、１％ＢＳＡで希釈し、切片に適用し、加湿チャンバ内で４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０でストリンジェントな洗浄を実施し（４×５分）、続いてＰＢＳですすいだ。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した、ビオチン標識二次抗体、ＨＰＶ１６　Ｅ４（Ａｌｅｘａ　４８８複合化）及び核対比染色を、切片上、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ（３×５分）で洗浄した後、ＳＡＢＣ−ＡＰキット（ＤＡＫＯ）でビオチンシグナルを増幅し、続いて３×５分のＰＢＳ洗浄を行った。Ｆａｓｔ　Ｒｅｄと共に１０分間インキュベートすることにより、アルカリホスファターゼシグナルを検出した。１０分後、水ですすぐことにより、この反応を停止させた。シティフルオル（ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ）マウント用媒体（Ａｇａｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でサンプルをマウントし、蛍光灯下で、Ｎｉｋｏｎ　Ｌａｂｏｐｈｏｔ　ＩＩ　顕微鏡で観察した。ＳｅｎＳｙｓ　モノクロカメラ及びＩＰＬａｂイメージングソフトウェア（Ｒｏｐｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でデジタル画像を捕えた。
【０１７９】
＜加圧クッキングによる抗原曝露および後に続く酵素的検出＞
スライドを脱蝋し、圧力鍋で処理し、上述の通りにブロックした。スライドを、ＴＢＳ、１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．１％トリトン（ｖ／ｖ）でそれぞれ１：５０及び１：１５希釈した、ＤＩＧ標識ＨＰＶ１６　Ｅ４（ＴＶＧ４０５）及びマウスモノクロナールＭＣＭ２抗体と共に、４℃にて一晩インキュベートした。ＴＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳで、１：５０希釈した抗ＤＩＧ−ＡＰ二次抗体及び１：２００希釈した抗マウスビオチンと共に、スライドを、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳで３×５分洗浄した後、ＭＣＭシグナルをＳＡＢＣ−ＨＲＰキット（ＤＡＫＯ）で増幅し、続いてＴＢＳで３×５分洗浄した。ＤＡＢ（ジミノベンジジン）及びＦａｓｔ　Ｒｅｄでシグナルを検出した。水ですすぐことによって反応を停止させ、軽いヘマトキシリン対比染色を適用した。あるいは、抗ＤＩＧ−ＨＲＰ及びＤＡＢでＥ４を検出し、ＳＡＢＣ−ＡＰキットでＭＣＭを増幅し、Ｆａｓｔ　Ｒｅｄで検出した。段階的アルコールで切片を脱水し、ＤＰＸマウント用媒体でマウントしたＮｉｋｏｎ　Ｌｕｃｉａ　イメージング用カメラ付及び関連ソフトウェア付きのＮｉｋｏｎ　Ｅｃｌｉｐｓｅ６００顕微鏡を用いて明視野画像をとらえた。
【０１８０】
記載の通り、ＨＳＩＬ及びＬＳＩＬでダブル染色を実施した；結果を図１０及び１１に示す。
【０１８１】
ＭＣＭ染色は、通常、ＨＳＩＬの表層に多いが、Ｅ４タンパク質の発現は、散在的分布を有する。このことは、ＨＳＩＬにおける表面細胞の９５％がＭＣＭ染色陽性であることを示したＷｉｌｌｉａｍｓら（ＰＮＡＳ　９５，１９９８）による既報と一致している。今まで、Ｅ４／ＭＣＭ同時定位に関する調査研究はない。
【０１８２】
Ｗｉｌｌｉａｍｓらは、ＬＳＩＬでＭＣＭ染色は明白である（染色を示す表面細胞の５３％、ＰＮＡＳ　９５（１９９８）ｐ１４９３５）と報告したが、我々は、Ｅ４陽性である領域では、通常、表層にＭＣＭはないことを確認した（５３８８、１０４５１、４１６５及び２５６５参照）。Ｅ４について陽性に染まる一部のＬＳＩＬ（たとえばＬＳＩＬ−ロー（２５６５）参照）は表面ＭＣＭ染色を欠くようである。示した例において、Ｅ４染色は、表面の広範囲に及ぶが、ＭＣＭ染色はない。
【０１８３】
ここに示すデータから、ＨＳＩＬから採取した子宮頚部切屑は、高レベルのＭＣＭ染色を示すが、低レベルのＥ４発現を示す。さらに、Ｅ４抗体は、ＭＣＭタンパク質に対する抗体を使用して検出することができないＬＳＩＬの検出を可能にすることが、データから示唆される。
【０１８４】
ＨＳＩＬ　Ｅ４／ＭＣＭ及びＬＳＩＬ　Ｅ４／ＭＣＭに示したデータを組合せるとき、さらなる結論を下すことができる。表層におけるＥ４陽性細胞及びＭＣＭ陽性細胞の相対数は、疾患の重症度を示す。大きい数のＭＣＭ陽性細胞及び小さい数のＥ４陽性細胞は、ＨＳＩＬの存在を示す。表層における高レベルのＥ４陽性細胞及び小さい数のＭＣＭ陽性細胞は、一般にＬＳＩＬである。このタイプの分析は、Ｅ４及びＭＣＭに対する抗体を使用したダブル染色の後、細胞ソーターを使用して行うことができる。
【０１８５】
ＭＣＭ２、ＭＣＭ５及びＭＣＭ７に対する抗体は、ＨＳＩＬ及びＬＳＩＬの両者に対して、本質的に同じパターンを示す。
【０１８６】
［実施例８］
＜正常な子宮頚部上皮のダブル染色＞
図１２は、実施例７の場合と同様に実施した、正常な子宮頚部上皮に関するダブル染色を示す図である。正常な子宮頚部の上皮表層には、Ｅ４もＭＣＭも存在せず、こうした抗体は、子宮頚部異常の検出にとって価値あることが強調される。腫瘍形成の領域では、両タンパク質の発現パターンが変化し、Ｅ４又はＭＣＭの両者を表面で検出することができる。
【０１８７】
［実施例９］
＜他のＨＰＶ型における、Ｅ４／ＭＣＭのダブル染色＞
図１３は、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２及びＨＰＶ１６いぼで得られたダブル染色の結果を示す図である。ＨＰＶＥ７タンパク質は、細胞性Ｒｂ遺伝子産物に結合することによって作用する。Ｒｂは、通常、その非リン酸化状態で、転写因子Ｅ２Ｆに結合することによって細胞周期の進行を妨げる。Ｇ１までの進行中、サイクリンＤキナーゼのレベルは、細胞に対して外的に作用する成長因子に応答して上昇する。このことは、Ｒｂのリン酸化及びＥ２Ｆの放出につながる。Ｅ２Ｆは、Ｓ期移行に必要なタンパク質の合成を刺激する（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ発行で再検討）。ＭＣＭ、ｃｄｃ６、ＰＣＮＡ及びサイクリンＡ等の、細胞のＤＮＡ複製に関与するタンパク質は、こうしたＥ２Ｆ誘導性遺伝子産物の仲間である（Ｈａｒｂｏｕｒ　＆　Ｄｅａｎ，Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　２０００年４月；２（４）：Ｅ６５−７）。
【０１８８】
正常な分化中の上皮細胞では、細胞は最終分化に委ねられるため、細胞周期進行は起こらない。正常な子宮頚部上皮の分化中の細胞では、Ｓ期マーカーもＨＰＶタンパク質も発現されない。このことは、実施例８に示す画像から明白である。
【０１８９】
ＨＰＶ１及び２によって生じるいぼ、及びＨＰＶ１６によって生じるＥ４発現性ＬＳＩＬでは、ＭＣＭが上皮系の下層に存在する。ＨＰＶタンパク質機能に関する我々の知識に基づけば、これは、Ｅ７発現の結果であると予測される。ＨＰＶＥ７タンパク質はＲｂに結合し、最終的にＳ期への移行につながるＥ２Ｆを追い出す。従って、Ｅ７によって活性化される細胞遺伝子は、ウイルス初期遺伝子の存在に関する代理マーカーと考えることができる。こうした遺伝子は、ＨＰＶ１６におけるｐ９７「初期」プロモーターから発現される。ＨＰＶ１、ＨＰＶ２及びＨＰＶ１６によって生じる増殖性感染では、ＭＣＭタンパク質は、上皮の表面に到達しない。これは、全てのＨＰＶ型にわたる可能性がある共通のパターンであると、我々は予測している。
【０１９０】
増殖型ウイルスＤＮＡ複製は、Ｅ４の最初の出現と同時に起こる（Ｄｏｏｒｂａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３８　ｐ４０−５２）。Ｅ４は、ＨＰＶ１６の場合、ｐ６７１にある主要な後期プロモーターから発現される。従って、Ｅ４の出現は、ウイルスの生活環の後期の開始を示す。ＨＰＶ１、ＨＰＶ２及びＨＰＶ１６によって生じる病変では、Ｅ４の存在は、表層内に根強く存続する。我々の最近の研究から、Ｅ４は、細胞周期をＧ２で停止させることがわかる。研究した３つのＨＰＶ型全てで、Ｅ４の最初の出現とＭＣＭ染色の欠損との間に重複がある。この観察結果から、我々は、これらの二重陽性細胞は、Ｅ７によってＳ期に押し進められるが、Ｅ４発現の結果として有糸分裂に入ることができないと考えるに至った。このような状況は、ウイルスゲノムの高レベル複製に役立つ可能性がある。この理論は、今日までに収集した全ての実験データに適合する。
【０１９１】
従って、我々は、４タイプの細胞があると述べることによってまとめることができる：
１．ＭＣＭ陽性細胞が表面に存在することは、増殖性感染が完結していないこと及びウイルスが不稔感染を引き起こしていることを示す徴候とみなすことができる。増殖性感染中、ＭＣＭ＋／Ｅ４−細胞は、下層のみに認められる。このような細胞は、ＨＳＩＬ及び癌に限って表層に多い。
２．ＭＣＭ＋／Ｅ４＋二重陽性細胞は、通常の増殖性感染における中間層（すなわちＭＣＭ／Ｅ４重複領域）に認められる。こうした細胞が表面で同定されることは、ローグレードの病変を示す可能性がある。
３．Ｅ４のみが陽性（ＭＣＭ−／Ｅ４＋）の細胞およびＳ期マーカーを欠く細胞は、ウイルスの複製に必要なタンパク質が存在しないため、増殖型ウイルスの複製を支持していることが全くできない。こうした細胞が表面に存在することは、増殖性感染を開始した病変の特徴である。増殖性感染もＬＳＩＬとして分類することができる。
４．Ｌ１発現はＥ４に後続する。Ｌ１＋／Ｅ４＋／ＭＣＭ−細胞がスメアに存在することを使用して、生活環が完結しようとしているローグレードの病変（ＨＰＶ１）を強調することが可能である。このことは、今まで研究されていない。
【０１９２】
癌に進行しないＨＰＶ１及びＨＰＶ２によって生じる病変は、こうした大きい変動を示さない。表面における全ての細胞がＭＣＭ−／Ｅ４＋であり、Ｅ４とＬ１の両者を発現する一部がＬ１＋／Ｅ４＋／ＭＣＭ−である。ＭＣＭ＋／Ｅ４＋及びＭＣＭ＋／Ｅ４−表現型を示す細胞が表面に存在することは、ＨＳＩＬ等の不稔感染が存在することと考えられるであろう。
【０１９３】
これらのパターンは、癌に向かって進行中の、ＨＰＶ１６によって生じるもののような病変のみでみられる。ＨＰＶ１及びＨＰＶ２によって生じるもの等の、全ＨＰＶ生活環を支持している病変は、Ｌ１＋／Ｅ４＋／ＭＣＭ−及びＥ４＋／ＭＣＭ−細胞のみを表面に有する。
【０１９４】
［実施例９］
＜その他のＥ２Ｆ誘導性タンパク質をＭＣＭの代用にすることができる＞
ほとんどの子宮頚部異常は、ハイリスク乳頭腫ウイルス感染に起因する。Ｅ７は、細胞増殖を仲介するウイルスタンパク質である。ＭＣＭ等のＥ７発現の代理マーカーは、全ての子宮頚部腫瘍形成に存在するが、増殖性感染における下上皮層に限定される。ＭＣＭはＳ期移行の優れたマーカーと思われるが、Ｅ２Ｆにより誘導される他の細胞タンパク質を同じ方式で使用することができない明白な理由はない。ＰＣＮＡはウイルスＤＮＡ複製に不可欠であり、また、Ｅ２Ｆによって制御されている（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ　＆　Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ　２０００年１月１３日；１０（１）：Ｒ２５−９）。ＰＣＮＡは増殖細胞のマーカーとして広く使用されてきた。Ｋｉ６７に対する抗体も、この目的で使用されてきた。
【０１９５】
図１４に示す画像から、ＰＣＮＡ及びＥ４に対する抗体を使用したダブル染色は、概して、Ｅ４及びＭＣＭに対する抗体を使用して生じさせたものに似ていることがわかる。増殖性感染中、ＰＣＮＡは下上皮層で発現されるが、Ｅ４が確認される領域が一部重複する。ＨＳＩＬでは、ＰＣＮＡが表層に存在する。
【０１９６】
我々は、やはりＥ２Ｆにより誘導されるサイクリンＡの分布も調べた。サイクリンＡは、Ｓ期までの進行に不可欠なキナーゼサブユニットである。ＨＳＩＬでは、サイクリンＡは表層内に達する。Ｅ４及びサイクリンＡに対する抗体を使用したダブル染色は、２つのタンパク質の発現部位の間の重複領域を明らかにする。ほとんどのローグレード病変では、サイクリンＡは、下上皮層に限定されるが、Ｅ４は表面に多い。
【０１９７】
従って、ＰＣＮＡ及びサイクリンＡ等のタンパク質は、ＬＳＩＬでもＨＳＩＬでも、ＭＣＭに似た総体的分布を有する。Ｅ４及びＭＣＭについてここに示したのと同じ方式で、ＰＣＮＡ／Ｅ４染色又はサイクリンＡ／Ｅ４染色を診断に使用することが可能である。こうしたアプローチの感度の比較は実行されていないが、ＰＣＮＡは、ＭＣＭに似た感度でＳ期細胞を検出すると思われる。同じ方式で、その他のＥ２Ｆ誘導性遺伝子を評価することも可能であろう。
【０１９８】
［実施例１０］
＜細胞増殖の他のマーカーを、Ｅ２Ｆ誘導性遺伝子の代用にすることができる＞
サイクリンＢは、Ｇ２のマーカーである（Ｏｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１９９９年４月；１１（２）：２６７−７３）。図１５に示す通り、ＨＳＩＬでは、サイクリンＢ染色が表層内に達する。Ｅ４が発現されるＬＳＩＬでは、こうしたタンパク質は下上皮層に限定される。ＰＣＮＡ、サイクリンＡ及びＭＣＭの場合と同様、ＬＳＩＬでは、サイクリンＢ染色を示す領域は、Ｅ４を検出することができる領域と一部重複する。このような病変では、サイクリンＢは、表層内に達しない。ウイルスにより誘導される他の細胞のタンパク質を、Ｅ４と一緒に使用することが可能である。
【０１９９】
ｐ１６は、ＩＮＫファミリーの細胞周期インヒビターである。このタンパク質は、通常、Ｓ期への予定外の移行に応答してアップレギュレートされる。ｐ１６は、サイクリンＤ／ｃｄｋ４及びサイクリンＤ／ｃｄｋ６に結合して、その機能を阻害する。サイクリンＤ複合体は、通常、Ｒｂをリン酸化して、Ｅ２Ｆの放出及びＳ期への移行を可能にする。この制御は、ＨＰＶ　Ｅ７タンパク質によって回避される。Ｅ７は、Ｒｂに直接結合し、サイクリンＤの存在と関係なくＥ２Ｆを放出させる。従って、ハイリスクＨＰＶ感染では、ｐ１６が多い（Ｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　１９９８年１２月；１５３（６）：１７４１−８）。ｐ１６は増殖マーカーではないが、ＨＰＶ初期遺伝子活性の有用なマーカーであると思われる。
【０２００】
従って、Ｅ４染色を、サイクリンＢ及びｐ１６等のウイルス活性の他のマーカーと組み合わせることが可能である。こうしたマーカーは、Ｅ４と一緒に使用するとき、子宮頚部腫瘍形成の診断に有用な可能性がある。
【０２０１】
［引用文献］
【表１】
2004505247.tif 000002
【表２】
2004505247.tif 000003
【表３】
2004505247.tif 000004
【０２０２】
上の明細書で述べた全ての出版物を、参照により本願に援用する。記載の方法及び本発明のシステムの様々な修飾及び変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に明らかにになるであろう。具体的な好ましい実施形態と関連して本発明を説明してきたが、請求の範囲に記載されている本発明は、このような具体的な実施形態に不当に制限されないことを理解すべきである。事実、分子生物学又は関連分野で熟練した者に明白な、本発明を実行するために記載されている方式の様々な修飾は、請求の範囲の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
（Ａ）　ＨＰＶ１６　Ｅ４タンパク質のアミノ酸配列、及び様々な抗体分子、又は抗体のＥ４特異的抗原−結合フラグメントの結合部位を示す図である。
（Ｂ）　ＨＰＶ１６（上列）、ＨＰＶ１（下列）及びコンセンサス配列（中列）からのＥ４タンパク質の配列、及び様々な抗体又は抗体の抗原−結合変異形の結合部位を示す図である。
【図２】
表面プラスモン共鳴装置を使用して得た４つのセンサーグラム（秒で表した時間に対する任意の応答単位）を示す図である。
【図３】
本文で説明した、様々に染色されたサンプルを示す顕微鏡写真を示す図である。
【図４】
本文で説明した、様々に染色されたサンプルを示す顕微鏡写真を示す図である。
【図５】
本文で説明した、様々に染色されたサンプルを示す顕微鏡写真を示す図である。
【図６】
本文で説明した、様々に染色されたサンプルを示す顕微鏡写真を示す図である。
【図７】
本文で説明した、様々に染色されたサンプルを示す顕微鏡写真を示す図である。
【図８】
本文で説明した、様々に染色されたサンプルを示す顕微鏡写真を示す図である。
【図９】
ＨＰＶ　Ｅ４タンパク質の一部のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図１０】
ある範囲のＨＰＶ１６誘導性ＨＳＩＬのＥ４及びＭＣＭタンパク質の分布を示す図である。パネル（Ａ）：ＨＳＩＬロー（４６４）；低出力画像；褐色＝ＭＣＭ；赤色＝Ｅ４。パネル（Ｂ）：ＨＳＩＬ（４６４）；褐色＝ＭＣＭ；赤色＝１６Ｅ４．パネル（Ｃ）：ＨＳＩＬ（１１４３１）；赤色＝ＭＣＭ；褐色＝Ｅ４。パネル（Ｄ）：ＨＳＩＬ（１１４３３）：褐色＝ＭＣＭ；赤色＝１６　Ｅ４．パネル（Ｅ）：ＨＳＩＬ（１５９１９）；褐色＝ＭＣＭ；赤色＝１６　Ｅ４。全ての画像で、核シグナルは細胞性ＭＣＭタンパク質の存在を示す。ＭＣＭの発現は、Ｅ２Ｆにより誘導され、本特許の他の図に表示の通り、組織学的に常な上皮の表層にはない。ＨＳＩＬでは、Ｅ７が広範に発現するため、ＭＣＭ染色が豊富である。示した一部のＨＳＩＬ（４６４、１１４３３、１５９１９）の表層に存在する細胞質シグナルは、ウイルスのＥ４タンパク質の存在を示す。一般に、上皮の表面における多少の細胞のみが陽性であり、ウイルス生活環の後期の刺激が不完全であることを示す。
【図１１】
ある範囲のＨＰＶ１６誘導性ＬＳＩＬのＥ４タンパク質及びＭＣＭの分布を示す図である。パネル（Ａ）：ＬＳＩＬ−ロー（２５６５）低出力画像；赤色＝ＭＣＭ；褐色＝Ｅ４。パネル（Ｂ）：ＬＳＩＬ（２５６５）；赤色＝ＭＣＭ；褐色＝Ｅ４。パネル（Ｃ）：ＬＳＩＬ（４１６５）；赤色＝ＭＣＭ；褐色Ｅ４。パネル（Ｄ）：ＬＳＩＬ（１０４５１）；赤色＝ＭＣＭ；褐色＝Ｅ４。パネル（Ｅ）：ＬＳＩＬ（５３８８）；赤色＝ＭＣＭ；褐色＝Ｅ４。上上皮層における細胞質染色はＥ４である。Ｅ４を発現している層より下の層で最も豊富な核染色は、ＭＣＭの分布を示す。ＭＣＭに関する核染色パターンは、基底層より上に達するが、表面に到達しない。Ｅ４発現は、ＭＣＭよりＬＳＩＬの表層ではるかに多い。
【図１２】
正常な子宮頚部上皮の表層における接合領域Ｅ４／ＭＣＭに関するダブル染色を示す図である。パネルＡ：ＬＳＩＬ縁；赤色＝ＭＣＭ；褐色＝Ｅ４．パネルＢ：ＨＳＩＬ縁；赤色＝Ｅ４；褐色＝ＭＣＭ。表層における細胞質染色は、Ｅ４が存在するためである。この下の核染色は、ＭＣＭタンパク質の分布を示す。２つの画像は、ＬＳＩＬと正常な組織の間、又はＨＳＩＬと正常な組織との間の接合部を示す。正常な組織には細胞質Ｅ４染色がなく（各画像の右方）及び核ＭＣＭシグナルは基底層内又は基底層付近の細胞に限定される。
【図１３】
免疫蛍光画像における、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２及びＨＰＶ１６におけるＥ４と、ＭＣＭとの組合せ染色を示す図である。パネルＡ：ＨＰＶ１いぼ；赤色＝ＭＣＭ５；緑色＝Ｅ４；青色＝ＤＡＰＩ核対比染色。パネルＢ：ＨＰＶ２いぼ；赤色＝ＭＣＭ５；緑色＝Ｅ４；青色＝ＤＡＰＩ核対比染色。パネルＣ：ＨＰＶ１６　ＬＳＩＬ；赤色＝ＭＣＭ５；緑色＝Ｅ４；青色＝ＤＡＰＩ核対比染色。Ｅ４発現は、常に他のＨＰＶ型で生じるローグレード病変でのＭＣＭ発現の後に続く。ＨＰＶ１（いぼ）、ＨＰＶ２（いぼ）及びＨＰＶ１６（ＬＳＩＬ）で生じる病変を示す。全ての場合に、核ＭＣＭ染色が下上皮層に存在するが、これらの細胞は上皮表面に向かって移動するため、細胞質のＥ４染色は、これらの細胞で開始することがわかる。Ｅ４及びＭＣＭの両者が陽性の細胞は、界面に存在する。Ｅ４発現はゲノム増幅の開始と同時に生じるため、Ｅ４発現が、ウイルスゲノムの増幅が成功する要件のようである。
【図１４】
Ｅ２Ｆ誘導性タンパク質をＭＣＭの代用にできることを証明するダブル色実験を示す図である。パネルＡ：ＰＣＮＡ／Ｅ４　ＬＳＩＬ；パネルＢ：ＰＣＮＡ／Ｅ４　ＬＳＩＬ高出力；パネルＣ：ＰＣＮＡ／Ｅ４　ＨＳＩＬ；パネルＤ：ＰＣＮＡ／Ｅ４　ＨＳＩＬ　高出力。全画像　赤色＝ＰＣＮＡ、緑色＝Ｅ４、青色＝ＤＡＰＩ。パネルＥ：サイクリンＡ／Ｅ４　ＬＳＩＬ；パネルＦ：サイクリンＡ／Ｅ４　ＬＳＩＬ高出力；パネルＧ：サイクリンＡ／Ｅ４　ＨＳＩＬ；パネルＨ：サイクリンＡ／Ｅ４　ＨＳＩＬ高出力；パネルＩ：サイクリンＡ／Ｅ４　ＨＳＩＬ　２；パネルＪ：サイクリンＡ／Ｅ４　ＨＳＩＬ　高出力２；全画像、赤色＝サイクリンＡ、緑色＝Ｅ４、青色＝ＤＡＰＩ。核タンパク質ＰＣＮＡは、Ｅ２Ｆにより活性化され、ＭＣＭに似た発現パターンを示す。その発現（核染色）は、Ｅ４発現（細胞質の染色）が豊富なところより下の上皮細胞層で最も広範である。ＨＳＩＬの表層におけるＰＣＮＡの発現は、ＬＳＩＬの表層でより豊富である。ＨＳＩＬでは、Ｅ４発現は、形態学的分化の若干の証拠を示す細胞の小さいポケットに制限される。
サイクリンＡは、Ｅ２Ｆによっても活性化される。ＨＰＶ１６によって生じる子宮頚部腫瘍形成の場合、サイクリンＡは、細胞質分布及び核分布を有し、基底上皮層及びそれより上の散在性細胞で見出される。Ｅ４（細胞質染色）は、サイクリンＡを発現している層より上の層内の細胞の細胞質で検出可能である。ＨＳＩＬでは、サイクリンＡ発現は、表面上皮層内に達するが、ＬＳＩＬでは、サイクリンＡが中間層より上に達することは稀である。ＭＣＭ及びＰＣＮＡと同様、表層におけるＥ４発現は、サイクリンＡ発現が表面にない領域で最も多い。
【図１５】
細胞増殖の他のマーカーをＥ２Ｆ誘導性遺伝子の代用にできることを示す、さらなるダブル染色を示す図である。パネルＡ：サイクリンＢ／Ｅ４　ＬＳＩＬ。パネルＢ：サイクリンＢ／Ｅ４　ＬＳＩＬ高出力。パネルＣ：サイクリンＢ／Ｅ４　ＨＳＩＬ。全画像：赤色＝サイクリンＢ；緑色＝Ｅ４、青色＝ＤＡＰＩ。サイクリンＢ及びＥ４の両者は、細胞質染色パターンを示す。ＬＳＩＬでは、サイクリンＢは、中間細胞層及びそれより下の層で見出される。Ｅ４は、中間層及びそれより上の層の散在性細胞で発現される。ＨＳＩＬでは、細胞質サイクリンＢ及びＥ４は両者とも、上皮の表面付近の細胞で見出される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（ｉ）】
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【図６（ｉｉ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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