(57)【要約】骨形成を増強する方法であって、以下の有効量を投与する工程を包含する：１）ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、またはそのアナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの１以上のオリゴマー複合体、２）骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の１以上の細胞内タンパク質の活性を増強し得る骨形成性化合物であって、ここで、該活性は、骨形成を示す、化合物、あるいは３）骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の１以上のホスファターゼを不活化し得る骨形成性化合物であって、ここで、該不活化は、骨形成を示す、化合物。この方法をまた用いて、本明細書中に開示されるオリゴマー複合体または骨形成性化合物を含む薬学的組成物を患者に投与することによって、骨量の損失によって少なくとも部分的に現れる疾患または状態を処置し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成のプロセスを増強する方法であって、骨形成が所望される場合、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、アナログ、誘導体または模倣物のうちの１以上のオリゴマー複合体の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記増強が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロセスが、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所望の骨形成が、骨の骨折部位での骨形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記所望の骨形成が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アナログ、誘導体または模倣物が、組換えＲＡＮＫＬタンパク質またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記融合タンパク質が、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、ＡＰ−ＲＡＮＫＬを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、ロイシンジッパー−ＲＡＮＫＬを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＡＮＫＬ誘導体が、ＴＡＬＬ−１のフラップ領域を含むＲＡＮＫＬタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
骨量の損失によって少なくとも部分的に現れる疾患または状態を処置する方法であって、骨形成を促進し、それによって該骨量の損失を予防、阻害または対抗するに有効な量の、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、アナログ、誘導体または模倣物のうちの１以上のオリゴマー複合体を含む薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記薬学的組成物が、断続的に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が、哺乳動物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が、ヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、ＡＰ−ＲＡＮＫＬを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が、ロイシンジッパー−ＲＡＮＫＬを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＡＮＫＬ誘導体が、ＴＡＬＬ−１のフラップ領域を含むＲＡＮＫＬタンパク質を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者への骨吸収阻害因子の同時投与をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨吸収阻害因子は、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、ＳＥＲＭおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者への１以上のさらなる骨形成因子の同時投与をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
１以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患または状態が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周疾患、骨格への転移、癌、加齢性骨損失、骨減少症、および変性関節疾患からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
骨形成のプロセスを増強する方法であって、骨形成が所望される場合、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の１以上の細胞内タンパク質の活性を増強し得る骨形成性化合物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、該活性は、骨形成を示す、方法。
【請求項２５】
前記増強が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロセスが、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記所望の骨形成が、骨の骨折部位での骨形成を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記所望の骨形成が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞内タンパク質が、キナーゼを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｐｌ３キナーゼ、ＩＫＫ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、およびｐ３８からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記キナーゼが、ＥＲＫ２を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞内タンパク質が、ＩＫＢ−αおよびＩＫＢ−βから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記増強された活性が、キナーゼのリン酸化を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記増強された活性が、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＩＫＫ、Ｐ１３キナーゼ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、およびｐ３８からなる群より選択されるキナーゼのリン酸化を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記増強された活性が、ＥＲＫ１のリン酸化を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記増強された活性が、ＥＲＫ２のリン酸化を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、前記骨芽細胞または骨芽細胞前駆体との前記骨形成性化合物のインキュベーション後に少なくとも約３０分にわたって検出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約４０分にわたって検出される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約６０分にわたって検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１以上の細胞内タンパク質が、キナーゼである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記キナーゼが、ＥＲＫ２を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
骨量の損失によって少なくとも部分的に現れる疾患または状態を処置する方法であって、骨形成を促進し、それによって該骨量の損失を予防、阻害または対抗するに有効な量の、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の１以上の細胞内タンパク質の活性を増強し得る骨形成性化合物を含む薬学的組成物を患者に投与する工程を包含し、ここで該活性が、骨形成を示す、方法。
【請求項４５】
前記薬学的組成物が、断続的に投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記患者が、哺乳動物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者がヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者への骨吸収阻害因子の同時投与をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、ＳＥＲＭおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記患者への１以上のさらなる骨形成因子の同時投与をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
１以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患または状態が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周疾患、骨格への転移、癌、加齢性骨損失、骨減少症、および変性関節疾患からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞内タンパク質が、キナーゼを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｐｌ３キナーゼ、ＩＫＫ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、およびｐ３８からなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記キナーゼが、ＥＲＫ２を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞内タンパク質が、ＩＫＢ−αおよびＩＫＢ−βから選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
前記増強された活性が、キナーゼのリン酸化を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
前記増強された活性が、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＩＫＫ、Ｐｌ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、およびｐ３８からなる群より選択されるキナーゼのリン酸化を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記増強された活性が、ＥＲＫ１のリン酸化を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記増強された活性が、ＥＲＫ２のリン酸化を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、前記骨芽細胞または骨芽細胞前駆体との前記骨形成性化合物のインキュベーション後に少なくとも約３０分にわたって検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項６３】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約４０分にわたって検出される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約６０分にわたって検出される、請求項６３に記載の方法
【請求項６５】
前記１以上の細胞内タンパク質が、キナーゼである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記キナーゼが、ＥＲＫ２を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
骨形成のプロセスを増強する方法であって、骨形成が所望される場合、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の１以上のホスファターゼを不活化し得る骨形成性化合物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、該不活化は、骨形成を示す、方法。
【請求項６９】
前記増強が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記プロセスが、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記所望の骨形成が、骨の骨折部位での骨形成を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記所望の骨形成が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼ、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼ、Ｐｌ３キナーゼ特異的ホスファターゼ、ＩＫＫ特異的ホスファターゼ、Ａｋｔ特異的ホスファターゼ、ＪＮＫ特異的ホスファターゼ、およびｐ３８特異的ホスファターゼからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記不活化が、ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
前記不活化が、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼ、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼ、ＩＫＫ特異的ホスファターゼ、Ｐｌ３キナーゼ特異的ホスファターゼ、Ａｋｔ特異的ホスファターゼ、ＪＮＫ特異的ホスファターゼ、およびｐ３８特異的ホスファターゼからなる群より選択されるホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記不活化が、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記不活化が、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
骨量の損失によって少なくとも部分的に現れる疾患または状態を処置する方法であって、骨形成を促進し、それによって該骨量の損失を予防、阻害または対抗するに有効な量の、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の１以上ホスファターゼを不活化し得る骨形成性化合物を含む薬学的組成物を患者に投与する工程を包含し、ここで、該不活化が骨形成を示す、方法。
【請求項８１】
前記薬学的組成物が、断続的に投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記患者が、哺乳動物である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記患者が、ヒトである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記患者への骨吸収阻害因子の同時投与をさらに包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、ＳＥＲＭおよびカルシウムからなる群より選択される請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記患者への１以上のさらなる骨形成因子の同時投与をさらに包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
１以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項８６に記載の方法
【請求項８８】
前記疾患または状態が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周疾患、骨格への転移、癌、加齢性骨損失、骨減少症、および変性関節疾患からなる群より選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８９】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼ、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼ、Ｐｌ３キナーゼ特異的ホスファターゼ、ＩＫＫ特異的ホスファターゼ、Ａｋｔ特異的ホスファターゼ、ＪＮＫ特異的ホスファターゼ、およびｐ３８特異的ホスファターゼからなる群より選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９０】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記不活化が、ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項９３】
前記不活化が、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼ、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼ、ＩＫＫ特異的ホスファターゼ、Ｐｌ３キナーゼ特異的ホスファターゼ、Ａｋｔ特異的ホスファターゼ、ＪＮＫ特異的ホスファターゼ、およびｐ３８特異的ホスファターゼからなる群より選択されるホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項９２に記載の方法
【請求項９４】
前記不活化が、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記不活化が、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
骨形成を刺激するための組成物であって、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、アナログ、誘導体または模倣物のうちの１以上のオリゴマー複合体の有効量を含む、組成物。
【請求項９７】
薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアをさらに含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９８】
前記骨形成の刺激が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９９】
前記骨形成の刺激が、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１００】
前記骨形成の刺激が、骨の骨折部位での骨形成の刺激を含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記骨形成の刺激が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成の刺激を含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記アナログ、誘導体または模倣物が、組換えＲＡＮＫＬタンパク質またはそのフラグメントを含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記融合タンパク質が、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記融合タンパク質が、ＡＰ−ＲＡＮＫＬを含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記融合タンパク質が、ロイシンジッパー−ＲＡＮＫＬを含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記ＲＡＮＫＬ誘導体が、ＴＡＬＬ−１のフラップ領域を含むＲＡＮＫＬタンパク質を含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０７】
１以上の骨吸収阻害因子をさらに含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、ＳＥＲＭおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
１以上のさらなる骨形成因子をさらに含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１１０】
１以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
骨形成を刺激するための組成物であって、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の１以上の細胞内タンパク質の活性を増強し得る骨形成性化合物の有効量を含み、ここで、該活性が、骨形成を示す、組成物。
【請求項１１２】
薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアをさらに含む、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記骨形成の刺激が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記骨形成の刺激が、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記骨形成の刺激が、骨の骨折部位での骨形成の刺激を含む、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記骨形成の刺激が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成の刺激を含む、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１７】
１以上の骨吸収阻害因子をさらに含む、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、ＳＥＲＭおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項１１７に記載の組成物。
【請求項１１９】
１以上のさらなる骨形成因子をさらに含む、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１２０】
１以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項１１９に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記細胞内タンパク質が、キナーゼを含む、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｐｌ３キナーゼ、ＩＫＫ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、およびｐ３８からなる群より選択される、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１を含む、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記キナーゼが、ＥＲＫ２を含む、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記細胞内タンパク質が、ＩＫＢ−αおよびＩＫＢ−βから選択される、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記増強された活性が、キナーゼのリン酸化を含む、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記増強された活性が、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＩＫＫ、Ｐｌ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、およびｐ３８からなる群より選択されるキナーゼのリン酸化を含む、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記増強された活性が、ＥＲＫ１のリン酸化を含む、請求項１２７に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記増強された活性が、ＥＲＫ２のリン酸化を含む、請求項１２７に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、前記骨芽細胞または骨芽細胞前駆体との前記骨形成性化合物のインキュベーション後に少なくとも約３０分にわたって検出される、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約４０分にわたって検出される、請求項１３０に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記１以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約６０分にわたって検出される、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項１３３】
前記１以上の細胞内タンパク質が、キナーゼである、請求項１３０に記載の組成物。
【請求項１３４】
前記キナーゼが、ＥＲＫ１を含む、請求項１３３に記載の組成物。
【請求項１３５】
前記キナーゼが、ＥＲＫ２を含む、請求項１３３に記載の組成物。
【請求項１３６】
骨形成を刺激するための組成物であって、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の１以上のホスファターゼを不活化し得る骨形成性化合物の有効量を含み、ここで、該不活性は、骨形成を示す、組成物。
【請求項１３７】
薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアをさらに含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３８】
前記骨形成の刺激が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１３９】
前記骨形成の刺激が、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４０】
前記骨形成の刺激が、骨の骨折部位での骨形成の刺激を含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４１】
前記骨形成の刺激が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成の刺激を含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４２】
１以上の骨吸収阻害因子をさらに包含する、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、ＳＥＲＭおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項１４４】
１以上のさらなる骨形成因子をさらに含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４５】
１以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項１４４に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼ、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼ、Ｐｌ３キナーゼ１特異的ホスファターゼ、ＩＫＫ特異的ホスファターゼ、Ａｋｔ特異的ホスファターゼ、ＪＮＫ特異的ホスファターゼ、およびｐ３８特異的ホスファターゼからなる群より選択される、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼを含む、請求項１４６に記載の組成物。
【請求項１４８】
前記ホスファターゼが、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼを含む、請求項１４６に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記不活化が、ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項１３６に記載の組成物。
【請求項１５０】
前記不活化が、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼ、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼ、ＩＫＫ特異的ホスファターゼ、Ｐｌ３キナーゼ特異的ホスファターゼ、Ａｋｔ特異的ホスファターゼ、ＪＮＫ特異的ホスファターゼ、およびｐ３８特異的ホスファターゼからなる群より選択されるホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記不活化が、ＥＲＫ１特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項１５０に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記不活化が、ＥＲＫ２特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項１５０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は米国国立衛生研究所助成金ＡＲ３２７８８、ＡＲ４６１２３およびＤＥ０５４１３のもとに一部、政府の援助を受けて行われた。政府は本発明の一定の権利を有する。
【０００２】
本出願は２００１年３月２２日、２００１年８月９日、２００１年１０月１２日、２００１年１０月１２日、および２００１年１０月１５日に出願されたそれぞれ米国仮特許出願番号６０／２７７，８５５、６０／３１１,１６３、６０／３２９,２３１、６０／３２８，８７６、および６０／３２９，３９３の利益を主張する。これらすべては本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、１）骨芽細胞または骨芽細胞前駆体における細胞内タンパク質の活性（この活性は骨形成の指標である）を増強する、あるいは２）骨芽細胞または骨芽細胞前駆体におけるホスファターゼを不活性化（この不活性化は骨形成の指標である）する能力を有するＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物または骨形成性の化合物のうちの１以上のオリゴマー複合体を有効量投与することにより骨形成を増強する方法に関する。
【０００４】
本発明はさらに骨の喪失または骨粗鬆症のような疾患によって生じる骨形成の減退の処置、予防または阻害に関する。さらには本明細書中に記載されるオリゴマー複合体または骨形成性化合物の投与による骨形成の増強により、骨折の修復の増強および整形外科的移植片または骨の融合部位への骨の内部成長の増強に関する。
【０００５】
本発明はさらに骨形成を刺激するための組成物を提供する。
【背景技術】
【０００６】
骨の喪失または薄片化が現れる種々の状態および疾患は重大かつ増大しつづけている健康問題である。骨粗鬆症のみについて、アメリカ人３千万人と世界の１億人ほど多くの人がリスクをかかえていると換算されている。Ｍｕｎｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：１９４６−１９４９（１９９９）。骨の減少をともなうことが既知の他の病状には若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチによる骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、加齢による骨の喪失、およびその他の骨減少症が含まれる。さらに新たな骨形成は多様な状況において必要である。例えば、骨の修復の増強または骨折のための置換、骨欠損、形成外科手術、歯およびその他の移植ならびに同様の状況などである。
【０００７】
骨は結合組織の高密度な特殊化した形態である。骨マトリックスはその表面または近くに存在する骨芽細胞により形成される。骨は破骨細胞（マクロファージの一つの型）として知られる別の細胞に再吸収（侵食）される。これらの細胞は酸（骨の鉱質を溶解）とヒドロラーゼ（骨の有機成分を消化）を分泌する。故に骨形成と再構築は骨芽細胞および破骨細胞による生成活性と侵食活性との間の持続的な相互関係を伴う動的過程である。Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．（第３版  １９９４），１１８２−１１８６頁。
【０００８】
骨の喪失の治療の現在の様式は、骨形成の増強よりむしろ骨吸収過程を阻害するという点で主として抗吸収剤に対するものである。薬剤が骨吸収を阻害する能力により、骨粗鬆症の治療に使用または示唆されている薬剤には、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプター調節因子（ＳＥＲＭ）、カルシウム、カルシトリオール、カルシトニン（Ｓａｍｂｏｏｋ，Ｐ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：１７４７−１７５３）、アレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）（Ｓａａｇ，Ｋ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：２９２−２９９）およびその他のビスホスホネートがある。Ｌｕｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１３，５８１（１９９８）。しかしながら抗吸収剤は、結果として頻繁に骨の喪失に関与する骨形成速度を補正できず、骨吸収／再構築の阻害または他の好ましくない副作用に対する抗骨吸収剤の影響に関連する望まない効果を有し得る。
【０００９】
骨細胞生物学の分野における重要な発展はストローマ細胞、骨芽細胞、活性化型Ｔリンパ球、および乳腺上皮細胞で発現しているＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ、あるいはオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）（ＴＲＡＮＣＥ）、破骨細胞分化因子（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）（ＯＤＦ）としても知られる)は、マクロファージの破骨細胞への分化に不可欠な独特の分子であるという近年の発見である。Ｌａｃｅｙ，ら，Ｃｅｌｌ  ９３：１６５−１７６（１９９８）（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  Ｌｉｇａｎｄ  ｉｓ  ａ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）。ＲＡＮＫＬの細胞表面レセプターはＲＡＮＫ、すなわちＲｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ（ＮＦ）−κＢである。ＲＡＮＫＬは約５０アミノ酸未満の細胞内ドメイン、約２１アミノ酸の膜貫通ドメイン、および約２４０から２５０アミノ酸の細胞外ドメインを有する２型膜貫通タンパク質である。ＲＡＮＫＬは天然には膜貫通型および可溶性型として存在している。少なくともマウス型、ラット型、およびヒト型のＲＡＮＫＬとその改変型の推定アミノ酸配列が公知である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第６，０１７，７２９号，Ｂｏｙｌｅ，米国特許第５，８４３，６７８号およびＸｕ  Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．（２０００／１５：２１７８）（参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。ＲＡＮＫＬ（ＯＰＧＬ）は骨吸収の強力なインデューサーとして、および破骨細胞発生のポジティブな調節因子として同定されている。Ｌａｃｅｙ等（前出）。
【００１０】
破骨細胞の分化と活性化を担う因子としての役割に加えて、ＲＡＮＫＬがヒト樹状細胞（ＤＣ）クラスター形成（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（前出））および乳腺上皮発生（Ｊ．Ｆａｔａら「Ｔｈｅ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，Ｃｅｌｌ，１０３：４１−５０（２０００））を誘導することが報告されている。しかしながらＲＡＮＫＬが同化性の骨形成過程において役割を果たし得るか、または骨芽細胞の増殖もしくは骨の小結節の石灰化を刺激する方法に用いることができることは以前には知られておらず、予測もされていなかった。
【００１１】
従って、破骨細胞と治療目的の破骨細胞の操作について多くの発見が成されたにもかかわらず、骨芽細胞と骨形成に関しては多くは知られていない。故に、一般的に、同化過程を刺激することにより、協調的な吸収より強い程度にまで、骨形成の増強および骨の喪失の予防、もしくは阻害のための方法が求められる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
従って、骨芽細胞の活性の増強、骨芽細胞表現型への骨芽細胞前駆体の傾倒（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）、およびインビボでの骨マトリックスの沈着を含む骨形成を刺激する方法と組成物の提供が本発明の目的である。故に、本方法は、骨形成の増強のため、ならびに骨吸収過程が影響を受けることがあろうとなかろうと、骨形成を増強することにより疾患および骨を喪失する状態の処置のため骨形成の増強に提供される。
【００１３】
要約すると、本発明は骨形成を増強する方法に関する。本方法は、１）ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの１以上のオリゴマー複合体、２）骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性（この活性は骨形成の指標である）を増強する能力がある骨形成性の化合物、または３）骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化（この不活性化は骨形成の指標である）する能力がある骨形成性の化合物を有効量投与することを必要とする。
【００１４】
疾患あるいは少なくとも部分的に骨量の喪失により現れる状態の処置方法も提供する。本方法は、骨形成を増強するために有効量のＲＡＮＫＬ融合タンパク質もしくはアナログ、誘導体またはその模倣物を含む薬学的組成物の投与を含む。別の実施形態において、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性（この活性は骨形成の指標である）を増強する能力がある骨形成性の化合物を含む薬学的組成物を使用し得る。さらなる実施形態において、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化（この不活性化は骨形成の指標である）する能力のある骨形成性の化合物を含む薬学的組成物を使用し得る。それにより、骨量の喪失を予防、阻害あるいは緩和することができる。
【００１５】
別の局面において、出願人は、骨形成を刺激するための組成物を提供している。組成物は、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤の中に有効量のＲＡＮＫＬ融合タンパク質、オリゴマー複合体、もしくはアナログ、誘導体またはその模倣物を含む。さらに、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤の中に有効量の骨形成性の化合物を含む組成物を提供する。ここで、骨形成性の化合物は、１）骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性（この活性は骨形成の指標である）を増強する能力があるか、または２）骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化（この不活性化は骨形成の指標である）する能力がある。
【００１６】
一つの実施形態として、細胞内タンパク質はＩＫＢ−αおよびにＩＫＢ−βから選択される。好ましい実施形態では、長期化した活性を示す細胞内タンパク質は細胞内キナーゼを含み、ＥＲＫ１／２、ＩＫＫ、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、およびｐ３８のようなキナーゼがより好ましい。より好ましい実施形態では、キナーゼはＥＲＫ１／２である。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、１以上の細胞内タンパク質の活性が前述したタンパク質のリン酸化を構成する。詳細には、リン酸化を受けるタンパク質はＥＲＫ１／２、ＩＫＫ、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＪＮＫおよびｐ３８を含む。より好ましくは、リン酸化をうけるキナーゼはＥＲＫ１／２である。
【００１８】
別の局面において、１以上の細胞内タンパク質の活性は、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体と共に骨形成性化合物をインキュベート後、少なくとも約１５分から３０分で検出することができる。好ましくは、活性は４０分間で検出でき、前述のインキュベート後、少なくとも６０分間で検出できる。
【００１９】
別の実施形態では、本発明の方法と組成物において骨芽細胞および骨芽細胞前駆体の１以上のホスファターゼを不活性化（この不活性化は骨形成の指標である）する能力がある骨形成性の化合物を使用し得る。好ましくは、前述のホスファターゼは、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＩＫＫ、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＪＮＫおよびｐ３８に特異的なホスファターゼからなる群から選択され、より好ましくは、このホスファターゼは、ＥＲＫ１／２に特異的なホスファターゼである。別の好ましい実施形態では、不活性化はホスファターゼのリン酸化を含む。
【００２０】
本明細書中に記載された方法と組成物に用いられる好ましいオリゴマー複合体はＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、ＡＰ−ＲＡＮＫＬ、ロイシンジッパー−ＲＡＮＫＬおよびＴＡＬＬ−１の「フラップ（ｆｌａｐ）」ドメインを含むＲＡＮＫＬ誘導体のオリゴマー複合体を含む。
【００２１】
他の目的および特徴は、一部は明白であり、一部は本明細書中下記に示す。
【００２２】
(略語と定義）
本発明の理解を容易にするため、多くの用語を以下に定義する。
【００２３】
「ＭＡＰキナーゼ」もしくは「ＭＡＰＫ」は、本明細書中で交換可能に用いられており、マイトジェン活性化プロテインキナーゼの略語である。
【００２４】
「ＥＲＫ１／２」は、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２を表し、それぞれ細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）１および細胞外シグナル調節キナーゼ２に対する略語である。
【００２５】
ＪＮＫは、ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼの略語である。
【００２６】
ｐ３８は、３８ｋＤａのキナーゼであり、キナーゼのＭＡＰＫファミリーのメンバーである。
【００２７】
Ａｋｔは、Ａｋｔセリントレオニンキナーゼである。
【００２８】
「ＩＫＢ」は、ＩκＢタンパク質の略語である。従って、ＩＫＢ−αはＩκＢαであり、ＩＫＢ−βはＩκＢβである。
【００２９】
「ＩＫＫ」は、ＩκＢ（ＩＫＢ）キナーゼに対する略語である。
【００３０】
「ＲＳＫ」は、ｐ９０リボソーマルＳ６プロテインキナーゼに対する略語である。
【００３１】
「ＲＡＮＫＬ」もしくは「ＲＡＮＫリガンド」は、本明細書中に交換可能に用いられており、ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦκＢ）のリガンドを示す。
【００３２】
「ＡＰ」は、アルカリホスファターゼに対する略語である。
【００３３】
「ＧＳＴ」は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対する略語である。
【００３４】
「ＨＰＲＴ」は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼに対する略語である。
【００３５】
「Ｃｂｆａ１」は、コア結合因子１（ｃｏｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １）に対する略語である。
【００３６】
「ＬａｃＺ」は、β−ガラクトシダーゼに対する略語である。
【００３７】
「骨形成能」もしくは「骨形成活性」は、本明細書中に交換可能に用いられており、骨形成アッセイで測定されるような骨形成を増強する能力がある任意の化合物を指す。
【００３８】
「ＢｒｄＵ」は、５−ブロモ−２’−デオキシウリジンに対する略語である。
【００３９】
「ＴＡＬＬ−１」は、「ＴＮＦおよびＡＰＯＬに関連する白血球発現リガンド１（ＴＮＦ−ａｎｄ  ＡＰＯＬ−ｒａｌａｔｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  １）」タンパク質に対する略語である。
【００４０】
用語「有効量」は、統計的に有意な効果をもたらす問題の物質の量を意味する。例えば、治療に用いる「有効量」は、骨折の修復の治癒速度の臨床的に有意な増加、骨粗鬆症における骨の喪失の逆転もしくは阻害、骨粗鬆症の発症の予防もしくは遅延、骨折の癒着不能および骨延長法（ｄｉｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）における骨形成の刺激および／もしくは増強、プロテーゼデバイス内への骨の成長の増加および／または加速、歯の欠損の修復もしくは予防、または本明細書上記で考察されているものを含む（限定されるものでない）他の骨の喪失状態、疾患もしくは欠損の処置または阻害をもたらすために求められる、本明細書中に記載された活性化合物を含む組成物の量である。このような有効量は慣用的な至適化方法を用いて決定され、処置される特定の症状、患者の状態、投与の経路、製剤形態および開業医の判断なたびに当業者に明白である他の要因に依存する。本発明の化合物に要求される投薬量（例えば、骨形成の増加が望まれる骨粗鬆症において）は、処置群とコントロール群の間で統計的に有意な骨量の差異を引き起こす投薬量として明示される。この骨量の差異は、例えば、少なくとも１−２％、もしくは処置群における臨床的に有意な骨量の増加として見られ得る。治癒における臨床的に有意な増加の他の測定法としては、例えば、Ｉ型コラーゲンのＮ末端プロペプチドに対するアッセイ、破壊強度と張力、破壊強度とねじれ、４点屈曲（４−ｐｏｉｎｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ）、骨の生検において増加した結合性についての試験および当業者に周知の他の生体力学の検定法が挙げられ得る。処置レジメンの一般的な方針は、目的の疾患の動物モデルにおいて実施される実験から得られる。
【００４１】
本明細書中に用いられている様に、「処置」は、予防法と治療法両方を含む。故に、被験体を処置するにあたって、本発明の化合物は、既に骨量の喪失に苦しんでいる被験者に、もしくはその様な状態の発症を予防または阻害するために投与され得る。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明に従って、本出願人は、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質のオリゴマー複合体、特にＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのオリゴマー、もしくはその改変体、アナログ、誘導体および模倣物が、活性化骨芽細胞数の純増加を刺激し、骨形成の同化過程を促進するような量および方法で投与できることを開示している。このような発見は、骨の置換もしくは修復を容易にするのに有用な方法のため、ならびに骨形成の同化過程を刺激することにより骨量の喪失を伴う疾患もしくは状態の処置のための基礎を提供する。
【００４３】
下記の詳細な説明は、本発明を実施するにあたり、当業者を補助するため提供される。そうであっても、この詳細な説明は、本発明の開示の精神もしくは範囲から逸脱することなく、本明細書中で考察される実施形態における修飾および改変が、通常の技術を持つ当業者により成され得るので、過剰に本発明を制限するよう構成されるべきではない。
【００４４】
本出願において引用された全ての刊行物、特許、特許出願、データベース、および本明細書中に引用された他の参考文献は、それぞれ個別の刊行物、特許、特許出願、データベースもしくは他の参考文献が明確に、および個別に参考として援用されるように、その全体が本明細書に参考として援用される。
【００４５】
ＲＡＮＫＬ、そのフラグメント、改変体、アナログ、模倣物、融合産物および前記の化合物のオリゴマー複合体（本明細書中で教示されるように、オリゴマー複合体は骨形成を増強する能力を持つ）の選択および／もしくは合成は、当業者の能力内であり、本発明の範囲内であることが意図される。例えば、Ｂｏｙｌｅ（前出）は、ＲＡＮＫＬ（「オステオプロテゲリン結合タンパク質」と呼ばれる）の多様な形態の合成の詳細な考察を提供しており、例えば、マウス型およびヒト型改変型、ＲＡＮＫＬの組換え型、ＲＡＮＫＬフラグメント、ＲＡＮＫＬのアナログ、模倣物および誘導体、ならびにその融合タンパク質を開示している。（グリコシル化タンパク質のような）翻訳後修飾をうけたＲＡＮＫＬの誘導体もしくはアナログ、ならびに高ストリンジェンシーの条件下でＲＡＮＫＬ  ｃＤＮＡのポリペプチドコード領域の一部もしくは全部にハイブリダイズことが示された核酸によりコードされるポリペプチドは、本発明の範囲に含まれる。ＢｏｙｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎら（前出）を参照のこと。マウス型ＲＡＮＫＬ核酸およびアミノ酸配列は、本明細書中において、それぞれ配列番号１および配列番号２として提供されている（図１参照）。しかしながら、他の生物種由来のＲＡＮＫＬ配列が、同定され、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で入手可能である。例えば、ヒト型ＲＡＮＫＬ核酸およびアミノ酸配列は、次の登録番号ＡＦ０１９０４７およびＡＡＢ８６８１１に該当する。例えば、ラット型ＲＡＮＫＬ核酸およびアミノ酸配列は、次の登録番号ＮＭ＿０５７１４９およびＮＰ＿４７６４９０に該当する。従って、任意のＲＡＮＫＬ分子が本発明の方法において使用され得、それ故、これらは本発明の範囲内であることが意図される。
【００４６】
ＲＡＮＫＬおよび関連分子は、当該分野において周知の手順を用いて、コードしている核酸配列を含む適切な発現ベクターにおいて、本発明のペプチドをコードする核酸分子を使用することによって、合成することが出来る。そのようなＤＮＡ分子は、調製され、次に、例えば、自動ＤＮＡ配列解析および遺伝コードの周知のコドン−アミノ酸の関係を用いて解析され得る。そのようなＤＮＡ分子は、オリゴヌクレオチドプローブおよび従来のハイブリダイゼーション方法論を用いて、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡとしても獲得され得る。そのようなＤＮＡ分子は、細菌（例えば、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞株のような適切な宿主におけるＤＮＡの発現とポリペプチドの産生に適合した発現ベクター（プラスミドを含む）に組み込まれ得る。例えば、実施例１および実施例２５を参照のこと。融合タンパク質を含む、このような組換えタンパク質の産生方法は、当該分野において周知であり、本明細書中に参考として援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  および  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版．，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９５、ならびに改定版、の様な標準的な分子生物学の参考文献に見出され得る。
【００４７】
さらに、ポリペプチドの活性を完全に失うことなく、特定の改変が成されることが公知である。改変としては、アミノ酸の除去、置換および付加が挙げられる。他の改変を含むポリペプチドは、当業者により合成され得る。故に、ポリペプチドの有効性は、アミノ酸配列もしくは構造の多様な変更を介して改変され得る。
【００４８】
さらに、前述のアナログもしくは模倣物は、可溶性、安全性もしくは有効性のような特性を改良するため、当該分野で公知の方法を用いて改変され得ることが理解されるべきである。これらの好ましい化合物の必須の特性は、本明細書中に記載された出願人らの方法に従って使用された場合、骨形成を刺激する能力である。
【００４９】
出願人らは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのオリゴマーの投与が骨形成の同化過程の促進を起こすことを開示した。実施例１および図２で示すように、サイズ排除クロマトグラフィーは、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質が生理的条件下でオリゴマー複合体として存在し得ることを示す。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのオリゴマーは、ＲＡＮＫＬおよびＧＳＴのそれぞれ二量体化および三量体化する傾向の結果として、形成されると考えられている。従って、ＧＳＴ以外の他の融合パートナーが、ＲＡＮＫＬ含有オリゴマー複合体形成に使用され得る。好ましい融合パートナーとして、アルカリホスファターゼ、ロイシンジッパーが挙げられるが、オリゴマー構造を形成する傾向を持つ他の任意のタンパク質も本発明の範囲内であることが意図される。好ましい実施形態において、ＲＡＮＫＬ融合パートナーは、ＲＡＮＫＬのＮ末端に付加される。オリゴマー複合体を形成するため用いられるＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの形成は、実施例１およびに実施例２５に記載される。さらに、周知の技術により、ＲＡＮＫＬオリゴマーの他の形態を作製することは、当業者の能力内である。例えば、当業者は、自己会合および／もしくは高次の複合体を形成する内在性の傾向を有する別のタンパク質あるいはポリペプチドを用いて、ＲＡＮＫＬオリゴマーを構築し得る。当業者は、化学修飾により、もしくは多コピーが連結したＲＡＮＫＬのポリマー型（例えば、真珠の鎖に似ている）を合成することによりその様なオリゴマーを作製し得る。そのような別の実施形態もまた、本発明の範囲内である。
【００５０】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、ＧＳＴと同様に、二量体化する傾向を有する。ＡＰは、全ての生物に共通する酵素の大きなファミリーを構成する。ヒトは、ＡＰの４つのアイソフォームを持ち、それらの３つは組織特異的であり、１つは非特異的で、骨、肝臓および腎臓に見られ得る。これらの３つの組織特異的ＡＰは、胎盤ＡＰ（ＰＬＡＰ）、生殖細胞ＡＰ（ＧＣＡＰ）、および腸ＡＰを含む。アミノ末端ＡＰ−ＲＡＮＫＬの構築は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質の構築と同様に実施され得る。使用され得るアルカリホスファターゼの例は、登録番号ＡＡＡ５１７１０、ＡＡＡ５１７０７、ＡＡＣ９７１３９、ＡＡＬ１７６５７、Ｐ２４８２３、およびＡＡＡ３７５３１に対応する、ヒト型胎盤ＡＰ−１、ヒト型胎盤ＡＰ−２、ヒト型胎盤ＡＰ前駆体、マウス型分泌型ＡＰ、マウス型胚ＡＰ前駆体、およびマウス型胚ＡＰを含むが、それらに限定されない。一つの好ましい実施形態において、ヒト型胎盤アルカリホスファターゼが使用されるが、ヒトかまたはＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓのような他の哺乳類種から単離された他のＡＰが、使用され得る。多くの異なるアルカリホスファターゼの使用は、全てのＡＰの二量体化する能力のため、可能であると考えられる。要約すると、所望のＡＰのアイソフォームをコードするｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから単離され得、結果として生じるＤＮＡ配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）中のＲＡＮＫＬ  ｃＤＮＡの上流（アミノ末端）でスプライスされ得る。ＡＰ−ＲＡＮＫＬを含むヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、当該分野において周知である任意の形質移入もしくは形質導入技術により、目的の宿主細胞に導入できる。実施例１７も参照のこと。
【００５１】
あるいは、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質は、ロイシンジッパードメインの様な、オリゴマー化する能力を有するペプチドを含み得る。ロイシンジッパーは、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で最初に発見された。（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９，１９８８）。ロイシンジッパードメインは、これら（および他の）タンパク質中に存在する保存されたペプチドドメインを称するために使用される用語であり、タンパク質二量体化の原因となる。ロイシンジッパードメインは、、他のアミノ酸間に散在する４個もしくは５個のロイシン残基を有する反復性の７価リピート（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）を含む。ロイシンジッパードメインの例は、酵母の転写因子ＧＣＮ４およびラットの肝臓に見られる熱安定ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１，１９８９）に見られるものである。
【００５２】
ロイシンジッパードメインは、短く平行なコイルドコイルとして折り畳まれることが公知である。（Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５３９；１９９１）。一般的な平行コイルドコイルの構造は、１９５３年にＣｒｉｃｋにより提案された「ノブズ−イントゥ−ホールズ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」パッキング（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６：６８９）で良く特徴づけられている。ロイシンジッパードメインにより形成された二量体は、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗａｒｔ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：２９３；１９７５）の概念に従い、（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎで示される７価リピートにより安定化される（残基ａおよびｄは、一般的に疎水性残基であり、ｄがロイシンにあたり、螺旋の同じ面に並ぶ）。逆の電荷を有する残基は、通常ｇおよびｅ位に存在する。故に、平行コイルドコイルは、二つの螺旋状のロイシンジッパードメインから形成され、第1の螺旋の疎水性側鎖により形成される「ノブ」は、第２の螺旋の側鎖の間に形成される「ホール」に充填される。
【００５３】
いくつかの研究は、保存的なアミノ酸は、二量体化する能力の最小の減少で個々のロイシン残基と置き換えられ得るが、多重の置換は、通常この能力の欠損を生じることを示している。（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１，１９８９；ＴｕｒｎｅｒおよびＴｊｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８９，１９８９；Ｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１４００，１９９０）。ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅｒｅｎらは、多くの異なるアミノ残基がＧＣＮ４のロイシンジッパードメインのロイシン残基と置換され得ることを報告し、さらに、２つのロイシンの置換を含む数個ののＧＣＮ４タンパク質は弱く活性を有することを見出した。（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３７２１．１９９２）。
【００５４】
ＧＣＮ４のロイシンジッパードメインに相当する合成ペプチドのａおよびｄ残基におけるアミノ酸置換は、ロイシンジッパードメインのオリゴマー化の性質を変化させることがわかっている。（Ａｌｂｅｒ，Ｓｉｘｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）。全てのａ位の残基がイソロイシンに変更される場合、ロイシンジッパーはなおも、平行な二量体を形成する。この置換に加え、全てのｄ位のロイシン残基もまたイソロイシンに変更される場合、結果として生じたペプチドは、溶液中で三量体化した平行コイルドコイルを自発的に形成する。全てのｄ位のアミノ酸をイソロイシンへ、ａ位のアミノ酸をロイシンへの置換により、四量体化したペプチドを生じる。これらの置換を含むペプチドもまた、ロイシンジッパードメインと呼ばれる。しかしながら、好ましい実施形態において、タンパク質を二量体化し得るロイシンジッパーが、ＲＡＮＫＬ融合パートナーとして用いられる事が、指摘されるべきである。ＲＡＮＫＬ−ロイシンジッパー融合タンパク質の構築は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬおよびＡＰ−ＲＡＮＫＬと同じ方法で実施され得る。実施例１８を参照のこと。細菌に加え、哺乳動物細胞株および昆虫細胞のような他の適切な発現システムも使用され得る。当業者は、ロイシンジッパー−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質を発現するため必要な修正を容易に行い得る。
【００５５】
別の実施形態として、ＲＡＮＫＬ誘導体は、オリゴマー複合体を形成するため、使用され得る。最近、新たに見出されたＴＮＦリガンドファミリーのメンバー、ＴＡＬＬ−１（ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＢＬｙＳ、およびｚＴＮＦ４としても知られる）が生理的条件下でオリゴマー形成する能力を有する事が発見された。（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ，１０８：３８３−３９４，２００２）。Ｌｉｕらは「フラップ（ｆｌａｐ）」領域（フラップを形成し、フラップを分子から拡がらせるループの長さによりそう名づけられた）が、三量体−三量体相互作用およびその後のクラスター形成を媒介することを示している。このフラップ領域は、ＴＮＦファミリーのメンバーのなかで、ＴＡＬＬ−１に固有であり、これまでに発見されている他のＴＮＦファミリータンパク質のどのＤＥループよりも長い表面ＤＥループ（ＴＡＬＬ−１のＤ鎖およびＥ鎖を連結するループ）により作られる。オリゴマー化は、長いＤＥループと周囲のＴＡＬＬ−１分子の非共有結合性の相互作用を介して起こり、その結果、大きなクラスターの形成を生じると考えられる。ＲＡＮＫＬおよびＴＡＬＬ−１は共にＴＮＦリガンドファミリーのメンバーであり、同様のβ鎖コア構造を有するので、本発明に従い、ＲＡＮＫＬは、生理的条件下で自発的にオリゴマー形成する変異型ＲＡＮＫＬ分子を作るように変異される。一つの実施形態において、ＲＡＮＫＬの改変は、そのＤＥループ（アミノ酸配列ＳＩＫＩＰを含むアミノ酸２４５〜２４９）がＴＡＬＬ−１のＤＥループ（アミノ酸配列ＫＶＨＶＦＧＤＥＬ）で置換されるように設計される。実施例１９を参照のこと。さらにＴＡＬＬ−１のオリゴマー化ドメインを反復発生させるため、ＲＡＮＫＬ分子全体にわたって、次のアミノ酸置換が成され得る：１６８Ｔ→Ｉ、１８７Ｙ→Ｌ、１９４Ｋ→Ｆ、２１２Ｆ→Ｙ、２５２Ｈ→Ｖ、２７９Ｆ→Ｉ、および２８３Ｒ→Ｅ。実施例２０を参照のこと。変異は、ＰＣＲで駆動させる部位特異的変異誘発により（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能）を用いて）ＲＡＮＫＬに導入され得る。そのような改変ＲＡＮＫＬのオリゴマー化能を測定するため、サイズ排除クロマトグラフィーのような、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを調べるものと同じアッセイを用いることができる。当業者は、過度の実験なく、前述の変異を作製し、変異を導入されたＲＡＮＫＬの構造と機能とを試験することができる。
【００５６】
出願人らにより教示されているように、ヒトおよびに動物の患者での骨形成の促進における本発明のオリゴマー性ＲＡＮＫＬ複合体の有効性を測定するため、インビトロもしくはインビボアッセイが使用され得る。インビトロ結合アッセイのために、骨芽細胞様細胞は、使用され得る。適切な骨芽細胞様細胞には、初代骨髄ストローマ細胞、初代骨芽細胞、ＳＴ−２細胞、Ｃ１細胞、ＲＯＳ細胞、およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞株の多くは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．より入手可能であり、標準の特定の増殖培地中で維持できる。インビトロ機能アッセイのために、オリゴマー複合体は、一定範囲の濃度の化合物と共に細胞を培養すること、および骨芽細胞の活性化、骨マトリックスの沈着、頭蓋冠の厚さおよび骨の小結節の形成のような骨形成のマーカーもしくは指標を評価することにより、検定できる。下記の実施例２を参照のこと。加えて、骨芽細胞の増殖、Ｉ型コラーゲンの発現および／もしくはＣｂｆａ１の発現は、骨形成の評価に使用され得る。下記の実施例１４を参照のこと。
【００５７】
さらに、化合物での骨芽細胞の処理の一般的なプロトコルは、当該分野で十分に確立されている。例として、Ｗｙａｔｔら，ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：１４，２００１を参照のこと。この文献において選択された細胞株は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１であり、この細胞株は、骨芽細胞の分化および成熟のインビトロモデルとして用いられている。細胞の処理は、この場合ではＢＭＰ−２を用い、下記の方法で実施された。細胞は、５％ウシ胎仔血清、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ  グルタミン、１００ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したα−ＭＥＭ培地中で、２５ｃｍ２のプラスチック培養フラスコにおいて５０００／ｃｍ２でプレーティングされ、加湿された５％ＣＯ２／９５％大気、３７℃において増殖された。細胞は、ＰＢＳ中で０．００２％プロナーゼＥを含むＰＢＳで剥がされた後、３日から４日おきに継代された。処理群の細胞は、２４時間増殖され、次いで、４ｍＭ  ＨＣｌおよび０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳに溶解したＢＭＰ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）と共に、３７℃にて、２４時間および４８時間、インキュベートされた。コントロール群は、等量のビヒクルのみで処理された。
【００５８】
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのようなオリゴマーでの骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の処理の例示的な条件は、下記に記載される。骨芽細胞前駆体は、ビヒクル、ＧＳＴ（ネガティブコントロール）、もしくは漸増濃度の精製されたオリゴマーＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ（例えば、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度）の存在下でインキュベートされる。骨形成促進タンパク質（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ））−２は、ポジティブコントロールとして投与される。試験組成物は、培養開始時のみ１２時間、もしくは開始時に１回と３日後に１回（これもまた１２時間）、投与される。用いられる条件は、使用される細胞株および化合物、それらのそれぞれの量、ならびにプレーティングする条件および培地の組成のようなさらなる要因により変動することに留意すべきである。そのような調整は、当業者により容易に決定される。
【００５９】
さらに、出願人らの方法に従い、骨形成を増強するオリゴマーＲＡＮＫＬ組成物は、種種の動物モデルにおいて評価され得る。実施例３〜実施例６および下記の記述を参照のこと。
【００６０】
一般に使用されるアッセイは、新生マウス頭蓋冠アッセイである。要約すると、出生後４日目に、ＩＣＲ  Ｓｗｉｓｓ  ｗｈｉｔｅマウスの新生仔の前頭および頭頂骨は、微小切開により取り出され、矢状縫合に沿って分割される。次いで、骨は、指定の培地中でインキュベートされる。その培地は、試験化合物もしくはコントロール化合物のどちらかを含む。インキュベーション後、骨は培地から取り出され、１０％緩衝ホルマリン中で２４時間〜４８時間固定され、１４％ＥＤＴＡ中で１週間脱灰され、段階的なアルコールで処理され、そしてパラフィンワックスに包埋される。頭蓋冠の３ミクロンの切片が調製され、骨形成もしくは骨吸収の組織形態計測解析を用いて評価される。骨の変化は、２００ミクロン隔てて切られた切片において測定される。骨芽細胞および破骨細胞は、それらの異なる形態により識別される。
【００６１】
このアッセイに加えて、マウス頭蓋冠の骨の成長における化合物の効果は、インビボにおいても試験され得る。このスクリーニングアッセイの一例において、４週齢〜６週齢の雄のＩＣＲ  Ｓｗｉｓｓ  ｗｈｉｔｅマウスが使用され、一群あたり４匹〜５匹のマウスが使用される。要約すると、試験化合物もしくは適切なコントロールは、正常マウスの右側頭蓋冠上の皮下組織に注入される。マウスは、１４日目に屠殺され、骨の成長は、組織形態学計測の方法により、測定される。骨の試料は、隣接する組織を取り除かれ、１０％緩衝ホルマリン中で２４時間〜４８時間固定され、１４％ＥＤＴＡ中で１週間〜３週間脱灰され、段階的なアルコールで処理され、パラフィンワックスに包埋される。頭蓋冠の３ミクロン〜５ミクロンの切片が調製され、代表的な切片は、骨形成および骨吸収の効果の組織形態計測の評価のため、選択される。切片は、顕微鏡像をデジタル化したプレート上に直接、記録するため、カメラルシーダ部品（ｃａｍｅｒａ  ｌｕｃｉｄａ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を使用して、測定される。骨の変化は、頭蓋冠の注入した側および注入しなかった側の両方において、２００ミクロン隔てて切られた切片の４箇所の隣接した１×１ｍｍ領域で測定される。新しい骨は、その特徴的な色の特性によって識別され、破骨細胞と骨芽細胞とは、それらの異なる形態により、識別される。組織形態計測のソフトウェア（ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ，Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ａｔｌａｎｔａ）は、細胞数を決定し、そして面積もしくは境界線を測定するためにデジタル化入力を処理するために使用され得る。
【００６２】
さらなるインビボアッセイは、インタクトな動物での投薬アッセイ、急性卵巣摘出（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ：ＯＶＸ）（予防モデル）動物での投薬アッセイ、および慢性ＯＶＸ動物（処置モデル）での投薬アッセイを含む。インタクトな動物での原型的な投薬は、例えば、皮下、腹腔内、経上皮、もしくは静脈内投与により実施され得、そして注射、もしくは他の送達技術により実施され得る。試験化合物の投与の期間は、変動し得る（例えば、２８日間ならびに３５日間が適切であり得る）。例として、下記に記載のあるように、インビボ経上皮もしくは皮下投与アッセイが実施され得る。
【００６３】
代表的な研究では、７０匹の３ヶ月齢、雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが、体重を揃えられ、各群１０匹の動物として７群に分けられる。これは、実験開始時に屠殺される動物のベースラインコントロール群、ビヒクルのみを投与されるコントロール群、ＰＢＳで処置されるコントロール群、および骨の成長を増強することが公知の化合物を投与されるポジティブ群を含む。３種の投薬量の試験化合物は、残りの群に投与される。試験化合物、ＰＢＳ、およびビヒクルは、３５日間、１日１回、皮下に投与される。全ての動物は、屠殺される９日前および屠殺される２日前に、（新たに形成された骨の適切な標識を確保するため）カルセインを注入される。体重は、週ごとに測定される。３５日間の最後に、動物は、体重を測られ、眼窩もしくは心臓の穿刺により、採決される。血清カルシウム、リン酸、オステオカルシン、およびＣＢＣが、測定される。末梢骨用定量的コンピューター断層撮影法（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ｐＱＣＴ；Ｆｅｒｒｅｔｔｉ，Ｊ，Ｂｏｎｅ，１７：３５３Ｓ−３６４Ｓ，１９９５）、二重エネルギーＸ線吸収法（ｄｕａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ：ＤＥＸＡ；Ｌａｖａｌ−Ｊｅａｎｔｅｔ  Ａ．ら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｌ，５６：１４−１８，１９９５，およびＣａｓｅｚ  Ｊ．ら、Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ，２６：６１−６８，１９９４）および／もしくは組織形態計測により実施されるような評価のために、脚の骨（大腿骨および脛骨）ならびに腰椎の両方は、取り出され、付着している軟組織を取り除かれ、７０％エタノール中もしくは１０％ホルマリン中に保存される。骨の再構築における試験化合物の効果は、このようにして評価され得る。
【００６４】
試験化合物は、急性の卵巣摘出動物においてもアッセイされ得る。そのようなアッセイは、コントロールとしてエストロゲン処置群も含み得る。これらの動物の試験の例は、下記に簡単に記載される。
【００６５】
代表的な研究では、８０匹の３ヶ月齢、雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットが、体重を揃えられ、各群１０匹の動物として８群に分けられる。これは、実験開始時に屠殺される動物のベースラインコントロール群、３種のコントロール群（偽ＯＶＸおよびビヒクルのみ、ＯＶＸおよびビヒクルのみ、ならびにＯＶＸおよびＰＢＳのみ）、骨量を増強することが公知の化合物を投与されるコントロールＯＶＸ群を含む。３種の投薬量の試験化合物は、ＯＶＸ動物の残りの群に投与される。
【００６６】
卵巣摘出は、摂食亢進を引き起こすので、３５日間の研究を通して、全てのＯＶＸ動物は、偽ＯＶＸ動物と同時飼育される。試験化合物、ポジティブコントロール化合物、ＰＢＳもしくはビヒクルのみは、３５日の間、１日１度、経上皮または皮下に投与される。代替として、試験化合物は、３５日間埋め込むことができる移植可能なペレット剤として処方され得るか、もしくは、経鼻投与のように経上皮投与され得る。全ての動物は、屠殺される９日前および屠殺される２日前を含む（しかし、限定されない）実験的に決定された間隔でカルセインを注入される。体重は、週ごとに測定される。３５日周期の最後に、その動物の血液および組織を、上記に記載したように処理する。
【００６７】
試験化合物は、慢性のＯＶＸ動物においてもアッセイされ得る。要約すると、８０匹から１００匹の６ヶ月齢、雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、実験開始時に、偽の外科手術（偽ＯＶＸ）、もしくは卵巣摘出術（ＯＶＸ）を施され、それと同時に、１０匹の動物は、ベースラインコントロールとして供するために屠殺される。体重は、週ごとに測定される。骨を欠乏させて約６週間もしくはそれ以上後に、１０匹の偽ＯＶＸおよび１０匹のＯＶＸラットは、欠乏期間のコントロールとするため、屠殺用に無作為に抽出される。残りの動物のうち、１０匹の偽ＯＶＸおよび１０匹のＯＶＸラットは、プラセボ処置コントロールとして、使用される。残りの動物は、３用量〜５用量の試験化合物で３５日間、処置される。本モデルにおいて、ＯＶＸラットの一群は、ポジティブコントロールとして、ＰＴＨのような公知の同化作用性の薬剤で処置され得る（Ｋｉｍｍｅｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３２：１５７７−１５８４，１９９３）。実験の最後で、動物は屠殺され、大腿骨、脛骨、および第１腰椎〜第４腰椎は切除され、集められる。近位の左および右脛骨は、ｐＱＣＴ測定、海綿骨質密度（ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ：ＢＭＤ）、および組織像に用いられ、一方、それぞれの脛骨の骨幹中部（ｍｉｄｓｈａｆｔ）は、皮質のＢＭＤもしくは組織像に用いられる。大腿骨は、生体力学の試験をする前に、骨幹中部のｐＱＣＴスキャンのため調製される。腰椎（ｌｕｍｂａｒ  ｖｅｒｔｅｂｒａｅ：ＬＶ）に関しては、ＬＶ２は、ＢＭＤのため処理され（ｐＱＣＴも実施され得る）、ＬＶ３は、脱灰していない骨の組織像のため調製され、ならびにＬＶ４は、力学試験のため処理される。
【００６８】
さらなる実施形態において、出願人は、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体において、オリゴマーＲＡＮＫＬとそのレセプターＲＡＮＫの間の相互作用が、細胞内タンパク質の延長した細胞内活性を生ずることを発見している。マウス骨芽細胞は、インビトロでＧＳＴ−ＲＡＮＫＬで処理された場合、ＮＦκＢおよびＥＲＫ細胞内シグナル経路の活性化で特徴付けられるような活性化を示した。出願人により言及されているように、細胞内タンパク質活性、特にＥＲＫ活性の時間経過は、細胞表面にＲＡＮＫも発現している破骨細胞前駆体の時間経過とは異なっている。破骨細胞前駆体において、ＥＲＫ活性は、ＲＡＮＫ／ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ相互作用の５分〜１０分後に最高に達し、１５分〜３０分後に基底レベルに戻る。対照的に、骨芽細胞のＥＲＫ活性は、同じ相互作用の１０分後に最高に達し、６０分後でもまだ基底レベルより高い。時間経過の延長化は、骨芽細胞前駆体において、さらに顕著であり、ここで、示されたＥＲＫ活性は、ＲＡＮＫ／オリゴマーＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ相互作用の６０分後でも最高に達していなかった。異なるＥＲＫ活性の時間経過に加え、骨芽細胞および骨芽細胞前駆体は、ＩＫＫ、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ、ｐ３８およびＪＮＫのようなキナーゼの延長した活性も示す。この骨芽細胞に関連した活性は、ＭＡＰキナーゼの短命な活性および骨吸収を生じる、破骨細胞におけるＧＳＴ−ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの相互作用と対照をなしている。したがって、特定の学説に拘束されないが、骨芽細胞においてオリゴマーＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激後に見られるキナーゼの延長した活性は、同化的な骨プロセスにおいて機能していると考えられる。
【００６９】
ＴＮＦファミリーのサイトカインに誘導される細胞内シグナル伝達は、レセプター−リガンド複合体のインターナリゼーションによって、弱められることが公知である。（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ＭおよびＡｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：３５５０−３５５８，１９９４参照のこと）。それ故、出願人は、ＲＡＮＫＬ含有オリゴマー複合体が、ＲＡＮＫＬ三量体と同様に早期のうちにインターナリゼーションされず、従ってレセプターとのより長い相互作用および延長した細胞内シグナル伝達を許容する、と考えている。図１６および実施例１３を参照のこと。
【００７０】
従って、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体において、１以上の細胞内タンパク質の活性を増強する能力をもつ骨形成性化合物（活性が骨形成の指標になる）は、本発明の方法に使用され得る。活性化される細胞内タンパク質はキナーゼを含むが、それに限定されない。好ましくは、キナーゼは、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、ＰＩ３キナーゼ、ＩＫＫ、Ａｋｔ、およびｐ３８を含み、さらにより好ましくは、キナーゼは、ＥＲＫ１／２である。他の細胞内タンパク質は、ＩＫＢ−α、ＩＫＢ−βを含む。
【００７１】
別の好ましい実施形態において、活性は、１以上の細胞内タンパク質のリン酸化を含み、さらに好ましくは、キナーゼのリン酸化を含む。ＭＡＰキナーゼファミリーにとって、完全な活性化は、グルタミン酸残基によって隔てられたチロシン残基とトレオニン残基（ＴＥＹモチーフとして公知であり、Ｔはトレオニン、Ｅはグルタミン酸、そしてＹはチロシンである）のＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＭＫＫ）として公知である単一の上流のキナーゼによる二重のリン酸化を必要とする。二重のリン酸化の必要条件により、確実にＭＡＰキナーゼがＭＫＫの作用により特異的に活性化される。
【００７２】
キナーゼがリン酸化されてるか否かを測定する技術的に利用可能などのようなアッセイも、使用され得る。好ましくは、そのようなアッセイは、ウェスタン分析法もしくはキナーゼアッセイを含む。
【００７３】
ウェスタン分析法は、一般的に下記のように実施される。一旦、細胞溶解物が、調製されると、細胞内タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を利用してサイズを基に分離される。分離されたタンパク質は、エレクトロブロティング法により、タンパク質が接着する適切なメンブレン（例えば、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン）に移される。メンブレンは、非特異的なシグナルを低減するため洗浄され、その後、ＲＡＮＫシグナル伝達の結果としてリン酸化された特定のアミノ酸のみを認識する抗体を用いて調べられる。さらに、余分な抗体を除く洗浄の後、（メンブレン上の特異的にリン酸化されたタンパク質に結合している）一次抗体を認識し、レポーター部分を含む二次抗体がメンブレンに加えられる。二次抗体のレポーター部分と相互作用する発色試薬の添加は、バンドの可視化を起こす。
【００７４】
キナーゼアッセイ（例えば、ＥＲＫ１／２に対する）は、ｐ９０リボソームＳ６プロテインキナーゼ（ＲＳＫ）のような、このキナーゼに対する公知の基質を用いて、実施できる。要約すると、例として、処理された骨芽細胞は、氷冷のＰＢＳで（例えば３回）洗浄され、細胞溶解物を得るため、溶解緩衝液で抽出される。細胞溶解物の微小遠心の後、得られた上清は、プロテインＧセファロースとともにヤギ抗ＲＳＫ２抗体（１：２００）と４℃で１晩、インキュベートされる。ビーズは、微量遠心により回収され、溶解緩衝液で２回、続いてキナーゼ緩衝液で洗浄される。ビーズ中のＲＳＫ２ホスホトランスフェラーゼ活性は、Ｓ６キナーゼアッセイキットおよび[γ−３２Ｐ]ＡＴＰを使用して、製造元（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）より提供されるプロトコルに従い、測定される。
【００７５】
骨芽細胞の活性化を測定するために応用できる別途のアッセイは、電気泳動移動度ゲルシフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｌ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ：ＥＭＳＡ）である。このアッセイは、（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬでの骨芽細胞活性化後のＮＦκＢのような）転写因子複合体の核移行を観察する。要約すると、ＥＭＳＡは、次のように実施される。処理された骨芽細胞の核は、単離され、その抽出物が作製される。その後、核タンパク質は、３２Ｐオルトリン酸で標識された特異的なオリゴヌクレオチドプローブとともにインキュベートされる。適切な時間後、推定されるタンパク質−ＤＮＡ複合体は、（ＳＤＳを含まない）ＰＡＧＥゲルで分離され、そのゲルは乾燥され、Ｘ線フィルムに露光される。もし、特異的な複合体（このケースではＮＦκＢと特異的なＤＮＡ配列の複合体）が形成されていれば、現像されたフィルム上にバンドが認められる。典型的には、適切なコントロールは、そのバンドが活性化された骨芽細胞に特異的であることを確定するため、実験試料と同時に泳動される。ウェスタン分析法、キナーゼアッセイ、およびＥＭＳＡの詳細な手順は、例としてＬａｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６（１７）：１４４４３−１４４５０，Ａｐｒｉｌ  ２７，２００１参照のこと。
【００７６】
骨芽細胞における活性化は、細胞をＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのようなオリゴマーとインキュベートした後、少なくとも６０分まで検出できる。骨芽細胞前駆体においては、活性化は５分から１０分後に最高に達し、少なくとも６０分後までの間、検出可能である。従って、１以上の細胞内タンパク質の活性は、骨形成性化合物を骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体とインキュベートした後、少なくとも約３０分までに検出し得る。好ましい実施形態において、活性は、前記のインキュベーション後、少なくとも約４０分で、より好ましくは、少なくとも約６０分で検出される。別の好ましい実施形態において、活性が少なくとも約３０分で検出される細胞内タンパク質は、キナーゼであり、より好ましくは、ＥＲＫ１／２である。
【００７７】
骨芽細胞を活性化および／もしくは骨芽細胞前駆体の分化を刺激する化合物が同化性の骨プロセスを増強し得ることを確認するため、そのような化合物を骨形成アッセイにおいて、試験することができ、ここでバックグラウンドの骨量における増加を上回る骨量における増加は、化合物が骨形成活性を有することを表す。本発明の潜在的な骨形成化合物をうまくスクリーニングするため用いられ得る複数の骨形成アッセがある。例えば、コラーゲンのレベルおよびアルカリホスファターゼ活性の測定に基づく骨芽細胞の分化と機能について細胞をベースとしたアッセイは、使用され得る。これらのアッセイは、当該分野で周知であり、当業者により容易に実施される。さらに、複数のインビトロおよびインビボアッセイは、上記の項に記述されている。骨芽細胞と骨芽細胞前駆体の両方とも、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのようなＲＡＮＫＬの同化型での刺激後、同じキナーゼの延長した活性を示すので、インビトロ骨形成アッセイは、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のどちらでも実施し得る事は言及されるべきである。
【００７８】
細胞内活性化アッセイおよび骨形成アッセイが化合物のライブラリーで実施される場合、骨形成性が示されている化合物を確実に同定することが必要であり得る。化合物の同一性の決定には、複数の方法がある。一つの過程は、Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．ｃｏｍ）から入手可能な質量分析装置を含む。ＮｅｏｇｅｎｅｓｉｓのＡＬＩＳ（自動化リガンド同定システム（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ））スペクトル検索エンジンおよびデータ解析ソフトウェアは、リガンドの正確な質量に基づくリガンド構造の高度に特異的な同定を可能にする。当業者は、化合物の同一性を決定するため質量分析実験を実施し得る。
【００７９】
別の実施形態において、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体における１以上のホスファターゼを不活性化（この不活性化は骨形成の指標である）し得る骨形成性化合物は、本発明の方法において使用され得る。一つの好ましい実施形態において、ホスファターゼは、ｐ３８、ＥＲＫｓ、ＪＮＫ、ＩＫＫ、およびＡｋｔを含む骨形成において関与するキナーゼを阻害する。より好ましくは、ホスファターゼは、ＭＡＰＫ特異的もしくはＡｋｔ特異的であり、さらに好ましくは、ホスファターゼは、ＥＲＫ１／２特異的である。特定の学説に束縛されないが、この方法は、キナーゼ活性は、それの対応するホスファターゼにより厳密に調節される事実に従い、この目的に適している。ＥＲＫ１／２の場合、そのホスファターゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼホスファターゼ−３（ＭＫＰ−３）として公知である。このホスファターゼは、対応するキナーゼのスレオニン残基およびチロシン残基からのリン酸基の除去を担う二重特異性ホスファターゼのファミリーに属している。（Ｃａｍｐｓら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１４，６−１６頁，１９９９）。ホスファターゼによるリン酸基の迅速な除去は、キナーゼの活性化は短命であり、休止細胞においてリン酸化のレベルは、低いということを確かにする。しかしながら、ホスファターゼが活性化しており、リン酸基を除去するためには、ホスファターゼもまたリン酸化を必要とする。それ故、ホスファターゼ活性の阻害は、ＥＲＫ１／２活性の活性化もしくは延長を生じる。
【００８０】
骨芽細胞／骨芽細胞前駆体において、ホスファターゼを不活性化する骨形成性化合物の能力を測定する一つの方法は、骨芽細胞／骨芽細胞前駆体をＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくはＢＭＰ−２（骨形成促進タンパク質２）のようなこれらの細胞を活性化することで公知である物質で最初に活性化することを含む。これは、ホスファターゼの活性化を導き、その時点で、骨芽細胞／骨芽細胞前駆体は、試験化合物で処理され、細胞溶解物が得られる。ホスファターゼを脱リン酸化する（不活性化する）試験化合物の能力は、ウェスタン分析法もしくはキナーゼアッセイの実施により測定される。上記参照のこと。ホスファターゼ活性を評価するさらなる詳細は、Ｍｕｄａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７３：９３２３−９３２９，１９９８およびＣａｍｐｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２６２−１２６５，１９９８を参照のこと。もし、化合物がホスファターゼ阻害活性を有すると決定されれば、さらにその骨形成性活性を測定するため、骨形成アッセイの一つにおいて試験され得る。これらのアッセイも上記に記載される。
【００８１】
（薬学的組成物および方法）
本発明の好ましい実施形態において、骨の喪失を予防する方法もしくは阻害する方法、または骨形成を増強する方法は、１）ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの１以上のオリゴマー複合体、２）骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性（この活性は骨形成の指標である）を増強する能力がある骨形成性の化合物、または３）骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質を不活性化（この不活性化は骨形成の指標である）する能力がある骨形成性の化合物、を投与することにより提供される。本発明の骨形成組成物は、このような組成物の有効量を、それらを必要とする患者に提供することにより利用され得る。一つの好ましい実施形態において、そのような組成物は、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全症、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周病、骨格への転移（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、癌、加齢による骨の喪失、骨減少症、および変質性関節疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）から成る群から選択される状態を処置するために使用される。
【００８２】
動物被験体の処置のための使用について、本発明の化合物は、薬学もしくは獣医学の組成物として処方され得る。処置されるべき被験体、投与様式、および所望される処置のタイプ（例えば、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、治療）に依存して；化合物は、これらのパラメータに一致する方法で処方される。そのような技術の概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出される。
【００８３】
本発明のＲＡＮＫＬ含有オリゴマーもしくは本発明の骨形成性化合物の投与は、投与の多様なパラメータ（頻度、投薬量、期間様式および投与経路を含む）を較正することにより、薬物動態学的および薬力学的に制御され得る。従って、一つの実施形態において、骨量の形成は、毎日の注射および／もしくは摂取のような非連続性の断続的な様式でＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫＬ融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの１以上のオリゴマー複合体のような同化性組成物を投与することにより達成される。一般的に、本明細書中に記載されるような任意の骨形成性化合物は、同様な効果を実現するため、断続的に投与され得る。投薬量、期間および投与様式におけるバリエーションもまた、求められる活性を産生するために操作され得る。
【００８４】
動物もしくはヒト被験体への投与のため、本発明の組成物の投薬量は、典型的には０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、投薬量は、疾患もしくは状態の性質、患者の状態、開業医の判断、および投与の頻度ならびに様式に高度に依存している。経口経路が採用される場合、その物質の吸収は、バイオアベイラビリティーをもたらす要因である。低い吸収は、胃−腸管内で、より高い濃度、従ってより高い投薬量を必要とする効果を持つ。
【００８５】
物質の適切な投薬量は、動物モデル試験（有効用量レベル（例えば、ＥＤ５０）および毒性用量レベル（例えば、ＴＤ５０）ならびに致死用量レベル（例えば、ＬＤ５０もしくはＬＤ１０）は、適切および受容可能な動物モデルにおいて証明される）を実施することにより適切に評価されるべきであることが、理解される。さらに、そのような動物試験において、ある物質が有効であると証明された場合、制御された臨床試験が実施されるべきである。
【００８６】
一般的に、処置における使用に関し、本発明の組成物は、骨の喪失の処置のため、単独もしくは他の組成物と組み合わせて使用され得る。そのような組成物としては、ビスホスフォネートのような抗吸収剤、カルシトニン、カルシトリオ−ル、エストロゲン、ＳＥＲＭおよびカルシウム供給源、もしくは副甲状腺ホルモンまたはその誘導体のような補助的な骨形成性の薬剤、骨形成促進タンパク質、オステオゲニン、ＮａＦ、もしくはスタチンが挙げられる。本明細書中に参考として援用される米国特許第６，０８０，７７９号を参照のこと。投与様式に依存して、化合物は適切な組成物に処方される。
【００８７】
処方物は、全身投与あるいは局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与または局所（ｌｏｃａｌ）投与のために適切な様式で調製され得る。全身的な処方物としては、注射（例えば、筋肉内注射、静脈内注射もしくは皮下注射）のために設計された処方物が挙げられるが、これらに限定されないか、あるいは経皮投与、経粘膜投与または経口投与のために調製され得る。処方物は、一般的に希釈剤ならびに（ある場合においては）アジュバント、緩衝剤、防腐剤などを含む。
【００８８】
経上皮投与のために、浸透される障壁に適した浸透剤が処方物中において使用される。一般的に、このような浸透剤は当該分野で公知である。経口投与のために、化合物はまた、リポソーム組成物もしくはマイクロエマルジョンとして投与され得る。適切な様式としては、当該分野において公知であるシロップ、カプセル、錠剤が挙げられる。注射のために、処方物は、溶液もしくは懸濁液として、または注射前の液体における溶液もしくは懸濁液として適切な固形物として、または乳化剤として慣習的な形状で調製される。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなどが挙げられる。そのような組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤のような補助的な非毒性物質量、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレートなどのｐＨ緩衝剤などを含み得る。
【００８９】
本明細書中に記載されたＲＡＮＫＬ含有オリゴマーおよび骨形成性化合物はまた、当業者に公知の多様な技術を用いて、患者（ヒトおよび他の脊椎動物（例えば、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、げっ歯類、ならびに家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ））の両方）の骨形成および成長が望まれる部位に局所的に投与され得る。例えば、これらとしては、スプレー、ローション、ゲルもしくは他のビヒクル（例えば、アルコール、ポリグリコール、エステル、オイルおよびシリコーン）が挙げられ得る。このような局所的な用途としては、例えば、骨折部位、あるいは損傷した骨の修復または置換の欠損部位が挙げられる。加えて、本発明のオリゴマー複合体および骨形成性化合物は、例えば、適切なキャリア中で自家移植片、同種移植片もしくはプロテーゼと天然の骨との接合部に、移植片もしくはプロテーゼの、天然の骨への結合を補助するために、投与され得る。
【００９０】
薬学的に受容可能な賦形剤としては、生理食塩水、リンゲル液、トコフェロール、リン酸溶液もしくは緩衝液、緩衝化生理食塩水、および当該分野において公知である他のキャリアが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的組成物はまた、安定剤、抗酸化剤、着色料、および希釈剤を含み得る。薬学的に受容可能なキャリアおよび添加剤は、薬学的化合物からの副作用が最小に抑えられ、化合物の能力が処置を無効にする限度まで取り消されも、もしくは阻害されるもしないように選択される。
【００９１】
下記の実施例は、本発明を例証するが、例証されるように本発明の多様な局面を限定するように挙げられていない。
【実施例】
【００９２】
（実施例１）
（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質としてのＲＡＮＫＬの発現）
マウス型ＲＡＮＫＬ残基１５８〜３１６をコードするｃＤＮＡを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１３８５３−ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅリストの核酸の欄を参照のこと）のグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼの下流にクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩＰＴＧ（０．０５ｍＭ）で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液の中で粉砕した。溶解物を、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質のアフィニティー精製のために、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともにインキュベートし、続いて１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で過剰に洗浄した。アフィニティーカラムからの競合溶出（１０ｍＭ  還元グルタチオン）の後、単離されたタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびｐＨに対し透析した。次いで、精製したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを、リムルス変形細胞溶解物試験（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ａｓｓａｙ）により、エンドトキシン汚染についてアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量した。
【００９３】
サイズ排除クロマトグラフィーにより示されるように、生理的環境を模した条件下で、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、大きなオリゴマー複合体を形成する。図２を参照のこと。図２の曲線下の面積により測定されるように、タンパク質の大部分は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのオリゴマー複合体として存在する。
【００９４】
（実施例２）
（全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激）
骨形成についてのアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第６，０８０，７７９号  カラム１０，ＩＩ．２９−５５に記載されるように実施した。新生仔のマウス頭蓋冠を、ビヒクル、ＧＳＴ（ネガティブコントロール）、もしくは実施例１に概要を述べたようにして得られた、精製された漸増濃度のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの存在下で、器官培養した。骨形成促進タンパク質（ＢＭＰ）−２を、ポジティブコントロールとして投与した。試験組成物を、培養開始時のみ、１２時間（１×）、もしくは開始時に１回と３日後にもう１回、１２時間の持続時間で（２×）、投与した。７日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するために、多様なコントロール群および実験群と比較した。要約すると、頭蓋冠の骨を、インキュベーション培地から取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン中で１２時間固定し、１４％ＥＤＴＡで３日間脱灰し、段階的にアルコールで脱水し、組織学的な切片作製のためにパラフィンに包埋した。頭蓋冠を、矢状縫合に垂直に、頭頂骨の中心部を通って、冠状に切断した。匹敵する解剖学的位置の代表的な冠状切片を、頭蓋冠の厚さの組織形態計測学的評価に供した（ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ，Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）。図３を参照のこと。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、１回もしくは２回投与された場合、頭蓋冠の厚さに用量依存的な増加を誘導した。図４を参照のこと。試験した最高の用量（１００ｎｇ／ｍｌ）において、頭蓋冠の厚さは２倍になった。
【００９５】
（実施例３）
（マウスにおける骨形成のインビボ刺激）
マウスＣ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、１００マイクログラムのＧＳＴ（コントロール）もしくは１００マイクログラムの実施例１において得られたようなＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１日１回、９日間、皮下に投与した。脛骨の組織学的試験は、コントロールマウスと比較して、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処置マウスにおいて、著しい骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を明らかにした。それぞれ低倍率および高倍率で撮影された図５（ａ）、図５（ｂ）を参照のこと。これらの図は、ＧＳＴを与えられたコントロール動物と比較して、皮質の厚さの顕著な増加および初期の海綿質（ｓｐｏｎｇｉｏｓａ）の小柱構造物の増加を明らかにした。
【００９６】
ＧＳＴ投与マウスもしくはＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスの二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ）解析もまた、標準的な手順で実施した。結果（図５（ｃ）を参照のこと）は、コントロールに比べ、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの骨塩密度の有意な増加を示す。
【００９７】
（実施例４）
（骨芽細胞のインビボ活性化）
マウスＣ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、実施例３において示された手順に従い、ＧＳＴ（コントロール）もしくはＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与した。脛骨の高倍率での組織学的試験は、コントロールマウスと比べ、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処置マウスにおいて骨芽細胞の顕著な活性化を明らかにした。休止した骨芽細胞は、コントロール動物において薄い骨表面細胞として明白である一方、活性化された骨芽細胞は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処置マウスにおいて、骨表面に沿った膨らんだ立方体の細胞として明白である。図６を参照のこと。
【００９８】
ＧＳＴコントロールと対比した、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのインビボ投与中の骨形成の速度の測定を、鉱質化している骨マトリックスに２種の蛍光標識を取り込ませるため、安楽死の７日前および２日前の２％ＮａＨＣＯ３中の２０ｍｇ／ｋｇカルセインの腹腔内投与により達成した。切開の後、頭蓋冠を、７０％エタノールで固定し、組織切片を切るため、ポリメチルメタクリレートに包埋した。冠状縫合とラムダ縫合と間の中間で撮った頭頂骨の冠状切片の顕微鏡写真は、図９に示されており、頭蓋冠の外表面が図の上側に、内表面が下側に向いている。５日間に合成された骨の量は、２セットの平行な蛍光バンド内に取り囲まれた量である。ＧＳＴのみを受けたコントロール動物における骨形成の強度は、明瞭に分離した二重の標識を産生するには不十分であるが、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処置動物においては、第１の標識と第２の標識との間の５日間に、骨の明確な沈積が存在する。
【００９９】
（実施例５）
（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの投与は、実質的に破骨細胞形成に影響することなく骨芽細胞の増殖を刺激する）
精製されたＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ融合産物を、マウスＣ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１，５００μｇ／ｋｇ、５，０００μｇ／ｋｇの漸増投薬量で、１日１回、７日間、皮下に投与した。ＲＡＮＫＬの最高の投薬量に相当するモル数のＧＳＴは、ネガティブコントロールとして働いた。マウスを屠殺し、長い骨を固定し、脱灰し、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ｔａｒｔｒａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ：ＴＲＡＰ）活性について染色した。ＴＲＡＰ活性は、骨に関する破骨細胞の特異的表現型マーカーである。海綿質表面１ｍｍあたりの活性化骨芽細胞および破骨細胞の数を、組織形態計測学的に定量した。図７に見られるように、間欠性の様式（すなわち毎日の注射による）で投与されたＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、活性化骨芽細胞における用量依存的な増加を生じたが、破骨細胞の数には生じなかった。ＧＳＴは、骨芽細胞もしくは破骨細胞のどちらにおいても顕著な影響を有さなかった。
【０１００】
（実施例６）
（エキソビボ骨小節形成により証明されるような骨芽細胞前駆体の分化の増強）
実施例３において考察されたようなＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ（１００μｇ）処置マウスおよびＧＳＴ処置マウス由来の同数の骨髄細胞を、骨を形成し得る骨芽細胞および関係する前駆体の数が増えているかどうか決定するため、２８日間、骨芽細胞形成条件に置いた。２８日後、細胞を、鉱質化骨小節を同定するために、アリザリンレッドで、そしてコロニー形成単位を同定するために、ヘマトキシリンで染色した。
【０１０１】
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処置マウスに由来する骨髄細胞は、ＧＳＴを投与された対応物より、実質的により鉱質化した骨小節を産生した（図８を参照のこと）。
【０１０２】
（実施例７）
（マウス破骨細胞前駆体において、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、迅速にＭＡＰキナーゼを活性化する）
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）より購入した。破骨細胞前駆体の単離のために、骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）を、４週齢〜６週齢のマウスの全骨髄から単離し、組織培養ディッシュ中で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間の培養後、非接着細胞を回収し、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ勾配で層状にし、勾配の界面の細胞を回収した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清を補ったα−最小必須培地中で、組換え型マウスＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、６５，０００／ｃｍ２で再プレートした。４日目もしくは５日目に、細胞をＧＳＴ−ＲＡＮＫＬで処理した。Ａｋｔの活性を扱う実験において、細胞をＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激前の２４時間、血清およびＭ−ＣＳＦを含まない培地で培養した。
【０１０３】
破骨細胞前駆体のイムノブロッティング（ウェスタンブロッティング）を、下記の指示に従って実施した。サイトカイン処理のＢＭＭの単層もしくはコントロールのＢＭＭの単層を氷冷ＰＢＳで２回、洗浄した。細胞を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭ  ピロリン酸（ｐｙｒｏｐｈｏｓｈａｔｅ）ナトリウム、１ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、および１×プロテアーゼインヒビターカクテルを含む緩衝液中で溶解した。細胞溶解物５０μｇをＳＤＳサンプル緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．０５％ｗ／ｖブロモフェノールブルー）存在下で５分間煮沸し、８％ゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質を、半乾燥ブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いてニトロセルロースメンブレンに移し、非特異的な結合を低減するため、ブロッキング溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝化生理食塩水中、５％脱脂粉乳）中で１時間インキュベートした。次いで、メンブレンを４℃で１晩、１次抗体に曝し、３回洗浄し、1時間、ヤギ抗マウスＩｇＧもしくは抗ラビットＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体と共にインキュベートした。メンブレンを、頻繁に洗浄し、製造元（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の指示に従い、増強化学発光検出（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）アッセイを実施した。
【０１０４】
イムノブロッティングアッセイの結果を図１０に示す。この図から見出されるように、ＪＮＫ、ｐ３８、およびＥＲＫの総細胞量は、このアッセイのどの時点においても有意には変わらなかった。ＥＲＫおよびｐ３８のリン酸化（活性化）は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の５分後に検出され、ＲＡＮＫ／ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ相互作用の１０分後、最高に達し、そして相互作用の３０分後には検出されなかった。ＪＮＫは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の１５分後にリン酸化されたが、このタンパク質は迅速に脱リン酸化され、その結果、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激後３０分までに、ＪＮＫのリン酸化形態は検出されなかった。データは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激後のマウス破骨細胞前駆体におけるＥＲＫ、ＪＮＫ、およびｐ３８の一過性で短命な活性を示した。
【０１０５】
（実施例８）
（マウス破骨細胞前駆体において、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、迅速にＡｋｔを活性化する）
破骨細胞前駆体を、実施例７に記載されたように単離、維持、および操作した。イムノブロッティングのプロトコルもまた、１次抗体がホスホ−Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社より入手した）に特異的であることを除き、実施例７と同様であった。
【０１０６】
図１１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の時点で、検出可能なＡｋｔのリン酸化が存在したことを示し、このことは、このタンパク質の迅速な活性化を示している。Ａｋｔは、ＰＩ３キナーゼの基質であり、活性化状態にあるＡｋｔは、抗アポトーシスシグナル伝達に関与する。Ａｋｔ活性は、経時的に増加した。すなわち、破骨細胞前駆体においてリン酸化Ａｋｔ分子の数は、経時的に増加した。従って、Ａｋｔの活性は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の０分後より５分後において強く、１５分後に最高に達した。
【０１０７】
（実施例９）
（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに誘導されたＭＡＰキナーゼの活性は、マウス骨芽細胞において延長される）
初代骨芽細胞を、連続的な酵素消化により新生仔マウス頭蓋冠から単離した。要約すると、頭蓋冠を刻み、カルシウムおよびマグネシウム不含のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に０．１％コラゲナーゼ、０．０５％トリプシン、および４ｍＭ  ＮＡ２ＥＤＴＡを含む酵素溶液中で穏やかに振とうしながら、室温で２０分間、インキュベートした。この手順を、計６の消化物を得るため、繰り返した。最後の４〜６の消化物から単離した細胞を、１５％ＦＢＳ、５０μＭアスコルビン酸、および１０ｍＭ  β−グリセロリン酸を含むＭＥＭ中で培養した。細胞を、６％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で、３７℃で維持し、培地およびサイトカインを毎日、置換した。
【０１０８】
示された時間および投薬量でのサイトカイン処理の後、細胞を、使用直前に１ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、および１×プロテアーゼインヒビターカクテルを加えたＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．２％デオキシコール酸ナトリウム、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）中で溶解した。タンパク質濃度を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、定量および標準化した。溶解物を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で加熱により変性し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース上に移した。全体およびリン酸化されたＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、およびＩｋＢαのレベルを、製造元が確立したプロトコルに従い、通常の化学発光検出を用いて、１次抗体および２次抗体を使用して決定した。メンブレンを、ハイブリダイゼイションの間に、１０μＭ  β−メルカプトエタノールおよび２％ＳＤＳを含むＰＢＳ中で剥がした。
【０１０９】
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくは等モルのＲＡＮＫＬ刺激後のＭＡＰキナーゼの活性を測定するイムノブロットアッセイの結果を、図１２に示す。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激を実施例７に記載されるように実施した。リン酸化を測定したキナーゼとしては、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、およびＡｋｔが挙げられる。さらに、破骨細胞前駆体に見られるように、全タンパク質の量は、細胞において、どの時点においても有意に変化しなかった。しかし、試験したキナーゼの全ては、骨芽細胞において、延長した活性を示した。両方のＥＲＫは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激後、５分までに活性化され、そしてそれらの活性は、刺激後、６０分において、検出可能であった。ＪＮＫ、ｐ３８、およびＡｋｔの活性は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の時点で検出可能であり、そして刺激後、少なくとも６０分までの間、検出可能であった。加えて、ＩｋＢαのリン酸化は、刺激の１０分後に検出され、そしてアッセイの終わりまで（６０分間）、増加した。このことはＮＦｋＢの核への増加した移行を示す。このデータは、ＭＡＰキナーゼ活性のパターンが、破骨細胞における同じキナーゼの活性と異なることを示唆している。骨芽細胞において観察される延長した活性は、加速した同化性の骨プロセスにおいて役割を果たしているようである。加えて、ＲＡＮＫＬ処理は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに見られるような、キナーゼの延長した活性を誘導できなかった。
【０１１０】
（実施例１０）
（マウス骨芽細胞前駆体において、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬが誘導したＥＲＫ１／２活性は、延長される）
実施例９に示された手順に従い、骨芽細胞前駆体を、単離し、そしてそれを維持した。イムノブロティングを、実施例９のイムノブロティングと同様の方法で実施した。
【０１１１】
図１３に示されるように、骨芽細胞前駆体のＥＲＫ活性は、延長され、そしてそれは、経時的に増加した。骨芽細胞において、この活性は延長されたが、長期にわたり有意に変化しなかった。一方、骨芽細胞前駆体のＥＲＫ活性は、最初、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の１０分後に検出され、そして活性化の６０分後まで（アッセイが実施された時間の長さ）増加した。
【０１１２】
（実施例１１）
（骨芽細胞におけるＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ曝露後のＡＰ活性）
初代頭蓋冠骨芽細胞を、１５％ＦＢＳ、５０μＭアスコルビン酸、および１０ｍＭ  β−グリセロリン酸を含むＭＥＭ中で培養した。細胞を、培地およびサイトカインを毎日交換しながら、３７℃で維持した。、骨芽細胞の分化および機能の直接の指標である骨芽細胞アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を、発色基質（５．５ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸）の添加により定量した。次いで、細胞を、異なるレジメンで投与されたＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに曝露した。５０ｎｇ／ｍｌＧＳＴ−ＲＡＮＫＬへのパルス状の曝露を、４８時間の処置時間枠あたり１時間、３時間、６時間、８時間、もしくは２４時間の全曝露として与えた。４回のこのような４８時間処理の後、ＡＰ活性を定量し（±Ｓ．Ｄ．）、全タンパク質レベルに対して標準化した。
【０１１３】
図１４から理解され得るように、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ曝露を、４８時間ごとに１回、８時間の処理時間枠に対して与えた場合、最大の同化効果を観察した。従って、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを、断続的な様式で投与した時に、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、ＡＰ活性における増加を誘導した。
【０１１４】
（実施例１２）
（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのオリゴマー化）
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを、そのＧＳＴ融合パートナーから切断されたＲＡＮＫＬフラグメントを単離するために、タンパク質分解に供した。要約すると、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１４型ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴ中で４℃で４時間インキュベートした。非切断の融合タンパク質およびＧＳＴタグ化プロテアーゼを、グルタチオン親和性マトリックスを通すことのより除去した。全ての精製された組換えタンパク質を、リムルス変形細胞溶解物試験（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ａｓｓａｙ）（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）により、エンドトキシン汚染についてアッセイし、そして同一性を確認するために、質量分析により解析した。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬおよび切断されたＲＡＮＫＬの両方を、生理的な塩およびｐＨに対して透析し、そしてＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  ２６／６０でのゲル濾過により、分画した。溶出容量を、以下の標準物質：リボヌクレア−ゼＡ（１３，７００）、キモトリプシノーゲンＡ（２５，０００）、卵白アルブミン（４３，０００）、ウシ血清アルブミン（６７，０００）、アルドラーゼ（１５８，０００）、カタラーゼ（２３２，０００）、フェリチン（４４０，０００）、サイログロブリン（６６９，０００）、およびブルーデキストラン２０００（２，０００，０００）を用いて分子量に対して較正した。異なる溶出容量に由来するタンパク質を含有するフラクションを、モノクローナル抗ＧＳＴ一次抗体を用いて、ウェスタン分析に供した。図１５（ａ）が示すように、切断されたＲＡＮＫＬは、単一の三量体種（１ｎ）として移動した一方で、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、非共有結合的に会合した単一の三量体（１ｎ）および動的平衡下にあるオリゴマー（２〜１００ｎ）の多分散系混合物として移動した。結晶学的な証拠は、ＧＳＴが、二量体化する本質的な傾向を持つ一方で、ＲＡＮＫＬは、自発的に三量体化することを立証している。従って、３ＲＡＮＫＬ分子および３ＧＳＴ分子から構成される単一のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ三量体は、隣接したＧＳＴと結合していない遊離ＧＳＴを包含し、オリゴマー化する傾向を生じる３：２の化学量論を生じる。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ三量体のＧＳＴが、隣接するＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ三量体由来のＧＳＴと共に二量体を形成する場合、高次の、枝分かれしたオリゴマーが形成する（図１５（ｂ）を参照のこと）。
【０１１５】
（実施例１３）
（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのインターナリゼーション）
初代マウス骨芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むα−ＭＥＭ中で維持し、そして分化のために１５％ＦＢＳ、５０μＭアスコルビン酸、および１０ｍＭ  β−グリセロリン酸を含むＭＥＭ中で培養した。細胞を、６％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で、３７℃で維持し、毎日、培地およびサイトカインを交換した。初代マウス骨芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むα−ＭＥＭ中で、カバースリップ上で培養し、示された時間、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくは切断されたＲＡＮＫＬで処理した。リン脂質膜染色のため、細胞をＶｙｂｒａｎｔ  ＤｉＩ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に、２０分間インキュベートした。細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、透過化処理し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ／０．２％脱脂粉乳でブロッキングし、ポリクローナル抗ＲＡＮＫ抗体でＲＡＮＫを染色した。連続した光学切片を、Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００レーザー走査共焦点顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ）を用いて得た。顕微鏡の設定を、アイソタイプＩｇコントロールで染色した細胞を用いて、黒レベル値に対して較正した。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを、実施例１２に記載されるように切断した。
【０１１６】
培養中の初代骨芽細胞を、５ｎＭの切断ＲＡＮＫＬもしくはＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに曝露した。示された時間において、細胞表面を、脂肪親和性の蛍光色素で染色し、そしてＲＡＮＫを抗ＲＡＮＫ抗体で染色した。共焦点顕微鏡を、ＲＡＮＫ（緑色蛍光）および細胞表面（赤色蛍光）を局在化するために使用した。重ねた画像において、ＲＡＮＫおよび細胞表面の共局在が黄色（緑色および赤色蛍光のオーバーラップ）に見える。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ：ＲＡＮＫ複合体は、細胞表面に少なくとも１時間留まった。このことは、延長した細胞内ＲＡＮＫシグナル伝達に対応している。対照的に、切断ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ複合体は、１時間以内に完全にインターナリゼーションされた。このことは、その時点での切断されたＲＡＮＫＬが誘導したＲＡＮＫシグナル伝達の欠如と相関している。結果を、図１６に示す。
【０１１７】
（実施例１４）
（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに応答したＩ型コラーゲンおよびＣｂｆａ１の発現）
インビボ実験において、マウスに、皮下注射により５μｇ／ｋｇＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくは（コントロールとして）ＧＳＴ単独を投与し、そして１時間後に安楽死させた。インビトロ実験において、初代骨芽細胞を、１００ｎｇ／ｍｌＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくは（コントロールとして）ＧＳＴ単独に曝露した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）で単離し、そしてゲノムＤＮＡを除去するため、デオキシリボヌクレア−ゼで消化した。続いて、メッセンジャーＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡより単離し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解析した。要約すると、１μｇのｍＲＮＡを、エキソン−イントロン境界にまたがるように設計したマウス遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー：Ｃｂｆａ１  センス  ５’−ＣＣＧＣＡＣＧＡＣＡＡＣＣＧＣＡＣＣＡＴ−３’（配列番号３）、Ｃｂｆａ１  アンチセンス  ５’−ＣＧＣＴＣＣＧＧＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣ−３’（配列番号４）、およびコラーゲンＩ型α１鎖  センス  ５’−ＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＣＣＴ−３’（配列番号５）ならびにコラーゲンＩ型α１鎖  アンチセンス  ５’−ＴＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＴＧＣ−３’（配列番号６）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。逆転写を、６０℃で３０分間実施し、続いて９５℃で５分間変性した。すぐにタッチダウンＰＣＲ増幅を続けた。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の発現レベルを、コントロールとして同時に評価した。反応産物を、２％アガロースで電気泳動により分画し、そして結果をアッセイの直線範囲から表した。
【０１１８】
骨芽細胞により合成されたＩ型コラーゲンは、骨の主要な有機構成成分である。図１７に示されるように、初代骨芽細胞は、培養中に分化するにつれて、コラーゲンの発現を徐々に上方制御する。断続的なＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ曝露は、この過程を加速し、それへの最初の曝露の１２時間以内に、強いコラーゲンの発現を誘導する。Ｃｂｆａ１は、骨芽細胞形成のための主要な転写因子であり、そしてマウスにおいて、その欠乏は、骨芽細胞および骨形成の完全な欠如を生じる（例えば、Ｏｔｔｏら、Ｃｅｌｌ  ８９，７６５−７７１頁，１９９７，およびＫｏｍｏｒｉら、Ｃｅｌｌ  ８９，７５５−７６４頁，１９９７を参照のこと）。図１８に示されるように、Ｃｂｆａ１の発現は、骨髄において、ＧＳＴ単独を受けたコントロールマウスの発現に対して、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの全身投与の１時間以内に増強される。
【０１１９】
（実施例１５）
（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、骨芽細胞の増殖を刺激する）
インビトロでの骨芽細胞の増殖速度を、ＤＮＡへの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みにより評価した。要約すると、細胞を、１０μＭ  ＢｒｄＵの存在下で、４８時間、１００ｎｇ／ｍｌＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくはコントロールとしてモル等量のＧＳＴ単独の存在下または非存在下で培養した。ＢｒｄＵの取り込みをペルオキシダ−ゼ標識化抗ＢｒｄＵ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で定量した。分光光度測定は、発色基質３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジンを加えた後、４５０ｎｍで実施した。
【０１２０】
図１９に示されるように、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処理は、骨芽細胞の増殖速度を４８時間のアッセイ期間の間に４倍にまで増強した。
【０１２１】
（実施例１６）
（ＥＲＫ活性化は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの同化効果に関与している）
本実験において使用されるキナーゼ欠損ＥＲＫ１ｃＤＮＡ（Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，５０９７−５１０６頁，１９９３を参照のこと）は、２１１位および２１２位のアデニン（ａｌａｎｉｎｅ）ヌクレオチドをそれぞれシトシンおよびグアニンに変異させた結果であり、リジン７１のアルギニンでの置換（Ｅｒｋ１  Ｋ７１Ｒ）を生じた。ＥＲＫ１  Ｋ７１Ｒは、ドミナントネガティブ様式で、ＥＲＫ１活性およびＥＲＫ２活性の両方の阻害に機能する（Ｌｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９６，５２４−５２８頁，１９９９を参照のこと）。ＥＲＫ１  Ｋ７１ＲｃＤＮＡを、前述のようにＳＦＧレトロウィルスベクターのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼサイトにクローニングした（Ｏｒｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１１４００−１１４０６頁，１９９６を参照のこと）。水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）−Ｇ糖タンパク質でシュードタイプ化されたレトロウィルス粒子の産生のため、ＳＦＧ−ＥＲＫ１  Ｋ７１Ｒレトロウィルスベクターを、テトラサイクリン制御下で、Ｍｕｌ  Ｖ  ｇａｇ−ｐｏｌおよびＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質を発現する２９３ＧＰＧパッケージング細胞株にトランスフェクトした。テトラサイクリンを中止した後、３日目から７日目に馴化培地を回収し、そして５×１０６コロニー形成単位／ｍｌ以上のウィルス力価を含有することを見出した。形質導入の前に、培地を、０．４５μｍメンブレンを通して濾過し、そして臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）を、８μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した。ネガティブコントロールとして、ＬａｃＺｃＤＮＡをもつレトロウィルスを同じ方法で産生した。ＶＳＶ−シュードタイプ化レトロウィルスの形質導入は、骨芽細胞の分化もしくは機能に影響を及ぼさないことが示されている（Ｋａｌａｊｚｉｃら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２８４，３７−４５頁，２００１およびＬｉｕら，Ｂｏｎｅ  ２９，３３１−３３５頁，２００１を参照のこと）。レトロウィルスの形質導入のため、初代骨芽細胞を、１５０ｍｍ培養ディッシュに１ｍｍ２あたり６０個の細胞の密度で培養し、５×１０６コロニー形成単位／ｍｌ以上を含有する２５ｍｌの馴化培地に、２４時間、曝露した。ＬａｃＺレトロウィルスで形質転換された骨芽細胞のＸ−ｇａｌ染色により証明した場合、形質転換効率は、９０％を越えた。
【０１２２】
図２０（ａ）に示されるように、ドミナントネガティブＥＲＫを形質導入された骨芽細胞は、ＲＳＫ（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処理に応答する公知下流のＥＲＫ基質）をリン酸化できなかった。さらに、図２０（ｂ）は、ドミナントネガティブＥＲＫを形質導入された骨芽細胞は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに応答したＩ型コラーゲンの発現の上方制御ができないことを示している。
【０１２３】
（実施例１７）
（ＡＰ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質としてのＲＡＮＫＬの発現）
マウス型ＲＡＮＫＬ残基１５８〜３１６をコードするｃＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクターにクローニングする。ヒト型アルカリホスファターゼ１をコードするｃＤＮＡを、ｃＤＮＡライブラリーから単離し、結果として生じるＤＮＡ配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１）中のＲＡＮＫＬ  ｃＤＮＡの上流（アミノ末端）に挿入する。生じたベクターを、標準的な方法により、（例えばＣＨＯのような）哺乳動物細胞株に形質導入する。精製したＡＰ−ＲＡＮＫＬを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。ヒト型ＡＰ１は、分泌型タンパク質であり、結果として、ＡＰ融合タンパク質は培地中に分泌される。ＡＰ−ＲＡＮＫＬがインビトロで哺乳動物細胞株により発現され、分泌されるための充分な時間の後、ＡＰ−ＲＡＮＫＬを単離するため、培地をアフィニティー精製する。ＡＰ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質の実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成するＡＰ−ＲＡＮＫＬの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【０１２４】
（実施例１８）
（ＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質としてのＲＡＮＫＬの発現）
マウス型ＲＡＮＫＬ残基１５８〜３１６をコードするｃＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクターにクローニングする。ＧＣＮ４ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、結果として生じるＤＮＡ配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（登録番号Ｕ７８８７２））中のＲＡＮＫＬ  ｃＤＮＡの上流（アミノ末端）に挿入する。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩＰＴＧ（０．０５ｍＭ）で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。ＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質の単離のため、溶解物を、アフィニティー精製する。その後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびｐＨに対し透析する。その後、精製したＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。
【０１２５】
ＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質の実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成するＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【０１２６】
（実施例１９）
（ＴＡＬＬ−１フラップ領域を含むＲＡＮＫＬ誘導体の発現）
残基１５８〜３１６を含むマウス型ＲＡＮＫＬを、そのＤＥループ（アミノ酸配列ＳＩＫＩＰを含むアミノ酸２４５−２４９）がＴＡＬＬ−１のＤＥループ（アミノ酸ＫＶＨＶＦＧＤＥＬ）で置換されるように変異する。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能）を用いて、ＰＣＲで駆動させる部位特異的変異誘発により、変異をＲＡＮＫＬ中に導入し得る。変異型ＲＡＮＫＬを、結果として生じるＤＮＡ配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクター（例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（登録番号Ｕ７８８７２））にクローニングする。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩＰＴＧ（０．０５ｍＭ）で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。変異型ＲＡＮＫＬタンパク質のアフィニティー精製のため、溶解物を、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートし、続いて１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で過剰に洗浄する。次いで、アフィニティーカラムからの競合溶出（１０ｍＭ  還元グルタチオン）の後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびｐＨに対し透析する。その後、精製したＲＡＮＫＬ誘導体を、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。
【０１２７】
変異型ＲＡＮＫＬの実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成する変異型ＲＡＮＫＬの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【０１２８】
（実施例２０）
（ＴＡＬＬ−１フラップ領域およびさらなるアミノ酸変化を含むＲＡＮＫＬ誘導体の発現）
残基１５８〜３１６を含むマウス型ＲＡＮＫＬを、そのＤＥループ（アミノ酸配列ＳＩＫＩＰを含むアミノ酸２４５〜２４９）がＴＡＬＬ−１のＤＥループ（アミノ酸配列ＫＶＨＶＦＧＤＥＬ）で置換されるように変異する。ＴＡＬＬ−１構造との類似性を増すため、ＲＡＮＫＬ分子全体にわたって、次のアミノ酸変化を実施する：１６８Ｔ→Ｉ、１８７Ｙ→Ｌ、１９４Ｋ→Ｆ、２１２Ｆ→Ｙ、２５２Ｈ→Ｖ、２７９Ｆ→Ｉ、および２８３Ｒ→Ｅ。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能）を用いて、ＰＣＲで駆動させる部位特異的変異誘発により、変異をＲＡＮＫＬ中に導入し得る。変異型ＲＡＮＫＬを、生じるＤＮＡ配列がインフレームであり、かつ介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１）にクローニングする。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩＰＴＧ（０．０５ｍＭ）で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。変異型ＲＡＮＫＬタンパク質のアフィニティー精製のため、溶解物を、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともにインキュベートし、続いて１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で過剰に洗浄する。アフィニティーカラムからの競合溶出（１０ｍＭ  還元グルタチオン）の後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびｐＨに対し透析する。その後、精製したＲＡＮＫＬ誘導体を、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。変異型ＲＡＮＫＬの実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成する変異型ＲＡＮＫＬの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【０１２９】
（実施例２１）
（全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激）
骨形成のアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第６，０８０，７７９号  カラム１０，ＩＩ．２９−５５に記載されるように実施する。新生仔マウスの頭蓋冠を、ビヒクル、ＡＰ（ネガティブコントロール）、または漸増濃度の精製したオリゴマーＡＰ−ＲＡＮＫＬの存在下で、器官培養する。骨形成促進タンパク質（ＢＭＰ）−２を、ポジティブコントロールとして投与する。試験組成物を、培養開始時のみ、１２時間（１×）、もしくは開始時に１回と３日後に再度１回、１２時間の持続時間で（２×）、投与する。７日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するために、多様なコントロール群および実験群と比較する。
【０１３０】
（実施例２２）
（マウスにおける骨形成のインビボ刺激）
マウスＣ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、１００マイクログラムのＡＰ（コントロール）もしくは１００マイクログラムのＡＰ−ＲＡＮＫＬを、１日１回、９日間、皮下に投与する。その後、コントロールマウスと比較したＡＰ−ＲＡＮＫＬ処置マウスでの骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を評価するために、脛骨の組織学的試験を実施する。
【０１３１】
ＡＰ処置マウスと比較したＡＰ−ＲＡＮＫＬ処置マウスでの骨鉱質密度の変化を評価するために、ＡＰ投与マウスもしくはＡＰ−ＲＡＮＫＬ投与マウスの二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ）解析もまた、通常の手順で実施する。
【０１３２】
（実施例２３）
（全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激）
骨形成のアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第６，０８０，７７９号  カラム１０，ＩＩ．２９−５５に記載されるように実施する。新生仔マウスの頭蓋冠を、ビヒクル、ＧＣＮ４（ネガティブコントロール）、もしくは漸増濃度の精製したＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬの存在下で、器官培養する。骨形成促進タンパク質（ＢＭＰ）−２を、ポジティブコントロールとして投与する。試験組成物を、培養開始時のみ、１２時間（１×）、もしくは開始時に１回と３日後に再度１回、１２時間の持続時間で（２×）、投与する。７日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するため、多様なコントロール群および実験群と比較する。
【０１３３】
（実施例２４）
（マウスにおける骨形成のインビボ刺激）
マウスＣ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、１００マイクログラムのＧＣＮ４（コントロール）もしくは１００マイクログラムのＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬを１日１回、９日間、皮下投与する。その後、コントロールマウスと比較したＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬ処置マウスでの骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を評価するために、脛骨の組織学的試験を実施する。
【０１３４】
ＧＣＮ４処置マウスと比較したＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬ処置マウスでの骨鉱質密度の変化を評価するために、ＧＣＮ４投与マウスもしくはＧＣＮ４−ＲＡＮＫＬ投与マウスの二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ）解析もまた、通常の手順で実施する。
【０１３５】
（実施例２５）
（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質としてのＲＡＮＫＬの発現）
マウス型ＲＡＮＫＬ残基１５８〜３１６をコードするｃＤＮＡを、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、ｐＧＥＸ−６ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７８８７２−ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにある米国国立医学図書館リストの核酸の欄を参照のこと）のグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼの下流にクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩＰＴＧ（０．０５ｍＭ）で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液の中で粉砕した。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質のアフィニティー精製のために、溶解物を、グルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートし、続いて１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で過剰に洗浄した。アフィニティーカラムからの競合溶出（１０ｍＭ  還元グルタチオン）の後、単離したタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに供し、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびｐＨに対し透析した。精製したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量した。
【０１３６】
サイズ排除クロマトグラフィーで示されるように（データは示さず）、生理的環境を模した条件下で、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、大きなオリゴマー複合体を形成した。タンパク質の大部分は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのオリゴマー複合体として存在した（データは示さず）。
【０１３７】
（実施例２６）
２０匹の６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、無作為に２実験群に割り当てた。群１のマウス（１０匹）には、右大腿骨の髄内の腔に１００μｇＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを注射した。群２のマウス（１０匹）には、右大腿骨の髄内の腔にＧＳＴビヒクルの等モル量を注射した。
【０１３８】
マウスを、ケタミン／キシラジンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンＩＰ）で麻酔し、左側の横臥位で置いた。右大腿骨の大転子および右大腿骨外側顆を、特定した。髄内注入部位は、これらのランドマークの間に、等距離であった。ツベルクリンシリンジに２９ゲージの針を付けて、注射を行った。９日目、マウスを、ケタミン／キシラジンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンＩＰ）で再麻酔し、それぞれの動物において、二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ，Ｐｉｘｉｍｕｓ）解析を実施した。ＤＥＸＡ解析の後、直ぐに単純Ｘ線写真を撮影した（Ｆａｘｉｔｒｏｎ，ＫＶ  ０．１５，時間＝２０ｓｅｃ）。動物は、ＣＯ２窒息により屠殺し、両方の大腿骨は、組織学的な解析のため、回収した。大腿骨は、１０％緩衝ホルマリン中で４８時間、固定し、１週間、脱灰した。ＤＥＸＡ解析は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処置群とコントロール群との間で総骨鉱質密度（ＴＢＭＤ）に有意な差を示した（表１を参照のこと）。右および左の大腿骨の骨鉱質密度の比較では、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくはコントロール群のどちらにおいても有意な差は見られなかった（表２を参照のこと）。両群の単純Ｘ線写真の比較では、骨格の密度に有意な差は見られなかった。
【０１３９】
（表１．群ごとのＢＭＤ）
平均値および標準偏差を報告する。Ｐ値は、群間の有意差を検定する。それらは、対応のないｔ検定に基づいている。
【０１４０】
【表１】
2004526748.tif 000002
（表２．片側ごとの大腿骨のＢＭＤ）
平均値および標準偏差を、それぞれの群で、右および左の大腿骨に対して報告する。Ｐ値は、右および左側の間の有意差を検定する。それらは、対応のあるｔ検定に基づいている。
【表２】
2004526748.tif 000003
本発明の他の特徴、目的、利点は、当業者に明らかである。本明細書中に表される説明および図解は、本発明、その原理、およびその実用的な用途を他の当業者に周知させることを意図する。当業者は、特定の用途の要求に最適であるように、多くの形式で本発明を採用および適用し得る。従って、示されたような本発明の特定の実施形態は、網羅することも、本発明を制限することも意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、下記、実施例１と実施例２５で考察した、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質を作成するため用いられるＲＡＮＫＬのマウスｃＤＮＡおよびタンパク質の構造および配列である。
【図２】図２は、生理的環境を模した条件下でのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。図１を参照のこと。
【図３】図３は、実施例２で考察した、全頭蓋冠器官培養物におけるエキソビボでの骨形成のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の組織像である。矢印は頭頂骨の厚さを示す。
【図４】図４は、実施例２で考察した、インビトロでの骨形成のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激による用量依存的な頭蓋冠の厚さの増加をグラフで示す。白棒は１用量のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬへの曝露、一方、黒棒は２用量のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬへの曝露を示す。
【図５Ａ】図５（ａ）は、実施例３で考察した、マウスにおけるインビボでの骨形成のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の組織像を低倍率で示す。
【図５Ｂ】図５（ｂ）は、実施例３で考察した、マウスにおけるインビボでの骨形成のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の組織像を高倍率で示す。
【図５Ｃ】図５（ｃ）は、実施例３で考察した、インビボにてＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくはコントロールビヒクルを投与した動物の骨鉱質密度を比較した脛骨の骨幹端の二重エネルギーＸ線吸収（ｄｕａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ：ＤＥＸＡ）解析を示す。スケールバー＝１ｍｍ。
【図６】図６は、マウス脛骨の高倍率の組織像であり、実施例４で考察した、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与した動物の骨芽細胞のインビボにおける活性化を示す。左のパネルの矢印は活性化された骨芽細胞を示し、右のパネルの矢印は扁平な骨表面細胞を示す。
【図７】図７は、実施例５で考察した、動物へのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの制御された投与の効果をグラフで表しており、破骨細胞と活性化骨芽細胞の細胞数を図示する。白棒は破骨細胞数を、黒棒は活性化骨芽細胞数を示す。
【図８】図８は、実施例６で考察した、エキソビボで培養された骨髄細胞における鉱化骨小結節（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ  ｎｏｄｕｌｅ）形成のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ刺激の組織像である。赤い組織化学反応産物は骨芽細胞の鉱化コロニー形成ユニットを示す。
【図９】図９は、実施例４で考察した、インビボでの鉱化骨への二重蛍光色素標識の取り込みを表す。ＭＡＲは硬質の付加（ｍｉｎｅｒａｌ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）、  ＢＦＲは骨形成、  （ｅｘ）および（ｅｎ）は、それぞれ頭蓋冠の頭蓋外（ｅｘｏｃｒａｎｉａｌ）、  頭蓋内（ｅｎｄｏｃｒａｎｉａｌ）表面を示す。
【図１０】図１０は、マウスの破骨細胞前駆体におけるＧＳＴ−ＲＡＮＫＬでの細胞処理後のＭＡＰＫ経路のメンバーの迅速な活性化を表すウェスタン分析像である。活性は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ相互作用時（０分）および相互作用の後、５分後、１５分後、３０分後に測定された。上から二段目、四段目、六段目のパネルは、それぞれＪＮＫ、ｐ３８、およびＥＲＫの総レベルを示す。一段目、三段目、五段目のパネルはそれぞれリン酸化（活性化）型のＪＮＫ、ｐ３８、およびＥＲＫを示す。
【図１１】図１１は、マウスの破骨細胞前駆体におけるＧＳＴ−ＲＡＮＫＬでの細胞処理後のＡｋｔ活性を表すウェスタン分析像である。活性化は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ相互作用時および相互作用の５分後、ならびに１５分後に測定された。下段のパネルは、指定の時点の全Ａｋｔレベルを示し、上段のパネルはＡｋｔのリン酸化型を示す。
【図１２】図１２は、ＲＡＮＫＬ単独での処理と比較した、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬでの細胞処理後の、マウス骨芽細胞のＭＡＰＫ経路のキナーゼの延長した活性を示すウェスタン分析像である。リン酸化が測定された時点は、０分（細胞のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくはＲＡＮＫＬ刺激時）およびＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫもしくはＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫの結合が起こってから、５分後、１０分後、２０分後、３０分後並びに６０分後である。活性が測定されたキナーゼは、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、およびＡｋｔを含む。ｐＥＲＫはリン酸化ＥＲＫ、ＥＲＫはＥＲＫタンパク質全量、ｐＪＮＫはリン酸化ＪＮＫ、ＪＮＫはＪＮＫタンパク質全量、ｐｐ３８はリン酸化ｐ３８、ｐ３８はｐ３８タンパク質全量、ｐＡｋｔはリン酸化Ａｋｔ、ＡｋｔはＡｋｔタンパク質全量を表す。上から一段目のパネルはｐ−ＩｋＢαであり、ｐ−ＩｋＢαは、リン酸化ＩｋＢαを表し、ＩｋＢαはＩｋＢαタンパク質全量を表す。
【図１３】図１３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬでの細胞処理後の、マウス骨芽細胞前駆体におけるＥＲＫ１／２の延長した活性を示すウェスタン分析像である。ＥＲＫ１／２活性を測定した時点は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫの結合が起こって０分後、５分後、１０分後、２０分後、３０分後、および６０分後である。ｐＥＲＫはリン酸化ＥＲＫ、ＥＲＫはＥＲＫタンパク質全量を表す。
【図１４】図１４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ曝露後のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性をグラフで表す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、オリゴマー複合体としてのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを示す一方、切断された（ＧＳＴが除かれた）ＲＡＮＫＬはオリゴマー形態中に存在しない。（ａ）は、切断されたＲＡＮＫＬが単一の三量体種（１ｎ）として移動し、一方、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、非共有結合性に結合した単一の三量体（１ｎ）および動的平衡下にあるオリゴマー（２−１００ｎ）ユニットの多分散系混合物として存在することを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、オリゴマー複合体としてのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを示す一方、切断された（ＧＳＴが除かれた）ＲＡＮＫＬはオリゴマー形態中に存在しない。（ｂ）は考え得るオリゴマー構造を表す。
【図１６】図１６は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ複合体が少なくとも１時間、細胞表面に留まることに対し、切断されたＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ複合体は迅速にインターナリゼーションされることを示す共焦点顕微鏡像である。重ねた画像において、ＲＡＮＫ（緑色蛍光）と細胞表面（赤色蛍光）の共局在が黄色に見える。
【図１７】図１７は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処理に応答したＩ型コラーゲンの発現を示すアガロースゲル像である。「＋」は初代骨芽細胞にＧＳＴ−ＲＡＮＣＬで処理した事を示し、「−」は同処理をしていないことを示す。骨芽細胞は、それぞれ連続した４８時間の処理時間の最初の１時間、２時間、４時間もしくは６時間、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに曝露された。８−４８時間の間に回収された全ての培養細胞はＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに６時間、曝露された。βアクチンの発現は、実験のコントロールとして用いている。
【図１８】図１８は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬもしくはＧＳＴ単独（「コントロール」と記す）で処理されたマウスの骨髄におけるＣｂｆａ１の発現を示すアガロースゲル像である。下段のパネルはコントロール実験であり、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）の発現を示している。
【図１９】図１９は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ処理に応答した、ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）の取り込みにより測定された骨芽細胞の増殖のグラフを示す。
【図２０Ａ】図２０（ａ）は、ドミナントネガティブＥＲＫを形質導入した骨芽細胞が、ＲＳＫとして知られるＥＲＫの基質をリン酸化できないことを示すウェスタン分析像である。ＤＮ−ＥＲＫは、ドミナントネガティブＥＲＫを示す。ＬａｃＺはβ−ガラクトシダーゼを示す。
【図２０Ｂ】図２０（ｂ）は、ドミナントネガティブＥＲＫを形質導入した骨芽細胞が、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに応答したＩ型コラーゲンの発現を上方制御することができないことを示すアガロースゲル像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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