(57)【要約】本発明は、修飾Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）類に関する。本発明の修飾ＧＰＣＲ類には、修飾ＧＰＣＲ類が構成的に脱感作されるように変化したＤＲＹモチーフ類を有するように修飾されたＧＰＣＲ類が含まれる。したがって、本発明の修飾ＧＰＣＲ類は、好ましくは、アゴニスト非依存様式でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化する。本発明はまた、修飾ＧＰＣＲ類を使用したＧＰＣＲ活性に関する化合物およびサンプル溶液をスクリーニングする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＲＹモチーフを含む単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントであって、該ＤＲＹモチーフは第２位にアルギニン以外のアミノ酸を含むように修飾され、該修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントはアゴニストの非存在下で構成的に脱感作される、単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項２】
前記単離された修飾ＧＰＣＲが、アゴニストの非存在下で、アレスチンに結合し、クラスリンコートピットに局在化し、またはエンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中に局在化している請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲ。
【請求項３】
前記単離された修飾ＧＰＣＲが図１の天然ＧＰＣＲに由来する請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲ。
【請求項４】
前記単離された修飾ＧＰＣＲがＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎのＧＰＣＲである請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲ。
【請求項５】
前記単離された修飾ＧＰＣＲがクラスＡのＧＰＣＲである請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲ。
【請求項６】
前記単離された修飾ＧＰＣＲがクラスＢのＧＰＣＲである請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲ。
【請求項７】
前記単離された修飾ＧＰＣＲがオーファンＧＰＣＲである請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲ。
【請求項８】
前記単離された修飾ＧＰＣＲが嗅覚ＧＰＣＲまたは味覚ＧＰＣＲに由来する請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲ。
【請求項９】
前記単離された修飾ＧＰＣＲが、図２Ｂの群から選択される修飾ＤＲＹモチーフを含む請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲ。
【請求項１０】
配列番号１〜６からなる群から選択されるポリペプチドであって、細胞中で発現した場合、該ポリペプチドはアゴニストの非存在下でアレスチンに結合するポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが修飾ＤＲＹモチーフを含み、該ＤＲＹモチーフのアルギニンがアルギニン以外の任意の天然アミノ酸または合成アミノ酸である、図１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１〜６からなる群から選択されるポリペプチドであって、細胞中で発現した場合、該ポリペプチドはアゴニストの非存在下でエンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中に局在化される、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸。
【請求項１４】
配列番号７〜１２からなる群から選択される核酸。
【請求項１５】
配列番号１〜６からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
ａ）アゴニストを使用せずにエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化する単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、
ｂ）該単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを基質に結合させるステップと、
ｃ）該単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを候補化合物に曝露するステップと、
ｄ）該単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントをアレスチンまたはアレスチンの生物学的に活性なフラグメントに曝露するステップと、
ｅ）アレスチンタンパク質とＧＰＣＲとの相互作用が試験化合物への曝露後に減少するかどうかを検出するステップであって、該相互作用の減少が、該化合物がＧＰＣＲへのアレスチン結合の阻害活性を有することの指標であるステップと
を含む、アレスチンへのＧＰＣＲの結合を阻害する化合物の識別方法。
【請求項１９】
ａ）アゴニストを使用せずにエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化する単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、
ｂ）アレスチンと検出可能な分子との抱合体をも発現する細胞中で該修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを発現させるステップと、
ｃ）該細胞を候補化合物に曝露するステップと、
ｄ）アレスチンタンパク質とＧＰＣＲとの相互作用が、試験化合物への曝露後に減少するかどうかを検出するステップであって、該相互作用の減少が該化合物が活性を有することの指標であるステップと
を含む、ＧＰＣＲのアンタゴニストまたは逆アゴニスト活性について化合物を識別する方法。
【請求項２０】
前記修飾ＧＰＣＲがクラスＡ受容体である請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記修飾ＧＰＣＲがクラスＢ受容体である請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記修飾ＧＰＣＲが嗅覚受容体または味覚受容体である請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾ＧＰＣＲがオーファン受容体である請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記修飾ＧＰＣＲが検出可能な分子に結合している請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能な分子が放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティ標識、酵素、蛍光基、または化学発光基である請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１８または請求項１９に記載の方法によって識別された化合物。
【請求項２７】
治療有効量の請求項２６に記載の化合物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、哺乳動物におけるＧＰＣＲによって媒介される病態の治療のための医薬組成物。
【請求項２８】
図３に記載の修飾ＧＰＣＲを発現する、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２９】
前記動物がマウスである請求項２８に記載の動物。
【請求項３０】
前記非ヒトトランスジェニック動物が、霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、またはヒツジである請求項２８に記載の動物。
【請求項３１】
修飾ＧＰＣＲを認識して結合する抗体を使用して生体サンプルをアッセイするステップと、該抗体が該修飾ＧＰＣＲに結合するかどうかを決定するステップとを含む、生体サンプル中での修飾ＧＰＣＲの検出方法。
【請求項３２】
（ａ）生体サンプルを修飾ＧＰＣＲプローブに曝露するステップと、
（ｂ）該修飾ＧＰＣＲプローブが該生体サンプルの核酸に結合するかどうかを決定するステップと
を含む、生体サンプル中の請求項１４に記載の核酸を検出する方法。
【請求項３３】
基質と、式Ｉのモチーフをコードする１つまたは複数の請求項１４に記載の核酸またはそのフラグメントとを含み、該式Ｉが修飾ＤＲＹモチーフである、組成物。
【請求項３４】
修飾ＧＰＣＲを認識して結合する抗体と、該修飾ＧＰＣＲに結合する抗体を検出する試薬とを含む、生体サンプル中の修飾ＧＰＣＲを検出するキット。
【請求項３５】
修飾ＧＰＣＲを認識して結合する、単離された免疫グロブリン。
【請求項３６】
前記免疫グロブリンが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、または抗体フラグメントである請求項３５に記載の免疫グロブリン。
【請求項３７】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ｖ）、およびｓｃＦｖである請求項３５に記載の免疫グロブリン。
【請求項３８】
有効量の２−エチル−５，７−ジメチル−３−［［２’−（１Ｈ−テトラゾル−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンまたはフェントラミンを、それを必要としている患者に投与することによる、ＧＰＣＲの構成的脱感作を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１２０条の下、２００１年１月２３日提出の米国特許出願番号６０／２６３，４０６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に関する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所の助成金ＨＬ６１３６５およびＮＳ１９５７６の援助を受けているので、政府は本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、修飾Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に関する。本発明の修飾ＧＰＣＲには、タンパク質がアゴニスト非依存様式でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化するように変化したＤＲＹモチーフを有するように修飾されたＧＰＣＲが含まれる。本発明はまた、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにアゴニストと独立してＧＰＣＲが局在化する変異タンパク質を含む。本発明はまた、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性の検出方法およびＧＰＣＲ活性のアッセイ方法に関する。本発明は、ＧＰＣＲ調節経路の成分と相互作用する化合物の識別方法およびＧＰＣＲのアンタゴニストの識別方法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ホルモンまたはリガンド結合を細胞内シグナルに翻訳する細胞表面タンパク質である。ＧＰＣＲは、これまで研究された全ての動物、昆虫、および植物で見出されている。ＧＰＣＲシグナル伝達は、光形質導入、嗅覚、神経伝達、血管緊張、心拍出量、消化、疼痛、および流体と電解質とのバランスを含む種々の生理学的機能の調節で極めて重要な役割を果たす。種々の生理学的機能に関連するにもかかわらず、ＧＰＣＲは多数の共通の構造上の特徴を共有する。ＧＰＣＲは、細胞内および細胞外ループの変化によって架橋した７回膜貫通ドメインおよび種々の長さの細胞内カルボキシ末端テールを含む。
【０００５】
ＧＰＣＲによって制御される生理学的応答の大きさは、ＧＰＣＲシグナル伝達とシグナル終結との間のバランスに関連する。ＧＰＣＲのシグナル伝達は、アレスチンと呼ばれる細胞内タンパク質ファミリーによって制御される。アレスチンは、活性化ＧＰＣＲ（アゴニスト活性化されたＧＰＣＲ、特にＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってリン酸化されたＧＰＣＲを含む）に結合する。
【０００６】
ＧＰＣＲを含む受容体は、高い親和性でリガンド、ホルモン、および薬物に結合するので、創薬および治療薬の標的であった。今日使用されている治療薬の約５０％がＧＰＣＲの標的であるかこれと相互作用する。例えば、Ｊｕｒｇｅｎ  Ｄｒｅｗｓ、２０００、「創薬：歴史的観点」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７、１９６０〜１９６４を参照のこと。
【０００７】
数百個のヒトＧＰＣＲしか知られていないが、千種以上のＧＰＣＲがヒトゲノム中に存在する。これら公知のＧＰＣＲの多数が、機能またはリガンドとの関連が明らかでないオーファン受容体である。
【０００８】
正確で解釈が容易なＧタンパク質共役受容体活性の検出方法およびＧＰＣＲ活性のアッセイ方法が必要である。Ｂａｒａｋらの米国特許第５，８９１，６４６号および同第６，１１０，６９３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている１つの方法は、ＧＰＣＲを発現する細胞およびアレスチンと検出可能な分子との抱合体を使用する。
【０００９】
既存のＧＰＣＲアンタゴニストの識別方法の大部分は、アゴニストの存在に依存する。ＧＰＣＲの活性化を防止する化合物の識別アッセイは、典型的には、妨害化合物を識別するためにＧＰＣＲを最初に活性化する必要がある。既知のアゴニストを使用する受容体のために、現在、これらのアゴニストを使用してこれらの受容体を活性化する。しかし、多数のＧＰＣＲは既知のリガンドおよびアゴニストを使用しないオーファン受容体である。
【００１０】
ＰａｕｓｃｈらのＷＯ００／１２７０４に開示されている１つの方法は、活性化リガンドの非存在下で受容体の機能的活性が検出される構成的に活性化した変異を有するＧＰＣＲを使用する。Ｐａｕｓｃｈらでは、構成的に活性な受容体が得られるようにＧＰＣＲを修飾する。Ｐａｕｓｃｈらの構成的に活性なＧＰＣＲ変異体は、野生型受容体と比較して固有の活性が高くなっていて、アゴニスト非依存様式で細胞内へテロ三量体Ｇタンパク質と相互作用して活性化する。Ｐａｕｓｃｈらの方法は、アゴニスト非依存性であるが、構成的に活性なＧＰＣＲ変異体を使用する。
【００１１】
オーファン受容体のアンタゴニストの発見は、典型的には以前のアゴニストおよびリガンドの発見に依存するので、ＧＰＣＲアッセイのアゴニスト非依存性は引き続き問題である。したがって、アゴニストに依存していないＧＰＣＲ活性化のさらなる方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、構成的に脱感作された修飾ＧＰＣＲに関する。
【００１３】
本発明の第１の態様は、ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントである。本発明の修飾ＧＰＣＲでは、ＤＲＹモチーフは、第２位のアルギニン以外のアミノ酸を含むように修飾される。修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントは、アゴニストの非存在下で構成的に脱感作される。本発明の修飾ＧＰＣＲは、アレスチンに結合するか、クラスリンに局在化するか、アゴニストの非存在下でエンドサイトーシス小胞もしくはエンドソーム中に局在化することができる。修飾ＧＰＣＲは、天然ＧＰＣＲに由来し得る。修飾ＧＰＣＲは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎ  ＧＰＣＲ、クラスＡのＧＰＣＲ、クラスＢのＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ、または嗅覚ＧＰＣＲもしくは味覚ＧＰＣＲであり得る。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、単離された修飾アレスチンポリペプチドに関する。本発明の単離された修飾アレスチンポリペプチドは、細胞中で発現した場合、構成的に脱感作されたＧＰＣＲを産生する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、単離された修飾ＧＲＫポリペプチドに関する。単離された修飾ＧＲＫポリペプチドは、細胞中で発現した場合、構成的に脱感作されたＧＰＣＲを産生する。
【００１６】
本発明はまた、本明細書中に記載の活性を有し、前述の、およびここに記載する配列番号１〜配列番号６から選択されるアミノ酸配列を示す、修飾ＧＰＣＲタンパク質を含む。細胞中で発現した場合、ポリペプチドはアゴニストの非存在下でアレスチンに結合し、アゴニストの非存在下でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに標的化することができる。ポリペプチドは修飾ＤＲＹモチーフを含み、ここで、ＤＲＹモチーフのアルギニンは、アルギニン以外の任意の天然アミノ酸または合成アミノ酸である。
【００１７】
本発明はまた、出願時の請求項１に記載の単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸に関する。本発明の核酸配列を、配列番号７〜配列番号１２から選択することができる。
【００１８】
本発明は、さらに、本明細書中に記載の核酸配列を含むベクターに関する。核酸を、発現調節配列に作動可能に連結させて、適切な宿主に導入することができる。したがって、本発明は、本発明の修飾ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ配列を含むクローン化遺伝子または組換えＤＮＡ分子で形質転換した単細胞宿主にまで及ぶ。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、組成物、化合物、およびサンプル溶液のスクリーニング方法に関する。これらの方法には、アレスチンのＧＰＣＲへの結合を阻害する化合物の識別方法が含まれる。この方法は、ａ）アゴニストを使用せずにエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化する単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、ｂ）前記単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを基質に結合させるステップと、ｃ）前記単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを候補化合物に曝露するステップと、ｄ）前記単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントをアレスチンまたはアレスチンの生物学的に活性なフラグメントに曝露するステップと、およびｅ）前記アレスチンまたはアレスチンの生物学的に活性なフラグメントとの結合が遮断されるかどうかを決定するステップとを含む。
【００２０】
本発明の方法はまた、アレスチンのアゴニスト非依存様式の局在化を妨害する化合物の識別方法を含む。この方法は、ａ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、ｂ）前記修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントをアレスチンもまた発現する細胞中で発現させるステップと、ｃ）細胞を候補化合物に曝露するステップと、およびｄ）前記候補化合物がアレスチンのエンドソーム標的化を阻害するかどうかを決定するステップとを含む。
【００２１】
本発明の方法はまた、ＧＰＣＲアンタゴニスト活性または逆アゴニスト活性を有する化合物の識別方法を含む。この方法は、ａ）アゴニストを使用せずにエンドソームまたはエンドサイトーシス小胞を標的化する単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、ｂ）アレスチンと検出可能な分子との抱合体をもまた発現する細胞中で前記単離された修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを発現させるステップと、ｃ）前記細胞を候補化合物に曝露するステップと、およびｄ）アレスチンタンパク質とＧＰＣＲとの相互作用が前記試験化合物との曝露後に減少するかどうかを検出するステップであって、前記相互作用の減少が前記化合物が活性を有することの指標であることを特徴とするステップとを含む。
【００２２】
本発明の方法では、修飾ＧＰＣＲは、クラスＡ受容体、クラスＢ受容体、嗅覚受容体もしくは味覚受容体、またはオーファン受容体であり得る。本発明の方法では、アレスチンを検出可能な分子に結合させることができる。本発明の方法では、修飾ＧＰＣＲを検出可能な分子に結合させることができる。検出可能な分子は、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティ標識、酵素、蛍光基、または化学発光基であってもよい。
【００２３】
本発明はまた、本発明の方法によって識別される化合物に関する。本発明は、さらに、本発明の方法によって識別された治療有効量の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む、哺乳動物におけるＧＰＣＲによって媒介される病態の治療のための医薬組成物に関する。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、修飾ＧＰＣＲを発現する非ヒトトランスジェニック動物に関する。動物は、マウス、霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、またはヒツジであり得る。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、生体サンプル中での修飾ＧＰＣＲの検出方法に関する。この方法は、修飾ＧＰＣＲを認識して結合する抗体を使用して生体サンプルをアッセイするステップと、前記抗体が前記修飾ＧＰＣＲに結合するかどうかを決定するステップとを含む。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、生体サンプル中の本発明の核酸の検出方法に関する。この方法は、（ａ）生体サンプルを修飾ＧＰＣＲプローブに曝露するステップと、（ｂ）前記修飾ＧＰＣＲプローブが前記生体サンプルの核酸に結合するかどうかを決定するステップとを含む。
【００２７】
本発明はまた、基質および式Ｉのモチーフをコードする１つまたは複数の本発明の核酸またはそのフラグメントを含み、前記式Ｉが修飾ＤＲＹモチーフである組成物に関する。
【００２８】
本発明はまた、生体サンプル中の修飾ＧＰＣＲ検出用のキットに関する。このキットは、修飾ＧＰＣＲを認識して結合する抗体および前記修飾ＧＰＣＲに結合する抗体を検出する試薬を含む。
【００２９】
本発明は、さらに、修飾ＧＰＣＲを認識して結合する単離された免疫グロブリンに関する。免疫グロブリンは、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、または抗体フラグメントであってもよい。免疫グロブリンは抗体フラグメントであってよく、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）、およびｓｃＦｖであってよい。
【００３０】
さらに別の態様では、本発明は、有効量の２−エチル−５，７−ジメチル−３−［［２’−（１Ｈ−テトラゾル−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンまたはフェントラミンを必要な患者に投与することによる、アレスチンのＧＰＣＲへの結合またはエンドサイトーシス小胞もしくはエンドソームへのＧＰＣＲ局在化を阻害する方法に関する。
【００３１】
他の目的および利点は、例示的な図面を参照した説明に照らして当業者に明らかとなる。
【００３２】
本発明の目的および利点は、図面と共に以下の詳細な説明によって理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明によれば、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、１９８９；「現代の分子生物学」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ編、１９９４；「細胞生物学：実験ハンドブック」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓら、１９９４；「現代の免疫学プロトコール」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編、１９９４；「オリゴヌクレオチド合成」、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４；「核酸ハイブリダイゼーション」、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５；「転写と翻訳」、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４；「動物細胞培養」、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、２０００；「固定化細胞と酵素」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニング説明書」、１９８４；「抗体の使用法：実験マニュアル：ポータブルプロトコールＮｏ．１」、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｄ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８；「抗体の使用法：実験マニュアル」、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｄ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；を参照のこと。
【００３４】
別記しない限り、明細書および特許請求の範囲で使用した以下の用語は、以下の意味を有する。
【００３５】
「免疫グロブリン」は、抗体および抗体活性を有する抗体フラグメントを含む。免疫グロブリンが修飾ＧＰＣＲに結合する場合の免疫活性が好ましい。さらに好ましい免疫グロブリンは、修飾ＧＰＣＲと野生型ＧＰＣＲとを区別することができるものである。最も好ましい免疫グロブリンは、修飾ＤＲＹモチーフまたはＧＰＣＲのＤＲＹモチーフに結合するものである。用語「抗体」は、抗体全体および特定のエピトープを認識するか、または特定のエピトープに結合するそのフラグメントを含む免疫グロブリンをいう。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体が含まれ、最後に記載のものは米国特許第４，８１６，３９７号および米国特許第４，８１６，５６７号にさらに詳述されている。用語「エピトープ」は、抗体または他の免疫系成分によって認識されるか認識可能な抗原または免疫原の１つまたは複数の部分を識別するために使用する。
【００３６】
免疫グロブリンの例は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、およびパラトープを含む免疫グロブリン分子の一部である。抗体フラグメントには、本明細書中に記載の治療方法での使用に好ましいＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ｖ）、およびｓｃＦｖが含まれる。
【００３７】
抗体フラグメントのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2部分を、周知の方法による実質的にインタクトな抗体に対するパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によってそれぞれ調製する。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらに付与された米国特許第４，３４２，５６６号を参照のこと。Ｆａｂ’抗体部分もまた周知であり、Ｆ（ａｂ’）2部分から産生され、その後メルカプトエタノールなどを使用して２つの重鎖部分に結合したジスルフィド結合を還元し、ヨードアセトアミドなどの試薬を用いてアルキル化する。本明細書中ではインタクトな抗体部分を含む抗体が好ましい。
【００３８】
「抗体結合部位（antibody combining site）」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変領域ならびに超可変領域からなる抗体の構造部分である。
【００３９】
その種々の文法上の形態における語句「モノクローナル抗体」とは、抗原上の特定のエピトープと免疫反応することができる抗体結合部位のたった１つの種を有する抗体をいう。したがって、モノクローナル抗体は、それぞれが異なる抗原に免疫特異的な複数の抗体結合部位を含むことができる（例えば、二重特異的（キメラ）モノクローナル抗体）。
【００４０】
「動物」は、脊椎動物（例えば、カエル、サンショウウオ、ニワトリ、またはウシ）および無脊椎動物（例えば、蠕虫など）を含む任意の動物界の構成要素を意味する。「動物」はまた、「哺乳動物」を含むことを意味する。好ましい哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、バッファロー、ウマ、ヒツジ、ブタ、およびヤギなどの有蹄動物）、げっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラット、およびモルモット）、イヌ、ネコ、霊長類、オオカミ、ラクダ、シカ、げっ歯類、鳥類、魚類が含まれる。
【００４１】
「アンタゴニスト」には、アゴニストに結合する野生型および／または修飾ＧＰＣＲ、野生型および／または修飾ＧＰＣＲ脱感作、野生型および／または修飾ＧＰＣＲ結合アレスチン、野生型および／または修飾ＧＰＣＲエンドソーム局在化などを妨害する全ての薬剤が含まれ、これには、野生型および／または修飾ＧＰＣＲに影響を与える薬剤ならびに野生型および／または修飾ＧＰＣＲシグナル伝達、脱感作、エンドソーム局在化、再感作などに関連する他のタンパク質に影響を与える薬剤が含まれる。
【００４２】
ＤＮＡ配列は、発現調節配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を調節および制御する場合に、発現調節配列に「作動可能に連結される」。用語「作動可能に連結される」は、発現すべきＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有することと、発現調節配列の調節下でＤＮＡ配列を発現させ、ＤＮＡ配列によってコードされた所望の産物を産生させる正確なリーディングフレームを維持することを含む。組換えＤＮＡ分子への挿入が所望される遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、このような開始シグナルを遺伝子の前に挿入することができる。
【００４３】
「異常なＧＰＣＲ脱感作」および「異常な脱感作」は、活性受容体と脱感作受容体との間のバランスが野生型条件に関して変化するようにＧＰＣＲ脱感作経路が破壊されることを意味する。通常よりも活性な受容体が存在するか、野生型条件よりも脱感作された受容体が存在する。異常なＧＰＣＲ脱感作は、正常よりも受容体のシグナル伝達が増加するか正常よりもシグナル伝達が減少する、構成的に活性である構成的に脱感作されたＧＰＣＲの結果であり得る。
【００４４】
「アレスチン」は、天然アレスチンおよびアレスチンの設計された変異型を意味し、視覚アレスチン（しばしばアレスチン１と呼ばれる）、βアレスチン１（しばしばアレスチン２と呼ばれる）、βアレスチン２（しばしばアレスチン３と呼ばれる）が含まれるが、これらには限定されない。
【００４５】
修飾ＧＰＣＲの「生物学的に活性なフラグメント」は、アゴニスト非依存様式でアレスチンに結合し、アゴニスト非依存様式でエンドサイトーシス小胞もしくはエンドソームまたはそれらの両方を標識する能力を有する修飾ＧＰＣＲのポリペプチドフラグメントを意味する。
【００４６】
アレスチンの「生物学的に活性なフラグメント」は、野生型および／または修飾ＧＰＣＲに結合する能力を有するアレスチンのフラグメントを意味する。
【００４７】
「生体サンプル」は、被験体から単離した組織、細胞、および体液ならびに被験体の体内に存在する細胞および流体を含むことを意図し、前記サンプルは、血液、血清、尿サンプル、糞便サンプル、腫瘍サンプル、細胞洗浄物、口内サンプル、唾液、体液、組織抽出物、新たに採取した細胞、組織培養でインキュベートした細胞であり得る。
【００４８】
本明細書中で使用される、「カルボキシル末端テール」は、ＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを意味する。多数のＧＰＣＲのカルボキシル末端テールは、７回貫通ドメインの末端をマークする保存ＮＰＸＸＹモチーフのすぐ後から始まる（すなわち、ＮＰＸＸＹモチーフに続くものがＧＰＣＲのカルボキシル末端テールである）。カルボキシル末端テールは、比較的長くてもよく（約数十〜数百個のアミノ酸）、比較的短くてもよく（約１０〜１００個のアミノ酸）、または事実上存在しなくてもよい（約１０アミノ酸未満）。本明細書中で使用される、「カルボキシル末端テール」は、これら３つの変異型（比較的長いか、比較的短いか、事実上存在しない）を意味する。
【００４９】
「クラスＡ受容体」は、好ましくは、ＨＥＫ−２９３細胞中でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化する。
【００５０】
「修飾クラスＡ受容体」は、ＤＲＹ変異を含むクラスＡ受容体を意味する。
【００５１】
「クラスＢ受容体」は、好ましくは、ＨＥＫ−２９３細胞中でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化しない。
【００５２】
「修飾クラスＢ受容体」は、ＤＲＹ変異を含むクラスＢ受容体を意味する。
【００５３】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下におかれた場合にインビボでポリペプチドに転写および翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界を、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定する。コード配列には、原核配列、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’末端に存在する。
【００５４】
転写および翻訳調節配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの宿主細胞中のコード配列を発現させるＤＮＡ調節配列である。
【００５５】
「並行投与」、「組み合わせ投与」、「同時投与」、または「同時に投与する」は、２つまたはそれ以上の化合物が同一の時間に投与されたかのように得られた結果が実質的に同一であるような時間内で同時にまたは十分に近い時間で化合物を投与することを意味する。
【００５６】
「異常性の保存」は、ＧＰＣＲ経路中の異常性を意味し、異常なＧＰＣＲシグナル伝達の原因となり得るＧＰＣＲ、ＧＲＫ、アレスチン、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、プロテインホスファターゼなどの異常が含まれるが、これらに限定されない。この異常なＧＰＣＲシグナル伝達は、ＧＰＣＲ関連疾患に寄与することができる。
【００５７】
「構成的に脱感作された」ＧＰＣＲに関して、従来のＧタンパク質シグナル伝達を適切に活性化することができるＧＰＣＲと、活性化することができないＧＰＣＲとの間の平衡は、従来のＧタンパク質シグナル伝達を適切に活性化できないほうへ移行する。さらに、本発明の構成的に脱感作されたＧＰＣＲは、構成的にリン酸化され、構成的にアレスチンに結合し、構成的にクラスリンコートピット（clathrin-coated pit）中に局在化し、そして／または構成的にエンドサイトーシス小胞もしくはエンドソームに局在化する。構成的に脱感作された受容体は、アゴニストに適切に応答する能力を欠き、アゴニストの非存在下でさえも脱感作することができる。感作ＧＰＣＲのアゴニスト刺激と独立して構成的に脱感作されたＧＰＣＲが形成される。構成的に脱感作された受容体は、多くの程度の不適切なシグナル伝達に及び、構成的に脱感作された受容体は、その寿命におけるいくつかの時点で、シグナルを送ることもあり、送らないこともある。
【００５８】
「検出可能な分子」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、放射性手段、および光学的手段によって検出することができる任意の分子（蛍光、リン光、および生体発光、および放射性崩壊が含まれるが、これらに限定されない）を意味する。検出可能な分子には、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ローダミン結合抗体などが含まれるが、これらに限定されない。検出可能な分子には、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティ標識、酵素、蛍光基、化学発光基などが含まれる。検出可能な分子には、他の分子とのその相互作用の関数として直接または間接的に検出される分子が含まれる。
【００５９】
「脱感作ＧＰＣＲ」は、アゴニストに応答して従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化する能力を現時点で持たないＧＰＣＲを意味する。本発明の脱感作ＧＰＣＲは、アゴニストに適切に応答せず、リン酸化されており、アレスチンに結合し、クラスリンコートピット中に構成的に局在化し、そして／またはエンドサイトーシス小胞もしくはエンドソームに構成的に局在化する。
【００６０】
「脱感作経路」は、脱感作過程の任意の細胞成分ならびに脱感作過程およびその後の過程に関与する任意の細胞構造を意味し、アレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、プロテインホスファターゼなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明のアッセイ方法では、ポリペプチドを、例えば、細胞質中、細胞膜上、クラスリンコートピット中、エンドサイトーシス小胞中、エンドソーム中、その間の任意の段階等で検出することができる。
【００６１】
「ＤＡＣ」類は、任意の脱感作活性化合物を意味する。脱感作活性化合物は、このプロセスを刺激すること、または阻害することのいずれかによってＧＰＣＲ脱感作機構に影響を与える任意の化合物である。ＤＡＣは、このプロセスの任意の細胞成分およびこのプロセスに関連する任意の細胞構造（アレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ＡＰ−２タンパク質、カルスリン、プロテインホスファターゼなどが含まれるが、これらに限定されない）に対する作用によってＧＰＣＲ脱感作経路に影響を与える。ＤＡＣには、アレスチンのＧＰＣＲへの移動を阻害する化合物、アレスチンのＧＰＣＲへの結合を阻害する化合物、アレスチンのＧＰＣＲへの移動を刺激する化合物、アレスチンのＧＰＣＲへの結合を刺激する化合物、ＧＲＫのＧＰＣＲへのリン酸化を阻害する化合物、ＧＲＫのＧＰＣＲへのリン酸化を刺激する化合物、プロテインホスファターゼのＧＰＣＲへの脱リン酸化を阻害する化合物、プロテインホスファターゼのＧＰＣＲへの脱リン酸化を刺激する化合物、ＧＰＣＲからのアレスチン放出を調節する化合物、ＧＰＣＲのアンタゴニスト、逆アゴニストなどを含み得るが、これらに限定されない。ＤＡＣは、好ましくは、ＧＰＣＲの伝統的なアゴニストおよびアンタゴニストと同一のＧＰＣＲのリガンド結合部位に結合することなくＧＰＣＲ脱感作過程を阻害または刺激する。
【００６２】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖または二本鎖ヘリックスのいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形態をいう。この用語は、分子の一次構造および二次構造についてのみをいい、特定の三次形態（tertiary form）に制限されない。したがって、この用語には、特に、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色体中で見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する場合、本明細書中では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’→３’方向でのみ配列を示す通常の習慣にしたがって配列を記載することができる。
【００６３】
「ＤＲＹモチーフ」は、第３の膜貫通領域と第２の細胞内ループの細胞質との境界付近に存在する高度に保存されたＧＰＣＲモチーフを意味する。ＤＲＹモチーフは、最も好ましくは、以下の３つのアミノ酸モチーフ：アスパラギン酸−アルギニン−チロシン（アスパラギン酸は第１のアミノ酸であり、アルギニンは第２のアミノ酸であり、チロシンは第３のアミノ酸である（または単一のアミノ酸置換を使用する場合、ＤＲＹ））であり、ＤＲＹは式Ｉともいう。アレスチンへのアゴニスト非依存性結合またはＧＰＣＲへのアゴニスト非依存性エンドソーム局在化を付与しないこのアミノ酸配列の変形形態もまた含まれる。例えば、第１のアミノ酸は、グルタミン酸（すなわち、ＥＲＹ）、ロイシン、プロリン、グルタミン、スレオニン、イソロイシン、システイン、グリシン、アスパラギン、バリン、ヒスチジン、またはアラニンであり得る。例えば、第３のアミノ酸は、ヒスチジン（すなわち、ＤＲＨ）、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、イソロイシン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン、システイン、ロイシン、アスパラギン酸、またはアラニンであり得る。ＤＲＹモチーフ中に１つを超える置換または置換基の任意の組み合わせが存在し得る。野生型ＤＲＹモチーフおよび好ましい修飾を、図２ａに例示する。
【００６４】
「発現調節配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を調節および制御するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、その後コード配列によってコードされたタンパク質に翻訳される場合、転写および翻訳調節配列の「調節下」におかれている。
【００６５】
「ＧＦＰ」は、天然供給源から単離するか遺伝子操作することができるＧＦＰの天然に存在する種々の形態および人為的に修飾したＧＦＰをいう緑色蛍光タンパク質を意味する。ＧＦＰは当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，６２５，０４８号、米国特許第５，７７７，０７９号、および米国特許第６，０６６，４７６号を参照のこと。ＧＦＰは、天然供給源から単離されるか遺伝子操作された他の蛍光タンパク質（黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェリン、ＵＶ励起蛍光タンパク質、またはこれらの間の任意の波長のものが含まれるが、これらに限定されない）と容易に交換可能であることが当該分野で十分に理解されている。本明細書中で使用される、「ＧＦＰ」は、当該分野で既知の全ての蛍光タンパク質を意味する。
【００６６】
「ＧＰＣＲシグナル伝達」は、Ｇタンパク質のＧＰＣＲ誘導活性化を意味する。これにより、例えば、ｃＡＭＰを産生することができる。
【００６７】
「Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ」（ＧＲＫ）には、ＧＰＣＲをリン酸化する能力を有する任意のキナーゼが含まれる。
【００６８】
「Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎ  ＧＰＣＲ」は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎに天然に存在するＧＰＣＲを意味する。
【００６９】
「ハイブリダイゼーション」は、相補ヌクレオチド間またはヌクレオチド塩基間のワトソン・クリック水素結合またはHoogsteenもしくは逆Hoogsteen水素結合であってよい水素結合を意味する。例えば、アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は、水素結合の形成を介して対合する相補的な核酸塩基である。
【００７０】
「逆アゴニスト（inverse agonist）」は、ＧＰＣＲへの結合の際にＧＰＣＲの基底（basal）の内因性活性を阻害する化合物を意味する。逆アゴニストは、アンタゴニストの１つの型である。
【００７１】
「単離された」または「精製された」ＧＰＣＲ核酸分子またはタンパク質、その生物学的に活性な部分、または抗体は、組換え技術によって産生された場合は本質的に他の細胞材料または培養培地を含まず、化学合成された場合には実質的に化合物の前駆体または他の化合物を含まない。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する（すなわち、核酸の５’および３’末端に存在する配列）配列（好ましくは、タンパク質コード配列）を含まない。本発明の目的のために、核酸分子について言及するために使用する場合、「単離された」は、単離された染色体を含まない。例えば、種々の実施形態では、単離されたＧＰＣＲ核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。実質的に細胞材料を含まないＧＰＣＲタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量）未満の非ＧＰＣＲタンパク質を含むＧＰＣＲタンパク質調製物を含む。ＧＰＣＲタンパク質またはその生物学的に活性な部分を組換えによって産生する場合、好ましくは、培養培地は、約３０％、２０％、１０％、または５％未満のタンパク質調製物を含む。ＧＰＣＲタンパク質を化学合成によって産生する場合、好ましくは、タンパク質調製物は、約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量）の化合物前駆体または非ＧＰＣＲ化合物を有する。
【００７２】
「修飾ＧＰＣＲ」は、構成的に脱感作されたＧＰＣＲが得られる１つまたは複数の修飾を有するＧＰＣＲをいう。したがって、修飾ＧＰＣＲは、好ましくはそのＤＲＹモチーフ中に１つまたは複数のアミノ酸配列の付加、置換、欠失を有し得る。
【００７３】
「修飾ＧＰＣＲプローブ」は、これらのポリペプチドをコードする核酸の修飾ＤＲＹ領域を介して特異的に結合するプローブを意味する。
【００７４】
「修飾ＤＲＹモチーフ」は、ＤＲＹモチーフ以外のアミノ酸配列が得られる１つまたは複数の修飾を有するＧＰＣＲのＤＲＹモチーフをいう。この修飾ＤＲＹモチーフにより、構成的に脱感作されたＧＰＣＲが得られる。より好ましくは、修飾ＤＲＹモチーフは、第２のアミノ酸としてアルギニン以外のアミノ酸からなる。ＤＲＹモチーフの第２のアミノ酸は、好ましくは、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギンであるが、図２ｂに示すアルギニンまたはリジン以外の任意のアミノ酸であってもよい。
【００７５】
「修飾ＧＲＫ」は、脱感作を変化させるように改変されたＧＲＫを意味する。
【００７６】
「天然ＧＰＣＲ」は、天然に存在するＧＰＣＲを意味する。
【００７７】
「嗅覚リガンド（Odorant ligand）」は、受容体への結合の際、アゴニストおよびアンタゴニスト分子を含む合成化合物および／または組換えによって産生した化合物を含む臭気を認知するリガンド化合物を意味する。
【００７８】
「嗅覚受容体」は、（通常、嗅覚リガンドの結合によって）活性化された場合に通常臭気が認知される嗅神経表面上に見出される受容体タンパク質を意味する。
【００７９】
「修飾嗅覚受容体」は、ＤＲＹ変異を含む嗅覚受容体である。
【００８０】
本発明のプローブについて言及するために本明細書中で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」を、２つまたはそれ以上、好ましくは３つ以上のリボヌクレオチドから構成される分子と定義する。その正確なサイズは、多数の因子に依存する。言い換えると、最終的な機能およびオリゴヌクレオチドの使用に依存する。
【００８１】
「複製起点」とは、ＤＮＡ合成に関連するＤＮＡ配列をいう。
【００８２】
用語「薬学的に許容可能な」は、ヒトに投与した場合に生理学的に許容され、且つ典型的には胃の不調およびめまいなどのアレルギー性のまたは類似の副作用を起こさない分子および組成物をいう。
【００８３】
本明細書中で使用される、用語「薬学的に許容可能なキャリア」とは、化合物の運搬または輸送に関連する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物、または賦形剤を意味する。
【００８４】
「霊長類化抗体」は、霊長類の可変配列または抗原結合部分およびヒト定常ドメイン配列を含む組換え抗体を意味する。
【００８５】
本明細書中で使用される、用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下ならびに適切な温度およびｐＨ）、合成開始点として作用することができる精製された制限消化物中で天然に生じる、または合成によって産生されるオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長産物合成の開始に十分な長さでなければならない。正確なプライマーの長さは、温度、プライマー供給源、および使用した方法を含む多数の因子に依存する。例えば、診断のために、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むことができる。
【００８６】
本明細書中のプライマーを、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的になるように選択する。これは、プライマーが、各々の鎖とハイブリダイゼーションするのに十分であるように相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、相補的でないヌクレオチドフラグメントを、プライマーの５’末端に結合させることができ、残りのプライマー配列はこの鎖に相補的である。あるいは、プライマー配列がハイブリダイゼーションする鎖の配列と十分に相補的であり、それにより伸長産物の合成用のテンプレートが形成される場合、相補的でない塩基またはより長い配列はプライマー中に散在させることができる。
【００８７】
本明細書中で使用される、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、それぞれ特定のヌクレオチド配列またはその付近の二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素をいう。
【００８８】
「現時点（presently）」とは、時間の前後関係において、感作、脱感作、または再感作を位置付けることを、時間的な前後関係として意味する。
【００８９】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’方向）コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列を、転写開始部位によってその３’末端で結合させ、バックグラウンドを超える検出可能なレベルでの転写開始に必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）を伸長させる。プロモーター配列内で、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を使用したマッピングによって都合よく見出される）およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物プロモーターは、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが常に含むわけではない。原核生物プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン・ダルカルノ配列を含む。
【００９０】
「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する（すなわち、それ自体の調節下で複製することができ）任意の遺伝子成分（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００９１】
「再感作されたＧＰＣＲ」は、先に脱感作され、現時点で感作されているＧＰＣＲを意味する。
【００９２】
「再感作活性化合物」は、ＧＰＣＲを再感作する化合物である。
【００９３】
「感作ＧＰＣＲ」は、現時点でアゴニストに応答して、従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化するＧＰＣＲである。
【００９４】
「シグナル配列」を、コード配列の前に含めることができる。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に方向付けるように宿主細胞に伝達する、またはポリペプチドを培地へ分泌するシグナルペプチド（ポリペプチドのＮ末端）をコードし、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞から離れる前に宿主細胞によって切り離される。原核生物および真核生物由来の種々のタンパク質に会合されたシグナル配列を見出すことができる。
【００９５】
「治療有効量」は、例えば、血圧上昇および呼吸などの病理学のいくつかの特徴の予防、好ましくは軽減に十分な量を意味する。
【００９６】
外因性または異種のＤＮＡがある細胞内に導入されている場合、その細胞は、そのようなＤＮＡによって「形質転換されている」。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムから作製した染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合）いてもよく、組み込まれていなくてもよい。例えば、原核生物（酵母）および哺乳動物では、形質転換するＤＮＡを、プラスミドなどのエピソームエレメント上に保持することができる。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、染色体の複製によって娘細胞に遺伝するように形質転換するＤＮＡが染色体に組み込まれている細胞である。この安定性を、形質転換するＤＮＡを含む娘細胞集団から構成される細胞株またはクローンを確立する真核細胞の能力によって示す。「クローン」は、１つの細胞または有糸分裂による共通の先祖由来の細胞集団である。「細胞株」は、インビトロで多数の世代を安定に成長することができる初代細胞のクローンである。
【００９７】
２つのＤＮＡ配列は、定義したＤＮＡ配列長と少なくとも７５％（好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％）のヌクレオチドがマッチする場合に「実質的に相同」である。実質的に相同な配列を、配列データバンクで利用可能な標準的なソフトウェアを使用した配列比較、例えば、または特定の系について定義したストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験によって識別することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出；「ＤＮＡクローニング」、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出；「核酸ハイブリダイゼーション」、前出を参照のこと。
【００９８】
「未知受容体またはオーファン受容体」は、その機能および／またはリガンドが未知のＧＰＣＲを意味する。
【００９９】
「修飾オーファン受容体」は、ＤＲＹ変異を含むオーファン受容体を意味する。
【０１００】
「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントが結合したセグメントの複製を引き起こすように結合することができるプラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。
【０１０１】
本発明は、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチド、好ましくは修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドの実質的に純粋な調製物、または修飾ＤＲＹモチーフを含む組換え修飾ＧＰＣＲポリペプチドを特徴とする。好ましい実施形態では、ポリペプチドは生物学的活性を有し、ポリペプチドは配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有し、好ましくは、配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と約６５％同一であり、最も好ましくは、配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と約９２％〜約９９％同一であり、ポリペプチドは配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と実質的に同一であり、ポリペプチドは、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、または１５０アミノ酸残基長であり、ポリペプチドは、少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約１０個、より好ましくは少なくとも約２０個、さらにより好ましくは少なくとも５０個、１００個、または１５０個の配列表に含まれる本発明の連続するアミノ酸残基を含む。さらに別の好ましい実施形態では、配列同一性が配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と約７％〜約８％異なるアミノ酸配列もまた、本発明に含まれる。
【０１０２】
好ましい実施形態では、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドは、配列表に含まれる本発明の核酸または配列表に含まれる本発明の核酸と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な核酸によってコードされる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドは、配列表に含まれる本発明の配列と約１、２、３、５、１０、またはそれ以上の残基が異なる。しかし、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドが、依然として構成的に脱感作された生物学的活性を示すように異なる。
【０１０４】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、リーディングフレームに、さらなるアミノ酸残基、好ましくは配列表に含まれる本発明の配列をコードするゲノムＤＮＡに対して５’または３’でゲノムＤＮＡよってコードされる残基に融合された、配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列の全てまたはフラグメントを含む。
【０１０５】
本発明のポリペプチドには、別の転写事象、別のＲＮＡスプライシング事象、および別の翻訳および翻訳後事象の結果として得られるものが含まれる。
【０１０６】
好ましい実施形態では、修飾ＤＲＹモチーフを含むコードされた修飾ＧＰＣＲポリペプチドは、（例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基のアミノ酸置換、付加、または欠失によって）アミノ酸配列中の約１、２、３、５、１０、またはそれ以上の残基が配列表に含まれる本発明の配列と異なる。しかし、修飾ＤＲＹモチーフを含むコードされた修飾ＧＰＣＲポリペプチドが、依然として構成的に脱感作された生物学的活性を示すように異なる。
【０１０７】
好ましい実施形態では、コードされたポリペプチドは、リーディングフレームに、さらなるアミノ酸残基、好ましくは配列表に含まれる本発明の配列をコードするゲノムＤＮＡに対して５’または３’でゲノムＤＮＡによってコードされる残基に融合された、配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列の全てまたはフラグメントを含む。
【０１０８】
本発明は、以下を含む。対立遺伝子変異型；天然の変異体；誘導変異体；配列表に含まれる本発明のポリペプチドをコードする核酸に対して低または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡによってコードされるタンパク質（高および低ストリンジェンシーの定義については、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９、６．３．１〜６．３．６（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと）；および抗血清によって修飾ＤＲＹモチーフを含むＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合したポリペプチド、特に、抗血清によって修飾ＤＲＹモチーフポリペプチドを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドの活性部位または結合ドメインに特異的に結合したポリペプチド。本発明はまた、フラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメントを含む。これらおよび他のポリペプチドを、本明細書中では修飾ＧＰＣＲポリペプチド類似体または変異型ともいう。
【０１０９】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を提供する。これには、二本鎖核酸ならびにコードする一本鎖およびアンチセンス一本鎖が含まれる。
【０１１０】
好ましい実施形態では、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲをコードする核酸は、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲの遺伝子配列（例えば、組換え宿主細胞における発現に適切な修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲをコードする遺伝子配列）に作動可能に連結された転写調節配列（例えば、少なくとも１つの転写プロモーター配列または転写エンハンサー配列）を含む。
【０１１１】
さらに好ましい実施形態では、本発明の修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸は、ストリンジェントな条件下で修飾ＤＲＹモチーフを含む配列表に含まれる本発明の少なくとも約８個の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列表に含まれる本発明の少なくとも約１２個の連続するヌクレオチド、さらにより好ましくは配列表に含まれる本発明の少なくとも約２０個の連続するヌクレオチド、最も好ましくは配列表に含まれる本発明の少なくとも約４０個の連続するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイゼーションする。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好ましい実施形態では、コードされたポリペプチドは、生物学的活性を有し、コードされたポリペプチドは、配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同なアミノ酸配列を有し、コードされたポリペプチドは配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と実質的に同一であり、コードされたポリペプチドは、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、または１５０アミノ酸残基長であり、コードされたポリペプチドは、少なくとも約５、好ましくは少なくとも約１０個、より好ましくは少なくとも約２０個、さらにより好ましくは少なくとも５０個、１００個、または１５０個の配列表に含まれる本発明の連続するアミノ酸を含む。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、以下を含む。修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドまたは本明細書中に記載の修飾ＤＲＹモチーフ変異型を含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、ベクターでトランスフェクトした宿主細胞、および、例えば細胞培養培地中で細胞を培養するステップと、例えば細胞または細胞培養培地から修飾ＤＲＹモチーフまたは変異型を含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドを単離するステップとを含む、修飾ＤＲＹモチーフまたは変異型を含む組換え修飾ＧＰＣＲポリペプチドを産生する方法。
【０１１４】
本発明の１つの実施形態は、実質的に単離された核酸に関する。本発明の核酸には、配列番号７〜配列番号１２の任意の１つまたはその相補物に対応する少なくとも約８ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１２ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも１５〜２０ヌクレオチド長の配列が含まれる。あるいは、核酸は、配列番号７〜配列番号１２のいずれかが一部を形成する完全なタンパク質コード配列を含む任意のＯＲＦ（リーディングフレーム）内に含まれる配列を含む。本発明は、これらの配列の配列保存変異型および機能保存変異体を含む。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、またはその誘導体であり得る。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、配列表に含まれる本発明の配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な精製された組換え核酸を特徴とする。
【０１１６】
本発明はまた、これらの修飾ＤＲＹモチーフ由来の配列を含む組換えＤＮＡ（ＤＮＡクローニングベクターおよび発現ベクター）、このようなＤＮＡを含む宿主細胞（真菌、細菌、酵母、植物、昆虫、および哺乳動物の宿主細胞を含む）、および修飾ＤＲＹモチーフ配列を含む修飾ＧＰＣＲによってコードされるＲＮＡおよびポリペプチドを含む発現産物の産生方法を含む。配列が発現する条件下で修飾ＤＲＹモチーフ由来の核酸配列を含む修飾ＧＰＣＲを含む宿主細胞のインキュベーションによってこれらの方法を行う。宿主細胞は、天然または組換えであってよい。ポリペプチドを、（ａ）細胞画分および培地画分を得るためにインキュベートした細胞を採取するステップと、（ｂ）細胞画分、培地画分、またはこれらの両方由来の修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドを回収するステップとによって得ることができる。ポリペプチドを、インビトロ翻訳によっても作製することができる。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲのｍＲＮＡに結合することができる核酸を特徴とする。このような核酸は、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲのｍＲＮＡの翻訳を調節するようにアンチセンス核酸として作用することができる。さらなる態様は、修飾ＤＲＹモチーフ核酸を含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合することができる核酸を特徴とする。これらの核酸を、本明細書中で相補物ともいい、プローブおよび捕捉試薬として使用する。
【０１１８】
別の態様では、本発明は、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲの核酸に対応するリーディングフレームを含む発現系を特徴とする。核酸は、さらに、意図する宿主に適合する調節配列を含む。発現系は、修飾ＤＲＹモチーフ核酸を含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドに対応するポリペプチドの作製に有用である。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、以下を含む。修飾ＤＲＹモチーフまたは本明細書中に記載の変異型を含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、ベクターでトランスフェクトした宿主細胞、および例えば、細胞培養培地中で細胞を培養するステップと、例えば、細胞または細胞培養培地から修飾ＤＲＹモチーフまたは変異型を含む修飾ＧＰＣＲポリペプチドを単離するステップとを含む、修飾ＤＲＹモチーフまたは変異型を含む組換え修飾ＧＰＣＲポリペプチドを産生する方法。
【０１２０】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。宿主動物中での抗体の産生方法も提供する。本発明の方法は、動物を修飾ＤＲＹモチーフ由来の免疫原性成分を含む少なくとも１つの修飾ＧＰＣＲで免疫化するステップを含み、前記免疫原性成分は、配列番号７〜配列番号１２のいずれか１つによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドまたはその配列保存変異型もしくは機能保存変異型；または完全なタンパク質コード配列（配列番号７〜配列番号１２のいずれかが一部を形成する）を含む任意のＯＲＦ内に含まれるポリペプチド、または配列番号１〜配列番号６のいずれかに含まれるポリペプチド配列、または配列番号１〜配列番号６のいずれかが一部を形成するポリペプチドを含む。宿主動物には、任意の温血動物（哺乳動物および鳥類が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。このような抗体を、修飾ＤＲＹモチーフ特異的抗原を含む修飾ＧＰＣＲの存在量および分布を評価するための免疫アッセイ用の試薬として使用する。
【０１２１】
本発明は、修飾ＧＰＣＲ、修飾ＧＰＣＲのポリペプチド、修飾ＧＰＣＲをコードする核酸分子、修飾ＧＰＣＲをコードする核酸分子を含むベクター、修飾ＧＰＣＲの核酸構築が可能なベクター、および修飾ＧＰＣＲを含む細胞に関する。本発明は、さらに、修飾ＧＰＣＲを使用するアッセイ系、修飾ＧＰＣＲを含む細胞を使用するアッセイ系、アッセイ系を使用して識別された化合物、識別された化合物を使用した処理方法、アッセイ系を使用した疾患の診断方法、および本発明のアッセイ試薬および本発明の細胞を含むキットに関する。本発明はまた、アンチセンスおよび修飾ＧＰＣＲ核酸を使用した処理技術に関する。
【０１２２】
特定のコドンを異なるアミノ酸をコードするコドンに変化させるようにＧＰＣＲまたは修飾ＧＰＣＲを変異させることができる。一般に、可能な限り少ないヌクレオチドの変化によってこのような変異を行う。非保存様式（すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸群に属するアミノ酸から別の群に属するアミノ酸へのコドンの変化による）または保存様式（すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸群に属するアミノ酸から同一の群に属するアミノ酸へのコドンの変化による）で得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるために、この種の置換変異を行うことができる。このような保存的変化により、一般に、得られたタンパク質の構造および機能はあまり変化しない。非保存的変化により、得られたタンパク質の構造、活性、または機能が変化する可能性が高い。本発明は、得られたタンパク質の活性または結合の特徴が有意に変化しない保存的変化を含む配列を含むとみなすべきである。本発明はまた、得られたタンパク質の活性または結合の特徴が有意に変化しない非保存的変化を含む配列を含むとみなすべきである。
【０１２３】
特定の実施形態では、本発明の修飾ＧＰＣＲには、アゴニスト非依存様式でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化するように修飾されたＧＰＣＲが含まれる。特定の実施形態では、本発明の修飾ＧＰＣＲには、アゴニスト非依存様式でβアレスチンに結合するように修飾したＧＰＣＲが含まれる。さらに好ましい実施形態では、本発明の修飾ＧＰＣＲは、βアレスチンに結合し、且つエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化する。
【０１２４】
本発明の修飾ＧＰＣＲは、修飾ＤＲＹモチーフを含む。ＤＲＹモチーフは、第３の膜貫通領域と第２の細胞内ループとの細胞質境界付近に存在する高度に保存されたＧＰＣＲモチーフである。ＤＲＹモチーフは、最も好ましくは、以下の３つのアミノ酸モチーフである。アスパラギン酸−アルギニン−チロシン（ＤＲＹ）。修飾ＤＲＹモチーフは、ＤＲＹモチーフ以外のアミノ酸配列が得られる１つまたは複数の修飾を有するＧＰＣＲのＤＲＹモチーフをいう。最も好ましくは、修飾ＤＲＹモチーフは、第２のアミノ酸としてアルギニン以外のアミノ酸からなる。ＤＲＹモチーフの第２のアミノ酸は、好ましくは、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギンであるが、アルギニンまたはリジン以外の任意のアミノ酸であってよい。
【０１２５】
修飾ＤＲＹモチーフにより、本発明前には知られていなかった構成的に脱感作されたＧＰＣＲが得られる。本明細書中に記載されているように、任意のＧＰＣＲのＤＲＹモチーフを修飾して、構成的に脱感作されたＧＰＣＲを得ることができる。
【０１２６】
修飾ＧＰＣＲには、Ｖ２Ｒを含んでもよいが、Ｖ２Ｒを排除することもできる。Ｖ２Ｒ  Ｒ１３７Ｈの修飾ＤＲＹモチーフを使用して、他のＧＰＣＲのＤＲＹモチーフに置換することができる。好ましくは、この３つのアミノ酸配列を、第３の膜貫通領域と第２の細胞内ループとの細胞質境界付近に設置する。ＤＲＹモチーフのＲの変異を含む修飾ＧＰＣＲは、アレスチンに対する親和性が増加し、アゴニスト非依存様式でエンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中でアレスチンと共存する。本発明は、好ましくはＤＲＹモチーフのＲの変異のためにアゴニスト非依存様式でエンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中でアレスチンと共存する修飾ＧＰＣＲを含む（に関する）。
【０１２７】
本発明の修飾ＧＰＣＲはまた、２００１年１１月５日提出の米国特許出願番号０９／９９３，８４４号、「修飾Ｇタンパク質共役受容体」（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載のようにカルボキシル末端テール中に適切に位置付けられた１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターを含むような修飾を含んでもよい。アミノ酸のクラスターは、２つの連続するアミノ酸位置のうちの２つ、３つのうちの２つ、３つのうちの３つ、４つの位置のうちの３つ、４つのうちの４つ、５つの位置のうちの４つ、５つのうちの５つなどを占めてもよい。リン酸化部位のこれらのクラスターは、好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端テール中に存在するセリン残基およびスレオニン残基である。これらの変異は、アミノ酸残基の個別の点変異、ＧＰＣＲの核酸配列中の変異、またはカルボキシル末端テールの全体または一部を、リン酸化部位を適切に位置付けたクラスターを有するＧＰＣＲのそれと交換することによって得ることができる。交換部位は、保存されているＮＰＸＸＹモチーフの後に存在するか、このモチーフに含まれる。あるいは、ＧＰＣＲの推定パルミトイル化部位を、保存されているＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流で識別することができ、交換部位は、パルミトイル化システインの後に存在するか、これを含み得る。テールを交換し、修飾ＧＰＣＲを核酸配列または対応するアミノ酸配列の操作によって構築することができる。
【０１２８】
本発明の修飾ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性を変化させることができる化合物のスクリーニングアッセイで有用である。これらのアッセイは、アレスチン、ＧＰＣＲ、または脱感作に関連する他のタンパク質に結合した検出可能な分子を使用することができる。検出可能な分子は、本明細書中に記載されており、蛍光基（例えば、ＧＦＰ）、酵素（例えば、βガラクトシダーゼ）、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティ標識、および化学発光基が含まれる。本発明で使用することができるアッセイの例には、米国特許第５，８９１，６４６号および米国特許第６，１１０，６９３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載のものを含んでもよいが、これらに限定されない。本発明で使用することができるさらなるアッセイの例には、化学発光を使用したアッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、およびＡｎｇｅｒｓ，Ｓ，Ｓａｌａｈｐｏｕｒ，Ａ．，Ｊｏｌｙ，Ｅ．Ｈｉｌａｉｒｅｔ，Ｓ．Ｃｈｅｌｓｋｙ、「生体発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を使用した、生きた細胞におけるβ２アドレナリン作動性受容体の二量体化」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７、３６８４〜３６８９に記載の生体蛍光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）技術を使用したアッセイを含んでもよいが、これらに限定されない。
【０１２９】
本発明を使用することができる既知のＧＰＣＲの非限定的なリストの例は、図１に含まれる。図１では、受容体を、構造の類似性およびリガンドに基づいた古典的な分類にしたがって分類している。
【０１３０】
例として、既知の受容体についての主要なＧＰＣＲクラスは、ＨＥＫ−２９３細胞中でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化することが好ましいクラスＡ受容体およびＨＥＫ−２９３細胞中でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化しないことが好ましいクラスＢ受容体である。
【０１３１】
アゴニストがＧＰＣＲに結合した後、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）はＧＰＣＲの細胞内ドメインをリン酸化することが発見された。リン酸化後、アレスチンタンパク質は、ＧＲＫリン酸化受容体に会合し、その同族Ｇタンパク質由来の受容体と結合しない。アレスチンのリン酸化ＧＰＣＲとの相互作用によりＧＰＣＲシグナル伝達が終結し、非シグナル伝達脱感作受容体が産生される。
【０１３２】
脱感作ＧＰＣＲに結合したアレスチンは、アダプタータンパク質としての機能によって、エンドサイトーシスのためにＧＰＣＲをクラスリンコートピットに標的化させ、ＧＰＣＲがアダプタータンパク質２（ＡＰ−２）およびクラスリンなどのエンドサイトーシス機構成分に結合する。インターナライズされたＧＰＣＲは脱リン酸化され、脱感作された細胞表面に戻される。本発明者らは、アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用の安定性が、ＧＰＣＲの脱リン酸化率、再利用率、および再感作率に影響することを決定した。脱感作プロセスにおけるＧＰＣＲリン酸化および脱リン酸化の関連が、２００１年１１月５日出願の米国特許出願番号０９／９９３，８４４号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で例示されている。
【０１３３】
本発明者らは、アレスチンのＧＰＣＲとの会合のアゴニストに対する依存がＧＰＣＲのＤＲＹモチーフによって媒介され得ることを発見した。ＤＲＹモチーフにより、アゴニストに依存してアレスチン−ＧＰＣＲ会合が可能であり得る。
【０１３４】
通常アゴニスト依存様式でアレスチンに結合するＧＰＣＲを、修飾ＤＲＹモチーフを含むように修飾することができる。この修飾により、好ましくは、アゴニストの非存在下で修飾ＧＰＣＲをアレスチンに結合させることが可能である。これらの修飾ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲ活性のアンタゴニストのスクリーニングに有用であり得る。
【０１３５】
ＧＰＣＲは、多数の疾患（狭心症などの心臓適応症、本態性高血圧症、心筋梗塞、上室および心室の不整脈、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、腎不全、糖尿病、喘息などの呼吸器適応症、慢性気管支炎、気管支痙攣、気腫、気道閉塞症、鼻炎などの上気道適応症、季節性アレルギー、炎症性疾患、損傷に対する炎症、慢性関節リウマチ、慢性炎症性腸疾患、緑内障、酸／ペプシン障害などの胃腸適応症、びらん性食道炎、胃腸過分泌、肥満細胞症、胃腸逆流、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、疼痛、肥満症、神経性大食症、うつ病、強迫性障害、器官奇形（例えば、心臓奇形）、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患、多発性硬化症、エプスタイン・バー感染、および癌が含まれるが、これらに限定されない）に関与している。したがって、ＧＰＣＲ活性およびアレスチン親和性の調整は、これらの病態の改善メカニズムである。
【０１３６】
本発明者らは、ＧＰＣＲシグナル伝達経路の任意の部分の異常により、ＧＰＣＲ関連疾患は発症させる異常なＧＰＣＲシグナル伝達を引き起こし得ると判断した。例えば、ＧＰＣＲシグナル伝達経路の成分（ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、アレスチン、プロテインホスファターゼ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリンなどが含まれるが、これらに限定されない）は変異を発現し得る。変異により、例えば、ＧＰＣＲシグナル伝達を変化させることができる異常なリガンド結合、Ｇタンパク質結合、ＧＰＣＲ輸送などを得ることができる。これらの変異により、構成的に脱感作されたＧＰＣＲを得ることができる。
【０１３７】
（１）現時点でアゴニストに応答して従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化することができることを意味する感作と、（２）現時点でアゴニストに応答することができず従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化することができないことを意味する脱感作と、（３）現時点でアゴニストに再度応答して従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化することができることを意味する再感作との間で野生型ＧＰＣＲは循環する。このバランスを崩壊させて、例えば、構成的に脱感作したＧＰＣＲを得ることができる。構成的に脱感作したＧＰＣＲは、上記のように循環しない。野生型条件下では、ＧＰＣＲは、感作ＧＰＣＲのアゴニスト活性化後に脱感作され、感作ＧＰＣＲのアゴニスト刺激から独立して構成的に脱感作されたＧＰＣＲが形成される。本発明の構成的に脱感作されたＧＰＣＲは、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中に局在化することが最も好ましい。
【０１３８】
本明細書中に記載のように、構成的に脱感作されたＧＰＣＲは、病態と関連がある可能性がある。これらの構成的に脱感作されたＧＰＣＲは、適切にアゴニストに応答せず、従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化しない。従来のＧタンパク質シグナル伝達のこの欠損は、病気の状態の原因であるかもしれない。これらの構成的に脱感作されたＧＰＣＲを、構成的にリン酸化して、構成的にアレスチンに結合することができる。アレスチン結合により、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中にＧＰＣＲを局在化することができる。
【０１３９】
ある条件は、これらの受容体の構成的脱感作を変化させることができる。これらの条件の中には、脱感作受容体を生ずるものもある。条件の中には、関連する病態を逆転させうるものもある。
【０１４０】
例えば、構成的に脱感作された変異受容体は、構成的脱感作、特にエンドソーム局在化を防止する第２の変異を保有することができる。例として、修飾ＧＰＣＲは、更なる変異を有することができ、リン酸化部位（例えば、ＳＳＳＴＳＳ）は、カルボキシル末端テール中の非リン酸化部位（例えば、ＡＡＡＡＡＡ）に変換され、それによりβアレスチンの結合が減少し、構成的脱感作、特にＧＰＣＲのエンドソーム局在化が防止される（図８）。脱感作経路中の変異タンパク質は、変異ＧＰＣＲの構成的脱感作およびエンドサイトーシス小胞中での局在化またはエンドソーム局在化を阻害することができる（図１４）。ＧＰＣＲのアンタゴニストは、構成的脱感作、特にエンドソーム局在化を防止することができる（図１４および１５）。脱感作経路に関連する他のタンパク質に結合する化合物はまた、構成的脱感作、特にエンドソーム局在化を防止することができる。
【０１４１】
例として、ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲの任意の部分（カルボキシル末端テール、細胞内ループ、および／または膜貫通領域の細胞質末端が含まれるが、これらに限定されない）に変異を有することができる。この修飾により、例えば、アレスチンに対するＧＰＣＲの親和性を増強することができる。変異によってアレスチンに対するＧＰＣＲの親和性が十分に増強された場合、ＧＰＣＲを構成的に脱感作することができる。構成的に脱感作された受容体は、ＧＰＣＲ関連疾患の病因に寄与し得る。
【０１４２】
アレスチンはまた、その任意の部分にＧＰＣＲに対するアレスチンの親和性を増強するか減少させる変異を有してもよい。さらに、ＡＰ−２タンパク質およびクラスリンは、その任意の部分に受容体に結合したアレスチンの結合を維持する能力を増強または減少させる変異を有してもよい。ＧＰＣＲに対するアレスチンの親和性の変化により、構成的に脱感作したＧＰＣＲを得ることができ、それによりＧＰＣＲ関連疾患の病因となりうる。さらに、野生型に関してアレスチンの発現を増加させて、構成的に脱感作したＧＰＣＲを得ることができる。
【０１４３】
さらに、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）は、その任意の部分にＧＰＣＲのリン酸化を増強してアレスチンに対するＧＰＣＲの親和性を増強させる変異を有し得る。修飾ＧＲＫにより、構成的に脱感作され、それによりＧＰＣＲ関連疾患の病因となりうる。さらに、野生型に関してＧＲＫの発現を増加させて、構成的に脱感作したＧＰＣＲを得ることができる。
【０１４４】
さらに、プロテインホスファターゼは、任意の部分にＧＰＣＲの脱リン酸化を増強または減少させてアレスチンに対するＧＰＣＲの親和性を増強または減少させることができる修飾（例えば、遺伝子の変異または他の機能の変化）を有し得る。プロテインホスファターゼの修飾により、構成的に脱感作され、それによりＧＰＣＲ関連疾患の病因に寄与し得る。ＧＰＣＲシグナル伝達経路に関連し得るプロテインホスファターゼには、例えば、カルシウム調節セリンスレオニンホスファターゼが含まれるが、これに限定されない。Ｃａ調節セリンスレオニンホスファターゼの例には、ホスファターゼのＰＰＥＦ１／ＰＰＥＦ２ファミリーが含まれる。
【０１４５】
特定の実施形態では、本発明の修飾ＧＰＣＲには、アゴニスト刺激の非存在下で基本レベルよりも高い比率でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化するように修飾されたＧＰＣＲが含まれる。
【０１４６】
［修飾ＧＰＣＲ］
本発明は、修飾ＧＰＣＲに関する。最も好ましくは、本発明の修飾ＧＰＣＲを、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中に構成的に局在化するように修飾する。通常、アゴニストはＧＰＣＲに結合し、活性化ＧＰＣＲはリン酸化され、アレスチンに結合し、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに標的化する。リン酸化ドメインは、カルボキシル末端ドメイン中に存在し得る。本発明者らは、カルボキシル末端ドメイン以外のＧＰＣＲ領域の修飾によりアレスチンへのＧＰＣＲの結合を調節することができると判断した。本発明者らは、修飾によりアゴニストの非存在下でのアレスチンへのＧＰＣＲ結合が可能であると判断した。修飾により、構成的に脱感作させた受容体を形成することができる。
【０１４７】
本発明者らは、特定のアミノ酸モチーフがＧＰＣＲ／アレスチン複合体のアゴニスト依存性の形成に関連し得るので、最終的にエンドサイトーシス小胞またはエンドソームへのアレスチンの補充を促進し得ることを発見した。これらのアミノ酸モチーフの修飾により、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体形成のアゴニスト依存性を緩和することができる。より好ましくは、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体のアゴニスト依存性の形成に関連するアミノ酸モチーフは、ＤＲＹモチーフであり得る。
【０１４８】
最も好ましくは、本発明の修飾ＧＰＣＲは、ＤＲＹモチーフ中に１つまたは複数の修飾を含む。ＤＲＹモチーフの１つ、２つ、または３つのアミノ酸を修飾することができるが、少なくともアルギニンが修飾されなければならない。ＤＲＹモチーフの全体または一部を修飾することができる。ＤＲＹモチーフは、第３の膜貫通領域と第２の細胞内ループの細胞質境界付近に存在する高度に保存されたＧＰＣＲモチーフである。ＤＲＹモチーフは、最も好ましくは、以下の３つのアミノ酸モチーフ：アスパラギン酸−アルギニン−チロシン（ＤＲＹ）である。このモチーフの修飾により、構成的に脱感作された受容体を形成することができる。
【０１４９】
例として、図３に示すように、Ｖ２Ｒは、アミノ酸１３６〜１３８にＤＲＹモチーフを有する。ＤＲＹモチーフの修飾により、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体のアゴニスト非依存性形成およびエンドサイトーシス小胞またはエンドソームへの構成的な局在化を促進することができる。α1B−ＡＲ受容体は、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進し、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化するＤＲＹモチーフを、アミノ酸１４２〜１４４に含む。ＡＴ1AＲ受容体は、ＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進し、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化するＤＲＹモチーフを、アミノ酸１２５〜１２７に含む。
【０１５０】
本発明は、これらの修飾ＧＰＣＲのポリペプチド配列を含む。本発明の修飾ＧＰＣＲには、アゴニスト非依存様式でエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化するＤＲＹモチーフで修飾したＧＰＣＲが含まれる。本発明の修飾ＧＰＣＲのポリペプチド配列には、１つまたは複数の付加、欠失、置換、または変異を有する配列が含まれる。これらの変異は、好ましくは、保存様式（すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸群に属するアミノ酸から同一の群に属するアミノ酸へのコドンの変化による）で得られる置換変異である。このような保存的変化により、一般に、得られたタンパク質の構造および機能はあまり変化しない。本発明は、得られたタンパク質の活性または結合の特徴が有意に変化しない保存的変化を含む配列を含むとみなすべきである。本発明はまた、得られたタンパク質の活性または結合の特徴が有意に変化しない非保存的変化を含む配列を含むとみなすべきである。
【０１５１】
本発明は、さらに、修飾ＧＰＣＲをコードする単離された核酸分子を含む。修飾ＧＰＣＲと同一のアミノ酸配列を有するが縮重している修飾ＧＰＣＲをコードする修飾ＧＰＣＲコードＤＮＡ配列は本発明の範囲内であると認識すべきである。「縮重」は、異なる三文字コドンを使用して特定のアミノ酸を特定することを意味する。
【０１５２】
本発明の修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲを作製するために、ＤＲＹモチーフを含むＧＰＣＲは、修飾ＧＰＣＲが構成的に脱感作された受容体であるようにそのＤＲＹモチーフ中に１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、置換、欠失、または変異を有し得る。例として、修飾ＧＰＣＲを得るためにアミノ酸残基の個別の点変異を得ることができる。例として、３つの連続するアミノ酸を、修飾ＧＰＣＲが得られるように変異することができる。例として、修飾ＧＰＣＲが得られるようにアルギニンをリジン以外の任意のアミノ酸、最も好ましくはアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、またはヒスチジンに変異することができる。
【０１５３】
さらに、修飾ＤＲＹモチーフを含む修飾ＧＰＣＲを作製するために、特定のコドンを異なるアミノ酸をコードするコドンに変化させるようにＧＰＣＲの核酸配列を変異させることができる。一般に、可能な限り少ないヌクレオチドの変化によってこのような変異を行う。構成的に脱感作した受容体を形成する修飾ＤＲＹモチーフを作製するために、得られたタンパク質のアミノ酸を変化させるこの種の置換変異を行うことができる。例として、核酸配列を個別に点変異することができる。
【０１５４】
さらに、本発明の修飾ＧＰＣＲを得るために、アゴニスト依存様式でアレスチンに結合するＧＰＣＲはまた、構成的に脱感作された受容体を形成する修飾ＤＲＹモチーフを有するＧＰＣＲのＤＲＹモチーフと交換したそのＤＲＹモチーフの全部または一部を有することができる。好ましくは、アゴニスト依存性様式でアレスチンに結合するＧＰＣＲのＤＲＹモチーフを、ＤＲＹモチーフに極めて近接したアミノ酸残基と交換する。
【０１５５】
遺伝子操作分野で標準的な分子生物学的技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素、発現ベクター、およびプラスミドなどが含まれるが、これらに限定されない）によって修飾ＧＰＣＲを作製することができる。例として、アレスチンに対するＧＰＣＲのアゴニストに依存しない親和性を増強するようにベクターをデザインすることができる。修飾すべきＧＰＣＲのＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを、適切な制限酵素によって消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏまたはｐＥＧＦＰ−Ｎ３などのベクターにサブクローン化することができる。上記の標準的な分子生物学的技術によってＤＮＡの修飾を導入することができる。
【０１５６】
標準的な受容体結合アッセイによって示すことができるように、アレスチンに対するアゴニスト非依存性の親和性、すなわち構成的なエンドソームの局在化を除いて、修飾ＧＰＣＲは野生型の対応物と実質的に区別することができない。例えば、修飾ＧＰＣＲは、アンタゴニストまたは逆アゴニストなどに対して類似の親和性を有する。
【０１５７】
例として、図５に示すように、Ｖ２Ｒは、修飾されたエンドサイトーシス標的化を生ずる修飾Ｒ１３７Ｈ（図３）を有し得る。この修飾Ｖ２Ｒは、腎性尿崩症（ＮＤＩ）に関連し得る。
【０１５８】
［ＧＰＣＲ活性のアッセイ方法］
本発明の修飾ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲ活性のアッセイ方法において有用である。本発明の修飾ＧＰＣＲを、アレスチンとの所望の相互作用または会合よりも強いＧＰＣＲおよびアレスチンとの相互作用または会合が未知であるＧＰＣＲを研究するためのアッセイにおいて使用することができる。修飾ＧＰＣＲを使用する本発明の方法により感度の高いアッセイが得られ、例えば、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにおいてアレスチン／ＧＰＣＲの検出を増強することができる。本発明の修飾ＧＰＣＲを使用するアッセイは、アンタゴニスト、逆アゴニスト、脱感作活性化合物、および再感作活性化合物などのための組成物、化合物、およびサンプル溶液などのスクリーニングに有用であり得る。一旦識別されると、これらの化合物は、ＧＰＣＲ活性を調整することができる薬物として有用であり、且つＧＰＣＲが関連する１つまたは複数の病態の治療において有用であり得る。
【０１５９】
本発明の好ましいアッセイでは、本発明の修飾ＧＰＣＲを発現する細胞が得られ、これらの細胞はアレスチンと検出可能な分子との抱合体をさらに含み得る。
【０１６０】
ＧＰＣＲ経路で機能するので、検出可能な分子に結合したアレスチンを検出およびモニターすることができる。細胞質中に均一に分散しているか、細胞膜に濃縮されているか、クラスリンコートピットに濃縮しているか、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームに局在化しているアレスチンの位置を検出することができる。アレスチンのＧＰＣＲとの近接および任意の他の細胞構造との近接をモニターすることができる。アゴニストの存在下でのこの近接の変化を、分析することができる。例えば、アンタゴニストに応答して、細胞膜でＧＰＣＲに近接しているか、クラスリンコートピットでＧＰＣＲと共に濃縮されているか、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム上でＧＰＣＲと共存しているアレスチンを検出することができる。
【０１６１】
好ましくは、本発明の修飾ＧＰＣＲは、アゴニストの非存在下でアレスチンに対する親和性が増加し、修飾ＧＰＣＲとアレスチンとの安定な複合体が得られ、それによりアゴニストの非存在下でエンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中に修飾ＧＰＣＲとアレスチンとの共存が促進される。本発明のアッセイ方法では、例えば、細胞質中、細胞膜で修飾ＧＰＣＲに近接して濃縮されているか、クラスリンコートピット中で修飾ＧＰＣＲに近接して濃縮されているか、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム上に修飾ＧＰＣＲと共存しているアレスチンなどを検出することができる。好ましくは、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム上でＧＰＣＲと共存したアレスチンを検出することができる。好ましくは、化合物は、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム上でのアレスチンのＧＰＣＲとのこの共存を変化させることができる。
【０１６２】
エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム上での修飾ＧＰＣＲとのアレスチンの会合を、アゴニストの非存在下で検出することができる。エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム上での修飾ＧＰＣＲとのアレスチンの共存を、アンタゴニストの存在下で破壊することができる。エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム上でのＧＰＣＲとのアレスチンの会合により、強力で容易に認識可能なシグナルを得ることができる。４０倍の対物レンズ下で、シグナルは、外観上はドーナツ型であり得る。エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中に共存するアレスチンとＧＰＣＲとの区画化（compartmentalization）に起因するシグナルは、典型的には検出が容易である。同様に、この会合の遮断も検出が容易である。検出方法の例を、本明細書中に記載する。このような方法には、例えば、偏光顕微鏡法、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、エバネッセント波励起顕微鏡法、および標準的な顕微鏡法または共焦点顕微鏡法が含まれる。
【０１６３】
本発明のＧＰＣＲ経路活性の評価方法は、（ａ）アゴニストを使用せずにエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化する修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、（ｂ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを基質に結合させるステップと、（ｃ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントをアレスチンに曝露するステップと、および（ｅ）修飾ＧＰＣＲのアレスチンとの相互作用を決定するステップとを含み得る。
【０１６４】
ＧＰＣＲ経路活性の評価方法は、（ａ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、（ｂ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを、アレスチンを含む細胞中で発現させるステップと、（ｃ）修飾ＧＰＣＲのアレスチンとの相互作用を決定するステップとを含み得る。
【０１６５】
ＧＰＣＲ経路活性の評価方法は、（ａ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、（ｂ）細胞内でのＧＰＣＲの細胞局在化を検出するステップとを含み得る。
【０１６６】
アレスチンは、修飾ＧＰＣＲに近接して存在し得る。例えば、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中、クラスリンコートピット、および細胞膜に近接して濃縮したアレスチン、修飾ＧＰＣＲ、および／またはアレスチン／修飾ＧＰＣＲ複合体を検出することができる。好ましくは、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中のアレスチン、修飾ＧＰＣＲ、および／またはアレスチン／修飾ＧＰＣＲ複合体を検出することができる。したがって、アゴニストの非存在下で、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中のアレスチン、修飾ＧＰＣＲ、および／またはアレスチン／修飾ＧＰＣＲ複合体を検出することができる。エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中でのアレスチンのＧＰＣＲとの会合により、長期間持続する強力で容易に認識可能なシグナルを得ることができる。
【０１６７】
本発明の修飾ＧＰＣＲを使用して、エンドソームの局在化を防止する第２の部位の変異をスクリーニングすることができ、これは疾患調整に関連し得る。構成的に脱感作された変異ＧＰＣＲは、構成的エンドソームの局在化を防止する第２の部位に変異を有することができる。例として、変異受容体はまた、そのカルボキシル末端テールにβアレスチン結合を減少させて構成的なエンドソーム局在化を防止する変異（ＡＡＡＡＡＡに変異したＳＳＳＴＳＳなど）を有し得る（図８）。ＧＰＣＲ中の第２の部位サプレッサー変異の識別方法は、（ａ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、（ｂ）アレスチンを発現する細胞中で修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを発現させるステップと、（ｃ）細胞を変異誘発物質に曝露するステップと、（ｄ）細胞内のＧＰＣＲの位置を検出し、前記変異誘発物質がＧＰＣＲのエンドソーム局在化を阻害するかどうかを決定するステップと、および（ｅ）第２の部位変異を識別するステップとを含む。ＧＰＣＲ中の第２の部位サプレッサー変異の識別方法は、ＰＣＲなどの標準的な分子生物学的技術によって得た、さらなる変異を含む修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、（ｂ）アレスチンを含む細胞中で修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを発現させるステップと、（ｃ）細胞内の修飾ＧＰＣＲの位置を検出し、前記変異がＧＰＣＲのエンドソーム局在化を阻害するかどうかを決定するステップと、および（ｅ）第２の部位変異を識別するステップとを含む。このアプローチを、ＧＰＣＲ脱感作経路に関連するタンパク質中の第２の部位サプレッサー（例えば、ＧＲＫおよびβアレスチンなど）の識別に使用することもできる。
【０１６８】
脱感作経路における変異タンパク質を、上記のスクリーニングで識別することができる。例えば、エンドサイトーシス経路での変異タンパク質により、構成的なエンドソーム局在化を防止することができる。例として、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）変異体は、野生型ダイナミンの存在下でエンドソーム中に構成的に局在化される脱感作受容体の構成的なエンドソーム局在化を防止する（図１４）。
【０１６９】
好ましくは、本明細書中に記載のように、アレスチンおよび／またはＧＰＣＲを検出可能な分子に結合させる。
【０１７０】
［スクリーニング方法］
本発明の修飾ＧＰＣＲを使用して、アンタゴニスト、逆アゴニスト、修飾ＧＰＣＲの構成的エンドソーム局在化を妨害する薬剤について組成物、化合物、サンプル溶液、化学的ライブラリー、組み合わせライブラリー、模倣ライブラリー、および免疫グロブリンなどをスクリーニングすることができる。したがって、修飾ＧＰＣＲは、アゴニストの非存在下で上記の薬剤をスクリーニングすることができる。例として、図１４および１５は、ＧＰＣＲの構成的なエンドソーム局在化を妨害するアンタゴニストを例示する。したがって、同様に、他のアンタゴニストなどを識別することができる。
【０１７１】
本発明のＧＰＣＲ経路活性の評価方法は、（ａ）アゴニストを使用せずにエンドサイトーシス小胞またはエンドソームを標的化する修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、（ｂ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを基質に結合させるステップと、（ｃ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを候補化合物に曝露するステップと、（ｄ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントをアレスチン（またはその生物学的に活性なフラグメント）に曝露するステップと、および（ｅ）アレスチンの結合が前記候補化合物によって遮断されたかを決定するステップとを含む。
【０１７２】
修飾ＧＰＣＲに結合するアゴニスト非依存性アレスチンを妨害する化合物の識別方法は、（ａ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、（ｂ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを、アレスチンを含む細胞中で発現させるステップと、（ｃ）細胞を候補化合物に曝露するステップと、（ｄ）細胞内のアレスチンの細胞局在化を検出し、前記候補化合物がアレスチンのエンドソーム局在化を妨害するかを決定するステップとを含む。
【０１７３】
修飾ＧＰＣＲのアゴニスト非依存性エンドソーム局在化を妨害する化合物の識別方法は、（ａ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを調製するステップと、（ｂ）修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを、アレスチンを含む細胞中で発現させるステップと、（ｃ）細胞を候補化合物に曝露するステップと、（ｄ）細胞内の修飾ＧＰＣＲの位置を検出し、前記候補化合物が修飾ＧＰＣＲのエンドソーム局在化を妨害するかを決定するステップとを含む。
【０１７４】
好ましくは、本明細書中に記載されているように、アレスチンおよび／または修飾ＧＰＣＲを検出可能な分子に結合させる。
【０１７５】
例として、化合物およびサンプル溶液を、本発明の修飾ＧＰＣＲを使用してＧＰＣＲアンタゴニストまたは逆アゴニストについてスクリーニングすることができる。少なくとも１つの本発明の修飾ＧＰＣＲを発現し、アレスチンおよび検出可能な分子をさらに含む細胞が得られる。細胞を、試験すべき組成物に曝露する。化合物への曝露によりアレスチンまたは修飾ＧＰＣＲのエンドソーム局在化が妨害されるか（この妨害は、組成物がＧＰＣＲアンタゴニスト活性または逆アゴニスト活性を有することを示す）を検出する。修飾ＧＰＣＲを、好ましくはカルボキシル末端で検出可能な分子と結合することもできる。上記で説明するように、本発明のようなＧＰＣＲに対する修飾により、アンタゴニストまたは逆アゴニストに対するＧＰＣＲの天然の親和性に影響を与えるべきではない。
【０１７６】
さらなる例として、化合物、組成物、およびサンプル溶液を、本発明の修飾ＧＰＣＲを使用してＧＰＣＲ再感作活性についてスクリーニングすることができる。少なくとも１つの本発明の第１の修飾ＧＰＣＲを発現する第１の細胞であって、アレスチンおよび検出可能な分子をさらに含む第１の細胞を提供する。かかる第１の細胞を、試験すべき化合物またはサンプル溶液に曝露する。アレスチンの第１の修飾ＧＰＣＲとの相互作用が組成物への曝露後に減少するかを検出する。アレスチンの第１の修飾ＧＰＣＲとの相互作用を減少させる組成物について、該細胞および溶液を、受容体の既知のアゴニストまたはリガンドに曝露する。次いで、アレスチンの第１の修飾ＧＰＣＲとの相互作用がアゴニストまたはリガンドへの曝露後に増加するか（組成物が再感作活性を有することを示す）を決定する。当該分野で既知のように、アレスチンの修飾ＧＰＣＲとの相互作用を、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム、クラスリンコートピット、および細胞膜付近などで検出することができる。次いで、少なくとも１つの本発明の第２の修飾ＧＰＣＲを発現する第２の細胞であって、アレスチンと検出可能な分子との抱合体をさらに含む第２の細胞を提供する。第２の修飾ＧＰＣＲは、第１の修飾ＧＰＣＲと無関係である。かかる第２の細胞を試験すべき組成物に暴露する。組成物への曝露後にアレスチンの第２の修飾ＧＰＣＲとの相互作用が減少するかどうかを検出する。アレスチンの第２の修飾ＧＰＣＲとの相互作用を減少させる組成物について、該細胞および溶液を、受容体の既知のアゴニストまたはリガンドに曝露する。ここで、相互作用の増加は、組成物が発現したＧＰＣＲに独立したＧＰＣＲ再感作活性を有することを示す。アレスチンの修飾ＧＰＣＲとの相互作用を、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム、クラスリンコートピット、および細胞膜付近などで検出することができる。好ましくは、第１の検出ステップでエンドサイトーシス小胞またはエンドソームでのアレスチンの修飾ＧＰＣＲとの相互作用を検出し、第２の検出ステップでクラスリンコートピットまたは細胞膜付近でのアレスチンの修飾ＧＰＣＲとの相互作用を検出し、第３の検出ステップでエンドサイトーシス小胞またはエンドソームでのアレスチンの修飾ＧＰＣＲとの相互作用を検出する。
【０１７７】
ＧＰＣＲを直接標的化する化合物に加えて（図１４および１５）、脱感作経路に関連する他のタンパク質を標識する化合物はまた、構成的な脱感作、特にエンドサイトーシス小胞またはエンドソームへの局在化を防止することができる。例として、ダイナミンを阻害する化合物は、脱感作受容体の構成的エンドソーム局在化を防止し、ダイナミンインヒビターの非存在下でエンドソーム中に構成的に局在化する。上記のダイナミンインヒビターは、このようなインヒビターの機能を示すダイナミン（Ｋ４４Ａ）変異体の効果を模倣することができる。
【０１７８】
［無細胞アッセイ（Cell Free Assays）］
無細胞アッセイで修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを分析することができる。
【０１７９】
本発明の無細胞アッセイでは、本発明の修飾ＧＰＣＲが蓄積している基質が得られる。アレスチンと検出可能な分子との接合物を含む流体を得ることもできる。
【０１８０】
修飾ＧＰＣＲおよびアレスチンを全細胞から得て、精製後に無細胞アッセイで使用することができる。修飾ＧＰＣＲはアレスチン結合部位を有し、多層または二重層脂質小胞中に維持することができる。修飾ＧＰＣＲが維持されうる小胞は基質上に蓄積し、修飾ＧＰＣＲは脂質小胞中に維持され、アレスチン結合部位がアレスチンに曝露されるように基質上に蓄積されうる。基質は、修飾ＧＰＣＲがその上に蓄積することができる任意の人工基質であってよく、ガラス、プラスチック、ダイヤモンド、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、生体適合性モノマー、生体適合性ポリマー、およびポリマービーズ（有機および無機ポリマー）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
［抱合体］
本発明のアッセイ方法で使用する細胞は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との抱合体を含むことができる。本発明の細胞および方法では、細胞はまた、本発明の修飾ＧＰＣＲと検出可能な分子との抱合体を含むことができる。
【０１８２】
視覚アレスチン、βアレスチン１、およびβアレスチン２を含んでもよいが、これらには限定されない全てのタイプのアレスチン（天然のアレスチンおよび操作された変異型アレスチン）を本発明で使用することができる。本発明の修飾ＧＰＣＲは、検出可能なレベルで全てのアレスチンのタイプと相互作用することができる。
【０１８３】
アレスチンとの結合に使用することができる検出可能な分子には、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、放射性手段、および光学的手段によって検出することができる分子（生体発光、リン光、および蛍光が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。検出可能な分子には、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ローダミンコンジュゲート抗体などが含まれるが、これらに限定されない。検出可能な分子には、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティ標識、酵素、蛍光基、化学発光基などが含まれる。検出可能な分子には、他の分子とのその相互作用の関数として直接にまたは間接的に検出される分子が含まれる。これらの検出可能な分子は、生物学的に適合する分子であるべきであり、アレスチンのＧＰＣＲ系に相互作用する能力を妥協すべきではなく、アレスチンのＧＰＣＲ系との相互作用は検出すべき検出可能な分子の能力を妥協してはならない。好ましい検出可能な分子は、化学的、機械的、電気的、または放射性の蛍光、リン光、または生体発光を発するように励起することができるような光学的に検出可能な分子（光学的に検出可能なタンパク質が含まれる）である。より好ましい検出可能な分子は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる）などの本来の蛍光分子である。Ｂａｒａｋｅら（米国特許第５，８９１，６４６号および米国特許第６，１１０，６９３号）に記載の方法によって、検出可能な分子をアレスチンタンパク質に結合させることができる。検出可能な分子を、アレスチンの前部、後部、または中央部に結合させることができる。
【０１８４】
修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントを、検出可能な分子と結合させることができる。好ましくは、修飾ＧＰＣＲのカルボキシル末端を検出可能な分子に結合させる。検出可能な分子に結合させるか付着させたカルボキシル末端テールをカルボキシル末端テール交換で使用して、本発明の修飾ＧＰＣＲを得ることができる。
【０１８５】
修飾ＧＰＣＲが検出可能な分子に結合した場合、修飾ＧＰＣＲのアレスチンとの近接を容易に検出することができる。さらに、修飾ＧＰＣＲが検出可能な分子にコンジュゲートした場合、修飾ＧＰＣＲとアレスチンとの区画化を容易に確認することができる。修飾ＧＰＣＲとの結合に使用される検出可能な分子には、上記の分子（例えば、化学的、機械的、電気的、または放射性に蛍光、リン光、または生体発光を発するように励起することができるような光学的に検出可能な分子が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい光学的に検出可能な分子を、免疫蛍光、発光、蛍光、およびリン光によって検出することができる。
【０１８６】
例えば、修飾ＧＰＣＲは、免疫蛍光分子に結合した抗体で標識した抗体であり、修飾ＧＰＣＲを発光ドナーとコンジュゲートさせることができる。特に、修飾ＧＰＣＲを、例えばルシフェラーゼ（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）またはローダミンコンジュゲート抗体（例えば、ローダミン結合抗ＨＡマウスモノクローナル抗体）と結合させることができる。好ましくは、修飾ＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを、発光ドナー（例えば、ルシフェラーゼ）とコンジュゲートさせることができる。Ｌ．Ｓ．Ｂａｒａｋら、「機能的にインタクトなβ2アドレナリン作動性受容体−緑色蛍光タンパク質抱合体の内部輸送および表面移動」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１９９７、５１、１７７〜１８４に記載のように、修飾ＧＰＣＲ、好ましくはカルボキシル末端テールを、ＧＦＰにコンジュゲートさせることもできる。
【０１８７】
［細胞型および基質］
本発明の細胞は、少なくとも１つの本発明の修飾ＧＰＣＲを発現することができる。細胞は、さらに、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との抱合体を含むことができる。有用な細胞には、真核細胞および原核細胞（細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、および動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な動物細胞には、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、および種々の霊長類哺乳動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。組織全体または特定の器官内または組織タイプ内のアレスチンと検出可能な分子との抱合体を発現する動物モデルを使用することもできる。
【０１８８】
本発明の細胞は、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにＧＰＣＲのアゴニスト非依存性で局在化する１つの修飾タンパク質を発現することができる。
【０１８９】
基質上に複数の本発明の細胞を蓄積することができる。基質は、任意の適切な生物学的基質（ガラス、プラスチック、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイヤモンド、生体適合性モノマーまたは生体適合性ポリマー材料）であってよい。
【０１９０】
［修飾ＧＰＣＲの発現］
本発明の別の特徴は、本明細書中に開示のＤＮＡ配列の発現である。当該分野で周知のように、適切な発現ベクター中での発現調節配列へのＤＮＡ配列の作動可能な連結および適切な単細胞宿主の形質転換のためのこの発現ベクターの使用によって、ＤＮＡ配列を発現させることができる。
【０１９１】
本発明のＤＮＡ配列の発現調節配列へのこのような作動可能な連結には、勿論、すでにＤＮＡ配列の一部でないにしても、ＤＮＡ配列の上流の適当なリーディングフレーム中への開始配列（ＡＴＧ）の提供が含まれる。
【０１９２】
広範な種々の宿主／発現ベクター組み合わせを、本発明のＤＮＡ配列の発現で使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体セグメント、非染色体および合成のＤＮＡ配列からなるものであってよい。このようなベクターは、プラスミドおよび線状ＤＮＡなどであってよく、形質転換、トランスフェクション、および遺伝子銃などの標準的な方法を介して宿主に導入することができる。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体、公知の細菌プラスミド（例えば、大腸菌プラスミドｃｏｌＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびその誘導体）、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ（例えば、λファージの多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９））および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および糸状菌一本鎖ファージＤＮＡ）；２μプラスミドまたはその誘導体などの酵母プラスミド；昆虫または哺乳動物で有用なベクターなどの真核細胞で有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現調節配列を使用するように修飾したプラスミドなどのプラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクターが含まれる。
【０１９３】
任意の広範な種々の発現調節配列（すなわち、作動可能に連結されるＤＮＡ配列の発現を調節する配列）をこれらのベクターで使用して、本発明のＤＮＡ配列を発現することができる。このような有用な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、またはアデノウイルスの初期プロモーターまたは後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ外殻タンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α交配因子のプロモーター、原核細胞もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を調節することが知られている他の配列、ならびにそれらの種々の組み合わせが含まれる。
【０１９４】
広範な種々の単細胞宿主細胞はまた、本発明のＤＮＡ配列の発現で有用である。これらの宿主には、真核生物宿主および原核生物宿主類（大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、酵母（例えば、サッカロミセス）などの真菌、植物細胞、線虫細胞、およびＨＥＫ−２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＲＩ．Ｉ細胞、Ｂ−Ｗ細胞、Ｌ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎細胞（例えば、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、およびヒト細胞などの動物細胞ならびに組織培養における植物細胞など）を含んでもよい。
【０１９５】
全てのベクターではないが、発現調節配列および宿主は本発明のＤＮＡ配列を発現するように十分に等しく機能することが理解される。全ての宿主が同一の発現系で等しく十分に機能するわけではない。しかし、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、所望の発現を達成するための過度の実験を行うことなく、適切なベクター、発現調節配列、および宿主を選択することができる。例えば、ベクターの選択では、宿主中でベクターが作動可能でなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、コピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質発現（抗生物質マーカーなど）も考慮する。
【０１９６】
発現調節配列の選択では、通常、種々の因子を考慮する。これらには、例えば、特に潜在的な二次構造に関する系の相対強度、調節性、および発現すべき特定のＤＮＡ配列または遺伝子との適合性が含まれる。適切な単細胞宿主を、例えば、選択したベクターとの適合性、分泌特性、タンパク質を正確に折りたたむ能力、および発酵要件、発現すべきＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、および発現産物の精製の容易さを考慮することによって選択する。
【０１９７】
これらおよび他の因子を考慮して、当業者は、発酵または大規模な動物培養においてＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現調節配列／宿主組み合わせを構築することができる。
【０１９８】
修飾ＧＰＣＲ類似体を、本発明の範囲内のタンパク質複合体／サブユニットのヌクレオチド配列から調製することができることがさらに意図される。修飾ＧＰＣＲのフラグメントなどの類似体を、例えば、修飾ＧＰＣＲ材料のペプシン消化によって産生することができる。ムテインなどの他の類似体を、修飾ＧＰＣＲコード配列の標準的な部位特異的変異誘発によって産生することができる。プロモーターまたはインヒビターのいずれかとして機能する小分子などの修飾ＧＰＣＲのように機能する類似体を、既知のインビボおよび／またはインビトロアッセイによって識別することができる。
【０１９９】
上記のように、修飾ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ配列を、クローン化よりもむしろ合成によって調製することができる。ＤＮＡ配列を、修飾ＧＰＣＲアミノ酸配列の適切なコドンを使用してデザインすることができる。一般に、発現のために配列を使用する場合、意図する宿主の好ましいコドンを選択する。完全な配列を、標準的な方法によって調製した重複オリゴヌクレオチドから構築し、完全なコード配列に組み立てる。例えば、Ｅｄｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ、２９２、７５６〜７６２、１９８１；Ｎａｍｂｉａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３、１２９９〜１３０１、１９８４；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９、６３１１〜６３１７、１９８４を参照のこと。
【０２００】
合成ＤＮＡ配列により、ＧＰＣＲ類似体または「ムテイン」を発現する遺伝子を都合よく構築可能である。あるいは、ムテインをコードするＤＮＡを、天然または修飾ＧＰＣＲ遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異的変異誘発によって作製することができ、従来のポリペプチド合成を使用してムテインを直接作製することができる。
【０２０１】
非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み込みの一般的方法は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１８２〜１８８、１９８９年４月に記載されている。この方法を使用して、非天然アミノ酸を含む類似体を作製することができる。一般に、非天然アミノ酸は、Ａｌｄｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｅｍなどの業者から市販されている。非天然アミノ酸の例には、ホモセリン、ホモシステイン、Ｎ−α−メチルアルギニン、ノルロイシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、ヒドロキシプロリン、ピログルタミン、オルニチン、２−アミノイソ酪酸、２−アミノ酪酸、β−シクロヘキシルアラニン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、シトルリン、ピペコリン酸、ピペラジン酸、４−クロロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、およびサルコシンが含まれる。
【０２０２】
［検出方法］
アレスチンと検出可能な分子との抱合体の細胞内の位置、検出可能な分子に融合したＧＰＣＲの細胞内の位置、または検出可能な分子に結合したアレスチンのＧＰＣＲとの相互作用、または任意の他の細胞構造（例えば、細胞膜でのアレスチン濃度、エンドサイトーシス小胞またはエンドソーム中でのアレスチンのＧＰＣＲとの共存、クラスリンコートピット中でのアレスチン濃度などを含む）の検出方法は、使用した検出可能な分子に依存して変化する。当業者は、使用した検出可能な分子に適切な検出方法を考え出すことができる。光学的に検出可能な分子のために、放出された光の再分布（redistribution）または再配向によって蛍光、生体発光、またはリン光の変化を測定することができる任意の光学的方法を使用することができる。このような方法には、例えば、偏光顕微鏡法、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、エバネッセント波励起顕微鏡法、および標準的な顕微鏡法または共焦点顕微鏡法が含まれる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰにコンジュゲートさせ、アレスチン−ＧＦＰ抱合体を共焦点顕微鏡法によって検出することができる。別の好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰにコンジュゲートさせ、修飾ＧＰＣＲを免疫蛍光分子にコンジュゲートさせ、抱合体を共焦点顕微鏡法で検出することができる。さらに好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰにコンジュゲートさせ、修飾ＧＰＣＲのカルボキシ末端をルシフェラーゼにコンジュゲートさせることができる。これらの抱合体を、生体発光共鳴放射技術（bioluminescence resonance emission technology）によって検出することができる。さらに好ましい実施形態では、アレスチンをルシフェラーゼにコンジュゲートさせ、修飾ＧＰＣＲをＧＦＰにコンジュゲートさせることができる。ルシフェラーゼ／ＧＦＰ抱合体を、生体発光共鳴放射技術によって検出することができる。本発明の方法は、ＧＰＣＲ活性の検出に関する。本発明の方法により、リアルタイムでＧＰＣＲ経路のモニタリングを増強することができる。
【０２０４】
［診断および治療上の処置］
ＧＰＣＲの存在によって得られる診断および治療上の処置の可能性は、因子が直接関連してリガンド間のタンパク質−タンパク質相互作用の原因となり、その後細胞内シグナルを開始するという事実に由来する。以前に考察され、本明細書中でさらに詳述するように、本発明は、天然または修飾ＧＰＣＲが関連する、ＧＰＣＲによって開始される活性を調整する反応のカスケードにおける薬学的な介入を意図する。
【０２０５】
したがって、特定の刺激または因子に起因する活性の減少または阻害を所望する例では、ＧＰＣＲのリガンドとの相互作用を遮断するために適切なＧＰＣＲのインヒビターを導入することができる。これに対して、Ｇタンパク質または第２のメッセンジャーの不十分な活性化が起こる例を、さらなる量のＧＰＣＲまたはそのキメラもしくは薬学的に同種の物質、類似体、およびフラグメントなどの導入によって修復することができる。
【０２０６】
本発明は、さらに、本発明の治療方法の実施において有用な治療用組成物を意図する。本発明の治療用組成物には、薬学的に許容可能な賦形剤（キャリア）および本明細書中に記載の有効成分として１つまたは複数のＧＰＣＲのアゴニスト、ＧＰＣＲのアンタゴニスト、またはＧＰＣＲのＤＡＣの混合物が含まれる。好ましい実施形態では、組成物は、標的細胞でのＧＰＣＲのリガンドとの特異的結合を調整することができる薬物を含む。
【０２０７】
［抗体］
また、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む抗体、修飾ＧＰＣＲおよび／またはその生物学的に活性なフラグメントもしくはサブユニットの産生または活性を調整する薬物は、一定の診断用途を有し、例えば、ウイルス感染などの病態を検出および／または測定する目的に使用することができる。例えば、修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくはサブユニットを使用して、種々の細胞培地中で、例えば、融合マウス脾臓リンパ球および骨髄腫細胞を使用したハイブリドーマ技術などの公知の技術によって修飾ＧＰＣＲまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくはサブユニットに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を産生することができる。同様に、本発明の修飾ＧＰＣＲ活性を模倣する小分子または遮断する（antagonize）小分子を発見するか合成することができ、これを診断および／または治療プロトコールで使用することができる。
【０２０８】
同様に、本発明は、天然に生じて、組換えで調製された抗体を含む、修飾ＧＰＣＲに対する抗体の開発に関する。例えば、抗体を使用して発現ライブラリーをスクリーニングし、修飾ＧＰＣＲをコードする遺伝子を得ることができる。このような抗体には、既知の遺伝子技術によって調製したポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、二重特異的（キメラ）抗体、ならびに修飾ＧＰＣＲ活性を調整する能力を使用してさらなる診断に適切な他の機能性を含む抗体を含み得る。好ましくは、本発明の診断方法で使用される抗修飾ＧＰＣＲ抗体は、アフィニティ精製したポリクローナル抗体である。より好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。さらに、本明細書中で使用される抗修飾ＧＰＣＲ抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ｖ）、またはｓｃＦｖの形態であることが好ましい。
【０２０９】
ハイブリドーマによる一般的なモノクローナル抗体の作製方法は周知である。モノクローナル抗ＧＰＣＲ抗体の産生方法も当該分野で周知である。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、４９４９〜４９５３、１９８３を参照のこと。典型的には、先に記載の抗ＧＰＣＲモノクローナル抗体の産生手順において、ＧＰＣＲまたはペプチド類似体を免疫原として単独でまたは免疫原性キャリアと共に使用する。ハイブリドーマが培地中に抗体を分泌するのに十分な条件下および期間で培養物を維持する。ハイブリドーマを、ＧＰＣＲまたはペプチド類似体と免疫反応する抗体の産生能力についてスクリーニングする。次いで、抗体含有培地を回収する。次いで、抗体を、周知の技術によってさらに単離することができる。不死化抗体産生細胞株を、癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン・バーウイルスでのトランスフェクションなどの融合以外の技術によって作製することもできる。例えば、「抗体の使用：実験マニュアル」、Ｈａｒｌｏｗ編、Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９を参照のこと。
【０２１０】
これらの組成物の調製に有用な培地は、当該分野で周知で、市販されており、このような培地には人工培地および近交系マウスなどが含まれる。人工培地の例としては、４．５ｇｍ／ｌのグルコース、２０ｍＭのグルタミン、および２０％のウシ胎児血清を補足したダルベッコ最小基本培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｖｉｒｏｌ．，８、３９６、１９５６）である。好ましい近交系マウス系列は、Ｂａｌｂ／ｃである。
【０２１１】
ポリクローナル抗ポリペプチド抗体の産生方法は、当該分野で周知である。Ｎｅｓｔｏｒらに付与された米国特許第４，４９３，７９５号を参照のこと。モノクローナル抗体およびその免疫学的に活性なフラグメントを、「抗体の使用法：実験マニュアル」、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｄ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載のハイブリドーマ技術を使用して調製することができる。簡単に述べれば、モノクローナル抗体組成物を産生するハイブリドーマを形成するために、骨髄腫細胞または他の自己永続的細胞株を、ＧＰＣＲで超免疫化した哺乳動物の脾臓から得たリンパ球と融合する。脾細胞を、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００ＭＷを使用して骨髄腫細胞に融合する。融合ハイブリッドを、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）補足培地に対する感受性によって選択する。本発明実施で有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、本発明のＧＰＣＲと免疫応答する能力および標的細胞中で特定のＧＰＣＲ活性を阻害する能力によって識別する。
【０２１２】
特に、特異的にリン酸化された因子に対する抗体を選択することができ、これは以下の活性化タンパク質の特定の能力について本発明の範囲内に含まれる。したがって、修飾ＧＰＣＲまたは関連すると考えられる特異的ポリペプチドの能力を、適切な標識量の修飾ＧＰＣＲまたはその抗体もしくは類似体を使用した本明細書中で考察されたアッセイ技術によって直接追跡することができる。
【０２１３】
修飾ＧＰＣＲペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、種々の性質（すなわち、イソ型、エピトープ、および親和性など）についてスクリーニングすることができる。修飾ＧＰＣＲまたはそのサブユニットの活性を中和するモノクローナル抗体を特に目的とする。このようなモノクローナル抗体を、ＧＰＣＲアッセイで容易に識別することができる。高アフィニティ抗体はまた、天然ＧＰＣＲまたは組換え修飾ＧＰＣＲの免疫アフィニティ精製が可能である場合に有用である。
【０２１４】
したがって、修飾ＧＰＣＲ類、それらの類似体および／または、類似体および修飾ＧＰＣＲに対して惹起され得る任意のアンタゴニストまたは抗体は、種々の診断技術（例えば、放射性添加物または放射性ヨウ素化のいずれかによって標識されたＧＰＣＲに対する抗体を使用したラジオイムノアッセイなどの免疫アッセイを含む）と共に使用することができる。
【０２１５】
免疫アッセイでは、対照量のアンタゴニストまたはそれに対する抗体などを調製し、酵素、特異的結合パートナーおよび／または放射性エレメントで標識し、細胞サンプルに導入することができる。標識材料またはその結合パートナーがサンプル内の部位と反応する機会を有していた場合、得られた集合物を既知の技術（結合した標識の性質によって変化し得る）によって試験することができる。例えば、特異的にリン酸化された因子に対する抗体を選択し、上記のように以下の活性化タンパク質の目的のためにアッセイプロトコールの例において適切に使用することができる。
【０２１６】
放射性標識（3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、および186Ｒｅなどであるが、これらに限定されない）を使用する場合、現在既知の利用可能な計数手段を使用することができる。標識が酵素である場合、本明細書中で考察され、当該分野で公知の現在使用されている任意の比色分析技術、分光学的分析技術、蛍光分光学的技術、電流滴定法、またはガス分析技術によって検出することができる。
【０２１７】
前記で示唆されるように、本発明の診断方法は、抗修飾ＧＰＣＲ抗体、好ましくはアフィニティ精製したポリクローナル抗体、より好ましくはｍＡｂなどの修飾ＧＰＣＲ／タンパク質に対する有効量のアンタゴニストを含むアッセイによって細胞サンプルまたは培地を試験するステップを含む。さらに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ｖ）、またはｓｃＦｖの形態である本明細書中で使用される抗修飾ＧＰＣＲ抗体フラグメントが好ましい。先で考察されるように、この方法の利益を得ることができる患者には、癌患者、前癌性病変患者、ウイルス感染患者、または他の類似の病態または疾患の患者が含まれる。抗修飾ＧＰＣＲ抗体を含む修飾ＧＰＣＲを単離し、抗修飾ＧＰＣＲ抗体の標的細胞の試験を補助する能力を決定および最適化する方法は、当該分野で周知である。
【０２１８】
本発明は、修飾ＧＰＣＲの存在範囲を定量し、その活性を模倣するか遮断することができる薬物または他の薬剤を識別するための試験キットの形態で準備することができるアッセイシステムを含む。そのようなシステムまたは試験キットは、本明細書中で述べた放射性の技術および／または酵素技術の１つによって調製される標識成分であって、標識を修飾ＧＰＣＲ、そのアゴニストおよび／またはアンタゴニストに結合する標識成分と、１つまたは複数のさらなる免疫化学的試薬であって、そのうちの少なくとも１つが、標識成分、その結合パートナー、識別される成分の１つ、またはその結合パートナーのいずれかと結合することができる遊離リガンドまたは固定リガンドである免疫化学的試薬とを含んでもよい。
【０２１９】
［アンチセンス組成物およびその使用］
別の実施形態では、上記方法によって識別される遺伝子の発現を調整するためのアンチセンス組成物および方法が得られる。好ましいアンチセンス組成物は、本明細書中に開示されているか当該分野で公知の系統的なイン・シリコ発見法を使用して標的核酸を識別するものである。好ましいアンチセンス組成物は、例えば、配列番号７〜配列番号１２（図１７）を標的化することができる。
【０２２０】
アンチセンスの特異的核酸を標的化することが好ましい。アンチセンス組成物の特定の核酸への「標的化」は、タンパク質をコードする本明細書中に開示の系統的なイン・シリコ法によって識別された核酸であることが好ましい。遺伝子は、病原性の生物に由来し得る。標的化は、アンチセンス領域の標的遺伝子内の部位（例えば、遺伝子または遺伝子転写物の機能を調整するためのセンス鎖およびアンチセンス鎖の連結物質）の決定を含む。好ましいアンチセンス組成物は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを含む部位を認識して結合する組成物である。当該分野で知られているように、典型的には、翻訳開始コドンは５’−ＡＵＧであるので（転写ｍＲＮＡ分子中；対応するＤＮＡ分子中の５’−ＡＴＧ）、翻訳開始コドンを、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」ともいう。少数の遺伝子は、インビボで機能することが認められているＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ、または５’−ＣＵＧおよび５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ、および５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有する。したがって、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、それぞれの場合の開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生物）であるにもかかわらず、多数のコドン配列を含み得る。
【０２２１】
真核生物遺伝子と原核生物遺伝子とが２つまたはそれ以上の代替の開始コドンを有し、好ましくは、その任意の１つを特定の細胞型もしくは組織または特定の条件下で使用することができることも当該分野で知られている。本発明の文脈では、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、インビボで本明細書中に開示の系統的なイン・シリコ法または本明細書中に開示の配列によって識別されたタンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するために使用されるコドンをいう。
【０２２２】
遺伝子転写物の翻訳終結コドン（または「終止コドン」）は、３つの配列（すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ、および５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ、および５’−ＴＧＡである））のうちの１つを有し得る。用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドン由来のいずれかの方向（すなわち、５’または３’方向）の約２５〜約５０個の連続するヌクレオチドを含むこのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部をいう。同様に、用語「終止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」は、翻訳終止コドン由来のいずれかの方向（すなわち、５’または３’方向）の約２５〜約５０個の連続するヌクレオチドを含むこのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部をいう。好ましいアンチセンス組成物は、コードする任意の標的遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の終止コドンおよび／または開始コドンを含む領域を認識して結合する。
【０２２３】
当該分野において、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域をいうことが知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」は、また、アンチセンス組成物の好ましい標的を有し得る領域である。他の標的領域には、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が含まれる。５’−ＵＴＲは、翻訳開始コドン由来の５’方向のｍＲＮＡの一部をいうので、ｍＲＮＡまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含む。３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）は、翻訳終止コドン由来の３’方向のｍＲＮＡの一部をいうので、ｍＲＮＡまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドの翻訳終止コドンと３’末端との間のヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’→５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡのほとんどの５’残基と結合したＮ７メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域を、５’キャップ構造自体およびキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むとみなす。５’キャップ領域はまた、アンチセンス組成物の好ましい標的領域であり得る。
【０２２４】
真核生物では、遺伝子はイントロンおよびエクソンから構成され、エクソンは遺伝子のタンパク質産物をコードする材料を含む。イントロン材料は、ｍＲＮＡを産生する遺伝子から転写されるが、タンパク質への翻訳前にｍＲＮＡ転写物から切り出される。エクソンと共にスプライシングして連続したｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位（すなわち、イントロンとエクソンの連結点）はまた、アンチセンス組成物の好ましい標的領域であり、異常なスプライシングが疾患に関連するか、特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が疾患に関連する状況において特に有用である。再整列または欠失による異常な融合連結点もまた好ましい標的である。イントロンもまた有効であり、それにより例えばＤＮＡまたはプレｍＲＮＡに標的されたアンチセンス組成物の好ましい標的領域であり得ることも見出された。
【０２２５】
一旦系統的な発見法を使用して識別した遺伝子中に１つまたは複数の標的部位が識別されると、所望の生物学的結果（例えば、ＧＰＣＲ関連疾患または病態の阻害および／または予防、調整したＧＰＣＲ活性の調整、アレスチン活性の調整）が得られるように標的に十分に相補的な（すなわち、十分にハイブリダイゼーションし、十分な特異性を有する）オリゴヌクレオチドを選択する。
【０２２６】
本発明の文脈では、「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオシド塩基間、またはヌクレオチド塩基間との間のワトソン・クリック、Hoogsteen、または逆Hoogsteen水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は、水素結合の形成を介して対合する相補的核酸塩基である。本明細書中で使用される、「相補的」は、典型的には２つのヌクレオチド間の正確な対合能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドの一定の位置のヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置で互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、各分子中の対応する位置で互いに水素結合することができるヌクレオチドが十分な数である場合、互いに相補的である。アンチセンス組成物の配列は特異的にハイブリダイゼーションされる標的核酸の配列と１００％相補的である必要がないことが当該分野で理解される。あるいは、この遺伝子を使用して三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給することができる。アンチセンス組成物は、典型的には、組成物の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合が有用性を喪失させる標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害する場合、特異的にハイブリダイゼーション可能である。特異的結合が望ましい条件下でアンチセンス組成物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性である場合、有用性が喪失する。好ましい特異的結合の条件は、インビボアッセイまたは治療上の処置の場合は生理学的条件であり、インビトロアッセイの場合はアッセイが行われる条件である。
【０２２７】
意図する好ましいアンチセンス組成物は、研究試薬および診断薬用である。例えば、特定の遺伝子の機能を解明するために遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドがしばしば使用される。例えば、生物学的経路の種々のメンバーの機能を区別するためにもアンチセンス組成物を使用する。したがって、アンチセンス調整は、研究で役立っている。
【０２２８】
オリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの病態の治療における治療部分として使用されている。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織、および動物（特に、ヒト）の治療計画で有用であるように形成することができる有用な治療方法であり得ることが確立されている。本発明の文脈では、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその模倣物のオリゴマーまたはポリマーをいう。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間（骨格）の共有結合、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、細胞取り込みの向上、核酸標的に対する親和性の向上、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望ましい性質のために、このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドはしばしば天然の形態よりも好ましい。
【０２２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス組成物の好ましい形態である一方で、本発明は、他のオリゴマーアンチセンス組成物（下記のものなどのオリゴヌクレオチド模倣物が含まれるが、これらに限定されない）を含む。本発明のアンチセンス組成物は、好ましくは、約８個〜約３０個の核酸塩基（すなわち、約８個〜約３０個の連結したヌクレオシドおよびその間の全ての長さのもの）を含む。アンチセンス組成物は、３０個よりも長くてよい（例えば、３５、４０、４５、５０、５５、６０，６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上およびこの間の範囲）。しかし、より好ましいアンチセンス組成物は、約１２個〜約２５個の核酸塩基およびその間の全ての長さのものを含む。
【０２３０】
当該分野で公知のように、核酸塩基は、塩基と糖との組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについて、リン酸基は糖の２’、３’、または５’水酸基部分のいずれかに連結することができる。オリゴヌクレオチドの形成では、リン酸基は互いに隣接するヌクレオシドと共有結合して、線状ポリマー組成物を形成する。次いで、この線状ポリマー構造の各末端をさらに結合させて環状構造を形成することができる。しかし、一般に、アンチセンス組成物としての使用には開環線状構造が好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、一般に、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間骨格の形成に関する。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合または骨格は、３’→５’リン酸ジエステル結合である。
【０２３１】
本発明で有用な好ましいアンチセンス組成物の特定の例には、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保有するものおよび骨格中にリン原子を含まないものが含まれる。本明細書に記載の目的のために、そして当該分野でしばしば参照されるように、ヌクレオシド骨格中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオシドと考えることもできる。
【０２３２】
アンチセンス組成物で使用される好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、メチルホスホナート類および他のアルキルホスホナート類（３’−アルキレンホスホナート類およびキラルホスホナート類が含まれる）、ホスフィナート類、ホスホラミデート類（３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート類が含まれる）、チオノホスホラミデート類、チオノアルキルホスホナート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、および正常な３’→５’結合を有するボラノホスフェート類、これらの２’→５’結合類似体、隣接するヌクレオシド単位の対が３’→５’から５’→３’または２’→５’から５’→２’で結合した逆の極性（inverted polarity）を有するものが含まれる。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態もまた含まれる。このようなリンを含む結合のさらなる調製方法については、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，４６９，８６３号、米国特許第４，４７６，３０１号、米国特許第５，０２３，２４３号、米国特許第５，１７７，１９６号、米国特許第５，１８８，８９７号、米国特許第５，２６４，４２３号、米国特許第５，２７６，０１９号、米国特許第５，２７８，３０２号、米国特許第５，２８６，７１７号、米国特許第５，３２１，１３１号、米国特許第５，３９９，６７６号、米国特許第５，４０５，９３９号、米国特許第５，４５３，４９６号、米国特許第５，４５５，２３３号、米国特許第５，４６６，６７７号、米国特許第５，４７６，９２５号、米国特許第５，５１９，１２６号、米国特許第５，５３６，８２１号、米国特許第５，５４１，３０６号、米国特許第５，５５０，１１１号、米国特許第５，５６３，２５３号、米国特許第５，５７１，７９９号、米国特許第５，５８７，３６１号、および米国特許第５，６２５，０５０号を参照のこと。
【０２３３】
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子、およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、１つまたは複数の短鎖へテロ原子または複素環ヌクレオシド結合によって形成された骨格を有し得る。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成されている）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；およびＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ2成分部分が混合した他の骨格を有するものが含まれる。リン原子を欠く修飾オリゴヌクレオチド骨格の調製方法については、例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、米国特許第５，１６６，３１５号、米国特許第５，１８５，４４４号、米国特許第５，２１４，１３４号、米国特許第５，２１６，１４１号、米国特許第５，２３５，０３３号、米国特許第５，２６４，５６２号、米国特許第５，２６４，５６４号、米国特許第５，４０５，９３８号、米国特許第５，４３４，２５７号、米国特許第５，４６６，６７７号、米国特許第５，４７０，９６７号、米国特許第５，４８９，６７７号、米国特許第５，５４１，３０７号、米国特許第５，５６１，２２５号、米国特許第５，５９６，０８６号、米国特許第５，６０２，２４０号、米国特許第５，６１０，２８９号、米国特許第５，６０２，２４０号、米国特許第５，６０８，０４６号、米国特許第５，６１０，２８９号、米国特許第５，６１８，７０４号、米国特許第５，６２３，０７０号、米国特許第５，６６３，３１２号、米国特許第５，６３３，３６０号、米国特許第５，６７７，４３７号、および米国特許第５，６７７，４３９号を参照のこと。
【０２３４】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物には、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち、骨格）が新規の基に置換されたような置換が含まれる。適切な核酸標的組成物とのハイブリダイゼーションのために塩基単位を保持する。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている１つのこのようなオリゴマー組成物（オリゴヌクレオチド模倣物）を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ組成物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格を、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換する。核酸塩基を保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接にまたは間接的に結合させる。このような方法の考察については、例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、米国特許第５，７１４，３３１号、米国特許第５，７１９，２６２号、およびＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００を参照のこと。
【０２３５】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格、特に−ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知）、−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2−（天然のホスホジエステル骨格を−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−と示す）、およびアミド骨格（米国特許第５，６０２，２４０号に記載のものなど）を有するオリゴヌクレオシドである。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチド（米国特許第５，０３４，５０６号に記載のものなど）も好ましい。
【０２３６】
本明細書中で意図されるアンチセンス組成物として使用される修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含むことができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’の位置に−ＯＨ；Ｆ−；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み、前記アルキル、アルケニル、およびアルキニルをＣ1〜Ｃ10アルキルまたはＣ2〜Ｃ10アルケニルおよびアルキニルに置換してもしなくても良い。Ｏ［（ＣＨ2）nＯ］mＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2、Ｏ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＮＨ2、およびＯ（ＣＨ2）nＯＮ［（ＣＨ2）nＣＨ3）］2（ｎおよびｍは１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましいオリゴヌクレオチド類は、２’の位置に、Ｃ1〜Ｃ10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＳＯＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターイカレータ、オリゴヌクレオチドの薬理学的特性を向上させる基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改良する基、および類似の性質を有する他の置換基の１つを含み得る。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＯＣＨ3、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知、Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。別の好ましい修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ2）2ＯＮ（ＣＨ3）2基、２’−ＤＭＡＯＥとしも公知）および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）が含まれる。
【０２３７】
意図されるアンチセンス組成物に対する他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ3）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、２’−５’結合オリゴヌクレオチド中、および５’末端ヌクレオチドの５’位で類似の修飾を行うこともできる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部分などの糖模倣物を含み得る。このような修飾された糖構造の調製方法については、例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、米国特許第５，１１８，８００号、米国特許第５，３１９，０８０号、米国特許第５，３５９，０４４号、米国特許第５，３９３，８７８号、米国特許第５，４４６，１３７号、米国特許第５，４６６，７８６号、米国特許第５，５１４，７８５号、米国特許第５，５１９，１３４号、米国特許第５，５６７，８１１号、米国特許第５，５７６，４２７号、米国特許第５，５９１，７２２号、米国特許第５，５９７，９０９号、米国特許第５，６１０，３００号、米国特許第５，６２７，０５３号、米国特許第５，６３９，８７３号、米国特許第５，６４６，２６５号、米国特許第５，６５８，８７３号、米国特許第５，６７０，６３３号、および米国特許第５，７００，９２０号を参照のこと。
【０２３８】
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（しばしば当該分野で単純に「塩基」という）の修飾または置換を含み得る。本明細書中で使用される、「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。本発明はまた、アンチセンス組成物中での修飾ヌクレオチドの使用を含む。このような修飾ヌクレオチドには、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（例えば、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル）および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、および３−デアザグアニン、および３−デアザアデニンなどの他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基は当業者に既知である。例えば、米国特許第３，６８７，８０８８号、「コンサイスポリマー科学技術百科事典」、８５８〜８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、ＡＮＧＥＷＡＮＤＴＥ  ＣＨＥＭＩＥ、第３０巻、６１３、Ｉｎｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１；およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，第１５章、「アンチセンス研究と応用」、２８９〜３０２、Ｃｒｏｏｋｅら、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３を参照のこと。一定のこれらの核酸塩基は、本発明のオリゴマー組成物の結合親和性の増加において特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンが含まれる）が含まれる。５−メチルシトシン置換により、核酸二重鎖の安定性が０．６〜１．２℃増加することが認められ（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．ら、１９９３）、これは現在好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合さらにより好ましい。
【０２３９】
アンチセンス組成物での使用が意図される別のオリゴヌクレオチドの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する１つまたは複数の部分または抱合体へのオリゴヌクレオチドの化学結合を含む。このような部分には、コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３〜６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４、４、１０５３〜６０）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２、６６０、３０６〜９およびＭａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９３、３、２７６５〜７０））、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２、２０、５３３〜８）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはエンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１、１０、１１１１〜８；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０、２５９、３２７〜３０；およびＳｉｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９〜５４））、リン脂質（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール−３−Ｈ−リン酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５、３６、３６５１〜４；およびＳｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０、１８、３７７７〜８３））、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９〜７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５、３６、３６５１〜４）、パルミトイル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９〜２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６、２７７、９２３〜９３７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
このようなオリゴヌクレオチド抱合体の調製方法は当該分野で既知であり、米国特許第４，８２８，９７９号、米国特許第４，９４８，８８２号、米国特許第５，２１８，１０５号、米国特許第５，５２５，４６５号、米国特許第５，５４１，３１３号、米国特許第５，５４５，７３０号、米国特許第５，５５２，５３８号、米国特許第５，５７８，７１７号、米国特許第５，５８０，７３１号、米国特許第５，５８０，７３１号、米国特許第５，５９１，５８４号、米国特許第５，１０９，１２４号、米国特許第５，１１８，８０２号、米国特許第５，１３８，０４５号、米国特許第５，４１４，０７７号、米国特許第５，４８６，６０３号、米国特許第５，５１２，４３９号、米国特許第５，５７８，７１８号、米国特許第５，６０８，０４６号、米国特許第４，５８７，０４４号、米国特許第４，６０５，７３５号、米国特許第４，６６７，０２５号、米国特許第４，７６２，７７９号、米国特許第４，７８９，７３７号、米国特許第４，８２４，９４１号、米国特許第４，８３５，２６３号、米国特許第４，８７６，３３５号、米国特許第４，９０４，５８２号、米国特許第４，９５８，０１３号、米国特許第５，０８２，８３０号、米国特許第５，１１２，９６３号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，０８２，８３０号、米国特許第５，１１２，９６３号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，２４５，０２２号、米国特許第５，２５４，４６９号、米国特許第５，２５８，５０６号、米国特許第５，２６２，５３６号、米国特許第５，２７２，２５０号、米国特許第５，２９２，８７３号、米国特許第５，３１７，０９８号、米国特許第５，３７１，２４１号、米国特許第５，３９１，７２３号、米国特許第５，４１６，２０３号、米国特許第５，４５１，４６３号、米国特許第５，５１０，４７５号、米国特許第５，５１２，６６７号、米国特許第５，５１４，７８５号、米国特許第５，５６５，５５２号、米国特許第５，５６７，８１０号、米国特許第５，５７４，１４２号、米国特許第５，５８５，４８１号、米国特許第５，５８７，３７１号、米国特許第５，５９５，７２６号、米国特許第５，５９７，６９６号、米国特許第５，５９９，９２３号、米国特許第５，５９９，９２８号、および米国特許第５，６８８，９４１号が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４１】
所定の化合物中の１つまたは複数の位置を修飾することができる。所定の化合物中の全ての位置を均一に修飾する必要はなく、実際、１つの化合物中に１以上の上記の修飾またはオリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドに上記の修飾を組み込むことができる。
【０２４２】
本発明はまた、キメラ組成物であるアンチセンス組成物を含む。アンチセンス組成物の文脈では、「キメラ」アンチセンス組成物または「キメラ」は、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位（オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド）から作製された２つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含む化合物である。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドが付与されるようにオリゴヌクレオチドを修飾してヌクレアーゼ分解に対する耐性が増加し、細胞の取り込みが増加し、および／または標的核酸に対する結合親和性が増加した少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として使用することができる。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡとＤＮＡとの二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化により、ＲＮＡ標的が切断されて遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率が非常に増強される。したがって、キメラオリゴヌクレオチドを使用した場合、同一の標的領域とハイブリダイゼーションするホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドを使用して類似の結果を得ることができる場合がある。ＲＮＡ標的の切断を、ゲル電気泳動、必要であれば、当該分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出することができる。
【０２４３】
本発明のキメラアンチセンス化合物を、２つまたはそれ以上の上記のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成することができる。このような化合物は、ハイブリッドまたはギャップマーとしても公知である。このようなハイブリッドの調製方法には、米国特許第５，０１３，８３０号、米国特許第５，１４９，７９７号、米国特許第５，２２０，００７号、米国特許第５，２５６，７７５号、米国特許第５，３６６，８７８号、米国特許第５，４０３，７１１号、米国特許第５，４９１，１３３号、米国特許第５，５６５，３５０号、米国特許第５，６２３，０６５号、米国特許第５，６５２，３５５号、米国特許第５，６５２，３５６号、および米国特許第５，７００，９２２号の教示が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４４】
本明細書中で意図されるアンチセンス化合物を、周知の固相合成法によって都合よく且つ日常的に作製することができる。オリゴヌクレオチドを、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの装置および技術を使用して調製することができる。さらにまたはその代わりとして、当該分野で公知のこのような任意の他の合成手段を使用することができる。
【０２４５】
本発明のアンチセンス化合物をインビトロで合成し、この化合物は生物学的起源のアンチセンス組成物またはアンチセンス分子のインビボ合成を指示するようにデザインされた遺伝子ベクター構築物を含まない。本発明の化合物は、混合物であるか、カプセル化されているか、結合しているか、他の分子、分子構造物、または化合物の混合物（例えば、取り込み、分散、および／または吸収を補助するためのリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所、または他の製剤）と会合していてもよい。このような取り込み、分散、および／または吸収を補助する製剤の方法および調製には、米国特許第５，１０８，９２１号、米国特許第５，３５４，８４４号、米国特許第５，４１６，０１６号、米国特許第５，４５９，１２７号、米国特許第５，５２１，２９１号、米国特許第５，５４３，１５８号、米国特許第５，５４７，９３２号、米国特許第５，５８３，０２０号、米国特許第５，５９１，７２１号、米国特許第４，４２６，３３０号、米国特許第４，５３４，８９９号、米国特許第５，０１３，５５６号、米国特許第５，０１８，９２１号、米国特許第５，２１３，８０４号、米国特許第５，２２７，１７０号、米国特許第５，２６４，２２１号、米国特許第５，３５６，６３３号、米国特許第５，３９５，６１９号、米国特許第５，４１６，０１６号、米国特許第５，４１７，９７８号、米国特許第５，４６２，８５４号、米国特許第５，４６９，８５４号、米国特許第５，５１２，２９５号、米国特許第５，５２７，５２８号、米国特許第５，５３４，２５９号、米国特許第５，５４３，１５２号、米国特許第５，５５６，９４８号、米国特許第５，５８０，５７５号、および米国特許第５，５９５，７５６号が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４６】
本明細書中に開示の意図するアンチセンス化合物および組成物には、任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与した際に生物学的に活性な代謝産物またはその残りを（直接に、または間接的に）得ることができる任意の他の化合物も含まれる。したがって、例えば、本発明のアンチセンス化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容可能な塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容可能な塩、および他の生物学的な等価物についても開示する。
【０２４７】
［医薬組成物］
有効成分としてポリペプチド、その類似体、または活性フラグメントを含む治療用組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。典型的には、このような組成物を、注射用の溶液または懸濁液として調製するが、注射前に液体にする溶液または懸濁液に適切な固体形態としても調製することができる。調製物を、乳化することもできる。有効治療成分を、しばしば薬学的に許容可能であり、且つ有効成分と適合する賦形剤と混合する。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストラン、グリセロール、およびエタノールなどおよびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、組成物は、有効成分の有効性を増強する潤滑剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の佐剤（auxiliary）を含めることができる。
【０２４８】
本明細書中に開示の方法によって得たＧＰＣＲアゴニスト、アンタゴニスト、またはＤＡＣを、中和された薬学的に許容可能な塩の形態として治療用組成物に処方することができる。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体の遊離基を使用して形成する）が含まれ、これは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機塩または酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびマンデル酸などの有機塩を使用して形成される。遊離のカルボキシル基から形成した塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなどの有機塩基にも由来し得る。
【０２４９】
治療用組成物を、例えば、従来の単位用量の注射によって静脈内投与する。本発明の治療用組成物に関して使用する場合、用語「単位用量」は、ヒト用の単回用量として適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は必要な希釈剤（すなわち、キャリア、または賦形剤）と共に所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性物質を含む。
【０２５０】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒト用の範囲の投薬量の処方に使用することができる。このような組成物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全く無いＥＤ50を含む循環濃度範囲内である。投薬量を、使用した投薬形態および使用した投与経路に依存してこの範囲内で変化させることができる。本発明の方法で使用した任意の組成物のために、最初に細胞培養アッセイから治療有効量を評価することができる。細胞培養で決定したＩＣ50（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための動物モデルの用量を処方することができる。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２５１】
投薬製剤に適合する様式および治療有効量で組成物を投与する。投与量は、治療を受ける被験体、被験体の免疫系の有効成分を利用する能力、および所望のＧＰＣＲ活性の調整の程度に依存する。投与に必要な正確な有効成分の量は、実務者の判断に依存し、各個体に固有である。しかし、適切な投薬量は、約０．００１〜３０、好ましくは約０．０１〜約２５、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇの有効成分／個体のｋｇ体重／日の範囲であってよく、これは投与経路に依存する。最初の投与およびブースター注射のための適切な投薬計画も変更可能であるが、最初の投与後に１時間〜数時間間隔でその後注射または他の投与方法を行うのが典型である。あるいは、ナノモル濃度からμモル濃度までの血中濃度の維持に十分な継続的な静脈内注入が意図される。
【０２５２】
当業者は、ある因子が被験体の有効な治療に必要な投薬量に影響を与え得ると認識しており、この因子には、疾患または病態、障害、または疾患の重症度、治療歴、被験体の身体全体の健康および／または年齢、および他の疾患の存在が含まれるが、これらに限定されない。さらに、治療有効量の組成物での被験体の治療には１回の治療を含み得るが、好ましくは一連の治療を含み得る。好ましい例では、被験体を、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重と２０ｍｇ／ｋｇ体重との間の範囲の組成物で、約１週間と１０週間との間、好ましくは２週間と８週間との間、より好ましくは約３週間と７週間との間、さらにより好ましくは４、５、および６週間で週１回治療する。治療に使用される組成物の有効量は特定の治療経路によって増減し得ると認識される。投薬量の変化により、本明細書中に記載の診断アッセイの結果が得られ、明らかとなり得る。
【０２５３】
治療用組成物は、有効量のＧＰＣＲアゴニスト、アンタゴニスト、またはＤＡＣおよび１つまたは複数の以下の有効成分をさらに含み得る。抗生物質およびステロイドなど。
【０２５４】
用語「プロドラッグ」は、内因性酵素または他の化合物および／または条件の作用によって体内または細胞内で活性形態（すなわち、薬物）に変換される、不活性な形態で調製された治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンを、例えば、ＷＯ９３／２４５１０号およびＷＯ９４／２６７６４号に開示の方法に従ってＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸）誘導体として調製することができる。
【０２５５】
用語「薬学的に許容可能な塩」は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容可能な塩（すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を維持し、望ましくない毒性を与えない塩）をいう。任意の開示の遺伝子、遺伝子転写物、またはそれによってコードされたタンパク質を調整するための化合物には、アンチセンス化合物および他の調整化合物が含まれる。
【０２５６】
アンチセンスおよび他の調整化合物と使用するための薬学的に許容可能な塩基付加塩を、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンを使用して形成させる。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムなどである。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミド、およびプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅら、「薬学的塩」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９７７、６６、１〜１９を参照のこと）。酸性化合物の塩基付加塩を、従来の様式で塩を得るための遊離酸形態の有効量の所望の塩基との接触によって調製する。遊離酸形態を、従来の様式での塩形態の酸との接触および遊離酸の単離によって再生することができる。遊離酸形態は、その各塩形態と極性溶媒への溶解性などの一定の物理的性質がいくらか異なるが、本発明の目的において塩はその各遊離酸と等価である。本明細書中で使用される、「製薬学的な付加塩」には、本発明の組成物の一成分の酸形態の薬学的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機または無機酸の塩が含まれる。好ましい酸の塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容可能な塩は当該分野で公知であり、種々の無機酸および有機酸の塩基性塩（例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸）；有機カルボン酸、スルホン酸、硫酸、リン酸、またはＮ置換スルファミン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸、またはイソニコチン酸）、アミノ酸（自然界でのタンパク質合成に関連する２０種のαアミノ酸など、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−ホスホグリセリン酸または３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成）、またはアスコルビン酸などの他の酸性有機化合物など）が含まれる。
【０２５７】
化合物の薬学的に許容可能な塩を、薬学的に許容可能なカチオンを使用して調製することもできる。適切な薬学的に許容可能なカチオンは当該分野で周知であり、アルカリ、アルカリ金属、アンモニウム、および第四級アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
【０２５８】
オリゴヌクレオチドのために、薬学的に許容可能な塩の好ましい例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン（スペルミンおよびスペルミジンなど）などのカチオンにより形成された塩、（ｂ）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸など）により形成された酸付加塩、（ｃ）有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸など）により形成された塩、および（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンにより形成された塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５９】
本明細書中に記載のアンチセンス化合物および他の調整化合物を、有効量のアンチセンス化合物または他の調整化合物の適切な薬学的に許容可能な希釈剤またはキャリアへの添加によって医薬組成物中で使用することができる。化合物の使用および本発明の方法もまた、予防に有用であり得る。
【０２６０】
本発明のアンチセンス化合物は、系統的な発見技術を使用して識別した遺伝子をコードする核酸またはそのｍＲＮＡ転写物にタイブリダイズするため、これらの化合物は研究および診断において有用である。このようなハイブリダイゼーションにより、この事実を利用するために容易に構築されるサンドイッチアッセイおよび他のアッセイを使用可能である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの系統的な発見方法によって識別された遺伝子または遺伝子転写物とのハイブリダイゼーションを、当該分野で公知の手段によって検出することができる。このような手段には、例えば、酵素のオリゴヌクレオチドとの結合、オリゴヌクレオチドの放射性標識、または任意の他の適切な検出手段を含み得る。サンプル中の遺伝子の転写物レベルを検出するためのこのような検出手段を使用するキットを調製することもできる。
【０２６１】
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物ならびに他の調整化合物および組成物を含む薬学的なアンチセンス組成物および製剤を含む。本発明の医薬組成物を、局所治療または全身治療のいずれが望ましいかおよび治療領域に依存した多数の方法で投与することができる。
【０２６２】
一定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療が必要な領域に局所投与することが望ましい。例えば、手術中の局所注入、局所塗布（例えば、手術後の損傷包帯剤を使用する）、注射、カテーテル、座薬、または移植片（移植片は、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質の材料（シラスティック（sialastic）膜などの膜を含む）またはファイバーである）によってこれを行うことができるが、これらには限定されない。１つの実施形態では、悪性腫瘍または新生物または新生物発生前の組織部位（またはその前の部位）への直接注射によって投与することができる。
【０２６３】
局所塗布のために、所望の活性に基づいて有効量が送達されるように、組成物をキャリアと組み合わせることができる。
【０２６４】
局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体、および粉末を含み得る。従来の薬学的キャリア、水溶液、粉末、油性基剤、および増粘剤などが必要であるか望ましい。
【０２６５】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、事前にゲル化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤を使用した従来の手段によって調製した錠剤またはカプセルの形態をとることができる。当該分野で周知の方法によって錠剤をコートすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとることができるか、使用前に水または他の適切な賦形剤を使用して構成するための乾燥生成物として存在することができる。このような液体調製物を、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性賦形剤（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留植物油）；および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加物を使用した従来の手段によって調製することができる。調製物は、必要に応じて、緩衝液、塩、香料、着色料、および甘味料も含み得る。
【０２６６】
経口投与用の調製物を、活性組成物が徐放されるように適切に処方することができる。
【０２６７】
組成物を、注射（例えば、ボーラス注射または連続的注入）による非経口投与のために処方することができる。注射用の製剤は、単位投薬量形態（例えば、防腐剤を添加したアンプルまたは複数回投与コンテナ）で存在することができる。組成物は、油性または水性賦形剤を含む懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤を含み得る。あるいは、有効成分は、使用前に適切な賦形剤（例えば、滅菌された発熱物質のない水）で形成されるために粉末形態であり得る。
【０２６８】
吸入による投与のために、本発明で使用される組成物を、エアロゾルスプレーの形態で都合よく送達され、適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用して加圧パックまたは噴霧器から投与する。加圧エアロゾルの場合、測定量（metered amount）を送達するためのバルブによって、投薬単位を決定することができる。例えば、組成物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含む吸入器または注入器用のゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０２６９】
組成物を、持続性薬剤として処方することもできる。このような長期作用製剤を、移植（例えば、皮下移植または筋肉内移植）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、適切な重合材料または疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂、またはやや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩）として組成物を処方することができる。
【０２７０】
所望であれば、組成物を、有効成分を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサー中に存在させることができる。パックは、例えば、ブリスター包装などの金属またはプラスチック製のフォイルを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには投与説明書を添付することができる。
【０２７１】
本発明の医薬組成物（例えば、本明細書中に記載の遺伝子、遺伝子転写物、またはタンパク質産物調整剤）には、溶液、乳濁液、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物を、種々の成分（予備形成脂質、自己乳化固体、および自己乳化半固体）から製造することができるが、これらに限定されない。
【０２７２】
単位投薬形態で都合よく存在することができる本発明の薬学的製剤を、医薬産業で周知の従来の技術によって調製することができる。このような技術は、有効成分を薬学的キャリアまたは賦形剤と会合させるステップを含む。一般に、有効成分を液体キャリアまたは細かく砕いた固体キャリアまたはその両方と会合させ、必要であれば生成物を成形することによって製剤を調製する。
【０２７３】
本発明の１つの実施形態では、医薬組成物を、フォーム（forms）として製剤化して使用することができる。薬学的フォームには、乳濁液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、およびリポソームが含まれるが、これらには限定されない。自然状態では基本的に類似しているが、これらの製剤は、最終生成物の成分および濃度が変化する。このような組成物および製剤の調製は、一般に、薬学および処方分野の当業者に公知であり、本発明の組成物の処方に適用することができる。
【０２７４】
本発明の組成物を、乳濁液として調製および処方することができる。乳濁液は、典型的には、ある液体が通常直径が０．１ｍを超える別の液滴形態中に分散した不均一な系である。例えば、Ｉｄｓｏｎ、「医薬品投薬形態」、第１巻、１９９、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ編、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｓｏｆｆ、「医薬品投薬形態」、第１巻、２４５；Ｂｌｏｃｋ、「医薬品投薬形態」、第２巻、３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉら、「レミントンの薬学３０１」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、１９８５を参照のこと。乳濁液は、しばしば完全に混合して互いに分散した２つの不混和性液相を含む二相系である。一般に、乳濁液は、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相が細かく分割されて、小さな液滴として大量の油相に分散した場合、得られた組成物を油中水型（ｗ／ｏ）乳濁液と呼ぶ。あるいは、油相が細かく分割されて、小さな液滴として大量の水相に分散した場合、得られた組成物を水中油型（ｏ／ｗ）乳濁液と呼ぶ。乳濁液は、分散相に加えてさらなる成分および水相、油相、またはそれ自体が個別の相として存在することができる活性薬を含み得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤などの薬学的賦形剤は、必要に応じて乳濁液中に存在することもできる。薬学的な乳濁液はまた、２つを超える相から構成される多相乳濁液（例えば油−水−油型（ｏ／ｗ／ｏ）乳濁液および水−油−水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳濁液）であり得る。このような複雑な製剤により、しばしば単純な二相乳濁液では得られない一定の利点が得られる。ｏ／ｗ乳濁液の各油滴が小さな水滴を取り囲んだ多相乳濁液は、ｗ／ｏ／ｗ乳濁液を旺盛する。同様に、油中に安定化された水滴に取り囲まれた油滴の系により、ｏ／ｗ／ｏ乳濁液が得られる。
【０２７５】
乳濁液は、熱力学的安定性がほとんどないか全く無いことによって特徴付ける。しばしば、乳濁液の分散相または不連続な相は、外部相または連続相に十分に分散され、乳化剤または製剤の粘度によってこの形態を維持している。乳濁液型の軟膏基剤およびクリームの場合と同様に、乳濁液のいずれかの相は、半固体または固体であり得る。乳濁液の他の安定化手段は、乳濁液のいずれかの相に組み込むことができる乳化剤を使用する必要がある。乳化剤を、以下の４つのカテゴリーに大きく分類することができる。合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤（absorption bases）、および細かく分散した固体（Ｉｄｓｏｎ、「医薬品投薬形態」、第１巻、１９９、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ編、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０２７６】
界面活性剤としても公知の合成界面活性剤は、乳濁液の処方において広範な適応性が見出され、文献（Ｒｉｅｇｅｒ、「医薬品投薬形態」、第１巻、２８５；Ｉｄｓｏｎ、「医薬品投薬形態」、第１巻、１９９）で概説されている。界面活性剤は、典型的には、両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性との比を親水／親油バランス（ＨＬＢ）といい、製剤の調製における界面活性剤の分類および選択における有用なツールである。界面活性剤を、親水基の性質に基づいて以下の異なるクラスに分類することができる。非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（Ｒｉｅｇｅｒ、「医薬品投薬形態」）。
【０２７７】
乳濁液製剤で使用される天然に存在する乳濁液には、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、水に浸漬して依然として半固体の一貫性を保持するｗ／ｏ乳濁液（無水ラノリンおよび親水性ワセリン）を形成することができるような親水性を有する。細かく分割した固体を、特に界面活性剤と組み合わせて粘性調製物における良好な乳化剤として使用した。これらの固体には、極性無機固体（重金属水酸化物など）、非膨潤粘土（例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム、およびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウム）、色素、および非極性固体（例えば、炭素またはニトログリセリン）が含まれる。
【０２７８】
種々の非乳化物質もまた乳濁液製剤に含まれ、乳濁液の性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ、「医薬品投薬形態」、第１巻、３８５、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ編、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０２７９】
親水性コロイド（hydrophilic colloid）または親水コロイド（hydrocolloid）には、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアールガム、カラヤゴム、およびトラガカント）などの天然に存在するゴムおよび合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が含まれる。これらは水中に分散および膨潤して分散相の液滴周囲に強固な界面フィルムを形成することによって、および、外部相の粘度の増加によって乳濁液を安定化するコロイド状溶液を形成する。
【０２８０】
乳濁液はしばしば微生物の成長を容易に補助することができる炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などの多数の生物を含むので、これらの製剤にしばしば防腐剤を組み込む。乳濁液製剤に含まれる一般的に使用されている防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が含まれる。一般に、製剤の変質を防止するために乳濁液製剤に抗酸化剤も添加する。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー（例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン）、または還元剤（例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム）、および抗酸化共力剤（例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチン）であり得る。
【０２８１】
皮膚科学的、経口、および非経口経路を介した乳濁液製剤の適用およびその製造方法は、文献（Ｉｄｓｏｎ、「医薬品投薬形態」、第１巻、１９９）で概説されている。処方の容易さ、吸収および生物学的利用能の見地からの有用性のために、経口送達用の乳濁液製剤は非常に広範に使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ、「医薬品投薬形態」、第１巻、２４５、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ編、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｄｓｏｎ、「医薬品投薬形態」）。鉱物油ベースの下剤、脂溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物は、一般にｏ／ｗ乳濁液として経口投与される材料である。
【０２８２】
本発明の１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドと核酸との組成物を、マイクロエマルジョンとして処方する。マイクロエマルジョンを、単一の光学的等方性を有し、熱力学的に安定な溶液である水系、油系、および両親媒系と定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ、「医薬品投薬形態」、第１巻、２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に水性界面活性剤溶液中の油に分散させ、その後十分な量の第４の成分（一般に、透明な系を形成させるための中鎖アルコール）を添加することによって調製した系である。したがって、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面フィルムによって安定化した２つの不混和性液体の熱力学的に安定な等方向性の透明な分散物とも説明されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ、「薬物の徐放：ポリマー系および凝集体系」、１８５〜２１５、Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．編、１９８９、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。マイクロエマルジョンは、一般に、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤、および電解質を含む３〜５つの成分の組み合わせを介して調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用した油および界面活性剤の性質および界面活性分子の極性ヘッドおよび炭化水素テールの幾何的パッキングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ、「レミントンの薬学２７１」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、１９８５）。
【０２８３】
マイクロエマルジョンの調製で使用した界面活性剤には、単独の、または補助界面活性剤（co-surfactant）と組み合わせたイオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が含まれるが、これらに限定されない。エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの通常は短鎖アルコールである補助界面活性剤は、表面フィルムへの浸透および表面分子間に空隙が作製されることによる無秩序なフィルムによって界面流動性を増加させるように作用する。
【０２８４】
しかし、補助界面活性剤を使用せずにマイクロエマルジョンを調製することができ、アルコールを含まない自己乳化マイクロエマルジョン系は、当該分野で公知である。水相は、典型的には、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの物質を含み得るが、これらに限定されない。
【０２８５】
薬物可溶化および薬物吸収の増強の観点から、マイクロエマルジョンは特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的利用能を向上させることが提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９４、１１、１３８５〜９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ、Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３、１３、２０５）。マイクロエマルジョンにより、薬物の可溶化の改良、酵素加水分解からの薬物の保護、膜の流動率および浸透性における界面活性剤に誘導される変化による薬物吸収の増強が可能であること、調製の容易さ、固体投薬形態での経口投与の容易さ、臨床的効力の改良、および毒性の減少という利点が得られる（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、１９９４；Ｈｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６、８５、１３８〜１４３）。マイクロエマルジョン成分が周囲温度で共存する場合、しばしばマイクロエマルジョンを自発的に形成することができる。熱不安定性薬物、ペプチド、またはオリゴヌクレオチドを処方する場合、これは特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、化粧品および医薬品における有効成分の経皮送達で有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤により、胃腸管からのオリゴヌクレオチド、核酸、および他の活性因子の全身性吸収の増加が促進され、胃腸管、膣、口腔、および他の投与領域内でのオリゴヌクレオチド、核酸、および他の活性因子の局所細胞取り込みが改善されると予想される。
【０２８６】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、製剤の性質を改良し、本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を増強するために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、ラブラゾール、および浸透増強剤などのさらなる成分および添加物を含み得る。本発明のマイクロエマルジョンで使用される浸透増強剤を、以下の５つの広範なカテゴリーのうちの１つに属するように分類することができる。界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２）。これらの各クラスについては、上で考察している。
【０２８７】
マイクロエマルジョンに加えて、薬物の製剤化について研究し、製剤化のために使用されている多数の組織化された界面活性剤構造が存在する。これらには、単分子膜、ミセル、二分子膜、および小胞が含まれる。作用の特異性および持続時間により、リポソームなどの小胞が有用である。本発明で使用される、用語「リポソーム」は、球状の二分子膜に整列した両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
【０２８８】
リポソームは、親油性物質および水性の内部から形成された膜を有する単層板または多層板の小胞である。水性部分は、送達されるべき組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に結合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁に有効に融合することができないにもかかわらず、インビボでマクロファージによって取り込まれる。当該分野で公知である封入される薬剤に依存した適切なリポソームの選択は明らかである。
【０２８９】
インタクトな哺乳動物の皮膚を通過させるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配（transdamal gradient）の影響下で、一連の微細孔（それぞれ直径５０ｎｍ未満）を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能で、且つこのような細かい孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
【０２９０】
リポソームのさらなる利点には、（ａ）天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性且つ生物分解性であること、（ｂ）リポソームは広範な種々の水および脂質可溶性薬物を組み込むことができること、（ｃ）リポソームは内部区画中にカプセル化薬物を代謝および分解から保護することができることが含まれる（Ｒｏｓｏｆｆ、「医薬品投薬形態」）。リポソーム製剤調製における重要な検討材料は、脂質表面の電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水分量である。
【０２９１】
リポソームは、有効成分の作用部位への移動および送達に有用である。リポソームの膜が生体膜と構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用した場合、リポソームは、細胞膜と同化し始める。リポソームの同化および細胞の進歩により、活性因子が作用し得る細胞中のリポソーム内容物は枯渇する。
【０２９２】
別の実施形態はまた、局所投与用のリポソームの使用を意図する。このような利点には、投与した薬物の全身性吸収の高さによる副作用の減少、所望の標的への投与薬物の蓄積の増加、広範な種々の親水性および疎水性の薬物を皮膚に投与する能力が含まれる。いくつかの報告で、リポソームの高分子量のＤＮＡを含む薬物を皮膚に送達させる能力が詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモン、および高分子量のＤＮＡを含む化合物を、皮膚に投与した。大部分の適用により、表皮が標的化されるという結果が生じた。
【０２９３】
リポソームは、２つの広範なクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負電荷のＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する正電荷のリポソームである。正電荷のＤＮＡ／リポソーム複合体は、負電荷の細胞表面に結合し、エンドソーム中にインターナライズされる。エンドソーム内部が酸性ｐＨであるために、リポソームが捕捉され、その内容物が細胞質に放出される（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９８７、１４７、９８０〜９８５）。
【０２９４】
ｐＨ感受性であるか負電荷のリポソームは、複合体を形成するよりもむしろＤＮＡを補足する。ＤＮＡおよび脂質はともに同様に荷電しているので、複合体形成よりもむしろ反発力がはたらく。それにもかかわらず、これらのリポソーム水性内部にいくつかのＤＮＡが捕捉される。ｐＨ感受性リポソームを使用して、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養物の細胞単層に送達した。標的細胞での外因性遺伝子の発現を検出した（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９２、１９、２６９〜７４）。
【０２９５】
別の企図されているリポソーム組成物は、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性のリポソーム組成物を、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、アニオン性融合誘導リポソームは主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のリポソーム組成物型は、例えば、ダイズＰＣおよび卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の型は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０２９６】
「立体的に安定化された」リポソームとは、１つまたは複数の特定の脂質を含むリポソームをいい、リポソームに組み込まれた場合、このような特定の脂質を欠くリポソームと比較して循環寿命が向上するものをいい、このような「立体的に安定化された」リポソームもまた意図される。立体的に安定化されたリポソームは、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含むか、（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されている。いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導脂質を含む立体安定化リポソームのために、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の向上は、細胞への網内系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に由来することが当該分野で考えられる（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８７、２２３、４２、Ｗｕら、Ｃａｎ．Ｒｅｓ．，１９９３、５３、３７６５）。
【０２９７】
１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化した脂質を含む多数のリポソームおよびその調製方法は、当該分野で公知である。例えば、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤２Ｃ１２  １５Ｇを含むリポソームを記載したＳｕｎａｍｏｔｏら、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０、５３、２７７８、重合グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングにより血液の半減期が有意に向上することに留意したＩｌｌｕｍら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８４、１６７、７９を参照のこと。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾した合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓ、米国特許第４，４２６，３３０号および米国特許第４，５３４，８９９号によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０、２６８、２３５は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームにより血液循環半減期が有意に増加することを示す実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９０、１０２９、９１は、このような観察を、ジステロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組み合わせから形成された他のＰＥＧ誘導体化リン脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）に適用した。外表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームは、欧州特許第ＥＰ０４４５１３１号およびＷＯ９０／０４３８４号、Ｆｉｓｈｅｒに記載されている。ＰＥＧで誘導化された１〜２０モル％のＰＥを含むリポソーム組成物およびその使用方法は、例えば、Ｗｏｏｄｌｅら、米国特許第５，０１３，５５６号および米国特許第５，３５６，６３３号およびＭａｒｔｉｎら、米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号に記載されている。多数の他の脂質−ポリマー抱合体を含むリポソームは、ＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（共にＭａｒｔｉｎら）およびＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）で開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、リポソーム上に機能的部分でさらに誘導化することができるＰＥＧ含有リポソームを記載している。
【０２９８】
リポソーム中に核酸をカプセル化する方法は、当該分野で公知である。ＷＯ９６／４００６２号は、リポソーム中への高分子量核酸のカプセル化方法を開示している。Ｔａｇａｗａらに付与された米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、このようなリポソームの内容物はアンチセンスＲＮＡを含むことができると主張している。Ｒａｈｍａｎらに付与された米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソーム中へのオリゴデオキシヌクレオチドのカプセル化方法を記載している。
【０２９９】
界面活性剤は、乳濁液（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームなどの製剤において広範に適用される。多数の異なる型の界面活性剤（天然および合成の両方）の性質を分類およびランキングするための最も一般的な方法は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）の使用である。親水基（「ヘッド」としても公知）の性質により、処方で使用した異なる界面活性剤の最も有用な分類手段が得られる（Ｒｉｅｇｅｒ、「医薬品投薬形態」、２８５、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，１９８８、２８５）。
【０３００】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、非イオン性界面活性剤として分類する。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品で広範に適用され、広範なｐＨ値で有用である。一般に、そのＨＬＢ値は、その構造に依存して２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルキルアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。
【０３０１】
水に溶解または分散させた場合に界面活性剤分子が負電荷を有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤には、セッケンなどのカルボン酸塩、アシル乳酸塩、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシル化アルキル硫酸塩などの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホン酸塩などのスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウリン塩、およびスルホコハク酸塩、およびリン酸塩が含まれる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な膜は、アルキル硫酸塩およびセッケンである。
【０３０２】
水に溶解または分散させた場合に界面活性剤分子が正電荷を有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤には、第４級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第４級アンモニウム塩は、このクラスで最も使用されているメンバーである。
【０３０３】
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれかを有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびリン脂質が含まれる。
【０３０４】
薬剤製品、製剤、および乳濁液中の界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ、「医薬品投薬形態」、２８５、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，１９８８）。
【０３０５】
１つの実施形態では、本発明は、核酸および他の薬剤（特にオリゴヌクレオチド）の動物の皮膚への有効な送達に影響を与える種々の浸透増強剤を使用する。ほとんどの薬物は、イオン化形態および非イオン化形態で溶液中に存在する。しかし、通常、脂溶性または親油性薬物は細胞膜を容易に通過する。通過する膜を浸透増強剤で処理した場合、非親油性薬物でさえも細胞膜を通過することができることが発見された。細胞膜を通過する非親油性薬物の拡散の補助に加えて、浸透増強剤はまた親油性薬物の透過性を増強する。
【０３０６】
浸透増強剤を、５つの広範なカテゴリー（すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、非キレート化非界面活性剤）のうちの１つに属するように分類することができる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２）。上記各クラスの浸透増強剤を、以下にさらに詳述している。
【０３０７】
本発明の別の実施形態は、界面活性剤を含む医薬組成物を意図する。界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解した場合に水溶液と別の溶液との間の溶液の表面張力または界面張力を減少させて、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を増強する化学的構成要素である。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透増強剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２）；およびＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物乳濁液（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８、４０、２５２）が含まれる。
【０３０８】
別の実施形態は、浸透増強剤として作用させるための種々の脂肪酸およびその誘導体の使用を意図し、これらの増強剤には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ1〜10アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、およびそのモノグリセリドおよびジグリセリド（すなわち、オレイン酸エステル、ラウリン酸エステル、カプリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、およびリノール酸エステルなど）（Ｌｅｅら、１９９１；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１〜３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２、４４、６５１〜４）が含まれる。
【０３０９】
本発明の活性因子を含む組成物は、胆汁酸塩をさらに含むことができる。胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ、第３８章、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ、「薬理学的治療の基礎」、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｙ．，１９９６、９３４〜９３５）。種々の天然の胆汁酸塩およびその合成誘導体は、浸透増強剤として作用する。したがって、用語「胆汁酸」には、任意の天然に存在する胆汁成分および任意のその誘導体が含まれる。本発明の胆汁酸塩には、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−タウリルエーテル（ＰＯＥ）（Ｌｅｅら、１９９１；Ｓｗｉｎｙａｒｄ、第３９章、「レミントンの薬学」、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、１９９０、７８２〜７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、１９９０；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２、２６３、２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０、７９、５７９〜８３）が含まれる。
【０３１０】
本発明は、さらに、キレート剤を含む組成物を意図する。キレート剤は、複合体形成によって溶液から金属イオンを除去し、その結果、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を増強させる化合物と定義することができる。活性因子がアンチセンス因子である場合のための浸透増強剤としての使用に関して、最も特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒のために二価の金属イオンを必要とすることによりキレート剤によって阻害されるので、キレート剤はＤＮＡインヒビターとしても作用するというさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３、６１８、３１５〜３９）。本発明のキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩、およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン類）が含まれるが、これらに限定されない（Ｌｅｅら、１９９１；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、１９９０；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０、１４、４３〜５１）。
【０３１１】
本発明はまた、活性因子および非キレート化非界面活性剤を含む医薬組成物を意図する。非キレート化非界面活性浸透増強調製物を、キレート剤または界面活性剤としての活性は不十分であるにもかかわらず、消化器粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を増強する化合物と定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、１９９０）。この浸透増強剤クラスには、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキルアザシクロ−アルカノン誘導体および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅら、１９９１）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７、３９、６２１〜６）が含まれる。
【０３１２】
オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物のために、細胞レベルでオリゴヌクレオチド取り込みを増強する薬剤を、本発明の医薬組成物および他の組成物に添加することもできる。例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１）などのポリカチオン性分子もまた、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強することが知られている。
【０３１３】
他の薬剤を使用して、投与した核酸の浸透を増強することができ、この薬剤には、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン類、およびテルペン類（例えば、リモネンおよびメトン）が含まれる。
【０３１４】
本発明の一定の組成物により、製剤中にキャリア化合物が組み込まれる。本明細書中で使用される、「キャリア化合物」または「キャリア」は、不活性（すなわち、それ自体が生物学的活性を含まない）であるが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解することによって、または循環からのこの核酸の除去を促進することにによって生物学的な活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを減少させるインビボプロセスにより核酸と認識される核酸またはその類似体をいうことができる。核酸およびキャリア化合物（典型的には過剰量の後者の物質と共に）の同時投与により、おそらくキャリア化合物と核酸との間の共通の受容体についての競合により、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵所で回収される核酸の量を実質的に減少させることができる。例えば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸、または４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’二硫酸（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５、５、１１５〜１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６、６、１７７〜１８３）と同時投与した場合、肝臓組織中のホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドの部分的回収率を減少させることができる。
【０３１５】
本明細書中に開示の医薬組成物は、賦形剤を含むこともできる。上記のキャリア化合物と対照的に、これらの賦形剤には、１つまたは複数の核酸または他の活性因子を動物に送達するための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬学的に不活性な媒介物が含まれる。賦形剤は液体であっても固体であってもよく、核酸または他の活性因子および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わせた場合、所望の容量が得られるように所定の投与様式で選択される。典型的な薬学的キャリアには、結合剤（例えば、予備ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１６】
核酸と有害に反応しない、非経口投与に適切な薬学的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。適切な薬学的に許容可能なキャリアには、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０３１７】
核酸および他の意図する活性因子の局所投与用製剤には、滅菌水溶液および非滅菌水溶液、非水溶液（一般に、アルコールなどの溶媒）、または液体もしくは固体の油ベースの核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物を含み得る。核酸または他の意図する活性因子と有害に反応しない非経口投与に適切な薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用することができる。
【０３１８】
本発明の組成物は、さらに、当該分野で確立された使用レベルで医薬組成物中に慣習的に見出される他の付加成分を含むことができる。したがって、例えば、組成物は、例えば、止痒剤、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬などのさらなる適合性の薬学的に活性な物質を含むことができ、または色素、香料、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の種々の投薬形態を物理的に製剤化するために有用なさらなる物質を含むことができる。しかし、このような物質は、添加した場合に本発明の組成物成分の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。製剤を滅菌することができ、所望であれば、製剤の核酸と有害に相互作用しない賦形剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、香料、および／または芳香物質など）と混合することができる。
【０３１９】
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる一定の物質を含み得る。懸濁液はまた、一定の安定剤を含み得る。
【０３２０】
別の関連する実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数のアンチセンス化合物または他の活性因子を含み得る。２つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、同時または連続して使用することができる。
【０３２１】
［試験キット］
本発明のさらなる実施形態では、医学専門家に適切な市販の試験キットを作製して、推測される標的細胞中の所定の修飾ＧＰＣＲ活性または所定のＧＰＰＰＣＲ活性の能力の有無を決定することができる。上記の試験技術にしたがって、このようなキットの１つのクラスは、少なくとも標識化ＧＰＣＲまたはその結合パートナー（例えば、特異的な抗体）、および勿論、選択したアッセイ方法（例えば、「競合アッセイ」、「サンドイッチアッセイ」、「ＤＡＳＰアッセイ」など）に沿った説明書を含む。キットはまた、緩衝液、安定剤、キット中の分子検出成分などのあまり重要ではない試薬を含んでもよい。
【０３２２】
したがって、（ａ）修飾ＧＰＣＲまたはその特異的結合パートナーの検出可能な標識への直接または間接的結合によって得た所定量の少なくとも１つの標識化免疫化学的に活性な成分と、（ｂ）他の試薬とを含む、所定のＧＰＣＲ活性について細胞の存在または能力を証明するための試験キットを準備することができる。
【０３２３】
より詳細には、診断試験キットは、（ａ）コントロールとして、既知量の修飾ＧＰＣＲ（または修飾ＧＰＣＲ結合パートナー）、あるいは適切なタグに結合しているもの、またはそれぞれの複数のこの最終生成物など（またはその結合パートナー）と、（ｂ）必要に応じて、他の試薬とを含み得る。
【０３２４】
さらなる変形形態では、所定のプロトコール（例えば、「競合」、「サンドイッチ」、「二重抗体」など）にしたがって操作する試験キットであって、（ａ）ＧＰＣＲを検出可能な標識への結合させることによって得た標識化成分と、（ｂ）少なくとも１つの試薬がリガンドまたは固定化リガンドであって、該リガンドが、（ｉ）標識成分と結合することができるリガンド、（ｉｉ）標識成分の結合パートナーと結合することができるリガンド、（ｉｉｉ）決定される少なくとも１つの成分に結合することができるリガンド、（ｉｖ）決定される少なくとも１つの成分の少なくとも１つの結合パートナーに結合することができるリガンドからなる群から選択される、１つまたは複数のさらなる免疫化学的試薬を含む試験キットを準備し、上記の目的のために使用することができる。
【０３２５】
上記に従って、ＧＰＣＲ活性の調整に有効な可能性のある薬物をスクリーニングするためのアッセイ系を準備することができる。修飾ＧＰＣＲを、試験系に導入することができ、可能性のある薬物を得られた細胞培養物に導入することもでき、その後培養物を試験してＧＰＣＲ活性の任意の変化（例えば、シグナル伝達、再利用、およびアレスチンに対する親和性など）を観察した。
【０３２６】
［ノックアウトマウスおよび動物］
疾患モデルとして使用し、本明細書中で識別された化合物を試験するために、修飾ＧＰＣＲトランスジェニックおよびノックアウトマウスおよび動物を産生および使用することができる。疾患モデルとして使用し、本明細書中で識別された化合物を試験するために、本明細書中に記載の脱感作経路の修飾成分を含むトランスジェニックおよびノックアウトマウスおよび動物を産生し、および使用することができる。
【０３２７】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの不活性な内因性アレスチン遺伝子（例えば、視覚アレスチン遺伝子、βアレスチン１遺伝子、およびβアレスチン２遺伝子が含まれる）を含むノックアウトマウスおよびマウス細胞である。マウスは、不活性内因性アレスチン遺伝子について完全なノックアウトであってもホモ接合性であってもよく、または、マウスは不活性内因性アレスチン遺伝子について部分的にノックアウトであってもヘテロ接合性であってもよい。
【０３２８】
ノックアウトマウスは、化合物が実際にアレスチンインヒビターであるかどうかの評価で有用であり得る。例えば、本発明のノックアウトマウスを、アレスチンインヒビターで処理した野生型マウスとの比較のためのモデルとして使用することができる。この比較を使用して、野生型マウスに投与した化合物がアレスチンインヒビターであるかを評価することができる。
【０３２９】
ノックアウトマウスはまた、化合物が実際にアレスチンアクチベーターであるかどうかの評価において有用であり得る。例えば、アレスチンアクチベーターで処理した部分的ノックアウトマウスを野生型マウスおよび完全なノックアウトマウスとの比較のためのモデルとして使用することができる。この比較を使用して、投与した化合物がアレスチンアクチベーターであるかを評価することができる。
【０３３０】
本明細書中に提供した開示および１９９９年１２月２２日提出の米国特許出願番号０９／４６９，５５４号、Ｒｏｓｅｓらに付与された米国特許第５，７６７，３３７号、Ｋｅｓｓｏｕｓ−Ｅｌｂａｚらに付与された米国特許第５，５６９，８２７号、Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒらに付与された米国特許第５，５６９，８２４号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）、およびＡ．Ｈａｒａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３６９、４８８、１９９４などに記載の当業者に既知の技術に照らして、アレスチンノックアウトマウスを産生することができる。
【０３３１】
本発明のノックアウトマウスの細胞は、少なくとも１つの不活性内因性アレスチン遺伝子（例えば、視覚アレスチン遺伝子、βアレスチン１遺伝子、およびβアレスチン２遺伝子が含まれる）を含む。マウスは、不活性内因性アレスチン遺伝子について完全なノックアウトであってもホモ接合性であってもよいか、マウスは不活性内因性アレスチン遺伝子について部分的にノックアウトであってもヘテロ接合性であってもよい。
【０３３２】
本発明の実施に好ましいマウスには、少なくとも１つの不活性内因性視覚アレスチン遺伝子、βアレスチン１遺伝子、およびβアレスチン２遺伝子を含むマウスが含まれる。少なくとも１つの不活性内因性視覚アレスチン遺伝子を含むノックアウトマウスを使用して、眼の活性をモニターすることができる。少なくとも１つの不活性内因性βアレスチン１遺伝子および／またはβアレスチン２遺伝子を含むノックアウトマウスを使用して、広範な種々の他の器官の活性をモニターすることができる。
【０３３３】
本発明の実施のためのマウスの例を以下に開示する。
【０３３４】
上記の例を参照して本発明を詳述しているが、本発明の精神を逸脱することなく種々の修正形態を実施することができ、これは当業者に容易に公知であると理解される。さらに、本発明は、以下の実施例によって制限されると解釈されない。
【０３３５】
本発明を、限定することを意図しない以下の例示的実施例によってさらに説明する。
【０３３６】
［材料］  アルギニン・バソプレシンをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し、［3Ｈ］−ＡＶＰをＡｍｅｒｓｈａｍ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手した。ノルエピネフリン（ＮＥ）をＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）から入手し、［3Ｈ］プラゾシンをＮＥＮ社（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手し、フェントラミンおよびアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）をＳｉｇｍａ社から入手した。Ｌ１５８，８０９（２−エチル−５，７−ジメチル−３−［［２’−（１Ｈ−テトラゾル−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン；ＣＡＳ登録番号１３３２４０−４６−７）は、Ｅ．Ｅｓｃｈｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅ、ＰＱ、Ｃａｎａｄａ）から贈与していただいた。ゴールデンハムスター野生型α1B−ＡＲおよびＲ１４３Ａは、Ｓ．Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  Ｌａｕｓａｎｎｅ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から贈与していただいた。ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＯＳ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、細胞培養試薬をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）およびＣｅｌｌｃｏ（Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ、ＭＤ）から入手した。
【０３３７】
［細胞培養およびトランスフェクション−Ｖ２Ｒ実験］  ＨＥＫ−２９３細胞を、１０％のウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンの１００倍希釈物（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補足したＥａｒｌｅ塩を含むイーグル最小基本培地（ＭＥＭ）中で成長させた。Ｂａｒａｋら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１、１７７〜８４に記載の改変カルシウムリン酸共沈法を使用して、細胞をプラスミドｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。α1B−ＡＲおよびＡＴ1AＲ実験：リン酸イノシトールについての上記の改変リン酸カルシウムトランスフェクション共沈法および結合アッセイを使用して、１０ｃｍ2の皿（Ｆａｌｃｏｎ社製）中で細胞を１μｇの受容体またはｐＣＤＮＡ３．１（−）中のＧＲＫプラスミドｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡のために、標準的な方法（Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ，Ｖ．ら、１９９９、Ｆｏｃｕｓ、２１．２、５４〜５５）を使用して、コラーゲン（Ｓｉｇｍａ社製）コートした３５ｍｍ2ガラス底共焦点皿（ＭａｔＴｅｋ社製、Ａｓｈｌａｎｄ．ＭＡ）中で細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡法用の細胞を、３０ｎｇのｐＥＧＦＰ中のβアレスチンまたは受容体プラスミドｃＤＮＡおおびｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ中の２５０ｎｇのダイナミン（Ｋ４４Ａ）、ＧＲＫ、または受容体でトランスフェクトした。
【０３３８】
［受容体結合およびアデニルイルシクラーゼの産生−Ｖ２Ｒ実験］  受容体ｃＤＮＡを一過性に発現するＨＥＫ−２９３細胞を、１２ウェルのＦａｌｃｏｎ皿にプレートした。細胞を、冷ＭＥＭで２回洗浄し、種々の濃度の［3Ｈ］ＡＶＰを含む２５０μｌの２％のＢＳＡの４℃のＭＥＭ溶液を、各ウェルに３０分間添加した。１００倍過剰の冷ＡＶＰの存在下で非特異的結合を決定した。ついで、細胞を冷ＭＥＭ／ＢＳＡで３回洗浄し、結合した［3Ｈ］ＡＶＰを、２５０μｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨのＰＢＳ溶液で抽出し、ＨＣｌで中和し、液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。Ｖ２Ｒ変異型を含むインタクトなＨＥＫ−２９３細胞におけるｃＡＭＰ産生を、Ｂａｒａｋら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１、１７７〜８４、１９９７に記載のように測定した。α1B−ＡＲおよびＡＴ1AＲ実験：１０ｃｍ2皿中の一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を、冷結合緩衝液（ＭＥＭ＋２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で２回洗浄し、種々の濃度の［3Ｈ］ピラゾシン（０．２５Ｍ〜８ｎＭ）を含む結合緩衝液中、室温で１時間インキュベートし、冷結合緩衝液で３回洗浄して非結合リガンドを除去した。［3Ｈ］ピラゾシンに結合した細胞を、シンチレーションカウンターを使用して測定した。非特異的結合を、１０００倍過剰のフェントラミン（１０μＭ）の存在下で決定した。ダイナミン（Ｋ４４Ａ）の同時発現または図１４のフェントラミン添加の効果を測定するために行う結合アッセイのために、固定濃度（８ｎＭ）の［3Ｈ］ピラゾシンを使用した。
【０３３９】
［リン酸イノシトールの決定］  １０ｃｍ2の皿中の一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を、２５ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ社製）をコートした１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）にプレートし、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）中、３７℃で一晩インキュベートした。リン酸イノシトール産生をアッセイするために、細胞を標識培地（１μＣｉ／０．５ｍｌ／ウェルの［3Ｈ］イノシトールのＭＥＭ＋５％ウシ胎児血清溶液）中、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＭＥＭ、２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ  ＬｉＣｌにて３７℃で５分間洗浄し、その後アゴニストで処理した。以前にＣｏｔｅｃｃｈｉａ，Ｓ．ら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７、１６３３〜１６３９に記載のように全てのリン酸イノシトールを抽出および分離した。
【０３４０】
［共焦点顕微鏡法］  トランスフェクションの翌日に、コラーゲン（Ｓｉｇｍａ社製  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で処理した３５ｍｍ2のガラス底培養皿にＨＥＫ−２９３細胞をプレートした。Ｚｅｉｓｓレーザースキャニング顕微鏡（ＬＳＭ−５１０）を使用した共焦点顕微鏡法を行った。４８８ｎｍのアルゴン励起および５０５ｎｍのロングパスフィルターを使用して、ＧＦＰ画像を回収した。α1B−ＡＲおよびＡＴ1AＲ実験：ＨＥＫ−２９３細胞を、３５ｍｍ2共焦点皿中で一過性にトランスフェクトした。細胞を１０μＭのＮＥまたは１μＭのＡｎｇＩＩで刺激し、観察前に３７℃で３０分間インキュベートした。あるいは、細胞を、１０μＭのフェントラミンまたは１μＭのＬ１５８，８０９中、３７℃で一晩培養した。×１００のＺｅｉｓｓレーザースキャニング顕微鏡（ＬＳＭ−５１０）を使用した共焦点顕微鏡法を行った。４８８ｎｍの励起および５０５ｎｍのロングパスフィルターを使用して、ＧＦＰおよびＦＩＴＣ画像を回収した。
【０３４１】
［抗体標識］  ガラス底ウェルを具備した３５ｍｍ2の皿に生きたトランスフェクトした細胞をプレートした。細胞を、１００倍希釈のローダミンタグ化抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む２％のＢＳＡ／ＭＥＭ溶液と共に室温で４０分間インキュベートし、ＭＥＭ／ＨＥＰＥＳで３回洗浄し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０を使用した蛍光および共焦点顕微鏡法によって試験した。
【０３４２】
［全細胞リン酸化（Whole Cell Phosphorylation）］  Ｂａｒａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、７５６５〜７５６９、１９９９に本質的に記載されているように、受容体のリン酸化を行った。全細胞に結合した［3Ｈ］ＡＶＰによって識別された等量の受容体および一定量の各サンプル中の可溶化タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、オートラジオグラフィーのために処理した。
【０３４３】
［受容体免疫沈降およびウェスタンブロッティング］  Ｂａｒａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、７５６５〜７５６９、１９９９に記載のように、ＡＶＰを使用するかまたは使用しないで、ＨＥＫ−２９３細胞を１０分間刺激し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、沈殿緩衝液にすくい入れ、４℃で１時間可溶化した。遠心分離後、上清を回収し、抗ＨＡ  １２ＣＡ５マウスモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してＨＡタグ化受容体を４℃で免疫沈降させた。回収したタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、抗ＨＡウサギポリクローナル抗体（ＢＡｂＣＯ社製、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）で免疫ブロットした。
【実施例１】
【０３４４】
［プラスミドＤＮＡの構築］
Ｎ末端ＨＡタグ化ヒトバソプレシンＩＩ型受容体Ｖ２Ｒ（Ａｌａ６）およびＶ２Ｒ（Ｔ３６２）を、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（Ｏａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．，Ｌａｐｏｒｔｅ，Ｓ．Ａ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ａ．Ｂａｒａｋ，Ｌ．Ｓ．＆  Ｃａｒｏｎ，Ｍ．Ｇ．，１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、３２２４８〜３２２５７）で発現させた。これらのＲ１３７Ｈ類似体を、ポリメラーゼ連鎖反応によって作製し、ＳａｃＩ／ＳａｌＩ制限部位（図１７、配列番号７）を使用してインタクトな終止コドンを含む発現ベクターｐＥＧＦＰＮ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に挿入した。野生型ヒトＶ２およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）受容体の緑色蛍光タンパク質抱合体を、ヒトＶ２ＲおよびヒトＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）ｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によって作製し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３のＸｈｏＩ／ＳａｌＩおよびＳａｃＩ／ＳａｌＩ制限部位にインフレームで挿入した。Ｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７、４８６９〜４８７４、１９９８に記載のように、βアレスチン２−ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を構築した。
【０３４５】
Ｎ末端ＨＡエピトープタグ化構築物を、ＨＡ配列（ＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧ−ＡＣＴＡＣＧＣＴ）およびその後に遺伝子配列を含む５’プライマーを使用したＰＣＲによって作製し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびｐＥＧＦＰ−Ｎ３（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ／ＳａｌＩ部位にクローン化した。以前に記載のように（Ｚｈａｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２、２７００５〜２７０１４およびＢａｒａｋら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２、２７４９７〜２７５００）、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）およびβアレスチン−ＧＦＰを構築した。
【０３４６】
α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｈ、Ｒ１４３Ｅ、およびＲ１４３ＮをＰＣＲで作製し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏおよびｐＥＧＦＰ−Ｎ３のＮｈｅＩ／ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ部位（図１７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１）に挿入した。
【０３４７】
ラットＡＴ1AＲ  Ｒ１２６ＨをＰＣＲで作製し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏおよびｐＥＧＦＰ−Ｎ３のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ／ＳａｌＩ部位（図１７、配列番号１２）にクローン化した。
【実施例２】
【０３４８】
［ＨＥＫ−２９３細胞におけるＶ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）の発現およびシグナル伝達］
Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）変異は、受容体とリガンドとの相互作用よりもむしろＧタンパク質共役に関連する保存ＧＰＣＲ領域で起こる。Ｒ１３７Ｈ変異の効果を評価に着手するために、Ｖ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）受容体を発現する細胞を、リガンド結合、原形質膜発現レベル、および下流シグナル伝達に関して比較した。リガンドＡＶＰに対するＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）変異体の親和性を、リガンドＡＶＰに対する野生型Ｖ２Ｒの親和性と比較した。原形質膜上のＶ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）の発現レベルを比較し、Ｖ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）受容体を発現する細胞中のｃＡＭＰ蓄積を測定して、シグナル伝達を比較した。
【０３４９】
図４Ａに示すＨＥＫ−２９３全細胞結合データは、野生型Ｖ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）は同一のＡＶＰに対する親和性を有することを示す。対照的に、スキャッチャードプロット（挿入図Ａ）により、原形質膜Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）での発現は非常に低いことが示唆される。この所見を、ローダミン結合抗ＨＡ抗体で標識した生きた非浸透化ＨＥＫ−２９３細胞表面でのＨＡタグ化Ｖ２Ｒ（図４Ｂ、左パネル）およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）（図４Ｂ、右パネル）を起源とする蛍光量の比較によって確認する。図４Ｃは、野生型Ｖ２ＲまたはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞中のＡＶＰ刺激（０〜２５０ｎＭ）した全細胞のｃＡＭＰ産生量を示す。Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）トランスフェクト細胞では、基底を越えるアデニルイルシクラーゼ活性は本質的に認められない。これらのデータは、受容体がＧタンパク質を活性化する能力がないことによりＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）ＮＤＩが得られることができることを示す。
【実施例３】
【０３５０】
［ＡＶＰに応答したＶ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）の分布および輸送］
多数のＧＰＣＲは、原形質膜での受容体発現に影響を与えることなくＧタンパク質由来の受容体に結合しない変異体を発現する。Ｓｃｈｏｎｅｂｅｒｇら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，１２、１９６〜２０５、１９９８に記載のように、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）の原形質膜発現は比較的小さいにもかかわらず、アゴニストの非存在下での細胞内補体は比較的大きい。したがって、Ｓｃｈｏｎｅｂｅｒｇら、Ｅｍｂｏ．Ｊ．，１５、１２８３〜１２９１、１９９６に記載のように、Ｒ１３７Ｈ変異はまた、受容体局在化を決定する輸送機構に影響を与え得る。
【０３５１】
ＨＥＫ−２９３細胞におけるＶ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）輸送を研究するために、Ｖ２ＲまたはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）緑色蛍光タンパク質キメラを使用したストラテジーを使用した。図５は、アゴニストの非存在下で、Ｖ２Ｒ−ＧＦＰ蛍光が原形質膜から支配的に発生することを示す（左上のパネル）。１００ｎＭのＡＶＰの添加により、膜蛍光が消失し、野生型Ｖ２Ｒに類似の様式でエンドサイトーシス小胞にＶ２Ｒが再分布する（右上のパネル）。アゴニスト添加後の時間または細胞を通した共焦点スライスの位置に依存してサイトゾルまたは核周囲領域のいずれかで小胞が認められる。対照的に、体部分のＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）−ＧＦＰは、アゴニストの非存在下でサイトゾル状および小胞状であり（図５、左下のパネル）、１００ｎＭのＡＶＰへの３０分間の曝露により、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）−ＧＦＰ分布は明らかに変化しなかった。
【実施例４】
【０３５２】
［ＡＶＰに応答してＶ２ＲまたはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）を発現するＨＥＫ−２９３細胞におけるβアレスチンの分布および輸送］
Ｂａｒａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、７５６５〜７５６９、１９９９に記載のように、ＨＥＫ−２９３におけるＶ２ＲのＡＶＰ媒介エンドサイトーシスにはβアレスチンが必要であることが証明されている。ＡＶＰの非存在下または存在下で認められたＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）−ＧＦＰの小胞局在化はβアレスチン媒介エンドサイトーシスに特徴的であり、これにより、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）はアゴニストを使用する異なるこれ自体のインターナライズの促進に十分にβアレスチンと結合することができることが示唆される。Ｌｏｈｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１５４７〜１５５０、１９９０およびＢａｒａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、７５６５〜７５６９、１９９９に記載のように、生きたＨＥＫ−２９３細胞におけるβアレスチンのＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）との相互作用を試験するために、Ｖ２ＲまたはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）のいずれかおよびβアレスチン２−ＧＦＰ融合タンパク質をトランスフェクトした。アゴニストの非存在下でＶ２Ｒを用いてβアレスチン２−ＧＦＰが発現した場合、蛍光はサイトゾル状であり且つ均一である（図６、左上のパネル）。ＡＶＰの添加により、βアレスチンが原形質膜Ｖ２Ｒに移動し、その後クラスリンコート小胞中でβアレスチン受容体複合体がＡＰ２に指示されてクラスターを形成し、βアレスチン−受容体複合体がエンドソームにインターナライズする。ＡＶＰ処理後のエンドソーム中のβアレスチン２−ＧＦＰの出現は、図６に示すＧＦＰ蛍光の小胞分布によって示される（右上のパネルおよび挿入図）。
【０３５３】
Ｖ２Ｒでの所見と対照的に、アゴニストと独立してＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）を発現する細胞中のエンドソームでβアレスチン２−ＧＦＰが分布する（図６の左下および右のパネル）。エンドサイトーシス小胞中のβアレスチン−ＧＦＰの局在化により（挿入図）、βアレスチン指示プロセスによって原形質膜受容体から細胞内Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）集団が発生し得ることが示唆される。これにより、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）がＧタンパク質を活性化できないことはＧタンパク質を活性化できないことよりもむしろリガンド独立脱感作に一部起因し得ることが示唆される。
【実施例５】
【０３５４】
［優性のネガティブダイナミンの存在下でのＶ２ＲまたはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）βアレスチン複合体のインターナライズの阻害］
サイトゾルタンパク質ダイナミンは、原形質膜からのクラスリンコート小胞の分離に必要であり、Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、１０９９９〜１１００６、１９９９に記載のように、クラスリンコート小胞の解離を競合的に阻害するダイナミン（Ｋ４４Ａ）変異型の過剰発現を使用してクラスリン媒介ＧＰＣＲインターナライズを評価した。アゴニストの非存在下でのβアレスチンの受容体との自発的会合が受容体インターナライズの誘導に十分である場合、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）のＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）を発現する細胞中でサイトゾルβアレスチン２−ＧＦＰの補体が原形質膜に再分布する能力を評価した。
【０３５５】
ＨＥＫ−２９３細胞では、アゴニストの非存在下で、Ｖ２Ｒを使用したダイナミン（Ｋ４４Ａ）の発現により、βアレスチン−ＧＦＰの均一なサイトゾル分布を有意に変化させた。それに対して、ＡＶＰ処理から３０分後、図７Ａ（左のパネル）および図６を比較して、βアレスチン−ＧＦＰは原形質膜に点状に分布したままであり、エンドサイトーシス小胞に移動しなかった。したがって、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）発現により、クラスリンコートピットを解してＶ２Ｒ−βアレスチン複合体のインターナライズが阻害された。アゴニストの非存在下では、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）とＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）との同時発現により、アゴニストの存在下でのＶ２Ｒで認められたβアレスチン２−ＧＦＰ分布に類似のβアレスチン２−ＧＦＰの原形質膜分布が認められた（図７Ａ、左パネル）。ＡＶＰ添加により、βアレスチン２−ＧＦＰの原形質膜分布は変化しなかったが（図７Ａ、右のパネル）、βアレスチン２−ＧＦＰコート小胞によりいくつかの細胞で明らかとなった。Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）を発現する細胞中でのサイトゾルβアレスチン２−ＧＦＰの補体が原形質膜に再分布するダイナミン（Ｋ４４Ａ）の能力により、アゴニストの非存在下でのβアレスチンの受容体との自発的会合は受容体インターナライズの誘導に十分であることが示唆される。
【実施例６】
【０３５６】
［Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）の構成的リン酸化］
多数のＧＰＣＲとβアレスチンとの間の親和性を、ＧＲＫリン酸化によって調節する。したがって、ＡＶＰの非存在下および存在下でのＨＥＫ−２９３細胞中に発現するＶ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）のリン酸化状態を研究した。免疫沈降Ｖ２Ｒのウェスタンブロット分析により、約７０、５０、および４０ｋＤａに移動するこの受容体の３つの主要な種が明らかとなった（図７Ｂ、矢印、左のパネル）。各Ｖ２Ｒ種で認められた基本的なリン酸化の量は最小であり、５０ｋＤａのみがアゴニストと反応してリン酸化された（図７Ｂ、右のパネル）。免疫沈降Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）のウェスタンブロット分析により、最も高い可能性で受容体の未熟なグリコシル化形態を示すエンドグリコシダーゼＨおおよびＰＮＧアーゼＡ（データ示さず）による消化に感受性を示す約７０ｋＤａと４０ｋＤａに移動するこの受容体の形態（図７Ｂ、左パネル）が明らかとなった（Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｈ．＆  Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，Ｍ．，１９９９、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、９、７３１〜７３７；Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｈ．Ｍ．，Ｉｎｎａｍｏｒａｔｉ，Ｇ  ＆  Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ，Ｍ．，１９９７、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１７、４３３〜４４５）。Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）のこれらの各形態は、構成的にリン酸化された（図７Ｂ、右のパネル）。５０ｋＤａのＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）種がウェスタンブロットで検出されなかったにもかかわらず、より感度の高いリン酸化アッセイにより、この形態の受容体に対する少量のアゴニスト媒介リン酸化が明らかとなった（図７Ｂ、中央の矢印、右のパネル）。さらに、５０ｋＤａのＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）形態もまた、アゴニストの非存在下でリン酸化された。したがって、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）の異常な表現型の挙動が主にβアレスチンのリン酸化受容体との構成的会合に影響を与え得るようである。
【実施例７】
【０３５７】
［Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）構成的脱感作の逆転およびβアレスチン親和性］
アゴニストの非存在下でのアレスチンに対する受容体の親和性の増加は、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）がＧタンパク質に正常に結合し、ｃＡＭＰを刺激する能力をマスクすることができる。アレスチンがＧＰＣＲを脱感作してそのインターナライズを促進するので、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）に対するアレスチンの親和性を減少させる介入により、より正常な受容体応答を再確立することができる。
【０３５８】
Ｂａｒａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、７５６５〜７５６９、１９９９に記載するように、野生型Ｖ２Ｒのアラニン置換およびＣテール短縮変異体（それぞれＶ２Ｒ（Ａｌａ６）およびＶ２Ｒ（Ｔ３６２））は、Ｖ２Ｒ  ＧＰＣＲのテール中の３つのセリンの１つのクラスターは受容体のβアレスチンに結合する能力を実質的に減少させることができることを示す。Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）、およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）の類似の変異体を構築した。変異体は、原形質膜での受容体の局在化を正常化するβアレスチン親和性を減少させ、アデニルイルシクラーゼを刺激する能力を修正する。図８Ａ（上のパネル）は、ローダミン抗ＨＡ抗体で標識した生きた透過できないようにしたＨＥＫ−２９３細胞におけるＨＡタグ化Ｖ２Ｒ、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）、およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）の代表的な画像を示す。各受容体サブタイプは、アゴニストの非存在下でローダミン蛍光によって原形質膜で容易に認められる。結果は、透過できないようにした（unpermeabilized）ＨＥＫ−２９３細胞表面上の比較的小さな抗体標識Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）を示す所見と対照的である（図４）。Ｖ２Ｒ、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）、およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）を含む細胞へのＡＶＰの添加により、原形質膜の蛍光が喪失し、受容体エンドサイトーシスの結果としてサイトゾル蛍光が認められる（図８Ａ、下のパネル）。Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）テール変異体の原形質膜集団の野生型レベルへの回復を、ＡＶＰの結合によって確認した（図８Ｂ）。
【０３５９】
このＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）受容体変異体は、図９Ａでβアレスチン２−ＧＦＰ融合タンパク質を使用してβアレスチンに対する親和性が低いことが示される。この所見と対照的に、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）、およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）は、ホルモンの非存在下での細胞の細胞質中のβアレスチン２−ＧＦＰの均一な分布によって示されるように、βアレスチンに構成的に会合しない。ＡＶＰの添加により、原形質膜での点状のβアレスチン２−ＧＦＰ再分布が促進されるが、エンドサイトーシス小胞への受容体の再分布は起こらない。βアレスチン２−ＧＦＰが、セリンクラスターが除去されたＶ２Ｒに会合したままで輸送することができないことは、受容体のアレスチンに対する親和性を減少させる。
【０３６０】
Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）のβアレスチンに結合する能力の減少により、ｃＡＭＰを刺激する能力が改良される。図９Ｂは、全ての受容体変異型の基本的ｃＡＭＰが類似していることを示す。ＣＯＳ−７細胞での所見と一致して、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）の基底のｃＡＭＰを超えるｃＡＭＰ濃度の小アゴニスト媒介増加が認められた。Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）Ｃ末端中のセリンクラスターの変異により、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）変異体の両方のｃＡＭＰ産生が６倍増強された（図９Ｂ）。これらのデータにより、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）がＧタンパク質と相互作用するにもかかわらず、野生型Ｖ２Ｒよりも低く、アレスチンに対するその強力な親和性によりこの相互作用が著しく阻害されることが示唆される。
【実施例８】
【０３６１】
［ＨＥＫ−２９３細胞における野生型α1B−ＡＲおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅの発現］
α1B−ＡＲおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅの原形質膜発現を、図１０に示すように［3Ｈ］プラゾシンの全細胞結合によって決定した。スキャッチャードプロット分析は、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３ＥのＢmaxは野生型α1B−ＡＲよりも非常に低いことを示す。この所見を、ＨＡ−エピトープでタグ化した野生型α1B−ＡＲまたはα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅを発現する生きている透過できないようにした細胞を使用した免疫蛍光によって確認した。細胞を、抗ＨＡ抗体とインキュベートし、その後ＦＩＴＣ標識化二次抗体とインキュベートした。α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅを発現する細胞の原形質膜を起源とする蛍光量（図１０Ｂ、右のパネル）は、野生型α1B−ＡＲ（左のパネル）よりも非常に低く、これは、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅの表面発現の減少を示す。
【実施例９】
【０３６２】
（α1B−ＡＲおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３のシグナル伝達）
α1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体が構成的に脱感作されるかどうかを決定するために、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体（本明細書中で、Ｒ１４３変異体はアラニン、グルタミン酸、ヒスチジン、またはアスパラギンとの置換をいう）、野生型α1B−ＡＲまたはα1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体を発現するＨＥＫ−２９３細胞中の［3Ｈ］ＩＰの蓄積を測定した（図１１）。野生型α1B−ＡＲを発現する細胞のアゴニストの非存在下での［3Ｈ」−ＩＰ蓄積は低く、１０μＭ  ＮＥを添加すると６倍に増加した。それに対して、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体は、アゴニスト誘導性ＩＰ応答を媒介する能力が有意に減少した。それに対して、ＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈ変異体は、１μＭのＡｎｇＩＩで刺激した場合、刺激された野生型ＡＴ1AＲと比較してシグナル伝達がわずかに減少する。
【実施例１０】
【０３６３】
［ノルエピネフリン（ＮＥ）に応答したα1B−ＡＲおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３−ＧＦＰ変異体の局在化］
結合データによって示されるα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ａの膜発現の不足により受容体プロセシングの欠陥が示唆されるので、Ｃ末端で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でタグ化した受容体のキメラを使用して、野生型α1B−ＡＲおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体の細胞局在化を決定した。図１２Ａは、ＨＥＫ−２９３細胞が野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰでトランスフェクトされた場合、共焦点顕微鏡法によって明らかとなった蛍光シグナルは、アゴニストの非存在下で原形質膜から主に発生することを示す。野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰを発現する細胞への１０μＭ  ＮＥの添加により、原形質膜発現が喪失し、受容体がエンドサイトーシス小胞に再分布する。それに対して、図１２Ｂは、アゴニストの非存在下でさえ、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３−ＧＦＰ変異体がエンドサイトーシス小胞中に支配的に局在化し、これは構成的に脱感作されたＶ２Ｒ  Ｒ１３７Ｈで見出されたものに類似することを示す。α1B−ＡＲ  Ｒ１４３−ＧＦＰ変異体を発現する細胞のアゴニストへの曝露により、残存する原形質膜受容体のエンドソーム分布が増強された（データ示さず）。
【実施例１１】
【０３６４】
［α1B−ＡＲを発現するＨＥＫ−２９３細胞中のβアレスチン−ＧＦＰの分布］
アゴニスト刺激されたα1B−ＡＲは、サイトゾルβアレスチンの原形質膜への移動（活性化受容体の脱感作およびエンドサイトーシスに関連する事象）を促進することが以前に示されている（Ｍｈａｏｕｔｙ−Ｋｏｄｊａ，Ｓ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５、３３９〜３４７）。どのようにしてβアレスチンがα1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体に影響を受けるのかを観察するために、ＨＥＫ−２９３細胞中でβアレスチン−ＧＦＰをこれらの受容体と同時発現させた。図１３Ａは、アゴニストの非存在下で、βアレスチン−ＧＦＰは野生型α1B−ＡＲを発現する細胞のサイトゾルに均一に分布し、細胞への１０μＭ  ＮＥの添加によりβアレスチン−ＧＦＰが原形質に迅速に移動することを示す。この移動パターンは、β2アドレナリン作動性受容体（β2−ＡＲ）などのいわゆるクラスＡ受容体を暗示する（Ｏａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．ら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５、１７２０１〜１７２１０）。Ｖ２ＲなどのクラスＢ受容体と同様に、クラスＡ受容体の活性化により、エンドサイトーシス小胞へのその後の同時輸送を行うことなくβアレスチンが原形質膜に移動する（Ｏａｋｌｅｙ，Ｒ．Ｈ．ら）。βアレスチン−ＧＦＰおよびα18−ＡＲ  Ｒ１４３変異体を同時発現する細胞では、βアレスチン−ＧＦＰの局在化はまた、野生型α1B−ＡＲとの分布と対照的に、アゴニストを添加することなく原形質膜に部分的に出現している（図１３Ｂ）。アゴニストの非存在下での変異体のβアレスチン−ＧＦＰを移動させる能力により、アゴニストを使用しないで野生型受容体よりもβアレスチンに対する親和性が高いことが示唆される（Ｏａｋｌｅｙ、Ｒ．Ｈ．ら）。βアレスチン−ＧＦＰおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体を同時発現する細胞への１０μＭ  ＮＥの添加により、この移動が増強される（データ示さず）。
【実施例１２】
【０３６５】
［ダイナミン（Ｋ４４Ａ）のアンタゴニストでのα1B−ＡＲ  Ｒ１４３構成的脱感作の逆転］
受容体−ＧＦＰ構築物によって明らかとなった変異受容体の膜発現および細胞内局在化が低いことは、原形質膜に到達できないことを反映し得る。例えば、受容体を、不適切に折りたたみ、そして／または小胞体中でプロセシングすることができる。しかし、図１４Ｂに示すように、発現の喪失がβアレスチンとの構成的会合による場合、エンドサイトーシス小胞にインターナライズする前に変異受容体は原形質膜に輸送されることが示唆される。２つのアプローチを使用して、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ変異体が原形質膜にトラップされてエンドサイトーシス小胞中で構成的インターナライズを逆転することができるかどうかを決定した。第１の方法では、α1B−ＡＲの選択的アンタゴニストであるフェントラミンを使用した。図１４Ａは、野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞が原形質膜で受容体を支配的に発現することを示す（左上のパネル）。野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰでトランスフェクトし、１０μＭフェントラミンの存在下で一晩培養したＨＥＫ−２９３細胞は、原形質膜での受容体の発現が変化しなかった（中央上のパネル）。しかし、ＨＥＫ−２９３細胞中のα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ−ＧＦＰはエンドサイトーシス小胞内に支配的に局在化し（左下のパネル）、フェントラミンの存在下で、完全な逆転が認められ、原形質膜で変異体が局在化した（中央下のパネル）。構成的脱感作を逆転するために使用した第２の方法は、受容体のダイナミン（Ｋ４４Ａ）（原形質膜由来のクラスリンコート小胞の分裂を競合的に阻害するエンドサイトーシスタンパク質変異型）との同時発現であった（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２、２７００５〜２７０１４）。ダイナミン（Ｋ４４Ａ）と同時発現する場合、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ−ＧＦＰはエンドサイトーシスを受けることができず、その発現が原形質膜に残存した（右下のパネル）。全細胞結合（図１４Ｂ）により、未処理α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ細胞は野生型α1B−ＡＲと比較して原形質膜上により低い受容体発現を示し、アンタゴニストの存在またはダイナミン（Ｋ４４Ａ）の同時発現により野生型α1B−ＡＲレベルへの原形質膜上でのα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅの発現を増加することができることが確認された。
【実施例１３】
【０３６６】
［ＡＴ1AＲを発現するＨＥＫ−２９３細胞中のβアレスチンの分布］
ＤＲＹモチーフアルギニンの変異に起因する構成的脱感作を別のＧＰＣＲに拡大することができるかを決定するために、ＡＴ1AＲを使用して受容体−ＧＦＰ局在化およびβアレスチン−ＧＦＰ翻訳を繰り返した。図１５Ａは、ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした場合、原形質膜に野生型ＡＴ1AＲ−ＧＦＰが支配的に発現し、１μＭのアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）の添加によりエンドサイトーシス小胞に受容体がインターナライズすることを示す。それに対して、ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトしたＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈ−ＧＦＰは、アゴニストを添加することなくエンドサイトーシス小胞中に局在化する。さらに、ＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈ−ＧＦＰを発現する細胞をＡＴ1AＲ選択性アンタゴニストＬ１５８，８０９中で培養した場合、原形質膜に戻される受容体局在化の逆転が起こる。図１５Ｂは、βアレスチン−ＧＦＰが野生型ＡＴ1AＲを発現するＨＥＫ−２９３細胞のサイトゾル中に均一に分布し、１μＭのＡｎｇＩＩの添加によりβアレスチン−ＧＦＰのエンドサイトーシス小胞に再分布されることを示す。それに対して、βアレスチン−ＧＦＰは、ＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈと同時発現する場合、アゴニストの非存在下でエンドサイトーシス小胞中に支配的に分布する。１μＭのＡｎｇＩＩのＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈを発現する細胞への添加により、エンドサイトーシス小胞へのβアレスチン−ＧＦＰの分布が増強された。
【実施例１４】
【０３６７】
［ＧＲＫの有無におけるＡＲ1AＲ  Ｒ１２６Ｈのシグナル伝達］
ＤＲＹモチーフアルギニン変異を有するＧＰＣＲがＧタンパク質に結合する能力を喪失し、アゴニストの非存在下でＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈがβアレスチン−ＧＦＰを移動させることができるという事実が与えられた場合（図１５Ｂに示す）、ＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈを、シグナル伝達表現型の喪失を示すと予想された。しかし、ＡＲ1AＲ  Ｒ１２６Ｈでトランスフェクトし、ＡｎｇＩＩで刺激したＨＥＫ細胞は、野生型ＡＴ1AＲでトランスフェクトし、ＡｎｇＩＩで刺激したＨＥＫ細胞と同一のレベルで［3Ｈ］−ＩＰを蓄積することができた（図１６Ｃ）。ＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈのシグナル伝達をＧＲＫの過剰発現によって廃止することができ、これがβアレスチン−ＧＦＰの局在化にどのような影響を与えるのかを決定するために、等量のＧＲＫプラスミドｃＤＮＡを含むか含まない野生型ＡＴ1AＲまたはＡＴ1AＲ  Ｒ１２６ＨでＨＥＫをトランスフェクトした。共焦点顕微鏡での観察のために、細胞をβアレスチン−ＧＦＰと同時トランスフェクトするか、［3Ｈ］−ＩＰ蓄積を測定するために「3Ｈ」イノシトールとインキュベートした。図１６Ａ（左上および下のパネル）は、βアレスチン−ＧＦＰおよび野生型ＡＴ1AＲでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞では、βアレスチン−ＧＦＰの局在化がＧＲＫの同時トランスフェクションを行うか行わないサイトゾル全体に分布されることを示す。これらの細胞への１μＭのＡｎｇＩＩの添加の際、５分後にβアレスチン−ＧＦＰがエンドサイトーシス小胞に移動する（図１６ａ、右のパネル、上および下のパネル）。図１６Ｂは、βアレスチン−ＧＦＰおよびＡＴ1AＲ  Ｒ１２６ＨでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞によりβアレスチン−ＧＦＰがエンドサイトーシス小胞に一部移動し（左上のパネル）、大量のβアレスチン−ＧＦＰがサイトゾル中に残存することを示す。図１６Ｂに示すように（右上のパネル）、この残存サイトゾルβアレスチンーＧＦＰは、１μｇのＡｎｇＩＩの添加によってエンドサイトーシス小胞に移動する。しかし、図１６Ｂ（左下のパネル）に示すように、βアレスチン−ＧＦＰ、ＡＴ１ＡＲ  Ｒ１２６Ｈ、およびＧＲＫでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞により、アゴニストを添加することなくβアレスチン−ＧＦＰがエンドサイトーシス小胞に完全に移動する。これらの細胞を１μｇのＡｎｇＩＩに曝露した場合、βアレスチン−ＧＦＰは、エンドサイトーシス小胞中に局在化したままである（図１６Ｂ、右下のパネル）。野生型ＡＴ1AＲまたはＲ１２６ＨでＧＲＫ過剰発現した細胞のシグナル伝達能力を測定するために、ＨＥＫ細胞を、等量のＧＲＫｃＤＮＡを含むか含まない１μｇの受容体ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。ついで、これらの細胞を「3Ｈ」−イノシトール中でインキュベートし、［3Ｈ］−ＩＰ蓄積を、基底状態または１μｇのＡｎｇＩＩの添加の際に測定した。図１６Ｃは、野生型ＡＴ1AＲおよびＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈは、１μｇのＡｎｇＩＩでの刺激の際に等量の［3Ｈ］−ＩＰを蓄積することを示す。しかし、ＧＲＫの過剰発現により、アゴニストで刺激したＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈ細胞中の「3Ｈ」−ＩＰの蓄積を完全に止めることができ、野生型ＡＴ1AＲのみがアゴニストで刺激された場合に［3Ｈ］−ＩＰ蓄積を減少させる。
【実施例１５】
【０３６８】
［アレスチン発現の増加によりＧＰＣＲが構成的に脱感作される］
上記のように、バックグラウンドを超えるレベルで発現したＧＲＫにより、ＧＰＣＲが構成的にエンドソームに局在化させることができる。ＧＲＫレベルの増加（野生型に関して）により、ＧＰＣＲのリン酸化が増加する。過リン酸化ＧＰＣＲはアレスチンに対する親和性が増加し（野生型に関して）、それによりＧＰＣＲの構成的エンドソーム局在化が増加する（野生型に関して）。
【０３６９】
同様に、バックグラウンドレベルを超えるアレスチンを発現し、ＧＰＣＲ結合が増加し、それによりＧＰＣＲが構成的に脱感作されるか、最も好ましくはＧＰＣＲが構成的にエンドソームに局在化する。
【実施例１６】
【０３７０】
［ＧＰＣＲ中のリン酸化部位の存在により、構成的に脱感作されたＧＰＣＲが得られる］
図９に記載のように、Ｖ２Ｒ  Ｃ末端テール中のＳＳＳＴＳＳのＡＡＡＡＡＡへの変異（米国特許出願０９／９９３，８４４（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）、Ｏａｋｌｅｙら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、１９４５２〜１９４６０）により、ＧＰＣＲの構成的エンドソーム局在化が阻害される。高度にリン酸化されたアミノ酸（セリンおよびスレオニン）のＧＰＣＲのＣ末端テールのリン酸化部位のより少ないリン酸化アミノ酸（アラニンなど）への変異により、ＧＲＫによるＧＰＣＲリン酸化が減少し、ＧＰＣＲへのアレスチン結合が減少し、ＧＰＣＲのエンドソーム局在化が減少した。
【０３７１】
同様に、一定のＧＰＣＲのＣ末端テールのリン酸化部位でリン酸化の低いアミノ酸の高度にリン酸化可能なアミノ酸（米国特許出願番号０９／９９３，８４４およびＯａｋｌｅｙら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６、１９４５２〜１９４６０に記載）への変異により、ＧＰＣＲのリン酸化が増加する。これらのリン酸化部位を、本発明の修飾ＧＰＣＲのＣ末端テールに付加することができる。得られた修飾ＧＰＣＲは、修飾ＤＲＹモチーフに加えて、そのＣ末端テール中に高度にリン酸化可能なアミノ酸を有し、高度にリン酸化され、増加した親和性（野生型に関して）でアレスチンに結合する。これにより、構成的脱感作、最も好ましくはＧＰＣＲがエンドソームに構成的に局在化する。
【実施例１７】
【０３７２】
［アレスチンノックアウトマウスの使用］
例として、本発明のアレスチンノックアウトマウスを、アレスチンインヒビターのマウスモデルとして使用する。アレスチンインヒビターとして識別されたアンタゴニストを、野生型マウスで分析する。本発明のアレスチンノックアウトマウスを使用して、アレスチンアンタゴニストがアレスチンノックアウトとして機能するかを決定する。
【実施例１８】
【０３７３】
［アレスチンノックアウトマウスの産生］
例として、βアレスチン２ノックアウト（βａｒｒ２−ＫＯ）マウスを、相同組換えによる遺伝子の不活化によって作製した。マウス１２９ｖＪゲノムＤＮＡのλバクテリオファージライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を、ラットβａｒｒ２ｃＤＮＡを使用してスクリーニングした（Ｈ．Ａｔｔｒａｍａｄａｌら、Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７、１７８８２、１９９２）。ポジティブファージを識別し、制限消化によって分析した。１２ｋｂのβａｒｒ２フラグメントをＢａｍＨＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）にサブクローニングし、配列決定した。標的ベクターを、ｐＨＳＶ−ＴＫカセット（ｐＩＣ１９Ｒ／ＭＣＩ−ＴＫ、Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ）、２．８ｋｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ  βａｒｒ２フラグメント、βａｒｒ２の０．８ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントを置換したｐＧＫ−ｎｅｏカセット（プラスミドｐＤ３８３由来、Ｒ．Ｈｅｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、および４．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ  βａｒｒ２フラグメントのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（−）に平滑末端ライゲーションによって構築した。この標的ベクターを、ＮｏｔＩで線状化し、マウス胚幹細胞にエレクトロポレーションした。Ｇ４１８およびガンシクロビルに耐性を示すトランスフェクタント由来のゲノムＤＮＡを、単離し、０．２ｋｂの５’外側βａｒｒ２プローブおよび０．３ｋｂの３’外側βａｒｒ２プローブを使用したサザン（ＤＮＡ）ブロット分析によってスクリーニングした。これらのＥＳ細胞のＣ５７ＢＬ／６未分化胚芽細胞への微量注入によってキメラ動物を作製した。５匹の雄キメラの子供を獲得し、Ｃ５７ＢＬ／６雌と交配した。サザンブロッティングによって生殖系列への伝達を確認した。ヘテロ接合性の子孫を異種交配してホモ接合性マウスを得た。本研究で使用した野生型および変異体マウスは、年齢が一致しており（３〜５月齢）、雄は兄弟であった。タンパク質免疫ブロット分析のために、溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、プロテアーゼインヒビター錠剤１錠／１０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＵＳＡ）、１％のｎｏｎｉｄｅｔ−４０）中でのポリトロン均一化によって全細胞溶解物を調製した。ポリアクリルアミドゲルに２５μｇのタンパク質／レーンでロードし、等しいタンパク質ローディングを、ゲルのＰｏｎｃｅａｕ  Ｓによる染色で確認した。ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに移行後、タンパク質を、βアレスチン２またはβアレスチン１に対するポリクローナル抗体でブロットした（Ｈ．Ａｔｔｒａｍａｄａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７、１７８８２〜１７８９０、１９９２）。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた二次抗体で視覚化し、化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で増強した。
【０３７４】
βアレスチン２を欠くマウスを、サザンＤＮＡブロット分析で識別し、βアレスチン２の不在を脳幹、中脳水道周囲灰白質（ＰＡＧ）組織、脾臓、肺および皮膚からの抽出物のタンパク質免疫ブロッティングによって確認した。βａｒｒ２−ＫＯマウスは生存しており、総表現型異常は含まれていなかった。
【０３７５】
βアレスチン１ノックアウトマウスおよび視覚アレスチンノックアウトマウスを作製し、同様の様式（その代わりとして、βアレスチン１遺伝子および視覚アレスチン遺伝子の不活化）で識別した。
【０３７６】
本発明を種々の特定の材料、手順、および実施例を参照して記載および例示しているが、本発明はこの目的のために選択した材料および手順の特定の組み合わせに制限されないと理解される。当業者によって認識されるこのような詳述の種々の改変された形態が意図される。
【０３７７】
以下は、上記開示、特に実験手順および考察に関連する文献のリストである。以下の書類および上記本文において参照された任意の書類は、引用することにより本明細書の一部をなすものとするとみなすべきである。
【０３７８】
【表１Ａ】
2004524834.tif 000002
【０３７９】
【表１Ｂ】
2004524834.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０３８０】
【図１】本発明を使用することができる例示的且つ非限定的な公知のＧＰＣＲのリストが図１に含まれる。構造の類似性およびリガンドに基づいた古典的分類にしたがって受容体を分類する。
【図２】（ａ）野生型ＤＲＹモチーフおよび（ｂ）修飾ＤＲＹモチーフを示す。
【図３】本明細書中に記載の修飾ＧＰＣＲのアミノ酸配列を示す。野生型配列と異なるアミノ酸を太字および下線で示す。
【図４】ＨＥＫ−２９３細胞におけるＶ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）の発現およびアデニルイルシクラーゼ刺激を示す。Ｖ２Ｒ（黒四角）またはＶ２Ｒ（Ｒ１３７）（□）についてｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした細胞を、種々の濃度の［3Ｈ］ＡＶＰに曝露した。（Ａ）スキャッチャード分析（挿入図）は、受容体が類似のＡＶＰ親和性を有することを示す（Ｖ２Ｒ、１６±６ｎＭ；Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）、１５±３ｎＭ）。Ｖ２Ｒの発現は、１ｍｇの細胞タンパク質あたり、２．５ｐｍｏｌと５ｐｍｏｌとの間で変化し、Ｖ２Ｒ（１３７Ｈ）の原形質膜発現はこれの約１／１２である（スキャッチャードのＸ切片）。データは、３つの実験（各測定点を２回測定）の代表である。（Ｂ）Ｖ２Ｒ（左）またはＶ２Ｒ（１３７Ｈ）（右）を発現する、ローダミンタグ化マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体で標識した生きた透過できないようにした細胞の蛍光画像。（Ｃ）０と２５０ｎＭとの間のＡＶＰ濃度で１５分間刺激した全細胞において測定したｃＡＭＰ。ｃＡＭＰ蓄積を、総［3Ｈ］ｃＡＭＰ数／細胞のウェルあたりの［3Ｈ］アデニンの総取り込みで示す。結果は、３つの実験の平均±ＳＤである。
【図５】ＨＥＫ−２９３細胞におけるＶ２Ｒ−ＧＦＰおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）−ＧＦＰの蛍光画像を示す。Ｖ２Ｒ−ＧＦＰ（上）またはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）−ＧＦＰ（下）を発現する細胞を、賦形剤またはＡＶＰで３０分間３７℃で処理した。原形質膜由来の野生型受容体（上）のアゴニストに媒介される再分布とエンドソーム中のＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）−ＧＦＰのアゴニスト非依存性局在化（下）とを対比させている。バー＝２５μｍ。
【図６】ＨＥＫ−２９３細胞におけるβアレスチン２−ＧＦＰとＶ２ＲまたはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）との間の会合の蛍光画像を示す。左は、Ｖ２Ｒ（上）またはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）（下）を発現する生きた細胞におけるβアレスチン２−ＧＦＰのアゴニスト非依存性分布を示す。アゴニスト処理を使用せずに、βアレスチン２−ＧＦＰは、野生型Ｖ２Ｒを含む細胞（左上）でサイトゾルであるが、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）を含む細胞（左下）ではエンドサイトーシス小胞中でもサイトゾルである。１００ｎＭのＡＶＰへの３０分間の曝露後（右）、βアレスチン−ＧＦＰは、両受容体サブタイプでエンドサイトーシス小胞に局在化する。
【図７】ＨＥＫ−２９３細胞におけるＶ２ＲおよびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）とのβアレスチン２の会合およびリン酸化を示す。（Ａ）βアレスチン２−ＧＦＰおよびＶ２ＲまたはＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）のいずれかと共にダイナミン（Ｋ４４Ａ）を発現させた。Ｖ２ＲのＡＶＰ（１００ｎＭ）（左）への曝露により、明らかにβアレスチン２−ＧＦＰが移動し、細胞内の小胞分布よりもむしろ細胞膜での点状の分布として３０分間継続して視覚可能である。アゴニストの非存在下では、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）を含む細胞はまた、原形質膜の点状領域中にβアレスチン２−ＧＦＰ蛍光分布を示す。アゴニストの存在下でも類似のパターンが明らかであった（右）。（Ｂ）左のパネルは、マウス抗ＨＡ抗体で免疫沈降させ、ウサギ抗ＨＡ抗体でブロットした受容体を示す。６つ全てのレーンで認められるわずかな５０ｋＤａのバンドは、交差反応マウスＩｇ重鎖である。右のパネルは、実験手順に記載のリン酸化についてアッセイした受容体を示す。等量の受容体（４０ｆｍｏｌ）を、各レーンにロードした。矢印は、抗ＨＡ抗体によって明らかとなった約７０、５０、および４０ｋＤａに移動した受容体種の位置を示す。結果は、３つの実験の代表である。
【図８】ＨＥＫ−２９３細胞におけるＶ２Ｒ、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）、およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）の発現を示す。（Ａ）原形質膜受容体を、ローダミンタグ化マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体で標識した。上のパネルは、アゴニストの非存在下での受容体分布を示す。下のパネルは、抗体で標識後、３７℃で３０分間、１００ｎＭのＡＶＰで処理した細胞を示す。（Ｂ）［3Ｈ］ＡＶＰによって測定した原形質膜受容体発現を、野生型Ｖ２Ｒ原形質膜発現に対して正規化した（約５ｐｍｏｌ／ｍｇ）。データを、３つの独立した実験由来の平均±ＳＤとして示す。
【図９】ＨＥＫ−２９３細胞におけるβアレスチン２−ＧＦＰの移動およびＶ２Ｒ、Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）およびＶ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）のアデニルシクラーゼ反応を示す。（Ａ）アゴニストの存在下（左）で、ＧＦＰ蛍光はサイトゾル型である。細胞の１００ｎＭ  ＡＶＰへの３７℃で３０分間の曝露後、ＧＦＰ蛍光は原形質膜の点状領域に再分布する（右）。（Ｂ）細胞を賦形剤または２．５μＭのＡＶＰで１５分間処理し、全細胞のｃＡＭＰを以下の実施例に記載のように決定した。絶対基底（absolute basal）および刺激したｃＡＭＰ反応を、（［3Ｈ］ｃＡＭＰ数／分／ウェル）／（［3Ｈ］アデニン取り込み数／分／ウェル）の単位で示し、それぞれ、模擬物（０．０１９±０．００９、０．０１７±０．００６、ｎ＝３）；Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ）（０．０１８±０．００４５、０．０４０±０．００８、ｎ＝４）；Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ａｌａ６）０．０２０±０．００１７、０．２３±０．０４０、ｎ＝４）；Ｖ２Ｒ（Ａｌａ６）（０．０１７±０．０００６、１．３±０．３１、ｎ＝３）；Ｖ２Ｒ（Ｒ１３７Ｈ、Ｔ３６２）（０．０２２±０．００５６、０．２２±０．０７０、ｎ＝４）；Ｖ２Ｒ（Ｔ３６２）（０．０１５±０．００２１、１．３±０．３４、ｎ＝３）；およびＶ２Ｒ（０．０２１±０．００２４、１．４±０．１９、ｎ＝４）であった。データを、４つの異なる実験に対する平均±ＳＤとして示す。
【図１０】ＨＥＫ−２９３細胞における野生型α1B−ＡＲおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ａの発現を示す。野生型α1B−ＡＲ（黒四角）またはα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ａ変異体（□）についてｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした細胞を、種々の濃度の［3Ｈ］プラゾシンに曝露した。（Ａ）スキャッチャード分析は、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ａ変異体は野生型α1B−ＡＲよりも低いＢmaxを示すことを示す。野生型α1B−ＡＲの原形質膜発現は、１．５と４ｐｍｏｌ／ｍｇの全細胞タンパク質との間で変化し、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ａは、０．２と０．５ｐｍｏｌ／ｍｇとの間で変化した。ノルエピネフリン（ＮＥ）についてのα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ａ変異体のＫDは、ＮＥについての野生型α1B−ＡＲのＫDと類似していた（１．５と３．５ｎＭとの間）。データは、各測定点を２回測定した３つの異なる実験の代表である。（Ｂ）野生型α1B−ＡＲ（左）またはα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ａ（右）を発現する生きた非浸透性ＨＥＫ−２９３細胞の蛍光画像は、野生型α1B−ＡＲと比較してα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ａは低い表面発現を示す。細胞をマウスモノクローナル抗ＨＡ抗体およびマウス抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ結合二次抗体で標識した。
【図１１】イノシトールリン酸（ＩＰ）蓄積のノルエピネフリン（ＮＥ）刺激を示す。ＨＥＫ−２９３細胞を野生型α1B−ＡＲまたはα1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体のｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトし、１０μＭのＮＥで３０分間刺激した。イノシトールリン酸の蓄積を記載のように測定し、［3Ｈ］ＩＰの総数／細胞のウェルとして示す。データは、各測定点を３回測定した３つの異なる実験の代表である。
【図１２】ＨＥＫ２９３細胞における野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３−ＧＦＰ変異体の蛍光画像を示す。（Ａ）非刺激のままの場合、野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰを発現する細胞は、原形質膜に局在化する（左）。細胞への１０μＭのＮＥの添加により、受容体がエンドソームに最分布する（右）。（Ｂ）α1B−ＡＲ  Ｒ１４３−ＧＦＰ変異体を発現する細胞は、アゴニストの非存在下でエンドソーム中に局在化する。
【図１３】βアレスチン−ＧＦＰと野生型α1B−ＡＲまたはα1B−ＡＲ  Ｒ１４３−ＧＦＰ変異体との間の会合のＨＥＫ−２９３細胞における蛍光画像を示す。（Ａ）βアレスチン−ＧＦＰは、野生型α1B−ＡＲと同時発現した場合にサイトゾル中に支配的に分布する（左）。１０μＭのＮＥの添加により、βアレスチン−ＧＦＰが野生型α1B−ＡＲを発現する細胞中の原形質膜に移動する（右）。（Ｂ）α1B−ＡＲ  Ｒ１４３変異体と発現した場合、アゴニストの非存在下でβアレスチン−ＧＦＰは原形質膜に部分的に移動する。
【図１４】フェントラミンと培養するか、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）と同時発現する場合の野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰおよびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３−ＧＦＰ変異体のＨＥＫ−２９３細胞における蛍光画像を示す。（Ａ）野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰ（上）およびα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ−ＧＦＰ（下）を発現する細胞を未処理のままにし（左）、１０μＭフェントラミン中、３７℃で一晩培養するか（中央）、またはダイナミン（Ｋ４４Ａ）と同時発現した（右）。フェントラミン処理およびダイナミン（Ｋ４４Ａ）の同時発現の両方により、エンドソームから原形質膜にα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ−ＧＦＰが再分布する一方で、同一の条件では野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰの分布に対して効果がない。（Ｂ）［3Ｈ］プラゾシンに結合する全細胞を、野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰまたはα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ−ＧＦＰ変異体を発現するＨＥＫ−２９３細胞において評価した。細胞を、未処理のままか、１０μＭフェントラミン中、３７℃で一晩培養するか、ダイナミン（Ｋ４４Ａ）と同時発現させた。野生型α1B−ＡＲ−ＧＦＰよりも低密度で原形質膜上にα1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ−ＧＦＰが発現する。細胞をフェントラミン中で培養するかダイナミン（Ｋ４４Ａ）と同時発現される場合、α1B−ＡＲ  Ｒ１４３Ｅ−ＧＦＰ変異体の発現は野生型受容体のレベルまで増加する。
【図１５】ＨＥＫ−２９３細胞における、野生型ＡＴ1AＲ−ＧＦＰ、ＡＴ1AＲ−Ｒ１２６Ｈ−ＧＦＰ変異体、およびβアレスチン−ＧＦＰの分布を例示する蛍光画像を示す。（Ａ）細胞は原形質膜上にＡＴ1AＲ−ＧＦＰを支配的に発現し、１μＭのアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）の添加により原形質膜からエンドソームに受容体が再分布する（上）。アゴニストの非存在下で細胞はＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈ−ＧＦＰを発現し、１μＭ  Ｌ１５８，８０９中での培養により、受容体が原形質膜に再分布する（下）。（Ｂ）野生型ＡＴ1AＲと同時発現したβアレスチン−ＧＦＰはサイトゾル中に支配的に分布し、１μＭ  ＡｎｇＩＩの添加により、βアレスチンがエンドソームに移動する（上）。それに対して、ＡＴ1AＲ  Ｒ１２６Ｈ−ＧＦＰと同時発現したβアレスチン−ＧＦＰは、アゴニストの非存在下でエンドソーム中に分布し、この分布は、１μＭ  ＡｎｇＩＩの添加により増強される（下）。
【図１６】ＡＴ1AＲのインターナライズに対するＧＲＫの過剰発現の効果を示す。（Ａ）上のパネルは、ＡｎｇＩＩの存在下および非存在下において野生型ＡＴ1AＲでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３中のβアレスチン−ＧＦＰの局在化を示す。下のパネルは、ＧＲＫと同時トランスフェクトした野生型ＡＴ1AＲでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３中のβアレスチン−ＧＦＰの局在化を示す。（Ｂ）上のパネルは、ＡｎｇＩＩの存在下および非存在下におけるＡＴ1AＲのＲ１２６Ｈ変異体でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３中のβアレスチン−ＧＦＰの局在化を示す。下のパネルは、ＧＲＫと同時トランスフェクトしたＡＴ1AＲのＲ１２６Ｈ変異体でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３中のβアレスチン−ＧＦＰの局在化を示す。（Ｃ）上記細胞についての［3Ｈ］−ＩＰ蓄積を決定した。
【図１７】本発明の修飾ＧＰＣＲをコードする核酸配列を示す。野生型配列と異なる核酸を太字および下線で示す。配列は、５’→３’方向で示す。
【図１Ａ】
2004524834.tif 000004
【図１Ｂ】
2004524834.tif 000005
【図１Ｃ】
2004524834.tif 000006
【図２】
2004524834.tif 000007
【図４】
2004524834.tif 000008
【図５】
2004524834.tif 000009
【図６】
2004524834.tif 000010
【図７】
2004524834.tif 000011
【図８】
2004524834.tif 000012
【図９】
2004524834.tif 000013
【図１０】
2004524834.tif 000014
【図１１】
2004524834.tif 000015
【図１２】
2004524834.tif 000016
【図１３】
2004524834.tif 000017
【図１４】
2004524834.tif 000018
【図１５】
2004524834.tif 000019
【図１６Ａ】
2004524834.tif 000020
【図１６Ｂ】
2004524834.tif 000021
【図１６Ｃ】
2004524834.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004524834.tif 000023
2004524834.tif 000024
2004524834.tif 000025
2004524834.tif 000026
2004524834.tif 000027
2004524834.tif 000028
2004524834.tif 000029
2004524834.tif 000030
2004524834.tif 000031
2004524834.tif 000032
2004524834.tif 000033
2004524834.tif 000034
2004524834.tif 000035
2004524834.tif 000036
2004524834.tif 000037
2004524834.tif 000038
2004524834.tif 000039
2004524834.tif 000040
2004524834.tif 000041
2004524834.tif 000042
2004524834.tif 000043
2004524834.tif 000044
2004524834.tif 000045
2004524834.tif 000046
2004524834.tif 000047
2004524834.tif 000048
2004524834.tif 000049
2004524834.tif 000050
2004524834.tif 000051
2004524834.tif 000052
2004524834.tif 000053
2004524834.tif 000054
2004524834.tif 000055
2004524834.tif 000056
2004524834.tif 000057
2004524834.tif 000058
2004524834.tif 000059
2004524834.tif 000060
2004524834.tif 000061
2004524834.tif 000062
2004524834.tif 000063
2004524834.tif 000064
2004524834.tif 000065
2004524834.tif 000066
2004524834.tif 000067
2004524834.tif 000068
2004524834.tif 000069
2004524834.tif 000070
2004524834.tif 000071
2004524834.tif 000072
2004524834.tif 000073
2004524834.tif 000074
2004524834.tif 000075
2004524834.tif 000076
2004524834.tif 000077
2004524834.tif 000078
2004524834.tif 000079
2004524834.tif 000080
2004524834.tif 000081
2004524834.tif 000082
2004524834.tif 000083
2004524834.tif 000084
2004524834.tif 000085
2004524834.tif 000086
2004524834.tif 000087
2004524834.tif 000088
2004524834.tif 000089
2004524834.tif 000090
2004524834.tif 000091
2004524834.tif 000092
2004524834.tif 000093
2004524834.tif 000094
2004524834.tif 000095
2004524834.tif 000096
2004524834.tif 000097
2004524834.tif 000098
2004524834.tif 000099
2004524834.tif 000100
2004524834.tif 000101
2004524834.tif 000102
2004524834.tif 000103
2004524834.tif 000104
2004524834.tif 000105
2004524834.tif 000106
2004524834.tif 000107
2004524834.tif 000108
2004524834.tif 000109
2004524834.tif 000110
2004524834.tif 000111
2004524834.tif 000112
2004524834.tif 000113
2004524834.tif 000114
2004524834.tif 000115
2004524834.tif 000116
2004524834.tif 000117
2004524834.tif 000118
2004524834.tif 000119
2004524834.tif 000120
2004524834.tif 000121
2004524834.tif 000122
2004524834.tif 000123
2004524834.tif 000124
2004524834.tif 000125
2004524834.tif 000126
2004524834.tif 000127
2004524834.tif 000128
2004524834.tif 000129
2004524834.tif 000130
2004524834.tif 000131
2004524834.tif 000132
2004524834.tif 000133
2004524834.tif 000134
2004524834.tif 000135
2004524834.tif 000136
2004524834.tif 000137
2004524834.tif 000138
2004524834.tif 000139
2004524834.tif 000140
2004524834.tif 000141
2004524834.tif 000142
2004524834.tif 000143
2004524834.tif 000144
2004524834.tif 000145
2004524834.tif 000146
2004524834.tif 000147
2004524834.tif 000148
2004524834.tif 000149
2004524834.tif 000150
2004524834.tif 000151
2004524834.tif 000152
2004524834.tif 000153
2004524834.tif 000154
2004524834.tif 000155
2004524834.tif 000156
2004524834.tif 000157
2004524834.tif 000158
2004524834.tif 000159
2004524834.tif 000160
2004524834.tif 000161
2004524834.tif 000162
2004524834.tif 000163
2004524834.tif 000164
2004524834.tif 000165
2004524834.tif 000166
2004524834.tif 000167
2004524834.tif 000168
2004524834.tif 000169
2004524834.tif 000170
2004524834.tif 000171
2004524834.tif 000172
2004524834.tif 000173
2004524834.tif 000174
2004524834.tif 000175
2004524834.tif 000176
2004524834.tif 000177
2004524834.tif 000178
2004524834.tif 000179
2004524834.tif 000180
2004524834.tif 000181
2004524834.tif 000182
2004524834.tif 000183
2004524834.tif 000184
2004524834.tif 000185
2004524834.tif 000186
2004524834.tif 000187
2004524834.tif 000188
2004524834.tif 000189
2004524834.tif 000190
2004524834.tif 000191
2004524834.tif 000192
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524834.tif 000193
【国際調査報告】
2004524834.tif 000194
2004524834.tif 000195
2004524834.tif 000196