(57)【要約】ポリアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の発現のための組換え発現系が提供される。関係するポリアミノ酸がUlp1プロテアーゼにより認識され、開裂されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質として発現される。関係するポリアミノ酸に結合されるアミノ酸配列はSUMO（小ユビキチン様分子）タンパク質からのものであることが好ましい。この配列は好ましい可溶性及び再折り畳み特性を融合タンパク質に与える。精製標識がまた容易な単離のために融合タンパク質にとり込まれてもよい。融合タンパク質を開裂するのに使用されるUlp1プロテアーゼはUlp1プロテアーゼ又は活性Ulp1(403-621)であってもよい。Ulp1プロテアーゼはUlp1開裂部位で本発明の融合タンパク質を迅速かつ特異的に開裂する。Ulp1プロテアーゼにより認識されたアミノ酸配列は非対称に開裂されて関係するポリアミノ酸に結合されたＮ末端セリンのみを残す。この組換え発現系は低可溶性を有し、又はその他の系中で発現し難いポリアミノ酸の発現及び迅速かつ高度に特異的な開裂並びに精製に特に有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ulp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列及び組換え発現系中で発現し難い関係する組換えポリアミノ酸を含むことを特徴とする組換え融合タンパク質。
【請求項２】
組換え発現系中で発現し難いことが知られている関係するポリアミノ酸を含む、請求項１記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
Ulp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列がSUMOのアミノ酸配列、又はその断片である、請求項１記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４】
SUMOがSmt3である、請求項１記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５】
精製標識を更に含む、請求項１記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
Ulp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列が精製標識と関係する組換えポリアミノ酸の間に位置される、請求項５記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
精製標識がUlp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列にＮ末端で位置され、かつ関係する組換えポリアミノ酸がUlp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能なアミノ酸配列にＣ末端で位置される、請求項６記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
Ulp1(403-621)プロテアーゼによる開裂がＮ末端セリンを含む関係する組換えポリアミノ酸を放出する、請求項７記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
精製標識がポリヒスチジン標識である、請求項５記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】
精製標識がコグネイト抗体を特異的に結合するエピトープを含む、請求項５記載の組換えタンパク質。
【請求項１１】
エピトープがGSTエピトープ、フラッグエピトープ又はチオレドキシンエピトープである、請求項１０記載の組換えタンパク質。
【請求項１２】
精製標識が金属イオン荷電アフィニティーカラムに結合するアミノ酸配列を含む、請求項５記載の組換えタンパク質。
【請求項１３】
関係する組換えポリアミノ酸の発現方法であって、その方法が
i)精製標識にＣ末端で位置される関係する組換えポリアミノ酸を含む融合タンパク質（その精製標識及び関係する組換えポリアミノ酸はUlp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列により分離されている）をコードするベクターを用意し、そして
ii)ベクターからの融合タンパク質を好適な組換え宿主細胞中で発現することを含むことを特徴とする組換えポリアミノ酸の発現方法。
【請求項１４】
i)精製標識にＣ末端で位置される関係する組換えポリアミノ酸を含む融合タンパク質（その精製標識及び関係する組換えポリアミノ酸はUlp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列により分離されている）をコードするベクターを用意し、
ii)そのベクターからの融合タンパク質を好適な組換え宿主細胞中で発現し、
iii)その融合タンパク質を精製標識により精製し、そして
iv)その融合タンパク質をUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片で開裂して関係するポリアミノ酸を放出することを特徴とする関係するポリアミノ酸の精製方法。
【請求項１５】
ポリアミノ酸が組換え系中で発現し難い、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ポリアミノ酸が組換え系中で発現し難いことが知られている、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
融合タンパク質をUlp1(403-621)プロテアーゼで開裂してＮ末端セリンを有する関係する組換えポリアミノ酸を放出することを更に含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
Ｎ末端セリンを有する関係する組換えポリアミノ酸を精製することを更に含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
Ｎ末端セリンを有する関係する組換えポリアミノ酸を商用規模で発現し、精製する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
精製標識、Ulp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列及び関係する組換えポリアミノ酸を含む融合タンパク質をコードする組換えベクターであって、その関係するポリアミノ酸が組換え系中で発現し難いことを特徴とする組換えベクター。
【請求項２１】
関係するポリアミノ酸が組換え系中で発現し難いことが知られている、請求項２０記載の組換えベクター。
【請求項２２】
請求項２０記載の組換えベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項２３】
i)精製標識、Ulp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列及び関係するポリアミノ酸をコードする核酸配列をクローン化するのに適した多クローニング部位を含む融合タンパク質をコードする組換えベクター、及び
ii)Ulp1プロテアーゼ製剤
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２４】
Ulp1プロテアーゼがUlp1の活性断片である、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
Ulp1プロテアーゼの活性断片がUlp1(403-621)である、請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
Ulp1(403-621)により開裂可能な発現増進アミノ酸配列がSUMOタンパク質のアミノ酸配列内に見られるアミノ酸配列を含み、キットがSUMOタンパク質のアミノ酸配列を特異的に結合する抗体を更に含む、請求項２３記載のキット。
【請求項２７】
SUMOタンパク質がsmt3である、請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
Upl1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列に特異性の抗体を更に含む、請求項２３記載のキット。
【請求項２９】
Ulp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片により開裂可能な発現増進アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子であって、そのDNA配列がUlp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の下流の制限酵素認識部位を含み、その制限酵素認識部位が関係するポリアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を組換え発現系中でクローン化するのに適していることを特徴とするDNA分子。
【請求項３０】
制限酵素認識部位がBamHI部位である、請求項２９記載のDNA分子。
【請求項３１】
プラスミドpSUMOのBamHI部位からNheI部位まで存在するDNA分子を含む、請求項２９記載のDNA分子。
【請求項３２】
Ulp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片により開裂可能な発現増進アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子を含むDNAベクターであって、そのDNA配列がUlp1(403-621)プロテアーゼにより開裂可能な発現増進アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の下流の制限酵素認識部位を含み、その制限酵素認識部位が組換え発現系中で発現し難い関係するポリアミノ酸をコードするヌクレオチド配列をクローン化するのに適していることを特徴とするDNAベクター。
【請求項３３】
制限酵素認識部位がBamHI部位である、請求項３２記載のDNAベクター。
【請求項３４】
プラスミドpSUMOのヌクレオチド配列を有する、請求項３４記載のDNAベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は2001年５月４日に出願された米国仮特許出願第60/288,656号及び2001年10月12日に出願された米国仮特許出願第60/329,080号（これらの明細書は参考として本明細書にそのまま含まれる）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
多くの組換え発現系が外来タンパク質の生成に利用し得る。例えば、Ausubelら（編集）, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, NY (1999); Wu, R.（編集）, Recombinant DNA methodology II, Academic Press, NY (1995)を参照のこと。利用できる発現系に共通の一つの問題は多くの外来タンパク質を活性形態で高レベルで有効に発現し難いことである。別の難点は関係するタンパク質の発現が発現ベクターを有する宿主細胞中で不溶性無定形物質としてのタンパク質の沈殿をもたらす場合に生じる。特に、発現し難いタンパク質について、有効な発現系に対する要望が存する。最適には、発現系は発現系から容易に精製し得る高レベルの可溶性の、正確に折り畳まれた、又は活性な組換えペプチド又はタンパク質を与えるべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明はUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片（例えば、アミノ酸位置403から621までの断片）により開裂可能な発現増進アミノ酸配列及び関係する組換えポリアミノ酸、特に組換え発現系中で発現し難い組換えポリアミノ酸を含む組換え融合タンパク質を提供する。その融合タンパク質はまた容易な単離のための精製標識を含んでもよい。
更に、本発明は好ましくは精製標識にＣ末端で配置された、関係する組換えポリアミノ酸を含む融合タンパク質をコードするベクターを用意する工程により、組換え発現系中で発現し難い関係する組換えポリアミノ酸を発現する方法を提供する。その精製標識及び関係する組換えポリアミノ酸はUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片、例えば、位置403のアミノ酸残基から位置621のアミノ酸残基までの断片により開裂可能な発現増進アミノ酸配列により分離されている。その融合タンパク質は好適な組換え宿主細胞中でベクターから発現される。
本発明はまたUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片（例えば、アミノ酸位置403から621までの断片）により開裂可能な発現増進アミノ酸配列及び関係する組換えポリアミノ酸を含む組換え融合タンパク質をコードするベクターを用意し、その融合タンパク質を好適な組換え宿主細胞中でベクターから発現し、融合タンパク質を精製標識により精製し、精製融合タンパク質をUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼ断片で開裂することにより関係するポリアミノ酸を精製する方法を提供する。
また、Ulp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片（例えば、アミノ酸位置403から621までの断片）により開裂可能な発現増進アミノ酸配列及び有効なプロモーターから発現された関係する組換えポリアミノ酸を含む組換え融合タンパク質をコードする発現ベクターが提供される。
【０００４】
本発明の別の実施態様において、Ulp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片（例えば、アミノ酸位置403から621までの断片）により開裂可能な発現増進アミノ酸配列及び関係する組換えポリアミノ酸を含む組換え融合タンパク質をコードする発現ベクターを有する宿主細胞が提供される。
また、精製標識、Ulp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片（例えば、アミノ酸位置403から621までの断片）により開裂可能な発現増進アミノ酸配列及び関係するポリアミノ酸（その関係するポリアミノ酸は組換え系中で発現し難い）をコードする核酸配列をクローン化するのに適した多クローニング部位を含む融合タンパク質をコードする組換えベクターを含み、更にUlp1プロテアーゼ製剤を含むキット及び製品が提供される。そのキットはUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片（例えば、アミノ酸位置403から621までの断片）により開裂可能な発現増進アミノ酸配列に特異性の抗体を更に含んでもよい。
更に別の実施態様において、本発明はUlp1プロテアーゼの活性断片を提供する。Ulp1プロテアーゼの活性断片はUlp1のアミノ酸残基403-621を含むことが好ましい。Ulp1プロテアーゼの活性断片は実質的にUlp1のアミノ酸残基403-621からなることが更に好ましい。
更に、本発明はUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片により開裂可能な発現増進アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子及びRNA分子を含む、核酸分子を提供する。Ulp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片により開裂可能な発現増進アミノ酸配列をコードする核酸配列はまたUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼ断片により開裂可能な発現増進アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の下流の制限酵素認識部位を含んでもよい。その核酸分子中に含まれる制限酵素認識部位は関係するポリアミノ酸をコードするヌクレオチド配列をクローン化するのに適している。本発明の核酸分子は組換え発現系中で発現し難い関係するポリアミノ酸の発現及び精製に特に有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は関係するポリアミノ酸及びUlp1プロテアーゼ開裂可能な開裂部位を含む発現増進アミノ酸配列を含む組換え融合タンパク質を提供する。Ulp1プロテアーゼ開裂可能な部位はあらゆるUlp1開裂可能な部位、例えば、ユビキチン様タンパク質、例えば、SUMO（小ユビキチン様分子）からのUlp1プロテアーゼ開裂可能な部位であってもよい。SUMOは、例えば、酵母からのSmt3、又はUlp1により認識され、開裂される能力を保持するSmt3の断片であってもよい。Smt3のこのような断片の例として、Smt3のアミノ酸位置14-98からの断片及びSmt3のアミノ酸位置1-98からの断片が挙げられる。
Smt3アミノ酸配列はサッカロミセス・セレビジエの染色体IVのヌクレオチド位置1,469,403-1,469,708に見られるSMT3遺伝子配列（NCIBデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi）から演繹されてもよい。ゲノム配列及び演繹アミノ酸配列が以下に示される。
【０００６】
S.セレビジエからのSMT3ゲノム配列
2004532033.tif 000002
Smt3アミノ酸配列
SMT3ゲノム配列から演繹されたサッカロミセス・セレビジエSmt3p 101アミノ酸配列は以下のとおりである。
2004532033.tif 000003
【０００７】
融合タンパク質は関係するペプチド又はタンパク質を含み、これは以下に互換可能にポリアミノ酸と称される。ポリアミノ酸は組換え発現系中で発現し難いペプチド又はタンパク質であってもよい。関係するポリアミノ酸はUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片による開裂により融合タンパク質から都合よく放出し得る。好ましい実施態様において、Ulp1プロテアーゼの活性断片はUlp1開裂部位の迅速かつ特異的な開裂をすることができるUlp1プロテアーゼの断片である。最適には、Ulp1プロテアーゼ断片はUlp1(403-621)である。
ポリアミノ酸は組換え発現系中で発現し難いと知られていることが好ましい。ポリアミノ酸はあらゆるサイズのものであってもよく、例えば、約６アミノ酸、好ましくは約10アミノ酸から長さ約300アミノ酸の平均サイズのタンパク質までの短いペプチド、又は更には長さが約600アミノ酸より大きい大きなタンパク質を含む。長さが1000アミノ酸を越える大きなタンパク質はしばしば組換え系中で高レベルで発現し難い。
本明細書の目的のために、組換え系中で発現し難いポリアミノ酸は、従来知られている組換え発現系中で発現される時に非有効もしくは不十分に、又はその両方で発現されるこれらのペプチド及びタンパク質である。組換え系中で発現し難いポリアミノ酸は公知である。発現し難いポリアミノ酸の例として、例えば、膜関連タンパク質、組換え宿主細胞中で沈殿するタンパク質及びペプチド、並びに非天然形態又は不活性形態で生成されるこれらのものが挙げられる。
【０００８】
本件出願の目的のために、非有効な発現はポリアミノ酸の低レベル発現を意味する。これは、例えば、下記の一つ以上を含む、幾つかの原因のいずれかのために生じ得る：プロモーター誘導発現からのコーディングメッセンジャー、mRNAの発現の不十分な効率；mRNAの不十分な安定性；mRNAの不十分な翻訳効率；及び発現された翻訳産物の不十分な安定性。ポリアミノ酸の発現はまたそれが発現される宿主細胞に毒性であり得る。このような毒性は、例えば、欠陥のプロセシング又は膜を横切る欠陥の輸送を含む、幾つかの理由のいずれかのためであるかもしれず、これらの夫々が、特に区画又は細胞構造中の、組換えタンパク質又はペプチドの蓄積を生じることがあり、これらが成長抑制を生じるかもしれず、又は細胞に毒性であるかもしれない。
本明細書の目的のために、非効率的に発現されるポリアミノ酸はその他のペプチド又はタンパク質を有効に発現する組換え発現中で全タンパク質の１重量％以下で発現されるこれらのタンパク質又はペプチドを意味する。有効な発現として、全細胞タンパク質の10％以上の発現が挙げられる。
発現し難いポリアミノ酸として、組換え系中で発現された時に構造又は機能に欠陥があるものが挙げられる。ポリアミノ酸の欠陥発現の例として、例えば、不溶性、無定形、結晶性、不活性又は不正確に折り畳まれたペプチド又はタンパク質の発現が挙げられる。
【０００９】
発現し難いポリアミノ酸の例として、免疫グロブリン鎖が挙げられる。機能性抗体が組換え免疫グロブリン鎖から集合されていた。例えば、Cabillyら“エシェリキア・コリ中で生成された免疫グロブリンポリペプチド鎖からの抗体活性の発生”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1984) 81(11):3273-7並びにSkerra及びPluckthun“エシェリキア・コリ中の機能性免疫グロブリンFv断片の集合”Science (1988) 240:1038-41を参照のこと。
免疫グロブリン機能性ドメインの融合タンパク質がまたE. coli中で発現され、突然変異誘発標識として使用されていた。例えば、Kolmarら“エシェリキア・コリ中の可変免疫グロブリンドメインの構築のための一般の突然変異誘発／遺伝子発現操作：β-ラクタマーゼへの融合によるBence-Jonesタンパク質REIvの生成”J. Mol. Biol. (1992) 228(2):359-65を参照のこと。更に最近、一本鎖抗体及び抗体フラグメントがE. coli中で発現されていた。例えば、Zhouら“ヒトゼラチナーゼＢ抑制一本鎖免疫グロブリン可変フラグメント(scFv)のクローニング及びエシャリキア・コリ中の発現”(1997) FEBS Lett. 414(3):562-6を参照のこと。
本発現系は高レベルの発現を与える。SUMO又はSUMO断片は関係するポリアミノ酸を安定化し、発現された融合タンパク質の溶解性を高めて、宿主細胞に毒性効果を生じないで正確な再折り畳みを可能にし、モノマーの発現を与える。
【００１０】
SUMOはUlp1開裂可能な部位を含むあらゆる小さいユビキチン様分子であってもよい。Ulp1開裂可能な部位を含む小さいユビキチン様分子は酵母のSmt3タンパク質であることが好ましく、又はSmt3タンパク質の断片、例えば、残基13-101からのSmt3のアミノ酸配列によりコードされたタンパク質であることが更に好ましく、或いは1-98からのSmt3のアミノ酸配列によりコードされたタンパク質であることが最も好ましい。Ulp1プロテアーゼ及びUlp1プロテアーゼの活性断片はGly残基とSer残基の間で配列Gly-Gly-Serで部位Smt3を開裂する。Smt3のＮ末端欠失の使用により、本発明者らは残基14-98を含むSmt3の断片がUlp1認識に充分であることを示した。Smt3の更に広範の欠失は折り畳まれたSmt3タンパク質の損失を生じ、こうしてSmt3融合中に存在する場合に認識され、開裂される能力の損失を生じる。
本発明のタンパク質中で、ポリアミノ酸はＮ末端融合又はＣ末端融合としてアミノ酸配列に結合し得る。融合は好ましくはＮ末端でUlp1(403-621)により開裂可能な発現増進アミノ酸配列とのＣ末端融合であることが好ましい。融合タンパク質は容易な精製のために精製標識を更に含んでもよい。精製標識はコグネイト結合剤又は抗体が利用できるあらゆる精製標識であってもよい。コグネイト結合剤が容易に利用できる好ましい精製標識の例はポリヒスチジン標識である。ポリヒスチジン標識のためのコグネイト結合剤は金属アフィニティーカラム、例えば、ニッケルアフィニティーカラムである。その他の有益な精製標識として、コグネイト高アフィニティー抗体が利用でき、又は公知の方法により産生し得るあらゆるエピトープ標識が挙げられる。このような普通の精製標識の例として、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、GSTのエピトープ、チオレドキシン、又はチオレドキシンのエピトープ及びインフルエンザウイルスHA抗原の市販のFLAGエピトープが挙げられる。得られる標識組換えポリペプチドは通常の手段、例えば、ポリヒスチジン標識タンパク質の精製のための既存のNiアフィニティークロマトグラフィーにより精製し得る。
Ulp1開裂可能、又はUlp1(403-621)開裂可能な部位を有する融合タンパク質のUlp1開裂部位を開裂することができるあらゆるプロテアーゼが精製後の関係する組換えポリアミノ酸から標識発現増進部分を特異的に開裂し、放出するのに使用し得る。好適なプロテアーゼの例として、Ulp1プロテアーゼ、Ulp1プロテアーゼの活性断片、又は好ましい実施態様において、Ulp1プロテアーゼの断片、例えば、Ulp1のアミノ酸残基403-621を含む断片が挙げられる。最適には、Ulp1のアミノ酸残基403-621を含むUlp1プロテアーゼの断片はUlp1(403-623)断片である。Ulp1又はUlp1の活性断片による組換えポリペプチドの開裂は酵母中の完全長SUMOからその成熟形態へのプロセシングと同様である。
【００１１】
Ulp1開裂部位を含む融合タンパク質の開裂は迅速かつ高度に特異的である。この開裂反応は多くのその他の部位特異性プロテアーゼを抑制する条件下で有効に行ない得る。例えば、融合タンパク質は緩衝剤、イオン濃度及び融合タンパク質並びにUlp1断片、例えば、Ulp1(403-621)断片の濃度の通常の条件下で４℃で開裂し得る。
また、本発明は上記組換え融合タンパク質をコードする核酸分子及び発現ベクターを提供する。本発明の核酸分子はUlp1プロテアーゼ又はUlp1プロテアーゼの活性断片により開裂可能な発現増進アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するDNA分子及びRNA分子を含む。核酸は起源が天然であってもよく、又は合成であってもよい。合成成分及び天然成分の両方を含む半合成核酸分子が本発明において意図されている。半合成は特異な制限部位及びプロテアーゼ開裂部位をコードする配列又は特異性エピトープ等の導入に特に有益である。
発現ベクターは当業界で知られている多くの発現ベクターから選ばれたあらゆる発現ベクターであってもよい。発現ベクターは細菌発現ベクターであることが好ましい。ベクターは強力プロモーター、精製標識をコードする配列及びコードされたUlp1開裂可能なアミノ酸配列とのイン-フレーム(in-frame)のポリアミノ酸をコードする断片のクローニングのための少なくとも一つのクローニング部位、又は多クローニング部位を含む。プロモーターはあらゆる強力プロモーターであってもよい。強力プロモーターは構成的プロモーター又は調節プロモーターであることが好ましい。好適なプロモーターが当業界で公知である。幾つかの例として、T7プロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター及びtacプロモーターのいずれか一種が挙げられる。強力プロモーターを含む好ましいベクターはノバゲン（マジソン、WI）から市販されるpET28bである。
【００１２】
精製標識はあらゆる精製標識、又はアフィニティー標識、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、FLAGTMエピトープ、ストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、及びインテイン又は精製に利用できる高アフィニティー抗体により認識されるあらゆるエピトープであってもよい（これらの標識及びその他の標識並びに有益な精製技術だけでなくタンパク質発現及び精製のための多くの一般方法の例がSambrook及びRussel, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第３編, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor Press, NYに見られる）。
米国特許第4,851,341号は多陰イオンアミノ酸残基を含むＮ末端を有する組換え融合タンパク質の精製方法を記載している。その方法はその配列に特異性の２価陽イオン依存性モノクローナル抗体とのそのタンパク質の複合体を生成し、複合体を単離し、その複合体と接触する２価陽イオンの濃度を選択的に枯渇することにより抗体及びタンパク質を解離することを含む。特別なカルシウム依存性モノクローナル抗体、4E11がペプチドDYKDDDDKを同定又は精製のために融合タンパク質にとり込む方法にそのコグネイト抗体として使用されてもよい。このような方法及び融合タンパク質はまた本発明の実施に有益であるかもしれない。
多クローニング部位(MCS)はBamHI部位及び停止コドンを含むことが好ましいが、イン-フレームＣ末端クローニング戦略と適合性のあらゆる制限酵素部位が好適である。大きい精製標識が幾つかの適用に便利であるかもしれない。これらの大きい精製標識として、例えば、スタフィロコッカスのプロテインＡ（Uhlenら, 1983, Gene 23:369）、E.coli trpE、アントラニレートシンセターゼ（Itakuraら, 1977, Science 198:1056）及び細菌のβ-ガラクトシダーゼ（Grayら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6598）が挙げられる。
【００１３】
融合タンパク質は関係するポリアミノ酸及び一種以上の精製標識、エピトープ標識等を含んでもよい。融合タンパク質は一つの側でUlp1又はUlp1断片により開裂可能な部位により、また他の側で別の開裂可能な部位により境界された関係するポリアミノ酸を含んでもよい。その他の開裂可能な部位として、コラゲナーゼ（Germino＆Bastis, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4692）、レニン（Haffeyら, 1987, DNA 6:565）、因子Xaプロテアーゼ（これはatを開裂する）（Nagai＆Thogersen, 1984, Nature 309: 810）、エンテロキナーゼ（Prickettら, 1989, BioTechniques 7:580）により開裂可能な部位が挙げられる。
酵素開裂ではなく化学的開裂を使用する融合系がまた報告されていた（総説について、Nilsson, B., Meth. Enz. 198:3 (1991)を参照のこと）。この系では、スタフィロコッカスのプロテインＡがIgG-セファロースによるアフィニティー精製を促進する融合タンパク質のアミノ末端部分を形成する。融合タンパク質を生成するのに使用されるベクターはプロテインＡのシグナル配列、プロテインＡのIgG結合ドメインの二つのコピー、続いて関係するペプチド又はタンパク質を逐次（アミノ末端からカルボキシ末端へ）含む。プロテインＡのシグナル配列は培地中の融合タンパク質の出現を促進する。精製後に、関係するポリアミノ酸がヒドロキシルアミン、臭化シアン又はN-クロロスクシンアミドによる処理により融合タンパク質から開裂される。ヒドロキシルアミンは配列Asn-Gly間で開裂し、こうして関係するポリアミノ酸の最初のアミノ酸がグリシンであることを必要とする。臭化シアンはメチオニン残基で開裂し、それ故、関係するポリアミノ酸が内部メチオニン残基を含む場合、部分消化が行なわれる必要がある。N-クロロスクシンアミドはトリプトファン残基のカルボキシ末端側で開裂し、それ故、関係するポリアミノ酸はトリプトファン残基を含んではならない。こうして、融合タンパク質の化学的開裂と連係するプロテインＡ融合系の使用は制限される。化学的開裂は関係するポリアミノ酸の内部の特別な残基の不在又は関係するポリアミノ酸とリンカー配列の間の結合部における配列中の特別なアミノ酸の存在を必要とする。
【００１４】
本発明の実施は当業界で知られている通常の分子生物学、微生物学及び組換えDNA技術を使用する。これらの技術は公知であり、文献に充分に開示されている。例えば、Sambrook及びRussel（編集）, Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2001, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor Press, NY; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait編集, 1984; Transcription and Translation, Hames＆Higgins, 1984を参照のこと。
融合タンパク質及びそれをコードするベクターの要素の例のスキームが図1Aに示される。Smt3の天然Ｃ末端グリシン（位置98）はBamHI部位のコードされたイン-フレームグリシンとオーバーラップする。
組換え融合タンパク質は好適な宿主細胞中で発現される。宿主細胞は原核生物宿主細胞であってもよく、又は宿主細胞は真核生物宿主細胞であってもよい。好適な宿主は原核生物宿主、例えば、E. coli細胞であることが好ましい。好適な別の宿主として、低い内因性Ulp1様開裂活性を有する真核生物宿主が挙げられる。組換え発現ベクター及び好適な宿主細胞の組み合わせが組換え発現系と普通称される。
一実施態様において、ベクターは関係するポリアミノ酸に融合された酵母SUMOの発現増進アミノ酸配列、Smt3のHis標識融合タンパク質を発現するDNAプラスミドベクターを含むことが好ましい。このような組換え融合タンパク質を発現する発現及び精製系は市販の系に対し幾つかの利点又は特徴を有する。これらの利点として、下記のものが挙げられる。
1.Smt3組換え融合タンパク質はモノマーであり、可溶性であり、かつ細菌中で高度に過剰発現される。精製標識、例えば、ポリヒスチジン標識(His標識)を含む実施態様において、組換え融合タンパク質は通常の方法（例えば、His標識融合タンパク質の場合にはNiアフィニティークロマトグラフィー）により容易に精製し得る。
2.組換え融合タンパク質の標識Smt3部分は高度に可溶性であり、単独で発現される場合に不溶性又はほんの部分的に可溶性であるポリアミノ酸の増大された溶解性をもたらす。
【００１５】
3.組換え融合タンパク質の標識Smt3部分は小さく、たとえあってもわずかな干渉を通常の折り畳みプロセスに与え、発現された組換え融合タンパク質が不溶性である場合には再折り畳みを可能にする。
4.組換えタンパク質の標識Smt3部分は短く、長さが100アミノ酸のオーダー（His標識Smt3構築物の一実施態様では118残基）であり、Smt3に融合された組換えポリアミノ酸の質量％を現在利用できる発現系よりも高くする。
5.かなりの利益が、Smt3（又はSmt3断片）（これは順に関係するポリアミノ酸に結合される）に結合されたＮ末端標識を含む標識Smt3融合分子中で、Smt3のＮ末端標識が関係するポリアミノ酸とは反対の方向に配向されるという事実に由来する。これはたとえ標識Smt3融合分子が精製標識を結合することにより固定される場合であっても、Ulp1開裂部位が開裂のために接近できることを確実にする。
6.Ulp1断片、Ulp1(403-621)pは安定であり、活性であり、Smt3に対し高度に特異性であり、組換えポリアミノ酸融合パートナーのバックグラウンドタンパク質分解をたとえあったとしてもわずかにもたらす。これは夫々の融合パートナーが非特異的タンパク質分解（即ち、折り畳まれていない組換えペプチド融合）を受け易い系に特に重要である。
7.Smt3のエピトープを特異的に結合するSmt3抗体が利用できる。その抗体はこのSmt3エピトープを有するSmt3組換え融合タンパク質を結合し、たとえ低レベルで発現された場合でもこれらの組換え融合タンパク質を検出するのに使用し得る。
8.組換え融合タンパク質から開裂された関係するポリアミノ酸は、pSUMOのBamHI部位にクローン化され、Smt3と融合パートナーの間に位置された場合に、放出された組換えポリアミノ酸生成物のＮ末端に唯一の非天然の付加アミノ酸（セリン）を含む。
9.同位体標識媒体中のSmt3-融合タンパク質／ペプチドの発現はNMR研究に適したサンプルをもたらすであろう。この特徴は合成により誘導された標識ポリアミノ酸の手の出せないコストのために高度に望ましい。
10.多量の組換えペプチドが一部Smt3により与えられる安定性及びUlp1によるSmt3からのペプチドの正確な開裂のために組換え宿主系から得られる。15merペプチド融合の一例において、ペプチド5-10mgが細菌培養液１リットル当り生成された。
【００１６】
あらゆる組換えベクター系へのATG翻訳開始部位、Smt3断片及び多クローニング部位(mcs)をコードするDNAの挿入のための核酸カセットがまた提供される。このカセットはあらゆる好適な組換えベクター系に挿入されてもよく、あらゆる関係するポリアミノ酸をコードする核酸の挿入のためのベクターを生成し得る。好適なベクターとして、プラスミドベクター及びファージベクターが挙げられる。幾つかの好適な原核生物クローニングベクターはE. coliからのプラスミド、例えば、colE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、pKSM、及びRP4を含む。原核生物ベクターはまたファージDNAの誘導体、例えば、M13fd、及びその他の繊維状一本鎖DNAファージを含む。
細菌、特にE.coli中でタンパク質を発現するのに適したその他のベクターとして、pK233（又はtacファミリーのいずれか）プラスミド、T7、ｐブルースクリプトII、バクテリオファージラムダZAP、及びラムダPL（Wu, R.（編集）, Recombinant DNA Methodology II, Methods Enzymol., Academic Press, Inc., New York, (1995)）が挙げられる。融合タンパク質を発現するベクターの例はDieckmann及びTzagoloff, J. Biol. Chem. 260, 1513-1520 (1985)により記載されたPATHベクターである。これらのベクターはアントラニレートシンセターゼ(TrpE)をコードするDNA配列続いてカルボキシ末端にあるポリリンカーを含む。その他の発現ベクター系はβ-ガラクトシダーゼ（pEX）；マルトース結合タンパク質（pMAL）；グルタチオンS-トランスフェラーゼ（pGST又はPGEX）（Smith, D.B. Methods Mol. Cell Biol. 4:220-229 (1993); Smith, D.B.及びJohnson,K.S., Gene 67:31-40 (1988);並びにPeptide Res. 3:167 (1990)を参照のこと）、及びTRX（チオレドキシン）融合タンパク質(TRXFUS)（LaVallie, R.ら, Bio/Technology 11:187-193 (1993)を参照のこと）をベースとしている。更なる例が本明細書に参考として含まれるSambrook及びRussel, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第３編, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor Press, NYに見られる。
【００１７】
また、ATG翻訳開始部位及びSmt3断片をコードするDNAの挿入のための単一制限酵素認識部位をコードするカセットが上記のようなクローニングベクターに挿入されてもよく、そのベクターは関係するポリアミノ酸をコードする核酸を挿入するのに適したトポイソメラーゼであってもよい。その他のトポイソメラーゼクローニングベクターがインビトロゲン社（カールズバッド、CA）から入手でき、その社はトポイソメラーゼクローニング系の詳細な記載を提供する。
【００１８】
残基403-621からのUlp1プロテアーゼ断片は顕著な性質を有する。それは天然完全長Ulp1と同じ開裂特異性を有するが、極めて活性である。例えば、Ulp1(403-621)によるSmt3-GST融合の開裂は緩衝液のpH及びイオン濃度の通常の条件下で４℃でさえも迅速かつ特異的に起こり、この場合、その他の部位特異性プロテアーゼによる開裂は、非特異的開裂が明らかになる時の一夜の如き延長期間後を除いて殆どごくわずかであるように低いであろう。基質1.0mg/ml及びUlp1(403-621)p 10-3-10-4mg/mlとの開裂反応に関する通常の条件は150 mM NaCl、1 mM DTT、10 mM トリス-HCl pH 8.0中で30℃で行なわれる。また、開裂は３時間にわたって37℃で溶解緩衝液：330 mM トリス-HCl pH 8.0、75 mM EDTA、1 mM PMSF、2 mMジチオスレイトール(DTT)中で行なわれてもよい。
Ｃ末端His標識Smt3(13-101)がpET-28bから発現され、Ulp1(403-621)pとして精製された。Smt3-GFPuvはSMT3をpGFPuv（クロンテク、パロアルト、CA）につなぐことにより構築され、JM109 E.coli細胞中で発現され、通常のクロマトグラフィー技術により精製され、蛍光を使用して検出された。Sumo-p-HisはSmt3(13-101)pとして調製された。His6-ユビキチン-Smt3-HAはJM109 E.coli細胞中でQE30（Li及びHochstrasser, 1999, Nature 398:246-251）から発現され、Niアフィニティークロマトグラフィー技術及び通常のクロマトグラフィー技術により精製された。
トロンビン感受性開裂部位を有する組換えSmt3-GST融合タンパク質は一夜にわたって室温でさえもUlp1(403-621)により開裂されるUlp1感受性部位よりも遅く開裂されて不完全な消化産物を残す。更なるインキュベーションが非特異的消化をもたらす。対照的に、プロテアーゼ断片Ulp1（残基403-621）は酵素及び基質の濃度の同じ条件下で１時間で完全かつ特異的に開裂し、非特異的開裂がSDS-PAGE分析により判断して検出できない。開裂の同様の特異性がその他のプロテアーゼ、例えば、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼで得られるが、その開裂反応速度はUlp1のそれと較べた場合に非常に遅く、特にUlp1(403-621)と較べた場合に一層遅い。
【実施例】
【００１９】
Smt3融合カセットをPCRにより構築して3'ヌクレオチドを突然変異させて3'BamHI制限部位を収容してUlp1(403)p開裂部位と夫々の融合パートナーの間のアミノ酸の数を最小にした。S.セレビジエゲノムDNAを鋳型として使用してその構築物をPCRによりつくった。２種のプライマー、5'プライマー及び3'プライマーを構築してpET28b（ノバゲン、マジソン、WI）へのSmt3カセットのクローニングを促進した。これらの5'プライマー及び3'プライマーのヌクレオチド配列は以下のとおりである。
2004532033.tif 000004
Smt3コードされたアミノ酸を上の場合の文字で夫々のアミノ酸を特定するコドンの下に１文字アミノ酸コードで表す。
2004532033.tif 000005
Smt3逆補体コードされたアミノ酸を上の場合の文字で表す。プライマー中で変化されるセリン残基を下の場合の文字で表す。
Smt3についての天然Ｃ末端コドン及び残基はそれらが天然に生じるとおりに下記のとおりである。
2004532033.tif 000006
【００２０】
１文字アミノ酸コードを逆（アンチセンス）プライマーのアンチコドンの下に示す。＊は翻訳ターミネーター配列の逆補体を表し、TAGは天然Smt3遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA配列中のUAGに相当する。
酵母（S.セレビジエ）ゲノムDNA鋳型についてのプライマー延長及び更なるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により、ACCグリシンコドンをTCCに突然変異させてUlp1開裂部位をオーバーラップするBamHI配列を生成した。
PCR産物をNheI及びBamHIで開裂して、pET28bのこれらの夫々の部位にクローン化して、Ｎ末端トロンビン開裂可能なヘキサヒスチジン標識Smt3融合タンパク質を生じた。次いで関係するポリアミノ酸又は遺伝子をコードする核酸をBamHI部位及びベクター、この場合にはpET28bの多クローニング部位領域中のあらゆるその他の下流部位にクローン化することができる。このプラスミド、pSUMOをATCC（マナサス、VA）に受理番号    として    （日付）に寄託する。
実施例１．ヒトＩκＢαの配列から誘導された14merペプチドの発現、開裂及びHPLC精製
ＩκＢαペプチドのコーディング領域を、Ｎ末端BamHI部位、ＩκＢαのコーディング領域中に含まれる14アミノ酸、及び停止コドン続いてHindIII制限酵素部位をコードする相補PCRオリゴヌクレオチドを操作することにより設計した。相補プライマーをアニールし、夫々の制限酵素で消化し、ゲル精製し、ヘキサヒスチジン標識Smt3コーディング領域を含むベクターにつないだ。E. coliの発現株を得られるプラスミドで形質転換し、増殖させ、培養物をタンパク質発現のために誘導した。Smt3-ＩκＢα組換え融合タンパク質をNiアフィニティーカラムにより細菌溶解産物から単離し、ゲル濾過により分級した。1:1000の質量比のUlp1とSmt3融合を使用して得られるピークを開裂した。２時間後に、混合物をC18逆相HPLCにより精製し（図1B）、ピークをSDS-PAGEにより分析した（図２を参照のこと）。
【００２１】
実施例２．膜関連ホスファチジルセリンシンターゼ(PSS)酵素の発現、精製
遺伝子をE. coli及びS.セレビジエからクローン化し、E. coli中で発現させ、精製した（図３）。Ｃ末端ヒスチジン標識E. coliホスファチジルセリンシンターゼ(PSS)構築物を充分に発現させずにクーマシーブルー染色SDSゲルによる視覚化を可能にし、又はNiカラムアフィニティークロマトグラフィーによる精製に充分な量で発現させた。如何なる特別な理論により束縛されないが、本発明者らは膜タンパク質が一般に細菌発現系から発現し、精製するのに非常に困難であると考える。対照的に、本発明の組換え融合タンパク質の発現増進アミノ酸配列との融合は組換えタンパク質の発現及び可溶性の両方を増大する。これは、例えば、S.セレビジエPSS酵素、及び融合タンパク質のS.セレビジエPSS酵素の性質の比較により示される。融合タンパク質のS.セレビジエPSS酵素へのＮ末端Smt3標識はこの酵素の発現特性を増進する。
実施例３．Smt3融合系を含むプロテアーゼ感受性mRNAキャッピングタンパク質の発現、精製、及び開裂
この実施例はプロテアーゼ感受性mRNAキャッピングタンパク質の分解が検出されなかったことを示すことによりUlp1プロテアーゼにより示されるプロテアーゼ特異性を実証する。S.セレビジエ（図４）及びカンジダ・アルビカンス（図５）からのmRNAキャッピング酵素はトロンビン、因子Xa、又はプレシッション(Precission)プロテアーゼ（ファーマシア、カラマズー、MI）に暴露される場合にタンパク質分解に非常に感受性である。Smt3融合系を使用して数種のキャッピング酵素構築物を調製してUlp1開裂配列の後に正確な開裂部位を有する物質を得た。Niアフィニティークロマトグラフィーを使用して酵素を精製した。Smt融合の開裂を上記のように1:1000の質量比のプロテアーゼと融合タンパク質を含む1-2時間の反応で行なった。
【００２２】
実施例４．完全長ヒトＩκＢαとのSmt3融合
Smt3融合系を使用して完全長ヒトＩκＢαの発現、精製、及び開裂を行なった（図６）。
２種のプライマー、BamHI制限酵素配列及び残基1-7をコードするＩκＢαのDNA配列をコードする5'プライマー、及びＩκＢα残基478-485、停止コドン、及びHindIII制限酵素部位をコードする配列をコードする3'プライマーを使用して、完全長ＩκＢα（GenBank受理番号M69043）のコーディング配列をヒトcDNAライブラリーから増幅した。PCR産物をSmt3融合配列を含むベクターにサブクローニングした。得られる構築物を使用してE. coli中でポリヒスチジン標識Smt3-ＩκＢα組換え融合タンパク質を過剰発現した。得られる組換え融合タンパク質をE. coli溶解産物から精製し、Niアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、Ulp1プロテアーゼで開裂した。
その他の研究所は組換え発現系中の不溶性ＩκＢαの発現を含む、難点を報告していた。ここでは、有効な発現がSmt3との融合分子の部分としてのＩκＢαを発現することにより得られた。このアプローチは発現問題を軽減し、多量の可溶性タンパク質がSmt3融合系から精製されることを可能にした。本発明を実施するのに有益な更なる物質及び方法が“Ulp1-SUMO結晶構造及び遺伝子分析が保存された相互作用及び酵母中の細胞増殖に必須の調節要素を明らかにする”及びLi＆Hochstrasser, 1999, Nature 398:246-251に記載されている。
当業者は意図される本発明の全範囲及び本明細書及び請求の範囲により包含されるその均等物を直ちに認めるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】本発明の融合タンパク質の略図を示す。融合タンパク質は融合タンパク質をコードする発現ベクターの強力プロモーターから発現された関係するポリアミノ酸、Ulp1開裂部位を含むSmt3断片及びポリヒスチジン標識を含む。
【図１Ｂ】高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)トレースを示す。HPLCトレース中のピーク１は図２に示されたSDS-PAGEゲル中のレーン２のサンプルに相当する。HPLCトレース中のピーク２は図２のSDS-PAGEゲル中のレーン３及び４のサンプルに相当する。HPLCトレース中のピーク３は図２のSDS-PAGEゲル中のレーン５のサンプルに相当する。HPLCトレース中のピーク４は図２のSDS-PAGEゲル中のレーン６のサンプルに相当する。
【図２】Smt3-ＩκＢα融合のHPLC精製のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析を示す。レーン１はカラムに装填された混合物を含む。レーン２、３、及び４は非タンパク質吸収物質を含む。レーン５はＩκＢαペプチドを含む。レーン６はSmt3を含む。
【図３】E. coli及びS.セレビジエホスファチジルセリンシンターゼ(PSS)の発現産物のSDS-PAGE分析を示す。レーン1-4：Ｎ末端Smt3標識E. coli PSS。レーン１：誘導された培養物。レーン２：溶解された培養物。レーン３：洗剤可溶性画分。レーン４：精製Niアフィニティー画分。レーン5-8：Ｃ末端ヒスチジン標識E. coli PSS。レーン５：誘導された培養物。レーン６：溶解された培養物。レーン７：洗剤可溶性画分。レーン８：精製Niアフィニティー画分。レーン9-12：Ｎ末端Smt3標識S.セレビジエPSS。レーン９：誘導された培養物。レーン10：溶解された培養物。レーン11：洗剤可溶性画分。レーン12：精製Niアフィニティー画分。レーン13：分子量標準物質。
レーン４及び12に明らかな高分子量バンドは組換えSmt3-PSS酵素に相当する。Smt3融合の若干の分解がレーン12で明らかである。
【図４】SDS-PAGEにより分析されたS.セレビジエmRNAトリホスファターゼの精製画分を示す。レーン１：Smt3融合。レーン２：開裂後のSmt3及び融合パートナー。レーン３：Smt3融合。レーン４：トロンビン開裂。レーン５：Smt3。レーン６：分子量標準物質。
【図５】SDS-PAGEにより分析されたC.アルビカンスキャッピング酵素の精製画分を示す。レーン１：分子量標準物質。レーン２：開裂後のmt3及びキャッピング酵素。レーン３：Smt3-キャッピング酵素融合。レーン４：開裂後のSmt3及びキャッピング酵素。
【図６】SDS-PAGEにより分析されたUlp1開裂前後のＩκＢαタンパク質の精製画分を示す。レーン1-3：Ni精製Smt3-ＩκＢα融合タンパク質の画分。レーン4-5：開裂後のSmt3及びＩκＢα。レーン6-7：レーン4-5のサンプルの低ローディング。
【図１Ａ】
2004532033.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004532033.tif 000011
【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2004532033.tif 000014
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532033.tif 000045
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532033.tif 000046
2004532033.tif 000047
2004532033.tif 000048