(57)【要約】多糖含有材料を架橋するためのおよび／または多糖含有材料の特性を改変するための組成物が提供される。多糖含有材料を架橋する方法は多糖構造物をＰＢＤ融合タンパク質で処理する工程を含む。多糖含有材料の特性は機能性成分を含むＰＢＤ融合タンパク質を用いた処理によって機能化され得る。増大した湿潤強度および／または弾性を有する紙および織物の如き多糖含有材料が記述される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触を、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および／またはその後に行い、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法。
【請求項２】
多糖含有材料の前記多糖構造物と前記多糖結合ドメイン含有組成物との接触が、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多糖含有材料の前記多糖構造物と前記多糖結合ドメイン含有組成物との接触が、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する途中において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
多糖含有材料の前記多糖構造物と前記多糖結合ドメイン含有組成物との接触が、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多糖含有材料が、紙、織物材料、糸および繊維からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記構造的性質が、前記多糖含有材料の多糖構造物間の所定レベルの架橋、前記多糖含有材料の多糖構造物の所定の凝集、および多糖含有材料の所定の表面性状からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化学的性質が、所定の疎水性、所定の親水性、所定の濡れ性、所定の化学的反応性、所定の光化学的反応性、所定の機能性、および所定の表面張力からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記物理的性質が、所定のヤング率、最大負荷における所定のひずみ、所定の破壊到達エネルギー、所定の水吸収性、所定の膨潤性、および所定の靱性からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記電気的性質が、所定の表面電荷および所定の電気伝導度からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記機械的性質が、所定の引張り強度、所定の剪断耐性、所定の耐摩耗性、所定の摩擦係数、所定の弾性、および所定の湿潤強度からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した少なくとも１つのさらなる多糖結合ドメインとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した別のタンパク質とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した疎水性基とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した親水性基とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した生物学的成分とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した酵素とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的反応性基とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的光反応性基とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したリパーゼとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したラッカーゼとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したプロテインＡ抗体とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したペプチドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリペプチドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した炭化水素または炭化水素誘導体とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した脂肪酸誘導体とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した電気的荷電成分とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したイオン性成分とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したケイ素結合性成分とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリマー結合性成分とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネイン様タンパク質とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェリチンとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属結合性成分とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した細菌シデロホアとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネインとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したチオール基とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したアルデヒドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したマレイミドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したヒドラジドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したエポキシドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したカルボジイミドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェニルアジドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、セルロース結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、デンプン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、セルロースに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、デンプンに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、キチンに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、グルカン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、連鎖球菌のグルカン結合反復を含む多糖結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
多糖構造物を含む多糖含有材料；および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖含有材料に少なくとも１つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質をもたらす組成物。
【請求項５１】
前記多糖含有材料が、紙、織物材料、糸および繊維からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記構造的性質が、前記多糖含有材料の多糖構造物間の所定レベルの架橋、前記多糖含有材料の多糖構造物の所定の凝集、および多糖含有材料の所定の表面性状からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
前記化学的性質が、所定の疎水性、所定の親水性、所定の濡れ性、所定の化学的反応性、所定の光化学的反応性、所定の機能性、および指定の表面張力からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５４】
前記物理的性質が、所定のヤング率、最大負荷における所定のひずみ、所定の破壊到達エネルギー、所定の水吸収性、所定の膨潤性、および所定の靱性からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５５】
前記電気的性質が、所定の表面電荷および所定の電気伝導度からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５６】
前記機械的性質が、所定の引張り強度、所定の剪断耐性、所定の耐摩耗性、所定の摩擦係数、所定の弾性、および所定の湿潤強度からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５７】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した少なくとも１つのさらなる多糖結合ドメインとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５８】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した別のタンパク質とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５９】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した疎水性基とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６０】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した親水性基とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６１】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した生物学的成分とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した酵素とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６３】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的反応性基とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６４】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的光反応性基とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６５】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したリパーゼとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６６】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したラッカーゼとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６７】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したプロテインＡ抗体とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６８】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したペプチドとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項６９】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリペプチドとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７０】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した炭化水素または炭化水素誘導体とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７１】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した脂肪酸誘導体とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した電気的荷電成分とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したイオン性成分とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７４】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したケイ素結合性成分とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７５】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリマー結合性成分とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７６】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７７】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネイン様タンパク質とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７８】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェリチンとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項７９】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属結合性成分とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８０】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した細菌シデロホアとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８１】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネインとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したチオール基とを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８３】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したアルデヒドとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８４】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したマレイミドとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８５】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したヒドラジドとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８６】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したエポキシドとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８７】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したカルボジイミドとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８８】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェニルアジドとを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項８９】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、セルロース結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項９０】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、デンプン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項９１】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、セルロースに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、デンプンに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項９３】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、キチンに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項９４】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、グルカン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項９５】
前記多糖結合ドメイン含有組成物が、連鎖球菌のグルカン結合反復を含む多糖結合ドメインを含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項９６】
多糖構造物を含む多糖含有材料；および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、前記多糖含有材料の前記多糖構造物を架橋する多糖結合ドメイン連結剤を形成する少なくとも２つの共有結合した多糖結合ドメインを含む組成物。
【請求項９７】
多糖構造物を含む多糖含有材料；および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している機能化成分とを含み、前記少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、前記機能化成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
【請求項９８】
多糖構造物を含む多糖含有材料；および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している疎水性成分とを含み、前記少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、前記疎水性成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
【請求項９９】
多糖構造物を含む多糖含有材料；および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している親水性成分とを含み、前記少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、前記親水性成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
【請求項１００】
多糖構造物を含む多糖含有材料；および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している化学的反応性成分とを含み、前記少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、前記化学的反応性成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
【請求項１０１】
多糖構造物を含む多糖含有材料；および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している光化学的反応性成分とを含み、前記少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、前記光化学的反応性成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
【請求項１０２】
少なくとも２つの共有結合した多糖結合ドメインを含む多糖結合ドメイン連結剤を含む組成物。
【請求項１０３】
少なくとも２つの多糖結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
【請求項１０４】
前記少なくとも２つの多糖結合ドメインを連結する少なくとも１つのリンカーペプチドをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０３に記載の核酸構築物。
【請求項１０５】
少なくとも１つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメインとの接触を、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および／またはその後に行い、その後、少なくとも１つの成分または基を前記多糖結合ドメインに共有結合させ、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、生物学的実体または化学的実体に融合または連結した多糖結合ドメインの多量体構造物に基づく生物学的架橋剤を使用して、多糖材料の構造的性質、化学的性質、物理的性質および機械的性質を変化させるための方法および組成物、ならびにそれによって得られる生物学的組成物に関する。本発明は、ティッシュペーペー、ろ紙および綿糸の機械的性質（湿潤強度など）を高めるために、２つのセルロース結合ドメイン、セルロース結合ドメイン−プロテインＡ−Ａｂ複合体またはＳペプチド−セルロース結合ドメイン−Ｓタンパク質融合体を含有するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）融合タンパク質を使用することによって例示される。
【０００２】
多糖は、自然界の至るところに見出される安定な構造的成分である。多くの生物は、３次元形状および表面構造を提供するためにその細胞の内外における構造的材料として多糖を使用している。天然供給源から得られる多糖の構造的一体性は、多くの場合、多糖が単離された後でも保持されており、多糖を様々な商業目的に使用することを可能にしている。その望ましい物理的特性のために、多糖はまた、商業目的のために合成的方法によっても製造されている。いずれの場合においても、合成的供給源または非合成的供給源のいずれかに由来するセルロースなどの多糖は、紙パルプおよび織物繊維などの様々な商業的に重要な製品に必要な原料を含んでいる。
【０００３】
製紙プロセスは、従来的には４つの主要な工程を含んでいる：一般にはパルプとして知られているセルロース繊維の水性懸濁物を得る工程；様々な加工物質および紙強化物質（強化剤および／またはサイズ剤など）をパルプスラリーに加える工程；大部分の水がろ過して除かれる成形用織物に得られた懸濁物を注ぐことによって紙をシート状にし、繊維を乾燥して、所望するセルロースウェブを形成させる工程；および様々な所望する特性を得られた紙に与えるために紙の初期乾燥の後でウェブを後処理する工程（紙の乾燥強度を増大させるサイズ剤の表面塗布を含む）。水性スラリーのパルプに適用されるそのような添加剤はウェットエンド添加剤として知られており、これには、微細物および填剤を保持するための歩留まり向上剤（例えば、ミョウバン、ポリエチレンイミン、カチオン性デンプンなど）；ポリエチレンイミンなどのドレネージ助剤；消泡剤；ならびにピッチ、またはマイクロファイバーおよび吸着填剤などの添加剤が含まれる。他のウェットエンド添加剤には、紙の乾燥強度だけでなく、湿潤強度を改善するために添加される、カチオン性ポリアリールアミドおよびポリ（アミドアミン／エピクロロヒドリン）などのポリマーが含まれる。デンプン、グアルゴムおよびポリアクリルアミドもまた、乾燥強度を改善させるために添加される。サイズ剤が、時々、疎水性を親水性のセルロース繊維に付与するために添加される。このようなサイズ剤は、液体容器（例えば、ミルクまたはジュース）用の紙を製造する際に使用され、紙コップおよび紙表面が水性インクで印刷される。この場合、インクが広がらないことが望ましい。そのようなサイズ剤には、松の木から得られるロジンサイズ剤、ワックスエマルション、そしてより近年においては、セルロース反応性サイズ剤が含まれる。シートの初期乾燥の後、スプレー、毛細管吸着、浸漬およびロールコーティングなどによって添加剤を紙に適用することは、多くの場合、ドライエンド添加と呼ばれている。ポリ（ビニルアルコール）、アクリルまたは酢酸ビニルのエマルション、デンプン、サイズ剤、ポリウレタンおよびＳＢＲラテックスがドライエンドにおいて一般に添加される。
【０００４】
製紙産業の主要な製品は、中しん原紙、中しん原紙において使用される中央波形加工用紙である。デンプンは波形加工用紙の総重量の２％〜５％を構成する。様々な技術が、中しん原紙の湿潤強度を改善するために使用されている。これには、ホルムアルデヒド樹脂などの化学的な架橋剤の使用、またはワックスなどの疎水性物質の塗布が含まれる。しかし、そのような化合物の紙への添加またはそのような化合物による紙の処理は、多くの場合、処理された紙の再利用性に対するこれらの化合物の好ましくない影響のために中断されている。使用される他の技術では、１平方メートルあたりの紙の重量および強度を増大させるために、半化学的パルプなどのより高価な原料が用いられている。この後者の方法は、出発材料および製造プロセス自体の両方のコストを増大させる。
【０００５】
例えば、製紙のように、綿繊維のようなセルロース材料を織物に加工することにもまた数工程が含まれる：繊維を糸に紡ぐこと；糸からの織布またはメリヤス生地の組み立て、その後の調製、染色および仕上げの各操作。織物製品は織物組み立ての一般的な形態である。糸は、一般にサイズボックスにおいてサイズ処理され、その後、水が蒸気缶で除かれ、そして糸は、シートを個々の糸に折れ込ませるためにバストロッドに広がるシートにされる。その後、糸は織られる。これは、一連のたて糸の間によこ糸を織ることによって行われる。調製に含まれる部分工程は、サイズ剤除去、スカーリングおよび漂白である。１工程の複合型スカーリング／漂白プロセスもまた業界で使用されている。
【０００６】
様々な化合物が、製織時における糸の切断を防止するために、たて糸に対するサイズ剤として使用されている。良好な糸サイズ剤は、サイズ処理されている糸に保護を提供する十分な強度を有する薄膜を形成するが、糸がサイズ剤の薄膜の下で切れるほど強くないサイズ剤である。サイズ剤は、強度を提供し、かつ糸を摩耗から保護するために、製織に先立ってたて糸に施される。綿を含有する糸に対する従来からのサイズ剤には、一般に、デンプン、デンプン誘導体、ポリビルアルコール、ポリエステル樹脂、ワックス、アクリルポリマーおよびアクリルコポリマーおよびそれらの塩などの薄膜形成剤、湿潤化剤、静電気防止剤、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。従来の熱硬化性樹脂システム（後硬化型または前硬化型のいずれか）は、耐摩耗性、破壊強度および引裂き強度が多くの場合に深刻なほどに損なわれるような程度にまで、セルロース繊維の微細構造ユニットを脆化させ、そしてその可動性を低下させる。多くの場合、耐摩耗性が７５％〜８５％低下し、破壊強度が５０％〜６０％低下し、引裂き強度が約５０％低下する。さらに、セルロース繊維を含有する糸が上記の従来的な方法によってサイズ処理された場合、サイズ処理された糸から完全にサイズ剤を除くことは困難である。サイズ処理された糸から完全に脱サイズ剤が除かれるとしても、サイズ剤除去プロセスは複雑であるか、または費用がかかる。
【０００７】
最近、サイズ剤の除去を、汚染を伴うことなく簡便なプロセスで行うことがますます重要な要件になっている。従って、潜在的に毒性の化学的架橋剤の使用を軽減または回避し、かつ使用が費用的および時間的に効果的である添加剤を多糖含有材料（紙および織物材料など）に対して開発することは注目される。
【０００８】
関連文献：
細菌セルラーゼの結合ドメインによるセルロース繊維の破壊が、Ｄｉｎ他（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１０９６〜１０９９によって記載されている。Ｋｉｍ他（１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２：３４８〜３５６）は、Ｓペプチドキャリア、プロテアーゼ認識配列を有するオリゴペプチドスペーサー、およびガラクトシダーゼ標的を有する組換え融合タンパク質を記載している。Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのＣＢＤのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合したヘパリナーゼＩ（例えば、フラボバクテリウム・ヘパリヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ））の融合タンパク質の発現がＳｈｐｉｇｅｌ他（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５：１７〜２３によって記載された。
【０００９】
米国特許第５１３７８１９号（Ｋｉｌｂｕｒｎ他）は、セルラーゼ基質結合領域を含む融合タンパク質、ならびにポリペプチドの固定化および精製におけるそれらの使用を開示している。米国特許第５９２８９１７号（Ｋｉｌｂｕｒｎ他）は、タンパク質でない化学的成分と、セルロース結合領域を有するポリペプチドとの結合体を開示している。多糖に結合するタンパク質および結合体が米国特許第５９６２２８９号（Ｋｉｌｂｕｒｎ他）に記載されている。米国特許第５８２１３５８号（Ｇｉｌｋｅｓ他）は、ポリサッカリダーゼに由来する結合ドメインおよび／または触媒ドメインを使用して多糖構造物（例えば、綿繊維およびラミー繊維）を改変するための方法および組成物を開示している。
【００１０】
米国特許第５８３７８１４号（Ｓｈｏｓｅｙｏｖ他）は、結晶性セルロースおよびキチンに対して大きな親和性を有するＣＢＤを、ＣＢＤと別のタンパク質との融合産物とともに開示している。ＣＢＤおよび融合産物に対する応用には、薬物送達、アフィニティー分離および診断的技術が含まれるが、これらもまた開示されている。米国特許第５７１９０４４号；米国特許第５４９６９３４号；および米国特許第５８５６２０１号もまた参照のこと（これらはすべてＳｈｏｓｅｙｏｖ他に対するものである；これらのそれぞれの内容は参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００１１】
紙添加剤の利用性の総説が、Ｂ．Ｂ．Ｓｐｅｎｃｅ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第１０巻、７６１頁〜７８６頁、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７年）により示される。
【００１２】
発明の要約
本発明は、少なくとも１つの多糖結合ドメインを含む組成物を使用してポリマー材料または多糖材料を架橋および／または機能化するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、多糖結合ドメイン（ＰＢＤ）融合タンパク質、ＰＢＤ連結剤ユニット、ＰＢＤ機能的成分、およびこのような組成物を使用して改変された多糖を含む。本発明のＰＢＤ連結剤ユニットは、それぞれが独立的に多糖に結合することができる１つまたは２つ以上のＰＢＤ、および必要に応じて、ＰＢＤ間に連結された１つまたは複数のリンカーユニットを含む。本発明の方法は、多糖構造物を含む多糖材料の１つまたは複数の特性を改変するために十分な条件および時間で、多糖構造物を十分な量のＰＢＤ融合タンパク質と接触させる工程を含む。本発明の方法および組成物は、変化した機械的性質、化学的性質、電気的性質および／または物理的性質を有する多糖含有材料を製造する際に使用される。
【００１３】
本発明の１つの側面により、少なくとも１つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触を、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および／またはその後に行い、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、少なくとも１つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料をもたらす組成物が提供される。
【００１５】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前に行われる。
【００１６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する途中において行われる。
【００１７】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する後に行われる。
【００１８】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料は、紙、織物材料、糸および繊維からなる群から選択される。
【００１９】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、構造的性質は、多糖含有材料の多糖構造物間の所定レベルの架橋、多糖含有材料の多糖構造物の所定の凝集、および多糖含有材料の所定の表面性状からなる群から選択される。
【００２０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、化学的性質は、所定の疎水性、所定の親水性、所定の濡れ性、所定の化学的反応性、所定の光化学的反応性、所定の機能性、および所定の表面張力からなる群から選択される。
【００２１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、物理的性質は、所定のヤング率、最大負荷における所定のひずみ、所定の破壊到達エネルギー、所定の水吸収性、所定の膨潤性、および所定の靱性からなる群から選択される。
【００２２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、電気的性質は、所定の表面電荷および所定の電気伝導度からなる群から選択される。
【００２３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、機械的性質は、所定の引張り強度、所定の剪断耐性、所定の耐摩耗性、所定の摩擦係数、所定の弾性、および所定の湿潤強度からなる群から選択される。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した少なくとも１つのさらなる多糖結合ドメインとを含む。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した別のタンパク質とを含む。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した疎水性基とを含む。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した親水性基とを含む。
【００２８】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した生物学的成分とを含む。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した酵素とを含む。
【００３０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的反応性基とを含む。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的光反応性基とを含む。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したリパーゼとを含む。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したラッカーゼとを含む。
【００３４】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したプロテインＡ抗体とを含む。
【００３５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したペプチドとを含む。
【００３６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリペプチドとを含む。
【００３７】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した炭化水素または炭化水素誘導体とを含む。
【００３８】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した脂肪酸誘導体とを含む。
【００３９】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した電気的荷電成分とを含む。
【００４０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したイオン性成分とを含む。
【００４１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したケイ素結合性成分とを含む。
【００４２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリマー結合性成分とを含む。
【００４３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属とを含む。
【００４４】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネイン様タンパク質とを含む。
【００４５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェリチンとを含む。
【００４６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属結合性成分とを含む。
【００４７】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した細菌シデロホアとを含む。
【００４８】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネインとを含む。
【００４９】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したチオール基とを含む。
【００５０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したアルデヒドとを含む。
【００５１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したマレイミドとを含む。
【００５２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したヒドラジドとを含む。
【００５３】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したエポキシドとを含む。
【００５４】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したカルボジイミドとを含む。
【００５５】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェニルアジドとを含む。
【００５６】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、セルロース結合ドメインである多糖結合ドメインを含む。
【００５７】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、デンプン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む。
【００５８】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、セルロースに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【００５９】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、デンプンに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【００６０】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、キチンに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【００６１】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、グルカン結合ドメイン（例えば、β−１，３−グルカン結合ドメイン）である多糖結合ドメインを含む。
【００６２】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、連鎖球菌のグルカン結合反復を含む多糖結合ドメインを含む。
【００６３】
本発明のさらに別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖含有材料の多糖構造物を架橋する多糖結合ドメイン連結剤を形成する少なくとも２つの共有結合した多糖結合ドメインを含む組成物が提供される。
【００６４】
本発明のさらに別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している機能化成分とを含み、少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、機能化成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【００６５】
本発明のさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している疎水性成分とを含み、少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、疎水性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【００６６】
本発明のなおさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している親水性成分とを含み、少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、親水性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【００６７】
本発明のさらにさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している化学的反応性成分とを含み、少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、化学的反応性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【００６８】
本発明のさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも１つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している光化学的反応性成分とを含み、少なくとも１つの多糖結合ドメインにより、光化学的反応性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【００６９】
本発明のなおさらなる側面により、少なくとも２つの共有結合した多糖結合ドメインを含む多糖結合ドメイン連結剤を含む組成物が提供される。
【００７０】
本発明のさらにさらなる側面により、少なくとも２つの多糖結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。好ましくは、核酸構築物は、少なくとも２つの多糖結合ドメインを結合する少なくとも１つのリンカーペプチドをコードする少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドをさらに含む。
【００７１】
本発明のさらなる側面により、少なくとも１つの所望する構造的性質、化学性質的、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメインとの接触を、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および／またはその後に行い、その後、少なくとも１つの成分または基を多糖結合ドメインに共有結合させ、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および／または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法が提供される。
【００７２】
本発明は、紙および織物材料などの優れた多糖構造物含有材料を製造するための方法および試薬を提供することによって、現在知られている形態の短所を解決する。
【００７３】
図面の簡単な説明
本発明は、添付された図面を参照して例としてのみ本明細書中に記載される。次に図面を詳細に特に参照することにより、示された詳細は、本発明の好ましい実施形態の例として、また本発明の好ましい実施形態の説明的な議論のためだけであり、そして本発明の原理的で概念的な側面の最も有用で、かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されていることが強調されている。この点に関して、本発明を根本的に理解するために必要である以上に詳しく本発明の構成的細部を示すことはなされておらず、図面とともに理解される説明により、当業者には、本発明のいくつかの形態が実際にどのように組み立てられ得るかが明らかになる。
図１ａは、ｐＥＴ−ＣＢＤプラスミドの概略図である。
図１ｂ〜１ｃは、ＣＢＤｃｌｏｓのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図１ｄは、ｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０の概略図である。
図１ｅ〜１ｇは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにＣＢＤ−１８０のヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図２ａは、１コピーのＣＢＤ−１８０と、それに読み枠を合わせて融合させた１つのＣＢＤとを含むｐＥＴ−ＣＣＰ−１８０の概略図である。
図２ｂ〜２ｅは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにＣＣＰ（セルロース架橋タンパク）のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
図３ａは、ｐＥＴ−ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤの概略図である。
図３ｂ〜３ｇは、ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤのヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
図４ａは、ｐＥＴ２９−Ｓｐｅｐ−ＣＢＤ−Ｓｐｒｏｔの概略図である。
図４ｂ〜４ｇは、Ｓｐｅｐ−ＣＢＤ−Ｓｐｒｏｔのヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
図５ａは、１分子あたり２つのセルロース結合ドメインを有するセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図５ｂは、１つのセルロース結合ドメインが第１のポリマー構造ユニットに結合し、第２のセルロース結合ドメインが第２のポリマー構造ユニットに結合している図５ａのセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図６は、一般的なＣＢＤ連結剤ユニットを概略的に示す。
図７ａ〜７ｃはそれぞれ、ＣＢＤ連結剤ユニットの様々な実施形態を概略的に示す。図７ａは、それぞれがＣＢＤに結合している１対のデンプン結合ドメインを含むリンカーユニットにより連結されている１対の末端ＣＢＤと、両方のデンプン結合ドメインに結合しているデンプン成分とを有するＣＢＤ連結剤ユニットを示す。図７ｂは、それぞれが隣接するＣＢＤにＪＵＮ／ＦＯＳ架橋を介して結合している複数のＣＢＤを含むリンカーユニットにより連結されている１対の末端ＣＢＤを有するＣＢＤ連結剤ユニットを示す。図７ｃは、大きなタンパク質成分により連結されている１対の末端ＣＢＤを有するＣＢＤ連結剤ユニットを示す。
図８は、少なくとも１つのＣＢＤと、それに結合した機能的成分（ＦＭ）とを有するＣＢＤ機能的成分（ＣＢＤＣ）を概略的に示す。
図９ａ〜９ｃは、ＣＢＤ連結剤ユニットがポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる様々な方法を概略的に示す。
図１０ａ〜１０ｄは、コントロール紙片、ＣＢＤ処理紙片およびＣＣＰ処理紙片に対するヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性のそれぞれの棒グラフである。
図１１は、試験配合物で糸を処理するために使用される糸コーティング装置を概略的に示す。
図１２ａ〜１２ｂは、コントロール糸、ＣＣＰ処理糸、ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤ処理糸およびＡｂ−ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤ処理糸に対するヤング率および最大負荷時のひずみのそれぞれの棒グラフである。
図１３は、大腸菌においてＳタンパク質−ＣＢＤ−Ｓペプチド（ＳＣＳ）を発現させた結果の写真を示す。タンパク質マーカー（レーン１）、ＩＰＴＧで誘導される前の総大腸菌タンパク質（レーン２）、ＩＰＴＧで誘導された後の総大腸菌タンパク質（レーン３）、およびＳＣＳタンパク質を含有する封入体（レーン４）。
図１４は、ＣＢＤ、ＣＣＰまたはＳＣＳでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。すべての測定値は２３℃および６５％相対湿度で得られた。
図１５は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示す。すべての測定値は２３℃および６５％相対湿度で得られた。
図１６は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示す。すべての測定値は２３℃および６５％相対湿度で得られた。
図１７は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示す。すべての測定値は２３℃および６５％相対湿度で得られた。
図１８は、ＣＢＤまたはＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示す。すべての測定値は、２３℃、６５％の相対湿度、および２０ｍｍ／分の一定の変形において得られた。四角−コントロール；丸−２．５ｍｇ／ｍｌのＣＢＤ；三角−２．５ｍｇ／ｍｌのＣＣＰ。
図１９は、種々の濃度のＣＢＤまたはＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。すべての測定値は２３℃で得られた。蒸留水（１０μｌ）を処理された紙にピペットで置き、完全に吸収されるまでの時間を秒単位で測定した（コントロール−黒棒；ＣＢＤ−点刻棒；ＣＣＰ−白棒）。
図２０は、ＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。水滴（それぞれ２０μｌ）をＣＣＰ処理紙に滴下して、写真を２５ｍｓ毎に撮影した。最初のフレーム（Ａ）は、水が紙に接触する前に撮影された。フレームＢ〜Ｅは、それぞれ、２分後、４分後、６分後および８分後に撮影された。最後のフレーム（Ｆ）は、処理されなかった紙に対して、水が紙と接触した２５ｍｓ後に撮影された。水の吸収は、光学的接触角度計を使用して視覚化された。
【００７４】
好適な実施形態の詳細な説明
本発明により、多糖材料の表面性質、化学的性質、電気的性質および機械的性質を変化させるための方法および組成物が提供される。
【００７５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施形態により例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実施され得るか、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられている表現法および用語法は説明のためであり、限定であると見なすべきではないことを理解しなければならない。
【００７６】
繊維およびフィラメントなどの多糖構造物は、構造物を多糖含有材料に加工する途中またはその後においてＰＢＤ含有組成物で処理され、それにより、多糖構造物および／またはそれらの製品（織物および紙など）は架橋および／または機能化される。ＰＢＤ含有組成物は万能的な生物学的架橋剤として機能し、その構造は、多糖を含有する最終製品の増大した弾性または疎水性などの所望する結果を得るために変化させることができる。このような生物学的架橋剤は、大きさが数百ダルトンから数百万ダルトンまでの範囲にある１つまたは２つ以上の生物学的実体または化学的実体に融合または連結（「融合または連結」＝共有結合）したセルロース結合ドメインなどのＰＢＤを少なくとも１つ含有する多量体タンパク質である。一般に、そのような生物学的実体は１つまたは２つ以上の第２のタンパク質である。第２のタンパク質は、セルロース結合ドメイン、またはデンプン結合ドメイン、または疎水性基もしくは酵素（特に、多糖構造物の処理および／または多糖含有最終製品の特性を改善および／または促進し得る酵素、例えば、リパーゼまたはラッカーゼなどの酵素）に結合したＰＢＤなどの機能化ＰＢＤなどの別のＰＢＤであり得る。あるいは、第２のタンパク質は、プロテインＡ−抗体複合体などの非ＰＢＤタンパク質であり得る。
【００７７】
改変された多糖含有材料を調製するために、多糖構造物は、多糖材料に加工している途中またはその後において、十分な量の生物学的架橋剤と、多糖構造物を含有する多糖材料の１つまたは２つ以上の特性を改変するのに十分な条件および時間で接触させられる。一例として、セルロース繊維を紙に加工するか、または綿を糸に加工する途中における従来のサイズ処理工程の代わりに、またはそのような工程とともに、ＰＢＤ融合タンパク質を使用して、多糖構造物を凝集させ、かつ／または多糖繊維およびフィラメントなどの多糖構造物を架橋して、加工時における構造物自体および／または製造される多糖含有材料の湿潤強度を増大させるようにすることができる。好ましくは、ＰＢＤ融合タンパク質による処理は従来のサイズ処理工程の代わりである。しかし、いくつかの適用においては、この２つの手順を、例えば、デンプンサイズ処理と、そしてデンプンおよび繊維を架橋するデンプン結合タンパク質を含むＰＢＤ融合タンパク質と組み合わせることは有用であると考えられる。さらに、機能的成分を含むＰＢＤは、例えば、紙などの多糖含有材料の濡れ性を低下させるために疎水性成分（脂肪酸誘導体または疎水性アミノ酸配列など）で多糖含有材料（セルロースマトリックスなど）を機能化するために使用することができる。
【００７８】
本発明は、例えば、商業的な製紙プロセスおよび織物プロセスにおいて使用されているような多糖構造物を処理する既存の方法を上回るいくつかの利点を提供する。セルロース繊維などの好適な多糖含有材料を生物学的架橋剤で処理することによって、処理されない材料、および／またはＰＢＤ融合タンパク質以外の強化剤を使用して処理された材料と比較して、改善された機械的性質（例えば、増大した強度および耐久性）を有する製品を得ることができる。さらに、波形加工用紙を製造する際、ＰＢＤ試薬を、紙の湿潤強度を増大させるために、成形段階において、あるいはサイズ処理段階の前またはその後において、そのいずれかで適用することができる。成形段階で適用された場合、十分な湿潤強度が得られ、その結果、サイズ処理工程を省略することができる。これにより、紙を加工するために使用される装置の約１／３を省略することができるために、時間が節約されるだけでなく、紙の製造コストが大きく低下する。化学的架橋剤および疎水性材料とは対照的に、生物学的架橋剤の使用により、このプロセスを使用して作製される紙製品の再利用性もまた改善される。
【００７９】
本発明の別の利点は、製紙の成形工程において、多くの微細繊維が、成形用織物を通過するために失われるということである。ＰＢＤ試薬により、それらは紙スラリー中に維持され、その結果、原料のより良好な回収がもたらされる。さらに、段ボール容器を製造する最終加工工程において、アルカリ糊が、波形加工用紙を壁板に結合するために使用される。ＰＢＤ分子は強アルカリ条件によって溶出され、これにより、アルカリ糊が紙に浸透し得る能力が高められる。
【００８０】
本発明の多量体ＰＢＤ融合タンパク質は、ＰＢＤと第２のタンパク質との２つの基本的な構成単位を有する。この場合、第２のタンパク質はＰＢＤであってもよく、またはＰＢＤでなくてもよい。ＰＢＤは、セルロースなどの多糖に結合するアミノ酸配列、またはＰＢＤが結合する多糖基質の基本的な構造ユニット（骨格糖および／または末端糖および糖自体のいずれかを含み、単糖および二糖を含む）を含むポリマーに結合するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドであり得る。ＰＢＤの定義には、天然に存在するＰＢＤの変異体、変化体およびその他が含まれる。その唯一の条件は、それらが多糖含有基質に結合するということである。ＰＢＤは可逆的または不可逆的のいずれかで基質多糖に結合することができ、基質は天然物または合成物であり得る。ＰＢＤ融合タンパク質は、同じポリサッカリダーゼまたはスカホールドタンパク質あるいは異なるポリサッカリダーゼまたはスカホールドタンパク質に由来し得る複数の多糖結合ドメインを有し、かつ同じ多糖または異なる多糖に結合し得る複数の多糖結合ドメインを有するタンパク質分子であり得る。複数のＰＢＤが存在する場合、それらは、好ましくは、ＰＢＤ融合タンパク質内において別個のドメインを占め、そして、互いに独立して機能し得る。用語ＣＢＤは、セルロース結合に関与している天然タンパク質から得ることができるドメインをいうか、あるいは自身がセルロースに結合する天然タンパク質の単離されたアミノ酸配列またはフラグメントをいう（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他、（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５７６２〜５７６８；Ｇｉｌｋｅｓ他、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０４０１〜１０４０７を参照のこと。これらの両方の内容は参考として本明細書中に組み込まれる）。ＰＢＤおよびＣＢＤは、天然物、合成物または部分合成物であり得る。
【００８１】
多糖結合ドメイン（多糖結合ドメインを含む触媒活性なポリサッカリダーゼおよび触媒不活性なポリサッカリダーゼの両方を含む）は、生化学的技術および／または遺伝子工学的技術を含む様々な技術のいずれかにより得ることができる。従って、多糖結合ドメインは、タンパク質分解（例えば、Ｇｉｌｋｅｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２１３：１０４０１〜１０４０７を参照のこと）によって、または当業者に知られている技術を使用する遺伝子操作（ランダム変異、部位特異的変異誘発法またはＤＮＡシャフリングなど）によって得ることができる。部位特異的変異誘発法を使用して、ポリサッカリダーゼの触媒活性に関連する特定のアミノ酸を変異させ、そして触媒活性を阻害または阻止するが、多糖の結合を妨げないアミノ酸によって置換することができる。例えば、ＣｅｎＡでは、２８３位のアスパラギン酸を置換することができる。そのような方法は、元のポリサッカリダーゼ配列に極めて類似するアミノ酸配列を効果的にもたらすが、触媒活性を含有する機能的ドメインは変異誘発法または生化学的改変によって機能不能にされる。結合ドメインのみが依然として機能的である。変化型ＰＢＤまたは変異型ＰＢＤを得るために、１つまたは２つ以上の所定のアミノ酸残基が置換され得るか、または様々なＰＢＤのアミノ酸配列に挿入され得るか、または様々なＰＢＤのアミノ酸配列から欠失され得る。ＰＢＤタンパク質配列またはＰＢＤポリペプチド配列におけるアミノ酸置換は、例えば、対象となるアミノ酸残基の極性、電荷、疎水性および親水性などの類似性または相違に基づいて合理的な様式で行うことができる。タンパク質において一般的に見出されるすべてのアミノ酸の極性および疎水性などの特性は、アミノ酸配列を特異的に変化（変異）させる技術が十分に知られているようにこの分野では十分に知られている。得られた変化型ＰＢＤまたは変異型ＰＢＤは本発明の範囲内であると見なされる。置換、挿入および／または欠失を、例えば、特定の多糖含有材料を架橋または機能化するために複数の望ましい属性を有する変化型ＰＢＤを得るために行うことができる。
【００８２】
特定の変異または改変を有するポリサッカリダーゼ配列全体ではなく、多糖結合ドメインだけに対応するアミノ酸配列を使用することができる。この場合、ＰＢＤが、ポリサッカリダーゼを機能的ドメインに切断することによって得られる。例えば、単離されたポリサッカリダーゼは、機能的ドメインからなる２つ以上のフラグメントにタンパク質を切断するプロテアーゼ処理に供される。ときには、ポリサッカリダーゼは特異的なプロテアーゼ部位を含む。例えば、Ｃ．ｆｉｎｉのエンドグルカナーゼＡ（ＣｅｎＡ）は、立体配座に特異的なＣ．ｆｉｎｉプロテアーゼにより切断されるＰＴボックスを含む。その反応の生成物は、ＰＴ配列を有する多糖結合ドメインと、ポリサッカリダーゼ触媒ドメインとである。ポリサッカリダーゼが非常に特異的配列なプロテアーゼにより切断されない場合、ポリサッカリダーゼは、特異性が低いプロテアーゼに供され、そして活性なフラグメントを、当業者に知られているクロマトグラフィーおよび他のペプチド精製技術によって単離することができる。
【００８３】
結合ドメインを得るために使用され得る他の技術には、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列をクローニングするためのプローブを作製するためにアミノ酸配列情報を使用することが含まれる。これらのクローン化された配列は、多糖結合ドメインのみをコードする欠失変異体を作製するために使用することができる。逆に、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が知られている場合、他のポリサッカリダーゼに対する配列相同性に基づいて、多糖結合ドメインの位置を予測するために生化学的データ、アミノ酸データおよびＤＮＡ配列データを使用することによって、多糖結合ドメインに対応するＤＮＡ配列を特異的に構築することができる。ポリサッカリダーゼ遺伝子および多糖結合タンパク質を単離する際に使用される技術はこの分野では知られており、これには、合成、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、またはそれらの組合せが含まれる。多糖結合ドメインを得るために使用され得る他の技術には、遺伝子融合、ファージディスプレイ、ＤＮＡシャフリング、およびランダム変異誘発法または部位特異的変異誘発法が含まれる。遺伝子操作の様々な技術が十分に知られており、これには、制限、消化、切り出し、連結、インビトロ変異誘発法、プライマー修復、リンカーおよびアダプターを用いることなどが含まれる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（編）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９年）を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる）。本発明のＰＢＤタンパク質をコードする核酸は、単離および精製されたＲＮＡから、またはゲノムクローニングによって得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのいずれかを、この分野で十分に知られている技術を使用して調製することができ、そしてコード配列の任意の部分に対して実質的に相補的なプローブを用いて特定のＰＢＤヌクレオチド配列についてスクリーニングすることができる。あるいは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、好適なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲクローニングのテンプレートとして使用することができる。全長のクローン、すなわち、所望するＰＢＤタンパク質のコード配列全体を含むクローンを、発現ベクターを構築するために選択することができ、または重複するｃＤＮＡを連結して、完全なコード配列またはその所望する部分（結合ドメインなど）を形成させることができる。あるいは、ＰＢＤをコードするＤＮＡは、この分野で十分に知られている固相技術を使用して化学合成によって全体または一部を合成することができる。
【００８４】
ＰＢＤは、本発明において使用されるオリゴ糖に結合する酵素を含む様々な供給源から得ることができる。下記の表５には、可溶性グルカン（α、βおよび／または混合結合体）に対する親和性を有するすべての結合ドメインを含む、１つまたは２つ以上の可溶性／不溶性の多糖に結合するそのような結合ドメインが列挙されている。Ｃ．ｆｉｍｉのエンドグルカナーゼＣｅｎＣに由来するＮ１セルロース結合ドメインは、可溶性のセロサッカリドに結合し、そしていずれかの可溶性多糖に結合することが知られている小さなタンパク質集団の１つである。また、表１〜表４には、仮想的なβ−１，３−グルカン結合ドメインを含有するタンパク質の例（表１）；連鎖球菌のグルカン結合反復を含有するタンパク質（Ｃｐｌスーパーファミリー）の例（表２）；キチン結合ドメインを有する酵素の例（表３）；およびデンプン結合ドメインを有する酵素の例（表４）が列挙されている。セルロース結合ドメインタンパク質を含む様々なスカホールドタンパク質、例えば、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）によって産生されるスカホールドタンパク質（Ｓｈｏｓｅｙｏｖ他、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０４１３２）などもまた、ＰＢＰを調製するために使用することができる。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｎｍａ）種およびその他を含むいくつかの菌類もまた、ＰＢＰが単離され得るポリサッカリダーゼを産生する。
【表１】
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【表２】
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【００８５】
注目される結合特性および結合特異性を有する新しいＰＢＰを様々な方法で同定およびスクリーニングすることができる。そのような方法には、例えば、ＮＭＲ分光法（Ｚｈｕ他、（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４；Ｇｅｈｒｉｎｇ他、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：５５２４〜５５３１）、ＵＶ差分光法（Ｂｅｉｓｈａｗ他、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７１７〜７２４）、蛍光（滴定）分光法（Ｍｉｌｌｅｒ他、（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１３６６５〜１３６７２）、ＵＶまたは蛍光によるストップフロー分析（Ｄｅ　Ｂｏｅｃｋ他、（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９：１４１〜４１５）、アフィニティー方法（アフィニティー電気泳動（Ｍｉｍｕｒａ他、（１９９２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５９７：３４５〜５３０）あるいは固定化された単糖またはオリゴ糖でのアフィニティークロマトグラフィーなど）、沈殿または凝集による分析（濁度法的または比濁法的な分析（Ｋｎｉｂｂｓ他、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４９４０〜１４９４７）を含む）、競合的阻害アッセイ（定量的なＩＣ５０決定を伴うかまたは伴わない）および様々な物理的または物理化学的な方法（示差走査熱測定法または等温滴定熱測定法を含む）（Ｓｉｇｕｒｓｋｊｏｌｄ他、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８３７１〜８３７６；Ｓｉｇｕｒｓｋｊｏｌｄ他、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．２２５：１３３〜１４１）、あるいは熱ＣＤ分光法または熱蛍光分光法を使用するオリゴ糖の非存在下または存在下でのタンパク質安定性の比較アッセイ（融解）などの分光学的（滴定）方法が含まれる。
【００８６】
一般に、ＰＢＰがオリゴ糖に結合するＫａは、少なくとも弱い抗体−抗原抽出物の範囲内にあり、すなわち、１０−３であり、好ましくは１０−４であり、最も好ましくは１０−６である。ＰＢＰのオリゴ糖に対する結合が発熱性または吸熱性である場合、多糖構造物を処理している時の温度を調節する手段を提供することにより、結合は、より低い温度で、それぞれ、増大または低下する。
【表３】
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【表４】
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ａ生デンプン消化アミラーゼ、ｂマルト生成α−アミラーゼ、ｃマルトテトラオース生成アミラーゼ（１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ）、ｄマルトペンタオース生成アミラーゼ、ｅ熱安定性α−アミラーゼ、ｆ以前のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ。ＡＭＹＧ、ＧＡＭおよびＧＬＡ：グルコアミラーゼ、ＡＭＹまたはＡＭＬ：α−アミラーゼ、ＣＧＴ：β−シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼまたはシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム。Ａ．：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂ．：Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃ．：Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ、Ｄ．：Ｄｉｃｔｉｏｓｔｅｉｕｍ、Ｈ．ｇｒｉｓｅａ：Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ、Ｈ．ｒｅｓｉｎｅａ：Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓ　ｒｅｓｉｎｅａ（Ａｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ　ｒｅｓｉｎｅａ）、Ｋ．：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｎ．：Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｓ．：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈ．ｃｕｒｖａｔａ：Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｃｕｒｖａｔａ、Ｔｈ．：Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ。
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表　　５
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【００８７】
多数のＣＢＤが知られており、これらは少なくとも１２のファミリーに分類されており、そのいずれも、ＣＢＤの目的とする使用に依存してＣＢＤの供給源として役立ち得る。ファミリーＩは菌類の酵素のＣＢＤのみを含む。残る１１ファミリーにおける大多数のＣＢＤは細菌起源である。最もよく理解されているＣＢＤは、ファミリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに属するＣＢＤであり、それらのＣＢＤは、長さが、平均して、それぞれ、３６アミノ酸、１０５アミノ酸、１５０アミノ酸および１５０アミノ酸である。ファミリーＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのいくつかのＣＢＤは、ロールカステラ状に折り畳まれた複数の反平行なβシートを含むとして特徴付けられており、ファミリーＩ、ＩＩおよびＩＩＩのＣＢＤは非晶質セルロースおよび結晶性セルロースの両方に結合し、これに対して、ファミリーＩＶのＣＢＤは非晶質セルロースに結合するが、結晶性セルロースには結合しない。ファミリーＩＶのＣＢＤのみが可溶性のセルロース誘導体およびセロオリゴ糖に結合する。結晶性セルロースおよびキチンに結合するＣＢＤは、類似する親和性で結合し、マイクロモル濃度の範囲の結合定数を有する。ファミリーＩのＣＢＤはセルロースに可逆的に結合し、これに対して、ファミリーＩＩおよびファミリーＩＩＩのＣＢＤは非変性条件のもとで不可逆的に結合する。好ましいＣＢＤには、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）およびＭ．Ｂｉｓｐｏｒａのそれぞれの種に属する菌株から得ることができるＣＢＤ（Ｎ．Ｒ．Ｇｉｌｋｅｓ他、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１０４０１〜１０４０７；Ｎ．Ｒ．Ｇｉｌｋｅｓ他、（１９９１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５５：３０３〜３１５）；セルロモナス・フィミから得られるセルラーゼ遺伝子（Ｗｈｉｔｔｌｅ他、（１９８２）Ｇｅｎｅ、１７：１３９〜１４５；Ｇｉｌｋｅｓ他、（１９８４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：１３７７〜１３８４）；Ｃ．ｆｉｍｉから得られるエキソグルカナーゼ（Ｃｅｘ）およびエンドグルカナーゼ（ＣｅｎＡ）ならびにそれらの遺伝子配列（ｃｅｘおよびｃｅｎＡ）（Ｗｏｎｇ他、（１９８６）Ｇｅｎｅ、４４：３１５〜３２４；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ他、（１９８６）Ｇｅｎｅ、４４：３２５〜３３０）；Ｓｈｏｓｅｙｏｖ他（１９９２）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：３４８３〜３４８７）により記載されるクロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）に由来する１７ＫＤ（ペプチド）ＣＢＤが含まれる。このＣＢＤの組換え形態はセルロースおよびキチンに対して強い親和性を示す（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他、（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５７６２〜５７６８）。
【００８８】
ＰＢＤタンパク質はまた、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質の多糖結合領域の機能的部分を少なくともコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を宿主細胞に形質転換することによって調製することができる。ＰＢＤのＤＮＡ配列は真核生物細胞または原核生物細胞のいずれかの宿主細胞で発現させることができる。発現して単離されたＰＢＤは、その後、他のＰＢＤおよび／または１つもしくは２つ以上の機能化タンパク質に結合させることができる。
【００８９】
これらの場合のいずれにおいても、単離された多糖結合ドメインは、一般に、ポリサッカリダーゼ活性が目的とする融合タンパク質の所望する特徴である場合を除いて、触媒的なポリサッカリダーゼ活性を除くために十分に純粋である。好ましくは、そのような調製物の触媒活性は、ポリサッカリダーゼを発現する細胞から得られた粗抽出物の活性よりも小さい。より好ましくは、触媒活性は、１０００個の機能的な結合ドメインあたり１個未満の機能的な触媒ドメインの化学量論を反映する。所望する発現産物の活性を試験するために、ＰＢＤの結合活性を、例えば、アビセル（微結晶性セルロース）などの微結晶性セルロースに対する結合によって、そして仮想的な結合ドメインが溶液から除かれることを示すことによって明らかにすることができる。所望する活性を有するポリペプチドは、高度に精製された形態でセルロースから容易に単離される。アビセルに対する結合は、天然型セルラーゼ（Ｇｉｌｋｅｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：１０４５５〜１０４５９）および組換えセルラーゼ（Ｏｗｏｌａｂｉ他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）５４：５１８〜５２３）の両方を精製するために使用されている。
【００９０】
多量体ＰＢＤ融合タンパク質の第２の基本的な構成単位は、第１の構成単位であるＰＢＤと同じであり得る第２のＰＢＤ、または第１の構成単位とは異なり得る第２のＰＢＤであり得るタンパク質である。従って、多量体融合タンパク質は、それぞれがＰＢＤをコードする１対のヌクレオチド配列によってコードされ、そしてこの分野で十分に知られているように読み枠を合わせて連結されている二量体ＰＢＤ融合タンパク質であり得る（例えば、米国特許第５８５６２０１号および米国特許第５８３７８１４号（ともにＳｈｏｓｅｙｏｖ他、これらはともにその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）。図５ａには、第１および第２の両方のタンパク質がＣＢＤであり、従って二量体ＣＢＤを形成するＰＢＤ融合タンパク質の一例が示されている。この場合、ＣＢＤは同じであってもよく（ホモ二量体ＣＢＤ）、または異なっていてもよい（ヘテロ二量体ＣＢＤ）。図５ｂには、図５ａのセルロース架橋タンパク質の使用が示されている。この場合、一方のセルロース結合ドメインが第１のポリマー構造ユニットに結合し、そしてもう一方のセルロース結合ドメインが第２のポリマー構造ユニットに結合している。図６は、リンカーユニットを介して連結された１対のＣＢＤを含む一般的なＣＢＤ連結剤ユニットを概略的に示している。
【００９１】
あるいは、第２の構成単位は、１つまたは２つ以上の機能化基を必要に応じて含むＰＢＤであり得る。機能化基により、多糖含有材料の１つまたは２つ以上の性質を改変することができる機能的な基が意味される。一般に、機能化基は、ケイ素結合性ペプチド、ポリマー結合性ペプチドまたは金属結合性ペプチドなどのタンパク質またはペプチドである（Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ他、（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６：５６３〜５６９；Ｓｐａｎｎｅｒ他、（１９９５）Ｂｏｎｅ１７：１６１〜１６５；Ｓｌｉｃｅ他、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２５６〜２６３；Ｐｅｓｓｉ他、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６２：３６７〜３６９）。機能化ポリペプチドの他の例には、多糖繊維およびデンプン分子を架橋する手段を提供するデンプン結合ドメインが含まれる；デンプンは、繊維の内因性成分であり得るし、またはサイズ剤として適用され得る。デンプン結合ドメインは、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のグルコアミラーゼから得ることができる（Ｃｈｅｎ他、（１９９１）Ｇｅｎｅ、９９：１２１〜１２６）。同様に、多糖分子およびグルテン分子は、マトリックスタンパク質（高分子量グルチニン（ＨＭＷＧ）など）を別のポリペプチドとして使用することによって架橋することができる。特定の適用には、機能化基はまた、１つまたは２つ以上のチオール基などの化学基、発色基、色素、反応性基（アルデヒド、マレイミド、ヒドラジド、エポキシ、カルボジイミドなど）、または光反応性基（ＰＢＤに結合したフェニルアジドなど）を含むことができる。様々な化学的実体をＰＢＤに結合させる方法が米国特許第５，９６２，２８９号に記載されている（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００９２】
ＰＢＤ融合タンパク質の第１の構成単位は、必要に応じて、リンカーユニットを介して第２の構成単位に連結させることができる。ＰＢＤ連結剤ユニットのリンカーユニットは、生物学的ポリマー（タンパク質、ポリペプチドまたは多糖など）ならびに合成ポリマー（アクリルポリマーなど）およびマトリックスタンパク質（高分子量グルチニン）を含む様々な天然分子または合成分子を含むことができる。リンカーユニットのペプチド成分またはタンパク質成分の例には、ＪＵＮタンパク質およびＦＯＳタンパク質（例えば、Ｇｅｎｔｚ他、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：１６９５〜１６９９を参照のこと）；デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）（例えば、Ｃｈｅｎ他、（１９９１）Ｇｅｎｅ、９９：１２１〜１２６を参照のこと）、およびＳペプチドまたはＳタンパク質（例えば、Ｋｉｍ他、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２：３４８〜３５６を参照のこと）が含まれる。融合タンパク質における第１および第２のポリペプチド（あるいは複数の第１および／または第２のポリペプチド）は、融合タンパク質の目的とする使用に部分的に依存して、ペプチド結合を介して、またはより大きなリンカーユニットを介して直接連結させることができる。図８は、第１のＣＢＤと、第２のＣＢＤと、第１および第２のＣＢＤを連結するリンカーユニット（ＬＵ）とを有するＣＢＤ連結剤ユニットを概略的に示している（図中ではＣＵと示される）。第１および第２のＣＢＤは末端性であるとして、そしてリンカーユニットの反対側の極に存在するとして図８には描かれているが、ＣＢＤおよびリンカーユニットの他の数および配置も考えられ、そして本発明の範囲内である。リンカーユニットは、共有結合的結合、イオン性結合、疎水性結合、水素結合、タンパク質翻訳およびタンパク質伸長を含む様々な手段の１つまたはその組合せによってＰＢＤ連結剤ユニットのそれぞれのＰＢＤに結合させることができる。
【００９３】
リンカーユニットの多糖成分は、ＰＢＤが結合しない多糖、またはＰＢＤが低い親和性で結合する多糖であり得る。そのような多糖の例として、デンプンが挙げられる。さらに、ＰＢＤ連結剤ユニットのリンカーユニットは、ＰＢＤ以外の１つまたは２つ以上の多糖結合ドメインであり得る。一例として、図７ａには、第１のＣＢＤと、第２のＣＢＤに連結した第２のデンプン結合ドメインと、第１のデンプン結合ドメインおよび第２のデンプン結合ドメインの両方に連結したデンプン成分とを含む連結剤ユニットによって連結されている１対の末端ＣＢＤを有するＣＢＤ連結剤ユニットが示されている。
【００９４】
ＰＢＤ連結剤ユニットのリンカーユニットはまた、１つまたは２つ以上のＰＢＤを含むことができる。一例として、図７ｂには、複数のＣＢＤを含む連結剤ユニットによって連結されている１対の末端ＣＢＤを有するＣＢＤ連結剤ユニットが示されている。この場合、リンカーユニットのそれぞれのＣＢＤは、ＪＵＮ／ＦＯＳ架橋を介して隣接するＣＢＤに連結されている（例えば、Ｇｅｎｔｚ他、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：１６９５〜１６９９を参照のこと）。図７ｃには、セルロースまたは関連ポリマーに結合しないか、またはセルロースまたは関連ポリマーに低い親和性で結合するだけであるペプチド成分またはタンパク質成分を含む連結剤ユニットによって連結されている１対の末端ＣＢＤを有するＣＢＤ連結剤ユニットが示されている。連結剤ユニット（例えば、リンカータンパク質）のペプチド成分またはタンパク質成分は、サイズが数百ダルトンから１メガダルトン以上まで変化し得る。一例して、図７ｃに表されるリンカーユニットは数アミノ酸の短いペプチドであり得るか、またはＨＭＷＧなどの比較的大きなリンカータンパク質であり得る。
【００９５】
多量体ＰＢＤ融合タンパク質は化学的または組換え的に作製することができる。例えば、当業者に知られている技術を使用して、多糖結合領域またはその複数体を思う通りに作製して、精製し、その後、機能化基を有するか、または機能化基を有しない第２のタンパク質に化学的に連結させることができる。タンパク質の結合方法には、多糖結合ドメインを改変するためのインビトロ結合化学反応が含まれる。これには、ドメインを多糖マトリックスに結合させながら、またはドメインを多糖マトリックスから遊離させながら、そのいずれかで行うことができる。例として、ＲｅｉｃｈｌｉｎによりＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）７０：１５９〜１６５に記載されるようなグルタルアルデヒド結合の使用が挙げられる。多糖結合ドメインがマトリックスに結合する場合、マトリックスに実際に結合する部位を保護し、その一方で、他の残基が第２の成分（第２のＰＢＤまたは機能化タンパク質のいずれか）と反応するようにしておくという利点が得られる。化学的成分を多糖結合ドメインに結合させることにより、多糖基質への結合能が損なわれる場合には、多糖マトリックスの存在を必要とする反応手順が、ドメインの結合特性を保持するためには好ましい。
【００９６】
あるいは、多量体ＰＢＤ融合タンパク質は組換え的に作製することができる。ＰＢＤ融合タンパク質を組換え的に作製するために、ＰＢＤ融合タンパク質の成分をコードするヌクレオチド配列が、ＰＢＤ融合タンパク質を発現させることができる組換え発現ベクターを構築するために使用される。一般に、核酸構築物は、タンパク質のヌクレオチドコード配列に機能的に連結されている転写調節情報および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含有する場合にタンパク質を発現させることができる。「機能的に連結されている」は、調節的なＤＮＡ配列および発現するＤＮＡが、転写および翻訳を可能にするような方法で連結されている連結をいう。多糖結合ドメインをコードするフラグメントと、第２の多糖結合ドメインまたは機能化ポリペプチドをコードするＤＮＡとは、ＰＢＤをコードする核酸が、第２のタンパク質をコードする核酸に連結され、その結果、ＰＢＤおよび第２のタンパク質が一緒になったオープンリーディングフレームが完全になり、これにより、ＰＢＤ融合タンパク質全体の翻訳が生じ得るように連結される。ＰＢＤ融合タンパク質がタンパク質連結剤ユニットを有する場合、ヌクレオチド配列が、ＰＢＤコード配列と第２のタンパク質をコードする配列との間において発現構築物に機能的に挿入される。得られた連結ＤＮＡは、その後、発現をもたらす様々な方法で操作することができる。
【００９７】
核酸増幅および核酸発現の両方に使用されるベクターはこの分野では十分に知られている。適切なベクターを選択することは、目的とする機能（例えば、増幅または発現）、ＤＮＡインサートのサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞を含む様々なパラメーターに依存する。様々な発現ベクター／宿主系を、ＰＢＤタンパク質およびＰＢＤ融合タンパク質の組換え発現のために当業者は利用することができる。そのような系には、所望するＰＢＤコード配列を含有する組換えファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたは組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌などの微生物；所望するＰＢＤコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換される酵母；所望するＰＢＤコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させられる昆虫細胞系；所望するＰＢＤコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染させられる植物細胞系、または所望するＰＢＤコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換される植物細胞系；または組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルスまたはワクシニアウイルス）に感染させられる動物細胞系で、多コピーのＰＢＤ核酸を含有するように操作され、二重微小染色体において安定に増幅される細胞株（例えば、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミン合成酵素）または二重微小染色体において安定に増幅されない細胞株（例えば、ネズミ細胞株）を含む動物細胞系が含まれる。
【００９８】
上記に列挙された成分の１つまたは２つ以上を含有し、かつ所望するコード配列および制御配列を含む好適なベクターの構築には、標準的な連結技術が用いられる。単離されたプラスミドまたは核酸フラグメントは、必要とされるプラスミドを作製するために所望される形態で、切断され、調整され、そして再連結される（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４年）を参照のこと）。ＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）における正しい配列を確認するために、連結混合物を使用して、大腸菌のＸｌ−１株およびＤＨ５２株が形質転換され、成功した形質転換体が抗生物質（例えば、アンピシリン）耐性によって選択される。これらは適宜行われる。形質転換体に由来するプラスミドが調製され、制限によって分析され、かつ／または配列決定される（例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．９：３０９（１９８１）；Ｍａｘａｍ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５：４９９（１９８０）を参照のこと）。一般に、発現ベクターは宿主細胞において効率よく複製することができ、その結果、宿主細胞は多数コピーの発現ベクターを蓄積し、次に、高レベルの目的タンパク質を合成する。発現カセットは、適切な細胞宿主におけるエピソーム維持のために複製系に含ませることができるか、または発現カセットが宿主のゲノム内に組み込まれる場合には複製系を用いることなく提供され得る。
【００９９】
ＰＢＤ融合タンパク質をコードするＤＮＡが得られると、ＤＮＡは宿主細胞において複製し得るベクターに入れられるか、あるいはＰＣＲまたはロングＰＣＲなどの技術によってインンビトロで増やされる。複製するベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド、人工染色体などを挙げることができる。望ましいベクターには、目的遺伝子の変異誘発に有用なベクター、または目的遺伝子の宿主細胞における発現に有用なベクターが含まれる。ロングＰＣＲの技術により、可能な長い構築物がインビトロで増やされており、その結果、変異誘発または発現シグナルの付加などの目的遺伝子の改変、および得られた構築物の増殖を、複製するベクターまたは宿主細胞を使用することなく完全にインビトロで行うことができる。
【０１００】
ＰＢＤ融合タンパク質を発現させるために、機能的な転写および翻訳の開始領域および終結領域が、ＰＢＤ融合タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に連結される。融合タンパク質をコードする領域の発現をインビトロまたは宿主細胞内で行うことができる。転写および翻訳の開始領域および終結領域は、発現させられるＤＮＡ、所望する系で発現し得ることが知られている遺伝子、または所望する系で発現し得ることが考えられる遺伝子、発現ベクター、化学合成を含む様々な非限定的な供給源に由来し得るか、あるいは宿主細胞の内在性遺伝子座に由来する。
【０１０１】
インビトロ発現を、例えば、インビトロでの使用のために設計された発現ベクターにＰＢＤ融合タンパク質のコード領域を入れ、そしてウサギ網状赤血球溶解物および補助因子を加えることによって達成することができる。この場合、標識されたアミノ酸を、所望する場合には混合することができる。そのようなインビトロ発現ベクターは、使用される系において必要な発現シグナルの一部またはすべてを備えることができる。これらの方法はこの分野では十分に知られており、系の成分は市販されている。その後、反応混合物は、例えば、その結合活性を測定することによって融合タンパク質について直接アッセイすることができ、あるいは合成された融合タンパク質を精製して、その後アッセイすることができる。
【０１０２】
宿主細胞における発現は一過的な様式または安定的な様式で達成することができる。一過的な発現は、宿主細胞において機能的な発現シグナルを含有するが、宿主細胞において複製せず、そして宿主細胞にほとんど組み込まれない導入された構築物から生じ得るか、または宿主細胞が増殖しない場合に生じ得る。一過的な発現はまた、目的遺伝子に機能的に連結されている調節可能なプロモーターの活性を誘導することによって達成され得るが、そのような誘導可能な系は、しばしば、低い基底レベルの発現を示す。安定的な発現は、宿主ゲノムに組み込まれ得る構築物、または宿主細胞において自律的に複製する構築物を導入することによって達成することができる。目的遺伝子の安定的な発現は、発現構築物に存在する選択マーカーの使用によってマーカーを発現する細胞について選択され得るか、または発現構築でトランスフェクションされ、その後、マーカーを発現する細胞について選択され得る。安定的な発現が組み込みから生じる場合、構築物の組み込みは宿主ゲノム内にランダムに生じ得るか、または宿主の遺伝子座との組換えを標的化するのに十分な宿主ゲノムとの相同性を有する領域を含有する構築物の使用によって標的化され得る。構築物が内因性の遺伝子座に標的化される場合、転写調節領域および翻訳調節領域のすべてまたは一部が内因性の遺伝子座によって提供され得る。
【０１０３】
供給源の生物におけるＰＢＤ融合タンパク質の増大した発現が所望される場合、いくつかの方法を用いることができる。ＰＢＤ融合タンパク質をコードするさらなる遺伝子を宿主生物に導入することができる。発現はまた、例えば、より強力なプロモーターを使用することによって、または脱安定化配列をｍＲＮＡまたはコードされるタンパク質のいずれかから除くことによって、または宿主ゲノムからそのような情報を除くことによって、または安定化配列をｍＲＮＡに加えることによって増大させることができる（米国特許第４９１０１４１号）。
【０１０４】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され、かつ目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸に機能的に連結されているプロモーターを含有する。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に存在し（一般には、開始コドンの約１００ｂｐ〜１０００ｂｐのところ）、かつプロモーターが機能的に連結されている特定の核酸配列（ＰＢＤ融合タンパク質をコードする配列など）の転写および翻訳を制御する非翻訳配列である。
【０１０５】
プロモーターは、典型的には、誘導的と構成的との２つのクラスに分けられる。誘導的プロモーターは、培養条件の何らかの変化（例えば、栄養素の存在または非存在あるいは温度の変化など）に応答してその制御下にある核酸からの増大したレベルの転写を開始させるプロモーターである。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される非常に多くのプロモーターがこの分野では十分に知られている。プロモーターは、制限酵素消化により供給源の核酸からプロモーターを除き、単離されたプロモーター配列を融合タンパク質のコード配列とともにベクターに挿入することによって、融合タンパク質をコードする核酸に機能的に連結される。プロモーターは、合成、半合成、（宿主細胞に対して）細胞本来のプロモーター配列または（宿主細胞に対して）異種のプロモーターとすることができ、融合タンパク質の増幅および／または発現を行わせるために使用することができる。原核生物宿主との使用に好適なプロモーターはこの分野では十分に知られている（例えば、Ｃｈａｎｇ他、（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ、２７５：６１５；Ｇｏｅｄｄｅｌ他、（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ、２８１：５４４；Ｇｏｅｄｄｅｌ、（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．８：４０５７；欧州特許庁特許出願公開第３６，７７６号；Ｈ．ｄｅ　Ｂｏｅｒ他、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１〜２５を参照のこと）。そのようなプロモーターのヌクレオチド配列は一般に知られており、それにより、当業者は、何らかの必要な制限部位を提供するリンカーまたはアダプターを使用して、融合タンパク質をコードするヌクレオチドにプロモーターを機能的に連結させることができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ他、（１９８０）Ｃｅｌｌ、２０：２６９を参照のこと）。
【０１０６】
細菌系において使用されるプロモーターはまた、ＰＢＤコード核酸に機能的に連結されているシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。例示的な転写調節領域またはプロモーターには、細菌の場合、ｌａｃプロモーター、ラムダのレフトプロモーターおよびライトプロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃのプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが含まれる。転写調節領域は、融合された遺伝子の発現時期を調節することができる調節配列をさらに含むことができる（例えば、栄養素または発現産物の増殖培地における存在または非存在、温度など）。例えば、融合遺伝子の発現は、バクテリオファージλＰＬプロモーター、バクテリオファージλＯＬオペレーターおよび温度感受性リプレッサーを含む調節配列を使用して温度によって調節することができる。プロモーターの調節は、リプレッサーとオペレーターとの相互作用によって達成される。真核生物宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結に必要な配列、およびｍＲＮＡを安定化させる配列を含有する。ある種のプロモーターからの発現は、ある種の誘導剤（例えば、メタロチオネインプロモーターに対する亜鉛イオンおよびカドミウムイオン）の存在下で高めることができる。このように、ＰＢＤ融合タンパク質の発現を制御することができる。発現を制御できることは、例えば、ＰＢＤ融合タンパク質が宿主細胞に対して致死的である場合には重要であり得る。
【０１０７】
宿主細胞が酵母である場合、酵母細胞において機能的な転写領域および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば、解糖経路における遺伝子（アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼなど）から、または調節可能な遺伝子（酸性ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼなど）から得ることができる。構成的または誘導的な転写が所望されるかどうか、目的のオープンリーディングフレームと一緒になったプロモーターの特定の効率、強力なプロモーターと誘導的な転写を可能にする異なるプロモーターの制御領域とを結合させることができること、構築の容易さなどに依存して、多数の調節配列のいずれか１つを特定の状況において使用することができる。特に注目されるものは、ガラクトースの存在下で活性化されるプロモーターである。ガラクトースにより誘導され得るプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０）が、酵母における高レベルの調節された発現のために広範囲に利用されている（Ｌｕｅ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第７巻、３４４６頁、１９８７；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．第５１巻、４５８頁、１９８７）。ＧＡＬプロモーターからの転写は、ガラクトースが存在するときには、プロモーター領域に結合して転写を活性化するＧＡＬ４タンパク質によって活性化される。ガラクトースが存在しない場合、アンタゴニストのＧＡＬ８０がＧＡＬ４に結合して、ＧＡＬ４が転写を活性化することを妨げる。ガラクトースの添加により、ＧＡＬ８０がＧＡＬ４による活性化を阻害することが妨げられる。
【０１０８】
翻訳開始コドンＡＴＧの周りのヌクレオチド配列は酵母細胞における発現に影響することが見出されている。所望するポリペプチドが酵母において良好に発現しない場合、外因性遺伝子のヌクレオチド配列を、最適な遺伝子発現を得るために効率的な酵母の翻訳開始配列を含むように改変することができる。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現の場合、これは、内因性のサッカロミセス遺伝子（好ましくは、ラクターゼ遺伝子などの高発現の遺伝子）に読み枠を合わせて翻訳開始部位を融合することにより、効率的に発現しない遺伝子の部位特異的変異誘発によって行うことができる。終結領域は、開始領域が得られた遺伝子の３’領域に由来し得るか、または異なる遺伝子に由来し得る。非常に多くの終結領域が知られており、同じ属および種ならびに異なる属および種の様々な宿主において申し分ないことが見出されている。終結領域は、通常、何らかの特定の性質のためからではなく、むしろ便宜的に選択される。好ましくは、終結領域は酵母の遺伝子に由来する（特に、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ））。２つの哺乳動物遺伝子（χインターフェロンおよびα２インターフェロン）の３’領域もまた、酵母において機能することが知られている。
【０１０９】
場合により、融合された遺伝子の分泌を規定するシグナル配列（分泌リーダー）を、構造遺伝子の上流に、構造遺伝子と読み枠を合わせて備えることが望ましいことがある。例示的な分泌リーダーには、ペニシリナーゼ、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、外膜タンパク質などの分泌リーダーが含まれる。正しい読み枠で融合することによって、キメラなポリペプチドを培地中に分泌させることができる。
【０１１０】
融合タンパク質のコード配列を含む構築物は標準的な様々な技術によって宿主細胞に導入することができる。これらの技術には、形質転換、プロトプラスト融合、リポフェクション、トランスフェクション、形質導入、接合、感染、弾道学的衝撃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、スクレイピング、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する任意の他の方法が含まれる。使用される形質転換方法には、酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、１８６頁〜１８７頁、１９９１）が含まれる。原核生物および真核生物の生物または細胞の遺伝子形質転換に対する様々な方法がこの分野では十分に知られている（例えば、Ｃｏｈｅｎ他、（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）６９：２１１０；Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（上記）を参照のこと）。宿主細胞は、上記の本発明の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いてトランスフェクションすることができ、好ましくは形質転換することができ、そして形質転換された細胞は、プロモーターを誘導するために、あるいは形質転換体を選択するために、あるいは所望するＰＢＤまたはＰＢＤ融合タンパク質をコードする遺伝子を増幅するために適するように改変され得る従来の栄養培地で培養することができる。「形質転換」により、核酸が染色体外エレメントとして、または宿主生物のゲノム内への組み込みにより、そのいずれかで複製可能であるように、核酸が生物に導入されることが意味される。
【０１１１】
対象の宿主は、少なくとも１コピーの発現構築物を有し、そして遺伝子がゲノムに組み込まれるか、増幅されるか、または多数コピーを有する染色体外エレメントに存在するかどうかに依存して２つ以上の発現構築物を有することがある。対象の宿主が酵母である場合、下記の４つの基本的なタイプの酵母プラスミドベクターを使用することができる：酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）、酵母複製プラスミド（ＹＲｐ）、酵母動原体プラスミド（ＹＣｐ）および酵母エピソームプラスミド（ＹＥｐ）。ＹＩｐは、酵母の複製起点を有しておらず、酵母ゲノムに組み込まれたエレメントとして増殖させなければならない。ＹＲｐは、染色体に由来する自律的な複製配列を有し、中程度のコピー数（２０〜４０）として増殖し、従って、自律的に複製し、不安定に分離するプラスミドである。ＹＣｐは、複製起点および動原体配列の両方を有し、低コピー数（１０〜２０）として増殖し、従って、自律的に複製し、安定に分離するプラスミドである。ＹＥｐは、酵母の２μプラスミドに由来する複製起点を有し、高コピー数として増殖し、従って、自律的に複製し、不規則に分離するプラスミドである。酵母におけるプラスミドの存在は、プラスミドに存在するマーカーに対する選択を維持することによって確保され得る。特に注目されるものは、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られるＹＥｐプラスミドで、ウラシルプロトトロフィー（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）および発現させるためのＧＡＬ１ガラクトース誘導プロモーターを提供する）、ｐＲＳ４２５−ｐＧ１（Ｔ．Ｈ．Ｃｈａｎｇ博士（オハイオ州立大学、分子遺伝学の準教授）から得られ、構成的なＧＰＤプロモーターを含有し、ロイシンプロトトロフィーを提供するＹＥｐプラスミド）、およびｐＹＸ４２４（構成的なＴＰ１プロモーターを有し、ロイシンプロトトロフィーを提供するＹＥｐプラスミド；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ（１９８２）、Ｊ．Ｍｏｌ＆Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１：４１９）の酵母ベクターである。
【０１１２】
形質転換された宿主細胞は、導入された構築物に含有されるマーカーに対する選択によって同定することができる。あるいは、別個のマーカー構築物を、多くの形質転換技術により多くのＤＮＡ分子が宿主細胞に導入されるように、所望する構築物とともに導入することができる。典型的には、形質転換された宿主は、選択培地におけるその生育能について選択される。選択培地には抗生物質を混合してもよく、あるいは選択培地は、形質転換されなかった宿主の生育に必要な因子（栄養素または成長因子など）を有しなくてもよい。そのために導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質耐性をもたらし得るか、または不可欠な成長因子または酵素をコードして、形質転換された宿主で発現したときに選択培地における生育を可能にし得る。形質転換された宿主の選択はまた、発現したマーカータンパク質が直接的または間接的のいずれかで検出され得るときに行うことができる。マーカータンパク質は、単独で、または別のタンパク質との融合体として発現させることができる。マーカータンパク質はその酵素活性によって検出することができる；例えば、β−ガラクトシダーゼは基質Ｘ−ｇａｌを着色産物に変換することができ、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光性産物に変換することができる。マーカータンパク質はその発光特性または改変特性によって検出することができる；例えば、発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、青色光で照らされたときに蛍光を発する。抗体を使用して、マーカータンパク質または分子標識（例えば、目的タンパク質に存在する分子標識）を検出することができる。マーカータンパク質または標識を発現する細胞は、例えば、視覚的に、または抗体を使用するＦＡＣＳまたはパンニングなどの技術によって選択することができる。酵母の形質転換体を選択する場合、酵母において機能する任意のマーカーを使用することができる。望ましくは、カナマイシンおよびアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性が、ウラシル、ロイシン、リシンまたはトリプトファンを含まない培地における生育能と同様に注目される。
【０１１３】
融合された遺伝子が適切な宿主に導入されると、宿主は、プロモーターを誘導するために、または形質転換体を選択するために、または遺伝子を増幅するために（適するように改変された）従来の栄養培地で生育させて、融合遺伝子を発現させることができる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質を産生させるために使用される原核生物細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｍｅｄｉａ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｎｏｌａｎ，Ｃ．編）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ａ．１〜４頁（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に一般的に記載されているような好適な培地で培養することができる。生成物が分泌される場合、栄養培地を回収して、多糖マトリックスに結合させることによって生成物を単離することができる。生成物が宿主細胞内に保持される場合、細胞を集め、溶解し、そして多糖基質に結合させることによって、生成物を単離および精製することができる。活性なタンパク質を産生させるために、タンパク質をフォールディングさせることが必要になる場合がある。挿入された配列の発現を調節するか、所望される特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞菌株が選ばれる。用語「宿主細胞」は、目的のＰＢＤタンパク質またはＰＢＤ融合タンパク質を発現し得るそのような細胞として定義され得る。宿主細胞には、原核生物細胞（細菌）および真核生物細胞（哺乳動物、酵母、昆虫、植物など）が含まれる。タンパク質生成物の修飾（例えば、リン酸化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能には重要であると考えられる。種々の宿主細胞は、多くの場合、発現したタンパク質の翻訳後プロセシングに対する特徴的または特異的な機構を有する。適切な細胞系統または宿主系を、発現したＰＢＤタンパク質またはＰＢＤ融合タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実に行うために選ぶことができる。一例として、組換え生成物は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ず、天然型グリコシル化または他のグリコシル化を有する。グリコシル化の量は、部分的には、生成物が産生される生物だけでなく、その特定のペプチドの配列に依存している。大腸菌細胞における生成物の発現は非グリコシル化生成物をもたらし、昆虫細胞における生成物の発現は、一般に、哺乳動物細胞における生成物の発現よりも少ないグリコシル化をもたらす。酵母における発現は過度なグリコシル化をもたらし得る。好ましくは、宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌することが望ましい。発現が真核生物宿主（他、植物または哺乳動物）で行われる場合、構築物はどれも潜在的なグリコシル化部位を含まないことが好ましい。
【０１１４】
ＰＢＤ融合タンパク質の産生は原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれかで行うことができる。目的とする原核生物細胞には、大腸菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、シアノバクテリアなどが含まれる。ＰＢＤ融合タンパク質のクローニングおよび発現のために特に注目される原核生物細胞として、大腸菌ＢＬ２（ＤＥ３）ＰＬＹＳ株が挙げられる。真核生物細胞には、乳汁分泌動物の細胞などの哺乳動物細胞、ニワトリなどの鳥類の細胞、ならびに昆虫細胞、菌類細胞、植物細胞および藻類細胞を含む遺伝子操作が容易な他の細胞が含まれる。これらの細胞は培養することができ、あるいは動物を含む宿主生物の一部またはすべてとして形成させることができる。ウイルスおよびバクテリオファージもまた、遺伝子移入、細胞ターゲティングおよび選択の場合には特に、ＰＢＤ融合タンパク質を産生させる際に細胞とともに使用することができる。宿主動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヤクなどが含まれる。これらは、トランス遺伝子発現集団の迅速な拡大のために遺伝子操作およびクローニングを行うことが容易である。動物の場合、遺伝子調節領域を改変することにより、ＰＢＤ融合タンパク質のコード配列を、標的とするオルガネラ、組織および体液（宿主動物の乳汁など）における発現のために適合させることができる。
宿主微生物の例には、サッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、あるいはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属または他の菌類などの他の酵母（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属などの糸状菌類）が含まれる。宿主微生物の望ましい特徴は、例えば、宿主微生物が遺伝子的に十分に特徴付けられ、そして超高密度発酵を使用する生成物の高レベル発現のために使用できるということである。
【０１１５】
鳥類種および鳥類細胞（ニワトリ、七面鳥、ウズラおよびアヒルなど）においてＰＢＤ融合タンパク質を産生させる場合、この分野で知られている手順に従って、ＰＢＤ融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入することによって遺伝子移入を行うことができる。トランスジェニック動物が所望される場合、胚の多能性幹細胞に、トランス遺伝子をコードするＰＢＤ融合タンパク質を有するベクターを導入して、多能性幹細胞を成体動物に発達させることができる（米国特許第５，１６２，２１５号；Ｏｎｏ他、（１９９６）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ａ　１１３（３）：２８７〜２９２；国際特許出願公開ＷＯ９６１２７９３；国際特許出願公開ＷＯ９６０６１６０）。ほとんどの場合において、トランス遺伝子は、高レベルのＰＢＤ融合タンパク質を発現させるように改変される。トランス遺伝子は、例えば、鳥類細胞において機能する転写調節領域および／または翻訳調節領域（特定の組織および卵部分（卵黄など）において発現を行わせるプロモーターなど）を備えることによって改変することができる。遺伝子の調節領域は、ニワトリ貧血症ウイルスまたはトリ白血病ウイルスまたは鳥類遺伝子（ニワトリのオバルブミン遺伝子など）を含む様々な供給源から得ることができる。
【０１１６】
昆虫細胞におけるＰＢＤ融合タンパク質の産生は、ＰＢＤ融合タンパク質トランス遺伝子を有するバキュロウイルス発現ベクターを使用して行うことができる。バキュロウイルス発現ベクターは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈなどのいくつかの市販元から得ることができる。上記に記載される他の発現ベクターの場合と同様に、ＰＢＤ融合タンパク質トランス遺伝子の発現時期、発現程度および活性を、ポリペプチドのコード配列を特定の使用のために選択された適切な転写調節領域および翻訳調節領域と合わせることによって調節することができる。特に注目されるものは、事前に選択された生育条件のもとで誘導され得るプロモーター領域である。例えば、温度感受性変異および／または代謝応答性変異をトランス遺伝子のコード配列に導入すること、および／またはその調節領域に導入すること、および／またはトランス遺伝子が導入される細胞のゲノムに導入することが、この目的のために使用することができる。
【０１１７】
形質転換された宿主細胞は、所望する最終結果に適合した適切な条件のもとで生育させられる。培養で生育させられる宿主細胞の場合、条件は、典型的には、最大収量または最も経済的な収量のＰＢＤ融合タンパク質を産生させるように最適化される。最適化され得る培地条件には、炭素源、窒素源、基質の添加、添加される基質の最終濃度、添加される基質の形態、好気的生育または嫌気的生育、生育温度、誘導剤、誘導温度、誘導時の生育期、収穫時の生育期、ｐＨ、密度、および選択の維持が含まれる。例えば、酵母などの微生物は、好ましくは、目的の選択された培地を使用して生育させられる。そのような培地には、酵母ペプトンブロス（ＹＰＤ）および最少培地（アミノ酸、酵母窒素基剤および硫酸アンモニウムを含有し、選択に必要な成分（例えば、ウラシル）を含まない）が含まれる。望ましくは、添加される基質は、最初にエタノールに溶解される。必要な場合には、目的とするポリペプチドの発現を、例えば、ＧＡＬプロモーターからの発現を誘導させるためのガラクトースを含むか、またはガラクトースを添加することによって誘導させることができる。
【０１１８】
宿主動物の細胞における発現を、同様に、一過的な様式または安定的な様式で達成することができる。導入された構築物の所望する発現レベルを維持するために、一過的な発現を知られている方法（例えば、感染またはリポフェクション）により達成することができ、そして繰り返すことができる（Ｅｂｅｒｔ、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９４／０５７８２を参照のこと）。安定的な発現を宿主ゲノムへの構築物の組み込みによって達成することができ、これによりトランスジェニック動物が得られる。構築物は、例えば、受精卵の前核への構築物のマイクロインジェクションによって、あるいはトランスフェクション、レトロウイルス感染または他の技術によって導入することができ、それにより、構築物が、成体動物を形成し得る細胞系統または成体動物に取り込まれ得る細胞系統に導入される（米国特許第４８７３１９１号；米国特許第５５３０１７７号；米国特許第５５６５３６２号；米国特許第５３６６８９４号；Ｗｉｌｍｕｔ他、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ、３８５：８１０）。組換えられた卵または胚は代理母に移される（米国特許第４８７３１９１号；米国特許第５５３０１７７号；米国特許第５５６５３６２号；米国特許第５３６６８９４号；Ｗｉｌｍｕｔ他（上記））。
【０１１９】
出生後、トランスジェニック動物は、例えば、導入されたマーカー遺伝子（毛の色に対する遺伝子など）の存在によって、あるいは導入された構築物を検出するための、血液サンプル、乳汁サンプルまたは組織サンプルからのＰＣＲまたはサザンブロッティングによって、あるいは発現したタンパク質またはそれから産生される生成物を検出するための免疫学的アッセイまたは酵素学的アッセイによって同定される（米国特許第４８７３１９１号；米国特許第５５３０１７７号；米国特許第５５６５３６２号；米国特許第５３６６８９４号；Ｗｉｌｍｕｔ他（上記））。得られたトランスジェニック動物は、完全なトランスジェニック体あり得るか、またはトランス遺伝子をその細胞の一部のみに有するモザイク体であり得る。核のある細胞を除核された卵と融合し、その後、代理母に移すことによって達成される哺乳動物クローニングの出現により、導入された構築物を含む「始祖」の動物または細胞を得ることに対する迅速で大規模な産生の可能性がもたらされる。これ以前では、トランス遺伝子を繁殖用の動物の生殖系列に存在させることが必要であった（Ｗｉｌｍｕｔ他（上記））。
【０１２０】
宿主動物における発現は、宿主が飼いならされた動物である場合には特に、ある程度の効率を示す。宿主動物から容易に得ることができる体液（乳汁など）にＰＢＤ融合タンパク質を産生させる場合、トランス遺伝子は、雌性宿主の乳腺細胞において発現させることができる。トランス遺伝子は、トランス遺伝子が乳腺細胞に保持されるか、または乳汁中に分泌されるように発現のために適合させて、乳汁に局在化するＰＢＤ融合タンパク質を形成させることができる（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９５／２４４８８）。発現は、特定の調節配列（ウシのα−ラクトアルブミン、α−カゼイン、β−カゼイン、χ−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリンまたは乳清酸性タンパク質の調節配列など）を使用して乳腺組織における発現のために標的化することができ、そして必要に応じて、１つもしくは２つ以上のイントロンおよび／または分泌シグナル配列を含むことができる（米国特許第５５３０１７７号；Ｒｏｓｅｎ、米国特許第５５６５３６２号；Ｃｌａｒｋ他、米国特許第５３６６８９４号；Ｇａｒｎｅｒ他、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９５／２３８６８）。精製が必要な場合、ＰＢＤ融合タンパク質は、基質多糖を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製される。
【０１２１】
本発明を使用する際、多糖構造物は、試薬、温度およびその他の適切な条件のもとで所望の改変を達成するために十分な時間にわたって多糖構造物を十分な量のＰＢＤ融合タンパク質と接触させることによってＰＢＤ融合タンパク質を使用して改変される。改変の条件は、一般に、Ｋｍ、Ｖｍａｘおよびｋｃａｔおよび他の生化学的パラメーター（ＰＢＤの至適ｐＨなど）を規定するように最適化される。ＰＢＤと基質との相互作用は一般に極めて早い。従って、所望する効果を達成するために、ＰＢＤ融合タンパク質の様々な濃度、ならびに／あるいは所望する効果を達成するための処理時間および／または処理温度を評価することが必要である。使用される条件は経験的に決定されるが、使用されるＰＢＤ融合タンパク質および所望する最終結果の要求に基づく。一例として、エンドグルカナーゼに由来するＰＢＤを含むＰＢＤ融合タンパク質に対して典型的な条件には、ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）、一般には、綿などのセルロース繊維の２５ｍｇあたり約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのＰＢＤ濃度が含まれる。温度は、一般的には約２０℃〜３７℃であり、好ましくは約２５℃である。処理時間は、５分から１２時間までの範囲であるが、多糖構造物が損傷を受けない限り、それよりも長い処置を使用することができる。一般には、適するように、混合物は、構造物の均一な処理を容易にするために穏やかに攪拌される。構造物の処理を行った後、構造物は乾燥され、その後、紙または織物などの最終製品を調製するために使用される。あるいは、またはさらに、紙または織物などの最終製品は、上記に列挙された事項に類似する事項を考慮に入れてＰＢＤによって処理される。
【０１２２】
改変の進行または反応速度のアッセイは、改変処理の途中で形成され得る阻害的な最終生成物を検出するために、そして処理の途中に生成される中間的または最終的な望ましい性質を検出するために使用することができる。例えば、繊維を完全に架橋しないことが望ましい場合がある。むしろ、構造物の不完全な架橋によって存在する、望ましい性質を有する多糖構造物を得るために、例えば、製織のためにあまり剛直でない糸を得るために、反応を中間点で停止させることが望ましい場合がある。多数の客観的な試験が、ＰＢＤ処理を評価するために当業者には知られており、これには、ヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性が含まれる。
【０１２３】
達成される多糖構造物の改変のタイプは、少なくも部分的には、結合ドメインに融合されるタンパク質の性質に依存する。ＰＢＤによる改変は、多糖の構造物における観測可能（検出可能）な変化として定義される。これには、増大した湿潤強度などの観測可能な改変をもたらす多糖構造物の凝集、疎水性、親水性、濡れ性、表面性状およびその他などの表面性質における変化が含まれる。変化させることができる多糖含有材料の電気的性質には、表面電荷（陽電荷または陰電荷）および電気伝導度が含まれる。変化させることができる多糖含有材料の化学的性質には、様々な化学的反応性化学基および光化学的反応性化学基を少なくとも多糖含有材料の表面に導入することが含まれる。変化させることができる多糖含有材料の機械的性質には、引張り強度、剪断耐性、耐摩耗性、摩擦係数および弾性が含まれる。一例として、多糖構造物がセルロースである場合、１分子あたり２つ以上のＰＢＤを有する試薬または組成物を使用して、セルロース繊維を架橋することができる。図９ａ〜図９ｃには、本発明のＣＢＤ連結剤ユニットが多糖のポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる方法がいくつか概略的に示されている。図９ａには、第１のポリマー構造ユニットに結合した第１のＣＢＤと、第２のポリマー構造ユニットに結合した第２のＣＢＤとを有するＣＢＤ連結剤ユニットが概略的に示されている。柔軟度が大きいリンカーユニットが使用される場合には少なくとも、ＣＢＤ連結剤ユニットの第１および第２のＣＢＤはともに同じポリマー構造ユニットに結合し得ることが予想されるはずである。図９ｂには、第１および第２の両方のＣＢＤが１個のポリマー構造ユニットに結合している柔軟なリンカーユニットを有するＣＢＤ連結剤ユニットが示されている。図９ｃには、ポリマー材料の三次元網目構造を形成させるために、複数のポリマー構造ユニットが複数のＣＢＤ連結剤ユニットによってどのように架橋されるかが概略的に示されている。このようにして、フィラメント状の多糖（例えば、セルロースフィラメント）の凝集体を形成させることができる。ＣＢＤ連結剤ユニットを介して架橋されたセルロース材料から組み立てられる材料（紙、綿糸および綿織物（織布および不織布の両方）など）は、ヤング率などの変化した機械的性質を有する。セルロース材料の架橋は、セルロース含有材料を製造する際の様々な段階で行うことができる。例えば、紙製品の場合、架橋は、製紙プロセスにおける様々な段階でセルロース繊維をＣＢＤ連結剤ユニット組成物で処理することによって行うことができ、あるいは得られた紙製品をＣＢＤ連結剤ユニットで処理することができる。同様に、綿糸または綿織物は、改善された表面性質および／または機械的性質を有する糸または綿織物を得るために、ＣＢＤ連結剤ユニット組成物で架橋することができる。
【０１２４】
機能的成分を含むＰＢＤ融合タンパク質で多糖構造物または多糖含有材料を処理することによって、様々な新規な物理的性質、電気的性質、化学的性質および機械的性質を有する新規な材料を得ることができる。図８には、少なくとも１つのＣＢＤと、それに結合した機能的成分（ＦＭ）とを含むＣＢＤ機能化成分が概略的に示されている。機能的成分は多数の化学種のいずれかであり得る。これには、濡れ性を低下させて、水分および水に対する材料の増大した耐性をもたらす疎水性アミノ酸の配列またはペプチドあるいは脂肪酸誘導体などの疎水性成分；親水性成分；電気的荷電成分またはイオン性成分；ケイ素結合性成分；ポリマー結合性成分；金属、または金属基質に対する結合をもたらす金属結合性成分（金属結合性成分の例には、細菌シドロホア、メタロチオネインおよびメタロチオネイン様タンパク質（Ｓｌｉｃｅ他、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２５６〜２６３）、フェリチン（Ｓｐａｎｎｅｒ他、（１９９５）Ｂｏｎｅ１７：１６１〜１６５）、ならびに設計された金属結合性タンパク質（例えば、Ｐｅｓｓｉ他、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６２：３６７〜３６９）が含まれる）；化学的反応性基；光化学的反応性基；またはチオール基が含まれる。本発明の化学的反応性基には、例えば、アルデヒド、マレイミド、ヒドラジド、エポキシドまたはカルボジイミドが含まれ得る。本発明の光化学的反応性基には、フェニルアジドが含まれ得る。
【０１２５】
同様に、疎水性成分（例えば、疎水性ポリペプチド、長鎖の炭化水素または炭化水素誘導体）を有する組成物を使用して、セルロース繊維またはセルロース繊維から作製された製造物に疎水性を付与することができる。疎水性は、改変されたセルロース繊維から組み立てられた材料の低下した濡れ性をもたらし、そして間接的には、水の存在下における材料の増大した耐久性をもたらす。一方で、セルロース繊維の架橋は、直接的には、材料の増大した湿潤強度をもたらす。簡略化するために、紙または他のセルロース含有材料の強度に対する本明細書中での参照は、そのような材料の湿潤強度を含むように限定的には使用されない。
【０１２６】
本発明のプロセスを使用して改変することができる多糖材料のタイプは様々である。例には、木材製品、セルロース繊維に由来する紙製品、および綿またはラミーに由来する製品（糸および織物など）が含まれる。用語「紙」には、繊維状のセルロース材料およびセルロース材料と合成材料との組合せから作製されるシート様の塊および成形された製造物が含まれる。紙の例には、ティッシュペーパー、事務用紙、新聞印刷用紙、波形加工用紙、ペーパータオル、ラミネート紙および板紙が含まれる。用語「多糖材料」または用語「多糖含有材料」は、セルロースまたはキチンなどの少なくとも１つの多糖（一般には、実質的な量の少なくとも１つの多糖）を含む材料をいう。
【０１２７】
ＣＢＤ含有組成物はまた、製紙プロセスにおいて適用することができる。本発明により、ＣＢＤ含有組成物は、製紙プロセスの種々の段階でセルロース材料を処理するために使用することができる。例えば、処理は、成形段階またはサイズ剤処理段階で行うことができる。製紙の成形段階における処理は、ＣＢＤ架橋組成物（例えば、ＣＢＤ連結剤ユニット組成物またはセルロース架橋（融合）タンパク質（ＣＣＰ））をセルロース繊維の懸濁物に加えることによって行うことができる。好ましくは、セルロース材料のＣＢＤ含有組成物による処理は、成形段階時またはその前に行われる。機能的成分は、ＣＢＤ連結剤ユニットを得るためにリンカーユニットをＣＢＤに結合させることに関して本明細書中上記に記載される方法に従ってＣＢＤに結合（ａｔｔａｃｈ）、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または連結することができる（図４ａ〜４ｇ、図５ａ〜５ｂ）（例えば、米国特許第５，９６２，２８９号もまた参照のこと）。
【０１２８】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、下記の実施例を検討したときに当業者には明らかになる。下記の実施例は、限定であることを意図するものではない。さらに、本明細書中上記に記載され、そして下記の請求項において特許請求されている本発明の様々な実施形態および態様はそれぞれ、下記の実施例において実験的に裏付けられている。
【０１２９】
実施例
次に、下記の実施例が参照される。下記の実施例は、上記の説明とともに、非限定的な様式で本発明を例示する。
【０１３０】
一般に、本明細書中で使用されている用語法、および本発明において利用される実験室手順は、分子的技術、生化学的技術、微生物学技術および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は文献に詳しく説明されている。例えば、下記を参照のこと：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ他（編）、「Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｓｅｒｉｅｓ」、第１巻〜第４巻、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に示される方法論；「Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる「Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ−Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ　Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他（編）、「Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイは特許および科学的文献に詳細に記載されている、例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号を参照のこと；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ　Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ　Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１−３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）。これらはすべて、全体が本明細書中に示されているかのように参考として組み込まれる。他の一般的な参考文献が本明細書中に示されている。それらにおける手順は、この分野では十分に知られていると考えられ、そして読者の便宜のために示されている。それらに含まれる情報はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１３１】
生物学的材料の寄託
大腸菌ｐＥＴ−ＣＢＤは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍ、ＶＡ２０１１０−２２０９）に１９９３年４月１２に寄託され、アクセション番号７５４４４が割り当てられている。
【０１３２】
実施例１
ＣＢＤおよびＣＢＤ融合タンパク質の構築および発現
様々なＣＢＤおよびＣＢＤ融合タンパク質の構築および発現を開示する下記の米国特許の内容は参考として本明細書中に組み込まれる：米国特許第５４９６９３４号、米国特許第５６７０６２３号、米国特許第５７１９０４４号、米国特許第５７３８９８４号、米国特許第５８３７８１４号および米国特許第５８５６２０１号（すべて、Ｓｈｏｓｅｙｏｖ他）；米国特許第５１３７８１９号、米国特許第５２０２２４７号、米国特許第５３４０７３１号、米国特許第５９２８９１７号および米国特許第５９６２２８９（すべて、Ｋｉｌｂｕｒｎ他）；米国特許第５８２１３５８号（Ｇｉｌｋｅｓ他）。
【０１３３】
１．１　Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合ドメイン（ＣＢＤｃｌｏｓ）の構築および発現：
Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合タンパク質Ａのセルロース結合ドメインの構築およびｐＥＴ−ＣＢＤプラスミド（図１ａ〜１ｃを参照のこと）を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるその過剰発現はＭ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他（１９９３）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５７６２〜５７６８）により記載されている。米国特許第５４９６９３４号および米国特許第５７１９０４４号もまた参照のこと（これらはともに、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１３４】
１．２　ＣＣＰ−１８０の構築および発現：
ｐＥＴ−ＣＣＰ−１８０（図２ａ〜２ｅ）を、ｐＥＴ−ＣＢＤ（図１ａ〜１ｃ、Ｍ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他、（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５７６２〜５７６８）およびｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０（図１ｄ〜１ｇ、Ｅ．Ｓｈｐｉｇｅｌ他、（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５：１７〜２３から構築した［ｐＥＴ−ＣＢＤおよびｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＤＮＡフラグメントをそれぞれ１．２％アガロースゲルおよび０．６％アガロースで分離した。ｐＥＴ−ＣＢＤの５００ｂｐフラグメントおよびｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０の５Ｋｂフラグメントを、ＱｉａｅｘＤＮＡゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してゲルから抽出して、この２つのフラグメントを連結した。連結混合物を大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞に形質転換し、その後、発現宿主の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。読み枠が一致して融合された２つのＣＢＤを含有する陽性クローンをｐＥＴ−ＣＣＰ−１８０と名付け、配列決定によって確認した。ＣＣＰ−１８０の発現を、ＣＢＤｃｌｏｓについて、Ｍ．Ａ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他、（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５７６２〜５７６８によって記載されているように行った。
【０１３５】
１．３　プロテインＡ−ＣＢＤのクローニングおよび発現：
ＣＢＤを、テンプレートとしてのｃｂｐＡ遺伝子（Ｓｈｏｓｅｙｏｖ他、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３４８３〜３４８７）；ＥｃｏＲＩ部位を含むプライマーＡ（Ｎ端プライマー）：５’−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴ−３’（配列番号１１）；およびＢａｍＨＩ部位が続く停止コドンを含むプライマーＢ（Ｃ端プライマー）：５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）を使用してＰＣＲ増幅した。これらのプライマーは、プロテインＡ遺伝子のＣ末端に読み枠を合わせて融合される５００ｂｐのＤＮＡフラグメントのプラスミドｐＲＩＴ２へのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩの強制的クローニングを可能にするように設計された。ＰＣＲ条件は、Ｉｎｎｉｓ他、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ他編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、１９９０）に記載されている通りであったが、下記の改変を行った：２ｎｇのテンプレートＤＮＡおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２を反応混合物において使用した。反応をプログラム可能なサーマルコントローラー（Ｍ＆Ｊ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。標準的なＤＮＡ操作を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他編、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）に従って行った。
【０１３６】
ＰＣＲ増幅された生成物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、予想される５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｅｘゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して１．５％アガロースゲルから単離した。ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで事前に消化されたｐＲＩＴ２に、Ｔ４リガーゼを使用して連結した。連結混合物を使用して、大腸菌菌株２０９７コンピテント細胞を形質転換し、そして形質転換されたコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天平板で選択した。目的のＤＮＡインサートを含有する成功した構築物をｐＲＩＴ２−ＣＢＤと名付けた。
【０１３７】
ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤを、Ｔ７により媒介される過剰発現ベクターｐＥＴ３ｄ（Ｆ．Ｓｔｕｄｉｅｒ他、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３〜１３０）にクローン化した。ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤを、下記のプライマーを使用し、テンプレートとしてｐＲＩＴ２−ＣＢＤを使用してＰＣＲ増幅した：上記に記載されるＣ末端プライマー（すなわち、５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＴ−３’、配列番号１２）；およびＮｃｏＩ部位内に開始部位を含むＮ末端プライマー：５’−ＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＧＣ−３’（配列番号１３）。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩで部分消化した。回収されたＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、１．３ＫｂのＤＮＡフラグメントをｐＥＴ３ｄにクローン化した。連結混合物を使用して、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞を形質転換し、形質転換されたコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天平板で選択した。ＤＮＡインサートを含有する成功した構築物をｐＥＴ−ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤと名付けた（図３ａ〜３ｇ）。ｐＥＴ−ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換した。融合タンパク質の発現を、Ｎｉｌｓｓｏｎ他、（１９８５）ＥＭＢＯ　Ｊ．４：１０７５〜１０８０によって記載されるように行った。５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンが補充され、そしてｐＲＩＴ２−ＣＢＤを含有する大腸菌２０９７の一晩培養物の４００μｌが接種された４０ｍＬ容量のＬＢにおいて、すべての細胞を振とうフラスコにおいて２５０ｒｐｍで生育させた。培養物を、０．４のＯ．Ｄ．６００ｎｍが得られるまで３０℃の温度で生育させた。その後、温度を４２℃に上げて４５分間保ち、その後、３７℃に下げてさらに２時間保った。
【０１３８】
ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤの過剰発現が、ｐＥＴ−ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で得られた。接種物を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９最少培地（０．６５　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．２５５　ＮａＣｌ、０．５％ＮＨ４Ｃｌ、２０％グルコース、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、および１ｍＭのチアミン−ＨＣｌ）で細胞を一晩生育させることによって調製した。接種物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（１．２％バクト−トリプトン、２．４％バクト−酵母抽出物、０．４％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１７ＭのＫＨ２ＰＯ４、および０．７２ＭのＫ２ＨＰＯ４）で１：５０に希釈した後、１．５のＯ．Ｄ．６００ｎｍになるまで細胞を３７℃で生育させ、その後、０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。細胞を３７℃でさらに４時間生育させた。細胞を、２，０００ｇで１０分間の遠心分離によって集めた。
【０１３９】
１．４　ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤの精製：
細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）に０．１ｇ／ｍｌの濃度で懸濁して、実験室用のＲＡＮＮＩＥ高圧ホモジナイザー（ＭＩＮＩ／ＬＡＢタイプ８．３０Ｈ）で破壊した。懸濁物を遠心分離し、タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌである１リットルの上清をセルロース（アビセル２００、Ｓｉｇｍａ）カラム（２．６ｘ３２ｃｍ）に加えた。カラムはＰＢＳ（１５ｍＭリン酸塩緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化された。２８０ｎｍの吸光度が０．０５未満になるまで、カラムを５ｍｌ／分の流速で洗浄した。ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤを５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＮａＯＨ溶液（ｐＨ１２．５）で溶出した。溶出されたＰｒｏｔＡ−ＣＢＤをＨＣｌで直ちにｐＨ８にして、凍結乾燥した。総大腸菌タンパク質（セルロースカラムに適用する前）、およびセルロースカラムから溶出したピーク（ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤ）を、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ、（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０〜６８５）に従って１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤのピークは、約４５ｋＤで単一バンドを示した。
【０１４０】
実施例２
処理（ＣＢＤ改変）材料および未処理材料の機械的性質の測定
機械的性質を万能試験機（図１１、Ｉｎｓｔｒｏｎ、Ｈｉｇｈ　Ｗｙｃｏｍｂｅ、英国）Ｉｎｔｅｒｆａｃｅタイプ：１０１１シリーズを使用して測定した。サンプル速度：１０ｐｔｓ／秒。クロスヘッド速度：５ｍｍ／分。すべての測定値は２３℃および６５％相対湿度で得られた。
【０１４１】
２．１　ヤング率：
縦弾性係数（すなわち、ヤング率）は材料の重要な性質である。ヤング率は、大ざっぱには、材料を不可逆的に伸長させない比較的小さい力を使用する弾性的な方法で材料を伸ばすために必要な力として定義することができる。
【０１４２】
２．２　紙の処理：
ティッシュペーパーの長方形片（大きさ：４５ｍｍｘ１０ｍｍｘ０．１ｍｍ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ７）における、ＣＢＤｃｌｏｓ、ＣＣＰ、ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤ、Ａｂ−ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤの各溶液（濃度がそれぞれ２．５ｍｇ／ｍｌおよび２．０ｍｇ／ｍｌ）に１０分間浸すことによって処理した。コントロール処理は、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ７）の溶液に同様に１０分間浸すことからなった。浸漬後、処理片およびコントロール片を液体から取り出して、真空下で２日間乾燥した。
【０１４３】
２．３　紙処理の結果：
２．３．１　ヤング率：
コントロール紙、ＣＢＤｃｌｏｓ処理サンプル紙およびＣＣＰ−１８０処理サンプルに対するヤング率の値を図１０ａに示す。ＣＢＤで処理された紙は、コントロール（未処理）紙のヤング率よりも著しく大きいヤング率を有した。ＣＣＰで処理された紙は、ＣＢＤ処理紙のヤング率よりもさらに大きいヤング率を有した。これらの結果は、ＣＢＤまたはＣＣＰによる紙の処理は紙の少なくとも１つの機械的性質を変えることを示している。より詳細には、ＣＢＤまたはＣＣＰのいずれかによる紙の処理は、未処理の紙と比較した場合、処理された紙の（ヤング率の値によって測定される）引張り強度を増大させた。
【０１４４】
２．３．２　最大負荷時のひずみ：
紙サンプルのＣＢＤｃｌｏｓ処理およびＣＣＰ−１８０処理に対する最大負荷時のひずみを示す結果を図１０ｂに示す。ＣＢＤ処理またはＣＣＰ処理はいずれも、コントロールの値と比較した場合、最大負荷時のひずみにおける実質的な変化を生じさせなかった。これらの結果は、ＣＢＤまたはＣＣＰによる紙の処理はその弾性を著しく変化させなかったことを示している。
【０１４５】
２．３．３　破壊到達エネルギー：
ＣＢＤまたはＣＣＰ−１８０で処理された紙サンプルに対する破壊到達エネルギーを示す結果を図１０ｃに示す。ＣＢＤで処理された紙の破壊到達エネルギーは、コントロールの破壊到達エネルギーと実質的に同じであった。しかし、架橋タンパク質のＣＣＰ−１８０で処理された紙は、コントロールと比較した場合、破壊到達エネルギーが著しく増大したことを示した。
【０１４６】
２．３．４　靱性：
ＣＢＤおよびＣＣＰで処理された紙サンプルに対する靱性を示す結果を図１０ｄに示す。ＣＢＤで処理された紙の靱性はコントロールの靱性と実質的に同じであった。しかし、ＣＣＰで処理された紙は、再度ではあるが、コントロールと比較した場合、靱性が著しく増大したことを示した。
【０１４７】
２．４　糸の処理：
この研究で使用された綿糸は、低いＴ．Ｐ．Ｕ（１インチあたりのターン数）を有する１００％グレーコットン二重糸繊維（３４／２）であった。糸の直径は０．５ｍｍであり、長さあたりの重量は０．８ｍｇ／ｃｍであった。それぞれの処理において、糸サンプルを、この分野で知られているタイプの特別仕様の糸処理装置（ＹＴＡ）を用いてタンパク質溶液に浸漬した。この糸処理装置は図１１に概略的に示されている。装置は、フィーダーホイール、回収ホイール、第１浴Ａ、第２浴Ｂ、および回収ホイールとかみ合う動力部を含む。フィーダーホイールおよび回収ホイールは相互に交換可能であり、それにより、糸を浴Ａおよび浴Ｂに再び通すことができる。動力部は様々な選択された速度で運転することができ、それにより、糸サンプルの浸漬時間を決定することができる。糸の長さはフィーダーホイールと回収ホイールとの間で関係し得るし、そして糸は、浴Ａおよび浴Ｂに含有される液体に糸を通すことによってフィーダーホイールから回収ホイールに移動させることができる。このようにして、糸を１つの液体（両方の浴に存在する）または２つの異なる液体に特定の時間にわたって浸けることができる。
【０１４８】
ある長さの綿糸（３ｍ〜４ｍ）がＹＴＡのフィーダーホイールに巻き付けられ、糸の一端が回収ホイールに接続され、そして糸が動力部によって浴Ａおよび浴Ｂを通って進められた。糸の浸漬継続時間は約４５秒であった。
【０１４９】
上記に記載される綿糸の処理は下記の通りであった：
（ｉ）ＣＣＰ−１８０による処理：糸繊維をＣＣＰ−１８０の溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ８）での１ｍｇ／ｍｌ）に浸けた（浴Ａ）。
（ｉｉ）プロテインＡ−ＣＢＤ（ＣＢＤ−ＰＡ）による処理：糸繊維をＣＢＤ−ＰＡ溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ８）での０．７５ｍｇ／ｍｌ）に浸け（浴Ａ）、その後、１ＸＴＢＳで洗浄した（浴Ｂ）（４５秒の浸漬時間）。
（ｉｉｉ）プロテインＡ−ＣＢＤおよび抗体による二重処理；糸繊維をＣＢＤ−ＰＡ溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ８）での０．７５ｍｇ／ｍｌ）に浸け（浴Ａ）、そして１ＸＴＢＳで洗浄した（浴Ｂ）（４５秒の浸漬時間）。その後、回収ホイールをフィーダーホイールと交換し、糸を抗血清溶液（０．７５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ）に浸け（浴Ａ）、そして１ＸＴＢＳで洗浄した（浴Ｂ）。
（ｉｖ）コントロール：糸繊維を２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ８）に４５秒間浸けた（浴Ａ）。
【０１５０】
処理後、３つの処理されたサンプルすべておよびコントロールを室温で数時間乾燥した。
【０１５１】
２．５　糸処理の結果：
２．５．１　ヤング率：
コントロール糸、ＣＣＰ−１８０処理サンプル糸、プロテインＡ−ＣＢＤ処理サンプル糸およびＡｂ−プロテインＡ−ＣＢＤ処理サンプル糸に対するヤング率の値を図１２ａに示す。ＣＣＰ−１８０およびＡｂ−プロテインＡ−ＣＢＤで処理された糸は、コントロール（未処理）糸の値よりも著しく大きいヤング率の値を有した。これらのデータは、Ａｂ−プロテインＡ−ＣＢＤおよびＣＣＰによる糸の処理により、コントロールと比較した場合、処理された糸の（ヤング率の値によって測定される）引張り強度が増大したことを示している。興味深いことに、ＣＢＤ−ＰＡで処理された糸は、コントロール糸の値よりもはるかに小さいヤング率の値を有した。理論によって限定されることを意図しないが、ＣＢＤ−ＰＡで処理された糸について低下したヤング率に対する考えられる説明は、ＣＢＤ−ＰＡによりセルロース繊維がゆるむことである（例えば、米国特許第５，８２１，３５８号（その内容は参考として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１５２】
２．５．２　最大負荷時のひずみ：
ＣＣＰ−１８０、ＣＢＤ−ＰＡおよびＣＢＤ−ＰＡ−Ａｂで処理された糸サンプルに対する最大負荷時のひずみを示す結果を図１２ｂに示す。ＣＣＰ−１８０またはＣＢＤ−ＰＡ−Ａｂのいずれかで処理された糸は、コントロールと比較した場合、最大負荷時のひずみのより小さい値を有した。従って、このことは、コントロールと比較した場合、これらの処理により、糸があまり弾性的にならなかったことを示している。ＣＢＤ−ＰＡで処理された糸は、コントロールの最大負荷時のひずみと類似する最大負荷時のひずみを有した。
【０１５３】
実施例３
材料の機能化
３．１　重金属種を液体から除くためのフィルター媒体の機能化：
ＣＢＤ機能的成分（例えば、図９ａ〜９ｃを参照のこと）を、重金属に対する親和性を有する機能的成分（金属結合性タンパク質など）にＣＢＤを結合させることによって調製する。セルロース材料（綿繊維など）を含む基質を、ＣＢＤ機能的成分のＣＢＤ成分が基質に結合するような条件（ｐＨ、温度、イオン強度など）のもとでＣＢＤ機能的成分で処理し、それにより、基質が、金属結合性の基質またはフィルター媒体をもたらす金属結合性の機能的成分によって機能化される。過度なレベルの重金属を含有する液体の流れが金属結合性のフィルター媒体に通され、それにより、液体流における重金属の濃度が非毒性レベルにまで大きく低下させられる。
【０１５４】
３．２　濡れ性を低下させた包装紙製品を製造するためのセルロース繊維の機能化：
ＣＢＤ機能的成分を、疎水性の機能的成分にＣＢＤを結合させることによって調製する。製紙に好適なセルロース繊維を、ＣＢＤ機能的成分のＣＢＤ成分がセルロース繊維に結合して、疎水性成分がそれに結合しているセルロース繊維が得られるような条件（ｐＨ、温度、イオン強度）のもとでＣＢＤ疎水性機能的成分で処理する。処理されたセルロース繊維から製造された紙は疎水性であり、耐水性である。
【０１５５】
代わりの例では、未処理（非機能化）のセルロース繊維から製造された紙が、紙を乾燥する前またはその後で、ＣＢＤに結合した疎水性成分で機能化される。ＣＢＤ疎水性機能的成分で処理された紙は疎水性であり、耐水性である。
【０１５６】
３．３　濡れ性を増大させたティッシュペーパーを製造するためのセルロース繊維の機能化：
ＣＢＤ機能的成分を、親水性の機能的成分にＣＢＤを結合させることによって調製する。ティッシュペーパーを、製紙プロセスの第１または第２の乾燥段階の前またはその後のいずれかで、ＣＢＤ親水性機能的成分で処理（機能化）する。ＣＢＤ親水性機能的成分で処理されたティッシュペーパーは親水性であり、水および水性液体の増大した吸収を示す。
【０１５７】
実施例４
Ｓタンパク質−ＣＢＤ−Ｓペプチド（ＳＳＣ）の発現
図１３は、ＳＣＳを大腸菌において発現させた結果を示す。ＩＰＴＧで誘導される前の大腸菌のタンパク質がレーン２に示され、ＩＰＴＧで誘導された後の大腸菌の総タンパク質がレーン３に示され、これに対して、ＳＣＳタンパク質を含有する封入体がレーン４に示されている。
【０１５８】
実施例５
予め成形された紙のＣＢＤ、ＣＣＰまたはＳＣＳによる処理：
図１４は、ＣＢＤ、ＣＣＰまたはＳＣＳでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。ＣＢＤまたはＣＣＰによるワットマン紙の処理は、試験したすべての濃度において、ヤング率が増大したことに留意すること。
【０１５９】
図１５は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示している。２．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＣＣＰを使用することにより、破壊到達エネルギーが約３０％増大したことに留意すること。さらに、ＳＣＳによる処理は、試験したすべての濃度において、破壊到達エネルギーが増大した。
【０１６０】
図１６は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示している。２．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＣＣＰを使用することにより、靱性が約４０％増大したことに留意すること。さらに、ＳＣＳによる処理は、試験したすべての濃度において、靱性が増大した。
【０１６１】
図１７は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示している。試験したすべての処理により、最大負荷時の応力が増大したことに留意すること。最も著しい効果が、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＣＰで得られた。最大負荷時の応力が増大することにより、紙の強度が増大していることが明らかにされる。
【０１６２】
もう一組の実験において、予め成形されたワットマン紙に対するＣＢＤおよびＣＣＰの影響を明らかにした。
【０１６３】
ワットマン紙Ｎｏ．１の長方形片（４０ｘ１０ｍｍ、０．１８ｍｍ厚）（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、英国）を２．５ｍｇ／ｍｌのＣＢＤまたはＣＣＰを含有する溶液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ７）に１０分間浸けた。その後、サンプルを６５％の相対湿度において２３℃で２４時間乾燥した。紙の最終水分含有量は３．２％であった。機械的性質を、紙および板紙の引張り特性に関する国際的な標準試験法（ＩＳＯ１９２４−４）に従って評価した。処理された紙の引張り試験を、Ｉｎｓｔｒｏｎ万能試験装置（ＵＴＭ）モデル１０１１（Ｈｉｇｈ　Ｗｙｃｏｍｂｅ、英国）を引張りモードで使用して行った。長方形の紙を、引張り実験中にわたって正しくつかむことを可能にする上部引張りグリップおよび下部引張りグリップ（ねじ作動型グリップ、Ｉｎｓｔｒｏｎ　Ｃｏｒｐ．、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）に入れた。すべての測定値は、２３℃、６５％相対湿度、および２０ｍｍ／分の一定した変形速度で得られた。測定された引張り特性には、破壊時応力、破壊時ひずみ、破壊点までの伸び、およびエネルギー吸収が含まれた。すべての計算を、Ｈａｙｄｅｎ，Ｗ．、Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｗ．Ｇ．＆Ｗｕｌｆｆ，Ｊ．、Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ、１〜２２（Ｊｏｈａｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、１９５６年）；Ｄｕｆｒｅｓｎｅ，Ａ．、Ｃａｖａｉｌｌｅ，Ｊ．Ｙ．＆Ｖｉｇｎｏｎ，Ｍ．Ｒ．、テンサイのセルロース微小細繊維から調製されたシートの物理的挙動、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．６４、１１８５〜１１９４（１９９６）に従って行った。
【０１６４】
応力（σ）は式１に従って計算された：
σ＝Ｆ／Ｓ　（１）
式中、Ｆは、加えられた負荷であり、Ｓは断面積である。Ｓは、サンプルの総容量が一定であり続けると仮定することによって求められる。従って、
Ｓ＝Ｓ０ｘｌ０／ｌ　（２）
式中、Ｓ０は、時間０での断面積である。ひずみ（ε）は、下記の式によって計算することができる：
ε＝ｌｎ（ｌ／ｌ０）　（３）
式中、ｌおよびｌ０は、それぞれ、試験中の長さおよび時間０での長さである。データは、応力対ひずみ曲線をプロットすることができ、ヤング率（Ｅ）の計算を可能にする：
Ｅ＝Δσ／Δε　（４）
【０１６５】
下記に報告されている値は、少なくとも１５回の測定の平均である。
【０１６６】
図１８は、ＣＢＤまたはＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示している。加えられた負荷のもとでの処理された紙の変形挙動を応力−ひずみ曲線から推定することができる。ひずみが０．０２までは、応力とひずみとの直線的な関係が認められた。しかし、ひずみが０．０２よりも大きい場合、直線的な関係は見出されなかった。引張り応力がコントロールからＣＢＤまで、そしてＣＣＰまで、それぞれ、増大していることが図１８から明かである。ＣＣＰで処理された紙の引張り強度の値は、未処理の紙よりも約４０％大きく、そしてＣＢＤで処理された紙よりも１４％大きかった。ＣＢＤで処理された紙の強度は、未処理の紙の強度よりも約２５％大きかった。両方の処理において、違いは統計学的に有意であった（表６）。
表　　６
2004504803.tif 000017
＊　ヤング率は３％の変形において計算した。異なる上付き文字を伴う列の値はｐ＝０．０１で有意に異なる。
【０１６７】
紙破壊ひずみの変化もまた重要である。ＣＣＰで処理された紙において、破壊までのひずみは、未処理の紙に対して約５０％増大した。ＣＢＤの作用は、あまり大きくなく、１２％の増大にすぎなかった。ＣＢＤまたはＣＣＰで紙を処理することにより、脆さが低下した紙が得られた。処理された紙のヤング率は、（変形が３％までは直線的である）応力−ひずみ曲線の初期の傾きから得られ、表６にまとめられている。ＣＣＰで紙を処理することにより、それらのヤング率は１７％増大したが、ＣＢＤ処理は７．５％の増大をもたらしただけであった。エネルギー吸収は、応力−ひずみ曲線下の面積を計算することによって求められ、その結果が表６にまとめられている。引張り強度に対するデータにおいて認められた傾向はエネルギー吸収について当てはまった。しかし、その大きさはより大きかった。ＣＣＰで処理された紙のエネルギー吸収は、コントロールのエネルギー吸収よりも約１００％大きかったが、ＣＢＤで処理された紙のエネルギー吸収は２３％大きいだけであった。ＣＣＰで処理された紙の値は、ＣＢＤで処理されたその対応物の値よりも約６４％大きかった。すべての試験されたパラメーターにおいて、ＣＣＰの作用は統計学的に有意であったが、これに対して、ＣＢＤによる処理は、破壊時応力およびエネルギー吸収についてだけ統計学的な有意をもたらした（表６）。
【０１６８】
図１９は、種々の濃度のＣＢＤまたはＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。図２０は、ＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。蒸留水（１０μｌ）を処理された紙にピペットで置き、完全に吸収されるまでの時間を秒単位で測定した。水の吸収はまた、光学的接触角度計ＣＡＭ２０００（ＫＳＶ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、フィンランド）を使用して可視化された。１滴の水を紙サンプルに滴下し、写真を２０ｍｓの経時露出で撮影した。最初のフレームは、水が紙に接触した２５ｍｓ後に撮影された。未処理の紙では、吸収時間は１秒未満であった。ＣＢＤ処理紙およびＣＣＰ処理紙の水吸収時間は、タンパク質の量が増大するととも増大した。ＣＣＰが２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で適用された場合、水吸収時間は、同じ濃度のＣＢＤで処理された紙の場合よりも２桁大きく（ＣＢＤの場合の５秒に対してＣＣＰの場合の５８０秒）、そして未処理紙よりも少なくとも４桁大きかった（コントロールの場合の１秒未満に対してＣＣＰの場合の５８０秒）。
【０１６９】
光学的接触角度計（ＣＡＭ）を使用して、ＣＣＰ処理紙に滴下された水の動力学を視覚化した。図２０（写真Ｆ）は、２５ｍｓ後の未処理紙について水滴の接触を例示する。水が、接触後、直ちに紙に吸収されていることが明かである。図２０（写真Ａ〜Ｅ）は、経過時間に対するＣＣＰ処理紙による滴下された水の吸収をさらに例示する。最初の２つのフレームにおいて、吸収は検出されず、接触角は＞９０ｏで維持された。４分後に、紙への吸収が認められただけであった。８分後でさえ、水は紙によって完全に吸収されなかった。紙への完全な吸収は１０分後に観測されただけであった（図１９）。
【０１７０】
実施例６
製紙プロセスの成形工程に先立つ微細セルロース繊維の架橋
ＣＢＤ連結剤ユニット組成物またはＣＢＤ連結剤ユニット試薬を、少なくとも２つのＣＢＤをリンカーユニットと連結することによって調製する。成形用織物（フィルター）を通過し得る相当量の微細なセルロース繊維を含むセルロース繊維の懸濁物を、成形用織物に懸濁物を通過させる前にＣＢＤ連結剤ユニット組成物で処理する。ＣＢＤ連結剤ユニット組成物のＣＢＤ連結剤ユニットは微細なセルロース繊維と架橋して、セルロース繊維の三次元凝集体を多数形成する。処理された懸濁物を成形用織物に通した後、セルロース繊維の三次元凝集体はろ紙によって保持され、それにより、原料（セルロース繊維）の回収を大きく高めることができる。
【０１７１】
上記の結果は、二重または二量体のＰＢＤを含むＰＢＤ融合タンパク質（例えば、２つのＣＢＤの融合産物、例えば、セルロース架橋タンパク質（ＣＣＰ））、ＣＢＤとプロテインＡとの融合産物、およびＳペプチド−ＣＢＤ−Ｓタンパク質融合体が、多糖構造物を改変するために調製および使用され得ることを明らかにしている。
【０１７２】
異なる様々な実施形態に関連して明確化のために記載されている本発明のいくつかの特徴はまた１つの実施形態において組合せられてもたらされ得ることが理解される。逆に、１つの実施形態に関連して簡潔化のために記載されている本発明の様々な特徴はまた別々にもたらされ得るか、または任意の好適な部分的な組合せで提供され得る。
【０１７３】
本発明はその特定の実施形態とともに記載されているが、多くの代替、改変および変化が当業者には明かであることは明白である。従って、本発明は、添付された請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替、改変および変化を包含するものとする。本明細書中において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれることを具体的かつ個々に示されているのと同じ程度にその全体が参考として本明細書中に組み込まれる。さらに、本明細書中における何らかの参考の引用および同定は、そのような参照が本発明に対する先行技術として利用できることの許可として解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａは、ｐＥＴ−ＣＢＤプラスミドの概略図である。
図１ｂ〜１ｃは、ＣＢＤｃｌｏｓのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図１ｄは、ｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０の概略図である。
図１ｅ〜１ｇは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにＣＢＤ−１８０のヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２】
図２ａは、１コピーのＣＢＤ−１８０と、それに読み枠を合わせて融合させた１つのＣＢＤとを含むｐＥＴ−ＣＣＰ−１８０の概略図である。
図２ｂ〜２ｅは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにＣＣＰ（セルロース架橋タンパク）のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３】
図３ａは、ｐＥＴ−ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤの概略図である。
図３ｂ〜３ｇは、ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤのヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図４】
図４ａは、ｐＥＴ２９−Ｓｐｅｐ−ＣＢＤ−Ｓｐｒｏｔの概略図である。
図４ｂ〜４ｇは、Ｓｐｅｐ−ＣＢＤ−Ｓｐｒｏｔのヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図５】
図５ａは、１分子あたり２つのセルロース結合ドメインを有するセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図５ｂは、１つのセルロース結合ドメインが第１のポリマー構造ユニットに結合し、第２のセルロース結合ドメインが第２のポリマー構造ユニットに結合している図５ａのセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
【図６】
図６は、一般的なＣＢＤ連結剤ユニットを概略的に示す。
【図７】
図７ａ〜７ｃはそれぞれ、ＣＢＤ連結剤ユニットの様々な実施形態を概略的に示す。図７ａは、それぞれがＣＢＤに結合している１対のデンプン結合ドメインを含むリンカーユニットにより連結されている１対の末端ＣＢＤと、両方のデンプン結合ドメインに結合しているデンプン成分とを有するＣＢＤ連結剤ユニットを示す。図７ｂは、それぞれが隣接するＣＢＤにＪＵＮ／ＦＯＳ架橋を介して結合している複数のＣＢＤを含むリンカーユニットにより連結されている１対の末端ＣＢＤを有するＣＢＤ連結剤ユニットを示す。図７ｃは、大きなタンパク質成分により連結されている１対の末端ＣＢＤを有するＣＢＤ連結剤ユニットを示す。
【図８】
図８は、少なくとも１つのＣＢＤと、それに結合した機能的成分（ＦＭ）とを有するＣＢＤ機能的成分（ＣＢＤＣ）を概略的に示す。
【図９】
図９ａ〜９ｃは、ＣＢＤ連結剤ユニットがポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる様々な方法を概略的に示す。
【図１０】
図１０ａ〜１０ｄは、コントロール紙片、ＣＢＤ処理紙片およびＣＣＰ処理紙片に対するヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性のそれぞれの棒グラフである。
【図１１】
図１１は、試験配合物で糸を処理するために使用される糸コーティング装置を概略的に示す。
【図１２】
図１２ａ〜１２ｂは、コントロール糸、ＣＣＰ処理糸、ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤ処理糸およびＡｂ−ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤ処理糸に対するヤング率および最大負荷時のひずみのそれぞれの棒グラフである。
【図１３】
図１３は、大腸菌においてＳタンパク質−ＣＢＤ−Ｓペプチド（ＳＣＳ）を発現させた結果の写真を示す。
【図１４】
図１４は、ＣＢＤ、ＣＣＰまたはＳＣＳでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。
【図１５】
図１５は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示す。
【図１６】
図１６は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示す。
【図１７】
図１７は、ＣＢＤ処理ワットマン紙、ＣＣＰ処理ワットマン紙およびＳＣＳ処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示す。
【図１８】
図１８は、ＣＢＤまたはＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示す。
【図１９】
図１９は、種々の濃度のＣＢＤまたはＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。
【図２０】
図２０は、ＣＣＰで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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