(57)【要約】本発明は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）またはＮＣＡＭリガンド（カウンター受容体）を提示している細胞（例えばニューロン）の生存を促進することのできる化合物に関する。本発明はさらに、医薬組成物または医薬品を使用してＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞を治療または保護することにも関する。さらに詳細には、本発明は、ＮＣＡＭ、その断片、その変異体、そのミミックのいずれかのアミノ酸配列に由来する連続した少なくとも５つのアミノ酸残基が含まれるペプチドを含む化合物を利用し、上記ＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞の細胞死を妨げる医薬品を調製する方法を説明している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号１）、その断片、その変異体、そのミミックのいずれかに由来する連続した少なくとも５つのアミノ酸残基を含むペプチドを含む化合物の、上記ＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞の細胞死を妨げる医薬品の製造における使用。
【請求項２】
上記化合物がＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインと結合できる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記化合物がＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインと結合できる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
上記化合物が、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインのホモフィリックなＩｇ１結合部位と結合できる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
上記化合物が、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインのホモフィリックなＩｇ２結合部位と結合できる、請求項１または３に記載の使用。
【請求項６】
上記化合物が、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ポリペプチド、その断片、その変異体、そのミミックのいずれかである、請求項１、２、及び４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
上記化合物が、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ポリペプチド、その断片、その変異体、そのミミックのいずれかである、請求項１、３、及び５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
上記化合物が、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含む結合モチーフを通じてＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインと結合できる、請求項１、２、４、及び６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
上記化合物が抗ＮＣＡＭ Ｉｇ１抗体である、請求項１、２、４、６、及び８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
上記化合物が抗ＮＣＡＭ Ｉｇ２抗体である、請求項１、３、５、及び６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
上記化合物がＩｇ２ドメインに対する抗体である、請求項３または５に記載の使用。
【請求項１２】
上記抗体がモノクローナルである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
上記抗体が、キメラであるか又はヒト化されている、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
上記抗体が非ポリペプチド分子である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
上記化合物が、Ｉｇ１ドメイン、その断片、そのポリペプチドミミックのいずれかによって構成されるＩｇ１−Ｉｇ２ドメインのホモフィリックな結合部位への結合を真似ることができる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
上記化合物がポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
上記化合物が、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基と、少なくとも１つの非極性アミノ酸残基とが含まれる結合モチーフを含む、請求項１又は４に記載の使用。
【請求項１８】
上記化合物が、少なくとも２個の酸性アミノ酸残基と、少なくとも１つの非極性アミノ酸残基とが含まれる結合モチーフを含む、請求項３又は５に記載の使用。
【請求項１９】
上記化合物が、１０個のアミノ酸残基からなる配列中に少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項２０】
上記化合物が、３個のアミノ酸残基からなる配列中に少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項２１】
上記化合物が、配列：
【化１】
2004515534.tif 000008
（式中、Ｘａａ＋は塩基性アミノ酸残基であり、Ｘａａ１は任意のアミノ酸残基であり、Ｘａａは任意のアミノ酸残基であり、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ独立に０または１である）を含む、請求項６、１９、及び２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
上記塩基性アミノ酸残基がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
ｒが１である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
Ｘａａ１がプロリン（Ｐ）またはグルタミン酸（Ｅ）である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
ｍとｎの少なくとも一方が１である、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
上記ポリペプチドが、（Ｋ／Ｒ）０−１−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒという配列（ただしＸはＸａａ１と同じ意味である）、好ましくはＫ／Ｒ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／ＲまたはＫ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒという配列、より好ましくはＫ／Ｒ−Ｐ−Ｋ／Ｒ、Ｋ／Ｒ−Ｋ／Ｒ−Ｐ−Ｋ／Ｒ、Ｋ／Ｒ−Ｋ／Ｒ−Ｅ−Ｋ／Ｒのいずれかの配列、より一層好ましくはＫ−Ｐ−Ｋ、Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｋ、Ｋ−Ｋ−Ｅ−Ｋ、Ｋ−Ｋ−Ｅ−Ｒのいずれかの配列、最も好ましくはＡ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｒ−Ｎ−Ｉ−Ｋ−Ａ（配列ＩＤ番号１）、Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｅ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｑ（配列ＩＤ番号２）、Ａ−Ｒ−Ａ−Ｌ−Ｎ−Ｗ−Ｇ−Ａ−Ｋ−Ｐ−Ｋ（配列ＩＤ番号３）のいずれかの配列を含む、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
上記ポリペプチドが、Ａ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｒ−Ｎ−Ｉ−Ｋ−Ａ（配列ＩＤ番号１）、Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｅ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｑ（配列ＩＤ番号２）、Ａ−Ｒ−Ａ−Ｌ−Ｎ−Ｗ−Ｇ−Ａ−Ｋ−Ｐ−Ｋ（配列ＩＤ番号３）のいずれかの配列を含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
１つ以上のアミノ酸残基が修飾されており、例えばアセチル化されている、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
上記ポリペプチドが、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインとの一部と一致する、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
上記ポリペプチドが、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの変異体、またはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの断片の変異体である、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
上記ポリペプチドが、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメイン上のＮＣＡＭ Ｉｇ２結合部位と結合する、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
上記ポリペプチドが、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメイン上のＮＣＡＭ Ｉｇ２結合部位とは異なる結合部位と結合する、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
上記結合モチーフ配列中のアミノ酸残基の数が最大で１２個である、請求項１７に記載の使用。
【請求項３４】
上記結合モチーフ配列中のアミノ酸残基の数が最大で８個である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
上記化合物が、配列：
【化２】
2004515534.tif 000009
（式中、Ｘａａ＋は塩基性アミノ酸残基であり、
Ｘａａ−は酸性アミノ酸残基であり、
Ｘａａｈは非極性アミノ酸残基であり、
Ｘａａは任意のアミノ酸残基であり、そして
ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑはそれぞれ独立に０または１である）を含む、請求項２、４、１７、３３、及び３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
上記塩基性アミノ酸残基が好ましくはリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
上記酸性アミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であることが好ましく、上記非極性アミノ酸残基がロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）のいずれかであることが好ましく、ｒが１であることが好ましい、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
上記ポリペプチドが、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）という配列（ただしＸは任意のアミノ酸残基である）、好ましくは（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、より好ましくは（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、より一層好ましくは（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、最も好ましくはＧＲＩＬＡＲＧＥＩＮＦＫ（配列ＩＤ番号２３）という配列を含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
上記ポリペプチドがＧＲＩＬＡＲＧＥＩＮＦＫ（配列ＩＤ番号２３）という配列を含む、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
１つ以上のアミノ酸残基が修飾されており、例えばアセチル化されている、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
上記ポリペプチドが、ＮＣＡＭ Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインにあってＩｇ２ドメインからなるホモフィリックな結合部位の一部のミミックまたは断片であるか、あるいはその一部と一致している、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
上記結合モチーフ配列中のアミノ酸残基の数が最大で１２個である、請求項１８に記載の使用。
【請求項４３】
上記結合モチーフ配列中のアミノ酸残基の数が最大で９個である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
上記ポリペプチドが、配列：
【化３】
2004515534.tif 000010
（式中、Ｘａａ＋は塩基性アミノ酸残基であり、
Ｘａａ−は酸性アミノ酸残基であり、
Ｘａａｈは非極性アミノ酸残基であり、
Ｘａａは任意のアミノ酸残基であり、そして
ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑはそれぞれ独立に０または１である）を含む、請求項３、５、１８、４２、及び４３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４５】
上記塩基性アミノ酸残基が好ましくはリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であることが好ましい、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４６】
上記酸性アミノ酸残基がグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）であることが好ましく、上記非極性アミノ酸残基がロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）のいずれかであることが好ましく、ｒが１であることが好ましい、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４７】
上記ポリペプチドが、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）という配列（ただしＸは任意のアミノ酸残基である）、好ましくは（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、より好ましくは（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）または（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、より一層好ましくは（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、最も好ましくはＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬ（配列ＩＤ番号２４）という配列を含む、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
上記ポリペプチドがＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬ（配列ＩＤ番号２４）という配列を含む、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
１つ以上のアミノ酸残基が修飾されており、例えばアセチル化されている、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
上記化合物が、ＮＣＡＭ Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインにあってＩｇ１ドメインからなるホモフィリックな結合部位の一部のミミックである、請求項４２〜４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
上記化合物が二量体である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５２】
上記化合物が多量体であり、例えばデンドリマーになっている、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
上記医薬品が、中枢神経系または末梢神経系の病気または疾患を治療するためのものであり、その病気または疾患が、手術後の神経の損傷、外傷性の神経損傷（例えば脊髄損傷に起因する神経損傷）、神経繊維有髄化の障害、虚血後のダメージ（例えば脳卒中に起因するダメージ）、多発性梗塞性痴呆、多発性硬化症、糖尿病に付随する神経変性、神経筋変性、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５４】
上記医薬品が、神経筋接続の機能が損なわれた疾患（例えば、遺伝性または外傷性の萎縮性筋肉疾患）などの筋肉の病気または疾患を治療するためのもの；あるいは、生殖腺の変性疾患、膵臓の変性疾患（例えばＩ型とＩＩ型の糖尿病）、腎臓の変性疾患（例えばネフローゼ）など、さまざまな器官の病気または疾患を治療するためのものである、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
上記医薬品が、心筋細胞の生存（例えば急性心筋梗塞後の生存）を促進するためのものである、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）またはＮＣＡＭリガンド（カウンター受容体）を提示している細胞（例えばニューロン）の生存を促進することのできる化合物に関する。本発明はさらに、医薬組成物または医薬品を使用してＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞を治療または保護することにも関する。
【０００２】
発明の背景
細胞接着分子（ＣＡＭ）は、細胞間の接着を媒介する一群のタンパク質である。ＣＡＭの主なグループは、免疫グロブリン・ドメインの存在を特徴とする免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属している。神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）は、そのようなＩｇスーパーファミリーに属する１つの細胞接着分子であり、神経系に特に豊富に存在する。ＮＣＡＭは、神経細胞の外層膜で発現する。１つの細胞にあるＮＣＡＭが別の細胞にある別のＮＣＡＭと結合したとき（ホモフィリックな結合）、これら２つの細胞間の結合が強化される。ＮＣＡＭは、ＮＣＡＭと結合するだけでなく、神経細胞の他のタンパク質および／または複合糖質や、細胞外マトリックスとも結合する（ヘテロフィリックな結合）。ＮＣＡＭはＡＴＰとも結合する。ＮＣＡＭは、神経細胞間の接着、または神経細胞と細胞外マトリックスの接着を媒介することにより、細胞の移動、神経突起の伸長、神経突起の束化、シナプスの形成に影響を与える。
【０００３】
ＮＣＡＭは、少なくとも２５個のエキソンを含む単一の遺伝子によってコードされている。前躯体ｍＲＮＡの選択的スプライシングによりさまざまな成熟ｍＲＮＡが得られ、その結果としてＮＣＡＭのいろいろなタンパク質アイソフォームが産生される。主要な３つのＮＣＡＭアイソフォームはエキソン１５および１８の選択的スプライシングによって産生される。これらエキソンは、それぞれ、細胞膜に対するＮＣＡＭの付着様式と、細胞内ＮＣＡＭドメインのサイズを決めている。神経系においては、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）が固着した１２０ｋＤａのアイソフォームがグリア細胞の表面で発現するとともに、１４０ｋＤａの膜貫通アイソフォームが神経細胞とグリア細胞の両方で発現するのに対し、１８０ｋＤａの膜貫通アイソフォームは主に神経細胞の表面で見つかる。ＮＣＡＭの細胞外部分は、５つのＩｇ様ホモロジー・モジュール（Ｉｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４、Ｉｇ５）と、２つのフィブロネクチン・タイプＩＩＩモジュール（ＦｎＩＩＩ１とＦｎＩＩＩ２）を含んでいる（Ｂｅｒｅｚｉｎ他、２０００年）。
【０００４】
ＮＣＡＭのヘテロフィリックなリガンドとしては、さまざまなヘパラン硫酸プロテオグリカン（例えばアグリン）やコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（例えばニューロカン）が挙げられる。ＮＣＡＭのＩｇ１とＩｇ２は、おそらくＮＣＡＭがヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用するための構造決定基である。というのも、これら２つのモジュールはヘパリンと結合することがわかっているからである（Ｋｉｓｅｌｙｏｖ他、１９９７年）。プロテオグリカンがＮＣＡＭに結合する際にコア・タンパク質または炭化水素部分が重要な役割を果たしているかどうかに関する複数の論文は相互に矛盾しており、ＮＣＡＭを媒介とした細胞機能に対するこの相互作用の寄与は現在のところわかっていない（Ｒｅｔｚｌｅｒ、１９９６年）。神経細胞接着分子Ｌ１と繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体は、ＮＣＡＭのヘテロフィリックなリガンドの別の例である。ＮＣＡＭとＬ１の相互作用は、Ｌ１が保持しているオリゴマンノース型Ｎ−グリカンと、ＮＣＡＭの４番目のＩｇモジュールに局在するレクチン様結合部位とによって媒介されることがわかっている。ＮＣＡＭは、この結合を通じ、いわゆる支援されたホモフィリックなＬ１−Ｌ１相互作用に関与することが示唆されている（Ｈｏｒｓｔｋｏｒｔｅ他、１９９３年）。これは、２つのＮＣＡＭ間での協働に関する興味深い例となっている。
【０００５】
ＮＣＡＭは、神経系が成長する際や、腎臓、肝臓、腸、心臓、生殖腺、膵臓、筋肉などの器官が成長する際に非常に重要な役割を果たす。成熟した神経系では、ＮＣＡＭは、再生、学習、記憶に伴うニューロンの接続の可塑性にとって重要である。末梢神経系では、ＮＣＡＭは、損傷などのダメージを受けた後の再生段階における神経繊維の成長開始や神経−筋肉接続の形成に関係している。
【０００６】
シグナル伝達に関しては、ＮＣＡＭは細胞外シグナルを伝達し、チロシンのリン酸化と細胞内カルシウム濃度の増加を引き起こす。ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ結合に関するモデルがいくつか提案されている。細胞接着とシグナル伝達は、全部で５つあるＩｇドメイン間の相互作用、あるいは少なくともＮＣＡＭドメインの対向する２つのＮＣＡＭ分子のＩｇ３ドメイン間の相互作用を媒介としていることが示唆されている。ある仮説によると、ホモフィリックなＮＣＡＭの接着は、対向する２つのＮＣＡＭ分子のＩｇ３ドメイン間の双方向性の相互作用によって媒介される。しかし構造に関する最近の研究によると、対向する２つのＮＣＡＭ分子のＩｇ１ドメインとＩｇ２ドメインの間の双方向性相互作用がホモフィリックなＮＣＡＭの結合を媒介していることが示唆されている（Ｔｈｏｍｓｅｎ他、１９９６年；Ｋｉｓｅｌｙｏｖ他、１９９７年；Ｊｅｎｓｅｎ他、１９９９年；Ｋａｓｐｅｒ他、２０００年）。
【０００７】
ＮＣＡＭを提示している細胞からの分化および／または神経突起成長を促進することのできるＮＣＡＭ結合化合物は、ＷＯ ００／１８８０１に開示されている。この文献では、そのような化合物が、ＮＣＡＭを提示している細胞を再生させるための治療に使用されている。
【０００８】
そのような化合物の１つ（Ｃ３）が同定されたことが、Ｒφｎｎらによって報告されている（１９９９年）。Ｃ３は、ホモフィリックなＮＣＡＭの結合によって活性化されるのと同じシグナル伝達経路を活性化させることによって成長を促進する。
【０００９】
さまざまな因子が神経細胞の死を引き起こす。細胞死を引き起こすリスク因子に曝されている人の神経細胞の死を防ぐことは、細胞の生存の維持／刺激または促進、あるいは神経細胞保護と呼ぶことができよう。
【００１０】
神経細胞が例えば酸素の供給低下などによって損傷を受けると、細胞死のプロセスがスタートし、細胞が機能不全になり、細胞間コミュニケーション（ネットワーク）が“崩壊”し、細胞プロセスが消滅し、そしてついには細胞死へと至る。神経細胞の死を防ぐとは、すなわち生存を刺激／促進するとは、細胞において細胞死のプロセスが開始されないようにすることを意味する。
【００１１】
生存は、いくつかの文献において議論されている（例えばＨｕｌｌｅｙ他、１９９８年）。これらの文献には、Ｌ１神経細胞接着分子が、毒素ＭＰＰ＋の存在下で培養した胎児中脳のドーパミン作動性ニューロンの生存と分化を促進しうることが開示されている。
【００１２】
米国特許第６，０３７，３２０号には、神経栄養因子ＮＴ−４の同定について記載されており、米国特許第５，７６７，２４０号には、脊髄神経細胞、脳皮質細胞、海馬ニューロンの生存を促進することのできる活性依存神経栄養因子が明らかにされている。
【００１３】
また米国特許第５，５６７，６８２号は、短鎖のペプチドを鼻孔内投与することによってアルツハイマー病の症状を治療する方法に関するものである。このペプチドは、進行する神経変性を減速または停止させることによって神経細胞の生存を促進する。
【００１４】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、ＮＣＡＭの合成リガンド（例えばＣ３）と、神経細胞接着分子からのペプチド配列が、ＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンド（すなわちカウンター受容体）を提示している細胞の細胞死を妨げうることを発見した。
【００１５】
要約
本発明は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、またはその変異体、またはそのミミックに由来する連続した少なくとも５つのアミノ酸が含まれるペプチド配列を含む化合物を利用して、このＮＣＡＭ、またはＮＣＡＭリガンド、またはそのミミックを提示している細胞の死を防止するための医薬品を調製する方法に関する。
【００１６】
本発明は、この医薬品を利用して神経系、筋肉、心臓の病気または疾患を治療する方法にも関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明の化合物は、神経細胞の死を防止することに関係している。末梢神経細胞は、さまざまな損傷を受けた後に再生する能力や、標的との機能的な接続を回復する能力をある程度持っている。しかし機能が完全に回復することは稀であり、末梢神経細胞の損傷が大きな問題として残る。中枢神経系では、再生能力ははるかに限られている。したがって、末梢神経系と中枢神経系における神経細胞の死を防ぐことのできる物質を同定することが、非常に注目されている。
【００１８】
この明細書では、“生存の刺激／促進”という表現は、“細胞死の防止”または“神経細胞保護”と同じ意味で用いる。生存を刺激／促進すると、神経系の疾患を防止すること、あるいは神経変性疾患を患っている人の神経系のさらなる変性を防止することができる。
【００１９】
“生存”とは、細胞が正常な環境下で外傷を受けたり傷ついたりして死ぬ可能性が大きいとき、本発明の化合物を使用してこの細胞が変性するのを防止し、したがって外傷を受けたこの細胞が生き延びるのを促進または刺激するプロセスを意味する。
【００２０】
本発明は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、またはその変異体、またはそのミミックに由来する連続した少なくとも５つのアミノ酸が含まれるペプチド配列を含む化合物を利用して、このＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞の死を防止するための医薬品を調製する方法に関する。
【００２１】
“ＮＣＡＭを提示している細胞”という表現は、細胞の外層膜にＮＣＡＭを発現している細胞のことを意味する。このような細胞の具体例としては、例えばニューロン、グリア細胞、あらゆるタイプの筋肉細胞、神経内分泌細胞、生殖腺細胞、腎臓細胞が挙げられる。
【００２２】
“ＮＣＡＭリガンドを提示している細胞”という表現は、ＮＣＡＭおよび／またはＮＣＡＭの一部が結合することのできる受容体またはリガンド（すなわち、いわゆるカウンター受容体）を発現している細胞のことを意味する。ＮＣＡＭリガンドの具体例としては、ＦＧＦ（繊維芽増殖因子）受容体、Ｌ１またはプロテオグリカン（例えばヘパリン）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが挙げられる。
【００２３】
本発明は、特に、少なくとも５つの連続したアミノ酸残基が、ＮＣＡＭのＩｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４、Ｉｇ５、またはその断片、またはその変異体、またはそのミミックのアミノ酸配列から選択された化合物を使用することに関する。
【００２４】
“その断片”とは、ＮＣＡＭの部分のうちでＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンド／受容体と結合し、その結合を通じてＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞の細胞死を防ぐことのできるすべての部分を意味するものとする。“その変異体”とは、ＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンド／受容体と結合し、その結合を通じてＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞の細胞死を防ぐことのできるあらゆるペプチド配列を意味するものとする。したがって断片または変異体は、以下のように定義できる。
ｉ）ＮＣＡＭの所定のアミノ酸配列を認識することのできる抗体によって認識されうるアミノ酸配列を含む断片／変異体、および／または
ｉｉ）ＮＣＡＭの所定のアミノ酸配列とも結合することができる受容体部分と結合可能なアミノ酸配列を含む断片／変異体、および／または
ｉｉｉ）少なくとも１つのＮＣＡＭ分子および／またはＮＣＡＭリガンドに対する結合アフィニティがＮＣＡＭの所定のアミノ酸配列と少なくとも実質的に同じである断片／変異体。
【００２５】
この明細書では、“機能的に等価”という表現は、上記の変異体を意味する。
【００２６】
本発明による化合物の結合アフィニティに関しては、ＮＣＡＭおよび／またはリガンドに対する結合アフィニティ（Ｋｄ値）が１０−３〜１０−１０Ｍの範囲であることが好ましく、さらに好ましいのは１０−４〜１０−８Ｍの範囲になっていることである。本発明によれば、結合アフィニティは、表面プラズモン共鳴分析または核磁気共鳴スペクトロスコピーによって明らかになる。
【００２７】
本発明の一実施態様は、ＮＣＡＭを提示している細胞の生存を促進するＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインに関する。したがってＮＣＡＭ Ｉｇ２は、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインのリガンドである。さらに、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインは、ＮＣＡＭ特異的シグナル伝達経路を活性化することによって生存を促進する。
【００２８】
同様に、本発明は、特異的なシグナル伝達経路を活性化することにより、ＮＣＡＭを提示している細胞の生存を促進することのできるＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインのリガンドとしてのＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインも開示している。
【００２９】
本発明の発明者らは、コンビナトリアル化学により、生存を促進する小さなＮＣＡＭ結合ペプチドも同定した。ペプチド・ライブラリから選択した活性ペプチドを同定し、２個以上の塩基性アミノ酸残基を含む推定モチーフを同定した。これらのペプチドは、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインと同じ特異的シグナル伝達経路を活性化することがわかった。
【００３０】
この結果は、特異的シグナル伝達経路を活性化できるＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインのリガンド、またはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインのリガンド、またはそのミミックのリガンドが、細胞死を防止できることを示している。ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインまたはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの他の機能的ミミック（例えば抗体や非ペプチド分子）も同様に有効である可能性がある。したがって本発明により、ＮＣＡＭのＩｇ１ドメインまたはＩｇ２ドメインを認識する小さなペプチド、ポリペプチド、抗体、非ペプチド分子からなる化合物および組成物、またはこれらを含む化合物および組成物が提供される。このような化合物および組成物をＮＣＡＭを発現する細胞を含む組織に適用した場合、ＮＣＡＭの機能を促進することになろう。このような化合物および組成物は、神経系、筋肉、ＮＣＡＭを発現する他のあらゆる組織（さまざまな器官を含む）の細胞に適用することができる。
【００３１】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）により、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインは、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインに結合できる可能性のあるＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインと同様、ＩｇドメインのＩ−セットに属することがわかった（Ｊｅｎｓｅｎ他、１９９９年）。個々のアミノ酸残基の化学シフトを分析することにより、Ｉｇ１ドメインとＩｇ２ドメインの間に明白な相互作用部位が見つかった。したがって、これら２つのドメインの一部が互いに合わさることにより、ＮＣＡＭと結合する本発明の化合物のための明白な１つの相互作用／結合部位を形成する。
【００３２】
化学シフトの分析と予想モデルによると、Ｉｇ２ドメインでは、グルタミン酸−１９０〜フェニルアラニン−２０１の範囲のアミノ酸が結合にとって特に重要である。同様にＩｇ１ドメインでは、グルタミン酸−２９、グルタミン酸−３０、グルタミン酸−３４、グルタミン酸−３５、リシン−３７、フェニルアラニン−３８、フェニルアラニン−３９というアミノ酸が結合にとって特に重要であるように思われる。
【００３３】
本発明の発明者らは、どの理論にも囚われておらず、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインおよび／またはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの活性リガンドが、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインおよび／またはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインと結合するリガンドであり、したがってドメインの立体配座の変化を引き起こし、シグナル伝達のカスケードを開始させると考える。このシグナル伝達は、細胞の分化および／または生存に影響を与える。したがって、適切なリガンドとしては、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインおよび／またはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの立体配座の変化を引き起こし、その結果として下流のメッセンジャー・カスケードを開始させることのできる任意の化合物が可能である。
【００３４】
したがって本発明には、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインまたはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインと結合する化合物が含まれる。これら２つのドメインが合わさり、ここに開示したホモフィリックな結合部位が形成される。
【００３５】
本明細書では、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインおよび／またはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインのミミックとは、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインまたはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインと結合する任意の化合物のことであると理解すべきであり、この結合を通じ、ＮＣＡＭを提示している細胞（すなわち機能的ミミック）の生存および／または分化が促進される。ミミックとしては、ペプチド、ペプチド誘導体、抗体、非ペプチド化合物（例えば小さな有機化合物）、糖と脂肪、ペプチド・ミミックが可能である。
【００３６】
本発明は、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインまたはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの非ペプチド・ミミックや、上記のペプチドにも関する。特に、このようなミミックは、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインおよび／またはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインと結合または相互作用し、そのことによってＮＣＡＭを提示している細胞の生存および／または分化を促進する化合物のことを意味すると理解すべきである。
【００３７】
一実施態様では、ミミックは、所定の好ましい配列から挿入、欠失、置換（保存された置換の増加も含む）の数と範囲がわずかにずれたアミノ酸配列になっていると理解することができる。この違いは、所定の配列とミミックの間の相同性の低下として測定される。
【００３８】
ペプチドは、例えば１つ以上のアミノ酸残基を置換するという方法で修飾することができる。Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の両方を使用することができる。これ以外の修飾としては、エステルや糖などの誘導体が挙げられる。具体例はメチルエステルやアセチルエステルである。重合（繰り返し配列など）や、従来技術でよく知られているさまざまな担体（例えばリシン骨格や、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質部分）への付着も本発明に含まれる。
【００３９】
本発明による断片のミミックは、同じミミックまたはその断片の中に、あるいは異なるミミックまたはその断片の中に、少なくとも１つの置換（例えば互いに独立に導入された複数の置換）を含んでいてもよい。したがって複合体のミミックまたはその断片は、互いに独立な保存された複数の置換を含むことができる。このミミックまたはその断片の少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのアラニン（Ａｌａ）は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのバリン（Ｖａｌ）は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのロイシン（Ｌｅｕ）は、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのイソロイシン（Ｉｌｅ）は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのアスパラギン酸（Ａｓｐ）は、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのアスパラギン（Ａｓｎ）は、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。このミミックまたはその断片の少なくとも１つのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸、好ましくはチロシンとトリプトファンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのチロシン（Ｔｙｒ）は、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸、好ましくはフェニルアラニンとトリプトファンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）は、リシンとヒスチジンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのリシン（Ｌｙｓ）は、アルギニンとヒスチジンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのプロリン（Ｐｒｏ）は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。これとは独立に、このミミックまたはその断片の少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンからなるアミノ酸グループの中から選択した１つのアミノ酸で置換される。
【００４０】
上記の説明から、等価物またはその断片が、上記の保存されるアミノ酸からなる２つ以上のグループからの保存される２個以上のアミノ酸置換を含みうることは明らかである。
【００４１】
保存される置換は、本発明による所定の好ましいポリペプチドまたはその断片の任意の位置に導入することができる。しかし保存されない複数の置換（中でも保存されない１つの置換）を任意の１つ以上の位置に導入することも望ましかろう。
【００４２】
本発明によるペプチドの断片と機能的に等価な断片を形成する保存されない置換では、以下のようなことが起こる。すなわち、ｉ）例えば非極性側鎖を有する残基（アラニン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン）が極性側鎖を有する残基（グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン）または帯電アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン）で置換されたり、帯電アミノ酸残基または極性アミノ酸残基が非極性アミノ酸残基で置換されると例えば極性が実質的に異なることになる、および／またはｉｉ）プロリンまたはグリシンが別のアミノ酸残基で置換されたり、プロリンまたはグリシンへの置換が起こったりするとポリペプチド骨格の方向に対する効果が実質的に異なることになる、および／またはｉｉｉ）例えば負に帯電しているアミノ酸残基（グルタミン酸、アスパラギン酸）が正に帯電しているアミノ酸残基（リシン、ヒスチジン、アルギニン）で置換されたりその逆だったりすると電荷が実質的に異なることになる、および／またはｉｖ）例えばかさばるアミノ酸残基（ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン）が側鎖の小さなアミノ酸残基（アラニン、グリシン、セリン）で置換されたりその逆だったりすると大きさが実質的に異なることになる。
【００４３】
一実施態様では、アミノ酸の置換は、疎水性および親水性の程度と、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性（例えば電荷、サイズなど）とに基づいて実行することができる。上記のさまざまな特徴を考慮した具体的なアミノ酸の置換は当業者には周知であり、具体的には、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；バリン、ロイシン、イソロイシンの間での置換が挙げられる。
【００４４】
アミノ酸の付加または欠失は、２個から好ましくは１０個のアミノ酸の範囲（例えば２〜８個のアミノ酸、２〜６個のアミノ酸、２〜４個のアミノ酸）での付加または欠失が可能である。しかし１０個を超えるアミノ酸を付加することも本発明に含まれる。多量体の形態になっている場合には、付加／欠失を多量体の各単量体で起こさせることが可能である。
【００４５】
したがって、本発明が少なくとも１つの受容体またはその変異体と結合することのできる少なくとも１つの断片（そのような少なくとも１つの断片の変異体や機能的等価物もすべて含まれる）を含む化合物に関係することが理解できよう。
【００４６】
ＮＣＡＭのＩｇ１結合領域またはＩｇ２結合領域を含む断片が特に好ましい。しかし本発明がＮＣＡＭ結合領域を含む断片に限定されることはない。断片の欠失によってＮＣＡＭ結合領域よりも短い領域が含まれる機能的に等価な断片が生成する場合も本発明に含まれる。本発明による機能的に等価なペプチドとその断片は、Ｉｇ１およびＩｇ２でＮＣＡＭリガンドと結合できるＮＣＡＭ結合領域と比べて少ないアミノ酸または多いアミノ酸を含むことができる。
【００４７】
ＮＣＡＭペプチドのあらゆる機能的等価物が、ＮＣＡＭペプチドまたはＮＣＡＭリガンド結合領域の所定の配列との相同性の程度とは関係なく、本発明の範囲に含まれる。というのも、結合領域のいくつかの部分が非常に突然変異しやすくなっていたり、その部分からペプチドが欠われたりするが、得られる断片の結合活性に大きな影響が及ぶことはないからである。
【００４８】
置換によって得られる機能的等価物は、元のＮＣＡＭの活性とある程度似た活性を示す可能性があるが、機能が似た側鎖を含むアミノ酸残基が置換された場合には、類似の程度は少なくなる。機能が似たとは、この明細書では、側鎖の主要な特徴（例えば疎水性、塩基性、中性、酸性）、またはかさばっているかどうかに関しての記載である。したがって、本発明の一実施態様では、ｉ）効果のある所定の機能的等価物とｉｉ）所定の好ましい断片の一致度は、断片が、本発明による所定の好ましい断片の変異体になっているか、あるいは機能的等価物になっているかどうかの主要な指標ではない。
【００４９】
少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸からなる所定の好ましい断片と少なくとも一部が相同な断片は、所定の好ましいＮＣＡＭペプチドまたはその断片またはそのミミックと少なくとも約２５％相同である場合に、本発明の範囲に含まれると考えられる。具体的には、少なくとも約３０％相同、少なくとも約４０％相同、少なくとも約５０％相同、少なくとも約５５％相同、少なくとも約６０％相同、少なくとも約６５％相同、少なくとも約７０％相同、少なくとも約７５％相同、少なくとも約８０％相同である状態が挙げられる。
【００５０】
配列の一致度は、配列分析ソフトウエア（例えばウィスコンシン大学バイオテクノロジー・センター（１７１０ ユニヴァーシティ・アヴェニュー、マディソン、ウィスコンシン州 ５３７０５）の遺伝学コンピュータ・グループの配列分析ソフトウエア・パッケージ）をその中で指定されているデフォルト・パラメータとともに用いることにより測定できる。
【００５１】
本発明の一実施態様は、Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインのホモフィリックなＩｇ１結合部位に結合することのできる化合物の利用に関する。本発明の発明者らは、ＮＣＡＭのＩｇ１ドメインとＩｇ２ドメインの両方が寄与するＮＣＡＭのホモフィリックな結合部位を同定した。“ホモフィリックな”結合部位とは、その部位が、２つの同種分子の間（ここではＮＣＡＭからＮＣＡＭへ）の結合を媒介することを意味する。したがって本発明は、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメイン（例えばＩｇ２、その断片、その変異体、そのミミック）に結合することのできる化合物の利用に関係する。このような化合物としては、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインを構成するペプチド、その断片、そのミミックが可能である。なお断片とミミックは、上に定義したものである。
【００５２】
この化合物は、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメイン上のＩｇ２結合部位、またはＮＣＡＭ Ｉｇ２結合部位とは異なる結合部位と結合することができる。（Ｒφｎｎらによって１９９９年に報告されている）Ｃ３、Ｄ３、Ｄ４というリガンドは、ＮＣＡＭ Ｉｇ２の結合部位またはその断片の結合部位とは異なる部位と結合する。
【００５３】
Ｉｇ１とＩｇ２は、ＮＣＡＭのアミノ酸配列のバリン−１８〜バリン−２１０で構成されている。単独のＩｇ２は、リシン−１２１〜バリン−２１０で構成されている。
【００５４】
このような化合物は、少なくとも２個の塩基性アミノ酸を含む結合モチーフを通じてＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインと結合することができる。本発明の一実施態様では、結合モチーフは、少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基と、少なくとも１つの非極性アミノ酸残基を含んでいる。
【００５５】
さらに別の実施態様では、上記少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基が、１０個のアミノ酸残基からなる配列に含まれている。さらに別の実施態様では、上記少なくとも２個の塩基性アミノ酸残基が、３個のアミノ酸残基からなる配列に含まれている。
【００５６】
ＮＣＡＭ Ｉｇ１への結合に関するモチーフを同定した。このモチーフ（Ｃ３）には正に帯電した複数のアミノ酸が比較的緩やかな順番で含まれており、正に帯電したこれらアミノ酸は、最大で８個のアミノ酸残基（ａａ）によって隔てられている。しかし正に帯電したアミノ酸は、互いに隣接するか、あるいはアミノ酸残基１個だけで隔てられていることが好ましい。すなわち、Ｋ／Ｒ（ａａ）０−８Ｋ／Ｒ（Ｋはリシン、Ｒはアルギニンを表わす）となっているが、Ｋ／Ｒ（ａａ）０−１Ｋ／Ｒであることが好ましい。
【００５７】
ペプチド・ライブラリから単離した活性ペプチドの分析結果からは、モチーフが正に帯電した３個以上のアミノ酸（例えば３または４個の塩基性アミノ酸）を含んでいることが示唆される。
【００５８】
好ましいペプチドは、配列：
（Ｘａａ＋）ｍ−（Ｘａａ）ｐ−（Ｘａａ＋）−（Ｘａａ１）ｒ−（Ｘａａ＋）−（Ｘａａ）ｑ（Ｘａａ＋）ｎ
（この式において、Ｘａａ＋は塩基性アミノ酸残基であり、Ｘａａ１は任意のアミノ酸残基であり、Ｘａａは任意のアミノ酸残基であり、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ独立に０または１である）を含んでいる。なお塩基性アミノ酸残基はリシンまたはアルギニンであることが好ましく、ｒは１であることが好ましい。
【００５９】
アミノ酸残基ＸａａとＸａａ１の性質は重要でないらしく、任意のアミノ酸残基にすることが可能であるように思われる。しかしＸａａ１はプロリン（Ｐ）またはグルタミン酸（Ｅ）であることが好ましい。
【００６０】
より好ましいペプチドでは、ｒが１で、ｍとｎの少なくとも一方が１である。
【００６１】
本発明による好ましいペプチドは、（Ｋ／Ｒ） ０−１−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒという配列（ただしＸはＸａａ１と同じ意味である）、好ましくはＫ／Ｒ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／ＲまたはＫ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒという配列、より好ましくはＫ／Ｒ−Ｐ−Ｋ／Ｒ、Ｋ／Ｒ−Ｋ／Ｒ−Ｐ−Ｋ／Ｒ、Ｋ／Ｒ−Ｋ／Ｒ−Ｅ−Ｋ／Ｒのいずれかの配列、より一層好ましくはＫ−Ｐ−Ｋ、Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｋ、Ｋ−Ｋ−Ｅ−Ｋ、Ｋ−Ｋ−Ｅ−Ｒのいずれかの配列、最も好ましくはＡ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｒ−Ｎ−Ｉ−Ｋ−Ａ（配列ＩＤ番号１）、Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｅ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｑ（配列ＩＤ番号２）、Ａ−Ｒ−Ａ−Ｌ−Ｎ−Ｗ−Ｇ−Ａ−Ｋ−Ｐ−Ｋ（配列ＩＤ番号３）のいずれかの配列を含んでいる。
【００６２】
本発明によれば、上記配列を含むペプチドとしては、ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの一部（今後は断片と呼ぶ）またはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインのミミックが可能である。さらに、このペプチドは、Ｉｇ１ドメインのＩｇ２結合部位に結合すること、またはＩｇ１ドメイン上の異なる結合部位に結合することができる。結合部位が“通常の”Ｉｇ２結合部位でない場合には、結合がその通常の結合を真似ることになり、ＮＣＡＭを提示している細胞は同様に生き延びることになろう。
【００６３】
したがって、本発明の化合物は、以下に示す２２種類の配列のうちの１つ以上を含むことができる。
【化４】
2004515534.tif 000002
【化５】
2004515534.tif 000003
【００６４】
Ｃ３（配列ＩＤ番号１）、Ｄ３（配列ＩＤ番号２）、Ｄ４（配列ＩＤ番号３）という３つのペプチドが特に好ましい。
【００６５】
本発明のさらに別の実施態様は、ＮＣＡＭ Ｉｇ１−Ｉｇ２のホモフィリックな結合部位の一部でＩｇ２ドメインからなる部分と結合するペプチドである可能性のある化合物に関する。このようなペプチドは、以下のような一般配列を含んでいるように思われる。なおこの配列には、その機能的誘導体も含まれる。
【化６】
2004515534.tif 000004
（この式において、Ｘａａ＋は塩基性アミノ酸残基であり、
Ｘａａ−は酸性アミノ酸残基であり、
Ｘａａｈは非極性アミノ酸残基であり、
Ｘａａは任意のアミノ酸残基であり、
ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑはそれぞれ独立に０または１である）。
なお塩基性アミノ酸残基はリシンまたはアルギニンであることが好ましく、酸性アミノ酸残基はグルタミン酸またはアスパラギン酸であることが好ましく、非極性アミノ酸残基はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンのいずれかであることが好ましく、ｒは１であることが好ましい。
【００６６】
このようなペプチドは、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）という配列（ただしＸは任意のアミノ酸残基である）、好ましくは（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、より好ましくは（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、より一層好ましくは（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、最も好ましくはＧＲＩＬＡＲＧＥＩＮＦＫ（配列ＩＤ番号２３）という配列を含むことができる。
【００６７】
配列ＩＤ番号２３はＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの配列であり、したがってＩｇ２−ペプチドまたは単にＰ２と呼ぶことにする。
【００６８】
別の実施態様では、本発明の化合物は、ＧＲＩＬＡＲＧＥＩＮＦＫ（配列ＩＤ番号２３）という配列を有することがわかったＩｇ２−ペプチドを含むことができる。しかしこのＩｇ２−ペプチドは、ＮＣＡＭの配列全体に由来する他の神経突起生成ペプチド、あるいはＮＣＡＭ分子と結合することが見いだされた他の神経突起生成ペプチドとの類似性はまったくない。
【００６９】
本発明のさらに別の実施態様は、ＮＣＡＭ Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインのホモフィリックな結合部位の一部でＩｇ１ドメインからなる部分と結合するペプチドである可能性のある化合物に関する。このようなペプチドは、以下のような一般配列を含んでいるように思われる。なおこの配列には、その機能的誘導体も含まれる。
（Ｘａａ）ｑ−（Ｘａａ−）−（Ｘａａ）−（Ｘａａ）−（Ｘａａ）ｍ−（Ｘａａ）ｎ−（Ｘａａ−）−（Ｘａａ）−（Ｘａａ＋）−（Ｘａａｈ）−（Ｘａａｈ）ｐ−（Ｘａａｈ）
（この式において、Ｘａａ＋は塩基性アミノ酸残基であり、
Ｘａａ−は酸性アミノ酸残基であり、
Ｘａａｈは非極性アミノ酸残基であり、
Ｘａａは任意のアミノ酸残基であり、
ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑはそれぞれ独立に０または１である）。
なお塩基性アミノ酸残基はリシンまたはアルギニンであることが好ましく、酸性アミノ酸残基はグルタミン酸またはアスパラギン酸であることが好ましく、非極性アミノ酸残基はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンのいずれかであることが好ましく、ｒは１であることが好ましい。
【００７０】
グループＩＩＩのペプチドは、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）という配列（ただしＸは任意のアミノ酸残基である）、好ましくは（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、より好ましくは（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）または（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、より一層好ましくは（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−Ｘ−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）、（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−（Ｋ／Ｒ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）−（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）のいずれかの配列、最も好ましくはＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬ（配列ＩＤ番号２４）という配列を含んでいる。
【００７１】
配列ＩＤ番号２４はＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインの配列であり、したがってＩｇ１−ペプチドまたは単にＰ１と呼ぶことにする。
【００７２】
本発明のさらに別の実施態様は、抗ＮＣＡＭ Ｉｇ１抗体、すなわちＩｇ２のの中でこの明細書に記載したＮＣＡＭ Ｉｇ１−Ｉｇ２結合部位に寄与する部分を認識する抗体である化合物に関係している。
【００７３】
この抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。組み換え抗体（例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体）も本発明に含まれる。
【００７４】
このような化合物としては、抗ＮＣＡＭ Ｉｇ１抗体や抗ＮＣＡＭ Ｉｇ２抗体（モノクローナル、ポリクローナル、組み換え）のほか、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインまたはＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインで構成されている結合部位あるいはその近傍においてエピトープを認識する別の抗体も挙げられる。なおこの別の抗体は、キメラになっていてもよく、ヒト化されていてもよい。ポリクローナル抗体の製造と、ａ）モノクローナル抗ＮＣＡＭ Ｉｇ１抗体および／またはｂ）抗ＮＣＡＭ Ｉｇ２抗体の製造は、公知の一般的な方法に従って行なうことができる。マウスまたはウサギが一次免疫化の場として機能し、これらの動物においてＮＣＡＭ Ｉｇ１に対する抗体またはＮＣＡＭ Ｉｇ２に対する抗体が増加する。精製したポリクローナル抗体は、それ以上処理をせずに使用することができる。ポリクローナル抗体は別の方法で製造することもできる。ポリクローナル抗体の製造法は、従来技術で知られている。組み換え抗体（例えばキメラ抗体やヒト化抗体）も、従来技術で知られている方法を利用して得ることができる。次に、可能な活性抗体を、上に説明した方法またはそれと同様の方法でスクリーニングする。
【００７５】
したがって本発明により、ニューロン、神経細胞系、神経細胞組織の生存を促進することのできる上記の配列を含む化合物または組成物、あるいはその誘導体として、例えばペプチド類似体、ペプチド断片、上記配列またはその類似配列を含むポリペプチド、この明細書に記載したペプチドに由来する非ペプチド分子が提供される。
【００７６】
この化合物または組成物を用いると、末梢神経系、および／または中枢神経系、および／または筋肉その他の組織でＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドを発現する組織の疾患や、ＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンドの機能を促進することが好ましい他の疾患を治療することができる。
【００７７】
ＮＣＡＭの適切なさまざまな断片と変異体について上に説明した。本発明の発明者らは、ＮＣＡＭ機能を促進することのできるリガンド候補を同定できるようにするため、さまざまなリガンドの効果を定量評価できる簡単な細胞培養系（細胞塊培養物）を確立した。海馬の細胞をラットの胎児から採取する。この細胞を所定の培地で増殖させ、分離させた細胞を微小滴定プレートに植えた。２４時間後、細胞塊の数を数えた。テストする化合物を細胞懸濁液に添加した直後、マイクロウエルに細胞を植える。細胞が凝集している間にＮＣＡＭ Ｉｇ１結合リガンドが存在している場合には、細胞を植えてから２４時間後に定量すると、以前よりも小さいが数が以前よりも増えた細胞塊が見られる。リガンドに抑制効果があってＮＣＡＭの接着特性が阻害されるため、多数ある小さな細胞塊が大きな細胞塊になることが阻止される。したがって活性なリガンドが存在している場合には、小さいが以前よりも多数の細胞塊が見られる。
【００７８】
細胞が凝集するときにＮＣＡＭ Ｉｇ１−Ｉｇ２ドメインの異なるリガンドが存在している場合にもこのような効果が観察された。したがって、組み換えＩｇ１とＩｇ２、Ｉｇ２配列（Ｉｇ２−ｐ）（配列ＩＤ番号２３）に由来する合成ペプチド、Ｉｇ１配列（Ｉｇ１−ｐ）（配列ＩＤ番号２４）に由来する合成ペプチド、合成ペプチドのライブラリ（配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３）から同定されたＮＣＡＭ Ｉｇ１のペプチド・リガンドのいずれもが、上記の細胞培養系で凝集を抑制した。
【００７９】
この系を用いると処理した細胞がバラバラになるのを調べることができる。
【００８０】
予想される人工リガンドをペプチド・ライブラリまたは非ペプチド・ライブラリから選択して同定することができる。どのペプチド・ライブラリを使用してもよい。合成ペプチド・ライブラリや天然のタンパク質の断片を含むライブラリを用いて有用なペプチドを探すことができる。非ペプチド化合物を含むあらゆるライブラリも使用することができる。
【００８１】
所定のアミノ酸配列を有することを特徴とするペプチドは、タンパク質の所定の領域を真似ることができる。天然のタンパク質は、Ｌ−アミノ酸残基で構成されている。しかし人工ペプチドは、Ｄ−アミノ酸残基も含むことができる。コンビナトリアル化学を利用し、それぞれのビーズに長さが同じで異なる配列のタンパク質が保持されるようにしたビーズの混合物を作ることができる（Ｌａｍ他、１９９１年）。ビーズ上にこのようにペプチドが混合したものは、ペプチド・ライブラリと呼ばれる。
【００８２】
本発明では、精製した組み換えＮＣＡＭ Ｉｇ１を提示しているペプチドをに樹脂に結合させたものを含むランダムな合成ペプチド・ライブラリをスクリーニングすることにより、ペプチドを同定した。樹脂結合１ビーズ１ペプチド・ライブラリの合成を、分割混合法を利用して行なった（Ｆｕｒｋａ， Ａ、Ｓｅｂｅｓｔｙｙｅｅｎ， Ｆ、Ａｓｇｅｄｏｍ， Ｍ、Ｄｉｂｏｅ， Ｇ、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．、第３７巻、４８７−４９３ページ、１９９１年）。ポリエチレン製の注射器が、合成の間を通じて反応容器として機能した。スクリーニングは、樹脂をビオチニル化したＮＣＡＭ Ｉｇ１とともに培養することによって行なった。次いで樹脂をアビジン−アルカリホスファターゼとともに培養した。基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（シグマ社）をＬａｍら（１９９２年）が記載しているようにして添加し、染色されたビーズを取り出してマイクロシークエンシングを行なった。
【００８３】
最も強く染色されたビーズを立体顕微鏡で見ながら選択し、ＡＢＩ １２０Ａ ＨＰＬＣを備えたＡＢＩ ４７０Ａでシークエンシングを行なった。ＮＣＡＭ Ｉｇ１結合ペプチドの配列を同定した（図７（Ａ）；配列ＩＤ番号１〜２２）。
【００８４】
興味の対象であるペプチドの同定と選択を行なうための方法は、予想モチーフの同定にとって重要ではないことを理解する必要がある。
【００８５】
小さな有機化合物のライブラリをスクリーニングすると、ＮＣＡＭのドメインの人工リガンドを同定することができる。さらに、ＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインとＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインの人工リガンド、中でもＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインのＩｇ１−Ｉｇ２結合部位でＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインとＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインで構成されている部位の人工リガンドのスクリーニングを行なう。このようなライブラリまたはその構成法はよく知られている。有用なリガンドのスクリーニングは、この明細書に記載したスクリーニング法に従って行なうこと、あるいは当業者にとって明らかな方法で行なうことが可能である。
【００８６】
本発明のさらに別の実施態様は、ポリペプチド、その断片、その変異体、そのミミックを利用してＮＣＡＭを提示している細胞および／またはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞の生存を促進することに関する。治療は、中枢神経系および末梢神経系や、筋肉その他の器官の病気および疾患の治療である。
【００８７】
すでに説明したように、本発明は、インビトロまたはインビボでＮＣＡＭを提示している細胞またはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞の細胞死を防いで患者を治療することに関する。治療には、１つ以上の上記化合物の有効量を投与することが含まれる。
【００８８】
本発明の化合物を使用した治療は、さまざまな因子によって死ぬリスクのある細胞の生存を促進するのに有効である。因子としては、例えば、外傷や怪我、急性疾患、慢性疾患、中でも通常は細胞死へと至る変性疾患のほか、これ以外の外的因子として例えば内科治療および／または外科治療および／またはフィリーラジカルを発生させるか細胞毒性効果を有する可能性のある診断法（例えばＸ線や化学療法）が挙げられる。化学療法に関しては、本発明のＮＣＡＭ結合化合物がガンの治療に有効である。というのも、必ずしもすべてのガン細胞がＮＣＡＭを発現するわけではないからである。
【００８９】
本発明の化合物は、移植した細胞の生存を促進するのに用いることもできる。これは、上に説明したＣ３などの長期効果を有する化合物を用いる場合に特に有効である。
【００９０】
本発明の別の実施態様では、遺伝子を操作した移植細胞または注入細胞の中で本発明の化合物を合成し、その化合物をこの細胞から分泌させることができる。
【００９１】
治療には、中枢神経系または末梢神経系の病気または疾患に関係した細胞死の治療および／または予防が含まれる。そのような病気または疾患は、手術後の神経の損傷、外傷性の神経損傷（例えば脊髄損傷に起因する神経損傷）、神経繊維有髄化の障害、虚血後のダメージ（例えば脳卒中に起因するダメージ）、多発性梗塞性痴呆、多発性硬化症、糖尿病に付随する神経変性、神経筋変性、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などである。
【００９２】
神経筋接続の機能損傷（例えば、遺伝性または外傷性の萎縮性筋肉疾患）などの筋肉の病気または疾患；あるいは、生殖腺の変性疾患、膵臓の変性疾患（例えばＩ型とＩＩ型の糖尿病）、腎臓の変性疾患（例えばネフローゼ）など、さまざまな器官の病気または疾患に関し、本発明の化合物を用いて細胞死を妨げること、すなわち細胞の生存を促進することができる。
【００９３】
さらに、本発明の化合物は、心筋細胞の生存（例えば急性心筋梗塞後の生存）を促進するためのものでもある。
【００９４】
本発明の別の特徴は、本発明の化合物を神経ガイド・プロテーゼと組み合わせて使用することである。
【００９５】
本発明に従って使用される化合物は、単量体のオリゴマー（多量体）であることが好ましい。なおそれぞれの単量体は、上記化合物に関して定義した単量体である。デンドリマーなどの多量体ペプチドは、柔軟性のあるペプチド単量体が多数存在しているために立体配座の決定基またはクラスターとなることができる。一実施態様では、化合物が二量体である。別の実施態様では、化合物がデンドリマーであり、例えば４つのペプチドがリシン骨格に結合していたり、ポリマー担体（例えばＢＳＡなどのタンパク質担体）に結合していたりする。この化合物は、それぞれが独立にＮＣＡＭまたはＮＣＡＭリガンド／カウンター受容体を提示している細胞の生存を促進することのできる複数の単量体を含んでいることが好ましい。
【００９６】
個々の単量体はホモ（すなわち互いに同じ）でもヘテロ（すなわち互いに異なる）でもよい。後者のタイプの単量体は、少なくとも２つの異なった単量体を含んでいる。一般に二量体と多量体は、２つ以上の同じ単量体、または互いに異なる２つ以上の単量体を含んでいる。
【００９７】
本発明は、上記の化合物を１つ以上含む医薬組成物にも関する。好ましい一実施態様では、ペプチドを多量体にし、例えば基剤に結合させる。ペプチドは、デンドリマーの形態したり（例えばリシン骨格に結合した４つのペプチド）、ポリマー担体（例えばＢＳＡなどのタンパク質担体）に結合させたりすることができる。このような形態の製剤は当業者には周知である。
【００９８】
この明細書では、医薬組成物という用語は、医薬品、治療剤、薬剤、薬と同じ意味で使用し、患者の病、痛み、疾患、病気、怪我の治療（予防、診断、痛み緩和、治癒を含む）に使用できるあらゆる治療剤または予防剤のことを意味する。治療に有効な遺伝子決定基、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ならびにその誘導体は、薬剤または薬という用語に含まれる。この明細書で明らかにしてあるように、“治療剤”、“薬剤”、“薬”、“医薬品”は、生物活性剤の一種である。生物活性剤は、治療または診断の用途（例えば患者に疾患があるかないかを診断する方法および／または患者の疾患を治療する方法）に関連して使用できる任意の物質である。“生物活性剤”は、インビトロおよび／またはインビボで生物に対して効果を及ぼすことのできる物質を意味する。生物活性剤は、中性でも、正または負に帯電していてもよい。適切な生物活性剤としては、例えば、プロドラッグ、診断剤、治療剤、薬剤、薬、酸素供給剤、血液代替物、合成有機分子、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、遺伝子決定基（例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド）などが挙げられる。
【００９９】
本発明は、インビトロまたはインビボで細胞の死を妨げる方法の利用にも関する。この方法は、インビトロまたはインビボで１つ以上の上記化合物または下記組成物の有効量を投与し、この明細書に記載したいくつかの組織および器官において、ＮＣＡＭを提示している細胞および／またはＮＣＡＭリガンドを提示している細胞の生存を促進する操作を含んでいる。本発明の医薬品は、１つ以上の上記化合物または下記組成物の有効量と、薬理学的に許容可能な添加物を含んでいる。このような医薬品は、経口、筋肉内、静脈内、頭蓋内、包膜内、脳室内、鼻孔内、肺内の投与に適した形態にすることができる。
【０１００】
ほとんどの症状において、局所的に適用すること、または実質的に局所的に適用することが好ましい。上記化合物は、特に、プロテーゼ装置（例えば神経ガイド・プロテーゼ）と組み合わせて使用される。したがって、本発明はさらに、１つ以上の上記化合物または下記組成物を含むことを特徴とする神経ガイド・プロテーゼにも関する。神経ガイドは公知である。
【０１０１】
医薬品および組成物を本発明の化合物に基づいて製造する方法は、一般に、タンパク質をベースとした他の任意の薬を製造する方法と同じである。潜在的な問題と、その問題を解決するのに必要なガイドは、いくつかの書籍に記載されている。例えば『治療用ペプチドとタンパク質製剤。製造と供給のためのシステム』、Ａ．Ｋ． Ｂａｎｇａ編、テクノミック出版、バーゼル、１９９５年がある。
【０１０２】
注射物は、通常は溶液または懸濁液として、あるいは注射する前に溶液または懸濁液にするのに適した固体形態として調製する。調製物は、乳化することもできる。活性成分は、薬理学的に許容可能でこの活性成分に適合した添加剤と混合することがしばしばある。適切な添加剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールや、これらの組み合わせである。さらに、望むのであれば、調製物の中に少量の補助物質として、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤のほか、この調製物の効果または移動を改善する物質などを入れることもできる。
【０１０３】
本発明による化合物の製剤は、当業者に知られている方法で調製することができる。製剤は、薬理学的に許容可能な基剤と添加剤（ミクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子など）を含むことができる。
【０１０４】
調製物は、必要に応じ、活性成分が効果を及ぼす場所に、注射によってうまく投与することができる。他の投与形態に適した製剤としては、座薬や、鼻孔内または肺内に投与する製剤のほか、場合によっては経口投与する製剤が挙げられる。座薬の場合には、従来からある結合剤および基剤として、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられる。このような座薬は、活性剤を０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％含む混合物から製造することができる。経口投与する製剤には、普通用いられる添加剤（例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）が含まれる。これら組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放剤、粉末の形態であり、一般に活性成分を１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％含んでいる。
【０１０５】
他の製剤は、鼻孔内または肺内に投与するのに適している（例えば吸入剤またはエーロゾル）。
【０１０６】
活性化合物は、中性の形態または塩の形態にすることができる。薬理学的に許容可能な塩は、（ペプチド化合物の遊離アミノ基とで形成される）酸添加塩を含んでおり、無機酸（例えば塩酸、リン酸）または有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて製造される。遊離カルボキシル基を用いて形成した塩は、無機塩基（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄）と有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。
【０１０７】
調製物は、それぞれの製剤に合った方法で、治療に有効と思われる量だけ投与する。投与量は、例えば体重、年齢、治療する疾患、疾患の程度などに応じ、患者ごとに異なる。適切な投与量は、投与１回につき活性成分を数百μｇの程度であるが、好ましい範囲は約０．１μｇ〜１０００μｇ、例えば約１μｇ〜３００μｇであり、中でも約１０μｇ〜５０μｇが好ましい。投与は、１回だけ、あるいは複数回にすることができる。投与量は、投与経路によって異なるだけでなく、治療する患者の年齢や体重によっても異なるであろう。好ましい投与量は、体重が７０ｋｇの人で３０ｍｇ〜７０ｍｇの範囲になろう。
【０１０８】
本発明の化合物のうちのいくつかは十分に活性であるが、他のいくつかは、調製物が薬理学的に許容可能な添加剤および／または基剤をさらに含んでいる場合に効果が増大するようになっている。そのような添加剤および基剤は公知であろう。場合によっては、活性物質を標的に到達させるのを促進する化合物を含むことが望ましかろう。
【０１０９】
多くの場合、製剤を複数回にわたって投与する必要があろう。投与は、連続的輸液（例えば心室内輸液）にすること、またはより多い投与量を投与する形態にすること（例えば、１日により多くの回数、毎日、一週間により多くの回数、毎週投与することなど）が可能である。薬剤の投与は、人が細胞死を起こす可能性のある因子に曝露される前、またはその直後に開始することが好ましい。薬剤は、因子への曝露開始から８時間以内、例えば５時間以内に投与することが好ましい。多くの化合物が長期効果を示すため、その化合物は長い間隔（例えば１〜２週間）をあけて投与することができる。
【０１１０】
神経ガイドを使用する場合には、活性化合物を連続的に投与すること、あるいは少量ずつ徐放させる形態の投与にすることができる。さらに、前躯体を用いて放出速度および／または放出場所を制御することができる。他の種類のインプラントや経口投与の場合にも、徐放形式にすること、および／または前躯体を使用することが可能である。
【０１１１】
以下に示すのは本発明の実施例であるが、本発明がこれら実施例に限定されることはない。
【０１１２】
実施例１
ＮＣＡＭのＩｇ１ドメインをピキア・パストリスの中で組み換えタンパク質として産生させた。ラットのＮＣＡＭのｃＤＮＡ断片をＰＣＲで合成し、増幅したｃＤＮＡをサブクローニングしてｐＨＩＬ−Ｓ１プラスミド（インヴィトロジェン社、サンディエゴ、アメリカ合衆国）のＸｈｏ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ部位に入れた。大腸菌株Ｔｏｐ １０Ｆ’（インヴィトロジェン社、サンディエゴ、アメリカ合衆国）を用いて形質転換を行なった。この組み換えプラスミドをＮｓｉ Ｉを用いて直線状にし、ピキア・パストリス株のＨｉｓ ４ ＧＳ−１１５（インヴィトロジェン社、サンディエゴ、アメリカ合衆国）の形質転換に使用した。形質転換と選択を、製造者のピキア発現キット・マニュアルに従って実行した。組み換えタンパク質をＩｇ１ ＰＰ（ピキア・パストリスの中で産生されるＩｇ様ドメイン１）と名づけた。Ｉｇ１ ＰＰが本物であることを、アミノ酸シークエンシングとＭＡＬＤＩ−ＭＳによって調べ、１１ｋＤａという予想される分子量であることを確認した。細胞を主としてピキア発現キット・マニュアルに従って増殖させた。誘導後、増殖中の細胞からの上清を０．２１ｍｍのフィルタで濾過し、限外濾過で濃縮し、セファデックスＧ−５０カラム（ファルマシア・バイオテクノロジー社、スウェーデン）を使用したゲル濾過で精製した（Ｔｈｏｍｓｅｎ他、１９９６年）。
【０１１３】
実施例２
ＮＣＡＭのＩｇ２ドメインをコードしているｃＤＮＡをＰＣＲで合成した。ラットのＮＣＡＭ−１２０のｃＤＮＡを鋳型として使用した。増幅したｃＤＮＡ断片をサブクローニングしてｐＰＩＣ９Ｋプラスミド（インヴィトロジェン社）のＳｎａＢＩ／ＡｖｒＩＩ部位に入れた。この組み換えプラスミドをＳａｃＩを用いて直線状にし、ピキア・パストリス株のＨｉｓ ４ ＧＳ−１１５（インヴィトロジェン社）を、製造者が提供するプロトコルに従って形質転換した。組み換えＮＣＡＭのＩｇ２ドメインは、２リットルの発酵装置（ＭＢＲミニバイオ反応器、ＭＢＲミニバイオリアクター社）の中で２時間にわたって誘導した後に発現した。その後、その発現媒体を限外濾過により１０回にわたって濃縮した。Ｉｇ２ドメインをセファデックスＧ−５０カラム（ファルマシア社）を使用したゲル濾過で精製した後、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＳＰカラム（ファルマシア社）を用いてイオン交換クロマトグラフィを行なうことにより、発現媒体が１リットルあたり１０〜１５ｍｇ得られた。ＮＣＡＭ Ｉｇ２ドメインが本物であることは、アミノ酸シークエンシングと質量分析によって確認した。Ｎ末端では、元のリシン−１およびロイシン−２という残基が、クローニング部位のためにチロシン−１およびバリン−２に置換された（Ｊｅｎｓｅｎ他、１９９９年）。
【０１１４】
ＮＣＡＭの最初の２つのドメインが二量体化されるというモデルを、以下のようなグループ突然変異法を利用して実験的に証明した。
【０１１５】
ＮＣＡＭ（２０−２０８）の３つの変異体を作った。第１の変異体では、ドメイン−１のホモフィリックな結合部位からのグルタミン酸−３０、グルタミン酸−３５、リシン−３７をアラニンで置換した。第２の変異体では、ドメイン−２のホモフィリックな結合部位からのアルギニン−１９２、アルギニン−１９６、グルタミン酸−１９８をアラニンで置換した。第３の変異体では、グルタミン酸−３０、グルタミン酸−３５、リシン−３７、アルギニン−１９２、アルギニン−１９６、グルタミン酸−１９８という６つのアミノ酸残基をアラニンで置換した。
【０１１６】
制限分析とＤＮＡシークエンシングによって突然変異が存在していることを確認した後、突然変異していないＮＣＡＭ（２０−２０８）と比べて突然変異体で発現レベルと精製パターンに有意な変化がないことを確認した。ゲル濾過クロマトグラフィを利用することにより、ＮＣＡＭ（２０−２０８）が約４６ｋＤａの二量体として溶離することが明らかになった。この発見は、突然変異したタンパク質が約２３ｋＤａの単量体として溶離するという発見と対比させたとき、ホモフィリックな結合部位における突然変異によって起こる効果を観察するための簡単かつ信頼性のある方法を提供するがわかる。したがって、突然変異が二量体の形成を妨げることが証明された。これは、突然変異した６つの残基のうちの１つまたはいくつかのペアが二量体の形成に関わっていることを示唆する。
【０１１７】
突然変異した３つのタンパク質のそれぞれに関する１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、突然変異した２つのドメインであるドメイン−１とドメイン−２の両方が、折り畳まれていないタンパク質の中で非常に似た折り畳まれ方をしていることがわかった（Ｊｅｎｓｅｎ他、１９９９年）。
【０１１８】
実施例３
樹脂結合１ビーズ１ペプチド・ライブラリの合成を分割混合法を利用して行なった（Ｆｕｒｋａ他、１９９１年）。合成の間とＴＦＡで最終的に保護をはずすとき、ポリエチレン製の注射器を反応容器として使用した。テンタゲル樹脂（ラップ・ポリメーレ社、チュービンゲン、ドイツ）を１８のアリコートに分割し、システインとヒスチジン以外はタンパク質のＬ−アミノ酸を使用した。側鎖は以下の保護基を用いて保護した：アスパラギン酸（ｔＢｕ）、グルタミン酸（ｔＢｕ）、チロシン（ｔＢｕ）、セリン（ｔＢｕ）、トレオニン（ｔＢｕ）、アスパラギン（ｔｒｔ）、グルタミン（ｔｒｔ）、リシン（Ｂｏｃ）、トリプトファン（Ｂｏｃ）、アルギニン（ｐｍｃ）。Ｆｍｏｃで保護したアミノ酸（５当量；ミリジェン社またはノヴァバイオケム社）を、５当量のＤＩＣと５当量のＨＯＢｔを用い、一晩かけて結合させた。Ｆｍｏｃ基の除去は、ＤＭＦ中の２５％ピペリジン溶液を用いて２０分間かけて行なった。側鎖保護基を、８２．５％ＴＦＡ、５％アニソール、５％Ｈ２Ｏ、５％ＥＤＴ、２．５％チオアニソールを用いて室温にて２．５時間かけて除去した後、テトラヒドロフランと１％ＨＯＡｃを用いて洗浄し、次いで樹脂を凍結乾燥させた。２ｍｌの樹脂（約１０６個のビーズに相当）をビオチニル化した受容体とともに０．１％のゼラチン（シグマ社）を含むトリス／ＨＣｌ緩衝液（０．０２５Ｍのトリス／ＨＣｌ 、ｐＨ７．２、０．２５ＭのＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）のトゥィーン２０）の中で６０分間にわたって培養することにより、スクリーニングを行なった。次に樹脂をトリス／ＨＣｌ緩衝液の中で洗浄し、アビジン−アルカリホスファターゼ（１：２００００に希釈）とともに３０分間にわたって培養した。基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（シグマ社）をＬａｍら（１９９２年）が記載しているようにして添加し、染色されたビーズを取り出してマイクロシークエンシングを行なった。このライブラリを受容体ＮＣＡＭ Ｉｇ１−ＰＰ（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いてスクリーニングした。
【０１１９】
実施例４
最も強く染色されたビーズを立体顕微鏡で見ながら選択し、ＡＢＩ １２０Ａ ＨＰＬＣを備えたＡＢＩ ４７０Ａでシークエンシングを行なった。２つのペプチド配列が得られた（配列ＩＤ番号２と３）。得られた配列のアラインメントを行ない、繰り返しパターンを調べて予想モチーフを明らかにすることにより、合成してさらに研究するペプチド配列を選択した。
【０１２０】
実施例５
ＮＣＡＭ Ｉｇ１の配列に由来する１つのペプチドＰ１（配列ＩＤ番号２４）を以下に説明するようにして合成した。さらに、ＮＣＡＭ Ｉｇ２の配列に由来する１つのペプチドＰ２（配列ＩＤ番号２３）を以下に説明するようにして合成した。コンビナトリアル・ライブラリから２２種類のＮＣＡＭ Ｉｇ１結合配列（配列ＩＤ番号１〜２２）が同定された。
【０１２１】
Ｃ３（配列ＩＤ番号１）、Ｄ３（配列ＩＤ番号２）、Ｄ４（配列ＩＤ番号３）という３つのペプチドを選択し、Ｆｍｏｃで保護したアミノ酸（３当量）を用い、テンタゲル樹脂上でリンク・アミド・リンカー（ｐ−（（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメトキシベンジル）−フェノキシ−酢酸（ノヴァバイオケム社））と結合させた。ＴＢＴＵ（３当量）、ＨＯＢｔ（３当量）、ＤＩＥＡ（４．５当量）との結合を手製のマルチカラム装置の中で６０分間以上行なわせた。ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液を用い、１０分間かけてＦｍｏｃによる保護をはずした。Ｆｍｏｃ−リシン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（ノヴァバイオケム社）をリンカー樹脂と結合させることによりペプチド・デンドリマーを合成した後、Ｆｍｏｃをはずし、さらにＦｍｏｃ−リシン（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを結合させる操作を実行した。Ｆｍｏｃをはずした後、ペプチドの合成を、上記の単量体ペプチドの合成と同じようにして行なった。ＴＦＡ９０％、５％Ｈ２Ｏ、３％ＥＤＴ、２％チオアニソールを用いてペプチジル樹脂から保護をはずし、このペプチジル樹脂をジエチルエーテルの中で沈殿させ、ジエチルエーテルの中で３回洗浄し、５％ＡｃＯＨの中に溶解させ、凍結乾燥した。ウォーターズ・ピコタグと、ＷＩＳＰ７１２に接続したウォーターズ・５０１ポンプとを用いてアミノ酸分析を行なった。ウォーターズ９９６フォトダイオード・アレイ検出器を備えたウォーターズ６００Ｅを用い、Ｃ１８カラム（デルタ−パック１００オングストローム、１５μｍ、ミリポア社）上で分析・分離のためのＨＰＬＣを行なった。ＶＧ ＴＯＦ Ｓｐｅｃ Ｅ（フィッションズ。インスツルメント社）を用いてＭＡＬＤＩ−ＭＳを行なった。ＨＰＬＣによると、得られたペプチドは純度が少なくとも９５％であった。
【０１２２】
実施例６
ＢＩＡｌｉｔｅ装置（ファルマシア・バイオセンサー社、スウェーデン）を用いてリアルタイムでの生体分子相互作用分析を行なった。すべての実験は、ヘペス緩衝液（ＨＢＳ：１０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０（ファルマシア・バイオセンサー社、スウェーデン））を流しながら２５℃で行なった。流量は５ｍｌ／分にした。デンドリマー・ペプチドＣ３ｄ、Ｄ３ｄ、Ｄ４ｄ（３つのリシンからなる骨格に４つのペプチド−単量体が結合したもの）を以下のようにしてセンサー・チップＣＭ５の表面に固定化した。すなわち、０．０５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド１０ｍｌと０．２ＭのＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いてチップを活性化し；６０μｇ／ｍｌの濃度にしたＨＢＳ中のペプチド溶液３５ｍｌを用いてペプチドを固定化し；最後に１Ｍのエタノールアミンヒドロクロリド（ｐＨ８．５）３５μｌを用いてチップをブロックした。Ｉｇ１をデンドリマー・ペプチドに結合させるため、指定された濃度のＩｇ１またはＩｇ１Ｉを添加した。５ｍＭのＮａＯＨを５ｍｌのパルスにして２回当てることにより、チップを再生させた。独立に２回の実験を行なった。その結果から、Ｃ３ｄ、Ｄ３ｄ、Ｄ４ｄがＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインに結合していることが確認された。
【０１２３】
以下の実施例に従って本発明をさらに説明する。
【０１２４】
実施例７
４つの異なる実験を行なってＣ３ｄがニューロンの生存に及ぼす効果を調べた。
【０１２５】
ａ）（ＮＧＦの除去）
第１の実験では、ＰＣ１２細胞のサブクローン（ＰＣ１２−Ｅ２）を用いた。褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞系は、ニューロン細胞系の確立されたモデルである。この細胞系は、神経成長因子（ＮＧＦ）で処理することにより交感神経タイプのニューロンに分化させることができる。この細胞系は、神経生物学の研究で広く用いられている。
【０１２６】
所定の培地（ＤＭＥＭ）にＮＧＦ（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）を補足したものの中に入れた９６ウエルの組織培養プレートにＰＣ１２細胞を植えることにより、ＰＣ１２細胞を分化させ、通常はこのＮＧＦ処理を６〜８日間にわたって行なった後に使用した。ＮＧＦの除去は以下のようにして行なった。すなわち、培地を除去し、細胞をあらかじめ暖めてある培地で素早く２回洗浄し、Ｃ３ｄを補足したＤＭＥＭを再度供給した。２日間にわたって培養を行なった後、新しいテトラゾリウム化合物であるＭＴＳ（プロメガ社、アメリカ合衆国）の還元を測定することにより細胞の生存を調べた。このＭＴＳは、細胞によって生体還元され、組織培養培地に溶解するホルマザンになる。４９０ｎｍにおけるホルマザンの吸光度を９６ウエルのアッセイ用プレートから直接測定した。そのとき追加処理は行なわなかった。ＭＴＳから水溶性ホルマザンへの転換は、代謝活性のある細胞内のデヒドロゲナーゼ酵素により行なわれた。４９０ｎｍにおける吸光度から測定されたホルマザン生成物の量は、培養物中で生存している細胞の数に正比例していた（ＹａｏとＣｏｏｐｅｒ、１９９５年；セルタイター９６水性非放射性細胞増殖アッセイ、プロメガ社、１９９６年；Ｅｉｌｅｒｓ他、１９９８年）。
【０１２７】
このアッセイによる生存の結果を図１に示す。
【０１２８】
ｂ）（血清の剥奪）
第２の実験では、ＰＣ１２細胞を飢餓状態にし、Ｃ３ｄの保護効果を分析した。
【０１２９】
Ｃ３ｄを補足したＤＭＥＭの中に入れた９６ウエルの組織培養プレートに、増殖因子なし（血清飢餓状態）の状態にしたＰＣ１２細胞を６日間にわたって入れ、ＭＴＳの還元を測定することにより細胞の生存を調べた（ＧｏｌｌａｐｕｄｉとＯｂｌｉｎｇｅｒ、１９９９年；ＷｉｌｌｉａｍｓとＤｏｈｅｒｔｙ、１９９９年）。
【０１３０】
このアッセイによる生存の結果を図２に示す。
【０１３１】
ｃ）（カリウムの脱分極）
第３の実験では、ラットの小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）の初代培養物を使用した。培養したＣＧＮは、高レベルのカリウム（ＨＫ）を含む培地を低レベルのＫ＋（ＬＫ）を含む培地に切り換えたとき、アポトーシスによって死ぬ。Ｋ＋の低下による死は、例えば脳由来の成長因子（ＢＤＮＦ）や、保護効果を有すると思われる物質を添加することにより防ぐことができる。
【０１３２】
生後７日のラットからの小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）をＨＫ（４０ｍＭ）の存在下で７〜８日間にわたって成長させた。この細胞を、ＬＰ（５ｍＭ）を含む無血清培地（イーグルの基本培地（ＢＭＥ））で２回洗浄し、Ｃ３ｄを補足した無血清培地で２日間にわたって成長させた。上に説明したようにしてＭＴＳの還元を測定することにより、培養物における細胞の生存を調べた（Ｄ’Ｍｅｌｌｏ他、１９９７年；Ｖｉｌｌａｂａ他、１９９７年；Ｓｋａｐｅｒ他、１９９８年）。
【０１３３】
このアッセイによる生存の結果を図３に示す。
【０１３４】
ｄ）６−ＯＨＤＡで処理したドーパミン作動性ニューロンの生存
第４の実験では、生後１４日のラットの中脳に由来するのドーパミン作動性ニューロン（ＤＮ）の初代培養物を使用した。６日間にわたってインビトロの状態にした後、６−ＯＨＤＡで２時間処理したＤＮは、数日で死ぬ。
【０１３５】
ＤＮを６−ＯＨＤＡなしで６日間増殖させる。ＤＮを無血清培地で２回洗浄し、１００μＭの６−ＯＨＤＡとＣ３ｄペプチドの存在下で２時間にわたって増殖させる。６−ＯＨＤＡを含む培地を除去した後、ＤＮをＣ３ｄの存在下で２日間にわたって増殖させる。チロシンヒドロキシラーゼの発現に関して免疫染色したニューロンの数を数えることにより、培養物における細胞の生存を調べる（Ｈｕｌｌｅｙ Ｐ、Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ Ｍ、Ｌｕｂｂｅｒｔ Ｈ、「Ｌ１神経細胞接着分子は胎児ドーパミン作動性ニューロンの生存因子である」、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ．、第５３巻、１２９−１３４ページ、１９９８年）。
【０１３６】
このアッセイによる生存の結果を図４に示す。
【０１３７】
実施例８
２つの異なる実験を行なってＦＧＬペプチドがニューロンの生存に及ぼす効果を調べた。
【０１３８】
ａ）（カリウムによる脱分極）
これは、Ｃ３ｄについて説明したのと同様にして行なった（詳細に関しては実施例７のｃを参照のこと）。
【０１３９】
このアッセイによる生存の結果を図５に示す。
【０１４０】
ｂ）（グルタミン酸の刺激毒性）
第４の実験では、ラットの小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）の初代培養物を使用した。培養したＣＧＮは、高濃度のグルタミン酸で処理したとき（グルタミン酸の刺激毒性）、アポトーシスによって死ぬ。ニューロンが高レベルのカリウム（ＨＫ）を含む培地の中で成長しているとき、ＨＫは細胞を脱分極させ、細胞の分化を引き起こす。ニューロンをグルタミン酸で処理すると細胞が死ぬ（Ｂｒｅｃｈｔ Ｓ．他、２００１年）。
【０１４１】
この実験は、上にＣ３ｄに関して説明したようにして行なったが、１つだけ異なる点がある。それは、ＨＫ−培地の中でＣＧＮを培養した後にＬＫ−培地に切り換えるのではなく、グルタミン酸（１ｍＭ）を含む培地を使用したことである。
【０１４２】
このアッセイによる生存の結果を図６に示す。
【化７】
2004515534.tif 000005
【化８】
2004515534.tif 000006
【化９】
2004515534.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＮＧＦを除去した後にＣ３ｄペプチドがＰＣ１２細胞の生存に及ぼす効果を示している。
【図２】
図２は、増殖因子なしの状態でＣ３ｄペプチドがＰＣ１２細胞の生存に及ぼす効果を示している。Ｃ３ｄのｄは、Ｃ３ペプチドから四量体デンドリマーを合成できるという事実を示している。
【図３】
図３は、Ｃ３ｄペプチドが小脳顆粒細胞の生存に及ぼす効果を示している。
【図４】
図４は、Ｃ３ｄペプチドがドーパミン作動性ニューロンの生存に及ぼす効果を示している。
【図５】
図５は、ＦＧＬペプチドが顆粒細胞の生存に及ぼす効果を示している。
【図６】
図６は、単量体ＦＧＬペプチドが顆粒細胞の生存に及ぼす効果を示している。
【図７】
図７Ａと図７Ｂは、ＮＣＡＭのいろいろな形態を示している。Ａ）ＮＣＡＭの主要な形態であり、どれもが、５つの免疫グロブリン・ドメイン（Ｉｇドメイン）と２つのフィブロネクチン・タイプＩＩＩドメイン（ＦｎＩＩＩドメイン）からなる似た細胞外部分を備えている。３つの膜貫通形態または膜固着形態（ＮＣＡＭ−１２０、−１４０、−１８０）は、選択的スプライシングによって産生される。それに加え、ＮＣＡＭのさまざまな可溶性形態（ＮＣＡＭｓ）が存在している。Ｂ）個々のＮＣＡＭドメインにＮ末端（ＮＨ２）から順番に番号を付してある。最もＮ末端寄りのドメインは、ＮＣＡＭ Ｉｇ１である。選択的スプライシングされる重要なエキソンはＶＡＳＥエキソンであり、ＮＣＡＭのＩｇ４ドメインをコードしている領域に挿入することができる。Ｉｇ５ドメインは、ポリシアル酸（ＰＳＡ）を用いてグリコシル化することができる。
【図８】
図８は、ビーズと結合したペプチドが結合するＮＣＡＭドメインの同定法を示している。Ａ）ビーズと結合したペプチドのライブラリを、組み換えＮＣＡＭ Ｉｇ１ドメインとともに培養する。例えばＮＣＡＭ Ｉｇ１と結合するビーズは、染色反応によって目に見えるようになる。染色されたビーズを単離し、マイクロシークエンシングを行なう（実施例３、４）。Ｂ）結合配列を評価した後、これらの配列に対応したペプチドを、単量体、デンドリマー（四量体）、ＢＳＡと結合した２０量体として合成する（実施例５）。Ｃ）ペプチド・デンドリマーの構造。４つのペプチド単量体（“ペプチド”）が、３つのリシンからなる骨格に結合している。
【図１】
2004515534.tif 000011
【図２】
2004515534.tif 000012
【図３】
2004515534.tif 000013
【図４】
2004515534.tif 000014
【図５】
2004515534.tif 000015
【図６】
2004515534.tif 000016
【図７】
2004515534.tif 000017
【図８】
2004515534.tif 000018
【国際公開パンフレット】
2004515534.tif 000019
2004515534.tif 000020
2004515534.tif 000021
2004515534.tif 000022
2004515534.tif 000023
2004515534.tif 000024
2004515534.tif 000025
2004515534.tif 000026
2004515534.tif 000027
2004515534.tif 000028
2004515534.tif 000029
2004515534.tif 000030
2004515534.tif 000031
2004515534.tif 000032
2004515534.tif 000033
2004515534.tif 000034
2004515534.tif 000035
2004515534.tif 000036
2004515534.tif 000037
2004515534.tif 000038
2004515534.tif 000039
2004515534.tif 000040
2004515534.tif 000041
2004515534.tif 000042
2004515534.tif 000043
2004515534.tif 000044
2004515534.tif 000045
2004515534.tif 000046
2004515534.tif 000047
2004515534.tif 000048
2004515534.tif 000049
2004515534.tif 000050
2004515534.tif 000051
2004515534.tif 000052
2004515534.tif 000053
2004515534.tif 000054
2004515534.tif 000055
2004515534.tif 000056
2004515534.tif 000057
2004515534.tif 000058
2004515534.tif 000059
2004515534.tif 000060
2004515534.tif 000061
2004515534.tif 000062
2004515534.tif 000063
2004515534.tif 000064
2004515534.tif 000065
2004515534.tif 000066
2004515534.tif 000067
2004515534.tif 000068
2004515534.tif 000069
2004515534.tif 000070
2004515534.tif 000071
2004515534.tif 000072
2004515534.tif 000073
2004515534.tif 000074
2004515534.tif 000075
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004515534.tif 000076
【国際調査報告】
2004515534.tif 000077
2004515534.tif 000078
2004515534.tif 000079
2004515534.tif 000080
2004515534.tif 000081