(57)【要約】本発明は、成魚前遡上性魚の飼育を改善するか、または海水移動のための成魚前遡上性魚を調製するための方法、組成物およびキットに関する。当該方法は、少なくとも１つの多価カチオン感受レセプター（ＰＶＣＲ）の発現および／または感受性を増大させるのに充分な量で少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を淡水へ添加する工程；ならびに魚消費用の飼料を淡水に添加する工程、ここで該飼料は、成魚前遡上性魚の血清中のＰＶＣＲ調節因子の有意に増加したレベルを与えるのに充分な量のＮａＣｌを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの多価カチオン感受レセプター（ＰＶＣＲ）の発現および／または感受性を調節するのに充分な量で少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を淡水へ添加する工程；ならびに
ｂ）成魚前溯上性魚の血清中の該ＰＶＣＲ調節因子の有意に増加したレベルを与える薬剤を含む魚消費用の飼料を淡水へ添加する工程
を含む、海水移行前に淡水で管理される成魚前溯上性魚の飼育を改善するための方法。
【請求項２】
成魚前溯上性魚がサケである請求項１記載の方法。
【請求項３】
薬剤がＮａＣｌを含んでなる請求項２記載の方法。
【請求項４】
飼料が少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含んでなる請求項３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を淡水に添加する工程が、約２．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの量までのカルシウム濃度をもたらすのに充分なカルシウムを淡水へ、および約０．５ｍＭ〜約１０．０ｍＭの量までのマグネシウム濃度をもたらすのに充分なマグネシウムを淡水へ添加する工程をさらに含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
ａ）少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性を調節するのに充分な量で少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を淡水へ添加する工程；ならびに
ｂ）成魚前溯上性魚の血清中の該ＰＶＣＲ調節因子の有意に増加したレベルを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む魚消費用の飼料を淡水へ添加する工程
を含む、海水移行前に淡水で管理される成魚前溯上性魚の飼育を改善するための方法。
【請求項７】
少なくとも１つのＰＶＣＲの増加した発現が成魚前溯上性魚が海水へ移行されるまで維持される請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＰＶＣＲ調節因子が二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオン、アミノ酸、Ｉ型カルシウム受容体作動薬、ＩＩ型カルシウム受容体作動薬、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ、サイトカイン、およびマクロファージ走化性ペプチド−１からなる群より選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
ａ）少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性を調節するのに充分な量でマグネシウムおよびカルシウムを淡水へ添加する工程；ならびに
ｂ）成魚前溯上性魚の血清中のカルシウムおよび／またはマグネシウムの有意に増加したレベルを与えるのに十分な量のＮａＣｌおよび少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を含む魚消費用の飼料を淡水へ添加する工程
を含む、海水移行前に淡水で管理される成魚前溯上性魚の飼育を改善するための方法。
【請求項１０】
飼料が少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含んでなる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
飼料に含まれる該ＰＶＣＲ調節因子がアミノ酸を含んでなる請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸が約１ｇｍ／ｋｇ〜約１０ｇｍ／ｋｇの量のトリプトファンを含んでなる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
成魚前溯上性魚が光周期に曝される工程をさらに含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ａ）少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性を調節するのに充分な量でマグネシウムおよびカルシウムを淡水へ添加する工程；ならびに
ｂ）成魚前溯上性魚の血清中のカルシウムおよび／またはマグネシウムの有意に増加したレベルを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む魚消費用の飼料を淡水へ添加する工程
を含む、海水移行前に淡水で管理される成魚前溯上性魚の飼育を改善するための方法。
【請求項１５】
約２．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの量までのカルシウム濃度をもたらすのに充分なカルシウムが淡水へ添加される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
約０．５ｍＭ〜約１０．０ｍＭの量までのマグネシウム濃度をもたらすのに充分なマグネシウムが淡水へ添加される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
飼料が少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含んでなる請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ａ）栄養の１つ以上の供給源；
ｂ）約１０，０００ｍｇ／ｋｇ〜約１００，０００ｍｇ／ｋｇの量のＮａＣｌ；および
ｃ）少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子；
を含んでなり、少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性を調節する、淡水中の溯上性魚による消費用の飼料。
【請求項１９】
ＰＶＣＲ調節因子がアミノ酸を含んでなる請求項１８記載の飼料。
【請求項２０】
アミノ酸が約１ｇｍ／ｋｇ〜約１０ｇｍ／ｋｇの量でトリプトファンを含んでなる請求項１９記載の飼料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、Ｈ． Ｗｉｌｌｉａｍ Ｈａｒｒｉｓ， Ｊｒ．らによる「成魚前の溯上性魚の養殖方法」と題された２０００年１０月１２日出願の一部継続出願第０９／６８７，４７７号；Ｈ． Ｗｉｌｌｉａｍ Ｈａｒｒｉｓ， Ｊｒ．らによる「成魚前の溯上性魚の養殖方法」と題された２０００年１０月１２日出願の出願第０９／６８７，４７６号；およびＨ． Ｗｉｌｌｉａｍ Ｈａｒｒｉｓ， Ｊｒ．らによる「成魚前の溯上性魚の養殖方法」と題された２０００年１０月１２日出願の出願第０９／６８７，３７２号である。前記出願の全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
自然界では、多くの溯上性魚は海水でそれらの成体期のほとんどを過ごすが、産卵の目的のために淡水へと上流へ泳ぐ。その結果、溯上性魚は淡水中でそれらの卵から孵化し、生まれる。これらの魚は成長するとともに、下流へ泳ぎ、しだいに海水に適応する。
【０００３】
魚の孵化場は、これらのタイプの魚の養殖の際、困難性を伴う。というのは、成魚前の魚が海水に適応する〔例えば、スモルト化（ｓｍｏｌｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を経る〕時間のウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）は短く、正確に指摘するのが困難でありうるためである。その結果、これらの孵化場は、溯上性魚を淡水から海水に移す際に有意な罹患率や死亡率を経験する。さらに、淡水から海水への移行で生存した魚の多くはストレスを受け、その結果、摂餌の減少、疾患に対する感受性の増加を経験する。それゆえ、これらの溯上性魚はしばしば海水に移行後、充分に成長しない。
【０００４】
水産養殖産業は、成魚前の溯上性魚を淡水から海水に移す際に遭遇する問題により、毎年、何百万ドルを失う。それゆえ、成魚前の溯上性魚の海水への移行に関する方法の改善が求められている。さらには、海水へ移された成魚前の溯上性魚の生存および成長の増加、ストレスの減少が求められている。
【０００５】
発明の要約
本発明は、成魚前の溯上性魚の養殖の改善方法、または多価カチオン感受レセプター（ＰＶＣＲ）と呼ぶレセプターの発現を調節（例えば、増加および／または減少）することによる海水への移行のためのこれらの魚の調整方法に関する。ＰＶＣＲの調節には、成魚前の溯上性魚をＰＶＣＲの少なくとも１つの調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ）に供することによる、ＰＶＣＲタンパク質およびｍＲＮＡ発現の変化並びにＰＶＣＲ感受性に対する変化を含む。成魚前の溯上性魚は、調節因子が、それらの淡水環境に添加される場合に、および任意に飼料に添加される場合に、調節因子に供される。本発明は、少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子の淡水への添加、および魚の血清中でのＰＶＣＲ調節因子レベルの有意な増加への寄与に充分な薬剤を含む、魚が消費する飼料の淡水への添加を包含する。１つの態様では、該薬剤は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。それゆえ、飼料はＮａＣｌを含み、任意に、成魚前の溯上性魚の血清中でのＰＶＣＲ調節因子レベルの有意な増加に寄与する量で少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を含む。ＰＶＣＲの調節された発現および／または感受性は魚が海水への移行の準備が整うまで維持される。成魚前の溯上性魚は、それらの海水への移行の準備が整うまで、少なくとも１つのＰＶＣＲアゴニストを含む淡水中に維持されうる。本発明はまた、溯上性魚の海水への移行前および移行後直ぐの両方において、成長および／またはスモルト化の増加に充分な光周期に成魚前の溯上性魚を曝露することを任意に含む。好ましくは、光周期は連続的である。光周期は、２４時間の期間中、約１２時間から約２４時間の間の範囲でありうる。また、本発明はさらに、連続的な光周期への曝露を維持したまま魚を海水へ移行することを含む。１つの例では、本発明は、少なくとも約１５グラムまたは多くとも約１２０ グラムの体重の成魚前の溯上性魚の海水への移行を可能にする。
【０００６】
本発明の１つの態様では、成魚前の溯上性魚〔例えば、サケ、マスおよびアルプスイワナ（ａｒｃｔｉｃ ｃｈａｒ ）〕は、淡水へのカルシウムおよびマグネシウム等のＰＶＣＲアゴニストの添加、および淡水への、約１重量％〜約１０重量％（例えば、約１０，０００ｍｇ／ｋｇ 〜１００，０００ｍｇ／ｋｇ）のＮａＣｌを含む、魚が消費する飼料の添加により、淡水から海水への移行に対し調整される。淡水に添加されるカルシウムの量は約２．０ｍＭ 〜約１０．０ｍＭの間までの濃度に達するのに充分な量であり、添加されるマグネシウムの量は約０．５ｍＭ 〜約１０．０ｍＭの間までの濃度に達するのに充分な量である。飼料は任意にアミノ酸等のＰＶＣＲアゴニストを含みうる。添加されうる特定のアミノ酸は、約１ｇｍ／ｋｇ〜約１０ｇｍ／ｋｇ の間の量のトリプトファンである。本発明はまた、成長および／またはスモルト化の増加に充分な量の時間の光周期に成魚前の溯上性魚を曝露することを任意に含む。好ましくは、光周期は連続的である（例えば、２４時間の期間中、約１２時間〜約２４時間の間）。連続的光周期は、本明細書に記載のように、海水への移行前後に、１日から数日間行われうる。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、海水への移行前および／または後での飼料消費の増加若しくは改善方法、成長の増加方法、生存率の増加および／または死亡率の減少方法、飼料変換率（ＦＣＲ ）の改善方法、特異的成長率（ＳＧＲ ）の増加方法、浸透圧損傷の低減方法、幼魚（例えば、約１５から約６０グラムの間）の海水への移行方法、並びに約１４℃〜約１９℃の高められた温度を有する海水への成魚前の溯上性魚の移行方法を含む。これらの方法は、少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を淡水に添加することにより、成魚前の溯上性魚を少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子に供するか若しくは曝露することにより、或いは少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子をＰＶＣＲの発現および／または感受性を調節するのに充分な量で含む淡水へ成魚前の溯上性魚を導入することにより行われる。本方法はまた、約１重量％〜約１０重量％の間のＮａＣｌを含む飼料を淡水に添加すること、および成魚前の溯上性魚を海水に移行させることを含む。
【０００８】
本発明はまた、成魚前の溯上性魚の組織（例えば、鰓）における塩類細胞（ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｅｌｌ ）中のナトリウムカリウムＡＴＰ アーゼ（Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ）活性の増加方法、または成魚前の溯上性魚の鰓の二次ラメラ（ｌａｍｅｌｌａｅ）における塩類細胞の頻度の低減方法を具体化する。本方法は、少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性を調節するのに充分な量での淡水へのＰＶＣＲ調節因子の添加；および成魚前の溯上性魚の血清中でのＰＶＣＲ調節因子レベルの有意な増加に寄与するのに充分な量のＮａＣｌを含む、魚が消費する飼料の淡水への添加を含む。淡水に維持され、本発明の工程に供されない同じサイズかつ年の群の魚と比較して、塩類細胞におけるＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の増加および／または二次ラメラにおける塩類細胞の数の減少が生ずる。二次ラメラ（ＳＬ）と一次ラメラ（ＰＬ）の間の塩類細胞の分布の比は決定することができる。淡水に維持され、本発明の工程に供されていない魚と比較して、ＳＬ／ＰＬ 比は減少する。本発明の方法は、それで処理された魚は未だ淡水中に維持されているが、既に海水に移された魚が示す比とかなり近くまでＳＬ／ＰＬ 比を減少させる。ＳＬ／ＰＬ 比は約０．１ 〜約１．０ の間の範囲でありうる。
【０００９】
他の態様では、本発明は、成魚前の溯上性魚におけるＰＶＣＲ発現の量および／または局在を評価することによる、少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子に供され、かつ約１重量％〜約１０重量％の間のＮａＣｌを含む飼料を給与された成魚前の溯上性魚が海水への移行の準備が整っているか否かを決定する検出アッセイまたは検出方法を包含する。対照（例えば、ＰＶＣＲ調節因子に供されていない魚由来のＰＶＣＲ発現）と比較して、発現および／または感度の調節された（例えば、増加または減少した）レベルは、成魚前の溯上性魚が海水への移行の準備が整っていることを示す。好ましい態様では、該アッセイは、抗ＰＶＣＲ抗体とＰＶＣＲとの間で複合体を形成するのに充分な条件下に試料（例えば、鰓、皮膚、小腸、嗅覚ラメラ、膀胱、腎臓、脳または筋肉）と抗ＰＶＣＲ抗体を接触させること；および該複合体の形成を検出することを含む。他の態様では、該アッセイは、検出可能な標識を有する核酸配列を成魚前の溯上性魚から採取した試料のＰＶＣＲの核酸配列にハイブリダイズさせること、およびハイブリダイゼーションを検出することに関する。さらに他の態様では、組織におけるＰＶＣＲの検出はまた、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により達成されうる。この態様は、少なくとも１つのＰＶＣＲを有する組織由来のｍＲＮＡの逆転写；ＰＶＣＲ特異的プライマーを用いるＰＣＲ 反応によるＲＴ−ＰＣＲ産物の獲得；およびＰＶＣＲの存在または量の測定を含む。
【００１０】
さらに他の態様では、本発明は、種々の組成物および混合物に関する。特に、本発明は、約１０，０００ｍｇ／ｋｇ 〜約１００，０００ｍｇ／ｋｇの間（例えば、約１２，０００ｍｇ／ｋｇ ）のＮａＣｌ濃度を有する水生飼料組成物に関する。該水生飼料組成物は任意にＰＶＣＲ調節因子（例えば、約１ｇｍ／ｋｇ〜約１０ｇｍ／ｋｇ の間の量のトリプトファン）を含みうる。
【００１１】
本発明はまた、成魚前の溯上性魚の養殖を改善する環境を提供する水生混合物を具体化する。該混合物は少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を含む。かかる混合物の例は、淡水に添加された時、約２．０ｍＭ 〜約１０．０ｍＭの間の濃度となるカルシウム源、および、淡水に添加された時、約０．５ｍＭ 〜約１０．０ｍＭの間の濃度となるマグネシウム源である。
【００１２】
さらに他の態様では、本発明はキットに関する。特に、本発明は、本明細書に記載のように、淡水および水生飼料組成物に添加するためのＰＶＣＲ調節因子を含む、成魚前の溯上性魚の養殖を改善するためのキットを具体化する。他の態様では、本発明は、少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子および約１重量％〜約１０重量％の間のＮａＣｌを含む飼料に供された後に、成魚前の溯上性魚が海水への移行の準備が整っているか否かを決定するためのキットを含む。該キットは、抗ＰＶＣＲ抗体、および固体支持体；または水生ＰＶＣＲの核酸にハイブリダイズしうる、検出可能な標識を有する核酸配列のいずれかを含む。
【００１３】
驚くべくことに、ＰＶＣＲの発現調節および／または感受性変化は、成魚前の溯上性魚の海水へのより良い適応を可能にすることが発見されている。本発明が発見されるまで、水産養殖産業は、魚にストレス、死および／または疾患をもたらすことなく成魚前の溯上性魚を海水に移行させることはできなかった。この経験と異なり、本発明の工程を実施することにより、ＰＶＣＲの発現が調節され、および／またはその感受性が変化し、ストレス、死および／または疾患を最小限でまたはそれらなく、成魚前の溯上性魚を海水へ移行することができ、予想に反して、さらに本明細書に記載するように、成長増加やより高温の水への該魚の移動能力増加等のいくつかの利益が得られる。本発明は、成魚前の溯上性魚の海水への移行の際に１以上の以下の利益を生ずる：死亡率の低下；摂餌の改善；成長増加；罹患魚の量の減少；および／または浸透圧ショックの減少。本発明はまた、魚のより早い収穫を可能にし、年間を通して、魚生産の柔軟性を増加させる。さらに、本発明の方法は、魚孵化場の有意なコスト削減をもたらしうる。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、成魚前の溯上性魚の飼養改善方法および／または淡水から海水への移行のための成魚前の溯上性魚の調整方法に関する。本方法は、多価カチオン感受レセプター（ＰＶＣＲ）（例えば、少なくとも１つのＰＶＣＲ）の発現の調節および／または該レセプターの感度の変更を含む。本発明は、魚の、海水への適応能力、スモルト化を受ける能力、生存する能力、成長増加能力、飼料消費増加能力、および／または疾患に対する低感受性能力に影響するＰＶＣＲの発現の調節に関する。
【００１５】
特に、本発明の方法は、少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子の淡水への添加、および魚による消費のための、淡水への特別に作製された若しくは修飾された飼料の添加を含む。該飼料は、血清中のＰＶＣＲ調節因子のレベルを有意に増加させるのに充分な量の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む（例えば、約１重量％〜約１０重量％、または約１０，０００ｍｇ／ｋｇ 〜約１００，０００ｍｇ／ｋｇの間）。飼料中のＮａＣｌのこの量は、成魚前の溯上性魚により多くの淡水を飲ませるようにするか、または飲むのを誘導する。淡水はＰＶＣＲ調節因子を含んでおり、魚は多くの量の水を摂取するので、ＰＶＣＲ調節因子の血清レベルが魚で有意に増加し、ＰＶＣＲ発現の調節（例えば、増加および／または減少）および／またはＰＶＣＲ感受性の変化が生ずる。このプロセスは、成魚前の溯上性魚の海水への移行の準備を可能とし、その結果、一旦、該魚を海水へ移したならば、該魚は海水へよりよく適応しうる。
【００１６】
本発明の方法は、成魚前の溯上性魚を海水に適応させることに関する。溯上性魚とは、産卵するために海水から淡水へと泳ぐ魚である。溯上性魚としては、例えば、サケ〔例えば、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ ）、ギンザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｋｉｓｕｔｃｈ ）、シロザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｅｔａ ）、マスノスケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ）、カラフトマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｇｏｒｂｕｓｃｈａ）、ベニザケ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｎｅｒｋａ）〕、チャー〔例えば、アルプスイワナ（Ｓａｌｖｅｎｉｎｕｓ　ａｌｐｉｎｕｓ ）〕およびマス〔例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｍｙｋｉｓｓ）〕が挙げられる。溯上性魚としては、海水へ泳ぐことができないが（例えば、陸封されたもの）、海水へ適応する生理学的メカニズムを有する魚も含まれる。本明細書で使用される用語「成魚前の溯上性魚」とは、未だ海水に適応していない溯上性魚をいう。これらの魚は、一般に稚魚である。成魚前の溯上性魚としては、限定されるものではないが、小魚（ｆｉｎｇｅｒｌｉｎｇｓ ）、幼魚（ｐａｒｒ）またはスモルト（ｓｍｏｌｔｓ）である魚が挙げられる。本明細書で使用する「スモルト」とは、魚が海水へ適応可能となる、または海水への続く移行の際に生存可能となる生理学的変化を受けた魚である。用語「スモルト」とはまた、海水への移行の際に無傷で生存する、まさに発達段階にあるのではなく、むしろ、統計的サンプリングおよび評価に基づき、海水への移行の準備が整った生理学的段階にあると決定される魚集団の１つである魚をいう。
【００１７】
本発明は、海水への移行のためのスモルト化のプロセスを受ける成魚前の溯上性魚の調整方法を含む。スモルト化とは、魚が淡水から海水への順化または適応化を受ける段階である。スモルト化はまた、未だ淡水中にいるが、海水への生理学的前適応にある成魚前の溯上性魚に生じるプロセスをいう。スモルト化プロセスは、種ごとで異なる。異なった種の溯上性魚は、魚の一生の内に、異なる大きさ、体重および時間でスモルト化を受けうる。本発明は、広範な多数のまたは全ての成魚前の溯上性魚に、このプロセスを受けさせ、海水への移行の準備をさせる。
【００１８】
成魚前の溯上性魚は、ＰＶＣＲ調節因子を添加する前に淡水中に維持される。用語「淡水」とは、例えば、小川、川、池、公共の上水道から来る、または、例えば、以下のイオン組成（約２ｍＭ 未満のマグネシウム、カルシウムおよびＮａＣｌ）を有する他の非海洋源から来る水を意味する。用語「淡水」はまた、本明細書で記載のように、少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子が添加された淡水をいう。
【００１９】
ＰＶＣＲ調節因子は、ＰＶＣＲの発現を調節するのに、またはＰＶＣＲの感度を変化させるのに充分な量で淡水に添加される。ＰＶＣＲは、実施例９に記載のように、分子生物学的手法を用いて、数種の溯上性魚の様々な組織から単離された。ＤＮＡ が、タイセイヨウサケ、チャー、シロザケ、ギンザケ、マスノスケ（Ｋｉｎｇ ｏｒ Ｃｈｉｎｏｏｋ ｓａｌｍｏｎ）、カラフトマス、ベニザケおよびマスを含む様々な種の溯上性魚由来の試料から単離された。ＰＶＣＲの組織での発現をＲＴ−ＰＣＲにより示す実施例２０を参照のこと。ＤＮＡ は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）法を用いて増幅された。実施例９に記載のようにして、増幅したＤＮＡ を精製し、ベクターにサブクローニングし、それらの配列を決定した。
【００２０】
成魚前の溯上性魚の様々な組織（例えば、鰓、皮膚、嗅覚ラメラ、小腸、腎臓、膀胱、脳または筋肉）にあるＰＶＣＲは、例えば、周囲の水中で、魚の血清中で、或いは、腎臓、膀胱、または小腸等の体内の細管の管腔内容物（ｌｕｍｉｎａｌ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）中で、種々のイオン（例えば、二価カチオン）を含むＰＶＣＲ調節因子における変化を感受する。これらの調節因子を感受するその能力はＰＶＣＲの発現を増加させ、および／または減少させ、それにより、魚が海水へよりよく適応可能となる。ＰＶＣＲの増加したおよび／または減少した発現は、例えば、１以上の組織でまたは全組織で生じうる。
【００２１】
「ＰＶＣＲ調節因子」は、ＰＶＣＲの発現を調節する（例えば、増加させるおよび／または減少させる）か、或いはＰＶＣＲの感受性または反応性を変化させる化合物を意味すると本明細書において定義されている。かかる化合物としては、限定されるものではないが、ＰＶＣＲアゴニスト（例えば、無機ポリカチオン、有機ポリカチオンおよびアミノ酸）、２型カルシウム受容体作動薬（ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔｉｃｓ ）、およびＰＶＣＲ発現を間接的に変化させる化合物　（例えば、約３，０００ 〜１０，０００国際単位／ｋｇ 飼料の濃度の１，２５ジヒドロキシビタミンＤ）、インターロイキンベータ等のサイトカイン、並びにマクロファージ走化性ペプチド−１（ＭＣＰ−１ ））が挙げられる。ＰＶＣＲの発現および／または感受性を増加させるおよび／または減少させる２型カルシミメティクスの例は、例えば、ＮＰＳ ファーマシューティカル　インコーポレイテッド（ソルトレイク、ユタ州、特許番号第５，９６２，３１４ 号；第５，７６３，５６９ 号；第５，８５８，６８４ 号；第５，９８１，５９９ 号；第６，００１，８８４ 号）製のＮＰＳ−Ｒ−４６７ およびＮＰＳ−Ｒ−５６８ である。それらは、飼料または水中、約０．１ μＭ 〜約１００ μＭ の間の濃度で投与されうる。ネメース（Ｎｅｍｅｔｈ）， Ｅ． Ｆ． ら、ＰＮＡＳ ９５： ４０４０−４０４５ （１９９８） 参照。無機ポリカチオンの例としては、約２０〜約１０．０ｍＭの間の濃度のカルシウムおよび約０．５ 〜約１０．０ｍＭの間の濃度のマグネシウムを含む二価カチオン；および限定されるものではないが、約１〜約５００ μＭ の間の濃度のガドリニウム（ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍｕ ）（Ｇｄ３＋）を含む三価カチオンである。有機ポリカチオンとしては、限定されるものではないが、約１ 〜約８ｇｍ／ｋｇ飼料の間の濃度のネオマイシンまたはゲンタマイシン等のアミノ糖類、並びにポリアミン類（例えば、飼料中、約１０μＭ 〜１０ｍＭの間の濃度の、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、スペルミン、カダベリン、プトレシン、ポリアルギン／ヒスチジンの共重合体、ポリリジン／アルギニン）を含む有機ポリカチオンが挙げられる。ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）， Ｅ． Ｍ． ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８：３０４７−３０５４ （１９９１）；クイン（Ｑｕｉｎｎ）， Ｓ． Ｊ． ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７３：Ｃ１３１５−１３２３ （１９９７） を参照。さらに、ＰＶＣＲアゴニストとしては、約１〜約１０ｇｍ／ｋｇ 飼料の間の濃度の、Ｌ−トリプトファン　Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、およびＬ−システイン等のアミノ酸が挙げられる。コニグレーブ（Ｃｏｎｉｇｒａｖｅ）， Ａ． Ｄ． ら、 ＰＮＡＳ ９７：４８１４−４８１９ （２０００） 参照。１つの態様では、アミノ酸はまた、低レベル　（例えば、約１ｍＭ 〜約１０ｍＭの間）の細胞外カルシウムの存在下に少なくとも１つの���ＶＣＲにより感受されうるアミノ酸と定義される。細胞外カルシウムの存在下、小腸、幽門盲腸、または腎臓等の器官または組織でのＰＶＣＲはよりよくアミノ酸を感受しうる。実施例２２参照。モル濃度とは、淡水中のＰＶＣＲ調節因子の遊離のまたはイオン化物の濃度をいい、結合したＰＶＣＲ調節因子（例えば、ガラス、タンパク質、またはプラスチック表面等の負に帯電した粒子に結合したＰＶＣＲ調節因子）の量は含まない。これらの調節因子の任意の組み合わせが、かかる組み合わせによりＰＶＣＲの発現および／または感度を調節する限り、（本明細書に記載のように、ＮａＣｌと共に）水にまたは飼料に添加されうる。
【００２２】
ＰＶＣＲ調節因子は、多くの方法で魚に投与することができる。本発明は、ＰＶＣＲの発現を調節するのに、および／またはＰＶＣＲの感受性を変化させるのに充分なあらゆる方法でのＰＶＣＲの投与を包含する。１つの態様では、ＰＶＣＲ調節因子は、本明細書に記載のように、様々な濃度で淡水に単純に添加される。少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を含む淡水環境は本明細書において「ＰＶＣＲ調節因子環境」という。水に添加されるＰＶＣＲ調節因子は、魚の皮膚および鰓上のＰＶＣＲの発現を調節および／またはＰＶＣＲの感受性を変化させ、特に、魚が約１％〜約１０％の間のＮａＣｌ（例えば、約１０，０００ｍｇ／ｋｇ 飼料〜約１００，０００ ｍｇ／ｋｇ 飼料の間の濃度）を含む飼料を給与された場合、該魚により摂取されうる。飼料にＮａＣｌを添加するのに加え、ＰＶＣＲ調節因子（例えば、トリプトファン等のアミノ酸）も飼料に添加することができる。飼料に添加されるＰＶＣＲ調節因子の量およびタイプも本明細書に記載されている。他の態様には、魚を調節因子、例えば、有機ポリカチオン類中に「浸漬」することにより、魚をＰＶＣＲ調節因子に供することが含まれる。有機ポリカチオン類は、ＰＶＣＲの発現を調節するのに充分な量で魚の皮膚および鰓に接着可能となるような方法で処方されうる。
【００２３】
１つの好ましい態様では、本発明は、２つのＰＶＣＲアゴニストの組み合わせを淡水に添加することにより実施される。特に、カルシウムとマグネシウムを淡水に添加し、各々の濃度を、カルシウム約２．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間およびマグネシウム約０．５ｍＭ 〜約１０．０ｍＭの間とする。水にカルシウムとマグネシウムを添加することに加え、これらのイオン濃度の範囲は、魚に対し淡海水（例えば、希釈した海水）環境を提供することにより達成されうる。
【００２４】
カルシウムとマグネシウムは種々の供給源から得られ、水に添加される場合、カルシウムおよび／またはマグネシウムのレベルは、ＰＶＣＲの発現を調節し、および／または前記範囲内にある。カルシウムとマグネシウムの供給源は種々の化合物の混合物でありえ、または各々は実質的に均一若しくは純粋な化合物に由来しうる。カルシウムの供給源としては、例えば、Ｃａ（ＣＯ３）２、ＣａＣｌ２ 、ＣａＳＯ４ 、およびＣａ（ＯＨ）２ が挙げられ、マグネシウムの供給源としては、例えば、ＭｇＣｌ２ 、ＭｇＳＯ４ 、ＭｇＢｒ２ 、およびＭｇＣＯ３ が挙げられる。
【００２５】
１つの態様では、本発明は、ＮａＣｌ食の間の、少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を含む海水への非連続的（例えば、中断した）並びに連続的（例えば、中断のない）曝露を含む。ＰＶＣＲへの非連続的曝露は、ＰＶＣＲ発現および／またはＰＶＣＲの変化した感受性が調節（例えば、種々の組織における増加および／または減少）されたままである限り、生じうる。少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を含む淡水中での連続的維持または該淡水への連続的曝露を実施例２および７に示す。
【００２６】
本発明のプロセスは、淡水から海水への移行のための魚の準備を整える。成魚前の溯上性魚は、ＰＶＣＲの発現を調節するのに、および／またはＰＶＣＲの感受性を変化させるのに充分に長く、ＰＶＣＲ調節因子を含む淡水環境中に維持される。時間の長さは、魚の生理学的および身体的成熟度に依存する。魚の中には、より容易に環境に適応し、それらのＰＶＣＲの発現を調節し、および／またはＰＶＣＲの感度を変化させるものがあるであろう一方、そうするのにもっと時間を要するものもあろう。ＰＶＣＲの発現を調節し、および／またはＰＶＣＲの感度を変化させるのに必要な時間の長さに影響を与えうる因子としては、限定されるものではないが、あるとすれば、ＰＶＣＲ調節因子の淡水への添加前における魚の大きさ、ＰＶＣＲ発現または感度のレベル、ＰＶＣＲ調節因子およびイオンを排出する魚の能力、魚の体積に対する表面の比などが挙げられる。それゆえ、魚が維持される時間の長さは、約７日から数カ月の範囲（例えば、７、１４、２１、３０、４５、９０および１２０ 日）でありうる。魚はまた、ＰＶＣＲ調節因子を含む淡水中に維持され、ＮａＣｌ食が給与される限り、無期限に維持されうる。例えば、１０ｇｍ未満の体重のサケ、マスまたはチャーは、海水への移行前に、少なくとも約１８０ 日間、ＰＶＣＲ調節因子を含む淡水中に維持され、ＮａＣｌ食を給与されうる。
【００２７】
本発明は、さらに飼料を淡水に添加することを含む。魚が給与される飼料の頻度および量は先行技術に教示される。一般に、魚は１日に１〜３回、合計で約０．２５〜５０％体重／日が給餌される。飼料は、成魚前の溯上性魚の血清中でのＰＶＣＲ調節因子のレベルの有意な増加に寄与するのに充分なＮａＣｌを含む。より具体的には、ＮａＣｌは少なくとも２つの効果を有する。最初のものは、充分な量のＮａＣｌが飼料中に存在する場合に生ずる。飼料中のＮａＣｌの存在は、成魚前の溯上性魚に周囲の環境から多くの水を飲ませるようにする。第２のものは、ＮａＣｌは直接的な負のＰＶＣＲ調節因子であり、ＰＶＣＲ感度を減少するように働く。感受性を減少するＮａＣｌの効果にもかかわらず、魚がＮａＣｌ食を給与され、周囲の淡水環境がその中に少なくとも１つのＰＶＣＲ調節因子を含む場合、驚くべきことに、特定の組織においてＰＶＣＲ発現が増加する。ＰＶＣＲ調節因子を含む淡水の摂取の増加は、ＰＶＣＲ調節因子の血清レベルの全体的な増加を引き起こす。
【００２８】
本発明はまた、水生飼料組成物に関する。１つの態様では、飼料は、溯上性魚の血清中でのＰＶＣＲ調節因子のレベルを有意に増加させるのに寄与するのに充分な薬剤を含む。かかる薬剤は本明細書に記載の本発明の方法において使用されうる。魚の血清中のＰＶＣＲ調節因子のレベルを有意に増加させる薬剤の一例はＮａＣｌである。飼料は、ＮａＣｌを約１重量％〜１０重量％の間で、または約１０，０００ｍｇＮａＣｌ／ｋｇ 飼料〜約１００，０００ ｍｇＮａＣｌ／ｋｇ 飼料（例えば、１２，０００ｍｇ／ｋｇ ）の間で含む。かかる飼料は、本明細書で「ＮａＣｌ食」という。ＮａＣｌを、ＰＶＣＲ発現の増加、ＰＶＣＲ感度の変化および／または魚の飲量の増加誘導の所望の効果が得られるように、他のナトリウム塩と組み合わせるかまたは置換しうる。それゆえ、本明細書で使用される、用語ＮａＣｌは、実質的に純粋な化合物、ＮａＣｌとナトリウムの他の供給源との混合物およびナトリウムの他の供給源の混合物を含む。飼料は、さらにＰＶＣＲ調節因子、特にアミノ酸等のＰＶＣＲアゴニストを含みうる。１つの態様では、飼料は約１重量％〜約１０重量％の間のＮａＣｌおよび約１〜約１０ｇｍ／ｋｇ の間の量のトリプトファン等のアミノ酸を含む。上記するように、飼料を構成する、本発明の特有の成分に加え、飼料は、さらに、例えば、栄養および／または嗜好性のために伝統的に飼料に添加される成分を含みうる。例えば、飼料は、カレイ若しくはイカ肉、または魚油等の魚成分を含みうる。
【００２９】
飼料は、適切な濃度のＮａＣｌが存在する限り、多くの方法で調製されうる。飼料は、例えば、飼料を再処方することにより、または飼料によるＮａＣｌを含む溶液の吸収を可能にし、任意にＰＶＣＲ調節因子を添加することにより、調製されうる。嗜好性のため追肥を添加することができる。実施例８には飼料を調製する１つの方法が詳細に記載されている。
【００３０】
本発明の他の態様は、約２０〜約１０．０ｍＭの間のカルシウム、および約０．５ｍＭ 〜約１０．０ｍＭの間のマグネシウムを含む淡水環境に成魚前の溯上性魚が維持される際に、該魚に１重量％〜１０重量％の間のＮａＣｌを含む飼料を給与することを含む。本発明のこの態様が実施される場合、約１％〜６０％、約１％〜４０％、および約１％〜１５％の間のそれぞれの淡水中に維持された同様の対の魚と比べて、成魚前の溯上性魚の血清中のカルシウム、マグネシウムおよび／またはナトリウムのレベルが増加する。
【００３１】
他の態様では、魚はまた、ＰＶＣＲ調節因子を含む淡水中にいる間、光周期（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ）に曝露される。光周期とは、魚を光（例えば、太陽光、白熱光または蛍光光）に曝露することをいう。好ましくは、光周期は、実質的に連続的であり、成長が増大するのに、スモルト化が誘導されるのに、および／または死亡率が減少するのに充分に長く行われる。魚は、淡水中で、本発明の工程を受けながら（例えば、ＰＶＣＲ調節因子環境中、ＮａＣｌ食を給与されながら）、並びにこの環境に曝露され、次いで海水に移行された後、連続的な光周期に曝露されうる。光周期は、２４時間内で少なくとも約１２時間、または約１４、１６、１８、２０、２２、または好ましくは約２４時間等のより長い期間、行われうる。魚が光周期に曝露される日数は約１日〜数カ月（例えば、１、３、７、１４、２１、３０、４５、９０および１２０ 日）の範囲でありうる。好ましくは、魚がＰＶＣＲ調節因子環境に維持され、ＮａＣｌ食を給与されている間の光周期は、好ましくは約４日〜約５０日の間である。魚はまた、ＰＶＣＲ調節因子を含む淡水中に維持され、ＮａＣｌ食を給与される限り、無期限に維持されうる。海水へ移行後、光周期曝露は、好ましくは約７日〜約４５日の間である。ＰＶＣＲは、松果体の茎を含む種々の組織で調節されうる。魚を光周期に曝露する方法は当技術分野で公知であり、例えば、ウィロービー（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ）， Ｓ．， Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｉｄ Ｆａｒｍｉｎｇ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ，　１０６， および１５２−１５４ （１９９９）に記載されている。
【００３２】
魚はまた、海水へ移行後、光周期に曝露されうる。光周期への魚の曝露の影響は、実施例１０および表１３に記載されている。光周期への曝露の利点としては、海水への移行後における魚の死亡率の劇的な減少が挙げられる。従って、１つの態様では、魚を連続的な光周期に維持することは、海水へのそれらの適応の際のそれらの生存率を増加させる。
【００３３】
本発明の工程に曝露した後、成魚前の溯上性魚は海水へ移行される。用語「海水」とは、海由来の水、または海由来の水の化学組成およびミネラル組成を擬態するように処方された水を意味する。調製された海水の主要な元素組成は、好ましくは、天然の海水（例えば、以下のイオン組成を有する：３０ｍＭを超えるマグネシウム、約６ｍＭ を超えるカルシウム、および約３００ｍＭ を超えるＮａＣｌ）の主要な元素組成の範囲内に実質的に入る。人工海水の調製方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，３５１，６５１ 号明細書に記載されている。
【００３４】
成魚前の溯上性魚に対し本発明の方法を実施する場合、魚は、本発明に供されていない成魚前の溯上性魚と比べて、成長（例えば、ＳＧＲ ）、消化管の運動性および／または飼料消費の有意な増加を示す。本発明は、海水移行の前、海水移行の際、および海水移行の後における、成長、消化管運動性および／または飼料消費の増大を可能にする。海水への移行の際、本発明の工程に供されていない魚は一般に、浸透圧ストレス、飼料消費の減少若しくは飼料の無消費、および死さえも経験する。浸透圧ストレスは、周囲の環境と魚の体内区画との間の浸透圧の差から生ずる。これは、魚の恒常的平衡を乱し、成長の減少、生殖不良および死への耐性の減少を生ずる。本発明の工程に供された魚は、有意な量の浸透圧ストレスを経験することなく、海水への移行時または移行後直ぐに摂餌を開始する。その結果、魚はまた、より急速に成長し、より早く市場サイズに達する。１つの態様では、ＡＰＳ プロセスＩ に供された魚は、海水への移行から２０日後に摂餌を開始した対照の魚（例えば、ＡＰＳ プロセスＩ に供されていない魚）と比べて、海水への移行後４８時間以内に活発に摂餌を開始した。これらの魚は、ＡＰＳ プロセスＩ に供されていない魚よりも７ヵ月早く市場サイズに達すると予測される。実施例１５を参照のこと。特に、約１％〜約１０％の間のＮａＣｌ、および飼料１ｋｇ 当たり約１ｇｍ 〜約１０ｇｍの間のアミノ酸を含む飼料を摂取した成魚前の溯上性魚は、海水への移行後、成長の実質的な増加を示す。実験において、本発明の工程に供された魚は、本発明の工程を経ることなく、海水へ移行された同様の対の魚と比べて、同じ時間間隔において約６５％程度の成長の増加を示した。実施例２の表４参照。他の実験では、ＡＰＳ プロセスＩ に供された魚は、対照の魚が海水中でさらに６４日間維持され、海水移行時に２５％大きかったとしても、海水への移行後、対照の魚とおよそ同じ大きさであった。実施例１５参照。成長の顕著な増加はＡＰＳ プロセスＩＩでも見られた。１つの特定の実験では、ＡＰＳ プロセスＩＩで処理された魚では、対照の魚と比べて、ある１５７ 日の間隔の間に９倍（１５．２ｇｍから１４２．５ｇｍ ）を超える急速な体重の増加、成長の有意な増加があった。実施例１２参照。さらに、本発明は、種々の大きさの魚の成長の増加を可能にする。成長の増加は、小型の魚（例えば、約１５ｇｍ）、中型の魚（例えば、４０ｇｍ）並びに大型の魚（例えば、９０〜１２０ｇｍ ）において見られる。実施例１２および１４参照。従って、本発明は、約１５ｇｍ〜約１２０ｇｍ の範囲の体重を有する成魚前の溯上性魚の成長の増加方法に関する。ＰＶＣＲの発現および／または感度を、例えば、鰓組織の塩類細胞中で、または胃腸管〔例えば、胃、幽門盲腸（ｐｙｌｏｒｉｃ ｃａｅｃａ ）、近位若しくは遠位小腸〕、腎臓の管、皮膚または膀胱中の上皮細胞中で調節することができる。
【００３５】
また、ある群における浸透圧ストレスを受けた魚の低いまたは乏しい摂餌の排除は、全群における全体的な飼料変換率を改善する。処理した魚の群の全メンバーによる海水移行後の最適な摂餌および成長は、より良い飼料の利用を可能とし、魚が市場サイズに達する場合の全体的な生産収量を改善する。
【００３６】
従って、本発明は、海水へ移行される成魚前の溯上性魚についてのＦＣＲ を改善する方法を含む。飼料変換率、すなわちＦＣＲ は、ある群の魚で増加した体重でこれらの群の魚に給与した飼料の量を割ることにより得られる。魚による体重成長への飼料の変換が効率的であればあるほど、ＦＣＲ は小さくなる（少量の飼料／魚の大きな体重増加）。非常に小さいＦＣＲ 数（１未満）は、体重増大への飼料の高効率の変換を包含し、それは、産業が努力していることである。対照的に、大きなＦＣＲ は、体重増大への飼料の不充分な変換を意味し、それは一般に望まれていない。大きな若しくは乏しいＦＣＲ は、望ましくない。というのは、飼料は通常高価であり、所定の体重まで魚を成長させるのにより多く使用しなければならないためである。本発明の方法に供された魚のＦＣＲ 値は一般に、いくつかの例において（例えば、魚が乾燥飼料を給与された場合）、ほとんどの産業が公表している値よりも小さく、望ましい。というのは、本発明は、飼料を食べるが成長しないので、全体的なＦＣＲ が増加する傾向にある、浸透圧ダメージを受けた魚の存在を排除するためである。結果として、魚を本発明の方法に供することにより、１つの態様において、ＦＣＲ は減少し、それによりほとんど全ての魚の最適な摂餌および成長が可能となる。本発明に供された魚のＦＣＲ は、大多数の魚の成長および摂餌を維持するのに充分であるか、または、好ましくは、大多数の魚の成長および飼料消費を増加するのに充分である。魚が本発明の方法に供された場合、それらは、例えば、約０．７ 〜約７．０ の値を含むであろうＦＣＲ の範囲を示す。特に、飼料消費または飼料摂取が改善される。というのは、魚が嗅覚ラメラまたは嗅球の細胞においてＰＶＣＲにより飼料の「匂いをかぎ」または該飼料を「感受する」と考えられるからである。
【００３７】
同様に、本発明は、成魚前の溯上性魚の世代間の時間の減少または低減を可能にする。これらの魚は、より早く繁殖を開始する。というのは、本発明は、本明細書に記載されるように、それらの成長を増加するためである。性的に成熟した魚を得るために２〜３年が必要であるので、特性の選択的な繁殖に取り組もうとする試みには、所定の特性が選択され得、魚がその特性の繁殖を示す前にこの２〜３年の間隔を要する。成長、および本発明により生産される成熟体に達する時間の改善は、魚が性的な成熟に達するのに必要な時間間隔を、約６ヵ月〜約１２ヵ月だけ低減する。繁殖の間隔の低減は、多くの魚の生産を可能とし、海水へのより良い適応が可能である特性以外の特性を有する魚の選抜（例えば、改善された味、増加した肉の厚さ、増加したα３オメガ脂肪酸含量を有する魚、またはＰＶＣＲ発現をより容易に調節することができる魚の選抜）を改善可能である。
【００３８】
本発明以前、淡水から海水へ移行される溯上性魚は一般に、「臨界サイズ（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｉｚｅ ）」と呼ばれる特定の大きさで移行される。臨界サイズは種ごとで変化するが、一般に、魚が海水へ移行されうる最小の大きさをいう。サケ、マスおよびチャーの臨界サイズは、それぞれ、約５０〜約１００ｇｍ の間、約７０〜約１２０ｇｍ の間、および１００ｇｍ を超える。ギンザケ、マスノスケおよびベニザケの臨界サイズは、それぞれ、約１０〜約１５ｇｍの間、約２０〜約４０ｇｍの間、および約１〜約２ｇｍ の間である。シロザケおよびカラフトマスはそれぞれ、約３ｇｍ 未満の臨界サイズを有する。
【００３９】
本発明以前、平均臨界サイズに達した成魚前の溯上性魚の集団が海水へ移行された。生理学的に移動の準備が整った魚がいる一方、準備が整っていない魚もいる。これは、海水への移行の際の死亡率の増加の理由の１つである。本発明の方法は、ＰＶＣＲ発現および／または感度を調節することにより、および／またはスモルト化を誘導することにより、全ての若しくはほとんど全ての、海水へ移行される魚を生理学的に調整する。約８０を超える（例えば、９０％、９５％、１００ ％）ものがスモルト化を経て、海水への移動の準備を整える。実際、１つの実験では、タイセイヨウサケに対して本発明の工程を実施する場合（例えば、魚をＰＶＣＲ調節因子環境およびＮａＣｌ食に供する）、１００ ％に近いタイセイヨウサケがスモルト化を受けた。実施例２参照。それゆえ、本発明の方法は、海水への移行への成魚前の溯上性魚を調整する方法、並びに成魚前の溯上性魚においてスモルト化を誘導する方法を含む。
【００４０】
本発明の方法は、成魚前の溯上性魚におけるＰＶＣＲの発現および／または感度を調節するので、魚は、海水へ移行された場合により良く生存する。浸透圧ストレスの低減は、死亡率の低減を生ずる。１つの例では、本発明の方法を経ていない成魚前の溯上性魚の特定の集団は海水への移行後に１００ ％の死亡率を示す（図９、実施例２参照）一方、本発明の方法を経ていない成魚前の溯上性魚の他の集団は約４０％〜７０％の間のみの生存率（例えば、約５０％）を有する。表Ｉ、実施例２参照。これは、魚が、淡水とは非常に異なるイオン組成を有する海水へ移行された場合に、浸透圧ショックを経験するために生ずる。しかしながら、本発明の方法に供された場合、魚は、未調整の魚の生存率よりも有意に高い生存率を示す（例えば、約８０〜約１００ ％の間）。実際、本発明をタイセイヨウサケに実施した場合、１つの実験で本発明の工程を経ていない魚では５０％が生存したのと比べて、９９％の魚が海水への移行から５日後に生存した。実施例２の表Ｉ参照。それゆえ、本発明は、成魚前の溯上性魚が海水へ移行された後の死亡率の低減方法を具体化する。
【００４１】
本発明は、海水への移行後の死亡率の低減に有効であるだけでなく、本発明は、移行前の淡水における生存率の増加にも使用される。本発明の発見前、「スモルトウインドウ」は、孵化場が海水へ成魚前の溯上性魚を移行させるか、若しくは、魚がスモルト化を経た後に淡水中で維持され続けるならば、魚が死亡したことを表した。本発明のＰＶＣＲ調節因子環境およびＮａＣｌ食は、魚が無期限に成長し続けるのを可能にする。魚は、飼料を消費し、成長し続ける。従って、本発明の方法は、魚が海水へ移行され得る期間またはウインドウを有意に増加させるか、或いはそれを全く排除する。本発明がタイセイヨウサケに実施された場合、９９％の魚が生存し、淡水中で少なくとも４５日間成長し、それにより、少なくとも約４５日まで（例えば、１〜４５日）スモルトウインドウが増加した。対照的に、本発明の工程を経ていない魚では、ほんの６７％が、１つの実験で、淡水中で４５日後に生存した。実施例２参照。さらに、これらの魚が海水へ移行された後、それらは、さらに本明細書に記載、特に実施例１５に記載するように、ＡＰＳ プロセスＩ またはＩＩのいずれも経ていない魚と比べて、より多く飼料を消費し、より良く成長する。
【００４２】
本発明はまた、特定の種の魚について産業で認められる臨界サイズと比べて、より小さな体重を有する成魚前の溯上性魚を海水へ移行させる方法を含む。本明細書に記載されるように、本発明の方法は、通常通りに海水へ移行された魚、またはスモルト化を経た若しくは経ようとしている魚よりも小さな魚においてＰＶＣＲ発現を調節する。これらの方法は、スモルトになる前の稚魚の段階にある幼魚を海水へ移行する工程を含む。幼魚は、稚魚または卵黄嚢稚魚の成熟後に生ずる成魚前の溯上性魚の生活段階である。幼魚または小魚は、それらの脇腹に沿って特徴的なオビッドストライプ（ｏｖｉｄ ｓｔｒｉｐｅｓ）または幼魚マークを表示し、通常、スモルト化前に淡水中で成長および発達を受ける。用語「幼魚」は当技術分野で公知の語である。卵黄嚢稚魚（ｙｏｌｋ ｓａｃ ｆｒｙ）に給餌し続けると、それらはより大きな幼魚に成長する。幼魚は、それらが成長した条件に依存して幅広い体重の範囲を有しうる。幼魚の体重は、種ごとで変わる。幼魚の体重は約０．５ｇｍ 〜約７．０ ｇｍの範囲で有意に変化する。本明細書に記載するように、１つの実験での本発明の実施により、臨界サイズ体重（約７０〜約１００ｇｍ の間）の約１３％〜約１８．５％の間、すなわち、約１３ｇｍ程度の体重を有するタイセイヨウサケ幼魚の移行に至った。ＮａＣｌ食に加え、ＰＶＣＲ調節因子（例えば、トリプトファン等のアミノ酸）を飼料に添加することで、特に低い体重を有する魚の海水への移行が可能となる。実施例２参照。１つの態様では、ＡＰＳ プロセスＩＩに供されたサケは１５グラム程度の体重で海水へ移行させられ得た。少なくとも１５グラムの体重のサケは、急速な成長を経験し、効率的に飼料を利用し、ＡＰＳ プロセスＩＩに曝されず、４倍を超える体重のサケよりも少ない死を被った。実施例１２参照。従って、本発明は、海水への移行のために、海水への移行時に約１５グラム〜約１２０ グラムの間の体重の溯上性魚を調製する方法を包含する。
【００４３】
本発明は、さらに、過去において魚が移行させられた水温（６゜〜１４℃）に比べて、暖かい温度（例えば、１４℃および１９℃）を有する海水へ成魚前の溯上性魚を移行する方法を提供する。魚は、本発明の方法を用いて海水へ移行された場合、低減された若しくはほとんどない浸透圧ストレスを経験するので、魚は、死亡率の増加を示すことなく、より高い水温への移行に耐えうる。実施例２参照。
【００４４】
本発明の方法はまた、スモルトおよび成長したサケの中での疾患の発生を減少させる。本発明の方法により処理されたスモルトは海水への移行の際に少ないストレスを経験するので、それらの免疫機能はより強く、それらは、寄生性、ウイルス性、細菌性および真菌性の疾患に対し感受性が低い。本明細書に記載の方法により処理されていない魚は、かかる疾患に対し感受性がより高く、健常な魚を感染しうる疾患の保有魚として機能しうる。
【００４５】
本発明の他の態様は、成魚前の溯上性魚の種々の組織における塩類細胞の分布を修飾することを含む。かかる組織の１例は鰓組織である。しかしながら、魚がＡＰＳ プロセスＩＩに供された多数の実験では、処理された魚が淡水中に維持されているにもかかわらず、海水に移行させた魚が示すパターンに類似する、二次ラメラ中の塩類細胞の数の有意な低減が存在するように、鰓中の塩類細胞の分布がシフトした。淡水中に維持され、本発明の工程に供されていない魚では、塩類細胞は、鰓組織の一次ラメラおよび二次ラメラの両方中でおよそ等しい数で局在する。対照的に、かかる魚が海水へ移行された場合、分布は、二次ラメラで観察される塩類細胞が有意に少ないように変化する。実施例２１参照。従って、本発明の方法は、魚を本明細書に記載の方法に供することにより、一次ラメラ中の塩類細胞の数を増加すること、および二次ラメラ中の塩類細胞の数を低減することを含む。塩類細胞の局在化は、当技術分野で公知の方法を用いて実施可能である。塩類細胞は、免疫細胞化学を用いて局在化されえ、並びに酵素的アッセイを用いて測定されうる、豊富な量のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼを含む。塩類細胞を局在化する１つの方法は、鰓の切片（例えば、パラフィン切片）を得て、抗ナトリウムカリウム（Ｎａ＋Ｋ＋ ）ＡＴＰ アーゼ抗体（マウスモノクローナルα５ 抗Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ抗体）で切片を染色することである。Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性は、塩類細胞中に見られ、塩類細胞のマーカーとして使用されうる。抗体は標識されえ、または標識され、抗Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ抗体に結合しうる二次抗体を用いて塩類細胞を染色し、観察しうる。セイデリン（Ｓｅｉｄｅｌｉｎ）ら、 Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｚｏｏｌ． ７３（４）：４４６−５３ （２０００）参照。
【００４６】
一次ラメラ（ＰＬ）および二次ラメラ（ＳＬ）中の塩類細胞の分布は、比を用いて決定することができる。ＰＬ中の塩類細胞の数に対するＳＬ中の塩類細胞の数の比（ＳＬ／ＰＬ ）が決定される。淡水中に維持され、本発明の方法に供されていない成魚前の溯上性魚では、ＳＬ／ＰＬ 比は当技術分野で公知であり、一般に約０．６ 〜約１．８ の間である。１つの実験で、本発明の方法に供され、淡水中に維持された魚は、ＳＬ／ＰＬ 比の減少を示す。かかる比は一般に、約０．１ 〜約１．０ の間であり、それは、海水へ移行された魚に見られるのに近い比（例えば、約０〜約０．１８の間の比）である。実施例２１参照。それゆえ、本発明の方法は、魚を本明細書に記載の方法（例えば、ＡＰＳ プロセスＩ またはＩＩ）に供することによる、淡水中に維持された成魚前の溯上性魚のＳＬ／ＰＬ 比の減少を含む。
【００４７】
同様に、本発明は、塩類細胞中のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の増加方法に関する。魚の鰓薄膜上に存在する塩類細胞と呼ばれる特定の上皮細胞は、淡水および海水の両方で魚が生存するのに重要であることが一般的に認識されている。淡水に適応した魚では、魚がその正常な体のイオン組成を維持できるように、鰓塩類細胞が、周囲の淡水中で希釈濃度で存在しているＮａ＋ イオンとＣｌ− イオンを魚の体液中に供給する。対照的に、同じ魚を海水に移すと、高浸透性の海水を飲んだ結果、魚の体液中に蓄積された過剰なＮａ＋ およびＣｌ− を除去できるように、鰓塩類細胞がその構造や機能を改める。塩類細胞は、このように豊富なＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼタンパク質を含み、この酵素の存在および活性の両方が塩類細胞の同定用マーカーおよびその作用の指標として使用され得る。本発明の方法（たとえば、ＡＰＳ プロセスＩ またはＩＩ）に供される魚は、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼタンパク質の発現および／または活性の増大を示す。一つの実施例において、鰓組織に見られる塩類細胞のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の有意な増大は、淡水中で維持され、かつＡＰＳ プロセスＩＩに供されない魚に比べてＡＰＳ プロセスＩＩに供された魚に見られた。実施例２１を参照のこと。
【００４８】
Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性は、酵素的方法を用いて測定することができ、このことは本明細書においてさらに記載される。塩類細胞を含有する組織（たとえば、鰓または幽門盲腸（ｐｙｌｏｒｉｃ ｃａｅｃａ）） のホモジェネートを得、これをＡＴＰ 加水分解を測定する酵素的アッセイに供する。Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性は、ウアバインを用いるまたは用いないＡＴＰ 加水分解における差から計算することができ、ウェル中のタンパク質含量について正規化され得る。このタンパク質は、たとえば、クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）系バイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ） を用いるプレートリーダーで分析することができる。実施例２１は、さらに詳細に、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性を測定するプロトコルを記載する。Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼおよび／または局在化している塩類細胞を定量する方法（これは当該分野で公知であるか将来開発されるものである）が使用され得る。Ｓｅｉｄｅｌｉｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｚｏｏｌ． ７３（４）：４４６−５３ （２０００） およびＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｃａｎ． Ｊ． Ｆｉｓｈ Ａｑｕａｔ． Ｓｃｉ． ５０， ６５６−６５８（１９９３） を参照のこと。
【００４９】
ＰＶＣＲの評価方法
本発明は、魚が淡水から海水へ移動する準備があるかどうかを決定するためにＰＶＣＲのレベルを検出する方法を含む。ＰＶＣＲレベルの測定方法は、いくつかの適当なアッセイを含む。適当なアッセイは、ＦＡＣＳ分析、放射免疫アッセイ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ ）および化学発光アッセイなどの免疫学的方法を含む。現在公知のまたは最近開発された任意の方法は、ＰＶＣＲ発現を測定するために使用され得る。
【００５０】
ＰＶＣＲまたはその一部と反応する抗体が使用され得る。好ましい態様において、抗体は、ＰＶＣＲまたはその一部と特異的に結合する。この抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびそれらの機能性断片を包含すると意図される。ポリクローナルおよびモノクローナルという用語は、抗体調製物の均等性の程度をいい、特定の製造方法に限定することを意図しない。
【００５１】
いくつかの好ましい態様において、免疫学的技術は、ＰＶＣＲレベルを、抗ＰＶＣＲ抗体（すなわち、１つ以上の抗体）を使って、検出する。用語「抗ＰＶＣＲ」抗体は、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体、およびそれらの混合物を含む。
【００５２】
抗ＰＶＣＲ抗体は、単離されたおよび／または組み換えＰＶＣＲまたはそれらの一部（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適当な免疫原に対して発生される。一つの態様において、抗体は、単離されたおよび／または組み換えＰＶＣＲまたはそれらの一部（たとえば、ペプチド）に対してあるいは組み換えＰＶＣＲを発現する宿主細胞に対して発生される。さらにトランスフェクト細胞などの組み換えＰＶＣＲを発現する細胞は、免疫原としてまたはレセプターを結合する抗体のスクリーニングに使用され得る。
【００５３】
任意の適当な技術は、免疫抗原を調製し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製することができる。当該分野は、種々のこれらの方法を含む（たとえば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）とＥｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１−５１９（１９７６）； Ｍｉｌｓｔｅｉｎｓ， Ｎａｔｕｒｅ ２６６： ５５０−５５２（１９９７）； Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ ら、米国特許第４，１７２，１２４ 号； Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＤ． Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．２（補遺２７， １９９４年夏）， Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら， 編， （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）， １１ 章， （１９９１）） 。一般に、適当な不死またはミエローマ細胞株（ＳＰ２／０ など）を抗体産生細胞と融合することでハイブリドーマを産生することができる。所望の抗原で免疫された動物は、抗体産生細胞、好ましくは膵臓またはリンパ節由来の細胞を提供する。選択的な培養条件は、抗体産生ハイブリドーマ細胞を分離し、一方、限界希釈技術はそれらを製造する。研究者らは、ＥＬＩＳＡ などの適当なアッセイを用いて所望の特異性を有する抗体産生細胞を選択することができる。
【００５４】
他の適当な方法は、必須の特異性を有する抗体を作製または分離することができる。他の方法の例は、ライブラリーから組み換え抗体を選択することまたはマウスなどのトランスジェニック動物の免疫に依存することを含む。
【００５５】
前記方法によれば、アッセイは、生物学的試料におけるＰＶＣＲのレベルを決定できる。ＰＶＣＲの量を決定する際に、アッセイは、抗体とＰＶＣＲとの複合体の形成に適当な条件下で、試験される試料をＰＶＣＲに対して特異性を有する抗体と組み合わせ、複合体の形成を検出または測定（直接的にまたは間接的に）することを含む。試料は、直接的または間接的に得ることができ、特定の試料および選択されたアッセイフォーマットに適当な方法により調製され得る。
【００５６】
特に、組織試料（たとえば、鰓組織試料）は、魚をＭＳ２２２ で麻酔したあと、その魚から採取することができる。組織試料は、魚の浸透性に対応した適当なリンガー溶液中２％パラホルムアルデヒドへの浸漬で固定化し、リンガー溶液で洗浄し、ついで包埋化合物（たとえば、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（登録商標）（Ｍｉｌｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｌｋａｈａｒｔ， Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）中で、液体窒素で冷却したメチルブタンを用いて凍結させる。クリオスタットで８−１０μの組織切片を切った後、個々の切片を種々の染色プロトコルに供する。たとえば、切片は、１）ヤギ血清または同じ種の魚から得られる血清でブロックされ、２）ウサギ抗ＣａＲ または抗ＰＶＣＲ抗血清とともにインキュベートされ、そして３）ペルオキシダーゼ共役アフィニィティー精製ヤギ抗ウサギ抗血清で洗浄およびインキュベートされる。結合したペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギ抗血清の位置は、ついで、淡紅色のアミノエチルカルバゾール反応生成物の発生で顕在化される。個々の切片は、標準的な光学顕微鏡技術により、検鏡板に固定し、観察し、写真撮影される。魚ＰＶＣＲタンパク質を検出するのに使用される抗ＣａＲ 抗血清は、ＲａＫＣａＲタンパク質の細胞外ドメインに局在化された２１４−２３６ のアミノ酸メンバーに対応する２３マーペプチドを用いてウサギで発生させる。２３マーペプチドの配列は、ＡＤＤＤＹＧＲＰＧＩＥＫＦＲＥＥＡＥＥＲＤＩＣ （配列番号：１９）であり、また、配列ＤＤＹＧＲＰＧＩＥＫＦＲＥＥＡＥＥＲＤＩＣＩ（配列番号：２０）またはＡＲＳＲＮＳＡＤＧＲＳＧＤＤＬＰＣ （配列番号：２１）を有する小ペプチドは、ＰＶＣＲに対する抗体を含有する抗血清を作製するのに使用され得る。かかる抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたはキメラであり得る。
【００５７】
放射性標識、蛍光標識または化学発光標識などの適当な標識を直接的に検出することができる。これらの標識は、酵素標識やビオチンのような他の抗原性または特異的結合パートナーなどの標識を用いて間接的に検出することもできる。かかる標識の例としては、フルオレセイン、ローダミンなどの蛍光標識、ルシフェラーゼなどの化学発光標識、３２Ｐ、 １２５Ｉ、 １３１Ｉなどの放射性同位体標識、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識、およびアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン、アビジン、スピン標識などが含まれる。複合体中における抗体の検出は、次いで検出される（たとえば、標識を用いる）二次抗体を用いて免疫学的にも行われ得る。通常の方法または他の適当な方法は、直接的または間接的に抗体を標識し得る。
【００５８】
前記方法を行う際に、種々の組織におけるＰＶＣＲのレベルは、対照と比較して変化する。種々の組織中のＰＶＣＲ発現の調節されたレベルまたは存在は、対照と比較して、その魚または統計的に有意な数の魚が試験された魚の群が淡水に移動する準備があることを示す。対照は、本発明の工程に供されない（たとえば、ＰＶＣＲ調節因子を有する淡水に供されないおよび／またはＮａＣｌ食餌を採らない）魚由来のものであるにしても、ＰＶＣＲのレベルを指示する。たとえば、図１３および図１８は、本発明に供されない魚が検出可能なＰＶＣＲレベルを持たない一方、本発明の工程に供された魚は、容易に検出されるＰＶＣＲレベルを有していたことを示す。
【００５９】
ＰＶＣＲは、また、組織試料由来のｍＲＮＡのノザンブロット分析によりアッセイされ得る。種々のサメ組織由来のノザンブロット分析は、最高度のＰＶＣＲ発現が鰓組織中にあり、次いで腎臓および直腸腺が続くことを示している。約７ｋｂ 、４．２ｋｂ および２．６ｋｂ の少なくとも３つの別々のｍＲＮＡ種があるようである。
【００６０】
ＰＶＣＲは、ハイブリダイゼーションにより、たとえば、本明細書で提供されるＰＶＣＲ配列（たとえば、配列番号：１ 、３ 、５ 、７ 、９ 、１１、１３、１５）の一つまたは該配列の一つから得られるオリゴヌクレオチドを魚由来のＤＮＡ 含有組織試料にハイブリダイズすることにより、アッセイされ得る。かかるハイブリダイゼーション配列は、ハイブリダイゼーション産物の検出を可能にするために付着する検出可能な標識、たとえば、放射能、蛍光などを有し得る。ハイブリダイゼーションの方法は周知であり、かかる方法は、Ｊａｃｏｂｓらによる米国特許第５，８３７，４９０ 号で提供され、そのすべての教示は本明細書に全て参照として取り込まれる。オリゴヌクレオチドプローブの設計は、これらのパラメーターに従うことが好ましいであろう：（ａ）あるとすれば、最も少数の不明瞭な塩基（「Ｎ」のもの）を有する配列の領域に設計され、（ｂ）およそ８０℃のＴｍ（ＡまたはＴ毎に２℃、ＧまたはＣ毎に４℃と仮定する）を有するように設計されるだろう。
【００６１】
ハイブリダイゼーションに対してストリンジェンシーな条件とは、一番目の核酸配列の２番目の核酸配列へのハイブリダイゼーションを可能にする温度条件および緩衝液組成の条件をいい、該条件は互いにハイブリダイズするそれらの配列間での同一性の程度を決定する。したがって、「高ストリンジェンシーな条件」は、互いに極めて類似している核酸配列のみがハイブリダイズするそれらの条件である。該配列は、中程度のストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする場合、互いに対する類似性は少なくなりうる。さらに少ない類似性は、低ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする２つの配列にとって必要とされる。ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーレベルからハイブリダイゼーションが初めて見られるレベルにハイブリダイゼーション条件を変えることにより、所定の配列がそれに最も類似するそれらの配列にハイブリダイズする条件を測定することができる。特定のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件には、イオン強度、温度、およびホルムアミドなどの脱安定化剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、それらの塩基組成、２つの配列間のミスマッチな塩基対の割合、他の非同一な配列内での配列のサブセット（たとえば、リピートの小ストレッチ）の出現の頻度などのファクターも含む。洗浄は、条件が互いにハイブリダイズする配列間の類似性の最小レベルを決定するために設定された工程である。一般に、相同のハイブリダイゼーションのみが生じる最低温度から、２つの配列間での１％のミスマッチは、任意の選ばれたＳＳＣ濃度あたり溶融温度（Ｔｍ）が１℃低減する。一般に、ＳＳＣの濃度を２倍にすると、Ｔｍが約１７℃増加する。これらのガイドラインを使用すると、洗浄温度は調べたミスマッチのレベルにより、経験に基づいて決定され得る。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら， 編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５，　最新情報を補足した） の２．１０．１頁〜２．１０．１６ 頁および６．３．１ 頁〜６．３．６ 頁において説明されている。
【００６２】
高ストリンジェンシーな条件は、（１）１×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ　ＮａＣｌ、０．３Ｍ　クエン酸ナトリウム・２Ｈ２ Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ　ＨＣｌでｐＨ７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、（２）１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、１ｍＭ　Ｎａ２ ・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＨＰＯ４ （ｐＨ７．２）（１Ｍ　ＮａＨＰＯ４ ＝１リットルあたり１３４ｇＮａ２ ＨＰＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ、４ｍｌ　８５％Ｈ３ ＰＯ４ ）、７％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（１００×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇのウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、水で５００ｍＬにする）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、のいずれかで、（１）０．３〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、または（２）１ｍＭ　Ｎａ２ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ　ＮａＨＰＯ４ （ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、６５℃のいずれかの高ストリンジェンシー洗浄を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。上記条件は、５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて用いられることが意図される。該ハイブリッドは、長さが１８塩基対よりも少ないと考えられる場合、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたＴｍのものより５〜１０℃低いだろう。ここでＴｍは、℃＝（２×Ａ塩基およびＴ塩基の数）＋（４×Ｇ塩基およびＣ塩基の数）である。長さが約１８〜約４９塩基対であると考えられるハイブリッドについて、Ｔｍは℃＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、ここで、「Ｍ」は一価のカチオン（たとえば、Ｎａ＋ ）の重量モル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである。
【００６３】
中程度ストリンジェンシーな条件は、（１）４×ＳＳＣ、（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ　ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム・２Ｈ２ Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ　ＨＣｌでｐＨ７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、（２）４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、１ｍＭ　Ｎａ２ ・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＨＰＯ４ （ｐＨ７．２）（１Ｍ　ＮａＨＰＯ４ ＝１リットルあたり１３４ｇＮａ２ ＨＰＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ、４ｍｌ　８５％Ｈ３ ＰＯ４ ）、７％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（１００×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇのウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、水で５００ｍＬにする）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、のいずれかで、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の中程度ストリンジェンシー洗浄を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。上記条件は、５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて用いられることが意図される。該ハイブリッドが、長さが１８塩基対よりも少ないと考えられる場合、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたＴｍのものより５〜１０℃低いだろう。ここでＴｍは、℃＝（２×Ａ塩基およびＴ塩基の数）＋（４×Ｇ塩基およびＣ塩基の数）である。長さが約１８〜約４９塩基対であると考えられるハイブリッドについて、Ｔｍは℃＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、ここで、「Ｍ」は一価のカチオン（たとえば、Ｎａ＋ ）の重量モル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである。
【００６４】
低ストリンジェンシーな条件は、（１）４×ＳＳＣ、（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ　ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム塩・２Ｈ２ Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ　ＨＣｌでｐＨ７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５０℃、（２）６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４０℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、１ｍＭ　Ｎａ２ ・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＨＰＯ４ （ｐＨ７．２）（１Ｍ　ＮａＨＰＯ４ ＝１リットルあたり１３４ｇＮａ２ ＨＰＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ、４ｍｌ　８５％Ｈ３ ＰＯ４ ）、７％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５０℃、（４）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（１００×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇのウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、水で５００ｍＬにする）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４０℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５０℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４０℃、のいずれかで、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、または　（２）０．５％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ　Ｎａ２ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ　ＮａＨＰＯ４ （ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳのいずれかの低ストリンジェンシー洗浄を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。上記条件は、５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて用いられることが意図される。該ハイブリッドが、長さが１８塩基対よりも少ないと考えられる場合、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたＴｍのものより５〜１０℃低いだろう。ここでＴｍは、℃＝（２×Ａ塩基およびＴ塩基の数）＋（４×Ｇ塩基およびＣ塩基の数）である。長さが約１８〜約４９塩基対であると考えられるハイブリッドについて、Ｔｍは℃＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、ここで、「Ｍ」は一価のカチオン（たとえば、Ｎａ＋ ）の重量モル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである。
【００６５】
本発明は、本明細書に開示されるプライマーまたは本明細書に記載の配列から得られるプライマーを使用するＰＣＲ 方法を用いたＰＶＣＲの検出を包含する。たとえば、ＰＶＣＲは、実施例９に記載されているように、配列番号：２２および２３を用いるＰＣＲ により検出することができる。ＰＣＲ は、配列特異的なプライマーおよび耐熱性ポリメラーゼを利用した核酸複製の繰り返される循環による、標的配列の選択的な増幅である。ＰＣＲ は、公知の配列の２つの末端の間の全配列の回収を可能にする。ＰＣＲ 法は、本明細書に記載され、当該分野で公知である。
【００６６】
特に、水性（ａｑｕａｔｉｃ） ＰＶＣＲのレベルは、水生種由来のポリＡ＋ＲＮＡ の単離後、リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、種々の組織において決定され得る。ＰＣＲ 法およびＲＴ−ＰＣＲ法は、当該分野で充分に特徴付けされ得る（一般には、ＰＣＲ 技術：ＤＮＡ 増幅に関する原理と応用（Ｈ．Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ 編， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， ＮＹ， １９９２ ）；ＰＣＲ プロトコル：方法と応用へのガイド（Ｉｎｎｉｓ，ら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９０ ）； Ｍａｔｔｉｌａ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＲｅＳ１９：４９６７ （１９９１） ；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ 法および応用， １：１７ （１９９１） ；ＰＣＲ （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ら編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ ）；Ａｕｓｅｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら， 分子生物学における最新のプロトコル、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．　およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８７ 、＆ Ｓｕｐｐ． ４９，２０００ ；および米国特許第４，６８３，２０２ 号を参照）。簡単には、ｍＲＮＡは所望の組織から抽出され、逆転写される。次いで、ＰＣＲ 反応を、ＰＶＣＲ特異的プライマーを用いて行い、予想されるＰＶＣＲ産物の存在を、たとえば、アガロースゲル電気泳動により決定する。ＰＶＣＲ特異的プライマーの例は、配列番号：２２および／または配列番号：２３である。ＰＶＣＲ特異的プライマーで行われるＲＴ−ＰＣＲ反応産物は、本明細書でＲＴ−ＰＣＲ産物と呼ばれる。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＰＶＣＲ配列の一部または全てを有する核酸分子を含みうる。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、必要に応じて放射性標識され得、ＰＶＣＲ産物の存在または量は、オートラジオグラフィを用いて決定され得る。かかるアッセイに使用され得る市販の蛍光プローブの２つの例は、モレキュラー・ビーコン（ストラタジーン）およびＴａｑｍａｎ（登録商標）（ＡｐＰＬｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） である。ＲＴ−ＰＣＲ産物を標識しかつ定量するかわりの方法は、当業者にとって周知である（Ａｕｓｅｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら、分子生物学における最新のプロトコル、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８７， ＆ Ｓｕｐｐ．４９， ２０００を参照。ポリＡ＋ＲＮＡは、標準的な方法により、少なくとも１つのＰＶＣＲを含む任意の組織から単離され得る。かかる組織には、たとえば、鰓、鼻腔薄膜、膀胱、腎臓、腸、胃、肝臓および脳が含まれる。
【００６７】
その上、本発明は、ＰＶＣＲまたはその一部に対して特異的な抗体、あるいはＰＶＣＲの核酸にハイブリダイズし得る核酸配列のいずれかを有するＰＶＣＲの検出用キットまたはＰＶＣＲの定量用キットを含む。
【００６８】
ＰＶＣＲの発現または感度の変化は、また、適当なトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ） の導入により達成され得る。適当なトランスジーンはＰＶＣＲ遺伝子自体またはＰＶＣＲ遺伝子発現に直接的または間接的に影響を与える修飾遺伝子のいずれかを含むだろう。魚卵母細胞、幼生および成体におけるトランスジーンの成功した導入方法、選択方法および発現方法は、Ｃｈｅｎ， ＴＴら、トランスジェニックフィッシュ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２０９−２１５ （１９９０）に記載されている。
【００６９】
本発明は、以下の実施例により、さらにかつより具体的に説明されるが、これはいかなる方法に限定することを意図するものではない。
【００７０】
実施例
実施例１．　多価カチオン感受レセプター（ＰＶＣＲ）は、魚において塩分濃度センサーとして役に立つ。
多価カチオン感受レセプター（ＰＶＣＲ）は、魚において塩分濃度センサーとして役に立つ。これらのレセプターは、浸透度調節を担うことが知られている魚の体（たとえば、鰓、腸、腎臓）内の種々の細胞の先端の膜に局在されている。ツノザメ科のサメ由来の全長カチオンレセプター（ＣａＲ 、「ＰＶＣＲ」とも呼ばれる）は、ヒトＨＥＫ細胞において発現されている。このレセプターは、ＨＥＫ細胞を浸す細胞外体液中のＮａＣｌ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋のイオン組成の変化に応答することが示された。イオン濃度は、淡水から海水に移すことを含む範囲を包含するように応答した。ＰＶＣＲ　ｍＲＮＡの発現は、淡水から海水への移行後の魚で増加し、ＰＶＣＲアゴニストにより調整される。ＰＶＣＲの部分的ゲノムクローンは、また、変性プライマーを用いる核酸増幅を使用することにより、冬および夏ヒラメおよびダンゴウオを含む他の魚の種から分離されている。
【００７１】
この方法を、タイセイヨウサケ（図１）、アルプスイワナ（図２）およびニジマス（図３）についてＰＶＣＲの部分的なゲノムクローンを分離するのにも使用した。使用した変性オリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＴＧＴ ＣＫＴ ＧＧＡ ＣＧＧ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＹＧ ＧＲＡ ＴＣＧ Ｃ−３’ （配列番号：２２）および５’−ＧＧＣ ＫＧＧ ＲＡＴ ＧＡＡ ＲＧＡ ＫＡＴ ＣＣＡ ＲＡＣ ＲＡＴ ＧＡＡ Ｇ−３’ （配列番号：２３）であった。ここでＫはＴまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、およびＲはＡまたはＧである。変性オリゴは、標準的な方法論により作製された（Ｐｒｅｓｔｏｎ， Ｇ．Ｍ．， １９９３，「遺伝子ファミリーメンバーをクローニングするための変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ５８， Ａ．Ｈａｒｗｏｏｄ 編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．３０３−３１２） 。これらの３つの種由来のゲノムバンドは増幅され、アガロースゲル電気泳動により精製され、適当なプラスミドベクター（サケおよびアルプスイワナ種−ｐＴ７ ブルー（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ： ｐＧｅｍ−Ｔを使用したマス（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） 内にライゲートされ、およびノバブルー（ＮｏｖａＢｌｕｅ）を有するサケおよびアルプスイワナ−ｐＴ７ ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） およびマスｐＧＥＭ−Ｔを適当な細菌宿主株に形質転換し、使用したＪＭ−１０９大腸菌は次いで、液体培地で生育させた。プラスミドおよび挿入物は、宿主細胞から精製され、シーケンスされた。図４は、ツノザメ科のサメ（スクアルス・アカンチア（Ｓｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｉａｓ））の腎臓由来のＰＶＣＲに対して、タイセイヨウサケ、カナダ産イワナおよびニジマス由来のＰＶＣＲについて誘導されたアミノ酸配列およびアライメントを示す。
【００７２】
実施例２：本発明の方法を用いる成魚前の溯上性の魚の生存と成長
最新のサケ養殖の重要な特徴は、淡水孵化場から海洋網生簀（ｎｅｔｐｅｎ）へのスモルトの配置である。現時点の方法は、約７０〜１１０ グラム体重の臨界サイズを達成したスモルトを使用する。本発明は、標準的な７０〜１１０ グラムのスモルトの海洋網生簀輸送を改善するならびにより小さな、たとえば体重が１５グラムしかない、スモルトの上手な海洋網生簀輸送を可能にするために使用されうる。標準的な７０〜１１０ グラムのスモルトについて、本発明を応用することにより、「スモルトのウインドウ」として知られる現象が除去され、１５℃以上の海水中に魚を維持し、移行することができる。１５グラムまたはそれより大きなスモルトに本発明を使用することで、淡水孵化場の容量の利用をより大きくすることができ、ついで、海洋網生簀への海水輸送を成功させることができる。両方の場合には、本発明の工程を経た魚は海洋網生簀への移行後、短い間隔で活発に餌を食べ、したがって、海水への移行時に急激な成長速度を示す。
【００７３】
図５は、ヨーロッパおよびチリにおける海洋温度でのタイセイヨウサケの最新の水産養殖の重要な特徴をスキームの形で示す。卵は内陸の淡水孵化場において孵化され、得られる稚魚は小魚や幼魚に成長する。より速い成長を遂げた幼魚は、スモルト化を経て、１年目の間でＳ０スモルト（７０グラム）として海洋網生簀に移すことができる。対照的に、ゆっくりと成長する幼魚は、２年目にスモルトとなり、Ｓ１スモルト（１００ グラム）として網生簀に移される。Ｓ０とＳ１の両方が海水に移行する際に、海洋温度および淡水温度がより冷たければ、新たに移行されたスモルトへの浸透性のショックのストレスを最小限にすることが望ましい。このことが、Ｓ１のスモルトについて特に本質的であるのは、淡水孵化場がしばしば海洋網生簀の生育場所と有意に離れた位置にあり、その水温が初夏の間では急激に上昇するためである。したがって、水温の上昇と、淡水中で長い間隔留まっている場合にスモルトが元に戻ったり、死んだりする傾向とを合わせて考えることにより、スモルトはスモルトウインドウの間に海水へ移行する必要が生じる。
【００７４】
海洋網生簀に新たに入れられた標準的なスモルトが、最初の４０〜６０日の間、海水中で最適に成長することができないのは、これらが餌を食べることを遅延させる浸透性ストレスの存在があるからである。この浸透性適応の間隔は、スモルトが春または秋のいずれかの配置直後に存在するディグリーデー（ｄｅｇｒｅｅ ｄａｙ）の大多数を利用することが妨げられる。スモルトウインドウの存在と、至適なスモルトの成長を達成することの遅延とを組み合わせることにより、生育間隔を引き延ばして市場サイズの魚を得る。これが、Ｓ０のものについて特に問題の多い事柄であるのは、それらの収穫の時点が周囲の光周期の減少に曝された魚を成長させる際に本年サケ（ｇｒｉｌｓｉｎｇ）の出現により時々悪化されるためである。
【００７５】
方法
以下の例は、終始ＡＰＳ プロセスＩ およびＡＰＳ プロセスＩＩに言及している。ＡＰＳ は「ＡｑｕａＢｉｏ ＰｒｏｄｕｃｔＳＳＣｉｅｎｃｅｓ（登録商標），Ｌ．Ｌ．Ｃ．」を表わす。ＡＰＳ プロセスＩ は、本明細書では、「ＳＵＰＥＲＳＭＯＬＴ（登録商標）Ｉ プロセス」または「プロセスＩ」と呼ばれる。「ＡＰＳ プロセスＩ 」の魚またはスモルトは、ＡＰＳ プロセスＩ の工程を経た魚またはスモルトをいう。ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトはまた、「ＳＵＰＥＲＳＭＯＬＴ（登録商標）Ｉまたは「プロセスＩ」のスモルトと呼ばれる。同様に、ＡＰＳ プロセスＩＩは、本明細書では、「ＳＵＰＥＲＳＭＯＬＴ（登録商標）ＩＩプロセス」または「プロセスＩＩ」とも呼ばれる。「ＡＰＳ プロセスＩＩ」の魚またはスモルトは、ＡＰＳ プロセスＩＩの工程を経た魚またはスモルトをいう。ＡＰＳ プロセスＩＩのスモルトはまた、「ＳＵＰＥＲＳＭＯＬＴ（登録商標）ＩＩまたは「プロセスＩＩ」のスモルトと呼ばれる。
【００７６】
ＡＰＳ プロセスＩ ：成魚前溯上性魚（これは通常に作製されたＳ０、Ｓ１またはＳ２のスモルトならびにより小さい幼魚／小魚の両方を含む）を２．０ 〜１０．０ｍＭカルシウムおよび０．５ 〜１０．０ｍＭマグネシウムイオンのいずれかを含む淡水中に曝露または維持する。この水は、淡水に炭酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを添加することにより調製される。魚には７％（重量／重量）ＮａＣｌを含む食餌ペレットを給餌する。この食餌に関するさらなる詳細については実施例８を参照のこと。魚は、水混合物のこの摂生と、標準的な孵化ケア技術を用いる全部で３０〜４５日間の給餌に曝されまたは維持される。水温は１０〜１６℃の間で変化する。魚は、ＡＰＳ プロセスＩ が継続される間一定の光周期に曝される。蛍光を光周期に用いる。
【００７７】
ＡＰＳ プロセスＩＩ：成魚前溯上性魚（これは通常に作製されたＳ０、Ｓ１またはＳ２のスモルトならびにより小さい幼魚／小魚の両方を含む）を２．０ 〜１０．０ｍＭカルシウムおよび０．５ 〜１０．０ｍＭマグネシウムイオンを含む淡水中に曝露または維持する。この水は、淡水に炭酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを添加することにより調製される。魚には７％（重量／重量）ＮａＣｌおよび食餌１ｋｇ あたり２ｇｍ または４ｇｍ のいずれかのＬ−トリプトファンを含む食餌ペレットを給餌する。食餌に関するさらなる詳細については実施例８を参照のこと。魚は、水混合物のこの摂生と、標準的な孵化ケア技術を用いる全部で３０〜４５日間の食餌に曝されまたは維持される。水温は１０〜１６℃の間で変化する。魚は、ＡＰＳ プロセスＩＩが継続される間一定の光周期に曝される。蛍光を光周期に用いる。
【００７８】
結果と考察
セクションＩ：タイセイヨウサケ、マスおよびカナダ産イワナに対するＡＰＳ プロセスＩ の利益の証明
タイセイヨウサケに対するＡＰＳ プロセスＩ の利益の証明：
ＡＰＳ プロセスＩ は、適合する淡水の対照と比較した場合、海水への移行後の小さなタイセイヨウサケＳ２様スモルトの生存率を増加する。至適生存率は、マグネシウムおよびカルシウム両方の水混合物ならびにＮａＣｌ食餌からなる完全なプロセスを用いることにより達成される。対照的に、食餌のみを介するまたはＮａＣｌ食餌補給なしのいずれかのカルシウムおよびマグネシウムの投与では、ＡＰＳ プロセスＩ と等しい結果が生じない。
【００７９】
表１は、約２５ｇｍの体重の１歳未満のタイセイヨウサケＳ２様スモルトから得られたデータを示す。この単一の魚の群は、以下に示すように、４つの特定の群に配分し、それぞれを試験した変数を除いて同じ研究室条件下で維持した。すべての魚を水温９ 〜１３℃、実験の間は、継続的な光周期に維持した。開始４５日間淡水に維持した対照の淡水群は、これらの条件下に３３％の死亡率を経験し、６７％だけが海水に移行できた。海水への移行後、この群は、またこれらのスモルトの半分だけが生き残るという高い死亡率を経験した。スモルトに与えられた食餌中にカルシウム（１０ｍＭ）およびマグネシウム（５ｍＭ ）を包含することで（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋食餌）、淡水（５１％対６７％）ならびに海水移行後（１％対５０％）の両方の場合に対照と比較して生存率が減少した。対照的に、淡水（ＡＰＳ プロセスＩ 水のみ）中に１０ｍＭ　Ｃａ２＋および５ｍＭ 　Ｍｇ２＋を包含することで、ＡＰＳ プロセスＩ 水ならびにスモルトの海水への移行後における生存率が向上した。しかしながら、スモルトをＡＰＳ プロセスＩ 水混合物中に維持し、７％塩化ナトリウムを補足した食餌を与えた場合に、最適の結果が得られた（ＡＰＳ プロセスＩ 水混合物ならびに海水移行後の両方において９９％が生存した）。
【００８０】
【表１】
2004510443.tif 000002
【００８１】
海水中への７０〜１００ｇｍ のスモルトの配置に対するＡＰＳ プロセスＩ の応用
これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ の使用が「スモルトウインドウ」を排除し、急速なスモルトの食餌とスモルトの成長速度に有意な改善を提供することを示す。
【００８２】
実験プロトコル：
米国、メイン、チェリーフィールドにあるコーナーズ・ブラザーズ・デブロイス（Ｃｏｎｎｏｒｓ Ｂｒｏｔｈｅｒｓ Ｄｅｂｌｏｉｓ）孵化場で産生されたタイセイヨウサケのセント・ジョン株由来のスモルトを、この大スケール試験に利用した。スモルトは、この孵化場での標準的なプラクティスを用いて産生され、１９９９年１ 月の卵の孵化から得られた。すべてのスモルトは、標準的な市販のスモルトのトラックと輸送人員で移行された。Ｓ１のスモルトは、メイン産２０００年のスモルトウインドウの間で購入され、スモルトの配達は、２０００年４ 月２９日〜２０００年５ 月１５日の日程の間で行われた。スモルトを、メインのブルー・ヒル湾（Ｂｌｕｅ Ｈｉｌｌ Ｂａｙ） にあるポーラー・サークル（Ｐｏｌａｒ Ｃｉｒｃｌｅ）網生簀（直径２４ｍ ）に直接移行する（対照）、またはそれらを全部で４５日間ＡＰＳ プロセスＩ で処理する処理施設に輸送した。ＡＰＳ プロセスＩ 処理を受けた後、スモルトを次いで同一のブルー・ヒル湾の網生簀位置に移行し、成長するまで隣接した方形のスチール製ケージ（１．５ｍ×１．５ｍ×５ｍ）に入れた。両方のグループの魚には、湿っぽい（水分３８％）および乾燥した（水分１０％）サケ科の魚の食餌（コーナーズ・ブロス（Ｃｏｎｎｏｒｓ Ｂｒｏｓ）） の同じ混合物を与えた。食餌を視覚化するカメラを用いて１日あたり２回十分満足させるために各網生簀に手でまたは食餌ブロワーにより給餌した。三歳のサケの潜水は通例の状態で行われ、各網生簀は、このサケ養殖において確立された同じ標準的なケアプラクティスを受けた。成長分析についての魚のサンプリングは、４２日（ＡＰＳ プロセスＩ ）または１２０ 日以上（対照）の魚のいずれかで行われた。両方の場合、魚を網生簀から取り出し、複数の分析を以下に記載するようにして行った。
【００８３】
食餌変換率（ＦＣＲ ）または特異的な成長速度（ＳＧＲ ）および成長因子（ＧＦ３）を得るためにすべての計算値を、標準的に認められた式を用いて行い（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ， Ｓ． Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｉｄ Ｆａｒｍｉｎｇ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ １９９９） 、以下の表２に示すようなブルー・ヒル湾地域についてのディグリーデーの測定を設定した。ディグリーデーは、一月の日数を摂氏での日温度の平均に掛けることで計算される。
【００８４】
【表２】
2004510443.tif 000003
【００８５】
表３は、対照Ｓ１のスモルトの海水移行後に得られたデータを示す。７５〜１２５ｇｍ の範囲のスモルトを３つの独立した網生簀に入れ、メインでの現在のサケ水産養殖について典型的な性質を示す通常の養殖プラクティスに供した。冷たい（１０℃）海水への移行後、有意な死亡率（平均３３％）を経験し、完全な食餌は、海洋の網生簀において有意な間隔（〜５６日）後にのみ達成された。結果として、これらの３つの網生簀の平均ＳＧＲ 値およびＧＦ３ 値は、測定した１０５ 〜１２１ 日間でそれぞれ１．０９および１．７６であった。
【００８６】
前記のように対照Ｓ１のスモルトの海洋網生簀への移行直後（表ＩＩＩ）とは対照的に、平均サイズが６３．６グラムである１０，６００のＳ１のスモルトの全部を、２０００年５ 月１１日にデブロイス淡水孵化場から研究施設に輸送した。標準的な円形タンクに維持しながら、これらの魚を平均水温１１℃で全部で４５日間保持し、ＡＰＳ プロセスＩ に供した。この間隔の間、スモルトの死亡数はわずか６４匹であった（０．６ ％）。ＡＰＳ プロセスＩ の魚に対応する対照として、対照の魚のより小さな群（ｎ＝２２０ ）を、同じ条件下で維持したが、ＡＰＳ プロセスＩ 処理を受けていなかった。これらの対照魚の死亡率は、１０℃の温度を保持することにより最小限にし、海水への移行の前に処理したスモルトと同じであった。
【００８７】
【表３】
2004510443.tif 000004
【００８８】
Ｓ１スモルトがＡＰＳ プロセスＩ を受けている場合、４５日間で、魚は平均１０グラム成長し、次いで海洋網生簀に移行した場合、平均体重７６．６ｇｍを有した。２０００年６ 月２６日に行った実際のスモルトの海水への移行は、普通は問題のあるスモルトの異常な活動力について顕著であったのは、この時点がスモルトの海洋の配置についての正常なウインドウをうまく通過するためである。ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの網生簀配置の時点での海洋温度は１５．１℃であった。前記標準的な産業プラクティスに供された対するＳ１のスモルトとは対照的に、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトは、海洋配置の４８時間以内に活発に食餌し、移行期間直後の食餌の消費が増大し続けた。ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの死亡率は、海洋網生簀の配置後最初の５０日間、夏により早く配置されたスモルトのもの（６．１ ％）と比べられ、それらの死亡率の３分の２は、直接的にはスケールロスによるものであり、残りは移行プロセス自体の間に受けた物理的なダメージによるものであった。
【００８９】
対照的に、対応する対照の魚（ＡＰＳ プロセスＩ 処理のない同じ条件下に保持された）は、網生簀への移行の間うまくいかず（１７％の移行死亡率）、海洋網生簀配置後最初の２０日間の任意の時点で活発に食餌しなかった。このより小数の対照の魚（１７６ ）を、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトを含むより大きな網生簀内に浮遊しているより小さな（１．５ｍ×１．５ｍ×１．５ｍ）網生簀に保持した。海洋網生簀配置後のこれらの死亡率は、５１日間で６３％と非常に高かった。
【００９０】
ＡＰＳ プロセスＩ および対照の両方のスモルトに、表３に示す産業標準魚により経験されたものと同じ方法で毎日給餌した。ＡＰＳ プロセスＩ の魚をその海水への配置の５１日後にサンプリングし、表３に示す産業標準のスモルトと比較した。表４に示すように、これらの特徴の比較は、産業標準のスモルト対ＡＰＳ プロセスＩ の間の劇的な差を示す。
【００９１】
【表４】
2004510443.tif 000005
【００９２】
要約すれば、ＡＰＳ プロセスＩ 、対照スモルトと産業標準のスモルトとの間の顕著な差は次のことを含む：
【００９３】
１．これらの魚がスモルトウインドウ後１．５ ヶ月で、非常に高い（１５．１℃）海水温度の海水に移行されているにも係わらず、海洋網生簀配置後に見られる死亡率は、対照（６３％）に対しＡＰＳ プロセスＩ （６．１ ％）では低い。ＡＰＳ プロセスＩ の死亡率は、スモルトウインドウの間により低い（１０℃）海水に移された、認められた産業標準のスモルトのもの（３ 〜１０％）と比べられた。ＡＰＳ プロセスＩ のこの特徴は、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの移行が産業プラクティスで現在使用されている通常の「スモルトウインドウ」を正確に制限しないため、淡水孵化場での作業においてより大きな融通性を提供する。
【００９４】
２．　ＡＰＳ プロセスＩ の魚は、海水への移行中および直後にピークの状態になった。完全な食餌を達成するのに５６日を必要とした産業標準のスモルトと異なり、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトは、２日以内に活発に食餌を行なった。さらに、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトで見られた初期成長速度（ＳＧＲ１．８）は、海水配置後の最初の５０日間の標準のスモルトの公表データよりも有意に大きい（０．２ 〜０．８ のＳＧＲ 範囲の公表値（Ｓｔｒａｄｍｅｙｅｒ， Ｌ．見込みのないものへの食餌は時間の無駄か、Ｆｉｓｈ Ｆａｒｍｅｒ ３：１２−１３， １９９１； Ｕｓｈｅｒ， ＭＬ， Ｃ ＴａｌｂｏｔとＦＢ Ｅｄｄｙ．　タイセイヨウサケのスモルトでの成長および食餌に対する海水への移行の影響（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ Ｌ．） Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ９４：３０９−３２６， １９９１） ）。事実、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの成長速度は、産業標準スモルトが海水配置の時点でより大きく、かつその成長が海水配置後１２０ 日で測定されたものであるにも関わらず、同じ位置で海水中に配置された産業標準のスモルトに比べて有意に大きい。これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトが、直ぐに食餌することを妨げるであろう有意な浸透度調節ストレスに供されていなかったという証拠を提供する。
【００９５】
３．　海洋網生簀への配置直後のＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの急速な成長は、海水での成長を続行した場合、サケのサイズの増大を倍加させることを提供する。したがって、体重１１２．５ グラム（ｇｍ）の産業標準のスモルトは、ＡＰＳ プロセスＩ 処理に供され、海洋網生簀に配置され、そして海洋網生簀配置の１２０ 日後に実験された場合、そのサイズは観察時３７７ グラムではなく平均７８２ グラムになることが予想される。これは、成長の初期段階での魚のサイズの倍加より大きなサイズを提供する。かかる魚は、産業標準の魚に比べて、より急速に市場サイズに到達するだろう。
【００９６】
標準産業プラクティスに供された対応するＳ１スモルトと対照的に、ＡＰＳ プロセスＩ で処理されたスモルトは、海洋配置の４８時間以内に活発に食餌し、移行期間直後に食餌の消費を増大し続けた。比較することにより、産業標準のスモルトは移行後第１週以内はわずかまたは全く食餌しなかった。図６Ａは、プロセスＩ処理されたスモルトと産業標準のスモルトとの間の魚あたりの１週間の食餌消費量を比較している。示されるように、プロセスＩ処理されたスモルトは、３０日後の産業標準のスモルトに比べて、最初の１週間の魚あたりおよび２倍の食餌を消費した。プロセスＩで処理されたスモルトは、産業標準のスモルトと比べて有意に多く食餌したので、プロセスＩ処理されたスモルトは、実施例１５に詳しく説明するように、より早く成長した。
【００９７】
図６Ｂは、海水移行後のＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの特徴についてのデータを示す。これらの実験は、１８５ 日にわたって行なわれ、これらのデータは同じ魚についても実施例１５において見られうる。
【００９８】
産業標準の「臨界サイズ」のスモルトよりも小さいタイセイヨウサケの成魚前の魚へのＡＰＳ プロセスＩ の応用
【００９９】
平均体重が２０．５グラムである合計１，４００ のランドキャッチ（Ｌａｎｄｃａｔｃｈ） ／セント・ジョン（Ｓｔ Ｊｏｈｎ） 株の小魚を、２０００年８ 月１ 日に米国、メイン、クオシック（Ｑｕｏｓｓｉｃ）、クオシック孵化場のメイン社のタイセイヨウサケから購入した。これらの小魚は、２０００年１ 月に孵化している卵から得られ、急速に成長した魚であると考えられた。それらは、標準的な通常のトラック輸送を用いて処理施設に輸送された。その到着後、これらの小魚をまず典型的な淡水の成育条件に１４日間おいた。ついで、これらの小魚を合計２９日間、継続的な光周期に曝しながらＡＰＳ プロセスＩ に供した。ついで、ＡＰＳ プロセスＩ をリポーゲン・フォート産物（Ａｑｕａｈｅａｌｔｈ社） で予防接種し、通常のトラック輸送により海洋網生簀に輸送し、捕食者用ネットならびにこれらのより小さなＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの損失を防ぐのに十分に小さなネット口（０．２５インチ）の両方を有する研究用海洋網生簀中の海水（１５．６℃）に入れた。かわりに、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトを研究室内の円形タンクに入れた。海水移行の４８時間後、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトは、通常の産業サケと比較して、より小さなＡＰＳ プロセスＩ のスモルトについてより小さいサイズの食餌を提供する必要性にしたがって再ペレット化された標準の水分（水分３８％）の、スモルトの食餌（Ｃｏｎｎｏｒｓ Ｂｒｏｓ．）を開始した。上記の７０グラムのスモルトについて記載されたのと同様の方法で、これらの３０グラムのＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの死亡率、食餌の消費量、成長および全体的な健康をより詳しくモニターした。
【０１００】
図７は、海水に移行する直前の１，２０９ のＡＰＳ プロセスＩ のスモルトのより大きな群の代表的なサンプルの特性を示す。これらのパラメーターは平均体重が２６．６＋８．６グラム、体長１３．１＋１．５４ｃｍ および条件因子が１．１２＋０．０６ を包含する。海水移行後、ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトは、それらの平均体重が産業標準の７０〜１００ グラムのＳ０−ＳＬのスモルトの２６〜３８％であるという事実にも係わらず、低い初期死亡率を示した。表５に示すように、海水配置後の最初の７２時間以内のＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの死亡率は、研究室タンクの１／１４０ または０．０７％であった。ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの配置後の海洋網生簀の死亡率は、１４３／１，０６９ または１３．４％であった。図７は、海洋網生簀または対応する研究室海水タンクのいずれかの海水に移行された、ある範囲の体の大きさを有する、代表的なＬａｎｄｃａｔｃｈ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ 株ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトを示す。ＡＰＳ プロセスＩ のスモルトは、平均体重が２６．６グラムである広い範囲のサイズ（たとえば、約５．６ グラムから約４６．８グラムの体重）を有する。これらのデータを用いた実験例は、魚の淡水タンクへの輸送後８４日間で行われ、かつこれらの実験由来のデータは、実施例１６に記載される。
【０１０１】
【表５】
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【０１０２】
図８は、Ｌａｎｄｃａｔｃｈ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ のＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの全グループについての体の特徴の分布対海水海洋網生簀配置後７２時間の死亡率の比較を示す。１，０６９ のＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの海水配置後に生じた１４３ の死亡体から得られた体長と体重のデータを、図７に前もって示したように、１００ の魚のサンプリングから得られたデータに基づいてプロットした。死亡体は、より大きなＡＰＳ プロセスＩ 網生簀の個体群内のより小さな魚の中でもっぱら分布することに注意せよ。
【０１０３】
海洋網生簀の底から回収された全死亡体についての体長測定と体重測定を図８に以前示した代表的なサンプルの分析から得られたＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの体の特徴の分布と比較した。データは、死亡体が、死亡体の平均体重が全移行個体群の平均体重の５４％（１４．７／２７ グラムまたは５４％）であるような体のサイズが小さいＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの間で選択的に発生したことを示す。したがって、体重が２５〜３０グラムのＡＰＳ プロセスＩ のスモルトの実際の死亡率は、０．４％（４／１，０６９ ）であり、体重が１８〜３０グラムのものでは２．９ ％（３１／１，０６９）である。
【０１０４】
産業標準の「臨界サイズ」のスモルトよりも小さいマスの成魚前の魚へのＡＰＳ プロセスＩ の応用
【０１０５】
表６は、小さな（３〜５グラム）のニジマスについてのＡＰＳ プロセスＩ の使用についてのデータを示す。稚魚マスは、稚魚タイセイヨウサケに比べて淡水から海水への突然の移行に対してあまり耐性がない。結果として、多くの市販の海水マス生産業者は自分達の魚を河口域または淡水のレンズにある淡海水の位置に移行する、あるいは「飲み水」システムを構築して、標準海洋網生簀にある十分な強度の海水のかわりに、マスに淡水を提供する。浸透性適応期間を延長した後、ついでマスをその成長サイクルを完了するためにより標準的な海洋網生簀の位置に移行する。一般に、マスは約７０〜９０または９０〜１２０ グラムの体重まで成長させるためにこれらの海洋の位置に移される。
【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
１歳未満の魚の一つのプールから全部で１４０ のマスをグループ分けし、以下に記載する実験を継続している間、水温９ 〜１３℃、ｐＨ７．８ 〜８．３ に保持された。対照の淡水のニジマスは海水中に直接移されると、２４時間以内の死亡率が１００ ％である（対照の淡水）。マスを１４日間一定の光周期に曝すと、海水への移行後の生存率がわずかに改善される。これに対して、マスを１４日間か２３日間のいずれかでＡＰＳ プロセスＩ に曝すと、海水への移行後の死亡率が有意に減少し、それぞれ、３０％および４６％の魚が海水中での５日間後に生存していた。これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ の適用は、現在の産業標準技術により生産された標準的な「臨界サイズ」のマスのサイズの７％未満である成魚前のマスの生存を増加させることを示す。
【０１０８】
産業標準の「臨界サイズ」のスモルトよりも小さいカナダ産イワナの成魚前の魚へのＡＰＳ プロセスＩ の応用
【０１０９】
カナダ産イワナは、サケ科の、溯上性の魚であるが、その海水移行への耐性は、サケやマスのいずれかと比べても、はるかに少ない。図９は、より小さなイワナ（３〜５グラム）が全部で１４日間と３０日間ＡＰＳ プロセスＩ に曝露された結果を示す。図９に示される全ての魚は、連続的な光周期に曝露された。淡水から海水へのイワナの直接の移行により、２４時間以内に全ての魚が死んだ。これに対して、１４日間および３０日間ＡＰＳ プロセスＩ でイワナを処理することにより、生存率の増大を生じ、それぞれ３３％　（３／９ ）または７３％（２２／３０ ）が３日間曝露後まだ生存している。これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ へ曝露し、次いで海水へ移行した後の、産業標準法により規定される場合の臨界サイズの１０％未満であるカナダ産イワナの生存率の増大を示す。
【０１１０】
図９は、種々の処理後のカナダ産イワナの生存率の比較を示す。１群のカナダ産イワナ（３〜５グラムはピールス（Ｐｉｅｒｃｅ）孵化場（Ｂｕｘｔｏｎ ，ＭＥ）から得られた）は、淡水で維持または海水への移行前にＡＰＳ プロセスＩ で処理された。
【０１１１】
セクションＩＩ：１０〜３０グラムのスモルトの海水網生簀およびタンクへの移し替え（ｔｒａｎｓｆｅｒ）を成功させるＡＰＳ プロセスＩＩの利用
ＡＰＳ プロセスＩＩは、成魚以前の遡河魚を、平均サイズ２５〜３０グラム以下の段階で海水に移すために、処理することに利用される。この方法は、成魚以前の遡河魚を海水に移す前の飼料にＬ−トリプトファンを含めたことが、ＡＰＳ プロセスＩ と異なる。ＡＰＳ プロセスＩＩは、成魚以前の遡河魚の浸透調節能をさらに改善し、タイセイヨウサケのスモルトの移し替えのための「臨界サイズ」をさらに小さくすることができる。要するに、ＡＰＳ プロセスＩＩは、海水の移し替えの成功のための「臨界サイズ」を現在の工業標準ＳＯスモルトのサイズの１／５ 未満まで小さくすることができる。
【０１１２】
ＡＰＳ プロセスＩＩのタイセイヨウサケ幼魚への適用
２０００年１ 月ふ化した卵から生まれた、平均体重０．８ グラムのＳｔ Ｊｏｈｎ ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ 系統成魚前幼魚を、２０００年４ 月２７日にＫｅｎｎｅｂｅｃ ＭａｉｎｅのＡｔｌａｎｔｉｃ Ｓａｌｍｏｎ ｏｆ Ｍａｉｎｅ Ｉｎｃ． Ｋｅｎｎｅｂｅｃふ化場から購入した。これらの魚を標準的な通常のトラック輸送によって処理施設へ輸送した。到着後、これらの稚魚サケは、まず、水温９．６ ℃、標準淡水稚魚サケ用飼料（Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ Ｆｅｅｄｓ ）等の淡水維持条件下で通常の流水中で維持した。２０００年７ 月１７日に、幼魚に対して、連続明期に曝露させながら、合計４９日間のＡＰＳ プロセスＩＩを開始した。つぎに、ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトを、ＡＰＳ プロセスＩＩ処理の第２８日（２０００ 年８ 月１４日） に、Ｌｉｐｏｇｅｎ Ｆｏｒｔｅ 製品（Ａｑｕａｈｅａｌｔｈ Ｌｔｄ．） で予防接種した。ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトは、ＡＰＳ プロセスＩＩ開始前と海水への移し替え直前にサイズ分けをした。Ｓｔ Ｊｏｈｎ ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ 系統ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトは、通常のトラック輸送で海洋網生簀に輸送し、ＡＰＳ プロセスＩ スモルトの配置について述べたものと同じ単独の海洋網生簀の中の海水（１５．２℃）中へ、または、研究施設内の実験室タンク（１５．６℃）の中に配置した。
【０１１３】
図 １０ は、海洋網生簀または対応する実験室海水タンクへ移し替えた代表的なＳｔ Ｊｏｈｎ ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ系統ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの身体サイズの範囲である。これらのＡＰＳ プロセスＩＩスモルトが、平均体重１１．５グラムを含む広範囲の体重（３．９５〜２８グラム）を有することに注目のこと。図 １０ は、Ｓｔ Ｊｏｈｎ ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの特性を示す。これらのＳｔ． Ｊｏｈｎ／Ｓｔ． Ｊｏｈｎ系統ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの平均測定値は、体重が１１．５０ ±５．６ グラム、体長が９．６ ±１．５ｃｍ 、条件ファクターは１．１９±０．０９であった。表８ に示したデータは、実験室タンクまたは海洋網生簀に、海水への移し替え後の、単一生産プール由来のＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの２ 群についての成果である。水温や海水への移し替えの場所への移送等の重要な変数は同一であったが、ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトのこれらの２ 群は、海水への移し替え５ 日後の死亡率が実験室タンクに移した場合（死亡率１０％）と海洋網生簀に移した場合（死亡率３７．７％）と異なった。
【０１１４】
海水実験室タンク（死亡率１０％）と海洋網生簀（死亡率３７．７％）との間のこの死亡率の違いについての有望な説明は、海水への移し替え後の異なる明期管理への曝露であろう。実施例１０に詳述されるように、幼魚タイセイヨウサケを海水への移し替え後、連続明期に曝露すると、海水への移し替え後の死亡率が約３４％から６ ％まで低下した。海洋網生簀に移した魚は連続的でない自然の明期に曝露されたため、死亡率が約４ 倍となった。表７ に示されるように、平均体重が２１グラムの幼魚Ｓｔ Ｊｏｈｎ ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ 系統タイセイヨウサケを別に海水に移したとき、ＡＰＳ プロセスＩＩと水面下照明とにより６ 週間処理後の死亡率は、わずか０．２ ％であった。これらの魚は、３０日間水面下ハロゲン照明によって連続明期に曝露された。
【０１１５】
【表７】
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【０１１６】
【表８】
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【０１１７】
海洋網生簀の範囲内の条件に存在する条件と折り合う、より小型の（１０〜３０グラム）ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトについては明白な問題は観察されなかった。これは、自由に群れを成して泳ぐ能力や、商業用のＢｌｕｅ Ｈｉｌｌ Ｂａｙ サケ養殖場に絶えず存在するかなりの海洋水流に通常は対向して泳ぐ能力等の明白な問題がないということも含まれた。これらの観察は、なお進行中であるが、これらのデータは、これらの成魚前の遡河魚が、存在する海洋の水流に対向して泳ぐ能力がなく、したがって適正な摂餌や成長ができないため、海洋網生簀にＡＰＳ プロセスＩＩスモルトを入れその後成長させることを意味しているであろうということを言おうとしているわけではない。
【０１１８】
図 １１ は、実験室タンク（図 １１Ａ）または海洋網生簀（図 １１Ｂ）中の海水への移し替え後のＡＰＳ プロセスＩＩスモルトと死亡魚の特徴を比較したものである。図 １１Ａデータは、海水タンクに移し替え、第５ 日にすべての魚を殺し、分析した１００ 匹のＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの解析から得られたものである。これに対して、図 １１Ｂは、海洋網生簀の死亡率データのみを示す。どちらの場合も、比較的小さなＡＰＳ プロセスＩＩスモルトが死亡した。図 １１Ａ−ＢのＹ軸目盛りの違いに注目のこと。
【０１１９】
海水への移し替え後生存したＡＰＳ プロセスＩＩスモルトと死亡したＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの平均体サイズを比較すると、不成功であったＡＰＳ プロセスＩＩスモルトは、ＡＰＳ プロセスＩＩスモルト移し替え群全体の平均体サイズと比べて、体重が有意に小さかった。すなわち、実験室タンクにおける死亡魚の平均体重（５．１０±２．２ グラム）と海洋網生簀における死亡魚の平均体重（６．４６±１．５ グラム）は、移し替えコホート全体の平均体重（１１．５グラム）のそれぞれ４４％および５６％である。これに対して、体重が１３グラムを超えるＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの死亡率は、実験室タンクでは０ ／１００、海洋網生簀については１ ／１３１６ すなわち０．０７６ ％である。これらのデータを総合すると、 ＡＰＳプロセスＩＩ処理はタイセイヨウサケスモルトの「臨界サイズ」を７０〜１００ グラムから約１３グラムへと定義しなおすことができる。
【０１２０】
ニジマスに対するＡＰＳ プロセスＩＩの適用
いくつかの要因がマスの養殖の発展を妨げている。そのような要因としては、マスの幼魚が、タイセイヨウサケの幼魚に比べて、淡水から海水への突然の移し替えに対する抵抗性がはるかに低いという事実が挙げられる。その結果、多くの商業的海水マス生産者は、維持しているマスを、河口水域にある塩気のある水の養魚場または淡水レンズに移すか、あるいは、標準的な海洋網生簀に存在する全強度海水の代わりに、淡水をマスに提供するような「飲用水」システムを備える。長期の浸透圧適応期間の後、マスをより標準的な海洋網生簀養魚場に移して、その十分な成長のサイクルを完了させる。一般に、マスは、十分成長させるためには、体重が約７０〜９０または９０〜１２０ グラムのときこれらの海洋養魚場への移し替えを行う。
【０１２１】
平均体重が１８グラムの２０００匹のＤｏｎａｌｄｓｏｎ 系統マスを地域の商業用ふ化場（Ｐｉｎｅ Ｔｒｅｅ Ｔｒｏｕｔ Ｆａｒｍ、Ｓａｎｆｏｒｄ 、Ｍａｉｎｅ 、米国）から入手した。これは１９９９年１２月にふ化したもので、淡水から、連続明期に曝露しつつ１１〜１２℃でのＡＰＳ プロセスＩＩへ移した。ＡＰＳ プロセスＩＩ処理の合計継続期間は３５日（２０００年６ 月２１日〜７ 月２６日）であった。Ｌｉｐｏｇｅｎ Ｆｏｒｔｅ （Ａｑｕａｈｅａｌｔｈ社）による予防接種後、マスを、タイセイヨウサケについて上に述べた標準的移し替え法によって、１５．６℃の全強度海水を含む研究用網生簀に直接移した。マスＡＰＳ プロセスＩＩ群全体の平均体重は、表９ に示したように、２２．７グラムであった。
【０１２２】
タイセイヨウサケについて述べたのと同じ方法で行った死亡魚の計数によると、最初の５ 日間に合計５１３ ／１１９０匹即ち４３．１％の死亡率であった。これらの死亡魚の平均体重は、図 １２ に示されるように、１５．５±１．５ グラムであった。タイセイヨウサケＡＰＳ プロセスＩ とプロセスＩＩスモルトが示したのと同様に、より小型のＡＰＳ プロセスＩＩスモルトが死亡し、より大型の魚はほとんどまたは全く死亡しなかった。このように、死亡魚の平均体重は１５．５グラム、即ち海水に移したマス全体の数値の６８．３％であった。全強度海水に入れてから４８時間目に湿った飼料を与え、マスの摂餌を観察した。
【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
図 １２ は、海洋網生簀へ移した後の最初の５ 日間におけるマスＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの死亡魚の体重および体長の分布を示す。これらの５１５ 匹の死亡魚の平均体重は１５．５±１．５ グラムであることに注目のこと。
【０１２５】
まとめると、これらのデータは、本発明の利点はタイセイヨウサケに限定されるのではなく、ニジマスを用いた場合も認められることを証明している。ＡＰＳ プロセスＩＩスモルト工程の適用によって、直接的な海水への移し替えのためのニジマスの「臨界サイズ」が約３０グラムまで有意に低下した。さらに、この適用によって、淡海水へニジマスを移すことの必要性をなくしている。このように、ＡＰＳ プロセスＩＩの適用は、ニジマスの全強度の海水への移し替えに利用することができる養魚場の数が大いに増える。
【０１２６】
海水への移し替え後のＡＰＳ プロセスＩ およびプロセスＩＩスモルトの摂餌および成長の測定
Ｌａｎｄｃａｔｃｈ ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ ＡＰＳ プロセスＩ スモルトに、実験室タンク中または海洋網生簀中の海水への移し替えの４８時間後から飼料給餌を開始した。実験室タンクに移したＡＰＳ プロセスＩ スモルトは、４８時間後に摂餌を開始したが、海洋網生簀に移した魚は７ 日後まで実質的な摂餌は観察されなかった。これらの観察を検証するために、本発明者らは、実験室タンク中、海水への移し替えの４ 日後のＡＰＳ プロセスＩ スモルト４９匹の代表的な試料から得た腸内容物を直接視覚的に調べた。２１／４９匹、即ち４２．９％にその時点でその腸内容物内に飼料の存在が認められた。
【０１２７】
Ｓｔ Ｊｏｈｎ ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトは、実験室タンクに収容するか海洋網生簀に収容するかに関係なく、海水への移し替えの４８時間後に初めて飼料を給餌したとき活発に摂餌した。上記と同じようにＡＰＳ プロセスＩＩスモルト腸内容物の直接分析は、６１／８３匹即ち７３．５％の魚が海水への移し替えの４ 日後に摂餌したことを示した。海洋網生簀内でも、実験室タンク内と同様に、ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの活発な摂餌行動が認められた。総合的に考えると、これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ およびＩＩスモルトが、このプロセスにより処理されてない、よりはるかに大型の工業標準タイセイヨウサケスモルトについて認められるような、海水への移し替え後ほとんど摂餌をしない長い期間（２０〜４０日）はないと考えられる。
【０１２８】
ＡＰＳ は、実験室海水タンク内でＡＰＳ プロセスＩ またはプロセスＩＩで処理した同一の魚の成長速度を定量した。表１０に示されるように、ＡＰＳ プロセスＩ またはプロセスＩＩで処理した両方のタイセイヨウサケは、海水への移し替え後、最初の期間（２１日間）は、急速に成長する。海水への移し替え後、最初の２０〜３０日間は、ほとんど摂餌せず、それゆえ成長しない体重７０〜１００ グラムの工業標準スモルトに比べて、ＡＰＳ プロセスＩ またはプロセスＩＩ処理をした成魚前のタイセイヨウサケは、工業標準スモルトの臨界サイズのわずか２７〜３８％（ＡＰＳ プロセスＩ ）および１２〜１６％（ＡＰＳ プロセスＩＩ）に過ぎないにも関わらず、どちらも実質的な体重増と成長とを示した。今のところ１５７ 日まで延長している期間中の上記のほかに合計４ つの期間について、これらの魚の死亡率、ＳＧＲ 、温度補正ＳＧＲ （ＧＦ３ ）、ＦＣＲ 、体重、体長、条件ファクターに関係するデータを得た。この追加データを実施例１２に示す。
【０１２９】
【表１０】
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【０１３０】
実施例３ ．Ｃａ２＋およびＭｇ２＋へのサケスモルトの曝露は、特定の組織のＰＶＣＲの発現を増加する。
１０ｍＭのＣａ２＋および５．２ｍＭ のＭｇ２＋に曝露したスモルトでは、ＰＶＣＲの発現が、処理せずに直接海水に移し替えたスモルトと同様に、増加することが認められた。
【０１３１】
ＭＳ２２２ により動物を麻酔後、タイセイヨウサケまたはニジマスから組織を採取した。組織試料は切開によって採取し、３ ％パラホルムアルデヒドに浸漬して固定し、リンゲル液で洗浄し、ついで、ドライアイス上、冷却したメチルブタンを用いてＯ．Ｃ．Ｔ．ＴＭ（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．、Ｅｌｋａｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ 、米国）等の包埋剤中凍結した。クライオスタットで厚さ８ ミクロンの組織切片を作成（ｃｕｔ） 後、個々の切片を様々な染色プロトコールに供した。簡単に述べると、ガラススライドにマウントした切片を、１ ）ヤギ血清または同一種の魚から得た血清でブロックし、２ ）ウサギ抗ＣａＲ 抗血清とともにインキュベートし、３ ）洗浄し、パーオキシダーゼ結合アフィニティー精製ヤギ抗ウサギ抗血清とともにインキュベートした。結合したパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗血清の位置を、バラ色のアミノエチルカルバゾール反応生成物の発生で視覚化した。個々の切片を標準的な光学顕微鏡法によってマウントし、観察し、撮影した。抗ＰＶＣＲ抗血清の作成方法は下記のとおりである。
【０１３２】
その結果を、抗ＰＶＣＲ抗血清を用いたタイセイヨウサケスモルトの近位腸上皮の免疫細胞化学を示す顕微鏡写真７ 枚からなる一組であるＦｉｇ． １３Ａ−１３Ｇ 並びにＣａ２＋およびＭｇ２＋処理淡水に曝露後、海水に移したサケスモルトの腸のウエスタンブロットであるＦｉｇ． １４ に示す。抗血清は、ツノザメＰＶＣＲのカルボキシル末端ドメインによってコードされたタンパク質配列を含む１６−ｍｅｒペプチド（「ＳＫＣａＲ 」）でウサギを免疫処置して作成した（Ｎｅａｒｉｎｇ，Ｊ ら、１９９７、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ． ８：４０Ａ ）。抗ＰＶＣＲ抗体の特異的結合は、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ ）反応生成物によって示される。
【０１３３】
図１３Ａ および１３Ｂ は、淡水で維持し、ついで、海水に移し、３ 日間経たスモルトの腸上皮を染色したものである。多量のＰＶＣＲ免疫染色が、腸腔表面の内壁にある細胞にはっきりと認められる。Ｆｉｇ． １３Ｂに示される高倍率（１４４０×）写真は、腸上皮細胞の頂端の（腔に面した）膜にＰＶＣＲタンパク質が局在していることを示す。ＰＶＣＲ染色パターンは、頂端の上皮細胞膜　（小さな矢尻）および球状細胞の膜（矢印）に局在する。図１３Ｃ は、ＡＰＳ プロセスＩ 処理し、１０ｍＭ　Ｃａ２＋と５．２ｍＭ 　Ｍｇ２＋とを含有する淡水に５０日間入れた代表的な１ 匹のスモルトから得た腸上皮を染色したものである。前記ＰＶＣＲ染色パターンが、頂端膜染色（小さな矢尻）および球状細胞（矢印）を含む図 １３Ａおよび１３Ｂ の上皮細胞のパターンと似ていることに注目のこと。図１３Ｄ は、ＡＰＳ プロセスＩ 処理し、１０ｍＭ Ｃａ２＋ および５．２ｍＭ Ｍｇ２＋を含む淡水中５０日間維持し飼料中１ ％のＮａＣｌを与えた別の代表的な魚から得た腸上皮をＰＶＣＲ染色したものの１９００×倍率写真である。やはり小さな矢尻と矢印とはそれぞれ頂端膜と球状細胞のＰＶＣＲ染色を表す。図１３Ａ −Ｄ に示される顕著なＰＶＣＲ染色とは対照的に、図１３Ｅ （１４４０×）および１３Ｆ （１９００×）は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋または飼料中ＮａＣｌを補充せずに淡水のみで維持した２ 匹から得た腸上皮の染色である。１３Ｅ および１３Ｆ の両方が有意なＰＶＣＲ染色を著しく欠如することを示す。図１３Ｇ （１４４０×）は、抗ＰＶＣＲ抗血清がＰＶＣＲタンパク質を識別した図１３Ａ に示されるものに対応する切片上に免疫前の血清を置換すると、いかなる明白なＰＶＣＲ染色をも欠如することを示す。ＰＶＣＲ染色の欠如は、抗ＰＶＣＲ抗血清のこれらの免疫細胞化学条件下の特異性を証明する対照である。
【０１３４】
淡水スモルトの腸上皮細胞に存在するＰＶＣＲタンパク質の相対的量（図１３Ｅ および１３Ｆ ）は、選ばれた腸上皮細胞のかすかな染色により示されるように、無視できるものであった。これに対して、これらのスモルトを海水に移すと、対応する腸上皮細胞のＰＶＣＲタンパク質含量は有意に増加した　（図１３Ａ および１３Ｂ ）。重要なことに、ＰＶＣＲタンパク質含量は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を補充した淡水中で維持したスモルトの腸上皮細胞でも有意に増加した（図１３Ｃ および１３Ｄ ）。免疫抗血清を免疫前のものに置き換えると、腸上皮細胞切片からすべての反応生成物が消えた（図１３Ｇ ）ため、ＡＥＣ 染色は抗ＰＶＣＲ抗血清の存在に特異的であった。
【０１３５】
パラフィン切片を用いたタイセイヨウサケの浸透調節臓器のその他の部分におけるＰＶＣＲタンパク質の局在の開示。ＰＶＣＲタンパク質が腸上皮細胞の頂端膜と側底膜の両者に局在していることの証明。
本明細書に記載される方法を用いて、海水に適応させた幼魚タイセイヨウサケスモルトの様々な浸透調節臓器のパラフィン切片の免疫局在データを得た。ＰＶＣＲタンパク質は、特異的抗ＰＶＣＲ抗体の結合で測定したところ、次の臓器に存在した。これらの臓器は、様々な浸透調節機能に重要である。これらの臓器としては、尿の処理に応答しうる特別な尿細管および膀胱、一つ一つが魚を取り巻く水に浸っている皮膚、鼻ラメラおよび鰓の選ばれた細胞等である。ＰＶＣＲは、魚が摂取した海水を処理する胃、幽門盲腸、近位腸、遠位腸等の消化管の様々な部分にも見られた。これらの組織を、ＡＰＳ プロセスによる処理後と、淡水から海水への移し替え後に分析した。さらに、ＰＶＣＲタンパク質には、胃、近位腸、幽門盲腸に存在すると報告されている様々なアミノ酸に対する栄養素受容体としての働きもあると考えられている。
【０１３６】
とくに、胃、近位腸および幽門盲腸の選ばれた細胞におけるＰＶＣＲ免疫局在の高倍率像が得られた。ＰＶＣＲタンパク質は、胃の陰窩の基底に局在する胃上皮細胞の頂端（腔に面した）膜と基底外側の（血管に面した）膜の両者に存在するだけでなく、胃の粘膜下部分に存在する神経内分泌細胞にも存在する。消化管の神経内分泌細胞上のその位置から、ＰＶＣＲタンパク質は、腸上皮細胞にごく近接した局所的環境を感知して、重要な消化管ホルモン（例えば、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、セロトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ ））の分泌と合成を調節することができる。重要なことに、ＡＰＳ プロセスＩＩの成分が少なくとも２ つの手段で消化管神経内分泌細胞に影響すると考えられている。ＡＰＳ プロセスＩＩの成分が消化管内分泌系を改造する１つのやり方は、これらの細胞によって発現されるＰＶＣＲの発現および／または感受性の改変を介することである。もう一つのやり方は、例えば、消化管代謝酵素によって５−ＨＴおよびセロトニンに変換されるトリプトファンのような先駆化合物を大量に供給することである。
【０１３７】
同様にして、ＰＶＣＲタンパク質は、近位腸の内壁の上皮細胞の頂端膜と基底外側の膜の両者に局在している。それぞれの位置から、ＰＶＣＲタンパク質は、二価陽イオン、ＮａＣｌ、特異的アミノ酸の管腔内含量も血液内含量も感知することができ、それにより、腸上皮細胞の多様な栄養素およびイオン吸収−分泌機能を統合することができる。幽門盲腸の上皮細胞も豊富な頂端ＰＶＣＲタンパク質を持っている。
【０１３８】
抗ＣａＲ 抗血清がサケスモルトＰＶＣＲを認識する特異性をさらに示すために、Ｆｉｇ．１４は、１０ｍＭのＣａ２＋、５ｍＭ のＭｇ２＋中で維持し、飼料中１ ％ＮａＣｌを与えたサケスモルトから得た腸タンパク質のウエスタンブロットを示す。近位および遠位腸の部分をＳＤＳ 含有緩衝液中でホモジナイズし溶解し、標準技術を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースに転写し、タンパク質定量法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ． 、Ｒｏｃｆｏｒｄ 、ＩＬ）とＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色との両方で測定した同量のホモジネートタンパク質について、標準ウエスタンブロッティング技術によってＰＶＣＲの存在を検索した。その結果、「ＣａＲ 」と表示して左列に示され、約１４０ 〜１６０ｋＤａのブロードなバンドといくつかのより高分子量の複合体を示す。このＰＶＣＲバンドパターンは、サメ腎臓（Ｎｅａｒｉｎｇ，Ｊ ら、１９９７、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８：４０Ａ）とラット腎臓内髄集合管（Ｓａｎｄｓ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１３９９−１４０５）について以前報告されたものと類似している。右列はＦｉｇ． １３Ｇに使用した免疫前の抗ＰＶＣＲ血清で処理されたものであり、バンドの完全な欠如を示す。図 １３ に示される免疫細胞化学データを考慮すると、この免疫ブロットは使用した抗血清がサケのＰＶＣＲタンパク質の検出に特異的であることが証明される。
【０１３９】
実施例４ ．Ｃａ２＋およびＭｇ２＋へのマス幼魚の曝露は、ＰＶＣＲの発現を増加させる。
鰓、腎臓、腸組織の上皮細胞における特異的イオン輸送能の発達は、成魚前の魚にとって海水への移し替え後、生存するために重要である。ＰＶＣＲ発現の変化が海水中のマス幼魚の生存率の増加に関係があるかどうか判定するために、免疫ブロッティングおよび免疫細胞化学を、サケスモルト組織に実施した時と同様に、マス幼魚から得た試料について行った。その結果を図１５、１６および１９に示した。
【０１４０】
図１５は、マス幼魚の腸組織の免疫ブロットである。抗ＣａＲ 抗血清は、免疫（ＣａＲ と表示した列）と免疫前（免疫前と表示した列）との比較から決定されるように、ＰＶＣＲ染色に特異的な多数のバンドを識別する。これらのバンドのうち顕著なものは、１２０ 〜１６０ｋＤａのブロードなバンドと、腸および鰓の両者の組織のバンドの上方に認められるより大きな分子量の複合体である。
【０１４１】
図１６Ａ 、１６Ｂ 、１６Ｃ 、１６Ｄ 、１６Ｅ 、１６Ｆ 、１６Ｇ および１６Ｈ は、抗ＰＶＣＲ抗血清を用いたニジマス近位腸上皮の免疫細胞化学を示した顕微鏡写真８ 枚のセットである。図１６Ａ 、１６Ｃ および１６Ｅ は、淡水のみで維持したマスの試料を示し、図１６Ｂ 、１６Ｄ 、１６Ｆ 、１６Ｇ および１６Ｈ は、１０ｍＭ Ｃａ２＋ 、５．２ｍＭ Ｍｇ２＋を補充した淡水中で維持し、１％ ＮａＣｌ 飼料を給餌したマスの試料を示す。近位腸断片は、Ｆｉｇ． １６Ａ−１６Ｄ 、１６Ｇ −１６Ｈ に、遠位腸断片をＦｉｇ． １６Ｅ−１６Ｆ に示す。図１６Ａ −１６Ｆ は、免疫ウサギ抗ＣａＲ 抗血清で処理し、洗浄し、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ ）反応を用いてセイヨウワサビのパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗血清で発色させたものである。図１６Ａ 、１６Ｃ および１６Ｅ は、ＰＶＣＲ染色がほとんどまたは全く無いが、図１６Ｂ 、１６Ｄ および１６Ｆ は、腸管腔内壁の細胞の頂端膜（小さな矢尻）および比較的大きな球状細胞（矢印）に存在する有意なＰＶＣＲ染色を示す。免疫抗ＰＶＣＲ抗血清に曝露した切片とは対照的に、図１６Ｈ は、免疫前ウサギ抗ＣａＲ 抗血清で処理し、そのため、着色したＡＥＣ 反応生成物を含まない。これらのデータは、この方法が抗ＰＶＣＲ抗血清に結合したＰＶＣＲタンパク質を特異的に検出することを示す。図１６Ｇ は、腸内に存在するムチン産生上皮細胞の局在決定を行うために、Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ （Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｄ．Ｃ．ら、１９８０、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （組織化学の理論と実際）、Ｂａｔｔｅｌｌｅ ＰｒｅＳＳＣｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ、米国）で直接染色したものである。図１３Ｄ におけるＰＶＣＲタンパク質に対する細胞染色（小さな矢印で示した）の外見が、図１３Ｇ において、Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ で染色した細胞と同様な形態学的外見を示していることに注目のこと。これらのデータは、ＰＶＣＲシグナル化作用が腸内のムチン産生を調節する場所である腸内のムチン産生細胞によってＰＶＣＲが発現されると考えられる。
【０１４２】
腸組織の免疫細胞化学によって、ＰＶＣＲタンパク質の含量は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を補充した淡水で維持しＮａＣｌ補充飼料を与えた場合（図１６Ｂ 、１６Ｄ および１６Ｆ ）に対して、淡水のみで維持したマス（図１６Ａ 、１６Ｃ および１６Ｅ ）では異なることを示す。通常、淡水では、ＰＶＣＲ発現は近位腸切片（図１５Ａ および１６Ｃ ）または遠位腸切片（図１６Ｅ ）のいずれでも低い。しかし、１０ｍＭ Ｃａ２＋ および５．２ｍＭ Ｍｇ２＋を補充した淡水に曝露しＮａＣｌ補充飼料を与えると、近位（図１６Ｂ および１５Ｄ ）および遠位断片（図１５Ｆ ）の両方でＰＶＣＲ発現は有意に増加する。
【０１４３】
ＰＶＣＲタンパク質は多数の細胞のいくつかの領域に局在しているが、ときどき球状細胞（大きな矢尻）と同様に、腸上皮細胞（小さな矢尻）の頂端膜上に強い染色が認められることは、ツノザメ（Ｎｅａｒｉｎｇ，Ｊ．ら、１９９７、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８：４０Ａ）やラット腎臓内髄集合管（ＩＭＣＤ）（Ｓａｎｄｓ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１３９９ 〜１４０５）の両方でＰＶＣＲタンパク質が局在するデータと同じである。タイセイヨウサケスモルトについて上述したように、マス腸の頂端ＰＶＣＲは、管腔Ｃａ２＋およびＭｇ２＋濃度の増加によって誘導され、これによって腸内容物からのＮａＣｌ仲介による水の回収を制御している。この回収は、皮膚と鰓とを介して起こる浸透圧による水損失を元に戻すため、海洋魚の生存に重要である（Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ｈ．、１９９３、Ｄ．Ｈ．Ｅｖａｎｓ 編集Ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｓ（魚類の生理学）中「Ｏｓｍｏｔｉｃ ａｎｄ Ｉｏｎｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（浸透圧とイオンの制御）」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ 、ＢｏＣａＲａｔｏｎ 、Ｆｌｏｒｉｄａ 、米国、第１１章、３１５ 〜３４１ 頁）。
【０１４４】
より大きな腸上皮細胞の合間に散在している球状細胞の抗ＰＶＣＲ染色（Ｆｉｇ． １６Ｄ）は、Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ で強く染まることが知られているムチン産生細胞に対応する細胞とも一致する（Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｄ．Ｃ．ら、１９８０、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （組織化学の理論と実際）、Ｂａｔｔｅｌｌｅ ＰｒｅＳＳＣｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ、米国）（Ｆｉｇ． １６Ｇ）。
【０１４５】
図 １７ は、図 １３ −１５に記載したのと同じ抗ＰＶＣＲ抗血清を用いて、マスの鰓組織から調製したタンパク質ホモジネートのＰＶＣＲ含量の全体レベルを比較する代表的な免疫ブロットを示す。鰓組織の切除とホモジネート化前に、淡水、または１０ｍＭカルシウムと５．２ｍＭ マグネシウムとを含む淡水と飼料中ＮａＣｌ補充、または飼料中ＮａＣｌ補充のみの淡水の３ 種類のいずれかでマスを処理した。鰓では、抗ＰＶＣＲ抗血清によって、やはり１２０ 〜１４０ｋＤａのブロードなバンドと、大きな分子（２００ｋＤａを超える）のバンドが識別され、これは図 １４ および１５に示したものと類似している。これらのデータは、ラット（Ｓａｎｄｓ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１３９９ 〜１４０５）、カレイ、サメ（Ｎｅａｒｉｎｇ，Ｊ．ら、１９９７、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．８：４０Ａ）等の複数の生物の免疫ブロッティング分析で観察されたものと似た、構造が既知のＣａＲ の分子と一致している。マスを淡水中維持した場合（ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ）、ＰＶＣＲ反応性バンドで判定した鰓中ＰＶＣＲ発現は中程度であった。マスをＡＰＳ プロセスＩ 処理した場合（Ｃａ、Ｍｇ＋ＮａＣｌ ｓｕｐＰＬ．Ｆｅｅｄ ）は、中央列に示したように、ＰＶＣＲタンパク質量が増加した（Ｃａ、Ｍｇ）。これに対して、マスを淡水中カルシウムおよびマグネシウムに曝露することなく淡水中で維持しＮａＣｌ飼料を与えた場合は、全体的なＰＶＣＲ染色強度に変化はないが、むしろＰＶＣＲ反応性が１２０ｋＤａから、より大きな２００ｋＤａの高分子バンドへシフトする（ｓａｌｔと表示した列）。これらのデータは、マスをＡＰＳ プロセスＩ （１０ｍＭカルシウムと５ｍＭ マグネシウムとを含有した淡水、飼料中ＮａＣｌ補充）処理すると、淡水のみの場合と比べて、鰓におけるＰＶＣＲ発現が増加することを証明している。マスを淡水中維持しながらＮａＣｌ補充飼料を給餌した場合は、ＰＶＣＲタンパク質の同様な発現増加は見られない。
【０１４６】
実施例２１に示されるデータは、鰓塩類細胞上に存在するＰＶＣＲタンパク質がＡＰＳ プロセスＩＩによる魚の処理に応答し、塩類細胞の分布とＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の両者を、魚を海水に移した後のプロセスと非常に似た様式で、改造することを示す。ＡＰＳ プロセスＩＩによる遡河魚のこの処置によって、タイセイヨウサケ幼魚を海水に移した後の適応がより迅速になり、動作や成長が改善される。
【０１４７】
実施例５ ：サケの表皮粘液細胞および脳における多価陽イオン受容体（ＰＶＣＲ）の免疫学的局在決定
サケ科の魚の皮膚表面は、その魚が淡水にいるか海水にいるかによって水分が増減するのを防ぐためのバリアとして極めて重要である。したがって、魚の表皮層の特別な細胞中のＰＶＣＲタンパク質の存在は、それまでに流れた環境水の塩度を「感知」し、サケ科の魚の皮膚をそれが存在する水の組成に基づいて絶えず改造する機会に備えることができるであろう。
【０１４８】
方法：海水中に１２日間以上いたタイセイヨウサケ幼魚から採取した皮膚の試料を、緩衝液（０．１Ｍ ＮａＰＯ４、０．１．５ｍ ＮａＣｌ 、０．３Ｍショ糖、ｐＨ７．４ ）に溶解した３％パラホルムアルデヒド中で固定し、手作業でうろこを取り、緩衝液ですすぎ、凍結切片のために、−８０℃で凍結した。１０ミクロン切片は、抗サメＰＶＣＲ抗血清を用いるＰＶＣＲ免疫学的局在決定に使用するか、または粘液の酸性糖タンパク質成分を含有する細胞を局在化するために１％ Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ色素で直接染色した。
【０１４９】
結果および考察：図 １８Ａは、サケ表皮が、様々な皮膚層に存在する多数のＡｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ 染色細胞を含むことを示す。一部のより大きな細胞（酸性ムチンを含む）の一部だけがＡｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ で染色されることに注目のこと（白矢尻で表示）。うろこは取り去ってあるので、方向を知る手がかりとして、星印はそれまで海水に浸っていた表面を表していることに注目のこと。図 １８Ｂはこの皮膚の表皮層内の多数の細胞（矢尻で示される）に局在するサケ皮膚ＰＶＣＲタンパク質の免疫学的局在決定を示す。抗ＰＶＣＲ染色が、図 １８Ａに示したように、Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ で染色される対応の頂端部分よりも大きな細胞体全体を示していることに注目のこと。結合した抗ＣａＲ 抗体の存在は、バラ色反応生成物によって示される。これらの切片について正式な定量はまだ行われていないが、ＰＶＣＲ細胞の数は、Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ 陽性細胞の総数より少ないようである。これらのデータは、Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ 陽性細胞のサブセットのみが豊富なＰＶＣＲタンパク質を含むことを示す。図 １８ の図 １８Ｃは、一次抗ＣａＲ 抗血清を染色反応から除外した対照免疫前切片を示す。一次抗体がなければバラ色の反応生成物はないことに注目のこと。
【０１５０】
これらのデータは、タイセイヨウサケ幼魚の表皮に局在する個々別々の上皮細胞（おそらく粘液細胞）にＰＶＣＲタンパク質が存在することを示す。この位置から、ＰＶＣＲタンパク質は、環境水の塩度を「感知」して、皮膚自体の中での粘液分泌の変化や粘液細胞の増殖を介して粘液産生を調節できると考えられる。環境水中に存在するＰＶＣＲアゴニスト（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）は、スモルトが本発明のプロセスに曝露されている期間中、これらの表皮ＰＶＣＲタンパク質を活性化する。本発明のプロセスによるタイセイヨウサケスモルトのこの処理は、スモルトを海水に移した後のその生存率増加に重要である。
【０１５１】
実施例６ ：タイセイヨウサケの脳におけるＰＶＣＲタンパク質の局在決定：
ＰＶＣＲタンパク質は、免疫細胞化学と、サメＰＶＣＲのカルボキシル末端に見られるペプチド配列に対して作られた抗体を用いて、タイセイヨウサケの脳幹部に特異的に局在決定することができる。これらのデータは、内分泌機能の調節におけるＰＶＣＲの役割およびタイセイヨウサケにおける食欲制御と一致する。
【０１５２】
カルシウム受容体の発現が哺乳動物の脳の特殊な部分に局在することはすでに判明している。哺乳動物の脳の多くの部分における哺乳動物ＣａＲ の正確な機能はまだ不明であるが、いくつかの証拠によると、ＣａＲ は、全身のカルシウム、ナトリウム、水の代謝の変化を、視床下部からのアドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）等のホルモンの分泌の差や、渇きや摂食の制御等の行動変化等の脳機能の調節と統合することができる。以下に詳述される開示知見で重要なことは、淡水から海水へ移る遡河魚の内分泌機能や飲水、摂食の変化に果たすＰＶＣＲ（ＣａＲ ）の役割が重要であることである。
【０１５３】
哺乳動物の脳では、脳弓下器官、すなわちＳＦＯ に顕著なＣａＲ 発現がある。ＳＦＯ は、中心的な視床下部の渇き感知中枢であり、体内カルシウムおよび水のホメオスタシスを統合するために飲水活動を調節する役割があると考えられている。ＳＦＯ に存在するＣａＲ の刺激による全身過カルシウム血により飲水行動を刺激すると、腎臓ろ過水の尿細管再吸収を鈍化させる腎臓機能の変化によって起こる脱水を最小限に抑えられると考えられる。魚の脳の同等ＳＦＯ 部分は今のところ見つかっていない。
【０１５４】
哺乳動物の脳では、脳幹の脳橋部分に、とくに第三脳室近くの最後野周囲に、ＣａＲ 発現が見られる。最後野は、食欲を仲介すると考えられるニューロンの集まりであることが知られており、「吐気中枢」と呼ばれている。哺乳動物の脳のこの部分から出るニューロン経路が、前庭機能（平衡の感知）からの感覚入力や視神経および脳におけるそれぞれの中核からの経路を通る視覚入力の統合に備えている。脳のこの部分は、過カルシウム血やヒトへのアヘン給餌によって起こる吐気に密接に関係していると考えられている。魚の脳の同等の最後野は現在のところ見つかっていない。
【０１５５】
生理学的データと解剖学的データを合わせると、ヒトにおいて血清カルシウム濃度の変化に様々な内分泌機能を統合させるＣａＲ の役割を示す証拠を提供する。血清カルシウム濃度を上昇させるに十分なカルシウムを静注すると、前下垂体によって産生されるＡＣＴＨと同様に、性腺刺激ホルモン放出ホルモンおよび甲状腺放出ホルモン（ＴＲＨ ）を選択的に増加させる。前下垂体はＣａＲ を発現する視床下部の特異的部分と直接連結していることが知られる。
【０１５６】
ヒトの血清中カルシウム濃度の増加は、内分泌機能にも、行動にも、多くの変化を引き起こす。したがって、過カルシウム血は、飲水を増進し、食物消費量を低減させ、特異的な視床下部ホルモンの循環濃度を変化させる。後述するように、類似の行動および循環ホルモン濃度の変化が、スモルト化中や淡水から海水への移し替え中の成魚前の遡河魚に起こる。
【０１５７】
方法：
ＡＰＳ プロセスＩＩに供し海水に移した成魚前タイセイヨウサケ（Ｓｔ．Ｊｏｈｎ ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ ＡＰＳ プロセスＩＩスモルト）から得た脳全体をその周囲組織から切除し、緩衝液［他の免疫細胞化学の記述と同じもの］中３ ％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ ）で固定した。８ ミクロン切片を作成し、ガラススライドに乗せ、ツノザメの非免疫対照抗血清または抗ＰＶＣＲを用いて免疫細胞化学のための処理を行った。特異的抗体結合は、セイヨウワサビのパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗血清の作用で生成したバラ色の反応生成物によって検出した。切片は標準的光学顕微鏡法によって観察し撮影した。
【０１５８】
結果および考察：
複数の成魚前タイセイヨウサケから得た一連の切片を観察後、サケ脳の少なくとも７ つのはっきり区別できる領域に局在する細胞にＰＶＣＲタンパク質の局在が一貫して認められた。ＰＶＣＲ局在の最初の領域は、迷走神経葉部分のニューロンの明確な染色である。ＰＶＣＲ染色の第二の部分はＣａｊａｌ 交連核におけるニューロン内である。サケ脳のこれらの領域はどちらも、味覚活動（食物を感知し食する）並びに食道および腸の運動を含む一般的な内臓活動（栄養素および水の再吸収のために食物および腸内容物を処理する）において重要な核であることが知られている。ＰＶＣＲタンパク質の発現は、血清およびＣＮＳ の両者のカルシウム濃度の変化を、遡河魚の海水への適応に重要な摂食と腸内容物の処理の変化に結び付ける。
【０１５９】
サケ脳における三つめのＰＶＣＲ局在は、ＰＶＣＲタンパク質が複数の細胞型にわたって分布する血管嚢である。血管嚢はｏｖｉｄであり下葉間の脳の腹側表面上に局在している。この構造物は、高度に血管化されており、髄液と血管空間との間の連結構造を含む。さらに、血管嚢内に存在するニューロンは、視床の上衣下部分に広がる大きな神経突起を持っている。この血管嚢系は、後結節および脳室周囲視床の中枢の機能を調節する。脳のこれらの区域は、下垂体に隣接している。
【０１６０】
成魚前タイセイヨウサケの脳におけるＰＶＣＲタンパク質の局在は、哺乳動物の脳について上述したのと同様に、ＰＶＣＲが遡河魚の中枢神経系における様々な機能に関与しうるという証拠を提供する。特に、ＰＶＣＲがタイセイヨウサケの味覚系の一部である核に局在していることは、ＰＶＣＲタンパク質が、哺乳動物の最後野について述べたのと同様に、食欲を調節するニューロンに発現されることを示す。したがって、本願におけるタイセイヨウサケについて示されたように、血清中のカルシウム、マグネシウム、ナトリウム濃度の変化を介してのＰＶＣＲの刺激またはその発現の変化は、食欲と食物消費量とを調節することができるであろう。一方、ＣＳＦ と血管系との間の交換によるこれらのイオンの髄液中濃度の変化にも関与しうる。現在の工業標準法によって生産されるタイセイヨウサケスモルトは、それを海水に移した後は、深刻な食欲不振の期間を経験するため、このよく知られた食欲抑制は、ＰＶＣＲシグナル伝達機構によって仲介されうる。
【０１６１】
同様に、ＰＶＣＲシグナル伝達経路は、飲水行動および下垂体ホルモン分泌のどちらも調節することができる。血管嚢に発現されたＰＶＣＲタンパク質は、タイセイヨウサケによる海水の飲水行動の開始に備えることができ、またこれは過カルシウム血によって起こる哺乳動物の飲水行動の増強と全く同じ可能性がある。成魚前の遡河魚を淡水から海水へ移すことによって起こる血清カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの濃度の増加は、ＡＣＴＨのような視床下部ホルモンの分泌増強にとっても刺激となりうる。ＡＣＴＨは魚の副腎によるコルチゾル分泌を刺激する。コルチゾルは、イオン輸送活動のモデュレータであることが証明されたホルモンであり、遡河魚における稚魚サケスモルト変成の調節に関与する。血管嚢、視床下部および下垂体間の結合を介する下垂体活動の調節が、これらの内分泌変化を調節しうる。
【０１６２】
松果体の柄、嗅神経、嗅球、下垂体のプロラクチン産生細胞等の幼魚タイセイヨウサケの脳および脳関連構造物のその他の領域において、ＰＶＣＲタンパク質の局在が認められた。ＰＶＣＲが局在した脳の上記３ 部分のほかに、得られた追加データは、遡河魚スモルトの海水中動作の中心的な制御要因であることが知られている少なくとも４ つのその他の脳部分または脳関連組織中に、ＰＶＣＲが発現されることを示した。
【０１６３】
これらの局在から得られたデータは、海水適応した幼魚タイセイヨウサケの大型細胞核、嗅葉および嗅神経に存在するニューロン並びに松果体の柄が大量のＰＶＣＲタンパク質を発現することを示す。これに対して、脳のその他の多数の脳核は、検出できるＰＶＣＲタンパク質を持っていない。脳の大型細胞核におけるＰＶＣＲタンパク質の存在は、おそらく、魚の飲水行動の制御要因としてのこの核の提唱された関与によるのであろう。このように、血清Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋またはＮａＣｌの濃度の変化が、ＰＶＣＲを有するニューロンによって感知され得、海水への移し替え後の生存に必要な飲水行動が開始されるのであろう。同様に、嗅葉および嗅神経の両方にＰＶＣＲタンパク質が存在することは、核をもった嗅覚ラメラ（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｌａｍｅｌｌｅ ）（環境水のイオンおよび栄養素濃度を感知する）から脳の他の部分へのニューロン入力をＣａ２＋、Ｍｇ２＋またはＮａＣｌの血清中濃度の感知に基づいて調節することができる。カルシウムイオンは、光によって調節されるホルモンであるメラトニンの魚松果体からの発生に中心的役割を果たす。したがって、松果体の柄に存在するＰＶＣＲタンパク質発現ニューロンは、血清中Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋またはＮａＣｌを感知し、それにより、明期曝露によって発生するシグナル、メラトニン合成、幼魚タイセイヨウサケの体組成の変化の間の統合を行っている。この系は、実施例１０に詳述されたように、プロセスＩＩ処理魚の海水への移し替え後の明期の影響を促進するのであろう。
【０１６４】
幼魚タイセイヨウサケの下垂体の免疫学的局在研究は、腺下垂体のプロラクチン産生細胞にＰＶＣＲタンパク質の顕著な発現を明らかにする。抗ＰＶＣＲ抗血清または抗成長ホルモン抗血清のいずれかによる単一下垂体の一連の切片の染色を得、分析した。得られたデータは、プロラクチン産生細胞のみがＰＶＣＲタンパク質を有し、一方、近接する成長ホルモン産生細胞は、検出可能なＰＶＣＲタンパク質を持たない。これらのデータは、淡水におけるサケ科の体組成の制御における中心的ホルモンとしてのプロラクチンの顕著な役割と一致する。さらに、プロラクチンは、海水が促進する成長ホルモンの作用の拮抗剤として作用する。これらのデータは、元来、プロラクチンが、海水への移行直前の期間に魚の組織を海水中の生活に向けての改造を促進すると思われる成長ホルモンの作用に対向することによって、幼魚サケを保護することを示す。幼魚タイセイヨウサケの下垂体のプロラクチン産生細胞におけるＰＶＣＲタンパク質の存在は、これらの細胞に、実施例７ で示されたように、血清中のＣａ２＋、Ｍｇ２＋またはＮａＣｌの変化を介して、魚が海水に移る正確な時期を感知させることができる。プロラクチンの放出および／または合成の低下は、循環プロラクチン濃度を低下させるため、成長ホルモンのプロラクチン拮抗作用を低下させて幼魚サケを完全に海水に適応させる。魚をＡＰＳ プロセスＩ またはプロセスＩＩ処理すると、血清中のＣａ２＋、Ｍｇ２＋またはＮａＣｌを海水への移行時と同じように変化させ、魚が海水への移し替えに備えられるようにする。
【０１６５】
実施例７ ：ＡＰＳ プロセスＩ またはＡＰＳ プロセスＩＩに曝した魚の血清中濃度
本明細書に記載されるデータは、遡河魚の体液中のカルシウム、マグネシウムおよびＮａＣｌの濃度の変化が海水への移し替え後に起こり、過剰に高い濃度は、遡河魚の海水への移し替え後、死亡を招き、或いは寄与することを示している。ＡＰＳ プロセスＩＩは、小型の成魚前遡河魚を浸透ストレスにさらすことなく、海水への移動を模倣するものである。したがって、魚のこの処理は、これまでより有意に小型のサイズの段階で、また工業標準実施法では許されていない条件下で、海水に移し替えることができる。
【０１６６】
ＰＶＣＲは、ＰＶＣＲが環境海水に曝露される複数の組織（鰓、皮膚）、嗅覚ラメラ、細管の管腔内容物（腎臓、腸）並びに内部体液（脳、内分泌組織、筋肉）に存在している。遡河魚が淡水から海水に移されると、カルシウム、マグネシウムおよびＮａＣｌの外部水中濃度が急激に上昇する。飲水行動または浸透圧によって、魚が吸収するカルシウム、マグネシウムおよびＮａＣｌの量が増えると、腸および腎臓の上皮細胞の頂端表面上に存在するＰＶＣＲが、増加したこれらの二価および一価のイオンに曝露されることになる。二価陽イオンのこれらの増加は、腎臓が二価陽イオンの第一の排泄臓器であり、腸は摂取した海水の処理による遡河魚にとって主要な水回収臓器であるため、生じる。このデータ開示にとって重要なのは、カルシウム、マグネシウムおよびＮａＣｌの濃度が魚の血液および細胞外液中で増加すれば、このような体液に浸っているＰＶＣＲが刺激され始めるであろう。血清カルシウムおよびマグネシウムの変化は実際のシグナル伝達経路を構成する。これに関して、遡河魚におけるカルシウム、ナトリウム、マグネシウムおよび塩化物の血清中濃度に対し、広い範囲の「正常」値があるということも注目に値する。これらのイオンの定常状態血清中濃度は、塩度の違いによって変化することは認識されているが、本明細書に記載されるようにＰＶＣＲ　「セットポイント」の違いを持った魚を表しているという認識はない。
【０１６７】
サケ科の魚の現在の生産方法は、スモルトと呼ばれる成魚前の魚が淡水から海水への移し替えに耐える（ｓｕｒｖｉｖｅ） 「臨界サイズ」の達成にかかっている。
【０１６８】
養殖漁業としてのサケ科の魚の生産は、成魚前の魚が直接淡水から海水への移し替えに耐えることができるかどうかにかかっている。この工程を行うために、現在の工業的方法では、サケ科の各種毎に「臨界サイズ」を同定している。この臨界サイズ以下では、多数の魚が水の浸透圧およびイオン組成の劇的な変化に耐えることはできない。「臨界サイズ」スモルトの能力に寄与する要因は、対容積比表面積と、新たな海水イオン環境に対処するためのイオン輸送およびホルモン機構の成熟度等である。これらの機構は、鰓、消化器官、腎臓、皮膚等のいくつかの臓器からの協調のとれた応答と、海水曝露後の飲行動の開始等の特別な行動変化等が関与する。淡水から海水環境への魚の移し替えは、魚が生存できるように急速に改造されるこれらの浸透調節系にとって、大きな挑戦である。基本的な浸透調節機構と応答を図 １９ に簡単に概説する。
【０１６９】
魚が淡水に棲んでいる場合、イオン含量および浸透圧が体内より有意に低い水環境に囲まれる（表１１）。魚の体液と周囲環境との間に存在する浸透勾配のために、魚は、該魚の体液のより高い濃度のイオン含量を希釈することにたえず直面する水を絶えず受け入れている。その結果、淡水魚は飲まずに大量の薄い尿を排泄する。重要な体内塩分を環境中へ失うことを防ぐために、鰓、消化器官および尿細管は、それらの管腔内容物または周囲淡水からイオンを積極的に取込むことに専念する。
【０１７０】
【表１１】
2004510443.tif 000012
【０１７１】
これに対して、魚が海水に棲んでいる場合、周囲の水環境のほうが魚自身の体組成に比べてイオン含量および浸透圧が有意に大きい（表１１）。図 １９ に示されるように、海洋サケ科の魚は絶えず周囲海水中に身体水分を失っている。これに関して、魚の皮膚層の統合性および浸透性のどちらもこれらの経皮損失をできるかぎり低く抑えるうえで重要である。これらの継続する水分損失を補うために、魚は海水を飲み、それを水とその構成イオンのごく一部を保持するように処理する。取り入れた海水は消化器官の内壁の上皮細胞によって処理される。このプロセスで、魚は水と一部のＮａＣｌを腸で取込むが、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋は尿細管によって吸収されないか排泄される。吸収されたＮａＣｌは鰓上皮細胞を介して魚体から押出される。
【０１７２】
図 １９ は魚に起こる適応変化を淡水中と海水中とで比較したものである。淡水魚に存在する特異的な生理学的適応を左図に模式的に示す。これに対して、魚が海水中にいるときの同じ生理学的応答の変化を右図に示す。
【０１７３】
成魚前の遡河魚にとって、淡水から海水への移し替え後にすばやくこれらの適応変化のすべてを遂行することが重要である。これらの機構の配備および成熟には、新しいタンパク質の合成と、経上皮輸送に関与する上皮細胞の改造が必要である。これらの変化は、スモルトがその新しい海水環境に耐えることができるような時間内に起こる。魚が小さいほど、その表面積／容積比は大きくなる。したがって、小型の魚ほどその体水分を急速に失い、体内のイオン組成の変化を緩衝するための体水分貯蔵が少ない。その結果、小型の魚は急速に水を失い、イオン除去機構が成熟していないので、この水を海水を飲むことを介しては補うことができない。その結果、より小型のまたは未成熟なスモルトは、海水の新しい浸透圧やイオン環境に適応できないために電解質および水分不均衡で急速に死亡する。これに対して、「臨界サイズ」より大型のスモルトは、表面積対容積比が低く、水分損失は遅く、イオン変化を緩衝する体水分を多く有する。このより大型のサイズは、魚が生き延びることができるような、より成熟したイオン輸送機構を配備するのに必要な期間を与える。
【０１７４】
臨界サイズ未満であるか、未成熟な生理学的イオン輸送機構を持ったスモルトでは、身体からの水の浸透性除去がイオン豊富な海水の摂取と組み合わさると、体液および電解質組成に特異的な変化が起こる。これらの変化としては、総体内水分含量の低下、カルシウム、マグネシウムおよび塩化ナトリウムの濃度の増加等が挙げられる。これらの一価および二価の陽イオンの異常に高い濃度は、臓器および細胞の機能に広範囲な特異的変化が起こり、例えば、細胞代謝および神経伝達の変化、正常な神経系および筋肉活動の低下、食物の正常な摂取、その消化の停止等が起こる。海水への移し替え後の異常行動および高度なストレスによる瀕死前の魚の出現は、実際、魚の体液内のカルシウム、マグネシウム等のイオン上昇の生理学的影響が原因であるといえる。
【０１７５】
本明細書に述べられるように、血清カルシウム、マグネシウム、ナトリウムの測定値はこれらのデータを確認するとともに、本発明が、生理学的およびイオン輸送機構に変化を起こさせ、現在の工業標準法によって決められている臨界サイズよりも有意に小型の成魚前遡河魚の海水移し替えを成功させることを証明している。
【０１７６】
方法：
尾洞内静脈穿刺によって魚（サケおよびマス）から採血し、ヘパリンリチウムの添加によって凝固を防いだ。血液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた血清を集め、分析まで保存した。２ マイクロリットルのアリコートの血清試料のカルシウムおよびマグネシウム濃度を、カルシウムおよびマグネシウム定量キット（Ｋｉｔ ＃５９５ 、＃５８７ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ 、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて定量し、Ｎａを日立７４７ 分析器を用いた商業用検査法（ＮｏｒＤｘ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳＳＣａＲｂｏｒｏｕｇｈ 、ＭＥ）によって測定した。
【０１７７】
結果および考察：
ＡＰＳ プロセスＩＩは、魚の体液と周囲の高張海水との間の大きな浸透勾配なく海水曝露を模倣する。
【０１７８】
図 ２０ は、淡水から直接、またはＡＰＳ プロセスＩＩの様々な成分に曝露後、海水に移した幼魚マス（平均体重約３０グラム）における血清中カルシウム濃度の変化を示す。淡水中維持したマスの平均定常状態カルシウム濃度は２．７２±０．１６ｍＭである。これに対して、海水へのマスの移し替えは、海水への移し替え後、最初の２４時間以内に血清カルシウムを約３．８０ｍＭまで有意に上昇させる。血清カルシウムのこの増加は、約１０８ 時間（４５日間）持続するが、その後、１２６ 時間までにこれよりやや低い平均濃度３．２０±０．４２ｍＭまで低下する。したがって、体内ＰＶＣＲは、淡水マスを海水に移し替えると、血清中カルシウム増加に曝露される。水中ＰＶＣＲは、実際にこの濃度の範囲のカルシウム変化を感知し応答するのであろう。したがって、血清カルシウム（ＰＶＣＲアゴニスト）の増加は、幼魚マスを海水中で生存させるための様々な臓器における多数のＰＶＣＲ活性化過程の開始のためのシグナルを構成する。
【０１７９】
３ｍＭ カルシウムと１ｍＭ マグネシウムとを含有する本発明の水混合物中にマスを入れ、標準淡水飼料（Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋｅ Ｆｅｅｄｓ）をこのマスに与えると、体外の水混合物（３ｍＭ ）から体内体液（２．７２ｍＭ）へ向かってのカルシウムのかなりの内部方向勾配があるにもかかわらず、淡水で維持したマスの血清カルシウム濃度に比べて、血清カルシウムが有意に増加する。さらに、この水混合物中で維持したマスの血清カルシウム濃度は、環境明期を正常（１０時間日光；１４時間暗期）から持続的日光曝露へと変化させても、変化しない。
【０１８０】
図 ２１ は、水混合物（３ｍＭ カルシウム、１ｍＭ マグネシウム）中維持したマスに追加の１ ％塩化ナトリウム（ｗ／ｗ ）を含有する淡水固形飼料を与えたときに起こる血清カルシウム濃度の増加を示す。ＮａＣｌ補充飼料の給餌は、ゼロ時間におけるベースラインの血清カルシウム濃度の測定直後に開始した。血清カルシウム濃度が２４時間後に上昇しはじめたことに注目のこと。示されたデータポイントは、１つの代表的な実験についての合計５ 回以上の独立した測定を表す。２４時間および７２時間での数値は、ゼロ時間での数値に比べて、有意に（ｐ＜０．０５）増加する。
【０１８１】
これに対して、本発明の水混合物中維持したマスに１ ％ＮａＣｌ（重量／重量）追加以外は、同じ標準飼料を給餌することは、血清カルシウム濃度が２４時間以内に有意な増加を生じる（図 ２１ ）。マスのこの血清カルシウム濃度の増加は、マスを海水に移すことによって起こる上昇を模倣している（図 ２０ と図２１とを比較する）。飼料中ＮａＣｌが血清カルシウム濃度を上昇させる作用は、おそらく、魚が摂取したこの過剰なＮａＣｌを排泄しなければならないために起こるのであろう。この過剰なＮａＣｌの摂取は魚の飲水行動を活発化し、それによって３ｍＭ カルシウムを含む水混合物を摂取し、ひいてはカルシウムを腸吸収することによってその体液カルシウム含量を増加させる。１ ％ＮａＣｌ単独摂取は、血清カルシウム濃度を変化させない。したがって、淡水中維持したマスの血清カルシウム濃度（２．７２±０．４３、ｎ ＝６ ）は、１％ＮａＣｌ（ｗ／ｗ ）含有飼料消費後３０日間も有意に変化しなかった（２．３７±０．２５、ｎ ＝５ ）。これらのデータは、このプロトコールが遡河魚の血清カルシウム濃度を増加させるために必要であることを証明している。
【０１８２】
淡水で育てた産業標準「臨界サイズ」を有するより大型のタイセイヨウサケスモルトを、血清カルシウム濃度および血清ナトリウム濃度を上昇させる海水に移行する：
図２０に示したデータは、マスを淡水から海水に移行したとき、平均血清カルシウム濃度が約４０％上昇することを示す。この上昇の大きさは、マスの「臨界サイズ」より小さいこれらの魚における浸透圧調節機能不全による有意マス死亡率（約３０〜４０％）に関連する。対照的に、血清カルシウム濃度における上昇の大きさは、臨界サイズ６０〜７０グラムを有するより大型のタイセイヨウサケスモルトを海水に移行した場合、より小さい（約３０％上昇）（図２２Ａ〜Ｂ）。海水に移行した後、この同じ期間中で、これらの同じ魚における血清ナトリウム濃度は約１７％上昇する。マス（図２１）およびサケ（図２２Ａ〜Ｂ）の両方から誘導されるデータは、この実験中において、ストレスの視覚的徴候を示さなかった魚（すなわち、ストレス魚は、体の退色、奇怪な泳動挙動または活動レベルの顕著な低下を示す）からのみ集めた。
【０１８３】
図２２は、標準的な現在の慣用法により規定される臨界サイズを有するＳ１タイセイヨウサケスモルトの海水に移行した後の血清カルシウム（図２２Ａ）および血清ナトリウム（図２２Ｂ）における変化を示す。各データ点は、５〜１０の独立した測定値の平均±Ｓ．Ｄ を表す。
【０１８４】
図２３Ａ〜Ｂは、ＡＰＳ処理Ｉ（水中、３ｍＭ Ｃａ２＋、１ｍＭ Ｍｇ２＋）および７％ＮａＣｌ食物補給物含有食餌で合計４５日間処理した後、図２２に示したのと同じＳ１タイセイヨウサケスモルト８０匹のコーホートから得た、海水への移行後の血清カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの値を示す。ＡＰＳ処理Ｉに曝露した魚の初期血清カルシウムは、やや高く（２．５ 対３．０ｍＭ ）、カルシウムおよびナトリウムの血清濃度の変化は図２２に示したものに類似することに注目されたい。さらに、これらの魚をカルシウム／マグネシウム混合物水から海水に移行したとき、カルシウムおよびマグネシウムは、最初の１２０ 時間の期間中、劇的な上昇は受けない。対照的に、血清ナトリウム濃度は、最初の２４時間以内で約１２％（１５８．０ｍＭ から１７８．８ｍＭ ）上昇する。
【０１８５】
図１９〜２３に示すこれらのデータは、総合すると、成魚前遡上性魚を淡水から海水に移行した後、血清カルシウムおよび血清ナトリウムの両方における上昇が生じることを示す。さらに、ＰＶＣＲタンパク質の全体的な発現は、腸などのこの浸透圧調節応答に関与する特定の細胞において調節される。ＰＶＣＲは、これらの濃度範囲内においてカルシウムおよびナトリウムの両方の変化に応答しうるため、これらのデータは、魚を海水に移行した後、ＰＶＣＲ活性の新しい「目標値」が確立されることを示す。
【０１８６】
図２１〜２３に示すデータは、ＡＰＳ処理Ｉでの成魚前遡上性魚の処理が、淡水から海水に移行することにより生じる濃度上昇を擬態する、該魚の血清カルシウム濃度上昇をもたらすこと示す。カルシウムおよびマグネシウムの組み合わせを含有する水およびＮａＣｌを含有する飼料に魚を曝露すると、浸透圧ストレスを伴わない高浸透圧海水の摂取を反映するカルシウム摂取の増加が引き起こされる。したがって、ＡＰＳ処理Ｉ魚におけるＰＶＣＲは、カルシウムおよびマグネシウムに曝露されており、その結果、魚は、後に海水に移行した場合、より容易に海水に適応しうる。
【０１８７】
海水に移行した後にストレスの視覚的症状を示す遡上性魚は、カルシウムおよび／またはマグネシウムの上昇した血清値を有する。魚がこれらのイオンを排泄できないことは、海水に移行した後に死亡する主な原因である：
淡水から直接、またはＡＰＳ処理Ｉに曝露した後のいずれかで成魚前遡上性魚を海水に移行すると、総数の魚のうち一部は、しばしば、浸透圧の劇的な差、および淡水と海水間のイオン組成の劇的な差に適応できず、結果的に生じる電解質不均衡により死亡する。海水に移行した後の、短期期間（２４〜１２０ 時間）以内に最終的に死ぬ魚の追跡を含む観察は、死ぬ２４〜７２時間前に、正常なうすい銀色の体色の黒っぽい色相への変化および奇怪な泳動挙動または活動レベルの顕著な低下を含む、高度ストレスの視覚的徴候を示し始めることを示す。
【０１８８】
対照非ストレス魚と高いレベルのストレスの徴候を示す魚との血清カルシウム、マグネシウムおよびナトリウム濃度の比較は、ストレス魚における血清イオン濃度は、対照に比べて有意に高いことを示す（表１２）。
【０１８９】
【表１２】
2004510443.tif 000013
【０１９０】
これらの高度ストレスの徴候は、魚の体液内のカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムイオンの濃度の異常上昇に直接帰することができる。したがって、過剰二価カチオンを排泄することができず、かつ浸透により失われた体内の水と置換するために海水を処理できない成魚前遡上性魚は、電解質不均衡の結果、死亡する。臨界サイズ未満の遡上性魚は、海水の新しい浸透圧環境に速やかに適応することができず、その結果的、死亡する。
【０１９１】
現在の産業標準法により規定される「臨界サイズ」未満の成魚前タイセイヨウサケ魚のＡＰＳ プロセスＩＩへの曝露は、血清カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの致死的上昇を抑制し、したがって非常に小さな体重を有する魚の良好な海水への移行を可能にする。
Ｓｔ Ｊｏｈｎ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ 種の成魚前タイセイヨウサケを、混合物水（３ｍＭ Ｃａ２＋および１ｍＭ Ｍｇ２＋）ならびに７％ＮａＣｌおよび２ｇｍ／ｋｇ（ｗ／ｗ ）Ｌ−トリプトファン（ＡＰＳ プロセスＩＩ）の組み合わせの飼料を含むＡＰＳ プロセスＩＩで合計４９日間で始め、その間、連続光周期に曝露した。これらの小さいが処理された成魚前タイセイヨウサケ（ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトと称する）を、次いで、単一海洋網生簀内または研究施設内の実験槽（１５．６℃）内の海水に入れた。図２４は、良好に海水に適応したＡＰＳ プロセスＩＩスモルト対海水に適応できずに死亡した同じ群のＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの体格特徴を比較するものである。
【０１９２】
図２４に示すように、最小の体重を有するＡＰＳ プロセスＩＩで処理したタイセイヨウサケ成魚前魚のみ（約１０％）が実験槽内で５日後に海水後死亡を経験した。９０％の生き残ったＡＰＳ プロセスＩＩスモルト対死亡した１０％のＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの平均体重の比較は、完全ＡＰＳ プロセスＩＩ移行群の平均体重（１１．５＋／−５．６５ｇｍ ）と比べて、不出来なＡＰＳ プロセスＩＩスモルトがより少ない体重（５．１０＋／−２．２ｇｍ）を有することを示す。したがって、これらのＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの臨界サイズは、約１３ｇｍである。この臨界体重は、産業標準技術により以前に規定された臨界サイズのわずか１３〜１８．６％（１３／７０ 〜１００ ）である。したがって、これらのデータは、プロセスＩＩの使用はタイセイヨウサケの稚魚／スモルトの「臨界サイズ」が８０％を超えて低減したことを示す。
【０１９３】
カルシウム／マグネシウム混合物水から海水への移行が良好に行われたＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの血清カルシウム、マグネシウムおよびナトリウム濃度の定量を図２５に示す。これらのＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの平均体重が、現在の産業標準法を用いて生産したタイセイヨウサケスモルトの通常の「臨界サイズ」の２０％未満（１１．５／６０．５ｇｍ ）であるという事実にもかかわらず、カルシウム、マグネシウムまたはナトリウムの血清濃度が変化しなかったことは注目に値する。図２５は、図２０および表２に示すデータならびに以前に公表されたデータから予期しうるように、血清カルシウム、マグネシウムまたはナトリウム濃度はいずれも劇的に上昇しないことを示す。産業標準タイセイヨウサケスモルト／稚魚のＡＰＳ プロセスＩＩでの処理は、大型の産業標準スモルトと比べると、ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの有意に小さい体格にもかかわらず、上述で測定したイオンのいずれの濃度においても劇的な上昇をもたらさない。図２２Ａ〜Ｂ　（産業標準Ｓ１スモルト）、図２３（ＡＰＳ処理Ｉで処理した産業標準Ｓ１スモルト）対図２５（産業標準臨界サイズの２０％未満の成魚前サケ）に示すデータの比較はまた、より小型のＡＰＳ プロセスＩＩスモルトのこれらの血清濃度が、より大型の産業標準Ｓ１スモルトにより示されるものに匹敵することを明らかにする。まとめると、これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩＩで処理した成魚前タイセイヨウサケは、有意に小型であるにもかかわらず、カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの体内組成における劇的な変化を示さないことを示す。これらのイオンの濃度における変化がないことは、これらの魚におけるストレスを大きく低減し、魚が容易に海水に適応するのを可能にする。
【０１９４】
実施例８：飼料
ＡＰＳ処理ＩおよびＩＩの一部としての、魚に消費させる飼料を調製するための一般的な方法が２つある。これらの２つの方法は、飼料の再配合または飼料に吸収させる濃縮溶液の添加、続く嗜好性のための追肥のいずれかを含む。この開示は、これらの２つの方法のそれぞれを用いて飼料を調製するための方法論を記載する。
【０１９５】
方法：
サケ実験のための飼料製造
飼料を再配合するための成分は、以下の通りである。ベース食餌は以下の成分および手順を用いて作製した：３０％イカ（ブレンダーで液状化）、７０％Ｃｏｒｅｙ Ａｑｕａｆｅｅｄｓ カレイ食餌（ブレンダーで粉末化）。成分を半湿性「生地」ボール内でブレンドした。実験での必要性にしたがって、ＮａＣｌまたはＰＶＣＲ活性化合物を含む他の成分を重量基準でベース食餌にブレンドした。
【０１９６】
Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ 標準淡水サケ科食餌（サイズ１．２ 、１．５ 、２．０ 、２．５ および３．５ｍＭ ）もまた使用しうる。追肥がベース食餌の重量の４％を構成するようにペレットに追肥を塗布した。追肥は、５０％クリル水解物（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍａｒｉｎｅ ＰｒｏｄｕｃｔＳＬｔｄ． ）および５０％ニシン魚油から構成される。追肥は嗜好性のため、および添加した成分の封入のために添加される。
【０１９７】
他の成分としては、重量基準のベース食餌に重量基準で添加されるＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２ 、ＣａＣｌ２ またはＬ−トリプトファンが挙げられうる。
【０１９８】
７％（重量／重量）ＮａＣｌを含有する飼料の調製
ＡＰＳ処理Ｉ用：Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ 標準淡水サケ科食餌の重量の７重量％の割合で配分された固体塩化ナトリウムまたはＮａＣｌを、ＮａＣｌの重量の約３〜４倍の容量の水道水に添加した。マグネティック・スターラー・バーの使用により混合しながら混合物を６０〜７０℃に加熱して塩を溶解した。次いで、ＮａＣｌ溶液をハンドヘルド噴霧器に注入し、１．５ 立方メートル電動セメントミキサーの内部で転動しているＭｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ 標準淡水サケ科食餌に塗布した。ＮａＣｌ高含有溶液の吸収の後、湿性Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ 標準淡水サケ科食餌を、ウィンドウスクリーニング上に薄く散布し、乾燥プロセスを促進するためのファンと１５００ワットヒーターを備えた密閉ラックシステムに配置する。約６時間乾燥させた後、乾燥ＮａＣｌ高含有ペレットをセメントミキサーに戻し、追肥を塗布する。飼料を使用時まで室温で保存する。
【０１９９】
ＡＰＳ プロセスＩＩのための７％（重量／重量）ＮａＣｌ＋ＰＶＣＲ拮抗薬（トリプトファン）を含有する飼料の調製：Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ 標準淡水サケ科食餌の重量の７重量％の割合で配分された固体塩化ナトリウムまたはＮａＣｌを、ＮａＣｌの重量の約３〜４倍の容量の水道水に添加した。マグネティック・スターラー・バーの使用により混合しながら混合物を６０〜７０℃に加熱して塩を溶解した。ＵＳＰ グレードＬ−トリプトファンを、配合の必要条件に応じて、Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ 標準淡水サケ科食餌１ｋｇ ごとに２グラムまたは４グラムのいずれかで水に添加した。トリプトファンが溶解し、溶液のｐＨが約４．０ になるまで、混合しながら希塩酸をこの水に添加した。次いで、ＮａＣｌ＋トリプトファン溶液をハンドヘルド噴霧器に注入した後、セメントミキサーの内部で転動しているＭｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ 標準淡水サケ科食餌に塗布した。ＮａＣｌ＋トリプトファン溶液の吸収後、湿性Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ 標準淡水サケ科食餌を、次いで、ウィンドウスクリーニング上に薄く散布し、乾燥プロセスを促進するためのファンと１５００ワットヒーターを備えた密閉ラックシステムに配置する。約６時間乾燥させた後、乾燥ＮａＣｌ− トリプトファン高含有ペレットをセメントミキサーに戻し、追肥を塗布する。この飼料は、使用するまで室温で保存した。Ｌ−トリプトファンは、本明細書に記載の、ＰＶＣＲ発現をモジュレートする任意のアミノ酸と置き換えることができる。
【０２００】
実施例９：８種の遡上性魚のＤＮＡ からＰＣＲ により増幅した多価カチオンレセプタータンパク質の部分ゲノムクローン由来ＤＮＡ 配列および推定タンパク質配列
これらのデータは、８種の遡上性魚のＰＶＣＲ遺伝子由来の部分ゲノム配列を提供する。完全長のクローンを実施例１に記載のようにして単離した。これらのヌクレオチド配列のそれぞれは特有であり、したがって、各種由来の完全長ｃＤＮＡを単離するための特有のプローブとして使用しうる。さらに、このＤＮＡ フラグメントは、これらの魚の種々の組織におけるＰＶＣＲ発現の検出のための特異的アッセイキットの基礎を構成しうる。実施例１９参照のこと。
【０２０１】
ＰＶＣＲは、サケ、イワナおよびマスのいくつかの種において単離されている。標準的な方法論（ＧＭ Ｐｒｅｓｔｏｎ、クローン遺伝子ファミリーメンバーに対する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． 第５８巻、Ａ．Ｈａｒｗｏｏｄ 編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、３０３ 〜３１２ 頁、１９９３の方法を参照のこと）を用い、多価カチオンレセプタータンパク質の貫膜ドメインにおいて高度に保存された領域に対する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するため、ＳＫＣａＲ （図２８Ａ〜Ｅ）のヌクレオチド配列とともに哺乳動物ＣａＲ の配列を使用した。これらのプライマーを用い、重要な商品を代表する種々の魚種由来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ を、標準的なＰＣＲ 方法論を用いて増幅する。次いで、増幅されたバンドをアガロースゲル電気泳動により精製し、細菌株内で形質転換される適切なプラスミドベクター内にライゲートする。液体培地内で増殖させた後、ベクターおよび挿入物を標準的技術を用いて精製し、制限酵素解析により解析し、適切な場所に配列決定した。この方法論を用い、ヌクレオチド配列を増幅した。
【０２０２】
図２６および２７において示されたデータを作成するため、標準的な公表された技術を用いて示した種のそれぞれの筋肉試料からＤＮＡ を単離した。次いで、
２つの縮重ＰＣＲ プライマー（ＤＳＫ−Ｆ３およびＤＳＫ−Ｒ４；配列番号２２および２３）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）方法論を用いてＤＮＡ を増幅した。次いで、増幅されたＤＮＡ をアガロースゲル電気泳動により精製し、プラスミドベクター内にサブクローニングし、標準法を用いて増幅、精製および配列決定した。
【０２０３】
図２６は、８種の遡上性魚種の整列された５９４ 個のヌクレオチドのゲノムＤＮＡ 配列を示し、それぞれは、ＰＶＣＲタンパク質の同一の領域をコードする。各特定種由来の各ヌクレオチド配列は特有であることに注目されたい。しかしながら、これらの遺伝子のＤＮＡ 配列における改変は、５９４ 個のヌクレオチドの各配列内の共通の特定のヌクレオチドで生じる。
【０２０４】
図２７は、図２６に示したゲノムヌクレオチド配列由来の整列された、対応する推定タンパク質配列を示す。図２６に示すヌクレオチド配列における改変の結果として、ＰＶＣＲのこの部分のアミノ酸配列においては３つの改変しか起こっていないことに注目されたい。これらの変化のすべて（Ａｌａ からＶａｌ ；Ａｒｇ からＬｙｓ ；およびＣｙｓ からＴｙｒ ）は、ペプチド配列の相対的な大きさ、電荷および親水性のいくつかの組合せを保存する点において、アミノ酸の「保存」置換として知られている。
【０２０５】
実施例１０：ＡＰＳ プロセスＩＩ処理を受けたスモルトの死亡率を低下させるための連続光周期の効果
データは、ＡＰＳ プロセスＩＩ魚を明１０時間および暗１４時間から構成される非連続光周期よりむしろ連続光周期に曝露した場合の、海水移行後死亡率の有意な改善を示す。
【０２０６】
実験プロトコルの記載：１００ 匹の魚の３つの実験群を、７％ＮａＣｌおよびトリプトファンを補給した食餌を含めた計４５日間のＡＰＳ プロセスＩＩに供しておいた単一の群の１２００匹のＳｔ．Ｊｏｈｎ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ ＡＰＳ プロセスＩＩ魚　（平均重量１１．５ｇｍ）から選んだ。淡水中でのＡＰＳ プロセスＩＩでの処理を伴うこの４５日の期間中、これらの魚を光の連続光周期に曝露した。海水移行後にこの定常光周期を継続する効果を試験する実験を開始するため、各群の１００ 匹の魚を、海水（３２ｐｐｔ ）を含む、それぞれにバイオフィルターが設けられ、一定の１９℃に維持された個々の１メートル円形槽に入れた。最適の水質を維持するため、毎日パラメータをチェックし、パラメータは、任意の３つの実験槽間で変化がなかった。海水を含んだ槽の表面から１メートルに配置した標準的な蛍光灯バルブを用い、第１槽（連続）を連続光周期に曝露した。また、海水が満たされた第２および第３槽（非連続＃１および＃２）は、１日あたりの間隔が、第１槽と同じ照光条件で１０時間の後、軽量重質ポリエチレンプラスチックシートで第２および第３槽を覆うことにより作製した完全暗部で１４時間から構成される非連続光周期に曝露した。この明暗摂生は、北半球の夏／初秋に存在する日周（ｄｉｕｒａｌ）条件下で海洋網生簀に入れた場合にＡＰＳ プロセスＩＩ魚が経験するものと類似する。３つの槽のそれぞれにおいて生じる死亡率を１日３回確認し、死亡した魚はいずれもすぐに取り除いた。魚には、第３日目から始めた標準的湿性食餌を与えた。
【０２０７】
結果：図２９および表１３は、十分な強度の海水に移行した後、連続光周期対非連続光周期のいずれかにＡＰＳ プロセスＩＩ魚を曝露した時に生じた死亡率の数値を示す。ＡＰＳ プロセスＩＩ魚の死亡率は、これらを連続光周期に曝露した場合、海水移行後の最初の９６時間の期間中は低かった　（６％）。対照的に、非連続光周期（連続光１０時間の後、暗１４時間）に曝露した両群のＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、連続光周期に曝露したＡＰＳ プロセスＩＩ魚に比べ、４．８ 倍（２．９ ％）および６．５ 倍（３９％）高い死亡率を経験した。これらのデータは、海水移行後、最初の４日間の連続光周期へのＡＰＳ プロセスＩＩ魚の曝露が死亡率を有意に低下させることを示す。これらのデータは、これらのＡＰＳ プロセスＩＩ魚をＡＰＳ研究用海水槽（連続光周期を有する）対海洋網生簀（暗期間を伴う天然光周期を有する）に移行したときにおいて観察される死亡率の差の簡単な説明を提供する。また、表７に含まれるデータは、ＡＰＳ プロセスＩＩで処理した１５ｇｍ以上の稚魚サケの曝露は、魚に３０日間照光する水中光を含む海洋網生簀に海水移行してから後、低い（０．２ ％）死亡率を経験したことを示す。
【０２０８】
【表１３】
2004510443.tif 000014
【０２０９】
実施例１１：ＡＰＳ プロセスＩＩでの稚魚タイセイヨウサケの成長速度
この実験の研究データは、淡水で管理した稚魚タイセイヨウサケが、海水への移行前にＡＰＳ プロセスＩＩに曝露した魚と同じ成長速度を有することを示す。
【０２１０】
実験プロトコルの記載：この実験は、ＡＰＳ プロセスＩＩを受けた稚魚タイセイヨウサケの成長速度を、淡水（ＦＷ）で管理した対応する対照と比較するために設計した。合計１８７ 匹の対照および３１４ 匹の実験Ｓｔ Ｊｏｈｎ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ 稚魚タイセイヨウサケを、単一の孵化群由来の多数の魚の群から無作為に選択した。両群を等カロリー食餌で維持し、同一の水質特性および温度を有する水に曝露した。しかしながら、実験群の魚を合計６週間（４５日間）ＡＰＳ プロセスＩＩに曝露した。次いで、両群の個々の魚の体長および体重を測定し、その分布を図３０に記載のようにして比較した。
【０２１１】
結果：この実験において、これらのデータは、両群が同一の成長速度を達成したことを示す。二群間の平均体重（２６＋／−９．５ＡＰＳ プロセスＩＩ魚対２３＋／−７．７ｇｍ対照ＦＷ ｐ＝０．３０ ）または平均体長（１３．２＋／−１．７ＡＰＳ プロセスＩＩ魚対１３．３＋／−１．５ｃｍ対照ＦＷ ｐ＝０．４３ ）において有意差はなかった。実験期間中、いずれの魚の群においても死亡はなかった。したがって、この場合、ＡＰＳ プロセスＩＩは、標準的淡水慣用法と比べ、淡水期間中、稚魚タイセイヨウサケの成長速度の上昇も低下ももたらさない。
【０２１２】
実施例１２：海水研究用槽におけるＡＰＳ プロセスＩＩ魚のさらなる成長データ
ＡＰＳ プロセスＩＩ魚の成長速度および飼料転換率は、ＡＰＳ プロセスＩＩの有用性を示す。これらのデータは、淡水中でＡＰＳ プロセスＩＩ処理に曝露し、次いで海水に移行した後の＜５ｇｍ 〜約３０ｇｍの範囲の種々の大きさの稚魚タイセイヨウサケの結果に関する具体的な情報を提供する。１５７ 日間の期間にわたって単一の群のＡＰＳ プロセスＩＩ魚に関して測定を繰り返すことで、この期間中における成長状態、死亡率および飼料利用の包括的な評価が提供される。死亡率データは、海水移行時に１５ｇｍを超える重量を有するＡＰＳ プロセスＩＩ魚が、ＡＰＳ プロセスＩＩ魚の４倍を超える重量の現在の産業標準タイセイヨウサケスモルト（６０〜１２０ｇｍ ）と比べ、速やかに成長し、死亡を経験せず、非常に効率的に飼料を利用することを示す。対照的に、海水移行時に１５ｇｍ未満の体重を有するＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、動作が乏しく、急性浸透圧調節機能不全により死亡するか、または浸透圧障害を被るかのいずれかであり、現在の産業標準スモルトのずっと大型の亜集団により示されるものに類似する特徴を有する「やせ型または小型」になる。これらの後者の観察は、稚魚タイセイヨウサケに適用される現在のＡＰＳ プロセスＩＩの有効性の下限を規定する。
【０２１３】
実験プロトコルの記載：この実験の設計は実施例２に記載している。実施例２において、海水移行後２１日の期間のデータを得た。この実施例において、これらの同じ魚の死亡率、ＳＧＲ 、温度修正ＳＧＲ （ＧＦ３ ）、ＦＣＲ 、体重、体長および条件要素を、こんどは１５７ 日間に延長した期間中全部でさらに４つの期間に得た。ＡＰＳ プロセスＩＩに曝露して海水に移行した後、サケの成長を、１５７ 日間にわたって体長および体重を繰り返し測定することにより測定した。
【０２１４】
結果：表１４は、１５７ 日の期間、研究用海水槽に移行して成長させた後のこのＡＰＳ プロセスＩＩ魚群のデータの一覧を提供する。表１４の最初の期間は表１０に示したデータに対応し、「ＡＰＳ プロセスＩＩ」と記す欄において、２つのデータ値が、一貫性を報告する実験データの調整を必要としたことに注目されたい。第１の調整は、海水進入時の日数の表記載に関するものである。当初の進入時は２１と記載したが、表１４の新しいデータは２０日で示す。この差は、当初の進入が魚を実際に海水に移行した日を含んだことによるものである。この値がわずか１２時間の期間を示すものであるため、２０日という数値に調整した。この事実の結果、０．６８（表１０当初）から０．７２５ （表１４）への初期ＳＧＲ 値の微調整が必要である。第２の調整は、海水中で最初の２０日間の期間中、水分３０％の湿性飼料を魚に与えたときの２．０４という当初のＦＣＲ 値に関するものである。ＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、合計６０日間湿性飼料を与えた後、乾燥飼料（９％水分）に変更したため、表１４では、修正飼料乾燥重量基準での期間のＳＧＲ の修正を反映する、２．０４の代わりに１４３ のＳＧＲ 値を報告している。３０％水分のためのこれらのＳＧＲ およびＧＦ３ 修正は、表１４の脚注として提供されている。
【０２１５】
【表１４】
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【０２１６】
表１４にまとめたデータは、海水配置時に１５ｇｍを超える重量のＡＰＳ プロセスＩＩ魚の全体的な死亡率が１５７ 日の期間全体で１．１ ％であったことを示す。この死亡率は非常に低く、細心の世話にもかかわらず通常の魚の管理で予期される範囲内である。対照的に、海水移行時に１５ｇｍ未満の重量であった亜集団において、海水に移行したＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、合計２３１ 匹、すなわち総数の５４．２％が死亡した。これらの死亡のすべては、海水移行後から最初６０日以内で２回の「波」において生じた。第１は、海水配置の２０日以内に、急性浸透圧機能不全により生じた。これらの魚はすべて、体重が１３ｇｍ未満であった。第２群の１３８ 匹の魚は、続く４０日の期間以内に死亡し、総数の３１％を占めた。図３１は、これらの１３８ 匹の死亡体の体格特徴を、海水移行時のＡＰＳ プロセスＩＩ魚の体長および体重と比較するものである。これらの魚の有意な数が体重の有意な低下を示し（図３１に示した黒三角が、海水配置後のそれぞれの値に比べて、右側にシフトしている）、より大型（６０〜１００ｇｍ ）のタイセイヨウサケスモルトにおいて、規則的に生じる「やせ型または小型」と称する浸透圧障害魚の出現がもたらされたことは注目に値する。したがって、これらのデータは、１５ｇｍ以上の体重でＡＰＳ プロセスＩＩ魚を海水に良好に移行させるための体格の下限を規定する。
【０２１７】
表１４および図３２は、合計５つの独立した測定が記録された１５７ 日の期間中に生き残ったＡＰＳ プロセスＩＩ魚のＳＧＲ およびＧＦ３ 値を示す。この期間中、ＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、急速に体重が９倍をこえて増加した（１５．２ｇｍから１４２．５ｇｍ ）。初期には、ＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、海水移行後、最初の２０日の期間で中程度のＳＧＲ ／ＧＦ３ 値しか示さなかった。しかしながら、次いでその成長速度は、２つの連続した期間のそれぞれにおいて２倍になり、海水移行後６０〜８２日間の間にピークＳＧＲ２．８７／ＧＦ３ ２．３３への到達が起こった。この期間中、魚は体重３１５ｇｍ から５９．３ｇｍに成長した。続いて、ＳＧＲ ／ＧＦ３ 値は次いで、最後の２つの期間中に低下し、平均ＳＧＲ０．９９／ＧＦ３ １．３６の値に達した。
【０２１８】
表１４および図３２に示すように、ＡＰＳ プロセスＩＩ魚に水分３０％を含む湿性飼料を与えた場合、海水移行直後の６０日の期間でのＦＣＲ 値は平均１．３７であった。次いで、ＦＣＲ 値は、９％未満の水分を含む乾燥飼料を与えると、残りの９７日間で平均０．７７まで低下した。これらの低ＦＣＲ 値は、平均０．９ 〜１．４ である、より大型のタイセイヨウサケスモルトの現在の産業標準ＦＣＲ 値と、好ましく比較されるものである。
【０２１９】
図３３は、最後の３つの測定期間中での体格および体長における進行性の増加を示す。最も大型の魚は約３００ｇｍ であり、これは、海水移行時の体重の１０倍を越える最低の成長を表すことに注目されたい。すべての魚は、直線的成長に正比例する体重増加を有する良好な条件因子（ｋ）を有する。
【０２２０】
実施例１３：群を淡水中で管理するか、またはＡＰＳ プロセスＩＩで処理した後海水に移行するかのいずれかの場合、６１日の期間中の２０ｇｍまたは４０ｇｍのいずれかの重量を有する一対の稚魚タイセイヨウサケの比成長速度　（ＳＧＲ ）、飼料消費率（ＦＣＲ ）、毎日の飼料消費率および体格特徴の比較
ここに開示する実験では、１）ＡＰＳ プロセスＩＩで処理し、海水に移行する、または２）淡水中で管理する、のいずれかである稚魚タイセイヨウサケの成長状態を比較した。また、これらの実験では、海水への移行後の、より小型（２０ｇｍ）対より大型（４０ｇｍ）のＡＰＳ プロセスＩＩ魚の成長状態を比較し、これらのデータを、対応する淡水対照で得られたものと比較した。この６１日間の実験での全体的な結論は、２０ｇｍおよび４０ｇｍの稚魚タイセイヨウサケは、ともに良好に海水に移行されうるということである。より小型の２０ｇｍ未満の魚が、より大型の４０ｇｍを超える魚と比べて劣った結果を生じ得、かつ８０〜１００ｇｍ の標準の魚と比べて、両者が有意に劣った成長を示し得るという現在の産業標準により予測されうることとは対照的に、以下に記載するこれらのデータは、２０ｇｍの魚が両方の４０ｇｍの魚と同等に成長することを示す。これらのデータは、２０ｇｍおよび４０ｇｍの魚の両方が、体格が現在の産業標準法により規定される臨界サイズの約１／５ および２／５ であるという事実にもかかわらず、ＡＰＳ プロセスＩＩでの処理後に海水に移行することができるという、さらなる証拠を提供する。また、これらのデータは、２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚の両方が、海水移行後、従来のより大型の産業標準スモルトと等しいかまたはそれより優れたＳＧＲ 、ＦＣＲ および体格特徴の成長を達成することを示す。ＳＧＲ およびＦＣＲ 基準により測定されるように、２０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、より大型の４０ｇｍ　ＡＰＳ プロセスＩＩ群より優れていた。しかしながら、２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚はともに、初期には、淡水で管理した対応する対照と比べて、劣ったＳＧＲ 、ＦＣＲ および体重を示す。この成長における一時的な低下は、海水への適応の初期の期間中のみである。注目すべきことは、これらのＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、実施例１２に示すように、海水中での極めて急速な成長を提供するこの６１日の期間直後に、ＳＧＲ 、ＦＣＲ および体重における顕著な改善を達成することである。
【０２２１】
これらのデータからの具体的な結論としては、次のことがあげられる。
【０２２２】
１．２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚を両方とも海水に移行し、湿性飼料（３０％水分）を４日間のみ与えた後、実験の残りの期間は乾燥飼料　（＜９％水分）を与えた。これらのデータは、北米の北東部における通常の現在の産業標準魚が約１４〜３０日間湿性飼料を与えられていることから、ＡＰＳ プロセスＩＩの有用性をさらに示すものである。
【０２２３】
２．海水への移行後の２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚での平均６１日ＳＧＲ は、それぞれ、淡水中で管理した対応する対照により達成されたＳＧＲ 値の６５％および５７％であった。海水移行時に２０ｇｍの重量であったＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、より大型の４０ｇｍの対のものに比べ、より大きな平均ＳＧＲ を示した。
【０２２４】
３．２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚により達成されたＳＧＲ は、新しい海水環境への適応を反映する最初の３０日の期間と比べて、第２の３０日の期間中にそれぞれ５８％および３６％増加した。
【０２２５】
４．低ＳＧＲ の結果、海水移行後に２０ｇｍ ＡＰＳプロセスＩＩ魚により達成された平均最終体重は、対応する淡水対照により達成された値の７３．４％であった。同様に、より大型のＡＰＳ プロセスＩＩ魚により達成された平均最終体重は、対応する対照の値の７１０ ％であった。これらのデータは、より小型のＡＰＳ プロセスＩＩ魚が、より大型の４０ｇｍの対のものと比べて類似の成長度を示したことを示す。
【０２２６】
５．海水移行後の全６０日の期間中では、より小型の２０ｇｍ ＡＰＳプロセスＩＩ魚の平均ＦＣＲ は、より大型の４０ｇｍ ＡＰＳプロセスＩＩ魚により示されたものに匹敵した。
【０２２７】
６．２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚は両方とも、海水移行から４８時間後に飼料を与えると、直ちに飼料を摂取した。しかしながら、両方の大きさのＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、対応する淡水対照と比べて、海水移行後、約２５〜３０日の期間の摂餌の抑制を示した。このＡＰＳ プロセスＩＩの１日当りの飼料消費の低下は、続いて、試験期間の残りの３０〜３５日間で、淡水対照と同等になった。
【０２２８】
実験プロトコルの記載：これらの一連の実験は、より小型（２０ｇｍ体重）の稚魚タイセイヨウサケが、淡水（ＦＷ）で管理した同一の大きさの対照魚、または淡水中で管理するかもしくは対のより小型の２０ｇｍのものと同様にして海水に移行した、より大型の稚魚タイセイヨウサケ（４０ｇｍ）と比べて、ＡＰＳ プロセスＩＩ後の海水（ＳＷ）への配置による悪影響を示すか否かを試験するために設計した。成長および飼料利用におけるあらゆる変化を定量するため、成長速度、ＦＣＲ 、１日あたりの食餌消費ならびに体重、体長および条件因子の組み合わせを各群について測定した。調べた４群は、すべてＳｔ．Ｊｏｈｎ／Ｓｔ．Ｊｏｈｎ 魚の単一の孵化群由来のものであり、以下のようにして処理した。
【０２２９】
１．　中型の４０ｇｍ対照魚を、１０３ 日の期間ＦＷ中で管理し、その対のＡＰＳ プロセスＩＩ魚に湿性飼料を４日間与える以外は、標準乾燥飼料を与え、同一の飼料調製物を与えた。ＦＷ中での最後の６１日間について、ＳＧＲ 、ＦＣＲ および１日当りの食餌消費を測定した（ｎ＝８４）。
【０２３０】
２．　小型の２０ｇｍの対照魚をＦＷ中に１０３ 日の期間、４０ｇｍの対のものに関して１．に記載したものと同一のようにして管理した（ｎ＝５１）。
【０２３１】
３．　中型の４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚をＡＰＳ プロセスＩＩに４２日の期間曝露した後、海水に移行し、４日間湿性飼料を与えた後、乾燥飼料に切りかえて６１日間管理した（ｎ＝９９）。
【０２３２】
４．　小型の２０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚をＡＰＳ プロセスＩＩに４２日の期間曝露した後、海水に移行し、４日間湿性飼料を与えた後、乾燥飼料に切りかえて６１日間管理した（ｎ＝８０）。
【０２３３】
水質を同じ高水準に維持し、したがって実験間のばらつきに寄与しないことを確実にするための、対応するバイオフィルターを有する個々の１メートル円形槽に、各群の魚を管理した。全ての魚に同じ分量の食餌を与えたが、例外としてＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、４２日のＡＰＳ プロセスＩＩそのものの期間では、食餌は、飼料１ｋｇ 当り７％ＮａＣｌおよび２ｇｍ のトリプトファンを含むものとした。４つの群すべてを、実験期間中、連続光周期に曝露した。
【０２３４】
４つの全ての群の魚の重量を測定し、第３および第４群の海水への移行時およびその後の約３０日間の２つの期間に測定した。
【０２３５】
結果：
６１日の試験期間中、各群により示された比成長速度（ＳＧＲ ）の比較
図３４は、ＡＰＳ プロセスＩＩ対照物で処理して海水に移行したか、または淡水中に連続的に管理したかのいずれかの２０ｇｍおよび４０ｇｍの稚魚タイセイヨウサケの、２つの連続した３０日の期間中のＳＧＲ を比較するものである。
【０２３６】
淡水中で連続的に管理した２０ｇｍおよび４０ｇｍの魚の両方のＳＧＲ は、海水中の対のＡＰＳ プロセスＩＩのいずれかよりも大きかった。淡水２０ｇｍおよび４０ｇｍ魚の平均６０日ＳＧＲ は、それぞれ１．５１および１．４５であった。対照的に、海水への移行後の２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚のＳＧＲ は、それぞれ、これらの淡水値の６５％（０．９８）および５７％（０．８３）であった。２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚の両方により示されたより低いＳＧＲ 値は、この最初の６０日の期間中の海水への適応を反映する。海水への適応の増大は、２０ｇｍおよび４０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚の両方のＳＧＲ が、第１と比較して、第２の３０日の期間中にそれぞれ５８％および３６％増加したことにより反映される。実施例１２に示すように、海水中のＡＰＳ プロセスＩＩ魚のＳＧＲ 値は、次の６０日の期間にわたって、ここに示すもののほぼ２倍の値まで有意に増加する。これらのデータは、２０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚が、同一の海水移行条件下で、対の４０ｇｍのものと比べて、より大きなＳＧＲ を示したことを示す。
【０２３７】
より大きなＳＧＲ の結果、淡水稚魚さけの平均の体重および体長は、６１日の試験期間中にＡＰＳ プロセスＩＩ魚により達成された対応する値よりも有意に（ｐ＜０．０５）大きかった。表１５ならびに図３５および３６に示すように、２０ｇｍで海水移行後、より小型のＡＰＳ プロセスＩＩ魚により達成された平均最終体重は、対応する淡水対照により得られた値の７３．４％であった。同様に、４０ｇｍ体重で移行され、海水中で成長させた、より大型のＡＰＳ プロセスＩＩ魚では、対応する対照で得られた平均体重のわずか７１０ ％しか達成されなかった。総合すると、これらのデータは、より小型の２０ｇｍの魚が対のより大型の４０ｇｍのものの半分の大きさであるという事実にもかかわらず、より小型およびより大型のＡＰＳ プロセスＩＩ魚の両方が、海水配置後最初の６１日間で類似の成長度を示したことを示す。実施例１２に記載するように、続く６０日の期間中での海水中のＡＰＳ プロセスＩＩ魚の成長の継続は、図３４に示すものの１．５ 〜２．５ 倍のＳＧＲ をもたらした。
【０２３８】
【表１５】
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【０２３９】
６１日試験期間中に各群により示された飼料消費率（ＦＣＲ ）の比較
図３７は、２つの連続した３０日の期間での、淡水群およびＡＰＳ プロセスＩＩ海水群の両方のＦＣＲ データを示す。最初に、２０ｇｍおよび４０ｇｍ　ＡＰＳ プロセスＩＩ魚は両方とも、湿性飼料から乾燥飼料への急激な転換を良好に許容した。１００ｇｍ 以上の重量のより大型の現在の産業標準スモルトでさえ、経口水補給におけるこの急激な低下を許容しえないだろう。
【０２４０】
しかしながら、これらのデータは、２０ｇｍおよび４０ｇｍ　ＡＰＳ プロセスＩＩ魚は両方とも、淡水中で成長させた対応する対照と比較して、海水移行後の６０日の期間中に食物のエネルギーを体重の増加に変換する際に効率が低かったことを示す。ＡＰＳ プロセスＩＩ魚によるこの食物のバイオマスへの低効率変換は、第２の３０日の期間中に両サイズのＡＰＳ プロセスＩＩ魚について改善された海水への適応の最初の３０日の期間を反映する。それにもかかわらず、海水移行後の全６０日の期間中、より小型の２０ｇｍ　ＡＰＳ プロセスＩＩ魚（ＦＣＲ （６０日）０．９７）の平均ＦＣＲ は、より大型の４０ｇｍ　ＡＰＳ プロセスＩＩ魚（ＦＣＲ （６０日）１．０ ）により示されたものに匹敵した。しかしながら、両群のＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、淡水中で成長させ、同一の分量の食餌を与えた対応する対照と比べて、より大きなＦＣＲ を示した（２０ｇｍ　淡水−ＦＣＲ （６０日）０．７８；４０ｇｍ　淡水−ＦＣＲ （６０日）０．７１）。これらのデータは、海水移行のわずか６０日後にＡＰＳ プロセスＩＩ魚が非常に望ましい０．８ 未満のＦＣＲ を達成する実施例１２に開示したデータに一致する。
【０２４１】
６１日試験期間中に各群により示された１日あたりの飼料摂取の比較
図３８および３９は、稚魚サケの４群のそれぞれにより達成された１日の食餌消費を、１日あたりの体重に対する％で表していることを示す。これらの魚は、海水への移行後４８時間まで食餌を与えず、６１日の試験期間中、第２１、２２、３１、３２、５５および５６日目には食餌を与えなかった。図３８に示すように、移行時重量２０ｇｍのＡＰＳ プロセスＩＩ魚は、淡水中での対応する対照と比べて低下した割合であったが、第３日目に食餌を与えると、即座に食餌を摂取し始めた。食餌の摂取は、１日あたりで大きく変動したが（以前に記載されており、水中養殖した魚にとっては正常と広く認められている）、これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩＩ魚の食餌消費が、海水移行後約２５〜３０日までは、対応する淡水対照により示されるものと同等のレベルに達しなかったことを示す。
【０２４２】
図３９は、海水への移行時４０ｇｍの重量を有するＡＰＳ プロセスＩＩ魚対淡水で管理した対応する対照の食餌消費を比較するものである。２０ｇｍ　ＡＰＳ プロセスＩＩ魚により示されたものと同様に、４０ｇｍ　ＡＰＳ プロセスＩＩ魚もまた、淡水の対のものと同一の割合で食餌を消費するために少なくとも２５日を必要とした。これらのデータは、海水への移行後２０日以上の非食餌摂取を示す、ずっと大型の１００ｇｍ の現在の産業標準タイセイヨウサケスモルトと比べて、海水移行後のＡＰＳ プロセスＩＩ魚の抑制された食餌摂取が顕著に短い期間であることのさらなる証拠を提供する。
【０２４３】
これらのデータは、食物栄養分の感知および利用において重要な役割を果たす種々の器官に存在するＰＶＣＲタンパク質の役割と一致する。実施例３〜６に示すように、これらの組織としては、嗅覚層板、嗅覚神経および嗅覚葉（塩分および栄養分を感知する）、迷走神経葉およびカハル副核を含む味脳核（腸運動および食欲の調節）ならびに稚魚サケ科魚の胃、幽門盲腸（ｐｙｌｏｒｉｃ ｃａｅｃａ） 、近位および遠位腸に存在する上皮細胞および神経内分泌細胞（食物栄養分の処理および吸収）が挙げられる。このように、ＡＰＳ プロセスＩＩは、これらのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートし、それにより、淡水から海水への移行後の魚による食餌の摂取および利用の両方を改善する。
【０２４４】
実施例１４：ＡＰＳ プロセスＩ またはＡＰＳ プロセスＩＩのいずれかで処理した場合の、大型９０〜１００ｇｍ の産業標準タイセイヨウサケスモルトの海水移行および成長の比較
これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ またはＡＰＳ プロセスＩＩのいずれかに６週間曝露した、より大型（９０〜１００ｇｍ ）の高速成長タイセイヨウサケスモルトの海水生存率および初期成長速度を比較するものである。これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ またはＩＩで処理した魚の両方が、海水移行後の３７日の期間にわたって同一の速度で成長したことを示す。両群は、同一の低い海水移行後死亡率を有した。データは、より大型（９０〜１００ｇｍ ）タイセイヨウサケに対するＡＰＳ プロセスＩＩの適用が、同一の魚をＡＰＳ プロセスＩ で処理した場合に示されるものに匹敵する海水後死亡率および成長速度をもたらすことを示す。
【０２４５】
実験プロトコルの記載：約９０ｇｍの重量の大型の高速成長する稚魚Ｌａｎｄｃａｔｃｈ／Ｓｔ Ｊｏｈｎ タイセイヨウサケの単一の群を業者から購入し（Ｍａｉｎｅ のタイセイヨウサケ）、体長および体重が対応する等しい大きさの２つの群に分け、それぞれを、別の槽内で、ＡＰＳ プロセスＩ またはＡＰＳ プロセスＩＩのいずれかで６週間処理した。次いで、体長および体重を得た後、各群の個々の魚を標識し、次いで、単一の大きな研究用海水槽に移行した。すべての魚に乾燥（＜９％水分）海水食餌を与えて海水中で３７日間成長させた後、魚を測定し、標準式を用いてＳＧＲ を算出した。
【０２４６】
結果：表１６は、海水移行の直前対海水で３７日間成長させた後の、ＡＰＳ プロセスＩ またはＡＰＳ プロセスＩＩのいずれかで処理したスモルトの平均体重、体長および条件因子（ｋ）を比較するものである。これらのデータは、海水移行前で、ＡＰＳ プロセスＩ またはＡＰＳ プロセスＩＩのいずれかで処理したスモルト間において体格特徴に有意差がなかったことを示す。ＡＰＳ プロセスＩ 魚およびＡＰＳ プロセスＩＩ魚の両方は、３７日間の海水での成長後、低死亡率２〜３％ならびに体重（約３０％）および体長　（約９〜１０％）における有意な増加の組み合わせを示した。しかしながら、３７日間の海水での成長後のＡＰＳ プロセスＩ 対ＡＰＳ プロセスＩＩ魚の体重を比較すると、有意差はなく、これは、各群の魚が類似する量で成長したことを示す（ＡＰＳ プロセスＩ のＳＧＲ＝０．８０対ＡＰＳ プロセスＩＩのＳＧＲ＝０．８６）。
【０２４７】
【表１６】
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【０２４８】
図４０Ａ〜Ｂは、海水移行前対３７日間の海水成長での、ＡＰＳ プロセスＩ またはＡＰＳ プロセスＩＩのいずれかで処理した魚の体重および体長を比較するものである。
【０２４９】
これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ およびＡＰＳ プロセスＩＩ群の両方に属する魚が、海水成長のこの３７日の期間中に、成長して類似の望ましい条件因子　（ｋ−表Ｉ参照）を維持したことを示す。総合すると、これらのデータは、より大型（９０〜１００ｇｍ ）タイセイヨウサケに対するＡＰＳ プロセスＩＩの適用が、同一の魚をＡＰＳ プロセスＩ で処理した場合に示されるものに匹敵する、海水移行後最初の３７日間での海水後死亡率および成長速度をもたらすことを示す。
【０２５０】
実施例１５：ＡＰＳ プロセスＩ での処理後の海洋網生簀内または現在の養殖法に供したより大型の産業標準タイセイヨウサケスモルト（１００ 〜７５ｇｍ）の海水移行および成長の比較
ＡＰＳ プロセスＩ で処理した魚および対の産業標準法で処理した対の対照を、ＡＰＳ処理魚の海水配置後、合計１８５ 日間、研究した。合計３つの主な結論が得られ、それぞれがＡＰＳ プロセスＩ の価値および有用性を示した：
【０２５１】
１．　従来の「スモルトウィンドウ」の制約の除去：海洋網生簀配置後に観察された死亡率は、ＡＰＳスモルトにおいて、これらの魚が、スモルトウィンドウ後の１．５ヶ月後に海水に、非常に高い（１５．１℃）海洋水温度内に移行されたという事実にもかかわらず低かった（６．１ ％）。ＡＰＳスモルトの死亡率は、６４日早いスモルトウィンドウ中に、より低温（１０℃）の海水に移行された産業標準スモルト（３３％）のものと類似する。ＡＰＳ処理スモルトのこの特徴は、ＡＰＳスモルトの配置は業界慣例法で現在使用されている従来の「スモルトウィンドウ」に厳格に規定されないため、淡水孵化操作においてより大きな融通性を提供する。
【０２５２】
２．　浸透圧ショックの低減または排除による海水移行後の期間中の高速成長：ＡＰＳスモルトは、海水移行中およびその直後にピーク状態にあった。完全な食餌摂取に達するのに少なくとも２０日を必要とする産業標準スモルトとは異なり、ＡＰＳスモルトは４８時間以内に激しく食餌を摂取した。さらに、ＡＰＳスモルトにより示される初期成長速度は、海水配置後最初の５０日中での標準スモルトに関して公表されたデータ、ならびに全１８５ 日の試験期間中で産業標準の対のものにより示された任意のＳＧＲ の両方より有意に大きかった。その結果、ＡＰＳスモルトは、産業標準スモルトがともに海水配置時に２５％大きいという事実および海水中での６４日のさらなる期間を有したという事実にもかかわらず、産業標準スモルトと同一の平均サイズの達成に近づいた。これらのデータは、ＡＰＳスモルトが有意な浸透圧調節ストレスに曝されていないという証拠を提供し、このことが、魚の即時の摂餌を妨げないのであろう。
【０２５３】
３．　市販サイズのサケに到達するまでの期間の低減：海洋網生簀配置直後の９６日の期間中での、ＡＰＳ プロセスＩ で処理したスモルトの急速成長は、海水成長が進行するにつれて、サケのサイズにおいていっそう大きな増加を提供する。したがって、ＡＰＳ プロセスＩ で処理されたこれらの魚を普通のスモルトウィンドウ中に配置した場合、その同じ網生簀部で成長させた産業標準魚と比べて７ヶ月も早く市販サイズに達することが予期される。
【０２５４】
実験プロトコルの記載：ＡＰＳ プロセスＩ 処理群および産業標準対照群の両方の特徴を含む実験設計を実施例２に詳述する。ＡＰＳ プロセスＩ 処理および対照の海水移行の初期データならびに比成長速度（ＳＧＲ ）を表２〜４に提供する。
【０２５５】
結果：表４は、５１日および１１５ 日の海水成長後のＡＰＳ プロセスＩ 処理魚および対照魚の両方のＳＧＲ に関するデータを提供する。これらの同一の研究を、以下の表１７に示すようにして拡張している。
【０２５６】
【表１７】
2004510443.tif 000018
【０２５７】
ＡＰＳ プロセスＩ で処理したスモルトは、最適期間後、すなわち「スモルトウィンドウ」の１．５ ヶ月後に海水に、非常に高い（１５．１℃）海洋水温度に移行されたという事実にもかかわらず、死亡率は、スモルトウィンドウ中に、より低温　（１０℃）の海水に移行された産業標準スモルト（３３％）のものと類似した。このＡＰＳ プロセスＩ 処理スモルトの能力は、ＡＰＳ プロセスＩ 処理スモルトの海水移行が、従来の「スモルトウィンドウ」に厳格に規定されないため、サケ養殖操作においてより大きな融通性を提供する。
【０２５８】
表１７ならびに図６Ａおよび４２に提供されたデータは、ＡＰＳ プロセスＩ で処理されたスモルトが、特に海水移行後最初の９６日の期間中に、産業標準対照と比べて、より大きなＳＧＲ および増大した食餌消費を示したことを示す。ＡＰＳ プロセスＩ 処理魚および対照魚の両方に関するＳＧＲ の全体的な低下傾向は、充分に記載されており、主に、夏から秋にかけてのような第２番目および第３番目の期間中の光周期における季節性低下によるものである。図６Ａに示すように、海水配置後の最初の７日間中にＡＰＳ プロセスＩ 魚によって消費された食餌は、海水への移行後３０日の産業標準スモルトと比べて、魚１匹あたりで約２倍多かった。
【０２５９】
図４１は、ＡＰＳ プロセスＩ 処理魚対対照のＳＧＲ のグラフによる比較を提供するものである。ＡＰＳ プロセスＩ 処理魚の平均ＳＧＲ は、海水移行後最初の６４日の期間中、産業標準スモルトと比べて８０〜９０％大きかった。このより大きなＳＧＲ 値は、ＡＰＳ プロセスＩ 処理魚が、６４日早く海水に移行されたより大型の産業標準スモルトのサイズの約８０であったという事実から、さらにより重要である。これらの因子（海水移行時の体格がより小さい、および海水への馴化時間がより少ない）の両方が、顕著にＳＧＲ 値を低下させる傾向にあることが一般に認められている。これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ で処理したタイセイヨウサケが、海水移行後の対照魚と比べて大きな成長速度を示すことを示す。
【０２６０】
図４２は、海水への移行後の、ＡＰＳ プロセスＩ で処理されたスモルトの体重および体長の両方における増加を示す。ＡＰＳ プロセスＩ で処理されたこれらの魚は、この１８５ 日の期間中に体重において８倍の増加を経験したことに注目されたい。その結果、ＡＰＳスモルト（図４３において白四角）は、産業標準スモルトがともに海水配置時に２５％大きいという事実および海水中での６４日のさらなる期間を有したという事実にもかかわらず、産業標準スモルト（黒ひし形）と同一の平均サイズの達成に近づいた　（図４３）。これらのデータは、ＡＰＳスモルトが有意な浸透圧調節ストレスに曝されていなかったという証拠を提供し、このことが、魚の即時の摂餌および急速な成長を妨げないのであろう。
【０２６１】
図４３に示すように、海洋網生簀配置直後の９６日の期間中での、ＡＰＳ プロセスＩ で処理したスモルトの急速な成長は、海水成長が進行するにつれて、サケのサイズにおいていっそう大きな増加を提供する。例えば、これらのＡＰＳ プロセスＩ 魚はともに、これらの産業標準スモルトと同じ平均サイズ（９５．８ｇｍ）であり、同時に海水に配置されると、現行の試験期間において産業標準魚により達成される８５９ｇｍ のかわりに１６２０ｇｍの重量となるだろう。したがって、ＡＰＳ プロセスＩ で処理されたこれらの魚は、その同じ網生簀部で成長させた産業標準魚と比べて７ヶ月も早く市販サイズに達するだろう。
【０２６２】
実施例１６：ＡＰＳ プロセスＩ で処理し、海水研究室タンクへ移行した後の８４日のインターバルの間の２６．６ｇｍの平均重量を有する稚魚タイセイヨウサケの成育
これらのデータは、産業標準Ｓ１スモルトの約３０％の平均体長を有する稚魚タイセイヨウサケがＡＰＳ プロセスＩ での６週処理後の淡水から海水への移行を首尾よく成し遂げ得ることを示す。しかし、より大型の産業標準スモルト同様、これらのＡＰＳ プロセスＩ 魚は、飼料転換比またはＦＣＲ における減少を伴うＳＧＲ における有意な増加の前にほとんど成育しないかまたは成育しない重大な６１日インターバルをこうむる。
【０２６３】
実験用プロトコールの記載：実施例２に記載したように、Ｌａｎｄｃａｔｃｈ／Ｓｔ．Ｊｏｈｎ タイセイヨウサケをＡＰＳ プロセスＩ で処理し、次いでＡＰＳ研究室内の海水を含む循環タンクへ移行した。海水移行４８時間後、ＡＰＳ プロセスＩ 魚に、通常の産業サケと比較してより小型のＡＰＳ プロセスＩ 魚に、より小型のサイズの飼料を提供する必要性に起因して再小粒状にされている標準的な湿った（３８％水分）スモルト飼料（Ｃｏｎｎｏｒｓ Ｂｒｏｓ． ）を与え始めた。２６．６ｇｍの重量のあるこれらの１０８ 匹のＡＰＳ プロセスＩ の死亡、飼料消費、成育および全体的な健康を、実施例２に示されるように綿密にモニタリングした。
【０２６４】
結果：表５に列挙した１４０ 匹のＡＰＳ プロセスＩ 魚のうち合計１０８ 匹を、合計８４日間綿密にモニタリングした。この群のうち残りの３２匹の魚を、本明細書に報告していない他の実験に利用した。
【０２６５】
表１８に示すように、これらのＡＰＳ プロセスＩ 魚の全死亡は、１８／１０８または１６．６％であった。１５ｇｍ未満の重量の魚間の死亡の割合は、１５ｇｍより重い重量の魚（７／１０８ ）と比較していくらか大きかった（１１／１０８）。これらのＡＰＳ プロセスＩ 魚についての成長速度は、これらの魚に湿った飼料（３８％水分含有量）を給餌する場合、海水後初期６１日間は不十分（ＳＧＲ０．３７５）であった。しかし、これらの魚についての平均ＳＧＲ は、ＡＰＳ プロセスＩ 魚に標準的な乾燥飼料（＜１０％水分含有量）を給餌する場合、最後の２３日インターバルの間で改善した。同様に、ＡＰＳ プロセスＩ 魚の飼料変換比（ＦＣＲ ）は、海水移行後のこの初期６１日インターバルの間は不十分　（ＦＣＲ（ａｖ）＝４．１９）であったが、最後の２３日インターバルの間で有意に改善した（ＦＣＲ ０．８９）。これらのデータは、不十分な給餌および緩慢な成育の長期のインターバルが報告されている今日の従来技術を用いて海水へ移行したより大型の（１００ｇｍ ）スモルトに現れたデータに類似している。
【０２６６】
【表１８】
2004510443.tif 000019
【０２６７】
図４４に示すデータは、海水における成育６１日後対海水配置時のＡＰＳ プロセスＩ 魚の身体特徴の比較を提供する。これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ 魚のこの群が、湿った飼料を給餌している事実にも関わらずその適切な体重／体長比を維持しながら緩慢に成育したことを示す。まとめると、これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩ 魚が首尾よくより大型の産業標準タイセイヨウサケスモルト（１００ｇｍ ）について報告された様式とほぼ同一の様式で海水移行をこうむり得るが、そのより大型の対照物の約１／３ の平均体重を有することを示す。
【０２６８】
実施例１７：異なるＰＶＣＲアゴニストを含有する食餌管理を受けた後の海水移行後初期７２時間の稚魚タイセイヨウサケの示差生存
合計３つのＰＶＣＲアミノ酸アゴニスト（トリプトファン、チロシンおよびヒスチジン）を試験し、海水移行後初期７２時間インターバル間の稚魚タイセイヨウサケの生存を高める能力を測定した。本明細書に開示するデータは、稚魚タイセイヨウサケの飼料中のトリプトファンの含有が、チロシンまたはヒスチジンのいずれかと比較して海水移行後の魚の生存増加に有意に有効であることを示す。トリプトファンと別のＰＶＣＲアゴニスト（ＭｇＣｌ２ ）の含有は、トリプトファン単独と比較した場合、海水生存を改善しない。
【０２６９】
実験用プロトコールの記載：単一の孵化由来の約１５ｇｍの平均体重（範囲５．５０〜３０．５ｇｍ）を有する稚魚タイセイヨウサケ（Ｓｔ．Ｊｏｈｎ／Ｓｔ．Ｊｏｈｎ 株）を、それぞれ４５匹の魚の同一の対応群に分け、淡水（対照）または３ｍＭ Ｃａ２＋および１ｍＭ Ｍｇ２＋を含有する淡水のいずれかで管理した。魚食糧を、３つのアミノ酸のうちの１つを用いて実施例８に記載のように処方して調製し、魚に、１４日のインターバルの間一日２回給餌した。次いで、魚を、ＡＰＳ研究室内の海水を入れている循環タンクへ移行した。
【０２７０】
死亡を２４時間毎に定量し、７２時間後、示差死亡率を比較した。全魚を実験の存続の間、連続的な光周期に曝した。
【０２７１】
結果：表１９は、稚魚サケの海水への移行後に観察された死亡率を示す。７２時間実験インターバル間に観察した全死亡の比較を、図４５に示す。淡水で管理し、標準的な飼料（４４％ ）のみを与えた対照稚魚サケの海水移行初期の死亡とは対照的に、いずれの５ＰＶＣＲ調節因子の添加も、海水移行死亡率を有意に（ｐ＜０．０５）減少した。７％ＮａＣｌ単独添加の食餌［＃２］（ＡＰＳ プロセスＩ ）は、９％未満まで初期の海水移行死亡率を減少した７％ＮａＣｌ＋トリプトファンの両方の含有　［＃３］（ＡＰＳ プロセスＩＩ）と比較して死亡において５０％の減少を生じた。
【０２７２】
【表１９】
2004510443.tif 000020
【０２７３】
この低い死亡率は、食餌中へのＰＶＣＲ機能の第３の調節因子の含有（７％ＮａＣｌ＋２ｍｇ／ｋｇトリプトファン＋２％ＭｇＣｌ２ ）［＃６］によっては変わらない（ｐ ＞０．３ ）。対照的に、チロシンまたはヒスチジンのいずれかの添加は、トリプトファン（８．９％）と比較して海水移行後の死亡において有意に低い減少（それぞれ２０％ および３１％ ）を生じた。
【０２７４】
実施例１８：抗ＰＶＣＲポリクローナル抗血清を用いる個々のタイセイヨウサケの種々の組織におけるＰＶＣＲの検出のための固相酵素連結アッセイの使用の説明
魚の種々の組織のＰＶＣＲ含有量を、ＥＬＩＳＡ ９６ウェルプレートアッセイ系を用いて定量し得る。本明細書に記載するデータは、９６ウェルＥＬＩＳＡ アッセイの有用性を示し、免疫細胞化学およびウエスタンブロットを実施するために利用されるウサギポリクローナル抗ＰＶＣＲ抗体を用いてＰＶＣＲタンパク質の組織含有量を定量する。これらのデータは、本明細書に記載するように本発明の処理を受ける稚魚溯上性魚の種々の組織におけるＰＶＣＲタンパク質の発現レベルをモニターする商業アッセイキットの開発に対する基礎をなす。このＥＬＩＳＡ の感受性を、図４６に示すように、単一の稚魚タイセイヨウサケ由来の１４個の組織の相対的ＰＶＣＲ含有量の測定によって示す。
【０２７５】
実験プロトコールの説明：
ホモジネートを稚魚タイセイヨウサケ（Ｓｔ．Ｊｏｈｎ／Ｓｔ．Ｊｏｈｎ 株　平均重量１５〜２０ｇｍ）の種々の組織を緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、０．５ ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ ）および１ｍＭ ベンザミジンｐＨ８．８ ）に置いて、回転乳棒を備える標準的なガラスＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｎｈｉｅｍホモジナイザーを用いて調製した。より大きな残屑を除去するため４℃、２，５５０ ×ｇで２０分間遠心分離後、上清を直接使用するか、またはさらなる使用まで−８０ ℃で冷凍するかのいずれかをした。ホモジネートタンパク質濃度を、ＢＣＡ アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ． ）を用いて測定した。個々の組織ホモジネートのアリコートを、１００ μＬの一定のアリコートサイズに希釈し、それぞれを９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＰＬａｓｔｉｃ ＰＬａｔｅｓ ）へ移行し、１５時間、室温空気中で乾燥させた。ＴＢＳ （２５ｍＭのＴｒｉＳ１３７ｍＭ の塩化ナトリウム、２．７ｍＭ のＫＣｌ 　ｐＨ８．０ ）中に５％脱脂粉乳＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０ の溶液を用いて非特異的結合のブロック後、一次抗血清（ウサギ抗ＰＶＣＲ免疫または対応するウサギ免疫前抗血清のいずれか）を１ ：１５００で希釈した。１時間インキュベーション後、個々のウェルを、５００ μＬのＴＢＳ を用いて３回リンスし、１ ：３０００の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ウサギ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ ）を添加し、１時間インキュベートさせた。次いで個々のウェルをリンスして、１５分のインキュベーション後Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＶＭＡＸ ）を使用して４０５ｎｍ でＳｉｇｍａ Ａ３２１９ ２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアジジン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｉｄｉｎｅ ）−６− スルホン酸）着色試薬を用いて結合した一次−二次抗体の複合体を検出した。組織ＰＶＣＲ含有量の相対量を、最小バックグランドおよび免疫前抗血清の結合によって測定される非特異的抗体結合について補正した後、測定した。
【０２７６】
結果およびデータ説明：
図４６は、単一の稚魚タイセイヨウサケの１４個の組織のＰＶＣＲタンパク質含有量の典型的な単一ＥＬＩＳＡ 測定から得られたデータを示す。上で概説したような実験プロトコールに明記する条件下で、一次および二次抗体の両方の非特異的結合を最小化した。これらの定量値を絶対量ではなく互いに比較して測定するが、各組織の広範囲な免疫組織化学試験に対応するデータを生じる。種々の器官のＰＶＣＲ含有量がタイセイヨウサケの浸透度調節においてその重要性を示すことに注目すること。本明細書に記載される免疫組織化学データは、腸（近位域および遠位域）、鰓、膀胱および腎臓などの組織がＰＶＣＲタンパク質を含んでいたことを示す。各場合において、これらの組織の表面をぬらす（ｂａｔｈｅ ）体液に接触する上皮細胞は、ＰＶＣＲを発現する。対照的に、他の器官（肝臓、心臓および筋肉が挙げられる）は、最小のＰＶＣＲタンパク質を含有する。試験した任意の組織の最高のＰＶＣＲ含有量は、嗅覚ラメラであることに注目のこと。この嗅覚ラメラで、サケは水中のカルシウム濃度における変化を「匂う（ｓｍｅｌｌ ）」能力を有する。嗅覚ラメラを刺激する神経を含む嗅球はまた、豊富なＰＶＣＲを有する。まとめると、これらのデータは、ＰＶＣＲタンパク質の組織含有量を測定し、本発明のプロセスを受けた稚魚溯上性魚の種々の組織におけるＰＶＣＲタンパク質の発現レベルをモニターする商業用アッセイキットの開発の基礎をなすためのＥＬＩＳＡ キットの有用性を示す。次いで、組織ＰＶＣＲ含有量における相対的変化または組織質量あたりのＰＶＣＲの絶対量のいずれかにおいて測定されたＰＶＣＲ組織含有量における変化を、相関性アッセイとして利用して、海水移行または給餌の開始に対する稚魚溯上性魚の準備（ｒｅａｄｉｎｅｓｓ ）を測定し得た。これらのデータは、本発明の方法での処理後、魚を淡水から海水へ移行するために利用される体長の範囲内の個々の稚魚タイセイヨウサケでこのようなアッセイを実施可能であることを示す。
【０２７７】
実施例１９：タイセイヨウサケＰＶＣＲタンパク質のカルボキシル末端部分から作製される抗体は、ＰＶＣＲタンパク質の存在、非存在または量を測定するための免疫組織化学および免疫ブロットアッセイに有効である。
本明細書に記載する縮重プライマー、配列番号２２および／または２３を、ＳＫＣａＲ ＤＮＡ 配列から特異的に構築した。これらのプライマーは、ゲノムＤＮＡ およびｃＤＮＡの両方由来のＰＶＣＲ配列の一部分の増幅用に有用な試薬であることが証明されている（実施例２０を参照のこと）。
【０２７８】
溯上性魚のＰＶＣＲからより多くのｃＤＮＡ配列、特に、ＰＶＣＲのカルボキシル末端ドメインの推定アミノ酸配列（特異的ペプチドおよび結果として特異的抗タイセイヨウサケＰＶＣＲ抗血清の産生に対する標的）を得て、タイセイヨウサケ腸由来の未増幅ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡライブラリーから生じるファージプラークを、３２Ｐ 標識６５３ｂｐ ゲノムタイセイヨウサケＰＣＲ 産物（配列番号１）を用いて高ストリンジェンシー下でスクリーニングした。このｃＤＮＡライブラリースクリーニング努力から、２，０２１ｂｐ ｃＤＮＡクローンを単離し、このクローンは、腸ＰＶＣＲタンパク質由来の完全ｃＤＮＡ配列の約半分に対応する推定アミノ酸配列に対する単一のオープンリーディングフレームを含有していた。この推定アミノ酸配列は、対応ゲノムプローブによってコードされる配列およびＰＶＣＲのカルボキシル末端ドメインに対応する推定アミノ酸配列に正確に対応する。
【０２７９】
この推定アミノ酸配列の知識に基づいて、ペプチド（以下に示す）を合成し、このペプチドは、推定カルボキシル末端ＰＶＣＲアミノ酸配列の別個の領域に対応した。
【０２８０】
抗体産生のためのペプチド配列は、以下：
ペプチド＃１：Ａｃ−ＣＴＮＤＮＤＳＰＳＧＱＱＲＩＨＫ−アミド（配列番号２４）
であり、ウサギ抗血清ＳＡＬ−１ を産生する。
【０２８１】
このペプチドを、キャリアタンパク質に誘導体化し、ポリクローナル抗体を作製する方法を用いて２羽のウサギにおいてペプチド特異的抗血清を惹起するために利用した。
【０２８２】
次いで、生じたペプチド特異的抗血清を、免疫ブロット技術および免疫細胞化学技術の両方を用いて試験して、抗体がＰＶＣＲタンパク質に対応するタンパク質バンドに結合するか、または他の抗ＰＶＣＲ抗血清を用いて生じた染色パターンと類似の染色パターンを生じるかどうかを測定した。ＳＡＬ−１ （配列番号２４）またはＳＫＣａＲ （配列番号１８）のいずれかを含むペプチドに対して惹起した抗血清により認識されるタンパク質バンドを示す免疫ブロットの写真を撮った（図２８Ａ〜Ｅ）。予想したように、ペプチドに対して惹起した抗血清は、ＳＫＣａＲ （配列番号１８）に対して惹起した抗血清により認識されるＰＶＣＲタンパク質と共に同時電気泳動したタンパク質バンドに一致した。３つの異なる抗ＰＶＣＲ抗血清（抗ＳａｌＩ、抗４６４１、および抗ＳＫＣａＲ ）を用いる稚魚タイセイヨウサケ腎臓切片の免疫染色は、サケ腎臓の小管中でＰＶＣＲタンパク質の類似の局在化を生じる。抗ＳＫＣａＲ 抗血清によって生じた染色は、抗４６４１抗血清（ＳＫＣａＲ （配列番号１８）に非常に類似する哺乳動物ＰＶＣＲの細胞外ドメインに対応する抗ペプチド抗血清）によって生じた染色と同一であった。これらのＰＶＣＲタンパク質パターンは、ＳＡＬ−１ 抗血清によって生じたパターンと全く同じに染色した。抗Ｓａｌ−１ 抗血清はまた、抗ＳＫＣａＲ と比較して腸ＰＶＣＲタンパク質の分布について類似の染色パターンを示す。従って、この新規な抗血清は、タイセイヨウサケ組織におけるＰＶＣＲに特異的である。この抗血清を使用して、本明細書に記載の方法を用いて魚の種々の組織中のＰＶＣＲの存在、非存在または量を測定し得る。
【０２８３】
実施例２０：種々の組織におけるＰＶＣＲの発現を検出するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用
実施例１、２において、縮重プライマー、配列番号２２および２３を開示する。これらの２つのプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡ を増幅し、種々の溯上性魚由来のＰＶＣＲのゲノムＤＮＡ 配列の一部分の配列を得た。これらの同じプライマーをまた使用して、種々の組織において対応ＰＶＣＲ ｍＲＮＡ 転写物の一部分を増幅し得る。特定のタイセイヨウサケ組織（嗅覚ラメラ、腎臓、膀胱）から増幅されたｃＤＮＡのＤＮＡ 配列解析は、本明細書に記載される特定のゲノムＰＶＣＲ配列（例えば、配列番号１−タイセイヨウサケ）と全て同一である。これらのデータは、以下を示す：
【０２８４】
１．ＰＶＣＲ ｍＲＮＡ 転写物は、溯上性魚の特定の組織において実際に発現される。これらのデータは、抗ＰＶＣＲ抗血清によって検出されるようなＰＶＣＲタンパク質発現に関するデータを強化する。
【０２８５】
２．海水への移動に対する溯上性魚の準備を予測するための手段としてＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、種々の組織におけるＰＶＣＲ発現の程度を検出および定量し得る。
【０２８６】
３．溶液または固相ＤＮＡ−ＤＮＡ もしくはＤＮＡ−ＲＮＡ 核酸ハイブリダイゼーションを使用してＰＶＣＲ発現を検出するか、あるいは特異的抗ＰＶＣＲ抗血清の産生に使用される推定ＰＶＣＲタンパク質配列を得るための特異的ｃＤＮＡプローブとして使用するためｃＤＮＡプローブを、溯上性魚の特定の組織から産生し得る。
【０２８７】
ＲＴ−ＰＣＲ法：
総ＲＮＡ を、Ｔｅｌｔｅｓｔ Ｂ 試薬（Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ ）を用い、かつ標準的プロトコールに付随して選択した組織から精製した。合計５μｇの総ＲＮＡ を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｃＤＮＡ Ｃｙｃｌｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ）を使用してオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写した。生じたｃＤＮＡ産物を変性し、第二回の精製を実施した。２μＬの生じた反応混合物を、縮重プライマー配列番号２２および２３を用いてＰＣＲ 反応（１分＠９４℃、２分＠５７℃、３分＠７２℃の３０サイクル）において増幅した。生じた産物を、増幅ｃＤＮＡ産物の検出のために臭化エチジウムを含有するＴＡＥ 緩衝液を用いて２％（ｗ／ｖ ）アガロースゲル上で電気泳動した。ゲルを、標準的研究室方法を使用して、写真に写した。
【０２８８】
ＲＴ−ＰＣＲ産物のＤＮＡ 配列決定を以下のように実施した：
合計１５μＬのタイセイヨウサケ膀胱、腎臓および鼻腔ラメラＲＴ−ＰＣＲ反応物を、４０μＬの水に希釈し、ＡｍｅｒｓｈａｍのＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）上のサイズ排除により精製した。精製ＤＮＡ を、配列決定プライマーとして縮重ＰＶＣＲプライマー（配列番号２２および２３）を用いて配列決定した。自動配列決定をＡｐＰＬｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ． Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｉｎｅ， Ｏｒｏｎｏ， Ｍａｉｎｅ ）を用いて実施した。生じたＤＮＡ 配列を、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ（ＧＣＧ ）およびＬａｓｅｒＧｅｎｅ （ＤＮＡ ＳＴＡＲ）配列解析ソフトウェアを用いて整列した。
【０２８９】
サザンブロットによる増幅ＲＴ−ＰＣＲ ｃＤＮＡ 産物の検出：
代替的に、増幅ＰＣＲ 産物の存在を、３２Ｐ 標識６５３ｂｐ タイセイヨウサケ増幅ゲノムＰＣＲ 産物（配列番号１）を用いてゲル分画ＲＴ−ＰＣＲ産物のサザンブロット解析によって検出した。合計１０μＬの各ＰＣＲ 反応物を、ＴＡＥ 緩衝液を用いて２％（ｗ／ｖ ）アガロースゲル上で電気泳動し、次いでＭａｇｎａｇｒａｐｈ膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ， Ｗｅｓｔｂｏｒｏ， ＭＡ）上にブロットした。ＤＮＡ のｕｖ架橋後、ブロットをプレハイブリダイズし、次いで６５３ｂｐ タイセイヨウサケＰＣＲ 産物　（ＲａｄＰｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ で標識化）を用いて一晩プローブした（６×ＳＳＣ 、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％ＳＤＳ１００ｕｇ／ｍｌ子ウシ胸腺ＤＮＡ ）。次いで、ブロットを、０．１ ×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ ＠５５℃で洗浄し、標準的な条件下でオートラジオグラフィに供した。
【０２９０】
図４７は、稚魚タイセイヨウサケの種々の組織由来の部分的ＰＶＣＲ ｍＲＮＡ 転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。ＲＴ−ＰＣＲ反応物を、ゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色するか、または膜に移動しタイセイヨウサケＰＶＣＲ遺伝子由来の３２Ｐ 標識６５３ｂｐ ゲノムＤＮＡ フラグメントを用いてサザンブロットするかのいずれかをした。図４７は、本明細書に記載するように、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたタイセイヨウサケのいくつかの組織型におけるＰＶＣＲの検出を示す。組織型は、鰓、鼻腔ラメラ、膀胱、腎臓、腸、胃、肝臓、および脳である。
【０２９１】
実施例２１：ＡＰＳ プロセスＩＩを用いた稚魚タイセイヨウサケの処理は、海水への移行後の生存に必要なより有効な鰓機能をこれらの魚に準備させる、鰓上皮細胞の構造および機能の両方における変化を生じる
本明細書に記載のデータは、稚魚タイセイヨウサケの鰓塩類細胞（ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｅｌｌ ）がＰＶＣＲタンパク質を有すること、およびＡＰＳ プロセスＩＩでの処理に対応して稚魚タイセイヨウサケは、淡水にとどまったままであることを除いて、海水への移行によって生じる鰓塩類細胞の分布に類似の分布をリモデルすることを示す。さらに、本明細書に記載するデータは、ＡＰＳ プロセスＩＩでの処理に対応して淡水にとどまったままである稚魚タイセイヨウサケの鰓（幽門盲腸ではなく）は、そのＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性を海水へ移行した魚の活性に類似の様式で二倍にする。まとめると、これらのデータは、鰓塩類細胞に存在するＰＶＣＲタンパク質がＡＰＳ プロセスＩＩでの魚の処理に応答し、魚が海水へ移行された後のプロセスに非常に似ている様式で塩類細胞の分布およびＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の両方をリモデルすることを示すための強力な証拠を提供する。ＡＰＳ プロセスＩＩでの溯上性魚のこの処理は、海水への稚魚タイセイヨウサケの移行後のより速やかな順応ならびにより良い能力および成長を提供する。
【０２９２】
以下のパラメーターをＡＰＳ プロセスＩ に順応した溯上性魚の鰓塩類細胞について確立している：
１．抗Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ抗体を用いて塩類細胞の鰓ラメラのパラフィン切片内の位置を測定し得る。サケ科の鰓の一次および二次ラメラの両方における塩類細胞の分布を指標として使用して、ＡＰＳプロセスの間に魚を移行した後に鰓をリモデルする方法を突きとめ得る。
２．鰓組織のホモジネートに存在するＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性を本明細書に記載する方法（例えば、酵素アッセイ）を使用して、定量し得る。非常に大多数のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素が塩類細胞に含まれるので、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素活性量における変化を、鰓塩類細胞活性における変化の指標として使用する。一般的に、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性は、淡水順応したサケ科が海水へ移行され、この新しい高浸透圧環境に対してその鰓をリモデルする場合に有意に増加する。
【０２９３】
以下に詳細に示すように、両方の技術を利用して、稚魚タイセイヨウサケの鰓塩類細胞の分布および活性における変化を示した。ＡＰＳ プロセスＩＩでの魚の処理後に生じるこれらの変化は、海水へ移行されたサケ科に生じる変化に類似している。
【０２９４】
実験プロトコールの説明：
Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性を、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ の方法（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， ＳＤ １９９３． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｎｏｎｌｅｔｈａｌ ｇｉｌｌ ｂｉｏｐｓｙ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰ アーゼ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｃａｎ Ｊ． Ｆｉｓｈ Ａｑｕａｔ． Ｓｃｉ． ５０， ６５６−６５８）によって鰓および幽門盲腸（脂肪を除いた）の粗ホモジネートにおいて測定した。９６ウェルプレートリーダーを使用した（ＶＥＲＳＡｍａｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）。簡単には、組織を切り裂き、氷冷却ＳＥＩ 緩衝液（３００ｍＭ スクロース、２０ｍＭ ＥＤＴＡ 、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．３ ）のアリコート中で凍結し、−８０ ℃で保管した。サンプルを、アッセイ直前に解凍し、ＳＥＩＤ（０．５ ％デオキシコール酸ナトリウムを含むＳＥＩ 緩衝液）のアリコートを添加して、最終濃度０．１ ％のデオキシコール酸ナトリウムを達成した。サンプルをＫｏｎｔｅｓ Ｄｕａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｒｉｎｄｅｒ（テフロン（登録商標）／ガラス）中でホモジナイズし、５０００ｇ で２分間遠心分離して、不溶性物質を除去した。活性を、ウアバイン（０．５ｍＭ ）を含むアッセイ混合物および含まないアッセイ混合物中のホモジネートの１０μｌ １アリコートにおいて二回測定した。アッセイ混合物は以下：５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５ 中に２．１ｍＭ ＰＥＰ 、０．５３ｍＭ ＡＴＰ、０．２９ｍＭ ＮＡＤＨ 、３Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ 、３．７５ Ｕ／ｍｌ ＰＫ、４７．２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．６３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０．５ｍＭ ＫＣｌであった。ＮＡＤＨ消滅の線形速度を、３４０ｎｍ で１０分間測定した。Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性を、ウアバインを含有するＡＴＰ 加水分解物またはウアバインを含有しないＡＴＰ 加水分解物における差異から計算し、ウェル中のタンパク質含有量に対して標準化した。タンパク質を、クマシーベースのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ ）を用いてプレートリーダーにおいて解析した。
【０２９５】
結果および考察：
海水における稚魚タイセイヨウサケの塩類細胞を、主に鰓の一次ラメラ上に局在化する：サケ科の鰓は、種々の上皮細胞および毛細血管を含むラメラと呼ばれる構造から構成される。鰓ラメラのパラフィン切片により示されるように、各一次鰓ラメラは、多数の二次ラメラを含む。これらの切片の写真を撮った。海水順応サケ科（例えば、本発明の方法に供していない魚）において、塩類細胞は、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ抗血清を用いる顕著な染色により同定される場合、ほとんどもっぱら二次ラメラの基底の両側に位置する一次ラメラへ局在化する。
【０２９６】
稚魚タイセイヨウサケの塩類細胞は、一次および二次鰓ラメラの両方に位置する。鰓ラメラの切片を、抗Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼまたは抗ＰＶＣＲ抗血清のいずれかを用いて染色し、これらの切片の写真を撮った。塩類細胞は、有意な量のＰＶＣＲタンパク質を含む。淡水順応した対の稚魚タイセイヨウサケ由来の鰓は、海水順応魚に存在する塩類細胞の分布と比較して、異なる分布を含む。しかし、魚をＡＰＳ プロセスＩＩに供した複数の実験において、鰓における塩類細胞の分布は、処理魚が淡水にとどまっているにもかかわらず、海水へ移行された魚が示すパターンに似ている二次ラメラ中の塩類細胞数における有意な減少を示すようにシフトした。淡水で管理されている魚において、塩類細胞は、鰓組織の一次および二次ラメラの両方においてほぼ等しい数で局在化する。対照的に、このような魚を海水へ移す場合、この分布は、二次ラメラにおいて観察される塩類細胞が有意にほとんど存在しないように変化する。粘液細胞は、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ抗血清では染色しなかった。
【０２９７】
抗ＰＶＣＲ抗血清を用いる隣接切片の免疫染色は、塩類細胞および粘液細胞の両方が有意な量のＰＶＣＲタンパク質を含むことを示す。溯上性魚の鰓におけるＰＶＣＲタンパク質の存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ゲルタンパク質バンドの免疫ブロットにより示した実施例３を参照のこと。これらのデータは、鰓の塩類細胞および粘液細胞の両方がＰＶＣＲタンパク質を有し、従って鰓組織にわたって流れる水のイオン組成を感じ得ることを示す。
【０２９８】
ＡＰＳ プロセスＩＩに曝された稚魚タイセイヨウサケにおける塩類細胞の分布は、このＡＰＳ プロセスＩＩ処理魚が淡水にとどまっているが、海水順応魚が表わす分布に類似している。鰓組織の切片は、４５日の期間ＡＰＳ プロセスＩＩで処理した対の魚における鰓塩類細胞の分布を示す。塩類細胞の分布は、これらの魚が淡水にとどまっているが、海水順応魚が示す分布に類似している。二次ラメラ（ＳＬ）対一次ラメラ（ＰＬ）に存在する塩類細胞の分布は、図４８に示すような比で発現され得る。ＳＬ／ＰＬ 比は淡水順応サケに対しては約１、海水順応魚に対しては約０．１ であることに注意のこと。対照的に、ＡＰＳ プロセスＩＩで処理した対の魚は、０．３ 〜０．４ のＳＬ／ＰＬ 比を示す。この値は、淡水で管理した魚とは有意に異なり、海水順応魚により示される値に近づく。まとめると、これらのデータは、鰓塩類細胞のリモデルの証拠を提供し、海水順応魚でのデータに似ている。鰓塩類細胞におけるＰＶＣＲタンパク質の存在は、塩類細胞が塩類細胞を取り巻くイオン環境における変化を感じ取ることを可能にし、結果的にリモデルを可能にする。
【０２９９】
ＡＰＳ プロセスＩＩへの稚魚タイセイヨウサケの処置は、海水へのサケの移行後に評されるＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の増加と類似の様式で、鰓のホモジネートにおけるＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性を増加する。図４９は、淡水で管理したか、または合計４５日間ＡＰＳ プロセスＩＩで処理したかのいずれかの対の稚魚タイセイヨウサケから単離した鰓または幽門盲腸のいずれかから調製したホモジネート中のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の比較を示す。ＡＰＳ プロセスＩＩで処理した魚の鰓由来のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性は、対の淡水魚由来の鰓での活性のほぼ二倍である。この有意な差異（８．１０＋／−３．８７ 対３．７６＋／−０．９４ ｐ ＜０．０００８）は、特異的である。なぜならば、これらの同じ魚の幽門盲腸由来のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性（１１．０＋／−１．７６ 対１１．１＋／−１．７１ ｐ ＜０．３５）は、有意に異ならないからである。
【０３００】
稚魚サケ科魚の海水への移動は、鰓塩類細胞のリモデルを反映するＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性における有意な増加を生じ、海水の飲用の開始時に魚により摂取および吸収されたＮａＣｌを除去することを可能にする。まとめると、本明細書に記載するデータは、稚魚タイセイヨウサケのＡＰＳ プロセスＩＩ処理が、魚が海水への移行なしに淡水にとどまっている間、鰓Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性を増加することを示す。Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性におけるこの増加は、鰓に特異的に現れる。なぜなら、類似の増加は同じ対の魚におけるＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の豊富な別の器官において生じないからである。
【０３０１】
本明細書に記載するデータは、ＡＰＳ プロセスＩＩでの稚魚タイセイヨウサケの処理が魚の浸透調節器官におけるＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素の活性に選択的変化を生じることを示す。これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩＩが稚魚タイセイヨウサケの海水への移行前に生じる特異的組織のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性における特異的増加を引き起こすことを示す。これらのデータは、淡水におけるＡＰＳ プロセスＩＩが海水へ移行された後にのみ産業標準魚において通常生じるＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の増加によく似るという直接的な分子証拠を提供する。
【０３０２】
ＡＰＳ プロセスＩＩでの処理に対応して、淡水にとどまる稚魚タイセイヨウサケの幽門盲腸ではなく鰓のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性は、海水へ移動した魚の活性の増加に類似の様式でそのＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性を有意に増加する。これらのデータは、ＡＰＳ プロセスＩＩでの処理が海水への移行後の稚魚タイセイヨウサケの生存を増加する方法に関して、直接証拠を提供する。稚魚の海水への移行後の遅延様式を生じる鰓Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性における増加の代わりに、鰓Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性は、淡水でのＡＰＳ プロセスＩＩ処理の間、増加し、従って海水移行前に上昇する。プロセスＩＩでの溯上性魚のこの処理は、稚魚タイセイヨウサケの海水への移行後のより速やかな順応ならびにより良い性能および成長を提供する。
【０３０３】
膜結合Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素は、淡水および海水の両方において、体成分を維持する魚の能力の重要な部分である。上記のように、鰓の塩類細胞は、この酵素の豊富な供給源である。本発明の工程に供していない魚についての鰓塩類細胞およびＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素活性における変化を、図５０に示す。Ｓｅｉｄｅｌｉｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｚｏｏｌ． ７３（４）：４４６−５３（２０００）を参照のこと。図５０におけるデータは、稚魚サケ科における塩分変化に対する細胞性応答の開始と重大なイオン輸送機構の活性化との間の有意な遅延を示す。図５０は、淡水で管理した（白棒）か、または２５ｐｐｔ （３／４ 海水）へ移行した後（黒棒）のいずれかの淡水順応稚魚マス（体重５１ｇｍ平均）由来の鰓組織ホモジネートのＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素活性における変化を比較する。海水移行後１２時間以内に、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素に対するｍＲＮＡの有意な増加（図５０、パネルＡ）および二次鰓ラメラのＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ免疫反応性（ＮＫＩＲ）塩類細胞数の５０％減少がある。しかし、Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素の活性における有意な増加は、海水移行５日後までは生じない。この遅延インターバル（３重線で示す）は、稚魚サケ科が非常にストレスを受ける時間インターバルを表す。なぜならば、新しい高浸透性海水環境を真似るため重要な浸透調節組織様鰓を速やかにリモデルしようと試みるからである。魚が鰓Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素活性における増加を達成することに失敗した場合、電解質不均等により死亡する。本明細書に記載するように、このインターバルを生存する能力は、魚のサイズ（臨界サイズ）に依存する。
【０３０４】
対照的に、淡水においてＡＰＳ プロセスＩＩで処理した稚魚タイセイヨウサケは、Ｇｉｌｌ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ のテキストに詳細に示されるように、海水への移行前に、淡水において両方のＮＫＩＲ（塩類）細胞の分布をリモデルし、その上鰓Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素活性を増加する。図４９に示すように、淡水で管理したか、またはＡＰＳ プロセスＩＩでの処理直後の魚由来の鰓および幽門盲腸におけるＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素活性の比較は、幽門盲腸ではなく鰓のＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素において有意な増加を示す。図４９は、淡水で管理したか、または淡水においてプロセスＩＩで４５日間処理したかのいずれかの稚魚タイセイヨウサケの鰓および幽門盲腸由来のホモジネートにおけるＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性の比較を示す。スター（＊ ）は、鰓における酵素活性の有意な（ｐ＜０．０５）増加を示す。
【０３０５】
従って、ＡＰＳ プロセスＩＩでの処理は、全ての器官においてＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素活性を単純に変更するわけではなく、これらの増加は、選択的器官に限定される。産業標準魚で実験した図５０に示すＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ酵素活性の増加における９６時間遅延の除去は、ＡＰＳ プロセスＩＩが海水の代わりのＡＰＳ プロセスＩＩの間に淡水で起きるタイセイヨウサケにおける生理的変化を生じるという直接証拠を提供する。ＡＰＳ プロセスＩＩ処理魚の海水への移行の際、これらの変化は、すでに明白であり、従ってこれらの魚に、浸透調節ストレスのインターバルまたは死亡なしに即時に新しい海水環境へ順応する能力を与える。
【０３０６】
実施例２２：ＰＶＣＲは、細胞外カルシウムの存在下で特異的アミノ酸を感じ得る
サメ腎臓カルシウムレセプター（ＳＫＣａＲ ）は、細胞外カルシウム（１〜１０ｍＭ）の存在下で特定のアミノ酸を感じ取る能力を有する。本明細書に記載するデータは、アミノ酸のＳＫＣａＲ の感受が、上皮経由アミノ酸吸収が生じる血清および体腔を含む魚体の種々の区画（腸、幽門盲腸および腎臓が挙げられる）に存在する細胞外カルシウムの範囲で生じることを示す。
【０３０７】
実験プロトコールの説明：
全長組換えアミア（Ｓｑｕａｌｕｓ ａｃａｎｔｈｉａｓ ）サメ腎臓カルシウムレセプター（ＳＫＣａＲ ）（配列番号１７）を、ヒト胚腎臓細胞において発現させた。ＳＫＣａＲ ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターＰＣＤＮＡ ＩＩにライゲーションし、標準的技術を用いてＨＥＫ 細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞におけるＳＫＣａＲ タンパク質の存在を、ウェスタンブロットにより検証した。ＳＫＣａＲ の活性化および個々のアミノ酸またはその混合物に応答する能力を、充分に特徴付けられたＦＵＲＡ−２比画像化蛍光アッセイを用いて定量した。ここで、ＳＫＣａＲ 活性化により生じた細胞内Ｃａ２＋における増加を検出し、レセプター活性化に対する％標準化細胞内カルシウム応答として表す。Ｂａｉ， Ｍ．，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ３２：１９５３７−１９５４５（１９９６）；Ｃｏｎｉｇｒａｖｅ， Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：４８１４−４８１９（２０００）。
【０３０８】
結果および考察：
図５１は、蛍光計へ配置する前に、１０ｍＭ Ｌ− イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ ）の存在下または非存在下で生理食塩水（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ 、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２ 、０．５ｍＭｇＣｌ２ 、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨ）、０．１ ％Ｄ−グルコースｐＨ７．４ ）に浴したＳＫＣａＲ を安定して発現するＦＵＲＡ−２負荷細胞の蛍光トレーシングの比較を示す。ベースライン細胞外Ｃａ２＋濃度は、０．５ｍＭ であった。Ｃａ２＋のアリコートを添加して、最終細胞外濃度２．５ｍＭ 、５ｍＭ 、７．５ｍＭ 、１０ｍＭおよび２０ｍＭのＣａ２＋を生成し、蛍光の変化を記録した。細胞蛍光における増加は、１０ｍＭ未満の細胞外Ｃａ２＋濃度に対して１０ｍＭのＰｈｅ の存在下でより大きくなることに注意のこと。
【０３０９】
図５２は、１０ｍＭフェニルアラニン（Ｐｈｅ ）、１０ｍＭイソロイシン（Ｉｌｅ ）または以下の濃度（マイクロモル／Ｌ）で全てのＬ−異性体を含むアミノ酸混合物（ＡＡ混合物）の影響を図５１に記載するような複数の実験からプロットしたデータを示す、以下：５０フェニルアラニン（Ｐｈｅ ）、５０トリプトファン（Ｔｒｐ ）、８０ヒスチジン（Ｈｉｓ ）、６０チロシン（Ｔｙｒ ）、３０シスチン（Ｃｙｓ ）、３００ アラニン（Ａｌａ ）、２００ スレオニン（Ｔｈｒ ）、５０アスパラギン（Ａｓｎ ）、６００ グルタミン（Ｇｌｎ ）、１２５ セリン（Ｓｅｒ ）、３０グルタミン酸（Ｇｌｕ ）、２５０ グリシン（Ｇｌｙ ）、１８０ プロリン（Ｐｒｏ ）、２５０ バリン（Ｖａｌ ）、３０メチオニン（Ｍｅｔ ）、１０アスパラギン酸（Ａｓｐ ）、２００ リジン（Ｌｙｓ ）、１００ アルギニン（Ａｒｇ ）、７５イソロイシン（Ｉｌｅ ）、１５０ ロイシン（Ｌｅｕ ）。１０ｍＭ Ｐｈｅおよび１０ｍＭ Ｉｌｅの両方ならびにアミノ酸の混合物は、所定のＣａ２＋濃度に対するＳＫＣａＲ の応答を増加することに注意のこと。従って、これらのデータは、単独または組み合わせのいずれかのアミノ酸の存在は生理的濃度のＣａ２＋の存在下でＳＫＣａＲ がアミノ酸を「感じる」ことを可能にするＣａ２＋に対する明白な感受性を増加することを示す。
【０３１０】
水生生物についてのこれらのデータの意義は、ヒトＣａＲ アミノ酸感受能力の役割について発表された報告に言及されるものとは著しく対照的に位置する。図５２は、アミノ酸を感じるＳＫＣａＲ の最大能力が水生外部環境および種々の魚の体液の両方に存在するＣａ２＋の範囲に制限されることを示す。魚におけるＰＶＣＲについての先の局在化に基づいて、以下が本発明の重要な生理的プロセスおよび適用である：
【０３１１】
１．魚の近位腸および幽門盲腸におけるアミノ酸の感受：腸上皮細胞の先端表面上に存在するＰＶＣＲは、ＡＰＳ プロセスＩＩの一部としてトリプトファンなどのアミノ酸に応答し得る。魚の飼料へのトリプトファンの含有は、腸ＰＶＣＲと相互作用して、稚魚溯上性魚の発育を改善し、海水移行に耐性を有する。
【０３１２】
２．成魚、稚魚および幼魚の両方において、胃および腸上皮細胞の先端膜に局在化するＰＶＣＲは、タンパク質のアミノ酸へのタンパク質分解により作製されたアミノ酸の存在を「感じ」得る。この機構を使用して、腸の上皮細胞および神経内分泌細胞の両方に栄養（タンパク質）の存在を通知し、多数の応答（腸上皮の成長および分化ならびに輸送タンパク質への結合、胃酸などのイオンの分泌または再吸収が挙げられる）を誘発し得た。先端ＰＶＣＲはまた、腸ホルモン（例えば、コレシストキン（ＣＣＫ ）など）の分泌を調節し得ると考えられる。
【０３１３】
３．魚の鼻ラメラの細胞に存在するＰＶＣＲを使用して、水塩分（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋およびＮａＣｌを介して）およびアミノ酸の両方を「匂い」得る。アミノ酸、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋および／またはＮａＣｌを誘引物質およびホーミング用の両方として使用し得る。
【０３１４】
引用される参考文献、特許、および特許出願は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。また、２０００年１０月１２日出願、タイトル「Ｇｒｏｗｉｎｇ Ｍａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈ ｉｎ Ｆｒｅｓｈ Ｗａｔｅｒ」、必携特許出願番号第０９／６８７，３７３号；２００１年１０月１１日出願、タイトル「Ｇｒｏｗｉｎｇ Ｍａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈ ｉｎ Ｆｒｅｓｈ Ｗａｔｅｒ」、特許出願番号第：（まだ割り当てられていない；代理人事件番号２２１３．１００３−００１ ）；２０００年１０月１２日出願、タイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｒａｉｓｉｎｇ Ｐｒｅ−ａｄｕｌｔ Ａｎａｄｒｏｍｏｕｓ Ｆｉｓｈ 」、特許出願番号第０９／６８７，４７６号；２０００年１０月１２日出願、タイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｒａｉｓｉｎｇ Ｐｒｅ−ａｄｕｌｔ Ａｎａｄｒｏｍｏｕｓ Ｆｉｓｈ 」、特許出願番号第０９／６８７，３７２号；２００１年１０月１１日出願、タイトル「Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｃａｔｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」、国際ＰＣＴ 出願番号（まだ割り当てられていない；代理人事件番号２２１３．１００６−００１ ）；２０００年１０月１２日出願、タイトル「Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｃａｔｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」、予備特許出願番号第６０／２４０，３９２号；２０００年１０月１２日出願、タイトル「Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｃａｔｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」、予備特許出願番号第６０／２４０，００３号；２００１年１０月１１日出願、タイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｆｉｓｈ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｏｄｏｒａｎｔ」、予備特許出願番号（まだ割り当てられていない；代理人事件番号２２１３．２００４−０００ ）は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。さらに、１９９８年９ 月２８日出願、出願番号第０９／１６２，０２１号、１９９７年３ 月２７日出願、国際ＰＣＴ 出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５０３１号、および１９９６年３ 月２７日出願、出願番号第０８／６２２，７３８号（タイトルは全て、「Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ 」）は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０３１５】
本発明は、その好ましい態様を参考として部分的に示され、記載されているが、種々の変更が添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずにその中でなされ得ることが当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ ）の多価カチオン感受レセプター（ＰＶＣＲ）の部分ヌクレオチド（配列番号：１）配列およびアミノ酸　（配列番号：２）配列を示す図である。
【図２】
図２は、アルプスイワナ（Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ ａｌｐｉｎｕｓ）のＰＶＣＲの部分ヌクレオチド（配列番号：３）配列およびアミノ酸（配列番号：４）配列を示す図である。
【図３】
図３は、ニジマス（Ｏｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）のＰＶＣＲの部分ヌクレオチド（配列番号：５）配列およびアミノ酸（配列番号：６）配列を示す図である。
【図４】
図４Ａ−Ｂは、サメ腎臓カチオンレセプター（「ＳＫＣａＲ 」）のアミノ酸配列（配列番号：１８）、サケのアミノ酸配列（配列番号：２）、アルプスイワナのアミノ酸配列（配列番号：４）およびニジマスのアミノ酸配列（配列番号：６）のアラインメントを示す図である。
【図５】
図５は、本発明の発見前の、サケ水産養殖生産の産業実施を示す概要図である。図は、Ｓ０（７５グラム）およびＳ１（１００ グラム）のスモルトのサケ生産における重要な工程を示す。波状の記号は淡水を示し、一方、泡は海水を示す。
【図６】
図６Ａは、プロセスＩで処理された、体重約７６．６ｇｍのスモルトと産業標準である、体重約９５．８ｇｍのスモルトとの間における魚一匹当たりの一週間の飼料消費の比較を示すグラフ図である。これらのデータは、いけす（ｐｅｎ ）当たり約１０，０００〜５０，０００匹の魚を含む、個々の魚の網いけすから得られたものである。示すように、プロセスＩで処理された魚は、３０日後の大規模産業標準のスモルトの１週間での飼料消費と比べて、海水移動後、最初の１週間に魚一匹当たり約２倍程度の飼料を消費した。
図６Ｂは、海洋網いけす配置から５０日後のＡＰＳ プロセスＩ スモルトの体長（ｃｍ）および体重（ｇｍ）を示すグラフ図である。ＡＰＳ プロセスＩ スモルトは、海水に配置し、５０日後に採取した場合、７６．６グラムの平均体重を有した。ＡＰＳ プロセスＩ は実施例２に規定される。
【図７】
図７は、海水に移動する前の代表的なＡＰＳ プロセスＩ スモルトの体長（ｃｍ）および体重（ｇｍ）を示すグラフ図である。
【図８】
図８は、移動する前のＡＰＳ プロセスＩ スモルトおよび死亡個体の体長（ｃｍ）および体重（ｇｍ）を示すグラフ図である。
【図９】
図９は、淡水に維持された後、１４日間のＡＰＳ プロセスＩ 後、および３０日間のＡＰＳ プロセスＩ 後での、海水におけるアルプスイワナの５日間での生存率を示す三次元グラフである。
【図１０】
図１０は、海水に移動する前のセント．ジョン（Ｓｔ．Ｊｏｈｎ ）／セント．ジョン（Ｓｔ．Ｊｏｈｎ ）ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの体長（ｃｍ）および体重（ｇｍ）を示すグラフ図である。ＡＰＳ プロセスＩＩは実施例２に規定される。
【図１１】
図１１Ａおよび１１Ｂは、海水タンクへの移動から５日後、および海洋網いけすへの移動から９６時間後でのＡＰＳ プロセスＩＩスモルト生存個体および死亡個体の体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。
【図１２】
図１２は、海洋網いけすへの移動から５日後でのＡＰＳ プロセスＩＩスモルト死亡個体の体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。
【図１３】
図１３Ａ−Ｇは、ＰＶＣＲ局在および発現を示す、タイセイヨウサケの近位小腸の上皮の免疫細胞化学の写真である。
【図１４】
図１４は、ＰＶＣＲ発現を示す、免疫（ＣａＲ とレーンにマーク、例えば、ＰＶＣＲ）および免疫前（免疫前とレーンにマーク）についての、ＡＰＳ プロセスＩ に供され続けたサケ由来の小腸組織のウエスタンブロットの写真である。
【図１５】
図１５は、ＰＶＣＲ発現を示す、免疫（ＣａＲ とレーンにマーク、例えば、ＰＶＣＲ）および免疫前（免疫前とレーンにマーク）についての、マス小魚由来の小腸組織のウエスタンブロットの写真である。
【図１６】
図１６Ａ−Ｈは、ＰＶＣＲ局在および発現を示す、抗ＰＶＣＲ抗血清を使用したニジマスの近位小腸の上皮の免疫細胞化学の写真である。
【図１７】
図１７は、ＰＶＣＲ発現を示す、淡水、カルシウムおよびマグネシウムを含む水、および海水における魚のＰＶＣＲレベルを比較するウエスタンブロットの写真である。
【図１８】
図１８Ａ−Ｃは、ＰＶＣＲ局在および発現を示す、サケの上皮におけるＰＶＣＲの免疫局在の写真である。
【図１９】
図１９は、海水および淡水における魚の適応変化を示す概要図である。
【図２０】
図２０は、海水または本発明の水混合物のいずれかへの移動に供したニジマスにおける経時的な血清カルシウム濃度（ｍＭ）のグラフ図である。全データポイントは、単一の代表的実験から得られた、少なくとも５回の別個の測定での、平均±標準偏差である。
【図２１】
図２１は、水混合物（３ｍＭ カルシウム、１ｍＭ マグネシウムおよびさらに１％塩化ナトリウム（ｗ／ｗ ）を含む標準淡水ペレット化飼料）中に維持されたマスに給餌することにより誘導された、経時的な血清カルシウム濃度（ｍＭ）の増加を示すグラフ図である。
【図２２】
図２２Ａおよび２２Ｂは、Ｓ１タイセイヨウサケ（Ａｌｔａｎｔｉｃ ｓａｌｍｏｎ ）スモルトの海水移動後での血清カルシウム（図２２Ａ）およびナトリウム　（図２２Ｂ）の変化のグラフ図である。
【図２３】
図２３ＡおよびＢは、ＡＰＳ プロセスＩ 処理されたＳ１魚であるタイセイヨウサケ由来の、経時的な血清カルシウム、マグネシウムおよびナトリウムレベル（ｍＭ）のグラフ図である。各値は、この単一の代表的実験由来の最小で１０回の別個の測定の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図２４】
図２４は、海水に移動する前の代表的なＡＰＳ プロセスＩＩスモルトの体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。ＡＰＳ プロセスＩＩスモルトのこの代表例（ｎ＝１００ ）は、幅広い体重（３．９５−２３ グラム）を有し、平均体重は１１．５ｇｍである。移動群では、全ての死亡（ｎ＝１０）は、より小さな魚でのみ生じたことに注意すべきである。
【図２５】
図２５は、海水への移動後のＡＰＳ プロセスＩＩに供された成魚前タイセイヨウサケにおけるカルシウム、マグネシウムおよびナトリウムの血清濃度（ｍＭ）の値を示すグラフ図である。示される全値は、単一の代表的実験由来の最小で１０個の別個の試料の平均＋Ｓ．Ｄ．である。
【図２６】
図２６Ａ−Ｃは、タイセイヨウサケ（配列番号：１）、チャー（Ｃｈａｒ）（配列番号：３）、サケ（Ｃｈｕｍ Ｓａｌｍｏｎ ）（配列番号：７）、ギンザケ　（配列番号：９）、マスノスケ（配列番号：１１）、カラフトマス（配列番号：１３）、ベニザケ（配列番号：１５）およびマス（配列番号：５）のＰＶＣＲについての核酸配列を示すアラインメントである。
【図２７】
図２７Ａ−Ｂは、タイセイヨウサケ（配列番号：２）、チャー（配列番号：４）、サケ（Ｃｈｕｍ Ｓａｌｍｏｎ ）（配列番号：８）、ギンザケ（配列番号：１０）、マスノスケ（配列番号：１２）、カラフトマス（配列番号：１４）、ベニザケ（配列番号：１６）およびマス（配列番号：６）のＰＶＣＲについてのポリペプチド配列のオープンリーディングフレームを示すアラインメントである。
【図２８】
図２８Ａ−Ｅは、ＳＫＣａＲ の核酸配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：１７および１８）を示す図である。
【図２９】
図２９は、海水への移動の前後において連続的または非連続的な光周期に曝露されたＡＰＳ プロセスＩＩ魚の海水への移動から１〜４日間の死亡数を示すグラフ図である。
【図３０】
図３０は、６週間、淡水（ＦＷ）またはＡＰＳ プロセスＩＩに曝露された稚魚タイセイヨウサケの体長（ｃｍ）および体重（ｇｍ）を示すグラフ図である。
【図３１】
図３１は、海水への移動から２０〜６０日間でのＡＰＳ プロセスＩＩ魚死亡個体の体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。
【図３２】
図３２は、海水配置から１〜５日間での、魚のＧＦ３ （水温の偏差を正規化したＳＧＲ ）、ＳＧＲ （特異的成長率）、およびＦＣＲ （飼料変換率）を示すグラフ図である。
【図３３】
図３３は、海水研究タンクへの移動後のＡＰＳ プロセスＩＩ魚の体重　（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。
【図３４】
図３４は、淡水中での生育後（ＦＷ− 対照）、またはＡＰＳ プロセスＩＩに供し、かつ海水へ移動後の生育後（ＡＰＩＩ−ＳＷ ）での、中型（４０ｇｍ）および小型（２０ｇｍ）の稚魚サケの３０日間に渡るＳＧＲ を示すグラフ図である。
【図３５】
図３５は、６２日間の配置およびやつれ（ｄｒａｗｎ ）で両者とも２０ｇｍの体重であった、淡水中で生育したサケ幼魚（黒菱形）と海水中で生育したＡＰＳ プロセスＩＩ魚（白丸）の体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。
【図３６】
図３６は、６２日間の配置および成長で両者とも４０ｇｍの体重であった、淡水中で生育したサケ幼魚（黒三角）と海水中で生育したＡＰＳ プロセスＩＩ魚（白四角）の体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。
【図３７】
図３７は、淡水（ＦＷ− 対照）またはＡＰＳ プロセスＩＩで処理後に海水（ＡＰＩＩ−ＳＷ ）のいずれかにおいて生育後の、一対の中型（４０ｇｍ）および小型（２０（ｇｍ）の稚魚サケの３０日間に渡るＦＣＲを示すグラフ図である。
【図３８】
図３８は、ＡＰＳ プロセスＩＩで処理後のＦＷまたはＳＷのいずれかにおいて維持された一対の２０ｇｍの稚魚サケについての６１日間に渡る飼料消費（％ｂｄｗｔ／ 日）を示すグラフ図である。
【図３９】
図３９は、ＡＰＳ プロセスＩＩで処理後のＦＷまたはＳＷのいずれかにおいて維持された一対の４０ｇｍの稚魚サケニツイテノ６１日間ニ渡る飼料消費　（％ｂｄｗｔ／ 日）を示すグラフ図である。
【図４０】
図４０Ａ−Ｂは、ＡＰＳ プロセスＩ （図４０Ａ）またはＡＰＳ プロセスＩＩ（図４０Ｂ）のいずれかに供されたサケの体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。各群（ｎ＝６０）の魚は、海水への移動直前（黒菱形）および３７日の海水での生育後（白四角）に測定した。
【図４１】
図４１は、ＡＰＳ プロセスＩ で処理した、より小さなタイセイヨウサケスモルト（平均体重７６．６ｇｍ）または海水移動後のより大きな産業標準スモルト（平均体重９５．８ｇｍ）のＳＧＲ を示すグラフ図である。対照魚は６４日も早く海水に移動されたという事実にもかかわらず、海水移動の直後の間にＡＰＳ プロセスＩ 魚のＳＧＲ がより大きいことに注意すべきである。
【図４２】
図４２は、ＡＰＳ プロセスＩ に供され、かつ海水に移動されたサケの体重（ｇｍ）および体長（ｍｍ）を示すグラフ図である。
【図４３】
図４３は、産業標準スモルト（赤菱形で示す）および海洋網いけすで生育後のＡＰＳ プロセスＩ で処理されたスモルト（青白抜き四角で示す）の体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。ＡＰＳスモルトは両方ともより小さな魚として開始され、対応する対照スモルトの６４日後に海水に移されたことに注意すべきである。
【図４４】
図４４は、湿った（水分含量３８％）飼料で維持された海水での生育から６１日後と比較した、海水移動時でのＡＰＳ プロセスＩ 魚の体重（ｇｍ）および体長（ｃｍ）を示すグラフ図である。
【図４５】
図４５は、海水移動後７２時間での、６群の稚魚タイセイヨウサケで観察された百分率（％）死亡率を示すグラフ図である。各群で異なる飼料添加物が給与され、海水移動前の２週間は、淡水（対照）または３ｍＭ Ｃａ２＋および１ｍＭ Ｍｇ２＋を含むＡＰＳ水混合物中のいずれかに維持された。
【図４６】
図４６は、単一の魚由来の種々の組織試料（例えば、鰓、肝臓、心臓、筋肉、胃、嗅覚上皮、腎臓、膀胱、脳、下垂体、嗅球、幽門盲腸（ｃｅａｃａｅ）、近位小腸、および遠位小腸）についての固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ ）でのタンパク質（ｎｇ）定量のグラフ図である。
【図４７】
図４７は、タイセイヨウサケの種々の組織（鰓、鼻腔ラメラ、膀胱、腎臓、小腸、胃、肝臓、および脳）由来のＰＶＣＲｍＲＮＡ部分転写物の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅の写真である。ＲＴ−ＰＣＲ反応物をゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）による染色、またはメンブレンへ写し、タイセイヨウサケＰＶＣＲ遺伝子由来の、３２Ｐ 標識した６５３ｂｐ のゲノムＤＮＡ フラグメントを用いるサザンブロッティング（ＳＢ）のいずれかを行った。
【図４８】
図４８は、淡水中の魚、淡水中のＡＰＳ プロセスＩＩで処理した魚、および海水中の魚についての、一次ラメラに対する二次ラメラにおける免疫活性細胞（Ｎａ＋Ｋ＋ＡＴＰアーゼ）の比のグラフ図である。
【図４９】
図４９は、淡水中に維持されたかまたはＡＰＳ プロセスＩＩ処理後のいずれかの稚魚サケから調製された鰓または幽門盲腸由来のホモジネートのＮａ＋Ｋａ＋ＡＴＰ アーゼ活性のグラフ図である。
【図５０】
図５０は、淡水または海水中に維持された魚についての、鰓由来のホモジネートのＮａ＋Ｋａ＋ＡＴＰ アーゼ活性（μｍｏｌＡＤＰ／ｍｇ タンパク質／ｈまたはβ−アクチンｍＲＮＡ比）のグラフ図である。
【図５１】
図５１は、細胞外カルシウム（Ｃａ２＋）の種々の濃度（０．５ 、２．５ 、５．０ 、７．５ 、１０．０および２０．０ｍＭ）での１０ｍＭ Ｌ− イソロイシンの存在下または非存在下でのＰＶＣＲ発現ＦＵＲＡ−２細胞から得られた比のグラフ図である。
【図５２】
図５２は、Ｃａ２＋のみ、フェニルアラニン、イソロイシン、またはＡＡ混合物〔以下の濃度（マイクロモル／リッター）のＬ−異性体：５０フェニルアラニン（Ｐｈｅ ）、５０トリプトファン（Ｔｒｐ ）、８０ヒスチジン（Ｈｉｓ ）、６０チロシン（Ｔｙｒ）、３０ シスチン（Ｃｙｓ ）、３００ アラニン（Ａｌａ ）、２００ トレオニン（Ｔｈｒ ）、５０アスパラギン（Ａｓｎ ）、６００ グルタミン（Ｇｌｎ ）、１２５ セリン（Ｓｅｒ ）、３０グルタミン酸（Ｇｌｕ ）、２５０ グリシン（Ｇｌｙ ）、１８０ プロリン（Ｐｒｏ ）、２５０ バリン（Ｖａｌ ）、３０メチオニン（Ｍｅｔ ）、１０アスパラギン酸（Ａｓｐ ）、２００ リジン（Ｌｙｓ ）、１００ アルギニン（Ａｒｇ ）、７５イソロイシン（Ｉｌｅ ）、１５０ ロイシン（Ｌｅｕ ）〕でのＰＶＣＲについての、細胞外Ｃａ２＋（ｍＭ）と比較した、部分的Ｃａ２＋応答のグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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