(57)【要約】新規ポリペプチド、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び関連する組成物及び方法が、ｚｃｙｔｏｒ１９、すなわち新規クラスＩＩサイトカイン受容体に関して開示される。前記ポリペプチドは、インビトロ及びインビボで、造血、リンパ及び骨髄細胞の増殖及び／又は進化を刺激するリガンドを検出するための方法内に使用され得る。リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた、インビトロ及びインビボでリガンド活性を阻止するためにも使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１９をコードするポリヌクレオチドは、染色体１ｐ３６．１１に位置し、そしてヒト疾病状態に関連するゲノムの領域を同定するために使用され得る。本発明はまた、タンパク質の生成方法、その使用方法及びそれに対する抗体を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；
（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド６６９の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｂ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド６７８の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｃ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド７４７の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｄ）ヌクレオチド７４８〜ヌクレオチド１４７３の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｅ）ヌクレオチド７４８〜ヌクレオチド１５６０の配列番号１８に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｆ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド１４７３の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｇ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド１５６０の配列番号１８に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｈ）ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１４７３の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｉ）ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１５６０の配列番号１８に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｊ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド４８９の配列番号２０に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；
（ｋ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド６３３の配列番号２０に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；及び
（ｌ）ヌクレオチド１〜ヌクレオチド６３３の配列番号２０に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドの群からのポリヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがさらに、配列番号２の残基２２７（Ｔｒｐ）〜２４９（Ｔｒｐ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成るポリペプチドをコードする請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがさらに、配列番号２の残基２５０（Ｌｙｓ）〜４９１（Ａｒｇ）又は配列番号１９の残基２５０（Ｌｙｓ）〜５２０（Ａｒｇ）から成る細胞内ドメインを含んで成るポリペプチドをコードする請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、細胞増殖、レポーター遺伝子の転写の活性化により測定されるような活性を有し、又はさらに、抗体に結合し、
ここで前記抗体が、
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；
（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチドに対して生ぜしめられ、そして
前記単離されたポリペプチドへの前記抗体の結合が、生物学的又は生化学的アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ−沈殿、ウェスターンブロット又は酵素連結されたイムノソルベントアッセイにより測定される請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；
（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び
転写ターミネーターを含んで成り、
ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡセグメントが前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項９】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基２２７（Ｔｒｐ）〜２４９（Ｔｒｐ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成る請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基２５０（Ｌｙｓ）〜４９１（Ａｒｇ）、又は配列番号１９の残基２５０（Ｌｙｓ）〜５２０（Ａｒｇ）から成る細胞内ドメインを含んで成る請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１１】
次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び
転写ターミネーターを含んで成り、
ここで前記プロモーターがＤＮＡセグメントに作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡセグメントが転写ターミネーターに作用可能に連結される請求項６記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを導入されている培養された細胞であって、前記ＤＮＡセグメントによりコードされる可溶性受容体ポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１３】
融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体であって、
（ａ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２０（Ｇｌｙ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２２７（Ｔｒｐ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号２２７（Ｔｒｐ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｉ）アミノ酸番号２２７（Ｔｒｐ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｍ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｎ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；
（ｏ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｐ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び
追加のポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントを含んで成り、ここで前記第１及び他のＤＮＡセグメントが読み取り柄を整合して連結され；そして前記第１及び他のＤＮＡセグメントが前記融合タンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ構造体。
【請求項１４】
次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター；
請求項１３記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体；及び
転写ターミネーターを含んで成り、
ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡ構造体に作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡ構造体が前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、前記ＤＮＡ構造体によりコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１６】
融合タンパク質の生成方法であって、
請求項１５記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項１７】
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；
（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；
（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸残基の配列から成る請求項１７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基２２７（Ｔｒｐ）〜２４９（Ｔｒｐ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成る請求項１７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがさらに、配列番号２の残基２５０（Ｌｙｓ）〜４９１（Ａｒｇ）又は配列番号１９の残基２５０（Ｌｙｓ）〜５２０（Ａｒｇ）から成る細胞内ドメインを含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、細胞増殖、レポーター遺伝子の転写の活性化により測定されるような活性を有し、又はさらに、抗体に結合し、
ここで前記抗体が、
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；
（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；
（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチドに対して生ぜしめられ、そして
前記単離されたポリペプチドへの前記抗体の結合が、生物学的又は生化学的アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ−沈殿、ウェスターンブロット又は酵素連結されたイムノソルベントアッセイにより測定される請求項１７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドの生成方法であって、
請求項８記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項２３】
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列； 及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも９０％同一である配列の群からのアミノ酸セグメントを含んで成り、造血受容体により通常会合されるトランスメンブラン及び細胞内ドメインを実質的に有さないことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
ポリペプチドの生成方法であって、
請求項１２記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項２５】
ポリペプチドに対する抗体の生成方法であって、
（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、５０〜４７１個のアミノ酸から成るポリペプチド；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、５０〜５００個のアミノ酸から成るポリペプチド；
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号１９におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、５０〜１９１個のアミノ酸から成るポリペプチド；
（ｄ）請求項１８記載のポリペプチド；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１１９（Ｔｙｒ）を含んで成るポリペプチド；
（ｆ）配列番号２のアミノ酸番号１２５（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド；
（ｇ）埋もれたＧ、Ｓ及びＴ、及び暴露されたＨ、Ｙ及びＷ残基が無視される、スライド性６−残基窓に基づいて、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールを用いて、疎水性プロットから予測されるような、配列番号２の親水性ペプチドを含んで成るポリペプチドの群からのポリペプチドにより動物を接種し、ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために動物において免疫応答を誘発し；そして
前記動物から抗体を単離することを含んで成る方法。
【請求項２６】
配列番号２、１９又は２１のポリペプチドに対して特異的に結合する請求項２５記載の方法により生成される抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項２６記載の抗体。
【請求項２８】
請求項１７記載のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体。
【請求項２９】
請求項１８記載のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体。
【請求項３０】
サイトカイン受容体タンパク質のモジュレータ−の存在を、試験サンプルにおいて検出する方法であって、
請求項６記載の発現ベクターを導入されている細胞を培養し、ここで前記細胞が試験サンプルの存在及び不在下でＤＮＡセグメントによりコードされるタンパク質を発現し；
生物学的又は生化学的アッセイにより、試験サンプルの存在及び不在下でのタンパク質の活性のレベルを比較し；そして
試験サンプルにおけるサイトカインタンパク質活性のモジュレーターの存在を、前記比較から決定することを含んで成る方法。
【請求項３１】
試験サンプル内のサイトカイン受容体リガンドの検出方法であって、
（ａ）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；及び
（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸配列を含んで成るサイトカイン受容体ポリペプチドと試験サンプルとを接触せしめ；そして
前記サンプルにおけるリガンドへの前記サイトカイン受容体ポリペプチドの結合を検出することを含んで成る方法。
【請求項３２】
前記サイトカイン受容体ポリペプチドが、培養された細胞内に膜結合され、そして前記検出段階が培養された細胞における生物学的応答を測定することを含んで成る請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的応答が、細胞増殖又はレポーター遺伝子の転写の活性化である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
患者における遺伝子異常性の検出方法であって、
患者から遺伝子サンプルを得；
配列番号１又は配列番号１の補体の少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含んで成るポリヌクレオチドと共に前記遺伝子サンプルを、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベーションすることによって、第１反応生成物を生成し；
前記第１反応生成物を可視化し；そして
野生型患者からの対照反応生成物に対して前記第１反応生成物を比較することを含んで成り、ここで前記第１反応生成物と前記対照反応する生成物との間の差異が患者における遺伝子異常性の表示であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
患者における癌の検出方法であって、
患者からの組織又は生物学的サンプルを得；
請求項２９記載の抗体と共に前記組織又は生物学的サンプルを、前記抗体が前記組織又は生物学的サンプルにおけるその相補的ポリペプチドに対して結合する条件下でインキュベートし；
前記組織又は生物学的サンプルにおける結合される抗体を可視化し；そして
正常対照組織又は生物学的サンプルに対して、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおける結合される抗体のレベルを比較することを含んで成り、ここで前記正常対照組織又は生物学的サンプルに対して、前記患者組織又は生物学的サンプルに結合される抗体のレベルの上昇が前記患者における癌の表示であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
患者における癌の検出方法であって、
患者から組織又は生物学的サンプルを得；
配列番号１， １８又は２０、又はそれらの補体の少なくとも１４個の連続したヌクレオチドを含んで成るポリヌクレオチドをラベリングし；
前記組織又は生物学的サンプルを、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートし；
前記組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドを可視化し；そして
正常対照組織又は生物学的サンプルに対して、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのレベルを比較することを含んで成り、ここで前記正常対照組織又は生物学的サンプルに対して、前記患者組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの上昇が前記患者における癌の表示であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
ホルモン及びポリペプチド増殖因子は、多細胞生物の細胞の増殖及び分化を制御する。それらの拡散性分子は、細胞のお互いの連絡を可能し、そして細胞、及び器官の形成、そして損傷された組織の修復に関して作用する。ホルモン及び成長因子の例は、ステロイドホルモン（例えば、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）及びカルシトニンを包含する。
【０００２】
ホルモン及び成長因子は、受容体に結合することによって細胞代謝に影響を及ぼす。受容体は、細胞内のシグナル化経路、例えば第２メッセンジャーシステムに結合される内在性膜タンパク質であり得る。他の種類の受容体は、可溶性分子、例えば転写因子である。サイトカイン、すなわち細胞の増殖及び／又は分化を促進する分子のための受容体が、特に興味の対象である。サイトカインの例は、赤血球細胞の成長を刺激するエリトロポエチン（ＥＰＯ）；巨核球系の細胞の成長を刺激するトロンボポエチン（ＴＰＯ）；及び好中球の成長を刺激する顆粒球−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を包含する。それらのサイトカインは、貧血、血小板減少症及び好中球減少症を有する患者における正常な血液細胞レベルの回復、又は癌のための化学療法の受容において有用である。
【０００３】
それらのサイトカインファミリーの例示されたインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの莫大な臨床学的可能性及びそれらの必要性を示す。本発明は、新規造血サイトカイン受容体、及び関連する組成物及び方法を提供することにより、それらの必要性と取り組む。
本発明は、当業者に明らかであるそれらの及び他の使用のために、そのようなポリペプチドを提供する。本発明のそれらの及び他の観点は、本発明の次の詳細な記載の基づいて明らかに成るであろう。
【０００４】
発明の記載：
本発明のそれらの及び他の観点は、次の本発明の特定の記載に基づいて明らかに成るであろう。
１つの観点においては，本発明は、（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００５】
１つの観点においては、上記単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド６６９の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｂ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド６７８の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｃ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド７４７の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｄ）ヌクレオチド７４８〜ヌクレオチド１４７３の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｅ）ヌクレオチド７４８〜ヌクレオチド１５６０の配列番号１８に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｆ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド１４７３の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｇ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド１５６０の配列番号１８に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｈ）ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１４７３の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｉ）ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１５６０の配列番号１８に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｊ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド４８９の配列番号２０に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；（ｋ）ヌクレオチド６１〜ヌクレオチド６３３の配列番号２０に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド；及び（ｌ）ヌクレオチド１〜ヌクレオチド６３３の配列番号２０に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドの群からのポリヌクレオチド配列を含んで成る。
【０００６】
もう１つの態様においては、上記に記載されるような単離されたポリヌクレオチドがさらに、配列番号２の残基２２７（Ｔｒｐ）〜２４９（Ｔｒｐ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成るポリペプチドをコードする。
もう１つの態様においては、上記に記載されるような単離されたポリヌクレオチドがさらに、配列番号２の残基２５０（Ｌｙｓ）〜４９１（Ａｒｇ）又は配列番号１９の残基２５０（Ｌｙｓ）〜５２０（Ａｒｇ）から成る細胞内ドメインを含んで成るポリペプチドをコードする。
【０００７】
もう１つの態様においては、上記に記載されるような単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、細胞増殖、レポーター遺伝子の転写の活性化により測定されるような活性を有し、又はさらに、抗体に結合し、ここで前記抗体が、（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチドに対して生ぜしめられ、そして前記単離されたポリペプチドへの前記抗体の結合が、生物学的又は生化学的アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ−沈殿、ウェスターンブロット又は酵素連結されたイムノソルベントアッセイにより測定される。
【０００８】
第２の観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡセグメントに作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡセグメントが前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクターを提供する。１つの態様においては、上記に記載される前記発現ベクターは、ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る。
【０００９】
第３の観点においては、本発明は、上記に記載される発現ベクターを含んで成る、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞を提供する。もう１つの態様においては、前記ポリペプチドはさらに、配列番号２の残基２２７（Ｔｒｐ）〜２４９（Ｔｒｐ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成る。もう１つの態様においては、上記ポリペプチドはさらに、配列番号２の残基２５０（Ｌｙｓ）〜４９１（Ａｒｇ）、又は配列番号１９の残基２５０（Ｌｙｓ）〜５２０（Ａｒｇ）から成る細胞内ドメインを含んで成る。
【００１０】
もう１つの態様においては、上記発現ベクターは、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターがＤＮＡセグメントに作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡセグメントが転写ターミネーターに作用可能に連結される。
【００１１】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に記載される発現ベクターを導入されている培養された細胞を提供し、ここで前記細胞は前記ＤＮＡセグメントによりコードされる可溶性受容体ポリペプチドを発現する。
【００１２】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２０（Ｇｌｙ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２２７（Ｔｒｐ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号２２７（Ｔｒｐ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｉ）アミノ酸番号２２７（Ｔｒｐ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｍ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｎ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；（ｏ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｐ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び追加のポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントを含んで成り、ここで前記第１及び他のＤＮＡセグメントが読み取り柄を整合して連結され；そして前記第１及び他のＤＮＡセグメントが前記融合タンパク質をコードすることを特徴とする融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体を提供する。
【００１３】
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；上記に記載される融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターが前記ＤＮＡ構造体に作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡ構造体が前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクターを提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、上記に記載される発現ベクターを含んで成る、前記ＤＮＡ構造体によりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、上記に記載される細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る、融合タンパク質の生成方法を提供する。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。
【００１５】
１つの観点においては、  上記のような前記単離されたポリペプチドは、（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列の群からのアミノ酸残基の配列から成る。
【００１６】
もう１つの態様においては、上記に記載される単離されたポリペプチドはさらに、配列番号２の残基２２７（Ｔｒｐ）〜２４９（Ｔｒｐ）から成るトランスメンブランドメインを含んで成る。もう１つの態様においては、上記に記載される単離されたポリペプチドはさらに、配列番号２の残基２５０（Ｌｙｓ）〜４９１（Ａｒｇ）又は配列番号１９の残基２５０（Ｌｙｓ）〜５２０（Ａｒｇ）から成る細胞内ドメインを含んで成る。
【００１７】
もう１つの態様においては、上記に記載される単離されたポリペプチドは、細胞増殖、レポーター遺伝子の転写の活性化により測定されるような活性を有し、又はさらに、抗体に結合し、ここで前記抗体が、（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２４９（Ｔｒｐ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｅ）アミノ酸番号２５０（Ｌｙｓ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｆ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｇ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｈ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｉ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９に示されるようなアミノ酸配列；（ｊ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１６３（Ｔｒｐ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；（ｋ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｌ）アミノ酸番号１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチドに対して生ぜしめられ、そして前記単離されたポリペプチドへの前記抗体の結合が、生物学的又は生化学的アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ−沈殿、ウェスターンブロット又は酵素連結されたイムノソルベントアッセイにより測定される。
【００１８】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に記載される細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る、ポリペプチドの生成方法を提供する。
【００１９】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列； 及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも９０％同一である配列の群からのアミノ酸セグメントを含んで成り、造血受容体により通常会合されるトランスメンブラン及び細胞内ドメインを実質的に有さないことを特徴とする単離されたポリペプチドを提供する。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に記載される細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る、ポリペプチドの生成方法を提供する。
【００２１】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）の配列番号２におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、５０〜４７１個のアミノ酸から成るポリペプチド；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）の配列番号１９におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、５０〜５００個のアミノ酸から成るポリペプチド；（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号１９におけるアミノ酸の連続配列を含んで成る、５０〜１９１個のアミノ酸から成るポリペプチド；（ｄ）請求項１８記載のポリペプチド；（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号１１９（Ｔｙｒ）を含んで成るポリペプチド；（ｆ）配列番号２のアミノ酸番号１２５（Ｐｒｏ）〜アミノ酸番号２２３（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド；（ｇ）埋もれたＧ、Ｓ及びＴ、及び暴露されたＨ、Ｙ及びＷ残基が無視される、スライド性６−残基窓に基づいて、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールを用いて、疎水性プロットから予測されるような、配列番号２の親水性ペプチドを含んで成るポリペプチドの群からのポリペプチドにより動物を接種し、ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために動物において免疫応答を誘発し；そして前記動物から抗体を単離することを含んで成る、ポリペプチドに対する抗体の生成方法を提供する。
【００２２】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２、１９又は２１のポリペプチドに対して特異的に結合する、上記に記載される方法により生成される抗体を提供する。１つの態様においては、前記抗体は、モノクローナル抗体である。
もう１つの観点においては、本発明は、上記に記載されるポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を提供する。
【００２３】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に記載される発現ベクターを導入されている細胞を培養し、ここで前記細胞が試験サンプルの存在及び不在下でＤＮＡセグメントによりコードされるタンパク質を発現し；生物学的又は生化学的アッセイにより、試験サンプルの存在及び不在下でのタンパク質の活性のレベルを比較し；そして試験サンプルにおけるサイトカインタンパク質活性のモジュレーターの存在を、前記比較から決定することを含んで成る、サイトカイン受容体タンパク質のモジュレータ−の存在を、試験サンプルにおいて検出する方法を提供する。
【００２４】
もう１つの観点においては、本発明は、（ａ）配列番号４に示されるようなアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２２６（Ａｓｎ）の配列番号２に示されるようなアミノ酸配列；及び（ｃ）アミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）の配列番号２１に示されるようなアミノ酸配列から成る群からのアミノ酸配列を含んで成るサイトカイン受容体ポリペプチドと試験サンプルとを接触せしめ；そして前記サンプルにおけるリガンドへの前記サイトカイン受容体ポリペプチドの結合を検出することを含んで成る、試験サンプル内のサイトカイン受容体リガンドの検出方法を提供する。
【００２５】
１つの態様においては、前記サイトカイン受容体ポリペプチドが、培養された細胞内に膜結合され、そして前記検出段階が培養された細胞における生物学的応答を測定することを含んで成る、試験サンプル内のサイトカイン受容体リガンドの検出方法が開示される。もう１つの態様においては、前記生物学的応答が、細胞増殖又はレポーター遺伝子の転写の活性化である、サイトカイン受容体リガンドの検出方法が開示される。
【００２６】
もう１つの観点においては、本発明は、患者から遺伝子サンプルを得；配列番号１又は配列番号１の補体の少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含んで成るポリヌクレオチドと共に前記遺伝子サンプルを、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベーションすることによって、第１反応生成物を生成し；前記第１反応生成物を可視化し；そして野生型患者からの対照反応生成物に対して前記第１反応生成物を比較することを含んで成り、ここで前記第１反応生成物と前記対照反応する生成物との間の差異が患者における遺伝子異常性の表示であることを特徴とする、患者における遺伝子異常性の検出方法を提供する。
【００２７】
もう１つの観点においては、本発明は、患者からの組織又は生物学的サンプルを得；上記に記載される抗体と共に前記組織又は生物学的サンプルを、前記抗体が前記組織又は生物学的サンプルにおけるその相補的ポリペプチドに対して結合する条件下でインキュベートし；前記組織又は生物学的サンプルにおける結合される抗体を可視化し；そして正常対照組織又は生物学的サンプルに対して、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおける結合される抗体のレベルを比較することを含んで成り、ここで前記正常対照組織又は生物学的サンプルに対して、前記患者組織又は生物学的サンプルに結合される抗体のレベルの上昇が前記患者における癌の表示であることを特徴とする、患者における癌の検出方法を提供する。
【００２８】
もう１つの観点においては、本発明は、患者から組織又は生物学的サンプルを得；配列番号１， １８又は２０、又はそれらの補体の少なくとも１４個の連続したヌクレオチドを含んで成るポリヌクレオチドをラベリングし；前記組織又は生物学的サンプルを、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートし；前記組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドを可視化し；そして正常対照組織又は生物学的サンプルに対して、前記患者からの組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのレベルを比較することを含んで成り、ここで前記正常対照組織又は生物学的サンプルに対して、前記患者組織又は生物学的サンプルにおけるラベルされたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの上昇が前記患者における癌の表示であることを特徴とする、患者における癌の検出方法を提供する。
【００２９】
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる：
【００３０】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ  トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識 （Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５）， 物質Ｐ、すなわちＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０， １９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ｆｏｒｄ など．， Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７， １９９１を参照のこと。親和性標識をコードするＤＮＡは、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈｅｖｅｎ， ＣＴ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から入手できる。
【００３１】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおいて変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００３２】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００３３】
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプタビジン）は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対、センス／アンチセンス  ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０９Ｍ−１の結合親和性を有する。
【００３４】
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’ は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に対して相補的である。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
【００３５】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状ＤＮＡ分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００３６】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノム  クローンを含む分子である。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する５’及び３’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｄｙｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１６： ７７４―７８， １９８５を参照のこと）。
【００３７】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００３８】
“作用可能に連結された”とは、ＤＮＡセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
用語“オルト体（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
【００３９】
“パラ体（ｐａｒａｌｏｇｓ）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００４０】
“ポリヌクレオチド”は、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略語“ｂｐ”）、ヌクレオチド（“ｎｔ”）、又はキロ塩基（“ｋｂ”）として表される。ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。
【００４１】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約  １０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
【００４２】
“プローブ及び／又はプライマー”とは、本明細書において使用される場合、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。ＤＮＡはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれかであり得る。ポリヌクレオチドプローブ及びプレイマーは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、一般的に合成オリゴヌクレオチドであるが、しかしクローン化されたｃＤＮＡ又はゲノム配列又はその補体から生成され得る。分析用プローブは一般的に、少なくとも２０個の長さのヌクレオチドであるが、但し幾分短いプローブ（１４〜１７個のヌクレオチド）が使用され得る。ＰＣＲプライマーは、少なくとも５個の長さのヌクレオチド、好ましくは１５又はそれ以上のｎｔ、よりも好ましくは２０〜３０のｎｔである。短いポリヌクレオチドは、遺伝子の小さな領域が分析のために標的化される場合に使用され得る。遺伝子の全体的な分析のためには、ポリヌクレオチドは、全エキソン又はそれ以上を含んで成る。プローブは、検出できるシグナルを供給するために、当業界において良く知られている技法を用いて多くの源、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬから市販されている、酵素、放射性核種、蛍光団、化学ルミネセンス、常磁性粒子及び同様のものによりラベルされ得る。
【００４３】
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡ ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【００４４】
用語“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００４５】
用語“受容体”は、生物活性分子（すなわち“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質、又はそのようなタンパク質のポリペプチドサブユニットを示す。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化（及び多くの場合、受容体多重化、すなわち同一油又は異なった受容体サブウニットの会合）をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、細胞増殖、ｃＡＭＰ生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。細胞−表面サイトカイン受容体は、下記により詳細に記載されるように、多−ドメイン構造により特徴づけられる。それらの受容体は、正に荷電された残基（Ｌｙｓ又はＡｒｇ）を通常、端に有する、疎水性アミノ酸残基（典型的には、約２１−２５個の残基）の配列により特徴づけられるトランスメンブランドメインに固定され得る。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり；モノマー（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体）、又はマルチマー（例えばＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ―ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポイエチン受容体及びＩＬ―６受容体）であり得る。用語“受容体ポリペプチド”とは、受容体ポリペプチド鎖及びその一部、例えば単離された機能的ドメイン（例えば、リガンド−結合ドメイン）を表すために使用される。
【００４６】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００４７】
“可溶性受容体”とは、細胞膜に結合されない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、最も通常には、トランスメンブラン及び細胞質ドメインを欠いているリガンド−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、追加のアミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供し、又は基質へのポリペプチドの結合のための部位、又は免疫グロブリン不変領域配列を提供する親和性標識を含んで成る。多くの細胞−表面受容体は、タンパク質加水分解により、又は交互にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される天然に存在する可溶性相対物を有する。受容体ポリペプチドは、それがそれぞれ、膜固定化又はシグナルトランスダクションを提供するために、それらのセグメントの十分な部分を欠いている場合、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないと言われる。
【００４８】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００４９】
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、正確には±１０％であることが理解されるであろう。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
【００５０】
サイトカイン受容体サブユニットは、リガンド−結合ドメイン、典型的には、シグナルトランスダクションに関与するエフェクタードメインを含んで成る多重−ドメイン構造により特徴づけられる。マルチマーサイトカイン受容体は、ホモダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αα及びββイソフォーム、エリトロポエチン受容体、ＭＰＬ（トロンボポイエチン受容体）及びＧ−ＣＳＦ受容体）、サブユニットがそれぞれリガンド−結合及びエフェクタードメインを有するヘテロダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αβイソフォーム）、及び種々の機能を有する成分サブユニットを有するマルチマー（例えば、ＩＬ−２， ＩＬ−３， ＩＬ−４， ＩＬ−５， ＩＬ−６， ＩＬ−７及びＧＭ−ＣＳＦ受容体）を包含する。いくつかの受容体サブユニットは、多くの受容体に共通する。
【００５１】
例えば、単独ではリガンドを結合できないが、しかし細胞内シグナルトランスダクションドメインを包含するＡＩＣ２Ｂサブユニットは、ＩＬ−３， ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−５受容体の成分である。多くのサイトカイン受容体は、その構造及び機能に基づいて、４種の関連するファミリーの１つに配置され得る。例えば、クラスＩ造血受容体は、保存されたシステイン残基及びＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号５）を含むドメインの存在により特徴づけられる。タンパク質キナーゼドメイン；フィブロネクチン第ＩＩＩ型ドメイン；及びジスルフィド結合されたループにより特徴づけられる免疫グロブリンドメインを包含する追加のドメインは、一定の造血受容体に存在する。
【００５２】
サイトカイン受容体構造は、Ｕｒｄａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２６： ２２１−２２８， １９９１及びＣｏｓｍａｎ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５：９５−１０６， １９９３により再考されている。新規生物学的機能を生物が獲得するための選択的圧力下で、新規のファミリーメンバーは、多重遺伝子ファミリーの存在を導く存在する受容体遺伝子の重複から、たぶん生まれると思われる。従って、ファミリーメンバーは、祖先遺伝子の痕跡を含み、そしてそれらの特徴は、追加のファミリーメンバーの単離及び同定において利用され得る。
【００５３】
細胞表面サイトカイン受容体はさらに、追加のドメインの存在により特徴づけられる。それらの受容体は、正に荷電された残基（Ｌｙｓ又はＡｒｇ）を通常、両端に有する疎水性アミノ酸残基（典型的には、約２１〜２５個の残基）の配列に特徴づけられるトランスメンブランドメインにより細胞膜に固定される。細胞外ドメインからの、及びそれからトランスメンブランにより分離されるタンパク質の反対側の末端に、細胞内ドメインが存在する。
【００５４】
ｚｃｙｔｏｒ１９受容体は、クラスＩＩサイトカイン受容体である。それらの受容体は通常、４−ヘリックス−束サイトカインに結合する。インターロイキン−１０及びインターフェロンは、このクラスに受容体を有する（例えば、インターフェロン−γ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖）。クラスＩＩサイトカイン受容体は、それらのドメインに１又は複数のサイトカイン受容体モジュール（ＣＲＭ）の存在により特徴づけられる。他のクラスＩＩサイトカイン受容体は、ｚｃｙｔｏｒ１１（通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４ （Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１７２２７号）、ＩＬ−１０Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ００６７２号及びＮＭ＿００１５５８号）、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）、ｚｃｙｔｏｒ１６、組織因子及び同様のものを包含する。クラスＩＩサイトカイン受容体のＣＲＭは、クラスＩサイトカイン受容体のより知られているＣＲＭとは幾分異なる。クラスＩＩ ＣＲＭは２種のＩＩＩ型フィブロネクチン−様ドメインを含むが、それらは構成的に異なる。
【００５５】
インターフェロン−α／β受容体α鎖を除いて、すべての既知のクラスＩＩ受容体と同様にｚｃｙｔｏｒ１９は、その細胞外ドメインに単一のクラスＩＩ ＣＲＭのみを有する。ｚｃｙｔｏｒ１９は、インターフェロン／ＩＬ−１０クラスのヘリカルサイトカインのための受容体である。上記に言及されたように、ｚｃｙｔｏｒ１９は、他のクラスＩＩサイトカイン受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１１及びｚｃｙｔｏｒ１６に類似する。Ｚｃｙｔｏｒ１９ （配列番号１） をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析は、分泌シグナル配列（配列番号２の残基１（Ｍｅｔ）〜２０（Ｇｌｙ））及び成熟ｚｃｙｔｏｒ１９サイトカイン受容体ポリペプチド（配列番号２の残基２１（Ａｒｇ）〜４９１（Ａｒｇ））を含んで成る４９１個のアミノ酸（配列番号２）をコードする読み取り枠、約２０６個のアミノ酸残基（配列番号２の残基２１（Ａｒｇ）〜２２６（Ａｓｎ））の細胞外リガンド−結合ドメイン、約２３個のアミノ酸残基（配列番号２の残基２２７（Ｔｒｐ）〜２４９（Ｔｒｐ））のトランスメンブランドメイン、及び約２４２個のアミノ酸残基（配列番号２の残基２５０（Ｌｙｓ）〜４９１（Ａｒｇ））の細胞内ドメインを表した。
【００５６】
細胞外リガンド−結合ドメインにおいては、２種のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン及びリンカー領域が存在する。前記第１フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは配列番号２の残基２１（Ａｒｇ）〜１１９（Ｔｙｒ）を含んで成り、リンカーは配列番号２の残基１２０（Ｌｅｕ）〜１２４（Ｇｌｕ）を含んで成り、そして第２フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、配列番号２の残基１２５（Ｐｒｏ）〜２２３（Ｐｒｏ）を含んで成る。従って、配列番号２のアミノ酸２１（Ａｒｇ）〜２２３（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド（配列番号４）が、リガンド結合フラグメントと思われる。さらに、典型的には、クラスＩＩ受容体に保存されるように、配列番号２に示されるような残基４３（Ｔｒｐ）及び６８（Ｔｒｐ）を含んで成る保存されたトリプトファン残基及び、配列番号２の位置７４， ８２， １９５， ２１７での保存されたシステイン残基が存在する。
【００５７】
さらに、本発明は、ポリペプチド（配列番号２に関する）の細胞内ドメインに約３０個のアミノ酸挿入体を包含するｚｃｙｔｏｒ１９受容体の変異体を包含する。Ｚｃｙｔｏｒ１９ （配列番号１８） をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析は、分泌シグナル配列（配列番号１９の残基１（Ｍｅｔ）〜２０（Ｇｌｙ））及び成熟ｚｃｙｔｏｒ１９サイトカイン受容体ポリペプチド（配列番号１９の残基２１（Ａｒｇ）〜５２０（Ａｒｇ））を含んで成る５２０個のアミノ酸（配列番号１９）をコードする読み取り枠、約２０６個のアミノ酸残基（配列番号１９の残基２１（Ａｒｇ）〜２２６（Ａｓｎ））の細胞外リガンド−結合ドメイン、約２３個のアミノ酸残基（配列番号１９の残基２２７（Ｔｒｐ）〜２４９（Ｔｒｐ））のトランスメンブランドメイン、及び約２７１個のアミノ酸残基（配列番号１９の残基２５０（Ｌｙｓ）〜５２０（Ａｒｇ））の細胞内ドメインを表した。
【００５８】
細胞外リガンド−結合ドメインにおいては、２種のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン及びリンカー領域が存在する。前記第１フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは配列番号１９の残基２１（Ａｒｇ）〜１１９（Ｔｙｒ）を含んで成り、リンカーは配列番号１９の残基１２０（Ｌｅｕ）〜１２４（Ｇｌｕ）を含んで成り、そして第２フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、配列番号１９の残基１２５（Ｐｒｏ）〜２２３（Ｐｒｏ）を含んで成る。従って、配列番号１９のアミノ酸２１（Ａｒｇ）〜２２３（Ｐｒｏ）を含んで成るポリペプチド（配列番号４）が、リガンド結合フラグメントと思われる。さらに、典型的には、クラスＩＩ受容体に保存されるように、配列番号１９に示されるような残基４３（Ｔｒｐ）及び６８（Ｔｒｐ）を含んで成る保存されたトリプトファン残基及び、配列番号１９の位置７４， ８２， １９５， ２１７での保存されたシステイン残基が存在する。
【００５９】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体ポリペプチドの切断された可溶性形が天然において発現されると思われる。Ｚｃｙｔｏｒ１９ （配列番号２０） をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析は、分泌シグナル配列（配列番号２１の残基１（Ｍｅｔ）〜２０（Ｇｌｙ））及び成熟ｚｃｙｔｏｒ１９サイトカイン受容体ポリペプチド（配列番号２１の残基２１（Ａｒｇ）〜２１１（Ａｒｇ））を含んで成る２１１個のアミノ酸（配列番号２１）をコードする読み取り枠、約１４３個のアミノ酸残基（配列番号２１の残基２１（Ａｒｇ）〜１６３（Ｔｒｐ））の切断された細胞外リガンド−結合ドメインを表し、トランスメンブランドメインは存在しないが、しかし約４８個のアミノ酸残基（配列番号２１の残基１６４（Ｌｙｓ）〜２１１（Ｓｅｒ））の追加のドメインを表した。
【００６０】
切断された細胞外リガンド−結合ドメインにおいては、２種のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン及びリンカー領域が存在する。前記第１フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは配列番号２１の残基２１（Ａｒｇ）〜１１９（Ｔｙｒ）を含んで成り、リンカーは配列番号２１の残基１２０（Ｌｅｕ）〜１２４（Ｇｌｕ）を含んで成り、そして第２フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、配列番号２１の残基１２５（Ｐｒｏ）〜１６３（Ｔｒｐ）を含んで成る。従って、配列番号２１のアミノ酸２１（Ａｒｇ）〜１６３（Ｔｒｐ）を含んで成るポリペプチドが、リガンド結合フラグメントと思われる。さらに、典型的には、クラスＩＩ受容体に保存されるように、配列番号２１に示されるような残基４３（Ｔｒｐ）及び６８（Ｔｒｐ）を含んで成る保存されたトリプトファン残基が存在し、そして、この切断された可溶性形のｚｃｙｔｏｒ１９受容体における保存されたシステイン残基は配列番号２１の位置７４及び８２で存在する。
【００６１】
さらに、本発明のｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドは天然において発現され得、ここで細胞外リガンド結合ドメインは、上記のように、成熟ポリペプチドのＮ−末端で追加の５〜１５個のアミノ酸残基、又は細胞外サイトカイン結合ドメイン又はサイトカイン結合フラグメントを含んで成る。
【００６２】
当業者は、それらのドメイン境界がおおよそであり、そして既知のタンパク質との一列整列、及びタンパク質折りたたみの予測に基づかれることを認識するであろう。ドメインの末端からの残基の欠失は可能である。さらに、配列番号２に関しての上記の領域、ドメイン及びモチーフはまた、配列番号１に示される通りであり；配列番号１９に関しての上記のドメイン及びモチーフはまた、配列番号１８に示される通りであり；そして配列番号２１に関しての上記のドメイン及びモチーフはまた、配列番号２０に示される通りである。
【００６３】
トランスメンブラン領域、及び保存され、そして低い変動性のモチーフの存在は一般的に、タンパク質における重要な構造領域と相互関係するか、又はその領域を定義する。低い変動性の領域（例えば、疎水性クラスター）は、一般的に、構造的に重要な領域に存在する（Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｐ． など．，Ｇｅｎｅ， １５０： １６３−１６７， １９９４）。低い変動性のそのような領域はしばしば、まれな又は数少ないアミノ酸、例えばトリプトファンを含む。そのような保存され且つ低い変動性のモチーフを端に有し、そしてそのモチーフ間の領域は、より変動性であるが、しかし、それらは重要な構造及び活性、例えば結合ドメイン、生物学的及び酵素学的活性、シグナルトランスダクション、細胞−細胞相互作用、組織極性ドメイン及び同様のものに関連し、又はそれらを明確にすることができるので、しばしば機能的に有意である。
【００６４】
上記のｚｃｙｔｏｒ１９における保存されたアミノ酸残基の領域は、新規ファミリーメンバーを同定するための手段として使用され得る。例えば、逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、種々の組織源又は細胞系から得られるＲＮＡからの保存された領域をコードする配列を増幅するために使用され得る。特に、ｚｃｙｔｏｒ１９配列から企画された高い変性プライマーがこの目的のために有用である。そのような変性プライマーの企画及び使用は、当業者により容易に実施され得る。
【００６５】
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号３は、配列番号２のｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列であり；配列番号２８は、配列番号１９のｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列であり；そして配列番号２９は、配列番号２１のｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列である。
【００６６】
当業者はまた、配列番号３、２８及び２９の縮重配列がＵとＴとを置換することによって、それぞれ、配列番号２、１９及び２１をコードするすべてのＲＮＡ配列も供給することを理解するであろう。従って、配列番号３のヌクレオチド１−１４７３、配列番号２８のヌクレオチド１−１５６０及び配列番号２９のヌクレオチド１−６３３を含んで成るｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド及びそれらのＲＮＡ相当物は、本発明により包含される。さらに、本明細書に記載されるように、それらの縮重配列のサブフラグメント、例えば成熟形のポリペプチド、細胞外サイトカイン結合ドメイン、細胞内ドメイン及び同様のものが本発明に包含される。
【００６７】
配列番号２，１９及び２１、及びそのサブフラグメントに関して、当業者は、それらのサブフラグメントをコードする、配列番号３， ２８又は２９におけるそれぞれのヌクレオチドを容易に決定することができる。表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３内に使用される１文字コードを示す。“決定”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードＹはＣ又はＴのいずれかを示し、そしてその補体ＲはＡ又はＧを示し、ＡはＴに対して相補的であり、そしてＧはＣに対して相補的である。
【００６８】
【表１】
2004532611.tif 000002
【００６９】
与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号３に使用される縮重コドンが表２に示される。
【００７０】
【表２】
2004532611.tif 000003
【００７１】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（ＡＧＲ）をコードすることができ、そしてアルギニン（ＭＧＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（ＡＧＹ）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２、１９及び／又は２１のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【００７２】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。一般的には、Ｇｒａｎｔｈａｍ，など．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８： １８９３−９１２， １９８０； Ｈａａｓ， など．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６： ３１５−２４， １９９６；  Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、など．，Ｇｅｎｅ  １３：３５５−６４，１９８１；Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒａ，Ｇｅｎｅ  １８：１９９−２０９、１９８２；Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３０７５−８７、１９８６；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３−９７，１９８２を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である（表３を参照のこと）。
【００７３】
例えば、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ＡＣＣが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったＴｈｒコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号３に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【００７４】
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、１８又は２０、又はそれに対して相補的な配列の類似するサイズの領域に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くあるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。
【００７５】
Ｔｍを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の長さのＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に対して特異的である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８８）； Ａｕｓｕｂｅｌ など．， （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （ｅｄｓ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； 及びＷｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：２２７ （１９９０）を参照のこと）。
【００７６】
配列分析ソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ６．０（ＬＳＲ； Ｌｏｎｇ Ｌａｋｅ， ＭＮ）及びＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ４．０ （Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ； Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， 並びにインターネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてＴｍを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することができる。典型的には、５０以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で行われる。５０以下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Ｔｍ又はそれよりも５〜１０℃以下で行われる。
【００７７】
これは、ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。低い温度でのより高い程度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドに関して、約１℃ハイブリッドのＴｍを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。適切な緊縮ハイブリダイゼーション条件は、約４０〜５０％のホルムアミド、約６×までのＳＳＣ、約５×のＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０〜約１０％のデキストラン硫酸及び約１０〜２０μｇ／ｍｌの変性された市販のキャリヤーＤＮＡを含んで成る溶液において約４２℃での５時間〜一晩インキュベーションに等しい。一般的に、そのような緊縮条件は、２０〜７０℃の温度及び６×までのＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を包含し；次にハイブリダイゼーションに続いて、約２×までのＳＳＣによるフィルターの洗浄を伴う。
【００７８】
例えば、適切な洗浄緊縮性は、０．１×のＳＳＣ〜２×のＳＳＣ， ０．１％のＳＤＳ， ５５℃〜６５℃の温度に等しい。異なった程度の緊縮性が、標的配列に対する最大の特異的結合を達成するためには、ハイブリダイゼーション及び洗浄の間に使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合対からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するために、高い程度の緊縮性で行われる。緊縮ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、プローブの長さに依存し、Ｔｍ，ハイブリダイゼーション及び使用される洗浄溶液において影響され、そして通常  当業者により実験的に決定される。
【００７９】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、ＲＮＡは、多量のｚｃｙｔｏｒ１９ ＲＮＡを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５２０１， １９８０）により同定され、そしてＰＢＬ、膵臓、胸腺、骨髄、前立腺、リンパ組織、ヒト赤白血病細胞系、急性単球白血病細胞系、Ｂ−細胞及びＴ−細胞白血病組織及び細胞形、他のリンパ球及び造血細胞系、及び同様のものを包含する。
【００８０】
前記活性、又はＲＮＡ生成細胞又は組織が同定されると、全ＲＮＡは、グアニジウム
ＨＣｌ抽出、続くＣｓＣｌグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２−９４， １９７９）。ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡは、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９： １４０８−１４１２， １９７２ ）の方法を用いて全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、既知の方法を用いて、ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡから調製される。他方では、ゲノムＤＮＡが単離され得る。次に、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により同定され、そして単離される（Ｍｕｌｌｉｓ， アメリカ特許第４，６８３，２０２号）。
【００８１】
ｚｃｙｔｏｒ１９をコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニング方法により得られる。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノムクローンを使用し、又は少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようｃＤＮＡクローンを修飾することが好ましい。ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包含する。発現ライブラリーは、ｚｃｙｔｏｒ１９、受容体フラグメント、又は他の特定の結合パートナーに対する抗体によりプローブされ得る。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ合成機械を用いても合成され得る。現在、好ましい方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本鎖ＤＮＡが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のために必要とされる場合、個々の相補的鎖が、別々に製造される。短い遺伝子（６０〜８０ｂｐ）の生成は技術的に直接的であり、そして相補的鎖の合成及び続いて、それらのアニーリングにより達成され得る。しかしながら、より長いポリヌクレオチド（３００ｂｐ以上）の生成に関しては、化学的ＤＮＡ合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに１００％でないので、特定の工程が通常使用される。この問題を解決するために、合成遺伝子（二本鎖）が、２０〜１００個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントから調整形でアセンブルされる。
【００８３】
十分な長さの遺伝子を調製するための他の手段は、特定組みのオーバーラップするオリゴヌクレオチド（４０〜１００個のヌクレオチド）を合成することである。３’及び５’の短いオーバーラップする相補的領域（６〜１０個のヌクレオチド）がアニーリングされた後、大きなギャップが残存するが、しかし短い塩基対合された領域は、その構造体を一緒に維持するのに十分に長く且つ十分に安定性である。ギャップが満たされ、そしてＤＮＡ複合体がＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩによる酵素ＤＮＡ合成により完結される。酵素合成の完結の後、ニックがＴ４ ＤＮＡリガーゼにより密閉される。
【００８４】
二本鎖構造体は、ＤＮＡ配列分析により確かめられる完全な遺伝子配列を形成するために、お互い連続的に連結される。Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． １９９４）； Ｉｔａｋｕｒａ など．， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３： ３２３−５６， １９８４及びＣｌｉｍｉｅ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓａ． ＵＳＡ ８７： ６３３−７， １９９０を参照のこと。さらに、転写及び翻訳の正しい開始及び停止のためのシグナルを含む他の配列が一般的に付加される。
【００８５】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物リガンド及びポリヌクレオチドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類ポリペプチドからのｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドである。ヒトｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃＤＮＡは、ｚｃｙｔｏｒ１９を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン  ブロットをプローブすることによって同定され得る。
【００８６】
次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。次に、オルト体のｚｃｙｔｏｒ１９−コードのｃＤＮＡが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される代表的なヒトｚｃｙｔｏｒ１９配列から企画されたプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ， 前記）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃＤＮＡライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現がｚｃｙｔｏｒ９ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム  クローンの単離に適用され得る。
【００８７】
サイトカイン受容体サブユニットは、細胞外ドメイン、細胞膜にポリペプチドを固定するトランスメンブランドメイン、及び細胞内ドメインを含んで成る多重−ドメイン構造により特徴づけられる。細胞外ドメインはリガンド−結合ドメインであり得、そして細胞内ドメインはシグナルトランスダクションに包含されるエフェクタードメインであり得るが、但しリガンド−結合及びエフェクター機能は、マルチマー受容体の別々のサブユニット上に存在する。マルチマー受容体は、ホモダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αα及びββイソフォーム、エリトロポエチン受容体、ＭＰＬ及びＧ−ＣＳＦ受容体）、サブユニットがそれぞれリガンド−結合及びエフェクタードメインを有するヘテロダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αβイソフォーム）、及び種々の機能を有する成分サブユニットを有するマルチマー（例えば、ＩＬ−２， ＩＬ−３， ＩＬ−４， ＩＬ−５， ＩＬ−６， ＩＬ−７及びＧＭ−ＣＳＦ受容体）を包含する。
【００８８】
いくつかの受容体サブユニットは、多くの受容体に共通する。例えば、単独ではリガンドを結合できないが、しかし細胞内シグナルトランスダクションドメインを包含するＡＩＣ２Ｂサブユニットは、ＩＬ−３及び ＧＭ−ＣＳＦ受容体の成分である。多くのサイトカイン受容体は、その構造及び機能に基づいて、４種の関連するファミリーの１つに配置され得る。例えば、造血受容体は、保存されたシステイン残基及びＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号５）を含むドメインの存在により特徴づけられる。サイトカイン受容体構造は、Ｕｒｄａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２６： ２２１−２２８， １９９１及びＣｏｓｍａｎ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５：９５−１０６， １９９３により再考されている。
【００８９】
新規生物学的機能を生物が獲得するための選択的圧力下で、新規のファミリーメンバーは、多重遺伝子ファミリーの存在を導く存在する受容体遺伝子の重複から、たぶん生まれる。従って、ファミリーメンバーは、祖先遺伝子の痕跡を含み、そしてそれらの特徴は、追加のファミリーメンバーの単離及び同定において利用され得る。従って、サイトカイン受容体スーパーファミリーは、いくつかのファミリー、例えば免疫グロブリンファミリー（例えば、ＣＳＦ−１， ＭＧＦ， ＩＬ−１及びＰＤＧＦ受容体）；ヘマトポイエチンファミリー（例えば、ＩＬ−２受容体β−サブユニット、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のα−サブユニット、ＧＭ−ＣＳＦ受容体β−サブユニット、及びＧ−ＣＳＦ，ＥＰＯ， ＩＬ−３， ＩＬ−５， ＩＬ−６， Ｉｌ−７及びＩＬ−９受容体）；ＴＮＦ受容体ファミリー（例えば、ＴＮＦ（ｐ８０）ＴＮＦ （ｐ６０） 受容体、ＣＤ２７，ＣＤ３０， ＣＤ４０， Ｆａｓ及びＮＧＦ受容体）に再分割される。
【００９０】
ｚｃｙｔｏｒ１９配列の分析は、クラスＩＩサイトカイン受容体、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１７２２７）、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）受容体と同じ受容体ファミリーのメンバーであることを示唆する。このサブファミリーにおける受容体は、シグナルを形質導入するホモダイマーを形成するために包含することができる。サブファミリーのいくつかのメンバー（例えば、インターフェロン、ＩＬ−１０， ＩＬ−１９及びＩＬ−ＴＩＦを結合する受容体は）、リガンドを結合し、そしてシグナルを形質導入するために、第２サブユニット（β−サブユニットと称する）と結合する。特定のβ−サブユニットは、多くの特定のサイトカイン受容体サブユニットと会合する。
【００９１】
例えば、クラスＩＩサイトカイン受容体に関して、ｚｃｙｔｏｒ１１（通常アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）及びＣＲＦ２−４受容体は、サイトカインＩＬ−ＴＩＦを結合するためにホモダイマー化する（ＷＩＰＯ公開ＷＯ００／２４７５８号；Ｄｕｍｏｎｔｉｅｒｎａｄｏ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４： １８１９， ２０００； Ｓｐｅｎｃｅｒ， ＳＤなど．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７： ５７１−５７８， １９９８； Ｇｉｂｂｓ， Ｖｃ ａｎｄ Ｐｅｎｎｉｃａ Ｇｅｎｅ １８６： ９７−１０１， １９９７ （ＣＲＦ２−４ ｃＤＮＡ） ； Ｘｉｅ， ＭＨなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ３１３３５−３１３３９， ２０００； 及びＫｏｔｅｎｋｏ， ＳＶなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｐｒｅｓｓ ｍｏｏ７８３７２００を参照のこと）。
【００９２】
さらに、ＩＬ−１０β受容体はＩＬ−ＴＩＦのための受容体として包含され得、そしてＣＲＦ２−４と同意語であると思われる（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ， Ｌ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７： １０１４４−１０１４９， ２０００； ＬｉｕＹ． など．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： １８２１−１８２９， １９９４ （ＩＬ−１０Ｒ ｃＤＮＡ））。クラスＩＩ受容体複合体は、ヘテロダイマー又はマルチマーであり得る。従って、ｚｃｙｔｏｒ１９サブユニットを含んで成る、モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体が本発明により包含される。
【００９３】
当業者は、配列番号１、１８又は２０に開示される配列がヒトｚｃｙｔｏｒ１９の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号１、１８又は２０に示されるＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２、１９又は２１の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。
【００９４】
ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡは、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００９５】
本発明はまた、配列番号２、１９又は２１のポリペプチド、及びそれらのオルト体に対して実質的に類似する単離されたｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する”とは、配列番号２、１９又は２１に示される配列又はそれらのオルト体に対して、少なくとも７０％、及びより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号２、１９又は２１、又はそのオルト体に対して、少なくとも  ９０％、及び最も好ましくは９５％又はそれ以上同一であろう。
【００９６】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ． ４８ ： ６０３−６１６， １９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ：１０９１５−１０９１９， １９９２を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （前記）の“ｂｌｏｓｕｍ ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
【００９７】
【数１】
2004532611.tif 000004
【００９８】
【表３】
2004532611.tif 000005
【００９９】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて、類似する方法により決定される。
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体ｚｃｙｔｏｒ１９のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。
【０１００】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号２、１９又は２１）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【０１０１】
“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。ＦＡＳＴＡ 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９０ （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【０１０２】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、誤りとして設定される他のＦＡＳＴＡパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。
【０１０３】
ＢＬＯＳＵＭ６２表（表３）は、関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９９２） ］。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。化学的性質に基づいてのみアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記のように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
【０１０４】
変異体ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド又は実質的に相同のｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（表４を参照のこと）及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
【０１０５】
従って、本発明は、配列番号２、１９又は２１のその対応する領域（標識、延長、リンカー配列及び同様のものを除く）に対して８０％、好ましくは少なくとも９０％、及びより好ましくは９５％又はそれ以上の同一性を有する配列を含んで成るポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Ｘａ因子分解部位を含む。
【０１０６】
【表４】
2004532611.tif 000006
【０１０７】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体、及び１又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質を提供する。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドは、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示されるようなダイマータンパク質への融合として調製され得る。それに関しての好ましいダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含する。免疫グロブリン−ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド融合体は、種々のマルチマーｚｃｙｔｏｒ１９類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子（例えば、コラーゲン）に対してそれらを標的化するためにｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドに融合され得る。ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎなど．， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： １−９， １９９６を参照のこと。
【０１０８】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。
【０１０９】
例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｌｍａｎ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１，１９９１； Ｃｈｕｎｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−０９， １９９３； 及びＣｈｕｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−４９， １９９３を参照のこと。
【０１１０】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる（ Ｔｕｒｃａｔｔｉ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９１−９８， １９９６ ）。 第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【０１１１】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Ｋｏｉｄｅ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−４６， １９９４を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３， １９９３）。
【０１１２】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、ｚｃｙｔｏｒ１９アミノ酸により置換され得る。
【０１１３】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９； Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２， １９９１）。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性（例えば、リガンド結合及びシグナルトランスダクション）について試験される。
【０１１４】
また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−５７０８， １９９６を参照のこと。リガンド−受容体相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ など．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２， １９９２； Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４， １９９２； Ｗｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９−６４， １９９２を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連する受容体による相同体の分析からも推定され得る。
【０１１５】
構造統合性の維持に対して決定的である領域又はドメイン内に存在するアミノ酸残基の決定が行われ得る。それらの領域内で、多かれ少なかれ、変化に耐性であり、そして分子の全体的な三次構造を維持するであろう特定の残基を決定することができる。配列構造を分析するための方法は、高いアミノ酸又はヌクレオチド同一性を有する複数配列の一列整列、及び利用できるソフトウェアー（例えば、ｔｈｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（商標）ｖｉｅｗｅｒ ａｎｄ ｈｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｏｏｌｓ； ＭＳＩ， Ｓａｎ Ｄｉｒｇｏ， ＣＡ）、二次構造性質、二元パターン、相補的パッケージング及び埋もれた極性相互作用を用いてのコンピューター分析を包含するが、但しそれらだけには限定されない（Ｂａｒｔｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：３７２−３７６， １９９５及びＣｏｒｄｅｓなど．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６： ３−１０， １９９６）。一般的に、分子への修飾を企画するか又は特定のフラグメントを同定する場合、構造の決定は、修飾された分子の活性を評価することによって付随されるであろう。
【０１１６】
アミノ酸配列の変更が、生物学的活性に対して必須である高次構造体の破壊を最少にするためにｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドにおいて行われる。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドが１又は複数の構造ドメイン、例えばフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む場合、アミノ酸残基の変更が、分子のドメイン構造及び幾何学的及び他の成分を破壊しないよう行われ、ここでコンホメーションの変化が、いくらかの決定的な機能、例えば分子の、その結合パートナー、例えばＡ及びＤヘリックス、すなわち配列番号２の残基４４， ４７及び１３５への結合を妨害する。アミノ酸配列の変更の効果は、例えば上記に開示されるようなコンピューターモデルにより予測され得、又は結晶構造の分析により決定され得る（例えば、Ｌａｐｔｈｏｒｎなど．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２： ２６６−２６８， １９９５）。
【０１１７】
当業界において良く知られている他の技法は、標準の分子（例えば、生来のタンパク質）と変異体タンパク質の折りたたみを比較する。例えば、変異体及び標準の分子におけるシステインパターンの比較が行われ得る。質量分光及び還元及びアルキル化を用いての化学的修飾は、ジスルフィド結合に関連するか又はそのような関連を有さないシステイン残基を決定するための方法を提供する（Ｂｅａｎなど．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０１： ２１６−２２６， １９９２； Ｇｒａｙ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： １７３２−１７４８， １９９３： 及びＰａｔｔｅｒｓｏｎなど．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６： ３７２７−３７３２， １９９４）。
【０１１８】
一般的に、修飾された分子が標準の分子と同じジスルフィド結合パターンを有さない場合、折りたたみが影響を及ぼされると思われる。折りたたみを測定するためのもう１つの良く知られており、且つ許容できる方法は、円ニ色性（ＣＤ）である。修飾された分子及び標準の分子により生成されるＣＤスペクトルの測定及び比較は、通常のことである（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ７：２０５−２１４， １９９０）。結晶学は、折りたたみ及び構造を分析するためのもう１つの良く知られた方法である。核磁気共鳴（ＮＭＲ）、消化ペプチドマッピング及びエピトープマッピングはまた、タンパク質とポリペプチドとの間の折りたたみ及び構造的類似性を分析するための既知方法でもある（Ｓｃｈａａｎａｎなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： ９６１−９６４， １９９２）。
【０１１９】
配列番号２、１９又は２１に示されるようなｚｃｙｔｏｒ１９タンパク質配列のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールが生成され得る（Ｈｏｐｐなど．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８： ３８２８， １９８１； Ｈｏｐｐ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ． ８８： １−１８， １９８６及びＴｒｉｑｕｉｅｒなど．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１： １５３−１６９， １９９８）。前記プロフィールは、スライドする６−残基窓（ｓｌｉｄｉｎｇ ｓｉｘ−ｒｅｓｉｄｕｅ ｗｉｎｄｏｗ）に基づかれている。埋もれたＧ， Ｓ及びＴ残基及び暴露されたＨ， Ｙ及びＷ残基は無視された。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドにおいては、親水性領域は、配列番号２のアミノ酸残基２９５〜３００；配列番号２のアミノ酸残基４５１〜４５６；配列番号２のアミノ酸残基３０１〜３０６；配列番号２のアミノ酸残基２４４〜２９９；及び配列番号２のアミノ酸残基６５〜７０を包含する。さらに、当業者は、抗原性エピトープ−担持のポリペプチドを包含するｚｃｙｔｏｒ１９親水性領域がＤＮＡＳＴＡＲタンパク質プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， ＩＮＣ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロットにより予測され得ることを認識するであろう。
【０１２０】
当業者は、親水性又は疎水性が、全体的な構造及び生物学的プロフィールを破壊しないよう、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのアミノ酸配列における修飾を企画する場合、考慮されるであろうことを認識するであろう。Ｖａｌ， Ｌｅｕ及びＩｌｅから成る群、又はＭｅｔ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ａｌａ， Ｔｙｒ及びＴｒｐから成る群から選択された疎水性残基の置換が特に興味の対象である。例えば、置換に耐性の残基は、配列番号２に示されるような残基を包含する。しかしながら、配列番号２又は１９の位置７４、８２、１９５及び２１７でのシステイン残基及び配列番号４における対応するＣｙｓ残基は、置換に対して比較的耐性であろう。さらに、配列番号２１の位置７４、８２でのシステイン残基は置換に対して比較的不耐性である。
【０１２１】
必須アミノ酸の正体はまた、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドとの、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーメンバー間の配列類似性の分析から推定され得る。前に記載された“ＦＡＳＴＡ”分析のような方法を用いて、高い類似性の領域が、タンパク質ファミリー内に同定され、そして保存された領域のためのアミノ酸配列を分析するために使用される。構造に基づいて変異体ポリヌクレオチドを同定するためのもう１つのアプローチは、可能性ある変異体ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドをコードする核酸分子が、上記で論じられたように、配列番号１、１８又は２０のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるかどうかを決定することである。
【０１２２】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸を同定する他の方法は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１ （１９８９）；Ｂａｓｓ など．， Ｐｒｏ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８ （１９９１）； Ｃｏｏｍｂｓ ａｎｄ Ｇｏｒｅｙ， “Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｕａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ， Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ （ｅｄ．）， Ｐ． ２５９−３１１ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８））。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子におけるあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるように、生物学的又は生化学的活性について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９ （１９９６） を参照のこと。
【０１２３】
本発明はまた、本明細書において定義されるようなｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの機能的フラグメント、及びそのような機能的フラグメントをコードする核酸分子を包含する。本明細書において定義されるような、“機能的” ｚｃｙｔｏｒ１９又はそのフラグメントは、その増殖又は分化活性により、特殊化された細胞機能を誘発し、又は阻害するその能力により、又は可溶性又は固定された抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体、ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドに特異的に結合するその能力により特徴づけられる。さらに、機能的フラグメントはまた、シグナルペプチド、細胞内シグナルドメイン、及び同様のものを包含する。前に本明細書において記載されたように、ｚｃｙｔｏｒ１９は、クラスＩサイトカイン受容体構造により特徴づけられる。
【０１２４】
従って、本発明はさらに、（ａ）本明細書に記載される細胞外ドメイン、サイトカイン−結合ドメイン、又は細胞内ドメインを含んで成るポリペプチド分子；及び（ｂ）１又は複数のそれらのドメインを含んで成る機能的フラグメントを包含する融合タンパク質を提供する。融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、もう１つのクラスＩＩサイトカイン受容体、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）及び同様のものにより、又は融合タンパク質の分泌を促進する非生来の及び／又は関連のない分泌シグナルペプチドにより寄与され得る。
【０１２５】
核酸分子の通常の欠失分析は、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために行われ得る。例示されるように、配列番号１、１８又は２０のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを有するＤＮＡ分子は、一連の欠失を得るためにＢａｌ３１ヌクレアーゼにより消化され得る。次に、それらのＤＮＡフラグメントが正しい読み取り枠を整合して発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドが単離され、そしてｚｃｙｔｏｒ１９活性について、又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はｚｃｙｔｏｒ１９受容体を結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化のための１つの方法は、欠失を導入するためにオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発を使用し、又は所望するｚｃｙｔｏｒ１９フラグメントの生成を特定するために停止コドンを使用することである。他方では、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドの特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。
【０１２６】
機能的ドメインを同定するための標準の方法は、当業者に良く知られている。例えば、インターフェロンのいずれかの又は両末端での切断に対する研究が、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｄｉ Ｍａｒｃｏ， ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ６６： ５０７ （１９９５） により要約されている。さらに、タンパク質の機能的分析のための標準技法は、例えばＴｒｅｕｌｔｅｒなど．， Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４０： １１３ （１９９３）， Ｃｏｎｔｅｎｔ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓｉ ｏｆ ｔｈｅ ４２ ｋＤａ ２−５Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ”， ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＩＳＩＲ−ＴＮＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｎｔｅｌｌ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ ６５−７２ （Ｎｉｊｈｏｆｆ １９８７）， Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ， “Ｔｈｅ ＥＧＦ Ｅｎｚｙｍｅ”， ｉｎ Ｃｏｒｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． １， Ｂｏｙｎｔｏｎ など．， （ｅｄｓ．） ｐａｇｅｓ １６９−１９９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）， Ｃｏｕｎａｉｌｌｅａｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２９２７０ （１９９５）； Ｆｕｋｕｎａｇａ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２５２９１ （１９９５）； Ｙａｍａｇｕｃｈｉ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０： １２９５ （１９９５）； 及びＭｅｉｓｅｌなど．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ３０： １ （１９９６）により記載される。
【０１２７】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。
【０１２８】
開示されるｚｃｙｔｏｒ１９ ＤＮＡ及びポリペプチド配列の変異体は、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０ ： ３８９−９１， １９９４， Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−５１， １９９４及びＷＩＰＯ公開ＷＩ９７／２００７８により開示されるように、ＤＮＡ  シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体ＤＮＡ分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親ＤＮＡのランダム断片化、続く、ＰＣＲを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はＤＮＡを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１２９】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたｚｃｙｔｏｒ１９受容体ポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。これに関する好ましいアッセイは、下記に記載される、細胞増殖アッセイ及びバイオセンサー−に基づくリガンド−結合アッセイを包含する。活性受容体又はその一部（例えば、又はリガンド−結合フラグメント、シグナル化ドメイン及び同様のもの）をコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にする。
【０１３０】
さらに、本発明のタンパク質（又はそのポリペプチドフラグメント）は、多機能分子を供給するために、他の生物活性分子、特に他のサイトカインに連結され得る。例えば，ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体からの１又は複数のヘリックスが、それらの生物学的性質又は生成の効率を高めるために、他のサイトカイン可溶性受容体に連結され得る。
【０１３１】
従って、本発明は、１又は複数のｚｃｙｔｏｒ１９のドメインを含んで成るセグメントが他のポリペプチドに融合されている一連の新規ハイブリッド分子を提供する。融合は好ましくは、組換え生成システムにおけるキメラ分子の発現を可能にするためにＤＮＡレベルをスプライシングすることにより行われる。次に、その得られる分子は、改良された溶解性、改良された安定性、延長されたクリアランス半減期、改良された発現及び分泌レベル、及び薬物力学についてアッセイされる。そのようなハイブリッド分子はさらに、成分タンパク質又はポリペプチド間に追加のアミノ酸残基（例えば、ポリペプチドリンカー）を含んで成る。
【０１３２】
本明細書に論議される方法を用いて、当業者は、シグナルトランスダクション又はリガンド結合活性を保持する、配列番号２又は１９の種々のポリペプチドフラグメント又は変異体を同定し、そして／又は調製することができる。例えば、サイトカイン−結合ドメイン（配列番号２又は１９の残基２１（Ａｒｇ）〜２２６（Ａｓｎ））、サイトカイン−結合ドメイン（配列番号２又は１９の残基２１（Ａｒｇ）〜２２３（Ｐｒｏ））、又はその対立遺伝子変異体又は種オルト体に対して実質的に相同であり、そして野生型ｚｃｙｔｏｒ１９タンパク質のリガンド−結合活性を保持する種々のポリペプチドを調製することによって、ｚｃｙｔｏｒ１９を、“可溶性受容体”にすることができる。そのようなポリペプチドは、トランスメンブラン及び細胞内ドメインの一部又はすべてからの追加のアミノ酸を包含することができる。そのようなポリペプチドはまた、一般的に本明細書に開示されるような追加のポリペプチドセグメント、例えばラベル、親和性標識及び同様のものも包含することができる。
【０１３３】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのｚｃｙｔｏｒ１６ポリペプチド、例えば変異体、可溶性受容体及び融合ポリペプチド又はタンパク質に関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を用意に生成することができる。
【０１３４】
本発明のｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド、例えば十分な長さのポリペプチド、生物学的に活性のフラグメント及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するための技法は次の文献に開示される：Ｓａｍｂｒｏｏｌ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９， 及びＡｕｓｕｂｅｌ など．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｓ．， ＮＹ， １９８７。
【０１３５】
一般的に、本発明のｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。
【０１３６】
ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、ｚｃｙｔｏｒ１９の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばｔ−ＰＡ ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、ｚｃｙｔｏｒ１９ ＤＮＡ配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるＤＮＡ配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【０１３７】
他方では、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌路中に他のポリペプチドを方向づけるために使用される。本発明はそのような融合ポリペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドが製造され得、ここで配列番号２又は１９のアミノ酸１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸２０（Ｇｌｙ）に由来する分泌シグナル配列が当業界において知られている方法及び本明細書に開示される方法を用いて、もう１つのポリペプチドに作用可能に連結されている。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は好ましくは、分泌路中い追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペプチドにアミノ末端的に融合される。
【０１３８】
そのような構造体は、当業界において知られている多くの用途を有する。例えば、それらの新規の分泌シグナル配列融合構造体は通常分泌されないタンパク質のポリペプチドフラグメント又は活性成分の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分泌路を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得る。さらに、そのような融合構造体は、本明細書に記載されるように、動物を接種し、そして抗体を生成するために使用され得るｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドフラグメントの発現、分泌及び精製を可能にする。
【０１３９】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性ＤＮＡを 、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒなど．， Ｃｅｌｌ １４ ： ７２５， １９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７ ：６０３， １９８１； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２； ４５６， １９７３），エレクトロポレーション（ Ｎｅｕｍａｎｎ など．， ＥＭＢＯ Ｊ． １： ８４１−８４５， １９８２ ）； ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ −Ｎｅｌｓｏｎ など．， Ｆｏｃｕｓ １５： ７３， １９９３； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ  など．，Ｆｏｃｕｓ １５： ８０， １９９３ ）を包含する。
【０１４０】
培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばｌｅｖｉｎｓｏｎ など．， アメリカ特許第４，７１３，３３９ 号； Ｈａｇｅｎ など．， アメリカ特許第４，７８４，９５０ 号； Ｐａｌｍｉｔｅｒ など．， アメリカ特許第 ４，５７９，８２１ 号； 及びＲｉｎｇｏｌｄ， アメリカ特許第 ４，６５６，１３４ 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６３２）、ＢＨＫ ５７０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １０３１４ ）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １５７３ ； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏ． ３６： ５９−７２， １９７７ ）、及びチャイニーズ  ハムスター卵巣（例えば  ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ６１ ）細胞系を包含する。
【０１４１】
追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えば Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、例えばＳＶ−４０ 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第４，９５６，２８８ 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許 ４，５７９，８２１ 号及び第 ４，６０１，９７８ 号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【０１４２】
薬物選択は一般的に、外来性ＤＮＡが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。
【０１４３】
増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン  アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４，  ＣＤ８，クラスＩ  ＭＨＣ、胎盤アルカリホスファターゼが、ＦＡＣＳ分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【０１４４】
他の高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒなど．、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． （ Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ） １１： ４７−５８， １９８７ により再考されている。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Ｇｕａｒｉｎｏ など．，アメリカ特許第５，１６２，２２２号；及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３号により公開される。
【０１４５】
昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染され得る。Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， １９９４； 及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， Ｅｄ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９５を参照のこと。
【０１４６】
組換えｚｃｙｔｏｒ１７バキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ （ Ｌｕｃｋｏｗ， ＶＡ， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７： ４５６６−７９， １９９３ ） により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。トランスファーベクターを利用するこのシステムは、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃＴＭキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）として市販されている。このシステムは、“ｂａｃｍｉｄ”  と呼ばれる大きなプラスミドとして、Ｅ．コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードするＤＮＡを移動せしめるために、Ｔｎ７トランスポゾンを含むトランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃＩ ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）を利用する。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【０１４７】
さらに、トランスファーベクターは発現されたｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端でエピトープ標識、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕ  エピトープ標識をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ， Ｔ． など．， Ｐｅｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： ７９５２−６， １９８５）。当業界において知られている技法を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１９を含むトランスファーベクターにより、Ｅ．コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄａ についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ が、通常の技法を用いて単離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）細胞、例えばＳｆ９ 細胞をトランスフェクトするために使用される。ｚｃｙｔｏｒ１９を発現する組換えウィルスが結果的に生成される。組換えウィルス  ストックは、当業者において通常使用される方法により製造される。
【０１４８】
組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， ＡＳＭ Ｐｒｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９４を参照のこと。もう１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）に由来するＨｉｇｈ ＦｉｖｅＯＴＭ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である（アメリカ特許第５，３００，４３５号）。
【０１４９】
市販の血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。適切な培地は、Ｓｆ９細胞のためには、ＳＦ９００ＩＩＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），又はＥＳＴ  ９２１ＴＭ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）； 及びＴ． ｎｉ 細胞のためには、Ｅｘ−ＣｅｌｌＯ４０５ＴＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｚａ， ＫＳ）又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）である。使用される方法は一般的に、入手できる実験用マニュアルに記載されている（Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ． Ｄ．， 前記； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ． Ｒ． など．， 前記；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｄ．， 前記）。上清液からのｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成され得る。
【０１５０】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） を包含する。外因性ＤＮＡによりＳ．  セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ など．， アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ， アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙ など．， アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。
【０１５１】
形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉ など． （アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．， アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ， アメリカ特許第４，９７７，０９２ 号を参照のこと）及びアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第４，９９０，４４６ 号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６ 号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。
【０１５２】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ）、ピチア・パストリス（ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２： ３４５９−３４６５， １９８６ 及びＣｒｅｇｇ， アメリカ特許第４，８８２，２７９ 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ など．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ．， アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。
【０１５３】
組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／１７４５０， ＷＯ９７／１７４５１、ＷＯ９８／０２５３６及びＷＯ９８／０２５６５に開示される。Ｐ．メタノリカの形質転換に使用するためのＤＮＡ分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、Ｐ．メタノリカ遺伝子、例えばＰ．メタノリカ  アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１又はＡＵＧ２）のものであることが好ましい。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、及びカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のものを包含する。
【０１５４】
宿主染色体中へのＤＮＡの組み込みを促進するためには、宿主ＤＮＡ配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア  メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ； ＥＣ． ４．１．１．２１）をコードするＰ．メタノリカＡＤＥ２遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１及びＡＵＧ２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０１５５】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及びＰＲＢ１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、Ｐ．メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ，好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの電場の強さ、及び１〜４０ｍ秒、最も好ましくは約２０ｍ秒の時定数（ｔ）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりＰ．メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０１５６】
原核宿主細胞、例えば細菌Ｅ．コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクローン化される外来性ＤＮＡ配列を発現するための技法は、当業界において良く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記を参照のこと）。細菌、例えばＥ．コリにおいてｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。
【０１５７】
次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０１５８】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。
【０１５９】
増殖培地は一般的に、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。Ｐ．メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地において、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーションを提供される。Ｐ．メタノリカのための好ましい培養培地は、ＹＥＰＤ（２％Ｄ−グルコース、２％のＢａｃｔｏＴＭペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）， １％のＢａｃｔｏＴＭ  酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）， ０．００４％のアデニン及び０．００６％のＬ−ロイシン）である。
【０１６０】
本発明の１つの観点においては、ｚｃｙｔｏｒ１９サイトカイン受容体（例えば、トランスメンブラン及び細胞内ドメイン）は、培養された細胞により生成され、そして細胞は、受容体のためのリガンド、例えば天然のリガンド、及び天然のリガンドのアゴニスト及びアンタゴニストについてスクリーンするために使用される。このアプローチを要約すると、受容体をコードするｃＤＮＡ又は遺伝子がその発現のために必要とされる他の遺伝子要素（例えば、転写プロモーター）と組合され、そしてその得られる発現ベクターが宿主細胞中に挿入される。ＤＮＡを発現し、そして機能的受容体を生成する細胞が選択され、そして種々のスクリーニングシステム内に使用される。
【０１６１】
本発明の新規受容体の発現及び受容体−介在性シグナルのトランスダクションへの使用のために適切な哺乳類細胞は、β−サブユニット、例えばクラスＩＩサイトカイン受容体サブユニット、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）受容体を発現する細胞を包含する。そのようなサブユニットは、天然において細胞において発現され得るか、又はｚｃｙｔｏｒ１９受容体により同時−トランスフェクトされ得る。クラスＩサイトカイン受容体のための典型的な細胞系は、ｇｐ１３０を発現する細胞、及びｇｐ１３０及びＬＩＦ受容体を同時発現する細胞を包含する（Ｇｅａｒｉｎｇなど．， ＥＭＢＯ． Ｊ． １０：２８３９−２８４８， １９９１； Ｇｅａｒｉｎｇ など．， アメリカ特許第５，２８４，７５５号）。
【０１６２】
これに関して、同じサブファミリーにおける受容体、例えばＩＬ−６又はＬＩＦに結合する他のサイトカインに対して応答性である細胞を使用することが一般的に好ましい。なぜならば、そのような細胞は必要なシグナルトランスダクション経路を含むであろうからである。このタイプの好ましい細胞は、ヒトＴＦ−１細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２００３）及びＤＡ−１細胞系を包含する（Ｂｒａｎｃｈなど．， Ｂｌｏｏｄ ６９： １７８２， １９８７； Ｂｒｏｕｄｙ など．， Ｂｌｏｏｄ ７５； １６２２−１６２６， １９９０）。他方では、適切な宿主細胞は、所望する細胞応答のために必要とされるβ−サブユニット又は他の細胞成分を生成するために構築され得る。
【０１６３】
例えば、ネズミ細胞系ＢａＦ３ （Ｐａｌａｃｉｏｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ， Ｃｅｌｌ ４１： ７２７−７３４， １９８５； Ｍａｔｈｅｙ− Ｐｒｅｖｏｔなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６： ４１３３−４１３５， １９８６），  子供ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系、又はＣＴＬＬ−２細胞系（ＡＴＴＣ ＴＩＢ−２１４）が、個々のクラスＩＩサブユニット、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）受容体を、ｚｃｙｔｏｒ１９の他に発現するためにトランスフェクトされ得る。
【０１６４】
同じ種からの宿主細胞及び受容体を使用することが一般的に好ましいが、しかしながら、このアプローチは、いずれかの種からの多数の受容体サブユニットを発現するための細胞系の構築を可能にし、それにより、種特異性から生じる可能性ある制限を克服する。他方では、マスス受容体ｃＤＮＡの種相同体、例えばＢａＦ３細胞系におけるマウスｃＤＮＡが、同じ種からの細胞系内でクローン化され、そしてその細胞内で使用され得る。従って、１つの造血成長因子、例えばＩＬ−３に依存する細胞系が、ｚｃｙｔｏｒ１９リガンド、又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体に依存性になるように構築され得る。
【０１６５】
機能的ｚｃｙｔｏｒ１９を発現する細胞が、スクリーニングアッセイ内に使用される。種々の適切なアッセイは、当業界において良く知られている。それらのアッセイは、標的細胞における生物学的反応の検出に依存する。１つのそのようなアッセイは、細胞増殖アッセイである。細胞は、試験化合物の存在又は不在下で培養され、そして細胞増殖は、例えばトリチウム化されたチミジンの組み込みを測定することにより、又はＡｌｙｍａｒ ＢｌｕｅＴＭ （ＡｃｃｕＭｅｄ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ） 又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Ｍｏｓｍａｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６５： ５５−６３， １９８３）の代謝性分解に基づく比色分析により検出される。
【０１６６】
他のアッセイ型は、レポーター遺伝子を発現するよう、さらに構築される細胞を用いる。レポーター遺伝子は、レポーター−連結経路、例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路に応答するプロモーター要素に連結され、そしてアッセイは、レポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。これに関しての好ましいプロモーター要素は、血清応答要素、又はＳＲＥである（例えば、Ｓｈａｗなど．， Ｃｅｌｌ ５６３−５７２， １９８９を参照のこと）。好ましいそのようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である（ｄｅ Ｗｅｔなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７： １９８７）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当業界において知られている方法を用いて発光により検出される（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： １９０９４−２９１０１， １９９４； Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｇｏｉｆｆｉｎ， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ ４１； １１， １９９３）。
【０１６７】
ルシフェラーゼアッセイキットは、例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩから市販されている。この型の標的細胞系は、化学物質、細胞−ならし培養培地、菌類ブイヨン、土壌サンプル、水サンプル及び同様のもののライブラリーをスクリーンするために使用され得る。例えば、細胞−又は組織−ならし培地サンプルのバンクが、リガンドを生成する細胞を同定するために標的細胞に対してアッセイされ得る。次に、陽性細胞が、プールに分けられ、宿主細胞中にトランスフェクトされ、そして発現される、哺乳類細胞発現ベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを生成するために使用される。
【０１６８】
次にトランスフェクトされた細胞からの培地サンプルがアッセイされ、続くプールの分割、トランスフェクション、継代培養、及び陽性細胞の再アッセイが伴ない、リガンドを発現するクローン細胞系が単離され得る。他方では、トランスフェクトされた細胞からの培地サンプルが、アッセイされ得、そしてリガンドｃＤＮＡを発現する細菌クローンを単離するために、つづくプールの分割、再トランスフェクション及び再アッセイが伴なう。腎臓、肝臓、膵臓、胸腺、他のリンパ組織、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞又は白血病細胞系により条件付けされた培地サンプルが、スクリーニング方法への使用のためのリガンドの好ましい源である。
【０１６９】
ｚｃｙｔｏｒ１９のための天然のリガンドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１９を発現するサイトカイン−依存性細胞系を突然変異誘発し、そしてそれを、オートクライン増殖について選択する条件下で培養することによって同定され得る。ＷＩＰＯ公開ＷＯ９５／２１９３０号を参照のこと。典型的な方法においては、ｚｃｙｔｏｒ１９を発現する細胞が、例えばＥＭＳにより突然変異誘発される。次に、細胞が、必要とされるサイトカインの存在下で回収され、次に、サイトカインを欠いている培養培地にトランスファーされる。
【０１７０】
生存細胞は、リガンドに対して競争するために、可溶性受容体ポリペプチドを、本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１９細胞外サイトカイン−結合ドメイン又はサイトカイン−結合フラグメントを含んで成る培養培地に添加することにより、又はｚｃｙｔｏｒ１９受容体を発現するトランスフェクトされた細胞に比較して、野生型細胞に基づくならし培地をアッセイすることにより、ｚｃｙｔｏｒ１９のためのリガンドの生成についてスクリーンされる。この方法に使用するための好ましい細胞系は、ｇｐ１３０又は、ＩＦ受容体と組合してｇｐ１３０を発現するためにトランスフェクトされる細胞を包含する。好ましいそのような宿主細胞系は、トランスフェクトされたＣＴＬＬ−２細胞（Ｇｉｌｉｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｎａｔｕｒｅ ２６８： １５４−１５６， １９７７）及びトランスフェクトされたＢａＦ３細胞を包含する。
【０１７１】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体ポリペプチドを使用する分泌トラップ方法は、ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドを単離するために使用され得る（Ａｌｄｒｉｃｈ， など．， Ｃｅｌｌ ８７： １１６１−１１６９， １９９６）。既知の又は疑わしいリガンド源から調製されたｃＤＮＡ発現ライブラリーが、ＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトされる。ｃＤＮＡライブラリーベクターは一般的に、ＣＯＳ−７細胞における増殖のためのＳＶ４０起点、及び高い発現のためのＣＭＶプロモーターを有する。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞は、単層において増殖され、そして次に固定され、そして浸透せしめられる。次に、本明細書に記載される、標的化されているか、又はビオチン−ラベルされたｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体が、細胞像と接触して配置され、そして抗−相補的分子、すなわちｚｃｙｔｏｒ１９リガンドを発現する、単層における細胞の結合を可能にされる。従って、リガンドを発現する細胞が、受容体分子により結合されるであろう。
【０１７２】
ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により接合される抗−標的抗体（Ｉｇ融合体のための抗−Ｉｇ、ＦＬＡＧ−標的化された融合体のためのＭ２又は抗−ＦＬＡＧ、ストレプタビジン及び同様のもの）は、標的化されているか、又はビオチン−ラベルされたｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体が結合しているそれらの細胞を可視化するために使用される。ＨＲＰは、チラミド試薬、例えばチラミド−ＦＩＴＣの付着を触媒する。市販のキットが、この検出のために使用され得る（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ＴＳＡ−ＤｉｒｅｃｔＴＭ Ｋｉｔ； ＮＥＮ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）。ｚｃｙｔｏｒ１７受容体リガンドを発現する細胞は、緑色の細胞として蛍光顕微鏡下で同定され、そしてＡｌｄｒｉｃｈ，など．， 前記に概略されるように、プラスミド救助のための方法を用いてのリガンドの続くクローニング、クローンが同定されるまでの続くラウンドの分泌トラップアッセイのために採取されるであろう。
【０１７３】
受容体として、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの活性は、受容体結合及び続く生理学的細胞応答に関連する細胞外酸性化速度又はプロトン排泄を測定する珪素基材のバイオセンサーマイクロフィジオメーターにより測定され得る。典型的な装置は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡにより製造されるＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒＴＭ Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒである。種々の細胞応答、たとえば細胞増殖、イオン輸送、エネルギー生成、炎症応答、調節及び受容体活性化及び同様のものが、この方法により測定され得る。例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ｈ．Ｍ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： １９０５−１９１２， １９９２； Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ， Ｓ． など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２８： ８４−１０８， １９９７； Ａｒｉｍｉｌｌｉ， Ｓ． など．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２１２： ４９−５９， １９９８； Ｖａｎ Ｌｉｅｆｄｅ， Ｉ． など．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４６： ８７−９５， １９９８を参照のこと。
【０１７４】
マイクロフィジオメーターは、付着性又は非付着性真核又は原核細胞をアッセイするために使用され得る。時間にわたって細胞培地における細胞外酸性化の変化を測定することによって、マイクロフィジオメーターは、種々の刺激、例えばｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに対する細胞応答を直接的に測定する。好ましくは、マイクロフィジオメーターは、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを発現しない対照の真核細胞に比較して、ｚｃｙｔｏｒ１７−発現性真核細胞の応答を測定するために使用される。ｚｃｙｔｏｒ１９−発現性真核細胞は、ｚｃｙｔｏｒ１９−調整刺激に対して応答性である細胞を創造するか、又は天然において発現性のｚｃｙｔｏｒ１９細胞、例えばリンパ球、膵臓、胸腺組織、又はＰＢＬに由来するｚｃｙｔｏｒ１９−発現性細胞である細胞を創造する、本明細書に記載されるように、アデノウィルスベクターを通して、ｚｃｙｔｏｒ１９がトランスフェクトされているか、又は感染されている細胞を包含する。
【０１７５】
対照に比較して、ｚｃｙｔｏｒ１９を発現する細胞の応答における細胞外酸性化の上昇又は低下により測定される差異が、ｚｃｙｔｏｒ１９−調節された細胞応答の直接的に測定である。さらに、そのようなｚｃｙｔｏｒ１９−調節された応答は、種々の刺激下でアッセイされ得る。また、マイクロフィジオメーターを用いれば、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを発現する細胞を供給し、前記細胞の第１部分を試験化合物の不在下で培養し、前記細胞の第２部分を試験化合物の存在下で培養し、そして前記細胞の第１部分に比較して、前記細胞の第２部分の細胞応答の上昇又は低下の変化を検出することを含んでなる、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するための方法が提供される。ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのためのアンタゴニスト及びアゴニストは、この方法を用いて急速に同定され得る。
【０１７６】
本発明により提供される追加のアッセイは、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を包含する。それらのハイブリッドポリペプチドは、２種の一般的なクラスに分けられる。第１のクラスにおいては、配列番号２の残基２５０（Ｌｙｓ）〜４９１（Ａｒｇ）、又は配列番号１９の残基２５０（Ｌｙｓ）〜５２０（Ａｒｇ）を含んで成るｚｃｙｔｏｒ１９の細胞内ドメインは、第２受容体のリガンド−結合ドメインに連結される。好ましくは、第２受容体は造血サイトカイン受容体、例えばｍｐｌ受容体である（Ｓｏｕｙｒｉなど．， Ｃｅｌｌ ６３： １１３７−１１４７， １９９０）。ハイブリッド受容体はさらに、いずれかの受容体に由来するトランスメンブランドメインを含んで成るであろう。次に、ハイブリッド受容体をコードするＤＮＡ構造体が宿主細胞中に挿入される。
【０１７７】
ハイブリッド受容体を発現する細胞が、結合ドメインのためのリガンドの存在下で培養され、そして応答についてアッセイされる。このシステムは、容易に入手できるリガンドを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１９により介在されるシグナルトランスダクションを分析するための手段を提供する。このシステムはまた、特定の細胞系がｚｃｙｔｏｒ１９により形質導入されたシグナルに応答できるかどうかを決定するためにも使用され得る。
【０１７８】
第２クラスのハイブリッド受容体ポリペプチドは、第２受容体、好ましくはサイトカイン受容体の細胞質ドメイン及びトランスメンブランドメインと共に、ｚｃｙｔｏｒ１９の細胞外（リガンド結合）サイトカイン−結合ドメイン（配列番号２又は１９の残基２１（Ａｒｇ）〜２２６（Ａｓｎ））、又はサイトカイン−結合フラグメント（例えば、配列番号２又は１９のの残基２１（Ａｒｇ）〜２２３（Ｐｒｏ））を含んで成る。トランスメンブランドメインは、いずれかの受容体に由来することができる。この第２クラスのハイブリッド受容体は、第２受容体により形質導入されるシグナルに応答することが知らされている細胞において発現される。それらの２種のハイブリッド受容体は、受容体に基づいくアッセイシステム内での広範囲の細胞型の使用を可能にする。
【０１７９】
次に、ｚｃｙｔｏｒ１９のためのリガンドを発現することが見出された細胞が、リガンド−コードのｃＤＮＡが上記に開示されるように単離され得るｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用される。従って、本発明は、新規受容体ポリペプチドの他に、受容体のためのポリペプチドリガンドをクローニングするための方法を提供する。
【０１８０】
ｚｃｙｔｏｒ１９構造及び組織発現は、初期造血又は胸腺細胞発生及び免疫応答調節において役割を演じることができる。それらの工程は、１又は複数のサイトカインのそれらの同種受容体への結合に応答しての細胞増殖及び分化の刺激を包含する。この受容体に関して観察される組織分布の観点から、アゴニスト（天然のリガンドを包含する）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。受容体アゴニストに同定される化合物は、インビトロ及びインビボで、標的細胞の増殖及び進化を刺激するために有用である。
【０１８１】
例えば、アゴニスト化合物又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、定義された細胞培養培地の成分として有用であり、そして細胞培養において通常使用される血清を置換するために、単独で又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。従って、アゴニストは、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、及びリンパ球及び骨髄性系の他の細胞、及び培養における造血細胞の増殖及び／又は進化を特別に促進することにおいて有用である。
【０１８２】
ｚｃｙｔｏｒ１９又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体のためのアゴニストリガンドは、細胞−介在性免疫性の刺激において、及びリンパ球増殖の刺激のために、例えば免疫抑制に関与する感染、例えば一定のウィルス感染の処理の研究への使用において有用である。追加の使用は、悪性形質転換が抗原性である腫瘍細胞をもたらす、腫瘍抑制のためのマウスモデルへの使用を包含する。アゴニストリガンド又は抗―ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、エフェクター細胞、例えばＴ−細胞、ＮＫ（天然のキラー）細胞又はＬＡＫ（リンパ性の活性化されたキラー）細胞の活性化を通して介在され得るか、又はアポプトシス経路を通して直接的に誘発され得る、細胞毒性を誘発するために使用され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１９−担持の癌細胞に対する細胞毒性又はＡＤＣＣを刺激するために使用され得る。アゴニストリガンドはまた、影響された細胞型のレベルを高めることによって白血球減少の処理において、及び骨髄移植の後、Ｔ−細胞レパートリーの再生の増強への使用のために有用である。
【０１８３】
アンタゴニストリガンド、化合物、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９受容体又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、免疫型の抑制、例えば自己免疫疾患、例えばリュウマチ様関節炎、多発性硬化症、真性糖尿病、炎症性腫疾患、クローン病、等の処理に使用され得る。免疫抑制はまた、組織又は器官移植片及び移植片の拒絶を低めるために、及び影響された細胞型の増殖を阻害することによってＴ−細胞特異的白血病又はリンパ腫を処理するためにも使用され得る。
【０１８４】
本発明は、上記で論じられたように、裸抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体（又はその裸抗体フラグメント）の使用、及び種々の疾病、例えばＢ−細胞悪性疾患、及びｚｃｙｔｏｒ１９が発現される、本明細書の記載される他の癌の処理をもたらすためへの免疫接合体の使用に関する。そのような免疫接合体及び抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１９−担持の癌細胞に対する細胞毒性又はＡＤＣＣを刺激するために使用され得る。免疫接合体は、標準技法を用いて調製され得る。例えば、免疫接合体は、抗体成分に治療剤を間接的に接合することによって生成され得る（例えば、Ｓｈｉｈなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ４１： ８３２−８３９ （１９８８）； Ｓｈｉｈなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６： １１０１−１１０６ （１９９０）； 及びＳｈｉｈなど．， アメリカ特許第５，０５７，３１３号を参照のこと。
【０１８５】
手短には、１つの標準アプローチは、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分と、少なくとも１つの遊離アミン機能を有し、そして多くの薬剤、トキシン、キレート化剤、硼素付加物又は他の治療材を負荷されているキャリヤーポリマーとを反応せしめることを包含する。この反応は、最終接合体を形成するために第二アミンへの還元により安定化され得る初期シェフ塩基（イミン）連結をもたらす。
【０１８６】
前記キャリヤーポリマーは、他の実質的に同等のポリマーキャリヤーがまた使用され得るが、少なくとも５０個のアミノ酸残基のアミノデキストラン又はポリペプチドであり得る。好ましくは、最終免疫接合体は、投与の容易性及び治療への使用のためへの効果的標的化のために、水溶液、及び哺乳類血清に可溶性である。従って、キャリヤーポリマー上の安定化官能基は、最終免疫接合体の血清溶解を増強するであろう。
【０１８７】
ポリペプチド治療剤を含んで成る免疫接合体を生成するための他のアプローチにおいては、治療剤は、グルタアルデヒド縮合により、又はポリペプチド上の活性化されたカルボキシ基とアミノデキストラン上のアミンとの反応によりアミノデキストランに結合される。キレート化剤は、放射性金属又は磁気共鳴エンハンサーを含んで成る免疫接合を調製するために抗体成分に結合され得る。例示的キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸及びジエチレントリアミン五酢酸の誘導体を包含する。硼素付加物、例えばカルボランは従来の方法により抗体成分に結合され得る。
【０１８８】
免疫接合体はまた、治療剤と抗体成分とを直接的に接合することによって調製され得る。その一般的方法は、間接的接合方法に類似し、但し治療剤は酸化された抗体成分に直接的に結合されている。
【０１８９】
さらなる例示として、治療剤は、ジスルフィド結合形成を通して、還元された抗体分分のヒンジ領域で結合され得る。例えば、テタヌストキシンペプチドは、抗体成分にペプチドを結合するために使用される単一のシステイン残基により構成され得る。他の手段として、そのようなペプチドは、ヘテロ二官能価架橋剤、例えばＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオーネートを用いて、抗体成分に結合され得る。
【０１９０】
そのような接合についての一般的技法は、当業界において知られている。例えば、Ｗｏｎｇ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）； Ｕｐｅｓｌａｃｉｓなど．， “ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｒｃｈなど． （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ１８７−２３０ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）； Ｐｒｉｃｅ， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒなど．， （ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ ６０−８４ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） を参照のこと。
【０１９１】
上記のように、抗体のＦｃ領域における炭水化物成分は、治療剤を接合するために使用され得る。しかしながら、Ｆｃ領域は、抗体フラグメントが免疫接合体の抗体成分として使用され得る場合、不在である。それにもかかわらず、抗体又は抗体フラグメントのＬ鎖可変領域中に炭水化物成分を導入することが可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４： ５９１９ （１９９６）； Ｈａｎｓｅｎ など．， アメリカ特許第５，４４３，９５３号（１９９５）を参照のこと。次に、構築された炭水化物成分が、治療剤を結合するために使用される。
【０１９２】
さらに、当業者は、接合方法の多くの可能性ある変法を認識するであろう。例えば、炭水化物成分は、血液、リンパ又は他の細胞外流体における損なわれていない抗体又はその抗原−結合フラグメントの半減期を拡張するために、ポリエチレングリコールを結合するために使用され得る。さらに、炭水化物成分又は遊離スルフヒドリル基に治療剤を結合することによって、二価の免疫接合体を構成することが可能である。そのような遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置することができる。
【０１９３】
１つのタイプの免疫接合体は抗体成分及びポリペプチド細胞毒素を含んで成る。適切なポリペプチド細胞毒素の例は、リボソーム不活性化タンパク質である。Ｉ型リボソーム不活性化タンパク質は一本鎖タンパク質であり、そしてＩＩ型リボソーム不活性化タンパク質は、ジスルフィド結合により連結される非同一のサブユニット（Ａ及びＢ鎖）から成る（再考のためには、Ｓｏｒｉａなど．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎ． Ｔｈｅｒ． ７： １９３ （１９９２） を参照のこと）。
【０１９４】
有用なＩ型リボソーム不活性化タンパク質は、次のものを包含する：サポナリア・オフィシナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（例えば、サポリン−１、サポリン−２、サポリン−３、サポリン−６）、モモルジカ・カランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）（例えば、モモルジン）、ビロニア・ジオイカ（Ｂｙｒｏｎｉａ ｄｉｏｉｃａ）（例えば、ブリオジン、ブリオジン−２）、トリコサンテス・キリロウイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ）（例えば、トリコサンチン、トリコキリン）、ゲロニウム・ムルチフロラム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）（例えば、ゲロニン）、フィトロカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）（例えば、ヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質、アマゴボウ抗ウィルスタンパク質−ＩＩ、抗ウィルスタンパク質）、及び同様のものからのポリペプチド。リボソーム不活性化タンパク質は、例えばアメリカ特許５，６３５，３８６号（Ｗａｌｓｈなど．，）により記載される。
【０１９５】
適切なＩＩ型リボソーム不活性タンパク質は、リシナス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（例えば、リシン）、アブラス・プレカトリウム（Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）（例えば、アブリン）、アデニア・ディジタタ（Ａｄｅｎｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）（例えば、モデシン）、及び同様のものからのポリペプチドを包含する。ＩＩ型リボソーム不活性化タンパク質は、ガラクトシドを結合するＢ鎖、及びアデンソインを浄化する毒性Ａ鎖を包含するので、ＩＩ型リボソーム不活性化タンパク質接合体はＡ鎖を包含するべきである。
【０１９６】
追加の有用なリボソーム不活性化タンパク質は、ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、クラビン、トウモロコシリボソーム不活性化タンパク質、バカリア・ピラミダタ（Ｖａｃｃａｒｉａ ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）リボソーム不活性化タンパク質、ニグリンｂ， 塩基性ニグリン１、エブリン、ラセモシンｂ、ルフィン−ａ、ルフィン−ｂ、ルフィン−Ｓ及び当業者に知られている他のリボソーム不活性化タンパク質を包含する。例えば、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ ａｎｄ Ｓｔｒｉｐｅによる国際公開番号ＷＯ９８／５５６２３号、Ｃｏｌｎａｇｈｉなどによる国際出願番号ＷＯ９７／４９７２６号、Ｈｅｙなどによるアメリカ特許第５，６３５，３８４号、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ ａｎｄ Ｓｔｒｉｐｅによる国際公開番号ＷＯ９５／０７２９７号、Ａｒｉａｓなどによる国際公開番号ＷＯ９４／２０５４０号、Ｗａｔａｎａｂｅなど．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０６： ６９７７ （１９８９）； Ｉｓｌａｍ など．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ５５： ２２９ （１９９１）， 及びＧａｏなど．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４７： ２５７ （１９９４） を参照のこと。
【０１９７】
天然に存在するリボソーム不活性化タンパク質はまた、本明細書に記載される標的化組成物のためにも適切であり、そしてそのようなタンパク質は当業者に知られている。リボソーム不活性化タンパク質は、公的に入手できるアミノ酸及びヌクレオチド配列を用いて生成され得る。例示のように、サポリン−６をコードするヌクレオチド配列は、Ｌｏｒｅｎｚｅｔｔｉなど．， アメリカ特許第５，５２９，９３２号により開示され、そしてＷａｌｓｈなど．， アメリカ特許第５，６３５，３８４号は、トウモロコシ及び大麦リボソーム不活性化タンパク質ヌクレオチド及びアミノ酸配列を記載する。さらに、リボソーム不活性化タンパク質はまた市販されている。
【０１９８】
追加のポリペプチド細胞毒素は、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン及びシュードモナスエンドトキシンを包含する。例えば、Ｐａｓｔａｎなど．， Ｃｅｌｌ ４７： ６４１ （１９８６）， 及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ， ＣＡ Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ４４： ４３ （１９９４） を参照のこと。他の適切なトキシンは、当業者に知られている。
【０１９９】
もう１つの一般的なタイプの有用な細胞毒素は、チロシンキナーゼインヒビターである。チロシンキナーゼによる増殖の活性化は腫瘍の進行及び経過において役割を演じることが示されているので、この活性化は、チロシンキナーゼインヒビターを供給するｚｃｙｔｏｒ１９抗体成分により阻害され得る。適切なチロシンキナーゼインヒビターは、イソフラボン、例えばゲニステイン（５， ７， ４’−トリヒドロキシイソフラボン）、ダイゼン（７， ４’−ジヒドロキシイソフラボン）及びビオカニンＡ（４−メトキシゲニステイン）及び同様のものを包含する。成長因子にチロシンインヒビターを接合する方法は、例えばアメリカ特許第５，９１１，９９５号（Ｕｃｋｕｎ）により記載される。
【０２００】
もう１つのグループの有用なポリペプチド細胞毒素は、免疫モジュレーターを包含する。本明細書に使用される場合、“免疫モジュレーター”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時刺激分子、造血因子及び同様のもの、並びにそれらの分子の合成類似体を包含する。免疫モジュレーターの例は、壊死因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２〜ＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、−ω及び−τ）、“Ｓ１因子”と称する幹細胞成長因子、エリトロポエチン及びトロンボポエチンを包含する。例示的な免疫モジュレーター成分は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α及び同様のものを包含する。
【０２０１】
免疫モジュレーターを含む免疫接合体は、免疫モジュレーターを標的細胞に供給するための手段を提供し、そして腫瘍細胞に対して特に有用である。免疫モジュレーターの細胞毒性効果は、当業者に良く知られている。例えば、Ｋｌｅｇｅｒｍａｎなど、“Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｋｉｎｅｓ”， ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｐｅｓｓｕｔｏなど． （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ５３−７０ （Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ １９９３） を参照のこと。例示のように、インターフェロンは、種々の細胞の表面上でのクラスＩ組織適合性抗原の高められた発現を誘発することによって細胞増殖を阻害し、そして従って、細胞毒性Ｔリンパ球による細胞の破壊速度を増強する。さらに、腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子−αは、ＤＮＡ断片化を誘発することによって、細胞毒性効果を生成すると思われる。
【０２０２】
本発明はまた、細胞毒素をコードする核酸分子を含んで成る免疫接合体を包含する。このアプローチの例として、Ｈｏｇａｎｓｏｎなど．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９： ２５６５ （１９９８） は、サポリン遺伝子を含んで成る発現ベクターにより縮合されたＦＧＦ−２−ポリリシン接合体を生成することによって、サポリン遺伝子のＦＧＦ−２介在性供給を記載する。
【０２０３】
他の適切な毒素は、当業者に知られている。
細胞毒性ポリペプチド及び抗体成分の接合体は、ポリペプチドを接合するための標準の技法を用いて調製され得る。例えば、Ｌａｍ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｈｅｒ， アメリカ特許第５，０５５，２９１号は、ジフテリア毒素フラグメントＡ又はリシン毒素のいずれかにより接合される抗体の生成を記載する。一般的なアプローチはまた、Ｌａｐｐｉなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １６０： ９１７ （１９８９）， Ｓｏｒｉａ など．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎ． Ｔｈｅｒ． ７： １９３ （１９９２）， Ｂｕｅｃｈｌｅｒなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３４： ７０６ （１９９５）， Ｂｅｈａｒ−Ｃｏｈｅｎなど．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３６： ２４３４ （１９９５）， Ｌａｐｐｉ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ， アメリカ特許第５，１９１，０６７号、Ｃａｌａｂｒｅｓｉなど．，アメリカ特許第５，４７８，８０４号、及びＬａｐｐｉ ａｎｄ Ｂａｉｒｄ， アメリカ特許第５，５７６，２８８号により記載されるように、サポリンによる線維芽細胞成長因子の接合方法により例示される。
【０２０４】
また、Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｖｉｔｔｅｔａ， “Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ”， ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｆｒａｎｃｉｓ ａｎｄ Ｄｅｌｇａｄｏ （Ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ １−２６ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００）， Ｈａｌｌ （Ｅｄ．）， Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００）， 及びＮｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ｒｙｂａｋ， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ”， ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｆｒａｎｃｉｓ ａｎｄ Ｄｅｌｇａｄｅ （Ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ２７−３５ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００） を参照のこと。
【０２０５】
一方では、抗体成分及び細胞毒素ポリペプチドを含んで成る融合タンパク質は、標準の方法を用いて生成され得る。細胞毒素ポリペプチド成分を含んで成る融合タンパク質を調製するための方法は、抗体−毒素融合タンパク質生成の業界において良く知られている。例えば、インターロイキン−２成分を含んで成る抗体融合タンパク質は、Ｂｏｌｅｔｉなど．， Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ． ６： ９４５ （１９９５）， Ｎｉｃｏｌｅｔなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２： １６１ （１９９５）， Ｂｅｃｋｅｒなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： ７８２６ （１９９６）， Ｈａｎｋなど．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２： １９５１ （１９９６）， 及びＨｕなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： ４９９８ （１９９６） により記載されている。さらに、Ｙａｎｇなど．， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６： １２９ （１９９５） は、Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント及び腫瘍壊死因子−α成分を含む融合タンパク質を記載する。
【０２０６】
抗体−シュ−ドモナスエキソトキシンＡ融合タンパク質は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４（１９８９）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ８６１６ （１９９１）， Ｂａｔｒａなど．， ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ５８６７ （１９９２）， Ｆｒｉｅｄｍａｎなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０： ３０５４ （１９９３）， Ｗｅｌｓ など．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎ． ６０： １３７ （１９９５）， Ｆｏｍｉｎａｙａなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １０５６０ （１９９６）， Ｋｕａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５： ２８７２ （１９９６）， 及びＳｃｈｍｉｄｔなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎ． ６５： ５３８ （１９９６） により記載されている。ジフテリア毒素成分を含む抗体−毒素融合タンパク質は、Ｋｒｅｉｔｍａｎなど．， ｋｅｕｋｅｍｉａ ７： ５５３ （１９９３）， Ｍｉｃｈｏｌｌｓなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ５３０２ （１９９３）， Ｔｈｏｍｐｓｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２８０３８ （１９９５）， 及びＶａｌｌｅｒａなど．， Ｂｌｏｏｄ ８８： ２３４２ （１９９６） により記載されている。
【０２０７】
Ｄｅｏｎａｒａｉｎなど．， Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ １： １７７ （１９９５） はＲＮアーゼ成分を有する抗体−毒素融合タンパク質を記載しており、そしてＬｉｎａｒｄｏｕなど．， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４−２５： ２４３ （１９９４） は、ＤＮアーゼＩ成分を含んで成る抗体−毒素融合タンパク質を生成した。ゲロニンは、Ｂｅｔｔｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： １４９５１ （１９９５） の抗体−毒素融合タンパク質における毒素成分として使用された。さらなる例として、Ｄｏｈｌｓｔｅｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ８９４５ （１９９４） は、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａを含んで成る抗体−毒素融合タンパク質を報告している。また、Ｎｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ｒｙｂａｋ， “Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｒｎａｓｅ Ｓｉｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｆｒａｎｃｉｓ ａｎｄ Ｄｅｌｇａｄｏ （Ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ７７−９５ （Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００） を参照のこと。
【０２０８】
ポリペプチド細胞毒性に代わるものとして、免疫接合体は、細胞毒素成分として放射性同位体を含むことができる。例えば、免疫接合体は、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９成分及びα−放射性同位体、β−放射性同位体、γ−放射性同位体、Ａｕｇｅｒ電子エミッター、α−粒子を放射する中性子捕獲剤、及び電子保護により崩壊する放射性同位体を含むことができる。適切な放射性同位体は次のものを包含する：１９８Ａｕ， １９９Ａｕ， ３２Ｐ， ３３Ｐ， １２５Ｉ， １３１Ｉ， １２３Ｉ， ９０Ｙ， １８６Ｒｅ， １８８Ｒｅ， ６７Ｃｕ， ２１１Ａｔ， ４７Ｓｃ， １０３Ｐｂ， １０９Ｐｄ， ２１２Ｐｂ， ７１Ｇｅ， ７７Ａｓ， １０５Ｒｈ， １１３Ａｇ， １１９Ｓｂ， １２１Ｓｎ， １３１Ｃｓ， １４３Ｐｒ， １６１Ｔｂ， １７７Ｌｕ， １９１Ｏｓ， １９３ＭＰｔ， １９７Ｈｇ及び同様のもの。
【０２０９】
放射性同位体は、抗体成分に、キレート化剤を通して直接的に、又は間接的に接合され得る。例えば、β−粒子及びγ−線を供給する放射性同位体であると思われる６７Ｃｕは、キレート化剤、すなわちｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミノ四酢酸を用いて、抗体成分に接合され得る。（Ｃｈａｓｅ ａｎｄ Ｓｈａｐｉｒｏ， “Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ”， ｉｎ ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐ． ９４３−８６５ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９５））。他のものとして、エネルギッシュなβ−粒子を放射する９０Ｙはジエチレントリアミン五酢酸を用いて、抗体成分に結合され得る。さらに、１３１Ｉによる抗体成分の直接的な放射性ラベリングのための典型的な適切な方法は、Ｓｔｅｉｎなど．， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ． Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ． ４： ７０３ （１９９１） により記載される。他方では、硼素添加物、例えばカルボランが、標準技法を用いて、抗体成分に結合され得る。
【０２１０】
免疫接合体の調製のためのもう１つの型の適切な細胞毒素は、化学療法薬物である。例示的な化学療法薬物は、窒素マスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、及び同様のものを包含する。化学療法薬物の特定の例は、メトトレキサート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、シス−プラチン、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、メルファラン、クロラムブシル、マイタンシノイド、カリケアマイシン、タキサノール及び同様のものを包含する。適切な化学療法剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄ． （Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９９５）， 及びＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ７ｔｈ Ｅｄ． （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９８５） に記載される。他の適切な化学治療剤は、当業者に知られている。
【０２１１】
もう１つのアプローチにおいては、免疫接合体は、抗体成分に光活性剤又は色素を接合することにより調製される。蛍光及び他の色原体、又は例えば可視光に対して敏感なポルフィリンは、病変に対して適切な光を向けることによって、病変を検出し、そして処理するために使用されて来た。このタイプの“光放射線”、“光治療”又は“光力学”療法は、例えばＭｅｗなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３０； １４７３ （１９８３）， Ｊｏｒｉなど． （ｅｄｓ．）， Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ １９８５）， ｏｓｅｒｏｆｆなど．， ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ８７４４ （１９８６）， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ， Ｃｈｅｍ． Ｂｒｉｔａｉｎ ２２： ４３０ （１９８８）， Ｈａｓａｎなど．， ｐｒｏｇ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． ２８８： ４７１（１９８９）， Ｔａｔｓｕｔａなど．， Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ． Ｍｅｄ． ９： ４２２ （１９８９）， 及びＰｅｌｅｇｒｉｎなど．， Ｃａｎｃｅｒ ６７： ２５２９ （１９９１） により記載される。
【０２１２】
上記アプローチはまた、免疫接合体を含んで成る多特異的抗体組成物を調製するためにも使用され得る。
抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体及び多特異的抗体組成物は、内因性ｚｃｙｔｏｒ１９受容体によりｚｃｙｔｏｒ１９リガンドの結合を妨げることによって、免疫系を調節するために使用され得る。そのような抗体は、処理の必要ないずれかの対象に投与され、そして本発明は、家畜及びヒトの両者の治療使用を企画する。例示的対象は、哺乳類対象例えば、農業用動物、家畜動物及びヒト患者を包含する。
【０２１３】
ｚｃｙｔｏｒ１９を結合する多特異的抗体組成物及び二重反応性抗体は、自己免疫疾患、Ｂ細胞癌、免疫調節、及び他の病理学（例えば、ＩＴＣＰ、Ｔ細胞−介在性疾病、ｃａｔｔｌｅｍａｎ’ｓ病、自己免疫疾患、脊髄形成異常症候群及び同様のもの）、腎疾患、移植片拒絶及び対宿主性移植片病の処理のために使用され得る。本発明の抗体は、免疫応答の間、Ｂ細胞応答を特異的に調節するよう標的化され得る。さらに、本発明の抗体は、Ｂ細胞増殖、Ｂ細胞による抗原提供、抗体生成及びサイトカイン生成を調節するために使用され得る。
【０２１４】
拮抗性抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、Ｂ細胞リンパ種及び白血病、慢性又は急性リンパ性白血病、骨髄腫、例えば多発性骨髄腫、血漿細胞腫及びリンパ腫、例えば非−Ｈｏｄｇｋｉｎｓリンパ腫（ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドポリペプチドの上昇が関連するか、又はｚｃｙｔｏｒ１９リガンドが生存因子又は成長因子である）を処理するためにｚｃｙｔｏｒ１９リガンドの効果を中和するために有用であり得る。抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体はまた、免疫無防備状態の患者（例えば、ＡＩＤＳ又は器官移植）において発生するＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス関連リンパ腫を処理するためにも使用され得る。
【０２１５】
ｚｃｙｔｏｒ１９と結合することによってシグナルを誘発する抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、増殖阻害、細胞周期の阻止、アポプトシス又は腫瘍細胞死を導くシグナルの誘発を通して直接的に、リンパ腫及び白血病細胞の増殖を阻害することができる。シグナルを開始するｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、癌細胞を直接的に阻害するか又は殺害するための好ましい抗体である。さらに、拮抗性抗−ｚｃｙｔｏｒ１９モノクローナル抗体は、正常Ｂ細胞を活性化し、そして抗癌免疫応答を促進することができる。抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、白血病、リンパ腫、及び多発生骨髄腫の増殖を直接的に阻害することができ、そしてその抗体は免疫エフェクター機能を誘発することができる。抗−ｚｃｙｔｏｒ１９モノクローナル抗体は、抗体−依存性細胞毒性、補体−依存性細胞毒性及びファゴサイトーシスを可能にすることができる。
【０２１６】
ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドは、好中球、単球、樹状突起細胞及び活性化された単球において発現され得る。自己免疫疾患（例えば、重症筋無力症及びリウマチ様関節炎）においては、Ｂ細胞は、ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドによる活性化の後、自己免疫性を悪化する。Ｂ−リンパ球の作用を選択的に阻止する免疫抑制タンパク質は、疾病の処理に使用される。自己抗体生成は、いく種かの自己免疫疾患に共通し、そして組織破壊及び疾病の悪化に寄与する。自己抗体はまた、免疫複合体付着合併症の発生を導くことができ、そして全身性エリテマトーデスの多くの症状、例えば腎不全，神経痛症状及び死を導く。
【０２１７】
細胞応答に無関係な抗体生成の調節はまた、多くの疾病状態において有益である。Ｂ細胞はまた、リウマチ様関節炎における関節炎原性免疫グロブリンの分泌において役割を演じることが示されている。ｚｃｙｔｏｒ１９リガンド抗体生成の阻害は、自己免疫疾患、例えば重症性筋無力症及びリウマチ様関節炎の処理において有益である。免疫抑制治療剤、例えばＢ−リンパ球の作用を選択的に阻止するか、又は中和する抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、そのような目的のために有用である。
【０２１８】
本発明は、自己免疫患者に関するか又は関連しない、最終段階の腎疾患に関するＢ細胞の作用を選択的に阻止するか又は中和するための抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は多特異的抗体組成物の使用方法を提供する。そのような方法はまた、免疫学的な腎疾患を処理するためにも有用である。そのような方法は、疾病、例えば膜ネフロパシー、ＩｇＡネフロパシー又はＢｅｒｇｅｒ’ｓ病、ＩｇＭネフロパシー、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ’ｓ病、後−感染症糸球体腎炎、糸球体間質増殖、慢性リンパ性白血病、微少変化ネフローゼ症候群に関連する糸球体腎炎の処理のために有用である。そのような方法はまた、狼瘡、多発生関節炎、Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ、硬皮症、ＨＩＶ−関連疾病、アミロイド症又は溶血性尿毒症症候群を処理するための治療用途として作用する。本発明の方法はまた、慢性腎盂炎に関する間質腎炎又は腎盂炎、鎮痛薬乱用、腎石灰、他の剤により引き起こされるネフロパシー、腎石症、又は慢性又は急性間質性腎炎を処理するための治療用途の一部として有用である。
【０２１９】
本発明はまた、腎又は泌尿器性新生物、多発生骨髄腫、リンパ腫、白血病、Ｌ鎖ニューロパシー、又はアミロイド症の処理方法も提供する。
本発明はまた、ぜん息及び他の慢性気道疾患、例えば気管支炎及び気腫の処理のために、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は多特異的抗体組成物を用いて、活性化されたＢ細胞を阻止するか又は阻害するための方法を提供する。
【０２２０】
免疫抑制、特に対宿主性移植片病及び移植片拒絶に関してのそのような治療使用のために、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は多特異的抗体組成物を用いて、Ｔ細胞応答を阻害するか又は中和するための方法がまた提供される。さらに、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は多特異的抗体組成物は、自己免疫疾患、例えばインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発生硬化症、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及びクローン病の処理のための治療プロトコールにおいて有用である。本発明の方法は、炎症性疾患を処理するために、特に関節痛、腫脹、貧血及び他の関連する症状を緩和するために、及び敗血性ショックを処理するために追加の治療価値を有する。
【０２２１】
Ｂ細胞応答は、感染性疾病、例えば細菌、ウィルス、原生動物及び寄生虫感染の攻撃において重要である。感染性微生物に対する抗体は、抗原への結合により、続いて補体介在性溶菌又は細胞介在性攻撃により病原体を固定することができる。拮抗性又はシグナル化抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、体液性応答を高めるように作用し、そして感染疾病の危険性での個人のための有用な治療剤であり、又はワクチン接種のためのサプリメントとして有用である。
【０２２２】
十分に確立された動物モデルが、一定の疾病状態における本発明の抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は多特異的抗体組成物のインビボ効能を試験するために入手できる。例示のように、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、多くの自己免疫疾患の動物モデル、例えばＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）のモデルとして作用するＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ又はＮＺＢ×ＮＺＷ Ｆ１コンジェニックマウス株において試験され得る。そのような動物は、当業界において知られている。
【０２２３】
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｂｌａｃｋ （ＮＺＢ） マウスとＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ （ＮＺＷ） マウスとの間の交雑の子孫が、ヒトにおけるＳＬＥに密接に類似するＳＬＥの自発形を成長せしめる。ＮＺＢＷとして知られているそれらの子孫マウスは、生後１ヶ月でＴ−細胞に対してＩｇＭ自己抗体を成長し始め、そして生後５〜７ヶ月までに、Ｉｇ抗−ＤＮＡ自己抗体は優性免疫グロブリンである。ポリクローナルＢ−細胞過活性は、自己抗体の過生成を導く。それらの自己抗体、特に一本鎖のＤＮＡに対して向けられたそれらの抗体の沈着は、タンパク尿、窒素血症及び腎不全からの死亡として臨床学的に明白である糸球体腎炎の進行に関連している。
【０２２４】
腎不全は、自発性ＳＬＥにより影響されるマウスにおいて死の腫瘍原因であり、そしてＮＺＢＷ株においては、この工程は慢性及び閉塞性である。前記疾病は雄よりも雌においてより急速且つ重症であり、そして平均生存日は雄の４０６日に比較して、雌はわずか２４５日である。雌マウスの多くは、生後７〜９ヶ月まで症候性（タンパク尿性）であるが、それらの何匹かは、それらが徴候を進行する場合、より若いか又は年をとっている。ＮＺＢＷマウスに見られる致命的な腎炎は、ヒトＳＬＥにおいて見られる糸球体腎炎に非常に類似し、この自発的ネズミモデルを、可能性あるＳＬＥ治療の試験のために非常に魅力的にする。
【０２２５】
実験用アレルギー性脳脊髄炎についてのネズミモデルが、免疫介在性疾病の機構、及び可能性ある治療介入方法の両者を調べるための手段として使用されて来た。このモデルはヒト多発性硬化症に類似し、そして神経タンパク質、例えばミエリン基本タンパク質又はタンパク脂質タンパク質へのＴ−細胞活性化の結果として脱髄を生成する。抗原による接種は、ＣＤ４＋、クラスＩＩ ＭＨＣ−制限されたＴ−細胞（Ｔｈ１）の誘発を導く。実験用アレルギー性脳脊髄炎についてのプロトコールの変化は、モデルの急性、慢性−再発性又は受動性−トランスファー変異体を生成することができる。
【０２２６】
コラーゲン−誘発された関節炎モデルにおいては、マウスは、ヒトリウマチ様関節炎に密接に類似する慢性炎症性関節炎を進行する。コラーゲン−誘発された関節炎はリウマチ様関節炎と、免疫学的及び病理学的特徴を共有するので、これは、可溶性あるヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための理想的モデルにする。コラーゲン−誘発された関節炎モデルを用いることのもう１つの利点は、病因の機構が知られていることである。ＩＩ型コラーゲン上のＴ及びＢ細胞エピトープは同定されており、そして免疫−介在性関節炎に関連する、種々の免疫学的（遅延された型の過毎性及び抗−コラーゲン抗体）及び炎症性（サイトカイン、ケモカイン及びマトリックス−分解性酵素）パラメーターは決定されており、そしてモデルにおける試験化合物効能を評価するために使用され得る。
【０２２７】
重症筋無力症は、ネズミモデルが利用できるもう１つの自己免疫疾患である。重症筋無力症は、ニコチン様アセチルコリン受容体に対して向けられた自己抗体の生成を包含する、神経筋肉伝達の障害である。重症筋無力症は、運動に対する異常な虚弱及び疲労を包含する臨床学的特徴を獲得するか、又は受け継がれる。重症筋無力症のマウスモデルは確立されている。実験の自己免疫重症筋無力症は、アセチルコリン受容体に対する抗体の存在により特徴づけられる抗体介在性疾病である。
【０２２８】
それらの抗体は、筋肉の虚弱さをもたらす、欠陥性神経筋肉電気的衝撃を導く受容体を破壊する。実験の自己免疫重症筋無力症モデルにおいては、マウスがニコチン様アセチルコリン受容体により免疫化される。重傷筋肉無力症の臨床学的徴候は、二次免疫化の後、数週で明らかになる。実験の自己免疫重症筋無力症は、ラジオイムノアッセイによるアセチルコリン受容体抗体の血清レベルの測定、筋肉アセチルコリン受容体の測定を包含するいくつかの方法、又は筋電図検査により評価される。
【０２２９】
一般的に、投与される抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は多特異的抗体組成物の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。例示のように、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は多特異的抗体組成物は、１度に、又は反復して、低いタンパク質用量、例えば用量当たり２０〜１００ｍｇのタンパク質で投与され得る。他方では、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は多特異的抗体組成物は、用量当たり３０〜９０ｍｇのタンパク質、又は用量当たり４０〜８０ｍｇのタンパク質、又は用量当たり５０〜７０ｍｇのタンパク質の用量で投与され得るが、但しそれよりも低いか又は高い容量が環境に応じて投与され得る。
【０２３０】
抗体成分の対象への投与は、局部カテーテルを通しての灌流によるか又は直接的な病変内注入による、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内投与であり得る。注射により治療用タンパク質を投与する場合、投与は連続的注入によるか、又は一回又は複数回のボーラスによることができる。投与の追加経路は、経口、粘膜、肺及び経皮を包含する。
【０２３１】
抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はニ特異的抗体成分を含んで成る医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って配合され得、それによれば、治療用タンパク質が医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。組成物は、その投与が受容体患者により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。無菌リン酸緩衝溶液は、医薬的に許容できるキャリヤーの１つの例である。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９５） を参照のこと。
【０２３２】
治療のためには、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はニ特異的抗体成分及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的に有効な量で患者に投与される。抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はニ特異的抗体成分、及び医薬的に許容できキャリヤーの組み合わせは、  その投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的に有効な量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体患者の生理学において検出される変化をもたらす場合、生理学的に有意である。例えば、炎症を処理するために使用される剤は、その存在が炎症応答を緩和する場合、生理学的に有意である。もう１つの例として、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用される剤は、その剤の投与が腫瘍細胞の数の低下、低められた転位、固形腫瘍のサイズの低下、又は腫瘍の高められた壊死をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０２３３】
抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はニ特異的抗体成分を含んで成る医薬組成物は、液体形、エーロゾル、又は固体形で維持され得る。液体形は、注射用溶液及び経口懸濁液により例示される。典型的な固体形は、カプセル、錠剤及び調節された開放形を包含する。後者の形は、ミニ浸透ポンプ及び移植体により例示される（Ｂｒｅｍｅｒ など．， Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：２３９ （１９９７）： Ｒａｎａｄｅ． “Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒａｎａｄｅ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ９５−１２３ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９５）； Ｂｒｅｍｅｒ など．， “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｐｕｍ−ｓ，” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ （ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ ２３９−２５４ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９７）； Ｙｅｗｅｙ など．， “Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｉｍｐｌａｎｔ，” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ （ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ ９３−１１７ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９７））。
【０２３４】
当業者は標準技法を用いて種々の医薬組成物を考案することができる。例えば次の文献を参照のこと：Ｌｉｅｂｅｒｍａｎなど．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｖｏｌ． １， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９８９）， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ など．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ； Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｖｏｌ． ２， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９９０）， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ など．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｖｏｌ． ３， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９９０）， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ など．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ： Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｖｏｌ． １， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ など．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｖｏｌ． ２， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ など．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｖｏｌ． ３， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９９８）， Ａｖｉｓ など．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ． １， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９９１）， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ など．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ． ２， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９９２）， ａｎｄ Ａｖｉｓ など．， （Ｅｄｓ．）， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｐａｒｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ． ３， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９９３）。
【０２３５】
もう１つの例として、リポソームは、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はニ特異的抗体成分を、患者に、静脈内、腹膜内、鞘内、筋肉内、皮下、又は経口、吸入又は鼻腔内供給するための１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り組む１又は複数の脂質二層から成る微小ビークルである（一般的には、Ｂａｋｋｅｒ Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇ など．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １２ （Ｓｕｐｐｌ． １）： Ｓ６１ （１９９３）， Ｋｉｍ Ｄｒｕｇｓ ４６：６１８ （１９９３）， ａｎｄ Ｒａｎａｄｅ， “Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ，” ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒａｎａｄｅ ａｎｄ組生Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ３−２４ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照のこと）。
【０２３６】
リポソームは、組成において細胞膜に類似し、そして結果として、リポソームは安全に投与され、そして生分解性である。調製方法に依存して、リポソームは、単層又は多層性であり得、そしてリポソームは０．０２μｍ〜１０μｍ以上の範囲の直径でサイズ的に変化することができる。種々の剤がリポソームに封入され得る：疎水性剤は二層に分割され、そして親水性剤は内部水性空間内に封入される（例えば、Ｍａｃｋｙ など．， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ １９８７）， 及びＯｓｔｒｏなど．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ． Ｈｏｓｐ． Ｐｈａｒｍ． ４６： １５７６ （１９８９） を参照のこと）。さらに、リポソームサイズ、二層の数、脂質組成、及びリポソームの電荷及び表面性質を変えることにより、封入される剤の治療利用性を調節することが可能である。
【０２３７】
リポソームは、実質的にいずれかのタイプの細胞に吸着することができ、そして次に、封入された剤をゆっくりと開放する。他方では、吸収されたリポソームは、食細胞性である細胞によりエンドサイト−シス化され得る。エンドサイト−シスに続いて、リポソーム脂質のリソソーム内分解が伴ない、そして封入された剤が開放される（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ など．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ４４６： ３６８ （１９８５））。静脈内投与の後、小さなリポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、典型的には、肝臓及び脾臓に主として位置する網内細胞系の細胞により摂取されるが、ところが３．０μｍよりも大きなリポソームは肺に沈着される。網内細胞系の細胞による小さなリポソームのこの好ましい摂取は、マクロファージ及び肝臓の腫瘍に化学治療剤を供給するために使用されて来た。
【０２３８】
網内細胞系は、いくつかの方法、例えば多量のリポソーム粒子による飽和、又は薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化により回避され得る（Ｃｌａａｓｓｅｎなど．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８０２： ４２８ （１９８４））。さらに、リポソーム膜中への糖脂質−又はポリエチレングリコール−誘導されたリン脂質の組み込みは、網内細胞系による有意に低められた摂取をもたらすことが示されている（Ａｌｌｅｎ など．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０６８：１３３ （１９９１）； Ａｌｌｅｎ など．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１５０： ９ （１９９３））。
【０２３９】
抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体成分を含んで成るリポソームを投与する他の手段として、標的細胞は、標的細胞により発現されるリガンドに対して特異的な、ビオチニル化された抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体によりプレラベルされる。遊離抗体の血漿排除の後、ストレプタビジン−接合されたリポソームが投与される。この一般的なアプローチは、例えばＨａｒａｓｙｍなど．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ３２： ９９ （１９９８）により記載される。そのようなアプローチはまた、多特異的抗体組成物を調製するために使用され得る。
【０２４０】
抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は二特異的抗体成分を含んで成るポリペプチドは、タンパク質のマイクロカプセル封入の標準技法を用いて、リポソーム内に封入され得るか、又はリポソームの外部に結合され得る（例えばＡｎｄｅｒｓｏｎなど．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ３１： １０９９ （１９８１）， Ｗａｓｓｅｆ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １４９： １２４ （１９８７）、Ａｎｄｅｒｓｏｎなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０： １８５３ （１９９０）， Ｃｏｂｅｎなど．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０６３：９５ （１９９１）， Ａｌｖｉｎｇ など．， “Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． ＩＩＩ， Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ （ｅｄ．）， ｐａｇｅ ３１７ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９３）， 及びＡｎｓｅｌｌなど．， “Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”， ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｆｒａｎｃｉｓ ａｎｄ Ｄｅｌｇａｄｏ（Ｅｄ．）， ｐａｇｅ５１−６８ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００を参照のこと）。上記に示されるように、治療的に有用なリポソームは、種々の成分を含むことができる。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含むことができる（Ａｌｌｅｎなど．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１５０： ９ （１９９３））。
【０２４１】
分解性ポリマー微小球が、治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するため企画された。微小球は、分解性ポリマー、例えばポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、モノ生分解性エチルビニルアセテートポリマー（タンパク質がポリマー封入される）から調製されるＧｏｍｂｏｔｚ ａｎｄ Ｐｅｔｔｉｔ， Ｂｉｏｃｏｎｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６：３３２ （１９９５）； Ｒａｎａｄｅ， “Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．” Ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒａｎａｄｅ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ５１−９３ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９５）； Ｒｏｓｋｏｓ ａｎｄ Ｍａｓｋｉｅｗｉｃｚ， “Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｅｎ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ４５−９２ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９７）； Ｂａｒｔｕｓ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１１６１ （１９９８）； Ｐｕｔｎｅｙ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１５３ （１９９８）； Ｐｕｔｎｅｙ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：５４８ （１９９８））。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆された超微小球はまた、治療用タンパク質の静脈内投与のためのキャリヤーを提供することができる（例えば、Ｇｒｅｆなど．， Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１６７ （１９９７） を参照のこと）。
【０２４２】
本発明はまた抗体成分がポリマーにより連結される、化学的に修飾された抗体成分を企画する。典型的には、前記ポリマーは、抗体成分が水性環境、例えば生理学的環境において沈殿しないよう水溶性である。適切なポリマーの例は、単一の反応基、例えばアシル化のための活性エステル、又はアルキル化のためのアルデヒドを有する修飾されている１つのポリマーである。この場合、重合化の程度は調節され得る。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はモノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、又はそれらのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓなど．， アメリカ特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは枝分かれ鎖であっても、又は枝分かれ鎖でなくても良い。さらに、ポリマーの混合物が抗体成分を生成するために使用され得る。
【０２４３】
適切な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＥＧ、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物基材のポリマーを包含する。適切なＰＥＧは、約６００〜約６０，０００、例えば５，０００、１２，０００及び２５，０００の分子量を有することができる。抗体成分はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物も含むことができる。
【０２４４】
例示のように、酸化ポリアルキル成分は、抗体成分のＮ−末端に結合される。ＰＥＧは、１つの適切な酸化ポリアルキルである。例示として、抗体成分は、ＰＥＧ、すなわち“ＰＥＧ化”として知られている方法により修飾され得る。抗体成分のＰＥＧ化は、当業界において知られているＰＥＧ化反応のいずれかにより行われ得る（例えば、ヨーロッパ特許第０１５４３１６号、Ｄｅｌｇａｄｏなど．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９： ２４９ （１９９２）， Ｄｕｎｃａｎ ａｎｄ Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２７： ２９０ （１９９４） 及びＦｒａｎｃｉｓ など．， Ｉｎｔ， Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ６８： １ （１９９８） を参照のこと）。例えば、ＰＥＧ化は反応性ポリエチレングリコール分子によるアシル化反応又はアルキル化反応により行われ得る。他のアプローチにおいては、抗体成分接合体は、ＰＥＧの末端ヒドロキシ又はアミノ基が活性化されたリンカーにより置換されている活性化されたＰＥＧを縮合することによって形成される（例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚなど．， アメリカ特許第５，３８２，６５７号を参照のこと）。
【０２４５】
アシル化によるＰＥＧ化は典型的には、抗体成分とＰＥＧの活性エステル誘導体との反応を必要とする。活性化されたＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたＰＥＧである。本明細書において使用される場合、用語“アシル化”とは、抗体成分と水溶性ポリマー間のタイプの結合を包含する：アミド、カルバメート、ウレタン及び同様のもの。アシル化によるＰＥＧ化されたＺｔｎｆｒ１２の調製方法は、典型的には、（ａ）抗体成分とＰＥＧ（例えば、ＰＥＧのアルデヒド誘導体の反応性エステル）とを、１又は複数のＰＥＧ基が抗体成分に結合する条件下で反応せしめ、そして（ｂ）その反応生成物を得る段階を含んで成る。一般的に、アシル化反応のための最適な反応条件は、既知のパラメーター及び所望する結果に基づいて決定されるであろう。例えば、ＰＥＧ：抗体成分の比が高いほど、ポリＰＥＧ化された抗体成分生成物の％が高くなる。
【０２４６】
アシル化によるＰＥＧ化の生成物は典型的には、リシンε−アミノ基がアシル結合を通してＰＥＧ化されるポリＰＥＧ化された抗体成分生成物である。典型的には、その得られる抗体成分は、少なくとも９５％、モノ−、ジ−又はトリ−ペルギレートされるが、但し高い程度のＰＥＧ化を有するいくつかの種は、その反応条件に依存して形成され得る。ＰＥＧ化された種は、標準の精製方法、例えば透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及び同様のものを用いて、接合されていない抗体成分から分離され得る。
【０２４７】
アルキル化によるＰＥＧ化は一般的に、還元剤の存在下で抗体成分と、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体との反応を包含する。ＰＥＧ基は好ましくは、−ＣＨ２−ＮＨ基を通してポリペプチドに結合される。
【０２４８】
モノＰＥＧ化された生成物を生成するためへの還元性アルキル化を通しての誘導体化は、誘導体化のために利用できる異なったタイプの第１アミノ基の示差反応性を利用する。典型的には、前記反応は、リシン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ−末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａ差異の利用を可能にするｐＨで行われる。そのような選択的誘導体化により、反応性基、例えばアルデヒドを含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が調節される。ポリマーとの接合は、他の反応性基、例えばリシン側鎖アミノ基の有意な修飾を伴なわないで、タンパク質のＮ−末端で優先的に生じる。
【０２４９】
モノポリマー抗体成分接合体分子の実質的に均質な集団を生成するための還元性アルキル化は、（ａ）抗体成分のアミノ末端でのα−アミノ基選択的修飾を可能にするために適切なｐＨでの還元性アルキル化条件下で反応性ＰＥＧとン抗体成分とを反応せしめ、そして（ｂ）反応生成物を得る段階を含んで成る。還元性アルキル化のために使用される還元剤は、水溶液において安定性であり、そして好ましくは、還元性アルキル化の初期工程において形成されるＳｃｈｉｆｆ塩基のみを還元できるべきである。好ましくは還元剤は、硼水素化ナトリウム、シアノ硼水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン及びビリジンボランを包含する。
【０２５０】
モノポリマー抗体成分接合体の実質的に均質な集団に関しては、還元性アルキル化反応条件は、抗体成分のＮ−末端への水溶性ポリマーの成分の結合を可能にするそれらの条件である。そのような反応条件に、Ｎ−末端でのα−アミノ基とリシンアミノ基との間のｐＫａ差異を提供する。ｐＨはまた、使用されるポリマー：タンパク質の比にも影響を及ぼす。一般的に、ｐＨが低い場合、タンパク質よりも過剰量のポリマーが、Ｎ−末端α−基が反応性であるほど、より多くのポリマーが最適な条件を達成するために、必要とされるので、所望される。ｐＨが高い場合、ポリマー：抗体成分は、より多くの反応性基が利用できるので、高くある必要はない。典型的には、ｐＨは、３〜９又は３〜６の範囲内であろう。
【０２５１】
ポリペプチド細胞毒素はまた、抗体成分への接合の前又は後、上記方法を用いて、適切なポリマーにより接合され得る。可溶性ポリマーはまた、抗体融合タンパク質により接合され得る。
【０２５２】
裸抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は抗体フラグメントは、免疫接合体又は抗体融合タンパク質投与により補充され得る。１つの変法においては、裸抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体（又は裸抗体フラグメント）は、低用量の放射性ラベルされた抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は抗体フラグメントと共に投与される。第２の変法として、裸抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体（又は抗体フラグメント）は、低用量の放射性ラベルされた抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体−サイトカイン免疫接合体と共に投与される。第３の変法として、裸抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体（又は抗体フラグメント）は、放射性ラベルされていない抗−ｚｃｙｔｏｒ１９−サイトカイン免疫接合体と共に投与される。“低用量”の１３１Ｉ−ラベルされた免疫接合体に関しては、好ましい用量は、１５〜４０ｍＣｉであり、そして最も好ましい範囲は２０〜３０ｍＣｉである。対照的に、好ましい用量の９０Ｙ−ラベルされた免疫接合体は１０〜３０ｍＣｉであり、そして最も好ましい範囲は１０〜２０ｍＣｉである。同様に、二特異的抗体成分は、免疫接合体又は抗体融合タンパク質投与により補充される。
【０２５３】
熱中性子活性化治療のための硼素添加された−負荷キャリヤーを有する免疫接合体は通常、類似する手段でもたらされるであろう。しかしながら、中性子照射が行われる前、標的化されていない免疫接合体がクリアランスになるまで待つことが好都合である。クリアランスは、免疫接合体に結合する抗体を用いて促進され得る。この一般的原理の記載については、アメリカ特許第４，６２４，８４６号を参照のこと。
【０２５４】
本発明はまた、免疫モジュレーターが、正常細胞及び特に造血細胞の放射線−誘発された、又は薬剤−誘発された毒性を妨げるか、移動せしめるか又は逆転するために投与される処理方法にも関する。付加的免疫モジュレーター療法は、受容体哺乳類の高められた耐性のために、より高い用量の細胞毒性剤の投与を可能にする。さらに、付加的免疫モジュレーター療法は、用量制限の骨髄毒性を妨げるか、軽減するか又は逆転することができる。付加的療法のための適切な免疫モジュレーターの例は、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、トロンボポイエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−１２及び同様のものを包含する。付加的免疫モジュレーター治療方法は、アメリカ特許第５，１２０，５２５号（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）により開示される。
【０２５５】
抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体療法の効能は、本明細書に記載される免疫接合体及び他の形の補充療法により裸抗体成分を補充することによって増強され得る。そのような多様レジメにおいては、補充治療組成物は、裸抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体の投与の前、それと同様に又はその後、投与され得る。本発明の多様性療法はさらに、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９免疫接合体の投与により補充される補抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体成分による免疫治療を包含する。もう１つの形の多様性治療においては、対象は、裸抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体及び標準の癌化学療法を受ける。
【０２５６】
本明細書に記載される、抗体、免疫接合体及び抗体融合タンパク質はまた、好都合には、第２のシステインに富んでいる領域とトランスメンブランドメインとの間に存在する、ＴＡＣＩ受容体のいわゆる“軸領域（ｓｔａｌｋ ｒｅｇｉｏｎ）”を結合する抗体成分（例えば、裸抗体、裸抗体フラグメント、免疫接合体、抗体融合タンパク質、等）により補充され得る。研究によれば、ＴＡＣＩタンパク質はある程度まで、細胞により分解され、そして分離され、細胞表面上に小さな細胞外ペプチド又は軸が残される。
【０２５７】
ネズミモノクローナル抗体は、リンパ腫ネズミモデルにおいて治療的に有用であることが見出された。エピトープマッピングは、抗体が、配列番号４のアミノ酸残基１１０−１１８により表されるＴＡＣＩ細胞外ドメインのフラグメントと結合することを示す。抗体は、第２のシステインに富んでいるドメインとトランスメンブランドメインとの間の領域を表すポリペプチド（配列番号４のアミノ酸残基１０５−１１６）、又はそのフラグメント（配列番号４のアミノ酸残基１１０−１１８）に対して生成され得る。そのような抗体は、ＴＡＣＩ−担持の腫瘍細胞、例えばＢ−リンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び同様のものの処理のために特に有用である。
【０２５８】
本発明の抗体及び抗体フラグメントは、上記の種々の障害及び疾病を処理するためにワクチンとして使用され得る。例として、二重反応性ＴＡＣＩ／ＢＣＭＡモノクローナル抗体の抗体成分は、ワクチンのための適切な基材を提供することができる。ｚｃｙｔｏｒ１９受容体のシステインに富んでいる領域はまた、ワクチンのための有用な成分を提供することができる。例えば、ワクチンは、次のポリペプチドの少なくとも１つを含んで成る：配列番号２のアミノ酸残基８−４１を含んで成るポリペプチド、配列番号４のアミノ酸残基３４−６６を含んで成るポリペプチド、及び配列番号４のアミノ酸残基７１−１０４を含んで成るポリペプチド。
【０２５９】
ワクチンとしての抗体成分の効能は、免疫原性キャリヤータンパク質に抗体成分を接合することによって増強され得る。適切なキャリヤータンパク質は、破傷風毒素／トキソイド、ＮＴＨｉ高分子量タンパク質、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒されたＰ．アエルギノサ毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、クロストリジウム・ペルフリゲンス外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コアー抗原、ロタウィルスＶＰ７タンパク質、呼吸シンシチウムウィルスＦ及びＧタンパク質、及び同様のものを包含する。接合されたワクチンを調製するための方法は、当業者に知られている。
【０２６０】
例えば、Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ （Ｓ． Ｋａｒｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ １９８９）， Ｏ’Ｈａｇａｎ （Ｅｄ．）， Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． ２０００） を参照のこと。ワクチン組成物はまた、アジュバントを含むことができる。適切なアジュバントの例は、水酸化アルミニウム及び脂質を包含する。ワクチン組成物を生成する方法は、当業者に良く知られている。例えば、Ｒｏｌａ， “Ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｋｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ”， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｅｎｎａｒｏ （Ｅｄ．）， ｐａｇｅ １４１７−１４３３ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９５） を参照のこと。
【０２６１】
医薬組成物は、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体成分又は二特異的抗体成分を含んで成る容器を含んで成るキットとして供給され得る。治療分子は、単一又は複数回用量のための注射用溶液の形で、又は注射の前、再構成される無菌粉末として提供され得る。他方では、そのようなキットは、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体成分の投与のための乾燥−粉末分散器、液体エアロゾル発生器又はネブライザーを包含することができる。そのようなキットはさらに、医薬組成物の表示及び使用法についての文章情報を含んで成る。さらに、そのような情報は、前記組成物が外因性抗体に対して既知の過敏性を有する患者において禁忌を示される言明を包含することができる。
【０２６２】
ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９受容体はまた、循環レベルのリガンドの検出のための診断システムン使用され得る。関連する態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体又は他の剤が、循環性受容体ポリペプチドを検出するために使用され得る。高められたレベルか又は低められたレベルのリガンド又は受容体ポリペプチドは、病理学的状態、例えば癌の表示であり得る。
【０２６３】
そのような受容体ポリペプチドは、病理学的工程に寄与し、そして基礎をなす疫病の間接的マーカーであり得る。例えば、ヒト血清における高められたレベルの可溶性ＩＬ−２は、広範囲の炎症及び腫瘍性状態、例えば心筋梗塞、ぜん息、重症筋無力症、リウマチ様関節炎、急性Ｔ−細胞白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、結腸癌、乳癌及び卵巣癌に関連している（Ｈｅａｎｅｙなど．， Ｂｌｏｏｄ８７：８４７−８５７，１９９６）。同様に、ｚｃｙｔｏｒ１９は、Ｂ−細胞白血病細胞において発現され、そしてｚｃｙｔｏｒ１９発現の上昇は、根本的な疾病、例えば白血病のマーカーとして作用することができる。
【０２６４】
ｚｃｙｔｏｒ１９受容体又は“可溶性受容体”のリガンド−結合ポリペプチドは、細胞外サイトカイン結合ドメイン（配列番号１９の残基２１（Ａｒｇ）〜２２６（Ａｓｎ）、サイトカイン結合フラグメント（例えば、配列番号２又は１９の残基２１（Ａｒｇ）〜２２３（Ｐｒｏ）；配列番号４）、ｚｃｙｔｏｒ１９の可溶性バージョン、又は非ヒト受容体のその対応する領域をコードする切断されたＤＮＡを発現することによって調製され得る。好ましくは、細胞外ドメインは、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さない形で調製され得る。
【０２６５】
さらに、上記ｚｃｙｔｏｒ１９サイトカイン結合ドメイン内のリガンド−結合ポリペプチドフラグメントはまた、本明細書に記載される使用のためのｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体として作用することができる。宿主細胞化らの受容体ポリペプチドの輸送を方向づけるためには、受容体ＤＮＡは、分泌ペプチド、例えばｔ−ＰＡ分泌ペプチド又はｚｃｙｔｏｒ１９分泌ペプチドをコードする第２ＤＮＡセグメントに結合される。分泌された受容体ポリペプチドの精製を促進するためには、Ｃ−末端延長、例えばポリ−ヒスチジン標識、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識ペプチド、物質Ｐ， ＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４−１２１０， １９８８； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴから入手できる）、又は抗体又は他の特定の結合剤が利用できるもう１つのポリペプチド又はタンパク質が、受容体ポリペプチドに融合され得る。
【０２６６】
もう１つのアプローチにおいては、受容体細胞外ドメインは、２種の不変領域ドメインを含み、そして可変領域を欠いている、免疫グロブリン、Ｈ鎖不変領域、典型的には、Ｆｃフラグメントとの融合体として発現され得る。そのような融合体は典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここでＦｃ部分はお互いジスルフィド結合され、そして２種の受容体ポリペプチドがお互い密接に接近して整列されている。このタイプの融合体は、溶液から同種リガンドを親和性精製するために、インビトロアッセイ手段として、リガンドを特異的に滴定することによってインビボでシグナルを阻止するために、及び循環リガンドを結合し、そしてそれを循環から洗浄するために、それらを非経口投与することによってインビボでのアンタゴニストとして使用され得る。
【０２６７】
リガンドを精製するためには、ｚｃｙｔｏｒ１９−Ｉｇキメラが、リガンドを含むサンプル（例えば、細胞−ならし培地又は組織抽出物）に、受容体−リガンド結合を促進する条件（典型的には、生理学的に近い温度、ｐＨ及びイオン強度）下で添加される。次に、キメラ−リガンド複合体が、固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）上に固定されているタンパク質Ａを用いて、混合物により分離される。次に、リガンドは、従来の化学的技法、例えば塩又はｐＨグラジエントを用いて溶出される。他方では、キメラ自体は、固体支持体に結合され、そして結合及び溶出は上記のようにして行われる。集められた画分は、所望する純度に達するまで、再分別され得る。
【０２６８】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体は、リガンドの存在が所望されない治療又は他の用途において、インビボ又はインビトロでリガンドを結合するために、“リガンドシンク（ｌｉｇａｎｄ ｓｉｎｋ）”、すなわちアンタゴニストとして使用され得る。例えば、多量の生物活性ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドを発現する癌においては、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体は、インビボで、リガンドの直接的なアンタゴニストとして使用され得、そして疾病に関連する進行及び病状の低下を助けることができる。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体は、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体を過剰発現する癌の進行を、それらの癌の増殖を増強するリガンドをインビボで結合することによって遅延するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体のための類似するインビトロ用途が、例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドの不在下で増殖する細胞系を選択するために負の選択として使用され得る。
【０２６９】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体は、インビボで、又は組織サンプルにおいて、ｚｃｙｔｏｒ１９リガンド−発現性癌を検出するために、インビボで又は診断用途において使用され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体は、本明細書に記載されるような放射性ラベル又は蛍光ラベルに接合され得、そしてインビトロリガンド−受容体型結合アッセイ又は蛍光イメージングアッセイを用いて、組織サンプルにおけるリガンドの存在を検出するために使用され得る。
【０２７０】
さらに、放射性ラベルされたｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体は、当業界において知られている放射性−イメージングを通して、リガンド発現性固形腫瘍を検出するために、インビボで投与され得る。同様に、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はペプチド結合フラグメントは、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体発現性癌を検出するために使用され得る。好ましい態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はペプチド結合フラグメントは、白血病、より好ましくは、Ｂ−細胞白血病、及び最も好ましくは、プレ−Ｂ−細胞急性リンパ芽球性白血病を検出するために使用され得る。
【０２７１】
分化は進行性で且つ動的な工程であり、多能性幹細胞で始まり、そして最終的に分化された細胞で終結する。拘束なしに系統に再生することができる多能生幹細胞は、細胞系統への拘束が行われる場合、失われる一組の分化マーカーを発現する。前駆体細胞は、細胞が成熟に向かって細胞系統路を進行する場合に、発現され続けることができても又はできなくても良い一組の分化マーカーを発現する。成熟細胞により独占的に発現される分化マーカーは通常、機能的性質のもの、例えば細胞生成物、細胞生成物を生成するための酵素、及び受容体である。
【０２７２】
細胞集団の分化の段階は、細胞集団に存在するマーカーの同定によりモニターされる。筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、クロンドロサイト、腺維芽細胞及び網様細胞は、通常の間葉幹細胞に起因すると思われる（Ｏｗｅｎなど．， Ｃｉｂａ Ｆｄｎ． Ｓｙｍｐ． １３６： ４２−４６， １９８８）。間葉幹細胞のためのマーカーはまだ十分には同定されておらず（Ｏｗｅｎなど．， Ｊ． ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ８７： ７３１−７３８， １９８７）、その結果、同定は、通常、前駆体及び成熟細胞段階で行われる。本発明の新規ポリペプチドは、間葉幹細胞及び単球又は他の前駆体細胞を、インビボ及びエクスビボの両者で単離するための研究のために有用である。
【０２７３】
最終分化又は脱分化の方の経路に特定細胞型を刺激する因子が、通常の前駆体又は幹細胞に起因する全細胞集団に影響を及ぼすことを示唆する証拠が存在する。従って、本発明は、リンパ細胞、造血細胞、及び内皮細胞の増殖の刺激または阻害を包含する。従って、本発明の分子、例えば、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９受容体、サイトカイン−結合フラグメント、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体、センス及びアンチセンスポリヌクレオチドは、腫瘍細胞、及び特にリンパ球、造血、前立腺、ン内皮及び甲状腺細胞の阻害に使用できる。
【０２７４】
分化を測定するアッセイは例えば、組織、酵素活性、機能的活性又は形態学的変化の段階−特異的発現に関連する細胞−マーカーを測定することに包含する（Ｗａｔｔ， ＦＡＳＥＢ， ５： ２８１−２８４， １９９１； Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５７： ６３−７５， １９９４； Ｒａｅｓ， Ａｄｖ． Ａｎｉｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， １６１−１７１， １９８９； すべては引用により本明細書に組み込まれる）。他方では、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド自体は、組織の段階−特異的発現に関連する追加の細胞表面又は分泌されたマーカーとして作用することができる。ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの直接的な測定、又はそれが分化するにつれての組織における発現のその損失は、たとえば前立腺組織又は単球細胞の同定又は分化のためのマーカーとして作用することができる。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９は、上記のように、プレ−Ｂ細胞急性ピンパ芽球性白血病細胞及びいくつかの他の癌において特異的に発現される。当業者は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体がそれらの癌のためのマーカーとして使用され得ることを認識するであろう。
【０２７５】
同様に、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの直接的な測定、又は組織における発現のその損失が、それらが腫瘍の進行を受けるにつれて、組織又は細胞において決定され得る。前癌又は癌状態における細胞の侵襲性及び運動性の上昇、又はｚｃｙｔｏｒ１９の発現の獲得又は損失が、正常な組織に比較して、腫瘍進行における形質転換、侵襲性及び転移についての診断として作用することができる。進行又は転移の腫瘍段階の知識は、所定の個々の癌患者のために、最も適切な治療又は処理の攻撃性を選択する上で医薬を助けるであろう。発現（ｍＲＮＡ又はタンパク質のいずれかの）の獲得及び損失を測定する方法は、当業界において良く知られており、そして本明細書に記載されており、そしてｚｃｙｔｏｒ１９発現に適用され得る。
【０２７６】
例えば、細胞運動性を調節するポリペプチドの出現又は消出が、前立腺癌の診断及び予後を助けるために使用され得る（Ｂａｎｙａｒｄ， Ｊ． ａｎｄ Ｚｅｔｔｅｒ， Ｂ． Ｒ．， Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔ． Ｒｅｖ． １７： ４４９−４５８， １９９９）。細胞運動性、又はＢ−細胞腫瘍−特異的マーカーのエフェクターとして、発現のｚｃｙｔｏｒ１９獲得又は損失がリンパ球、Ｂ−細胞、内皮、造血、及び他の癌についての診断分析として作用することができる。さらに、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に類似する、天然において発現される組織特異的マーカーとして、正常な対照に比較して、患者におけるｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体の高められたレベルは、ｚｃｙｔｏｒ１９が発現される正常組織における疾病の表示であり得る（例えば、Ｍｕｌｄｅｒｓ， ＩＭＴ、など．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ． １６： ３７−４１， １９９０を参照のこと）。
【０２７７】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９発現が特定の正常なヒト組織に制限されると思われる場合、それらの組織におけるｚｃｙｔｏｒ１９発現の欠失、又は非特異的組織における強いｚｃｙｔｏｒ発現は、細胞又は組織型における異常性の診断、非癌組織への癌組織の侵入又は転移の診断として作用し、そしてさらなる試験又は調査の指図において医者を助け、又は治療の指図を助けることができる。ｚｃｙｔｏｒ１９は食道、肝臓、卵巣、胃及び子宮腫瘍、及びメラノーマにおいて発現されるので、診断プローブは、それらの癌からの組織の診断及び同定に使用される。
【０２７８】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９は組織特異的、ポリヌクレオチドプローブ、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体及び検出であるので、組織におけるｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの存在は、特定の組織が例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９が発現される、疾病又は癌性組織の切除を包含する手術の後の評価において、存在するかどうかを評価するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体は、すべての組織が、手術の後、例えば癌についての手術の後、切除されるかどうかを決定するための助剤として使用され得る。そのような場合、癌からの回復を最大にし、そして再発を最少にするために、すべての可能性ある疾病組織を除去することは特に重要である。好ましい態様は、組織学的に又は現場使用され得る。蛍光性、放射性ラベルされた、又は比色的にラベルされた抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体及びｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド結合パートナーを包含する。ｚｃｙｔｏｒ１９が発現される特定の組織が本明細書において開示される。
【０２７９】
さらに、腫瘍進行及び転移に対するｚｃｙｔｏｒ１９の活性及び効果が、インビボで測定され得る。いくつかの同系マウスモデルが、腫瘍進行に対するポリペプチド、化合物又は他の処理の影響を研究するために開発されて来た。それらのモデルにおいては、培養継代された腫瘍細胞が、腫瘍ドナーと同じ株のマウス中に移植される。細胞は、受容体マウスにおいて類似する特徴を有する腫瘍中に増殖し、そして転移がまた、そのモデルのいくつかにおいて生じるであろう。本発明者の研究のための適切な腫瘍モデルは、中でも、Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１６４２）及びＢ１６黒色腫（ＡＴＣＣ Ｎｏ． Ｃｒｌ−６３２３）を包含する。それらは、インビトロで容易に培養され、そして操作される、Ｃ５７ＢＬ６マウスと同種の通常使用される腫瘍系である。
【０２８０】
それらの細胞系のいずれかの移植に起因する腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ６マウスの肺に転移することができる。Ｌｅｗｉｓ肺癌モデルが最近、脈管形成のインヒビターを同定するためにマウスに使用されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ， など． Ｃｅｌｌ ７９： ３１５−３２８， １９９４）。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスが、組換えタンパク質、アゴニスト又はアンタゴニストの毎日の注入、又は組換えアデノウィルスの１回の注入を通して、実験剤により処理される。この処理に続いて３日で、１０５〜１０６個の細胞が背面の皮膚下に移植される。他方では、細胞自体が、タンパク質が全身的によりもむしろ腫瘍部位で又は細胞内で合成されるよう、移植の前、組換えアデノウィルス、例えばｚｃｙｔｏｒ１９を発現するアデノウィルスにより感染され得る。
【０２８１】
マウスは、通常５日以内に眼に見える腫瘍を進行する。腫瘍が３週間までの間、増殖され、この間、それらは対照の処理グループにおいて１５００−１８００ｍｍ３のサイズに達することができる。腫瘍サイズ及び体重が、その実験を通して注意してモニターされる。殺害の時点で、腫瘍が、肺及び肝臓と共に除去され、そして計量される。肺の重量が、転移性腫瘍負荷量と相互関係することが示された。さらなる測定として、肺表面転移が計数される。切除された腫瘍、肺及び肝臓が、当業界において知られており、そして本明細書に記載される方法を用いて、組織学的試験、免疫組織化学及び現場ハイブリダイゼーションのために調製される。
【０２８２】
従って血管構造を回復し、そして転移を受ける腫瘍の能力に対する、問題の発現されたポリペプチド、例えばｚｃｙｔｏｒ１９の影響が評価され得る。さらに、アデノウィルスとは別に、移植された細胞がｚｃｙｔｏｒ１７により一時的にトランスフェクトされ得る。安定したｚｃｙｔｏｒ１９トランスフェクトの使用、及びインビボでのｚｃｙｔｏｒ１９発現を活性化する誘発性プロモーターの使用は、当業界において知られており、そして転移のｚｃｙｔｏｒ１９誘発を評価するためにこのシステムに使用され得る。さらに、精製されたｚｃｙｔｏｒ１９又はｚｃｙｔｏｒ１９ならし培地が、このマウスモデルに直接的に注入され、そして従って、このシステムに使用される。一般的な文献については、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ＭＳ， など． Ｃｅｌｌ ７９： ３１５−３２８， １９９４， 及びＲｕｓｃｉａｎｏ Ｄ， など、Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ， Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １４： ３４９−３６１，１９９５を参照のこと。
【０２８３】
ヒト血液学的悪性に由来する腫瘍細胞の増殖及び散在に対するｚｃｙｔｏｒ１９及びその誘導体（接合体）の活性がまた、マウスの異種移植モデルにおいてインビボで測定され得る。ヒト腫瘍細胞が、集合的には、異種移植モデルとして言及される、ヒト腫瘍細胞が免疫欠損マウス中に移植されているいくつかのマウスモデルが開発されている。Ｃａｔｔａｎ， ＡＲ ａｎｄ Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｅ Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ． １８： ５１３−２２， １９９４； 及びＦｌａｖｅｌｌ， ＤＪ． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４： ６７−８２， １９９６を参照のこと。疾病モデルの特徴は、マウスに供給される細胞の型及び量により変化する。
【０２８４】
典型的には、腫瘍細胞は、急速に増殖し、そして血液において循環し、そして多くの器官系に存在することが見出され得る。そのようなモデルにおいて試験するための適切な治療方法は、抗体誘発性毒性、リガンド−毒素接合体又は細胞い基づく治療を包含する。養子免疫療法として通常言及される後者の方法は、ヒト免疫系の成分（すなわち、リンパ球、ＮＫ細胞）による動物の処理を包含し、そしてｚｃｙｔｏｒ１９又は他の免疫調節剤と細胞とのエクスビボインキュベーションを包含することができる。
【０２８５】
この新規ＤＮＡに対応するｍＲＮＡは、プレ−Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病を包含するリンパ組織、骨髄における発現を示し、そして、脾臓、リンパ節及び末梢血液リンパ球において発現され得る。それらのデータは、免疫細胞の白血病、例えばＢ−細胞白血病における増殖、分化及び／又は活性化におけるｚｃｙｔｏｒ１９受容体のための役割を示し、そして免疫応答の進行及び調節における役割を示唆する。このデータはまた、ｚｃｙｔｏｒ１９とそのリガンドとの相互作用が骨髄性細胞の増殖及び進化を刺激し、そしてＩＬ−２，ＩＬ−６，ＬＩＦ，ＩＬ−１１及びＯＳＭのように（Ｂａｕｍａｎｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ８４１４−８４１７， １９９３）、肝細胞における急性相タンパク質合成を誘発することができる。
【０２８６】
本発明のポリペプチドを８０％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらに好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、９９．９％以上の純度であり、そして感染性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０２８７】
発現された組換え体ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド（又はｚｃｙｔｏｒ１９キメラ又は融合ポリペプチド）は、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましい。
【０２８８】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、オクチル−Ｓｅｐｈａｒｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０２８９】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド  カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８を参照のこと。
【０２９０】
本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除、及び親和性クロマトグラフィーを包含する方法の組み合わせより単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される（ Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３： １−７， １９８５）。
【０２９１】
ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐＨの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １８２， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， （ ｅｄ．）， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０， ｐｐ． ５２９−３９）。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、ＦＬＡＧ標識、Ｇｌｕ−Ｇｋｕ標識、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０２９２】
さらに、当業界において記載される方法を用いて、ポリペプチド融合体又はハイブリッドｚｃｙｔｏｒ１９タンパク質が、他のマウス又はヒトサイトカイン受容体ファミリータンパク質、又は異種タンパク質と組合して、本発明のｚｃｙｔｏｒ１９の領域又はドメインを用いて構成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， 前記；Ａｌｔｓｃｈｕｌ など．， 前記；Ｐｉｃａｒｄ， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ５１１−５， １９９４及びそれらにおける引例）。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在性を変更し、そして未知の構造のポリペプチドに適用される。
【０２９３】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の１又は複数の成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべてが、本発明のｚｃｙｔｏｒ１９と、もう１つのサイトカインファミリーメンバーからのその機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。
【０２９４】
そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：分泌シグナル配列、細胞外サイトカイン結合ドメイン、フィブロネクチン第ＩＩＩドメイン、トランスメンブランドメイン、及び細胞内シグナル化ドメイン、Ｂｏｘ Ｉ及びＢｏｘ ＩＩ部位。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他の既知のファミリータンパク質と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。
【０２９５】
標準の分子生物学及びクローニング技法が、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドと、それらが融合されるそれらのポリペプチドとの間の同等のドメインを交換するために使用され得る。一般的に、興味あるドメイン、例えば本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１９ドメインをコードするＤＮＡセグメントが、追加のポリペプチド（例えば、もう１つのサイトカイン受容体、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）又は他のクラスＩＩサイトカイン受容体）をコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントに読み取り枠を接合して作用可能に結合され、そして本明細書に記載されるように、適切な発現ベクター中に挿入される。
【０２９６】
一般的に、ＤＮＡ構造体は、ポリペプチドのその対応する領域をコードするいくつかのＤＮＡセグメントが、完全な融合タンパク質又はその機能的部分をコードする単一の構造体を製造するために読み取り枠を整合して、作用可能に連結されるように、製造される。例えばＤＮＡ構造体は、Ｎ−末端からＣ−末端側に、単一のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質、続いて、サイトカイン結合ドメイン、続いてトランスメンブランドメイン、続いて細胞内シグナル化ドメインをコードする。そのような融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、発現され、単離され、そして活性についてアッセイされ得る。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に記載のような抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体を生成するために動物を接種するのに使用されるべきｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのフラグメントを発現し、そして分泌するために使用され得る。
【０２９７】
例えば、分泌シグナル配列は、本明細書に開示されるような、細胞外サイトカイン結合ドメイン、サイトカイン結合フラグメント、個々のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、トランスメンブランドメイン、及び細胞内シグナル化ドメイン、又はそれらの組合せ（例えば、リンカーに結合されるフィブロネクチンＩＩＩを含んで成る作用可能に連結されるポリペプチド、又は本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドフラグメント）に作用可能に連結され、本明細書に記載のようにして精製され得、そして本明細書に記載のようにして、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体を生成するために動物に接種されるべき抗原として作用することができるｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのフラグメントが分泌される。
【０２９８】
ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学的合成を通して調製され得る。ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドはモノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペルギレ−ト化されても又はペルギレ−トされなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。
【０２９９】
本発明のポリペプチドはまた、排除固相合成、部分固相合成、フラグメント縮重又は従来の溶液合成により合成され得る。ポリペプチドを合成するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９， １９６３； Ｋａｉｓｅｒなど．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３４： ５８５，１９７０を参照のこと。固体支持体上での所望するペプチドの完全な合成の後、ペプチド−樹脂は、その樹脂からポリペプチドを分解する試薬と共に存在し、そしてほとんどの側鎖保護基を除去する。そのような方法は、当業界において十分に確立されている。
本発明の分子の活性は、細胞の分化及び増殖を側定する種々のアッセイを用いて測定され得る。そのようなアッセイは、当業界において良く知られている。
【０３００】
本発明のタンパク質は、例えば、リンパ性、免疫性、炎症性、脾臓性、血液又は骨疾患の処理及び診断において有用であり、そして培養された細胞を用いてインビトロで、又は適切な動物モデルに本発明の分子を投与することによってインビボで測定され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞は、アルギン酸塩環境下で包埋され、そして受容体動物中に注入（移植）され得る。アルギネート−ポリ−Ｌ−リシン微小封入、透過性膜封入及び拡散チャンバーは、トランスフェクトされた哺乳類細胞又は一次哺乳類細胞を捕獲するための手段として記載されている。
【０３０１】
それらのタイプの非免疫原性“封入”は、微小環境への栄養物ノトランスファーを可能にしそして又は、捕獲された細胞により分泌され又は開放されるタンパク質及び他の高分子の受容体動物への拡散を可能にする。最も重要なことには、カプセル又は微小環境は、受容体動物の免疫応答から外来性の包埋された細胞をマスクし、そして遮断する。そのような微小環境は、注入される細胞の寿命を、数時間又は数日（裸細胞）から数週間（包埋された細胞）まで拡張することができる。アルギン酸塩糸は、包埋された細胞を生成するための単純且つ迅速な手段を提供する。
【０３０２】
アルギン酸塩糸を生成するために必要とされる材料は、当業者に知られている。製造されると、そのアルギン酸塩糸は、インビトロで、及びその糸を用いて得られるデータに基づいて、インビボで、比較的強く且つ耐久性がある。そのアルギン酸塩糸は容易に操作でき、そしてその方法論は多くの調製のために評価できる。典型的な方法においては、３％のアルギン酸塩が、無菌水において調製され、そして滅菌濾過される。アルギン酸塩糸の調製の直前、アルギン酸塩溶液が再び濾過される。約５０％の細胞懸濁液（１ｍｌ当たり約５×１０５個〜約５×１０７個の細胞を含む）が３％アルギン酸塩溶液と共に混合される。１ｍｌのアルギン酸塩／細胞懸濁液が、約１５分間にわたって、１００ｍＭの滅菌濾過されたＣａｃｌ２ 溶液中に押し出され、“糸（Ｔｈｒｅａｄ）”が形成される。
【０３０３】
次に、押し出された糸は、５０ｍＭのＣａｃｌ２の溶液に移され、そして次に２５ｍＭのＣａｃｌ２の溶液に移される。次に、糸が、脱イオン水によりすすがれ、その後、ポリ−Ｌ−リシンの０．０１％溶液においてインキュベートすることによって糸を被覆する。最後に、糸は乳酸塩化されたリンガー溶液によりすすがれ、そして注射器（針のない）中に溶液から抜き取られる。次に大きな孔の針がその注射器につけられ、そして糸が最少量の乳酸塩化されたリンガー溶液において受容体中の腹腔内注入される。
【０３０４】
本発明のタンパク質をアッセイするためのインビボアプローチは、ウィルス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種拡散の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Ｔ． Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４３： １６１−８９， １９９４； 及びＪ． Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ４４−５３， １９９７ を参照のこと）。アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ ｉ ）アデノウィルスは比較的大きなＤＮＡ挿入体を適応せしめることができ；（ ｉｉ ）高い力価に増殖され得；（ ｉｉｉ ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ ｉｖ ）多数の異なったプロモーター、例えば偏在する、組織特異的、及び調節可能なプロモーターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。
【０３０５】
アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスを用いて、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須Ｅ１遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞（ヒト２９３細胞系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。アデノウィルス供給システムがＥ１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう（そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する）。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
【０３０６】
さらに、ウィルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウィルスベクターは、そのベクターに対する免疫応答を低めるか又は排除するために使用され得る。そのようなアデノウィルスは、Ｅ１−欠失され、そしてさらに、Ｅ２Ａ又はＥ４の欠失を含む（Ｌｕｓｋｙなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２０２２ （１９９８）； Ｒａｐｅｒ など．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ６７１ （１９９８））。さらに、Ｅ２ｂの欠失はまた、免疫応答を低めることが報告されている（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９２６ （１９９８））。さらに、完全なアデノウィルスゲノムを欠失することによって、異種ＤＮＡの非常に大きな挿入体が収容され得る。すべてのウィルス遺伝子が欠失されている、いわゆる“不活性（ｇｕｔｌｅｓｓ）”アデノウィルスの生成は、異種ＤＮＡの大きな挿入体の挿入のために特に好都合である（Ｙｅｈ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１： ６１５ （１９９７） を参照のこと）。
【０３０７】
アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使用され得る。アデノウィルス感染された非−２９３細胞を、その細胞が急速に分裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を生成することができる。例えば、ＢＨＫ細胞は、細胞工場において集密性まで増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルスベクターに暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。
【０３０８】
他方では、アデノウィルスベクター感染された２９３Ｓ細胞が、有意な量のタンパク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養において増殖せしめられ得る（ Ｇａｒｎｉｅｒ など．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： １４５−５５， １９９４ を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異種タンパク質が、細胞における発現されたタンパク質の素因に依存して、細胞培養物上清液、溶解物又は、膜画分から反復して単離され得る。感染された２９３Ｓ 細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得られる。
【０３０９】
ｚｃｙｔｏｒ１９に関して観察される組織分布の観点においては、アゴニスト（天然のリガンド／基質／補因子／等を包含する）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。ｚｃｙｔｏｒ１９アゴニストとして同定される化合物は、インビオロ及びインビボで、免疫及び造血細胞の増殖の刺激において有用である。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体及びアゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の化合物として有用であり、そして細胞培養において通常使用される血清を置換するために、単独で又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。従って、アンタゴニストは、培養物におけるＴ−細胞、Ｂ−細胞、及びリンパ性及び骨髄系の増殖及び／又は進化を特異的に促進することにおいて有用である。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体、アゴニスト又はアンタゴニストは、単離された一次骨髄培養物からのコロニー形成の刺激を測定するためにも有用である。そのようなアッセイは、当業界において良く知られている。
【０３１０】
アンタゴニストはまた、リガンド−受容体の部位を特徴づけるための研究試薬としても有用である。Ｚｃｙｔｏｒ１９活性（ｚｃｙｔｏｒ１９アンタゴニスト）の阻害は、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体及び可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９受容体、並びに他のペプチド及び非−ペプチド剤（例えば、リボザイム）を包含する。
【０３１１】
ｚｃｙｔｏｒ１９はまた、その活性のインヒビター（アンタゴニスト）を同定するためにも使用され得る。試験化合物は、ｚｃｙｔｏｒ１９の活性を阻害する化合物を同定するために、本明細書に開示されるアッセイに添加される。本明細書に開示されるそれらのアッセイの他に、サンプルは、ｚｃｙｔｏｒ１９結合、オリゴマー化、又はｚｃｙｔｏｒ１９−依存性細胞応答の刺激／阻害を測定するよう企画された種々のアッセイにより、ｚｃｙｔｏｒ１９活性の阻害について試験され得る。例えばｚｃｙｔｏｒ１９−発現性細胞系は、ｚｃｙｔｏｒ１７−刺激された細胞経路に応答するレポーター遺伝子構造体によりトランスフェクトされ得る。
【０３１２】
このタイプのレポーター遺伝子構造体は、当業界において知られており、そして一般的に、アッセイ検出可能タンパク質、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子に作用可能に連結されるｚｃｙｔｏｒ１９−ＤＮＡ応答要素を含むであろう。ＤＮＡ応答要素は、サイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、ホルモン応答要素（ＨＲＥ）、インスリン応答要素（ＩＲＥ）（Ｎａｓｒｉｎ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ５２７３−７， １９９０）及び血清応答要素（ＳＲＥ）（Ｓｈａｗ など．， Ｃｅｌｌ ５６： ５６３−７２， １９８９）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。サイクリックＡＭＰ応答要素は、Ｒｏｅｓｔｌｅｒ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３ （１９）： ９０６３−６， １９８８及びＨａｂｅｎｅｒ， Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ４ （８）： １０８７−９４， １９９０に再考される。
【０３１３】
ホルモン応答要素は、Ｂｅａｔｏ， Ｃｅｌｌ ５６： ３３５−４４ｌ， １９８９に再考される。候補体化合物、溶液、混合物又は抽出物、又は種々の細胞型からのならし培地は、レポーター遺伝子発現のｚｃｙｔｏｒ１９刺激の上昇により明らかなように、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体の活性を増強する能力について試験される。このタイプのアッセイは、受容体の結合を通して、又はシグナルカスケードの一部の刺激により、ｚｃｙｔｏｒ１９シグナルトランスダクション活性を直接的に刺激する化合物を検出するであろう。
【０３１４】
それ自体、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドに応答する細胞を供給し、試験化合物の不在下で細胞の第１部分を培養し、試験化合物の存在下で前記細胞の第２部分を培養し、そして前記細胞の第１部分に比較して、前記細胞の第２部分の細胞応答における上昇性を検出することを含んで成る、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドのアゴニストを同定するための方法が提供される。さらに、上記のレポーター遺伝子構造体を含むが、しかしｚｃｙｔｏｒ１９受容体を発現しない第３細胞は、前記レポーターの非−特異的な、又は非−ｚｃｙｔｏｒ１９−介在性刺激を評価するための対照細胞として使用され得る。従って、アゴニスト、例えば天然のリガンドは、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド機能を刺激し、又は増強するために有用である。
【０３１５】
ｚｃｙｔｏｒ１９リガンド−結合ポリペプチド、例えば本明細書に記載される細胞外ドメイン又はサイトカインドメインはまた、リガンドの精製のためにも使用される。前記ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド又は使用の条件下で安定している同様の材料のビーズ上に固定される。
【０３１６】
固体支持体にポリペプチドを結合するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアノゲン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒体は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてリガンドを含む流体が、受容体ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にするために、カラムに１又は複数回、通される。次に、リガンドが、塩濃度の変化、カオトロピック剤（グアニジンＨＣｌ）、又はリガンド−受容体結合を破壊するｐＨを用いて溶出される。
【０３１７】
リガンド−結合受容体（又は抗体、補体／抗補体対の１つのメンバー）、又はその結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用され得る（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ；又はＳＥＬＤＩＴＭ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ， Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）。そのような受容体、抗体、補体／抗補体対のメンバー、又はフラグメントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５： ２２９−４０， １９９１ 及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２３４： ５５４−６３，１９９３により開示される。
【０３１８】
受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は補体／抗補体対の反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定された受容体、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化学量の評価が可能にされる。
【０３１９】
リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のアッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスカチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０−７２， １９４９）及び熱量測定アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３： ５４５−４８， １９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： ８２１−２５， １９９１）を包含する。
【０３２０】
ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１９エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド又はそのフラグメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するための剤（免疫原）として作用する。当業者は、抗原性エピトープ担持のポリペプチドがｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド（例えば、配列番号２、１９又は２１）の少なくとも６、好ましくは少なくとも９及びより好ましくは少なくとも１５〜約３０個の連続したアミノ酸残基を含むことを認識するであろう。ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの大きな部分、すなわちアミノ酸配列の３０〜１００個の残基〜その全体の長さの残基を含んでなるポリペプチドが含まれる。
【０３２１】
抗原又は免疫原エピトープはまた、本明細書に記載されるように、結合された標識、アジュバンド及びキャリヤーを含むことができる。適切な抗原は、配列番号２のアミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号４９１（Ａｒｇ）、又は連続した９〜４７１個のそのアミノ酸フラグメントによりコードされるｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを含む。適切な抗原はまた、配列番号１９のアミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号５２０（Ａｒｇ）、又は連続した９〜５００個のそのアミノ酸フラグメントによりコードされるｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド；及び配列番号２１のアミノ酸番号２１（Ａｒｇ）〜アミノ酸番号２１１（Ｓｅｒ）、又は連続した９〜１９１個のそのアミノ酸フラグメントによりコードされる切断された可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを含む。
【０３２２】
抗原として使用するための好ましいペプチドは、細胞外サイトカイン結合ドメイン、サイトカイン結合フラグメント、フィブロネクチン第ＩＩＩ型ドメイン、細胞内シグナル化ドメイン、又は本明細書に開示される他のドメイン及びモチーフ、又はそれらの込み合わせ；及びｚｃｙｔｏｒ１９親水性ペプチド、例えば埋もれたＧ、Ｓ及びＴ、及び暴露されたＨ、Ｙ及びＷ残基が無視される、スライド性６−残基窓に基づいて、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールから決定される、疎水性プロットから当業者により推定されるそれらのペプチドである。
【０３２３】
ｚｃｙｔｏｒ１９親水性ペプチドは、（１）配列番号２のアミノ酸残基２９５〜３００；（２）配列番号２のアミノ酸残基４５１〜４５６；（３）配列番号２のアミノ酸残基３０１〜３０６；（４）配列番号２のアミノ酸残基２９１〜２９９；及び（５）配列番号２のアミノ酸残基６５〜７０から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るペプチドを包含する。さらに、例えばＤＮＡＳＴＡＲ Ｐｒｏｔｅａｎ プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， ＩＮＣ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆｐｌｏｔ Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ ｐｌｏｔから推定される親水性ペプチドはまた、適切な抗原である。さらに、保存されたモチーフ、及びｚｃｙｔｏｒ１９の保存されたモチーフ間の可変領域が適切な抗原である。この免疫応答から生成される抗体は、本明細書に記載のようにして単離され、そして精製され得る。
【０３２４】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など．， （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５； Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； 及びＨｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．Ｇ．Ｒ．， Ｅｄ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８２ を参照のこと。
【０３２５】
当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得る。ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン  ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばｚｃｙｔｏｒ１９又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
【０３２６】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２及びＦａｂタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（ｃｌｏａｋｉｎｇ）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。
【０３２７】
多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。さらに、ヒト抗体は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９８／２４８９３号に開示されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むよう構築されたトランスジェニック非−ヒト動物において生成される。好ましくは、それらの動物における内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えにより不活性化されるか又は排除される。
【０３２８】
本明細書において有用な抗体を生成するか又は選択するための他の技法は、インビトロで、ｚｃｙｔｏｒ１９タンパク質又はペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたｚｃｙｔｏｒ１９タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。可能性あるｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。
【０３２９】
それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。そのようなランダム  ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，４０３，４８４ 号及びＬａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，５７１，６９８ 号、及びＫａｙなど．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６））、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） 及びＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． （Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ， ＭＪ） から市販されている。
【０３３０】
ランダムペプチド表示ライブラリーは、ｚｃｙｔｏｒ１９に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるｚｃｙｔｏｒ１９配列を用いてスクリーンされ得る。ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合ペプチド”は、細胞、例えばｚｃｙｔｏｒ１９を特異的に発現される細胞を標識するために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に接合され得る。それらの結合ペプチドはまた、分析方法に、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る。
【０３３１】
結合ペプチドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断アッセイにも使用され得る。それらの結合ペプチドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１９結合及びシグナルトランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するために、ｚｃｙｔｏｒ１９ “アンタゴニス”として使用することができる。それらの抗−ｚｃｙｔｏｒ１９結合ペプチドは、ｚｃｙｔｏｒ１９と結合するリガンドの作用を阻害するために有用である。
【０３３２】
抗体は、１）それらが限界レベルの結合活性を示す場合、及び２）それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合すると考えられる。限界レベルの結合は、本明細書における抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体が対照（非−ｚｃｙｔｏｒ１９）ポリペプチドへの結合親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性を伴って、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合するかどうか決定される。好ましくは、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、及び最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を示す。抗体の結合親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ 分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ｇ．， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１： ６６０−６７２， １９４９）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。
【０３３３】
抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しないかどうかは、例えば、標準のウェスターンブロット分析を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドであるが、しかし知られていない関連するポリペプチドを検出する抗体により示される（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）。既知の関連するポリペプチドの例は、従来技術に開示されているそれらのもの、例えば既知のオルト体及びパラ体、及びタンパク質ファミリーの類似する既知メンバー（例えば、クラスＩＩサイトカイン受容体、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）受容体）である。
【０３３４】
スクリーニングはまた、非ヒトｚｃｙｔｏｒ１９及びｚｃｙｔｏｒ１９変異体ポチペプチドを用いて行われ得る。さらに、抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドに対して特異的に結合する集団を単離するために、既知の関連するポリペプチドに“対してスクリーンされ得る”。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９に対して生ぜしめられた抗体は不溶性マトリックスに付着される関連するポリペプチドに吸着され；ｚｃｙｔｏｒ１９に対して特異的な抗体は適切な緩衝液条件下で前記マトリックスを通して流れるであろう。スクリーニングは、既知の溶接に関連するポリペプチドに対して交差反応しないポリクローナル及びモノクローナル抗体の単離を可能にする（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など． （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５）。
【０３３５】
特異的抗体のスクリーニング及び単離は当業界において当業界において良く知られている。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｕｌ （ｅｄｓ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９３； Ｇｅｔｚｏｆｆなど．， Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： １−９８， １９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ．Ｗ． （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， １９９６； Ｂｅｎｊａｍｉｎ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２： ６７−１０１， １９８４を参照のこと。特異的に結合する抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、当業界において知られており、そして下記に開示される多くの方法により検出され得る。
【０３３６】
当業者に知られている種々のアッセイがｚｃｙｔｏｒ１９タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ ｌａｎｅ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｅｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８ に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ、及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体のｚｃｙｔｏｒ１９タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
【０３３７】
ｚｃｙｔｏｒ１９に対する抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１９を発現する細胞を標識するために；アフィニティー精製によりｚｃｙｔｏｒ１９を単離するために； ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９を検出し又は定量化するために；基本となる病理学又は疾病のマーカーとして組織学、生検又は組織サンプルｚｃｙｔｏｒ１９受容体における検出又は定量化のために；ｚｃｙｔｏｒ１９−ライブラリーに対する細胞毒性又はＡＤＣＣを刺激するために；ＦＡＣＳ を使用する分析方法において、発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗−インディオタイプ抗体を生成するために；及びインビトロでｚｃｙｔｏｒ１９活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。
【０３３８】
適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、例えば当業界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変性されたｚｃｙｔｏｒ１９又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得る。
【０３３９】
ｚｃｙｔｏｒ１９に対する抗体は、受容体を発現する細胞を標識し、そしてｚｃｙｔｏｒ１９発現レベルをアッセイするために、可溶性受容体ポリペプチドの循環レベルを決定するために診断アッセイ内での親和性精製のために、蛍光−活性化された細胞分類を用いる分析方法のために有用である。二価抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドの効果を模倣するアゴニストとして使用され得る。
【０３４０】
本明細書における抗体はまた、薬剤、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体は、治療用途を研究するためのネズミモデルにおいて、又は治療の用途において、インビボ診断のために使用される。例えば、本発明のｚｃｙｔｏｒ１９を認識する抗体又は結合ポリペプチドは、対応する抗−相補的分子（すなわち、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。
【０３４１】
より特定には、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又はその生物活性フラグメント又は一部が、検出可能な又は細胞毒性の分子に連結され、そしてｚｃｙｔｏｒ１９分子を発現する細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。そのような接合された抗体の好ましい使用は、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体を発現する癌に対する薬剤を標的化することである。例えば、そのような抗体は、リンパ、Ｂ−細胞及びプレ−Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病癌、及び食道、肝臓、卵巣、直腸、胃及び子宮腫瘍、及びメラノーマを標的化するために使用され得る。
【０３４２】
適切な検出可能分子は、ｚｃｙｔｏｒ１９（上記に開示される結合ペプチドを包含する“結合ポリペプチド”、抗体、又はその生物活性フラグメント又は一部に直接的に又は間接的に結合され得る。適切な検出可能分子は、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばＩ−１３１、レニウム−１８８又はイットニウム−９０（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ−ト成分により間接的に結合される）を包含する。
【０３４３】
結合ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は細胞毒性分子は相補的／抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメンバーは結合ポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビオチン／ストレプタビジンが典型的な相補的／抗相補的対である。
【０３４４】
もう１つの態様においては、結合ポリペプチド−毒素融合タンパク質又は抗体−毒素融合タンパク質は、標的化された細胞又は組織阻害又は除去（例えば、癌細胞又は組織、例えばｚｃｙｔｏｒ１９が発現される特定の組織及び腫瘍を処理するために）のために使用され得る。他方では、結合ポリペプチドが複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン、及び標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを包含する融合タンパク質は、検出可能分子、細胞毒性分子又は相補的分子を、興味ある細胞又は組織型に向けるために適切である。例えば、単一のドメインのみのを包含する融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗−相補的分子は検出可能又は細胞毒性分子に接合され得る。従って、そのようなドメイン−相補的分子融合タンパク質は、一般的抗−相補的−検出可能／細胞毒性分子接合体のための一般的標的化ビークルを表す。
【０３４５】
同様に、もう１つの態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１９−サイトカイン融合タンパク質又は抗体−サイトカイン融合タンパク質は、結合ポリペプチドサイトカイン又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体が過剰増殖性細胞を標的化する場合、標的組織（例えば、血液、リンパ球、結腸及び骨髄癌、又はｚｃｙｔｏｒ１９が発現される本明細書に記載される他の癌）のインビボ殺害を増強するために使用され得る（一般的には、Ｈｏｒｎｉｃｋなど．， Ｂｌｏｏｄ ８９： ４４３７−４４４７， １９９７を参照のこと）。記載される融合タンパク質は、作用の所望する部位へのサイトカインの標的化を可能にし、それにより、サイトカインの高められた局部濃度を提供する。適切な抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体は、所望しない細胞又は組織（例えば、腫瘍又は白血病）を標的化し、そして融合されたサイトカインはエフェクター細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。例えば、この目的のための適切なサイトカインは、インターロイキン−２及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＭ）を包含する。
【０３４６】
他方では、本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１９結合ポリペプチド又は抗体融合タンパク質は、ｚｃｙｔｏｒ１９−調節されたアポプトシス経路を直接的に刺激することにより、標的組織のインビボ殺害の増強のために使用され、ｚｃｙｔｏｒ１９を発現する高増殖性細胞の細胞死がもたらされる。
本明細書に記載される生物活性結合ポリペプチド又は抗体接合体は、経口、静脈内、動脈内又は管内供給され得、又は作用の意図された部位に局部的に導入され得る。
【０３４７】
さらに、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体及び結合フラグメントは、ｚｃｙｔｏｒ１９を特異的に発現する細胞、例えば本明細書に記載される、骨髄及び甲状腺細胞、及び他の細胞を標的化し、そして分類するために使用され得る。そのような細胞標的化及び分類方法は、当業界において良く知られている（例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ”， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ａｌｂｅｒｔ， Ｂ． など． （Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｌｏｎｄｏｎ ＆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４を参照のこと）。当業者は、細胞を研究するための細胞組織型の分離の重要性及び特定の細胞組織型の分離のためへの抗体の使用を認識するであろう。基本的には、細胞型の表面に結合する抗体は、抗体により認識される細胞のみが付着するであろう親和性表面を形成するために、種々のマトリックス、例えばコラーゲン、多糖ビーズ又はプラスチックにカップリングされる。
【０３４８】
次に、結合された細胞は、従来の技術により回収される。他の方法は、蛍光活性化された細胞ソーター（ＦＡＣＳ）による細胞の分離を包含する。この技法においては、蛍光色素に結合される抗体により細胞をラベリングする。次に、ラベルされた細胞は、ＦＡＣＳ機械によりラベルされていない細胞から分離される。ＦＡＣＳ分離においては、単一の列で移動する個々の細胞が、レーザービームを通過し、そして個々の細胞の蛍光が測定される。
【０３４９】
わずかにさらなる下流の小滴（ほとんどは、１つの細胞を含むか又はまったく含まない）が、振動ノズルにより形成される。単一の細胞を含むその小滴は、それらが含む細胞が蛍光であるかどうかに依存して、形成の瞬間で、正又は負の電荷を自動的に付与され、そして次に、強い電界により適切な容器中に偏向される。そのような機械は、１０００の細胞のうち１つを選択し、そして１秒当たり約５０００個の細胞を分類できる。これは、細胞培養物について均等な細胞集団を生成する。
【０３５０】
当業者は、本発明のｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドに対する抗体は、必ずしもすべての組織型がｚｃｙｔｏｒ１９受容体を発現せず、そして生物学者がさらなる研究及び／又は身体中への治療的再移植のために特定の細胞型を分離することができることは重用であるので、有用である。これは、細胞、例えばｚｃｙｔｏｒ１９が発現される免疫細胞において特に適切である。
【０３５１】
サイトカイン受容体に結合する４−ヘリックス束サイトカイン、及び活性化されたリンパ球により生成される他のタンパク質は、身体を通して細胞の分化、活性化、レクルートメント及び恒常性において重要な生物学的役割を演じる。治療有用性は、免疫調節を必要とする疾病、例えば自己免疫疾患、例えばリウマチ様関節炎、多発生硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス及び糖尿病の処理を包含する。ｚｃｙｔｏｒ１９受容体アンタゴニスト又はアゴニスト、例えばｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体、抗−受容体抗体及び天然リガンドは、炎症の調節において重要であり、そして従って、リウマチ様関節炎、ぜん息、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン症、膵炎及び敗血症の処理において有用である。
【０３５２】
腫瘍細胞殺害の仲介においてｚｃｙｔｏｒ１９アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、抗−受容体抗体及び天然リガンドの役割が存在し、そして従って、癌の処理において有用である。ｚｃｙｔｏｒ１９アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、抗−受容体抗体及び天然リガンドは、移植片拒絶を低めるために、又は対宿主性移植片病の予防において重要である免疫系の抑制において有効的な治療剤である。
【０３５３】
他方では、ｚｃｙｔｏｒ１９アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、抗−ｚｃｙｔｏｒ１９受容体抗体及び天然リガンドは、感染性疾病に対する免疫性を高めることにおいて、免疫無防備状態の患者、例えばＨＩＶ＋患者の処理において、又はワクチンを改良することにおいて重要である免疫系を活性化することができる。特に、ｚｃｙｔｏｒ１９アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば可溶性受容体、抗−受容体抗体及び天然リガンドは、ＮＫ細胞又はそれらの前駆体を、調節し、刺激又は拡張し、そしてウィルス感染の処理において治療的価値を、及び抗−腫瘍因子として提供する。ＮＫ細胞は転移性腫瘍細胞の排除において重要な役割を演じると思われ、そして転移及び固形腫瘍を有する患者は、低められたレベルのＮＫ細胞活性を有する（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅなど．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３０： ２２１−２４４， １９９８）。
【０３５４】
ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｚｃｙｔｏｒ１９活性を高め、又は阻害することが所望される遺伝子治療用途内で有用である。哺乳類が突然変異誘発されたｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子が哺乳類の細胞中に導入され得る。１つの態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドをコードする遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。そのようなベクターは、弱毒化された又は欠陥ＤＮＡウィルス、例えばヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０３５５】
ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好ましい。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ など．， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２： ３２０−３０， １９９１）、弱毒化されたアデノウィルス  ベクター、例えばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄａｔ など． （Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０： ６２６−３０， １９９２） により記載されるベクター、及び欠陥アデノ−関連ウィルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１： ３０９６−１０１， １９８７； Ｓａｍｕｌｓｋｉ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３： ３８２２−２８，１９８９）。
【０３５６】
もう１つの態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子は、次の文献に記載のようにして、レトロウィルスベクターに導入され得る：Ａｎｄｅｒｓｏｎ など．， アメリカ特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎ など．， Ｃｅｌｌ ３３： １５３， １９８３； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２： １１２０， １９８８； Ｔｅｍｉｎ など．， アメリカ特許第５，１２４，２６３ 号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ など．， ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９５／０７３５８ 号；及びｋｕｏ など．， Ｂｌｏｏｄ ８２： ８４５−５２， １９９３。
【０３５７】
他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−１７， １９８７； 及びＭａｃｋｅｙ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０２７−３１， １９８８）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。
【０３５８】
特定細胞へのリポソームの分子標的化は、１つの領域の利点を表す。より特定には、特定細胞へのトランスフェクションの方向づけは、１つの有益な分野を提供する。例えば、特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチド、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０３５９】
身体から細胞を除去し、そして裸ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子治療のための裸ＤＮＡベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用により導入され得る（例えば、Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ９６３−７， １９９２； Ｗｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １４６２１−２４， １９８８）。
【０３６０】
アンチセンス方法は、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子転写を阻害するために、例えばインビボでの細胞増殖を阻害するために使用され得る。Ｚｃｙｔｏｒ１９−コードのポリヌクレオチドのセグメントに対して相補的であるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、１８又は２０に示されるようなポリヌクレオチド）は、ｚｃｙｔｏｒ１９−コードのｍＲＮＡに結合し、そしてそのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するよう企画される。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養物、又は対象において、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド−コードの遺伝子の発現を阻害するために使用される。
【０３６１】
さらに、細胞表面分子として、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドは、細胞中に遺伝子療法を導入するための標的物として使用され得る。この用途は、ｚｃｙｔｏｒ１９が通常発現される細胞、例えばリンパ組織、骨髄、前立腺、甲状腺、及びＰＢＬ、又はｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを発現できる癌細胞中に治療遺伝子を導入するために、特に適切である。例えば、上記のようなウィルス遺伝子療法は、ウィルス受容体よりもむしろ細胞受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを発現する特定の細胞型に標的化され得る。抗体、又は標的細胞表面上のｚｃｙｔｏｒ１９分子を認識する他の分子が、ウィルスの感染を方向づけ、そして標的細胞に遺伝子治療材料を投与するために使用され得る。
【０３６２】
ＷＯＯ， Ｓ．Ｌ．Ｃ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ， １４： １５３８， １９９６； Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｔ．Ｊ． など．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： １５７０−１５７３， １９９６； Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｊ．Ｔ． など．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： １５７４−１５７８， １９９６； Ｒｉｈｏｖａ， Ｂ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７： １４９−１６９， １９９７； 及びＶｉｌｅ， Ｒ．Ｇ． など．， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ４： ８４−９２， １９９８を参照のこと。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９−特異的抗体に結合されるウィルス−中和性Ｆａｂフラグメントを含むニ特異的抗体が、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体を発現する細胞にウィルスを方向づけ、そして遺伝子要素を含むウィルスの細胞中への効果的侵入を可能にするために使用され得る。例えば、Ｗｉｃｋｈａｍ， Ｔ．Ｊ． など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ７６６３−７６６９， １９９７； 及びＷｉｃｋｈａｍ， Ｔ．Ｊ．， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏ． ７０：６８３１−６８３８， １９９６ を参照のこと。
【０３６３】
本発明はまた、診断用途に使用される試薬を提供する。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子、すなわちｚｃｙｔｏｒ１９ ＤＮＡ又はＲＮＡ又はその副配列を含んで成るプローブは、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子が染色体１上に存在するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１９は染色体１の１ｐ３６．１１領域に存在する。ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０３６４】
それらの異常性は、コード配列内、イントロン内、又は上流のプロモーター及び調節領域を包含するフランキング配列内で発生することができ、そしてコード配列内での物理的変更、又は遺伝子発現レベルでの変化として明らかである。そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現象（ＲＥＬＰ）分析、蛍光現場ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記；Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記；Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８： ２５５−６５， １９９５）。
【０３６５】
遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばＹＡＣ， ＢＡＣ又はｃＤＮＡクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照。
【０３６６】
ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子は、染色体の１ｐ３６．１１領域に位置する。当業者は、１ｐ３６領域における及びその回りにおける染色体異常型がいくつかの癌、例えば神経芽腫、メラノーマ、乳癌、前立腺癌及び他の癌に包含されることを理解するであろう。そのような異常型は、１ｐ３６における及びその回りにおける全体的染色体異常、例えばトランスロケーション、異種性の損失（ＬＯＨ）及び同様のものを包含する。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドにより提供される１ｐ３６．１１遺伝子座におけるマーカーは、癌に存在するこの染色体領域を包含する、トランスロケーション、異数性、転位、ＬＯＨ、他の染色体異常の検出のために有用である。
【０３６７】
例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドプローブは、神経芽腫に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得、ここで１ｐ３６．１と１ｐ３６．３との間のＬＯＨが有力であり、そして１ｐ３６．１での分解点が明白である。少なくとも７０％の神経芽腫は、１ｐにおいて細胞遺伝子学的に見える染色体異常型、例えばトランスロケーション及び欠失を有し、そしてその異常性はたぶん、複雑なトランスロケーション及び欠失機構のためである。例えば、Ｒｉｔｋｅ， ＭＫなど．， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ５０： ８４−９０， １９８９； 及びＷｅｉｔｈ， Ａなど．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ１： １５９−１６６， １９８９を参照のこと。
【０３６８】
ｚｃｙｔｏｒ１９は１ｐ３６．１１に局在し、そして異常型が神経芽腫において有力である領域内に直接的に分類されるので、当業者は、本発明のポリヌクレオチドが神経芽腫についての診断剤、及び神経芽腫を生ぜしめるトランスロケーション及び欠失機構の誘発の助剤として作用することを理解するであろう。
【０３６９】
さらに、１ｐ３６でのＬＯＨは、メラノーマ（Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ， ＮＣなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ４５ （ｓｕｐｐｌ．）： Ａ１９， １９８９； Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ， ＮＣなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ４６１４−４６１８， １９８９； Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， ＡＭなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｔ． ５２： ５３７−５５０， １９９３）； 前立腺及び脳癌の両者の病歴を有する家族における前立腺癌（１ｐ３６， ＬＯＨ）（Ｇｉｂｂｓ， Ｍなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ６４：７７６−７８７， １９９９）； 及び染色体１の欠失及び重複が乳癌において最も共通する異常型である乳癌（１ｐ３６）（Ｋｏｖａｃｓ， Ｇ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２１： ６８８−６９４， １９７８； Ｒｏｄｇｅｒｓ， Ｃ など．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ． Ｃｙｔｏｇｅｎｔ． １３： ９５−１１９， １９８４； 及びＧｅｎｕａｒｄｉ，Ｍなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ４５： ７３−８２， １９８９） において明白である。ヒト染色体１のこの領域におけるトランスロケーション、ＬＯＨ及び他の異常型は、ヒト癌において有力であり、そしてｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子が１ｐ３６．１１に特異的に位置するので、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、ヒト疾病に明確に関連するそのような異常型の検出に使用される。
【０３７０】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９が位置し、そしてポリヌクレオチドプローブが関連する異常型又は遺伝子型を検出するために使用され得る１ｐ３６領域における突然変異に起因する癌についての証拠が存在する：Ｐ７３、すなわち神経芽腫及び他の癌において時折欠失される１ｐ３６領域の可能性ある腫瘍サプレッサー地図（Ｋａｇｈａｄ， Ｍなど．， Ｃｅｌｌ ９０： ８０９−８１９， １９９７）； 染色体１３上のＦＫＨＲ遺伝子と染色体１からのＰＡＸ７遺伝子との融合に起因する、染色体１の１ｐ３６．２−ｐ３６．１２領域でのトランスロケーションを包含する横数筋肉腫；種々の型の白血病の細胞において高められる白血病−関連のタンパク質（ＬＡＰ（１ｐ３６．１−ｐ３５））； 腫瘍に関連し、そしてトランスロケーションが見られるヘパリンスルフェートプロテオグリカン（Ｐｅｒｌｅｃａｎ）（１ｐ３６．１）； 及び結腸癌（１ｐ３６−ｐ３５）。
【０３７１】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドプローブが、染色体１ｐ３６．１１欠失に関連する異常性又は遺伝子型、及びヒト疾病、及び好ましくは癌に関連するトランスロケーションを検出するために使用され得る。さらに、他の遺伝子座の中で、Ｃ１ｑ補体成分（Ｃ１ＱＡ， Ｂ， 及びＧ）（１ｐ３６．３−ｐ３４．１）；欠読証（１ｐ３６−ｐ３４）；リンパ活性化抗原ＣＤ３０（１ｐ３６）；ナトリウムチャネル非電圧−ゲート１型（１ｐ３６．３−ｐ３６．２）；ｚｃｙｔｏｒ１９がサイトカイン受容体である腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲＳＦ１ｂ及びＴＮＦＲＳ１２）（１ｐ３６．３−ｐ３６．２）；ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）（１ｐ３５）；硬性脊椎筋ジストロフィー（１ｐ３６−ｐ３５）についてのそれらの遺伝子座は、すべてヒト疾病状態において明白であり、そしてヒトゲノムのこの領域に位置する。
【０３７２】
ＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ−ｐｏｓｔ／Ｏｍｉｍ／ｇｅｔｍａｐ？ｃｈｒｏｒｎｏｓｏｍｅ＝１ｐ３６）。上の染色体１のこの領域について、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ Ｍａｎ （ＯＭＩＭＴＭ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ 遺伝子地図を参照のこと。それらのすべては、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子と同じ染色体領域への連鎖を示す遺伝性疾病についての可能性ある候補体遺伝子として作用する。従って、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドプローブは、それらの欠陥に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０３７３】
同様に、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子座自体における欠陥は、本明細書に論じられるような遺伝性ヒト疾病状態をもたらすことができる。ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子（１ｐ３６．１１）は、もう１つのクラスＩＩ受容体、すなわちｚｃｙｔｏｒ１９サイトカイン受容体遺伝子（１ｐ３５．１）（通常アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）及びＴＮＦ受容体（１ｐ３６．３−ｐ３６．２）近くに位置し、このことは、この染色体領域が通常、免疫機能のために調節され、そして／又は重要であることを示唆する。さらに、当業者は、サイトカイン受容体の欠陥がヒトにおける疾病状態を引き起こすことが知られていることを理解するであろう。
【０３７４】
例えば、成長ホルモン受容体突然変異は、小人症をもたらし（Ａｍｓｅｌｅｍ， Ｓなど．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１： ９８９−９９５， １９８９）、ＩＬ−２受容体γ突然変異は重度の組合された免疫欠損（ＳＣＩＤ）をもたらし（Ｎｏｇｕｃｈｉ， Ｍなど．， Ｃｅｌｌ ７３： １４７−１５７， １９９３）、ｃ−Ｍｐｌ突然変異は血小板減少をもたらし（Ｉｈａｒａ， Ｋなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９６： ３１３２−３１３６， １９９９）、そして重度のマイコバクテリア及びサルモネラ感染がインターロイキン−１２受容体−欠失患者をもたらす（ｄｅ Ｊｏｎｇ， Ｒなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０： １４３５−１４３９， １９９８）。従って、同様に、ｚｃｙｔｏｒ１９における欠陥は、疾病状態、又は疾病又は感染に対する敏感性を引き起こすことができる。
【０３７５】
ｚｃｙｔｏｒ１９は、多くの癌に関与する異常型についての染色体ホットスポトにおけるサイトカイン受容体であり、そしてプレ−Ｂ−細胞急性白血病細胞及び本明細書に記載される他の癌において発現されることが示されているので、本発明の分子はまた、癌形成又は転移に直接的に包含され得る。ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子は１ｐ３６．１１領域ｚｃｙｔｏｒ１９ に位置するので、ポリヌクレオチドプローブは、ヒト疾病、例えば免疫細胞癌、神経芽腫、骨髄癌、甲状腺、上皮小体前立腺癌、又は他の癌、又は免疫疾患に関連する、染色体１ｐ３６．１１損失、トリソミー、重複又はトランスロケーションを検出するために使用され得る。さらに、本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子欠陥に関連する、検出、診断予防及び処理を助けるであろう。
【０３７６】
診断は、疾病のタイプ及び適切な関連する治療の決定において医者を助けることができるか、又は遺伝的カウンセリングを助けることができる。それ自体、本発明の抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体、ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド、ｍＲＮＡ又は抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体の検出のために使用され、従って当業界において知られており、そして本明細書において記載される方法を用いて、本明細書に記載されるようにして、遺伝的疾病又は癌の検出のためのマーカーとして作用し、そしてそのために直接的に使用される。
【０３７７】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドプローブは、ヒト疾病に関連する染色体１ｐ３６．１１欠失及びトランスロケーション、又は悪性又は他の癌における染色体転位に関与することが予測される、腫瘍の悪性進行又は他の１ｐ３６．１１突然変異に関与する他のトランスロケーションに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。同様に、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドプローブが、染色体１ｐ３６．１１三染色体性、及びヒト疾病に関連する染色体欠失に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。従って、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドプローブは、それらの欠陥の関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０３７８】
上記で論じられるように、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子自体における欠陥は、遺伝性ヒト疾病状態をもたらすことができる。本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子欠陥に関連する疾病の検出、診断予防及び処理を助ける。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドプローブは、ｚｃｙｔｏｒ１９染色体遺伝子座で、疾病又は非疾病の個人間での対立遺伝子差異を検出するために使用され得る。それ自体、ｚｃｙｔｏｒ１９配列は、法的なＤＮＡプロフィーリングにおける診断として使用され得る。
【０３７９】
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界において知られている。分析用プローブは一般的に、少なくとも２０個の長さのｎｔを有するが、但し幾分短いプローブも使用され得る（例えば、１４−１７ｎｔ）。ＰＣＲプライマーは、少なくとも５個の長さのｎｔ、好ましくは１５又はそれ以上の長さのｎｔ、より好ましくは２０−３０個の長さのｎｔである。遺伝子又は染色体ＤＮＡの全体的な分析のために、ｚｃｙｔｏｒ１７ポリヌクレオチドプローブは、完全なエキソン又はそれ以上を含むことができる。エキソンは、ｚｃｙｔｏｒ１９配列（配列番号１、１８又は２０）とｚｃｙｔｏｒ１９についてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００２７８１号）とを比較することによって、容易に決定される。一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界に知られている。
【０３８０】
ほとんどの診断方法は、（ｉ）潜在的に疾病の患者、疾病の患者又は劣性疾病対立遺伝子の可能性ある非疾病キャリヤーから遺伝子サンプルを得；（ｉｉ）ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドプローブと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより（ここで、前記ポリヌクレオチドは、ＲＦＩＰ分析においては、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）、又は適切なＰＣＲ反応条件下でＰＣＲ反応において、センス及びアンチセンスプライマーと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより、第１反応生成物を生成し；（ｉｉｉ）前記第１反応生物を、電気泳動及び／又は他の既知方法により可視化し、例えば、前記第１反応生成物を、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドプローブ（ここで、前記ポリヌクレオチドは第１反応の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）により可視化し、そして（ｉＶ）正常又は対照の個人からの遺伝子サンプルの第２対照反応生成物と、前記可視化された第１反応生成物とを比較する段階を含んで成る。
【０３８１】
第１反応生成物と対照反応生成物との間の差異は、疾病又は潜在的に疾病の患者における遺伝子異常性の、又は非疾病患者についてのヘテロ接合性劣性キャリヤー表現型の存在の、又は疾病患者からの腫瘍における遺伝子欠陥の存在の、又は胎児又は移植前胚における遺伝子異常性の存在の表示である。例えば、制限フラグメントパターン、ＰＣＲ生成物の長さ、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子座の反復性配列の長さ、及び同様のもの差異は、遺伝子異常性、遺伝子異常型、又は正常な対照に比較しての対立遺伝子差異の表示である。対照は、サンプルの試験及び利用性に依存して、影響されていないファミリーメンバー又は無関係の個人からであり得る。
【０３８２】
本発明内への使用のための遺伝子サンプルは、患者からのいずれかの組織又は他の生物学的サンプル、例えば血液、唾液、精子、胚細胞、羊水及び同様のもの（但し、それらだけには限定されない）から単離されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを包含する。ポリヌクレオチドプローブ又はプライマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、そして配列番号１、１８又は２０の一部、配列番号１、１８又は２０の補体、又はそれらのＲＮＡ同等物を含んで成る。ヒト疾病表現型ヘの遺伝子連鎖分析を示すそのような方法は、当業界において良く知られている。
【０３８３】
診断における、ＰＣＲに基づく方法の参照のためには、一般的、次の文献を参照のこと：Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９１）， Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ）， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ， １９９３）， Ｃｏｔｔｅｒ （ｅｄ）， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｈａｎａｕｓｅｋ ａｎｄ Ｗａｌａｓｚｅｋ （ｅｄｓ．）， Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ。（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８）． Ｌｏ （ｅｄ）， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８）， 及びＭｅｌｔｚｅｒ （ｅｄ）， ＰＣＲ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９８））。
【０３８４】
ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子座に関連する突然変異は、直接的名突然変異分析のための標準の方法、例えば制限フラグメント長さ他型現象分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体分析、増幅−不応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、ＲＮアーゼ切断方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析により、本発明の核酸分子を用いて検出され得る（例えば、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９１）， Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８：２５５ （１９９５）， Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｅｌｌｅｓ （ｅｄ．） Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （ｅｄ．）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６）， Ｂｕｒｒｅｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｏｌ． ２： Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８）， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）， 及びＲｉｃｈａｒｄｓ ａｎｄ Ｗａｒｄ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ，” ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｐａｇｅｓ ８３−８８ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓａ． Ｉｎｃ． １９９８） を参照のこと）。
【０３８５】
突然変異についてのｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子の直接的な分析は、対象のゲノムＤＮＡを用いて行われ得る。末梢血液リンパ球から得られるゲノムＤＮＡを増幅するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉなど． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ａｔ ｐａｇｅ ７．１．６ ｔｏ ７．１．７ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８） を参照のこと）。
【０３８６】
“トランスジェニックマウス”として言及される、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子を発現するように構築されたマウス、及び“ノックアウトマウス”として言及される、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子機能の完全な不在を示すマウスがまた、生成され得る（Ｓｎｏｕｗａｅｒｔなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： １０８３， １９９２； Ｌｏｗｅｌｌなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３６６： ７４０−７４２， １９９３； Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １２８８−１２９２， １９８９； Ｐａｌｍｉｔｅｒなど．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２０： ４６５−４９９， １９８６）。例えば、偏在的に、又は組織−特異的又は組織−制限されたプロモーター下でｚｃｙｔｏｒ１９を過剰発現するトランスジェニックマウスは、過剰発現が表現型を引き起こすかどうかを決定するために使用さえ得る。
【０３８７】
例えば、野生型ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド、そのポリペプチドフラグメント又は変異体の過剰発現は、正常な細胞工程を変更することができ、ｚｃｙｔｏｒ１９発現が機能的に適切であり、そしてｚｃｙｔｏｒ１９、そのアゴニスト又はアンタゴニストのための治療標的物を示すことができる組織を同定する表現型をもたらす。例えば、構築する好ましいトランスジェニックマウスは、“優性−陰性”表現型を発現するマスス、例えば結合されるトランスメンブランドメインと共に細胞外サイトカイン結合ドメインを含んで成るｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチド（トランスメンブランドメインに整合して結合される配列番号２又は１９のアミノ酸２１（Ａｒｇ）〜２４９（Ｔｒｐ）；配列番号４）を過剰発現するマウスである。
【０３８８】
もう１つの好ましいトランスジェニックマウスは、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体、例えば本明細書に開示されるそれらの受容体を過剰発癌するマウスである。さらに、そのような過剰発現は、ヒト疾病との類似性を示す表現型をもたらすことができる。同様に、ノックアウトｚｃｙｔｏｒ１９マウスは、ｚｃｙｔｏｒ１９がインビボで絶対的に必要とされる場所を決定するために使用され得る。ノックアウトマウスの表現型は、ｚｃｙｔｏｒ１９アンタゴニスト、例えば本明細書に記載されるそれらのもののインビボ効果を予測することができる。マウス又はヒトｚｃｙｔｏｒ１９ ｃＲＮＡは、ネズミｚｃｙｔｏｒ１９ｍＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを単離するために使用され得、これはノックアウトマウスを生成するために使用される。
【０３８９】
それらのトランスジェニック及びノックアウトマウスは、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質をインビボシステムにおいて研究するために使用され得、そして対応するヒト又は動物疾病（例えば、市販の生存動物集団におけるそれらの疾病）のためのインビボモデルとして使用され得る。本発明のマウスモデルは、癌生物学及び進行の研究のための腫瘍モデルとして特に適切である。そのようなモデルは、ヒト癌に使用される治療分子の開発及び効力において有用である。ｚｃｙｔｏｒ１９発現の上昇、及びｚｃｙｔｏｒ１９発現の下降が、特定のヒト癌に関連するので、トランスジェニックマウス及びノックアウトマウスの両者は、癌のための有用な動物モデルとして作用する。
【０３９０】
さらに、好ましい態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１９トランスジェニックマウスは、特定の腫瘍、特に食道、肝臓、卵巣、直腸、胃、及び子宮腫瘍、及びメラノーマ、Ｂ−細胞白血病及び他のリンパ癌のための動物モデルとして作用することができる。さらに、本明細書に記載される、ｚｃｙｔｏｒ１７に対して向けられた、ｚｃｙｔｏｒ１９アンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムのトランスジェニックマウス発現がまた、上記トランスジェニックマウスと同じようにして使用され得る。
【０３９１】
医薬使用のためには、本発明の可溶性受容体ポリペプチドは、従来の方法に従って、非経口、特に静脈内又は皮下供給のために配合される。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤は、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体ポリペプチドを、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと共にを含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【０３９２】
配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９ｔｈ ｅｄ．， １９９５に開示される。治療用量は、一般的に、０．１〜１００μｇ／ｋｇ患者の体重／日、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり、そして正確な用量は処理される病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従って、臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、１週間又はそれ以下にわたって、しばしば１〜３日間にわたって投与され得、又は慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。一般的に、ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体ポリペプチドの治療的有効量は、臨床学的に有意な効果を生成するのに十分な量である。
【０３９３】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、さらに、遺伝学及び分子生物学、タンパク質化学、及び抗体生成及び分析に関連する実験用実習キットにおいて教育用用具として有用であろう。その独得のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のために、ｚｃｙｔｏｒ１９の分子は、試験のための標準として、又は“未知”として使用され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドは、ｚｃｙｔｏｒ１９が発現されるべき遺伝子である、融合構造体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構造体をいかにして調製するかを学生に教授するために；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を決定するために；組成におけるｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ及びＤＮＡ位置を決定するために（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及びポリメラーゼ鎖反応による）；そして核酸ハイブリダイゼーションにより関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドを同定するために、補助体として使用され得る。
【０３９４】
ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドは、抗体の調製；ウェスターンブロットによるタンパク質の同定；タンパク質の精製；発現された合計のタンパク質に対する割合としての発現されたｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの重量の決定；ペプチド分解部位の同定；アミノ及びカルボキシル末端標識のカップリング；アミノ酸配列分析；及び生来の及び標識されたタンパク質（すなわち、受容体結合、シグナルトランスダクション、増殖及び分化）の生物学的活性のインビトロ及びインビボでのモニターリングのための補助体として、教育的に使用され得る。
【０３９５】
ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、質量分析学、コンホメーション、例えば４個のαヘリックスを決定するために、円ニ色性を、原子の立体構造を詳細に決定するために、Ｘ−線結晶学を、溶液におけるタンパク質の構造を表すために、核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、ｚｃｙｔｏｒ１９を含むキットが、学生の分析熟練を開発するために未知のタンパク質として、又は学生の熟練の試験として、分析する学生に与えられ得る。アミノ酸配列は教師によっては知られており、すなわちタンパク質は学生の熟練を決定し、又はその熟練を進展せしめるための試験として学生に提供されるので、教師は、学生がポリペプチドを正しく分析したかどうかを知ることができる。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、ｚｃｙｔｏｒ１９の教育的利用はそれ自体ユニークであろう。
【０３９６】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９は組織−特異的発現を有し、そしてクラスＩサイトカイン受容体構造及び明白な染色体局在化、及び発現パターンを有するポリペプチドであるので、活性は増殖アッセイ、本明細書に記載されるルシフェラーゼ及び結合アッセイを用いて測定され得る。さらに、単球、前立腺、リンパ及び他の組織におけるｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現は、診断及び組織−特異的同定及び方法の使用において学生を訓練するために分析され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドは、その遺伝子座が知られているので、染色体検出及び診断方法の使用に基づいて学生を訓練するために使用され得る。
【０３９７】
さらに、学生は、ヒト染色体１について、及びより特定には、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子が位置する遺伝子座１ｐ３６．１１について訓練され、そして教育され得る。そのようなアッセイは、当業界において良く知られており、そしてサイトカイン受容体タンパク質について学生を教授し、そしてｚｃｙｔｏｒ１９と当業界における他のサイトカイン受容体との間の種々の性質、例えば細胞に対する細胞効果、酵素運動学、種々の抗体結合親和性、組織特異性及び同様のものを試験するために、教育環境において使用され得る。
【０３９８】
ｚｃｙｔｏｒ１９に対して特異的に結合する抗体は、ｚｃｙｔｏｒ１９を精製し、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、そして配列決定するために、親和性クロマトグラフィーカラムをいかにして調製するかを学生に教授するための教授援助として、及び従って、ヒト適合された抗体をいかにして企画するかを学生に教授するための実習課目として使用され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９に対して特異的に結合する抗体は、例えば当業界において知られている組織学的及び現場方法を用いて、Ｂ−細胞組織、食道、肝臓、卵巣、直腸、胃及び子宮腫瘍、及びメラノーマ、プレ−Ｂ−細胞リンパ芽球生白血病、及び他のリンパ癌の検出への使用のための教授助剤として使用され得る。
【０３９９】
次に、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、試薬会社によりパッケージされ、そして学生が分子生物学の分野において熟練を得るために大学及び他の教育機関に市販される。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は、実験実習課目における学生のためのユニークな挑戦及び学習経験を創造する。ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子、ポリペプチド又は抗体を含むそのような教育用キットは、本発明の範囲内で有ると思われる。
【０４００】
本発明は、次の非−制限的例によりさらに例示される。
実施例
例１．十分な長さのヒトｚｃｙｔｏｒ１９ｃＤＮＡの同定及び単離
ｚｃｙｔｏｒ１９を、ヒトゲノムＤＮＡからの予測される十分な長さのｃＤＮＡとして同定した。その予測される十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１に示され、そして対応するポリペプチドは、配列番号２に示される。十分な長さの変異ｚｃｙｔｏｒ１９ ｃＤＮＡ配列を同定し、そして配列番号１８として示し、そしてその対応するポリヌクレオチドを、配列番号１９として示す。さらに、切断された可溶性形のｚｃｙｔｏｒ１９ ｃＤＮＡ配列番号を同定し、そして配列番号２０として示し、そしてその対応するポリヌクレオチドを配列番号２１として示す。
【０４０１】
例２．ノザンブロット及びＰＣＲを用いての組織パネルにおける組織分布
Ａ．ノザンブロットを用いてのヒトｚｃｙｔｏｒ１９組織分布：
Ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｓ （Ｈｕｍａｎ １２−ｌａｎｅ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ Ｉ ａｎｄ ＩＩ， 及びＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ ＩＩ） （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、プローブし、ヒトｚｃｙｔｏｒ１９発現の組織分布を決定した。配列番号１又は１８に対してハイブリダイズするＰＣＲ由来のプローブを、標準ＰＣＲ増幅方法を用いて増幅する。典型的なＰＣＲ増幅を次の通りに行った：９４℃で１分、６５℃で１分及び７２℃で１分（３０サイクル）；続いて７２℃で７分（１サイクル）。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により可視化し、そして約５００ｂｐのＰＣＲ生成物を、本明細書に記載のようにしてゲル精製した。プローブを、ＰＲＩＭＥ ＩＴ ＩＩＴＭ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を用いて、その製造業者の説明書に従って、放射性ラベルした。
【０４０２】
プローブを、ＮＵＣＴＲＡＰＴＭ プッシュカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて精製した。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢＴＭ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） 溶液を、プレハイブリダイゼーションのために、及びノザンブロットのためのハイブリダイゼーション溶液として使用した。プレハイブリダイゼーションは、６８℃で２時間、行われた。ハイブリダイゼーションは、約１．５×１０６ｃｐｍ／ｍｌのラベルされたプローブにより６８℃で一晩を要した。プローブを、室温で２×ＳＳＣ、０．０５％のＳＤＳにより３度、続いて、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより５０℃で１０分間、１度、洗浄した。Ｘ−線フィルムへの暴露の後、配列番号１、１８又は２０の長さ、又は配列番号２、１９又は２１をコードするｍＲＮＡの長さに対応する転写体が、ｚｃｙｔｏｒ１９を特異的に発現する組織に見出されることが予測されるが、しかし他の組織においては見出されない。
【０４０３】
ノザン分析をまた、ヒト癌細胞系ＭＴＮＴＭ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） を用いて行う。ＰＣＲ及びプロービング条件は上記の通りである。癌系における強いシグナルは、ｚｃｙｔｏｒ１９が、活性化された細胞において発現され、そして／又は癌性疾病状態を、示すことを示唆された細胞において発現され、そして／又は癌性疾病状態を示すことを示唆する。さらに、当業界において知られている方法を用いての、活性化されたリンパ球細胞のノザンブロット又はＰＣＲ分析はまた、ｚｃｙｔｏｒ１９が活性化された免疫細胞において発現されるかどうかを示すことができる。電子ノザーン情報に基づけば、ｚｃｙｔｏｒ１９は、プレ−Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞において特異的に発現することが示された。
【０４０４】
Ｂ．ＰＣＲを用いての組織パネルにおける組織分布：
ヒト組織からのｃＤＮＡのパネルを、ＰＣＲを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１９発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして種々の正常及び癌性ヒト組織からの９４種のマラソンｃＤＮＡ及びｃＤＮＡサンプルを包含し、そして細胞系は下記表５に示される。前記ｃＤＮＡは自家ライブラリーからであり、又はマラソンｃＤＮＡは自家ＲＮＡ調製物、すなわちＣｌｏｎｔｅｃｈ ＲＮＡ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＮＡからであった。マラソンｃＤＮＡは、マラソン−ＲｅａｄｙＴＭ キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて製造され、そしてクラスリンプライマーＺＣ２１，１９５（配列番号６）及びＺＣ２１，１９６（配列番号７）によりＱＣ試験し、そして次に、クラスリンバンドの強さに基づいて希釈された。
【０４０５】
パネルサンプルの性質を評価するために、品質管理（ＱＣ）についての次の３種の試験を行った：（１）ライブラリーのために使用されるＲＮＡ品質を評価するために、自家ｃＤＮＡを、個々のｃＤＮＡライブラリーについてのベクター配列に対して特異的であるベクターオリゴによるＰＣＲにより、平均挿入体について試験し；（２）パネルサンプルにおけるｃＤＮＡの濃度の標準化を、５’ベクターオリゴＺＣ１４，０６３（配列番号８）及び３’α−チューブリン特異的オリゴプライマーＺＣ１７，５７４（配列番号９）又は３’Ｇ３ＰＤＨ特異的オリゴプライマーＺＣ１７，６００（配列番号１０）を用いて、十分な長さのαチューブリン又はＧ３ＰＤＨ ｃＤＮＡを増幅するために、標準のＰＣＲ方法を用いて達成し；そして（３）サンプルを、可能なリボソーム又はミトコンドリアＤＮＡ汚染について調べるために配列決定に送った。
【０４０６】
パネルを、ヒトゲノムのＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ， Ａｌｔｏ， ＣＡ）陽性対照サンプルを含む９６−ウェル形式において組みたてた。個々のウェルは約０．２〜１００ｐｇ／μｌのｃＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応を、オリゴＺＣ３７６８５（配列番号２６）及びＺＣ３７６８１（配列番号２７）、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ （ＴＡＫＡＲＡ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ． ＬＴＤ， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｊａｐａｎ）， 及びＲａｄｉｌｏａｄ 色素（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて組みたてた。増幅を次の通りに行った：９４℃で２分（１サイクル）、９４℃で３０秒、７０℃で３０秒（５サイクル）、９４℃で３０秒、６４℃で３０秒及び７２℃で３０秒（３５サイクル）、続いて７２℃で５分（１サイクル）。約１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、４％アガロースゲルを用いての標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。
【０４０７】
正しい推定されるＤＮＡフラグメントサイズを、副腎、膀胱、頸部、結腸、胎児心臓、胎児皮膚、肝臓、肺、メラノーマ、卵巣、唾液腺、小腸、胃、脳、胎児肝臓、腎臓、前立腺、脊椎、甲状腺、胎盤、精巣、食道癌、肝臓癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、子宮癌、骨髄、ＣＤ３＋ライブラリー、ＨａＣＡＴ ライブラリー、ＨＰＶライブラリー、及びＨＰＶＳライブラリーにおいて観察した。このプライマー対はイントロンに及ばないので、ゲノムＤＮＡ又はプロセッシングされていないｍＲＮＡ情報により汚染されているいくつかの組織がこのアッセイにおいて誤った陽性を創造する危険性が存在する。
【０４０８】
従って、イントロンに及ぶ種々のプライマー対ＺＣ３８４８１（配列番号４７）及びＺＣ３８６２６（配列番号４８）を、上記方法を用いて、組織分布を再評価するために使用した。予測される正しいＤＮＡフラグメントサイズ（２５６ｂｐ）を、結腸、胎児心臓、胎児肝臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、前立腺、唾液腺、小腸、脂肪細胞ライブラリー、脳ライブラリー、ランゲルハンス島ライブラリー、及び前立腺ライブラリー、ＲＰＭＩ １７８８ （Ｂ−細胞系）、脊椎、胎盤ライブラリー、精巣、食道癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、ＨａＣＡＴライブラリー、ＨＰＶライブラリー、及びＨＰＶＳライブラリーにおいて観察した。
【０４０９】
マウス組織パネルをまた、上記方法を用いて、もう１つの組のプライマー対：（１）ＺＣ３８７０ｂ（配列番号４９）及びＺＣ３８７１１（配列番号５０）（８００ｂｐの生成物）により試験した。このパネルは、マウスｚｃｙｔｏｒ１９についての次の制限された組織分布を示した：マウス前立腺細胞系、唾液腺ライブラリー及び皮膚。
【０４１０】
【表５】
2004532611.tif 000007
【０４１１】
【表６】
2004532611.tif 000008
【０４１２】
例３．ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子のＰＣＲに基づく染色体マッピング
ｚｃｙｔｏｒ１９を、市販のＧｅｎｅｂｒｉｄｇｅ ４ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ（ＲＨ）Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐａｎｅｌ （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて、染色体１にマッピングした。そのＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ ＲＨ Ｐａｎｅｌは、９３の放射線ハイブリッドクローンの個々からのＰＣＲ可能ＤＮＡ、及び２種の対照ＤＮＡ（ＨＦＬ ドナー及びＡ２３受容体）を含む。公開されているＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）は、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐａｎｅｌにより構成されたヒトゲノムのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ放射線ハイブリッド地図（“ＷＩＣＧＲ”放射線ハイブリッド地図）に関してのマッピングを可能にする。
【０４１３】
ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ ４ ＲＨ Ｐａｎｅｌによるｚｃｙｔｏｒ１９のマッピングのために、２０μｌの反応体をＰＣＲのために適合する９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に提供し、そして”ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎ ９６” 熱サイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において使用した。個々の９５のＰＣＲ反応体は、２μｌの１０×ＫｌｅｎＴａｑ ＰＣＲ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）、１．６μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、１μｌのセンスプライマー、ＺＣ２７，８９５ （配列番号１４）、１１μｌのアンチセンスプライマー、ＺＣ２７，８９９ （配列番号２４）、２μｌのＲｅｄｉＬｏａｄ （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）、０．４μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ ポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、２５ｎｇ の個々のハイブリッドクローン又は対照からのＤＮＡ、及び２０μｌの合計体積のためのｄｄＨ２Ｏから構成された。
【０４１４】
反応を同量の鉱油により被覆し、そして密封した。ＰＣＲサイクラー条件は次の通りであった：９４℃で５分間の変性、初期の１サイクル、９４℃で４５秒間の変性、５４℃で４５秒間のアニーリング及び７２℃で１．２５分間の延長、３５サイクル、続いて７２℃で７分間の延長、最終の１サイクル。反応を、２％アガロースゲル上で電気泳動により分離し（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）、そして臭化エチジウムによる染色により可視可した。その結果は、ｚｃｙｔｏｒ１９が１ｐ３６．１１染色体領域における染色体１ ＷＩＣＧＲ放射線ハイブリッド地図上に位置することを示した。
【０４１５】
例４．次のｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体を発現する哺乳類発現ベクターの構成：ｚｃｙｔｏｒ１９ ＣＥＥ， ｚｃｙｔｏｒ１９ ＣＦＬＧ，ｚｃｙｔｏｒ１９ ＣＨＩＳ及びｚｃｙｔｏｒ１９−Ｆｃ４
Ａ． ｚｃｙｔｏｒ１９ ＣＥＥ， ｚｃｙｔｏｒ１９ ＣＦＬＧ及びｚｃｙｔｏｒ１９ ＣＨＩＳを含むｚｃｙｔｏｒ１９哺乳類発現ベクターの構成
発現ベクター、すなわちｐＺｐ９ｚｃｙｔｏｒ１９ＣＥＥを、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドの可溶性、細胞外ドメインの発現のために調製し、ここで前記構造体は、予測される開始メチオニンから成り、そして予測されるトランスメンブランドメインに隣接して切断され、そしてＣ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識（配列番号１１）を有するｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドを発現するよう企画されている。
【０４１６】
本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１９細胞外又はサイトカイン結合ドメインを含んで成るｚｃｙｔｏｒ１９ ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲを用いて創造し、そして標準方法を用いて精製する。切除されたＤＮＡを、シグナルペプチド、例えば生来のｚｃｙｔｏｒ１９シグナルペプチドを有するプラスミド発現ベクター中にサブクローン化し、そしてｚｃｙｔｏｒ１９ポリペプチドコードのポリヌクレオチド配列のＣ−末端にＧｌｕ−Ｇｌｕ標識（配列番号１１）を結合する。そのような哺乳類発現ベクターは、哺乳類プロモーター、コード配列の挿入のための複数の制限部位、停止コドン及び哺乳類ターミネーターを有する発現カセットを含む。このプラスミドはまた、複製のＥ．コリ起点、ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複数の起点を有する哺乳類選択マーカー発現単位、ＤＨＦＲ遺伝子及びＳＶ４０ターミネーターも有することができる。
【０４１７】
制限消化されたｚｃｙｔｏｒ１９挿入体及び前に消化されたベクターを、標準の分子生物学技法を用いて連結し、そしてＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中に、その製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートし、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートした。コロニーを、個々のコロニーから調製されたＤＮＡの制限分析によりスクリーンした。陽性クローンの挿入体配列を、配列分析により確かめた。大規模プラスミド調製を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）Ｍａｘｉ ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って行った。
【０４１８】
同じ方法を用いて、一列に並んでの６個のＨｉｓ残基から成るＣ−末端ｈｉｓ標識及びＣ−末端フラッグ（配列番号１２）標識、すなわちｚｃｙｔｏｒ１９ ＣＦ１．ＡＧを有するｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体を調製した。それらの構造体を調製するためには、前記ベクターは、ｇｌｕ−ｇｌｕ標識（配列番号１１ ）の変わりにＨＩＳ又はＦＬＡＧ（商標）標識のいずれかを有する。
【０４１９】
Ｂ．可溶性ヒトｚｃｙｔｏｒ１９受容体、すなわちｚｃｙｔｏｒ１９−Ｆｃ４の哺乳類発現構成
発現ベクター、ｚｃｙｔｏｒ１９／Ｆｃ４／ｐｚｍｐ２０を調製し、ＢＨＫ細胞においてｚｃｙｔｏｒ１９のＣ末端Ｆｃ４標識された可溶性型（ヒトｚｃｙｔｏｒ１９−Ｆｃ４）を発現した。ｚｃｙｔｏｒ１９受容体の細胞外ドメインからのポリヌクレオチド配列を含む、ｚｃｙｔｏｒ１９ ｃＤＮＡのフラグメントを、Ｆｃ４ポリヌクレオチド配列（配列番号１３）に整合して融合し、ｚｃｙｔｏｒ１９−Ｆｃ４融合体（配列番号２２及び２３）を生成した。Ｐｚｍｐ２０ベクターは、Ｆｃ４ポリヌクレオチド配列、及び標準の分子生物学技法を用いてＣ−末端Ｆｃ４融合体の急速な構成を可能にするクローニング部位を含む哺乳類発現ベクターである。
【０４２０】
ヒトｚｃｙｔｏｒ１９の細胞外ドメイン、及びそれぞれ、５’及び３’末端上にコードされるＢａｍＨＩ及びＢｇｌ２部位と共にを含む、６３０塩基対のフラグメントをＰＣＲにより生成した。このＰＣＲフラグメントを、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからの増幅により、プライマーＺＣ３７９６７（配列番号２４）及びＺＣ３７９７２（配列番号２５）を用いて生成した。ＰＣＲ反応条件は次の通りであった：９４℃で２０秒及び６８℃で２分；（３０サイクル）；６８℃で４分（１サイクル）；続いて１０℃でのソーキング。フラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌ２制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そして続いて、１％ゲル電気泳動、及びＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてのバンド精製により精製した。得られる精製されたＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌ２部位のＦｃ４ ３’を含む、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌ２により前もって消化されたｐｚｍｐベクター中に、室温で５時間、連結した。
【０４２１】
１μｌの連結混合物を、３７μｌのＤＨ１０ＢエレクトロコンピテントＥ．コリ（Ｇｉｂｃｏ）において、製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートした。形質転換された細胞を、４００μｌのＬＢ培地に希釈し、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートした。クローンを制限消化により分析し、そして陽性クローンをＤＮＡ配列決定のために送り、融合構造体の配列を確かめた。
【０４２２】
例５．ｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体ポリペプチドのトランフェクション及び発現
Ａ． 哺乳類発現ヒトｚｃｙｔｏｒ１９可溶性受容体：ｚｃｙｔｏｒ１９／Ｆｃ４
ＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ： ＣＲＬ−１０３１４）を、Ｔ−７５組織培養フラスコにプレートし、そしてＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ， （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、５％ウシ胎児血清、１ｍＭのＬ−グルタミン（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅａ， ＫＳ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））において、３７℃で５％ＣＯ２において、約５０〜７０％の集密性まで増殖した。次に、細胞を、血清フリー（ＳＦ）培地配合物（ＤＭＥＭ、１０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｍｇ／ｍｌのインスリン、２ｍｇ／ｍｇのフェチュイン、１％のＬ−グルタミン及び１％のピルビン酸ナトリウム）において、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ （Ｇｉｂｃｃｏ ＢＲＬ） を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１９／Ｆｃ４／ｐｚｍｐ２０（例４Ｂ）を含むプラスミドによりトランスフェクトした。
【０４２３】
１０μｇのプラスミドＤＮＡ ｚｃｙｔｏｒ１９／Ｆｃ４／ｐｚｍｐ２０（例４Ｂ）を、１５ｍｌの管中に希釈し、ＳＦ培地により５００μｌの最終合計体積にした。５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを、４５０μｌのＳＦ培地と共に混合した。そのＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を、ＤＮＡ混合物に添加し、そして室温で約３０分間インキュベートした。４ｍｌのＳＦ培地を、ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物に添加した。細胞を５ｍｌのＳＦ培地により１度すすぎ、吸引し、そしてＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を添加した。細胞を３７℃で５時間インキュベートし、そして次に、５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地を添加した。
【０４２４】
フラスコを３７℃で一晩インキュベートし、この後、細胞を、１：２、１：１０及び１：５０で、１５０ｍｍのプレートに１μＭのメトトレキセート又は１０μＭのメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む上記からの選択培地（ＤＭＥＭ／ＰＢＳ培地）中に分けた。トランスフェクションの約１０日後、１μＭのメトトレキセート耐性コロニーの１つの１５０ｍｍプレートを、トリプシン処理し、細胞をプールし、そして細胞の半分を１０μＭのメトトレキセートに再プレートし、ｚｃｙｔｏｒ１９／Ｆｃ４タンパク質の発現をさらに増殖した。この増幅された細胞のプールからのならし培地サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターン分析を用いて、発現レベルについて試験した。
【０４２５】
可溶性受容体を発現する単一のクローンを、単離し、スクリーンし、そして細胞培養培地において増殖し、そして標準技法を用いて精製した。さらに、ＣＨＯ細胞はまた、そのような目的のための適切な細胞である。
【０４２６】
例６．ＯＲＩＧＥＮアッセイを用いてのｚｃｙｔｏｒ１９受容体へテロダイマー化の評価
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９受容体ｚｃｙｔｏｒ１９ ＣＦＬＡＧ （例４及び５）、又はｇｐ１３０ （Ｈｉｂｉ， Ｍ． など．， Ｃｅｌｌ６３： １１４９−１１５７， １９９０） を、５倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｃｅ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）との反応により、製造業者のプロトコールに従って、ビオチニル化する。可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９受容体及び他の可溶性受容体サブユニット、例えば可溶性クラスＩＩサイトカイン受容体、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）可溶性受容体を、ラベルする。このサブファミリーにおける受容体は会合し、シグナルを形質導入するホモダイマーを形成する。
【０４２７】
それらの可溶性受容体を、５倍モル過剰のＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＳ（Ｉｇｅｎ、Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）により、製造業者のプロトコールに従って、ラベルする。可溶性ｚｃｙｔｏｒ１９受容体のビオチニル化され、そしてＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＰ−ラベルされた形は、それぞれＢｉｏ− ｚｃｙｔｏｒ１９受容体及びＲｕ− ｚｃｙｔｏｒ１９と命名され；他の可溶性受容体サブユニットのビオチニル化され、そしてＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＳ−ラベルされた形も同様に命名され得る。アッセイを、ｚｃｙｔｏｒ１９へテロダイマー受容体を結合するリガンドを発現する細胞からのならし培地を用いて、又は精製されたリガンドを用いて行うことができる。好ましいリガンドは、クラスＩヘテロダイマーサイトカイン受容体、例えばＩＬ−１０、 ＩＬ−９、 ＩＬ−ＴＩＦ、 インターフェロン、ＴＳＬＰ（Ｌｅｖｉｎｅ，ＳＤなど．， 前記；Ｉｓａｋｓｅｎ， ＤＥなど．， 前記；Ｒａｙ， ＲＪなど．， 前記；Ｆｒｉｅｎｄ， ＳＬなど．，前記）及び同様のものを結合することができるそれらのリガンドである。
【０４２８】
初期受容体結合特徴化のために、一連サイトカイン又はならし培地を、それらがｚｃｙｔｏｒ１９受容体ホモダイマー化を介在することができるかどうか、及びそれらが上記の可溶性サブユニットｚｃｙｔｏｒ１９受容体へのヘテロダイマー化を介在できるかどうかを決定するために試験する。これを行うために、５０μｌのならし培地又はＴＢＳ−Ｂ含有の精製されたサイトカインを、例えば４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ− クラスＩＩサブユニット及びＢｉｏ− ｚｃｙｔｏｒ１９、又は４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ− ｚｃｙｔｏｒ１９受容体及びＢｉｏ−ｇｐ１３０、又は４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ−ＩＬ２Ｒγ及びＢｉｏ− ｚｃｙｔｏｒ１９を含むＴＢＳ−Ｂ（２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．２）５０μｌと組合す。
【０４２９】
室温での１時間のインキュベーションに続いて、３０μｇのストレプタビジン被覆された、２．８ｍｍの磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ， Ｉｎｃ．， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）を添加し、そしてその反応を、室温でさらに１時間インキュベートする。次に、２００μｌのＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝液（Ｉｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を添加し、そして受容体会合の程度を、Ｍ８  ＯＲＩＧＥＮ分析機（Ｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて測定する。
【０４３０】
例７．ｚｃｙｔｏｒ１９ 受容体へテロダイマーを生成するための構造体
分泌されたヒトｚｃｙｔｏｒ１９へテロダイマーを発現するベクターを構成する。この構造体においては、ｚｃｙｔｏｒ１９の細胞外サイトカイン−結合ドメインを、ＩｇＧガンマ１（ＩｇＧγ１）（配列番号１４ 及び１５）のＨ鎖に融合し、そしてヘテロマ−サイトカイン受容体サブユニット（例えば、クラスＩＩサイトカイン受容体、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）受容体）の細胞外部分を、ヒトカッパＬ鎖（ヒトκＬ鎖）（配列番号１６及び１７）に融合する。
【０４３１】
Ａ．ＩｇＧγ１及びヒトκＬ鎖融合ベクターの構成：
ＩｇＧγ１（配列番号１４）のＨ鎖を、Ｚｅｍ２２９Ｒ哺乳発現ベクター（ＡＴＣＣ寄託番号６９４４７号）中にクローン化し、その結果、５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＮｈｅＩ部位を有するいずれかの所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインをクローン化でき、Ｎ−末端細胞外ドメイン−Ｃ−末端ＩｇＧγ１融合体をもたらすことができる。この構造体に使用されるＩｇＧγ１フラグメントを、鋳型としてＣｌｏｎｔｅｃｈ ｈＦｅｔａｌ Ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡライブラリーからＩｇＧγ１配列を単離するために、ＰＣＲを用いることにより製造する。ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて、精製し、そしてＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、エタノール沈殿し、そして本明細書に開示される標準の分子生物学技法を用いて、ＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩにより前もって消化されたＺｅｍ２２９中にＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩリンカーを含んで成る、オリゴと共に連結する。
【０４３２】
ヒトκＬ鎖（配列番号１６）を、Ｚｅｍ２２８Ｒ哺乳類発現ベクター（ＡＴＣＣ寄託番号６９４４６号）においてクローン化し、その結果、５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＫｐｎＩ部位を有する、いずれかのサイトカイン受容体細胞外ドメインがクローン化し、Ｎ−末端サイトカイン細胞外ドメイン−Ｃ−末端ヒトκＬ鎖融合体をもたらすことができる。ＫｐｎＩ部位はヒトκＬ鎖配列（配列番号１６におけるヌクレオチド６２の後を、ＫｐｎＩ酸素により分解される）内に位置するので、特定のプライマーが、サイトカイン受容体の所望する細胞外ドメインの３’末端を、このＫｐｎＩ部位中にクローン化するよう企画される。前記プライマーは、その得られるＰＣＲ生成物が、ＫｐｎＩ部位までのヒトκＬ鎖（配列番号１６）のセグメントと共に、所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインを含むよう企画される。
【０４３３】
このプライマーは好ましくは、配列番号１６に５’側で融合される所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインの３’末端の少なくとも１０個のヌクレオチドの部分を含んで成る。この構造体に使用されるヒトκＬ鎖フラグメントを、上記で使用されるのと同じＣｌｏｎｔｅｃｈヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーからヒトκＬ鎖配列を単離するために、ＰＣＲを用いることによって製造する。ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、エタノール沈殿せしめ、そして本明細書に開示される標準の分子生物学技法を用いて、ＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩにより前もって消化されたＺｅｍ２２８Ｒ中に、上記ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩリンカーにより連結する。
【０４３４】
Ｂ．融合ベクター構造体中へのｚｃｙｔｏｒ１９受容体又はヘテロダイマーサブユニット細胞ドメインの挿入
上記構造ベクターを用いて、ＩｇＧγ１に融合されるｚｃｙｔｏｒ１９を有する構造体を製造する。この構成は、標準方法及びＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ制限部位を供給するオリゴを用いて、前立腺ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）又は活性化されたリンパ球ｃＤＮＡライブラリーからの本明細書に記載されるｚｃｙｔｏｒ１９受容体の細胞外サイトカイン−結合ドメインを、ＰＣＲ処理することによって行われる。その得られるＰＣＲ生成物を、本明細書に記載のようにして、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩにより消化し、ゲル精製し、そして上記の前もってＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ消化され、そしてバンド−精製されたＺｅｍ２２９Ｒ／ＩｇＧγＩ中に連結する。得られるベクターを、配列決定し、ｚｃｙｔｏｒ１９／ＩｇＧガンマ１融合体（ｚｃｙｔｏｒ１９／Ｃｈ１ ＩｇＧ）が正しいことを確認する。
【０４３５】
κＬ鎖に融合されるヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニット細胞外ドメインを有する別々の構造体をまた、上記のようにして構成する。サイトカイン受容体／ヒトκＬ鎖の構成を、標準方法を用いて、例えばリンパ球ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ制限部位を供給するオリゴから、ＰＣＲにより上記のようにして行う。得れれるＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩにより消化し、そして次に、この生成物を、上記のようにして、前もってＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ消化され、そしてバンド−精製されたＺｅｍ２２８Ｒ／ヒトκＬ鎖ベクター中に連結する。得られるベクターを配列決定し、サイトカイン受容体サブユニット／ヒトκＬ鎖融合体が正しいことを確認する。
【０４３６】
Ｄ．ｚｃｙｔｏｒ１９及びヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニット細胞外ドメインの同時−発現
約１５μｇの個々の上記ベクターを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓＴＭ 試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、製造業者の説明書に従って、哺乳類細胞、例えばＢＨＫ−５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）中に同時トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、１μＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）及び０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）において、１０日間、選択する。得られるトランスフェクタントのプールを、１０μｍのＭＴＸ及び０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８において再び選択する。
【０４３７】
得られる二重選択された細胞のプールを用いて、タンパク質を生成する。このプールの３種の画分（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、血清フリーのならし培地１０Ｌを生成する。このならし培地を、１ｍｌのタンパク質−Ａカラム上に通し、そして約１０， ７５０μｌの画分に溶出する。最高のタンパク質濃度を有する画分をプールし、そしてＰＢＳに対して透析する（１０ｋＤのＭＷのカットオフ）。最終的に、透析された材料を、通常の方法を用いてのアミノ酸分析（ＡＡＡ）のために提供する。
【０４３８】
例８．インビトロでのｚｃｙｔｏｒ１９受容体の再構成
ｚｃｙｔｏｒ１９−シグナル化複合体に包含される成分を同定するために、受容体再構成の研究を、次の通りにして行う。例えば、ルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクタープラスミドにより、本明細書に記載される標準方法を用いて、トランスフェクトされたＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）は、ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドの存在下でルシフェラーゼレポーターに対する、トランスフェクトされたｚｃｙｔｏｒ１９受容体複合体からのシグナルトランスダクション応答を測定するために、バイオアッセイ細胞系として作用する。ＢＨＫ細胞は、ＢＨＫ細胞がｚｃｙｔｏｒ１９受容体を内因的に発現しない場合において使用され得る。他の細胞系も使用され得る。
典型的なルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクターは、次の４種の遺伝子からのＳＴＡＴ転写因子結合要素を含む相補的オリゴヌクレオチドにより構成されたＫＺ１３４プラスミドである：修飾されたｃ−ｆｏｓ Ｓｉｓ誘発性要素（ｍ６７ＳＩＥ又はｈＳＩＥ）（Ｓａｄｏｗｓｋｉ， Ｈ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： １７３９−１７４４， １９９３）、 ｐ２１ ＷＡＦ１遺伝子からのｐ２１ ＳＩＥ１（Ｃｈｉｎ，Ｙ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２： ７１９−７２２， １９９６）、β−カゼイン遺伝子の乳腺応答要素（Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｎｅｙ， Ｍ． など．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１： ３７４５−３７５５， １９９１）、及びＦｃｇ ＲＩ遺伝子のＳＴＡＴ誘発性要素（Ｓｅｉｄｅｌ，Ｈ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２： ３０４１−３０４５， １９９５）。
【０４３９】
それらのオリゴヌクレオチドは、Ａｓｐ７１８−ＸｈｏＩ適合性末端を含み、そして同じ酵素により消化されたｃ−Ｆｏｓプロモーター（Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｌ．Ｋ． など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ６２２９−６２３２， １９９８）を有し、そしてネオマイシン選択マーカーを含む受容体ホタルルシフェラーゼレポーターベクター中に、標準の方法を用いて連結された。ＫＺ１３４プラスミドを用いて、ＢＨＫ又はＢａＦ３細胞を標準のトランスフェクション及び選択方法により安定してトランスフェクトし、それぞれ、ＢＨＫ／ＫＺ１３４又はＢａＦ３／ＫＺ１３４細胞系を製造する。
【０４４０】
バイオアッセイ細胞を、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体のみによりトランスフェクトし、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体及び種々の他の既知受容体サブユニットの１つにより同時にトランスフェクトする。受容体複合体は、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体のみ、クラスＩＩサイトカイン受容体、例えばインターフェロンγ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖、ｚｃｙｔｏｒ１１ （通常、アメリカ特許第５，９６５，７０４号所有の）、ＣＲＦ２−４、ＤＩＲＳ１、ｚｃｙｔｏｒ７（通常、アメリカ特許第５，９４５，５１１号所有の）受容体と、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体との種々の組み合わせを包含するが、但しそれらだけには限定されない。次に、個々の独立した受容体複合体細胞系を、サイトカイン−ならし培地又は精製されたサイトカインの存在下でアッセイし、そしてルシフェラーゼ活性を通常の方法を用いて測定する。
【０４４１】
トランスフェクトされていないバイオアッセイ細胞系は、バックグランドルシフェラーゼ活性のための対照として作用し、そして従って、種々の受容体複合体組み合わせによるシグナルを比較するための基線として使用される。正しい受容体複合体の存在下でｚｃｙｔｏｒ１９受容体を結合するならし培地又はサイトカインは、バックグラウンドよりも約５倍又はそれ以上のルシフェラーゼ読み取りを付与することが予測される。
他方では、ＢａＦ３／ ｚｃｙｔｏｒ１９細胞系が上記のように同時−トランスフェクトされ、そして増殖が、既知アッセイ、例えば標準Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ増殖アッセイを用いて、測定される類似するアッセイを行うことができる。
【０４４２】
例９．ＣＯＳ細胞トランスフェクション及び分泌トラップ
分泌トラップアッセイを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体リガンドを同定することができる。ｚｃｙｔｏｒ２９はクラスＩＩサイトカイン受容体であるので、既知の又は孤児サイトカインとｚｃｙｔｏｒ１９ｓＲ／Ｆｃ４融合タンパク質との結合を試験した。サイトカイン（ヒトＩＬ−ＴＩＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＬ−１０を包含する）のｃＤＮＡを含むｐＺＰＴ発現ベクターを、ＣＯＳ細胞中にトランスフェクトし、そしてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞へのｚｃｙｔｏｒ１９ｓＲ／Ｆｃ４の結合を、下記に記載される分泌トラップアッセイを用いて行う。このアッセイにおける陽性結合は、可能性あるｚｃｙｔｏｒ１９受容体−リガンド対を示す。
【０４４３】
Ａ．ＣＯＳ細胞トランスフェクション
ＣＯＳ細胞トランスフェクションを次の通りに行った：５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ及び４５μｌの血清フリーＤＭＥＭ培地と共に、５０μｌの血清フリーＤＭＥＭ培地（５００ｍｇのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中、５５ｍｇのピルビン酸ナトリウム、１４６ｍｇのＬ−グルタミン、５ｍｇのトランスフェリン、２．５ｍｇのインスリン、１μｇのセレニウム及び５ｍｇのフェチュイン）中、０．７５μｇのサイトカインＤＮＡを混合する。室温で３０分間インキュベートし、そして次に、４００μｌの血清フリーＤＭＥＭ培地を添加する。この５００μｌの混合物を、１２−ウェル組織培養プレート上にプレートされる１．５×１０５個のＣＯＳ細胞上に添加し、そして３７℃で５時間インキュベートする。５００μｌの２０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地（５００ｍｌのＤＭＥＭ中、１００ｍｌのＦＢＳ、５５ｍｇのピルビン酸ナトリウム及び１４６ｍｇのＬ−グルタミン）を添加し、そして一晩インキュベートする。
【０４４４】
Ｂ．分泌トラップアッセイ
分泌トラップを次の通りにして行った：培地上の細胞を、ＰＢＳによりすすぎ、そしてＰＢＳ中、１．８％ホルムアルデヒドにより１５分間、固定した。次に、細胞を、ＴＮＴ（水中、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）により２度、洗浄し、そしてＰＢＳ中、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにより１５分間、透過せしめ、そしてＴＮＴにより３度、洗浄した。細胞を、水中、ＴＮＢ（０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．５％のブロッキング試薬（ＮＥＮ Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ ＴＳＡ−Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ）により１時間、阻止した。細胞を、ＴＮＢ中、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ又は０．２５μｇ／ｍｌのｚｃｔｏｒ１９−Ｆｃ４可溶性受容体融合タンパク質（例１０）と共に１時間インキュベートした。次に、細胞をＴＮＴにより３度、洗浄し、そしてＴＮＢ中に、１：１０００で希釈されたヤギ−抗−ヒトＩｇ−ＨＲＰ（Ｆｃ４特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によりさらに１時間インキュベートした。再び、細胞をＴＮＴにより洗浄した。
【０４４５】
正の結合を、希釈緩衝液（ＮＥＮキット）中、１：５０に希釈されたフルオレセインチラミド試薬により検出し、そして４．５分間インキュベートし、そしてＴＮＴにより洗浄した。細胞を、ＴＮＴ中、１．５に希釈されたＶｅｃｔａｓ ｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ） により保存した。細胞を蛍光顕微鏡上でＦＴＴＣフィルターを用いて可視化した。
【０４４６】
ｚｃｙｔｏｒ１９はクラスＩＩサイトカイン受容体であるので、既知の又は孤児のサイトカインとのｚｃｙｔｏｒ１９ｓＲ／Ｆｃ４融合タンパク質の結合を試験する。サイトカイン（中でも、ヒトＩＬ−ＴＩＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＬ−１０）のｃＤＮＡを含むｐＺＰ７発現ベクターを、ＣＯＳ細胞中にトランスフェクトし、そしてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞へのｚｃｙｔｏｒ１９ｓＲ／Ｆｃ４の結合を、上記のような分泌トラップアッセイを用いて行う。このアッセイにおける正の結合は、可能性あるｚｃｙｔｏｒ１９受容体−リガンド対を示す。
【０４４７】
例１０．Ｅ．コリにおけるヒトｚｃｙｔｏｒ１９の発現
Ａ．ｚｃｙｔｏｒ１９−ＭＢＰ融合発現ベクターｐＴＡＰ１７０／ｚｃｙｔｏｒ１９の構成：
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＮ末端に融合されるヒトｚｃｙｔｏｒ１９の一部をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを、相同組換えを通して構成した。ヒトｚｃｙｔｏｒ１９ ｃＤＮＡ（配列番号１）のフラグメントを、ＰＣＲを用いて、単離した。次の２種のプライマーを、ＰＣＲ反応におけるヒトｚｃｙｔｏｒ１９フラグメントの生成に使用した：（１）ベクターフランキング配列４０ｂｐ及びヒトｚｃｙｔｏｒ１９のアミノ酸末端に対応する２４ｂｐを含むプライマーＺＣ３９２０４（配列番号３０）、及び（２）フランキングベクター配列に対応する３’末端側の４０ｂｐ及びヒトｚｃｙｔｏｒ１９のカルボキシル末端に対応する２４ｂｐを含むプライマーＺＣ３９２０５（配列番号３１）。
【０４４８】
ＰＣＲ反応条件は次の通りであった：９４℃で１分（１サイクル）；次に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び６８℃で１．５分（２０サイクル）；続いて４℃でのソーキング（二重反復して行われる）。個々の１００μｌのＰＣＲ反応の５μｌを、分析のために１×ＴＢＥ緩衝液と共に１．０％アガロースゲル上で試験し、そして約７００ｂｐのフラグメントの予測されるバンドを見出した。残りの９５μｌのＰＣＲ反応を、４００μｌの絶対エタノールにより沈殿された第２のＰＣＲ管と共に組合し、そして下記のように、ＭＢＰ−ヒトｚｃｙｔｏｒ１９融合体をコードする構造体を生成するために、Ｓｍａ１により切断された受容体ベクターｐＴＡＰ１７０中に組合すために使用される水１０μｌに再懸濁した。
【０４４９】
プラスミドｐＴＡＰ１７０は、プラスミドｐＲＳ３１６及びｐＭＡＬ−ｃ２に由来する。プラスミドｐＲＳ３１６は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シャトルベクターである（Ｈｉｅｔｅｒ Ｐ． ａｎｄ Ｓｉｋｏｒｓｋｉ， Ｒ．， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２： １９−２７， １９８９）。ｐＭＡＬ−Ｃ２ （ＮＥＢ）は、Ｅ．コリ発現プラスミドである。それは、ｔａｃプロモーター駆動ＭａｌＥ（ＭＢＰコードの遺伝子）、続いて、Ｈｉｓ標識、トロンビン切断部位、クローニング部位及びｒｒｎＢターミネーターを担持する。ベクターｐＴＡＰ１７０を、酵母相同組換えを用いて構成する。
【０４５０】
１００ｎｇのＥｃｏＲＩ切断された、ｐＭＡＬ−ｃ２を、１μｇのＰｖｕＩ切断されたｐＲＳ３１６， １μｇのリンカーと共に組合し、そして１μｇのＳｃａＩ／ＥｃｏＲＩ切断されたｐＲＳ３１６を、ＰＣＲ反応において組合す。オリゴｚｃ１９，３７２ （１００ｐモル）：ｚｃ１９，３５１ （１ｐモル）：ｚｃ１９，３５２ （１ｐモル）及びｚｃ１９，３７１ （１００ｐモル）から成るリンカーを、ＰＣＲ反応において組合した。条件は次の通りであった：９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒（１０サイクル）；続いて４℃でのソーキング。ＰＣＲ生成物を、１００％エタノール沈殿を通して濃縮した。
【０４５１】
１００μｌのコンピテント酵母細胞（Ｓ．セレビシアエ）を、約１μｇのヒトｚｃｔｏｒ１９挿入体及び１００ｎｇのＳｍａＩ消化されたｐＴＡＰ１７０ベクターを含む混合物１０μｌと共に組合し、そして０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移した。その酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ （５ｋＶ／ｃｍ）， 無限オーム、２５μＦで電気パルスした。個々のキュベットに、１．２Ｍのソルビトール６００μｌを添加した。次に、酵母を、２−ＵＲＡＤプレート上に２つの３００μｌのアリコートでプレートし、そして３０℃でインキュベートした。
【０４５２】
約４８時間後、単一のプレートからＵｒａ＋酵母形質転換体を、１ｍｌの水に再懸濁し、そして少々の時間、回転せしめ、酵母細胞をペレット化した。その細胞ペレットを、１ｍｌの溶解緩衝液（２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， １％ＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。５００μｌの溶解混合物を、３００μｌの酸洗浄されたガラスビーズ及び５００μのフェノール−クロロホルムを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に添加し、１分間隔で２又は３度、回転せしめ、続いて６分後までに、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機において最大速度で回転せしめた。３００μｌの水性相を、新しい管に移し、そしてＤＮＡを６００μｌのエタノール（ＥｔＯＨ）により沈殿し、続いて、４℃で１０分間、遠心分離した。ＤＮＡペレットを、１００μｌの水に再懸濁した。
【０４５３】
エレクトロコンピテントＥ．コリ細胞（ＭＣ１０６１， Ｃａｓａｄａｂａｎなど．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３８， １７９−２０７）の形質転換を、１μｌの酵母ＤＮＡ調製物及び４０μｌのＭＣ１０６細胞により行った。細胞を、２．０ｋＶ， ２５μＦ及び４００オームで電気パルスした。エレクトロポレーションに続いて、０．６ｍｌのＳＯＣ（２％のＢａｃｔｏＩ Ｔｒｙｐｔｏｎ （Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）， ０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４， ２０ｍＭのグルコース）を、細胞に添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、細胞を、ＬＫ Ｋａｎプレート（ＬＢブイヨン（Ｌｅｎｏｘ）、１．８％のＢａｃｔｏＴＭ Ａｇａｒ （Ｄｉｆｃｏ）， ３０ｍｇ／ｌのカナマイシン）上に、１アリコートでプレートとした。
【０４５４】
ヒトｚｃｙｔｏｒ１９のための正しい発現構造体を有する個々のクローンを発現により同定した。細胞を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンと共に、ＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｎｓｏｎ）において一晩、増殖した。その一晩の培養物５０μｌを用いて、２ｍｌの新しいＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ ＩＩ＋３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを接種した。培養物を、３７℃で２時間、振盪しながら増殖した。
【０４５５】
１ｍｌの培養物を、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘発した。２〜４時間後、個々の培養物２５０μｌを、５％のβＭＥ及び色素を含むＴｈｏｒｎｅｒ緩衝液（８Ｍのウェア、１００ｍＭのトリス、ｐＨ７．０、１０％グルセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ）２５０ｍｌと共に混合した。サンプルを５〜１０分間、煮沸した。その２０μｌを、４％−１２％のＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ）上のレーン当たりに負荷した。ゲルを１×ＭＥＳ緩衝液において展開した。陽性クローンを、ｐＴＡＰ３１７と命名し、そして配列分析にゆだねた。ｐＴＡＰ３１７内のＭＢＰ−ｚｃｙｔｏｒ１９融合体のポリヌクレオチド配列を、配列番号３２として示し、そしてＭＢＰ−ｚｃｙｔｏｒ１９融合体のその対応するポリペプチド配列を、配列番号３３として示す。
【０４５６】
Ｂ． ヒトｚｃｙｔｏｒ１９の細菌発現：
１０μｌの配列決定ＤＮＡを、次の反応においてＮｏｔ Ｉ（ＮＥＢ）により消化し、ＣＥＮ−ＡＲＳを除去した：３７℃で１時間、１０μｌのＤＮＡ、３μｌの緩衝液３（ＮＥＢ）、１５μｌの水、及び２μｌのＮｏｔＩ（１０Ｕ／μｌＮＥＢ）。次に、消化物７μｌを、２μｌの５×緩衝液及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μｌ ＢＲＬ）と共に混合した。反応を室温で１時間インキュベートした。反応体１μｌを用いて、Ｅ．コリ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ）を形質転換した。細胞を、２．０ｋＶ， ２５μＦ及び４００オームで電気パルスした。細胞を、２．０ｋＶ， ２５μＦ及び４００オームで電気パルスした。エレクトロポレーションに続いて、０．６ｍｌのＳＯＣ（２％のＢａｃｔｏＩ Ｔｒｙｐｔｏｎ （Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）， ０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４， ２０ｍＭのグルコース）を、細胞に添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、細胞を、ＬＫ Ｋａｎプレート（ＬＢブイヨン（Ｌｅｎｏｘ）、１．８％のＢａｃｔｏＴＭ Ａｇａｒ （Ｄｉｆｃｏ）， ３０ｍｇ／ｌのカナマイシン）上に、１アリコートでプレートとした。個々のクローンを、酵母マーカー及び複製配列の不在について診断消化物により分析した。
【０４５７】
陽性クローンを用いて、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む、Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の一晩の開始培養物を接触した。その開始培養物を用いて、５００μｌのＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ ＩＩ＋Ｋａｎによりそれぞれ充填された４個の２Ｌ−そらせ板付きフラスコを接種した。ＯＤ６００が４．１に達するまで、培養物を３７℃で２５００ｒｐｍで振盪した。この点で、培養物を、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘発した。培養物を、３７℃で、２５０ｒｐｍでさらに２時間、増殖し、この点で、２ｍｌを分析するために保存し、そして残りを遠心分離により収穫した。ペレットを、タンパク質精製のために移行するまで、−８０℃で保存した。
【０４５８】
例１１．ｚｃｙｔｏｒ１９−Ｆｃ４融合体についての精製スキーム
すべての工程は、特にことわらない限り、４℃で行った。ならし培地を、まず２０倍に、Ａｍｉｃｏ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｐｉｒａｌ 遠心分離機１０ｋＤ  ＭＷＣＯ（周囲温度）を用いて濃縮した。次に、その濃縮された培地を、適切なサイズのＰＯＲＯＳ ５０Ａ （プロテインＡを結合された）カラムに、最適な捕獲流速で適用した。カラムを、１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝液により洗浄し、次に、３ＣＶの０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３）により急速に溶出した。集められた画分は、ｐＨを約７．２に中和するために、溶出の前、予測される体積の２ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）を有した。
【０４５９】
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｄ （Ｓｉｇｍａ） により染色されたＮｕＰＡＧＥゲルを展開し、溶出液を分析した。興味ある画分をプールし、そして３０ｋＤ ＭＷＣＯ遠心分離濃縮機を用いて、呼称体積まで濃縮した。濃縮されたプロテインＡプールを、適切なサイズのＰｈａｍｉｃｉａ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ２００カラム上に注入し、凝集物を除去し、そしてタンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．３）中に交換した。再び、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ （Ｓｉｇｍａ） により染色されたＮｕＰＡＧＥゲルを用いて、溶出液を分析した。画分をプールした。Ｗｅｓｔｅｒｎ及びＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ （Ｓｉｇｍａ） により染色されたＮｕＰＡＧＥゲルを展開し、純度及び含有率を確かめた。さらなる分析のために、タンパク質をＡＡＡ及びＮ−末端配列決定のために提出した。ＡＡＡ分析及びＮ−末端配列決定はｚｃｙｔｏｒ１９−Ｆｃポリペプチドを確かめ；Ｎ−末端アミノ酸配列は、予測されるＳＲＰＲＬ ＡＰＱＸ ＶＴＬＬＳ ＱＮＦＳＶ （配列番号３４） の通りであった。
【０４６０】
例１２．複数組織及び血液画分第１鎖ｃＤＮＡパネルのＲＴ−ＰＣＲ分析に基づいてのヒトｚｃｙｔｏｒ１９発現
ｚｃｙｔｏｒ１９の遺伝子発現を、市販の標準化された複数組織第１鎖ｃＤＮＡパネル（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ； ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて試験した。それらは、Ｏｒｉｇｅｎｅ’ｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕ Ｒａｐｉｄ−ＳｃａｎＴＭ Ｐａｎｅｌ （２４種の異なった組織を含む） 及び次のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ （ＭＴＣＴＭ） Ｐａｎｅｌｓ を含んだ：Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ １ （８種の異なった成人組織を含む）、Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ＩＩ （８種の異なった成人組織を含む）、 Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ （８種の異なった退治組織を含む）、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ （７種の異なった器官から癌を含む）、Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ（９種の異なった血液画分を含む）及びＨｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ （６種の異なった器官及び末端血液リンパ球を含む）。
【０４６１】
ＰＣＲ反応を、４２６ｂｐの生成物を生成するｚｃｙｔｏｒ１９特異的オリゴプライマーＺＣ４０２８５（配列番号３５）及びＺＣ４０２８６（配列番号３６）、Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）及びＲｅｄｉＬｏａｄＴＭ 色素（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を組みたてた。ＰＣＲサイクラー条件は次の通りであった：９５℃で１５分の初期変性（１サイクル）、９５℃で４５秒の変性、６３℃で１分のアニーリング及び７２℃で１分１５秒の延長（３５サイクル）、続いて７２℃で７分の最終延長（１サイクル）。反応物を、２％アガロースゲル（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）上での電気泳動により分離し、そして臭化エチジウムによる染色により可視化した。
【０４６２】
正しいサイズのＤＮＡフラグメントを、次のヒト成人組織において観察した：副腎、骨髄、結腸、心臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、小腸、膵臓、胃、精巣、甲状腺及び扁桃。正しいサイズのＤＮＡフラグメントを、次のヒト胎児組織において観察した：心臓、肝臓、肺、腎臓、骨格筋、脾臓、及び胸腺。正しいサイズのＤＮＡフラグメントを次のヒト血液画分において観察した：末梢血液リンパ球、単核細胞（Ｂ−細胞、Ｔ−細胞及び単球）、休止ＣＤ８＋細胞（Ｔ−サプレッサー／細胞性）、休止ＣＤ１９＋細胞（Ｂ−細胞）、活性化された単核細胞及び活性化されたＣＤ４＋細胞。正しいサイズのＤＮＡフラグメントを次の腫瘍組織において観察した：乳癌、結腸腺癌、肺癌、卵巣癌、膵臓腺癌及び前立腺性腺癌。
【０４６３】
ｚｃｙｔｏｒ１９はそれらの特定の腫瘍組織において発現されるので、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体は、本明細書に開示されるように、腫瘍マーカーとして使用され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９に対する抗体は、抗−腫瘍活性、及び抗体の毒素−接合体、サイトカイン接合体又は他の接合体、又はｚｃｙｔｏｒ１９受容体リガンド自体を有する。ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドンのアンタゴニスト、例えば抗−ｚｃｙｔｏｒ１９抗体又は可溶性受容体がまた、抗−腫瘍試薬として作用することができる。
【０４６４】
例１３．ｚｃｙｔｏｒ１９ ＫＯマウスの生成及び分析
Ａ．マウスｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子に関して陽性のＢＡＣクローンの同定
マウスｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子に関して陽性の１つのＢＡＣクローンを、Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ’ｓ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ） Ｅａｓｙ−ｔｏ−Ｓｃｒｅｅｎ ＤＮＡ Ｐｏｏｌｓ， ＢＡＣ Ｍｏｕｓｅ ＥＳ （Ｒｅｌｅａｓｅ Ｉ） を用いて、製造業者の説明書に従って同定した。オリゴヌクレオチドを、部分的エキソン６、完全なイントロン６及び部分的エキソン７配列を含むＰＣＲフラグメントを生成するよう企画した。
【０４６５】
ＰＣＲ反応を、１．７５単位のＡｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、２５μｌで行った。２μｌ又は１０μｌのＢＡＣライブラリーＤＮＡを、６７ｍＭのトリス、ｐＨ８．８、１６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．７ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのゼラチン、１０％ジメチルスルホキシド、１ｍＭのデオキシヌクレオチド、１４０ｎＭの前方向プライマーＺＣ３９１２８（配列番号３７）及び１４０ｎＭの逆方向プライマーＺＣ３９１２９（配列番号３８）を含む緩衝液において、鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は次の通りであった：９５℃で１分；９５℃で１５秒、５５℃で３０秒及び６８℃で３０秒（３０サイクル）；及び６８℃で２分；続いて４℃での維持。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。陽性ＰＣＲ生成物は、１．１４９ｂｐであることが見出された。
【０４６６】
マウスｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子に関して陽性の４種の追加のＢＡＣクローンを、Ｉｎｃｙｔｅ’ｓ ＢＡＣ Ｍｏｕｓｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｓｅｔ （Ｒｅｌｅａｓｅ ＩＩ） を用いて、製造業者の説明書に従って同定した。オリゴヌクレオチドを、マウスｃＤＮＡ鋳型からの部分エキソン６及び部分エキソン７配列を含むＰＣＲフラグメントを生成するよう企画した。
【０４６７】
ＰＣＲ反応を、１．７５単位のＡｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、２５μｌで行った。２μｌのＮｅｏｎａｔａｌ Ｍｏｕｓｅ皮膚ｃＤＮＡライブラリー（ＪＡＫ ０６２７００Ｂ）を、６７ｍＭのトリス、ｐＨ８．８、１６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．７ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのゼラチン、１０％ジメチルスルホキシド、１ｍＭのデオキシヌクレオチド、１４０ｎＭの前方向プライマーＺＣ３９１２８（配列番号３７）及び１４０ｎＭの逆方向プライマーＺＣ３９１２９（配列番号３８）を含む緩衝液において、鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は上記と同じであった。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、そしてＱｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用いて精製した。陽性ＰＣＲ生成物は、１．１４９ｂｐであることが見出された。単離された約４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） Ｒａｎｄａｍ Ｐｒｉｍｅｒ ラベリングキットを用いてラベルし、そしてＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−２００ＨＲカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製した。
【０４６８】
ラベルされたプローブを用いて、Ｉｎｃｙｔｅの７個のフィルターＢＡＣライブラリー組をスクローンした。ハイブリダイゼーションを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、５５℃で一晩、行った。次に、フィルターを、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより５０℃で３０分間、３度洗浄し、一晩オートラジオグラフィー処理し、そして陽性クローンを同定するために、製造業者のグリッドパターンに比較した。
【０４６９】
Ｂ．ｚｃｙｔｏｒ１９マウス陽性ＢＡＣの特徴化
１２９／ＳｖＪ胚幹細胞ライブラリー（Ｒｅｌｅａｓｅ Ｉ及びＩＩ）からの５種のｚｃｙｔｏｒ１９マウス陽性ＢＡＣクローンを、Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから得た。ＢＡＣクローンを、液体培地において、Ｅ．コリ宿主株内で増殖し、そしてＢＡＣ大プラスミド精製キットＭＫＢ−５００（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて、製造業者の説明書に従って抽出した。５種のＢＡＣのうち４種は、ＰＣＲにより決定されるように、少なくとも２，０００ｂｐの５’未翻訳領域、エキソン１及びエキソン５を含むことが見出された。
【０４７０】
１００ｎｇの個々のＢＡＣ ＤＮＡを、次の条件を用いて、鋳型として使用した：ＰＣＲ反応を、６７ｍＭのトリス、ｐＨ８．８、１６．６ｎＭの（ＮＨｒ）２ＳＯ４， ６．７ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのゼラチン、１０％ジメチルスルホキシド、１ｍＭのデオキシヌクレオチド、１４０ｎＭの前方向及び１４０ｎＭの逆方向プライマーを含む緩衝液中、１．７５単位のＡｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、２５μｌで行った。ＰＣＲ条件は次の通りであった：９５℃で１分；９５℃で１５秒、５５℃で３０秒及び６８℃で３０秒（３０サイクル）；及び６８℃で２分；続いて４℃での維持。
【０４７１】
ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により分析した。前方向プライマーＺＣ４０７８４（配列番号３９）及び逆方向プライマーＺＣ４０７８５（配列番号４０）部分５’ＵＴＲを用いて増幅し、そして９５７ｂｐであることが見出された。前方向プライマーＺＣ４０７８６（配列番号４１）及び逆方向プライマーＺＣ４０７８７（配列番号４２）部分５’ＵＴＲ、完全エキソン１及び部分イントロン１を用いて増幅し、そして約９５０ｂｐであることが見出された。前方向プライマーＺＣ３９１２８（配列番号３７）、及び部分エキソン６、完全イントロン６及び部分エキソン７を含む前方向はプライマーＺＣ３９１２９（配列番号３８）を用いて、増幅し、そして１，１４９ｂｐであることが見出された。
【０４７２】
５種のＢＡＣクローンのうち４種は、サザン分析によれば、少なくとも３．７９６ｂｐの５’ＵＴＲ及び少なくとも６，９２２ｂｐの３’ＵＴＲを含むことが見出された。オリゴヌクレオチドＺＣ４０７８４（配列番号３９）及びＺＣ３９１２９（配列番号３８）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて末端ラベリングし、そして制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により消化された５種のＢＡＣ候補体を含むサザンブロットをプローブするために使用した。結果は、５種のＢＡＣのうち４種が少なくとも３，７９６ｂｐの５’ＵＴＲを含み、そして５種のＢＡＣのうち５種が少なくとも６，９２２ｂｐの３’ＵＴＲを含むことを示した。
【０４７３】
Ｃ．ｚｃｙｔｏｒ１９マウスイントロン６配列の決定
オリゴヌクレオチドを、部分エキソン６、完全イントロン６及び部分エキソン７配列を含むＰＣＲフラグメントを生成するよう企画した。
ＰＣＲ反応を、１．７５単位のＡｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、２５μｌで行った。１００ｎｇの１２９／ＳｖマウスゲノムＤＮＡを、６７ｍＭのトリス、ｐＨ８．８， １６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４， ６．７ｍＭのＭｇＣｌ２， ５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｇのゼラチン、１０％ジメチルスルホキシド、１ｍＭのデオキシヌクレオチド、１４０ｎＭの前方向プライマーＺＣ３９１２８（配列番号３７）及び１４０ｎＭの逆方向プライマーＺＣ３９１２９（配列番号３８）を含む緩衝液において鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は上記の通りであった。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、そして１．１４９ｂｐであることが見出された。次に、ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。イントロン６配列の決定は、オリゴＺＣ２９１２８（配列番号３７）及びＺＣ３９１２９（配列番号３８）を用いて、配列分析により行われた。
【０４７４】
Ｄ．ｚｃｙｔｏｒ１９マウスイントロン５配列の決定
オリゴヌクレオチドを、部分エキソン５、完全イントロン５及び部分エキソン６配列を含むＰＣＲフラグメントを生成するよう企画した。ＰＣＲ反応を、１．７５単位のＡｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、２５μｌで行った。１００ｎｇの１２９／ＳｖマウスゲノムＤＮＡを、６７ｍＭのトリス、ｐＨ８．８， １６．６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４， ６．７ｍＭのＭｇＣｌ２， ５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｇのゼラチン、１０％ジメチルスルホキシド、１ｍＭのデオキシヌクレオチド、１４０ｎＭの前方向プライマーＺＣ３９４０８（配列番号４３）及び１４０ｎＭの逆方向プライマーＺＣ３９４０９（配列番号４４）を含む緩衝液において鋳型として使用した。
【０４７５】
ＰＣＲ条件は次の通りであった：９５℃で１分；９５℃で１５秒、５５℃で３０秒及び６８℃で３０秒（３０サイクル）；及び６８℃で２分；続いて４℃での維持。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、そして３５６ｂｐであることが見出された。次に、ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。イントロン６配列の決定は、オリゴＺＣ３９４０８（配列番号４３）及びＺＣ３９４０９（配列番号４４）を用いて、配列分析により行われた。
【０４７６】
Ｅ．マウスｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子のＫＯ構成体の生成のためのオリゴヌクレオチドの企画
Ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子の生物学的機能を調べるために、ノックアウトマウスモデルを、胚幹（ＥＳ）細胞において相同組換え技法により生成する。このモデルにおいて、コードするエキソン１，２及び３を欠失し、ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子のヌル突然変異を創造する。この欠失は、ｚｃｙｔｏｒ１９タンパク質の翻訳開始コドン、シグナルドメイン、及び細胞ドメインの一部を除去し、従ってｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子を不活性化する。
【０４７７】
ＥＴクローニング技法を用いて、ＫＯベクター（Ｓｔｅｗａｒｔなど．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７： ６， １９９９）を生成する。まず、カナマイシン耐性カセットを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１９マウス遺伝子のイントロン１，２及び３を置換する。前方向オリゴヌクレオチド（配列番号４５）を、ｚｃｙｔｏｒ１９ｍの５’ＵＴＲに対して相同の５２ｂｐ部分、ＳｆｉＩ， ＦｓｅＩ， ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を有する４２ｂｐのリンカー、及びカナマイシン耐性カセットの５’末端に対して相同の２７ｂｐの部分を有する、長さ１２１個のヌクレオチドであるよう企画する。
【０４７８】
逆方向ノックアウトオリゴヌクレオチド（配列番号４６）を、ｚｃｙｔｏｒ１９ｍの５’ＵＴＲに対して相同の５２ｂｐ部分、ＳｆｉＩ， ＦｓｅＩ， ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を有する４２ｂｐのリンカー、及びカナマイシン耐性カセットの５’末端に対して相同の２７ｂｐの部分を有する、長さ１２１個のヌクレオチドであるよう企画する。上記オリゴヌクレオチドを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１９マウスの５’ＵＴＲに対して相同性を有する最初の５２ｂｐ部分及びイントロン３に対して相同性を有する少なくとも５０ｂｐの部分と共に、完全なカナマイシン耐性カセットを含む、長さ１０７３ｂｐのＰＣＲフラグメントを合成することができる。
【０４７９】
次に、前記フラグメントを用いて、ＥＴクローンニングによりノックアウトベクターを構成し、ここでｚｃｙｔｏｒマウス陽性ＢＡＣ細胞宿主がグリセロールによる処理によりコンピテントにされ、次にプラスミドｐＢＡＤａｌｐｈａ／ｂｅｔａ／ｇａｍｍａ（Ａｍｐ） によりトランスフェクトされる。クロラムフェニコール及びアンピシリンに対する耐性が形質転換された細胞を選択する。次に、細胞を、相同アームを含むカナマイシンＰＣＲフラグメントにより再形質転換するｐＢＡＤａｌｐｈａ／ｂｅｔａ／ｇａｍｍａ（Ａｍｐ）のβ及びγ組換えタンパク質を、Ｒｅｄα遺伝子の活性化を通して、増殖培地へのアラビノースの添加により誘発する。
【０４８０】
組換えＢＡＣを、カナマイシン及びアンピシリンに対する耐性により選択し、次にＰＣＲによりスクリーンする。組換えＢＡＣが同定されると、カナマイシン耐性カセット挿入の上流の少なくとも１，８００ｂｐの配列、及び下流の少なくとも６，０００ｂｐの配列を含むフラグメントを、ｐＧＥＭ７由来のベクター中にサブクローン化する。次に、カナマイシン耐性カセットを、ＩＲＥＳ／ＬａｃＺ／Ｎｅｏ−ＭＣ１カセットにより、標準の連結クローニングにより置換する。ＩＲＥＳは、脳心筋炎由来の内部リボソーム侵入配列である。それを、レポーターｌａｃＺ遺伝子に整合して融合し、ポリＡシグナルに連結する。
【０４８１】
ＩＲＥＳ／ＬａｃＺレポーター遺伝子の下流のＭＣ１プロモーターは、Ｇ４１８耐性選択マーカーＮｅｏ遺伝子の発現を駆動する。選択マーカーカセットは、すべての３種の読み取り枠における停止コドンを含む。従って、薬物耐性遺伝子Ｎｅｏは、胚幹（ＥＳ）細胞において、相同組換え現象の選択のために使用される。ＩＲＥＳ／ＬａｃＺレポーター遺伝子は、相同組換えの後、置換された遺伝子の発現をモニターするために使用されるであろう。ＥＳ細胞におけるノックアウトベクター及び標的遺伝子座の相同組換えが、長さ約５，２００ｂｐであるＩＲＥＳ／ＬａｃＺ／Ｎｅｏ−ＭＣ１カセットによる、野生型遺伝子座の完全エキソン１，２及び３を含む合成１７，９８０ｂｐの部分の置換を誘導する。
【０４８２】
Ｆ．ｚｃｙｔｏｒ１９ＫＯマウスの生成
上記ＫＯベクターを、ＰｍｅＩ消化により線状化し、そしてＥＳ細胞中にエレクトロポレートする。相同組換え現象を、ＰＣＲスクリーニング技法により同定し、そして標準のＫＯプロトコールを用いて、サザンブロット分析により確かめる。Ａ．Ｌ． Ｊｏｙｎｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９３を参照のこと。
【０４８３】
相同組換え現象が同定されると、ＥＳ細胞を拡張し、そして未分化胚芽細胞中に注入し、キメラを生成する。キメラ性雄を用いて、Ｃ５７ｂｌａｃｋ雌を交雑し、ヌル突然変異の生殖系伝達を達成する。Ｈｏｇａｎ， Ｂ． など．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９４を参照のこと。
ヘテロ接合性ＫＯ動物を交雑し、ｚｃｔｏｒ１９遺伝子の生物学的機能を試験する。生成される子孫の１／４は野生型であり、１／２はへテロ接合性であり、そして１／２はホモ接合性であるべきである。ホモ接合体を下記のようにして詳細に分析する。
【０４８４】
Ｇ．ｚｃｙｔｏｒ１９ホモ接合性動物からの組織の顕微鏡的評価
ｚｃｙｔｏｒ１９は次の組織において発現されるので、それらの組織を注意して試験する：結腸、卵巣、胎盤、下垂体、リンパ節、小腸、唾液腺、直腸、前立腺、精巣、脳、肺、腎臓、甲状腺、脊椎、骨髄、及び頸部。
【０４８５】
脾臓、胸腺及び腸間膜リンパ節を、ｚｃｙｔｏｒ１９を発現するトランスジェニック動物から集め、そして組織学的試験のために調製する。通常収穫された他の組織は次のものである：脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節、腎臓、皮膚、乳腺、膵臓、胃、小腸及び大腸、脳、唾液腺、気管支、食道、副腎、下垂体、生殖管、アクセサリー雄性腺、骨格筋、例えば末梢神経、及び骨髄を含む大腿骨。組織を、ホモ接合性動物及び野生型対照から収穫する。サンプルを１０％緩衝されたホルマリンに固定し、通常通りに進行せしめ、パラフィンに包埋し、５ミクロンで断片化し、そしてヘマトキシリン及びエオシンにより染色する。スライドを、組織学的及び病理学的変化、例えば炎症反応、及び一定の細胞型の低増殖性について試験する。
【０４８６】
Ｈ．ｚｃｙｔｏｒ１９を欠くホモ接合性マウス変異体からの組織の流動細胞計測分析
ｚｃｙｔｏｒ１９遺伝子を欠いているホモ接合性動物を殺し、末梢血液、胸腺、リンパ節、骨髄及び脾臓の流動動物計測分析する。
【０４８７】
細胞懸濁液を、氷冷却培養培地（５００ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）； ５ｍｌの１００倍Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ． Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）； ５ｍｌの１００倍ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）； ５ｍｌの１００倍ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン（ＰＳＮ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））において、鉗子により器官を取り出し、そして次に、細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ， ＶＷＲ Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）に細胞を軽く通すことによって、脾臓、胸腺及びリンパ節から製造する。
【０４８８】
末梢血液（２００ｍｌ）を、ヘパリン処理された管に集め、そして１０Ｕのヘパリン／ｍｌを含むＨＢＳＳにより１０ｍｌに希釈する。赤血球を脾臓及び末梢血液調製物から低張溶解により除去する。骨髄細胞懸濁液を、氷冷却された培養培地により大腿骨から骨髄をフラッシングすることにより製造する。細胞を計数し、そしてトリパンブルー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて生存性について試験する。細胞を、氷冷却された染色培地（ＨＢＳＳ， １％ウシ胎児血清、０．１％アジ化ナトリウム）に１×１０７／ｍｌの再懸濁する。Ｆｃ受容体の阻止、及び細胞への抗体の非特異的結合の阻止を、前記細胞懸濁液に、１０％正常ヤギ血清及びＦｃ Ｂｌｏｃｋ （ＰｈａｒＭｉｎｇｅｒ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ） を添加することによって達成した。
【０４８９】
細胞懸濁液を、等体積の蛍光色素によりラベルされたモノクローナル抗体（ＰｈｏｒＭｉｎｇｅｎ）と共に混合し、氷上で６０分間インキュベートし、そして次に、氷冷却された洗浄緩衝液（ＰＢＳ， １％ウシ胎児血清、０．１％アジ化ナトリウム）により２度、洗浄し、その後、１ｍｇ／ｍｌの７−ＡＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を含む洗浄緩衝液４００ｍｌに再懸濁する。流動データが、ＦＡＣＡＣａｌｉｂｕｒ流動細胞計測計（ＢＤ Ｉｍｍｕｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）上で得られた。獲得及び分析の両者を、Ｃｅｌｌｕｅｓｔ ソフトウェア（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った）。
すべてのリンパ器官における細胞集団を分析し、Ｔ細胞、Ｂ細胞又は他のリンパ細胞の特定系統における異常性、及びそれらの器官における細胞性を検出する。
【０４９０】
例１４．現場ハイブリダイゼーションを用いてのｚｃｔｏｒ１９を発現する細胞の同定
頸部癌、正常及び癌性結腸、十二指腸、子宮内膜癌、正常及び癌性卵巣、子宮、心臓、肝臓、肺、筋肉腫、及び正常及び癌性皮膚からのヒト組織を、現場ハイブリダイゼーションにより、ｚｃｙｔｏｒ１９発現についてスクリーンした。組織を、１０％の緩衝されたホルマリンに固定し、そして標準を用いてパラフィンにおいて阻止した。組織を５ミクロンで断片化した。組織を標準のプロトコールを用いて調製した。（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｒ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｒｌｅｐ／ｉｓｈ．ｈｔｍｌでの“非等張現場ハイブリダイゼーションの進行”）。手短には、組織断片を、ＨｉｓｔｏＣｌｅａｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ）によりパラフィン除去し、そして次に、エタノールにより脱水した。次に、それらを、プロティナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＮＪ）により、２３℃で４−１５分間、消化した。この段階に続いて、組織をアセチル化し、そして再水和化した。
【０４９１】
１つの現場プローブを、ヒトｚｃｙｔｏｒ１９配列に対して企画した。プラスミドＤＮＡ１００９３３を、３’ＵＴＲの末端から０．７ｋｂまで及ぶ、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより消化した。Ｔ−７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、アンチセンスプローブを生成した。プローブを、インビトロ転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、製造業者の説明書に従って、ジゴキシゲニン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によりラベルした。
【０４９２】
現場ハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニン−又はビオチン−ラベルされたｚｃｙｔｏｒ１９プローブ（上記）により行った。プローブを、スライドに、１〜５ｐモル／ｍｌの濃度で６０℃で１２〜１６時間、添加した。スライドを、２×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣにより５５℃で連続的に洗浄した。シグナルを、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）（ＴＳＡ、現場間接的キット；ＮＥＮ）を用いて増幅し、そしてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）によりその製造業者の説明書に従って可視化した。次に、スライドをヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）により対比染色した。
【０４９３】
陽性シグナルを、癌サンプルのほとんどにおいて観察した。頸部癌においては、癌上皮細胞が陽性であった。リンパ小胞におけるリンパ球のサブセットにおいていくつかのシグナルが存在した。同様に、癌及びいくつかの免疫細胞は、結腸癌サンプルにおいて陽性であり、そして正常結腸サンプルは陰性であった。弱い染色が子宮内膜癌及び卵巣にも存在し、そして正常卵巣及び子宮は陰性であった。筋肉腫サンプルの癌領域に弱い染色が存在した。ケラチノサイドは、皮膚癌及びカポシ肉腫サンプルにおいて陽性であり、そして正常皮膚においては染色は観察されなかった。
【０４９４】
心臓及び肝臓においては、ＷＢＣをたぶん循環する細胞のサブセットは、ｚｃｙｔｏｒ１９に関して陽性であった。いくらかの血管における内皮細胞がまた、陽性であると思われる。肺においては、タイプＩＩ肺胞細胞及びマクロファージ様細胞は陽性であった。気管支上皮及び内皮はまた、いくつかの肺検体において陽性であった。要約すれば、ｚｃｙｔｏｒ１９は癌細胞においてアップ−レギュレートされるように思える。リンパ球及び内皮細胞のサブセットにおいて、低レベルのｚｃｙｔｏｒ１９ ｍＲＮＡが存在する。
【０４９５】
Ｚｃｙｔｏｒ１９はそれらの特定の腫瘍組織において発現されるので、ｚｃｙｔｏｒ１９ポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体が、本明細書に開示されるように、腫瘍マーカーとして使用され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１９に対する抗体は、抗体のトキシン−接合体、サイトカイン接合体又は他の接合体、又はｚｃｙｔｏｒ１９受容体リガンド自体と同じように、抗腫瘍活性を有する。ｚｃｙｔｏｒ１９リガンドのアンタゴニスト、例えば抗−ｚｃｔｙｏｒ１９抗体又は可溶性受容体はまた、抗−腫瘍試薬として作用することができる。
【０４９６】
例１５．プロマイシン耐性及びゼオマイシン耐性ベクターによるｚｃｙｔｏｒ１９受容体を発現するＢａＦ３細胞（ＢａＦ３ Ｚｃｙｔｏｒ１９細胞）の構成
十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１９受容体を発現する２種の型のＢａＦ３細胞（１つは、プロマイシン耐性であり、他の１つはゼオマイシン耐性である）を、３０μｇのｚｃｙｔｏｒ１９発現ベクターを用いて構成した。プロマイシン耐性を有する、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体ｍＲＮＡを発現するＢａＦ３細胞を、ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１９−ｐとして命名した。ゼオマイシン耐性を有する、ｚｃｙｔｏｒ１９受容体ｍＲＮＡを発現するＢａＦ３細胞を、ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１９−ｚとして命名した。
【０４９７】
Ａ．ｚｃｙｔｏｒ１９受容体を発現するＢａＦ３細胞の構成
ＢａＦ３、すなわちネズミ骨髄に由来するインターロイキン−３ （ＩＬ−３） 依存性プレ−リンパ球細胞系（Ｐａｌａｃｉｏｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ， Ｃｅｌｌ ４１： ７２７−７３４， １９８５； Ｍａｔｈｅｙ−Ｐｒｅｖｏｔ など．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：４１３３−４１３５， １９８６）を、１０％熱−不活性化されたウシ胎児血清、２ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ−３ （ｍＩＬ−３） （Ｒ＆Ｄ． Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａＭａｘ−１ＴＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）， １ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及びＰＳＮ抗生物質（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により補充された完全倍地（ＲＰＭＩ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ））において維持した。エレクトロポレーションの前、ｐＺＰ−５Ｎ／ＣＲＦ２−４を調製し、そしてＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って精製した。
【０４９８】
エレクトロポレーションのためのＢａＦ３細胞を、ＲＰＭＩ培地により２度洗浄し、そして次に、ＲＰＭＩ培地に１０７個の細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。１ｍｌの再懸濁されたＢａＦ３細胞を、３０μｇのｐＺＰ−７ｐ／ ｚｃｙｔｏｒ１９ プラスミドＤＮＡ又は３０μｇのｐＺＰ−７ｚ／ ｚｃｙｔｏｒ１９ プラスミドＤＮＡと共に混合し、そして別々の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に移した。細胞に、エレクトロポレーション装置（ＣＥＬＬ−ＰＯＲＡＴＯＲＴＭ； ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により供給される２回の連続したショック（８００ １Ｆａｄ／３００Ｖ； １１８０ １Ｆａｄ／３００Ｖ）（シロックの間は１分の休止を置く）を与えた。
【０４９９】
５分の回復時間の後、エレクトロポレートされた細胞を、５０ｍｌの完全培地に移し、そしてインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に１５〜２４時間、配置した。次に、細胞を回転沈降せしめ、そしてｐＺＰ−７ｐ／ｚｃｙｔｏｒ１９によりトランスフェクトされた細胞のためのプロマイシン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）選択（２μｇ／ｍｌ）、又はｐＺＰ−７ｚ／ｚｃｙｔｏｒ１９によりトランスフェクトされた細胞のためのゼオシン選択（１：１５０−１：３３３）を含む完全培地５０ｍｌに再懸濁し、そしてＴ−１６２フラスコに配置し、抗生物質耐性プールを単離した。この後、トランスフェクトされたＢａＦ３細胞のプールを、ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１９−ｐｕｒｏ及びＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１９−ｚｅｏ細胞と命名し、それらのプールを、ＲＴ−ＰＣＲによりｚｃｙｔｏｒ１９の発現についてアッセイした。
【０５００】
Ｂ．ＲＴ−ＰＣＲによるｚｃｙｔｏｒ１９発現の確認
ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１９−ｐｕｒｏ及びＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１９−ｚｅｏ細胞を、ＤＮＡのために収穫し、これを、次に逆転写反応にゆだね、そして続いて、ｚｃｙｔｏｒ１９の存在についてＰＣＲにより試験した。
【０５０１】
フラスコ中の細胞を、集密性まで増殖し、次に、その１０ｍｌを取り出し、そして回転沈降し、細胞ペレットを得た。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを、追加のＲＮアーゼフリーのＤＮアーゼ組（Ｑｉａｇｅｎ）と共に用いて、製造業者の説明書に従って、前記ペレットから精製した。次に、逆転写を、ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ ＴＲ−ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って、ＲＴ反応の完結を通してサンプルに対して行った。次に、ＰＣＲを、０．２ｐモルの個々のプライマーＺＣ４０２７９及びＺＣ３７８６３、等量の個々のヌクレオチドを含む０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物（Ｒｏｃｈｅ）、５μｌの１０×ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）， ＲＴ反応からの３μｌのＤＮＡ， ０．５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ） を混合することによって行った（水の添加により５０μｌの最終体積にした）。
【０５０２】
反応を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００上で次の通りに行った：９５℃で５分；次に、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分（３０サイクル）；次に７２℃で７分及び４℃でのソーキング。サンプルを、３ｍｌの色素と共に混合し、そしてその２５ｍｌを、１％ＯｍｎｉＰｕｒ Ａｇａｒｏｓｅ （Ｍｅｒｃｋ） ゲル上で展開した。ｚｃｙｔｏｒ１９バンドを、ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１９−ｐｕｒｏ及びＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１９−ｚｅｏの両者についてゲル上で検出し、このことは、それらの細胞が前記遺伝子を発現することを示唆する。
前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために記載されてきたが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、理解されるであろう。
【国際公開パンフレット】
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2004532611.tif 000208
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532611.tif 000209
【国際調査報告】
2004532611.tif 000210
2004532611.tif 000211
2004532611.tif 000212