(57)【要約】本発明は、前立腺組織に対して高い特異性を示す発現パターンを示す、ＰＲＯＳＴ　０３と称する新規ヒトポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリペプチドの生成方法、前記ポリペプチドの発現のための発現ベクター及び遺伝子的に構築された宿主細胞に関する。本発明はさらに、研究、診断及び治療用途への前記ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用方法に関する。
2004504811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）図２（配列番号２）に示されアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド又は生物学的もしくは免疫学的に活性なそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、；及び
（ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；
から成る群から選択されたメンバーに対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドを含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸１〜アミノ酸５３を含んで成るポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド１〜ヌクレオチド３３２０の配列を含んで成る請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド２８２〜ヌクレオチド１９４３の配列を含んで成る請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含んで成るベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９記載の宿主細胞から、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸１〜アミノ酸５５３を含んで成る請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを生成するための方法であって、
（ａ）請求項９記載の宿主細胞を、ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして
（ｂ）前記培養物からポリペプチドを回収する；
段階を含んで成る方法。
【請求項１３】
ポリペプチドを発現する細胞の生成方法であって、請求項８記載のベクターにより前記細胞を遺伝子的に構築することを含んで成る方法。
【請求項１４】
（ａ）図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は生物学的もしくは免疫学的に活性なそのフラグメント；及び
（ｂ）上記（ａ）のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリペプチド；
から成る群から選択されたメンバーを含んで成るポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸１〜アミノ酸５５３を含んで成る請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
（ａ）図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は生物学的もしくは免疫学的に活性なそのフラグメント；
（ｂ）図２（配列番号２３）に示されるようなアミノ酸１８１〜アミノ酸１９７を含んで成るポリペプチド；
（ｃ）図２（配列番号２６）に示されるようなアミノ酸２２５〜アミノ酸２４０を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）図２（配列番号２５）に示されるようなアミノ酸２９４〜アミノ酸３２２を含んで成るポリペプチド；
（ｅ）図２（配列番号２１）に示されるようなアミノ酸４０６〜アミノ酸４３１を含んで成るポリペプチド；
（ｆ）図２（配列番号２４）に示されるようなアミノ酸５４４〜アミノ酸５５３を含んで成るポリペプチド；及び
（ｇ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリペプチド；
から成る群から選択されたメンバーを含んで成るポリペプチドに対して特異的に結合する単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１７】
前記抗体が、アミノ酸配列ＩＤＷＤＴＳＡＬＡＰＹＬＧＴＱＥＥ（配列番号２３）に対して特異的に結合する請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、アミノ酸配列ＰＴＥＰＡＥＧＬＳＡＰＳＰＬＳＰＨ（配列番号２６）に対して特異的に結合する請求項１６記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、アミノ酸配列ＤＦＶＧＥＧＬＹＱＧＶＰＲＡＥＧＴＥＡＲＲＨＹＤＥＧＶＲ（配列番号２５）に対して特異的に結合する請求項１６記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、アミノ酸配列ＥＫＱＶＦＬＰＫＹＲＧＤＴＧＧＡＳＳＥＤＳＬＭＴＳＦ（配列番号２１）に対して特異的に結合する請求項１６記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、アミノ酸配列ＤＫＳＤＬＡＫＹＳＡ（配列番号２４）に対して特異的に結合する請求項１６記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、ポリクローナル抗体である請求項１６記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項１６記載の抗体。
【請求項２４】
（ａ）図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は生物学的もしくは免疫学的に活性なそのフラグメント；
（ｂ）図２（配列番号２３）に示されるようなアミノ酸１８１〜アミノ酸１９７を含んで成るポリペプチド；
（ｃ）図２（配列番号２６）に示されるようなアミノ酸２２５〜アミノ酸２４０を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）図２（配列番号２５）に示されるようなアミノ酸２９４〜アミノ酸３２２を含んで成るポリペプチド；
（ｅ）図２（配列番号２１）に示されるようなアミノ酸４０６〜アミノ酸４３１を含んで成るポリペプチド；
（ｆ）図２（配列番号２４）に示されるようなアミノ酸５４４〜アミノ酸５５３を含んで成るポリペプチド；及び
（ｇ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリペプチド；
から成る群から選択されたメンバーを含んで成る、治療剤に接合されるポリペプチドに対して特異的に結合する単離された抗体又は抗体フラグメントを含んで成る免疫接合体。
【請求項２５】
前記治療剤が細胞毒性剤である請求項２４記載の免疫接合体。
【請求項２６】
前記細胞毒性剤が、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラシチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、グルココルチコイド及び放射性同位体から成る群から選択される請求項２５記載の免疫接合体。
【請求項２７】
前記抗体フラグメントが、Ｆｖ， Ｆ（ａｂ’） 及びＦ（ａｂ’）２フラグメントから成る群から選択される請求項２４記載の免疫接合体。
【請求項２８】
図２（配列番号２）のポリペプチドを発現する細胞を選択的に破壊するための方法であって、請求項２４記載の免疫接合体と前記細胞とを、前記免疫接合体の治療剤が前記細胞を破壊できるよう反応せしめることを含んで成る方法。
【請求項２９】
ヒト患者における、ＰＲＯＳＴ ０３の発現に関連する疾病状態の処理方法であって、治療的有効量の請求項２４記載の免疫接合体を前記患者に投与すること含んで成る方法。
【請求項３０】
（ａ）図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は生物学的もしくは免疫学的に活性なそのフラグメント；及び
（ｂ）上記（ａ）のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリペプチド；
から成る群から選択されたメンバーを含んで成る、低められたレベルのポリペプチドを必要とする患者における、ＰＲＯＳＴ ０３の不適切な発現に関連する疾病状態の処理方法であって、前記ポリペプチドをコードするＲＮＡを特異的に分解する、治療的有効量のリボザイムを、前記患者に投与することを含んで成る方法。
【請求項３１】
図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を有する、低められたレベルのポリペプチドを必要とする患者における、ＰＲＯＳＴ ０３の不適切な発現に関連する疾病状態の処理方法であって、前記ポリペプチド又はその一部をコードするポリヌクレオチドに対して相補的である、治療的有効量のポリヌクレオチドを、前記患者に投与することを含んで成る方法。
【請求項３２】
（ａ）図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は生物学的もしくは免疫学的に活性なそのフラグメント；
（ｂ）図２（配列番号２３）に示されるようなアミノ酸１８１〜アミノ酸１９７を含んで成るポリペプチド；
（ｃ）図２（配列番号２６）に示されるようなアミノ酸２２５〜アミノ酸２４０を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）図２（配列番号２５）に示されるようなアミノ酸２９４〜アミノ酸３２２を含んで成るポリペプチド；
（ｅ）図２（配列番号２１）に示されるようなアミノ酸４０６〜アミノ酸４３１を含んで成るポリペプチド；
（ｆ）図２（配列番号２４）に示されるようなアミノ酸５４４〜アミノ酸５５３を含んで成るポリペプチド；及び
（ｇ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリペプチド；
から成る群から選択されたメンバーを含んで成るポリペプチドの存在について、宿主に由来するサンプルを分析することを含んで成る診断方法。
【請求項３３】
前記分析が、前記ポリペプチドに対して特異的に結合する請求項１６記載の抗体又は抗体フラグメントと前記サンプルとを接触せしめ、そして前記サンプルにおけるポリペプチドへの抗体の結合を検出することを含んで成る請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）図２（配列番号２）に示されアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド又は生物学的又は免疫学的活性のそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、；及び
（ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；
から成る群から選択されたメンバーに対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドを含んで成るポリヌクレオチドの存在について分析することを含んで成る診断方法。
【請求項３５】
患者における、図２（配列番号２）のポリペプチドに関連する転移を診断するための方法であって、
（ａ）前記患者から組織及び／又は流体サンプルを得；
（ｂ）前記サンプルと、請求項１６記載の抗体とを接触し；そして
（ｃ）前記サンプルにおけるポリペプチドと抗体との結合を検出することを含んで成る方法。
【請求項３６】
前記抗体が、検出できるシグナルを直接的に又は間接的に生成するために、放射性ラベル、酵素、発色団及び蛍光剤から成る群から選択された化合物によりラベルされる請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ＰＲＯＳＴ ０３発現に関連する前立腺癌に対するヒトにおける免疫応答を誘発するために有効な量の、生理学的に許容できる非毒性ビークルに分散される、図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は生物学的もしくは免疫学的に活性的なフラグメントを含んで成るワクチン。
【請求項３８】
図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は生物学的又は免疫学的に活性的なフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含んで成るワクチンであって、前記ＤＮＡは、ＰＲＯＳＴ ０３発現に関連する前立腺癌に対してヒトを免疫化するのに有効な免疫原量の前記ポリペプチド又はフラグメントを生成するために、プロモーターに操作可能的に連結され、そして哺乳類の組織へのインビボ投与に続いて、前記ＤＮＡの細胞中への十分な摂取が生じ、そして前記ポリペプチド又はフラグメントの十分な発現が生じることを特徴とするワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、新しく同定されたポリヌクレオチド及びポリペプチド；前記ポリヌクレオチド及びポリペプチドの変異体及び誘導体；前記ポリヌクレオチド及びポリペプチド、及びそれらの変異体及び誘導体の製造方法；前記ポリペプチドに対して向けられた抗体、それらの変異体及び誘導体；及び前記ポリヌクレオチド、ポリペプチド、変異体及び抗体の使用に関する。特に、それらの及び他に関して、本発明は、前立腺組織に対して高い特異性を示す新規ヒトＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドに対して向けられた抗体、及びＰＲＯＳＴ ０３の発現を阻止するアンチセンスポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
発明の背景：
前立腺癌は、それが４５歳以上の男性の約１／３に見出されることにおいて、男性において頻繁に発生する疾病である。遺伝的及び環境的原因の証拠が存在し、そしてそれらの主要原因はたぶん前記要因の組み合わせの結果である。家族性癌の研究は、遺伝的素因がすべての前立腺癌の約５〜１０％、及び５５歳以下の若い男性の約４５％において役割を演じることを示唆している。
【０００３】
前立腺癌は多段階疾病として進行する証拠が存在し、そして前駆体疾病の１つは、前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）である。疾病の初期段階はアンドロゲン依存性であり、そして後期段階はホルモンには無関係である。良性前立腺過形成として知られている前立腺の増殖性疾患はしばしば、臨床的に検出されるが、しかしたぶん、癌の進行における段階ではない。しかしながら、それはしばしば、前立腺癌に関連している。前立腺における癌はしばしば、多病巣性であり、一般的にゆっくりと増殖し、そして異種性である。後期段階の癌はしばしば、リンパ節及び骨に転移する。
【０００４】
前立腺癌は通常、物理的試験により及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の血清レベルにより診断される。基本的な前立腺切除は、局在化する疾病のための選択的処理である。進行した転移性疾病は現在、精巣切除又はＧｎＲＨ（ゴナドトロピン放出ホルモン）による処理により誘発されるアンドロゲン変性により、及び抗−アンドロゲン治療により処理される。しかしながら、進行した疾病はほとんど一定して、ホルモン耐性になり、そして進行性疾病のための治療が必要に成る。さらに、基本的な前立腺切除及びアンドロゲン変性治療の両者に関連する重度の副作用が存在する。それらは、基本的前立腺切除に関連する失禁及びインポテンス、及びアンドロゲン変性治療に関連する骨破損及びオステオポローシスの高い危険性を包含する。
【０００５】
従って、初期及び後期段階の前立腺癌の両者のための新規治療アプローチの相当の必要性が存在する。これは、処理に有意に影響を及ぼすので、新規診断剤、特に疾病の段階を識別できる剤についての有意な必要性が存在する。例えば、疾病が前立腺以上に進行し、そしてリンパ節に移転する場合、基本的な前立腺切除は、それが進行に対して効果を有さず、しかも所望しない有意な副作用を有するので、保証されない。インビボでの転移を検出するいずれかの剤が相当の価値を有するのであろう。それらの発現パターンにおいて、前立腺組織に対して特異性を示すタンパク質は、転移検出及び治療剤のために有用であるべきである。
【０００６】
特定タンパク質の発現の変化が、前立腺癌、例えば後期段階の前立腺癌における異常ｐ５３発現、低められたレベルのＴＧＦ−β受容体、低められたレベルのＥ−カドヘン、Ｃ−ＣＡＭ（細胞付着分子）及びいくつかのインテグリンにおいて示されて来た。腫瘍遺伝子ｂｃｌ−２の発現は、後期段階アンドロゲン依存性腫瘍において著しく高められ、そして高められたレベルでｂｃｌ−２を発現する患者についての予後は比較的不良である。前で言及された遺伝子発現における変化は十分に記録されているが、疾病の原因であることが示されている発現の変化は同定されていない。従って、発現は、前立腺癌の診断及び治療のための分子標的物として作用するので、それらの発現が前立腺腫瘍の存在又は進行に連結される新規タンパク質を同定することが有用である。
【０００７】
輸送システムは、必須栄養物及びイオンの摂取、代謝の最終生成物の排泄、及び細胞と環境との間の連絡を可能にする（Ｍｉｔｃｈｅｌ， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２９： ３３−８７， １９６３）。　一次活性輸送体は、ＡＴＰ加水分解、光吸収、電子流、基質脱カルボキシル化又はメチルトランスファーを用いることによって、種々の物質の溶質蓄積又は押出しを可能にする（Ｍｉｔｃｈｅｌ， Ｆｅｄ． Ｐｒｏｃ． ２６： １３７０−１３７９， １９６７）。１００以上のファミリーの輸送体が分類されており、それらのうち２種は、生存生物のすべての分類において偏在的に存在する。
【０００８】
それらの１種、すなわち主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）は、種々の物質の共輸送、対向輸送又は単輸送に関与する膜輸送タンパク質から成る（Ｇｒｉｆｆｉｔｈなど．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４： ６８４−６８５， １９９２； Ｍａｒｇｅｒ など．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １８： １３−２１）。ＭＦＳ内で、明確なファミリーの膜輸送タンパク質がお互い漸進的に関連している（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｂｉｏｅｎｅｒｇ． Ｂｉｏｍｅｍｂｒ． ２２： ５２５−５６９， １９９０）。ＭＦＳメンバーは現在、３００のＦＳＦタンパク質を表す１７（１８）の明確なファミリーに分類される。前記タンパク質は、糖摂取、耐薬物性、クレブス回路中間体の摂取、リン酸エステル／リン酸対向輸送、及びオリゴ糖摂取に関与している（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎなど．， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｅｒ． Ｂ３２６： ３９１−４１０， １９９０）。
【０００９】
第二構造レベルで、水治療法の考慮は、３種を除いて、前記ファミリーはすべて、１２のトランスメンブラン−スパナ−（ＴＭＳ）タンパク質トポロジーにより特徴づけられることを示唆している。３種のファミリーにおいて、２種の追加のトランスメンブラン−スパナーが見出されている（Ｐａｕｌｓｅｎなど．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏ． Ｒｅｖ． ６０： ５７５−６０８， １９９６）。トランスメンブラン−スパナーは、α−ヘリカルコンホメーションで形質膜を横切ることが提案されている（Ｇｏｓｗｉｔｚ ａｎｄ Ｂｒｏｏｋｅｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４： ５３４−５３７， １９９５）。
【００１０】
ＴＭＳ２とＴＭＳ３との間の十分に保存されたＭＦＳ特異的モチーフ、及びＴＭＳ８とＴＭＳ９との間の関連するが、しかし十分には保存されていないモチーフは、実質的にすべてのＭＦＳファミリーメンバーの特性を示し、そして機能的に有意なものであると思われる（Ｐａｏなど．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２（１）： １−３４， １９９８）。ＭＦＳ輸送体のＣ−末端領域は主に、ＭＦＳ内のタンパク質の基質特異性の決定に関与し、そしてそのＮ−末端領域は主に輸送の促進に関与することが仮定されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈなど．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４： ６８４−６９５， １９９２； Ｒｏｕｃｈなど．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４： ２０５１−２０６２， １９９０）．ファミリー特異的モチーフは、ＭＦＳのメンバー内に同定されており、これは、新しく同定されたＭＦＳタンパク質を、それらの適切なファミリーグループに配置するための手段を提供する（Ｐａｕｌｓｅｎなど．， Ｇｅｎｅ １２４： １−１１， １９９３）。
【００１１】
糖輸送体（ＳＰ）ファミリーは、細菌、始原細菌、真核原生生物、菌類、動物及び植物に由来する１３３種の配列決定されたメンバーから成る最大のＭＦＳファミリーを示す。タンパク質は１２のＴＭＳを有し、そして配列及び機能においては非常に多様である。生理学的条件下で、それらは単輸送又はＨ＋共輸送により機能する。共輸送体は中心部に向けられた極性を有する、促進された細胞において機能する。
【００１２】
糖輸送体ファミリーのメンバーは、基質が膜の両側上で存在する場合、溶質：溶質対向輸送を触媒することができることを示されている。糖輸送体ファミリーの基質は、細菌においてグルコース、植物においてヘキソース、及び動物において有機カチオン及び神経伝達物質を包含する。タンパク質は、４０４−８１８個のアミノ酸残基のサイズ範囲を示す。真核タンパク質の親水性領域は、調節又は細胞骨格結合において役割を演じることができ、そしてそれらはＡＴＰ−依存性タンパク質キナーゼによるリン酸化を時おり受けやすい。
【００１３】
糖輸送体ファミリーのタンパク質はしばしば、薬物輸送に関与し、そしてそれらのタンパク質における変化は薬物耐性の出現において役割を演じることができる（Ｌｅｗｉｓ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９： １１９−１２３， １９９４）。高められたレベルの輸送タンパク質は、効果の低い化学治療をもたらす、蓄積された薬物の急速な輸送を導くことが可能である。そのようなタンパク質のレベルの低下、又はその活性の低下は、細胞内での効果的な治療薬物の維持において重要であることがわかっている。
【００１４】
それらのデータは、輸送体タンパク質が癌の診断及び治療介在への使用のための良好な候補体であり得ることを示唆する。新規ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、膜輸送タンパク質の糖輸送体ファミリーに対する類似性を示し、そして従って、癌のための治療及び診断有用性を有する。
【００１５】
発明の要約：
本発明は、ＰＲＯＳＴ ０３として本明細書において称する新規タンパク質をユニークにコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、腫瘍性及び正常な前立腺組織において、及び骨及びリンパ節に転移する前立腺癌において選択的に発現される。さらに、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、それが細胞表面タンパク質であることを示唆する、スクロース／Ｈ＋共輸送体タンパク質、すなわちＤｃＳＵＴ２（Ｇｅｎｂａｎｋ　ｏ６５８０３．ｓｐ．， ｐｌａｎｔ）に対する類似性を示す。それは、膜輸送タンパク質のＭＦＳファミリーのメンバーに共有するトランスメンブラン−スパナータンパク質トポロジーを包含する。
【００１６】
ＰＲＯＳＴ ０３として本明細書において称し、そして本明細書において、図１（配列番号）に記載されるポリヌクレオチド配列は、図２（配列番号２）に示される、ＰＲＯＳＴ ０３のためのアミノ酸配列をコードする。ＰＲＯＳＴ ０３の発現の前立腺−特異的性質及びその細胞表面位置は、ＰＲＯＳＴ ０３が転移性前立腺癌を検出するための診断剤のための新規標的物を提供し、そしてＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドで指図される抗体に連結される治療剤の使用を通しての治療介在性のための可能性ある標的物を提供する。
【００１７】
中でも、前立腺組織において選択的に発現される新規タンパク質として同定されたポリペプチドを供給することが本発明の目的である。ポリペプチドはまた、図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列及びもう１つの糖輸送体タンパク質、ＤｃＳＵＴ２の既知のアミノ酸配列の比較により示されるように、膜輸送タンパク質の糖輸送体ファミリーに対する類似性を有すると思われる。
さらに、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特にＰＲＯＳＴ　０３として本明細書において命名されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００１８】
本発明のこの観点によれば、ＰＲＯＳＴ　０３をコードする単離されたポリヌクレオチオド、例えばｍＲＮＡ， ｃＤＮＡ，　及び、本明細書の観点のさらなる態様においては、生物学的、診断的に、臨床学的に又は治療的に有用なその変異体、類似体、又は誘導体、又はそのフラグメント、例えば前記変異体、類似体及び誘導体のフラグメントが提供される。
本発明のこの観点の特に好ましい態様においては、ＰＲＯＳＴ　０３として本明細書において命名されたポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体が存在する。
【００１９】
本発明のこの観点によれば、ＰＲＯＳＴ　０３として本明細書において言及されるヒト起源の新規ポリペプチド、及び生物学的、診断的又は治療的に有用なそのフラグメント、変異体及び誘導体、前記フラグメントの変異体及び誘導体、及び前記のものの類似体が提供される。
本発明のこの観点の特に好ましい態様においては、ＰＲＯＳＴ　０３ ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体にコードされるＰＲＯＳＴ　０３の変異体が提供される。
【００２０】
前述のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、変異体及び誘導体、前記変異体及び誘導体のフラグメント、及び前述のものの類似体の生成方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。本発明のこの観点の好ましい態様においては、前記ＰＲＯＳＴ　０３ポリペプチドを生成する方法が提供され、ここで前記方法は、外因性由来のＰＲＯＳＴ　０３ コードのポリヌクレオチドを、そこに発現可能的に組み込んでいる宿主細胞を、ヒトＰＲＯＳＴ　０３の宿主において発現のための条件下で培養することを含んで成る。
【００２１】
本発明のもう１つの目的によれば、前記ポリペプチド及びポリヌクレオチドを、中でも研究、生物学、臨床学及び治療目的のために使用する、生成物、組成物及び方法が提供される。
本発明のこの観点の好ましい態様によれば、ＰＲＯＳＴ　０３ポリペプチド又はＰＲＯＳＴ　０３コードのｍＲＮＡを決定することにより細胞におけるＰＲＯＳＴ　０３の発現を評価し、そしてｐｒｏｓｔ ０３を含むゲノム配列における遺伝子変動及び異常性、例えば欠損及び突然変異をアッセイするための生成物、組成物及び方法が提供される。
【００２２】
本発明のこの及び他の観点の好ましい態様によれば、ｐｒｏｓｔ ０３ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするプローブが提供される。
ＰＲＯＳＴ　０３ポリペプチド又はそのフラグメントに対して高い選択性であり、そして前立腺癌に関連する、ＰＲＯＳＴ　０３発現の診断及び／又は検出のための方法に使用され得る抗体を提供することが本発明のさらなる目的である。本発明のこの観点の好ましい態様によれば、抗体は、検出できるシグナルを生成するような手段でラベルされる。放射性ラベル、酵素、発色団及び蛍光剤によりラベルされた抗体が特に好ましい。
【００２３】
本発明のさらなる観点においては、インビトロ細胞、エクスビボ細胞及び細胞又は多細胞生物への投与のための治療剤に接合される抗体が提供される。これに関しては、細胞毒性である治療剤が特に好ましい。これに関する好ましい態様においては、ＰＲＯＳＴ　０３活性又は発現により特徴づけられる疾病状態、例えば前立腺癌の処理のためにヒト患者にそのような接合された抗体が投与される。
内在化される（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）治療用抗体を供給することが本発明のさらなる観点である。
【００２４】
本発明のさらなる観点においては、免疫応答を刺激するために使用され得るペプチド及び抗−イジオタイプ抗体が提供される。
本発明のさらなる観点においては、細胞インビトロ、細胞エクスビボ及び細胞インビボ又は多細胞生物への投与のためのｐｒｏｓｔ ０３ポリヌクレオチド（すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド）に対して相補的なリボザイム及びポリヌクレオチドが提供される。これに関して、疾病状態、例えば前立腺癌又は良性前立腺過形成の処理のためへのヒト患者へのアンチセンス分子の投与が特に好ましい。
【００２５】
本発明の他の目的、特徴、利点及び観点は、次の記載から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の好ましい態様を示す次の記載及び特定の例は、例示目的のためにのみ与えられることが利用されるべきである。開示される本発明の範囲内での種々の変更及び修飾は、次の記載及び開示される本発明の他の部分から当業者に容易に明らかになるであろう。
【００２６】
本発明の特定の記載：
定義：
本明細書、例及び請求項において使用される場合、特にことわらない限り、次の用語は、示される意味を有する。
“ＰＲＯＳＴ ０３”は、図２（配列番号２）に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体、類似体、誘導体及びフラグメント、及び前記変異体、類似体及び誘導体のフラグメントを言及する。用語“フラグメント”、及び“類似体”とは、図２（配列番号２）のポリペプチドを言及する場合、図２（配列番号２）のポリペプチドと実質的に同じ生物学的及び／又は免疫学的活性を保存するポリペプチドを意味する。
【００２７】
“ｐｒｏｓｔＴ ０３”とは、図１（配列番号１）に示される配列を有するポリヌクレオチド、及び図２（配列番号２）に示されるＰＲＯＳＴ ０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及びＰＲＯＳＴ ０３変異体、類似体、誘導体及びフラグメント、及び前記変異体、類似体及び誘導体のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを言及する。ＰＲＯＳＴ ０３はまた、ＲＮＡから構成されるそのようなポリヌクレオチド、及び図２（配列番号２）に示されるポリペプチド配列コードするポリヌクレオチドの補体であるポリヌクレオチドも言及する。
【００２８】
“ポリヌクレオチド”とは一般的に、修飾されていないＲＮＡ又はＤＮＡ、又は修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであり得るいずれかのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを言及する。従って、例えば、ポリヌクレオチドとは、本明細書において使用される場合、中でも、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ；一本鎖又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含んで成るハイブリッド分子を言及する。
【００２９】
さらに、ポリヌクレオチドは、本明細書において使用される場合、ＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両者を含んで成る三本鎖領域を言及する。そのような領域における鎖は、同じ分子又は異なった分子からであり得る。前記領域は１又は複数のすべての分子を包含するが、しかしより典型的には、前記分子のいくらかの領域のみを包含する。三本鎖ヘリックスの分子の１つはしばしば、オリゴヌクレオチドである。
【００３０】
本明細書において使用される場合、用語“ポリヌクレオチド”は、１又は複数の修飾された塩基を含む、上記のようなＤＮＡ又はＲＮＡを包含する。従って、安定性又は他の理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡは、本明細書において意図されるような“ポリヌクレオチド”である。さらに、通常でない塩基、例えばイノシン、又は修飾された塩基、例えばトリチウム−ラベルされた塩基を含んで成るＤＮＡ又はＲＮＡは、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドである。
【００３１】
非常に多くの修飾が、当業者に知られている多くの有用な目的を満たすＤＮＡ及びＲＮＡに行われて来たことが理解されるであろう。用語“ポリヌクレオチド”は、本明細書において使用される場合、そのような化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、及びウィルス及び細胞、例えば単純及び複雑な細胞の特徴を有する、化学的形のＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
【００３２】
“ポリペプチド”は、本明細書において使用される場合、下記に記載されるようなすべてのポリペプチドを包含する。ポリペプチドの基本的構造は良く知られており、そして当業界における無数のテキストブック及び他の出版物に記載されている。このような関係においては、前記用語は、ペプチド結合により直鎖においてお互い結合される複数のアミノ酸を含んで成るいずれかのペプチド又はタンパク質を言及する。本明細書において使用される場合、前記用語は、また通常、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとして当業界において言及される短鎖、及び多くのタイプが存在するタンパク質として当業界において一般的に言及される長鎖の両者を言及する。
【００３３】
ポリペプチドはしばしば、２０個の天然に存在するアミノ酸として通常言及される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み、そして末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸が、天然の工程、例えばグリコシル化及び他の後翻訳修飾により、又は当業界において良く知られている化学的修飾技法のいずれかにより、所定のポリペプチドにおいて修飾され得ることが理解されるであろう。ポリペプチドにおいて天然に存在する通常の修飾でさえ、本明細書において徹底的に列挙するには多過ぎるが、しかしそれは基本的なテキスト及びより詳細なモノグラフ、及び多数の研究文献において良く記載されており、そしてそれらは当業者に良く知られている。
【００３４】
本発明のポリペプチドに存在することができる既知の修飾は次のものを包含する：アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリケーション、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解工程、リン酸化、プレニル化、セラミ化、セレン酸化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ介在性付加、例えばアルキン化、及びユビキチン化。
【００３５】
そのような修飾は、当業者に良く知られており、そして化学文献において、より詳細に記載されている。いくつかの特に共通する修飾、すなわちグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化が、ほとんどの基本的テキスト、例えばＩ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３に記載されている。これに関する多くの詳細な再考は、次の文献により供給されるそれらのものから入手できる：Ｗａｌａ． Ｆ． Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １−１２， １９８３； Ｓｅｉｆｔｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６−６４６， １９９０及びＲａｔｔａｎなど．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３： ４８−６２， １９９２。
【００３６】
ポリペプチドは必ずしも完全には直線ではないことは、良く知られているように及び上記に示されるように、理解されるであろう。例えば、ポリペプチドはユビキチル化の結果として枝分かれされ得、そしてそれらは、後翻訳現象、例えば天然のプロセッシング現象及び天然において存在しないヒト操作によりもたらされる現象の結果として、枝分かれを有するか又はそれを有さない環状であり得る。環状、枝分かれ及び枝分かれ環状ポリペプチドは、非翻訳性の天然の方法及び完全に合成の方法により合成され得る。
【００３７】
修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を包含するポリペプチドにおけるいずれかの位置で存在することができる。実際、共有修飾によるポリペプチドにおけるアミノ又はカルボキシル基、又は両者の遮断は、天然に存在するポリペプチド及び合成のポリペプチドにおいて共通し、そしてそのような修飾は、本発明のポリペプチドにおいても存在することができる。例えば、タンパク質分解工程の前、Ｅ．コリにおいて製造されるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど変わりなく、Ｎ−ホルミルメチオニンであろう。
【００３８】
ポリペプチドにおいて存在する修飾はしばしば、それがいかにして製造されるかの機能であろう。例えば、宿主におけるクローン化された遺伝子の発現により製造されるポリペプチドに関しては、修飾の性質及び程度は大部分、ポリペプチドアミノ酸配列に存在する宿主細胞の後翻訳修飾能力及び修飾シグナルにより決定されるであろう。例えば、良く知られているように、グリコシル化はしばしば、細菌宿主、例えば、Ｅ．コリにおいては存在しない。従って、グリコシル化が所望される場合、ポリペプチドは、グリコシル化宿主、一般的に真核細胞において発現されるべきである。昆虫細胞はしばしば、哺乳類細胞と同じ後翻訳グリコシル化を行い、そしてこの理由のために、昆虫細胞発現システムは、中でも、グリコシル化の生来のパターンを有する哺乳類タンパク質を効果的に発現するよう環発されて来た。類似する考えが、他の修飾に適用される。
【００３９】
同じタイプの修飾が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じか又は種々の程度、存在することができることが理解されるであろう。また、所定のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を有することができる。
一般的に、本明細書において使用される場合、用語、ポリペプチドは、すべてのその修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現することによって合成されるポリペプチドに存在するそれらの修飾を包含する。
【００４０】
“ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド”は、本明細書において使用される場合、本発明のポリペプチド、特に図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドをコードする配列を包含する。前記用語は、追加の領域と共に、前記ポリペプチドをコードする単一の連続領域又は不連続領域（例えば、イントロンにより中断される）を包含するポリヌクレオチドを包含する。
【００４１】
“生物学的”とは、天然に存在するＰＲＵＳＴ ０７ポリペプチドの構造的、調節的又は生化学的機能を言及する。
“免疫的活性”とは、適切な動物又は細胞において特定の免疫応答を誘発し、そして特定の抗体と結合する、天然、組換え又は合成ＰＲＯＳＴ ０３、又はそのいずれかのフラグメントの能力を言及する。
【００４２】
“オリゴヌクレオチド”とは、比較的短いポリヌクレオチドを言及する。しばしば、その用語は、一本鎖デオキシリボヌクレオチドを言及するが、しかしそれは中でも一本鎖又は二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド及び二本鎖ＤＮＡを言及することができる。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドはしばしば、化学的方法、例えば自動化されたオリゴヌクレオチド合成機上で実施されるそれらの方法により合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法、例えばインビトロ組換えＤＮＡ−介在性技法、及び細胞及び生物におけるＤＮＡの発現により製造され得る。“オリゴヌクレオチド”又は“オリゴマー”、又はオリゴヌクレオチド“フラグメント”、“部分”又は“セグメント”とは、少なくとも約１０個のヌクレオチド、及び約６０個ほどのヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０個のヌクレオチド、及びより好ましくは約２０〜２５個のヌクレオチド配列を言及する。
【００４３】
“天然に存在するＰＲＯＳＴ ０３”とは、遺伝子的に構築されていないヒト細胞により生成されるＰＲＯＳＴ ０３を言及し、そして特に、ポリペプチドの後−翻訳修飾、例えばアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化及び分解（但し、それだけには限定されない）からの種々のＰＲＯＳＴ ０３形を企画する。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの“変異体”とは、本明細書において使用される場合、それぞれ、対象のポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるポリヌクレオチド又はポリペプチドである。この変異体は下記に及び本発明の開示の他の場所において、より詳細に記載される。
【００４４】
（１）もう１つの対照ポリヌクレオチドとはポリヌクレオチド配列において異なるポリヌクレオチド。一般的に、差異は、対照及び変異体のポリヌクレオチド配列が全体的に密接に類似し、そして多くの領域において同一であるよう、制限される。
【００４５】
下記に示されるように、変異体のポリヌクレオチド配列の変化はサイレントであり得る。すなわち、それらはポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変更することはできない。変更がこのタイプのサイレント変化に制限される場合、変異体は、対照と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするであろう。下記に示されるように、変異体のポリヌクレオチド配列の変化は、対照のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更することができる。そのようなポリヌクレオチド変化は、下記で論じられるように、対照の配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらすことができる。
【００４６】
（２）もう１つの対照ポリペプチドとは、アミノ酸配列において異なるポリペプチド。一般的に、差異は、対照及び変異体の配列が全体的に密接に類似し、そして多くの領域において同一であるよう、制限される。変異体及び対照ポリペプチドは、いずれかの組み合わせで存在することができる、１又は複数の置換、欠失、融合及び切断によりアミノ酸配列において異なることができる。それらの同じか又は類似するポリペプチドをコードする組換え変異体は、遺伝子コードにおける“冗長性”の使用により合成され得るか又は選択され得る。種々のコドン置換、例えば種々の制限部位を生成するサイレント変化は、プラスミド又はウィルスベクター中へのクローニング又は特定の原核又は真核システムにおける発現を最適化するために導入され得る。突然変異はまた、ポリペプチドの性質を修飾し、すなわちリガンド結合親和性、鎖間親和性又はポリペプチド分解又はターンオーバー速度を変えるためにも導入され得る。
【００４７】
“対立遺伝子変異体”とは、ＰＲＯＳＴ ０３ポリヌクレオチドの他の形を言及する。対立遺伝子は突然変異、すなわちポリヌクレオチド配列の変化に起因し、そして一般的に、構造体又は機能が変更され得るか又は変更され得ない、変更されたｍＲＮＡ又はポリペプチドを生成する。いずれかの所定の遺伝子は、何も有さないか、１又は多くの対立遺伝子形を有することができる。対立遺伝子を生ぜしめる通常の突然変異変化は一般的に、ヌクレオチドの天然の欠失、付加又は置換に帰する。それらのタイプの変化の個々は、所定の配置において，単独で、又は他と組合して、又は１又は複数回、存在することができる。
【００４８】
“誘導体”とは、化学的修飾、例えばユビキチン化、ラベリング（例えば、放射性核種、種々の酵素的修飾による）、ペグュルチ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）又はヒトタンパク質において通常存在しない、アミノ酸、例えばオルニチンの挿入又は置換（又は例えばアミノ酸をコードするヌクレオチドの置換）により、それぞれ天然に存在するＰＲＯＳＴ ０３又はＰＲＯＳＴ ０３から誘導されるポリヌクレオチド又はポリペプチドを言及する。
【００４９】
“欠失”とは、１又は複数のポリヌクレオチド又はアミノ酸残基がそれぞれ不在であるポリヌクレオチド又はアミノ酸配列における変化として定義される。
“挿入”又は“付加”は、天然に存在するポリヌクレオチド又はアミノ酸配列に比較して、それぞれ、１又は複数のポリヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加に起因する、ポリヌクレオチド又は酸配列の変化である。
“置換”は、それぞれ、異なったポリヌクレオチド又はアミノ酸による１又は複数のポリヌクレオチド又はアミノ酸の置換に起因する。
【００５０】
好ましくは、アミノ酸置換は、類似する構造的及び／又は化学的性質を有するもう１つのアミノ酸による１つのアミノ酸の置換、例えばイソロイシン又はバリンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギン又はセリンによるトレオニンの置換、すなわち保存性アミノ酸置換に起因する。挿入又は欠失は典型的には、約１〜５個のアミノ酸の範囲にある。その変動は、組換えＤＮＡ技法を用いてポリペプチドにおけるアミノ酸の挿入、欠失又は置換を組織的に製造し、そして活性についてその得られる組換え変異体をアッセイすることによって、実験的に決定され得る。
【００５１】
“フラグメント”は、前記ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド及びその変異体又は誘導体のアミノ酸配列とすべてではないが、一部と完全に同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
ポリペプチド“フラグメント”、“部分”又は“セグメント”は、少なくとも約５個のアミノ酸、しばしば少なくとも約７個のアミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３個のアミノ酸及び種々の態様においては、少なくとも１７個又はそれ以上のアミノ酸の長さのアミノ酸残基である。
【００５２】
“組換え体”又は“組換えＤＮＡ分子”とは、天然に存在しないか、又は配列の２種の分離されたセグメントの人工的な組み合わせにより製造されるポリヌクレオチド配列を言及する。“組換え的に生成される”とは、化学的合成手段、又はポリヌクレオチドの単離されたセグメントの人工的操作、例えば遺伝子構築技法により達成される人工的組み合わせを意味する。そのような操作は通常、同じか又は保存性アミノ酸をコードする冗長性コドンにより１つのコドンを置換するために行われ、そして典型的には、配列認識部位を導入するか又は除去することによって行われる。
【００５３】
他方では、それは、通常の天然形においては見出されない所望する組み合わせの機能を含んで成る単一の遺伝子存在物を生成するための所望する機能を有するポリヌクレオチドセグメントと共に連結するために行われる。制限酵素認識部位、調節配列、制御配列又は他の有用な特徴が企画により組み込まれ得る。“組換えＤＮＡ分子”は、クローニング及び発現ベクターを包含する。“組換え体”はまた、ポリペプチドをコードし、そして組換えＤＮＡ技法を用いて調製されるポリヌクレオチドを言及することができる。
【００５４】
“単離された”とは、天然の状態から“人の手により”変更されることを意味し、すなわち、それが天然において存在する場合、それは元の環境から変更され又は除去されている。例えば、その天然の状態で生存動物に天然において存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは“単離され”ないが、しかしその天然の状態の同時存在する材料から単離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その用語が本明細書において使用される場合、“単離される”。
【００５５】
例えば、ポリヌクレオチドに関しては、用語、“単離された”とは、それが天然に存在する染色体及び細胞から分離されることを意味する。ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、組成物、例えば細胞中へのポリヌクレオチド又はポリペプチドの導入のための培地配合物又は溶液、天然に存在する組成物ではない、化学又は酵素反応のための組成物又は溶液に存在することができ、そして本明細書において使用されるような用語の意味内に単離されたポリヌクレオチオド又はポリペプチドとして存続することができる。
【００５６】
“実質的に単純な”及び実質的に相同な“とは、交換可能的に使用され、そしてＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド又はそのフラグメント、又はそれをコードするポリヌクレオチドセグメントを記載し、ここでそのようなポリペプチド又はポリヌクレオチドは、天然においてそれに付随する成分から分離される。ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド又はそのフラグメント、又はそれをコードするＤＮＡセグメントは、それがその天然の状態でそれに付随する天然の汚染物から分離される場合、天然において関連する成分を実質的に含まない。
【００５７】
従って、化学的に合成されるか、又はそれが天然において起因する細胞とは異なった細胞システムにおいて合成されるポリペプチドは、その天然において関連する成分を実質的に有さないであろう。同様に、化学的に合成されるか、又はそれが天然において起因する細胞とは異なった細胞システムにおいて合成されるポリヌクレオチドは、その天然において関連する成分を実質的に有さないであろう。
【００５８】
“相同”とは、ポリヌクレオチドを説明するために使用される場合、２種のポリヌクレオチド又はその企画された配列は、任意に一列配列され、そして比較される場合、少なくとも７０％のヌクレオチド、通常、約７５〜９９％及びより好ましくは少なくとも約９９％のヌクレオチドにおいて、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴なって、同一であることを示す。
“類似性”とは、ポリペプチドを記載するために使用される場合、１つのポリペプチドのアミノ酸及び保存されたアミノ酸置換基を第のポリペプチドの配列に比較することによって決定される。
【００５９】
“ポリメラーゼ連鎖反応”又は“ＰＣＲ”とは、ＤＮＡの特定の断片が、１９８７年７月２８日に発行されたアメリカ特許第４，６８３，１９５号に記載のようにして増幅される方法を言及する。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーが企画され得るよう、興味あるか又はそれ以外のポリペプチドフラグメントの末端からの配列情報が入手できる必要であり；それらのプライマーはお互いの方向に向き、そして増幅されるべき鋳型の反対の鎖に、配列において同一であるか又は類似するであろう。２種のプライマーの５’末端のヌクレオチドは、増幅された材料の末端と同時に存在する。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、全細胞ＲＮＡから転写されるｃＤＮＡ、プラスミド配列、等を増幅するために使用され得る（一般的には、Ｍｕｌｌｉｓなど．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， ５１， ２６３， １９８７， Ｅｒｉｃｈ， ｅｄ． ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔａｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， １９８９を参照のこと）。
【００６０】
“緊縮性”は典型的には、約Ｔｍ（溶融温度）−５℃（プローブのＴｍより６５℃低い）〜約２０℃−２５℃（Ｔｍよりも２５℃低い）の範囲で存在する。当業者により理解されるように、緊縮ハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定し、又は検出するために、又は類似するか又は関連するポリヌクレオチド配列を同定するか又は検出するために使用され得る。本明細書において使用される場合、用語“緊縮条件”とは、ハイブリダイゼーションが、配列間で少なくとも９５％及び好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合でのみ存在するであろうことを意味する。
【００６１】
“ハイブリダイゼーション”は、本明細書において使用される場合、“ポリヌクレオチド鎖が塩基対合を通して相補的鎖と連結するいずれかの方法”を包含するであろう（Ｃｏｏｍｂｓ， Ｊ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９４）。
【００６２】
“治療的有効用量”とは、疾病状態の症状又は病状を緩和する、ポリペプチド又はその抗体、アンタゴニスト、又はインヒビター、例えばアンチセンス分子及びリボザイムの量を言及する。そのような化合物の治療効率及び毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％を致死をもたらす用量）は、細胞培養物又は実験動物における標準の医薬方法により決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は、治療指数であり、そしてそれは比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。
“処理する”又は“処理”とは、本明細書において使用される場合、疾病状態が前立腺腫瘍増殖に関連し、そして患者が低められたレベルのＰＲＯＳＴ ０３の必要性を有する疾病状態を包含する、ヒト患者における疾病状態の処理を包含する。
【００６３】
発明の特定の記載：
本発明は、中でも、下記により詳細に記載されるような、新規ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド、ｐｒｏｓｔ ０３ポリヌクレオチド及びＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに対して向けられた抗体に関する。特に、本発明は、新規ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド及びそれらのＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関して、そして特に、図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するＰＲＯＳＴ ０３、及び図１（配列番号１）に示されるポリヌクレオチド配列を有するｐｒｏｓｔ ０３に関する。
【００６４】
本発明はまた、ＰＲＯＳＴ ０３変異体を包含する。好ましいＰＲＯＳＴ ０３変異体は、図２（配列番号２）に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の類似性（好ましくは、少なくとも７０％の同一性）、及びより好ましくは少なくとも９０％の類似性（より好ましくは、少なくとも９０％の同一性）、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する変異体であり、そしてまた、一般的に少なくとも１０個のアミノ酸及びより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドのそのような部分を有するそのようなポリペプチドの部分も包含する。
【００６５】
ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの予測される活性形のためのコード配列は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の５’末端から２８２個の塩基対で開始する。ＰＲＯＳＴ ０３は、ＭＦＳファミリーの膜輸送タンパク質の特性を有する１２−１３のトランスメンブラン−スパナー構造ドメインを含む。
本発明は、ＰＲＯＳＴ ０３とスクロース／Ｈ＋共輸送タンパク質（ＤｃＳＵＴ２）との間の図３に示される構造類似性に一部基づかれている。
【００６６】
本発明はまた、前立腺組織ライブラリーにおけるその発現及び前立腺腫瘍ライブラリーにおけるその過剰発現により示されるように、そのＰＲＯＳＴ ０３の発現プロフィールに一部基づかれている。この組織プロフィールは、正常及び腫瘍組織からの組織サンプルにおけるｍＲＮＡ発現の、ＰＣＲに基づくＴａｑｍａｎ分析による分析に見られる。この分析方法は、ＰＲＯＳＴ ０３をコードするｍＲＮＡが、他の組織に比較して、前立腺組織において過剰発現されることを示した。
【００６７】
ポリヌクレオチド：
本発明の１つの観点によれば、図２（配列番号２）の推定されるアミノ酸配列を有するＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００６８】
本明細書において提供される情報、例えば図１（配列番号１）に示されるポリヌクレオチド配列を用いて、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準のクローニング及びスクリーニング方法、例えば出発材料としてヒト組織の細胞からのｍＲＮＡを用いてのｃＤＮＡのクローニングのためのそれらの方法を用いて得られる。図１（配列番号１）におけるポリヌクレオチド配列は、ヒト前立腺組織から得られるｃＤＮＡクローニングに見出された。
【００６９】
ＰＲＯＳＴ ０３は、Ｉｎｃｙｔｅ’ｓ ＬｉｆｅＳｅｑデータベースを調べることによって、前立腺において発現される遺伝子として同定された。ヌクレオチド配列は、前立腺腫瘍関連のＥＳＴについて記載データベースを調べることによって同定された。ヌクレオチド配列は、注釈されるデータベースにおける膜輸送分子のカテゴリーに見出された。ライブラリー組みにおけるｐｒｏｓｔ ０３ポリヌクレオチド配列の分布の電子ノザン分析は、ｐｒｏｓｔ ０３ ｍＲＮＡが前立腺ライブラリーにおいて高いレベルで及び多数の他の組織、例えば正常及び腫瘍組織ライブラリーにおいて低いレベルで発現されることを示した。
【００７０】
Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑデータベースの調査は、実験使用のために前記Ｉｎｃｙｔｅから得られた一群のｃＤＮＡクローンを生ぜしめた。連続ポリヌクレオチド配列中へのｐｒｏｓｔ ０３クローンの電子アセンブリー及び連続配列の編集に続いて、部分コード配列が、予測されるアセンブリーされたポリヌクレオチドにおいて同定された。この例は、コード領域の５’末端を欠失していた。
【００７１】
ｐｒｏｓｔ ０３のための追加の５’配列が、ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリーからクローン化された。これは、ＰＲＯＳＴ ０３のための十分な長さのコード領域を含むことが予測されるＩｎｃｙｔｅデータベースにおけるクローンの同定を導びいた。前記十分な長さのポリペプチド配列は、ＦａｓｔＡプログラムを用いて、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びＳＰＴＲＥＭＢＬデータベースを調べるために使用された、この調査の結果は、ＰＲＯＳＴ ０３配列が植物において前に同定された輸送体組、特にスクロース／プロトン輸送体組みに対する類似性を示すことを指摘した。特に、類似性は、ＰＲＯＳＴ ０３とＤｃＳＵＴ２、すなわちスクロース／Ｈ＋共輸送タンパク質との間に見出された。
【００７２】
Ｉｎｃｙｔｅクローン３３６２０３０， ３４５８０７６及び３３５２３３１を、実験研究のためにＩｎｃｙｔｅから得た。それらのクローンは十分に配列決定され、そしてすべては、予測されるＰＲＯＳＴ ０３タンパク質につての十分なコード配列を含んだ。クローン３３５２３３１の配列は、図１（配列番号１）に示される。
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの形で、又はＤＮＡの形で、例えばクローニングにより得られるか、又は化学的合成技法、又はそれらの組み合わせ、又は本明細書に記載される方法により生成される、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの形で存在することができる。ＤＮＡは二本鎖であっても又は一本鎖であっても良い。一本鎖ＤＮＡは、またセンス鎖としても知られているコード鎖であり得、又はそれは、アンチセンス鎖としても言及される非コード鎖ででもあり得る。
【００７３】
前記ポリペプチドをコードする配列は、図１（配列番号１）で示されるポリヌクレオチドのコード配列と同一であり得る。それはまた、遺伝子コードの冗長性（縮重）の結果として、図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする、異なった配列を有するポリヌクレオチドででもあり得る。
【００７４】
図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、次のポリペプチド自体のためのコード配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない：前記ポリペプチドのコード配列、及び追加の非コード配列、例えばイントロン及び非コード５’及び３’配列、例えば転写において役割を演じる、転写された非翻訳配列、ｍＲＮＡプロセッシング（例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナル）、又は追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列、例えば追加の官能価を提供するそれらの配列と共に、前述の追加のコード配列を有する又は有さないポリペプチドのコード配列。
【００７５】
従って、例えば、ポリペプチドは、融合されるポリペプチドの精製を促進するマーカー配列、例えばペプチドに融合され得る。本発明のこの観点の好ましい態様においては、マーカー配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、中でもｐＴｒｃｈｉｓＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｉｓｂａｄ， ＣＡ）に供給される標識（それらの多くは市販されている）である。例えば、Ｇｅｎｉｚなど．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ８２１−８２４， １９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。
【００７６】
ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドである１つのポリペプチド、及び追加のアミノ又はカルボキシル末端アミノ酸、又はポリペプチドの内部ンアミノ酸（活性形が１つよりも多くのポリペプチド鎖を有する場合）をコードすることができる。そのような配列は、中でも前駆体から最終形へのポリペプチドのプロセッシングにおいて役割を演じることができ、ポリペプチドトラフッキングを促進することができ、ポリペプチドの半減期を延長するか又は短縮することができ、又はアッセイ又は生成のためのポリペプチドの操作を促進することができる。一般的に、良くあることであるが、追加のアミノ酸は、細胞酵素によりポリペプチドから除去され得る。
【００７７】
本発明はさらに、図２（配列番号２）の推定されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、類似体及び誘導体をコードする、上記に記載されたポリヌクレオチドの変異体にも関する。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する変異体、例えば天然に存在する対立遺伝子変異体であり得、又はそれは天然において存在することが知られている変異体であり得る。ポリヌクレオチドのそのような天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技法、例えばポリヌクレオチド、細胞又は生物に適用されるそれらの技法により製造され得る。
【００７８】
これに関する変異体は、ポリヌクレオチド置換、欠失又は付加により前述のポリヌクレオチドとは異なる変異体である。置換、欠失又は付加は、１又は複数のポリヌクレオチドを包含することができる。変異体は、コード又は非コード領域、又は両領域において変更され得る。コード領域の変更は、保存性又は非保存性アミノ酸置換、欠失又は付加を生成することができる。
中でも、これに関しての本発明の特に好ましい態様は、図２（配列番号２）に示されるＰＲＯＳＴ ０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、その変異体、類似体、誘導体及びフラグメント、及び前記変異体、類似体及び誘導体のフラグメントである。
【００７９】
これに関してのさらに特に好ましいものは、いくつかの、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、２個、１個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換され、欠失され又は付加されているか、又はいずれかのアミノ酸も置換、欠失又は付加されていない、図２（配列番号２）のＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、ＰＲＯＳＴ ０３変異体、類似体、誘導体及びフラグメント、及び前記フラグメントの変異体、類似体及び誘導体をコードするポリヌクレオチドである。それらの中で特に好ましいものは、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの性質及び活性を変更しない、サイレント置換、付加及び欠失である。また、これに関して特に好ましいものは、保存性置換である。最も好ましいものは、置換を伴なわないで、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００８０】
本発明のさらに好ましい態様は、図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドをコードするポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチドである。他方では、最も好ましいものは、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドをコードするポリペプチドに対して少なくとも８０％同一である領域を含んで成るポリヌクレオチド及びそれに対して相補的であるポリヌクレオチドである。
【００８１】
これに関して、少なくとも９０％の同一性のポリヌクレオチドが特に好ましくは、そしてそれらの特に好ましいポリヌクレオチドの中で、少なくとも９５％の同一性を有するそれらのものが特に好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を有するそれらのものが非常に好ましく、そしてそれらの中で、少なくとも９８％及び少なくとも９９％の同一性を有するそれらのものが特に非常に好ましく、そして少なくとも９９％の同一性のものがより好ましい。
【００８２】
この観点における特に好ましい態様は、図１（配列番号１）のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物学的活性を保持するポリペプチドを、コードするポリヌクレオチドである。
本発明はさらに、上記配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は特に、上記ポリヌクレオチドに対して、緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して、本明細書においてさらに論じられるように、上記で論じられたような本発明のポリヌクレオチドは、ＰＲＯＳＴ ０３をコードする十分な長さのｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するために、そしてＰＲＯＳＴ ０３遺伝子に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。そのようなプローブは一般的に、少なくとも１５個の塩基を含んで成るであろう。好ましくは、そのようなプローブは、少なくとも３０個の塩基を有するであろうし、そして少なくとも５０個の塩基を有することができる。
【００８４】
例えば、ＰＲＯＳＴ ０３遺伝子のコード領域は、既知のＤＮＡ配列を用いて企画された合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を有するラベルされたオリゴヌクレオチドは、プローブにハイブリダイズするクローンを同定するためにｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーンするために使用され得る。
要するに、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチド、ポリペプチド及びリーダー配列（プレポリペプチドとして言及され得る）をコードすることができる。
【００８５】
本発明はまた、中でも、ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドフラグメント、特に緊縮条件下でハイブリダイズするそれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのポリヌクレオチド、例えばＰＣＲプライマーに関する。それらに関しては、好ましいポリヌクレオチドは、下記で論じられるような、好ましいポリペプチドフラグメントに対応するそれらのポリヌクレオチドである。
【００８６】
ポリペプチド：
本発明はさらに、図２（配列番号２）の推定されるアミノ酸配列を有するＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに関する。
本発明はまた、それらのポリペプチドのフラグメント、類似体及び誘導体に関する。用語、フラグメント、誘導体及び類似体は、図２（配列番号２）のポリペプチドに関する場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドであり得る。好ましい態様においては、それは組換えポリペプチドである。
【００８７】
図２（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導体又は類似体は、（ｉ）１又は複数のアミノ酸残基が、保存された又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）により置換され、そしてそのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされる残基であっても又はなくても良いもの、又は（ｉｉ）１又は複数のアミノ酸残基が置換基を包含するもの、又は（ｉｉｉ）ポリペプチドがもう１つの化合物、例えばポリペプチドの半減期を高めるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）により融合されるもの、又は（ｉＶ）追加のアミノ酸がポリペプチド、例えばリーダー又は分泌配列、又はポリペプチドの精製のために使用される配列に融合されるものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体及び類似体は、本明細書における技術から当業者の範囲内であると思われる。
【００８８】
これに関しての本発明の特に好ましい態様は、図２（配列番号２）に示されるＰＲＯＳＴ ０２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体、誘導体及びフラグメント、及び前記フラグメントの変異体、類似体及び誘導体である。
好ましい変異体は、保存性アミノ酸置換により対照とは異なるそれらの変異体である。そのような置換は、同様の特徴のもう１つのアミノ酸によりポリペプチドにおける所定のアミノ酸を置換するそれらの置換である。典型的には、次のような保存性置換が見出される：脂肪族アミノ酸Ａｌａ， Ｖａｌ， Ｌｅｕ及びＩｌｅ間の置換、ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの相互交換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎ間の置換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換、及び芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒ間での置換。
【００８９】
いくつかの、少々の、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、２個、１個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで、置換され、欠失され又は付加されているか、又はいずれのそれらも存在しない、図２（配列番号２）のＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのアミノ酸残基を有する、変異体、類似体、誘導体及びフラグメント、及び前記フラグメントの変異体、類似体及び誘導体が、これに関して特に好ましい。それらの中で特に好ましいものは、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの性質及び活性を変更しないサイレント置換、付加及び欠失である。これに関して特に好ましいものは、保存性置換である。置換を伴なわないで、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、最も好ましい。
【００９０】
本発明のポリペプチドはまた、図２（配列番号２）のポリペプチド、及び図２（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）及びより好ましくは少なくとも９０％の類似体（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、そしてまた、一般的に少なくとも１０個のアミノ酸及びより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドのそのような部分を有するそのようなポリペプチドの部分を包含する。
【００９１】
当業界において知られているように、２種のポリペプチド間の“類似性”は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換と第２のポリペプチドの配列を比較することによって決定される。
本発明のポリペプチドのフラグメント又は一部は、ペプチド合成によりその対応する十分な長さのポリペプチドを生成するために使用され得；従って、フラグメントは、十分な長さのポリペプチドを生成するための中間体として使用され得る。
【００９２】
フラグメント：
また、本発明のこの観点の好ましい態様は、ＰＲＯＳＴ ０３のフラグメント、最も特定には、図２（配列番号２）のＰＲＯＳＴ ０３のフラグメント、及び図２（配列番号２）のＰＲＯＳＴ ０３の変異体及び誘導体のフラグメントを含んで成るポリペプチドである。
これに関して、フラグメントは、前記ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド及びその変異体又は誘導体のアミノ酸配列のすべてではないが、一部と完全に同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００９３】
そのようなフラグメントは、“自立構造体（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）”であり得、すなわち他のアミノ酸又はポリペプチドの一部又はそれに融合せず、又はそれらは、それが一部又は領域を形成する大きなポリペプチド内包含され得る。大きなポリペプチド内に包含される場合、現在論じられているフラグメントは、最も好ましくは、単一の連続した領域を形成する。しかしながら、いくつかのフラグメントは、単一の大きなポリペプチド内に包含され得る。例えば、一定の好ましい態様は、宿主における発現のために企画され、そしてＰＲＯＳＴ ０３フラグメントのアミノ酸末端に融合される異種プレ−及びプロポリペプチド領域、及びフラグメントのカルボキシル末端に融合される追加の領域を有する前駆体ポリペプチド内に包含される本発明のＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのフラグメントに関する。従って、本発明において意図される意味の１つの観点におけるフラグメントは、ＰＲＯＳＴ ０３に由来する融合ポリペプチド又は融合タンパク質の一部を言及する。
【００９４】
本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例として、約１０〜約５５３個のアミノ酸を有するそれらのフラグメントが言及され得る。
本明細書において、“約”とは、特別に引用される範囲、及びいずれかの極限又は両極限でいくつかの、少数の、５，４，３，２又は１個のアミノ酸、多いか又は少ない範囲を包含する。例えば、約５５３個のアミノ酸とは、１０±いくらかの、少数の、５，４，３，２又は１個のアミノ酸〜５５３±いくつかの、少数の、５，４，３，２又は１個のアミノ酸残基のポリペプチドフラグメントを意味し、すなわち広範囲としての１０−いくつかのアミノ酸〜５５３＋いくつかのアミノ酸〜狭い範囲としての１０＋いくつかのアミノ酸〜５５３−いくつかのアミノ酸の範囲である。
【００９５】
これに関して、いずれかの極限又は両極限での引用された範囲±５個ほどのアミノ酸の範囲が、非常に好ましい。いずれかの極限又は両極限での引用された範囲±３個ほどの長さのアミノ酸の範囲が特に非常に好ましい。いずれかの極限又は両極限での引用された範囲（付加又は欠失を有さない）±１個のアミノ酸の範囲が特に好ましい。これに関しては、約１０〜約５５３個のアミノ酸が最も好ましい。
【００９６】
本発明の特に好ましいフラグメントは、ＰＲＯＳＴ ０３の切断変異体である。ＰＲＯＳＴ ０３の切断変異体は、図２（配列番号２）の配列の変異体又は誘導体を包含するが、但し次のものを除く：図２（配列番号２）に示される配列のアミノ末端を包含する連続した一連の残基の欠失（すなわち、連続した領域、部分又は一部）、又はカルボキシル末端、又は二重切断変異体におけるような、２つの連続した一連の残基の欠失、アミノ末端を包含する欠失及びカルボキシル末端を包含する欠失を包含する連続した一連の残基。上記に示されるサイズ範囲を有するフラグメントはまた、一般的にフラグメント間で特に好ましい切断フラグメントの好ましい態様である。
【００９７】
本発明のこの観点においては、ＰＲＯＳＴ ０３の生物学的及び／又は免疫学的特性により特徴づけられるフラグメントが特に好ましい。そのようなフラグメントは、例４に記載されるように、抗体を生成するために使用されるそれらのフラグメントを包含する、予測されるループドメイン及びアミノ及びカルボキシ末端ドメインを含むそれらのフラグメントを包含する。
それらに関する一定の好ましい領域は、図２（配列番号２）に示され、図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列の分析により同定される前記タイプの領域（但し、それだけには限定されない）を包含する。
【００９８】
さらに好ましい領域は、ＰＲＯＳＴ ０３の活性を介在するそれらの領域である。これに関して最も好ましいものは、ＰＲＯＳＴ ０３の化学的、生物学的又は他の活性を有するフラグメント、例えば類似する活性、又は改良された活性、又は低められた所望しない活性を有するそれらのフラグメントである。これに関しては、関連するポリペプチド、例えばＰＲＯＳＴ ０３を包含する、ＭＦＳファミリーの他のタンパク質の活性領域に対して、配列において、又は位置において、又は配列及び位置の両者において相同である領域を含むフラグメントが、非常に好ましい。
【００９９】
ベクター、宿主細胞及び発現システム：
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターにより遺伝子的に構築される宿主細胞、及び組換え技法による本発明のポリペプチドの生成に関する。そのような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ． Ｙ． １９８９， 及びＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． など．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ，Ｙ．， １９８９に記載されている。
【０１００】
宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを組み込み、そしてポリペプチドを発現するよう、遺伝子的に構築され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、感染、トランスダクション、トランスフェクション、トランスベクション及び形質転換の良く知られている技法を用いて、宿主細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチドは、単独で、又は他のポリヌクレオチドと共に導入され得る。そのような他のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに、独立して導入され、同時導入され、又は導入連結され得る。
【０１０１】
従って、例えば本発明のポリヌクレオチドは、例えば哺乳類細胞のおける同時トランスフェクション及び選択のための標準技法を用いて、選択マーカーをコードするもう１つの別のポリヌクレオチドと共に宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。この場合、ポリヌクレオチドは一般的に、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれるであろう。
【０１０２】
他方では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含むベクターに連結され得る。そのベクター構造体は、前記技法により宿主細胞中に導入され得る。一般的に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物、又は荷電された脂質との複合体におけるＤＮＡとして導入される。エレクトロポレーションはまた、宿主中にポリヌクレオチドを導入するためにも使用され得る。ベクターがウィルスである場合、それはインビトロでパッケージングされ、又はパッケージング細胞中に導入され、そしてパッケージングされたウィルスが細胞中にトランスダクションされ得る。
【０１０３】
本発明のこの観点に関して、ポリヌクレオチドを製造し、そしてポリヌクレオチドを細胞中に導入するために適切な広範囲の種類の技法は、良く知られており、そして当業者に通常のことである。そのような技法は、それらの技法を詳細に説明する多くの実験マニュアルを例示する、上記で引用されたＳａｎｂｒｏｏｋなどに再考される。本発明のこの観点によれば、ベクターは、例えばプラスミドベクター、一本鎖又は二本鎖ファージベクター、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡウィルスベクターであり得る。
【０１０４】
そのようなベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡを細胞中に導入するための良く知られている技法により、ポリヌクレオチド、好ましくはＲＮＡとして細胞中に導入され得る。ベクターは、ファージ及びウィルスベクターの場合、また好ましくは感染及びトランスダクションのための良く知られている技法により、パッケージングされた又は封入されたウィルスとして細胞中に導入される。ウィルスベクターは、複製能力を有するか、又は複製欠陥性であり得る。後者の場合、ウィルス増殖は一般的に、宿主細胞を補足することにおいてのみ存在する。
【０１０５】
ある観点において、好ましいベクターは、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現のためのそれらのベクターである。一般的に、そのようなベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに操作可能的に連結される宿主における発現のために効果的なシス−作用性制御領域を含んで成る。適切なトランス−作用性因子は、宿主により供給され、補充ベクターにより供給され、又は宿主中への導入に基づいてベクター自体により供給される。
【０１０６】
これに関しての好ましい態様においては、ベクターは特定の発現を提供する。そのような特定の発現は、誘発性発現又は一定タイプの細胞においてのみの発現、又は誘発性及び細胞特異的発現であり得る。操作するのに容易である環境因子、例えば温度及び栄養添加剤による発現のために誘発され得るベクターが、誘発性ベクター間で特に好ましい。本発明のこの観点に適切な種々のベクター、例えば原核及び真核宿主への使用のための構成及び誘発性発現ベクターは良く知られており、そして当業者により日常的に使用され得る。
【０１０７】
構築された宿主細胞は、中でも、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、又は遺伝子を増幅するために適切なように変性され得る従来の栄養培地において培養され得る。発現のために選択される宿主細胞により従来使用されて来た培養条件、例えば温度、ｐＨ及び同様のものは一般的に、当業者に明らかなように、本発明のポリペプチドの発現のために適切であろう。
【０１０８】
多種の発現ベクターが、本発明のポリペプチドを発現するために使用され得る。適切なベクターは、染色体、エピソーム及びウィルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵素染色体要素、ウィルス、例えばバキュロウィルス、パポーバウィルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、家禽類ポックスウィルス、偽性狂犬病ウィルス、レトロウィルス及びアルファウィルス、例えばＳｉｎｄｂｉｓウィルスに由来するベクター、及びそれらの組み合わせに由来するベクター、例えばプラスミド及びバクテリアファージ遺伝子要素、例えばコスミド及びファゲミドに由来するそれらのベクターを包含し、ここですべては、本発明のこの観点に従って発現のために使用され得る。一般的に、宿主においてポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを発現するために維持し、増殖し又は発現するために適切ないずれかのベクターが、これに関しての発現のために使用され得る。好ましいベクターは、バキュロウィルスに由来するベクターである。
【０１０９】
適切なＤＮＡ配列が、種々の良く知られており且つ通常の技法のいずれかによりベクター中に挿入され得る。一般的に、発現のためのＤＮＡ配列は、１又は複数の制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡ配列及び発現ベクターを切断し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に連結することによって、発現ベクターに連結される。この目的のために使用され得る制限及び連結のための方法は、当業者に良く知られており、且つ通常の方法である。これに関して、及び当業者に良く知られ且つ通常のものである他の技法を用いての発現ベクターを構成するための適切な方法は、本明細書に引用により組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋなどに詳細に示されている。
【０１１０】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列、例えばｍＲＮＡ転写を方向づけるためのプロモーターに操作可能的に連結される。そのようなプロモーターの代表は、ファージランダムＰＬプロモーター、Ｅ．コリｌａｃ， ｔｒｐ、ｔａｃ及びｔｒｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター、及び少数のプロモーターを命名するためのレトロウィルスＬＴＲのプロモーターを包含する。言及されない多くのプロモーターが、本発明のこの観点への使用のために適切であり、良く知られており、そして本明細書における論議及び例により例示される態様で当業者により容易に使用され得ることは理解されるであろう。
【０１１１】
一般的に、発現構造体は、転写開始及び終結のための部位、及び転写された領域における、翻訳のためのリボソーム結合部位を含むであろう。前記構造体により発現される転写体のコード部分は、開始での翻訳開始ＡＵＧ、及び翻訳されるべきポリペプチドの末端にほぼ位置する終結コドンを含むであろう。
さらに、構造体は、発現を調節し、そして生ぜしめる制御領域を含むことができる。一般的に、多くの通常実施される方法によれば、そのような領域、例えば、中でもリプレッサー結合部位及びエンハンサーが、転写を制御することによって作動するであろう。
【０１１２】
増殖及び発現のためのベクターは一般的に、選択マーカーを包含するであろう。そのようなマーカーはまた、増幅のために適切であり、又はベクターはこの目的のための追加のマーカーを含むことができる。これに関して、発現ベクターは好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を供給するための１又は複数の選択マーカー遺伝子を含む。好ましいマーカーは、真核細胞培養物のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン、プロマイシン又はヒグロマイシン耐性遺伝子、及びＥ．コリ及び他の細菌を培養するためのテトラサイクリン、テオマイシン、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子を包含する。
【０１１３】
本明細書の他の部分で記載されるような適切なＤＮＡ配列、及び適切なポロモーター、並びに他の適切な制御配列を含むベクターが、所望するポリペプチドの底における発現のために適切な良く知られている種々の技法を用いて、適切な宿主中に導入され得る。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞、例えばＥ．コリ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びサルモネラ・チピムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞、菌類細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ５２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ及びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞；及び植物細胞、好ましくは昆虫細胞ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４を包含する。多種の発現構造体のための宿主は良く知られており、そして当業者は、本発明のこの観点に従って、ポリペプチドを発現するための宿主の容易な選択を可能にされる。
【０１１４】
種々の哺乳類細胞培養物システムが発現のために使用され得る。哺乳類発現システムの例は、モンキー腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系を包含する（Ｇｌｕｚｍａｎなど．， Ｃｅｌｌ ２３： １７５， １９９１）。適合できるベクターを発現できる他の細胞系は、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ヒト腎臓２９３及びＢＨＫ細胞系を包含する。哺乳類宿主細胞においては、多くのウィルスに基づく発現システムが使用され得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、ＰＲＯＳＴ ０３をコードするポリヌクレオチド配列は、後期プロモーター及び三元リーダー配列から成るアデノウィルス転写／翻訳複合体中に連結され得る。ウィルスゲノムの非必須のＥ１又はＥ３領域における挿入は、感染された宿主細胞におけるＰＲＯＳＴ ０３の発現を可能にする生存ウィルスをもたらすであろう（Ｌｏｇｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３６５６−５９， １９８４）。さらに、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウィルス（ＲＶＳ）エンハンサーが、哺乳類宿主細胞における発現を高めるために使用され得る。
【０１１５】
より特定には、本発明はまた、上記の１又は複数の配列を含んで成る、組換え構造体、例えば発現構造体を包含する。前記構造体は、本発明のそのような配列が挿入されているベクター、例えばプラスミド又はウィルスベクターを含んで成る。前記配列は、前方向又は逆方向で挿入され得る。これに関しての好ましい態様においては、構造体はさらに、調節配列、例えば前記配列に操作可能的に連結されるプロモーターを含んで成る。多数の適切なベクター及びプロモーターは、当業者に知られており、そして本発明への使用のために適切な多くの市販のベクターが存在する。
【０１１６】
市販されている次のベクターが例により提供される。細菌への使用のために適切なベクターは、次のものを包含する：Ｑｉａｇｅｎ ＵＳＡ （Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ） から入手できる、ｐＱＥ７０， ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ） から入手できる、ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ベクター、ｐＮＨ８Ａ， ｐＮＨ１６ａ， ｐＮＨ１８Ａ， ｐＮＨ４６Ａ； 及びＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ） から入手できる、ｐｔｒｃ９９ａ， ｐｋ２２３−３， ｐｋｋ２３３−３， ｐＤＲ５４０， ｐＲＩＴ５。好ましい真核ベクターは、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手できるｐＷＬＮＥＯ， ｐＳＶ２ＣＡＴ， ｐＯＧ４４， ＰＸＴＩ及びｐＳＧ；及びＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手できるｐＳＶＫ３， ｐＢＰＶ， ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬである。Ｐｒｏｍｅｇａから入手できるｐＣｉｎｅｏベクターが最も好ましい。
【０１１７】
それらのベクターは、本発明のこの観点に従っての使用のために当業者により入手できる、多くの市販の良く知られているベクターにより列挙される。例えば、宿主における本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの導入、維持、増殖又は発現のために適切ないずれかの他のプラスミド又はベクターが本発明のこの観点において使用され得ることが理解されるであろう。
【０１１８】
プロモーター領域は、プロモーター領域を欠いているレポーター転写単位、例えば候補体プロモーターフラグメント、すなわちプロモーターを含むことができるフラグメントを導入するための制限部位の下流のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（“ｃａｔ”）転写単位を含むベクターを用いていずれかの所望する遺伝子から選択され得る。良く知られているように、ｃａｔ遺伝子の上流の制限部位でのプロモーター包含フラグメントのベクター中への導入は、標準のＣＡＴアッセイにより検出され得る、ＣＡＴ活性の生成を生ぜしめる。この目的のために適切であるベクターは良く知られており、そして容易に入手できる。２種のそのようなベクターは、ｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７である。従って、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターは、良く知られ、且つ容易に入手できるプロモーターのみならず、また、レポーター遺伝子を用いて前記技法により容易に得られるプロモーターも包含する。
【０１１９】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現のために適切な既知の細胞プロモーターは、Ｅ．コリｌａｃｔ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、Ｔ５ｔａｃプロモーター、ラムダＰＲ， ＰＬプロモーター、ｔｒｐプロモーター及びｔｒｃハイブリッドプロモーター（ｔｒｐ及びｌａｃプロモーターに起因する）である。これに関しての適切な既知の真核プロモーターは、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウィルスＬＴＲのプロモーター、例えばテウス肉腫ウィルス（“ＲＳＶ”）及びメタロチオネインプロモーター、例えばマウスメタロチオネイン−１プロモーターである。
【０１２０】
宿主細胞における発現のための適切なベクター及びプロモーターの選択は、良く知られている方法であり、そして発現ベクター構成のための必要な技法、宿主中へのベクターの導入、及び宿主における発現は、当業者の通常の範囲内にある。
一般的に、組換え発現ベクターは、複製の起点、下流の構造配列の転写を方向づけるための高く発現された遺伝子に由来するプロモーター、及びベクターへの暴露の後、ベクター含有細胞の単離を可能にする選択マーカーを包含するであろう。
【０１２１】
本発明はまた、上記構造体を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、高等真核細胞、例えば哺乳類細胞、又は下等真核細胞、例えば酵母細胞であり得、又は宿主細胞は原核細胞、例えば細菌細胞であり得る。宿主細胞中の構造体は、組換え配列によりコードされる遺伝子生成物を生成するために従来の態様で使用され得る。
ポリペプチドは、適切なプロモーターの制御下で、哺乳類細胞、酵母、細菌又は他の細胞において発現され得る。細胞フリーの翻訳システムがまた、本発明のＤＮＡ構造体に由来するＲＮＡをも用いて、そのようなタンパク質を生成するために使用され得る。真核及び原核と共に使用するための適切クローニング及び発現ベクターは、本明細書に引用されるＳａｍｂｒｏｏｋなどにより記載される。
【０１２２】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって高められ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を高めるよう作用する、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡの要素である。エンハンサーの例は、ｂｐ１００〜２７０での複製起点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリマーエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーを包含する。
【０１２３】
本発明のポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは一般的に、標準技法を用いてベクター中に挿入され得、その結果、それは発現のためにプロモーターに操作可能的に連結される。ポリヌクレオチドは、転写が５’側のリボソーム結合部位側に位置するよう位置決定されるであろう。リボソーム結合部位は、発現されるべきポリペプチドの翻訳を開始する５’側のＡＵＧ側に存在するであろう。一般的に、開始コドン、通常ＡＵＧにより開始し、そしてリボソーム結合部位と開始ＡＵＧとの間に存在する他の読み取り枠は存在しないであろう。また、一般的に、ポリペプチドの末端で翻訳停止コドンが存在し、そして転写された領域の３’末端でほぼ配置されるポリアデニル化シグナル及び転写終結シグナルが存在するであろう。
【０１２４】
小胞体の内腔、細胞周辺腔又は細胞外環境中への翻訳されたタンパク質の挿入のために、適切な分泌シグナルが、発現されたポリペプチド中に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得、又はそれらは異種シグナルであり得る。ポリペプチドは修飾された形、例えば融合タンパク質の形で発現され得、そして分泌シグナルのみならず、また追加の異種官能領域も包含することができる。従って、例えば追加のアミノ酸、特に荷電されたアミノ酸の領域が、精製の間、又は続く取り扱い及び貯蔵の間、宿主細胞における安定性及び持続性を改良するために、ポリペプチドのＮ−末端に付加され得る。また、特定の領域がまた、精製を促進するためにポリペプチドに付加され得る。
【０１２５】
そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前、除去され得る。中でも、分泌又は排泄を生ぜしめ、安定性を改良し、そして精製を促進するためにポリペプチドへのペプチド成分の付加は、当業界においては良く知られた通常の技法である。例えば多量のＰＲＯＳＴ ０３が抗体の生成のために必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指図するベクターが所望される。
【０１２６】
そのようなベクターは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：多官能Ｅ．コリクローニング及び発現ベクター、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） （ここで、ＰＲＯＳＴ ０３をコードする配列が、ハイブリッドタンパク質が生成されるよう、アミノ末端Ｍｅｔ及びβ−ガラクトシダーゼの続く７個の残基と読み取り枠を整合してベクター中に連結され得る）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｄｅ ａｎｄ Ｓｈｕｓｔｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： ５５０３−５５０９， １９８９）及び同様のもの。
【０１２７】
ＰｔｒｃＨｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ， Ｃａｒｉｓｂａｄ， ＣＡ）が、急速な精製のためにポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）標識を含む融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現するために使用され得る。そのようなシステムにより製造されたタンパク質は、切断部位、例えばエンテロキナーゼ切断部位を含むよう企画され、その結果、興味あるクローン化されたポリペプチドが意図して、融合ペプチド成分から開放され得る。
【０１２８】
適切な宿主株の形質転換及び適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、存在するなら、誘発性プロモーターが、適切な手段（例えば、温度シフト、又は化学的インデューサーへの暴露）により誘発され、そして細胞が追加の期間、培養される。
次に、細胞は、典型的には、遠心分離により収穫され、物理的又は化学的手段により破壊され、そして得られる粗抽出物は追加の精製のために保持される。
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、いずれかの従来の方法、例えば凍結−融解循環、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用（そのような方法は、当業者に良く知られている）により破壊され得る。
【０１２９】
ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、次の良く知られている方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る：硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びシレチンクロマトグラフィー。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）が、精製のために使用される。
【０１３０】
タンパク質を折りたたむための良く知られている技法が、ポリペプチドが単離及び／又は精製の間、変性される場合、活性配座を再生するために使用され得る。当業界において良く知られているタンパク質精製の種々の他の方法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９８２； 及びＳｃｏｐｅｓ， Ｒ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｉａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２ に記載されるそれらの方法を包含する。
【０１３１】
他方では、本発明のポリペプチドは、固相技法を用いての直接的なペプチド合成により生成され得る（Ｓｔｅｗａｒｔなど．， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， １９６９； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， ｊ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９−２１５４， １９６３）。インビトロタンパク質合成は、手動技法を用いて、又は自動装置により行われ得る。自動合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆａｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ）を用いて、その製造業者により提供される説明書に従って達成され得る。ＰＲＯＳＴ ０３の種々のフラグメントは、十分な長さの分子を生成するために、化学的方法を用いて、別々に化学的に合成され、そして組み合わされ得る。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは、天然において精製された生成物、化学的合成方法の生成物及び原核又は真核宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞から組換え技法により生成せれた生物を包含する。組換え生成方法に使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されても又はされなくても良い。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主介在性方法の結果として、初期修飾されたメチオニン残基を含むことができる。
【０１３３】
ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチドの使用：
ＰＲＯＳＴ ０３ポリヌクレオチド及びＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、種々の用途、例えばＰＲＯＳＴ ０３の化学的及び生物学的性質を使用するそれらの用途に従って使用され得る。追加の用途は、細胞増殖の疾病、例えば前立腺癌の診断及び処理に関する。本発明のそれらの観点は、次の論議によりさらに例示され、そしてさらに、本明細書内に記載される。
【０１３４】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の使用のための基本原理は、他の組織に比較して、前立腺組織におけるＰＲＯＳＴ ０３の選択的発現に、及び 本明細書に開示されるＰＲＯＳＴ ０３と、ＰＲＯＳＴ ０３が細胞表面タンパク質であることを示唆する、糖輸送体分子との間の化学的及び構造的類似性に基づかれている。ＰＲＯＳＴ ０３及びＰＲＯＳＴ ０３の関連する分子は前立腺癌の不適切な増殖に関連する状態、障害又は疾病の診断及び処理に使用され得る。それらは、前立腺における癌及び転移性腫瘍増殖、及び他の腫瘍組織を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１３５】
ＰＲＯＳＴ ０３ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡプローブとして、及びアンチセンス及びリボザイム治療のための標的物として、又はアンチセンスポリヌクレオチドの生成のための鋳型として使用され得る。
ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、細胞及び組織におけるＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのレベルを検出することにおいて、及び薬剤を一次及び転移性腫瘍に標的化することにおいて有用である、ＰＲＯＳＴ ０３に対する抗体を生成するために使用され得る。
ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、ＰＲＯＳＴ ０３を含む細胞に対する免疫応答を刺激するために使用され得る。
【０１３６】
ＰＲＯＳＴ ０３をコードするポリヌクレオチドは、細胞及び組織におけるＰＲＯＳＴ ０３をコードするポリヌクレオチドのレベルを検出するための診断アッセイにおいて有用である。
ＰＲＯＳＴ ０３の発現に関連する状態、例えば前立腺癌においては、ＰＲＯＳＴ ０３の発現又は活性を制御することが好都合である。ＰＲＯＳＴ ０３の発現は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムの投与により抑制され得る。さらに、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに結合し、そしてＰＲＯＳＴ ０３活性を担当できる抗体が、ＰＲＯＳＴ ０３活性に関連する疾病又は病状を処理するために投与され得る。さらに、小分子アゴニスト及びアンタゴニストが、ＰＲＯＳＴ ０３活性をもたらすために投与され得る。
【０１３７】
ポリヌクレオチドアッセイ：
本発明はまた、例えば診断試薬として、相補的ポリヌクレオチドを検出するためへのＰＲＯＳＴ ０３−関連ポリヌクレオチドの使用にも関する。疾病状態に関連するＰＲＯＳＴ ０３ポリヌクレオチドの検出は、ＰＲＯＳＴ ０３の組織特異的発現に起因する疾病の診断又は疾病に対する感受性を定義することができる、インビトロ及びインビボ診断の開発のための手段を提供するであろう。
【０１３８】
ＰＲＯＳＴ ０３をコードする遺伝子に突然変異を担持する個人は、種々の技法によりＤＮＡレベルで検出され得る。診断のためのポリヌクレオチドサンプルは、患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検及び検死材料から得られる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接的に使用され得、又は分析の前、ＰＣＲを用いることによって、酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋｉなど．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２４： １６３−１６６， １９８６）。ＲＮＡ又はｃＤＮＡはまた、同じ手段で使用され得る。
【０１３９】
例として、ＰＲＯＳＴ ０３をコードするポリヌクレオチド配列に対して相補的なＰＣＲプライマーが、ＰＲＯＳＴ ０３発現及び突然変異を同定し、そして分析するために使用され得る。例えば、欠失及び挿入は、正常な遺伝子型への比較において、増幅された生成物のサイズの変化により検出され得る。点突然変異は、放射性ラベルされたＰＲＯＳＴ ０３ ＲＮＡ又は他方では、放射性ラベルされたＰＲＯＳＴ ０３アンチセンスＤＮＡ配列に対して、増幅されたＤＮＡをハイブリダイズすることによって同定され得る。完全に適合された配列は、ＲＮアーゼＡ消化又は溶解温度の差異によりミスマッチ重複体から区別され得る。
【０１４０】
対照遺伝子と、突然変異を有する遺伝子との間の配列差異はまた、直接的なＤＮＡ配列決定により示され得る。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメントは、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用され得る。そのような方法の感度は、ＰＣＲ又はもう１つの増幅方法の適切な使用により非常に増強され得る。例えば、配列決定プライマーは、二本鎖ＰＣＲ生成物、又は改良されたＰＣＲにより生成された一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放射性ラベルされたポリヌクレオチドによる従来の方法により、又は蛍光標識による自動配列決定方法により行われる。
【０１４１】
ＤＮＡ配列差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を伴なって又はそれを伴わないで、ゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動性の変更の検出により達成され得る。小さな配列欠失及び挿入は、高解像度ゲル電気泳動により可視化され得る。異なった配列のＤＮＡフラグメントは、異なったＤＮＡフラグメントの移動性がそれらの特定の溶解又は部分溶解温度に従って異なった位置でゲルにおいて遅延される、変性ホルムアミドグラジエントゲル上で区別さえ得る（例えば、Ｍｙｅｒｓなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １２４２， １９８５を参照のこと）。
【０１４２】
特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮ−アーゼ及びＳ１保護、又は化学的切断方法により表され得る（例えば、Ｃａｔｔｏｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８５： ４３９７−４４０１， １９８５を参照のこと）。
従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、種々の方法、例えばハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護化学的切断、直接的なＤＮＡ配列決定又は制限の使用（例えば、ゲノムＤＮＡの制限フラグメント長さ多型現象（“ＲＦＬＰ”）及びサザンブロット）により達成され得る。
従来のゲル電気泳動及びＤＮＡ配列決定の他に、突然変異はまた、現場分析により検出され得る。
【０１４３】
ポリペプチドアッセイ：
本発明はまた、診断アッセイ、例えば正常及び異常レベルの決定を包含する。細胞及び組織、及び体液におけるＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのレベルを決定するための定量及び診断アッセイにも関する。従って、例えば正常な対照組織サンプルに比較して、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの過剰発現を検出するための本発明の診断アッセイが、過形成、例えば前立腺癌の存在を検出するために使用され得る。そのような診断試験は、転移性腫瘍増殖を検出するために使用され得る。宿主に由来するサンプルにおけるポリペプチド、例えば本発明のＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのレベルを決定するために使用され得るアッセイ技法は、当業者に良く知られている。
【０１４４】
そのようなアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競争結合アッセイ、ウェスターンブロット分析及び酵素結合された免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化された細胞分類（ＦＡＣＳ）を包含する。それらの中で、ＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡアッセイはまず、ＰＲＣＳＴ ０７に対して特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含んで成る。さらに、モノクローナル抗体に結合するレポーターが一般的に調製される。レポーター抗体は、検出できる試薬、例えば放射性、蛍光又は酵素試薬に結合される。この例においては、ホースラディシュペルオキシダーゼ酵素が使用される。
【０１４５】
ＥＬＩＳＡを行うためには、サンプルが宿主から除かれ、そして固体支持体、例えばサンプルにおけるポリペプチドを結合するポリスチレン皿上でインキュベートされる。次に、皿上のいずれかの遊離ポリペプチド結合部位が、非特異的タンパク質、例えばウシ血清アルブミンと共にインキュベートすることによって被覆される。次に、モノクローナル抗体が、前記モノクローナル抗体が皿においてインキュベートされ、この間、ポリスチレン皿に結合されるいずれかのＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに結合する。
【０１４６】
結合されていないモノクローナル抗体が緩衝液により洗浄される。ホースラディシュペルオキシダーゼに結合されるレポーター抗体が皿に配置され、ＰＲＯＳＴ ０３に結合されるいずれかのモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合がもたらされる。次に、結合されなかったレポーター抗体が洗浄される。次に、比色基質を包含する、ペルオキシダーゼ活性のための試薬が皿に添加される。第１及び第抗体を通してＰＲＯＳＴ ０３に結合される、固定されたペルオキシダーゼは、着色された反応生成物を生成する。所定の時間で進行する色彩の量は、サンプルに存在するＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを示す。定量的結果は典型的には、標準曲線により得られる。
【０１４７】
それらの及び他のアッセイは、中でも次の文献に記載されている：Ｈａｍｐｔｏｎなど． （Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｔ． Ｐａｕｌ， Ｍｉｎｎ， １９９０） 及びＭａｄｄｏｘなど． （Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １５８： １２１１， １９８３）。
【０１４８】
抗体：
本発明はさらに、本明細書においてＰＲＯＳＴ ０３抗体として言及される、ＰＲＯＳＴ ０３に対して特異的に結合する抗体に関する。ＰＲＯＳＴ ０３発現は、腫瘍及び正常の前立腺組織に高く制限される。さらに、ＰＲＯＳＴ ０３発現は、骨及びリンパ節への前立腺癌転移において強い。その可能性ある細胞表面位置と組合されるそれらの特徴は、スクリーニング、予後、フォローアップアッセイ及びイメージング方法のための卓越したマーカーの特徴を示す。
【０１４９】
さらに、それらの特徴は、ＰＲＯＳＴ ０３が治療方法、例えば標的化された抗体治療、免疫治療及び遺伝子療法のための卓越した標的物であり得る。本明細書において使用される場合、用語“特異的に結合する”とは、抗体及びポリペプチドの相互作用を言及し、ここで前記相互作用は、ポリペプチド上での特定の構造体（すなわち、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存し、換言すれば、抗体は一般的にタンパク質よりもむしろ特定のポリペプチド構造体を認識し、そしてそれに結合する。
【０１５０】
ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド、それらのフラグメント又は誘導体、又はその類似体、又はその類似体、又はそれらを発現する細胞が、それに対する抗体を生成するために免疫原として使用され得る（Ｈａｒｌｏｗ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ ＮＹ （１９８９））。さらに、ＰＲＯＳＴ ０３コードの核酸分子及びＰＲＯＳＴ ０３を発現することができる組換えベクターは、抗体を生成するための免疫原として使用され得る（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏ． １８：９２７−７４， ２０００； Ｓｈｅｄｌｏｃｋ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ６８：７９３−８０６， ２０００）。それらの抗体は、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ、一本鎖及びヒト抗体、及びＦａｂフラグメント、又はＦａｂ発現ライブラリーの生成物を包含する。当業界において知られている種々の方法が、そのような抗体及びフラグメントの生成のために使用され得る。
【０１５１】
本発明の配列に対応するペプチドに対して生成された抗体は、動物中へのポリペプチドの直接的な注入により、又は動物、好ましくは非ヒトにポリペプチドを投与することにより得られる。次に、そのようにして得られる抗体は、ポリペプチド自体を結合するであろう。この態様においては、ポリペプチドのフラグメントのみを配列でさえ、完全な生来のポリペプチドを結合する抗体を生成するために使用され得る。そのような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。
【０１５２】
モノクローナル抗体の調製に関しては、連続細胞系培養により生成される抗体を供給するいずれかの技法が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７， １９７５）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒなど．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４， ７２ １９８３）及びヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅなど．， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． Ｉｎｃ．， ７７−９６， １９８５）を列挙することができる。
【０１５３】
さらに、“キメラ抗体”の生成のための技法、すなわち適切な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るために、ヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングが使用され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ６８５１， ６８５５， １９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６０４−６０８， １９８４； Ｔａｋｅｄａなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２−４５４， １９８５）。他方では、一本鎖抗体の生成について記載される技法（アメリカ特許第４，８４６，７７８号）が、ＰＲＯＳＴ ０３−特異的一本鎖を生成するよう適合化され得る。
【０１５４】
抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ生成を誘発することによって、又はＯｒｉａｎｄｉなど． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３−３９３７， １９８９） 及びＷｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ２９３−２９９， １９９１） に開示されるような高い特異的な結合試薬のパネル又は組換え免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって生成され得る。
【０１５５】
ＰＲＯＳＴ ０３のための特異的結合部位を含む抗体フラグメントがまた生成され得る。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生成され得るＦ（ａｂ’）２ フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメントを包含するが、但しそれらだけには限定されない。他方では、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望する特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの急速且つ容易な同定を可能にするために構成され得る（Ｈｕｓｅなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １２７０−１２８１， １９８９）。
【０１５６】
本発明書において提供されるＰＲＯＳＴ ０３のアミノ酸配列は、抗体を生成するためにＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの特異的領域を選択するために使用され得る。当業者により理解されるように、抗体が方向づけされるＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの領域又はエピトープは、その意図された用途により変化することができる。例えば、前立腺細胞上の膜結合されたＰＲＯＳＴ ０３の検出のためのイムノアッセイへの使用のために意図された抗体は、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド上の接近できるエピトープに対して向けられるべきである。免疫原性構造、及び他の領域及びドメインを示す、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの領域は、当業界において知られている種々の他の方法、例えばＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、又はＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析を用いて、容易に同定され得る。
【０１５７】
それらの残基を含むフラグメントは、抗−ＰＲＯＳＴ ０３抗体の生成において特に適切である。特に有用なフラグメントは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＶＰＰＬＬＬＥＶＧＶＥＥＫＦ（配列番号１８）、ＹＴＤＦＶＧＥＧＬＹＱＧＶＰＲＡＥＰ（配列番号１９）、ＥＰＧＴＥＡＲＲＨＹＤＥＧＶＲＭ（配列番号２０）、ＥＫＱＶＦＬＰＫＹＲＧＤＴＧＧＡＳＳＥＤＳＬＭＴＳＦ（配列番号２１）、ＰＴＥＰＡＥＧＬＳＡＳＰＬＳＰＨ（配列番号２６）、ＬＡＧＬＬＣＰＤＰＲＰＬＥ（配列番号２２）、ＩＤＷＤＴＳＡＬＡＰＹＬＧＴＱＥＥ（配列番号２３）、ＤＫＳＤＬＡＫＹＳＡ（配列番号２４）、及びＤＦＶＧＥＧＬＹＱＧＶＰＲＡＥＧＴＥＡＲＲＨＹＤＥＧＶＲ（配列番号２５）。それらの領域に対するポリクローナル抗体の生成は、例４に記載される。
【０１５８】
本発明のＰＲＯＳＴ ０３抗体は、診断アッセイ、イメージング方法、及び前立腺癌の管理のための治療方法において特に有用であり得る。本発明は、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの検出及び前立腺癌の診断のために有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。そのようなアッセイは一般的に、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを認識し、そして結合することができる１又は複数のＰＲＯＳＴ ０３抗体を含んで成る。最も好ましい抗体は、ＰＲＯＳＴ ０３に選択的に結合し、そして非−ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに結合しないであろう（又は弱く結合する）。
【０１５９】
前記アッセイは、当業界において良く知られている種々の免疫学的アッセイ型を包含するが、但しそれらだけには限定されない：種々のタイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合の免疫吸着アッセイ及び同様のもの。さらに、前立腺癌を検出することができる免疫学的イメージング方法、例えばラベルされたＰＲＯＳＴ ０３抗体を用いての放射性シンチグラフィーイメージング方法がまた、本発明により提供される。そのようなアッセイは、前立腺癌の検出、モニター及び予後において臨床学的に有用である。
【０１６０】
上記抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離し又は同定するために、又は親和性クロマトグラフィーによる単離及び／又は精製のために固体支持体への抗体の結合により本発明のポリペプチドを精製するために使用され得る。
さらに、ＰＲＯＳＴ ０３抗体は、細胞分類及び精製技法を用いてＰＲＯＳＴ ０３陽性細胞を単離するために使用され得る。特に、ＰＲＯＳＴ ０３抗体は、抗体に基づく細胞分類又は親和性精製技法を用いて、異種移植腫瘍組織、培養細胞、等から前立腺癌細胞を単離するために使用され得る。本発明のＰＲＯＳＴ ０３抗体の他の使用は、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを模倣する抗−イディオタイプ抗体の生成を包含する。
【０１６１】
種々の生物学的サンプル、例えば、血清、前立腺及び他の組織生検検体内のそのようなＰＲＯＳＴ ０３包含細胞の存在は、ＰＲＯＳＴ ０３抗体により検出され得る。さらにＰＲＯＳＴ ０３抗体は、種々のイメージング方法、例えばＴｃ−９９ｍ（又は他の同位体）接合の抗体による免疫シンチグラフィーに使用され得る。例えば、Ｉｎ−１１１接合の抗−ＰＳＭＡ抗体を用いての最近記載されているプロトコールに類似するイメージングプロトコールは、再発生及び転移性前立腺癌を検出するために使用され得る（Ｓｏｄｅｅなど．， Ｃｌｉｎ． Ｎｕｃ． Ｍｅｄ． ２１： ７５９−７６６， １９９７）。
【０１６２】
本発明のＰＲＯＳＴ ０３抗体は、検出できるマーカーによりラベルされ得るか、又は第２分子、例えば細胞毒性別に接合され得、そしてＰＲＯＳＴ ０３陽性細胞に前記第２分子を標的にするために使用され得る（Ｖｉｔｅｔｌａ， Ｅ．Ｓ． など．， Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ， ｉｎ Ｄａｒｉｔａ． Ｊｒ． Ｖ． Ｔ． など．， ｅｄｓ， Ｃａｎｃｅｒ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ４ｔｈ ｅｄ．， Ｊ． Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ２６２４−２６３６， １９９３）。細胞毒性剤の例は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラシチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、グルココルチコイド及び他の化学療法剤、並びに放射性同位体。
【０１６３】
適切な検出マーカーは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体、蛍光化合物、生物発行化合物、化学発光化合物、金属キレーター又は酵素。適切な放射性同位体は、次のものを包含する：アンチモン−１２４、アンチモン−１２５、砒素−７４、バリウム−１０３、バリウム−１４０、ベリリウム−２０６、ビスマス−２０７、カドミウム−１０９、カドミウム−１１５ｍ、カルシウム−４５、セシウム−１３９、セリウム−１４１、セリウム−１４４、セシウム−１３７、クロム−５１、コバルト−５６、コバルト−５７、コバルト−５８、コバルト−６０、コバルト−６４、エルビウム−１６９、ユーロピウム−１５２、ガドリニウム−１５３、全−１９５、全−１９９、ハフニウム−１７５、ハフニウム−１７５−１８２、インジウム−１１、イリジウム−１９２、鉄−５５、鉄−５９、
【０１６４】
クリプトン−８５、鉛−２１０、マンガン−５４、水銀−１９７、水銀−２０３、モリブデン−９９、ネオジム−１４７、ネプチウム−２３７、ニッケル−６３、ニオブ−９５、オスミウム−１８５＋１９１、パラジウム−１０３、白金−１９５ｍ、プラセオジウム−１４３、プロメチウム−１４７、プロトアクチニウム−２３３、ラジウム−２２２６、レニウム−１８６、ルビジウム−８６、ルテニウム−１０３、ルテニウム−１０６、スカンジウム−４４、スカンジウム−４６、セレニウム−７５、銀−１１０ｍ、銀−１１、ナトリウム−２２、ストロンチウム−８５、ストロンチウム−８９、ストロンチウム−９０、硫黄−３５、タンタル−１８２、テクネチウム−９９ｍ、テルル−１２５、テルル−１３２、タリウム−２０４、トリウム−２２８、トリウム−２３２、タリウム−１７０、錫−１１３、チタン−４４、タングステン−１８５、バナジウム−４８、バナジウム−４９、イッテルビウム−１６９、イットリウム−８８、イットリウム−９０、イットリウム−９１、亜鉛−６５及びジルコニウム−９５。
【０１６５】
前立腺癌についての免疫療法：
本発明は、前立腺癌を処理するための種々の免疫療法、例えば抗体治療、インビボワクチン及びエクスビボ免疫治療アプローチを提供する。１つのアプローチにおいては、本発明は、前立腺癌を処理するために組織的に使用され得るＰＲＯＳＴ ０３抗体を提供する。例えば、接合されていないＰＲＯＳＴ ０３抗体が、患者中に導入され、その結果、抗体は前立腺癌細胞上の又は中のＰＲＯＳＴ ０３に結合し、そして補体−介在性細胞溶解、抗体−依存性細胞毒性、ＰＲＯＳＴ ０３の生理学的機能の変更及び／又はリガンド結合又はシグナルトランスダクション経路の阻害を包含する機構により、細胞及び腫瘍の破壊を介在する。毒性剤、例えばリシン又は放射性同体に接合されるＰＲＯＳＴ ０３抗体はまた、毒性別をＰＲＯＳＴ ０３−担持の前立腺腫瘍細胞（接合された抗体の表面上に又はインターナリゼーシオンを通して）に直接的に供給し、そしてそれにより、腫瘍細胞を破壊するために治療的にも使用され得る。
【０１６６】
ＰＲＯＳＴ ０３抗体を用いての前立腺免疫治療は、次の他のタイプの癌に関して都合良く使用されて来た種々のアプローチから生成される教授に従うことができる：結腸癌（Ａｒｌｅｎなど．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８： １３３−１３８， １９９８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉなど．， Ｂｌｏｏｄ ９０： ３１７９−３１８５， １９９７； Ｔｓｕｎｅｎａｒｉなど．， Ｂｌｏｏｄ ９０： ２４３７−２４４４， １９９７）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２： ２７７１−２７７６， １９９２）、Ｂ−細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉなど．， Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ． Ｅｍｐｈｏｓｉｓ Ｔｕｍｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９：９３−１０１， １９９６）、白血病（Ｚｈｏｎｇなど．， Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ． ２０： ５８１−５８９， １９９６）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４： ６１６０−６１６６， １９９４； Ｖｅｌｄｅｒｓなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５： ４３９８−４４０３， １９９５）及び乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄ など．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：１１７−１２７， １９９１）。
【０１６７】
本発明はさらに、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド又はそのフラグメントを含むよう配合されたワクチンを提供する。抗−癌治療への使用のための体液及び細胞介在された免疫性を生成するためのワクチンへの腫瘍抗原の使用は、当業界において良く知られており、そしてヒトＲＳＭＡ及び囓歯動物ＰＡＰ免疫原を用いて前立腺癌に使用されて来た（Ｈｏｄｇｅなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６３： ２３１−２３７， １９９５； Ｆｕｎｇなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ３１１３−３１１７， １９９７）。そのような方法は、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド又はそのフラグメント、又はＰＲＯＳＴ ０３−コードの核酸分子、及びＰＲＯＳＴ ０３免疫原を発現でき、そしてそれを適切に表すことができる組換えベクターを用いることによって容易に行われ得る。
【０１６８】
例えば、ウィルス遺伝子供給システムは、ＰＲＯＳＴ ０３−コードの核酸分子を供給するために使用され得る。本発明のこの観点の実施に使用され得る種々のウィルス遺伝子供給システムは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ワクシニア、鶏痘、カナリア痘、アデノウィルス、インフルエンザ、ポリオウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス及びシンドビスウィルス（Ｒｅｓｔｉｆｏ， ｉｎ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８： ６５８−６６３， １９９６）。非ウィルス供給システムはまた、抗腫瘍応答を誘発するために、患者中に導入される（すなわち、筋肉内）、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする裸ＤＮＡを用いることによっても使用され得る（引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許第６，２１４，８０４号を参照のこと）。
【０１６９】
１つの態様においては、十分な長さのヒトＰＲＯＳＴ ０３ ｃＤＮＡが使用され得る。もう１つの態様においては、ヒトＰＲＯＳＴ ０３ ｃＤＮＡフラグメントが使用され得る。もう１つの態様においては、特定のＴリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードするＰＲＯＳＴ ０３核酸分子が使用され得る。ＣＴＬエピトープは、特定されたＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合することができるＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド内のペプチドを同定するために、特定のアルゴリズム（例えば、Ｅｐｉｍｅｒ， Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて決定され得る。
【０１７０】
種々のエクスビボ方法がまた使用され得る。１つのアプローチは、患者の免疫系に抗原としてＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを提供するために樹状突起細胞を包含する。樹状突起細胞はＭＨＣクラスＩ及びＩＩ、Ｂ７補刺激体及びＩＬ−１２を発現し、そして従って、抗原提供細胞を高く特殊化される。前立腺癌においては、前立腺−特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドによりパルスされた自己由来の樹状突起細胞は、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために相Ｉ臨床学的試験に使用される（Ｔｊｏａなど．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２８： ６５−６９， １９９６； Ｍｕｒｐｈｙなど．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９： ３７１−３８０， １９９６）。樹状突起細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子のＴ細胞にＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを提供するために使用され得る。
【０１７１】
１つの態様においては、自己由来の樹状突起細胞が、ＭＨＣ分子に結合することができるＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドによりパルスされる。もう１つの態様においては、樹状突起細胞は、完全なＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドによりパルスされる。さらにもう１つの態様は、当業界において知られている種々の実施ベクター、例えばアデノウィルス（Ａｒｔｈｕｒなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４： １７−２５， １９９７）、レトロウィルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： ３７６３−３７７０， １９９６）、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０： ２８６５−２８６９， １９９７）及び腫瘍由来のＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙなど．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６： １１７７−１１８２， １９９７）を用いて、樹状突起細胞におけるＰＲＯＳＴ ０３遺伝子の過剰発現の構築を包含する。
【０１７２】
抗−イディオタイプ抗−ＰＲＯＳＴ ０３抗体はまた、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを発現する細胞に対する免疫応答を誘発するためのワクチンとして抗癌療法に使用され得る。特に、抗−イディオタイプの抗体の生成は、当業界において良く知られており、そしてＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド上のエピトープを模倣する抗−イディオタイプ抗−ＰＲＯＳＴ ０３抗体を生成するために容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒなど．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６： ３３−４０， １９９７； Ｆｏｏｎなど．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６： ３３４−３４２， １９９５； Ｈｅｒｔｙｎ など．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４３： ６５−７６， １９９６を参照のこと）。そのような抗−イディオタイプ抗体は、腫瘍抗原に対して向けられた他の抗−イディオタイプ抗体により現在実施されるように、抗−イディオタイプ治療に使用され得る。
【０１７３】
遺伝子免疫化方法は、ＰＲＯＳＴ ０３を発現する癌細胞に対して向けられた予防又は治療製体液及び細胞免疫応答を生成するために使用され得る。本明細書に記載されるＰＲＯＳＴ ０３−コードのＤＮＡ分子を用いて、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド／免疫原をコードするＤＮＡ及び適切な調節配列を含んで成る構造体が、個人の筋肉又は皮膚中に直接的に注入され、その結果、筋肉又は皮膚の細胞が前記構造体を摂取し、そしてコードされたＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド／免疫原を発現する。ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド／免疫原は、分泌されるべき細胞表面ポリペプチドとして発現され得る。ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド／免疫原の発現は、前立腺癌に対する予防又は治療性体液及び細胞免疫性の生成をももたらす。当業界において知られている種々の予防及び治療遺伝子免疫化技法が使用され得る（再考のためには、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍ での情報及び公開される文献を参照のこと）。
【０１７４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスベクター及びリボザイム：
ｐｒｏｓｔ ０３に対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、合成的に調製され得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、細胞中へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの摂取を助けることができる脂質を伴なって又はそれを伴なわないで、細胞中に供給され得る。
他方では、レトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペス又はワクシニアウィルス、又は種々の細胞プラスミドに由来する発現ベクターはまた、アンチセンスｐｒｏｓｔ ０３を発現するであろう組換えベクターの構成及び供給のためにも使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．（前記）及びＡｕｓｕｂｅｌなど． （前記）に記載される技法を参照のこと。
【０１７５】
十分な長さのｃＤＮＡ配列及び／又はその調節要素を含んで成るポリヌクレオチドは、遺伝子機能の調節のために、センス鎖（Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ ａｎｄ Ｌｏｄｉｓｈ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３： ９８−１０４， １９９３）又はアンチセンス鎖（Ｅｇｕｃｈｉ．など．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０： ６３１−６５２， １９９１）における調査手段としてのＰＲＯＳＴ ０３ポリヌクレオチドの研究者による使用を可能にする。そのような技法は、現在当業界において良く知られており、そしてセンス又はアンチセンスオリゴマー、又はより大きなフラグメントが、制御領域のコードにそっての種々の位置から企画され得る。
【０１７６】
ＰＲＯＳＴ ０３をコードする遺伝子は、高レベルの企画されたＰＲＯＳＴ ０３ポリヌクレオチドフラグメントを発現する発現ベクターにより細胞又は組織をトランスフェクトすることによって停止され得る。そのような構造体は、末翻訳センス又はアンチセンス配列を有する細胞を満たす。ＤＮＡ中への組み込みの存在下でさえ、そのようなベクターは、すべてのコピーが内因性ヌクレオチドにより無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。遷移的発現は、非複製ベクターにより１ヶ月又はそれ以上の間、続くことができ、そして適切な複製要素がベクターシステムの一部である場合、さらに長く続くことができる。
【０１７７】
上記で言及されたように、遺伝子発現の修飾は、ＰＲＯＳＴ ０３の領域、すなわちプロモーター、エンハンサー及びイントロンを制御するようアンチセンス分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを企画することによって得られる。転写開始部位、例えばリーダー配列の−１０〜＋１０領域由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。アンチセンス分子はまた、転写体のリボソームへの結合を妨げることによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するよう企画され得る。同様に、阻害は、“三本鎖ヘリックス”塩基対合方法を用いて達成され得る。三本鎖ヘリックス対合は、ポリメラーゼ、転写因子、又は調節分子の結合のために十分に二本鎖ヘリックスを切開する能力を失う。三本鎖ＤＮＡを用いての最近の治療進歩は、Ｇｅｅ， Ｊ． Ｅ． など． （Ｉｎ Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， Ｎ．Ｙ．， １９９４）により再考されている。
【０１７８】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子である（アメリカ特許第４，９８７，０７１号；ＷＯ９３／２３０５７号）。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、続くエンドヌクレアーゼ分解性切断を包含する。ＰＲＯＳＴ ０３をコードするＲＮＡのエンドヌクレアーゼ分解性切断を特異的且つ効果的に触媒する構築されたハンマーベッドモチーフのリボザイム分子は、本発明の範囲内である。いずれかの可能性あるＲＮＡ標的物内の特定のリボザイム切断部位は最初に、次の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを包含するリボザイム切断部位のための標的分子を走査することによって同定される。
【０１７９】
いったん同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する、１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを操作可能にすることができる二次構造特徴について評価され得る。候補体標的物の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションへの接近性を試験することによって評価され得る（Ｉｒｉｅなど．， Ａｄｖａｃｅ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４０： ２０７−２５７， １９９７）。
【０１８０】
本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成について当業界において知られているいずれかの方法により調製され得る。それらは、オリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技法、例えば固相ホスホラミジド化学合成を包含する。他方では、ＲＮＡ分子は、インビトロ及びインビボ転写により、又はＰＲＯＳＴ ０３をコードするＤＮＡ配列により生成され得る。いくつかのＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７又はＳＰ６と共に、広範囲の種類のベクター中に組み込まれ得る。他方では、アンチセンスＲＮＡを構成的に又は誘発的に合成するアンチセンスｃＲＮＡ構造体は、細胞系、細胞又は組織中に導入され得る。
【０１８１】
ＲＮＡ分子は、細胞内安定性及び半減期を高めるために修飾され得る。可能な修飾は、分子の５’及び／又は３’末端でのフランキング配列の付加、又は分子の主鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖よりもむしろホスホチオエート又は２’ Ｏ−メチルの使用を包含するが、但しそれだけに限定されない。高められた安定性はまた、非従来の塩基、例えばイノシン及びキュエオシン、及びアセチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されない、同様に修飾された形のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの封入により達成され得る。
【０１８２】
細胞又は組織中へのアンチセンスベクターを導入するための方法は、下記に論じられ、そしてインビボ、インビトロ及びエクスビボ治療のために同等に適切であるそれらの方法を包含する。エクスビボ治療に関しては、アンチセンスベクターが、患者から採取された細胞中に導入され、そして自己由来の移植片についてクローン的に増殖され、引用により本明細書に開示されるアメリカ特許第５，３９９，４９３号及び第５，４３７，９９４号に提供されるように、同じ患者中に戻される。トランスフェクション及びリポソームによる供給、又は他の脂質基材又は非脂質基材の剤は、当業界において良く知られている。
【０１８３】
ＰＲＯＳＴ ０３に結合する剤を同定するためのアッセイ：
本発明はまた、ＰＲＯＳＴ ０３に結合する剤を同定するために使用され得るアッセイ及び方法にも関する。特に、ＰＲＯＳＴ ０３に結合する剤は、ＰＲＯＳＴ ０３に結合する、ＰＲＯＳＴ ０３リガンド又は他の剤、又は構成生物の能力及び／又はＰＲＯＳＴ ０３活性を阻害し／刺激する能力により同定され得る。
【０１８４】
他方では、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに結合する剤は、酵母２−ハイブリッドシステム又は結合捕獲アッセイを用いて同定され得る。酵母２−ハイブリッドシステムにおいては、２−サブユニット転写因子の１つのサブユニット及びＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドから構成される融合タンパク質をコードする発現単位が、酵母細胞に導入され、そして発現される。細胞はさらに、（１）その発現が、発現のための２つのサブユニット転写因子を必要とする検出可能マーカーをコードする発現単位、及び（２）転写因子の第２サブユニット及びＤＮＡのクローン化されたセグメントから製造される融合タンパク質をコードする発現単位を含むよう修飾される。
【０１８５】
ＤＮＡのクローン化されたセグメントが、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに結合するタンパク質をコードする場合、発現はＰＲＯＳＴ ０３及びコードされたタンパク質の相互作用をもたらす。これは、結合に接近して転写因子の２つのサブユニットを架橋し、転写因子の再構成を可能にする。これは、検出できるマーカーの発現をもたらす。酵母２−ハイブリッドシステムは特に、ＰＲＯＳＴ ０３の細胞結合パートナーのためのセグメントをコードするｃＤＮＡのライブラリーのスクリーニングにおいて有用である。
【０１８６】
上記アッセイに使用され得るＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：単離されたＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのフラグメント、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを発現するよう変更された細胞、又はＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを発現するよう変更された細胞の画分。さらに、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドは、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの完全なポリペプチド又は定義されたフラグメントであり得る。ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドが分子量又は活性のシフトにより、結合する剤についてアッセイされる限り、本アッセイが使用され得ることは、当業者に明らかであろう。
【０１８７】
剤／細胞成分がＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに結合するかどうかを同定するために使用される方法は、主に、使用されるＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの性質に基づかれるであろう。例えば、ゲル遅延アッセイは、剤がＰＲＯＳＴ ０３又はそのフラグメントに結合するかどうかを決定するために使用され得る。他方では、免疫検出及びバイオチップ技法が、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドとの使用のために採用され得る。当業者は、特定の剤がＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドに結合するかどうかを決定するために多くの当業界において知られている技法を酔う容易に使用することができる。
【０１８８】
剤及び細胞成分はさらに、細胞フリーシステム又は細胞アッセイシステムを用いて、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの活性を調節する能力について試験され得る。ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの活性がより定義されるようになるので、同定された活性に基づいての機能的アッセイが使用され得る。
【０１８９】
本明細書において使用される場合、剤は、その剤がＰＲＯＳＴ ０３活性を低める場合、ＰＲＯＳＴ ０３活性をアンタゴナイズすると言われる。好ましいアンタゴニストは、いずれかの他の細胞タンパク質に影響を及ぼさないで、ＰＲＯＳＴ ０３を選択的にアンタゴナイズするであろう。さらに、好ましいアンタゴニストは、ＰＲＯＳＴ ０３活性を、５０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくはすべての活性を低めるであろう。
【０１９０】
上記方法においてアッセイされる剤は、ランダムに選択され、又は合理的に選択されるか又は企画され得る。本明細書において使用される場合、剤は、その剤がＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの特定の配列を考慮しないでランダムに選択される場合、ランダムに選択されると言われる。ランダムに選択された剤の例は、化学的ライブラリー又はペプチド結合ライブラリー、又は生物又は植物抽出物の増殖ブイヨンの使用である。
【０１９１】
本明細書において使用される場合、剤は、その剤が標的物部位の配列及び／又は剤の作用に関するそのコンホメーションを考慮する非ランダムに基礎に基づいて選択される場合、合理的に選択され、又は企画されると言われる。剤は、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを製造するペプチド配列を用いることによって、合理的に選択され、又は合理的に企画され得る。例えば、合理的に選択されたペプチド剤は、そのアミノ酸配列がＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのフラグメントと同一であるペプチドであり得る。
【０１９２】
本発明の方法により試験される剤は、例えばペプチド、抗体、オリゴヌクレオチド、小分子及びブタミン誘導体、並びに炭水化物であり得る。当業者は、本発明のスクリーニング方法に使用される剤の構造的性質に関して制限は存在しないことを容易に認識することができる。本発明の１つの種類の剤は、ペプチド剤であり、そのアミノ酸配列は、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて選択される。
【０１９３】
ペプチド剤は、当業界において知られているような、標準の固相（又は溶液相）ペプチド合成方法を用いて調製され得る。それらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成され得、そして標準の組換え生成システムを用いて組換え的に生成され得る。固相ペプチド合成を用いての生成は、遺伝子コードのアミノ酸が包含されない場合、必要とされる。
【０１９４】
本発明のもう１つの種類の剤は、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドの決定位置と免疫反応性の抗体である。上記でされたように、抗体は、その抗体により標的化されるＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドのそれらの部分を、抗原性領域として含む、ペプチドにより適切な哺乳類対象を免疫化することによって得られる。そのような剤は、第２世代阻害剤を同定し、そしてＰＲＯＳＴ ０３活性を阻止するために競争結合研究において使用され得る。
【０１９５】
本発明の方法により試験される細胞抽出物は例えば、細胞又は組織の水性抽出物、細胞又は組織の有機抽出物、又は部分的に精製された細胞画分であり得る。当業者は、本発明のスクリーニング方法に使用される細胞抽出物の源に関して制限は存在しないことを容易に理解することができる。
ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチドを結合する剤、例えばＰＲＯＳＴ ０３抗体は、ＰＲＯＳＴ ０３を調節し、適切な哺乳類細胞に抗癌剤を標的化し、又はＰＲＯＳＴ ０３との相互作用を阻止する剤を同定するために使用され得る。ＰＲＯＳＴ ０３を発現する細胞は、ＰＲＯＳＴ ０３に結合する剤を用いて、標的化されるか同定され得る。
【０１９６】
ＰＲＯＳＴ ０３結合剤がいかに使用されるかは、ＰＲＯＳＴ ０３結合剤の性質に依存する。例えば、ＰＲＯＳＴ ０３結合は、接合された毒素、例えばジフテリア毒素、コレラ毒素、ワシン又はシュードモナス外毒素を、ＰＲＯＳＴ ０３を発現する細胞に供給し；ＰＲＯＳＴ ０３活性を調製し；ＰＲＯＳＴ ０３発現細胞を直接的に殺害し；又は競争結合剤をスクリーニングにおいて同定するために使用され得る。例えば、ＰＲＯＳＴ ０３阻害剤は、ＰＲＯＳＴ ０３発現細胞の増殖を直接的に阻害するために使用され得、そしてＰＲＯＳＴ ０３結合剤が診断剤として使用され得る。
【０１９７】
医薬組成物及び投与：
本発明はまた、ＰＲＯＳＴ ０３ポリヌクレオチド、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド、抗体、アゴニスト、又はインヒビターを、単独で、又は少なくとも１つの他の剤、例えばいずれかの無菌の、生物適合性キャリヤー、例えば塩溶液、緩衝溶液、デキストロース及び水（但し、それらだけには限定されない）において投与され得る安定化合物と組合して含んで成る医薬組成物にも関する。それらの分子のいずれかが、患者に、単独で、又は他の剤、薬剤又はホルモンと組合して、賦形剤又は医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される医薬組成物として投与され得る。本発明の１つの態様においては、医薬的許容できるキャリヤーは、医薬的に不活性である。
【０１９８】
本発明はまた、医薬組成物の投与にも関する。そのような投与は経口又は非経口により行われる。非経口供給の方法は、局部、動脈内（腫瘍に直接的に）、筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内、心室内、静脈内、腹膜内又は鼻腔内投与を包含する。活性生物の他に、それらの医薬組成物は、賦形剤、及び医薬的に使用され得る製剤中への活性化合物の加工を促進する助剤を含んで成る医薬的に許容できる適切なキャリヤーを含むことができる。配合及び投与についての技法に関する追加の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｅｄ． Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．） に見出され得る。
【０１９９】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与のために適切な用量として、当業界において良く知られている医薬的に許容できるキャリヤーを用いて配合され得る。そのようなキャリヤーは、患者による摂取のための錠剤、ピル、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液及び同様のものへの医薬組成物の配合を可能にする。
【０２００】
経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤との活性化合物の組み合わせを通して、任意には、得れる混合物を粉砕し、そして適切な助剤を添加した後、所望には、錠剤又は糖剤コアーを得るために、前記顆粒の混合物を加工することにより得られる。適切な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質充填剤、例えば糖、例えばラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトール；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ又は他の植物からの澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はナトリウムカルボキシメチルセルロース及びガム、例えばアラビアゴム及びトラガカントガム；及びタンパク質、例えばゼラチン及びコラーゲンである。所望には、砕解剤又は溶解剤、例えば架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギンサン又はその塩、例えばアルキン酸ナトリウムが添加され得る。
【０２０１】
糖剤コアーは、適切な被膜、例えばまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含むことができる、濃縮された糖溶液により供給される。色素又は顔料が、生成物の同定のために、又は活性化合物の量、すなわち容量を特徴づけるために、錠剤又は糖剤被膜に添加され得る。
【０２０２】
経口的に使用され得る医薬剤は、ゼラチンから製造された押し込み嵌めカプセル、及びゼラチン及び被膜、例えばグリセロール又はソルビトールから製造された軟質の密封されたカプセルを包含する。押し入れ嵌めカプセルは、充填剤又は結合剤、例えばラクトース又は澱粉、滑剤、例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム、及び任意には安定剤と共に混合される活性成分を含むことができる。軟質カプセルにおいては、活性化合物は、適切な液体、例えば脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコールにおいて、安定剤を伴なって又はそれを伴わないで、溶解され又は懸濁され得る。
【０２０３】
非経口投与のための医薬製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射に関しては、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは生理学的に適合できる緩衝液、例えばハンクス溶液、リンガー溶液又は生理学的緩衝溶液において配合され得る。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール又はデキストランを含むことができる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒又はビークルは、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリド又はリポソームを含む。任意には、懸濁液はまた、適切な安定剤、又は高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解を高める剤を含むことができる。
【０２０４】
局部又は鼻腔内投与に関しては、透過されるべき特定のバリヤーに適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤は一般的に当業界において知られている。
【０２０５】
キット：
本発明はさらに、本発明の前述の組成物中の１又は複数の成分により充填された１又は複数の容器を含んで成る医薬用パック及びキットに関する。そのような容器は、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制して、そしてヒト投与のための製品の製造、使用又は販売の許可を与える政府機関により処方される形で存在することができる。
【０２０６】
製造及び貯蔵：
本発明の医薬組成物は、当業界において知られている態様で、例えば従来の混合、溶解、粒質化、糖剤製造、磨砕、乳化、カプセル封入、閉じ込め又は凍結乾燥工程により製造され得る。
【０２０７】
医薬組成物は、塩として供給され得、そして酸、例えば塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸、等により形成され得る。塩は、その対応する遊離塩基形である、水性又は他のプロトン性溶媒においてより溶解できる傾向がある。他の場合、好ましい製剤は、使用の前、緩衝液と共に組合される、ｐＨ４．５〜５．５での１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１〜２％のスクロース、２〜７％のマンニトールにおける凍結乾燥粉末であり得る。
許容できるキャリヤーに配合される本発明の化合物を含んで成る医薬組成物が調製された後、それらは適切な容器に配置され、そして示される病状の処理のためにラベルされるＰＲＯＳＴ ０３の投与に関しては、そのようなラベリングは、投与の量、頻度及び方法を包含する。
【０２０８】
治療的有効量：
本発明への使用のために適切な医薬組成物は、活性成分が意図される目的、すなわちＰＲＯＳＴ ０３発現により特徴づけられる特定の疾病状態の処理を達成するための有効量で含まれる組成物を包含する。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
いずれかの化合物に関して、治療的有効量は、まず、細胞培養アッセイ、例えば新形成細胞又は動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ又はブタのいずれかにおいて評価され得る。動物モデルはまた、所望する濃度範囲及び投与の経路を得るためにも使用される。次に、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量及び投与の経路を決定するために使用され得る。
【０２０９】
治療的有効量とは、徴候又は病状を緩和する、タンパク質又はその抗体、アゴニスト又はインヒビターの量として言及される。そのような化合物の治療効率及び毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に効果的な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な量）は、細胞培養物又は実験動物において標準の医薬方法により決定され得る。治療効果及び毒性の用量化は、治療指数であり、そしてそれは比、ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータが、ヒト使用のための用量範囲を決定することに使用される。そのような化合物の用量は、好ましくは、ほとんど毒性がないか又はまったく毒性がない、ＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内にある。用量は、使用される投与形、患者の感受性及び投与の経路に依存して、この範囲内で変化する。
【０２１０】
正確な用量は、処理されるべき患者の観点から、個々の医薬により選択される。用量及び投与は、十分なレベルの活性成分を供給し、又は所望する効果を維持するよう調節される。考慮され得る追加の要因は、疾病状態の重症度、例えば腫瘍サイズ及び位置；年齢、体重及び患者の性別；食事、投与の時点及び頻度、薬剤の組み合わせ、反応感度及び治療に対する耐性／応答を包含する。長く作用する医薬組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に依存して、３〜４日、１週ごとに、又は２週ごとに投与される。
【０２１１】
通常の用量は、投与の経路に依存して、０．１〜１００，０００μｇから１ｇの合計用量まで変化することができる。特定の用量及び供給方法に関する案内は文献に提供されている。アメリカ特許第４，６５７，７６０号；第５，２０６，３４４号又は第５，２２５，２１２号を参照のこと。当業者は、タンパク質又はそれらのインヒビターのためによりもポリヌクレオチドのために異なった配合を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの供給は、特定の細胞、病状、位置、等に対して特異的であろう。
【０２１２】
実施例
本発明はさらに、次の例により記載される。例は、特定の態様により本発明を例示するためにのみ提供される。それらの例は、本発明の特定の観点を例示するものであって、開示される発明の範囲を制限するものではない。
すべての例は、詳細に記載されていることを除いて、当業者に良く知られ、そして通常のことである標準の技法を用いて行われた。次の例の通常の分子生物学技法は、標準の実験マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋなど．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９に記載のようにして行われ得る。
【０２１３】
例１．ＰＲＯＳＴ ０３のための追加の５’側配列のクローニング
Ｉｎｃｙｔｅ’ｓ ＬｉｆｅＳｅｑデータベースの調査は、前立腺において発現される遺伝子としてのｐｒｏｓｔ ０３の同定を導いた。前記データベースからのｐｒｏｓｔ ０３クローンを、部分コード配列を含むことが決定されている連続配列中にアセンブリーした。前記連続配列は、前記コード領域の５’末端を欠いていた。
【０２１４】
ＰＲＯＳＴ ０３のための追加の５’側配列を、ＰＣＲを用いて、ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ５’−Ｓｔｒｅｔｃｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からクローン化した。一次増幅を、ｐｒｏｓｔ ０３特異的プライマーＰｒｏｓｔ ０３−１と共にＬａｍｂｅｄａＧＴ１１前方向又は逆方向プライマーを用いて行った。一次及びネスティドＰＣＲ反応の両者からの増幅された生成物を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローン化した。個々のクローンを、ＰＣＲにより再試験し、そして配列を決定した。
【０２１５】
新規５’側ｐｒｏｓｔ ０３配列を、２種のクローンから得、そしてＬｉｆｅＳｅｑデータベースのＢＬＡＳＴ調査に使用した。新規連続配列をアセンブリーし；この配列は、ＰＲＯＳＴ ０３タンパク質のための完全コード領域を含むことが予測された。十分な長さのクローン（＃３３５２３３１）を、Ｉｎｃｙｔｅから得、そしてその配列を確かめた。
【０２１６】
プライマー配列：
ＬａｍｂｄａＧＴ１１−前方向プライマー：５’−ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＡＣ ＧＡＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＡＧＣ Ｃ−３’（配列番号３）；
ＬａｍｂｄａＧｔ１１−逆方向プライマー：５’−ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＧＡ ＣＣＡ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＡＴ Ｇ−３’（配列番号４）；
ＰＲＯＳＴ ０３−１：５’−ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＧＧ−３’（配列番号５）：
ＰＲＯＳＴ ０３−２：５’−ＣＡＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＧＴ ＧＧＣ ＡＣＣ−３’（配列番号６）：
十分な長さのポリペプチド配列が、ＦａｓｔＡプログラムを用いてＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びＳＰＴＲＥＭＢＬデータベースを調べるために使用された。この調査の結果は、ＰＲＯＳＴ ０３配列が、植物においてこれまで同定されている輸送体組、特にスクロース／プロトン輸送体組に対する類似性を示すことを示唆した。
【０２１７】
例２．ＣＯＳ細胞におけるＰＲＯＳＴ ０３の過渡的発現
ＰＲＯＳＴ ０３をコードするｃＤＮＡを、３部分連結方法を用いて、哺乳類発現ベクターｐＣｌｎｅｏ（Ｏｒｏｍｅｇａ）中にサブクローン化した。ｐＣｌｎｅｏ をＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩにより消化し、そして次に、ウシ腸アルカリホースファターゼにより処理した。ｐｒｏｓｔ ０３コード領域の５’側部分を、鋳型としてＩｎｃｙｔｅクローン＃３３５２３３１を用いて、ＰＣＲにより増幅した。５’側プライマーを、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を含むより企画した。ＰＣＲフラグメントをゲル精製し、そして次に、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩにより消化した。ｐｒｏｓｔ ０３コード領域の３’側部分を、ＳｐｈＩ及びＢｓｒＢＩによるＩｎｃｙｔｅクローン＃３３５２３３１の消化、９１６個の塩基対フラグメントの続くゲル精製により得た。次に、ｐｒｏｓｔ ０３ ＤＮＡフラグメントをｐＣｌｎｅｏベクターと共に連結し、そしてＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、クローンを得た。
【０２１８】
次に、得られる発現プラスミドＣＩＰｒ３を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＣＯＳ細胞中に一時的にトランスフェクトした。全細胞溶解物は、ウェスターンブロットにより分析される場合、ＰＲＯＳＴ ０３タンパク質を含むことが示された。
５’側ＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＴＧＧ−３’（配列番号７）；
３’側ＰＣＲプライマー：５’−ＣＣＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ−３’（配列番号８）。
【０２１９】
例３．ｐｒｏｓｔ ０３ ｍＲＮＡ発現
正常及び腫瘍組織からの種々のサンプルにおける及び細胞系におけるｐｒｏｓｔ ０３ ｍＲＮＡの発現を、Ｔａｑｍａｎアッセイを用いての半定量性ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。改良されたＧｌｅａｓｏｎ分類システムに従って等級付けされた前立腺正常、良性及び腫瘍組織サンプルを、Ｕｒｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ａｔ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ から得た。ＲＮＡを標準の方法によりそれらから単離した。他の腫瘍及び正常組織からのＲＮＡを、市販源、例えばＣｌｏｎｅｔｅｃｈ及びＢｉｏｃｈａｉｎから購入した。前立腺腫瘍細胞系（ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ及びＤＵ１４５）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ から得、そして血清含有培地を用いての標準の方法により培養において増殖した。それらの細胞系に由来する異種移植片腫瘍を、ヌードマウスにおいて確立し、そして移植の約４〜６週間後、マウスから収穫した。ＲＮＡを、標準方法により腫瘍から単離した。
【０２２０】
Ｔａｑｍａｎに基づくＰＣＲ分析を、次の組のプライマー及びプローブを用いて行った：
第１組：プライマー：ＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＡＴ（配列番号９）及びＡＴＧＧＣＧＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣ（配列番号１０）、及びプローブ６−ＦＡＭ−ＴＧＣＡＧＧＣＧＴＴＣＧＧＡＴＧＧＧＣ−Ｔａｍｒａ（配列番号１１）；
第２組：プライマー：ＡＴＴＣＧＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＣＴＡ（配列番号１２）及びＴＧＡＧＧＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴ（配列番号１３）、及びプローブ６−ＦＡＭ−ＣＡＧＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡ−Ｔａｍｒａ（配列番号１４）；並びに
第３組：プライマー：ＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＧＴＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴ（配列番号１５）及びＴＣＧＣＴＣＴＴＧＴＣＡＡＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＡ（配列番号１６）、及びプローブ６−ＦＡＭ−ＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡ−Ｔａｍｒａ（配列番号１７）。
【０２２１】
それらのプライマー及びプローブを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ’ｓ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて企画し、そしてＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより合成した。ＰＣＲ反応を、３０〜４０サイクルを行い、そして前立腺ＲＮＡを用いて定量化し、相対的比較のための標準曲線を生成した。この分析は、ｐｒｏｓｔ ０３ ｍＲＮＡが高く前立腺に制限されたことを示した。
【０２２２】
例４．抗体生成
ウサギポリクローナル抗血清を、ＰＲＯＳＴ ０３ポリペプチド配列に由来する８種の合成ポリペプチド配列に対して生ぜしめた。それらの配列が、表面エピトープをたぶん認識する抗血清を生成するために、それらの予測される細胞外配向のために選択された。システイン残基を、アミノ酪酸（Ａｂｕ）により置換し、合成を助けた。特定のアミノ配列、ＰＲＯＳＴ ０３タンパク質上での位置及び３種のペプチドについての名称が下記に列挙される。
【０２２３】
名称　　　位置　　　アミノ酸配列
Ｐｅｐ１　　３９−５２　　　 ＶＰＰＬＬＬＥＶＧＶＥＥＫＦ（配列番号１８）
Ｐｅｐ４　　２９２−３０９　　 ＹＴＤＦＶＧＥＧＬＹＱＧＶＰＲＡＥＰ（配列番号１９）
Ｐｅｐ５　　３０８−３２３　　 ＥＰＧＴＥＡＲＲＨＹＤＥＧＶＲＭ（配列番号２０）
Ｐｅｐ７　　４０６−４３１　　 ＥＫＱＶＦＬＰＫＹＲＧＤＴＧＧＡＳＳＥＤＳＬＭＴＳＦ（配列番号２１）
Ｐｅｐ８　　２２５−２４０　　 ＰＴＥＰＡＥＧＬＳＡＰＳＰＬＳＰＨ（配列番号２６）
Ｐｅｐ９　　１０９−１２１　　 ＬＡＧＬＬＣＰＤＰＲＰＬＥ（配列番号２２）
Ｐｅｐ１０　 １８１−１９７　　 ＩＤＷＤＴＳＡＬＡＰＹＬＧＴＱＥＥ（配列番号２３）
Ｐｅｐ１１　 ５４４−５５３　　 ＤＫＳＤＬＡＫＹＳＡ（配列番号２４）
Ｐｅｐ４＋５　２９４−３２２　　 ＤＦＶＧＥＧＬＹＱＧＶＰＲＡＥＧＴＥＡＲＲＨＹＤＥＧＶＲ（配列番号２５）
【０２２４】
ペプチドを、免疫原として使用するために、追加のアミノ末端システインを通して、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有結合した。同様に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）接合体を、ＥＬＩＳＡを通しての抗血清力価の分析のために調製した。
２匹の動物を、個々のペプチドにより免疫化した。初期免疫化を、フロイント完全アジュバント（０．５ｍｇ／動物）において行い、続いて、フロイント不完全アジュバントにおいて０．２５ｍｇ／動物で３週間隔で定期的に筋肉内投与により追加免疫化した。定期的な試験用採血を取り、そして特異的ＢＳＡ−ペプチド接合体に対する抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定し、そしてプレ免疫血清と比較した。
【０２２５】
抗血清を、ＣＯＳ細胞において一時的に発現されるＰＲＯＳＴ ０３に対して、ＥＬＩＳＡ及びウェスターンブロットを通して、ＰＲＯＳＴ ０３特異性について試験した。ペプチド７，８，１０，１１及び４＋５に対する抗血清が、ＰＲＯＳＴ ０３を認識した。ＰＲＯＳＴ ０３−特異的抗血清を、ＬＮＣＡＰ腫瘍、ＬＮＣＡＰ細胞、ＰＣ３腫瘍、ＰＣ３細胞及びヒト前立腺腫瘍のいくつかの癌床学的サンプルから調製された溶解物に対して、さらに試験した。結合特異性を、相同及び異種ペプチドの存在下での結合により確証した。
【０２２６】
ＰＲＯＳＴ ０３に対するヒトモノクローナル抗体を、ＰＲＯＳＴ ０３ペプチドによりトランスジェニックマウスを免疫化することによって生成した。それらの動物からの脾臓細胞を、骨髄腫細胞により融合し、ハイブリドーマ細胞を生成した。得られるハイブリドーマを、ＰＲＯＳＴ ０３ペプチド及びタンパク質に対して向けられた抗体を生成するそれらのハイブリドーマによりスクリーンした。
【０２２７】
例５．ＰＲＯＳＴ ０３発現の免疫組織化学的染色
ＰＲＯＳＴ ０３タンパク質の発現を、種々のヒト正常及び腫瘍組織、例えば乳房、結腸、肺、脳及び前立腺において、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． により決定した。さらに、骨及びリンパ節に転移する前立腺癌を、ＰＲＯＳＴ ０３タンパク質発現を決定するために選択した。ホルマリン固定されたパラフィン−包埋された組織を、一次抗体としての抗−ＰＲＯＳＴ ０３抗体と共にインキュベートし、そして主要検出システムは、ｆｕｓｃｈｉａ着色された赤色沈着物（ＳＫ−５１００）を生成するために使用されたＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ基質キット及びＶｅｃｔｏｒ ＡＢＣ−ＡＰキット（ＡＫ５００１）から成った。
【０２２８】
組織をまた、正の対照抗体（ＣＤ３１）により染色し、組織抗原が保存され、そして免疫組織化学分析のために入手できることを確かめた。ＣＤ３１に対して陽性に染色された組織のみを、この研究の残りのために選択した。負の対照は、一次抗体の不在下で、隣接する断片に対して、完全な免疫組織学方法を行うことから成った。ＰＲＯＳＴ ０３発現は、正常な前立腺、前立腺癌、及び骨及びリンパ節への転移に見られた。大部分の癌は、癌における種々のレベルのタンパク質発現を伴なって、抗−ＰＲＯＳＴ ０３抗体による正の染色を示した。
【０２２９】
本明細書に言及されるすべての出版物及び特許は、引用により本明細書に組み込まれる。本発明はその特定の態様により記載されて来たが、種々の変更が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者により理解されるべきである。さらに、多くの修飾が、本発明の範囲内の特定の情況、材料、物質の組織、方法、工程段階、目的物を適合するために行われ得る。すべての修飾は、本発明の範囲内で意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、生物学的又は免疫学的活性形のＰＲＯＳＴ ０３をコードする、ｐｒｏｓｔ ０３のポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】
図２は、ＰＲＯＳＴ ０３の推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を示し、そして予測されるトランスメンブランドメインは下線が引かれている。トランスメンブランドメインは、ＭＴＭトランスメンブランドメイン推定のプログラムを用いて推定される。
【図３】
図３は、ＰＲＯＳＴ ０３及びＤｃＳＵＴ２、すなわちスクロース／Ｈ＋共輸送体のアミノ酸一列整列を示す。ＰＲＯＳＴ ０３配列は底部上に存在する。個々の配列についての推定されるトランスメンブランドメインは下線が引かれている。
【図４】
図４は、ＰＲＯＳＴ ０３のポリヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を示す。
【図５】
図５は、Ｔａｑｍａｎに基づくＰＣＲ分析による、ヒト組織におけるＰＲＯＳＴ ０３ ｍＲＮＡの発現を示す。ヒト組織（腫瘍及び正常）からのＲＮＡが標準方法により単離された。ｐｒｏｓｔ ０３ ｍＲＮＡ発現を検出するためのプライマー及びプローブは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ’ｓ Ｅｓｐｒｅｓｓ ソフトウェアを用いて企画され、そしてＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ により合成された。ｐｒｏｓｔ ０３ ｍＲＮＡは、前立腺組織において主に見出された。
【図６】
図６は、ヒト前立腺組織におけるＰＲＯＳＴ ０３発現の免疫組織化学的染色を示す。正常及び腫瘍組織が、組織化学染色を用いて、ＰＲＯＳＴ ０３発現について試験された。大部分の癌は、抗−ＰＲＯＳＴ ０３抗体による正の染色を示した（例５を参照のこと）。
【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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