(57)【要約】本発明は、二対立遺伝子マーカーを含むゲノム地図、新規な二対立遺伝子マーカー、および二対立遺伝子マーカーの使用法に関する。また、これらの二対立遺伝子マーカーに隣接する領域とハイブリダイズするプライマーも提供される。本発明は、本発明の１つ以上の二対立遺伝子マーカーについて核酸含有サンプルを遺伝子型判定するのに適するポリヌクレオチドおよび方法を提供する。更に、本発明は、二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子と表現型との間および／または二対立遺伝子マーカーのハプロタイプと表現型との間の統計学的相関を検出する方法を含めて、本発明の二対立遺伝子マーカーを利用するいくつかの方法を提供する。
2004504037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルにおいて、地図関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定することを含む遺伝子型判定方法であって、地図関連二対立遺伝子マーカーが配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項２】
地図関連二対立遺伝子マーカーが、配列番号１〜１００および１０１〜１６２の二対立遺伝子マーカーならびにそれらの相補体からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号１〜１００の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ばれる５種の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ばれる１０種の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ばれる２０種の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ばれる５０種の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ばれる１００種の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
生物学的サンプルにおいて、１セットの二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体におけるヌクレオチドの正体を特定することを含む遺伝子型判定方法であって、該セットが配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群から選ばれる１０種の地図関連二対立遺伝子マーカーを含み、該二対立遺伝子マーカーが、少なくとも約０．１８のヘテロ接合率を有するように選ばれ、且つ平均距離で１０ｋｂ〜２００ｋｂだけ互いに離れている、上記方法。
【請求項９】
二対立遺伝子マーカーの前記セットが、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群から選ばれる２０種の地図関連二対立遺伝子マーカーを含み、該二対立遺伝子マーカーが少なくとも約０．１８のヘテロ接合率を有するように選ばれ、且つ平均距離で１０ｋｂ〜２００ｋｂだけ互いに離れている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
二対立遺伝子マーカーの前記セットが、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群から選ばれる１００種の地図関連二対立遺伝子マーカーを含み、該二対立遺伝子マーカーが少なくとも約０．１８のヘテロ接合率を有するように選ばれ、且つ平均距離で１０ｋｂ〜２００ｋｂだけ互いに離れている、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
地図関連二対立遺伝子マーカーが少なくとも約０．３２のヘテロ接合率を有するように選ばれる、請求項８、９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
地図関連二対立遺伝子マーカーが平均距離で２５ｋｂ〜５０ｋｂだけ互いに離れている、請求項８、９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的サンプルが単一の被験者に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を、被験者のゲノム内に存在する該二対立遺伝子マーカーの両コピーについて特定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的サンプルが複数の被験者に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記特定ステップを行う前に、前記二対立遺伝子マーカーを含む配列の一部を増幅することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅がＰＣＲにより行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記特定が、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイ、または酵素に基づくミスマッチ検出アッセイにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の、集団中での頻度を決定する方法であって、
ａ）請求項１に記載の方法に従って、集団からの個体を該二対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定し；
ｂ）該集団における該二対立遺伝子マーカーの比例代表を決定する；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項２０】
地図関連二対立遺伝子マーカーが、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
地図関連二対立遺伝子マーカーが、配列番号１〜１００および１０１〜１６２の二対立遺伝子マーカーならびにそれらの相補体からなる群から選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ステップａ）における遺伝子型判定が前記集団の各個体について行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子型判定が、前記集団から誘導される１つの生物学的サンプルについて行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
対立遺伝子と表現型との関連を検定する方法であって、
ａ）請求項１９に記載の方法に従って、形質陽性集団における少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーの頻度を決定し；
ｂ）請求項１９に記載の方法に従って、対照集団における該地図関連二対立遺伝子マーカーの頻度を決定し；
ｃ）該対立遺伝子と該表現型との間に統計的に有意な関連が存在するか否かを判定する；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項２５】
集団における１セットの二対立遺伝子マーカーについてのハプロタイプの頻度を推定する方法であって、
ａ）請求項１３に従って、集団中の各個体を、少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定し；
ｂ）ゲノム中に存在する第２の二対立遺伝子マーカーの両コピーについて第２の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定することにより、集団中の各個体を、第２の二対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定し；
ｃ）ステップａ）およびｂ）で特定されたヌクレオチドの正体にハプロタイプ判定方法を適用して、上記頻度の推定値を得る；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項２６】
ハプロタイプ判定方法が、非対称ＰＣＲ増幅、特定の対立遺伝子の二重ＰＣＲ増幅、クラーク法、または期待値最大化アルゴリズムからなる群から選ばれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
地図関連二対立遺伝子マーカーが、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相同体からなる群から選ばれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
地図関連二対立遺伝子マーカーが、配列番号１〜１００および１０１〜１６２の二対立遺伝子マーカーならびにそれらの相同体からなる群から選ばれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ハプロタイプと表現型との関連を検出する方法であって、
ａ）請求項２５に記載の方法に従って、形質陽性集団において少なくとも１つのハプロタイプの頻度を推定し；
ｂ）請求項２５に記載の方法に従って、対照集団において該ハプロタイプの頻度を推定し；
ｃ）該ハプロタイプと表現型との間に統計的に有意な関連が存在するか否かを判定する；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項３０】
対照集団が形質陰性集団である、請求項２４または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記症例対照集団が無作為抽出集団である、請求項２４または２９に記載の方法。
【請求項３２】
ステップａ）およびｂ）の遺伝子型判定がそれぞれ、前記集団の各々から誘導される１つのプールした生物学的サンプルについて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
ステップａ）およびｂ）の遺伝子型判定が、前記集団の各個体から誘導される生物学的サンプルについて個別に行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項３４】
表現型が、疾患、薬物に対する応答性、薬物の有効性、治療に対する応答性、治療の有効性、および薬物毒性からなる群から選ばれる、請求項２４または２９に記載の方法。
【請求項３５】
ステップａ）およびｂ）において、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーの全てにおけるヌクレオチドの正体を特定する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
ステップａ）およびｂ）において、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーのうち１０種におけるヌクレオチドの正体を特定する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
検出可能な形質と関連する遺伝子の同定方法であって、
ａ）請求項２３に記載の方法に従って、検出可能な形質をもつ個体および検出可能な形質をもたない個体において、少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーの各対立遺伝子の頻度を決定し；
ｂ）検出可能な形質と統計的に有意な関連を有する該二対立遺伝子マーカーの少なくとも１つの対立遺伝子を同定し；
ｃ）該対立遺伝子と連鎖不平衡にある遺伝子を同定する；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項３８】
更に、ｄ）検出可能な形質と関連する遺伝子の突然変異を同定するステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
検出可能な形質と関連する二対立遺伝子マーカーの同定方法であって、
ａ）検出可能な形質を発現する個体および検出可能な形質を発現しない個体において、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群から選ばれる少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーを含む二対立遺伝子マーカーの１セットの頻度を決定し；
ｂ）該検出可能な形質の発現と統計的に関連する該セット中の少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを同定する；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項４０】
個体が検出可能な形質を発症する危険性があるか否か、または該形質と関連する検出可能な形質に罹患しているか否かを判定する方法であって、
ａ）該個体から核酸サンプルを取得し；
ｂ）配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群から選ばれる少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーを用いて該核酸サンプルをスクリーニングし；
ｃ）該核酸サンプルが検出可能な形質と統計的に関連する少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを含むか否かを判定する；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項４１】
検出可能な形質が、疾患、薬物に対する応答性、薬物の有効性、治療に対する応答性、治療の有効性、および薬物毒性からなる群から選ばれる、請求項３７、３９および４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
薬物もしくは治療を施す方法であって、
ａ）個体から核酸サンプルを取得し；
ｂ）請求項１３に記載の方法に従って、該薬物もしくは治療に対する陽性の応答と関連する少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーまたは該薬物もしくは治療に対する陰性の応答と関連する少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーの多型塩基の正体を特定し；
ｃ）該核酸サンプルが該薬物もしくは治療に対する陽性の応答と関連する少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを含む場合、または該核酸サンプルが該薬物もしくは治療に対する陰性の応答と関連する少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを含まない場合に、該薬物または治療を個体に施す；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項４３】
薬物もしくは治療の臨床治験に組み入れるための個体を選択する方法であって、
ａ）個体から核酸サンプルを取得し；
ｂ）請求項１３に記載の方法に従って、核酸サンプル中の、薬物もしくは治療に対する陽性の応答と関連する少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーまたは薬物もしくは治療に対する陰性の応答と関連する少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーの多型塩基の正体を特定し；
ｃ）核酸サンプルが薬物もしくは治療に対する陽性の応答と関連する少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを含む場合、または核酸サンプルが薬物もしくは治療に対する陰性の応答と関連する少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを含まない場合に、該個体をその臨床治験に組み入れる；
各ステップを含む、上記方法。
【請求項４４】
核酸サンプルが薬物もしくは治療に対する陽性の応答と関連する少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを含み、且つ核酸サンプルが薬物もしくは治療に対する陰性の応答と関連する少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを含まない場合は、前記投与ステップが該薬物もしくは治療を該個体に施すことを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群から選ばれる地図関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定するためのポリヌクレオチドの使用。
【請求項４６】
前記特定が、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイ、または酵素に基づくミスマッチ検出アッセイで行われる、請求項４５に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項４７】
配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群から選ばれる地図関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントを増幅するためのポリヌクレオチドの使用。
【請求項４８】
地図関連二対立遺伝子マーカーが、配列番号１〜１００および１０１〜１６２の二対立遺伝子マーカーならびにそれらの相補体からなる群から選ばれる、請求項４５および４７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項４９】
ポリヌクレオチドが固相支持体に結合されている、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項５０】
ポリヌクレオチドがアレイに結合されている、請求項４９に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項５１】
アレイがアドレス可能である、請求項５０に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項５２】
ポリヌクレオチドが更に標識を含む、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項５３】
地図関連二対立遺伝子マーカーを含む配列番号１〜１７１からなる群から選ばれる１２ヌクレオチドからなる連続スパンを含むポリヌクレオチドの配列が記憶されているコンピューター可読媒体の、ヌクレオチド配列を分析するための使用。
【請求項５４】
演算処理装置とデータ記憶装置とを備えるコンピューターシステムの、ヌクレオチド配列を分析するための使用であって、該データ記憶装置には、地図関連二対立遺伝子マーカーを含む配列番号１〜１７１からなる群から選ばれる１２ヌクレオチドからなる連続スパンを含むポリヌクレオチドの配列が記憶されている、上記使用。
【請求項５５】
コンピューターシステムが更に、配列コンペアラーと参照配列が記憶されているデータ記憶装置とを備える、請求項５４に記載のコンピューターシステムの使用。
【請求項５６】
第１の配列を参照配列と比較する方法であって、
ａ）配列同士を比較するコンピュータープログラムの使用により、第１の配列および参照配列を読み取り；
ｂ）該コンピュータープログラムを用いて、第１の配列と参照配列との差異を判定する；
各ステップを含んでなり、その際、第１の配列は、地図関連二対立遺伝子マーカーを含む配列番号１〜１７１からなる群から選ばれる１２ヌクレオチドからなる連続スパンを含むポリヌクレオチドの配列である、上記方法。
【請求項５７】
前記データ記憶装置には、配列番号１〜１７１からなる群から選ばれる地図関連二対立遺伝子マーカーを含む１０種のポリヌクレオチドの配列が記憶されている、請求５４に記載のコンピューターシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、二対立遺伝子マーカーを含むゲノム地図、新規な二対立遺伝子マーカー、および二対立遺伝子マーカーの使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
近年の遺伝子工学およびバイオインフォーマティクスの進歩により、ヒトゲノムの大部分を操作したり特性決定したりすることができるようになった。ヒトゲノムの全配列を得るための努力が急速に進展していると同時に、ヒトゲノム配列についての部分的な知見を用いて実施しうる遺伝情報の実際的用途が数多く存在している。
【０００３】
ヒトゲノムの全配列はアセンブリされるので、入手可能な部分配列情報を用いて、検出可能なヒトの形質に関与する遺伝子（例えばヒトの疾患と関連する遺伝子）を同定したり、また、特定の遺伝子型を持つために検出可能な形質を発現する個体または持っている遺伝子型によって将来的に検出可能な形質が顕れる危険性がある個体を同定できる診断試験を開発したりすることができる。部分ゲノム配列情報のこれら用途の各々は、既知のゲノム配列をヒト染色体に沿って順序づける遺伝的および物理的な地図のアセンブリに基づいている。
【０００４】
本発明は、一塩基多型を含むヒトゲノム配列の順序づけられたセット、ならびにヒトゲノムの高解像度地図としてのこれら多型の使用、検出可能なヒトの形質と関連する遺伝子の同定方法、および検出可能な形質を引き起こす遺伝子もしくは将来的に検出可能な形質を発現させる危険性をもたらす遺伝子を保有する個体を同定するための診断薬に関する。
【０００５】
本発明の二対立遺伝子マーカーの利点
本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーは、他の遺伝子マーカー、例えばＲＦＬＰ（制限断片長多型）、ＶＮＴＲ（反復数が変化する縦列反復配列）のマーカーおよび初期のＳＴＳ（配列タグ部位）誘導マーカーなどと比較して、幾つかの重要な利点をもたらす。
【０００６】
第一世代のマーカーはＲＦＬＰであり、これは制限断片の長さを変更する変異マーカーである。しかし、ＲＦＬＰの同定や型別に用いられる方法は、材料、労力および時間を比較的浪費するものである。それらは二対立遺伝子マーカーであるので（つまり、２つの対立遺伝子しか提示せず、制限部位は存在しても存在しなくてもよい）、それらの最大のヘテロ接合度は０．５である。理論上ヒトゲノム全体にわたって分布するＲＦＬＰの数は１０５より多く、そのため可能性のある平均マーカー間距離は３０キロベースとなる。しかし、実際には、遺伝子多型の追跡に有用なものとなるために均一に分布し集団において十分な頻度で存在するＲＦＬＰの数は、非常に限られる。
【０００７】
第二世代の遺伝子マーカーはＶＮＴＲであり、これはミニサテライトまたはマイクロサテライトのいずれかに分類できる。ミニサテライトは、５〜５０個の反復配列のユニットで存在する縦列反復ＤＮＡ配列であり、これは長さが０．１〜２０キロベースの範囲のヒト染色体の領域に沿って分散している。それらは多くの可能性のある対立遺伝子を提示するので、有益な情報内容が非常に多く含まれている。ミニサテライトは、サザンブロットを行って、被験個体からの核酸サンプル中に存在する縦列反復配列の数を同定することにより評価される。しかし、サザンブロッティングによりタイプ分けできる可能性のあるＶＮＴＲは１０４程度にすぎない。したがって、これらの地図内での容易にタイプ分けされ情報価値のあるマーカーの数は少なすぎて、情報価値のあるマーカー間の平均距離は有用な遺伝子地図としての要件を満たさない。更に、ＲＦＬＰマーカーおよびＶＮＴＲマーカーはいずれも、開発や多数のアッセイに費用も時間もかかる。
【０００８】
ＲＦＬＰではない二対立遺伝子マーカーに基づいて遺伝子地図を構築しようとする初期の試みは、配列タグ部位（ＳＴＳ）（既知の配列を有し、長さが平均で約２５０ｂｐであるゲノムＤＮＡの断片）内に存在する二対立遺伝子マーカーの同定に焦点をあてたものである。３０，０００を上回るＳＴＳが同定されており、ゲノムに沿って順序づけられている（Ｈｕｄｓｏｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１９４５−１９５４ （１９９５）；Ｓｃｈｕｌｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：５４０−５４６ （１９９６）；これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｈｏｎの集大成された地図は１５，０８６のＳＴＳを含む。
【０００９】
これらの配列タグ部位をスクリーニングして、その中に存在する多型、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）、更に好ましくはＲＦＬＰではない二対立遺伝子マーカーを同定することができる。一般に、多型は、５〜１０人の個体においてＳＴＳの配列を決定することにより同定される。
【００１０】
近年、Ｗａｎｇら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ： Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｐａｐｅｒｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｏｎ ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， 第１７頁 （１９９７年５月１４〜１８日）；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）は、８人の非血縁個体における、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ地図からの１２，０００のＳＴＳのシークエンシングから得られる７５０の一塩基多型の同定およびマッピングを発表した。この地図は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから入手できるＤＮＡチップ法の利用に基づくハイスループット系を用いて組み立てられた（Ｃｈｅｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６１４ （１９９６）；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【００１１】
しかし、実験データおよび統計的算出値によれば、今日マッピングされている全てのＳＴＳのうち、情報価値のある一塩基多型を含んでいるのは、１０のうち１未満である。これは、主に、既存のＳＴＳの長さが短いためである（通常は２５０ｂｐ未満）。１０６個の情報価値のあるＳＮＰがヒトゲノムに沿って並んでいると仮定した場合、関心のあるマーカーは、３×１０９／１０６毎に（すなわち３，０００ｂｐ毎に）平均して１個存在することになる。したがって、そのような１個のマーカーが２５０ｂｐのストレッチ上に存在する確率は１／１０未満である。
【００１２】
現時点の既存のマーカーに基づくＳＴＳ法では、高密度地図は作製できるであろうが、得られたマーカーを最適にゲノム全体に分布させるのを確実にするための系統だった取組みはなされていない。むしろ、多型は、ＳＴＳが利用可能な位置に限定されている。
【００１３】
マーカーを関心のある染色体または特定の染色体領域に沿って均一に分布させることは、ゲノム解析を更に成功させる上で重要である。特に、適当に配置されているマーカーを有する高密度地図は、検出可能な形質（例えば後記で記載されているもの）に関与する遺伝子の同定を目的とした、散発性症例についての関連研究の実施には必須である。
【００１４】
後記で更に詳細に説明するように、従来、遺伝的研究の大半は、連鎖解析（ｌｉｎｋａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）と呼ばれる統計的アプローチに基づいており、これは、マイクロサテライトマーカーをうまく利用して、十分な個体数が研究対象の形質を提示する家族内でそれらの遺伝パターンを調べるものであった。連鎖解析には特有の制限があり（これについては後記で更に詳細に述べる）、これらの研究には適切な家系の動員が必要であるために、全ての形質、特に散発性の症例しか利用できない形質（例えば薬物応答性の形質）や研究対象の集団内での比率が低い形質の遺伝的解析に十分に適合するとは言えない。
【００１５】
本発明の二対立遺伝子マーカーにより可能になる関連研究（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）は、連鎖解析の代替法となる。適当に間隔をおいて配置され十分に情報価値のあるマーカーの高密度地図の使用と組み合わせれば、関連研究（例えば連鎖不平衡に基づく全ゲノム関連研究）は複雑な形質に関与する大半の遺伝子の同定を可能にするだろう。
【００１６】
一塩基多型または二対立遺伝子マーカーは、ＲＦＬＰやＶＮＴＲと同様にして使用できるが、幾つかの利点をもたらす。一塩基多型は、ヒトゲノム内に高密度に配置されており、最も頻度の高い変異タイプに相当する。推定で１０７以上の部位がヒトゲノムの３×１０９塩基対に沿って散在している。したがって、一塩基多型は、ＲＦＬＰまたはＶＮＴＲマーカーよりも高頻度かつ高い均一性で存在し、このことは、そのようなマーカーが関心のある遺伝子座の近傍に見られる確率がより高いことを意味する。一塩基多型はＶＮＴＲマーカーほど可変ではないが、突然変異としてはより安定である。
【００１７】
また、特性決定されている一塩基多型の別の形態（例えば本発明の二対立遺伝子マーカー）は容易に識別されることが多いので、ルーチンに容易にタイプ分けできる。二対立遺伝子マーカーは、単一塩基に基づく対立遺伝子を有し、２つの共通の対立遺伝子しか持たない。そのため、より高度に並行した検出および自動化されたスコアリングが可能になる。本発明の二対立遺伝子マーカーは、多数の個体の迅速でハイスループットの遺伝子型判定の可能性をもたらす。
【００１８】
二対立遺伝子マーカーは、ゲノム内に高密度に配置されており、十分に情報価値が高く、多数をアッセイできる。これらの利点の複合的効果のために、二対立遺伝子マーカーは遺伝子研究において極めて有用なものになる。二対立遺伝子マーカーは、家族における連鎖研究、対立遺伝子共有法、集団における連鎖不平衡研究、症例−対照集団の関連研究に使用できる。本発明の重要な点は、二対立遺伝子マーカーのおかげで、関連研究を実施して複雑な形質に関与する遺伝子を同定することが可能になることである。関連研究は、無関係な症例集団および対照集団においてマーカー対立遺伝子の頻度を調べるものであり、一般に多遺伝子性または散発性の形質の検出に用いられる。関連研究は一般集団内でも行うことが可能であり、罹患家族中の血縁個体について実施する研究（連鎖研究）に限定されない。異なる遺伝子内の二対立遺伝子マーカー同士は、並行して、疾患または治療応答性との直接的な関連についてスクリーニングできる。この複数遺伝子法は、種々のヒト遺伝的研究の強力なツールである。何故ならば、この方法は、特定の表現型、薬物応答性、散発性の形質または複雑な遺伝的病因をもつ病状に及ぼす複数の遺伝因子の相乗作用を調べるために必要な統計的威力を提供するからである。
【００１９】
肥満障害関連領域
肥満は、深刻で広範にわたる公衆衛生上の問題である。工業先進国の人口の１／３が、理想体重よりも少なくとも２０％オーバーしている。この現象は、特に経済が現代化している世界の各地域では、益々悪化の一途をたどっている。アメリカ合衆国では、肥満の人々の数は、７０年代の終わりには２５％であったものが、９０年代の初めには３３％にまで増えている。
【００２０】
肥満は、心血管系または代謝性の疾患が発症する危険率をかなり増大させる。全人口が理想体重であれば、冠動脈不全の危険率は２５％、心不全および脳血管障害の危険率は３５％低下するだろうと推定される。冠動脈不全、アテローム性疾患および心不全は、肥満により引き起こされる心血管系の合併症の最たるものである。体重が３０％以上オーバーした場合、冠動脈疾患の発生率は、５０歳以下の患者では二倍になる。他の疾患について行った研究からも同様の結果が示されている。２０％の体重オーバーでは、高血圧の危険率が２倍になる。３０％の体重オーバーでは、インスリン非依存性糖尿病を発症する危険率は３倍になり、高脂血症を発症する危険率は６倍になる。
【００２１】
肥満によって発症が促進される疾患のリストとしては次のものが挙げられる：高尿酸血症（肥満患者では１１．４％、一般集団では３．４％）、消化器系の病理、肝機能の異常、更に特定の癌。
【００２２】
肥満の生理学的変化は、脂肪細胞の数の増大、各脂肪細胞に貯蔵されるトリグリセリド量の増加、またはそれらの双方により特徴付けられるが、いずれにしても、この体重オーバーは主として、摂取カロリーの量と身体が消費するカロリーの量との不均衡によって起こる。この不均衡の原因についての研究は幾つかの方向で進められている。ある研究は、食物吸収の作用機構、つまり食物摂取をコントロールする分子や飽満感に注目している。他の研究では、身体がそのカロリーを消費する経路を特徴付けている。
【００２３】
提唱されている肥満の治療には５つのタイプがある。（１）食物の制限が最も頻繁に用いられる。肥満個体は、少な目のカロリーを摂取するよう食事習慣を変えるようにアドバイスされる。このタイプの治療は短期間で有効であるが、再発率が非常に高い。（２）身体的運動により消費カロリーを増大させることも提唱されている。この治療は、単独で適用された場合には有効でないが、低カロリー食を摂っている患者では減量が向上する。（３）胃腸の手術は、摂取したカロリーの吸収を低下させ、有効ではあるが、それが引き起こす副作用のために、実際には断念される。（４）医薬品によるアプローチは、中枢神経系のレベルで関与する分子の食欲減退作用、または熱発生を増大させることによるエネルギー消費を増大させる分子の作用のいずれかを利用する。このタイプの分子のプロトタイプは、ミトコンドリア呼吸鎖の酸化的リン酸化を遮断する甲状腺ホルモンである。このタイプの治療には副作用および毒性があるために、それらの使用は危険である。（５）消化管の内腔に食物脂質を隔離することにより食物脂質の吸収を低下させることを目的とするアプローチも行われている。しかし、それは、許容しがたい生理的不均衡、すなわち脂溶性ビタミンの吸収不全、膨満感および脂漏症を誘発する。用いられる治療法がどのようなものであっても、肥満の治療は全て、再発率が非常に高いことを特徴とする。
【００２４】
ヒトにおいて肥満に関与する分子機構は複雑であり、遺伝的および環境的な要因を伴う。現行の治療の有効性は低いので、より良い標的治療薬が開発できるように、肥満を決定する遺伝的機構を明確にすることが急がれる。
【００２５】
２０種を上回る遺伝子が可能性のある候補として研究されている。その理由は、それらが肥満を臨床的兆候の１つとする疾患に関与しているか、またはモデル動物において肥満に関与する遺伝子の相同体であるからである。ヒト脂肪細胞特異的ＡＰＭＩ遺伝子は、３ｑ２７染色体領域に位置しており、脂肪組織の分泌タンパク質をコードし、肥満の病因において一役を担っていると考えられる。ＡＰＭＩのゲノム配列（特にそのプロモーター配列およびスプライス接合配列）の情報があれば、脂質代謝に作用する新規な診断・治療上のツールの設計が可能になり、肥満症の診断および治療に有用である。
【００２６】
Ｈａｇａｒ， Ｊ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９９８） １１月号；２０：３０４−３０８は、罹患している血縁ペアにおいて全ゲノムスキャンを行って、フランス人家族の集団における肥満と関連する染色体領域を同定した。モデルフリー複数点連鎖解析から、１０ｐ染色体の領域への連鎖の証拠が明らかにされた（ＭＬＳ＝４．８５）。この領域についてのＭＬＳ値は、連鎖のために提示された基準閾値を上回っている（Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １１， ２４１−２４７ （１９９５））。
【００２７】
ＬＳＲは、１９ｑ１３．１染色体上に位置する単一遺伝子の産物によってコードされる多量体型の受容体であり、Ｙｅｎ， Ｆ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒｅｍｎａｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ（肝臓で発現される脂肪分解刺激レムナント受容体の分子クローニング）”（印刷中）、ＰＣＴ特許ＷＯ ＩＢ９８／０１２５６およびＰＣＴ特許ＷＯ ＩＢ９８／０１２５７に十分に記載されている。細胞生物学、動物生理学、分子生物学および古典的生化学技法を用いて得られたデータに基づいて、本発明者らは、ＬＳＲが２つの主な機能、すなわちトリグリセリドに富むリポタンパク質の細胞取り込みおよびレプチンの結合、を果たすことを実証した。
【００２８】
ＬＳＲは、α１／β２からα１／β５の範囲（平均α１／β３）の化学量論で構成されるαサブユニットとβサブユニットからなる多量体であり、トリグリセリドに富むリポタンパク質の細胞結合、取込みおよび分解に関与する。ＬＳＲは主に肝臓で発現され、食物性ＴＧのクリアランスの律速段階であると考えられるので、この経路は、肝臓と周辺組織との間で食物脂質を隔絶する手段となる。ＬＳＲに遺伝的欠陥があると、食物脂質が脂肪組織に過剰に送達されると考えられる。食物性ＴＧの肝臓クリアランスにおける結果は、糖尿病、高血圧およびアテローム性動脈硬化症などの代謝、輸送および貯蔵に関係する幾つかの障害を引き起こす可能性がある。これらの貯蔵部位に送達される量がそれらのＦＦＡ（遊離脂肪酸）放出能を上回ると、それら貯蔵部位の大きさは増大して、肥満や、ついには一連の代謝性合併症を引き起こす結果となる。
【００２９】
明らかに、ヒトの体重を低減させるための新規な医薬品が必要とされている。そのような医薬組成物は、有利なことに肥満のコントロールに役立ち、そのため、この症状に伴う心血管系の障害の多くを軽減する。
【００３０】
また、肥満と関連する新遺伝子を発見することによっても、脂質代謝に作用する新規な診断・治療上のツールの設計が可能になり、肥満症の診断および治療に有用である。
【００３１】
本発明は、本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーを含んでなる、ヒトゲノムの高密度の連鎖不平衡に基づく遺伝地図に関するものであり、全ゲノム関連研究および連鎖不平衡マッピングを用いた検出可能な形質に関与する遺伝子の同定を可能にする。
【００３２】
発明の概要
本発明は、新規な地図関連二対立遺伝子マーカー（ｍａｐ−ｒｅｌａｔｅｄ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ｍａｒｋｅｒ）の１セットを見い出したことに基づく。表１ａを参照されたい。これらのマーカーの位置および周辺の配列情報を用いて、ヒトゲノムの高密度マッピング、そのマーカー位置におけるヌクレオチドの正体の特定、ならびに疾患状態の遺伝的素地を調べるのに有用なより複雑な関連研究およびハプロタイプ判定研究に有用であるポリヌクレオチド組成物を設計した。更に、本発明の組成物および方法は、薬剤および診断法の開発のための標的を同定するために、また、疾患に作用する薬剤および他の治療に対する異なった薬効応答ならびにそれらの副作用を特徴付けるために使用される。
【００３３】
本発明の第１の実施形態は、順序づけられた二対立遺伝子マーカーのアレイを含むヒトゲノムまたはヒトゲノム領域の地図であり、ここにおいて、その二対立遺伝子マーカーの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種または全部が地図関連二対立遺伝子マーカーである。更に、本発明の地図は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する地図を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から、個々に、または任意の組合せで選ぶことができる；場合により、上記の順序づけられたアレイは、少なくとも２０，０００、４０，０００、６０，０００、８０，０００、１００，０００または１２０，０００の二対立遺伝子マーカーを含む；場合により、上記の二対立遺伝子マーカーは、ヒトゲノム内で、平均距離で１０ｋｂ〜２００ｋｂ、１５ｋｂ〜１５０ｋｂ、２０ｋｂ〜１００ｋｂ、１００ｋｂ〜１５０ｋｂまたは２５ｋｂ〜５０ｋｂだけ互いに離れている；場合により、上記の二対立遺伝子マーカーは、ヒトゲノム内で、１５０ｋｂ、５０ｋｂまたは３０ｋｂ毎に少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーの平均密度で分布している；または、場合により、上記の二対立遺伝子マーカーの全てが、少なくとも約０．１８、０．３２または０．４２のヘテロ接合率を有するよう選ばれる。本発明はまた、順序づけられた二対立遺伝子マーカーのアレイを含んでなり、上記の二対立遺伝子マーカーの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種または全部が地図関連二対立遺伝子マーカーである、ヒトゲノムの１以上の領域の地図、好ましくはヒトゲノムの１以上の領域の高密度地図に関する。この地図関連二対立遺伝子マーカーは、３番、１０番、１９番染色体上にある肥満症関連染色体領域に局在する地図関連二対立遺伝子マーカーの任意の数または任意の組合せを含むこともでき、本明細書に更に詳細に記載される。場合により、二対立遺伝子マーカー地図は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種の二対立遺伝子マーカーを含み、ここで、その二対立遺伝子マーカーのうち少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０種が次のものからなる二対立遺伝子マーカーの群から選ばれる。
【００３４】
３番染色体の二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２７、７０、７２、７３、７４、７５、７６、７７；および（ｂ）配列番号１０２、１０５、１０６、１０７、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１５９、１６０、１６１；および（ｃ）１６３、１６６、１６７；
１０番染色体の二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７，９、１１、２１、２２、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００；（ｂ）配列番号１０１、１０３、１０４、１０８、１０９、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８；および（ｃ）配列番号１６４、１６５、１６８、１６９、１７０、１７１；ならびに
１９番染色体の二対立遺伝子マーカー；（ａ）配列番号１６２。
【００３５】
本発明の第２の実施形態は、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３またはそれらの相補体からなる群から個々にまたは任意の組合せで選ばれる配列のヌクレオチドの連続スパンからなるか、あるいは本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含んでなる、単離された、精製されたまたは組換えのポリヌクレオチドを包含し、ここで、上記の連続スパンは、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とする。また、本発明は、ストリンジェントまたは中程度の条件下で、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３およびそれらの相補体からなる群から選ばれる配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。更に、本発明のポリヌクレオチドは、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有するポリヌクレオチドを包含する：上記の連続スパンは地図関連二対立遺伝子マーカーを含むことができる；場合により、表１ａに示すような、それぞれの配列番号の第１または第２の対立遺伝子は、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するものとして特定され得る；場合により、上記の二対立遺伝子マーカーは、上記のポリヌクレオチドの中心から６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以内または上記ポリヌクレオチドの中心に存在しうる；場合により、上記のポリヌクレオチドは、長さが８、１０、１２、１５、１８、２０〜２１、２５、３５、４０、４３または４７ヌクレオチドからの範囲である連続スパンを含むか、該連続スパンからなるか、あるいは本質的に該連続スパンからなるものであり得る；場合により、上記のポリヌクレオチドは、長さが８、１０、１２、１５、１８、２０〜２１、２５、３５、４０、４３または４７ヌクレオチドからの範囲である連続スパンを含むか、該連続スパンからなるか、あるいは本質的に該連続スパンからなるものであり得るか、あるいは長さが１０、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、４３または４７ヌクレオチドで、且つ上記の配列の地図関連二対立遺伝子マーカーに含まれるものとして特定でき、場合により、表１ａの第１の対立遺伝子が上記の二対立遺伝子マーカーに存在しうる；場合により、上記の連続スパンの３’末端は、上記のポリヌクレオチドの３’末端に存在しうる；場合により、二対立遺伝子マーカーは、上記のポリヌクレオチドの３’末端に存在しうる；場合により、上記のポリヌクレオチドの３’末端は、上記の配列中の地図関連二対立遺伝子マーカーの内部または少なくとも２、４、６、８または１０ヌクレオチド上流（そのような距離はその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とする）に位置しうる；場合により、上記のポリヌクレオチドの３’末端は、上記の配列中の地図関連二対立遺伝子マーカーの１ヌクレオチド上流に位置しうる；場合により、上記のポリヌクレオチドは更に標識を含むことができる。
【００３６】
本発明の更に別の実施形態は、本発明のヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも９０％同一であり、更に好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、あるいは該ポリヌクレオチドからなる単離された核酸分子を含む。
【００３７】
本発明の第３の実施形態は、固相支持体に結合された本発明のポリヌクレオチドを包含する。更に、固相支持体に結合された本発明のポリヌクレオチドは、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有するポリヌクレオチドを包含する：場合により、上記のポリヌクレオチドは、少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００、２００または５００種の異なる本発明のポリヌクレオチドを個々に、またはグループで１つの固相支持体に結合させたものとして特定され得る；場合により、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同一の固相支持体に結合させることができる；場合により、複数のポリヌクレオチドが１つの固相支持体に結合される場合は、それらをランダムな位置に、または順序づけられたアレイとして結合させることができる；場合により、上記の順序づけられたアレイは、アドレス可能とすることができる。
【００３８】
本発明の第４の実施形態は、地図関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定するためのポリヌクレオチドの使用、またはその特定において使用するためのポリヌクレオチドを包含する。更に、地図関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定する際に使用するための本発明のポリヌクレオチドは、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有するポリヌクレオチドを包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、個々に、または任意の組合せで、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ぶことができる；場合により、上記のポリヌクレオチドは、本明細書に開示する配列を含むことができる；場合により、上記のポリヌクレオチドは、本明細書に開示する任意のポリヌクレオチドを含むか、あるいは該ポリヌクレオチドからなるか、あるいは本質的に該ポリヌクレオチドからなるものであり得る；場合により、上記の特定は、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイまたは酵素ミスマッチ検出アッセイにおいて行うことができる；場合により、上記のポリヌクレオチドは、固相支持体、アレイまたはアドレス可能アレイに結合させることができる；場合により、上記のポリヌクレオチドは標識され得る。
【００３９】
本発明の第５の実施形態は、地図関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドセグメントの増幅におけるポリヌクレオチドの使用、またはその増幅において使用するためのポリヌクレオチドを包含する。更に、地図関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントの増幅に使用するための本発明のポリヌクレオチドは、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有するポリヌクレオチドを包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、個々に、または任意の組合せで、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ぶことができる；場合により、上記のポリヌクレオチドは、個々に、または任意の組合せで、配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３からなる群から選ばれる配列を含むか、該配列からなるか、本質的に該配列からなるものであり得る；場合により、上記のポリヌクレオチドは、本明細書に開示する任意のポリヌクレオチドを含むか、本質的に該ポリヌクレオチドからなるか、または該ポリヌクレオチドからなるものであり得る；場合により、上記の増幅は、ＰＣＲまたはＬＣＲにより行うことができる。場合により、上記のポリヌクレオチドは、固相支持体、アレイまたはアドレス可能アレイに結合されていてもよい。場合により、上記のポリヌクレオチドは標識され得る。
【００４０】
本発明の第６の実施形態は、地図関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定することを含んでなる、生物学的サンプルの遺伝子型判定方法を包含する。更に、本発明の遺伝子型判定方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、個々に、または任意の組合せで、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ぶことができる；場合により、上記の方法は、更に、上記の二対立遺伝子マーカーにある第２のヌクレオチドの正体を特定することを含み、但し、上記の第１のヌクレオチドおよび第２のヌクレオチドは互いに（ワトソン−クリック塩基対合により）塩基対合していないものである；場合により、上記の生物学的サンプルは、単一の個体または被験者から誘導されるものである；場合により、上記の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる；場合により、上記の二対立遺伝子マーカーは、上記の固体のゲノム内に存在する該二対立遺伝子マーカーの両コピーについて特定される；場合により、上記の生物学的サンプルは、複数の被験者または個体から誘導されるものである；場合により、上記の方法は、上記の特定ステップの前に、二対立遺伝子マーカーを含む上記配列の一部を増幅することを更に含む；場合により、上記の増幅は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、または複製起点と上記部分を含む組換えベクターの宿主細胞における複製により行われる；場合により、上記の特定は、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイまたは酵素ミスマッチ検出アッセイにより行われる。
【００４１】
本発明の第７の実施形態は、集団における対立遺伝子の頻度を推定する方法であって、集団からの個体を地図関連二対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定し、集団における該対立遺伝子の比例代表（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を決定することを含む上記方法を含む。更に、本発明の集団における対立遺伝子の頻度の推定方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、この地図関連二対立遺伝子マーカーは、個々に、または任意の組合せで、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ぶことができる；場合により、集団における二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の頻度は、集団中の各個体のゲノム内に存在する上記の二対立遺伝子マーカーの両コピーについてヌクレオチドの正体を特定し、該集団について上記の地図関連二対立遺伝子マーカーの比例代表を算出することにより決定しうる；場合により、集団における二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の頻度は、集団中の代表数の個体または各個体から得られたプールした生物学的サンプルについて遺伝子型判定方法を行い、総量と比較した該ヌクレオチドの比例量を算出することにより決定できる。
【００４２】
本発明の第８の実施形態は、対立遺伝子と表現型との関連を検出する方法であって、ａ）形質陽性集団において少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度を決定し；ｂ）対照集団においてその地図関連二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度を決定し；ｃ）その遺伝子型と表現型との間に統計的に有意な関連が存在するか否かを判定する、各ステップを含んでなる上記方法を含む。更に、本発明の対立遺伝子と表現型との関連を検出する方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、個々に、または任意の組合せで、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ぶことができる；場合により、上記の対照集団は、形質陰性集団または無作為抽出集団であり得る；場合により、上記の表現型は、疾患、治療への応答性、治療の有効性、薬物への応答性、薬物の有効性および薬物の毒性からなる群から選ばれる；場合により、決定ステップａ）およびｂ）は配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーの全てに対して実施される。
【００４３】
本発明の第９の実施形態は、集団において二対立遺伝子マーカーの１セットについてのハプロタイプの頻度を推定する方法であって、ａ）少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーについて集団中の各個体を遺伝子型判定し；ｂ）ゲノム内に存在する第２の二対立遺伝子マーカーの両コピーについて第２の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定することにより、該集団中の各個体を第２の二対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定し；ｃ）ステップａ）およびｂ）で特定されたヌクレオチドの正体にハプロタイプ判定方法を適用して、上記頻度の推定値を得る、各ステップを含んでなる上記方法を包含する。更に、本発明のハプロタイプの頻度を推定する方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記のハプロタイプ判定方法は、非対称ＰＣＲ増幅、特定の対立遺伝子の二重ＰＣＲ増幅、クラーク（Ｃｌａｒｋ）法、または、期待値最大化アルゴリズムからなる群から選ばれる；場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、個々に、または任意の組合せで、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーおよびそれらの相補体からなる群から選ぶことができる；場合により、上記の第２の二対立遺伝子マーカーは、地図関連二対立遺伝子マーカーである；場合により、配列番号１〜１７１の配列のそれぞれに含まれる二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を、ステップａ）およびｂ）で特定する。
【００４４】
本発明の第１０の実施形態は、ハプロタイプと表現型との関連を検出する方法であって、ａ）本発明のハプロタイプの頻度を推定する方法に従って、形質陽性集団において、少なくとも１つのハプロタイプの頻度を推定し；ｂ）本発明のハプロタイプの頻度を推定する方法に従って、対照集団において、ハプロタイプの頻度を推定し；ｃ）そのハプロタイプと表現型との間に統計的に有意な関連が存在するか否かを判定する、各ステップを含んでなる上記方法を包含する。更に、本発明のハプロタイプと表現型との関連を検出する方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらの相補体から個々に、または任意の組合せで選ばれる配列中に存在しうる；場合により、上記の対照集団は、形質陰性集団または無作為抽出集団でありうる；場合により、上記の表現型は、疾患、治療に対する応答性、治療の有効性、薬物に対する応答性、薬物の有効性、および薬物の毒性からなる群から選ばれる；場合により、配列番号１〜１７１の配列のそれぞれに含まれる二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を、推定ステップａ）およびｂ）に含める。
【００４５】
本発明の第１１の実施形態は、検出可能な形質と関連する遺伝子の同定方法であって、ａ）検出可能な形質をもつ個体および検出可能な形質をもたない個体において、少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーの各対立遺伝子の頻度を決定し；ｂ）検出可能な形質と統計的に有意な関連を有する１以上の二対立遺伝子マーカーの少なくとも１つの対立遺伝子を同定し；ｃ）該対立遺伝子と連鎖不平衡にある遺伝子を同定する、各ステップを含んでなる上記方法である。更に、本発明の検出可能な形質と関連する遺伝子の同定方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、この方法は、ｄ）ステップｃ）で同定された検出可能な形質と関連する遺伝子における突然変異を同定することを更に含む；場合により、検出可能な形質をもつ個体および検出可能な形質をもたない個体は、互いに容易に識別できる；場合により、検出可能な形質をもつ個体および検出可能な形質をもたない個体は、二峰性（ｂｉｍｏｄａｌ）の集団から選ばれる；場合により、検出可能な形質をもつ個体は、その集団の一方の極大値に存在し、検出可能な形質をもたない個体は、その集団の他方の極大値に存在する；場合により、上記地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらの相補体からなる群から個々に、または任意の組合せで選ばれる配列内に存在しうる；場合により、上記の検出可能な形質は、疾患、治療に対する応答性、治療の有効性、薬物に対する応答性、薬物の有効性、および薬物の毒性からなる群から選ばれる。
【００４６】
本発明の第１２の実施形態は、検出可能な形質と関連する二対立遺伝子マーカーの同定方法であって、ａ）検出可能な形質を発現する個体およびその検出可能な形質を発現しない個体において、少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーを含む二対立遺伝子マーカーのセットの頻度を決定し；ｂ）検出可能な形質の発現と統計的に関連する上記セット中の１つ以上の二対立遺伝子マーカーを同定する、各ステップを含んでなる上記方法である。更に、本発明の検出可能な形質と関連する二対立遺伝子マーカーの同定方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらの相補体からなる群から個々に、または任意の組合せで選ばれる配列内に存在しうる；場合により、上記の検出可能な形質は、疾患、治療に対する応答性、治療の有効性、薬物に対する応答性、薬物の有効性、および薬物の毒性からなる群から選ばれる。
【００４７】
本発明の第１３の実施形態は、形質誘発対立遺伝子と連鎖不平衡の状態にあるか、または形質関連二対立遺伝子マーカーと連鎖不平衡の状態にある二対立遺伝子マーカーの同定方法であって、ａ）形質誘発対立遺伝子または形質関連二対立遺伝子マーカーを含むと予想されるゲノム領域内にある少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーを選択し；ｂ）どの地図関連二対立遺伝子マーカーが形質誘発対立遺伝子と関連するのか、あるいは形質関連二対立遺伝子マーカーと連鎖不平衡な状態にあるのかを判定する、各ステップを含んでなる上記方法である。更に、本発明の形質誘発対立遺伝子と連鎖不平衡の状態にあるか、または形質関連二対立遺伝子マーカーと連鎖不平衡の状態にある二対立遺伝子マーカーの同定方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらの相補体からなる群から個々に、または任意の組合せで選ばれる配列内に存在しうる；場合により、上記の検出可能な形質は、疾患、治療に対する応答性、治療の有効性、薬物に対する応答性、薬物の有効性、および薬物の毒性からなる群から選ばれる。
【００４８】
本発明の第１４の実施形態は、個体が検出可能な形質を発症する危険があるか否か、または検出可能な形質に罹患しているか否かを判定する方法であって、ａ）個体から核酸サンプルを取得し；ｂ）少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーを用いて、その核酸サンプルをスクリーニングし；ｃ）その核酸サンプルが、検出可能な形質と統計的に関連している地図関連二対立遺伝子マーカーの少なくとも１つの対立遺伝子を含んでいるか否かを判定する、各ステップを含んでなる上記方法である。更に、本発明の個体が検出可能な形質を発症する危険があるか否か、または検出可能な形質に罹患しているか否かを判定する方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらの相補体からなる群から個々に、または任意の組合せで選ばれる配列内に存在しうる；場合により、上記の検出可能な形質は、疾患、治療に対する応答性、治療の有効性、薬物に対する応答性、薬物の有効性、および薬物の毒性からなる群から選ばれる。
【００４９】
本発明の第１５の実施形態は、薬物または治療の投与方法であって、ａ）個体から核酸サンプルを取得し；ｂ）治療または薬物に対する陽性の応答と関連する少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカー、または治療または薬物に対する陰性の応答と関連する少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーの多型塩基の正体を特定し；ｃ）核酸サンプルがその治療または薬物に対する陽性の応答と関連する二対立遺伝子マーカーを含んでいるか、あるいは核酸サンプルがその治療または薬物に対する陰性の応答と関連する二対立遺伝子マーカーを含んでいない場合に、その治療または薬物を個体に投与する、各ステップを含んでなる上記方法である。更に、本発明の薬物または治療の投与方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらの相補体からなる群から個々に、または任意の組合せで選ばれる配列内に存在しうる；場合により、投与ステップは、核酸サンプルが治療または薬物に対する陽性の応答と関連する二対立遺伝子マーカーを含んでおり、且つ核酸サンプルが治療または薬物に対する陰性の応答と関連する二対立遺伝子マーカーを含んでいない場合に、その治療または薬物を個体に投与することを含む。
【００５０】
本発明の第１６の実施形態は、治療または薬物の臨床治験に組み入れるための個体のスクリーニング方法であって、ａ）個体から核酸サンプルを取得し；ｂ）核酸サンプルにおいて、治療または薬物に対する陽性の応答と関連する少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカー、または治療または薬物に対する陰性の応答と関連する少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーの多型塩基の正体を特定し；ｃ）核酸サンプルがその治療または薬物に対する陽性の応答と関連する地図関連二対立遺伝子マーカーを含んでいるか、または核酸サンプルがその治療または薬物に対する陰性の応答と関連する二対立遺伝子マーカーを含んでいない場合に、その個体を臨床治験に組み入れる、各ステップを含んでなる上記方法である。更に、本発明の治療または薬物の臨床治験に組み入れるための個体のスクリーニング方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらの相補体からなる群から個々に、または任意の組合せで選ばれる配列内に存在しうる；場合により、組み入れるステップは、核酸サンプルが治療または薬物に対する陽性の応答と関連する二対立遺伝子マーカーを含んでおり、且つ核酸サンプルが治療または薬物に対する陰性の応答と関連する二対立遺伝子マーカーを含んでいない場合に、その治療または薬物を個体に投与することを含む。
【００５１】
本発明の第１７の実施形態は、検出可能な形質と関連する遺伝子の同定方法であって、検出可能な形質と関連すると予想される遺伝子を選択し；ｂ）検出可能な形質と関連する該遺伝子内の少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーを同定する、各ステップを含む上記方法である。更に、本発明の検出可能な形質と関連する遺伝子の同定方法は、単独もしくは任意の組合せで特定された、本開示に記載する任意の更なる限定（つまり下記のもの）を有する方法を包含する：場合により、上記の地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらの相補体からなる群から個々に、または任意の組合せで選ばれる配列内に存在しうる；場合により、同定ステップは、検出可能な形質を発現する個体および検出可能な形質を発現しない個体において地図関連二対立遺伝子マーカーの頻度を決定し、その検出可能な形質の発現と統計的に関連する１つ以上の二対立遺伝子マーカーを同定することを含む。
【００５２】
その他の実施形態は、「発明の詳細な説明」および「実施例」に示す。
【００５３】
図面の説明
図１は、２１番染色体の細胞遺伝学的地図である。
【００５４】
図２Ａは、ランダムに分布している二対立遺伝子マーカーのセットについての、マーカー間距離の分布のコンピューターシミュレーションの結果を示し、ゲノム地図において、１、２または３マーカー／ＢＡＣについて、所与の距離だけ離れている二対立遺伝子マーカーの割合（％）を示す（そのゲノムをカバーする最小限に重複している２０，０００のＢＡＣのセットが評価されると仮定）。
【００５５】
図２Ｂは、ランダムに分布している二対立遺伝子マーカーのセットについての、マーカー間距離の分布のコンピューターシミュレーションの結果を示し、ゲノム地図において、１、３または６マーカー／ＢＡＣについて、所与の距離だけ離れている二対立遺伝子マーカーの割合（％）を示す（そのゲノムをカバーする最小限に重複している２０，０００のＢＡＣのセットが評価されると仮定）。
【００５６】
図３は、形質陽性サンプルと形質陰性サンプルとの対立遺伝子頻度の差に関する種々の仮説に従って、高密度二対立遺伝子地図からの個々のマーカーを用いて行った関連研究で得られたｐ値有意性を、一連の仮説サンプルサイズについて、示す。
【００５７】
図４は、約３，０００の二対立遺伝子マーカーを含む地図を用いて行った仮説関連解析である。
【００５８】
図５は、約２０，０００の二対立遺伝子マーカーを含む地図を用いて行った仮説関連解析である。
【００５９】
図６は、約６０，０００の二対立遺伝子マーカーを含む地図を用いて行った仮説関連解析である。
【００６０】
図７は、Ａｐｏ Ｅ領域内の二対立遺伝子マーカーを用いたハプロタイプ解析である。
【００６１】
図８は、図７のハプロタイプ解析に含まれるＡｐｏ Ｅ領域内の二対立遺伝子マーカーを用いたハプロタイプ解析のシミュレーションである。
【００６２】
図９は、前立腺癌と関連する二対立遺伝子マーカーの更なる研究のために選択された重複クローンの最小アレイ、コンティグに沿って候補ゲノム領域内に位置することが知られているＳＴＳマーカーの位置、および本発明の方法を用いて同定した前立腺癌と関連する候補遺伝子を保有するゲノム領域を保有するＢＡＣコンティグに沿った二対立遺伝子マーカーの位置を示す。
【００６３】
図１０は、罹患集団および非罹患集団において図９の二対立遺伝子マーカーの頻度を決定することにより得られた、前立腺癌の候補遺伝子の大まかな局在化である。
【００６４】
図１１は、図１０に示す大まかな局在化には含まれなかった別の二対立遺伝子マーカーを用いた前立腺癌の候補遺伝子の局在化を更に詳細に示したものである。
【００６５】
図１２は、前立腺癌と関連する遺伝子のゲノム領域内にある二対立遺伝子マーカーを用いたハプロタイプ解析である。
【００６６】
図１３は、図１２のハプロタイプ５に含まれる６種のマーカーを用いたハプロタイプのシミュレーションである。
【００６７】
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＬＳＲ遺伝子の染色体上での局在化およびゲノム構成を示す。図１４Ａは、１９番染色体およびＬＳＲのゲノム構成の模式図である。エキソンおよびイントロンの長さ（ｂｐ）は、それぞれ通常の数字およびイタリック体の数字として示してある。更に下流にあるＵＳＦ２の位置も示してある。図１４Ｂは、１９ｑ１３．１上のＳＮＰを示し、関連研究に使用されたものを確定している（四角で囲んで強調してある）。
【００６８】
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、血漿中の脂質値とＬＳＲ ＳＮＰとの関連研究をグラフで表したものである。血漿中のＴＧ（図１５Ａ）、総コレステロール（図１５Ｂ）および遊離脂肪酸（図１５Ｃ）の値が全集団の平均値（表６）よりも高いか低いかに従って分けた２群の若い女子における遺伝子型頻度の差を、３×２χ２（カイ二乗）解析により解析した。各被験マーカーについてのχ２値は棒線で示す。１８種のランダムなマーカーを用いて得られた平均χ２値は実線で示す。この平均値の計算された９９．９９％信頼区間を、各パラメーターについて点線で示す。
【００６９】
図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、肥満体の若い女子において食後高脂肪血症に及ぼすＬＳＲの第６エキソンがコードする突然変異の影響をグラフで示す。３４人の一夜絶食させた肥満体の若い女子に、高脂肪の試験食を摂食させた。この食事の前、２時間後および４時間後に、血漿中のＴＧを測定した。本明細書に記載されるようにして、ＬＳＲマーカー＃１、２および３の遺伝子型を判定した。各多型部位における遺伝子型の差異の関数としての食後応答性（平均±ＳＥＭ）を、１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃに示す。図１６Ｄは、ＬＳＲのＳＮＰ＃１および＃３の双方の遺伝子型を考慮に入れた、食後高脂肪血症応答のプロットである。まず、平均値間での差の統計的比較を分散分析により行った。次に、有意な結果について、片側ｔ検定により検定した。このｔ検定の有意性をグラフに示す。各群において十分な被験者数を得るために、データはヘテロ接合体およびホモ接合体の被験者のプールしたサンプルを用いて表わす。
【００７０】
図１７Ａおよび１７Ｂは、肥満体の女子におけるインスリンとＢＭＩとの関係に及ぼすＬＳＲ多型の影響を示す。空腹時血漿中インスリンレベルを肥満体女子の集団において測定し、それらのＢＭＩに対してプロットし、回帰線を作成した（図１７Ａ）。５種のＬＳＲマーカーの遺伝子型頻度を、個体がその回帰線よりも上か下かに基づいて比較し、χ２解析値として表した（図１７Ｂ）。これらの結果から、肥満体女子において、ＬＳＲのマーカー２がインスリンとＢＭＩとの関係に有意に影響を及ぼすことが示される。ランダムなマーカーの平均値および９９．９９％信頼区間は、それぞれ実線および破線として示す。
【００７１】
図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、肥満体女子におけるグルコース耐性に及ぼすＬＳＲ多型の影響を示す。グルコースおよびインスリンの濃度を、グルコース耐性試験の前（ｔ０）および２時間後（ｔ１２０）に採取した血漿サンプルについて測定し、血漿中インスリンの増加と比較した血漿中グルコースの相対的増加を算出し、ＳＮＰ遺伝子型の関数としてプロットした。ＳＮＰ＃１を図１８Ａに、ＳＮＰ＃２を図１８Ｂに、ＳＮＰ＃３を図１８Ｃに、ＳＮＰ＃４を図１８Ｄに示す。データから、ＬＳＲのマーカー２における多型だけが、血漿中グルコースの相対的増加と血漿中インスリンの相対的増加の比に有意な影響を及ぼすことが示される。
【００７２】
図１９は、一例として挙げるコンピューターシステムのブロック図である。
【００７３】
図２０は、新規なヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列のデータベースと比較して、その新規な配列とデータベース中の配列との相同性レベルを調べるための、プロセス２００の１つの実施形態を説明する流れ図である。
【００７４】
図２１は、２つの配列が相同であるか否かを判定するための、コンピューター内でのプロセス２５０の１つの実施形態を説明する流れ図である。
【００７５】
配列表の簡単な説明
配列番号１〜１７１は、地図関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチド配列を含む。
【００７６】
配列番号１７２〜３４２は、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーを含む配列を増幅するように設計された上流増幅用プライマー（ＰＵ）のヌクレオチド配列を含む。
【００７７】
配列番号３４３〜５１３は、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーを含む配列を増幅するように設計された下流増幅用プライマー（ＲＰ）のヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
配列番号５１４〜５１９は、実施例７に記載されるようにアルツハイマー病と関連することが示されている地図関連二対立遺伝子マーカーの一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【００７９】
配列番号５２０〜５３１は、実施例１０〜２２に記載されるように前立腺癌と関連することが示されている地図関連二対立遺伝子マーカーの一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【００８０】
配列番号５３２〜５３５は、実施例２３〜２６において肥満体の若者において血漿中ＴＧの上昇と関連することが示されている地図関連二対立遺伝子マーカーの一部を含むヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
配列番号５３６〜５５７は、配列番号５１４〜５３５の二対立遺伝子マーカーを含む配列を増幅するように設計された上流増幅用プライマー（ＰＵ）のヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
配列番号５５８〜３４３〜５７９は、配列番号５１４〜５３５の二対立遺伝子マーカーを含む配列を増幅するように設計された下流増幅用プライマー（ＲＰ）のヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
配列表に関する規約に従って、配列表では、次のコードを用いて、配列内での二対立遺伝子マーカーの位置を示し、多型塩基に存在するアレルの各々を特定する。配列中のコード「ｒ」は、多型塩基の一方のアレルがグアニンであり、他方のアレルがアデニンであることを示す。配列中のコード「ｙ」は、多型塩基の一方のアレルがチミンであり、他方のアレルがシトシンであることを示す。配列中のコード「ｍ」は、多型塩基の一方のアレルがアデニンであり、他方のアレルがシトシンであることを示す。配列中のコード「ｋ」は、多型塩基の一方のアレルがグアニンであり、他方のアレルがチミンであることを示す。配列中のコード「ｓ」は、多型塩基の一方のアレルがグアニンであり、他方のアレルがシトシンであることを示す。配列中のコード「ｗ」は、多型塩基の一方のアレルがアデニンであり、他方のアレルがチミンであることを示す。
【００８４】
実施形態の詳細な説明
本発明を更に詳細に説明する前に、本明細書中で本発明を開示するのに用いられる用語の意味および範囲を説明し規定するために、以下の定義について述べておく。
【００８５】
定義
本明細書において相互交換可能に用いられる「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」なる用語は、一本鎖または二本鎖の形態の２個以上のヌクレオチドからなるＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。本明細書において、「ヌクレオチド」なる用語は、一本鎖または二本鎖の形態で任意の長さのＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を説明するための形容詞として用いられる。本明細書において、「ヌクレオチド」なる用語はまた、個々のヌクレオチドもしくはヌクレオチドの改変体をいうための名詞としても用いられ、分子または大きな核酸分子内の個々の単位を意味し、プリンもしくはピリミジン、リボースもしくはデオキシリボース糖成分、およびリン酸基、またはオリゴヌクレオチド内もしくはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合にはホスホジエステル結合を含む。本明細書中で、「ヌクレオチド」なる用語は、（ａ）別の結合基、（ｂ）プリンの類似形態、（ｃ）ピリミジンの類似形態、または（ｄ）類似の糖の少なくとも１つの修飾を含む「修飾型ヌクレオチド」を包含するのにも用いられるが、類似の結合基、プリン、ピリミジンおよび糖の例としては、ＰＣＴ特許公開Ｎｏ． ＷＯ９５／０４０６４を参照されたい。しかし、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、５０％以上が通常のデオキシリボースヌクレオチドから構成され、最も好ましくは９０％以上が通常のデオキシリボースヌクレオチドから構成される。本発明のポリヌクレオチド配列は、いずれの公知の方法によっても調製でき、例えば、合成、組換え、ｅｘ ｖｉｖｏでの作製またはそれらの組合せ、ならびに当業界で公知のいずれかの精製方法の利用が挙げられる。
【００８６】
本明細書で用いられる「精製された」なる用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的な定義である。ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々の５’ポリヌクレオチドクローンは、従来から電気泳動で均質になるまで精製されている。これらのクローンから得られる配列は、そのライブラリーからも全ヒトＤＮＡからも直接には得ることができない。ｃＤＮＡクローンは、そのような形態では天然に存在せず、部分精製された天然の物質（メッセンジャーＲＮＡ）を操作することにより得られる。ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーへの変換には、合成物質（ｃＤＮＡ）の作製が含まれ、純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、合成ライブラリーからクローン選別により単離できる。したがって、メッセンジャーＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーを作製した後で、そのライブラリーから個々のクローンを単離することにより、天然のメッセージが約１０４〜１０６倍精製される。出発物質または天然物質を少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、更に好ましくは４桁または５桁精製することが特に意図される。あるいはまた、精製は、異種ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの両者）と比較しての「少なくとも」の純度％として表わすことができる。１つの好ましい実施形態として、本発明のポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％または１００％の純度である。更に好ましい実施形態として、このポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドと比較して、９０％〜１００％の範囲内であらゆる数値（但し少数点以下３桁まで）からの範囲の「少なくとも」純度を有している（例えば５’ポリヌクレオチドは少なくとも９９．９９５％の純度）。更に、このポリヌクレオチドの純度は、（上記で説明されているように）キャリアー溶液を除く全ての物質および化合物と比較した百分率（％）として表わすこともできる。それぞれの数値（但し少数点以下３桁まで）は、個々の種の純度として言うことができる。
【００８７】
本明細書で用いられる「単離された」なる用語は、その物質が生来の環境（例えば、天然に存在する場合には天然環境）から取り出されていることを要件とする。例えば、生きている動物の体内に存在する天然のポリヌクレオチドは、単離されているとは言わないが、同じポリヌクレオチドでも、天然の系における共存物質の幾つかまたは全部から分離されていれば、それは単離されていると言う。「単離された」という定義から特に除外されるものとしては：天然の染色体［例えば染色体スプレッド（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｐｒｅａｄ）］、人工染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸調製物もしくはトランスフェクト／形質転換された宿主細胞調製物として存在するｃＤＮＡライブラリーが挙げられ、この場合、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ不均質調製物であるか、あるいは単一コロニーの不均質集団としてプレートされているものである。また、５’ポリヌクレオチドがベクター分子内の核酸インサートの数の５％未満を構成している上記のライブラリーも特に除外される。更に特に除外されるものは、全細胞ゲノムＤＮＡ調製物または全細胞ＲＮＡ調製物（これらの全細胞調製物の機械的剪断または酵素消化されているものを含む）である。更に特に除外されるものは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ調製物としての、または電気泳動により分離された不均質混合物（そのブロット転写物を含む）としての上記の全細胞調製物であり、この場合、本発明のポリヌクレオチドは、電気泳動媒体において異種ポリヌクレオチドから更に分離されることはない（例えば、アガロースゲルもしくはナイロンブロットで不均質なバンド集団から一本のバンドを切り出すことにより更に分離される）。
【００８８】
「ストリンジェント」、「中程度」および「低」ハイブリダイゼーション条件は、以下で定義するとおりである。
【００８９】
「プライマー」なる用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的であって、その標的ヌクレオチド配列にハイブリダイイズさせるのに用いられる特定のオリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素により触媒されるヌクレオチド重合の開始点となる。
【００９０】
「プローブ」なる用語は、サンプル中に存在する特定のポリヌクレオチド配列の同定に使用できる範囲の定められた核酸セグメント（またはヌクレオチド類似セグメント；例えば本明細書で規定されるようなポリヌクレオチド）を意味し、その核酸セグメントは、同定しようとする特定のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
「検出可能な形質」、「形質」および「表現型」は、本明細書中では、目視できる、検出可能な、または測定可能なあらゆる生物の特性をいうのに相互交換可能に用いられ、例えば、疾患の症状または疾患に対する感受性などが挙げられる。典型的には、「検出可能な形質」、「形質」または「表現型」は、本明細書中では、疾患の症状もしくは疾患に対する感受性をいうか；あるいは疾患に作用する物質、薬物もしくは治療に対する個体の応答性をいうか；あるいは疾患に作用する物質の副作用の症状もしくはその副作用に対する感受性をいう。
【００９２】
「治療」なる用語は、本明細書では、当業界で知られているあらゆる医療的介入を包含し、例えば、医薬品の投与、医療目的で指定される食事の変更、または喫煙もしくは飲酒を減らす等の習慣、手術、医用装置の適用、および特定の物理的条件（例えば光や放射線）の適用もしくは軽減が挙げられる。
【００９３】
「対立遺伝子」なる用語は、本明細書では、１ヌクレオチド配列の変異体をいうのに用いられる。二対立遺伝子多型は２つの形態を有し、本明細書中では第１の対立遺伝子および第２の対立遺伝子と呼ぶ。二倍体生物は、１つの対立遺伝子の形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
【００９４】
「ヘテロ接合率」なる用語は、本明細書では、特定の対立遺伝子においてヘテロ接合性である個体の、集団における出現率をいうのに用いられる。二対立遺伝子系において、ヘテロ接合率は、平均して、２Ｐａ（１−Ｐａ）［式中、Ｐａは最低頻度の対立遺伝子の頻度である］に等しい。遺伝的研究において有用であるためには、遺伝子マーカーは、無作為に選択したヒトがヘテロ接合性である確率が相当高くなるように、十分なレベルのヘテロ接合度をもつべきである。
【００９５】
本明細書で用いられる「遺伝子型」なる用語は、個体またはサンプル中に存在する対立遺伝子の正体をいう。本発明では、遺伝子型とは、好ましくは、個体またはサンプル中に存在する二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の記載を指す。サンプルまたは個体を二対立遺伝子マーカーについて「遺伝子型判定する（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」という用語は、二対立遺伝子マーカーにおいて個体が保有する特定の対立遺伝子または特定のヌクレオチドを特定することからなる。
【００９６】
本明細書で用いられる「突然変異」なる用語は、頻度が１％より低い、異なるゲノム間または個体間でのＤＮＡ配列の差異をいう。
【００９７】
「ハプロタイプ」なる用語は、個体またはサンプル中に存在する対立遺伝子の組合せをいう。本発明では、ハプロタイプとは、好ましくは、表現型と関連する可能性がある、所定の個体において見られる対立遺伝子の組合せをいう。
【００９８】
本明細書で用いられる「多型」なる用語は、異なるゲノム間または個体間で２種以上の別のゲノム配列が存在することをいう。「多型（多型性）の」とは、特定のゲノム配列の２種以上の異型が１つの集団において見られる状態をいう。「多型部位」とは、その変異が起こっている遺伝子座である。一塩基多型とは、１つの塩基対の変化である。典型的には、一塩基多型は、多型部位で１個のヌクレオチドが別のヌクレオチドで置換されていることである。また、１個のヌクレオチドの欠失または１個のヌクレオチドの挿入によっても、一塩基多型は生じる。本発明では、「一塩基多型」とは、好ましくは１個のヌクレオチドの置換をいう。典型的には、異なるゲノム間または異なる個体間で、多型部位は２個の異なるヌクレオチドによって占められる。
【００９９】
「二対立遺伝子多型」または「二対立遺伝子マーカー」なる用語は、本明細書では、ある集団において２種の対立遺伝子を相当高い頻度で有する多型を指すのに相互交換可能に用いられ、好ましくは一塩基多型を指す。「二対立遺伝子マーカー（の）対立遺伝子」とは、二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチド変異体を指す。典型的には、本発明の二対立遺伝子マーカーの頻度の低い対立遺伝子の頻度は１％を上回ることが確認されており、好ましくはその頻度は１０％を上回り、更に好ましくはその頻度は少なくとも２０％（すなわち、少なくとも０．３２のヘテロ接合率）であり、一層好ましくはその頻度は少なくとも３０％（すなわち、少なくとも０．４２のヘテロ接合率）である。頻度の低い対立遺伝子の頻度が３０％以上である二対立遺伝子マーカーを「高品質二対立遺伝子マーカー」と呼ぶ。
【０１００】
ポリヌクレオチド内での、そのポリヌクレオチドの中心を基準にしたヌクレオチドの位置は、本明細書では、次のように記載する。ポリヌクレオチドが奇数個のヌクレオチドを有する場合、そのポリヌクレオチドの３’末端および５’末端から等距離にあるヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドの「中心にある」と見なされ、中心のヌクレオチドの直ぐ隣りにあるヌクレオチドまたは中心のヌクレオチド自体は「中心から１ヌクレオチド以内」にあると見なされる。ポリヌクレオチド中には奇数個のヌクレオチドがあるので、そのポリヌクレオチドの中央部にある５つのヌクレオチドの位置はいずれも、中心から２ヌクレオチド以内にあると見なされる、等々。ポリヌクレオチドが偶数個のヌクレオチドを有する場合、そのポリヌクレオチドの中心にはヌクレオチドではなく、１つの結合が存在する。したがって、中心にある２個のヌクレオチドはいずれも「中心から１ヌクレオチド以内」にあると見なされ、そのポリヌクレオチドの中央部にある４個のヌクレオチドはいずれも「中心から２ヌクレオチド以内」にあると見なされる、等々である。１個以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失を含む多型の場合、その多型の置換、挿入または欠失させてあるポリヌクレオチドからそのポリヌクレオチドの３’末端までの距離と、その多型の置換、挿入または欠失させてあるポリヌクレオチドからそのポリヌクレオチドの５’末端までの距離との差がゼロまたは１ヌクレオチドならば、その多型、対立遺伝子または二対立遺伝子マーカーは、ポリヌクレオチドの「中心にある」と言う。この差が０〜３であるならば、その多型は「中心から１ヌクレオチド以内」にあると見なされる。その差が０〜５であるならば、その多型は「中心から２ヌクレオチド以内」にあると見なされる。その差が０〜７であるならば、その多型は「中心から３ヌクレオチド以内」にあると見なされる、等々。１個以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失を含む多型の場合、その多型の置換、挿入または欠失させてあるポリヌクレオチドからそのポリヌクレオチドの３’末端までの距離と、その多型の置換、挿入または欠失させてあるポリヌクレオチドからそのポリヌクレオチドの５’末端までの距離との差がゼロまたは１ヌクレオチドならば、その多型、対立遺伝子または二対立遺伝子マーカーは、ポリヌクレオチドの「中心にある」と言う。この差が０〜３であるならば、その多型は「中心から１ヌクレオチド以内」にあると見なされる。その差が０〜５であるならば、その多型は「中心から２ヌクレオチド以内」にあると見なされる。その差が０〜７であるならば、その多型は「中心から３ヌクレオチド以内」にあると見なされる、等々。
【０１０１】
「上流」なる用語は、本明細書では、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かっての位置を言うのに用いられる。
【０１０２】
「塩基対合した」および「ワトソン＆クリック塩基対合した」なる用語は、本明細書では、チミンまたはウラシル残基が２つの水素結合でアデニン残基に結合し、シトシンおよびグアニン残基が３つの水素結合で結合している二重らせんＤＮＡにおいて見られるような様式で、互いに水素結合できるヌクレオチドをいうのに相互交換可能に用いられる（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第４版， １９９５を参照）。
【０１０３】
「相補的」または「その相補体」なる用語は、本明細書では、別の特定のポリヌクレオチドと、相補性領域全体にわたってワトソン＆クリック塩基対合を形成できるポリヌクレオチドの配列をいうのに用いられる。この用語は、ポリヌクレオチドのペアに対して、それらの配列のみに基づいて適用されるものであり、それら２つのポリヌクレオチドが実際に結合を起こす特定の条件セットには適用されない。
【０１０４】
本明細書で用いられる「地図関連二対立遺伝子マーカー（ｍａｐ−ｒｅｌａｔｅｄ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ｍａｒｋｅｒ）」とは、地図の二対立遺伝子マーカーを含み、配列番号１〜１７１に開示されている配列のいずれかと連鎖不平衡にある二対立遺伝子マーカーをいう。「地図関連二対立遺伝子マーカー」なる用語は、配列番号１〜１７１に開示されている二対立遺伝子マーカーの全てを包含する。本発明の好ましい地図関連二対立遺伝子マーカー対立遺伝子には、個々に、または対立遺伝子のあらゆる可能な組合せからなる群として、添付した「配列表」の対立遺伝子特徴のフィールド＜２２３＞で特定されるような、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーから個々にまたは任意の組合せで選ばれる対立遺伝子のそれぞれが含まれる。
【０１０５】
「第１の対立遺伝子」および「第２の対立遺伝子」なる用語は、それぞれの配列番号について添付の「配列表」の対立遺伝子特徴のフィールド＜２２２＞に特定されるような、二対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチド配列の多型塩基に位置するヌクレオチドをいう。本明細書で用いられる「多型塩基」とは、一般に、表１ａに記載されるように、配列番号１〜１７１の各々の２３位ヌクレオチドに位置している。
【０１０６】
Ｉ．二対立遺伝子マーカーおよび二対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチド：
本発明は、本発明の方法においてプライマーおよびプローブとして使用するためのポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは全て、単離、精製または組換えされているものとして特定できる。これらのポリヌクレオチドは、「配列表」中の任意の配列に由来する配列ならびにそれらに相補的な配列（それらの相補体）のヌクレオチドの連続スパン（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｓｐａｎ）からなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含むものでありうる。この「連続スパン」は、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とすることができる。本発明のポリヌクレオチドは、「配列表」に記載される多型塩基の周辺の正確な隣接配列をもつようには限定されないことに注意すべきである。そうではなく、二対立遺伝子マーカーの周辺の隣接配列または該マーカーからより遠位にある本発明のプライマーまたはプローブはいずれもが、それらの使用目的に適合する限り、どのような程度にも長くまたは短くすることができ、本発明はそのような配列を特に意図している、ことが理解されよう。配列表に示されるポリヌクレオチドは、それらの使用目的に適合する限り、どのような長さであってもよい、ことが理解される。また、連続スパンの外側の隣接領域は、必ずしもヒト被験者に実際に存在する天然の隣接配列と相同である必要はない。ヌクレオチドの使用目的に適合する任意のヌクレオチド配列の付加は、特に意図されている。上記の連続スパンは、その配列内に地図関連二対立遺伝子マーカーを含んでいてもよい。二対立遺伝子マーカーは一般に、１つの単一塩基の位置での多型からなる。したがって、それぞれの二対立遺伝子マーカーは、互いに比較した場合、１つの位置にヌクレオチ改変を示すポリヌクレオチド配列の２つの形態に相当する。通常、このヌクレオチド改変には、１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置換が含まれる。場合によっては、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーの第１の対立遺伝子または第２の対立遺伝子のいずれかを、地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するものとして特定することができる。
【０１０７】
好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１〜１００からの配列ならびにそれらに相補的な配列のヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含むものでありうる。この「連続スパン」は、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とすることができる。特に好ましいものは、配列番号１〜１００またはそれらの相補体のいずれかの配列のヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含み、但し、その配列番号の二対立遺伝子マーカーの第１対立遺伝子が地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するポリヌクレオチドである。他の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１〜１００またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含み、但し、その配列番号の二対立遺伝子マーカーの第２対立遺伝子が地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するものである。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１０１〜１６２からの配列ならびにそれらに相補的な配列の、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内の連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含むものでありうる。特に好ましいのは、配列番号１０１〜１６２またはそれらの相補体のいずれかの配列のヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含み、但し、その配列番号の二対立遺伝子マーカーの第１対立遺伝子が地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するポリヌクレオチドである。他の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１０１〜１６２またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含み、但し、その配列番号の二対立遺伝子マーカーの第２対立遺伝子が地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するものである。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１６３〜１７１からの配列ならびにそれらに相補的な配列の、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内の連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含むものでありうる。特に好ましいのは、配列番号１６３〜１７１またはそれらの相補体のいずれかの配列のヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含み、但し、その配列番号の二対立遺伝子マーカーの第１対立遺伝子が地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するポリヌクレオチドである。他の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１６３〜１７１またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含み、但し、その配列番号の二対立遺伝子マーカーの第２対立遺伝子が地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するものである。
【０１０８】
本発明はまた、肥満障害と関連する染色体の領域およびサブ領域に位置する二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカーのセットに関する。したがって、本発明は、３番染色体の地図関連二対立遺伝子マーカー；１０番染色体の地図関連二対立遺伝子マーカー；および１９番染色体の地図関連二対立遺伝子マーカーに存在する多型塩基を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、本発明に記載される地図関連二対立遺伝子マーカーにおける遺伝子型判定方法、ならびに該地図関連二対立遺伝子マーカーにおける増幅および遺伝子型判定に使用するためのポリヌクレオチドも包含し、場合によっては、本開示に記載される任意の更なる限定を受けることもある、ことが理解されよう。
【０１０９】
別の実施形態において、二対立遺伝子マーカー地図は、３番、１０番または１９番染色体に位置する上記の地図関連マーカーの１つ以上または全部を含む。特に好ましい地図関連二対立遺伝子マーカーは以下に示すものであり、したがって、本発明のポリヌクレオチドは、
３番染色体の二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２７、７０、７２、７３、７４、７５、７６、７７；および（ｂ）配列番号１０２、１０５、１０６、１０７、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１５９、１６０、１６１；および（ｃ）１６３、１６６、１６７；
１０番染色体の二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７，９、１１、２１、２２、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００；（ｂ）配列番号１０１、１０３、１０４、１０８、１０９、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８；（ｃ）および配列番号１６４、１６５、１６８、１６９、１７０、１７１；ならびに
１９番染色体の二対立遺伝子マーカー；（ａ）配列番号１６２；
からなる群から選ばれる配列番号からの配列またはそれらに相補的な配列のヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含むことができる。
【０１１０】
「連続スパン」は、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とすることができる。
【０１１１】
場合によっては、本明細書全体を通して記載される、任意の二対立遺伝子マーカー、二対立遺伝子マーカーのセット、ポリヌクレオチド、または核酸コードは、上記した配列番号の３番、１０番および１９番染色体の地図関連二対立遺伝子マーカーの１つ以上を特に除外した群から、個々に、または任意の組合せで選ぶことができる。
【０１１２】
本発明はまた、高ストリンジェンシーまたは中程度のストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１ならびにそれらに相補的な配列のいずれかからの配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、そうしたポリヌクレオチドは、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とすることができる。好ましいポリヌクレオチドは、地図関連二対立遺伝子マーカーを含む。場合によっては、その配列番号に開示される二対立遺伝子マーカーの第１または第２の対立遺伝子のいずれかを、地図関連二対立遺伝子マーカーに存在するものとして特定することができる。高ストリンジェンシーおよび中程度のストリンジェンシーの条件については、本明細書で更に説明する。
【０１１３】
本発明のプライマーは、開示される配列から、当業界で公知のいずれかの方法を用いて設計できる。好ましいプライマーのセットは、「配列表」の配列と同一である連続スパンの３’末端がプライマーの３’末端に存在するように作製される。そのような構成をとることにより、プライマーの３’末端が選択した核酸配列にハイブリダイズできるようになり、増幅反応またはシークエンシング反応を行う際のプライマーの効率が飛躍的に増大する。
【０１１４】
好ましいプライマーセットでは、連続スパンは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３に記載される配列またはそれらの相補体の１つに存在する。本発明はまた、配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３からの配列ならびにそれらに相補的な配列のヌクレオチドの連続スパンからなるか、本質的に該連続スパンからなるか、あるいは該連続スパンを含むポリヌクレオチドに関し、但し、その「連続スパン」は、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とすることができる。
【０１１５】
対立遺伝子特異的プライマーは、二対立遺伝子マーカーが連続スパンの３’末端にあり、且つその連続スパンがプライマーの３’末端に存在するように設計できる。そのような対立遺伝子特異的プライマーは、それらが二対立遺伝子マーカーに存在する２つの対立遺伝子の一方を含む核酸サンプルと共に用いられる限り、増幅反応またはシークエンシング反応を選択的に開始させる傾向がある。本発明のプライマーの３’末端は、上記配列内にある地図関連二対立遺伝子マーカーの内部に、または少なくとも２、４、６、８または１０ヌクレオチド（この距離がその特定の配列番号と一致するまで）上流に、あるいは新規な配列またはマーカーのシークエンシング、増幅または位置決めに使用するのに適した任意の他の位置に、位置づけることができる。３’末端が地図関連二対立遺伝子マーカーの１ヌクレオチド上流にあるプライマーには、マイクロシークエンシングアッセイとしての特別の用途がある。好ましいマイクロシークエンシング用プライマーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１に記載されるものであり、但し、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の各々について、センスマイクロシークエンシング用プライマーは、３’末端がそれぞれの配列番号の多型塩基の１ヌクレオチド上流に位置する、１９ヌクレオチドからなる相補体を含み、アンチセンスマイクロシークエンシング用プライマーは、その相補鎖の１９ヌクレオチドからなる相補体（すなわち、該プライマーのヌクレオチドは各配列番号の相補鎖上にある多型塩基の１ヌクレオチド上流に位置する３’末端を有する）を含む。配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の各々に対するマイクロシークエンシング用プライマーの最も好ましいものは、マイクロシークエンシング実験において確認されている表１ａに「Ａ」または「Ｓ」で示すマイクロシークエンシング用プライマーである。
【０１１６】
本発明のプローブは、当業界で公知の方法、特に本明細書に開示される特定の配列またはマーカーが存在するか否かを調べられるようにする方法のために、開示される配列から設計できる。好ましいプローブのセットは、本発明のハイブリダイゼーションアッセイでの使用のために、特定のセットのアッセイ条件下で、それらが二対立遺伝子マーカーの一方の対立遺伝子には選択的に結合するが、他方には結合しないように当分野で公知の任意の方法で設計できる。好ましいハイブリダイゼーション用プローブは、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドから、これらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内である、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１またはそれらの相同体の連続スパンからなるか、または本質的に該連続スパンからなるか、または該連続スパンを含むことができるか、あるいは、長さが１２、１５、１８、１９、２０、２５、３５、４０、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドであり、且つ上記配列の地図関連二対立遺伝子マーカーを含むものとして特定できる。場合により、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の第１対立遺伝子または第２対立遺伝子は、二対立遺伝子マーカー部位に存在するものとして特定できる。場合により、上記の二対立遺伝子マーカーは、ハイブリダイゼーション用プローブの中心から６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以内にあるか、あるいは該プローブの中心にあるものとすることができる。
【０１１７】
本発明のポリヌクレオチドのいずれもが、所望により、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段により検出しうる標識を組み入れることによって標識することができる。例えば、有用な標識としては、放射性物質、蛍光色素またはビオチンが挙げられる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、それらの３’末端および５’末端で標識される。また、標識は、プライマーまたはプライマー伸長産物（例えば増幅したＤＮＡ）の固相支持体への固定が容易になるように、プライマーを捕捉するためにも使用できる。捕捉標識は、プライマーまたはプローブに結合され、固相試薬の特異的結合メンバーと結合対を形成する特異的結合メンバーでありうる（例えばビオチンとストレプトアビジン）。したがって、ポリヌクレオチドまたはプローブが担持する標識のタイプによって、それは、標的ＤＮＡを捕捉または検出するのに用いることができる。更に、本明細書で提供されるポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、それら自体が捕捉標識となり得る、ことが理解されよう。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合、それは、プライマーまたはプローブの相補的部分と結合することによって、そのプライマーまたはプローブを固相支持体に固定させるように選択できる。ポリヌクレオチドプローブ自体が結合メンバーとなる場合は、当業者であれば、そのプローブが標的に相補的ではない配列または「テイル（尾部）」を含むことを理解するであろう。ポリヌクレオチドプライマー自体が捕捉標識となる場合は、そのプライマーの少なくとも一部が固相支持体上で核酸とハイブリダイズするのを免れる。ＤＮＡ標識法は当業者にはよく知られている。
【０１１８】
本発明のポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブのいずれもが、通常のようにして固相支持体上に固定できる。固相支持体は、当業者には公知であり、反応トレイのウェルの壁面、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、微粒子（例えばラテックス粒子）、ヒツジ（または他の動物）の赤血球、デュラサイト（Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ）（登録商標）などが挙げられる。固相支持体は特に決まっておらず、当業者により適宜選択され得る。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁性もしくは非磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁面、ガラスもしくはシリコンチップ、ヒツジ（または他の動物）の赤血球およびデュラサイトは全て、好適な例である。核酸を固相支持体に固定するための適切な方法としては、イオン的、疎水的、共有結合的な相互作用などが挙げられる。本明細書で用いられる固相支持体とは、不溶性であるか、またはその後の反応により不溶性になり得る任意の材料をいう。固相支持体は、捕捉試薬を誘引し固定するその本来の能力に基づいて選ぶことができる。あるいはまた、固相支持体は、捕捉試薬を誘引し固定する能力を有する別の受容体を保持してもよい。別の受容体としては、捕捉試薬自体または捕捉試薬に結合している荷電物質とは逆の電荷をもつ荷電物質を挙げることができる。更に別の形態として、その受容体分子は、固相支持体に固定（結合）されており、且つ特異的結合反応により捕捉試薬を固定することができる任意の特異的結合メンバーであってもよい。受容体分子は、アッセイの実施前またはアッセイを実施している間に捕捉試薬の固相支持体材料への間接的結合を可能にする。したがって、固相支持体は、プラスチック、誘導体化されたプラスチック、磁性もしくは非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、ヒツジ（もしくは他の動物）の赤血球、デュラサイト（登録商標）、および当業者に公知である他の構造体であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、固相支持体に個々に、または少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０もしくは２５種の異なる本発明のポリヌクレオチドの群として１つの固相支持体に結合または固定することができる。更に、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを、本発明の１以上のポリヌクレオチドと同一の固相支持体に結合させることも可能である。
【０１１９】
本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、固相支持体上の重複する領域またはランダムな位置に結合させることができる。あるいはまた、本発明のポリヌクレオチドは、順序づけられたアレイとして結合させてもよく、この場合、それぞれのポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドの結合部位とは重ならない固相支持体の異なる領域に結合される。好ましくは、そのようなポリヌクレオチドの順序づけられたアレイは「アドレス可能」であるように設計され、この場合、アッセイ手順の一部として、明確に区別される位置を記録して、アクセス可能にする。アドレス可能なポリヌクレオチドアレイは、典型的には、支持体表面の既知の異なる位置に結合されている複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチドの正確な位置の情報により、これらの「アドレス可能」型アレイは、ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用なものとなる。当業界で公知のどのようなアドレス可能型アレイ法も、本発明のポリヌクレオチドと共に用いることができる。これらのポリヌクレオチドアレイの特定の実施形態は、ジーンチップ（Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）（商標）として知られており、概略的には米国特許第５，１４３，８５４号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／１５０７０および９２／１００９２に記載されている。これらのアレイは、一般に、機械的合成法または光誘導（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成法（ホトリソグラフィー法と固相オリゴヌクレオチド合成との組合せを採用）を用いて作製できる（Ｆｏｄｏｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：７６７−７７７， １９９１：この開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。固相支持体上へのオリゴヌクレオチドのアレイの固定は、一般に「超大規模固定化ポリマー合成（Ｖｅｒｙ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（ＶＬＳＩＰＳ（商標））と称される技法の開発により可能になっており、この技法では、典型的には、プローブがチップの固相表面に高密度アレイで固定される。ＶＬＳＩＰＳ技法の例は、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，４１２，０８７号ならびにＰＣＴ公開 ＷＯ ９０／１５０７０、ＷＯ ９２／１００９２およびＷＯ ９５／１１９９５（それらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に提供されており、それらは、光誘導合成法などの技法によるオリゴヌクレオチドアレイの形成方法を記載している。固相支持体に固定されたヌクレオチドのアレイを提供することを目的とする戦略の設計では、ハイブリダイゼーションパターンおよび配列情報を最大にしようとして、オリゴヌクレオチドアレイをチップ上に順序づけて表示するために、更なる提示戦略が開発された。そのような提示戦略の例はＰＣＴ公開ＷＯ ９４／１２３０５、ＷＯ ９４／１１５３０、ＷＯ ９７／２９２１２およびＷＯ ９７／３１２５６（それらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドアレイは、サンプルが本発明の二対立遺伝子マーカーの１以上の対立遺伝子を含んでいるか否かを判定するために、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、およびそれらに相補的な配列、ならびにそれらの少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７の連続ヌクレオチド（但し、その長さは、これらの長さの断片がその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とする）の断片からなる群から選ばれる配列を少なくとも１つ含み得る。また、オリゴヌクレオチドアレイは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーの１以上の対立遺伝子を増幅するために、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、およびそれらに相補的な配列、ならびにそれらの少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７の連続ヌクレオチド（但し、この長さは、これらの長さの断片がその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とする）の断片からなる群から選ばれる配列を少なくとも１つ含み得る。別の実施形態において、アレイはまた、サンプルが本発明の二対立遺伝子マーカーの１以上の対立遺伝子を含んでいるか否かを判定するためのマイクロシークエンシング分析を行うために、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、およびそれらに相補的な配列、ならびにそれらの少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７の連続ヌクレオチド（但し、この長さは、これらの長さの断片がその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内とする）の断片からなる群から選ばれる配列を少なくとも１つ含み得る。更に別の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドアレイは、サンプルが本発明の二対立遺伝子マーカーの１以上の対立遺伝子を含んでいるか否かを判定するために、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、およびそれらに相補的な配列、ならびに長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドからこれらの長さの断片がその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内のヌクレオチドであるそれらの断片からなる群から選ばれる配列を少なくとも１つ含み得る。
【０１２１】
固相支持体に固定されたヌクレオチドのアレイを提供することを目的とする戦略の設計において、ハイブリダイゼーションパターンおよび配列情報を最大にしようとして、プローブアレイをチップ上に順序づけて提示するために、更なる提示戦略が開発された。そのような提示戦略の例はＰＣＴ公開 ＷＯ ９４／１２３０５、ＷＯ ９４／１１５３０、ＷＯ ９７／２９１２１およびＷＯ ９７／３１２５６（それらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【０１２２】
各ＤＮＡチップは、格子状パターンに配列されて１０セント硬貨の大きさに小型化された、数千〜数百万もの個々の合成ＤＮＡプローブを含むことができる。幾つかの実施形態においては、チップに結合させたプローブによるサンプル中の核酸のハイブリダイゼーション効率は、疎水性領域によって互いに隔絶されたポリアクリルアミドゲルのパッド（ＤＮＡプローブはアクリルアミドマトリックスに共有結合で結合される）を用いることにより改善される。
【０１２３】
サンプル核酸の二対立遺伝子マーカーに存在する多型塩基は、次のようにして特定される。本発明の二対立遺伝子マーカーの１以上の少なくとも一部を含むプローブを、ｉｎ ｓｉｔｕでまたは慣用の合成法で合成し、当業者に公知の方法を用いて適当なチップに固定する。
【０１２４】
本明細書に記載される二対立遺伝子マーカー（配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、またはそれらに相補的な配列）または多型塩基を含むその断片の１以上の対立遺伝子は、固相支持体（例えばマイクロチップまたは他の固定化表面）に固定することができる。これらの核酸の断片は、本明細書に記載される二対立遺伝子マーカーの少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または２５を超える連続ヌクレオチドを含み得る。好ましくは、これらの断片は、二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む。
【０１２５】
核酸サンプルを固定化表面にアプライし、分析して、二対立遺伝子マーカーの１以上の多型塩基の正体を特定する。幾つかの実施形態において、固相支持体はまた、サンプル中の分析しようとする二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む増幅産物を作製するために、本明細書に記載される増幅用プライマー、またはそれらの少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０の連続ヌクレオチドを含む断片を１つ以上含み得る。
【０１２６】
本発明の別の実施形態は、固相支持体に固定された１以上の二対立遺伝子マーカーの多型塩基の正体を特定するための、本発明のマイクロシークエンシング用プライマー、またはそれらの少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０の連続ヌクレオチドを含み、且つ３’末端が対応する二対立遺伝子マーカーの多型塩基の直ぐ上流にある断片を１つ以上含む固相支持体である。
【０１２７】
例えば、本発明の１つの実施形態は、固相支持体（例えばマイクロチップ、ビーズまたは他の固定化表面）に固定された核酸のアレイであって、該核酸のアレイは、本発明の地図中の二対立遺伝子マーカー、または多型塩基を含む少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または２５を超える連続ヌクレオチドを含むそれらの断片を１以上含む。例えば、このアレイは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１またはそれらに相補的な配列、または多型塩基を含む少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または２５を超える連続ヌクレオチドを含むそれらの断片からなる群から選ばれる二対立遺伝子マーカーを１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種含むことができる。
【０１２８】
本発明の別の実施形態は、１以上、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、または４００を超える本発明の地図中の二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む増幅産物を作製するための増幅用プライマーを含むアレイである。例えば、このアレイは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１またはそれらに相補的な配列からなる群から選ばれる二対立遺伝子マーカーの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種または全部の多型塩基を含む増幅産物を作製するための増幅用プライマーを含むことができる。そのようなアレイでは、アレイに含まれる増幅用プライマーが、アレイにアプライされた核酸サンプル中の検出しようとする二対立遺伝子マーカー配列を増幅することができる（すなわち、増幅用プライマーはアレイに固定された二対立遺伝子マーカーに対応する−表１ａを参照）。したがって、このアレイは、アレイに含まれる配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の１以上の二対立遺伝子マーカーに対応する配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の増幅用プライマーを１以上含むことができる。
【０１２９】
本発明の別の実施形態は、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１またはそれらに相補的な配列からなる群から選ばれる二対立遺伝子マーカーの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種または全部の多型塩基の正体を特定できるマイクロシークエンシング用プライマーを含むアレイである。例えば、このアレイは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１またはそれらに相補的な配列の二対立遺伝子マーカーの１以上、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、または４００を超えるものの多型塩基の正体を特定できるマイクロシークエンシング用プライマーを含み得る。
【０１３０】
本発明の地図中の二対立遺伝子マーカーの多型塩基の特異的な検出または同定を可能にする上記核酸の任意の組合せ（配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれらに相補的な配列の中の任意の組合せを含む）を含むアレイもまた、本発明の範囲内である。例えば、このアレイは、二対立遺伝子マーカーと、二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む増幅産物を作製できる増幅用プライマーとの双方を含み得る。あるいはまた、このアレイは、二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む増幅産物を作製できる増幅用プライマーと、これらのマーカーの多型塩基の正体を特定できるマイクロシークエンシング用プライマーとの双方を含み得る。
【０１３１】
上記の例は特定の二対立遺伝子マーカーの群を含むアレイを記載し、幾つかの実施形態では、特定の増幅用プライマーおよびマイクロシークエンシング用プライマーを記載するが、本発明は、本明細書に記載される任意の二対立遺伝子マーカー、二対立遺伝子マーカーの群、増幅用プライマー、増幅用プライマーの群、マイクロシークエンシング用プライマー、または本明細書に記載される増幅用プライマーの群、ならびに上記核酸の任意の組合せを含むアレイを包含することが理解されよう。
【０１３２】
また、本発明は、１以上の本発明のポリヌクレオチドと、場合によっては、地図関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定することにより被験者を遺伝子型判定するのに必要な試薬および説明書の一部または全部を含んでなる診断キットも包含する。キットのポリヌクレオチドは、場合によっては、固相支持体に結合されていてもよいし、あるいはポリヌクレオチドのアレイもしくはアドレス可能型アレイの一部であってもよい。このキットは、シークエンシングアッセイ法、マイクロシークエンシングアッセイ法、ハイブリダイゼーションアッセイ法または対立遺伝子特異的増幅法を含む（しかしそれらに限定されない）当業界で公知の任意の方法により、マーカー位置におけるヌクレオチドの正体を特定することができる。場合によっては、そのようなキットは、疾患に罹患する被験者の危険性、疾患に作用する物質の有望な応答、または疾患に作用する物質の副作用が生じる可能性に関して判定結果を評価するための説明書を含んでいてもよい。
【０１３３】
ＩＩ．二対立遺伝子マーカーのｄｅ ｎｏｖｏ同定方法
種々の方法のいずれかを用いて、一塩基多型についてゲノム断片をスクリーニングすることができ、例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いるディファレンシャルハイブリダーゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ゲル電気泳動により測定される移動度の変化の検出、または増幅した核酸の直接シークエンシングが挙げられる。好ましい二対立遺伝子マーカーの同定方法は、適当数の非血縁個体からのゲノムＤＮＡ断片の比較シークエンシングを含む。
【０１３４】
第１の実施形態において、非血縁個体からのＤＮＡサンプルをプールした後、関心のあるゲノムＤＮＡを増幅し、シークエンシングする。次に、こうして得られたヌクレオチド配列を分析して、有意な多型を同定する。この方法の主な利点の１つは、ＤＮＡサンプルをプールすることにより、ＤＮＡ増幅反応およびシークエンシング反応（これらは実施しなければならないが）の回数が実質的に減る、ことにある。更に、この方法は十分に感度が高いので、それにより得られた二対立遺伝子マーカーでは、一般に、関連研究を行うのに有用な程度に、頻度の低い対立遺伝子の頻度が十分なものになる。通常、この方法により同定される二対立遺伝子マーカーの最低頻度の対立遺伝子の頻度は少なくとも１０％である。
【０１３５】
第２の実施形態では、ＤＮＡサンプルはプールされず、したがって、個々に増幅およびシークエンシングされる。この方法は、一般に、候補遺伝子内で関連研究を行うために二対立遺伝子マーカーを同定する必要がある場合に好ましい。好ましくは、プロモーター領域またはエキソン領域などの非常に関連の高い遺伝子領域が二対立遺伝子マーカーについてスクリーニングされる。この方法を用いて得られる二対立遺伝子マーカーは、例えば、頻度の低い対立遺伝子の頻度が約１０％未満である可能性がある場合には、関連研究の実施にとってそれほど情報価値が高くない可能性がある。しかし、そのような二対立遺伝子マーカーは、関連研究を実施する上では十分に情報価値があり、更に、本発明の遺伝子解析研究にそれ程情報価値がない二対立遺伝子マーカーを含めると、通常見られる突然変異（それらの浸透度によっては、稀有な突然変異となる）を直接同定できる場合もあることが理解されよう。
【０１３６】
以下は、本発明の二対立遺伝子マーカーの同定のために、本発明者らが用いた好ましい方法の種々のパラメーターの説明である。
【０１３７】
ＩＩ．Ａ．ゲノムＤＮＡサンプル
本発明の二対立遺伝子マーカーを作製する元となるゲノムＤＮＡサンプルは、好ましくは、人種的背景が判っている不均一集団に該当する非血縁個体から得る。ＤＮＡサンプルを得る個体の数は、実質的に様々なものであってよく、好ましくは約１０〜約１０００、更に好ましくは約５０〜約２００の個体である。通常、ＤＮＡサンプルは、可能な限り多くのマーカーを同定し統計的に有意な結果を得るのに十分な多型多様性を示すように、少なくとも約１００の個体から収集する。
【０１３８】
分析に供しようとするゲノムＤＮＡの供給源としては、いずれの試験サンプルであっても、特に制限を受けることなく可能性がある。これらの試験サンプルとしては、本明細書に記載される本発明の方法により試験できる生物学的サンプルが挙げられ、全血、血清、血漿、髄液、尿、リンパ液、ならびに気道、腸管および尿生殖路の種々の外分泌物、涙、唾液、乳汁、白血球細胞、骨髄腫などのヒトおよび動物の体液；細胞培養上清などの生物学的液体；腫瘍性および非腫瘍性の組織ならびにリンパ節組織などの固定組織試験片；骨髄穿および固定細胞試験片が含まれる。本発明で用いられるゲノムＤＮＡの好ましい供給源は、各ドナーの末梢静脈血からのものである。生物学的サンプルからのゲノムＤＮＡの調製方法は、当業者には十分に公知である。好ましい実施形態の詳細を実施例１２に示す。当業者であれば、プールしたサンプルを増幅するのか、またはプールされていないＤＮＡサンプルを増幅するのかを選択できる。
【０１３９】
ＩＩ．Ｂ．ＤＮＡ増幅
ゲノムＤＮＡのサンプル中の二対立遺伝子マーカーの同定は、ＤＮＡ増幅法を使用することにより容易に行うことができる。ＤＮＡサンプルは、増幅ステップのためにプールしてもよいしプールしなくてもよい。ＤＮＡ増幅法は、当業者には十分に公知である。二対立遺伝子マーカーを保有するＤＮＡ断片を増幅するための種々の方法は、本明細書のＩＩＩ．Ｂに更に詳細に記載されている。ＰＣＲ法は、新規な二対立遺伝子マーカーの同定に用いられる好ましい増幅技法である。
【０１４０】
第１の実施形態において、二対立遺伝子マーカーは、本発明者らが得たゲノム配列情報を用いて同定される。ゲノムＤＮＡ断片（例えば上記に記載したＢＡＣクローンのインサート）をシークエンシングし、これを用いて５００ｂｐ断片を増幅するためのプライマーを設計する。これらの５００ｂｐ断片を、ゲノムＤＮＡから増幅し、二対立遺伝子マーカーについてスキャンする。プライマーは、ＯＳＰソフトウェア（Ｈｉｌｌｉｅｒ Ｌ．，およびＧｒｅｅｎ Ｐ．， １９９１）を用いて設計できる。全てのプライマーは、特定の標的塩基の上流に、シークエンシング用プライマーとして役立つ共通のオリゴヌクレオチドテイル部を含み得る。当業者であればプライマー伸長法に精通しており、それらがこれらの目的に使用できる。
【０１４１】
本発明の別の実施形態において、候補遺伝子のゲノム配列は、二対立遺伝子マーカーについての直接的なスクリーニングを可能にする公共のデータベースから入手できる。候補遺伝子をコードするゲノム配列の増幅に有用である好ましいプライマーは、その遺伝子のプロモーター、エキソンおよびスプライシング部位に集まる。遺伝子のこれらの機能的領域に存在する二対立遺伝子マーカーは、偶然に突然変異する確率が高い。
【０１４２】
好ましいプライマーとしては、配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３に開示されているものが挙げられる。
【０１４３】
ＩＩ．Ｃ．増幅したゲノムＤＮＡのシークエンシングおよび一塩基多型の同定
上記のようにして作製された増幅産物を、次に、当業者に公知であり当業者が利用可能な任意の方法を用いてシークエンシングする。ジデオキシ法（サンガー法）またはマキサム−ギルバート法のいずれかを用いるＤＮＡのシークエンシング方法は、当業者には広く知られている。そのような方法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， 第２版， １９８９；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に開示されている。別のアプローチとしては、Ｃｈｅｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， ６１０， １９９６；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているような高密度ＤＮＡプローブアレイへのハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１４４】
好ましくは、増幅されたＤＮＡを、ダイ−プライマーサイクルシークエンシングプロトコールを用いる自動化ジデオキシターミネーターシークエンシング反応に供する。このシークエンシング反応の生成物をシークエンシング用ゲルに流し、ゲル画像分析を用いて判定する。この多型検索は、同一位置に存在する異なる塩基から得られる電気泳動パターンに重なったピークが存在することに基づく。各ジデオキシターミネーターは異なる蛍光分子で標識されているので、二対立部位に対応する２つのピークは、配列上の同一位置にある２つの異なるヌクレオチドに対応する別々の色を示す。しかし、２つのピークの存在は、バックグラウンドノイズによるアーチファクトである可能性がある。そうしたアーチファクトを排除するために、２つのＤＮＡ鎖をシークエンシングし、ピーク同士の比較を行う。多型配列として登録するためには、その多型が、両方の鎖で検出されなければならない。
【０１４５】
上記の手順により、同定しようとする二対立遺伝子マーカーを含む増幅産物が可能になる。１００の個体のシークエンシング用プールによって検出される二対立多型の頻度の検出限界は、対立遺伝子頻度が判明しているシークエンシング用プールにより確認されているように、従たる対立遺伝子については約０．１である。しかし、このプール法により検出される二対立多型の９０％以上が、従たる対立遺伝子について０．２５を上回る頻度を示す。したがって、この方法により選ばれる二対立遺伝子マーカーは、従たる対立遺伝子については少なくなくとも０．１、主たる対立遺伝子については０．９未満の頻度を有する。好ましくは、従たる対立遺伝子については少なくとも０．２で主たる対立遺伝子については０．８未満、更に好ましくは従たる対立遺伝子については少なくとも０．３で主たる対立遺伝子については０．７未満であり、したがって、ヘテロ接合率は０．１８を上回るか、好ましくは０．３２を上回るか、更に好ましくは０．４２を上回る。
【０１４６】
別の実施形態において、二対立遺伝子マーカーは、個々のＤＮＡサンプルをシークエンシングすることにより検出され、そうした二対立遺伝子マーカーのマイナーな対立遺伝子の頻度は０．１未満となり得る。
【０１４７】
同一のゲノムＤＮＡの断片（例えばＢＡＣクローン内のインサート）が保有するマーカーは、関連研究を実施するためには、必ずしもそのゲノム断片内で互いに順序よく整列している必要はない。しかし、本発明の幾つかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの同一の断片が保有する二対立遺伝子マーカーの順序が決定される。
【０１４８】
ＩＩ．Ｄ．本発明の二対立遺伝子マーカーの確認
集団中に両方の対立遺伝子が存在することを確認することにより、遺伝子マーカーとしての多型の有用性を評価する。二対立遺伝子マーカーの確認は、本発明の方法により個体のグループを遺伝子型判定し、両対立遺伝子が存在することを実証することにより行う。マイクロシークエンシングは、対立遺伝子を遺伝子型判定するのに好ましい方法である。遺伝子型判定ステップによる確認は、そのグループの各個体から得た個々のサンプルについて行ってもよいし、あるいは２以上の個体に由来するプールサンプルを遺伝子型判定することにより行ってもよい。そのグループは、その個体が問題となる対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合には、１個体という小さなものとすることができる。好ましくは、そのグループは少なくとも３の個体を含み、更に好ましくは、１回の確認試験でより多くの被験二対立遺伝子マーカーの確認が得られる可能性がより高くなるように、そのグループは５または６の個体を含む。しかし、小さなグループについて確認試験を実施する場合、サンプリングミスによりどの被験個体も２つの対立遺伝子の一方を保有していないと、擬陰性の結果となる可能性があることに注意すべきである。したがって、この確認方法は、配列の特定の位置に真の二対立遺伝子マーカーが存在することを実証する場合に比べて、特定の最初の結果がアーチファクトであることを実証する場合には有用性が低い。本発明の全ての遺伝子型判定、ハプロタイプ判定、関連、相互作用の研究方法は、場合によっては、既に確認済の二対立遺伝子マーカーだけを用いて実施することができる。
【０１４９】
ＩＩ．Ｅ．本発明の二対立遺伝子マーカーの頻度の評価
確認された二対立遺伝子マーカーを、二対立遺伝子マーカー部位において最も稀な対立遺伝子の頻度を決定することにより、遺伝子マーカーとしてのそれらの有用性について更に評価する。最も稀な対立遺伝子の測定は、本発明の方法により個体のグループを遺伝子型判定し、両方の対立遺伝子が存在することを実証することにより達成される。遺伝子型判定ステップによるこの頻度の測定は、グループの各個体から得られる個々のサンプルについて行ってもよいし、あるいは２以上の個体から得られるプールサンプルを遺伝子型判定することにより行ってもよい。そのグループは、全体としてその集団を代表するのに十分大きなものでなければならない。好ましくは、グループは少なくとも２０の個体を含み、更に好ましくはグループは少なくとも５０の個体を含み、最も好ましくはグループは少なくとも１００の個体を含む。勿論、グループが大きくなるほど、サンプリングミスは減るので、頻度測定の精度は高くなる。頻度が低いほうの対立遺伝子の頻度が３０％以上である二対立遺伝子マーカーは「高品質二対立遺伝子マーカー」と呼ぶ。本発明の遺伝子型判定、ハプロタイプ判定、関連および相互作用の研究方法は全て、場合によっては、高品質二対立遺伝子マーカーだけを用いて行うことができる。
【０１５０】
ＩＩＩ．二対立遺伝子マーカーについての個体の遺伝子型判定方法
生物学的サンプルを本発明の１種以上の二対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定するための方法を提供する。それらの方法は全てｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。そのような遺伝子型判定方法は、当業界で公知の任意の方法により地図関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を特定することを含む。これらの方法は、関連研究における症例−対照集団や、所与の形質と関連することが判っている二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の検出における個体の遺伝子型判定において用途が見い出されており、この場合、個体のゲノム内に存在する二対立遺伝子マーカーの両コピーを特定して、個体が特定の対立遺伝子に関してのホモ接合性またはヘテロ接合性として分類できるようにする。
【０１５１】
これらの遺伝子型判定方法は、１つの個体から得られる核酸サンプルについて実施してもよいし、またはプールしたＤＮＡサンプルについて実施してもよい。
【０１５２】
遺伝子型判定は、二対立遺伝子マーカーの同定について上記に記載した方法と同様の方法を用いて、または更に詳細に後述する他の遺伝子型判定方法を用いて行うことができる。好ましい実施形態では、新規な二対立遺伝子マーカーを同定するためには、異なる個体からの増幅ゲノム断片の配列間の比較が用いられ、一方、診断および関連研究の用途において既知の二対立遺伝子マーカーを遺伝子型判定するためには、マイクロシークエンシングを用いる。
【０１５３】
ＩＩＩ．Ａ．遺伝子型判定用ＤＮＡの供給源
いずれの核酸の供給源も、それが所望の特定の核酸配列を含む、または含む可能性があれば、出発核酸として（精製形態または非精製形態で）使用できる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞、組織、体液などから上記のＩＩ．Ａ．で記載したようにして抽出できる。本発明の遺伝子型判定方法に用いる核酸はあらゆる哺乳動物の供給源から得ることができるが、核酸サンプルを採取する試験被験体および個体は一般にヒトであると理解されたい。
【０１５４】
ＩＩＩ．Ｂ．二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅
本発明の１種以上の二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントを増幅するための方法およびポリヌクレオチドを提供する。二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅は、種々の方法において種々の目的で使用でき、遺伝子型判定に限定されないことが理解されよう。しかし、（全部ではないが）多くの遺伝子型判定方法では、関心のある二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡ領域を予め増幅しておく必要がある。そのような方法により、二対立遺伝子マーカーにかかっている、もしくはその部位を含む配列、ならびそれの遠位もしくは近傍に位置する配列の濃度または総数を特異的に増大させる。診断アッセイもまた、本発明の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡセグメントの増幅に基づく。
【０１５５】
ＤＮＡの増幅は、当業界で公知である任意の方法により達成できる。確立されているＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、およびそれらを発展させた方法または別法。本明細書で使用可能な増幅方法としては、限定するものではないが、ＥＰ Ａ ３２０ ３０８およびＥＰ Ａ ４３９ １８２に記載されているようなリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ギャップＬＣＲ（Ｗｏｌｃｏｔｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５：３７０−３８６）、Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８， １９９０）およびＣｏｍｐｔｏｎ Ｊ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１−９２， １９９１）、に記載されているいわゆる「ＮＡＳＢＡ」法もしくは「３ＳＲ」法、欧州特許出願第４５４４６１０号に記載されているようなＱ−ベータ増幅、Ｗａｌｋｅｒら（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４２：９−１３， １９９６）およびＥＰ Ａ ６８４ ３１５に記載されているような鎖置換増幅、ならびにＰＣＴ公報ＷＯ ９３２２４６１に記載されているような標的仲介増幅が挙げられる（それらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【０１５６】
ＬＣＲおよびギャップＬＣＲは指数的増幅法であり、両者とも、ＤＮＡ分子にアニーリングした隣り合うプライマーを結合するＤＮＡリガーゼに依存する。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）では、２つの１次（第１および第２）プローブおよび２つの２次（第３および第４）プローブを含むプローブ対が用いられ、それらは全て、標的に対してモル過剰で用いられる。第１プローブは標的鎖の第１セグメントにハイブリダイズし、第２プローブは標的鎖の第２セグメントにハイブリダイズし、第１セグメントと第２セグメントは、１次プローブ同士が互いに５’リン酸−３’ヒドロキシの関係で隣接するように、そしてリガーゼが２つのプローブを共有結合的に融合または連結して融合産物にすることができるように隣接している。更に、同様の隣接様式で、第３（２次）プローブは第１プローブの一部にハイブリダイズでき、第４（２次）プローブは第２プローブの一部にハイブリダイズできる。勿論、標的が最初に二本鎖であるならば、２次プローブは先ず標的相補体にハイブリダイズする。連結された１次プローブの鎖が標的の鎖から離れたら、それは第３および第４のプローブ（連結されて、相補的な２次連結された産物を形成できる）とハイブリダイズする。重要なことは、連結産物が標的またはその相補体と機能的に同等であることを認識することである。ハイブリダイゼーションおよび連結のサイクルを繰り返すことにより、標的配列の増幅が達成される。多重ＬＣＲの方法も記載されている（ＷＯ ９３２０２２７、この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）は、ＬＣＲの１つの変法であり、プローブは隣接しておらず、２〜３塩基だけ離れている。
【０１５７】
ｍＲＮＡの増幅については、ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとした後、ポリメラーゼ連鎖反応を行うこと（ＲＴ−ＰＣＲ）；または米国特許第５，３２２，７７０号（その開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているように両方のステップに１つの酵素を使用すること；またはＭａｒｓｈａｌｌ Ｒ．Ｌ．ら（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４：８０−８４， １９９４；その開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているように非対称ギャップＬＣＲ（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を用いることは本発明の範囲内である。ＡＧＬＣＲは、ＲＮＡの増幅を可能にするＧＬＣＲの変法である。
【０１５８】
これらの増幅方法の中には、一塩基多型の検出に特に適しており、標的配列の同時増幅および多型ヌクレオチドの同定を可能にするものもあり、ＩＩＩ．Ｃ．で更に詳細に説明する。
【０１５９】
ＰＣＲ法は、本発明で用いられる好ましい増幅技法である。種々のＰＣＲ法が当業者等に良く知られている。ＰＣＲ法の概説としては、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６７： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ （１９９７）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｗｈｉｔｅ， Ｂ．Ａ．編および「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」という表題の刊行物（１９９１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい（それらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。これらのＰＣＲ法の各々において、増幅させようとする核酸配列の両側にあるＰＣＲ用プライマーを、ｄＮＴＰおよび耐熱性ポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ、ＰｆｕポリメラーゼまたはＶｅｎｔポリメラーゼ）と共に、適切に調製された核酸サンプルに添加する。サンプル中の核酸は変性され、ＰＣＲ用プライマーがサンプル中の相補的核酸配列に特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイズしたプライマーを伸長させる。その後、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長をもう１サイクル開始する。このサイクルを複数回繰り返して、プライマー部位間に核酸配列を含む増幅断片を得る。ＰＣＲは、幾つかの特許に更に詳細に記載されており、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８８号（それらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）が挙げられる。
【０１６０】
上記に記載されているような二対立遺伝子マーカーを同定することにより、適切なオリゴヌクレオチドの設計が可能になり、これをプライマーとして用いて本発明の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片を増幅することができる。増幅は、本明細書に記載する新規な二対立遺伝子マーカーを見い出すのに最初に用いたプライマー、または本発明の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅を可能にする任意のプライマーのセットを用いて行うことができる。プライマーは、任意の適切な方法によって調製できる。例えば、Ｎａｒａｎｇ Ｓ．Ａ．らのホスホジエステル法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０−９８， １９７９）、Ｂｒｏｗｎ Ｅ．Ｌ．らのホスホジエステル法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９−１５１， １９７９）、Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエチルホスホラミデート法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９−１８６２， １９８１）、およびＥＰ ０ ７０７ ５９２に記載されている固相支持体法などの方法による直接化学的合成が挙げられる（それらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【０１６１】
幾つかの実施形態において、本発明は、本発明の１種以上の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを提供する。好ましい増幅用プライマーは、配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３に記載されているものである。記載のプライマーはあくまでも例示にすぎず、本発明の１種以上の二対立遺伝子マーカーを含む増幅産物を作製するならば、どのような他のプライマーのセットであってもよいことが理解されよう。
【０１６２】
プライマーは、増幅させようとする特定の各配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選ばれる。本発明のプライマーの長さは、８〜１００ヌクレオチド、好ましくは８〜５０ヌクレオチド、８〜３０ヌクレオチド、更に好ましくは８〜２５ヌクレオチドの範囲とすることができる。プライマーが短いほど、標的核酸配列に対する特異性が失われる傾向があり、通常、十分に安定な鋳型とのハイブリッド複合体を形成するためには低めの温度が必要である。プライマーが長いほど、作製にコストがかかり、自己ハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する可能性もある。安定なハイブリッドの形成は、ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）に依存する。このＴｍは、プライマーの長さ、溶液のイオン強度およびＧ＋Ｃ含量に依存する。Ｇ＋Ｃ含量が高いほど、融解温度は高い。何故ならば、Ｇ：Ｃ対は３つの水素結合によって保持されており、これに対して、Ａ：Ｔ対はたった２つしか有しないからである。本発明の増幅用プライマーのＧ＋Ｃ含量は、好ましくは１０〜７５％、更に好ましくは３５〜６０％、最も好ましくは４０〜５５％の範囲である。適切なアッセイ条件セット下の適切なプライマーの長さは、当業者であれば経験的に決定できる。
【０１６３】
プライマー間の間隔によって、増幅されるセグメントの長さが決まる。本発明では、二対立遺伝子マーカーを保有する増幅するセグメントの大きさは少なくとも約２５〜３５ｂｐの範囲とすることができる。２５〜３０００ｂｐの増幅断片が典型的であり、５０〜１０００ｂｐの断片が好ましく、１００〜６００ｂｐの断片が非常に好ましい。二対立遺伝子マーカー用の増幅用プライマーは、上記マーカーを保有する任意のＤＮＡ断片の特異的増幅を可能にするものであれば、どのような配列でもよいことが理解されよう。Ｉで記載したように、増幅用プライマーは、標識されてもよいし、固相支持体に固定されてもよい。
【０１６４】
ＩＩＩ．Ｃ．二対立遺伝子マーカーについてのＤＮＡサンプルの遺伝子型判定方法
当業界で公知であるいずれかの方法を用いて、二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドを同定することができる。本発明では、検出しようとする二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子は同定・特定されているので、当業者であれば、多くの技法のいずれかを用いて容易に検出できることが判るだろう。多くの遺伝子型判定方法では、関心のある二対立遺伝子マーカーを保有するＤＮＡ領域を予め増幅させておく必要がある。現時点では標的またはシグナルを増幅させることが好ましい場合が多いが、増幅を必要としない超高感度検出方法もまた、本発明の遺伝子型判定方法に包含される。二対立多型を検出するのに使用できる当業者に十分に公知な方法としては、通常のドットブロット分析、Ｏｒｉｔａらにより記載されている一本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：２７７７６−２７７０， １９８９、この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二本鎖解析、ミスマッチ切断検出、ならびにＳｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ｖ．Ｃ．ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４９：６９９−７０６， １９９１）、Ｗｈｉｔｅら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２：３０１−３０６， １９９２）、Ｇｒｏｍｐｅ， Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：５８５５−５８９２， １９８９）およびＧｒｏｍｐｅ， Ｍ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１１１−１１７， １９９３）（これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているような他の慣用の技法が挙げられる。特定の多型部位に存在するヌクレオチドの正体を特定するための別の方法は、米国特許第４，６５６，１２７号（その開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているような特化したエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を用いるものである。
【０１６５】
好ましい方法は、シークエンシングアッセイ、酵素に基づくミスマッチ検出アッセイまたはハイブリダイゼーションアッセイにより二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの正体を直接特定することを含む。以下に、幾つかの好ましい方法を記載する。非常に好ましい方法は、マイクロシークエンシング法である。「シークエンシングアッセイ」なる用語は、本明細書では、二本鎖プライマー／鋳型複合体のポリメラーゼ伸長をいうのに用いられ、古典的なシークエンシングおよびマイクロシークエンシングの両方を含む。
【０１６６】
１）シークエンシングアッセイ法
多型部位に存在するヌクレオチドは、シークエンシング法により判定できる。好ましい実施形態では、上記に記載したようにしてシークエンシングする前に、ＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅に供する。ＤＮＡシークエンシング法は、ＩＩ．Ｃに記載してある。
【０１６７】
好ましくは、増幅したＤＮＡは、ダイ−プライマーサイクルシークエンシングプロトコールを用いる自動化ジデオキシターミネーターシークエンシング反応に供する。配列を分析することにより、二対立遺伝子マーカー部位に存在する塩基の同定が可能になる。
【０１６８】
２）マイクロシークエンシングアッセイ法
マイクロシークエンシング法では、標的ＤＮＡ中の対立遺伝子の１つにユニークな多型部位におけるヌクレオチドを、一塩基プライマー伸長反応で検出する。この方法では、標的核酸中の関心のある多型塩基の直ぐ上流にハイブリダイズする適当なマイクロシークエンシング用プライマーが必要である。ポリメラーゼを用いて、多型部位の選択したヌクレオチドに相補的な１つのｄｄＮＴＰ（チェーンターミネーター）により、このプライマーの３’末端を特異的に伸長させる。次に、任意の適切な方法で、取り込まれたヌクレオチドの正体を特定する。
【０１６９】
典型的には、マイクロシークエンシング反応は蛍光ｄｄＮＴＰを用いて行い、伸長されたマイクロシークエンシング用プライマーは、ＥＰ ４１２ ８８３（その開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているようにして、ＡＢＩシークエンシング装置で電気泳動により分析して、取り込まれたヌクレオチドの正体を特定する。あるいはまた、多数のアッセイを同時に処理するために、キャピラリー電気泳動を用いてもよい。本発明で使用できる典型的なマイクロシークエンシング手順を実施例８に示す。
【０１７０】
別のアプローチを用いて、マイクロシークエンシング用プライマーに付加されたヌクレオチドを検出することができる。蛍光共鳴エネルギー転移による均質相検出法（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｐｈａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）は、ＣｈｅｎおよびＫｗｏｋ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３４７−３５３ １９９７）およびＣｈｅｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４／２０ １０７５６−１０７６１， １９９７）により記載されている（それらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。この方法では、多型部位を含む増幅されたゲノムＤＮＡ断片を、対立遺伝子色素標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸および改変型Ｔａｑポリメラーゼの存在下で、５’−フルオレセイン標識プライマーと共にインキュベートする。この色素標識プライマーは、鋳型に存在する対立遺伝子に特異的なダイ−ターミネータにより一塩基伸長される。遺伝子判定反応の最後に、反応混合物中の２種の色素の蛍光強度を、分離または精製をせずに、直接分析する。これらのステップは全て、同一の試験管中で行うことができ、蛍光の変化はリアルタイムでモニターできる。あるいはまた、伸長されたプライマーはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析することもできる。多型部位にある塩基は、マイクロシークエンシング用プライマーに加わった質量により同定される（Ｈａｆｆ Ｌ．Ａ．およびＳｍｉｒｎｏｖ Ｉ．Ｐ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ７：３７８−３８８， １９９７を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【０１７１】
マイクロシークエンシングは、確立されているマイクロシークエンシング法、それを発展させた方法、またはその変法により達成できる。別法としては、幾つかの固相マイクロシークエンシング法が挙げられる。基本的なマイクロシークエンシングプロトコールは、先に記載されているものと同じであるが、但し、この方法は不均質相アッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｐｈａｓｅ ａｓｓｅｙ）として行われる点が異なり、プライマーまたは標的分子は固相支持体に固定または捕捉されている。プライマーの分離および末端ヌクレオチド付加分析を簡単にするために、オリゴヌクレオチドは固相支持体に結合させるか、または、アフィニティ分離ならびにポリメラーゼ伸長が可能になるように修飾する。合成オリゴヌクレオチドの５’末端および内部ヌクレオチドは、異なるアフィニティ分離法を可能にする幾つかの異なる方法（例えばビオチン化）で修飾する。オリゴヌクレオチドについて単一の親和基を用いれば、そのオリゴヌクレオチドを、取り込まれたターミネーター試薬から分離することができる。これにより、物理的分離またはサイズ分離を行う必要がなくなる。２種以上の親和性基を用いれば、２種以上のオリゴヌクレオチドを同時にターミネーター試薬から分離して分析することができる。これにより、１回の伸長反応あたり、数種の核酸種またはより多くの核酸配列情報の分析が可能になる。親和性基は、プライミングするオリゴヌクレオチド上にある必要はないが、そのかわりに鋳型上にある。例えば、固定は、ビオチン化したＤＮＡとストレプトアビジンでコーティングしたウェルまたはアビジンでコーティングしたポリスチレン粒子との相互作用により行うことができる。同様に、オリゴヌクレオチドまたは鋳型を高密度フォーマットで固相支持体に結合させてもよい。そのような固相マイクロシークエンシング反応では、取り込まれたｄｄＮＴＰは放射性標識されていてもよいし（Ｓｙｖａｅｎｅｎ， Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２２６：２２５−２３６， １９９４；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）、あるいはフルオレセインに結合されていてもよい（ＬｉｖａｋおよびＨａｉｎｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ３：３７９−３８５， １９９４；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。放射性標識したｄｄＮＴＰの検出は、シンチレーションに基づく技法により達成できる。フルオレセインに結合させたｄｄＮＴＰの検出は、アルカリホスファターゼと結合した抗フルオレセイン抗体の結合に基づくものとすることができ、続いて発色原性染色体物質（ｐ−ニトロフェニルホスフェートなど）と共にインキュベートする。他の可能性のあるリポーター検出ペアとしては次のものが挙げられる：ジニトロフェニル（ＤＮＰ）に結合させたｄｄＮＴＰおよび抗ＤＮＰアルカリホスファターゼ・コンジュゲート（Ｈａｒｊｕら， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９／１１ ２２８２−２２８７， １９９３；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）、またはビオチン化ｄｄＮＴＰおよび西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンと基質としてのｏ−フェニレンジアミン（ＷＯ ９２／１５７１２；こ���開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。更に別法としての固相マイクロシークエンシング手法としては、Ｎｙｒｅｎら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０８：１７１−１７５， １９９３；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に、酵素発光無機ピロリン酸検出アッセイ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＤＡ）によるＤＮＡポリメラーゼ活性の検出に基づく方法が記載されている。
【０１７２】
Ｐａｓｔｉｎｅｎら（Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：６０６−６１４， １９９７；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）には、一塩基多型の多重検出方法が記載されている。そこでは、固相ミニシークエンシング原理をオリゴヌクレオチドアレイフォーマットに適用している。固相支持体に結合させたＤＮＡプローブの高密度アレイ（ＤＮＡチップ）は、ＩＩＩ．Ｃ．５で更に詳細に記載する。
【０１７３】
１つの態様において、本発明は、マイクロシークエンシングアッセイを実施することにより本発明の１種以上の二対立遺伝子マーカーを遺伝子型判定するためのポリヌクレオチドおよび方法を提供する。好ましい実施形態では、３’末端が多型ヌクレオチドに直に隣接している任意のプライマーをマイクロシークエンシング用プライマーとして使用できることが理解される。同様に、マイクロシークエンシング解析が、本発明のあらゆる二対立遺伝子マーカーまたは本発明の二対立遺伝子マーカーのあらゆる組合せについて実施できることが理解されよう。本発明の１つの態様は、二対立遺伝子マーカー部位におけるヌクレオチドの正体を特定するための、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１のヌクレオチド配列もしくはそれらの相補体、またはそれらの少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５もしくは少なくとも２０の連続ヌクレオチドを含み、且つ対応する二対立遺伝子マーカーの直ぐ上流に３’末端を有する断片に相補的なヌクレオチドを含む、１以上のマイクロシークエンシング用プライマーを含む固相支持体である。
【０１７４】
３）ポリメラーゼおよびリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイ
１つの態様において、本発明は、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイにより、生物学的サンプル中で本発明の１種以上の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子を特定するためのポリヌクレオチドおよび方法を提供する。これらのアッセイは、ポリメラーゼおよびリガーゼの特異性に基づいている。重合反応では、増幅用プライマーの３’末端の正しい塩基対合について特にストリンジェントな要件が必要とされ、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズさせた２つのオリゴヌクレオチドの結合は、連結部位（特に３’末端）近傍でのミスマッチに対して非常に敏感である。「酵素に基づくミスマッチ検出アッセイ」なる用語は、本明細書では、リガーゼおよびポリメラーゼの特異性に基づいて二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子を特定する任意の方法をいうのに用いる。好ましい方法は後述する。本発明の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片を増幅するための方法、プライマーおよび種々のパラメーターは、上記のＩＩＩ．Ｂ．で更に詳細に説明してある。
【０１７５】
対立遺伝子特異的増幅
また、二対立遺伝子マーカーの２つの対立遺伝子の識別は、対立遺伝子特異的増幅、つまり選択的戦略によっても達成でき、それにより、それら対立遺伝子の一方が、他方の対立遺伝子を増幅することなしに増幅される。これは、多型塩基を増幅用プライマーの１つの３’末端に配置することにより達成される。伸長はプライマーの３’末端から形成するので、この位置またはこの位置の近傍でのミスマッチは増幅に対して阻害作用を有する。したがって、適当な増幅条件下では、これらのプライマーはそれらに相補的な対立遺伝子の増幅だけを指令する。適切な対立遺伝子特異的プライマーの設計および対応するアッセイ条件は、当業者には十分に公知である。
【０１７６】
連結／増幅に基づく方法
「オリゴヌクレオチド連結アッセイ」（ＯＬＡ）では、標的分子の一本の鎖の隣接配列にハイブリダイズできるように設計された２つのオリゴヌクレオチドを用いる。これらのオリゴヌクレオチドの一方はビオチン化されており、他方は検出できるように標識されている。正しい相補配列が標的分子の中で見つかると、そのオリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接するようにハイブリダイズして、捕捉・検出が可能な連結基質となる。ＯＬＡは、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ Ｄ．Ａ．ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：８９２３−８９２７；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）により記載されているように、二対立遺伝子マーカーを検出でき、有利にはＰＣＲと組み合わせることができる。この方法では、ＰＣＲを用いて標的ＤＮＡを指数的に増幅させ、次にＯＬＡを用いてそれを検出する。
【０１７７】
二対立遺伝子マーカーの検出に特に適する他の方法としては、上記のＩＩＩ．Ｂ．に記載のＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）が挙げられる。上記で述べたように、ＬＣＲは、２つのプローブ対を用いて、特定の標的を指数的に増幅させる。各オリゴヌクレオチドペアの配列を、そのペアが標的の同じ鎖の隣接配列にハイブリダイズできるように選択する。そのようなハイブリダイゼーションにより、鋳型依存性リガーゼの基質が形成される。本発明によれば、ＬＣＲは、二対立遺伝子マーカー部位の同じ鎖の近接配列および遠位配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。１つの実施形態では、どちらのオリゴヌクレオチドも、二対立遺伝子マーカー部位を含むように設計される。そのような実施形態において、標的分子がオリゴヌクレオチド上の二対立遺伝子マーカーに相補的な特定のヌクレオチドを含むか、または含んでいない場合に、オリゴヌクレオチドが共に連結できるように反応条件を選択する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／０１０６９（この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているように、それらが標的分子にハイブリダイズする時に「ギャップ」ができるように、二対立遺伝子マーカーを含んでいない。次に、このギャップを（ＤＮＡポリメラーゼにより）相補的なｄＮＴＰで、または別のオリゴヌクレオチドペアで「満たす」。したがって、各サイクルの終点では、各一本鎖は、次のサイクルの際に標的となり得る相補体を有しており、目的とする配列の指数的対立遺伝子特異的増幅が達成される。
【０１７８】
リガーゼ／ポリメラーゼ仲介型Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）は、核酸分子中の所定の部位のヌクレオチドの正体を特定するためのもう１つの方法である（ＷＯ ９５／２１２７１、この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。この方法は、所定の部位に存在するヌクレオチドと相補的であるヌクレオシド三リン酸の、プライマー分子の末端への取込み、およびそれに続く第２のオリゴヌクレオチドとのそれらの連結を含む。この反応は、反応の固相に結合させた特定の標識の検出、または溶液状態での検出によりモニターする。
【０１７９】
４）ハイブリダイゼーションアッセイ法
二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの正体を特定するための好ましい方法としては、核酸ハイブリダイゼーションが挙げられる。このような反応に便利に使用できるハイブリダイゼーション用プローブとしては、好ましくは、本明細書で規定するプローブが挙げられる。サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーションおよび固相ハイブリダイゼーションなどの任意のアッセイが使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【０１８０】
ハイブリダイゼーションとは、相補的な塩基対合によって２つの一本鎖核酸により二本鎖構造が形成されることをいう。ハイブリダイゼーションは、厳密に相補的な核酸鎖同士または僅かなミスマッチ領域を含む核酸鎖同士で起こり得る。特異的プライマーは、二対立遺伝子マーカーの一方の形態にはハイブリダイズするが他方にはハイブリダイズせず、したがって異なる対立遺伝子形態同士を識別できるように設計できる。対立遺伝子特異的プローブは、ペアで使用される場合が多い。ペアの一方のメンバーは、元の対立遺伝子を含む標的配列に対して完全な一致を示し、他方のメンバーは、別の対立遺伝子を含む標的配列に対して完全な一致を示す。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間でハイブリダイゼーション強度の有意な差があり、好ましくは本質的に二成分反応であるように十分にストリンジェントなものでなければならず、そうすることにより、プローブは対立遺伝子の一方にだけハイブリダイズする。プローブが厳密に相補的な標的配列にだけハイブリダイズするストリンジェントな配列特異的ハイブリダイゼーション条件は、当業界で十分に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ストリンジェント条件は、配列に応じて決まり、異なる環境では違ったものになる。一般的に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。一例として（しかし限定するものではないが）、高ストリンジェンシーの条件を用いる手順は次のとおりである：ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で、６５℃で８時間〜終夜行う。フィルターを、１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で、６５℃（好ましいハイブリダイゼーション温度）で４８時間ハイブリダイズする。あるいはまた、ハイブリダイゼーションステップは、ＳＳＣ緩衝液（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５Ｍ クエン酸Ｎａに相当する）の存在下で、６５℃で行うことができる。続いて、フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶＰ、０．０１％フィコールおよび０．０１％ ＢＳＡを含有する溶液中で、３７℃で１時間行い、続いて、０．１×ＳＳＣ中で５０℃で４５分間洗浄することができる。あるいはまた、フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳまたは０．５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳまたは０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中で、６８℃で１５分間間隔で行ってもよい。洗浄ステップの後、ハイブリダイズしたプローブはオートラジオグラフィーにより検出できる。例えば、限定するものではないが、中程度ストリンジェンシーの条件を用いる��順は次のとおりである：ＤＮＡを含むフィルターをプレハイブリダイズし、次に、５×ＳＳＣ緩衝液および標識したプローブの存在下で、６０℃の温度でハイブリダイズする。続いて、フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣを含有する溶液中で５０℃で行い、ハイブリダイズしたプローブはオートラジオグラフィーにより検出できる。使用可能な他の高〜中程度ストリンジェンシーの条件は、当業界では十分に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．， １９８９；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）により引用されている通りである。
【０１８１】
そのようなハイブリダイゼーションは溶液状態で行うことができるが、固相ハイブリダイゼーションアッセイを用いるのが好ましい。本発明の二対立遺伝子マーカーを含む標的ＤＮＡは、ハイブリダイゼーション反応の前に増幅させてもよい。サンプル中の特定の対立遺伝子の存在は、プローブと標的ＤＮＡとの間で形成される安定なハイブリッド二本鎖の存在の有無を検出することにより判定する。ハイブリッド二本鎖の検出は、幾つかの方法により行うことができる。標的またはプローブのどちらかに結合させた検出可能な標識を利用してハイブリッド二本鎖の検出を可能にする種々の検出アッセイ方式が良く知られている。典型的には、ハイブリダイゼーション二本鎖を、ハイブリダイズしなかった核酸から分離して、次に、その二本鎖に結合している標識を検出する。当業者であれば、洗浄ステップを用いれば、過剰な標的ＤＮＡまたはプローブを洗い出すことができることが判るであろう。プライマー上およびプローブ上に存在する標識を用いてハイブリッドを検出するためには、標準的な不均質アッセイ方式が適する。
【０１８２】
近年開発された２種のアッセイにより、分離または洗浄を必要としないハイブリダイゼーションに基づく対立遺伝子の識別が可能になっている（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ Ｕ．ら， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓａｒｃｈ， ８：７６９−７７６， １９９８を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ＴａｑＭａｎアッセイは、蓄積された増幅産物に特異的にアニーリングしたＤＮＡプローブを消化するのにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用する。ＴａｑＭａｎプローブは、蛍光エネルギー転移により相互作用している供与体−受容体色素ペアで標識される。増幅の間に前進しているポリメラーゼによってＴａｑＭａｎプローブが切断されると、消光性の受容体色素から供与体色素が分離し、供与体の蛍光が非常に増大する。２つの対立遺伝子の変異の検出に必要な全ての試薬は、反応の前に組み込むことができ、結果をリアルタイムでモニターする（Ｌｉｖａｋら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ９：３４１−３４２， １９９５を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。別の均質ハイブリダイゼーションに基づく手順では、対立遺伝子の識別に分子ビーコンを用いる。分子ビーコンは、均質溶液中で特定の核酸の存在をレポートするヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブである。それらが標的に結合すると、内部消光した蛍光発色団の蛍光を回復させる構造再編成が起こる（Ｔｙａｇｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６：４９−５３， １９９８；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【０１８３】
本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、生物学的サンプル中の二対立遺伝子マーカー対立遺伝子を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイで使用できる。これらのプローブは、好ましくは８〜５０のヌクレオチドから構成されること、および本発明の二対立遺伝子マーカーを含む配列に対して、それらにハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、好ましくはたった１つのヌクレオチドの変異について標的配列を識別できるよう十分に特異的であることを特徴とする。本発明のプローブ中のＧＣ含量は、通常、１０〜７５％、好ましくは３５〜６０％、更に好ましくは４０〜５５％の範囲である。これらのプローブの長さは、１０、１５、２０または３０ヌクレオチドから少なくとも１００ヌクレオチド、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、更に好ましくは１８〜３５ヌクレオチドの範囲とすることができる。特に好ましいプローブは、長さが２５ヌクレオチドである。好ましくは、二対立遺伝子マーカーは、ポリヌクレオチドプローブの中心から４ヌクレオチド以内にある。特に好ましいプローブでは、二対立遺伝子マーカーは、そのポリヌクレオチドの中心にある。プローブが短いほど、標的核酸配列に対する特異性が失われる可能性があり、一般には、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには低めの温度が必要とされる。プローブが長くなるほど、作製するコストが高くなり、自己ハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する可能性がある。オリゴヌクレオチドプローブの合成方法は上記の通りであり、本発明のプローブにも適用できる。
【０１８４】
好ましくは、本発明のプローブを標識するか、または固相支持体に固定する。標識および固相支持体は、Ｉで更に詳細に説明してある。検出用プローブは、通常、核酸配列または荷電していない核酸類似体であり、例えば、国際特許出願ＷＯ ９２／２０７０２に開示されているペプチド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号、同第５，０３４，５０６号および同第５，１４２，０４７号に記載されているモルホリノ類似体が挙げられる。プローブは、「伸長不能」にしておかねばならない場合があり、この場合、追加のｄＮＴＰをプローブに付加することはできない。類似体において、および類似体自体、通常は伸長不能であり、核酸プローブは、水酸基が伸長に関与できなくなるようにプローブの３’末端を修飾することにより伸長不能にすることができる。例えば、プローブの３’末端を捕捉用または検出用の標識で官能基化して、水酸基を消費またはブロッキングすることができる。あるいはまた、３’水酸基を、単純に切断、置換または改変してもよく、米国特許出願第０７／０４９，０６１号（１９９３年４月１９日出願）にはプローブを伸長不能にするのに使用できる修飾法が記載されている。
【０１８５】
本発明のプローブは、多くの目的に有用である。それらは、ゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションまたはｍＲＮＡへのノーザンハイブリダイゼーションに使用できる。また、このプローブは、ＰＣＲ増幅産物の検出にも使用できる。対立遺伝子特異的プローブへのハイブリダイゼーションをアッセイすることにより、所与のサンプル中の二対立遺伝子マーカーの存在の有無を検出できる。
【０１８６】
アレイフォーマットでのハイスループット並行ハイブリダイゼーションは「ハイブリダイゼーションアッセイ」に特に包含されるものであり、後述する。
【０１８７】
オリゴヌクレオチドのアドレス可能型アレイへのハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイは、完全にマッチングまたはミスマッチングしている標的配列変異に対する短鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション安定性の差に基づいている。多型情報への効率的なアクセスは、固相支持体（チップ）に所定の位置に結合させたオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイを含む基本的な構造により達成される。各ＤＮＡチップは、格子状パターンに整列され、１０セント硬貨の大きさに小型化されている、数千〜数百万もの個々の合成ＤＮＡプローブを含み得る。
【０１８８】
チップ法は、多くのケースで既に成功裏に応用されている。例えば、突然変異のスクリーニングは、ＢＲＣＡ１遺伝子、Ｓ．セレビシエ突然変異株およびＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼ遺伝子において着手されている（Ｈａｃｉａら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １４（４）：４４１−４４７， １９９６；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １４（４）：４５０−４５６， １９９６；Ｋｏｚａｌら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２：７５３−７５９；これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。二対立多型の検出に使用するための種々のフォーマットのチップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ［ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）］、Ｈｙｓｅｑ（ＨｙＣｈｉｐおよびＨｙＧｎｏｓｔｉｃｓ）およびＰｒｏｔｏｇｅｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが受注生産することができる。
【０１８９】
一般的に、これらの方法では、個体からの標的核酸配列セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブのアレイが用いられ、標的配列としては多型マーカーが含まれる。ＥＰ ７８５２８０（この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）には、一塩基多型を検出するためのタイリング法が記載されている。簡単に説明すると、アレイは通常、多数の特定の多型について「タイリング」することができる。「タイリング（ｔｉｌｉｎｇ）」とは、一般に、関心のある標的配列に相補的な配列、ならびにその配列の所定の変異体［例えば、１以上の所定の位置をモノマーの基本セット（すなわちヌクレオチド）の１以上のメンバーで置換すること］からなる所定の１セットのオリゴヌクレオチドプローブを合成することを意味する。タイリング法は、ＰＣＴ出願第９５／１１９９５号（この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に更に詳細に記載されている。特定の態様において、アレイを、多くの特異的で同定済みの二対立遺伝子マーカー配列についてタイリングする。特に、このアレイは、多くの検出ブロックを含むようにタイリングされており、各検出ブロックは、特定の二対立遺伝子マーカーまたは１セットの二対立遺伝子マーカーに対して特異的である。例えば、検出ブロックは、多くのプローブを含むようにタイリングされており、これは特異的な多型を含む配列セグメントにまで亘っている。プローブが確実に各対立遺伝子に相補的であるためには、プローブを、二対立遺伝子マーカーにおいて異なる一対の形態で合成する。多型塩基において異なるプローブに加えて、１置換されているプローブも通常検出ブロック内にタイリングする。これらの１置換型プローブは、多型からいずれか一方の方向に向かって特定の塩基番号に存在する、またはその特定の塩基番号までに亘って存在する、残りのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵから選ばれる）で置換された塩基を含む。典型的には、タイリングされた検出ブロック中のプローブは、二対立遺伝子マーカーから５塩基離れている配列に亘る配列位置、またはその配列位置を含む位置の置換を含む。１置換型プローブは、実際のハイブリダイゼーションをアーチファクトの交叉ハイブリダイゼーションから区別するための、タイリングしたアレイについての内部対照となる。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄が完了したら、アレイをスキャンして、標的配列がハイブリダイズしているアレイ上での位置を測定する。次に、スキャンしたアレイからのハイブリダイゼーションデータを分析して、サンプル中に二対立遺伝子マーカーのどの対立遺伝子（単数または複数）が存在するかを特定する。ハイブリダイゼーションおよびスキャニングは、ＰＣＴ出願第９２／１００９２号および同第９５／１１９９５号ならびに米国特許第５，４２４，１８６号（これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されているようにして行うことができる。
【０１９０】
したがって、多くの実施形態では、このチップは、長さが約１５ヌクレオチドの断片の核酸配列のアレイを含み得る。別の実施形態では、このチップは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１およびそれらに相補的な配列、ならびに少なくとも約８の連続ヌクレオチド、好ましくは１０、１５、２０、更に好ましくは少なくとも３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７の連続ヌクレオチドからこれらの長さの連続スパンがその特定の配列番号の長さと一致するまでの範囲内であるそれらの断片からなる群から選ばれる配列の少なくとも１つを含むアレイを含み得る。幾つかの実施形態では、このチップは、本発明のこれらポリヌクレオチドのうち少なくとも２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のアレイを含み得る。本発明の固相支持体および固相支持体に結合されたポリヌクレオチドは、Ｉで更に詳細に記載する。
【０１９１】
５）統合システム
多型の解析に使用可能な別の技法としては、多成分統合システム（ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げらる。これは、１つの機能性装置内で、ＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動反応などの工程を小型化および区画化したものである。そのような方法の一例は、米国特許第５，５８９，１３６号に開示されており、そこでは、チップ内でのＰＣＲ増幅とキャピラリー電気泳動との統合が記載されている。
【０１９２】
統合システムは、主に、微小流体系を用いる場合を想定している。これらのシステムは、マイクロチップ上に含まれるガラス、シリコン、石英またはプラスチックのウェハ上に設計されたマイクロチャンネルのパターンを含む。サンプルの移動は、マイクロチップの異なる領域に加えられた電力、電気浸透力、静浮力（ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｆｏｒｃｅ）で調節される。二対立遺伝子マーカーの遺伝子型判定の場合、微小流体系は、核酸増幅、マイクロシークエンシング、キャピラリー電気泳動および検出方法（例えばレーザー誘導蛍光検出）を統合できる。
【０１９３】
ＩＶ．本発明の二対立遺伝子マーカーを用いる遺伝子解析法
各種の方法が複合的な形質の遺伝子解析に利用できる（ＬａｎｄｅｒおよびＳｃｈｏｒｋ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６５， ２０３７−２０４８， １９９４を参照）。疾患感受性遺伝子の検索は、次の２つの主な方法を用いて行う：ファミリー研究を用いて遺伝子座と推定形質遺伝子座との共分離（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）についての証拠を探す連鎖法（ｌｉｎｋａｇｅ ａｐｐｒｏａｃｈ）、および対立遺伝子と形質もしくは形質誘発対立遺伝子（ｔｒａｉｔ ｃａｕｓｉｎｇ ａｌｌｅｌｅｓ）との間の統計的に有意な関連（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）についての証拠を探す関連法（Ｋｈｏｕｒｙ Ｊ．ら， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， １９９３；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。一般に、本発明の二対立遺伝子マーカーは、遺伝子型と表現型との間の統計的に有意な相関関係を実証するための当業界で公知のあらゆる方法に用途が見い出されている。二対立遺伝子マーカーは、パラメトリックおよびノンパラメトリック連鎖解析法に使用できる。好ましくは、本発明の二対立遺伝子マーカーを、関連研究を用いて検出可能な形質と関連がある遺伝子を同定するのに使用する。この方法は、罹患している家族を用いる必要がなく、複合的で散発性の形質と関連する遺伝子の同定を可能にする。
【０１９４】
本発明の二対立遺伝子マーカーを用いる遺伝子研究は、あらゆる規模で実施できる。本発明の二対立遺伝子マーカーの全セットまたは本発明の二対立遺伝子マーカーの任意のサブセットが使用できる。ある実施形態では、１種または数種の候補遺伝子に対応する二対立遺伝子マーカーのサブセットが使用できる。別の実施形態では、特定の疾患経路からの候補遺伝子に対応する二対立遺伝子マーカーのサブセットが使用できる。あるいはまた、特定の染色体セグメント上に位置する本発明の二対立遺伝子マーカーのサブセットが使用できる。更に、本発明の二対立遺伝子マーカーを含む遺伝子マーカーのあらゆるセットが使用できる。本発明の二対立遺伝子マーカーと組み合わせて遺伝子マーカーとして使用可能な二対立遺伝子多型のセットは、ＷＯ ９８／２０１６５（この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に記載されている。上述の通り、本発明の二対立遺伝子マーカーは、ヒトゲノムの完全なまたは部分的な遺伝子地図に含まれ得ることに注意すべきである。これらの各種の使用は、本発明および請求の範囲で特に意図されているものである。
【０１９５】
ＩＶ．Ａ．連鎖解析
連鎖解析は、１つの家族の世代を通じての遺伝子マーカーの伝達と特定の形質の伝達との相関関係を確立することに基づく。したがって、連鎖解析の目的は、家系において、関心のある形質との共分離を示すマーカーの遺伝子座を検出することである。
【０１９６】
パラメトリック法
連続する世代からデータが入手できれば、遺伝子座のペア間での連鎖の程度を調べることができるようになる。組換えフラクションが推定されれば、遺伝子座を順序付けて遺伝子地図にのせることができる。遺伝子マーカーである遺伝子座の場合、遺伝子地図を確立でき、次にマーカーと形質との連鎖の強度を算出することができ、これを用いてマーカーとそれらの形質に影響を及ぼす遺伝子との相対的な位置を示すことができる（Ｗｅｉｒ， Ｂ．Ｓ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＩＩ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．， Ｉｎｃ．， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ， ＵＳＡ， １９９６；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。連鎖解析のための古典的な方法は対数オッズ（ロッド）スコア法である（Ｍｏｒｔｏｎ Ｎ．Ｅ．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ７：２７７−３１８， １９５５；Ｏｔｔ Ｊ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ， Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９９１を参照；これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ロッドスコアの算出には、その疾患に関する遺伝様式を特定する必要がある（パラメトリック法）。一般に、連鎖解析を用いて同定される候補領域の長さは、２〜２０Ｍｂである。上記のようにして候補領域が同定されたら、別のマーカーを用いて組換え個体の分析を行うことにより、その候補領域の更なる領域確定（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）が可能になる。連鎖解析研究は、一般に、最大で５，０００のマイクロサテライトマーカーの使用に基づくものであり、したがって、最大の理論上の到達可能な連鎖解析の解像度は平均して約６００ｋｂに制限される。
【０１９７】
連鎖解析は、明白なメンデル遺伝パターンを示し且つ高い浸透率（すなわち、対立遺伝子ａの形質陽性キャリヤの数の、集団中のａのキャリヤの総数に対する割合）を有する単純な遺伝子形質をマッピングするのに成功裏に応用されている。しかし、パラメトリック連鎖解析には、様々な欠点がある。まず第１に、研究対象の各形質に適する遺伝モデルの選択についての信頼性により制限される。更に、既に述べたように、連鎖解析を用いて達成可能な解像度には限界が有り、最初に連鎖解析により同定した典型的な２Ｍｂ〜２０Ｍｂの領域の解析を精密化するには、補完的な研究が必要とされる。更に、パラメトリック連鎖解析法は、複合的な遺伝形質（例えば、複数の遺伝子および／または環境要因の複合作用によるもの）に適用する場合には、困難であることが判明している。これらの要因をロッドスコア解析に十分に盛り込むことは非常に困難である。そのような場合、近年Ｒｉｓｃｈ， Ｎ．およびＭｅｒｉｋａｎｇａｓ， Ｋ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７３：１５１６−１５１７， １９９６；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）が述べているように、これらの状況に連鎖解析を適用するのに必要な適当数の罹患家族を募るには、非常に多大な労力と費用が必要である。
【０１９８】
ノンパラメトリック法
連鎖解析のためのいわゆるノンパラメトリック法の利点は、疾患に関する遺伝様式の特定を必要としないことであり、複合的な形質の解析により有用である。ノンパラメトリック法は、罹患している親族が偶発的であるとしたときに推定される頻度よりも高い頻度で或る染色体領域の同一コピーを受け継いでいることを示すことによって、その染色体領域の遺伝パターンがランダムなメンデル分離と一致しないことを明らかにしようとするものである。罹患している親族は、不完全浸透や多因子遺伝が存在していたとしても、過剰な「対立遺伝子共有」を示すはずである。ノンパラメトリック連鎖解析では、２個体間でのマーカー遺伝子座の一致の程度は、同質対立遺伝子（ＩＢＳ）の数または同祖対立遺伝子（ＩＢＤ）の数により測定できる。罹患同胞対解析は良く知られている特殊な場合であり、これらの方法の中で最も簡易な形態である。
【０１９９】
本発明の二対立遺伝子マーカーは、パラメトリックおよびノンパラメトリック連鎖解析の両方に使用できる。好ましくは、二対立遺伝子マーカーは、複合的な形質に関与する遺伝子をマッピングすることができるノンパラメトリック法に用いることができる。本発明の二対立遺伝子マーカーをＩＢＤ法およびＩＢＳ法の双方において用いて、複合的な形質に影響を及ぼす遺伝子をマッピングすることができる。そのような研究では、高密度の二対立遺伝子マーカーを利用して、複対立遺伝子マーカーによって達成される効率を達成するために幾つかの隣接する二対立遺伝子マーカー遺伝子座をプールしてもよい（Ｚｈａｏら， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ６３：２２５−２４０， １９９８；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。
【０２００】
しかし、パラメトリックおよびノンパラメトリック連鎖解析方法は両者とも、罹患している親族を解析するものであり、それらは薬物応答の遺伝子解析や治療の副作用の解析における有用性が限られる傾向がある。このタイプの分析は、家族性発症（ｆａｍｉｌｉａｌ ｃａｓｅｓ）が利用できないような場合には役に立たない。事実、家族のうち２人以上の個体が同一の薬物に同時に暴露される可能性は極めて低い。
【０２０１】
ＩＶ．Ｂ．集団の関連研究
本発明は、本発明の二対立遺伝子マーカーを用いる、検出可能な形質と関連する１セットの候補遺伝子間で１種または数種の遺伝子を同定する方法を含む。１つの実施形態において、本発明は、二対立遺伝子マーカー対立遺伝子または二対立遺伝子マーカーハプロタイプと形質との関連を検出する方法を含む。更に、本発明は、本発明の任意の二対立遺伝子マーカー対立遺伝子と連鎖不平衡にある形質誘発対立遺伝子を同定する方法を含む。
【０２０２】
上記に記載したように、別のアプローチを用いて関連研究、すなわち全ゲノム関連研究、候補領域の相関関連研究および候補遺伝子の関連研究を行うことができる。１つの好ましい実施形態では、本発明の二対立遺伝子マーカーを用いて、候補遺伝子の関連研究を行う。更に、本発明の二対立遺伝子マーカーは、全ゲノム関連研究を行うために、ヒトゲノムの遺伝子マーカーの任意の地図に組み込むことができる。二対立遺伝子マーカーの高密度地図の作製方法は、米国特許出願第０９／８４２２，９７８号に記載されている。本発明の二対立遺伝子マーカーは、上記ゲノムの特定の候補領域（例えば、特定の染色体または特定の染色体セグメント）の任意の地図に更に組み込むことができる。
【０２０３】
上記で述べたように、関連研究は一般集団内で行うことができ、罹患家族の血縁個体について行う研究に限定されない。関連研究は、散発性または多因子性の形質の分析を可能にするので、非常に有用である。更に、関連研究は、連鎖研究よりもより精細な形質誘発対立遺伝子のマッピングを可能にする微細規模マッピングのための強力な方法となる。家系に基づく研究は、単に形質誘発対立遺伝子の位置を狭めてしまうことが多い。したがって、本発明の二対立遺伝子マーカーを用いる関連研究は、連鎖解析法により同定された候補領域内で形質誘発対立遺伝子の位置を精密化するのに使用できる。更に、関心のある染色体セグメントが同定されると、関心のある領域内に候補遺伝子（本発明の候補遺伝子など）が存在していれば、形質誘発対立遺伝子の同定を直ちに特定することができる。本発明の二対立遺伝子マーカーは、候補遺伝子が形質と関連していることを実証するのに使用できる。そのような使用は、本発明および請求の範囲で特に意図されるものである。
【０２０４】
１）集団中の二対立遺伝子マーカー対立遺伝子または二対立遺伝子マーカーハプロタイプの頻度の決定
関連研究により、遺伝子座間での対立遺伝子セットの頻度の相関関係を調べる。
【０２０５】
集団中の対立遺伝子の頻度の測定
集団中での二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子頻度は、上記に「二対立遺伝子マーカーについての個体の遺伝子型判定方法」というタイトルで記載した方法の１以上またはこの所期の目的に適する任意の遺伝子型判定手順を用いて測定できる。プールサンプルまたは個体のサンプルを遺伝子型判定することにより、集団中の二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度を求めることができる。必要とされる遺伝子型判定の回数を減らすための１つの方法は、プールサンプルを用いることである。プールサンプルの使用における大きな障害は、そのプールを用意する上での、正確なＤＮＡ濃度の測定の精度と再現性の面にある。個体のサンプルの遺伝子型判定では、より高い感度、再現性および精度が得られ、これは本発明において好ましい方法である。好ましくは、各個体を別個に遺伝子型判定し、簡易な遺伝子計数を適用して、所与の集団における二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子または遺伝子型の頻度を求める。
【０２０６】
集団中のハプロタイプの頻度の決定
二倍体の個体が２以上の遺伝子座においてヘテロ接合性である場合、ハプロタイプの配偶子相は判らない。家族の家系情報を用いて、配偶子相を推定することができる場合もある（Ｐｅｒｌｉｎら， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ５５：７７７−７８７， １９９４；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。家系情報が入手できない場合は、別の戦略を用いればよい。１つの可能性として、ヘテロ接合体および単一部位ヘテロ接合型個体だけを残しつつ多部位へテロ接合型二倍体を分析から除くことができるが、この方法では、サンプル組成にバイアスがかかってしまう可能性や、低頻度のハプロタイプが過小評価される可能性がある。もう１つの可能性は、単一染色体を、例えば非対称ＰＣＲ増幅により（Ｎｅｗｔｏｎら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １７：２５０３−２５１６， １９８９；Ｗｕら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：２７５７， １９８９を参照；これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）、または限界希釈法により単一染色体を単離した後でＰＣＲ増幅を行うことにより（Ｒｕａｎｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６２９６−６３００， １９９０を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）独立して調べることができることである。更に、サンプルは、特定の対立遺伝子の二重ＰＣＲ増幅により、十分に近接している二対立遺伝子マーカーについてハプロタイプ判定できる（Ｓａｒｋａｒ， Ｇ．およびＳｏｍｍｅｒ Ｓ．Ｓ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９１，；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。これらのアプローチは、技術面での複雑性、それらに伴う追加コスト、大規模に汎用化できないこと、またはそれらによりかかる可能性あるバイアス、のいずれかの理由から、完全に満足できるものではない。これらの難点を克服するために、Ｃｌａｒｋ Ａ．Ｇ．により導入された、ＰＣＲ増幅したＤＮＡの遺伝子型の相を推定するためのアルゴリズム（Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．， ７：１１１−１２２， １９９０；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）を使用できる。簡単に説明すると、その原理は、疑わしくない個体（すなわち完全なヘテロ接合体および単一部位へテロ接合体）を調べることにより、サンプル中に存在するハプロタイプの予備的なリストを埋めることである。次に、同一サンプル中の他の個体を、既に確認済みのハプロタイプの存在の可能性についてスクリーニングする。全ての個体についての相情報が解明されるか、または解明されないことが確認できるまで、陽性であると特定される度に補完的なハプロタイプを確認済みのハプロタイプのリストに加えてゆく。この方法では、単一のハプロタイプを各多重へテロ接合型個体に割り当てる。一方、２以上のヘテロ接合部位が存在する場合は、数種のハプロタイプが可能である。あるいはまた、ハプロタイプを各個体に割り当てずに、集団中でのハプロタイプの頻度を推定する方法を用いることもできる。好ましくは、ハーディ−ワインバーグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）比率（無作為交配）の推定下での��プロタイプ頻度の最尤推定値を導く、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズム（Ｄｅｒｍｐｓｔｅｒら， Ｊ． Ｒ． Ｓｔａｔ． Ｓｏｃ．， ３９Ｂ：１−３８， １９７７；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）に基づく方法を用いる（Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ Ｌ．およびＳｌａｔｋｉｎ Ｍ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．， １２（５）：９２１−９２７， １９９５を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。ＥＭアルゴリズムは、データが不明確かつ／または不完全である場合に有用な、汎用化された反復最尤推定方法である。ＥＭアルゴリズムを用いて、ヘテロ接合体をハプロタイプへと分解する。ハプロタイプ推定については、「統計的方法」と題して更に詳細に後述する。また、集団中でハプロタイプ頻度を決定または推定するための当業界で公知である任意の他の方法を使用することもできる。
【０２０７】
２）連鎖不平衡解析
連鎖不平衡は、２以上の遺伝子座における対立遺伝子の非偶発的な関連であり、疾患形質に関与する遺伝子のマッピングの強力な手段となる（Ａｊｉｏｋａ Ｒ．Ｓ．ら， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ６０：１４３９−１４４７， １９９７を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。二対立遺伝子マーカーは、ヒトゲノムに高密度に配置されており、他のタイプの遺伝子マーカー（例えばＲＦＬＰまたはＶＮＴＲマーカー）よりも多数が遺伝子型判定できるので、連鎖不平衡に基づく遺伝子解析において特に有用である。本発明の二対立遺伝子マーカーは、当業界で公知であるいずれの連鎖不平衡解析でも使用できる。
【０２０８】
簡単に説明すると、まず、疾患性突然変異が（新規な突然変異または突然変異キャリヤの移入により）集団に導入されると、それは必然的に単一の染色体上、すなわち連結されたマーカーの単一の「素性（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）」または「祖先（ａｎｃｅｓｔｒａｌ）」ハプロタイプ上に存在する。その結果、これらのマーカーとその疾患性突然変異との間に完全な不平衡が生じ、その疾患性突然変異は特定のマーカー対立遺伝子セットの存在下でのみ見られる。それ以降の世代を通じて、その疾患性突然変異とこれらのマーカー多型との間で組換えが起こり、不平衡は徐々に消失する。この消失の速度は組換え頻度の関数であるので、疾患遺伝子に最も近接しているマーカーは、それより遠位にあるマーカーよりも高レベルの不平衡を示す。組換えによりバラバラになってしまっていない場合は、「祖先」ハプロタイプおよび異なる遺伝子座にあるマーカー対立遺伝子間の連鎖不平衡が、家系によってだけでなく、個体数によっても追跡できる。連鎖不平衡は、通常、１つの遺伝子座にあるある特定の対立遺伝子と第２の遺伝子座にある別の特定の対立遺伝子との関連として見られる。
【０２０９】
疾患とマーカー遺伝子座との間の不平衡のパターンまたは曲線から、疾患遺伝子座で最大を示すと予期される。したがって、疾患対立遺伝子とより近接して連結されている遺伝子マーカーとの間の連鎖不平衡の量から、疾患遺伝子の位置に関する有用な情報が得られる可能性がある。疾患遺伝子座の大縮尺のマッピングでは、研究対象領域内でマーカー間に存在する連鎖不平衡のパターンについてある程度の知識を持っていることが有用である。上記で述べたように、連鎖不平衡の解析により達成されるマッピングの解像度は、連鎖研究の場合よりもずっと高い。連鎖不平衡解析と組み合わせた高密度の二対立遺伝子マーカーは、大縮尺のマッピングの強力な手段となる。連鎖不平衡を算出するための各種の方法は、「統計的方法」と題して後述する。
【０２１０】
３）形質−マーカー関連についての集団に基づく症例−対照研究
上記で述べたように、同一染色体上の異なる遺伝子座における特定の対立遺伝子のペアの出現はランダムではなく、ランダムからの偏差が連鎖不平衡と呼ばれる。関連研究は、集団頻度に注目し、連鎖不平衡の現象に基づいている。所与の遺伝子における特定の対立遺伝子が特定の形質を引き起こすのに直接関与している場合、その頻度は、罹患している（形質陽性の）集団では、形質陰性の集団または無作為な対照集団における頻度と比較して統計的に高まる。連鎖不平衡が存在するために、形質誘発対立遺伝子を保有するハプロタイプに存在する全ての他の対立遺伝子の頻度もまた、形質陽性の個体では、形質陰性の個体または無作為な対照と比較して高まるであろう。したがって、形質と、形質誘発対立遺伝子と連鎖不平衡な状態にある任意の対立遺伝子（特に二対立遺伝子マーカー遺伝子座）とが関連するということは、その特定の領域に形質関連遺伝子が存在することを十分に示唆する。症例−対照集団を二対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定して、形質誘発対立遺伝子の位置を厳密に特定する関連を特定することができる。ある形質と関連する１つの所与のマーカーと連鎖不平衡な状態にある任意のマーカーは、その形質と関連しているといえる。連鎖不平衡により、形質誘発対立遺伝子を見つけ出すために全ての可能性のある機能性多型をスクリーニングすることの別法として、限定数の遺伝子多型（特に二対立遺伝子マーカー）の症例−対照集団における相対頻度が分析可能になる。関連研究は、非血縁症例−対照集団におけるマーカー対立遺伝子の頻度同士を比較するものであり、複合的な形質の解明の強力な手段となる。
【０２１１】
症例−対照集団（適応基準）
集団に基づく関連研究は、家族性の遺伝に関するものではなく、症例−対照集団中で特定の遺伝子マーカーまたは１セットのマーカーの保有率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を比較するものである。それは、非血縁症例（罹患または形質陽性）の個体と非血縁対照（非罹患、形質陰性、または無作為）の個体との比較に基づく症例−対照研究である。好ましくは、対照群は、罹患していない、または形質陰性の個体から構成される。更に、対照群は、症例集団と人種が一致しているものとする。更に、対照群は、好ましくは、研究対象の形質についての主な既知の錯乱因子が症例集団と一致しているものとする（例えば、年齢依存性の形質の場合には年齢の一致）。理想的には、これら２種のサンプル中の個体は、相違点が疾患状態だけであると考えられるくらいに一致している。以下において、「形質陽性集団」、「症例集団」および「罹患集団」は相互交換可能に用いられる。
【０２１２】
関連研究を用いた複合的な形質の解明における重要な段階は、症例−対照集団の選択である（ＬａｎｄｅｒおよびＳｃｈｏｒｋ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６５， ２０３７−２０４８， １９９４を参照；この開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。症例−対照集団の選択の重要な段階は、所与の形質または表現型の臨床的定義である。形質陽性および形質陰性の表現型群に含める個体を注意深く選択すれば、本明細書で提案される関連法により任意の遺伝形質が分析できる。次の４つの基準が有用である場合が多い：臨床的表現型、発症年齢、家族歴、および重篤度。連続形質または量形質（例えば血圧など）の選択手順は、重複していない表現型を有するこれらの形質陽性集団および形質陰性集団の個体が組み入れられるように、研究対象の形質の表現型分布が正反対の個体を選択することを含む。好ましくは、症例−対照集団は、表現型が均一な集団から構成される。形質陽性集団および形質陰性集団は、それぞれ研究対象の総人数の１〜９８％、好ましくは１〜８０％、更に好ましくは１〜５０％、更に好ましくは１〜３０％、最も好ましくは１〜２０％に該当する、均一な表現型を有する個体の集団から構成され、重複しない表現型を示す個体間で選択される。２種の形質の表現型の相違が明確であるほど、二対立遺伝子マーカーとの関連を検出できる可能性は高い。非常に異なるが比較的均一な表現型を有する個体を選択すれば、関連研究における効率的な比較が可能となり、また、研究対象の集団のサンプルの大きさが十分であれば、遺伝子レベルでの際立った相違を検出することが可能である。
【０２１３】
好ましい実施形態において、５０〜３００、好ましくは約１００の形質陽性個体からなる第１の群を表現型に従って募集する。ほぼ同数の形質陰性個体をその研究に組み入れる。
【０２１４】
関連解析
候補遺伝子を保有する領域から誘導される二対立遺伝子マーカーを用いて関連研究を実施するための一般的な戦略は、２つの個体群（症例−対照集団）をスキャンして、両群における本発明の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子頻度を決定し統計的に比較することである。
【０２１５】
少なくとも１以上の分析された二対立遺伝子マーカーについて、ある形質との統計的に有意な関連が確定された場合は、次のように推定できる：関連する対立遺伝子は、形質の誘発に直接関与する（関連する対立遺伝子は形質誘発対立遺伝子である）か、あるいはより一層可能性が高いこととして、関連する対立遺伝子は形質誘発対立遺伝子と連鎖不平衡にある。通常、関連する対立遺伝子の、候補遺伝子の機能に関する特定の特性は、関連する対立遺伝子と形質との関係（偶発的であるのか、連鎖不平衡にあるのか）についての更に深い見識をもたらす。証拠から、候補遺伝子内の関連する対立遺伝子が形質誘発対立遺伝子である可能性は最も低いが真の形質誘発対立遺伝子と連鎖不平衡にあることが示された場合は、その形質誘発対立遺伝子は、関連するマーカーの近傍をシークエンシングすることにより見つけることができる。
【０２１６】
関連研究は通常、２段階の連続ステップで実施する。第１段階では、１種または数種の候補遺伝子からの少数の二対立遺伝子マーカーの頻度を、形質陽性集団および形質陰性集団中で測定する。解析の第２段階では、候補遺伝子の正体および所与の形質に関与する遺伝子座の位置を、関連領域からのより高密度のマーカーを用いて精密化する。しかし、本発明で解析される候補遺伝子の多くがそうであるように、研究対象の候補遺伝子の長さが比較的短い場合には、有意な関連を確立するのに１段階で十分な場合もある。
【０２１７】
ハプロタイプ解析
上記のように、突然変異または移入により、集団中で疾患対立遺伝子を保有する染色体が最初に現れる場合は、突然変異型対立遺伝子は、必然的に連結させた１セットのマーカーを有する染色体（祖先ハプロタイプ）上に存在する。このハプロタイプは集団全体にわたって追跡でき、所与の形質とのその統計的関連が分析できる。１点（対立遺伝子）関連研究を複数点関連研究で補完すること（これもまたハプロタイプ研究と呼ぶ）により、関連研究の統計的検出力は増大する。こうして、ハプロタイプの関連研究により、祖先キャリヤハプロタイプの頻度およびタイプを明らかにすることができる。ハプロタイプ解析は、個々のマーカーを含む解析の統計的検出力を増大させるという点で重要である。
【０２１８】
ハプロタイプ頻度解析の第１段階では、本発明の同定済みの二対立遺伝子マーカーの種々の組合せに基づいて可能性のあるハプロタイプの頻度を求める。次に、このハプロタイプ頻度を、別の形質陽性個体および対照個体の集団と比較する。統計的に有意な結果を得るためにこの分析に供するべき形質陽性個体の数は通常、３０〜３００の範囲であり、好ましい個体の数は５０〜１５０である。同じことは、本研究で用いられる罹患していない個体（つまり無作為な対照）の数にも当てはまる。この第１の解析の結果から、症例−対照集団におけるハプロタイプ頻度が得られ、評価されたハプロタイプ頻度それぞれについて、ｐ値およびオッズ比を算出する。統計的に有意な関連が見い出されたら、所与のハプロタイプを保有する個体が研究対象の形質に罹患する相対危険度を推定することができる。
【０２１９】
相互作用解析
本発明の二対立遺伝子マーカーはまた、多因子性相互作用により生じる検出可能な形質と関連する二対立遺伝子マーカーのパターンを同定するのにも使用できる。連結されていない遺伝子座にある対立遺伝子間での遺伝的相互作用の解析には、本明細書に記載されている技法を用いた個々の遺伝子型判定が必要である。適切なレベルの統計的有意性を有する選択した１セットの二対立遺伝子マーカーの間での対立遺伝子相互作用の解析は、ハプロタイプ解析であると考えることができる。相互作用の解析は、症例−対照集団を第１の遺伝子座の所与のハプロタイプについて分類し、各サブ集団を用いて第２の遺伝子座についてハプロタイプ解析を行うことに基づく。
【０２２０】
関連研究で用いる統計的方法は、ＩＶ．Ｃ．で更に詳細に後述する。
【０２２１】
４）関連の存在下での連鎖についての試験
本発明の二対立遺伝子マーカーは、更に、ＴＤＴ（伝達／不平衡試験）において使用できる。ＴＤＴは、連鎖および関連の両方について試験するものであり、集団の構成に影響を受けない。ＴＤＴでは、罹患個体と、それらの親に関するデータまたは親からのデータの代わりに非罹患血縁者からのデータとが必要である（Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｓ．ら， Ａｍ． Ｊ． Ｇｅｎｅｔ．， ５２：５０６−５１６， １９９３；Ｓｃｈａｉｄ Ｄ．Ｊ．ら， Ｇｅｎｅｔ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．， １３：４２３−４５０， １９９６；Ｓｐｉｅｌｍａｎｎ Ｓ．およびＥｗｅｎｓ Ｗ．Ｊ．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ６２：４５０−４５８， １９９８を参照；これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる）。このような組合せ試験では一般に、別々に解析したときに生じる偽陽性のエラーが低減する。
【０２２２】
ＩＶ．Ｃ．　統計的手法
一般的には、形質と遺伝子型とが統計的に有意な相関を示すかを試験するための当技術分野で公知の任意の方法を使用することが可能である。
【０２２３】
１）　連鎖解析の方法
連鎖解析に有用な統計的手法およびコンピュータープログラムは、当業者に周知である（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ Ｊ． Ｄ． および Ｏｔｔ Ｊ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ， Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９９４； Ｏｔｔ Ｊ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ， Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， １９９１を参照されたい。それらの開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。）。
【０２２４】
２）　集団におけるハプロタイプ頻度の推定方法
上述したように、遺伝子型を評価する場合、ヘテロ接合体を識別できないことが多いため、ハプロタイプ頻度を簡単には推測することができない。配偶子相が分からない場合、多座の遺伝子型データからハプロタイプ頻度を推定することができる。当業者に公知の任意の方法を用いてハプロタイプ頻度を推定することができる（Ｌａｎｇｅ Ｋ．， Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９７； Ｗｅｉｒ， Ｂ． Ｓ． ， Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＩＩ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．， Ｉｎｃ．， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ， ＵＳＡ， １９９６を参照されたい。これらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。）。好ましくは、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを用いて最尤ハプロタイプ頻度を計算する（Ｄｅｍｐｓｔｅｒら， Ｊ． Ｒ． Ｓｔａｔ． Ｓｏｃ． ， ３９Ｂ ： １−３８， １９７７； Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ Ｌ． および Ｓｌａｔｋｉｎ Ｍ． ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ， １２（５）： ９２１−９２７，１９９５を参照されたい。これらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。）。この手順は、配偶子相が分からないときに多座の遺伝子型データからハプロタイプ頻度の最尤推定値を得ることを目的とした反復プロセスである。ハプロタイプ推定は、通常、ＥＭ−ＨＡＰＬＯプログラム（Ｈａｗｌｅｙ Ｍ．Ｅ． ら， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ａｎｔｈｒｏｐｏｌ．， １８：１０４， １９９４。この開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。）またはＡｒｌｅｑｕｉｎプログラム（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ら， Ａｒｌｅｑｕｉｎ ： 集団遺伝学データ解析用のソフトウェア（ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ）， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ， １９９７。この開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。）など用いてＥＭアルゴリズムを適用することにより行われる。ＥＭアルゴリズムは、推定値を得るための一般化された反復最尤法である。これについて以下で簡単に説明する。
【０２２５】
以下の説明では、表現型は、未知のハプロタイプ相を示す多座位の遺伝子型について言うものとする。遺伝子型は、既知のハプロタイプ相を示す多座位の遺伝子型について言うものとする。
【０２２６】
Ｋ種類のマーカーに対してタイプ付けされた血縁関係のないＮ個の個体のサンプルを仮定する。観測するデータは、Ｆ種類の異なる表現型に分類される可能性のある未知相のＫ個の座位についての表現型である。Ｈ種類の可能なハプロタイプがあると仮定する（Ｋ種類の二対立遺伝子マーカーの場合、可能なハプロタイプの最大数はＨ＝２Ｋである）。
【０２２７】
ｃｊ種類の可能な遺伝子型があり得る表現型ｊの場合、次式が得られる：
2004504037.tif 000003
式中、Ｐｊは、ｊ番目の表現型の確率であり、Ｐ（ｈｋ，ｈｌ）は、ハプロタイプｈｋおよびｈｌから構成されたｉ番目の遺伝子型の確率である。任意交配（すなわち、ハーディ・ワインベルク平衡）のもとでは、Ｐ（ｈｋ，ｈｌ）は次のように表される：
Ｐ（ｈｋ，ｈｌ） ＝ Ｐ（ｈｋ）２ 　 ｈｋ ＝ ｈｌの場合
Ｐ（ｈｋ，ｈｌ） ＝ ２Ｐ（ｈｋ）Ｐ（ｈｌ） 　 ｈｋ ≠ ｈｌの場合　　 式２
Ｅ−Ｍアルゴリズムは次のステップから構成される。最初に、ハプロタイプ頻度の初期値のセットから遺伝子型頻度を推定する。これらのハプロタイプ頻度をＰ１（０）、Ｐ２（０）、Ｐ３（０）、．．．．．．ＰＨ（０）と記す。ハプロタイプ頻度の初期値は、乱数発生器からまたは当技術分野で周知のなにか他の方法により、得ることができる。このステップは「予測ステップ」と呼ばれる。この方法の次のステップは「最大化ステップ」と呼ばれ、遺伝子型頻度の推定値を用いてハプロタイプ頻度を再計算することからなる。１回目の反復計算によるハプロタイプ頻度の推定値をＰ１（１）、Ｐ２（１）、Ｐ３（１）、．．．．．．ＰＨ（１）と記す。一般的には、ｓ回目の反復時の予測ステップは、前回の反復時のハプロタイプ頻度に基づいて各表現型がさまざまな可能な遺伝子型に割り当てられる確率を計算することからなる：
2004504037.tif 000004
式中、ｎｊは、ｊ番目の表現型を示す個体の数であり、Ｐｊ（ｈｋ，ｈｌ）（ｓ）は、表現型ｊに含まれる遺伝子型ｈｋ，ｈｌの確率である。遺伝子カウント法（Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ２１：２５４−２７６， １９５７）に相当する最大化ステップでは、遺伝子型の推定値に基づいてハプロタイプ頻度を再推定する：
2004504037.tif 000005
式中、δｉｔは、ｉ番目の遺伝子型にハプロタイプｔが含まれるという事象の発生数を示す指標変数であり、０、１、または２の値をとる。
【０２２８】
次の判定基準に達したときにＥ−Ｍ反復は停止する。最尤推定（ＭＬＥ）理論を用いて、表現型ｊが多項分布すると仮定する。各反復ｓにおいて、尤度関数Ｌを計算することができる。２つの連続する反復間の対数尤度の差が、ある小さい数、好ましくは１０−７よりも小さいとき、収束に達している。
【０２２９】
３）　マーカー間の連鎖不平衡の計算方法
いくつかの方法を用いて任意の２つの遺伝的位置間の連鎖不平衡を計算することができる。実際には、集団から取得したハプロタイプデータに統計的関連試験を適用して連鎖不平衡を求める。
【０２３０】
マーカーＭｉに対立遺伝子（ａｉ／ｂｉ）を有しマーカーＭｊに対立遺伝子（ａｊ／ｂｊ）を有する本発明に係る二対立遺伝子マーカーのうちの少なくとも１つを含む二対立遺伝子マーカーの任意のペア（Ｍｉ，Ｍｊ）間の連鎖不平衡を、ピアッツァ（Ｐｉａｚｚａ）の式： Δａｉａｊ＝√θ４−√（θ４＋θ３）（θ４＋θ２）により、すべての対立遺伝子の組み合わせ（ａｉ，ａｊ、ａｉ，ｂｊ、ｂｉ，ａｊおよびｂｉ，ｂｊ）について計算することができる。式中、変数は次のとおりである：
θ４ ＝ −− ＝ Ｍｉに対立遺伝子ａｉをもたずＭｊに対立遺伝子ａｊをもたない遺伝子型の頻度
θ３ ＝ −＋ ＝ Ｍｉに対立遺伝子ａｉをもたずＭｊに対立遺伝子ａｊをもつ遺伝子型の頻度
θ２ ＝ ＋− ＝ Ｍｉに対立遺伝子ａｉをもちＭｊに対立遺伝子ａｊをもつ遺伝子型の頻度
【０２３１】
Ｗｅｉｒ（Ｗｅｉｒ Ｂ．Ｓ．， 「遺伝データ解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」 Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓ． Ｅｄｓ， １９９６。その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載されているようなδ（複合遺伝子型不平衡係数）に対する最尤推定（ＭＬＥ）に基づいて、すべての対立遺伝子の組み合わせ（ａｉ，ａｊ、ａｉ，ｂｊ、ｂｉ，ａｊおよびｂｉ，ｂｊ）について二対立遺伝子マーカーペア（Ｍｉ，Ｍｊ）間の連鎖不平衡（ＬＤ）を計算することもできる。複合連鎖不平衡に対するＭＬＥは次のとおりである：
Ｄａｉａｊ＝（２ｎ１ ＋ ｎ２ ＋ ｎ３ ＋ ｎ４／２）／Ｎ − ２（ｐｒ（ａｉ）．ｐｒ（ａｊ））
式中、ｎ１＝Σ表現型（ａｉ／ａｉ，ａｊ／ａｊ）、ｎ２＝Σ表現型（ａｉ／ａｉ，ａｊ／ｂｊ）、ｎ３＝Σ表現型（ａｉ／ｂｉ，ａｊ／ａｊ）、ｎ４＝Σ表現型（ａｉ／ｂｉ，ａｊ／ｂｊ）、およびＮはサンプル中の個体の数である。ハプロタイプデータがなく遺伝子型データしか利用できない場合でも、この式により対立遺伝子間の連鎖不平衡を推定することができる。
【０２３２】
マーカー間の連鎖不平衡を計算する他の手段は次のとおりである。ハーディ・ワインベルク平衡を満たす一対の二対立遺伝子マーカーＭｉ（ａｉ／ｂｉ）およびＭｊ（ａｊ／ｂｊ）について、上述した方法に従って所与の集団における４つの可能なハプロタイプ頻度を推定することができる。ａｉとａｊとの間の配偶子不平衡の推定は単純である：
Ｄａｉａｊ＝ ｐｒ（ハプロタイプ（ａｉ，ａｊ）） − ｐｒ（ａｉ）．ｐｒ（ａｊ）
式中、ｐｒ（ａｉ）は対立遺伝子ａｉの確率であり、ｐｒ（ａｊ）は対立遺伝子ａｊの確率である。また、ｐｒ（ハプロタイプ（ａｉ，ａｊ））は、先の式３と同様にして算出される。一対の二対立遺伝子マーカーでは、ＭｉとＭｊとの間の関連を記述するのに必要な不平衡尺度は１つだけである。
【０２３３】
次に、上記の値の標準化値を次のように計算する：
Ｄ’ａｉａｊ ＝ Ｄａｉａｊ ／ ｍａｘ（−ｐｒ（ａｉ）．ｐｒ（ａｊ），−ｐｒ（ｂｉ）．ｐｒ（ｂｊ））　Ｄａｉａｊ＜０の場合
Ｄ’ａｉａｊ ＝ Ｄａｉａｊ ／ ｍａｘ（ｐｒ（ｂｉ）．ｐｒ（ａｊ），ｐｒ（ａｉ）．ｐｒ（ｂｊ））　Ｄａｉａｊ＞０の場合
【０２３４】
過度の実験を行うことなく他のＬＤ計算法を使用しうることは当業者であれば容易に理解されよう。
【０２３５】
十分なヘテロ接合率を有する１セットの二対立遺伝子マーカー間の連鎖不平衡は、５０〜１０００の血縁関係のない個体、好ましくは７５〜２００、より好ましくは１００前後の血縁関係のない個体の遺伝子型を判定することにより求めることができる。
【０２３６】
４）　関連試験
表現型と遺伝子型（ここでは、二対立遺伝子マーカーにおける対立遺伝子またはそのような対立遺伝子から構成されたハプロタイプ）との相関の統計学的有意性を決定する方法は、当技術分野で公知の任意の統計学的試験により決定すればよく、この場合、統計的有意性に対するなんらかの許容される閾値が必要である。個々の具体的な方法および有意性の閾値の適用は、当業者の技術範囲内である。
【０２３７】
症例集団および対照集団において、二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の頻度を決定し、これらの頻度を統計学的試験と比較して、研究対象の形質と二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子との相関を示唆する頻度における統計学的有意差があるかどうかを判定することにより、関連試験を行う。同様に、症例集団および対照集団において、二対立遺伝子マーカーの所与の集合について可能なすべてのハプロタイプの頻度を推定し、この頻度を統計学的試験と比較し、研究対象のハプロタイプと表現型（形質）との間に統計学的に有意な相関があるかどうかを判定することにより、ハプロタイプ解析を行う。遺伝子型と表現型との間に統計学的に有意な関連があるかを調べるのに有用な任意の統計学的ツールを使用することが可能である。好ましくは、利用する統計学的試験は自由度１のカイ二乗検定である。ｐ値を計算する（ｐ値は、観察値と同程度またはそれ以上の統計値が偶然に生じる確率である）。
【０２３８】
統計学的有意性
好ましい実施形態では、さらなる診断試験のための明確な基準としてまたは早期の予防的治療のための予備的な出発段階としての診断目的で有意性を調べる場合、二対立遺伝子マーカーの関連に関するｐ値は、単一の二対立遺伝子マーカーによる解析では、好ましくは約１×１０−２以下、より好ましくは約１×１０−４以下であり、いくつかのマーカーを利用するハプロタイプ解析では、約１×１０−３以下、さらに好ましくは１×１０−６以下、最も好ましくは約１×１０−８以下である。これらの値は、単一のマーカーまたは複数のマーカーの組み合わせを利用する任意の関連研究に適用できると考えられる。
【０２３９】
当業者であれば、上記の値の範囲を出発点として使用し、本発明の二対立遺伝子マーカーを用いた関連研究を行うことができる。そうすることにより、本発明の二対立遺伝子マーカーと疾患との間の有意な関連を明らかにすることができる。
【０２４０】
表現型の並べ替え
上述した第１段階のハプロタイプ解析の統計的有意性を確認するために、症例個体−対照個体から得た遺伝子型判定データをプールし、形質表現型に関してランダム化して、さらなる解析を行うとよい場合がある。個々の遺伝子型判定データを２つのグループにランダムに割り当てる。このとき、第１段階で得られたデータを作成するために用いた症例−対照集団と同数の個体がこれらのグループに含まれるようにする。好ましくは、第２段階のハプロタイプ解析は、これらの人工的グループを対象として、好ましくは第１段階の解析において最大の相対危険度係数を呈したハプロタイプに含まれていたマーカーについて行う。この実験を少なくとも１００〜１００００回繰り返す。こうした反復を繰り返すことにより、有意なｐ値レベルを有する、得られたハプロタイプの割合を決定することができる。
【０２４１】
統計的関連の評価
偽陽性の問題に対処するために、同一の症例−対照集団を用いてランダムなゲノム領域で同様の解析を行ってもよい。「検出可能な形質に関連づけられる遺伝子を保有するゲノム領域を同定するための方法、ソフトウェアおよび装置 （Ｍｅｔｈｏｄｓ， ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｉ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ａ ｇｅｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｔｒａｉｔ）」という名称の米国仮特許出願の記載に従って、ランダム領域の結果と候補領域の結果とを比較する。
【０２４２】
５）　危険因子の評価
危険因子（遺伝疫学では、危険因子とは、マーカー座位における特定の対立遺伝子またはハプロタイプの有無である）と疾患との間の関連は、オッズ比（ＯＲ）および相対危険度（ＲＲ）により求められる。Ｐ（Ｒ＋）がＲをもつ個体で疾患の発症する確率であり、Ｐ（Ｒ−）が危険因子をもたない個体で発症する確率である場合、相対危険度は単に２つの確率の比率にすぎない。すなわち、ＲＲ ＝ Ｐ（Ｒ＋）／Ｐ（Ｒ−）。
【０２４３】
症例−対照研究では、サンプリングデザインが原因で相対危険度の直接的な測定値を得ることができない。しかしながら、発生率の低い疾患の場合、相対危険度の良好な近似値をオッズ比から得ることができる。オッズ比は次のように計算できる：
2004504037.tif 000006
Ｆ＋は、症例群において危険因子に暴露されている頻度であり、Ｆ−は、対照群において危険因子に暴露されている頻度である。Ｆ＋およびＦ−は、研究対象の対立遺伝子またはハプロタイプの頻度を用いて計算され、さらに基礎となる遺伝モデル（優性、劣性、相加性など）に依存する。
【０２４４】
所与の危険因子に基づく形質を呈する集団中の個体の割合を示す寄与危険度（ＡＲ）をさらに推定することができる。この尺度は、病因学において特定因子の役割を定量化するうえでおよび危険因子の公衆衛生上の影響力という点で重要である。この尺度の公衆衛生上の利用性は、対象となる曝露がなければ防止しうる集団中の疾患症例の割合を推定することである。ＡＲは次のように求められる：
ＡＲ ＝ ＰＥ（ＲＲ−１）／（ＰＥ（ＲＲ−１）＋１）
ＡＲは、二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子または二対立遺伝子マーカーのハプロタイプに起因する危険度である。ＰＥは、集団全体内での対立遺伝子またはハプロタイプに暴露されている頻度であり、ＲＲは、研究対象の形質の発生率が集団全体で比較的低いときにオッズ比で近似される相対危険度である。
【０２４５】
ＩＶ．Ｆ．　本発明の二対立遺伝子マーカーと連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーの同定
対象のゲノム領域で第１の二対立遺伝子マーカーを同定した後、当業者であれば、本発明の教示を用いて、この第１のマーカーと連鎖不平衡状態にある別の二対立遺伝子マーカーを容易に同定することができる。上述したように、ある形質に関連した第１のマーカーと連鎖不平衡状態にあるマーカーはいずれも、その形質に関連づけられる。したがって、所与の二対立遺伝子マーカーと形質との間の関連が実証された後は、この特定領域の二対立遺伝子マーカーの密度を増加させるために、この形質に関連した別の二対立遺伝子マーカーを見いだすことが大きな関心事となる。形質との最大の相関を示す１種のマーカーまたは複数種のマーカーのセットの近傍に、原因となる遺伝子または突然変異が見いだされるであろう。
【０２４６】
所与のマーカーと連鎖不平衡状態にある別のマーカーの同定には、（ａ）複数の個体から得られた第１の二対立遺伝子マーカーを含むゲノム断片を増幅することと、（ｂ）該第１の二対立遺伝子マーカーを保有するゲノム領域で第２の二対立遺伝子マーカーを同定することと、（ｃ）該第１の二対立遺伝子マーカーと第２の二対立遺伝子マーカーとの間の連鎖不平衡解析を行うことと、（ｄ）該第１のマーカーと連鎖不平衡状態にある該第２の二対立遺伝子マーカーを選択することとが含まれる。ステップ（ｂ）および（ｃ）を含む部分組み合わせステップも考えられる。
【０２４７】
本明細書には二対立遺伝子マーカーの同定および連鎖不平衡解析を行う方法が記載されており、当業者であれば過度の実験を行うことなくこれらの方法を実施することができる。したがって、本発明はまた、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーのいずれかと連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子であって、それらのそれぞれが所与の形質と関連するという点で同様の特性を呈すると予想される二対立遺伝子マーカーに関する。
【０２４８】
実施例５は、アルツハイマー病関連ＡｐｏＥ遺伝子内に位置する公知の二対立遺伝子マーカー「ＡｐｏＥ部位Ａ」と、ＡｐｏＥ遺伝子を含有するゲノム領域からランダムに得られた他の二対立遺伝子マーカーとの間の連鎖不平衡の計算結果を示している。
【０２４９】
ＩＶ．Ｇ．　機能的突然変異の同定
本発明の二対立遺伝子マーカーを用いて正の関連を確認した後、所定数の形質陽性の個体と形質陰性の個体の配列を比較することにより、関連候補遺伝子配列について突然変異を調べることができる。好ましい実施形態では、候補遺伝子のエキソンおよびスプライス部位、プロモーターおよび他の調節領域などの機能性領域について突然変異を調べる。好ましくは、形質陽性個体は、形質と関連することが実証されたハプロタイプをもち、形質陰性個体は、形質と関連するハプロタイプまたは対立遺伝子をもたない。この突然変異検出方法は、二対立遺伝子部位の同定に使用したものと本質的には同じである。
【０２５０】
そのような突然変異の検出に用いられる方法には、通常、（ａ）形質陽性患者および形質陰性対照のＤＮＡサンプルから、形質に関連する１種または１群の二対立遺伝子マーカーを含む候補遺伝子領域を増幅するステップと、（ｂ）増幅された領域の配列を決定するステップと、（ｃ）形質陽性患者由来のＤＮＡ配列と形質陰性対照由来のＤＮＡ配列とを比較するステップと、（ｄ）形質陽性患者に特異的な突然変異を決定するステップとが含まれる。ステップ（ｂ）および（ｃ）を含む部分組み合わせステップが特に考えられる。
【０２５１】
次に、任意の遺伝子型判定手順、たとえば、本明細書に記載の手順を用いて、好ましくは、個々の試験形式においてマイクロシークエンシングを用いて、より大きな症例集団および対照集団をスクリーニングすることにより、候補多型を検証することが好ましい。多型が、期待される関連の結果に匹敵する頻度で症例および対照に存在した場合に、その多型は候補突然変異であるとみなされる。
【０２５２】
Ｖ．　疾患の診断、予防および治療における本発明の二対立遺伝子マーカー
遺伝的診断法における本発明の二対立遺伝子マーカー：
本発明の二対立遺伝子マーカーを用いれば、特定の遺伝子型の結果として検出可能な形質を発現している個体、または遺伝子型が原因で検出可能な形質を後になっ発現する危険性のある個体を同定することのできる診断試験を開発することが可能である。本診断法を用いて解析される形質とは、疾患、疾患に作用する薬剤に対する応答、または疾患に作用する薬剤に対する副作用を含めて、いかなる検出可能な形質であってもよい。
【０２５３】
本発明に係る診断法においては、さまざまな方法を利用して、たとえば、家系研究、単一精子ＤＮＡ解析または体細胞ハイブリッドのように個体の染色体を解析してハプロタイプを決定することのできる方法を利用して、検出可能な形質を発現する危険性の増大に関連した二対立遺伝子マーカーパターンを被験体が有しているかどうか、または特定の突然変異の結果として検出可能な形質を個体呈しているかどうかを判定することが可能である。
【０２５４】
本発明は、本発明の候補遺伝子における突然変異または多型に起因した疾患の発症する危険性を個体が有しているかどうかまたはそのような疾患に罹患しているかどうかを判定する診断方法を提供する。本発明はまた、疾患に作用する薬剤に対して個体が陽性に応答する可能性があるかどうかまたは疾患に作用する薬剤に対して個体が有害な副作用を生じる危険性があるかどうかを判定する方法を提供する。
【０２５５】
これらの方法では、個体から核酸サンプルを採取して、特定の候補遺伝子の多型もしくは突然変異（形質誘発対立遺伝子）を有する結果として形質を発現する危険性があることを示すかまたは個体が形質を発現していることを示す少なくとも１種の対立遺伝子または少なくとも１種の二対立遺伝子マーカーのハプロタイプがその核酸サンプルに含まれているかどうかを判定する。
【０２５６】
好ましくは、そのような診断方法では、個体から核酸サンプルを採取し、先にＩＩＩで述べた方法を用いてこのサンプルの遺伝子型を判定する。この診断は単一の二対立遺伝子マーカーに基づくものであってもよいし１群の二対立遺伝子マーカーに基づくものであってもよい。
【０２５７】
これらの方法のいずれにおいても、被験体から核酸サンプルを採取し、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１のうちの１種以上の二対立遺伝子マーカーの二対立遺伝子マーカーパターンを決定する。
【０２５８】
１実施形態では、検出可能な表現型に関連する多型が同定された領域を増幅するように核酸サンプルのＰＣＲ増幅を行う。増幅産物の配列を決定し、検出可能な表現型に関連する１種以上の多型をその個体が所有しているかどうかを判定する。増幅産物の生成に使用するプライマーには、配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３のプライマーが含まれうる。他の選択肢では、上述したように核酸サンプルをマイクロシークエンシング反応に付し、候補遺伝子の突然変異または多型により生じる検出可能な表現型に関連した１種以上の多型を個体が有しているかどうかを判定する。他の実施形態では、検出可能な表現型に関連する候補遺伝子対立遺伝子の１種以上に特異的にハイブリダイズする１種以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブに、核酸サンプルを接触させる。
【０２５９】
特定の状況では、これらの診断法を用いて予防的治療を開始したり重要なハプロタイプをもつ個体で軽度の症状のような要注意な徴候を予見したりできるという点で、これらの診断法は極めて価値がある。発作がきわめて激烈で処置が間に合わなければ致命的なこともある疾患では、潜在的な素因を知っていれば、たとえこの素因が絶対的なものでないとしても、非常に有意義な形で治療の有効性に寄与しうる。同様に、副作用を起こす可能性のある素因が診断された場合、医師は、臨床試験でそのような副作用が見られなかった治療を施すことが可能である。
【０２６０】
薬物に対する応答または薬物に対する副作用を解析および予測する診断法を用いれば、ある個体を特定の薬物で治療すべきかどうかを判断することが可能である。たとえば、特定の薬物による治療に個体が陽性の応答を示すという見込みが診断から明らかになれば、その個体にその薬物を投与することができる。逆に、特定の薬物による治療に個体が陰性の応答を示すという見込みが診断から明らかになれば、別の治療計画を指示することができる。陰性の応答とは、有効な応答が認められないかまたは毒性の副作用が見られるかのいずれかであると定義しうる。
【０２６１】
本発明のマーカーには臨床治験における他の用途もある。疾患に作用する薬剤に対する応答または疾患に作用する薬剤に対する副作用を示す１種以上のマーカーを、上述した方法により同定することができる。その後、そのような薬剤の臨床試験に参加する予定の被験体をスクリーニングして、薬剤に対して良好な応答を示す可能性が最も高い個体を特定し、また副作用を起こしそうな個体を除外することができる。このようにして、陽性の応答が見られそうにない個体が試験に含まれることによる評価値の低下を伴うことなく、しかも望ましくない安全上の問題を生じる危険をおかすこともなく、薬剤に対して陽性の応答を示す個体で薬物治療の有効性を評価することができる。
【０２６２】
二対立遺伝子マーカーを用いる疾患の予防および治療：
疾患に対する個体の羅患性を検出することは非常に重要である。たとえば、ある種の肥満障害では、疾患の進行ならびに糖尿病や心臓病のような肥満関連疾患を防止するかまたは少なくとも遅らせるような治療を行うことが可能である。
【０２６３】
したがって、本発明は、
・疾患に関連する１種の地図関連二対立遺伝子マーカーまたは１群の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡに含まれる個体を選択するステップと、・疾患に関係した症状の出現（および場合により進行）に関して該個体を経過観察するステップと、
・該疾患に作用するかまたはその症状に作用する治療を疾患の適切ステージに該個体に施すステップと、
を含む、疾患の治療方法に関する。ここで、疾患は任意の障害を包含するものとする。
【０２６４】
本発明の他の実施形態には、
・疾患に関連する１種の地図関連二対立遺伝子マーカーまたは１群の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡに含まれる個体を選択するステップと、・該疾患の予防的治療を該個体に施すステップと、
を含む、疾患の治療方法が含まれる。
【０２６５】
さらなる実施形態では、本発明は、
・疾患に関連する１種の地図関連二対立遺伝子マーカーまたは１群の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡに含まれる個体を選択するステップと、
・該疾患の予防的治療を該個体に施すステップと、
・疾患症状の出現および進行に関して該個体を経過観察するステップと、
場合により、
・該疾患に作用するかまたはその症状に作用する治療を疾患の適切なステージに該個体に施すステップと、
を含む、疾患の治療方法に関する。
【０２６６】
疾患に羅患した個体の治療経過を判定するための使用として、本発明はまた、・肥満障害またはその症状に関連する１種の地図関連二対立遺伝子マーカーまたは１群の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡに含まれる、疾患に羅患した個体を選択するステップと、
・該肥満障害に作用するかまたはその症状に作用する治療を該個体に施すステップと、
を含む、疾患の治療方法に関する。
【０２６７】
本発明はまた、個体の所定の集団における疾患の治療方法に関する。この方法は、
・肥満障害またはその症状に作用する有効量の医薬を用いた治療に対する陽性の応答に関連する１種の地図関連二対立遺伝子マーカーもしくは１群の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡに含まれる、肥満障害を患った個体を選択するステップ、および／または
・該医薬を用いた治療に対する陰性の応答に関連する１種の地図関連二対立遺伝子マーカーまたは１群の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡに含まれない、肥満障害を患った個体を選択するステップと、
・選択された該個体に有効量の該医薬を適切な間隔で投与するステップと、
を含む。
【０２６８】
本発明に関連して、医薬に対する「陽性の応答」とは、疾患に関連する症状の軽減を含むものとして定義することができる。本発明に関連して、医薬に対する「陰性の応答」とは、医薬に対する陽性の応答がなく、かつ、症状の軽減が認められないかまたは医薬の投与後に副作用が観察されることを含むものとして定義することができる。
【０２６９】
本発明はまた、医薬を用いた治療に対して被験体が陽性の応答を示す可能性が高いかどうかを判定する方法に関する。この方法は、該医薬に対して陽性の応答を示す個体からなる第１の集団および該医薬に対して陰性の応答を示す個体からなる第２の集団を同定することを含む。該医薬に対する陽性の応答に関連する１種以上の二対立遺伝子マーカーを第１の集団で同定するかまたは該医薬に対する陰性の応答に関連する１種以上の二対立遺伝子マーカーを第２の集団で同定する。二対立遺伝子マーカーは、本明細書に記載の方法を用いて同定することが可能である。
【０２７０】
次に、試験対象の被験体からＤＮＡサンプルを採取する。ＤＮＡサンプルを解析し、それに前記医薬を用いた治療に対する陽性の応答に関連する１種以上の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子および／または前記医薬を用いた治療に対する陰性の応答に関連する１種以上の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子が含まれるかどうかを判定する。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、前記医薬を用いた治療に対する陽性の応答に関連する１種以上の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡサンプルに含まれる場合および／または前記医薬を用いた治療に対する陰性の応答に関連する１種以上の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡサンプルに含まれない場合、臨床試験でその医薬を被験体に投与することができる。好ましい実施形態では、前記医薬は、肥満障害に作用する薬物である。
【０２７２】
本発明の方法を用いて、前記医薬に対して良好な応答を示す見込みのある個体からなる集団で薬効の評価を行うことが可能である。
【０２７３】
本発明の他の態様は、被験体からＤＮＡサンプルを採取すること、前記医薬に対する陽性の応答に関連する１種以上の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡサンプルに含まれるかどうかおよび／または前記医薬に対する陰性の応答に関連する１種以上の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡサンプルに含まれるかどうかを判定すること、前記医薬に対する陽性の応答に関連する１種以上の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡサンプルに含まれる場合および／または前記医薬に対する陰性の応答に関連する１種以上の地図関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡサンプルに含まれない場合に前記医薬を被験体に投与することを含む、前記医薬の使用方法である。
【０２７４】
本発明はまた、医薬、好ましくは疾患またはその症状に作用する医薬、より好ましくは肥満障害に作用する医薬について、臨床試験を行う方法に関する。この方法は、
・医薬、好ましくは疾患またはその症状に作用すると思われる医薬を個体の不均質集団に投与するステップと、
・該医薬に対して陽性の応答を示す個体からなる第１の集団および該医薬に対して陰性の応答を示す個体からなる第２の集団を同定するステップと、
・該医薬に対する陽性の応答に関連する地図関連二対立遺伝子マーカーを該第１の集団で同定するステップと、
・該医薬に対する陽性の応答に関連する地図関連二対立遺伝子マーカーがＤＮＡに含まれる個体を選択するステップと、
・該医薬をその個体に投与するステップと、
を含む。
【０２７５】
医薬を使用する方法、医薬の臨床試験を行う方法、医薬を用いた治療に対して被験体が陽性の応答を示す可能性が高いかどうかを判定する方法を含む、疾患を予防、診断および治療する方法のいずれにおいても、前記の地図関連二対立遺伝子マーカーまたは地図関連二対立遺伝子マーカーのセットは、本出願の開示に記載したなんらかのさらなる限定要素を伴う二対立遺伝子マーカーおよび二対立遺伝子マーカーのセットまたは地図を包含しうる。本明細書に記載されているように、好ましくは、該地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーを含む。任意に、該地図関連二対立遺伝子マーカーまたは地図関連二対立遺伝子マーカーのセットは、３番染色体地図関連二対立遺伝子マーカー、１０番染色体地図関連二対立遺伝子マーカー、および１９番染色体地図関連二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される少なくとも１種の二対立遺伝子マーカーを含む。
【０２７６】
好ましくは、該３番、１０番および１９番染色体地図関連二対立遺伝子マーカーは、下記の二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される：
３番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２７、７０、７２、７３、７４、７５、７６、７７；および（ｂ）配列番号１０２、１０５、１０６、１０７、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１５９、１６０、１６１； および（ｃ）１６３、１６６、１６７；
１０番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１１、２１、２２、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００；（ｂ）配列番号１０１、１０３、１０４、１０８、１０９、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８；および（ｃ）配列番号１６４、１６５、１６８、１６９、１７０、１７１；ならびに
１９番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ） 配列番号１６２。
【０２７７】
そのような方法は、望ましくない副作用を引き起こす可能性がある医薬、および／または医薬が通常どおりに投与された患者集団の一部分には効果がない可能性がある医薬を投与することによって生ずる、利益／リスク比率を増加させるのにきわめて有用であると考えられる。
【０２７８】
個体が疾患に羅患していると診断されれば、治療に対する陽性の応答に関連するかまたは副作用もしくは無応答が含まれる治療に対する陰性の応答に関連する１種の二対立遺伝子マーカーまたは１群の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がこの個体のＤＮＡに含まれているかどうかを判定する選択試験を実施する。
【０２７９】
本発明の方法を用いて治療すべき患者の選択は、上述した検出方法により行うことができる。選択される個体は、好ましくは、治療に対する陰性の応答に関連する１種の二対立遺伝子マーカーまたは１群の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子がＤＮＡに含まれていない個体である。特定の医薬に対する無応答または副作用に関わる個体の遺伝的素因がわかれば、臨床医は、疾患またはその症状に対する適切な薬物を用いる治療を行うことができる。
【０２８０】
患者の遺伝的素因が決定されれば、臨床医は、陰性の応答（特に、副作用）が報告されていないかまたは報告されてはいるがわずかである適切な治療法を、その患者に対して選択することができる。
【０２８１】
「二対立遺伝子マーカーを用いる疾患の予防および治療」というタイトルのこの節の好ましい実施形態では、疾患には肥満障害が包含される。本発明の二対立遺伝子マーカーは、肥満障害の遺伝的決定因子を含有すると思われるゲノム領域に位置する。先に記載されている予防法、診断法、予後判定法および治療方法を多種多様な肥満障害に関連して使用しうることは理解されよう。たとえば、疾患座位が実証されている参考文献（そのいくつかは先に引用されている）に記載されているような肥満障害に関連して、特定のゲノム領域に位置する二対立遺伝子マーカーを使用することが可能である。たとえば、肥満障害の例としては、肥満関連アテローム性動脈硬化症、肥満関連インスリン抵抗性、肥満関連高血圧症、肥満関連ＩＩ型糖尿病に起因する微小血管症性病変、ＩＩ型糖尿病を患った肥満個体の微小血管障害により惹起された眼の病変、およびＩＩ型糖尿病を患った肥満個体の微小血管障害により惹起された腎臓の病変が包含されうるが、これらに限定されるものではない。肥満関連障害には、高インスリン血症および高血糖症も含まれうる。
【０２８２】
しかしながら、該ゲノム領域には、肥満障害以外の遺伝的決定因子が含まれている可能性もある。したがって、本発明は、任意の障害を予防、診断、管理、および治療する方法において本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーを用いる本明細書に記載の予防法、診断法、予後判定法および治療法のいずれかを含む。
【０２８３】
ＶＩ． コンピューターに関連した実施形態
本発明のいくつかの実施形態では、コンピューターを利用したシステムにより、二対立遺伝子マーカーの同定と、それに対応する異なるグループにおけるそれらの頻度の解析との間のオンライン連携を支援することが可能である。
【０２８４】
本明細書中で使用する場合、「配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の核酸コード」という用語には、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３のヌクレオチド配列、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の断片、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３に相同的なヌクレオチド配列または配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の断片に相同的なヌクレオチド配列、ならびに前記の配列に相補的なすべての配列が包含される。本明細書中で使用する場合、「配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の核酸コード」という用語には、下記のうちのいずれか１つを含むか、下記のうちのいずれか１つから本質的になるか、または下記のうちのいずれか１つからなるヌクレオチド配列がさらに包含される：
【０２８５】
ａ） 配列番号１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１のうちのいずれかにおける、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドの連続スパンであって、その長さが特定の配列番号の長さと一致する範囲内のものである連続スパンまたはその相補体；
【０２８６】
ｂ） 配列番号１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１のうちのいずれかにおける、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドの連続スパンであって、その長さが特定の配列番号の長さと一致する範囲内のものである連続スパンまたはその相補体であって、それぞれの配列番号の多型塩基の第１の対立遺伝子をさらに含むもの；
【０２８７】
ｃ） 配列番号１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１のうちのいずれかにおける、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドの連続スパンであって、その長さが特定の配列の長さと一致する範囲内のものである連続スパンまたはその相補体であって、それぞれの配列番号の多型塩基の第２の対立遺伝子をさらに含むもの；
【０２８８】
ｄ） 配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３のうちのいずれかにおける、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドの連続スパンであって、その長さが特定の配列番号の長さと一致する範囲内のものである連続スパンまたはその相補体。
【０２８９】
「配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の核酸コード」には、以下の配列に相同なヌクレオチド配列がさらに包含される：
【０２９０】
ａ） 配列番号１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１のうちのいずれかにおいて、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドの連続スパンであって、その長さが特定の配列番号の長さと一致する範囲内のものである連続スパンまたはその相補体；
【０２９１】
ｂ） 配列番号１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１のうちのいずれかにおいて、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドの連続スパンであって、その長さが特定の配列番号の長さと一致する範囲内のものである連続スパンまたはその相補体であって、それぞれの配列番号の多型塩基の第１の対立遺伝子をさらに含むもの；
【０２９２】
ｃ） 配列番号１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１のうちのいずれかにおいて、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４３、４４、４５、４６または４７ヌクレオチドの連続スパンであって、その長さが特定の配列番号の長さと一致する範囲内のものである連続スパンまたはその相補体であって、それぞれの配列番号の多型塩基の第２の対立遺伝子をさらに含むもの；
【０２９３】
ｄ） 配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３のうちのいずれかにおいて、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドの連続スパンであって、その長さが特定の配列番号の長さと一致する範囲内のものである連続スパンまたはその相補体。
【０２９４】
相同的な配列とは、これらの連続スパンに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％の相同性を有する配列を意味する。デフォルトパラメーターまたは任意の変更されたパラメーターでＢＬＡＳＴ２Ｎを使用するなどを含む、本明細書に記載のいずれかの方法を用いて相同性を決定することができる。相同的な配列には、本発明の核酸コードのチミンがウリジンで置換されたＲＮＡ配列が含まれていてもよい。本発明の核酸コードは伝統的な一文字形式（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌｕｂｅｒｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第３版 Ｗ．Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの裏表紙の内側を参照されたい）または配列中のヌクレオチドの同一性を記述する他の任意の形式または表記で表現されうることは理解されよう。
【０２９５】
本発明の核酸コードには本出願で開示、説明または特許請求されたすべてのポリヌクレオチドがさらに包含されることに留意されたい。このほか、本発明では、特に、そのようなコードを個別にまたはなんらかの組み合わせとして格納するコンピューター可読媒体やコンピューターシステムも対象となる。
【０２９６】
コンピューターに基づく実施形態のいずれにも先に記載の核酸コードのセットまたは地図が含まれうることにも留意されたい。特に、実施形態のいずれにも、配列番号１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１からなる群より選択される少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００または１１３２種の核酸コードのセットが含まれうる。任意に、該核酸コードは、下記のマーカーからなる群より選択される。
【０２９７】
３番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２７、７０、７２、７３、７４、７５、７６、７７；および（ｂ）配列番号１０２、１０５、１０６、１０７、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１５９、１６０、１６１； および（ｃ）１６３、１６６、１６７；
１０番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１１、２１、２２、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００；（ｂ）配列番号１０１、１０３、１０４、１０８、１０９、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８；および（ｃ）配列番号１６４、１６５、１６８、１６９、１７０、１７１；ならびに
１９番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ） 配列番号１６２。
【０２９８】
コンピューターによる読み取り可能なおよびアクセス可能な任意の媒体において、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の核酸コードを、格納、記録および操作しうることは、当業者であれば理解されよう。本明細書中で使用する場合、「記録」および「格納」という語は、コンピューター媒体に情報を格納するプロセスを意味する。当業者であれば、コンピューター可読媒体に情報を記録する現在知られている方法のいずれかを採用して、本発明の核酸コードを１種以上含む製品を容易に作製することができる。本発明の他の態様は、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１、１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の核酸コードのうちの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、５００、１０００種またはすべてを記録したコンピューター可読媒体である。
【０２９９】
他の実施形態では、コンピューターによる読み取り可能なおよびアクセス可能な任意の媒体において、本発明の二対立遺伝子マーカーの１つ以上の特性を、格納、記録、および操作することができる。媒体に格納、記録、および操作しうる特性の例としては、たとえば、本発明の二対立遺伝子マーカーが記載されている参考文献、集団における本発明の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の対立遺伝子頻度、本発明の二対立遺伝子マーカーのタイプ（欠失、単一ヌクレオチド多型など）、本発明の二対立遺伝子マーカーのヒトゲノムにおける染色体中の局在位置、コンティグ中の局在位置、遺伝子中の局在位置、形質との関連または遺伝的エレメントとの連鎖不平衡が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、二対立遺伝子マーカーに対応する本発明の核酸コードおよび該二対立遺伝子マーカーに対応する特性を該媒体に格納する。
【０３００】
さらなる実施形態では、本発明の二対立遺伝子マーカーを用いた遺伝子型判定アッセイの結果を、コンピューターによる読み取り可能なおよびアクセス可能な任意の媒体に格納する。特に、形質を示すかもしくは形質の影響を受けた少なくとも１個体または１対照個体についての本発明の二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を、コンピューターによる読み取り可能なおよびアクセス可能な任意の媒体において格納、記録、および操作することができる。配列番号１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の地図関連二対立遺伝子マーカーのうちの２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、５００、１０００種またはすべてについて、形質を示すかもしくは形質の影響を受けた少なくとも１、２、５、１０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００もしくは５０００個体または対照個体の遺伝子型を、コンピューターによる読み取り可能なおよびアクセス可能な任意の媒体において格納、記録、および操作することができる。好ましくは、個体の地図関連二対立遺伝子における遺伝子型に対応する本発明の核酸コードを、場合により、地図関連マーカーに対応するなんらかの参考文献、名称または核酸コード、および二対立遺伝子マーカーにおける個体の対立遺伝子が何であるか、または遺伝子型の表示と共に、該媒体に格納する。
【０３０１】
コンピューター可読媒体としては、磁気可読媒体、光可読媒体、電子可読媒体および磁気／光媒体が挙げられる。たとえば、コンピューター可読媒体としては、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ディジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、または読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）ならびに当業者に公知の他のタイプの他の媒体が挙げられる。
【０３０２】
本発明の実施形態には、システム、特に、本明細書に記載の本発明の二対立遺伝子マーカーの配列、特性および遺伝子型判定情報を格納および操作するコンピューターシステム、が含まれる。コンピューターシステム１００の１例を図１９にブロック図形式で示す。本明細書中で使用する場合、「コンピューターシステム」とは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列の解析に使用されるハードウェアコンポーネント、ソフトウェアコンポーネント、およびデータ記憶コンポーネントを意味する。１実施形態では、コンピューターシステム１００は、Ｓｕｎ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ １０００サーバー（Ｓｕｎ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）である。コンピューターシステム１００は、好ましくは、配列、特性および遺伝子型判定のデータを処理、アクセス、および操作するための演算処理装置を具備する。演算処理装置１０５としては、Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＰｅｎｔｉｕｍ ＩＩＩ、またはＳｕｎ製、Ｍｏｔｏｒｏｌａ製、Ｃｏｍｐａｑ製もしくはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍａｃｈｉｎｅｓ製の類似の演算処理装置など、任意の周知のタイプの中央演算処理装置を利用することが可能である。
【０３０３】
好ましくは、コンピューターシステム１００は、演算処理装置１０５と、データを格納するための１つ以上の内部データ記憶コンポーネント１１０と、データ記憶コンポーネントに格納されたデータを読み出すための１つ以上のデータ読み出しデバイスとを備えた汎用システムである。当業者であれば、現在入手可能なコンピューターシステムはいずれも好適であることが容易に理解できよう。
【０３０４】
特定の１実施形態では、コンピューターシステム１００は、メインメモリー１１５（好ましくはＲＡＭとして実装される）に接続されたバスに接続された演算処理装置１０５と、ハードドライブおよび／またはデータを記録する他のコンピューター可読媒体などの１つ以上の内部データ記憶デバイス１１０とを具備する。いくつかの実施形態では、コンピューターシステム１００はさらに、内部データ記憶デバイス１１０に格納されたデータを読み取るための１つ以上のデータ読み出しデバイス１１８を具備する。
【０３０５】
データ読み出しデバイス１１８は、たとえば、フロッピーディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブなどであってもよい。いくつかの実施形態では、内部データ記憶デバイス１１０は、取り外し可能なコンピューター可読媒体であって記録された制御ロジックおよび／またはデータを含む前記媒体、たとえば、フロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどである。コンピューターシステム１００は、データ読み出しデバイス中に一旦挿入されたデータ記憶コンポーネントから制御ロジックおよび／またはデータを読み取るための、適切なソフトウェアを備えるかまたはそうしたソフトウェアによりプログラムされていることが有利であると思われる。
【０３０６】
コンピューターシステム１００は、コンピューターのユーザーに出力を提示するために用いるディスプレイ１２０を具備する。また、コンピューターシステム１００をネットワーク内または広域ネットワーク内の他のコンピューターシステム１２５ａ〜ｃとリンクさせてコンピューターシステム１００への集中アクセスを提供することが可能であることにも留意されたい。
【０３０７】
本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または特性および遺伝子型判定情報にアクセスして処理するためのソフトウェア、たとえば、検索ツール、比較ツール、ゲノムのマッピングおよび図式化ツール、ならびにモデリングツールなどを、実行時にメインメモリー１１５に存在するようにしてもよい。
【０３０８】
本発明にはまた、以下に記載の方法に従っておよび／または本明細書に記載のなんらかのさらなる限定要素とともに、該コンピューター可読媒体およびコンピューターシステムを使用することが包含される。
【０３０９】
したがって、本発明は、コンピュータープログラムを用いて地図関連二対立遺伝子マーカーにアクセスし、処理し、そして選択する方法に関する。１態様において、本発明には、コンピュータープログラムを用いて、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１の地図関連二対立遺伝子マーカーに対応する核酸コード、特性および／または遺伝子型判定の情報にアクセスすることが包含される。
【０３１０】
他の態様において、本発明には、コンピュータープログラムを用いて、地図関連二対立遺伝子マーカーに対応する核酸コード、特性および／または遺伝子型判定の情報を読み出すこと、ならびに指定の染色体領域、指定のコンティグまたは指定の遺伝子中に位置する二対立遺伝子マーカーを同定または選択することが包含される。ここで、該地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーから選択される。
【０３１１】
他の態様において、本発明には、コンピュータープログラムを用いて、二対立遺伝子マーカーに対応する核酸コード、特性および／または遺伝子型判定の情報を読み出すこと、地図関連二対立遺伝子マーカーから指定の距離だけ離れた指定の染色体領域、指定のコンティグまたは指定の遺伝子中に位置する二対立遺伝子マーカーを同定または選択することが包含される。ここで、該地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーから選択される。
【０３１２】
他の態様において、本発明には、コンピュータープログラムを用いて、地図関連二対立遺伝子マーカーに対応する核酸コード、特性および／または遺伝子型判定の情報を読み出すこと、それらのマーカーの対立遺伝子について、指定の対立遺伝子頻度、好ましくは最小または最大の対立遺伝子頻度を有する二対立遺伝子マーカーを同定または選択することが包含される。ここで、該地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーから選択される。
【０３１３】
本発明はまた、例えば遺伝解析に使用するための、二対立遺伝子マーカーの地図またはセットを構築する方法に関する。次に、そのような二対立遺伝子マーカーの該地図は、ひいては法医学用途または疾患関連研究などに使用することができる。これについて本明細書でさらに説明している。１態様において、コンピューター可読媒体に格納された二対立遺伝子マーカーから１セットの二対立遺伝子マーカーを選択する。二対立遺伝子マーカーは、ゲノムの所望の領域中のそれらの位置など、上記の所望の判定基準に従って選択してもよい。また、ゲノム中、または所定のゲノム領域中、コンティグ中もしくは遺伝子中において指定の平均距離だけ互いに離れるように、マーカーを選択することもできる。他の例では、指定のヘテロ接合率を有するように、二対立遺伝子マーカーを選択することができる。
【０３１４】
このように、以上に列挙された実施形態はいずれも、二対立遺伝子マーカーの地図の構築に適用しうる。ここで、地図関連二対立遺伝子マーカーにアクセスし、処理し、そして選択する方法には、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、５００、１０００または１００００種の二対立遺伝子マーカーを選択または同定することが含まれる。特に、本発明には、コンピュータープログラムを用いて、地図関連二対立遺伝子マーカーに対応する核酸コード、特性および／または遺伝子型判定の情報を読み出すこと、ならびに指定の染色体領域、指定のコンティグまたは指定の遺伝子中に位置する少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、５００、１０００種の二対立遺伝子マーカーを同定または選択することが包含される。ここで、該地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーから選択される。
【０３１５】
二対立遺伝子マーカー地図およびそれを構築する方法には、二対立遺伝子マーカーおよび地図に対する本明細書に記載したなんらかのさらなる限定要素が含まれていてもよいことは理解されよう。地図および地図を構築する方法にはまた、遺伝子型判定方法および／または二対立遺伝子マーカー地図のなんらかの使用方法がさらに含まれていてもよい。染色体領域を指定するために任意の好適な名称または参照配列を使用しうることもまた理解されよう。
【０３１６】
他の態様において、本発明には、本発明の二対立遺伝子マーカーを用いて遺伝解析を行う方法が包含される。地図関連二対立遺伝子マーカーにおける任意の数の個体の遺伝子型判定情報をコンピューター可読媒体に格納しうる。たとえば、個体の遺伝子型としてまたは集団中の頻度として、遺伝子型判定情報を格納しうる。１態様においては、１種以上の二対立遺伝子マーカーおよび該二対立遺伝子マーカーに関して遺伝子型の判定された任意の個体を特定することにより、１種以上の該二対立遺伝子マーカーにおける１個体以上から得られた遺伝子型判定結果を提供し、次に、本明細書に記載されているような遺伝解析法でさらに解析することができるようにする。
【０３１７】
したがって、本発明には、遺伝解析に使用するための遺伝子型判定情報を提供する方法であって、地図関連二対立遺伝子マーカーを特定すること、個体を特定すること、および該個体の遺伝子型判定情報を含むコンピューター可読媒体にアクセスするコンピュータープログラムを用いて該個体の遺伝子型を提供することを含む前期方法が包含される。好ましくは、該地図関連二対立遺伝子マーカーには、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１からなる群より選択される少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、５００、１０００種の二対立遺伝子マーカーが含まれる。好ましくは、少なくとも１、２、５、１０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００、２０００または５０００個体を特定する。
【０３１８】
したがって、本発明の１種以上の地図関連二対立遺伝子マーカーにおける遺伝子型判定情報は、関連研究の場合と同様に遺伝解析法にも有用である。これについて本明細書でさらに説明する。第１の例において、検出可能な形質を呈する個体からなる影響を受けたグループと影響を受けない対照グループとの間での候補遺伝子中の遺伝変異を比較することにより、形質の因子として候補遺伝子が関係しているかまたは関係していないかが明らかになる。いくつかの二対立遺伝子マーカーの地図（好ましくは、マーカーの順番および相対位置を提供する）は、遺伝的変異を比較するのに役立つと思われる。該地図によって、地図上に与えられたマーカーの天然の順番を利用してハプロタイプを構築することが可能となり、個体が有する２つの染色体のそれぞれについて遺伝的変異の全体像を含むこれらのハプロタイプを、影響を受けた個体と対照との間で比較して、関連を示す証拠があるかを調べることができる。二対立遺伝子マーカー地図の所定の二対立遺伝子マーカーにおける遺伝子型判定情報をコンピューター可読媒体に提供することにより、コンピュータープログラムを用いてハプロタイプを比較することができる。このほか、隣接マーカーのペアについて連鎖不平衡（ＬＤ）を計算することも可能である。ＬＤ値がわかれば、二対立遺伝子マーカーペアの近傍にある、それ自体はマッピングされていない遺伝的変異をマーカーの関連研究において検出できるかどうかを予測することが可能になるであろう。
【０３１９】
他の例において、候補となる遺伝子またはゲノム領域を選択する代わりに、ゲノムの二対立遺伝子マーカー地図を用いて、関連研究により疾患または形質に影響を及ぼす遺伝子のおよその位置をマッピングすることができると思われる。特定の二対立遺伝子マーカーを用いて得られる正の関連の結果は、その二対立遺伝子マーカーのおおよその位置に可能性のある疾患遺伝子変異体が存在することを示唆しており、したがってこのことは、ゲノム地図または二対立遺伝子マーカー地図のこの特定領域に的をしぼったさらなる研究に役立つであろう。
【０３２０】
したがって、本発明には、集団における対立遺伝子の頻度を推定する方法であって、ａ） 二対立遺伝子マーカーについて該集団から個体の遺伝子型を読み取ることと、ｂ） 該集団における該二対立遺伝子マーカーの比例代表を決定することとを含む方法が包含される。
【０３２１】
他の態様において、本発明は、遺伝子型と表現型との間の関連を検出する方法であって、ａ） 形質陽性集団において１種以上の地図関連二対立遺伝子マーカーにおける少なくとも１個体の遺伝子型を読み取るステップと、ｂ） 対照集団において該地図関連二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を読み取るステップと、ｃ） 該遺伝子型と該表現型との間に統計的に有意な関連が存在するかどうかを判定するステップとを含む方法を用いる。
【０３２２】
本発明はまた、１セットの二対立遺伝子マーカーについて集団におけるハプロタイプの頻度を推定する方法であって、ａ） 形質陽性集団において１種以上の少なくとも１種の地図関連二対立遺伝子マーカーにおける少なくとも１個体の遺伝子型を読み取ることと、ｂ） 該集団中の各個体のゲノム中に存在する第２の二対立遺伝子マーカーの両コピーについて該第２の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの正体を読み取ることと、ｃ） ステップａ）およびｂ）で決定されたヌクレオチドの正体にハプロタイプ判定法を適用し、該頻度の推定値を得ることとを含む方法を用いる。好ましくは、該ハプロタイプ判定法は、非対称ＰＣＲ増幅、特定の対立遺伝子の二重ＰＣＲ増幅、クラークアルゴリズムまたは期待値最大化アルゴリズムからなる群より選択される。好ましくは、地図関連二対立遺伝子マーカーは、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される。
【０３２３】
本発明にはさらに、ハプロタイプと表現型との間の関連を検出する方法であって、ａ） 上記の方法により形質陽性集団における少なくとも１種のハプロタイプの頻度を推定するステップと、ｂ） 上記の方法により対照集団における該ハプロタイプの頻度を推定するステップと、ｃ） 該ハプロタイプと該表現型との間に統計的に有意な関連が存在するかどうかを判定するステップとを含む方法が包含される。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンピューターシステム１００は、コンピューター可読媒体に格納された本発明の上記の核酸コード配列を、コンピューター可読媒体に格納された参照ヌクレオチド配列と比較するための配列コンペアラーをさらに具備するものであってもよい。「配列コンペアラー」とは、ヌクレオチド配列をデータ記憶手段内に格納された他のヌクレオチド配列と比較するためにコンピューターシステム１００において実装された１つ以上のプログラムを意味する。たとえば、配列コンペアラーを用いて、コンピューター可読媒体に格納された本発明の核酸コードのヌクレオチド配列をコンピューター可読媒体に格納された参照配列と比較して相同性を同定することが可能である。本特許明細書の他の部分に明記されているさまざまな配列コンペアラープログラムは、特に、本発明のこの態様で使用することを特に意図したものである。
【０３２５】
図２０は、新しい配列とデータベース中の配列との間の相同性レベルを決定するために、新しいヌクレオチド配列をデータベースの配列と比較するプロセス２００の１実施形態を示す流れ図である。配列のデータベースは、コンピューターシステム１００内に格納された私的データベースであってもよいし、インターネット経由で利用できるもののような公共データベースであってもよい。
【０３２６】
プロセス２００は、開始状態２０１からスタートして、比較を行うべき新しい配列がコンピューターシステム１００のメモリに格納される状態２０２に移行する。上述したように、メモリは、ＲＡＭや内部記憶デバイスを含めて、いかなるタイプのメモリであってもよい。
【０３２７】
次に、プロセス２００は、解析および比較を行うために配列のデータベースが開かれている状態２０４に移行する。次に、プロセス２００は、データベースに格納された第１の配列がコンピューターのメモリに読み込まれる状態２０６に移行する。次に、状態２１０で比較が実行されて、第１の配列が第２の配列と同一であるかどうかが判定される。このステップは新しい配列とデータベース中の第１の配列と間で厳密な比較を行うことに限定されるものではない点に留意することが重要である。２つのヌクレオチド配列を、それらが同一でない場合であっても比較する周知の方法は、当業者に知られている。たとえば、２つの試験する配列間の相同性レベルを高めるために、一方の配列にギャップを導入することが可能である。比較時にギャップまたは他の特徴を配列に導入するかどうかを制御するパラメーターは、通常、コンピューターシステムのユーザーが入力する。
【０３２８】
状態２１０で２つの配列の比較を実行した後、判定状態２１０で２つの配列が同一であるか否かの判定が行われる。当然のことながら、「同一」という用語は、完全に同一である配列に限定されるものではない。ユーザーが入力した相同性パラメーターの範囲内にある配列はプロセス２００では「同一」として示される。
【０３２９】
２つの配列が同一であるという判定がなされた場合、プロセス２００は、データベース由来の配列の名称をユーザーに提示する状態２１４に移行する。この状態では、名称の提示された配列は入力した相同性の制約を満足するものであることがユーザーに通知される。この格納配列の名称をユーザーに提示した後、プロセス２００は、データベース中にさらに配列が存在しているかどうかを判定する判定状態２１８に移行する。データベース中にさらに配列が存在していなければ、プロセス２００は終了状態２２０で終了する。しかしながら、データベース中にさらに配列が存在している場合、プロセス２００は、新しい配列と比較できるようにデータベース中の次の配列にポインターが移動する状態２２４に移行する。このようにして、新しい配列を、データベース中の各配列に対してアラインメントし、比較する。
【０３３０】
判定状態２１２で配列が相同でないという判定がなされた場合、プロセス２００は、データベース中に比較に利用できる他の配列が存在するかどうかを判定するために直ちに判定状態２１８に移行することに留意されたい。
【０３３１】
したがって、本発明の１態様は、演算処理装置と、本発明の核酸コードが格納されたデータ記憶デバイスと、本発明の核酸コードと比較される参照ヌクレオチド配列が読み出し可能な状態で格納されたデータ記憶デバイスと、比較を行うための配列コンペアラーとを具備したコンピューターシステムである。配列コンペアラーを用いて、比較される配列間の相同性レベルを示したり、本発明の核酸コード中の構造的モチーフを同定したり、本発明の核酸コードと比較される配列中の構造的モチーフを同定したりすることが可能である。いくつかの実施形態では、本発明の核酸コードのうちの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、５００、１０００種またはすべての配列をデータ記憶デバイスに格納することが可能である。
【０３３２】
１態様において、本発明の方法およびシステムは、本発明の核酸コードに相同な配列を含有する特定の遺伝子および／またはヌクレオチド配列コンティグに含まれるヌクレオチド配列などのヌクレオチド配列の同定を可能にする。本発明の方法およびシステムは、たとえば、ヒトゲノム中、コンティグ上または遺伝子内で本発明の二対立遺伝子マーカーの位置を決めるために使用することが可能である。本方法はまた、特定の配列上に位置する本発明の二対立遺伝子マーカーの同定、ならびに本発明の核酸コードを含有する該コンティグまたは遺伝子配列上に位置するさらなる二対立遺伝子マーカーなどのさらなる遺伝標識の同定に、使用することが可能である。
【０３３３】
したがって、本発明には、ａ） 配列を比較するコンピュータープログラムを用いて第１の配列と本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーを含む第２の配列とを読み取るステップと、ｂ） 該二対立遺伝子マーカーが該第１の配列上に位置しているかどうかを判定するステップとを含む、ヌクレオチド配列上の地図関連二対立遺伝子マーカーの位置決定法が包含される。任意に、本方法には、該第１の配列の多型塩基の位置を決定することが含まれる。ステップｂ）には、好ましくは、該コンピュータープログラムを用いて該第１の配列と該第２の配列と差異を決定することが含まれる。本方法には、第１の配列内の第２の配列の位置を決定することがさらに含まれていてもよい。好ましくは、該第２の配列には、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される地図関連二対立遺伝子マーカーの少なくとも８，１０，１２，１５、１８，２０，２５，３０、４７ヌクレオチドが含まれる。
【０３３４】
本発明の他の態様は、本発明の核酸コードと参照ヌクレオチド配列との相同性のレベルを判定する方法である。この方法には、相同性レベルを判定するコンピュータープログラムを用いて該核酸コードおよび該参照ヌクレオチド配列を読み込むステップと、コンピュータープログラムを用いて核酸コードと参照ヌクレオチド配列との間の相同性を判定するステップとが含まれる。コンピュータープログラムとしては、相同性レベルを決定するための多数のコンピュータープログラムのうちのいずれをも利用することが可能であり、例えば、本明細書に具体的に列挙されているプログラム、たとえば、ＢＬＡＳＴ２Ｎをデフォルトパラメーターまたは任意の変更されたパラメーターで利用することが可能である。本方法は上記のコンピューターシステムを用いて実施可能である。本方法はまた、コンピュータープログラムを用いて本発明の上記の核酸コードのうちの２，５，１０，１５、２０，２５，３０，５０，１００，２００，５００、１０００種またはすべてを読み込み、さらに該核酸コードと間の参照ヌクレオチド配列との相同性を決定することにより行うことも可能である。
【０３３５】
図２１は、２つの配列が相同であるかどうかを判定するためのコンピューターにおけるプロセス２５０の１実施形態を示す流れ図である。プロセス２５０は、開始状態２５２でスタートし、次に、比較すべき第１の配列がメモリに格納される状態２５４に移行する。次に、比較対象の第２の配列が状態２５６でメモリに格納される。次に、プロセス２５０は、第１の配列の第１の文字を読み取る状態２６０に、続いて第２の配列の第１の文字を読み取る状態２６２に移行する。配列がヌクレオチド配列である場合、文字は通常、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵのいずれかであることは理解できよう。
【０３３６】
次に、判定状態２６４で、これらの２つの文字が同一であるかどうかの判定が行われる。同一である場合、プロセス２５０は、第１の配列および第２の配列の次の文字を読み取る状態２６８に移行する。次いで、次の文字が同一であるかどうかの判定が行われる。同一である場合、プロセス２５０は、２つの文字が同一でなくなるまでこのループを続ける。次の２文字が同一でないという判定がなされた場合、プロセス２５０は判定状態２７４に移行し、いずれかの配列に読み取るべきなんらかの文字が他にあるかどうかを判定する。
【０３３７】
読み取るべき文字がなくなったら、プロセス２５０は、第１の配列と第２の配列との間の相同性のレベルをユーザーに提示する状態２７６に移行する。相同性のレベルは、第１の配列中の配列の全数に対する同一配列部分の文字数の割合を計算することにより求められる。したがって、第１の１００ヌクレオチド配列中のすべての文字が第２の配列中のすべての文字とアラインされる場合には、相同性レベルは１００％となる。
【０３３８】
このほか、コンピュータープログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列を参照ヌクレオチド配列と比較し、本発明の核酸コードが参照核酸配列と１ヶ所以上の位置で異なっているかどうかを判定するコンピュータープログラムであってもよい。任意に、そのようなプログラムは、参照ポリヌクレオチドまたは本発明の核酸コードの配列に関して、挿入、欠失または置換されたヌクレオチドの長さおよび正体を記録する。１実施形態では、コンピュータープログラムは、参照ヌクレオチド配列が、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列に対して１以上の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含むかどうかを判定するプログラムであってもよい。これらの単一ヌクレオチド多型はいずれも、単一塩基の置換、挿入、または欠失を有するものであってもよい。
【０３３９】
したがって、本発明の他の態様は、本発明の核酸コードが１個以上のヌクレオチドで参照ヌクレオチド配列と異なっているかどうかを判定する方法である。この方法には、核酸配列間の差異を識別するコンピュータープログラムを用いて核酸コードおよび参照ヌクレオチド配列を読み取るステップと、コンピュータープログラムを用いて核酸コードと参照ヌクレオチド配列との差異を識別するステップとが含まれる。いくつかの実施形態では、コンピュータープログラムは、参照ヌクレオチド配列中の単一ヌクレオチド多型を同定するプログラムである。本方法は、上述したコンピューターシステムおよび図２１に示す方法により実施可能である。また、コンピュータープログラムを用いて、本発明の核酸コードのうちの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、５００、１０００種またはすべて、および参照ヌクレオチド配列を読み取り、コンピュータープログラムを用いて核酸コードと参照ヌクレオチド配列との間の差異を識別することにより本方法を実施してもよい。
【０３４０】
他の実施形態では、上述したコンピュータベースのシステムは、本発明の二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を判定するアッセイに使用するためのプライマーまたはプローブとして機能しうるヌクレオチド配列を特定するためのプライマーもしくはプローブジェネレーターをさらに備えてもよい。したがって、方法には、プライマーまたはプローブ配列を特定するコンピュータープログラムを用いて本発明のポリヌクレオチドコードを読み取ることと、コンピュータープログラムを用いてプライマーまたはプローブを特定することとが含まれる。
【０３４１】
本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードは、さまざまなフォーマットでさまざまなデータ処理プログラムにより格納および操作することが可能である。たとえば、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷＯＲＤまたはＷＯＲＤＰＥＲＦＥＣＴの場合のようにワード演算処理装置用ファイルにテキスト形式で格納したり、ＤＢ２、ＳＹＢＡＳＥ、またはＯＲＡＣＬＥの場合のように当業者が熟知するさまざまなデータベース用プログラムでＡＳＣＩＩファイルとして格納することが可能である。また、配列コンペアラー、識別子、または本発明の核酸コードもしくは本発明のポリペプチドコードと比較される参照ヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列の起源として、多くのコンピュータープログラムおよびデータベースを利用できる。以下の一覧は、本発明を限定するものではなく、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードと併用するのに有用なプログラムおよびデータベースを参考として提供するものである。使用可能なプログラムおよびデータベースとしては、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＢａｓｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）、ＧｅｎｅＭｉｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）、Ｌｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）、ＭａｃＬｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２（ＮＣＢＩ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， １９９０）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８）、ＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ． １９９０）、たとえばＨＭＭＥＲ （ＨＭＭｓ ： Ｒ ．Ｄｕｒｂｉｎ， Ｓ． Ｅｄｄｙ， Ａ． Ｋｒｏｇｈ， ａｎｄ Ｇ． Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ， 「生物学上の配列解析： タンパク質および核酸の確率論モデル（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ： ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９８）等のプロフィール隠れマルコフモデル， Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｃｅｒｉｕｓ２．ＤＢＡｃｃｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＨｙｐｏＧｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＣＨＡＲＭｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｆｅｌｉｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＱｕａｎｔｅＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｍｏｄｅｌｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＩＳＩＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＷｅｂＬａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＷｅｂＬａｂ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＭＤＬ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙデータベース、ＭＤＬ Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔデータベース、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙデータベース、Ｄｅｒｗｅｎｔｓ’ｓ Ｗｏｒｌｄ Ｄｒｕｇ Ｉｎｄｅｘデータベース、ＢｉｏＢｙｔｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅデータベース、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース、Ｇｅｎｓｅｑｎデータベースがあげられるが、これに限定されるものではない。本明細書の開示内容から、当業者であれば他の多くのプログラムおよびデータベースも明らかであろう。
【０３４２】
本発明の核酸コードにはさらに本出願で開示、説明、または特許請求されたポリヌクレオチドがすべて包含されることに留意されたい。さらに、本発明では、特に、そのようなコードを個別にまたは任意の組み合わせでコンピューター可読媒体およびコンピューターシステムに格納すること、ならびにＶＩの方法におけるそのようなコードの使用および組み合わせた使用も意図される。
【０３４３】
ＶＩＩ． 本発明の二対立遺伝子マーカーのマッピングおよびそれを含む地図
ヒト半数体ゲノムには、２４個の染色体に分配された３×１０９塩基長の二本鎖ＤＮＡ上に散在する、推定で８０，０００〜１００，０００個またはそれ以上の遺伝子が含まれる。ヒトはいずれも二倍体である。すなわち、２つの半数体ゲノムを有しており、一方は父方に由来し、他方は母方に由来する。ヒトゲノムの配列は、集団内の個体間で異なる。３×１０９塩基対のＤＮＡに沿って散在する約１０７個の部位が多型であり、対立遺伝子と呼ばれる少なくとも２種の変異型で存在する。これらの多型部位のほとんどは単一塩基置換突然変異により生じたものであり、二対立遺伝子である。１０５個未満の多型部位はさらに複雑な変化によるものであり、複対立遺伝子、すなわち２種を超える対立遺伝子型で存在する場合が非常に多い。所与の多型部位では、個体（二倍体）は、ホモ接合（同一の対立遺伝子が２つ）またはヘテロ接合（異なった対立遺伝子が２つ）のいずれかであろう。所与の多型または希な突然変異は、中立（形質に影響を及ぼさない）であるかまたは機能的（すなわち、特定の遺伝形質の原因となる）のいずれかである。
【０３４４】
遺伝的地図
検出可能な形質、たとえば、疾患または他の任意の検出可能な形質に関連する遺伝子の同定の最初のステップは、遺伝子マッピング法を用いて形質誘発遺伝子を含有するゲノム領域の局在位置を決定することである。本発明の範囲内にあるとみなされる好ましい形質は、治療的管針の分野に関連し、特定の実施形態では、それらは、薬効または毒性となって現れる疾患形質および／または薬物応答形質であろう。形質は、糖尿病と非糖尿病のような「二面的」であるかまたは高血圧のような「量的」であるかのいずれかである。量的形質の現れた個体は、形質値の適切なスケール、たとえば、血圧範囲によって分類することができる。この場合、それぞれの形質値範囲を二面的形質として解析することができる。そのようなある範囲内の形質値を示す患者は、その範囲外の形質値を示す患者と比較して研究されるであろう。そのような場合、規定の範囲内の形質値を示す個体の亜集団に遺伝解析法が適用されるであろう。
【０３４５】
遺伝子マッピングでは、形質陽性集団および形質陰性集団における多型遺伝子座の分離の解析を伴う。さまざまな個体の染色体において配列が同一であるヒトゲノムＤＮＡの大部分に対して、多型遺伝子座はヒトゲノムのごく一部分（１％未満）を構成する。すべての既知ヒト多型遺伝子座の中から、多型性が十分に高いためにランダムに選択された個体がヘテロ接合である可能性がかなり高く、そのため連鎖解析または関連研究のような方法による遺伝解析には有益である遺伝マーカーを、ゲノム由来ポリヌクレオチドとして定義することができる。
【０３４６】
遺伝子地図は、ヒト染色体上に位置づけされた多型マーカーのコレクションからなる。ヒト染色体に沿った配置が既知であるゲノムＤＮＡの断片を順序づけて重ねたコレクションである物理的地図と遺伝子地図を組み合わせてもよい。最適な遺伝子地図は、次の特徴を有していなければならない：
・ゲノムに沿って散在する遺伝子マーカーの密度は、任意の形質関連多型の同定および局在位置決定を行うのに十分なものでなければならない、
・それぞれのマーカーは、さまざまな減数分裂の大部分で役立つように適切なヘテロ接合レベルを有していなければならない、
・マーカーはすべて、慣例に従って、妥当な費用で、かつ妥当な時間で容易にタイプ分けされるものでなければならない、
・マーカーの全セットは、染色体ごとに、高い信頼性をもって順序づけられるものでなければならない。
【０３４７】
しかしながら、上記地図が最適である一方、本発明の地図がお互いに単一のＢＡＣから誘導された二対立遺伝子マーカーの順序を決定する必要なく、下記の個々のマーカーおよびハプロタイプ関連解析で使用できることが理解されるだろう。
【０３４８】
物理的地図の構築
二対立遺伝子マーカーの高密度遺伝子地図の構築の最初のステップは、物理的地図の構築である。物理的地図は、ゲノムの一部分をカバーする、好ましくは１個またはすべての染色体をカバーするゲノムＤＮＡのクローン化断片を順序づけて重ねたものからなる。ゲノムの物理的地図を得るには、ゲノムＤＮＡライブラリーの構築および順序づけが必要である。ＢＡＣライブラリーからの物理的地図の構築についての詳細な説明については、たとえば、１９９８年７月１７日に出願された関連ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ９８／００１９３号を参照されたい。その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。そこに開示されている方法を用いることにより、マーカーのより大きい完全なセット、および本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーを含むヒトゲノムの全地図を作製することができる。
【０３４９】
二対立遺伝子マーカー
これらの群の二対立遺伝子マーカーを含有する順序づけられたＤＮＡ断片は、これらの長さのゲノム領域を完全にカバーする必要はなく、その代わりに、１つ以上のギャップを有する不完全なコンティグであってもよいことは理解されるであろう。以下でさらに詳細に論じられているように、二対立遺伝子マーカーは、それらを保有する対応する物理的コンティグの完全性とは関係なく、単一マーカーおよびハプロタイプ関連解析で使用することが可能である。
【０３５０】
上記の手順を用いて、ゲノム上の局在位置が決定されたＢＡＣから得られた配列を用いて、それぞれ２個の対立遺伝子を有する１７１種の二対立遺伝子マーカーを同定した。場合により、プールされたＢＡＣを用いてマーカーを同定し、その後、実施例１および２に記載されているようなＳＴＳスクリーニング法を用いて個々のＢＡＣに再び割り当てた。これらの二対立遺伝子マーカーの配列は、配列番号１〜１７１として添付の配列表に提供されている。本出願の全体にわたり配列番号１〜１７１の配列を代表的マーカーとして使用するが、これらのマーカーは、配列番号１〜１７１に列挙されている多型塩基を取り囲む正確なフランキング配列を有するマーカーに制限されるものではない。もっと正確に言えば、配列番号１〜１７１の多型塩基を取り囲むフランキング配列は、それらの使用目的に合った任意の長さまで延長または短縮しうることは理解されよう。本発明では、特に、そのような配列が対象となる。これらの二対立遺伝子マーカーの配列は、本明細書に記載されている遺伝子の同定および診断法に使用するだけでなく、ゲノム地図を構築するためにも使用することが可能である。本明細書に記載の二対立遺伝子マーカーはマーカーが多型塩基を含んでいる限りそれらの使用目的に合った任意の長さであってよいことは理解されよう。本発明では、特に、そのような配列が対象となる。
【０３５１】
好ましい実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列のうちの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種またはすべてが含まれる。他の実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列と連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００、２００、３００、５００、７００、または１０００種の二対立遺伝子マーカーが含まれる。いくつかの実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、配列番号１〜１００の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列のうちの１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種またはすべてが含まれる。他の実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、配列番号１〜１００の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列と連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種の二対立遺伝子マーカーが含まれる。いくつかの実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、配列番号１０１〜１６２の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列のうちの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０種またはすべてが含まれる。他の実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、配列番号１０１〜１６２の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列と連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０種の二対立遺伝子マーカーが含まれる。いくつかの実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、配列番号１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列のうちの少なくとも１、５、８種またはすべてが含まれる。他の実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、配列番号１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列と連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００、２００、３００ 、５００、７００または１０００種の二対立遺伝子マーカーが含まれる。さらに他の実施形態では、「ヒトゲノムの高密度不平衡地図の構築に使用するための二対立遺伝子マーカー（Ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ）」という名称の同時係属米国特許出願第０９／４２２，９７８号の配列番号１〜３９０８の二対立遺伝子マーカーからなる群より選択される少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００、２００、３００、５００、７００または１０００種の二対立遺伝子マーカーが含まれる。
【０３５２】
さらなる実施形態では、二対立遺伝子マーカー地図には、３番、１０番または１９番染色体上での局在位置が決定された該地図関連マーカーのうちの１種以上またはすべてが含まれる。特に、二対立遺伝子マーカー地図には、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種の二対立遺伝子マーカー（ただし、該二対立遺伝子マーカーのうちの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０種は、以下の二対立遺伝子マーカーからなる二対立遺伝子マーカー群より選択される）が含まれる。
【０３５３】
３番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２７、７０、７２、７３、７４、７５、７６、７７；および（ｂ）配列番号１０２、１０５、１０６、１０７、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１５９、１６０、１６１； および（ｃ）１６３、１６６、１６７；
１０番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１１、２１、２２、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００；（ｂ）配列番号１０１、１０３、１０４、１０８、１０９、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８；および（ｃ）配列番号１６４、１６５、１６８、１６９、１７０、１７１；ならびに
１９番染色体二対立遺伝子マーカー：（ａ） 配列番号１６２。
【０３５４】
二対立遺伝子マーカーの順序づけ
当技術分野で公知の方法ならびに１９９８年７月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ９８／００１９３号および米国特許出願第０９／８４２２，９７８号（これらの開示内容は、その全体が本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている方法により、二対立遺伝子マーカーの順序づけを行って、染色体、好ましくは亜染色体領域に沿ったそれらの位置を決定することができる。
【０３５５】
染色体に沿った二対立遺伝子マーカーの位置を、さまざまな方法を用いて決定することができる。１つの方法として、放射線ハイブリッドマッピングが使用される。放射線ハイブリッド（ＲＨ）マッピングとは、ヒトゲノムの高解像度マッピングに使用することのできる体細胞遺伝学的方法である。この方法では、１以上のヒト染色体を含む細胞系を致死線量まで照射し、各染色体を破壊して断片にする。断片のサイズは放射線量に依存する。これらの断片を、培養した齧歯動物細胞との融合によりレスキューし、異なるヒトゲノム部分を含むサブクローンを得る。この技法については、Ｂｅｎｈａｍら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５０９−５１７， １９８９）およびＣｏｘら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：２４５−２５０， １９９０）（これらの全内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする）により報告されている。これらのサブクローンのランダムかつ独立した性質により、任意のヒトゲノムマーカーを効率的にマッピングすることができる。８０〜１００個の細胞系のパネルから単離したヒトＤＮＡから、二対立遺伝子マーカーの順序づけを行うためのマッピング試薬が得られる。この方法では、マーカー間の切断頻度を用いて距離を求める。この距離により、ＥＳＴの場合と同様に高解像度の地図を構築することができる（Ｓｃｈｕｌｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：５４０−５４６， １９９６。その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。）。
【０３５６】
ＲＨマッピングは、成長ホルモン（ＧＨ）遺伝子およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子にまたがるヒト染色体１７ｑ２２−ｑ２５．３（Ｆｏｓｔｅｒら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３：１８５−１９２， １９９６）、ゴーリン症候群遺伝子周辺の領域（Ｏｂｅｒｍａｙｒら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ４：２４２−２４５， １９９６）、１２番染色体の全短腕をカバーする６０個の遺伝子座（Ｒａｅｙｍａｅｋｅｒｓら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：１７０−１７８， １９９５）、神経繊維腫症２型遺伝子座を含むヒト２２番染色体の領域（Ｆｒａｚｅｒら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：５７４−５８４， １９９２）、および５番染色体の長腕上の１３個の遺伝子座（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：７０１−７０８， １９９１）の高解像度全ゲノム放射線ハイブリッド地図を作製するために使用されてきた。
【０３５７】
このほか、ＰＣＲに基づく技法およびヒト−齧歯動物体細胞ハイブリッドを用いて、染色体上の二対立遺伝子マーカーの位置を判定することが可能である。そのような方法では、二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む増幅産物を産生することのできるオリゴヌクレオチドプライマー対をデザインする。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは１８〜２３ｂｐ長であり、ＰＣＲ増幅用としてデザインされる。既知配列からのＰＣＲプライマーの生成については当業者に周知である。ＰＣＲ技法の概説については、Ｅｒｌｉｃｈ， Ｈ．Ａ．， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．１９９２． Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０３５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でプライマーを使用することにより、全ヒトゲノムＤＮＡから鋳型を増幅する。ＰＣＲ条件は、以下のとおりである。８０ｎｇの各オリゴヌクレオチドプライマー、０．６単位のＴａｑポリメラーゼ、および１ｍＣｕの３２Ｐ標識デオキシシチジン三リン酸と共に、ＰＣＲ用の鋳型として６０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用する。９４℃、１．４分；５５℃、２分；および７２℃、２分を３０サイクルならびに７２℃、１０分の最終伸長の条件下でマイクロプレートサーモサイクラー（Ｔｅｃｈｎｅ）を用いてＰＣＲを行う。６％ポリアクリルアミドシークエンシングゲルにより増幅産物を解析し、オートラジオグラフィーで視覚化する。得られたＰＣＲ産物の長さが、二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む増幅産物について予想される長さと同一であれば、ヒト−齧歯動物体細胞ハイブリッドの２つのパネル、すなわち、ＢＩＯＳ ＰＣＲａｂｌｅ ＤＮＡ（ＢＩＯＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＮＩＧＭＳ Ｈｕｍａｎ−Ｒｏｄｅｎｔ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐａｎｅｌ Ｎｕｍｂｅｒ １ （ＮＩＧＭＳ， Ｃａｍｄｅｎ， ＮＪ）に由来するＤＮＡ鋳型を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。
【０３５９】
規定されたヒト染色体セットを含む一連の体細胞ハイブリッド細胞系に所与の二対立遺伝子マーカーが存在するかを、ＰＣＲを用いてスクリーニングする。体細胞ハイブリッドからＤＮＡを単離し、二対立遺伝子マーカーに由来するプライマー対を用いたＰＣＲ反応用の出発鋳型として使用する。二対立遺伝子マーカーに対応するヒト配列を含む染色体をもつ体細胞ハイブリッドだけから増幅断片が生じるであろう。体細胞ハイブリッドＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ産物の分離パターンを解析することにより、二対立遺伝子マーカーを染色体に割り当てる。増幅断片を生じるすべての細胞ハイブリッドに存在する単一のヒト染色体は、二対立遺伝子マーカーを含む染色体である。体細胞遺伝子マッピング実験の技法および結果の解析の概説については、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６：４７５−４８１（１９９０）を参照されたい。その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０３６０】
実施例２には、ゲノムＤＮＡライブラリーから得られたクローン（たとえば、ＢＡＣクローン）上での二対立遺伝子マーカーの位置を決定するための好ましい方法が記載されている。そのような手順を用いて、所定の二対立遺伝子マーカーをもつ多数のＢＡＣクローンを単離することができる。実施例１に記載されているようなＳＴＳスクリーニングを行うことにより、これらのＢＡＣクローンのヒトゲノム上での位置を規定することができる。好ましくは、試験対象のＳＴＳの数を減らすために、以下の実施例３および４に記載されているような手順により、染色体領域または亜染色体領域上での各ＢＡＣの局在位置を決定することができる。この局在位置がわかれば、同定された染色体領域または亜染色体領域に対応するＳＴＳのサブセットを選択することができるだろう。ＳＴＳのそのようなサブセットを用いて各ＢＡＣを試験し、ゲノムに沿ったＳＴＳの位置および順序を考慮することにより、ゲノムに沿った対応する二対立遺伝子マーカーの位置を正確に決定することができるだろう。
【０３６１】
他の実施形態では、所定の二対立遺伝子マーカーを保有するＢＡＣインサートまたは任意のタイプのゲノムＤＮＡ断片を単離するために使用したＤＮＡライブラリーがすでにゲノムまたはその任意の部分の物理的地図を構成している場合、そのＤＮＡ断片の既知の順序を用いて、確定しようとする二対立遺伝子マーカーの順序を決定することができるだろう。
【０３６２】
上述したように、ゲノムＤＮＡの同一断片（例えば、ＢＡＣクローン中のインサート）に含まれるマーカーについては単点またはハプロタイプ関連解析を行ううえでそのゲノム断片内での相互の順序を必ずしも決定する必要はないことは理解されよう。しかしながら、本発明に係る地図の他の実施態様では、ゲノムＤＮＡの同一断片に含まれる二対立遺伝子マーカーの順序を決定してもよい。
【０３６３】
本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーの亜染色体中の局在位置の決定について本明細書に記載するが、本発明の地図を構築するために使用されるさらなる二対立遺伝子マーカーの位置を蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により割り当てることができる（Ｃｈｅｒｉｆら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７：６６３９−６６４３（１９９０）、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）。ＦＩＳＨ解析については実施例３で説明する。
【０３６４】
順序づけ解析を行うことにより、約２０，０００、４０，０００、６０，０００、８０，０００、１００，０００、１２０，０００種の二対立遺伝子マーカーを含みかつ１個のＢＡＣあたりほぼ妥当な数の二対立遺伝子マーカーを有する統合全ゲノム遺伝子地図を作製することが可能である。いくつかの実施形態では、地図には、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の配列またはそれに相補的な配列からなる群より選択された１種以上のマーカーが含まれる。
【０３６５】
このほか、より小さなゲノム部分（たとえば、１セットの染色体、単一の染色体、特定の亜染色体領域、または他の任意の望ましいゲノム部分）を含みかつ１個のＢＡＣあたり先に指定した平均数の二対立遺伝子マーカーを有する地図を本明細書に記載の手順により構築することもできる。
【０３６６】
いくつかの実施態様では、地図内の二対立遺伝子マーカー間の平均距離は、１０〜２００ｋｂ、１５〜１５０ｋｂ、２０〜１００ｋｂ、１００〜１５０ｋｂ、５０〜１００ｋｂ、または２５〜５０ｋｂである。以上で指定されたマーカー間距離を有しかつより小さなゲノム部分（たとえば、１セットの染色体、単一の染色体、特定の亜染色体領域、または他の任意の望ましいゲノム部分）を含む地図を本明細書に記載の手順により構築することもできる。
【０３６７】
図２は、ランダムに分布させた１セットの二対立遺伝子マーカーについてマーカー間距離の分布をコンピューターでシミュレートした結果を示したものであり、この図から、ゲノム地図内における所与の数のマーカー／ＢＡＣに対する所与の離間距離の二対立遺伝子マーカーの割合がわかる（全ゲノムをカバーする最小限のオーバーラップをもつアレイを構成する２０，０００個のＢＡＣを評価したと仮定する）。各シミュレーションで１００回の反復を行った（２０，０００マーカー地図、４０，０００マーカー地図、６０，０００マーカー地図、１２０，０００マーカー地図）。
【０３６８】
図２Ａに示されているように、６０，０００個の均一に分布したマーカーを作製したと仮定すると（１個のＢＡＣあたり３個）、マーカー間距離の９８％は１５０ｋｂ未満であり、４０，０００個の均一に分布したマーカーを作製したと仮定すると（１個のＢＡＣあたり２個）、マーカー間距離の９０％は１５０ｋｂ未満であり、２０，０００個の均一に分布したマーカーを作製したと仮定すると（１個のＢＡＣあたり１個）、マーカー間距離の５０％は１５０ｋｂ未満であろう。
【０３６９】
図２Ｂに示されているように、１２０，０００個の均一に分布したマーカーを作製したと仮定すると（１個のＢＡＣあたり６個）、マーカー間距離の９８％は８０ｋｂ未満であり、６０，０００個の均一に分布したマーカーを作製したと仮定すると（１個のＢＡＣあたり３個）、マーカー間距離の８０％は８０ｋｂ未満であり、２０，０００個の均一に分布したマーカーを作製したと仮定すると（１個のＢＡＣあたり１個）、マーカー間距離の１５％は８０ｋｂ未満であろう。
【０３７０】
先に述べたように、高密度二対立遺伝子マーカー地図を用いて関連研究を行うと、複雑な形質に関与する遺伝子を同定することができる。
【０３７１】
表７には、本明細書に記載されている二対立遺伝子マーカーのゲノム内位置が提示されている。列挙されているのは、実施例３の方法を用いてかつ発表済および未発表のＳＴＳに対してＢＡＣ配列をスクリーニングすることにより二対立遺伝子マーカーが割り当てられた染色体領域および亜領域である。表７に列挙されているマーカーの位置は、隣接するＳＴＳが公に入手可能な位置である。「隣接ＳＴＳ」の欄には、対象の二対立遺伝子マーカーと同一のＢＡＣ上に局在位置が決定されたＳＴＳの公的受託番号および該ＳＴＳの別名が提示されている。先に述べたように、表７に提示されているマーカー局在位置はすべて、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法および周知のＳＴＳスクリーニングにより確定したものである。
【０３７２】
連鎖不平衡
次に、本発明はまた、以上に記載の特異的な二対立遺伝子マーカーと連鎖不平衡状態にあって所与の形質との関連の点で類似の特徴を示すと予想される二対立遺伝子マーカーに関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれらと相補的な配列と連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーに関する。
【０３７３】
適切なヘテロ接合率を有する１セットの二対立遺伝子マーカー間のＬＤは、５０〜１０００、好ましくは７５〜２００、より好ましくは約１００の血縁関係のない個体の遺伝子型を決定することにより求めることができる。二対立遺伝子マーカーの遺伝子型の決定は、二対立遺伝子マーカーの所与の多型塩基位置で個体が有する特異的な対立遺伝子を決定することからなる。遺伝子型の決定は、二対立遺伝子マーカーの作製に関連して先に記載した方法と類似の方法を用いて、または以下にさらに記載されているような他の遺伝子型判定法を用いて行うことができる。
【０３７４】
全ゲノム連鎖不平衡マッピングは、いかなる形質誘発対立遺伝子を探索する場合でも、該形質誘発対立遺伝子と連鎖不平衡状態にある少なくとも１種の二対立遺伝子マーカーを同定することを目的としている。好ましくは、連鎖不平衡地図の検出力を高めるためには、いくつかの実施態様では、地図内の二対立遺伝子マーカーのマーカー間平均距離は、より短いマーカー間距離が連鎖不平衡の検出に必要とされるゲノム領域もあるという事実にかんがみて、１５０ｋｂ以下、７５ｋｂ以下、５０ｋｂ以下、３０ｋｂ以下、または２５ｋｂ以下である。
【０３７５】
本発明により、マーカー間平均距離が１５０ｋｂ以下の二対立遺伝子マーカー地図を作製する方法が提供される。いくつかの実施態様では、高密度地図を構成する二対立遺伝子マーカー間の平均距離は、７５ｋｂ未満、好ましくは５０ｋｂ未満であろう。本発明に係るさらに好ましい地図は、３７．５ｋｂ未満の離間距離を有するマーカーを含む。非常に好ましい実施態様では、非常に高密度の地図を構成する二対立遺伝子マーカーのマーカー間平均距離は、３０ｋｂ未満、最も好ましくは２５ｋｂ未満である。
【０３７６】
二対立遺伝子マーカー（配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれらと相補的な配列を含む）を含む遺伝子地図を用いて、検出可能な形質に関連する遺伝子を同定し、単離することができる。本発明の遺伝子地図の使用を下記により詳細に記載する。
【０３７７】
ＶＩＩＩ． 検出可能な形質に関連する遺伝子を同定するための高密度二対立遺伝子マーカー地図の使用
本発明の１実施形態には、本発明の二対立遺伝子マーカー地図を用いて、検出可能な形質に関連する遺伝子を同定および単離する方法が含まれる。
【０３７８】
旧来、検出可能な形質に関連する遺伝子の同定は、連鎖解析と呼ばれる統計的手法に依拠するものであった。連鎖解析は、ある家系内の全世代にわたり遺伝子マーカーの伝播と特定の形質の伝播との相関関係を実証することに基づく。この方法では、１０Ｍｂにつき１個の平均密度で分布する数百個のマーカー（典型的には、マイクロサテライトマーカー）を用いて、一連の罹患家系のすべてのメンバーの遺伝子型を決定する。すべての家系メンバーの遺伝子型を比較することにより、対立遺伝子のセットを親の半数体ゲノムに割り当てることができる（ハプロタイプ決定または相判定）。次に、全家系の子孫において、組換えられた断片の起源を判定する。形質と共分離するマーカーを追跡する。全家系からのデータをプールした後、統計的方法を用いて、全家系においてマーカーと形質が独立に分離する尤度を決定する。統計解析の結果として、形質と関連する遺伝子を有する確率が高い１領域またはいくつかの領域を、さらなる解析の候補として選択する。マーカーと形質が独立に分離する可能性が１／１，０００未満である場合（ＬＯＤスコア＞３で表される）、連鎖解析の結果は有意であるとみなされる（すなわち、その領域が検出可能な形質に関与する遺伝子を含んでいる確率が高い）。一般に、連鎖解析を用いて同定される候補領域の長さは、２〜２０Ｍｂである。
【０３７９】
上述したように候補領域が同定されれば、さらなるマーカーを用いて組換え個体を解析することにより、候補連鎖領域をさらに図で示すことができる。
【０３８０】
連鎖解析研究は、一般的には、最大５，０００個のマイクロサテライトマーカーの使用に依拠するものであった。したがって、連鎖解析の達成可能な最大理論解像度は、平均で約６００ｋｂに制限される。
【０３８１】
連鎖解析は、明らかなメンデル遺伝パターンを示しかつ高い浸透度を有する単純な遺伝形質をマッピングすることにうまく利用されてきた（浸透度とは、形質陽性の対立遺伝子ａ保因者の数と集団内のａ保因者の全数との比率である）。過去１０年間にわたり、連鎖解析を用いて、約１００種の病理学的形質誘発遺伝子が発見された。これらの症例のほとんどで、罹患個体の大多数が親類に影響を及ぼしており、一般集団では、検出可能な形質は希であった（０．１％未満の頻度）。アルツハイマー病、乳癌、ＩＩ型糖尿病などの約１０の症例では、検出可能な形質はより一般的なものであったが、検出可能な形質に関連する対立遺伝子は罹患集団で希であった。したがって、これらの形質に関連する対立遺伝子は、すべての散発症例における形質の原因ではなかった。
【０３８２】
連鎖解析はさまざまな欠点を抱えている。第１に、連鎖解析は、研究対象の各形質に適した遺伝モデルの選択に依拠することが原因で制約を受ける。さらに、すでに述べたように、連鎖解析を用いて達成しうる解像度には限界があり、連鎖解析により最初に同定された典型的な２Ｍｂ〜２０Ｍｂ領域の解析を手直しするために、補足研究が必要である。
【０３８３】
さらに、複数の遺伝子および／または環境因子の作用の組み合わせに起因した遺伝形質のように複雑な遺伝形質に適用する場合、連鎖解析法は困難であることがわかっている。そのような場合、Ｒｉｓｃｈ，Ｎ．およびＭｅｒｉｋａｎｇａｓ，Ｋ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１５１６−１５１７（１９９６）、この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）により最近論じられたように、これらの状況に連鎖解析を適用するのに必要とされる適切な数の罹患家系を募集するには、必要な労力および費用があまりにも大きすぎる。
【０３８４】
最後に、連鎖解析は、情報の得られる大きな家系を利用できない形質を研究する場合には適用できない。典型的には、これは、薬物治療に対する陽性または陰性の応答に関連する対立遺伝子のように散発症例が関与する形質誘発対立遺伝子を同定しようとする試みの場合であろう。
【０３８５】
本発明の遺伝子地図および二対立遺伝子マーカー（配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれらと相補的な配列を含む）は、関連研究を用いて、検出可能な形質に関連する遺伝子を同定および単離するために使用することも可能である。これは、罹患家系の使用を必要とせず、散発形質に関連する遺伝子の同定を可能にする方法である。
【０３８６】
関連研究
すでに述べたように、所与の形質の原因または部分的原因となる遺伝子はいずれも、いくつかのフランキングマーカーと連鎖不平衡状態にあるであろう。そのような遺伝子をマッピングするために、形質の原因となる１種または複数種の遺伝子に関連するこれらのフランキングマーカーの特異的対立遺伝子を同定する。特定の形質に関連する１種または複数種の遺伝子を連鎖不平衡マッピングにより見いだす技法に関する以下の説明では、形質の原因となる単一の遺伝子の局在位置の決定について言及しているが、同じ技法を用いて、形質の部分的原因となる複数の遺伝子を同定することもできることは理解されよう。
【０３８７】
本明細書にさらに説明されているように、任意の所与の形質の原因となる遺伝子を同定するために本発明を使用しうることは理解されよう。しかしながら、本発明の二対立遺伝子マーカーは、肥満または関連障害の遺伝的決定因子を保有すると思われるゲノム領域に位置するので、検出可能な形質は、好ましくは、肥満障害であろう。上述したように、たとえば、肥満障害の例としては、肥満関連アテローム性動脈硬化症、肥満関連インスリン抵抗性、肥満関連高血圧症、肥満関連ＩＩ型糖尿病に起因する微小血管症性病変、ＩＩ型糖尿病を患った肥満個体の微小血管障害により惹起された眼の病変、およびＩＩ型糖尿病を患った肥満個体の微小血管障害により惹起された腎臓の病変が包含されうるが、これらに限定されるものではない。肥満関連障害には、高インスリン血症および高血糖症も含まれうる。
【０３８８】
関連研究は一般集団内で行うことが可能である（１罹患家系内またはいくつかの罹患家系内の血縁関係のある個体に対して行う研究に限定される上述した連鎖解析法とは対照的である）。
【０３８９】
二対立遺伝子マーカーＡと形質Ｔとの関連は、主として、二対立遺伝子マーカーと形質との３つの可能な関係の結果として生じうる。
【０３９０】
第１に、二対立遺伝子マーカーＡの対立遺伝子ａは形質Ｔの直接的原因となる可能性がある（たとえば、Ａｐｏ Ｅ∈４ ｓｉｔｅ Ａとアルツハイマー病）。しかしながら、遺伝子マッピング研究で用いられる二対立遺伝子マーカーの大多数はランダムに選択されるので、主として遺伝子の外側にマッピングされる。したがって、対立遺伝子ａが形質Ｔに直接関連する機能的変異である尤度は非常に低い。
【０３９１】
第２に、二対立遺伝子マーカーＡと形質Ｔとの関連はまた、二対立遺伝子マーカーが形質遺伝子座と非常に密接に連鎖している場合に生じる可能性がある。言い換えると、対立遺伝子ａが形質誘発対立遺伝子と連鎖不平衡状態にある場合に関連を生じる。二対立遺伝子マーカーが、形質の原因となる遺伝子に密接している場合、より網羅的に遺伝子マッピングすることにより、形質Ｔを有するヒトにおいて突然変異を有するマーカー遺伝子座の近傍に遺伝子（すなわち、形質の原因となる遺伝子または形質の原因となる複数の遺伝子のうちの１つ）を最終的に発見することができるだろう。以下でさらに説明するが、形質の原因となる遺伝子に密接する１群の二対立遺伝子マーカーを用いて、二対立遺伝子マーカーと形質との関連曲線のプロフィールから原因となる遺伝子の位置を推定することができる。原因となる遺伝子は、通常、形質と最も高い関連を示すマーカーの近傍に見いだされるであろう。
【０３９２】
最後に、形質をもつヒトと形質をもたないヒトが、同時に対立遺伝子ａの頻度についても異なった遺伝的に区別される集団サブセットに対応する場合（集団の層別化）、二対立遺伝子マーカーと形質との関連が生じる可能性がある。この現象は、同一民族に由来する多数の不均一サンプルを用いることで回避することができる。
【０３９３】
関連研究は、共通の多型を示し、かつ単因子遺伝の疾患の頻度よりも比較的高い頻度の多因子形質に関与する遺伝子を、効率的に同定するのに特に好適である。
【０３９４】
関連研究は、主として、４つのステップ、すなわち、明確に規定された表現型を有する形質陽性（Ｔ＋）集団と対照集団、好ましくは形質陰性（Ｔ−）集団を募集するステップ、形質誘発遺伝子を保有すると思われる候補領域を同定するステップ、該領域内の候補遺伝子からの該遺伝子を同定するステップ、最後に、該形質誘発遺伝子において形質の原因となる突然変異（複数個も可）を確定するステップからなる。
【０３９５】
第１のステップでは、形質陽性は、明確に規定されたものでなければならない。それと同時に、好ましくは、対照の表現型は、明確に規定された形質陰性表現型である。本明細書に記載されているような効率的で有意な関連研究を行うために、研究対象の形質は、好ましくは、研究対象の集団内で明らかに重ならない形質陽性と形質陰性の２つの表現型を示す二峰性分布に従わなければならない。
【０３９６】
それにもかかわらず、そのような二峰性分布が得られない場合でも（実際には、複雑な遺伝形質の場合がこれに相当すると思われる）、形質陽性群および好ましくは同様に形質陰性の表現型群に含まれる個体を注意深く選択することにより、同様に、本明細書で提案された相関解析法を用いて任意の遺伝形質を解析することが可能である。この選択手順には、理想的には、重なりがなく好ましくは極端な表現型を明瞭に示す個体がこれらの形質陽性集団および形質陰性集団に組み込まれるように、研究対象の形質の非二峰性表現型範囲の両端に位置する個体を選択することが含まれる。
【０３９７】
上述したように形質陽性集団および対照集団への組み込みの判定基準の定義は、本発明の重要な態様である。
【０３９８】
図３は、形質陽性サンプルと形質陰性サンプルとの対立遺伝子頻度差に関する種々の仮説に従って、高密度二対立遺伝子地図に由来する個々のマーカーを用いて行った関連研究で得た一連の仮定サンプルサイズに対するｐ値有意性を示している。このことから、いずれの場合においても、１５０〜５００個体のサンプルは、統計的有意性を得るのに十分な程度に数の多いサンプルであることがわかる。さらに数の多いまたは少ない群を用いて本発明の方法により関連研究を行うことができることは理解されよう。
【０３９９】
第２のステップでは、χ２統計検定（自由度１）により上記の形質陽性および形質陰性の集団における各二対立遺伝子マーカーの遺伝子型頻度を比較するマーカー／形質の関連研究を行う。この単一マーカー関連解析に加えて、ハプロタイプ関連解析を行うことにより、先祖保因者ハプロタイプの頻度およびタイプを規定する。ハプロタイプ解析は、二対立遺伝子マーカーセットの多くの情報を組合せることにより関連解析の検出力を高め、単一マーカー研究で生じるおそれのある偽陽性および／または偽陰性データを除去することができる。
【０４００】
遺伝子型判定は、実施例８に記載のマイクロシークエンシング法を含めたＩＩＩに記載の任意の方法を用いて、行うことができる。
【０４０１】
十分に高い密度の二対立遺伝子マーカーアレイを用いて形質との陽性の関連が同定された場合、形質との陽性の関連を示すマーカーが形質遺伝子座と連鎖不平衡状態にあるので、原因となる遺伝子は、関連するマーカーの近傍に物理的に位置づけられるであろう。特定の形質の原因となる遺伝子を有する領域の長さは、高密度の二対立遺伝子マーカーセットを用いた関連研究により同定すると、平均で、連鎖解析により同定された領域の長さの１／２０〜１／４０であろう。
【０４０２】
先に述べたように陽性の関連を確定した後、第３のステップは、関連解析で同定されたマーカーを有するＢＡＣインサートを完全に配列決定することからなる。これらのＢＡＣは、先に述べたようにマーカープローブおよび／またはプライマーを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。候補領域の配列決定および解析を行った後、適切なソフトウェアを用いて所定数の形質陽性および形質陰性の個体で候補領域内の機能配列（たとえば、エキソン、スプライス部位、プロモーター、および他の潜在的な調節領域）を走査して機能的領域の配列を比較することにより、形質の原因となる突然変異を調べる。配列解析用のツールについて実施例９でさらに説明する。
【０４０３】
次いで、最後に、以下に記載の遺伝子型判定法を用いて形質陽性および形質陰性の個体のより大きな集団をスクリーニングすることにより、候補突然変異を確定する。確定集団が試験集団における突然変異と形質との間に見いだされる関連の結果と適合する関連の結果を示した場合、多型が候補突然変異として確定される。
【０４０４】
実際には、候補遺伝子を有する領域を規定するために、適切な数の二対立遺伝子マーカーを用いて、形質陽性および形質陰性の集団の遺伝子型を決定する。マーカーには、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１のマーカーまたはそれらと相補的な配列が１種以上含まれていてもよい。
【０４０５】
候補遺伝子を有する領域を規定するために用いるマーカーは、１０〜２００ｋｂあたり１個のマーカーの平均密度で分布していてもよい。好ましくは、候補遺伝子を有する領域を規定するために用いるマーカーは、１５〜１５０ｋｂにつき１個のマーカーの平均密度で分布する。さらに好ましい実施形態では、候補遺伝子を有する領域を規定するために用いるマーカーは、２０〜１００ｋｂにつき１個のマーカーの平均密度で分布する。さらに他の好ましい実施形態では、候補遺伝子を有する領域を規定するために用いるマーカーは、１００〜１５０ｋｂにつき１個のマーカーの平均密度で分布する。さらに非常に好ましい実施形態では、候補遺伝子を有する領域を規定するために用いるマーカーは、５０〜１００ｋｂにつき１個のマーカーの平均密度で分布する。さらに他の実施形態では、候補遺伝子を有する領域を規定するために用いる二対立遺伝子マーカーは、２５〜５０キロ塩基につき１個のマーカーの平均密度で分布する。上述のように、連鎖不平衡に基づく地図の検出力を高めるために、好ましい実施態様では、対象のゲノム領域における連鎖不平衡分布を考慮して、それに合うように地図のマーカー密度を適合させるだろう。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、全ゲノム規模で行う場合には数千個の二対立遺伝子マーカーを含む予備的地図を用いて、検出可能な表現型に関連する遺伝子を有する候補ゲノム領域の最初の同定を行うことができる。その後、検出可能な形質の原因となる遺伝子を有するゲノム領域を、より多くの二対立遺伝子マーカーを含む地図を用いてさらに詳細に明確化することができる。さらに、検出可能な形質の原因となる遺伝子を有するゲノム領域を、二対立遺伝子マーカーの高密度地図を用いてさらに明確化することができる。最後に、検出可能な形質に関連する遺伝子を、非常に高密度の二対立遺伝子マーカー地図を用いて同定および単離することができる。
【０４０７】
他の実施形態では、検出可能な表現型に関連する遺伝子を保有すると思われる候補ゲノム領域を、高密度地図または対象の１つ以上のゲノム領域に位置する多数の二対立遺伝子マーカーを用いて明確化する。特に、所定のゲノム領域は、先に発明の背景の節で記載したゲノム領域であってよい。さらに、表現型は肥満障害であってよい。
【０４０８】
実施例６では、検出可能な形質に関連する遺伝子を有する候補領域を同定するための手順について説明し、該手順でシミュレートされた結果を提示する。実施例６では３，０００、２０，０００、および６０，０００個のマーカーを有する地図に由来するマーカーを用いたシミュレーション解析の結果を比較するが、地図に含まれるマーカーの数は、これらの例示的な数字に制限されるものではないことは理解されよう。もっと正確に言えば、実施例６は、マーカー密度の増加と共に、候補領域の正確さが増加することを例示している。解析に用いるマーカーの数が増加するにつれて、関連解析点は幅広いピークになる。研究対象の検出可能な形質に関連する遺伝子は、このピーク下にある領域の内部または近傍に存在するであろう。
【０４０９】
高密度マーカー地図を用いる連鎖不平衡マッピングの統計的検出力はまた、上述した単点関連解析をＩＶに記載のハプロタイプ解析の多マーカー関連解析で補完することにより増強される。マーカー密度を増加させた地図を用いて上述したように行われる個々のマーカーの関連解析の統計的検出力を向上させるために、ゲノム領域内で互いに近接して位置するマーカー群を用いてハプロタイプ研究を行うことができる。たとえば、３，０００個のマーカー、２０，０００個のマーカー、および６０，０００個のマーカーからなる地図を用いて個々のマーカーと検出可能な表現型との関連を解析する上述した方法により、そのような地図またはマーカー密度がさらに高い地図に由来する連続マーカー群を用いて一連のハプロタイプ研究を行うことができる。
【０４１０】
好ましい実施態様では、１Ｍｂを超える領域にまたがるマーカー群を含む一連の連続ハプロタイプ研究を行うことが可能である。いくつかの実施態様では、これらの各群に含まれる二対立遺伝子マーカーは、１ｋｂ未満、１〜５ｋｂ、５〜１０ｋｂ、１０〜２５ｋｂ、２５〜５０ｋｂ、５０〜１５０ｋｂ、１５０〜２５０ｋｂ、２５０〜５００ｋｂ、５００ｋｂ〜１Ｍｂ、または１Ｍｂを超えるゲノム領域内に位置してもよい。好ましくは、この連続ハプロタイプ解析に用いられる、二対立遺伝子マーカー群を含むゲノム領域は、重なっている。二対立遺伝子マーカー群は、上述した指定の長さのゲノム領域を完全にカバーする必要はなく、その代わりに１以上のギャップを含む不完全なコンティグから得たものであってもよいことは理解されよう。以下でさらに詳細に説明されているように、二対立遺伝子マーカーは、それらを有する対応する物理的コンティグの完全性に関係なく、単点関連解析およびハプロタイプ関連解析に用いることができる。
【０４１１】
十分な密度のマーカーアレイを用いる関連研究による全ゲノムマッピングを行えば、ｐ−値有意性閾値の個別的な最良の評価が可能である。約５０〜約５００個体またはそれ以上の個体からなる２つの同一民族形質陽性群および対照群を含む試験集団が与えられれば、上記の関連研究を行なって、たとえば、対立遺伝子頻度差の有意数を解析するにより、または適切な場合にはいくつかの症例について、実施例６、１５および２６に記載されているようなコンピューターシミュレーションもしくは対照研究を行うことにより、ｐ−値の「カットオフ」を設定することが可能であろう。
【０４１２】
ｐ−値が閾値を超える場合、形質と研究対象のマーカーとの対応する関連は有意でないとみなされ、一方、ｐ−値がそのような閾値未満である場合、該関連は有意であるとみなされるであろう。ｐ−値が有意であれば、形質誘発遺伝子についてマーカー周辺のゲノム領域をさらに詳細に調べることになろう。
【０４１３】
ｐ−値有意性閾値はそれぞれの症例／対照集団の比較に対して評価されることが好ましい。サンプリングされた集団間の遺伝距離（「層別化」）およびサンプルのランダム選択に起因する分散はいずれも、確かにｐ−値有意性閾値に影響を及ぼす可能性がある。
【０４１４】
任意の規模で（すなわち、全ゲノム、１セットの染色体、単一の染色体、特定の亜染色体領域またはゲノムの他の任意の望ましい部分にわたって）、上記の方法行いうることは理解されよう。上述したように、有意性閾値が設定されれば、図３に例示されているように、それに応じて集団サンプルサイズを適合させることが可能である。
【０４１５】
以下の実施例７および１５では、ハプロタイプ解析により関連研究にもたらされる統計的検出力が増加することを示す。
【０４１６】
アルツハイマー病形質誘発遺伝子の領域で約４０ｋｂに等しい平均密度の二対立遺伝子マーカーセットを用いた個体研究およびハプロタイプ研究から得られた実施例５および７に記載の結果から、形質誘発対立遺伝子周辺の約２００ｋｂゲノム領域内に位置する十分な情報提供量の二対立遺伝子マーカーはすべて、本発明により提供された方法を用いて形質誘発遺伝子の局在位置を決定するためにうまく使用できる可能性があることがわかる。この結論は、アルツハイマー病患者においてマーカー９９−３６５−３４４または９９−３５９−３０８とＡｐｏＥ ４ Ｓｉｔｅ Ａマーカーとの連鎖不平衡を測定することにより得られた結果によってさらに裏づけられる。すなわち、予想されるように、連鎖不平衡は関連研究を支える基礎であるので、これらのマーカー対間の連鎖不平衡は疾患集団 対 対照集団で増強された。同様に、ハプロタイプ解析により、対応する関連研究の有意性が増強された。
【０４１７】
所与の多型部位が見いだされ本発明の方法に従って二対立遺伝子マーカーとして特性づけされれば、ＩＩＩに記載されているようないくつかの方法を用いて所与の多型塩基において個体の有する特異的な対立遺伝子を決定することができる。
【０４１８】
検出可能な形質に関連する遺伝子の位置
高密度二対立遺伝子マーカー地図を用いて候補領域が明確化されれば、配列解析法により、該遺伝子の潜在的な機能的特性と共に、該領域内に位置するすべての遺伝子を検出することが可能であろう。同定された機能的特徴により、同定された遺伝子の中から好ましい形質誘発候補を選択することが可能でありうる。次に、より多くの二対立遺伝子マーカーを該候補遺伝子内に作製して、形質誘発遺伝子の同定を支援する改良された関連研究を行うために使用することが可能である。配列解析法については実施例９で説明する。
【０４１９】
実施例１０〜２２では、二対立遺伝子マーカーを用いる上記の方法を、大きな候補領域内で、複合病である前立腺癌に関連する遺伝子を同定するために適用することについて示す。前立腺癌に関連する遺伝子の同定のさらなる詳細については、１９９９年１０月２０日に出願された「ヒトゲノム高密度不平衡地図の構築に使用するための二対立遺伝子マーカー（Ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ）」という名称の米国特許出願中に与えられている。その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０４２０】
肥満に関連する遺伝子の魅力的な候補であった遺伝子中の二対立遺伝子マーカーを同定するためにも上記の方法を使用した。実施例２３〜２６では、本発明の方法を用いて研究対象の集団中の肥満および肥満関連障害の原因（少なくとも部分的原因）となるこの遺伝子をいかにして同定することが可能であったかを示す。肥満に関連する遺伝子の同定のさらなる詳細については、２０００年２月１０日に出願された「ＬＳＲ遺伝子の多型マーカー（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＬＳＲ ｇｅｎｅ）」という名称の米国特許出願中に与えられている。その開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０４２１】
このほか、検出可能な形質に関連する遺伝子を次のように同定することも可能である。形質に関連する遺伝子を保有すると思われる候補ゲノム領域は、本明細書に記載されているような技法を用いて同定しうる。そのような技法では、検出可能な形質を発現する個体および検出可能な形質を発現しない個体に由来する核酸サンプル中で、二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子頻度を比較する。このようにして、研究対象の検出可能な形質に関連する遺伝子を保有すると思われる候補ゲノム領域を同定する。
【０４２２】
候補領域内の検出可能な形質に関連する１個以上の遺伝子が存在することは、候補領域に存在するより多くの二対立遺伝子マーカーを同定することにより確証される。最初のハプロタイプ解析は、形質関連遺伝子を保有すると思われるゲノム領域内の二対立遺伝子マーカー群の可能な組み合わせのそれぞれについて行う。たとえば、それぞれの群は３種の二対立遺伝子マーカーを含んでもよい。マーカー群のそれぞれに対して、形質を発現する個体および形質を発現しない個体に可能なハプロタイプ（３種のマーカーからなる群では、８種の可能なハプロタイプがある）のそれぞれの頻度を推定する。たとえば、ＩＶに記載されているようにハプロタイプ推定法を適用する。たとえば、Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ ＬおよびＳｌａｔｋｉｎ Ｍ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． １２： ９２１−９２７ （１９９５）（その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）の期待値最大化法を用いてハプロタイプ頻度を推定することが可能である。
【０４２３】
形質を発現する個体および形質を発現しない個体においてグループ分けされたマーカーの可能なハプロタイプ（または個々のマーカーのそれぞれの対立遺伝子）のそれぞれの頻度を比較する。たとえば、χ２解析を行うことにより頻度を比較してもよい。それぞれの群内で、形質との最大の関連を有するハプロタイプ（またはそれぞれ個々のマーカーの対立遺伝子）を選択する。それぞれの二対立遺伝子マーカー群（または個々のマーカーのそれぞれの対立遺伝子）についてこの方法を繰り返して、関連値の分布を作製する。本明細書中では、この関連値の分布を「形質関連」分布と呼ぶことにする。
【０４２４】
形質関連遺伝子を保有すると思われないゲノム領域内の二対立遺伝子マーカー群のそれぞれの可能な組み合わせについて第２のハプロタイプ解析を行う。たとえば、それぞれの群は３種の二対立遺伝子マーカーを含んでもよい。マーカー群のそれぞれに対して、形質を発現する個体および形質を発現しない個体に可能なハプロタイプ（３種のマーカーからなる群では、８種の可能なハプロタイプがある）のそれぞれの頻度を推定する。
【０４２５】
形質を発現する個体および形質を発現しない個体においてグループ分けされたマーカーの可能なハプロタイプ（または個々のマーカーのそれぞれの対立遺伝子）のそれぞれの頻度を比較する。たとえば、χ２解析を行うことにより頻度を比較してもよい。それぞれの群内で、形質との最大の関連を有するハプロタイプ（または個々のマーカーの対立遺伝子）を選択する。それぞれの二対立遺伝子マーカー群（または個々のマーカーのそれぞれの対立遺伝子）についてこの方法を繰り返して、関連値の分布を作製する。本明細書中では、この関連値の分布を「ランダム」分布と呼ぶことにする。
【０４２６】
次に、形質関連分布とランダム分布を互いに比較してそれらの間に有意差があるか否かを決定する。たとえば、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位検定（Ｎｏｅｔｈｅｒ， Ｇ．Ｅ．（１９９１） Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ： 「Ｔｈｅ ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｗａｙ」， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮｅｗＹｏｒｋ， Ｂｅｒｌｉｎ。その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）もしくはＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定（Ｓａｐｏｒｔａ， Ｇ．（１９９０） 「Ｐｒｏｂａｌｉｔｅｓ， ａｎａｌｙｓｅ ｄｅｓ ｄｏｎｎｅｅｓ ｅｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｑｕｅｓ」 Ｔｅｃｈｎｉｐ ｅｄｉｔｉｏｎｓ， Ｐａｒｉｓ。その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）またはＷｉｌｃｏｘｏｎ順位検定とＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定の両者を用いて、形質関連分布とランダム分布とを比較することができる。
【０４２７】
形質関連分布とランダム分布との間に有意差があることが判明した場合、候補ゲノム領域は、検出可能な形質と関連する遺伝子を含有する可能性が高い。したがって、形質関連遺伝子を単離するために、候補ゲノム領域をさらに十分に評価する。このほか、上記解析を用いて形質関連分布とランダム分布が等しい場合、候補ゲノム領域は検出可能な形質と関連する遺伝子を含有する可能性はない。したがって、候補ゲノム領域のさらなる解析は行わない。
【０４２８】
実施例１０〜２６には、候補遺伝子が疾患の原因（少なくとも部分的原因）となることを確証するために、本発明の地図およびマーカーを用いて大きなゲノム領域内の複合病に関連する新しい遺伝子を同定することが示されているが、本発明の地図およびマーカーはまた、薬物応答、薬物毒性、または薬効を含む他の検出可能な表現型に関連する１種以上の二対立遺伝子マーカーまたは１つ以上の遺伝子を同定するために使用することも可能である。そのような薬物応答解析に使用されるかまたは本発明の方法を用いてそのような形質に関連することが示された二対立遺伝子マーカーは、特定の疾患（たとえば、薬物を作用させる対象となる疾患）の原因または部分的原因となる遺伝子内またはその近傍に位置するか、あるいは疾患の原因とならないまたは部分的な原因とならないゲノム領域内に位置する可能性がある。
【０４２９】
本発明に関連して、薬剤に対する「陽性の応答」とは、治療対象の疾患または状態に関連する症状の軽減を含むものとして定義することができる。本発明に関連して、薬剤に対する「陰性の応答」とは、薬剤に対する陽性の応答がなく、症状の軽減が認められないかまたは薬剤の投与後に副作用が観察されることを含むものとして定義することができる。
【０４３０】
薬効、応答および耐性／毒性は、アルツハイマー病、前立腺癌、高血圧症または糖尿病のような複合病と同じように遺伝的要素が関与する多因子形質と見なすことができる。したがって、ポジショナルクローニング法の後、たとえば、家系内の連鎖解析を行って遺伝子（１種もしくは複数種）の亜染色体中の位置を決めるにより、薬効および毒性に関与する遺伝子の同定を行うことが可能である。しかしながら、利用可能な家系症例が欠如しているため、実際には、薬物応答性に関してこのタイプの解析を行うことはできない。実際、特定の家系において２個体以上が同一の薬物に同時に暴露される可能性は非常に低い。したがって、薬効および毒性は単に散発形質として解析することができるにすぎない。
【０４３１】
疾患に罹患した患者群において関連研究により所与の薬物に対する個体の応答を解析するために、４群までスクリーニングを行って上記の技法により二対立遺伝子マーカーのパターンを決定する。４群とは以下のとおりである：
・疾患のない対照またはランダムな対照、
・疾患のある患者／薬物応答者、
・疾患のある患者／薬物非応答者、および
・疾患のある患者／薬物副作用。
【０４３２】
好ましい実施形態では、異なる群を規定する表現型が重ならないように、好ましくは極端な表現型であるように、以上に記載の特徴を有する表現型判定基準に従って上記の群を募集する。きわめて好ましい実施形態では、そのような表現型判定基準は先に述べた二峰性分布を有する。
【０４３３】
それぞれの薬物関連研究用の群の最終的な数および内容を、研究対象の集団内で上記の表現型の分布に適合させる。
【０４３４】
好適な集団を選択した後、本明細書に記載されているように関連およびハプロタイプの解析を行って、薬物応答、好ましくは薬物毒性または薬効に関連する１種以上の二対立遺伝子マーカーを同定することが可能である。そのような１種以上の二対立遺伝子マーカーの同定を行えば、個体に薬物を投与したときに薬物応答、好ましくは薬物毒性または薬効が得られるか否かを判定する診断テストを行なうことが可能になる。
【０４３５】
前立腺癌に関連する遺伝子および喘息を患う危険性のあることを示す二対立遺伝子マーカーを同定する上記の方法を利用して、他の検出可能な表現型に関連する遺伝子を同定することが可能である。特に、上記の方法は、配列番号１〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれらと相補的な配列を含む本発明の地図中に含まれる任意のマーカーまたはマーカーの組み合わせと共に使用することが可能である。上述したように、本発明の地図およびマーカーを用いて関連研究を行う一般的なストラテジーは、明確に規定された表現型により特性づけられた２群の個体（形質陽性個体および形質陰性対照）を走査して、これらの群のそれぞれにおいて二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子頻度を測定することである。好ましくは、それぞれの群において、約１５０ｋｂのマーカー間距離を有すマーカー頻度になるようにする。より好ましくは、それぞれの群において、約７５ｋｂのマーカー間距離を有すマーカー頻度になるようにする。さらにより好ましくは、それぞれの集団において、約５０ｋｂ、約３７．５ｋｂ、約３０ｋｂ、または約２５ｋｂのマーカー間距離を有すマーカー頻度を試験するだろう。
【０４３６】
いくつかの実施形態では、それぞれの集団において、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１からなる群より選択された二対立遺伝子マーカーまたはそれらと相補的な配列のうちの１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００種または全ての頻度を測定する。他の実施形態では、それぞれの集団において、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２および１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれらと相補的な配列と連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーからなる群より選択された少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、または１００種の二対立遺伝子マーカーの頻度を測定する。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、それぞれの集団において、約２０，０００または約４０，０００種の二対立遺伝子マーカーの頻度を決定する。きわめて好ましい実施形態では、それぞれの集団において、約６０，０００、約８０，０００、約１００，０００、または約１２０，０００種の二対立遺伝子マーカーの頻度を決定する。いくつかの実施形態では、１ｋｂ未満、１〜５ｋｂ、５〜１０ｋｂ、１０〜２５ｋｂ、２５〜５０ｋｂ、５０〜１５０ｋｂ、１５０〜２５０ｋｂ、２５０〜５００ｋｂ、５００ｋｂ〜１Ｍｂ、またはｌＭｂを超える領域にまたがる領域内に位置するマーカー群を用いて、ハプロタイプ解析を行うことが可能である。
【０４３８】
対立遺伝子頻度は、マイクロシークエンシング法を含めて、本明細書に記載されている任意の遺伝子型判定法を用いて測定することができる。好ましいハイスループットマイクロシークエンシング法については、ＩＩＩにさらに例示されている。さらに、また本明細書で意図される所期の目的に好適な他の任意の大規模な遺伝子型判定法を用いてもよいことは理解されよう。
【０４３９】
全ゲノム関連研究を開始するために十分に高密度の二対立遺伝子マーカー地図を使用することは必要でないことは理解されよう。次に、第１のステップで候補関連が確定されたＢＡＣにおいて最初に開始することで、より高密度の二対立遺伝子マーカーを有する地図（１個のＢＡＣあたり２個以上のマーカー、約７５ｋｂ以下のマーカー間平均距離）を作製することが可能である。候補関連が提案または確定されかつ二対立遺伝子マーカーが作製されている染色体領域は、「発明の背景」にさらに記載されている。
【０４４０】
１以上の候補領域があらかじめ明確化された場合、たとえば、特定の遺伝子またはゲノム領域が形質と関連すると思われるある場合、該ゲノム領域もしくは遺伝子またはそれらの一部分を保有するＢＡＣを用いて、１５０ｋｂあたり１個を超えるマーカーの密度を有する二対立遺伝子マーカー地図の局所的な抜粋を開発することが可能である。また、これらの場合、増大された密度、好ましくは１５０ｋｂごとに約１個〜７５ｋｂごとに約１個の密度を呈する二対立遺伝子マーカーのセット、より好ましくは、約５０ｋｂ未満、約３７．５ｋｂ未満、約３０ｋｂ未満、最も好ましくは約２５ｋｂ未満のマーカー間距離を有するマーカーのセットが使用されるであろう。
【０４４１】
また、候補領域内の二対立遺伝子マーカー群を用いてハプロタイプ解析を行うことも可能である。これらの群のそれぞれに含まれる二対立遺伝子マーカーは、１ｋｂ未満、１〜５ｋｂ、５〜１０ｋｂ、１０〜２５ｋｂ、２５〜５０ｋｂ、５０〜１５０ｋｂ、１５０〜２５０ｋｂ、２５０〜５００ｋｂ、５００ｋｂ〜１Ｍｂ、またはｌＭｂを超える領域にまたがるゲノム領域内に位置しうる。これらの二対立遺伝子マーカー群を含有する順序づけられたＤＮＡ断片はこれらの長さのゲノム領域を完全にカバーする必要はなく、その代わりに、１個以上のギャップを有する不完全なコンティグであってもよいことは理解されよう。以下でさらに詳細に論じられているように、マーカー間の連鎖不平衡を評価することができる限り、それらを保有する対応する物理的コンティグの完全性に関係なく、二対立遺伝子マーカーを関連研究およびハプロタイプ解析で使用することが可能である。
【０４４２】
上述したように、疾患あるいは薬効および／または毒性のような形質との陽性の関連を、本発明の二対立遺伝子マーカーおよび地図を用いて同定する場合、地図は、関連の確定だけでなく研究対象の形質に関与する遺伝子の同定へのショートカットを提供するだろう。上述したように、形質との陽性の関連を示すマーカーは形質遺伝子座と連鎖不平衡状態にあるので、原因となる遺伝子は物理的にこれらのマーカーの近傍に位置するであろう。高密度地図を用いて関連研究により同定される領域の長さは、平均で、連鎖解析により同定される領域の長さ（２〜２０Ｍｂ）の１／２０〜１／４０であろう。
【０４４３】
上述したように、本発明の高密度二対立遺伝子マーカー地図を用いて陽性の関連を確定した後、最高の関連を呈したマーカーの由来源であるＢＡＣを完全に配列決定し、ゲノム解析ツールを適用して原因となる遺伝子中の突然変異を探索する。上述したように、検出可能な形質に関連する遺伝子を保有する領域の配列決定および解析を行った後、適切なソフトウェアを用いて、候補機能領域（たとえば、エキソンおよびスプライス部位、プロモーターおよび他の調節領域）を走査し、所定数の対照および症例の配列と比較することにより、突然変異を調べる。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、原因となる突然変異を同定するために比較されている形質陽性サンプルは、祖先ハプロタイプを有するものの中から選択される。これらの実施形態では、対照サンプルは、該祖先ハプロタイプをもたない個体から選択される。
【０４４５】
さらなる実施形態では、原因となる突然変異を同定するために比較されている形質陽性サンプルは、祖先ハプロタイプにできるだけ近いハプロタイプを示すものの中から選択される。これらの実施形態では、対照サンプルは、症例集団について選択されたハプロタイプをまったく有していない個体から選択される。
【０４４６】
本発明の地図および二対立遺伝子マーカーはまた、多遺伝子性相互作用に起因する検出可能な形質に関連する二対立遺伝子マーカーのパターンを同定するために使用することも可能である。非連鎖遺伝子座における対立遺伝子間の遺伝的相互作用の解析を行うには、本明細書に記載されている技法を用いて個体の遺伝子型を決定する必要がある。適切なｐ−値を用いて所定のセットの二対立遺伝子マーカー中の対立遺伝子相互作用を解析することは、本発明の範囲内でさらに詳細に説明されている解析と同様に、ハプロタイプ解析と見なすことができる。
【０４４７】
ＩＸ． 既知遺伝子の特定の対立遺伝子に関連する検出可能な形質を呈すると思われる個体を同定するための二対立遺伝子マーカーの使用
全ゲノムレベル、全染色体レベル、亜染色体レベルで検出可能な形質に関連する遺伝子の探索に有用であることに加えて、本発明の地図および二対立遺伝子マーカーは、特定の検出可能な形質を呈すると思われる個体または検出可能な形質に関連する遺伝子の特定の対立遺伝子を保有している結果として特定の検出可能な形質を呈する個体を同定するために、より標的化された方法で使用することも可能である。たとえば、本発明の二対立遺伝子マーカーおよび地図は、特定の検出可能な形質と関連すると思われる既知の遺伝子の対立遺伝子を有する個体を同定するために使用することが可能である。特に、標的遺伝子は、個体を特定の疾患状態を患いやすくする対立遺伝子を有する遺伝子であってもよい。他の場合では、標的遺伝子は、薬物もしくは他の医薬組成物、食品または任意の投与化合物に対する個体の望ましいまたは望ましくない応答を示しやすくする対立遺伝子を有する遺伝子であってもよい。既知の遺伝子は、さまざまなタイプの生体分子のいずれかをコードしていてもよい。たとえば、そのような解析で標的化される既知の遺伝子は、破壊により検出可能な形質が惹起されうる代謝経路内の特定のステップに関与することが知られている遺伝子であってもよい。このほか、標的遺伝子は、受容体または受容体に結合するリガンドをコードする遺伝子（破壊により検出可能な形質が惹起されうる）、トランスポーターをコードする遺伝子、シグナリング活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、免疫応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子、造血に関与するタンパク質をコードする遺伝子、または創傷治癒に関与するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。標的遺伝子は特に先に列挙したものに限定されるものではなく、検出可能な形質と関連すると思われる既知の任意の遺伝子であってもよいことは理解されよう。
【０４４８】
先に述べたように、本発明の地図およびマーカーは、薬物応答に関連する遺伝子を同定するために使用することが可能である。本発明の二対立遺伝子マーカーはまた、薬物の臨床試験に組み入れる個体を選択するために使用することも可能である。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１のマーカーまたはそれらと相補的な配列は、検出可能な形質、たとえば、複合病もしくは望ましい／望ましくない薬物応答を発生する危険性のある個体を同定するかまたは該形質を呈する個体を同定するために、標的化された方法で使用してもよい。本発明は、本明細書に記載されている任意の二対立遺伝子マーカーと本明細書に特に記載されている形質を含めた任意の検出可能な形質との推定の関連を確定する方法を提供する。
【０４４９】
さらなる標的化された方法で本発明の地図およびマーカーを使用するために、上記の開示されたマーカーのいずれかと連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーを同定することが可能である。本発明の１種以上の二対立遺伝子マーカーが検出可能な形質に関連していることが示された場合、本明細書に提供されている方法に従って、関連づけられた該二対立遺伝子マーカーと連鎖不平衡状態にあるより多くの二対立遺伝子マーカーを作製し、それを用いて、該検出可能な形質を呈するかまたは呈すると思われる個体を同定することを目的とした標的化された方法を行うことが可能である。
【０４５０】
さらに、候補遺伝子が特定の検出可能な形質と関連するかまたは検出可能な形質を惹起すると思われる場合、該候補遺伝子と連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーを同定し、Ａｐｏ Ｅ遺伝子に対して先に利用した方法のような標的化された方法で使用することが可能である。
【０４５１】
検出可能な形質に関連するマーカーもしくは検出可能な形質に関連する遺伝子または関連すると思われる遺伝子と連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーは、単一マーカー解析、ハプロタイプ関連解析、または標的のマーカーまたは遺伝子の近傍に位置する二対立遺伝子マーカーを用いる上記の形質陽性および形質陰性の個体からのサンプルを対象とした連鎖不平衡測定を行うことにより同定される。このようにして、個体が標的のマーカーまたは遺伝子の特定の対立遺伝子をもつ結果として検出可能な形質を所有すると思われるかまたは所有するということを示唆する単一の二対立遺伝子マーカーまたは１群の二対立遺伝子マーカーが同定されうる。
【０４５２】
標的遺伝子の特定の対立遺伝子をもつ結果として検出可能な形質に対する素因または検出可能な形質の所有に関して試験される個体からの核酸サンプルを、以上に記載の診断法を用いて調べることが可能である。
【０４５３】
Ｘ． ＤＮＡタイピング法およびシステム
本発明にはまた、現在利用可能なＤＮＡタイピングシステムよりもかなり識別能力の高いＤＮＡタイピングシステムが包含される。システムおよび関連する方法は、法科学および親子鑑定のために個体を同定するのに特に適用可能である。これらの適用はますます重要になっており、法科学では、たとえば、多型解析による個体の同定が、証拠として法廷で広く承認されるようになっている。
【０４５４】
法医学の遺伝学者は、ＤＮＡの同種のセグメントを比較してセグメントが同一であるかまたはそれらの１ヌクレオチド以上が異なっているかを決定するための多くの技法を開発してきたが、いずれの技法にも依然としてある種の欠点がある。特に、これらの技法は、解析の費用、解析を行うのに要する時間および統計的検出力の点でかなり異なっている。
【０４５５】
ＲＦＬＰ解析法
法医学的ＤＮＡタイピングにおいて最もよく知られかつ最も広く普及している方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析である。ＲＦＬＰ試験では、個体ごとに異なる可変数縦列反復配列（ＶＮＴＲ）と呼ばれる反復ＤＮＡ配列を解析する。コア反復配列は、典型的には約１５塩基対の長さの配列であり、高多型性のＶＮＴＲ遺伝子座は、平均で約２０個の対立遺伝子を有することもある。ＶＮＴＲの両側に位置するＤＮＡ制限部位を利用して、約０．５Ｋｂ〜１０Ｋｂ未満のＤＮＡ断片を形成し、次に、それを電気泳動により分離し、個体の特定の遺伝子座で見いだされた反復配列の数を明らかにする。ＲＦＬＰ方法は、一般的には、（１）ＤＮＡの抽出および単離、（２）制限エンドヌクレアーゼ消化、（３）電気泳動によるＤＮＡ断片の分離、（４）キャピラリー転移、（５）放射能標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーション、（６）オートラジオグラフィー、および（７）結果の解釈からなる（Ｌｅｅ， Ｈ． Ｃ．ら， Ａｍ． Ｊ． Ｆｏｒｅｎｓｉｃ． Ｍｅｄ． Ｐａｔｈｏｌ． １５ （４）： ２６９−２８２ （１９９４））。ＲＦＬＰ法は、一般的には、約５ヶ所の遺伝子座での解析を組み合わせる。また、ＶＮＴＲの多型性が高いので、他の利用可能な試験よりも高い識別能力を有している。しかしながら、オートラジオグラフィーは高価で、しかも時間がかかり、解析は、一般にターンアラウンド（ｔｕｒｎａｒｏｕｎｄ）に数週間または数か月を要す。さらに、大量のサンプルＤＮＡが必要であり、犯罪現場では入手不可能であることが多い。そのうえ、電気泳動で離間距離の小さいバンドを解析するので、誤差の割合が大きく、システムの信頼性および証拠として信憑性は低い。
【０４５６】
ＰＣＲ法
ＰＣＲに基づく方法は、ＲＦＬＰ法の代替法である。ＡｍｐＦＬＰと呼ばれる第１の方法では、ＶＮＴＲを含有するＤＮＡ断片を増幅し、次に、電気泳動により分離するので、ＲＦＬＰ法のときのような制限ステップはない。この方法では小量のサンプルＤＮＡを使用することで済み、オートラジオグラフィーを用いないので解析時間が短く、高い識別能力が保持されるが、それにもかかわらず、かなりの時間を要しかつ有意な誤差率を高くする電気泳動分離が必要である。他のＡｍｐＦＬＰ法では、２〜８塩基対の短い縦列反復配列（ＳＴＲ）を解析する。ＳＴＲは、より小さな増幅断片を必要とするので、分解されたＤＮＡサンプルの解析により適しているが、増幅断片の分離が必要であるという欠点がある。ＳＴＲは、より長い反復配列よりもかなり情報量が少ないが、単一の解析で十分なＳＴＲを使用すれば、類似の識別能力を達成することができる。
【０４５７】
他の方法は、ミトコンドリアＤＮＡの配列決定を行うことを含むものであり、サンプルＤＮＡがかなり分解されているかまたは少量であるときに特に適している。しかしながら、Ｄループ遺伝子座と呼ばれるミトコンドリアＤＮＡのわずか１Ｋｂの小さな領域は、多型性であるため、タイピングに有用であることが見いだされ、ＲＦＬＰ法またはＡｍｐＦＬＰ法よりも識別能力が低い。さらに、ＤＮＡ配列決定は、多数のサンプルを用いて行われるので高価なものとなる。
【０４５８】
さらなる利用可能な方法としては、多型部位の１個の対立遺伝子に特異的な配列にハイブリダイズする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いることを含むドットブロット法が挙げられる。このシステムとしては、Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．で開発された約１／２０の識別値を有するＨＬＡ ＤＱ−αキット、および５個の遺伝子座を組み合わせて約数千分の１の識別値を示すＰｏｌｙｍａｒｋｅｒストリップと呼ばれるドットブロットストリップが挙げられる。（Ｗｅｅｄｎ， Ｖ．， Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂ． Ｍｅｄ． １６（１）： １８７−１９６ （１９９６））。
【０４５９】
解析の困難さおよび時間のかかる実験手順に加えて、すべてのＤＮＡタイピングシステムは依然としてより高い識別能力を有することが望まれる。いくつかの適用例が存在するが、最高の識別度の試験でさえも、そのような解析から得られる結果は依然としてかなり疑わしいので、そうした疑いをなくすように改良が必要である。下記の表１ｂは、現在利用可能な法医学試験システム（Ｗｅｅｄｎ（１９９６））の特徴を列挙し、それらを本発明の方法と比較したものである。
【０４６０】
2004504037.tif 000007
【０４６１】
適用例
上述したように、ＤＮＡタイピング試験の重要な適用例は、ＤＮＡサンプル（たとえば、犯罪現場からのサンプル）がそのＤＮＡサンプルを残してきたと推測される個体に由来するものか否かを決定することである。
【０４６２】
特に強力な遺伝子型判定システムを必要とするＤＮＡタイピングのいくつかの適用例がある。第１の適用例では、たとえば、米国連邦捜査局（Ｕ．Ｓ． Ｆｅｄｅｒａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）により管理されているようなＤＮＡプロフィールデータベースを探索することにより容疑者の身元を明らかにする場合、高い検出力のタイピングシステムが有利である。データベースは常に増大すると予想される多数のデータエントリーを保有しうるので、現在使用されている法医学システムは、相対的検出力の不足が原因でいくつかの一致するＤＮＡプロフィールを同定すると予想されうる。データベース検索は一般的には他の可能な容疑者を除外することにより証拠を固めるが、数人の個体が同定されるような低い検出力のタイピングシステムでは、多くの場合、被告に対する申し立てが全般的に行いにくくなる傾向がある。
【０４６３】
他の適用例では、ＤＮＡサンプルと同一のＤＮＡプロフィールを有する個体を同定するために、標的集団を系統的に試験する。そのような状況では、罪のない個体の大きな集団からのＤＮＡプロフィールに基づいてランダムに被告を選択する。試験対象の集団はしばしばかなり大きいこともあり、その場合には、少なくとも１つの陽性の一致が同定されて、集団を網羅的に試験することは通常できないので、証拠の有用性は、法医学検査の有意レベルに依存するであろう。そのような適用で単一のまたは主要な証拠源として役立つようにするために、かなり高い識別能力のＤＮＡタイピングシステムが必要である。
【０４６４】
さらなる他の適用例では、血縁関係のある個体を識別できることが望ましい。血縁関係のある個体は多型部位で対立遺伝子の大部分を共有すると予想されるので、それらを識別するためには、非常に高い検出力のＤＮＡタイピングアッセイが必要になるであろう。サンプルが被告のＤＮＡプロフィールと一致することが判明し、加害者は親族であるという証拠を見いだすことができない場合、これは重要な影響を及ぼしうる。
【０４６５】
したがって、当技術分野では、個体間の関係および関連度の差を判定するために、非常に高い解像度値を有する高速で、単純で、低価格で、および高精度の技法が必要である。また、当技術分野では、ごく少量の初期ＤＮＡサンプルを使用するが非常に正確な結果を生じる非常に正確な遺伝関係試験手順が必要である。
【０４６６】
したがって、本発明には、生物学的サンプルにおいて遺伝子マーカーのセットでヌクレオチドの正体を判定することを含む、個体の同定方法が包含される。ここで、該遺伝子マーカーのセットには、少なくとも１つの地図関連二対立遺伝子マーカーが含まれる。本発明は、現用の法医学タイピングシステムで使用されている遺伝子マーカーよりも高い識別能力を可能にする二対立遺伝子マーカーの広範なセットを提供する。また、現用の法医学タイピングシステムで使用されている遺伝子マーカーよりも高い効率および精度で、個体の二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を判定することができる。好ましい実施形態では、本発明には、単一ヌクレオチドプライマー伸長により地図関連二対立遺伝子マーカーでヌクレオチドの正体を決定することが包含される。この場合、上述した技法のような電気泳動は必要でなく、実験誤差率は減少する。上記の表１ｂに示されているように、数千〜数百万の識別能力を可能にするＰＣＲに基づくＶＮＴＲベースの方法および最適な状態を仮定してもわずか数百万〜数十億の識別能力を可能にするＲＦＬＰに基づく方法と比較して、本発明の二対立遺伝子マーカーに基づく方法は、識別能力のかなりの増加を提供する。
【０４６７】
本発明の遺伝子マーカーおよび二対立遺伝子マーカーの任意の好適なセットを使用することができ、そして所望の識別能力に応じて選択することが可能である。二対立遺伝子マーカー、二対立遺伝子マーカーのセット、プローブ、プライマーおよび該二対立遺伝子マーカーの正体を判定する方法について、さらに本明細書で説明する。
【０４６８】
二対立遺伝子マーカータイピングの識別能力
識別能力の計算
法医学試験の識別能力は、積の法則（ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｕｌｅ）を適用することにより、ランダムマッチ確率とも呼ばれるプロフィール頻度により決定することができる。積の法則には、試験対象のすべての個々の対立遺伝子の対立遺伝子頻度を乗じることおよびそれぞれのヘテロ接合遺伝子座に対して追加因子２を乗じることが含まれる。
【０４６９】
以下で論じる１例では、法科学に関連して、二対立遺伝子マーカータイピングの識別能力を検討することができる。遺伝的タイピングシステムに使用する二対立遺伝子マーカーの数に対して識別能力を決定するために、次の式および計算を仮定する：（１）研究対象の集団は十分に大きい（したがって、血縁関係はないと仮定することができる）；（２）選択されたすべてのマーカーには相関はなく、したがって積の法則（ＬａｎｄｅｒおよびＢｕｄｌｏｗｌｅ （１９９２））を適用することができる；および（３）上限則（ｃｅｉｌｉｎｇ ｒｕｌｅ）を適用することができるか、または研究対象の集団においてマーカーの対立遺伝子頻度が十分な確度でわかっている。
【０４７０】
Ｗｅｉｒ， Ｂ． Ｓ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＩＩ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．， Ｉｎｃ．， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ， ＵＳＡ， １９９６に記載されているように、この例は、犯罪が行われ、加害者（Ｐ）からのＤＮＡのサンプルが解析に利用できると仮定する。いくつかの遺伝子マーカーについてこのＤＮＡサンプルの遺伝子型を決定することができ、それにより加害者のプロフィールＡを決定することができる。
【０４７１】
この例では、１容疑者（Ｓ）をタイピングに利用することができる。本発明の二対立遺伝子マーカーのような遺伝子マーカーの同一セットをタイプ分けし、（Ｓ）および（Ｐ）について同一のプロフィールＡを得る。従って次のように２つの仮説を設ける：
2004504037.tif 000008
【０４７２】
次に、次式を用いて両者の確率の比Ｌを計算することができる：
2004504037.tif 000009
【０４７３】
次いでさらに次式によってＬを計算することができる：
2004504037.tif 000010
【０４７４】
これらの確率およびＬは、いくつかの設定条件で、特に、遺伝子マーカーについてＰとＳとの間で異なる親縁係数について設定して、計算することができる （Ｗｅｉｒ， （１９９６）を参照）。
【０４７５】
選択された遺伝子マーカーがすべて互いに独立していると仮定すると、１セットの遺伝子マーカーに対する大域比Ｌは、すべてのＬのそれぞれの遺伝子マーカーについての積になるであろう。
【０４７６】
さらに、次式を用いて確率変数Ｌの期待値を計算することにより、比Ｌを１０８または１０６に等しくするのに必要な二対立遺伝子マーカーまたはＶＮＴＲの平均数を推定することができる：
2004504037.tif 000011
（式中、Ａｉｊは、ｉ番目のマーカーの遺伝子型ｊであり、Ｌｉｊは、そのような遺伝子型に関連づけられる比率であり、Ｇｉは、遺伝子座ｉの遺伝子型の数である）。Ｌｉの期待値がこのマーカーの可能な遺伝子型の数Ｇｉであることは、式１から容易に誘くことができる。
【０４７７】
次に、１セットの遺伝子マーカーに対する全体的期待値を次式により表すことができる：
2004504037.tif 000012
【０４７８】
二対立遺伝子マーカーに基づくＤＮＡタイピングシステム
以上に記載の式を用いて、所望の識別能力を有する二対立遺伝子マーカーに基づくＤＮＡタイピングシステムを選択することができる。
【０４７９】
したがって、二対立遺伝子マーカーを用いて、Ｅ（Ｌ）を３Ｎとして表すことができる。ＶＮＴＲに基づくＤＮＡタイピングシステムを用いる場合、ＶＮＴＲが１０個の対立遺伝子を有すると仮定すると、Ｅ（Ｌ）を５５Ｎとして表すことができる。これらの結果に基づいて、平均で少なくとも１０６または１０８の比率を得るのに必要な二対立遺伝子マーカーまたはＶＮＴＲの数を計算することができ、以下の表ｌｃに示す。
【０４８０】
2004504037.tif 000013
【０４８１】
したがって、第１の実施形態では、本発明のＤＮＡタイピングシステムおよび方法には、二対立遺伝子マーカーにわたるＬの一様な分布を仮定して、少なくとも１０６または１０８の比率を得るために少なくとも１３種または少なくとも１７種の二対立遺伝子マーカーからなるセットの遺伝子型を決定することが含まれうる。好ましい実施形態では、より大きいＬ値を得るために、より多くの二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を決定する。好ましくは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１３、１５、１７、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００、１５０種、またはすべての地図関連二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を決定する。本発明の該ＤＮＡタイピングシステムでは、以下の表１ｄに列挙されているようなＬ値が得られるであろう。これらの値は、本発明のシステムの識別能力を示すものである。
【０４８２】
2004504037.tif 000014
【０４８３】
Ｌの分布が一様でない場合、たとえば、加害者に関してそれぞれの遺伝子座の主要対立遺伝子がホモ接合であり、したがって、Ｌが最低の値をとる場合のような最悪の場合では、同一の識別能力を得るのにより多くの二対立遺伝子マーカーが必要になる。したがって、好ましい実施形態では、より多くの二対立遺伝子マーカーを用いる本発明のＤＮＡタイピングシステムおよび方法は、二対立遺伝子マーカーにわたるＬの分布が一様でない場合にも対処できるものである。たとえば、血縁関係のない個体、０．１／０．９の対立遺伝子頻度を有する独立したマーカーのセット、および主要な対立遺伝子についてそれぞれの遺伝子座でホモ接合体の遺伝的プロフィールを仮定した場合、１０６の比率を得るには６６種の二対立遺伝子マーカーが必要であり、１０８の比率を得るには８８種の二対立遺伝子マーカーが必要である。したがって、十分に高い頻度の主要対立遺伝子を有するマーカーの使用に基づく好ましい実施形態では、これは、ＤＮＡタイピングシステムに必要なマーカーの上限の一次評価である。
【０４８４】
さらなる実施形態では、親族を識別する能力を有していることも望まれる。血縁関係のない個体では遺伝的プロフィールを共有する確率は低いが、親族の場合には確率は大幅に増大する。たとえば、容疑者のＤＮＡプロフィールが、犯罪現場におけるサンプルのＤＮＡプロフィールと一致することにもなるので、タイプ分けされていない親族がいる場合には同一のＤＮＡプロフィールが得られる確率が必要となる。以下の表ｌｅ （Ｗｅｉｒ （１９９６））は、対立遺伝子ＡｉおよびＡｊならびに集団頻度ｐｉおよびｐｊを仮定していくつかの異なるタイプの関係について確率を列挙し、０．１の対立遺伝子頻度を有する遺伝子座を仮定して尤度比を列挙したものである。
【０４８５】
2004504037.tif 000015
【０４８６】
１例として、容疑者が加害者と同父母の兄弟である場合、それぞれの二対立遺伝子マーカーで主要対立遺伝子についてホモ接合体であるというプロフィールを仮定すると、必要な二対立遺伝子マーカーの数は１８７であろう。
【０４８７】
さらなる実施形態では、本発明のＤＮＡタイピングシステムおよび方法は、さらに識別能力に及ぼす亜集団の影響を考慮に入れることが可能である。たとえば、以上に記載の実施形態では、ＤＮＡタイピングシステムは、近縁の家族関係は考慮に入れているが、同一の集団の帰属関係は考慮に入れていない。集団の帰属関係はほとんど影響しないと予想されるが、本発明にはさらに、より高い識別能力を達成するために、より大きなセットの二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を決定することが包含されうる。あるいは、所定の集団のタイプ分けを行うために二対立遺伝子マーカーのより大きなセットを最適化することが可能である。あるいは、上限の原理を用いて、任意の特定の遺伝子型に対して集団で見いだされる最大の対立遺伝子頻度を適用し、対象の種々の集団の個体から得られる対立遺伝子頻度を研究することも可能である。
【０４８８】
したがって、本発明には、生物学的サンプル中の少なくとも１３、１５、１７、２０、２５、３０、４０、５０、６６、７０、８５、８８、１００、１８７、２００、３００、５００、７００、１０００または２０００種の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定することを含む、遺伝子型の決定方法が包含される。ただし、該二対立遺伝子マーカーのうちの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１３、１７、２０、２５、３０、４０、５０、７０、８５、１００、１５０またはすべては、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１からなる群より選択される地図関連二対立遺伝子マーカーである。
【０４８９】
本明細書に記載のＤＮＡタイピング方法およびシステムにおいて、たとえば、ＳＮＰのコレクションおよびそれらのＳＮＰに関する情報を提供する以下のウェブサイトのうちのいずれかで、当技術分野で公知の任意のマーカーを本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーと併用することが可能である。
【０４９０】
Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ （ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧＡＩ／）。一般に癌および腫瘍形成に関係すると考えられる候補ＳＮＰについての情報を含む、ＮＩＨの運営するサイト。
【０４９１】
ｄｂＳＮＰ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）。生物医学研究で広範な適用性を有するＳＮＰについての情報を含む、ＮＩＨの管理するより包括的なデータベース。
【０４９２】
ＨＵＧＯ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ （ｈｔｔｐ：／／ａｒｉｅｌ．ｕｃｓ．ｕｎｉｍｅｌｂ．ｅｄｕ．ａｕ：８０／￣ｃｏｔｔｏｎ／ｍｄｉ．ｈｔｍ）。ＳＮＰを含むヒト突然変異に関する情報への系統的アクセスを提供することを意図したデータベース。このサイトは、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ （ＨＵＧＯ）により運営されている。
【０４９３】
Ｈｕｍａｎ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＳＮＰ／ｈｕｍａｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。 Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより運営されている。このサイトには、マッピングおよび配列決定について多くのＷｈｉｔｅｈｅａｄ研究プロジェクトから得られたＳＮＰに関する情報が含まれている。
【０４９４】
ＳＮＰｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ−Ｇｅｎｏｍｅ ＳＮＰ ｄａｔａｂａｓｅ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂｃ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ＳＮＰ）。このウェブサイトは、染色体および細胞遺伝学的位置により組織化されたＳＮＰへのアクセスを提供する。このサイトは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより運営されている。
【０４９５】
ＨＧＢａｓｅ （ｈｔｔｐ：／／ｈｇｂａｓｅ．ｃｇｒ．ｋｉ．ｓｅ／）． ＨＧＢＡＳＥは、遺伝子型が通常の疾患、薬物応答および他の複雑な表現型にどのように影響を及ぼすかを調べる研究を促進するためにヒトゲノム中のすべて既知の配列変異をまとめようと試みたものであり、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｗｅｄｅｎにより運営されている。
【０４９６】
Ｔｈｅ ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｄａｔａｂａｓｅ （ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ／ｄｂ／ｓｎｐ／ｍａｐ）。多数の大きな医薬会社および情報処理会社の協力により得られたＳＮＰおよび関連情報のコレクション。
【０４９７】
ＧｅｎｅＳＮＰｓ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｓｎｐｓ／）。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈにより運営されている。このサイトには、Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈが率先して遺伝的変異と環境刺激および生体異物に対する応答との関係を理解しようとして得られたＳＮＰに関する情報が含まれている。
【０４９８】
このほか、以下の特許および特許出願に提供されている二対立遺伝子マーカーも、以上に記載したＤＮＡタイピング法およびシステムにおいて本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーと併用することが可能である：２０００年３月２４日出願の米国特許出願第６０／２０６，６１５号；２０００年６月３０日出願の米国特許出願第６０／２１６，７４５号；２０００年２月１１日出願のＷＩＰＯ出願第ＰＣＴ／ＩＢ００／００１８４号；１９９８年７月１７日出願のＷＩＰＯ出願第ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１１９３号；１９９９年４月２１日出願のＰＣＴ公開第ＷＯ ９９／５４５００号；および２０００年３月２４日出願のＷＩＰＯ出願第ＰＣＴ／ＩＢ００／００４０３号。
【０４９９】
本明細書には、二対立遺伝子マーカー、二対立遺伝子マーカーのセット、プローブ、プライマー、および該二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定する方法も含まれており、それについてさらに説明もなされており、また本開示物に記載されている任意のさらなる制限も、単独でまたは任意の組み合わせで包含されうる。
【０５００】
マイクロシークエンシングによる法医学的一致についてはさらに、以下の実施例２７に記載されている。
【０５０１】
本出願全体にわたって、種々の刊行物、特許および公開特許明細書が引用されている。本発明が関係する当技術分野の状況についてより詳細に記述するために、本出願で参照された刊行物、特許および公開特許明細書の開示内容は、本明細書においてその全体が参照により本開示内容に組み入れられるものとする。
【０５０２】
実施例
本発明の方法のうちのいくつかを以下の実施例で説明する。これらの実施例は、例示にすぎず、限定するものではない。本明細書に記載されている本発明には、その精神および範囲を逸脱することなく他の多くの改変および変更を行うことが可能であり、したがって、そのような限定は添付の特許請求の範囲に示されたものによってのみ課せられるべきである。
【０５０３】
実施例１
ＢＡＣライブラリーの順序づけ： ＳＴＳを有するクローンのスクリーニング
ＳＴＳを含むクローンを同定するために、１セットのＰＣＲタイプ分け可能なＳＴＳで、ＢＡＣライブラリーをスクリーニングする。数千クローン、たとえば２００，０００クローンのＰＣＲスクリーニングを容易にするために、クローンのプールを調製する。
【０５０４】
Ｃｈｕｍａｋｏｖらの記載内容に従ってＢＡＣライブラリーの三次元プールを調製し、順序づけられたＳＴＳ由来のプライマーを用いて行われる増幅反応で増幅断片を生成させる能力についてスクリーニングする。（Ｃｈｕｍａｋｏｖら（１９９５）， 前掲）。ＢＡＣライブラリーは、典型的には、２００，０００個のＢＡＣクローンを含む。各インサートの平均サイズは１００〜３００ｋｂであるので、そのようなライブラリーの全体のサイズは、少なくとも約７ヒトゲノムのサイズに相当する。このライブラリーを、個々のクローンのアレイとして、５１８３８４ウェルのプレートに保存する。これを、７４個の一次プール（各７プレート）に分けることができる。次いで、各一次プールを、各クローンのプレートの横列および縦列のアドレスに基づいて三次元プーリングシステムにより調製される４８個のサブプールに分けることができる（さらに詳細には、所与のマイクロタイタープレートに存在するすべてのクローンからなる７個のサブプール；所与の横列のすべてのクローンからなる１６個のサブプール；所与の縦列のすべてのクローンからなる２４個のサブプール）。
【０５０５】
ＳＴＳに特異的なプライマーを用いて、プールしたＢＡＣクローンに対して増幅反応を行う。たとえば、互いの位置およびゲノムに沿った位置がわかっている４５，０００個のＳＴＳを用いて、三次元プールをスクリーニングすることが可能である。好ましくは、互いの位置およびゲノムに沿った位置がわかっている約３０，０００個のＳＴＳを用いて、三次元プールをスクリーニングする。きわめて好ましい実施形態では、互いの位置およびゲノムに沿った位置がわかっている約２０，０００個のＳＴＳを用いて、三次元プールをスクリーニングする。
【０５０６】
増幅反応により生じる増幅産物を、自動画像捕捉および自動画像処理と組み合わせた従来のアガロースゲル電気泳動により検出する。ＳＴＳに関するＰＣＲスクリーニングには、（１）陽性の一次プールを同定するステップ；（２）各陽性の一次プールについて、陽性のプレートの横列および縦列の「サブプール」を同定して陽性クローンのアドレスを取得するステップ；（３）同定されたクローンに対するＰＣＲアッセイを直接確認するステップの３つのステップが含まれる。ＳＴＳを特異的に規定するプライマーを使用して、ＰＣＲアッセイを行う。
【０５０７】
以下の通りにスクリーニングを行う。ゲノムインサートを含有する第１のＢＡＣ ＤＮＡを以下の通りに調製する。ＢＡＣを含有する細菌を、クロラムフェニコール（１２μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ １２０μｌ中、３７℃で一晩増殖させる。以下のプロトコールにより、ＤＮＡを抽出する：
４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
上清を除去し、ペレットを１２０μｌのＴＥ １０−２（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ）に再懸濁させる。
４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
上清を除去し、ペレットを２０μｌのリゾチーム１ｍｇ／ｍｌと共に室温で１５分間インキュベートする。
２０μｌのプロテイナーゼＫ １００μｇ／ｍｌを添加し、６０℃で１５分間インキュベートする。
８μｌのＤＮＡｓｅ ２Ｕ／μｌを添加し、室温で１時間インキュベートする。
１００μｌのＴＥ １０−２を添加し、−８０℃に保つ。
【０５０８】
以下のプロトコールを使用して、ＰＣＲアッセイを行う：
2004504037.tif 000016
【０５０９】
Ｇｅｎｉｕｓ ＩＩサーモサイクラーを用いて増幅を行う。９５℃で１０分間加熱した後、４０サイクルを行う。各サイクルは、９５℃で３０秒、５４℃で１分、７２℃で３０秒で構成される。最後の伸長を７２℃で１０分行ってから増幅を終了する。０．１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルを用いてＰＣＲ産物を解析する。
【０５１０】
あるいは、ＹＡＣ（酵母人工染色体）ライブラリーを用いてもよい。１メガベースという単位の非常に大きなインサートを保持できるというのがＹＡＣライブラリーの主な利点である。ライブラリーは、Ｃｈｕｍａｋｏｖ， ｅｔ ａｌ．（１９９５，前掲）に記載されているように、典型的には約３３，０００のＹＡＣクローンを含有する。ＹＡＣスクリーニングプロトコールは、ＢＡＣスクリーニングで採用されているものと同じでよい。
【０５１１】
次いで、ＳＴＳの既知の順番を用いて、全ヒトゲノムにわたり順序づけられたアレイ（コンティグ）にＢＡＣインサートを整列させる。必要であれば、選択したＢＡＣインサートの両末端を配列決定することにより、試験対象の新しいＳＴＳを作製してもよい。Ｃｈｅｒｉｆら，１９９０および以下の実施例３に記載されているように、中期染色体に対して行われる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、ＢＡＣの染色体上のより詳細な位置を確定および／または確認することができる。ＢＡＣインサートのサイズは、制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、パルスフィールドゲル電気泳動により測定することができる。
【０５１２】
最後に、インサートサイズおよび染色体上のより詳細な位置が既知であり、全ゲノム、１セットの染色体、単一の染色体、特定の亜染色体領域、または任意の他の望ましいゲノム部分を包含する、ＢＡＣクローンの最小の重複するセットを、ＤＮＡライブラリーから選択する。例えば、ＢＡＣクローンは、少なくとも１００ｋｂの連続ゲノムＤＮＡ、少なくとも２５０ｋｂの連続ゲノムＤＮＡ、少なくとも５００ｋｂの連続ゲノムＤＮＡ、少なくとも２Ｍｂの連続ゲノムＤＮＡ、少なくとも５Ｍｂの連続ゲノムＤＮＡ、少なくとも１０Ｍｂの連続ゲノムＤＮＡ、または少なくとも２０Ｍｂの連続ゲノムＤＮＡを包含しうる。
【０５１３】
実施例２
二対立遺伝子マーカーを用いたＢＡＣライブラリーのスクリーニング
二対立遺伝子マーカーを有するＤＮＡ断片の特異的増幅を可能にする増幅プライマー、例えば本発明の地図関連二対立遺伝子マーカーを用いて、任意のゲノムＤＮＡライブラリー中、好ましくは、上記のＢＡＣライブラリー中のクローンを、二対立遺伝子マーカーの存在に関してスクリーニングすることが可能である。
【０５１４】
配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーを有する断片またはそれと相補的な配列の増幅を可能にする、配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３のプライマー対を設計した。配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３の増幅プライマーを用いて、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれらと相補的な配列の存在に関してゲノムＤＮＡライブラリー中のクローンをスクリーニングすることが可能である。
【０５１５】
配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカー用の増幅プライマーは、配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３のプライマーと同じである必要はないことに理解されたい。もっと正確に言えば、それらは、このマーカーを有するいずれかのＤＮＡ断片の特異的増幅を可能にする他の任意の婦タイマーであってもよく、当業者に周知の方法を用いて設計することが可能である。増幅プライマーは、マーカーの多型部位をを含む任意の断片の増幅を可能にする８、１０、１５、２０塩基長またはそれより長いオリゴヌクレオチドとすることができる。多型塩基は、増幅産物の中心にあってもよいし、あるいは中心から離れた位置にあってもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、これらのプライマーを用いて産生される増幅産物は、少なくとも１００塩基長としうる（すなわち、多型塩基が中心に存在する増幅産物では、多型塩基の両側はいずれも５０ヌクレオチドである）。他の実施形態では、これらのプライマーを用いて産生される増幅産物は、少なくとも５００塩基長であってもよい（すなわち、多型塩基が中心に存在する増幅産物では、多型塩基の両側はいずれも２５０ヌクレオチドである）。さらなる実施形態では、これらのプライマーを用いて産生される増幅産物は、少なくとも１０００塩基長であってもよい（すなわち、多型塩基が中心に存在する増幅産物では、多型塩基の両側はいずれも５００ヌクレオチドである）。以上に記載されているような増幅プライマーは、本発明の範囲内に含まれる。
【０５１６】
本質的に実施例１に記載されているとおりに、ＢＡＣクローン上の二対立遺伝子マーカーの局在位置を決定する。
【０５１７】
実施例１に記載されているとおりに、スクリーニング対象のＢＡＣクローンを三次元プールに分配する。
【０５１８】
実施例１に記載のものと本質的に類似した方法により、二対立遺伝子マーカーに特異的なプライマーを用いて、プールしたＢＡＣクローンに対して増幅反応を行い、二対立遺伝子マーカーを含むＢＡＣクローンを同定する。
【０５１９】
増幅反応により生じる増幅産物を、自動画像捕捉および自動画像処理と組合せた従来のアガロースゲル電気泳動により検出する。二対立遺伝子マーカーに対するＰＣＲスクリーニングには、（１）陽性の一次プールを同定するステップと、（２）陽性の一次プールのそれぞれについて、陽性のプレート、横列および縦列の「サブプール」を同定して陽性クローンのアドレスを取得するステップと、（３）同定されたクローンについてＰＣＲアッセイで直接確認するステップとの３つのステップが含まれる。二対立遺伝子マーカーを規定するプライマーを用いて、ＰＣＲアッセイを行う。
【０５２０】
以下の通りにスクリーニングを行う。第１のＢＡＣ ＤＮＡを以下のように単離する。ゲノムインサートを含む細菌を、クロラムフェニコール（１２μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ １２０μｌ中、３７℃で一晩増殖させる。以下のプロトコールにより、ＤＮＡを抽出する：
４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
上清を除去し、ペレットを１２０μｌのＴＥ １０−２（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ）に再懸濁する。
４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
上清を除去し、ペレットを２０μｌのリゾチーム１ｍｇ／ｍｌと共に室温で１５分間インキュベートする。
２０μｌのプロテイナーゼＫ １００μｇ／ｍｌを添加し、６０℃で１５分間インキュベートする。
８μｌのＤＮＡｓｅ ２Ｕ／μｌを添加し、室温で１時間インキュベートする。
１００μｌのＴＥ １０−２を添加し、−８０℃に保つ。
【０５２１】
以下のプロトコールを使用して、ＰＣＲアッセイを行う：
2004504037.tif 000017
【０５２２】
Ｇｅｎｉｕｓ ＩＩサーモサイクラーを用いて増幅を行う。９５℃で１０分間加熱した後、４０サイクルを行う。各サイクルは、９５℃で３０秒、５４℃で１分、７２℃で３０秒で構成される。最後の伸長を７２℃で１０分行ってから増幅を終了する。０．１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルを用いてＰＣＲ産物を解析する。
【０５２３】
実施例３
二対立遺伝子マーカーの亜染色体領域への割り当て
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激血液細胞ドナーから中期染色体を調製する。健常な男性に由来するＰＨＡ刺激リンパ球をＲＰＭＩ−１６４０培地で７２時間培養する。同調化のために、１７時間にわたりメトトレキセート（１０ｍＭ）を添加し、続いて６時間にわたり５−ブロモデオキシウリジン（５−ＢｕｄＲ、０．１ｍＭ）を添加する。最後の１５分間でコルセミド（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、その後、細胞を回収する。細胞を回収し、ＲＰＭＩで洗浄し、低張ＫＣｌ溶液（７５ｍＭ）と共に３７℃で１５分間インキュベートし、メタノール：酢酸（３：１）を３回交換して固定する。この細胞懸濁液をスライドガラス上に滴下し、風乾させる。
【０５２４】
本発明の地図を構築するのに使用される二対立遺伝子マーカーを有するＢＡＣクローン（配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれらと相補的な配列を含む）は、上述したように単離することができる。これらのＢＡＣまたは該二対立遺伝子マーカーを有する断片などのＢＡＣの一部分（たとえば、配列番号１７２〜５１３、１７２〜２７１、２７２〜３３３、３３４〜３４２、３４３〜４４２、４４３〜５０４および５０５〜５１３のプライマー対を用いた増幅反応から得られる部分）は、中期染色体にハイブリダイズさせるためのプローブとして使用することができる。本方法で使用する目的のハイブリダイゼーションプローブは当業者に周知の他の方法を用いて作製してもよいことに理解されたい。ハイブリダイゼーションプローブは、この所期の目的に合った任意の長さとしうる。
【０５２５】
次いで、製造会社の説明書（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）に従ってニックトランスレーションによりビオチン−１６ ｄＵＴＰでプローブを標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｓｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて精製し、沈殿させる。ハイブリダイゼーションの直前に、ＤＮＡペレットをハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、１ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、ｐＨ７）に溶解し、プローブを７０℃で５〜１０分間変性させる。
【０５２６】
−２０℃で保存したスライドを３７℃でＲＮａｓｅ Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）により１時間処理し、２×ＳＳＣで３回すすぎ、エタノール希釈系で脱水する。染色体調製物を７０℃で７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中で２分間変性させ、次いで４℃で脱水する。スライドを３７℃でプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／１００ｍｌ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中）、２ｍＭ ＣａＣｌ２）により８分間処理し、脱水する。プローブを含有するハイブリダイゼーション混合物をスライド上に置き、カバーガラスで覆い、ゴムセメントで密封し、３７℃の加湿チャンバ内で一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後洗浄を行ってから、ビオチン化プローブをアビジン−ＦＩＴＣで検出し、ビオチン化ヤギ抗アビジンおよびアビジン−ＦＩＴＣをさらに積層して増幅を行う。染色体中の局在位置を決定する場合、既に報告されているように蛍光Ｒ−バンドを採取する（Ｃｈｅｒｉｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）前掲）。ＬＥＩＣＡ蛍光顕微鏡（ＤＭＲＸＡ）下でスライドを観察する。染色体をヨードプロピジウムで対比染色すると、プローブの蛍光シグナルが２つの対称的な黄緑色のスポットとして蛍光Ｒ−バンド染色体の両染色分体（赤色）上に現れる。したがって、所与の染色体上の特定の細胞遺伝学的Ｒ−バンドに対して特定の二対立遺伝子マーカーの局在位置を決定することが可能である。
【０５２７】
二対立遺伝子マーカーを亜染色体領域に割り当てるのに要する時間は、自動化により削減することが可能である。たとえば、適切なロボットを用いてマイクロタイタープレート方式でプローブの調製を行うことが可能である。二対立遺伝子マーカーを亜染色体領域に割り当てるのに要する時間は、単一の顕微鏡スライド上での複数のプローブのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを可能にする方法、たとえば、Ｌａｒｉｎら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：３６８９−３６９２（１９９４）（この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている方法を用いて削減することができる。報告されている最大規模の試験方式では、さまざまなプローブがガラスプレート上で反転された９６ウェルマイクロタイターディッシュから直接適用することにより、同時にハイブリダイズを行っている。使用するそれぞれの光学システム、試験方式、および蛍光プローブに適した画像データ取得および解析用ソフトウェアは、Ｌｉｃｈｔｅｒら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：６４−６９（１９９０）（この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載のシステムに基づいたものとすることができる。そのようなソフトウェアは、ハイブリダイズさせたプローブに対応する蛍光スポットの中心と、対応する染色体の短腕のテロメア末端との間の距離を、染色体の全長と比較した相対距離として測定する。二対立遺伝子マーカーを染色体の詳細な位置に割り当てるのに要する時間は、異なる蛍光タグで標識されたプローブを９６ウェルディッシュの各ウェルに同時に適用することにより、さらに削減することができる。１つのスライド上で解析を行うさらなる利点は、自動化が容易になることである。なぜなら、移動ステージを備えていてさまざまな中期染色体で蛍光シグナルを検出する能力を有する顕微鏡を用いれば、９６ウェルディッシュに分配された中期染色体上の各プローブの座標を取得することができるからである。
【０５２８】
以下の実施例４では、二対立遺伝子マーカーの位置を決定してヒト染色体に割り当てることのできる他の方法について説明する。
【０５２９】
実施例４
二対立遺伝子マーカーのヒト染色体への割り当て
本発明の地図を構築するのに使用される二対立遺伝子マーカー（例えば、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列）は、以下に記載されているような一染色体解析によりヒト染色体に割り当てることができる。
【０５３０】
体細胞ハイブリッドパネルを用いて、二対立遺伝子マーカーの染色体中の局在位置を決定することができる。たとえば、それぞれ異なるヒト染色体の入った２４個のパネルを使用することが可能である（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ ２２：４２５−４３１（１９９６）； Ｄｒｗｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６：３１１−３１４（１９９３）、それらの開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）。
【０５３１】
次のように二対立遺伝子マーカーの局在位置を決定する。各体細胞ハイブリッドのＤＮＡを抽出して精製する。体細胞ハイブリッドパネルからゲノムＤＮＡサンプルを次のように調製する。下記の成分を含む溶解溶液３．７ｍｌを用い手細胞を４２℃で一晩かけて溶解させる：
2004504037.tif 000018
【０５３２】
タンパク質を抽出するために、１ｍｌの飽和ＮａＣｌ（６Ｍ）（１／３．５ ｖ／ｖ）を添加する。激しく攪拌した後、１０，０００ｒｐｍで溶液を２０分間遠心分離する。ＤＮＡを沈殿させるために、２〜３倍容量の１００％エタノールを先の上清に加え、溶液を２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。ＤＮＡ溶液を７０％エタノールで３回すすいで塩類を除去し、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。ペレットを３７℃で乾燥させ、１ｍｌのＴＥ １０−１または１ｍｌの水に再懸濁させる。２６０ｎｍでＯＤを測定することにより、ＤＮＡ濃度を評価する（１単位ＯＤ ＝ ５０μｇ／ｍｌ ＤＮＡ）。ＤＮＡ溶液中のタンパク質の存在を判定するために、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比を求める。１．８〜２のＯＤ２６０／ＯＤ２８０比を有するＤＮＡ調製物のみをＰＣＲアッセイで使用する。
【０５３３】
次いで、二対立遺伝子マーカーを規定するプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲアッセイを行う。先にＢＡＣスクリーニングについて説明したように、ＰＣＲアッセイを行う。０．２ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルにおいてＰＣＲ産物を分析する。
【０５３４】
実施例５
連鎖不平衡の測定
１９９３年にＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒらおよびＳａｕｎｄｅｒｓらにより最初に報告されたように、Ａｐｏ Ｅ ｅ４対立遺伝子は、後期発症性家族性および散発性アルツハイマー病（ＡＤ）のいずれとも強く関連している（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ａ．Ｍ． Ｌａｎｃｅｔ ３４２： ７１０−７１１（１９９３）およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｅｒ， Ｗ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： １９７７−１９８１（１９９３）、それらの開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）。等電点電気泳動により同定されるヒトアポリポタンパク質Ｅの３つの主要なイソ型（ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３およびａｐｏＥ４）は、３つの対立遺伝子によりコードされている（ｅ２、ｅ３、およびｅ４）。イソ型ｅ２、ｅ３、およびｅ４は、残基１１２（部位Ａと呼ばれる）および残基１５８（部位Ｂと呼ばれる）の２つの部位でアミノ酸配列が異なる。このタンパク質の祖先イソ型はＡｐｏ Ｅ３であり、部位Ａ／Ｂにシステイン／アルギニンを含むが、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ４は、それぞれ、システイン／システインおよびアルギニン／アルギニンを含む（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ， Ｋ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５６： ９０７７−９０８３（１９８１）； Ｒａｌｌ， Ｓ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７９： ４６９６−４７００（１９８２）、それらの開示内容をその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）。
【０５３５】
アルツハイマー病患者５９３０例および対照８６０７例に対して行われた研究（Ｆａｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ ２７８： １３４９−１３５６（１９９７）、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）で最近報告されているように、４０〜９０才の全年齢でかつ男性および女性の両方で、Ａｐｏ Ｅｅ４は、さまざまな民族群（ヒスパニック系またはアフリカ系米国人と比較して、特にコーカサス人および日本人）の個体でアルツハイマー病を発症するおそれのある主要な危険因子であると現在のところ考えられている。より詳細には、部位Ａのアルギニン１１２をコードするＣ塩基の頻度は、アルツハイマー病患者ではかなり高くなっている。
【０５３６】
Ａｐｏ Ｅｅ ４とアルツハイマー病に特有なニューロン変性との力学的関連は今後の検討課題であるが、現在の仮説によれば、Ａｐｏ Ｅ遺伝子型は、脳内のアミロイドβペプチドの沈着および／または凝集を増大させることによりあるいはアテローム性動脈硬化を促進してニューロンのエネルギー利用能を間接的に低減させることにより、ニューロンの脆弱性に影響を及ぼす可能性があることが示唆される。
【０５３７】
本発明の方法を用いて、Ａｐｏ Ｅ部位Ａの近傍にある二対立遺伝子マーカーを作製し、それらの対立遺伝子の１つとアルツハイマー病との関連を解析した。Ａｐｏ Ｅパブリックマーカー（ｓｔＳＧ９４）を用いて、先に述べたようにヒトゲノムＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。Ａｐｏ Ｅ遺伝子と連鎖不平衡にある二対立遺伝子マーカーを見いだすために、染色体領域１９ｑ１３．２．３（Ａｐｏ Ｅ遺伝子を含む染色体領域）にユニークなＦＩＳＨハイブリダイゼーションシグナルを与えるＢＡＣを次のように選択した。
【０５３８】
このＢＡＣは、先に述べたようにサブクローン化された２０５ｋｂのインサートを含んでいた。５０種のＢＡＣサブクローンをランダムに選択してその配列を決定した。２５つのサブクローン配列を選択し、それを用いて、５００ｂｐアンプリコンを生成することのできる２５対のＰＣＲプライマーを設計した。次いで、既に述べたように、これらのＰＣＲプライマーを用いて、血縁関係のない１００個体（フランス系の血液ドナー）からのＤＮＡプール中の対応するゲノム配列を増幅した。
【０５３９】
既に述べたように、プールしたＤＮＡから得た増幅産物の配列を決定し、二対立遺伝子多型の存在について解析した。５個のアンプリコンが、血縁関係のない１００個体のプール内に多型塩基を含むことがわかった。したがって、Ａｐｏ Ｅ遺伝子の近傍のランダム二対立遺伝子マーカーとしてこれらの多型を選択した。これらの二対立遺伝子マーカー（９９−３４４−４３９； ９９−３６６−２７４， ９９−３５９−３０８； ９９−３５５−２１９； ９９−３６５−３４４）の両対立遺伝子の配列は、配列番号５１４〜５１８に対応する。これらの二対立遺伝子マーカーを含有するアンプリコンを生成するための対応する増幅プライマー対は、配列番号５３６〜５４０及び配列番号５５８−５６２として列挙したものの中から選択することができる。
【０５４０】
増幅対象のＡｐｏＥマーカー（９９−２４５２−５４； Ｃ／Ｔ； 添付の配列表で配列番号５１９として記されている； Ａｐｏ Ｅ部位Ａとして公知である（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１），前掲； Ｒａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８２），前掲））に対応する二対立遺伝子多型を有するゲノム断片の増幅を可能にするさらなるプライマー対（配列番号５４１および５６３）を設計した。
【０５４１】
既に述べたように公知のＡｐｏ ＥマーカーｓｔＳＧ９４を用いてゲノムＤＮＡライブラリーから最初に選択したすべての利用可能なＢＡＣを用いて対応するアンプリコンのＰＣＲスクリーニングを行うことにより、５つのランダム二対立遺伝子マーカーと共にＡｐｏ Ｅ部位Ａマーカーを物理的に並べた。このＢＡＣスクリーニングから導かれるアンプリコンの順序は以下のとおりである：（９９−３４４−４３９／９９−３６６−２７４） − （９９−３６５−３４４／９９−２４５２−５４） − ９９−３５９−３０８ − ９９−３５５−２１９。ここで、括弧は、それぞれのアンプリコンの正確な順番を確定できなかったことを示す。
【０５４２】
ランダム二対立遺伝子マーカーの同定に用いたのと同じ血縁関係のない１００個体の遺伝子型を判定することにより、６つの二対立遺伝子マーカー（５つのランダムマーカーおよびＡｐｏ Ｅ部位Ａ）間の連鎖不平衡を判定した。
【０５４３】
二対立遺伝子マーカーの作製について先に述べたのと同様の条件で、ＤＮＡサンプルおよびゲノムＰＣＲによる増幅産物を取得し、蛍光ｄｄＮＴＰ（各ｄｄＮＴＰに特有の蛍光）および二対立遺伝子マーカー中の多型塩基のすぐ上流に３′末端を有する適切なマイクロシークエンシングプライマーを使用した自動マイクロシークエンシング反応に付した。相補的蛍光ジデオキシヌクレオチド類似体を用いてＤＮＡポリメラーゼにより３′末端を特異的に伸長させた後（熱サイクル）、組み込まれなかった蛍光ｄｄＮＴＰを除去するためにマイクロシークエンシングプライマーを沈殿させた。ＡＢＩ３７７配列決定機を用いて電気泳動により反応生成物を解析した。実施例８でさらに詳述する適切なソフトウェアにより結果を自動解析した。
【０５４４】
δ（複合連鎖不平衡係数）に対する最尤推定値（ＭＬＥ）に従って、すべての二対立遺伝子マーカー対（Ｍｉ，Ｍｊ）の連鎖不平衡（ＬＤ）を対立遺伝子の組合せ（Ｍｉ１，Ｍｊ１； Ｍｉ１，Ｍｊ２； Ｍｉ２，Ｍｊ１； Ｍｉ２，Ｍｊ２）ごとに計算した。Ａｐｏ Ｅ部位Ａマーカーと５つの新しい二対立遺伝子マーカー（９９−３４４−４３９； ９９−３５５−２１９； ９９−３５９−３０８； ９９−３６５−３４４； ９９−３６６−２７４）との間の連鎖不平衡解析の結果を以下の表２にまとめる。
【０５４５】
表２
2004504037.tif 000019
【０５４６】
上記の連鎖不平衡の結果から、Ａｐｏ Ｅ遺伝子を含む約２００ｋｂの領域内でランダムに選択された５つの二対立遺伝子マーカーのうちマーカー９９−３６５−３４４ＴがＡｐｏ Ｅ部位Ａ対立遺伝子（９９−２４５２−５４Ｃ）と比較的強い連鎖不平衡にあることがわかる。
【０５４７】
したがって、Ａｐｏ Ｅ部位Ａ対立遺伝子はアルツハイマー病と関連しているため、マーカー９９−３６５−３４４のＴ対立遺伝子はアルツハイマー病と関連していることがおそらく見いだされるであろうと予想される。この仮説を試験するために、配列番号５１４〜５１８の二対立遺伝子マーカーを用いて以下のように関連試験を行った。
【０５４８】
ＭＭＳＥ試験に基づく臨床試験組み入れ判定基準に従って、２２５名のアルツハイマー病患者を募集した。この試験に含めた２４８名の対照例は、民族的にも年齢的にも疾患症例と一致していた。罹患個体も対照個体も、血縁関係のない事例に相当した。上記の方法を用いて、これらの各個体における各二対立遺伝子マーカーの多型塩基が何であるかを判定した。関連試験を行う方法を以下でさらに説明する。
【０５４９】
この試験の結果を以下の表３にまとめる。
【０５５０】
表３
2004504037.tif 000020
【０５５１】
アルツハイマー病症例および対照の両方のＡｐｏ Ｅ部位Ａ対立遺伝子の頻度は、既に報告されている頻度と一致することが判明した（対照では約１０％、アルツハイマー病症例では約３４％、したがって、対立遺伝子頻度差は２４％である）。したがって、この試験に使用した集団におけるＡｐｏ Ｅ ｅ４の関連が立証される。
【０５５２】
さらに、連鎖不平衡解析（表３）から予想されるように、マーカー９９−３６５／３４４のＴ対立遺伝子とアルツハイマー病症例との有意な関連が観測された（対照と比較してアルツハイマー病症例におけるＴ対立遺伝子頻度は１８％高く、この差に対するｐ値は６．９Ｅ−１０であった）。
【０５５３】
以上の結果から、形質に関連する所与の１つのマーカーと連鎖不平衡にあるマーカーはいずれも形質と関連することが示される。この場合にはＡｐｏＥ部位Ａマーカーは形質誘発対立遺伝子（ＴＣＡ）そのものであるが、研究対象の形質に関連した他の任意の非形質誘発対立遺伝子マーカーを用いても、同じ結論を引き出すことができることは理解されよう。
【０５５４】
さらに、これらの結果から、十分な密度（ここでは、平均で４０ｋｂ毎に約１つの二対立遺伝子マーカーがある）で候補領域内にランダムに配置した１セットの二対立遺伝子マーカーを用いて関連試験を行うことにより、形質に関連した少なくとも１つのマーカーを同定することが可能になることが示される。
【０５５５】
さらに、これらの結果は、本実施例（上記参照）の範囲内と考えられる６つの二対立遺伝子マーカーの物理的順序（配置）と相関しており、マーカー９９−３６５／３４４（ＡｐｏＥ部位Ａマーカーまでの物理的距離という点で最も近いことが確認されている）はＡｐｏ Ｅ部位Ａマーカーと最も強い連鎖不平衡にあることが見出されている。
【０５５６】
二対立遺伝子マーカー間の物理的距離と連鎖不平衡との関係をさらに精密に解析するために、８番染色体上のゲノム領域に由来する約４５０ｋｂの断片の配列を完全に決定した。
【０５５７】
それから誘導される約２３０対の二対立遺伝子マーカー内のＬＤをランダムなフランス人集団で測定し、既知の物理的マーカー間距離の関数として解析した。この解析により、２つの二対立遺伝子マーカー間の連鎖不平衡（ＬＤ）は、平均して、それらの物理的離間距離と相関があることが確認された。さらに、この解析から、２つの二対立遺伝子マーカー間距離が増加すると、両者の間の連鎖不平衡は減少する傾向があることが示される。より詳細には、２つの二対立遺伝子マーカー間の距離が５０ｋｂよりも大きいと、両者の間の連鎖不平衡は減少する傾向があり、マーカー間の距離が７５ｋｂよりも大きいと、さらに減少する。２つの二対立遺伝子マーカーが１５０ｋｂよりも離れていると、ほとんどの場合、両者の間に有意な連鎖不平衡はみられないことがわかった。マーカー間の連鎖不平衡の測定に使用されるサンプル集団のサイズおよび生立は連鎖不平衡が検出できなくなるような距離に影響を及ぼす可能性があることは理解されよう。平均１５０ｋｂの長さまでの領域ではマーカー間の連鎖不平衡が測定可能であると仮定して、平均マーカー間距離が１５０ｋｂ未満であれば、二対立遺伝子マーカー地図を用いて全ゲノムの連鎖不平衡マッピングを行うことが可能である。
【０５５８】
実施例６
検出可能な形質に関連する遺伝子を含む候補領域の同定
約２０，０００個の二対立遺伝子マーカーを含む全ゲノム地図を用いて、検出可能な形質に関連する遺伝子を含む候補ゲノム領域の最初の同定を行うことが可能である。約４０，０００個のマーカー、約６０，０００個のマーカー、約８０，０００個のマーカー、約１００，０００個のマーカー、または約１２０，０００個のマーカーを含む地図等の、マーカー密度がより高い地図を用いて、候補ゲノム領域をさらに詳細に規定することが可能である。
【０５５９】
上述したような高密度の地図を用いると、検出可能な形質と真に関連する遺伝子を同定できる。なぜなら、偶然に生じる関連はゲノムに沿ってランダムに分布するが、真の関連は１ヶ所以上の不連続なゲノム領域内にマッピングされるからである。したがって、検出可能な形質に関連する遺伝子の近傍に位置する二対立遺伝子マーカーは、形質陽性個体ｖｓ対照個体として二対立遺伝子マーカーの頻度をプロットしたグラフにおいては幅広いピークを形成することになる。それとは対照的に、検出可能な形質と関連する遺伝子の近傍にない二対立遺伝子マーカーは、このようなプロットではユニークな点を形成することになる。検出可能な形質に関連する遺伝子を含む領域内のいくつかのマーカーの関連を判定することにより、研究対象の各マーカーについて、形質陽性集団における対立遺伝子頻度と対照集団における対立遺伝子頻度との差を表す関連曲線を用いて、検出可能な形質に関連する遺伝子を同定することができる。検出可能な形質に関連する遺伝子は、形質との最大の関連を示すマーカーの近傍に見いだされるであろう。
【０５６０】
図４、５および６に、上記原理をシミュレートした結果を図示する。図４に示されているように、約３，０００個の二対立遺伝子マーカーを含む地図で行った関連解析で、１群の点が得られる。しかしながら、さらに多くの二対立遺伝子マーカーを含むより高密度の地図を用いて関連解析を行った場合、この点は、検出可能な形質と関連する遺伝子の位置を示す幅広いピークになる。たとえば、図５に示されたシミュレーション結果からわかるように、約２０，０００個の二対立遺伝子マーカーを含む地図から、最初の関連解析で使用する二対立遺伝子マーカーを得ることができる。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列のうちの１つ以上を関連解析に使用する。
【０５６１】
図４のシミュレーション結果では、３，０００個のマーカーを用いた関連解析から、マーカー９および１７の近傍にピークがあることが示される。
【０５６２】
次に、図５のシミュレーション結果に示されているように、約２０，０００マーカーの地図を使用し、マーカー９および１７の近傍にある別のマーカーを用いて、第２の解析を行う。このステップでもまた、マーカー１７のごく近傍での関連が示される。なぜなら、この領域内のさらに多くのマーカーが形質との関連を示すからである。しかしながら、マーカー９の周囲の他のマーカーはいずれも形質との有意な関連を示さないので、マーカー９は潜在的擬陽性である。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１からなる群より選択される１つ以上の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列を第２の解析に使用する。これらの２つの疑わしい関連の妥当性をさらに調べるために、約６０，０００個の二対立遺伝子マーカーを含む地図を用いて、第３の解析を行うことも可能である。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１７１、１〜１００、１０１〜１６２、１６３〜１７１からなる群より選択される１つ以上の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列を第３の解析に使用する。図６のシミュレーション結果では、マーカー１７の周囲にあるより多くのマーカーが、検出可能な形質との高度の関連を示す。それとは逆に、マーカー９の近傍では、関連はまったく確認されない。したがって、マーカー１７の周囲のゲノム領域を、このシミュレーションの潜在的形質に対する候補領域と考えることができる。
【０５６３】
実施例７
ハプロタイプ解析：アルツハイマー病（ＡＤ）と関連するゲノム領域を確定する二対立遺伝子マーカーの同定
実施例５の表３に示されているように、４０ｋｂあたりマーカー１個の平均地図密度にて、Ａｐｏ Ｅ遺伝子周囲の約２００ｋｂのゲノム領域に由来する５個のランダム二対立遺伝子マーカーのうち、１個のマーカー（９９−３６５−３４４）のみが、アルツハイマー病との明瞭な関連を示した（症例および対照におけるδ対立遺伝子頻度＝１８％； ｐ値＝６．９Ｅ−１０）。他の４つのランダムマーカーの対立遺伝子頻度は、アルツハイマー病症例と対照との間で、有意差はなかった（ｐ値≧Ｅ−０１）。しかしながら、先に述べたように、平均で４０ｋｂを超えて離れて位置するマーカー間では、通常、連鎖不平衡が検出される可能性があるため、マーカー間平均距離が約４０ｋｂで約２００ｋｂの範囲を含む二対立遺伝子マーカー地図の局所的抜粋図を用いた関連試験を行えば、アルツハイマー病と関連する１つ以上の二対立遺伝子マーカーを同定することが可能である。
【０５６４】
（配列番号５１４〜５１８の）二対立遺伝子マーカー９９−３４４−４３９；９９−３５５−２１９；９９−３５９−３０８；９９−３６５−３４４；および９９−３６６−２７４を用いてハプロタイプ解析を行った。
【０５６５】
第１ステップでは、アルツハイマー病に関連することが既に明らかになっているマーカー９９−３６５−３４４はハプロタイプ試験に含めなかった。二対立遺伝子マーカー９９−３４４−４３９；９９−３５５−２１９；９９−３５９−３０８；および９９−３６６−２７４（これらは、個別に調べたときはアルツハイマー病との有意な関連を示さなかった）のみを使用した。第１のハプロタイプ解析では、アルツハイマー病の症例集団および対照集団において、すべての可能な２つ、３つまたは４つのマーカーのハプロタイプの頻度を測定した。図７に示されているように、個別的には有意でない４つのマーカーをベースとした可能性のある異なるすべてのハプロタイプのうちの１つのハプロタイプ（マーカー９９−３６６−２７４がＴ対立遺伝子を有する配列番号５１５と、マーカー９９−３４４−４３９がＡ対立遺伝子である配列番号５１４と、マーカー９９−３５９−３０８がＧ対立遺伝子である配列番号５１６と、マーカー９９−３５５−２１９がＧ対立遺伝子である配列番号５１７とを含む「ハプロタイプ８」ＴＡＧＧ）は、統計学的に有意差のある頻度でアルツハイマー病の症例集団および対照集団に存在していた（Ｄ＝１２％； ｐ値＝２．０５Ｅ−０６）。さらに、上記の「ハプロタイプ８」に含まれる３つのマーカーのハプロタイプについては、すでに有意差が確認されていた（「ハプロタイプ７」、ＴＧＧ、Ｄ＝１０％； ｐ値＝４．７６Ｅ−０５）。ハプロタイプ７には、マーカー９９−３６６−２７４がＴ対立遺伝子である配列番号５１５と、マーカー９９−３５９−３０８がＧ対立遺伝子である配列番号５１６と、マーカー９９−３５５−２１９がＧ対立遺伝子である配列番号５１７とが含まれる。このように、ハプロタイプ関連解析を行うことにより、単一のマーカーの連関解析のときと比較して、個々のマーカー関連試験の統計学的検出力は４桁超で明らかに増大された。すなわち、個々のマーカーについてｐ値≧Ｅ−０１（表２参照）から４つのマーカーの「ハプロタイプ８」についてのｐ値≦２Ｅ−０６まで増大された。表３を参照されたい。
【０５６６】
次のコンピューターシミュレーションにより、このハプロタイプ関連解析で得られた値の有意性を評価した。アルツハイマー病の症例および非罹患対照から得た遺伝子型データをプールし、図７にまとめたデータの作成に使用した症例／対照群と同じ個体数を含む２グループにランダムに割り当てた。これらの人為的なグループに対して、４つのマーカーのハプロタイプ解析（９９−３４４−４３９； ９９−３５５−２１９； ９９−３５９−３０８；および９９−３６６−２７４）を行った。この実験を１００回繰り返した。その結果を図８に示す。これらの生成させたハプロタイプのうち、両集団間で頻度差のｐ値が１Ｅ−０５よりも有意であったものはなかった。さらに、生成させたハプロタイプの４％のみが、１Ｅ−０４未満のｐ値を示した。これらのｐ値の閾値はいずれも、「ハプロタイプ８」が示したｐ値２Ｅ−０６よりも有意性が低いので、このハプロタイプはアルツハイマー病に有意な関連があると考えることができる。
【０５６７】
第２ステップで、マーカー９９−３６５−３４４をハプロタイプ解析に含めた。マーカー：９９−３４４−４３９； ９９−３５５−２１９； ９９−３５９−３０８； ９９−３６６−２７４；および９９−３６５−３４４を含むすべての２つ、３つ、４つまたは５つのマーカーのハプロタイプについて、罹患集団と非罹患集団との間の頻度差を計算した。どのマーカーがハプロタイプに含まれているかまたはいないかによって、ハプロタイプの各カテゴリー（２、３、４または５個のマーカーを含む）で得られた最も有意なｐ値を調べた。この結果、マーカー９９−３６５−３４４を含むすべてのハプロタイプがアルツハイマー病との有意な関連を示すことがわかった（Ｅ−０４〜Ｅ−１１の範囲のｐ値）。
【０５６８】
ハプロタイプ関連解析で得られた値の有意性を評価する他の方法は、１３番または２１番染色体に由来するゲノム領域に対応するインサートを含有するＢＡＣから生成されかつアルツハイマー病に関与していることが明らかになっていない二対立遺伝子マーカーに対して、同じようにアルツハイマー病の症例−対照試験を行うことであった。上述したようなハプロタイプ解析および個体関連解析を行ったが、有意な関連の結果は得られなかった（ハプロタイプ解析でのｐ値はすべて、Ｅ−０３よりも有意性が低く；単一マーカー関連試験でのｐ値はすべて、Ｅ−０２よりも有意性が低かった）。
【０５６９】
実施例８
マイクロシークエンシング法を用いた二対立遺伝子マーカーの遺伝子型判定
液相で行われるいくつかのマイクロシークエンシングプロトコールは、当業者に周知である。マイクロシークエンシング反応の生成物の対立遺伝子の特徴づけを可能にする第１の可能な検出解析法は、ゲル電気泳動後の蛍光ｄｄＮＴＰ伸長マイクロシークエンシングプライマーの検出に基づくものである。この方法の第１の代替法は、液相マイクロシークエンシング反応を行うことにあり、その解析は、固相で行うことも可能である。
【０５７０】
たとえば、５′−ビオチン化オリゴヌクレオチドプライマーおよびフルオレセイン−ジデオキシヌクレオチドを用いて、マイクロシークエンシング反応を行うことが可能である。ビオチン化オリゴヌクレオチドを対象の多型ヌクレオチド位置のすぐ隣の標的核酸配列にアニーリングさせる。次いで、ＰＣＲサイクル後、その３′末端を特異的に伸長させ、そこに、多型塩基に相補的な標識ジデオキシヌクレオチド類似体を組み込む。次いで、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート上にビオチン化プライマーを捕捉する。このようにして、解析は、完全にマイクロタイタープレート方式で行われる。組み込まれたｄｄＮＴＰをフルオレセイン抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いて検出する。
【０５７１】
実際には、マイクロシークエンシング解析は以下のように行われる。２０μｌのマイクロシークエンシング反応物を８０μｌの捕促緩衝液（ＳＳＣ ２×、２．５％ ＰＥＧ ８０００、０．２５ Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１．８％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）に添加し、ストレプトアビジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）でコーティングされたマイクロタイタープレート上で２０分間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１回すすぐ。アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせ、１．８％ ＢＳＡを含む洗浄緩衝液で１／５０００に希釈した１００μｌの抗フルオレセイン抗体をマイクロタイタープレートに添加する。この抗体をマイクロタイタープレート上で２０分間インキュベートする。マイクロタイタープレートを４回洗浄した後、０．１Ｍジエタノールアミン ｐＨ９．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２で０．４ｍｇ／ｍｌに希釈した１００μｌの４−メチルウンベリフェリルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を添加する。２０分間のインキュベーションを行った後、蛍光計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）でマイクロシークエンシング反応の検出を行う。
【０５７２】
他の代替法として、固相マイクロシークエンシング反応が開発されている。この反応のために、オリゴヌクレオチドマイクロシークエンシングプライマーまたは対象のＤＮＡ断片から得たＰＣＲ増幅産物のいずれかが固定化される。たとえば、ビオチン化ＤＮＡと、ストレプトアビジン被覆マイクロタイターウェルまたはアビジン被覆ポリスチレン粒子との相互作用を介して、固定化を行うことができる。
【０５７３】
さらなる代替法として、遺伝子型判定の対象となるアンプリコンを生成するＰＣＲ反応を、ＷＯ ９６／１３６０９（この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載されているような方法に従って固相条件で直接行うことができる。
【０５７４】
そのような固相マイクロシークエンシング反応では、組み込まれるｄｄＮＴＰには、放射性標識（Ｓｙｖａｎｅｎ， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． ２２６：２２５−２３６（１９９４）参照、この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）またはフルオレセイン結合（Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｈａｉｎｅｒ， Ｈｕｍ． Ｍｅｔａｔ． ３：３７９−３８５（１９９４）参照、この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）のいずれかの処理を施すことが可能である。シンチレーションに基づく方法により、放射性標識されたｄｄＮＴＰの検出を行うことができる。フルオレセイン結合ｄｄＮＴＰの検出は、アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせた抗フルオレセイン抗体の結合、それに続く発色基質（たとえば、ｐ−ニトロフェニルリン酸）とのインキュベーションに基づいて行うことができる。
【０５７５】
上記のマイクロシークエンシング法に用いられる他の可能なレポーター検出対としては、以下のものが挙げられる：
・ジニトロフェニル（ＤＮＰ）結合ｄｄＮＴＰと抗ＤＮＰアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｈａｒｊｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ：３９（１１Ｐｔ１）：２２８２−２２８７（１９９３）参照、この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）
・ビオチン化ｄｄＮＴＰと西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（基質としてｏ−フェニレンジアミンを用いる）（ＷＯ ９２／１５７１２参照、この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）。
【０５７６】
フルオレセイン結合ｄｄＮＴＰとアルカリホスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体に基づく診断キットは、ＧａｍｉｄａＧｅｎ ＬｔｄからＰＲＯＮＴＯの名で商品化されている。
【０５７７】
さらに他の代替マイクロシークエンシング法として、Ｎｙｒｅｎら（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０８：１７１−１７５（１９９３）、この開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）は、酵素的発光性無機ピロリン酸検出アッセイ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＤＡ）によるＤＮＡポリメラーゼ活性の検出に基づく固相ＤＮＡ配列決定法について報告している。この方法では、ＰＣＲ増幅産物をビオチン化し、ビーズに固定化する。マイクロシークエンシングプライマーをアニーリングさせ、この混合物の４つのアリコートを、別々に、ＤＮＡポリメラーゼと４つの異なるｄｄＮＴＰのうちの１つと共にインキュベートする。反応後、得られた断片を洗浄し、４種の全てのｄＮＴＰを存在させて行うプライマー伸長反応の際に基質として使用する。ＤＮＡに向けられた重合反応の進行を、ＥＬＩＤＡを用いてモニターする。最初の反応でｄｄＮＴＰが組み込まれると、続くｄＮＴＰ反応時にピロリン酸の生成が妨害される。それとは対照的に、最初の反応でｄｄＮＴＰが組み込まれないと、ｄＮＴＰ反応時にピロリン酸がかなり放出され、これによりＥＬＩＤＡ反応時に光が発生する。このＥＬＩＤＡの結果から、プライマーの後の最初の塩基が何であるかが容易に推定される。
【０５７８】
当業者であれば上記のマイクロシークエンシング法のいくつかのパラメーターが過度の実験を行うことなく適宜変更しうることは理解されよう。特に、以下でさらに説明されるような原理に従って、これらの方法に対してスループットを向上させる改良を行うことができる。
【０５７９】
実施例９
配列解析
検出可能な形質と関連する候補遺伝子を含む領域を含有するＢＡＣインサートのようなＤＮＡ塩基配列の配列決定を行い、可能性のある遺伝子配列を保持しつつ反復配列を取り除く自動ソフトウェアを用いて、それらの配列を解析する。正規化（ｔｒａｉｎｅｄ）隠れマルコフモデル（統計解析モデル）（プロモーター予測ツールを含む）およびＧＲＡＩＬニューラルネットワークのような１組のスコアリングアルゴリズムを用いて、可能性のある遺伝子配列を多数のデータベースと比較することにより、可能性のあるエキソンを同定する。
【０５８０】
ＮＲＰＵ （非重複タンパク質特有）データベース：
ＮＲＰＵは、公に入手可能なＮＢＲＦ／ＰＩＲ、ＧｅｎｐｅｐｔおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを重なりを除いて統合したものである。ＮＲＰＵにより相同性が見いだされれば、既知のタンパク質をコードしている可能性のある領域または既知のタンパク質に関連する領域（翻訳されるエキソン）の同定が可能になる。
【０５８１】
ＮＲＥＳＴ （非重複ＥＳＴデータベース）：
ＮＲＥＳＴは、公に入手可能なＧｅｎＢａｎｋデータベースのＥＳＴサブセクションを統合したものである。ＮＲＥＳＴにより相同性が見いだされれば、転写される可能性のある領域（翻訳されるかまたは翻訳されないエキソン）の局在位置を決定することができる。
【０５８２】
ＮＲＮ （非重複核酸データベース）：
ＮＲＮは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびそれらの毎日の更新情報を統合したものである。
【０５８３】
ＮＲＰＵやＮＲＥＳＴで可能性のあるデータがヒットするかあるいはＧＲＡＩＬおよび／または他のスコアリングアルゴリズムを用いて「優れた」スコアを与える配列はいずれも、機能領域である可能性があり、ゲノム分析に対する候補になると考えられる。
【０５８４】
この第１のスクリーニングは「最も強力な」エキソンの検出を可能にするものであるが、配列の集合に関連して残りの配列については半自動式のスキャニングが行われる。すなわち、５’部位に隣接する配列またはエキソンを、修正パラメーターを用いてバイオインフォマティクス解析の他のラウンドに供する。このようにして、新しいエキソン候補を生成させてゲノム分析にかける。
【０５８５】
上記の手順を用いて、検出可能な形質に関連する遺伝子を同定することが可能である。
【０５８６】
実施例１０
候補ゲノム領域内でのＹＡＣコンティグの構築
かなりの量のＬＯＨデータにより、異なる癌型に関連する遺伝子はヒトゲノムの特定の領域内に位置するという仮説が支持された。より詳細には、この領域は、前立腺癌に関連する遺伝子を保有する可能性がある。この前立腺癌遺伝子を同定するために、以下に記載されているように関連試験を行った。最初に、候補ゲノム領域を含有するＹＡＣコンティグを以下のように構築した。候補ゲノム領域にマッピングされることが知られている遺伝子マーカーを含むゲノム領域で詳細なコンティグを構築するために、全ヒトゲノムに対するＣＥＰＨ−Ｇｅｎｅｔｈｏｎ ＹＡＣ地図（Ｃｈｕｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９５），前掲）を使用した。いくつかの公に入手可能な遺伝子マーカーに利用可能なスクリーニングデータを用いて、候補領域内に位置する１セットのＣＥＰＨ ＹＡＣを選択した。上記の遺伝子マーカーならびに候補領域内に位置すると推定される他の公に入手可能なマーカーを用いて、このＹＡＣセットをＰＣＲにより試験した。これらの試験結果として、このゲノム領域にマッピングされることが知られている遺伝子マーカーの周囲でＹＡＣ ＳＴＳコンティグ地図を作成した。２つのＣＥＰＨ ＹＡＣは、この領域内で約２Ｍｂの推定サイズを有する最小タイリングパスを構成することが判明した。
【０５８７】
このマッピング作業中、いくつかの公に知られているＳＴＳマーカーが、コンティグ内に正確に位置づけられた。
【０５８８】
以下の実施例１１で、候補ゲノム領域内の二対立遺伝子マーカーセットの同定について説明する。
【０５８９】
実施例１１
ＢＡＣコンティグの構築および候補染色体領域内の二対立遺伝子マーカーの位置の決定
次に、候補ゲノム領域を含むＢＡＣコンティグを次のように構築した。Ｗｏｏら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：４９２２−４９３１（１９９４）（その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載されているように、ＢＡＣライブラリーを取得した。簡潔に述べると、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクター（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６），前掲）を用いて、関連ＷＩＰＯ出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／００１９３号に既に記載されている２つの全ヒトゲノムＢａｍＨＩライブラリーおよびＨｉｎｄＩＩＩライブラリーを構築した。
【０５９０】
次いで、上記の実施例１に記載の方法に従って、上記のＳＴＳすべてを用いて、ＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。
【０５９１】
ＳＴＳスクリーニングによる選択およびＦＩＳＨによる確認が行われて並べられたＢＡＣを集成してコンティグを構築し、それらのうちのいくつからインサート末端を部分的に配列決定することにより新しいマーカーを作製した。これらのマーカーを用いて、２Ｍｂ塩基の推定サイズを有する候補染色体領域を含むＢＡＣクローンのコンティグのギャップをうめた。
【０５９２】
図９は、さらなる研究のために選択した重複クローンの最小アレイおよび該コンティグに沿った周知のＳＴＳマーカーの位置を表している。
【０５９３】
本質的に関連ＷＩＰＯ出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／００１９３号に記載の方法に従って、コンティグから選択されたＢＡＣクローンをサブクローニングして配列を決定した。
【０５９４】
関連ＷＩＰＯ出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／００１９３号（その開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載の方法に従って、コンティグに存在する二対立遺伝子マーカーを同定した。
【０５９５】
図９は、ＢＡＣコンティグにある二対立遺伝子マーカーの位置を示している。この第１のセットのマーカーは、候補遺伝子座の中密度地図に相当し、マーカー間距離は平均で５０ｋｂ〜１５０ｋｂである。
【０５９６】
次いで、以下に説明するように、関連試験を行うために使用することのできる第１のセットのマーカーを用いて同定される領域の非常に高密度の地図を提供するために、上述したように第２のセットの二対立遺伝子マーカーを作製した。この非常に高密度の地図は、２〜５０ｋｂの平均間隔で配置されたマーカーを有する。
【０５９７】
次いで、二対立遺伝子マーカーを関連試験に使用した。実施例１２に記載されているように、前立腺癌の罹患個体および非罹患個体からＤＮＡサンプルを採取した。
【０５９８】
実施例１２
罹患個体および非罹患個体に由来するＤＮＡサンプルの採取
病理学的記録または根治的前立腺切除記録に基づく臨床試験組み入れ判定基準に従って、前立腺癌患者を募集した。この試験に含めた対照例は、民族的にも年齢的にも罹患症例と一致していた。前立腺癌の存在または危険性を規定する臨床的および生物学的判定基準がいずれもまったく存在しないことならびに血縁関係のある家族性前立腺癌症例が存在しないことを確認した。罹患個体および対照個体はいずれも血縁がなかった。
【０５９９】
以下の２群の独立した個体を関連試験に使用した。前立腺癌に罹患した個体を含む第１群には、１８５個体が含まれていた。前立腺癌のこの１８５症例のうち、４７症例は散発性であり、１３８症例は家族性であった。対照群には、非罹患個体１０４例が含まれていた。
【０６００】
類似の基準に従って募集した個体群からの追加の疾患サンプル（全サンプル数：２８１）および対照サンプル（全サンプル数：１３０）を用いて、ハプロタイプ解析を行った。
【０６０１】
関連ＷＩＰＯ出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／００１９３号に記載されているように、すべての個体の末梢静脈血からＤＮＡを抽出した。
【０６０２】
実施例１３に記載されているように、各集団における二対立遺伝子マーカーの頻度を判定した。
【０６０３】
実施例１３
罹患個体および対照個体の遺伝子型判定
以下のマイクロシークエンシング手法を用いて、遺伝子型の決定を行った。先に説明したように設計したプライマーを用いて、各ＤＮＡサンプルに対して増幅を行った。配列番号５４２〜５５３および５６４〜５７５のプライマー対を用いて、関連ＷＩＰＯ出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／００１９３号に記載のプロトコールにより、配列番号５２０〜５３１の二対立遺伝子マーカーまたはそれと相補的な配列（マーカー９９−１２３−３８１、４−２６−２９、４−１４−２４０、４−７７−１５１、９９−２１７−２７７、４−６７−４０、９９−２１３−１６４、９９−２２１−３７７、９９−１３５−１９６、９９−１４８２−３２、４−７３−１３４および４−６５−３２４）を含むアンプリコンを作製した。
【０６０４】
既に述べたように、各二対立遺伝子マーカーに合わせて、マイクロシークエンシングプライマーを設計した。増幅産物の精製後、製造会社の指示に従って、最終体積２０μｌで、１０ｐｍｏｌのマイクロシークエンシングオリゴヌクレオチド、１Ｕのサーモシークエナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｅ７９０００Ｇ）、１．２５μｌのサーモシークエナーゼ緩衝液（２６０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ９．５、６５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、および試験対象の各二対立遺伝子マーカーの多型部位のヌクレオチドに相補的な２つの適切な蛍光標識ｄｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｓｅｔ ４０１０９５）を添加することにより、マイクロシークエンシング反応混合物を調製した。Ｔｅｔｒａｄ ＰＴＣ−２２５サーモサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）内で、９４℃で４分の後、５５℃で１５秒、７２℃で５秒、および９４℃で１０秒のＰＣＲサイクルを２０サイクル行った。次いで、組み込まれなかったダイターミネーターを、エタノール沈殿で除去した。最後に、ホルムアミド−ＥＤＴＡローディング緩衝液にサンプルを再懸濁させ、９５℃で２分間加熱してからポリアクリルアミド配列決定ゲルにローディングした。データをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシークエンサーで収集し、ＧＥＮＥＳＣＡＮソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて処理した。
【０６０５】
ゲル解析を行った後、各増幅断片に存在する二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子を判定することのできるソフトウェアでデータを自動処理した。
【０６０６】
このソフトウェアは、上記のマイクロシークエンシング手法から得られたシグナルの強度が弱いか、普通か、または飽和しているか、あるいはシグナルが不明瞭であるかのような因子を評価する。さらに、このソフトウェアは、顕著なピークを同定する（形状および高さの判定基準に基づいて同定する）。顕著なピークの中から、それらの位置に基づいて、標的部位に対応するピークを同定する。２つの顕著なピークが同じ位置で検出された場合、高さの比率に基づいて各サンプルをホモ接合体またはヘテロ接合体として分類する。
【０６０７】
次いで、以下に記載されているように、二対立遺伝子マーカーを用いて、関連解析を行った。
【０６０８】
実施例１４
関連解析
逐次的に２ステップで関連試験を行った。第１のステップで、罹患集団および非罹患集団において、図９の二対立遺伝子マーカーの頻度を決定することにより、候補遺伝子のおよその位置を決定した。このおよその位置の結果を図１０に示す。この解析から、前立腺癌の原因である遺伝子は４−６７と称する二対立遺伝子マーカーの近傍に位置することがわかった。
【０６０９】
解析の第２ステップで、配列番号５２０〜５３１のマーカーまたはそれらと相補的な配列（マーカー９９−１２３−３８１、４−２６−２９、４−１４−２４０、４−７７−１５１、９９−２１７−２７７、４−６７−４０、９９−２１３−１６４、９９−２２１−３７７、９９−１３５−１９６、９９−１４８２−３２、４−７３−１３４および４−６５−３２４）を含む非常に高密度のマーカーセットを用いて、前立腺癌の原因である遺伝子の位置をさらに精密に調べた。
【０６１０】
図１１に示されているように、解析の第２ステップで、前立腺癌の原因である遺伝子は４−６７−４０と称する二対立遺伝子マーカーの近傍にあることが確認された（最も可能性が高いのはそのマーカーを含む約１５０ｋｂの領域内である）。
【０６１１】
また、実施例１５に記載されているように、ハプロタイプ解析も行った。
【０６１２】
実施例１５
ハプロタイプ解析
罹患集団および非罹患集団において、二対立遺伝子マーカー９９−１２３−３８１、４−２６−２９、４−１４−２４０、４−７７−１５１、９９−２１７−２７７、４−６７−４０、９９−２１３−１６４、９９−２２１−３７７、および９９−１３５−１９６の各対立遺伝子の対立遺伝子頻度を決定した。表４は、ハプロタイプ解析に使用したマーカーの内部識別番号（配列番号５２０〜５２８）、各マーカーの対立遺伝子、非罹患個体および前立腺癌罹患個体の両者において最大頻度を示す対立遺伝子、非罹患個体および前立腺癌罹患個体の両者において最低頻度を示す対立遺伝子、ならびに各集団における最低頻度の対立遺伝子の頻度を列挙したものである。
【０６１３】
表４
2004504037.tif 000021
【０６１４】
２〜９個のマーカーに基づく理論上可能な異なるすべてのハプロタイプの中で、前立腺癌との強い関連を示す１１個のハプロタイプを選択した。これらのハプロタイプの解析結果を図１２に示す。
【０６１５】
図１１および１２は、関連解析の結果と、実施例１６でさらに説明する方法に従って得られる配列決定結果とを統合したものであり、これによりマーカー間の物理的順番および／または距離を推定することができる。
【０６１６】
コンピューターシミュレーションの以下の結果により、図１２で得られた値の有意性を明確にする。コンピューターシミュレーションを行うために、罹患個体および非罹患対照から得られたデータをプールし、図１２でまとめたデータの編集に用いた罹患群および非罹患群と同数の個体を含む２群にランダムに割り当てた。これらの人為的な群に対して、図１２のハプロタイプ５に含まれる６つのマーカーについてハプロタイプ解析を行った。この実験を１００回繰り返す。その結果を図１３に示す。１００回繰り返した中で、得られたハプロタイプの５％だけが有意にＥ−０４未満のｐ値で存在するのに対して、図１２のハプロタイプ５ではｐ値は９Ｅ−０７である。さらに、図１２のハプロタイプ５では、得られたハプロタイプの６％だけが５Ｅ−０３未満の有意性レベルを示すのに対して、それらのなかに５Ｅ−０３未満の有意性レベルを示すものはない。
【０６１７】
このように、図１３のデータを用いて単一マーカーの対立遺伝子またはハプロタイプについて関連を評価することにより、対応する保因者（ｃａｒｒｉｅｒ）が前立腺癌を発症する危険性を推定することが可能であろう。相対的危険性の有意な閾値は試験される集団に応じてさらに細かく評価されることは理解されよう。
【０６１８】
個体が前立腺癌を発症する危険性を判定するための診断法は、配列番号５２０〜５２８のマーカー（マーカー９９−１２３−３８１、４−２６−２９、４−１４−２４０、４−７７−１５１、９９−２１７−２７７、４−６７−４０、９９−２１３−１６４、９９−２２１−３７７および９９−１３５−１９６）を含む本発明の地図中のマーカーについて以下に記載されているように実施することが可能である。
【０６１９】
上記のハプロタイプ解析から、二対立遺伝子マーカー４−１４−２４０と９９−２２１−３７７との間の１７１ｋｂのゲノムＤＮＡが完全にまたは部分的に前立腺癌の原因となる遺伝子を含むことが示された。したがって、この領域内に位置するタンパク質のコード配列は、前立腺癌と関連する遺伝子の位置を決定するものとして特性づけられた。この解析については以下でさらに詳細に説明するが、この解析から、１７１ｋｂのゲノム領域中の単一のタンパク質コード配列が明らかにされた。これをＰＧ１遺伝子と称した。
【０６２０】
実施例１６
候補領域中のゲノム配列の同定
ＰＧ１遺伝子の配列決定を行うための鋳型ＤＮＡを次のように取得した。図９のＢＡＣ ＥおよびＦを既に述べたようにサブクローン化した。適切なプライマー、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ｄＮＴＰｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、緩衝液およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより推奨されるようなサイクル条件下で、ＰＥ ９６００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＣＲにより最初にプラスミドインサートを増幅させた。
【０６２１】
次に、自動ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いてＰＣＲ産物の配列を決定した。標準的なダイプライマー化学およびサーモシークエナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰＥ ９６００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により、配列決定反応を行った。ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡ色素でプライマーを標識した。配列決定反応に使用するｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒから購入した。配列決定緩衝液、試薬濃度およびサイクル条件は、Ａｍｅｒｓｈａｍにより推奨されるとおりとした。
【０６２２】
配列決定反応の後、サンプルをＥｔＯＨで沈澱させ、ホルムアミドローディング緩衝液に再懸濁させ、標準的な４％アクリルアミドゲル上にローディングした。ＡＢＩ ３７７シークエンサーを用いて３０００Ｖで電気泳動を２．５時間行い、配列データを収集し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ配列決定解析ソフトウェア， ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．２で解析した。
【０６２３】
以上で得た配列データを専用データベースに送り、品質管理および検証のステップを行った。ピークの形状、ピーク間分解能およびノイズレベルを考慮に入れて、専用の塩基コーラー（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｅｒ）により、疑わしいピークに印をつけた。専用の塩基コーラーは、自動トリミングも行った。疑わしいピークを４つ以上有する２５塩基以下のストレッチは信頼性なしと考えて除外した。
【０６２４】
上述したように単離したＢＡＣサブクローン由来の配列断片を、Ｒ． Ｓｔａｄｅｎ （Ｂｏｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． １９９５）からのＧａｐ４ソフトウェアを用いてアセンブリーさせた。このソフトウェアは、配列断片から単一配列への再構築を可能にする。異なる断片のアライメントから推定された配列はコンセンサス配列と呼ばれる。定方向配列決定法（プライマーウォーキング）を用いて、配列を完成させコンティグを連結させた。
【０６２５】
次に、可能性のある機能配列を実施例１７に記載されているように同定した。
【０６２６】
実施例１７
機能配列の同定
タンパク質、核酸およびＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）公共データベースを用いて相同性検索を行うことにより、ＢＡＣ由来ヒトゲノム配列中の可能性のあるエキソンの位置を決定した。実施例９に記載されているように、主要な公共データベースを局所的に再構築した。Ｇｅｎｐｅｐｔ（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：１−５ （１９９６）、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ（Ｂａｉｒｏｃｈ， Ａ． ａｎｄ Ａｐｗｅｉｌｅｒ， Ｒ． ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２１−２５ （１９９６）、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）およびＰＩＲ／ＮＢＲＦ（Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： １７−２０ （１９９６）、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）のデータベースの重複は除いて融合させることにより、タンパク質データベースＮＲＰＵ（Ｎｏｎ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｉｑｕｅ）を作成した。ＮＲＤＢソフトウェア（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６），前掲）の使用により冗長なデータを取り除き、ＸＮＵソフトウェア（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．前掲）により内部反復配列をマスキングした。ＮＲＰＵデータベースを用いて相同性を見いだすことにより、既知のタンパク質に関連した可能なコードエキソンに対応する配列を同定することが可能であった。
【０６２７】
ＧｅｎＢａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６），前掲）のｇｂｅｓｔセクション（１〜９）により、ＥＳＴローカルデータベースを構築した。したがって、公に利用可能な転写産物断片がすべて含まれる。このデータベースを用いて相同性を見いだすことにより、可能性のある転写領域の位置を決定することが可能であった。
【０６２８】
このローカル核酸データベースには、ＥＳＴセクションを除いて、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｔｏｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：６−１２ （１９９６）、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）のすべてのセクションが含まれていた。冗長なデータは先に述べたように取り除いた。
【０６２９】
タンパク質または核酸のデータベース中の類似性検索は、ＢＬＡＳＴソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）、その開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）を用いて行った。アライメントは、Ｆａｓｔａソフトウェアを用いて精緻化し、マルチプルアライメントを利用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗ． Ｈｏｍｏｌｏｇｙの閾値は、試験領域の長さおよび複雑度ならびに参照データベースのサイズに基づく各解析に合わせて調節した。
【０６３０】
上述したように同定された可能性のあるエキソン配列を、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。陽性クローンの末端の配列を決定し、先に決定したゲノム配列上に配列ストレッチを位置づけた。次に、上記の手順を用いて同定された前立腺癌に関連する遺伝子に由来したｃＤＮＡのクローニングを可能にするために、これらのアライメントの結果を用いてプライマーを設計した。
【０６３１】
次に、得られたｃＤＮＡ分子の配列を決定した。また前立腺ｍＲＮＡのノーザンブロット解析の結果は、５〜６ｋｂの長さを有する主要なｃＤＮＡの存在を裏付けた。前立腺癌に関連する遺伝子の構造を実施例１８に記載されているように評価した。
【０６３２】
実施例１８
遺伝子構造の解析
最後に、上述したように得たｃＤＮＡおよび上述したように得たゲノムＤＮＡ配列からのｍＲＮＡ配列のアライメントを行うことにより、遺伝子のイントロン／エキソン構造を完全に推定した。このアライメントにより、イントロンおよびエキソンの位置、少なくとも８つのエキソンのそれぞれを規定する開始および末端ヌクレオチドの位置、５’および３’スプライス部位の位置および状態、停止コドンの位置、ならびにゲノム配列で決定されるポリアデニル化部位の位置の決定が可能であった。また、この解析により、ｍＲＮＡ中のコード領域の位置ならびにｍＲＮＡ中のポリアデニル化シグナルおよびｐｏｌｙＡストレッチの位置を得た。
【０６３３】
上述したように同定した遺伝子は、少なくとも８個のエキソンを含み、５２ｋｂ以上にまたがって存在する。Ｇ／Ｃに富んだ推定プロモーター領域は、コード配列の上流に同定された。推定プロモーター中にＣＣＡＡＴも同定された。プロモーター領域は、Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ， Ｄ．Ｓ．， Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｐｏｌ ＩＩ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４９：９２３−９３２ （１９９５）に記載されているように同定した。その文献の開示内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０６３４】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙヒト前立腺ｃＤＮＡキット（カタログＮｏ． ＰＴ１１５６−１）を用いる５’ＲＡＣＥ反応のような従来法を用いた追加の解析を行うことにより、以上で得られたｃＤＮＡの５’側がｍＲＮＡ中の信頼できる５’末端であるかを確認することが可能である。
【０６３５】
このほか、同定されたコード領域の５’末端から伸長する一連のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、転写産物の５’配列を決定することができる。
【０６３６】
実施例１９
候補遺伝子中の二対立遺伝子マーカーの検出： ＤＮＡ抽出
血縁関係のない健常なドナーを用いた。ドナーはフランス人の異種集団を代表するのに十分な多様性を示した。１００個体からＤＮＡを抽出し、二対立遺伝子マーカーを検出するために試験を行った。
【０６３７】
各ドナーからＥＤＴＡの存在下で末梢静脈血３０ｍｌを採取した。２０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、細胞（ペレット）を回収した。溶解液（最終容積５０ｍｌ： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６； ５ｍＭ ＭｇＣｌ２； １０ｍＭ ＮａＣｌ）で赤血球を溶解した。溶解液中にペレットを再懸濁させた後、上清中に残留している赤血球を除去するのに必要な回数だけこの溶液を遠心（１０分間、２０００ｒｐｍ）した。
【０６３８】
以下の組成を有する溶解液３．７ｍｌを用いて４２℃で一晩かけて白血球のペレットを溶解した。
【０６３９】
2004504037.tif 000022
【０６４０】
タンパク質を抽出するために、１ｍｌ飽和ＮａＣｌ（６Ｍ）（１／３．５ｖ／ｖ）を添加した。激しく撹拌した後、溶液を１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ＤＮＡを沈降させるために、２〜３倍容量の１００％エタノールを上記の上清に添加し、この溶液を２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ＤＮＡ溶液を７０％エタノールで３回すすいで塩を除去し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを３７℃で乾燥させ、１ｍｌのＴＥ １０−１または１ｍｌの水に再懸濁させた。２６０ｎｍでＯＤを測定することにより、ＤＮＡ濃度を評価した（１単位ＯＤ＝５０μｇ／ｍｌ ＤＮＡ）。
【０６４１】
ＤＮＡ溶液中にタンパク質が存在するかを判定するために、ＯＤ ２６０／ＯＤ ２８０の比を求めた。以下に記載の後続の実施例では、ＯＤ ２６０／ＯＤ ２８０比が１．８〜２の間にあるＤＮＡ調製物のみを使用した。
【０６４２】
各個体から得たＤＮＡを等量ずつ混合してプールを作製した。
【０６４３】
実施例２０
二対立遺伝子マーカーの検出： ＰＣＲによるゲノムＤＮＡの増幅
先に得たＤＮＡのプールについて、配列番号５４２〜５５３および５６４〜５７５の増幅プライマーを用いて、実施例１９のＤＮＡサンプルの特異的ゲノム配列を増幅した。また、５０個体のサンプルを同様に増幅した。
【０６４４】
下記のプロトコールを用いてＰＣＲアッセイを行った：
2004504037.tif 000023
【０６４５】
候補喘息関連遺伝子のプロモーター領域、エキソンおよび３’末端を増幅するために、候補遺伝子の配列情報およびＯＳＰソフトウェア（Ｈｉｌｌｉｅｒ ＆ Ｇｒｅｅｎ， １９９１）を用いて、第１のプライマーの対を設計した。この第１のプライマーは約２０ヌクレオチド長であり、増幅の標的である特異塩基の上流に共通のオリゴヌクレオチドテイルを含んでいた。このテイルは、配列決定に有用である。ＧＥＮＳＥＴ ＵＦＰＳ ２４．１シンセサイザーを用いてホスホルアミダイト法によりこれらのプライマーの合成を行った。
【０６４６】
ＤＮＡ増幅は、Ｇｅｎｉｕｓ ＩＩサーモサイクラーを用いて行った。９４℃で１０分間加熱した後、４０サイクルを行った。各サイクルの構成は、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３０秒である。最終的な伸長を７２℃で７分間行ってから、増幅を終了した。蛍光光度計およびインターカレート剤としてのＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート上で、得られた増幅産物の量を測定した。
【０６４７】
実施例２１
二対立遺伝子マーカーの検出
増幅したゲノムＤＮＡの配列決定および多型の同定
実施例２０で得られた増幅ＤＮＡの配列決定をＡＢＩ ３７７シークエンサーで行った。ダイターミネーターサイクルシークエンシングプロトコルを用いた自動ジデオキシターミネーター塩基配列決定反応により、増幅産物の配列を判定した。配列決定反応の反応産物を配列決定ゲルで泳動させ、先に述べたように配列を解析した。
【０６４８】
プールした増幅断片での二対立遺伝子マーカーの存在を検出するように設計された上記の多型解析ソフトウェアを用いて、配列データをさらに評価した。多型検索は、既に述べたように、同一位置に異なる塩基が座位することで生じる電気泳動パターンのピークの重ね合わせの存在に基づくものであった。
【０６４９】
コーカサス系フランス人のランダムな血液ドナーの集団で、対立遺伝子頻度を決定した。それらの範囲が広いといえるのは、上述したように１００個体のプールをスクリーニングすることにより二対立遺伝子マーカーを生成させたことに加えて、５０サンプルに対して個別試験方式で多型探索も行ったという事実による。それらを用いる関連試験において原因であると推定される突然変異の同定を行うのが手っ取り早い方法であると考えられるので、本実施例では、こうした手法を採用した。１個体のみで見いだされた二対立遺伝子マーカーは、関連研究では考慮にいれなかった。
【０６５０】
実施例２２
マイクロシークエンシングによる多型の確認
実施例２１で同定した二対立遺伝子マーカーをさらに確認し、マイクロシークエンシングによりそれぞれの頻度を求めた。マイクロシークエンシングを実施したのは実施例１８で述べた各個体のＤＮＡ試料であった。
【０６５１】
二対立遺伝子マーカーの検出について先に述べたようにして、上記と同一のプライマーセットを使用し、ＰＣＲにより個体のゲノムＤＮＡから増幅を行った。
【０６５２】
マイクロシークエンシングで使用した好ましいプライマーは約１９ヌクレオチド長であり、対象の多型塩基のすぐ上流にハイブリダイズした。
【０６５３】
５つのプライマーは、遺伝子の非コード鎖にハイブリダイズした。二対立遺伝子マーカー１０−２０４−３２６、１０−３５−３５８および１０−３６−１６４については、プライマーは遺伝子のコード鎖にハイブリダイズした。
【０６５４】
マイクロシークエンシング反応は実施例１３に記載されているように行った。
【０６５５】
実施例２３
肥満の若者における高頻度なＬＳＲ多型と高血漿ＴＧとの関連
選択されたＳＮＰと、代謝障害に関連する臨床値との関連を判定した。本実施例およびこれ以降の実施例は、たんなる例示にすぎず、マーカー、臨床値および代謝疾患の間に他の有意な関連がないことを示唆するものではない。しかしながら、それらは、診断学、予測医学および薬理ゲノム学に役立つ有意な関連を同定するうえで有用な方法の例を提供する。
【０６５６】
マーカーの選択
次の３つの判定基準に基づいて５つのマーカーを選択した： １）ＬＳＲ遺伝子と等しい距離をカバーする； ２）ＵＳＦ２遺伝子とＬＩＰＥ遺伝子中に位置する； および３）対立遺伝子頻度が１０％未満である。ＳＮＰがＬＳＲタンパク質のアミノ酸を変化させるというのは判定基準にしなかった。なぜなら、多くのイントロンマーカーが、ｍＲＮＡの安定性、スプライシングの速度またはスプライス変異体の産生に影響を及ぼすことにより、遺伝子の機能を調節する可能性があるからである。５つのマーカーの位置は、図１４Ｂ中に四角で囲んで示されている。マーカー１、２および３はそれぞれ、配列番号５３２、５３３および５３４に列挙されている。マーカーのうちの３つは、ＬＳＲ遺伝子内に位置する（マーカー１〜３）。マーカー＃１および＃３は、コード領域内にある。マーカー＃１の部位での多型は、タンパク質レベルでは変化として翻訳されない（バリン→バリン）。マーカー＃３は、推定リポタンパク質結合部位を含有するレセプターの細胞外ドメインにＳｅｒ→Ａｓｎ置換を引き起こす。マーカー＃２は、異なるＬＳＲイソ型を産生するスプライス部位の１３７ｂｐ上流にあるイントロン３中に位置する。マーカー＃４（配列番号５３５）および＃５は、それぞれ、ＵＳＦ２遺伝子およびＬＩＰＥ遺伝子のイントロン中に見出される。ＬＳＲに対するＵＳＦ２およびＬＩＰＥの相対的位置を図１４Ａに示す。
【０６５７】
対照として、種々のゲノム領域に分布した１８個のランダムなマーカーを選択した。それらのマーカーの染色体上の位置、対立遺伝子頻度およびハーディ・ヴァインベルク（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡試験を、以下の表５に示す。これらの試験で使用したマーカーはすべて、ハーディ・ヴァインベルク平衡にあった（表５）。それぞれの遺伝子型判定プレート内に挿入されている既知の多型部位を用いて品質管理を体系的に行った。その結果、精度が９８％を超えていることが示された。この試験に使用した２３の異なるＳＮＰに対して自動遺伝子型コーリング（ｃａｌｌｉｎｇ）を行ったところ、その９６．７％で不明瞭な遺伝子型の決定が行われた。不明瞭な遺伝子型は解析の対象にはしなかった。それぞれのマーカーで生じた不明瞭な遺伝子型判定の割合（％）を以下の表５に示す。それは次のページから始まる。
【０６５８】
表５
2004504037.tif 000024
＊ ＳＮＰは、本明細書に記載されているように、１００個のＤＮＡクローンのプールを用いて同定した。対立遺伝子頻度およびハーディ・ヴァインベルク平衡は、それぞれのマーカーについて測定した。解析で考慮しなかったそれぞれの不明瞭な遺伝子型の割合（％）を最後のカラムに示す。
【０６５９】
被験者の選択
試験に参加した被験者は、パリ地区に住む血縁関係のないコーカサス人の少女１６１人であった。肥満少女は、ＭａｒｇｅｎｃｙクリニックまたはＳａｉｎｔ Ｖｉｎｃｅｎｔ ｄｅ Ｐａｕｌ病院で減量プログラムに参加した。被験者はすべて、集団の百分位数９８を超えるＢＭＩにより規定されるような幼児期に重度の肥満を発症したものであった。
【０６６０】
入院時に、体重および身長を測定し、血液サンプルを採取し、ＤＮＡ調製物を得るために軟膜を単離し、生化学分析のために血漿を分離した。血漿ＴＧ、総コレステロールおよびＦＦＡを、市販の酵素キットを用いて、製造業者の説明書に従って測定した。これらの被験者の血液サンプルの採取および試験は、減量治療前に行った。
【０６６１】
臨床的特徴
被験者の臨床的特徴を表６に示す。これらの値は、臨床検査室に入る前日の夜から絶食し前日の夜の食事についての標準化は行わずに採取した血漿サンプルに対する測定値である。これらの条件下では、血漿ＴＧ濃度は同一の個体において日ごとにかなり変化しうる（２１）ことが判明した。
【０６６２】
2004504037.tif 000025
【０６６３】
ＳＮＰの同定
対象のアンプリコンは、ＬＳＲ、ＵＳＦ２およびＬＩＰＥ遺伝子のエキソンおよびイントロンを含んでいた。ランダムマーカーは、指定のゲノム領域のＢＡＣ配列に由来するアンプリコンから生成された。ＰＣＲプライマーを用いて、血縁関係のない１００個体（フランス系血液ドナー）からのＤＮＡのプールにおいて対応するゲノム配列を増幅させた。
【０６６４】
ダイプライマーサイクル解析を用いてＡＢＩ ３７７シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で蛍光自動配列決定を行うことにより、そしてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ配列決定解析ソフトウェアを用いてＤＮＡ配列抽出を行うことにより、両方の鎖について、プールしたＤＮＡサンプルからの増幅産物の配列を決定した。プールされた増幅断片におけるＳＮＰの存在を検出するように設計されたソフトウェアプログラムＡｎａＰｏｌｙｓ（Ｇｅｎｓｅｔ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、配列データ解析を自動で行った。
【０６６５】
遺伝子型判定
ＳＮＰ同定について記載したのと同様にＰＣＲ反応を行うことにより、ＳＮＰを含有する増幅産物を得た（前掲）。個々のＤＮＡサンプルの遺伝子型判定は、マイクロシークエンシング法を用いて行った。
【０６６６】
統計解析
データを収集した際、対立遺伝子頻度およびハーディ・ヴァインベルク均衡のχ２検定を行った（Ｈｉｌｌ， Ｗ． Ｇ． （１９７４） Ｈｅｒｅｄｉｔｙ， （Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）， ｐｐ． ２２９−２３９； Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ， Ｊ． Ｏ． （１９９４） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ （Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｒｌｅｑｕｉｒｚ ： Ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ， １．１ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｈｒｏｐｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ， Ｇｅｎｅｖａ））。第２の表現型に従って分けられた肥満被験者の遺伝子型頻度の差を３×２χ２解析を用いて解析した。１９ｑｌ３遺伝子座内に位置するＳＮＰ対に対する非段階的遺伝子型データから２つの遺伝子座の連鎖不平衡（Ｄ）値を計算し（Ｈｉｌｌ， Ｗ． Ｇ． （１９７４） Ｈｅｒｅｄｉｔｙ， （Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）， ｐｐ． ２２９−２３９ ； Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ， Ｊ． Ｏ． （１９９４） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ （Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ））、ＥＨコンピュータープログラムのアウトプットから得られた４つのハプロタイプ頻度の推定値の有意性に関して試験した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｒｌｅｑｕｉｎ ： Ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ， １．１ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｈｒｏｐｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ， Ｇｅｎｅｖａ））。対立遺伝子頻度の積から得られるＤｍａｘ陽性および陰性を用いてＤ／ＤｍａｘとしてＤ’を計算した。ＳＡＳプログラミング言語を用いてデータベースを構築、解析、およびフォーマットし、他の遺伝連鎖コンピュータープログラムへの入力に供した。
【０６６７】
遺伝子型頻度の比較
集団の平均値を超える血漿ＴＧ、総コレステロールおよびＦＦＡの値を有する被験者の遺伝子型頻度（試験マーカーおよび対照マーカーについての頻度）を、平均未満の値を有する被験者の遺伝子型頻度と比較した。５つの候補マーカーのそれぞれで得られたχ２値を図１５に示す。ＬＳＲ ＳＮＰ ＃３の遺伝子型頻度だけが、肥満被験者の２つの群の間で、集団の平均を超えるかまたはそれより少ない血漿ＴＧを有する被験者に対してのみ、有意差を示した（図１５Ａ）。このχ２値は、ランダムマーカーで得られた平均χ２の９９．９９％信頼区間および１８のランダムマーカーで得られた任意のχ２の９９．９９％信頼区間を超えるものであった。ランダムマーカーの平均および９９．９９％信頼区間を、それぞれ実線および点線として示す。肥満集団を総コレステロールまたはＦＦＡのレベルによって分けた場合、ＬＳＲマーカーの遺伝子型頻度の有意な変化は観測されなかった。これらのデータから、塩基１９７３９で突然変異Ｇ→Ａが起こると、Ｓｅｒ→Ａｓｎ置換（アミノ酸残基３６３）が生じ、思春期の肥満少女の血漿ＴＧレベルに選択的に影響を及ぼすことが示唆される。
【０６６８】
思春期の少女では、正常な血漿ＴＧ値は、３７〜１３１ｍｇ／ｄｌ（２０）の範囲であり； 高グリセリド血は１３０ｍｇ／ｄｌ ＴＧを超えるものである。高グリセリド血の個体の遺伝子型頻度と正常ＴＧを示す個体の遺伝子型頻度との比較では、高グリセリド血の個体（ｎ＝３５）の３３％が少なくとも１つのＡ対立遺伝子を有し、一方、正常トリグリセリド血の個体（ｎ＝１２５）の１６％のみがＡ対立遺伝子を有することが示された（χ２＝４．５およびｐ＜０．０４）。ＬＳＲ突然変異の直接の結果として肥満少女が高グリセリド血であるときのオッズ比の計算値は、２．５の値に戻る。
【０６６９】
ＬＳＲタンパク質の外部ドメインでアスパラギンからセリンへの突然変異を引き起こすＬＳＲ ＳＮＰ ＃３多型は、ＬＳＲ推定リポタンパク質結合ドメインの近傍にある。したがって、ＬＳＲ遺伝子のこの多型は、リポタンパク質レセプターとしてのＬＳＲの活性を減少させるＬＳＲタンパク質中の突然変異を引き起こすように思われる。ＬＳＲは、主としてＴＧに富んだリポタンパク質を除去する働きがあるので、遺伝的多型によりこの機能が損なわれると思春期の肥満少女の高脂血症が惹起されるであろう。この結果は思春期の少女を用いた実験で見いだされたものであるが、類似の結果が思春期の少年に見られないという理由はないし、類似の結果が両方の性別の大人に存在しないとう理由もない。
【０６７０】
実施例２４
肥満の若者における高頻度なＬＳＲ多型と食事性脂肪血症との関連
この試験では、臨床研究センターに入院した３４人の思春期の肥満少女について、絶食後および食事後の両方で血漿ＴＧを測定した。血漿ＴＧ値は、研究室で測定した。別段の記載のない限り、材料および方法は、実施例２３のときと同じであった。
【０６７１】
被験者の選択および試験
実施例２３に記載されている被験者のサブセット（ｎ＝３４）を、試験に先立って夕方にクリニックに入院させた。通常の標準的な試験食を摂らせ、１２時間にわたり水以外はなんら許可しなかった。午前８：００に血漿を採取し、各人は、標準化された高脂肪試験食を１５分以内に摂取した。高脂肪試験食は、１０００ｋｃａｌを提供し、６２％の脂肪（２９％の飽和脂肪、２７％の単不飽和脂肪および４４％の多価不飽和脂肪）、２９％の炭水化物および９％のタンパク質、ならびにバターおよびパン、マヨネーズ付き卵、チーズ、ヒマワリ油あえサラダおよびアップルソースからなるものとした。血液サンプルは、食事前と、食事の２および４時間後に採取した。
【０６７２】
遺伝子型頻度の比較
ＬＳＲ遺伝子型（マーカー＃１、＃２および＃３）が試験食に対する食後のトリグリセリド応答に及ぼす影響を、図１６ Ａ〜Ｃに示す。マーカー＃３にホモ接合性ＧＧ（セリン）を有する被験者は、食事前および食事の４時間後の両方で、有意に低い血漿ＴＧレベルを有していた（図１６Ｃ）。ＬＳＲマーカー＃２の遺伝子型の差は、絶食性および食事性脂肪血症に対して検出可能な影響を示さなかった（図１６Ｂ）。興味深いことに、ＬＳＲマーカー＃１は、絶食時の血漿ＴＧレベル（図１６Ａ）に有意な影響を及ぼすように思われた。
【０６７３】
マーカー＃１の遺伝子型がＬＳＲマーカー＃３とは独立して絶食時にまちがいなく影響を及ぼすか否かを調べるために、マーカー＃１および＃３の両方の遺伝子型を考慮に入れて、血漿ＴＧ応答をプロットした（図１６Ｄ）。ＬＳＲマーカー＃１多型は、マーカー＃３に正常なＧＧ遺伝子型を有する個体の食事後応答に影響を及ぼさなかった。しかしながら、マーカー＃１に高頻度な対立遺伝子を有し、マーカー＃３に希な対立遺伝子を有する例はなかった。したがって、そのような関連が、Ａｓｎ突然変異を有する被験者で見られた異常な脂質応答を悪化させるかまたは低減させるかを決定することはできない。
【０６７４】
絶食時の血漿脂質値に及ぼすＳＮＰマーカー＃１の影響についての最も簡単な説明は、アミノ酸置換により引き起こされる機能の異常は低レベルではあるが、このマーカー＃１がマーカー＃３と連鎖不平衡にあるということである。この可能性を試験するために、５つの試験マーカーすべてについて連鎖不平衡度を調べた。データは、ＬＳＲ遺伝子内の３つのマーカーすべてが連鎖不平衡にあることを示している（データは示さない）。したがって、タンパク質レベルでは影響が現れないが、マーカー＃１はマーカー＃３と連鎖不平衡にあるために血漿ＴＧに有意な影響を及ぼすことは驚くべきことではない。このことはまた、１６１例の被験者の中にマーカー＃１およびマーカー＃３に、それぞれ、ＣＣおよびＡＧまたはＡＡ遺伝子型の両方を有するものがいない理由を説明するものでもある。
【０６７５】
配列解析
Ｓｅｒ（ｎ＝１２）またはＡｓｎ（ｎ＝３）置換のいずれかのホモ接合をもつ被験者のゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、すべてのＬＳＲエキソンについて両方向で配列を決定した。Ｓｅｒ→Ａｓｎ置換以外にはコード領域の突然変異は検出されなかった。したがって、血漿ＴＧに及ぼすマーカー＃３の影響は、ＬＳＲタンパク質中で生じる突然変異が直接の原因であると思われる。ＳＮＰ＃３は、絶食後および食事後のいずれの血漿ＴＧに対しても、他の未確認の突然変異の存在との単なる情報伝達によってではなく、それ自体で直接影響を及ぼすように思われる。
【０６７６】
有意性と仮説
なんら限定しようとするものではないが、本発明者らは、アルコール官能基を除去して塩基性アミノ酸を導入するＬＳＲエキソン６における突然変異が起こるとレセプターの効率が低下し食事性ＴＧの除去速度が減少するという仮説を立てている。この突然変異が絶食後および食後４時間でのより低レベルの血漿ＴＧと関連し、食後２時間で測定された血漿ＴＧに著しい影響を及ぼさないという事実は、この解釈と一致する。本発明者らはさらに、食後のピーク時（２時間）に、腸による乳糜脂粒の放出速度ならびにリポタンパク質リパーゼおよびおそらく肝性リパーゼによるＴＧ加水分解の速度により血漿ＴＧレベルをほぼ決定できるという仮説を立てている。しかしながら、４時間後では、残った乳糜脂粒の細胞への取り込みに依存する別の機構が有意な役割を果たしているとも考えられる（Ｋａｒｐｅ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３８，２３３５−２３４３）。
【０６７７】
したがって、少なくとも思春期の肥満少女では、ＬＳＲ遺伝子の多型は、ＴＧに富んだリポタンパク質の代謝に顕著な影響を及ぼす。遺伝的な証拠は、ＬＤＬレセプターおよびＬＳＲがリポタンパク質の除去に寄与するという考え方を支持する。ＬＤＬレセプターの欠陥は主として高コレステロール血症を引き起こし、一方、ＬＳＲの欠陥は肥満の思春期の少女では高コレステロール血症のない高トリグリセリド血症に影響を及ぼす。ＬＤＬレセプターの機能的突然変異はほとんどの罹患個体で重い高コレステロール血症を引き起こすが、ＬＳＲ遺伝子のみの突然変異は、思春期の肥満少女では高グリセリド血である確率が２．５倍になるにすぎない。このほか、突然変異を持ったいくつかの個体は低レベルのＴＧを有するが、反対に、高トリグリセリド血症を示す肥満の被験者の３分の２はＬＳＲ遺伝子のレベルに異常を示さない。明らかに、環境要因および他の遺伝子もまた血漿ＴＧレベルに影響を及ぼしている。それらの遺伝子の影響を同時に解析し、それによってそれらの相互の相対的重要度を判定することが可能であろう。
【０６７８】
女性では、心筋梗塞の生存者中で観測された最も一般的な脂質異常である高トリグリセリド血症（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ５２，１５３３−１５４３）は、心臓血管疾患の独立危険因子であると考えられる（Ａｕｓｔｉｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ８１，７Ｂ−１２Ｂ）。したがって、ＬＳＲマーカー＃３の遺伝子型判定は、肥満の被験者の心臓血管系の併発症の危険を予測する診断ツールを提供しうる（肥満でない被験者の場合でさえも、その可能性はある）。
【０６７９】
ＬＳＲ多型は過剰体重を有する被験者の場合にのみ高トリグリセリド血症に寄与する可能性があるとも考えられる。確かに、ＬＳＲ発現が減少すれば、そうでなければ影響を受けることのないＬＳＲタンパク質中の小さな突然変異の機能的効果が現れる可能性がある。この点に関して、タイプＩＩＩ高脂血症で生じる乳糜脂粒の欠損クリアランスが体重の減少により迅速に修正されることが多いことも注目に値する興味深い点である （Ｍａｈｌｅｙ， Ｒ． Ｗ．， ａｎｄ Ｒａｌｌ， Ｊｒ．， Ｓ． Ｃ ． （１９９５） Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｓｃｒｉｖｅｒ， ｅｔ ａｌ．編（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， ｐｐ． １９５３−１９８０）。ＬＳＲはタイプＩＩＩ高脂血症およびａｐｏＥ２／２表現型を有する被験者から単離されたβ−ＶＬＤＬに結合しないので（Ｙｅｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，１１７２−１１８０）、過剰の体重により低減したＬＳＲ発現が、異常なＡｐｏＥイソ型と一緒になって、タイプＩＩＩ高脂血症の様相を引き起こすことが推測される。
【０６８０】
実施例２５
肥満の若者における高頻度なＬＳＲ多型とインスリンおよびグルコースのレベルとの関連
インスリン：
肥満児では、インスリンは、以前の試験と一致して、強くかつ明確にＢＭＩと関連している（図１７Ａ）。ＬＳＲ多型とこれらの変数との関連を、以上に記載の解析（実施例２３）と同じような解析を行うことにより判定した。
【０６８１】
個体がインスリン−ＢＭＩ回帰直線の上にくるか下にくるかにより、肥満の集団を別々の集団に分け、それぞれの群の遺伝子型頻度を比較した（図１７Ｂ）。その結果、ＬＳＲ多型がＢＭＩを基準にしたインスリンレベルと関連を示すことがわかった。マーカー＃２の遺伝子型頻度は、高いインスリン対ＢＭＩ比を有する被験者で著しく異なっていた（ｐ＜０．０３）。χ２値は、ランダムマーカーの分布により規定された値を大きく超えた。Ａ対立遺伝子がホモ接合である被験者は、Ｇ対立遺伝子がヘテロ接合またはホモ接合のいずれかである被験者よりも、有意に高いインスリン対ＢＭＩ比を有していた： それぞれ０．５７１＋／−０．０５８および０．５０５＋／−０．０５８ （ｐ ＜ ０．０５）であった。
【０６８２】
したがって、このデータから、Ａ対立遺伝子がホモ接合である個体では、ＢＭＩで正規化した循環インスリンレベルは、Ｇ対立遺伝子を有する個体のときよりも高いことがわかる。このことから、ＬＳＲは、血漿インスリンレベルを決定する場合、あらかじめ決められた役割を担い、思春期の肥満少女でインスリン抵抗レベルに影響を及ぼす可能性もあることが示唆される。この場合にも、類似の結果が思春期の少年に見られないという理由はみあたらないし、類似の結果が両方の性別の大人に存在しないとう理由もみあたらない。
【０６８３】
グルコース応答
ＬＳＲマーカー＃２とインスリン感受性との関連をさらに確認するために、サブセットとして一晩絶食させた１２０名の肥満児に５０ｇのグルコースを経口的に与えた。この試験を行う前および試験終了の２時間後に収集したサンプルについて、血漿グルコースおよびインスリンの両濃度を測定した。
【０６８４】
マーカー＃２にＡＡ遺伝子型を有する被験者は、ＧＧの被験者よりも、インスリンに対する血漿グルコースが著しい増加を示した（図１８Ｂ）。マーカー＃２にヘテロ接合を有する被験者は中間の応答を有していた。マーカー＃２がＡＡであった群では、５４個体のうち７個体が試験後２時間において１２０ ｍｇ／ｄｌを超える血漿グルコースレベルを有していた。ＡＧ／ＧＧ群では、６６個体のうち２個体だけが１２０ ｍｇ／ｄｌよりも大きい値を有していた（ｐ＜０．０５）。マーカー＃１、＃３または＃４の部位での遺伝子型の違いは、グルコース負荷を与えた後、インスリン対グルコースの変化に有意な影響を及ぼさなかった（図１８Ａ、１８Ｃおよび１８Ｄ）。
【０６８５】
マーカー＃２とインスリン対ＢＭＩ比との関連と一致して（図１７）、ＬＳＲマーカー２のレベルでＡ対立遺伝子がホモ接合である被験者は、Ｇ対立遺伝子がヘテロ接合またはホモ接合である被験者よりもインスリンに対するグルコースが有意に増加する（図１８）。このことから、比較的より高いインスリン対体重比をもつ個体は、比較的高いブドウ糖不耐性を有する個体でもあることがわかる（図１７）。したがって、遺伝子型判定ＬＳＲマーカー２は、インスリン対ＢＭＩ比だけでなく耐糖能のレベルの予測をも可能にする。このことから、このマーカーは、年をとったときにタイプＩＩ糖尿病を発症する危険性の有意な予測因子であり、したがって予測医学および診断学に有用である。
【０６８６】
ＬＳＲ遺伝子の産物がインスリン感受性に影響を及ぼすときの推定分子機構は、２つある（ただし、本発明者らは次の仮説により制限しようとするものではない）。最初に、ＬＳＲは、ＦＦＡの結合によりコンホメーション変化を受けるレセプターである。ＬＳＲ一次配列は、リン酸化を介したレセプターシグナル伝達の機能と適合する。門脈系中のＦＦＡの濃度は、タイプＩＩ糖尿病の発症の危険性に著しく影響を及ぼすことが示されている。したがって、ＦＦＡがＬＳＲに結合すると細胞へのシグナル伝達が生じ、これによりインシュリン受容体へのインスリンシグナル伝達の効率が減少すると推測される。第２に、ＬＳＲα’サブユニットは、レプチンと強い親和力で結合し、細胞内小胞から細胞表面へのＬＳＲの移動を引き起こす。レプチンは、あらかじめインスリン感受性をモジュレートすることが示されている。したがって、ＬＳＲマーカー＃２のレベルで、多型は、レプチンに結合する能力、ＦＦＡに結合する能力または細胞へのシグナル伝達能力のいずれかの点で、レセプターの機能不全を示す可能性がある。
【０６８７】
実施例２６
若者における高頻度なＬＳＲ多型と肥満との関連
被験者（症例と対照）はすべて、女性コーカサス人であった。症例群中の被験者は、幼年期に重度の過剰体重を経験し（ＢＭＩ＞百分位数９８ （ｎ＝１３８））、一方、対照被験者は成年期全体にわたって細身のままであった（ＢＭＩ １８〜２３（ｎ＝７８））。この実験に参加した被験者はすべて、パリ（Ｐａｒｉｓ）またはブリュッセル（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）の地域に住んでいた。症例と対照のいくつかの臨床的特徴は表６（前掲）にまとめられている。
【０６８８】
ＬＳＲのマーカー１、２および３の遺伝子型を、肥満および細身の被験者の集団について判定した。遺伝子型の関連解析を行ったところ、肥満の被験者は、マーカー＃１、＃２および＃３の位置でそれぞれＣＴ／ＴＴ、ＡＡ、ＧＧの遺伝子型の頻度がかなり大きいことがわかった。この遺伝子型関連は、肥満の群では２３％の頻度であり、細身の群では２．５％の頻度であることがわかった。
【０６８９】
頻度のこの差がランダムに生じる確率の推定値をχ２解析により求めた。計算されたχ２は１５．９８（ｐ＜０．００００８）であった。したがって、以上で規定された遺伝子型関連が、肥満の集団の中でより大きな頻度で偶然に生じる可能性は少ない。この多型は、個体が肥満になる確率を直接増大させるレセプターの機能不全の存在を示す可能性はより高い。
【０６９０】
ＳＮＰが肥満と相関しかつレセプター機能不全を示す確率の推定値を、オッズ比の計算により求めた。この計算では、推定値１１．５が得られた。したがって、ＬＳＲマーカー１、２および３がＣＴ／ＴＴ＋ＡＡ＋ＧＧである個体は、それらのマーカーが異なる遺伝子型を持った個体よりも肥満になる可能性が１１．５倍である。したがって、遺伝子型判定ＬＳＲマーカー＃１、＃２および＃３は、個体が肥満になる確率の予測を可能にする。ＬＳＲが肥満を引き起こす分子機構について先に述べたが、その機構に含まれるものとしては、１）血漿ＦＦＡの結合、２）食物脂質の処理、２）レプチンの処理、３）レプチンのシグナル伝達、４）インスリン感受性の調節、また５）血液脳関門を通るレプチン輸送が挙げられる。
【０６９１】
実施例２７
マイクロシークエンシングによる法医学的照合
ＤＮＡサンプルは、たとえば、従来法により毛髪、精液、血液または皮膚細胞の法医学的標本から単離する。次に、本明細書に記載されている方法により、配列番号１〜１１３２のうちのいくつかの配列に基づく一群のＰＣＲプライマーを利用して、法医学的標本から長さ約５００塩基のＤＮＡを増幅する。次に、二対立遺伝子マーカー配列番号１〜１１３２に対応する選択した所定の二対立遺伝子マーカー部位のそれぞれに存在する対立遺伝子を、実施例１３に従って同定する。解析結果の単純なデータベース比較により差異があるか否かを判定するが、差異がある場合には、被験個体の配列又はデータベースの配列のいずれかと法医学的標本との間の差異を判定する。好ましい方法では、容疑者のＤＮＡ塩基配列とサンプルからのＤＮＡ配列との間の統計的有意差により、最終結論として同一性の欠如を証明する。同一性のこの欠如は、たとえば、単一の配列を用いて証明することができる。一方、同一性は、多数の配列を用いて、すべてが一致することで、実証しなければならない。
【０６９２】
特定の好ましい実施形態に関して本発明を説明してきたが、本明細書の開示内容に照らして当業者に明白になるであろう他の実施形態もまた本発明の範囲内である。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲を参照することによってのみ規定されるものとする。
【０６９３】
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【０６９４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、２１番染色体の細胞遺伝学的地図である。
【図２】
図２は、ランダムに分布している二対立遺伝子マーカーのセットについての、マーカー間距離の分布のコンピューターシミュレーションの結果を示す。
【図３】
図３は、形質陽性サンプルと形質陰性サンプルとの対立遺伝子頻度の差に関する種々の仮説に従って、高密度二対立遺伝子地図からの個々のマーカーを用いて行った関連研究で得られたｐ値有意性を、一連の仮説サンプルサイズについて、示す。
【図４】
図４は、約３，０００の二対立遺伝子マーカーを含む地図を用いて行った仮説関連解析である。
【図５】
図５は、約２０，０００の二対立遺伝子マーカーを含む地図を用いて行った仮説関連解析である。
【図６】
図６は、約６０，０００の二対立遺伝子マーカーを含む地図を用いて行った仮説関連解析である。
【図７】
図７は、Ａｐｏ Ｅ領域内の二対立遺伝子マーカーを用いたハプロタイプ解析である。
【図８】
図８は、図７のハプロタイプ解析に含まれるＡｐｏ Ｅ領域内の二対立遺伝子マーカーを用いたハプロタイプ解析のシミュレーションである。
【図９】
図９は、前立腺癌と関連する二対立遺伝子マーカーの更なる研究のために選択された重複クローンの最小アレイ、コンティグに沿って候補ゲノム領域内に位置することが知られているＳＴＳマーカーの位置、および本発明の方法を用いて同定した前立腺癌と関連する候補遺伝子を保有するゲノム領域を保有するＢＡＣコンティグに沿った二対立遺伝子マーカーの位置を示す。
【図１０】
図１０は、罹患集団および非罹患集団において図９の二対立遺伝子マーカーの頻度を決定することにより得られた、前立腺癌の候補遺伝子の大まかな局在化である。
【図１１】
図１１は、図１０に示す大まかな局在化には含まれなかった別の二対立遺伝子マーカーを用いた前立腺癌の候補遺伝子の局在化を更に詳細に示したものである。
【図１２】
図１２は、前立腺癌と関連する遺伝子のゲノム領域内にある二対立遺伝子マーカーを用いたハプロタイプ解析である。
【図１３】
図１３は、図１２のハプロタイプ５に含まれる６種のマーカーを用いたハプロタイプのシミュレーションである。
【図１４】
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＬＳＲ遺伝子の染色体上での局在化およびゲノム構成を示す。
【図１５】
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、血漿中の脂質値とＬＳＲ ＳＮＰとの関連研究をグラフで表したものである。
【図１６】
図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、肥満体の若い女子において食後高脂肪血症に及ぼすＬＳＲの第６エキソンがコードする突然変異の影響をグラフで示したものである。
【図１７】
図１７Ａおよび１７Ｂは、肥満体の若い女子におけるインスリンとＢＭＩとの関連に及ぼすＬＳＲ多型の影響を示す。
【図１８】
図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、肥満体の若い女子におけるグルコース耐性に及ぼすＬＳＲ多型の影響を示す。
【図１９】
図１９は、一例として挙げるコンピューターシステムのブロック図である。
【図２０】
図２０は、新規なヌクレオチドまたはタンパク質の配列を配列のデータベースと比較して、その新規な配列とデータベース中の配列との相同性レベルを調べるための、プロセス２００の１つの実施形態を説明する流れ図である。
【図２１】
図２１は、２つの配列が相同であるか否かを判定するための、コンピューター内でのプロセス２５０の１つの実施形態を説明する流れ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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