(57)【要約】神経型ニコチン性受容体の活性化に増強作用をもつＣＧＲＰペプチドのＮ−末端１−７フラグメントのＳｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ配列のミューテイン、それを含む医薬組成物及び神経学的病気の治療への使用可能性が記述されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のペプチドＣＧＲＰ １−７の配列中の変化により発生しそしてニコチン性神経型受容体活性化に増強作用を有するミューテイン。
【請求項２】
Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ７間のジスルフィド架橋が消失するような７位システイン残基の置換、修飾または欠失をＣＧＲＰ １−７ペプチドが含む請求項１に記載のミューテイン。
【請求項３】
ペプチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のミューテイン。
【請求項４】
ペプチドが少なくとも４アミノ酸を含む配列：Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒを持つ請求項１に記載のミューテイン。
【請求項５】
ペプチドが少なくとも５アミノ酸を含む配列：Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａを持つ請求項４に記載のミューテイン。
【請求項６】
ペプチドが少なくとも６アミノ酸を含む配列：Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒを持つ請求項５に記載のミューテイン。
【請求項７】
上記請求項に記載のＣＧＲＰ １−７ペプチドミューテインの少なくとも１つ及び医薬品として受容し得る補助剤及び賦形剤を１つ（またはそれ以上）を含む医薬製剤。
【請求項８】
さらに１つ以上のｎＡＣｈＲアロステリック調節剤（ＡＰＬ）を含む請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項９】
アロステリック調節剤がフィゾスチグミンである請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
治療薬として使用される請求項１−６に記載のミューテイン。
【請求項１１】
神経型ニコチン性受容体の機能障害による神経学的疾患の症状の治療に有用な薬物の調製のために請求項１−６に記載のミューテインの使用。
【請求項１２】
神経型ニコチン性受容体の機能障害による神経学的疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、及び神経精神病と同定される請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はＣＧＲＰ １−７ペプチドフラグメント（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）のミューテイン及び神経型ニコチン性受容体増強剤としての使用に関するものである。特に、この発明は、全３７アミノ酸ペプチドのＮ−末端ＣＧＲＰ １−７ペプチドフラグメント、少なくとも４アミノ酸を有する、のミューテイン、及び神経型ニコチン性受容体の機能障害による神経学的疾患を治療する可能性を持つ薬物を製造するためにそれを使用することに関するものである。
【０００２】
ニコチン性受容体は横紋筋の神経筋接合部（筋型ニコチン性受容体）、自律神経系及び脳の一部の領域にある末梢神経節（神経型ニコチン性受容体）にコリン作動性伝達をする重要な分子である。（Ｇｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｎｏｒｄｂｅｒｇ， ２０００）。
【０００３】
ニコチン性受容体は全てサブユニットが集合した５量体構造（細胞の膜に中に挿入された）を形成し、中央にチャネルを含んでいる。ニコチン性受容体は種々のサブユニットの組み合わせにより造られでおり、その組み合わせにより異なる機能及び薬理的性質を示す。
【０００４】
サブユニットは以下のように命名されている：αサブユニット（α１−α９）；すなわち、アゴニストに結合しそして隣接したシステイン残基の間でジスルフィド架橋、例えば筋型α１サブユニットにおけるＣｙｓ−１９２−Ｃｙｓ １９３、を含むサブユニット。受容体に特別な性質を付与する非αサブユニットはシステイン残基を含まず、そしてそのアミノ酸配列によって、β１−β４，γ，ε，δと命名されている。サブユニットは全て、１つの伸びた細胞外ドメイン（Ｎ−末端）、４つの膜貫通ドメイン（Ｍ１−Ｍ４）、Ｍ３及びＭ４ドメインに結合する１つの細胞内ドメイン（その長さはサブユニットによる）、及び１つの小さな細胞外Ｃ−末端ドメインを含む類似の局部構造を有している（Ｃｈａｎｇｅｕｘ ａｎｄ Ｅｄｅｌｅｓｔｅｉｎ， １９９８）。
【０００５】
種々のサブユニットのアミノ酸配列分析により、ニコチン性受容体は３つのサブクラスに分類できることが示されている。第一のファミリーは筋型ヘテロマー受容体を含み、典型的に骨格筋及び魚電気器官に存在し、胎児型及び成人型においてそれぞれ （α１）２β１γδ及び（α１）２β１γεの５量体構造を持っている。これらの筋型受容体はα−ブンガロトキシンによって選択的に阻害される。
【０００６】
第二のファミリーはα−ブンガロトキシン非感受性、ヘテロマーサブユニットからなる神経型ニコチン性受容体（ｎＡＣｈＲ）を含む。これらの受容体も、α２，α３，α４及びα６とβ２またはβ４、そしてある場合にはα５，β３サブユニットとの種々の組合せからなる５量体構造を有している。
【０００７】
第三のファミリーは５個の同じサブユニット（α７，α８またはα９）からなるα−ブンガロトキシン結合ニコチン性神経型同種重合受容体を含んでいる。
【０００８】
アセチルコリン及びその他のアゴニストの結合部位はαサブユニットと非αサブユニットの境界にあるＮ−末端細胞外ドメインに位置している。異種重合神経型受容体においてはα及びβサブユニットが結合部位に関与している。
【０００９】
神経型受容体の構造、機能及び薬理に関する研究から、これらの受容体は非常に多くの大脳機能及び神経系疾患の病理機序に関係していることが最近示されているので、非常に重要である（最近の総説としては、Ｃｌｅｍｅｎｔｉ ａｎｄ Ａｄｌｋｏｆｅｒ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ ｏｎ“ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”２０００を参照）。
【００１０】
このように、この受容体のアゴニスト、拮抗剤及び調節剤は種々の神経病理的な病気と関連して広く治療的または診断的興味をそそってきた。
【００１１】
神経型ニコチン性受容体の障害により生じた病気としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、及び精神分裂症、トーレット症候群、不安及び抑鬱のようなその他の精神病がある。
【００１２】
アルツハイマー病
アルツハイマー病（ＡＤ）は６５歳以上の人の１／１０が罹る進行性神経退行性疾患である。老人性痴呆の５０％以上（及び若年性痴呆の大部分）を占めており、記憶を含む高度認識機能が徐々に低下することが特徴である。ＡＤ患者の脳を死後に調べてみると、ＡＤ診断の二つの主要な指標である二つの神経病理学的特徴を示す：細胞内ニューロフィラメントの蓄積及び細胞外斑。
【００１３】
ＡＤ脳は大脳皮質及び海馬内のコリン作動性神経の著しい消失を示す（Ｃｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。これから、認識低下はコリン作動性経路の変性に密接に関係するとする仮説が生れる（コリン作動性仮説；Ｂａｒｔｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９８２）。
【００１４】
さらに、ＡＤ脳では、ニコチン性アゴニストの結合が対照に比較して著しく減少している。しかし、この脳ではα−ブンガロトキシンの結合は低下していないので、同種重合α７受容体の消失は生じていないことを示している。ＡＤ罹患脳について行われた研究ではα４β２が最も障害を生じる部類であることが示されている（Ｗａｒｐｍａｎ ａｎｄ Ｎｏｒｄｂｅｒｇ， １９９５）。
【００１５】
ＡＤに対する最も一般的治療法は低下したコリン作動性伝達の回復を狙ったものである。通常その方法はタクリン、ドネゼピル及びリバスチグミンのようなコリンエステラーゼ阻害剤を使用しており、コリン作動性神経から放出されるアセチルコリンの分解を防ぎ、したがってｎＡＣｈＲと反応できるアセチルコリン濃度を増加させる。この類の薬物はＡＤ症状に対して一時凌ぎの効果を与えるのみであり、神経変性を遅延する能力については疑問がある（Ａｍｂｅｒｉａ ｅｔ ａｌ．，　Ｍａｌｔｂｙ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｎｏｒｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｎｏｒｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｓｖｅｎｓｓｏｎ １９９８）。これらの薬物の可能性のある利点は、神経伝達物質の細胞外濃度の増加及びタクリンまたはガランタミンにより生じるアロステリックｎＡＣｈＲ変化によるｎＡＣｈＲ活性化に基づくようである（Ｍａｅｌｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｏｒｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｓｖｅｎｓｓｏｎ １９９８）。
【００１６】
いくつかの研究は、ｎＡＣｈＲの活性化がＡＤ治療に重要であることを示している：
１）ニコチンによるｎＡＣｈＲ活性化は記憶機能を増強する。動物モデルにおいて、β２サブユニット欠損マウスは学習記憶欠陥を示し（Ｐｉｃｃｉｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９５）、ニコチンを慢性的に投与された健康動物は記憶がよくなる（Ｌｅｖｉｎ １９９２）ことが観察されている。ニコチンはＡＤ患者においても同様に記憶を増強する（Ｒｕｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ． １９９４）。
２）ニコチン受容体の活性化はアセチルコリン、ドパミン、ＧＡＢＡ及びグルタミン酸のような多くの脳神経伝達物質の放出を促進する（Ｗｏｎｎａｃｏｔｔ １９９７）。
３）ｎＡＣｈＲ活性化は部分的にβ−アミロイドの毒性を防御する。事実、ニコチンは培養ニューロンのβ−アミロイド誘発細胞死、α４β２受容体の拮抗剤であるジヒドロ−β−エリスロイジンにより阻害される効果、を阻止する。またその他のニコチン性アゴニストであるシチシンはβ−アミロイド毒性を阻止する（Ｋｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【００１７】
したがって、ニコチン性神経受容体活性化は重要な治療目標であるが、現在まで、達成されておらずまた長期間の受容体機能との関係について十分に理解されていない（Ｓｊｏｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ １９９８， Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． ２０００）。
【００１８】
パーキンソン病
ＡＤに類似してパーキンソン病もまた脳低神経節におけるコリン作動性ニューロンの消失と共に高親和性ニコチン結合部位の著しい減少を示す（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． １９８３， Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ． １９９３）。運動障害に加えて、ＰＤ患者はしばしばｎＡＣｈＲ消失による認識力低下を示す（Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ． １９９５）。ＰＤ患者における最も重要な環境因子は、この病状が喫煙者では少ないということである（Ｍｏｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ １９９５）。タバコはニコチンの他に多くの物質を含んでいるが、ニコチンがそのような効果の原因物質の可能性が強い。例えば、ニコチンを慢性的に投与したげっ歯類においてＰＤの病理生理学的特徴であるドパミン作動性神経の変性を防止する（Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ １９９３）。マウスにおいてニコチンは薬物ＭＰＴＰによって誘発される実験的脳低神経節障害に対する部分的な神経防御物質である。さらに、新規な特異的α４β２受容体アゴニストであるＳＩＢ−１５０８Ｙは、Ｌ−ＤＯＰＡと併用して投与した場合に、実験的ＰＤのサルにおいて認識能力を増強する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８ａ， １９９８ｂ）。
【００１９】
てんかん
てんかんには中枢神経系障害の不均一な集団が含まれている。これらの中で、常染色体性前頭葉てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）は睡眠中に短時間の痙攣を起こす部分てんかんである。最近、ＡＤＮＦＬＥはｎＡＣｈＲα４サブユニットをコードする遺伝の突然変異の結果であることが示された。この突然変異はＭ２膜貫通ドメインにおけるセリン（Ｓｅｒ２４７）のフェニルアラニンによる置換である（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９９５）。この突然変異はカエル卵母細胞に発現するα４β２チャネルの性質を修飾する。また同じα４サブユニットに生じた第二の突然変異、が同じてんかん症状に罹った別の家族から発見された。この突然変異は、Ｍ２ドメインにおけるＣ−末端の２５９位（細胞外）にロイシンが挿入されたものである（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９９５）。後者の突然変異は臨床的に問題ないが、両者の突然変異はα４β２受容体のカルシウム透過性を減少させている（Ｗｅｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９６）。
【００２０】
さらにセリン２４７変異受容体は正常受容体より７倍も弱いＡＣｈ親和性を示し、容易に脱感作する（Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【００２１】
てんかんは脳ニューロンの過剰活性化により発生すると考えられるので、ニコチン性受容体の低下した機能が痙攣を起こすのは矛盾するように思われる。その説明は、α４β２受容体がＧＡＢＡ及びグリシンのような抑制的神経伝達物質の放出を調節するシナプス前作用を有する事実から始まる（Ｗｏｎｎａｃｏｔｔ　１９９７）。抑制性ニューロンからのＧＡＢＡ及びグリシンの放出の増加、またはα４β２受容体が介在するそのニューロンの活性化、はてんかん発作を阻止することができた。
【００２２】
このような理由により、この種のニコチン性受容体を直接増強することができる薬物はこのタイプのてんかんの治療に有用であった。
【００２３】
その他の精神障害
これらの神経病理に加えて、精神分裂病の脳において海馬ＣＡ３領域及び前頭葉皮質におけるα７受容体の有意な減少があるので、精神分裂病もやはり異常ｎＡＣｈＲ活性化と関係することが示唆されている（Ｆｒｅｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９５， １９９７）。同様に、トーレット症候群を治療するためにｎＡＣｈＲ指向性薬物の開発が目論まれている（Ｏｌａｌｅ ｅｔ ａｌ． １９９７）。ニコチン性受容体は不安及び抑鬱の生理的病理に明らかに関係している（Ｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｍａｇｇｉｏ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【００２４】
さらに、タバコ依存におけるニコチン性受容体の役割が指摘されている。長期間のニコチン曝露によりニコチン性受容体の数が増加する。喫煙者の脳の死後検査により吸ったタバコの数に比例するニコチン及びアセチルコリン結合部位の増加が明らかになっている（Ｂｅｎｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ １９８８， Ｂｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ １９９７）。さらに、この結合部位の数は非喫煙者より前喫煙者の方が少ない。この現象の説明は、ニコチンへの慢性的曝露により生じたｎＡＣｈＲの脱感作及びその結果としての過剰発現が喫煙者に生じるニコチン耐性及び依存性の基になっていることである（Ｄａｎｉ ａｎｄ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ １９９６）。
【００２５】
以上の考察を総合すると、ｎＡＣｈＲの障害により生じる病気の治療のための化学物質を同定しそして供給することが明らかに必要である。理想的には、これらの物質が、脱感作を生ずることなくｎＡＣｈＲ活性化により発現する反応を速やかにしかも持続的に増強できるものでなければならない。もしこれらの物質がアゴニスト結合部位（アセチルコリンまたはニコチンに対する）に直接作用するならば、他の受容体系に影響することがない高度な特異性の利点があるであろう。
【００２６】
ｎＡＣｈＲは中枢及び末梢神経系の主要なコリン作動性経路の中に、シナップス前におけると同様にシナップス後にも広く分布しているので、今日まで生体系におけるｎＡＣｈＲの研究には問題がある（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ　１９９７）。
【００２７】
多くの研究が、構成的にはニコチン性受容体がないが種々のサブユニットを組合わせたｎＡＣｈＲを発現する細胞からなる異種発現系において実施されてきた。そのため、多数のサブユニット重合体の生物物理学的及び薬理学的性質を研究することができる。
【００２８】
しばしば、最初の段階に発現系としてアフリカツメガエル卵母細胞を使用する。しかし、この方法は、生体の受容体の役割と機能に関する多くの局面を理解するには不適当である、多分両生類細胞は半分の遺伝子相補体を持っているので、活性を変えるｎＡＣｈＲの翻訳後修飾を生じるからである。例えば、卵母細胞発現ｎＡＣｈＲを調節するアトロピン及びイベルメクチンは本来の受容体にはそのような作用をしない（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【００２９】
哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ細胞、を発現系として使用するのは、これが神経細胞でなく、ニューロンに典型的な細胞内受容体調節機構を欠如しているので、やはり重大な限界がある。
【００３０】
このように、本来の受容体を発現する細胞は、ｎＡＣｈＲの生物物理学的及び薬理学的研究、特に種々の神経精神病の診断と治療に使用する中枢及び末梢ニューロンに作用する薬物の開発には、欠くことができないものである。
【００３１】
本発明に使用した適切な実験モデルは、副腎の髄質を構成するラットクロマフィン細胞に代表される。この組織は神経管稜から発生したクロマフィン細胞として自律神経系に属している。
【００３２】
クロマフィン細胞は内臓神経により放出されるアセチルコリンに曝露されており、高いｎＡＣｈＲ密度を有している。その性質により、ｎＡＣｈＲを分析するための薬理学的及び生物物理学的研究に広く使用されてきた（Ｋｈｉｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８， １９９７， Ｇｉｎｉａｔｕｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００３３】
筋型ニコチン性受容体は、細胞内セカンドメッセンジャーの活性化により作動する内在性ＣＧＲＰ神経ペプチドによって強く調節されていることが知られている（カルシトニン遺伝子関連ペプチド；Ｍｕｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｍｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。我々の研究室は最近、ｎＡＣｈＲを競合的に阻害する、すなわちｎＡＣｈＲ上の結合部位からコリン作動性アゴニストを追い出すＣＧＲＰを報告した（Ｇｉｎｉａｔｕｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ． １９８９）。この作用は通常のＧ−タンパク共役ＣＧＲＰ受容体を介するものではなく、細胞内伝達系に関係することは注目に価する（Ｇｉｎｉａｔｕｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。構造‐活性研究によりＣＧＲＰ阻害活性は既に１−７ Ｎ−末端フラグメントの中に完全に存在することが示された（Ｇｉｎｉａｔｕｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。生体のＣＧＲＰのように、ＣＧＲＰ １−７は急速に発現し、洗浄により容易に復帰し得る競合的拮抗を示す（Ｇｉｎｉａｔｕｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。
【００３４】
本特許出願の主題である新規なそして予期せぬ発見は、ＣＧＲＰペプチドの一部のフラグメント（ミューテイン）は生体神経型ニコチン性受容体の活性化によって生じる応答を急速にそして可逆的に増強することである。この受容体は、我々が生体受容体との類似性を分析した培養クロマフィン細胞において研究した。ペプチドミューテインの作用はμＭ以下の濃度で観察されそしてニコチン性アゴニストの濃度に依存した。事実、アゴニストの最大用量に対する応答は増強されないが、少ない用量に対する応答は急速に増加した。ｎＡＣｈＲ活性化がない場合にはこれらの化合物は活性を示さなかった。
【００３５】
さらに、ペプチドＣＧＲＰ １−６は筋型ニコチン性受容体応答を修飾しないことを観察したので、神経型に選択的であることを示している。これらの知見から、ＣＧＲＰ １−７より短い一部のペプチド誘導体はアゴニスト結合部位の明らかに競合的な調節に関して異常な作用をすることが示唆される。我々はまた、ＣＧＲＰ １−６フラグメントはフィゾスチグミンのような典型的アロステリック調節剤とは異なる作用をすることを示した。このように、ＣＧＲＰ １−６及びその誘導体は、ｎＡＣｈＲの機能障害による神経学的病気の症状の潜在的治療のためのリード化合物として使用することができる。
【００３６】
さらに、我々は、ＣＧＲＰ １−７ペプチドから７番目のアミノ酸、つまりシステイン、を除去するとこのペプチド内に形成されていたジスルフィド架橋がなくなり、新規な立体配置をとることを観察した。
【００３７】
したがって、本発明の目的はＣＧＲＰ １−７（Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ， ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）ペプチドから誘導されそしてｎＡＣｈＲに対して増強作用を持つミューテインである。
【００３８】
ミューテインとは、一つ以上のアミノ酸の置換、修飾または欠失により修飾され、しかも増強作用を保持しているペプチドを意味する。
【００３９】
増強剤とは、受容体に対して直接の活性化作用は示さないが、アゴニストに対する受容体応答を増加させる物質のことである。
【００４０】
本発明によると、一つのＣＧＲＰ １−７ペプチドミューテインは７位にあるシステイン残基の置換、修飾または欠失をすることができるが、そうすると２位にあるシステイン残基とのジスルフィド架橋は形成できない。
【００４１】
システインがアラニンで置換されたペプチドは下記のアミノ酸配列を持つ：
【００４２】
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）はＣＧＲＰ １−７ Ａと命名され、ＣＧＲＰ １−７ペプチドミューテインの一例である。
【００４３】
ＣＧＲＰペプチドミューテインは、少なくとも４アミノ酸、すなわちＳｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ；望ましくは５アミノ酸、すなわちＳｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ；さらにより望ましくは６アミノ酸、すなわちＳｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒを含むアミノ酸配列を有している。
【００４４】
本発明のその他の目的は、少なくとも１つのＣＧＲＰペプチドミューテイン及び１つ以上の医薬品として受容し得る補助剤及び賦形剤を含む医薬組成物である。
【００４５】
医薬組成物はさらに１つ以上のｎＡＣｈＲアロステリック調節剤、例えばフィゾスチグミンのような、を含むことができる。
【００４６】
本発明のミューテインは、例えばニコチン性神経型受容体の機能障害による神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、精神病、の症状改善のための薬物として使用することができる。
【００４７】
本発明を、主要な成績の代表例（しかし限定しない）により添付した説明図を参照して説明する：
【００４８】
例１：クロマフィン細胞の調製
ラットクロマフィン細胞の培養はＢｒａｎｄｔの方法（Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９７６， Ｇｉｎｉａｔｕｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｋｈｉｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７， １９９８）にしたがって調製した。２５−３５日齢のラットを高濃度ＣＯ２により麻酔し、副腎を摘出した。ＮａＣｌ １３７， ＫＣｌ ３， Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．７， ＨＥＰＥＳ ２５，グルコース１０（ｍＭ）及びペニシリン及びストレプトマイシン３５０ Ｕｍｌ−１を含む緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で髄質部分を皮質部分から分離した。
【００４９】
続いて、１５分間隔でパスツールピペットを通過させ、そしてコラゲナーゼＡ及びＤＮＡ分解酵素Ｉ（０．５ Ｕ ｍｌ−１及び１０ μｇ ｍｌ−１）で酵素処理することにより約６０分間３７℃で髄質切片から細胞を分離した。細胞を含む懸濁を７００ ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、１０％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を加えたＤＭＥＭ培地（ダルベッコ修正イーグル培地）に再懸濁した後、ポリリジン（５ ｍｇ／ｍｌ）−前処置ペトリ皿に展開し、５％ ＣＯ２含有雰囲気中３７℃で１−２日間培養した。
【００５０】
一部の実験は、筋管を示し、したがって筋型ニコチン性受容体を含む１２８細胞を使用して行なった。この目的のために、細胞はＩｒｉｎｔｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７）の方法に従って調製した。
【００５１】
例２：パッチ‐クランプ電気生理学的記録
培養細胞（調製後０から３日に使用）を含む皿を倒立ニコンディアフォト顕微鏡上に置き、そしてＮａＣｌ １３５， ＫＣｌ ５， ＭｇＣｌ２ １ ， ＣａＣｌ２　２，グルコース１５， ＨＥＰＥＳ １０（ｍＭ）を含む対照食塩液（ＮａＯＨを添加してｐＨ７．４；浸透圧２８５ ｍＯｓｍ） を連続的に表面潅流した（５−１０ ｍｌ／ｍｉｎ）。ガラス毛細管（外径１．５ ｍｍ）から作成したパッチピペットは、ＣｓＣｌ １２０； ＨＥＰＥＳ ２０； ＭｇＣｌ２ １ ； Ｍｇ２ＡＴＰ３， ＢＡＰＴＡ １０（ｍＭ）を含む）細胞内溶液（２４０ ｍＯｓｍ）を充填した時に５−６ ＭΩであった。細胞内溶液のｐＨはＣｓＯＨで７．２に調整した。特定しない限り、全ての記録は−７０ ｍＶの膜電位において行なった。ホールセル法（Ｈａｍｉｌｌ ｅｔ ａｌ． １９８１）を行なった後、各細胞を５分間安定化させ、その後ｎＡＣｈＲ活性化により生じる膜イオン電流を記録した、１ｋＨｚでカットし、後にｐＣＬＡＭＰ ６．０４プログラム（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で分析するためにＰＣに保存した。
【００５２】
例３：物質の投与
濃縮溶液を含みそして記録細胞から１５−２５ μＭの距離の置いたマイクロピペットから加圧システムにより単一の細胞にｎＡＣｈＲアゴニストを投与した。予備試験から、この用法では標的細胞膜における物質の濃度はピペット中の濃度より３分の１に低下することが示され（Ｇｉｎｉａｔｕｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、そして実験的にもまた表面潅流（Ｄｉ Ａｎｇｅｌａｎｔｏｎｉｏ ａｎｄ Ｎｉｓｔｒｉ ２００１）適用を対照とした理論試験によっても確認された。この方法によると化学物質を投与して数ｍｓの遅れで細胞応答を観察することができる。アゴニスト、被検化合物及び対照の溶液を適用するために、速やかな回転により処理細胞上に溶液流を生じるガラス毛細管（０．８ ｍｍ外径）からなる急速表面潅流システム（Ｂｉｏ−ｌｏｇｉｃ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。この場合に２つの溶液を変更するに要する時間は５０ ｍｓである。
【００５３】
例４：単一細胞のＰＣＲ
ＰＣＲに先立って逆転写酵素反応（ＲＴ）をおこなった。（電気生理学的記録の後）記録用ピペットに連結した１０ ｍｌシリンジを使用して、監視下に細胞の細胞質を吸引した。Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）の方法に従って逆転写酵素反応混合物を細胞質に加えた。この反応の間に、細胞に含まれるＲＮＡはｃＤＮＡに変換され、そして４℃で保存した。
【００５４】
ＰＣＲ分析には下記の方法を使用した。ＤＮＡ分析の第１段階はニコチン性受容体に相当する配列の（特別に調製したオリゴヌクレオチド混合物による）増幅である（ＰＣＲ技術の完全な記述についてはＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９を参照）。各反応の量は種々の受容体に対応する個別の配列の増幅に必要な再分類をするのに充分であった（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９９）。この予備増幅の後、反応生成物は、それぞれ特異なプライマーを使用する個別の増幅反応のために分割した（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９９）。
【００５５】
実験のために、下記のサブユニットを増幅した：α２，α３，α４，α５，α６，α７，β２，β３，β４。次いでＰＣＲ生成物は標準的電気泳動で分析した（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９９）。
【００５６】
例５：ペプチドフラグメントの合成
ａ．　組み立て
ペプチドはｔ−ブチルを使用する固相Ｆｍｏｃ合成法に従って組み立てた（この技術の詳細な記述についてはＣｈａｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， ２０００を参照）。
【００５７】
原料樹脂は１％交差結合Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋｅ−Ａｍｉｄｅ−Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ ＰＳまたはＦｍｏｃ−ＡＡ−Ｗａｎｇ ＰＳであった。
【００５８】
保護手順は下記のとおり：
１．ＤＭＦ（３ｘ３０秒）
２．２５％ピペリジン（３ｘ３分）
３．ＤＭＦ（６ｘ３０秒）
４．ＤＭＦカップリング（１ｘ１５分）
５．ＤＭＦカップリング（１ｘ１５分）
各段階に樹脂１０ ｍｌ／ｇペプチドを使用した。
アミノ酸カップリング（５倍過剰）は、ＢＯＰ，　Ｈｏｂｔ及びＤＩＥＡの存在下にＤＭＦ中でおこなった。
【００５９】
以下の試薬を側鎖の保護に使用した。
セリンまたはスレオニンにはｔ−ブチル
アスパラギンまたはシステインにはトリチル
【００６０】
ｂ．ペプチド結合の切断
トリフロロ酢酸によりペプチドを樹脂から切り離し、保護基を除去した。
第１段階：
−　樹脂‐ペプチドコンジュゲートをＴＦＡ中に入れ、スカベンジャーとしてフェノール、エタンジチオール、チオアニソール及び水の存在下に１５０分攪拌した。
第２段階
−　溶液を冷却し、ペプチドをメチルｔ−ブチルエーテルを使用して沈殿させて分離し、次いで遠心分離した。
−　粗製ペプチドをアセトニトリル／水／酢酸（７０／３０／１）の混合物に溶解し、凍結乾燥した。
【００６１】
データ分析
データは平均±標準偏差（ｎ＝細胞数）で示した；統計的有意性はＷｉｌｃｏｘｏｎテスト（ノンパラメトリックデータについて）または対応のあるｔ−テスト（データがガウス分布をとっている時）により評価した。ｐ＜０．０５の場合に有意差ありとした。
【００６２】
例６：　ｎＡＣｈＲ活性化により生じる反応に対するＣＧＲＰペプチドミューテインの影響の検討
例１−５に記述した方法に従って実施した検討は以下の内容を有する：
−　ラットクロマフィン細胞のｎＡＣｈＲを構成するサブユニットの同定；
−　ＣＧＲＰ １−６はｎＡＣｈＲ介在反応を増強する；
−　ＣＧＲＰ １−６の効果は膜電位に無関係；
−　ＣＧＲＰ １−６と ＣＧＲＰ １−７の比較；
−　ＣＧＲＰ １−６より短いフラグメントの効果；
−　ＣＧＲＰ １−７Ａフラグメントの効果；
−　ＣＧＲＰフラグメントとｎＡＣｈＲアロステリック調節剤との相互作用
−　筋型ニコチン性受容体に対するＣＧＲＰ １−６の効果
【００６３】
ラットクロマフィン細胞のｎＡＣｈＲを構成するサブユニット
高度に選択的なコリン作動性物質を検討するための最初の方法として、ｎＡＣｈＲが不均一であるので新規化合物の薬理学的選択性を同定するためにクロマフィン細胞の受容体タイプを示す必要がある。
【００６４】
図２は単一細胞のＲＴ−ＰＣＲにより得られた１５クロマフィン細胞に含まれるｍＲＮＡの分析結果を示している。ラットクロマフィン細胞はα３，α６，β２及びβ４サブユニットからなる異種重合ｎＡＣｈＲを有していることは明らかである。一方α３β４は自律神経系の神経節に広く分布する受容体の組合せであり、α６及びβ２は中枢神経系の典型的サブユニットであり、特に、脳低神経節ドパミン作動系内に含まれるコリン作動性経路の主たるサブユニットである（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ ｅｔ ａｌ． １９９９， １９９６， Ｃｈａｒｐａｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）。さらに、異種発現系において行われた研究では、α６はβ２及びα３β４のいずれとも機能性受容体を形成し得ることが示されている（Ｆｕｃｉｌｅ ｅｔ ａｌ． １９９８）。これらの結果は、ラットクロマフィン細胞はα３β４，α６β２，α６β４，及び最後にα３α６β４型の受容体を含む確実なモデルである。
【００６５】
ｎＡＣｈＲ介在反応のＣＧＲＰ １−６による増強
図３は短いニコチンパルス（図３に示されているような典型的なｎＡＣｈＲアゴニスト；０．１ ｍＭピペット内；種々な長さのパルス）をクロマフィン細胞に適用して得られたデータを示している。図３Ａは、ＣＧＲＰ １−６（１ μＭ）の存在下に、例えば２０ ｍｓパルス適用により誘発された最大未達ニコチン性反応の著しい増強を示している。これに反して、ｎＡＣｈＲが飽和し、最大電流を発生するのに充分な長さの（２００ ｍｓ）ニコチンパルスの場合には、同じ細胞でも増強を生じない（図３Ｂ）。ＣＧＲＰ １−６の効果はわずか５秒の適用でも観察されるように急速に発現し、そして約１分間の洗浄で回復する（図３Ｃ）。この現象は静止膜伝導または静止電流に対するＣＧＲＰ １−６の直接作用ではない。このようにＣＧＲＰ １−６はｎＡＣｈＲの調節剤であったが、アゴニストが存在しない場合にはそうではなかった。
【００６６】
このペプチドフラグメントの作用の薬理学的機序を理解するために、ＣＧＲＰ １−６の適用前及び後のニコチン用量‐反応曲線を作成する必要があるであろう。しかし、ｎＡＣｈＲの急速な脱感作のために、広い範囲のニコチン濃度を適用してこの種の実験を行なうのは非常に困難である。この技術的問題を避けるために、一定濃度のニコチンをガラスピペットに充填し、圧パルスの時間を変えて、脱感作を最小限にするために非常に短時間（数十ｍｓ）適用する（Ｇｉｎｉａｔｕｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｄｉ Ａｎｇｅｌａｎｔｏｎｉｏ ａｎｄ Ｎｉｓｔｒｉ ２００１を参照）。
【００６７】
この方法を使用して、対照条件におけるニコチン用量反応曲線は図３Ｄ（小四角）に示されている。ＣＧＲＰ １−６（１ μＭ）の存在下に同じニコチンパルスを適用した場合には、曲線は最大反応を変えることなく左方に平行移動した。星印は増強作用が対照に対して統計的有意差があることを示している。この平行移動は、膜受容体の動態に関する最近の知識（Ｃｏｌｑｕｈｏｕｎ １９９８）に基づくと、ＣＧＲＰ １−６の作用部位はニコチンの作用部位と同じであり、受容体とこれら２つの物質の相互作用は相対的結合親和性及び物質濃度のような性質に依存することは明らかである。
【００６８】
最近、「アロステリック増強剤リガンド」（ＡＰＬ）（Ｍａｅｌｉｃｋｅ ａｎｄ Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ ２０００）として分類されている一部の物質が、例えば極めて狭い濃度範囲でその作用を発現することを含む異なる薬理的性質でｎＡＣｈＲ反応を増強することが示された。これに反して、ＣＧＲＰ １−６は非常に広い濃度範囲においてｎＡＣｈＲ反応の増強を示す：１，０００倍異なる濃度（０．０５−１００ μＭ）で試験を行ない、ＣＧＲＰ １−６の増強作用の閾値は０．１ μＭ（１０５±７％増強、ｎ＝７ ）であり、５０μＭで最大値（１５６±６％増強、ｎ＝５ ）に達することを観察した。この現象は図４Ａに示されており、存在するＣＧＲＰ １−６の濃度が増加すると一定のニコチン用量（２０ ｍｓ；０．１ ｍＭ）に対する電流反応は増加する。ＣＧＲＰ １−６増強効果はｎＡＣｈＲがシチシン（２０ ｍｓ；０．１ ｍＭ，図４Ｂ）により活性化された場合でもやはり生じたので、この増強はニコチン性アゴニストの種類には影響されないことを確認した。アセチルコリンはコリンエステラーゼにより速やかに加水分解されるので、信頼できる応答を得ることが困難であるために試験しなかった。
【００６９】
ＣＧＲＰ １−６の効果は膜電位と無関係
ペプチドの増強作用は図４Ｃに示すように膜電位に無関係であり、膜電位を−４０、−７０及び−１００ ｍＶにセットした６細胞からのデータにより示されている。増強の程度は一定に保たれていたので、ＣＧＲＰ １−６の作用に対する細胞の感受性は細胞の活動レベルに影響されないことを示している。
【００７０】
ＣＧＲＰ １−６とＣＧＲＰ １−７の比較
ＣＧＲＰ １−６の増強能力とＣＧＲＰ １−７誘発抑制を比較する実験を行なった。図４Ｄは、ＣＧＲＰ １−６増強は平均して３１％であり、そしてＣＧＲＰ １−７抑制は４２％であり、これら２種フラグメント（いずれも１ μＭ濃度）の同時適用では両者の効果が消失し、ニコチン電流に有意な変化はなかった（９９±４％、ｎ＝６）ことを示している。この結果は、両ペプチドは同じ受容体部位に作用するが、反対の効果を示すことを示めしている。
【００７１】
ＣＧＲＰ １−６より短いフラグメントの効果
図５Ａは、ＣＧＲＰ １−５は濃度依存的作用によりニコチン電流を増強し得ることを示している。この作用はＣＧＲＰ １−６よりは小さい。事実、ＣＧＲＰ １−６（１ μＭ）の増強は３１±７％（ｎ＝６）であったが、ＣＧＲＰ １−５により同様の増強（２６±４％；ｎ＝５）を達成するには１０倍高い濃度（１０ μＭ）が必要であった。
【００７２】
ＣＧＲＰ １−４（１ μＭ）は非常に弱い増強効果（８±１％；ｎ＝１４）を保持しているが、ＣＧＲＰ １−３（１ μＭ）はニコチン誘発電流を変化させなかった（０±１％；ｎ＝７）。これらのデータは、天然ＣＧＲＰ及びＣＧＲＰ １−７に対する拮抗データについても示している、図５Ｂにまとめた。これらの成績は、ＣＧＲＰのＮ−末端鎖に相当する一連のペプチドフラグメントは種々の程度にｎＡＣｈＲ活性を増強することができることを示している。この現象はこのペプチドの構造活性相関に関する将来の研究に役立つはずである。
【００７３】
ＣＧＲＰ １−７Ａフラグメントの効果
１−７フラグメントの抑制効果に拮抗する１−６、１−５及び１−４フラグメントの増強作用を総括して、１−７フラクションが２つのシステイン（２位及び７位）を結合するジスルフィド架橋を持つことに注目した。このジスルフィド架橋がニコチン性受容体活性を抑制する構造であり、増強作用を持つ短いフラグメントはこれが無いことに注目した。この仮説を確かめるために、７位のシステインがアラニンで置換されている１−７Ａフラグメントの効果を試験した。図６Ａは、フラグメント１−７Ａが２０ ｍｓニコチンパルスにより発生する電流を増強する（＋１８％）ことを示している；この効果は約１分の洗浄で回復した。図６はニコチン応答に対するＣＧＲＰ １−７Ａの作用の時間経過を示している：増強は速やかに発現し、平衡状態に達し（最大増強＝１７±４％；ｎ＝８）、洗浄により速やかに回復する。図６Ｃは、対照溶液（四角）または１ μＭ ＣＧＲＰ １−７Ａの存在下のニコチン用量／反応曲線を示している。曲線は最大反応を増加させずに左方に有意に移動した（ｎ＝８細胞）。
【００７４】
これらの実験は、ジスルフィド架橋によって作られた環状構造が無くなったＣＧＲＰ １−７Ａフラグメントはクロマフィン細胞に対するニコチン作用を増強することを示している。
【００７５】
ＣＧＲＰフラグメントとｎＡＣｈＲアロステリック調節剤の相互作用
ＣＧＲＰフラグメント及びＡＰＬ作用物質の比較は、それらの相乗効果の可能性を明らかにし、またＣＧＲＰフラグメントの作用機序を理解するために必要である。フィゾスチグミン（エゼリン）、コリンエステラーゼ阻害剤、はコリンエステラーゼ阻害を示すよりも低い用量においてニコチン性受容体に対してアロステリック効果を有することが知られている（Ｍａｅｌｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｍａｅｌｉｃｋｅ ａｎｄ Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ ２０００）。最初に、クロマフィン細胞ｎＡＣｈＲに対するフィゾスチグミンの作用が文献の記載と一致するか否か調べた。結局、低濃度（０．５ μＭ）または高濃度（５ μＭ）のフィゾスチグミン存在下にニコチンを適用した。図７Ａは、ニコチン（０．１ ｍＭニコチン；２０ ｍｓ）の反応を０．５ μＭのフィゾスチグミンは増強し（平均２８±５％；ｎ＝１４）、そして５ μＭフィゾスチグミンは抑制（平均４８±５％；ｎ＝４）することを示している。
【００７６】
以前の研究（Ｍａｅｌｉｃｋｅ ａｔ ａｌ． １９９７）では最大増強を生じるフィゾスチグミン濃度は０．５ μＭであることが示されていた。さらに濃度を上げると直ちにｎＡＣｈＲを抑制する。我々の今回の実験はこの観察と一致し、そしてフィゾスチグミンはＡＰＬ化合物と同様にクロマフィン細胞に作用し、したがってＣＧＲＰ １−６とは異なることを確認した。図７Ｂは対照溶液及び０．５ μＭフィゾスチグミンの存在下におけるニコチン用量反応曲線を示している：フィゾスチグミンの場合に曲線は左方に移動し、そして最大反応の増加を示した。ＣＧＲＰ １−６を用いた実験ではこのような性質は全く認められなかった（図３Ｄ参照）。
【００７７】
図７Ｃは、それぞれの物質自体がｎＡＣｈＲ反応を増強することを予め確かめた後に、ＣＧＲＰ １−６（１ μＭ）またはフィゾスチグミン（０．５ μＭ）の存在下にニコチンを適用した実験の平均値を示している。２つの調節剤の併用による増強は３７±６％であったが、これは個別の効果（ＣＧＲＰ及びフィゾスチグミンそれぞれ２１±４％及び１０±１％）の和にほぼ近いものである。これに反して、高用量（５ μＭ）のフィゾスチグミンの適用はニコチン反応の７７±１％の低下を生じた。この場合に、ＣＧＲＰ １−６（１ μＭ）を同時に適用すると、ニコチン電流は対照の７９±１％（ｎ＝４）に相当するので、フィゾスチグミン抑制に部分的に拮抗した。これらの結果は、フィゾスチグミンとＣＧＲＰ １−６の効果の相違を明らかに示しており、またこれらの分子のｎＡＣｈＲとの相互作用は異なることを示している。
【００７８】
筋型ニコチン性受容体に対するＣＧＲＰ １−６の効果の検討
上記の実験はＣＧＲＰ １−６の興味ある増強作用を示しているがｎＡＣｈＲに対する選択性については明らかにしていない。結局培養筋細胞（筋管、１２８）を使用して記録されるニコチン電流にこのペプチドが影響を与えるか否か調べた。この細胞をパッチ電極により−６０ ｍＶ電位に維持した。ニコチン適用（表面潅流により１００ μＭ）により振幅１．０６±０．２２ ｎＡ（ｎ＝７）の平均反応を誘発し、これは洗浄により容易に回復した。このニコチン濃度は最大反応を発生させる濃度の半分に相当する。ＣＧＲＰ １−６ １μＭ（２分前に適用）の存在下では、ニコチン反応の振幅は変化しなかった（１．０９±０．２４ ｎＡ、対照の１０１±２ ％に相当、ｎ＝７）。これらの知見から、ｎＡＣｈＲに対するＣＧＲＰ １−６の作用は筋型ニコチン性受容体には及ばないことが確認された。
【００７９】
参考文献
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2004509134.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、末端ＣＧＲＰフラグメントのアミノ酸配列を示している。ＣＧＲＰ １−７はそれぞれ２位及び７位の２つのシステインの間にジスルフィド架橋を有している。
【図２】
図２は、クロマフィン単細胞において行われたＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。クロマフィン細胞によって発現されたニコチン性サブユニットに対応するｍＲＮＡは正規化した合計（発現を１として）に対する比率を示すヒストグラムに表示した。主なサブユニットはα３，α６，β２及びβ４であった。
【図３】
図３は、局所ニコチン適用によるｎＡＣｈＲ介在イオン電流に及ぼすＣＧＲＰ １−６の影響を示している。Ａ：非飽和ニコチンパルス（２０ ｍｓ）により誘導された最大未達電流はペプチドフラグメントにより増強されるが、最大電流は変化しない（Ｂ）。Ｃ：ｎＡＣｈＲに対するＣＧＲＰ １−６の作用の時間経過：増強は急速に誘発されそして電流は４５−６０秒洗浄後最初の値に戻る。Ｄ：対照溶液中及びＣＧＲＰ １−６存在下の用量（パルス持続として表現；Ａｎｇｅｌａｎｔｏｎｉｏ ａｎｄ Ｎｉｓｔｒｉ， ２００１参照）／反応（正規化したイオン電流として表示、Ｉ）カーブ。ペプチドの作用は最大反応を変化させずにカーブを左方に平行移動させていることに注目（ｎ＝５−１２細胞）。
【図４】
図４はＣＧＲＰ １−６の作用機序を示している。Ａ：図は種々のＣＧＲＰ １−６濃度によるニコチン性電流（０．１ ｍＭ， ２０ ｍｓ）の増強を示している；増強作用の閾値は０．１μＭ。Ｂ：アゴニストとしてシチシン（０．１ ｍＭ， ２０ ｍｓ）使用された場合には、同じ増強が観察された。横軸：ＣＧＲＰ １−６濃度（対数単位）；縦軸：増強された電流／対照電流比。図４Ｂの右に挿入した図はニコチンまたはシチシン電流のＣＧＲＰ １−６による増強を重ねあわせたものである：これらのグラフは相互に違いがないので、増強はアゴニストに依存しないことを示している。Ｃ：棒グラフはｎＡＣｈＲ介在電流の増強作用は膜電位に依存しないことを示している（各棒グラフの下にｍＶとして記されている値はクランプ電位に相当する；ｎ＝７）。Ｄ：ｎＡＣｈＲに対するＣＧＲＰ １−６及びＣＧＲＰ １−７の作用の比較：ＣＧＲＰ １−６増強作用はＣＧＲＰ １−７競合拮抗を打ち消しているのとに注目。反応はすべて種々の薬物の存在下におけるニコチン誘発電流の対照に対する比率で表示されている。
【図５】
図５はｎＡＣｈＲに対するＣＧＲＰ １−５， １−４， 及び１−３の作用を示している。Ａ：図はＣＧＲＰ １−５フラグメントがｎＡＣｈＲ介在電流を増強することを示している；この作用は濃度依存的であるが、ＣＧＲＰ １−５受容体応答増強能力はＣＧＲＰ １−６より低い（図４Ａのデータと比較）。Ｂ：まとめた棒グラフはニコチン性電流に対する種々のＣＧＲＰフラグメントの作用を示している。ＣＧＲＰ １−４は中程度の増強作用を有しているが、ＣＧＲＰ １−３は作用がない。比較のために、ＣＧＲＰ及びその１−７フラグメントにより誘発されるｎＡＣｈＲ拮抗に関するデータも示されている。全ての反応は対照に対する比で表示されている。
【図６】
図６はニコチン誘発反応に対するＣＧＲＰ １−７Ａフラグメント（Ｃｙｓ７をＡｌａで置換）の影響を示している。Ａ：２０ ｍｓニコチンにより誘発された電流及び１ μＭ ＣＧＲＰ １−７Ａの適用による増強の例。この影響はペプチドを洗浄した後に消失する（右パネル）。Ｂ：２０ ｍｓニコチン曝露に対する反応のＣＧＲＰ １−７Ａ増強の時間経過。数秒で約１８％に達しそして洗浄により回復する増強の速やかな発現に注目。Ｃ：対照溶液中及びＣＧＲＰ １−７Ａ存在下におけるニコチン（用量は適用時間、ｍｓ）に対する用量／反応曲線。この処置により、最大反応を変えることなく曲線を左方に平行移動する。星印は対照からの統計的有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図７】
図７はＣＧＲＰ １−６フラグメント及びフィゾスチグミン（Ｐｈｙｓ）の潜在的相互作用に関する検討を示している。フィゾスチグミンはｎＡＣｈＲアロステリック調節剤である：図は、同じ細胞において、低濃度（０．５ μＭ）または高濃度（５ μＭ）のフィゾスチグミンは反対の作用、つまりニコチン誘発電流（０．１ ｍＭ， ２０ ｍｓ）の増強または抑制、をそれぞれ持つことを示している。Ｂ：対照としてのニコチン（右）及びフィゾスチグミン存在下（左；０．５ μＭ；ｎ＝４−１４細胞）の用量／反応曲線。アロステリック調節剤は最大反応を含めて全ての反応を増強する。Ｃ：ＣＧＲＰ １−６（１μＭ）、フィゾスチグミン（０．５ μＭ）及びそれらの併用の増強作用を比較した棒グラフ。相加効果に注目。星印は有意水準（ｎ＝５細胞）を示す。Ｄ：ニコチン誘発反応に対するフィゾスチグミンの抑制作用（５ μＭ）及びＣＧＲＰ １−６ （１ μＭ；ｎ＝４）の続く適用による抑制作用の回復を比較した棒グラフ。これらのグラフ中においてニコチン反応は薬物存在下における電流（Ｉ）／対照溶液（Ｉｃｏｎｔｒｏｌ）の比として表示されている。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509134.tif 000042
【国際調査報告】
2004509134.tif 000043
2004509134.tif 000044
2004509134.tif 000045