(57)【要約】本発明は一般式（Ｉ）の８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸アルキルエステル（式中、ＲはＣ１−４アルキル）から、一般式（Ｒ）−ＩＩ（Ｓ）−ＩＩの（Ｒ）もしくは（Ｓ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸アルキルエステル（式中、Ｒは上記のとおり）の生産の為の方法に関連する。所望の鏡像異性体の生産は、生物触媒によりエナンチオ区別反応により、達成されている。ここにおいて、（Ｓ）−ＩＩ化合物に関してムコール・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）及び（Ｒ）−ＩＩ化合物に関してゲオトリクム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）を用いている。このようにして得たエステルは汎用の方法論により、立体特異的に（Ｒ）−α−リポ酸へと転換されて良い。
2004505618.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸アルキルエステルからの式（Ｒ）−ＩＩの（Ｒ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸アルキルエステル（式中、ＲはそれぞれＣ１−４アルキルである）の生産の為の方法であって、反応が生体触媒により行われていることを特徴とする、方法。
【化１】
2004505618.tif 000004
【請求項２】
式Ｉの８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸アルキルエステルからの式（Ｓ）−ＩＩの（Ｓ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸アルキルエステル（式中、ＲはそれぞれＣ１−４アルキルである）の生産の為の方法であって、反応が生体触媒により行われていることを特徴とする、方法。
【化２】
2004505618.tif 000005
【請求項３】
８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸メチルエステルをプロキラル出発化合物として用いていることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
生体触媒としてゲオトリクム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ）種の株を用いていることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
所定の株（ＤＳＭ １３７７６）のゲオトリクム・カンジダムを用いていることを特徴とする、請求項１又は４記載の方法。
【請求項６】
生体触媒としてムコール・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）種の株を用いていることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項７】
所定の株（ＤＳＭ １３７７５）のムコール・ラセモサスを用いていることを特徴とする、請求項２又は６記載の方法。
【請求項８】
完全合成培地が生物工学的生産の為に用いられており、この培地が更なる栄養塩類と一緒に炭素源、無機窒素源を含むことを特徴とする、請求項１、２、４−７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記方法により生じる、任意の式（Ｒ）−ＩＩの（Ｒ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸もしくは式（Ｓ）−ＩＩの（Ｓ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸 （式中、Ｒはそれぞれ水素である）を、公知の方法のエステル化によって、式（Ｒ）−ＩＩもしくは（Ｓ）−ＩＩのアルキルエステル（式中ＲはそれぞれＣ１−４アルキルである）に転換することを特徴とする、請求項１−８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ムコール・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）か又はゲオトリクム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）株の助けによって、所望したように、反応産物の対応する（Ｓ）−又は（Ｒ）−鏡像異性体をそれぞれ得るのに、式Ｉのプロキラル８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸アルキルエステルの新規生体触媒によるエナンチオ区別還元の為の方法に関連する。公知の方法において、一度キラル中心が形成されると、Ｒ−α−リポ酸への更なる立体特異性の転換が進みうる（ＤＥ １９５ ３３ ８８１）。α−リポ酸は主にラセミ化混合物として、糖尿病性の神経障害及び慢性の肝臓の疾患の治療をする為に用いられている。生物学的な活性を示すのは天然の（Ｒ）−（ｔ）−立体異性体のみなので、この純粋な天然物質の不斉合成は非常に重要である。
【０００２】
公知の先行技術の特性
化合物Ｉは公知であり且つラセミチオクト酸の大規模な工業生産の為の中間体として働く（Ｍ．Ｗ． Ｂａｌｌｏｃｋら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９５４， ７６， １８２８）。
【０００３】
刊行物には化学的な合成法のみならず、鏡像異性体として純粋な（Ｒ）−α−リポ酸の生産の為の生体触媒による副次段階を含んで成る方法の記載もある（総論：Ｊ．Ｓ． Ｙａｄａｖら、Ｊ． Ｓｃｉ． Ｉｎｄ． Ｒｅｓ． １９９０， ４９， ４００）。化学的な不斉合成の方法には一般的に高価且つ複雑な出発物質が必要である。その理由は、例えばエナンチオ区別化学触媒の利用の可能性が特殊な電子的な且つ立体的な構造の特性に関連しているからである。
【０００４】
一方で、生体触媒による副次段階を伴う生産方法は、リパーゼ及びオキシドレダクターゼの酵素製剤、他方では酵母（ｙｅａｓｔ）を用いる。
【０００５】
公知のリパーゼが触媒する方法の段階（Ｙ．Ｒ． Ｓａｎｔｏｓｈ Ｌａｘｍｉ及びＤ．Ｓ． Ｉｙｅｎｇａｒ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９９６， ５９４； Ｎ．Ｗ， Ｆａｄｎａｖｉｓ及びＫ． Ｋｏｔｅｓｈｗａｒ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ １９９７， ８， ３３７； Ｎ．Ｗ． Ｆａｄｎａｖｉｓら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ １９９８， ９， ４０１９； Ｓ． Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙ． Ａｈｎ， Ｊ． Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９， ４３， １２８）は、純度の高い鏡像異性体を達成する為に、エナンチオ区別エステル解裂を基礎としている。これらの方法はラセミ混合物より出発する。生体触媒による反応では、鏡像異性体として純粋な化合物を獲得するのに利用できるラセミ混合物はせいぜい５０％である。残留する不要な鏡像異性体は、廃棄するか又は複雑な反応段階によりラセミ混合物へと転換し直さなければならない。単一のオキシゲナーゼによる方法（Ｂ． Ａｄｇｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇ， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９７， ５， ２５３）は高価な補酵素、例えばＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨか又は高価な補酵素再循環系が必要になる。
【０００６】
ムコール及びゲオトリクム属の酵母（サッカロミセス・セレビジアエ）（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）及び真菌（ｆｕｎｇｉ）を中間体の生体触媒による転換に利用できる。
【０００７】
酵母は、長きに渡りβ−ケトエステルの還元反応、エステルの開裂及び他の合成において生体触媒として用いられている（総論：Ｓ． Ｓｅｒｖｉ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９０， ９３， １）。
【０００８】
実際には、エナンチオ区別エステル開裂反応はムコール種（例えばムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）及びムコ・ジャバニクス（Ｍｕｃｏ ｊａｖａｎｉｃｕｓ））に関して詳細に記載されている。ムコール・ラセモサスはテトラメチルシクロヘキサンジオンの還元に関連してのみ説明されている（Ｊ． ｄ’Ａｎｇｅｌｏら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９８６， ５１， ４０） 一方で、β−ケトエステルの生体触媒による還元はゲオトリクム・カンジダムに関して記載されている（Ｂ． Ｗｉｐｆら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９８３， ６６， ４８５）。
【０００９】
これ迄に、酵母（Ａ．Ｓ． Ｇｏｐａｌａｎ及びＨ．Ｋ． Ｈｏｌｌｉｅ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９８９， ３０， ５７０５； Ｌ． Ｄａｓａｒａｄｈｉら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９０， ７２９； Ｍ． Ｂｅｚｂａｒｕａら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９９６， １２８９； ＤＥ ４０ ３７ ４４０）か又はゲオトリクム・カンジダム（Ｂ． Ｗｉｐｆら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９８３， ６６， ４８５）により、中間体を、反応中心に対するβ位において酵素がない小さなリガンドで、対応するＳ−もしくはＲ−鏡像異性体へとエナンチオ区別転換をできる方法は知られていない。代わりに、巨大な、酸素を含有するリガンドが、複雑な中間段階によって、ケト基に対するβ位へと導入され、かくして、そのリガンドがエナンチオ区別転換を可能にするものであった。
【００１０】
本明細書中に記載した解決法において、既知の合成法と比較して、用いた出発物質は、ケト基に対してα−又はβ−位においてのみとても小さなリガンドを持つが、高度なエナンチオ区別により転換されるものである。
【００１１】
本明細書中で提示した解決法実際には驚くほどに公知の先行技術に関連する。その理由は、Ｋ． Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９， ２４５３−４， １９８８ には、デヒドロゲナーゼは、エステル官能基のみを認識し且つ反応中心に隣接する位置の塩素原子は認識せず且つエナンチオ区別転換を生じる記載があるからだ。
【００１２】
本発明の詳細な説明
従って、本発明の基礎となる目的は、公知の合成の基本的な要素を利用する一方で、より簡単且つ一層経済的な、細菌を基礎とする（Ｒ）−α−リポ酸合成系内の不斉誘導の為の方法を供することだ。
【化３】
2004505618.tif 000003
【００１３】
本発明に従い、前記の目的は新規の方法により達成された。その方法は、所望のとおりに、株ムコール・ラセモサスか又はゲオトリクム・カンジダムの助けによって、それぞれ対応する（Ｓ）−もしくは（Ｒ）−鏡像異性体を産出する為に、式Ｉのプロキラル８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸アルキルエステル（式中、ＲはＣ１−４アルキルである）のエナンチオ区別還元を可能にする。８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸メチルエステルが特に有効であることが証明されている。
【００１４】
式（Ｒ）−ＩＩの（Ｒ）−鏡像異性体を産出するプロキラル化合物のエナンチオ区別還元は、ゲオトリクム・カンジダムの助けにより進む。プロキラル前駆体の、式（Ｓ）−ＩＩの（Ｓ）−鏡像異性体への転換は、ムコール・ラセモサスにより達成されて良い。
【００１５】
式Ｉの８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸アルキルエステルの還元の高度なエナンチオ区別性は予測されていなかった。何故なら、高度な不斉誘導は、立体的及び／又は電子的に非常に異なる基がケト基に対してαもしくはβ位の両側に対する選択性を促進する化合物に関する文献にのみ記載されていたからだ。更に驚くべきことには、２つの株は又高い収率及びエナンチオ区別性で、対照的な鏡像異性体への転換を触媒することができうることが分かった。
【００１６】
本発明に係る方法は、式（Ｒ）−ＩＩの８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸アルキルエステルを、汎用の真菌栄養アガー、好適にはＳａｂｏｕｒａｕｄのグルコースアガー上でゲオトリクム・カンジダム（ＤＳＭ １３７７６）を培養することにより獲得可能であることにおいて、先行技術と異っている。この株は好適には、１％のイースト・エクストラクト、２％のペプトン及び２％のグルコースを伴う複合培地を用いることで前培養されている。バイオマスの更なる増殖は、炭素源としてグルコース、窒素源として硫酸アンモニウムを更なる栄養塩類と共に含む、好適には、２０ｇ／ｌのグルコース、３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、０．２ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのイースト・エクストラクト、３ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ、３ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ及び０．０５ｍｇのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏの組成における完全合成培地において達成されている。前培養及び本培養のどちらも１９−２８℃、好適には２４℃で、１−５日、好適には３日に渡り、オービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）上で１００−３００ｒｐｍ、好適には１９０ｒｐｍで振とうすることにより行う。
【００１７】
実際の生物触媒による転換は、エネルギー源としてグルコースの添加により緩衝化した水性溶液中で行われている。生物触媒の濃度は、バイオマス固体０．１〜１００ｇ／ｌ、好適にはバイオマス固体５ｇ／ｌである。基質を５ｇ／ｌの濃度において生体内変換バッチに添加している。生体内変換を２４℃で１−３日に渡る振とうで行っている。
【００１８】
一度生体内変換が完了すると、バイオマスを遠心しそして有機溶媒で、好適には酢酸エチルで２度上清を抽出する。得た抽出物を脱水し乾燥する。粗製の産物は、公知の方法において、後のエステル化により所定のアルキルエステルに変換される式（Ｒ）−ＩＩ（Ｒ＝Ｈ）の（Ｒ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸 （ＤＥ １９５ ３３ ８８１）ある割合でを含む。
【００１９】
ムコール・ラセモサス（ＤＳＭ １３７７５） を、培養しそしてゲオトリクム・カンジダムに関して記載したのと同じ方法により、更に転換を行った。
【００２０】
粗製の産物は、公知の方法において、後のエステル化により所定のアルキルエステルに変換される、式（Ｓ）−ＩＩ（Ｒ＝Ｈ）の（Ｓ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸（ＤＥ １９５ ３３ ８８１）のある割合でを含む。
【００２１】
本発明に従う方法を用いて生産された化合物（Ｒ）−ＩＩ及び（Ｓ）−ＩＩは一般的に、光学的収率７０−９５％に値し、鏡像異性体の増えたこと示す。鏡像異性体の比率は光学活性カラムによるキラルガスクロマトグラフィーにより直接測定されている。
【００２２】
実施例
実施例１
ムコール・ラセモサス株（ＤＳＭ １３７７５） をＳａｂｏｕｒａｕｄのアガー上２４℃で培養した。１００ｍｌのＹＰＤ栄養溶液（１％のイースト・エクストラクト、２％ペプトン及び２％のグルコース）を接種ループにより接種し、そしてオービタルシェーカー（１９０ｒｐｍ）により２４℃で３日間に渡りインキュベートした。この培養物の１０％を１００ｍｌのＳＭＧ培地（２０ｇ／ｌのグルコース、３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、０．２ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのイースト・エクストラクト、３ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ、３ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ及び０．０５ｍｇのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ）に移植し、そして２４℃で更に３日に渡り培養した。
【００２３】
生じたバイオマスを遠心し、そして５ｇ／ｌのグルコースを含んで成る１００ｍｌの緩衝化水性溶液（５０ｍｍｏｌのリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ６．５）中に移植した。０．５ｇの８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸メチルエステルを２ｍｌのエタノールに溶かし、そして生体内変換バッチに添加した。２４時間後、前記バイオマスを除去し、そして培地を５０ｍｌずつの酢酸エチルにより２度抽出した。抽出物を組み合わせ、そしてロータリー・エバポレーター中で溶媒をストリッピングした。残留物を再度１０ｍｌのメタノール中に溶かし、そして０．０４ｍｌの濃ＨＣｌの添加後、１時間に渡り還流した。次いで蒸留により溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン　３：１）により一度、残留物を精製し、０．３３ｇ（６６％）の（Ｓ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸メチルエステルを、鏡像異性体を９２％（キラルＧＣ）で得ている。
【００２４】
実施例２
ゲオトリカム・カンジダム株（ＤＳＭ １３７７６） をＳａｂｏｕｒａｕｄのアガー上２４℃で培養した。１００ｍｌのＹＰＤ栄養溶液（１％のイースト・エクストラクト、２％ペプトン及び２％のグルコース）を接種ループにより接種し、そしてオービタルシェーカー（１９０ｒｐｍ）により２４℃で３日間に渡りインキュベートした。この培養物の１０％を１００ｍｌのＳＭＧ培地（２０ｇ／ｌのグルコース、３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、０．２ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのイースト・エクストラクト、３ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ、３ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ及び０．０５ｍｇのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ）に移植し、そして２４℃で更に３日に渡り培養した。
【００２５】
生じたバイオマスを遠心し、そして５ｇ／ｌのグルコースを含んで成る１００ｍｌの緩衝化水性溶液（５０ｍｍｏｌのＮａリン酸緩衝液、ｐＨ６．５）中に移植した。０．５ｇの８−クロロ−６−オキソ−オクタン酸メチルエステルを２ｍｌのエタノールに溶かし、そして生変変換バッチに添加した。２４時間後、前記バイオマスを除去し、そして培地を５０ｍｌの酢酸エチルにより２度抽出した。抽出物を組み合わせ、そしてロータリー・エバポレーター中で溶媒をストリッピングした。残留物を再度１０ｍｌのメタノール中に溶かし、そして０．０４ｍｌの濃ＨＣｌの添加後、１時間に渡り還流した。次いで蒸留により溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン　３：１）により一度、残留物を精製し、０．３１ｇ（６２％）の（Ｒ）−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸メチルエステルを、鏡像異性体を８８％（キラルＧＣ）で得ている。
【国際公開パンフレット】
2004505618.tif 000006
2004505618.tif 000007
2004505618.tif 000008
2004505618.tif 000009
2004505618.tif 000010
2004505618.tif 000011
2004505618.tif 000012
2004505618.tif 000013
2004505618.tif 000014
2004505618.tif 000015
2004505618.tif 000016
2004505618.tif 000017
2004505618.tif 000018
2004505618.tif 000019
2004505618.tif 000020
【国際調査報告】
2004505618.tif 000021
2004505618.tif 000022
2004505618.tif 000023
2004505618.tif 000024
2004505618.tif 000025
2004505618.tif 000026