(57)【要約】本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡ−６１と命名される新規の哺乳動物分子内シグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本発明はまた、ＭＵＲＦ１遺伝子産物またはＭＡＦＢＸ遺伝子産物を結合する因子を検出および／または測定するのに使用され得るアッセイシステムを提供する。本発明はまた、ＭＵＲＦ１もしくはＭＡＦＢＸと、シグナル伝達を開始するかまたはＭＵＲＦ１もしくはＭＡ−６１への結合、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、もしくはＭＡ−６１のｍＲＮＡ発現の阻害因子、またはＭＵＲＦ１経路、ＭＵＲＦ３経路、もしくはＭＡＦＢＸ経路の阻害を介してユビキチン結合の阻害を開始する因子との間の相互作用に基づく診断方法および治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図７、９および１７に示されるようなアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
ＭＵＲＦ１、またはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）図６、８、または１７に示されるようなＭＵＲＦ１のコード領域を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）相補体が、（ａ）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＭＵＲＦ１の生物学的活性を有する分子をコードする、配列；または
（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ、該（ａ）のヌクレオチド配列の相補体または該（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、そして該ヌクレオチド配列は、ＭＵＲＦ１の生物学的活性を有する分子をコードする、配列、
からなる群から選択される配列を有する、核酸分子。
【請求項３】
哺乳動物ゲノム由来の単離された核酸分子であって、以下：
ａ）ストリンジェントな条件下で図６、８、または１６の核酸分子にハイブリダイズし；そして
ｂ）環状ドメインを含む遺伝子産物をコードする、
核酸分子。
【請求項４】
ＭＵＲＦ１、またはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）図６、８、または１６に示されるようなＭＵＲＦ１のコード領域を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）相補体が（ａ）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＭＵＲＦ１の生物学的活性を有する分子をコードする、配列；または
遺伝コードの縮重がなければ、（ｃ）該（ａ）のヌクレオチド配列の相補体または該（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、そして該ヌクレオチド配列は、ＭＵＲＦ１の生物学的活性を有する分子をコードする、配列、および
（ｄ）ＭＵＲＦ３（図２１）をコードするヌクレオチド配列を包含しない配列からなる群から選択される配列を有する、核酸分子。
【請求項５】
請求項１、２、３、または４に記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項１、２、３、または４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターであって、ここで前記核酸分子は、宿主細胞においてその発現を指向し得る発現制御配列に作動可能に連結される、ベクター。
【請求項８】
ＭＵＲＦ１ポリペプチドの産生のための宿主ベクター系であって、ここで該宿主ベクター系は、請求項６のベクターで形質転換された宿主細胞を含む、宿主ベクター系。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主ベクター系であって、ここで前記宿主細胞が細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、宿主ベクター系。
【請求項１０】
請求項１、２、３、または４に記載の核酸を含む導入遺伝子を保有する細胞を有する、トランスジェニック動物。
【請求項１１】
請求項１、２、３、または４に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子座において不活化される動物。
【請求項１２】
請求項５に記載のＭＵＲＦ１ポリペプチドを結合する抗体。
【請求項１３】
萎縮の阻害、肥大の誘導、ユビキチン結合の減少、ユビキチン経路の妨害、またはＭＵＲＦ１発現またはＭＵＲＦ１活性の調節の方法における使用のためのＭＵＲＦ１アンタゴニスト。
【請求項１４】
萎縮の阻害、肥大の誘導、ユビキチン結合の減少、ユビキチン経路の妨害、またはＭＵＲＦ１発現またはＭＵＲＦ１活性の調節の方法における使用のためのＭＵＲＦ１経路のアンタゴニスト。
【請求項１５】
筋肉萎縮の処置またはＭＵＲＦ１を発現する筋肉細胞と化合物とを接触させる工程を包含する萎縮および関連する疾患および障害の検出、ならびにＭＵＲＦ１タンパク質活性またはユビキチン結合における変化の検出のために有用な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで前記変化は、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ、ファージディスプレイ系、ゲル電気泳動、酵母−ツーハイブリッドアッセイ、ノーザン分析もしくはウエスタン分析、免疫組織化学、従来のシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナ、ＰＥＴスキャナ、ＳＰＥＣＴスキャナ、ＭＲＩスキャナ、ＮＭＲスキャナ、またはＸ線装置によって測定される、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、ここでＭＵＦＲ１タンパク質活性における前記変化は、ＭＵＲＦ１と１つ以上のタンパク質との相互作用における変化の検出によってか、別のタンパク質と環状ドメインとの相互作用における変化の検出によってか、またはユビキチン経路における１つ以上のタンパク質のユビキチン結合のレベルにおける変化の検出によって検出される、方法。
【請求項１８】
１つ以上のタンパク質のうちの１つがＭＵＲＦ１の基質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記筋肉細胞が骨格筋起源である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記筋肉細胞が、培養された細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記筋肉細胞が、トランスジェニック生物由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記トランスジェニック生物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が挙げられるが、これらに限定されない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記筋肉細胞が、トランスジェニック生物内にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記トランスジェニック生物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が挙げられるが、これらに限定されない、請求２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭＵＲＦ１およびＭＵＲＦ１を検出し得る分子が、核酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＵＲＦ１およびＭＵＲＦ１を検出し得る分子が、ポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、ＭＵＲＦ１のための基質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質発現における前記変化が、前記ユビキチン経路における１つ以上のタンパク質のタンパク質量における変化によって示される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
患者サンプルにおいてＭＵＲＦ１を測定する工程を包含する、動物において筋肉萎縮を検出する方法。
【請求項３０】
ＭＵＲＦ１もしくはその環状ドメインを調節することによる萎縮の阻害または肥大の誘導をする方法。
【請求項３１】
症状が緩和されるように、ＭＵＲＦ１経路、ユビキチン結合、ＭＵＲＦ１またはＭＵＲＦ１の環状ドメインの発現または活性を調節する化合物を、動物に投与する工程を包含する、筋肉萎縮に関連する疾病、症候群または障害を処置する方法。
【請求項３２】
前記動物が、哺乳動物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
図２２に示されるようなアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３４】
ＭＵＲＦ３、またはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）図２１に示されるようなＭＵＲＦ１のコード領域を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）相補体が（ａ）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＭＵＲＦ３の生物学的活性を有する分子をコードする、配列；または
（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ、該（ａ）のヌクレオチド配列の相補体または該（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、そして該ヌクレオチド配列は、ＭＵＲＦ３の生物学的活性を有する分子をコードする、配列、
からなる群から選択される配列を有する、核酸分子。
【請求項３５】
哺乳動物ゲノム由来の単離された核酸分子であって、以下：
ａ）ストリンジェントな条件下で図２１の核酸分子にハイブリダイズし；そして
ｂ）環状ドメインを含む遺伝子産物をコードする、
核酸分子。
【請求項３６】
ＭＵＲＦ３、またはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号７に示されるようなＭＵＲＦ１のコード領域を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）相補体が（ａ）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＭＵＲＦ３の生物学的活性を有する分子をコードする、配列；または
（ｅ）遺伝コードの縮重がなければ、該（ａ）のヌクレオチド配列の相補体または該（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、そして該ヌクレオチド配列は、ＭＵＲＦ３の生物学的活性を有する分子をコードする、配列；および
（ｆ）ＭＵＲＦ１（図６、８、または１６）をコードするヌクレオチド配列を包含しない配列、
からなる群から選択される配列を有する、核酸分子。
【請求項３７】
請求項３３、３４、３５または３６に記載の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３３、３４、３５、または３６に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３９】
請求項３９に記載のベクターであって、ここで前記核酸分子は、宿主細胞においてその発現を指向し得る発現制御配列に作動可能に連結される、ベクター。
【請求項４０】
請求項３８に記載のベクターで形質転換される宿主細胞を含む、ＭＵＲＦ３ポリペプチドの産生のための宿主−ベクター系。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項４０に記載の宿主−ベクター系。
【請求項４２】
請求項３３、３４、３５、または３６に記載の核酸を含む導入遺伝子を保有する細胞を有するトランスジェニック動物。
【請求項４３】
請求項３３、３４、３５、または３６に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子座において不活化された動物。
【請求項４４】
請求項３７に記載のＭＵＲＦ３ポリペプチドを結合する抗体。
【請求項４５】
萎縮の阻害、肥大の誘導、ユビキチン結合の減少、ユビキチン経路の妨害、またはＭＵＲＦ３発現またはＭＵＲＦ３活性の調節の方法における使用のためのＭＵＲＦ３アンタゴニスト。
【請求項４６】
萎縮の阻害、肥大の誘導、ユビキチン結合の減少、ユビキチン経路の妨害、またはＭＵＲＦ３発現またはＭＵＲＦ３活性の調節の方法における使用のためのＭＵＲＦ３経路のアンタゴニスト。
【請求項４７】
筋肉萎縮の処置またはＭＵＲＦ３を発現する筋肉細胞と化合物とを接触させる工程を含有する萎縮および関連する疾患および障害の検出、ならびにＭＵＲＦ３タンパク質活性またはユビキチン結合における変化の検出のために有用な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、ここで前記変化は、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ、ファージディスプレイ系、ゲル電気泳動、酵母−ツーハイブリッドアッセイ、ノーザン分析もしくはウエスタン分析、免疫組織化学、従来のシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナ、ＰＥＴスキャナ、ＳＰＥＣＴスキャナ、ＭＲＩスキャナ、ＮＭＲスキャナ、またはＸ線装置によって測定される、方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法であって、ここで前記ＭＵＦＲ３タンパク質活性における変化は、ＭＵＲＦ３と１つ以上のタンパク質との相互作用における変化の検出によってか、別のタンパク質と環状ドメインとの相互作用における変化の検出によってか、またはユビキチン経路における１つ以上のタンパク質のうちの１つのユビキチン結合のレベルにおける変化の検出によって検出される、方法。
【請求項５０】
１つ以上のタンパク質のうちの１つがＭＵＲＦ３の基質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記筋肉細胞が骨格筋起源である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記筋肉細胞が、培養された細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記筋肉細胞が、トランスジェニック生物由来である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記トランスジェニック生物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が挙げられるが、これらに限定されない、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記筋肉細胞が、トランスジェニック生物内にある、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
トランスジェニック生物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が挙げられるが、これらに限定されない、請求５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＭＵＲＦ３およびＭＵＲＦ３を検出し得る分子が、核酸である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＭＵＲＦ３およびＭＵＲＦ３を検出し得る分子が、ポリペプチドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物が、ＭＵＲＦ３のための基質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
タンパク質発現における前記変化が、前記ユビキチン経路における１つ以上のタンパク質のタンパク質量における変化によって示される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６１】
患者サンプルにおいてＭＵＲＦ３を測定する工程を包含する、動物において筋肉萎縮を検出する方法。
【請求項６２】
ＭＵＲＦ３もしくはその環状ドメインを調節することにより、萎縮の阻害または肥大の誘導をする方法。
【請求項６３】
症状が緩和されるように、ＭＵＲＦ３経路、ユビキチン結合、ＭＵＲＦ３の発現または活性を調節する化合物を、動物に投与する工程を包含する、筋肉萎縮に関連する疾病、症候群または障害を処置する方法。
【請求項６４】
前記動物が、哺乳動物である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
図１１、１３、または１９に示されるようなアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項６７】
ＭＡＦＢＸ、またはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）図１０、１２、または１９に示されるようなＭＡＦＢＸのコード領域を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）相補体が（ａ）のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＭＡＦＢＸの生物学的活性を有する分子をコードする、配列；または
（ｃ）遺伝コードの縮重がなければ、該（ａ）のヌクレオチド配列の相補体または該（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、そして該ヌクレオチド配列は、ＭＡＦＢＸの生物学的活性を有する分子をコードする、配列、
からなる群から選択される配列を有する、核酸分子。
【請求項６８】
哺乳動物ゲノム由来の単離された核酸分子であって、以下：
ａ）ストリンジェントな条件下で図１０、１２、または１８の核酸分子にハイブリダイズし；そして
ｂ）Ｆ−ｂｏｘドメインを含む遺伝子産物をコードする、
核酸分子。
【請求項６９】
哺乳動物ゲノム由来の単離された核酸分子であって、以下：
ａ）ストリンジェントな条件下で図１０、１２、または１８の核酸分子にハイブリダイズし；そして
ｂ）Ｆｂｘ２５ドメインを含む遺伝子産物をコードする、
核酸分子。
【請求項７０】
請求項６６、６７、６８、または６９に記載の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項７１】
請求項６６、６７、６８、または６９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項７２】
請求項７１に記載のベクターであって、ここで前記核酸分子は、宿主細胞においてその発現を指向し得る発現制御配列に作動可能に連結される、ベクター。
【請求項７３】
請求項６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を含むＭＡＦＢＸポリペプチドの産生のための宿主−ベクター系。
【請求項７４】
前記宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項７３に記載の宿主−ベクター系。
【請求項７５】
請求項６６、６７、６８、または６９に記載の核酸を含む導入遺伝子を保有する細胞を有する、トランスジェニック動物。
【請求項７６】
請求項６６、６７、６８、または６９に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子座において不活化された、動物。
【請求項７７】
請求項７０に記載のＭＡＦＢＸポリペプチドを結合する、抗体。
【請求項７８】
萎縮の阻害、肥大の誘導、ユビキチン結合の減少、ユビキチン経路の妨害、またはＭＡＦＢＸ発現またはＭＡＦＢＸ活性の調節の方法における使用のためのＭＡＦＢＸアンタゴニスト。
【請求項７９】
萎縮の阻害、肥大の誘導、ユビキチン結合の減少、ユビキチン経路の妨害、またはＭＡＦＢＸ発現またはＭＡＦＢＸ活性の調節の方法における使用のためのＭＡＦＢＸ経路のアンタゴニスト。
【請求項８０】
筋肉萎縮の処置またはＭＡＦＢＸを発現する筋肉細胞と化合物とを接触させる工程を包含する萎縮および関連する疾患および障害の検出、ならびにＭＡＦＢＸタンパク質活性またはユビキチン結合における変化の検出のために有用な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項８１】
請求項８０に記載の方法であって、ここで前記変化は、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ、ファージディスプレイ系、ゲル電気泳動、酵母−ツーハイブリッドアッセイ、ノーザン分析もしくはウエスタン分析、免疫組織化学、従来のシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナ、ＰＥＴスキャナ、ＳＰＥＣＴスキャナ、ＭＲＩスキャナ、ＮＭＲスキャナ、またはＸ線装置によって測定される、方法。
【請求項８２】
請求項８０に記載の方法であって、ここで前記ＭＡＦＢＸタンパク質活性における変化は、ＭＡＦＢＸとの１つ以上のタンパク質と相互作用における変化の検出によってか、またはユビキチン経路における１つ以上のタンパク質のユビキチン結合のレベルにおける変化の検出によって検出される、方法。
【請求項８３】
１つ以上のタンパク質のうちの１つがＭＡＦＢＸの基質である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記筋肉細胞が骨格起源である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記筋肉細胞が、培養された細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
前記筋肉細胞が、トランスジェニック生物由来である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
前記トランスジェニック生物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が挙げられるが、これらに限定されない、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記筋肉細胞が、トランスジェニック生物内にある、請求項８０に記載の方法。
【請求項８９】
トランスジェニック生物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が挙げられるが、これらに限定されない、請求８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＭＡＦＢＸおよびＭＡＦＢＸを検出し得る分子が、核酸である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＭＡＦＢＸおよびＭＡＦＢＸを検出し得る分子が、ポリペプチドである、請求項８０に記載の方法。
【請求項９２】
前記化合物が、ＭＡＦＢＸのための基質である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９３】
タンパク質発現における前記変化が、前記ユビキチン経路における１つ以上のタンパク質のタンパク質量における変化によって示される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９４】
患者サンプルにおいてＭＡＦＢＸタンパク質またはｍＲＮＡを測定する工程を包含する、動物において筋肉萎縮を検出する方法。
【請求項９５】
ＭＡＦＢＸまたはそのＦ−ｂｏｘを調節することにより萎縮の阻害または肥大の誘導をする方法。
【請求項９６】
症状が緩和されるように、ＭＡＦＢＸ経路、ユビキチン結合、ＭＡＦＢＸまたはＭＡＦＢＸのＦ−ｂｏｘの発現または活性を調節する化合物を動物に投与する工程を包含する、筋肉萎縮に関連する疾病、症候群または障害を治療する方法。
【請求項９７】
前記動物が、哺乳動物である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記動物が、ヒトである、請求項９６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願全体にわたり、種々の刊行物が、参照される。それらの内容におけるこれらの刊行物の開示は、本明細書により、本出願において参考として援用される。本出願は、米国仮出願第６０／２６４，９２６号（２００１年１月３０日に出願された）、同第６０／３１１，６９７号（２００１年８月１０日に出願された）および同第６０／３３８，７４２号（２００１年１０月２２日に出願された）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（序論）
本発明は、新規のヒトヌクレオチド配列に関する。これらの２つ（本明細書中で示される、ＭＵＲＦ１およびＭＡ−６１）は、ユビキチンリガーゼの新規の基質標的サブユニットをコードし、そして筋萎縮症を誘導するか、阻害するかまたは逆転させる（ｒｅｖｅｒｓｅ）かのいずれかである状態または薬剤により変調される（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）。ＭｕＲＦ−１に対する高い相同性を有するさらなる配列は、基質がシンコイリン（Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ）である、本明細書中に示される分子ＭｕＲＦ−３をコードする。萎縮症の誘導は、これらの遺伝子のｍＲＮＡの発現における増加を引き起こし；萎縮症の逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）または防止は、これらの遺伝子発現を減少させるかまたはブロックする。本明細書中に記載されるＭＵＲＦ１およびＭＡＦＢＸのｃＤＮＡ配列、ならびにさらなる実験は、ＭＵＲＦ１およびＭＡＦＢＸタンパク質分子が、ユビキチン化（細胞内でのタンパク質分解を開始させる特定の経路）を引き起こすことを立証する。本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ−３および／またはＭＡ−６１をコードする核酸分子、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス、宿主細胞発現系、ならびに本発明のヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む。本発明はさらに、これらの遺伝子自身およびそれらがコードするタンパク質、ユビキチン化、筋萎縮症ならびに関連する疾患、障害および状態に効果を現すような、強力な治療薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおけるこれらの核酸の使用に関する。加えて本発明はさらに、関連疾患の処置のための、治療プロトコルおよびユビキチン経路およびその基質を標的化することを示す薬学的組成物を含む。本明細書中に開示される分子は、筋萎縮症を変調するか、または筋肥大を誘導するように機能する。
【０００３】
（発明の背景）
筋肉重量（ｍａｓｓ）の減少、または萎縮は、種々の生理学的状態および病理学的状態に関与する。例えば、筋萎縮症は、以下に起因して脱神経から生じ得る：神経損傷；変性ニューロパシー、代謝性ニューロパシーまたは炎症性ニューロパシー（例えば、グイリムバール症候群（Ｇｕｉｌｌｉａｎ  Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））；末梢ニューロパシー；または環境毒または薬物によって引き起こされる神経損傷。筋萎縮症はまた、以下に起因して、脱神経から生じ得る：運動性ニューロパシー（例えば、成人の運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリグ病）を含む）；乳児脊髄性筋萎縮および若年性脊髄性筋萎縮；ならびに多数の導体ブロック（ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｂｌｏｃｋ）を伴う自己免疫性運動ニューロパシー。筋萎縮症はまた、例えば、以下に起因する麻痺から生じる慢性疾患から生じ得る：脳卒中または脊髄損傷；損傷（例えば、骨折、捻挫または脱臼）に起因する骨格不動化；あるいは、長期の床上安静（Ｒ．Ｔ．Ｊａｇｏｅ、Ａ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ  ４，１８３（２００１）。代謝性ストレスまたは栄養性機能不全（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（また、筋萎縮症を結果として生じ得る）としては、特に、癌の悪液質、ＡＩＤＳ、および他の慢性疾患、飢餓（ｆａｓｔｉｎｇ）、または横紋筋融解症、および内分泌性障害（例えば、甲状腺および糖尿病の障害）が挙げられる。筋萎縮症は、筋ジストロフィー症候群（例えば、デュシェーヌ、ベッカー型、筋緊張性、顔面肩甲上腕型（ｆａｓｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ）、エメリー−ドライフス、眼咽頭、肩甲上腕、四肢帯（ｌｉｍｂ  ｇｉｒｄｌｅ）、および先天性型）、ならびに遺伝性遠位型ミオパシーとして知られるジストロフィーに起因し得る。筋萎縮症はまた、先天性ミオパシー（例えば、良性先天性低張（ｂｅｎｉｇｎ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｙｐｏｔｏｎｉａ）、中心コア病、ネマリンミオパシー（ｎｅｍａｌｅｎｅ  ｍｙｏｐａｔｈｙ）、および筋細管（中心核）ミオパシー）に起因し得る。筋萎縮症はまた、老化プロセス中に起こる。
【０００４】
種々の病理学的状態における筋萎縮症は、蛋白分解の増大および筋タンパク質合成の減少に関連する。筋細胞は、リソソームプロテアーゼおよび細胞質可溶性プロテアーゼを含む。細胞質可溶性プロテアーゼとしては、Ｃａ２＋−活性化中性プロテアーゼ（カルパイン）およびＡＴＰ依存性ユビキチン−プロテアソーム蛋白分解系が挙げられる。リソソーム系および細胞質可溶性系は、インビトロで筋タンパク質を分解し得るが、インビボでの筋タンパク質分解におけるそれらの役割については、ほとんど知られていない。いくつかの研究は、プロテアソームインヒビターが、ラットの骨格筋の萎縮における蛋白分解を減少させ（例えば、Ｔａｗａら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １００：１９７）、ユビキチン−プロテアソーム経路が、蛋白分解の増大において役割を有するという示唆を導くことを報告している。しかし、筋肉の萎縮における蛋白分解の詳細な機構は、十分に特徴付けられていないままである。蛋白分解のよりよい理解は、萎縮症の予防および処置のための戦略計画および薬剤を与える。
【０００５】
タンパク質分解は、タンパク質の存在量を制御するために細胞によって使用される共通のメカニズムである。しかし、全てのタンパク質を単に分解するのではなく、ユビキチン作用が、タンパク質標的選択に対して非常に特異的であるように思われる。このようなユビキチン−タンパク質結合体の形成は、３つの構成成分（ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、および基質特異性決定構成成分（Ｅ３））からなるタンパク質複合体を伴って生じる（Ｓｋｏｗｙｒａら、１９９７，Ｃｅｌｌ  ９１：２０９−２１９）。どのタンパク質標的がユビキチン化されるかを調節する、いくつかの別個の分子戦略が存在する。最近発見された機構は、ＳＣＦ  Ｅ３  ユビキチンリガーゼ複合体と言われる（複合体の図解表示について図１を参照のこと）。このＳＣＦタンパク質複合体は、いくつかの別個のタンパク質サブユニット（「Ｆ−ｂｏｘ」と呼ばれるドメインを有するタンパク質を含む）を含む。リン酸化基質の存在下で、このＳＣＦ複合体は、その基質に結合し、そしてＳＣＦ複合体の一部でもあるＥ２  ユビキチントランスフェラーゼを用いて、それをユビキチン化する（Ｐａｔｔｏｎら、１９９８、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：６９２−７０５）。この結果は、基質の特異的なタンパク分解性の分解である。Ｆ−ｂｏｘタンパク質は、以下の３つのサブファミリーに分類され得る大きなファミリーを含む：１）複数のＴｒｐ−Ａｓｐ反復（ＷＤ−４０反復）によって特徴付けられる、Ｆｂｗｓ；２）ロイシンリッチな反復によって特徴付けられる、Ｆｂｌｓ；および３）既知のタンパク質相互作用ドメインを欠いている、Ｆｂｘｓ（現在既知の哺乳動物のＦ−ｂｏｘタンパク質ファミリーメンバーの考察について、Ｗｉｎｓｔｏｎら、１９９９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１１８０−１１８２を参照のこと）。Ｆ−ｂｏｘタンパク質は、通常、特定のタンパク質基質およびＦ−ｂｏｘと呼ばれる、４２〜４８アミノ酸のモチーフと相互作用するさらなる基質結合ドメインを含む（Ｗｉｎｓｔｏｎ、１９９９）。ｈＭＡＦＢＸの、他のＦ−ｂｏｘを含むタンパク質との比較について、図２を参照のこと。
【０００６】
ユビキチンの、特定の基質への結合に関する別の機構は、「環状ドメイン」を含むタンパク質に関与する。環状ドメインタンパク質は、独立した単量体のユビキチンリガーゼとして作用し得るか、またはそれらのタンパク質は、ＳＣＦ複合体の一部分として機能し得るかのいずれかである。環状ドメインタンパク質は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質を有する場合、通常、特定の基質に結合する第２のドメインを含む。この環状ドメインは、ユビキチンリガーゼを補強する。最終的な結果は、最終的に蛋白質分解を生じる、基質のユビキチン化である。
【０００７】
正常な筋組織の維持に関連する別のタンパク質複合体は、筋細胞の細胞外マトリクスとアクチン細胞骨格との間の連結において不可欠な役割を果たすと考えられる、ジストロフィンタンパク質複合体である。ジストロフィンタンパク質複合体の鍵となる成分は、ａ−ジストロブレビン（ｄｙｓｔｒｏｂｒｅｖｉｎ）（その非存在が、神経筋接合部欠損および筋ジストロフィーを結果的に生じる、ジストロフィン関連タンパク質）である。最近、シンコイリン（Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ）と呼ばれる、新規のａ−ジストロブレビン結合パートナーが、同定された（Ｎｅｗｅｙら、ＪＢＣ  Ｐａｐｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年１０月２５日）。シンコイリンは、中間フィラメントファミリーのメンバーである。これは、骨格筋および心臓において高発現され、そして神経筋接合部に集まる。
【０００８】
本発明に従って、ＭＵＲＦ１（正式には、ＭＵＳＣＬＥ  ＡＴＲＯＰＨＹ−１６またはＭＡ−１６と呼ばれる）、ＭＵＲＦ３、およびＭＵＳＣＬＥ  ＡＴＲＯＰＨＹ−６１（ＭＡ−６１）と名付けられた新規のタンパク質分子が、発見されている。ＭＡＦＢＸは、骨格筋および心筋において、そしてそれ程の程度ではないが、脳の特定の領域において特異的に発現される、新規のＦ−ｂｏｘタンパク質である（図解表示について図３を参照のこと）。ＭＡＦＢＸｍＲＮＡの発現レベルは、骨格筋萎縮症の間に、顕著に増加する。ＭＵＲＦ１は、骨格筋および心臓で特異的に発現される、新規の環状ドメインタンパク質（略図について、図４を参照のこと）である。ＭＵＲＦ１  ｍＲＮＡの発現レベルは、骨格筋萎縮症の間に顕著に増加する。従って、ＭＵＲＦ１またはＭＡＦＢＸのｍＲＮＡ発現が、筋萎縮症についての独特のマーカーを提供するという本発明と一致して発見されている。ＭＵＲＦ３は、新規の環状ドメインタンパク質であり、その基質は、ジストロフィンタンパク質複合体に関与するシンコイリンである。この複合体は、正常な筋組織を維持に関与するので、ＭＵＲＦ−３はまた、萎縮症、ならびに筋系の他の疾患および合併症の予防に有用である。本発明の発見は、萎縮症の処置および予防のための薬剤の同定、ならびに萎縮症の処置および予防のための標的薬剤に有用な経路の同定を可能にする。本発明は、特に、ＳＣＦタンパク質複合体およびジストロフィン複合体に関する正常な筋肉の機能に一般的識見を提供する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、新規の哺乳動物の細胞外シグナル伝達分子（ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、およびＭＵＳＣＬＥ  ＡＴＲＯＰＨＹ−６１（ＭＡ−６１）と呼ばれる）のタンパク質および核酸配列、ならびに筋萎縮症もしくは他の関連疾患の処置における治療プロトコルおよびこのような分子を利用した組成物を提供する。本発明は、これらの分子の基質を同定するためのスクリーニングアッセイ、およびこれらの分子を変調するかまたは標的化する薬剤、ユビキチン結合またはユビキチン経路、もしくはジストロフィン複合体の同定に関する。これらのスクリーニングアッセイは、筋萎縮症および関連する障害の処置のための強力な治療薬剤を同定するために使用され得る。
【００１０】
本発明は、ＭＡＦＢＸのＦ−ｂｏｘモチーフまたはＭＵＲＦ１およびＭＵＲＦ３の環状ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、ならびにこのようなモチーフおよび／またはドメインをコードする核酸を提供する。
【００１１】
本発明はまた、ＭＵＲＦ３核酸とシンコイリン遺伝子との間の共結合（ｃｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を記載する。この相互作用は、正常筋細胞の機能、および特に、ジストロフィンタンパク質複合体、中間フィラメントスーパーファミリー、およびユビキチン結合タンパク質複合体の間の相互関係の識見を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、ＭＡ−６１の新規のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを記載する。このドメインは、ＭＡＦＢＸタンパク質を、以前に発見されたＦ−ｂｏｘを含むタンパク質（Ｆｂｘ２５）と比較することにより決定された。これら２つのタンパク質は、Ｆ−ｂｏｘドメインと異なる相同な領域を含む。本出願人らは、このドメインを、Ｆｂｘ２５相同ドメインと呼ぶ。ＭＡＦＢＸのＦｂｘ２５との比較に関して、図５Ａ〜５Ｂを参照のこと。
【００１３】
本発明はさらに、単離されたＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸの核酸分子、あるいはＭＡＦＢＸのＦ−ｂｏｘモチーフ、またはＭＵＲＦ１もしくはＭＵＲＦ３の環状ドメインを含むベクターを提供する。このベクターは、ＭＵＲＦ１ペプチド、ＭＵＲＦ３ペプチドまたはＭＡＦＢＸペプチド、あるいはＭＡ−６１のＦ−ｂｏｘモチーフ、あるいはＭＵＲＦ１核酸またはＭＵＲＦ３核酸の環状ドメイン、あるいはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３タンパク質、またはＭＡＦＢＸタンパク質を、細菌内、酵母内、または哺乳動物細胞内で発現させるために、使用され得る。
【００１４】
従って、本発明は、以下の核酸配列、このような核酸配列を発現する宿主細胞、ならびに以下のようなヌクレオチド配列の発現産物を含む：（ａ）ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡ−６１をコードする、ヌクレオチド配列（ヒトホモログおよびラットホモログの両方を含む）、ならびにそれらの遺伝子産物；（ｂ）ＭＵＲＦ１分子、ＭＵＲＦ３分子、およびＭＡＦＢＸ分子のサブユニットを標的化する新規の基質タンパク質をコードする、ヌクレオチド配列（ＭＡ−６１のＦ−ｂｏｘモチーフ、ＭＵＲＦ１またはＭＵＲＦ３の環状ドメイン、ＭＵＲＦ３分子のシンコイリン遺伝子と共結合する部分、ならびにＭＡ６１のＦｂｘ２５相同ドメインを含む）；（ｃ）ドメインの全てまたは一部が欠失または変化された、新規分子（ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、およびＭＡＦＢＸｉｎ）の変異体、ならびにこのようなヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド産物をコードする、ヌクレオチド配列；（ｄ）新規のユビキチン経路分子、または別のポリペプチドと融合した、１つのドメインを含む融合タンパク質をコードする、ヌクレオチド配列ドメイン、ならびに新規のジストロフィン複合体タンパク質または別のポリペプチドと融合したそれらのドメインの１つをコードする、ヌクレオチド配列ドメイン、（ｅ）上記に列挙されたヌクレオチド配列のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列（ストリンジェントな条件としては、例えば、５×ＳＳＰＥ（０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）緩衝液中に３０％ホルムアミドを含む緩衝液中で、４２℃の温度でハイブリダイズし、４２℃で、０．２×ＳＳＰＥによって洗浄された場合に結合を維持する条件；好ましくは、５×ＳＳＰＥ緩衝液中に５０％ホルムアミドを含む緩衝液中で、４２℃の温度でハイブリダイズし、４２℃で、０．２×ＳＳＰＥ緩衝液によって洗浄された場合に結合を維持する条件；または、好ましくは、２０％ＳＤＳ、１０％  ＢＳＡ、１Ｍ  ＮａＰＯ４、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８を含む緩衝液中で、６０℃の温度でハイブリダイズし、６５℃で、０．１％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣによって洗浄された場合に結合を維持する条件）；ならびに（ｆ）少なくとも１００塩基対の長さで配列のブロック内で、上記に列挙されるヌクレオチド配列に６５％相同である、ヌクレオチド配列。
【００１５】
本発明はさらに、ユビキチン経路、ＭＵＲＦ１核酸もしくはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３核酸もしくはＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＡＦＢＸ核酸もしくはＭＡＦＢＸタンパク質の活性または発現、筋萎縮および／あるいはジストロフィン複合体と相互作用するかまたはこれらを調節する、薬物または因子をスクリーニングする際の、ＭＵＲＦ１核酸もしくはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３核酸もしくはＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＡＦＢＸ核酸もしくはＭＡＦＢＸタンパク質、ＭＡ−６１のＦ−ｂｏｘモチーフ、ＭＵＲＦ１またはＭＵＲＦ３のリングドメイン、Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ遺伝子と同時結合するＭＵＲＦ３分子の部分、およびＭＡ−６１のＦｂｘ２５相同性ドメインの使用を提供する。従って、本発明は、ＭＵＲＦ１核酸もしくはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３核酸もしくはＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＡＦＢＸ核酸もしくはＭＡＦＢＸタンパク質および／あるいはそれらの特定のドメインの使用を提供し、細胞内（特定には、筋細胞であるが、ＭＡＦＢＸ発現はまた、脳の領域で検出されるので、特定の神経細胞も含む）の特定の薬物、因子または分子の相互作用を追跡または調節するための使用を提供する。特定の実施形態において、ＭＡＦＢＸのＦ−ｂｏｘモチーフまたはＭＵＲＦ１もしくはＭＵＲＦ３のリングドメインは、ＭＵＲＦ１分子、ＭＵＲＦ３分子またはＭＡＦＢＸ分子との相互作用するかあるいはこれらの活性または発現を調節する分子または因子をスクリーニングするために利用される。他の実施形態において、ＭＵＲＦ１核酸またはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３核酸またはＭＵＲＦ３タンパク質およびＭＡＦＢＸ核酸またはＭＡＦＢＸタンパク質は、筋萎縮をブロックまたは防止する薬物を見出すためのアッセイ実験の間のマーカーとして使用される。
【００１６】
本発明はまた、ＭＵＲＦ１タンパク質もしくはＭＵＲＦ１ペプチド、ＭＵＲＦ３タンパク質もしくはＭＵＲＦ３ペプチドおよびＭＡＦＢＸタンパクもしくはＭＡＦＢＸペプチドの発現または活性を調節するか、あるいはユビキチン化を阻害するために細胞内でＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３タンパク質およびＭＡＦＢＸタンパク質の相互作用をもたらすことによって、ユビキチン化および／または筋萎縮を低下させるためのＭＵＲＦ１核酸またはＭＵＲＦ１核酸タンパク質、ＭＵＲＦ３核酸またはＭＵＲＦ３タンパク質およびＭＡＦＢＸ核酸またはＭＡＦＢＸタンパク質の使用を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、新規のＭＵＲＦ１分子、ＭＵＲＦ３分子およびＭＡＦＢＸ分子ならびにそれらのサブユニットの全てのアゴニストおよびアンタゴニスト（低分子、高分子、ネイティブなＭＵＲＦ１結合タンパク質、ＭＵＲＦ３結合タンパク質およびＭＡＦＢＸ結合タンパク質と競合する変異体、ならびに抗体を含む）、ならびに、ＭＵＲＦ１タンパク質およびＭＵＲＦ１ペプチド、ＭＵＲＦ３タンパク質およびＭＵＲＦ３ペプチドならびにＭＡＦＢＸタンパク質およびＭＡＦＢＸペプチドの発現を阻害するために使用され得る（アンチセンス分子およびリボザイム分子ならびに遺伝子調節構築物または遺伝子置換構築物を含む）、またはＭＵＲＦ１タンパク質もしくはＭＵＲＦ１ペプチド、ＭＵＲＦ３タンパク質もしくはＭＵＲＦ３ペプチドおよびＭＡＦＢＸタンパク質もしくはＭＡＦＢＸペプチドの発現を増強するためのヌクレオチド配列（ＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子またはＭＡＦＢＸ遺伝子を強力なプロモータ配列の制御下に置く発現構築物を含む）、そして、ＭＵＲＦ１導入遺伝子、ＭＵＲＦ３導入遺伝子もしくはＭＡＦＢＸ導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物またはＭＵＲＦ１分子、ＭＵＲＦ３分子もしくはＭＵＦＢＸ分子を発現しないノックアウト動物を包含する。
【００１８】
本発明はまた、ヒト（ｈ）ＭＵＲＦ１、げっ歯類（ｒ）ＭＵＲＦ１、（ｈ）ＭＵＲＦ３、（ｒ）ＭＵＲＦ３、（ｈ）ＭＡ−６１、または（ｒ）ＭＡＦＢＸＤＮＡの配列の範囲内に含まれる配列とハイブリダイズ可能な核酸プローブを提供し、ヒトおよびげっ歯類においてＭＵＲＦ１  ｍＲＮＡ、ＭＵＲＦ３  ｍＲＮＡまたはＭＡＦＢＸ  ｍＲＮＡを発現する組織の検出のために有用である。
【００１９】
本発明はさらに、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡＦＢＸの結合サブユニットの誘導体およびアナログ（これらは、筋萎縮ならびに関連する疾患および障害の予防のための潜在的な治療法として分子の活性を調節する）を同定するためのスクリーニング方法を包含する。本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡ−６１またはその誘導体、フラグメントもしくはドメイン（例えば、ＭＡ−６１のＦ−ｂｏｘモチーフ、ＭＵＲＦ１およびＭＵＲＦ３のリングドメイン、Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ遺伝子と同時結合するＭＵＲＦ３分子の部分、ならびにＭＡ−６１のＦｂｘ２５相同性ドメイン）と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法を提供する。本発明に従って、スクリーニング方法は、タンパク質−タンパク質相互作用を同定するための既知のアッセイを利用し得、このようなアッセイとして、ファージディスプレイアッセイ、タンパク質に結合する抗体を用いる免疫沈降に続くサイズ分画分析、ウエスタン分析、ゲル電気泳動，酵母２ハイブリッドアッセイ系またはこれらの改変が挙げられる。
【００２０】
本発明はさらに、ＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３タンパク質、もしくはＭＡＦＢＸタンパク質、またはＭＡＦＢＸタンパク質のＦ−ｂｏｘモチーフ、またはＭＵＲＦ１タンパク質もしくはＭＵＲＦ３タンパク質のリングドメイン、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む、抗体を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、診断上および治療上の有用性を有する。このような方法は、診断検査または遺伝子検査のための遺伝子配列および／または遺伝子産物配列を利用し得る。本発明の特定の実施形態において、ＭＵＲＦ１  ｍＲＮＡ、ＭＵＲＦ３  ｍＲＮＡもしくはＭＡＦＢＸ  ｍＲＮＡの発現の検出方法、または本明細書中に記載されるＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３タンパク質もしくはＭＡＦＢＸタンパク質の検出方法は、神経筋接合部を冒すものを含む、心臓または骨格の、種々の病気、症候群または障害と関連する骨格筋萎縮の診断において使用され得る。ユビキチン経路を調節または標的化する分子における変異は、検出され得、そして被験体は、筋萎縮に関連する疾患または障害が進行する危険性について評価され得る。
【００２２】
他の実施形態において、ＭＵＲＦ１  ｍＲＮＡ、ＭＵＲＦ３  ｍＲＮＡまたはＭＡＦＢＸ  ｍＲＮＡの発現の操作、あるいはこれらの遺伝子もしくは遺伝子産物の活性もしくは発現と相互作用するかまたは遺伝子もしくは遺伝子産物を調節する他の因子は、筋萎縮およびジストロフィーに関連する病気、症候群または障害（例えば、骨格筋または心筋の障害）の処置において使用され得る。さらに、ＭＵＲＦ１核酸もしくはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３核酸もしくはＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＵＦＢＸ核酸もしくはＭＵＦＢＸタンパク質のレベルまた活性の測定または分析は、他の実施形態において、薬学的因子が萎縮過程を撹乱するか否かを決定するために使用され得；発現の増加は、タンパク質の崩壊における増加と相関するが、発現の減少または妨害は、筋タンパク質の崩壊の効果的な減少または妨害と相関する。さらなる実施形態において、ＭＡＦＢＸのＦ−ｂｏｘモチーフまたはＭＵＲＦ１もしくはＭＵＲＦ３のリングドメインを、筋萎縮およびジストロフィーと関連する病気、症候群または障害（例えば、骨格筋または心筋の障害）の処置のために操作し得る。
【００２３】
本発明はさらに、筋細胞における萎縮を阻害する方法を包含し、この方法は、細胞を、ＭＵＲＦ１タンパク質もしくはＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３タンパク質もしくはＭＵＲＦ３核酸またはＭＡＦＢＸタンパク質もしくはＭＡＦＢＸ核酸のインヒビター、ＭＵＲＦ１経路、ＭＵＲＦ３経路またはＭＡＦＢＸ経路のインヒビター、あるいはユビキチン化のインヒビターと接触させる工程を包含する。本発明はさらに、筋細胞における萎縮を阻害する方法を包含し、この方法は、細胞を、筋萎縮のインヒビターと接触させる工程を包含し、ＭＵＲＦ１核酸もしくはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３核酸もしくはＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＡＦＢＸ核酸もしくはＭＡＦＢＸタンパク質の発現の減少あるいはＭＵＲＦ１ペプチドもしくはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３ペプチドもしくはＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＡＦＢＸペプチドもしくはＭＡＦＢＸタンパク質の活性の減少を生じる。この実施形態において、ＭＵＲＦ１核酸もしくはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３核酸もしくはＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＡＦＢＸ核酸もしくはＭＡＦＢＸタンパク質の発現、あるいはＭＵＲＦ１ペプチドもしくはＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３ペプチドもしくはＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＡＦＢＸペプチドもしくはＭＡＦＢＸタンパク質の活性は、筋萎縮またはそれに関連する疾患を阻害における試験化合物の効率を証明するためのマーカーとして使用される。
【００２４】
本発明はさらに、筋萎縮と関連する疾患または障害の処置において有用な因子をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、図７、９、１１、１３、１７、１９および２２のアミノ酸配列をそれぞれ有するＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸ、あるいはそのフラグメントを発現する細胞およびその基質を化合物と接触させる工程、ならびにＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物またはＭＡＦＢＸ遺伝子産物のいずれかの活性の変化を検出する工程を包含する。活性のこのような変化は、ＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物またはＭＡＦＢＸ遺伝子産物と１つ以上のタンパク質（例えば、そのタンパク質の基質の１つまたはユビキチン経路の構成要素の一つ）との相互作用における変化によってか、あるいはユビキチン化または基質の分解の変化によって、明らかにされ得る。
【００２５】
本発明はさらに、筋萎縮に関連する疾患または障害の処置において有用な因子をスクリーニングするための方法を提供し、ＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３タンパク質、またはＭＡＦＢＸタンパク質を生成する工程、およびこれらのタンパク質のいずれかをインビトロユビキチンリガーゼアッセイにおいて使用する工程を包含する。因子は、インビトロでの遍在性連結（ｕｂｉｑｕｉｔｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）阻害におけるその有効性についてスクリーニングされる。
【００２６】
本発明はまた、筋萎縮と関連する動物の疾患または障害を処置する方法を提供し、このような疾患または障害の症状が緩和されるように、ＭＵＲＦ１経路、ＭＵＲＦ３経路またはＭＡＦＢＸ経路、ユビキチン化、あるいはＭＵＲＦ１遺伝子もしくはＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子もしくはＭＵＲＦ３遺伝子産物またはＭＡＦＢＸ遺伝子もしくはＭＡＦＢＸ遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物をその動物に投与する工程を包含する。
【００２７】
本発明は、筋萎縮と関連する動物の疾患または障害を診断する方法を提供し、この方法は、患者または患者サンプル中のＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子、またはＭＡＦＢＸ遺伝子の発現を測定する工程を包含する。例えば、本発明は、哺乳動物における筋萎縮を検出するための方法を包含し、この方法は、ａ）画像化因子と結合されたＭＵＲＦ１核酸もしくはＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３核酸もしくはＭＵＲＦ３ポリペプチドまたはＭＡＦＢＸ核酸もしくはＭＡＦＢＸポリペプチドを検出し得る分子を含む組成物を、その哺乳動物に投与する工程；ｂ）その組成物を筋肉中に蓄積可能にする工程；ならびにｃ）筋萎縮の指標としてＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡ−１６の存在を検出するために、この蓄積された組成物を検出する工程。ＭＵＲＦ１分子、ＭＵＲＦ３分子、またはＭＡＦＢＸ分子に結合または付着し得るこのような分子は、例えば、化学物質、核酸、ポリペプチド、またはペプチドであり得る。さらに、このような診断薬は、転写物の量または発現産物の量を直接的に定量することによって遺伝子の発現を測定し得る。例えば、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡ−６１ならびにこれらにコードされるタンパク質のレベルが、測定され得る。このような測定は、当該分野で公知の標準的技術（限定しないが、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ、ノザン分析、ウエスタン分析または免疫組織化学が挙げられる）の使用を介してなされ得る。
【００２８】
本発明はさらに、上記された方法を包含し、ここで、筋細胞は、トランスジェニック生物から得られるかまたはトランスジェニック生物内に存在し、ここで、このトランスジェニック生物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明はさらに、萎縮が誘導する状態を有する動物において萎縮を阻害する方法を包含し、この方法は、有効量のＭＵＲＦ１タンパク質もしくはＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３タンパク質もしくはＭＵＲＦ３核酸、またはＭＡＦＢＸタンパク質もしくはＭＡＦＢＸ核酸のインヒビターで哺乳動物を処置する工程、あるいは細胞をＭＵＲＦ１経路、ＭＵＲＦ３経路またはＭＡＦＢＸ経路のインヒビターで処理する工程を包含する。本発明はさらに、筋萎縮ならびに関連する疾患および障害の処置に有用な化合物をスクリーニングする方法を包含し、ＭＵＲＦ１を発現する筋細胞を化合物と接触させる工程、およびＭＵＲＦ１タンパク質活性、ＭＵＲＦ３タンパク質活性またはＭＡＦＢＸタンパク質活性における変化を検出する工程を包含する。この変化は、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ、ファージディスプレイ系、ゲル電気泳動、酵母２ハイブリッドアッセイ、ノザン分析またはウエスタン分析、免疫組織化学、慣用的なシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直進スキャナ、ＰＥＴスキャナ、ＳＰＥＣＴスキャナ、ＭＲＩスキャナ、ＮＭＲスキャナ、またはＸ線装置によって検出され得る。ＭＵＲＦ１タンパク質活性、ＭＵＲＦ３タンパク質活性またはＭＡＦＢＸタンパク質活性の変化はまた、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸと１つ以上のタンパク質との相互作用の変化を検出することによって検出され得る。この方法は、筋細胞が骨格由来であるか、培養細胞であるか、トランスジェニック生物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類）から得られたものであるか、あるいは、トランスジェニック生物において、使用され得る。タンパク質発現の変化は、ユビキチン経路における１つ以上のタンパク質のタンパク質量の変化によって実証され得る。
【００３０】
本発明はさらに、動物における萎縮を阻害する方法を包含し、ここでこの動物は、萎縮が誘導する状態への曝露または発症に先立って処置される。このような、萎縮が誘導する状態は、不動化、脱神経、飢餓、栄養の欠乏、代謝性ストレス、糖尿病、老化、筋ジストロフィーまたはミオパシーを含み得る。好ましい実施形態において、萎縮が誘導する状態は、不動化、老化または床上安静である。好ましい実施形態において、萎縮が誘導する状態は、癌またはＡＩＤＳである。
【００３１】
本発明はさらに、骨格筋細胞において筋の肥大を生じる方法を包含し、この方法は、骨格筋細胞をＭＵＲＦ１タンパク質もしくはＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３タンパク質もしくＭＵＲＦ３核酸またはＭＡＦＢＸタンパク質もしくはＭＵＲＦ３核酸のインヒビターで処置する工程、あるいは骨格筋細胞をＭＵＲＦ１経路、ＭＵＲＦ３経路またはＭＡＦＢＸ経路のインヒビターで処置する工程を包含する。
【００３２】
化合物検出システムを利用する本発明の実施形態において、任意の検出器が、当該分野で公知であり、例えば、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ、ノザン分析またはウエスタン分析、免疫組織化学、慣用的なシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直進スキャナ、ＰＥＴスキャナ、ＳＰＥＣＴスキャナ、ＭＲＩスキャナ、ＮＭＲスキャナ、およびＸ線装置である。さらに、当該分野で公知の任意の画像化因子（例えば、放射性核種またはキレート）が、使用され得る。
【００３３】
ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸを検出し得る分子は、核酸およびｍＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドもしくは合成ポリペプチドであり得る。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態において、過剰なＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸを罹患する患者は、ＭＵＲＦ１遺伝子コード領域、ＭＵＲＦ３遺伝子コード領域またはＭＵＦＢＸ遺伝子コード領域に対応する有効量のアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、またはＲＮＡｉを投与することによって処置され、それによって、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３および／またはＭＡ−６１の発現を減少され得る。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、本出願人による、分子ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡ−６１の発見および特徴付けに基づく。ＭＵＲＦ１およびＭＡＦＢＸは、ラットおよびヒトの成体心臓および成体骨格筋の両方で発現され、そして、これらの発現は、骨格筋萎縮の様々な状態下で増加する。本発明は、ヒト（ｈ）ＭＵＲＦ１、ヒト（ｈ）ＭＵＲＦ３およびＨＵＭＡＮ  ＭＵＳＣＬＥ  ＡＴＲＯＰＨＹ−６１（ｈＭＡ−６１）と呼ばれる新規ヒト細胞内シグナル伝達分子のタンパク質および核酸、ならびにＲＡＴ  ＭＵＲＦ１、ＲＡＴ  ＭＵＲＦ３およびＲＡＴ  ＭＵＳＣＬＥ  ＡＴＲＯＰＨＹ−６１（ｒＭＡ−６１）と呼ばれる新規ラット細胞内シグナル伝達分子のタンパク質および核酸を提供する。本説明の全体にわたって、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸのタンパク質および核酸の言及としては、本明細書中で記載されるようなｈＭＵＲＦ１、ｈＭＵＲＦ３、ｈＭＡ−６１、ｒＭＵＲＦ１、ｒＭＵＲＦ３またはｒＭＡＦＢＸのタンパク質および核酸の特定の実施形態が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＵＲＦ１分子およびＭＵＲＦ３分子はリング（ｒｉｎｇ）ドメインを含み、そしてＭＡＦＢＸは、Ｆ−ボックスモチーフを含む。この分子のこれらのドメインの両方は、この分子と、それらの基質とユビキチンリガーゼ系との間の相互作用を促進する。
【００３６】
本発明は、ユビキチン経路に関する新規タンパク質およびその基質に関連する。本発明は、筋成長、筋機能化および筋増殖の障害に関与する新規核酸およびポリペプチドを提供する。これらとしては、このような活性を有する以下のようなＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸのタンパク質もしくは核酸、またはそれらのドメインが挙げられる：例えば、ＭＡ−６１のＦ−ボックスモチーフ、ＭＵＲＦ１もしくはＭＵＲＦ３のリングドメイン、Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ遺伝子と共同提携（ｃｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ）するＭＵＲＦ３分子の一部、およびＭＡ−６１のＦｂｘ２５相同ドメイン。
【００３７】
本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡＦＢＸの核酸、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡＦＢＸのポリペプチド、それらの誘導体およびアナログ、ならびにＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３もしくはＭＡＦＢＸの核酸またはタンパク質の欠失変異体または種々のアイソフォームを含む。これらは、融合生成物（例えば、非ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸのポリペプチドおよび核酸との融合生成物）として提供され得る。さらに、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡＦＢＸの核酸およびペプチドは、宿主発現系に関連され得る。
【００３８】
本発明はさらに、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡ−６１をコードするヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡ−６１に対する抗体、それらのアゴニストおよびアンタゴニストの使用を提供する。本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡＦＢＸならびに／または分子の基質を同定するように設計されたスクリーニングアッセイに関し、この基質は、新規な分子であるＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡＦＢＸの活性を、独立してかまたはそれらの基質に関連して調節する。さらに、本発明は、筋萎縮ならびに関連する疾患および障害を阻害、ブロックまたは改善する見込みのある治療薬を同定するために使用されるスクリーニングアッセイの使用に関する。
【００３９】
（遺伝子）
本発明は、核酸分子（これは、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡ−６１をコードする）を提供する。本発明は、ＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物およびＭＡＦＢＸ遺伝子産物（ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡ−６１の機能的ドメイン（例えば、ＭＡ−６１のＦ−ボックスモチーフ、ＭＵＲＦ１もしくはＭＵＲＦ３のリングドメイン、Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ遺伝子と共同提携するＭＵＲＦ３分子の一部、およびＭＡ−６１のＦｂｘ２５相同ドメイン）を含む）に対応するポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸配列、またはその誘導体、フラグメントもしくはドメイン、それらの変異形態、短縮形態または欠失形態、および前述のいずれかを組み込むかまたは生成する宿主細胞発現系を含む。
【００４０】
本発明は、図６、図８（ａ〜ｃ）、図１０、図１２、図１６、図１８および図２１中のＤＮＡ配列；図７、図９、図１１、図１３、図１７および図１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする任意のＤＮＡ配列；ストリンジェント条件下または高ストリンジェント条件下で、図６、図８（ａ〜ｃ）、図１０、図１２、図１６、図１８および図２１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列、および／または低ストリンジェント条件下で、図７、図９、図１１、図１３、図１７、図１９および図２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、図１０、図１２および図１８に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、そしてＦ−ボックスモチーフのいずれかを含む遺伝子産物をコードし、そして、少なくとも４７ヌクレオチド長である、哺乳動物ゲノム由来の任意のヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
本発明は、哺乳動物供給源由来の核酸分子およびタンパク質を含む。核酸配列としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡが挙げられ得る。特定のアミノ酸配列をコードする核酸をいう場合、この核酸は、特定のアミノ酸配列をコードするようにプロセシングされたｍＲＮＡ種が転写されるｃＤＮＡ配列であり得ることが理解されるべきである。
【００４３】
本発明はまた、開示された配列および／またはそれらの相補鎖のいずれか（これらは、調節エレメントに連結され得る）を含むベクターおよび宿主細胞を含む。このような調節エレメントとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：発現を駆動するかまたは調節するためのプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび当業者に公知の他のエレメント（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＭＣＫ、ＨＳＡおよびアデノプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＲＣ系、ファージＡのプロモーターおよびオペレーター）。
【００４４】
本発明はさらに、本明細書中に開示された核酸配列、および、開示された配列に対して約５０％よりも高いアミノ酸同一性を有するＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡＦＢＸの遺伝子産物をコードする遺伝子配列のいずれかのフラグメントを含む。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡＦＢＸをコードする核酸配列のヌクレオチドフラグメント（図６、図８（ａ〜ｃ）、図１０、図１２、図１６、図１８および図２１）を提供する。このようなフラグメントは、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸの遺伝子配列の少なくとも８つのヌクレオチド（すなわち、ハイブリダイゼーション部分）からなり；他の実施形態において、この核酸は、ＭＵＲＦ１配列、ＭＵＲＦ３配列またはＭＡＦＢＸ配列の少なくとも２５個連続するヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチドまたは２００ヌクレオチドからなる。別の実施形態において、この核酸は、４７ヌクレオチド長より短い。本発明はまた、前述の配列に対してハイブリダイズ可能な核酸、または前述の配列の相補鎖に関する。全配列は、１本鎖であるか、２本鎖であり得る。さらに、本発明のヌクレオチド配列としては、図７、図９、図１１、図１３、図１７および図１９のＭＵＲＦ１配列、ＭＵＲＦ３配列またはＭＡＦＢＸ配列によってコードされるポリペプチドに対して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が挙げられ得る。
【００４６】
本発明の１つの実施形態は、本明細書中の図７、図９、図１１、図１３、図１７および図１に記載のアミノ酸配列に対応するＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチドまたはＭＡＦＢＸポリペプチド、またはＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３もしくはＭＡ−６１特異的活性もしくは特異的発現レベルを有するそれらのフラグメントをコードする組換え核酸である。
【００４７】
なお別の実施形態は、ネイティブＭＵＲＦ１またはＭＡＦＢＸの配列を有する核酸の相補鎖に特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１８個連続した塩基を有する、本明細書中の図６、図８（ａ〜ｃ）、図１０、図１２、図１６、図１８および図２１に記載のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントを含む単離された核酸である。
【００４８】
さらに、開示されたＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸またはＭＡＦＢＸ核酸の配列は、選択された発現系のために最適化され得るか（Ｈｏｌｌｅｒら、（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３６：３２３〜３２８；Ｍａｒｔｉｎら、（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５４：１５０〜１６６）、または核酸配列をコードする天然のＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸの単離において使用するための縮重オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを生成するために使用され得る（「ＧＣＧ」ソフトウェア、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸをコードする核酸は、例えば、以下のために、発現ベクターの一部となり得、そして組換え宿主細胞に組み込まれ得る：発現およびスクリーニング、トランスジェニック動物、または、機能的研究（例えば、ＭＵＲＦ１またはＭＡ−６１媒介細胞活性、またはＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３もしくはＭＡＦＢＸのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質発現に関連する疾患に対する候補薬剤の効果）。発現系は、選択的な翻訳後プロセシングを介して、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチドまたはＭＡＦＢＸポリペプチドの構造改変体および機能的改変体を達成するために、選択および／または変更される。
【００４９】
特許請求されたＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸、またはＭＡＦＢＸ核酸は、単離されていても、純粋でも、かつ／または非天然でもよい。「純粋な」核酸は、所定のサンプル中の全ての核酸の少なくとも約９０重量％、好ましくは、少なくとも約９９重量％を構成する。「非天然」の核酸は、天然の産物であると考えられないかもしれない程度に操作された核酸である。非天然の核酸の１つの例は、当該分野において公知の組換え技術を介して産生された核酸である。この目的の核酸は、合成されても、組換え技術によって産生されても、細胞から精製されてもよい。本明細書中に開示されるヌクレオチド配列およびそれらのフラグメントを含む核酸は、それが天然の染色体上で結合されている配列以外の配列に直接隣接するか、またはそれが天然の染色体上で結合されている配列以外の配列に直接隣接する１０ｋｂより短い（好ましくは２ｋｂより短い）ネイティブの隣接領域に隣接するように配列またはフラグメントを末端に含み得る。この核酸は、通常、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列であり、他の塩基またはヌクレオチドアナログを含む核酸を用いて、例えば、改変された安定性を提供することは、しばしば有利である。
【００５０】
本発明は、以下を含むが、これらに限定されないＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸、またはＭＡＦＢＸ核酸の広範な種々の適用を提供する：筋萎縮症、ユビキチン化、あるいはＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸、およびＭＡＦＢＸ核酸またはポリペプチド自体の発現もしくは活性を調節する分子、薬剤および薬物の同定および研究；筋萎縮症またはユビキチン化のマーカーとして；筋萎縮症またはユビキチン化の予防または軽減のためのマーカーとして；筋ジストロフィーを調節する分子、薬剤および薬物の同定および研究；筋ジストロフィーのマーカーとして；筋ジストロフィーの予防または軽減のためのマーカーとして；翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、または診断核酸、イメージング剤として；ＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子、またはＭＡＦＢＸ遺伝子および遺伝子転写物の存在の検出；ならびにさらなるＭＵＲＦ１ホモログ、ＭＵＲＦ３ホモログ、またはＭＡＦＢＸホモログおよび構造的アナログをコードする核酸の検出または増幅。
【００５１】
本明細書中に記載される、ＭＵＲＦ１ｍＲＮＡ、ＭＵＲＦ３ｍＲＮＡ、またはＭＡＦＢＸｍＲＮＡに結合するか、またはその発現を調節する新規薬剤は、ＭＵＲＦ１ｍＲＮＡ、ＭＵＲＦ３ｍＲＮＡ、またはＭＡＦＢＸｍＲＮＡを発現する細胞において筋萎縮症を予防し得る。本明細書中に記載される、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡ−６１に結合するかまたはそれが媒介するユビキチン化もしくはそれらの活性を調節する新規薬剤は、ＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３タンパク質、またはＭＡＦＢＸタンパク質のいずれかを含む細胞において筋萎縮症を予防し得る。ＭＡＦＢＸｍＲＮＡの発現もしくはＭＡＦＢＸタンパク質の活性を阻害するか、またはＭＡ６１経路を阻害する薬物または薬剤は、標的タンパク質の、特定のＳＣＦ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ媒介ユビキチン化を減少させることが予想される。ＭＵＲＦ１ｍＲＮＡ、ＭＵＲＦ３ｍＲＮＡの発現、またはＭＵＲＦ１タンパク質もしくはＭＵＲＦ３タンパク質の活性を阻害するか、あるいはＭＵＲＦ１経路もしくはＭＵＲＦ３経路を阻害する薬物または薬剤は、標的タンパク質の、特定の環状ドメイン媒介ユビキチン化を減少させることが予想される。ＭＡ６１ｍＲＮＡの発現またはＭＡＦｂｘタンパク質の活性を阻害する薬物（ｒｕｇ）または薬剤は、標的タンパク質のＦ−ボックス媒介ユビキチン化を減少させることが予想される。ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの優性ネガティブな阻害形態は、骨格筋萎縮症をブロックするための遺伝子治療に用いられ得る。ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの優性ネガティブ阻害形態（ＭＡ−６１のＦ−ボックスドメインもしくはＦｂｘ２５ホモロジードメイン、またはＭＵＲＦ１もしくはＭＵＲＦ３の環状ドメインのいずれかが単独で発現される）もまた、骨格筋萎縮症をブロックするための遺伝子治療に用いられ得る。
【００５２】
本発明は、ＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子、およびＭＡＦＢＸ遺伝子（例えば、転写因子阻害剤、アンチセンスおよびリボザイム分子、ならびに遺伝子または調節配列置換構築物を含む）の発現を阻害するか、あるいはＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸの優性ネガティブ形態（例えば、このコード配列が、発現制御エレメントに作動可能に連結される発現構築物を含む）の発現を促進する抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、化合物、またはヌクレオチド構築物をさらに包含する。
【００５３】
本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、およびＭＡ−６１をコードする核酸の検出を提供する。これは、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸのｃＤＮＡ特異的配列を有し、かつ図６、図８（ａ〜ｃ）、図１０、図１２、図１６、図１８、および図２１との特異的なハイブリダイゼーションをもたらすのに十分な核酸ハイブリダイゼーションプローブおよび複製／増幅プライマーの使用を通じて行われ得る。特異的なハイブリダイゼーションを実証することは、一般的に、ストリンジェントな条件（例えば、４２℃の温度で、５×ＳＳＰＥ（０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）緩衝液中に３０％ホルムアミドを含む緩衝液中でハイブリダイズし、そして４２℃の温度で、０．２×ＳＳＰＥを用いる洗浄に供する場合に結合を保持すること；好ましくは４２℃の温度で、５×ＳＳＰＥ緩衝液中に５０％のホルムアミドを含む緩衝液中で、ハイブリダイズし、そして４２℃の温度で、０．２×ＳＳＰＥ緩衝液を用いる洗浄に供する場合に結合を保持すること；最も好ましくは、６０℃の温度で、２０％ＳＤＳ、１０％ＢＳＡ、１Ｍ  ＮａＰＯ４、．５Ｍ  ＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ８）中で、ハイブリダイズし、そして６５℃で、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いる洗浄に供する場合に結合を保持すること）を必要とする。ＭＵＲＦ１またはＭＡＦＢＸｃＤＮＡホモログはまた、アラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０））を用いて夫々区別され得る。
【００５４】
本明細書中に開示される配列と遺伝子的または物理学的に同じ位置に存在する遺伝子配列を同定および単離するための、開示される配列の使用もまた包含され、そしてそのような配列は、例えば、標準的配列決定および細菌性人工染色体（ＢＡＣ）技術を通して得られ得る。ヒトまたは他の種における遺伝子ホモログをクローニングするための、開示される配列の使用もまた、包含される。そのようにするために、この開示される配列は、標識され得、そしてｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。必要とされるストリンジェンシーのレベルは、用いられるＤＮＡの供給源に依存する。従って、低いストリンジェンシー条件は、特定の環境において適切であり得、そしてそのような技術は、当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。さらに、ＭＵＲＦ１ホモログ、ＭＵＲＦ３ホモログ、またはＭＡＦＢＸホモログは、本明細書中に開示される配列を用いて設計された２つの変性オリゴヌクレオチドプライマーのプールにより、ＰＣＲを用いて単離され得る。次いで、この同定されたフラグメントは、さらに、当該分野において公知の種々の技術（ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングを含む）を用いて全長のクローンを単離するために用いられ得る。さらに、ＰＣＲは、全長ｃＤＮＡ配列を直接的に同定するために用いられ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。これらの開示される配列はまた、変異体ＭＵＲＦ１対立遺伝子、変異体ＭＵＲＦ３対立遺伝子、または変異体ＭＡＦＢＸ対立遺伝子を同定するために用いられ得る。変異体対立遺伝子は、高スループットの臨床的診断剤のための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを作製するために用いられる。ＭＵＲＦ１対立遺伝子、ＭＵＲＦ３対立遺伝子、およびＭＡＦＢＸ対立遺伝子は、当該分野において公知の多数の技術（１本鎖配座多型性（ＳＳＣＰ）変異検出技術、サザンブロッティング、および／またはＰＣＲ増幅技術が挙げられるが、これらに限定されない）によって同定され得る。
【００５５】
ＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸、またはＭＡＦＢＸ核酸はまた、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドの細胞性発現または細胞内の濃度もしくはアベイラビリティを調節するために用いられ得る。ＭＵＲＦ１阻害性核酸、ＭＵＲＦ３阻害性核酸、またはＭＡＦＢＸ阻害性核酸は、代表的に、開示されるＭＵＲＦ１コード配列、ＭＵＲＦ３コード配列、またはＭＡＦＢＸコード配列の相補体を含むアンチセンス１本鎖配列である。所定のＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドの発現のアンチセンス調節は、遺伝子調節配列に作動可能に連結されたアンチセンス核酸を用い得る。細胞は、プロモーター配列を伴いＭＵＲＦ１配列、ＭＵＲＦ３配列、またはＭＡＦＢＸ配列を含むベクターを用いてトランスフェクトされ、このプロモーター配列は、この遺伝子の転写が、内因性ＭＵＲＦ１コードｍＲＮＡ、内因性ＭＵＲＦ３コードｍＲＮＡ、または内因性ＭＡＦＢＸコードｍＲＮＡに結合し得るアンチセンスの転写物を産生するように配置されている。このアンチセンス核酸の転写は、構成的でも誘導性でもよく、そしてこのベクターは、安定な染色体外維持または組込みを提供し得る。あるいは、所定のＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合する１本鎖アンチセンス核酸は、標的化されたポリペプチドの発現の実質的な減少を生じる濃度で、標的細胞に投与され得る。ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸの発現または活性の増強は、対応する遺伝子産物の機能的発現を増大させるＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸、またはＭＡＦＢＸ核酸の、標的化された細胞型への導入によってもたらされる。そのような核酸は、ＭＵＲＦ１発現ベクター、ＭＵＲＦ３発現ベクター、もしくはＭＡＦＢＸ発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能的発現をアップレギュレートするベクター、または変異体対立遺伝子の標的とされる修正のための置換ベクターであり得る。生存細胞に核酸を導入するための技術は、当該分野において公知であり、そしてレトロウイルスに基づくトランスフェクションまたはウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介トランスフェクションが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
（タンパク質およびペプチド）
本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸの遺伝子産物（例えば、ＭＡ−６１のＦ−ボックスモチーフ、ＭＵＲＦ１もしくはＭＵＲＦ３の環状ドメイン、Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ遺伝子と共に結合されるＭＵＲＦ３分子の部分、そしてＭＡ−６１のＦｂｘ２５ホモロジードメイン、またはそれらの誘導体、フラグメントもしくはドメイン、それらの変異、短縮または欠失形態、それらの融合タンパク質、のようなＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、およびＭＡ−６１の機能性ドメインが挙げられる）に対応するポリペプチドまたはペプチドならびに上記のいずれかを組み込むかまたは産生する宿主細胞発現系を提供する。
【００５７】
本発明の１つの実施形態は、本明細書中、図７、図９、図１７、図１１、図１３、図１９、および図２２に示されるとおりのアミノ酸配列を含む単離されたＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、もしくはＭＡＦＢＸポリペプチド、またはそれらのフラグメントであり、これらは、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３もしくはＭＡ−６１に特異的な活性または発現レベルを有する。
【００５８】
開示されるＭＵＲＦ１ポリペプチド配列、ＭＵＲＦ３ポリペプチド配列、またはＭＡＦＢＸポリペプチド配列の配列は、ＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸、またはＭＡＦＢＸ核酸から推定される。本発明の、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドは、単離されていても、純粋でも、および／または非天然でもよい。「単離された」ポリペプチドとは、それがその天然の状態で関連しているいくつかの物質をもはや伴わないポリペプチドであり、所定のサンプルの全てのポリペプチドの、好ましくは少なくとも約０．５重量％、より好ましくは約５重量％を構成する。「純粋な」ポリペプチドは、所定のサンプル中の全てのポリペプチドの少なくとも約９０重量％、好ましくは、少なくとも約９９重量％を構成する。目的のポリペプチドは、合成されても、組換え技術により産生されても、細胞から精製されてもよい。「非天然」のポリペプチドは、もはや天然の産物であると考えられないかもしれない程度に操作されたポリペプチドである。非天然のポリペプチドの１つの例は、当該分野において公知の組換え技術を介して作製されたポリペプチドである。広範な種々の分子生化学的方法は、目的の組成物の生化学的合成、分子発現および精製により入手可能である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）を参照のこと）。
【００５９】
本発明はまた、例えば、ＭＡ−６１のＦ−ボックスモチーフ、ＭＵＲＦ１もしくはＭＵＲＦ３の環状ドメイン、Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ遺伝子と共に結合されるＭＵＲＦ３分子の部分、そしてＭＡ−６１のＦｂｘ２５ホモロジードメイン、またはそれらの誘導体、フラグメントもしくはドメインのような、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、およびＭＡ−６１の機能性ドメインに対応するポリペプチドまたはペプチド、、それらの変異形態、短縮形態または欠失形態、それらの融合タンパク質ならびにスクリーニングのために上記のいずれかを組み込むかまたは産生する宿主細胞発現系、あるいはこれらの分子、筋肉萎縮症ならびに関連する疾患および障害と相互作用するかまたは改変する薬剤の使用を提供する。分子のスクリーニングは、当該分野において公知の任意の数の方法によって達成され得、この方法としては、免疫沈降、サイズフラクショネーション（ｓｉｚｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、ウェスタンブロット、およびゲル電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、スクリーニングの方法は、酵母ツーハイブリッドシステム、またはそれらの任意のバリエーションである。本発明は、低分子、高分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸および抗体をスクリーニングし得るインビトロおよびインビボでの試験の両方を含む。
【００６０】
ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸのポリペプチド、またはペプチドフラグメントの多数の適用が、これらの特性から提唱される。これらは、筋萎縮症、筋ジストロフィー、ユビキチン化、またはＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸ自体の発現もしくは活性を調節する分子、薬剤、および薬物の同定および研究に有用であり得る。これらは、筋萎縮症、筋ジストロフィー、またはユビキチン化のマーカーとして、および筋萎縮症、筋ジストロフィー、またはユビキチン化の予防もしくは軽減のためのマーカーとして有用であり得る。これらはまた、抗体の作製のためにも用いられ得る。
【００６１】
さらに、これらの開示されるポリペプチドおよび核酸は、筋萎縮、筋ジストロフィー、ＭＵＲＦ１経路、ＭＵＲＦ３経路、およびＭＡＦＢＸ経路、またはユビキチン化の阻害に有用であり得る。さらに、これらは、筋萎縮、筋ジストロフィー、増大されたユビキチン化に関連する状態の処置に有用であり得る。ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドは、増殖因子、サイトカインおよび／またはホルモンを用いて処置される状態に類似する状態の研究、処置または診断に有用であり得る。機能的に等価なＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物、およびＭＡＦＢＸ遺伝子産物は、欠失、付加、および／または置換を含み得る。そのような変化は、この遺伝子産物の機能的変化を全く生じなくてもよく、この遺伝子産物に変化を生じるようにこの遺伝子産物が、操作されてもよい。そのような遺伝子産物は、当該分野において公知の技術を介する組換え技術（例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換え）によって産生され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。さらに、そのような遺伝子産物をコードするＲＮＡは、当該分野において公知の技術を持ちいて化学合成され得る（例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、１９８４  Ｇａｉｔ、編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと）。
【００６２】
（抗体）
本発明はまた、本明細書中に記載されるＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドに対する抗体も提供し、この抗体は、例えば、診断適用におけるこのポリペプチドの検出に有用である。ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体の調製のために、培養における連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が、用いられ得る。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７）、およびトリオマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術）Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、ｉｎ  「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．ｐｐ７７〜９６）などは、本発明の範囲内にある。
【００６３】
診断的用途または治療的用途のためのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス（もしくは他の種）モノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当該分野において公知の多数の技術のいずれか（例えば、Ｔｅｎｇら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０８−７３１２；Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２−７９；Ｏｌｓｓｏｎら，１９８２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３−１６）によって作製され得る。ヒト定常領域と共にマウス抗原結合ドメインを含むキメラ抗体分子が、調製され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，Ｔａｋｅｄａら，１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２）。
【００６４】
当該分野において公知の種々の手順が、本明細書中に記載されるＭＵＲＦ１ポリペプチドに対するポリクローナル抗体、ＭＵＲＦ３ポリペプチドに対するポリクローナル抗体またはＭＡＦＢＸポリペプチドに対するポリクローナル抗体の生成のために使用され得る。抗体の生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない）が、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチドまたはＭＡＦＢＸポリペプチド、あるいはこれらのフラグメントまたは誘導体を注射することによって免疫化され得る。種々のアジュバントが、宿主の種に依存する免疫応答を増大するために使用され得、アジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、活面活性剤（例えば、リゾレチシン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ポリペプチド、油乳濁物、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール）および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
選択されたＭＵＲＦ１ポリペプチドエピトープ、ＭＵＲＦ３ポリペプチドエピトープまたはＭＡＦＢＸポリペプチドエピトープに対する抗体の分子クローンは、公知の技術によって調製され得る。組換えＤＮＡ方法論（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）が、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築するために使用され得る。
【００６６】
本発明は、抗体分子およびこのような抗体分子のフラグメントを提供する。この分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術によって作製され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂ’フラグメント、ならびにパパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することによって生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。抗体分子は、公知の技術によって精製され得、公知の技術としては、免疫吸着クロマトグラフィーもしくは免疫親和性クロマトグラフィー、クロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー））、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明はまた、単鎖Ｆｖを提供する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、軽鎖のＶ領域に合成ペプチドのストレッチによって連結された重鎖のＶ領域のみを有する、切断されたＦａｂである。例えば、本明細書中で参考として援用されるＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに譲渡された米国特許第５，５６５、３３２号；同第５、７３３、７４３号；同第５，８３７、２４２号；同第５，８５８，６５７号、および同第５，８７１，９０７号を参照のこと。
【００６８】
（アッセイ）
本発明のＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸およびＭＡＦＢＸ核酸、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチドおよびＭＡＦＢＸポリペプチド、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチドならびにＭＡＦＢＸポリペプチドに結合する抗体は、広い種々の使用を見出し、この使用としては、免疫原としての使用；スクリーニングアッセイにおける標的としての使用；および筋萎縮症またはユビキチン結合を調節、阻害、検出または測定するための生理活性剤としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。前述で列挙される分子は、任意の都合よい方法によって特定の細胞集団に導入され得るか、発現され得るか、または抑制され得、任意の都合よい方法としては、マイクロインジェクション、組換えタンパク質のプロモーター特異的発現または脂質ビヒクルを介する標的化送達が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
この発明の１つの局面は、ＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子およびＭＡＦＢＸ遺伝子およびＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物およびＭＡＦＢＸ遺伝子産物の、基質ならびにそのフラグメント、誘導体およびアナログをアッセイおよびスクリーニングするための方法を提供し、そしてＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子およびＭＡＦＢＸ遺伝子およびＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物およびＭＡＦＢＸ遺伝子産物と相互作用する因子を同定するための方法を提供する。本発明はまた、ＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子およびＭＡＦＢＸ遺伝子およびＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物およびＭＡＦＢＸ遺伝子産物とそれらの基質および／またはユビキチンリガーゼ複合体サブユニットとの相互作用を調節または阻害する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。本発明のスクリーニングアッセイはまた、ＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子およびＭＡＦＢＸ遺伝子、およびＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物およびＭＡＦＢＸ遺伝子産物の発現ならびに活性のモジュレーターを同定する高処理スクリーニングアッセイを含む。このようなアッセイは、ＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物またはＭＡＦＢＸ遺伝子産物のアゴニストまたはアンタゴニストを同定し得る。
【００７０】
本発明は、ＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子およびＭＡＦＢＸ遺伝子およびＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物およびＭＡＦＢＸ遺伝子産物と結合するかまたは直接相互作用する、因子の同定のためのスクリーニング方法を提供する。このようなスクリーニング方法論は、当該分野において周知である（例えば、１９９６年、１０月３１日に公開されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／３４０９９を参照のこと）。この因子は、内因性細胞成分および外因性細胞成分の両方を含む。これらのアッセイは、インビトロでか、または培養物におけるインタクトな細胞でか、または動物モデルにおいて実行され得る。
【００７１】
好ましい実施形態において、酵母ツーハイブリッド系が、ＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子、およびＭＡＦＢＸ遺伝子の基質、ならびにそのフラグメント、誘導体およびアナログを決定するため、ならびにＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物、およびＭＡＦＢＸ遺伝子産物と相互作用する因子を同定するために使用される（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５〜２４６および米国特許第５，２８３，１７３号）。この系は、レポーター遺伝子の発現の検出に基づき、このレポーター遺伝子の転写は、それぞれ転写レギュレーターの半分に融合する２つのタンパク質の相互作用による転写レギュレーターの再構成に依存する。ＭＵＲＦ１タンパク質、ＭＵＲＦ３タンパク質、およびＭＡＦＢＸタンパク質またはその誘導体および試験されるべきタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写調節ドメインとの融合タンパク質として発現される。
【００７２】
本発明は、ＭＵＲＦ１特異的結合因子、ＭＵＲＦ３特異的結合因子またはＭＡ−６１特異的結合因子、このような因子を同定および作製する方法、ならびに診断、治療および医薬の開発におけるその使用を提供する。ＭＵＲＦ１特異的結合因子、ＭＵＲＦ３特異的結合因子、またはＭＡ−６１特異的結合因子としては、ＭＵＲＦ１特異的抗体、ＭＵＲＦ３特異的抗体、またはＭＡ−６１特異的抗体が挙げられ、そしてまたアッセイ（例えば、１−ハイブリッドスクリーニング、２−ハイブリッドスクリーニング、および３−ハイブリッドスクリーニング）で同定される他の結合因子、および以下に記載されるような化学ライブラリーのスクリーニングにおいて同定される非天然の結合因子が挙げられる（例えば、抗体の製造および使用の考察について、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。特に目的の因子は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸのｍＲＮＡまたはポリペプチドの機能、活性または発現を調節する。
【００７３】
本発明は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸが調節可能な細胞機能またはＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸのｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルで活性な因子、化合物または因子のリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。一般に、これらのスクリーニング方法は、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチドまたはＭＡＦＢＸポリペプチドまたはＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸またはＭＡＦＢＸ核酸と天然のＭＵＲＦ１結合標的、ＭＵＲＦ３結合標的、またはＭＡＦＢＸ結合標的との相互作用を調節する化合物についてアッセイする工程、あるいはＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現を調節する化合物についてアッセイする工程を包含する。発現を調節する結合因子または因子についての広範な種々のアッセイが提供され、このアッセイとしては、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、イムノアッセイ、または細胞に基づくアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい方法は、リード化合物についての化学ライブラリーの自動化され、費用効率の良い高処理スクリーニングにされ易い。
【００７４】
インビトロ結合アッセイは、別のペプチドまたはポリペプチド（例えば、検出またはアンカーのためのタグ）との融合産物の一部であり得る、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドを含む成分の混合物を用いる。このアッセイ混合物は、天然のＭＵＲＦ１結合標的またはＭＡＦＢＸ結合標的を含む。天然の結合標的が使用され得る一方で、その一部が、アッセイにおいて都合よく測定可能な対象のＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸに対する結合親和性および結合力を提供する限り、その一部を使用することが頻繁に好まれる。このアッセイ混合物はまた、候補の薬理学的因子を含む。候補因子は、多数の化学的クラスを含むが、代表的にこれらは、有機的化合物であり、好ましくは小さい有機化合物であり、そして合成化合物ライブラリーまたは天然化合物ライブラリーを含む広範な種々の供給源から得られる。種々の他の試薬（例えば、塩、緩衝液、天然タンパク質（例えば、アルブミン）、洗剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、または抗菌剤）もまた、含まれ得る。この混合成分は、必須の結合を提供する、任意の順序で添加され得、そしてインキュベーションが、最適の結合を促進する任意の温度で実行され得る。この混合物は、候補の薬理学的因子の存在下でなければ、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドが、参照の結合親和性で結合標的、部分またはアナログと特異的に結合する条件下でインキュベートされる。インキュベーション期間は、最適の結合について選択されるが、しかしまた迅速な高処理スクリーニングを容易にするために最短化される。
【００７５】
インキュベーション後、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドと１つ以上の結合標的との間のその因子に基づく結合とは、任意の都合よい方法によって検出される。無細胞結合型アッセイについて、分離工程が、しばしば結合していない成分から結合成分を分離するために使用される。分離は、多数の方法によってもたらされ得、この方法としては、沈殿または固定化に続く、例えば、膜ろ過、またはゲルクロマトグラフィーによる洗浄が挙げられるが、これに限定されない。無細胞結合アッセイについて、成分の１つは、通常標識を含むか、または標識に結合される。この標識は、放射活性、蛍光、光学密度または電子密度のような直接的検出、あるいはエピトープタグまたは酵素のような間接的検出を提供し得る。種々の方法が、標識および他のアッセイ成分の性質に依存する標識の検出のために使用され得、この方法としては、光学密度または電子密度、放射活性放射、非放射活性エネルギー転移を介するか、または非制限的な例として抗体結合体を用いる間接的な検出が挙げられるが、これらに限定されない。因子の存在下での結合親和性と比較した因子の非存在下での標的に対するＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドの結合親和性における差異は、この因子が、対応する結合標的に対するＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチドまたはＭＡＦＢＸポリペプチドの結合を調節することを示す。本明細書中で使用される場合、差異は、統計学的に有意であり、そして好ましくは、少なくとも５０％の差異、より好ましくは少なくとも９０％の差異を表す。
【００７６】
本発明はさらに、筋萎縮症と関連する疾患または障害の処置において有用な因子についてスクリーニングするための方法を提供し、それぞれ図７、９、１７、１１、１３、１９、および２２のアミノ酸配列、またはそのフラグメントを発現する細胞とその基質とＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸを有する化合物とを接触させる工程、ならびにＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物またはＭＡＦＢＸ遺伝子産物のいずれかの活性における変化を検出する工程を包含する。活性におけるこのような変化は、１つ以上のタンパク質（例えば、それらの基質またはユビキチン経路の成分の１つ）とＭＵＲＦ１遺伝子産物、ＭＵＲＦ３遺伝子産物、またはＭＡＦＢＸ遺伝子産物との相互作用における変化においてか、または基質のユビキチン結合または分解における変化によって明白になり得る。
【００７７】
ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡ−６１の比活性、機能または発現は、都合のよいインビトロアッセイ、細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイによって決定され得る。インビトロアッセイまたは細胞に基づくアッセイとしては、結合アッセイおよび細胞培養アッセイおよびユビキチン結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。インビボアッセイとしては、免疫応答、遺伝子治療およびトランスジェニック動物および萎縮症に羅患した動物が挙げられるが、これらに限定されない。結合アッセイは、ＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、またはＭＡＦＢＸポリペプチドと結合標的との特異的分子相互作用が評価されるか、または、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸのｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルまたは活性が、評価されるか、または基質の結合もしくはユビキチン結合が評価される、任意のアッセイを含む。この結合標的は、例えば、リン酸化タンパク質、特異的免疫ポリペプチド（例えば、抗体）、またはＭＵＲＦ１核酸特異的結合因子、ＭＵＲＦ３核酸特異的結合因子もしくはＭＡ−６１核酸特異的結合因子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）であり得る。ＭＵＲＦ１核酸、ＭＵＲＦ３核酸、およびＭＡＦＢＸ核酸およびＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチド、およびＭＡＦＢＸポリペプチドについての潜在的な結合標的としては、ＳＣＦ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体およびジストロフィンタンパク質複合体の他の公知のメンバーが挙げられる。例えば、他のＦ−ｂｏｘ含有タンパク質が、Ｃｕｌｌｉｎ−１と呼ばれるタンパク質、またはＣｕｌｌｉｎファミリーのファミリーメンバー（例えば、Ｃｕｌｌｉｎ−２、Ｃｕｌｌｉｎ−３、Ｃｕｌｌｉｎ−４ａ、Ｃｕｌｌｉｎ−４ｂ、またはＣｕｌｌｉｎ−５）に結合することが公知である（Ｌｉｓｚｔｗａｎ  Ｊ，Ｍａｒｔｉ  Ａ，Ｓｕｔｔｅｒｌｕｔｙ  Ｈ，Ｇｓｔａｉｇｅｒ  Ｍ，およびＷｉｒｂｅｌａｕｅｒ  Ｃ，Ｋｒｅｋ  Ｗ，１９９８  ＥＭＢＯ  １７（２）：３６８〜８３；Ｌｙａｐｉｎａ  ＳＡ，Ｃｏｒｒｅｌｌ  ＣＣ，Ｋｉｐｒｅｏｓ  ＥＴ，Ｄｅｓｈａｉｅｓ  ＲＪ．，１９９８  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（１３）：７４５１〜６）。それ故、１つの潜在的アッセイは、試験化合物が、Ｃｕｌｌｉｎファミリーメンバーに対するＭＡＦＢＸの結合を破壊し得るか否かを観察することである。また、ＳＣＦ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の１部であるＦ−ｂｏｘタンパク質は、Ｓｋｐ−１またはＳｋｐ−１ファミリーメンバーに結合することが公知である（Ｓｋｏｗｙｒａら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ９１：２０９〜２１９）。それ故、潜在的アッセイが、試験化合物が、Ｓｋｐ−１またはＳｋｐ−１ファミリーメンバーに対するＭＡＦＢＸの結合を破壊し得る場合、決定され得る。さらに、ＳＣＦ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の１部であるＦ−ｂｏｘタンパク質は、リン酸化基質に結合し、これは次いでユビキチン結合される（Ｓｋｏｗｙｒａら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ９１：２０９〜２１９）。そのため、本発明の特徴的実施形態において、潜在的なアッセイが、試験化合物が、リン酸化基質に対するＭＡＦＢＸタンパク質の結合を破壊し得る場合、決��されるか、または試験化合物が、リン酸化基質のＭＡ−６１媒介ユビキチン結合を減少し得る場合、決定される。
【００７８】
ＭＵＲＦ３タンパク質が、ジストロフィン複合体のメンバーと結合するという知見は、ＭＵＲＦ３タンパク質またはＭＵＲＦ３核酸の阻害が、その複合体を安定化し得、従って、筋ジストロフィー、およびジストロフィン複合体がユビキチン媒介性分解に供される他の状態の処置を助け得ることを示唆する。従って、本発明の別の実施形態は、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３もしくはＭＡ−６１またはこの経路に関する他の分子、ならびにＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３もしくはＭＡＦＢＸ経路の阻害または筋ジストロフィーおよび神経筋接合部における欠損と関連する症状、状態および疾患の処置における特にそのインヒビターの使用である。
【００７９】
ＭＵＲＦ１  ｃＤＮＡ、ＭＵＲＦ３  ｃＤＮＡ、またはＭＡＦＢＸ  ｃＤＮＡ、あるいはＭＵＲＦ１ポリペプチド、ＭＵＲＦ３ポリペプチドまたはＭＡＦＢＸポリペプチドを認識する抗体は、診断の手段として（例えば、そのオリゴヌクレオチドプライマーに類似性を有する配列を増幅する試験におけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用、およびＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸのｍＲＮＡが、正常および異常（例えば、萎縮症の状態）下で特定の組織またはサンプル中にどの程度存在するかを見出すＰＣＲ試験におけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用を介して）か、または抗体を用いる免疫染色、もしくは抗体を用いるＥＬＩＳＡ試験によるＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸタンパク質の上方制御の測定を介して有用であり得る。ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３、またはＭＡＦＢＸの単離は、これらの分子と相互作用するか、またはこれらの分子もしくはその経路の発現もしくは活性を変更する因子について、その特性を研究する手がかり、およびこの因子についてのアッセイを設計する手がかりを提供する。ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸの単離はまた、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸの発現または活性が中断される状態についての処置を開発する手がかりを提供する。
【００８０】
本発明はまた、患者サンプル中のＭＵＲＦ１遺伝子、ＭＵＲＦ３遺伝子またはＭＡＦＢＸ遺伝子の発現を測定する工程を包含する、筋萎縮に関連する疾患または障害を診断する方法を提供する。例えば、本発明は、哺乳動物における筋萎縮を検出するための方法を包含し、本方法は、以下、ａ）造影剤に結合されたＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸ核酸またはポリペプチドを検出し得る分子を含む組成物を、哺乳動物に投与する工程；ｂ）この組成物を筋内に蓄積させる工程；およびｃ）筋萎縮を画像化するために、蓄積された組成物を検出する工程、を包含する。さらに、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸ核酸またはポリペプチドは、被験体から取得されたｍＲＮＡまたはタンパク質を使用して、および標準的方法論（例えば、ＰＣＲＴ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析、Ｗｅｓｔｅｒｎ分析、ＥＬＩＳＡまたは免疫染色）を使用して、検出され得る。
【００８１】
検出における使用のためのＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸ核酸またはポリペプチドに結合され得る適切な造影剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で有用な薬剤（例えば、ガドリニウムキレート（例えば、Ｌａｄｄ，ＤＬら、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０：３６１〜３７０を参照のこと）、共有結合非イオン性、大環状、多量体ランタニドキレート（例えば、Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，ＲＳら、１９９８、Ｉｎｖｅｔ  Ｒａｄｉｏｌ  ３３：７７９〜７９７を参照のこと）、およびモノクローナル抗体コート化マグネタイト粒子（Ｔｏ，ＳＹら、１９９２、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｓｅｒ  Ｍｅｄ  Ｓｕｒｇ  １０：１５９〜１６９を参照のこと）。ＭＲＩの基本原理に関する総覧としては、Ｋｉｒｓｃｈ，ＪＥ、１９９１、Ｔｏｐ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ３：１〜１８およびＷａｌｌｉｓ，ＦおよびＧｉｌｂｅｒｔ，ＦＪ、１９９９、Ｊ  Ｒ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ  Ｅｄｉｎｂ  ４４：１１７〜１２５を参照のこと。放射性ヌクレオチドもまた、核医学技術（例えば、陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）、単一陽子射出断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）およびコンピューター断層撮影（ＣＡＴ）スキャン）における使用に適した造影剤である。非限定的な例として、このような薬剤としては、テクネチウム９９ｍ、クエン酸ガリウム６７、ヨウ素１２３およびインジウム１１１が挙げられる（Ｃｏｌｅｍａｎ，ＲＥ、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ  ６７：１２６１〜１２７０を参照のこと）。造影剤として適切な他の放射性ヌクレオチドとしては、１２３Ｉおよび１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡが挙げられる（Ｋａｌｔｓａｓ，ＧＡら、１９９８、Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｏｘｆ）４９：６８５〜６８９を参照のこと）、放射標識化抗体（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＤＭおよびＮａｂｉ，ＨＡ、１９９９、Ｓｅｍｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２９：４１〜４８、およびＳｔｅｆｆｅｎｓ，ＭＧら、１９９９，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４０：８２９〜８３６を参照のこと）が挙げられる。放射性核医薬技術の基本原理に関する総覧としては、Ｓｃｈｉｅｐｅｒｓ，Ｃ．およびＨｏｈ，ＣＫ，１９９８、Ｅｕｒ  Ｒａｄｉｏｌ  ８：１４８１〜１４９４、およびＦｅｒｒａｎｄ，ＳＫら、１９９９，Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ  ８：１８５〜２０４を参照のこと。例えば、放射ヌクレオチドまたはキレートを含む任意の造影剤が、利用され得る。
【００８２】
開示された方法は、インビボまたはインビトロで適用可能であり得、そして、この細胞としては、例えば、培養化筋細胞、筋芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、分化筋芽細胞または筋管が挙げられ得る。
【００８３】
本発明はまた、動物における筋萎縮に関する疾患または障害を処置する方法を提供し、本方法は、この動物に、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸ遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調節する化合物を投与し、その結果、このような疾患または障害の症状が緩和される工程を包含する。
【００８４】
（本明細書中で記載される本発明の使用のための他のアッセイおよび方法の詳細な説明として、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／１２６７９号（２０００年３月９日公開）（本明細書中にその全体が参考として援用される）もまた参照のこと）。
【００８５】
本発明はまた、ＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３およびＭＡ−６１の機能的ドメイン（例えば、ＭＡ−６１のＦ−ボックスモチーフ、ＭＵＲＦ１またはＭＵＲＦ３の環状ドメイン、Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ遺伝子に同時結合するＭＵＲＦ３分子、およびＭＡ−６１のＦｂｘ２５相同ドメイン、またはその誘導体、フラグメントもしくはドメイン、その変異形態、短縮形態もしくは欠損形態、その融合タンパク質）に一致するＭＵＲＦ１、ＭＵＲＦ３またはＭＡＦＢＸポリペプチドまたはペプチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞および動物、ならびに上述のいずれかを組み込むかまたは生成する宿主発現系、ならびにこれらを阻害するか、または「ノックアウト」発現するように遺伝子操作された宿主細胞および動物に関する。いずれかの種の動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヤギ、ヒツジおよび非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限定されない）は、トランスジェニック動物およびその子孫を生成するために使用され得、ここで、「トランスジェニック」は、別の供給源（例えば、別の種）由来の遺伝子配列を発現すること、ならびに内因性ＭＵＲＦ１配列、ＭＵＲＦ３配列またはＭＡＦＢＸ配列を過剰発現すること、または内因性遺伝子配列の非発現（ノックアウト）を意味する。当該分野で公知の任意の技術を使用して、ＭＵＲＦ１導入遺伝子またはＭＡＦＢＸ導入遺伝子を動物に導入し、トランスジェニック動物の創始株を生成し得、この技術は以下を含む：前核注入（ＨｏｐｐｅおよびＷａｇｎｅｒ、１９８９、米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８２、６１４８〜６１５２）；胚幹細胞における遺伝子の標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９、Ｃｅｌｌ  ５６、３１３〜３２１）；エレクトロポレーションまたは胚（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３，１８０３〜１８１４）；および精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、１９８９、Ｃｅｌｌ  ５７、７１７〜７２３）。さらに、任意の技術は、ＭＵＲＦ１導入遺伝子、ＭＵＲＦ３導入遺伝子またはＭＡＦＢＸ導入遺伝子を含むトランスジェニック動物クローンを生成するために使用され得る（例えば、休止状態に誘導された培養化胚細胞、胎児細胞または成人細胞由来の核の除核された卵母細胞への核の移入）（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０、６４〜６６；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５、８１０〜８１３）。本発明は、全細胞、ならびにいくつかの細胞のみ（例えば、特定の細胞型）に導入遺伝子を有する動物を提供する。
【００８６】
本発明の核酸、ポリペプチド、ならびに本発明の作製方法および使用方法を記載する前に、本発明は、記載された特定の分子または方法のみに限定されないということは理解される。この分子および方法は変化し得、そして、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的である。この用語および定義は、保護の範囲は最終的に特許請求の範囲に依存するので、限定であることが意図されない。
【００８７】
（実施例）
（実施例１：萎縮についての動物モデル）
骨格筋は、全筋質量の損失、およびその結果としての個体の筋繊維の大きさの減少に関する萎縮、プロセスを起こすことによって、活性および負荷を減少させるように適応される。Ｒ．Ｔ．Ｊａｇｏｅ，Ａ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ  ４、１８３（２００１）。筋萎縮は、脱神経、損傷関節固定、減量または寝たきり、グルココルチコイド処置、炎症性疾患（例えば、セプシス、癌および老化）の結果として生じる（Ｃ．Ｒｏｍｍｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，１００９（２００１））。
【００８８】
筋萎縮を試験するために、げっ歯類（マウスまたはラット）の足関節を、９０°の屈曲で固定化した。この手順は、足関節（例えば、ヒラメ筋、内部腓腹筋内側頭および側方腓腹筋内側頭、前脛骨筋）で作用する筋肉の萎縮を、様々な程度まで誘導する。再現性のある量の萎縮を、１４日間にわたって後肢筋肉において測定し得る。
【００８９】
固定手順は、ギプス包帯することか（マウス）または足関節を固定すること（ラット）のいずれかに関し得る。げっ歯類に、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、そして、右足関節を固定化する。ラットにおいては、足軸に沿って、かかと領域までわたって、０．５ｃｍ切開する。次いで、ネジ（１．２×８ｍｍ）を、石灰および尾部を介して、脛骨幹に挿入する。創傷は、皮膚膠に近い。マウスにおいて、関節の周りに軽量ギプス包帯物質（ＶＥＴ−ＬＩＴＥ）用いて、足関節を９０°に固定する。この物質を、水中に浸し、次いで、足の周りを包む。この物質は乾燥した場合、強固であるが、軽量である。
【００９０】
固定化の７日後および１４日後に、動物に麻酔をかけ、そして、脛部脱臼によって屠殺する。前脛骨筋（ＴＡ）、内側腓腹筋（ＭＧ）、およびヒラメ筋（Ｓｏｌ）を、右後肢（固定化）および左後肢（インタクト）から収集し、重量を測定し、そして、液体窒素冷却化イソペンタン中、固定長で凍結する。実験動物と同一の体重および年齢であるコントロール動物の一群をまた屠殺し、そして、筋肉を収集し、重量を測定し、そして凍結する。萎縮量を、固定化した足由来の筋肉の重量と、コントロール動物由来の筋肉の重量を比較することによって、評価する。萎縮のさらなる評価を、筋線維の大きさおよび筋肉緊張力を測定することで行なう。
【００９１】
ラットにおける脱神経、固定化（関節固定による）、および非過重（ｕｎｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）化（後肢の懸吊化による）は全て、類似の内側腓腹筋質量の減少速度を生じ（図１Ａ）、萎縮を誘導する共通の機構があるという見解と少なくとも一致する結果を生じる。萎縮の普遍マーカーが存在するか否かを決定するために、本発明者らは、最初に、固定化および脱神経での遺伝子発現と、萎縮の間に変化するような、文献から選択された一組の筋肉特異的遺伝子を比較した。さらに、本発明者らは、これらの２つのモデルの間の遺伝子発現パターンが驚くほど類似している事を発見した（図１Ｂ、中央のパネルに対して左のパネルを比較する）。しかし、非過重モデル（後肢懸吊）を分析した場合、選択された遺伝子のいずれも、固定化および脱神経と類似の調節をされておらず、これは、これらの遺伝子が萎縮プロセスのための「普遍」マーカーでないことを示した（図１Ｂ）。萎縮の潜在的普遍マーカーを同定するために、本発明者らは、最初に、１つの特定のモデル（固定化）で調節される遺伝子の同定を試み、そして、これらの遺伝子がもしあれば、複数の他のモデルにおいても同様に調節されるか否かを決定した（図１Ｃ）。
【００９２】
本発明者らは、３つの萎縮モデル（固定化、脱神経および後肢懸吊）に関するラットの筋肉由来のＲＮＡを用いてノーザンブロットを実施した。ノーザンブロットは、ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＣＫ）、ｍｙｏＤ、ｍｙｏｇｅｎｉｎおよびＭｙｆ５の発現に対する萎縮の効果を示す。筋肉を、時間経過（示すような０日、１日、３日、７日、１０日または１４日のいずれか）とともに、ラットから取得した。各レーンについて、全ＲＮＡを、３つのラット内側腓腹筋（ＭＧ）からプールした（図２４）。
【００９３】
本発明者らはまた、ＭｕＲＦ１のイムノブロットを実施し、これは、ＭｕＲＦ１タンパク質が足関節固定誘導化萎縮（Ｉｍｍ）後にアップレギュレートされることを実証した。図２５Ａにおいて、レーン１は、ＣＯＳ細胞中で発現された組換えラットＭｕＲＦ１のコントロール（登録番号ＡＹ０５９６２７号）である。溶解物をこれらの細胞から作製し、その結果、ＭｕＲＦ１の予想サイズを確立し得た。レーン２〜７について、タンパク質溶解物を、非処置ラット（ＣＯＮ）、固定化後１日目のラット（Ｉｍｍ１）および３日目のラット（Ｉｍｍ３）から選ばれた３つの腓腹筋からプールした。イムノブロットを、全長ラットＭｕＲＦ１に対して産生した抗体を使用して示す。ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＭＡＦｂｘまたはＧＳＴ−ＭＡＦｂｘＤＦｂ（ＭＡＦｂｘアミノ酸２１６〜２６３のＦ−ボックス欠損）をコードする哺乳動物発現ベクターを、Ｃｏｓ７細胞へ一過的にトランスフェクトし、そして、１％のＮＰ４０、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、２５ｍＭのβグリセロホスフェート、１００ｎＭのオカダ酸、２０ｎＭのミクロシスチンＬＲおよび５ｍＭのＮ−エチルマレイミドを含む冷リン酸緩衝化生理食塩水中で、４８時間後にこの細胞を溶解した。３０μｌのグルタチオン−アガロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を浄化溶解物（５００ｍｇ）に添加し、そして、４℃で３時間回転した。ビーズを、溶解緩衝液を用いて遠心分離することで３回洗浄し、還元ＳＤＳサンプル緩衝液中で煮沸し、そして、抗Ｓｋｐ１（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｎｏ  Ｌａｂｓ）および抗Ｃｕｌｌｉｎ１（Ｚｙｍｅｄ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／イムノブロット分析に供した。筋肉溶解物（１ｍｇ）を免疫沈降し、そして、固定化ＧＳＴで予備吸収されたＧＴＳ−ＭｕＲＦ１に対して産生された抗血清を用いてイムノブロットした。
【００９４】
マウスｍｙｏＤに対するノーザンプローブはコード配列の５７１ｂｐ〜９３８ｂｐ部位にわたり；マウスｍｙｏｇｅｎｉｎに対するプローブはコード配列の４２３ｂｐ〜８６１ｂｐにわたり、マウスＭｙｆ５に対するプローブは、コード配列の４０６ｂｐ〜７４５ｂｐにわたる。コード配列の２４ｂｐ〜６１２ｂｐにわたるラットＭｕＲＦ１に対するノーザンプローブをＰＣＲによって作成した。マウスＭｕＲＦ２について、プローブを、５’ＰＣＲオリゴ：ＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＴＧＴＣおよび３’ＰＣＲオリゴ：ＣＣＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧ（これは、マウスＭｕＲＦ２の第５番目のエキソン部位にわたる）を使用して作製した。マウスＭｕＲＦ３について、プローブは、８６７ｂｐ〜１１０１ｂｐにわたった。ラットＭＡＦｂｘについて、プローブをＰＣＲによって作製し、そして、コード配列の２１ｂｐ〜５６３ｂｐにわたった。ヒトＭＡＦｂｘについて、プローブは、２０５ｂｐ〜５８５ｂｐにわたった。ＭＡＦｂｘ＋／＋マウス、ＭＡＦｂｘ＋／−マウスおよびＭＡＦｂｘ−／−マウスのｍＲＮＡのノーザンを、６６０ｂｐ〜８４０ｂｐにわたるコード配列を用いてプローブした。ロードした全ＲＮＡの量について制御するために、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、そして撮影し、リボソームＲＮＡバンドを評価した。５’末端のＭＡＦｂｘ対立遺伝子の欠損を確認するサザンを、マウスＭＡＦｂｘゲノムプローブを用いて実施し、これは、ＡＴＧの上流および示されるＥｃｏＲＩ部位の下流の１．１ｋｂ  ＳａｃＩＩフラグメントにわたる。ＭｕＲＦ１＋／＋マウス、ＭｕＲＦ１＋／−マウス、ＭｕＲＦ１−／−マウス由来のｍＲＮＡのノーザンを、１ｂｐ〜５００ｂｐのラットＭｕＲＦ１（登録ＡＹ０５９６２７）にわたるコード配列を用いてプローブした。５’末端のＭｕＲＦ１対立遺伝子の欠損を確認するサザンを、マウスＭｕＲＦ１ゲノムプローブを用いて実施し、これは、ＡＴＧの上流および示すＥｃｏＲＩ部位の下流の０．５ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントにわたる。
【００９５】
（実施例２：ラットＭＵＲＦ１遺伝子、筋肉特異的環ドメイン遺伝子のクローニング）
この実験を、骨格筋萎縮条件の間に、遺伝子が差示的に発現されることを決定する目的で、実施した。ディファレンシャルディスプレイ分析は、７４の転写産物を生じ、これらの転写産物を、ＭＡ１−ＭＡ７４（筋萎縮（Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｔｒｏｐｈｙ）について「ＭＡ」）と標識した。元来の転写産物および続くＲＡＣＥｄ  ｃＤＮＡに対するバイオインフォマティック分析によって、６１の転写産物の決定が可能となった。転写解析を、ＧｅｎｅｔａｇＴＭ法（Ｌ．Ｙ．Ｗｏｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８，７７６（２０００））を使用して実施した（図２３）。
【００９６】
前出の実施例１において概説したように、ラットを、萎縮を誘導する（ａｔｒｏｐｈｙ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）モデルの対象とした。手術３日後、筋肉組織を、外科的に処置した動物から収集した。コントロールとして、筋肉組織をまた、未処置の動物から収集した。メッセンジャーＲＮＡを、萎縮した筋肉組織およびコントロールの筋肉組織から単離し、そしてディファレンシャルディスプレイアッセイの対象とした。３’のＭＵＲＦ１転写物の未翻訳部分を含有する遺伝子転写物の１つは、萎縮の間にアップレギュレーションされることを見出した。この３’フラグメントを、ＤＮＡプローブを作製するために使用し、このＤＮＡプローブを、ＭＵＲＦ１のコード配列を含有する全長遺伝子をクローン化するために使用した。ｒＭＵＲＦ１  ＶＲＶスプライス形態（ｓｐｌｉｃｅ  ｆｏｒｍ）と命名されるより小さな代替的なスプライス形態もまた同定された。この代替的な形態は、３’末端で全長の形態と異なり、全長の形態は、より長い１５２アミノ酸を有する。この代替的なスプライス形態は、そのカルボキシ末端にアミノ酸配列「ＶＲＶ」を有し、この「ＶＲＶ」は、ＰＤＺ相互作用ドメインである（Ｔｏｒｒｅｓ  Ｒ，Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  ＢＬ，Ｄｏｎｇ  Ｈ，Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  Ｊ，Ｏｌｓｏｎ  ＥＮ，Ｈｕｇａｎｉｒ  ＲＬ，Ｂｒｅｄｔ  ＤＳ，Ｇａｌｅ  ＮＷ，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ＧＤ（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ：１４５３−６３）。ＰＤＺ相互作用ドメインの存在は、このタンパク質がタンパク質−タンパク質相互作用に関与し得ることを予測させる。対照的に、全長の形態は、他のタンパク質相互作用ドメイン、例えば、アミノ酸配列「ＤＥＥＥＥＦＴＥＥＥＥＥＥＤＱＥＥ」を含有する酸性ドメインを有する。このドメインの存在は、この形態もまた他のタンパク質と相互作用し得ることを予測させる。全長ｒＭＵＲＦ１についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ以下の図６および図７に添える。ｒＭＵＲＦ１  ＶＲＶスプライス形態についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ以下の図１６および図１７に添える。
【００９７】
（実施例３：ヒトＭＵＲＦ３遺伝子、筋肉特異的リング（ｒｉｎｇ）ドメイン遺伝子のクローニング）
ラットＭＵＲＦ１コード配列を、標準的な分子生物学的技術によって、ヒトＭＵＲＦ３を単離するために使用した。このコード配列は、既に、１９９９年１２月１０日に特許寄託記号（Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）＃ＰＴＡ−１０４９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｔ３／Ｔ７ベクターのヒトＭＡ１６  Ｃ８として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託されている。ｈＭＵＲＦ３についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ以下の図８Ａ〜８Ｃおよび図９に添える。ヒトＭＵＲＦ１を、標準的な技術によって、ラットＭＵＲＦ１にハイブリダイズさせるために使用した。
【００９８】
（実施例４：ラットＭＡ−６１、筋肉特異的Ｆ−ボックス遺伝子のクローニング）
この実験を、骨格筋萎縮の条件の間、どの遺伝子が差示的に発現されるかを決定するという目的で実施した。このような遺伝子を発見するために、前出の実施例１において概説したように、ラットを、萎縮を誘導するモデルの対象とした。手術３日後、筋肉組織を、外科的に処置した動物から収集した。コントロールとして、筋肉組織をまた、未処置の動物から収集した。メッセンジャーＲＮＡを、萎縮した筋肉組織およびコントロールの筋肉組織から単離し、そしてディファレンシャルディスプレイアッセイの対象とした。３’のＭＡＦＢＸ転写物の未翻訳部分を含有する遺伝子転写物の１つは、萎縮の間にアップレギュレーションされることを見出した。この３’フラグメントを、ＤＮＡプローブを作製するために使用し、このＤＮＡプローブを、標準的な分子生物学的技術によって、ＭＡ−６１のコード配列を含有する全長遺伝子をクローン化するために使用した。ｒＭＡＦＢＸについてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ以下の図１０および図１１に添える。
【００９９】
（実施例５：ヒトＭＡＦＢＸ遺伝子、筋肉特異的Ｆ−ボックス遺伝子のクローニング）
ラットＭＡＦＢＸコード配列を、標準的な分子生物学的技術によって、ＭＡＦＢＸＤ１８のヒトホモログを単離するために使用した。この遺伝子の２つの代替的な形態を同定し、ｈＭＡＦＢＸＤ１８およびｈＭＡＦＢＸＫ８と命名した。この遺伝子のＤ１８形態は、タンパク質をコードし、このタンパク質は、Ｋ８形態よりもカルボキシ末端で１１個のアミノ酸だけより長い。この遺伝子が２つの形態を有することの有意性は未知である。しかし、代替的なスプライス形態が、タンパク質−タンパク質相互作用の調節に貢献することは頻繁な事例である。これらのコード配列は、既に、特許寄託記号＃ＰＴＡ−１０４８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｔ３／Ｔ７ベクターのヒトＭＡＦＢＸＫ８および特許寄託記号＃ＰＴＡ−１０５０、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｔ３／Ｔ７ベクターのヒトＭＡＦＢＸＤ１８として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））に寄託されている。ｈＭＡＦＢＸＫ８についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ以下の図１２および図１３に添える。ｈＭＡＦＢＸＤ１８についてのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ以下の図１８、および図１９に添える。
【０１００】
ラットおよびヒトのＭＡＦｂｘタンパク質、およびヒトＦｂｘ２５の配列を、整列させた（Ｃ．Ｃｅｎｃｉａｒｅｌｌｉら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９，１１７７（１９９９））。公開された部分的なＦｂｘ２５配列は、ＭＡＦｂｘのアミノ酸８５に示されるロイシン（Ｌ）で始まる。Ｆ−ボックスの周囲の領域を、２連の核局在化シグナルと同じように示す（図２６）。ラットおよびヒトのＭＡＦｂｘの登録（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号は、それぞれＡＹ０５９６２８およびＡＹ０５９６２９である。
【０１０１】
（実施例６：ＭＵＲＦ１およびＭＡＦＢＸが筋肉萎縮に対する普遍的なマーカーであることの証明）
ノザンブロット分析によって、ＭＵＲＦ１およびＭＡＦＢＸが、固定化に誘導される筋肉萎縮の間、両方ともにアップレギュレーションされることを確認した後、他のモデルの筋肉萎縮を試験した。筋肉は、筋肉への神経が分断される脱神経；筋肉負荷を減少させるために肢が物理的に吊られる後肢懸吊；糖質コルチコイド薬物デキサメタゾンを用いる処置を含む、種々のストレス下で萎縮を生じ得る。これらの萎縮性条件のそれぞれの対象とされた筋肉組織から得られたｍＲＮＡのノザン分析は、ＭＵＲＦ１およびＭＡＦＢＸが、試験した萎縮のモデルの全てにおいてアップレギュレーションされることを示した。従って、ＭＵＲＦ１およびＭＡＦＢＸの転写性のアップレギュレーションは、筋肉萎縮についての臨床的指標として貢献し得る。
【０１０２】
本発明者らは、初めて、ＧｅｎｅＴａｇＴＭディファレンシャルディスプレイアプローチによって、３日間固定化したラット骨格筋（内側の腓腹筋）由来のｍＲＮＡをコントロールの筋肉由来のｍＲＮＡと比較した。本発明者らは、マーカーと同様に、萎縮過程の潜在的なトリガーとして機能し得る遺伝子を同定するために、より長い時点（例えば、１４日）とは対照的に、比較的初期の時点（３日）での分析を選択した。発現が３倍またはそれよりも高く変化した遺伝子のみを、差示的に調節されるとして受容した。次いで、受容可能な転写物を、１〜１４日の期間、脱神経、固定化または無負荷（ｕｎｗｅｉｇｈｔ）の対象にした筋肉から調製されたｍＲＮＡのパネルを使用するノザン分析によって「普遍性」についてアッセイした。経過観察として、糖質コルチコイドまたはＩＬ−１を用いる全身性処置に続いて、萎縮した筋肉由来のｍＲＮＡをまた分析した。最終的に、肥大を生じている筋肉から調製されたｍＲＮＡのパネルを、これらの遺伝子が、萎縮の間に調節されるかを観察するために試験し、肥大の間に反対方向に調節した。
【０１０３】
実施されるようなディファレンシャルディスプレイ技術の不都合の１つは、結果として得られたｃＤＮＡが、しばしば、３’未翻訳配列に制限され、そして７５塩基対の平均長であることであった。従って、十分な配列を入手して遺伝子同定を行うために、引き続くＰＣＲベースの３’および５’のＲＡＣＥ分析を実施することが頻繁に必要であった。ディファレンシャルディスプレイ分析は７４個の転写物を生じ、この転写物をＭＡ１〜ＭＡ７４（筋肉萎縮の「ＭＡ」）と標識した。初代の転写物および引き続くＲＡＣＥｄ  ｃＤＮＡに関するバイオインフォマティクス分析は、６１個の転写物での決定を可能にした（図２３）。
【０１０４】
遺伝子のいくつかの主要なクラスは、関節の固定化に誘導される筋肉萎縮に引き続いて調節された。「エネルギー利用経路」に関わる遺伝子は、ダウンレギュレーションされる遺伝子の最大のクラスを構成し、そして乳酸デヒドロゲナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、およびフルクトース１，６二リン酸を含む。これらの経路のダウンレギュレーションは、エネルギー経路が、持久力運動の場合に観察されているように転写的に調節され得ることを示す（Ｋ．Ｂａａｒ，Ｅ．Ｂｌｏｕｇｈ，Ｂ．Ｄｉｎｅｅｎ，Ｋ．Ｅｓｓｅｒ，Ｅｘｅｒｃ  Ｓｐｏｒｔ  Ｓｃｉ  Ｒｅｖ  ２７，３３３−３７９（１９９９））。最大のクラスのアップレギュレーションされた遺伝子は、２６ｓプロテアソーム調節性サブユニットｐ３１、ポリユビキチン、プロテアソームアクチベーターサブユニットｐａ２８β、および以下に議論される２つの新規なユビキチンリガーゼを含む、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ）およびプロテアソーム経路に関する遺伝子であった。標的タンパク質へのユビキチンの添加およびプロテアソームによるそれらの引き続くタンパク質分解を介して、ＡＴＰ依存性のタンパク質分解は、筋肉萎縮の間増加されることが既に示されているが（Ｒ．Ｍｅｄｉｎａ，Ｓ．Ｓ．Ｗｉｎｇ，Ａ．Ｈａａｓ，Ａ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ５０，３４７−３５６（１９９１）；Ｓ．Ｔｅｍｐａｒｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４，５５６８−７３（１９９４）；Ｒ．Ｍｅｄｉｎａ，Ｓ．Ｓ．Ｗｉｎｇ，Ａ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０７，６３１−６３７（１９９５））、ユビキチン化に関わる遺伝子のいずれかが、萎縮過程に対するマーカーを構成し得るか、またはこれらの遺伝子のいずれかが、萎縮を誘導するために、実際に要求されるかもしくはまさに十分であるのか、のどちらであるかは明らかでなかった。
【０１０５】
固定化の間混乱される遺伝子の大多数は、脱神経の間同様に調節される一方で、同様な萎縮の速度が１日と７日との間のこれらのモデルで見られるという事実にも関わらず（図１Ａ）、これらの遺伝子のほとんどは、無負荷のモデルにおいて変更されなかった（データを示さず）。
【０１０６】
ラットの内側の腓腹筋の筋肉損失の時間経過を、３つのインビボのモデルで試験した：脱神経、固定化および後肢懸吊。２５０〜２７５ｇｍの体重のメスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、全てのモデルにおいて用いた。脱神経の手順について：右坐骨神経を、中央の大腿領域で切断し、下部肢筋肉の脱神経をもたらした。固定化の手順について：右足関節を、踵骨および尾を介して、脛骨幹にねじ（１．２×８ｍｍ）を挿入することによって９０°の屈曲で固定化した。後肢懸吊の手順について：後肢を、記載されるような尾−牽引の帯具を用いて、ラットをそれらの尾から吊るすことによって無負荷にした（Ｄ．Ｂ．Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．Ｈｅｒｒｉｃｋ，Ｄ．Ｓｕｒｄｙｋａ，Ｋ．Ｍ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６３，１３０（１９８７））。示された日に、ラットを殺し、そして後肢筋肉を採取、計量および凍結した。重さの一致した未処置のラットをコントロールとして供した。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝１０のラットである（図２８Ａ〜２８ＤＡ）。
【０１０７】
ノザンブロットをまた、ＭｕＲＦ１転写物およびＭＡＦｂｘ転写物に萎縮の効果を示すように実施した。内側の腓腹筋を、３つの萎縮モデル（足関節固定、脱神経、および後肢懸吊）の時間経過（０日、１日、３日、および７日）を被っているラットから入手した（図２８Ａ〜２８Ｄ  Ｂ）。
【０１０８】
これらの知見は、脱神経および固定化が、無負荷から転写的に容易に区別可能であることを示す。おそらくなぜなら、無負荷は、吊られた肢における比較的正常な神経活性および関節運動が存在することに特徴があるからである。しかし、本発明者らは、萎縮の３つのモデルの全てにおいてアップレギュレーションされる２つの遺伝子を同定した；後にＭｕＲＦ１として同定されるＭＡ１６（筋肉特異的なリングフィンガー（ｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒ）タンパク質について）、およびＭＡ６１（筋肉萎縮Ｆ−ボックスタンパク質について、引き続いてＭＡＦｂｘと呼ばれる）（図２Ａ）。
【０１０９】
ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘの発現を、骨格筋萎縮の２つのさらなるモデルにおいて分析した：悪液質のサイトカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）を用いた処置（Ｒ．Ｎ．Ｃｏｏｎｅｙ，Ｓ．Ｒ．Ｋｉｍｂａｌｌ，Ｔ．Ｃ．Ｖａｒｙ，Ｓｈｏｃｋ  ７，１−１６（１９９７））および糖質コルチコイド、デキサメタゾンを用いた処置（Ａ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４４，３２２３−９（１９６９））。最初の３つのモデルが、神経活性の変更および／または筋肉が種々の程度に被る外部負荷によって筋肉萎縮を誘導する一方で、これらのさらなるモデルは、これらのパラメーターに直接影響することなしに萎縮を誘導する。ノザンブロットを、ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘの発現に対するデキサメタゾン（ＤＥＸ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）の効果を示すために実施した。内側の腓腹筋の筋肉を、未処置のラット（ＣＯＮ）、および９日間６μｇ／ｍｌの濃度で経口的に送達されるＤＥＸで処置したラット、および３日間０．１ｍｇ／ｋｇの用量で毎日皮下に送達されるＩＬ−１で処置したラットから入手した。図２８Ａ〜２８Ｄ（ｃ）。両方の悪液質の薬剤は、ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘのアップレギュレーションを引き起こし、デキサメタゾンは、ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘの発現において１０倍よりも大きい増加をもたらした（図２Ｂ）。
【０１１０】
発現が、萎縮の間アップレギュレーションされ、そして肥大の間ダウンレギュレーションされる遺伝子の同定は、この遺伝子が、萎縮の表現型についてのマーカーであるという主張を非常に強固にし、そして目的の遺伝子が、萎縮過程の直接的なメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）として機能し得るという相関性の証拠を提供する。従って、本発明者らは、骨格筋肥大の２つのモデルにおけるＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘの発現を試験した：１４日間の無負荷期間に続く後肢の再負荷（Ｄ．Ｂ．Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．Ｈｅｒｒｉｃｋ，Ｄ．Ｓｕｒｄｙｋａ，Ｋ．Ｍ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６３，１３０−７（１９８７））、ならびに腓腹筋およびヒラメ筋の筋肉を除去し、これらの協力筋の損失を補償するために足底筋を残す代償的な肥大（Ｇ．Ｒ．Ａｄａｍｓ，Ｆ．Ｈａｄｄａｄ，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８１，２５０９−１６（１９９６）；Ｒ．Ｒ．Ｒｏｙら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８３，２８０−９０（１９９７））。これらのモデルの両方において、ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘの発現は、減少し、これらの遺伝子が、萎縮とポジティブに相関があるだけでなく、肥大ともネガティブに相関があることを示す（図２Ｃ）。さらに、ラットの「組織ブロット（ｔｉｓｓｕｅ  ｂｌｏｔ）」およびヒトの「組織ブロット」の両方に対するノザンブロットは、心筋および骨格筋の両方において（図２Ｄ）、筋肉特異的であるとして、ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘを同定し、これらの組織においてそれらが果たす特定の役割と一致する。
【０１１１】
ラットおよびヒトの組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から入手した総ＲＮＡを、示される遺伝子についてのプローブとハイブリダイズさせた（図２８Ａ〜２８ＤＤ）。
【０１１２】
（実施例７：ＭＵＲＦ１が、ユビキチンリガーゼ複合体中で機能し得ることの立証）
最近、リングドメインを含む遺伝子が、「単量体ユビキチンリガーゼ」として機能し得ることが示された。特定の条件下で、これらのタンパク質は、同時に基質およびユビキチンリガーゼに結合し、基質のユビキチン化およびプロテアソーム媒介性分解を引き起こす。このプロセスにおいて、リングドメインタンパク質そのものは、ユビキチン化される。ラットＭＵＲＦ１遺伝子をコードするベクターを、ユビキチンのＨＡエピトープタグ化形態をコードするべクターと一緒に、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。タンパク質溶解物をＣＯＳ細胞から回収した。ＭＵＲＦ１を、ＭＵＲＦ１ペプチドに対して惹起された抗体を使用して、溶解物から免疫沈降した。免疫沈降されたタンパク質を、ＨＡタグに対する抗体を使用して、ウエスタンブロット分析にかけた。ＭＵＲＦ１が、高度にユビキチン化されることが見られた。さらに、コントロールとして、遺伝子のリングドメイン部分を除去したＭＵＲＦ１の変異型形態をコードするベクターを、タグ化ユビキチンを用いてＣＯＳに同時トランスフェクトした。この場合、ユビキチン化は見られなかった。これらの結果は、ＭＵＲＦ１が、ユビキチン複合体の一部として機能し、リングドメインが、他のリングドメインタンパク質で見られるように、ユビキチン化に必要であるという仮説と一致する。図１４は、ｈＭＵＲＦ１と、他のリングフィンガータンパク質との比較である。
【０１１３】
ＭｕＲＦ１は、大きな（３００ｋＤ）サルコメアのタンパク質タイチンの３０ｋＤドメインをコードする構築物を使用した、酵母のツーハイブリッド実験において、相互作用によって、以前にクローン化された（Ｔ．Ｃｅｎｔｎｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０６、７１７−７２６（２００１））。ＭｕＲＦ１中の「リングフィンガードメイン（Ｋ．Ｌ．Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．Ｓ．Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ６，３９６−４０１（１９９６）；Ｐ．Ｓ．Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６８４，７４−１９２（１９９３））」の存在が、以前に注目されたのに対して、ＭｕＲＦ１が、ユビキチンリガーゼとして機能し得るかどうかを見るための、さらなる分析はなされなかった。本発明者らは、ＭｕＲＦ１が、リングドメイン含有単量体ユビキチンリガーゼの全ての正準の構造的特徴を含むことに注目し（Ｐ．Ｓ．Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １０，Ｒ８４−８７（２０００）；Ｃ．Ａ．Ｊｏａｅｉｒｏ，Ａ．Ｍ．Ｗｉｅｓｓｍａｎ，Ｃｅｌｌ  １０２，５４９−５５２（２０００））、さらに分解に対して筋肉タンパク質を標的化し得るユビキチンリガーゼが、筋肉萎縮を媒介する強力な候補であることを理由付けた。
【０１１４】
ＭｕＲＦ１タンパク質およびその潜在的なユビキチンリガーゼ活性の特徴づけを開始するために、本発明者らは、まず、ｍＲＮＡの発現レベルに加えて、ＭｕＲＦ１タンパク質レベルが、ＭｕＲＦ１を認識する抗体で固定に供された動物から得られる筋肉溶解物を免疫ブロッティングすることによって、萎縮の間増加することを示した（図３Ａ）。次に、組換えＭｕＲＦ１タンパク質が産出され、基質として放射標識されたユビキチンを使用した、インビトロのアッセイにおいて、ユビキチンリガーゼ活性について試験した。ＭｕＲＦ１は、潜在的なユビキチンリガーゼであることが示され（図３Ｂ）、そこでは、タンパク質１μｇあたりの、放射標識化ユビキチン自己結合体の量によって決定されるように、ＭｕＲＦ１の非存在下では、ユビキチンリガーゼ活性は検出されず（図３Ｂ）、このアッセイで試験された他のリングフィンガーユビキチンリガーゼは、ＭｕＲＦ１ほど強力ではない。
【０１１５】
ＭｕＲＦ１タンパク質は、ユビキチンリガーゼ活性を有する。精製されたグルタチオンセファロース結合ＭｕＲＦ１タンパク質（ＧＳＴ−ＭｕＲＦ１）を、記載されるように、ユビキチンリガーゼ反応物に加えた。Ａ．Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１５４３２（２０００）。簡潔には、組換えＧＳＴ−ＭｕＲＦ１（１００ｎｇ）を、ＡＴＰ、Ｅ１、および組換えＵｂｃ５ｃの存在下で、３２Ｐ−ユビキチン（３ｍｇ）と共にインキュベーションした（図２９Ａ〜２９Ｄ（Ｄ）、レーン５）。レーン１〜４において、指示された成分を、省いた。反応物のアリコートを、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、３２Ｐ−標識化高分子量ユビキチン結合体を検出した。「ユビキチンポリマー」は、ユビキチン化されたＵｂｃ５ｃおよびＭｕＲＦ１を含み得る。図２９Ａ〜２９ＤＤ。
【０１１６】
（実施例８：ＭＡＦＢＸが、「ＳＣＦ」ユビキチンリガーゼ複合体において機能し得ることの実証）
最近、Ｆ−ボックスドメインを含む遺伝子が、「ＳＣＦ」複合体と呼ばれるユビキチンリガーゼ複合体の一部として機能し得ることが示され、ここで、Ｓは遺伝子産物ＳＫＰ１を表し、Ｃはクリン（Ｃｕｌｌｉｎ）と呼ばれる遺伝子産物を表し、そして、「Ｆ」はＦボックスタンパク質を表す。ＭＡＦＢＸが、ＳＣＦ複合体の一部であるかどうかを決定するために、共免疫沈降アッセイをすることによって、ＭＡＦＢＸが、ＳＫＰ１またはクリンのいずれに結合するかを決定するために研究した。ＧＳＴ（ＧＳＴ／ＣＯＮ）、ＧＳＴ−ＭＡＦｂｘ、またはＧＳＴ−ＭＡＦｂｘＤＦｂ（ＭＡＦｂｘのＦボックス欠失体、アミノ酸２１６〜２６３）をコードするベクターを、Ｃｏｓ７細胞に一時的にトランスフェクトした。クリン１およびＳＫＰ１の両方を、グルタチオンアガロースビーズを使用して、ＧＳＴ−ＭＡＦｂｘでトランスフェクトされた細胞の溶解物から同時精製し得た（図２９Ａ〜２９Ｄ（Ａ）、レーン３を参照のこと）。Ｆボックスの検出は、共沈殿されるクリン１およびＳｋｐ１の量を、著しく減少した（図２９Ａ〜２９Ｄ（Ａ）、レーン４を参照のこと）。
【０１１７】
ＭＡＦｂｘの過剰発現は、萎縮を引き起こす。Ｃ２Ｃ１２筋管は、感染されない（ＣＯＮ）か、またはＥＧＦＰを発現するアデノウイルスもしくはＭｙｃエピトープタグ化ラットＭＡＦｂｘ遺伝子およびＥＧＦＰ（ＭＡＦｂｘ−ＥＧＦＰ）の両方を発現するアデノウイルスのいずれかで、感染されるかのいずれかである。分化後４日で、蛍光筋管を撮影し、筋管の直径を測定した（右）。アデノウイルスを、記載されるように作製した（Ｔ．−Ｃ．Ｈｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５，２５０９（１９９８））。較正＝５０ｍｍ。図２９Ａ〜２９Ｄ（Ｂ）。
【０１１８】
ＥＧＦＰウイルスおよびＭＡＦｂｘ−ＥＧＦＰウイルスが、ＥＧＦＰ遺伝子を含むために、抗ＥＧＦＰ免疫ブロット（Ｉ．Ｂ．）は、感染レベルの相対的な決定を可能にする。溶解物の免疫ブロット（Ｉ．Ｂ．）は、ＭＡＦｂｘウイルスで感染された筋管における、Ｍｙｃエピトープタグ化ＭＡＦｂｘタンパク質の存在を確認した。図２９Ａ〜２９ＤＣ。
【０１１９】
これらの結果は、ＭＡＦＢＸが、ＳＣＦユビキチンリガーゼ複合体の一部として機能し、この複合体の他のメンバーで見られるように、Ｆボックスドメインが、結合に必要であるという仮説と一致する。
【０１２０】
（実施例９：ＭＵＲＦ３の基質が、シンコイリン（Ｓｙｎｃｏｉｌｉｎ）遺伝子である実証）
ＭＵＲＦ３に対する潜在的な基質を決定するために、「酵母ツーハイブリッド」実験を行った。これは、目的のタンパク質と同時結合するタンパク質を検出する標準的な方法である。この実験において、目的の遺伝子をコードするベクターが、同時トランスフェクトされ、そして酵母ＬｅｘＡドメインに融合され、ｃＤＮＡをコードするライブラリーは、ＧＡＬ４ドメインに融合される。ライブラリー中のｃＤＮＡが、試験遺伝子と結合する場合、ＬｅｘＡドメインおよびＧＡＬ４ドメインは、一緒になり、決定的な酵母タンパク質の産出を生じ、酵母が、特定の培地中で生育可能になる。この方法を使用して、本発明者らは、ＭＵＲＦ３に対する基質が、シンコイリンという最近クローン化された遺伝子であることを決定した。
【０１２１】
（実施例１０：萎縮をブロックし、ＭＵＲＦ１およびＭＡ−６１のアップレギュレーションをブロックする、クレンブテロール（Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ）処理）
ＭＵＲＦ１およびＭＡＦＢＸが、筋痙攣プロセスに対するマーカーおよび痙攣をブロックする強力な標的となり得るかどうかをさらに確立するために、クレンブテロールと呼ばれる薬物を、筋痙攣を阻害するために使用し、この阻害がＭＵＲＦ１およびＭＡ−６１のアップレギュレーションの減少に関連するかどうかを見た。クレンブテロール、βアドレナリン作用性アゴニストは、筋痙攣のインヒビターとして確立されている（例えば、Ｓｎｅｄｄｏｎ  ＡＡ，Ｄｅｌｄａｙ  ＭＩ，Ｍａｌｔｉｎ  ＣＡ，（２０００）を参照のこと）。クレンブテロールによる脱神経誘導性の痙攣の改善は、増加したＰＫＣ−α活性に関連する（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０００  Ｊｕｌ；２７９（１）：Ｅ１８８−９５）。
【０１２２】
ラット四肢の筋肉を、上述の実施例１で記載されるように、固定した。ラットを固定すると同時に、これらを、クレンブテロールで処理した（３ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）。コントロールの固定された動物は、処理されないままにした。コントロール動物の筋肉組織およびクレンブテロール処理動物の筋肉組織由来のメッセンジャーＲＮＡを、標準的な方法（ＭＵＲＦ１プローブおよびＭＡＦＢＸプローブを使用するノーザンハイブリダイゼーション）によって、ＭＵＲＦ１発現およびＭＡＦＢＸ発現について試験した。痙攣を有意にブロックする、クレンブテロールでの処理によって、ＭＵＲＦ１およびＭＡ−６１のアップレギュレーションもまたブロックされたことが見出された。
【０１２３】
（実施例１１：ＭｕＲＦ２およびＭｕＲＦ３の分析）
ＭｕＲＦ１に密接に関連する２つの遺伝子が、クローン化され、ＭｕＲＦ２およびＭｕＲＦ３と名づけられた（Ｔ．Ｃｅｎｔｎｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０６，７１７−７２６（２００１），Ｊ．Ａ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｅｌｉａｚｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｉｌａｒｉａ，Ｊ．Ａ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５０，７７１−７８４（２０００））。ノーザン分析は、ＭｕＲＦ２発現およびＭｕＲＦ３発現が、筋肉特異的で、ＭｕＲＦ１に高度に相同であるにも関わらず、骨格筋痙攣の間、一貫してアップレギュレーションされるわけではないことを示した（図４Ｃ）（Ｔ．Ｃｅｎｔｎｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０６，７１７−７２６（２００１））。筋肉を、３つの痙攣モデル：固定、脱神経、および後肢浮遊の時間経過（０日、１日、３日、および７日）を経験するラットから得た。各々のレーンにおいて、全ＲＮＡを、３つのラット内側腓腹筋（ＭＧ）からプールした。ノーザンハイブリダイゼーションを、示された遺伝子に対するプローブを用いて実行した。マウスｍｙｏＤに対するノーザンプローブは、コード配列の塩基対５７１〜９３８にまたがり、マウスｍｙｏｇｅｎｉｎは、コード配列の塩基対４２３〜８６１にまたがり、マウスＭｙｆ５は、コード配列の４０６〜７４５にまたがった。ラットＭｕＲＦ１に対するノーザンプローブを、ＰＣＲによって作製し、コード配列の塩基対２４〜６１２にまたがった。マウスＭｕＲＦ２に対して、プローブを、５’ＰＣＲオリゴ：
【０１２４】
【化１】
2004524024.tif 000002
および３’ＰＣＲオリゴ：
【０１２５】
【化２】
2004524024.tif 000003
を使用して作製し、マウスＭｕＲＦ２の５番目のエクソンにまたがった。マウスＭｕＲＦ３に対して、プローブは、コード配列の塩基対８６７〜１１０１にまたがった。負荷された全ＲＮＡ量を制御するために、アガロースゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、撮影し、リボソームＲＮＡのバンドを評価した。ＭｕＲＦ２またはＭｕＲＦ３が、ユビキチンリガーゼとして機能するかどうかは、未知である。
【０１２６】
（実施例１２：ユビキチン化は、筋痙攣の間増加する）
上記に示されるように、ＭＵＲＦ１は、ユビキチンリガーゼのリングドメインの一部であり、ＭＡＦＢＸは、「ＳＣＦ」ユビキチンリガーゼ複合体の一部である。ユビキチン化は、筋痙攣のプロセスに関与することを示すために、ウエスタンブロットを、コントロールの筋組織から、および脱神経または固定誘導痙攣を受ける筋組織から得られるタンパク質を用いて実行した。両痙攣条件下で、ユビキチン化のレベルが痙攣の間増加することが示された。この点はまた、文献中で確立されている（例えば、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｖ，Ｂａｒａｃｏｓ  Ｖ，Ｓａｒｒａｆ  Ｐ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＡＬ．（１９９８）を参照のこと）。ユビキチン結合の速度は、主にＮ末端規則経路の活性化を通して、痙攣と共に増加する。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９８  Ｏｃｔ  １３；９５（２１）：１２６０２−７。
【０１２７】
（実施例１３：ＭＡＦＢＸは、ＭＡＦＢＸとＳｋｐ１との間の酵母ツーハイブリッド結合によって示されるように、ＳＣＦ  Ｅ３ユビキチンリガーゼファミリーのメンバーである）
本発明者らは、この遺伝子について、全長のラットｃＤＮＡおよびヒトｃＤＮＡをクローン化した。ラットＭＡＦｂｘ  ｃＤＮＡ配列およびヒトＭＡＦｂｘ  ｃＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームによって、９０％同一であるタンパク質が予想される（図４Ａ）。このタンパク質の配列は、「Ｆボックス」ドメインの存在が顕著であり、Ｆボックスドメインが、「ＳＣＦユビキチンリガーゼ複合体」と呼ばれる、特定のＥ３ユビキチンリガーゼのメンバーであるタンパク質において同定されているので、このＦボックスドメインの存在は、興味深い（Ｄ．Ｓｋｏｗｙｒａ，Ｋ．Ｌ．Ｃｒａｉｇ，Ｍ．Ｔｙｅｒｓ，Ｓ．Ｊ．Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｊ．Ｗ．Ｈａｒｐｅｒ，Ｃｅｌｌ  ９１，２０９−１９（１９９７）；Ｊ．Ｌｉｓｚｔｗａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １７，３６８−８３（１９９８）。従って、ＳＣＦ複合体は、それが、以下のタンパク質：Ｓｋｉｐ１（Ｓｋｐ１）、クリン１（Ｃｕｌ１）および多くの「Ｆボックス」含有タンパク質（Ｆｂｐ）の１つの間の安定な相互作用に関与するために、名づけられる。３８より多くの異なるＦｂｐが、ヒトで同定された（Ｊ．Ｔ．Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｋｏｅｐｐ，Ｃ．Ｚｈｕ，Ｓ．Ｊ．Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｊ．Ｗ．Ｈａｒｐｅｒ，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９，１１８０−２（１９９９）；Ｃ．Ｃｅｎｃｉａｒｅｌｌｉら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９，１１７７−９（１９９９））。ＭＡＦｂｘに最も近接な遺伝子は、Ｆｂｘ２５であり、それは、Ｆボックス含有タンパク質についての大きな検索で、以前にクローン化された遺伝子である（１９）。興味深いことに、ＭＡＦｂｘ発現が、骨格筋および心臓に限定されるのに対して、Ｆｂｘ２５は、ほとんどの他の組織において発現されるが、骨格筋では発現されない（データは示さず）。本発明者らは、ＭＡＦｂｘが、実際、２つの様式で、ＳＣＦ型Ｅ３ユビキチンリガーゼであることを示した。第１に、「ベイト」として、全長ＭＡＦｂｘを使用する酵母ツーハイブリッドクローニングによって、Ｓｋｐ１の９４の独立したクローンを得、全９４クローン以外は、相互作用実験から得られた（データは示さず）。第２に、ＭＡＦｂｘでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からのＭＡＦｂｘの免疫沈澱から、Ｓｋｐ１およびＣｕｌ１の両方の共沈殿を得た（図４Ｂ）。この共沈殿は、ＭＡＦｂｘ中のＦボックスドメインの存在に依存した（図４Ｂ、レーン３および４を比較のこと）。Ｆボックスモチーフは、ＦｂｐとＳｋｐ１の間の相互作用に必要であることが示された（Ｅ．Ｔ．Ｋｉｐｒｅｏｓ，Ｍ．Ｐａｇａｎｏ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１（２０００））。
【０１２８】
（実施例１４：ＭＵＲＦ１は、ユビキチンリガーゼとして機能する）
ＭＵＲＦ１が、ユビキチンリガーゼとして機能するかどうかを決定するために、組換えＭＵＲＦ１タンパク質を、標準的な技術を使用して、Ｅ．Ｃｏｌｉ細菌中で生成した。この組換えタンパク質を、精製し、Ｃｈｅｎら、２０００，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５，ｐｇ１５４３２−１５４３９に記載されるように、インビトロのユビキチンリガーゼアッセイで使用した。ＭＵＲＦ１は、高度に活性で、この活性は、Ｅ２として、Ｅ１およびＵＢＣ５ｃの両方に依存することが見出された（Ｅ１成分およびＥ２成分は、リングドメインタンパク質媒介性ユビキチンライゲーションにとって必要である）。ネガティブコントロールタンパク質は、作用しなかった。ポジティブコントロールとしての、他のリングドメイン含有タンパク質もまた、このアッセイで機能したが、ユビキチン結合によって測定した場合、より低い効率であった。ＭＵＲＦ１がどのようにしてユビキチンリガーゼとして機能したかの図示に関しては、図１５を参照のこと。
【０１２９】
（実施例１６：ノックアウト動物）
（ＭＡＦＢＸノックアウト動物は、筋痙攣の減少を示す）
ＭＡＦｂｘの機能をさらに解明するために、本発明者らは、マウス中でＭＡＦｂｘヌル対立遺伝子を遺伝子操作した。ここで、ＡＴＧからＦボックス領域をコードするエクソンにわたるゲノムＤＮＡが、ＬａｃＺ／ネオマイシンカセットによって置換され（図５Ａ）、同時にＭＡＦｂｘ機能の破壊、およびＭＡＦｂｘの発現パターンを決定するための、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）染色を可能にした。ＭＡＦｂｘ座の分析は、ＭＡＦｂｘ＋／−動物およびＭＡＦｂｘ−／−動物での期待される摂動を示した（図５Ｂ）。さらに、ＭＡＦｂｘ−／−動物は、ＭＡＦｂｘ  ｍＲＮＡについてヌルであった（図５Ｃ）。ＭＡＦｂｘ−／−マウスは、生存可能で、受胎能力があり、そして正常に見える。ＭＡＦｂｘ欠損マウスは、野生型の同産児に関する正常な成長曲線を有し、そして骨格筋および心臓は、通常の重さおよび形態を有した（データは示さず）。
【０１３０】
明らかな表現型の非存在を考慮して、本発明者らは、骨格筋の損失を引き起こすことにおけるＭＡＦｂｘの役割を（もしあれば）決定するために、萎縮モデルにおいてマウスを検証することに決めた。筋萎縮は、坐骨神経を切断することにより誘導され、これは前脛骨筋および腓腹筋の脱神経および不使用を生じた。脱神経は、ＭＡＦｂｘ＋／−マウスの前脛骨筋におけるｂ−ｇａｌ染色（図６Ａ）により実証されるように、全ての筋線維におけるＭＡＦｂｘ遺伝子座の上方調節を生じた。有意な筋萎縮は、脱神経後の７日目および１４日目に、野生型のＭＡＦｂｘ＋／＋マウスの前脛骨筋および腓腹筋で生じた（図６Ｂ）。ＭＡＦｂｘ欠乏性（ＭＡＦｂｘ−／−）マウスは、７日目および１４日目の両方でのＭＡＦｂｘ＋／＋マウスより顕著に少ない萎縮を有した（図６Ｂ）。実際に、ＭＡＦｂｘ−／−マウスは、７日目と１４日目の間の更なる筋損失がないことを示したのに対して、ＭＡＦｂｘ＋／＋は、質量を失い続けた。１４日目の筋質量の保持はまた、平均の線維サイズおよび線維サイズの可変性の保持に反映され；ＭＡＦｂｘ−／−マウスは、ＭＡＦｂｘ＋／＋マウスより顕著に大きな線維を有し、そして非脱神経されていない肢でみられるのと同じ線維サイズの可変性を維持した（図６Ｃ）。これらのデータは、ＭＡＦｂｘが、筋萎縮の必要とされる調節因子であり、筋タンパク質の分解における重要な役割を果たし得る強い証拠を提供する。
【０１３１】
（ＭｕＲＦ−１ノックアウト動物は、筋萎縮における減少を示す）
ＭｕＲＦ１の機能をさらに解明するために、本発明者らは、マウスにおいて、ＭｕＲＦ１ヌル対立遺伝子を遺伝学的に操作し、このマウスにおいて、Ｆ−ｂｏｘ領域をコードするエキソンを通りＡＴＧにまたがるゲノムＤＮＡを、ＬａｃＺ／ネオマイシンカセットと取り替え、これは、（図５Ａ）ＭｕＲＦ１発現パターンを決定するために、本発明者らがＭｕＲＦ１の機能を乱し、そして同時にｂ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）染色を実施することを可能にする。ＭｕＲＦ１座の分析は、ＭｕＲＦ１＋／−および−／−動物における予想された混乱を実証した（図５Ｂ）。さらに、ＭｕＲＦ１−／−動物は、ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡに対するヌルであった（図５Ｃ）。ＭｕＲＦ１−／−マウスは、生存可能で、稔性であり、そして正常に思われた。ＭｕＲＦ１欠乏性のマウスは、野生型の同腹仔の片方に比例して正常な増殖曲線を有し、骨格筋および心臓は、正常な重さおよび正常な形態学を有した（データは示されていない）。
【０１３２】
この研究において、本発明者らは、筋特異的であり、そして種々の撹乱により誘導された筋萎縮の間に上方調節される２つの遺伝子を同定した。ＭｕＲＦ１とＭＡＦｂｘの両方は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの異なる型をコードする。骨格筋萎縮の多数のモデルに対するマーカーとして２つのユビキチンリガーゼの発見は、高い不同性の撹乱（脱神経からグルココルチコイド処置までの範囲である）が、共通の萎縮誘導経路を活性化することを示唆する。さらに、ＡＴＰ依存プロテアソームによるタンパク分解のための別個の基質を標的化する、ユビキチンリガーゼの特定の機能は、特定のタンパク質の分解経路が、萎縮の間に上方調節されそしてＭＡＦｂｘおよびＭｕＲＦ１により媒介されることを示唆する。
【０１３３】
ＭｕＲＦ１は、リングフィンガードメインを含み、そしてインビトロにおいてユビキチンリガーゼとして機能することが示され、その結果、これは、単量体のリング−フィンガーリガーゼとして骨格筋において機能し得ることを示唆した。本研究は、基質を同定しなかったが、これまでの研究は、ＭｕＲＦ１がサルコメリック（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ）タンパク質タイチンに結合すると確認し、これはＭｕＲＦ１が、筋節複合体の重要なオーガナイザーである、タイチンに対するユビキチンリガーゼとして機能し得る可能性を生じる（Ｔ．Ｃｅｎｔｎｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０６、７１７〜７２６（２００１）．）。
【０１３４】
ＭＡＦｂｘは、Ｆ−ｂｏｘを含むＳＣＦファミリーのメンバーである。基質は、これらの研究においてＭＡＦｂｘについて決定されていない；しかし、インビトロにおける骨格筋管におけるＭＡＦｂｘの発現は、これらの細胞において萎縮を誘導するのに十分であった。さらに、ＭＡＦｂｘ欠乏性マウスは、脱神経モデルにおける野生型マウスより顕著に少ない萎縮を示した。この発見は、ＭＡＦｂｘが、重大な筋タンパク質の分解の調節を介する可能性が最もありそうな、筋萎縮プロセスの決定的な調節因子であることを実証する。さらなる萎縮および肥大モデルにおけるこれらのＭＡＦｂｘ欠乏性のマウスの分析は、筋萎縮およびタンパク質の代謝回転におけるＭＡＦｂｘの役割をさらに解明する。
【０１３５】
今後の研究は、ＭＡＦｂｘおよびＭｕＲＦ１の基質の同定そしてＭＡＦｂｘまたはＭＵＲＦ１のいずれか、ＭｕＲＦの関連物、ならびに種々の組み合わせを欠如するマウスのさらなる試験に焦点をあてる。ＭｕＲＦ１欠乏性のマウスの予備的な分析は、それらが生存可能であり、そして外見および増殖の特徴において正常であることを示す（データは示されない）。現在の研究は、骨格筋萎縮のマーカーとして、および萎縮の臨床的な状況における骨格筋の欠失を妨げる治療的な介入に対する強力な標的としてＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘを同定する。ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘの両方はまた、心筋で特異的に発現されるので、心臓の再構築および疾患におけるこれらのユビキチンリガーゼの役割を試験することもまた重要である。
【０１３６】
（ＭＡＦｂｘおよびＭｕＲＦ１座の標的化）
ＭＡＦｂｘ座の標的化。マウスのＥＳ細胞における相同組換えのためのベクターを標的化する遺伝子を産生するために、ＢＡＣゲノムクローンを、ＭＡＦｂｘ遺伝子の第一のコードエキソンに特異的なプローブを用い、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １２９Ｓｖ／Ｊゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得た。このＢＡＣは、約９５ｋｂのゲノムＤＮＡの挿入を含み、そして全体のＭＡＦｂｘ遺伝子を包含した。これは９個のコードエキソンからなる（ラットおよびヒトの相同分子種における場合）。ＭＡＦｂｘ遺伝子を乱すために、ＬａｃＺ／ネオマイシンカセットを、ＭＡＦｂｘプロモーターにより由来されるＬａｃＺ遺伝子発現を可能にさせるために、ＡＴＧ開始コドンに正確に挿入した。ＬａｃＺの挿入では、コードエキソン１〜７およびエキソン８のほとんどを含む、約３５ｋｂのＭＡＦｂｘゲノム配列を同時に取り替えた。このＦ−ｂｏｘは、マウスＭＡＦｂｘ遺伝子、ラットＭＡＦｂｘ遺伝子およびヒトＭＡＦｂｘ遺伝子におけるエキソン７および８によりコードされる。この標的化ベクターを、Ｎｏｔ１を用いる消化により直線化し、そしてＣＪ７のＥＳ細胞にエレクトロポレーションした（Ｔ．Ｍ．ＤｅＣｈｉａｒａら、Ｃｅｌｌ  ８５、５０１（１９９６））。Ｇ４１８における選択において生存したＥＳ細胞クローンを、スクリーニングし、相同組換えされた異型接合ＥＳ細胞を同定した。３つの標的化クロ−ンを、４．６％の組換え頻度を生じるスクリーニングされた６５のクローンから同定した。図２７Ａ〜２７ＢＡを参照のこと。
【０１３７】
ＭｕＲＦ１座の標的化。マウスのＥＳ細胞における相同組換えのためのベクターを標的化する遺伝子を産生するために、ＢＡＣゲノムクローンを、ＭｕＲＦ１遺伝子の第一のコードエキソンに特異的なプローブを用い、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １２９Ｓｖ／Ｊゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得た。このＢＡＣは、約３３ｋｂのゲノムＤＮＡの挿入を含み、そしてＭｕＲＦ１遺伝子の最初の５エキソンを含んだ。ＭｕＲＦ１遺伝子を乱すために、ＬａｃＺ／ネオマイシンカセットを、ＭｕＲＦ１プロモーターにより由来されるＬａｃＺ遺伝子発現を可能にさせるために、ＡＴＧ開始コドンに正確に挿入した。ＬａｃＺの挿入では、コードエキソン１〜４およびエキソン５のほとんどを含む、約８ｋｂのＭｕＲＦ１ゲノム配列を同時に取り替えた。このＲＩＮＧフィンガーは、マウスＭｕＲＦ１遺伝子、ラットＭｕＲＦ１遺伝子およびヒトＭｕＲＦ１遺伝子におけるエキソン１および２によりコードされる。この標的化ベクターを、Ｎｏｔ１を用いる消化により直線化し、そしてＣＪ７のＥＳ細胞にエレクトロポレーションした（Ｔ．Ｍ．ＤｅＣｈｉａｒａら、Ｃｅｌｌ  ８５、５０１（１９９６））。Ｇ４１８における選択において生存したＥＳ細胞クローンを、スクリーニングし、相同組換えされた異型接合ＥＳ細胞を同定した。３つの標的化クロ−ンを、１４％の組換え頻度を生じるスクリーニングされた２２のクローンから同定した。図２７Ａ〜２７ＢＢを参照のこと。
【０１３８】
（標的化対立遺伝子の非存在の確認：ＭＡＦｂｘ）
ＭＡＦｂｘ遺伝子の標的化を、ＥＳ細胞および異型接合ＭＡＦｂｘ変異体マウスおよび同型接合ＭＡＦｂｘ変異体マウスの両方で、内因性（ｅｎｄ．対立遺伝子）３．１ｋｂおよび標的化（ｍｕｔ．対立遺伝子）４．９ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントを検出するために、ＥｃｏＲ１を用いてゲノムテールＤＮＡを消化することおよび５’１．１ｋｂ  ＳａｃＩＩフラグメントを用いてプローブすることにより確認した（図３０Ａ〜３０ＤＡ）。
【０１３９】
ＭＡＦｂｘ遺伝子における標的化変異を、ＭＡＦｂｘプローブ（コード配列の６６０〜８４０ｂｐにまたがる（ＭＡＦｂｘ；上パネル））、ならびに挿入されたＬａｃＺ遺伝子のプローブを用いてＭＡＦｂｘ＋／＋、＋／−および−／−マウスから調製した前脛骨筋（ＴＡ）および腓腹筋（ＧＡ）の両方からｍＲＮＡをプローブすることにより証明した（図３０Ａ〜３０ＤＢ）。
【０１４０】
（標的化対立遺伝子の非存在の確認：ＭｕＲＦ１）
ＭｕＲＦ１遺伝子の標的化を、ＥＳ細胞および異型接合ＭｕＲＦ１変異体マウスおよび同型接合ＭｕＲＦ１変異体マウスの両方で、内因性（ｅｂｄ．対立遺伝子）１５ｋｂおよび標的化（ｍｕｔ．対立遺伝子）１０ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントを検出するために、ＥｃｏＲ１を用いてゲノムテールＤＮＡを消化することおよび５’０．５ｋｂ  ＢｇｌＩＩフラグメントを用いてプローブすることにより確認した（図３０Ａ〜３０Ｄ（Ｃ））。
【０１４１】
ＭｕＲＦ１遺伝子における標的化変異を、ラットＭｕＲＦ１コード配列の１〜５００ｂｐにまたがるプローブ（ＭｕＲＦ１；上パネル）ならびに挿入されたＬａｃＺ遺伝子のプローブを用いて、ＭｕＲＦ１＋／＋、＋／−および−／−マウスから調製した前脛骨筋（ＴＡ）および腓腹筋（ＧＡ）の両方からｍＲＮＡをプローブすることにより証明した（図３０Ａ〜３０ＤＤ）。
【０１４２】
（ＭＡＦｂｘおよびＭｕＲＦ１遺伝子が、脱神経後の筋肉において上方調節されることの確認）
ＭＡＦｂｘおよびＭｕＲＦ１遺伝子の調節を、ＭＡＦｂｘ＋／−およびＭｕＲＦ１＋／−マウスにおけるｂ−ｇａｌ染色を使用して、試験した。右側の坐骨神経を、異型接合マウスにおいて切断し、前脛骨（ＴＡ）筋の脱神経を生じた。７日後、右および左の前脛骨筋を、切り出し、そして同じ時間、同じ培地中でｂ−ｇａｌ活性について染色した。コントロールの筋肉において、いくつかの（主に深い領域）（しかし全てではない）ＴＡの筋線維におけるＭＡＦｂｘの発現の低いレベルがある。比較において、ＭｕＲＦ１は、ＭＡＦｂｘよりわずかに高いレベルで全ての線維において発現される。脱神経後、ＭＡＦｂｘおよびＭｕＲＦ１発現の両方は、全ての筋線維で上方調節される。図３１Ａ〜３１Ｃ（Ａ）。
【０１４３】
欠乏性のＭＡＦｂｘおよびＭｕＲＦ１由来の筋質量を、野生型（＋／＋）マウスと比較し、そして野生型（＋／＋）マウスと比較した場合、脱神経後にマウスが筋質量を維持することが見出された。成体のマウス（ＭＡＦｂｘ＋／＋および−／−）の右後肢筋を、右坐骨神経を切断することにより脱神経した。各動物の左後肢は、それ自身のコントロールとして役立った。脱神経後７日および１４日目に、右および左の腓腹筋複合体（ＧＡ）を、除去し、そして重さを量った。筋重量（ＧＡ）を、コントロールの％（右／左の筋重量データが、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝５〜１０匹のマウスとなるように計算される）としてプロットした。図３０Ａ〜３０Ｄ（Ｂ）。
【０１４４】
筋線維のサイズおよび可変性は、脱神経後、ＭＡＦｂｘ欠乏性マウス由来の筋肉において維持された。前脛骨筋からとられた切断面を、ラミニンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。図３０Ａ〜３０Ｄ（Ｃ）において、代表的な切断面は、前脛骨筋から示されている：野生型（＋／＋）、コントロールの左側（左上）；野生型（＋／＋）、脱神経されて１４日目の右側（左下）；異型接合（−／−）、コントロールの左側（右上）；異型接合、脱神経されて１４日目の右側。
【０１４５】
本明細書中で論じられるような、ノックアウト動物の生成において使用され得る方法論の詳細な説明については、内容が本明細書により参考として援用される、２０００年１０月３１日に出願された米国特許出願第６０／２４４，６６５号より優先を主張する２０００年１２月７日に出願された米国特許出願第０９／７３２，２３４を参照のこと。
【０１４６】
本願を通して、用語ＭＵＲＦ１およびＭＵＲＦ３は、ＭＡＦｂｘであるとして、使用される。本発明者らが以前に出願した優先出願において、用語ＭＡ−１６およびＭＡＦＢＸは使用された。用語におけるこの変化は、命名法における変化を表わし、そして分子は、これらの配列によりさらに正確に同定される。
【０１４７】
（生物材料の寄託）
以下のクローンは、１９９９年１２月１０日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９に寄託された。
クローン                                            特許寄託命名
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴ３／Ｔ７ベクターの
ヒトＭＡ６１Ｋ８                                    ＰＴＡ−１０４８
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴ３／Ｔ７ベクターの
ヒトＭＡ１６Ｃ８                                    ＰＴＡ−１０４９
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴ３／Ｔ７ベクターの
ヒトＭＡ６１Ｄ１８                                  ＰＴＡ−１０５０
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態による範囲に限定されない。実際は、本明細書中に記載されるものに加えて本発明の種々の改変は、前述の説明および添付の図から当業者に明白となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＳＣＦ複合体のＭＡＦＢＸタンパク質に関連する構成成分の概略図を示す。
【図２】
図２は、ＭＡ−６１のＦ−ボックスドメインを示す配列比較を示す。
【図３】
図３は、ヒトＭＡＦＢＸタンパク質の構造ドメインの概略図を示す。
【図４】
図４は、ヒトＭＵＲＦ１タンパク質の構造ドメインの概略図を示す。
【図５Ａ】
図５Ａ〜図５Ｂは、広範な相同性を示すＭＡＦＢＸとＦｂｘ２５との間の配列比較を示す。
【図５Ｂ】
図５Ａ〜図５Ｂは、広範な相同性を示すＭＡＦＢＸとＦｂｘ２５との間の配列比較を示す。
【図６】
図６は、ラットＭＵＲＦ１のヌクレオチド配列を示す。
【図７】
図７は、ラットＭＵＲＦ１の推定アミノ酸配列を示す。
【図８】
図８〜８Ｃは、ヒトＭＵＲＦ１のヌクレオチド配列を示す。
【図９】
図９は、ヒトＭＵＲＦ１の推定アミノ酸配列を示す。
【図１０】
図１０は、ラットＭＡＦＢＸのヌクレオチド配列を示す。
【図１１】
図１１は、ラットＭＡＦＢＸの推定アミノ酸配列を示す。
【図１２】
図１２は、ヒトＭＡＦＢＸクローンＫ８のヌクレオチド配列を示す。
【図１３】
図１３は、ヒトＭＡＦＢＸクローンＫ８の推定アミノ酸配列を示す。
【図１４】
図１４は、ＭＵＲＦ１のリングドメインを示す配列比較を示す。
【図１５】
図１５は、ユビキチンリガーゼ複合体のＭＵＲＦ１タンパク質に関連する構成成分の概略図を示す。
【図１６】
図１６は、ラットＭＵＲＦ１  ＶＲＶスプライス形態のヌクレオチド配列を示す。
【図１７】
図１７は、ラットＭＵＲＦ１  ＶＲＶスプライス形態の推定アミノ酸配列を示す。
【図１８】
図１８は、ヒトＭＡＦＢＸクローンＤ１８のヌクレオチド配列を示す。
【図１９】
図１９は、ヒトＭＡＦＢＸクローンＤ１８の推定アミノ酸配列を示す。
【図２０】
図２０は、ｈＭＵＲＦ３とｒＭＵＲＦ１の配列アライメントを示す。
【図２１】
図２１は、ヒトＭＵＲＦ３クローンＣ８のヌクレオチド配列を示す。
【図２２】
図２２は、ヒトＭＵＲＦ３クローンＣ８の推定アミノ酸配列を示す。
【図２３】
図２３は、萎縮症に関する遺伝子の差示的表示分析を示す。
【図２４】
図２４は、筋肉クレアチニンキナーゼ（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）（ＭＣＫ）、ｍｙｏＤ、ミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）およびＭｙｆ５の発現に対する萎縮症の効果を示すノーザンブロットを示す。
【図２５】
図２５Ａは、全長のラットＭｕＲＦ１に対して惹起される抗体を用いての免疫ブロットを示す。図２５Ｂは、ＭｕＲＦ２およびＭｕＲＦ３のノーザン分析を示す。
【図２６】
図２６は、ラットＭＡＦｂｘタンパク質およびヒトＭＡＦｂｘタンパク質、ならびにヒトＦｂｘ２５の配列アライメントを示す。
【図２７】
図２７Ａ〜図２７ＢＡは、ＬａｃＺ／ＰＧＫ  ｎｅｏと交換されるＭＡＦｂｘ遺伝子の部分を示す概略図を示す。図２７Ａ〜図２７ＢＢは、ＬａｃＺ／ＰＧＫ  ｎｅｏと交換されるＭｕＲＦ１遺伝子の部分を示す概略図を示す。
【図２８】
図２８Ａ〜図２８ＤＡは、ラットの内側腓腹筋の質量減少の時間経過が、３つのインビボモデルで試験されたことを示す：脱神経、固定化および後肢吊り下げ。図２８Ａ〜図２８ＤＢは、ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘ転写物に対する萎縮症の効果を示すノーザンブロットを示す。図２８Ａ〜図２８ＤＣは、ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘの発現に対するデキサメタゾン（ＤＥＸ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）の効果を示すノーザンブロットを示す。
図２８Ａ〜図２８ＤＤは、ＭｕＲＦ１およびＭＡＦｂｘの組織特異的発現を示す。
【図２９】
図２９Ａ〜図２９ＤＡは、共沈殿を示す：ＭＡＦｂｘ、Ｃｕｌｌｉｎ、Ｓｋｐ−１。図２９Ａ〜図２９ＤＢは、ＭＡＦｂｘの過剰発現によって誘発される萎縮症を示す。図２９Ａ〜図２９ＤＣは、ＭＡＦｂｘウイルスに感染した筋管中における、Ｍｙｃ−エピトープでタグ化ＭＡＦｂｘタンパク質の存在を確認する溶解物の免疫ブロット（Ｉ．Ｂ．）を示す。図２９Ａ〜図２９ＤＤは、３２Ｐ標識高分子量ユビキチン結合体の検出を示す。
【図３０】
図３０Ａ〜図３０ＤＡは、標的化された対立遺伝子の決失の確認を示す：ＭＡＦｂｘ。図３０Ａ〜図３０ＤＢは、標的化された対立遺伝子の決失の確認を示す：ＭＡＦｂｘ。図３０Ａ〜図３０ＤＣは、標的化された対立遺伝子の決失の確認を示す：ＭｕＲＦ１。図３０Ａ〜図３０ＤＤは、標的化された対立遺伝子の決失の確認を示す：ＭｕＲＦ１。
【図３１】
図３１Ａ〜図３１ＣＡは、マウスの（ＭＡＦｂｘ＋／−およびＭｕＲＦ１＋／−組織のＢ−ｇａｌ染色を示す。図３１Ａ〜図３１ＣＢは、野生型（＋／＋）マウスと比較した場合の脱神経後の筋肉塊を示す。図３１Ａ〜図３１ＣＣは、脱神経後のＭＡＦｂｘ決失マウス由来の筋肉中の筋線維サイズおよび変動性を示す。
【図３２】
図３２は、ＭＡＦｂｘタンパク質が、ＭＡ６１と同じタンパク質であることを示す配列アライメントを示し、そして異なる名前は、命名法での変化を示す。
【図３３】
図３３は、ＭｕＲＦ１タンパク質が、ＭＡ１６と同じタンパク質であることを示す配列アライメントを示し、そして異なる名前は、命名法での変化を示す。
【図３４】
図３４は、ｈＭＵＲＦ１とｒＭＡ１６の配列アライメントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２０】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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