(57)【要約】本発明は、改善された安定性を有する新規なＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼに関する。変種セルラーゼは、感受性残基を、修飾された安定性を有する残基に置換した性能を有する。
2004505630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７，Ｇ３１，Ａ３５，Ｔ１４５，Ｙ１４７，Ｑ１６２及び／又はＹ１６８の一つ又は複数に相当する位置において置換又は欠失を含む、変種ＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼ。
【請求項２】
ＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７Ｙ，Ｇ３１Ｑ，Ａ３５Ｖ，Ｔ１４５Ｅ，Ｙ１４７Ｗ，Ｑ１６２Ｐ及び／又はＹ１６８Ｆの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む、請求項１記載の変種。
【請求項３】
真菌、細菌又は放線菌に由来する、請求項１記載のセルラーゼ。
【請求項４】
真菌に由来する、請求項３記載のセルラーゼ。
【請求項５】
繊維状真菌に由来する、請求項４記載のセルラーゼ。
【請求項６】
繊維状真菌がＥｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅに属する、請求項５記載のセルラーゼ。
【請求項７】
Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ種、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒｅ種、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ種又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種に属する、請求項６記載のセルラーゼ。
【請求項８】
セルラーゼがエンドグルカナーゼである、請求項１記載のセルラーゼ。
【請求項９】
請求項１記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
工程：
（ａ）セルラーゼを生成するのに適した条件下で適当な培養培地中で請求項１１記載の宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）生成されたセルラーゼを得ること
を含む、セルラーゼを生成する方法。
【請求項１３】
界面活性剤及びセルラーゼを含む洗浄剤組成物であって、上記セルラーゼがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７，Ｇ３１，Ａ３５，Ｔ１４５，Ｙ１４７，Ｑ１６２及び／又はＹ１６８の一つ又は複数に相当する位置において置換又は欠失を含む変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを含む、洗浄剤組成物。
【請求項１４】
ＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７Ｙ，Ｇ３１Ｑ，Ａ３５Ｖ，Ｔ１４５Ｅ，Ｙ１４７Ｗ，Ｑ１６２Ｐ及び／又はＹ１６８Ｆの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む、請求項１３記載の洗浄剤。
【請求項１５】
洗浄剤がランドリー用洗浄剤である、請求項１４記載の洗浄剤。
【請求項１６】
請求項が皿洗い用洗浄剤である、請求項１４記載の洗浄剤。
【請求項１７】
セルロース含有織物の処理における、請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼの使用。
【請求項１８】
インディゴ染色されたデニムのストーンウオッシングにおける、請求項１７記載のＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼの使用。
【請求項１９】
飼料付加物としての、請求項１記載のＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼの使用。
【請求項２０】
ウッドパルプ処理における、請求項１記載のＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼの使用。
【請求項２１】
バイオマスからグルコースへの還元における、ウッドパルプ処理における、請求項１記載のＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府後援の研究及び開発
適用外。
【０００２】
発明の背景
セルラーゼは、セルロース中のβ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解が可能な酵素である。セルロース分解酵素は伝統的に３つの主要なクラスに分類されてきた：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドラーゼ及びβ−グルコシダーゼであり（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，（１９８７），ＴＩＢＴＥＣＨ　５，２５５−２６１）；多数の細菌、酵母及び真菌により製造されることが知られている。
【０００３】
セルラーゼはウッドパルプ及び動物用飼料を分解するのに用いられるが、セルラーゼは主に織物の処理、例えば泥又は灰色傾向の除去の補助のための界面活性剤組成物において（例えば、大英帝国出願番号２，０７５，０２８、２，０９５，２７５及び２，０９４，８２６を参照）又は織物の感触及び外観を改良するための販売前の織物の処理にいおいて使用される。即ち、大英帝国出願番号１，３５８，５９９は、コットンを含む織物のざらつきを軽減するために界面活性剤中のセルラーゼの使用を例示する。
【０００４】
セルラーゼは、織物の色をより活気あるものにすることにより使用された織物を改良するために織物の処理においても使用されてきた（Ｔｈｅ　Ｓｈｉｚｕｏｋａ　Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ　Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｔｅｘｔｉｌｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｒｅｐｏｒｔ　２４：５４−６１（１９８６））。コットンを含む織物の繰り返しの洗浄は織物に灰色傾向をもたらすが、破壊されて不規則になった繊維によると信じられ、ときどき機械の作用による「毛玉（ｐｉｌｌｓ）」と呼ばれる。この灰色傾向は色付きの織物において特に目立つ。結果として、織物の不規則な上部層を除去して即ち織物の全体の外観を改良することにおけるセルラーゼの能力は価値がある。
【０００５】
多くの工業上のプロセスにおけるその有用性のため、ひとつ又は複数の特定の応用に関して特に有効な性能特性を有する特定のセルラーゼ組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）又は成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を研究する分野において時代の風潮があった。セルラーゼの可能な源として、実務家は真菌及び細菌に焦点を合わせた。例えば、特定の真菌、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種（特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）により生産されるセルラーゼは大いに注目されたが、何故ならばセルロースの結晶形態を分解することができる完全なセルラーゼが発酵の手法により大量に容易に提供されるからである。この特定のセルロース複合体を広く分析することにより、その特定の成分の性質及びそれらの成分が工業上のプロセスにおいて機能する能力を測定した（Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，１６０，２５，ｐａｇｅｓ　２３４，及び次参照（１９８８））。米国特許番号５，４７５，１０１（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＥＧＩＩＩ）と呼ばれる一つの特に有用な酵素の精製及び分子クローニングを開示する。
【０００６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１４９５３は、各２０ヌクレアーゼ有する一連のＤＮＡ配列の何れか一つを含む核酸によりコードされるエンドグルカナーゼを開示する。
【０００７】
Ｏｏｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２１７−２２２（１９９０）は、アミノ酸ストリングスＮＮＬＷＧ，ＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓにより生産されるエンドグルカナーゼＥＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を開示する。Ｓａｋａｍｏｔｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３５−４３９（１９９５）は、アミノ酸ストリングスＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ由来のエンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１をコードするｃＤＮＡ配列を開示する。Ｗａｒｄ，ｅｔ　ａｌ．，は、アミノ酸ストリングスＮＮＬＷＧ，ＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを有するＥＧＩＩＩの配列を開示する。さらに、２つのセルラーゼ配列、一方がＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖａｒａそしてＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓが、Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　９０：９−１４（１９９０）及びＨｒｅｇｇｖｉｄｓｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．６２：３０４７−３０４９（１９９６）に開示されており、アミノ酸ストリングＥＬＭＩＷを含む。
【０００８】
上記のエリアの幾つか又は全てにおいて応用性を有する多くのセルラーゼ組成物に関する業界の知見に拘わらず、セルラーゼが有用な応用において存在する条件下で改良された安定性を有する新規のセルラーゼ組成物、例えば家庭の界面活性剤及びランドリーの界面活性剤及び織物処理用の組成物に関する継続する要求が存在する。
【０００９】
発明の概要
変種（ｖａｒｉａｎｔ）のＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼが提供され、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７，Ｇ３１，Ａ３５，Ｔ１４５，Ｙ１４７，Ｑ１６２及び／又はＹ１６８の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。好ましい態様において、変種は、ＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７Ｙ，Ｇ３１Ｑ，Ａ３５Ｖ，Ｔ１４５Ｅ，Ｙ１４７Ｗ，Ｑ１６２Ｐ及び／又はＹ１６８Ｆの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。この態様の一つの側面において、上記セルラーゼは、真菌、細菌又は放線菌に由来する。より好ましい側面において、上記セルラーゼは真菌に由来する。もっとも好ましい態様において、繊維状真菌である。好ましくは、繊維状真菌は、Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ，特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ種、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒｅ種、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ種又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種に属する。この態様の別の側面において、この発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼはエンドグルカナーゼである。
【００１０】
発明の別の態様において、この発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡが提供される。好ましい態様において、ＤＮＡはベクター中にある。さらなる態様において、上記ＤＮＡは上記ベクターにより形質転換された宿主細胞中にある。
【００１１】
この発明の別の態様において、この発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼを生産する方法が提供される。当該方法は、セルラーゼを生産するために適した条件下で適当な培養培地中で請求項１１記載の宿主細胞を培養し、そして生産されたセルラーゼを得る工程を含む。
【００１２】
発明のさらに別の態様において、界面活性剤及びセルラーゼを含む洗浄剤が提供される。上記セルラーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７，Ｇ３１，Ａ３５，Ｔ１４５，Ｙ１４７，Ｑ１６２及び／又はＹ１６８の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを含む。より好ましい態様において、変種は、ＥＧＩＩＩ中の残基Ｗ７Ｙ，Ｇ３１Ｑ，Ａ３５Ｖ，Ｔ１４５Ｅ，Ｙ１４７Ｗ，Ｑ１６２Ｐ及び／又はＹ１６８Ｆの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。
この発明の好ましい側面において、洗浄剤はランドリー用又は皿洗い用の洗浄剤である。この発明の別の態様において、上記変種ＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、セルロース含有織物の処理、特にストーンウオッシュ又はインディゴ染色されたデニムに使用される。あるいは、この発明のセルラーゼは、飼料添加物として、ウッドパルプの処理において、及びバイオマスのグルコースへの還元において使用することができる。
【００１３】
発明の詳細な説明
出願人は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩに相同性を有するセルラーゼのファミリーの新規なメンバーを単離した。これらのセルラーゼの分析は、有意な相同性にも拘わらず、セルラーゼの間で異なる性能をもたらした。特に、Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ，Ｍｅｍｎｏｎｅｌｌａ　ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ及びＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ由来のＥＧＩＩＩ様セルラーゼは熱ストレス下の条件において優秀な性能を有することが発見された。これらのＥＧＩＩＩ様セルラーゼをＥＧＩＩＩのそれと整列化することにより、熱に対してより安定なセルラーゼとＥＧＩＩＩの間の残基の差異を同定して、即ちＥＧＩＩＩ様セルラーゼの熱安定性を改善するのに重要な残基を同定することが可能である。従って、ＥＧＩＩＩ内並びにＥＧＩＩＩ様セルラーゼ内で同定された残基を最適化することにより、ＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ様セルラーゼの両方の熱安定性をさらに改善することが可能である。
【００１４】
本発明は、即ち、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼのアミノ酸配列比較を通して同定されたそのような全ての修飾を包含する。酵素の熱アミノ酸の変化をもたらすそれらの修飾に対して特に注意が引かれる。
【００１５】
本発明により改善された蛋白質は、前駆体蛋白質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含む。前駆体蛋白質は天然に生じる蛋白質又は組換え蛋白質であってよい。改善された蛋白質のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により前駆体蛋白質のアミノ酸配列に由来する。そのような修飾は、前駆体蛋白質自体の操作よりもむしろ前駆体蛋白質のアミノ酸配列をコードする前駆体ＤＮＡ配列に一般的である。前駆体ＤＮＡ配列のそのような修飾の適切な方法は、本明細書及び引用により編入される、共通の譲受人の米国特許第４，７６０，０２５号、第５，１８５，２５８号に開示された方法を含む。
【００１６】
配列の整列化は、別のＥＧＩＩＩ様セルラーゼを用いて生じさせてよく、そして配列の数及び相同姓の程度しだいで、一つの整列化とその他がわずかに異なってよい。適切な修飾を決定するための適切な実験は、本開示に関連して当業者には日常的である。
【００１７】
明細書内では、特定の用語を以下のように定義して、特許請求の範囲の発明の性質を明らかにする。
「セルラーゼ」は、当業界においてよく分類されているカテゴリーの酵素であり、セルロースポリマーを短いロ−オリゴサッカライドオリゴマー、セロビオース及び／又はグルコースに加水分解できる酵素を含む。セロビオース酵素の共通の例は、セロビオヒドロラーゼ類及びエンドグルカナーゼ類であり、そしてセルロース分解性生物の多くの種から得ることができ、特に真菌及び細菌を含む。
【００１８】
「ＥＧＩＩＩ」セルラーゼは、米国特許第５，４７５，１０１号及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　ＴＲＩＣＥＬ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　Ｒｅｅｓｅｉ　Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ　Ａｎｄ　Ｏｔｈｅｒ　Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，Ｓｕｏｍｉｎｅｎ　＆　Ｒｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ　ｅｄｓ．，Ｅｓｐｏｏ　Ｆｉｎｌａｎｄ（１９９３），ｐｐ．１５３−１５８（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８）に記載されたエンドグルカナーゼ成分を意味する。本明細書において議論されるとおり、ＥＧＩＩＩはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）に由来し、そして約５．８の至適ｐＨ、約７．４の等電点（ｐＩ）及び約２５ｋＤの分子量により特徴付けられる。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩと一般に呼ばれる酵素は、文献において数人の著者らにより名称ＥＧＩＩＩと呼ばれたが、その酵素は分子量、ｐＩ及び至適ｐＨに関して本明細書中のＥＧＩＩＩと定義した酵素とは実質的に異なる。
【００１９】
本発明による「ＥＧＩＩＩ様酵素」、「ＥＧＩＩＩ様蛋白質」又は「ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ」は、ＥＧＩＩＩと共通の特定のアミノ酸ストリングスを有することによりＥＧＩＩＩに関連する酵素を意味する。本明細書にて使用されるとおり、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩを包含することも意図する。即ち、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、
【００２０】
【化１】
2004505630.tif 000003
【００２１】
の一つ又は複数からなる群から選択されるアミノ酸ストリングスを中に含むアミノ酸配列を含む、セルロース溶解活性を有する酵素を含む。
一つの態様において、発明の酵素は、さらに、ＥＧＩＩＩに対して有意な構造上及び／又は配列上の相同性を有する。即ち、発明のこの態様の一つの側面において、上記酵素はＥＧＩＩＩに対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、そしてもっとも好ましくは少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有する。しかしながら、相同性のみでは、本明細書に記載された方法により同定された特定の酵素がＥＧＩＩＩ様セルラーゼを代表するか否かの適切な尺度には多くの場合ならないことを認識するべきである。相同性が低いか否かに拘わらず類似の酵素機能がＥＧＩＩＩ様セルラーゼを同定するかもしれない。従って、相同な酵素が本明細書に記載されて例示された方法により実際に検出されるが、相同の程度は発明の範囲を限定するものとして見なすべきではない。
【００２２】
発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼはセルラーゼを生産する多くの生物において見いだされるかもしれないと予期される。しかしながら、ありそうなこととして、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの源は、細菌又は真菌、より好ましくは放線菌、桿菌又は繊維状真菌に由来するものを含む。好ましい態様において、セルラーゼは、繊維状真菌ファミリーの後生動物、好ましくはＥｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅに由来する。後生動物において、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを生産する真菌の系統発生上の分類は、栄養胞子Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍを含む），Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａを含む），Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ（Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ、例えばＦｕｓａｒｉｕｍ，Ｎｅｃｉｔｉａ，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ及びＧｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ；及びＨｙｐｏｃｒｅａを含む）及びＥｕｒｏｔｉａｌｅｓ（栄養胞子Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍを含む）を含む。
【００２３】
Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅは、好ましくは、Ｄｉａｐｏｒｔｈａｌｅｓ，Ｈａｌｏｓｐｈａｅｒｉａｌｅｓ，Ｍｉｃｒｏａｓｃａｌｅｓ，Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａｔａｌｅｓ，Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｌｅｓ，Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ又はＸｙｌａｒｉａｌｅｓに属する。また、好ましくは、Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅは、Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ，Ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ，Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ，Ｎｉｅｓｓｌｉａｃｅａｅ又はＭｉｔｏｓｐｏｒｔｉｃ　Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓを含むＨｙｐｏｃｒｅａｌｅｓに属する。さらに好ましくは、Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａを含まないＨｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅに属する。もっとも好ましくは、Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅは、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ種、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ種、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ種、Ｅｍｅｒｃｅｌｌａ種及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ種である。Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ様セルラーゼを所有するものとして予期される特定の生物は、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ　ｖａｒ．ｔｈｅｒｍ．，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ａｔｒｏｂｒｕｎｎｅｕｍ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｇｌｏｂｏｓｕｍ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｖｉｔｅｌｌｉｕｍ，Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｌａｃｉｎｕｓ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ　ｖａｒ．ｄｉｓｓｉｔｕｍ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｂｒｅｖｉｓ，Ｍｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ　ｅｃｈｉｎａｔａ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｅｑｕｉｓｅｔｉ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｔｉｌｂｏｉｄｅｓ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ，ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ，Ｓｔｉｂｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ，Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ　ａｌｂｏｍｙｃｅｓ，Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ　ｓｕｐｅｒｂａ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ　ｈｉｎｕｎｉｌｅａ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｐａｃｈｙｐｏｄｉｏｄｅｓ，Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ，Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ　ｓｕｌｆｕｒｅａ，Ｌｕｎｕｌｏｓｐｏｒａ　ｃｕｒｖｕｌａ，Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｔｒｉｃｔｕｍ，Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ　ｈｅｔｅｒｏｎｅｍａ，及びＵｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｃｈａｒｔａｒｕｍを含む。放線菌の中で、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓはＥＧＩＩＩ様セルラーゼを所有しているらしい。
【００２４】
本発明によるＥＧＩＩＩ様セルラーゼは以下の方法に従い得てよい。縮重ＤＮＡプライマーを、
【００２５】
【化２】
2004505630.tif 000004
【００２６】
の一つ又は複数からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするように構築し、そして確立された方法によりセルロース溶解活性を有する酵素をコードするＤＮＡ及び遺伝子をクローン化するのに使用される。縮重プライマーを用いてＤＮＡを得る技術は当業者の範囲内であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．においてか又はＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ−Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（第２版）１−３巻、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８９）（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；及びＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，（編纂），Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ　ｊｏｉｎｔ　ｖｅｎｔｕｒｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９７補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に見いだすことができる。さらに、発明のＥＧＩＩＩは、分子生物学の慣用の方法、例えば、標識プローブを用いたライブラリースクリーニング、発現スクリーニング及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍクローン化により、本明細書においてＥＧＩＩＩ様セルラーゼとして同定されたセルラーゼバックボーンの一つを用いて、得てよい。
【００２７】
縮重プライマーは、与えられた断片が標的生物中で類似の配列に相関するか否かを分析するために、標的生物から得られたゲノミックライブラリーに対してハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。有用なハイブリダイゼーションアッセイは以下のとおりである：特定の標的源からのゲノミックＤＮＡを制限酵素：例えばＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＫｐｎＩ，ＭｌｕＩ，ＳｐｅＩ，ＢｇｌＩＩ，ＮｃｏＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ及びＸｍａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｖ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ　ａｎｄ　Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍにより供給された）による、製造者の指示書に従った消化により断片化する。次に、サンプルをアガロースゲルを通して電気泳動して（例えば、０．７％アガロースのような）、ＤＮＡ断片の分離がサイズにより可視化できる。ゲルを簡単に蒸留水中で洗い、そして次に適切な溶液（例えば、０．２５Ｍ　ＨＣｌのような）中でゆるやかな撹拌により脱プリン化し、そして３０分間変性させる（例えば０．４Ｍ　ＮａＯＨ中で）。再生の工程は、ゲルを１．５Ｍ　ＮａＣｌ，１Ｍ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０の中においてゆるやかに３０分間撹拌する。次に、ＤＮＡを適切な陽性電荷膜、例えばＭａｘｉｍｕｍ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｎｙｔｒａｎ　Ｐｌｕｓ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．）に、転写溶液（例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭ　ＮａＣｌ，９０ｍＭ）クエン酸３ナトリウムのような）を用いて転写する。転写後に、ゆるやかに２時間またはそれ以上、膜を洗浄して（例えば、２ＸＳＳＣ［２ＸＳＳＣ＝３００ｍＭ　ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸３ナトリウム］中で）、室温において空気乾燥する。次に、膜を再度ハイブリダイズさせる（約２時間またはそれ以上）が、適切な再ハイブリダイゼーション溶液（例えば、１００ｍＬあたり：３０−５０ｍＬホルムアミド、２５ｍＬの２０Ｘ　ＳＳＰＥ（１ＸＳＳＰＥ＝０．１８Ｍ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．７），２．５ｍＬの２０％ＳＤＳ、及び１ｍＬの１０ｍｇ／ｍｌ専断ニシン精子ＤＮＡを含む水溶液のような）中においてである。
【００２８】
上記プライマー配列に相当するＤＮＡプローブをアガロースゲル中で単離して、断片をゲルから切り出して、そして切り出したゲルから回収する。この精製されたＤＮＡ断片を次に標識する（例えば、製造者の指示書に従いＭｅｇａｐｒｉｎｅ標識システムを用いることによりＰ３２をＤＮＡに取り込む（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国））。標識されたプローブを９５℃において５分間変性させ、そしてすぐに上記膜を含む再ハイブリダイゼーション溶液に加える。ハイブリダイゼーション反応は適切な時間の間、適切な条件下で進行するべきであり、例えば、１８時間３７℃にてゆるやかに撹拌する。上記膜を洗浄し（例えば、２Ｘ　ＳＳＣ／０．３％ＳＤＳ中）、次に適切な洗浄溶液を用いて洗浄して、ゆるやかに撹拌する。所望のストリンジェンシーが、膜（フィルター）を洗浄する条件の反映になる。
【００２９】
特定すれば、与えられた反応のストリンジェンシー（即ち、ハイブリダイゼーションの成功に必要な相同性の程度）は、サザンブロットからのフィルターがハイブリダイゼーション後に供される洗浄条件に大きく依存する。本明細書にて定義される「低ストリンジェンシー」条件は、０．２Ｘ　ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳの溶液を用いた２０℃における１５分間のサザンブロットからのフィルターを洗浄することを含む。標準のストリンジェンシー条件は、０．２Ｘ　ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳの溶液を用いた３７℃における３０分間の２回目のサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む洗浄工程をさらに含む。
【００３０】
発明のこの側面による好ましい態様において、縮重プライマーは、一つ又は複数の上記ペプチドに対応して調製される。上記プライマーを標準反応を開始するのに適した条件下で標的生物（即ち、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを検索した生物）からのゲノミックＤＮＡと混合する。この態様において、（ｃ）及び／又は（ｅ）に対応するペプチド（ａ）及び／又は（ｄ）プラスプライマーに相当する縮重プライマーを選択して、それらのプライマーを用いてＤＮＡを増幅するのが有利である。ＰＣＲ反応を実行後に、結果のＤＮＡをポリアクリルアミドゲル上を移動させ、（ｃ）及び／又は（ｅ）に加えて、ペプチド（ａ）及び／又は（ｄ）を含むＥＧＩＩＩ断片にサイズが相当するバンド、即ち４００−１０００塩基対の範囲のバンドを選択する。これらの断片をプールして、ペプチド（ｂ）に相当するペプチド（ａ）及び／又は（ｄ）プラスプライマーに相当するプライマーを用いるかあるいはペプチド（ｂ）に相当するペプチド（ｃ）及び／又は（ｅ）プラスプライマーに相当するプライマーを用いて再度増幅する。予測されたサイズの強いバンド（ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの場合、バンドは約２５０−５００塩基対に相当する）を切り出し、そして配列決定する。単離された配列を次にプライマーのデザインに用いて、これらのプライマーを、例えばゲノミックＤＮＡの末端の迅速な増幅（ＲＡＧＥ）を通して用いることにより、完全長の遺伝子を得る。例えば、Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ，ｅｔ　ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１５：２１５−２１６（１９９３）を参照。
【００３１】
上記概要のＤＮＡプライマーとハイブリダイズするＤＮＡ、即ち対応するＥＧＩＩＩコーディング遺伝子をこの方法により同定したＤＮＡを、日常的な方法により単離して、日常的な技術に従い対応するＥＧＩＩＩ様セルラーゼを発現させるために使用してよい。クローン化された遺伝子を得る際、適切な宿主細胞を次に形質転換可能なベクターに上記ＤＮＡを挿入するための日常的な方法を用いる。適切な条件下で形質転換された宿主細胞を培養することは、必要に応じて特定の応用のために得ることができて、精製できてかつ調製できるＥＧＩＩＩ様セルラーゼの生産をもたらす。
【００３２】
発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼは単離するか又は精製するのが好ましい。本発明のコンテクストにおいて、精製又は単離は一般的に、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを、天然において、例えば源生物において付随する天然に生じる置換体のいくつか又は全て、例えばＥＧＩＩＩセルラーゼに関連して源生物から発現される他のセルラーゼ又は酵素から分離する目的で、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをその天然状態から変更させることを意味する。同様に、発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼは天然状態において天然に存在しない他の成分と化合してよい。単離又は精製は、当業界において認識される分離技術、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿又は他の蛋白質塩沈殿技術、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、マイクロ濾過、ゲル電気泳動又は勾配上の分離により、最終の塑性物中に置いて不所望な細胞、細胞残渣、不純物、無関係な蛋白質、又は酵素を除去してよい。
【００３３】
ＥＧＩＩＩ内に存在する残基に「相当する」か又は「均等な」ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ中の残基は、一次配列相同性、三次構造相同性（例えば、結晶構造又はコンピューターモデリングにより示される）又は機能均等性により示されるとおり、ＥＧＩＩＩ中のそれの均等な位置に存在する残基を意味する。変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、前駆体ＥＧＩＩＩ様セルラーゼのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。前駆体セルラーゼは天然のセルラーゼ及び組換えセルラーゼを含む（本明細書において定義される）。ＥＧＩＩＩ様セルラーゼのアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により前駆体ＥＧＩＩＩ様セルラーゼアミノ酸配列に由来する。そのような修飾は、前駆体セルラーゼ酵素事態の操作よりむしろ前駆体セルラーゼのアミノ酸配列をコードする前駆体ＤＮＡ配列の修飾である。前駆体ＤＮＡ配列のそのような操作のための適切な方法は、本明細書そして権利者が同じ米国特許第４，７６０，０２５号及び第５，１８５，２５８号に開示された方法を含む。界面活性剤の存在下で不安定性に必須の位置に相当する特定の残基が置換又は欠失に関して本明細書に同定される。アミノ酸の数（例えば、＋３５）は、図１に示す成熟Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ配列に付された番号を意味する。発明は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ中で特に同定された残基に均等な位置のアミノ酸残基を含むＥＧＩＩＩ様セルラーゼの変異に向けられる。前駆体セルラーゼの残基（アミノ酸）は、それがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ中の特定の残基又は残基の位置に相同であるか（即ち、一次又は三次構造の何れかの位置に相当する）又は機能上類似である（即ち、同じか又は類似の、化学上又は構造上、結合、反応又は相互作用する能力を有する）なら、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの残基に均等である。本明細書にて使用されるとおり、ナンバリングは図１に示した成熟ＥＧＩＩＩアミノ酸配列のそれに対応することを意図する。
【００３４】
相同性蛋白質は、「配列比較計算式」を用いて決定することもできる。比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ　＆　Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性計算式によるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　＆　Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）１９７０）の相同性整列化計算式によるか、Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によるか、これらの計算式のコンピューター化の実行によるか（ウイスコンシンジェネティックスソフトパッケージ、ジェネティックスコンピューターグループ、５７５サイエンス　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は可視点検により行うことができる。
【００３５】
配列類似性を決定するために適した計算式の例はＢＬＡＳＴ計算式であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ計算式のを実行するためのソフトウエアは、バイオテクノロジー情報国立センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。この計算式は、データベース配列中の同じ長さの言葉と整列化したときに、いくつかの陽性評価された閾値スコアに適合するか又は満足する質問配列中の長さＷの短い言葉を同定することにより、高いスコアの配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。これらの初期の隣接する言葉のヒットはそれらを含む長いＨＳＰｓを発見するための開始ポイントとして作用する。言葉のヒットは、蓄積する整列化のスコアが増加し得る限り、２つの配列の各々が比較される両方向に沿って伸長する。言葉のヒットの伸長は、蓄積する整列化スコアが達成された最大値からの量Ｘにより低下する場合；蓄積スコアがゼロ又はそれ以下になる場合；又は何れかの配列の末端が延びる（ｒｅａｃｈｅｄ）場合に停止する。ＢＬＡＳＴ計算式のパラメーターＷ，Ｔ及びＸは整列化の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは欠点としてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ＆２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ　＆　Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５（１９８９）を参照）整列化（Ｂ）５０、気体（Ｅ）１０、Ｍ’５，Ｎ’−４、及び両鎖の比較を用いる。
【００３６】
ＢＬＡＳＴ計算式は次に、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ　＆　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴ計算式により提供される類似性の一つの測定は最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり２つのヌクレオチド又は間の配列の間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、プロテアーゼアミノ酸配列に対する試験アミノ酸配列の比較における最少合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そしてもっとも好ましくは約０．００１未満ならば、アミノ酸配列はプロテアーゼに類似であると考えられる。
【００３７】
「均等な残基」は、ｘ線結晶解析によりその三次構造が決定された前駆体プロテテアーゼに関する三次構造のレベルにおいて相同性を決定することにより定義してもよい。均等な残基はＨ．ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ及びＴ．ｒｅｅｓｅｉのからのＥＧＩＩＩ相同物の特定のアミノ酸残基の主鎖の２つ又は複数の原子の原子配位結合（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ、Ｏ上のＯ）が整列化後に０．１３ｎｍ及び好ましくは０．１ｎｍの範囲であるものとして定義される。整列化は、最良のモデルが並べられて配置されることにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩに対して問題のＥＧＩＩＩ相同物の非水素蛋白質原子の原子配位結合の最大のオーバーラップを提供した後に達成される。最良のモデルはもっとも高い解析において実験上異なるデータに関するもっとも低いＲ因子を利用可能にさせる結晶解析モデルである。
【００３８】
【数１】
2004505630.tif 000005
【００３９】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの特定の残基に機能上類似する均等な残基は、それらがＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの特定の残基に対して定義され且つ原因とされるような様式にて蛋白質の構造、基質結合又は触媒性を変更するか又は修飾するか、又は一因となるコンフォメーションを採用してよい、セルラーゼのアミノ酸として定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が相同の位置を占めることに基づいて均等の基準を満たさないかもしれないが、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子配位結合がＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍに位置する範囲に類似の位置を占めるセルラーゼの残基（ｘ線結晶解析により得られた三次構造に関して）である。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの結晶構造は、Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．２０００年８月５−９日に存在し、その開示は全体を引用により編入する。ファミリー１２のグリコシルヒドロラーゼの相同メンバーである、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓのＣｅｌｌ　Ｂの配位結合は、Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６：６０３２（１９９７）及びＳｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３８：４８２６（１９９９）に提供される。
【００４０】
「変種」は、Ｃ−末端及びＮ−末端のいずれか又は両方への一つ又は複数のアミノ酸の追加、アミノ酸配列中の一つ又は複数の異なる部位における一つ又は複数のアミノ酸の置換、蛋白質の一方又は両方の末端か又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の欠失、又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の挿入により、前駆体蛋白質（例えば、天然蛋白質）から誘導される蛋白質を意味する。酵素の変種の調製は、好ましくは、天然蛋白質をコードするＤＮＡ配列を修飾し、そのＤＮＡ配列による適当な宿主の形質転換、及び修飾されたＤＮＡ配列の発現による変種酵素の形成により達成する。発明の変種は、前駆体アミノ酸配列との比較の上で変更されたアミノ酸配列を含むペプチドを含み（例えば、野生型又は天然の状態の酵素）、そのペプチドは前駆体酵素の特徴的な酵素の性質は保持するが、いくつかの特定の側面において変更された特性を有する。例えば，ＥＧＩＩＩ変種は増加した至適ｐＨ又は増加した温度安定性又は酸化安定性を有してよいが、セルロース溶解活性は保持する。本発明による変種は、発現されたセルラーゼ誘導体の機能活性が保持されたセルラーゼ誘導体をコードするＤＮＡ断片に由来してよいことが意図される。例えば、セルラーゼをコードするＤＮＡ断片は、コードされたセルラーゼの機能活性が保持されるように、５’又は３’の何れかにおいてセルラーゼＤＮＡ配列に連結したヒンジ又はリンカーをコードするＤＮＡ配列又はその一部をさらに含んでよい。
【００４１】
「セルロース含有織物（ｆａｂｒｉｃ）」は、セルロースを含むコットン又は非コットン又はセルロースブレンドを含むコットン又は非コットンから作成された、あらゆる縫われたか又は縫われていない織物、編み糸又は繊維製品を意味し、天然セルロース誘導体及び人工セルロース誘導体（例えば、黄麻、亜麻、ラミー、レーヨン及びライオセル（ｌｙｏｃｅｌｌ））を含む。人工のセルロース含有織物の項に含まれるのは再生織物であり、当業界においてはレーヨンとしてよく知られている。他の人工セルロース含有織物は、化学修飾されたセルロース織物（例えば、アセテートにより誘導したセルロース）及び溶剤で紡いだ（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｓｐｕｎ）セルロース織物（例えば、ライオセル）を含む。セルロース含有織物に特別に含まれるのは、そのような材料から作成されたあらゆる編み糸又は繊維製品である。セルロース含有織物は、合成繊維のような材料及びウール及びシルクのような天然セルロース誘導繊維とのブレンドにしばしば取り込まれる。
【００４２】
「コットン含有織物」は、純粋なコットンまたはコットンブレンドから作られた、縫われたか又は縫われていない織物、編み糸又は繊維製品を意味し、コットンを織り込まれた織物、コットンニット、コットンデニム、コットン編み糸、未加工のコットン等を含む。コットンブレンドを用いる場合、織物中のコットンの量は、好ましくは、コットンの重量あたり少なくとも約３５％である。ブレンドとして用いる場合、織物中に用いられる相手の材料は一つ又は複数の非コットン繊維を含むことができ、セルロース誘導体又は合成繊維、例えばポリアミド繊維（例えば、ナイロン６及びナイロン６６）、アクリル繊維（例えば、ポリアクリロニトリル繊維）、及びポリエステル繊維（例えば、ポリエチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（例えば、ビニロン）、塩化ポリビニル繊維、ポリビニリデンクロリド繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維及びアラミド繊維を含む。
【００４３】
「ストーンウオッシュ組成物」は、セルロース含有織物をストーンウオッシュすることにおける使用のための製剤を意味する。ストーンウオッシュ組成物は消費者への売買のための公開の前に、即ち製造プロセスの間に、セルロース含有織物を修飾するために使用する。対照的に、界面活性剤組成物は汚れた衣服の洗濯を意図している。
【００４４】
「ストーンウオッシング」は、振動させ、そしてカスケードさせる条件、即ちデニムに対して「ストーンウオッシュ」された外観を付与するために回転ドラム洗濯機中でセルラーゼ溶液によりセルラーゼ含有織物を処理することを意味する。本発明によるセルラーゼ溶液は、そのような当業界で認識された方法においての石の使用を完全か又は一部、機能上置き換えることになる。デニムに対してストーンウオッシュされた外観を付与する方法は、米国特許第４，８３２，８６４号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。伝統的に、ストーンウオッシュ技術はインディゴ染色したコットンデニムに適用されてきた。
【００４５】
「洗浄剤組成物」は、汚れたセルロース含有織物の洗濯のための洗浄媒質中での使用のために意図される混合物を意味する。本発明のコンテクストにおいては、そのような組成物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、追加の加水分解酵素、研摩剤、漂白剤、漂白活性化剤、青み剤及び蛍光染料、ケーキング阻害剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤を含んでよい。そのような組成物は、汚れた衣服を洗濯するために一般的に使用されて、ストーンウオッシュ組成物とは対照的に製造工程において使用されない。セルラーゼを含む界面活性剤組成物は、例えば米国特許第５，２９０，４７４号及びＥＰ公開番号２７１　００４に記載されており、引用により本明細書に編入される。
【００４６】
「発現ベクター」は、適切な宿主において上記ＤＮＡの発現を作用させ得る適切な制御配列に作動可能なように連結させたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列は、転写を作用させるためのプロモーター、転写を制御するための追加のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでよい。別の細胞種が別の発現ベクターと共に使用されるのが好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて使用されるベクターのための好ましいプロモーターはＡｐｒＥプロモーターであり；Ｅ．ｃｏｌｉにおいて使用される好ましいプロモーターはＬａｃプロモーターであり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて使用される好ましいプロモーターはＰＧＫ１であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒにおいて使用される好ましいプロモーターはｇｌａＡであり、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのための好ましいプロモーターはｃｂｈＩである。ベクターはプラスミド、ファージ又は単純に有力なゲノミック挿入物であってよい。適切な宿主細胞を形質転換したら、ベクターを宿主のゲノムと独立に複製させて機能させてよく、あるいは適切な条件下でゲノム自体に組み込んでよい。本明細書においては、プラスミド及びベクターを時々交換可能に使用する。しかしながら、発明は、均等な機能を担う発現ベクターの他の形態を含むことを意図し、そして当業界にて公知であるか又は公知になる。即ち、様々な宿主／発現ベクターの組み合わせをこの発明のＤＮＡ配列を発現させるために用いてよい。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の様々な公知の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ　Ｅ１，ｐＣＲ１，ｐＢＲ３２２，ｐＭｂ９，ｐＵＣ１９及びそれらの誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、ホストレンジの広いプラスミド、例えばＲＰ４，ファージＤＮＡ、例えばファージλの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９及び他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３繊維状一本鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド例えば２μプラスミド又はそれらの誘導体、真核生物において有用なベクター、例えば動物細胞において有用なベクター及びプラスミドＤＮＡとファージのＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、例えばファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドからなってよい。本発明の発現ベクターを用いる発現技術は当業界公知であり、そして一般的には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載される。しばしば、発明のＤＮＡ配列を含むそのような発現ベクターは、組み込み事象を通して特定の種のゲノムに直接挿入することにより単細胞生物を形質転換する（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ　＆　Ｌａｓｕｒｅ，ＭＯＲＥ　ＧＥＮＥ　ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ　ＩＮ　ＦＵＮＧＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．７０−７６（１９９１）及び真菌宿主における標的化ゲノミック挿入を記載するその中で引用された文献を参照、引用により本明細書に編入される）。
【００４７】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明によるＤＮＡを含む発現ベクターに適した宿主を意味する。本発明において有用な宿主細胞は一般的に原核生物宿主及び真核生物宿主であり、発現を達成できるあらゆる形質転換可能な微生物を含む。好ましい宿主株は、限定ではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ｒ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒを含む。もっとも好ましい宿主はＡ．ｎｉｇｅｒである。宿主細胞、組換えＤＮＡ技術を用いて構築ベクターにより形質転換されるか又はトランスフェクトされる。そのような形質転換された宿主細胞は、変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするベクターを複製することができるか又は所望のペプチド生成物を発現できる。
【００４８】
「シグナル配列」は、細胞外への蛋白質の成熟形態の分泌を促進する蛋白質のＮ−末端部分に結合したアミノ酸の配列を意味する。シグナル配列のこの定義は機能性配列である。成熟形態の細胞外蛋白質は分泌プロセスの間に分断されるシグナル配列を欠く。
【００４９】
「ＤＮＡベクター」は、上で記載されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼ又は変種をコードする一つ又は複数のＤＮＡ断片又はＤＮＡ変種断片を含むヌクレオチド配列を意味し、変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの発現を誘導するために適切な宿主細胞を形質転換することに際して使用され得る。
【００５０】
「機能的に結合させた」は、制御領域、例えばプロモーター、ターミネーター、分泌シグナル又は増強領域が構造遺伝子に連結されてその遺伝子の発現を制御することを意味する。
【００５１】
本発明は、変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの発現、生成及び／又は単離及び使用に関する。これらの酵素は、以下に記載される方法に従い同定及び単離された遺伝子を利用する組換え方法により調製するのが好ましい。しかしながら、本発明における使用のための酵素は他の当業界で認識される手段、例えば天然単離物からの精製により得てよい。
【００５２】
本発明に従いＥＧＩＩＩ様セルラーゼを発現させるために形質転換される微生物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ種由来の株を含むのが有利であるかもしれない。即ち、本発明に従いＥＧＩＩＩ様セルラーゼを製造するための好ましい様式は、上記のとおりに検出されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼの一部又は全部をコードするＤＮＡの断片を少なくとも含むＤＮＡ構築物によりＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の宿主細胞を形質転換することを含む。当該ＤＮＡ構築物はプロモーターに機能するように結合させるのが一般的である。形質転換された宿主細胞は、次に、所望の蛋白質を発現する条件下にて生育させる。次に、所望の蛋白質生成物を実質均一までに精製する。
【００５３】
しかしながら、もっとも好ましい態様において、変種Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ様セルラーゼのための最良の発現媒体はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒである。Ａ．ｎｉｇｅｒによる形質転換技術の記載に関しては、その全体の引用によりその開示を編入する、ＷＯ　９８／３１８２１を参照されたい。
【００５４】
一つの態様において、株は過剰発現された蛋白質を得るための有用な株であるＴ．ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）を含む。例えば、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）により記載されたＲＬ−Ｐ３７は上昇量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能上の均等物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２６９２１）を含む。これらの株は変種ＥＧＩＩＩを過剰発現するためにも有用なはずである。
【００５５】
潜在的に有害な天然のセルロース溶解活性の不在下で変種ＥＧＩＩＩを得ることが望まれる場合、変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築物又はプラスミドの導入前に欠損させた一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を有していたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主細胞株を得るために有用である。そのような株は、引用により編入される、米国特許第５，２４６，８５３号及びＷＯ　９２／０６２０９に開示された方法により調製してよい。一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を欠落している宿主微生物中で変種ＥＧＩＩＩを発現させることにより、同定及び次の精製の手法を単純化させる。クローン化されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種からの何れの遺伝子も欠損させることができ、例えば、ｃｂｈ１，ｃｂｈ２，及びｅｇｌ３遺伝子並びにＥＧＩＩＩ及び／又はＥＧＶ蛋白質をコードするものである（例えば、それぞれ、米国特許第５，４７５，１０１号及びＷＯ　９４／２８１１７）。
【００５６】
遺伝子の欠損は、欠損されるか又は破壊されるべき所望の遺伝子の形態を当業界公知の方法によりプラスミドに挿入することにより達成してよい。欠損したプラスミドは次に適当な制限酵素部位において所望の遺伝子コーディング領域内部で切断されて、そして遺伝子コーディング配列又はその一部を選択マーカーで置き換える。欠損させるか又は破壊する遺伝子の位置の周辺のＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５から２．０ｋｂであり、選択可能なマーカー遺伝子の何れかのサイド上に保持される。適当な欠損プラスミドはその中に存在する唯一の制限酵素部位を有することにより、欠損遺伝子を含む断片、周辺ＤＮＡ配列、及び選択可能なマーカー遺伝子が単一の直鎖片として除去されることを可能にさせる。
【００５７】
選択可能なマーカーは、形質転換された微生物の欠損を可能にさせるように選択されなければならない。選択された微生物において発現されるあらゆる選択可能なマーカー遺伝子が適することになる。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種に関しては、選択可能なマーカーは形質転換体において選択可能なマーカーの存在が上記真菌の特性に顕著に影響しないように選択される。そのような選択可能なマーカーはアッセイ可能な生成物をコードする遺伝子であってよい。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の遺伝子の機能性コピーを使用してよく、宿主内で欠損しているなら、栄養要求性表現型を表す宿主株をもたらす。
【００５８】
好ましい態様において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのｐｙｒ４−誘導株は機能性ｐｙｒ４遺伝子により形質転換されて、即ち、形質転換のための選択可能なマーカーを提供する。ｐｙｒ４−誘導株は、フルオロオロティック酸（ＦＯＡ）に耐性のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の株の選択により得てよい。ｐｙｒ４遺伝子はオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードし、ウリジンの生合成に必要な酵素である。完全なｐｙｒ４遺伝子を含む株はウリジン欠損培地中で生育するが、フルオロオロティック酸には感受性である。機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠くｐｙｒ４−誘導株を選択して、ＦＯＡ耐性に関して選択することにより、生育のためにウリジンを要求することは可能である。ＦＯＡ選択技術を用いることにより、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能するコピーによりこれらの細胞を形質転換することができる（Ｂｅｒｇｅｓ　＆　Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１））。誘導株の選択は上で言及されたＦＯＡ耐性技術を用いて容易に実施され、即ち、ｐｙｒ４遺伝子は選択可能なマーカーとして好ましく用いられる。
【００５９】
一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を発現することに関する能力を欠如させるためにｐｙｒ４−Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を形質転換するため、破壊されたか又は欠損させたセルラーゼ遺伝子を含む単一のＤＮＡ断片を次に欠損プラスミドから単離して、適当なｐｙｒ−Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主を形質転換するのに用いた。次に、ｐｙｒ４遺伝子産物を発現させて即ち宿主株のウリジン栄養要求性を相補するそれらの能力に基づいて、形質転換体を同定及び選択する。サザンブロット分析を次に結果の形質転換体に実施することにより、欠損させた遺伝子のゲノミックコピーのコード領域の一部又は全てをｐｙｒ４選択可能マーカーにより置き換える二重クロスオーバー組み込み事象を確認（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）及び確証（ｃｏｎｆｉｒｍ）する。
【００６０】
上記の特定のプラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の製造に関するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。様々な遺伝子を上記技術を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種において欠損及び置換させることができる。さらに、何れかの利用可能な選択可能なマーカーを上記のとおりに用いることができる。事実、クローン化されて即ち同定された何れのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の遺伝子も上記の戦略を用いてゲノムから欠損させることができる。
【００６１】
上記のとおり、用いられた宿主株は、非機能性遺伝子又は選択された選択可能なマーカーに相当する遺伝子を欠くか又は有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の誘導体である。例えば、ｐｙｒ４の選択可能マーカーを選択したら、次に、特定のｐｙｒ４−誘導株を形質転換法においてレシピエントとして用い。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓの遺伝子ａｍｄＳ，ａｒｇＳ，ａｒｇＢ，ｔｒｐＣ，ｎｉａＤに均等なＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種遺伝子を含む選択可能なマーカーを用いてよい。対応するレシピエント株は、よって、誘導株、例えばそれぞれａｒｇＢ−，ｔｒｐＣ−，ｎｉａＤ−でなければならない。
【００６２】
次に、適当な微生物への挿入のために、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡを調製する。本発明によれば、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡは、機能するセルロース溶解活性を有する蛋白質をコードするのに必要なＤＮＡを含む。変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又は誘導体をコードするＤＮＡ変種断片は、真菌のプロモーター配列、例えばｃｂｈ１又はｅｇｌ１遺伝子のプロモーターに帰納するように連結されてよい。
【００６３】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡの一つより多いコピーを株の中で組換えることにより過剰発現を促進することも意図される。ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡは、セルラーゼをコードするＤＮＡを有する発現ベクターの構築により製造してよい。ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードする挿入されたＤＮＡ断片を有する発現ベクターは、所定の宿主生物内で自律複製可能であるか、又は宿主のＤＮＡに組み込み可能であるあらゆるベクターであってよく、典型的にはプラスミドである。好ましい態様において、遺伝子発現を得るための２種類の発現ベクターが意図される。第１は、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現される遺伝子起源である、ＤＮＡ配列を含む。遺伝子の末端削除は、不所望のＤＮＡ配列（例えば、望まないドメインをコードする配列）を欠損させることにより、それ自身の転写及び翻訳制御配列の制御下で発現されるドメインを残すことが望まれる場合に、得てよい。選択可能なマーカーも当該ベクター上に含まれることにより、新規の遺伝子配列の複数コピーの宿主への組み込みのための選択を可能にさせる。
【００６４】
第２の種類の発現ベクターは予め集合させ、そして高いレベルの転写に必要な配列及び選択可能なマーカーを含む。遺伝子又はその一部のコード領域をこの一般的な目的の発現ベクターに発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下に挿入できることが意図される。例えば、ｐＴＥＸはそのような一般的な目的の発現ベクターである。遺伝子又はその一部は強いｃｈｂ１プロモーターの下流に挿入することができる。
【００６５】
上記ベクター中では、本発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡを転写及び翻訳配列、即ち適当なプロモーター配列及びシグナル配列に作動可能なように構造遺伝子とインフレームにて連結させるべきである。プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示す如何なるＤＮＡ配列でもよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種の何れかの蛋白質をコードする遺伝子に由来してよい。上記シグナルペプチドは、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ又はその誘導体の細胞外生産を提供する。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は発現される遺伝子に天然では付随しているのが好ましいが、しかしながら、あらゆる適当な源、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来のエキソセロビオヒドラーゼ又はエンドグルカナーゼからのシグナル配列が本発明において意図される。
【００６６】
本発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡ配列のプロモーターとの連結及び適当なベクターへの挿入に用いられる手法は、当業界においてよく知られている。
【００６７】
上記のＤＮＡベクター又は構築物は、公知の技術、例えば形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、バイオリスティック砲撃等により宿主細胞に導入してよい。
【００６８】
好ましい形質転換技術において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種内のＤＮＡへの細胞壁の透過性が極めて低いことを考慮しなければならない。従って、所望のＤＮＡ配列、遺伝子又は遺伝子断片の取り込みはせいぜい最少である。形質転換プロセスの前に、誘導株（即ち、使用した選択可能なマーカーに相当する機能性遺伝子を欠く）内のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞壁の透過性を増加させるための多数の方法が存在する。
【００６９】
形質転換のためにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を製造するために本発明において好ましい方法は、真菌の菌糸体からのプロトプラストの調製を含む。菌糸体は出芽した生長性胞子から得ることができる。菌糸体を、細胞壁を消化する酵素により処理することにより、プロトプラストをもたらす。次に、プロトプラストを懸濁媒質中で浸透圧スタビライザーの存在により保護する。これらのスタビライザーはソルビトール、マニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これらのスタビライザーの濃度は０．８Ｍと１．２Ｍの間で変動する。懸濁媒質中で約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【００７０】
宿主Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種株へのＤＮＡの取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭ　ＣａＣｌ２と５０ｍＭ　ＣａＣｌ２の間が取り込み溶液において用いられる。取り込み溶液におけるカルシウムイオンに関する要求のほかにも、通常含まれる他のアイテムは緩衝系、例えばＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１ｍＭ　ＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ　ＭＯＰＳ，ｐＨ６．０バッファー（モルフォリンプロパンスルフォニック酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させて、即ち媒質の含有物がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞質へ送達されることを許容して、そしてプラスミドＤＮＡが核に移送されると信じられる。この融合は、宿主染色体へ優しく（ｔｅｎｄｅｒｌｙ）組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数コピーをしばしば残す。
【００７１】
通常、１０８から１０９／ｍＬ、好ましくは２ｘ１０８／ｍＬの密度にて透過性処理に供されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種のプロトプラスト又は細胞を含む懸濁液を形質転換に用いる。適当な溶液（例えば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭ　ＣａＣｌ２）中のこれらのプロトプラスト又は細胞の１００マイクロリットル容量を所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを取り込み溶液に加える。０．１から１容量の２５％　ＰＥＧ　４０００をプロトプラスト懸濁液に加えることができる。しかしながら、プロトプラスト懸濁液に約０．２５容量を加えるのが好ましい。付加物、例えばジメチルスルフォキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等も取り込み溶液に加えて、形質転換を補助してよい。
【００７２】
通常、上記混合物を１０分から３０分の間０℃においてインキュベートする。追加のＰＥＧを次に混合物に加えることにより、所望の遺伝子又はＤＮＡ配列のとりこみをさらに増強する。２５％　ＰＥＧ４０００を通常は形質転換混合物の容量の５から１５倍の容量にて加える；しかしながら、より高いか又はより低い容量が適当かもしれない。２５％　ＰＥＧ４０００は形質転換混合物の容量の約１０倍が好ましい。ＰＥＧを加えた後に、形質転換混合物を次に室温においてソルビトールとＣａＣｌ２溶液の添加前にインキュベートする。プロトプラスト懸濁液を次にさらに加えることにより生育培地のアリコートを溶解する。この生育培地は形質転換体の生育のみを許容する。所望の形質転換体を生育させるのに適した如何なる生育培地も本発明において使用できる。しかしながら、Ｐｙｒ＋形質転換体が選択されるなら、ウリジンを含まない生育培地を用いることが好ましい。次のコロニーをウリジン枯渇生育培地上に移して精製する。
【００７３】
この段階において、ウリジンを欠く固形培養培地上でのそれらの早い生育及び不規則な輪郭よりむしろスムーズな環状コロニーの形成により、安定な形質転換体を不安定な形質転換体から識別してよい。さらに、いくつかの場合、安定性に関するさらなる試験を、固形の非選択培地上で形質転換体を生育させ（即ちウリジンを含む）、この培養培地から胞子を回収し、そしてウリジンを欠く選択培地上でのちに出芽及び生育するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより行ってよい。
【００７４】
上記の方法の特定の態様において、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ又はその誘導体は、新規なＥＧＩＩＩ様セルラーゼ又はその誘導体の適切な後翻訳プロセスの結果として、液体培地中で生育させた後に宿主細胞から活性形態で回収される。
【００７５】
発現されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、遠心分離、濾過及び塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過物中の蛋白質の沈殿により培地からの細胞の分離を含む慣用技術により培地か回収してよい。さらに、クロマトグラフィー手法、例えばイオン交換クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーを使用してよい。抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）を天然の精製されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼに対して生じさせてよく、あるいは合成ペプチドをＥＧＩＩＩ様セルラーゼ分子の一部から製造して、ポリクローナル抗体を生じさせるために用いてよい。
【００７６】
より熱に安定なＥＧＩＩＩ様セルラーゼからの残基のＥＧＩＩＩセルラーゼへの置換はより安定なＥＧＩＩＩをもたらすことは好ましいが、それはほんの起こり得る有用な結果ではない。当業者にとって、安定性の低いＥＧＩＩＩセルラーゼをもたらす置換は、例えば、デリケートな織物を処理するのに用いる組成物において、及び活性なＥＧＩＩＩの存在の延期が望ましくない他の応用においても有用であることも明らかになる。さらに、当業者は、逆置換（ｃｏｎｖｅｒｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）が有用であることを認識する。例えば、より熱安定性の低いＥＧＩＩＩからの残基をより安定性の高いＥＧＩＩＩ様セルラーゼに置換することにより、安定性の低い（か又は高い）ＥＧＩＩＩ相同体を作成することができる。再び、低い安定性の相同体は活性なセルラーゼの存在が延期される必要がない場合に、使用することができる。
【００７７】
本発明による織物の処理は、セルラーゼを含む織物の加工又は洗浄を意図する。そのような処理は、限定ではないが、ストーンウオッシュ、セルロース含有織物の手ざわり、質感及び／又は外観を修飾すること又はセルロース含有織物の製造、洗濯／修理の間に使用される他の技術を含む。さらに、この発明のコンテクスト内での処理は、セルロース編み糸又は繊維製品からの「未成熟な」又は「死んだ」コットンの除去を意図する。未成熟なコットンは成熟コットンよりも顕著に無定形であり、そして例えば平行でない乾燥により存在する場合に質の低い織物をもたらす。本発明において意図される組成物は、さらに、よごして製造されたセルロース含有織物の洗浄における使用のためのセルラーゼ成分を含む。例えば、セルラーゼは洗濯ランドリーのための界面活性剤組成物中で使用してよい。本発明により有用な界面活性剤組成物は、特定の製剤、例えば、洗浄前の、前以て浸す、そしてホームユースの色再生組成物を含む。本明細書において記載されるそのような処理組成物は、希釈を必要とする濃縮物の形態又は希釈溶液の形態又はセルロース含有織物に直接適用できる形態であってよい。織物のセルラーゼ処理の一般的な処理技術は、例えば、ＥＰ公開番号２２０　０１６及びＧＢ出願番号Ｎｏｓ．１，３６８，５９９号及び２，０９５，２７５号に記載される。
【００７８】
本発明によるセルロース溶解物質の処理は、さらに、動物用飼料、パルプ及び／又は紙、当業界公知の食品及び穀類の処理を意図する。例えば、セルラーゼは動物飼料の有用性を高め、ウッドパルプの排水性（ｄｒａｉｎａｂｉｌｉｔｙ）を改善し、食品を増強し、そして穀類の湿潤製粉プロセス又は乾燥製粉プロセスの間に穀類中の繊維を減少させることが知られている。
【００７９】
本発明による処理は、有効量のセルラーゼ並びに他の任意の成分、例えばバッファー、界面活性剤、及び／又は研磨剤を包含する成分を含む水性溶液を含む。有効量のセルラーゼ酵素組成物はその意図される目的のために十分なセルラーゼ酵素の濃度である。即ち、例えば、本発明によるストーンウオッシング組成物中の「有効量の」セルラーゼは、例えば使い古されて色あせた外観を縫い目の中及び織物パネル中に生じさせる所望の効果を提供することになる量である。同様に、セルロース含有織物の質感及び／又は外観を改善することを意図した組成物中の「有効な量の」セルラーゼは、質感における測定可能な改善、例えば織物のスムーズさを改善すること、又は外観を改善すること、例えば織物の外観において鋭さを低下させる傾向がある毛玉（ｐｉｌｌｓ）及び原繊維（ｆｉｂｒｉｌｓ）を除去する量である。用いられるセルラーゼの量は、用いられる装置、用いられるプロセスパラメーター（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液への暴露時間等）、及びセルラーゼの活性（例えば、活性の低いセルラーゼ組成物に比較してより活性の高いセルラーゼ組成物を用いる場合、特定の溶液が低濃度のセルラーゼに必要となる）にも依存する。織物が処理される水性処理溶液中のセルラーゼの正確な濃度は、上記因子並びに所望の結果に基づいて当業者により容易に決定することができる。ストーンウオッシングプロセスにおいては、セルラーゼを約０．５から５，０００ｐｐｍ、もっとも好ましくは約１０から２００ｐｐｍ全蛋白質の濃度にて水性処理溶液中に存在させることが一般的には好ましかった。セルロース含有織物の質感及び／又は外観の改善のための組成物においては、約０．１から２０００ｐｐｍ、もっとも好ましくは約０．５から２００ｐｐｍ全蛋白質の濃度にてセルラーゼが水性処理溶液中に存在することが一般的に好ましいとされてきた。
【００８０】
好ましい処理態様において、バッファーは、用いられたセルラーゼがかっせいをていし、そして今度は用いられたセルラーゼの性質に依存する範囲内で溶液のｐＨを保持するのにバッファーの濃度が十分であるように、処理用組成物中に存在するように用いる。用いられるバッファーの正確な濃度は、当業者が容易に参酌できるいくつかの因子に依存することになる。例えば、好ましい態様において、バッファー、並びにバッファー濃度は、最適なセルラーゼ活性に必要なｐＨ範囲内で最終セルラーゼ溶液のｐＨを維持するように選択される。発明のセルラーゼの最適なｐＨ範囲の測定はよく知られた技術に従い確かめることができる。上記セルラーゼの活性範囲内のｐＨにおける適切なバッファーは、当業者によく知られている。
【００８１】
セルラーゼ及びバッファーに加えて、処理組成物は任意に界面活性剤を含んでよい。適当な界面活性剤は、上記セルラーゼ及び織物に適合可能な何れの界面活性剤も含み、例えばアニオン性、非イオン性及び両性の界面活性剤を含む。本明細書中の使用のための適当なアニオン性界面活性剤は、直鎖又は分枝のアルキルベンゼンスルフォネート；直鎖又は分枝アルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテルスルフェート；アルキル又はアルケニルエーテルスルフェート；オレフィンスルフォネート；アルカンスルフォネート等を含む。アニオン性界面活性剤のための適当なカウンターイオンは、アルカリ金属イオン、例えばナトリウム及びカリウム；アルカリ土類金属イオン、例えばカルシウム及びマグネシウム；アンモニウムイオン；及び炭素数２又は３の１から３のアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性界面活性剤は、第四級スルホン酸アンモニウム、及びベタインタイプの両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は、同じ分子中に陽性荷電基と陰性荷電基の両方を有する。非イオン性界面活性剤は一般的に、ポリオキシアルキレンエータル、並びに高脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキシド付加物、及び脂肪酸グリセリンモノエステルを含む。界面活性剤の混合物は、当業者に知られている様式にて用いられることもできる。
【００８２】
濃縮されたセルラーゼ組成物は本明細書に記載される方法における使用のために調製することができる。そのような濃縮物は、濃縮された量の上記セルラーゼ組成物、バッファー及び界面活性剤を、好ましくは水性溶液中に含む。そうして製剤化された場合、セルラーゼ濃縮物を水により希釈することにより、必要な濃度の各成分を有するセルラーゼ調製物を迅速かつ正確に調製することができる。水性濃縮物を製剤化する場合、これらの濃縮物を希釈することにより、上で示された通りに必要な濃度の成分をセルラーゼ溶液中にて達することができる。容易に明白なとおり、そのようなセルラーゼ濃縮物はセルラーゼ溶液の容易な製剤化を許容し、並びにそれが使用されることになる位置への上記組成物の便利な運搬を許容する。処理用濃縮物は当業界において認識された形態、例えば液体、エマルジョン、ゲル又はペーストであり得る。そのような形態は当業者によく知られている。
【００８３】
固形のセルラーゼ濃縮物を使用する場合、セルラーゼ組成物は顆粒、粉末、塊又は固形ディスクであってよい。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を減じる物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は、米国特許第５，２５４，２８３号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【００８４】
他の物質も所望であれば本発明のセルラーゼ組成物と共にか又は代わりに用いることができ、石、軽石、充填剤、溶剤、酵素活性化剤、及び抗−再貯蔵（ａｎｔｉ−ｒｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）剤を含み、上記組成物の最後の用途に依存する。
【００８５】
例示の目的で、ストーンウオッシング法を詳細に記載するが、しかし、記載されたパラメーターは、他の応用のために、例えば織物の質感及び／又は外観の改善のために当業者により容易に修飾される。セルロース含有織物を有効量のセルラーゼを含むセルラーゼ含有ストーンウオッシング組成物と接触させるが、処理された組成物とストーンウオッシング組成物とを混ぜ合わせて、そして即ちセルラーゼ酵素を織物に近接させることによる。次に、セルラーゼを含む水性溶液と織物を撹拌する。処理組成物が水性溶液ならば、織物は直接上記溶液中に浸してよい。同様に、ストーンウオッシング組成物が濃縮物であれば、当該濃縮物をセルラーゼ含有織物を含む水浴中に希釈する。ストーンウオッシング組成物が固体の形態、例えば洗濯前のゲル又は固形スティックの形態の場合、ストーンウオッシング組成物を直接に織物又は洗浄液体にかけることにより当該組成物を接触させてよい。
【００８６】
セルラーゼ含有織物にストーンウオッシュの外観を授与させるような酵素の作用を可能にさせる条件下で、セルラーゼ含有織物をストーンウオッシング溶液とインキュベートさせる。例えば、ストーンウオッシュの間、ｐＨ，液体比率、温度及び反応時間を調節することにより、ストーンウオッシング組成物が作用する条件を最適にしてよい。「有効な条件」は必然的に、セルラーゼ酵素が、セルラーゼ含有織物と有効に反応すること、この場合にはストーンウオッシュ効果を生じさせることを可能にさせるｐＨ，液体比率、及び温度を意味する。しかしながら、そのような条件は、当業者により容易に確かめられ得る。本発明のストーンウオッシング組成物に有効な反応条件は、対応する従来技術のセルラーゼ組成物により用いられた公知の方法に実質類似である。従って、本発明に従いストーンウオッシング組成物を使用するための条件を最大にすることは当業者の範囲内である。
【００８７】
ストーンウオッシュの間の液体の比率、即ち織物の重量に対する、ウオッシング組成物溶液（即ち、洗浄液体）の重量比率は、本明細書で用いる場合、一般的に、デニムの織物において所望のストーンウオッシュ効果を達成するのに十分な量であり、使用されるプロセスに依存する。好ましくは、液体の比率は約４：１から約５０：１、より好ましくは約５：１から約２０：１、そしてもっとも好ましくは約１０：１から約１５：１である。
【００８８】
本発明のストーンウオッシング組成物によるストーンウオッシュの間の反応温度は２つの競合因子により支配される。第１に、高い温度は、増強された反応キネティックス、即ち速い反応に一般的には対応し、低温において必要な反応時間に比較して反応時間の減少を可能にさせる。従って、セルラーゼは所定の反応温度を越えて活性を損失する蛋白質であって、その温度は使用されるセルラーゼの性質に依存する。即ち、反応温度があまりに高くなるまで許容すればセルロース溶解活性はセルラーゼの変性の結果として損失する。当業界におけるセルラーゼ使用のための標準温度は一般的に３５℃から６５℃の範囲内であり、その条件は発明のセルラーゼに適していると予測されるはずでもあるから、最適な温度条件は、使用される特定のセルラーゼに関してよく知られた技術に従い確認するべきである。
【００８９】
反応時間はストーンウオッシュが起こる特定の条件に依存する。例えば、セルラーゼのｐＨ，温度及び濃度はすべて最適反応時間に影響することになる。一般的に、反応時間は約５分から約５時間、好ましくは約１０分から約３時間、そしてより好ましくは約２０分から約１時間である。
【００９０】
本発明のまた別の好ましい態様によると、発明のセルラーゼは洗浄剤組成物中に用いてよい。本発明による洗浄剤組成物は前洗浄剤組成物、前浸潤組成物として、又は通常の洗浄又はリンスサイクルの間の洗浄のために有用である。好ましくは、本発明の洗浄剤組成物は、有効量のセルラーゼ、界面活性剤を含み、そして任意に以下に記載される他の成分を含む。
【００９１】
この発明の洗浄剤組成物の中に用いられる有効量のセルラーゼは、例えば、毛玉除去（ｄｅｐｉｌｌｉｎｇ）、軟化、抗−毛玉化、表面繊維除去、抗−灰色化及び洗浄を含む、セルラーゼ含有織物上でセルラーゼにより生じることが知られている所望の効果を授与するのに十分な量である。好ましくは、上記洗浄剤組成物中のセルラーゼは約１０ｐｐｍから約２０，０００ｐｐｍの洗浄剤の濃度にて用いられる。
【００９２】
洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の濃度は、洗浄媒質への希釈に際してセルラーゼ酵素の濃度が約０．０１から約１０００ｐｐｍ、好ましくは約０．０２ｐｐｍから約５００ｐｐｍ、そしてもっとも好ましくは約０．５ｐｐｍから約２５０ｐｐｍ全蛋白質の範囲にあるように、選択されるのが好ましい。洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の量は、洗浄剤が水に添加されて希釈されて洗浄溶液を形成する程度に依存することになる。
【００９３】
本発明の洗浄剤組成物は、当業界において認識されている形態、例えば液体中、顆粒中、エマルジョン中、ゲル中、又はペースト中であってよい。そのような形態は当業者によく知られている。固形の洗浄剤組成物を用いる場合、セルラーゼは顆粒として用いるのが好ましい。好ましくは、顆粒を製剤化することにより、セルラーゼ保護剤を追加して含ませることができる。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を低下させるための物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は米国特許第５，２５４，２８３号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【００９４】
この発明の洗浄剤組成物は表面活性化剤、例えば界面活性剤を用い、洗浄剤組成物中でのそれらの使用に関してよく知られた、アニオン性、非イオン性及び量性界面活性剤を含む。本発明の洗浄剤組物は酸性からアルカリ性のｐＨにわたる広いｐＨ範囲において使用することができる。好ましい態様において、本発明の洗浄剤組成物は、５から上で、１２を越えないｐＨを有する弱酸性（ｍｉｌｄｌｙ ａｃｉｄｉｃ）、中性又はアルカリ性の洗浄剤洗浄媒質中で使用することができる。
セルラーゼを除くヒドロラーゼ
適当なヒドロラーゼは、エステル結合に作用する、カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、ホスフェートモノエステルヒドロラーゼ、及びホスフェートジエステルヒドロラーゼ；グリコシル化合物に作用するグリコシドヒドロラーゼ；Ｎ−グリコシル化合物を加水分解する酵素；エーテル結合に作用するチオエーテルヒドロラーゼ；及びペプチド結合に作用するアミノ−アシル−ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ、アシル−アミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ及びペプチジル−ペプチドヒドロラーゼを含む。とりわけ好ましいのは、カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、及びペプチジル−ペプチドヒドロラーゼである。適当なヒドロラーゼは（１）ペプチジル−ペプチドヒドロラーゼ、例えばペプシン、ペプシンＢ，レニン、トリプシン、キモトリプシンＡ、キモトリプシンＢ、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンＣ、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリシン、レニン、ズブチリシン、アスペルギロペプチダーゼＡ、コラゲナーゼ、クロストリジオペプチダーゼＢ、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンＤ、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンＣ、ペプシンＣ、アスペルギロペプチダーゼＢ、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ及びＢ、及びアミノペプチダーゼ；（２）グリコシドヒドロラーゼ（必須成分であるセルラーゼはこのグループから除外される）、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ及びデキストラナーゼを含む。とりわけ好ましいのは、α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼである。それらは酸から中性の系で機能するが、一つはアルカリ系においてもっとも高い活性を呈する細菌から得られる；（３）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチネステラーゼ、及びクロロフィラーゼを含むカルボキシレートエステルヒドロラーゼ。それらの間で特に有効なのはリパーゼである。
【００９５】
セルラーゼ以外のヒドロラーゼは目的に従い要求されるほど、洗浄剤組成物中に混合される。好ましくは、精製された蛋白質に関して、０．００１から５重量パーセント、より好ましくは０．０２から３重量パーセントにて混合されるべきである。この酵素は、洗浄剤組成物中で単独又は他の成分と混合して粗酵素により作成された顆粒の形態で使用されるべきである。粗酵素の顆粒は、精製された酵素が顆粒の中で０．００１から５０重量パーセントである量にて使用される。顆粒は０．００２から２０、好ましくは０．１から１０重量パーセントの量にて使用される。セルラーゼに関するように、これらの顆粒を製剤化することにより、酵素保護剤及び溶解遅延剤を含ませることができる。
研磨剤
Ａ．二価封鎖剤（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）
上記組成物は、以下の化合物：ホスフェート、ホスホネート、ホスホノカルボキシレート、アミノ酸の塩、アミノポリアセテート高分子量電解質、非解離ポリマー、ジカルボキシル酸も塩、及びアルミノシリケート塩のアルカリ金属塩及びアルカノールアミン塩からなる群から選択される一つまたは複数の研磨剤を約０から約５０重量パーセント含んでよい。適当な二価の封鎖剤は英国特許出願番号２　０９４　８２６Ａに開示されており、その開示は引用により本明細書に編入される。
【００９６】
Ｂ．アルカリ又は無機電解質
上記組成物は、約１から約５０重量パーセント、好ましくは約５から約３０重量パーセントを、アルカリ又は無機電解質として、以下の化合物：シリケート、カーボネート及びスルフェートの一つ又は複数のアルカリ金属塩ナラビニ無機アルカリ、例えばトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン及びトリイソプロパノールアミンの組成物に基づいて含んでよい。
抗再沈殿剤
上記組成物は、抗再沈殿剤として約０．１から約５重量パーセントの一つ又は複数の以下の化合物：ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びカルボキシメチルルロースを含んでよい。
【００９７】
それらの間で、カルボキシメチルセルロース及び／又はポリエチレングリコールと、本発明のセルラーゼ組成物の組み合わせは本質的に有用な泥除去組成物を提供する。
漂白剤
本発明のセルラーゼの漂白剤、例えばモノ過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硼酸ナトリウム、硫酸ナトリウム／過酸化水素付加物及び塩化ナトリウム／過酸化水素付加物又は／及び光感受性漂白染料、例えばスルフォン酸フタロシアニンノアルミニウム塩と組み合わせた使用は、洗浄剤の効果をさらに改善する。同様に、ＥＰ　６８４　３０４に記載された漂白剤及び漂白触媒を使用してよい。
青み剤及び蛍光染料
様々な青み剤及び蛍光剤を必要であれば上記組成物において用いてよい。適当な青み剤と蛍光染料は、英国特許出願番号２　０９４　８２６Ａに開示されており、その開示は引用により本明細書に編入される。
ケーキング阻害剤
以下のケーキング阻害剤を粉末洗浄剤の中に混合してよい：ｐ−トルエスルフォン酸塩、キシレンスルフォン酸塩、酢酸塩、スルフォン琥珀酸塩、タルク、微細に粉状にされたシリカ、非晶シリカ、クレイ、珪酸カルシウム（例えば、Ｊｏｈｎｓ　Ｍａｎｖｉｌｌｅ社のマイクロセル）、炭酸カルシウム及び酸化マグネシウム。
セルラーゼ活性を阻害する因子のマスク剤
この発明のセルラーゼ組成物は、銅、亜鉛、クロミウム、水銀、鉛又は銀イオン又はそれらの化合物の存在下でいくつかの場合において脱活性化される。様々な金属キレート剤及び金属沈殿剤がこれらの阻害剤に有効である。それらは、例えば、任意の付加物並びに珪酸マグネシウム及び硫酸マグネシウムに関して上記の項目においてリストされた二価金属イオン封鎖剤を含む。
【００９８】
セロビオース、グルコース及びグルコノラクトンはときどき阻害剤として作用する。これらのサッカライドとセルラーゼの共存は出来る限り避けることが好ましい。共存が避けがたい場合には、例えばそれらをコーティングすることによりサッカライドとセルラーゼの直接の接触を避ける必要がある。
【００９９】
長鎖の脂肪酸塩及びカチオン性界面活性剤はいくつかの場合に阻害剤として作用する。しかしながら、これらの物質のセルラーゼとの共存は、それらの直接の接触がいくつかの手段、例えば錠剤化又はコーティングにより避けられるなら許容可能である。
【０１００】
上記のマスキング剤及び方法は必要であれば本発明において採用してよい。
セルラーゼ−活性化剤
活性化剤は特定のセルラーゼに依存して変更してよい。蛋白質、コバルト及びその塩、マグネシウム及びその塩、及びカルシウム及びその塩、カリウム及びその塩、ナトリウム及びその塩又はモノサッカライド、例えばマンノース及びキシロースの存在下において、多くのセルラーゼは活性化されて、それらの洗浄剤粉末が顕著に改善される。
抗酸化剤
抗酸化剤は、例えば、第三級−ブチル−ヒドロキシトルエン，４，４’−ブチリデンビス（６−第三級−ブチル−３−メチルフェノール）、２，２’−ブチリデンビス（６−第三級−ブチル−４−メチルフェノール），モノスチレン化クレゾール、ジスチレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジスチレン化フェノール及び１，１−ビス（４−ヒドロキシ−フェニル）シクロヘキサンを含む。
可溶化剤
可溶化剤は、例えば、低級アルコール、例えばエタノール、ベンゼンスルフォン酸塩、低級アルキルベンゼンスルフォン酸塩、例えばｐ−トルエンスルフォン酸塩、グリコール例えばプロピレングリコール、アセチルベンゼン−スルフォン酸塩、アセトアミド、ピリジンジカルボキシル酸アミド、安息香酸塩及び尿素を含む。
【０１０１】
本発明の洗浄剤組成物は酸性からアルカリ性のｐＨにわたる広いｐＨ範囲において使用することができる。好ましい態様において、本発明の洗浄剤組成物は、５より上から約１２を越えないｐＨを有する弱酸性、中性、又はアルカリ洗浄剤洗浄媒質中で使用することができる。
【０１０２】
上記成分とは別に、香料、バッファー、保存剤、染料等を、所望であれば、この発明の洗浄剤組成物と共に用いることができる。そのような成分は当業界において使用されたこれまでの量にて慣用的に使用される。
【０１０３】
本発明において使用される洗浄剤ベースが粉末の形態の場合、スプレー乾燥法及び顆粒化法を含む公知のあらゆる製造方法により調製されるものであってよい。特にスプレー乾燥法、凝塊形成法、乾燥混合法又は非タワールート法により得られる洗浄剤ベースが好ましい。スプレー乾燥法により得られる洗浄剤ベースは中空の顆粒であって、熱耐性成分、例えば表面活性剤及び研磨剤の水性スラリーをホットスペースにスプレーすることにより得られる。スプレー乾燥した後に、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリ研磨剤を加えてよい。例えばスプレー乾燥顆粒化又は凝塊形成法により得られる高い密度の顆粒洗浄剤ベースを用いる場合、様々な成分をベースの調製後に加えてもよい。
【０１０４】
洗浄剤ベースが液体の場合、均質な溶液か又は不均質な分散の何れかであってよい。洗浄剤中のセルラーゼによるカルボキシルメチルセルラーゼの分解物を除去するためには、組成物の取り込み前にカルボキシルメチルセルラーゼを顆粒化するか又はコートする。
【０１０５】
この発明の洗浄剤組成物は、これらの環境において慣用に用いられる温度、反応時間及び液体比率における工業上の使用及び家庭内の使用において、セルロース含有織物、例えば織物とインキュベートしてよい。インキュベーション時間、即ち本発明により洗浄剤組成物を用いてセルロース含有織物を処理するために有効な条件は、当業者により容易に確認されることになる。従って、本発明の洗浄剤による処理に有効な適切な条件は、公知のセルラーゼを含む類似の洗浄剤組成物を用いたものに相当する。
【０１０６】
本発明による洗浄剤は、柔軟化、毛玉除去、毛玉化阻止、表面繊維除去又は洗浄に所望の改善を提供するための十分な活性が存在する中間ｐＨにおいて適切な溶液中での前洗浄としてさらに製剤化してよい。洗浄剤組成物が前浸潤（例えば、前洗浄又は前処理）組成物であり、液体、スプレー、ゲル又はペースト組成物のいずれかである場合、セルラーゼ酵素は、前浸潤組成物又は前処理組成物の全重量に対して、約０．０００１から約１重量パーセントにて用いるのが一般的である。そのような組成物においては、界面活性剤を用いてよく、用いる場合は、前浸潤の全重量に対して約０．００５から約２０重量パーセントの濃度にて存在してよい。組成物の残りは、前浸潤において使用される慣用の成分、例えば、希釈剤、バッファー、他の酵素（プロテアーゼ）等をそれらの慣用の濃度にて含む。
【０１０７】
本明細書に記載されたセルラーゼ酵素を含む組成物は、色あせた織物に色を回復させるために適した標準単独組成物としての家庭内の使用において使用することができ（その全体を引用により本明細書に編入する、米国特許第４，７３８，６８２号を例えば参照されたい）、並びにスポット剥離剤において及び毛玉除去又は抗毛玉化（毛玉阻害）のために使用することができることを意図する。
【０１０８】
発明によるセルラーゼの使用は、飼料の添加物及びパルプ及び上の加工において特に有用であるかもしれない。これらの追加の工業上の応用は、例えばそれぞれ、ＰＣＴ公開番号９５／１６３６０及び終了した許可された特許番号８７３７２に記載される。
【０１０９】
本発明及びその利点をさらに例示するために、以下の特定の実施例を、本発明を例示するために提供されるという理解のもとに提供するが、如何なる様式においてもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１０】
実施例
実施例１：ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするゲノミックＤＮＡの調製
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼが特定の生物のＤＮＡによりコードされているか否かを決定するためにＰＣＲ反応に着手する目的で、いくつかの異なる微生物に関してゲノミックＤＮＡを調製した。
【０１１１】
ゲノミックＤＮＡは、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｂｒａｃｈｙｐｅｎｉｕｍ　寄託番号　ＣＢＳ　８６６．７３；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｂｒａｓｉｌｌｉｅｎｃｅ　寄託番号　ＣＢＳ　１４０．５０；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｖｉｔｅｌｌｉｕｍ　寄託番号　ＣＢＳ　２５０．８５；Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ　寄託番号　ＣＢＳ　６５３．７３；Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｅｑｕｉｓｅｔｉ　寄託番号　ＣＢＳ　１８５．３４；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ　寄託番号　ＣＢＳ　４４３．６５；Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ　ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｉａ　寄託番号　ＣＢＳ　２２５．６３；Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ　寄託番号　ＡＴＣＣ　４８１０３−４８１０４；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎｏｔａｔｕｍ　寄託番号　ＡＴＣＣ　９１７８，９１７９；及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ　寄託番号　ＡＴＣＣ　２８３２６から得て、標準の方法に従い単離した。
【０１１２】
ＰＣＲは、ＭＪリサーチ社のＰＣＴ−１５０　ＭｉｃｒｏＣｙｃｌｅｒのような標準のＰＣＲマシン上で、以下の条件下において実施した：
１）１分間、９８℃、１サイクル；
２）１分間、９４℃、
９０秒間、４０℃、
１分間、７２℃
３）工程２を３０サイクル繰り返す、
４）７分間、７２℃、１サイクル、及び
５）低温から１５℃にて貯蔵及び次の分析。
【０１１３】
以下のＤＮＡプライマーを、様々な微生物から構築されたライブラリーからのＥＧＩＩＩ遺伝子の増幅における使用のために構築した。蛋白質及びＤＮＡの配列に関する本明細書中の全てのシンボルは、ＩＵＰＡＣ　ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎコードに対応する。
【０１１４】
【化３】
2004505630.tif 000006
【０１１５】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：１０μＬの１０Ｘ反応バッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ８−８．５；２５０ｍＭ　ＫＣｌ；５０ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４；２０ｍＭ　ＭｇＳＯ４を含む１０Ｘ反応バッファー）；０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ（最終濃度）；１μＬの１００ｎｇ／μＬのゲノミックＤＮＡ；１μＬのＰＷＯポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム、カタログ番号１６４４−９４７）をμＬあたり１ユニット；５００ｍＭのプライマー（最終濃度）及び水を１００μＬまで。上記溶液にミネラルオイルを重層した。
【０１１６】
ＰＣＲの戦略は以下のとおりであった：ＢＯＸ１及びＢＯＸ１’のフォワードプライマーを、ＢＯＸ３からのリバースドプライマーと、所望のゲノミックＤＮＡサンプルと共に混合し、そして４００−１０００塩基対の範囲の断片を得るためゲル上を移動させた。そうして得られた断片をプールして、当該プールを２つのおおよそ等しい部分に分割した（ｓｐｌｉｔ）。第１のプールを、ＢＯＸ１及びＢＯＸ１’からのフォワードプライマーと、ＢＯＸ２からのリバースドプライマーと共に、混合した。第２のプールを、ＢＯＸ２と、ＢＯＸ３からのリバースドプライマーと共に、混合した。上記遺伝子内のプライマーの位置を考慮してＥＧＩＩＩ様セルラーゼに比較して近似のサイズを有する断片、この場合約２５０−５００塩基対に相当する断片を単離して配列決定した。
【０１１７】
配列決定した断片から、完全長の遺伝子の配列を迅速に得るために、ＲＡＧＥ技術（ゲノミックの末端の迅速な増幅）を使用することが可能であった。完全長の遺伝子を得て、図３のいくつかの追加のＥＧＩＩＩ様セルラーゼを提供する。図３に示すとおり、Ｈｙｐｏｃｒｅａ　ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ（１），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ（２），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｂｒａｓｉｌｌｉｅｎｓｅ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｅｑｕｉｓｅｔｉ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ（１），Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ（２），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（１），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（２），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（３），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（４），Ｍｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ　ｅｃｈｉｎａｔａ，Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ　１１ＡＧ８，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ　ＣｅｌＢ，Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ，及びＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖａｒａから単離された全部が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩに有意な相同性を含んだ。
実施例２：ＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ様セルラーゼの温度安定性試験
Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ，Ｅｍｅｒｃｅｌｌａ　ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ及びＭｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ　ｅｃｈｉｎａｔａ由来のＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ様セルラーゼを、温度ストレス下のそれらの安定性を測定するために試験した。
【０１１８】
安定性は、固定された高い温度においてインキュベーションの際の活性の損失の速度をたどることによりアッセイした：５０ｍＭクエン酸／リン酸バッファーｐＨ８．０中において０．１ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌの間のＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ様セルラーゼの溶液を水浴中で４８℃においてインキュベートした。測定された時間において、１００μｌアリコートを取り出して、素早く冷やした（又は冷凍した）。これらのアリコート中の残りの活性は以下に詳細なとおりにアッセイされた。不可逆な熱不活性化曲線が残存活性対時間をプロットすることにより生じ、そしてデータは単一の対数減衰にフィットした。この対数減衰のハーフタイムを熱安定性の測定値として決定した。
【０１１９】
活性のアッセイは以下のとおりに実施した：９６ウエルマイクロタイタープレートのウエル中において、１０μＬの酵素サンプルを５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．７中の１２０μＬの基質（４．２ｍｇ／ｍｌ　ｏ−ニトロフェニルセロビオシド）に加えた。次に、プレートを１０分間４０℃においてインキュベートして、反応を７０μＬの０．２Ｍグリシンにより停止させた。４１０ｎｍにおける吸光をマイクロタイタープレートリーダー中で測定した。このエンドポイントの４１０ｎｍの読みは、上記酵素サンプル中のセルラーゼ活性に比例した。
【０１２０】
安定性試験の結果を表１に示す。
【０１２１】
【表１】
2004505630.tif 000007
上記の結果から認識し得るとおり、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼはＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩに対して相対的に相同であるにも拘わらず、有意に改善された安定性を有した。従って、より安定な相同体において異なる残基がＥＧＩＩＩ様セルラーゼの改善された安定性に必須であり、そしてそのようにして、これらの残基を修飾することによりＥＧＩＩＩ様セルラーゼ及びＥＧＩＩＩ自体のさらなる改善がＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ様セルラーゼの安定性の追加の改善をもたらすことは明らかである。
実施例３：熱安定性のＥＧＩＩＩ様セルラーゼからの残基を有するＥＧＩＩＩの安定性
以下のプライマー落ちいて、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ及びＨ．ｇｒｉｓｅａ由来のＥＧＩＩＩ様セルラーゼの中のシステイン置換を生じさせた。ＰＣＲは公知の技術に従い実施した。
【０１２２】
【表２】
2004505630.tif 000008
【０１２３】
簡単に云うと、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡをｃＤＮＡクローンから（Ｗａｒｄ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｒｉｃｅｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　”Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．”Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ　１９９３　Ｅｄ．Ｓｏｕｍｉｎｅｎ，Ｐ．ａｎｄ　Ｒｅｉｎｉｋａｎｅｎ，Ｔ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８，ｐｐ１５３−１５８；米国特許第５，４７５，１０１号）、ｅｇｌ３遺伝子の５’末端にＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（最初のＡＴＧコドンのすぐ上流）及び３’末端にＸｂａＩ部位を導入した（「停止」コドンのすぐ下流）ＰＣＲプライマーを用いて、増幅した。増幅された断片を、次に、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩにより消化して、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結した。
【０１２４】
変種はこのプロトプラスト中においてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）変異導入法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作成した。変種遺伝子を次にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの発現ベクターｐＧＡＰＴ−ｐｙｒＧにサブクローン化した。これは、必須でないＤＮＡが切り出されているＰＧＰＴ−ｐｙｒＧ（Ｂｅｒｋａ　ａｎｄ　Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｄｖ．７：１２７（１９８９））の変種である。変種遺伝子を有するベクターにより次にＡ．ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ：ａｗａｍｏｒを形質転換して、その結果の株を撹拌フラスコ培養にて成育させた（ＷＯ　９８／３１８２１）。
【０１２５】
ＥＧＩＩＩ変種を次にこれらの培養物の細胞不含上清からカラムクロマトグラフィーにより精製した。簡単に云えば、１０ｍｇのＥＧＩＩＩあたり、約１ｍＬのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｕｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（高速流）樹脂を０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む使い捨てドリップカラムに負荷した。当該カラムを次に０．０５ＭのＢｉｓ　Ｔｒｉｓ　Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８により平衡化した。
【０１２６】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを含む上清を一晩０．１８ｍｇ／ｍＬのエンドグルカナーゼＨにより３７℃において処理した。硫酸アンモニウムを処理上清に約０．５Ｍの最終濃度まで加えた。遠心分離後に、上清を上記カラムに負荷した。当該カラムを次に３容量の平衡化バッファーにより洗浄して、次に２ｘ１容量の０．０５Ｍ　Ｂｉｓ　Ｔｒｉｓ　Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．０５Ｍ酢酸安アンモニウムによりｐＨ８にて溶出した。フロースルーの各容量を別々の画分として回収したところ、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは第２の画分に出現した。
【０１２７】
平衡ＣＤ実験を、Ａｖｉｖにより供給された５位の熱電気セルホルダーを備えたＡｖｉｖ　６２ＤＳ又は６２ＡＤＳ分光光度計により実施した。バッファー条件は酢酸によりｐＨ８．０に調節された５０ｍＭ　ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン及び５０ｍＭ酢酸アンモニウムであった。各実験に関する最終蛋白質濃度は、５−３０μＭの範囲であった。データを０．１ｃｍのパスの長さのセルに回収した。
【０１２８】
スペクトルを２６５〜２１０ｎｍにおいて回収した。熱編成は２１７ｎｍにおいて３０から９０℃において実施して、データを２℃おきに回収した。各温度における平衡時間は０．１分であり、そしてデータはサンプルあたり４秒間回収した。
【０１２９】
ｐＨ８．０サンプルの残りを５ｘ４００ｕＬアリコートに分割した。２つのサンプルを酢酸によｐＨ５から７に調節して、２つのその他を水酸化ナトリウムによりｐＨ９及び１０に調節した。全５サンプルの熱変性は上記のとおりに同時に実施した。融点を、Ｌｕｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４：１０６６９及びＧｌｏｓｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６：５６１２の方法により測定した。
【０１３０】
【表３】
2004505630.tif 000009
【０１３１】
認識し得るとおり、ＥＧＩＩＩ相同対からＥＧＩＩＩへの好ましい残基の補充は様々な効果を有した。一つの例において、３５位置のアラニンのバリンへの変更は酵素の熱安定性を有意に増加させた。別の例においては、３１位のグリシンのグルタミンへの変更が酵素の熱安定性を有意に低下させた。
実施例４：変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの比活性
比活性をアッセイするため、ＮＰＣの加水分解アッセイを用いた。マイクロタイタープレート中で、１００μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５及び２０μｌの２５ｍｇ／ｍＬ　ｏ−ＮＰＣ（ｏ−ニトロフェニルｏ−Ｄ−セロビオシド（シグマＮ　４７６４））をアッセイバッファー中で加えた。プレートを１０分間４０℃においてインキュベートした。
【０１３２】
平衡化したら、１０μｌのＥＧＩＩＩ様セルラーゼを加えて、プレートを４０℃においてさらに１０分間インキュベートした。加水分解を消滅させて反応を停止するため、７０μＬの０．２Ｍグリシン、ｐＨ１０．０を加えた。次に、プレートをマイクロタイターリーダー中で４１０ｎｍにおいて読んだ。規準として、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの１０μＬの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液は約０．３付近のＯＤを提供した。
【０１３３】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの濃度を２８０ｎｍにおける吸光により測定したが、減衰定数はＰａｃｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｓｃｉ．４：２４１１（１９９５）に記載されたＥｄｅｌｈｏｃｈの方法により実験上測定された７８７１１　Ｍ−１ｃｍ−１又は３．３５２ｇ／Ｌ−１であった。
【０１３４】
【表４】
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【０１３５】
表４から認識し得るとおり、ＥＧＩＩＩ由来のＥＧＩＩＩ様セルラーゼを安定化させる変異は、活性を維持させる。３１位のグリシンのグルタミンへの変更は熱安定性を有意に低下させたが、活性も有意に低下させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明により記載された残基を示すＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉの成熟ＥＧＩＩＩ蛋白質のアミノ酸配列を示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）。
【図２】
図２は、イントロンを除いたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩのＤＮＡ配列を示す。
【図３】
図３は、２０のＥＧＩＩＩ様セルラーゼの完全長のＥＧＩＩＩの整列化における整列化を示し、一次配列モデリングに基づいた均等残基を示し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ，Ｈｙｐｏｃｒｅａ　ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ（１），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ（２），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｂｒａｓｉｌｌｉｅｎｓｅ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｅｑｕｉｓｅｔｉ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ（１），Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ（２），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（１），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（２），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（３），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ（４），Ｍｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ　ｅｃｈｉｎａｔａ，Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ　１１ＡＧ８，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ　ＣｅｌＢ，Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ，及びＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖａｒａを含む。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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