(57)【要約】本発明は特定のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性抑制剤としてのプロトベルベリン誘導体の用途を提供することを目的とするものである。シゾサカロマイセス・ポンベを培養し、前記プロトベルベリンの前記リン酸化酵素に対する最小阻害濃度を決定してから、前述のプロトベルベリン誘導体を、３種のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するそれぞれの経路のノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）変異体に処理し、その影響を測定した。これを以って、ｗｉｓ１−ｓｐｃ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達系のｗｉｓ１およびｓｐｃ１ノックアウト変異体にのみ影響を及ぼすことを確認した。次に、このような各プロトベルベリン誘導体が、ｗｉｓ１−ｓｐｃ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達系の全体に作用しているか、あるいはそのシグナル伝達系内のｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素にのみ作用しているかを測定した。これを測定するために、ｗｉｓ１およびｓｐｃ１の上流にあるマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化リン酸化リン酸化酵素に対する遺伝子であるｗｉｎ１およびｗｉｓ４ノックアウト変異体に対する影響を測定した結果、ｗｉｎ１およびｗｉｓ４には作用しないので、このような各プロトベルベリン誘導体はｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素の活性のみを抑制するということを見出した。
2004503500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で表されるプロトベルベリン誘導体でなる、マイトジェンにより活性化されるタンパク質（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ）に対するリン酸化酵素（ｋｉｎａｓｅ）の活性抑制剤。
【化１】
2004503500.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または互いに異なる、炭素数１ないし５のアルコキシ基を示し、
Ｒ４は、水素原子または下記の一般式（ＩＩ）で表される基を示し、
Ａ−は、無機酸イオン、有機酸イオンまたはハライドを示す。）
【化２】
2004503500.tif 000014
（式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、同一または互いに異なっており、水素、ハロゲン、炭素数１ないし５のアルキル基、トリフルオロメチル、フェニル、置換されたフェニル、ニトロ、炭素数１ないし４のアルコキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、フェノキシ、ビニル、またはメトキシカルボキシル基を示す。）
【請求項２】
前記Ｒ１−Ｒ２はメチレンジオキシ基（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）を示し、
前記Ｒ３はメトキシ基を示し、
前記Ｒ４は４−（ｔ−ブチル）ベンジル基を示し、
前記Ａ−はクロリドを示す
プロトベルベリン誘導体であって、
請求項１に記載のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性抑制剤。
【請求項３】
前記Ｒ１−Ｒ２はメチレンジオキシ基（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）を示し、
前記Ｒ３はメトキシ基を示し、
前記Ｒ４は４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル基を示し、
前記Ａ−はクロリドを示す
プロトベルベリン誘導体であって、
請求項１に記載のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性抑制剤。
【請求項４】
前記Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は共にプロポキシ基を示し、
Ｒ４は水素原子を示し、
Ａ−はヨウ素を示す
プロトベルベリン誘導体であって、
請求項１に記載のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）により活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性を抑制するプロトベルベリン誘導体に係り、より詳しくは、マイトジェンにより活性化されるタンパク質（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ）に対するリン酸化酵素（ｋｉｎａｓｅ）が機能する細胞内のシグナル伝達系において、ｗｉｓ１またはｓｐｃ１リン酸化酵素の活性を抑制するプロトベルベリン誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内のシグナル伝達系は、生命現象の維持のために必須な細胞の成長や分裂などを調節し、特に、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入する細胞内シグナル伝達系は、細胞が成長因子、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）またはホルモンなど種々のマイトジェンによる刺激を受けたとき、リン酸化酵素が次のリン酸化酵素をリン酸化し活性化する方法にて細胞外からの刺激を細胞内に伝達する。
【０００３】
これは、細胞内の種々の中間伝達物質を介し細胞外からの刺激を実際に核内に伝達し転写調節因子を活性化し、細胞内の他の標的タンパク質を活性化することにより、細胞の成長および分化の生理活性を誘導する。かかる作用機序は酵母から哺乳類動物に至るまで様々な生命体で維持されている〔Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ，１９，４７０（１９９４）〕。
【０００４】
細胞分裂およびシグナル伝達過程の変異体の蓄積されている、分子遺伝学的な接近の容易な分裂型酵母である、シゾサカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｏｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）細胞には、外部環境の変化を認知しそれを細胞内に伝達し、また細胞の形態を維持する３種のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の伝達経路が存在していると知られており、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化リン酸化リン酸化酵素（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化リン酸化酵素（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の順にシグナル伝達が行われる〔Ｎｅｉｍａｎ，Ａ．，ＴＩＧＳ，９，３９０（１９９３）：Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ，８０，１７９（１９９５）〕。
【０００５】
前記経路としては、例えば培地内の栄養分が枯渇したときや、またはメイティング・フェロモン（ｍａｔｉｎｇ ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）などに反応し、そのシグナルを細胞内に伝達し、細胞形態の変化を誘導するラス・シグナル経路（Ｒａｓ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ）、浸透圧性ストレス（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ）などの細胞外からのストレスを細胞内に伝達するｗｉｓ１−ｓｐｃ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入する経路、および浸透圧性ストレスなどの細胞外からの刺激に反応し細胞壁の再形成およびサイトキネシス（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）を調節するｓｐｍ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入する経路、などが挙げられる。
【０００６】
その殆どがこれらのマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達経路における遺伝子の異常は、正常の環境では成長に影響を及ぼさないが、外部の環境を変化させたときはその変化に対応できなくなり、細胞の成長が抑制されたり、過分裂または細胞形態の変化などを伴ったりする。
【０００７】
一方、本発明におけるプロトベルベリン誘導体は、ベルベリンを先導化合物（ｌｅａｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）とし合成したもので、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）のような皮膚糸状菌を含めた真菌に対し致死効果または成長抑制効果を表わす。様々なプロトベルベリン誘導体は、ラノステロール（ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ）が７−還元酵素によりエルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）に変る段階において作用し、細胞膜形成に影響を与えると共に、細胞壁の主成分であるキチンの合成に関与する様々なキチン合成酵素の活性を抑制することにより抗真菌性を表わす。しかし、これらの抗真菌剤が、どのように生理活性を抑制しているかに対する機序は未だに知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、プロトベルベリン誘導体を、特定のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性抑制剤としての用途を提供することである。本発明では、細胞外の環境変化を認知しその細胞外からの刺激を細胞内に伝達し、また細胞の形態を維持する機序が知られているシゾサカロマイセス・ポンベを用いて、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達系内の特定のｗｉｓ１、ｓｐｃ１リン酸化酵素の活性を直接に抑制するプロトベルベリン誘導体の用途を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明のプロトベルベリン誘導体は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物である。
【００１０】
【化３】
2004503500.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または互いに異なっており、炭素数１ないし５のアルコキシ基を示し、Ｒ４は、水素原子または下記の一般式（ＩＩ）で表される基を示し、Ａ−は、無機酸イオン、有機酸イオンまたはハライドを示す。）
【００１２】
【化４】
2004503500.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、同一または互いに異なっており、水素、ハロゲン、炭素数１ないし５のアルキル基、トリフルオロメチル、フェニル、置換されたフェニル、ニトロ、炭素数１ないし４のアルコキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、フェノキシ、ビニル、またはメトキシカルボキシル基を示す。）
また、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、特に、Ｒ１−Ｒ２がメチレンジオキシ基（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）を示し、Ｒ３がメトキシ基を示し、Ｒ４が３，４−ジメチルベンジル基を示す化合物であるか、Ｒ１−Ｒ２がメチレンジオキシ基（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）を示し、Ｒ３がメトキシ基を示し、Ｒ４が４−（ｔ−ブチル）ベンジル基を示す化合物であるか、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が共にメトキシ基を示し、Ｒ４が３，４−ジメチルベンジル基を示す化合物であるか、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が共にメトキシ基を示し、Ｒ４が４−イソプロピルベンジル基を示す化合物であるか、Ｒ１−Ｒ２がメチレンジオキシ基（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）を示し、Ｒ３がメトキシ基を示し、Ｒ４が４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル基を示す化合物であるか、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が共にメトキシ基を示し、Ｒ４が４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル基を示す化合物であるか、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が共にメトキシ基を示し、Ｒ４が４−フェニルベンジル基を示す化合物であるか、またはＲ１、Ｒ２およびＲ３が共にプロポキシ基を示し、Ｒ４が水素原子を示す化合物であるとき、本発明のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性抑制剤として好ましい。
【００１４】
本発明のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性抑制剤であるプロトベルベリン誘導体としては、例えば、１３−ベンジルベルベリン＝ヨージド、１３−（４−クロロベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（３−ブロモベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（２，３−ジクロロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，４−ジメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチル−３−ニトロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（３−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−トリフルオロメトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシカルボニルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−ｉ−プロピルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）パルマチン＝ヨージド、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）パルマチン＝クロリド、２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドなどが挙げられ、これは大韓民国特許出願第２５８８４９号およびアメリカ合衆国特許第６００８３５６号の明細書に詳細に記載されている。
【００１５】
本発明では、シゾサカロマイセス・ポンベを培養し、前記プロトベルベリンの前記リン酸化酵素に対する最小阻害濃度を決定してから、前述のプロトベルベリン誘導体を、３種のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するそれぞれの経路のノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）変異体に処理し、その影響を測定した。これを以って、ｗｉｓ１−ｓｐｃ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達系のｗｉｓ１およびｓｐｃ１ノックアウト変異体にのみ影響を及ぼすことを確認した。次に、このような各プロトベルベリン誘導体が、ｗｉｓ１−ｓｐｃ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達系の全体に作用しているか、あるいはそのシグナル伝達系内のｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素にのみ作用しているかを測定した。
【００１６】
それを測定するために、ｗｉｓ１およびｓｐｃ１の上流にあるマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化リン酸化リン酸化酵素に対する遺伝子であるｗｉｎ１およびｗｉｓ４ノックアウト変異体に対する影響を測定した結果、ｗｉｎ１およびｗｉｓ４には作用しないので、かかる各プロトベルベリン誘導体はｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素の活性のみを抑制するということを見出した。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図面および実施例を以って、本発明におけるマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性抑制剤としてのプロトベルベリン誘導体の用途を詳細に説明するが、本発明の権利範囲が下記実施例に記載される事項のみに制限されるものではない。
【００１８】
【実施例】
〔実施例１：各プロトベルベリン誘導体のシゾサカロマイセス・ポンベに対する最小阻害濃度の測定〕
シゾサカロマイセス・ポンベの野生型菌株であるＫＧＹ２４６を、０．７５ｍｇ／Ｌのアデニンおよびウラシルが含有されたリッチ培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕｍ）であるＹＥＡＵ〔イースト破砕物、ペプトン、麦芽エキス（ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、デキストロ、寒天；ｐＨ６．２〕において対数増殖期（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで培養した。各プロトベルベリン誘導体の最小阻害濃度を決定するために、対数増殖期の細胞を様々な濃度のプロトベルベリン誘導体を含有するＹＥＡＵ培地に移し、１２時間培養した後、３時間の間隔で細胞数を測定し、細胞数が一定に維持される濃度を最小阻害濃度として決定した。本発明のプロトベルベリン誘導体である、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリド、および２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドの最小阻害濃度は、それぞれ２０μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌであった。ここで、溶媒自体による細胞成長抑制の効果を最小限にするために、１０％エタノールを各プロトベルベリン誘導体の溶媒として使用した。なお、１３−ベンジルベルベリン＝ヨージド、１３−（４−クロロベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（３−ブロモベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（２，３−ジクロロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，４−ジメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチル−３−ニトロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（３−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−トリフルオロメトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシカルボニルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−ｉ−プロピルベンジル）ベルベリン＝クロリドを用い、上記の培養および測定の過程を繰り返した結果、これらの化合物においても、同様に、１８ないし２２μｇ／ｍｌの最小阻害濃度を示した。
【００１９】
〔実施例２：各プロトベルベリン誘導体の様々なシゾサカロマイセス・ポンベノックアウト変異体に対する影響〕
本発明の各プロトベルベリン誘導体の細胞の成長に及ぼす影響を調べるために、それぞれの菌株を前記リッチ培地であるＹＥＡＵにおいて対数増殖期（５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで培養した後、対数増殖期に到達した細胞をそれぞれ２０μｇ／ｍｌの１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、２０μｇ／ｍｌの１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリド、および７μｇ／ｍｌの２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドを含有するＹＥＡＵ培地に移し、再び１２時間培養し、３時間の間隔で細胞数を測定した。次いで、酵母の成長を阻害すると既に一般に知られているミコナゾールを３μｇ／ｍｌの濃度で処理し、その結果を相互比較することにより、各プロトベルベリン誘導体が、細胞成長への影響において、特異性を有していることを証明した。
【００２０】
本発明において用いられたそれぞれのシゾサカロマイセス・ポンベの菌株（ｓｔｒａｉｎ）を下記の表１に示す。
【００２１】
【表１】
2004503500.tif 000005
【００２２】
シゾサカロマイセス・ポンベの野生型は、表２のように、プロトベルベリン誘導体が存在するときにその細胞増殖が抑制され、公知のマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入する経路をそれぞれのノックアウト変異体で処理しその影響を測定した結果、表２および表３に示すように、野生型による影響と同様の結果を表わした。表５に示すように、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素を認知するｗｉｓ１ノックアウト変異体は、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリド、または２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドにより、その成長が抑制されなかった。表６に示すように、ｗｉｓ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素によりリン酸化され活性化されるｓｐｃ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素を認知するｓｐｃ１ノックアウト変異体は、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリドによってはその成長が全く抑制されておらず、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリドによっては部分的にその成長が抑制されており、また、２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドによってはその成長が完全に抑制された。すなわち、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリド、または２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドは、ｗｉｓ１リン酸化酵素の活性を抑制し、２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドは、ｓｐｃ１リン酸化酵素の活性を抑制した。なお、１３−ベンジルベルベリン＝ヨージド、１３−（４−クロロベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（３−ブロモベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（２，３−ジクロロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，４−ジメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチル−３−ニトロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（３−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−トリフルオロメトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシカルボニルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−ｉ−プロピルベンジル）ベルベリン＝クロリドを用い、前述の培養過程と、それぞれのノックアウト変異体の処理による影響を測定する過程とを繰り返した結果、これらの化合物においても、同様に、ｗｉｓ１リン酸化酵素の活性を抑制した。
【００２３】
【表２】
2004503500.tif 000006
【００２４】
【表３】
2004503500.tif 000007
【００２５】
【表４】
2004503500.tif 000008
【００２６】
【表５】
2004503500.tif 000009
【００２７】
【表６】
2004503500.tif 000010
【００２８】
〔実施例３：ｗｉｎ１およびｗｉｓ４ノックアウト変異体に対するこれらのプロトベルベリン誘導体の影響〕
表７および表８に示すように、ｗｉｎ１およびｗｉｓ４ノックアウト変異体に、プロトベルベリン誘導体、例えば１３−ベンジルベルベリン＝ヨージド、１３−（４−クロロベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（３−ブロモベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（２，３−ジクロロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，４−ジメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチル−３−ニトロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（３−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−トリフルオロメトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシカルボニルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−ｉ−プロピルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）パルマチン＝ヨージド、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）パルマチン＝クロリド、および２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドの中から選ばれた１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリド、および２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドを加え培養した結果、ｗｉｓ１およびｓｐｃ１の上流にある２つのマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化リン酸化酵素をリン酸化する酵素をエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）するそれぞれのｗｉｎ１およびｗｉｓ４ノックアウト変異体は、野生型と類似に、プロトベルベリン誘導体によりその成長が完全に抑制された。これは、これらのプロトベルベリン誘導体がｗｉｓ１−ｓｐｃ１マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達系の全体に影響を及ぼすものではなく、特定のｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素に作用することを表す。
【００２９】
【表７】
2004503500.tif 000011
【００３０】
【表８】
2004503500.tif 000012
【００３１】
〔実施例４：ｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素の発現誘導および精製〕
培地のチアミンの存在によりその発現が抑制されるｎｍｔ１促進子を含み、ＧＳＴをタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）することのできるｐＲｅｐ１ベクターに、ｗｉｓ１およびｓｐｃ１をクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）し、このプラスミドをシゾサカロマイセス・ポンベの野生型であるＫＧＹ２４６細胞に転移させた。転移された細胞を０．４ｍＭチアミンの含まれたＭＭＡＵ培地において培養した後、チアミンを取り除いたＭＭＡＵ培地１００ｍｌにおいて対数増殖期（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように２０時間前後で培養し、ＧＳＴのタギングされたｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素の発現を誘導した。
【００３２】
ＧＳＴのタギングされたｗｉｓ１またはｓｐｃ１が発現された細胞に、浸透圧性ストレス（０．６Ｍ塩化カリウム）と酸化的ストレス（１００ｍＭ過酸化水素）とを２５分間与えた後、４℃で回収し、冷却したＰＢＳ／ＮａＦ（５０ｍＭ）／ＮａＮ３（１ｍＭ）緩衝溶液と、ＨＢ緩衝溶液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ・ｐＨ７．５，６０ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｒｏｐｈ １５ｍＭ ＥＧＴＡ，０．１ｍＭ Ｎａ ｖａｎａｄａｔｅ，０．１％ｔｒｉｔｏｎ）で洗浄し、タンパク質分解抑制剤を含むＨＢ緩衝溶液においてシグマ社市販のガラスビーズ（ｇｌａｓｓ ｂｅａｄ）とビーズビーター（ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ）とを使用して加水分解した。加水分解した細胞の上清液を１００ｍＭ塩化ナトリウムで培養し、不要なタンパク質を一次的に取り除く塩析（ｓａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ）を行った。該上清液に、０．０４５ｇ／ｍｌのＧＳＴビーズを加え、４℃で１時間３０分間培養し、ＧＳＴビーズに結合しない他のそれぞれのタンパク質を１００ｍＭ塩化ナトリウムを含むＨＢ緩衝溶液により取り除き、リン酸化酵素を精製した。分離精製されたｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素を７％ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した後、ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロット法（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で精製度を確認した。
【００３３】
〔実施例５：ｗｉｓ１およびｓｐｃ１リン酸化酵素の活性およびプロトベルベリン誘導体の影響〕
上記実施例４において分離精製したｗｉｓ１またはｓｐｃ１リン酸化酵素を分析する前に、リン酸化酵素分析用緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４，２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ Ｎａ ｖａｎａｄａｔｅ，１ｍＭ ＤＴＴ）において、プロトベルベリン誘導体である、例えば１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリド（２０μｇ／ｍｌ）、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリド（７μｇ／ｍｌ）、および２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージド（２０μｇ／ｍｌ）と１０分間予備培養した。予備培養されたリン酸化酵素に、通常リン酸化酵素の基質として用いられる１ｍｇ／ｍｌのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、１ｍＭのＡＴＰおよび２０μＣｉの３２γ−ＡＴＰを加えた後、３０℃で３０分間の培養で反応させた。このキナーゼ反応後、ドデシル硫酸ナトリウムのサンプル緩衝溶液を入れ、９０℃で５分間加熱し反応を停止させた後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。次いで、１０％酢酸／１０％メタノールでゲルを固定してから乾燥し、Ｘ線（Ｘ−ｒａｙ）フィルムに露出させた。ｗｉｓ１は、刺激により活性化されると、自家リン酸化で自分の活性を増幅するので、かかる自家リン酸化に及ぼす影響度を測定した。
【００３４】
図２に示すように、マイトジェンにより活性化されたタンパク質に対するリン酸化酵素（ＭＡＰＫ）リン酸化酵素であるｗｉｓ１は、１３−（４−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ベンジル）ベルベリン＝クロリドにより直接にリン酸化酵素の活性が抑制されており、１３−（４−ｔ−ブチルベンジル）ベルベリン＝クロリドによってもｗｉｓ１リン酸化酵素の活性が直接に抑制された。なお、１３−ベンジルベルベリン＝ヨージド、１３−（４−クロロベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（３−ブロモベンジル）ベルベリン＝ヨージド、１３−（２，３−ジクロロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２−クロロ−６−フルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（２，４−ジメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メチル−３−ニトロベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（３−トリフルオロメチルベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−トリフルオロメトキシベンジル）ベルベリン＝クロリド、１３−（４−メトキシカルボニルベンジル）ベルベリン＝クロリド、または１３−（４−ｉ−プロピルベンジル）ベルベリン＝クロリドを用い、前述した培養、反応および自家リン酸化に及ぼす影響度測定の過程を繰り返した結果、同様に、ｗｉｓ１リン酸化酵素の活性が直接に抑制された。一方、図３に示すように、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素であるｓｐｃ１は、ミエリン塩基性タンパク質を基質として使用したとき、２，３，９，１０−テトラプロポキシプロトベルベリン＝ヨージドによってのみ直接にリン酸化酵素の活性が抑制された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明は、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入されるシグナル伝達系内のｗｉｓ１リン酸化酵素およびｓｐｃ１リン酸化酵素の活性を特異的に抑制するプロトベルベリン誘導体を提供することにより、該プロトベルベリン誘導体をシグナル伝達系の研究のための試薬として使用することができる。また、シゾサカロマイセス・ポンベのマイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達系が、哺乳動物を含む全ての真核細胞において、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）やＤＮＡ損傷（ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ）などの外部刺激を細胞内に伝達するＳＡＰＫ／ＪＮＫ伝達系に比べ類似性が高いということを考慮するとき、前述の各プロトベルベリン誘導体を、ＳＡＰＫ／ＪＮＫリン酸化酵素の活性抑制剤または抗がん剤として使用することができると共に、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素の活性度を調節する治療剤への開発にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明におけるシゾサカロマイセス・ポンベの、マイトジェンにより活性化されるタンパク質に対するリン酸化酵素が介入するシグナル伝達系の３つの経路を示す。
【図２】
本発明におけるｗｉｓ１リン酸化酵素の活性を阻害するプロトベルベリン誘導体の電気泳動写真である。
【図３】
本発明におけるｓｐｃ１リン酸化酵素の活性を阻害するプロトベルベリン誘導体の電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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