(57)【要約】本発明は、生化学的及び医学的サンプルにおける時間分解蛍光をイメージングするための装置及び方法に関する。主要な態様において、本装置は．アパーチャが大きいレンズと、照明経路にあるフラッシュランプと、発光経路にある高速ソリッドステートシャッタまたはゲート検出器と、マイクロウェルプレート内に分布する複数のウェルに均質な単色照明を送達するための装置と、高量子効率のデジタルカメラと、コンピュータとを含む。コンピュータ制御下で、ランプは短い間隔でパルシングする。高速発光シャッタまたはゲート検出器は、カメラの露出を各ランプパルスの消光後数マイクロ秒の期間に制限し、その間に遅延蛍光のみをカメラに伝送する。本発明は、高感度及び高スループットで複数のサンプルの同時時間分解イメージングを達成する。
2004519667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明に曝されるように収容媒体上に準備された化学的、生物学的及び医学的なサンプルを発光させて、それらの時間分解蛍光測定を実施するためのイメージングシステムにおいて、
略１００マイクロ秒未満の時間内に実質的な全強度から全強度の約１％未満まで調節できる照明光源と、
前記照明光源から顕微鏡の視野より大きくなり得るサンプルの近傍領域まで照明を提供する照明システムと、
照明領域内に入っているサンプルから発せられた光を収集するレンズと、
サンプルからの光が前記レンズを通過して当たり、サンプル発光の画像の描写を生成するように配置された画像生成装置と、
サンプルと前記画像生成装置との間に配置されており、不透明（オフ）または透明（オン）にすることができる構造を有し、オン／オフ時間が略１００マイクロ秒より短く、オンとオフとのコントラスト比が略１００：１を超えているシャッタと、
前記照明光源のオン／オフ時間及び前記シャッタの開／閉時間を設定するための制御装置と
を備えることを特徴とするイメージングシステム。
【請求項２】
前記シャッタは、印加される電界に応じてそれを通過する光の偏りの回転を変化させる偏光器として構成された強誘電結晶装置であることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
サンプルと前記画像生成装置との間の発光経路に挿入された偏光解析装置をさらに備えることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記シャッタは、できる限り最良のコントラスト比を生み出すような位置で、前記レンズ内に配置されていることを特徴とする請求項１、２または３のいずれかに記載のシステム。
【請求項５】
前記レンズは、前記シャッタの法線に対して光の入射角度が２０°を超えないように構成された光学素子を有し、前記シャッタは、自身の法線に対して光の入射角度が２０°を超えないように発せられた光の光学経路に配置されていることを特徴とする請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記収容媒体は、プレート内に配列された複数のウェルを有しており、前記レンズは、視差を伴わずにウェルの全内容物を検出するように構成されていることを特徴とする前述の請求項のいずれかに記載のシステム。
【請求項７】
前記照明光源は、フラッシュランプであることを特徴とする前述の請求項のいずれかに記載のシステム。
【請求項８】
前記制御装置は、複数回のオン／オフサイクルを通して前記シャッタ及び照明光源を作動するように構成されており、前記画像生成装置は、複数のサイクル中に自身へ当たる光を蓄積するようにしたことを特徴とする前述の請求項のいずれかに記載のシステム。
【請求項９】
発せられた光が強度における減衰を示し、減衰過程での種々の時点で画像を獲得できるように、サンプルの照明後の減衰中に前記シャッタが２回以上ゲートオン及びゲートオフされるようにしたことを特徴とする前述の請求項のいずれかに記載のシステム。
【請求項１０】
前記照明システムは、前記照明光源からの光をサンプルに向けて前記レンズの内部及び外部へ誘導するように構成されていることを特徴とする前述の請求項のいずれかに記載のシステム。
【請求項１１】
前記照明システムは、前記レンズとサンプルとの間に、前記照明光源からの光をサンプルに向けて反射し、サンプルから発生せられた光を前記レンズに向けて伝送するように構成されたビームスプリッタを有することを特徴とする前述の請求項のいずれかに記載のシステム。
【請求項１２】
補正された遅延蛍光画像を作成するために、前記シャッタを閉じて即時蛍光の漏れ画像を保存し、この保存した漏れ画像を後続の遅延蛍光画像から減じる補正処理装置をさらに備えることを特徴とする前述の請求項のいずれかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全開示がこれにより参照してここに組み込まれる２００１年２月２８日に提出された米国仮特許出願第６０／２７２，０８３号に基づいて３５米国特許法第１１９条（ｅ）に規定された優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、生化学的及び医学的サンプルにおける時間分解蛍光をイメージングするための装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
（発明の背景）
蛍光体が入射光子と相互作用した際に、蛍光は発せられる（励起）。光子の吸収は、蛍光体中の電子が基底状態から高エネルギレベルへ上昇するのを誘発する。蛍光体及びその環境に依存する時間が経過した後、電子は転換中に放出されるエネルギの量に依存する波長を有する光子を放出しながら最初のレベルへ戻る（蛍光発光）。蛍光体は、電子が様々な軌道関数からそれらの基底状態へ落下するにつれて単一または多重波長で発光することができる（発光スペクトルの作成）。発光スペクトルは蛍光体の各種について一定である。
【０００３】
蛍光標識は、典型的にはフルオレセイン、テキサスレッドもしくはローダミン等の小さな有機色素分子であり、ステプタビジン等のプローブ分子へ容易に共役結合できる。蛍光体は、適切な励起周波数の光線を用いて照明することによって検出でき、結果として生じるスペクトル発光は電気光学センサまたは目視で検出することができる。
【０００４】
蛍光物質を対象にアッセイを実施する方法は当分野において周知であり、例えばラコヴィッツ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ）  Ｊ．Ｒ．、蛍光分光分析法の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ニューヨーク：プレナム・プレス（１９８３年）；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ），Ｄ．Ｌ．及びワン（Ｗａｎｇ），Ｙ．−Ｌ．編集による培養中の生存細胞の蛍光顕微鏡法、パートＢ、細胞生物学における方法、第３０巻（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｇｙ，  Ｖｏｌ．  ３０）中のハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）Ｂ．、共鳴エネルギ移動顕微鏡法（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、サンディエゴ：アカデミック・プレス（１９８９年）、第２１９〜２４３頁；テュロ（Ｔｕｒｒｏ）  Ｎ．Ｊ．、現代分子光化学（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、メンロパーク：ベンジャミン／カミングス・パブリッシング（１９７８年）、第２９６〜３６１頁及び分子プローブカタログ（ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ）（２００１）、オレゴン州、米国の中で記載されている。
【０００５】
蛍光計は、蛍光を測定する機器である。蛍光計は、３つの主要コンポーネントを有する。すなわち、（ａ）励起用の光源であって、最も典型的にはレーザまたは広帯域光源、（ｂ）励起及び発光の両方において所望の波長領域を選択するためのフィルタ及び／または分光モノクロメータ、並びに（ｃ）衝突する蛍光発光を電気信号に変換する検出器である。本発明は、生物学的サンプル中で、最も詳細には新薬開発プログラムで使用される生物学的サンプル中で蛍光を測定する蛍光計に関する。
【０００６】
一部の蛍光計（マイクロ蛍光計）は、共焦点または非共焦点顕微鏡の周囲に構成され、蛍光標識細胞または微量のサンプルを個々の標的として視認できるように設計されている。係るマイクロ蛍光計に関連する先行技術は大量にある。これら先行技術の部分集合は、マイクロウェルプレートまたはウェハを備えたマイクロ蛍光計の使用に関連する（例、ガルブレイス（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ）等、１９９１；リグラー（Ｒｉｇｌｅｒ）、１９９５）。
【０００７】
その他の蛍光計（マクロ蛍光計）は、細胞解像度では測定せず、複数のサンプル中の各サンプルからの信号を収集するためにむしろ低倍率光学素子を使用し（例、ビョルソン（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ）等の米国特許第５，１２５，７４８号；エデン（Ｅｄｅｎ）の米国特許第５，３４０，７４７号）、最も典型的にはウェルはマイクロウェルプレート内に配列されている（例、モドリン（Ｍｏｄｌｉｎ）等の米国特許第６，０７１，７４８号；アコン（Ａｋｏｎｇ）等の米国特許第５，６７０，１１３号）。
【０００８】
複数のサンプルを測定する手段は、「スキャニング蛍光計」、「ステッピング蛍光計」及び「エリアイメージング蛍光計」の間で相違する。
【０００９】
スキャニングマクロ蛍光計（例、ケイン（Ｋａｉｎ）の米国特許第５，６７２，８８０号に開示）では、サンプル上方の励起ビームをスキャンし、各発光点を連続的に収集することによって、複数のサンプルを連続的に検出する。スキャニング蛍光計は、各サンプルを複数の解像点に分解することができる。
【００１０】
ステッピングマクロ蛍光計では、励起ビーム及び検出器（通常は光増倍管またはダイオード）がサンプルからサンプルへ段階的に移動する。検出器（または検出器のアレイ）は各サンプルから単一の測定を実施し、各サンプル内の複数の解像点は識別しない（例、ハルートゥニアン（Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎ）の米国特許第５，５８９，３５１号；アコン（Ａｋｏｎｇ）等の第５，６７０，１１３号；トューナネン（Ｔｕｕｎａｎｅｎ）等の第６，１４４，４５５号；アコン（Ａｋｏｎｇ）等の第６，１２７，１３３号）。
【００１１】
エリアイメージングマクロ蛍光計において、検出器は並列に配置された複数のサンプルへ向けられ（スキャニングまたはステッピングを使用せずに）、各サンプルは検出器領域の様々な部分で検出される。種々のサンプルを検出器の様々な地点へ配置することによって、エリアイメージング蛍光計は複数サンプル内の個々のサンプルを識別する能力を維持する。エリアイメージングマクロ蛍光計は、各サンプル内にある複数の解像点を識別できる場合とできない場合とがある。
【００１２】
エリアイメージングマクロ蛍光計は周知のものである（例、ハガート（Ｈａｇｇａｒｔ）１９９４；チェ（Ｃｈｅ）の米国特許第６，１４０，６５３号；カワノ（Ｋａｗａｎｏ）等の第６，０６９，７３４号；多数の市販システム）。これらの多くは、例えば電気泳動法用ゲルのようなフラットなサンプルに好適である。一部の特許（例、ラインチェス（Ｒｅｉｎｔｊｅｓ）等の米国特許第５，２７５，１６８号；ヌッテル（Ｋｎｕｔｔｅｌ）の第５，３０９，９１２号）は、ラマン分光法または照明の位相／振幅変調法等の高度に特殊化された方法を必要とし、さらに複数の生物学的サンプルと一緒に使用する場合の即時または時間分解蛍光強度測定のいずれにも適合しない。他の特許（ステイビル（Ｓｔａｂｉｌｅ）等の第５，８５４，６８４号）は、マクロ蛍光計においてイメージング検出器の効果的使用を可能にする照明及び光学的検出システム内の特定の実施形態を記載せずに、複数のサンプルから反射された光線を定量するためのイメージング検出器の一般的使用について言及している。最後に、その他の特許（マクニール（ＭｃＮｅｉｌ）等の国際公開第ＷＯ９６／０５４８８号）は、エリアイメージングマクロ蛍光測定を遂行するための特定の手段を開示しているが、その手段は目的のためには最適ではない。
【００１３】
薬剤開発への適用においては、サンプルのスループットを上げる必要性があり、通常、蛍光性の試験片を複数のウェル内に配列して、高いスループットを要求する。エリアイメージング蛍光計は、多数のサンプルを並列的に定量化することによって高いスループットを達成するというその能力における周知の利点を提供するが、装置がスループット及び感度の両方で高くなければならない場合、この目的に適当な特定の実施形態を必要とする。
【００１４】
エリアイメージングマクロ蛍光計の技術を考察すると、サンプルをイメージングできるようにＣＣＤカメラを位置決めし、既知の手段によって蛍光励起を送達し、さらに既知の方法でレンズを使用して放射光を収集することは自明である。しかしながら、マクニール（ＭｃＮｅｉｌ）等の国際公開第ＷＯ９６／０５４８８号によって開示された種類のイメージング蛍光計は、感度において非イメージング蛍光計との同等性を達成することはできず、信号検出における誤差に悩まされている。例えば、それらは反射０予備の他の形態の擬似信号を最小限に抑えられるように計算されたメカニズムを含有していない標準レンズ系を使用しており、視差に悩まされており、さらに通例はマイクロウェルプレートがそれを通してサンプルが読み取られる透明な底部を備えた種類のマイクロウェルプレートであることを必要とする。これとは対照的に、非イメージング蛍光計は高感度であり、視差を有しておらず、プレートの上部もしくは底部から読み取ることができ、さらに底部が透明である高価なプレートを必要としない。薬物スクリーニングにおけるエリアイメージング蛍光計の潜在的使用者は、例えば上記で説明したような要因のために先行技術システムを余り広く採用してこなかった。
【００１５】
薬物スクリーニングへエリアイメージング蛍光測定を適用することにおける課題は、主として下記の４つの要因から生じる。
ａ）ウェルは照明の入射角と相互作用するアパーチャを形成する。大きな角度で照明を受けるウェルは、より直接的な照明を受けるウェルより良好には照明されない。大多数のイメージング蛍光計は集光レンズに側方領域から照明を送達するので（例、ネリ（Ｎｅｒｉ）等、１９９６）、それらはフラットな試料については良好な結果を得ることができるが、深いウェルを適正に照明することには失敗する可能性がある。実際に、照明の送達がマイクロウェルプレートの底部を通してのか発生するのでない限り、マイクロウェルプレートにおける様々な位置にあるウェルへの光の送達において３００％を超える差異を観察することは珍しくない（例、シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）の米国特許第５，３５５，２１５号、及び、マクニール（ＭｃＮｅｉｌ）等の国際公開第ＷＯ９６／０５４８８号）。
ｂ）ウェルは極めて薄暗い。標準マイクロウェルプレート内に含まれている複数のウェルは約９６ｃｍ平方の空間的広がりを占めている。マクロエリアイメージング蛍光計がすべてのウェルを並列的にイメージングできなければならないのであれば、すべてのウェルが同時に照明されなければならない。このため、いずれか１つのウェルに送達される照明の量（照明される面積と強度／単位面積との間の幾何学的反比例関係によって説明される）は極めて小さく、いずれか１つのウェルから発光される蛍光の量もまた小さくなる傾向を有し、高感度検出器が必要とされる。しかしながら、検出器が高感度であっても、すべてのウェルができる限り効率的に照明光線を受けることが重要である。照明が一部のウェルの内容物に到達できなければ、極めて高感度の検出器でさえ使用可能な信号を引き出すことは不可能であろう。
ｃ）視差が存在する。マイクロウェルプレート内の様々な位置に配置された奥深いウェルは標準型レンズによって様々な角度でイメージングされる。このよく知られている視差は、集光光学素子の精度に、特に光学素子が上部から複数のウェルをイメージングするときには大きな影響を及ぼす。
ｄ）照射光線は検出用光学素子と相互作用する。ウェルプレート全体へ照明を送達するための、及びプレート内の複数のウェルからの蛍光発光を同時に収集するための光学素子は特別の特性を有していなければならない。例えば、最も効率的な照明方法は集光レンズ内からであるが（エピイルミネーション）、マクロエピイルミネーションレンズは、反射及びその他の明白ではない起源の偽信号に曝される。
【００１６】
ウェルプレート、ゲル及びブロット内のアッセイのためのデジタルシステムのイメージングシステムは、ラム（Ｒａｍｍ）等による米国特許出願第０９／２４０，６４９号及び第０９／４７７，４４４号に開示されている。このシステムは、高スロープット・エリアイメージング蛍光測定に対する必要を満たし、さらに上記のａ）〜ｄ）に挙げた問題を克服することにおける技術的進歩を達成する。最も詳細には、そこに開示されたシステムは：
ａ）上方からであろうと下方からであろうと、効率的かつ一様な方法で複数のウェルを照明できるようにウェルアパーチャと最小限に相互作用し；
ｂ）効率的方法で照明することによって、エリアイメージング蛍光測定においてより高感度を可能にし、
ｃ）視差を回避するためにテレセントリック光学素子を使用し；
ｄ）マクロエリアイメージング蛍光測定において発生するバックグラウンド信号源を最小限に抑える（例えば、集光レンズ内に取り付けられた発光フィルタからの内部反射を最小限に抑える）ように計算された光学素子及びコンポーネントを含有する。
【００１７】
開示された上記のシステムは、実施化されており、蛍光のエリアイメージング及び即時蛍光信号のために広く使用されてきた。時間分解蛍光イメージングのためのシステムを使用する手段は上記の特許出願に開示されているが、この目的のための実施形態の詳細な説明は記載されていない。そこで本発明では、ウェルプレート、ゲル及びブロットにおける時間分解アッセイのためのエリアイメージング蛍光計の好ましい実施形態を開示する。
【００１８】
即時蛍光発光とは、発光された蛍光が収集されるのと同時の励起照明の送達であると定義されている。即時蛍光における課題には下記が含まれる：
・システムが励起光で投光されている間に発光における極めて小さな変化が検出されなければならない；
・発光は強度に関して励起よりはるかに低く、減衰していない発光を残せるように励起全部をフィルタリングすることは困難である；
・サンプル媒体（例、溶媒、標識化合物を含有する細胞）、光学素子（例、ベヴァルー（Ｂｅｖｅｒｌｏｏ）等、１９９０，１９９２）及びサンプル担体（ウェルプレート、キュベット）が対象の蛍光体のものに類似するスペクトル成分を発光する可能性がある。
【００１９】
これらをまとめて、検出器に到達する励起光またはサンプル媒体の寄与は「バックグラウンド」と呼ばれている。発光フィルタは、バックグラウンド信号が検出器に到達するのをできる限り阻止できるようにサンプルと検出器との間に配置される（例、ラム（Ｒａｍｍ）等の国際公開第ＷＯ９９／０８２３３号）。しかしながら、発光フィルタはバックグラウンド全部を取り除くことはできず、検出器へのバックグラウンドの残存漏出は検出感度の悪化を生じさせる。即ち、蛍光計の感度は高レベルのバックグラウンド信号の存在によって制限される傾向がある。
【００２０】
時間分解蛍光（ＴＲＦ）は、バックグラウンドを減少させて検出感度を増加させるために使用されるよく知られている技術である（例、ヘミラ（Ｈｅｍｉｌｌａ）等の米国特許第４，５６５，７９０号、ミコラ（Ｍｉｋｏｌａ）等の第４，８０８，５４１号、ツァーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）等の第５，７３６，４１０号）。ＴＲＦでは、サンプルを励起するために光源が使用され、その後迅速に消光または遮蔽される。励起期間中、検出器のスイッチは切られている。スイッチが切られているので、検出器は励起期間中に発生するバックグラウンド寄与（例、発光フィルタを通しての励起光の漏出）には曝されない。
【００２１】
励起終了後には、ほとんどのバックグラウンド寄与は欠如するか、または急速に減衰する（例、溶媒蛍光）。これとは対照的に、蛍光体はそれらの発光を直ちには中止しない。むしろ、励起が終了した後に蛍光体が発光し続ける期間（ピコ秒〜ミリ秒の範囲内）が存在する。この期間中に、最小のバックグラウンドを伴う重要な蛍光シグナルを観察するために検出器のスイッチが入れられる。この検出期間の遅延性タイミングがＴＲＦの主要原理である。
【００２２】
ＴＲＦ検出を可能にするためには、検出器のスイッチを制御された時間内に入れたり切ったりしなければならない。検出期間は励起の終了からある時間の経過後（遅延時間後）にスタートし、一定時間（捕獲時間）継続する。ＴＲＦは最も頻回には、バックグラウンド源の典型的な減衰時間よりはるかに長いほぼ１００マイクロ秒〜２ミリ秒の減衰時間を有するランタニド系元素（ユーロピウム［Ｅｕ］、テルビウム［Ｔｂ］等）に基づく蛍光体と一緒に使用される。典型的には、遅延時間はほぼ数十マイクロ秒であり、さらに捕獲時間は数十〜数百マイクロ秒である。
【００２３】
励起期間及び遅延時間の間は、検出器は遮蔽されている、またはスイッチが切られている（以下、ゲートオフという）。捕獲時間中には、検出器はサンプルからの発光に曝される（以下、ゲートオンという）。ゲートオフ及びゲートオンのいずれかの単一サイクルが検出器に信頼できる信号を発生させることは考えられないので、十分な信号が蓄積されるまでそのサイクルは繰り返される。
【００２４】
遅延蛍光発光は、即時蛍光発光よりはるかに強度が低いので、エリアイメージングシステムは極めて低いレベルの発光／単位面積に対して機能しなければならない。このため、エリアイメージング蛍光計は他のタイプの蛍光計より検出器のノイズレベルにおける遅延発光の消失により多く曝される。従って、ＴＲＦシステムは高光学スループット（エテンデュ［ｅｔｅｎｄｕｅ］）及び低い伝送損失量を生じさせる幾何学的配置を有していることが望ましい。この迅速なゲーティング及び高エテンデュの組み合わせを達成するためにシステムを最適化することに関する課題が発生する。
【００２５】
励起光及び検出器はどちらもゲーティングされなければならない。機械的チョッパを用いて及び／またはパルスレーザ類（例、ガデラ（Ｇａｄｅｌｌａ）及びジョバン（Ｊｏｖｉｎ）、１９９５）によっての励起のゲーティングは、遅延捕獲へのそれらの寄与が最小限であるために十分迅速に減衰するフラッシュランプの使用のように（例、ラム（Ｒａｍｍ）等の国際公開第ＷＯ９９／０８２３３号；ヴァイサラ（Ｖａｉｓａｌａ）等の欧州特許第０９８７５４０Ａ２号；ヴェレブ（Ｖｅｒｅｂ）等、１９９８）、広く知られている。
【００２６】
ＴＲＦにおける発光経路のゲーティングには、一般に３種の方法が使用されている。
（ａ）シャッタホイールを迅速に回転させて放射光のマイクロ秒規模のゲーティングが作り出される。このアプローチは、ＴＲＦ顕微鏡において即時蛍光からの信号を拒絶し、それによって自己蛍光を減少させるために適用されている（セビュース（Ｓｅｖｅｕｓ）等、１９９２）。類似の方法は、ヴァイサラ（Ｖａｉｓａｌａ）等の欧州特許第０６２６５７５Ａ１号、及びスキャニング検出システム（ハリユ（Ｈａｒｊｕ）等の米国特許第５，７８０，８５７号）の中で開示されている。１度に１つのサンプルを検出する顕微鏡またはシステム上では、エテンデュが極めて小さいので単一高速シャッタが実行可能である。これとは対照的に、マクロイメージングシステムのエテンデュは大きく、顕微鏡のエテンデュの約２桁大きい。マクロイメージングシステムは、開放から閉鎖までの比較的段階的な移行を示す大きな機械的シャッタ機構を必要とするであろう。
（ｂ）高速回転式シャッタホイールを使用するマルチコンポーネント機械的シャッタは、検出器の小さなセクションを一度に露出させるような方法で同期化される開口部を有している。この配列（例、ヴァイサラ（Ｖａｉｓａｌａ）等の欧州特許第０９８７５４０Ａ２号に開示されている）は単一ホイールより高速であるが、複雑で、高速に作動するパーツから構成されており、さらに不良なエテンデュを有する。
（ｃ）検出器は電気的にゲーティングされ、さらに発光光子を電子に転換する。この方法では、フォトカソード（光電陰極）が光経路内に配置される。フォトカソードは、ＴＲＦのタイミング要求に対応するために短時間の間隔でスイッチを入れたり切ったりすることができる。しかしながら、このタイプのデバイスは低い量子効率を有しており、イメージング検出器に薄暗い蛍光発光をイメージングするために使用することはできないであろう。このため、標的に先立って光電子のエネルギを増加させるために加速電界が適用されるが、多くの場合に加速電子がマイクロチャンネルプレートを通して誘導され、そこでそれらははるかに多数の加速電子の発光を開始する。従って、電気的にゲーティングされる検出器は通常、標的に先立って電子流を増幅させる光増幅器を組み込んでいる。
【００２７】
フォトカソード及びマイクロチャンネルプレート増幅を用いて電気的にゲーティングされる検出器を使用するマクロＴＲＦイメージングシステムは開示されている（ラム（Ｒａｍｍ）等の国際公開第ＷＯ９９／０８２３３号；ラム（Ｒａｍｍ）、１９９９）。レンズと検出器との間での増幅された光電陰極の使用は固有の欠点を有している。
（ａ）最も典型的には、ＴＲＦは長い波長で発光される。これは特に、スペクトルの赤色部分に放射する傾向がある蛍光共鳴エネルギ伝達（ＦＲＥＴ）におけるドナー／アクセプタの対について当てはまる。これらのタイプの信号を検出するためには、フォトカソードのバンドギャップは長波長の光子が光電子を生成できるように十分に低い必要がある。しかしながら、バンドギャップが低い材料は熱信号を生成し、検出されるべき信号から識別できない機器バックグラウンドを作り出す傾向がある。フォトカソードを軽度に冷却することは（市販で入手できる装置において実施化されているように）、熱バックグラウンドを除去しない。熱バックグラウンドを大きく減少させるためにフォトカソードを十分に低い温度へ大幅に冷却することは、重大な技術的課題を意味しており、一般には使用されていない。
（ｂ）インテンシファイドシステムのカメラコンポーネントはノイズ、特に熱バックグラウンドを生成する。これを克服するために、熱バックグラウンドを減少させるためにＣＣＤを冷却することができる（多数の市販装置において実施化されているように）。インテンシファイアからの熱負荷を吸収するファイバ結合ＣＣＤを冷却すること、及び暖かいファイバ結合と冷却ＣＣＤとの結合を保持することには困難が存在する。
（ｃ）ゲーティング／増幅コンポーネントのＱＥ（量子効率）は、典型的には青色−緑色波長では約１０％、赤色波長では１％と低い。このため、増幅されたゲーティングシステムへ入射するほとんどの信号は失われ、さらに赤色で発光する時間分解蛍光を備えたシステムの使用は問題が多い。
（ｄ）増幅プロセスは入射光電子当たり一定数の電子を生み出さない。このゲインノイズは、典型的には検出されたイベントに対する最低閾値を設定し、さらに有効である確率が高いイベントだけを計数することによって克服される。この方法で、増幅した装置は積算イメージャとしての代わりにカウンタとして操作される。この計数モードでは高感度であるが、増幅した装置は極めて非効率的でもあり、画像を作製するために十分に閾値を超えるイベントを集積するためには長時間の検出が必要とされる。
【００２８】
さらに、光増幅器の易損性（明るい光線によって容易に破壊される）及び増幅された画像への不良な変調伝達を含む他の短所がある。さらに、試料の明るい領域はそれらの周囲領域に影響を及ぼす傾向があり、このためマイクロウェルプレートのイメージングはウェル間のクロストークに大きく曝される。これらをまとめると、フォトカソード・ゲーティング及び増幅を使用する先行技術システムはすべて本発明の分野において欠点を示している。
【００２９】
【特許文献１】
米国特許第４，５６５，７９０号明細書
【特許文献２】
米国特許第４，８０８，５４１号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，７３６，４１０号明細書
【００３０】
【課題を解決するための手段】
ゲーティング及び増幅機能が検出器に最初から装備されている、ＴＲＦのためのマクロエリアイメージング蛍光計を構築することが可能である。例えば、電子衝撃ＣＣＤ（ＥＢＣＣＤ）をラム（Ｒａｍｍ）等（国際公開第ＷＯ９９／０８２３３号）によって開示された構成のシステム内で実行することは確証されている。例えば電子増幅ＣＣＤ（英国のマルコーニ・アプライド・テクノロジーズ［Ｍａｒｃｏｎｉ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］によって実施化されているような）他の一体化増幅検出器もまたここで開示する形状のシステム内で適用できるであろうことも想定されている。インテンシファイドＣＣＤカメラと比較して、かすかな遅延蛍光信号を検出するためにはまだ十分に高感度であるが、イメージング用マイクロウェルプレートにおいては極めて小さなクロストークしか示さないことがＥＢＣＣＤ（及びおそらく他の一体化ゲーティング検出器）の長所である。
【００３１】
ほぼあらゆるタイプの高速シャッタはＴＲＦシステムのためのゲートして想定できるであろう。光経路内の試料の後だが検出器の前に取り付けられた液晶、リーフもしくはその他のシャッタを使用するマクロエピイルミネーションシステムを備えたＴＲＦは開示されている（ラム（Ｒａｍｍ）等の国際公開第ＷＯ９９／０８２３３号）。ある好ましい実施形態において、本発明は、その使用を可能にできるように至適化されているシステム内に導入されたシャッタを組み込んでいる。
【００３２】
それによって本発明が適用されるプロセスの自動化は詳細には記載されていないが、ここに記載されているモジュレータ、経路、有用な活性を有する化学薬品を同定するために自動化された一体化可能なワークステーションを利用するシステム及び方法並びにここに記載されたその他の方法と一緒に使用できることは想像できる。そのようなシステムは、一般に当分野において記載されている（クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）等の米国特許第４，０００，９７６号（１９７７年１月４日発行）、ポスト（Ｐｆｏｓｔ））等の米国特許第５，１０４，６２１号（１９９２年４月１４日発行）、ビョルソン（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ）等の米国特許第５，１２５，７４８号（１９９２年６月３０日発行）、コワルスキー（Ｋｏｗａｌｓｋｉ）の米国特許第５，１３９，７４４号（１９９２年８月１８日発行）、ビョルソン（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ）等の米国特許第５，２０６，５６８号（１９９３年４月２７日発行）、マッツァ（Ｍａｚｚａ）等の米国特許第５，３５０，５６４号（１９９４年９月２７日）、ハルートゥーニアン（Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎ）の米国特許第５，５８９，３５１号（１９９６年１２月３１日発行）、並びにバクスター・ドイツＧＭＢＨ社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧＭＢＨ）のＰＣＴ特許公開第ＷＯ９３／２０６１２号（１９９３年１０月１４日公開）、マクニール（ＭｃＮｅｉｌ）等の公開第ＷＯ９６／０５４８８号（１９９６年２月２２日公開）及びアゴン（Ａｇｏｎｇ）等の公開第ＷＯ９３／１３４２３号（１９９３年７月８日公開）を参照）。
【００３３】
本発明によると、ウェルプレート、ゲル及びブロット内のサンプルの時間分解蛍光測定のためのエリアイメージングシステムは、高感度カメラに結合された大きなエテンデュのストロボ照明システム内に導入された速効型電子発光シャッタを組み込んでいる（好ましくはラム（Ｒａｍｍ）等の国際公開第ＷＯ９９／０８２３３号に開示されている）。好ましくは、だが必要という訳ではないシステムの発光シャッタは、強誘電体結晶（ＦＬＣ）テクノロジーに基づいている。ＦＬＣシャッタは、入力偏光器、電界に応じて偏光の回転を変化させる強誘電物質、及びサンプルと固相アレイ検出器との間でアレイイメージングシステムの発光経路に挿入された偏光解析器から構成される強誘電に基づくデバイスである。
【００３４】
電子シャッタを通る伝送損失が光増幅段階を必要とせずに対応できるほどＦＬＣシャッタを含有する光学／検出コンポーネントが高感度である点が本発明のシステムの特性である。ある好ましい構成では、検出器の量子効率が高く、光学素子のエテンデュは大きい。そのようなシステム内で使用すると、本発明のシャッタは、非イメージング時間分解蛍光計から入手される測定値に匹敵する測定値を生み出すのに十分な遅延蛍光を伝達し、そのようなシステムの欠点（クロストーク、易損性、等）を伴わずに増幅したフォトカソードを使用するシステムの感度を超える。
【００３５】
当業者であれば、高速電子シャッタがＴＲＦのためのゲーティング機構として有用であろうことを理解するであろう。しかしながら、ケルセル（Ｋｅｒｒ  ｃｅｌｌｓ）、音響光学的モジュレータ類または電気光学的モジュレータ類のようなほとんどの高速シャッタは、顕微鏡のような小さなエテンデュを備えたシステムへのそれらの適用を制限する限られたエテンデュを有している。大きなアパーチャを有し、本発明のシステムのエテンデュの長所を利用することが本発明の電子シャッタの長所である。
【００３６】
本発明のシステムには、液晶に基づくシャッタを装備することができよう。このタイプのシャッタは本発明の大きなエテンデュと共に使用できる十分なアパーチャを有することができるが、これは閉鎖状態に対する伝達状態の不良な比（コントラスト比と定義されている）を有している。最も典型的には、液晶シャッタのコントラスト比は、ＦＬＣシャッタを用いた場合に＞４００：１が観察されるのと比較してほぼ＜２００：１である。液晶に基づくシャッタはまた、多数の一般に使用される発光体を用いたＴＲＦイメージングのためには十分に高速ではない。
【００３７】
好ましくは、本発明のシステムは強誘電結晶（ＦＬＣ）に基づくシャッタを組み込んでいる。ＦＬＣシャッタが、１００マイクロ秒未満以内でゲートオンからゲートオフへ遷移することができ、一般に使用されるランタニド、ユーロピウム及びテルビウム発光体の遅延蛍光イメージングに適合する点が本発明のシステムの長所である。
【００３８】
ＴＲＦ顕微鏡法においてＦＬＣシャッタを使用する以前の試みにおいて開示されたようなＦＬＣの短所は、不適正なコントラスト比に起因する即時蛍光の不良な拒絶であった（フルウールト（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ）等、１９９４；ショッテン（Ｓｈｏｔｔｅｎ）、１９９５）。この不良なコントラスト比は、２個のＦＬＣシャッタの連続した使用を余儀なくさせ、その結果として生じる伝達損失が極めて高いために（ヴェレブ（Ｖｅｒｅｂ）等、１９９８）マクロイメージング蛍光計における使用は不可能であろう。本発明では、ＦＬＣが最高に可能なコントラスト比を生じる位置で光学素子内に配置される。法線に対してシャッタ上への入射角度が２０°を超えないような方法で、発光された蛍光の光経路に高速シャッタが配置されるように、光学素子が構築される点が本発明のシステムの特性である。この位置決めは、シャッタからの最高のコントラスト比を達成し、さらに伝送光線の波長特性に対する前記シャッタの作用を最小限に抑える。
【００３９】
本発明のある好ましい実施形態では、ＦＬＣシャッタを通しての漏出は、まず最初にシャッタを閉鎖して即時蛍光の画像（漏れ画像）を撮像することによって補正される。この画像は、遅延蛍光画像の収集に先立って、ＣＣＤカメラから読み取られる。その後、ＦＬＣシャッタを通しての漏れによって付加されたバックグラウンドを伴わない遅延蛍光の画像を残すために、漏れ画像が遅延蛍光画像から差し引かれる。
【００４０】
それらを現行マクロエリアイメージング蛍光計に使用できるように、前記装置の大きな修正を必要（例、ラム（Ｒａｍｍ）等の国際公開第ＷＯ９９／０８２３３号に開示されているように）とせずに適合させることができる点が本発明の照明システム及び電子シャッタの長所である。それどころか、本発明の照明システムは既存のマクロエリアイメージング蛍光計内に据え付けることができ、さらにシャッタは大きな修正なしで前記装置内に据え付けることもできる。
【００４１】
前記シャッタからの妨害なく極めて広範囲の適用のために前記蛍光計を使用できるようにするために、シャッタをマクロエリアイメージング蛍光計内に容易に挿入したり、取り外したりできることは本発明の長所である。
【００４２】
モジュレータ類、経路、有用な活性を有する化学薬品を同定するための自動化かつ一体化可能なワークステーションを利用するシステム及び方法並びにここに記載した他の方法と共に使用できることは本発明のシステムの長所である。そのようなシステムは、一般に当分野において記載されている（クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）等の米国特許第４，０００，９７６号（１９７７年１月４日発行）、ポスト（Ｐｆｏｓｔ）等の米国特許第５，１０４，６２１号（１９９２年４月１４日発行）、ビョルソン（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ）等の米国特許第５，１２５，７４８号（１９９２年６月３０日発行）、コワルスキー（Ｋｏｗａｌｓｋｉ）の米国特許第５，１３９，７４４号（１９９２年８月１８日発行）、ビョルソン（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ）等の米国特許第５，２０６，５６８号（１９９３年４月２７日発行）、マッツァ（Ｍａｚｚａ）等の米国特許第５，３５０，５６４号（１９９４年９月２７日）、ハルートゥニアン（Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎ）の米国特許第５，５８９，３５１号（１９９６年１２月３１日発行）、並びにバクスター・ドイツＧＭＢＨ社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧＭＢＨ）のＰＣＴ特許公開第ＷＯ９３／２０６１２号（１９９３年１０月１４日公開）、マクニール（ＭｃＮｅｉｌ）等の公開第ＷＯ９６／０５４８８号（１９９６年２月２２日公開）及びアゴン（Ａｇｏｎｇ）等の公開第ＷＯ９３／１３４２３号（１９９３年７月８日公開）を参照）。
【００４３】
本発明は時間分解マクロ蛍光エリアイメージングに向けられているが、当業者であれば、偏光マクロ蛍光エリアイメージングシステムを構築するために、偏光光学素子を組み込んでいるＦＬＣシャッタまたはその他のシャッタにおいて具現化されているように、本発明の偏光能力を使用できるであろうと理解されなければならない。そのようなシステムでは、励起光はまず最初にＦＬＣシャッタまたは一部の他の偏光装置を通過することによって偏光させられる。放射光は発光経路内に取り付けられた偏光器を通過する。どちらかの偏光器を他方の偏光器に対して回転させることができ、このシステムは非エリアイメージング装置の測定値に匹敵する偏光測定値を達成するほどに高感度である。
【００４４】
本発明の上記及びその他の目的、特徴及び長所は、下記の添付の図面を参照しながら本発明に従った現在好ましい、しかしあくまでも例示を目的とする実施態様についての下記の説明からより完全に理解されるであろう。
【００４５】
【発明の実施の形態】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
図１は、マイクロウェルプレート３内に含まれた複数のウェル２の蛍光イメージングのために使用される光学系１を断面図で示している。光学系１の主要コンポーネントは、レンズ系４、パルス光源５、一次励起フィルタ６、環状照明器７、一次発光フィルタ８（望ましいサンプル信号に無関係の波長を除去するため）、及びＣＣＤカメラシステム９である。光学系１のレンズ系４は、テレセントリックスペースで機能し、さらにＣＣＤカメラ９のＣＣＤ検出器１０上にウェルプレート３の画像を形成するフロントエレメント４ａを有している。
【００４６】
操作時に、光源５は、ウェル２内の試料へ適用するのに必要な光エネルギを提供する。好ましくは、光源は、１００マイクロ秒未満の時間で高強度から高強度の１％未満へ調節することができる。光源からの光はフィルタ６を通して伝送され、例えば光ファイバ束または液状光導波路のような光導波路を通してレンズ系の内部にある環状照明器７へ伝導され、その環状照明器は、エピイルミネーション、好ましくは２５ｃｍ平方より大きな面積の照射を実施する。エピイルミネーションによって励起された試料により発光された光エネルギは、レンズ４ａ及びレンズ系４全体を通してカメラ９へ伝送され、そこでＣＣＤ検出器１０上に画像が生成される。
【００４７】
図２は、環状照明器のエピタキシャル照明システムへの置換を含めて、図１を複写している。エピタキシャル照明はパルス光源１１、一次励起フィルタ１２、及びサンプル上への励起波長を反射して試料から発光された波長をカメラへ伝送するダイクロイックミラー１３から構成される。
【００４８】
図３は、高速シャッタ１４の追加を含めて、図２を複写している。シャッタ１４は、全光線が光学軸に近い位置で、発光フィルタ８の極めて近位にある。好ましくは、シャッタ１４は、１００マイクロ秒より短いオン−オフ時間及び２００：１を越えるコントラスト比で不透明（オフ）または透明（オン）にできる材料から作られている。さらにまたシャッタが５００〜７００ナノメータ間の光の波長で２０％以上の透過性であることが好ましい。ある好ましい実施形態では、シャッタ１４はＦＬＣ装置であるが、発光経路内では速効型電子シャッタを適用する原理が一般的であり、シャッタ１４は他の速効型電子シャッタであってよい。例えば、シャッタ１４は、電界に応じて偏光の回転を変化させる圧電材料から構成される入力偏光器、及びサンプル３とＣＣＤカメラ９との間に配置される偏光解析器と一緒に導入できよう。
【００４９】
図４は、プレートの１つのコーナーの１つのポイントから始まる光線Ａ１−Ａ３がその後高速シャッタ１４及び発光フィルタ８をどのように通過するのかを示している。さらにまた、プレートの中央及び反対側のコーナーから各々始まる光線Ｂ１−Ｂ３及び光線Ｃ１−Ｃ３もまた示されている。シャッタ１４及びフィルタ８はレンズ４を通してイメージングされるプレート３に対して無限共役位置であるように計算された位置にある。シャッタ１４及びフィルタは、ａ）放射光線（光線Ａ１′−Ａ３′、Ｂ１′−Ｂ３′及びＣ１′−Ｃ３′によって示される）がフィルタの光学軸を通過する角度がどちらもフィルタ８の面に対する法線に近く、フィルタ８の法線の中心に集まり、並びに、ｂ）プレート３からフィルタ８への光線の分布が一様であるように配置される。図示された構成では、本発明のシステムは、フィルタが干渉型のフィルタである場合に、発光フィルタ８の作用から生じるスペクトル・シフトを最小限に抑えることができる。発光フィルタがレンズ４の無限共役位置にあること、ビームもまた法線に対して小さな角度でシャッタ１４に衝突することは本発明の特長であり、本発明は、ａ）シャッタ１４のコントラスト比が最大である；ｂ）発光フィルタ８及びシャッタ１４のサイズは所定の最高入射角に対して最小限に抑えられる；並びにｃ）検出器１０上に作成される画像において明るい、またはは暗いスポットを作り出すことなく、不可避のシャッタ１４の点欠陥の作用が検出器全体に一様に分散されるという有益な特長を有している。
【００５０】
図５は、時間分解蛍光のための最適なコンポーネントを装備した非イメージング時間分解蛍光計（この場合は、ワラック・ビクター２（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ２、パーキンエルマー・ライフサイエンス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が例示されている）と比較した、本発明のシステムの性能を示している。ユーロピウムについての検出限界は３：１の信号：ノイズ比によって定義されており、これはどちらの装置についても同様である。どちらかと言えば、本発明は検出限界に近い優れた性能を提供する。
【００５１】
図６は、本発明のシステム内に導入されるような電子衝撃ＣＣＤカメラ（ハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）製）の性能を示している。この場合には、ゲーティングが、レンズ４内に取り付けられた高速電子シャッタの使用による場合とは反対に電子衝撃ＣＣＤ検出器内で遂行される。この構成では、性能はやはり非イメージング蛍光計の性能と同等である。図６は、発光経路内のシャッタであろうと検出装置内に導入されたゲーティング機構であろうと、本発明のシステムに多数の形態の電子ゲーティングを用いて実行できることを例示している。
【００５２】
図５及び図６から、本発明によって少なくとも最良の非イメージング蛍光計と同様に良好に時間分解イメージング蛍光計システムにおいて性能を達成することが可能になることは理解されるであろう。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態を実例として開示してきたが、当業者であれば添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲及び精神から逸脱することなく多数の追加、変形及び置換が可能であることは理解するであろう。
【参考文献】
１．ベヴァルー，Ｈ．Ｂ．、ファン・シャデウェイク，Ａ．、ファン・ゲルデレン・ベーレ，Ｓ．及びタンケ，Ｈ．Ｊ．、「免疫細胞化学及び時間分解顕微鏡法のための新規蛍光標識としての無機蛍光体」。細胞測定、１１：７８４−９２（１９９０年）。
１．Ｂｅｖｅｒｌｏｏ，Ｈ．Ｂ．，ｖａｎ  Ｓｃｈａｄｅｗｉｊｋ，Ａ．，ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒｅｎ−Ｂｏｅｌｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｔａｎｋｅ，Ｈ．Ｊ．  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ  ａｓ  ｎｅｗ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１１：７８４−９２（１９９０）．
２．ベヴァルー，Ｈ．Ｂ．、ファン・シャデウェイク，Ａ．、ボネ，Ｊ．、ファン・デル・ゲースト，Ｒ．、ルニア，Ｒ．、フルウールト，Ｎ．Ｐ．、フローリック，Ｊ．、プレーム，Ｊ．Ｓ．及びタンケ，Ｈ．Ｊ．、「多色蛍光免疫蛍光体の調製及び顕微鏡による視認」。細胞測定、１３：５６１−７０（１９９２年）。
２．Ｂｅｖｅｒｌｏｏ，Ｈ．Ｂ．，ｖａｎ  Ｓｃｈａｄｅｗｉｊｋ，Ａ．，Ｂｏｎｎｅｔ，Ｊ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｓｔ，Ｒ．，Ｒｕｎｉａ，Ｒ．，Ｖｅｒｗｏｅｒｄ，Ｎ．Ｐ．，Ｖｒｏｌｉｊｋ，Ｊ．，Ｐｌｏｅｍ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｔａｎｋｅ，Ｈ．Ｊ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｓ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１３：５６１−７０（１９９２）．
３．ガデラ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．Ｊｒ．及びジョバン，Ｔ．Ｍ．、「時間分解蛍光イメージング顕微鏡法によるＡ４３１細胞上の上皮成長因子のオリゴメリゼーション研究。チロシンキナーゼ受容体活性化の立体化学的モデル」。細胞生物学ジャーナル、１２９：１５４３−１５５８（１９９５年）。
３．Ｇａｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｗ．Ｊ．Ｊｒ．ａｎｄ  Ｊｏｖｉｎ，Ｔ．Ｍ．  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  Ａ４３１  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｂｙ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｙ．  Ａ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２９：１５４３−１５５８（１９９５）．
４．ガルブレイス，Ｗ．、ワグナー，Ｍ．Ｃ．Ｅ．、チャオ，Ｊ．、アバザ，Ｍ．、エルンスト，Ｌ．Ａ．、ネダーロフ，Ｍ．Ａ．、ハートソック，Ｒ．Ｊ．、テイラー，Ｄ．Ｌ．及びワゴナー，Ａ．Ｓ．、「マルチパラメータ蛍光によるイメージング細胞測定」。細胞測定。１２：５７９−５９６（１９９１年）。
４．Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，Ｗ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｅ．，Ｃｈａｏ，Ｊ．，Ａｂａｚａ，Ｍ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｌ．Ａ．，Ｎｅｄｅｒｌｏｆ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｒｔｓｏｃｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｌ．ａｎｄ  Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ａ．Ｓ．，  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１２：５７９−５９６（１９９１）．
５．ハガート，Ｒ．、「冷却スロースキャン電荷結合素子イメージング蛍光計」。アナリティカル  チミカ  アクタ、２９０：４８−５７（１９９４年）。
５．Ｈａｇｇａｒｔ，Ｒ．  Ｃｏｏｌｅｄ  ｓｌｏｗ−ｓｃａｎ  ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ２９０：４８−５７（１９９４）．
６．ネーリ，Ｄ．、プロスペロー，Ｔ．、ペトルール，Ｈ．、ウィンター，Ｇ．、ブラウン，Ｍ．及びファンダーパント，Ｌ．、「多目的高感度蛍光解析装置（ＬＵＡＮＡ）：ゲル電気泳動法における使用」。バイオテクニクス、２０：７０８−１３（１９９６年）。
６．Ｎｅｒｉ  Ｄ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  Ｔ．，Ｐｅｔｒｕｌ  Ｈ．，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．，Ｂｒｏｗｎｅ  Ｍ．ａｎｄ  Ｖａｎｄｅｒｐａｎｔ  Ｌ．  Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＬＵＡＮＡ）：ｕｓｅ  ｉｎ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：７０８−１３（１９９６）．
７．ラム，Ｐ．、「アッセイスクリーニングにおけるイメージングシステム」、ドラッグ・ディスカバリー・トゥディ、４：４０１−４１０（１９９９年）。
７．Ｒａｍｍ，Ｐ．  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：４０１−４１０（１９９９）．
８．リグラー，Ｒ．、「バイオテクノロジーにおける蛍光相関、単一分子検出及び大量スクリーニング適用」。バイオテクノロジージャーナル、４１：１７７−１８６（１９９５）。
８．Ｒｉｇｌｅｒ，Ｒ．  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ，ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４１：１７７−１８６（１９９５）．
９．セビュース，Ｌ．、ヴァイサラ，Ｍ．、サンドベリ，Ｍ．、クーシスト，Ａ．、ハリュ，Ｒ．、サロ，Ｊ．、ヘミラ，Ｉ．、コヨラ，Ｈ．及びソイニ，Ｅ．。「免疫組織化学及びインシツハイブリダイゼーションにおけるユーロピウムキレート標識の時間分解蛍光イメージング」。細胞測定、１３：３２９−３３８（１９９２年）。
９．Ｓｅｖｅｕｓ，Ｌ．，Ｖａｉｓａｌａ，Ｍ．，Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｋｕｕｓｉｓｔｏ，Ａ．，Ｈａｒｊｕ，Ｒ．，Ｓａｌｏ，Ｊ．，Ｈｅｍｍｉｌａ，Ｉ．，Ｋｏｊｏｌａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｓｏｉｎｉ，Ｅ．  Ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｒｏｐｉｕｍ  ｃｈｅｌａｔｅ  ｌａｂｅｌ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：３２９−３３８（１９９２）．
１０．ショットン，Ｄ．Ｍ．、「電子光線顕微鏡−現在の能力及び将来の展望」。組織化学及び細胞生物学、１０４：９７−１３７（１９９５年）。
１０．Ｓｈｏｔｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０４：９７−１３７（１９９５）．
１１．ヴェレブ，Ｇ．、ジャーレス・エリーマン，Ｅ．、セルビン，Ｐ．Ｒ．及びジョバン，Ｔ．Ｍ．、「ランタニドキレート類の時間的及び空間的分解イメージング蛍光顕微鏡法」、生物学ジャーナル、７４（５）、２２１０−２２２２（１９９８年５月）。
１１．Ｖｅｒｅｂ，Ｇ．，Ｊａｒｅｓ−Ｅｒｉｊｍａｎ，Ｅ．，Ｓｅｌｖｉｎ，Ｐ．Ｒ．ａｎｄ  Ｊｏｖｉｎ，Ｔ．Ｍ．  Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  Ｃｈｅｌａｔｅｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７４（５），２２１０−２２２２（Ｍａｙ  １９９８）．
１２．フルウールト，Ｎ．Ｐ．、ヘニンク，Ｅ．Ｊ．、ボネ，Ｊ．、ファンデルゲースト，Ｃ．Ｒ．及びタンケ，Ｈ．Ｊ．、「時間分解蛍光顕微鏡法のための強誘電液晶シャッタの使用」。細胞測定、１；１６（２）：１１３−７（１９９４年６月）。
１２．Ｖｅｒｗｏｅｒｄ  Ｎ．Ｐ．，Ｈｅｎｎｉｎｋ，Ｅ．Ｊ．，Ｂｏｎｎｅｔ  Ｊ．，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｓｔ  Ｃ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔａｎｋｅ，Ｈ．Ｊ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｅｒｒｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｈｕｔｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １９９４  Ｊｕｎ  １；１６（２）：１１３−７。
【図面の簡単な説明】
【図１】
蛍光イメージングのために有用な本発明による光学系の好ましい実施形態の模式的断面図である。
【図２】
環状照明器をエピタキシャル照明システムに置き換えた図１に記載の光学系の断面図である。
【図３】
高速シャッタの追加を示している図２と同様の断面図である。
【図４】
光学系におけるシャッタ及びフィルタの操作を具体的に示している光線図である。
【図５】
本発明によるシステムの性能を非イメージング時間分解蛍光計と比較したグラフである。
【図６】
現行システム内に導入された電子衝撃ＣＣＤカメラと非イメージング時間分解蛍光計との性能を比較したグラフである。
【図５】
2004519667.tif 000003
【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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