(57)【要約】本発明はゲノム病原体核酸を用いて、微生物病原体のゲノムによりコードされる生物学的に活性な構造体を同定する方法に関するものである。
2004532011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム病原体核酸を用い、微生物病原体のゲノムによりコードされる生物学的に活性な構造体を同定する方法であって、
（ａ）ゲノム病原体核酸を病原体含有サンプルから抽出し；
（ｂ）ゲノム病原体核酸を配列独立増幅に付し；
（ｃ）増幅した病原体核酸を発現させ；および
（ｄ）生物学的に活性な構造体をスクリーニングして同定する；
工程を含む、方法。
【請求項２】
微生物病原体のゲノムによりコードされる生物学的に活性な構造体が細菌病原体のゲノムによりコードされるという特徴がある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物病原体のゲノムによりコードされる生物学的に活性な構造体がＤＮＡ含有ウイルスのゲノムによりコードされるという特徴がある、請求項１記載の方法。
【請求項４】
微生物病原体が細胞内ウイルスあるいは細菌病原体である、請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
微生物病原体が細胞外ウイルスあるいは細菌病原体である、請求項１〜３記載の方法。
【請求項６】
微生物病原体が致命的でない、および／または感染性がない、請求項１〜３記載の方法。
【請求項７】
生物学的に活性な構造体が病原体抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
生物学的に活性な構造体が微生物病原体の病原性因子である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
生物学的に活性な構造体が酵素活性をもつ蛋白である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
１０〜２０ｐｇの病原体核酸が同定に使用される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
１〜１０ｐｇの病原体核酸が同定に使用される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
サンプルが血液、組織、培養細胞、血清、病変からの分泌液および他の体液を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）の病原体含有サンプルからのゲノム病原体核酸の抽出が、以下の工程：
（ａ１）病原体粒子を病原体含有サンプルから放出する工程；
（ａ２）混入した宿主の核酸を任意にて除去および／または減少させる工程；および
（ａ３）ゲノム病原体核酸を放出した病原体粒子から抽出する工程；
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ１）における病原体粒子の放出が細胞の溶解、沈殿、遠心分離および／または濾過を通して起こる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ２）における混入した宿主の核酸の除去および／または減少がＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ消化を通して起こる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ３）におけるゲノム病原体核酸の抽出が、プロテアーゼＫ消化、変性、リソチーム処理あるいは有機抽出による病原体の微粒子成分からの病原体の遺伝物質の分離を通して起こる、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）におけるゲノム病原体核酸の配列独立増幅が、変性した３´末端におけるアダプタオリゴヌクレオチドでのクレノー反応およびその後のアダプタ配列に対応するオリゴヌクレオチドでのＰＣＲを通して起こる、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）における病原体核酸の増幅が変性したオリゴヌクレオチドでの逆転写およびその後のＰＣＲ増幅を通して起こる、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）における病原体核酸の増幅が変性したオリゴヌクレオチドでの逆転写およびその後のＴ７ＲＮＡポリメラーゼでの増幅を通して起こる、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）における増幅した病原体核酸を発現させるために、病原体核酸のベクターへの導入、およびベクターのラムダファージでの封入が起こる、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）における増幅した病原体核酸を発現させるために、病原体核酸を線状ファージベクターに導入する、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
ベクターがウイルス、真核生物、あるいは原核生物ベクターの群から選択される、請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２３】
スクリーニングが病原体抗原の免疫スクリーニングであり、工程（ｄ）における病原体抗原の同定が以下の工程：
（ｄ１）細菌をラムダファージに感染させ；
（ｄ２）ファージプラークを形成することでその感染細菌を培養し；
（ｄ３）ファージプラークをニトロセルロース膜あるいは病原体由来の組換え蛋白を固定するのに適当な別の固相に移し；
（ｄ４）当該膜を感染した宿主の血清または抗体含有体液と共にインキュベートし；
（ｄ５）当該膜を洗浄し；
（ｄ６）当該膜を感染した宿主の免疫グロブリンに特異的なＡＰ結合抗ＩｇＧ二次抗体と一緒にインキュベートし；
（ｄ７）着色反応によって、宿主の血清と反応するクローンを検出し；および
（ｄ８）反応性クローンを単離かつ配列決定する；
工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
スクリーニングが病原体抗原の免疫スクリーニングであり、工程（ｄ）における病原体抗原の同定が以下の工程：
（ｄ１）線状ファージベクターを細菌に導入することによって、組換え線状ファージを生成し；
（ｄ２）生成した組換え線状ファージを感染した宿主からの血清と一緒にインキュベートし；
（ｄ３）感染した宿主の免疫グロブリンに特異的な固定試薬を用いて、宿主の免疫グロブリンが結合している線状ファージを選択し；および
（ｄ４）選択されたクローンを単離かつ配列決定する；
工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
核酸の抽出の前に、ポリエチレングリコールを用いる沈殿、超遠心分離、勾配遠心分離あるいはアフィニティクロマトグラフィーにより微生物病原体を豊富にさせる、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１あるいは２２の配列の一つに８０％相同である核酸により抗原がコードされるという特徴がある、ワクシニアウイルス抗原。
【請求項２７】
配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１あるいは２２の配列の一つに９０％相同である核酸により抗原がコードされるという特徴がある、請求項２６記載のワクシニアウイルス抗原。
【請求項２８】
配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１あるいは２２の配列の一つに９５％相同である核酸により抗原がコードされるという特徴がある、請求項２６記載のワクシニアウイルス抗原。
【請求項２９】
配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１あるいは２２の核酸の一つにより抗原がコードされるという特徴がある、請求項２６記載のワクシニアウイルス抗原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム病原性核酸に基づき、微生物病原体のゲノムによりコードされる生物学的に活性な構造体を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子的に定義された血清診断剤およびワクチンを発展させるための要件は、感染した宿主の免疫系により認識される病原体の抗原（微生物免疫）の分子的知識および有用性である。感染症の血清診断は、病原体の免疫原性成分（抗原）に対し特異的に反応し、こうして既存のあるいは最近の感染を示す、血中を循環する抗体を検出することに基づく。これらの抗原に対する知識により、組換え操作を通して分子的に定義されたワクチンとして抗原を産生することができる。これらのワクチンは問題となっている病原体により引き起こされる感染に対する生体防御を与えることができ（予防免疫）、また永続性で慢性の場合にはそれらを除去する働きもする（治療免疫）。特異的診断および特異的治療の両方にとってのそのような抗原の重要性により、これらの構造の同定にかなりの関心がもたれる結果となっている。
【０００３】
既知のゲノムを有する低度な感染病原体（例えば単純ウイルス）の場合に大抵の関連する抗原は分子的に同定されてきたが、より高度な感染病原体（例えば細菌）の場合に抗原が免疫学的に関連しているということはまだはっきりしていない。この理由は、これらの病原体の高度なゲノムが多くの遺伝子（１０００〜４０００以上まで）を含み、そのことが問題とされる抗原の素早い同定を難しくしているからである。ゲノムが完全に既知である病原体の場合でさえも、すべてのヌクレオチド領域が実際に蛋白をコードしている部分だとされるわけでなく、また抗原を生産する部分になりうるわけでないと思うに違いない。
【０００４】
抗原を同定するために過去何年にもわたって発展してきた多くの科学技術はこの難問と取り組もうとしている。これらの大部分の方法は、高処理量蛋白分析技術という名前の「プロテオミクス」技術という分野に由来する。
これらの高処理量技術の一つは２−Ｄゲル（例えばLiu  B、Marks  JD、(2000)、Anal.Biochem.286、1191-28）の使用を含む。病原体の多くがこの方法において必要とされるので、これらを最初に培養条件下で増殖させる。溶解した病原体からの抽出物をその後生産し、それらに含まれる蛋白をゲル電気泳動により分離する。免疫血清（患者の血清、免疫のある動物からの血清）により同定した蛋白複合体は単離および微小配列決定を通して分析されうる。大量の病原性物質が分析に必要とされるので、この方法は多くの制限および不利な点を有する。分析は初期外傷から直接可能ではなく、しばしばとても時間のかかる培養の後だけ（例えばマイコバクテリアの場合に）である。病原体の中には単純な方法で培養されることができないものもある。つまり未知の病原体では培養条件がしばしば決定されないのである。死んだ病原体は一般的にこの培養方法から除外される。
【０００５】
２−Ｄゲル技術の別の不利な点は、細胞培養での病原体の遺伝子発現状態が生体内でのものと明らかに違うということである。多くの病原体遺伝子産物は、病原体が宿主の生体を侵す場合にのみ関与する。この理由のために、分析には培養時に感染病原体で発現する蛋白だけが利用できる。これにより感染条件下にのみ検出できる量で宿主において発現される多くの蛋白が除外される。しかし、それらの蛋白でさえ診断血清学に関連しうるものであり、臨床的に関係のないコロニー形成と侵襲性感染とを区別することができるに違いない。
また、抗原は２−Ｄゲルにより蛋白として同定される。多くのその後の分析の基礎となるヌクレオチド配列も今なお決定されなければならない。
２−Ｄゲル法の代わりとして、完全なヌクレオチド配列が知られている病原体では、すべての推定される遺伝子を発現カセットに導入し、それらを組換え操作にて発現させ、それらの免疫性および抗原性を実験できる（Pizzaら、(2000)、Science287(5459):1816-20）。組換え操作を通して発現された遺伝子は、例えば免疫血清での平行ドットブロット法でスクリーニングされる。
【０００６】
この方法の不利な点は、関心のある病原体で発現すると知られている蛋白のみ分析されうるということである。未知のヌクレオチド配列を有する病原体をこの分析で検出することができない。
前述の分析技術は大量の物質、時間、人および費用がかかるので、それらはいくつかの大規模施設でのみ確保されている。
ゲノム発現バンクの免疫スクリーニング（例えばPereboevaら、(2000)、J.Med.Virol.60:144-151）は、「プロテオミクス」法の効率的で、可能性として効果的な別法である。しかし、この目的のためには定義された培養条件下で感染病原体を増やすことも必要である。病原体のゲノムはその後分離され、酵素によりあるいは機械的に断片に切断され、最後に発現ベクター中でクローン発生される。発現した断片はその後血清により感染した生体から認識されるかどうか決定するために実験されうる。この方法の利点はそれが金銭的に効果的で素早い抗原の同定を提供することができるということである。しかし、同様にこの方法には、大量の病原体核酸が必要とされるという理由によりインビトロでの培養を通して病原体を増殖させ、その後それらを再精製することが必要である。その結果として、その方法はこれまでのところ培養および精製の様相が知られており、確立されている病原体に限られている。
【０００７】
一つの問題はこれまで特徴付けられていないか、あるいは不十分にしか特徴付けられていない感染病原体を同定することである。本発明は特に以下の〔ＳＨ１〕攻撃を取り扱う。
１）原因が疫学およびそれらの臨床経過に基づく炎症性疾患は、病原体が既知の方法により定義され得ない、および／または不十分にしか特徴付けられ得ない感染であるように思われる。これは多発性硬化症、川崎病、サルコイドーシス、糖尿病、ホウィップル病、粃糠疹などのような疾患も含む。リンパ節生検などの、初期患者の物質から未知の感染病原体を測定するための系統的分析を与えるこれらの病気に対する方法を有することが望ましい。
【０００８】
２）新しい新興感染症。これはこれまでのところ未知であるか、あるいはあまり特徴がない病原体（例えば８０年代のＨＩＶ）により引き起こされ、例えば疫学の変化のために突然臨床の関心の焦点となった感染症を含む。医学および社会経済学の見地からすると、迅速な病原体の同定、対応する診断法の発展および可能であればワクチンの生産が不可欠である。一般的に特徴がない病原体の培養条件を確立するには数年かかるかもしれないので、同様にこの場合も、病原体および病原体の抗原を感染組織から直接同定することがかなり望ましいが、これは既知の方法を用いて行うことはできない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それゆえ病原体の培養基を使用せずに、初期物質を直接使用して病原体を同定することを可能とする方法に対する大きな要求がある。さらに、この方法によりこれまで初期物質において未知であった病原体を効率的に発見できるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
それゆえ本発明の一つの目的は限られた量（例えば、５０ｍｍ３）の感染した患者の物質から直接病原体核酸の同定を行う方法を発展させることであった。
本発明は病原体およびその抗原をコードした未知の核酸に加え既知の核酸の、宿主の生体においてそれらにより引き起こされる免疫応答を用いての系統的同定法を記載する。
したがって、本発明の対象は、微生物病原体のゲノムによりコードされた生物学的に活性な構造体の、ゲノム病原体核酸を用いての同定法であり、その方法は以下の工程：病原体を含むサンプルからのゲノム病原体核酸の抽出、ゲノム病原体核酸の配列独立増幅（sequence-independent  amplification）、増幅した病原体核酸の発現および生物学的に活性な構造体のスクリーニングおよび同定、を含む。
本発明の方法は、宿主の生体により認識される病原体抗原（微生物免疫）の完全な同定がかなり少ない量の病原体でさえ可能であるという決定的な利点がある。
【００１１】
本発明の方法は、１ｐｇほどの最小の初期量の病原体核酸で効果的な分析を行うのに十分であるという特徴がある。好ましい具体例では、１０〜２０ｐｇ、より特異的には１〜１０ｐｇの病原体核酸を使用する。
一方では、高感度なこの方法により、前もってインビトロでの培養によりこれらの病原体を増やす必要なく、初期単離物から病原体を分析することができる。このようにして、既知の方法では培養するのが難しい（例えば結核菌）か、あるいはまったく培養できない（例えばライ菌あるいは致命的でない病原菌）病原体を実験できる。
他方で、インビトロでの増量がもはや必要でない場合、インビトロでの培養により起こる病原体の混入（例えば混合感染での、問題となる病原菌の過度の繁殖による）を避けることができる。
さらに、高感度なこの方法により病原体単離のための広範囲の原物質を使用できる。
本明細書では、「サンプル」なる語は細胞、組織、体液のようなさまざまな生物学的物質を指す。好ましい具体例では、血液、組織、培養細胞、血清、病変からの分泌液（膿疱、痂皮など）および尿、唾液、液、関節液、胆汁および涙のような他の体液が好ましく使用されるサンプルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
病原体含有サンプルからゲノム病原体核酸の入手
本発明の方法の第一工程では、ゲノム病原体核酸は病原体含有サンプルから得られる。
本明細書で用いる場合、「病原体微生物」なる語はウイルスおよび細菌病原体を含む。病原体は宿主細胞中に、あるいは宿主細胞と細胞共生して存在し、血清中を循環する病原体を除いて入手しやすくなければならない。本発明の好ましい具体例では、病原体は細胞内あるいは細胞外に存在する。
【００１３】
細胞内病原体は細胞溶解により（例えば真核生物の細胞膜で機械的に、あるいは界面活性剤により、例えばＳＤＳにより）放出されうる。好ましいＳＤＳ濃度はグラム陽性菌で＞０．０５％ないし１％、グラム陰性菌で０．０５％ないし０．１％である。当業者ならエンベロープ、例えばグラム陽性あるいは陰性菌の壁は無傷のままであるが、真核生物の細胞壁ならば既に溶解される濃度を用いて、他の界面活性剤の適当な濃度を簡単に決定することができる。
細胞外病原体は、例えばそれらのかなり小さい粒度（２０ｎｍ〜１μｍ）のために（例えば沈殿／遠心分離および／または濾過により）宿主細胞から分離されうる。本発明の特に好ましい具体例では、病原体は感染性がなく、致命的でない。高感度のこの方法により、病原体を感染性のない病原体および／または感染の全盛期を経過した後に残った致命的でない病原体にさえすることもできる。
【００１４】
本発明の方法の第一工程、つまり病原体含有サンプルからのゲノム病原体核酸の入手は、さらに以下で記載される。
病原体含有サンプルからのゲノム病原体核酸の入手は、本発明の好ましい具体例として以下の工程：病原体含有サンプルからの病原体粒子の放出、次に混入宿主核酸の除去および／または減少、その後の放出した病原体粒子からのゲノム病原体核酸の抽出、という特徴がある。
本発明の一つの具体例によると、病原体粒子の放出は細胞溶解、沈殿、遠心分離および／または濾過により達成される。
好ましい具体例によると、混入宿主核酸の除去は病原体核酸の抽出の前に実施されているＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの消化工程により達成される。
【００１５】
これは病原体がカプシド蛋白により保護されるウイルスの場合、特に有利である。ウイルスのカプシドエンベロープはヌクレアーゼに対する保護を提供するので、病原体は従って細胞外ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの活性に対し保護される。本発明のさらなる具体例はそれゆえ、特に（ワクシニアウイルスのような）ウイルス病原体においてＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ消化による混入宿主核酸の除去および／または減少の工程を含む。ウイルス粒子の精製のためのＤＮａｓｅ処理は当業者に公知であり、例えばDahl  R、Kates  JR、Virology  1970；42(2)：453-62、Gutteridge  WE、Cover  BTrans  R  Soc  Trop  Med  Hyg  1973；67(2)：254、Keel  JA、  Finnerty  WR、Feeley  JC、Ann  Intern  Med  1979  Apr；90(4)：652-5あるいはRotten  S、in  Methods  in  Mycoplasmology、Vol.1、Academic  Press1983に記載されているように実施されうる。
組織から由来のグラム陽性またはグラム陰性菌などの病原体を組織から富ませる別の可能性は、本発明の方法で適用されるように、例えばＳＤＳのような脂質膜を溶解する界面活性剤での感染組織の分画溶解（逐次溶解として以下で明示される）を用いることである。この状況では、使用は、真核生物の宿主細胞の細胞膜が低濃度のＳＤＳに対して極めて高い感度で反応して溶解するが、細菌壁はさらに耐性であり、それらの小体の一体性が維持されるということから選択される。
【００１６】
増加させた後、病原体核酸を病原体の微粒子成分から分離させ、病原体から放出させる。これは当業者により既知の標準技術で実施されることができ、それにより本発明の好ましい具体例では、分離はプロテアーゼＫ消化、変性、熱および／または超音波処理、リソチーム処理により酵素で、あるいは有機抽出により行われる。
ＳＤＳのような界面活性剤による細菌／ウイルスの精製はTakumi  K、Kinouchi  T、Kawata  T、microbial  Immunol  1980；24(6)：469-77、Kramer  VC、Calabrese  DM、Nickerson  KW、Environ  Microbiol  1980  40(5)：973-6、Rudoi  NM、Zelenskaia  AB,Erkovskaia、Lab  Delo  1975；(8)：487-9あるいはKeel  JA、Finnerty  WR、Feeley  JC、Ann  Intern  Med  1979  Apr；90(4)：652-5により記載されているように実施されうるが、米国特許第４，２８３，４９０号も参照されたい。
本発明は、感染した組織／器官において一部の組織／細胞のみが病原体に感染するという問題を解決する。
【００１７】
本発明はまた、マイコバクテリア症のような、わずかなあるいは単離した病原体粒子しか感染組織中に存在しない場合に病原体の形跡を提供するのに適する。
本発明は、組織単位（例えば５０ｍｍ３）につき少しの合計量の病原体核酸しか感染していない場合に病原体の検出が可能であるという利点がある。ＤＮＡをコードした多くの病原体の例として、１０，０００塩基の平均的なゲノムの大きさのウイルスおよそ１０６個あるいは１，０００，０００塩基の平均的なゲノムの大きさの細菌１０４個がちょうど１０ｐｇの病原体核酸を含む。さらに、大部分の感染病原体のゲノムはヒトのゲノムよりもかなり小さい（ウイルスで１０６の因子までおよび細菌で１０４の因子まで）。結果として、宿主の核酸の合計量に比較して病原体核酸の合計量の割合は、コピーの数および病原体ゲノムの大きさにより、１０の累乗倍希釈される（病原体核酸に対する宿主の核酸の比率は１０４〜１０９）。
【００１８】
ゲノム病原体核酸の配列独立増幅
本発明の方法はさらに、原物質を増やすのに役立つポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるゲノム病原体核酸の配列独立増幅を含む。
本明細書では、ＰＣＲのプライマーは無作為な配列（無作為なオリゴヌクレオチド）で使用され、結果として特異的な遺伝子の範囲だけでなく、可能な限り病原体の完全なゲノムが典型的な方法で増幅されうる（変性したオリゴヌクレオチドでの非選択的核酸増幅）。これらのプライマーは宿主のＤＮＡにも結合するのが自然であるが、先ほど記載したように、それらＤＮＡは事前のＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ消化、あるいは選択的細胞溶解により減少あるいは除去されている。
しかし、事前のＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ消化、あるいは選択的細胞溶解それぞれによる宿主ＤＮＡの除去あるいは減少は本発明の方法において絶対に必要なわけではない。例えば膿疱あるいはウイルス水疱に存在するような高濃度の病原体ＤＮＡあるいはＲＮＡでは、宿主ＤＮＡの除去あるいは減少は必要でない。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「ゲノム病原体核酸」なる語はゲノムＲＮＡだけでなくゲノムＤＮＡ両方を含む。
本発明の好ましい具体例では、ゲノム病原体核酸がＤＮＡであり、その配列独立増幅が変性した３´末端におけるアダプタオリゴヌクレオチドでのクレノー反応およびその後のアダプタ配列に対応するオリゴヌクレオチドでのＰＣＲにより実施される。
病原体がＲＮＡかＤＮＡどちらによりコードされているかわからない場合、両方の反応を別々の反応容器で実施し、別々に増幅させる。アンプリコンはどちらの場合もゲノム核酸断片を表わす。変性したオリゴヌクレオチドを用いることで、完全なゲノムの無作為増幅（ショットガン技法）が可能となる。
【００２０】
本発明の方法の強みは、その高感度および効率のよさ（ほんの数ｐｇの初期量で十分である）であり、同時に全ゲノムのすべての領域の発現が十分維持される。本発明の方法により生成されるライブラリの微生物遺伝子部分の十分な発現は、例えば塩濃度の変化のような二段階ＰＣＲでの変化により達成される。それゆえ発現が広く維持される高効率なこの方法により、増加に伴う制限があるにもかかわらず、病原体の増加のための初期培養の準備が不必要になる。未知の病原体の場合培養条件は定義されず、試行錯誤により近づけていかなければならないだろう。さらに、一連の既知の病原体は培養するのが難しい。混合感染では、初期培養は異常増殖現象により問題とされる病原体の数を特異的に薄めることができる。死んだ病原体はまったく検出されないだろう。他の技術でのこれらの不利な点は本発明の方法により避けられる。
【００２１】
好ましい具体例では、病原体核酸の配列非特異的増幅は次々と適用される、各段階で３５〜４０周期の二つの逐次ＰＣＲ段階で実施される。
これを行うにあたり、様々な条件下（例えば塩化マグネシウム濃度、緩衝液条件、あるいはポリメラーゼの変化）で再増幅するために最初のＰＣＲの２０分の１ないし５０分の１の量が最初の増幅後使用される。二回目のＰＣＲでの再増幅の結果として、実施例３Ａに示されるようにより高感度なこの方法が保証される。再増幅条件の変化（実施例６図６参照）により病原体ゲノムのさまざまな部分の特に十分な発現およびそれによる病原体の完全な分析が可能となる。
【００２２】
増幅した病原体核酸の発現
ゲノム病原体核酸の増幅を行い、つづいてそれらの発現を行う。これを行うにあたり、病原体のゲノム発現バンクを適当な発現ベクターに生成するために病原体核酸を複製する。
本発明の一つの具体例では、発現ベクターはウイルス、真核生物あるいは原核生物ベクターの群から選択される。本発明の枠内で、組換え蛋白の発現を可能にするすべての方法が使用されうる。
【００２３】
ベクターに病原体核酸を導入した後、ベクターをラムダファージ中に封入するのが好ましい。
本発明の好ましい具体例では、病原体核酸の発現はラムダファージベクター（例えば、米国特許第５，１２８，２５６号のラムダＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ発現ベクター）への病原体核酸の導入により保証される。別法として、当業者に公知の他のベクターを用いることができ、特に好ましいのは線状ファージベクター、真核生物ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターあるいはアルファウイルスベクターである。
【００２４】
生物学的に活性な構造体のスクリーニングおよび同定
本発明の方法の最終工程はゲノムの発現バンクのスクリーニングおよび感染した宿主の免疫応答による病原体の生物学的に活性な構造体の同定を含む。
本明細書で用いる場合、「生物学的に活性な構造体」なる語は病原体抗原、酵素的活性のある蛋白あるいは微生物病原体の病原性因子を示す。
本発明の好ましい具体例によると、スクリーニングは病原体抗原の免疫スクリーニング工程を示し、病原体抗原の同定は以下の工程：細菌のラムダファージでの感染、ファージプラークの形成による感染した細菌の培養、ニトロセルロース膜（あるいは病原体由来の蛋白の組換え体に適する他の固相）へのファージプラークの移動、血清あるいは感染した宿主の抗体含有体液との膜のインキュベーション、膜の洗浄、感染した宿主の免疫グロブリンに特異的なアルカリホスファターゼ結合抗ＩｇＧ二次抗体との膜のインキュベーション、着色反応による宿主の血清に反応性のあるクローンの検出、および反応性クローンの単離および配列決定、を含む。
【００２５】
原則として、生物学的に活性な構造体の同定のために線状ファージの表面に直接抗原が発現できるようにする（ｐＪｕｆｏのような）組換え線状ファージベクターへ病原体核酸を導入することもできる。この場合、病原体抗原の同定は以下の工程：細菌への線状ファージベクターの導入による組換え線状ファージの生成、感染した宿主の結成での生成した組換え線状ファージの培養、感染した宿主の免疫グロブリンに特異的な固定試薬による、宿主の免疫グロブリンが結合している線状ファージの選択、および選択されたクローンの単離および配列決定、を含む。
病原体ゲノム由来および組換えて発現する蛋白は、例えば固相に結合しうるか、あるいは感染した宿主の特異的免疫応答相当物での選別／獲得方法の枠内でスクリーニングされうる。これらは一方ではさまざまな免疫グロブリンのクラス／サブクラスの抗体、主にＩｇＧである。宿主の血清はこの目的に用いられる。しかしこれらは病原体抗原のエピトープに特異的なリンパ球でもあり、ＭＨＣレストリンゲントとして認識され、真核生物の組織中で検査されなければならない。
ゲノムバンクを確立するための条件として、挿入した断片はＰＣＲプライマーの特有の性質のために無作為生成原理により存在する。したがって、蛋白としても当然形成される既知の抗原領域が発現される。読み取り枠の長さにより短いナンセンスな蛋白あるいはペプチドを発現しうるが、通常発現されない中間遺伝子領域の断片でさえ存在しうる。一つの重要な考察すべきこととしては、本発明の方法ではこれまで同定されていない病原体蛋白でさえ自然と存在しうるということである。
【００２６】
本発明の好ましい具体例の詳細な記載
本発明はすべての考えられる組換え蛋白の発現をその後の高度に厳密なフィルターの使用、つまり疾患の自然経過の枠内での感染した宿主に生じる特異的免疫応答と結びつける。
本発明のさらなる具体例では、ポリエチレングリコール、超遠心分離、勾配遠心分離での沈殿による、あるいはアフィニティクロマトグラフィーによる核酸の増幅以前に病原体が増やされる。
ポリエチレングリコールでの沈殿は特にウイルス粒子に効率的である。代わりとして、既知の病原体では、定義され安定した表面構造に対する病原体特異的抗体を利用するアフィニティクロマトグラフィーが別の選択である。未知の病原体でのさらなる代わりはポリクローナル患者の血清自体の使用であり、ポリクローナル患者の血清は固相に固定され、特異的獲得試薬として病原体の親和増加に使用される。
本明細書記載の方法は、かなり少量の病原体含有物質から抗原をコードする病原体核酸をかなり効率よく同定するためのプラットホーム技術として使用される。以下の実施例で示されるように、１〜２０ｐｇのゲノム核酸で、自然の免疫反応により血清学的に同定される個々の病原体の抗原レパートリーの完全な同定を行うのに十分である。こうして本明細書記載の技術は、例えば２０ｐｇのＤＮＡから生じるワクシニアウイルスに免疫優性であると知られている抗原の同定を可能にした。
【００２７】
この方法に必要とされる少量の核酸により、以前から知られている十分でない方法で扱われるだけか、あるいはまったく扱われない医学的に重要な問題にこの方法を適用できるようになる。
これは例えば、インビトロでの受容細胞列、器官、皮膚あるいは粘膜の膿疱のような炎症性外傷のような感染細胞から、感染した内在リンパ性および非リンパ性器官から、あるいは感染した器官から得られる（唾液、痰、血液、尿、膿あるいは他の滲出液のような）病原体含有分泌液からの病原体核酸の系統的直接的同定を含む。基礎として１ｐｇの感度を考慮した場合、病原体のゲノムの大きさにより（例えばウイルスは３，０００〜２５０，０００塩基対あるいは細菌は１００，０００〜５，０００，０００塩基対）、５０〜１０５個の病原体粒子で抗原をコードしている病原体核酸を同定するのに十分である。大抵の場合、多くの病原体粒子が本発明の方法の感度制限をかなり越えているだろうと考えるであろう。
本発明の高感度のこの方法は、すでに上で記載されているようにインビトロ培養を必要とせずに初期単離物から病原体を検査できる。少量の生検材料あるいは数マイクロリットルの感染したサンプル分泌液のようなかなり少量の原材料で本発明の方法を用いて生物学的に活性な構造体の増加および同定がうまくいくのに十分であるということが特に重要である。したがって本発明の方法は医学臨床診断の分野からのどんな過剰物質にも、および（実施例９で示されているように）低温保存されたサンプル物質にも適用されうる。
【００２８】
本発明の方法を基礎に同定された病原体核酸の配列決定は病原体核酸が由来する病原体の同定をもたらす。したがって病原体に関する事前の知識は必要なく、この方法は以前には同定されていなかった感染病原体あるいは以前には知られていなかった抗原を発見するのに適する。
この方法はそれゆえ感染病原体の存在が原因だと推測されるが、いまだに同定されていない一連の疾患を調べるのに適用されうる。これは（伝染病のような）コッホの仮説を部分的に満たすが、病原体の培養能／単離能がないためにまだ病原体を同定できていない疾患を含む。他の例はサルコイドーシス、粃糠疹、多発性硬化症、糖尿病、およびクローン病などの疾患である。
同様に、原因のはっきりしない慢性肝炎（慢性非Ｂ型非Ｃ型肝炎）の患者の中には、以前は知られていないウイルス性疾患が予測される。既知のウイルス性肝炎の患者の血清中の病原体の数は多い。例えば感染性慢性ＨＢＶあるいはＨＣＶ誘因肝炎の患者には、血液１ｍＬ中に１０８個のＢ型肝炎あるいはＣ型肝炎粒子がある。おおよそ比較できる病原体の数を想定すると、本発明の方法は感染した患者からの少量の血液／血清（１〜１０ｍＬ）を用いて推定される非Ｂ型非Ｃ型肝炎病原体を同定するのにも適する。
【００２９】
本発明での免疫スクリーニングの工程により、高感度で高度に特異的な高処理量検出方法として、１０６〜１０７個の非免疫原性クローンの間の抗原をコードしている核酸を同定できるようになる。
この目的のためには、低純度の病原体核酸で病原体の同定に十分である。この低純度は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはアフィニティクロマトグラフィーおよび／またはヌクレアーゼでの混入した宿主核酸の消化での病原体粒子の沈殿のような、以前の技術で知られているさまざまな方法により難なく達成されうる。
病原体粒子を増やすさらなる可能性としては、病原体粒子に対する感染した生体で形成される獲得工程に特異的な抗体を使用するものである。
【００３０】
この方法の不可欠な部分としての免疫スクリーニングにより、一人の人で短い期間（２ヶ月）内に１０６〜５×１０６個のクローンの分析ができる。配列独立増幅および血清学検査の組み合わせにより、初期核酸が適度な純度であっても（病原体核酸＞全核酸の１％）、現在の発現状態にかかわらずポリペプチドをコードしている可能性のあるすべての領域を完全に検査できる。ゲノム核酸を検査することにより、ある特異的な瞬間に（例えば特異的な感染時にのみ）発現するだけの遺伝子を含むすべての遺伝子領域が扱われるだろう。これは個々の抗原について述べることができるようになるだけでなく、ヌクレオチドをコードした免疫原性領域全体（免疫、図４Ａ〜Ｃおよび図５参照）についての情報を提供する。さらに複数の部分的に重複する断片の同定を通して、血清学的に認識されたエピトープを同定された抗原（図４Ａ〜Ｃ参照）内に制限できるようになる。シグナルの強みは優性および非優性エピトープ（図４Ａ〜Ｃ参照）のさらなる識別を実施できることである。同定された病原体核酸の断片は免疫診断の薬剤およびワクチンの発展に直接利用できる。同定された核酸は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の特異的増幅を用いての高感度の直接病原体検出方法の発展のためのマトリックスとして使用されうる。同定された断片は抗原特異的Tリンパ球反応の存在の検出に基づく診断試験の発展のためにも使用されうる。
【００３１】
（本発明の方法が）「プロテオミクス」のような技術と異なる点はすでに前文で論じられてきた。本発明の方法は専門用語において、使用された二つの他の関連する方法：ゲノム病原体ライブラリの血清学的調査およびＳＥＲＥＸ技術と異なる。
ゲノムライブラリの血清学的検査において、（Luchiniら(1983)、Curr  Genet10：245-52、Bannantineら、(1998)、Molecular  Microbiology  28：1017-1026などの）多くのグループが、精製かつ機械的に切断されるか酵素により消化された病原体ＤＮＡから発現ライブラリを産生してきた。この方法での発現ライブラリの確立において、ゲノムの大きさにより対応するバンクを生産するために、０．５〜５μｇの精製した病原体核酸が必要とされる（１０５〜１０６個の病原体核酸がさらに必要となる）。結果としてこの方法はかなり少量の病原体および病原体核酸が存在する初期単離物から病原体を検査するのに適さない。この場合病原体がインビトロで単離、培養され、その後複雑な精製工程を経ることが不可欠である。したがってこの方法を行う必要条件として、培養および精製様相が個々の病原体各々に対して知られており、前もって確立されていなければならない。しかし、多くのウイルスおよび細胞内病原体にとって、これはかなりの専門技術を必要とする技術的に複雑な工程である。したがって、この方法も、もはや生存しないものも含む、未知の病原体を同定する可能性を削除する。
【００３２】
この方法とＳＥＲＥＸと呼ばれる方法（Sahinら、(1995)、Proc  Natl  Acad  SciUSA92:11810-3;Sahinら(1997)、Curr  Opin  Immunol  9、709-716）も区別されなければならない。ＳＥＲＥＸでは、ｍＲＮＡが病気の組織から抽出され、ｃＤＮＡ発現ライブラリが確立され、組織をとったのと同じ人の血清で免疫反応のある抗原に対してスクリーニングされる。
これと本発明の方法との実質的な違いは、感染した組織の宿主細胞からのｃＤＮＡ発現ライブラリがＳＥＲＥＸ法に使用されるという事実である。
【００３３】
核酸の異なる特性および異なる起源は以下の識別につながる。
ＳＥＲＥＸ法を用いての宿主細胞からの全ｍＲＮＡの使用はライブラリの複雑性を増加させ、病原体由来の転写物の同定の可能性を減少させる。動物の宿主細胞では、４０，０００〜１００，０００の異なる宿主特異的な転写物が存在すると想定されるに違いない。大部分の病原体の転写物の数はそれよりかなり少ない（ウイルスで３〜２００の転写物、細菌で５００〜４，０００の潜在的遺伝子産物）。加えて、大抵の場合で、宿主細胞の少しの割合だけが病原体に感染し、その結果全ｍＲＮＡ中の病原体由来の核酸の部分はさらに薄くなる。多くの宿主特異的な転写物は自然のあるいは病気に関連する自己抗原もコードする（Sahinら、2000、Scanlanら、（1998）Int  J  Cancer  76、652-658）ので、宿主組織自己抗原の選択的検出による病原体由来の抗原の同定は非常に難しくなる。これは今までＨＢＶ−Ａｇ＋肝細胞癌のような多くの感染した組織のサンプルを検査する場合、どの病原体抗原もＳＥＲＥＸ技術を用いて同定されていないという事実と関係している（Scanlanら、(1998)、Int  J  Cancer  76、652-658;Stennerら、(2000)、Cancer  Epideminol  Biomakers  Prev9、285-90）。
以下の説明および実施例から、本発明の方法で極端に少ない量の病原体核酸から免疫学上関連のあるウイルスおよび細菌の抗原を同定し、特徴付けることができるということがわかる。以下の実施例で同定されたウイルスの抗原はこの場合ワクシニアウイルスの全ゲノムにわたって分布した。そのため、本発明の方法で増幅したＤＮＡ中のさまざまな遺伝子の十分な発現があると我々は結論付けることができる（図５参照）。実施例で同定された抗原の一つは抗体の中和さえ引き起こし、それゆえ治療状況においてかなり重要である。したがってこの方法は治療に重要な抗原の検出にも適する。
【００３４】
本発明の方法は実施例でウイルスおよび細菌の抗原の同定のために使用された。本発明にしたがって、以下のＳＤＳ濃度はグラム陽性菌で＞０．０５％〜１％、グラム陰性菌で０．０５％〜０．１％のＳＤＳで、それぞれグラム陰性およびグラム陽性病原体を増やすために細菌病原体に使用されるのが好ましい。
病原体がウイルスであるか細菌であるかわからない場合、必要とされる物質量はとても少ないので（例えば二つのサンプル容器に）、初期サンプルを分割し、原因となるウイルスあるいは細菌病原体を想定して異なる方法を用いて処理できる（図１２）。
本発明のもう一つ別の特徴は、抗原が配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１あるいは２２の配列の一つと８０％の相同性、特に９０％の相同性、好ましくは９５％の相同性を示す核酸によりコードされる特徴のある、新しいワクシニアウイルス抗原に関するものである。
特に好ましくは抗原が配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１あるいは２２の核酸の一つによりコードされる特徴のある、ワクシニアウイルス抗原である。
【００３５】
本発明の方法により同定される、本発明のワクシニアウイルス抗原は実施例５および表３に、より詳細に記載されている。ワクシニアウイルス抗原をコードする好ましい核酸配列は、配列プロトコルに配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１あるいは２２として表わされる。好ましい核酸配列は図１３にも表わされる。
したがって、もう一つ別の特徴は、ワクシニアウイルスの検出のための方法においての、配列番号：４〜２２の核酸および前者の核酸と８０％、９０％あるいは９５％の相同性を示す核酸の使用に関するものでもある。そのような検出方法は当業者に公知である。
【００３６】
本発明のワクシニアウイルスのさらなる使用方法は：
ワクシニアウイルスの抗原に保存されるエピトープによる大痘瘡（天然痘病原体）の、可能性のある血清学的検出。大痘瘡は軍事施設に確保されているので、免疫学的分析には利用できない。
サブユニットワクチンでの大痘瘡に対する予防接種。ワクシニアウイルスでの予防接種は天然痘病原体に対する十分な防御を提供する。ここのワクシニアウイルス抗原はそれゆえ、天然痘病原体に対する免疫学的防御の誘導のための候補となる可能性がある。
【００３７】
（図面の簡単な記載）
以下の図は本発明を説明するのに用いる。
図１：本発明の方法の具体例の一つである逐次分析工程の模式図を示す。
図２Ａ：病原体核酸の異なる原量（source  quantities）の増幅を示す。
クレノー標識ワクシニアウイルスＤＮＡを、実施例３Ａに説明されるように、３５周期で増幅させ（ＰＣＲ１）、１μＬをさらに３５周期で再増幅させた（Ｒｅ−ＰＣＲ１）。各々１ｎｇ（レーン１）、４０ｐｇ（レーン２）、８ｐｇ（レーン３）、０．８ｐｇ（レーン４）および０．０８ｐｇ（レーン５）のクレノー酵素標識ワクシニアウイルスＤＮＡを増幅の原量として使用した。レーン６はワクシニアウイルスＤＮＡを加えていない負の対照を示す。
図２Ｂ：ワクシニアウイルスＤＮＡの増幅；ワクシニアウイルスＤＮＡの増幅をクレノー酵素反応によって誘導し（左図）、そのために変性３’末端を有するアダプタオリゴヌクレオチドを配列独立プライミングに用いた。これに続いて当該アダプタ配列に対応するオリゴヌクレオチドで現行のＰＣＲ増幅を行った。記載のＰＣＲの条件では異なる長さの断片（２００−２５００ｂｐ）が生じた（右図）。
【００３８】
図３：３９ｋＤａの抗原クローン３（２８８−９３９）およびＡＴＩ抗原クローン１（５１１−１１１）の免疫スクリーニングおよび同定を示す。まずスクリーニングで同定したクローンを隣接した無反応ファージプラークを含ませることによりオリゴクローナルに（oligoclonally）単離し、確認してモノクローナルにした。
図４Ａ：クローン１（２８８−６８８）、クローン２（２８８−７８８）およびクローン３（２８８−９８８）を表し、これらはワクシニアウイルスの３９ｋＤａ蛋白から由来の部分的に一致する領域をコードする。クローンは異なる免疫反応を示す。
図４Ｂ：ワクシニアウイルスのＡ型封入体蛋白（ＡＴＩ）と部分的に一致する範囲をコードして同様の免疫反応を示す３つのクローンを示す。
図４Ｃ：ワクシニアウイルスのプラークサイズ／宿主範囲（ｐｓ／ｈｒ）蛋白と部分的に一致する範囲をコードし異なる免疫反応を示す３つのクローンを示す。
【００３９】
図５：本発明の同定したワクシニアウイルスゲノムにおけるクローンの分布を示す。同定した抗原はワクシニアウイルス全体に渡って分布し、これは本発明の方法によって確立したライブラリ内にワクシニアウイルス遺伝子の望ましい代表があるという推測を可能にする。
図６：本発明の方法によって増幅したワクシニアウイルスＤＮＡ内の１０個の任意に選択したワクシニアウイルス遺伝子の代表の分子分析を示す。ワクシニアウイルスのゲノム由来の遺伝子部分をＰＣＲで合成した。遺伝子部分、長さ３１７ないし５４９ｂｐ、各量１０ｎｇをゲル電気泳動によってアガロースゲル内に分離し、サザンブロット法を使用してナイロン膜に移した。３２Ｐ標識プローブを製作するために、１０−２０ｐｇのワクシニアウイルスＤＮＡを使用した。図６Ａは単一Ｒｅ−ＰＣＲからのＰＣＲ断片とのハイブリダイゼーションを示す。図６Ｂはハイブリダイゼーションに関して、実施例２に記載されるようにいくつかの多様なＲｅ−ＰＣＲからの貯蔵断片を使用したという事実より代表の改善を示す。ワクシニアウイルスゲノムの１０個のブロットした無作為に選択した断片（弱いものから鮮明なものまで黒く見える）と予備の増幅ＤＮＡのハイブリダイゼーションはあらゆる部分が増幅ＤＮＡ内に含まれているということを示す。最も弱いハイブリダイゼーションシグナルを有する遺伝子（レーン２、９４ｋＤａＡ型封入体蛋白、ＡＴＩ）でさえライブラリの免疫スクリーニングにおける抗原として３０回同定されたということは強調されなければならない（表３参照）。
【００４０】
図７Ａ：本発明の方法によってクローン化したワクシニアウイルスの免疫優性（immnodominant）３９ｋＤａ抗原に対する血清価の定量を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の血清をワクシニアウイルスに感染させた２１日後採血して示されるように希釈した。抗原の製作のために、３９ｋＤａ抗原をコードするラムダファージをイー・コリ菌に感染させた。この方法で組換え発現した３９ｋＤａ抗原に対する希釈血清の反応をニトロセルロース膜上で試験した。ここで使用した血清に関して、抗体価は＞１：１６０００である。
図７Ｂ：２ｘ１０６ｐｆｕのワクシニアウイルスまたは２ｘ１０５ｐｆｕのリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＷＥ株）への感染後の抗体価の３９ｋＤａ抗原に対する曲線を示す。非感染価（未処理）は３９ｋＤａ抗原に対して全く反応を示さない。高い反応特異性はリンパ球脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウス（１４日目）由来の血清との唯一つの最小交差反応性によっても示される。
【００４１】
図８：各々真核細胞およびグラム陰性菌およびグラム陽性菌の異なる感受性を示す。実験において、グラム陰性菌（上）、グラム陽性菌（中）、および真核細胞の各々の比較可能な細胞体積を示されるＳＤＳ濃度でインキュベートした。非溶解小体構造を遠心分離でペレット化した。真核細胞は既に最小濃度でＳＤＳによって完全に溶解するのに対し（細胞ペレットは確認できず顕微鏡でも細胞を確認できない）、細菌は比較的耐性で、それらの小体の完全性が維持されるので、遠心分離によって収集可能である。
【００４２】
図９：ヒト病原菌トロフェリマ・ホウィッペリ（Tropheryma  whippelii）の推定抗原の同定および分子特性を示す。インターロイキン１０およびインターロイキン４脱活性化ヒトマクロファージをホウィップル病で死亡した患者から採取したトロフェリマ・ホウィッペリを含む脳内物質と一緒にインキュベートした。細菌特異遺伝子を分画溶解およびその後のＤＮＡプロセシングによって単離し、本発明の方法を使用してライブラリを確立した。免疫スクリーニングをトロフェリマ・ホウィッペリに感染した患者から由来の血清で行った。生物情報学的（bioinformatic）分析により、例えば公的に接続可能な配列データベースと比較することにより、これまでに知られていない抗原が本発明の方法によって同定されたことを示す。
【００４３】
図１０：ホウィップル病患者の脾臓組織からの細菌の直接的単離を示す。細菌を、実施例９に示されるように、低温保存したホウィップル病患者の脾臓サンプルから単離し、蛍光顕微鏡検査で分析した。像は相対照における露光の折り重ね（小体粒子の存在、上部）さらに青色のシグナルを有する折り重ね（ＤＮＡの存在）を示す。
【００４４】
図１１Ａ：実施例９記載のように患者サンプルから直接採取した病原体核酸の富化を示す。
図１１Ｂ：患者サンプルから直接単離した病原体核酸の増幅を示す。脾臓サンプルから収集した細菌ＤＮＡを実施例１０に記載ように増幅した（レーン２）。レーン１は別のＤＮＡサンプルを有する正の対照を示す。ＤＮＡを加えていない負の対照はトラック３に適用される。
図１２：病原がウイルスか細菌かわからない場合に、病原抗原の同定を可能とする手段の図を示す。開始サンプルを分離して異なる方法で処理して細菌性病原および／またはウイルス性病原の同定を可能にする。
図１３：表３に記載の同定したワクシニアウイルス抗原の核酸配列を示す。核酸配列は配列決定プロトコールにおいて配列番号：４ないし配列番号：２２の配列に一致する。
【００４５】
本発明をまた、以下の実施例によって、限定するものではなく、説明する。
【００４６】
実施例１
ウイルス感染細胞からの病原体核酸の単離：
ＢＳＣ４０細胞を２ｘ１０６ｐｆｕのワクシニアウイルスに感染させた。感染細胞をＣＯ２インキュベーター内２４時間３７℃でインキュベートして収穫した。収集した細胞を均質化して緩衝媒体に吸収させた。ウイルス粒子を宿主細胞断片から分離するために、媒体に吸収された細胞溶解産物を超音波で処理した。粗粒子構造物を１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離してペレット化した。遠心分離に付した後、上清を取り出してペレットを捨てた。上清内の小体粒子を濃縮するために、２ｍＬの冷却上清を６％ＰＥＧ６０００／０．６ＭＮａＣｌ（１時間氷上でインキュベート）で沈殿させた；沈殿を１０分間１０００ｘｇで遠心分離してペレット化した。上記工程にて汚染宿主細胞の分離および溶解の両方が為されるべきであるので、上清を捨てた後沈殿を３００μＬのＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅ緩衝液に吸収させて、３０分間３７℃でＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅで消化した。これによって以前に崩壊した宿主細胞の目下の細胞外核酸を除去することに成功した。ウイルス核酸は完全なウイルスカプシドによってヌクレアーゼから保護されて消化されなかった。ウイルス粒子を１倍容量のＧＩＴＣ緩衝液と一緒に攪拌して崩壊させ、ヌクレアーゼを加えて不活化させた。放出した病原体ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出して１等容量のイソプロパノールで沈殿させた。沈殿した核酸を８０％エタノールで洗浄して２０μＬの蒸留水に吸収させた。
【００４７】
実施例２
ワクシニアウイルス感染および血清の獲得
水疱性口内炎ウイルス（ＶａｃｃＧ）（Mackettら（1985）、Science227、433-435）をＢＳＣ４０細胞上で培養してウイルス濃度をプラークアッセイで定量した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Institute  of  Laboratory  Animal  Science、University  of  Zurich）に２ｘ１０６ｐｆｕのＶａｃｃＧを静脈内感染させた。２００−３００μｌの血液サンプルを感染８、１６および３０日目のマウスから採取し、血清を遠心分離して得て−２０℃で保存した。マウスを免疫化した後、抗ワクシニア抗体の適正な誘導を中和アッセイ（Ludewigら、2000.Eur  J  Immunol.30:185-196）にてＶＳＶに対する試験を行い、計画した分析に関して血清を抽出するのに最適な時間を測定した。表１に示されるように、総免疫グロブリンおよびＩｇＧクラスの両方の増加が１６日の時点で最大に達し、その結果１６日および３０日に抽出したこの血清を使用することが可能であった。
【００４８】
【表１】
2004532011.tif 000003
【００４９】
実施例３Ａ
病原体核酸の最小量の全体増幅
病原体のゲノム核酸の全体増幅は本発明に記載の方法において不可欠な工程である。ここにおける主な試みは完全な形で（例えば、可能なら、ゲノムのあらゆる部分を含んで）感染組織から単離される（前培養せずに）ごく僅かな量のゲノムの胚性核酸を増幅することである。増幅ＤＮＡはその後のスクリーニングのために発現可能であってクローン化可能でなければならない。ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ発現ライブラリはしばしば記載され、製造されて使用されて（例えば、Edwardsら、1991）時にはキットとして市販されるが（例えば、ＳＭＡＲＴ−ｃＤＮＡ  library  construction  kit、Clontech）、僅かな量の（＜１０ｎｇ）病原体核酸に基づいた完全なゲノムライブラリの確立は今まで記載されたことがない。ナノグラム級の物質から完全なゲノム発現バンクの製造を可能にする本発明の方法においてＤＮＡ増幅基本単位を改善することが必要であった。その方法をワクシニアウイルスゲノムに関して確立することで修飾せずにあらゆるＤＮＡをコードした病原体へ移し、僅かな修飾もせずに、ＲＮＡをコードした病原体へ移すことが可能になった。変性３’末端を有するアダプタオリゴヌクレオチドを無作為原理に従う配列独立プライミングで使用するクレノー酵素反応によってワクシニアウイルスＤＮＡの増幅を開始した。ここからはアダプタ配列に対応するオリゴヌクレオチドで２つのＰＣＲ増幅を逐次行った。特に有効な増幅に関する条件を一連の独立して行った実験で修正した。方法を最大限に活用することに続いて、方法の感受性を定量するために、異なる量のワクシニアウイルスＤＮＡ（例えば、２５ｎｇ、１ｎｇ、２００ｐｇ、２０ｐｇ、２ｐｇ）を２ｐモルのアダプタ−Ｎ（６）（ＧＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＡ［Ｐ２］［Ｐ３］ＴＴＧＧＡＣＴＣＡＴＡＴＡＮＮＮＮＮＮ）と混合して、５分間９５℃で変性させて氷上で冷却した。Ｎは、このような状況において、変性したプライマー部分である。クレノー酵素（２Ｕ）、ＤＮＡポリメラーゼ−１緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、７．５ｍＭのジチオトレイトール、１ｎモルのｄＮＴＰ）を使用するプライマー反応開始物質を調製した後、プライマー伸長を２時間３７℃で行った。ついで、クレノーポリメラーゼを用いて伸長させた断片を標準技術を用いて遊離アダプタオリゴヌクレオチドから精製した。クレノーポリメラーゼで標識したＤＮＡの各２５分の１を（例えば１ｎｇ、８ｐｇ、０．８ｐｇ、０．０８ｐｇ）増幅一次工程で使用した。アダプタオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅は２つの異なるオリゴヌクレオチドで（ＥｃｏＲ１アダプタオリゴヌクレオチドＧＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＣＡＴＡＴおよび／またはＭｆｅ１アダプタオリゴヌクレオチドＧＡＴＧＴＡＡＴＡＣＡＡＴＴＧＧＡＣＴＣＡＴＡＴ）行われた（１分間６０℃でアニール；２．５分間７２℃で伸長；１分間９４℃で変性；３５周期）。４０ｐｇ以下の核酸に関して一回の核酸の増幅では臭化エチジウム／アガロースゲル内で任意に検出できる増幅スミアを作製するには不十分であるということがわかった。増幅したものの各１μｌをテンプレートとして３０−３５周期の同一の条件下で二次増幅に移した。増幅産物をゲル電気泳動で分��した。記載したＰＣＲ条件は最小０．８ｐｇのテンプレートＤＮＡまでのあらゆるアッセイ条件で異なる長さの断片での（１５０−２０００ｂｐ）増幅を引き起こした（図２Ａ）。この工程で、平均より短い断片はＤＮＡの開始量が少ない場合で増幅した。Ｒｅ−ＰＣＲに関する条件は異なる実験で様々であった。緩衝液の条件（例えば、Ｍｇ濃度）および使用する酵素、例えば、ＴａｑポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ断片を変化させると異なる増幅パターンが生じるということがわかる（図６参照）。開始ＰＣＲの１／５０しか再増幅では使用されない。再増幅は５０の異なる条件下で行える。増幅条件を変化させることが特に望ましい完全な全体増幅を可能にするということがリバースサザンブロット（図６参照）における代表的な分析で示された。増幅断片の同一性を証明するために、後者をブルースクリプトクローニングベクター（Stratagene）内に標準技術でライゲーションして２０クローンをスクリーニングした。アーチファクト配列（例えば、ポリマー化プライマー配列）の増幅を除外すると、２０のうち２０がワクシニアウイルス配列と同一であった。
【００５０】
実施例３Ｂ
ゲノムライブラリの確立
実施例３Ａにおける条件と同様にクレノー酵素で標識した２０ｐｇのワクシニアウイルスＤＮＡを増幅してワクシニアライブラリを確立した。精製した断片の（１分間６０℃でアニール；２．５分間７２℃で伸長；１分間９４℃で変性；３５−４０周期）各１／５０をアダプタオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅で２つの異なるオリゴヌクレオチドを有する（ＥｃｏＲ１アダプタオリゴヌクレオチドＧＡＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＣＡＴＡＴおよび／またはＭｆｅ１アダプタオリゴヌクレオチドＧＡＴＧＴＡＡＴＡＣＡＡＴＴＧＧＡＣＴＣＡＴＡＴ）分離溶液にて使用した。増幅したものの各１μｌをテンプレートとして３０周期の同一の条件下で二次増幅に移した。増幅産物をゲル電気泳動で分析した。記載したＰＣＲ条件は異なる長さの断片での（２００−２５００ｂｐ）増幅を引き起こした（図２Ｂ）。ＤＮＡテンプレートを全く使用しなかった全ての対照反応は負のままであった。増幅産物を精製し、ＥｃｏＲ１および／またはＭｆｅ１制限酵素で消化して、ラムダＺＡＰエクスプレスベクター（ＥｃｏＲ１断片、Stratagene）にてライゲートした。２つの独立した制限酵素を組み合わせると変化および免疫優性領域が内部制限酵素の干渉によって破壊されずそのため未検出とならない可能性が増加する。核酸断片をベクターにライゲートした後、標準技術を使用して後者をラムダファージに封入した。これは製造者の指導に従って市販の封入抽出物で行った（例えば、ギガパックゴールドIII、Stratagene）。この方法で確立したラムダファージライブラリ（ＥｃｏＲＩアダプタはＳＥ、ＭｆｅＩアダプタはＳＭ）を免疫スクリーニングによってさらに増幅せずに分析した。
【００５１】
実施例４
免疫スクリーニングおよび抗原の同定
Sahinら、(1995)、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  92:11810-3；およびTureciら、(1997)、MolMed  Today  3、342-349によって記載されるように免疫スクリーニングを行った。
イー・コリＫ１２由来ＸＬ１  ＭＲＦ株からの細菌を指数増殖期で収穫し、ＯＤ６００＝０．５に設定して記載の発現バンクからのラムダファージに感染させた。プラーク形成単位、ｐｆｕ、の数を、かかる方法にて、集密下（subconfluence）のプラークを得るようにセットした（例えば、約５０００ｐｆｕ／１４５ｍｍペトリ皿）。トップアガーおよびＩＰＴＧを加えることによって、感染バッチをテトラサイクリン含有アガープレート上に置いた。３７℃で一夜培養すると、ファージプラークが細菌培地上に形成された。個々のプラークは、各々、ラムダファージクローンを、このクローンに挿入される核酸と一緒に有し、さらに当該核酸によりコードされ、組換え操作により発現される蛋白を含有する。
【００５２】
ニトロセルロース膜（SchleicherおよびSchull）を適用して、組換え蛋白（プラークリフト）の複製調製物を産生した。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中での洗浄工程に付し、ＴＢＳ＋１０％ミルク粉にて非特異的結合部位を遮断した後、感染宿主の血清中でインキュベーションが一夜にわたって生じた。感染日１６日および３０日からの貯蔵血清を使用してこの目的のために１：１００−１：１０００に希釈した。さらなる洗浄工程に付した後、ニトロセルロース膜をマウスＩｇＧと拮抗するＡＰ結合二次抗体と一緒にインキュベートした。この方法では、着色反応によって、血清抗体のファージプラークにて組換え操作により発現した蛋白への結合事象を可視化することが可能であった。宿主血清との反応として培養プレート上に同定したクローンを追跡することができ、そこから、モノクローナルに対応するファージ構造物を単離することができる。このような正のクローンはさらに別に平板培養して確認した。ラムダファージクローンをインビボ除去によってファージミドへと環状化した（Sahinら、(1995)、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  92:11810-3）。
【００５３】
上記の方法で２つのバンク（ＳＥおよびＳＭ）において総数１５０００のクローンをスクリーニングした。この目的で、感染後１６日および３０日目の感染動物からの貯蔵血清を１：５００希釈で使用した。まず初期に同定したクローンを隣接した無反応ファージプラークを含めることによりオリゴクローナル的に単離し、確認後、モノクローナル化した（図３）。免疫化動物からの血清と反応性に富む２６（ＳＥバンク）および／または４１（ＳＭバンク）クローンを単離した。
加えて、全ての同定したクローンをマウス由来の同一株の前免疫血清で試験した；それらは反応しなかった。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
配列決定およびデータベースの比較は、とりわけ、クローン間の以下の３種の異なる免疫原性ワクシニアウイルス蛋白を明らかにした。
【００５６】
３９ｋＤａ免疫優性抗原蛋白
３つのクローンはワクシニアウイルスの３９ｋＤａ蛋白由来の部分をコードする（図４Ａ）。クローンはこの蛋白の断片を示す。それらの全てはヌクレオチド位２８８で始まるが、この遺伝子産物の３’末端まで異なる距離で、すなわち、ヌクレオチド位６８８、７８８または９３８まで伸長する。
３９ｋＤａ蛋白をコードする遺伝子はウェスタンリザーブ（ＷＲ）株におけるＯＲＦＡ４Ｌである（MaaおよびEsteban(1987)、J.Virol.61、3910-3919）。２８１アミノ酸の長さの３９ｋＤａ蛋白はヒトおよび動物の両方において強い免疫原性を有する（Demkovicら、(1992)、J.Virol.66、386-398）。
３９ｋＤａ蛋白を用いる免疫化はマウスにおいて保護免疫性を誘発しうることは既に記載されている（Demkovicら、(1992)、J.Virol.66、386-398）。
【００５７】
最も強い抗原ドメインはＣ末端に位置する最後の１０３アミノ酸内に存在すると考えられる（Demkovicら、(1992)、J.Virol.66、386-398）。ここで見出される断片の位置は血清エピトープの指標と考えられる。興味深いことに、２つの強い免疫反応性を示すクローン２および３はこれらの１０３アミノ酸の領域を含み、強い抗原性として記載される。
この実施例は本発明の方法に基づいてなされた説明の多次元性を強調するものでもある。抗原の同定に加えて、同時に、免疫保護も提供し、部分的に一致するクローンの数は抗体のアバンダンスの指標である。クローンの位置は血清エピトープの限局を可能とし、反応性の強さは抗体のアビディティを示す。これは下記の抗体にも適用する。
【００５８】
Ａ型封入体蛋白（ＡＴＩ）
ここで見られるクローンの中にはＡ型封入体蛋白（ＡＴＩ）、種々のオルトポックスウイルス内に存在する約１６０ｋＤａの蛋白（Patelら、(1986)、Virology  149、174-189）を示すものもあり（図４Ｂ）、大部分の特徴的な封入体の蛋白を説明する。ワクシニアウイルスの場合では、この蛋白は切断されて、その大きさは９４ｋＤａでしかない（Amegadzie(1992)、Virology  186、777-782）。ＡＴＩは感染細胞内成熟ワクシニア粒子と特異的に結合して、エンベロープを有する細胞外ワクシニアウイルスでは見つけることができない（Uleatoら、(1996)、J.Virol.70、3372-3377）。ＡＴＩはマウスにおける免疫優性抗原の１つであって、免疫優性ドメインは分子のカルボキシ末端に位置する（Amegadzie(1992)、Virology  186、777-782）。ここで見られる３つのクローンは、同一の反応強度を有し、ｂｐ３０８ないし１４３７の間の範囲をカバーし、実際にはコードした蛋白においてＣ末端ないし中央に位置する。
【００５９】
プラークサイズ／宿主範囲（ｐｓ／ｈｒ）蛋白
３８または４５ｋＤａのプラークサイズ／宿主範囲蛋白（ｐｓ／ｈｒ）はＯＲＦＢ５Ｒにコードされる（Takahashi-Nishimakiら、(1991)、Virology  181、158-164）。ｐｓ／ｈｒは、細胞外ウイルス粒子の膜に組み込まれるか、または感染時に細胞によって分泌され得る、１型の膜貫通蛋白である。ｐｓ／ｈｒに対する抗体はワクシニアウイルス感染を中和する（Galmicheら、(1999)、Virology  254、71-80）。ｐｓ／ｈｒの欠損はインビボでウイルスの弱毒化を引き起こす（Sternら、(1997)、Virology  233、118-129）。加えて、Ｂ５Ｒでの免疫化はそうでなければ致死に当たる量のウイルス感染に対する保護を提供する（Galmicheら、(1999)、Virology  254、71-80）。ここで同定した３つのクローンは、順次、この抗原の同一の領域をカバーし、Ｃ末端を含む断片である（図４Ｃ）。これはこれらのクローンによって示される血清エピトープがこのウイルス表面分子の細胞外領域に位置してそれゆえ抗体に容易に接触可能であるということを意味する。
【００６０】
実施例５
同定したワクシニアウイルス抗原の配列決定および生物情報学的分析
サンガー連鎖終結方法において側面に挿入物（ＢＫリバース、ＢＫユニバース）を付加したオリゴヌクレオチドを用い、標準技術に従って同定したクローンの配列決定を行った。決定された配列を遺伝子バンクにおける既知の配列とブラスト分析（blast  analysis）によって比較した。ワクシニアウイルス抗原のゲノム上の位置（接続番号Ｍ３５０２７）および標準学名を表３に示す。この分析はワクシニアウイルスゲノム全体に渡って分布した抗原が本発明の方法で同定されたことを示す。これまで、同定した遺伝子の大多数において、遺伝子産物が抗原として作用することは知られていなかった。本発明の方法を使用することによって、既知の抗原を同定できるのみならず、未知の抗原も同定可能である。本発明の方法の別の利点はゲノムの両鎖（コード鎖および相補鎖）で見出された抗原を同定できることである。
【００６１】
【表３】
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図５は読み取り枠（ＯＲＦ）を示すワクシニアウイルスゲノムの図表であり、本発明の方法で同定した抗原がワクシニアウイルスゲノム全体に渡って分布していることを示す。これは本発明の方法が最小量の原料（１−２０ｐｇ）からの特異的な病原体核酸の増幅を可能にすることを示す。
【００６２】
実施例６
リバースサザンブロットによる代表分析
本発明の方法による最小数の病原体核酸からの代表的な増幅は以下の実験でも明らかにされた。
ワクシニアウイルスゲノムの１０個の遺伝子部分を選択してＰＣＲ反応で増幅した。ゲル電気泳動による分離に付した後、アルカリ移動を介してＤＮＡ断片をナイロン膜にブロットした。本発明の方法に従って産生し、３２Ｐで標識した２０ｎｇのＤＮＡを使用して放射性ハイブリダイゼーションを行った。図６Ａは１０個のゲノムから無作為に選択した部分の一部だけが本発明の方法に従って生成した単一Ｒｅ−ＰＣＲＤＮＡに含まれることを示す。異なるバッチ内で、種々の条件下で生成された数個のＲｅ−ＰＣＲＤＮＡを組み合わせると、本発明の方法に従って生成されたＤＮＡにて無作為に選択された遺伝子部分を１００％表していることは明らかである（図６Ｂ）。すなわち、３９ｋＤａ抗原（図６Ｂ、レーン１０）の核酸の存在量の変化は、特定の遺伝子部分が本発明の方法に従って生成されたＤＮＡにより頻繁に見出されることを、少なくとも部分的、説明しうる。しかしながら、増幅物中のＤＮＡの存在量が低いと、Ａ型封入体蛋白ＤＮＡの一例（図６Ｂ、レーン２）において示されるように、スクリーニングにおいて数々の検出を除外しない。
【００６３】
実施例７
多様な血清学
組換え挿入体が感染マウスの血清内の抗体によって認識される抗原をコードするラムダファージを、非感染動物（免疫学的に純系）由来の血清およびリンパ球脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウス由来の血清を使用して反応性について試験した。これらの研究はプラークリフト（plaque  lift）アッセイとして行われた。クローン抗原に対する血清の抗体価および反応特異性を測定するのは容易である。図７Ａではワクシニアウイルス感染後２１日目から得た血清の３９ｋＤａ抗原に対する反応性を測定した方法を示す。血清の２倍希釈液をイー・コリ内のファージによって誘導した組換え３９ｋＤａ抗原と一緒にインキュベートした。反応特異性は１：１６０００の血清希釈液においてもまだ検出可能である。ワクシニアウイルス感染マウス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス感染マウス、および非感染マウスにおける３９ｋＤａ抗原に対する抗体反応性の時間曲線を図７Ｂに示す。ワクシニアウイルスに感染した後の抗体応答曲線はこの感染の典型例である。未処理マウスにおいて３９ｋＤａ抗原に対する反応性が全く無かったこと、およびリンパ球脈絡髄膜炎ウイルスに感染した後のほんのわずかな交差反応性は、本発明の方法を用いて同定された抗原を用いて行うことができる診断の高い質を示すものである。
【００６４】
実施例８
本発明の方法による細菌抗原の同定
まず、感染サンプルから細菌病原体を富化させる条件を工夫した。このため、細菌壁がＳＤＳのような溶媒で溶解しにくいことを利用した。ＳＤＳ濃度を変化させてグラム陽性菌、グラム陰性菌および真核細胞の安定性を測定した。図８に示されるように、グラム陽性菌の小体構造は１％のＳＤＳの下で維持される。このサンプルのイー・コリにあるグラム陰性菌は０．１％以下のＳＤＳに対して溶解しにくいことを示す。対照的に、この場合、線維芽細胞のような、真核細胞のあらゆる膜構造（細胞質、核）は完全に溶解した。真核細胞の高いＳＤＳ感受性は白血球、脾臓細胞およびリンパ節生検の他の例においても確認された。条件を工夫した後、本発明の方法をこれまで十分に特徴付けされていない病原体、トロフェリマ・ホウィッペリに使用した。トロフェリマ・ホウィッペリはグラム陽性菌である；この病原体の感染はホウィップル病を引き起こす。ホウィップル病は別の器官へ慢性的に感染し、その主な発現は腸管であって、診断されずに死に至る。この病原体をインビトロで培養するのは困難でしかなく、分子分析用にほんのわずかな量の核酸しか入手できない。これらの問題のため、この病原体の抗原構造を分析することはこれまで不可能であった。
本発明の方法を使用すれば、この病原体の潜在的な抗原を限定することが可能であった。トロフェリマ・ホウィッペリ特異抗原の特徴化に至る不可欠な工程を図９に示す。
【００６５】
ホウィップル病で死亡した患者由来のトロフェリマ・ホウィッペリを含む均質化した脳内物質を用い、インターロイキン１０およびインターロイキン４で脱活性化したマクロファージに接種した（Schoedonら、(1997)  J  Infect  Dis.  176：672-677）。感染後７日目に感染マクロファージを収穫して２５μＬのマクロファージ／細菌混合物を処理した。２０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫと共に１％のＳＤＳを含有するプロテイナーゼＫ緩衝液中で細菌感染マクロファージを１５分間５５℃でインキュベートすると分化した細胞の溶解産物が生じた。この処理で混合物に含まれるマクロファージ（真核細胞）は溶解した。マクロファージを溶解させることにより、その核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）は溶液中に放出される。対照的に、グラム陽性菌壁の完全性は維持されるので、細菌の核酸は細菌壁内に残る。ＳＤＳ／プロテイナーゼＫと一緒にインキュベートした後、懸濁液を遠心分離して細菌をペレット化した。しかしながら、プロテイナーゼＫを加えないと、溶液の高粘性のため、細菌は容易にペレット化しない。マクロファージの核酸を含む上清を捨ててほとんど見えないペレットを繰り返し洗浄した。洗浄工程に付した後、ペレット化した細菌を１００μＬの水に再懸濁し、懸濁液各量１０μＬを光学顕微鏡を用いて、免疫蛍光においてＤＡＰＩ  ＤＮＡ染料で染めて細菌数を測定した。顕微鏡計測によると、２５μＬの感染マクロファージから単離した細菌数は約４０００−６０００ＤＮＡ含有粒子であった。その後、残り８０μＬの富化細菌を用い、標準技術（加熱処理、変性、フェノール／クロロホルムによるＤＮＡ単離）を介して細菌核酸を得た。細菌から単離したＤＮＡ量を実験的に計量するのは少量のため不可能であった（ＥｔＢｒゲルにて検出可能なシグナルは存在しない）。細菌数を光学および免疫蛍光顕微鏡（最大６０００）を介して測定したため、１−２百万塩基の二本鎖ＤＮＡの推定細菌ゲノムサイズとして最大収量６−１２ｐｇの病原体ＤＮＡを算定した（ヌクレオチドの平均重量を６６０として計算した）。本発明の方法（クレノー、逐次ＰＣＲ、Ｒｅ−ＰＣＲ）に記載の通り、抽出したＤＮＡの５０％を増幅させ（すなわち、最大３−６ｐｇ）、ラムダＺＡＰ発現ベクター（Stratagene）中の増幅断片を使用してゲノムライブラリを確立した。トロフェリマ・ホウィッペリ感染患者由来の血清で免疫スクリーニングを行った。反応陽性クローンの配列決定および生物情報学的分析を行った。一例として、図８は細菌の推定リポ蛋白および推定ヒスチジントリアド蛋白の両方をコードするクローンを示す。
この実施例は、本発明の方法が、ウイルス抗原の同定に加えて、細菌抗原の同定にも適していることを示す。
【００６６】
実施例９
全身感染患者からの感染脾臓サンプル由来のホウィップル病細菌の富化
ホウィップル病患者からの低温保存した脾臓組織の各２０μＬのサンプルを細菌を富化するための５つにわずかに修飾した条件下で用いた（総量１００μＬ）。このために、実施例８に記載したように２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加した１．５ｍＬのプロテイナーゼＫ緩衝液中で脾臓サンプルを１０−６０分間５５℃でインキュベートした。感染脾臓サンプル中の細菌を上記した実施例に記載されるように遠心分離に付して富化し、上記したように顕微鏡検査で確認した。図１０は細菌に富むペレット分画を示す。細菌をＧＩＴＣ緩衝液内で処理して超音波処理に付すことによって消化させ、細菌核酸を標準的な方法で単離した。予想通り、富化分画から単離した核酸量は１ｎｇの検出閾値以下であった。細菌富化を示すために、単離した核酸の各１／１００をホウィップル病細菌（挿入される配列）またはヒトＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチド（挿入される配列）でのＰＣＲ増幅のために使用して３７周期で増幅した。図１１Ａは増幅の結果を示す（Ａ：ホウィップル病細菌で特異的なＰＣＲ、Ｂ：ヒトＤＮＡで特異的なＰＣＲ）。細菌富化分画（レーン１−３）または非富化分画（レーン４−６）の増幅バンドに関する結果を示す。予想通り、非富化分画におけるヒトＤＮＡの増幅シグナルは明らかに弱いのに対して（レーン４−６）、分画１および２は、特に、ほとんど独占的に病原体核酸の増幅を示す。当該実施例は、必要とされる少量の物質が富化条件をわずかに変化させて最も富化した病原体分画で（この場合、１および２）本発明の方法を継続することを可能にすることを示す。
【００６７】
実施例１０
脾臓サンプルから単離したＤＮＡから直接病原体核酸を全体増幅した。本発明の方法に従って単離した病原体核酸を、実施例９に示されるように、実施例３に記載されるように増幅した；ゲノムライブラリを増幅した断片由来のラムダＺＡＰ発現ベクター（Stratagene）にて確立した。トロフェリマ・ホウィッペリに感染した患者からの血清で免疫スクリーニングを行った。反応陽性クローンの配列決定および生物情報学的分析を行った。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の方法の具体例の一つである逐次分析工程の模式図を示す。
【図２Ａ】病原体核酸の異なる原量の増幅を示す。
【図２Ｂ】ワクシニアウイルスＤＮＡの増幅を示す。
【図３】３９ｋＤａの抗原クローン３（２８８−９３９）およびＡＴＩ抗原クローン１（５１１−１１１）の免疫スクリーニングおよび同定を示す。
【図４Ａ】ワクシニアウイルスの３９ｋＤａ蛋白から由来の部分的に一致する領域をコードする、クローンを示す。
【図４Ｂ】ワクシニアウイルスのＡ型封入体蛋白（ＡＴＩ）と部分的に一致する範囲をコードして同様の免疫反応を示す３つのクローンを示す。
【図４Ｃ】ワクシニアウイルスのプラークサイズ／宿主範囲（ｐｓ／ｈｒ）蛋白と部分的に一致する範囲をコードし異なる免疫反応を示す３つのクローンを示す。
【００６９】
【図５】本発明の同定したワクシニアウイルスゲノムにおけるクローンの分布を示す。
【図６】本発明の方法によって増幅したワクシニアウイルスＤＮＡ内の１０個の任意に選択したワクシニアウイルス遺伝子の代表の分子分析を示す。
【図７Ａ】本発明の方法によってクローン化したワクシニアウイルスの免疫優性（immnodominant）３９ｋＤａ抗原に対する血清価の定量を示す。
【図７Ｂ】２ｘ１０６ｐｆｕのワクシニアウイルスまたは２ｘ１０５ｐｆｕのリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＷＥ株）への感染後の抗体価の３９ｋＤａ抗原に対する曲線を示す。
【図８】各々真核細胞およびグラム陰性菌およびグラム陽性菌の異なる感受性を示す。
【００７０】
【図９】ヒト病原菌トロフェリマ・ホウィッペリの推定抗原の同定および分子特性を示す。
【図１０】ホウィップル病患者の脾臓組織からの細菌の直接的単離を示す。
【図１１Ａ】実施例９記載のように患者サンプルから直接採取した病原体核酸の富化を示す。
【図１１Ｂ】患者サンプルから直接単離した病原体核酸の増幅を示す。
【図１２】病原がウイルスか細菌かわからない場合に、病原抗原の同定を可能とする手段の図を示す。
【図１３】表３に記載の同定したワクシニアウイルス抗原の核酸配列を示す。
【図１】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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