(57)【要約】Ｒが場合によってはヒドロキシル基で置換された炭素原子数１〜３のアルキル基であってかつＸが反応中にジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンで置換される基である基Ｒ−Ｘを有するポリマーの出発成形体、または反応中にジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンが付加する基Ｙを有するポリマーの出発成形体と、ジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンとの反応によって製造可能である変性されたポリマーの成形体によって、ＡＧＥ前駆体を、血液、血漿またはＰＢＳ緩衝液から除去することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンと、ポリマーの出発成形体との反応により製造可能な変性されたポリマーの成形体において、前記のポリマーの出発成形体は基Ｒ−Ｘ
［式中、Ｒは場合によってはヒドロキシル基で置換された炭素原子数１〜３のアルキル基であり、Ｘは反応中にジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンで置換される基である］を有するか、又は前記のポリマーの出発成形体は反応中にジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンが付加する基Ｙを有する、変性されたポリマーの成形体。
【請求項２】
基Ｒ−Ｘが、ハロメチル基−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２Ｉまたは−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２Ｃｌである、請求項１記載の変性されたポリマーの成形体。
【請求項３】
基Ｙが、式
【化１】
2004504453.tif 000009
［式中、ｎ＝１〜１０である］のエポキシドである、または式
【化２】
2004504453.tif 000010
［式中、ｍ＝１〜４およびｐ＝１から３である］のエポキシドである、請求項１記載の変性されたポリマーの成形体。
【請求項４】
ポリマー膜である、請求項１から３までのいずれか１項記載の変性されたポリマーの成形体。
【請求項５】
ポリマーの出発成形体が合成ポリマーからなっている、請求項１から４までのいずれか１項記載の変性されたポリマーの成形体。
【請求項６】
前記合成ポリマーがポリアミドである、請求項５記載の変性されたポリマーの成形体。
【請求項７】
ポリマーの出発成形体がポリアミドであって、アミノ末端基に、
【化３】
2004504453.tif 000011
が結合している、請求項６記載の変性されたポリマーの成形体。
【請求項８】
ポリマーの出発成形体がポリエーテルスルホンである、請求項５記載の変性されたポリマーの成形体。
【請求項９】
ポリエーテルスルホンの１つまたは複数の位置３，３´，５および５´に、
【化４】
2004504453.tif 000012
が結合している、請求項８記載の変性されたポリマーの成形体。
【請求項１０】
変性されたポリマーの成形体を製造する方法において、
次の段階、すなわち、
ａ）基Ｒ−Ｘ［式中、Ｒは場合によってはヒドロキシル基で置換された炭素原子数１〜３のアルキル基であり、Ｘはハロゲン原子であるような基Ｒ−Ｘをポリマーに導入して、基Ｒ−Ｘを含むポリマーからポリマーの出発成形体を製造するか、または前記の基Ｒ−Ｘをポリマーの出発成形体に導入するか、またはジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンを付加可能な基Ｙをポリマーの出発成形体に導入する段階、および
ｂ）基Ｒ−Ｘまたは基Ｙを有するポリマーの出発成形体をジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンと反応させ、変性されたポリマーの成形体を得る段階を有する、変性されたポリマーの成形体を製造する方法。
【請求項１１】
基Ｙが、式
【化５】
2004504453.tif 000013
［式中、ｎ＝１〜１０である］のエポキシド、または式
【化６】
2004504453.tif 000014
［式中、ｍ＝１〜４およびｐ＝１〜３である］のエポキシドである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ポリマーの出発成形体として、多孔性の構造を有する半透性のポリマー膜を製造するもしくは使用する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
段階ａ）で、ポリマーとして合成ポリマーを、もしくはポリマーの出発成形体として合成ポリマーからなる出発成形体を使用する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１４】
段階ａ）で、合成ポリマーがポリエーテルスルホンである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
段階ａ）で、ポリエーテルスルホンをクロロ−、ブロモ−またはヨードメチル化して、そこからクロロ−、ブロモ−またはヨードメチル化されたポリエーテルスルホン出発成形体を製造し、このポリエーテルスルホン出発成形体を、段階ｂ）で、ジアミノグアニジンと反応させる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
合成ポリマーがポリアミドである、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
段階ａ）で、ポリアミドからなる出発成形体を使用し、エピクロロヒドリンと反応させ、続いて段階ｂ）で、ジアミノグアニジンと反応させる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
段階ｂ）での反応をアルカリ水溶液中で行う、請求項１０から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
段階ｂ）での反応を室温から約８０℃までの温度範囲で行う、請求項１０から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
血液、血漿またはＰＢＳ緩衝液から反応性のカルボニル化合物を除去するための、請求項１から１９までのいずれか１項記載の変性された変性されたポリマーの成形体の使用。
【請求項２１】
前記の反応性のカルボニル化合物がジカルボニル化合物である、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
前記ジカルボニル化合物が、グリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、グリコールジアルデヒドおよび２−ヒドロキシプロパナールであり、前記の化合物は単独でまたは混合した形で存在する、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
変性されたポリマーの成形体が、変性されたポリマー膜である、請求項２０から２２までのいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、変性されたポリマーの成形体、それを製造する方法およびその使用に関する。
【０００２】
血液および血漿中には、特に腎臓病患者および糖尿病患者では、いわゆるＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ、後期糖化生成物）が存在する。このＡＧＥは、変性および糖の分解産物との架橋によりその機能を失ったタンパク質である。ＡＧＥは、様々な動脈硬化症およびアミロイド症のような併発症の原因となる。それゆえ、血液または血漿からＡＧＥを除去することは様々な方法で試みられてきた。
【０００３】
高流量透析、低流量透析または血液透析濾過のような通常の血液処理方法によって、ＡＧＥ濃度を顕著に下げることはできない。
【０００４】
したがって、従来の技術では、ＡＧＥを除去するための種々様々な試みが提案されている。
【０００５】
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ （１９９３）、Ｂａｎｄ １６、８２３〜８２９頁には、疎水化されたセルロース球を充填した吸収カラムが記載されている。
【０００６】
これにより、β−２−ミクログロブリンの濃度、ひいてはＡＧＥ変性されたβ−２−ミクログロブリンの濃度も減少するが、それと同時に、たとえばＲＢＰ、プロラクチン、Ｃ−ＰＴＨ、ＨＳ−ＰＴＨおよびＷＢＣのような除去すべきでないタンパク質を除去してしまう。
【０００７】
米国特許５８９１３４１号明細書には、１７〜１８個のアミノ酸からなっていてシステインによって結合しているリングが記載されており、このリングは、透析膜に固定されている。これにより、種々様々なＡＧＥを、透析中に血液から除去することができる。しかし、この場合、血液中に溶解しているＡＧＥしか除去されない。すでに沈殿したＡＧＥは、この処理によって捕捉されない。さらに、このようなタンパク質変性された膜の取り扱いは、このような膜を滅菌することができないために、極めて難しい。これに加えて、ＡＧＥ形成それ自体は妨げられない。
【０００８】
米国特許５１２８３６０号明細書には、ＡＧＥ形成を阻害するための、たとえばアミノグアニジン、α−ヒドラジノヒスチジンおよびリジン、またはこれらの混合物のような、活性窒素を有する化合物が開示されている。この米国特許５１２８３６０号明細書によれば、これらの化合物は、初期のグリコシル化産物と反応して、これにより、初期のグリコシル化産物がＡＧＥ形成するのを阻害する。これらの化合物は、医薬品として投与され、これにより必然的に組織と接触してしまう。
【０００９】
刊行物 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ （１９９６）、Ｂａｎｄ ３、１４９〜１６６頁によれば、アミノグアニジンが、たとえばグリオキサール、メチルグリオキサールおよび３−デオキシグリコソンのようなα−オキシアルデヒド、つまりＡＧＥ前駆体を捕捉し、これにより、ＡＧＥ生成を阻害することが知られている。しかし、アミノグアニジンは、組織と接触した場合、ＮＯシンターゼの抑制の状態で極めて不都合な副作用を引き起こす。
【００１０】
したがって、本発明の課題は、不都合な副作用なしでＡＧＥ前駆体を血液または血漿から除去できかつＡＧＥの形成を抑制できる製品、およびそれを製造する方法を得ることである。
【００１１】
この課題は、１つには、Ｒが場合によってはヒドロキシル基で置換された炭素原子数１〜３のアルキル基であり、Ｘが反応中にジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンで置換される基である基Ｒ−Ｘを有するポリマーの出発成形体、または反応中にジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンが付加する基Ｙを有するポリマーの出発成形体と、ジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンが反応することによって製造可能である変性されたポリマーの成形体によって解決される。
【００１２】
本発明による変性されたポリマーの成形体では、ジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンを、置換−もしくは付加反応によってポリマーの出発成形体と共有結合させる。これによって、本発明による変性されたポリマーの成形体が、ジアミノグアニジン−および／またはトリアミノグアニジンリガンドを有するようになる。共有結合によって、血液および血漿を患者の体内に導入する場合に、本発明による変性されたポリマーの成形体が血液および血漿と接触する際にジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンが溶解せず、組織と接触しないことが保証される。また、驚くべきことに、ジアミノグアニジン−およびトリアミノグアニジンリガンドは、ＡＧＥ前駆体との高い反応性を示す。したがって、ＡＧＥ前駆体を血液および血漿から迅速に除去することができ、これにより、ＡＧＥの形成を顕著に抑制できる。
【００１３】
本発明によるポリマーの出発成形体が有する基Ｒ−Ｘとしては、基本的には、ジアミノグアニジンまたはトリアミノグアニジンが求核置換反応できるすべての基Ｒ−Ｘが適しており、この場合、基Ｒ−Ｘとしては、ハロメチル基−ＣＨ２−Ｃｌ、−ＣＨ２−Ｂｒ、−ＣＨ２−Ｉまたは−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｃｌが有利である。それというのは、これらの基Ｒ−Ｘによって、求核置換反応が迅速に起こるからである。
【００１４】
本発明のポリマーの出発成形体が有する基Ｙとしては、基本的には、ジアミノグアニジンまたはトリアミノグアニジンが付加できるすべての基Ｙが適しており、この場合、基Ｙとしては、式
【００１５】
【化７】
2004504453.tif 000002
【００１６】
［式中、ｎ＝１〜１０である］のエポキシド、または式
【００１７】
【化８】
2004504453.tif 000003
【００１８】
［式中、ｍ＝１〜４およびｐ＝１〜３である］のエポキシドが有利である。それというのは、これらの基Ｙによって、付加が迅速に起こるからである。
【００１９】
ＡＧＥ前駆体を含んだ血液または血漿と接触すると、変性されたポリマーの成形体のジアミノグアニジン−および／またはトリアミノグアニジンリガンドがＡＧＥ前駆体と反応して化学的な結合を形成するので、ＡＧＥ前駆体は、血液または血漿から不可逆的に除去される。たとえば、ＡＧＥ前駆体であるグリオキサール、メチルグリオキサールおよび３−デオキシグリコソンのα，β−ジカルボニル基が、ジアミノグアニジン−および／またはトリアミノグアニジンリガンドと反応して、１，２，４−トリアジンを形成する。この反応は、リガンド内に存在するヒドラジン基が高い反応性を有するために極めて迅速であり、室温でほぼ１０〜１５分後にはすでに終了している。
【００２０】
本発明による変性されたポリマーの成形体は、たとえば、有利には多孔性の構造を有する粒子状の材料であり、この材料は吸収カラムに充填することができ、そこへ血液または血漿を案内する。この粒子状の材料の粒度および多孔性によって、ＡＧＥ前駆体がジアミノグアニジン−および／またはトリアミノグアニジンリガンドと反応するための大きな表面積を得ることができる。
【００２１】
本発明の有利な実施態様では、変性されたポリマー成形体は、多孔性の構造を有する半透性のポリマー膜、特に平膜または中空糸膜であり、この場合、ポリマー膜が、血漿または血液と接触する際に十分な生体適合性を備えていると、特に有利である。
【００２２】
本発明による変性されたポリマーの成形体を製造可能なポリマーの出発成形体は、生体ポリマー、たとえばセルロースまたはセルロース性のポリマーであってよい。しかし、ポリマーの出発成形体は、有利には、合成ポリマーからなっている。それというのは、合成ポリマーの化学的な反応挙動の方が、たとえばセルロースの反応挙動よりも制御しやすいからである。
【００２３】
合成ポリマーとしては、ポリアミドが特に有利である。極めて良く適しているのは、ポリアミド４，６、ポリアミド６，６、ポリアミド６である。
【００２４】
本発明による特に有利な変性されたポリマーの成形体は、ポリアミドからなるポリマーの出発成形体から製造可能であって、この場合、ポリアミドのアミノ末端基には、
【００２５】
【化９】
2004504453.tif 000004
【００２６】
が結合している。
【００２７】
さらに、ポリマーの出発成形体としては、たとえばポリスルホン、ポリエーテルスルホンまたはポリアリールエーテルスルホンのようなスルホン基を有するポリマーが有利である。特に有利であるのは、ポリエーテルスルホン、つまり式（ＩＩＩ）に示す繰り返し単位を有するポリマーである。
【００２８】
【化１０】
2004504453.tif 000005
【００２９】
このようなポリエーテルスルホンは、たとえばＵｌｔｒａｓｏｎ Ｅ（Ｒ）（ＢＡＳＦ）の登録商標で市販されている。このような市販のポリエーテルスルホンは、たとえばＵｌｔｒａｓｏｎ Ｅ ６０２０ Ｐであって、光散乱によって測定された平均分子量Ｍｗは、ほぼ５８０００である。
【００３０】
本発明の特に有利な実施態様では、本発明による成形体は、ポリエーテルスルホンからなっていて、このポリエーテルスルホンの１つまたは複数の位置３、３´、５および５´には、
【００３１】
【化１１】
2004504453.tif 000006
【００３２】
が結合している。
【００３３】
本発明の課題は、さらに、次の段階
ａ）基Ｒ−Ｘ［式中、Ｒは場合によってはヒドロキシル基で置換された炭素原子数１〜３のアルキル基であり、Ｘはハロゲン原子である］をポリマーへ導入して、基Ｒ−Ｘを含むポリマーからポリマーの出発成形体を製造するか、または前記の基Ｒ−Ｘをポリマーの出発成形体へ導入するか、またはジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンに付加可能な基Ｙをポリマーの出発成形体へ導入する段階、および
ｂ）基Ｒ−Ｘまたは基Ｙを含むポリマーの出発成形体を、ジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンと反応させ、これにより、変性されたポリマー成形体を得る段階
を有する変性されたポリマーの成形体の製造の方法によって解決される。
【００３４】
有利には、基Ｙとして、式
【００３５】
【化１２】
2004504453.tif 000007
【００３６】
［式中、ｎ＝１〜９である］のエポキシド、または式
【００３７】
【化１３】
2004504453.tif 000008
【００３８】
［式中、ｍ＝１〜４およびｐ＝１〜３である］のエポキシドを導入する。
【００３９】
ポリマーの出発成形体がジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンと反応することによって、表面にジアミノグアニジン−およびトリアミノグアニジンリガンドを有する変性されたポリマーの成形体が得られる。ポリマーの出発成形体が多孔性の材料でない場合には、外表面にリガンドを有するだけである。これに対して、ポリマーの出発成形体が多孔性の材料、有利にはミクロ孔を有する材料である場合には、外表面だけでなく、孔によって形成された内表面にもリガンドを得られる。このようにして、リガンドの高密度性が得られ、これによって、ＡＧＥ前駆体が結合するための大きなキャパシティーが得られる。
【００４０】
本発明による方法の有利な実施態様では、ポリマーの出発成形体として、多孔性の構造を有する半透性のポリマー膜を製造するもしくは使用する。
【００４１】
本発明による方法の範囲内では、ポリマーとしては、基本的には、基Ｒ−Ｘを導入できる生体適合性の全てのポリマーが適している。ポリマーの出発成形体としては、本発明の場合には、基Ｒ−Ｘまたは基Ｙを導入できる生体適合性の全てのポリマーの出発成形体が適している。たとえば、ポリマーもしくはポリマーの出発成形体は、生体ポリマー、たとえばセルロースまたはセルロース性ポリマーからなっている。
【００４２】
しかし、有利には、本発明による方法では、段階ａ）で、ポリマーとして合成ポリマーが、もしくはポリマーの出発成形体として合成ポリマーからなる出発成形体が使用される。それというのは、合成ポリマーの化学的な反応挙動は、たとえばセルロースの反応挙動よりも制御しやすいからである。
【００４３】
本発明による方法の特に有利な実施態様では、この合成ポリマーはポリエーテルスルホン、つまり式（ＩＩ）に示した繰り返し単位を有するポリマーである。このようなポリエーテルスルホンは、たとえば、光散乱により測定した平均分子量Ｍｗがほぼ５８０００であるＵｌｔｒａｓｏｎ Ｅ ６０２０ Ｐ（ＢＡＳＦ）である。さらに有利な合成ポリマーは、スルホン基を有する別のポリマー、たとえばポリスルホンまたはポリアリールエーテルスルホンである。
【００４４】
特に、本発明による方法の実施態様では、段階ａ）で、ポリエーテルスルホンをクロロ−、ブロモ−またはヨードメチル化して、そこからクロロ−、ブロモ−またはヨードメチル化されたポリエーテルスルホン出発成形体を製造し、段階ｂ）で、ジアミノグアニジンと反応させると有利である。ポリエーテルスルホンのクロロ−、ブロモ−、ヨードメチル化に特に適した方法は、たとえばドイツ連邦共和国特許第１００１２３３２号明細書に記載されている。
【００４５】
中でも特に有利には、段階ａ）で、ポリエーテルスルホンを、クロロ−、ブロモ−、ヨードメチル化して、そこからクロロ−、ブロモ−、ヨードメチル化したポリエーテルスルホン膜を製造し、このポリエーテルスルホン膜を段階ｂ）で、ジアミノグアニジンと反応させる。
【００４６】
本発明による方法の特に有利な別の実施態様では、合成ポリマーはポリアミドである。極めて良く適しているのは、ポリアミド４，６、ポリアミド６，６、ポリアミド６である。
【００４７】
特に、本発明による方法の実施態様では、段階ａ）で、ポリアミドからなる出発成形体を使用し、エピクロロヒドリンと反応させ、これに続いて段階ｂ）で、ジアミノグアニジンと反応させると有利である。
【００４８】
中でも特に有利には、段階ａ）で、ポリアミド出発成形体としてポリアミド膜をエピクロロヒドリンと反応させ、段階ｂ）で、ジアミノグアニジンと反応させる。ポリアミド膜としては、Ｍｅｍｂｒａｎａ ＧｍｂＨの型番「ｍｉｃｒｏ ＰＡ ３８６ｃ」で入手できるポリアミド６膜が極めて良く適している。
【００４９】
本発明による方法の段階ｂ）には、基本的には、ジアミノグアニジンまたはトリアミノグアニジンによるＲ−Ｘ中のハロゲンＸの脂肪族求核置換が可能であるような、もしくはジアミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンとの基Ｙの反応が可能であるような全ての反応条件が適している。本発明による方法の実施態様では、段階ｂ）で、反応をアルカリ水溶液中で行うと特に有利である。なぜならば、この条件の下では、ジアミノグアニジンおよびトリアミノグアニジンが、最高の求核性を有するからである。
【００５０】
段階ｂ）での反応のための温度範囲は、アミノグアニジンおよび／またはトリアミノグアニジンを含む溶液の凝固点より高い温度から沸点より低い温度までとなっている。本発明による方法の特に有利な実施態様では、段階ｂ）での反応は、室温から約８０℃までの温度範囲で行う。たとえば、１時間の反応時間で行おうとする場合、エピクロロヒドリンと反応させたポリアミド膜をジアミノグアニジンと反応させるには８０℃の温度が必要であるが、一方では、クロロメチル化されたポリエーテルスルホンから製造したポリエーテルスルホン膜を反応させるには室温で十分である。
【００５１】
本発明による変性された成形体は、有利には、ＡＧＥ前駆体を血液または血漿から除去する方法において使用する。ＡＧＥ前駆体は、反応性のカルボニル化合物である。したがって、本発明による変性された成形体を、血液、血漿またはＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ　８ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ　２．９ｇ／ｌおよびＮａ２ＨＰＯ４　０．２ｇ／ｌ、ｐＨ＝７．４）から反応性のカルボニル化合物を除去するために使用して高い成果をあげることができる。
【００５２】
有利には、本発明による変性されたポリマーの成形体は、ジカルボニル化合物、特に、単独でまたは混合された形で存在するグリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグリコソン、マロンジアルデヒド、グリセロールジアルデヒドおよび２−ヒドロキシプロパナールの除去のために使用される。
【００５３】
有利には、本発明による変性されたポリマーの成形体を、適当なケーシング内の変性されたポリマーの膜として使用する。この場合、この膜はたとえば血液透析膜であるので、ＡＧＥ前駆体は血液透析中にジアミノグアニジン−またはトリアミノグアニジンリガンドに化学的に結合し、これによって、ＡＧＥ前駆体を血液から除去する。さらに、変性されたポリマーの膜は、相応のモジュール内に配置されたミクロ孔を有する膜であってよく、この場合、処理すべき血液または血漿を、デッドエンドモジュールまたはクロスフローモジュールで膜を通して案内できる。このようなモジュールは、独立したユニットとしてまたはたとえば血液透析装置と組み合わせても使用できる。
【００５４】
本発明による変性された成形体によって可能となる血液、血漿またはＰＢＳ緩衝液からのＡＧＥ前駆体の分離は、ＡＧＥ前駆体の、ジアミノグアニジン−および／またはトリアミノグアニジンリガンドとの化学的な反応に基づいているので、ＡＧＥ前駆体の大きさとは無関係である。したがって、本発明による変性された成形体によって、透析によっては除去できない大きなＡＧＥ前駆体を、血漿または血液から除去することができる。
【００５５】
本発明を、以下の実施例に基づき詳細に説明する。
【００５６】
実施例１：毛管膜、エピクロロヒドリンおよびジアミノグアニジンから製造した変性されたポリマー膜の、
２ｇのポリアミド毛管膜（「ｍｉｃｒｏ ＰＡ ３８６ ｃ」、Ｍｅｍｂｒａｎａ ＧｍｂＨ）を下方から流入可能な管内に設ける。膜へ塩素−炭素結合を導入するために、エピクロロヒドリンを、同じ重量部の水とイソプロパノールとからなる溶剤の５質量％溶液として使用する。ジアミノグアニジン（ＤＡＧ）は、ＤＡＧに対して等モル量のＮａＯＨを含む５質量％水溶液として使用する。ポリアミド毛管膜の変性は、以下に示す薬剤／時間／温度／体積−概要に基づき行われる。この概要で述べる各段階後、それぞれの溶剤をデカントする。
【００５７】
薬剤　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　時間　　　温度　　　体積
［ｍｉｎ］　　［℃］　　　［ｍｌ］
Ｈ２Ｏ／ｉ−プロパノール　　　　　　　　　　　　１０　　５０　　　２００
（膜を湿すため）
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　５０　　　２００
（膜の洗浄のため）
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　１００　　２００
（膜の洗浄のため）
エピクロロヒドリン／Ｈ２Ｏ／ｉ−プロパノール溶液　６０　　５０　　２００
（膜のアミノ末端基のエポキシ化およびＣｌ−Ｃ結合の導入のため）
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　５０　　２００
（膜の洗浄のため）
ＤＡＧ／ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液　　　　　　　　　　　６０　　８０　　１００
（ＤＡＧを膜に結合させるため）
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３×（１５　　５０　　３００）
（変性された膜を洗浄するため）
変性された膜は、一定重量となるまで空気中で乾燥する。滅菌貯蔵は、たとえば７０％エタノールにより可能となる。ＤＡＧが膜に共有結合したことを確認するために、ニンヒドリン反応によってジアミノグアニジンの−ＮＨ２基の含有を測定するする。
【００５８】
実施例２：変性されたポリマー膜の、クロロメチル化されたポリエーテルスルホン平膜およびジアミノグアニジンからの製造
ポリエーテルスルホンを、ドイツ連邦共和国特許第１００１２３３２号明細書に記載のように、置換度０．０３でクロロメチル化する。この場合、置換度とは、クロロメチル化されたポリエーテルスルホン中のクロロメチル基の総数と、ポリエーテルスルホンの繰り返し単位の総数との商である。
【００５９】
クロロメチル化されたポリエーテルスルホン８ｇ、ジメチルアセトアミド３６ｇ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００）９．６ｇからなる溶液を、７５μｍのウエットフィルム厚さを有するフィルムになるようにブレード塗布し、表面を水蒸気で凝固させ、水中に落とし、洗浄して乾燥させる。クロロメチル化されたポリエーテルスルホン平膜をシャーレに入れ、これを振盪板上に置き、以下に示す薬剤／時間／体積−概要に基づき、室温でジアミノグアニジン（ＤＡＧ）と反応させる。ＤＡＧは、５質量％のＤＡＧおよびこれと等モル量のＮａＯＨの水溶液として使用する。以下に示す概要で述べる各段階後、それぞれの溶剤をデカントする。
【００６０】
薬剤　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　時間　　　体積
［ｍｉｎ］　　　［ｍｌ］
Ｈ２Ｏ／ｉ−プロパノール　　　　　　　　　　　　　　１０　　１００
（膜を湿すため）
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　１００
（膜の洗浄のため）
ＤＡＧ／ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液　　　　　　　　　　　　６０　　１００
（ＤＡＧを膜に結合させるため）
Ｈ２Ｏ（膜の洗浄のため）　　　　　　　　　　　３×［１０　　２００］
ＨＣｌでｐＨ＝２まで酸性化
Ｈ２Ｏで膜を中性洗浄　　　　　　　　　　　　　３×［１０　　２００］
一定重量となるまで膜を乾燥させる。
【００６１】
実施例３：ＤＡＧ変性されたポリマー膜によるＨＤ血漿中でのペントシジン形成の阻害
ポリエーテルスルホンを、ドイツ連邦共和国特許第１００１２３３２号明細書に記載のように、０．１７の置換度でクロロメチル化する。このクロロメチル化されたポリエーテルスルホンから実施例２で述べたように平膜を製造して、ＤＡＧと反応させる。
【００６２】
以下に述べるような１２日間の３７℃でのインキュベートをエッペンドルフキャップ内で行う。変性された膜を、ＨＤ血漿（血液透析患者の透析前の血漿）と共にインキュベートし、その後、ＡＧＥであるペントシジンの濃度を測定する。この試験で使用する変性された膜の面積は、ＨＤ血漿１ｍｌあたり５μｍｏｌのＤＡＧが存在しているように規定する。
【００６３】
ペントシジン濃度は、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂａｎｄ ５５（１９９９）、２４８７〜２４９２頁に記載のように測定する。その結果を図１の棒グラフに示す。この場合、ペントシジン濃度は相対単位（ｒＥ）で示す。図１のバー５は、ＨＤ血漿中のペントシジンの初期濃度を示しており、その値は約６．３ｒＥである。図１のバー３は、ＨＤ血漿をインキュベートした後のペントシジン濃度を示している。ＨＤ血漿中に存在するＡＧＥ前駆体によって、ＡＧＥであるペントシジンが約１９．３ｒＥに上昇しているのが明らかであり、したがって、インキュベート中には約１３ｒＥのペントシジンが生じている。図１のバー２に示すように、変性されていないポリエーテルスルホン膜のインキュベート中にも、ほぼ同量のペントシジンが生じる。図１のバー１には、変性された膜と共にインキュベートした後に測定したペントシジン濃度を示している。膜なしで生じた１３ｒＥのペントシジンを１００％とすると、変性された膜を使用した場合に生じたペントシジンが７．４ｒＥであるということは、変性された膜によってペントシジンが約５７％しか生じなかったということを意味する。したがって、変性された膜は、ペントシジン形成を約４３％抑制する。バー４は、ＨＤ血漿１ｍｌあたり５μｍｏｌのアミノグアニジンを有するＨＤ血漿をインキュベートした後のペントシジン濃度を示している。図中に記した許容誤差を考慮すると、変性されたポリマー膜を使用した場合とほぼ同じペントシジン濃度が結果として得られている。したがって、反応性の基が同数であることに基づけば、ＤＡＧの共有結合のペントシジン形成の阻害は、遊離したアミノグアニジンと比較して、より少なくなっているというわけではない。
【００６４】
実施例４：ＤＡＧ変性されたポリマー膜による透析されたＨＤ血漿中でのペントシジン形成の阻害
実施例３を繰り返すが、３回８時間、３５００ダルトンの排除限界を有する再生セルロースに通して透析したＨＤ血漿を使用する。
【００６５】
結果を図２の棒グラフに示す。この図のバー４は、ＨＤ血漿中のペントシジンの初期濃度を示しており、その値は約６ｒＥである。図１のバー２は、変性された膜なしでインキュベートした後のＨＤ血漿ののペントシジン濃度を示している。ＨＤ血漿中に存在するＡＧＥ前駆体によって、ＡＧＥであるペントシジンが約９．６ｒＥに上昇しているのが明らかであり、したがって、インキュベート中には約３．６ｒＥのペントシジンが生じている。図２のバー１は、変性された膜と共にインキュベートした後に測定したペントシジン濃度を示している。膜なしで生じた３．６ｒＥのペントシジンを１００％とすると、変性された膜を使用した場合に約２．４ｒＥのペントシジンが生じたということは、変性された膜によってペントシジンが約６６％しか生じなかったということを意味する。したがって、変性された膜は、ペントシジン形成を約３４％抑制する。図２のバー３は、ＨＤ血漿１ｍｌあたり５μｍｏｌのアミノグアニジンを有するＨＤ血漿をインキュベートした後のペントシジン濃度を示している。図中に記した許容誤差を考慮すると、変性されたポリマー膜を使用した場合とほぼ同じペントシジン濃度が結果として得られる。
【００６６】
実施例５：ＰＢＳ緩衝液からのメチルグリオキサールの、ＤＡＧ変性されたポリマー膜との結合
エッペンドルフキャップ内で、特にＡＧＥ前駆体であるメチルグリオキサール（ＭＧＯ）を１ｍＭの濃度で含むＰＢＳ緩衝液、ｐＨ＝７．４（Ｓｉｇｍａ社）１ｍｌを、クロロメチル化してジアミノグアニジン（ＤＡＧ）と反応させた実施例３に基づくポリエーテルスルホン平膜と接触させる。この変性された膜の面積は、ＤＡＧのＮＨ２−ＮＨ−基１μｍｏｌが、ＭＧＯを含むＰＢＳ緩衝液と接触するように規定する。
【００６７】
室温で振盪板上で４時間後、ＰＢＳ緩衝液中のＭＧＯ濃度を次の方法により測定する：ＭＧＯを含むＰＢＳ緩衝液１００μｌ、内部標準として２，３−ブタンジオン溶液１０μｌ、過塩素酸（２Ｍ）８０μｌおよびオルト−ジアミノフェニレン溶液（１％）４０μｌを混合し、１時間暗所で室温で反応させる。この場合、ジカルボニル化合物であるＭＧＯは、オルト−ジアミノフェニレンと反応して相応のキノキサリン誘導体を生じる。ＰＢＳ緩衝液は付加的に、ＡＧＥ前駆体であるグリオキサールおよび３−デオキシグリコソン（それぞれ１ｍＭ）を含んでおり、これらのＡＧＥ前駆体も、オルト−ジアミノフェニレンと反応して相応のキノキサリン誘導体を生じる。
【００６８】
生じたキノキサリン誘導体は、ＨＰＬＣによって分離し、ＵＶ検出器によって３１５ｎｍにおいて検出することができる。１９．７分後に現れるピークは、ＭＧＯに帰属する。カラム材料としては、Ｗａｔｅｒｓ社の「Ｐｕｒｅｓｉｌ」（Ｃ１８、１２０Å、４．６×２５０ｍｍ）を用い、カラムは、流速１ｍｌ／ｍｉｎで運転する。誘導されたＡＧＥ前駆体を含むＰＢＳ緩衝液を注入する。続いて溶液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液）および溶液Ｂ（０．０８％トリフルオロ酢酸の８０％アセトニトリル水溶液）によって、以下に述べる濃度／時間−プログラムを行う。
【００６９】
時間［ｍｉｎ］　　溶液Ｂの濃度（１００％との差が溶液Ａの濃度）
０　　　　　　　１５％
０〜２５　　　　１５〜２８％、直線状に上昇
２５〜２７　　　　１００％
結果を図３に示す。この場合、ＭＧＯ濃度は相対単位（ｒＥ）で示す。図３のバー１〜７は、変性されたポリマー膜を含むＰＢＳ緩衝液中のＭＧＯ濃度を示している。変性されたポリマー膜は、その製造後、ＨＣｌ形にし（図３のバー１および２）、遊離塩基として使用し（図３のバー３およびバー４）、ＨＣｌ形にして水中に入れ（図３のバー５）、ＮａＮ３水溶液に入れ（図３のバー６）、遊離塩基として水中に入れ（図３のバー７）、その後、ＭＧＯを含むＰＢＳ緩衝液と接触させた。図３のバー１〜７は、ＡＧＥを含むＰＢＳ緩衝液との４時間の接触時間後、変性されたポリマー膜を使用する形とは無関係に、ＰＢＳ緩衝液中の約５ｒＥであるＭＧＯ濃度が、単にクロロメチル化されたポリエーテルスルホン膜（図３のバー８）および試験前に乾燥して置かれたポリエーテルスルホン膜（図３のバー９）が存在しているＰＢＳ緩衝液中でそれぞれ測定されたＭＧＯ濃度のほぼ６分の１であることを示している。ほぼ同量のＭＧＯが、膜なしのＰＢＳ緩衝液中でも存在するが（図３のバー１０）、その一方で、１μｍｏｌのアミノグアニジン塩酸塩を含むＰＢＳ緩衝液（図３のバー１１）は、変性されたポリマー膜を有するＰＢＳ緩衝液中で得られるＭＧＯ濃度とほぼ同じ濃度を有している。
【００７０】
実施例６：ＨＤ血漿からのＡＧＥ前駆体の、ＤＡＧ変性されたポリマー膜との結合
実施例５を繰り返すが、ＰＢＳ緩衝液の代わりに、特にＡＧＥ前駆体であるメチルグリオキサール（ＭＧＯ）、グリオキサール（ＧＯ）および反応性のジカルボニル化合物を含んでいるＨＤ血漿を使用する。これらのＡＧＥ前駆体のキノキサリン誘導体は、実施例５で述べたＨＰＬＣ方法により１４．３分後に検出される。変性された膜の面積は、ＤＡＧのＮＨ２−ＮＨ−基１０μｍｏｌがＨＤ血漿と接触するように規定する。
【００７１】
ＡＧＥ前駆体を測定するためには、まず、タンパク質をＨＤ血漿から除去しなくてはならない。このためには、ＨＤ血漿２００μｌをエッペンドルフキャップ内で、水（純粋）２００μｌで希釈する。さらに、２ＭのＨＣｌＯ４１００μｌを加えて混合すると、これによって、タンパク質が沈殿する。沈殿物を沈殿させるためには、３分間１２０００ｒｐｍで、続いて０．４５μｍのフィルターを通し、３分間５０００ｒｐｍで遠心分離する。内部標準として２，３−ブタンジオン５μｌと１％オルト−フェニレンジアミン溶液２０μｌとを加えた後、１時間室温で反応させる。これにより、ＡＧＥ前駆体は、キノキサリン誘導体に変換する。このキノキサリン誘導体の分離は、実施例５に示したようにＨＰＬＣによって行われる。
【００７２】
ＭＧＯに関する結果を図４に示す。図４のバー２は、変性されたポリマー膜とＨＤ血漿との４時間の接触時間後に測定された相対単位（ｒＥ）でのＭＧＯ濃度を示している。膜なしのＨＤ血漿中で測定されたＭＧＯ濃度（図４のバー６）と比較して、変性されたポリマー膜と４時間の接触させた後のＭＧＯ濃度は、約４２％でしかない。図４のバー３〜５は、ＨＤ血漿１ｍｌあたり２０、５および１μｍのアミノグアニジン塩酸塩を含むＨＤ血漿との４時間の接触時間後に得られたＭＧＯ濃度を示す。図４のバー１は、３回８時間、３５００ダルトンの排除限界を有する再生セルロースに通して透析されたＨＤ血漿中のＭＧＯ濃度を示す。その大きさを考慮すると、ＭＧＯはこれにより完全に除去可能であることが望まれるが、透析後、まだ約１．５ｒＥのＭＧＯがＨＤ血漿中に存在している。
【００７３】
ＨＰＬＣで１４．３分後に検出される反応性のジカルボニル化合物に関する結果を図５に示す。図５のバー２は、変性されたポリマー膜とＨＤ血漿との４時間の接触時間後に測定された、反応性のジカルボニルの濃度を相対単位（ｒＥ）で示している。変性されたポリマー膜なしのＨＤ血漿中で測定された反応性のジカルボニルの濃度（図５のバー６）と比較すると、反応性のカルボニルの濃度は約７％でしかない。図５のバー３〜５は、ＨＤ血漿１ｍｌあたり２０、５、１μｍｏｌのアミノグアニジン塩酸塩を加えたＨＤ血漿との４時間の接触時間後に得られたＨＤ血漿中の反応性のジカルボニルの残留濃度を示している。図５のバー１は、前もって３回８時間、３５００ダルトンの排除限界を有する再生セルロースに通して透析した反応性のジカルボニルの濃度を示す。図５のバー１をバー２と比較すると、変性されたポリマー膜が、ＨＤ血漿中に存在する反応性のジカルボニルを、透析よりもはるかに効果的に除去したことが分かる。
【００７４】
ＧＯに関する結果を図６に示す。図６のバー２は、変性されたポリマー膜とＨＤ血漿との４時間の接触時間後に測定されたＧＯ濃度を相対単位（ｒＥ）で示している。変性されたポリマー膜なしのＨＤ血漿中で測定されたＧＯ濃度（図６のバー６）と比較すると、ＧＯ濃度は約３７％でしかない。図６のバー３〜５は、ＨＤ血漿１ｍｌあたり２０、５および１μｍｏｌのアミノグアニジン塩酸塩を含むＨＤ血漿との４時間の接触時間後に得られたＧＯ濃度を示す。図６のバー１は、前もって３回８時間、３５００ダルトンの排除限界を有する再生セルロースに通して透析を行ったＨＤ血漿中のＧＯ濃度を示す。この透析によって、小さなＧＯ分子は完全に除去される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＤ血漿中のペントシジン濃度を示す棒グラフである。
【図２】透析したＨＤ血漿中のペントシジン濃度を示す棒グラフである。
【図３】ＰＢＳ緩衝液中のＭＧＯ濃度を示す棒グラフである。
【図４】ＨＤ血漿中のＭＧＯ濃度を示す棒グラフである。
【図５】ＨＤ血漿中の反応性のジカルボニル濃度を示す棒グラフである。
【図６】ＨＤ血漿中のＧＯ濃度を示す棒グラフである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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