(57)【要約】新規免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体およびβ−プロピオンアミド連結オリゴサッカリド−タンパク質結合体、ならびにこれら結合体を産生する方法が提供される。この結合体化手段は単純、迅速、再現性があり、そして細菌種、酵母、癌細胞または化学的合成由来の種々のポリサッカリドまたはオリゴサッカリドに適用可能である。この免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体およびβ−プロピオンアミド連結オリゴサッカリド−タンパク質結合体を用いて感染または癌に対する免疫化のワクチンおよび方法もまた開示される。
2004505885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオネート部分のβ位でタンパク質に直接的に結合体化したＮ−プロピオネート化ポリサッカリドまたはＮ−プロピオネート化オリゴサッカリドを含む、ポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項２】
前記タンパク質が少なくとも１つのリジン残基またはシステイン残基を含む、請求項１に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項３】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、細菌、酵母、癌細胞由来であるか、または化学的に合成される、請求項１に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項４】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来である、請求項１に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項５】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、血清型Ｉａ、血清型Ｉｂ、血清型ＩＩ、血清型ＩＩＩ、血清型Ｖ、血清型ＶＩＩＩ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＢ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来である、請求項１に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項６】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、Ｂ群、Ｃ群、Ｙ群、Ｗ１３５群、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＭｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ群由来である、請求項４に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項７】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ９２、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ　４型、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ　１４型、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ａ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｃ群、またはそれらの組み合わせ由来である、請求項４に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項８】
前記タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソシド、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質、ニューモリソイド、Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからのＣ−βタンパク質およびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからの非ＩｇＡ結合Ｃ−βタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項９】
前記タンパク質が、組換えにより産生される、請求項８に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１０】
前記タンパク質が、組換え体Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質である、請求項９に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１１】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、グリコサミノグリカンを含む、請求項１に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１２】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、少なくとも１つの遊離アミノ基またはＮ−アシル基を有する、構造的に反復する単位のグリコシル残基を含む、請求項１に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１３】
前記グリコシル残基が、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、フコサミンおよびシアル酸からなる群から選択される、請求項１２に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１４】
前記Ｎ−プロピオネート化ポリサッカリドまたはＮ−プロピオネート化オリゴサッカリドが、前記タンパク質のリジン残基のε遊離アミノ基またはシステイン残基のチオール基に直接的に結合体化している、請求項１に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１５】
Ｎ−プロピオネート化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　１４型ポリサッカリド−破傷風トキソイド結合体、Ｎ−プロピオネート化Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＩＩＩ型ポリサッカリド−破傷風トキソイド結合体、Ｎ−プロビオネート化Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＩＩ型ポリサッカリド−破傷風トキソイド結合体、Ｎ−プロピオネート化Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１ポリサッカリド−タンパク質結合体、またはＮ−プロピオネート化ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　Ｃ　ポリサッカリド−破傷風トキソイド結合体を含む、ポリサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１６】
Ａ）脱Ｎ−アセチル化試薬を用いて単離されたポリサッカリドまたはオリゴサッカリドを脱Ｎ−アセチル化し、脱Ｎ−アセチル化ポリサッカリドまたは脱Ｎ−アセチル化オリゴサッカリドを形成する工程、
Ｂ）該脱Ｎ−アセチル化ポリサッカリドまたは脱Ｎ−アセチル化オリゴサッカリドを、アクリロイル化試薬でＮ−アクリロイル化し、Ｎ−プロピオネート化ポリサッカリドまたはＮ−プロピオネート化オリゴサッカリドを形成する工程、および
Ｃ）該Ｎ−プロピオネート化ポリサッカリドまたはＮ−プロピオネート化オリゴサッカリドをタンパク質に直接的に結合体化し、ポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体を形成する工程、
を包含する方法によって産生される、ポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１７】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、細菌、酵母、癌細胞または化学的合成由来である、請求項１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１８】
前記結合体化が約７．０のｐＨで実施される、請求項１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項１９】
前記結合体化が９を超えるｐＨで実施される、請求項１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項２０】
前記結合体化が、リン酸、炭酸／重炭酸緩衝液およびホウ酸緩衝液からなる群から選択される試薬中で実施される、請求項１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項２１】
前記脱Ｎ−アセチル化試薬が塩基または酵素であり、そして前記アクリロイル化試薬がＮ−アクリロイルクロリド、アクリロイル無水物、アクリル酸および脱水剤からなる群から選択される、請求項１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体。
【請求項２２】
請求項１または１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
アジュバントをさらに含む、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記アジュバントが、ミョウバンまたはステアリルチロシンからなる群から選択される、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
第２の成分をさらに含み、該第２の成分が、ＤＴＰ、ＤＴａＰ、Ｔｄ、ＤＴａＰ−Ｈｉｂ、ＤＴａＰ−ＩＰＶ−Ｈｉｂ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項１または１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体を含む免疫原であって、ポリサッカリド特異的免疫応答またはオリゴサッカリド特異的免疫応答を惹起する、免疫原。
【請求項２７】
前記免疫応答が、ポリサッカリド特異的またはオリゴサッカリド特異的免疫グロブリンの生成である、請求項２６に記載の免疫原。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはそれらの組み合わせである、請求項２７に記載の免疫原。
【請求項２９】
β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体またはβ−プロピオンアミド連結オリゴサッカリド−タンパク質結合体を作製する方法であって：
Ａ）脱Ｎ−アセチル化試薬を用いてポリサッカリドまたはオリゴサッカリドを脱Ｎ−アセチル化し、脱Ｎ−アセチル化ポリサッカリドまたは脱Ｎ−アセチル化オリゴサッカリドを形成する工程、
Ｂ）該脱Ｎ−アセチル化ポリサッカリドまたは脱Ｎ−アセチル化オリゴサッカリドを、アクリロイル化試薬でＮ−アクリロイル化し、β−プロピオネート化ポリサッカリドまたはβ−プロピオネート化オリゴサッカリドを形成する工程、および
Ｃ）該β−プロピオネート化ポリサッカリドまたはβ−プロピオネート化オリゴサッカリドをタンパク質に直接的に結合体化し、β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体またはβ−プロピオンアミド連結オリゴサッカリド−タンパク質結合体を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記脱Ｎ−アセチル化試薬が塩基または酵素である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記脱Ｎ−アセチル化試薬が、ＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＫｉＯＨからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記アクリロイル化試薬がアクリロイルクロリド、アクリロイル無水物、アクリル酸および脱水剤からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、細菌，酵母、癌細胞または化学的合成由来である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソシド、ナイセリア外膜タンパク質、ニューモリソイド、およびＢ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからのＣ−βタンパク質およびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからの非ＩｇＡ結合Ｃ−βタンパク質からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質が、組換えにより産生される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１または１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体を含むワクチンであって、疾患を引き起こす生物または細胞に対する保護免疫を提供する、ワクチン。
【請求項３８】
前記疾患を引き起こす生物または細胞が、細菌、酵母および癌細胞からなる群から選択される、請求項３７に記載のワクチン。
【請求項３９】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである、請求項３８に記載のワクチン。
【請求項４０】
前記ポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体と組み合わせた第２の免疫原をさらに含み、該第２の免疫原が、ＤＴＰ、ＤＴａＰ、Ｔｄ、ＤＴａＰ、Ｈｉｂ、ＤＴａＰ−ＩＰＶ−Ｈｉｂ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載のワクチン。
【請求項４１】
免疫化する量の請求項３７に記載のワクチンを含む、疾患を引き起こす生物または疾患を引き起こす細胞に対して哺乳動物を免疫化するための、薬学的組成物。
【請求項４２】
免疫化する量の請求項３７に記載のワクチンを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して哺乳動物を免疫化するための、薬学的組成物。
【請求項４３】
免疫化する量の請求項３７に記載のワクチンを含む、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対して哺乳動物を免疫化するための、薬学的組成物。
【請求項４４】
免疫化する量の請求項３７に記載のワクチンを含む、Ｂ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して哺乳動物を免疫化するための、薬学的組成物。
【請求項４５】
免疫化する量の請求項３７に記載のワクチンを含む、Ｃ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して哺乳動物を免疫化するための、薬学的組成物。
【請求項４６】
免疫化する量の請求項３７に記載のワクチンを含む、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｂ型に対して哺乳動物を免疫化するための、薬学的組成物。
【請求項４７】
有効量の、請求項１または１６に記載のポリサッカリド−タンパク質結合体またはオリゴサッカリド−タンパク質結合体を含む、哺乳動物においてポリサッカリドまたはオリゴサッカリドに応答する抗体を惹起するための、薬学的組成物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の薬学的組成物によって産生された、免疫グロブリンまたはその抗原結合フラグメント。
【請求項４９】
ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４８に記載の免疫グロブリン。
【請求項５０】
前記抗体が単離されたＩｇＧである、請求項４９に記載の免疫グロブリン。
【請求項５１】
請求項１または１６に記載のβ−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体またはβ−プロピオンアミド連結オリゴサッカリド−タンパク質結合体に応答して惹起される、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、Ｎ−プロピオネート化ポリサッカリドまたはＮ−プロピオネート化オリゴサッカリドと特異的に免疫反応性であり、かつ該β−プロピオネート化ポリサッカリドまたはβ−プロピオネート化オリゴサッカリドが由来するネイティブのＮ−アセチル化ポリサッカリドと免疫反応性である、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５２】
前記ネイティブのＮ−アセチル化ポリサッカリドが、細菌、酵母または癌細胞の成分である、請求項５１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５３】
前記ポリサッカリドがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来である、請求項５２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５４】
前記抗体が組換えにより産生される、請求項５１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５５】
疾患を引き起こす生物または疾患を引き起こす細胞に対して受動免疫化するための薬学的組成物であって、有効量の、請求項４８または５１に記載の免疫グロブリンまたは抗体を含み、該量が、疾患を引き起こす生物または疾患を引き起こす細胞を阻害または殺傷するに十分である、薬学的組成物。
【請求項５６】
前記免疫グロブリンが、単離されたＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項５５に記載の受動免疫化するための薬学的組成物。
【請求項５７】
前記免疫グロブリンが、単離されたＩｇＭ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項５５に記載の受動免疫化するための薬学的組成物。
【請求項５８】
前記免疫グロブリンが、単離されたＩｇＡ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項５５に記載の受動免疫化するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体、および細菌、酵母または癌細胞からこの結合体を産生するための方法に関する。この結合体は、ワクチンとして有用である。
【０００２】
（発明の背景）
グラム陽性細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、ＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）によって、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ、　Ｎｅｉｓｓｅｒｉａおよび特定の型のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）によって引き起こされる細菌感染は、世界中で深刻な罹患率を引き起こす。このことは、細菌によって示される抗生物質に対する耐性の出現と合わせて、細菌ワクチンの開発の必要性を示す。例えば、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）は、それらの細胞壁ポリサッカリドの抗原性および構造に基づいていくつかの群に分類されている、大きくかつ様々な属のグラム陽性細菌である（２６、２７）。これらの群のうちの２つは、重篤なヒト感染に関連している。Ａ群連鎖球菌は、「連鎖球菌性咽喉炎（ｓｔｒｅｐ　ｔｈｒｏａｔ）」、リウマチ熱、連鎖球菌性膿痂疹および敗血症を含む、種々の感染性障害を引き起こす。Ｂ群連鎖球菌は、米国ならびに発展途上国における、重大な周産期の病原体である（３７）。
【０００３】
グラム陰性細菌はまた、疾患の有意な原因である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｂ型細菌（Ｈｉｂ）に対するポリサッカリド−タンパク質ワクチンの近年の開発および使用まで、Ｈｉｂ細菌感染は、幼児における精神遅滞の多くのケースの原因であった。Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１感染は、新生児髄膜炎の原因である。グラム陰性細菌の株である、Ｅ．ｃｏｌｉは、深刻な疾病（Ｅ．ｃｏｌｉ株で汚染された肉を食べることによる死を含む）に関連している。
【０００４】
ポリサッカリドは、ポリペプチドまたはタンパク質のような別の免疫原性分子に結合体化された場合、種々のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する抗体応答を誘発するために使用されている。ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドのポリペプチドへの結合体化は、代表的にＴ細胞非依存性のポリサッカリドまたはオリゴサッカリドに対する免疫応答を、Ｔ細胞依存性である免疫応答に変換する。
【０００５】
先行技術は、結合体を形成するための、ポリサッカリドのタンパク質への直接的なカップリングおよび間接的なカップリングの両方を開示する（参考文献（１１）および米国特許第５，３０６，４９２号に要約される）。結合体化方法は、ジアゾカップリング、チオエーテル結合、アミド化、還元的アミノ化およびポリサッカリドをタンパク質キャリアにカップリングするためのチオカルバモイルを含む。
【０００６】
Ｇｅｙｅｒら、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６５：１７１−２８８（１９７９）は、還元的アミノ化、およびアゾカップリングを使用する誘導体化された糖の結合による、特定のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜ポリサッカリドフラグメントのニトロフェニル−エチルアミンリンカーへの結合体化を記載する。
【０００７】
ＭｃＩｎｔｉｒｅによる米国特許第４，０５７，６８５号は、ハロアシルハライドとの反応によってタンパク質抗原に共有結合された、毒性が減少されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉリポポリサッカリドを記載する。
【０００８】
Ｊｅｎｎｉｎｇｓらによる米国特許第４，３５６，１７０号は、還元的アミノ化によるポリサッカリド−タンパク質結合体の生成を記載する。
【０００９】
Ａｎｄｅｒｓｏｎによる米国特許第４，６７３，５７４号、同第４，７６１，２８３号および同第４，８０８，７００号は、過ヨウ素酸塩での酸化的切断のような手段またはグリコシル結合の加水分解によって調製された還元末端を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの莢膜ポリマー由来の免疫原性莢膜ポリサッカリドフラグメントの還元的アミノ化産物を、タンパク質キャリアとして細菌性毒素またはトキソイドとともに含む、免疫原性結合体の生成を記載する。
【００１０】
Ｈｉｌｌｍａｎらによる米国特許第４，４５９，２８６号は、臭化シアンでのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｂ型ポリサッカリドの活性化、この活性化されたポリサッカリドのスペーサー分子である６−アミノカプロン酸での誘導体化、および６−アミノカプロン酸スペーサーからポリサッカリドへの複雑な種々の連結を介するタンパク質へのアミド型の連結を形成するためのＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの主要外膜タンパク質の水溶性カルボジイミドでの結合体化による、ポリサッカリド−タンパク質結合体の調製を記載する。
【００１１】
Ｇｏｒｄｏｎによる米国特許第４，９６５，３３８号は、水溶性の共有結合性のポリサッカリド−ジフテリアトキソイド結合体の生成を記載し、ここで、純粋なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｂ型ポリサッカリドは、臭化シアンによって活性化され、そして直ちにＡＤＨスペーサーで誘導体化されたジフテリアトキソイドと混合される。
【００１２】
Ｔｓａｙらによる米国特許第４，６６３，１６０号は、４〜１２の炭素部分によって、同種のグラム陰性細菌由来の解毒されたタンパク質に共有結合的にカップリングされたグラム陰性細菌由来の解毒されたポリサッカリドを記載する。
【００１３】
Ｇｏｒｄｏｎらによる米国特許第４，６１９，８２８号は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｂ型、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのような病原性細菌由来のポリサッカリド分子と、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドのようなＴ細胞依存性抗原との間の結合体を記載する。
【００１４】
Ｐｏｒｒｏらによる米国特許第４，７１１，７７９号は、グラム陽性細菌の莢膜ポリサッカリド由来の抗原決定基、ならびにＣＲＭ１９７、破傷風トキソイドまたは百日咳毒素のいずれかを含む、３価の免疫原性活性を有する糖タンパク質結合体ワクチンを記載する。
【００１５】
Ｐｏｒｒｏによる米国特許第５，３０６，４９２号は、末端還元基を有するオリゴサッカリドを、還元的アミノ化が生じるようにピリジンボランの存在下でジアミノメタンと反応させて、そのアミノ化されたオリゴサッカリド産物を２つの官能基を有する分子と反応させて、次いで、この活性化されたオリゴサッカリド産物をキャリアタンパク質と反応させることによって生成される、オリゴサッカリド−キャリアタンパク質結合体を記載する。
【００１６】
Ｋｕｏらによる米国特許第５，１９２，５４０号は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｂ型の莢膜ポリサッカリドから誘導された酸化されたポリリボシル−リビトール−ホスフェートポリサッカリドフラグメントの還元的アミノ化産物、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｂ型の外膜タンパク質を含む、ポリサッカリド−タンパク質結合体を記載する。
【００１７】
欧州公開番号ＥＰ　０７４７０６３　Ａ２は、複数のシアル酸誘導体およびキャリアタンパク質に連結されたヘテロ二官能性リンカー分子を含む、修飾された莢膜ポリサッカリドを記載する。このリンカーは、ポリサッカリドあたり約５までのシアル残基をＮ−アルキル化するために使用される。次いで、残存するアミノ基を、無水プロピオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ）または無水酢酸でアシル化する。
【００１８】
免疫原性ポリサッカリド−タンパク質結合体ワクチンの大規模生成のための、精製免疫原性ポリサッカリド−タンパク質結合体を得る、より効率的で、より高収率で、そしてより単純な手段が望ましい。
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体およびβ−プロピオンアミド連結オリゴサッカリド−タンパク質結合体である。
【００２０】
本発明の目的は、現在利用されている方法に対して利点を提供する、免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体を調製する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、上記の免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体から誘導される、薬学的組成物、ワクチンおよび他の免疫学的試薬を提供することである。
【００２１】
免疫原性ポリサッカリド−タンパク質結合体を調製する方法が、提供され、この方法は、塩基加水分解または酵素加水分解によるポリサッカリドまたはオリゴサッカリドの脱Ｎ−アセチル化、続いてこのＮ−脱アセチル化ポリサッカリドのＮ−アクリロイル化を包含する。このＮ−アクリロイル化ポリサッカリドは、直接、キャリアタンパク質へカップリングされて、免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体が形成される。
【００２２】
莢膜および細胞表面のポリサッカリドは、本発明に従って、細菌、酵母、もしくは哺乳動物の細胞上清から、あるいは塩基不安定結合（これは、ポリサッカリドを他の細胞性成分に結合させる）の加水分解によってまたは酵素加水分解によって細菌、酵母もしくは哺乳動物の細胞から直接にのいずれかで抽出され得る。ポリサッカリドから加水分解によって除去されたある割合のＮ−アセチル基は、Ｎ−アクリロイル基によって置換され、次いで、タンパク質に直接カップリングされて、本発明の結合体を形成する。
【００２３】
本発明のある局面は、タンパク質（単数または複数）へ複数の部位で直接カップリングされるオリゴサッカリドおよびポリサッカリドを提供する。
【００２４】
本発明の別の局面は、細菌または酵母の感染あるいは癌に対して哺乳動物を免疫化する方法であり、この方法は、疾患を引き起こす生物または癌に対しての予防のために、本発明の有効量のワクチンを哺乳動物へ投与する工程を包含する。
【００２５】
本発明のある局面は、感染または疾患に対して哺乳動物を保護するβ−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体を使用して、哺乳動物における抗体の産生を誘発する方法である。
【００２６】
本発明の別の局面は、β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体を使用する免疫化に応答して惹起される、免疫グロブリンおよび単離された抗体である。このような免疫グロブリンおよび単離された抗体は、治療剤および診断試薬として有用である。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細菌感染、酵母感染に対する免疫原およびワクチンとしてならびに癌の治療剤として有用である、新規のポリサッカリド−タンパク質結合体およびオリゴサッカリド−タンパク質結合体である。免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体の形成において有用であるポリサッカリドおよびオリゴサッカリドは、グラム（＋）細菌またはグラム（−）細菌、酵母、癌細胞または癌性組織などを含むがこれらに限定されないポリサッカリドおよびオリゴサッカリドの供給源に由来し、ここで、上記のポリサッカリドおよびオリゴサッカリドは、宿主防衛機制を回避する細胞についての病原性因子として役割を果たす。本発明のポリサッカリド−タンパク質結合体は、タンパク質上の求核部位のマイケル型の付加によってＮ−アクリロイル化ポリサッカリドをタンパク質に直接カップリングすることによって形成される。
【００２８】
ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、種々の供給源（グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母、癌性細胞または各々の組換え形態を含む）から、ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドを細胞性成分へ付着する結合の、塩基加水分解または酵素加水分解を用いて、得られ得る。ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、上記の生物または細胞あるいは上記の生物または細胞のフラグメントを含有する溶液を塩基または酵素と接触させることによって、上記の生物または細胞から抽出され得る。次いで、ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、種々の方法によって、塩基加水分解または酵素加水分解の後、回収され得る。本発明に従う使用のためのグラム陽性細菌およびその組換え株の非制限的例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍである。詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの使用がより好ましく、そしてＢ群　ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉのＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩＩＩ型の使用が最も好ましい。本発明で使用するためのグラム陰性細菌およびその組換え株の非制限的例には、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられる。詳細には、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｂ型、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＢ、Ｃ、Ｙ型およびＷ１３５型、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１、ならびにＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ９２がより好ましい。本発明においての使用のための酵母の例には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓが挙げられるが、これに限定されない。本発明においての使用のための癌細胞または癌性組織の例には、小細胞肺癌、神経芽細胞腫、乳癌、結腸癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
多種多様の条件が、当該分野において公知の方法による、本発明に従う水性溶媒または有機溶媒のいずれかにおけるポリサッカリドまたはオリゴサッカリドの加水分解のために使用され得る。糖質のＮ−アセチル結合が加水分解される程度は、反応条件によって制御され得る。１つの実施態様において、少なくとも約５％のＮ−アセチル基が、加水分解によって除去され、好ましくは約５０％〜約１００％が除去され、より好ましくは約９０％以上の未変性のＮ−アセチル基が除去される。特定の実施態様において、約９５％以上のＮ−アセチル基が、加水分解試薬での処理によって、ポリサッカリドから加水分解される。
【００３０】
塩基抽出に敏感な莢膜ポリサッカリドは、交換され得ない塩基不安定置換基（例えば、免疫原性に重要であるＯ−アセチル基）が全くないポリサッカリドである。塩基抽出に敏感な他の莢膜ポリサッカリドは、ホスホジエステル結合を欠くもの、および４−連結ウラン酸残基を欠くものである。
【００３１】
塩基加水分解についての好ましい実施態様において、ＣＰＳが、Ｂ群　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（ＧＢＳ）から抽出される。最も好ましい実施態様において、ＣＰＳが、ＧＢＳのＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩＩＩ型から抽出される。
【００３２】
塩基加水分解についての別の好ましい実施態様において、ＣＰＳは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから抽出される。塩基加水分解についてのより好ましい実施態様において、ＣＰＳは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＩＩＩ、ＩＶおよびＸＩＶ型から抽出される。
【００３３】
塩基加水分解についての別の好ましい実施態様において、ＣＰＳは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細菌から抽出される。塩基抽出についてのより好ましい実施態様において、ＣＰＳは、Ｎｅｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＢ、Ｃ、ＹまたはＷ１３５型、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１あるいはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ９２から抽出される。
【００３４】
酵素的脱アセチル化を受け入れるポリサッカリドは、置換基が免疫原性部分により置き換えられ得ないかまたは置換され得ない免疫原性に重要である任意の酵素に不安定な置換基を欠くポリサッカリドであり、これらのポリサッカリドには、ＧＢＳなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３５】
（Ａ．Ｎ−アクリロイル化ポリサッカリドの調製）
（１．ポリサッカリドの脱アセチル化）
（ａ）．出発物質）
ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、当該分野で公知の標準的な方法を使用して、濃縮した細菌、酵母、哺乳動物細胞またはこれらの細胞の組換え形態から、あるいはホモジナイズした細胞からの上清から、または馴化培地から、塩基加水分解または酵素的加水分解を使用して得られ得る。このポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、当該分野で公知の標準的な方法によって単離および精製され得る。市販の供給源から単離されかつ精製されたポリサッカリドまたはオリゴサッカリドもまた、出発物質として使用され得る。
【００３６】
ポリサッカリドの単離のための方法は、使用される特定のポリサッカリドに依存する。一般的な方法は、荷電したポリサッカリドと結合体化するイオン性界面活性剤の使用である。この結合体は、沈澱されかつ単離される。次いで、この結合体は、高いイオン強度の溶液（例えば、塩化カルシウム）中に溶解され、次いで、このポリサッカリドは、エタノールで沈澱される。
【００３７】
本発明の使用のために得られた単離されかつ精製されたポリサッカリドおよびオリゴサッカリドは、好ましくは、ヒトでの使用のために、１％未満の純度の核酸およびタンパク質不純物を含む。８０〜１００％の純度の炭水化物は、しばしば、無機塩の存在に起因して精製後に観察される。
【００３８】
（ｂ）．塩基加水分解）
Ｎ−アセチル基を除去するために、精製されたポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、塩基で処理され得る。本発明に従って使用され得る塩基の非限定的な例には、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＣＮ、Ｅｔ３Ｎ、ＮＨ３、Ｈ２Ｎ２Ｈ２、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ、ＮａＯＥｔまたはＫＯｔＢｕである。ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨ、ＮａＯＭｅまたはＫＯｔＢｕのような塩基は、０．５Ｎ〜５．０Ｎの範囲において最も効果的に使用される。ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３およびＫＣＮのような塩基は、それらの溶解度が許す限りの濃度にて使用され得る。Ｅｔ３Ｎのような有機塩は、加水分解をもたらす水またはアルコールのような物質が存在する限り、中〜高（５０〜１００％）濃度で使用され得る。ＮＨ３またはＨ２Ｎ２Ｈ２のような塩基が、１００％を含むほとんど全ての濃度で使用され得る。溶媒（例えば、水、アルコール（好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドまたはこれらの溶媒および他の有機溶媒の混合物）が使用され得る。水を含む塩基の溶液が、最も好ましい。
【００３９】
ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドからのＮ−アセチル基の除去に最も効果的なｐＨ範囲は、約９〜約１４であり、ここで最適なｐＨは、およそ１２である。このＮ−脱アセチル化ポリサッカリドは、その後、当該分野で公知の標準的な方法により、膜または透析を使用する超精製によって、残存する試薬から精製される。
【００４０】
（ｃ）．酵素的加水分解）
酵素であるＮ−脱アセチラーゼは、ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドからＮ−アセチル基を酵素的に除去するために使用され得る。１つの実施態様では、ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドからのＮ−アセチル残基の除去に有用なＮ−デアセチラーゼ酵素は、参考文献４７、４８および４９に記載される。酵素的加水分解では、ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドおよびデアセチラーゼ酵素は、適切なｐＨおよび温度の条件下で、適切な酵素緩衝系と混合され、そしてＮ−アセチル基の除去に十分な期間の間反応させる。１つの実施態様では、ポリサッカリドおよびデアセチラーゼ酵素は、Ｎ−脱アセチル化ポリサッカリドの形成のために、３７℃で６０分間、適切な酵素緩衝系（例えば、５０ｍＭ　ＭＥＳ、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、ｐＨ６．３）と混合される。この反応は、適切な停止溶液（例えば、１Ｍ　モノクロロ酢酸、０．５Ｍ　ＮａＯＨ、２Ｍ　ＮａＣｌ）を使用して、または適切な緩衝溶液を使用する希釈によって停止される。
【００４１】
（２．ポリサッカリドのＮ−アクリロイル化）
ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドのアルカリ加水分解または酵素的加水分解は、ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドのシアル酸およびアミノ糖残基からのＮ−アセチル基の除去を生じる。加水分解後に、このポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、種々のアルクロイル化試薬を使用することにより所望される程度まで、Ｎ−アクリロイル化される。
【００４２】
１つの実施態様では、この方法は、Ｎ−脱アセチル化ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドをＮ−アクリロイル化するアクリロイル化試薬を添加することを含む。アクリロイル化試薬の例には、約１Ｍの濃度で過剰に使用される、アクリロイルクロライド、アクリロイル無水物、アクリル酸および脱水試薬（例えば、ＤＣＣ、ＣＨ２ＣＨＣＯＣＮなど）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｎ−脱アセチル化ポリサッカリドのＮ−アクリロイル化の方法では、ｐＨは、反応の間、約９〜約１１に、好ましくは約ｐＨ１０に調製され、そして維持される。この反応の間の温度は、約２℃〜約８℃、好ましくは約４℃である。この反応は、約１時間の期間にわたって行われる。得られたＮ−アクリロイル化ポリサッカリドまたはＮ−アクリロイル化オリゴサッカリドは、少なくとも約９５％を超えてアクリロイル化される。
【００４３】
（Ｂ．β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体の調製）
本発明のポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、別の免疫原性分子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）に結合体化される場合に、種々のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、酵母および個体における癌に対する抗体応答を誘発するために使用され得る。ポリペプチドへのポリサッカリドまたはオリゴサッカリドの結合体化は、代表的には、Ｔ細胞非依存性であるポリサッカリドまたはオリゴサッカリドに対する免疫応答をＴ細胞依存性であるポリサッカリドまたはオリゴサッカリドに対する免疫応答に変換する。従って、ポリペプチドのサイズは、好ましくは、Ｔ細胞非依存性からＴ細胞依存性にこの応答を変更することを引き起こすに十分なサイズである。第２の免疫原を提供する目的のために、より小さいポリペプチドを使用することが有用であり得る。タンパク質キャリアのサイズは、代表的には、約５０，０００〜約５００，０００Ｍ．Ｗ．である。
【００４４】
好ましいキャリアタンパク質には、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラ毒素サブユニットＢ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質、ニューモリソイド（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｏｉｄ）、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のＣ−βタンパク質、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来の非ＩｇＡ結合Ｃ−βタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａトキソイド、百日咳トキソイド、リジンまたはシステインを含む合成タンパク質などが含まれるがこれらに限定されない。キャリアタンパク質は、ネイティブなタンパク質、化学的に改変されたタンパク質、無毒化したタンパク質または組換えタンパク質であり得る。本発明に従って調製された結合体分子は、タンパク質分子に関しては、モノマー、ダイマー、トリマー、およびより高度に架橋した分子であり得る。
【００４５】
本発明は、結合体分子を生成する能力を提供する。ここで、そのタンパク質は、そのポリサッカリドまたはオリゴサッカリドと、そのポリサッカリドもしくはオリゴサッカリド上の１つ以上の部位を通じて連結されている。このポリサッカリドまたはオリゴサッカリドのサイズは、大いに変動し得る。１または複数のポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、１または複数のタンパク質と架橋し得る。本発明の結合体は、好ましくは格子構造である。接着点は、そのタンパク質のリジンもしくはシステインと、そのポリサッカリドもしくはオリゴサッカリドのＮ−アクリロイル基との間にある。
【００４６】
免疫原性ポリサッカリド−タンパク質結合体を形成する１つの方法において、その反復ユニットを構成する糖残基における遊離のアミノ基もしくはＮ−アシル基（例えば、Ｎ−アセチル基）を含む、単離されたポリサッカリド（グリコサミノグリカン）はまず、塩基もしくは酵素を用いて加水分解処理されて、そのＮ−アシル基の部分もしくはすべてが除去される。次いで、遊離のアミノ基を、Ｎ−アクリロイル化試薬を用いてＮ−アシル化して、上記のＮ−アクリロイル化ポリサッカリドを形成する。次いで、Ｎ−アクリロイル化ポリサッカリドを、最適なｐＨ、温度および時間条件下で直接タンパク質に結合させて、免疫原性のβ−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体を形成する。
【００４７】
１つの実施態様において、結合体化の方法を、そのタンパク質のリジン残基のε遊離アミノ基の最適な反応性のために、９．０よりも上のｐＨ、好ましくは約９．０〜約１０．０のｐＨで実施する。別の実施態様において、結合体化の方法を、そのタンパク質のシステイン残基のチオール（ＳＨ）基の最適な反応性のために、約７．０の中性ｐＨで実施する。結合体化の方法を実施するためのｐＨの選択は、特定のキャリアタンパク質における反応基の数に基づき得る。例えば、システイン残基に比してより多くの反応性リジン残基から構成されるタンパク質を用いる方法は、塩基性ｐＨにおいて好ましく実施される。リジン残基に比してより多くの反応性システイン残基から構成されるタンパク質を用いる結合体化の方法は、ほぼ中性のｐＨで好ましく実施される。
【００４８】
この結合体化反応は、以下を含む緩衝化試薬を含むがこれらに限定されない緩衝化試薬において実施され得る：炭酸／重炭酸、ホウ酸緩衝液、リン酸など。この結合体化反応の温度は、少なくとも２５℃、好ましくは約３７℃であり、好ましくは約２４時間の期間にわたる。重要な反応は、Ｒｏｍａｎｏｗｓｋａら（４６）に記載されるような、Ｎ−アクリロイル化糖残基を有するタンパク質上の求核性システインのチオール基またはリジンのε−ＮＨ２基の１，４−結合体付加（マイケル型付加）を含む。これらの残基は、図１に示されるようなポリサッカリドの反復ユニットに存在する。得られるβ−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体は、約０．１〜約０．６のポリサッカリド対タンパク質比を有する。
【００４９】
タンパク質上のシステインおよび／またはリジン残基との直接結合体化に受け入れられるＮ−アシル基を有するポリサッカリドのグリコシル残基は、以下を含むがそれらに限定されない：グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、フコサミン、シアル酸など。このポリサッカリドは、細菌、酵母または癌細胞のような天然供給源に由来し得るか、または合成供給源に由来し得る。合成供給源としては、化学合成、酵素合成および化学酵素合成が挙げられる。この合成は、デノボ合成または天然の糖の改変であり得る。天然に単離された糖は、糖残基上の官能基を変更することによるか、または糖残基の付加もしくは除去によって改変され得る。
【００５０】
本発明のβ−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質およびβ−プロピオンアミド連結オリゴサッカリド−タンパク質の結合体の調製において使用するためのポリサッカリドまたはオリゴサッカリドは、キャリアタンパク質との結合体化のために大きさを変動させ得る。本明細書において規定されるように、本発明における使用のためのオリゴサッカリドは、少なくとも１０の糖残基を含み、そして好ましくは、１０〜約５０の糖残基を含む。本明細書において規定されるポリサッカリドは、５０の糖残基よりも大きく、そして約６００以上の残基の大きさであり得る。いくつかの場合において、大きな構築物が免疫原性の増強のために好ましい。本発明の方法は、非常の大きなポリサッカリドの使用のために提供される。なぜなら、多くの反応性部位が単一のポリサッカリドに導入され得るからである。先行技術に対する本発明の方法の別の利点は、そのポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが、免疫のために重要なエピトープとしばしば相互作用するか、またはそれらの部分を形成する荷電官能基において変化していないということである。
（Ｃ．ワクチン）
本発明はまた、ワクチン調製物に関する。本発明に従って、上記の単離されたβ−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体を抗原として使用して、そのポリサッカリドまたはオリゴサッカリドに対して反応性であり、そしてそれゆえ、そのポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが単離された生物または細胞に対して反応性である抗体を生成し得る。本発明のワクチンは、種々の疾患を生じる生物または疾患を生じる細胞に対して免疫するにおいて有用な多機能性ワクチンを提供するために、β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体と組み合わせて、さらに以下が挙げられるがそれらに限定されない他の成分を含む、組合せまたは多成分ワクチンであり得る：ジフテリア−破傷風−百日咳（ＤＴＰ）、破傷風−ジフテリア（Ｔｄ）、ＤＴａＰ、ＤＴａＰ−Ｈｉｂワクチン、ＤＴａＰ−ＩＰＶ−Ｈｉｂワクチンなどおよびそれらの組合せ。
【００５１】
本発明のワクチンは、能動免疫または受動免疫を提供し得る。能動免疫を提供するためのワクチンは、少なくとも１つの抗原性ペプチドと結合体化された、単離されそして精製されたＮ−アクリロイル化ポリサッカリドもしくはオリゴサッカリドを含む。
（Ｄ．薬学的組成物）
本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つのオリゴサッカリド−タンパク質結合体および薬理学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど）を含み得る。別の実施態様において、この薬学的組成物は、別の免疫原性部分（例えば、ペプチド）または本発明のＣＰＳの１つによって惹起された抗体を含む組成物を含む。この組成物はまた、そのレシピエントの免疫学的応答を増強するためのアジュバントを含み得る。そのようなアジュバントは、アルミニウムベース（例えば、ミョウバンまたは長鎖アルキルアジュバント（例えば、ステアリルチロシン（米国特許出願第５８３，３７２号（１９９０年９月１７日出願）；欧州特許ＥＰ０　５４９　６１７　Ｂ１；Ｍｏｌｏｎｅｙら、米国特許第４，２５８，０２９号を参照のこと）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）もしくはその誘導体、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、サポニン（Ｑｕｉｌ−Ａ）などであり得る。Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、米国特許第５，６８３，６９９号およびＰａｏｌｅｔｔｉら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１９９７；１７５；１７５：１２３７−９もまた参照のこと。この薬学的組成物は、さらに、以下を含むがそれらに限定されない１つ以上のさらなる免疫原を含み得る：ジフテリア−破傷風−百日咳（ＤＴＰ）、破傷風−ジフテリア（Ｔｄ）、ＤＴａＰ、ＤＴａＰ−Ｈｉｂ、ＤＴａＰ−ＩＰＶ−Ｈｉｂなどおよびそれらの組合せ。これらの薬学的組成物は、ワクチンとして特に有用である。
【００５２】
受動免疫を惹起するために、この薬学的組成物は、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体、その誘導体またはそれらのフラグメントおよびそれらの組換え形態からなり得る。抗体、フラグメントまたは誘導体の量は、標準的な臨床学的技術によって決定されるような治療的にまたは予防的に有効な量である。
【００５３】
本発明の薬学的組成物は、当該分野で有効であると公知である方法によって個体に導入され得る。導入経路の中でも、とりわけ、皮内、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、経口および鼻内があるが、これらのみではない。
【００５４】
本発明の組成物は、当業者に公知である標準的なキャリア、緩衝剤または保存剤を含み得る。これらは、ワクチンについて適切であり、生理食塩水または他の注射可能な液体のような薬学的に受容可能な、任意の適切なキャリアを含むがそれらに限定されない。ワクチンにおいて慣用される添加剤もまた存在し得る（例えば、ラクトースまたはソルビトールのような安定化剤およびリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムおよびステアリルチロシンんおような免疫原性応答を増強するためのアジュバント）。本発明に従って生成されたワクチンは、複数の感染因子に対して免疫応答を惹起する多機能性ワクチンの成分として使用され得る。
【００５５】
本発明のワクチンは、免疫原性応答の一部として抗体の生成を惹起するために充分な量で投与される。このワクチンを非経口的に使用して、ＩｇＧおよびＩｇＭを生成し得るか、またはこのワクチンを、粘膜に送達して、組織表面においてＩｇＡを惹起し得る。投薬量を、そのワクチンを受ける個体の大きさ、体重または年齢に基づいて調整し得る。個体における抗体応答を、抗体力価または殺菌活性についてアッセイすることによってモニターし得、そしてその応答を増強することが必要な場合、追加免疫し得る。代表的には、乳児についての単回用量は、１用量あたり約１０μｇの結合体ワクチンであるか、または約０．５〜２０μｇ／ｋｇである。成体は、１用量が約０．５〜２０μｇ／ｋｇの結合体ワクチンを受ける。ＣＰＳ−タンパク質結合体ワクチンについて、代表的な用量は、１用量あたり約２５μｇの各個々のＣＰＳである。すなわち、Ｂ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対するワクチンは、９つの血清型の各々について、各々２５μｇのＣＰＳを含み得る。
（Ｅ．抗体）
ポリサッカリドに対して指向される抗体は，当該分野で周知の任意の技術によって生成され得る。１つのアプローチに従って、この抗体は、単離された免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体を宿主動物へと投与することによって生成され得る。この宿主動物は、ラット、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類またはヒトであり得るがそれらに限定されない。好ましくは、その宿主はヒトである。１つの実施態様において、免疫学的応答は、当該分野で公知のアジュバントの使用によって増加され得る。
【００５６】
そのポリサッカリドに対して指向されたモノクローナル抗体もまた、当該分野で周知の技術のいずれかによって調製され得る。１つの方法に従って、ハイブリドーマ細胞株の培養物が使用され得る（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７）。そのポリサッカリドに対して指向されたモノクローナル抗体は、当該分野で周知の技術のいずれかによって調製された、ヒトモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であり得る。１つのアプローチに従って、ヒト定常領域と組み合わせた非ヒト（例えば、マウス）抗原結合ドメインを有するキメラモノクローナル抗体が生成され得る（Ｔａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４５２）。ヒト化抗体は、Ｑｕｅｅｎらの手順に従って生成され得る。（米国特許第５，５８５，０８９号および米国特許第５，５３０，１０１号）。単鎖抗体は、当該分野で公知の方法によって構築され得る（米国特許第４，９４６，７７８；Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｔ．ら、１９９１　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：１６５−１６９；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．１９９０　Ｎａｔｕｒｅ　３４７：４９７−４９８）。この抗体の定常領域ドメインは、当該分野で公知の手順によって改変され得る（ＷＯ　８９／０７１４２）。
【００５７】
このポリサッカリドまたはオリゴサッカリドに対して指向された抗体は、以下を含むがそれらに限定されない当該分野で周知の技術のいずれかによって精製され得る：免疫吸着またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、または他のクロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣ）。抗体はまた、血清、血漿または細胞培養培地からの免疫グロブリン画分として精製され得る。
【００５８】
本発明の抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、または免疫グロブリン分子のそれらの部分（例えば、Ｆａｂフラグメント）（これらは、抗原結合部位を含む）であり得る。抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡを含む任意のクラスであり得る。
【００５９】
ＣＰＳに対して指向された抗体のフラグメントは、当該分野で周知の技術のいずれかによって生成され得る（Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８５）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｂｕｒｄｏｎら（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
【００６０】
抗体もしくは抗原またはそれらの抗原結合フラグメントは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌または酵母によって生じる疾患に対して受動防禦を提供するにおいて治療剤として有用である。抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、細菌、酵母または癌細胞の検出および／または同定のための標準的な免疫アッセイにおいて診断試薬として有用である。この抗体は、キット形態において単独で、または免疫アッセイのための標準的な試薬とともに供給され得る。
【００６１】
本発明の別の実施態様において、本発明のポリサッカリドまたはオリゴサッカリドに対して指向された抗体は、別の個体に対して宿主個体からの受動免疫を付与するため（すなわち、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌または酵母に対する個体の免疫応答を増強するため、あるいはＡＩＤＳ患者を含む免疫減弱化したかまたは免疫涸渇した個体における応答を提供するため）に、治療的適用または予防的適用において薬学的調製物として使用され得る。抗体の受動移動は、当該分野で公知であり、そして公知の方法のいずれかによって達成され得る。１つの方法に従って、本発明のその結合体に対して指向された抗体は、免疫適合宿主（「ドナー」）動物において生成され、その宿主動物から採取され、そしてレシピエント個体へと輸注される。例えば、ヒトドナーを使用して本発明のポリサッカリド−タンパク質結合体に対して反応性の抗体を生成し得る。次いで、この抗体を、治療的にまたは予防的に有効な量で、処置を必要とするヒトレシピエントへと投与し得、それによって、そのポリサッカリド成分によって惹起される抗体に結合されている細菌に対して、そのレシピエントにおいて耐性を付与し得る。（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｍ．およびＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，「Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第７版、（Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｐ．ａｎｄ　Ｔｅｒｒ，Ａ．Ｔ．編，Ａｐｐｌｅｔｏｎ　＆　Ｌａｎｇｅ　１９９１）５８章「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」を参照のこと）。
【００６２】
特定の場合において、本発明とともに用いられるポリサッカリドは、他の病原性生物と交叉反応性である抗体を誘導し得、従って、これらの他の細菌による感染から防禦する能力を有し得る。
【００６３】
（Ｆ．診断キット）
別の実施態様において、本発明のＣＰＳまたはその誘導体もしくはフラグメントは、細菌、酵母または癌細胞に対する抗体の存在を示すための診断キットにおいて提供され得る。このような抗体の存在は、病原体に対する以前の曝露を示し得、そして感染に抵抗性であり得る個体を予測し得る。この診断キットは、少なくとも１つの本発明のＣＰＳまたはその誘導体もしくはフラグメント（単独またはタンパク質と結合体化されている）、および改変されたＣＰＳまたは誘導体もしくはフラグメントが、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母または癌細胞もしくは癌組織に対する抗体を含有するサンプルと混合された場合に、抗体反応を検出するための適切な試薬を含み得る。抗体反応は、当該分野で記載される任意の方法により同定され得、これらの方法としては、ＥＬＩＳＡアッセイが含まれるが、これらに限定されない。このような知見は重要であり、そして不必要なワクチン接種を回避し得る。
【００６４】
あるいは、この診断キットは、固体支持体または磁性ビーズまたはプラスティックマトリクス、および少なくとも１つの本発明のＣＰＳまたはその誘導体もしくはフラグメントをさらに含み得る。
【００６５】
いくつかの場合において、ＣＰＳまたは誘導体もしくはフラグメントが標識されることは好ましくあり得る。標識因子は、当該分野で周知である。例えば、標識因子としては、放射能、化学発光、生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、発光、または簡便な分析のための他の同定「タグ」が挙げられるが、これらに限定されない。体液または組織サンプル（例えば、血液、血清、唾液）が採取および精製され得、そして診断キットに適用され得る。ＣＰＳ、誘導体またはフラグメントは、精製されてもよいし、精製されなくてもよく、そして分子の混合物（ｃｏｃｋｔａｉｌ）から構成されてもよい。
【００６６】
固体マトリクスは当該分野で公知かつそして利用可能であり、そして試験管、ビーズ、微粒子、ディップスティック（ｄｉｐ−ｓｔｉｃｋ）、プレートなどの形状にあるポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、または任意の固体プラスティック材料が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、マトリクスとしては、メンブレン、９６ウェルマイクロタイタープレート、試験管およびエッペンドルフチューブなどが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、このようなマトリクスは、リガンド結合因子が接着され得る任意の表面か、またはそれ自体がリガンド接着部位を提供する表面を含む。
【００６７】
本明細書中で参照される全ての刊行物、特許および学術文献は、そこに参照することにより、本明細書中に全体として明らかに援用される。以下の実施例は、本発明を例示するために示され、如何様にも本発明の範囲を制限するとは見なされない。非常に多くの変更および置換が、本発明の思想および範囲を逸脱することなく行われ得ることが当業者に認識される。
【００６８】
（実施例１：β−プロピオンアミドに結合したポリサッカリド−タンパク質キャリア結合体の調製）
以下の非限定的な実施例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（１４型）、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＧＢＳ）ＩＩＩ型およびＩＩ型、ならびにＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１に対するワクチンのための、一連の臨床的に関連するポリサッカリド−タンパク質結合体の調製を記載する。本実施例で使用される上記のポリサッカリドの全ては、それらの構造的反復単位の構成成分である、１つ以上のグリコシル残基においてＮ−アセチル基を含むグリコサミノグリカンである。
【００６９】
（Ａ．１４型肺炎双球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）ポリサッカリドの脱重合）
その可溶性を増大させるために、ポリサッカリドを、最初に超音波処理により部分的に脱重合した。２００ｍｇの肺炎双球菌ポリサッカリド１４型（ロット番号２０２０５１０、アメリカンタイプカルチャーコレクション）を、２０ｍｌのＰＢＳに溶解し、そして０℃で４時間、Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　４５０を用いて超音波処理した。得られたポリサッカリドを透析し、そして凍結乾燥し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムを通してサイズ分画した。ピーク画分をプールし、次いで、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）メンブレン　ＭＷＣＯ：３，５００を用いて脱イオン水に対して透析した。収量１５７．５ｍｇの固体を凍結乾燥後に得た。超音波処理したポリサッカリドは、ｍｉｎｉＤＡＷＮ（Ｗｙａｔｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ　Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を備えたＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって測定した場合、約５０，０００の平均分子量を有した。
【００７０】
（Ｂ．１４型肺炎双球菌ポリサッカリドの脱Ｎ−アセチル化）
１００ｍｇのサイズ分画した１４型肺炎双球菌ポリサッカリドを、１０ｍｌの２Ｎ　ＮａＯＨに溶解し、次いで、１０ｍｇのＮａＢＨ４を、この反応混合物に添加した。この混合物を１時間１００℃で加熱し、次いで、室温に冷却した。Ｎ−脱アセチル化成分を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）メンブレン　ＭＷＣＯ：３，５００を用いて脱イオン水に対して透析し、そして凍結乾燥して、８４ｍｇの白色固体を得た。Ｎ−脱アセチル化したポリサッカリドを、Ｈｌ−ＮＭＲにより５００ＭＨｚで分析し、そして５％未満の残余のＮ−アセチル基を含むことを見出した。
【００７１】
（Ｃ．Ｎ−脱アセチル化１４型肺炎双球菌ポリサッカリドのＮ−アクリロイル化）
８４ｍｇのＮ−脱アセチル化１４型肺炎双球菌ポリサッカリドを、４．２ｍｌの脱イオン水に溶解した。この溶液（氷浴中）を、２Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ１０に合わせた。次いで、４２０μｌの１：１　ｖ／ｖ　アクリロイルクロリド：ジオキサンを添加し、そして２Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ１１に合わせた。この反応系をｐＨ１１でさらに１時間放置して、Ｏ−アセチル化の結果として見出され得るエステルを確実に完全に加水分解させた。この溶液を透析し、そして凍結乾燥して、４２ｍｇの乾燥粉末を得た。５００ＭＨｚのＨｌ−ＮＭＲによる分析後、このポリサッカリドは、９５％を超えてＮ−アクリロイル化されたことが見出された。
【００７２】
（Ｄ．１４型Ｎ−アクリロイル化肺炎双球菌ポリサッカリドの破傷風トキソイドモノマーへの結合）
２２ｍｇの１４型Ｎ−アクリロイル化肺炎双球菌ポリサッカリドを、１．１ｍｌの炭酸塩／炭酸水素塩ｐＨ９．５緩衝液に溶解した。破傷風トキソイドモノマー２２ｍｇを、この反応混合物に添加した。この反応混合物を、３７℃で一晩インキュベートした。結合体化の進行を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラムを備えたＢｉｏｌｏｇｉｃシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分析した。ポリサッカリドと破傷風トキソイドとの結合体化は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の測定値によりモニターして、カラムのボイドボリュームに溶出してくるピークが徐々に増加することにより示された。結合体化が終了した後、この溶液を、０．１Ｎ　ＨＣｌでｐＨ７に中和し、次いで、ＰＢＳに対して透析した。この結合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ＰＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１．６×６０ｃｍカラムを通過させることにより精製し、そして０．０１％チメロサール含有ＰＢＳで溶出した。ボイドボリュームピークに対応する画分をプールした。結合体中の糖質およびタンパク質の含量は、Ｄｕｂｏｉｓら（５１）のフェノール硫酸アッセイおよびＢｒａｄｆｏｒｄ（９）のクーマシーアッセイにより予測した。
【００７３】
ＧＢＳ　ＩＩ型、ＩＩＩ型、ならびにＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１および髄膜炎菌Ｃポリサッカリドに関して、同様の方法を使用した。これらのポリサッカリドの各々に対する反応条件を、以下の表に示す。
【００７４】
【表１】
2004505885.tif 000003
【００７５】
【表２】
2004505885.tif 000004
【００７６】
【表３】
2004505885.tif 000005
（Ｆ．Ｋｌポリサッカリドの脱Ｎ−アセチル化）
３００ｍｇのＫ１　ＰＳを、１５ｍＬの２．０Ｎ　ＮａＯＨ溶液に溶解して、それに１５０ｍｇのホウ化水素ナトリウムを添加した。この溶液を１１０℃で６時間加熱し、室温に冷却し、そして２０倍容量の脱イオン水で希釈した。Ａｍｉｃｏｎ　ＹＭ３メンブレンを通して脱イオン水でダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔａｔｉｏｎ）した後、この溶液を凍結乾燥して、２５５ｍｇのＮ−脱アセチル化Ｋ１　ＰＳを得た。５００ＭＨｚのＨｌ−ＮＭＲにより、完全なＮ−脱アセチル化が生じたことを確認した。
【００７７】
（Ｇ．ＫｌポリサッカリドのＮ−アクリロイル化）
２５０ｍｇの脱Ｎ−アセチル化Ｋ１　ＰＳを含む１０ｍＬの脱イオン水溶液（氷浴中で冷却している）に、１ｍＬのアクリロイルクロリドと１ｍＬのジオキサンとを合わせて調製したアクリロイルクロリド（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）溶液を滴下した。この溶液のｐＨを、２Ｎ　水酸化ナトリウム溶液を添加して、７．０〜１０．５の間に維持した。添加終了後、このｐＨを１３に上げ、そして室温で１時間にわたり１２．９〜１３．１に維持した。この溶液のｐＨを、１Ｎ　ＨＣｌを滴下することにより９．５に合わせた。この溶液を、攪拌セル（ｓｔｉｒｃｅｌｌ）中のＡｍｉｃｏｎ　ＹＭ３メンブレンを用いて脱イオン水でダイアフィルトレーションした。その保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を乾燥するまで凍結乾燥し、そして物質（Ｎ−アクリロイルＫ１　ＰＳ）を−２０℃の冷凍庫でデシケーターに入れて保存した。５００ＭＨｚのＨ−ＮＭＲにより、反応の間に、完全にＮ−アクリロイル化が生じたことが示された。
【００７８】
（Ｈ．β−プロピオンアミドに結合したＫ１−ｒＰｏｒＢ結合体（Ｋｌ−ｒＰｏｒＢ　Ｉ））
０．３ｍＬの０．２Ｍ　ホウ酸塩、０．０５％　ＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎＴＭ３，１４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ｐＨ９．５中に８．４ｍｇのＮ−アクリロイルＫｌ　ＰＳおよび４．０ｍｇの組換えＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　ＰｏｒＢを含む溶液を、３７℃で３日間インキュベートした。この結合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００分取グレードカラムを通してサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、そして０．０１％チメロサール含有ＰＢＳで溶出した。このカラムのボイドボリュームに、またはその付近に溶出したｕｖ−２８０ｎｍの活性シグナルの画分をプールし、そして冷蔵庫中で保存した。この結合体を、シアル酸およびタンパク質の含有量について、それぞれ、レゾルシノールアッセイおよびクーマシータンパク質アッセイにより分析した。
【００７９】
（Ｉ．チオール化ｒＰｏｒＢの調製）
０．２５Ｍ　塩化ナトリウムおよび０．０５％ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３−１４を含有するｐＨ８．５の０．２５Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のｒＰｏｒＢ　ポーリン溶液１ｍｌに、０．２ｍｌの０．０５Ｍ　Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート溶液を添加した。この溶液を十分に混合し、そしてＲＴで１時間静置した。この溶液に、同緩衝液中の１Ｍ　ジチオスレイトール溶液を０．０６ｍｌ添加した。この溶液を再び十分に混合し、そしてさらにＲＴで２時間静置した。この溶液を、０．２５Ｍ　塩化ナトリウムおよび０．０５％　ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３−１４を含有する０．２５Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１．３ｍｌで希釈し、そして同緩衝液で予備平衡化しておいたＰｈａｒｍａｃｉａ　ＰＤ−１０脱塩カラムにロードした。このカラムを同緩衝液で溶出し、そして溶出液を回収し、そして５，０００ＲＰＭで１時間にわたりＡｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０濃縮器を用いて濃縮した。この保持物を採取し、そしてタンパク質濃度を決定した。
【００８０】
（Ｈ．Ｎ−アクリロイル化Ｋｌ−Ｓ−ｒＰｏｒＢ結合体（Ｋｌ−Ｓ−ＰｏｒＢ）の調製）
上記の２５ｍｇ／ｍｌ濃度のチオール化ｒＰｏｒＢ溶液０．１７ｍｌに、９ｍｇのＮ−アクリロイル化Ｋ１ポリサッカリドを添加した。この溶液を十分に混合し、そして３７℃のオーブン中で１８時間インキュベートした。この溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、溶出液としてＰＢＳを通過させて精製した。カラムのボイドボリュームで、またはその付近で溶出した、ＵＶ−２８０ｎｍで活性な画分を合わせた。分析により、結合体が２５μｇ／ｍｌのポリサッカリドおよび１８８μｇ／ｍｌのタンパク質を含むことが示された。
【００８１】
（Ｉ．Ｎ−アクリロイル化ＧＣＭＰ−Ｓ−ｒＰｏｒＢ結合体（ＧＣＭＰ−Ｓ−ｒＰｏｒＢ）の調製）
同様に、Ｎ−アクリロイル化ＧＣＭＰ−Ｓ−ｒＰｏｒＢを、Ｎ−アクリロイル化Ｋ１−Ｓ−ｒＰｏｒＢ結合体に関する上記の手順に匹敵する手順で調製し、そして４３μｇ／ｍｌのポリサッカリドおよび２００μｇ／ｍｌのタンパク質を含むことを見出した。
【００８２】
【表４】
2004505885.tif 000006
（実施例２）
（β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質キャリア結合体の免疫原性および有効性）
（マウスにおけるこの結合体の前臨床評価）
イムノアッセイ：各ポリサッカリド結合体に対する血清抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡアッセイのために使用するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）結合体を、還元的アミノ化によって調製した。酸化ポリサッカリドをＨＳＡに添加し、続いてＮａＣＮＢＨ３を用いて還元的アミノ化を行った。この結合体を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって単離し、そして−７０℃で凍結乾燥して保存した。ＰＳ特異的抗体力価を、以下のようにＥＬＩＳＡによって決定した。ポリスチレンの９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ　Ｐｏｌｙｓｏｒｂ）（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、０．２５μｇ／ウェル（１００μＬ／ウェル）において３７℃で１時間インキュベートすることにより、ＰＢＳ（０．０１Ｍ　リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中のＰＳ−ＨＳＡ結合体を用いてコーティングし、続いてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ中の０．０５％　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した（５回）。続く全てのインキュベーションを、室温で実施した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを、全ての必要な洗浄のために使用した。次いで、コーティングしたプレートを、ＩｇＧ　ＥＬＩＳＡについてＰＢＳ−ＢＳＡ（ＰＢＳ中の０．５％　ｗ／ｖ　ウシ血清アルブミン）、またはＩｇＭ　ＥＬＩＳＡについて０．１％　ｗ／ｖ　カーネーション脱脂粉乳を用いて、０．１５ｍＬ／ウェルで１時間ブロックし、続いて洗浄した。血清を２倍に希釈して、１００μＬ／ウェルでプレート中に二連にし、そして１時間インキュベートし、続いて洗浄した。抗体結合体（ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウス（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、１００μＬ／ウェルで添加し、そして３０分間インキュベートし、続いて洗浄した。１：１の色素および基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　ＴＭＢ）、ならびにペルオキシドを、０．０５ｍＬ／ウェルで添加し、そして１０分間インキュベートした。次いで、ペルオキシダーゼ反応を、０．０５ｍＬ／ウェルで１Ｍ　Ｈ３ＰＯ４を用いて停止させ、そしてこのプレートを、参照波長として６５０ｎｍを使用して、４５０ｎｍの波長でＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｅｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ，ＣＡ）上にロードした。バックグラウンドの吸光度を、血清を含まない数個のコントロールウェルにおいて決定し、そして各プレートについて平均した。各血清希釈物について、平均バックグラウンド吸光度を除算し、次いで二連の血清の吸光度の値を平均した。改変したＳｃａｔｃｈａｒｄプロットを、続くデータ分析のために使用し、ここで、吸光度（ｙ軸）を、吸光度×希釈の逆数（ｘ軸）（ｒｅｆ）に対してプロットした。平衡および抗体過剰を許容する条件下で、各血清希釈系列について直線を得た；この線を、抗体力価の決定のためにｘ軸に対して外插した。以前に決定した抗体力価を有するポジティブコントロール血清を、各プレート上で使用して、全ての血清が標準化されてプレート−プレート間および日−日間の変動を最小化する参照を提供��た。これらのアッセイの結果を、表５、６および７に示す。
【００８３】
オプソニン食菌アッセイ（ＯＰ）：マウス抗血清の、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｂ（ＧＢＳ）およびＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ結合体に対するオプソニン活性を、ヒト前骨髄球性白血病ＨＬ−６０細胞株（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ　２４０）を使用する、インビトロオプソニン食菌殺傷アッセイにおいて試験した。簡潔には、２００ｃｆｕのＧＢＳ　ＩＩＩ型株Ｍ７８１細胞または肺炎球菌性１４型株を、血清抗体と等容量で混合し、そして５％　ＣＯ２インキュベーター中で３５℃にて１５分、振盪下でインキュベートした。９０ｍＭ　ＤＭＦの存在下で５日間培養した仔ウサギ補体およびＨＬ−６０細胞（５×１０５）をこの混合物に添加し、そして３７℃にて１時間、振盪下でインキュベートした。アリコートを、定量培養のために取り出した。力価を、５０％の生細菌に対応する抗体希釈物を外插することによって決定した。これらのアッセイの結果を、肺炎球菌性１４型結合体については表５に、そしてＧＢＳ　ＩＩＩ型結合体については表６に示す。
【００８４】
血清殺菌性アッセイ（ＳＢＡ）：抗体依存性の補体媒介殺菌性活性を、標的化細菌の５０％殺傷を提供する、殺菌性力価、すなわち希釈の逆数によって測定した。全ての血清中の補体を、まず、５６℃で３０分間インキュベートした。次いで、２倍希釈系列を、滅菌した９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート（Ｓｉｇｍａ）中でＧＢＳＳを用いて各血清について樹立し、５０μＬ／ウェルの最終容量を与えた。新生仔ウサギ血清補体（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ，Ｂｒｏｗｎ　Ｄｅｅｒ，ＷＩ）を、作業濃度のＧＢＭ細菌（血清型１５株、４４／７６）またはＣ群髄膜炎菌Ｃ１１参照株で１：１に希釈し、そして５０μＬを、希釈した血清を含有する各ウェルに添加して、１００μＬ／ウェルの最終反応混合容量を与えた。この反応混合物（これは、５０％血清（熱非働化し、そして希釈した）、２５％ウサギ血清補体、および２５％細菌（作業濃度で））を、マイクロタイトレーションプレート振盪器（ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ；ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で速い速度で６０分間、３７℃で５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター中でインキュベートした。
【００８５】
次いで、全てのウェルを、３０μＬ／プレートの拡散によってチョコレート寒天上でプレート化した。時間ゼロの細菌性サンプルもまた、プレートした。全てのプレートを、以前のように、一晩インキュベートした。次いで、コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を、Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）からの自動化コロニーカウンターを用いて計数し、１プレートあたり３つの読み取りの平均を得た。５０％の殺傷を与える、希釈の逆数、すなわち力価を、ｘ軸が対応する希釈の逆数のｌｏｇ１０値を表し、そしてｙ軸が生存の割合を表す場合に解釈されるグラフから直接読み取った。このアッセイの結果を、表７に示す。
【００８６】
【表５】
2004505885.tif 000007
コントロールワクチンは、還元的アミノ化によって調製した１４型ポリサッカリド−破傷風トキソイド結合体であった。Ｐｎ１４−ＴＴ結合体は、Ｎ−アクリロイル化１４型肺炎球菌性ポリサッカリドと破傷風トキソイドとの間の直接的な結合の産物であった。
【００８７】
この研究のために、６〜８週齢の１０ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の群に、２．０μｇの結合体化ポリサッカリドを用いて、０日目、２８日目および３８日目に皮下的に注射した。この動物から、０日目、２８日目および３８日目に採血し、そしてこの動物を５９日目に瀉血した。ＥＬＩＳＡを、還元的アミノ化によって調製したＰｎ１４ポリサッカリド−ＨＳＡ結合体を使用して実施した。表５において報告されるＥＬＩＳＡ力価は、全てのＩｇＧを表す。報告されたＯＰ力価は、肺炎球菌性１４型株に対してである。
【００８８】
【表６】
2004505885.tif 000008
コントロール結合体ワクチンは、過ヨウ素酸塩の酸化ＧＢＳ　ＩＩＩ型ポリサッカリドおよび破傷風トキソイドの還元的アミノ化によって調製したＧＢＳ　ＩＩＩ型−破傷風トキソイド結合体であった。ＧＢＳ　ＩＩＩ−ＴＴ結合体は、Ｎ−アクリロイル化ＩＩＩ型ポリサッカリドと破傷風トキソイドとの間の直接的な結合の産物であった。
【００８９】
この研究のために、６〜８週齢の１０ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の群に、２μｇの結合体化ポリサッカリドを用いて、０日目、２１日目および４２日目に皮下的に注射した。マウスから０日目、２１日目、４２日目に採血し、そしてそのマウスを５２日目に瀉血した。ＥＬＩＳＡ力価を、ヒト血清アルブミンに結合したＧＢＳ　ＩＩＩ型ポリサッカリドを使用して測定し、表６に与えられる力価は、ＩＩＩ型ポリサッカリドに対する全てのＩｇＧを表す。
【００９０】
【表７】
2004505885.tif 000009
コントロールワクチン（Ｋ１−ｒＰｏｒＢ　ＩＩ）は、過ヨウ素酸塩−酸化Ｎ−アクリロイル化Ｋ１ポリサッカリドと破傷風トキソイドとの間の還元的アミノ化の産物であった。Ｋ１−ｒＰｏｒＢ　Ｉワクチンは、Ｎ−アクリロイル化Ｋ１ポリサッカリドおよび破傷風トキソイドの直接的な結合の産物であった。Ｋ１−Ｓ−ｒＰｏｒＢは、チオール化ポーリンｒＰｏｒＢおよびＮ−アクリロイル化Ｋ１ポリサッカリドの直接的な結合の産物であった。
【００９１】
これらの研究のために、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの１０ＣＤ１マウス（４〜６週齢）を、０日目、２８日目および４２日目に腹腔内に免疫した。マウスから０日目、２８日目、４２日目に採血し、次いでそのマウスを５２日目に瀉血した。ＥＬＩＳＡ力価を、ヒト血清アルブミンに結合したＮ−プロピオニル化Ｋ１ポリサッカリドを使用して測定した。表７に示される力価は、改変したＮ−プロピオニル化Ｋ１ポリサッカリドに対する全てのＩｇＧを表す。５２日目の採血についての、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ群Ｂ血清型１５Ｈ４４／７６株に対する血清殺菌性活性（ＳＢＡ）もまた、表７に示す。
【００９２】
【表８】
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ＧＣＭＰ−Ｓ−ｒＰｏｒＢは、Ｎ−アクリロイル化Ｃ群髄膜炎菌性ポリサッカリド（ＧＣＭＰ）とチオール化ｒＰｏｒＢとの間の直接的な結合の産物であった。これらの動物の研究のために、ＨＳＤからの１０匹の異系交配Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒ雌性マウス（６〜８週齢）の群に、０日目および２８日目に用量あたり２μｇの結合体化ポリサッカリドをｓ．ｃ．注射した。動物を、３８日目に瀉血した。Ｃ群ポリサッカリドに対するＥＬＩＳＡ力価を、ヒト血清アルブミンに結合したＧＣＭＰを使用して測定した。血清殺菌性力価を、髄膜炎菌性Ｃ１１参照株を使用して得る。
【００９３】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、免疫原性β−プロピオンアミド連結ポリサッカリド−タンパク質結合体を作製する方法の概略である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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