(57)【要約】少なくとも１つのＦｃレセプターリガンドと少なくとも１つの免疫抑制因子を含む免疫調節剤、及びその製造並びに使用方法を提供する。免疫調節剤は、ポリペプチドまたはキメラ抗体の形態であってもよく、Ｔ細胞レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを含む免疫抑制因子を組み込んでいることが好ましい。本発明の化合物及び組成物は、アレルギー、移植組織拒絶反応、及び自己免疫性糖尿病、リウマチ様関節炎並びに多発性硬化症を含む自己免疫疾患のような免疫疾患に関連する症状を治療するために、選択的に免疫系を抑制するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患に関連する抗原に結合する免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物であって、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することができる組成物。
【請求項２】
前記組成物がさらに薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がアジュバントを含まない、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫グロブリンが多価型である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫グロブリンが基質中に包埋または吸着されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫グロブリンが凝集している、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原が疾患に関連する抗原を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗原が、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原がプロテオリピドタンパク質由来の抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原がミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンまたはその一部が免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンが、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原が、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原がＣＤＲ３内に位置している、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンがキメラである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
自己免疫疾患に関連する症状を改善する方法であって、前記方法が、前記自己免疫疾患に係わる抗原と結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を得ることを含み、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することができ、並びに前記組成物を前記自己免疫疾患に罹患している個体に投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記組成物がさらに薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物がアジュバントを含まない、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記免疫グロブリンが凝集している、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗原が疾患に関連する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原が、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原がプロテオリピドタンパク質由来の抗原である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原がミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリンまたはその一部が免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンが、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原が、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの範囲内に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原がＣＤＲ３内に位置している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫グロブリンがキメラである、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、ＩＬ−１０レベルを増加する必要性のある個体を識別すること、並びに抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することによって前記個体のＩＬ−１０レベルを増加することを含み、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することができる方法。
【請求項３４】
前記個体が自己免疫疾患に罹患している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物がさらに薬学的に許容可能な担体を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物がアジュバントを含まない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫グロブリンが凝集している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫グロブリンが脂質またはポリマー基質上に固定化されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗原が、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗原がプロテオリピドタンパク質由来の抗原である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗原がミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫グロブリンまたはその一部が免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫グロブリンが、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗原が、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗原がＣＤＲ３内に位置している、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
前記免疫グロブリンがキメラである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、ＩＬ−１０レベルを増加する必要性及び末梢性寛容を刺激する必要性のある個体を識別すること、並びに抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することによって前記個体のＩＬ−１０レベルを増加し且つ末梢性寛容を刺激することを含み、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することができる方法。
【請求項５０】
前記抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記個体が自己免疫疾患に罹患している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物がさらに薬学的に許容可能な担体を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物がアジュバントを含まない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫グロブリンが凝集している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫グロブリンが脂質またはポリマー基質上に固定化されている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗原が、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗原がプロテオリピドタンパク質由来の抗原である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗原がミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫グロブリンまたはその一部が免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫グロブリンが、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗原が、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗原がＣＤＲ３内に位置している、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ分子である、請求項４９に記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫グロブリンがキメラである、請求項４９に記載の方法。
【請求項６５】
個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、ＩＦＮγレベルを低下させる必要性のある個体を識別し、並びに抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することによって前記個体のＩＦＮγレベルを低下させることを含み、前記組成物が抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することができる方法。
【請求項６６】
前記抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
複数の自己抗原に対する免疫応答に起因する自己免疫疾患の症状を軽減する方法であって、前記方法が、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することを含み、前記組成物が、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することができ、並びに前記抗原が前記自己免疫疾患の原因となる抗原の一つである方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、概して、免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって効果的に提示するための化合物、組成物及び方法に関する。さらに詳細には、本発明は、限定はされないが、自己免疫疾患を含む種々の疾患の治療に有用な免疫抑制因子を含む化合物、方法及び組成物に関する。好ましい実施態様では、前記免疫抑制因子はＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。本発明の他の実施態様によって新生児または乳児における寛容の誘導がもたらされる。さらなる実施態様は、免疫グロブリンまたはその一部が抗原提示細胞の細胞表面に存在するＦｃレセプターと架橋することができる、抗原と結合する免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を提供する。他の実施態様は、ＩＬ−１０レベルを、それを必要とする個体において増加する方法に関する。さらに他の実施態様は、末梢性寛容及び／またはバイスタンダーによる抑制を、それを必要とする個体において刺激する方法に関する。他の実施態様は、ＩＦＮγレベルを、それを必要とする個体において減少する方法に関する。さらなる実施態様において、本発明は、同時刺激性分子を欠如するか、あるいはそのレベルが低下している抗原提示細胞による自己抗原提示を促進する組成物を提供する。
【０００２】
［発明の背景］
脊椎動物は、環境由来の病原体、及び、例えば内部的に発生する腫瘍細胞のような、異常細胞に対する防御として免疫応答を生じさせる能力を有している。免疫応答は多様な細胞と因子との間の複雑な相互作用の結果であるが、一般的には２つの主要な様相を含んでいる。１つは、細胞性成分であって、この場合には特別の細胞が（抗原を有する）有害作用物質を直接攻撃し、もう１つは体液性成分であって、この場合には抗体分子が抗原に特異的に結合してその排除を助長する。協同して働くと、それぞれの要素は侵入病原体の初期攻撃を制限して、それら病原体を宿主から排除するのに極めて有効である。
【０００３】
免疫応答の提供に関与する主要な細胞はリンパ球であり、リンパ球は一般的に２つの主要なクラスを含む。Ｂ細胞またはＢリンパ球と命名されるこれらクラスの第一のものは、典型的には骨髄で産生され、そして中でも、抗体の産生及び分泌に関与している。Ｂ細胞抗体産物は外来抗原と直接反応して、これらを中和するか、あるいは免疫系のその他の成分を活性化して、抗原を排除する傾向がある。特に、オプソニン化抗体は細胞外の外来因子と結合し、それによって食作用（ファゴサイトーシス）並びに後続する細胞内殺作用を受けやすくなる。他方、Ｔ細胞またはＴリンパ球は、一般的には胸腺で発生あるいは成熟し、細胞性免疫応答の媒介に関与している。これらの細胞は抗原全体を認識するのではなく、その代わりに、標的細胞の表面に出現する特定のタンパク質に結合した抗原の短いペプチドフラグメントに応答する。さらに詳細には、細胞内で産生されるか、または細胞によって細胞外環境から取り込まれたタンパク質は正常な代謝経路によってペプチドまで連続的に分解されると思われる。その結果生じる短いフラグメントは細胞内の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と会合して、このＭＨＣ−ペプチド複合体は細胞表面に輸送されてＴ細胞によって認識される。従って、細胞免疫系は細胞が産生または摂取した全てのタンパク質を常に監視しており、外来抗原または腫瘍抗原を提示している全ての細胞、即ちウイルス感染細胞またはガン細胞、を排除するために構えている。
【０００４】
哺乳類抗体のうちで最も一般的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の一般的構造を図１に概略的に示す。図示されるように、ＩｇＧは２本の同一の重（Ｈ）鎖と２本の同一の免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖を含む四量体タンパク質複合体である。これらの鎖はジスルフィド結合で結合されて、Ｙ字状抗体複合体を形成する。しかしながら、溶液中ではこの分子はより球状の形態をとり、生体体液中に存在する外来抗原と容易に結合する。
【０００５】
免疫グロブリンのアミノ酸配列分析によって、種々の機能活性を有する特異的な領域が鎖内に特定されている。各Ｌ鎖及び各Ｈ鎖は、最初の１１０個のアミノ末端残基内に特定された可変領域（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）を有する。ＶＬ及びＶＨ領域の三次元的対合は、免疫グロブリン分子の抗原認識部分あるいは「抗原結合部位」（「ＡＣＳ」）を構成する。免疫グロブリンは四量体であるため、１分子当たり２個の同一の抗原結合部位が存在している。これらの鎖の可変ドメインは配列が高度に不均一であるので、極めて多様な抗原構造に対して高度に特異的な抗原結合部位の多様性が生じる。可変ドメインの不均一性は可変領域全体に均等に分布しているのではなくて、３つのセグメントに位置しており、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と命名されている。 これらの構造に関するさらなる情報については、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ（遺伝子の分子生物学）、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ、 １９８７ （本明細書に参照により編入されている）を参照のこと。
【０００６】
各Ｈ鎖はまた、特別のイソタイプを特定する定常領域も含んでおり、これによって免疫グロブリンは免疫グロブリンクラス及びサブクラスの１つに割り当てられる。定常領域は、単一クラスの抗体間で顕著には変動しないドメインと呼ばれる単位（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２等）を含んでいる。定常領域は抗原結合に関与せず、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面のＦｃレセプターとの結合並びに補体タンパク質との結合のような「エフェクター機能」として公知のいくつかの生物学的活性に関連する可能性がある。樹状細胞及びマクロファージのような抗原提示細胞は、なかでも、Ｆｃレセプターの存在という特徴によって一般に識別される。従って、抗体が病原体と結合する場合には、抗体は食細胞とＦｃ部分を介して結合することができる。これは食細胞によって病原体が摂取および破壊されることを可能とし、このプロセスはオプソニン化として公知である。さらに、以下で詳細に考察するように、種々の病原性抗原はＡＰＣによってプロセシング且つディスプレイされて免疫応答をさらに刺激すると思われる。
【０００７】
Ｈ鎖とは異なり、Ｌ鎖は単一の定常ドメイン（ＣＬ）を有している。Ｌ鎖は、Ｈ定常領域ＣＨ１をＣＬに結合するジスルフィド結合によってＨ鎖と対合する。 さらに、Ｈ鎖は定常領域ＣＨ１及びＣＨ２を分子の残り部分から分離するヒンジ領域を有している。四量体の可動性（フレキシビリティ）に大いに寄与しているのはこのヒンジ領域である。分子の２本のＨ鎖はヒンジ領域とＣＨ２間の結合部でジスルフィド結合によって対合する。
【０００８】
このような広範なレパートリーを提供するために、免疫グロブリン遺伝子は有限数の遺伝子から莫大な数の異なる免疫グロブリンタンパク質の産生が可能になるように（即ち遺伝的多型性）進化している。 遺伝的多型性の故に、哺乳動物は見たところは無限に多様な抗原に対して抗体を産生することができる。免疫グロブリン遺伝学及びタンパク質構造の総説については、Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ ＩＩＩ（遺伝子ＩＩＩ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９８７、並びにＢｅｎｊａｍｉｎｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学）、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９８８（これらは本明細書に参照により編入されている）を参照のこと。
【０００９】
この２、３年の間に、その多様性及び特異性の故に、抗体は診断や治療の用途に極めて重要になってきている。科学的用途における抗体の多様性や利用可能性を発展させるために、分子生物学技術がますます使用されるようになっている。例えば、単一の抗体産生Ｂ細胞を腫瘍細胞との融合によって不死化させて、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）として公知の単一の特異性を有する抗体のインビトロの源を提供するように増殖することができる。このような不死化Ｂ細胞系は「ハイブリドーマ」と称されている。
【００１０】
最近まで、ほとんどのｍＡｂの源はインビトロで培養されたマウスハイブリドーマであった。すなわち、マウスは典型的には選択された抗原または免疫原の注射を受ける。その後、動物を屠殺し、その脾臓から取り出した細胞を不死化骨髄腫細胞と融合させた。これらは診断方法で広範に使用されているが、マウスｍＡｂがヒトを含む大部分の哺乳動物での治療適用に好適であるとは証明されていない。これは、一部には、マウス抗体が他の哺乳類種によって外来性として認識され、そして疾病または望ましくない副作用を起因し得る免疫応答を誘発するという事実に拠る。
【００１１】
外来性ｍＡｂによって生じる免疫応答並びに適切なヒトｍＡｂが無いという問題のうちの少なくともいくつかを克服するために、遺伝子工学を使用して、マウス抗体の抗原結合相補性決定領域は含有しているが分子の残り部分は外来性と認識されないヒト抗体配列から成るヒト化キメラ免疫グロブリン分子が構築されてきた。そのような抗体は、マウス可変領域が腫瘍抗原を認識し、さらに分子のヒト化部分が、身体によって迅速に排除されることなく免疫応答を媒介することが可能であるために、腫瘍の治療に使用されている。例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５、１９８６年を参照のこと（本明細書に参照により編入されている）。
【００１２】
そのような抗体の他の用途は、同時係属中の米国特許出願第０８／３６３，２７６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ ９４／１４８４７号に詳記されている（これらもまた本明細書に参照により編入している）。これらの場合には、ウイルスまたは細菌エピトープのような外来抗原のエピトープが免疫グロブリンの超可変領域に移植されて応答を誘導する。すなわち、工学操作された抗体はワクチンとして使用されて免疫応答を誘発し、そして長期間の抗原性記憶を与え、それによって対象はその後の感染を退けることができる。
【００１３】
これらのワクチン及びより伝統的なワクチンは、免疫系の両枝を刺激する点で効果的である。免疫応答の体液性成分に関連した複雑な作用にも係わらず、体液成分のみでは毎日曝されている無数の病原体攻撃から動物を効果的に保護することはできないであろう。むしろ、高等生物の生存及び増殖を可能にするのは高度に進化した細胞応答の存在のみである。
【００１４】
前記に示したように、骨髄内の前駆体から生じるＴリンパ球またはＴ細胞が、侵入ウイルス並びにその他の微生物に対する免疫応答における主役である。前駆幹細胞は胸腺に移動し、そこで、所謂胸腺細胞として特異化される。特に、これらは後に成熟Ｔ細胞による感染の検出を可能にするレセプター分子をディスプレイし始める。有益であるためには、Ｔ細胞はそのレセプターを介して微生物抗原（侵入物の存在をシグナル伝達するタンパク質マーカー）に付着可能でなければならない。同時に、自己反応性Ｔ細胞は正常組織を破壊する可能性があるので、それらは身体によって生成される物質に対して遮蔽されていなければならない。典型的には、有用なレセプターを作成する胸腺細胞のみが完全に成熟して血流に入って、身体をパトロールする。効果のない、あるいは身体自体の組織を攻撃するその他の細胞は、健常な個体では、胸腺を離れる前にアポトーシスによって排除される。
【００１５】
細胞溶解性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞のどちらかとして最終的に循環に入る成熟Ｔ細胞は、そのレセプターが認識し得る抗原に遭遇しない限り、静止状態にある。前記リンパ球が親和性を有する特異的抗原に遭遇すると、リンパ球は増殖して、エフェクター機能を果たし、その結果外来抗原が排除される。
【００１６】
Ｔ細胞は、これらが果たす異なるタスクに基づいていくつかの亜集団に分類されている。これらの亜集団には、Ｔ及びＢ細胞応答の促進または増強に必要なヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）、細胞溶解によって標的細胞を直接殺傷する細胞毒性（または細胞溶解性）Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及び免疫応答をダウンレギュレートするサプレッサーＴ細胞（Ｔｓ）が含まれる。各々の場合に、Ｔ細胞は、抗原が抗原提示細胞表面に付着した特殊なタンパク質複合体によって細胞表面に提示されたときのみに、抗原を認識する。さらに詳細には、Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と集合的に称されるタンパク質群と会合した抗原を認識し得る膜貫通タンパク質複合体である、Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）と称する特異的なレセプターを使用する。数千もの同一のＴＣＲが各細胞に発現される。ＴＣＲは、機能と構造の両面について、Ｂ細胞が抗原レセプターとして使用する表面抗体（非分泌性）と関連する。さらに、Ｔ細胞の異なる亜集団もまた多様な細胞表面タンパク質を発現し、これらのうちのいくつかは特定の亜集団に特徴的であるため、「マーカータンパク質」と称される。例えば、ほとんどのＴｈ細胞は細胞表面にＣＤ４タンパク質を発現するが、ほとんどのＣＴＬ及びＴｓ細胞は細胞表面にＣＤ８タンパク質を発現する。これらの表面タンパク質は、ＡＰＣ表面にある特定のタンパク質またはタンパク質複合体の認識及びこれらタンパク質間の相互作用に依存する免疫応答の開始及び維持に重要である。
【００１７】
かなり長い間、主要組織適合遺伝子複合体、すなわちＭＨＣは実際に、明白な四次構造を含む一連のグリコシル化タンパク質を含むことが公知である。一般的には、この構造は以下の２つのタイプから成る：細胞内部で生成されるタンパク質由来のペプチド（ウイルス複製後に産生されるタンパク質等）をディスプレイしているクラスＩ ＭＨＣ、及び一般的に外部から細胞に入ったタンパク質由来のペプチド（細菌トキシンのような可溶性抗原）をディスプレイしているクラスＩＩ ＭＨＣ。種々の抗原の認識は、生じ得る微生物ペプチドのいずれをも結合することが可能な多様なＭＨＣ分子プールを連続的に生じる遺伝的多型性によって保証される。本質的に、全ての有核細胞は、天然ペプチド、腫瘍関連ペプチド、あるいはウイルス侵入物によって産生されたペプチドを呈示することができるクラスＩ ＭＨＣを産生且つ発現する。それとは逆に、一般的に抗原提示細胞として公知である、２、３の特定のリンパ系細胞のみが、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質を産生且つ発現する。細胞型に関わらず、ＭＨＣの両クラスはペプチドを細胞表面に運搬し、これらを静止Ｔリンパ球に提示する。通常、Ｔｈ細胞はクラスＩＩ ＭＨＣ−抗原複合体を認識し、一方ＣＴＬはクラスＩ ＭＨＣ−抗原複合体を認識する傾向がある。
【００１８】
適切なＴＣＲを有する静止Ｔ細胞が、ペプチドをその表面にディスプレイしているＡＰＣに遭遇すると、ＴＣＲはペプチド−ＭＨＣ複合体と結合する。さらに詳細には、数百ものＴＣＲが多数のペプチド−ＭＨＣ複合体と結合する。十分なＴＣＲが接触すると、累積効果がＴ細胞を活性化する。ＭＨＣ−抗原複合体の特異的認識、及びこれに対する応答の原因となるＴ細胞上のレセプターは、いくつかの不可欠な血漿膜タンパク質の複合体で構成されている。先に考察したＭＨＣ複合体と同様に、多様なＴＣＲプールは、体細胞の再配置を誘導する遺伝的多型性によって保証される。ＴＣＲのプールは多様であるが、それぞれ個々のＴ細胞は単一の特異的ＴＣＲのみを発現するということが強調されるべきである。しかしながら、各Ｔ細胞は典型的には、各細胞表面にある１個のペプチドにのみ特異的なこのレセプターのコピーを数千個も呈示する。その上に、他のいくつかのタイプの膜関連タンパク質がＴ細胞結合及び活性化に関与している。
【００１９】
Ｔ細胞の活性化は一連の化学的シグナル（主として、サイトカイン）の産生を伴い、その結果細胞は直接作用するかまたは免疫系の他の細胞を刺激して作用させる。クラスＩ ＭＨＣ−抗原活性化の場合には、ＣＴＬは増殖し、同一の抗原を提示している感染細胞を破壊するように作用する。感染細胞の殺傷はウイルスから生命維持を奪って抗体へのアクセスを可能として、最終的にウイルスを排除する。対照的に、クラスＩＩ ＭＨＣ−抗原複合体によるＴｈ細胞の活性化は、（宿主の防御系の一部である）抗原提示細胞を破壊するのではなくて、むしろＴｈ細胞を刺激して増殖させ、そして種々の細胞に影響を与えるシグナル（再び主としてサイトカイン）を産生させる。特に、シグナル伝達は、Ｂ細胞の刺激、マクロファージの活性化、ＣＴＬの分化、並びに炎症の促進を誘導する。この協同した応答は比較的特異的であり、そしてクラスＩＩ ＭＨＣ系によって提示されるペプチドを有する外来性エレメントに向けられる。
【００２０】
正しく機能するとき、免疫応答は、微細病原体、そして程度はより低いが、新生細胞の排除に驚くほど有効である。一般的に、自己認識の複雑なメカニズムは極めて効率的であり、外来抗原に限ってのみ強い応答を起こすことが可能である。残念なことに、免疫系はしばしば機能不全を起こし、宿主の細胞に向かい、それによって自己免疫応答を誘発する。典型的には、自己免疫は、免疫細胞上の抗原レセプターが健常細胞上の特定の抗原を認識すると自己免疫が生じ、そのような特定の物質を有する細胞の死滅を起こすと考えられる。多くの場合に、自己免疫反応はこの反応を促す抗原がなくなると消失する点で、自己限定的である。しかしながら、ある場合は、自己反応性リンパ球は本来あるべき状態よりも長く生存して、アポトーシスを誘導するか、さもなければ正常細胞を排除し続ける。動物及びヒトにおいて、自己反応性細胞の生存の延長が少なくとも２つの慢性自己免疫疾患、即ち全身性エリテマトーデス及びリウマチ様関節炎、に関与していることを示すいくつかの証拠がある。
【００２１】
他の作用メカニズムも種々の自己免疫疾患発症の原因であると考えられる。例えば、この数年間に、Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用のアビディティーが自己抗原に対する胸腺の学習と寛容を指令することが明らかになってきた。従って、アビディティー相互作用が高いとＴ細胞が排除されるが、アビディティー相互作用が低いと成熟及び胸腺からの退出が可能になる。このメカニズムは自己反応性の免疫系を除去するのに有効であるが、自己抗原が隔離されたり、有効レベルの胸腺提示値を達成しないか、胸腺の潜在性の影響を受けるか、または殆ど提示されない場合、自己反応性を有するＴ細胞前駆体は依然として産生されて末梢まで移動することができる。さらに、特定のＴ細胞レセプターと反応し得る超抗原、並びに抗原擬態、エピトープの拡散、またはペプチド潜在性よる末梢解放を刺激し得るイベントはそれらの自己反応性Ｔ細胞の活性化をトリガして、抗原暴露を起こす可能性がある。いずれの場合にも、自己抗原の連続的供給及びＴ細胞レセプターリガンド（ペプチド−ＭＨＣ複合体）の豊富な産生がＴ細胞攻撃力のメカニズムであるらしい。自己寛容のこのような自然発生的崩壊の例には、多発性硬化症（ＭＳ）、リウマチ様関節炎（多分、複数のメカニズム）及びＩ型糖尿病が含まれ、その全てがＴ細胞介在性自己免疫疾患であると考えられている。
【００２２】
いずれのメカニズムが免疫系の崩壊に寄与するかに関わりなく、その結果は個体にとって破滅的であり得る。例えば、多発性硬化症は米国において約２５０，０００人に影響を与えている慢性の炎症性疾患である。この炎症プロセスは始めは中枢神経系の白質内で生じ、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージによって媒介され、軸索の脱髄の原因となる。臨床的な経過は正に多様であるが、最も一般的な形態は麻痺、感覚欠損及び視覚障害を含む神経欠損の再発によって示される。
【００２３】
免疫細胞が中枢神経系の白質に拡散すると、免疫応答はミエリン上のいくつかの異なる抗原に対して標的化される。例えば、髄液中に出現する膜攻撃複合体によって補体カスケードを活性化するミエリンに向けられる重大な抗体応答が存在する。さらに、Ｔ細胞は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及びプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）上に提示されているような種々のミエリン抗原の一定の重要部分に対して標的化される。Ｔ細胞は次々にサイトカインを産生し、次にマクロファージが影響を受けてミエリンを攻撃し、ミエリン鞘の大きなチャンクを貧食する。協同的な攻撃によって脱髄部分が生じ、これによって軸索に沿った健全な伝達機能が障害されて、病態生理学的欠陥が生じる。多発性硬化症におけるミエリン鞘または原発性胆汁性肝硬変におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のような超分子構造のいくつかの成分に対する複数の免疫応答は、別々の臓器に関わる自己免疫疾患に罹患している個体に共通している。
【００２４】
自己免疫疾患の治療法は種々のレベルで成功している。例えば、代謝制御によって臓器特異性自己免疫疾患を矯正することがしばしば可能である。機能を喪失して回復し得ない場合、機械的代用品または組織移植片が適当であることがある。しかしながら、ＭＳを含むほとんどの不能障害のいくつかには有効な治療法がない。 コルチコステロイド及び修飾β−インターフェロンを含むいくつかの化合物は、ＭＳの症状のあるものを軽減し得るが、重篤な副作用を有することが実証されているか、あるいは長期間の使用には望ましくないことが示されている。その他の治療法が有望であることが示されているが、有効性は未だ示されていない。
【００２５】
この点に関して、ＭＳの１つの有望な治療法はＷＯ ９６／１６０８６（本明細書に参照により編入している）に記載されており、これはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のペプチド類似体の使用について開示している。これらの類似体を含む組成物は、過度の副作用を有することなくＭＳの症状を改善できることが報告されている。さらに、ミエリン構築タンパク質のペプチド類似体の使用は、ＭＳモデルとしてのマウスでしばしば使用される臓器特異性免疫疾患である、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の症状の治療に有効であることが示されている。 詳細には、プロテオリピド（ＰＬＰ）ペプチド由来のペプチド類似体によって、ＥＡＥの回復が達成された（Ｋｕｃｈｒｏｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３３２６〜３３３６、１９９４、本明細書に参照より編入している）。天然ＰＬＰペプチド内の主要ＴＣＲ接触残基を変異させたとき、結果として生じるペプチド類似体は、天然ペプチドと同様に、ＭＨＣに結合するがＰＬＰ特異的Ｔ細胞を活性化しないことが示された。その代わり、ＰＬＰ類似体はＴ細胞のインビトロ活性化を阻害する。
【００２６】
ペプチド類似体は、攻撃的なＴ細胞のエフェクター機能を調節し、自己免疫疾患を改善する魅力的なアプローチを代表するが、いくつかの問題がこれらペプチド類似体の有効性を制限する。例えば、典型的なＡＰＣの表面では数個のＭＨＣ−ペプチド複合体しか利用が可能ではなく、これはＴ細胞を活性化するために単一複合体が約２００個のＴＣＲを連続的にトリガしなければならないことを意味する。自己抗原がＭＨＣ系による正常なプロセシング及び提示用に連続的に利用できる場合、前記ペプチド類似体との結合には極めて少数の表面ＭＨＣ複合体しか利用できないように思われる。さらに、遊離ペプチドは典型的に半減期が非常に短く、ＭＨＣ−抗原提示系によって容易に取り込まれたりプロセシングされたりしないので、天然ではＡＰＣ上に殆ど発現されない。提示が非効率的であるため、各Ｔ細胞上にある数千ものＴＣＲと直接に結合するためには、細胞内において法外に高レベルの遊離ペプチドを必要とすると思われる。細胞表面ＭＨＣ分子の代謝も細胞外環境で形成された複合体の存在時間が短い一因である（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ分子は細胞外ペプチドと結合する前にかなりの期間細胞表面に存在している）が、エンドサイトーシス用コンパートメントで形成された複合体は細胞表面に位置を移されたばかりなので、通常の期間残留する。結局、先に言及したように、そのような合成エピトープまたは類似体の投与は哺乳類体内におけるペプチドの半減期が短いことからしても、非常に問題が多い。ＭＨＣ複合体と投与されたペプチドの短い半減期の間では、十分な免疫応答の誘導を可能にするには有効な暴露が短すぎて、さらに高用量を必要とする。
【００２７】
従って、本発明の一般的な目的は、免疫疾患を治療するために脊椎動物の免疫系を効果的に修飾するための方法と関連組成物を提供することである。
【００２８】
本発明の他の目的は、細胞免疫応答の調節を必要としている対象の細胞免疫応答を調節するために、Ｔ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを効果的に提示するための方法と組成物を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、種々の免疫疾患の治療及び改善のための方法と組成物を提供することである。
【００３０】
本発明のさらに他の目的は、新生児または乳児におけるＴ細胞寛容の誘導のための方法及び組成物を提供することである。
【００３１】
本発明のさらに他の目的は、多発性硬化症を含む自己免疫疾患に関連する病理学的症状の軽減を提供することである。
【００３２】
［発明の概要］
これら及びその他の目的は、広範な見地からすれば、Ｆｃレセプターが媒介する、エンドサイトーシス送達系を提供する本発明の方法並びに関連化合物及び組成物によって達成される。選択された実施態様では、本発明は免疫抑制因子の効果的な提示を提供し、好ましい実施態様では、前記因子はＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み得る。その他の好ましい実施態様は、１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子を組み込んでいる。即ち、本発明は一般的に、脊椎動物において免疫応答を選択的に修飾するための免疫抑制因子を提示する方法、化合物及び組成物を提供する。特に好ましい実施態様では、本発明は、特定の抗原に対して生じる免疫応答を調節するために、１つまたはそれ以上の選択されたＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストのＦｃレセプター介在性のエンドサイトーシスによる提示を提供する。当業者によって認められるように、開示された方法及び組成物を使用して、脊椎動物の免疫応答に関連する任意の生理学的異常を治療することができる。例えば、免疫系の選択された成分を抑制するこの能力は、中でも、自己免疫疾患の治療、組織または臓器移植の容易化、並びにアレルゲンによって生じた症状の緩和を可能にすると思われる。また、本発明はさらに、新生児及び乳児において自己抗原に関する寛容の誘導を提供する。
【００３３】
本発明の好ましい局面では、選択された免疫抑制因子のエンドサイトーシスによる提示は、抗原提示細胞のＦｃレセプター（ＦｃＲ）と結合することのできる免疫調節剤の使用によって容易になる。典型的には、前記免疫調節剤はＦｃレセプターと結合し得る少なくとも１つのリガンドと会合した少なくとも１つの免疫抑制因子を含む。免疫調節剤は抗原提示細胞（ＡＰＣ）と結合すると、ＡＰＣの天然エンドサイトーシス経路によって細胞内に取り込まれそしてプロセシングされる。好ましくは、自己抗原性ポリペプチドまたはＴ細胞レセプターアンタゴニスト又はアゴニストの一部またはそれ自体であり得る免疫抑制因子は細胞内に取り込まれた後、新たに合成された内因性ＭＨＣクラスＩＩ構造体と会合してＡＰＣ表面に提示される。当業者は、免疫抑制因子（特にアンタゴニスト）は、ＭＨＣクラスＩＩ構造体と結合したときＴ細胞レセプターと複合体を形成するが、Ｔ細胞の活性化は促進しないことを認めるであろう。同様に、同時刺激性分子が存在しない場合、自己抗原性ポリペプチドまたは直接投与されたＴＣＲアゴニストのＡＰＣによる提示が寛容の誘導を導くことが認められるであろう。従って、適切なＴＣＲアンタゴニストまたはアゴニストがＦｃＲ介在によって効率良く提示されると（ここで、アゴニストは自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントに由来し得る）、既に感作されたＴ細胞（即ち、特定の自己抗原に感作された細胞）が活性化され、天然自己抗原が正常に提示されているにもかかわらず、免疫応答をトリガすることを防御できる。
【００３４】
広義には、本発明の免疫調節剤は、抗原提示細胞のＦｃレセプターと結合して細胞内に取り込まれることができる任意のリガンド（ＦｃＲリガンド）を含み得る。即ち、ＦｃＲリガンドは、任意の抗原提示細胞の表面のＦｃレセプターと効果的に結合する任意のタンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチドまたは分子であり得る。ＦｃＲリガンドは、免疫グロブリン分子の定常領域の少なくともある部分を含むか、あるいは模擬しており、対象内で抗原応答を誘発しないことが好ましい。本発明の選択された局面では、ＦｃＲリガンドはＩｇＧ分子の定常領域の一部または全部を含んでいる。特に好ましい実施態様では、治療を受ける種に由来する選択された免疫グロブリン分子の全定常領域を含むＦｃＲリガンドが使用される。勿論、Ｆｃレセプターとの結合はまた、単一定常領域ドメインの小フラグメントまたは非アミノ酸分子を含むリガンドによって影響されることがあることも認められよう。いずれにしても、ＦｃＲリガンドは、定方向進化、組み合わせ化学、またはラショナルドラッグデザインのような近代的製薬技術を用いて得ることができる。
【００３５】
先に言及したように、本発明の化合物は、免疫調節剤を供給するためにＦｃＲリガンドと会合した免疫抑制因子をさらに含む。本発明の目的では、免疫抑制因子はＡＰＣによってプロセシングされ、細胞表面のクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合して提示され得る任意の分子であり得る。前述するように、本発明の選択された実施態様は、Ｆｃ介在性取り込みを介して効果的な提示を行うために、少なくとも１個のＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストをＦｃＲリガンドと会合させること含む。特に好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、所望するＴＣＲアゴニストを供給するためにプロセシング（即ち、消化あるいはタンパク質分解）し得る、１つまたはそれ以上の選択された自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む。好ましくは、自己抗原性ポリペプチド（複数でもよい）、またはそのフラグメントは、エンドサイトーシスによるプロセシング中のタンパク質分解から生じる、１つ以上のペプチドアゴニスト（即ち、１つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド）を供給する。適切な同時刺激性分子が存在しない場合にＡＰＣによってアンタゴニストまたはアゴニストが提示されると、関連する自己抗原に対する免疫応答のダウンレギュレーションを起因する。
【００３６】
特に好ましい実施態様では、本発明はＴ細胞アンタゴニストの全部または一部を含む免疫抑制因子を使用する。本開示の目的では、「アンタゴニスト」の用語は、その通常の意味に従って、別の物質のレセプターと結合し、これをブロックすることによって、その物質の生理学的作用を干渉する任意の物質を含む。さらに詳細には、ＴＣＲアンタゴニストは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子と共同して、Ｔ細胞レセプターと非反応的に会合して、さらにそのＴ細胞レセプターを介して負のシグナル伝達を誘導できる分子的実体である。好ましくは、ＴＣＲアンタゴニストは、正常な活性化抗原アゴニストの類似体であるペプチドまたはタンパク質フラグメントを含む。特に好ましい実施態様では、ＴＣＲアンタゴニストはＴ細胞エピトープの類似体である。
【００３７】
他の好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、提示されるが、結合に際して感作ＴＣＲを活性化しないＴ細胞アゴニストを含むことができる。本発明のこの局面に関して、驚くべきことには、ＦｃＲリガンドを用いて自己抗原アゴニストが効果的に提示されると、免疫系を刺激するよりはむしろ寛容誘導を導き得ることが発見されている。即ち、自己抗原性アゴニストの効率の良いＦｃＲ取り込みは、一般的に同時刺激性分子を欠如するノンプロフェッショナル及び／または非活性化プロフェッショナルＡＰＣによるアゴニストの提示を導くと思われる。先行技術に基づく考えに反して、このタイプの提示は、最終的には自己反応性Ｔ細胞の不活性化、免疫系のダウンレギュレーション、及び任意の関連する自己免疫疾患の改善を誘導する。ＡＰＣの活性化または同時刺激性分子（即ち、Ｂ−７．１、Ｂ−７．２、ＣＤ４０等）の産生を回避するために、ＴＣＲアゴニスト構築物あるいは自己抗原性ポリペプチド構築物を産生するアゴニストの投与は、好ましくは（生理食塩水のような）アジュバントを欠如する担体を用いて行われる。
【００３８】
本開示の目的では、「アゴニスト」の用語は通常容認される生化学的意味に従って使用される。この点に関して、Ｔ細胞アゴニストは所望の免疫原性結果を提供する任意の分子であり得るが、選択されるアゴニストは好ましくはペプチド又はタンパク質フラグメントを含むことが認められるであろう。さらに、当業者は、１つまたはそれ以上のＴ細胞レセプターアゴニストを含む免疫調節剤は、１つまたはそれ以上のＴ細胞レセプターアンタゴニストを含む免疫調節剤と組み合わせて、患者の免疫応答を選択的に軽減するために使用できる医薬製剤を提供することができることを認めるであろう。
【００３９】
本発明のこの局面に関して、最終的に提示されたＴＣＲアゴニストは１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドの全部または一部を含む免疫抑制因子に由来し得る。即ち、本発明の構築物は、１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントと会合するＦｃＲリガンドを含むことが好ましい。典型的には、組み込まれた自己抗原性ポリペプチド（複数でもよい）またはフラグメントは、野生型アミノ酸配列を含み、ＦｃＲ介在による取り込み後にプロセシング（即ちタンパク質分解）されたときに、プロフェッショナルまたはノンプロフェッショナルＡＰＣによる提示に対する１つまたはそれ以上のＴＣＲアゴニストを供給する。本発明に従うそのような構築物の投与は、エピトープの拡散を伴う障害を克服するために使用できるために特に好都合である。さらに詳細には、自己免疫が自己抗原上にある複数のエピトープに関連する場合、対応する（自己抗原全体を含む免疫抑制因子由来の）アゴニストのそれぞれの提示は、目的のエピトープ全てについて寛容を誘導する。同様にして、複数のアゴニストの提示は、別々の個体が特定の自己抗原の別々のエピトープに対して自己反応性を生じるような集団に投与される場合に有効であると証明されるであろう。
【００４０】
例として、本発明の構築物は、天然ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または天然プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）に共有結合するＩｇＧ分子の全Ｆｃ領域を含む融合またはキメラタンパク質の形状をとり得る。他の実施態様では、本発明と適合性のある融合タンパク質は、共有結合されたＰＬＰ及びＭＢＰの天然型（即ち、ＩｇＧＦｃ−ＭＢＰ−ＰＬＰ）を含む免疫抑制因子に共有結合するＩｇＧのＦｃ領域を含むことができる。そのような構築物は、ＦｃＲを介して細胞内に取り込まれ、エンドサイトーシスによるプロセシングを受け（タンパク質分解され、結果生じるアゴニストフラグメントがＭＨＣ複合体と会合する）、そしてＡＰＣの表面上に提示される。構築物の効率の良い取り込みと同時刺激性分子の欠如に基づき、提示されるアゴニストレベルが比較的高い故に、ＦｃＲリガンド／自己抗原構築物の投与は、免疫応答を刺激するというよりはむしろアネルギー（抗原反応不顕性）を誘導する。勿論、天然自己抗原性ポリペプチドの選択されたフラグメントまたは部分を使って、適合性のある免疫抑制因子を作成することができる。当業者は、そのような融合またはキメラタンパク質は、近代の分子生物学技術を用いて容易に構築し得ることを認めるであろう。
【００４１】
開示する化合物及び関連方法では、ＦｃＲリガンドは免疫抑制因子と会合して免疫調節剤を形成するため、実質的に同時に両方ともＡＰＣによって細胞内に取り込まれる。先に言及したように、本会合は、抗体−抗原複合体のように互いに結合する２個またはそれ以上の分子の形状をとるか、または、好ましい実施態様では、免疫抑制因子（即ち、１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはＴＣＲアンタゴニストまたはアゴニスト）及びＦｃＲリガンドの両方を組み込む単一の融合またはキメラ分子の形成を含むことがある。例えば、選択されたＴＣＲアンタゴニストは、タンパク質分解技術によって産生されたＦｃＲリガンド領域（即ち、Ｆｃフラグメント）に化学的に結合されてもよい。その他の実施態様は、アンタゴニストまたはアゴニストペプチドに立体的に結合されたＦｃＲリガンドを含む正常免疫グロブリンを含み得る。本発明の特に好ましい実施態様は、遺伝子工学技術によって産生されたキメラ免疫グロブリンを含む。これらの化合物においては、ＦｃＲリガンド（そして通常は該分子の大部分）は１つまたはそれ以上の免疫グロブリン定常領域を含んでおり、一方１つまたはそれ以上の可変領域が工学操作されて、１つまたはそれ以上の所望のペプチドＴＣＲアンタゴニストまたはＴＣＲアゴニストを発現する。当業者は、前述の免疫調節剤の任意の組み合わせを会合させて本発明の組成物を形成できるように、別の免疫抑制因子を含む類似の免疫調節剤も同様に形成できることを認めるであろう。さらに、先に考察したように、種々の免疫調節剤の混合物または「カクテル」は、本発明の範囲内に含まれるように特に意図されている。
【００４２】
本発明のある局面では、免疫調節剤は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することが可能な形状であり得る。例えば、免疫調節剤は多価型であり得る。ある実施態様では、免疫調節剤（複数でもよい）は固定化あるいは凝集されて、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することが可能な構築物または構造体を提供することができる。
【００４３】
マクロファージ上にあるＦｃγＲの架橋が抗炎症活性を有することが示されている。（Ｂｅｒｇｅｒ ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ２６：１２９７〜１３０１、１９９６； Ｂｅｒｇｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ２７：２９９４〜３０００、 １９９７； Ｓｕｔｔｅｒｗａｌａ ら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８８：２１７〜２２２、１９９８、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。同様に、凝集は、ＦｃＲの架橋及び補体結合のようなＩｇ　Ｆｃ関連機能を供与する（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ８４：１１２〜１２１、 １９６０； Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔ ら、 Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ２４：４９５〜５０１、 １９８７、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。
【００４４】
ＩＬ−１０またはＩＬ−４がプラズミドまたはウイルスベクターから産生されるＴ細胞またはハイブリドーマ細胞株を、進行性のＥＡＥを罹患する動物に注射すると、疾患の回復を誘導することが示されている（Ｍａｔｈｉｓｅｎ ら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８６：１５９〜１６４、１９９７； Ｓｈａｗら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８５：１７１１〜１７１４、１９９７； Ｍａら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１：１５１６〜１５２４、 １９９８、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。
【００４５】
抗原−抗体複合体への暴露に際してマクロファージによって産生されるＩＬ−１０が、ＩＬ−１２産生に対するアンタゴニスト効果を及ぼすこと、並びにプロ炎症応答を回復することが示されている（Ｓｕｔｔｅｒｗａｌａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８８：２１７〜２２２、 １９９８； Ｂｅｒｇｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２９９４〜３０００、 １９９７、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。
【００４６】
その上、ＩＬ−１０はバイスタンダー抑制を生じ、それによって自己免疫疾患の原因となる種々の抗原に向けられたＴ細胞の活性を阻害することができる（Ｆａｌｃｏｎｅら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８５：９０１〜９０７、 １９９７； Ｓｔｏｈｌｍａｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６３：６３３８〜６３４４、 １９９９、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。バイスタンダー抑制は、ＡＰＣによって産生されたＩＬ−１０による病原性Ｔ細胞のアンタゴニズム（拮抗性）に起因するか、あるいはＩＬ−１０の作用によって生じた制御性Ｔ細胞によるダウンレギュレーションに起因すると提案されている（Ｇｒｏｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ．）、３８９：７３７〜７４２、１９９７、この開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。ＩＬ−１０が、ナイーブＴ細胞をＩＬ−１０、ＩＬ−５、あるいはＴＧＦβを産生できる調節細胞に発生分化させ、抑制を持続することにより病原性Ｔ細胞の機能を阻害することが示唆されている（Ｇｒｏｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ．）、３８９：７３７〜７４２、１９９７；Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 ９３：３８８〜３９１、１９９６； Ａｓｓｅｍａｎら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０：９９５〜１００３、１９９９； Ｇｒｏｕｘら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｔｏｄａｙ、２０：４４２〜４４５、１９９９； Ｓｅｄｄｏｎら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８９：８７７〜８８１、１９９９；Ｓｅｄｄｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、 ２１：９５〜９９、２０００、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。
【００４７】
従って、本発明のある実施態様では、免疫調節剤は、ＩＬ−１０及びＩＬ−６のような抗炎症性サイトカインの産生を誘導且つ／または以下にさらに詳細に記述されるように個体においてＩＦＮγのレベルを減少することができる。凝集免疫調節剤による治療はまた、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−βのようなその他のサイトカインのアップレギュレーションを誘導し得る。
【００４８】
当業者は、所望する凝集または固定化免疫調節剤は、いくつかの公知の技術の任意の一つを用いて製造し得ることを認めるであろう。例えば、本発明の免疫調節剤は、ミクロスフェアまたは微細粒子（例えば、ラテックス、脂質、アルブミン、ＰＶＰ、あるいはメタクリル酸塩微細粒子）と化学的に会合するか、または投与し易いポリマー基質中に固定化することができる。他の実施態様では、免疫調節剤は、化学的または熱力学的に結合または修飾されて、可溶性あるいは不溶性凝集物を形成することができる。さらなる実施態様では、凝集免疫調節剤は、硫酸アンモニウム沈降法のような、沈降法によって調製することができる。これらの凝集物あるいは固定化構築物は次に、薬学的に許容可能な担体を組み合わせて、本明細書の教示に従って投与することができる。
【００４９】
その上、免疫調節剤は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在する同時刺激性分子のレベルを減少して、それによって末梢性寛容を誘導する（Ｆｏｗｌｋｅｓら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：８７３〜８７９、 １９９３； Ａｒｎｏｌｄ ら、 Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、１４：１２〜１４、１９９３；Ｋｏｓａｋａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７７：３６７〜３７８、１９９３；ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０：３７８５〜３７９２、１９９３；Ｒｏｃｈａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｄ．Ｃ．）、 ２５１：１２２５〜１２２８、１９９１；Ｗｅｂｂら、Ｃｅｌｌ．、６３：１２４９〜１２５６、１９９０；Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：３６１〜３６７、１９９３、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。末梢性寛容は、末梢（即ち、自己抗原を標的化するＴ細胞に対する初期選択が起こる胸腺の外部）における自己免疫疾患に関与する抗原の利用性、及び同時刺激性分子が存在しないか、あるいはそのレベルが低下している非活性化抗原提示細胞による末梢での自己抗原の提示に起因する。
【００５０】
さらに詳細には、凝集、固定化または非凝集の可溶性形状のいずれであるにせよ、開示された組成物は、従来の製薬技術および担体を用いて製剤化することができ、通常のルートで投与することができる。特に好ましい実施態様は、アジュバントを含まない製剤または担体の使用を含む。アジュバントを含まない形状での抗原の供給は、ＡＰＣ上の同時刺激性分子の発現を刺激せず、これによってＴ細胞活性化に不適当である抗体提示を起因するらしい（Ｆｏｗｌｋｅｓら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ５：８７３〜８７９、 １９９３；Ｊａｃｏｂｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８２：２９４〜３００、１９９４； Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３７５〜３８１、 １９９５、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。このアプローチは、自己反応性Ｔ細胞を調節し、さらに疾病の回復を促進する（Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、９８：１６０２〜１６１２、１９９６； Ｇａｕｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｄ．Ｃ．）、 ２５８：１４９１〜１４９４、１９９２；Ｌｉｂｌａｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、 １８：５９９〜６０４， １９９７；Ｃｒｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｄ．Ｃ．）、２６３：１１３９〜１１４３、 １９９４；Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３：３８８〜３９１、１９９６； Ｄｅｖａｕｘら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、 ７５：１６９〜１７３、１９９７； Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：５０４〜５１２、１９９８；Ｓｔａｙｋｏｖａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７５：５４〜６４、１９９７、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。従って、当業者は、そのような調剤は、免疫応答を惹起し得る同時刺激性分子の発生を回避するか、あるいは最小限にすることを認めるであろう。
【００５１】
いずれにせよ、免疫調節剤のＦｃＲ介在性取り込みを使用することによって先行技術による組成物に関連した問題の多くが回避される。さらに詳細には、本発明の方法は、先行技術で開示されているような遊離ペプチドアンタゴニストの投与に関連した制限の多くを克服している。従って、ＴＣＲアンタゴニストのような免疫抑制因子のエンドサイトーシスによる効率の良い提示によって相当量のＭＨＣ−アンタゴニストリガンドが産生され、自己反応性抗原の連続的提示に係わる自然発生免疫疾患で産生される天然ＭＨＣ−自己抗原複合体に対抗することができる。同様に、ＦｃＲリガンド−アゴニスト（または自己抗原性ポリペプチド）構築物の効果の良い取り込みと、これに後続する所望するアゴニスト（複数でもよい）の提示は、自己反応性Ｔ細胞にアネルギーを誘導することができる。このため、本発明を使用して免疫抑制因子の提示に応答する任意の免疫疾患を治療することができる。これは、例えば、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎を含むＴ細胞介在性自己免疫疾患に特に当てはまる。同様にして、本発明を使用してアレルゲンのような連続的に提示されるアゴニストに関して免疫系を選択的にダウンレギュレートすることができる。さらに、本発明の化合物や関連組成物を使用して免疫系の種々の成分を選択的に抑制して、移植後の組織または臓器の拒絶反応の可能性を低下させることができる。
【００５２】
前述の利点の他に、驚くべきことには、本発明の化合物、組成物及び方法を使用して新生児及び乳児に種々の自己抗原に対する寛容を誘導できることが見い出された。さらに詳細には、本発明は、成体期における自己免疫疾患の誘導に対して新生児または乳児哺乳類に耐性を与える組成物や方法をさらに提供する。本明細書の教示によれば、この新生児寛容は、二次リンパ系器官における応答の逸脱及び適切な自己抗原のチャレンジに際しての異常なγインターフェロン介在性脾臓アネルギーを特徴としている。前記に考察するように、本発明の好ましい実施態様は、非反応性担体（すなわち、アジュバントを含まないもの）中での投与に際して、所望する新生児寛容の誘導を提供することができる。
【００５３】
本発明のいくつかの局面を以下に要約する。
【００５４】
本発明の一つの実施態様は、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物であり、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部は、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターと架橋することができる。組成物はさらに薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本発明のある局面では、免疫グロブリンは多価型である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは基質中に包埋されているか、あるいは吸着されている。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはＩｇＧ分子である。本実施態様のその他の局面では、抗原は疾患に関連する抗原を含む。本実施態様のその他の局面では、抗原は自己免疫疾患に関連する抗原を含む。例えば、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連し得る。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のその他の局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のさらなる局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。例えば、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はＣＤＲ３内に位置する。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはヒトＩｇＧ分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【００５５】
本発明の他の実施態様は、自己免疫疾患に関連する症状を改善する方法であって、前記方法が、前記自己免疫疾患に係わる抗原と結合する免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を得ることを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部は抗原提示細胞の細胞表面に存在するＦｃレセプターを架橋することができ、さらに前記組成物を前記自己免疫疾患に罹患している個体に投与することを含む。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、抗原は疾患と関連する。本実施態様のある局面では、抗原は自己免疫疾患と関連する。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のその他の局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はＣＤＲ３内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトＩｇＧ分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【００５６】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、ＩＬ−１０レベルを増加する必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより前記個体のＩＬ−１０レベルを増加することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面上に存在するＦｃレセプターを架橋することができる。本実施態様のある局面では、個体は自己免疫疾患に罹患している。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは脂質またはポリマー基質上に固定化されている。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換する。本実施態様のある局面では、抗原はＣＤＲ３内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトＩｇＧ分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【００５７】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法がＩＬ−１０レベルを増加する必要性及び末梢性寛容を刺激する必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより該個体のＩＬ−１０レベルを増加並びに末梢性寛容を刺激することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するＦｃレセプターを架橋することができる。本実施態様のある局面では、個体は自己免疫疾患に罹患している。本実施態様のある局面では、組成物はさらに製剤上に許容可能な担体を含む。本実施態様のある局面において、組成物はアジュバントを含まない。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは凝集している。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは脂質またはポリマー基質上に固定化されている。本実施態様のある局面では、抗原は、多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎から成る群から選択される自己免疫疾患に関連する。本実施態様のある局面では、抗原はプロテオリピドタンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、抗原はミエリン塩基性タンパク質由来の抗原である。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンまたはその一部は、免疫グロブリン分子の定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンは、前記抗原が前記免疫グロブリンまたはその一部に共有結合されている融合タンパク質を含む。本実施態様のある局面では、抗原は、前記免疫グロブリンの相補性決定領域の少なくとも一つの内部に位置し、前記相補性決定領域を部分的あるいは完全に置換していることがある。本実施態様のある局面では、抗原はＣＤＲ３内に位置する。本実施態様のある局面では、免疫グロブリンはヒトＩｇＧ分子である。本実施態様の他の局面では、免疫グロブリンはキメラである。
【００５８】
本発明の他の実施態様は、個体における疾患症状を軽減する方法であって、前記方法が、ＩＦＮγレベルを低下させる必要性のある個体を識別すること、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することにより前記個体のＩＦＮγレベルを低下させることを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するＦｃレセプターを架橋することができる。
【００５９】
本発明の他の実施態様は、複数の自己抗原に対する免疫応答に起因する自己免疫疾患の症状を軽減する方法であって、前記方法が、抗原に結合した免疫グロブリンまたはその一部を含む組成物を投与することを含み、ここで前記免疫グロブリンまたはその一部が、抗原提示細胞の細胞表面に存在するＦｃレセプターを架橋することができ、さらに前記抗原が前記自己免疫疾患の原因となる抗原の一つである。
【００６０】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、本発明の以下に詳記した好ましい実施態様の説明を、簡単に記載されている図面と共に考慮することによって、当業者には明白であろう。
【００６１】
［好ましい実施態様の詳細な説明］
本発明は多数の異なる形態で実施することができるが、本明細書では本発明の原理を例示する具体的な実施例を開示する。本発明は例示した特定の実施態様に限定されないことを強調すべきである。
【００６２】
先に言及したように、本発明はＦｃレセプター介在性エンドサイトーシス送達系を用いて脊椎動物の免疫応答を選択的に修飾する化合物、組成物及び方法を提供する。本質的に、免疫系をダウンレギュレートするためにこの細胞取り込み形態を利用できる免疫調節剤はいずれも本発明の一部を構成すると考えられる。中でも、本発明の免疫調節剤はキメラまたは融合ポリペプチド、抗原−抗体複合体、キメラ抗体または非ペプチド性免疫活性化合物を含むことができる。好ましい実施態様では、本明細書に開示した免疫調節化合物は少なくとも１つのＦｃＲリガンドと、エンドサイトーシスによる提示に際して免疫応答をダウンレギュレートし得る少なくとも１つの免疫抑制因子を含む。本発明の特に好ましい実施態様は、免疫抑制因子が、エンドサイトーシスによるプロセシング及び提示後に、感作Ｔ細胞表面のレセプターとは結合し得るが免疫原性応答を生じさせることができない、１以上のＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストである免疫調節剤を含む。このような実施態様では、提示された免疫抑制因子は、関連する感作Ｔ細胞の活性化を防止して、生じる応答を低下させる。この免疫系の選択的抑制は、中でも、Ｔ細胞介在性自己免疫疾患を含む免疫疾患、アレルギー及び移植手術における組織拒絶反応に関連した症状を治療するために使用することができる。
【００６３】
従って、一つの実施態様では、本発明は脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための免疫調節剤を含み、前記免疫調節剤は少なくとも１つのＦｃレセプターリガンドと少なくとも１つの免疫抑制因子とを含む。好ましい実施態様では、免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部分に相当するＦｃレセプターリガンドが含まれており、一方免疫抑制因子は少なくとも１つのＴ細胞レセプターアンタゴニストに相当する。他の好ましい実施態様は、Ｔ細胞レセプターアゴニストを含む免疫抑制因子が組み入れられている。さらに、前記に詳細に考察したように、免疫抑制因子は１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを含むことができ、従って、エンドサイトーシスによるプロセシング及び提示の際に１つまたはそれ以上のＴＣＲアゴニストを生じる。特に好ましい実施態様では、免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【００６４】
選択した免疫調節剤のＦｃＲ介在性取り込みを利用することによって、本発明は身体自体の代謝経路を非常に巧妙に利用して有害な免疫応答をダウンレギュレートする。さらに詳細には、本発明は、Ｔ細胞が他の細胞の表面に付着すると外来抗原を認識且つ応答するという事実を利用している。本明細書の教示に従って適当な免疫調節剤（複数でもよい）を選択すると、投与された化合物の効率的な取り込みが生じる。ＦｃＲ介在性取り込み後に、抗原提示細胞の天然エンドサイトーシス経路によって、選択された免疫抑制因子はＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成し効果的に提示される。
【００６５】
前記のように、ある細胞をクラスＩＩ ＭＨＣ制限ヘルパーＴ細胞リンパ球用の抗原提示細胞として機能させることができる２つの必須の特性は、エンドサイトーシスを受けた抗原をプロセシングできること及びクラスＩＩ ＭＨＣ遺伝子産物の発現である。プロフェッショナル及びノンプロフェッショナルＡＰＣを含むほとんどの細胞は、タンパク質抗原をエンドサイトーシスし、且つプロセシングできると思われる。従って、プロフェッショナルＡＰＣに関しては、決定因子はクラスＩＩ ＭＨＣ分子の発現であると考えられる。この点に関して、ヘルパーＴリンパ球について最も的確に特定された抗原提示細胞には、単核食細胞、Ｂリンパ球、樹状細胞、皮膚のランゲルハンス細胞が含まれ、そしていくつかの哺乳動物においては、内皮細胞が含まれる。勿論、別々の細胞が別々の領域で集中し、Ｔ細胞介在性免疫応答の異なる段階に関与し得ることが認められよう。
【００６６】
いずれにしても、本明細書で使用する際は、「プロフェッショナル抗原提示細胞」または「プロフェッショナルＡＰＣ」とは、Ｔ細胞介在性免疫応答を誘導し、高レベルの同時刺激性分子を発現し得る任意の細胞を意味すると考えるべきである。反対に、ノンプロフェッショナルＡＰＣは典型的には高レベルの同時刺激性分子を発現しない。本発明の目的には、両型の細胞が、選択された免疫抑制因子を提示し、そして免疫系をダウンレギュレートするために利用できることが認識されよう。これについては、選択されたＦｃＲリガンドは、多様な細胞型に見られるいくつかの異なるＦｃレセプターのいずれかと相互作用して、免疫調節剤のエンドサイトーシスを促進し得る。単なる例として、利用可能である選択されたヒトＦｃレセプターにはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢサブファミリーが含まれる。
【００６７】
さらに一般的には、本発明に従って、当業者は、ＦｃＲ複合体と結合してエンドサイトーシスを開始し得るリガンドはいずれも本発明に適合し、さらに開示された免疫調節剤に組み入れることができることが認められよう。従って、ＦｃＲリガンドは、限定はしないが、ペプチド、タンパク質、タンパク質誘導体、またはアミノ酸を組み込むかあるいは組み込まない小分子的実体を含むことができる。例えば、リコンビナントケミストリーまたはラショナルドラッグデザインのような近代生化学技術を用いて誘導される小分子は、必須のＡＰＣ取り込みを提供する限りにおいて使用することができる。
【００６８】
適合性のある分子はいずれのタイプでも使用できることを強調しなけれはならないが、本発明のＦｃＲリガンドは１つまたはそれ以上のペプチドを含んでいることが好ましい。さらに好ましくは、ＦｃＲリガンドは免疫グロブリンの定常領域のドメインの少なくとも一部分を含んでいる。特に好ましい実施態様では、ＦｃＲリガンドは、免疫グロブリン分子の定常領域由来のドメインを１つまたはそれ以上含んでいる。当業者は、必要に応じて、種々の免疫グロブリンのイソタイプ及びアロタイプを使用できることを認めるであろう。例えば、適合性のあるＦｃＲリガンドはＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＭの定常領域に見られるアミノ酸配列に相当するものから選択することができる。中でも、ＦｃＲリガンドとして使用される特定のイソタイプの選択は、結合係数のような生化学的特性または治療対象となる種において免疫反応性が低いことに基づいて属性を断定できる。同様に、単一ドメイン、そのフラグメント、または複数ドメインの選択は生化学的因子、あるいは最終的には、提示効率に基づいて決定することができる。
【００６９】
前記のように、本発明の免疫調節剤はさらに免疫抑制因子を含む。本発明の範囲によれば、免疫抑制因子は、エンドサイトーシスによってプロセシングされてＡＰＣ表面に提示されるとき、免疫系をダウンレギュレートする任意の化合物であり得る。このため、免疫抑制因子は小分子、ペプチド、タンパク質フラグメント、タンパク質誘導体、ポリペプチドまたはそれらの組み合わせを含み得る。好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、ＡＰＣ表面に提示されるとき、同様に提示されたアゴニストと選択されたレセプターとの結合に干渉するという点で、アンタゴニストとして作用する。特に好ましい実施態様では、免疫抑制因子は、免疫応答を活性化しないでＴ細胞レセプターと会合するＴ細胞レセプターアンタゴニストを含む。本発明のその他の実施態様が、対象の自己抗原に対する免疫応答を低下させるＴ細胞レセプターアゴニストを組み入れている免疫調節剤を含むことが認められるであろう。これらの実施態様に関しては、天然自己抗原性ポリペプチドのＦｃ介在性提示を使って、エンドサイトーシスによる提示を介して所望するＴ細胞レセプターアゴニストを提供できることが認められよう。即ち、ＦｃＲリガンドと会合する天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントの投与は、本明細書の教示に従って１つまたはそれ以上のＴ細胞レセプターアゴニストの効率の良い提示を起因する。
【００７０】
本発明による免疫抑制因子として任意の機能的に適合性のある分子を使用できるが、当業者は、開示された化合物及び方法における用途にはタンパク質（ポリペプチド）、タンパク質フラグメントまたはペプチドが特に適していることを認めるであろう。そのような分子は正常なエンドサイトーシス経路で容易にプロセシングされて、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子と協同して容易に抗原提示細胞表面に提示される。さらに、望ましくない免疫応答を誘発する化合物の大部分は典型的にはタンパク質フラグメントであるために、Ｔ細胞レセプターは通常、これらがアゴニストでもまたはアンタゴニストであっても、類似するフラグメントに対して最も応答性がある。特に好ましい実施態様では、アンタゴニスト性の免疫抑制因子は、選定されたＴ細胞レセプターと免疫反応性のある選択されたペプチドまたはタンパク質フラグメントの類似体である。
【００７１】
本明細書で使用される、「ペプチド類似体」または「類似体」は、類似体と天然タンパク質フラグメントまたはペプチドとの間のそれぞれの対応する配列に少なくとも１つの異なるアミノ酸を含む。他に示さない限り、指定したアミノ酸はＬ型を言う。天然ペプチド由来のＬ−アミノ酸はタンパク質中に通常見られる２０種のＬアミノ酸のうちの任意の他のもの、対応するＤ−アミノ酸のうちの任意のもの、希少アミノ酸、例えば４−ヒドロキシプロフィン及びヒドロキシリジン、または非タンパク質アミノ酸、例えばβ−アラニン及びホモセリン、に改変することができる。メチル化（例えば、ａ−メチルバリン）、エチルアミン、エタノールアミン及びエチレンジアミンのようなアルキルアミンによるＣ末端アミノ酸のアミド化、並びにアミノ酸側鎖官能基のアシル化またはメチル化（例えば、リジンのイプシロンアミノ基のアシル化）のような化学的手段で改変されたアミノ酸も本発明の範囲内に含まれる。
【００７２】
多発性硬化症（ＭＳ）の治療に効率の良いペプチドアンタゴニストを選択する方法は、本出願で先に参照したＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／１６０８６号に開示されている。開示された方法を本発明と一緒に使用して、開示された免疫調節剤に組み入れる有効な免疫抑制因子を提供することができる。例えば、以下で詳記するアッセイを使用し、ＭＨＣとの競合的結合を測定するアッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイまたは実験的脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導を評価するアッセイによって、候補ペプチド類似体のＭＳ治療能力をスクリーニングすることができる。天然自己反応性ペプチドの結合を阻害し、天然ペプチド反応性細胞系の増殖を刺激せず、そして公知の自己抗原によるＥＡＥ（ＭＳの実験的モデル）の発生を阻害する類似体は治療法に有用である。当業者は、類似するタイプのアッセイを使用して、他の天然ペプチド（即ち、連続的に提示される自己抗原）及び他の免疫疾患用の免疫抑制因子をスクリーニングできることを認めるであろう。特に好ましい実施態様では、選択された免疫抑制因子はＴ細胞エピトープの類似体を含む。
【００７３】
さらに一般的には、多様な免疫反応性の作因を有する多数の疾病について、不必要に過度の実験を行うことなく免疫抑制因子（アゴニストまたはアンタゴニスト）を得ることができる。例えば、多発性硬化症を治療するために、ペプチド類似体アンタゴニストまたはアゴニストをプロテオリピドタンパタ質またはミエリン塩基性タンパク質上のＴ細胞エピトープについて産生させることができる。他方、天然ポリペプチド（即ち、ＭＢＰまたはＰＬＰ）またはその組み合わせをＦｃＲリガンドと会合させて投与することにより、所望する免疫抑制効果を供与することができる。同様に、原発性胆汁性肝硬変を治療するために、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、あるいは同一タンパク質のＴ細胞エピトープから誘導されたＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当する天然ポリペプチドまたはそのフラグメントを使用することができる。どちらの例も、天然または誘導免疫抑制因子は本明細書に記載したように免疫調節剤に組み込まれて、これを必要とする患者に投与される。（天然自己抗原の投与に起因するアゴニストを含む）免疫抑制因子が効果的に提示されると、天然ペプチドによる自己反応性Ｔ細胞の刺激が選択的に減少され、それによって対象の免疫疾患の症状が緩和される。
【００７４】
共に免疫調節剤を構成している選択された免疫抑制因子とＦｃＲリガンドは、多数の形態のうちの任意の１つで効果的に投与することができる。さらに詳細には、前記のように、本発明の免疫調節剤は、免疫応答を選択的抑制することにおいて機能的に有効である任意の形態のそれぞれの要素を組み合わせることができる。例えば、免疫調節剤は、当業者に公知である分子生物学を用いて産生された組換え（または融合）ポリペプチドまたはタンパク質を含むことができる。そのような場合には、ＦｃＲリガンドは単一の免疫グロブリン定常領域ドメインの１つのフラグメントまたは、好ましくは、定常領域全体を含み得る。他の実施態様では、免疫調節剤は、抗原がＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストあるいは天然自己抗原を含んでいる、立体的に結合した抗体−抗原複合体を含むことかできる。他の好ましい実施態様は、免疫抑制因子がＦａｂフラグメント上に発現されているキメラ抗体を含む免疫調節剤を特徴としている。さらに他の実施態様では、免疫調節剤は、有効なＦｃＲリガンドと免疫抑制因子をそれぞれ含む２個の共有結合された分子を含むことができる。
【００７５】
本発明の特に好ましい実施態様では、単一の融合ポリペプチドを含む免疫調節剤をコードする組換えヌクレオチド構築物が使用される。当業者は、標準的な遺伝子工学技術によって少なくとも１つのＦｃＲリガンドと少なくとも１つの免疫抑制因子を含む融合タンパタ質またはキメラが提供され得ることを認めるであろう。本明細書で使用するとき、「キメラ」または「キメラの」の用語は、１つ以上の源からの配列フラグメントを含む任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含するように最も広範な意味で使用される。例えば、ペプチドＴＣＲアンタゴニストとＩｇＧ分子からの単一のＦｃドメインを組み入れている遺伝子工学操作によるポリペプチドは、正確にはキメラまたは融合タンパク質と称される。同様に、キメラ抗体は、異種ペプチド免疫抑制因子を組み入れるように工学操作された組換えＨ鎖及び野生型Ｌ鎖を含むことができる。本発明の目的では、前記の本質的に相違する領域は異なる種に由来する必要はない。即ち、キメラ抗体はヒトＬ及びＨ鎖並びにＣＤＲで発現されている工学操作されたヒトＴＣＲアンタゴニストを含むことができる。逆に、キメラ免疫調節剤はヒトとマウスのような異なる種に由来するＦｃＲリガンドと免疫抑制因子を含むことができる。
【００７６】
このため、本発明の１つの局面は、Ｆｃレセプターリガンドに相当する少なくとも１つのヌクレオチド配列及び免疫抑制因子に相当する少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子を含む。好ましくは、免疫抑制因子は、１つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当し、Ｆｃレセプターリガンドは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一つに相当する。特に好ましい実施態様では、ポリヌクレオチド分子は、相補性決定領域が少なくとも一部欠失しておりＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当するヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリンＨ鎖に相当するヌクレオチド配列をコードしている。免疫抑制因子の混合物を含む組成物もまた本明細書の教示に従って効果的に使用することができる。
【００７７】
いずれにしても、当該分野で公知の技術を使用して、所望の免疫調節剤を含むＤＮＡ構築物を原核または真核細胞内で発現させることができる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２（本明細書に参照により編入）参照のこと。好ましい実施態様では、工学操作されたプラスミドは不死化細胞系内にトランスフェクトされて、前記細胞が所望の産物を分泌する。当該分野で公知であるように、そのように工学操作された生物は選択された免疫調節剤を比較的高いレベルで産生するように修飾することができる。他方、工学操作された分子は大腸菌のような原核細胞内で発現させることができる。いずれの産生源を使用しようと、分画、クロマトグラフィーまたはその他の精製方法のような通常の生化学方法と従来の製剤化技術を用いて、産物を分離し次いで送達可能な組成物に製剤化することができる。
【００７８】
従って、本発明のもう１つの局面は、脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための免疫調節剤を製造する方法を含み、この方法は、
ａ．適切な宿主細胞を、少なくとも１つのＦｃレセプターリガンド及び少なくとも１つの免疫抑制因子を含むホリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド分子で形質転換またはトランスフェクトすること、
ｂ．形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記細胞が組換えポリヌクレオチド分子を発現して、免疫調節剤の少なくとも一部分を含む前記ポリペプチドを産生させる条件下で培養すること、 並びに
ｃ．前記免疫調節剤を回収すること、から成る工程を含む。
【００７９】
同様に、本発明のもう１つの局面は、ポリペプチドであって、少なくとも１つのＦｃレセプターリガンドと少なくとも１つの免疫抑制因子を含むポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子を含むトランスフェクトまたは形質転換された細胞を含む。
【００８０】
前記の局面のどちらにおいても、好ましくは、免疫抑制因子は、１つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストに相当し、Ｆｃレセプターリガンドは好ましくは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一部を含む。さらに好ましくは、免疫調節剤は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）がＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストで置換されている、ポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【００８１】
本発明のキメラ抗体、ポリペプチド及びその他の構築物は単独でまたは医薬組成物として投与できることがさらに認められよう。端的には、本発明の医薬組成物は、本明細書で記載した１つまたはそれ以上の免疫調節剤を１つまたはそれ以上の医薬的にまたは生理学的に許容性のある担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、中性の緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等のような緩衝液、グルコース、マンノース、ショ糖またはデキストランのような炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡのようなキレート剤又はグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）及び保存剤を含むことができる。その上、前述のように、好ましい実施態様は、同時刺激性分子を誘導可能なアジュバントを含まない医薬的に許容性のある担体を含む。しかし、本発明の医薬組成物は、例えばサイトカイン様Ｂ−インターフェロンのような１つまたはそれ以上の追加活性成分を含有することもできる。
【００８２】
この点に関して、本発明のさらなる局面は、脊椎動物の抗原提示細胞の表面に免疫抑制因子をエンドサイトーシスによって提示するための医薬組成物を含み、前記組成物は少なくとも１つの免疫調節剤と医薬的に許容性のある担体とを含んでおり、前記の少なくとも１つの免疫調節剤は少なくとも１つのＦｃレセプターリガンドと少なくとも１つの免疫抑制因子とを含む。同様に、本発明は免疫疾患を治療する医薬組成物の製造方法を含み、前記方法は少なくとも１つのＦｃレセプターリガンドと少なくとも１つの免疫抑制因子とを含む少なくとも１つの免疫調節剤を生理学的に許容性のある担体または希釈剤と組み合わせることを含む。これらの局面のどちらにおいても、免疫抑制因子は、１つまたはそれ以上の天然自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み、且つ前記Ｆｃレセプターリガンドは免疫グロブリンの定常領域ドメインの少なくとも一部を含むことができる。好ましくは、前記免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体の形態である。
【００８３】
前述するように、キメラ抗体を含む免疫調節剤は本発明の特に好ましい局面である。そのような抗体は、典型的にはペプチドＴＣＲアンタゴニストまたはアゴニストである免疫抑制因子を、１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部分と置換することによって形成することができる。以下の実施例でさらに詳細に記載されるように、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を工学操作して少なくとも１つのＣＤＲの全部または一部を自己抗原の全部または一部であるペプチドまたはペプチド類似体で置換することができる。適当な細胞系で発現されると、組換えＨ鎖は野生型Ｌ鎖と複合体を形成して、２つの免疫抑制因子をディスプレイする免疫反応性四量体を形成することができる。当業者は、有害な免疫応答（即ち、ヒトの抗マウス応答）の発生を最小限にするために、免疫グロブリン分子は治療を受ける種から選択できることを認めるであろう。選択した免疫グロブリンの定常領域は本質的に修飾されていないため、この形態の免疫調節剤は容易にエンドサイトーシスを受けて、関連免疫抑制因子の効果的な提示を可能にする。
【００８４】
他の形態では、本発明の免疫調節剤は、抗原が免疫抑制因子である抗原−抗体複合体を含むことができる。近代免疫学的技術を使用して、好ましくはモノクローナル抗体である所望の抗体を産生且つ精製できることが認められよう。単なる例として、選択されたペプチドアンタゴニスト（即ち、ペプチド自己抗原の類似体）またはアゴニストをマウスに注射して免疫反応性細胞を生じることができ、前記細胞はその後標準的な方法を用いて収集且つ不死化することができる。所望するならば、マウスモノクローナルは従来の組換え方法を使用して「ヒト化」して、患者に有害な免疫応答を誘発しないヒト免疫グロブリン上に小さなマウス可変領域を発現させることができる。いずれにしても、モノクローナル抗体は免疫抑制因子と複合体を形成して所望の免疫調節剤を形成し、その後、前述のように製剤化且つ投与することができる。ＦｃＲリガンドを形成する無傷の定常領域を用いると、ファゴサイトーシスの生起は比較的急速であり、さらに結合した免疫抑制因子の提示の効率が良いはずである。
【００８５】
実施態様は定常領域全体に相当するＦｃレセプターリガンドを含むことができるが、本発明は、投与された免疫調節剤が無傷の免疫グロブリン定常領域を含むことを必要としないことを強調しなければならない。むしろ、ＦｃＲと結合してエンドサイトーシスを受けることができる任意のＦｃＲリガンドを、選択した免疫抑制因子と組み合わせて使用することができる。詳細には、定常領域の単一ドメインまたはそれらのフラグメントをペプチドアンタゴニストと組み合わせて、本明細書の教示に従って免疫系を抑制し得る単量体ポリペプチド（単一アミノ酸鎖を有する）を形成することができる。最小量の有効なＦｃＲリガンド及び／または免疫抑制因子を有し、はるかに安定であるために送達を促進させ、おそらく生物利用効率を高めることができるような融合タンパク質を構築することができる。さらに、これらの工学操作したポリペプチドまたはタンパク質は、異種の全抗体を投与するときに見られるような免疫応答を誘発することなく、長期間投与することができると思われる。このため、比較的小さなキメラポリペプチドが有効な免疫調節剤であることが証明されるであろう。
【００８６】
同様に、非ペプチド分子実体は、効率の良いＦｃＲリガンド、免疫抑制因子、または組み合わせることにより免疫調節剤であることが証明されるであろう。当業者は、選択された役割（即ち、ＦｃＲリガンド）で有効に機能する分子実体（ペプチド性または非ペプチド性）が、リコンビナントケミストリー、定方向進化、ラショナルドラッグデザインのような現行の方法を用いて提供できることを認めるであろう。例えば、ラショナルドラッグデザインを使用して、既に解明されているＦｃレセプターと有効に結合する非ペプチド小分子実体を作ることが可能であり得る。次いで、誘導されたＦｃＲリガンドをペプチドアンタゴニストのような免疫抑制因子と共有結合させ（またはそうでない場合、可逆的に会合させ）て、特別な安定性または他の望ましい形質を示す免疫調節剤を提供することができる。
【００８７】
既述のように、本発明の免疫調節剤または融合タンパク質は固定化あるいは凝集されて、Ｆｃレセプターの架橋に便利な構築物または構造体を生じたり、及び／またはＩＬ−１０及びＩＬ−６のような抗炎症性サイトカインの産生を誘導することができる。凝集または固定化構築物が完全形態であることは重要ではなく、本発明との関連においては開示された免疫調節剤の任意の形態も包含される。この点に関しては、凝集または固定化構築物は可溶性または不溶性であり、さらに専ら薬剤から構成され、あるいは薬剤と会合する担体、基質、構造体または微粒子を含むことができる。例えば、開示された薬剤は、任意の生物学的適合性のある物質を含む微細粒子担体と会合または複合体形成するか、あるいは比較的持続性の長い脂質またはポリマー基質中に包埋または吸着することができる。当業者には、多数の商業的に利用可能な構造体及び生物学的構築物を会合する関連方法があることが認められるであろう。そのため、代表的な微細粒子担体は、タンパク質、多糖類、脂質、または合成及び天然ポリマーを含むことができる。
【００８８】
特に好ましい実施態様では、複合体化された薬剤は、当該分野に公知の技術を用いて凝集される。その他の方法では、凝集物は、熱、化学的架橋または、硫酸アンモニウム沈降法のような沈降を用いて形成することができる。生成される凝集物は、可溶性、不溶性、あるいはその混合物であり得る。そのβプリーツシート構造のために、免疫グロブリンの変性は、分子内というよりはむしろ分子間相互作用に有利な疎水基を露出することはさらに認められるであろう。これらの分子間相互作用が凝集を促進する。例えば、免疫グロブリン（即ち、免疫調節剤）を６３℃で１５分加熱すると、免疫複合体に類似する多数の生物学的特性を有する可溶性凝集物の形成を導出する。そのような凝集物または構築物は、所望する免疫応答をそれを必要とする患者において提供するために特に有効である。
【００８９】
特定の理論によって制限されることは望まないが、凝集または固定化することによって免疫調節剤はオプソニン化抗原を模擬することができると思われる。典型的には、標的細胞は、オプソニン化粒子を効率良く消化して、生物学的応答修飾因子を分泌して、適切に炎症応答を増強あるいはダウンレギュレートする。凝集または固定化薬剤の場合、構築物は、初期感染に対する炎症応答が鎮静される免疫応答後期を模擬するように作用すると思われる。即ち、凝集または固定化免疫調節剤は、免疫活性細胞を「ごまかして」、感染因子が排除され、従って保護的免疫応答がもはや必要ではないと考えさせる。さらに詳細には、活性化されたＡＰＣは、活性Ｔ細胞をダウンレギュレートするＩＬ−１０及びＩＬ−６のような生物学的応答修飾因子を分泌する。本明細書に説明するように、ＩＬ−１０産生は、自己免疫疾患に関連する複数のＴ細胞特異的エピトープの活性を阻害し（即ち、ＩＬ−１０はバイスタンダー抑制を供与する）、さらに自己免疫疾患の症状を改善する。その上、免疫調節剤は、投与される対象においてＩＦＮγレベルを低下させることができる。本発明と関連する場合、そのような生物学的応答修飾因子の分泌は、対象の自己免疫疾患の原因である自己反応性Ｔ細胞をダウンレギュレートするために作用する。
【００９０】
前記のように、本発明の組成物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２発生経路に関与するサイトカインを含む生物学的応答修飾因子の誘導を提供し、さらにＡＰＣとして機能できる細胞によって産生されることが公知である。この点では、Ｔｈ１／Ｔｈ２発生に関与すると思われるサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１０を含む。単球によって産生され、ＩＬ−４合成を誘導すると思われるＩＬ−６は、Ｔｈ２　Ｔ細胞の発生に関与する。ＩＬ−１０は単球によって産生され、ＭＨＣクラスＩＩ発現を明らかにダウンレギュレートし、且つ同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害することによって、ＡＰＣ依存性Ｔ細胞活性化を阻害する機能を有する。同時刺激性分子がそのレベルが低下しているか、あるいは存在しないＡＰＣによる抗原の提示は末梢性寛容を刺激する。便利なことには、本発明は、これら及びその他の有利な生物学的応答修飾因子の選択的な刺激を可能にする。
【００９１】
さらに詳細には、以下の実施例ＸＸＶＩＩ及びＸＸＶＩＩＩに説明するように、凝集性免疫調節剤は、ＥＡＥマウスにおいて症状を改善するために使用することができ（実施例ＸＸＶＩＩ）、さらに活性化細胞において選択された生物学的応答修飾因子の産生を誘導できる（実施例ＸＸＶＩＩＩ）。これに関しては、図２５が、凝集性構築物の投与によってＥＡＥマウスにおける疾患の臨床的徴候が劇的に減少することを示す。後の実施例では、マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞を精製し、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートして、ＩＬ−６及びＩＬ―１０の産生について試験した。図２６Ａ及び２６Ｂに示す結果は、マクロファージはＩＬ−６及びＩＬ−１０のどちらも産生するが、樹状細胞はＩＬ−１０のみを産生することを示す。凝集性免疫調節剤で刺激される場合、Ｂ細胞はどちらのサイトカインも産生しないと思われる。
【００９２】
当業者は、ＩＬ−１０が抗増殖性サイトカインであり、その他のサイトカインの産生を阻害することが公知であることを認めるであろう。Ｉｇ−ＰＬＰ１（特に凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１）を結合し、次いでＩＬ−１０を産生するＡＰＣは、少なくとも２つの方法でＴ細胞−ＡＰＣ相互作用を影響できる。第一に、ＩＬ−１０はクラスＩＩ分子の発現及び同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害することはどちらも公知である（Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １５９：４７７２〜４７８０、１９９７； Ｄｉｎｇら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １５１：１２２４〜１２３４、１９９３；Ｗｉｌｌｅｍｓら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：１００７〜１００９、１９９４；Ｍｏｏｒｅら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １９：６８３〜７６５、 ２００１；Ｐｅｇｕｅｔ−Ｎａｖａｒｒｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ２４：８８４〜８９１、１９９４、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。その上、ＩＬ−１０は、Ｔ細胞活性化に必要なサイトカインの合成を阻害することができる。前記例はさらに、処理されたＡＰＣがＴｈ２型細胞の発生を有利にすることが公知のサイトカインであるＩＬ−６を産生できることを示す。免疫調節剤の結合時にＡＰＣによって産生されたＩＬ−６は、Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用を有利に影響して、Ｔ細胞の調節を誘導することができることが認められるに違いない。さらに、ＴＧＦβがＡＰＣによって産生されると、これはまたＴ細胞に対して調節効果を及ぼすことができる。これに関して、凝集性または固定化免疫調節剤は、抗炎症性サイトカイン産生の誘導に特に有効であり得る。
【００９３】
事実、実施例ＸＸＩＸ及びＸＸＸＩＶに示すように、凝集性免疫調節剤はＥＡＥの治療に特に有効である。実施例ＸＸＸ及びＸＸＸＩに示すように、凝集性免疫調節剤はＦｃγＲ１レセプターを架橋することによってＩＬ−１０産生を誘導する。凝集性免疫調節剤はまた、ＩＦＮγレベルを低下させる（実施例ＸＸＸＩＩ）。さらに、ＩＬ−１０は、末梢性寛容と相乗して、自己免疫反応に関与するＴ細胞の活性を低下させる（実施例ＸＸＸＩＩＩ）。実施例ＸＸＸＶに実証されるように、凝集性免疫調節剤への応答において産生されるＩＬ−１０は、マクロファージ上の同時刺激性分子をダウンレギュレートする。凝集免疫グロブリンはまた、バイスタンダー抑制を介して、自己免疫疾患に関与する複数の抗原に特異的なＴ細胞の活性を抑制することができる。（実施例ＸＸＸＶＩ及びＸＸＸＶＩＩ）。
【００９４】
特定の理論によって制限されることは望まないが、固定化または凝集性免疫調節剤はＦｃγレセプターを架橋し、さらにＩＬ−１０の産生を誘導する。ＩＬ−１０はＩＦＮγ産生の低下を誘導する。さらに、ＩＬ−１０はＡＰＣの表面上の同時刺激性分子をダウンレギュレートして、それによって末梢性寛容を誘導する。ＩＬ−１０はまたバイスタンダー抑制を生じ、それによって自己免疫疾患に関与する複数の抗原に対するＴ細胞の活性を低下させる。このことは、ＩＬ−１０のインビボ中和によって保護効果が取り消されることを実証する実施例ＸＸＸＩＩＩにおいて直接支持される。
【００９５】
要約すると、固定化または凝集性免疫調節剤による処置は、病原性Ｔ細胞活性を直接的あるいは間接的にダウンレギュレートできるＩＬ―１０を含む可溶性媒介物質のＡＰＣによる産生を誘導し、ＭＨＣクラスＩＩ分子及び同時刺激性分子の発現をダウンレギュレートするか、あるいはＩＦＮγレベルを低下させることによりＡＰＣの機能を抑制でき、同時刺激性分子が存在しないか、あるいはそのレベルが低下しているノンプロフェッショナルＡＰＣによる治療用エピトープの提示を誘導でき、抗原活性化細胞死またはアネルギーを誘導する。さらに、固定化または凝集性免疫調節剤は、末梢性寛容及び／またはバイスタンダー抑制を刺激することができる。総じて、これらの効果は、病原性Ｔ細胞の発生の予防、Ｔ細胞機能を病原性から非病原性状態に転換する、疾患を抑制するＴ細胞の産生、及び病原性Ｔ細胞の排除として説明できる。これは、本明細書の教示に従って、自己免疫疾患の予防、安定化、または寛解を導くことができる。
【００９６】
いずれの形態の免疫調節剤を選択するにしても、本発明の組成物は所望する安定性を提供し、且つ選択する投与形態を容易にするために製剤化することができる。例えば、組成物は、経口、経膣、経耳、経鼻、経肺、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下または筋肉内投与を含むがこれらに限定されない従来の全ての経路を使用して投与することができる。本発明の他の実施態様の範囲内で、本明細書に記載した組成物は徐放性インプラントの一部として投与することができる。さらに他の実施態様の範囲内で、本発明の組成物は、安定性が強化する適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物または噴霧乾燥製剤として製剤化することができる。これらの好ましい製剤は、次に乾燥粉末吸入器を用いて、担体または噴霧剤と組み合わせる場合は、計量式吸入器、ネブライザー、アトマイザー、噴霧瓶またはドロッパーから投与できる。
【００９７】
本発明は、ダウンレギュレーションを受ける免疫系を含む任意の脊椎動物の治療に有用である。本発明は、細胞免疫応答を有する哺乳動物のような脊椎動物において特に有用である。好ましい実施態様では、治療対象となる脊椎動物は新生児または乳児の状態である。
【００９８】
この点に関して、本発明のさらなる局面では、免疫調節剤を生理学的に許容性のある担体または希釈剤と組み合わせて含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む免疫疾患の治療方法が含まれ、ここで前記免疫調節剤は少なくとも１つのＦｃレセプターリガンド及び少なくとも一つの免疫抑制因子を含む。この局面では、免疫抑制因子はＴ細胞レセプターアンタゴニストまたはアゴニストを含み、Ｆｃレセプターリガンドは免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部を含むことができる。先に言及したように、免疫調節剤は、好ましくは組換えポリペプチドまたはキメラ抗体の形態である。前記方法は、自己免疫疾患、アレルギー応答及び移植片拒絶反応を含む免疫疾患を治療するために使用することができ、そして多発性硬化症、狼瘡、リウマチ様関節炎、強皮症、インスリン依存性糖尿病及び潰瘍性大腸炎からなる群から選択される自己免疫疾患の治療に特に有用である。
【００９９】
前述のように、本発明の組成物、化合物及び方法は、新生児または乳児哺乳動物において寛容を誘導し、それによって将来の自己免疫を予防するかまたは低下させるのに特に有用である。「乳児」の用語は、本明細書で使用する際は、免疫系が末だ十分には成熟していない誕生後の生活期間中のヒトまたは非ヒト哺乳動物を言及する。ヒトでは、この期間は誕生から約９カ月齢までであり、一方マウスでは、この期間は誕生から約４週齢までである。「新生」及び「新生児」の用語は、本質的に正に生まれたばかりの乳児哺乳動物のサブセットを意味する。本発明による「乳児」に関連した他の特徴には、（ｉ）高ゾーン寛容になりやすい（Ｔ細胞前駆体の欠失／アネルギー、アポトーシス傾向の増大）、（ｉｉ）Ｔｈ２バイアスヘルパー応答（新生児Ｔ細胞の表現型特徴、新生児Ｔ細胞でのＣＤ４０Ｌ発現の低下）、（ｉｉｉ）細胞性応答の低下（機能性Ｔ細胞数の減少、抗原提示細胞機能の低下）、及び（ｉｖ）体液応答の低下及び型の限定（ＩｇＭｈＩｇｈ、ＩｇＤｌｏｗ、Ｂ細胞の優勢、ＴｈとＢ細胞間の協力の低下）を有する免疫応答が含まれる。本発明の具体的な非限定的実施態様では、開示された免疫調節剤は、母親の抗体が検出可能な量で未だ存在している乳児哺乳動物に投与することができる。関連実施態様では、所望のＴ細胞寛容を胎児に生じさせるように、開示された組成物を妊娠母親に接種することができる。いずれにしても、誘導されたＴ細胞寛容は、投与された免疫調節剤に関連する自己免疫疾患の後の発症に抵抗性を付与することができる。
【０１００】
対象が乳児であるかそれとも成体であるかに関係なく、本発明の医薬組成物を、治療（または予防）する疾病に適する方法で投与することができる。投与量及び回数は、患者の状態並びに患者の疾病の型及び重篤度のような要素によって決定される。本発明の特に好ましい実施態様の範囲内で、本明細書に記載した医薬組成物は、適当な投与量を臨床試験で決定することができるが、１ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまでの範囲の用量で投与してもよい。当業者は、ＭＲＩまたは臨床悪化の徴候によって治療有効性について患者をモニターできることを認めるであろう。
【０１０１】
投与後に、免疫調節剤は少なくとも１つの型の抗原提示細胞表面に存在する１つまたはそれ以上のＦｃレセプターと結合すると考えられる。当業者は、ＦｃＲリガンドの選択が、免疫調節剤を細胞内に取り込むためにどのクラスのＦｃレセプターを使用するのかを、少なくともある程度まで、決定することを認めるであろう。即ち、ＩｇＧ定常領域に相当するＦｃＲリガンドはＩｇＥ定常領域に相当するＦｃＲリガンドとは異なるクラスのＦｃレセプターによって結合される。さらに、異なるクラスのＦｃレセプターが異なる型の抗原提示細胞上に発現されるので、選択されたＡＰＣ上に免疫抑制因子を提示することが可能である。例えば、ＩｇＧ定常領域に相当するＦｃＲリガンドは、マクロファージまたは好中球によってエンドサイトーシスを受け、それに応じて提示されると思われる。これは、ある種のＡＰＣは種々のタイプの抗原を提示するのに一層効果的であり、その抗原が次にどのＴ細胞を活性化するのかに影響を与え得るという点で興味深い。
【０１０２】
いずれにしても、免疫調節剤全体がＡＰＣによるレセプター介在性エンドサイトーシスを受け、そして通常はクラスリン被覆小胞内に局在化する。細胞内取り込み後、免疫調節剤は最終的にＡＰＣ表面に提示されるようにプロセシングされる。プロセシングは一般的に、酸性ｐＨと、プロテアーゼを含む選択された酵素を含む細胞小器官であるリソソームへの、免疫調節剤の小胞輸送を伴う。ここで免疫調節剤は消化されて、本発明の目的ではタンパク質、ポリペプチド、あるいはペプチドの形態であり得る遊離免疫抑制因子を生じる。放出された免疫抑制因子が自己抗原性ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはそのフラグメントを含む場合、前記因子はさらに消化されて、１またはそれ以上のＴ細胞レセプターアゴニストを生じると考えられる。ペプチドがアンタゴニストまたはアゴニスト（免疫調節剤の一部として直接投与されるか、あるいは投与された自己抗原性ポリペプチドに由来する）のいずれであっても、提示されたペプチドの平均長は、例えば、５〜３０アミノ酸程度である。消化後、免疫抑制因子フラグメントを含む免疫調節剤フラグメントのうち少なくとも一部はエキソサイトーシス用小胞内でＭＨＣ分子と会合する。ＭＨＣ−免疫抑制因子複合体は、次にＡＰＣ表面まで輸送され、ヘルパーＴ細胞に提示される。
【０１０３】
前記に指摘のように、本発明の好ましい実施態様では、クラスＩＩ ＭＨＣ分子と協同して提示される免疫抑制因子としてＴＣＲアンタゴニストを使用する。従って、以下の考察の目的では、（ペプチド類似体であり得る）そのようなアンタゴニストが使用される。しかしながら、本発明は、免疫応答をダウンレギュレートする任意の免疫抑制因子をレセプター介在性エンドサイトーシスで提示するために使用できることを強調しなければならない。このため、所望する免疫原性応答の低下を提供するＴ細胞レセプターアゴニストを免疫抑制因子として使用することができ、そしてこのようなアゴニストは本発明の範囲内である。さらに、既に示したように、提示されたアゴニスト（または複数可）は、免疫抑制因子として直接的に投与されるか、または１またはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子から得てもよい。
【０１０４】
即ち、選択された実施態様では、投与される免疫抑制因子は、ＦｃＲリガンドからのエンドサイトーシスによる分離後に実質的にプロセシングされずに、ＭＨＣ複合体と協同して提示されるアゴニストペプチドであり得る。その他の実施態様では、免疫抑制因子は好ましくは少なくとも１つの自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。そのような場合、免疫抑制因子は、典型的にはＦｃＲリガンドから切断された後、プロセシング（消化）を受け、１またはそれ以上のペプチドアゴニストを生じ、それが次に本明細書の教示に従って、ＭＨＣクラスＩＩ分子と協同して提示される。他の場合は、Ｔ細胞レセプターに対する適切なアゴニストの効率の良い提示を利用して免疫応答をダウンレギュレートすることができる。
【０１０５】
従って、単なる例として、Ｔ細胞をミエリン塩基性タンパク質のフラグメントに相当するペプチドアゴニストに予め感作させることができる。多発性硬化症では、この自己アゴニストが連続的に提示され、それによってミエリン鞘の構成成分に向けた免疫応答が活性化される。さらに詳細には、感作された個々のＴ細胞は、提示された自己アゴニストと選択的に結合して細胞にシグナル伝達する数千ものレセプターを発現する。十分なレセプターが結合されると、感作Ｔ細胞は応答を生じさせるように働き、即ち、インターロイキンを分泌する。ＴＣＲアンタゴニストがＭＨＣクラスＩＩ分子と協同して提示される場合、Ｔ細胞は提示された複合体を認識するが活性化はされない。
【０１０６】
従って、本発明によれば、免疫抑制因子（即ち、アンタゴニスト）をエンドサイトーシスによって効率良く提示すると、レセプターに対する競合によってアゴニスト−ＴＣＲ結合が阻害される。即ち、提示されたＴＣＲアンタゴニストは感作Ｔ細胞のＴＣＲと効果的に結合し、それによって提示された自己抗原またはそのフラグメントの結合を妨げる。しかし、免疫抑制因子−ＴＣＲ複合体は、自己抗原−ＴＣＲ複合体とは異なって、応答を生じさせるようにはＴ細胞にシグナル伝達を行わない。従って、免疫抑制因子（非反応性アゴニストまたはアンタゴニスト）の結合は、Ｔ細胞が十分な自己抗原と結合して、細胞が作用するように誘導する活性化レベルのしきい値に達するのを妨げることができる。それ故、天然のアゴニストを含む、連続提示されている自己抗原に対する有害な免疫応答は回避される。
【０１０７】
他方、ＦｃＲ介在によるアゴニストの効率の良い提示は、本明細書の教示に従って哺乳動物の免疫応答をダウンレギュレートするために使用できる。これに関しては、最終的に提示されるアゴニスト（複数でもよい）は、免疫抑制因子として直接的に投与されるか、またはエンドサイトーシスによってタンパク質分解される自己抗原性ポリペプチド免疫抑制因子から得てもよい。特定の理論によって制限されることは望まないが、自己抗原性アゴニストは、同時刺激性分子を欠如する、あるいは低レベルの同時刺激性分子を有するノンプロフェッショナル及び／または非活性化ＡＰＣによって提示され得ると考えられる。前述のように、このタイプの提示が最終的にＴ細胞の不活性化を誘導することが驚くべきことにも見出された。特に、以下に説明するように、本発明の免疫調節剤は、ＩＬ−１０の産生を誘導し、ＩＦＮγレベルを低下させ、さらに末梢性寛容及び／またはバイスタンダー抑制を刺激する。そのような実施態様では、免疫調節剤構築物は、同時刺激性分子の活性化及び／産生を最小限に抑えるか、あるいは排除するためにアジュバントを含まない小胞中に投与されることが好ましい。本発明のこの局面に関する特に好ましい実施態様は、１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む免疫抑制因子を包含することができる。例えば、本実施態様による構築物は、少なくとも１つのＣＤＲ領域が少なくとも部分的にＰＬＰからのペプチドアゴニストで置換されている融合またはキメラＩｇＧを含み得る。そのような構築物は、アジュバントを含まない医薬的に有効な担体中で治療有効量を投与されると、多発性硬化症に関連する少なくともいくつかの症状を改善することができるはずである。多発性硬化症治療用のその他の有効な構築物は、自己抗原性タンパク質ＭＢＰ及びＰＬＰを含む免疫抑制因子に共有結合されているＩｇＧのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドを含んでいることがある。これらの構築物はさらにアジュバントを含まない担体中で投与されてもよい。
【０１０８】
１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントの投与は典型的に、ＡＰＣの表面における１つ以上のペプチドアゴニストのエンドサイトーシスによる効果的な提示を起こすことであろうことが認められよう。即ち、投与された自己抗原性ポリペプチド（複数でもよい）は、エンドサイトーシスによりタンパク質分解されて、いくつかの異なるペプチドアゴニストを生じ、これらが同時に提示されると思われる。複数アゴニストのそのような提示は、エピトープの拡散と集団の多様性に関連する困難についての解決を提供する。この点に関しては、自己免疫疾患は１つまたはそれ以上のポリペプチド上にある１つ以上の自己抗原性エピトープに起因するであろうことが認められるべきである。同様に、対象集団内の別々の個体が１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド上の別々のエピトープに対する自己免疫を発生することがあり得る。しかし、前述のように、本発明は、１つまたはそれ以上の自己抗原性ポリペプチド、またはそのフラグメントを投与することにより、正常エンドサイトーシスによるプロセシング後に、ＡＰＣ表面上に複数のアゴニストペプチドの提示を起こすことによって、極めて巧妙にそのような困難を回避することができる。即ち、全てのペプチドアゴニストを、本明細書に開示される組成物と技術を使用して、効率的に提示することができる。そのようなアゴニストの提示は、本発明が提供するようなＦｃＲ介在による効率的な取り込みなしには達成できないと思われることを強調するべきである。さらに詳細には、天然自己抗原性ポリペプチド（即ち、ＦｃＲリガンドを含まない）または遊離アゴニストペプチドのカクテルの単純な投与によっては治療有効レベルのアゴニストの提示を達成できるとは思われない。そのような組成物が効率良く細胞内に取り込まれて、投与されたアゴニストの提示が治療有効量になることは疑わしい。逆に、本発明は比較的低用量で所望するアゴニストの有効な提示を提供する。
【０１０９】
さらに、以下に説明するように、本発明の免疫調節剤は、バイスタンダー抑制を刺激する。特定の理論によって制限されることは望まないが、本発明の免疫調節剤を取り込んだＡＰＣによって分泌されるＩＬ−１０は、免疫調節剤に含まれる抗原以外の抗原に対する特異性を有する近隣Ｔ細胞による免疫応答を低下させることができると思われる。
【０１１０】
以下の非限定例の呈示は、本発明の原理をさらに説明するのに役立つであろう。この点に関して、以下の考察及び実施例を通して使用する略号と対応する定義の一覧を示す。
ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質、多発性硬化症の病因に関係している。
ＰＬＰ：プロテオリピドタンパク質、多発性硬化症の病因に関係している。
ＰＬＰ１：アミノ酸残基１３９〜１５１を含むＰＬＰのペプチドフラグメント。
ＰＬＰ−ＬＲ：ＰＬＰ１のペプチド類似体、ＰＬＰ１パルス細胞を活性化しない。
ＰＬＰ２：アミノ酸残基１７８〜１５１を含むＰＬＰのペプチドフラグメント。
Ｉｇ−Ｗ：Ｂａｌｂ／ｃｇ２ｂ定常領域と結合した抗アルソン酸塩（ａｎｔｉ−ａｒｓｏｎａｔｅ）抗体９１Ａ３のＨ鎖可変領域及び親の９１Ａ３κＬ鎖を含むＩｇ構築物（本明細書ではコントロールとして使用されている）。
Ｉｇ−ＰＬＰ１：Ｈ鎖ＣＤＲ３がＰＬＰのアミノ酸残基１３９〜１５１で置換されたことを除いてＩｇ−Ｗと同一の構築物。
Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ：Ｈ鎖ＣＤＲ３がＰＬＰのアミノ酸残基１３９〜１５１のペプチド類似体で置換されたことを除いてＩｇ−Ｗと同一の構築物。
Ｉｇ−ＨＡ：（本明細書ではコントロールとして使用されている）Ｈ鎖ＣＤＲ３がインフルエンザウイルスＨＡのアミノ酸残基１１０〜１２０で置換されたことを除いてＩｇ−Ｗと同一の構築物。
ＰＰＤ：精製タンパク質誘導体、コントロールアクチベーターとして使用される全結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｏｌｏｓｉｓ）抽出物。
【０１１１】
明白な実施上及び道徳上の理由により、多数の疾病に関する実験的組成物または方法の有効性を決定するヒトでの初期研究は実行できない。それ故、医薬品の初期開発中には、安全性及び費用の理由により適当な動物モデルを使用することが標準的な方法である。実験動物モデルの実行で成功するという根拠は、主要抗原決定基が異なる宿主種でしばしば活性であるという理解に基づいている。従って、１つの種、例えば、齧歯類またはブタにおいて有効な自己免疫の治療法は、ヒトのような異なる種においても有効である。適当な動物モデルが十分に開発された後でのみ、ヒトにおけるワクチンの安全性及び有効性をさらに証明するヒトでの臨床試験が実施される。従って、限定の目的ではなく説明の目的として、本発明は主として、哺乳類宿主としてのマウスに関する例で証明される。当業者は、本発明をヒト及び家畜動物を含む他の哺乳類宿主で実施できることを認めるであろう。
【０１１２】
この点に関して、ＭＳの動物モデルとして使用される実験的脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＰＬＰ及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のようなミエリン自己抗原を用いてマウスの感受性系で誘導することができる。これらタンパク質の脳炎誘発活性は、インビボでクラスＩＩ制限脳炎誘発性Ｔ細胞を誘導し、そして結果としてＥＡＥを誘導するペプチドの存在と相関している。ＰＬＰのアミノ酸残基１３９〜１５１に相当するペプチド（ＰＬＰ１）はＨ−２ｓ ＳＪＬマウスにおいて脳炎誘発性であり、ＰＬＰ１に特異的なＴ細胞系はＥＡＥをナイーブ動物に伝達する。ヒトＭＳでの標的抗原（複数でもよい）は未だ議論の余地があるが、ミエリンタンパク質に特異的なＴ細胞の頻度は正常な対象よりＭＳ患者の方が多い。それらのミエリン反応性Ｔ細胞のサイレンシングは、ＭＳを回復するための論理的な方法であると思われる。このため、このモデルを使用して本発明の利点を証明する。
【０１１３】
実施例　Ｉ
ペプチドの調製
本出願においては、アミノ酸は標準的な３文字または１文字コードで呼称される。他に特定しない限り、アミノ酸はＬ型が意図されている。１文字コードを使用するとき、大文字はＬ型を示し、そして小文字はＤ型を示す。１文字コードは次の通りである。Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；及びＹ、チロシン。
【０１１４】
以下の実施例で使用するペプチドは全て、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、 Ａｌａｂａｍａ）で固相法を使用して製造され、そして従来の方法を使用してＨＰＬＣカラムで９０％以上の純度まで精製された。ＰＬＰ１ペプチド（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＮＫＦ：配列番号１）は、天然プロテオリピドタンパク質のアミノ酸残基１３９〜１５１に相当する脳炎誘発配列を包含している。ＰＬＰ−ＬＲ（ＨＳＬＧＫＬＬＧＲＰＮＫＦ：配列番号２）はＰＬＰ１の類似体であり、Ｔｒｐ １４４とＨｉｓ １４７がそれぞれＬｅｕとＡｒｇ（下線表示）で置換されていた。ＰＬＰ１とＰＬＰ−ＬＲはＩ−ＡＳクラスＩＩ分子（即ち、マウスの特定の系で産生されるＭＨＣクラスＩＩ構造）と良く結合する。ＰＬＰ２ペプチド（ＮＴＷＴＴＣＱＳＩＡＦＰＳＫ：配列番号３）はＰＬＰのアミノ酸残基１７８〜１９１に相当する脳炎誘発配列を包含している。このペプチドもＩ−ＡＳクラスＩＩ分子と結合してＳＪＬマウスでＥＡＥを誘導する。ＨＡペプチド（配列表示なし）はインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのアミノ酸残基１１０〜１２０に相当する。ＨＡはＩ−ＥＤクラスＩＩ分子と結合してここではコントロールペプチドとして使用される。
【０１１５】
実施例　ＩＩ
外因性ペプチドを含むマウスキメラ免疫グロブリンの産生
Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲと命名され、図１に概略的に示す２つの免疫グロブリン−ペプチドキメラを実施例　Ｉに説明するように構築して、ペプチドＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲを発現させた。どちらも、Ｈ鎖ＣＤＲ３ループを欠失し、選択したペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換された。従来のＤＮＡ配列決定分析法によって、ペプチドヌクレオチド配列が正しい読み枠に挿入されていることが示された。
【０１１６】
これらのキメラを構築するために使用した遺伝子には、Ｇｉｌｌｉａｎら、Ｃｅｌｌ．３３：７１７、１９８３、によって記載されたＢＡＬＢＫ ＩｇＧ２ｂ定常領域をコードする遺伝子、Ｒｕｔｈｂａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、２０２：３８３〜３９８、１９８８、によって記載された９１Ａ３Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子、及びＧａｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４：１０８５〜１０８９、１９８７、によって記載された全９１Ａ３κＬ鎖をコードする遺伝子が含まれる（これら文献は全て本明細書に参照により編入する）。Ｈ鎖ＣＤＲ３領域を欠失させそしてＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲをコードするヌクレオチド配列で置換する方法は、ＰＲ８インフルエンザＡウイルスの核タンパク質のアミノ酸残基１４７〜１６１に相当するＣＴＬエピトープを有するキメラであるＩｇ−ＮＰの産生についてＺａｇｈｏｕａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３６０４〜３６０９、１９９２、（本明細書に参照により編入されている）によって記載された方法と同様である。同一の参照文献が、９１Ａ３　ＩｇＧのＣＤＲ３がペプチド発現に適合しており、また天然セグメントの代わりにグラフトされたときに、クラスＩ及びクラスＩＩ制限エピトープがどちらも効率良くプロセシングされてＴ細胞に提示されたことを報告している。
【０１１７】
端的には、９１Ａ３ＶＨ遺伝子をｐＵＣ１９プラスミドのＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化して、ＰＣＲ変異誘発反応で鋳型ＤＮＡとして使用して、ＣＤＲ３の代わりにＰＬＰ１（９１Ａ３ＶＨ−ＰＬＰ１）及びＰＬＰ−ＬＲ（９１Ａ３ＶＨ−ＰＬＰ−ＬＲ）配列を有する９１Ａ３ＶＨフラグメントを生成した。ヌクレオチド配列決定分析によって、ＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲの全配列が正しい読み枠に挿入されていることが示された（表示なし）。９１Ａ３ＶＨ−ＰＬＰ１及び９１Ａ３ＶＨ−ＰＬＰ−ＬＲフラグメントを次に、それぞれｐＳｖ２−ｇｐｔ−９１Ａ３ＶＨ−ＰＬＰ１−Ｃｇ２ｂ及びｐＳｖ２−ｇｐｔ−９１Ａ３ＶＨ−ＰＬＰ１−ＬＲ−Ｃｇ２ｂプラスミドを発生させる、Ｂａｌｂ／ｃｇ２ｂの定常領域をコードするエキソンの前にあるｐＳｖ２−ｇｐｔ−Ｃｇ２ｂのＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした。これらのプラズミドを次に別々に非Ｉｇ産生ＳＰ２／０Ｂ骨髄腫細胞中に親の９１Ａ３Ｌ鎖である、ｐＳＶ２−ｎｅｏ−９１Ａ３Ｌを有する発現ベクターと共にコトランスフェクト（同時形質移入）した。Ｉｇキメラを産生するトランスフェクタントはゲネチシン及びミコフェノール酸の存在下で選択した。トランスフェクタントを限界希釈法によりクローン化して、最終クローンは１〜４μｇ／ｍＬのＩｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（まとめてＩｇ−ＰＬＰキメラと称する）を分泌した。選択した細胞系はＩｇ−ＰＬＰ１−９Ｂ１１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ−２１Ａ１０と命名され、本発明者の実験室で継代培養して永久保存している。
【０１１８】
キメラ及び野生型抗体もコントロールとして使用した。例えば、Ｉｇ−ＨＡは、Ｄセグメントの代わりに、ＣＤＲ３内部に挿入されたペプチドだけがＩｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲと異なっている、インフルエンザウイルスＨＡから得られたＨＡ１１０−１２０Ｔヘルパーエピトープを有しているＩｇＧ分子である。Ｉｇ−Ｗは、修飾されていない（野生型）９１Ａ３ＶＨ遺伝子産物、即ち、Ｂａｌｂ／ｃｇ２ｂ定常領域及び９１Ａ３κＬ鎖である。それ故、これは、親のＤセグメントを含むＣＤＲ３領域がＩｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲと異なっている。つまり、Ｉｇ−ＰＬＰ２は、Ｈ鎖ＣＤＲ３ループ内にＰＬＰのアミノ酸残基１７８〜１９１を有するキメラ抗体である。従来のクローン化、配列決定、及び精製方法を使用して適当な細胞系を作成した。これらの方法はＺａｇｈｏｕａｎｉら（前記引用）によって記載された方法及びＩｇ−ＨＡを産生させるために先に使用した方法（Ｚａｇｈｏｕａｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５９：２２４〜２２７、１９９３（本明細書に参照によりまた編入されている）と同様である。
【０１１９】
トランスフェクタントの大規模培養は１０％の鉄濃縮子牛血清（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を含有するＤＭＥＭ培地中で実施した。Ｉｇ−ＰＬＰキメラは、ラット抗マウス κ鎖ｍＡｂをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させたカラムの培養上清から精製した。ラット抗マウス κ鎖ｍＡｂ（ＲＡＭ１８７．１またはＡＴＣＣ番号、ＨＢ−５８）及びマウス抗ラット κＬ鎖ｍＡｂ（ＭＡＲ１８．５またはＡＴＣＣ番号、ＴＩＢ　２１６）はＡＴＣＣから調達した。これらのハイブリドーマは大規模にまで増殖させ、そして互いに培養上清から精製した。ラット抗マウスκｍＡｂを使用してカラムを調製し、そしてこのカラムでＩｇ−ＰＬＰキメラを培養上清から精製した。交差汚染を避けるために、別々のカラムを使用して個々のキメラを精製した。
【０１２０】
実施例　ＩＩＩ
プロテオリピドタンパク質の精製
天然プロテオリピドタンパク質またはＰＬＰは、Ｌｅｅｓら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（神経化学研究方法−プロテオリピドの調製方法）、Ｎ．Ｍａｒｋｓ及びＲ．Ｒｏｄｎｉｇｈｔ編、Ｐｌｕｎｅｍｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７８ （本明細書に参照により編入している）によって先に記載された方法に従ってラット脳から精製した。
【０１２１】
端的には、脳組織は２／１（ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノール中でホモジナイズし、さらに焼結ガラス漏斗でろ過して可溶性の粗脂質抽出物を分離した。ＰＬＰを次にアセトンで沈殿させ、ペレットをクロロホルム／メタノール／酢酸の混合物中に再溶解し、さらにＬＨ−２０−１００セファデックスカラム（Ｓｉｇｍａ）を通過させて残留脂質を除去した。溶出物からのクロロホルムの除去とＰＬＰからアポタンパク質体への転換は、穏やかな窒素流下で水を徐々に添加して同時に実施した。その後、水に対する十分な透析を実施して、残留酢酸及びメタノールを除去した。
【０１２２】
実施例　ＩＶ
ウサギ抗ペプチド抗体の産生
実施例Ｉで調製したＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲペプチドを、Ｚａｇｈｏｕａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８８：５６４５〜５６４９、１９９１（本明細書に参照により編入している）に記載されるようにＫＬＨ及びＢＳＡと結合させた。ニュージーランドシロウサギはＭｙｒｔｌｅ’ｓ Ｒａｂｂｉｔｒｙ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ、 ＴＮ）から購入した。これらのウサギは、１ｍｇのペプチド−ＫＬＨ複合体を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で免疫し、そして１ｍｇの複合体を含有する不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で、高い抗体力価に達するまで毎月チャレンジ（攻撃誘発）した。ペプチド−ＢＳＡ複合体はセファロースと結合させ、ウサギ抗血清から抗ペプチド抗体を精製するために使用した。
【０１２３】
実施例　Ｖ
ウサギ抗ペプチド抗体の特徴づけ
捕獲ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用し、実施例ＩＩに説明するように製造したＩｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲを用いて、ＩｇＧ分子上のＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲペプチドの発現を評価した。
【０１２４】
マイクロタイター９６ウエルプレートは、実施例ＩＶで製造したウサギ抗ペプチド抗体（５μｇ／ｍＬ）を用いて４℃で一晩コートし、さらに２％のＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした。これらのプレートを次にＰＢＳで３回洗浄し、そして段階的に変化する量のＩｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲを添加し、そして室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、捕獲されたＩｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲは、プレートに１００×１０３ｃｐｍの１２５Ｉ標識ラット抗マウス κｍＡｂを加えて３７℃で２時間インキュベートして検出した。プレートを次にＰＢＳで５回洗浄してから、ＬＫＢガンマカウンターでカウントした。２７ｍｇ／ｍＬのキメラで得られた三重測定の平均値±ＳＤが示される。
【０１２５】
図２に示すように、合成ＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲペプチドに対するウサギ抗体は、実施例ＩＩで製造されたキメラ抗体Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲを認識した。さらに詳細には、Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲは、ウサギ抗ＰＬＰ１でコートしたプレート上でインキュベートしたとき、有意量で捕獲され、また標識ラット抗マウスκ鎖ｍＡｂと結合した（図２Ａ）。同様に、Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲはどちらもウサギ抗ＰＬＰ−ＬＲによって捕獲された（図２Ｂ）。逆に、Ｉｇ−Ｗ、即ち、外因性ペプチドを有していない野生型９１Ａ３マウス抗体及びＩｇＭコントロール抗体（表示なし）、はウサギ抗体との有意な結合を示さなかった。Ｉｇ−ＰＬＰ１は、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲよりも抗ＰＬＰ１及び抗ＰＬＰ−ＬＲの両方と良く結合し、構造の違いがウサギ抗体に対するペプチドのアクセス可能性に影響を与えることを示した。さらに、図２に示された結果は、キメラでペプチドが発現しても、ウサギ抗体はＨ鎖上のＰＬＰペプチドと結合し、標識ラット抗マウスκはＬ鎖に結合するために、Ｈ鎖とＬ鎖の対合を改変しなかったことを示している。
【０１２６】
実施例　ＶＩ
抗原特異的Ｔ細胞系増殖アッセイ
ＰＬＰ１特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ５Ｂ６及び４Ｅ３並びにＩＬ−２依存性ＨＴ−２ Ｔヘルパー細胞は、Ｅｕｎｉｃｅ Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｓｈｒｉｖｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、 ＭＡから得た。５Ｂ６及び４Ｅ３ Ｔ細胞は、Ｋｕｃｈｒｏｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３３２６〜３３３６、１９９４（本明細書に参照により編入している）によって報告されているように、Ｉ−ＡＳクラスＩＩ ＭＨＣと会合したペプチドＰＬＰ１を認識し、これと共にインキュベートしたとき、ＩＬ−２を産生する。逆に、Ｋｕｃｈｒｏｏらは、ＰＬＰ１で刺激して、さらにその後ＰＬＰ−ＬＲで刺激したとき、５Ｂ６及び４Ｅ３細胞は最早どちらもＩＬ−２を産生しないことを報告している。同様に、ＰＬＰ−ＬＲの存在下でＴ細胞ハイブリドーマをＰＬＰ１で刺激すると明らかにＩＬ−２産生を阻害する。
【０１２７】
Ｋｕｃｈｒｏｏらと実質的に同一の技術を使用して、種々のアゴニストに対するＴ細胞ハイブリドーマの活性化を次のようにして実施した。ＳＪＬマウス由来の照射（３，０００ラド）脾細胞をこの実施例用の抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。照射脾細胞は、９６ウェルの丸底プレート（５×１０５細胞／ウェル／５０ｍＬ）中で、段階的に変化する濃度の抗原（１００ｍＬ／ウェル）を加えてインキュベートした。１時間後、Ｔ細胞ハイブリドーマ、即ち、５Ｂ６または４Ｅ３（５×１０４細胞／ウェル／５０ ｍＬ）を添加して培養を一晩継続した。Ｔ細胞の活性化（即ち増殖）は培養上清中におけるＩＬ−２の産生を測定することにより評価した。これはＩＬ−２依存性ＨＴ−２細胞を用いる３Ｈ−チミジン取り込みによって実施された。即ち、ＩＬ−２が存在する（即ち、活性化したＴ細胞によって分泌される）と、ＨＴ−２細胞は増殖し、周囲培地から標識チミジンを取り込む。
【０１２８】
これらのアッセイを実施するために用いた培養用培地は１０％ＦＢＳ、０．０５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム及び５０ｍｇ／ｍＬ硫酸ゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭであった。端的には、培養上清（１００ ｍＬ／ウェル）は９６ウェルの平底プレート中で、ＨＴ−２細胞（１×１０４細胞／ウェル／１００ ｍＬ）を加えて２４時間インキュベートした。その後１ウェル当たり１ｍＣｉの３Ｈ−チミジンを添加し、さらに１２〜１４時間培養を続けた。細胞を次にガラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれなかった３Ｈ−チミジンを洗い流した。次に、トレース９６プログラム及びＩｎｏｔｅｃｈ　ｂカウンターを使用して取り込まれたチミジンをカウントした。ＩＬ−２（活性化Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞株によって分泌された）レベルがより高いウェルはより高レベルのＨＴ−２細胞増殖を誘導し、３Ｈ−チミジン取り込み値の増加を記録することが認められよう。
【０１２９】
２種の異なるＴ細胞系を使用した前述のアッセイの結果を図３に示す。詳細には、Ｔ細胞ハイブリドーマ４Ｅ３（図３Ａ）及び５Ｂ６（図３Ｂ）はＩｇ−ＰＬＰ１、ＰＬＰ１及び天然ＰＬＰを加えて予めインキュベートしたＡＰＣによって刺激した後、ＩＬ−２をかなりの量産生した。ネガティブコントロールであるＩｇ−Ｗ、Ｉｇ−ＨＡ及びＰＬＰ２ペプチドはＴ細胞によるＩＬ−２の産生を誘導しなかった。同様に、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ及びＰＬＰ−ＬＲペプチドはどちらも５Ｂ６及び４Ｅ３を刺激せず、有意量のＩＬ−２を産生しなかった。ＰＬＰ−ＬＲペプチドはＩＬ−２産生を刺激するというよりはむしろ無効にすることが知られているので、前記した最後の結果は予期されないことでない。抗原濃度はＩｇ−ＰＬＰ１、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ、Ｉｇ−ＨＡ及びＩｇ−Ｗについては０．１ｍＭ、ＰＬＰ１及びＰＬＰ２ペプチドについては１ｍＭ、そしてＰＬＰについては１．７ｍＭであった。各値は三重複ウエルの平均値±ＳＤを表す。
【０１３０】
これらの結果は、Ｉｇ−ＰＬＰ１が活性化を伝導する様式でＴ細胞ハイブリドーマに提示されたことを示している。立体障害は抗体全体がＭＨＣ構造及びＴＣＲに同時・直接的に結合することを妨げるように思われる。Ｔ細胞は可溶性タンパク質とは反応しないので、ＰＬＰ１ペプチドはエンドサイトーシスによるプロセシングによってＩｇから遊離され、さらにＭＨＣクラスＩＩ　Ｉ−ＡＳ分子と結合したと思われる。従って、ＰＬＰ１ペプチドの隣接領域はＩｇ−ＰＬＰ１のエンドサイトーシスによるプロセシング、またはＰＬＰ１ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ構造との結合に干渉しないと思われる。
【０１３１】
実施例　ＶＩＩ
ＰＬＰ１ペプチドのＩｇ−ＰＬＰ１を介するＴ細胞への提示
自然発生免疫疾患においては、自己抗原の暴露及び連続的なエンドサイトーシスによる提示によってかなりのレベルのＭＨＣ−自己抗原複合体が生じると思われる。現在、多数の免疫疾患にはこの連続的な提示を再現する有効なインビトロモデルが存在せず、有効な治療法の開発に重大な障害となっている。比較的効率の悪い細胞内取り込みメカニズムまたは先に考察した遊離ペプチドに関する限界のため、所望の刺激を供与するためには比較的高レベルの天然抗原が必要である。従って、本発明の１つの局面は、アゴニストリガンドをエンドサイトーシスによって連続的に提示するインビトロモデルを提供することである。
【０１３２】
さらに詳細には、本発明は、
ａ）Ｆｃレセプターを発現する複数の抗原提示細胞を含む培地を用意し、そして
ｂ）前記培地を、免疫調節剤組成物であって少なくとも１つのＦｃレセプターリガンド及び少なくとも１つの免疫抑制因子を有している免疫調節剤並びに適合性のある担体を含む組成物と組み合わせる、
工程を含む、Ｔ細胞アンタゴニストをインビトロエンドサイトーシスによって効果的に提示する方法を提供する。
【０１３３】
好ましくは、免疫抑制因子は少なくとも１つのＴ細胞レセプターアンタゴニストであり、そしてＦｃレセプターリガンドは免疫グロブリン定常領域ドメインの少なくとも一部分である。さらに、本発明の好ましい局面では、免疫調節剤は組換えポリペプチドまたはキメラ抗体を含む。
【０１３４】
この点に関して、Ｉｇ−ＰＬＰ１（または任意の免疫グロブリン会合アゴニスト）は、免疫系を研究するためのインビトロ系を提供するために、エンドサイトーシス経路で効率的に機能し、さらに高レベルのアゴニストリガンドを生じさせ得るペプチド送達系を確立する目的で使用することができる。特に、開示した系は、自己抗原のインビボ提示と同様の状況における拮抗作用を研究するために使用することができる。
【０１３５】
抗原の連続的なエンドサイトーシスによる提示を模擬するために免疫グロブリン会合アゴニストが使用できることを証明するために、Ｔ細胞活性化アッセイを遊離ＰＬＰ１ペプチド、天然ＰＬＰ及びＩｇ−ＰＬＰ１を使用して実施した。これらのアッセイの結果を図４に示す。
【０１３６】
詳細には、異なる濃度の３つの抗原（即ち、アゴニスト）に照射ＳＪＬ／Ｊ脾細胞を加えてインキュベートし、その後４Ｅ３　Ｔ細胞ハイブリドーマと会合させた。ＩＬ−２産生は、実施例ＶＩに説明したように、ＩＬ−２依存性ＨＴ−２細胞を用いて３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した。各点は三重測定の平均値を表す。標準偏差は平均値の１０％を超えなかった。
【０１３７】
図４は、最大活性値は３種のアゴニスト間で様々であったが、Ｔ細胞を刺激するのに必要な値は遊離ＰＬＰ１または天然ＰＬＰのいずれよりもＩｇ−ＰＬＰ１の方がはるかに低かったことを示している。即ち、細胞系を刺激するには、天然ＰＬＰまたは遊離ペプチドのどちらよりもＩｇ−ＰＬＰ１の方が実質的に少量を要した（１／１００程度）。詳細には、最大値の半分まで刺激するためには、Ｉｇ−ＰＬＰ１（０．００５ ｍＭ）はＰＬＰ（０．５ ｍＭ）またはＰＬＰ１ペプチド（０．６ ｍＭ）と比べて少量を必要とするのみであった。これらの結果は、ＰＬＰ１ Ｔ細胞エプトープが天然ＰＬＰまたは合成ＰＬＰ１ペプチドよりも、Ｉｇ−ＰＬＰ１によってより良く提示されることを示している。ＩＬ−２産生のプラトーは、Ｔ細胞アクチベーターが遊離ＰＬＰ１合成ペプチドであるときの方がより高かったが、これはインビボで長期間にわたって得ることは困難と思われるような実質的により高値のアゴニストを必要とする。
【０１３８】
いかなる方法によっても本発明を限定するものではないが、ペプチド送達におけるＩｇ−ＰＬＰ１の効力はＦｃＲ介在性細胞内取り込み及び新たに合成されたＭＨＣ分子へのアクセス性に関係していると思われる。さらに詳細には、天然ＰＬＰはむしろ効果的ではない単純な流体相ピノサイトーシスによる細胞内取り込みを行い、一方遊離ＰＬＰ１ペプチドは細胞表面の空ＭＨＣクラスＩＩ分子と単純に結合するだけであるように思われる。これらの形態による自己抗原の無効な提示は図４で明らかに示されており、これはＭＨＣクラスＩＩ分子と組み合わせてＰＬＰ１ペプチドを提示するには、Ｉｇ−ＰＬＰ１の方が遊離ペプチドまたは天然タンパク質よりも効率が良いことを明白に示している。
【０１３９】
実施例　ＶＩＩＩ
インビトロにおけるＴ細胞活性化の阻害
Ｉｇ−ＰＬＰ１−ＬＲによるＰＬＰ１、ＰＬＰ及びＩｇ−ＰＬＰ１　Ｔ細胞活性化の拮抗作用をプレパルス増殖アッセイを使用して検出した。
【０１４０】
照射（３，０００ラド）ＳＪＬ脾細胞（ＡＰＣとして使用）は、選択したアゴニスト（１ｍＭ ＰＬＰ１ペプチド、０．０５ ｍＭ Ｉｇ−ＰＬＰ１または７ ｍＭ ＰＬＰ）及び種々の濃度のアンタゴニスト（１００ ｍＬ／ウェル）を加えて９６ウェルの丸底プレート（５×１０５細胞／ウェル／５０ ｍＬ）中で１時間インキュベートした。次に、４Ｅ３Ｔ細胞ハイブリドーマ（５×１０４細胞／ウェル／５０ ｍＬ）を添加し、そして培養を一晩継続した。ＨＴ−２細胞を用いて実施例ＶＩと同様に測定した上清中のＩＬ−２産生をＴ細胞活性化の尺度として使用した。このアッセイの結果を図５に示す。
【０１４１】
さらに詳細には、図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃはそれぞれ、遊離ＰＬＰ１ペプチド（５Ａ）、Ｉｇ−ＰＬＰ１キメラ免疫グロブリン（５Ｂ）及び天然ＰＬＰ（５Ｃ）の拮抗作用を示す。アンタゴニストはＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（□）及びＰＬＰ−ＬＲ（○）であり、コントロールはＩｇ−Ｗ（◇）及びＰＬＰ２（△）であった。
【０１４２】
アゴニストを加えるがアンタゴニストを使用しないでＡＰＣをインキュベートしたときに得られたｃｐｍ値をコントロールチミジン取り込みとして使用した。この値はＩｇ−ＰＬＰ１では７，５０３±１，３０２、ＰＬＰ１ペプチドでは３１，０８９±３，８６０、そしてＰＬＰでは８，２６８±９１５であった。ＡＰＣをアゴニストもアンタゴニストも加えずにインキュベートしたときに得られたｃｐｍ値はバックグランド（ＢＧ）として使用した。この値はＩｇ−ＰＬＰ１では１，５６０±３２３、ＰＬＰ１ペプチドでは２，５７４±２９０、そしてＰＬＰでは２，１２７±１７７であった。コントロールに対するチミジン取り込みパーセントは次のようにして計算した。［（試験アンタゴニストの存在下で得られたｃｐｍ）−（ＢＧ）］／［（ｃｐｍコントロールチミジン取り込み値）−（ＢＧ）］。各点は三重測定の平均値を表す。
【０１４３】
前記で考察したように、Ｉｇ−ＰＬＰ１キメラのＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド負荷能力は、抗原の連続的な供給によってしばしばＴ細胞を攻撃的にトリガできる自己ペプチドを豊富に産生させるインビボ自己免疫環境に似ていると思われる。図５Ａ（ＰＬＰ１アゴニスト）は、Ｔ細胞にＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの両方が存在する状態でＡＰＣを加えてインキュベートしたとき、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ濃度が上昇するに従いＩＬ−２産生がかなり減少したことを示している。ＰＬＰ１ペプチドによるＴ細胞活性化中に合成ＰＬＰ−ＬＲペプチドを使用したとき、ＩＬ−２産生の減少が同様に明白であった。逆に、コントロールＩｇ−Ｗ免疫グロブリン及びＰＬＰ２ペプチドでは拮抗作用効果は観察されなかった。ＩＬ−２産生の最大値の５０％阻害（コントロールに対して６０％のチミジン取り込み）には、ＰＬＰ−ＬＲペプチドでは９ｍＭであるのに対してＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲでは０．４ｍＭしか必要でなく、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲがはるかに効率の良い提示及びＴ細胞拮抗作用を示す。
【０１４４】
Ｔ細胞拮抗作用においてキメラ免疫グロブリンが遊離ペプチドよりも効率が良いというさらなる証拠は図５Ｂ及び５Ｃに示されている。詳細には、図５Ｂは、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲはＩｇ−ＰＬＰ１によって介在されるＴ細胞活性化を阻害したが、遊離ＰＬＰ−ＬＲは、ネガティブコントロールＰＬＰ２ペプチドと同様に、有意な拮抗作用を全く示さなかったことを示している。意義深いことに、図５Ｂはまた、Ｉｇ−Ｗ、即ち外因性ペプチドを有していない野生型９１Ａ３免疫グロブリン、がＩｇ−ＰＬＰ介在性Ｔ細胞活性化で部分的な阻害活性を呈することも示している。これは、Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−Ｗがどちらも同一のＩｇＧ２定常領域を共有しているため、ＡＰＣ上でのＦｃＲ結合に対する競合の結果であると考えられる。ＩＬ−２産生の５０％阻害の最大値は、Ｉｇ−ＰＬＰ１によるＴ細胞の活性化がＩｇ−Ｗの存在下で行われたときに見られた。従って、Ｉｇ−ＷはＦｃＲ結合及び細胞内取り込みについてＩｇ−ＰＬＰ１と競合し、それによってＴ細胞の活性化を低下させると思われる。即ち、Ｉｇ−Ｗの濃度が土昇するに従い、ＦｃＲと結合してＡＰＣによって細胞内に取り込まれるＩｇ−ＰＬＰ１は少なくなり、その結果、提示及びこれに対応するＩＬ−２産生が減少することになる。応答におけるこのＩｇ−Ｗ介在性の減少は拮抗効果の結果ではなくて、むしろ単にＦｃＲ結合に対する競合の結果であることに注目することが重要である。即ち、提示されたＩｇ−ＷエピトープはＰＬＰ１に対するＴＣＲアンタゴニストではなく、ＰＬＰ１特異的ＴＣＲとは相互作用しない。
【０１４５】
図５Ｂとは対照的に、図５ＣはＩｇ−ＷではなくてＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲが天然ＰＬＰによるＴ細胞の活性化を有意に低下させることを示している。Ｉｇ−Ｗは天然ＰＬＰと異なる様式で細胞内に取り込まれるらしく（Ｆｃレセプターに対して、単純な流体相ピノサイトーシス）、取り込み及びプロセシングについて直接的な競合は全くないので阻害もないはずである。
【０１４６】
便宜上の目的で、図５に示した結果をすぐ下の表１にまとめる。ＡＰＣをＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの存在下でＰＬＰ１ペプチドを加えてインキュベートしたとき、ＰＬＰ１特異的Ｔ細胞ハイブリドーマは活性化されなかった（図５ａ）。さらに、天然ＰＬＰ及びＩｇ−ＰＬＰ１によるＴ細胞の活性化を種々の濃度のＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの存在下で実施したとき、ＩＬ−２産生（即ち、Ｔ細胞活性化）はＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの増加につれて減少した。しかしなから、遊離ＰＬＰ−ＬＲペプチドは、天然ＰＬＰまたはＩｇ−ＰＬＰ１によって介在されるＴ細胞活性化を阻害できなかった。これらの２つの系列の証拠によって、Ｔ細胞のＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ介在性不活性化の主要なメカニズムは、細胞表面上でのＭＨＣクラスＩＩ分子の直接的な遮断というよりはむしろエンドサイトーシスによる提示とＴＣＲ拮抗作用であることが示唆される。
【０１４７】
以下の表で、プラスの記号はＩＬ−２産生の阻害し、従って拮抗作用があることを示し、マイナスの記号はＩＬ−２産生を殆どまたは全く阻害せず、従って拮抗作用が殆どまたは全くないことを示す。
【０１４８】
【表１】
2004509978.tif 000002
【０１４９】
前述の実施例の結果は、ペプチドアンタゴニストのＦｃＲ介在性取り込み及びそれに続くプロセシングが抗原提示細胞による効率的な提示と矛盾しないことを示している。これは、遊離ペプチド類似体が送達されると、ＭＨＣまたはＴＣＲ結合部位についての直接的な競合によって効率的な拮抗作用が提供されると考えられた先行技術からは全く予期されていなかったことである。
【０１５０】
実施例　ＩＸ
Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲによる拮抗作用のメカニズムの特徴づけ
実施例ＶＩＩＩで実施したアッセイと同様のアッセイを用いて、Ｆｃレセプターとの直接的な結合についての競合は、それ自体、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ介在性拮抗作用のメカニズムではないであろうことが証明された。
【０１５１】
ＳＪＬ脾臓ＡＰＣを、２ｍＭのＩｇ−ＰＬＰ２、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲまたはＩｇ−Ｗの存在下で天然ＰＬＰ（６．８ｍＭ）を加えてインキュベートし、そして前記実施例のようにＨＴ−２細胞を用いて３Ｈ−チミジン取り込みによってＩＬ−２産生をアッセイした。Ｉｇ−ＰＬＰ２は実施例Ｉに詳記した配列を用いて実施例ＩＩのように調製した。コントロールに対するチミジン取り込み％は実施例ＶＩＩＩと同様に計算した。アッセイの結果を図６に示す。図６の各欄は三重測定の平均値±ＳＤを表す。
【０１５２】
図５Ｂに示した結果と同様に、本実施例はＭＨＣクラスＩＩ構造上での効率の良い提示及び有効なペプチド類似体の両方によって最も顕著な結果がもたらされるという見解を支持している。即ち、例えＩｇ−ＰＬＰ２キメラ抗体が取り込まれてプロセシングされたとしても、これが天然ＰＬＰアゴニストの類似体ではないため、Ｉ−ＡＳによるＰＬＰ２ペプチドの効率的な提示はＴ細胞の活性化を妨げない。従って、抗原提示細胞上におけるＭＨＣクラスＩＩ分子との単純な競合結合では所望の拮抗作用を生じさせないと思われる。
【０１５３】
実施例 Ｘ
ＰＬＰ１に対するＴ細胞応答のインビボ誘導
この実施例によって、本発明のキメラ抗体は、インビトロでのＴ細胞応答を生じさせる（実施例ＶＩＩ）ことに加えて、インビボで細胞応答を生じさせるために使用できることが証明された。詳細には、次の実施例はＩｇ−ＰＬＰ１によるＰＬＰ１特異的Ｔ細胞のインビボ感作を実証する。
【０１５４】
６〜８週齢のＳＪＬマウス（Ｈ−２Ｓ）をＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、 ＭＤ）から購入し、実験期間は動物施設で飼育した。
【０１５５】
マウスは、１：１（ｖ／ｖ）のＰＢＳ／ＣＦＡ混合物２００ｍＬ中で乳化した５０ｍｇのＩｇ−ＰＬＰ１を使用して足蹠並びに肢基部及び尾に皮下免疫した。１０日後、頸部脱臼によってマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節（腋窩、鼠蹊部、膝窩及び仙骨）を切除し、単一細胞懸濁液を調製し、Ｔ細胞応答を分析した。図７に示した結果は、４×１０５リンパ節細胞／ウェル（７Ａ）及び１０×１０５脾細胞／ウェル（７Ｂ）で得られたものである。アクチベーター　ＰＬＰ１及びＰＬＰ２は１５ｍｇ／ｍＬで使用し、そしてＰＰＤは５ｍｇ／ｍＬで使用した。
【０１５６】
先の実施例と同様に、Ｔ細胞活性化は３Ｈ−チミジン取り込みを含む増殖アッセイを使用してモニタした。ここでは、リンパ節及び脾細胞は、それぞれ４及び１０×１０５個の細胞／１００ｍＬ／ウェルで、９６ウェル丸底プレート内において、単一の選択したアクチベーター１００ｍＬを加えてに３日間インキュベートした。その後１ウェル当たり１ｍＣｉの３Ｈ−チミジンを添加し、さらに１２〜１４時間培養を続けた。細胞を次にグラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれた３Ｈ−チミジンはトレース９６プログラム及びＩｎｏｔｅｃｈβカウンターを使用してカウントした。刺激剤を有していないコントロール培地を各マウスについて含み、バックグランドとして使用した。
【０１５７】
図７に示した各値は実施例ＶＩＩＩに説明するように計算され、アクチベーターを含まない培地で得られたバックグランドｃｐｍを差し引いた後の三重測定の平均値±ＳＤを表す。マウス当たり１５０ｍｇのＩｇ−ＰＬＰでマウスを免疫したときに、同様の結果が得られた（表示なし）。
【０１５８】
図７Ａ及び７Ｂは、Ｉｇ−ＰＬＰ１を足蹠並びに肢基部及び尾に皮下注射したとき、ＰＬＰ１ペプチドに対する強く特異的なＴ細胞応答が誘導されたことを明らかに示している。反応の強さに関しては個々のマウス間で幾らか変動があったが、各マウスのリンパ節及び脾細胞はＰＬＰ１ペプチドによるチャレンジの際に顕著な応答を生じた。興味深いことに、全身性抗原を主としてろ過しそして応答する臓器である脾臓において顕著なＰＬＰ１特異的応答が検出されている。これらの結果を説明するために提案できる１つの可能性は、Ｉｇ−ＰＬＰ１は半減期が長いために、循環してリンパ及び血液循環の両方に到達して、その結果全身及びリンパの両部位で提示される可能性があったことである。これは自己免疫疾患の治療法を実施する際に非常に有益な可能性がある。マウスのなかには、細胞をＰＬＰ２ペプチドによってインビトロ刺激すると増殖を示すものがあることも興味深かった。おそらく、このペプチドがＩ−ＡＳ様ＰＬＰ１によって提示されるという事実によって、親和性の低い細胞が結合して応答を生じさせることが可能である。いずれにしても、その結果は、Ｉｇ−ＰＬＰ１が効率良くペプチドをＴ細胞にインビトロ提示することを示す前記実施例によって示された結果と一致していた。
【０１５９】
実施例　ＸＩ
ＰＬＰ１に対するＴ細胞応答のインビボ阻害
先の実施例に見られるように、Ｉｇ−ＰＬＰ１はインビボでＴ細胞を感作することができ、アゴニストＰＬＰ１ペプチドに暴露されたとき強力な免疫応答を生じる。本実施例では、ペプチドアンタゴニストをキメラ抗体免疫調節剤の形態で投与するとアゴニストリガンドのエンドサイトーシスによる提示によって生じる免疫応答を実質的に低下できることが証明される。具体的には、この実施例はＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲをＩｇ−ＰＬＰ１と同時投与することによってＰＬＰ１ペプチドに対する免疫応答が顕著に減少することを証明する。
【０１６０】
マウスは、５０ｍｇのＩｇ−ＰＬＰ１と１５０ｍｇのＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ、または５０ｍｇのＩｇ−ＰＬＰ１と１５０ｍｇのＩｇ−Ｗのいずれかの混合物で同時免疫した。特に、３つの群（４マウス／群）の個々のマウスに、５０ｍｇのＩｇ−ＰＬＰ１と１５０ｍｇのＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの混合物、５０ｍｇのＩｇ−ＰＬＰ１と１５０ｍｇのＩｇ−Ｗの混合物、あるいはＩｇ−ＰＬＰ１と１００ｍｇ のＰＬＰ−ＬＲペプチドの混合物のうちの１つを含有する２００ｍＬの混合物（ＰＢＳ／ＣＦＡ、１：１ ｖ／ｖ）を用いて実施例　Ｘと同様に皮下注射した。脾臓及びリンパ節Ｔ細胞応答は、実施例　Ｘに記載したプロトコルを用いて免疫後１０日目に分析した。リンパ節細胞は４×１０５細胞／ウェルで、脾細胞は１０×１０５細胞／ウェルでアッセイした。アゴニストリガンドは１５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ１であった。それぞれ図８Ａ及び８Ｂに示され以下の表２に要約されたリンパ節及び脾細胞に関する結果は、アゴニストを含有しない培地で得られたバックグランドｃｐｍを差し引いた後の三重測定の平均値±ＳＤを表す。
【０１６１】
図８Ａ及び８Ｂは、Ｉｇ−ＰＬＰ１が効率的に提示され、強いインビボＴ細胞応答を誘導した（実施例Ｘ）が、マウスに投与した混合物中にＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲを含むことによってそのような応答に拮抗作用することが可能であったことを示す。実際、マウスにＩｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲを同時投与したとき、それに引き続いて生じる遊離ＰＬＰ１ペプチドに対する免疫応答は図８Ａ及び８Ｂの右半分に示したように顕著に減少した。Ｉｇ−ＰＬＰ１と野生型抗体であるＩｇ−Ｗとの同時投与がＴ細胞応答を有意に低下させなかったので、脾臓及びリンパ節の両組織のＰＬＰ１応答の低さはＰＬＰ−ＬＲ拮抗作用の結果であったと思われる。これらの結果は、細胞応答低下の原因は、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲのＦｃＲ結合とエンドサイトーシスによるプロセシングを介するＰＬＰ−ＬＲの効率的なインビボ提示であることを強く示している。
【０１６２】
さらに、すぐ下の表２に示されるように、遊離ＰＬＰ−ＬＲペプチドとＩｇ−ＰＬＰ１を同時投与したとき、ＰＬＰ１応答が減少した徴候はなかった。この表に示した数値はＰＰＤ特異的増殖に対するＰＬＰ１特異的増殖のパーセント値を表しており、以下ようにして得られた。（ＰＬＰ１刺激で得られた三重測定の平均値（ｃｐｍ）−三重測定ＢＧの平均値（ｃｐｍ））／（ＰＰＤで得られた三重測定の平均値（ｃｐｍ）−三重測定ＢＧの平均値（ｃｐｍ））×１００。
【０１６３】
【表２】
2004509978.tif 000003
【０１６４】
前記の結果は明らかに、遊離アンタゴニストペプチド、またはアンタゴニストペプチドを欠損するコントロールＩｇ−Ｗとの同時投与は、発生する免疫応答を殆ど影響しないことを示している。遊離ＰＬＰ−ＬＲペプチドによる拮抗作用効果の欠如は、マウスは遊離ペプチド形態のＰＬＰ−ＬＲをＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ形態のものより約３４倍多く投与された（１５０，０００Ｄの分子量に基づくと、マウスに投与された１５０μｇのＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲは２ｎＭのＰＬＰ−ＬＲペプチドを含有する１ｎＭのＩｇに相当し、一方１００μｇの遊離ＰＬＰ−ＬＲペプチドは、分子量が１，４６８ダルトンであるので、６８ｎＭのペプチドに相当する）ので、注射ペプチドの正味量がより少ないためではなかった。Ｉｇ−ＰＬＰ１　Ｔ細胞刺激に拮抗するＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの潜在能力と合わせても、ＰＬＰ−ＬＲペプチドがＩｇ−ＰＬＰ１介在性Ｔ細胞活性化を阻害しなかったことは、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ介在性インビボ拮抗作用が提示の効率の良さに関連しているであろうという考えを支持している。
【０１６５】
実施例　ＸＩＩ
エンドサイトーシスによって提示されたアンタゴニストに対するＴ細胞応答の誘導
先の実施例は、アゴニストリガンドを含むキメラ抗体の投与がインビボで免疫細胞を感作できることを示している。アンタゴニストを含むキメラ抗体の投与が、その後のアゴニストリガンドによるチャレンジに対する応答を低下させ得ることもまた示された。この実施例では、アンタゴニストの効率的な提示は免疫細胞をインビボで感作し、そしてアゴニストペプチドに対するＴ細胞の反応に影響を与え得る強い応答を生じさせ得ることを証明する。具体的には、Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲを同時に注射したマウスは、ＰＬＰ−ＬＲに対して比較的高い増殖応答を発生するが、ＰＬＰ１ペプチドに対しては実際には全く応答を生じない。
【０１６６】
リンパ節及び脾細胞は、Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲとの同時投与後に実施例Ｘに先述した方法と同様にして得た。個々のマウスの増殖応答も、１５μｇ／ｍＬの遊離ＰＬＰ１ペプチドまたはＰＬＰ−ＬＲペプチドのどちらかによるインビトロ刺激後に先の実施例に前述した方法を用いて測定した。リンパ節及び脾臓細胞を用いたアッセイの結果をそれぞれ図９Ａ及び９Ｂに示す。
【０１６７】
図９から理解されるように、脾臓とリンパ節は共にアンタゴニストＰＬＰ−ＬＲに対して応答を生じたが、ＰＬＰアゴニストＰＬＰ１には応答を生じなかった。Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲをＩｇ−ＰＬＰ１と同時投与したとき、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲがＰＬＰ−ＬＲ特異的Ｔ細胞を誘導したことを理解すると、これらのＰＬＰ−ＬＲ特異的Ｔ細胞はＰＬＰ１特異的Ｔ細胞をダウンレギュレートすると推測することができる。逆に、遊離ＰＬＰ−ＬＲペプチドをＩｇ−ＰＬＰ１と共に投与したとき、ＰＬＰ−ＬＲ特異的応答の誘導が生じた（表示なし）が、ＰＬＰ１に対する増殖応答の明白な減少はなかった。従って、本実施例に記載したデータは、アンタゴニストを含むキメラ抗体の使用が、遊離ペプチドアンタゴニストよりも、抗原アゴニストに対する免疫応答を調節するのにははるかに有効であることを証明している。
【０１６８】
さらに詳細には、先述の実施例から、ＡＰＣ表面でＴＣＲがＰＬＰ−ＬＲ−Ｉ−ＡＳ複合体（即ち、ＭＨＣ−ＰＬＰ−ＬＲ複合体）に結合すると、Ｔ細胞を刺激するというよりはむしろこれらに拮抗作用するように思われる。従って、エンドサイトーシス液胞内でのＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの効率的な提示によって有意なレベルのＰＬＰ−ＬＲ−ＡＳ複合体（アンタゴニスト複合体）が確実に産生されるため、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲによる拮抗作用が生じると思われる。細胞表面にある複合体の量はＡＰＣに提供されるＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの量に比例する。ＰＬＰ１刺激をＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの存在下で実施すると、ＰＬＰ−ＬＲ−Ｉ−ＡＳとＰＬＰ１−Ｉ−ＡＳの両方とも所定ＡＰＣの表面に提示され、そこでＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ濃度が上昇するとＰＬＰ−ＬＲ−Ｉ−ＡＳ複合体数がさらに増加する。Ｔ細胞が活性化されるためには約３５００個のＴＣＲが結合されなければならず、そしてＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体のうちの所定の複合体が約２００個のＴＣＲを連続的に結合することが認められよう。このため、ＰＬＰ−ＬＲ−Ｉ−ＡＳ複合体によるＴＣＲの結合がアゴニストＰＬＰ１−Ｉ−ＡＳによる結合に優先するときに、Ｔ細胞が拮抗作用されると思われる。総じて、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲによってＰＬＰ−ＬＲが効率的に負荷されるため、Ｔ細胞拮抗作用はＰＬＰ−ＬＲ−Ｉ−ＡＳ複合体によるＴＣＲのより頻繁な連続的なトリガによって達成される。即ち、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲの効率的な取り込み及びプロセシングは単に、余りにも多くの表面ＭＨＣ複合体がＰＬＰ−ＬＲアンタゴニストを提示するので、ＰＬＰ１アゴニストリガンドを提示する残りの表面複合体がＴ細胞を活性化するためのＴＣＲ数を結合できないことを意味している。それ故、アンタゴニストが、ＭＨＣクラスＩＩ−アゴニスト複合体の活性化濃度がＡＰＣに到達しないことが確実な速度で提示されない限り、Ｔ細胞は活性化されない。
【０１６９】
実施例　ＸＩＩＩ
Ｉｇ−ＰＬＰキメラによる免疫に対するリンパ節増殖応答
増殖応答は、個々のＩｇ−ＰＬＰキメラまたはＩｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲから成る種々の混合物で免疫したマウスで測定した。マウスに単独で投与したＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲがＴ細胞を誘導したことが観察され、そしてこれらのＴ細胞は、Ｉｇ−ＰＬＰ１によって誘導されたＴ細胞と同様に、ＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲペプチドの両方と交差反応した。しかしながら、驚いたことに、応答の交差反応性にも拘わらず、キメラを共に投与したとき、これらは互いに用量依存性拮抗作用を呈示し、その結果両Ｔ細胞応答のダウンレギュレーションを起因した。つまり、ＩＧ−ＰＬＰ１またはＩＧ−ＰＬＰ−ＬＲのどちらかによって誘導された抗原特異的Ｔ細胞は、これら細胞をＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲの両方で同時にインビトロ刺激したとき、ペプチド混合物によるダウンレギュレーションに抵抗を示し、有意に増殖した。これらの所見は、アゴニストとアンタゴニストのペプチドのどちらも互いに逆反応を及ぼし、逆平行拮抗作用及びナイーブＴ細胞のレベルでＴＣＲトリガにストリンジェントな制御があることを示している。
【０１７０】
前述のように材料を取得してマウスを免疫した。増殖応答は前記実施例ＶＩに先述したようにチミジン取り込みによって測定した。リンパ節及び脾細胞は、Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの同時投与後に実施例Ｘに先述した方法と同方法で得た。マウスには、５０μｇのＩｇ−ＰＬＰ１（１０Ａ）、５０μｇのＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（１０Ｂ）、１００μｇのＰＬＰ１（１０Ｃ）または１００μｇのＰＬＰ−ＬＲ（１０Ｄ）を含有するＣＦＡを注射して、１０日後に、リンパ節細胞を指定の遊離ペプチドでインビトロ刺激した。刺激剤ＰＬＰ１、ＰＬＰ−ＬＲ及びＰＬＰ２は１５μｇ／ｍＬの特定された最適濃度で使用した。
【０１７１】
図１０Ａ〜１０Ｄに示したデータは、ＰＬＰ１ペプチドと同様に、Ｉｇ−ＰＬＰ１がＰＬＰ１ペプチドに対する特異的Ｔ細胞応答を誘導することを示した。同様に、ＰＬＰ−ＬＲペプチドと同様に、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲはＰＬＰ−ＬＲペプチドに対する特異的Ｔ細胞応答を誘導した。Ｉｇキメラまたは遊離ペプチドのどちらも、Ｉ−ＡＳクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドであるネガティブコントロールＰＬＰ２と有意に反応するＴ細胞を誘導しなかった。しかしながら、驚いたことに、Ｉｇ−ＰＬＰ１によって誘導される応答はＰＬＰ−ＬＲペプチドと交差反応し、一方Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲによって誘導される応答はＰＬＰ１と交差反応した。遊離ＰＬＰ１または遊離ＰＬＰ−ＬＲで誘導される応答は交差反応性ではなかった。
【０１７２】
実施例　ＸＩＶ
Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲによる同時免疫に対する リンパ節Ｔ細胞増殖応答 マウスに指定したキメラを注射して、１０日後にリンパ節細胞を遊離ペプチドでインビトロ刺激し、先に詳記した［３Ｈ］チミジン取り込みによって増殖アッセイを行った。結果を図１１に示す。
【０１７３】
Ｉｇキメラ表示の前の数字はマウス当たりの注射量（μｇ）を示す。刺激剤は５μｇ／ｍＬのＰＰＤ、１５μｇ／ｍＬのＰＬＰ１、ＰＬＰ−ＬＲ及びＰＬＰ２であった。刺激剤を加えないでインキュベートした細胞をバックグランド（ＢＧ）として使用した。マウスは個別に試験し、そして各刺激剤について三重複ウェルをアッセイした。結果を標準化して個々に固有の変動性を排除するために、本発明者は結果を以下のように算定した相対的増殖として表した：（試験ペプチドの平均値（ｃｐｍ）−ＢＧの平均値（ｃｐｍ））／（ＰＰＤの平均値（ｃｐｍ）−ＢＧの平均値（ｃｐｍ））。表示の相対的増殖は個別に試験した５匹のマウスの平均値±ＳＤを表す。異なるマウス群についてＰＰＤ刺激で得られた平均値（ｃｐｍ）±ＳＤを以下に示す：５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ１：１６，４１３±１３３０；５０μｇ　Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ：１１，２２４±３４８１；５０μｇ Ｉｇ−Ｗ：１１，５１３±１，５７２；５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ１＋５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ：１６，８１７±２，８６９；５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ１＋１５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ：１６，１５６±２００６；５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ１＋１５０μｇ　Ｉｇ−Ｗ：１１，６９９±１，１４２；５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ＋１５０μｇ　Ｉｇ−Ｗ：１３，４３５±１，６５０；５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ１＋５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ２：１０，０５６±１，４０７；及び５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ＋５０μｇ Ｉｇ−ＰＬＰ２：１０，８７７±５６３。斜め格子付き棒及び平行斜線付き棒はそれぞれＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲに対する増殖を示す。ＰＬＰ２ペプチドに対する増殖は、Ｉｇ−ＰＬＰ２を免疫混合物中に使用した場合を除いてはバックグランドレベルであった。
【０１７４】
図１１に見られるように、Ｉｇ−ＰＬＰ１で免疫したマウス群由来のリンパ節Ｔ細胞はＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲに対して同等に良く増殖したが、Ｉｇ−Ｗコントロールは殆ど反応を起こさなかった。驚いたことに、ＰＬＰ−ＬＲ応答はバックグランドレベルであった。従って、Ｉｇキメラに対する応答はＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲペプチド間に交差反応性を共有しているが、この混合物は追加応答ではなくてダウンレギュレーションを起こした。事実、これらのデータはＩｇ−ＰＬＰ１（アゴニスト）とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（アンタゴニスト）間に逆平行ダウンレギュレーションがあることを示唆している。５０μｇの Ｉｇ−ＰＬＰ１と１５０μｇの Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲの混合物を注射したマウスがＰＬＰ１には応答せず、ＰＬＰ−ＬＲに対してはＩｇ−ＰＬＰ１のみを注射したマウスで観察された値にまで減少した応答を生じたため、このダウンレギュレーションは用量依存性であると思われた。
【０１７５】
ＩＧ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ間で観察された逆方向のダウンレギュレーションに対する１つの可能な説明は、クローンの増殖には同種ペプチドによる最適な連続トリガが必要である（即ち、増殖するためには単一のナイーブＴ細胞上のレセプターの全てまたは大部分が１つの型のペプチドを利用しなければならない）ということである。Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの混合物に関わる免疫中に生じる可能性がある、ＴＣＲ接触残基に僅かな差異を有するペプチドでナイーブＴ細胞を同時刺激すると、Ｔ細胞の増殖及びインビトロ増殖を生じさせない。
【０１７６】
実施例　ＸＶ
Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲで同時免疫したマウスの脾臓増殖Ｔ細胞応答
図１２に示したように、実施例ＸＩＶに記載したマウス由来の脾細胞を、三重複ウェルでＰＬＰ１（斜め格子付き棒）及びＰＬＰ−ＬＲ（平行斜線付き棒）で刺激して、前記のように増殖を測定した。結果は、ＰＰＤ刺激による脾細胞の増殖が最小であったため、リンパ節Ｔ細胞で得られたＰＰＤのｃｐｍを使用して前記のように標準化した。表示した相対的増殖は個別に試験した５匹のマウスの平均値±ＳＤを表す。
【０１７７】
これらのマウス由来の脾臓Ｔ細胞はＰＬＰ−ＬＲ刺激に応答しなかった。しかしながら、別の群のマウスをＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲで免疫したとき、リンパ節と脾細胞はどちらもＰＬＰ１及びＰＬＰ−ＬＲペプチドに対して増殖した。脾臓では、増殖応答はリンパ節よりもはるかに低かったが、追加応答は未だ観察されなかった。むしろ、Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ間に逆方向のダウンレギュレーション効果が観察された。Ｉｇ−ＷにＩｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲのいずれかを加える同時注射はどちらの応答にも影響を与えなかったが、Ｉｇ−ＰＬＰ２とＩｇ−ＰＬＰ１の同時注射はＩｇ−ＰＬＰ１で誘導されたＴ細胞のなかでＰＬＰ−ＬＲに対する反応性を増加させた。
【０１７８】
実施例　ＸＶＩ
Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲで同時免疫したマウスの脾細胞によるＩＬ−２産生　
Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ間の逆方向のダウンレギュレーションをさらに研究するために、脾臓抗原誘導性サイトカイン応答を、単一のＩｇ−キメラまたは両方のＩｇ−キメラのいずれかで免疫した動物で測定した。図１３に示されるように、実施例ＸＩＶで説明したマウス由来の脾臓細胞（１×１０６細胞／ウェル）をＰＬＰ１（斜め格子付き棒）及びＰＬＰ−ＬＲ（平行斜線付き棒）で２４時間刺激した。ＩＬ−１（１３Ａ）、ＩＦＮγ（１３Ｂ）及びＩＬ−４（１３Ｃ）の産生は以下のように測定した。
【０１７９】
細胞は、９６ウェルの丸底プレートの１０×１０５細胞／１００μＬ／ウェルで１００μＬの刺激剤を使用して先述のように、２４時間インキュベートした。サイトカイン産生は、１００μＬの培養上清を使用してＰｈａｒｍｉｎｇｅｎの指示に従ってＥＬＩＳＡ法で測定した。捕獲抗体はラット抗マウスＩＬ−２、ＪＥＳ６−１Ａ１２；ラット抗マウスＩＬ−４、１１Ｂ１１；ラット抗マウスＩＦＮγ、Ｒ４−６Ａ２；及びラット抗マウスＩＬ−１０、ＪＥＳ５−２Ａ５であった。ビオチン化抗サイトカイン抗体はラット抗マウスＩＬ−２、ＪＥＳ６−５Ｈ４；ラット抗マウスＩＬ−４、ＢＶＤ６−２４Ｇ２；ラット抗マウスＩＦＮγ、ＸＭＧ１２；及びラット抗マウスＩＬ−１０、ＪＥＳ５−１６Ｅ３であった。ＯＤ４０５は、ＳＯＨ ＭＡＸ ＰＲＯバージョン１．２．０．ソフトウエアを使用してＳｐｅｃ　３４０カウンター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。標準曲線を作成するために、段階的に変化する量の組換えマウスＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ及びＩＬ−１０を全ての実験に含めた。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。刺激剤を加えないでインキュベートした細胞をバックグランド（ＢＧ）として使用した。各マウスは各刺激剤について三重複ウエルで個別に試験し、表示値（ｃｐｍ）はＢＧ値（ｃｐｍ）を差し引いた後の平均値±ＳＤを表す。ＩＬ−１０の産生も測定したが、結果はバックグランドレベルであった（表示なし）。
【０１８０】
ＰＬＰ１ペプチドによるインビトロ刺激に際して、Ｉｇ−ＰＬＰ１で免疫したマウス由来のＴ細胞はＩＬ−２、ＩＦＮγ及び少量のＩＬ−４を産生した。しかしながら、同一細胞をＰＬＰ−ＬＲで刺激すると最小量のＩＬ−２が産生されたが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４は検出されなかった。Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲで免疫したマウス由来の脾細胞は、ＰＬＰ１ペプチドによる刺激によってＩＬ−２を産生したが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４は全く産生しなかった。さらに、ＰＬＰ−ＬＲペプチド刺激では最小限のＩＬ−２応答しか生じなかった。等量のＩｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲで免疫したマウスでは、いずれのペプチドによる刺激の際も、サイトカイン産生は最小限またはバックグランドレベルにまで減少した。Ｉｇ−Ｗとキメラのいずれかによる同時免疫はサイトカイン産生パターンに対して測定可能な効果を及ぼさなかった。動物にＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ：Ｉｇ−ＰＬＰ１＝３：１の比率になるようにキメラを投与したとき、脾臓増殖応答及びＩＬ−２産生はバックグランドレベルであったが、ＰＬＰ−ＬＲペプチドによる刺激の際に有意量のＩＬ−４及びＩＦＮγが産生されたことが明らかであった。従って、過剰Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲは、ＰＬＰ−ＬＲが優先する混合によるＴＣＲトリガを導き、サイトカインを産生できる細胞を誘導するが増殖応答は示さない。これらのデータは、Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲは互いに逆の反応を及ぼし合い、両Ｔ細胞応答のダウンレギュレーションをもたらすことを示した。
【０１８１】
実施例　ＸＶＩＩ
ＰＬＰ１とＰＬＰ−ＬＲペプチド混合物によるインビトロ刺激時の抗原暴露Ｔ細胞の増殖
Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲが、抗原に暴露された交差反応性Ｔ細胞レベルで互いに逆の反応を呈することができるか否かを研究するために、マウスをＩｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ単独で免疫し、そして遊離ＰＬＰ１とＰＬＰ−ＬＲペプチドから成る種々の混合物によるインビトロ刺激時の増殖性Ｔ細胞応答を評価した。
【０１８２】
さらに詳細には、マウス（４匹／群）は、５０μｇのＩｇ−ＰＬＰ１（１４Ａと１４Ｂ）または５０μｇのＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（１４Ｃと１４Ｄ）を含有するＣＦＡで免疫し、１０日後にリンパ節（１４Ａと１４Ｃ）及び脾臓（１４Ｂと１４Ｄ）の細胞を指定のペプチドで刺激して、前記のように［３Ｈ］チミジン取り込みについてアッセイした。ペプチド標示の前の数字は、インビトロ刺激に使用した量μｇ／ｍＬを示す。特異的増殖は、試験サンプルから得た値（ｃｐｍ）からＢＧ（刺激剤なしで細胞をインキュベートして得た）の平均値（ｃｐｍ）を差し引いて評価した。表示値（ｃｐｍ）は個別に試験した４匹のマウスの平均値±ＳＤを表す。ＮＤは測定しなかったことを示す。
【０１８３】
図１４Ａ〜１４Ｄに見られるように、Ｉｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲで免疫したマウス由来のリンパ節と脾の細胞はどちらも、単一のペプチドによる刺激に対してと同様に、ＰＬＰ１とＰＬＰ−ＬＲの混合物に対して同等に増殖した。前記混合物に対する増殖応答は、殆どの場合、単一ペプチドの刺激に対する応答よりもさらに高かった。
【０１８４】
実施例　ＸＶＩＩＩ
ＰＬＰ１／ＰＬＰ−ＬＲペプチド混合物による インビトロ刺激時の抗原暴露Ｔ細胞によるＩＬ−２産生
Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲが、抗原に暴露された交差反応性Ｔ細胞レベルで互いに逆の反応を呈することができるか否かを研究するために、マウスをＩｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ単独で免疫し、そして遊離ＰＬＰ１とＰＬＰ−ＬＲペプチドから成る種々の混合物によるインビトロ刺激時のサイトカイン応答を評価した。結果を図１５Ａと１５Ｂに示す。
【０１８５】
Ｉｇ−ＰＬＰ１（１５Ａ）及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（１５Ｂ）で免疫したマウス由来の脾細胞を指定するペプチドで刺激し、そして実施例ＸＶＩのようにＥＬＩＳＡ法によってＩＬ−２産生について試験した。これらの実験で使用した脾臓細胞は実施例ＸＶＩＩに記載のマウス由来であった。ペプチドの名称の前の数字は刺激に使用した量μｇ／ｍＬを表す。表示のμｇ／ｍＬのＩＬ−２値は個別に試験した４匹のマウスの平均値ｄ：ＳＤを表す。
【０１８６】
実施例ＸＶＩＩで示したように、ＩＬ−２産生はＰＬＰ１とＰＬＰ−ＬＲから成る種々の混合物による脾細胞の刺激時には減少しなかった。反対に、ペプチド混合物による刺激の殆どの場合、ＩＬ−２産生は単一ペプチドによる刺激よりも多かった。これらの所見は、アゴニストとアンタゴニストのペプチドのどちらも互いに逆の反応を及ぼし、そして逆平行拮抗作用及びナイーブＴ細胞のレベルでＴＣＲトリガにストリンジェントな制御があることを示している。
【０１８７】
成体の免疫応答を減弱するために、Ｔ細胞レセプターアンタゴニスト及びアゴニストを含む免疫調節剤を使用することに加えて、以下の実施例で証明されるように、好都合にも同一組成物が新生児及び乳児で寛容を誘導するために使用できる。
【０１８８】
実施例　ＸＩＸ
出生時にＩｇ−ＰＬＰ１の注射を受けたＳＪＬ／Ｊマウスは成体期でのＥＡＥの誘導に抵抗性を有する
本発明の組成物を新生児または乳児に接種することの利点を証明するために、本明細書に説明するように新生児マウスに免疫調節剤を投与し、そして自己免疫誘導剤に暴露した。
【０１８９】
さらに詳細には、新生児マウス（１０マウス／群）に、誕生後２４時間以内に１００μｇのアフィニティクロマトグラフィー精製Ｉｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−Ｗを注射して、７週齢時に遊離ＰＬＰ１ペプチドでＥＡＥを誘導した。臨床徴候についてマウスを以下のように毎日スコアした。０、臨床徴候なし；１、尾部緊張の喪失；２、後肢弱化；３、後肢麻痺；４、前肢麻痺；及び５、瀕死または死亡。パネルＡは全マウスの臨床スコア平均値を示し、パネルＢは生存動物についてのみスコア平均値を示す。ＥＡＥは足跡並びに肢及び尾基部に、１００μｇの遊離ＰＬＰ１ペプチド及び２００μｇの結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｅｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａを含有する２００μＬのＩＦＡ／ＰＢＳ（１ｖ／１ｖ）溶液を皮下注射することによって誘導した。６時間後、５×１０９個の不活性化百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を静脈内投与した。４８時間後、さらに５×１０９個の不活性化百日咳菌をマウスに投与した。
【０１９０】
図１６Ａ及び１６Ｂに見られるように、出生時にＩｇ−ＰＬＰ１含有生理食塩水を投与された成体マウスは遊離ＰＬＰ１ペプチドによるＥＡＥ誘導に抵抗性を有した。実際、それらのマウスにおいては、ＰＬＰペプチドを有さない親の野生型ＩｇであるＩｇ−Ｗを投与された動物よりも臨床スコアがはるかに低かった。その上、Ｉｇ−Ｗを投与されたマウスとは反対に、Ｉｇ−ＰＬＰ１を注射されたマウスは再発を示さなかった（図１６Ｂ）。
【０１９１】
実施例　ＸＸ
新生児胸腺及び脾臓抗原提示細胞による Ｉｇ−ＰＬＰ１のインビボ提示
実施例　ＸＩＸで観察された臨床結果を確認するために、サイトカイン応答を新生児マウスで測定した。得られたデータを図１７示す。
【０１９２】
詳細には、新生児（５マウス／群）に、誕生後２４時間以内に１００μｇのＩｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−Ｗを注射した。２日後マウスを屠殺し、プールした胸腺（１７Ａ）及び脾臓（１７Ｂ）の細胞を照射し、前述のようにＰＬＰ１特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ４Ｅ３の刺激用ＡＰＣとして使用した。Ｔ細胞活性化の尺度として使用した上清中のＩＬ−２産生は、ＩＬ−２依存性ＨＴ−２細胞系を使用して、Ｋｕｃｈｒｏｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３３２６、１９９４、に説明されるように測定した（本明細書に参照により編入している）。表示の値（ｃｐｍ）は三重測定の平均値±ＳＤを表す。
【０１９３】
投与されたＩｇ−ＰＬＰ１は新生児ＡＰＣによって効率的に提示された。Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与された新生児由来の胸腺（１７Ａ）及び脾臓（１７Ｂ）のＡＰＣはどちらも、外因性抗原を追加しなくてもＰＬＰ１ペプチドに特異的なＴ細胞ハイブリドーマを活性化した。Ｉｇ−Ｗを投与された新生児由来のＡＰＣはＴ細胞ハイブリドーマを活性化できなかった。
【０１９４】
実施例　ＸＸＩ
出生時にＩｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスにおける脾臓増殖Ｔ細胞応答の低下
先の２つの実施例で観察された結果をさらに確認するために、増殖応答を出生時に免疫調節剤を接種されたマウスで測定した。結果を図１８Ａと１８Ｂに示す。
【０１９５】
新生児には、１００μｇのＩｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−Ｗ含有生理食塩水を誕生後２４時間以内に腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。マウスが７週齢に達したとき、足跡並びに肢及び尾基部の皮下（ｓ．ｃ．）に１００μｇの遊離ＰＬＰ１ペプチドを含有する２００μＬのＣＦＡ／ＰＢＳ（１容量／１容量）で免疫した。１０日後マウスを屠殺し、（１８Ａ）リンパ節（０．４×１０６細胞／ウェル）及び（１８Ｂ）脾臓（１×１０６細胞／ウェル）の細胞を、ＰＬＰの脳炎誘発配列１７８〜１９１（１３）に相当するネガティブコントロールペプチドである、１５μｇ／ｍＬの遊離ＰＬＰ１またはＰＬＰ２で４日間インビトロ刺激した。１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを、刺激の最後の１４．５時間中に添加し、増殖はＩｎｏｔｅｃｈγカウンター及びトレース９６　Ｉｎｏｔｅｃｈプログラムを使用して測定した。表示の値（ｃｐｍ）は個別に試験したマウスの三重複試験平均値±ＳＤを表す。Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−Ｗを投与された全てのマウスのリンパ節増殖応答の平均値（ｃｐｍ）±ＳＤはそれぞれ、３４，８１２±７，５０８及び３７，０２６±１０，１３３であった。脾臓増殖応答平均値はＩｇ−ＰＬＰ１投与群で３，３００±３，４００であり、Ｉｇ−Ｗ投与群では１４，８９２±４，７６９であった。
【０１９６】
出生日にＩｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスは、Ｉｇ−Ｗを注射されたマウスと同様に、これらマウスを遊離ＰＬＰ１ペプチド（１８Ａ）を含有するＣＦＡで免疫したとき、ＰＬＰ１に対して等価の成体リンパ節Ｔ細胞増殖応答を生じた。しかしながら、脾臓増殖応答はＩｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウス（１８Ｂ）において顕著に減少し、従って寛容の誘導を示した。どの群のマウスも、ＰＬＰ１と同様に、Ｉ−ＡＳクラスＩＩ分子によって提示されるネガティブコントロールペプチドであるＰＬＰ２に対して有意な増殖応答を示さなかった。
【０１９７】
実施例　ＸＸＩＩ
出生時にＩｇ−ＰＬＰ１で処理したマウスにおけるリンパ節Ｔ細胞逸脱
乳児または新生児における寛容の誘導をさらに証明するために、出生時に免疫調節剤を接種したマウスでサイトカイン応答を測定した。結果を図１９Ａ〜１９Ｃに示す。
【０１９８】
特に、実施例ＸＸＩに記載したマウス由来のリンパ節細胞（４×１０５細胞／ウェル）を、遊離ＰＬＰ１またはＰＬＰ２（１５μｇ／ｍＬ）を用いてインビトロで２４時間刺激し、そしてＩＬ−２（１９Ａ）、ＩＬ−４（１９Ｂ）及びＩＦＮγ（１９Ｃ）の産生を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎの抗サイトカイン抗体対を用いて実施例ＸＶＩに説明するようにＥＬＩＳＰＯＴで測定した。表示の値（スポット形成単位）は個別に試験した８匹のマウスの平均値±ＳＤを表す。
【０１９９】
これらの結果は、サイトカイン産生パターンが新生児マウスの接種によって影響されたことを示す。出生時にＩｇ−Ｗを投与されたマウス由来のリンパ節細胞は、ＰＬＰ１刺激すると、ＩＬ−２を産生したがＩＦＮγまたはＩＬ−４は産生しなかった。対照的に、Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウス由来の細胞は逸脱し、そして代わりにＩＬ−４を産生した。ＰＬＰ２ペプチドで刺激してもサイトカイン産生は観察されなかった。
【０２００】
実施例　ＸＸＩＩＩ
出生日にＩｇ−ＰＬＰ１の注射を受けたマウス由来の脾臓Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生の低下
実施例ＸＸＩＩで得られた結果を確認するために、同一マウス由来の脾細胞をサイトカイン応答についてアッセイした。結果を図２０Ａと２０Ｂに示す。
【０２０１】
さらに詳細には、前記マウス由来の脾細胞（１×１０６細胞／ウェル）を、遊離ＰＬＰ１またはＰＬＰ２（１５μｇ／ｍＬ）を用いてインビトロで２４時間刺激し、上清中のＩＬ−２（２０Ａ）、ＩＬ−４（２０Ｂ）及びＩＦＮγ（２０Ｃ）の産生を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製の抗サイトカイン抗体対を製造者の指示に従って用いてＥＬＩＳＡ法で測定した（実施例ＸＶＩ）。表示のサイトカイン量は個々に試験した８匹のマウスの平均値±ＳＤを表す。
【０２０２】
脾臓では、Ｉｇ−Ｗを接種したマウス由来細胞はＩＬ−２及びＩＦＮγを産生した。逆に、Ｉｇ−ＰＬＰ１の注射を受けたマウス由来の細胞はＩＬ−２を産生したが検出可能なレベルのＩＦＮγは産生しなかった。ネガティブコントロールであるＰＬＰ２ペプチドはサイトカイン産生を誘導しなかった。
【０２０３】
実施例　ＸＸＩＶ
出生時にＩｇ−ＰＬＰ１の注射を受けたマウスにおける脾臓Ｔ細胞増殖のサイトカイン介在性回復
増殖応答が回復可能であることを証明するために、接種された新生児マウス由来の細胞を外因性ＩＦＮγに暴露した。結果を図２１に示す。
【０２０４】
特に、出生時に１００μｇのＩｇ−ＰＬＰ１を腹腔内注射された新生児群は、実施例ＸＸＩのように１００μｇのＰＬＰ１ペプチドを含有するＣＦＡで免疫して、遊離ＰＬＰ１ペプチド（１５μｇ／ｍＬ）による脾細胞（１×１０６細胞／ウェル）のインビトロ刺激を、１００単位のＩＦＮγまたはＩＬ−１２を含むことを以外は、実施例ＸＸＩに記載したように実施した。各マウスについての表示値（ｃｐｍ）は三重複ウエルの平均値±ＳＤを表す。
【０２０５】
驚いたことには、出生時にＩｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウス由来の脾細胞に外因性ＩＦＮγを添加すると増殖応答を回復した。ＩＦＮγの誘導物質（１４）であるＩＬ−１２も脾臓細胞増殖応答を回復した。
【０２０６】
総じて、出生時にＩｇ−ＰＬＰ１の注射を受けたマウスはリンパ節Ｔ細胞逸脱及び異常なＩＦＮγ介在性脾臓アネルギーを発生した。興味深いことに、遊離ＰＬＰ１ペプチドを用いてこれらのマウスにＥＡＥを誘導したとき、マウスは軽度の単相性疾病を発症したが、再発はなかった。Ｉｇは長い半減期を有しているため、Ｉｇに基づく免疫調節剤は長期間にわたって存続すると思われ、その結果、従来の抗原を有する不完全フロイントアジュバントを用いた通常の新生児寛容化方法で生じるものと同様な免疫抑制因子の連続的且つ緩慢な放出が生じる可能性がある。従って、Ｉｇで送達すると新生児寛容の誘導においてアジュバントの使用が回避できると思われる。さらに、ＦｃＲを介する免疫抑制因子の細胞内取り込みとそれに続くエンドサイトーシス経路におけるプロセシングによって、新たに合成されたＭＨＣクラスＩＩ分子にアクセスが可能となり、有意量のＭＨＣ−免疫抑制因子複合体が産生される。これらの好ましいパラメーター（即ち、ＦｃＲ介在性ＡＰＣ活性化、緩慢なペプチド放出及び効率の良いペプチド提示）はリンパ節逸脱及び脾臓アネルギーの誘導に寄与すると思われる。本開示による組成物の成体への投与と同様に、アジュバントを使用しない寛容化方法を使用して自己反応性Ｔ細胞を沈静化し、自己免疫を予防することができる。
【０２０７】
実施例　ＸＸＶ
可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１はＥＡＥ罹患マウスにおいて麻痺の重症度を低下させ、さらに臨床的再発を抑制する
遊離ＰＬＰ１ペプチドでＳＪＬ／ＪマウスにＥＡＥを誘導し、疾患の臨床的徴候が明白になったとき、動物に可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１（可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１）を含有する生理食塩水の注射を３回、４日間隔で行い、疾患重症度の低下について評価した。コントロールマウスには、ＰＬＰ１ペプチドを含まない親Ｉｇである、可溶性Ｉｇ−Ｗ（可溶性Ｉｇ−Ｗ）を投与した。６〜８週齢のＳＪＬ／Ｊマウス群に１００μｇのＰＬＰ１ペプチドを用いてＥＡＥを誘導し、次に疾患誘導後９日目、１３日目、及び１７日目に、５００μｇの可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、５００μｇの可溶性Ｉｇ−Ｗ、または１００μｇの遊離ＰＬＰ１ペプチドを含有するＰＢＳの腹腔内投与を行った。Ｉｇ−ＰＬＰ１の分子量（１５０ｋＤ）及び遊離ＰＬＰ１の分子量（１．５ｋＤ）に基づき、３回の注射中に投与された３００μｇの遊離ＰＬＰ１は、約　２００ｎＭのＰＬＰ１ペプチドに相当し、１５００μｇの可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１は約　２０ｎＭのＰＬＰ１ペプチドを包含する。従って、遊離ＰＬＰ１を処理に使用する場合、マウスは可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１による処理よりも　約１０倍多いペプチドを投与された。
【０２０８】
結果は図２２に示す。各点は８匹のマウスの臨床スコア平均値を表す。図２２に示す結果は、２つの個別の実験を表示する。
【０２０９】
図２２に示すように、可溶性Ｉｇ−Ｗで処理されたマウスは、麻痺の初期重症フェーズでは最大スコア平均値が３．７ （ ０．５ であり、１２０日間の試験期間を通して再発を呈した。しかしながら、可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理を受けたマウスは、疾患の初期フェーズにおいて麻痺重症度が軽減され、最大スコア平均値が２．５ （ ０．３ （ｐ＜ ０．００５） を示し、４２日目までには完全に回復した。遊離ＰＬＰ１ペプチドの１０倍過剰で処理されたマウスは、疾患の初期フェーズで麻痺重症度を若干軽減したが（最大臨床スコア平均値：３．０ （ ０．２）、全く回復することはなく、さらに１２０日間の全観察期間を通じて再発を起こした（図２２）。
【０２１０】
図２２に示すように、罹患マウスへのアジュバントを含まないＩｇ−ＰＬＰ１キメラの注射はＰＬＰ１特異的病原性Ｔ細胞を調節して、ＥＡＥを改善するために（図２２）、Ｉｇによるペプチド送達の効力は、同時刺激性分子その発現レベルが最小限であるか、あるいは発現していない末梢ＡＰＣにまで拡大すると思われる。この結論は、遊離ペプチド形態にある２００ｎＭのＰＬＰ１では疾患重症度を僅か軽減するのみで、動物が回復しないが、可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１形態にある２０ｎＭのペプチドは、疾患初期フェーズの重症度を低下させ、さらにほとんどの動物が４２日までに完全に回復したという所見によって支持される（図２２）。
【０２１１】
実施例　ＸＸＶＩ
アゴニストまたはアンタゴニストを含むがアジュバントを含まない可溶性免疫グロブリンの投与は、疾患重症度を低下させ、さらに同時刺激がなくてもペプチド提示を生じる
ＰＬＰ１ペプチドでＳＪＬマウス群にＥＡＥを誘導し、疾患が臨床的に明らかになったとき、動物に可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１または可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲを含有する生理食塩水の注射を３回、４日間隔で行って、疾患重症度の低下について評価した。コントロール目的で、ミエリンペプチドを含まない親のＩｇであるＩｇ−Ｗを投与されたマウス群を含んだ。
【０２１２】
ＳＪＬ／Ｊマウスの群に、１００μｇのＰＬＰ１ペプチドを含有する２００μｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） Ｈ３７Ｒａを含むＰＢＳ／ＩＦＡ（ｖ／ｖ）の皮下注射によってＥＡＥを誘導した。注射の６時間及び４８時間後に、５×１０９　百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を静脈内投与して、麻痺の徴候について以下のように毎日マウスをスコア付けした：０、臨床徴候なし；１、尾部緊張の喪失；２、後肢弱化；３、後肢麻痺；４、前肢麻痺；及び５、瀕死または死亡。疾患誘導後９日目、１３日目、及び１７日目に、マウスに５００μｇ　可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ、またはＩｇ−Ｗを含有する５００μｌＰＢＳを腹腔内投与した。
【０２１３】
図２３に示す結果は、Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ処理マウスはどちらも疾患の初期ピーク中に臨床的重症度を軽減し、最大スコア平均値は、Ｉｇ−Ｗ処理マウスの３．７ （ ０．５からＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ及びＩｇ−ＰＬＰ１処理マウスではそれぞれ ２．９ （ ０．２及び２．４ （ ０．３ までの降下を呈した（表３）。興味深いことには、Ｉｇ−Ｗ投与マウスは観察した全１２０日を通して再発を示したが、Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ処理マウスはそれぞれ３１日及び３８日までに麻痺を回復し、再発を示さなかった。１０倍過剰の遊離ＰＬＰ１またはＰＬＰ−ＬＲペプチドで処理されたマウスは、臨床的重症度をほとんど軽減せず、１２０日の観察期間を通じて再発を続けた（データ表示なし）。
【０２１４】
【表３】
2004509978.tif 000004
【０２１５】
Ｉｇ−キメラはアジュバントなしでマウスに投与されたため、末梢ＡＰＣ上の同時刺激性分子のアップレギュレーションが生じることはなく、同時刺激性分子を欠如するか、あるいはそのレベルが低下されている細胞によるペプチド提示を誘導して、それによって自己反応性Ｔ細胞の寛容を導く可能性はない。
【０２１６】
この点を研究するために、ＡＰＣ表面上の主要な同時刺激性分子の発現を、可溶性Ｉｇキメラを加えてインキュベーションすることによって評価した。マクロファージは２ｍＬのチオグリコレートブロスの注射を行った５日後に、腹膜腔を８ｍＬのＨＢＳＳ　４μＭ　ＥＤＴＡで洗浄することによってマウスの腹膜細胞から収集した。マクロファージ（１．０ ｘ １０６ 細胞／ｍＬ）は次に０．３μＭ　可溶性Ｉｇ−ＰＬＰキメラ（黒線）または培地のみ（ＮＩＬ、灰色）を加えてインキュベートした。２４時間後、細胞を収集して抗−Ｆ４／８０（ＨＢ−１９８、ＡＴＣＣ）、及び抗Ｂ７．１（１Ｇ１０；ＣＲＬ−２２２３，ＡＴＣＣ）、抗−Ｂ７．２（２Ｄ１０；ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ）、あるいは抗ＣＤ４０で染色した。柱状図表は、Ｆ４／８０＋ゲート細胞を示し、Ｂ７．１、Ｂ７．２、あるいはＣＤ４０の強度を示す。
【０２１７】
図２４に示す結果は、可溶性Ｉｇ−キメラの存在下で２４時間培養された腹膜マクロファージは、Ｉｇ−キメラを含まない状態で培養されたマクロファージと同レベルのＢ７．２を有することを示す。しかしながら、Ｂ７．１及びＣＤ４０発現は、可溶性Ｉｇ−キメラを含まない培地中で培養された細胞に観察される発現の基礎レベルと比べて低下されている。従って、アゴニストまたはアンタゴニストを含む可溶性免疫グロブリンによる処理は、同時刺激なしにペプチド提示を生ぜしめ、それによって天然末梢性寛容を刺激して自己反応性Ｔ細胞を調節する。
【０２１８】
実施例　ＸＸＶＩＩ
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１によるＥＡＥの改善
本発明の組成物及び方法に関する臨床的利点をさらに記述するために、ＥＡＥマウスに凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を接種した。結果を図２５に示す。
【０２１９】
ＥＡＥは、１０匹のマウスから成る群において、前述のように１００μｇの遊離ＰＬＰ１ペプチドで誘導した。溶解可能な凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１はＩｇ−ＰＬＰ１溶液を６３℃で１５分加熱し、次に遠心分離してから生成された調製物を濾過して、本プロセス中に形成された不溶性凝集物を取り除くことによって調製された。可溶化凝集物の濃度を次に標準的な生化学技術を用いて定量した。
【０２２０】
疾患誘導後１０日目にＥＡＥの臨床的徴候が生じたとき、マウスに３００μｇの加熱凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を含む生理食塩溶液を注射した。２回目及び３回目の３００μｇの凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の注射を１４日目と１７日目に行った。凝集性Ｉｇ−Ｗ及び可溶性（非凝集性）Ｉｇ−ＰＬＰ１を用いるコントロール処理を平行して行った。臨床状態の類別を実施例ＸＩＸに記載するように行った。図２５では、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理マウスを●によって表し、一方コントロールは○（可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１）及び△（凝集性Ｉｇ−Ｗ）で表す。
【０２２１】
この結果は明らかに、開示の免疫調節剤の凝集性配合物は免疫疾患に関連する症状を効果的に軽減するために使用できることを示す。
【０２２２】
実施例　ＸＸＶＩＩＩ
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を精製ＡＰＣと共にインキュベートするとＩＬ−６及びＩＬ−１０産生を誘導する
本発明による組成物が好都合にも抗炎症性サイトカインを誘導することを実証するために、抗原提示細胞を凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１に暴露した。結果を図２６Ａと２６Ｂに示す。
【０２２３】
３つの細胞型を、凝集性Ｉｇペプチド構築物を加えてインキュベートする際のサイトカイン産生について試験した。これらはＢ細胞、マクロファージ／単球、及び樹状細胞を含む。マクロファージを得るためには、ＳＪＬ／Ｊ成体マウスにチオグリコレートを注射して、注射５日後に、氷冷ショ糖（０．３４Ｍ）で十分に洗浄することによって腹膜細胞から収集し、プラスチック製の培養フラスコに４時間粘着させた。非粘着細胞は勢いよくピペット操作して除去した。さらに一晩培養した後、粘着細胞を細胞スクレーパーによって回収した。樹状細胞は脾臓から精製し、標準的な生化学技術を用いて濃縮した。Ｂ細胞はラット抗κｍＡｂによるパニングによって脾臓から精製した。静止Ｂ細胞の濃縮には、マクロファージ、樹状細胞、及び大型（活性化）Ｂ細胞をセファデックスＧ１０カラムを使って除去した。次に、抗Ｔｈｙ１．２抗体及び補体処理によって溶出細胞からＴリンパ球を取り除いた。９０％以上にまで濃縮された調製物のみが凝集性構築物によって刺激されることを確実にするために、次にＦＡＣＳ分析を実施する。
【０２２４】
濃縮マクロファージは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製の抗サイトカイン抗体を用いてＥＬＩＳＡ法によってＩＬ−６及びＩＬ−１０の産生について試験した。マクロファージは１００×１０３細胞／ウェル、そしてＢ細胞及び樹状細胞は５０×１０３細胞／ウェルを使用した。細胞（三重複ウェル）に段階的に変化する量の凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１またはマウス骨髄腫ＩｇＭを加えて２４時間インキュベートして、その上清をサイトカイン産生測定に使用した。上清中のサイトカイン量は、サイトカインの既知量によって作成された標準曲線上に外挿することによって算定した。
【０２２５】
図２６Ａ及び２６Ｂは、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の投与がＩＬ−６及びＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインの産生を増強することを示す。さらに詳細には、図２６Ａは、凝集性構築物への暴露がマクロファージにおいて比較的高レベルのＩＬ−６を誘導し（□）、他方図２６Ｂは同一構築物がマクロファージ（□）及び樹状細胞（△）においてＩＬ−１０産生を増強することを示す。そのようなサイトカインの産生は、Ｔｈ２型細胞の発生を促すが、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現及び同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害できることが認められるであろう。
【０２２６】
実施例　ＸＸＩＸ
活動性ＥＡＥの転帰において凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１は可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１よりもより高い有効性を呈する
可溶性免疫調節剤は自己免疫疾患の症状を改善し、本発明の範囲に含まれるが、標的細胞上のＦｃレセプターを架橋することができ、さらに自己免疫疾患を改善する免疫調節剤の能力について以下のように研究した。
【０２２７】
ＦｃＲを架橋し、さらにＩＬ−１０産生を誘導し、それによって可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１よりも自己免疫疾患をさらに大きく改善する、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の能力はを以下のように研究した。Ｉｇ−Ｗ、Ｉｇ−ＰＬＰ１、及びＩｇ−ＰＬＰ２トランスフェクタントの大規模培養を１０％　ｓｅｒｕｍ　ｓｕｐｒｅｍｅ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、 Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、 ＭＤ）を含むＤＭＥＭで行い、交差汚染を避けるために別のラット抗マウスκ鎖セファロースカラム上で精製した。次に、Ｉｇ−キメラをＰＢＳに対して透析して、コロジオン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕａｌｌ、 Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）で濃縮した。キメラは説明したように５０％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４ による沈降によって凝集された（Ｃｈａｓｅ ら、 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ら、編集 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ２：２４９〜３４１、 １９６８、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。端的には、可溶性Ｉｇ−キメラ調製物に同量の濾過済み１００％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４ を加えた。この混合物を２０分ごとに緩やかな撹拌を加えながら２４℃で１時間インキュベートした。次に試料を１０，０００ｒｐｍで沈降して、ペレットを１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに再懸濁した。１０％アクリルアミドゲル上の電気泳動は、可溶性Ｉｇ−キメラがゲル中に入り、約１６０ｋＤに移動することを示した。しかしながら、凝集性Ｉｇ−キメラはゲルには入らなかった。２μｇに等価の凝集性Ｉｇ−キメラをアプライし、さらに本テクノロジーの感度が０．１μｇであることが知られているため、発明者らは少なくとも９５％の凝集性Ｉｇ−キメラ調製物が凝集形態であると結論した。
【０２２８】
マウス（８匹／群）の群に１００μｇのＰＬＰ１でＥＡＥを誘導して、次に疾患誘導後９日目、１３日目、及び１７日目に、３００μｇの凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−Ｗを含有するＰＢＳで処理を行った。結果を図２７Ａと２７Ｂに示す。
【０２２９】
図２７ａに見られるように、麻痺性疾患重症度の初期フェーズは、最大スコア平均値が凝集性Ｉｇ−Ｗ処理動物の３．３ （ ０．３ から凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスの１．１ （ ０．５ （ｐ＜０．００１） にまで減少した。その上、動物は処理完了の９日以内に完全に回復し、全１２０日の観察期間を通じて全く再発しなかったが、一方凝集性Ｉｇ−Ｗ処理マウスは決して回復することがなく、臨床評価の全期間を通じて再発を示した。
【０２３０】
図２７ｂは、可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１（図２２）に対する凝集Ｉｇ−ＰＬＰ１（図２７ａ）による処理後のＰＬＰ１ペプチド誘発性ＥＡＥの疾患経過の直接比較である。各点は８匹のマウスの臨床スコア平均値を示す。これらの結果は、３つの個別実験を表す。図２７ｂに示すように、マウスに投与された９００μｇの凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１は約１２ｎＭのＰＬＰ１を含み、遊離ＰＬＰ１として投与された２００ｎＭよりも約１７倍低いにも係わらず、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１による疾患の調節はずっと効果的であった。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の有効性は、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理動物の臨床的徴候を可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１を注射した動物のそれと比較したときにもまた明白である（ｐ＜０．００１）（図２７ｂ）。実際に、最大臨床スコア平均値はかなり低くまた回復はより早かった。
【０２３１】
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１または凝集性Ｉｇ−Ｗで処理したマウスの組織学的検査をまた実施した。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１または凝集性Ｉｇ−Ｗで処理したマウスを、疾患の初期フェーズピーク時（疾患誘導後２８日目）に屠殺して、脳及び脊髄を切除して、ホルマリンで固定してからパラフィンに包埋した。小脳、大脳、及び腰髄からの連続横断切片（６μｍ）を作成して、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。少なくとも２０個の単核細胞を含む血管周囲クラスタを炎症病巣としてカウントした。
【０２３２】
疾患ピーク時の小脳の病理組織検査は、所定の凝集性Ｉｇ−Ｗを投与されたマウスに対して凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理マウスにおいては病巣数が少なく、病巣当たりの浸潤性単核細胞数が減少していることを示した（データ示さず）。さらに、連続的病理組織の横断切片を脳及び脊髄から作成して、横断切片当たりの平均病巣数を算定したとき、凝集性Ｉｇ−Ｗを投与されたマウスに対して凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理マウスにおいて病巣数は２〜３倍減少していた（表４）。さらに、ＩｇーＰＬＰ１処理マウスにおける病巣では、凝集性Ｉｇ−Ｗ処理マウスよりも浸潤性単核細胞数が少なかった（凝集性Ｉｇ−Ｗ：７３ （３９、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１：３２ （ １４， ｐ＜０．００５）。
【０２３３】
【表４】
2004509978.tif 000005
【０２３４】
６〜８週齢マウスにＰＬＰ１でＥＡＥを誘導して、次に引き続いて疾患誘導後９日目、１３日目、及び１７日目に３００μｇの凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１または凝集性Ｉｇ−Ｗで処理して、臨床的疾患について毎日スコア付けした。最大重症度平均値は、群内の各マウスから得られた臨床スコア最大値を平均することによって決定した。病理学的疾患を決定するためには、疾患誘導後２８日目（疾患ピーク時）にマウスから脳と脊髄を切除して、ホルマリン固定、パラフィン包埋して、６μｍに横断切片してから、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。炎症病巣は、最低でも２０個の単核細胞／血管周囲クラスタを示す。
【０２３５】
実施例　ＸＸＸ
凝集性ＩＧ−ＰＬＰ１はＡＰＣによるＩＬ−１０産生を誘導する
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１による効果的なＥＡＥの調節の基礎となるメカニズムを描写するために、ＡＰＣによるＩＬ−１０産生を刺激するための凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の能力及びＩＬ−１０産生ＡＰＣによって提示されるＰＬＰ１ペプチドの識別に係わるＴ細胞を阻害するためのＩＬ−１０の能力を研究した。このため、ナイーブ脾細胞に可溶性または凝集性Ｉｇキメラを加えてインキュベートして、次にその上清をＩＬ−１０検出に使用した。
【０２３６】
照射（３０００ラド）ＳＪＬ／Ｊ脾細胞（５ ｘ １０５細胞／ウェル）に段階的に変化する量の可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、凝集性可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、凝集性Ｉｇ−Ｗ、可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ２、または凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ２を加えて２４時間インキュベートして、その上清を使って以下のようにＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−１０産生を定量した。
【０２３７】
ＥＬＩＳＡ法はＰｈａｒＭｉｎｇｅｎの標準プロトコルに従って実施した。捕獲抗体はラット抗マウスＩＬ−１０であり、ビオチン化抗サイトカイン抗体はラット抗マウスＩＬ−１０であった。結合リガンドはＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＡ）を用いて解明した。アッセイはＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ３４０カウンターで読み取った。段階的に変化する量の組換えマウスＩＬ−１０を標準曲線を作成するための全ての実験に含んだ。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。各点は三重複ウェルの平均値を示し、このデータは４回の個別実験を表す。
【０２３８】
図２８ａに示すように、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、Ｉｇ−ＰＬＰ２、及びＩｇ−Ｗキメラは、用量依存性で脾臓細胞によるＩＬ−１０の産生を刺激した。キメラの可溶性形態は検出可能レベルのＩＬ−１０を誘導しなかった。
【０２３９】
プロフェッショナルＡＰＣとして機能することが公知の細胞が、凝集性Ｉｇキメラと共にインキュベートする際にＩＬ−１０を産生できるか否かを研究するために、以下の実験を行った。チオグリコレート誘導腹膜マクロファージ及び脾性Ｂ細胞及び樹状細胞を単離して、以下のように凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートする際のＩＬ−１０産生について試験した。
【０２４０】
マクロファージは前述のようにチオグリコレートブロスを注射したマウスの腹膜細胞から得た（Ｄｏｙｌｅら、Ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， Ｗｅｉｒｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編集、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ， １５４．１〜１５４．８， １９９６、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。端的には、チオグリコレートブロス　２ｍＬを腹腔内注射して、その５日後に腹膜腔を８ｍＬのＨＢＳＳ　４μＭ　ＥＤＴＡで洗浄することによってマクロファージをマウスの腹膜細胞から収集した。マクロファージの純度はＦ４／８０マーカーに対する抗体を用いてＦＡＣＳ（登録商標）分析によって測定された時に９３％以上であった。
【０２４１】
樹状細胞は、標準コラゲナーゼ／分別粘着法に従ってＳＪＬ／Ｊ脾臓から精製された（Ｒｏｍａｎｉら、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ　 Ｗｅｉｒｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、 ＭＡ， １５６．１〜１５６．１４、 １９９６、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。細胞の純度は３３Ｄ１マーカーに対する抗体を用いてＦＡＣＳ（登録商標）分析によって測定された時に９４％以上であった。
【０２４２】
ＳＪＬ／Ｊ脾細胞は、ラット抗マウスκ（１ｍｇ／ｍＬ）でコートしたプレート上、２５℃で１５分パニングされた。非粘着細胞はＰＢＳで洗い流した。Ｂ細胞は次にリドカインＨＣｌ（０．８ｍｇ／ｍＬ）を加えてインキュベートした後で勢いよくピペット操作することによってプレートから剥離させた。細胞純度はＢ２２０マーカーの発現についてのＦＡＣＳ（登録商標）分析によって測定された時に９０％以上であった。
【０２４３】
照射（３０００ラド）Ｂ細胞（２ｘ１０５細胞／ウェル）、マクロファージ（０．２ｘ １０５細胞／ウェル）及び樹状細胞（０．２ｘ １０５細胞／ウェル）に段階的に変化する量の凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１（中白シンボル）またはマウスＩｇＭ（中塗りシンボル）を加えて２４時間インキュベートして、細胞培養上清を使ってＩＬ−１０産生を測定した。各点は三重測定の平均値を表す。これらの結果は、４つの個別実験を表す。
【０２４４】
図２８ｂはＢ細胞ではなく、マクロファージ及び樹状細胞は、凝集Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートするとＩＬ−１０を産生することを示す。マウスＩｇＭは、試験されたいずれのＡＰＣによってもＩＬ−１０産生を刺激できなかった。これらの結果は、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１がＦｃγＲを架橋して、ＡＰＣによるＩＬ−１０の産生を誘導することを示す。さらに、ＡＰＣに可溶性マウスＩｇＧを加えてプレインキュベートすると、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１−誘導によるＩＬ−１０産生を阻害した（データ表示なし）。
【０２４５】
これらの結果は、ＡＰＣによって産生されたＩＬ−１０は、エンドトキシンによる汚染というよりはむしろＦＣγＲの架橋に起因したことを示す。
【０２４６】
実施例　ＸＸＸＩ
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１は、ＦｃγＲ１レセプターを架橋することによってＩＬ―１０を誘導する。
Ｆｃレセプターを架橋する凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の能力を以下のようにして研究した。Ｉｇ−ＰＬＰ１は硫酸アンモニウムを用いて凝集させ、ＩＬ−１０の誘導について試験した。ＳＪＬ／Ｊ脾細胞（０．５ ｘ １０６ 細胞／ウェル）に０．１μＭ　可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、０．１μＭ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、０．１μＭ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋５０μｇ／ｍＬ　２．４Ｇ２、または０．１μＭ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋１００μｇ／ｍＬ　マウスＩｇを加えてインキュベートした。２４時間後、細胞をペレット化して、１００ｍＬの培養上清を使って、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎの標準プロトコルに従ってＥＬＩＳＡ法によってＩＬ−１０産生を評価した。
【０２４７】
図２９に見られるように、可溶性Ｉｇ−キメラではなく、凝集性Ｉｇ−キメラを加えて脾細胞をインキュベートすると、ＡＰＣによるＩＬ−１０の誘導を導出した。２．４Ｇ２　ｍＡｂによるＦｃＲ２及びＦｃＲ３の遮断はＩＬ−１０産生を阻害しなかったが、マウスＩｇＧを加えてインキュベートすることによる全３種のＦｃＲ遮断は凝集性Ｉｇ−キメラ誘導性ＩＬ−１０を有意に低下させたため、ＩＬ−１０産生はＦｃＲ１依存性であると思われる。総じて、これらの結果は、Ｉｇ−キメラの凝集はＡＰＣを誘導してＦｃＲ１依存性でＩＬ−１０を産生することを示した。
【０２４８】
実施例　ＸＸＸＩＩ
凝集性ＩＧ−ＰＬＰ１は特異的Ｔ細胞によるインビトロＩＦＮγ分泌をダウンレギュレートする
抗原提示によってＡＰＣと特異的に係わるＴ細胞に及ぼすＡＰＣ誘導性ＩＬ−１０の影響を研究するため、ペプチド刺激に際してタイプＩ及びタイプＩＩサイトカインの両方を産生できるＰＬＰ１特異的Ｔｈ０クローンを使用した。ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０と命名されたこのクローンは以下のように調製された。
【０２４９】
成体ＳＪＬマウスを１００μｇのＰＬＰ１ペプチドを含有するＣＦＡで皮下免疫して、１０日後に流入領域リンパ節を切除して、その細胞（５ ｘ １０６ 細胞／ｍｌ）をＰＬＰ１（１５μｇ／ｍＬ）で刺激した。５日後に、芽球をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、 Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ）で単離して、次にペプチド及び新鮮な照射（３０００ラド）シンジェニック（同質遺伝子的）ＡＰＣで刺激した。１０日後、細胞を洗浄して、１０％Ｔ−Ｓｔｉｍ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、 Ｂｏｓｔｏｎ、 ＭＡ）を含む培地に再懸濁して、７日間静止させた。刺激／静止を３サイクル繰り返した後、細胞を限界希釈（１細胞／３ウェル）によってクローン化して、ポジティブな細胞には限界希釈クローニングの第二ラウンドを行った。その後、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０と命名された一つのクローンを以下のようにさらに特徴づけした。
【０２５０】
ＰＬＰ１、ＰＬＰ２、凝集Ｉｇ−ＰＬＰ１及び凝集Ｉｇ−ＰＬＰ２に対するＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０の増殖応答を以下のように試験した。ＳＪＬ／Ｊ脾細胞（１０ ｘ １０５細胞／ウェル／１００μＬ）を丸底９６ウェルプレートで段階的に変化する量の抗原で４時間パルスして、ペレット化し、１％のパラホルムアルデヒドで１５分固定し、洗浄してから新しい９６ウェルプレートに移した。ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０細胞（０．５ｘ １０５細胞／ウェル／１００μＬ）を次に添加して３日間インキュベートした。その後１ウェル当たり１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンを添加し、さらに１４．５時間インキュベートを継続した。細胞を次にガラスファイバーフィルター上に収集して、取り込まれた［３Ｈ］チミジンをＩｎｏｔｅｃｈβカウンター（Ｗｏｈｌｅｎ、 Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてカウントした。結果を図３０ａに示す。
【０２５１】
図３０ａに示すように、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０は、遊離ＰＬＰ１ペプチドまたは凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１で予めパルスした、パラホルムアルデヒドで固定した脾臓ＡＰＣを加えてインキュベートすると増殖する。ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０は、ＡＰＣをネガティブコントロールであるＰＬＰ２または凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ２でパルスした場合は有意な増殖を示さなかった。
【０２５２】
遊離ＰＬＰ１または凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１による刺激に際してＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０によって産生されるサイトカインを以下のように研究した。照射（３０００ラド）ＳＪＬ／Ｊ脾細胞（５ ｘ １０５細胞／ウェル）に段階的に変化する量のＰＬＰ１ペプチド（中塗り丸）または、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１（中白丸）を加えて１時間インキュベートし、その後ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０細胞（０．５ｘ １０５細胞／ウェル）を加えてさらに２４時間インキュベートを続けた。サイトカイン産生は１００μＬの培養上清から以下のようにしてＥＬＳＡ法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。ＥＬＩＳＡ法はＰｈａｒＭｉｎｇｅｎの標準プロトコルに従って実施した。捕獲抗体は、ラッ抗マウストＩＬ−２、ＪＥＳ６−１Ａ１２；ラット抗マウスＩＬ−４、１１Ｂ１１；ラット抗マウスＩＦＮγ、Ｒ４−６Ａ２；ラット抗マウスＩＬ−１０、ＪＥＳ５−２Ａ５；及びラット抗マウスＩＬ−５、ＴＲＦＫ５であった。ビオチン化抗サイトカイン抗体は、ラット抗マウスＩＬ−２、ＪＥＳ６−５Ｈ４；ラット抗マウスＩＬ−４、ＢＶＤ６−２４Ｇ２；ラット抗マウスＩＦＮγ、ＸＭＧ１．２；ラット抗マウスＩＬ−１０、ＪＥＳ５−１６Ｅ３；及びラット抗マウスＩＬ−５、ＴＲＦＫ４であった。活性ＴＧＦβ検出のためのＥＬＩＳＡ法は、ヒトＴＧＦβ１ＤｕｏＳｅｔ ｋｉｔ （Ｇｅｎｚｙｍｅ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、 ＭＡ） を製造元の指示に従って用いて実施した。結合リガンドは、ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＡ）を用いて解明した。アッセイはＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ３４０カウンターで読み取った。標準曲線を作成するために、段階的に変化する量の組換えマウスＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、及びＴＧＦβを全ての実験に含めた。培養上清中のサイトカイン濃度は標準曲線の直線部分から外挿して算定した。
【０２５３】
非固定脾臓ＡＰＣ及び遊離ＰＬＰ１ペプチドを加えてインキュベートした際のサイトカイン産生を試験したとき、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０は有意量のＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮγを産生した（図３０ｂ、３０ｃ、及び３０ｄ）３種のサイトカイン全てがまた、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を刺激に使用したときにも検出された（図３０ｂ、３０ｃ、及び３０ｄ）。しかしながら、ＩＬ−１０は、刺激剤が遊離ＰＬＰ１ではなく凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１のときに有意なレベルで検出可能であった（図３０ｅ）。
【０２５４】
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１はマクロファージ及び樹状細胞によるＩＬ−１０産生を誘導するため、Ｔ細胞サイトカイン評価アッセイに見られるＩＬ−１０はＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０というよりはむしろ脾臓ＡＰＣの産物であったと思われる。これを確認するために、以下の実験を行った。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１によるＴ細胞活性化におけるＩＬ−１０源を識別するために、固定及び生ＡＰＣを使用した。固定ＡＰＣアッセイでは、ＳＪＬ／Ｊ脾細胞（１０ ｘ １０５細胞／ウェル）を段階的に変化する量の凝集生Ｉｇ−ＰＬＰ１で４時間パルスして、十分に洗浄してから、パラホルムアルデヒドで固定した。生ＡＰＣアッセイでは、照射（３０００ラド）ＳＪＬ／Ｊ脾細胞（５ ｘ １０５細胞／ウェル）に段階的に変化する量の凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を混合して、１時間インキュベートした。その後ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０細胞（０．５ｘ １０５細胞／ウェル）を両アッセイに加えてさらに２４時間インキュベートを継続した。ＩＬ−１０産生は１００μＬの培養上清からＥＬＳＡ法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。
【０２５５】
結果を図３１に示す。図３１に示すように、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１でパルスされたＡＰＣを洗浄して、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０を加えてインキュベートする前にパラホルムアルデヒドで固定したときは、ＩＬ−１０は検出不能であり、これはＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０というよりはむしろ脾臓ＡＰＣがＩＬ−１０源であったことを実証した。
【０２５６】
Ｔ細胞サイトカイン評価アッセイからのその他の驚くべき観察は、ＡＰＣによるＩＬ−１０産生が増加するとＩＦＮγ産生が減少するらしいことであった（図３０ｃ及び３０ｅ）。この問題をさらに研究するために、さらに広範囲のＩｇ−ＰＬＰ１濃度をバルク及び精製ＡＰＣの刺激に使用し、さらにＩＬ−１０及びＩＦＮγ産生を以下のように同一組織培養ウェルから同時に評価した。
【０２５７】
照射（３０００ラド）ＳＪＬ／Ｊ脾細胞（５ ｘ １０５細胞／ウェル）、樹状細胞（０．２ｘ １０５細胞／ウェル）、マクロファージ（０．２ｘ １０５細胞／ウェル）、またはＢ細胞（２ｘ １０５細胞／ウェル）に段階的に変化する量の凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートし、１時間後にＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０細胞（０．５ｘ １０５細胞／ウェル）を加えて、さらに２４時間インキュベートを継続した。同一培養ウェルでのＩＦＮγ及びＩＬ―１０産生をＥＬＩＳＡ法によって測定した。各点は三重測定ウエルの平均値を表す。結果を図３２に示す。
【０２５８】
図３２に示すように、ＡＰＣによって分泌されるＩＬ−１０は、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生に拮抗作用する。事実、脾細胞、精製ＤＣ、または濃縮腹膜マクロファージ（その全てが凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１と共にインキュベートする際にＩＬ−１０を産生する。図２８）をＡＰＣとして用いて刺激アッセイを行うと、Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生は劇的に減少し、ＡＰＣによるＩＬ−１０産生が増加すると検出不能になった（図３２ａ、３２ｂ、及び３２ｃ）。しかしながら、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１と共にインキュベートされるときにＩＬ−１０を産生しないＢ細胞がＡＰＣとして使用される場合（図２８ｂ）、Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌は影響を受けなかった（図３２ｄ）。総じて、これらの結果は、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１が提示ＡＰＣ（樹状細胞及びマクロファージ）によるＩＬ−１０産生をトリガし、またそのようなＩＬ−１０がＴ細胞によるＩＦＮγの産生に拮抗作用することを示す。
【０２５９】
さらにＩＬ−１０産生がＴ細胞によるＩＦＮγの産生を拮抗作用することを確認するために、以下の実験を行った。照射（３０００ラド）ＳＪＬ／Ｊ腹膜マクロファージ（０．２ ｘ １０５細胞／ウェル）（前述のように精製した）に段階的に変化する量の凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えて１時間インキュベートし、次にＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０細胞（０．５ｘ １０５細胞／ウェル）を加えてさらに２４時間インキュベートを継続した。同一培養ウェルでのＩＦＮγ及びＩＬ―１０産生を前記のように１００μＬの培養上清から評価した。その上、ＩＦＮγ産生に対する効果を測定するために、抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　２Ａ５またはラットＩｇＧをいくつかの培養中に含んだ。
【０２６０】
その結果を図３３に示す。ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０に腹膜マクロファージ及び凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートすると、提示マクロファージによって分泌されるＩＬ−１０レベルと比例してＩＦＮγ産生が減少する（図３３ａ）。さらに、Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生の阻害は、抗ＩＬ−１０　ｍＡｂである２Ａ５によるそのようなＩＬ−１０の中和がＩＦＮγ産生を回復するため、ＡＰＣ誘導性ＩＬ−１０に直接的に関連する（図３３ｂ）。抗ＩＬ−１０の代わりにイソタイプコントロールであるラットＩｇＧを加えてインキュベートしても、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０によるＩＦＮγ産生を阻害するＩＬ−１０の能力に効果はなかった。
【０２６１】
実施例　ＸＸＸＩＩＩ
攻撃性Ｔ細胞のインビボ調節に対する内因性ＩＬ−１０と末梢性寛容間の相乗作用
アジュバントなしで動物に投与された全身性抗原は、同時刺激性分子を発現していないか、あるいはその発現レベルが最小限である末梢ＡＰＣによる抗原提示によって操作される寛容を生ぜしめる。精製マクロファージまたは樹状細胞に、ＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチドの効率的な負荷を可能にする可溶性または凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートすると、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＣＤ４０のアップレギュレーションを誘導しない（データ表示なし）。さらに、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１はＡＰＣによるＩＬ−１０の産生を起因するため（図２８）、ＩＬ−１０はＡＰＣ上にある同時刺激性分子のアップレギュレーションを阻害すると思われる。
【０２６２】
ＩＬ−１０はＴｈ１サイトカインを拮抗作用すること（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １４６：３４４４〜５１、１９９１、その開示はその全文を参照により本明細書に編入している）並びにおそらく炎症機能を妨害するであろうことが示されているため、Ｔ細胞調節における凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の有効性及び同時刺激性分子の発現レベルが最小限であるＡＰＣによる不適切なペプチド提示を介する疾患の転帰、及びそのようなＡＰＣによって産生されるＩＬ−１０の阻害機能を以下のように研究した。
【０２６３】
ＰＬＰ１ペプチドを用いてマウスにＥＡＥを誘導し、麻痺の徴候が明白になったとき、マウスに凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を抗ＩＬ−１０抗体と共に投与して、以下のように疾患重症度の軽減について評価した。１００μｇのＰＬＰ１でＳＪＬ／Ｊマウス（８匹／群）にＥＡＥを誘導し、９日目、１３日目、及び１７日目に３００μｇ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１（凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１）；３００μｇ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋５００μｇ　ラット抗マウスＩＬ−１０抗体である２Ａ５（凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋抗ＩＬ−１０）；３００μｇ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋５００μｇ　ラットＩｇＧ（凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋ラットＩｇＧ）；３００μｇ　凝集性Ｉｇ−Ｗ（凝集性Ｉｇ−Ｗ）；あるいは３００μｇ　凝集性Ｉｇ−Ｗ＋５００μｇ　ラット抗マウスＩＬ−１０抗体である２Ａ５（凝集性Ｉｇ−Ｗ＋抗ＩＬ−１０）を含有するＰＢＳを腹腔内投与した。全ての注射は腹腔内にＰＢＳで行った。結果を図３４ａに示す。
【０２６４】
図３４ａに示すように、麻痺の重症度は、インビボＩＬ−１０が抗ＩＬ−１０抗体によって中和されたときに回復した。事実、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１のみで処理したマウスは、最大臨床スコア平均値が１．１±０．５であったが、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１と抗ＩＬ−１０抗体の両方の注射を受けたマウスは３．３±０．３のスコアを示し、これは凝集性Ｉｇ−Ｗ処理を受けたマウスに観察された３．３±０．３（ｐ＞０．２３）と同等である。さらに、抗ＩＬ−１０抗体の代わりにラットＩｇＧを凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１と共に投与されたコントロールマウスは、疾患重症度を回復せず、最大スコア平均値は１．６±０．２であった。抗ＩＬ−１０抗体を凝集性Ｉｇ−Ｗと共に注射しても疾患重症度を軽減したり、悪化させることはなかった。これらの結果は、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１誘導性ＩＬ−１０は、疾患重症度の制御において重要な役割を果たしており、ＩＬ−１０の効果が生じるためにはＡＰＣと標的Ｔ細胞間の特異的相互作用が必要であることを実証する。
【０２６５】
さらにこのメカニズムは、可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋外因性ＩＬ−１０による処理が凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１と同程度まで麻痺の重症度を軽減する事実に拠って支持される。１００μｇのＰＬＰ１でマウス群（８匹／群）にＥＡＥを誘導し、９日目、１３日目、及び１７日目に３００μｇ　可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１（可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１）；３００μｇ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１（凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１）；３００μｇ　可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋４００Ｕ　ｒＩＬ１０（可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋ＩＬ−１０）；または３００μｇ　Ｉｇ−Ｗ（凝集性Ｉｇ−Ｗ）を含有するＰＢＳを投与した。図３４ｂに示すように、検出可能レベルのＩＬ−１０を誘導しない可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１は、疾患を僅かに改善し、最大スコア平均値が２．５±０．３であり、一方外因性ＩＬ−１０と併用された可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１は、疾患を最大臨床スコア平均値が１．１±０．３まで軽減し、これは凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理されたマウスから得られたスコア１．１ （ ０．５ と同等である。
【０２６６】
内因性ＩＬ−１０が疾患を調節するためには、ＡＰＣをＴ細胞と物理的に架橋することが必要であると思われる。このメカニズムを確認するために、以下の実験を行った。１００μｇのＰＬＰ１でマウス群（８匹／群）にＥＡＥを誘導し、次に疾患誘導後９日目、１３日目、及び１７日目に、３００μｇ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１（凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１）、３００μｇ　凝集性Ｉｇ−Ｗ（凝集性Ｉｇ−Ｗ）、または３００μｇ　凝集性Ｉｇ−Ｗ＋１００μｇ　ＰＬＰ１（凝集性Ｉｇ−Ｗ＋ＰＬＰ１）を含有するＰＢＳで処理した。結果を図３５に示す。
【０２６７】
図３５に示すように、疾患の発症はこれらの実験群では７日目であった。疾患マウスを、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の代わりに凝集性Ｉｇ−Ｗと遊離ＰＬＰ１ペプチドの混合物で処理すると、疾患重症度は軽減されなかった。総じて、有効なＴ細胞ダウンレギュレーションは、ＩＬ−１０産生ＡＰＣと標的病原性Ｔ細胞間の物理的相互作用を必要とする。この必要条件についての可能な説明は、パラ分泌サイトカインとしてのＩＬ−１０が拮抗作用を達成するためには、Ｔ細胞の近接に存在する必要があることである。
【０２６８】
実施例　ＸＸＸＩＶ
凝集性ＩＧ−ＰＬＰ１は、自己免疫疾患の迅速な改善を提供する
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ及び凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１のどちらも自己免疫疾患の症状を改善するが、より迅速な軽減は凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１によってもたらされる。ＳＪＬマウス群にＰＬＰ１ペプチドで疾患を誘導し、９日目、１３日目、及び１７日目に、３００μｇ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ、または凝集性Ｉｇ−Ｗを含有する３００μＬ　ＰＢＳを用いて腹腔内処理した。結果は図３６及び表５に示す。
【０２６９】
図３６及び表５に見られるように、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１は疾患重症度を劇的に軽減した。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ及び凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理のどちらもＥＡＥの回復を起因するが、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスは、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ及を投与されたマウスよりもより迅速に回復した。最大臨床スコア平均値は、凝集性Ｉｇ−Ｗ処理群の３．３ （ ０．３ から、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１群では１．１（ ０．５ に減少した（表５を参照）。さらに、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１による処理後の疾患の完全回復は迅速であり（２４．４（ ２．２日目）、１２０日の臨床評価期間中に再発は生じなかった。
【０２７０】
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１が可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１よりも疾患調節においてより有効であることは特記に値する。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１は最大臨床スコアを１．１（ ０．５まで減少するが、Ｉｇ−ＰＬＰ１の可溶性形態は麻痺の重症度を２．４ （ ０．３ にまで低減するのみである（表３と表５を比較すること）。その上、回復は可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスよりも凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理された群の方がはるかに速かった（表３及び表５を参照）。
【０２７１】
【表５】
2004509978.tif 000006
【０２７２】
組織病理学的分析をまた実施した。図３６のようにＥＡＥを誘導して凝集性Ｉｇ−キメラ処理されたマウス群を、疾患誘導後２８日目に屠殺して、脳及び脊髄を取り出して、ホルマリンで固定してからパラフィンに包埋した。大脳及び腰髄からの連続横断切片（６μｍ）を作成して、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。少なくとも２０個の単核細胞を含む血管周囲クラスタを炎症病巣としてカウントした。
【０２７３】
結果を図３７に示す。図３７に示すように、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理マウスは、大脳及び腰脊髄のどちらにおいても炎症病巣数を有意に減少した。
【０２７４】
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１のＥＡＥ改善効力は、５００μｇ／注射の量で投与された可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１よりもはるかに低用量（３００μｇ／注射）で生じた。これはおそらく、Ｉｇ−ＰＬＰ１の可溶性形態ではなく凝集性形態による処理に際するＩＬ−１０のインビボ産生に起因すると思われる。
【０２７５】
特定の理論によって制限されることは望まないが、以下のメカニズムによって凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲと比べて凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１によって迅速な結果が得られることを説明できると思われる。ＰＬＰ−ＬＲはＰＬＰを修飾することによって作成されるＴ細胞アンタゴニストペプチドであるため、この修飾ペプチドを提示するＴ細胞とＡＰＣ間の相互作用の親和性は、非修飾ＰＬＰ１を提示するＴ細胞とＡＰＣ間の親和性よりも低いことが予測される。この低い親和性の結果として、Ｔ細胞はＰＬＰ１を提示するＡＰＣと相互作用する限りは、ＰＬＰ−ＬＲを提示するＡＰＣと相互作用せず、従って凝集免疫グロブリンによって誘導されるＩＬ−１０への暴露期間が減少する。
【０２７６】
他方、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１によって得られる迅速な結果は、自己反応性Ｔ細胞レパートリーの多様性の結果である。ＰＬＰ１反応性であるＴ細胞の頻度がＰＬＰ−ＬＲ反応性であるＴ細胞の頻度よりも大きい場合、この二つのキメラによる疾患調節の示差は観察されたパターンに適合する。この場合、ＩＬ−１０が存在しないと可溶性キメラはＴ細胞の通常集団を影響するが、高親和性Ｔ細胞が有効なＩＬ−１０暴露を受けるために、凝集性形態はＩｇ−ＰＬＰ１に有利に働く。
【０２７７】
実施例　ＸＸＸＶ
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１への応答で産生されたＩＬ−１０は同時刺激性分子をダウンレギュレートする
ＩＬ−１０はＡＰＣ上の同時刺激性分子の発現をダウンレギュレートすることが報告されている。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１への応答で産生されたＩＬ−１０がＡＰＣ上の同時刺激性分子をダウンレギュレートするか否かを測定するために、以下の実験を行った。
【０２７８】
腹膜マクロファージに凝集性Ｉｇ−ＰＬＰキメラを加えて２４時間インキュベートして、次に同時刺激性分子の細胞表面発現を評価した。マクロファージは、前述のようにチオグリコレートブロスを注射したマウスの腹膜細胞から収集した。精製マクロファージ（１．０ ｘ １０６ 細胞／ｍＬ）は次に０．３μＭ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰキメラ（黒線）または培地のみ（ＮＩＬ、灰色）を加えてインキュベートした。２４時間後、細胞を収集して、抗−Ｆ４／８０、及び抗Ｂ７．１、抗−Ｂ７．２、あるいは抗ＣＤ４０で染色を行った。柱状図表は、Ｆ４８０＋ゲート細胞を示し、Ｂ７．１、Ｂ７．２、あるいはＣＤ４０の強度を示す。
【０２７９】
結果を図３８に示す。図３８に示すように、Ｂ７．１、Ｂ７．２、あるいはＣＤ４０発現のアップレギュレーションはなかった。反対に、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰキメラを含まない培養で観察される基礎レベルと比べてこれらの分子の有意なダウンレギュレーションがあった。従って、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１への応答で産生されるＩＬ−１０は、同時刺激性分子をダウンレギュレートする。
【０２８０】
実施例　ＸＸＸＶＩ
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理は、複数エピトープによって誘導された活動性ＥＡＥの臨床重症度を低下させる。
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１介在によるＦｃＲ架橋の結果としてのＡＰＣによるＩＬ−１０産生は、ＡＰＣ上のＰＬＰ１−ＭＨＣリガンドに係わる特異的Ｔ細胞、並びに無関係の特異性を有する隣接Ｔ細胞を拮抗作用することができる。バイスタンダー抑制として公知であるこの低下は、ＩＬ−４及びＩＬ−１０設定に有効であることが証明されている。
【０２８１】
バイスタンダー抑制が、自己免疫疾患に関与する抗原を含む凝集免疫グロブリンへの応答で産生されたＩＬ―１０に起因するか否かを測定するために、エピトープの混合物でＥＡＥを誘導して、非関連自己反応性Ｔ細胞を調節し且つ疾患を改善する凝集性Ｉ−ＰＬＰ１の能力を測定した。１００μｇのＰＬＰ１及び１００μｇのＰＬＰ２から成る混合物でＳＪＬ／Ｊマウス群（８匹／群）にＥＡＥを誘導し、９日目、１３日目、及び１７日目に、３００μｇ／注射量の凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１または凝集性Ｉｇ−Ｗで処理した。全ての処理は腹腔内ＰＢＳであった。疾患の発症は、これらの実験群では７日目であった。各点は８匹のマウスの臨床スコア平均値を示す。
【０２８２】
結果を図３９ａに示す。図３９ａに示すように、ＰＬＰ１とＰＬＰ２ペプチド混合物によって誘導された進行性のＥＡＥを罹患するマウスは、麻痺の重症度の低下を示し、さらに凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理後、疾患誘導後３３日目に完全に回復したが、一方凝集性Ｉｇ−Ｗ処理動物は重度の麻痺を有し、５０日の臨床評価期間中に疾患を回復しなかった。従って、内因性ＩＬ−１０は、ＰＬＰ２特異的Ｔ細胞へのダウンレギュレート効果を有すると思われる。
【０２８３】
ＰＬＰ２ペプチドによる疾患の誘導は、全ＰＬＰを暴露して、ＰＬＰ１特異的Ｔ細胞の拡散と活性化を生ぜしめるにちがいない（ＭｃＲａｅら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、 １８２：７５〜８５、１９９８；Ｔｕｏｈｙ ら、 Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、 １６４：９３〜１００、 １９９８、これらの開示はその全文を参照により本明細書に編入している）。この場合、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の注射は、ＩＬ−１０産生ＡＰＣをＰＬＰ１特異的Ｔ細胞に架橋して、これらの細胞並びに隣接ＰＬＰ２特異性Ｔ細胞のバイスタンダー抑制を促進するにちがいない。ＰＬＰ２によってＥＡＥが誘導されているマウスへの凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の投与がＰＬＰ２特異的Ｔ細胞のバイスタンダー抑制を生じるか否かを測定するために、以下の実験を行った。
【０２８４】
ＰＬＰ２ペプチドでマウスにＥＡＥを誘導して、麻痺徴候が明らかになったとき、以下のように凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１で処理した。１００μｇのＰＬＰ２でＳＪＬ／Ｊマウス群（８匹／群）にＥＡＥを誘導し、９日目、１３日目、及び１７日目に、３００μｇ／注射量の凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１で腹腔内処理した。未処理マウス（ＮＩＬ）群を、比較目的で含んだ。結果を図３９ｂに示す。
【０２８５】
図３９ｂに示すように、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理マウスにおける麻痺の初期フェーズは未処理マウスに比べて僅かに軽いのみであるが、動物は２６日目までに迅速に回復して、未処理マウスとは異なり、残りの臨床評価期間のあいだに再発は見られなかった。これらの結果はバイスタンダー抑制を支持し、さらにエピトープの拡散が麻痺の後期に疾患を調節する機会を提供することを実証する。
【０２８６】
ＰＬＰ１以外の抗原に特異的なＴ細胞のバイスタンダー抑制を生じる凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の能力をさらに探求するために、以下の実験を行った。ミエリン自己抗原の全域を組み込むＣＮＳホモジネートによって誘導された疾患を調節するための凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の能力を測定した。ＣＮＳホモジネートは以下のように調製した。５０個の冷凍した圧搾していないラット脳（Ｐｅｌｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、 Ｒｏｄｇｅｒｓ、 ＡＫ）をＷａｒｉｎｇブレンダーを用いてＰＢＳ中でホモジネートして、ＰＢＳで３００ｍｇ／ｍＬに調整した。ＣＮＳホモジネートは−２０℃で保存した。６ｍｇのＣＮＳホモジネートでＳＪＬ／Ｊマウス群（９匹／群）にＥＡＥを誘導し、９日目、１３日目、及び１７日目に、３００μｇ／注射量の凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１または凝集性Ｉｇ−Ｗで腹腔内処理した。未処理マウス（ＮＩＬ）群を、比較目的で含んだ。結果を図３５に示す。
【０２８７】
図３５に示すように、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の注射を受けたマウスは、麻痺の初期フェーズにおいて麻痺の軽い徴候を有したが、疾患誘導後２４日目までに完全に回復し、６０日の臨床評価期間に再発はなかった。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の代わりに凝集性Ｉｇ−Ｗ処理されたコントロールマウスは、未処理動物と同様な疾患パターンを有した。これらの結果は、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１のダウンレギュレーション機能は、分子内及び分子間エピトープのどちらにも拡大して、多様なＴ細胞特異性を抑制することを示す。
【０２８８】
実施例　ＸＸＸＶＩＩ
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１は、ＡＰＣによるＩＬ−１０産生を誘導することにより、バイスタンダー抑制を生じる
ＩＬ−１０への暴露は、病原性ミエリン特異的Ｔ細胞のダウンレギュレーション及び抑制の基礎をなすメカニズムであると思われる。図２８及び３４に実証されたように、ＩＬ−１０の源は、樹状細胞及びマクロファージのようなＡＰＣである。しかしながら、この設定におけるＴ細胞調節の広範な有効性及び持久性は、このバイスタンダー抑制がＡＰＣのＩＬ−１０による病原性Ｔ細胞の拮抗作用に起因するのか、あるいはそのようなＩＬ−１０の効果の下で発生した制御性Ｔ細胞によるダウンレギュレーションであるのかの疑問を提起した。
【０２８９】
凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１がＴ細胞増殖の抑制を介するのか、あるいは制御性Ｔ細胞によって作用するのかを決定するために、以下の実験を行った。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１による処理を受けたＣＮＳ誘導性麻痺から回復するマウス由来リンパ節Ｔ細胞を抗原刺激して、増殖及びサイトカイン（制御性Ｔ細胞マーカー）の産生について試験した。マウス（６匹／群）にＣＮＳホモジネートでＥＡＥを誘導し、次に前記のように９日目、１３日目、及び１７日目に凝集性Ｉｇ−Ｗ（斜め格子付き棒）または凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１（空白棒）で処理した。処理療法完了の２日後、リンパ節（腋窩、側腋窩、及び膝窩）を収集して、細胞（４×１０５細胞／１００ μＬ／ウェル）を１００ μＬ／ウェルの抗原（ＰＬＰ１、ＰＬＰ２、ＭＢＰ３、またはＨＡ（コントロール））で刺激した。細胞増殖を３日後に［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用いて評価した（図４０ａ）。その上、サイトカイン応答を、抗原を加えてインキュベートした２４時間後に５ ｘ １０５ 細胞／ウェルを用いてＥＬＩＳＰＯＴによって分析した（図４０ｂ〜ｇ）。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、Ｍｉｎら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８８：２００７〜２０１７、１９９８（その開示はその全文を参照により本明細書に編入している）に記載されるように抗原刺激の際にリンパ節Ｔ細胞によって産生されるサイトカインを測定することを用いた。端的には、リンパ節細胞（５ ｘ １０５細胞／１００μＬ／ウェル）及び抗原（１００μＬ／ウェル）を、捕獲抗体でコートされたＨＡマルチスクリーンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、 ＭＡ）中で２４時間インキュベートした。結合サイトカインはペルオキシダーゼ及び抗サイトカイン抗体で解明された。使用した抗サイトカイン抗体対は、ＥＬＩＳＡ法に説明される抗体対であった。スポットは解剖顕微鏡下でカウントした。
【０２９０】
抗原は特定された最適濃度（ＰＬＰ１、ＰＬＰ２、及びＨＡは１５μｇ／ｍＬ、並びにＭＢＰ３は３０μｇ／ｍＬ）で使用した。抗原を添加しない培地のコントロールウェルを含み、バックグラウンドとして使用した。グラフの各棒は６匹の個別に試験されたマウスについての平均値±標準偏差を表す。図４１に示す結果は、凝集性Ｉｇ−キメラの最終注射２日後、ミエリンペプチドの増殖は、コントロールＩｇ−Ｗ処理されたマウスで有意であったが、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスではバックグラウンドレベルであったことを示す。同様に、凝集性Ｉｇ−Ｗの注射を受けたマウスは有意量のＩＬ−２及びＩＦＮγを有したが、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理マウスは、Ｔｈ１及びＴｈ２タイプサイトカインのどちらも有せず、さらにＩＬ−１０、ＩＬ−５、またはＴＧＦβのいずれも産生しなかった。この処理療法完了後９日目にマウスを試験したときにも、同様な結果が得られた（データ表示なし）。さらに、脾臓Ｔ細胞及び腹膜から収集した細胞は、同様なパターンの応答を示した（データ表示なし）。総じて、これらの結果は、制御性Ｔ細胞の典型的な増殖性及びサイトカイン応答トレードマークは、活動性自己免疫の全身治療のこの特定の設定では検出不能であることを示唆する。従って、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の投与に起因するバイスタンダー抑制はＡＰＣによって産生されるＩＬ−１０による病原性Ｔ細胞の拮抗作用に起因した。
【０２９１】
当業者はさらに、本発明が、本発明の精神または主要な特質から逸脱することなく他の特定の形態で実施可能であることを認めるであろう。前述する本発明についての説明は本発明の例示的な実施態様を開示したに過ぎないという点で、他の変形が本発明の範囲内であることが意図されていると理解すべきである。従って、本発明は、本明細書に詳細に記載されている具体的な実施態様に限定されることはない。むしろ、本発明の範囲及び内容を示すものとしては付記する請求の範囲を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ及び１Ｂは、一般的な特徴及びＨ鎖可変領域のＣＤＲ３ループ内における外来ペプチドの封入体を示すキメラ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子の概略図であり、ここで図１Ａ（Ｉｇ−ＰＬＰ１）はプロテオリピドタンパク質由来の天然ペプチドＰＬＰ１（アゴニスト）の挿入を示し、一方図１Ｂ（Ｉｇ−ＰＬＰーＬＲ）はＰＬＰーＬＲと称するＰＬＰ１のペプチド類似体（アンタゴニスト）の封入体を含む免疫調節剤を示している。
【図２】
図２及び２Ｂは、対応する遊離ペプチドに対する抗体を使用して、それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示すキメラ抗体Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ―ＬＲのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）による捕獲を示すグラフであり、ここで、図２ＡはＰＬＰ１に対する抗体による捕獲レベルを示し、そして図２ＢはＰＬＰ−ＬＲに対する抗体による捕獲レベルを示し、Ｉｇ−Ｗはネガティブコントロールとしての野生型抗体である。
【図３】
図３Ａ及び３Ｂは、ＩＬ−２産生で測定される、キメラ免疫グロブリンの相対的なＴ細胞活性化能力を決定するために、ＰＬＰ１特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ４Ｅ３（図３Ａ）及び５Ｂ６（図３Ｂ）に対するＩｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（並びにポジディブ及びネガティブコントロール）の提示を示すグラフである。
【図４】
図４は、脾臓ＳＪＬ抗原提示細胞をＰＬＰ１特異的４Ｅ３Ｔ細胞ハイブリドーマと共にインキュベートした後にＩＬ−２産生レベルで測定される、本発明のキメラ抗体（Ｉｇ−ＰＬＰ１）に対する遊離ペプチドＰＬＰ１または未変性プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）の相対的なＰＬＰ１提示有効性を示すグラフである。
【図５】
図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、それぞれのアゴニスト及び種々のレベルのＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲまたはコントロールと共に予めインキュベートしたＳＪＬ脾臓ＡＰＣの存在下、Ｔ細胞ハイブリドーマ４Ｅ３によるＩＬ−２産生によって測定された、ＰＬＰ１（５Ａ）、Ｉｇ−ＰＬＰ１（５Ｂ）及びＰＬＰ（５Ｃ）介在性Ｔ細胞活性化のＩｇ−ＰＬＰ１−ＬＲアンタゴニズムを示す比較グラフである。
【図６】
図６は、前述の免疫グロブリンのうちの１つを天然プロテオリピドタンパク質とを組み合わせて予めインキュベートしたＳＪＬ脾臓ＡＰＣの存在下で、Ｔ細胞ハイブリドーマＨＴ−２によるＩＬ−２の産生によって測定される、Ｉｇ−ＰＬＰ２、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ及びＩｇ−Ｗの相対的拮抗作用を示すグラフである。
【図７】
図７Ａ及び７Ｂは、リンパ節（７Ａ）または脾臓（７Ｂ）由来の細胞による３Ｈ−チミジン取り込みによって測定される、Ｉｇ−ＰＬＰ１接種後のＰＬＰ１のインビボ提示を示すグラフであり、ここで示された値は、アゴニストＰＬＰ１またはコントロールペプチドＰＬＰ２に暴露したとき３Ｈ−チミジン取り込みによって測定される、個々のマウスから収集された細胞がＴ細胞応答を生じる能力を表している。
【図８】
図８Ａ及び８Ｂは、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲをＩｇ−ＰＬＰ１と同時投与したとき、リンパ節（８Ａ）または脾臓（８Ｂ）由来のマウス細胞で測定される、ＰＬＰ１ペプチドに対する免疫応答を低下させるＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲの能力を示すグラフであり、ここで示された値はＰＬＰ１に暴露したとき３Ｈ−チミジン取り込みによって測定される、個々のマウスから収集された細胞がＴ細胞応答を生じる能力を表している。
【図９】
図９Ａ及び９Ｂは、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲとＩｇ−ＰＬＰ１の混合物を接種されたマウスが、リンパ節（９Ａ）または脾臓（９Ｂ）由来の細胞で測定すると、ペプチドＰＬＰ１に対してよりペプチド類似体ＰＬＰ−ＬＲに対して一層激しい免疫応答を発現することを示すグラフであり、ここで示された値は、ＰＬＰ１ペプチドまたはペプチド類似体ＰＬＰ−ＬＲに暴露したとき３Ｈ−チミジン取り込みに反映される、個々の対象から収集された細胞がＴ細胞応答を生じる能力を表している。
【図１０】
図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｉｇ−ＰＬＰキメラによる免疫化に対するリンパ節増殖応答を示すグラフであり、マウスは各刺激剤について三重複ウエルで個別に試験されて、ここで表示のｃｐｍはバックグランドｃｐｍを差し引いた後の平均値±ＳＤを表す。
【図１１】
図１１は、Ｉｇ−ＰＬＰ１とＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲによる同時免疫に対するリンパ節Ｔ細胞増殖応答のグラフであり、刺激剤はＰＰＤを５μｇ／ｍＬ、ＰＬＰ１、ＰＬＰ−ＬＲ及びＰＬＰ２を１５μｇ／ｍＬ含む。
【図１２】
図１２は、三重複ウエルでＰＬＰ１（斜め格子付き棒）及びＰＬＰ−ＬＲ（平行斜線付き棒）で刺激したとき、Ｉｇ−Ｗ、Ｉｇ−ＰＬＰ１、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ及びこれらの組合せで免疫したマウスの脾臓増殖Ｔ細胞応答のグラフである。
【図１３】
図１３Ａ〜１３Ｃは、Ｉｇ−Ｗ、Ｉｇ−ＰＬＰ１、Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ及びこれらの組合せで免疫したマウスの脾臓細胞によるＩＬ−２（１３Ａ）、ＩＮＦγ（１３Ｂ）及びＩＬ−４（１３Ｃ）の産生を示すグラフである。
【図１４】
図１４Ａ〜１４Ｄは、ＰＬＰ１ペプチド、ＰＬＰ−ＬＲペプチド及びこれらの混合物によるインビトロ刺激に際して、Ｉｇ−ＰＬＰ１（ａ及びｂ）またはＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（ｃ及びｄ）含有ＣＦＡで免疫したマウスからの、抗原暴露Ｔ細胞の増殖をグラフで示している。
【図１５】
図１５Ａ及び１５Ｂは、ＰＬＰ１ペプチド、ＰＬＰ−ＬＲペプチド及びこれらの混合物によるインビトロ刺激に際して、Ｉｇ−ＰＬＰ１（１５Ａ）及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ（１５Ｂ）で免疫した抗原暴露Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を示すグラフである。
【図１６】
図１６Ａ及び１６Ｂは、Ｉｇ−ＷではなくＩｇ−ＰＬＰ１を注射した新生児マウスがＥＡＥの誘導に抵抗することをグラフで示しており、臨床的に得られた曲線が全マウス（１６Ａ）と生存マウス（１６Ｂ）について示されている。
【図１７】
図１７Ａ及び１７Ｂは、誕生後２４時間以内にＩｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−Ｗを注射した後の新生児の胸腺（１７Ａ）及び脾臓（１７Ｂ）の抗原提示細胞によるＩｇ−ＰＬＰ１のインビボ提示をグラフで示している。
【図１８】
図１８Ａ及び１８Ｂは、誕生後すぐにＩｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−Ｗを注射したマウスにおける、遊離ＰＬＰ１、ＰＬＰ２またはＰＬＰの脳炎誘発配列１７８〜１９１に相当するネガティブコントロールペプチドによる刺激時の、リンパ節（１８Ａ）及び脾臓（１８Ｂ）の増殖Ｔ細胞応答をグラフで示している。
【図１９】
図１９Ａ〜１９Ｃは、誕生後すぐにＩｇ−ＰＬＰ１で処理し、さらに遊離ＰＬＰ１またはＰＬＰ２で刺激したマウスにおけるＩＬ−２（１９Ａ）、ＩＬ−４（１９Ｂ）及びＩＦＮγ（１９Ｃ）の産生によって測定される、リンパ節Ｔ細胞逸脱をグラフで表している。
【図２０】
図２０Ａ〜２０Ｃは、誕生後すぐにＩｇ−ＰＬＰ１で処理し、さらに遊離ＰＬＰ１またはＰＬＰ２で刺激したマウスにおけるＩＬ−２（２０Ａ）、ＩＬ−４（２０Ｂ）及びＩＦＮγ（２０Ｃ）の産生によって測定される、脾臓Ｔ細胞逸脱をグラフで表している。
【図２１】図２１は、誕生後すぐにＩｇ−ＰＬＰ１を注射し、７週目に遊離ＰＬＰ１で免疫し、さらに遊離ＰＬＰ１で刺激したマウスにおける脾臓Ｔ細胞増殖のサイトカイン介在性回復をグラフで示しており、細胞はコントロール培地（ＮＩＬ）、ＩＬ−１２を有する培地及びＩＮＦγを有する培地中で増殖させ、各マウスについて示したｃｐｍは三重複ウエルの平均値±ＳＤを表している。
【図２２】
図２２は、ＥＡＥの発生分化を誘導したマウスに対する可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、可溶性Ｉｇ−Ｗ、あるいは遊離ＰＬＰ１ペプチド投与の結果を示す。可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１の投与は、ＥＡＥを罹患するマウスにおいて麻痺の重症度を低下させ、再発を抑制した。
【図２３】
図２３は、ＥＡＥの発生分化を誘導したマウスに対する可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、可溶性ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲ、あるいは可溶性Ｉｇ−Ｗ投与の結果を示す。Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ処理マウスはどちらも、疾患の初期ピーク中において臨床的重症度を軽減した。Ｉｇ−Ｗ投与マウスは観察した全１２０日を通して再発を示したが、Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇ−ＰＬＰ−ＬＲ処理マウスはそれぞれ３１日及び３８日までに麻痺を回復し、再発を示さなかった。
【図２４】
図２４は、ＥＡＥ罹患マウスにアジュバンドを含まない可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与した後における同時刺激性分子レベルを示す。Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスは、培地のみを投与されたコントロールマウスよりも低いＢ７．１及びＣＤ４０レベルを呈示した。
【図２５】
図２５は、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の投与が、長期間にわたる状態の臨床段階付けによって示されるように、マウスにおいて効果的にＥＡＥを改善することを示す。
【図２６】
図２６Ａ及び２６Ｂは、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１に精製ＡＰＣを加えてインキュベートすると、好都合にも抗炎症性サイトカインＩＬ−６（２６Ａ）及びＩＬ−１０（２６Ｂ）の産生を誘導することを示す。
【図２７】
図２７ａは、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１及び凝集性Ｉｇ−ＷがＥＡＥを改善する能力を比較する。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスは疾患重症度の低下を呈したが、一方凝集性Ｉｇ−Ｗ処理マウスは決して回復せず、臨床評価の全期間を通じて再発を示した。
図２７ｂは、可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１と凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１による処理後のＰＬＰ１ペプチド誘発性ＥＡＥの疾患経過の直接比較である。凝集Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスの最大臨床スコア平均値ははるかに低く、また回復時間は可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１を投与されたマウスよりも迅速であった。
【図２８】
図２８ａは、脾臓細胞によるＩＬ−１０産生を誘導するための、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、凝集性Ｉｇ−Ｗ、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ２及び可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ２の能力の比較である。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、Ｉｇ−ＰＬＰ２、及びＩｇ−Ｗキメラは、脾臓細胞によるＩＬ−１０の産生を用量依存性で刺激するが、一方キメラの可溶型は検知可能レベルのＩＬ−１０を誘導しなかった。
図２８ｂは、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマクロファージによるＩＬ−１０産生に対する凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＩｇＭの効果を示す。Ｂ細胞ではなく、マクロファージ及び樹状細胞は、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートするとＩＬ−１０を産生する。マウスＩｇＭは、試験されたいずれのＡＰＣによってもＩＬ−１０産生を刺激できなかった。
【図２９】
図２９は、脾細胞を０．１μＭ　可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、０．１μＭ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、０．１μＭ　凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋５０μｇ／ｍＬ　２．４Ｇ２、または０．１μＭ　凝集Ｉｇ−ＰＬＰ１＋１００μｇ／ｍＬ　マウスＩｇと接触後のＩＬ−１０産生を示す。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１は、ＦｃγＲ１レセプターを架橋することによってＩＬ−１０を誘導する。
【図３０】
図３０ａは、ＰＬＰ１、ＰＬＰ２、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１及び凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ２に対するＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０の増殖応答を示す。ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０は、遊離ＰＬＰ１ペプチドまたは凝集Ｉｇ−ＰＬＰ１で予めパルスしたパラホルムアルデヒド固定脾臓ＡＰＣを加えてインキュベートすると増殖するが、ＡＰＣをネガティブコントロールであるＰＬＰ２または凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ２でパルスした場合には有意な増殖を示さない。
図３０ｂは、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０に非固定脾臓ＡＰＣ及び遊離ＰＬＰ１ペプチドまたは凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートした時のＩＬ−２産生の測定結果である。ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０は、遊離ＰＬＰ１ペプチド及び凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートすると大量のＩＬ−２を産生した。
図３０ｃは、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０に非固定脾臓ＡＰＣ及び遊離ＰＬＰ１ペプチドまたは凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートした時のＩＦＮγ産生の測定である。ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０は、遊離ＰＬＰ１ペプチド及び凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートすると大量のＩＦＮγを産生した。
図３０ｄは、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０に非固定脾臓ＡＰＣ及び遊離ＰＬＰ１ペプチドまたは凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートした時のＩＬ−４産生の測定である。ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０は、遊離ＰＬＰ１ペプチド及び凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートすると大量のＩＬ−４を産生した。
図３０ｅは、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０に非固定脾臓ＡＰＣ及び遊離ＰＬＰ１ペプチドまたは凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートした時のＩＬ−１０産生の測定である。ＩＬ−１０は、刺激剤が遊離ＰＬＰ１ではなく凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１のときに有意なレベルで検出可能であった。
【図３１】
図３１は、固定または生ＡＰＣに凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートして、それに引き続いてＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０を加えてインキュベートした後のＩＬ−１０産生の測定である。Ｉｌ−１０は、固定ＡＰＣでは検出不能であったが、生ＡＰＣはこれを産生した。
【図３２】
図３２ａは、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生に拮抗するために脾細胞によって産生されるＩＬ−１０の能力を測定する。脾細胞によって産生されるＩＬ−１０は、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生に拮抗作用することができる。
図３２ｂは、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生に拮抗作用するための樹状細胞によって産生されるＩＬ−１０の能力を測定する。樹状細胞によって産生されるＩＬ−１０は、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生に拮抗作用することができる。
図３２ｃは、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生に拮抗作用するためにマクロファージによって産生されるＩＬ−１０の能力を測定する。マクロファージによって産生されるＩＬ−１０は、Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生に拮抗作用することができる。
図３２ｄは、Ｂ細胞に凝集Ｉｇ−ＰＬＰ１及びＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０を加えてインキュベートしたときのＩＬ−１０及びＩＦＮ−γレベルを示す。Ｂ細胞は凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートしたときにはＩＬ−１０を産生せず、またＴ細胞によるＩＦＮγの分泌を阻害しない。
【図３３】
図３３ａは、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０に腹膜マクロファージ及び凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を加えてインキュベートしたときに産生されるＩＦＮγ及びＩＬ−１０レベルを示す。ＩＦＮγ産生は、提示マクロファージによって分泌されるＩＬ−１０レベルに比例して減少した。
図３３ｂは、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０に腹膜マクロファージ、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、及び抗ＩＬ−１０ｍＡｂである２Ａ５を加えてインキュベートしたときに産生されるＩＦＮγ及びＩＬ−１０レベルを示す。Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生の阻害は、抗ＩＬ−１０　ｍＡｂである２Ａ５によるそのようなＩＬ−１０の中和がＩＦＮγ産生を回復するため、ＡＰＣ誘導性ＩＬ−１０に直接関連する。
図３３ｃは、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０に腹膜マクロファージ、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、及びラットＩｇＧを加えてインキュベートしたときに産生されるＩＦＮγ及びＩＬ−１０レベルを示す。抗ＩＬ−１０の代わりにイソタイプコントロールであるラットＩｇＧを加えてインキュベートしても、ＴＣＣ−ＰＬＰ１−１Ｂ１０によるＩＦＮγ産生を阻害するＩＬ−１０の能力に効果はなかった。
【図３４】
図３４ａは、ＥＡＥ罹患マウスにおける凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋抗ＩＬ−１０、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋ラットＩｇＧ、凝集性Ｉｇ−Ｗ、または凝集性Ｉｇ−Ｗ＋抗ＩＬ−１０による処理効果を示す。ＩＬ−１０に対する抗体は、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１による疾患症状の改善を阻止した。
図３４ｂは、ＥＡＥ罹患マウスに対する可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１＋ＩＬ−１０、あるいは凝集性Ｉｇ−Ｗによる処理効果を示す。可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１は、検出可能なレベルのＩＬ―１０を誘導せず、疾患を僅かに改善するが、一方可溶性Ｉｇ−ＰＬＰ１に外因性ＩＬ−１０を加えると、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理マウスに観察されるレベルと同等なレベルまでさらに疾患を軽減する。
【図３５】
図３５は、ＥＡＥ罹患マウスに対する凝集性Ｉｇ−Ｗ、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１、または凝集性Ｉｇ−Ｗ＋ＰＬＰ１による処理効果を示す。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１による処理のみが疾患症状を軽減し、これは内因性ＩＬ−１０が疾患を調節するためには、ＡＰＣがＴ細胞に物理的に架橋する必要があることを実証した。
【図３６】
図３６は、ＥＡＥ罹患マウスに対する凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ−ＬＲまたは凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１投与効果を示す。これらの免疫調節剤のいずれかを投与されたマウスは疾患を回復するが、凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１を用いると回復がさらに迅速である。
【図３７】
図３７は、図３６と同様に処理されたマウスの組織病理学的分析である。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理マウスは、大脳及び腰脊髄のどちらにおいても炎症病巣数が有意に減少した。
【図３８】
図３８は、腹膜マクロファージ上の同時刺激性分子レベルに対する凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１の効果を示す。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１はＢ７．１、Ｂ７．２、またはＣＤ４０発現をダウンレギュレートする。
【図３９】
図３９ａは、ＰＬＰ１及びＰＬＰ２の両方によってＥＡＥが誘導されたマウスに対する凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理効果を示す。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理は疾患重症度を軽減した。
図３９ｂは、ＰＬＰ２によってＥＡＥが誘導されたマウスに対する凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理効果を示す。凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理は疾患重症度を軽減した。
【図４０】
図４０ａは、ＣＮＳホモジネートでＥＡＥを誘導後に凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１またはＩｇ−Ｗで処理されたマウスの、ＰＬＰ１、ＰＬＰ２、ＭＢＰ３、またはＨＡへの応答におけるＴ細胞増殖アッセイを示す。
図４０ｂは、図４０ａのマウスのＩＬ−２レベルを示す。
図４０ｃは、図４０ａのマウスのＩＦＮγレベルを示す。
図４０ｄは、図４０ａのマウスのＩＬ−４レベルを示す。
図４０ｅは、図４０ａのマウスのＩＬ−１０レベルを示す。
図４０ｆは、図４０ａのマウスのＩＬ−５レベルを示す。
図４０ｇは、図４０ａのマウスのＴＧＦβレベルを示す。
【図４１】
図４１は、ＣＮＳホモジネートによってＥＡＥが誘導されたマウスに対する凝集性Ｉｇ−ＰＬＰ１処理効果を示す。凝集性ＩｇＰＬＰ１処理は疾患重症度を軽減した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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