(57)【要約】αｄモノクローナル抗体を使用した脊髄損傷の治療方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊髄損傷患者に有効量の抗αｄモノクローナル抗体を投与する工程を含む、脊髄損傷後の運動回復を促進する方法。
【請求項２】
前記リガンドがＩＣＡＭ−ＲおよびＶＣＡＭ−１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脊髄損傷患者に有効量の抗αｄモノクローナル抗体を投与する工程を含む、脊髄損傷後の運動損傷を阻害する方法。
【請求項４】
前記リガンドがＩＣＡＭ−ＲおよびＶＣＡＭ−１からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脊髄損傷患者に有効量の抗αｄモノクローナル抗体を投与する工程を含む、脊髄損傷後の運動障害を制限する方法。
【請求項６】
前記リガンドがＩＣＡＭ−ＲおよびＶＣＡＭ−１からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脊髄損傷患者に有効量の抗αｄモノクローナル抗体を投与する工程を含む、脊髄損傷後の自律神経および感覚機能障害を制限する方法。
【請求項８】
前記リガンドがＩＣＡＭ−ＲおよびＶＣＡＭ−１からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗αｄモノクローナル抗体が、２１７Ｌまたは２２６Ｈからなる群から選択されるハイブリドーマによって分泌される、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗αｄモノクローナル抗体が、２１７Ｌまたは２２６Ｈとαｄへの結合について競合する、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗αｄモノクローナル抗体が、αｄリガンドへのαｄ結合を阻害する、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記脊髄損傷が、脊髄圧迫を含む、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９５年８月１日に米国特許第５，４３７，９５８号として付与された、１９９３年１２月２３日提出の米国特許出願第０８／１７３，４９７号の一部継続である、１９９５年１１月２８日に米国特許第５，４７０，９５３号として付与された、１９９４年８月５日提出の米国特許出願第０８／２８６，８８９号の一部継続である、１９９８年７月１６日に米国特許第５，７６６，８５０号として付与された、１９９４年１２月２１日提出の米国特許出願第０８／３６２，６５２号の一部継続である、１９９８年１０月６日に米国特許第５，８１７，５１５号として付与された、１９９６年２月２２日提出の米国特許出願第０８／６０５，６７２号の一部継続である、係属中の１９９７年１０月３日提出の米国特許出願第０８／９４３，３６３号の一部継続である、係属中の１９９８年１１月１６日提出の米国特許出願第０９／１９３，０４３号の継続である係属中の１９９９年７月８日提出の米国特許出願第０９／３５０，２５９号の一部継続である。これらの出願は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
（発明の背景）
インテグリンは、細胞接着に積極的に関連する膜関連分子のクラスである。インテグリンは、βサブユニットに非共有結合したαサブユニットを含む膜貫通ヘテロ二量体である。現在まで、少なくとも１４個のαサブユニットおよび８個のβサブユニットが同定されている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３４６、４２５〜４３４、１９９０にて概説）。βサブユニットは、一般に、１つを超えるαサブユニットと会合することができ、βサブユニットを共有するヘテロ二量体は、インテグリン集団内のサブファミリーとして分類されている。
【０００１】
白血球中での発現に制限されるヒトインテグリンの１つのクラスは、共通のβ２サブユニットによって特徴付けられる。この細胞特異的発現の結果として、これらのインテグリンは、一般に、白血球インテグリン、Ｌｅｕ−ＣＡＭ、またはロイコインテグリンと呼ばれる。共通のβ２サブユニットのために、このクラスの別の名称はβ２インテグリンである。３つの異なるαサブユニットＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、またはＣＤ１１ｃの１つと関連するβ２サブユニット（ＣＤ１８）は、以前に単離されている。ヒトＣＤ１８をコードするｃＤＮＡの単離は、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、４８、６８１〜６９０、１９８７に記載されている。ＷＨＯ承認の命名法では、ヘテロ二量体タンパク質は、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、およびＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８と呼ばれ、一般的な命名法では、それぞれＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１またはＭｏ１、およびｐ１５０，９５またはＬｅｕＭ５と呼ぶ（Ｃｏｂｂｏｌｄら、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩＩ、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、７８８、１９８７）。ヒトβ２インテグリンαサブユニットＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃは、還元環境下での電気泳動で、それぞれ１８０ｋＤ、１５５ｋＤ、および１５０ｋＤの見かけ上の分子量に移動することが示され、これらのサブユニットをコードするＤＮＡがクローン化されている（ＣＤ１１ａについてはＬａｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０８、７０３〜７１２、１９８９、ＣＤ１１ｂについてはＣｏｒｂｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１２４０３〜１２４１１、１９８８、ＣＤ１１ｃについてはＣｏｒｂｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６、４０２３〜４０２８、１９８７）。ほぼ同一の分子量によって同定されるヒトβ２インテグリンαおよびβ鎖の推定ホモログは、サルおよび他の霊長類（Ｌｅｔｖｉｎら、Ｂｌｏｏｄ、６１、４０８〜４１０、１９８３）、マウス（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５４、１５１７、１９８１）、およびイヌ（Ｍｏｏｒｅら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、３６、２１１〜２２０、１９９０）を含む他の種で多様に同定されている。
【０００２】
他の種由来の推定ホモログの絶対分子量は、有意に変化することが示されている（例えば、Ｄａｉｌｅｎｋｏら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、４０、１３〜２１、１９９２を参照のこと）、配列情報がない場合、ヒトインテグリンサブユニットと他の種で同定されたインテグリンサブユニットとの間の決定的な相関は不可能である。さらに、異なる種間でのタンパク質ファミリーにおける膜数のばらつきが認められている。例えば、ヒトより多数のＩｇＡイソ型がウサギで単離されていることを考慮のこと（Ｂｕｒｎｅｔｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、８、４０４１〜４０４７、１９８９およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６、７５６１〜７５６５、１９８９）。同様に、ヒトでは、少なくとも６種のメタロチオネインタンパク質の変異体が以前に同定されおり（Ｋｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２９９、７９７〜８０２、１９８２およびＶａｒｓｈｎｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６、２６〜３７、１９８６）、マウスでは、このような変異体が２種だけ証明されている（Ｓｅａｒｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４、１２２１〜１２３０、１９８４）。したがって、１つの種に複数のタンパク質ファミリーのメンバーが存在することは、別の種に対応するファミリーメンバーが存在することを必ずしも意味しない。
【０００３】
β２インテグリンの特定の文脈では、ヒトＣＤ１８に対する推定イヌβ２相対物が４個もの潜在的に異なるαサブユニットと二量体を形成することができることがイヌで認められている（Ｄａｎｉｌｅｎｋｏら、前出）。マウスのイヌ脾細胞での免疫化によって産生された抗体により、主に類似するが同一ではない分子量に基づいてヒトＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃに対するイヌホモログと暫定的に呼ばれるタンパク質が免疫沈降するモノクローナル抗体が得られた。４個のα様イヌサブユニットを認識および免疫沈降させる別の抗イヌ脾細胞抗体Ｃａ１１．８Ｈ２もまた、β２サブユニットと会合することができるが、固有の分子量を有し、分化組織マクロファージのサブユニットに発現が制限される。
【０００４】
マウス樹状細胞でのハムスターの免疫化によって産生される抗体により、２つの抗インテグリン抗体が得られた（Ｍｅｔｌａｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７１、１７５３〜１７７１、１９９０）。第１の抗体２Ｅ６は、分子量範囲１５０〜１６０ｋＤの小さなバンドに加えて分子量約１８０ｋＤおよび９０ｋＤの主要なサブユニットを有するヘテロ二量体を免疫沈降させた。第２の抗体Ｎ４１８は、分子量約１５０ｋＤおよび９０ｋＤのサブユニットを有する別の明らかなヘテロ二量体を沈降させた。細胞接着遮断研究では、抗体２Ｅ６はヒトＣＤ１８に対するマウス相対物を認識すると推測された。Ｎ４１８抗原の分子量により、ヒトＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８に対するマウス相対物の認識が示唆されたが、さらなる分析により、マウス抗原はＣＤ１１ｃ／ＣＤ８で認められたものと矛盾する組織分布パターンを示すことが示された。
【０００５】
イヌＣａ１１．８Ｈ２抗体およびマウスＮ４１８抗体によって認識される抗原は、以前に同定されたイヌまたはマウスαサブユニットの変異種（例えば、グリコシル化またはスプライス変異体）を示し得る。あるいは、これらの抗原は、固有のイヌおよびマウスインテグリンαサブユニットを示し得る。一次構造に関する特定の情報の非存在下では、これらの代替物を区別することができない。
【０００６】
ヒトでは、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８は、全ての白血球上で発現される。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８およびＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８は、本質的に単球、顆粒球、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上での発現に制限されるが、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８はまた、いくつかのＢ細胞型で検出される。一般に、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８はリンパ球で優先され、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は顆粒球で優先され、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８はマクロファージで優先される（Ａｒｎａｏｕｔ、Ｂｌｏｏｄ、７５、１０３７〜１０５０、１９９０の概説を参照のこと）。しかし、α鎖の発現は、活性化状態および各細胞型の分化によって変化し得る（Ｌａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、１１４、１８１〜２１７、１９９０の概説を参照のこと）。
【０００７】
β２インテグリン関連細胞接着を遮断することができるモノクローナル抗体を使用して、ヒト免疫応答および炎症応答におけるβ２インテグリンの関与が示された。例えば、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、およびＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８は、リンパ腫および腺癌細胞（Ｐａｔａｒｒｏｙｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、１１４、６７〜１０８、１９９０）へのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の結合、顆粒球蓄積（Ｎｏｕｒｓｈａｒｇｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２、３１９３〜３１９８、１９８９）、顆粒球独立性血漿漏出（Ａｒｆｏｒｓら、Ｂｌｏｏｄ、６９、３３８〜３４０、１９８７）、刺激白血球の走化性応答（Ａｒｆｏｒｓら、前出）、および血管内皮への白血球接着（Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９、４１７４〜４１７７，１９８７およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８３、２００８〜２０１７、１９８９）に積極的に関与する。免疫応答および炎症応答におけるβ２インテグリンの基本的役割は、白血球接着不全（ＬＡＤ）と呼ばれる臨床症候群で明らかとなり、臨床的発現には再発性およびしばしば生命を脅かす細菌感染が含まれる。ＬＡＤは、β２サブユニットの外因性変異に起因し（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、５０、１９３〜２０２、１９８７）、疾患状態の重症度は、β２サブユニット発現の欠損度に比例する。完全なインテグリンヘテロ二量体の形成は、β２変異によって阻害される（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、前出）。興味深いことに、ＣＤ１８に特異的な少なくとも１つの抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）シンシチウム形成を阻害することが示されているが、この阻害の正確な機構は不明である（Ｈｉｌｄｒｅｔｈ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｔａｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１０７５〜１０７８、１９８９）。この所見は、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８の主要なカウンター受容体ＩＣＡＭ−１もまた主要なライノウイルス血清型群の表面受容体であるという発見に一致する（Ｇｒｅｖｅら、Ｃｅｌｌ、５６、８３９、１９８９）。
【０００８】
ヒト免疫応答および炎症応答におけるβ２インテグリン結合活性の有意性により、この表面タンパク質クラスのより完全な理解を得る必要性が強調される。このサブファミリーの未知のメンバーおよびそのカウンター受容体の同定ならびにモノクローナル抗体またはβ２インテグリンの生物活性を変化することができる他の可溶性因子の産生により、β２インテグリン関連免疫応答および炎症応答における治療介入のための実用的手段が得られる。
（発明の簡単な説明）
１つの態様では、本発明は、新規のヒトβ２インテグリンαサブユニットαｄおよびαｄに固有の結合性および／または免疫学的性質を有するその変異体（すなわち、欠失、付加、または置換アナログ）をコードする新規の精製および単離ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写物（共にセンス鎖およびアンチセンス鎖））を提供する。本発明の好ましいＤＮＡ分子には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および完全または部分的に化学合成されたＤＮＡ分子が含まれる。現在好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２のポリペプチドをコードする配列番号１に記載のＤＮＡである。内因性または外因性転写調節エレメントに作動可能に連結されたαｄコード配列を含む組換えプラスミドおよびウイルスＤＮＡ構築物（発現構築物）もまた提供する。
【０００９】
ヒトαｄをコードするポリヌクレオチドに相同性を示す単離および精製マウスおよびラットポリヌクレオチドもまた、本発明によって得られる。好ましいマウスポリヌクレオチドを配列番号５２に示し、好ましいラットポリヌクレオチドを配列番号５４に示す。
【００１０】
本発明の別の態様として、αｄポリペプチドまたはその変異体を発現する、本発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトした原核または真核宿主細胞が得られる。本発明の宿主細胞は、宿主細胞自体または宿主細胞が成長した培地から単離することができるαｄポリペプチドの大量産生に特に有用である。その細胞外膜表面上にαｄポリペプチドを発現する宿主細胞もまた、αｄ特異的抗体の免疫原として有用である。好ましくは、αｄでトランスフェクトした宿主細胞を、β２インテグリンサブユニットを発現するように同時トランスフェクトしてヘテロ二量体を表面に発現させる。
【００１１】
精製および単離αｄポリペプチド、そのフラグメントおよび変異体もまた本発明によって得られる。好ましいαｄポリペプチドを、配列番号２に示す。本発明の新規のαｄ産物を、αｄ変異産物と共に、天然供給源由来の単離物として得ることができる、本発明の宿主細胞を含む組換え法によって産生することが好ましい。組換え産生および／または単離後の処理のために選択された宿主細胞の変化によって、αｄポリペプチドの完全にグリコシル化された形態、部分的にグリコシル化された形態、および完全に脱グリコシル化された形態を産生することができる。本発明の変異体αｄポリペプチドは、（１）αｄに特異的な１つまたは複数の生物活性または免疫学的特徴が喪失することなく、且つ好ましくは増強されているか（２）特定のリガンド／受容体結合またはシグナル伝達機能が特異的に損傷されている、１つまたは複数のアミノ酸が欠失または置換されたアナログを含む水溶性および不溶性αｄポリペプチドを含み得る。αｄアミノ酸配列が他のポリペプチド由来のアミノ酸配列と連続的に発現する融合ポリペプチドもまた得られる。このような融合ポリペプチドは、野生型αｄと比較して改変された生物学的、生化学的、および／または免疫学的性質を有し得る。多量体形成を促進するさらなるアミノ酸（例えば、リジンまたはシステイン）残基を含むアナログポリペプチドも意味する。
【００１２】
αｄに特異的に結合するポリペプチドおよび他の非ペプチド分子も本発明に含まれる。好ましい結合分子には、抗体（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体）、カウンター受容体（例えば、膜会合形態および溶解形態）、および他のリガンド（例えば、天然に存在する分子または合成分子）が含まれる（αｄモノクローナル抗体および／または特異的カウンター受容体の存在下でαｄに競合して結合する分子が含まれる）。結合分子は、αｄポリペプチドの精製およびαｄを発現する細胞型の同定に有用である。結合分子はまた、αｄのｉｎ  ｖｉｖｏ結合および／またはシグナル伝達活性の調整（すなわち、阻害、遮断、または刺激）に有用である。
【００１３】
固定化リガンド結合アッセイ、溶液結合アッセイ、およびシンチレーションシンチレーション近接アッセイなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイならびに２ハイブリッドスクリーニングアッセイ、スプリットハイブリッドスクリーニングアッセイなどの細胞ベースのアッセイなどを含むαｄ結合分子を同定するアッセイもまた得られる。細胞ベースのアッセイにより、特異的結合相互作用または特異的結合相互作用の破壊の結果として宿主細胞中の表現型の変化が得られ、それにより、いくつかの特異的結合相互作用が間接的に定量または測定される。
【００１４】
αｄ活性を調整する抗体または他の化合物の同定のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、例えば、αｄまたはαｄに結合する天然リガンドの固定、非固定化結合パートナーの検出可能な標識、結合パートナーとのインキュベート、試験因子がαｄ結合のインヒビターであることを示す、試験化合物の存在下で結合した標識の減少を試験化合物の非存在下で結合した標識の量と比較した標識の結合量に対する試験化合物の効果の同定を含み得る。
【００１５】
αｄとリガンドとの間の相互作用を調整する化合物を同定するための他のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ型は、蛍光剤でコートされた（または浸漬させた）固体支持体上へのαｄまたはそのフラグメントの固定、蛍光剤を励起することができる化合物でのリガンドの標識、推定モジュレーター化合物の存在下および非存在下での標識リガンドとの固定化αｄの接触、蛍光剤による発光の検出、および調整化合物の非存在下での蛍光剤による発光と比較した蛍光剤によって発光に影響を与える化合物としての調整化合物の同定を含む。あるいは、αｄリガンドを固定し、αｄをアッセイで標識することができる。
【００１６】
αｄとリガンドとの間の相互作用を調整する化合物を同定するための本発明によって意図される細胞ベースのアッセイ法は、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの調節下でのレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物での適切な宿主細胞の形質転換またはトランスフェクション、宿主細胞におけるαｄの一部または全部および転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１の融合物をコードする第１のハイブリッドＤＮＡ配列の発現、リガンドの一部または全部および宿主細胞における第１の融合物中に組み込まれない転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインをコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列の発現、推定モジュレーターの存在下または非存在下における宿主細胞でのレポーター遺伝子産物産生の測定による特定の宿主細胞におけるリガンドのαｄへの結合の検出によるαｄとリガンドとの間の相互作用に対する推定調整化合物の効果の評価、および調整化合物の非存在下でのレポーター遺伝子産物の産生と比較した報告された遺伝子産物の産生を変化させる化合物としての調整化合物の同定を含む。現在アッセイで好ましいものは、ｌｅｘＡプロモーター、ｌｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４トランス活性化ドメイン、ｌａｃＺレポーター遺伝子、および酵母宿主細胞である。
【００１７】
ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの調節下でのレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物での適切な宿主細胞の形質転換またはトランスフェクション、宿主細胞におけるαｄの一部または全部と転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１の融合物をコードする第１のハイブリッドＤＮＡ配列の発現、推定αｄ結合タンパク質の一部または全部と第１の融合物中に組み込まれない転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインとの第２の融合物をコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列のライブラリーの発現、宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の産生の検出による特定の宿主細胞でのαｄへのαｄ結合タンパク質の結合の検出、および特異的に宿主からのαｄ結合タンパク質をコードする第２のハイブリッドＤＮＡ配列の単離によってαｄに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの単離に上記アッセイの修正形態を使用することができる。
【００１８】
好ましい実施形態では、スプリットハイブリッドアッセイを使用して、本発明は、（ａ）第１の選択マーカータンパク質をコードする第１の選択マーカー遺伝子およびリプレッサータンパク質をコードするリプレッサー遺伝子を含む第１のＤＮＡ発現構築物で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程であって、前記リプレッサー遺伝子はプロモーターの転写調節下にあり、（ｂ）第２の選択マーカータンパク質をコードする第２の選択マーカー遺伝子および第３の選択マーカータンパク質をコードする第３の選択マーカー遺伝子を含むを含む第２のＤＮＡ発現構築物で前記宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程であって、前記第３の選択マーカー遺伝子はオペレーターの転写調節下にあり、前記リプレッサータンパク質の前記オペレーターと；の相互作用により前記第３の選択マーカータンパク質発現が減少するように前記オペレーターは前記リプレッサータンパク質によって特異的に作用し、（ｃ）第４の選択マーカータンパク質をコードする第４の選択マーカー遺伝子およびαｄタンパク質または前記転写活性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは前記転写活性タンパク質のトランス活性化ドメインのいずれかをインフレームで含むそのフラグメントをコードするαｄ融合タンパク質遺伝子を含む第３のＤＮＡ発現構築物で前記宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程と、（ｄ）第５の選択マーカータンパク質をコードする第５の選択マーカー遺伝子およびαｄタンパク質または前記転写活性タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたは前記転写活性タンパク質のトランス活性化ドメインのいずれかをインフレームで含むその結合フラグメントをコードする第２の融合タンパク質遺伝子を含むがいずれも第１の融合タンパク質遺伝子に含まれない第４のＤＮＡ発現構築物で前記宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程と、（ｅ）前記αｄタンパク質またはそのフラグメントおよび前記αｄ結合タンパク質またはそのフラグメントを発現させる条件下で前記宿主細胞を成長させることにより、前記αｄタンパク質またはそのフラグメントおよびαｄ結合タンパク質またはその結合フラグメントが相互作用して前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記トランス活性化ドメインが近接し、前記トランス活性化タンパク質が再構築される工程であって、前記転写活性化タンパク質は前記プロモーターに対して作用して前記リプレッサータンパク質の発現を増加させ、前記リプレッサータンパク質は前記第３の選択マーカータンパク質が発現しないように前記オペレーターを相互作用し、（ｆ）前記選択遺伝子の発現の非存在を検出する工程と、（ｇ）前記αｄタンパク質またはそのフラグメントと前記αｄ結合タンパク質またはそのフラグメントとの間の結合の試験インヒビターの存在下で前記宿主細胞を成長させる工程と、（ｈ）前記試験インヒビターの存在下および非存在下で前記選択マーカータンパク質の発現を比較する工程であって、前記選択マーカータンパク質の発現の減少が、前記転写活性化タンパク質が再構築されず、前記リプレッサータンパク質発現が増加せず、前記オペレーターにより前記選択マーカータンパク質の発現が増加するような、前記αｄタンパク質またはそのフラ���メントと前記αｄ結合タンパク質またはその結合フラグメントとの間の結合を阻害する試験インヒビターの能力を示す、αｄタンパク質またはそのフラグメントとαｄ結合タンパク質またはその結合フラグメントとの間の結合インヒビターを同定する方法を提供する。
【００１９】
本発明は、種々の遺伝子および調節配列が１つのＤＮＡ分子にコードされる宿主細胞ならびに１つまたは複数のリプレッサー遺伝子、選択マーカー遺伝子、αｄ融合タンパク質遺伝子、およびαｄ結合タンパク質遺伝子が異なるＤＮＡ発現構築物にコードされる宿主細胞を含む。好ましい実施形態では、宿主細胞を、それぞれ異なる発現構築物にコードされる、リプレッサー遺伝子、選択マーカー遺伝子、αｄ融合タンパク質遺伝子、およびαｄ融合結合タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトする。移入されるＤＮＡ発現構築物数に関係なく、各形質転換またはトランスフェクトされたＤＮＡ発現構築物は、選択マーカー遺伝子配列をさらに含み、その発現を使用して実際にトランスフェクトまたは形質転換されたことを確認する。それぞれ形質転換またはトランスフェクトされたＤＮＡ発現構築物にコードされる選択マーカー遺伝子を、ｔｅｔオペレーターによって調節された選択マーカー遺伝子の発現が好ましい実施形態の中心であるという点でｔｅｔオペレーターの転写調節下で選択マーカーと区別可能である（すなわち、ｔｅｔオペレーターによる選択マーカー遺伝子発現の調節により宿主細胞における測定可能な表現型の変化が得られ、これを使用して結合タンパク質インヒビターを同定する）。各ＤＮＡ発現構築物の首尾のよいトランスフェクションまたは形質転換の決定要因として、それぞれ形質転換またはトランスフェクトされたＤＮＡ発現構築物にコードされる選択マーカー遺伝子が得られる。本発明の好ましい宿主細胞には、１９９６年８月１３日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２に寄託され、それぞれアクセッション番号ＡＴＣＣ７４３８４およびＡＴＣＣ７４３８５と割り当て在られたＹＩ５９６およびＹＩ５８４と呼ばれる形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株が含まれる。
【００２０】
本発明の宿主細胞には、上記の必要なαｄおよびαｄ結合タンパク質を発現することができ、記載の外因性タンパク質の発現も調節する機能的プロモーターおよびオペレーター配列で形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞型が含まれる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、または酵母起源のいずれかである。本発明の好ましい酵母細胞を、表１に記載のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母形質転換体を含む種々の株から選択することができる。別の酵母検体には、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓが含まれる。本発明の好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、３Ｔ３、ＣＶ１、ＬＴＫ、２９３Ｔ３、Ｒａｔ１、ＰＣ１２、またはヒトもしくはげっ歯類起源の任意の他のトランスフェクション可能な細胞株が含まれる。好ましい昆虫細胞株には、ＳＦ９細胞が含まれる。
【００２１】
好ましい実施形態では、選択マーカー遺伝子は、オペレーターによって調節され、選択マーカータンパク質の発現が栄養所要量を欠く培地での宿主細胞の成長に必要であるように宿主細胞の栄養所要量の合成経路の酵素をコードする。したがって、リプレッサータンパク質がオペレーターと相互作用する好ましい実施形態として、選択マーカー遺伝子の転写が下方調節され、宿主細胞は栄養所要量を欠く培地では成長できないことおよび栄養所要量を含む培地での成長能力によって同定される。最も好ましい実施形態では、選択マーカー遺伝子は、ＨＩＳ３タンパク質をコードし、ＨＩＳ３コードＤＮＡ発現産物で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞がヒスチジンの存在下および非存在下での培地の成長後に選択される。しかし、本発明は、オペレーターによって調節される任意の多数の別の選択マーカー遺伝子を含む。別の遺伝子には、例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、または成長培地から最終的に排除することができる栄養所要量の種々の生産経路で必要な任意の多数の酵素をコードする遺伝子が含まれる。さらに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、β−グルクロニダーゼ、ネオマイシン、ハイグロマイシン、チミジンキナーゼ（ＴＫ）などの従来のレポーター遺伝子を、本発明で使用することができる。
【００２２】
好ましい実施形態では、宿主細胞には、ｔｅｔオペレーターに作用して選択マーカー遺伝子の発現を減少させるテトラサイクリン耐性タンパク質をコードするリプレッサータンパク質遺伝子が含まれる。しかし、本発明はまた、ｔｅｔリプレッサーおよびオペレーターの代替物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐリプレッサーおよびオペレーター、ｈｉｓリプレッサーおよびオペレーター、ならびにｌａｃオペロンリプレッサーおよびオペレーター）を含む。
【００２３】
融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメイン成分は、αｄとαｄ結合タンパク質との間の結合を介した２つのドメインの近接によりリプレッサータンパク質の発現が高い効率で増加する機能的転写活性化タンパク質が形成される限り、同一の転写因子または異なる転写因子に由来し得る。高効率転写活性化タンパク質を、認識されたプロモーター配列に高い結合親和性を示すＤＮＡ結合ドメインおよびリプレッサー遺伝子ｍＲＮＡの発現に必要な転写機械タンパク質に高い結合親和性を有するトランス活性化ドメインの両方を有するものと定義する。本発明の融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン成分は、任意の多数の異なるタンパク質（例えば、ＬｅｘＡまたはＧａｌ４）に由来し得る。同様に、本発明の融合タンパク質のトランス活性化成分は、多数の異なる転写活性化タンパク質（例えば、Ｇａｌ４またはＶＰ１６を含む）に由来し得る。
【００２４】
リプレッサータンパク質の転写を調節する本発明のプロモーター配列は、選択した宿主細胞中での転写を駆動することができる任意の配列であり得る。プロモーターは、本発明の選択されたＤＮＡ結合ドメインによって特異的に認識されたＤＮＡ配列または融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが高親和性で相互作用することができる任意の他のＤＮＡ配列であり得る。本発明の好ましい実施形態では、本発明のプロモーター配列は、ＨＩＳ３またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーターのいずれかである。現在最も好ましい実施形態では、ＡＤＨプロモーターを本発明で使用する。しかし、本発明は、多数の別のプロモーター（例えば、ＨＩＳ３、ＡＤＨ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２などをコードする遺伝子由来のプロモーターを含む）を含む。
【００２５】
本発明の方法は、上記の宿主細胞における任意および全ての変形形態を含む。特に、本発明は、宿主細胞が酵母細胞であり、選択マーカー遺伝子がＨＩＳ３をコードし、選択マーカー遺伝子の転写がｔｅｔオペレーターによって調節され、リプレッサータンパク質遺伝子がテトラサイクリン耐性タンパク質をコードし、テトラサイクリン耐性タンパク質の転写がＨＩＳ３プロモーターで調節され、ＤＮＡ結合ドメインがＬｅｘＡに由来し、トランス活性化ドメインがＶＰ１６に由来する方法を含む。別の実施形態では、本発明は、宿主細胞が酵母細胞であり、選択マーカー遺伝子がＨＩＳ３をコードし、選択マーカー遺伝子の転写がｔｅｔオペレーターによって調節され、リプレッサータンパク質遺伝子がテトラサイクリン耐性タンパク質をコードし、テトラサイクリン耐性タンパク質の転写がアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターで調節され、ＤＮＡ結合ドメインがＬｅｘＡに由来し、トランス活性化ドメインがＶＰ１６に由来する方法を含む。
【００２６】
宿主細胞が哺乳動物である本発明の別の実施形態では、変形形態には、αｄおよびαｄ結合融合遺伝子、リプレッサー遺伝子、選択マーカー遺伝子の使用ならびに抗生物質または薬物耐性マーカー（すなわち、ネオマイシン、ハイグロマイシン、チミジンキナーゼ）をコードする選択マーカー遺伝子の使用が含まれる。
【００２７】
小分子モジュレーターの同定に使用される少なくとも３つの異なる型のライブラリーが存在する。これらには、（１）化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、および（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子から構成される組み合わせライブラリーが含まれる。
【００２８】
化学ライブラリーは、天然産物スクリーニングによる「ヒット」として同定された既知の化合物の構造アナログからなる。天然産物ライブラリーは、（１）土壌、植物、または海洋性微生物の発酵および抽出または（２）植物または海洋生物によるスクリーニング用の混合物を作製するために使用される微生物、動物、植物、または海洋生物の集団である。組み合わせライブラリーは、混合物としての多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物から構成される。これらは、伝統的な自動化合成法、ＰＣＲ、クローニング、または工業所有権を有する合成法によって比較的容易に調製される。特に興味深いものには、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、マルチパラレル合成集合物、組換え、およびポリペプチドライブラリーが含まれる。
【００２９】
αｄに特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明に含まれる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの産生技術は、当該分野で周知である。ハイブリドーマ細胞株を、精製αｄ、αｄの変異体、またはαｄもしくはその変異体が細胞外膜表面上で発現する細胞での動物の免疫化後に作製することができる。免疫原細胞型には、ｉｎ  ｖｉｖｏでαｄを発現する細胞、通常ｉｎ  ｖｉｖｏでは正常に発現しないトランスフェクトした原核または真核細胞株が含まれる。現在好ましい本発明の抗体は、１６９Ａ、１６９Ｂ、１７０Ｄ、１７０Ｆ、１７０Ｅ、１７０Ｘ、１７０Ｈ、１８８Ａ、１８８Ｂ、１８８Ｃ、１８８Ｅ、１８８Ｆ、１８８Ｇ、１８８Ｉ、１８８Ｊ、１８８Ｋ、１８８Ｌ、１８８Ｍ、１８８Ｎ、１８８Ｐ、１８８Ｒ、１８８Ｔ、１９５Ａ、１９５Ｃ、１９５Ｄ、１９５Ｅ、１９５Ｈ、１９７Ａ−１、１９７Ａ−２、１９７Ａ−３、１９７Ａ−４、１９９Ａ、１９９Ｈ、１９９Ｍ、２０５Ａ、２０５Ｃ、２０５Ｅ、２１２Ａ、２１２Ｄ、２１７Ｇ、２１７Ｈ、２１７Ｉ、２１７Ｋ、２１７Ｌ、２１７Ｍ、２２６Ａ、２２６Ｂ、２２６Ｃ、２２６Ｄ、２２６Ｅ、２２６Ｆ、２２６Ｇ、２２６Ｈ、２２６Ｉ、２３６Ａ、２３６Ｂ、２３６Ｃ、２３６Ｆ、２３６Ｇ、２３６Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｋ、２３７Ｌ、２３６Ｍ、２４０Ｆ、２４０Ｇ、２４０Ｈ、および２３６Ｌと呼ばれるハイブリドーマによって分泌される。
【００３０】
αｄのＤＮＡおよびアミノ酸配列の開示によって寄与された情報の価値が明白である。一連の例では、開示したαｄｃＤＮＡ配列により、ゲノム配列の転写調節エレメントを含むヒトαｄゲノムＤＮＡ配列の単離が可能である。αｄ対立遺伝子変異体および外来種（例えば、ラットまたはマウス）ＤＮＡの同定もまた含まれる。ヒトαｄゲノムＤＮＡおよび外因種ＤＮＡの単離を、適切にストリンジェントな条件下で適切なライブラリーをスクリーニングするためのプローブとしてαｄｃＤＮＡ配列の全部または一部を使用した標準的なＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成技術によって行うことができる。あるいは、既知のｃＤＮＡ配列に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ゲノムαｄＤＮＡ配列を増幅および同定することができる。フラグメントおよび他の変異体を含むαｄポリペプチドをコードする合成ＤＮＡを、従来の合成法によって産生することができる。
【００３１】
本発明のＤＮＡ配列情報により、相同組換えまたは「ノックアウト」ストラテジー（例えば、Ｋａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１２８８〜１２９２、１９８９を参照のこと）によって機能的αｄポリペプチドを発現することができないか変異αｄポリペプチドを発現するげっ歯類を開発することが可能である。このようなげっ歯類は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのαｄおよびαｄモジュレーター活性の研究用モデルとして有用である。
【００３２】
本発明のＤＮＡおよびアミノ酸配列により、カウンター受容体結合に積極的に関与するαｄエピトープならびに結合に積極的に関与するよりもむしろ調節することができるエピトープを分析可能である。膜貫通シグナル伝達に関与し得るエピトープの同定もまた、本発明に含まれる。
【００３３】
本発明のＤＮＡはまた、αｄポリペプチドを発現する細胞型の検出に有用である。αｄＲＮＡの検出にαｄＤＮＡを使用する標準的ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形成技術を使用して、細胞内のαｄ転写の構成性レベルならびに内部または外部因子に応答する転写レベルの変化を同定することができる。次いで、αｄの転写および／または翻訳を改変する因子の同定により、潜在的な治療または予防価値を評価することができる。本発明のＤＮＡにより、細胞ＲＮＡへのαｄＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成して、複雑な細胞集団および組織内のαｄ特異的メッセージの細胞局在化を同定することも可能である。
【００３４】
本発明のＤＮＡはまた、ヒトαｄ配列に対する相同性を表示する非ヒトポリヌクレオチド配列の同定に有用である。非ヒトαｄＤＮＡ配列の保有により、ヒト系の動物モデル（例えば、トランスジェニックモデルを含む）を開発可能である。
【００３５】
本発明の別の態様として、αｄに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、免疫組織化学的分析で使用して、αｄを細胞内区画または組織内の各細胞に局在化させることができる。この型の免疫組織化学的分析は、αｄｍＲＮＡおよびαｄ遺伝子のポリペプチド産物の両方の局在化するためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成と組み合わせて使用した場合に特に有用である。
【００３６】
αｄを発現する細胞型の同定は、治療薬および予防薬開発のための有意な副産物を有し得る。本発明のαｄ関連産物をマクロファージが疾患過程の不可欠要因である疾患の治療に使用することができると思われる。マクロファージ活性に関連する多数の病態についての動物モデルは、当該分野で説明されている。例えば、マウスでは、慢性および急性炎症部位へのマクロファージの漸増は、Ｊｕｔｉｌａら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．、５４、３０〜３９、１９９３で報告されている。ラットでは、Ａｄａｍｓら、（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５３、１１１５〜１１１９、１９９２およびＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５６、７９４〜７９９、１９９３）が、異所性腹部同種移植片移植後の移植片動脈硬化症モデルを記載している。Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、７、９〜２３、１９８７およびＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、７、２４〜３４、１９８７）は、コレステロール補充食を与えたウサギのアテローム性動脈硬化症の誘導を記載している。Ｈａｎｅｎｂｅｒｇら（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３２、１２６〜１３４、１９８９）は、ＢＢラットのインスリン依存性糖尿病の自発的発症を報告している。Ｙａｍａｄａら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１０４、７５９〜７７１、１９９３）は、連鎖球菌ペプチドグリカン−多糖類ポリマーの注射後のラットにおける炎症性腸疾患、慢性肉芽腫性大腸炎を記載している。Ｃｒｏｍａｒｔｉｅら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４６、１５８５〜１６０２、１９７７）およびＳｃｈｗａｂら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５９、４４３６〜４４４２、１９９１）は、ラットへの連鎖球菌細胞壁タンパク質の注射により末梢関節の炎症およびその後の関節崩壊によって特徴付けられる関節炎を引き起こすことを報告している。最後に、Ｈｕｉｔｉｎｇａら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３、７０９〜７１５、１９９３）は、ルイスラットにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（多発性硬化症モデル）を記載している。各これらのモデルでは、αｄ抗体、他のαｄ結合タンパク質、αｄの可溶性形態を使用して、おそらくマクロファージ活性の不活化により疾患状態を弱毒化する。
【００３７】
本発明によってこれらおよび他の病態の治療用の薬学的組成物が得られる。薬学的組成物は、αｄとそのリガンドとの間の相互作用の阻害を目的としてデザインされ、これには、αｄの種々の可溶性および膜結合形態（完全なαｄポリペプチドまたはαｄ結合に積極的に関与するそのフラグメント）、αｄ結合タンパク質の可溶性および膜結合形態（抗体、リガンドなどを含む）、αｄ結合活性の細胞内または細胞外モジュレーター、および／またはαｄおよび／またはαｄ−リガンドポリペプチド発現のモジュレーター（転写、翻訳、翻訳後プロセシング、および／または細胞内輸送のモジュレーターを含む）が含まれる。
【００３８】
本発明は、病態を罹患した患者にαｄ結合またはαｄを発現する細胞型の蓄積の調整に十分な量の本発明の薬学的組成物を投与する、αｄ結合（すなわち、αｄを発現する細胞の局在化蓄積）を含む病態の治療方法を含む。本発明の治療方法は、Ｉ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、喘息、乾癬、肺炎、急性呼吸促迫症候群、および慢性関節リウマチなどが含まれるが、これらに限定されない病態に適用可能である。
【００３９】
本発明はまた、個体に有効量の抗αｄモノクローナル抗体を投与する工程を含む、中枢神経系損傷部位でのマクロファージ浸潤の阻害方法を提供する。１つの態様では、この方法は、αｄと結合パートナーとの間の結合を遮断する抗αｄモノクローナル抗体の使用を含む。１つの実施形態では、結合パートナーはＶＣＡＭ−１である。好ましい実施形態では、抗αｄモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ２２６Ｈによって分泌されたモノクローナル抗体およびハイブリドーマ２３６Ｌによって分泌されたモノクローナル抗体からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、本発明の方法は、脊髄損傷である中枢神経系損傷用である。
【００４０】
本発明は、さらに、個体に有効量の抗αｄモノクローナル抗体を投与する工程を含む、中枢神経系損傷部位の炎症を軽減する方法を提供する。１つの態様では、この方法は、αｄと結合パートナーとの間の結合を遮断する抗αｄモノクローナル抗体の使用を含む。１つの実施形態では、結合パートナーはＶＣＡＭ−１である。好ましい実施形態では、抗αｄモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ２２６Ｈによって分泌されたモノクローナル抗体およびハイブリドーマ２３６Ｌによって分泌されたモノクローナル抗体からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、本発明の方法は、脊髄損傷である中枢神経系損傷用である。
【００４１】
ハイブリドーマ２２６Ｈおよび２３６Ｌは、１９９８年１１月１１日にブタペスト条約の条項の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｓａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９に受託され、それぞれアクセッション番号ＨＢ−１２５９２およびＨＢ−１２５９３が割り当てられた。
【００４２】
本発明はまた、食細胞と有効量の免疫特異的αｄモノクローナル抗体と接触させる工程を含む、マクロファージまたは脾細胞からのＴＮＦα放出を調整する方法を提供する。好ましい態様では、本発明の方法は、ＴＮＦα放出を阻害する抗モノクローナル抗体を含む。好ましい実施形態では、本発明の方法は、ハイブリドーマ２０５Ｃによって分泌されるモノクローナル抗体およびハイブリドーマ２０５Ｅによって分泌されるモノクローナル抗体からなる群から選択される抗αｄモノクローナル抗体の使用を含む。
【００４３】
本発明の方法は、有用な抗体には、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む抗αｄモノクローナル抗体のフラグメントが含まれることを意図する。改変抗体の使用方法もまた、本発明に含まれる。改変抗体には、例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフティング抗体（本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む）、ならびにヒト化抗体が含まれる。ヒト抗体の使用を含む方法もまた意図される。ヒト抗体の同定および単離技術を以下に示す。
【００４４】
本発明はまた、個体に有効量のαｄ結合を阻害する小分子を投与する工程を含む、中枢神経系損傷部位でのマクロファージ浸潤の阻害方法を提供する。特に、本発明の方法は、脊髄損傷である中枢神経系損傷を含む。αｄ結合に特異的な小分子を、上記のように同定し、ライブラリーから単離する。
【００４５】
本発明は、さらに、個体に有効量のαｄ結合を阻害する小分子を投与する工程を含む、中枢神経系損傷部位の炎症を軽減する方法を提供する。特に、本発明の方法は、脊髄損傷である中枢神経系損傷を含む。αｄ結合に特異的な小分子を、上記のように同定し、ライブラリーから単離する。
【００４６】
本発明は、さらに、患者由来の組織サンプルを得る工程と、前記サンプルを抗αｄモノクローナル抗体で染色する工程と、この染色パターンと既知の正常なドナーから得た組織の染色パターンと比較する工程とを含む、クローン病を検出および診断する方法を含む。２つの組織サンプル間の染色の相違を検出することができる場合、患者をクローン病の可能性についてさらに試験することができる。
【００４７】
本発明はまた、細胞表面上にαｄを発現する病原性細胞集団を除去するための標的としてのαｄの使用を意図する。１つの態様では、αｄモノクローナル抗体の超可変領域をクローン化し、補体固定ヒトイソ型の状況下で発現させる。この様式での超可変領域のクローニングにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの結合の際に補体が結合しその後細胞死を起こすαｄの結合パートナーが得られる。あるいは、抗αｄモノクローナル抗体を細胞傷害性化合物に結合させ、αｄへの抗体の結合により病原性細胞型が細胞死する。
【００４８】
本発明はまた、有効量の抗αｄモノクローナル抗体の脊髄損傷患者への投与による運動回復を促進するか、運動損傷を阻害するか、運動障害を制限する方法を提供する。有効量の抗αｄモノクローナル抗体の脊髄損傷患者への投与による、脊髄損傷後の自律神経および感覚機能障害を制限する方法もまた意図される。１つの実施形態では、抗αｄモノクローナル抗体は、２１７Ｌまたは２２６Ｈ抗体である。別の実施形態では、抗αｄモノクローナル抗体は、αｄへの結合について２１７Ｌまたは２２６Ｈと競合する。さらなる実施形態では、抗αｄモノクローナル抗体は、αｄリガンドへのαｄ結合を阻害する。意図されるαｄリガンドには、ＩＣＡＭ−ＲおよびＶＣＡＭ−１が含まれる。これらの方法によって治療される脊髄損傷の例には、脊髄圧迫を含む損傷が含まれる。
【００４９】
以下の説明を考慮し、図面を参照すれば、本発明の多数の他の態様および利点が明らかとなる。
（発明の詳細な説明）
本発明を、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー由来のαｄをコードするｃＤＮＡクローンの単離に関連する以下の実施例によって例示する。より詳細には、実施例１は、相同ヒトタンパク質を検出するための抗イヌαＴＭ１の使用を例示する。実施例２は、イヌαＴＭ１の精製およびイヌαＴＭ１遺伝子のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーをデザインするためのポリペプチドのＮ末端配列決定を詳述する。実施例３は、さらなるＰＣＲプライマーのデザインのための内部配列決定用のイヌαＴＭ１の大量精製に取り組む。実施例４は、イヌαＴＭ１遺伝子のフラグメントを増幅するためのＰＣＲおよび内部配列プライマーの使用を記載する。実施例５は、ヒトαｄコードｃＤＮＡ配列のクローニングに取り組む。実施例６は、ヒト組織およびαｄｍＲＮＡ発現用の細胞のノーザンブロットハイブリッド形成分析を記載する。実施例７は、ヒトαｄ発現プラスミドの構築および得られたプラスミドでのＣＯＳ細胞のトランスフェクションを詳述する。実施例８は、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞でのαｄ発現のＥＬＩＳＡ分析に取り組む。実施例９は、ヒトαｄ発現プラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞のＦＡＣＳ分析を記載する。実施例１０は、同時トランスフェクトしたＣＯＳ細胞におけるαｄに会合したＣＤ１８の免疫沈降に取り組む。実施例１１は、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるαｄ発現構築物の安定なトランスフェクションに関する。実施例１２は、細胞内接着分子ＩＣＡＭ−Ｒ、ＩＣＡＭ−Ｒ変異タンパク質、および補体因子ｉＣ３ｂへのαｄのＣＤ１８依存性結合に取り組む。実施例１３は、αｄリガンド／抗リガンド結合相互作用のインヒビターまたはエンハンサー（すなわち、モジュレーター）を同定するためのシンチレーション近接スクリーニングアッセイを記載する。実施例１４は、αｄの可溶性形態をコードする発現プラスミドの構築および発現産物の結合分析に取り組む。実施例１５は、αｄ特異的ポリクローナル血清およびモノクローナル抗体の産生に関する。実施例１６は、αｄモノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリー分析を記載する。実施例１７は、ヒト単球上でのαｄでの発現に取り組む。実施例１８は、αｄ組織分布の分析、末梢血リンパ球上でのαｄの発現、抗αｄポリクローナル血清を使用した炎症性および非炎症性滑膜での発現、罹患した肺および肝臓、ヒト骨髄、および乳癌患者由来のＰＢＭＣでの発現を記載する。実施例１９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのαｄ発現の上方制御に取り組む。実施例２０は、ヒトαｄ遺伝子配列に対する相同性を示すラットｃＤＮＡ配列の単離を記載する。実施例２１は、ラットαｄｍＲＮＡの組織特異的発現に取り組む。実施例２２は、全長ラットαｄプラスミド、Ｉドメイン／ＩｇＧ融合タンパク質を含むラットαｄＩドメイン発現プラスミドの構築、全長およびＩドメイン融合タンパク質に対するモノクローナル抗体の産生、およびヒトＩｇＧ４に融合したラットαｄＩドメインに対するポリクローナル抗体の産生に関する。実施例２３は、モノクローナル抗体１９９Ｍの特異性を記載する。実施例２４は、ラットαｄ発現マクロファージを使用したＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。実施例２５は���骨髄由来のラットαｄの免疫沈降を記載する。実施例２６は、種々の動物モデルにおけるαｄ発現を記載する。実施例２７は、αｄモノクローナル抗体を使用したＮＫ−腫瘍細胞誘導標的細胞溶解の阻害アッセイに関する。実施例２８は、ヒトαｄ遺伝子配列に相同性を示すマウスｃＤＮＡ配列の単離に取り組む。実施例２９は、配列分析の確認に使用したさらなるマウスαｄｃＤＮＡクローンの単離を記載する。実施例３０は、ヒトαｄに対する推定マウスホモログの組織および細胞特異的発現を同定するための種々のマウス組織のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成分析に関する。実施例３１は、ヒトαｄの推定マウスホモログをコードする発現構築物の産生を記載する。実施例３２は、ヒトαｄの推定マウスホモログをコードする遺伝子が破壊された「ノックアウト」マウスのデザインに取り組む。実施例３３は、ヒトαｄコード配列に相同性を示すウサギｃＤＮＡクローンの単離を記載する。実施例３４は、サルαｄの単離を記載する。実施例３５は、モノクローナル抗体２１７Ｌによって特徴付けられる抗原の特徴付けに関する。実施例３６は、αｄの調整により治療能力をアッセイするヒト病態の動物モデルを記載する。実施例３７は、動物モデルの病態におけるαｄの発現を記載する。実施例３８は、脊髄損傷におけるαｄの役割に取り組む。実施例３９は、クローン病におけるαｄ発現を記載する。実施例４０は、αｄを発現する脾細胞からのＴＮＦα放出に関する。実施例４１は、αｄモノクローナル抗体を使用した脾細胞からのＴＮＦα放出を調整する方法を記載した。実施例４２は、好酸球上でのαｄ発現を特徴付ける。実施例４３は、ＶＣＡＭ−１へのαｄ結合のさらなる特徴付けに関する。実施例４４は、病原性細胞集団の除去用の標的としてのαｄの使用を記載した。
【００５０】
【実施例１】
イヌαＴＭ１のヒトホモログの検出
イヌαＴＭ１に特異的なモノクローナル抗体Ｃａ１１．８Ｈ２（Ｍｏｏｒｅら、前出）を、イヌαＴＭ１のヒトホモログの同定におけるヒト末梢血白血球に対する交差反応性について試験した。細胞調製物（典型的には、１×１０６細胞）を、０．１％アジ化ナトリウムの存在下で氷上にて非希釈ハイブリドーマ上清または精製マウスＩｇＧ陰性コントロール抗体（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。モノクローナル抗体結合を、６μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）とのその後のインキュベーションによって検出した。染色細胞を２％ｗ／ｖパラホルムアルデヒドのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で固定し、Ｆａｃｓｔａｒ  Ｐｌｕｓ蛍光細胞分析分離装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で分析した。典型的には、蛍光強度についての対数増幅を使用して１０，０００個の細胞を分析した。
【００５１】
結果は、Ｃａ１１．８Ｈ２はヒト末梢血白血球上で発現した表面タンパク質と交差反応しないが、コントロール細胞である新生物性イヌ末梢血リンパ球は本質的に全てがαＴＭ１に陽性であることを示した。
【００５２】
イヌαサブユニットに特異的なモノクローナル抗体Ｃａ１１．８Ｈ２はヒトホモログと交差反応しないので、イヌαＴＭ１ＤＮＡの単離は、相対物ヒト遺伝子の単離のための先行必要条件と思われた。
【００５３】
【実施例２】
Ｎ末端配列決定のためのイヌαＴＭ１の親和性精製
オリゴヌクレオチドプローブ／プライマーデザイン用のＮ末端アミノ酸配列を決定するために、イヌαＴＭ１を親和性精製した。簡単に述べれば、抗αＴＭ１モノクローナル抗体Ｃａ１１．８Ｈ２を、Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）１０クロマトグラフィー樹脂（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に結合させ、特異的抗体−タンパク質相互作用によったタンパク質を単離した。ＢｉｏＲａｄが提唱するプロトコールにしたがって、約５ｍｇ抗体／ｍｌ樹脂の濃度で抗体を樹脂に結合させた。結合反応後、過剰な抗体を除去し、３倍体積の０．１Ｍ  エタノールアミンで遮断した。次いで、樹脂を３０カラム体積のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
【００５４】
２５ｇの単一系列のイヌ脾臓を、プロテアーゼインヒビターを含む０．３２Ｍ  スクロースの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む２５０ｍｌの緩衝液中でホモジナイズした。核および細胞片を１０００ｇで１５分間の遠心分離でペレット化した。１００，０００ｇで３０分間の遠心分離で上清から膜をペレット化した。膜ペレットを、２００ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ホウ酸（ｐＨ８．０）（２％ＮＰ−４０を含む））中に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、１００，０００ｇで６０分間の遠心分離によって不溶性物質をペレット化した。１０ｍｌの明澄化溶解物を、０．５ｍｌの上記Ｃａ１１．８Ｈ２結合Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）１０樹脂を含む１５ｍｌのポリプロピレンチューブに移した。チューブを、回転しながら４℃で一晩インキュベートし、その後５０倍体積のＤ−ＰＢＳで樹脂を洗浄した。次いで、樹脂を微量遠心チューブに移し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、および０．００２％ブロモフェノールブルーを含む１ｍｌのＬａｅｍｍｌｉ（非還元）サンプル緩衝液中で１０分間ボイルした。樹脂を遠心分離によってペレット化して破棄し、上清を１／１５倍体積のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で処理し、７％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。以下のように、分離したタンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移した。
【００５５】
ゲルを、脱イオンＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）濾過水で１回洗浄し、１０％メタノールを含む１０ｍＭの３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）トランスファー緩衝液（ｐＨ１０．５）中で１５〜４５分間平衡化した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜を、メタノールで湿らせ、濾過水で洗浄し、ＣＡＰＳトランスファー緩衝液中で１５〜３０分間平衡化した。Ｂｉｏｒａｄトランスファー装置を使用して、７０ボルトで３時間最初のトランスファーを行った。トランスファー後にＩｍｍｏｂｉｌｏｎ膜を除去し、濾過０．１％Ｒ２５０クーマシー染色液中で１０分間染色した。膜を５０％メタノール／１０％酢酸中で３回各１０分間脱色した。脱色後、膜を濾過水で洗浄し、風乾した。
【００５６】
約１５０ｋＤ、９５ｋＤ、５０ｋＤ、および３０ｋＤのタンパク質バンドが検出された。おそらく、５０ｋＤおよび３０ｋＤのバンドは、抗体汚染に起因していた。次いで、１５０ｋＤおよび９５ｋＤのバンドについてＮ末端配列決定を試みたが、９５ｋＤのタンパク質は遮断されて配列決定が妨げられた。１５０ｋＤのタンパク質バンドを膜から切り出し、製造者の説明書に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）モデル４７３Ａタンパク質シークエンサーで直接配列決定を行った。得られたアミノ酸配列を、３文字アミノ酸表記を使用して配列番号５に記載する。
ＦＮＬＤＶＥＥＰＭＶＦＱ（配列番号５）
同定した配列は、インテグリンファミリーのαサブユニットに特徴的なＦＮＬＤ配列を含んでいた（Ｔａｍｕｒａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１１、１５９３〜１６０４、１９９０）。
【００５７】
プライマーデザインおよびイヌαＴＭ１配列の増幅
Ｎ末端配列情報から、ハイブリッド形成のために以下の３つのオリゴヌクレオチドプローブをデザインした：哺乳動物のコドン使用頻度の基づいたａ）「Ｔｏｍｍｅｒ」、完全な縮重ヌクレオチド；ｂ）「Ｐａｔｍｅｒ」、部分的な縮重オリゴヌクレオチド；およびｃ）「Ｇｕｅｓｓｍｅｒ」、非縮重オリゴヌクレオチド。これらのプローブを、それぞれ以下にそれぞれ配列番号６、７、および８として記載する。本明細書中のこれらおよび全ての他のヌクレオチド配列についての核酸記号は、米国特許法施行規則第１．８８２条に従う。
５’−ＴＴＹＡＡＹＹＴＧＧＡＹＧＴＮＧＡＲＧＡＲＣＣＮＡＴＧＧＴＮＴＴＹＣＡ−３’（配列番号６）
５’−ＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡ−３’（配列番号７）
５’−ＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＡＣＧＴＮＧＡＡＳＡＮＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＣＡＡ−３’（配列番号８）
配列決定データに基づいて、λＺＡＰ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にクローン化したイヌ脾臓／末梢血マクロファージｃＤＮＡライブラリーへのいくつかの低ストリンジェンシーでのハイブリッド形成におけるこれらのオリゴヌクレオチドを使用して関連クローンは検出されなかった。
【００５８】
その後、上記のＳｔｒａｔａｇｅｎｅライブラリーのプレート溶解物から精製したファージライブラリーＤＮＡ由来のＰＣＲによるイヌαＴＭ１配列の増幅のために推定Ｎ末端配列に基づいて５’Ｄｅｇ、５’Ｓｐｅｃ、３’Ｄｅｇ、および３’Ｓｐｅｃと呼ばれる４つの他のオリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、Ｄｅｇは縮重を示し、Ｓｐｅｃは非縮重を示す）をデザインした。
５’−ＴＴＹＡＡＹＹＴＮＧＡＹＧＴＮＧＡＲＧＡＲＣＣ−３’（配列番号９）
５’−ＴＴＹＡＡＹＹＴＧＧＡＣＧＴＮＧＡＡＧＡ−３’（配列番号１０）
５’−ＴＧＲＡＡＮＡＣＣＡＴＮＧＧＹＴＣ−３’（配列番号１１）
５’−ＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＴＮＧＧＹＴＣ−３’（配列番号１２）
αＴＭ１オリゴヌクレオチドプライマーを、λＺＡＰ（登録商標）で見出されるＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）中のポリリンカー領域に隣接する配列とハイブリッド形成する、それぞれ配列番号１３および１４に記載のＴ３およびＴ７ベクタープライマーと対合した。
５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’（配列番号１３）
５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号１４）
１５０ｎｇのラブラリーＤＮＡ、１μｇの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、および２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含むマグネシウムを含むＴａｑ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）中でＰＣＲ増幅を行い、０．２５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含むＴｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液中の１％アガロースゲルでの電気泳動によって産物を分離した。１０×ＳＳＰＥ中で一晩の毛細管現象による移動によってＨｙｂｏｎｄ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）膜にＤＮＡを移した。トランスファー後、固定ＤＮＡを０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む０．５ＭのＮａＯＨで変性させ、１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の１．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で中和し、２×ＳＳＰＥで洗浄し、その後Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）交差装置でＵＶ交差させた。膜を予備ハイブリッド形成緩衝液（５×ＳＳＰＥ、４×デンハート液、０．８％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド）中、５０℃で２時間震盪しながらインキュベートした。
【００５９】
オリゴヌクレオチドプローブ５’Ｄｅｇ、５’Ｓｐｅｃ、３’Ｄｅｇ、および３’Ｓｐｅｃ（それぞれ配列番号９、１０、１１、および１２）を、１００〜３００μＣｉのγＰ３２−ｄＡＴＰおよび１〜３単位のポリヌクレオチドキナーゼを含むＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍキナーゼ緩衝液を使用して３７℃で１〜３時間標識した。非組み込み標識を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液、および予備ハイブリッド形成溶液に直接添加したフロースルーを使用したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５ファイン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）クロマトグラフィーで除去した。膜を撹拌しながら４２℃で１６時間探索し、１×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳの最終ストリンジェンシー洗浄を使用して５０℃で１５分間繰り返し洗浄した。次いで、ブロットを、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに−８０℃で１〜４時間曝露した。
【００６０】
オリゴヌクレオチド５’Ｄｅｇ、５’Ｓｐｅｃ、３’Ｄｅｇ、および３’Ｓｐｅｃは、プライマーとして使用した反応物由来のＰＣＲ産物とのみハイブリッド形成し、プライマーとして使用していない反応物由来のＰＣＲ産物に曝露した場合ハブリッド形成できなかった。したがって、全ての適切なプローブとハイブリッド形成する産物は存在しなかったので、αＴＭ１に特異的なＰＣＲ産物は存在しないと結論付けた。
【００６１】
【実施例３】
内部配列決定用のイヌαＴＭ１の大量親和性精製
プライマーデザイン用のさらなるアミノ酸配列を得るために、イヌαＴＭ１を内部配列決定のために精製した。凍結脾臓の３つの切片（それぞれ約５０ｇ）および成体イヌ由来の２つの部分的脾臓由来の凍結細胞を使用して、内部配列決定用のタンパク質を作製した。５０ｇの脾臓を、Ｗａｒｉｎｇブレンダーを用いて２００〜３００ｍｌのホウ酸緩衝液中でホモジナイズした。ホモジナイズした物質を４％ＮＰ−４０を含む１倍体積の緩衝液で希釈し、混合物を少なくとも１時間穏やかに撹拌した。得られた溶解物を、２０００ｇで２０分の遠心分離で大きな破片を除去し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）プレフィルターまたはＣｏｒｎｉｎｇ０．８ミクロンフィルターのいずれかで濾過した。Ｃｏｒｎｉｎｇ０．４ミクロンフィルターシステムによる濾過によって溶解物をさらに明澄化した。
【００６２】
脾臓溶解物および実施例２に記載の抗体結合Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）１０樹脂を、１００ｍｌアリコート中に１５０：１の比で合わせ、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。１０００ｇで５分間の遠心分離後に溶解物を取り出し、より大量の抗体結合Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）１０樹脂と合わせ、上記のように一晩インキュベートした。吸収した樹脂アリコートを合わせ、５０倍体積のＤ−ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で洗浄し、樹脂を５０ｍｌのＢｉｏｒａｄカラムに移した。吸着タンパク質を、３〜５倍体積の０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．５）で樹脂から溶出させ、約９００μｌの画分を回収し、１００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和した。１５μｌのアリコートを各画分から取り出し、１／１５倍体積の１Ｍ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む同体積の２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中でボイルした。これらのサンプルを、８％Ｎｏｖｅｘ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、製造者が推奨するプロトコールに従って、クーマシー染色またはＤａｉｉｃｈｉキット（Ｅｎｐｒｏｔｅｃｈ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を使用した銀染色のいずれかによって視覚化した。大量のタンパク質を含む画分を合わせ、減圧濃縮した。残りの溶液を、還元Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液で５０％希釈し、Ｔｒｉｓ−グリシン／ＳＤＳ緩衝液における１．５ｍｍの７％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。Ｈｏｅｆｅｒトランスファー装置を使用した実施例２に記載の手順によって、タンパク質をゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ膜に移した。
【００６３】
αＴＭ１に対応するタンパク質バンドを、１０枚のＰＶＤＦ膜から切り出して全部で約４７μｇのタンパク質を得た。バンドを４ｍｌの５０％メタノール中で５分間脱色し、風乾し、１×２ｍｍ片に切断した。膜片を、２ｍｌの９５％アセトン中に時々ボルテックスしながら４℃で３０分間浸漬し、風乾した。
【００６４】
膜結合タンパク質のタンパク質分解の前に、３ｍｇの臭化シアン（ＣＮＢｒ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、１．２５ｍｌの７０％蟻酸に溶解した。次いで、この溶液を、ＰＶＤＦ膜片を含むチューブに添加し、チューブを室温の暗所で２４時間インキュベートした。次いで、上清（Ｓ１）を別のチューブに取り出し、０．２５ｍｌの７０％蟻酸で膜片を洗浄した。この上清（Ｓ２）を取り出して先の上清（Ｓ１）に添加した。２ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水を合わせた上清（Ｓ１およびＳ２）に添加し、溶液を凍結乾燥させた。ＰＶＤＦ膜片を窒素下で乾燥させ、１．２５ｍｌの６０％アセトニトリル、０．１％テトラフルオロ酢酸（ＴＦＡ）にて４２℃で１７時間再び抽出した。この上清（Ｓ３）を取り出し、０．０８％ＴＦＡを含む１．０ｍｌ８０％アセトニトリルにて４２℃で１時間再び膜片を抽出した。この上清（Ｓ４）を先の上清（Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３）と合わせ、減圧乾燥させた。
【００６５】
乾燥ＣＮＢｒ画分を、６３μｌの８Ｍ  尿素、０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３に溶解した。画分を５μｌの４５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、その後５０℃で１５分間インキュベートした。次いで、溶液を室温まで冷却し、５μｌの１００ｍＭ  ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の添加によって画分をアルキル化した。室温で１５分間のインキュベーション後、サンプルを１８７μｌのＭｉｌｌｉＱ水で最終尿素濃度２．０Ｍまで希釈した。次いで、トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ）を酵素：タンパク質＝１：２５（ｗ：ｗ）の比で添加し、タンパク質を３７℃で２４時間消化した。３０μｌのＴＦＡを添加して消化を停止させた。
【００６６】
次いで、タンパク質画分を、０．０５％ＴＦＡおよびＨＰＬＣ水（緩衝液Ａ）で平衡化した２．１×２５０ｍｍの５ミクロンＶｙｄａｃＣ−１８カラム（Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を使用したＷａｔｅｒｓ６２５ＬＣシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した。８０％アセトニトリルの０．０４％ＴＦＡ溶液（緩衝液Ｂ）（緩衝液Ｂの勾配３８〜７５％）で６５〜９５分および７５％〜９８％の勾配の緩衝液Ｂを９５〜１０５分の漸増濃度でペプチドを溶出した。ペプチドを０．２ｍｌ／分の流速で分画し、２１０ｎｍで検出した。
【００６７】
分画後、ペプチドのアミノ酸配列を、製造者の標準的サイクルおよびモデル６１０Ａデータ分析ソフトウェアプログラムバージョン１．２．１を使用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３７Ａタンパク質シークエンサーでの自動化エドマン分解によって分析した。全ての配列決定用試薬を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。８個の内部画分のうち７個のアミノ酸配列を以下に示し、「Ｘ」はアミノ酸の同一性が明白ではなかった。
ＶＦＱＥＸＧＡＧＦＧＱ（配列番号１５）
ＬＹＤＸＶＡＡＴＧＬＸＱＰＩ（配列番号１６）
ＰＬＥＹＸＤＶＩＰＱＡＥ（配列番号１７）
ＦＱＥＧＦＳＸＶＬＸ（配列番号１８）
ＴＳＰＴＦＩＸＭＳＱＥＮＶＤ（配列番号１９）
ＬＶＶＧＡＰＬＥＶＶＡＶＸＱＴＧＲ（配列番号２０）
ＬＤＸＫＰＸＤＴＡ（配列番号２１）
プライマーデザイン
得られた１つの内部アミノ酸配列（配列番号２２に示す）を使用して、配列番号２３に記載のｐ４（Ｒ）と呼ばれる完全に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。
ＦＧＥＱＦＳＥ（配列番号２２）
５’−ＲＡＡＮＣＣＹＴＣＹＴＧＲＡＡＡＣＴＹＴＣ−３’（配列番号２３）
【００６８】
【実施例４】
イヌαＴＭ１フラグメントのＰＣＲクローニング
イヌαＴＭ１遺伝子の５’部分を、ＰＣＲによって二重標準イヌ脾臓ｃＤＮＡから増幅した。
【００６９】
二重標準イヌ脾臓ｃＤＮＡの作製
幼若イヌ脾臓由来の１ｇの凍結材料をドライアイス上の液体窒素中で磨砕し、２０ｍｌのＲＮＡ−Ｓｔａｔ６０緩衝液（Ｔｅｌ−ＴｅｓｔＢ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）中でホモジナイズした。４ｍｌのクロロホルムを添加し、溶液を１２，０００ｇで１５分間の遠心分離によって抽出した。１０ｍｌエタノールで水相からＲＮＡを沈殿させた。次いで、Ｄｙｎａｌ  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）でポリＡ＋ＲＮＡを選択した。５アリコートの全部で１００μｇのＲＮＡを合わせ、同体積の２×結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．０Ｍ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）で希釈した。次いで、ＲＮＡをＯｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（全てのサンプルについて１．０ｍｌまたは５ｍｇのビーズ）と共に５分間インキュベートした。製造者が推奨するプロトコールに従って、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳを含む緩衝液でビーズを洗浄し、その後ポリＡ＋ｍＲＮＡを２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で溶出した。次いで、製造者が推奨するプロトコールに従って溶出ポリＡ＋ｍＲＮＡおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して、二重標準ｃＤＮＡを作製した。
部分的なイヌαＴＭ１ｃＤＮＡの単離
マンガンを含む１５０ｎｇの二重標準ｃＤＮＡ、５００ｎｇの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、および１．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のＴａｑ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用した標準的ＰＣＲ反応で、オリゴヌクレオチドプライマー５’Ｄｅｇ（配列番号９）およびｐ４（Ｒ）（配列番号２３）を使用した。得られた産物（１μｌの元の反応物）を、産生収率を増加させるために同一のプライマーを含む第２ラウンドのＰＣＲに供した。このバンドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含む６５℃の緩衝液中のＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）ＮＡ４５ペーパー上で１％アガロースゲルから溶出させ、沈殿させ、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および製造者の推奨するプロトコールを使用してｐＣＲｔｍＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にライゲーションした。ライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによってＸＬ−１  Ｂｌｕｅバクテリア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。１つのクローン２．７は、αＴＭ１ペプチド配列に対応する配列を含むと同定され、プライマーデザインに使用しなかった。
【００７０】
以下のように蛍光標識ｄＮＴＰが非対称ＰＣＲ反応に組み込まれたＤｙｅ−デオキシターミネーターサイクル配列キット（ＡＢＩ）を具備したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で配列決定を行った（ＭｃＣａｂｅ、「非対称ＰＣＲによる一本鎖ＤＮＡの産生」、ＰＣＲプロトコール：方法および応用ガイド、Ｉｎｎｉｓら編、７６〜８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０）。サンプルを９６℃で４分間保持し、２５サイクルのステップ配列に供した：９６℃で１５秒；５０℃で１秒；６０℃で４分。クロマトグラムおよびテキストファイルを含む配列データを、コンピュータのサンプルファイルに自動的にダウンロードした。クローン２．７の全インサート配列を、配列番号２４に示す。
【００７１】
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅライブラリーから全長イヌαＴＭ１ｃＤＮＡを単離する試み（実施例２に記載）は成功しなかった。約１×１０６個のファージプラークを、プローブとしてクローン２．７を含む３０％ホルムアミドを使用した低ストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成によってスクリーニングしたが、陽性クローンは得られなかった。クローン２．７由来の特異的オリゴヌクレオチドまたは保存αサブユニットアミノ酸モチーフＧＦＦＫＲ（Ｔａｍｕｒａら、前出）に基づいた縮重オリゴヌクレオチドと対合した他のペプチドフラグメント由来のアミノ酸配列を使用したクローン２．７に示された配列由来の関連配列下流の増幅もまた成功しなかった。
【００７２】
【実施例５】
イヌαＴＭ１の推定ヒトホモログのクローニング
イヌαＴＭ１に対するヒト配列ホモログの単離を試みるために、クローン２．７由来の約１ｋｂのイヌαＴＭ１フラグメントをプローブとして使用した。ＮＴ２（配列番号２５に記載）およびｐ４（Ｒ）（配列番号２３）プライマーを使用した実施例２に記載の条件下でのＰＣＲによってプローブを作製した。
５’−ＧＴＮＴＴＹＣＡＲＧＡＲＧＡＹＧＧ−３’（配列番号２５）
Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＧＡ）Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎキットおよび製造者が推奨するプロトコールを使用して、ＰＣＲ産物を精製した。精製ＤＮＡ（２００ｎｇ）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇキットおよび製造者が推奨するプロトコールを使用して、２００μＣｉのα３２ＰｄＣＴＰで標識した。非組み込み同位体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５（ファイン）重力クロマトグラフィーを使用して除去した。プローブを、使用前に０．２Ｎ  ＮａＯＨで変性させ、０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。
【００７３】
ｐＣＤＮＡ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中のヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーのＨｙｂｏｎｄ（登録商標）フィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上のコロニーリフトを調整した。フィルターを最初に変性させ、実施例２に記載のように中和し、その後３０％ホルムアミドを含む前ハイブリッド形成溶液（８ｍｌ／フィルター）中で穏やかに撹拌しながら５０℃で２時間インキュベートした。上記の標識プローブをこの溶液に添加し、フィルターと共に４２℃で１４時間インキュベートした。フィルターを３７℃で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、５０℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。最後のストリンジェンシー洗浄物は、６５℃の１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回であった（１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）である）。フィルムを増感紙と共にＫｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに６時間曝露した。二重リフト上にシグナルを発生したコロニーを、マグネシウム（ＬＢＭ）／カルベニシリンプレートを含むＬＢ培地上に画線し、３７℃で一晩インキュベートした。得られた画線コロニーを、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）フィルターでリフトし、これらのフィルターを上記のように処理した。前に記載のように標識したクローン２．７由来の１ｋｂプローブを使用した５０℃の５０％ホルムアミドハイブリッド形成溶液中で３時間のよりストリンジェンシーの高い条件下で、フィルターをハイブリッド形成した。探索したフィルターを、６５℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの最終ストリンジェンシーで洗浄し、増感紙と共に−８０℃で２．５時間Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに曝露した。陽性クローンを同定し、ＬＢＭ／カルベニシリン培地中で一晩培養した。製造者が推奨するプロトコールに従ってＰｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ミニプレップキットを使用して、培養由来のＤＮＡを調製し、得られたＤＮＡを配列決定した。
【００７４】
最初のスクリーニングにより１８個の陽性クローンが得られ、よりストリンジェンシーの高いハイブリッド形成条件下での第２のスクリーニングにより１つの陽性クローンが得られ、これを１９Ａ２と命名した。αｄクローン１９Ａ２のＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。
【００７５】
ヒトαｄｃＤＮＡおよび推定ポリペプチドの特徴付け
クローン１９Ａ２は、成熟タンパク質の全コード領域に加え、４８塩基（１６アミノ酸残基）の５’上流シグナル配列およびポリアデニル化配列で集結していない２４１塩基の３’非翻訳配列を含む。成熟タンパク質の中心分子量は、約１２５ｋＤと推定される。細胞外ドメインは、配列番号２の約１７〜１１０８残基を含むと推定される。この細胞外領域は、ヒトＣＤ１１ｃ巻く貫通領域（配列番号２の残基１１０９〜１１２８）に相補的な約２０個のアミノ酸領域に隣接している。細胞質ドメインは、約３０個のアミノ酸（配列番号２の残基１１２９〜１１６１）を含む。タンパク質はまた、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃに共通のＩ（挿入）ドメイン（Ｌａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、前出）に相補的な約２０２個のアミノ酸ホモログ領域（残基約１５０〜３５２）、αＥ（Ｓｈａｗら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、６０１６〜６０２５、１９９４）、およびＶＬＡ−１ならびにＶＬＡ−２（Ｔａｍｕｒａら、前出）を含む。他のインテグリン中のＩドメインは、ＩＣＡＭ結合に関与することが示されており（Ｌａｎｄｉｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２０、１５１９〜１５２７、１９９３；Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２０、１０３１〜１０４３、１９９３）、これにより、αｄもまた表面分子のＩＣＡＭファミリーのメンバーに結合し得ることが示唆される。この領域は、任意の他のインテグリンサブユニット中に存在することが示されている。
【００７６】
αｄの推定アミノ酸配列は、ＣＤ１１ａと約３６％の同一性、ＣＤ１１ｂと約６０％の同一性、およびＣＤ１１ｃと約６６％の同一性を示す。ＣＤ１１ｂ（配列番号３）、ＣＤ１１ｃ（配列番号４）、およびαｄ（配列番号２）のアミノ酸配列のアラインメントを、図１に示す。
【００７７】
β２インテグリン中のαサブユニットの細胞質ドメインは、典型定期には同種内で互いに異なるが、各αサブユニットは種の境界を超えて高い相同性を示す。これらの所見に一致して、αｄの細胞質領域は、全てのαインテグリン間で保存されていることが示されている膜近接ＧＦＦＫＲアミノ酸配列を除いてＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃと顕著に異なる（Ｒｏｊｉａｎｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、９８５９〜９８６６、１９９１）。インテグリンの細胞質テール領域が「インサイドアウト」シグナル伝達およびアビディティー制御に関連しているので（Ｌａｎｄｉｓら、前出）、αｄはＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃと相互作用するものと異なるサイトゾル分子と相互作用することが可能であり、結果として他のβ２インテグリンに関連するシグナル伝達経路と異なる経路に関連する。
【００７８】
αｄの細胞外ドメインは、Ｉドメインに隣接する保存ＤＧＳＧＳアミノ酸配列を含み、ＣＤ１１ｂではＤＧＳＧＳ配列はリガンド相互作用に必要な金属結合領域である（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａら、Ｃｅｌｌ、７２、８５７〜８６７、１９９３）。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃ中の３つのさらなる推定カチオン結合部位は、クローン１９Ａ２（配列番号１）中のアミノ酸４６５〜４７４、５１８〜５２７、および５９２〜６００のαｄ配列中に保存されている。αｄＩドメインは、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃの対応する領域にそれぞれ３６％、６２％、および５７％同一であり、この領域で比較的配列相同性が低いことから、αｄは他の公知のβ２インテグリンが相互作用するタンパク質を異なる細胞外タンパク質組と相互作用し得ることが示唆される。あるいは、公知のβ２インテグリンリガンド（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、および／またはＩＣＡＭ−Ｒ）のαｄの親和性は、他のβ２インテグリン／ＩＣＡＭ相互作用で示された親和性と異なり得る。（実施例１２を参照のこと。）
配列検証のためのさらなるヒトαｄｃＤＮＡクローンの単離
ヒトαｄをコードするＤＮＡ配列を確認するために、３ｋｂより長いｃＤＮＡについてのアガロースゲル電気泳動によってサイズ選択されたｐｃＤＮＡ／Ａｍｐ（実施例５に記載）中のヒト脾臓オリゴｄｔプライミングｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からハイブリッド形成によってさらなるヒトｃＤＮＡを単離した。ハイブリッド形成用プローブは、下記のようにαｄの５’領域に由来していた。ハイブリッド形成条件は、以下のハイブリッド形成以外は上記の最初のヒトαｄクローンの単離の条件と同一であり、フィルターを室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄し、４２℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。フィルターを、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに一晩曝露した。
【００７９】
５’αｄハイブリッド形成プローブを、以下の条件下でプライマーＣＤ１１ｃ５’Ｆｏｒ（配列番号９４）およびＣＤ１１ｃ５’Ｒｅｖ（配列番号９５）を使用して１９Ａ２クローンからＰＣＲによって作製した。サンプルを、９４℃で４分間保持し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００サーモサイクラー以下の３０サイクルの温度ステップに供した：ｉ）９４℃で１５秒間、ｉｉ）５℃で３０秒間、およびｉｉｉ）７２℃で１分間。
ＣＤ１１ｃ５’Ｆｏｒ：（５’）ＣＴＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧ（３’）（配列番号９４）
ＣＤ１１ｃ５’Ｒｅｖ：（５’）ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＣＣ（配列番号９５）
増幅産物を、製造者が推奨するプロトコールに従ってＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅキットを使用して精製した。得られた５’αｄプローブは、約７２０塩基長であり、配列番号１のヌクレオチド１１２１〜ヌクレオチド１８３９に対応する。精製ＤＮＡ（約５０ｎｇ）を、製造者が推奨するプロトコールに従ってＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットを使用して３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。非組み込み同位体を、製造者が推奨するプロトコールに従ってＣｅｎｔｒｉｓｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ）を使用して除去した。標識プローブを、４５％ホルムアルデヒドを含む前ハイブリッド形成溶液中でフィルターに添加し、５０℃で一晩インキュベーションを進行させた。インキュベーション後、上記のようにフィルターを洗浄した。
【００８０】
１３個のコロニーが、二重リフトでシグナルを発した。陽性コロニーをマスタープレートから拾い、ＬＢＭおよびカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）で希釈し、種々の希釈度でＨｙｂｏｎｄ（登録商標）フィルターにプレートした。二重フィルターを、最初のハイブリッド形成由来の同一の溶液でハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成後、フィルターを４２℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの最終ストリンジェンシーで洗浄し、フィルムに曝露した。
【００８１】
最初に同定した１３個の陽性クローンのうちの１０個を、第２のスクリーニングで確認した。これら１０個のクローンのうち、２個（Ａ７．ＱおよびＡ８．Ｑと呼ぶ）を配列決定し、ヒトαｄをコードすることが同定された。クローンＡ７．Ｑは、５’リーダー、コード領域の一部、および５’非翻訳配列のさらなる６０塩基を含む約２．５ｋｂ長であることが見出された。不完全なコード領域は、対応する配列番号１のヌクレオチド２１５２での異常なスプライシングイントロン領域に起因することが認められた。クローンＡ８．Ｑは、全αｄコード領域にわたり、対応する配列番号１の塩基３０５でのイントロン配列も含む約４ｋｂ長であることが見出された。最初に単離されたαｄクローン（配列番号１）と比較して、Ａ７．ＱおよびＡ８．Ｑクローンの両方が塩基１４９５に３つの塩基ＣＡＧコドンが挿入されていることが同定されたという点で１つの相違が認められた。クローンＡ７．ＱおよびＡ８．Ｑの配列をそれぞれ配列番号９６および９７に示し、クローンＡ７．ＱおよびＡ８．Ｑ由来の混成ヒト配列ならびに対応する推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号９８および９９に示す。
【００８２】
【実施例６】
組織中のヒトαｄ発現のノーザン分析
αｄの相対発現レベルおよび組織特異性を同定する為に、プローブとしてクローン１９Ａ２由来のフラグメントを使用してノーザン分析を行った。いくつかの各ヒト組織または培養細胞株由来の約１０μｇの全ＲＮＡを、１μｇの臭化エチジウムの存在下でのホルムアルデヒドアガロースゲルにロードした。１００Ｖで４時間の電気泳動後、１０×ＳＳＣ中で一晩の毛細管現象による移動によってニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。膜を８０℃の真空下で１．５時間ベーキングした。５０％ホルムアミドの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液を含む前ハイブリッド形成溶液を使用して、４２℃で３時間膜をブロックした。クローン１９Ａ２のフラグメントを、製造者が推奨する説明に従って、αＰ３２ｄＣＴＰおよびαＰ３２ｄＴＴＰを含むＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍｅ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅキットを使用して標識した。非組み込み標識を、ＴＥ緩衝液を含むＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５カラムで除去した。膜を前ハイブリッド緩衝液１ｍｌあたり１．５×１０６カウントで探索した。次いで、ブロットを、室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、４２℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃の１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃の０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、および５０℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで連続的に洗浄した。次いで、ブロットを、１９時間フィルムに曝露した。
【００８３】
クローン１９Ａ２由来のＢｓｔＸＩフラグメント（配列番号１のヌクレオチド２０１１〜３３８８に対応）を使用したハイブリッド形成により、肝臓、胎盤、胸腺、および扁桃の全ＲＮＡ中に約５ｋｂレンジの弱いシグナルが明らかとなった。腎臓、脳、または心臓サンプルではシグナルは検出されなかった。内皮ブロミド染色で同定したところ、腎臓株に存在するＲＮＡ量が最小であった。
【００８４】
クローン１９Ａ２の第２のフラグメント（配列番号１の塩基５００〜２１００の領域を含む）を使用した場合、ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用したヒト多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットで２つの異なるサイズのＲＮＡ転写物が検出された。脾臓および骨格筋で約６．５ｋｂのバンドが認められ、肺および末梢血白血球で４．５ｋｂのバンドが検出された。認められたサイズバリエーションは、組織特異的ポリアデニル化、他のインテグリンファミリーメンバーとのプローブの交差反応性、または選択的スプライシングｍＲＮＡとのハイブリッド形成に起因し得る。
【００８５】
配列番号１のヌクレオチド２０００〜３１００にわたる、クローン１９Ａ２由来の第３のフラグメントを使用したノーザン分析による結果は、他のクローン１９Ａ２フラグメントを使用した結果と一致した。
【００８６】
３つの骨髄系列細胞株由来のＲＮＡもまた、配列番号１のヌクレオチド５００〜２１００および２０００〜３１００に対応するフラグメントを使用して探索した。先にＰＭＡで刺激したＴＨＰ−１細胞株は、同一のサイズ範囲（約５．０ｋｂ）で散在性シグナルを発し、これは組織シグナルよりもわずかに高い強度であった。非刺激およびＤＭＳＯ刺激ＨＬ−６０細胞由来のＲＮＡは組織サンプルと同一の強度でαｄプローブとハイブリッド形成したが、ＰＭＡ処理によりシグナル強度は増加するようである。ＰＭＡおよびＤＭＳＯはそれぞれ単球／マクロファージおよび顆粒球経路に向かってＨＬ−６０細胞分化を駆動し、この結果は、単球／マクロファージ細胞株ではαｄ発現が増強されると示唆される。Ｕ９３７細胞はαｄメッセージを発現し、このシグナルはＰＭＡ刺激に伴って増加しなかった。Ｍｏｌｔ、Ｄａｕｄｉ、Ｈ９、ＪＹ、またはＪｕｒｋａｔ細胞でバンドは検出されなかった。
【００８７】
【実施例７】
ヒトαｄ構築物の一過性発現
ヒトクローン１９Ａ２は、メチオニン開始コドンおよびおそらくいくつかの５’シグナル配列を欠く。したがって、１９Ａ２配列を含むヒト発現プラスミドを作製するために、２つの異なるストラテジーを使用した。第１に、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１ｃのいずれかをコードする遺伝子由来のシグナルペプチド配列をクローン１９Ａ２にスプライシングしてキメラαｄ配列を得た２つのプラスミドを構築した。第２のアプローチでは、開始メチオニンをコードするようにクローン１９Ａ２中の第０位にアデノシン塩基を付加した第３のプラスミドを構築した。
【００８８】
３つのプラスミドは、αｄ配列またはキメラαｄ配列の５’部分をコードする異なる領域を含んでいた。αｄ領域を、特異的３’プライマーＢａｍＲｅｖ（以下の配列番号２６に記載）および３つの５’プライマーのうちの１つでＰＣＲ増幅した（実施例２の条件を参照のこと）。３つの５’プライマーは、配列中に以下を含んでいた：（１）消化可能な第１〜６位の同一の非特異的塩基、第７〜１２位のＥｃｏＲＩ部位、および第１３〜１８位のコンセンサスＫｏｚａｋ配列、（２）ＣＤ１１ｂ（プライマーＥＲ１Ｂ）もしくはＣＤ１１ｃ（プライマーＥＲ１Ｃ）シグナル配列の一部、またはアデノシン（プライマーＥＲ１Ｄ）、および（３）プライマーをアニーリング可能なクローン１９Ａ２由来の特異的に重複する５’配列のさらなる１５〜１７塩基。プライマーＥＲ１Ｂ、ＥＲ１Ｃ、またはＥＲ１Ｄをそれぞれ配列番号２７、２８、または２９に記載し、開始メチオニンコドンに下線を引き、ＥｃｏＲＩは二重線を引いた。
５’−ＣＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＧＣＣＣＧＴＧ−３’（配列番号２６）
５’−ＡＧＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＡＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２７）
５’−ＡＧＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＧＧＡＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２８）
５’−ＡＧＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＡＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２９）
得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。
【００８９】
３つ全てのプラスミドは、αｄクローンの３’末端を含む共通の第２のαｄ領域（先の段落に記載の５’領域からすぐ下流に挿入される）を含んでいた。ヌクレオチド６２５からクローン１９Ａ２のベクター３’ポリリンカー領域中のＸｂａＩ部位に伸長した第２のαｄ領域を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩでのクローン１９Ａ２の消化によって単離した。
【００９０】
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍｎｎｈｅｉｍリガーゼ緩衝液およびＴ４リガーゼ（反応あたり１単位）を使用して３’αｄＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントを３つの５’αｄＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの１つにライゲートした３つのライゲーション反応物を調製した。１４℃で４時間のインキュベーション後、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した適量のベクターｐｃＤＮＡ．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、さらにリガーゼ単位と共に各反応に添加した。さらに１４時間反応を継続した。ついで、反応混合物の１／１０をコンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。得られたコロニーを培養し、実施例５のようにＤＮＡを単離した。ＥｃｏＲＩ消化により、制限部位に陽性の３つのクローン（したがって、操作シグナル配列）が同定された。これらのクローンを、ｐＡＴＭ．Ｂ１（プライマーＥＲ１Ｂ由来のＣＤ１１ｂ／αｄ）、ｐＡＴＭ．Ｃ１０（プライマーＥＲ１Ｃ由来のＣＤ１１ｃ／αｄ）、およびｐＡＴＭ．Ｄ１２（プライマーＥＲ１ｄ由来のアデノシン／αｄ）と命名した。各クローン中の適切なシグナル配列の存在を、核酸配列決定によって確証した。
【００９１】
各プラスミドおよびＣＤ１８発現プラスミドｐＲＣ．ＣＤ１８でのＣＯＳ細胞の同時トランスフェクションによって、上記のαｄプラスミドから発現させた。陽性クローンとして、ＣＯＳ細胞を、プラスミドｐＲＣ．ＣＤ１８およびＣＤ１１ａ発現プラスミドｐＤＣ．ＣＤ１１Ａでも同時トランスフェクトした。
【００９２】
細胞を、トランスフェクションの１６時間前に５０％コンフルエンスで１０ｃｍのＣｏｒｎｉｎｇ組織培養処理ぺトリ皿の培養培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）中に継代した。全ての手順においてトリプシンを使用せずにＶｅｒｓｅｎｅ緩衝液（０．５ｍＭ  ＮａＥＤＴＡのＰＢＳ溶液）を用いて細胞をプレートから取り出した。トランスフェクション前に、プレートを無血清ＤＭＥＭで１回洗浄した。１５ｍｇの各プラスミドを、各プレート上の５ｍｌトランスフェクション緩衝液（２０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎおよび０．５ｍＭクロロキンを含むＤＭＥＭ）に添加した。３７℃で１．５時間のインキュベーション後、５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＤＭＳＯで１分間細胞にショックを与えた。次いで、このＤＭＳＯ溶液を、１０ｍｌ／プレート培養培地と置換した。
【００９３】
得られたトランスフェクタントを、実施例８、９、および１０に記載のＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、および免疫沈降によって分析した。
【００９４】
【実施例８】
ＣＯＳトランスフェクタントのＥＬＩＳＡ分析
ＣＤ１８発現プラスミドｐＲＣ．ＣＤ１８およびαｄプラスミドで同時トランスフェクトしたＣＯＳ細胞がＣＤ１８に会合した細胞表面上αｄを発現するかどうかを同定するために、ＣＤ１８に対して惹起した一次抗体（例えば、ＡＴＣＣ  ＨＢ２０３から精製したＴＳ１／１８）を使用してＥＬＩＳＡを行った。ポジティブコントロールとして、ＣＤ１８発現プラスミドおよびＣＤ１１ａ発現プラスミドｐＤＣ．ＣＤ１１Ａで同時トランスフェクトした細胞についてもＥＬＩＳＡを行った。このコントロール中の一次抗体は、ＣＤ１８抗体および抗ＣＤ１１ａ抗体（例えば、ＡＴＣＣ  ＨＢ２０２から精製したＴＳ１／２２）を含んでいた。
【００９５】
ＥＬＩＳＡのために、各プレート由来の細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅ緩衝液を使用して取り出し、１つの９６ウェル平底Ｃｏｒｎｉｎｇ組織培養プレートに移した。アッセイ前の細胞を培養培地中で２日間インキュベートした。次いで、プレートを１５０μｌ／ウェルのＤ−ＰＢＳ／０．５％硬骨類皮膚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）溶液で２回洗浄した。この緩衝液を、発生中以外の全工程で使用した。全ての洗浄およびインキュベーションを、室温で行った。ウェルを、ゼラチン溶液で１時間ブロックした。一次抗体をゼラチン溶液で１０μｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌを各ウェルに添加した。各一次抗体について３連のウェルをセットした。１時間のインキュベーション後、プレートを１５０μｌ／ウェルのゼラチン溶液で３回洗浄した。３５００倍希釈の二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇ／ＨＲＰ−Ｆｃ特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を５０μｌ／ウェルで添加し、プレートを１時間インキュベートした。３回の洗浄後、プレートを１００μｌ／ウェルのｏ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ）溶液（１ｍｇ／ｍｌＯＰＤを含むクエン酸緩衝液）で２０分間発色後、５０μｌ／ウェルの１５％硫酸を添加した。
【００９６】
抗ＣＤ１８特異的抗体を使用したＥＬＩＳＡ形式でのトランスフェクタントの分析により、ＣＤ１８をコードするプラスミドのみでトランスフェクトした細胞においてバックグラウンドを超える有意な発現は認められなかった。ＣＤ１１ａおよびＣＤ１８を含むプラスミドで同時トランスフェクトした細胞では、ＣＤ１８特異的抗体またはＣＤ１１ａ特異的な試薬で分析した場合にバックグラウンドを超える発現の増加が認められた。ＣＤ１８およびαｄ発現構築物（ｐＡＴＭ．Ｃ１０またはｐＡＴＭ．Ｄ１２）をコードするプラスミドで同時トランスフェクトした細胞のさらなる分析により、ＣＤ１８の細胞表面発現がαｄの同時発現によってレスキューされることが明らかとなった。ｐＡＴＭ．Ｃ１０またはｐＡＴＭ．Ｄ１２でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で検出可能なＣＤ１８発現の増加は、同時トランスフェクトしたＣＤ１１ａ／ＣＤ１８ポジティブコントロール細胞で認められた増加に匹敵した。
【００９７】
【実施例９】
ＣＯＳトランスフェクタントのＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析のために、トランスフェクションの翌日にぺトリ皿中の細胞に新鮮な培養培地を与え、アッセイ前に２日間インキュベートした。３ｍｌＶｅｒｓｅｎｅを使用してプレートからトランスフェクタントを取り出し、５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ／０．２％アジ化ナトリウム）で１回洗浄し、０．１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で５００，０００細胞／サンプルに希釈した。１０μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ結合ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、またはＣＤ１１ｂ特異的抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）または８００μｇ／ｍｌのＣＦＳＥ結合マウス２３Ｆ２Ｇ（抗ＣＤ１８）（ＡＴＣＣ  ＨＢ１１０８１）のいずれかを各サンプルに添加した。次いで、サンプルを氷上で４５分間インキュベートし、５ｍｌ／洗浄ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、０．２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルを、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣｓｃａｎで処理し、データをＬｙｓｙｓＩＩソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｏｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【００９８】
ＣＤ１８配列でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞は、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、またはＣＤ１１ｂについてのみしか染色されなかった。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８で同時トランスフェクトした場合、約１５％の細胞がＣＤ１１ａまたはＣＤ１８に対する抗体で染色された。ＣＤ１８および任意のαｄ構築物でトランスフェクトされた細胞は全てＣＤ１１ａおよびＣＤ１１ｂについて検出可能に染色されなかった。ｐＡＴＭ．Ｂ１、ｐＡＴＭ．Ｃ１０、およびｐＡＴＭ．Ｄ１２群は、ＣＤ１８についてそれぞれ４％、１３％、および８％陽性に染色された。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８群の陽性集団の蛍光は、バックグラウンドの４倍であった。比較として、ＣＤ１８構築物でのαｄ構築物の同時トランスフェクションにより、蛍光強度がバックグラウンドより４〜７倍増加した陽性集団が得られた。
【００９９】
【実施例１０】
同時トランスフェクトしたＣＯＳ細胞由来のヒトαｄ／ＣＤ１８複合体のビオチン標識免疫沈降
αｄがインテグリンに特徴的なαβヘテロ二量体の一部として単離することができるかどうかを同定するために、実施例７に記載のようにＣＤ１８および各αｄ発現プラスミドを個別に同時トランスフェクトした細胞について免疫沈降を試みた。
【０１００】
トランスフェクトした細胞（１〜３×１０８細胞／群）を、Ｖｅｒｓｅｎｅ緩衝液を用いてぺトリ皿から取り出し、５０ｍｌ／群のＤ−ＰＢＳで３回洗浄した。各サンプルを、室温の２ｍｇのＳｕｌｐｈｏ−ＮＨＳビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で１５分間標識した。５０ｍｌ／サンプルの冷Ｄ−ＰＢＳでの３回の洗浄によって反応を停止させた。洗浄細胞を、１ｍｌ溶解緩衝液（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  Ｃａ＋＋、２ｍＭ  Ｍｇ＋＋、およびプロテアーゼインヒビター）中で再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。不溶物質を１０，０００ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上清を新鮮なチューブに取り出した。マウス免疫グロブリンと非特異的な反応性を示す物質と除去するために、最初に明澄化を行った。２５μｇのマウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を、４℃で上清と共にインキュベートした。２．５時間後、１００μｌ（２５μｇ）のウサギ抗マウスＩｇ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂおよびウサギ抗マウスＩｇＧ（共にＺｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から調製）を各サンプルに添加し、穏やかに撹拌しながら１６時間４℃でインキュベーションを継続した。遠心分離によってＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズを上清から除去した。予備クリアランス後、上清を２０μｇの抗ＣＤ１８抗体（ＴＳ１．１８）で２時間、４℃で処理した。上記の１００μｌ／サンプルの上記ウサギ抗マウス／プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）調製物とのインキュベーションによって、抗体／抗原複合体を上清から単離した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）で４回洗浄した。洗浄ビーズをペレット化し、２％β−メルカプトエタノールを含む２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で１０分間ボイルした。サンプルを遠心分離し、８％調製済みＮｏｖｅｘポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）にて１００Ｖで３０分間電気泳動した。タンパク質を、２００ｍＡで１時間ＴＢＳ−Ｔ緩衝液中のニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。膜を、３％ＢＳＡのＴＢＳ−Ｔ溶液で２時間ブロックした。膜を、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の６０００倍希釈物で１時間処理し、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、製造者の説明書に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅキットを使用して、ブロットを発色させた。膜を、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（登録商標）ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に０．５〜２分間曝露した。
【０１０１】
ｐＲＣ．ＣＤ１８およびｐＡＴＭ．Ｂ１、ｐＡＴＭ．Ｃ１０、またはｐＡＴＭ．Ｄ１２のいずれかでトランスフェクトした細胞からのＣＤ１８複合体の免疫沈降により、約１００ｋＤのβ鎖からなるヘテロ二量体種の表面発現が明らかになり、これはＣＤ１８の推定サイズおよびαｄに対応する約１５０ｋＤのα鎖と一致した。
【０１０２】
【実施例１１】
チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるヒトαｄの安定なトランスフェクション
αｄがＣＤ１８に会合したヘテロ二量体として細胞表面上に発現するかどうかを同定するために、各鎖をコードするｃＤＮＡを、αｄおよびＣＤ１８の両方を欠く細胞株に一過性および安定にトランスフェクトした。
【０１０３】
これらの実験のために、実施例７に記載のようにαｄｃＤＮＡをさらなるリーダー配列およびＫｏｚａｋコンセンサス配列を使用して増加させ、発現ベクターｐｃＤＮＡ３にサブクローン化した。ｐＡＴＭ．Ｄ１２と命名した最終構築物を、ヒトＣＤ１８をコードする市販の改変ベクターｐＤＣ１．ＣＤ１８でジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）−チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に同時トランスフェクトした。プラスミドｐＤＣ１．ＣＤ１８は、ＤＨＦＲ＋マーカーをコードし、トランスフェクタントを、適切なヌクレオシド欠損培地を使用して選択することができる。ｐＤＣ１．ＣＤ１８が得られる改変を、以下に示す。
【０１０４】
プラスミドｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、サイトメガロウイルスプロモーターおよびアンピシリン耐性マーカー遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターである。プラスミドｐＳＣ１１９０−ＤＨＦＲ由来のＤＨＦＲ遺伝子を、ＳＶ４０の複製起点のｐＲＣ／ＣＭＶ５’に挿入した。さらに、プラスミドｐＨＦ２Ｇ−ＤＨＦの５’領域由来のポリリンカーを、ｐＲＣ／ＣＭＶ／ＤＨＦＲ構築物（ＤＨＦＲ遺伝子の３’）にライゲートした。次いで、ＣＤ１８コード配列を、得られたプラスミドの５’隣接ポリリンカー領域とウシ成長ホルモンポリＡコード領域との間にクローン化した。
【０１０５】
ＣＤ１８の表面発現を、モノクローナル抗体ＴＳ１／１８を使用したフローサイトメトリーによって分析した。この細胞株におけるαｄとＣＤ１８との間で検出されたヘテロ二量体形成は、ＣＯＳ細胞中で一過性に発現した実施例１０に記載の免疫沈降と一致した。
【０１０６】
【実施例１２】
ＣＤ１８依存性様式でヒトαｄはＩＣＡＭ−Ｒに結合する
白血球インテグリンと細胞−細胞接触を媒介する細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）との間の相互作用を証明した報告（Ｈｙｎｅｓ、Ｃｅｌｌ、６９、１１〜２５、１９９２）に照らして、αｄ／ＣＤ１８を発現するＣＨＯ細胞のＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−Ｒ、またはＶＣＡＭ−１に結合する能力を２つの方法によって評価した。
【０１０７】
複製活性では、可溶性ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−Ｒ、またはＶＣＡＭ−１  ＩｇＧ１融合タンパク質を、プラスチック上に固定し、αｄ／ＣＤ１８ＣＨＯトランスフェクト細胞の固定化リガンドへの結合能力を同定した。トランスフェクトした細胞を、カルセインで内部標識し、結合緩衝液（１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ）で洗浄し、緩衝液のみ（１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを含むか含まない）または１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１８モノクローナル抗体を含む緩衝液中でインキュベートした。トランスフェクトした細胞を、可溶性ＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１、ＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１、またはＶＣＡＭ−１／ＩｇＧ１融合タンパク質またはネガティブコントロールとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で予めコートした９６ウェルのＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４マイクロタイタープレートに添加した。これらの接着分子の可溶性形態のデザインは、１９９３年８月５日に提出された同時係属された共有米国特許出願第０８／１０２，８５２号に記載され、完全に開示されている。標的細胞の添加前にウェルを１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロックした。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳへの２０分間の浸漬によるプレートの洗浄後、各ウェル中に残存する全蛍光を、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ（登録商標）２３００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して測定した。
【０１０８】
固定化ＩＣＡＭを使用した実験では、αｄ／ＣＤ１８同時トランスフェクタントは、ＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１ウェルへの結合がＢＳＡコートウェルよりも一貫して３〜５倍であった。この結合の特異性およびＣＤ１８依存性を、抗ＣＤ１８抗体ＴＳ１／１８の阻害効果によって証明した。ＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１ウェルへのＣＤ１１ａ／ＣＤ１８でトランスフェクトした細胞の結合は、ＢＳＡコートウェルで認められた結合に匹敵した。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８トランスフェクト細胞は、ＰＭＡで前処理しただけでＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１ウェルへの結合が２〜３倍に増加した。αｄ／ＣＤ１８トランスフェクタントのＰＭＡ処理は、ＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１またはＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１ウェルへの結合に影響を与えなかった。ＶＣＡＭ−１／ＩｇＧ１ウェルへのαｄ／ＣＤ１８トランスフェクタントの検出可能な結合は認められなかった。
【０１０９】
可溶性ＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１、ＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１、またはＶＣＡＭ−１／ＩｇＧ１へのαｄ／ＣＤ１８トランスフェクト細胞の結合を、フローサイトメトリーによって同定した。測定あたり約１００万個のαｄ／ＣＤ１８トランスフェクトＣＨＯ細胞（高発現用の撹拌フラスコで増殖させる）を、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ−１８抗体を含むか含まない１００μｌの結合緩衝液（ＲＰＭＩおよび１％ＢＳＡ）中に懸濁した。室温で２０分間のインキュベーション後、細胞を結合緩衝液で洗浄し、最終濃度が５μｇ／ｍｌの可溶性ＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１またはＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１融合タンパク質を添加した。３７℃で３０分間結合を進行させ、その後細胞を３回洗浄し、１００倍希釈のＦＩＴＣ結合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ１を含む１００μｌの結合緩衝液中に再懸濁した。３０分のインキュベーション後、サンプルを３回洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎでの分析のために２００μｌの結合緩衝液に懸濁した。
【０１１０】
約４０〜５０％のαｄ／ＣＤ１８トランスフェクタントがＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１に結合したが、ＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１またはＶＣＡＭ−１／ＩｇＧ１タンパク質には結合しなかった。トランスフェクト細胞のＰＭＡでの前処理は、ＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１、ＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１、またはＶＣＡＭ−１／ＩｇＧ１へのαｄ／ＣＤ１８結合に対する効果がなく、これは固定化接着アッセイと一致していた。ＩＣＡＭ−Ｒによる結合は、抗ＣＤ１８抗体ＴＳ１／１８でのαｄ／ＣＤ１８トランスフェクタントの処理後にバックグラウンドレベルまで減少した。
【０１１１】
これらの２つの結合アッセイ由来の収集データは、αｄ／ＣＤ１８はＩＣＡＭ−Ｒに結合し、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１と比較して非常に好ましいことを示す。ＩＣＡＭ−１を超えるＩＣＡＭ−Ｒについてのαｄ／ＣＤ１８結合優先度は、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８およびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８で認められた優先度に反する。したがって、αｄ／ＣＤ１８結合の改変は、ＩＣＡＭ−Ｒが重要な役割を果たす正常および病原性の免疫機能に選択的に影響を与えると予想することができる。さらに、ＩＣＡＭ−Ｒの種々の細胞外ドメインに免疫特異的な抗体をαｄ／ＣＤ１８トランスフェクタントの結合を阻害する能力試験した類似のアッセイの結果は、αｄ／ＣＤ１８およびＣＤ１１ａ／ＣＤ１８がＩＣＡＭ−Ｒの異なるドメインと相互作用することを示した。
【０１１２】
溶液中でＣＤ１１ａ／ＣＤ１８がＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ１またはＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１に結合できないことにより、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８とＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−Ｒとの間の結合親和性が低すぎて溶液中で結合できないことが示唆される。しかし、ＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ１へのαｄ／ＣＤ１８結合の検出により、通常は高結合親和性が示唆される。
【０１１３】
上記のアッセイでは、ＶＣＡＭ−１／Ｉｇ１８融合タンパク質は、７個の細胞外免疫グロブリン様ドメインを含んでいた。トランスフェクトＣＨＯ細胞中で融合タンパク質を産生し、サンドイッチＥＬＩＳＡによってタンパク質収率を同定した。ＣＨＯ細胞上清由来の７個のドメインＶＣＡＭ−１融合タンパク質を精製せずに使用し、タンパク質収率は非常に低いことが見出された。ＶＣＡＭ−１調製物中の低タンパク質収率のために、ＶＣＡＭ−１へのαｄ／ＣＤ１８結合を、市販のＶＣＡＭ−１調製物（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して再試験して、低濃度のＶＣＡＭ−１によりαｄ結合が検出不可能であるかどうかを同定した。
【０１１４】
以前のように、αｄおよびＣＤ１８を発現するＣＨＯ細胞を、固定化組換え接着分子を使用する接着アッセイで使用した。フローサイトメトリーを使用して、αｄトランスフェクトＣＨＯ細胞がαｄおよびＣＤ１８の両方を発現し、他のβ２インテグリンを発現しないことが示された。トランスフェクトＣＨＯ細胞もまた、２つの公知のＶＣＡＭ−１結合パートナータンパク質α４β１およびα４β７のいずれも発現しないことが示された。親ＣＨＯ細胞株は、α４またはβ２インテグリンを発現しないことが示された。本質的に上記のように結合実験を行った。
【０１１５】
結果は、αｄトランスフェクトＣＨＯ細胞は、７．５％の固定化ＢＳＡへの結合および２．８％の固定化Ｅ選択への結合と比較して、約１４．２％の割合で固定化ＶＣＡＭ−１に結合することを示した。さらに、固定化ＶＣＡＭ−１への結合は、ＶＣＡＭ−１の第１のドメインに特異的なモノクローナル抗体の存在下で本質的に遮断された（３．０％の結合）。親ＣＨＯ細胞は、ＶＣＡＭ−１、Ｅ選択、またはＢＳＡのいずれにも結合しなかった（全ての結合率は２％未満であった）。トランスフェクトＣＨＯ細胞の結合もまた細胞を連続継代するにつれて減少し、これは同一期間にわたるαｄ表面発現で認められる減少に一致した。
【０１１６】
αｄ／ＣＤ１８を天然に発現する細胞が結合パートナーとしてＶＣＡＭ−１を使用するかどうかを同定するために、末梢血好酸球を単離し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−５の存在下で５〜７日間培養してαｄ発現を増加させた。フローサイトメトリーは、ＩＬ−５インキュベーションによりαｄ発現が２〜３倍に増加したが、α４発現に影響を与えないことを示した。
【０１１７】
結果は、培養好酸球が約２８．８％の割合で固定化ＶＣＡＭ−１に結合し、この結合が抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（結合率１７．１％）およびα４に対するモノクローナル抗体（結合率１８．１％）の両方によって部分的に阻害されることを示した。ＶＣＡＭ−１が低レベルおよび／または純度が低い上記の予備的結果と対照的に、これらのデータによりαｄβ２がＶＣＡＭ−１のリガンドであることが示唆される。
【０１１８】
上記のＦＡＣＳ接着アッセイを使用して、αｄ／ＣＤ１８を発現するＣＨＯ細胞へのＩＣＡＭ−Ｒ変異体Ｅ３７Ａ／Ｉｇの結合を試験した。Ｅ３７Ａ／Ｉｇは、ＬＦＡ−１／Ｉｇキメラへの結合を回避することが示されている（Ｓａｄｈｕら、Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２、４２９〜４４０、１９９４）。変異タンパク質は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株から可溶性形態で発現し、Ｓａｄｈｕら、前出に記載のようにＰｒｏｓｅｐ（登録商標）Ａカラムで精製した。
【０１１９】
αｄ／ＣＤ１８トランスフェクタントとのＥ３７Ａ／Ｉｇ結合は、反復アッセイで検出されなかった。ＦＩＴＣ結合抗ヒト抗体によって検出されたＥ３７Ａ／Ｉｇキメラの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、抗体のみで検出されるＭＦＩと同一であり、これは、本アッセイでＥ３７Ａ／Ｉｇ変異タンパク質を使用してもバックグラウンドを超えるシグナルは検出不可能であることを示す。同様に、実施例１４で行ったＥＬＩＳＡでは、Ｅ３７Ａ／Ｉｇ変異体は、固定化αｄ／ＣＤ１８に結合しないようであった。
【０１２０】
ｉＣ３ｂへのαｄ結合
補体成分Ｃ３をタンパク質分解して、複合体ｉＣ３ｂを形成することができ、これは補体活性化の代替経路を始動させて最終的に標的を細胞を媒介して破壊する。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃは、ｉＣ３ｂ結合およびその後のｉＣ３ｂコート粒子の食作用に関与する。最近、ＣＤ１１ｂＩドメイン中のペプチドフラグメントがｉＣ３ｂ相互作用部位として同定されている（Ｕｅｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、１０６８０〜１０６８４、１９９４）。ｉＣ３ｂ結合領域は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびαｄで高度に保存されており、αｄ／ｉＣ３ｂ結合相互作用が示唆される。
【０１２１】
ロゼットアッセイにおいてトランスフェクタントまたはαｄを天然に発現する細胞株（例えば、ＰＭＡ刺激ＨＬ６０細胞）およびｉＣ３ｂコートヒツジ赤血球（ｓＲＢＣ）を使用して、ｉＣ３ｂをαｄに結合させる（Ｄａｎａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７３、１５３〜１５９、１９８４）。αｄ／ＣＤ１８  ＣＨＯトランスフェクタント、ＶＬＡ４−ＣＨＯトランスフェクタント（ネガティブコントロール）、およびＰＭＡ刺激ＨＬ６０細胞（ポジティブコントロール）のロゼットを形成する能力を、抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（例えば、ＴＳ１／１８．１）の存在下および非存在下で比較する。
【０１２２】
【実施例１３】
シンチレーション近接アッセイＩＤによるαｄ結合モジュレーターのスクリーニング
本発明のαｄリガンドとその結合パートナーとの間の結合（αｄリガンド／抗リガンド対）の特異的インヒビターを、米国特許第４，２７１，１３９号、Ｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２、２６５〜２６７、１９７９、およびＨａｒｔ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．、２０、１０６２〜１０６５、１９７９（それぞれ本明細書中で参考として援用される）に一般的に記載されているシンチレーション近接アッセイ技術などの種々の手段によって同定することができる。
【０１２３】
簡単に述べれば、αｄリガンド／抗リガンド対の１つのメンバーを、個体支持体に直接または間接的に結合させる。間接的捕捉は、可溶性インテグリンβ鎖タンパク質のＣ末端で特異的エピトープを認識する支持体に直接結合したモノクローナル抗体を含む。このエピトープは、血球凝集素タンパク質またはマイコバクテリアＩＩＩＥ９エピトープのいずれかである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１、６０７〜６１３、１９８８）。蛍光剤も支持体に結合させる。あるいは、米国特許第４，５６８，６４９号（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、蛍光剤を固体支持体に組み込むことができる。αｄリガンド／抗リガンド対の非支持体結合メンバーを、蛍光剤で励起することができる放射能を放射する放射性化合物で標識する。リガンドが放射性標識抗リガンドに結合する場合、標識は支持体結合蛍光剤を有効に閉鎖して蛍光剤を励起し、発光する。結合しない場合、一般に、標識は固体支持体から離れすぎて蛍光剤が励起されず、あまり発光しない。放出された光を測定し、これはリガンドと抗リガンドとの間の結合に相関する。サンプルへの結合インヒビターの添加により、放射性標識の固体支持体に近接した捕捉が維持されて蛍光発光が減少する。したがって、結合インヒビターを、サンプルからの蛍光発光に対するその効果によって同定することができる。αｄに対する潜在的な抗リガンドもまた、同様の方法によって同定することができる。
【０１２４】
可溶性組換えαｄ／ＣＤ１８ロイシンジッパー構築物（実施例１４を参照のこと）を、シンチレーション近接アッセイで使用して、以下の方法によりＣＡＭ結合のモジュレーターをスクリーニングする。組換えインテグリンを、シンチラント包埋プレート上に予めコートした非ブロッキング抗αサブユニットまたは抗βサブユニット抗体で固定する。化学ライブラリー化合物および特異的ビオチン化ＣＡＭ／Ｉｇキメラを、プレートに同時に添加する。Ｃａｍ／Ｉｇキメラの結合を、標識ストレプトアビジンで検出する。アッセイでは、ＩＣＡＭ−１／ＩｇおよびＩＣＡＭ−Ｒ／Ｉｇを、製造者が推奨するプロトコールに従って、ＮＨＳ−スルホ−ビオチンＬＣ（長鎖、Ｐｉｅｒｃｅ）でビオチン化する。標識タンパク質は、依然としてＣＡＭ特異的抗体に反応性を示し、ＥＬＩＳＡ、ストレプトアビジン−ＨＲＰでの検出およびその後のＯＰＤでの発色によって固定化ＬＦＡ−１と反応性を示し得る。
【０１２５】
あるいは、組換えロイシンジッパータンパク質を精製または部分精製し、シンチラント包埋プレート上に直接コートする。非標識ＣＡＭ／Ｉｇキメラと化学ライブラリー化合物は同じに添加される。非標識ＣＡＭ／Ｉｇを、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇで検出する。
【０１２６】
さらに別の代替方法として、精製ＣＡＭ／Ｉｇタンパク質を、シンチラントプレートに固定する。化学ライブラリー化合物および組換えロイシンジッパーインテグリンを発現する細胞由来の濃縮上清をプレートに添加する。組換えインテグリンの結合を、標識した非ブロッキングαまたはβサブユニット抗体で検出する。
【０１２７】
小分子モジュレーターのスクリーニング
シンチレーション近接アッセイの代替方法として、αｄ結合パートナーおよびそのインヒビターを、下記のＥＬＩＳＡ様アッセイを使用して同定することができる。
【０１２８】
可溶性αｄ／ＣＤ１８ロイシンジッパー（ＬＺ）構築物（実施例１４を参照のこと）を、抗αｄ抗体２１２Ｄ（実施例１５を参照のこと）を使用して組織培養上清から捕捉した。２１２Ｄ抗体を、重炭酸コート緩衝液（ｐＨ９．５）を含む９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）ＩＶプレート（Ｃｏｓｔａｒ）上に４℃で一晩固定する。ＬＦＡ−１ロイシンジッパー（ＬＦＡ−１ＬＺ）融合タンパク質の固定のために同一のプロトコールを使用して抗ＣＤ１１ａ抗体ＴＳ２／４．１を固定し、ＬＦＡ−１を、ＶＣＡＭ−１結合のネガティブコントロールおよびＩＣＡＭ−１結合のポジティブコントロールとして使用した。プレートを、３００μｌ／ウェルの３％ウシ血清アルブミンで１時間ブロッキングし、Ｄ−ＰＢＳで洗浄した。αｄ／ＣＤ１８ＬＺまたはＬＦＡ−１ＬＺのいずれかを発現する安定なＣＨＯトランスフェクタント由来の組織培養上清を１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で６〜８時間インキュベートした。プレートを、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）（ＴＢＳ−Ｔ）を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、その後２ｍＭの各塩化カルシウム、塩化マグネシウム、および塩化マンガンを含むＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含まない）で１回洗浄した。後者を、アッセイおよび残りのアッセイの間の洗浄緩衝液として使用した。
【０１２９】
インテグリン捕捉後、プレートを２５０μｌ／ウェルのＴＢＳで３回洗浄した。１０〜２０μｇ／ｍｌの濃度で開始する２：３連続希釈後に、精製ＣＡＭ／Ｉｇ（実施例１２を参照のこと）を各ウェルに添加した。ＣＡＭ／Ｉｇを室温で２時間結合させて、プレートを上記のように洗浄した。結合融合タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体（Ｊａｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）で検出し、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）で発色させた。
【０１３０】
結果は、ＬＦＡ−１ＬＺと結合した場合、ＩＣＡＭ−１／Ｉｇによりシグナルが５〜７倍に増加し、αｄ／ＣＤ１８ＬＺに結合できないことを示す。対照的に、ＶＣＡＭ−１／Ｉｇにより、αｄ／ＣＤ１８ＬＺを含むウェル中でバックグラウンドを超えるシグナルが５倍に増加するが、ＬＦＡ−１ＬＺを含むウェル中では増加しなかった。ＩＣＡＭ−Ｒ変異体Ｅ３７Ａ／Ｉｇ（実施例１２を参照のこと）は、いずれのインテグリンとも結合しなかった。
【０１３１】
αｄ特異的モノクローナル抗体２１２Ｄ、２１７Ｌ、２１７Ｉ、２１７Ｈ、２１７Ｇ、２１７Ｋ、および２１７Ｍを、固定化αｄ／ＣＤ１８へのＶＣＡＭ−１結合能力について試験した。さらに、抗ＶＣＡＭ−１モノクローナル抗体１３０Ｋ、１３０Ｐ、およびＩＧ１１Ｂ１（Ｃａｌｔａｇ）を使用して、反応特異性を同定した。抗αｄモノクローナル抗体を、５μｇ／ｍｌで使用し、抗ＶＣＡＭ−１抗体を２５μｇ／ｍｌで使用し、ＶＣＡＭ−１がアッセイ系の溶液中に存在するという事実を考慮して、より高濃度の抗ＶＣＡＭ−１抗体を使用した。
【０１３２】
部分的ブロッキング（５０％）により、２１７Ｉまたは１３０Ｋおよび１３０Ｐの共用のいずれかで処理したウェルが得られた。１３０Ｋ／１３０Ｐの組み合わせもまたＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−１の相互作用を完全に阻害し、これにより、αｄおよびＶＬＡ−４がＶＣＡＭ−１の異なる部位に結合し、αｄ／ＶＣＡＭ−１結合と選択的に相互作用するアンタゴニストを開発することができることが示唆される。
【０１３３】
このアッセイを以下のように適用して、αｄ結合インヒビターについての高処理スクリーニングアッセイを行うことができる。ＶＣＡＭ−１／Ｉｇをビオチン化し、上記のように予めＤＭＳＯに溶解した化合物プールの存在下で使用し、結合ＶＣＡＭ−１／Ｉｇを、ストレプトアビジン−ユーロピウム（Ｅｕ）複合体で検出する。ストレプトアビジン−Ｅｕ複合体をキレート化によって活性化して、測定可能な発光を得る。発光の変化、より詳細には減少は、おそらく小分子プール中の１つまたは複数の化合物による作用の結果としてＶＣＡＭ−１／αｄ結合の阻害の指標であり、これをそれぞれかより小さな群でアッセイする。
【０１３４】
【実施例１４】
可溶性ヒトαｄ発現構築物
全長可溶性ヒトαｄ／ＣＤ１８ヘテロ二量体タンパク質の発現により、免疫化および結合アッセイのための容易に精製された物質が得られる。可溶性タンパク質作製の利点は、細胞溶解物（全長膜結合αｄ／ＣＤ１８として）よりもむしろ上清から精製することができる（したがって、収率が高くなり、且つ夾雑物が減少する）という点である。
【０１３５】
可溶性αｄ発現プラスミドを、以下のように構築した。ｐＡＴＭ．Ｄ１２にクローン化した配列番号１の塩基０〜３１６１の領域に対応するヌクレオチドフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡａｔＩＩでの消化によって単離した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡａｔＩＩフラグメントに重複し、且つ３’末端にＭｌｕＩ制限部位を含む、配列番号１の塩基３１３０〜３３９０に対応するＰＣＲフラグメントを、それぞれ配列番号３０および３１に記載のプライマーｓＨＡＤ．５およびｓＨＡＤ．３を使用してｐＡＴＭ．Ｄ１２から増幅させた。
５’−ＴＴＧＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号３０）
５’−ＧＴＴＣＴＧＡＣＧＣＧＴＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣ−３’（配列番号３１）
ＰＣＲ増幅産物を、ＡａｔＩＩおよびＭｌｕＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡａｔＩＩフラグメントにライゲートした。得られた産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＭｌｕＩ消化プラスミドｐＤＣ１．ｓにライゲートした。
【０１３６】
この構築物を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞中に可溶性ＣＤ１８と同時発現させ、発現を３５Ｓ−メチオニン標識細胞由来の免疫沈降ＣＤ１８複合体のオートラジオグラフィーによる視覚化によって検出する。構築物を、２９３細胞中でＣＤ１８と同時発現させる（Ｂｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５２、１８３〜１９５、１９９３）。
【０１３７】
可溶性全長αｄ構築物
別のαｄ発現構築物も本発明で意図される。インタクトなαｄ／ＣＤ１８ヘテロ二量体の発現および精製を容易にするために、精製中にヘテロ二量体が安定化する「ロイシンジッパー」融合配列を含むように可溶性αｄおよびＣＤ１８発現プラスミドを構築する（Ｃｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９１、１１４０８〜１１４１２、１９９４）。簡単に述べれば、ジッパーの酸性および塩基性鎖をコードするＤＮＡを、Ｃｈａｎｇらに記載のオリゴヌクレオチドを使用したプライマーアニーリングによって作製した。前に記載のαｄおよびＣＤ１８発現構築物へのサブクローニングを容易にするためにＤＮＡのそれぞれ５’および３’末端にさらなるＭｌｕＩおよびＸｂａＩ制限部位を含むようにＤＮＡ配列をさらに改変した。さらに、血球凝集素タンパク質またはポリヒスチジン配列のいずれかを示す配列を添加し、ＸｂａＩ部位の後に停止コドンを挿入する。血球凝集素またはポリヒスチジン配列を組み込んで、発現タンパク質の親和性精製を容易にする。ジッパーの塩基性鎖をコードする配列を、ＣＤ１８を発現するプラスミドベクターに組み込み、酸性鎖をα鎖構築物に挿入する。宿主細胞での改変αｄおよびＣＤ１８タンパク質の発現の際に、ジッパー構造の酸性鎖と塩基性鎖との間の相互作用がヘテロ二量体を安定化し、上記の親和性精製によってインタクトなαｄ／ＣＤ１８分子が単離されると推定される。
【０１３８】
酸性および塩基性「ロイシンジッパー」配列を含む可溶性αｄおよびＣＤ１８の発現用のプラスミドを構築し、実施例７に記載のＤＥＡＥ／Ｄｅｘｔｒａｎ法によってＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。得られたタンパク質を、αｄ／ＣＤ１８ＬＺと呼ぶ。血球凝集素およびポリヒスチジンタグを、αｄ／ＣＤ１８ＬＺに組み込まなかった。トランスフェクト細胞を、完全血清（２％）条件下で１４日間成長させた。５日毎にトランスフェクト細胞から回収した上清を、実施例８に記載のＥＬＩＳＡによってタンパク質産生についてアッセイした。簡単に述べれば、αｄ／ＣＤ１８ＬＺヘテロ二量体を、抗αｄモノクローナル抗体１６９Ｂでコートしたプレート上に固定した（実施例１５を参照のこと）。αｄ／ＣＤ１８ＬＺ複合体を、ビオチン化抗ＣＤ１８モノクローナル抗体ＴＳ１／１８．１の添加およびその後のストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合物およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）の添加によって検出し（実施例８を参照のこと）、上清中のタンパク質が明白に検出可能であった。
【０１３９】
可溶性全長αｄ発現産物を使用した結合アッセイ
上記の可溶性全長αｄ／ＣＤ１８ＬＺヘテロ二量体を使用した機能的結合アッセイを、モノクローナル抗体１６９Ｂまたは非ブロッキング抗ＣＤ１８モノクローナル抗体でコートしたプレート上へのヘテロ二量体の固定によって行った（実施例１５を参照のこと）。ウェルを魚類の皮のゼラチンでブロックして非特異的結合を回避し、その後開始濃度１０μｇ／ｍｌのＣＡＭ／Ｉｇキメラ（実施例１２を参照のこと）を添加した。αｄ／ＣＤ１８へのキメラの結合を、ヤギ抗ヒトＩｇＨＲＰ結合物（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）およびＯＰＤでの発色によって検出した。
【０１４０】
ＶＣＡＭ−１／Ｉｇは、捕捉ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８よりも３〜５倍のレベルで捕捉αｄ／ＣＤ１８ＬＺに結合することが認められた。ＩＣＡＭ−１／ＩｇおよびＩＣＡＭ−２／Ｉｇは、可溶性ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８ヘテロ二量体にバックグラウンドよりそれぞれ約１５および１０倍で結合するが、αｄ／ＣＤ１８に結合しなかった。ＶＣＡＭ−１結合は、組み合わせて使用したＶＣＡＭ−１特異的抗体１３０Ｋおよび１３０Ｐの存在下で約５０％減少した。
【０１４１】
９６ウェルプレート上に固定したＩＣＡＭ／Ｉｇタンパク質を使用し、その後細胞上清中の組換え可溶性インテグリンの添加によって結合アッセイを行った。非標識の非ブロッキングαまたはβサブユニット特異的マウス抗体を使用し、その後ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体とのインキュベーションおよびＯＰＤでの発色によって、可溶性インテグリンの結合を検出した。
【０１４２】
結果は、非ブロッキング抗体により、抗体を含まないコントロールウェル中で検出された結合よりも１０倍を超えるＩＣＡＭ−Ｒ／Ｉｇへのαｄ／ＣＤ１８ＬＺ結合が検出されることを示した。固定化ＩＣＡＭ−１／Ｉｇでは可溶性αｄ／ＣＤ１８結合は検出されなかったが、αｄ／ＣＤ１８と固定化ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８およびＣＤ１１ａ／ＣＤ１８との間の結合は、それぞれバックグラウンド結合よりも１５および５倍検出された。
【０１４３】
以前の研究では、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃはリポポリサッカリド（ＬＰＳ）に結合することが証明されており（Ｗｒｉｇｈｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３、８３〜９０、１９９１；Ｉｎｇａｌｌｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８１、１４７３〜１４７９、１９９５）、αｄ／ＣＤ１８へのＬＰＳ結合もまたフローサイトメトリーおよびプレートベースのアッセイを使用して評価した。結果は、２０μｇ／ｍｌのＳ．ＭｉｎｎｅｓｏｔａおよびＳ．ｔｙｐｈｏｓａ（共にＳｉｇｍａ）から単離したＦＩＴＣ標識ＬＰＳはαｄ／ＣＤ１８トランスフェクトＣＨＯ細胞に弱く結合することができることを示した。非トランスフェクトコントロールＣＨＯ細胞では結合は認められなかった。ＥＬＩＳＡ形式アッセイでは、０．５〜３．０μｇのビオチン化ＬＰＳ（Ｌｕｋら、Ａｌａｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３２、２１７〜２２４、１９９５）は、捕捉抗体およびブロッキング試薬のみより４倍のシグナルで固定化αｄ／ＣＤ１８ＬＺに結合した。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８へのＬＰＳの見かけ上の結合は、各実験値から抗ＣＤ１１ａ抗体ＴＳ２／４に結合するバックグラウンドを引くことによって減少した。
【０１４４】
αｄ／ＣＤ１８の他のリガンドを同定するために、組換えαｄ／ＣＤ１８ＬＺタンパク質を２段階研究で使用する。固定化タンパク質への種々の細胞型の結合を使用して、細胞が細胞表面上でαｄリガンドを発現するかどうかを同定する。次いで、抗体阻害を使用して、認められた細胞結合が既知の表面接着分子との相互作用に起因するかどうかを同定する。阻害効果が認められない場合、αｄに結合する細胞の溶解物由来のタンパク質に結合したαｄ／ＣＤ１８ＬＺとの同時免疫沈降を使用して、リガンドの同定を試みる。
【０１４５】
可溶性ヒトαｄＩドメイン発現構築物
ＣＤ１１ａ中のＩドメインを、リガンド結合能および抗体認識を維持する独立した構造単位として発現することができることが以前に報告されている（Ｒａｎｄｉ  ａｎｄ  Ｈｏｇｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、１２３９５〜１２３９８、１９９４；Ｚｈｏｕｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、１７０７５〜１７０７９、１９９４；Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａら、Ｃｅｌｌ、７２、８５７〜８６７、１９９３）。αｄＩドメインおよびヒトＩｇＧ４を含む可溶性融合タンパク質を作製するために、αｄＩドメインを、サブクローニングを容易にするために隣接ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を付加するようにデザインしたプライマーを使用したＰＣＲによって増幅させる。これらのプライマーを、配列番号３２および３３に示し、制限部位に下線を引いた。
５’−ＡＣＧＴＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＣＴ（配列番号３２）
５’−ＡＣＴＧＣＡＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＣＡＴＣ（配列番号３３）
配列番号３２中のＢａｍＨＩ部位の３’直前のＣヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド４３５に対応し、配列番号３３のＸｈｏＩ部位３’側のＧヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド１０６７に相補的である。増幅Ｉドメインを、適切な酵素で消化し、精製フラグメントを哺乳動物発現ベクターｐＤＣおよび真核生物発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にライゲートし、Ｉドメインを配列決定した。次いで、融合タンパク質を、適切な発現構築物でトランスフェクトまたは形質転換したＣＯＳ、ＣＨＯ、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞中で発現させる。
【０１４６】
αｄがＩＣＡＭ−Ｒに親和性を示す場合、αｄＩドメインは、αｄが関与する細胞接着の有用なインヒビターであるほど十分な親和性を示し得る。
【０１４７】
ヒトαｄＩドメイン／ＩｇＧ４融合タンパク質の分析
タンパク質を、還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し、銀染色またはクーマシー染色のいずれかによって視覚化した。次いで、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰＶＤＦ膜に移し、抗ＩｇＧモノクローナル抗体または抗ウシＩｇモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロット分析に供した。
【０１４８】
検出されたタンパク質は、非還元条件下では約１２０ｋＤ、還元条件下では約４５ｋＤに移動すると同定された。非還元ゲル上に抗ヒト抗体に反応性を示すが抗ウシ抗体には反応性を示さない約４０〜５０ｋＤの小さなバンドもまた検出された。２００ｋＤの小さなバンドは、ウェスタンブロットによってウシＩｇであると同定された。
【０１４９】
Ｉドメイン発現産物を使用した結合アッセイ
ＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧキメラタンパク質を特異的に認識するＩドメインの能力を、ＥＬＩＳＡ形式で試験した。αＩドメインＩｇＧ４融合タンパク質（Ｉαｄ／ＩｇＧ４）のＴＢＳでの連続希釈物を、Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）ＩＶ  ＲＩＡ／ＥＩＡプレートに固定したＩＣＡＭ−１／ＩｇＧ、ＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧ、ＶＣＡＭ−１／ＩｇＧ、または無関係のＩｇＧ１骨髄腫タンパク質をインキュベートした。ネガティブコントロールとしてＣＤ１１ａＩドメイン／ＩｇＧキメラタンパク質およびヒトＩｇＧ４／κ骨髄腫タンパク質を使用した。結合したＩｇＧ４を、ビオチン化抗ＩｇＧ４モノクローナル抗体ＨＰ６０２３、その後のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合物、および基質ｏ−フェニレンジアミンでの発色によって検出した。
【０１５０】
反復アッセイでは、いかなる固定化タンパク質を使用しても、ＣＤ１１ａ／ＩｇＧ４タンパク質もＩｇＧ４骨髄腫タンパク質の結合も検出されなかった。Ｉαｄ／ＩｇＧ４タンパク質は魚の皮のゼラチンまたはウシ血清アルブミン遮断薬、ヒトＩｇＧ１、またはＩＣＡＭ−１／ＩｇＧのいずれにも結合しなかった。１〜５μｇ／ｍｌの濃度のＩαｄ／ＩｇＧ４タンパク質を使用したＩＣＡＭ−Ｒ／ＩｇＧタンパク質コートウェルにおいてバックグラウンドよりも２倍または３倍の結合シグナルの増加が検出された。ＶＣＡＭ−１／ＩｇＧタンパク質コートウェルにおけるシグナルは、バックグラウンドの７〜１０倍であった。先のアッセイでは、αｄ／ＣＤ１８トランスフェクトＣＨＯ細胞は、ＶＣＡＭ−１／ＩｇＧタンパク質に結合しなかったことから、ＶＣＡＭ−１結合は、単離Ｉドメインアミノ酸配列に特徴的であり得ることが示唆される。
【０１５１】
さらなるαｄＩドメイン構築物
さらなるαｄＩドメイン構築物を、先の構築物と同一の様式であるが、αｄＩドメイン周囲により多くのアミノ酸を組み込んで作製する。特異的構築物には、ｉ）現在の構築物の前に存在するエキソン５由来の配列（配列番号２の１２７〜３５３）、ｉｉ）Ｉドメインの後のＥＦ−ハンド反復（配列番号２のアミノ酸１７〜６０３）、およびｉｉｉ）精製および検出用のＩｇＧ４テールを含む膜貫通領域（配列番号２のアミノ酸１７〜１０２９）で短縮されたα鎖が含まれる。これらの構築物を哺乳動物発現ベクターｐＤＣＳ１または真核生物発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にライゲートし、Ｉドメインを配列決定する。次いで、融合タンパク質を、適切な発現構築物で形質転換またはトランスフェクトしたＣＯＳ、ＣＨＯ、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞中で発現させる。タンパク質を、ＰｒｏＳｅｐＡ（登録商標）カラム（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ）で精製し、抗ＩｇＧ４モノクローナル抗体ＨＰ６０２３との反応性について試験し、クーマシー染色でポリアクリルアミドゲルを視覚化する。
【０１５２】
全αｄポリペプチドの発現プラスミドを構築するために、前に記載のｐＡＴＭ．Ｄ１２を、以下の方法によってαｄ−ＩｇＧ４融合タンパク質を発現するように改変する。ＩｇＧ４をコードするＤＮＡを、５’ＡａｔＩＩ制限部位（配列番号８９）および３’ＸｂａＩ制限部位（配列番号９０）をそれぞれ組み込んだプライマーを使用したＰＣＲによってベクターｐＤＣＳ１から単離する。
５’−ＣＧＣＴＧＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧ−３’（配列番号８９）
５’−ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号９０）
プラスミドｐＡＴＭ．Ｄ１２をＡａｔＩＩおよびＸｂａＩで消化し、適切に消化し、精製ＩｇＧ４  ＰＣＲ産物を線状ベクターにライゲートする。
【０１５３】
【実施例１５】
ヒトαｄ特異的モノクローナル抗体の産生
１．実施例７由来の一過性トランスフェクト細胞を、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、５×１０６細胞／マウスを５０μｇ／マウスのムラミールジペプチド（Ｓｉｇｍａ）のＰＢＳ溶液と共にＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。マウスに、同一の様式で２倍を超える量を２週間間隔で注射した。予備採血して免疫化したマウス由来の血清を、実施例９に概説のＦＡＣＳ分析によってスクリーニングし、αｄ／ＣＤ１８でトランスフェクトした細胞に最も高い反応性を示すマウス由来の脾臓に融合した。次いで、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞に対する反応性を欠損およびαｄ発現プラスミドおよびＣＤ１８で同時トランスフェクトした細胞との反応性についてハイブリドーマ培養上清を個別にスクリーニングした。
【０１５４】
本方法により、モノクローナル抗体は得られなかった。
【０１５５】
２．モノクローナル抗体の別の産生法として、可溶性αｄＩドメイン／ＩｇＧ４融合タンパク質を、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清から親和性精製し、上記のようにこれを使用してＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。ハイブリドーマを確立し、これらのハイブリドーマ由来の上清を、αｄＩドメイン融合タンパク質に対する反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次いで、陽性培養物をＣＨＯトランスフェクタント上で発現した全長αｄ／ＣＤ１８複合体との反応性について分析した。
【０１５６】
マウス１９０８に、αｄ／ＣＤ１８トランスフェクトＣＨＯ細胞の最初の免疫化を３回およびその後の可溶性αｄ／ＣＤ１８ヘテロ二量体での２回追加免疫を行った。２回の最後の免疫化は、５０μｇ／マウスのαｄＩドメイン／ＩｇＧ４融合タンパク質を含んでいた。融合物により、２７０ＩｇＧ産生ウェルを作製した。４５ウェル由来の上清は、ＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧ４よりもＩαｄ／ＩｇＧ４融合タンパク質に少なくとも７倍の結合を示した。ＦＡＣＳ分析で同定したところ、上清はαｄ／ＣＤ１８トランスフェクトＣＨＯ細胞に反応しなかった。
【０１５７】
上清が別の状況でインテグリンαサブユニットタンパク質を認識することができるかどうかを同定するために、新鮮な凍結脾臓切片を、４５ウェルのうちの２４ウェル由来の上清で染色した。３つの上清が陽性と同定された：１つは赤脾髄中の巨大細胞を染色し、他の２つは赤脾髄および小柱中の散乱細胞を染色した。
【０１５８】
これらの上清を、αｄ／ＣＤ１８トランスフェクトＣＨＯ細胞またはＰＭＡ刺激ＨＬ６０細胞のいずれか由来のビオチン化ＣＤ１８複合体を免疫沈降させる能力によってさらに分析した。界面活性剤溶解物中のタンパク質（ヘテロ二量体として発現するタンパク質に高次構造が制限されるべきではない）を認識する上清を含む融合ウェルを、さらなるクローニングのために選択した。界面活性剤中のタンパク質を認識するモノクローナル抗体は、トランスフェクタント、組織、および細胞株由来のヘテロ二量体複合体の免疫沈降により有用であり得る。
【０１５９】
３．別のモノクローナル抗体産生法として、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（モノクローナル抗体ＴＳ２／４を使用）およびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（モノクローナル抗体Ｍｏ−１を使用）の予備的除去後に抗ＣＤ１８モノクローナル抗体２３Ｆ２Ｇを使用してヒト脾臓溶解物からＣＤ１８複合体を免疫沈降させた。１０〜１２週齢の５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、約３０μｇの得られたタンパク質のフロイント完全アジュバント溶液の０日目の皮下注射、その後の２８日目および４３日目の３０μｇ免疫原／マウスのフロイント不完全アジュバント溶液の２回の追加免疫によって免疫化した。最終追加免疫から１０日後に試験血清を採取し、ウェスタンブロットにおける１μｇ／レーンの免疫原を検出するための各血清の５００倍希釈物の使用によって、反応性を評価した。３匹のマウス由来の血清から、９５および１５０ｋＤのバンドが検出され、免疫前血清の５０倍希釈物で処理したレーンにはシグナルは認められなかった。１５０ｋＤのバンドは、ｉｎ  ｖｉｖｏグリコシル化状態のαｄを示すと推定された。さらに、全ての免疫後血清は、ヘテロ二量体を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の適切な分子量で移動したビオチン化αｄ／ＣＤ１８ＣＨＯ細胞の溶解物由来のタンパク質を免疫沈降させた。これらの結果から、マウス番号２２１２を選択し、６４日目の３０μｇの免疫原のＰＢＳ溶液の腹腔内注射によってさらに免疫化した。４日後にマウスを屠殺し、滅菌状態で脾臓を取り出した。
【０１６０】
２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｎａｄａ）を補足した無血清ＲＰＭＩ１６４０に浸漬した２つの顕微鏡用ガラススライドのつや消しした端での脾臓の磨砕によって、単一細胞懸濁液を形成させた。細胞懸濁液を７０メッシュの滅菌Ｎｉｔｅｘ細胞濾過器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）で濾過し、濾過物を２００×ｇで５分間の遠心分離によって２回洗浄した。得られたペレットを、２０ｍｌの無血清ＲＰＭＩに再懸濁した。３つのナイーブＢａｌｂ／ｃマウスから採取した胸腺細胞を、類似の様式で調製した。
【０１６１】
融合前に、融合前の３日間１０％Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｏｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）でＲＰＭＩ中で対数期に維持したＮＳ−１骨髄腫細胞を、２００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、上記段落に記載のように２回洗浄し、計数した。約２×１０８個の脾臓細胞を、４×１０７個のＮＳ−１細胞と合わせ、得られた混合物を、２００×ｇの遠心分離によってペレット化した。上清を捨てた。細胞ペレットをチューブのタッピングによって離し、２ｍｌの５０％ＰＥＧ１５００の７５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ溶液（ｐＨ８．０、３７℃）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、撹拌しながら１分かけて添加した。その後さらに１４ｍｌの無血清ＰＲＭＩを７分間にわたって添加し、その直後に１６ｍｌのＲＰＭＩを添加した。得られた混合物を、２００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを、１５％ＦＢＳ、１００ｍＭヒポキサンチンナトリウム、０．４ｍＭアミノプテリン、１６ｍＭチミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５単位／ｍｌのＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、および１．５×１０６胸腺細胞／ｍｌを含む２００ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁し、２００μ／ウェルで１０枚の９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に分注した。融合から２、４、および６日目に、１８Ｇニードル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した各ウェルからの約１００μｌの吸引および１００μｌ／ウェルの１０単位／ｍｌのＩＬ−６を含み且つ胸腺細胞を欠く以外は上記のプレーティング培地の添加により細胞を供給した。
【０１６２】
融合から７〜１０日目に、各ウェル由来の上清を、マウスＩｇＧの存在を試験する抗体捕捉ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を、４℃の５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で５０００倍に希釈した５０μｌ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）でコートした。プレートを、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３回洗浄し、各ウェル由来の５０μｌの培養上清を添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、上記のようにウェルをＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴで３５００倍に希釈した５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｆｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を各ウェルに添加した。上記のようにプレートをインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）および０．１μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２の１００ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ４．５）からなる１００μｌの基質を添加した。５分後に５０μｌの１５％Ｈ２ＳＯ４の添加によって染色反応を停止させた。プレートリーダー（Ｄｙｎｅｔｅｃｈ）を使用して各ウェルについて４９０ｎｍでの吸光度を同定した。
【０１６３】
ハイブリドーマを、以下のようにさらに特徴付けた。ＩｇＧ産生培地由来の上清を、αｄ／ＣＤ１８形質転換ＣＨＯ細胞に対する反応性をフローサイトメトリーで分析したが、ＪＹ細胞（ＬＦＡ−１に陽性のＢ細胞株であるが、前に記載のインハウス染色試験で認められた他のβ２インテグリンではない）に対しては分析しなかった。簡単に述べれば、５×１０５個のαｄ／ＣＤ１８形質転換ＣＨＯまたはαｄ／ＣＤ１８−ＪＹ細胞を、２％ＦＢＳおよび１０ｍＭ  ＮａＮ３を含む５０μｌのＲＰＭＩ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に懸濁した。各細胞懸濁液を、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェル中の５０μｌのＩｇＧ陽性ハイブリドーマ培養上清に添加した。氷上で３０分のインキュベーション後、細胞を臨床遠心分離機でのペレット化によって２回洗浄し、各ウェル由来の上清を捨て、ペレットを２００〜３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。最後の洗浄物を、ＦＡＣＳ緩衝液中で調製したヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ結合物（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＦ（ａｂ’）２フラグメント１００倍希釈物を５０μｌ／ウェルで置換した。上記のようなインキュベーション後、細胞を１０ｍＭ  ＮａＮ３を補足したダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）で２回洗浄し、最後に１％パラホルムアルデヒドを含むＤ−ＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣｓａｎ分析器を具備したフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）のためにサンプルをポリスチレンチューブに移した。
【０１６４】
４つの培養物から得られた融合物は、両方の基準に陽性であると考えられる。約４日後に拡大した上清で第２のスクリーニングを繰り返した場合、４つの培養物のうちの３つが陽性のままであった。１６９Ａ、１６９Ｂ、１６９Ｄと命名した３つのウェルを、１５％ＦＢＳ、１００ｍＭヒポキサンチンナトリウム、１６ｍＭチミジン、および１０単位／ｍｌのＩＬ−６を含むＲＰＭＩでの二重希釈によって２〜３回連続的にクローン化した。４日後にクローンプレートのウェルを視覚的に記録し、最も低密度のクローン数を記録した。７〜１０日後に、各クローニングの選択されたウェルを、ＦＡＣＳによってアッセイした。２つの培養物１６９Ａおよび１６９Ｂで活性が認められた。最後のクローニングでは、１つのクローンを含む陽性ウェルを、１１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中に拡大した。１６９Ａおよび１６９Ｂのクローン上清由来の抗体を、製造者の説明書に従ってＩｓｏＳｔｒｉｐキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、イソ型に分類し、ＩｇＧ１イソ型であると見出された。
【０１６５】
ＣＨＯトランスファクタントおよびＰＭＡ刺激ＨＬ−６０細胞由来のαｄ／ＣＤ１８複合体の免疫沈降を、特異性についての第３のスクリーニングとして使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定したところ、ハイブリドーマ１６９Ａおよび１６９Ｂは、ＣＨＯ株およびＨＬ６０細胞由来の１５０〜１６０ｋＤの１つのα鎖種由来の適切なバンドを沈降させた。ハイブリドーマ１６９Ａおよび１６９Ｂは、１９９５年５月３１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２に寄託され、それぞれアクセッション番号ＨＢ１１９０７およびＨＢ１１９０６と割り当てられた。
【０１６６】
１６９Ａおよび１６９Ｂの結合特性をさらに完全に特徴付けるために、各抗体の可溶性αｄ／ＣＤ１８への他または抗ＣＤ１８抗体ＴＳ１／１８．１の結合を阻害する能力を試験した。溶解性全長αｄ／ＣＤ１８を、９６ウェルプレート形式で各非標識抗体によって個別に固定し、ビオチン化抗体を使用して同一または異なる非標識抗体によって結合したタンパク質を検出した。ヤギ抗マウスＩｇ／ＨＲＰ結合物を使用し、ＯＰＤ基質を添加して結合を検出した。結果は、抗体１６９Ａはビオチン化１６９ＡおよびＴＳ１．１８．１の結合を遮断することができ、抗体１６９Ｂはそれ自体の結合のみを遮断することを示した。
【０１６７】
４．マウス番号２２１２と同一のプロトコールで免疫化した別のマウス（番号２２１４）を選択し、７０日目に、３０μｇの脾臓溶解物由来の精製αｄのＰＢＳ溶液で融合前追加免疫によってさらに免疫化した。４日後にマウスを屠殺し、脾臓を無菌的に取り出した。
【０１６８】
上記のように陽性細胞の融合およびクローニングを行った。融合により、製造者の説明にしたがってＩｓｏＳｔｒｉｐキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用してＩｇＧ１とイソ型分類された１７０Ｄ、１７０Ｆ、１７０Ｅ、１７０Ｘ、および１７０Ｈと呼ばれる５つの抗αｄモノクローナルハイブリドーマが産生された。
【０１６９】
５．マウス番号２２１２およびマウス番号２２１４と同一の最初のプロトコールによって免疫化したさらに別のマウス番号２２１１を選択し、８８日目に、３０μｇの免疫原および２０３日目に３０μｇの免疫原の融合前追加免疫でさらに免疫化した。４日後にマウスを屠殺し、脾臓を取り出し、上記のように融合した。ハイブリドーマ上清を、上記段落に詳述のように抗体捕捉ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
【０１７０】
１８８Ａ、１８８Ｂ、１８８Ｃ、１８８Ｅ、１８８Ｆ、１８８Ｇ、１８８Ｉ、１８８Ｊ、１８８Ｋ、１８８Ｌ、１８８Ｍ、１８８Ｎ、１８８Ｐ、１８８Ｒ、および１８８Ｔと呼ばれる１５個の陽性ハイブリドーマを同定し、ＥＬＩＳＡアッセイでイソ型分類した。簡単に述べれば、Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で５０００倍に希釈した５０μｌ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）にて４℃でコートした。プレートを、３７℃、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で３０分間ブロックし、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、５０μｌの培養上清（ＰＢＳＴで１０倍希釈）を添加した。上記のようにインキュベーションおよび洗浄後、１％の正常なヤギ血清を含むＰＢＳＴで１０００倍に希釈した５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、またはＩｇＧ３（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を添加した。プレートを上記のようにインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、その後１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）および０．１μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２の１００ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ４．５）からなる１００μｌの基質を添加した。５分後に５０μｌの１５％Ｈ２ＳＯ４の添加によって染色反応を停止させた。プレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）でＡ４９０を読み取り、１５個全ての抗体がＩｇＧ１であると同定された。
【０１７１】
マウス番号２２１１由来の過剰な脾臓細胞を、凍結バイアル中で凍結し、液体窒素中で保存した。凍結バイアルを３７℃の水浴によって急速解凍し、成分が溶解するまで円運動を行った。細胞を、１１％ＦＢＳを含む温かいＲＰＭＩを一度に１ｍｌずつ添加した１５ｍｌ遠心チューブに移し、添加の間に３〜５分遠心分離した。別の５ｍｌの温かいＲＰＭＩを添加し、５分後にチューブを２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞をＲＰＭＩに再懸濁し、上記のように融合を行った。ハイブリドーマ上清を、上記のように抗体捕捉およびフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
【０１７２】
融合は、１９５Ａ、１９５Ｃ、１９５Ｄ、１９５Ｅ、および１９５Ｈと呼ばれる５つのクローンを生じる。クローンを上記のようにＥＬＩＳＡ法によってイソ型分類し、モノクローナル抗体１９５Ａ、１９５Ｃ、１９５Ｄ、および１９５ＥがＩｇＧ１であると同定され、１９５ＨがＩｇＧ２ａであると同定された。
【０１７３】
６．抗αｄモノクローナル抗体を作製する別の試みでは、マウス番号２２１３を、２２１４、２２１１、および２２１２と同一のプロトコールで免疫化するが、４１４日目および４４１日目にＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズに結合した３０μｇのヒトαｄ／ＣＤ１８ロイシンジッパー（ＬＺ）でさらに免疫化した。マウス番号２２１３の免疫原を、抗ＣＤ１８モノクローナル抗体およびプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）でのヒトαｄ／ＣＤ１８ＬＺでの免疫沈降（実施例１４）によって調製した。沈降した複合体を、ＰＢＳでの１：１の比でのスラリーとして注射前に再懸濁した。追加免疫免疫化から４日後にマウスを屠殺した。脾臓を取り出し、上記のように融合した。
【０１７４】
非ブロッキング抗ＣＤ１８抗体のＦ（ａｂ）’２フラグメントで免疫化したヒトαｄ／ＣＤ１８ＬＺを使用したＥＬＩＳＡによって、陽性ハイブリドーマを同定した。簡単に述べれば、Ｆ（ａｂ）’２フラグメントを、１００ｎｇ／ウェルでＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４ＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩コートした。緩衝液を吸引後、ウェルを３７℃で３０分間０．５％魚の皮のゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でブロックした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、可溶性αｄ／ＣＤ１８ＬＺをコードするプラスミドで予め形質転換した５０μｌ／ウェルのＣＨＯ細胞由来の上清を添加し、プレートを３７℃で３０分インキュベートした。洗浄工程を繰り返し、５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清を添加した。上記のようにモノクローナル抗体の検出を行った。、上記のようにαｄ／ＣＤ１８コードＤＮＡで形質転換したＣＨＯ細胞を使用したフローサイトメトリーによって陽性ウェルをアッセイし、２１２Ａおよび２１２Ｄと呼ばれる２つのハイブリドーマを同定した。ハイブリドーマによって分泌された抗体を、上記のイソ型ＥＬＩＳＡ法を使用してＩｇＧ１とイソ型分類した。
【０１７５】
７．抗ヒトαｄモノクローナル抗体のさらに別の方法では、上記のように調製したαｄ／ＣＤ１８ＬＺ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズでマウスを免疫化し、０、３６、および６６日目に、各マウスに３０μｇの免疫原を投与した。上記のように組換えタンパク質ＥＬＩＳＡ形式によってマウス血清をスクリーニング後に、融合のためにマウス番号２４７７を選択した。上記の方法を使用して、融合２１２について、融合、選択、およびクローニングを行った。７個の陽性ハイブリドーマ２１７Ｆ、２１７Ｇ、２１７Ｈ、２１７Ｉ、２１７Ｋ、２１７Ｌ、および２１７Ｍが同定されたが、ハイブリドーマ２１７Ｆは、最終ラウンドのクローニング中のフローサイトメトリーによって同定したところ反応性を喪失していた。６個の残りのハイブリドーマ株由来の抗体を前に記載のようにイソ型分類し、ＩｇＧ１であることが見出された。
【０１７６】
８．αｄモノクローナル抗体の別の作製方法では、番号２４８０を番号２４７７と同一のプロトコールによって免疫化するが、２１７日目および２１８日目に３０μｇのαｄ／ＣＤ１８ＬＺの腹腔内注射によってさらに免疫化した。２２１日目にマウスを屠殺し、脾臓を取り出し、上記のように融合した。ハイブリドーマ上清を上記のＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによってスクリーニングして、αｄ／ＣＤ１８をコードするＤＮＡで予めトランスフェクトしたＪＹ細胞に対する反応性を同定した。上記のようにスクリーニングを行った。融合により、３個の陽性ハイブリドーマ２４０Ｆ、２４０Ｇ、および２４０Ｈが産生され、分泌された抗体をＥＬＩＳＡによって全てＩｇＧ１とイソ型分類された。第４のハイブリドーマ２４０Ｉは、その後ＩｇＧ１イソ型と特徴付けられた。
【０１７７】
９．機能的αｄ結合を阻害することができる抗体を同定するために、可溶性αｄ／ＣＤ１８ＬＺ（実施例１４を参照のこと）を免疫化に使用した。親和性クロマトグラフィー樹脂で一過性トランスフェクトＣＯＳ細胞の上清からタンパク質を単離し、樹脂結合αｄを免疫原として使用した。選択したマウスを、上記のように免疫化し、最初の免疫化から２週間後に最後の追加免疫を行った。この技術による免疫化により、細胞の界面活性剤溶解物にしばしば会合するタンパク質の高次構造の変化が回避される。さらなるマウスを樹脂にも結合している組換えタンパク質で免疫化するが、細胞溶解物から精製したタンパク質で最初に免疫化しなかった。
【０１７８】
非ブロッキング抗体のＦａｂフラグメントを使用して細胞上清から固定化した組換えタンパク質についてのＥＬＩＳＡによって、上記のように調製した免疫化に起因するハイブリドーマをスクリーニングした。あるいは、フローサイトメトリーを使用して、αｄｃＤＮＡで予めトランスフェクトしたＪＹ細胞に対する反応性についてアッセイした。
【０１７９】
１０．別の方法として、モノクローナル抗体を以下のように作製した。上記のように親和性精製した安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の界面活性剤溶解物由来のαｄ／ＣＤ１８ヘテロ二量体タンパク質を、５０μｇ／ｍｌのムラミールジペプチドと共に使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。マウスに３回免疫化を行い、その後αｄ／ＣＤ１８に対する血清の反応性を、ＣＨＯトランスフェクタント中のビオチン化複合体の免疫沈降によって同定した。標準的なプロトコールに従って陽性動物由来のハイブリドーマを確立し、その後ハイブリドーマ培養物を、αｄ／ＣＤ１８トランスフェクタントを使用したフローサイトメトリーによって選択した。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８トランスフェクタントを使用して、ＣＤ１８のみの反応性を調節した。
【０１８０】
１１．モノクローナル抗体産生の別の方法として、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、免疫化に使用したトランスフェクタントにおけるＣＨＯ細胞決定基に対する反応性を減少させるようにデザインした免疫化／免疫抑制プロトコールに供する。このプロトコールは、非トランスフェクトＣＨＯ細胞での免疫化およびシクロホスファミド処理によるＣＨＯ反応性Ｂ芽細胞の死滅を含む。３ラウンドの免疫化およびシクロホスファミド処理の実行後、上記のようにマウスをαｄ／ＣＤ１８ＣＨＯトランスフェクト細胞で免疫化する。
【０１８１】
１２．別の方法として、ＰＭＡ刺激ＨＬ６０細胞の界面活性剤溶解物由来のＣＤ１８複合体を、上記の予備クリアランスによって富化する。同一のカラムで他のβ２インテグリンを明澄化する。上記のように得られた複合体での免疫化、ハイブリドーマ産生、およびスクリーニングプロトコールを行う。
【０１８２】
ポリクローナル血清の産生
精製αｄＩドメイン／ＩｇＧ４キメラ（実施例１４）を使用して、ウサギにおいてポリクローナル抗血清を作製した。αｄＩドメイン／ＩｇＧ４抗原を含むフロイント完全アジュバントを、１００μｇ／ウサギで最初に注射し、その後同量のタンパク質を含むフロイント不完全アジュバントで３回追加免疫した。第３および第４の注射後に試験血液をアッセイした。プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムでウサギ免疫グロブリン（Ｉｇ）を血清から精製し、ヒトＩｇＧ／Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）１０カラムで抗ヒトＩｇＧ反応性を予備明澄化した。ＥＬＩＳＡによるＩドメインキメラに対する反応性（しかしヒトＩｇＧに対してではない）を使用して、完全な予備明澄化を確認した。
【０１８３】
予備明澄化したポリクローナル血清を使用して、αｄおよびＣＤ１８発現ベクターで予めトランスフェクトした表面ビオチン化ＣＨＯ細胞の界面活性剤溶解物由来のタンパク質を免疫沈降させた。実施例１０に記載の方法によって、免疫沈降を行った。予備明澄化血清は、抗ＣＤ１８モノクローナル抗体ＴＳ１．１８によって沈殿したものと同一の分子量のタンパク質複合体を認識した。さらに、血清は、αｄ／ＣＤ１８トランスフェクトＣＨＯ細胞由来のＣＤ１８複合体のウェスタンブロットにおいて適切なサイズの１つのバンドを認識した。ヒト脾臓由来の親和性精製したインテグリンＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、およびＶＬＡ４は、ウサギポリクローナル血清によって認識されなかった。この血清はフローサイトメトリーで同定したところ、αｄトランスフェクトＣＨＯ細胞と反応できなかった。したがって、ポリクローナルウサギ血清は変性αｄＩドメイン／ＩｇＧ４タンパク質のみを認識することができると結論付けた。
【０１８４】
αｄ／ＣＤ１８に対するポリクローナル抗血清の産生において、マウスを、アジュバントペプチドを含むαｄトランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｄ６．ＣＨＯ、αｄ／ＣＤ１８）で３回および精製αｄ／ＣＤ１８ヘテロ二量体で１回免疫化した。最終追加免疫は、αｄ／ＣＤ１８ヘテロ二量体のみを含んでいた。約１００μｌの免疫化血清を、約１０８個のＬＦＡ−１トランスフェクトＣＨＯ細胞の添加によって４℃で２時間予備明澄化した。得られた血清を、５０００倍、１００００倍、２００００倍、および４００００倍希釈で正常なヒト脾臓に対するαｄの反応性についてアッセイした。ポリクローナル抗体は、２００００倍希釈で反応性を示したが、４００００倍希釈での染色は非常に弱かった。
【０１８５】
【実施例１６】
抗αｄモノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリー分析
いくつかの初代および固定化細胞株を、抗αｄモノクローナル抗体２１２Ｄ、２１７Ｋ、および２１７Ｌを使用した調査で使用した。細胞染色を行い、実施例１７に記載の方法に従って分析した。ＭＡＧＥ−３（黒色腫関連タンパク質）ペプチドに特異的な初代ＣＤ８＋／ＣＤ５６−およびＣＤ４−／ＣＤ８−／ＣＤ５６＋細胞株は、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃに対して強力に陽性を示すが、いかなるαｄ抗体によっても染色されなかった。ＭＡＧＥ−３ペプチド特異的細胞を、ペプチド負荷抗原提示細胞（ＡＰＣ、樹状細胞または単球のいずれか）を使用して末梢血単核細胞集団から拡大する。表現型選択と組み合わせた限界希釈条件下での刺激の反復により、ペプチドを由来する天然タンパク質を有する標的細胞を特異的に死滅させるクローン細胞溶解株が得られる。
【０１８６】
サイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養した末梢血由来の樹状細胞は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃに対する抗体ならびに２１７Ｌ抗αｄ抗体によって強力に染色された。反復実験において、抗体２１２Ｄ、２１７Ｋ、２１７Ｉ、２１７Ｈ、および２１７Ｍは種々のドナーから得たこれらの細胞とも樹状細胞とも反応しなかった。培養１４日目までに、２１７Ｌ抗原の表面発現が減少し、２１日目に完全に染色が消滅した。培養期間中、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃ発現は高レベル（バックグラウンド染色の２〜３対数）で残存した。
【０１８７】
【実施例１７】
末梢血由来のヒト単球のαｄ精製のヒト単球発現
ボランティアドナーから約３００ｍｌの血液を３．８％クエン酸ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａ）に採取した。血液を、無エンドトキシンＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で４８０ｍｌに希釈し、３０ｍｌの希釈血液を５０ｍｌ遠心チューブ中の１７ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ上に伸長に重層した。Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍで３０分間勾配物をスピンした。単核細胞を示す細胞層を、各勾配から回収し、新規の５０ｍｌチューブに移した。無エンドトキシンＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ（無エンドトキシン）で体積を５０ｍｌに増加させ、チューブをＢｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を少量のＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁し、その後プールした。
【０１８８】
第２の勾配（Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｄｅｎｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｗｏｌｂｅｒ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１４４、２４７〜２５１、１９９１））は、上記のように得た細胞の混合集団から単球を精製する必要があった。簡単に述べれば、１０ｍｌの１０×ハンクス緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を、６００μｌの１．０Ｎ  ＨＣｌと混合した。この混合物に、６０ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を添加し、全てのＰｅｒｃｏｌｌが溶液中に浸漬するまで混合物をゆっくり撹拌した。Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液のｐＨを７．０に調整し、その後８．０ｍｌの勾配混合物を６つの１５ｍｌ丸底ポリスチレンチューブに添加した。正確に４．０ｍｌの細胞懸濁液を各勾配に添加し、チューブを数回逆さにして完全に混合した。勾配物を、固定角ローターにて室温で１６９０ｒｐｍで２５分間遠心分離した。勾配物中で薄い白色バンドとして出現した単球画分を回収し、新規の５０ｍｌ遠心チューブに移した。ＰＢＳ／０．１％ＰＢＳで体積を５０ｍｌに調整し、遠心分離によって細胞をペレット化した。細胞ペレットを少量に再懸濁し、プールし、血球計を使用して細胞数を決定した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＲＰＩ  １６４０、２．０％ＦＢＳ、０．２％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、１０６細胞／条件に調整した（すなわち、１００万個の細胞を各ＦＡＣＳ染色条件に使用して種々の細胞マーカーについてアッセイした）。
【０１８９】
ＦＡＣＳ染色および分析
蛍光タグ検出マーカーと直接結合したαｄまたは細胞マーカーに特異的な抗体を使用して、１抗体細胞染色を行った。マウス抗ヒトαｄ抗体２１２Ｄまたは２１７Ｌを１０μｇ／ｍｌで細胞に添加し、その後混合物を氷上で３０分間インキュベートし、３回洗浄した。１０μｌの直接結合させた細胞マーカーＣＤ３−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｔ細胞に特異的））またはＣＤ３３−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（単球に特異的））を、さらなる細胞サンプルに添加し、１０μｌの二次抗体である抗マウスＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を、２１２Ｄおよび２１７Ｌ染色細胞に添加した。全サンプルを氷上、３０分間暗所でインキュベートし、３回洗浄し、３００μｌの２．０％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。サンプルをＢｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳｃａｎで処理し、データをＬｙｓｙｓＩＩソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【０１９０】
第１の実験では、二重勾配法を使用して精製した全細胞のうち６８％が単球であり、１８％がＴ細胞であった。２１２Ｄおよび２１７Ｌの両方によるαｄの両細胞型の細胞が十分な量で染色された（それぞれ５５％および６５％）。後者の実験に基づいて、新たに単離したヒト単球に対するαｄの相対染色量はドナー間でいくらかばらつきが在るにもかかわらず、単離単球は常に陽性染色された。ヒトＩｇＧ（一次抗体の添加前に氷上で１０分間１ｍｇ／ｍｌで使用）を細胞に添加して、任意の潜在的Ｆｃ受容体結合問題を遮断した場合、αｄ染色は変化しなかった。これらの細胞を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭ−１６４０を含むＨｙｄｒｏｎコート皿（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して懸濁液中で培養してαｄ発現について分析した場合、２４時間以内に表面発現が喪失し、これは７日間にわたり減少し続けた。ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃを含む新たに単離したヒト単球上での他のインテグリンの発現に比例して、αｄ染色は低かった。
【０１９１】
αｄのヒト単球の二色ＦＡＣＳ染色
二色ＦＡＣＳ染色のために、２１２Ｄおよび２１７Ｌ抗体を、製造者の説明書に従ってＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してビオチン化した。異なる実験では、上記のように細胞を単離し、１０μｇ／ｍｌのビオチン化２１２Ｄおよび２１７Ｌ抗体およびビオチン化コントロールＩｇＧ１抗体を使用して氷上で３０分間染色した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、および０．２％アジ化ナトリウムを含むように改変）で３回洗浄し、１．０ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１０μｌのＦＩＴＣ結合ＣＤ３３（単球に特異的）および５μｌストレプトアビジンＰＥ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を共に細胞懸濁液に添加した。サンプルを暗所の氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、３００μｌの１％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。サンプルを、上記のようにＦＡＣＳで処理した。
【０１９２】
２つの抗体のうち、２１７Ｌはコントロールと比較してＣＤ３３＋細胞を有意に染色した。抗体２１２Ｄはこの細胞型も染色するが、ＣＤ３３＋細胞の染色数は、抗体２１７Ｌよりも有意に低かった。この結果は２つの個々の実験と一致した。ビオチン化抗体２１２Ｄおよび２１７Ｌを使用した関連実験では、２１７Ｌ−ビオチンは、一貫して２１２Ｄ−ビオチンよりも多数の細胞を染色した。
【０１９３】
Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配分離前に得たリンパ球および単球を示す単核細胞もまた、上記の二色分析で試験し、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ５（胸腺細胞、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞の亜母集団）、ＣＤ８（細胞傷害性／サプレッサーＴ細胞）、ＣＤ１４（単球、好中球、小胞性樹状細網細胞）、ＣＤ２０（Ｂ細胞）、およびＣＤ５６（ＮＫ細胞、Ｔ細胞のサブセット）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に免疫特異的なＦＩＴＣ結合抗体と組み合わせた２１２Ｄならびに２１７Ｌ−ビオチンを二重染色した。区別可能なαｄ陽性細胞集団は、これらの細胞マーカーと同時発現しなかった。
【０１９４】
【実施例１８】
αｄ分布の分析
αｄ／ＣＤ１８の組織分布を、実施例１５に記載のように作製したポリクローナル抗血清を使用して同定した。
【０１９５】
凍結ヒト脾臓切片の免疫細胞核的分析のために、精製ウサギポリクローナル抗体を１２０ｎｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用した。６ミクロン厚の切片を、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｌｉｄｅｓ（ＶＷＲ）上の重層し、−７０℃で保存した。使用前に、スライドを−７０℃から取り出し、５５℃で５分間静置した。次いで、切片を冷アセトンで２分間固定し、風乾した。切片を、１％ＢＳＡ、３０％正常ヒト血清、および５％の正常なウサギ血清を含む溶液中、室温で３０分間ブロックした。一次抗体を、室温で１時間各切片に適用した。非結合抗体を、ＴＢＳ緩衝液で１回５分間のスライドの洗浄を３回行って除去した。次に、ウサギ抗マウスＩｇＧ結合抗体を、同一のＴＢＳ緩衝液中の各切片に適用した。室温で３０分間インキュベートしたマウスアルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）抗体を使用して、第２の抗体を検出した。次いで、スライドをＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を適用し、水への浸漬によって発色を停止させた。スライドをＮｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）中で対比染色し、水でリンスし、Ａｑｕａ  Ｍｏｕｎｔ（Ｂａｘｔｅｒ）でマウントした。この試薬を使用して赤脾髄中の染色が検出されるが、無関係のウサギポリクローナルＩｇ調製物や同一の動物由来の非精製成熟前血清では検出されなかった。
【０１９６】
一旦マウス血清が特異的αｄ反応性を有することが同定されると、これを使用して種々のリンパ系細胞および非リンパ系組織を染色した。ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃを認識するモノクローナル抗体を、コントロールとして同一の実験で使用した。正常な脾臓切片のαｄポリクローナル血清ならびにＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ１８に対するモノクローナル抗体での染色により、以下の結果が明らかとなった。αｄポリクローナル血清を使用して認められたパターンは、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、またはＣＤ１８と同一の標識パターンを示さなかった。白脾髄の辺縁帯中に存在するいくつかの細胞を使用した異なる標識パターンおよび辺縁帯周囲の細胞の異なる標識が存在する。このパターンは、他の抗体を使用しても認められなかった。赤脾髄中に散乱した各細胞も標識した、これは、ＣＤ１１ａおよびＣＤ１８で認められた同一の集団またはサブセットであってもなくてもよい。
【０１９７】
ＣＤ１１ｃでの標識は、辺縁帯中で染色されたいくつかの細胞を表示したが、αｄポリクローナル抗体と比較した場合、この抗体は異なる環パターンを示さず、赤脾髄中の標識によってαｄポリクローナル血清と同一の染色パターンも示さなかった。
【０１９８】
したがって、αｄポリクローナル血清で認められた標識パターンは、他のβ２インテグリン（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ１８）に対する抗体を使用して認められたパターンと比較して珍しく、これにより、ヒトにおけるαｄのｉｎ  ｖｉｖｏ分布は他のβ２インテグリンの分布と異なることが示唆される。
【０１９９】
モノクローナル抗体を使用したヒトαｄ発現の特徴付け
ハイブリドーマ１６９Ａおよび１６９Ｂによって分泌された抗体を使用して、免疫細胞化学による凍結組織切片中およびフローサイトメトリーによる細胞株および末梢血白血球でのヒトαｄ発現を分析した。両実験組で使用したハイブリドーマ上清は希釈していなかった。
【０２００】
組織染色
以下の様式で染色した肝臓以外の全ての染色を上記のように行った。アセトン固定後、切片を１％Ｈ２Ｏ２および１％アジ化ナトリウムのＴＢＳ溶液にて室温で１５分間停止させた。一次抗体の染色後、ペルオキシダーゼに直接結合させたウサギ抗マウス抗体を、室温で３０分間適用した。スライドを、ＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ペルオキシダーゼに直接結合させたブタ抗ウサギ抗体を、室温で３０分間インキュベートして、第２の抗体を検出した。次いで、スライドをＴＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＡＥＣ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を適用し、発色させた。スライドを、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｇｉｌｌ’ｓ  Ｎｏ．２（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、水でリンスし、加水分解およびマウンティングを行った。
【０２０１】
脾臓切片では、発現の大部分は、形態学によって顆粒球およびマクロファージと同定された細胞上の赤脾髄に局在していた。多数の顆粒球が染色された一方で、マクロファージのサブセットのみがシグナルを発生した。白脾髄中の少数の小胞性樹状細網細胞もまたαｄ抗体によって弱く染色された。赤脾髄および白脾髄全体にＣＤ１１ａおよびＣＤ１８染色が検出された。ＣＤ１１ｃ染色は、脾臓赤脾髄および白脾臓周囲の辺縁帯中にマクロファージと推定される巨大細胞中でより明らかであり、赤脾髄中の核酸染色もまた顕著であった。ＣＤ１１ｂは、赤脾髄中のαｄに重複するが同一ではない分布を示すようであるが、白脾髄は関与しなかった。
【０２０２】
正常および（リウマチ様）関節炎滑膜組織中のインテグリン発現を比較した。正常組織における全ての抗インテグリン抗体（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８ならびにαｄに特異的に免疫反応性を示す抗体を含む）での染色は最小であり、常在細胞（おそらくマクロファージ）に広範に分布している。炎症滑膜では、全インテグリンの発現は、リンパ管周囲に密集する細胞により局在していた。αｄおよびＣＤ１１ｂ発現パターンは類似しているが、ＣＤ１１ｃは強力に発現しないようであり、白血球のサブセットに限定されていた。
【０２０３】
イヌでは、肝臓マクロファージまたはクップファー細胞上でＣＤ１１ｂ発現が認められたが、αｄ発現は認められなかった。正常な肝臓切片の染色（イヌ肝臓切片染色について前に記載）により、ヒトにおけるこの染色パターンの保存が確認された。さらに、低レベルのＣＤ１１ｃが検出された。肝炎患者由来の切片では、全てのロイコインテグリン染色は、正常肝臓よりも高く、αｄ発現は、これらのサンプルにおいてマクロファージおよび顆粒球上で検出された。
【０２０４】
抗αｄ抗体を使用して正常なヒト結腸切片の最初染色が認められ、わずかな平滑筋染色および白血球染色が認められた。クローン病患者由来の切片では、全てのロイコインテグリンがより高いレベルで認められた。
【０２０５】
正常な肺では限定数の弱いαｄ陽性細胞が認められ、これらは、形態学によってマクロファージおよび好中球と同定された。気腫患者由来の肺組織では、好中球、ヘモジデリン（鉄含有色素）を含むマクロファージでαｄ染色が認められ、これは、これらの細胞による赤血球の包含が示す。
【０２０６】
正常な脳および多発性硬化症（ＭＳ）患者由来のプラーク病変の切片を、インテグリン発現について試験した。正常な脳では、αｄ染色は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃの染色よりも弱く、形態学およびＣＤ６８染色によって小グリア細胞と分類された細胞に制限された。ＣＤ１１ｂ陽性細胞は、周辺の血管および組織のいたるところに存在した。ＣＤ１１ｃ＋細胞は、血管内に存在するようであるが、αｄ＋細胞血管周囲に存在した。ＭＳ組織切片では、小グリア細胞および非マクロファージ白血球サブセットの両方でαｄ発現が認められ、αｄ＋細胞はプラーク病変内および皮質のいたるところに存在した。αｄシグナルはＣＤ１１ｃの強度と等しいが、ＣＤ１１ｂの強度よりも低かった。
【０２０７】
ＰＤＡＹ由来の胸大動脈および腹大動脈切片（Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｏｕｔｈ、ＬＳＵ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）組織サンプルを、抗ロイコインテグリンおよび抗ＣＡＭ抗体を使用して分析した。試験した病変は、巨大泡沫細胞（大部分が脂質貪食マクロファージ）およびより小さな白血球の浸潤物の内膜下凝集体からなる大動脈脂肪線条と一致した。αｄおよび他のβ２インテグリンα鎖（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃ）に特異的なモノクローナル抗体＋マクロファージマーカー（ＣＤ６８）を使用した１標識研究により、大部分の脂質排出マクロファージが中程度のレベルのαｄおよびＣＤ１８を発現し、低レベルまたは低レベル〜中程度のレベルのＣＤ１１ａおよびＣＤ１１ｃを発現することが明らかとなった。ＣＤ１１ｂはわずかに発現されるが、これはマクロファージのサブセットのみによってである。
【０２０８】
大動脈切片中のαｄおよびＩＣＡＭ−Ｒ抗原の相対的局在化を同定するために二重標識研究を行った。これらの切片中の泡沫細胞がマクロファージマーカーに特異的な抗体Ｈａｍ５６内で染色されるが、平滑筋アクチンに対する抗体では染色されないので、泡沫細胞は内膜下平滑筋細胞に由来しないと同定された。αｄを発現するＣＤ６８陽性マクロファージは、小さなＩＣＡＭ−Ｒ陽性白血球の周囲に存在するかこれらと共に散在していた。ＣＤ６８陰性であるがαｄおよびＩＣＡＭ−Ｒ抗体で染色される小さな白血球の数は限定されていると考えられた。
【０２０９】
正常な組織中のαｄ分布は、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃと重複するが同一ではないパターンで常在白血球上に存在するようであった（白血球分布が制限されていると以前に特徴付けられている２つの他のロイコインテグリンα鎖）。細胞形態学は、αｄ染色がマクロファージおよび顆粒球に限定され、リンパ球染色が制限されることを示した。一般に、組織の炎症は、特定の組織で認められる白血球の数および型を増加させ、それと共にαｄを含むロイコインテグリン染色を増加させると考えられた。ロイコインテグリンの細胞および空間的分布は罹患組織で異なるので、特定の状況でαｄを含む各ファミリーメンバーについて異なる機能およびリガンドが存在すると推測された。
【０２１０】
興味深いことに、初期アテローム動脈硬化症病変におけるαｄ発現は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃの発現よりも明らかであり、これにより、αｄはこれらの病変確立において中心的役割を果たし得ることが示唆される。αｄとＩＣＡＭ−Ｒとの間の相互作用を示唆する証拠によって支持されたαｄおよびＩＣＡＭ−Ｒ陽性細胞の同格の分布により、αｄは白血球漸増またはこれらの病変の初期段階での活性化に関連し得ることが示唆された。
【０２１１】
細胞株および末梢血白血球の染色
抗体１６９Ａおよび１６９Ｂは、ＦＡＣＳによって前骨髄性単球株ＨＬ６０を染色した。これらの細胞中でのαｄの表面発現は、マクロファージ経路への分化を誘導すると報告されているＰＭＡ刺激によって負の影響を受けるが、顆粒球分化を誘導するＤＭＳＯによって影響を受けない（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｂｌｏｏｄ、７０、１２３３〜１２４４、１９８７）。ＰＭＡ刺激を用いた１６９Ａおよび１６９ＢのＦＡＣＳプロフィールは、抗ＣＤ１１ｂおよび抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体で認められたプロフィールと相反した。単球株ＴＨＰ−１もまた、１６９Ａおよび１６９Ｂで弱く染色された。さらには、リンパ球中の細胞サブセットおよび末梢血白血球の単球ゲートは、ＦＡＣＳによって陽性が低いようである。末梢血単球のサブセットは、１６９Ａおよび１６９Ｂで弱く染色され、Ｂリンパ球は、αｄを表面発現しないことが見出された。Ｔリンパ球のＣＤ８＋サブセットはαｄ＋であった。さらに、抗体１６９Ａおよび１６９Ｂは、Ｂ細胞株、ＪＹ、Ｒａｍｏｓ、抗塩基球株、ＫＵ８１２、およびＴ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ、ＳＫＷ、およびＭｏｌｔ１６上に抗原を検出できなかった。
【０２１２】
ＨＬ６０細胞での結果に照らして、フィコール／ハイパーク勾配遠心分離およびその後の赤血球溶解によって末梢血から顆粒球を単離した。酢酸中での核形態学の視覚化によって、全調製物はＰＭＮが９０％を超えることが見出された。異なる集団を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡまたは１０−８Ｍのホルミルペプチド（ｆＭＬＰ）で３０分間刺激して、潜在的な細胞内貯蔵インテグリンを放出させた。非刺激集団は、ＩｇＧ１コントロールを超える１６９Ａおよび１６９Ｂ抗原を低いが有意に発現し、この発現は刺激により検出可能に増加する。ＰＭＮでは、αｄおよびＣＤ１１ｃの表面発現レベルは、ＨＬ６０細胞で認められるレベルよりも類似していた。その後抗体１６９Ｂを使用して、それぞれαｄおよびＣＤ１８に適切な約１５０および９５ｋＤのサブユニットサイズのビオチン化ＰＭＮの界面活性剤溶解物由来のヘテロ二量体分子を沈殿させた。
【０２１３】
ＰＭＮ上のαｄの存在は、イヌαｄは発現について既知の情報から予想することができなかった。イヌ好中球は、ヒト相対物と異なり、Ｔヘルパー細胞マーカーＣＤ４を発現し、インテグリンＶＬＡ−４も発現するので、イヌはヒトと異なるリガンドおよび機能を有し得る。
【０２１４】
ＰＢＬ亜群の染色
ヒト末梢血白血球中のこのβ２インテグリンの分布を同定するために本研究を行った。さらに、他のβ２インテグリンに関するαｄの細胞表面密度を比較した。最後に、精製ヒト好酸球におけるαｄ発現の急速な調節も評価した。
【０２１５】
ヒト末梢血白血球を、密度勾配遠心分離によって単核細胞画分（単球、リンパ球、および好酸球を含む）および顆粒球（好中球および好酸球）に分離した（Ｗａｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０５、１０７〜１１０、１９８７）。いくつかの実験のために、ＣＤ１６免疫磁性選択を使用して９５％を超える純度に精製した（Ｈａｎｓｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１２２、９７〜１０３、１９８９）。以前に記載のように、皮膚肥満細胞をヒト皮膚から分散させて富化した（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９、３０６２〜３０６９、１９８７）。
【０２１６】
細胞を、ＣＤ１１ａ（ＭＨＭ２４）、ＣＤ１１ｂ（Ｈ５Ａ４）、ＣＤ１１ｃ（ＢＵ−１５）、またはαｄ（１６９Ａ）のいずれかに特異的なモノクローナル抗体の適切な希釈物で標識した。マウスコントロールＩｇＧ１も使用した。細胞を洗浄し、フィコエリスリン結合ヤギ抗マウスＩｇＧとインキュベートした。いくつかの実験では、細胞を、特定の細胞（例えば、Ｔ細胞にはＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８；ＮＫ細胞にはＣＤ１６＋リンパ球；好塩基球には抗ＩｇＥ）に特異的な過剰なマウスＩｇＧおよびＦＩＴＣ標識マウスモノクローナル抗体、またはヤギポリクローナル抗体とインキュベートした（Ｂｏｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１２５、２６５〜２７１、１９８９）。次いで、サンプルを、適切なゲーティングを使用したフローサイトメトリー（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  Ｐｒｏｆｉｌｅ）によって試験して、細胞サブセットを同定した。
【０２１７】
αｄ発現の迅速な上方制御を試験するヒト好酸球を使用した研究のために、細胞をホルボールエステル（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＴＥＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｃｈａｌｌ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、３、１６５〜１８３、１９９１）、またはＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍｌ）にて３７℃で１５分間刺激し、その後上記のように種々のモノクローナル抗体で標識した。
【０２１８】
結果は、αｄは全ての末梢血好酸球、好塩基球、好中球、単球、およびＮＫ細胞上に存在することを示した。小さなサブセット（約３０％）のＣＤ８＋リンパ球もまた、αｄを発現することが見出された。皮膚肥満細胞およびＣＤ４＋リンパ球は、αｄを発現しなかった。一般に、ＣＤ１１ａおよびＣＤ１１ｂは、αｄよりも高密度で白血球上に存在し、後者はＣＤ１１ｃと類似して比較的低レベルで発現する。白血球のうち、単球およびＣＤ８＋細胞はαｄ密度が最も高く、好酸球はαｄ密度が最も低い。好中球、好塩基球、およびＮＫ細胞は、中間である。
【０２１９】
ＣＣケモカインＲＡＮＴＥＳでの末梢血好酸球の刺激により、いかなるβ２インテグリンの発現も変化しなかった。しかし、ホルボールエステルでの処理により、ＣＤ１１ｂおよびαｄの発現が２〜３倍に増加するが、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１１ｃの発現には影響を与えなかった。ＩＬ−５処理により、他のインテグリンサブセットレベルに影響を与えることなくＣＤ１１ｂは発現が選択的に下方制御された。
【０２２０】
これらの結果の組み合わせは、末梢血白血球では、αｄは一般にＣＤ１１ｃに匹敵するレベルで発現することを示す。単球およびＣＤ８＋リンパ球のサブセットで最も高いレベルが見出された。ヒト皮膚肥満細胞は、αｄを発現しない。精製好酸球は、ＣＤ１１ｂおよびαｄの予め形成された細胞質内貯蔵プールを有するようである。しかし、ＰＭＡに対してＩＬ−５によるＩＬ−５異なる上方制御により、これらの貯蔵プールは互いに独立していることが示唆される。
【０２２１】
１６９Ａ／Ｂ陰性リンパ球群をより正確に定義するために、末梢血白血球（ＰＢＬ）亜群の染色パターンを、上記のゲーティングおよび表面マーカーの組み合わせを使用したフローサイトメトリーによって同定した。前に記載のようにＦｉｃｏｌｌでＰＢＬを単離し、１６９Ａ、１６９Ｂ、ＣＤ１４（単球／マクロファージマーカー）、ＣＤ２０（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞受容体α／β（Ｔ細胞）、ＣＤ１６（好中球、ＮＫ）、およびα４（好中球の陰性マーカー）に対するモノクローナル抗体で個別に染色した。ゲートを、サイズおよびマーカー分布によって定義した。結果は、ＣＤ１４＋単球ゲート中の細胞が低レベルの１６９Ａおよび１６９Ｂ染色を示すことを示した。リンパ球ゲートにおける初期の実験で認められた複峰性発現パターンを、前方散乱の増加によって解析した。混合ＴＣＲ＋／ＣＤ２０＋集団は、低いが同レベルの１６９Ａ／Ｂ発現を示し、ＣＤ５６に５０％陽性で染色されるわずかに高い側方散乱（細胞の複雑性）でマッピングされた集団は、明らかに１６９Ａ／Ｂ陰性集団を有するようであった。陰性集団はまた、ＴＣＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１４、またはＣＤ１６抗体によって認識されなかった。
【０２２２】
αｄの滑膜分布
炎症性および非炎症性滑膜中のαｄ、他のβ２インテグリンおよびそのカウンター受容体の細胞分布を同定するために、種々のβ２インテグリンおよび免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーに対するモノクローナル抗体を免疫組織学研究に使用した。正常、骨関節症、およびリウマチ様の滑膜組織サンプルにおけるタンパク質発現を同定した。
【０２２３】
結果は、滑膜結合細胞層が高レベルのＶＣＡＭ−１、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、およびαｄ／ＣＤ１８を発現することを示した。これらの細胞では、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８発現は制限され、一般にＣＤ１１ａ／ＣＤ１８は検出されなかった。慢性関節リウマチの滑膜では、滑膜細胞層中のβ２インテグリンの発現は、過形成の程度に比例して減少する。ＣＤ１１ｃを発現する細胞の比は有意に増加してＣＤ１１ｂおよびαｄの比に近づくが、ＣＤ１１ａ発現は増加しない。
【０２２４】
組織の内面下領域では、ＣＤ３／ＣＤ１１ａ／ＩＣＡＭ−Ｒ＋リンパ球の凝集および散在性浸潤物が、ＣＤ６８／ＣＤ１１ｂ／αｄ＋マクロファージ間で散在している。有意数の凝集物は、特にＴ細胞が豊富な領域中の強いαｄ染色を示す。
【０２２５】
ＩＣＡＭ−Ｒ発現の形跡が最小であることにより、滑膜内皮のＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２発現は変化しやすかった。
【０２２６】
これらの結果の組み合わせは、滑膜マクロファージおよびマクロファージ様滑膜細胞は高レベルのβ２インテグリンＣＤ１１ｂおよびαｄを構成性に発現することを示す。滑膜では、ＣＤ１１ｃ発現の明らかな増加と共に内面および内面下領域の両方のこの細胞サブセットが拡大する。ＣＤ１１ａおよびＩＣＡＭ−Ｒ発現に加えて、リウマチ様滑膜Ｔリンパ球の特異的集団もまた高レベルのαｄを発現し、後者の分子は、末梢血リンパ球によって低レベルで発現することが示された。
【０２２７】
罹患肺および肝臓組織におけるαｄ発現
類肉腫症個体由来の肺組織および２人の肝硬変個体由来の肝臓組織を、６μｍの厚さに切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）スライド上にて室温で１５分間風乾した。使用前に、スライドを５０℃で約５分間インキュベートした。切片を、冷（４℃）アセトン（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）中にて室温で２分間固定し、室温で風乾した。切片を、１００ｍｌの１×ＴＢＳ、１．１ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）、１．０ｍｌの１０％  ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ）溶液中に室温で１５分間置き、内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。各切片を２０％正常ヒト血清（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ）、５％正常ラット血清（Ｈａｒｌａｎ）、および２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む１５０μｌの１×ＴＢＳ溶液中にて室温で３０分間ブロッキングした。インキュベーション後、切片から溶液を吸い取った。ブロッキング溶液中に１０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度の一次モノクローナル抗体を調製し、７５μｌを室温で１時間各組織切片に適用した。インキュベーション後、切片を１×ＴＢＳで１回５分間の洗浄を３回行って、非結合抗体を除去した。最終洗浄後、組織周囲の吸引によって過剰なＴＢＳを除去した。ビオチン化ラット抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ブロッキング溶液で４００倍に希釈し、各切片に７５μｌを室温で３０分間適用した。スライドを、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を２回行った。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ビオチン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ブロッキング溶液で２００倍に希釈し、各切片に７５μｌを室温で３０分間適用した。スライドを、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を２回行った。基質３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または３，３’−ジアミノベンズイミド（ＤＡＢ）基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用し、水への浸漬によって発色を停止させた。スライドを、Ｇｉｌｌ’ｓヘマトキシリン番号２（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、水でリンスし、Ａｑｕａｍｏｕｎｔ（Ｂａｘｔｅｒ）またはＣｙｔｏｓｅａｌ（ＶＷＲ）のいずれかでマウントした。
【０２２８】
類肉腫症の肺では、２１７Ｌモノクローナル抗体染色細胞および大部分の２１７Ｌエピトープ発現のみが肉芽種に局在した。肉芽種内の巨細胞は、２１７Ｌ抗原に陰性なようであった。２１７Ｌエピトープ発現は、形態学的に類上皮組織球（マクロファージ系統の高度に分化した食細胞）と考えられる細胞に局在した。他のインテグリンの分布は、類肉腫症肺中の２１７Ｌエピトープの分布に重複していたが、発現パターンは同一ではなかった。例えば、全ての他のインテグリンに免疫特異的な抗体で、肉芽種中の細胞および２１７Ｌ染色に陰性を示す巨細胞を標識した。
【０２２９】
類肉腫症と診断された第２の患者由来の切片は、２１７Ｌエピトープ発現に陰性であるが、この患者がステロイド性免疫抑制薬を投与されているか（最も一般的な治療形態）どうかは病理学報告からは不明である。
【０２３０】
肝硬変組織由来の切片では、肝小結節間の結合組織中の泡沫細胞およびリンパ球サブセットを、抗αｄ抗体で標識した。ＣＤ１１ｃ分布は、αｄ発現と重複するが同一ではなく、泡沫細胞のサブセットもまた抗ＣＤ１１ｃ抗体で標識するが、抗αｄ抗体よりも多くのマクロファージおよびリンパ球を標識された。ＣＤ１１ａおよびＣＤ１１ｂ発現の分布はαｄ発現と明白に重複していなかった。
【０２３１】
抗体２１７Ｌはまた、密集し、２１２Ｄおよび２１７Ｌの両方で同定される集団である食細胞型細胞を染色した。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃに対する抗体は、異なる様式で２１７Ｌ＋クラスターを染色した。
【０２３２】
関連実験では、抗体２１２Ｄおよび２１７Ｌを使用して、ヒト脾臓組織切片および非ヒト霊長類Ｍ．ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａの脾臓由来の連続切片を染色した。新鮮なヒトおよびサルの脾臓組織から単離した脾細胞も、フローサイトメトリーによってαｄ発現について評価した。抗体２１２Ｄおよび２１７Ｌは共にヒトおよびサル脾細胞を認識した。ＩＣＣおよびＦＡＣＳにより、αｄ＋集団は、全細胞の２０％を占め、αｄ＋細胞がより高い割合を占めるげっ歯類とは異なる。陽性集団は、形態学的にマクロファージと同一なようであった。
【０２３３】
ヒト骨髄染色
標準的な技術に従って、健康な骨髄ドナーの腸骨からヒト骨髄サンプルを得た。元のサンプルをＩｓｃｏｖｅ培地で３倍に希釈し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。軟膜層を慎重に回収し、１回洗浄し、溶血緩衝液（０．８３％塩化アンモニウム、０．１％重炭酸ナトリウム、無ＥＤＴＡ）を使用して溶血させた。細胞を１５％ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁し、１００μｌの１００，０００細胞／チューブに等分し、氷上に置いた。以前に記載のように免疫染色を行った。簡単に述べれば、モノクローナルマウス抗ヒトαｄ抗体２１２Ｄもしくは２１７Ｌまたはマウス抗ヒトＣＤ１８もしくはマウス抗ヒトＣＤ５０（ＩＣＡＭ−Ｒ特異的）抗体を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で各細胞サンプルに個別に添加し、混合物を氷上で２０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ヤギ抗マウスＦＩＴＣと共にさらに２０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。蛍光細胞分析分離装置ＦＡＣＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、蛍光を測定した。
【０２３４】
４つの実験由来の結果は、抗体２１２Ｄを使用して同定したところ、αｄ発現は１３〜４３％（中央値２７％）の細胞で認められ、抗体２１７Ｌを使用した場合、６〜５５％の（中央値２１％）の細胞で認められることを示した。ＣＤ１８発現は、６０〜９６％（中央値７１％）で認められ、ＣＤ５０発現は８６〜９９％（中央値９４％）で認められた。
【０２３５】
乳癌患者由来の末梢血単核細胞上でのαｄの発現
末梢血単核細胞を、乳癌発症リスクの高い患者（すなわち、骨髄移植を受けた予後が悪い乳癌患者）由来の血液サンプルのＦｉｃｏｌｌ分離を使用して単離した。細胞を、上記のようにαｄ発現について免疫染色によってスクリーニングした。
【０２３６】
結果は、抗体２１２Ｄを使用して同定したαｄ発現は２０％の細胞で認められ、抗体２１７Ｌを使用すると１３％の細胞で認められることを示した。抗体２１２Ｄはまた、リンパ球である可能性の高い小細胞集団を染色した。αｄを発現する細胞の割合は、正常な血液ドナーで一般に見出される割合に匹敵した。
【０２３７】
さらに、抗体２１２Ｄは、ＣＤ１４＋である巨細胞だけでなく、試験的にＣＤ３＋と同定されたさらにより小さな細胞も染色するようであった。この結果は、血液および骨髄の両方で認められた。
【０２３８】
αｄを発現する細胞数のばらつきは、吸引される骨髄の細胞組成がドナーによってばらつくことによって説明することができる（例えば、循環血液の量と比較した骨髄の量）。
【０２３９】
【実施例１９】
αｄ発現の下方制御
一般に、白血球インテグリンは血液透析中に下方制御されて慢性腎不全で認められる免疫の変化に寄与するので（Ｒａｂｂら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、６、１４４５〜１４５０、１９９５およびＲａｂｂら、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｔ  Ｄｉｓ．、２３、１５５〜１６６、１９９４）、血液透析および慢性腎不全におけるαｄ／ＣＤ１８表面発現を試験した。さらに、ＰＫＣ刺激後のαｄ／ＣＤ１８  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現もまた調査した。
【０２４０】
５人の非腎疾患の無作為に選択した病因患者から全血サンプルを得た。血液サンプルを、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡと３７℃で３０分間インキュベートし、その後染色およびフローサイトメトリーを行った。慢性腎不全患者からも血液サンプルを採取した。患者は安定で糖尿病ではなく、週３回透析を受けている。透析開始前にベースラインサンプルを得て、その後のサンプルを、カプロファン膜での透析中の１５分と１８０分で採取した。罹患していない正常な被験体由来の血液サンプルを、ネガティブコントロールとして使用した。
【０２４１】
細胞染色のために、５μｇの抗体１６９Ａおよび１６９Ｂ（およびネガティブコントロール１Ｂ７）を、１００μｌの全血と共に暗所で１５分間インキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ溶解試薬（２ｍｌ）を各混合物に添加し、暗所で１０分間インキュベーションを継続した。次いで、細胞をペレット化し、ＰＢＳに懸濁した。遠心分離によって細胞を再びペレット化し、ＦＩＴＣ結合二次抗体と混合し、暗所で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、吸引し、１．０％ホルマリンに再懸濁した。
【０２４２】
Ｒａｂｂら（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、６、１４４５〜１４５０、１９９５）を使用して、フローサイトメトリーを行った。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のＳｉｍｕｌｓｅｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、サンプルを分析した。各サンプルについて最低２２，０００個の細胞を分析した。顆粒球、単球、およびリンパ球サブセットを、前方散乱光および側方散乱光によってゲーティングした。細胞サブセットの純度を、ＣＤ４５染色およびＣＤ１４染色によって評価した。
【０２４３】
結果は、αｄ／ＣＤ１８発現を正常なヒト被験体から採取したサンプル中で検出することができ、発現は単球で最も高く、リンパ球で最も低いことを示した。好中球上での発現は、単球とリンパ球との間であった。抗体１６９Ｂでの染色は、抗体１６９Ａでの染色よりも弱かった。ＰＭＡ処理により、特に好中球および単球上でのαｄ／ＣＤ１８発現が上方制御された。
【０２４４】
腎不全患者由来のサンプルでは、αｄ／ＣＤ１８発現は、透析前に好中球、単球、およびリンパ球上で検出可能であった。白血球活性化膜を使用した透析の１５分後、αｄ／ＣＤ１８発現が少し増加した。単球およびリンパ球上での発現は、処理の終了によって実際に減少した。この結果は、αｄ／ＣＤ１８発現は、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８で認められた発現および透析後のＬ−選択発現と異なることを示す。
【０２４５】
【実施例２０】
ラットｃＤＮＡクローンの単離
イヌおよびヒトαｄサブユニットの存在に照らして、ラット（本実施例）およびマウス（実施例２０、下記）を含む他の種の相同遺伝子を単離した。
【０２４６】
ヒトαｄ遺伝子と相同性を示すラットｃＤＮＡの部分配列を、ラット脾臓λｇｔ１０ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得た。ライブラリーを、２×１０４ｐｆｕ／プレートで１５０ｍｍのＬＢＭ／寒天プレートにプレートした。標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、２．１１０）に記載のように、ライブラリーをＨｙｂｏｎｄ（登録商標）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にリフトし、３分間変性させ、３分間中和し、緩衝液で５分間洗浄した。その直後に膜をＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に置き、自動架橋設定を使用してＤＮＡを架橋した。膜を予備ハイブリッド形成し、３０％または５０％ホルムアミド中（低および高ストリンジェンシー条件）でハイブリッド形成した。最初に、クローン１９Ａ２（配列番号１）の塩基５００〜２１００に対応するαｄｃＤＮＡから作製した３２Ｐ標識プローブを使用して、膜をスクリーニングした。製造者が推奨するプロトコールに従って、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍのランダムプライマーキットを使用して、プローブを標識した。５５℃の２×ＳＳＣでフィルターを洗浄した。
【０２４７】
ヒトαｄ、ヒトＣＤ１１ｂおよびヒトＣＤ１１ｃに配列相同性を示す６８４．３および７０５．１と呼ばれる２つのクローンを同定した。両クローンを、ヒトαｄ遺伝子と、３’領域のクローン６８４．３については塩基１８７１から塩基３０１２、クローン７０５．１については塩基１５５１〜３３６７とアラインメントした。
【０２４８】
５’領域を含むより完全なラット配列を単離するために、最初のスクリーニングで使用したプロトコールであるが、クローンＡ１１６０から作製したマウスプローブ（以下の実施例２０を参照のこと）を使用して、同一のライブラリーを再スクリーニングした。１つの単離プラークを、第２のスクリーニングから選択し、１つのクローンとしてＬＢＭ／寒天プレート上に維持した。配列決定プライマー４３４ＦＬおよび４３４ＦＲ（それぞれ配列番号３４および３５）を標準的なＰＣＲプロトコールで使用して、配列決定用のＤＮＡを作製した。
５’−ＴＡＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＡＧＴＣＣＣＣＡＣ−３’（配列番号３４）
５’−ＴＧＡＡＧＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＣＡＧＡ−３’（配列番号３５）
ＰＣＲ由来のＤＮＡを、製造者が推奨するプロトコールに従って、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
【０２４９】
重複領域でクローン６８４．３および７０５．１に重複する７４１．４および７４１．１１と呼ばれる２つのクローンを同定し、クローン７４１．４および７４１．１１は、クローン６８４．３および７０５．１に１０％相同する。ヒトαｄ遺伝子に相同性を示す混成ラットｃＤＮＡを、配列番号３６に示し、推定アミノ酸配列を配列番号３７に示す。
【０２５０】
ラットαｄの５’末端のクローニング
製造者が推奨するプロトコールに従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈラット脾臓ＲＡＣＥクローニングキットを使用して、ラットαｄ遺伝子の５’ｃＤＮＡフラグメントを得た。使用したオリゴヌクレオチドに特異的な遺伝子を、７４１．１１＃２Ｒおよび７４１．２＃１Ｒ（それぞれ配列番号５９および５８）と呼んだ。
５’−ＣＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号５９）
５’−ＧＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号５８）
オリゴ７４１．１１＃２Ｒは、配列番号３６の塩基対１３１〜１５２を含み（逆方向）、７４１．２＃１Ｒは配列番号３６の塩基対６９６〜７１５を含む（これも逆方向）。３’ｍｏｓｔオリゴ７４１．２＃１Ｒを使用して、一次ＰＣＲを行った。その後、オリゴ７４１．１１＃２Ｒおよび第１の反応から作製したＤＮＡを使用して、第２のＰＣＲを行った。１％アガロースゲルで約３００塩基対のバンドが検出された。
【０２５１】
二次ＰＣＲ産物を、製造者が推奨するプロトコールに従って、プラスミドｐＣＲＴＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートした。白色（陽性）コロニーを拾い、丸底９６ウェル組織培養プレート中の各ウェル中の１μｌの５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンストック溶液および１μｌ  Ｍ１３Ｋ０７ファージ培養物を含む１００μｌのＬＢＭに添加した。混合物を３７℃で３０分〜１時間インキュベートした。最初のインキュベーション後、１００μｌのＬＢＭ（１μｌの５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２５０倍希釈の１０ｍｇ／ｍｌカナマイシンストック溶液を含む）を添加し、３７℃で一晩インキュベーションを継続した。
【０２５２】
滅菌９６ウェル金属移行突起を使用して、９６ウェルプレート由来の上清を、４つのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）ナイロンフィルターに移した。標準的なプロトコールによって、フィルターを変性させ、中和し、架橋した。フィルターを５０℃の２０ｍｌの予備ハイブリッド形成緩衝液（５×ＳＳＰＥ；５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ；１％ＳＤＳ；５０μｇｓ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）で撹拌しながら数時間予備ハイブリッド形成させた。
【０２５３】
正方向および逆方向に塩基対８６〜１０５（配列番号３６）を含むオリゴプローブ７４１．１１＃１および７４１．１１＃１Ｒ（それぞれ配列番号５６および５７）を、以下のように標識した。
５’−ＣＣＴＧＴＣＡＴＧＧＧＴＣＴＡＡＣＣＴＧ−３’（配列番号５６）
５’−ＡＧＧＴＴＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡＣＡＧＧ−３’（配列番号５７）
約６５ＷＰのオリゴＤＮＡの１２μｌｄＨ２Ｏ溶液を、６５℃で２分間加熱した。４μｌの５×キナーゼ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）および１μｌのＴ４  ＤＮＡキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ）と共に３μｌの１０ｍＣｉ／ｍｌγ−３２Ｐ−ＡＴＰをチューブに添加した。混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１６μｌの各標識オリゴプローブを予備ハイブリッド形成緩衝液に添加し、フィルターおよびハイブリッド形成を４２℃で一晩継続した。フィルターを、５×ＳＳＰＥ；０．１％ＳＤＳで１回の洗浄あたり５分間を室温で３回洗浄し、６時間オートラジオグラフィーを行った。陽性クローンを拡大し、製造者が推奨するプロトコールにしたがってＭａｇｉｃ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＤＮＡを精製した。配列決定用にクローン２Ｆ７を選択し、これは重複領域中でクローン７４１．１１に１００％相同であった。完全なラットαｄ核酸配列を配列番号５４に示し、アミノ鎖配列を配列番号５５に示す。
【０２５４】
ラットｃＤＮＡおよびアミノ酸配列の特徴付け
β２インテグリン中のラットαサブユニットは核酸およびアミノ酸配列のいずれも報告されていない。しかし、報告されたヒトβ２インテグリンとの配列比較により、単離ラットクローンおよびその推定アミノ酸配列はαｄヌクレオチドおよびアミノ酸配列に最も密接に関連していることが示唆される。
【０２５５】
核酸レベルでは、単離ラットｃＤＮＡクローンは、ヒトαｄｃＤＮＡと比較して８０％同一であり、ヒトＣＤ１１ｂと比較して６８％同一であり、ヒトＣＤ１１ｃと比較して７０％同一であり、マウスＣＤ１１ｂと比較して６５％同一である。ヒトＣＤ１１ａおよびマウスＣＤ１１ａと比較して有意な同一性は認められない。
【０２５６】
アミノ酸レベルでは、単離したｃＤＮＡによってコードされる推定ラットポリペプチドは、ヒトαｄポリペプチドと比較して７０％同一であり、ヒトＣＤ１１ａと比較して２８％同一であり、ヒトＣＤ１１ｂと比較して５８％同一であり、ヒトＣＤ１１ｃと比較して６１％同一であり、マウスＣＤ１１ａと比較して２８％同一であり、マウスＣＤ１１ｂと比較して５５％同一である。
【０２５７】
【実施例２１】
αｄ発現についてのラット組織のノーザン分析
ラットαｄプローブを使用したノーザン分析を行うために、ルイスラット組織のパネルからＲＮＡを得た。サンプルは、脾臓、脳、脊髄、胸腺、皮膚、小腸、ラット抗原活性化Ｔ細胞、および罹患ＥＡＥ（実験用アレルギー性脳脊髄炎）脾臓、およびリンパ節由来のポリ（Ａ＋）ＲＮＡに加えて、正常な脾臓、腎臓、肝臓、肺、および骨髄由来の全ＲＮＡを含んでいた。実施例６に記載の技術を使用して、実験を行った。
【０２５８】
αｄプローブを、ラットＣＤ１１ｃおよびラットＣＤ１１ｂと最も相同性の低い領域を示す配列番号５４のヌクレオチド１１８４〜３００８を含むラットｃＤＮＡ領域から選択した。１０μｇのラットαｄｃＤＮＡクローン６８４．３のＥｃｏＲＩでの制限酵素消化によって、１１２４ｂｐのプローブを作製した。フラグメントをゲル精製し、実施例６に記載のランダムプライミング標識反応で使用した。５．５×１０５ｃｐｍ／ｍｌのプローブをハイブリッド形成緩衝液に添加すること以外は実施例６に記載のようにノーザンブロットを予備ハイブリッド形成し、ハイブリッド形成し、洗浄した。
【０２５９】
５日間のオートラジオグラフィー後、全脾臓ＲＮＡおよび正常なラット由来のポリ（Ａ＋）ＲＮＡ、ＲＮＡの量は正常な脾臓よりも有意に多い活性ＥＡＥを含むラット由来の脾臓を含むレーンでバンドが検出された。転写物のサイズは、全長ラットｃＤＮＡクローンのサイズと一致した。
【０２６０】
【実施例２２】
ラットαＩドメイン／Ｈｕ  ＩｇＧ４融合タンパク質に対するげっ歯類αｄ特異的抗体−抗体の産生および特徴付け
ヒトβ２インテグリンのＩドメインがリガンド結合に関連すると証明されているという事実を考慮して、これはラットαｄタンパク質にも当てはまると予想される。したがって、ラットαｄＩドメインに免疫特異的なモノクローナル抗体は、αｄ結合が関与するヒト病態のラットモデルで有用であり得る。
【０２６１】
オリゴ「ラットα−ＤＩ５」（配列番号８７）および「ラットα−ＤＩ３」（配列番号８８）を、それぞれ配列番号５４の塩基対４６９〜４９３および塩基対１１０１〜１１２５（逆方向）に対応するラットαｄ配列から作製した。標準的なＰＣＲ反応でオリゴを使用して、配列番号５４の塩基対４５９〜１１２５にわたるＩドメインを含むラットαｄＤＮＡフラグメントを作製した。ＰＣＲ産物を、製造者が推奨するプロトコールにしたがってベクターｐＣＲＴＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートした。陽性コロニーを選択し、製造者が推奨するプロトコールにしたがって、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｔｈ、ＧＡ）のＭｉｄｉ  Ｐｒｅｐキットを使用してＤＮＡ精製用に拡大した。ＤＮＡを、標準的な制限酵素消化物中のＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、６００塩基対のバンドをゲル精製し、その後ｐＤＣＳ１／Ｈｕ ＩｇＧ４発現ベクターにライゲートした。陽性クローンを選択し、拡大し、Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ  ＰｒｅｐキットでＤＮＡを精製した。
【０２６２】
１００ｍｍ培養皿上に半コンフルエントでＣＯＳ細胞をプレートし、７％ＣＯ２中、３７℃で一晩成長させた。細胞を５ｍｌＤＭＥＭで１回リンスした。上記のように、５ｍｌのＤＭＥＭに、５０μｌ  ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、２μｌクロロキノン、および１５μｇのラットαｄＩドメイン／ＨｕＩｇＧ４  ＤＮＡを添加した。ＣＯＳ細胞に混合物を添加し、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、５ｍｌの１０％ＤＭＳＯのＣＭＦ−ＰＢＳ溶液を正確に１分間添加した。細胞を、ＤＭＥＭで１回穏やかにリンスした。１０％ＦＢＳを含む１０ｍｌのＤＭＥＭを細胞に添加し、７％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベーションを継続した。翌日、培地を新鮮な培地と交換し、さらに３日間インキュベーションを継続した。培地を回収し、プレートに新鮮な培地を添加した。３日後、再び培地を回収し、プレートを破棄した。２リットルの培養上清を回収できるまでこの手順を繰り返した。
【０２６３】
上記のように回収した上清を、ＰｒｏｓｅｐＡ（登録商標）カラム（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）にロードし、下記のようにタンパク質精製した。
【０２６４】
最初にカラムを３５ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含む１５カラム体積の洗浄緩衝液で洗浄した。１時間あたり約６０カラム体積未満の低速で上清をロードした。ローディング後、カラムを１５カラム体積の洗浄緩衝液、１５カラム体積の０．５５Ｍジエタノールアミン（ｐＨ８．５）、および１５カラム体積の５０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．０）で洗浄した。５０ｍＭクエン酸（ｐＨ３．０）でタンパク質を溶出した。タンパク質を、１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和し、滅菌ＰＢＳ中で透析した。
【０２６５】
ラットαｄＩドメインタンパク質を、実施例１４に記載のように分析した。検出されたタンパク質は、ヒトＩドメインタンパク質と同一の様式で移動した。
【０２６６】
ラットαｄＩドメイン／ＨｕＩｇＧ４融合タンパク質に対するモノクローナル抗体の産生
マウスを、同体積のフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（Ｓｉｇｍａ）中で予め乳化した５０μｇの精製ラットαｄＩドメイン／ＨｕＩｇＧ４融合タンパク質で個別に免疫化した。約２００μｌの抗原／アジュバント調製物を、各マウスの背中および側腹の４つの部位に注射し、２週間後、マウスに、同体積のフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中で予め乳化した１００μｌのラットαｄＩドメイン／ＨｕＩｇＧ４抗原（５０μｇ／マウス）で追加免疫した。さらに２週間後、マウスを５０μｇ抗原の２００μｌＰＢＳ溶液での静脈内注射で追加免疫した。
【０２６７】
免疫化マウスの血清力価を評価するために、第３の免疫化から１０日後の動物に球後出血を行った。血液を凝固させ、遠心分離によって血清を単離した。ビオチン化（ＢＩＰ）ラット脾細胞に対する免疫沈降において血清を使用した。各マウス由来の血清は、ラットαｄおよびラットＣＤ１８の推定分子量のタンパク質バンドを免疫沈降させた。融合用に１匹のマウスを選択し、上記の第３の追加免疫のように４回追加免疫した。
【０２６８】
ハイブリドーマ上清を、下記の抗体捕捉によってスクリーニングした。Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を、４℃で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で５０００倍に希釈した５０μｌ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）でコートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含むＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌの培養上清を添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、上記のように洗浄し、ＰＢＳＴで３５００倍に希釈した５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ９（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を添加した。上記のようにプレートをインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。その直後に、１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）および０．１μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２の１００ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ４．５）を含む１００μｌの基質を添加した。染色反応を、５０μｌの１５％Ｈ２ＳＯ４の添加によって５分後停止させた。４９０ｎｍでの吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈプレートリーダーで読み取った。
【０２６９】
抗体含有ウェル由来の上清も、固定化ラットαｄＩドメイン／ＨｕＩｇＧ４融合タンパク質を使用するＥＬＩＳＡによって分析した。ＨｕＩｇＧ４抗体コートプレートを使用したＥＬＩＳＡを、ＩｇＧ融合パートナーに対する反応性のコントロールとして使用した。下記の技術を使用したラット脾細胞溶解物についてのＢＩＰによるさらなるスクリーニングのために陽性ウェルを選択した。
【０２７０】
ラットαｄＩドメイン／ＨｕＩｇＧ４融合タンパク質に対するポリクローナル血清の産生
１００μｇの精製ラットαｄＩドメイン／ＨｕＩｇＧ４融合タンパク質溶液での免疫化の前に、２匹のウサギから採血した。３週間毎フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を、繰り返し注射した。３回の注射後、ウサギを試験採血し、ラット脾細胞溶解物に対する標準的な免疫沈降で回収された血清を使用した。両ウサギ由来の血清はラットαｄに免疫反応性を示すと同定された。ウサギを１００μｇの抗原のＩＦＡ溶液で追加免疫し、回収した血清を、免疫沈降によってラットαｄとの免疫反応性の増加についてアッセイした。動物を最終追加免疫し、１０日後に採血し、血清を回収した。
【０２７１】
ラットαｄ組織学
ラットαｄ「Ｉ」ドメインに対して作製されたウサギポリクローナル血清を、実施例１８に記載の技術によるラット組織切片の免疫組織化学的染色に使用した。凍結およびパラフィン包埋ラット脾臓切片で検出された染色パターンは、赤脾髄のいたるところの各細胞が染色されるヒトαｄに対する抗体を使用して認められたパターンと本質的に同一であった。染色パターンは、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１８に対するモノクローナル抗体を使用して認められたパターンと異なっていた。さらに、胸線中の皮質のいたるところの各細胞で陽性染色パターンが認められた。ウサギ前免疫血清で染色した場合、これらの組織はいかなるシグナルも発しなかった。
【０２７２】
抗体特異性の分析
ＣＯ２での窒息によってマウスを屠殺し、標準的な手術技術を使用して脾臓を取り出した。３ｃｃのシリンジプランジャーを有するワイヤーメッシュによって２０ｍｌのＲＰＭＩ中で脾臓をやさしく押すことによって脾細胞を回収した。細胞を、５０ｍｌのコニカルチューブに回収し、適切な緩衝液で洗浄した。
【０２７３】
細胞を、冷Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄し、１０８〜１０９細胞の密度で４０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。４ｍｇのＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を細胞懸濁液に添加し、室温で正確に１５分間反応を計測した。細胞をペレット化し、冷Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄した。
【０２７４】
細胞を、１０８細胞／ｍｌの濃度で冷溶解緩衝液（１％ＮＰ４０；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；２ｍＭ  ＣａＣｌ；２ｍＭ  ＭｇＣｌ；ペプスタチン、ロイペプチン、およびアプロチニンの１００倍希釈溶液（細胞への添加直前添加）；０．０００１ｇＰＭＳＦ結晶（細胞への添加直前添加））に再懸濁した。溶解物を約３０秒間ボルテックスし、室温で５分間インキュベートし、氷上で１５分間さらにインキュベートした。溶解物を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離して不溶性物質をペレット化した。上清を新規のチューブに回収し、４℃〜−２０℃で保存した。
【０２７５】
１ｍｌの細胞溶解物を、２００μｌのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）スラリー（Ｚｙｍｅｄ）を使用した４℃で一晩のインキュベーションによって予備明澄化した。予備明澄化溶解物を、試験すべき各抗体について５０μｌ／チューブでエッペンドルフチューブに等分した。２５μｌのポリクローナル血清または１００〜５００μｌのモノクローナル抗体上清を、予備明澄化溶解物に添加し、得られた混合物を、震盪しながら４℃で２時間インキュベートした。次いで、１００μｌのウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）結合プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズを含むＰＢＳスラリーを添加し、震盪しながら室温で３０分間インキュベートした。穏やかな遠心分離によってビーズをペレット化し、冷洗浄緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；０．２Ｍ  ＮａＣｌ；１％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００）で３回洗浄した。吸引によって上清を取り出し、１０％β−メルカプトエタノールを含む２０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液を添加した。サンプルを水浴中で２分間ボイルし、サンプルを５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。分離後、タンパク質を、定電流で一晩ニトロセルロースに移した。ニトロセルロースフィルターを、３％ＢＳＡのＴＢＳ−Ｔにて室温で１時間ブロックし、ブロッキング緩衝液を除去した。６０００倍希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰ結合物（Ｊａｃｋｓｏｎ）の０．１％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔを添加し、室温で３０分間インキュベーションを継続した。フィルターをそれぞれＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、製造者が推奨するプロトコールにしたがってＡｍｅｒｓｈａｍのＥＣＬキットを使用してオートラジオグラフィーを行った。
【０２７６】
全長ラットαｄタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生
ラットαｄをラット脾細胞から精製して、抗ラットαｄモノクローナル抗体作製用の免疫原を調製した。１２〜２０週齢の約５０匹の正常な雌ルイスラット由来の脾臓を回収し、細かいワイヤースクリーンで押し付けることによって単一細胞懸濁液を作製した。１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含む緩衝液での溶解によって赤血球を除去し、残存した白血球をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。脾細胞を遠心分離によってペレット化し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプスタチン、および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）を含む緩衝液に溶解した。５×１０８脾細胞あたり１ｍｌの溶解緩衝液を使用して、氷上で３０分間脾細胞溶解を行った。不溶性物質を、遠心分離によって除去した。
【０２７７】
ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃを、以下のように免疫沈降によって脾臓溶解物から取り出した。７５０μｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）スラリーを、
２ｍｇのウサギ抗マウス免疫グロブリンと共に４℃で３０分間インキュベートした。ウサギ抗マウス−プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を、溶解緩衝液で３回洗浄し、最終体積１．５ｍｌの溶解緩衝液に懸濁した。約２００μｇの各ラットβ２インテグリン特異的モノクローナル抗体５１５Ｆ（ラットＣＤ１１ａに特異的）、ＯＸ−４２（ラットＣＤ１１ｂに特異的）、および１００ｇ（ラットＣＤ１１ｃに特異的）を、それぞれ５０ｍｌのラット脾臓溶解物に添加した。４℃で３０分間のインキュベーション後、５００μｌのウサギ抗マウスプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を脾臓溶解物に添加し、回転させながら４℃で３０分間混合した。溶解物を、２５００×ｇで１０分間遠心分離して、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃ結合ウサギ抗マウス−プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）をペレット化し、上清を清潔な５０ｍｌ遠心チューブに移した。抗体５１５Ｆ、ＯＸ−４２、および１００ｇでの免疫沈降さらに２回繰り返して、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃの完全な除去を確実にした。
【０２７８】
溶解物中に残存するβ２インテグリンを、親和性精製を使用して単離した。約２５０μｌの抗ラットＣＤ１８モノクローナル抗体２０Ｃ５Ｂ結合ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のスラリーを溶解物に添加し、回転させながら４℃で３０分間混合した。抗体／抗原複合体を、２５００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化し、ペレットを溶解緩衝液で３回洗浄し、４℃で保存した。
【０２７９】
アルメニアハムスターの免疫化
１．６〜８週齢のアルメニアハムスターを、フロント完全アジュバント中に乳化したヒトＩｇＧ４重鎖に融合したラットαｄのＩドメインからなる約５０μｇの組換えタンパク質で最初に免疫化した。一次免疫化後、フロイント不完全アジュバント中に乳化したラットαｄＩドメイン／ＨｕＩｇＧ４で１４、３３、および９５日目に免疫化した。１９７および１９９と呼ばれる２つの異なる融合物を、その後に使用した。
【０２８０】
１９７の融合４日前（３０６日目）に、１匹のハムスターに、脾細胞およびラットαｄでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から精製したラットαｄタンパク質の組み合わせを投与した。融合の３日前（３０７日目）に、精製らとαｄタンパク質およびαｄトランスフェクトＣＨＯ細胞で融合追加免疫を行った。ラットαｄトランスフェクトＣＨＯ細胞を、下記のように調製した。
【０２８１】
全長ラットαｄタンパク質をコードする遺伝子セグメントを、ｐＤＣ１ベクターに挿入し、エレクトロポレーションによってヒトＣＤ１８−ｐＲＣ構築物と共にＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、ヒポキサンチンの存在下で成長させて、ｐＲＣ構築物で首尾よくトランスフェクトした細胞を選択し、ｇ４１８の存在下で成長させてｐＤＣ１構築物でトランスフェクトした細胞を選択した。３週間後、細胞をラットαｄ特異的ウサギポリクローナル血清で染色し、ＦＡＣＳによって分類した。最も高レベルの表面αｄを発現した少量の細胞（全集団の約３％）を回収し、さらに拡大した。ＦＡＣＳ選択を数回繰り返して高レベルのαｄ表面発現が得られる細胞集団を得た。
【０２８２】
αｄトランスフェクト細胞も、ラットαｄ特異的ポリクローナル血清およびヒトＣＤ１８特異的モノクローナル抗体ＴＳ１．１８．１を使用したフローサイトメトリーによって特徴付けた。結果により、トランスフェクトＣＨＯ細胞は高レベルのラットαｄおよびヒトＣＤ１８を発現すことが確認された。
【０２８３】
最後に、細胞中のαｄおよびＣＤ１８発現を、免疫沈降によって評価した。ラットαｄ特異的ウサギポリクローナル血清は、以下の２つの異なる分子量のタンパク質を免疫沈澱させることが見出された：高分子量タンパク質（約１７０ｋＤ）および低分子量タンパク質（９５ｋＤ）。これらの所見は、トランスフェクトＣＨＯ細胞の表面上のラットαｄ／ヒトＣＤ１８ヘテロ二量体複合体の発現と一致した。
【０２８４】
融合日に、脾臓を取り出し、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足した無血清ＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｎａｄａ）に浸漬した２つの顕微鏡用ガラススライドのつや消しした端での組織の磨砕によって単一細胞懸濁液を形成した。細胞懸濁液を７０メッシュの滅菌Ｎｉｔｅｘ細胞濾過器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）で濾過し、２００×ｇで５分間の遠心分離によって２回洗浄し、２０ｍｌの無血清ＲＰＭＩに再懸濁した。３つのナイーブＢａｌｂ／ｃマウスから採取した胸腺細胞を、類似の様式で調製した。融合３日前に１０％Ｆｅｔａｃｌｏｎｅ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔｈａ）を含むＲＰＭ１中で対数期に保持したＮＳ−１骨髄腫細胞を、２００×ｇで５分間遠心分離し、ペレットを上記のように２回洗浄した。
【０２８５】
約１．１５×１０８個の脾細胞を、５．８×１０７個のＮＳ−１細胞と組み合わせ、遠心分離し、上清を吸引によって除去した。細胞ペレットをチューブのタッピングによって離し、７ｍｌの３７℃のＰＥＧ１５００（５０％の７５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ溶液（ｐＨ８．０））（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、撹拌しながら１分かけて添加し、その後１４ｍｌの無血清ＲＰＭＩを７分間にわたり添加した。さらに８ｍｌのＲＰＭＩを添加し、細胞を２００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを１５％ＦＢＳ、１００ｍＭヒポキサンチンナトリウム、０．４ｍＭアミノプテリン、１６ｍＭチミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５単位／ｍｌのＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、および１．５×１０６胸腺細胞／ｍｌを含む２００ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁した。上清を、９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に２００μｌ／ウェルで分注し、融合から４、５、６、および７日目に１８Ｇニードル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での各ウェルからの約１００μｌの吸引および胸腺細胞を欠く以外は上記の１００μｌのプレーティング培地の添加によって細胞に添加した。
【０２８６】
１０日目に、融合ウェル由来の上清を、ラットαｄ／ヒトＣＤ１８トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する反応性についてフローサイトメトリーによってスクリーニングした。約５×１０５個のラットαｄトランスフェクトＣＨＯ細胞を、２．０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０μｌＲＰＭＩに懸濁し、９６ウェルの丸底プレート中の約１００μｌのハイブリドーマ培養上清に添加した。染色用の陽性コントロールは、ウサギ抗αｄポリクローナル血清およびＴＳ１／１８（抗ヒトＣＤ１８）を含んでいた。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＲＰＭＩ、２．０％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）で３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で２００倍に最終希釈したＦＩＴＣ結合ヤギ抗ハムスター抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２００ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルを、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ分析器で分析した。陽性クローンウェルがラットαｄに特異的であることを確認するために、非トランスフェクトＣＨＯ細胞でスクリーニングを繰り返した。ラットαｄＣＨＯトランスフェクタントとの反応基準を満たすが、非トランスフェクトＣＨＯ細胞とは満たさないウェルをクローン化した。
【０２８７】
一次スクリーニング後、陽性ウェル由来の細胞を、最初に二重希釈その後のＲＰＭＩ、１５％ＦＢＳ  １００ｍＭヒポキサンチンナトリウム、１６ｍＭチミジン、および１０単位／ｍｌ  ＩＬ−６での限界希釈によってクローニングした。限界希釈工程では、成長を示すウェルの割合を同定し、Ｐｏｓｓｏｎ分布分析を使用してクローナリティを予想した。成長を示すウェルを、１０〜１２日後にＦＡＣＳによって分析した。最後のクローニング後、陽性ウェルをＲＰＭＩおよび１１％ＦＢＳに拡大した。１培養物を得たクローニングは、これらの基準により陽性と考えられ、１９７Ａ−１、１９７Ａ−２、１９７Ａ−３、および１９７Ａ−４と呼ばれるこれら由来の４つの異なるサブクローンを拡大した。
【０２８８】
融合１９９の前に、３０７日目に第２のハムスターを、２．３×１０６個のラットαｄ（ＲＡＤ）トランスフェクトＣＨＯ細胞を追加免疫した。融合の４日前（３３４日目）に２回の最終免疫化を行い、融合の３日前（３３５日目）に再び行った。２×１０６ラットαｄトランスフェクトＣＨＯ細胞およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（前に記載）に結合した２００μｌの精製ラットαｄからなる３３４日目の追加免疫を、腹腔内注射で行った。５×１０６ラットαｄトランスフェクトＣＨＯ細胞からなる３３５日目の追加免疫もまた、腹腔内注射によって投与した。融合１９９のための融合およびスクリーニングプロトコールは融合１９７と同一であり、ラットαｄに上清反応性を有する１９９Ａ、１９９Ｈ、および１９９Ｍと呼ばれる３つのハイブリドーマを同定およびクローン化した。
【０２８９】
２．融合１９７および１９９へつながる同一のプロトコールを使用して、第２の免疫化を行った。追加免疫から３３４日後、３９４および３９５日目までさらに免疫化しなかった。融合前に、ハムスターに３００μｌの精製ラットαｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）の腹腔内投与と共に、２×１０６ＲＡＤトランスフェクトＣＨＯ細胞を投与した。その後の融合２０５用の融合およびスクリーニングプロトコールは、クローニング中にアルメニアハムスターＥＬＩＳＡ試薬（例えば、ヤギ抗アルメニアハムスター抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ））を最初のスクリーニングとして使用する以外は融合１９９および１９７と同一であった。この方法で同定された陽性ウェルを、記載のようにＦＡＣＳによってスクリーニングした。融合２０５により、２０５Ａ、２０５Ｃ、および２０５Ｅと呼ばれる３つの異なる陽性クローンが得られた。
【０２９０】
３．抗ラットαｄモノクローナル抗体の別の作製方法では、６〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１日目に精製ラットαｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を含むフロイント完全アジュバントの皮下投与で免疫化した。同一の免疫原を含むフロイント不完全アジュバントの２５日目の同一経路の投与により第２の追加免疫を行った。４２日目に第２の追加免疫への第３の追加免疫を行った。４００μｌ（融合２２６用）および２５０μｌ（融合２３６用）の精製ラットαｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）からなる融合前追加免疫を腹腔内注射するまでさらなる追加免疫を行わなかった。クーマシー染色で同定したところ、各体積は、約１０〜１５μｇの抗原を含んでいた。６２日目および６３日目に融合２２６用の融合前追加免疫を行い、６６日目に融合した。融合２３６のために、１３２日目および１３３日目に融合前追加免疫を行い、１３６日目に融合した。融合プロトコールは、アルメニアハムスター融合の１：２と比較して脾細胞：ＮＳ−１細胞＝５：１で使用した点で上記のアルメニアハムスター融合と異なっていた。融合プロトコールは、他の全ての点ではアルメニアハムスタープロトコールと同一であった。
【０２９１】
融合２２６および２３６のスクリーニングおよびクローニングプロトコールは、ＥＬＩＳＡによって最初のスクリーニングを行う以外は融合１９７、１９９、および２０５で使用したものと同一であった。ＥＬＩＳＡでは、ヤギ抗マウス全細胞を使用して、ハイブリドーマ上清からマウス抗体を捕捉し、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物を使用して、マウス抗体を検出した。陽性上清を、融合１９７〜２０５に記載のようにＦＡＣＳによってスクリーニングした。
【０２９２】
融合２２６により、２２６Ａ、２２６Ｂ、２２６Ｃ、２２６Ｄ、２２６Ｅ、２２６Ｆ、２２６Ｇ、２２６Ｈ、および２２６Ｉと呼ばれる９個の陽性クローンが得られた。融合２３６により、２３６Ａ、２３６Ｂ、２３６Ｃ、２３６Ｆ、２３６Ｇ、２３６Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｋ、２３６Ｌ、および２３６Ｍと呼ばれる１０個の陽性クローンが得られた。これらのクローンから作製されたモノクローナル抗体を、実施例１５に記載のようにＥＬＩＳＡによってイソ型分類した。全抗体は、ＩｇＧ１イソ型であると見出された。
【０２９３】
ラットαｄに対するモノクローナル抗体の特徴付け
抗ラットαｄ抗体を特徴付けるために、ビオチン標識脾臓溶解物を、実施例２２のＤ節に記載のように調製した。免疫沈降に使用する前に、溶解物を予備明澄化した。最初に、５０μｇ／ｍｌの正常なマウス免疫グロブリンを溶解物に添加し、得られた溶液を４℃で３０分間回転させながら混合した。ウサギ抗マウス免疫グロブリンをコートした７５μｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のスラリーを添加し、３０分間回転させながら混合を継続した。ウサギ抗マウスコートプロテインＡビーズを、卓上型遠心分離機での４℃で５分間の１５，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレット化し、上清を回収した。ペレット化物質を捨てた。
【０２９４】
各クローン化ハイブリドーマのために、約３００μｌの上清をエッペンドルフ微量遠心チューブに入れ、これに３０μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）、３０μｌのペプスタチン、ロイペプチン、およびアプロチニン、１００μｇのＰＭＳＦ結晶、および５０μｌの予備明澄化ビオチン化ラット脾臓溶解物の１００×ストック溶液を添加した。サンプルを穏やかにボルテックスし、回転ローターに４℃で３０分間置いた。コントロールサンプルを、５０μｌのラット脾臓溶解物への１０ｍｇ／ｍｌのウサギ抗ラットαｄ特異的ポリクローナル抗体の添加によって調製した。
【０２９５】
３０分間のインキュベーション後、７５μｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズを含むＰＢＳスラリーを各サンプルに添加し、回転ローターを用いて４℃で３０分間インキュベートした。プロテインＡ結合ビーズを、卓上型遠心分離機での４℃で５分間の１５，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレット化し、上清を回収した。ペレット化ビーズを以下の一連の１ｍｌ界面活性剤洗浄剤で連続的に洗浄した：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）（ｐＨ８．０）を含む緩衝液番号１；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）（ｐＨ８．０）を含む緩衝液番号２；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）、０．１％デオキシコレート（ｐＨ８．０）を含む緩衝液番号３；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＬｉＣｌ２（ｐＨ８．０）を含む緩衝液番号４。洗浄緩衝液番号１を使用して最終洗浄を行った。各洗浄の間にビーズを穏やかにボルテックスし、卓上型遠心分離機を使用してペレット化した。上清を、移動ピペットで除去し、最後の洗浄後、全ての残存緩衝液を、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジによってビーズから除去した。ブロモフェノールブルーおよびピロニンＹ色素、β−メルカプトエタノールを最終濃度１０％で含む５０μｌアリコートのＳＤＳサンプル緩衝液を、各ペレットに添加した。混合物を１〜２分間激しくボルテックスし、室温で５〜１０分間インキュベートした。サンプルを、卓上型遠心分離機にて４℃で５分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離し、放出したタンパク質を回収し、新規の遠心チューブに移した。各サンプル由来のアリコートを水浴中で４分間ボイルし、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ＰＡＧＥによる分離後、タンパク質を２００ｍＡで１時間ニトロセルロースフィルターに移し、フィルターを３．０％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液にて４℃で一晩ブロックした。６０００倍希釈のストレプトアビジン−ＯＰＤを含む０．１％ＢＳＡ−ＴＢＳ−Ｔ溶液を各フィルターに添加し、室温で１時間インキュベーションを継続した。フィルターをＴＢＳ−Ｔで各１０分間を５回洗浄し、製造者が推奨するプロトコールにしたがってＡｍｅｒｓｈａｍのＥＣＬキットを使用して発色させた。
【０２９６】
クローン１９９Ｍは、ヘテロ二量体タンパク質を免疫沈降させることが見出された。巨大タンパク質サブユニットの分子量は約１７０〜１７５ｋＤであり、これはウサギ抗αｄポリクローナル抗体によって免疫沈降されたタンパク質のサイズと一致する。分子量約９５ｋＤの第２のタンパク質もまた沈降され、これはＣＤ１８の分子量と一致する。
【０２９７】
【実施例２３】
モノクローナル抗体１９９Ｍの特異性
１９９Ｍモノクローナル抗体が結合したＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）親和性カラムを使用して、脾臓細胞溶解物からラットαｄを親和性精製した。簡単に述べれば、約１．３×１０１０ラット脾臓細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）（ｐＨ８．０）からなる緩衝液に溶解した。緩衝液中の細胞を、氷上で３０分間インキュベートし、４℃で約１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。
【０２９８】
抗体１９９Ｍを、以下の方法によるＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供した。１ｇの活性化樹脂を、１ｍＭ  ＨＣｌに１５分間懸濁し、１５ｍｌの１ｍＭ  ＨＣｌで３回および０．１ｍＭ  ＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む１５ｍｌのカップリング緩衝液（ｐＨ８．０）で１回洗浄した。抗体１９９Ｍを含むカップリング緩衝液を、約１０〜２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で樹脂懸濁液に添加し、混合物を４℃で一晩インキュベートした。翌日、結合樹脂を遠心分離でペレット化し、上清を除去した。樹脂上の非反応基を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）での室温で１時間のインキュベーションによってブロックした。結合樹脂を、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）で洗浄し、０．１％アジ化ナトリウムを含む１：２スラリーとして溶解緩衝液中に保存した。
【０２９９】
親和性精製のために、脾臓細胞を、０．４ｍｌの１９９Ｍ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂と共に一晩の回転混合でインキュベートした。次いで、樹脂を遠心分離によってペレット化し、１５ｍｌの溶解緩衝液で４回洗浄した。約１００μｌの各ゲルのアリコートを、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２．０％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０００２％ブロモフェノールブルー、１０％β−メルカプトエタノールを含む還元サンプル緩衝液（最終濃度５％）中で短時間ボイルし、６．０％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にロードしてタンパク質を分離した。
【０３００】
親和性精製物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した場合、２つの主要なタンパク質種および１つの小さなタンパク質種を含むことが見出された。分子量９０ｋＤの主要なタンパク質バンドは、既知のサイズのＣＤ１８と一致し、このバンドを配列決定した。１６０ｋＤの第２の主要なバンドが検出され、これはαｄの推定分子量と一致した。さらに、見かけの分子量が２００ｋＤの小さなバンドも検出された。１６０ｋＤおよび２００ｋＤの種を、アミノ末端タンパク質配列決定によってさらに分析し、結果をラットαｄｃＤＮＡによって推定されるアミノ酸配列ならびにＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂの既知のアミノ酸配列と比較した。１６０ｋＤおよび２００ｋＤバンドの配列は、クローン化ラットαｄによって推定されるアミノ酸配列と一致し、これにより、おそらくスプライス変異体またはグリコシル化の相違に起因するαｄの２つの形態が存在し得ることが示唆される。
【０３０１】
【実施例２４】
ラットαｄ発現マクロファージを使用したＴ細胞増殖アッセイ
ラット脾臓から単離されたαｄを発現するマクロファージを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用して、ＬＲ−２１と呼ばれるミエリン塩基性タンパク質特異的Ｔ細胞株を刺激した。簡単にのべれば、ラットに１００μｌの鉄粒子（ＢｉｏＭａｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を静脈内注射した。翌日、脾臓から単一細胞懸濁液を調製し、鉄粒子を貪食したαｄ＋マクロファージを磁石を使用して回収した。フローサイトメトリーおよび免疫沈澱は、貪食した５０〜８０％の細胞がαｄ＋であることを示した。
【０３０２】
結果は、αｄを発現する脾臓マクロファージは、胸腺マクロファージなどの他のＡＰＣと比較して不十分なＡＰＣであることを示した。２０５Ｃと呼ばれるモノクローナル抗体もαｄ陽性マクロファージおよびＬＲ−２１細胞株を使用した増殖アッセイで試験した。次いで、以下のように増殖アッセイを行った。
【０３０３】
αｄ発現に陽性の脾臓マクロファージを、５％正常ラット血清を含むＲＰＭＩ中に６×１０６細胞／ｍｌの密度で懸濁し、１００μｌのマクロファージ懸濁液を各ウェルに添加した。ＬＲ−２１株由来の細胞を、５％正常ラット血清を含むＲＰＭＩ中に１×１０６細胞／ｍｌの密度で懸濁し、５０μｌの懸濁液を各ウェルに添加した。モノクローナル抗体２０５Ｃを、５０μｌの体積で最終濃度５０、１０、および２μｇ／ｍｌで各ウェルに添加した。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、１μＣｉの３Ｈ−チミジンをインキュベーションの最後の２４時間に添加した。細胞をガラスフィルターマットで回収し、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｍａｔｒｉｘ  ９６）を使用して３Ｈ組み込みを同定した。
【０３０４】
実験結果は、高濃度の抗体２０５Ｃ（１０および５０μｇ／ｍｌ）が用量依存様式でＴ細胞増殖を減少させることができることを示す。
【０３０５】
【実施例２５】
ラット骨髄由来のαｄの免疫沈降
ＰＢＳでの大腿骨のフラッシュによって、ルイスラットから骨髄細胞を採取した。２０μｇの精製モノクローナル抗体を使用して、本質的に実施例１８に記載のように、細胞を洗浄し、ビオチン化し、免疫沈降させて、１００μｌの予備明澄化細胞溶解物からタンパク質を免疫沈澱させた。前に記載の様式で、免疫沈降タンパク質の検出を行った。
【０３０６】
ラットαｄモノクローナル抗体２０５Ｃは、１６０ｋＤおよび９５ｋＤに移動した２つのバンドを免疫沈降させた。このサイズのバンドは、同一の抗体を使用した脾臓細胞溶解物由来のタンパク質の免疫沈降で認められたαｄ／ＣＤ１８中のαおよびβ鎖のサイズと一致した。ラットＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、またはＣＤ１１ｃに対する抗体は、αｄと異なるα鎖を免疫沈降させ、全ての抗体は、ＣＤ１８で知られている分子量と一致する分子量を有するタンパク質を同時免疫沈降させた。
【０３０７】
【実施例２６】
動物モデルでのαｄの発現
予備的結果は、ラットαｄは胸腺の皮質マクロファージ、肝臓のクップファー細胞、中枢神経系の脈間周囲細胞、腹膜マクロファージのサブセット、および常在骨髄マクロファージを含むマクロファージの亜集団によって選択的に発現することを示した。さらに、チオグリコレートマクロファージのサブセットにより、デキサメタゾンでの刺激後のαｄ発現の上方制御が認められた。認められたラットαｄのマクロファージ制限発現により、種々の動物モデルの発現のさらなる分析が示唆される。
【０３０８】
フェニルヒドラジンモデルにおけるラットαｄの発現
動物へのフェニルヒドラジンの投与により、一過性虚血を引き起こす重症赤血球（ｒｂｃ）損傷を引き起こす。損傷ｒｂｃを、赤脾髄マクロファージによって循環からクリアランスし、それにより有意な巨脾腫を引き起こす。αｄを発現するマクロファージは、損傷ｒｂｃおよび循環由来の他の外来物質のクリアランスに関連し得ることが提案される。
【０３０９】
この仮説を試験するために、ラット群を、生理食塩水のみまたは生理食塩水に溶解したフェニルヒドラジンで処理し、１００ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量での腹腔内注射によって投与した。いくつかの実験では、ラットを、ラットαｄの「Ｉドメイン」に対して作製したポリクローナル抗体で処理した。
【０３１０】
フェニルヒドラジン投与後の種々の測定点で、動物を屠殺した。脾臓重量およびヘマトクリットを、ｒｂｃクリアランスのパラメーターとして使用した。さらに、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびαｄの免疫染色を含む組織病理学的評価のために、腎臓、脾臓、および肝臓を回収した。
【０３１１】
肉眼的所見は、フェニルヒドラジンでの処理（生理食塩水コントロールおよびαｄ処理）から４日後に、ラットが劇的な巨脾症を発症するが、ヘマトクリットレベルは減少することを示した。αｄポリクローナル血清での処理は、フェニルヒドラジンで誘導した脾臓重量およびヘマトクリットの減少に影響を与えなかった。
【０３１２】
生理食塩水および第４日目のフェニルヒドラジン処理ラット由来の組織を４μｍ厚に切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ（ＶＭＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）スライド上で室温で１５分間風乾した。使用前に、スライドを、５０℃で約５分間インキュベートした。切片を、冷（４℃）アセトン（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）にて室温で２分間固定し、室温で乾燥させた。切片を、１００ｍｌ  １×ＴＢＳ、１．１ｍｌ  ３０％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｌ  １０％  ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ）中に室温で１５分間静置して、外来ペルオキシダーゼ活性を除去した。各切片を、３０％正常ラット血清（Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の１×ＴＢＳ溶液を含む１５０μｌの溶液を使用して室温で３０分間ブロックし、その後溶液を切片から穏やかに吸い取った。各切片に、ブロッキング溶液で１３．３μｇ／ｍｌに希釈した７５μｌのビオチン化ハムスター抗ラットαｄ抗体２０５Ｃを室温で１時間投与した。インキュベーション後、切片を１×ＴＢＳで各洗浄あたり５分間の洗浄を３回行って、任意の非結合抗体を除去した。最後の洗浄後、過剰なＴＢＳを、組織周囲の吸引によって除去した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ビオチン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ブロッキング溶液で２００倍に希釈し、各切片に７５μｌを室温で３０分間適用した。インキュベーション後、スライドを１×ＴＢＳで各洗浄あたり５分間の洗浄を２回行った。ＡＥＣ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用し、水への浸漬によって発色を停止させた。スライドを、Ｇｉｌｌ’ｓヘマトキシリン番号２（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、水でリンスし、その後７０％、９５％、１００％エタノールおよびキシレンで連続的に脱水した。切片を、ｃｙｔｏｓｅａｌ（ＶＷＲ）でマウントした。
【０３１３】
生理食塩水処理ラット脾臓切片では、αｄ発現の大部分は、脾臓赤脾髄中の形態学的にマクロファージ、顆粒球、およびリンパ球亜集団と同定された細胞上に局在していた。しかし、フェニルヒドラジン処理ラット脾臓では、脾臓赤脾髄は、同定された細胞型のみが損傷赤血球を貪食した巨大マクロファージの集団であるような形態学的変化を受けていた。これらの巨大マクロファージの大部分は、αｄを発現することが認められた。また、フェニルヒドラジン処理ラットでは、αｄを発現する脾臓白脾髄中でマクロファージ数が増加するようである。
【０３１４】
αｄおよびＣＤ１１ｃ発現を同定するためのフェニルヒドラジン処理ラット脾臓に対する二重標識実験も行った。前に記載するように、脾臓赤脾髄中の損傷赤血球を貪食したと考えられる巨大マクロファージおいてαｄ発現が検出された。脾臓赤脾髄中の巨大マクロファージにおいてＣＤ１１ｃ発現もまた検出され、これにより赤脾髄中にαｄ陽性細胞よりもＣＤ１１ｃ陽性細胞が多いと考えられる。ＣＤ１１ｃを発現しないαｄ陽性マクロファージの小さなサブセットが認められているにもかかわらず、αｄを発現するマクロファージの大部分もＣＤ１１ｃを発現した。αｄを発現しないＣＤ１１ｃ陽性マクロファージ集団も存在した。
【０３１５】
したがって、免疫組織学的分析は、４日目に生理食塩水コントロールと比較してフェニルヒドラジン処理動物の脾臓ではＣＤ１１ｃ発現を上方制御するようであることを示す。しかし、他のインテグリンＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびαｄの発現は、フェニルヒドラジン処理に影響を受けないようである。ポリクローナル「Ｉ」ドメインαｄ抗体での処理は赤脾髄マクロファージによるｒｂｃ取り込みに影響を与えなかったが、ｒｂｃを貪食したマクロファージの大部分はαｄ陽性である。損傷ｒｂｃを貪食したαｄ陽性マクロファージは、フェニルヒドラジン投与から７日目に回収された脾臓中に存在しなかった。
【０３１６】
次いで、４日目にアポトーシスアッセイおよびビオチン結合抗体２５０Ｃを使用したＩＣＣを使用して、フェニルヒドラジン処理ラット脾臓に対して二重標識実験を行った。正常なラットおよび４日目のフェニルヒドラジン処理ラット由来の組織を、４ミクロン厚に切断し、室温で１５分間Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｃｔｉｆｉｃ）上で風乾し、スライドを５０℃に加温した。加温スライドを１００ｍｌ  １×ＴＢＳ、１．１ｍｌ  ３０％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｌ  １０％  ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ）を含む緩衝液に室温で１５分間入れて、外因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。各切片を、２０％正常ラット血清（Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の１×ＴＢＳ溶液を含む１５０μｌの溶液を使用して３７℃で１０分間ブロックし、その後溶液を切片から穏やかに吸い取った。各切片を、ブロッキング溶液で希釈した２６．６μｇ／ｍｌのタンパク質濃度の７５μｌのビオチン化ハムスター抗ラットαｄ抗体２０５Ｃと３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、切片を１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を３回行って、非結合抗体を除去した。過剰なＴＢＳを、最後の洗浄後の組織周囲の吸引によって除去した。製造者の説明に従って調製したアルカリホスファターゼ結合アビジン／ビオチン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、各切片に３７℃で２０分間適用した。インキュベーション後、スライドを１×ＴＢＳで各洗浄あたり５分間の洗浄を２回行った。切片を、４℃の４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で５分間固定した。次いで、切片を１×ＰＢＳでリンスし、ＣＳＫ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭスクロース、１０ｍＭｐｉｐｅｓ（ｐＨ６．８）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（登録商標））に４℃で２分間入れた。切片を、１×ＰＢＳにて室温で２分間リンスし、その後切片を、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を３回行った。ＴＵＮＥＬ反応混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、各切片に３７℃で６０分間適用した。インキュベーション後、切片を、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を３回行った。アポトーシスキット法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成に類似しており、ＴＵＮＥＬ試薬（ＦＩＴＣ結合）は、「ニック」ＤＮＡとハイブリッド形成する。Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ−ＰＯＤ（ＴＵＮＥＬ試薬においてＦＩＴＣタグを認識するペルオキシダーゼ結合抗体）を、各切片に３７℃で３０分間適用し、切片を、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を３回行った。ＡＥＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用し、水への浸漬によって発色を停止させた。切片を、Ａｑｕａｍｏｕｎｔ（ＶＷＲ）でマウントした。
【０３１７】
この方法では、脾臓の赤脾髄および白脾髄中の多数の細胞がアポトーシスされるが、ＰＢＣを貪食した赤脾髄中の巨大マクロファージ（αｄを発現し、７日目にモデルから消滅する）は、アポトーシスが認められなかった。
【０３１８】
正常ラット脾臓におけるラットαｄ発現の細胞型分析
ラット細胞型がαｄを発現するかを同定するために、正常なラット脾臓に対して二重標識染色を行った。正常ラット脾臓の切片を、ラット血清ブロッキング工程によって上記のように調製した。一次細胞マーカー抗体の添加後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、一次抗体と同一の希釈剤で５００倍に希釈し、７５μｌを、各切片に室温で３０分間適用した。スライドを、１×ＴＢＳで各洗浄あたり５分間の洗浄を２回行った。アルカリホスファターゼ結合ロバ抗ヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、抗体希釈剤で３００倍に希釈し、７５μｌを、各切片に室温で３０分間適用した。上記のように洗浄およびブロッキング後、各切片に、７５μｌのビオチン化ハムスター抗ラットαｄ抗体（２０５Ｃ）を２０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度でそれぞれ１時間４５分投与し、洗浄して非結合抗体を除去した。過剰なＴＢＳを、最後の洗浄後の組織周囲の吸引によって除去した。ペルオキシダーゼ結合抗ビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を抗体希釈剤で２００倍に希釈し、７５μｌを、各切片に室温で４５分間適用した。スライドを、１×ＴＢＳで各洗浄あたり５分間の洗浄を２回行った。ＡＥＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用し、水への浸漬によって発色を停止させた。スライドを、Ａｑｕａｍｏｕｎｔ（Ｂａｘｔｅｒ）でマウントした。
【０３１９】
αｄを発現する細胞の表現型を同定するために、抗αｄ抗体と併せてＣＤ５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫマーカー、またはＨＩＳ４５（Ｔ細胞マーカー）に対する抗体を使用して、二重抗体免疫細胞化学を行った。二重標識細胞を、ＣＤ２／αｄまたはＨＩＳ４５／αｄを用いて検出された。正常なラットαｄの脾臓の赤脾髄は、ＣＤ５も発現することが見出された小細胞クラスターを標識した。ＣＤ５陽性細胞がＴ細胞またはＢ細胞であるかどうかは同定されなかった。赤脾髄中の細胞を発現するαｄの小集団もまた、ＣＤ４を発現すると同定された。さらに、αｄを発現するＮＫ細胞およびＣＤ８陽性細胞のサブセットもまた同定された。したがって、脾臓中のαｄ発現は、Ｔ細胞のサブセット、おそらくＢ細胞のサブセット、ＮＫ細胞のサブセット、およびマクロファージのサブセットで見出された。
【０３２０】
Ｆ３４４ラットモデル由来の巨大顆粒球性白血球（ＬＧＬ）腫瘍細胞上のαｄ発現
ＬＧＬ白血病のラットモデルを、Ｆ３４４ラットにおいて、国立癌研究所から入手した、３匹の雄Ｆ３４４ラットに静脈内注射した腫瘍細胞（各１００万個の細胞）を使用してデザインした。疾患発症まで３ヶ月かかり、この時点で数匹の動物を屠殺し、組織をＦＡＣＳおよび組織化学的分析によって試験した。
【０３２１】
ＦＡＣＳ分析のために、脾臓の一部を取り出し、以下の実施例に記載のように単一細胞懸濁液を調製した。簡単に述べれば、脾臓組織を鋏でより小さな一片に切り刻み、Ｄ−ＰＢＳの存在下でワイヤーメッシュスクリーンに通した。細胞を、遠心分離によってペレット化し、３０ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を、１５ｍｌの遠心チューブ中の５．０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ上への５．０ｍｌの細胞懸濁液の重層によって調製した。勾配物を、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。細胞を、１×１０６細胞／サンプルの密度までＦＡＣＳ緩衝液（ＲＰＭＩ−１６４０／２％ＦＢＳ、０．２％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。
【０３２２】
ビオチン（１０μｇ／ｍｌ）に結合したハムスター抗ラットαｄ抗体２０５ＣおよびＦＩＴＣ結合したラット細胞マーカーに対する一連の抗体の１つとのインキュベーションによって、細胞を二色染色した。これらの二次抗体は、ＮＫ細胞特異性を有するＦＩＴＣ結合抗体（Ｈａｒｌａｎ）に加えて、抗マクロファージ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、および抗ＩｇＭ（Ｂ細胞）−ＦＩＴＣ抗体（全てＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含んでいた。ＦＩＴＣ結合抗体を、それぞれ１０μｌ／サンプルで使用した。
【０３２３】
サンプルを、最初に２０５Ｃ−ビオチン抗体と３０分間氷上でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１．０ｍｌ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。５μｌのストレプトアビジン−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）および氷上に３０分間置いたサンプルと共にＦＩＴＣ結合物を添加した。インキュベーション後、サンプルを、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルをＢｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳｃａｎを使用して試験し、データをＬｙｓｙｓＩＩソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【０３２４】
結果は、ＮＫまたはＬＧＬ細胞表面上でのαｄの発現を圧倒的に示した。Ｂ細胞およびＴ細胞マーカーについて陽性に染色された細胞は、αｄ発現が明らかではなく、マクロファージマーカーを使用して染色した細胞は、わずかなαｄ発現を示した。疾患のこの時点では、脾臓は主にＮＫ腫瘍細胞から構成され、これは脾細胞の巨大集団がＮＫマーカーおよびαｄの両方の発現を染色した所見に一致すると考えられる。
【０３２５】
これらの所見はまた、同一の動物から回収し、ＦＡＣＳ用に上記のように処理した末梢血細胞を使用した並行実験由来の結果と一致していた。末梢血細胞を使用した結果は、循環ＮＫ細胞もまたαｄを発現する一方で、血液中の他の細胞マーカーを発現する細胞はαｄ発現を示さないことを示した。しかし、末梢血細胞を使用した結果は、おそらく脾臓および末梢血中に存在する異なる細胞型の割合の相違により、脾臓細胞での結果ほど劇的ではなかった。
【０３２６】
これらのモデル動物由来のラット脾臓細胞のその後のＦＡＣＳ分析では、同一の結果が得られた。上記細胞調製法を使用したさらなる分析では、ＬＧＬ腫瘍細胞は、ＣＤ１８ならびにＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃの発現についての染色も示した。
【０３２７】
上記のＩＣＣ手順を使用して正常およびＮＫ  Ｆ３４４疾患組織の両方について組織化学的分析を行った。予備データは、αｄはＮＫ  Ｆ３４４腫瘍肺および肝臓組織で発現するが、正常な各組織では検出されないか非常に低レベルで発現することを示した。罹患肺組織は、細胞の小クラスターおよび大クラスターならびに肺のいたるところの各細胞上でαｄの発現を示した。ＮＫ  Ｆ３４４肝臓は、血管周囲および組織のいたるところの他の細胞で弱い標識を示した。他のβ２インテグリンに対する抗体は、これらの分子が、標識パターンは異なるが正常および罹患組織中で類似のレベルで発現することを示した。
【０３２８】
並行分析では、正常なラット胸腺は、皮質中の散乱細胞でわずかなαｄ発現を示し、Ｆ３４４  ＮＫ胸腺は、αｄ発現レベルが増加した。正常な脾臓は、赤脾髄で発現し、ＮＫ脾臓は組織のいたるところでクラスター標識を有していた。
【０３２９】
次いで、ＮＫ脾臓を疾患発症から一週間間隔で試験し、これにより、αｄ発現レベルは３週間まで増加し、その後４週間で減少することが示された。
【０３３０】
【実施例２７】
抗αｄモノクローナル抗体を使用したＮＫ腫瘍細胞誘導性標的細胞溶解の阻害アッセイ
ＮＫ細胞の特異的機能は、ウイルス感染細胞および外来細胞を標的して死滅させることである。ＮＫ細胞の特定の標的細胞を溶解する能力をアッセイするために、標的細胞を５１Ｃｒで標識し、溶解した場合、培地中に放射能の増大が検出される。αｄ（以前にＮＫ細胞上で発現することが示されている）はＮＫ標的化細胞死滅に関与すると仮定した。この仮説を試験するために、腫瘍細胞をαｄ抗体と予備インキュベートして、機能的アッセイにおいてαｄの役割を評価した。
【０３３１】
αｄ陽性ＮＫ腫瘍エフェクター細胞の調製
Ｆ３４４ラットに、最初に国立癌研究所から入手し、脾臓から取り出す３〜４週間前に動物によって継代したＮＫ腫瘍細胞を注射した。脾臓を取り出し、切り刻んで小片にし、Ｄ−ＰＢＳの存在下でワイヤーメッシュスクリーンに通した。得られた細胞懸濁液を、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍで室温で１０分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを３０ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁した。
【０３３２】
次いで、血液由来の単球のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ分離を以下のように行った。５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）を、６つの１５ｍｌ遠心チューブに添加し、その上に上記の５．０ｍｌの細胞懸濁液を重層した。細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍで室温で３０分間遠心分離した。細胞層を回収し、プールし、血球計で計数した。Ｄ−ＰＢＳ緩衝液中に単離腫瘍細胞のいくつかの希釈物を調製し、その後５０μｇ／ｍｌの濃度の抗ラットαｄ抗体の存在下または非存在下でインキュベートした。コントロール抗体には、５０μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした抗ラットＣＤ１８抗体および抗ラットＩＣＡＭ−１抗体が含まれる。アッセイ前に、腫瘍細胞を、抗体と３７℃で約３０分間予備インキュベートした。
【０３３３】
Ｙａｋ−１標的細胞のクロム標識
Ｙａｋ−１細胞（ＡＴＣＣ）（マウスリンパ球細胞株）を、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。遠心分離によって細胞を回収し、５００ｍｌ  ＲＰＭＩ  １６４０、５ｍｌ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ抗生物質溶液、および１０ｍｌＦＢＳから作製した１．５〜４．０ｍｌのＲＰＭＩ「試験培地」中に約１×１０７細胞の密度で再懸濁した。約２００〜３００μＣｉの５１Ｃｒを、Ｙａｋ−１細胞懸濁液に添加し、その後穏やかに混合しながら３７℃で４５〜６０分間インキュベートした。インキュベーション後、試験培地で体積を５０ｍｌに増加させ、遠心分離によって細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を１〜３ｍｌの試験培地に懸濁し、密度を５×１０４細胞／ｍｌに調整した。自己コントロールとして使用するために、１×１０７細胞／ｍｌの濃度の非標識Ｙａｋ−１細胞も調製した。
【０３３４】
標識細胞の活性を、ガンマカウンターを使用した１００μｌの標識細胞懸濁液の３連のアッセイによって同定した。
【０３３５】
短期クロム放出アッセイ
各希釈物のＮＫエフェクター細胞を、３連で９６ウェルマイクロタイタープレート中の１００μｌの試験培地に入れ、１００μｌの標識Ｙａｋ−１細胞を各ウェルに添加した。各エフェクター希釈での非標識Ｙａｋ細胞との１００μｌの標識細胞のインキュベーションによって自己（すなわち、自発的またはバックグラウンド）放出させた。１セットのウェル中での標的細胞への１．０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）の添加によって全ての５１Ｃｒを放出させた。標的細胞のみを含むウェル中で見出された５１Ｃｒ量によって自発的放出を測定した。３７℃で４時間のエフェクター／標的細胞のインキュベーションを行い、その後プレートを遠心分離し、１００μｌの上清を各ウェルから回収し、放射能を測定した。
【０３３６】
細胞溶解活性を、以下の式を使用して計算した。
％細胞溶解活性＝（サンプル（ｃｍｐ）−自発的放出（ｃｐｍ））／（１００％放出（ｃｍｐ）−自発的放出（ｃｍｐ））×１００
結果は、ハムスター抗ラットαｄ抗体（１９９Ｍおよび２０５Ｃを含む）およびマウス抗ラットαｄ抗体（２２６Ａ、２２６Ｂ、２２６Ｃ、２２６Ｄ、２２６Ｆ、２２６Ｇ、２２６Ｈ、および２２６Ｉ）はいずれもＮＫ腫瘍細胞の標的細胞を死滅または溶解する能力に影響を与えないことを示した。
【０３３７】
【実施例２８】
マウスｃＤＮＡクローンの単離
マウスαｄホモログの単離を試みた。
【０３３８】
交配種以下の２つのＰＣＲ作製プローブを使用して、交差ハイブリッド形成を行った：ヒトクローン１９Ａ２（配列番号１）由来の塩基５２２〜２０４７に対応する１．５ｋｂフラグメントおよびヒトクローン１９Ａ２（配列番号１）の塩基１９００〜２９００に対応する１．０ｋｂラットフラグメント。ヒトプローブを、それぞれ配列番号３８および３９に記載のＡＴＭ−２および９−１０．１と呼ばれるプライマー対を使用したＰＣＲによって作製し、ラットプローブをそれぞれ配列番号３４および３５に記載のプライマー対４３４Ｌおよび４３４Ｒを使用して作製した。サンプルを９４℃で４分間インキュベートし、以下の３０サイクルの連続的温度ステップに供した：９４℃、５０℃で２分；７２℃で４分。
５’−ＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号３８）
５’−ＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＧＧ−３’（配列番号３９）
ＰＣＲ産物を、製造者が推奨するプロトコールにしたがってＱｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎキットを使用して精製し、ＤＮＡ中の約１８０個を、製造者が推奨するプロトコールにしたがってＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットを使用して２００μＣｉ［３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識した。非組み込み同位体を、製造者が推奨するプロトコールにしたがってＣｅｎｔｒｉ−ｓｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ）を使用して除去した。使用前に０．２Ｎ  ＮａＯＨでプローブを変性させ、０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。
【０３３９】
マウス胸腺オリゴｄＴプライマーｃＤＮＡライブラリーを含むλＺＡＰ（登録商標）ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、１５ｃｍのプレートあたり約３０，０００プラークでプレートした。ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）上にリフトしたプラークを、３０％ホルムアミドを含む予備ハイブリッド形成溶液（８ｍｌ／リフト）中で撹拌しながら５０℃で１時間インキュベートした。標識ヒトおよびラットプローブを、予備ハイブリッド形成溶液に添加し、５０℃で一晩インキュベーションを継続した。フィルターを、室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回、３７℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回、４２℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。フィルターを、増感紙を含むＫｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに−８０℃で２７時間曝露した。
【０３４０】
２つのリフトで陽性シグナルを示す４つのプラークを、マグネシウム（ＬＢＭ）／カルベニシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）プレート中のＬＢ培地に画線し、３７℃で一晩インキュベートした。ファージプラークを、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）フィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でリフトし、最初のスクリーニングとして探索し、増感紙を含むＫｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに−８０℃で２４時間曝露した。
【０３４１】
シグナルを発した１２個のプラークを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＭｇ＋＋ファージ希釈物に移した。Ｔ３およびＴ７プライマー（それぞれ配列番号１３および１４）を使用したＰＣＲ増幅および以下の反応条件によって、インサートサイズを同定した。サンプルを９４℃で４分間インキュベートし、以下の３０サイクルの温度ステップに供した：９４℃で１５秒間；５０℃で３０秒間；および７２℃で１分間。
【０３４２】
６個のサンプルは、３００塩基〜１ｋｂのサイズ範囲の異なるバンドを産生した。ヘルパーファージとの同時感染によってファージミドを放出させ、再環状化してＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を作製した。得られたコロニーを、ＬＢＭ／カルベニシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）中で一晩培養した。製造者が推奨するプロトコールにしたがってＰｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ミニプレップキット（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限分析によって、ＰＣＲを使用して検出した分子量を確認した。インサートＤＮＡを、それぞれ配列番号４０および４１に記載のＭ１３およびＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅ．１プライマーを使用して配列決定した。
５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号４０）
５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号４１）
実施例４に記載のように、配列決定を行った。
【０３４３】
６つのクローンのうち、１０．３−１および１０．５−２と呼ばれる２つのみから配列情報が得られ、これは同一の６００ｐｂフラグメントであった。６００ｂｐ配列は、対応するヒトαｄに６８％同一であり、ヒトＣＤ１１ａとは４０％同一であり、ヒトＣＤ１１ｃとは５８％同一であり、マウスＣＤ１１ｂとは５４％同一であった。次いで、この６００ｂｐフラグメントを使用して推定マウスαｄホモログをコードするより完全なｃＤＮＡを単離した。
【０３４４】
マウス脾臓ｃＤＮＡライブラリー（オリゴｄＴ−およびランダムプライマー）を含むλＺａｐ（登録商標）を、２．５×１０４ファージ／１５ｃｍ  ＬＢＭプレートでプレートした。プラークを、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）ナイロントランスファー膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にリフトし、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌで変性させ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ／１１．６ＨＣｌで中和し、２×ＳＳＣで洗浄した。ＵＶ照射によって、ＤＮＡをフィルターに架橋させた。
【０３４５】
約５００，０００個のプラークを、前に記載のように標識したプローブ１０．３−１および１０．５−２を使用してスクリーニングした。プローブを予備ハイブリッド形成溶液に添加し、５０℃で一晩インキュベートした。フィルターを、室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回、３７℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回、および４２℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。フィルターを、増感紙を含むＫｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに−８０℃で２４時間曝露した。２連のリフトで陽性シグナルを発した１４個のプラークを、５０℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃の０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、および５５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの最後の高ストリンジェンシー以外は最初のスクリーニングと同一の二次スクリーニングに供した。フィルターを、増感紙を含むＫｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに−８０℃で１３時間曝露した。
【０３４６】
１８個の陽性プラークを低Ｍｇ＋＋ファージ希釈物に移し、上記のようにＰＣＲ増幅によってインサートサイズを同定した。７個のサンプルは、６００ｂｐ〜４ｋｂのサイズ範囲の１つのバンドを示した。精製ＤＮＡのＥｃｏＲＩ制限分析により、ＰＣＲで認められるサイズを確認し、プライマーＭ１３およびＭ１３  ｒｅｖｅｒｓｅ．１（それぞれ配列番号４０および４１）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。
【０３４７】
Ｂ３８００と呼ぶ１つのクローンは、ヒトαｄ１９Ａ２クローンの５’末端の２００塩基下流領域に対応する４ｋｂインサートおよび３’非翻訳領域の５５３塩基を含んでいた。クローンＢ３８００は、ヒトαｄの対応領域と７７％同一であり、ヒトＣＤ１１ａの対応領域と４４％同一であり、ヒトＣＤ１１ｃの対応領域と５９％同一であり、マウスＣＤ１１ｂの対応領域と５１％同一であった。第２のクローンＡ１１６０は、開始メチオニンの約１２核酸下流のヒトαｄのコード配列の５’末端に並べた１．２ｋｂインサートであった。クローンＡ１１６０は、ヒトαｄの対応領域と７５％同一であり、ヒトＣＤ１１ａの対応領域と４６％同一であり、ヒトＣＤ１１ｃの対応領域と６２％同一であり、マウスＣＤ１１ｂの対応領域と６６％同一であった。
【０３４８】
クローンＡ１１６０（ヒトクローン１９Ａ２の５’末端により近いフラグメント）は１１６０塩基長であり、塩基２０５〜塩基１１３４のクローンＢ３８００と重複領域を共有する。クローンＡ１１６０は、クローンＢ３８００の重複領域中に存在しない１１０塩基の挿入（クローンＡ１１６０の塩基７０４〜８１４）を有する。この挿入は、探索可能なエクソン−イントロン境界で起こり（Ｆｌｅｍｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０、４８０〜４９０、１９９３）、その後のクローンＡ１１６０およびＢ３８００のライゲーション前に除去した。
【０３４９】
推定マウスαｄクローンの５’ｃＤＮＡ末端の急速増幅
ＲＡＣＥ  ＰＣＲ（Ｆｒｏｈｍａｎ「ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端急速増幅」、ＰＣＲプロトコール：方法および応用ガイド、Ｉｎｎｉｓら編、２８〜３８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０）を使用して、推定マウスαｄクローンの５’配列を欠き、５’非翻訳配列および開始メチオニンを含む配列を得た。製造者が推奨するプロトコールにしたがって、マウス脾臓ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用した。一次ＰＣＲおよびネストＰＣＲを行うように２つのアンチセンス遺伝子特異的プライマーＡ１１６０ＲＡＣＥ−１一次およびＡ１１６０  ＲＡＣＥ２−ネスト（配列番号４２および４３）をデザインした。
５’−ＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＡＧＧ−３’（配列番号４２）
５’−ＧＧＣＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＡＣＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧ−３’（配列番号４３）
プライマー（配列番号４２および４３）は、それぞれ５’末端から３０２および２４７塩基の領域に対応する。５’アンカープライマー（配列番号４４）およびキットに含まれるマウス脾臓ｃＤＮＡを使用して、ＰＣＲを上記のように行った。
ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧ（配列番号４４）
ＰＣＲ産物の電気泳動により、約２８０塩基サイズのバンドが明らかとなり、製造者が推奨するプロトコールにしたがってＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してサブクローン化した。得られたコロニーを培養し、ＤＮＡを単離し、配列決定した。５’配列のさらなる６０塩基がこの方法で同定され、これは配列番号４５の塩基１〜６０に対応していた。
【０３５０】
マウスｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列の特徴付け
ヒトαｄの推定ホモログをコードするマウスｃＤＮＡの混成配列を、配列番号４５に示す。ヒトおよびマウスクローンの外部ドメインの間の相同性が高いにもかかわらず、細胞質ドメイン間の相同性はわずか３０％である。認められた変形形態は、ヒトおよびマウスタンパク質の間のＣ末端の機能的相違を示し得る。あるいは、細胞質ドメインの変形形態は、スプライス変異に起因するか、さらなるβ２インテグリン遺伝子の存在を示し得る。
【０３５１】
アミノ酸レベルでは、マウスｃＤＮＡにより、マウスＣＤ１１ａと２８％同一であり、マウスＣＤ１１ｂと５３％同一であり、ヒトＣＤ１１ａと２８％同一であり、ヒトＣＤ１１ｂと５５％同一であり、ヒトＣＤ１１ｃと５９％同一であり、ヒトαｄと７０％同一であるタンパク質（配列番号４６）が推定される。ヒトαｄの細胞質ドメインおよび推定マウスホモログのアミノ酸配列の比較により、同一の長さであるが異なる一次構造の領域が示される。これらの領域中の類似の配列長により、スプライス変異体形態よりもむしろ種のばらつきが示唆される。推定ラットポリペプチド（実施例２０、前出）と比較した場合、マウスおよびラット細胞質ドメインは６０％を越えて同一である。
【０３５２】
【実施例２９】
配列評価のためのさらなるマウスαｄ ｃＤＮＡクローンの単離
マウスαｄについての実施例２８に記載の核酸およびアミノ酸配列を評価するために、確認用のさらなるマウス配列を単離した。
【０３５３】
マウス脾臓ランダムプライマーライブラリーおよびオリゴｄＴプライマーｃＤＮＡライブラリーを含むλＺＡＰ（登録商標）ＩＩ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を使用して、２つのホモログαｄプローブ（３’および５’）でのハイブリッド形成によるマウスｃＤＮＡの単離を行った。５×１０５ファージ／１５ｃｍＬＢＭプレートでライブラリーをプレートした。プラークを、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でリフトし、膜を変性し（０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ）、中和し（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ／１１．６Ｍ  ＨＣｌ）、洗浄した（２×ＳＳＣ塩溶液）。ＵＶ照射によって、ＤＮＡをフィルターに架橋させた。
【０３５４】
以下の条件下でのＰＣＲ反応において下記のプライマーを使用してプローブを作製した。サンプルを、９４℃に４分間保持し、３０サイクルの温度ステップ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００サーモサイクラーにおいて９４℃で１５秒間；５０℃で３０秒間；および７２℃で１分間）に供した。
【０３５５】
３’プローブは、約９００塩基長であり、ヌクレオチド２７５２〜３６５１（配列番号１中）（５’→３’）の領域にわたり、それぞれ配列番号６９および７４に示すプライマー１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１１および１１．ｂ−１／２ＲＥＶ２を使用して産生させた。このプローブを、第１のリフトセットで使用した。
【０３５６】
５’プローブは、約８００塩基長であり、ヌクレオチド１４９〜９４６（配列番号１）（５’→３’）の領域にわたり、それぞれ配列番号５０および８５に示すプライマー１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１および１１．ａ−１／１ＲＥＶ１を使用して産生させた。このプローブを、第２のリフトセットで使用した。
【０３５７】
第３のリフトセットでは、上記両プローブを、サンプルプレート上で一緒に使用した。
【０３５８】
約５００，０００個のプラークを、実施例２０と同一の方法で標識した二つのプローブを使用してスクリーニングした。標識プローブを、４５％ホルムアミドを含む予備ハイブリッド形成溶液に添加し、５０℃で一晩インキュベートした。フィルターを、室温（２２℃）の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。５０℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで最後の洗浄を行った。増感紙を含むＫｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲフィルム−８０℃で１９時間オートラジオグラフィーを行った。
【０３５９】
少なくとも２連のリフトで溶液シグナルを発する１３個のプラークを、ハイブリッド形成に３’および５’標識プローブを使用し、６５℃の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを使用した最終洗浄を組み込む以外は最初スクリーニングについて記載のように二次スクリーニングに供した。上記のように２．５時間オートラジオグラフィーを行った。
【０３６０】
陽性シグナルを発する１３個のプラーク（ＭＳ２Ｐ１〜ＭＳ２Ｐ１３）を、低Ｍｇ＋＋ファージ希釈剤に移した。上記の同一の条件下でのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ファージミドを含むＺＡＰ（登録商標）ＩＩ（前に記載の配列）にアニーリングしたＴ３およびＴ７プライマーを使用したＰＣＲ増幅（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００サーモサイクラー）によってインサートサイズを同定した。バンドサイズは、５００塩基〜４Ｋｄの範囲であった。ファージミドを、Ｍ１３およびＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅ．１プライマー（それぞれ配列番号４０および４１）を使用して、単離し、調製し、配列決定した。１３個のクローンのうち５個（ＭＳ２Ｐ−３、ＭＳ２Ｐ−６、ＭＳ２Ｐ−９、ＭＳ２Ｐ−１２、およびＭＳ２Ｐ−１３）を配列決定し、これらは共に５’末端の塩基約２００から３’の最初の終止コドンを過ぎた約３００塩基までの領域を示した。
【０３６１】
Ｍ１３およびＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅ．１プライマー（それぞれ配列番号４０および４１）を最初に使用して実施例４に記載のように自動化配列決定を行い、各クローンの末端を配列決定し、構築物番号１７（配列番号４５）に相対する位置を同定した。次いで、各クローンを、特定の領域について特定のプライマー（以下に列挙）を使用して完全に配列決定した。
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１  ５’−ＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＣＡＧＡＣ−３’（配列番号５０）
１１．ａ−１／１ＦＯＲ２  ５’−ＣＣＧＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＣ−３’（配列番号６０）
１１．ａ−１／１ＦＯＲ３  ５’−ＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＧＴＣＡＡ−３’（配列番号６１）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ４  ５’−ＧＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＧＣＴＡＴＧＣ−３’（配列番号６２）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ５  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号６３）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ６  ５’−ＣＡＧＡＴＣＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号６４）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ７  ５’−ＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧ−３’（配列番号６５）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ８  ５’−ＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ−３’（配列番号６６）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ９  ５’−ＣＴＴＣＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＧＴＣ−３’（配列番号６７）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１０  ５’−ＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧ−３’（配列番号６８）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１１  ５’−ＣＣＧＴＧＡＴＣＡＧＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号６９）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１２  ５’−ＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡＡＣＣＴＣＣ−３’（配列番号７０）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１３  ５’−ＧＣＴＣＣＴＧＡＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡ−３’（配列番号７１）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１４  ５’−ＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号７２）
１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１５  ５’−ＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＧ−３’（配列番号７３）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ２  ５’−ＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧ−３’（配列番号７４）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ３  ５’−ＣＧＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧ−３’（配列番号７５）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ４  ５’−ＣＡＣＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号７６）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ５  ５’−ＣＴＣＡＣＴＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号７７）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ６  ５’−ＣＧＧＴＡＡＧＡＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号７８）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ７  ５’−ＧＡＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号７９）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ８  ５’−ＧＡＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＣＣ−３’（配列番号８０）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ９  ５’−ＣＡＣＧＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号８１）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ１０  ５’−ＣＡＣＧＴＣＣＣＣＴＡＧＣＡＣＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号８２）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ１１  ５’−ＣＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号５１）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ１２  ５’−ＴＴＧＡＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＴＧＧＧ−３’（配列番号８３）
１１．ｂ−１／２ＲＥＶ１３  ５’−ＧＡＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧ−３’（配列番号８４）
１１．ａ−１／１ＲＥＶ１  ５’−ＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＡＧＴＧＣＴＡＣ−３’（配列番号８５）
１１．ａ−１／１ＲＥＶ２  ５’−ＧＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣ−３’（配列番号８６）
配列を編集し、アラインメントし、前に単離したマウスαｄ配列（構築物番号１７、配列番号４５）と比較した。
【０３６２】
新規の配列のアラインメントにより、構築物番号１７中にヌクレオチド２３０８から始まる１８塩基の欠失が明らかとなり、この欠失は読み取り枠をシフトさせなかった。上記で配列決定したクローンＭＳ２Ｐ−９もまた、同一の１８塩基欠失が明らかとなった。この領域を含むマウスクローンの５０％でこの欠失が認められたが、ラットまたはヒトαｄクローンでは検出されなかった。１８塩基の欠失は、１２塩基の回文配列ＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＧＴ（配列番号９１）によって特徴付けられる。核酸配列中のこの反転の反復は自己相補的であり、逆転写によって切断されるループアウトを形成することができる。さらなる１８塩基を含むマウスαｄ配列を、配列番号５２に示し、推定アミノ酸配列を配列番号５３に示す。
【０３６３】
【実施例３０】
マウスのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成
次いで、マウスαｄについての組織分布を同定して、実施例６に記載のヒトの組織分布と比較した。
【０３６４】
３５Ｓ−ＵＴＰを組み込んだｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって、一本鎖２００ｂｐ  ｍＲＮＡプローブをマウスｃＤＮＡの細胞質テール領域中のヌクレオチド３４６０〜３７０７に対応するＤＮＡテンプレートから作製した。
【０３６５】
全マウス胚（受精から１１〜１８日目に採取）および種々のマウス組織（脾臓、腎臓、肝臓、小腸、および胸腺を含む）を、放射性標識一本鎖ｍＲＮＡプローブとｉｎ  ｓｉｔｕでハイブリッド形成させた。
【０３６６】
組織を、６μｍ厚に切断し、Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）をコートしたスライドに接着させ、−７０℃で保存した。使用前に、スライドを−７０℃から取り出し、５０℃に約５分間置いた。切片を、４℃の４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、各濃度で４℃で１分間の漸増エタノール勾配（７０−９５−１００％）で脱水し、室温で３０分間風乾した。切片を、７０℃で２分間の７０％ホルムアミド／２×ＳＳＣで変性し、２×ＳＳＣで２回リンスし、上記のエタノール勾配で脱水し、３０分間風乾した。６×１０５ｃｐｍ／切片の３５Ｓ標識リボプローブおよびジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水を含む溶液中、５５℃で一晩（１２〜１６時間）ハイブリッド形成させて、５０％ホルムアミド、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％硫酸デキストラン、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および５ｍＭ  ＥＤＴＡの最終濃度を得た。ハイブリッド形成後、切片を、室温の４×ＳＳＣ／１０ｍＭ  ＤＤＴで１時間、６０℃の５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ／１０ｍＭ  ＤＤＴで４０分、室温の２×ＳＳＣで３０分、および室温の０．１×ＳＳＣで３０分洗浄した。切片を、脱水し、２時間風乾し、Ｋｏｄａｋ  ＮＴＢ２写真乳剤でコートし、２時間風乾し、現像し（４℃の完全な暗所での保存後）、ヘマトキシリン／エオシンで対比染色した。
【０３６７】
脾臓組織は、主に赤脾髄中に強いシグナルを示した。このパターンは、脾臓中の組織マクロファージ分布パターンと一致するが、他の細胞型を排除しない。
【０３６８】
【実施例３１】
マウス発現構築物の作製
ヒトαｄに相同性を示すマウスｃＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを構築するために、クローンＡ１１６０およびＢ３８００由来のインサートをライゲートした。このライゲーション前に、開始メチオニンを含む５’リーダー配列を、クローンＡ１１６０に添加した。「５’ＰＣＲリーダー」と呼ばれるプライマー（配列番号４７）を、以下を含むようにデザインした：（１）消化用の第１〜６位の同一の非特異的塩基、（２）発現ベクターへのサブクローニングを容易にするための第７〜１２位のＢａｍＨＩ部位（配列番号４７の下線）、（３）第１３〜１８位のコザック配列、（４）開始メチオニンのコドンを含むシグナル配列（配列番号４７の太字）、（５）プライマーアニーリング用のクローンＡ１１６０由来の５’配列に特異的に重複するさらなる３１塩基。クローンＡ１１６０由来のインサートを増幅するための「３’ｅｎｄ  ｆｒａｇ」と呼ばれる第２のプライマー（配列番号４８）を、プライマー「５’ＰＣＲリーダー」と共に使用した。
５’−ＡＧＴＴＡＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号４７）
５’−ＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号４８）
得られたＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩで消化されず、これにより、制限部位の前の塩基数が不十分であり、酵素による認識を妨害していると示唆された。５’プライマー（配列番号４７）中のＢａｍＨＩ部位に先行する「テール」配列の長さはが増加し、第１のＰＣＲ由来の増幅産物についてＰＣＲを繰り返した。ｍＡＤ．５’．２（配列番号４９）と呼ばれる５’プライマーを、第１〜４位のさらなる非特異的塩基および先に使用した「５’ＰＣＲリーダー」プライマー配列に特異的に重複するさらなる２０塩基を使用してデザインした。
５’−ＧＴＡＧＡＧＴＴＡＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＴ−３’（配列番号４９）
プライマー「ｍＡＤ．５’．２」および「３’ｅｎｄ  ｆｒａｇ」を、テンプレートとして第１の増幅由来の産物を使用したＰＣＲで共に使用した。得られた二次ＰＣＲ産物を、製造者が推奨するプロトコールにしたがってｐＣＲｔｍＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化し、コンピテントＯｎｅショット細胞（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。ＰＣＲ産物を含む１つのクローンを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを使用する制限酵素分析で同定し、配列決定した。配列を評価した後、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩでの消化によってインサートを単離し、ゲル精製した。
【０３６９】
クローンＢ３８００由来のインサートを、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでの消化によって単離し、ゲル精製し、Ａ１１６０  ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントが増加したライゲーション反応に添加した。１４℃で１４時間ライゲーションを進行させた。ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化したベクターｐｃＤＮＡ．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、さらなるリガーゼと共にライゲーション反応に添加し、さらに１２時間反応を継続させた。反応混合物のアリコートを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、得られたコロニーを培養し、１つの陽性クローンを、プライマー１１．ｂ−１／２ＦＯＲ１および１１．ｂ−１／２ＲＥＶ１１（それぞれ配列番号５０および５１）を使用したＰＣＲで同定した。これらのプライマーは、Ａ１１６０およびＢ３８００フラグメントに架橋するので、増幅産物の欠失は、ライゲートした２つのフラグメントを示す。陽性クローンの配列を、開始メチオニンの後の塩基１００〜１４０５を増幅した配列番号５０および５１に記載のプライマーで評価した。
【０３７０】
【実施例３２】
ノックアウトマウスの構築
推定マウスαｄｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の免疫学的役割をより正確に評価するために、推定αｄホモログをコードするゲノムＤＮＡ配列が相同組換えによって破壊されている「ノックアウト」マウスをデザインした。それにより、破壊遺伝子によってコードされるタンパク質の有意性を、コードタンパク質の不在によって評価する。「ノックアウト」マウスの作製は、Ｄｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１３、２１３４〜２１４０、１９９３に記載されている。
【０３７１】
このようなマウスのデザインは、相同組換えによって「ノックアウト」すべき配列を含むプラスミドの構築から始まる。７５０塩基対のマウスｃＤＮＡのフラグメント（配列番号４５のヌクレオチド１９８５〜２７３３に対応する）を使用して、λＦＩＸＩＩゲノムライブラリー由来の推定マウスαｄホモログをコードするマウスゲノム配列を同定した。一次スクリーニングにより、１４個の陽性プラークが得られ、そのうちの７個を、二次スクリーニングで確認した。最も強いシグナルを発した２つのプラークから液体溶解物を獲得し、従来の方法によってλＤＮＡを単離した。制限マッピングおよびサザン分析により１４−１と呼ばれる１つのクローンの信頼性を確認し、インサートＤＮＡをＮｏｔＩでの消化によって単離した。このフラグメントを、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫＩＩ＋にクローン化した。
【０３７２】
約９〜１４ｋｂ（相同組換えの可能性を至適化すると報告されている長さ）の制限フラグメントを同定するために、７５０ｂｐのｃＤＮＡプローブを使用してサザンハイブリッド形成を行った。ハイブリッド形成前に、クローン１４−１の制限地図を構築した。１２ｋｂのフラグメントは可能な候補と同定され、このフラグメントを、マウスＤＮＡがチミジンキナーゼコードカセットに隣接する位置でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫＩＩ＋にサブクローン化した。Ｉドメインプローブ（配列番号４５のヌクレオチド４５４〜１０６４に対応する）を使用したこのクローンのさらなる分析は、クローンがＩドメインコード配列を含まないことを示した。
【０３７３】
同一のＩドメインプローブを使用して、λＦＩＸＩＩゲノムライブラリーを再スクリーニングした。最初に、６つの陽性クローンが検出され、その１つが二次スクリーニングの際に陽性を保持していた。このクローンから単離したＤＮＡは、Ｉドメインプローブを使用したサザン分析で強力に反応した。しかし、元の７５０ｂｐプローブを使用しても反応性は検出されず、これは、このクローンが配列番号４５のヌクレオチド１９８５〜２７７３を含むことを示す。
【０３７４】
あるいは、７５０ｂｐプローブのハイブリッド形成の欠損により、クローンはタンパク質のインテグリンファミリーの別のメンバーであることを示唆し得る。この説明が妥当であるかどうかを同定するために、１３ｋｂのインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫＩＩ＋にサブクローン化した。精製ＤＮＡを、αｄＩドメイン核酸配列４４１〜４６１、５９１〜６１２、７１７〜７３９に対応するプライマーおよび配列番号５２の逆方向８９８〜９１８に対応するプライマーを使用して配列決定された。配列情報は第１の４４４１〜４４６１プライマーのみを使用して得られ、Ｉドメインの５’−ｍｏｓｔエクソンのみが有効に増幅した。Ｉドメインの残存物は、増幅されなかった。したがって、得られたクローンは、マウスαｄ遺伝子のエクソン６およびエクソンの３’および５’末端に対するイントロン配列を含んでいた。エクソン７は、クローン中に示されなかった。配列決定後、ネオマイシン耐性遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子を含む構築物を作製する。
【０３７５】
ネオマイシン耐性（ｎｅｏ’）遺伝子を、ゲノムマウスＤＮＡのタンパク質コード配列を妨害する様式で得られたプラスミドに挿入する。したがって、得られたプラスミドは、マウスゲノムＤＮＡ配列内のｎｅｏ’遺伝子を含み、その全ては、チミジンキナーゼコード領域内に存在する。この様式でのプラスミド構築物は、無作為組換えよりも相同組換えを優先させる必要がある（Ｃｈｉｓａｋａら、Ｎａｔｕｒｅ、３５５、５１６〜５２０、１９９２）。
【０３７６】
別のストラテジーを使用して、αｄノックアウトマウスの産生に有用な構築物を作製した。胚幹細胞のゲノムＤＮＡから作製した巨大インサートの高ストリンジェンシーＰＣＲ分析のために、２組のオリゴヌクレオチドプライマーをＧｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に提出した。プライマーは、αｄ中のＩドメインの最初および最後のエクソンに対応していた。３つのクローンを同定し、１１１７および１１１８と呼ばれるそのうちの２つは、両プライマーに反応性を示し、１１１９と呼ばれる残りの１つは、最後のエクソン由来のプライマーを増幅することができる。
【０３７７】
マウスゲノムαｄＤＮＡの同定
製造者（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）が推奨するプロトコールにしたがって、クローン１１１７および１１１８の細菌溶解物からプラスミドＤＮＡを調製した。αｄインサートを、オリゴヌクレオチドｍａｄｋ．ｆ１（配列番号１０４）およびｍａｄｋ．ｒ１（配列番号１０５）、およびｍａｄｋ．ｒ２（配列番号１０６）を使用したＰＣＲによって評価した。
ｍａｄｋ．ｆ１  ＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣ（配列番号１０４）
ｍａｄｋ．ｒ１  ＧＡＧＣＴＡＴＴＴＣＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＴＧＧＧ（配列番号１０５）
ｍａｄｋ．ｒ２  ＴＡＴＡＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＴＧＡＴＣＣ（配列番号１０６）
両プラスミドのアリコートを、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、およびＸｈｏＩ・（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。各消化サンプルを、０．８％アガロースゲルで分離し、分析のためにポリヌクレオチドをＨｙｂｏｎｄ（登録商標）−Ｎ＋核酸トランスファー膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ブロットを、オリゴｍａｄｆｏｒ１（配列番号１０７）およびｍａｄｒｅｖ１（配列番号１０８）を使用したＰＣＲによって得た１．６ｋｂテンプレートを使用して作製した３２ＰランダムプライマーＤＮＡで探索した。
ｍａｄｆｏｒ１  ＡＴＧＧＴＣＣＧＴＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＴＣ（配列番号１０７）
ｍａｄｒｅｖ１  ＴＣＧＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣ（配列番号１０８）
５０％ホルムアミドを含むＳＳＰＥ緩衝液中、４２℃で一晩ハイブリッド形成を行った。標識ブロットを、室温の２×ＳＳＰＥで５回洗浄した。放射性標識バンドを、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔオートラジオグラフィーフィルムへの−７０℃で２時間のブロットの曝露によって視覚化した。
【０３７８】
以下の２つの目的のフラグメントを、クローン１１１８から同定した：４．１ｋｂのＳａｃＩフラグメントおよび８．３ｋｂのＸｂａＩフラグメント。クローン１１１８のＳａｃＩおよびＸｂａＩ消化物由来の全サンプル成分をさらに精製することなくベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲ  ＫＳ＋にライゲートし、ライゲーション後、全反応成分をＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１／λＳｍＲ株のカルシウムコンピテント調製物に形質転換した。得られたコロニーを単離し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーウイルスを含む２００μｌの選択培地で培養して一本鎖ＤＮＡを複製した。次いで、１０μｌアリコートの各ウェル由来の上清を、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）−Ｎ＋トランスファー膜にブロッティングし、上記と同一のプローブおよびプロトコールを使用してハイブリッド形成させた。９個の陽性クローンから培養物を拡大し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して各培地からプラスミドＤＮＡを単離した。制限消化物およびＰＣＲを使用して、単離プラスミド中のインサートの存在およびサイズを確認した。
【０３７９】
３つのクローンを、ベクタープライマーＴ３およびＴ７ならびにマウスαｄ配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用した配列分析に供した。Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓソフトウェアを使用したこれら３つのクローンとマウスｃＤＮＡとの配列比較は、３つ全てがマウスαｄのエクソン１および２の両方を含むことを示した。Ａと呼ばれる最も長いクローンは、８２８０ｋｂ長のＸｂａＩクローンであり、ＥおよびＨと呼ばれる２つのより短いクローンは、４１１２ｋｂ長の同一のＳａｃＩクローンであった。８２８０ｋｂ  ＸｂａＩクローンを、さらなる開発のために選択した。
【０３８０】
【実施例３３】
ウサギαｄのクローニング
ウサギｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング
ラットおよびマウスにおけるヒトαｄホモログの同定により、前記のヒト病態のウサギモデルに有用なウサギホモログの存在を調査した。
【０３８１】
製造者が推奨するプロトコールにしたがってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびキットに付属の試薬を使用して、全ウサギ脾臓からポリＡ＋ＲＮＡを調製した。１．６５ｇの組織から、７３μｇのポリＡ＋ＲＮＡが単離された。ウサギ脾臓ＲＮＡを使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のキットを使用して、ＺＡＰ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたｃＤＮＡを、ｐＢＫ−ＣＭＶファージミドベクターのλアーム中のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位に直接クローン化した。Ｇｉｇａｐａｃｋ（登録商標）ＩＩＧｏｌｄ（Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ）を使用して、ファージ粒子にλアームをパッケージングした。得られたライブラリーの力価は、約８×１０５粒子、平均インサートサイズ１．２ｋｂと評価された。
【０３８２】
コンフルエントなプラーク成長のプレーティングによってライブラリーを増幅し、細胞溶解物を回収した。増幅ライブラリーに、約３０，０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／１５０ｍｍプレートでＥ．ｃｏｌｉをプレートし、得られた混合物を３７℃で１２〜１６時間インキュベートしてプラークを形成させた。ファージＤＮＡを、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）に移した。膜に２つのランダムプライミング放射性標識マウスαｄＰＣＲ  ＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた。第１のプローブを、配列番号５２のヌクレオチド１４９〜９４６のＰＣＲ産物から作製した。第２のプローブは、配列番号５２のヌクレオチド２７５２〜３６５１のＰＣＲ産物由来であった。プローブをランダムプライミング（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット）によって標識し、反応混合物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−５０カラムに通過させて、非取り込みヌクレオチドを除去した。ハイブリッド形成溶液は、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、１％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド、および１×１０６ｄｐｍ／ｍｌの標識プローブから構成されていた。フィルターを、室温の２×ＳＳＰＥ／１％ＳＤＳで強く洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露して任意のハイブリッド形成プラークを視覚化した。
【０３８３】
ヒトαｄに有意な配列相同性を有する２つのクローンを同定した。クローン番号２は、約８００ｂｐ長であり、ヒトαｄの５’末端にマッピングされた。クローン番号２は、開始メチオニンおよび完全なリーダー配列を含む。クローン番号７は、約１．５ｋｂであり、開始メチオニンを含む。クローン番号７の５’末端は、クローン番号２のそれと重複する一方で、３’配列は、Ｉドメイン配列を超える位置で終結していた。クローン番号７を、プライマーウォーキング法によって完全に配列決定した。クローン番号７のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号１００および１０１に示す。
【０３８４】
クローン番号２および７から同定したウサギαｄの推定Ｎ末端アミノ酸配列は、タンパク質がヒトαｄと７３％同一であり、マウスαｄと６５％同一であり、マウスＣＤ１１ｂ、ヒトＣＤ１１ｂ、およびヒトＣＤ１１ｃと５８％同一であった。クローン番号２の核酸配列を配列番号９２に示し、推定アミノ酸配列を配列番号９３に示す。
【０３８５】
標識ウサギクローン番号７の使用およびフラグメントが由来するｃＤＮＡライブラリーの再クローニングによって、全長ウサギαｄｃＤＮＡの単離を試みた。最も巨大と同定されたクローン４９と呼ばれる１つのクローンを使用して、２５個のさらなるクローンを同定した。ネスト化欠失技術を使用して、クローン４９を完全に配列決定した。クローン４９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０２および１０３に示す。クローン番号７および４９は重複しないので、欠失配列を単離するための第１鎖ウサギ脾臓ｃＤＮＡを使用したＰＣＲでのプライマーとして使用されるようにオリゴヌクレオチドをデザインした。
【０３８６】
これら２つの部分的クローンの推定アミノ酸配列と他のロイコインテグリンのそれとの関係を、表１に記載する。
【０３８７】
【表１】
アミノ酸レベルにおけるβ２インテグリンファミリーメンバーの同一性％
2004532800.tif 000002
＊同一性が２５未満である場合、ランダムアラインメントを行い、有意ではない。
αｄクローンの単離により、トランスフェクタントの表面上または可溶性全長形態もしくは短縮形態としてタンパク質が発現する。次いで、このタンパク質を、ヒト病態のウサギモデル用のモノクローナル抗体の産生の免疫原として使用する。
【０３８８】
【実施例３４】
サルαｄの単離
親和性カラムの調製
サル脾臓からαｄを単離するための親和性カラム樹脂を調製するために、１０ｍｇの各抗ヒトαｄ抗体２１２Ｄおよび２１７Ｌを、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）を含む結合緩衝液に対して一晩透析した。製造者が推奨するプロトコールにしたがって、各透析抗体と組み合わせた１．０ｍｌの樹脂を使用して約１．０ｇのＣＮＢｒ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を調製した。得られたスラリーを４℃で一晩の回転によって混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機での１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって得られた樹脂と結合させた。非吸収上清画分を回収し、分光器によって非結合タンパク質の存在をアッセイした。結果は、全ての利用可能な抗体がゲルマトリックスに結合したことを示した。樹脂上の非結合活性基を１Ｍ  エタノールアミンにて室温で２時間ブロックし、樹脂を、結合緩衝液での一連のｐＨの高低変化で洗浄し、その後０．１Ｍ  ＮａＣ２Ｈ３Ｏ２・３Ｈ２Ｏおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）を含む酢酸緩衝液を使用して最終的に洗浄した。両樹脂を、４℃の結合緩衝液中で保存した。
【０３８９】
サル脾臓の調製
ワシントン大学地域霊長類センターから雌のマカークザルの脾臓を得た。脾臓組織に、１００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ）を注射し、小片に切り刻んだ。次いで、組織片を、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）界面活性剤を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ８．０）を含む少量の溶解緩衝液に懸濁し、−７０℃で保存した。プロテアーゼインヒビターＰＬＡ（ペプスタチンＡ、ロイペプチン、およびアプロチニンの混合物（それぞれＳｉｇｍａ））および４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フルオリドＨＣｌ（ＡＥＢＳＦ）（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を添加して、保存中のタンパク質分解を防止した。全部で６つのマカークザル脾臓が得られるまで組織を保存した。
【０３９０】
６匹のサル由来の脾臓組織をプールし、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＮａＮ３、１．０％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、１×ＰＬＡ、および０．１ｍＭ  ＡＥＢＳＦを含むＴＳＡ溶解緩衝液を含む１０秒間に３サイクルのＷａｒｉｎｇブレンダー中でホモジナイズした。溶解物を回収し、ロッキングプラットフォーム上に４℃で１時間置き、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離にて３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、ペレット化し、細胞破片を捨てた。全体積５５０ｍｌの溶解物を回収し、反応部位をブロックするために１Ｍ  エタノールアミンで前処理したＣＮＢｒ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）にて４℃で２時間溶解物のインキュベーションによって予備明澄化した。インキュベーション後、樹脂を遠心分離によって除去し、上清を回収した。
【０３９１】
親和性精製および配列決定
上記のように調製した脾臓溶解物を、半分に分け、それぞれ２１２Ｄおよび２１７Ｌ調製ＣＮＢｒ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ゲルと合わせた。得られたスラリーを、４℃で３日間回転させながら混合し、その後非吸収画分をＢｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離での１５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収した。ゲルを、１５ｍｌ遠心チューブに移し、いくらかの体積のＤ−ＰＢＳで連続的に洗浄した。約１００μｌの各ゲルアリコートを、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２．０％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０００２％ブロモフェノールブルー、１０％β−メルカプトエタノール（最終濃度５％）を含む還元サンプル緩衝液中で短時間ボイルし、６．０％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にロードし、タンパク質を分離した。ゲルを、クーマシー染色し、多数のバックグラウンドタンパク質と共にαｄおよびＣＤ１８と一致する分子量のタンパク質が検出された。
【０３９２】
αｄと類似の分子量を有するタンパク質の精製を改良するために、結合タンパク質を含む各ゲルの２つの１００μｌアリコートを、異なる手段で洗浄した。１つの方法では、ゲルを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１．０％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（登録商標）（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で数回洗浄し、第２の方法では、ゲルを同様に洗浄するが、結合タンパク質を、０．０５Ｍ  グリシン（ｐＨ２．４）を含む最終洗浄で溶出した。上記のように、溶出タンパク質を還元緩衝液中で短時間ボイルし、６．０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。クーマシー染色で、低ｐＨグリシン緩衝液で洗浄した樹脂からαｄおよびＣＤ１８と一致するタンパク質のみが検出されたので、この単離法を選択した。配列決定用のタンパク質を単離するために、残存するＣＮＢｒ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂を上記のように４回洗浄し、約３／４の樹脂を２．０ｍｌの０．０５Ｍ  グリシン（ｐＨ２．４）に懸濁し、激しくボルテックスした。樹脂を３分間の遠心分離によってペレット化し、非吸収画分を回収した。次いで、ゲルをぶり新緩衝液で１回を越えて洗浄し、この洗浄物を前の非吸収画分と共にプールした。プールした画分を、Ｄ−ＰＢＳに対して４℃で一晩透析した（２回交換する）。透析後、サンプルを乾燥させて体積を１．０ｍｌに減少させた。
【０３９３】
配列決定のために、溶出物を、７．０％の分離用ゲルで分離し、実施例２に記載のようにタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）に移した。簡単に述べれば、ゲルを脱イオン水で１回洗浄し、１０％メタノールを含む１０ｍＭ  シクロヘキシルアミノ−プロパンスルホン酸緩衝液（ＣＡＰＳ）（ｐＨ１０．５）で１５〜４５分間平衡化した。ＰＶＤＦ膜をメタノールおよび蒸留水の両方でリンスし、ＣＡＰＳトランスファー緩衝液で１５〜３０分平衡化した。タンパク質をＰＤＶＦ膜に７０ボルトで３時間移し、その後これらを濾過した０．１％Ｒ２５０クーマシー染色液で１０分間染色した。膜を５０％メタノール／１０％酢酸で３回洗浄して脱色し（各洗浄は１０分間）、１回を超えて濾過水で洗浄し、乾燥させた。
【０３９４】
２１２Ｄおよび２１７Ｌ結合樹脂から約１５０ｋＤおよび９５ｋＤの２つの主要なタンパク質バンド検出され、これらは先に泳動した分析スケールのゲルで検出されたタンパク質と一致していた。１５０ｋＤのタンパク質のすぐ下に存在する２１７Ｌ結合樹脂由来の膜上にあまりはっきりしないバンドが認められたが、このバンドは膜の乾燥後検出されなかった。各膜由来の１５０ｋＤのバンドを膜から切り出し、製造者が推奨するプロトコールにしたがってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）モデル４７３Ａタンパク質シークエンサーで直接配列決定した。
【０３９５】
結果は、２１２Ｄ結合樹脂を使用して単離したサルタンパク質のアミノ末端配列は配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を有し、２１７Ｌ結合樹脂を使用して単離したサルタンパク質のアミノ末端配列は配列番号１１０に記載の配列を有することを示した。配列番号１１０中の「Ｘ」は、確定できない残基を示す。
２１２Ｄ結合タンパク質  ＮＬＤＶＥＥＰＴＩＦＱＥＤＡ（配列番号１０９）
２１２Ｌ結合タンパク質  ＮＬＤＶＥＥＰＴＩＦＸＥＤＡ（配列番号１１０）
サル配列とβ２インテグリンファミリーにおけるヒトαｄおよび他のα鎖のアミノ末端配列との比較を表２に示す。
【０３９６】
【表２】
サルαｄアミノ末端配列とヒトβ２αサブユニットとの比較
2004532800.tif 000003
配列同一性に基づいて、２１２Ｄおよび２１７Ｌは共にマカークザルおよびヒトの両方のαｄを認識すると結論付けることができる。
【０３９７】
【実施例３５】
２１７Ｌ抗原の特徴付け
以前の実施例のサル脾臓から沈殿したタンパク質のＮ末端配列に基づいて、抗体２１７Ｌおよび２１２Ｄはサルおよびヒトの両方のαｄを認識すると結論付けることができる。しかし、免疫細胞化学（ＩＣＣ）分析および免疫沈降実験は、２１７Ｌは２１２Ｄと共有していないさらなる反応性を有することを示す。全てのα鎖に対する抗体を使用したＦＡＣＳおよびＩＣＣ実験では２１７ＬのＣＤ１１ｃ、最も密接に関連するロイコインテグリンα鎖、およびＣＤ１１ｂとの交差反応が除外された。従って、２１７Ｌ抗体はまたαｄまたはαｄと配列相同性を共有する新規のα鎖の高次構造変異体、グリコシル化変異体、またはスプライス変異体のいずれかを認識するかもしれない。
【０３９８】
ＣＤ１１ｃとの関係において染色パターンが異なる類肉腫肺組織（実施例１８を参照のこと）中の２１７Ｌによって認識される抗原の固有の分布により、抗原は生物学的有意性を有すると示唆される。したがって、２１７Ｌ抗原の有意性をより完全に理解するために、タンパク質分析およびタンパク質をコードする基礎的なＤＮＡが必要であり、種々のアプローチが意図される。
【０３９９】
抗体２１７Ｌを使用してヒト樹状細胞または末梢血由来のタンパク質複合体の免疫沈降を行い、その後沈降タンパク質のＮ末端配列を決定する。配列分析により、末梢血細胞によって認識されるタンパク質はαｄとアミノ末端同一性を共有するかどうかが明らかとなる。次いで、樹状細胞または末梢血細胞から沈降したタンパク質を、脱グリコシル化酵素で処理し、他の供給源から沈降したＣＤ１１ｃおよびαｄと比較し、アミノ酸一次配列の分子量を比較する。
【０４００】
さらに、樹状細胞ＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、低ストリンジェンシーでαｄｃＤＮＡで探索する。非αｄ配列がクローン中に存在するかどうかを同定するために、反応性クローンを、クローンの全長についての核酸配列決定によって分析した。
【０４０１】
【実施例３６】
αｄの治療有用性同定用の動物モデル
イヌにおける免疫組織学データおよびラットおよびマウスにおけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成により、脾臓αｄは主に赤脾髄に存在するマクロファージによって発現され、αｄは髄索および洞で見出されると同定された。発現パターンは、モノクローナル抗体Ｆ４／８０およびＳＫ３９によって定義される２つのマウス抗原について報告されているものに非常に類似している。これらのマウス抗原の生化学的特徴付けにより、これらの抗原はαｄと異なり、おそらくαｄはマウスＦ４／８０およびＳＫ３９抗原と同一のマクロファージサブセットを定義することが示された。
【０４０２】
マウスでは、ＳＫ−３９陽性マクロファージが脾臓の赤脾髄中で同定され、これらは循環およびリンパ節髄質由来の外来物質のクリアランスに関連し得る（Ｊｕｔｉｌａら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．、５４、３０〜３９、１９９３）。さらに、チオグリコール酸炎症性腹膜腔に漸増するマクロファージもまたＳＫ３９抗原を発現する。まとめると、これらの所見により、ＳＫ３９＋細胞もまたαｄ＋である場合、これらの細胞は脾臓中の外来物質のクリアランスを担い、マクロファージが有意な役割を果たす炎症に関連することが示唆される。
【０４０３】
αｄの機能が不明なままである一方で、他のより十分に特徴付けられたβ２インテグリンは、細胞移動を促進し、食作用を増強し、細胞−細胞相互作用を促進する広範な種々の接着事象（全て炎症過程を上方制御する事象）に関与することが示されている。したがって、正常なαｄ機能の妨害によりマクロファージが有意な役割を果たす炎症を妨害し得るということが非常に妥当である。このような抗炎症効果は以下に起因し得る：ｉ）炎症部位へのマクロファージ漸増の遮断、ｉｉ）炎症部位でのマクロファージ活性化の予防、またはｉｉｉ）特異的自己免疫応答または巻き添え細胞損傷の結果のいずれかによる正常な宿主組織を損傷させるマクロファージエフェクター機能の妨害。
【０４０４】
マクロファージが疾患過程において有意な役割を果たすことが証明されている病態には、多発性硬化症、関節炎、移植片アテローム性動脈硬化症、いくつかの形態の糖尿病、および炎症性腸疾患が含まれる。以下に考察した動物モデルにより、これらのヒト障害の多数の局面が得られることが示されている。αｄ機能のインヒビターをこれらのモデル系で試験して、対応するヒト疾患を治療する可能性があるかどうかを同定する。
【０４０５】
移植片動脈硬化症
心臓移植は、いくつかの末期心臓病型のための治療介入の承認された形態である。シクロスポリンＡの使用は１年生存率を８０％に増加させ、１年以上生存した心臓移植片の主要な原因として進行性移植片動脈硬化症が発症する。現在の研究では、心臓移植から３年後の有意な移植片動脈硬化症の発症率は３６〜４４％の範囲であることが見出されている（Ａｄａｍｓら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５３、１１１５〜１１１９、１９９２；Ａｄａｍｓら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５６、７９４〜７９９、１９９３）。
【０４０６】
移植片動脈硬化症は、心血管壁全体に影響を与え、しばしば脂質沈着を伴う散在性、閉塞性、内膜性病変からなる。移植片動脈硬化症の病因は未知であるが、おそらくドナーとレシピエントとの間の組織適合性の相違に関連し、本質的には免疫学的なものである。組織学的に、内膜肥厚領域は、主にマクロファージから構成されが、時折Ｔ細胞が認められる。したがって、αｄを発現するマクロファージは、移植片動脈硬化症の誘導および／または発症に優位な役割を果たし得る可能性がある。このような場合、モノクローナル抗体またはαｄ機能の小分子インヒビター（例えば、可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ）は、心臓移植を受けて移植片動脈硬化症のリスクがある個体を予防することができる。
【０４０７】
心臓移植片のアテローム性動脈硬化症最も生命を脅かすにもかかわらず、移植片動脈硬化症もまた、腎臓および肝臓を含む他の固体器官移植片で認められる。αｄ遮断薬の治療での使用により、他の器官移植片での移植片動脈硬化症を予防し、移植片不全に起因する合併症を減少させることができる。
【０４０８】
ラットの移植片動脈硬化症の１つのモデルは、副組織適合性障壁を通過する異所性心臓同種移植片を含む。ルイス心臓同種移植片を、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ適合性Ｆ−３４４レシピエントに移植し、８０％の同種移植片が少なくとも３週間生存するが、２５％の移植片の生存は不確定である。このグレードの低い移植片拒絶の際、ドナー心臓に動脈硬化病変が形成される。１２０日目の同種移植片の動脈病変は、典型的には、ヒト心臓同種移植片の拒絶で見出される移植片動脈硬化症病変と外観上は区別不可能な散在性線維性内膜肥厚を有する。
【０４０９】
ラットに副組織適合性抗原が適合しない心臓を移植する（例えば、ルイスにＦ−３４４を移植する）。ラットαｄまたはαｄの小分子インヒビターに特異的なモノクローナル抗体を、移植片レシピエントに周期的に投与する。治療により、非拒絶ドナー心臓の移植片動脈硬化症の発症率が減少すると予想される。ラットのαｄモノクローナル抗体または小分子インヒビターでの治療により、予防治療は制限されないであろう。αｄ機能の遮断により、マクロファージ媒介炎症が減少し、移植片の動脈損傷が逆転することも予想される。
【０４１０】
コレステロールを与えたウサギのアテローム性動脈硬化症
ウサギに、コレステロール補助食品を含むアテローム発生食を約１２〜１６時間与えたラットは、上行大動脈の内腔表面のほとんどを対象とする内膜病変を発症する（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、７、９〜２３、１９８７；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、７、２４〜３４、１９８７）。これらのウサギに認められるアテローム性動脈硬化症病変は、ヒトの病変と類似する。病変は、多数のＴ細胞（そのほとんどが記憶Ｔ細胞に関連するマーカーであるＣＤ４５ＲＯを発現する）を含む。浸潤Ｔ細胞の約半分は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原も発現し、ＩＬ−２受容体を発現するものもあり、多数の細胞が活性化状態であることが示唆される。
【０４１１】
コレステロールを与えたウサギで見出されるがげっ歯類モデルでは明らかに認められないアテローム性動脈硬化症病変の１つの特徴は、泡沫細胞が豊富な病変の蓄積である。泡沫細胞マクロファージは、特異的受容体による酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込みに起因すると考えられる。酸化ＬＤＬ粒子は、内皮細胞および平滑筋細胞を含むいくつかの細胞型に誘導であることが見出されている。マクロファージによるおそらく有毒な酸化ＬＤＬ粒子の取り込みにより刺激原として作用してマクロファージ活性化を駆動し、アテローム性動脈硬化症病変に関連する炎症を引き起こす。
【０４１２】
一旦ウサギαｄに対するモノクローナル抗体が作製されると、コレステロールを与えたウサギを治療する。治療には、αｄ＋マクロファージが疾患過程に関連することを証明するために、αｄモノクローナル抗体または処分しインヒビターの予防的投与が含まれる。さらなる研究により、αｄまたは小分子インヒビターのモノクローナル抗体がアテローム発生食を与えたウサギで検出された血管損傷を逆転することができることが証明される。
【０４１３】
インスリン依存性糖尿病
ＢＢラットは、７０〜１５０日齢でインスリン依存性糖尿病を自発的に発症する。免疫組織化学を使用して、疾患初期に膵島に浸潤するＭＨＣクラスＩＩ＋、ＥＤ１＋マクロファージを、検出することができる。多数のマクロファージは、細胞破片または正常細胞の食作用に従事するようである。疾患が進行するにつれて、膵島に浸潤した大多数のマクロファージが認められるが、有意な数のＴ細胞およびその後Ｂ細胞もまたその部位に漸増するようである（Ｈａｎｅｎｂｅｒｇら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３２、１２６〜１３４、１９８９）。
【０４１４】
ＢＢラットにおける糖尿病の発症は、初期マクロファージ浸潤およびその後のＴ細胞漸増の両方に依存するようである。マクロファージに有毒なシリカ粒子でのＢＢラットの治療は、膵島の初期マクロファージ浸潤の遮断に有効であった。初期マクロファージ浸潤が認められない場合、自己免疫性リンパ球集団によるその後の組織損傷は起こらない。疾患のＴ細胞関連期を遮断するモノクローナル抗体ＯＸ−１９（ラットＣＤ５に特異的）またはモノクローナル抗体ＯＸ−８（ラットＣＤ８に特異的）の投与はまた、糖尿病発症の抑制に有効である。
【０４１５】
このモデルの病理学におけるマクロファージの中心的役割は、αｄ機能のインヒビターの試験には魅力的である。一般にインスリン依存性糖尿病を発症しやすいラットを、αｄまたは小分子インヒビターに対するモノクローナル抗体で治療し、疾患の発症について評価する。臨床的発症の予防または遅延は、αｄが膵島細胞のマクロファージによる損傷に中心的役割を果たすことの証拠である。
【０４１６】
炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の研究で使用した動物モデルを、一般に、有毒刺激原（例えば、酢酸またはトリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール）の直腸内投与によって惹起される。これらの薬剤で誘導された結腸炎症は、科学的または代謝損傷の結果であり、ヒトＩＢＤに関連する慢性および自発的に再発する炎症を欠く。しかし、Ａ群またはＤ群の連鎖球菌由来の精製ペプチドグリカン−ポリサッカリド（ＰＧ−ＰＳ）ポリマーの漿膜下注射を使用した最近記載されたモデルは、ヒトＩＢＤのより生理学的に関連するモデルであるようである（Ｙａｍａｄａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１０４、７５９〜７７１、１９９３）。
【０４１７】
このモデルでは、ＰＧ−ＰＳを、遠位結腸の漿膜下層に注射する。得られた炎症反応は、注射から３日後の初期急性エピソードおよびその後の３〜４週間後の自発的慢性期の二相性を示す。後期応答は、本質的には肉芽腫性であり、結腸肥厚、接着、慢性結節、および粘膜病変を引き起こす。粘膜損傷に加えて、ＰＧ−ＰＳ大腸炎は、貧血性関節炎および肉芽腫性肝炎を頻繁に引き起こす。疾患の腸管外発現により、このモデルは、有意数の活性クローン病患者は、関節疾患および肝臓胆管炎症を罹患するという点でクローン大腸炎研究に魅力的である。
【０４１８】
肉芽腫性病変は、単球／マクロファージ系統の細胞の漸増およびその後の活性化を引き起こす慢性炎症の結果である。クローン病における肉芽腫性病変の存在および上記の動物モデルは、αｄモノクローナル抗体またはαｄ機能の他のインヒビターのための魅力的な臨床標的が得られる。αｄ機能のインヒビターＩＢＤに関連する病変の形成または疾患で認められる逆組織損傷でさえも遮断すると予想される。
【０４１９】
関節炎
関節炎は、好中球、Ｔリンパ球、および食作用マクロファージを含む種々の炎症性細胞型に関する多因子疾患のようである。種々の関節炎モデルが存在するにもかかわらず、連鎖球菌細胞壁プロテオグリカン調製物は、ヒト疾患に最も類似した障害を引き起こす。
【０４２０】
ラットでは、連鎖球菌細胞壁は、疾患の進行エピソードの反復によって特徴付けられる末梢関節炎症を誘導し、その後寛解し、最終的に数ヶ月にわたり関節が破壊される（Ｃｒｏｍａｔｉｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４６、１５８５〜１６０２、１９７７；Ｓｃｈｗａｂら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５９、４４３６〜４４４２、１９９１）。疾患の慢性期に、単核食細胞またはマクロファージは、滑膜破壊の主要な役割を果たすと考えられる。さらに、滑膜へのマクロファージ漸増を抑制する薬剤により、炎症および関節炎の病理学的特徴が有効に軽減する。
【０４２１】
関節炎を引き起こす滑膜破壊におけるマクロファージの中心的役割は、αｄに対するモノクローナル抗体またはαｄ機能のインヒビターがこの疾患の治療において治療能力を有すると予想される。他のモデルで以前に記載されているように、予防的に投与したαｄモノクローナル抗体または小分子インヒビターは、関節炎を遮断または緩和して滑膜破壊を予防すると予想される。αｄ機能を阻害する薬剤もまた、関節へのさらなるマクロファージの漸増を防止するかマクロファージ活性化の遮断によって進行中の炎症を緩和することができる。基本的な結果は、関節破壊の進行を逆転し、組織修復を促進することである。
【０４２２】
多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）の病因は不明であるが、一般に、この疾患は中枢神経系中の自己抗原を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介されて炎症カスケードを開始すると認められている。得られた免疫応答により、疾患に寄与する活性化マクロファージを含むさらなる炎症性細胞を漸増させる。実験用自己免疫脳髄膜炎（ＥＡＥ）は、ＭＳのいくつかの局面を再現した動物モデルである。最近、炎症性マクロファージ上に存在するＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に反応性を示すモノクローナル抗体（Ｈｕｉｔｉｎｇａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３、７０９〜７１５、１９９３）は、臨床疾患および組織学的疾患を遮断することが示された。結果により、αｄに対するモノクローナル抗体または小分子インヒビターはＥＡＥにおける炎症反応の遮断に有効なようであることが示唆される。このような薬剤もまた、ＭＳの治療における重要な治療用途がある。
【０４２３】
免疫複合体肺胞炎
肺胞管、気道、結合組織、および肺の胸膜腔に存在する肺胞マクロファージは、吸引した環境因子に対する肺の最初の防御ラインを示す。細菌由来ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ、および免疫複合体を含む因子による刺激に応答して、肺胞マクロファージは、活性酸素ラジカルおよび窒素中間体を含む種々の強力な炎症メディエーターを放出する。スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、および一酸化窒素（ＮＯ・ ）は病原体の根絶および腫瘍標的の溶解に重要な機能を有する一方で、これらの因子は正常な組織を損傷し得る。
【０４２４】
免疫複合体肺胞炎のラットモデルでは、肺胞マクロファージからのＮＯ・放出は、肺損傷の多くを媒介することが示されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８８、６３８〜６３４２、１９９１）。ＮＯ・はまた、皮膚脈管炎を含む損傷を媒介する他の免疫複合体中のメディエーターとして関与しており（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、前出）、糸球体腎炎などの疾患において潜在的に役割を果たし得る。
【０４２５】
ＮＯ・媒介組織損傷は、免疫複合体が関与する炎症に制限されない。例えば、ＰＭＡ、ＬＰＳ、またはＩＦＮ−γなどの因子によって刺激された小グリア細胞は、希突起膠細胞を死滅させることができるレベルでＮＯ・を生成する（Ｍｅｒｒｉｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１、２１３２、１９９３）。膵島細胞もまた、ＮＯ・に感受性を示すことが見出されており、このメディエーターのマクロファージ放出は、糖尿病を引き起こす組織損傷に関与している（Ｋｒｏｎｃｋｅら、ＢＢＲＣ、１７５、７５２〜７５８、１９９１）。より最近では、ＮＯ・放出は、内毒素ショックで役割を果たすと最終的に示した（ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇら、Ｃｅｌｌ、８１、６４１〜６５０、１９９５）。リポポリサッカリド（ＬＰＳ）を投与した場合、正常な野生型マウスは、重症で進行性の動脈圧の低下を経験し、死に至る。しかし、誘導性一酸化窒素が欠損したマウスは、ＬＰＳに応答して動脈圧はあまり低下せず、全て治療で生存した。
【０４２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、αｄの遮断は、ＮＯ・放出を含むマクロファージ（または一般にαｄを発現する白血球）の活性化のいくつかの局面の遮断に有効であることを示す。抗αｄポリクローナル抗血清（ウサギでラットαｄＩドメインポリペプチドに対して作製）の存在下ＩＦＮ−γで刺激した肺胞マクロファージは、有意に少量の亜硝酸塩／硝酸塩（コントロール抗血清で処理したマクロファージよりのＮＯ・の分解生成物）を生成することが示された。この所見は、αｄ、特にＩドメインに対するモノクローナル抗体は、ＭＳ、糖尿病、肺炎、および内毒素ショックで潜在的に使用される強力な抗炎症薬であり得ることを示す。さらに、広範な種々の白血球型の機能に影響を与えるＣＤ１８と対照的に、αｄ分布の制限は、マクロファージ（または一般にαｄを発現する白血球）の活性化の防止についてＣＤ１８よりも魅力的な標的となり得る。
【０４２７】
ラットＩｇＧ免疫複合体誘導性肺胞炎は、急性肺損傷の理解において重要な広範に使用されているモデルである。気管カニューレ挿入を介した肺への抗ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）抗体の滴下およびＢＳＡの静脈内注射によって損傷を惹起する。肺の微小血管中での免疫複合体の形成により、補体が活性化されて肺に好中球が漸増する。おそらく、血液由来の白血球の管外遊出後の肺での免疫複合体の形成およびその後の肺上皮を通過する白血球の移動。疾患の進行に関与する活性化内皮細胞由来のラジカル（ＴＮＦ−αおよび一酸化窒素（ＮＯ・））、好中球、およびマクロファージを含むメディエーターのその後の放出。疾患の病理学的特徴には、浮腫を引き起こす血管透過性の増加および肺胞腔に存在する多数の赤血球およびＰＭＮの存在が含まれる。
【０４２８】
αｄのＩドメインに特異的なポリクローナル抗血清を、免疫複合体誘導性肺胞炎のラットモデルで試験した。抗αｄポリクローナル血清を、気管カニューレ挿入によって抗ＢＳＡを肺に移入すると同時に投与した。その後、肺損傷に起因する浮腫を定量するための微量の１２５Ｉ標識ＢＳＡ（約８００，０００ｃｐｍ）と共にＢＳＡの静脈内投与によって肺損傷を惹起した。４時間肺損傷を進行させ、損傷を肺透過値（肺中の１２５Ｉ標識ＢＳＡと１．０ｍｌの血液中に存在する標識の量との比）を使用して評価した。典型的には、ポジティブコントロール速度についての肺透過値は、０．６と０．８との間の範囲であり、ネガティブコントロール（ＢＳＡを投与していないラット）の肺透過値は、０．１〜０．２の範囲である。
【０４２９】
最初の研究は、抗αｄポリクローナル抗血清は肺透過値を５０％を超えて減少させ、肺損傷を劇的に緩和することを示す。組織学的には、抗ＣＤ１８での治療により、透過値は６０％に減少する。これらの所見は、αｄは急性肺損傷の際の最も重要なβ２インテグリンであるが、抗血清が血液からの白血球溢出または肺上皮を通過する移動を妨害するかどうかを正確に同定できないことを示す。
【０４３０】
αｄが肺損傷を緩和するさらなる証拠として、気管支肺胞液中のＴＮＦ−αレベルを評価した。抗αｄ抗血清での処理により、ＴＮＦ−αレベルを約１／４に減少させることが見出された。ＴＮＦ−αは急性肺炎の重要なメディエーターとして考えられており、炎症性細胞活性化、および組織損傷部位への炎症性細胞の漸増を担う。おそらく、抗αｄ抗血清は、免疫複合体肺胞炎の形成時の常在配合マクロファージの活性化を遮断し、それによりＴＮＦ−αおよびＮＯ・の放出を緩和し、これらの因子に起因するその後の組織損傷および好中球の漸増を減少させる。
【０４３１】
ＬＧＬ白血病のＦ３４４ラットモデル
Ｆ３４４ラットにおけるＬＧＬ白血病は、１９８０年代初期に安定なＮＫ細胞活性を有する移植可能な白血病として最初に記載された。この白血病は、ヒトＴγリンパ腫およびＴ細胞リンパ性白血病の可能なモデルとして提案されている（Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１１１、１〜１０、１９８２；Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１１９、５１７〜５１９、１９８５；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３２、５３４〜５４０、１９８４）。このモデルにより、ＬＧＬおよびＮＫ細胞機能研究用の細胞が豊富に得られる。特に関心があるのは、実施例２６に記載のＦＡＣＳ分析によってハムスター抗ラット抗体２０５Ｃを使用して検出される、これらの細胞表面上のαｄの存在である。この所見を考慮して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、以前に記載の細胞傷害性アッセイを使用する）およびｉｎ  ｖｉｖｏでのαｄの役割を試験した。
【０４３２】
ＬＧＬ白血病の病理学的特徴には、重症巨脾症、青斑状肝臓、末梢リンパ節の拡大、および肺、脳、およびリンパ節の出血が含まれる。αｄは正常なラット脾臓の赤脾髄（脾臓マクロファージ上）に存在し、ＬＧＬ白血病の特質は重症巨脾症であるので、αｄ陽性ＮＫ腫瘍細胞はまた、未だ定義されていないリガンドでこの場所で増殖する「ホーム」または範囲であると推測された。この仮説を試験するために、腫瘍細胞を放射性標識し、αｄ抗体処理を行うか行わないでレシピエントラットに注射した。３時間後にこれらの動物由来の脾臓を取り出し、ＮＫ腫瘍細胞の存在を同定した。使用した方法のより完全な説明およびおよび試験結果を以下に示す。
【０４３３】
ＬＧＬ白血病ラットの脾臓から獲得し、以下のように調製した腫瘍細胞を、各実験の２〜４週間前にレシピエントラットに養子的に免疫伝達した。組織学およびＦＡＣＳ分析による以前の研究から、養子免疫伝達の３〜４週間後に、腫瘍が急速に増殖し、それにより巨脾症が発症することが知られていた。第１の実験では、４週間腫瘍細胞に曝露した動物から脾臓を取り出した。鋏による脾臓の小片への切り刻みおよびＤ−ＰＢＳの存在下でのメッシュスクリーンによる小片の通過により単一細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液を５０ｍｌのチューブに回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機にて１５００ｒｐｍで１０分間室温で遠心分離した。上清を捨て、細胞を３０ｍｌのＤ−ＰＢＳ中に懸濁した。約５．０ｍｌのこの細胞懸濁液を、５．０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅに重層し、１５００ｒｐｍで３０分間勾配遠心分離した。これらの勾配物由来の細胞層を回収し、プールし、血球計で計数した。各レシピエントラットに１．０×１０７個の細胞が投与されるように洗浄中およびシリンジでの調製による細胞損失を考慮してわずかに過大評価して細胞数を調整した。細胞を、ＮＫ「試験培地」（ＲＰＭＩ−１６４０＋抗生物質＋２％ＦＢＳ）に懸濁し、１０ｍＣｉの５１Ｃｒにて３７℃で１時間標識した。インキュベーション後、細胞懸濁液の体積を試験培地で５０ｍｌに増加し、１２００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を上記のように２回以上洗浄した。標識細胞を、最終濃度１×１０７細胞／ｍｌに懸濁し、レシピエントラットへの注射前に抗ラットα抗体およびコントロールＩｇＧ１抗体の存在下または非存在下で予備インキュベーションを行った。１動物あたりに使用した抗体の最終濃度を、５．５ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／動物に調整した。各条件下で最低４匹の動物を使用した。
【０４３４】
レシピエントラットを秤量し、１５０〜２００μｌのＡＣＥ溶液（０．２５ｍｌのケタミン、０．２ｍｌのＡｃｅ、および０．８ｍｌのロムピンを含む）を皮下注射して麻酔した。各抗体治療から、１．０×１０７個の細胞を、動物に静脈内注射した。約３００μｌの各細胞懸濁液をガンマカウンターを使用して試験して、全ｃｐｍ注射／ラットを同定した。標識ＮＫ細胞を３時間ラットに循環させた後、動物を屠殺し、１．０ｍｌの末梢血を大動脈穿刺によって採血した。各動物から脾臓を取り出し、秤量し、ガンマカウンターを使用して計数した。脾臓に戻る細胞の割合を同定するために、１分間あたりの数（ｃｐｍ）／脾臓を、ラットに注射した既知の全ｃｐｍで割った。末梢血中のｃｐｍを同定するために、全ラット重量あたり約６．０％の血液が存在すると仮定した。１．０ｍｌの血液中のｃｐｍを、６．０％の総動物重量とかけて血液中の全ｃｐｍを同定した。次いで、この数を各動物に注射したｃｐｍの総数で割って、血液中に残存する割合を得た。
【０４３５】
第１の実験では、抗体２２６Ｂ、２２６Ｇ、２２６Ｈ、２２６Ｉ、２０Ｃ５Ｂ（非ブロッキングＣＤ１８抗体）、およびコントロール抗体を使用した。抗体２２６Ｂおよび２２６Ｇは、コントロール抗体および他の２つの２２６抗体と比較して脾臓に戻ってくる細胞数が有意に減少するようであり、コントロール抗体とのインキュベーション後では約７〜８％の標識細胞が戻ってくる一方で、２２６Ｂおよび２２６Ｇ抗体とのインキュベーション後では約６％の細胞が戻ってきた。血液中の全ｃｐｍの割合（０．９％と１．４％との間）は、２２６Ｂ（他の全ての群よりも低い値）以外は治療間で顕著な相違は認められなかった。
【０４３６】
第２の実験では、上記定義のプロトコールをいくらか調整した。第１に、条件あたりの動物数を４匹に増加し、第２に、腫瘍保有ラット由来の脾臓を上記の養子免疫伝達から４週間後よりもむしろ２．５週間後に取り出した。同一の様式でＮＫ細胞を正確に調製し、上記定義の用量での抗体２２６Ｂ、２２６Ｇ、またはコントロール抗体のいずれかとのインキュベーション後にレシピエント動物に注射した。再び標識細胞を３時間循環させ、その後上記のように動物を屠殺し、血液および脾臓を回収した。さらに、２匹の動物／条件由来の組織を取り出して、腫瘍細胞の他の所在を同定した。これらの組織には、肝臓、脳、胸腺、肺、長骨（骨髄用）、および腎臓が含まれる。
【０４３７】
結果は、コントロールＩｇＧ１では、約３２％の腫瘍細胞が脾臓中に存在するが、２２６Ｂおよび２２６Ｇは共にそれぞれ脾臓中の標識細胞数が２８％および２９％に減少することを示した。血液中の細胞の割合各抗体で類似しており、全ｃｐｍの約３〜４％が血液中で見出され、２２６Ｇ抗体治療では他の２つの群よりもわずかに低かった。
【０４３８】
組織分布は、治療群間で類似しており、肝臓では全ｃｐｍの２７％、脳では０．０５％、胸腺では０．１０％、肺では１５％、腎臓では０．８０％、長骨では１．３％であった。
【０４３９】
第３の実験では、上記の３つの治療群の統計的相違を検出するために、条件あたりの動物数を増加させた（ｎ＝６または７）。実験前に腫瘍細胞を注射した動物由来の脾臓を再び使用し、上記と同様の方法で調製した。同一の様式で細胞を標識し、動物に注射し、３時間循環させた。この実験では、使用動物が多数であるために血液サンプルおよび脾臓のみを動物から回収した。
【０４４０】
結果は、コントロール群では約３０％の標識細胞が脾臓に戻ってくるが、２２６Ｂ抗体治療細胞では２５％、２２６Ｇ抗体治療細胞では２７％しか脾臓で見出されないという点で第２の実験と一致した。血液値は、群間で大きな相違は認められず、コントロール群では全ｃｐｍの約１７％が血液中で見出され、２２６Ｂおよび２２６Ｇ治療群ではそれぞれ１５．８％および１４．７５％が見出された。
【０４４１】
治療群間の相違を試験するには３時間の測定点が適切であるかどうかを同定するために、第４の実験を少し調整した。さらなる抗ＣＤ１８抗体２０Ｃ５Ｂを試験抗体のパネルに添加すること以外はレシピエント動物への注射と同一の方法で再び細胞を単離および調製した。さらに、各条件で４匹の動物のみを使用した。この実験では、注射後に細胞を３０分だけ循環させ、その時点で血液サンプルを採取し、動物から脾臓を取り出した。
【０４４２】
３０分の測定点では、脾臓中の全ｃｐｍは、第２および第３の実験で認められた値よりも１２〜１３％減少した。脾臓サンプルでの全ての治療群間で明らかな相違は認められなかったが、抗体２２６Ｂで処理した群の４匹の動物のうちの２匹の値がわずかに低かった。血液値は全群間でさらに類似しており、血液中で見出された全ｃｐｍの約６％〜７％であった。２２６Ｂおよび２２６Ｇ抗体治療動物由来の測定点のみで、血液群間の顕著な相違がより拡大した。これらの所見により、αｄは白血球の脾臓への帰巣で役割を果たすことが示唆された。実験は、帰巣には数時間が必要であり、αｄ特異的モノクローナル抗体での最大阻害は３時間で起こることを示す。
【０４４３】
多発性硬化症およびアテローム性動脈硬化症のマカークザルモデル
このクローナル抗体２１２Ｄおよび２１７Ｌは、マカークザル脾細胞との交差反応に対する免疫細胞化学染色および免疫沈降によって示された。認識特異性を、マカークザル脾臓由来のαｄ種ホモログの免疫沈降およびアミノ末端配列決定によって確認した（実施例３４）。前の所見を考慮して、２つの抗体を使用して、実験用自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）またはアテローム性動脈硬化症研究においてマカークザルから得た組織を染色した。これらの疾患の両方を、ＥＡＥ中のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはアテローム性動脈硬化症における低密度リポタンパク質を取り込んだ貪食マクロファージの病変への浸潤によって記録した。ＭＢＰまたは脂質貪食マクロファージを、形態学的またはオイルレッドＯ（ＯＲＯ）もしくは抗体Ｈａｍ５６（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）での染色によって同定することができる。ヒト組織中のαｄ発現を特徴付けるためにこれらの研究で使用したプロトコールを、実施例１８に記載する。
【０４４４】
リンパ球およびマクロファージの浸潤によって、ＥＡＥを含むマカークザル脳由来の切片を作製した。αｄの発現は、ＭＢＰの先の取り込みを示すＯＲＯで染色された病変中のマクロファージのサブセットに局在していた。ＯＲＯ染色陰性の病変は、αｄ発現も陰性であった。この結果により、ＯＲＯ染色とαｄとの間の直接的相関が示唆される。抗体２１７Ｋ、２１７Ｉ、および２１７Ｈを使用して類似の結果が得られた。
【０４４５】
高脂肪食を与えたマカークザルの胸部および腹部動脈のいずれかからアテローム性動脈硬化症病変を得た。ヒトでは両病変で損傷が認められたが、病理学的に進行する損傷は腹部大動脈でより頻繁に認められた。本研究で試験した損傷を、５つの異なる段階（Ｉ〜Ｖ）および正常に分類した。段階（ＩＶ／Ｖ）損傷は腹部大動脈に由来し、残りは、胸部大動脈に由来した。
【０４４６】
初期段階損傷（Ｉ／ＩＩ）では、マクロファージ浸潤はほとんど認められず、αｄ発現レベルは低いか存在しなかった。より遅い段階の損傷では、泡沫細胞浸潤がより多く、αｄ発現が検出可能である。
【０４４７】
他のロイコインテグリンα鎖サブユニットの染色パターンは、両組織でのαｄ発現と重複するが同一ではなかった。最も注目すべき点は、非αｄロイコインテグリンのαサブユニットを、抗αｄ抗体で染色されないリンパ球で検出されたことである。
【０４４８】
これらの結果により、αｄ発現は、両動物モデルの貪食マクロファージに特徴的でありうることが示唆される。しかし、αｄが食作用または抗原提示などのいくつかの後続過程に直接関連するかどうかは不明である。
【０４４９】
【実施例３７】
前臨床モデルにおけるαｄの発現
種々の病態におけるαｄの異なる発現を評価するために、動物疾患モデル由来の組織切片を、上記のように産生させた抗αｄポリクローナル血清で染色した（実施例２２を参照のこと）。正常または罹患ラット由来の組織を、６μｍ厚に切断し、室温のＳｕｐｅｒ  Ｐｌｕｓ（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）スライド上で風乾した。乾燥後、使用まで切片を−７０℃で保存した。使用前に、スライドを−７０℃から取り出し、約５分間５０℃に置いた。切片を冷（４℃）アセトン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、室温で１０分間ブロックし、室温で乾燥させた。各切片を、３０％正常ラット血清（Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、５％正常ヤギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および１％ウシ血清（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の１×ＴＢＳ溶液を含む１５０μｌの溶液で３０分間ブロックし、その後溶液を切片から穏やかに吸い取った。切片から血清溶液を吸い取り、非結合抗体を、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を３回行った。過剰なＴＢＳを、最終洗浄後の吸い取りによって除去した。Ｅｌｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）由来のビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体を、製造者が推奨するプロトコールにしたがって調製し、得られた溶液の１００μｌを各切片に３７℃で１５分間適用した。スライドを、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を２回行い、その後５％正常ラット血清および１％ＢＳＡで１００倍に希釈した１００μｌのストレプトアビジン−金結合物（Ｇｏｌｄｍａｒｋ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、各切片に室温で１時間適用した。スライドを、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を３回行い、１００μｌの１％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳ緩衝液を、室温で５分間適用した。スライドを再び１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を３回、１回３分間の滅菌脱イオン水での洗浄を５回行った。各スライドから過剰な液体を吸い取り、２滴の銀増強および開始溶液（Ｇｏｌｄｍａｒｋ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、各切片に適用した。室温で２０〜３０分反応を進行させ、その後切片を滅菌脱イオン水で完全にリンスし、室温で一晩風乾し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ６０（ＶＷＲ）でマウントした。コントロールとして、組織切片を、同一の実験で、同一のプロトコールによりＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ１８を認識するモノクローナル抗体で標識した。
【０４５０】
ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ１８に対するαｄポリクローナル血清およびモノクローナル抗体での染色により、αｄの染色パターンが他のαサブユニットで認められたパターンと異なることが明らかとなった。
【０４５１】
正常な肺組織では、αｄ発現は、気管支の気道上皮（肺胞腔上皮では検出されない）および気腔内の肺胞マクロファージと考えられる各細胞上で検出された。ポリクローナル血清を使用して認められたシグナルは、免疫前血清コントロールを使用したバックグラウンドシグナルレベルよりも有意に高かった。肺肉芽腫組織では、グリカン投与から２４および９６時間後、肺胞領域のいたるところの気道上皮にαｄ染色が検出され、気道のいたるところの肺胞マクロファージと考えられる場所でより強力なシグナルが検出された。おそらく疾患から回復した動物由来の肺組織では（グリカン投与後１６日目で屠殺）、αｄ抗体でのシグナルは認められなかった。これらの各組織では、免疫化前血清ではバックグラウンドはほとんど認められなかった。
【０４５２】
抗原誘導喘息モデル由来のラット肺組織を使用して、気管支および肺胞腔の気道上皮中ではαｄ抗体で非常に強力なシグナルが検出された。シグナルは、免疫化前血清コントロールでのバックグラウンドシグナルよりも有意に高かった。
【０４５３】
前臨床モデル−Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ
証拠により、脾臓赤脾髄中のαｄ陽性マクロファージが損傷ｒｂｃおよび循環からの他の粒子のクリアランスに関連することが示唆される。細菌因子もまた脾臓赤脾髄中のαｄ陽性マクロファージによって循環からクリアランスされると推測される。抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導に必要ではない非感染因子は、赤脾髄マクロファージによって直接消滅する。対照的に、赤脾髄マクロファージによってクリアランスされる日和見感染因子は、細菌根絶のために生成物Ｔ細胞免疫応答が必要である。したがって、赤脾髄マクロファージ上のαｄ発現は、赤脾髄から辺縁帯へのマクロファージの移動またはＴ細胞を活性化させるマクロファージ／Ｔ細胞相互作用に関連するアクセサリー分子としての活動のいずれかによってマクロファージ／Ｔ細胞相互作用を制御するように作用することができることが提案される。
【０４５４】
感染因子に対する免疫応答の際のαｄの役割を調査するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓのマウスモデルを使用して、脾臓中のαｄ発現を評価する。細菌を貪食した赤脾髄マクロファージにおけるαｄ発現を試験する。このモデルにおいてαｄに対する抗体を試験して、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対するＴ細胞防御応答の誘導におけるαｄが果たす役割を同定する。
【０４５５】
【実施例３８】
脊髄損傷におけるαｄの役割
中枢神経系（ＣＮＳ）外傷後、免疫応答は、侵入した好中球、ナチュラルキラー細胞、および貪食単球／マクロファージの混合物を含む（Ｍｅａｎｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｔｈｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４２、７０７〜７１９、１９８３）。この応答には、炎症メディエーターの放出、反応性小グリア細胞の誘導、血小板の浸潤、血管浸透性の増加に伴う内皮損傷、および浮腫の発症が含まれる。最近の所見により、脊髄の外傷後炎症は一部脱髄よるか、ニューロンおよび軸索のより直接的損傷による慢性欠失に寄与することが示唆される（Ｂｌｉｇｈｔ，Ａ．Ｃ．、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｒａｕｍａ、２、２９９〜３１５、１９８５）。さらに、最近の研究により、マクロファージ／小グリア細胞数は衝撃損傷後の脊髄の各レベルでの組織損傷量に有意に相関することが報告された（Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１５１、７１〜８１、１９９８）。好中球およびマクロファージは共に破片を貪食してその後酸化体バーストを誘導し、活性酸素種を生成する。これらの細菌因子は、有効であるが、周囲の健康な組織を損傷し得る。したがって、白血球浸潤および活性酸素種の付随生成は、最初の衝撃部位以上の二次的損傷の拡大に関連することが可能である。この仮説は、好中球またはマクロファージ浸潤の遮断により脳卒中または脊髄損傷範囲が減少するという研究によって支持される（Ｂｌｉｇｈｔ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、６０、２６３〜２７３、１９９４）。
【０４５６】
完全離断モデル
脊髄損傷におけるαｄの役割を評価するために、ラット離断モデルを、αｄに対するモノクローナル抗体（そのいくつかがそのリガンドＶＣＡＭ−１への結合を遮断する）と組み合わせて使用した。このモデルでは、第４の胸部（Ｔ）脊髄セグメントに一貫して自律性レフレキシア機能障害を発症する完全な離断を導入する（Ｋｒａｓｓｉｏｕｋｏｖら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６８、Ｈ２０７７〜Ｈ２０８３、１９９５）。小さな外科病変によりその領域上の脊髄損傷効果の分析を容易にする十分に定義された初期組織破壊の狭い領域が得られるのでこのモデルは有利である。
【０４５７】
全ての実験は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｓｅｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって作成された「実験動物のケアおよび使用ガイド」で確立された方針に従って行った。最初に２７０〜３２０グラムの４２匹の雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、腹腔内注射によってアトロピン（０．５ｍｇ／ｋｇ）およびジアゼパン（２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したＳ。１０分後、ラットをフェノバルビタールナトリウム（３５ｍｇ・ｋｇ）での腹腔内注射によって麻酔した。必要ならば手術中に麻酔薬（２ｍｇ／ｋｇ）を追加で注射した。手術中はラットを電気座布団の上におき、体温を３７℃付近に維持した。第３の胸部椎骨（Ｔ３）の背側突起を除去し、椎弓切除術を行って、微視的誘導装置下に脊髄を曝露した。脊髄を、外科用メスでＴ４脊髄セグメントで完全に離断した。椎弓切除上の筋肉および皮膚を閉じ、動物を太陽灯下で回復させた。対麻酔ラットの術後のケアを以前に記載のように行った（Ｋｒａｓｓｉｏｕｋｏｖら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、７０、２１１〜２２６、１９９６）。手術から回復後、食餌および水を自由に与えた。動物は術後２日間生存していた。
【０４５８】
ラット（群あたり４〜５匹）を、以下の治療群に分けた：（１）１ｍｇ／ｋｇのαｄモノクローナル抗体２２６Ｈ、２３６Ｌ、２２６Ｂ、または関連イソ型適合ＩｇＧ１κ抗体１Ｂ７のいずれかおよび（２）５ｍｇ／ｋｇのαｄモノクローナル抗体２２６Ｈ、２３６Ｌ、またはコントロール１Ｂ７のいずれか。各マウスに、治療計画における１抗体のみを投与した。
【０４５９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ後に免疫グロブリン領域に融合した組換えヒトＶＣＡＭ−１およびαｄおよびヒトＣＤ１８を発現するＣＨＯ細胞株を使用して、抗体を選択した。抗体パネルを、各抗体のＶＣＡＭ−１へのαｄ結合を遮断する能力について試験した。結合アッセイ由来の結果は、いくつかの抗体が結合を遮断せず（「非遮断薬」）、いくつかが５０％の範囲で結合を遮断し（「中程度の遮断薬」）、その他が７５％〜８５％の範囲で結合を遮断する（「強力な遮断薬」）ことを示した。非遮断、中程度の遮断、および強力な遮断由来の代表的な抗体を、上記の用途に選択した。
【０４６０】
手術の２４時間前、手術の２時間後、および２４時間後に、尾静脈を介して全てのモノクローナル抗体を投与した。注射が容易に至適体積を確実にするために、抗体を、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈した。別のコントロール群では、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）を、脊髄の完全な離断から３０分後に３０ｍｇ／ｋｇ、２時間後および２４時間後に１５ｍｇ／ｋｇの濃度で尾静脈を介して注射した。さらなるラットコントロール群を上記のように脊髄離断したが、付随の治療は行わなかった。
【０４６１】
手術の２日後、経心臓灌流前に、動物を３ｇ／ｋｇウレタン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、ＵＳＡ）の腹腔内注射で深く麻酔した。胸腔切開後、左心室にヘパリンを注射した。ラットを、２５０ｍｌの酸素化組織培養培地（ｐＨ７．４）（ダルベッコ改変イーグル培地；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、その後５００ｍｌの４％ホルムアルデヒド固定液を灌流した。以前に記載のように、試験のために胸部脊髄から尾部（Ｔ４〜８）を除去した（Ｋｒｅｎｚ  ａｎｄ  Ｗｅａｖｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、８５、４４３〜４５８、１９９８）。同一の固定液での一晩の固定後、脊髄部分を１０％、２０％、および３０％のスクロース溶液を含むＰＢＳを用いて４℃で凍結防止を行った。次いで、脊髄部分を、低温保持装置上で水平方向の切片（５０μｍ）に切断した。切片を、標準的な手順を使用して１％クレシルバイオレット（ｐＨ４）で染色して多形核白血球を視覚化し、キシレン中で明澄化し、ＤＰＸマウンタント（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）でカバーガラスをかけた。病変部位の脊髄領域中の球形の食作用形態のマクロファージ／小グリア細胞およびクレシルバイオレット染色後に特徴的な多葉性の核を示す好中球を計数した。明視野顕微鏡およびグリッドを装着した４０×対物レンズを使用して免疫細胞を定量した（全領域：０．０８ｍｍ２）。免疫細胞について３つのサンプル領域（離断液髄の端、尾部、一方の側面から他方まで）を試験した。この手順により、２．７２ｍｍ２の脊髄の平均総定量領域が得られた。次いで、この方法を別の脊髄切片で繰り返した。灰白質で炎症反応が最も顕著であるので、最も大きな灰白質を有する脊髄（薄片ＶとＶＩＩとの間の境界）の水平切片からサンプル領域を選択した。各サンプルで計数したマクロファージおよび好中球の総数を総サンプル領域（ｍｍ２）で割って、各治療群におけるｍｍ２あたりのマクロファージおよび好中球の平均数を得た。抗体治療群（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）を、同用量の各関連ＩｇＧ適合コントロールおよび非薬物治療離断コントロールと比較した。さらなる比較のために、平均免疫細胞数が最も有意に減少した群を、ＭＰ治療動物および手術コントロール動物と比較した。治療群の同定に関して盲目的に全ての細胞計数を行った。
【０４６２】
結果は、単核として同定された活性化小グリア細胞および／または血液マクロファージ（巨大な半透明の細胞質を有する球形の細胞）が離断から２日後の病変中で明らかであることを示した。付随するαｄ抗体を投与していないかコルチコステロイド処理を行ったコントロール動物は、脊髄部位で平均３９６±２６マクロファージ／小グリア細胞／ｍｍ２であることが見出された。低用量（１ｍｇ／ｋｇ）での関連ＩｇＧ１抗体１Ｂ７の処理によりマクロファージ／小グリア細胞数が３６２±４３／ｍｍ２に増加するが、この値は抗体治療を行わなかったコントロール動物と有意な相違は無かった。試験したαｄ抗体のうち、それぞれ１ｍｇ／ｋｇの２２６Ｈおよび２３６Ｌにより１Ｂ７抗体および離断コントロールと比較して１ｍｍ２あたりのマクロファージの平均数が有意に減少する。詳細には、１Ｂ７および治療を受けていない動物と比較して、２２６Ｈ投与によりマクロファージ／小グリア細胞／ｍｍ２が１４７±１７に減少し、２３６Ｌ投与によりマクロファージ／小グリア細胞／ｍｍ２が１３１±４に減少した。対照的に、１ｍｇ／ｋｇのαｄ抗体の注射により、マクロファージ／小グリア細胞数／ｍｍ２が３２７±６５に減少し、これはコントロールでの値と有意に異ならなかった。ＭＰ治療により、２５０±２４マクロファージ／小グリア細胞数／ｍｍ２が認められ、これはコントロール動物より有意に小さいが、２２６Ｈおよび２３６Ｌαｄ抗体で治療した動物で検出された値より大きかった。メチルプレドニゾロンは最も広く使用されている急性脊髄損傷の臨床治療薬であるので、この結果は予想外であった。
【０４６３】
αｄ抗体の用量を５ｍｇ／ｋｇに増加した場合、２２６Ｈおよび２３６Ｌ治療での１ｍｍ２あたりの平均マクロファージ／小グリア細胞数はコントロールよりも有意に小さいが、この数は関連ＩｇＧ１イソ型適合コントロール抗体で治療した動物における数と有意に異ならなかった。
【０４６４】
好中球（ＮＬ）に関する結果は、大部分が灰白質のいたるところで単独または凝集して検出されることを示した。灰白質の両側の白質中で視覚可能な小部分のみが検出された。さらに、いくつかの好中球は、脊髄切片中の小静脈および小動脈への接着が認められた。治療を受けていない動物では、１ｍｍ２あたりの平均ＮＬ数は２９５±５６であり、１ｍｇ／ｋｇの１Ｂ７で処理した動物では、ＮＬ数は４１６±６３に有意に増加した。αｄ抗体治療により、治療を受けていないコントロール動物と比較した場合、ＮＬ数は有意に減少した。詳細には、１ｍｇ／ｋｇの２２６Ｈおよび２２６Ｂにより、１ｍｍ２あたりのＮＬ数は、それぞれ３６１±８０および３３２±４３に増加した。１Ｂ７治療動物と比較して、１ｍｇ／ｋｇの２３６ＬおよびＭＰ治療は、１ｍｍ２あたりのＮＬ数をそれぞれ２７０±３９および１９３±３９に有意に減少させた。しかし、これらの所見は、治療を受けていないコントロール群と有意に異ならなかった。
【０４６５】
５ｍｇ／ｋｇでは、１Ｂ７治療によりＮＬの平均数は３４３±３７に増加したが、認めら得た増加は、非治療動物群と比較して有意ではなかった。１Ｂ７治療と比較して、抗体２２６ＨによりＮＬの平均存在数は２３６±３８に減少したが、この減少は、治療を受けていない動物と比較して有意ではなかった。対照的に、２３６Ｌにより、ＫＬ数は１９０±１７／ｍｍ２に減少し、これは１Ｂ７治療を受けた動物と比較して有意であった。
【０４６６】
これらの結果は、低用量のαｄモノクローナル抗体により、おそらくＶＣＡＭ−１との反応性の破壊によって損傷脊髄中の白血球数が減少することを示し、これは以前に報告された所見と一致する。ＶＣＡＭ−１、ＶＬＡ−４の最も知られたカウンター受容体に対する抗体を使用した他の報告は、ＶＬＡ−４陽性細胞の脳への浸潤の減少および実験用アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床および病理学的徴候の防止を示した。同様に、抗ＴＮＦα治療は、ＥＡＥの発症および重症度を阻害することが示され、作用機構の１つは、ＣＮＳへの白血球侵入を有意に減少させる脊髄血管上のＶＣＡＭ−１発現の阻害であった。これらの以前の所見により、白血球表面上のαｄの内皮細胞またはグリア細胞表面上のＶＣＡＭ−１との相互作用の遮断は、認められた弱毒化炎症反応を担い得ることが示唆される。
【０４６７】
マクロファージ浸潤を遮断する抗体の１つ２２６Ｈは、αｄとＶＣＡＭ−１との間結合を遮断せず、これらの結果により、この抗体による阻害様式は、ＶＣＡＭ−１以外のαｄ結合パートナーの遮断を含み得ることが示唆される。１つの可能性は、ＩＣＡＭ−Ｒに対するラット相対物の存在である。以前の所見により、ＶＣＡＭ−１に加えて、αｄはＩＣＡＭ−Ｒにも結合するが、ＶＣＡＭ−に対する親和性は非常に低いことが示された。興味深いことに、ＩＣＡＭ−Ｒは、内皮細胞上に存在しないようであり、休止単球、リンパ球、および好中球上で発現し、正常な環境下での白血球−内皮接着への関与が排除される。ＩＣＡＭ−Ｒは白血球の細胞−細胞接触の初期段階で役割を果たし、ＩＣＡＭ−ＲはＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１白血球細胞内相互作用の調節に関与することが示唆される。初期白血球相互作用におけるＩＣＡＭ−Ｒの役割は、細胞凝集の誘導であることが示されている。凝集を起こす初期接触の破壊により、免疫応答の効率が減少する。ＩＣＡＭ−Ｒの別のリガンドＬＦＡＳ−１の相互作用により細胞間接触部位でのＬＦＡ−１のその活性化状態への切り替えが誘導されることも示された。休止白血球上でのαｄおよびＩＣＡＭ−Ｒの同時発現はほぼ同一の方法で作用し、２つのタンパク質間の相互作用は接触依存性白血球活性化事象を促進し得ることが可能である。逆に、例えばαｄ抗体の使用による相互作用の破壊を、白血球の脊髄への侵入の減少によって説明することができる。
【０４６８】
いくつかの説明により、マクロファージ浸潤の増加を説明することができる。最も単純には、結果は系の減少であり得る。あるいは、より高い用量の抗体により成熟マクロファージ上でＦｃγＲが架橋され、ケモカイン生成が初期バーストし、さらなる白血球が損傷部位を攻撃する。同一の方法では、ケモカイン生成は、大部分の症例で起こる１Ｂ７での治療後の損傷部位での好中球およびマクロファージ数の増加を説明することができる。認められた結果についての別の可能な説明は、動物間の変異性であり、これは、Ｗｉｓｔａｒラットの異形交配株のαｄ抗体を試験したためである。例えば、異なるラット群は、免疫能の状態がわずかに異なり得る。この可能性を試験するために、同一または関連する同腹子由来の動物において低用量および高用量のモノクローナル抗体と同時に使用した実験を複製する。
【０４６９】
クリップ圧迫損傷（ＣＣＩ）モデル
臨床的により関連する脊髄の別の動物モデルは、クリップ圧迫損傷（ＣＣＩ）モデルである（Ｒｉｖｌｉｎら、Ｓｕｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１０、３８〜４３、１９７８；Ｍａｉｏｒｏｖら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１５、３６５〜７４、１９９８）。簡単に述べれば、胸部セグメントＴ３およびＴ４での背側椎弓切除による脊髄の曝露による完全な脊髄離断用に、上記のようにラットを調製する。改変動脈瘤クリップを使用して、Ｔ３およびＴ４の後根の間の脊髄下にクリップの下の部分を滑らせることにより、脊髄を圧迫する。次いで、クリップをとめて１分間遮断し、その後クリップを開けて除去する。次いで、ラットを縫合糸で閉じる。これらの動脈瘤スリップを、較正した力で閉じられるように特別に改変した。この方法では、重症、中程度、または軽症の脊髄損傷を誘導するようにクリップを較正することができる。重症、中程度、および軽症の脊髄損傷クリップ圧迫モデルにより、ヒト脊髄損傷誘導虚血の全ての病態生理学局面を正確且つ一貫して再現される。
【０４７０】
全ての実験を、動物のケアおよび治療薬の投与に関する上記の手順を使用して行った。重症ＣＣＩ（５０ｇ）に供したラットを、以下のうちの１つで損傷から２、２４、および４８時間後に治療した：（ｉ）抗αｄモノクローナル抗体２１７Ｌ（１ｍｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）抗αｄモノクローナル抗体２２６Ｈ（１ｍｇ／ｍｌ）、（ｉｉｉ）抗αｄモノクローナル抗体２３６Ｌ（１ｍｇ／ｍｌ）、（ｉｖ）イソ型コントロール抗体１Ｂ７（１ｍｇ／ｍｌ）、または（ｖ）ＰＢＳ（治療コントロール）。第６ラット群に、３０ｍｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロン（ＭＰ）をＣＣＩから２４時間および４８時間後に投与した。各治療群について４匹または５匹のラットを試験した。７２時間で、動物を屠殺し、固定液で灌流し、その後さらなる処理のために脊髄を取り出した。抗αｄモノクローナル抗体（２１７Ｌ、２２６Ｈ、および２３６Ｌ）の損傷部位に対するＥＤ１＋（すなわち、単球／マクロファージ）ＭＰＯ＋（すなわち、食細胞）細胞の浸潤を減少させる効果を分析した。ＥＤ１＋およびＭＰＯ＋細胞を、２つの異なる蛍光色素を使用した免疫細胞化学的二重染色法によって同定した。好中球様形態の細胞とマクロファージ様形態の細胞との区別が困難である場合があるので、両細胞をＭＰＯ＋細胞として計数した。一般に、ほとんどのＭＰＯ＋細胞は、好中球であるようである。損傷の一方（一般に尾側）で細胞を計数した。各動物のために、損傷が存在する全脊髄セグメントを通した１０個の連続した水平切片由来の１つの１６μｍの切片を計数した。この手順により、計数した動物あたり全部で６〜１０個の切片が得られた。
【０４７１】
この分析結果は、ＰＢＳまたはコントロール１Ｂ７抗体または２３６Ｌ抗体で治療した動物と比較して抗体２１７Ｌおよび２２６Ｈでの治療後の損傷部位でＥＤ１＋細胞浸潤が４０〜５５％減少したことを示した。ＰＢＳまたはコントロール１Ｂ７抗体を投与したコントロール動物は、それぞれ６８１．３±４７．４および６４１．８±７７．８ＥＤ１＋細胞を有することが見出され、重傷ＣＣＩ部位に浸潤した。２１７Ｌ、２２６Ｈ、または２３６Ｌ抗体で治療したラットは、損傷部位でそれぞれ３８８．６±５２．８、２９１．９±６７．７、および６９２．７±９８．４個の浸潤ＥＤ１＋細胞を示した。メチルプレドニゾロンで治療したラット、損傷部位で４０９．０±４２．６個の浸潤ＥＤ１＋細胞を示した。二元Ａｎｏｖａを使用したこれらの結果の統計分析により、２１７Ｌまたは２２６Ｈ抗体のいずれかで治療された動物は、コントロール群と異なる有意な改良を示す（ｐ＜０．０５）ことが示された。浸潤ＭＰＯ＋細胞の類似の分析により、非治療動物またはコントロール抗体１Ｂ７で治療した動物と比較した場合、２１７Ｌは、損傷部位へのこれらの細胞の移動を最も一貫して減少させることが示される。２１７Ｌ、２２６Ｈ、または２３６Ｌ抗体で治療したラットは、損傷部位で、それぞれ１５６．５±６３．３、１９１．３±３９．０、および２９９．１±４４．０個の浸潤ＭＰＯ＋細胞を有することが見出された。ＰＢＳまたは１Ｂ７抗体のいずれかで治療したコントロール動物は、損傷部位でそれぞれ６１５．３±４５．７および２６０．９±４８．９２個の浸潤ＭＰＯ＋細胞を示した。しかし、好中球のピーク時間は一般にＣＣＩから約１８時間であるので、損傷から７２時間後で得たデータは、好中球浸潤減少における抗αｄモノクローナル抗体の有効性を反映することができない。
【０４７２】
中程度のＣＣＩ（３５ｇ）に供したラットを使用した類似の実験も行った。この実験結果は、２１７Ｌ抗体を投与した動物は、損傷部位で浸潤ＥＤ１＋細胞およびＭＰＯ＋細胞数が減少したことを示す。ＰＢＳまたは１Ｂ７抗体のいずれかを投与したコントロール動物は、８３２．３±６９および１０７５±８７．９４個の浸潤ＥＤ１＋細胞を示した。２１７Ｌ、２２６Ｈ、または２３６Ｌ抗体で治療したラットは、損傷部位でそれぞれ５０７．０±５１．４、７９７．４±６５．１、および７６１．２±８８．２個のＥＤ１＋細胞を示した。これらの動物の損傷部位での浸潤ＭＰＯ＋細胞の試験により、２１７Ｌ、２２６Ｈ、または２３６Ｌ抗体で治療したラットは、損傷部位でそれぞれ１９０．５±２８．４、２５３．７±４５．２、および３０１．４±３６．６個のＭＰＯ＋細胞を有することが示された。ＰＢＳまたは１Ｂ７抗体を投与したコントロール動物は、損傷部位でそれぞれ６１１．７±１４０．５および２４７．６±１８．１個のＭＰＯ＋細胞を示した。
【０４７３】
抗αｄｍＡｂ治療ラットの運動スコア
４匹のラットを、上記のように重症ＣＣＩに供し、抗体で治療した。損傷から１、７、１０、１４、１７、および１９日目に、ラットを、Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）２１ポイントスコアシステムによって評価した運動能力の復旧について評価した（Ｂａｓｓｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１２、１〜２１、１９９５）。簡単に述べれば、ＢＢＢスコアシステムは、脊髄損傷後の３つの一般的な回復段階に基づく。後肢運動がほとんど認められないか全く認められない初期、ぎくしゃくした歩進で特徴付けられる中間期、動物がつま先および尾のひきずり、不安定な体幹、および足の回転を示す後期を観察する。各３つの段階を、特定の挙動によって特徴付けられるカテゴリーにさらに分ける。ラット４１Ｃ４５０および４２Ｃ５０を１９日間にわたり評価し、ラット４４Ｃ５０および４５Ｃ５０を１７日間にわたり評価した。１４日間の評価における水平のバーは、同一の重症度の損傷の非治療ラットで達成された平均ＢＢＢスコアを示す。各ラットの両端のスコアは、圧迫損傷が脊髄に均一に適用されたことを示す。
【０４７４】
非治療ラットと比較して、４匹の試験ラットのうちの３匹が明白な運動回復の増加を示した。１７日目までに４匹全てのラットが一定の程度の膀胱調節を回復したことに留意すべきである。
【０４７５】
ＣＣＩラットにおける自律性レフレキシア機能障害の評価
上記の同一の４匹のラットを、結腸の膨張によって自律性レフレキシア機能障害について評価した（Ｍａｉｏｒｏｖ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１５、３６５〜３７４、１９９８）。この評価を、ラット４４Ｃ５０および４５Ｃ５０については１７日目から、ラット４１Ｃ５０および４５Ｃ５０については１９日目から行った。心拍数（ＨＲ）、動脈圧（ＡＲ）、および平均動脈圧（ＭＡＰ）を、動脈カニューレ挿入日から２日連続で２回同時記録した。重症に損傷したラットへの２１７Ｌ抗体の投与により、動脈圧についての結腸膨張効果が５０％減少した。非治療ラットは、約１００ｍｍＨｇの基礎圧から４２±３ｍｍＨｇのＭＡＰの平均増加が示された。対照的に、２１７Ｌ抗体で治療した同様に注射した動物は、２２±３ｍｍＨｇのＭＡＰの平均増加を示した。非治療ＣＣＩ安静ラットの平均心拍数（ＨＲ）は５１５±１６回／分であった。このＨＲ値は、結腸膨張時の自律性レフレキシア機能障害の誘導後に１２４±１３回／分に減少した。２１７Ｌ抗体で治療した４匹の安静ラットの平均心拍数は、５４４±９回／分であった。これは、結腸膨張に起因する自律性レフレキシア機能障害の誘導後に１１７．７±１８に減少した。したがって、自律性レフレキシア機能障害誘導前後の治療ラットと非治療ラットとの間のＨＲに統計的に有意な相違はなく、これは、結腸膨張に反応する心拍数の変化は、脊髄損傷に独立して機能する副交感神経の迷走神経を介して起こるという事実による。
【０４７６】
損傷から１２、２４、または４８時間後に抗αｄモノクローナル抗体で治療したラットの試験
抗αｄ抗体の最初の投与を、脊髄損傷から１２、２４、または４８時間後に遅延することができ、且つ有効である場合、有効な治療の送達のための時間枠が広がるので、これは有用である。この可能性を調査するために、ラットを、以下と共に重症または中程度のＣＣＩに供した：（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）１Ｂ７抗体、（ｉｉｉ）上記の抗αｄモノクローナル抗体（抗体をＣＣＩの１２時間後（その後ＣＣＩの２４時間および４８時間後に抗体を注射する）またはＣＣＩの２４時間後（その後ＣＣＩから４８時間後に別の抗体注射を行う）に投与する以外）。抗体をＣＣＩから４８時間後にのみ投与する類似の試験も行う。ＥＤ１＋およびＭＰＯ＋細胞数を、上記の方法を使用して評価する。抗αｄ抗体の投与をＣＣＩかＲ１２、２４、または４８時間後に遅延し、動物が浸潤ＥＤ１＋およびＭＰＯ＋細胞数の有意な減少を示す場合、この抗体を使用した治療を、損傷からより遅れた時点で開始することができる。
【０４７７】
損傷部位へのＥＤ１＋およびＭＰＯ＋細胞の浸潤を減少させるための抗αｄモノクローナル抗体の単一注射の有効性と３注射治療計画の有効性との比較
単回用量の抗体を使用した治療は、３回用量治療計画を使用した治療よりも有利である。単回用量治療は、費用を軽減し、治療手順を単純にし、副作用発生の可能性を減少させることもできる。上記のように行った実験の結果に基づいて、抗体投与の至適時間を同定する。重症または中程度のＣＣＩに供したラットに、抗αｄモノクローナル抗体、コントロール１Ｂ７抗体、またはＰＢＳをＣＣＩから２時間後または上記結果の分析によって同定した至適時間で単回注射する。損傷から７２時間後にラットを屠殺し、損傷部位のＥＤ１＋およびＭＰＯ＋の細胞数を評価する。単回用量を投与した動物の結果を、３回用量治療計画で治療した動物由来の結果と比較して、単回用量治療の有効性を同定する。
【０４７８】
損傷部位への好中球のピーク浸潤の減少における抗αｄモノクローナル抗体治療の有効性試験
好中球浸潤の正常なピークは損傷の１８時間後に起こり、その後非常に低い持続したレベルに急速に減少する。抗α抗体が損傷部位への好中球浸潤を減少させることができるかを同定するために、ラットを、ＣＣＩ（重症または中程度）から２時間後または１２時間後に抗αｄ抗体、コントロール１Ｂ７抗体、またはＰＢＳで治療し、ＣＣＩから１８〜２０時間後に屠殺した。損傷部位へ浸潤した好中球数を評価して、ピーク好中球浸潤中の抗αｄ抗体投与の効果を分析する。
【０４７９】
ＣＣＩに供したラットおよび抗αｄ抗体で治療したラットにおける運動能力および自律性レフレキシア機能障害の試験
上記概説の試験結果に基づいて、至適な治療計画を同定した。ラットを、重症または中程度ＣＣＩに供し、至適な治療計画を使用してＰＢＳ、コントロール１Ｂ７抗体、または抗αｄ抗体で治療する。損傷から３日毎に、ラットを上記の標準的ＢＢＢ採点システムを使用して運動能力を評価する。ＣＣＩから３週間後に、動物のサブセットを自律性レフレキシア機能障害について試験し、残りのラットを別の３週間運動能力について評価する。自律性レフレキシア機能障害を、上記のように評価する。
【０４８０】
【実施例３９】
クローン病におけるαｄ発現
前の研究（実施例１８）は、ロイコインテグリンは、クローン病患者由来の切片中でより高いレベルで検出されることを示した。クローン病でαｄ発現が調整される程度を評価するために、以下のように罹患結腸および正常結腸由来の組織切片における発現を試験した。
【０４８１】
５人のクローン病個体由来の結腸組織および正常な結腸を、６μｍ厚で切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）スライド上にて室温で５分間風乾した。スライドを、アッセイを行うまで−２０℃で保存した。使用前に、スライドを５０℃で約２分間インキュベートした。切片を、冷（４℃）アセトン（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）中で２分間固定し、室温で風乾した。切片を、１００ｍｌの１×ＴＢＳ、１．１ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ）、および１．０ｍｌの１０％  ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ）を含む緩衝液中に室温で１５分間置き、内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。各切片を２０％正常ヒト血清（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ）、５％正常ラット血清（Ｈａｒｌａｎ）、および２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の１×ＴＢＳ溶液を含む１５０μｌのブロッキング溶液中にて室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、切片から溶液を穏やかに吸い取った。ブロッキング溶液中に１０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度の一次モノクローナル抗体を調製し、７５μｌを室温で１時間各組織切片に適用した。インキュベーション後、切片を１×ＴＢＳで１回５分間の洗浄を３回行って、非結合抗体を除去した。最終洗浄後、組織周囲の吸引によって過剰なＴＢＳを除去した。ビオチン化ラット抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ブロッキング溶液で４００倍に希釈し、各切片に７５μｌを室温で３０分間適用した。スライドを、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を２回行った。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ビオチン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９μｌの試薬Ａおよび９μｌの試薬Ｂ（両試薬は製造者から提供されている）の７８２μｌの１×ＴＢＳへの添加によって調製し、各切片に得られた混合物の７５μｌを室温で３０分間適用した。スライドを、１回５分間の１×ＴＢＳ洗浄を２回行った。基質３，３’−ジアミノベンズイミド（ＤＡＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用し、水への浸漬によって発色を停止させた。１滴の１％オスミウム酸（ＶＷＲ）を各切片に１５秒間適用してシグナル強度を増強し、水への浸漬によって反応を停止させた。スライドを、Ｇｉｌｌ’ｓヘマトキシリン番号２（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、脱水前に水でリンスし、Ｃｙｔｏｓｅａｌ（ＶＷＲ）でマウントした。
【０４８２】
正常な結腸では、抗体２１７Ｌ、２１７Ｋ、または２１２Ｄで標識は検出されなかった。抗体２４０Ｉは、粘膜固有層に分散したリンパ球系凝集体中の多数の細胞ならびにリンパ球および好酸球を標識した。抗体２４０Ｉは、マクロファージまたは活性化リンパ球のいずれかと考えられる細胞型も標識した。抗体１６９Ａでの染色は、抗体２４０Ｉでの染色に類似していた。抗体１６９Ｂは、動脈周囲の平滑筋細胞のサブセットおよび外部筋層に加えて、粘膜固有層および粘膜下組織に分散したリンパ球およびマクロファージを標識した。
【０４８３】
クローン病の結腸サンプルを使用して、各抗体で認められた標識パターンは重複していたが、発現パターンは同一ではなかった。抗体２１２Ｄおよび２１７Ｋでは標識は検出されなかった。抗体２４０Ｉは、リンパ球系凝集体中の多核巨細胞上で発現が異なる肉芽種を標識し、リンパ球系凝集体中のリンパ球を標識した。抗体２４０Ｉは、粘膜固有層に分散した好酸球およびリンパ球を標識した。抗体２１７Ｌはまた、リンパ球系凝集体中の多核巨細胞上で発現が異なる肉芽種を標識した。抗体２１７Ｌは、２４０Ｉでも標識された粘膜固有層および粘膜下組織中のリンパ腫の小サブセットを標識した。１６９Ａがより少数のリンパ球を標識する以外は、抗体１６９Ａの染色パターンは、２４０Ｉで見出された染色パターンと非常に類似していた。１６９Ｂが血管周囲および外部筋層中の平滑筋細胞のサブセットも標識する以外は、抗体１６９Ｂ染色は１６９Ａパターンと類似していた。
【０４８４】
【実施例４０】
ラット脾臓αｄ＋細胞からのＴＮＦα放出
刺激の際にサイトカインを生成する能力に関してαｄ＋細胞の固有の脾臓亜集団を特徴付けるために、以下の実験を行った。
【０４８５】
Ｌｅｗｉｓラットの背中側の側腹部に１００μｌのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）のＰＢＳとの１：１乳濁液を皮下注射し、７日後に動物を屠殺した。脾臓を採取し、標準的な手順によって単一細胞懸濁液を調製した。抗マウスＩｇＧ磁性ビーズ結合物に予め装着したＣＤ４（抗体Ｗ３／２５、Ｅ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｃ．番号８４１１２００２）、ＣＤ１１ｂ（抗体ＯＸ４２、Ｅ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｃ．番号８７０８１８０３）、およびＣＤ４５Ｒａ／ｂ（抗体ＯＸ３３、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するモノクローナル抗体を使用して、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、およびマクロファージを取り出した。ＣＤ４抗体はＴ細胞を識別し、ＣＤ１１ｂ抗体はマクロファージ、単球、顆粒球、およびナチュラルキラー細胞を識別し、ＣＤ４５Ｒａ／ｂ抗体はＢ細胞、Ｔ細胞サブセット、単球、顆粒球、およびマクロファージを認識する。次いで、磁石を使用して、抗体コート細胞を取り出す。非接着細胞を回収し、ビオチン化ラット抗αｄモノクローナル抗体２０５Ｃおよび２２６Ｇを使用して正の選択を行い、その後ストレプトアビジン磁性ビーズとインキュベートした。磁石を使用して抗体コート細胞を回収し、５×１０５細胞／ｍｌを成長培地（２％正常Ｌｅｗｉｓラット血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０）に懸濁した。
【０４８６】
２ｍｌの細胞懸濁液を、３μｇ／ｍｌの抗ラットＣＤ３モノクローナル抗体（Ｇ４１８、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、無関係のコントロール抗体、または抗体なしでコートした２４ウェルプレート上の各ウェルに添加した。プレートを、３７℃の７％ＣＯ２下でインキュベートし、２０時間後、４８時間後、および７２時間後に各ウェル由来の上清を回収した。上清を等分し、回収時に−７０℃で保存した。アッセイ前に、上清を２倍希釈し、抗ラットＴＮＦα検出アッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）に供した。
【０４８７】
結果は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での刺激後、抗体コントロールおよび培地のみで処理した群での約４０ｐｇ／ｍｌと比較して、αｄ＋細胞は、２０時間後に約２８０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦαを放出させることを示した。
【０４８８】
【実施例４１】
αｄ抗体での活性化脾細胞からのＴＮＦα放出の調整
炎症反応でのαｄ＋食作用脾細胞の役割を評価するために、以下の実験を行った。
【０４８９】
αｄ＋脾臓マクロファージがラットに注射した磁性粒子を貪食することが以前に示されているので、この細胞型を以下の様式で回収した。４匹のマウスに、２００μｌの磁性ビーズ懸濁液（アミン結合、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を静脈内注射した。２４時間後、脾臓を取り出し、ワイヤーメッシュスクリーンへの組織の通過によって単一細胞懸濁液を調製した。磁石を使用して細胞を単離し、マグネシウムおよびカルシウムを含むＰＢＳで１回洗浄し、ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ培地に入れ、以下の６つの条件で成長させた：（ｉ）処理せず、（ｉｉ）マウスαｄと交差反応するハムスター抗ラットαｄモノクローナル抗体２０５Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）、（ｉｉｉ）マウスαｄと交差反応するハムスター抗ラットαｄモノクローナル抗体２０５Ｅ（１０μｇ／ｍｌ）、（ｉｖ）リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、（ｖ）ＬＰＳおよびモノクローナル抗体２０５Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）、および（ｖｉ）マウスαｄとも交差反応するＬＰＳおよびモノクローナル抗体２０５Ｅ（１０μｇ／ｍｌ）。
【０４９０】
示す場合、最初に細胞を抗体で３０分間処理し、その後最初の測定点（ｔ＝０）を示すために２００μｌの馴化培地のサンプルを回収した。次いで、上記のようにＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、培地のアリコートを０．５時間後、１時間後、２時間後、および４時間後に回収し、マウスＴＮＦαキット（ＥＮＤＯＧＥＮ、番号００５４５２）を使用したＥＬＩＳＡによってＴＮＦα放出をアッセイした。回収直後にサンプルを１：１に希釈し、製造者が推奨するプロトコールにしたがってアッセイした。
【０４９１】
結果は、ＬＰＳで活性化しなかった脾細胞は前の抗体処理と無関係に培地にＴＮＦαが有意に放出されないことを示した。ＬＰＳで処理した脾細胞検出可能なレベルで培地にＴＮＦαを放出する一方で、２０５Ｃまたは２０５Ｅ抗体のいずれかで処理したＬＰＳ活性化細胞はＴＮＦαの放出が有意により低かった。これらの結果は、試験したすべての測定点で一致し、その後の反復アッセイで確認した。さらに、磁性ビーズを使用して単離しなかった脾細胞を使用した後者の実験でも同一の結果が認められた。最後に、予備的結果は、脾細胞からのＩＬ−１β放出は、抗αｄモノクローナル抗体によって同様に阻害されることを示す。
【０４９２】
【実施例４２】
好酸球上のαｄ発現の特徴付け
先の所見ではαｄは全ての末梢血好酸球上で発現することを示した（実施例１８）。ヒト好酸球におけるαｄの発現および機能をさらに試験するために、以下の分析を行った。
【０４９３】
ヒト顆粒球上でのαｄインテグリンの発現
ヒト顆粒球上でのαｄインテグリンの発現を、以下のように調製した細胞に対して試験した。正常密度の好酸球（すなわち、１．０９を超える正常比重の好酸球）を、以前に記載のように、密度勾配遠心分離、低張赤血球溶解、および免疫磁性の負の選択によってアレルギーのボランティアの末梢血から単離した（Ｈａｎｓｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１４５、１０５、１９９１）。好中球を、密度勾配遠心分離および低張赤血球溶解によって正常なボランティアの末梢血から精製した（Ｂｏｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５、１８３２、１９９０）。細胞型の各純度は、常に９５％を超えていた。二重パーコール密度勾配分離を使用して末梢血の好塩基球の富化を行い、好塩基球数を、総白血球数の３〜１０％に増加させた（Ｂｏｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１２５、２６５、１９８９）。培養物中での刺激後の血液由来の新たに単離した細胞上でのインテグリンの発現を、以前に記載の単色間接免疫蛍光およびフローサイトメトリーを使用して評価した（Ｂｏｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１２５、２６５、１９８９；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、８６、１４３７、１９９５）。好塩基球の二色検出（抗ＩｇＥを使用）も行った。全サンプルを、０．１％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）中で固定し、ＥＰＩＣＳ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ＩＩフローサイトメトリー（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。約１０，０００事象を回収し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値が得られる４つの対数スケールで示した。
【０４９４】
結果は、好酸球は４つ全てのβ２インテグリンを発現することを示した。αｄインテグリンの表面発現レベルはＣＤ１１ｃよりも高かったが、α４インテグリン（ＣＤ４９ｄ）、ＣＤ１１ａ、またはＣＤ１１ｂの発現より低かった。結果はまた、好塩基球は、好中球と比較してαｄインテグリン発現レベルがわずかに高いことを示した。
【０４９５】
ヒト好酸球上のαｄインテグリン表面発現の調節
好中球で報告されているように、好酸球がαｄβ２の細胞内ストアを迅速に移動させることができるかどうかを同定するために、最初の実験を行った（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｉｅｒｅｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３、６８３、１９９５）。精製末梢血好酸球（上記のように調製）を、ＰＭＡまたはカルシウムイオノフォアＡ２３１８７と１５分間インキュベートし、β２インテグリンファミリーのいくつかのα鎖の表面発現を、間接的免疫蛍光（上記）によって測定した。
【０４９６】
結果は、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μＭのカルシウムイオノフォアはともにαｄおよびＣＤ１１ｂの発現を有意に増加させることを示した。ＰＭＡ添加から数分以内に発現が増加し、１０分までに有意な増加レベルに到達した。この所見により、好酸球は、ＣＤ１１ｂストアに類似して、細胞表面に迅速に固定化することができるαｄβ２の細胞質ストアを有することが示唆される。
【０４９７】
これらの結果を考慮して、αｄβ２発現に対する迅速な効果について他の好酸球活性刺激を試験した。ＭＤＣ（１００ｎＭ）、ＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＴＥＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびエオタキシン（１００μＭ）との１５分間の好酸球のインキュベーションでは、αｄインテグリン発現を変化させることができなかった。
【０４９８】
以前の所見は、多数の好酸球応答を、「感作」と呼ばれる現象におけるＩＬ−５などの一定のサイトカインへの長期曝露によって増強することができることを示していた（Ｗａｌｓｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７１、２５８、１９９０）。したがって、ＩＬ−５を含む感作好酸球培地がαｄインテグリンの表面発現を変化させるかどうかを試験するように実験をデザインした。上記のように調製した精製好酸球を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−５と４日間インキュベートし、種々のインテグリンの発現を上記のようにアッセイした。
【０４９９】
結果は、細胞表面上でのαｄインテグリンの発現は４〜５倍に増加する一方で、α４インテグリンの発現レベルは変化しないことを示した。αｄインテグリン発現増加の速度は、４〜７日間の培養後の発現が統計的に有意に増加した。対照的に、α４インテグリンレベルは、有意に変化しなかった。ＰＭＡ曝露によるαｄ発現の増加速度はＣＤ１１ｂのそれと類似しており、これにより、これら２つのロイコインテグリンが類似または同一の細胞内区画に存在し得ることが示唆される。好酸球中のいずれかのインテグリンのためのこの区画の位置は知られていないが、好中球では、ＣＤ１１ｂの予備形成ストアが特定の粒子に位置付けられている（Ｔｏｄｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７４、１２８０、１９８４；Ｂａｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６６、１６４１、１６４１）。
【０５００】
後期気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）好酸球はサイトカイン感作好酸球の多数の特徴を発現するので（Ｋｒｏｅｇｅｌら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１４３、Ａ４５、１９９１；Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９、３７１０、１９９２）、この細胞型上でのαｄの発現も試験した。以前に記載のようにブラクサまたはＤ．ｐｅｔｒｙｎｉｓｓｉｎｕｓ抽出物のいずれかでの気管支内分節性アレルゲン攻撃誘発を受けたアレルギー患者からＢＡＬ細胞を得た（Ｋｒｏｅｇｅｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９３７２５、１９９４）。後期ＢＡＬ液中の好酸球の純度は、１９±４％であった。
【０５０１】
結果は、後期ＢＡＬ好酸球はまたαｄインテグリン発現の統計的に有意な増加を示し、そのレベルはＩＬ−５で刺激した培養物の３日後に認められるレベルに類似することを示した。後期ＢＡＬ好酸球（すなわち、気道内腔に到達するためにすでに細胞接着および移動している細胞）上のαｄインテグリンの試験では、新たに単離され、ＩＬ−５培養した好酸球で認められるものに対する発現中間体のレベルが認められた。これらのデータにより、ＩＬ−５培養後に見出されるαｄレベルの上昇の少なくとも一部はおそらくαｄインテグリンの転写および翻訳の増加によることが示唆される。
【０５０２】
αｄを発現する好酸球はＶＣＡＭ−１に結合する
αｄインテグリンはＩＣＡＭ−Ｒに結合し、おそらく白血球−白血球接着を媒介していることが示されているにもかかわらず（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｉｅｒｅｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３、６８３、１９９５）、好酸球上で発現するαｄの他の可能なリガンドを試験するように実験をデザインした。一部はβ２インテグリン依存性、ＣＤ１１ｂ独立性のＶＣＡＭ−１の好酸球接着を示唆する以前の研究のために（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、８６、１４３７、１９９５）、固定組換えＶＣＡＭ−１を使用して最初の実験を行った。
【０５０３】
新たに精製した好酸球および培養好酸球について、ＶＣＡＭ−１（２５０ｎｇ／ｍｌ）またはＢＳＡ（１％）コートウェルへの５１Ｃｒ標識細胞接着を、以前に記載のように３７℃で３０分間行った（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、８６、１４３７、１９９５）。いくつかの実験では、接着を試験する前に、細胞を飽和濃度の１つまたは複数の以下のブロッキングモノクローナル抗体と４℃で３０分間予備インキュベートした：抗ＣＤ１８（７Ｅ４）、抗ＣＤ１１ａ（ＭＨＭ２４）、抗ＣＤ１１ｂ（クローン４４）、抗ＣＤ１１ｃ（Ｂｕ−１５）、抗αｄ（２４０Ｉ）、および抗α４（ＨＰ２／１）。
【０５０４】
トランスフェクトまたは親のＣＨＯ細胞について、好酸球接着で使用したものと同一のコートプレートを使用して接着を行った。形質転換ＣＨＯ細胞の試験は、αｄ発現相対的に低く、結果として、ＣＨＯトランスフェクタントとＶＣＡＭ−１との間の相互作用は好酸球とＶＣＡＭ−１との間の相互作用ほど強く検出されないことを示した。したがって、以前に記載の穏やかな洗浄技術（Ｓｈａｎｌｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０、１０１４、１９９８）の修正形態を使用した。この技術により、２０℃の１×ｇで３０分間の遠心分離によって非接着細胞が逆さにしたプレートから除去される。次いで、残存した接着細胞を０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用して取り出し、いくつかの接着実験でこれを使用してウェルをコートした。ＶＣＡＭ−１に加えて、Ｅ選択（１００ｎｇ／ｍｌ）もまた、いくつかの接着実験においてコートウェルに使用された。好酸球研究で使用したブロッキングモノクローナル抗体に加えて、ＣＨＯ細胞の添加前に固定化ＶＣＡＭ−１をＦ（ａｂ’）２抗ＶＣＡＭ−１モノクローナル抗体の適切な希釈物で前処理した。
【０５０５】
結果は、新たに単離された好酸球はＶＣＡＭ−１に接着し、α４インテグリンのモノクローナル抗体ブロッキングは接着を有効に阻害することを示した。好ＣＤ１１ｂ抗体でのブロッキングでは効果が無かった。接着は抗αｄモノクローナル抗体２４０Ｉによって有意且つ一貫して阻害され得るにもかかわらず、その程度は抗α４抗体を使用して認められるものよりも低い（約３０％阻害）。
【０５０６】
さらにより顕著なものは、αｄインテグリンの発現レベルを増加させるＩＬ−５培養好酸球を使用したＶＣＡＭ−１接着試験であった。これらの条件下で、ＣＤ１８、αｄ、またはα４インテグリンに対するモノクローナル抗体は、接着のバックグラウンドレベルへの減少に等しく有効である一方で、ブロッキング抗体のＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃとの組み合わせでは効果が無かった。ＩＬ−５培養好酸球は、新たに単離した好酸球と比較してバックグラウンド接着を増加させ、ＶＣＡＭ−１接着を減少させることも認められた。新たに単離した好酸球を使用したモノクローナル抗体ブロッキング研究に基づいて、ＶＣＡＭ−１への接着は主にα４インテグリンによって媒介された。しかし、ＩＬ−５培養好酸球では、ＶＣＡＭ−１への接着は、α４およびαｄインテグリンによって等しく媒介された。まとめると、これらのデータは、αｄβ２インテグリン発現の活性化依存性調節およびヒト好酸球における機能およびＶＣＡＭ−１の代替リガンドとしてのαｄβ２の新規の機能を示す最初である。
【０５０７】
好酸球上のαｄインテグリンがＶＣＡＭ−１に結合してＩＬ−５で上方制御することができるという結果に基づいて、このロイコインテグリンは、炎症部位へのサイトカイン感作好酸球漸増で役割を果たし得る。
【０５０８】
【実施例４３】
αｄを発現するＣＨＯ細胞はＶＣＡＭ−１に結合する
αｄβ２がリガンドＶＣＡＭ−１として機能することをさらに評価するために、以下のようにヒトαｄおよびβ２インテグリン鎖を発現するＣＨＯトランスファクタントを作製した。
【０５０９】
チャイニーズハムスター卵巣細胞を、実施例に記載のようにトランスフェクトした。αｄβ２トランスフェクトＣＨＯ細胞を、１０％透析ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足した１ｍＭ  ピルビン酸および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。非透析ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、Ｇ４１８のかわりに０．１ｍＭ  ヒポキサンチンおよび１６ｎＭ  チミジン（Ｓｉｇｍａ）を使用する以外は、親ＣＨＯ細胞株の培養培地は類似していた。トランスフェクト細胞は、適度なレベルでαｄおよびβ２インテグリンを発現し、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、またはα４インテグリンを発現しなかった。親ＣＨＯ細胞株は、これらのいかなるインテグリンも発現できなかった。実施例４２に記載のように接着アッセイを行った。
【０５１０】
結果は、αｄβ２トランスフェクトＣＨＯ細胞はＶＣＡＭ−１コートウェルに接着することを示した。ＶＣＡＭ−１の第１のドメインに対するＦ（ａｂ’）２モノクローナル抗体およびＣＤ１８またはαｄのいずれかに対するモノクローナル抗体によって接着は有効に遮断された。対照的に、親非トランスフェクトＣＨＯ細胞はＶＣＡＭ−１に接着することができず、いずれの細胞型もＥ−セレクチンでコートしたウェルへの有意な接着を示した。
【０５１１】
ＶＣＡＭ−１の第１のドメイン中のα４インテグリン結合部位に対するモノクローナル抗体はαｄβ２インテグリン依存性ＶＣＡＭ−１接着を完全に遮断するという所見により、αｄβ２結合部位はα４インテグリンの結合部位に近いか同一であることが示唆される。αｄとα４インテグリンとの間のアミノ酸相同性はほとんど無いので、この結果は予想外であった。αｄβ２インテグリンはフィブロネクチンまたは粘膜アドレシン細胞接着分子１などの他のα４インテグリンリガンドに結合することができるかどうかは未知である。
【０５１２】
αｄ結合に必要なＶＣＡＭ−１領域
ＶＣＡＭ−１の第１の２つのドメインはα４インテグリンの結合を支持することが示されており、このドメイン中の関連アミノ酸を同定した。αｄがＶＣＡＭ−１分子と類似の認識部位を共有するかどうかを同定するために、ヒト免疫グロブリンＦｃに融合させたＶＣＡＭ−１のドメイン１および２の配列を含むプラスミドを構築した。さらに、ＶＣＡＭ−１発現構築物の２つのドメインの修正バージョンを、残基４０をアスパラギン酸残基に置換する置換変異を含むようにＰＣＲによって作製した。２つの発現構築物を、前に記載のＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎプロトコールを使用してＣＯＳ細胞に一過性にトランスフェクトした。タンパク質を、以前に記載のようにプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を使用して培養上清から精製した。
【０５１３】
α４β１またはαｄβ２のいずれかを発現するＣＨＯ細胞の５つのドメインＶＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質またはＩＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質に結合する能力を以下のように試験した。重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中で、０．５μｇ／ウェルのＣＡＭを９６ウェルマイクロタイタープレート上に固定した。プレートを、１％の魚類ゼラチンでブロックし、緩衝液、非関連抗体、またはブロッキングＶＣＡＭ−１抗体のいずれかで処理した。αｄまたはα４形質転換ＣＨＯ細胞を、緩衝液のみ、α鎖に特異的なモノクローナル抗体の非関連抗体（αｄについては１３０Ｋまたは２１７Ｉ、α４についてはα４．１）、またはブロッキングα鎖抗体のいずれかで処理した。細胞を洗浄し、１００，０００細胞／ウェルの密度でＣＡＭコートウェルに添加した。細胞を、固定化抗体の存在下で２０分間インキュベートし、５％グルタルアルデヒドを添加した。固定後、プレートを蒸留水で洗浄し、細胞を１％クリスタルバイオレットで染色し、６６％エタノールで数時間脱色後、Ｄｙｎａｔｅｃｈプレートリーダーで５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【０５１４】
結果は、αｄβ２およびα４βは共に等しい程度でＶＣＡＭ−１の５つのドメインおよび２つのドメイン形態を認識することを示し、これにより結合のためのさらなるドメインは必要ないことが示された。αｄ／ＶＣＡＭ−１結合とα４／ＶＣＡＭ−１２結合との間の相違が検出されたが、この相違は形質転換ＣＨＯ細胞中の異なる発現に起因するようである。両細胞株の結合は、ＶＣＡＭ−１抗体（５０〜１００％）、α４抗体（１００％）、およびαｄ抗体（５０％）によって遮断された。α４トランスフェクト株は変異ＶＣＡＭ−１を認識せず、αｄ細胞株の変異体への結合は野生型ＶＣＡＭ−１で検出された結合の５０％であった。いずれのＣＨＯ細胞株もＩＣＡＭ−１／Ｉｇの結合を示さなかった。まとめると、これらの結果により、αｄおよびα４はＶＣＡＭ−１のドメイン１および２を認識し、エピトープ重複を認識するが同一ではないことが示唆される。
【０５１５】
【実施例４４】
腫瘍抗原としてのαｄのターゲティング
αｄの空間的および時間的に制限された発現により、この分子は表面上にαｄを発現する病原性細胞集団除去のための標的として作用し得ることが示唆される。いくつかの以前の所見によりこの可能性が得られる。
【０５１６】
例えば、他のロイコインテグリンと比較して、αｄ発現はあまり広範ではない。αｄ発現は、特殊化し、そして／または高度に分化した白血球のサブセットであるようである。他のロイコインテグリンと異なり、αｄ発現は、培養における初代または形質転換細胞の迅速な下方制御によって証明される制御を受けているようである。αｄのモノクローナル抗体は、抗体がαｄに特異的であっても多様な反応性を示す。例えば、別の抗αｄモノクローナル抗体２１７Ｌで認められる反応性を比較して、抗αｄ抗体２１２Ｄは正常な組織および高度に分化した骨髄性細胞に対する反応性が制限されている。興味深いことに、ノックアウトαｄマウスは誕生から来世まで生存するが、この所見によってαｄの生物学的機能に関連する情報はほとんど得られない。最後に、αｄ発現はイヌ白血病約７０％で検出されたが、新たに単離されたＦ３４４ラット由来のＮＫ白血病細胞（実施例２６）で高レベルのαｄ発現が検出された。腫瘍細胞は標的としてのαｄを使用したクリアランスに好ましい集団である一方で、下記の様式でαｄを発現する任意の望ましくない細胞型もまたクリアランスし得る。
【０５１７】
正常組織との反応性が低い抗体を参照して、１つまたは複数の抗体を選択する。上記の理由のために、１つの可能性は、抗体２１２Ｄである。ネガティブコントロールとして非関連抗体を含む適切なコントロール抗体も選択する。血液および腫瘍サンプルを白血病およびリンパ腫患者から獲得し、免疫細胞化学（細胞表面発現についてはＦＡＳｃａｎによる分析を使用する）、免疫沈降、選択抗体を使用したウェスタンブロット分析によってスクリーニングする。次いで、陽性染色の検出により、クリアランス法を発展させた別の手順が得られる。
【０５１８】
１つのアプローチでは、上記のように選択した陽性染色抗体の超可変領域をクローン化し、補体固定ヒトイソ型の状況下で発現させた。サブクローニングおよびイソ型切り替え後、上記のように特異性および反応性を再び評価する（例えば、ＦＡＣＳ分析、正常組織の組織学、および免疫沈降）。ヒトＩｇＧ１中の選択した超可変領域を発現する目的でカセットベクターを開発した。さらに、ハイブリドーマ細胞株由来の目的の抗体の超可変領域の増幅を容易にするように一連のプライマーをデザインおよび合成した（Ｇａｖｉｌｏｄｏ−Ｃｏｗｌｅｙら、ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ、第９巻第５号、１９９０、Ｍａｒｙ  Ａｎｎｅ  Ｌｅｉｂｅｒｔ  Ｉｎｃ．発行、Ｍｅｄｉａ、ＰＡ、４０７〜４１７）。次いで、得られた抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験して、補体存在下での結合により細胞が死滅するかどうかを同定する。好ましくは、腫瘍細胞を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行う。コントロールアッセイにより、モノクローナル抗体がαｄを発現しない細胞培養物中で同一の活性を示すかどうかを同定する。
【０５１９】
モノクローナル抗体を試験して、結合により内在化する（抗体が細胞傷害薬と結合することができることを示す）かどうかも同定する。
【０５２０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性を試験する前臨床モデルを開発した。１つの例では、Ｆ３４４ラットモデルの当量を試験する（実施例２６）。別のモデルは、ヒト細胞が移植されたＳＣＩＤ／Ｈｕ系である。例えば、骨髄性Ｕ９３７細胞、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、またはヒト結腸癌ＨＴＣ１６６細胞をマウスに移植し、腫瘍を採取し、腫瘍を抗αｄ抗体（例えば、２１２Ｄおよび２１７Ｌ）を使用して表面抗原を染色する。αｄ発現の検出には、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を除去するための抗体を使用する。
【０５２１】
【実施例４５】
ヒト抗αｄモノクローナル抗体
ヒトモノクローナル抗体を、以前に記載のように炎症性ファージ上に表示された抗体レパートリーのスクリーニングによって同定する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１、２２６５〜２２６６、１９９３；Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９、１０４３〜１０４９、１９９６）。簡単に述べれば、非免疫化ヒトドナー由来の機能的Ｖ遺伝子セグメントを使用して、ファージ表面に表示された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントのレパートリーを構築する。両ファージを表示し、サブクローニングすることなく可溶性ｓｃＦｖが産生されるファージミド中でフラグメントをクローン化する。ニッケルキレートクロマトグラフィーによって迅速にｓｃＦｖが精製されるようにヒスチジンタグを組み込んだ。一般に、このライブラリー形式を使用して、２週間未満でヒトモノクローナル抗体フラグメントを単離する。上記のように単離する（Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１〜５９７、１９９１；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．。１４．３０９〜３１４、１９９６）。おそらく、Ｉドメインを特異的に認識する抗体を同定する。
【０５２２】
【実施例４６】
Ｍｏｔｈｅａｔｅｎマウスにおける抗αｄ抗体治療
ｍｏｔｈｅａｔｅｎ変異体マウス（Ｋｏｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７、１１９４〜１２００、１９９２；Ｋｏｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１、６７３３〜６７４１、１９９３）では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける造血細胞タンパク質チロシンホスファターゼの点変異として常染色体劣性ｍｅｖ遺伝子が自発的に得られる。ホモ接合体は、肺および皮膚中の骨髄性単球の蓄積に関連する慢性骨髄性炎症を発症させ、それにより間質性肺炎、胸腺萎縮症、ならびにＴ細胞およびＮＫ細胞機能障害を発症する。炎症病態は、これらのマウスの骨髄細胞によって伝達可能であり、これは、ｍｅｖ変異は骨髄性単球経路中の幹細胞の欠損によることを示す。αｄが骨髄性細胞中に存在するので、ｍｏｔｈｅａｔｅｎ変異マウス由来の骨髄移植後の正常マウスの抗αｄモノクローナル抗体治療を使用して免疫病理学的変化に対する任意の阻害効果評価する手順を行った。
【０５２３】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）−ｍｅｖ／ｍｅｖおよびその正常＋／−兄弟（Ｂ６）−＋／−マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから得た。飼料および水を自由に与える無病原体環境下でマウスを維持した。全てのマウスは、６〜１０週齢であった。
【０５２４】
−１日目に、全てのマウスに２μｇ／ｍｌのα−ＮＫ１．１抗体であるＰＫ１３６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の０．５ｍｌＰＢＳ溶液を腹腔内注射によって投与した。０日目に、全てのＢ６＋／−マウスに、７５０Ｒａｄを照射した。前に記載のように、（Ｂ６）ｍｅｖ／ｍｅｖから骨髄を採取した。脛骨および大腿骨から取り出した細胞を、補足ＲＰＭＩ培地に移し、２時間インキュベートし、照射マウスに静脈内注射した。その直後にマウスを、腹腔内注射によって、５ｍｇ／ｋｇの２００μｌＰＢＳ溶液の抗αｄ抗体２０５Ｃまたは非関連抗体のいずれかで治療した。マウスαｄモノクローナル抗体に交差反応性を示す精製２０５Ｃハムスター抗ラットは、上に記載されている。ネガティブコントロールとして、１つのマウス群に同体積の生理食塩水を注射した。４〜２５日目に、マウスを１日毎に抗体または生理食塩水のいずれかを全部で１０回注射し、動物を体重および疾患の徴候の変化についてモニターした。一般に、各群の観察を全部で２ヶ月間継続した。
【０５２５】
瀕死状態がアッセイの終点である。しかし、重症の動物は屠殺した。群間の生存率を評価し、組織の組織学的分析を、αｄ抗体治療効果のさらなる指標として使用する。上記の予防研究を補うためにαｄ抗体の治療特性を調査する類似の研究を行う。
【０５２６】
３５日目に、αｄ抗体で治療したマウスは死亡しなかったが、生理食塩水治療群では９匹中２匹が死亡し、残りの７匹のうち３匹が症候群に特有の病態を発症した。非関連抗体で治療した群では、８匹のうち３匹が死亡した。
【０５２７】
【実施例４７】
ヒト白血病におけるαｄの発現
細胞系統にしたがって白血病を２つのクラス（骨髄性およびリンパ性）に分けることができ、これらのクラスの両方を急性または慢性にさらに区別することができる。αｄ発現の骨髄性細胞系統の明らかな制限により、骨髄性（リンパ球性ではない）白血病はαｄを発現すると推測される。第１の仮説が正しい場合、第２の損傷株は、病原性によってαｄ発現が異なることによりこれらの細胞におけるαｄの疾患関連機能を含むかどうかを同定することであった。
【０５２８】
末梢血細胞上のαｄ発現を、実施例１８に記載のように抗体２１２Ｄおよび２１７Ｌを使用して検出した。白血病細胞の試験では、最初に正常な骨髄細胞をαｄ発現についてフローサイトメトリーによって分析して、この細胞型のベースラインを確立した。製造者が推奨するプロトコールにしたがって抗体２１２Ｄおよび２１７Ｌを使用して患者サンプルを染色し、両抗体は骨髄中の単球に弱い反応性を示した。抗体２１２Ｄは、わずかに陽性であるのみであった。
【０５２９】
患者の末梢血または骨髄のいずれか由来の白血病細胞のフローサイトメトリー分析により、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の骨髄性芽細胞および単芽球上に２１２Ｄおよび２１７Ｌエピトープの存在が示された。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者由来の細胞で発現も認められた。別のＡＭＬ患者由来の細胞をより後期に評価し、αｄ陽性であることが見出された。細胞上のαｄ発現は、コントロールモノクローナル抗体よりも５０〜１００％高いが、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１１ｃ発現レベルより有意に低かった。
【０５３０】
これらの結果に照らして、（Ｍ１〜Ｍ５の分化スケールにおける）Ｍ−４期と等価の骨髄性白血病系統であるＵ９３７細胞株もまた評価した。ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびαｄの発現パターンは、ＡＭＬ患者の細胞のそれと類似していた。興味深いことに、細胞表面αｄタンパク質の存在は、培養条件に依存していた。抗血清レベルの富化培地（Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地、２０％ＦＢＳ）はαｄ発現を支えるが、基本培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ）は支えない。
【０５３１】
αｄ発現はＣＬＬ患者由来のリンパ芽球常で検出されるという所見は、αｄをリンパ球系統細胞中で発現することができることを示し、これは他のデータ（すなわち、ラットＣＤ５＋細胞およびイヌＣＤ８＋細胞上でのαｄ発現）と一致する。これらの細胞上での他のロイコインテグリンの比較的高い発現レベルは、再生可能な様式でのαｄ機能を試験するためのこれらの細胞の使用が排除され、このファミリーの余剰機能はこれらの細胞型の１つのメンバーの阻害を埋め合わせる。実際、これらの細胞によるαｄ発現は、異常な転写と同時に起こり得る。
【０５３２】
これらの実験は最初の仮説を十分に支持していないが、骨髄性およびリンパ性白血病上のαｄタンパク質の存在により、機能阻害よりもむしろ腫瘍除去を目的とした抗αｄ治療の使用は広範な患者集団で有利であり得ることが示唆される。
【０５３３】
当業者によって上記実施例に記載の本発明の多数の修正形態および変形形態が予想される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲のみで制限されるべきである。
【０５３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ１１ｂ（配列番号３）、ＣＤ１１ｃ（配列番号４）、およびαｄ（配列番号２）のヒトアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１Ａ】
2004532800.tif 000198
【図１Ｂ】
2004532800.tif 000199
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2004532800.tif 000201
【国際公開パンフレット】
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2004532800.tif 000470
2004532800.tif 000471
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004532800.tif 000472
【国際調査報告】
2004532800.tif 000473
2004532800.tif 000474
2004532800.tif 000475
2004532800.tif 000476