(57)【要約】【課題】新たなエリシターを使用して、作物栽培学的に有用な、植物の病原体を防除する病原体防除方法を提供する。【解決手段】この発明は、トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子を粉砕し、種皮及び粘液質の部分から子葉及び胚芽の部分を分離し、前記子葉及び胚芽の部分を水と混ぜ、そして、撹拌状態で、適温の温水により活性エリシターの成分の抽出を行うことからなる、新たなエリシターを使用して、有用な植物の病原体を防除することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリシター生成物を使って作物栽培学的に有用な植物の病原体を防除する病原体防除方法であって、前記エリシター生成物が少なくともトリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物から生じる一つのエリシター分子を含むことを特徴とする病原体防除方法。
【請求項２】
前記エリシター生成物の適用が植物の早い段階と植物の成育した段階の少なくとも一方で実施されることを特徴とする請求項１記載の病原体防除方法。
【請求項３】
前記エリシター抽出物が植物の感染に使用されるとき、前記エリシター抽出物が病原体及びすべての種類の植物の寄生生物に対する防除に効果を有することを特徴とする請求項１記載の病原体防除方法。
【請求項４】
前記エリシター生成物の植物への適用が、繰り返しの時間間隔で、必要な頻度で、例えば、１０日あるいは１５日ごとに実施されて、前記植物は前記エリシター生成物による処理の繰り返しに耐えるとともに、前記植物の防御機構が各処理で活性化されることを特徴とする請求項１又は２に記載の病原体防除方法。
【請求項５】
請求項２、３又は４に記載の病原体防除方法を実施するための新たなエリシターであって、前記新たなエリシターは前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物から生じる少なくとも一つのエリシター分子を含むことを特徴とする新たなエリシター。
【請求項６】
前記新たなエリシターは、少なくとも一方が３０，０００ダルトンを越え、他方が３０，０００ダルトンより小さい２つのエリシター分子を有する前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物からなることを特徴とする請求項５記載の新たなエリシター。
【請求項７】
請求項６記載の新たなエリシターの調製方法であって、前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子を粉砕し、種皮及び粘液質の部分から子葉及び胚芽の部分を分離し、前記子葉及び胚芽の部分を水と混ぜ、そして、撹拌状態で、適温の温水により活性エリシターの成分の抽出を行うことからなることを特徴とする。
【請求項８】
前記抽出が、好ましくは、重さ１０パーセントの子葉及び胚芽の部分と重さ９０パーセントの水を含む組成で実施され、抽出温度は、好ましくは、周囲の温度（約２５℃）と約１００℃との範囲内であることを特徴とする請求項７記載の新たなエリシターの調製方法。
【請求項９】
前記子葉及び胚芽の部分を分離する段階,水分処理及び活性エリシターの成分の抽出後に、前記エリシター生成物が脱水されることを特徴とする請求項７又は８に記載の新たなエリシターの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物を自然防御する新たな活性化物質即ちエリシター（eｌｉｃｉｔｅｕｒ）を使って、病原体及びすべての種類の植物の寄生生物（きのこ、バクテリア、ウイルス、昆虫等）を防除する方法及びこの方法を実施するための成分に関する。この新たな成分は予防及び治療として効力があるとともに、コロハ即ちトリゴネラ・フォエヌム・グラエクム（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ  ｆｏｅｎｕｍ  ｇｒａｅｃｕｍ）の種子の抽出物を含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
植物はウイルス、バクテリア、菌類、あるいは昆虫のような多くの病原体の寄生生物の影響を常時受けている。病原体への植物の抵抗性は、その植物（同じ遺伝子の関係）による病原体の認識か、あるいは、寄生生物によって生じた傷による防御の活性化の結果として生じる。
【０００３】
第１のケースでは、植物の抵抗性は、「非病原性遺伝子」（ｇ e nｅ  ｄ 'ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）と呼ばれる特別な遺伝子を持つ病原体を、これに対応した「抵抗遺伝子」（ｇeｎｅ  ｄｅ  ｒeｉｓｔａｎｃｅ）を持つ植物によって認識することから生じる。このケースでは、植物と病原体との間に遺伝子的にプログラムされた実際の相互関係がある。これら２つの敵対者の認識後、病原体による宿主組織への侵入が非常に局所的である間に、植物（一連の代謝、植物の抵抗性を伝達するシグナルの合成）が固有の機構に抵抗的性格を与えて発展させる。
【０００４】
第２のケースでは、植物の防御機構は、例えば、菌類の攻撃の間に、一方では、宿主のヒドラーゼによるキノコ壁の分解、他方では、キノコの酵素により加水分解された細胞壁の分解から生じるオリゴ糖により誘導される。同様に、これらの壁の破片は植物の抵抗性のメッセンジャーとして役立つ。
【０００５】
植物の抵抗機構が始動した後、特に、植物の感染しなかった部分で、植物は寄生生物の新たな攻撃に直面してより大きい抵抗性を発達させることができる。植物はいくつかの《自然の化学的メッセンジャー》（ｍｅｓｓａｇｅｒｓ  ｃｈｉｍｉｑｕｅｓ  ｎａｔｕｒｅｌｓ）によって新しいものとなる。この抵抗機構は《体系的獲得抵抗性》（Ｒeｓｉｓｔaｎｃｅ  Ｓｙｓｔe ｍｉｑｕｅ  Ａｃｑｕｉｓｅ）と呼ばれている。
【０００６】
植物が病原体に弱いとき、この植物は病原体の攻撃が同じ遺伝子の関係によるのか、あるいは《傷》（ｂｌｅｓｓｕｒｅ）によるのか認識できない。したがって、この植物は防御種子を効果的に活性化できない。その場合、いくつかの病原体に関していくつかのケースでは防御種子が生産できない抵抗性の《自然の化学的シグナル》（ｓｉｇｎａｕｘ  ｃｈｉｍｉｑｕｅｓ  ｎａｔｕｒｅｌｓ）を外生的に与えることによって、植物の自然防御を活性化できる。
【０００７】
植物及び病原体との間に認識があるとき、特有の機構が植物により発達させられる。しばしば、植物は病原体による攻撃部位で細胞死を出現させて応答し、その進行を止めている。この防御反応は、フィタルキシン（抗菌性分子）の合成や、キチナーゼあるいは、ベータ‐１，４‐エンドグルカナーゼ（β‐１，４‐ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｓ）のような病因（タンパク質ＰＲ）に関連するペリオキシダーゼ又は蛋白質のような防御酵素の合成のような機構の実施にほとんど常に関連している。これらの防御酵素は真菌及びバクテリアの壁を溶解できる。抵抗性があるとき、植物は侵入部位で病原体を止めるために細胞壁（リグニンの合成）を強化することができる。
【０００８】
作物栽培学的に有用な植物の自然防御を活性化する方法が知られている。この方法は、体系的獲得抵抗性のように、適用する部位において防御種子を予防的に活性化する植物に接触できる反応誘導あるいは反応促進する物質を有する植物への適用を含んでいる。上述した方法は、より詳しくは、１９９７年７月１８日、ゴエマール研究所（ＧＯＥＭＡＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ）出願の仏国特許出願、第２ ７６６ ０５９号に記載されている。
【０００９】
この方法は、効果的な多くのアン オリゴ ベータ １‐３‐グルカンヌ（ｕｎ ｏｌｉｇｏ β １‐３‐ｇｌｕｃａｎｅ）を使用する。これは、オリゴ ベータ  １‐３‐グルカンヌ（ｏｌｉｇｏ β  １‐３‐ｇｌｕｃａｎｅｓ）に加水分解されたさまざまな由来のベータ １‐３‐グルカンヌ（β １‐３‐ｇｌｕｃａｎｅｓ）から調製される。これらのβ １‐３‐グルカンヌ（β １‐３‐ｇｌｕｃａｎｅｓ）はバクテリア、特に、アルカリジェンヌ・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、菌類、特に、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）及びシェロテウム・グルカニウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｇｌｕｃａｎｉｕｍ）、酵母、特に、サッカロミス・セルヴィゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、藻類及び穀類に由来する。
【００１０】
しかしながら、この方法は抵抗性を続けて何回も生じさせられない。ただ粉末にすることだけができる。したがって、この方法は主として予防的であり、かっては限定されていた。
【００１１】
１９９９年１１月２日、エデン・バイオサイエンス（ＥＤＥＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）登録の米国特許第５ ９７７ ０６０号には、植物における昆虫の防除方法が説明されている。この米国特許では、昆虫に対する植物の防御システムのためのエリシターに関する参照可能な多数の文献が引用されている。この方法は植物のために昆虫を防除する方法であって、これは昆虫を防除するための効果的な状態において、植物又は種子にポリペプチド又はプロテインのエリシターを適用することにある。過敏感反応を引き起こすエリシター（ポリペプチド、又はプロテイン）は、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、フィロフトラ（Ｐｈｙｒｏｐｈｔｏｒａ）及びそれらの混合物から構成される群の中で選択された病原体から得られたものに対応する。
【００１２】
実施例において、前記エリシターはポリペプチド又はプロテインを分泌あるいは排出できる遺伝子を含むバクテリアに適用することにより、植物に適用されることができる。バクテリアは病気を引き起こさないとともに、過敏感反応のエリシターのポリペプチドあるいはプロテインをコード化する遺伝子によって形質転換（例えば、組替えのように）される。したがって、この文献は全体として病原体に対してでなく昆虫に対する防除方法を説明している。その上、この文献は一般の人々に非常に悪く見られている遺伝子操作に依拠している。
【００１３】
さらに、香辛料として農産物食品産業及び医薬品産業で使用されているコロハの種子が知られている。このコロハ、すなわちトリゴネラ・フォエヌム・グラエクム、すなわち、さらにセネグレはマメ科の植物である。コロハは４０のさまざまな混合物から構成されたエッセンシャルオイルを含んでおり、３‐ヒドロキシ‐４，５‐デメチル‐オキシランヌ‐２‐オン（３‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐４，５‐ｄｉｍｅｔｈｙｌ‐ｏｘｏｌａｎｅ‐２‐ｏｎｅ）は最も重要な芳香性成分であると思われる。コロハの含むこれらの非揮発性成分の間で、フロスタノール・グリコシド（ｆｕｒｏｓｔａｎｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）及びステロール（ｓｔeｒｏｌ）及びステロイドサポニン（s a p o n i n e s  s t e r o i d i q u e s）（医薬品産業で潜在的利点を有している）が特定されている。
【００１４】
１９９９年１２月７日、エメラルド・シード・プロダクツ有限会社（Ｅｍｅｒａｌｄ Ｓｅｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．）登録の米国特許第５ ９７７ ８７７号には、コロハ種子の商業的価値のある部分の抽出方法が記載されている。コロハ種子は中心に黄色い種を有しており、この種は白く半透明の胚乳及び種皮で囲まれた子葉及び芽である。この胚乳はガラトマンナン・ゴム（ｑｏｍｍｅｓ  ｄｅ  ｇａｌａｔｏｍａｎｎａｎｅ）、を含んでおり、濃い褐色の皮層で囲まれている。ガラトマンナン・ゴム、すなわちオレオレジンヌ（ｏｌeｏｒeｓｉｎｅｓ）の回収方法は、コロハ種子を１４パーセントから２０パーセントの湿度範囲で湿らせ；コロハ種子を粉砕し；いくつかの成分が溶媒に吸収されるようにある一定の温度で接触期間の間、溶媒に粉砕されたコロハ種子を混ぜ；溶媒から抽出物を分離することからなる。この方法はアルコール・ポレール（ａｌｃｏｏｌ  ｐｏｌａｉｒｅ）である溶媒を使用する不都合がある。
【００１５】
米国特許第５ ９７７ ８７７号に記載された他の方法は、溶解性繊維を回収することからなる。このため、コロハ種子を粉砕し、ふるい分けて種皮及び粘液質（皮膜）からなる重い部分を回収する。次いで、この重い部分は温水で処理される。これにより、溶解性繊維を回収できる。次に、軽い部分にあるガラトマンナン・ゴムは溶媒によって回収される。
【００１６】
ドイツ国特特許第１９７ ２６６号、欧州特許第０ ４９３ ６７０号あるいはＤＡＴＡＢＡＳＥ１９９４‐８４１２１号、ＸＰ００２１９４３７６あるいは化学抄録、１１９巻、１１号（１９９３‐９‐１３）、ＫＲＡＳＴＡような公知技術の文献は、毒になる可能性がある溶媒物質によって分離及び純化された分子、ただトリゴネリン（ｔｒｉｇｏｎeｌｉｎｅ）の使用に言及しているだけである。
【特許文献１】
仏国特許出願第２ ７６６ ０５９号
【特許文献２】
米国特許第５ ９７７ ８７７号
【特許文献３】
ドイツ国特許第１９７ ２６６号
【特許文献４】
欧州特許第０ ４９３ ６７０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、上述したように特許文献１の方法では、抵抗性を続けて何回も生じさせることができず、ただ粉末にできるものであって、主として予防的であり、限定的なものである。
【００１８】
また、特許文献２の方法では、全体として病原体に対してでなく昆虫に対する防除方法であり、好ましくないと思われている遺伝子操作に依拠している。また、この方法はアルコール・ポレール（ａｌｃｏｏｌ  ｐｏｌａｉｒｅ）である溶媒を使用する不都合がある。
【００１９】
また、特許文献３及び４等の方法では、毒になる可能性がある溶媒物質によって分離及び純化された分子、ただトリゴネリンの使用に言及しているだけである。
【００２０】
本発明が解決しようとする課題は、予防と同様に治療として作用できる新たなエリシター生成物を使って、病原体及びすべての種類の植物の寄生生物（菌類、ウイルス、バクテリア、昆虫等）を防除する方法を提供することにある。
【００２１】
さらに、本発明の別の課題は、複数のエリシター分子を含むことができる新たなエリシターを提供することにある。
また、本発明の他の課題は、環境に対して非攻撃的であって、新たなエリシターを分離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
請求項１の発明は、エリシター生成物を使って作物栽培学的に有用な植物の病原体を防除する病原体防除方法であって、前記エリシター生成物が少なくともトリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物から生じる一つのエリシター分子を含むことを特徴とする。
【００２３】
請求項２の発明では、前記エリシター生成物の適用が植物の早い段階と植物の成育した段階の少なくとも一方で実施されることを特徴とする。
【００２４】
請求項３の発明では、前記エリシター抽出物が植物の感染に使用されるとき、前記エリシター抽出物が病原体及びすべての種類の植物の寄生生物に対する防除に効果を有することを特徴とする。
【００２５】
請求項４の発明では、前記エリシター生成物の植物への適用が、繰り返しの時間間隔で、必要な頻度で、例えば、１０日あるいは１５日ごとに実施されて、前記植物は前記エリシターによる処理の繰り返しに耐えるとともに、前記植物の防御機構が各処理で活性化されることを特徴とする。
【００２６】
請求項５の発明では、前記新たなエリシターは前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物から生じる少なくとも一つのエリシター分子を含むことを特徴とする。
【００２７】
請求項６の発明では、前記新たなエリシターは、少なくとも一方が３０，０００ダルトンを越え、他方が３０，０００ダルトンより小さい２つのエリシター分子を有する前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物からなることを特徴とする。
【００２８】
請求項７の発明では、前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子を粉砕し、種皮及び粘液質の部分から子葉及び胚芽の部分を分離し、前記子葉及び胚芽の部分を水と混ぜ、そして、撹拌状態で、適温の温水により活性エリシターの成分の抽出を行うことからなることを特徴とする。
【００２９】
請求項８の発明では、前記抽出が、好ましくは、重さ１０パーセントの子葉及び胚芽の部分と重さ９０パーセントの水を含む組成で実施され、抽出温度は、好ましくは、周囲の温度（約２５℃）と約１００℃との範囲内であることを特徴とする。
【００３０】
請求項９の発明では、前記子葉及び胚芽の部分を分離する段階,水分処理及び活性エリシターの成分の抽出抽出後に、前記エリシター生成物が脱水されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３１】
したがって、本発明は、エリシターのように、トリゴネラ・フゥナム・グレカムの種子の抽出物から生じる一つあるいは複数の分子を使用する方法に関するものであり、これらの分子はどんな純化及び分離プロセス、処理植物に対して結果として毒を誘導する溶媒によるどんな処理も受けない。
【００３２】
さらに、本発明の新たなエリシターは複数のエリシター分子を含むことができるものであって、環境に対して非攻撃的である。
【００３３】
さらに、本発明は、予防と同様に治療として作用する新たなエリシター生成物を使って、病原体及びすべての種類の植物の寄生生物（菌類、ウイルス、バクテリア、昆虫等）を防除できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、次の実施例によりより詳しく説明される、これらの実施例は本発明の範囲をどのような場合でも限定するものでない。
【００３５】
本出願の発明者達は、研究所での試験後、コロハから抽出された抽出物が、病原体及びすべての種類の植物の寄生生物（菌類、バクテリア、ウイルス、昆虫等）に対して植物の防御機構に含まれるさまざまな酵素の活性を強く賦活することを発見した。
【００３６】
実施例１―新たなエリシターの抽出方法
【００３７】
コロハ種子が使用され、このコロハ種子は粉砕されて粉末にされる。比重による方法で種皮及び粘液質の部分から子葉及び胚芽の部分が分離される。
【００３８】
１００グラムの子葉及び胚芽の部分が１０００ミリリットルの水に混合され、そして、ゆっくりと撹拌しながら、周囲の温度と１００℃との間にある温度で抽出が行われる。次に、好ましくは、２ミクロンと５００ミクロンとの間の大きさの細孔を有するフィルターで生成物を濾す。前記子葉及び胚芽部分の機械的分離と濾過による水分処理の段階の後で、最初湿っていた生成物が傷むのを避ける、あるいは、安定及び防腐剤に頼らないようにするために、全く公知の方法及び手段（微粒子化、凍結乾燥、あるいは、例えば蒸発乾燥）によって脱水段階を導くことが有利に思われる。
【００３９】
実施例２―野菜植物及び観賞植物のコロハ抽出物による処理
【００４０】
上記実施例１で調製された抽出物が次の植物に散布され、そして、さまざまな植物のさまざまな寄生生物への抵抗性がテストされている。例として、メロン／うどん粉病；メロン／細菌症；メロン／スリップス（Ｔｈｒｉｐｓ）；メロン／コハナムシ；ブドウ／うどん粉病；ブドウ／べと病（ｍｉｌｄｉｏｕ）等に関して予防的及び治療的処理のとき、非常に重要な結果が得られた。
【００４１】
処理された植物を処理されていない植物と比較する。
【００４２】
予防的処理のケースでは、定期的に処理を繰り返す条件において、処理植物は（未処理植物と反対に）寄生生物にほとんど攻撃されなかったか、攻撃がなかった。治療的処理のケースでは、処理植物はコロハ抽出物によって感染の兆候が最初の処理から数日後に減少するのが見られた。この処理は、若い植物、挿し穂、あるいは成体植物について、どのような植物の成長段階であろうとも行える。
【００４３】
同様に、本発明に係る処理の防虫効果も証明された。
【００４４】
なお、実施された試験でエリシター生成物が少なくとも大きさの異なるエリシター分子を備えている可能性が示された。３０，０００ダルトンを越える大きさ、あるいは３０，０００ダルトンより小さいただ１つの分子は非常に限られた効果であるとともに、３０，０００ダルトンを越えるものと３０，０００ダルトンより小さいものの２つの分子の組み合わせが非常に興味ある結果を生じることが確認された。
【国際公開パンフレット】
2004532278.tif 000002
2004532278.tif 000003
2004532278.tif 000004
2004532278.tif 000005
2004532278.tif 000006
2004532278.tif 000007
2004532278.tif 000008
2004532278.tif 000009
2004532278.tif 000010
2004532278.tif 000011
2004532278.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成15年5月12日(2003.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリシター生成物を使って作物栽培学的に有用な植物の病原体を防除する病原体防除方法であって、前記エリシター生成物が少なくともトリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物から生じる少なくとも２つのエリシター分子を含むことを特徴とする病原体防除方法。
【請求項２】
前記エリシター生成物が水で抽出及び濾過により得られたトリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物から生じる少なくとも２つのエリシター分子を含むことを特徴とする請求項１記載のエリシター生成物を使って作物栽培学的に有用な植物の病原体を防除する病原体防除方法。
【請求項３】
前記エリシター生成物の適用が植物の早い段階と植物の成育した段階の少なくとも一方で実施されることを特徴とする請求項１又は２に記載の病原体防除方法。
【請求項４】
前記エリシター抽出物が植物の感染に使用されるとき、前記エリシター抽出物が病原体及びすべての種類の植物の寄生生物に対する防除に効果を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の病原体防除方法。
【請求項５】
前記エリシター生成物の植物への適用が、繰り返しの時間間隔で、必要な頻度で、例えば、１０日あるいは１５日ごとに実施されて、前記植物は前記エリシター生成物による処理の繰り返しに耐えるとともに、前記植物の防御機構が各処理で活性化されることを特徴とする請求項１、２、３又は４に記載の病原体防除方法。
【請求項６】
請求項２、３、４又は５に記載の病原体防除方法を実施するための新たなエリシターであって、前記新たなエリシターは前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物から生じる少なくとも一つのエリシター分子を含むことを特徴とする新たなエリシター。
【請求項７】
前記新たなエリシターは、少なくとも一方が３０，０００ダルトンを越え、他方が３０，０００ダルトンより小さい２つのエリシター分子を有する前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子の抽出物からなることを特徴とする請求項６記載の新たなエリシター。
【請求項８】
請求項７記載の新たなエリシターの調製方法であって、前記トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムの種子を粉砕し、種皮及び粘液質の部分から子葉及び胚芽の部分を分離し、前記子葉及び胚芽の部分を水と混ぜ、そして、撹拌状態で、適温の温水により活性エリシターの成分の抽出を行うことからなることを特徴とする。
【請求項９】
前記抽出が、好ましくは、重さ１０パーセントの子葉及び胚芽の部分と重さ９０パーセントの水を含む組成で実施され、抽出温度は、好ましくは、周囲の温度（約２５℃）と約１００℃との範囲内であることを特徴とする請求項８記載の新たなエリシターの調製方法。
【請求項１０】
前記子葉及び胚芽の部分を分離する段階,水分処理及び活性エリシターの成分の抽出後に、前記エリシター生成物が脱水されることを特徴とする請求項８に記載の新たなエリシターの調製方法。
【国際調査報告】
2004532278.tif 000013
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2004532278.tif 000019
2004532278.tif 000020