(57)【要約】多能性細胞を含む哺乳動物神経下垂体細胞の単離された集団が同定された。少なくともオリゴデンドロサイト及び／又はＩＩ型アストロサイト及び／又はニューロンに分化できるＯ−２Ａ前駆細胞を記載する。本発明はまた、このような細胞集団の単離、培養、移植の方法、並びに、神経障害又は神経疾患用の医薬としてのそれらの使用を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性細胞を含む哺乳動物神経下垂体細胞の単離された集団。
【請求項２】
多能性細胞は、少なくともオリゴデンドロサイト及び／又はＩＩ型アストロサイト及び／又はニューロンに分化できる、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
該集団は、構造が未だ発達している新生児神経下垂体由来であるか、又は成熟した神経下垂体由来である、請求項１又は２に記載の集団。
【請求項４】
該集団は、生理的刺激後の成熟した神経下垂体由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。
【請求項５】
該集団は、適切な培養培地で培養した神経下垂体の外植体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の集団。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞集団の取得方法であって、神経下垂体外植体からの懸濁液を調製する工程、該集団の成長及び／又は増殖用の適切な培地中で懸濁液を培養する工程を含む方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞集団の単離方法であって、
−培養で維持でき、少なくともオリゴデンドロサイト及び／又はＩＩ型アストロサイト及び／又はニューロンに分化する能力を有する前駆細胞を含む神経下垂体外植体を培養すること；
−該外植体を、該外植体の前駆細胞の増殖を引き起こす薬剤と接触させること；
−該外植体から、該薬剤に応答して増殖する前駆細胞を単離すること；
を含む方法。
【請求項８】
オリゴデンドロサイト−ＩＩ型アストロサイト（Ｏ−２Ａ）前駆細胞及び／又はそれらの子孫の取得方法であって、
−培養で維持でき、分化する能力を有する前駆細胞を含む神経下垂体外植体を培養すること；
−該外植体を、該外植体の前駆細胞の増殖とオリゴデンドロサイト−２型及び／又はアストロサイトへの分化を引き起こす薬剤と接触させること；
−懸濁液を、Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫のマーカーと接触させること；
−Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を単離すること；
を含む方法。
【請求項９】
Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫の単離技術は、磁気分離、抗体被覆磁気ビーズ、アフィニティクロマトグラフィ、マトリックス結合抗体、増殖因子への応答、特異的遺伝子発現、抗原的細胞特異的表面マーカー、基本的形態学の１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
神経下垂体Ｏ−２Ａ前駆細胞を少なくとも５０％含む単離された細胞組成物の調製を更に含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１１】
神経下垂体から得られる前駆細胞の成長、増殖及び／又は分化の１つを調節する能力を有する化合物のスクリーニング方法であって、
−培養で維持でき、分化する能力を有する前駆細胞を含む神経下垂体外植体を培養すること；
−該外植体を、該外植体の前駆細胞の増殖を引き起こす薬剤と接触させること；
−該外植体を試験化合物と接触させること；
−試験化合物無しの結果と比較することによって、前駆細胞の成長、増殖及び／又は分化の１つを検出すること；
を含む方法。
【請求項１２】
形質転換された哺乳動物多能性オリゴデンドロサイト−２型アストロサイト（Ｏ−２Ａ）前駆細胞及び／又はそれらの子孫の単離された集団の取得方法であって、少なくとも核酸の導入を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法に従って得られる、形質転換された哺乳動物多能性オリゴデンドロサイト−２型アストロサイト（Ｏ−２Ａ）前駆細胞及び／又はそれらの子孫の集団。
【請求項１４】
脳の少なくとも１ケ所に神経下垂体Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を提供する方法であって、脳へのＯ−２Ａ前駆細胞の体内移植を含む方法。
【請求項１５】
Ｏ−２Ａ前駆細胞は、予め形質転換されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｏ−２Ａ前駆細胞を含む神経下垂体外植体のインビボ発達及び分化のアッセイ方法であって、
−新生児又は成熟した神経下垂体外植体を抽出すること；
−外植体を標識し、新生児又は成熟した哺乳動物脳の周室部に外植体を移植すること；
−脳内で移植細胞の分布を同定すること；
を含む方法。
【請求項１７】
多能性Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を特徴付ける表面マーカーを認識できる抗体のスクリーニング方法であって、適切な培地で該細胞を培養し、試験抗体を加え、抗体−マーカー複合体を同定することを含む方法。
【請求項１８】
多能性Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を特徴付ける表面マーカーを認識できる抗体の提供方法であって、該細胞で動物を免疫化し、産生された抗体を単離することを含む方法。
【請求項１９】
神経下垂体から抽出され、少なくともオリゴデンドロサイト及び／又はＩＩ型アストロサイト及び／又はニューロンに分化できる単離された哺乳動物前駆細胞。
【請求項２０】
請求項１８に記載の少なくとも１つの単離された細胞の取得方法であって、
−培養で維持でき、少なくともオリゴデンドロサイト及びＩＩ型アストロサイトに分化する能力を有する前駆細胞を含む神経下垂体外植体を培養すること；
−該外植体から、少なくともオリゴデンドロサイト及びＩＩ型アストロサイトに分化する能力を有する少なくとも１つの前駆細胞を単離すること；
を含む方法。
【請求項２１】
神経下垂体Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫の集団、又は形質転換された該集団、並びに医薬上許容できるビヒクルを含有する医薬組成物。
【請求項２２】
細胞集団として、Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を少なくとも５０％含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
神経障害又は神経疾患用の医薬として使用される、請求項２１又は２２に記載の組成物。
【請求項２４】
神経障害又は神経疾患の治療用の医薬組成物の製造のための、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法によって得られる集団の使用。
【請求項２５】
神経障害又は神経疾患の治療用の移植片の製造のための、請求項５に記載の外植体の使用。
【請求項２６】
神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病である、請求項２４又は２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、神経生物学、詳細には、哺乳動物の神経下垂体から単離される多能性幹細胞の集団の単離及び使用に関する。より詳細には、本発明は、オリゴデンドロサイト−２型アストロサイト（Ｏ−２Ａ）前駆細胞に関する。
本発明はまた、特に、治療的処置及び細胞培養のための、哺乳動物多能性Ｏ−２Ａ前駆細胞及びそれらの子孫の再生及び使用のためにこの集団を使用する方法に関する。
【０００２】
多能性前駆細胞は、器官の十分に分化した細胞の欠如、又は活性の喪失もしくは異常活性に付随する疾患の治療に非常に有用であり得ると考えられている。従って、多能性細胞源を見出す必要性がある。このような前駆細胞を単離するために、研究できる多くの組織が存在するが、単離方法は、前駆細胞の各源に特異的である。
【０００３】
特に、中枢神経系（ＣＮＳ）では、オリゴデンドロサイト−ＩＩ型アストロサイト前駆細胞（Ｏ−２Ａ）と言われる多能性前駆細胞の集団が既に同定されている。この前駆体集団は、細胞系列及び細胞分化において分岐点であることが示されている。Ｒａｆｆと共同研究者による研究（Ｒａｆｆ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３０３：３９０， １９８３）は、ラット視神経における２能性グリア前駆細胞の存在を示した。それは、適切な増殖条件下、インビトロで、オリゴデンドロサイト又はＩＩ型アストロサイトに分化する力を有し、ある条件下、ニューロンに分化する力を有する（Ｋｏｎｄｏ ａｎｄ Ｒａｆｆ， ２０００）。他の神経領域からのＯ−２Ａ前駆体は、インビトロで２能性であることが示され、それは、培養培地によって、オリゴデンドロサイト又は２型アストロサイトを生じる（Ｂｕｔｔ （１９９８） ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｅ （１９８７））。
【０００４】
ＣＮＳの細胞は、ニューロン又はグリア細胞として分類される。グリア細胞は、オリゴデンドロサイト及びアストロサイトに更に分類できる。オリゴデンドロサイトは、ＣＮＳのミエリン産生細胞である。オリゴデンドロサイトの死は、多発性硬化症に見られる脱ミエリンを誘導するらしい（Ｗａｘｍａｎ， Ｓ． Ｇ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ Ｍｅｄ．， ３０６：１５２９， １９８２）、又は、未熟児にしばしば見られる痙攣性運動や認識欠損の原因と考えられる周室部白質傷害を誘導するらしい（Ｏｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １３：１４４１， １９９３）。
【０００５】
治療的移植は、多発性硬化症などの脱ミエリン化疾患に特に有望である。ラットにおいて、インビトロで成長し、増殖したオリゴデンドロサイト前駆体培養物は、動物に戻し移植できる。ミエリン産生のマウス突然変異体は、これらの細胞のレシピエントとして役立ち得るし、注目の細胞は、遊走し、移植され、分化し、レシピエントの神経線維をミエリン化するのが見られる（Ｅｓｐｉｎｏｓａ ｄｅ ｌｏｓ Ｍｏｎｔｅｒｏｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １４：９８， １９９２）。このような観察は、脱ミエリン化疾患、及び恐らくＣＮＳの外傷後の治療として、移植におけるヒトオリゴデンドロサイト前駆体の使用を示唆する。更に、近年、神経変性疾患の治療として、ヒト組織を移植するという考えが、ますます注目されている（Ｂｊｏｒｋｌａｎｄ， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：４１４， １９９３）。
【０００６】
Ｏ−２Ａ前駆体及び子孫の単離とクローン増殖はまた、米国特許 ５，６９３，４８２に記載のように、神経冠から得られた。
同系で、急速に増殖でき、神経組織、即ち、脳にうまく移植される前駆細胞源を同定する必要性が依然として存在する。
【０００７】
本発明の目的は、神経障害を補償するのを可能とする細胞をインビボで生じさせるために、首尾よく移植できるＯ−２Ａ前駆体の他の哺乳動物源を同定することである。
別の目的は、インビボでニューロンを生じさせるために、首尾よく移植できる哺乳動物組織を同定することである。
別の目的は、移植アプローチはドナー組織の入手性によって限定され得ることを考慮して、モデル動物システム及びヒトにおいて、ＣＮＳ及びＰＮＳの神経学疾患の治療に有用な前駆細胞の源を提供することである。
【０００８】
大規模で産生でき、時間にわたってサブカルチャーでき、神経生物学研究や神経薬学研究及びＣＮＳ薬剤発見の努力、並びに治療のために、これらの細胞に対する種々の神経活性組成物の効果をアッセイするのに使用できるＯ−２Ａ前駆体及びＯ−２Ａ前駆体由来の細胞の培養物を取得する必要性もある。
【０００９】
更なる目的は、システムの非常な複雑性を考慮して、このような前駆体の単離と培養の条件を最適化することである。実際、ＣＮＳには多数の型の細胞が存在し、それらの成長と分化に影響を与える多数の異なる神経栄養因子が存在する。細胞の型や、細胞が存在する脳の領域に依存して、異なる神経栄養因子又は因子の特異的組合せが、インビボで細胞の生存、増殖、分化に影響を与える。各型の細胞が、神経伝達物質、神経栄養因子、及び天然環境における他の分子の異なる組み合わせに応答する。
【００１０】
更なる目的は、問題の遺伝子を含む遺伝子工学操作されたＯ−２Ａ前駆体及びそれらの子孫細胞を提供することである。
更なる目的は、インビボでＯ−２Ａ前駆体及びそれらの子孫を特徴付けるマーカーを同定する方法を提供することである。
【００１１】
記載した目的に基き、第１の局面によれば、本発明は、多能性細胞を含む哺乳動物神経下垂体（ＮＨ）細胞の単離された集団に関する。
該多能性細胞は、少なくともオリゴデンドロサイト及び／又はアストロサイト及び／又はニューロンに分化できる。
１実施態様によれば、該集団は、構造が未だ発達している新生児神経下垂体由来であるか、又は成熟した神経下垂体由来である。
１実施態様によれば、該集団は、生理的刺激後の成熟した神経下垂体由来である。
１実施態様によれば、該集団は、適切な培養培地で培養した神経下垂体の外植体である。
【００１２】
本発明はまた、細胞集団の取得方法であって、神経下垂体外植体からの懸濁液を調製する工程、該集団の成長及び／又は増殖用の適切な培地中で懸濁液を培養する工程を含む方法に関する。
本発明はまた、細胞集団の単離方法であって、
−培養で維持でき、少なくともオリゴデンドロサイト及び／又はＩＩ型アストロサイト及び／又はニューロンに分化する能力を有する前駆細胞を含む神経下垂体外植体を培養すること；
−該外植体を、該外植体の前駆細胞の増殖を引き起こす薬剤と接触させること；
−該外植体から、該薬剤に応答して増殖する前駆細胞を単離すること；
を含む方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫の取得方法であって、
−培養で維持でき、分化する能力を有する前駆細胞を含む神経下垂体外植体を培養すること；
−該外植体を、該外植体の前駆細胞の増殖とオリゴデンドロサイト及び／又は２型アストロサイトへの分化を引き起こす薬剤と接触させること；
−懸濁液を、Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫のマーカーと接触させること；
−Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を単離すること；
を含む方法に関する。
Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫の単離技術は、例えば、磁気分離、抗体被覆磁気ビーズ、アフィニティクロマトグラフィ、マトリックス結合抗体、増殖因子への応答、特異的遺伝子発現、抗原的細胞特異的表面マーカー、基本的形態学の１つを含み得る。
方法は、神経下垂体Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を少なくとも５０％含む単離された細胞組成物の調製を更に含み得る。
【００１４】
本発明はまた、神経下垂体から得られる前駆細胞の成長、増殖及び／又は分化の１つを調節する能力を有する化合物のスクリーニング方法であって、
−培養で維持でき、分化する能力を有する前駆細胞を含む神経下垂体外植体を培養すること；
−該外植体を、該外植体の前駆細胞の増殖を引き起こす薬剤と接触させること；
−該外植体を試験化合物と接触させること；
−試験化合物無しの結果と比較することによって、前駆細胞の成長、増殖及び／又は分化の１つに対する効果を検出すること；
を含む方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、形質転換された哺乳動物多能性オリゴデンドロサイト−２型アストロサイト（Ｏ−２Ａ）前駆細胞及び／又はそれらの子孫の単離された集団の取得方法であって、少なくとも核酸の導入を含む方法に関する。核酸は、同種由来又は異種由来であり得る。形質転換は、即ち遺伝子工学であり得る。
核酸は、問題の遺伝子又は遺伝子のフラグメントであり得、Ｏ−２Ａ前駆体及び／又はそれらの子孫への導入は、異常機能を正し、又は新規特徴を誘導するであろう。核酸は、例えば、治療遺伝子、神経栄養因子もしくは生存因子の遺伝子、遊走因子の遺伝子、不死化オンコジーン、ベータガラクトシダーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子、選択圧下での、成長する能力を同定するのを可能とする選択マーカーであろう。
本発明はまた、該方法によって得られる、形質転換された哺乳動物多能性Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫の集団に関する。
【００１６】
本発明はまた、脳の少なくとも１ケ所に神経下垂体Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を提供する方法であって、脳へのＯ−２Ａ前駆細胞の移植を含む方法に関する。実際、神経下垂体Ｏ−２Ａ前駆体は、特に脳において遊走能力を有し、それによって、Ｏ−２Ａ前駆体は、細胞が移植される第１の場所から、細胞が分化し得る、少なくとも第２の場所に遊走できることが示されている。
本発明はまた、Ｏ−２Ａ前駆細胞は、予め形質転換されている、この方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、Ｏ−２Ａ前駆細胞を含む神経下垂体外植体のインビボ発達及び分化のアッセイ方法であって、
−新生児又は成熟した神経下垂体外植体を抽出すること；
−外植体を標識し、新生児又は成熟した哺乳動物脳の周室部に外植体を移植すること；
−脳内で移植細胞の分布を同定すること；
を含む方法に関する。
本発明はまた、多能性Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を特徴付ける表面マーカーを認識できる抗体のスクリーニング方法であって、適切な培地で該細胞を培養し、試験抗体を加え、抗体−マーカー複合体を同定することを含む方法に関する。
本発明はまた、多能性Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を特徴付ける表面マーカーを認識できる抗体の提供方法であって、該細胞で動物を免疫化し、産生された抗体を単離することを含む方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、神経下垂体から抽出され、少なくともオリゴデンドロサイト及び／又はアストロサイト及び／又はニューロンに分化できる単離された哺乳動物前駆細胞に関する。
本発明はまた、少なくとも１つの上記単離された細胞の取得方法であって、
−培養で維持でき、少なくともオリゴデンドロサイト及びＩＩ型アストロサイトに分化する能力を有する前駆細胞を含む神経下垂体外植体を培養すること；
−該外植体から、少なくともオリゴデンドロサイト及びＩＩ型アストロサイトに分化する能力を有する少なくとも１つの前駆細胞を単離すること；
を含む方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、神経下垂体Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫の集団、又は形質転換された該集団、並びに医薬上許容できるビヒクルを含有する医薬組成物に関する。
本発明はまた、細胞集団として、Ｏ−２Ａ前駆細胞及び／又はそれらの子孫を少なくとも５０％含有する、上記組成物に関する。
本発明はまた、神経障害又は神経疾患用の医薬として使用される、このような組成物に関する。
【００２０】
本発明はまた、神経障害又は神経疾患の治療用の医薬組成物の製造のための、上記方法によって得られる集団の使用に関する。
本発明はまた、神経障害又は神経疾患の治療用の移植片の製造のための、神経下垂体の外植体の使用に関する。
神経疾患は、特にアルツハイマー病、パーキンソン病であり得る。
【００２１】
本発明の他の性質及び利点は、図面によって図示される、以下の詳細な説明から明らかであろう。
色は、細胞型のより良き観察を可能とする、マーカー及び蛍光化合物による染色を指す。
【００２２】
ここで本発明をより詳細に説明する。
用語「前駆細胞」（又は、現在、用語「幹細胞」も使用される）は、増殖でき、より前駆体の細胞を生じることができる未分化細胞を指す。より前駆体の細胞は、特殊化された特徴を示す子孫と言われる十分に分化した細胞に分化する多数の細胞を産生する能力を有する細胞である。神経下垂体Ｏ−２Ａ前駆細胞は、神経下垂体の神経葉に存在し、分化した子孫、即ち、成熟した、機能を有するオリゴデンドロサイト及び２型アストロサイトを生じさせる前駆細胞集団を指す。「Ｏ−２Ａ前駆体」又は「Ｏ−２Ａ前駆細胞」を区別せずに用いる。
用語「外植体」は、哺乳動物身体から取られ、人工培地中で増殖させた器官、即ち、神経下垂体の一部を指す。
用語「細胞の単離された集団」は、細胞は身体から抽出されることを意味する。例えば、神経下垂体の神経葉の解剖は、単離技術である。更に単離への工程は、細胞を少なくとも７５％含む調製物を得るための精製である。
用語「培養培地」は、生細胞の培養のための調製物である。組織培養は、構造と機能を保存するように、インビトロでの組織、即ち、外植体の維持又は増殖を指す。細胞培養は、インビトロでの細胞の増殖を指す；細胞は、増殖し、及び／又は分化するが、組織には組織化されない。
【００２３】
視床下部−神経下垂体系は、オキシトシンとバソプレッシンを分泌し、適切な刺激に応答して、大人で顕著な可塑性を示す。下垂体後葉細胞は、下垂体の神経葉（ＮＨ）の主要な細胞要素である。それは、グリア細胞の形態的特徴を有し、グリア線維状酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）（Ｓａｌｍ ｅｔ ａｌ．， １９８２）、及び初期グリアマーカーであるビメンチン（Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９）とＳ−１００（Ｃｏｃｃｈｉａ ａｎｄ Ｍｉａｎｉ， １９８０）に対して免疫反応性である。
静止状態で、下垂体後葉細胞は、神経分泌軸索と、視床下部からの大型細胞ニューロン終末を取り囲み、血管壁と神経分泌終末との間の物理的障壁を形成し得る。例えば、分娩、泌乳、又は脱水によって刺激されるとき、軸索終末と血管の並置が増大すると、一般的循環にニューロペプチドが放出される。生理的刺激に応答して形態的変化を行う下垂体後葉細胞の能力は、ポリシアリル化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）の発現に依存する（Ｔｈｅｏｄｏｓｉｓ ｅｔ ａｌ， １９９１ ； Ｔｈｅｏｄｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｏｕｌａｉｎ， １９９９）。ＮＨは、ミエリン化軸索を含まず、従って成熟オリゴデンドロサイトを含まない。
【００２４】
本出願人は、下垂体後葉細胞に加えて１つの細胞集団を同定した。それは、成熟した及び発育中のげっ歯類神経下垂体で、Ｏ−２Ａ前駆体のインビトロとインビボの両方の表現形質マーカーを発現する。このために、本出願人は、以下の主要な方法を用いた。
【００２５】
動物
使用した動物は、繁殖コロニーで作出されたオスのラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）とマウス（Ｓｗｉｓｓ株）である。新生児齢は、誕生日として新生（ＰＮ）日０として計算した。ＰＮ０〜３のラットとマウスの仔並びに成熟ラットを用いた。動物の使用を含む方法の全ては、欧州動物ケアガイドライン及び指針に従って行った。
【００２６】
抗体
Ｏ−２Ａ前駆体及びそれらの子孫の細胞集団の同定を可能とする、異なる抗体を解析に用いた。異なる抗体を以下に列挙する。
【００２７】
【表１】
2004528019.tif 000002
【００２８】
蛍光標識第２抗体の全ては、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ， 米国）からであった。
グリア線維状酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）（アストロサイト細胞骨格マーカー）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）（オリゴデンドロサイトマーカー）、Ｏ４（オリゴデンドロサイトマーカー）及びＡ２Ｂ５（オリゴデンドロサイト表面マーカー）は、Ｏ−２Ａ前駆体及びそれらの子孫を同定できる神経細胞特異的表面マーカーである。
【００２９】
脱水及びＢｒｄＵ組み込み実験
成熟ラットを個別に住まわせ、通常飲用水又は２％ＮａＣｌ溶液で９日間維持した。殺す前に、ＢｒｄＵ（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）中１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ，仏国）の４回の注射（５０ｍｇ／ｋｇ）を、１２時間間隔で腹腔内に与えた。各実験で、少なくとも３匹の対照と３匹の脱水ラットを用いた。
切片、組織片、外植体培養物を、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ， ＵＳＡ）にマウントし、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡で検査した。
【００３０】
統計解析
増殖は、３匹対照ラットと４匹脱水ラットの各々に関し３〜４個の無作為選択切片でＢｒｄＵ−陽性細胞を計測することによって推定した。表面積は、Ｖｉｓｉｏｌａｂ ２０００ソフトウエア（Ｂｉｏｃｏｍ）を用いて計算し、データは、μｍ２当りＢｒｄＵ＋細胞の数として表した。
対照と他の条件との間の差異の有意性は、ＳｔａｔＶｉｅｗ−Ｓｔｕｄｅｎｔソフトウエアを用いＡＮＯＶＡで計算した。ＮＧ２−陽性細胞の数は、成熟ラットからの２個の無作為選択切片で計測し、ＴＯＰＲＯ３核マーカーによって同定される細胞総数と比較した。
【００３１】
免疫組織化学及びＢｒｄＵ染色方法
ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで動物を灌流した。下垂体を、４℃でＰＢＳ中４％ＰＦ中で１時間後固定を行い、ＰＢＳで洗浄し、３０％シュークロース中で低温保護した。低温切片作製後、水平連続切片（３５μｍ）をＰＢＳ中に集め、４℃で一晩１次抗体とインキュベートし、洗浄し、室温で１時間、適切な蛍光２次抗体とインキュベートした。必要な場合、透過化処理を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて、室温で２０分間行った。Ａ２Ｂ５抗体標識に関し、新鮮な全体マウントＮＨ片を、室温で１時間、１次抗体とインキュベートした。徹底的な洗浄と、ＰＢＳ中４％ＰＦ中での１０分間固定後、片を、室温で１時間、適切な蛍光２次抗体とインキュベートした。
ＢｒｄＵ標識のために、調製物を、漂流切片に関し２Ｎ ＨＣｌと０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中３７℃で３０分間、又は組織片と外植体培養物に関し２Ｎ ＨＣｌ中室温で２０分間インキュベートした。０．１Ｍの４ホウ酸ナトリウム中で３回の洗浄後、抗ＢｒｄＵ抗体とのインキュベーションを、漂流切片に関し４℃で一晩、又は外植体培養物と組織片に関し室温で１時間行った。洗浄後、適切な蛍光２次抗体とのインキュベーションを行った。２重染色の場合、１次抗体インキュベーション後、ＢｒｄＵ標識を行った。必要な場合、ＴＯＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， ＰＢＳ中 １：１０００）を用いて、マウント前に、核染色を行った。
【００３２】
神経下垂体の外植体培養物
神経下垂体の培養を、Ｗａｎｇら （Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）（引用により本明細書に含まれる）に記載のように行った。簡単に言うと、Ｐ０−Ｐ３ラット仔又は成熟ラット（記載時）からの下垂体を、Ｈａｎｋｓ ＢＳＳ中で切開した。それから脳膜を剥ぎ取り、前葉と中葉から注意深く、神経葉を分離した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）培地中で、各ＮＨを４〜６片に分離した。次いで、０．４％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ， 仏国）存在下、ｂＦＧＦ （１０ ｎｇ／ｍｌ）， ＰＤＧＦ−ＡＡ （１０ ｎｇ／ｍｌ） 及び ＮＴ３ （１０ ｎｇ／ｍｌ）を補充した血清非含有培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、１００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、１００μＭプトレシン、２０ｎＭプロゲステロン、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを補充；ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ）中、ポリ−Ｌ−リシン処理ガラスカバースリップ上で断片を体外培養した。
５％ＣＯ２及び９５％空気雰囲気中、３７℃で培養物をインキュベートした。
全体マウント調製物に関し、上記のように、ＰＢＳ中４％ＰＦ中での１０分間の固定後、インビトロ外植体培養物の標識を行った。
これらの実施の他に、特記されていなければ、本発明では、細胞培養、細胞生物学、分子生物学の従来の適切な技術を使用する。
Ｏ−２Ａ前駆体のインビボとインビトロの同定に関する好適な実施態様をここで記載する。
【００３３】
脳移植によるＯ−２Ａ前駆体のインビボでのキャラクタリゼーション
新生児マウス神経下垂体の脳移植を以下のように行う。
移植は、以前に記載のように（Ｖｉｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９）（引用により本明細書に含まれるものとする）行った。簡単に言うと、新生児マウスからのＮＨ片を、３７℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２を含有するＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中でインキュベートし、ＤＭＥＭ中で洗浄し、左大脳半球の脳室下帯の近く、新生児マウスの脳に注入した。移植後異なるときに（５、１５、２１日）、マウスを殺し、クリオスタット切片のために、脳を加工した。連続前後方向切片（１４μｍ）を集め、ヘキスト標識細胞をＵＶ光下検出した。ヘキスト陽性細胞を含む切片を、Ｖｉｔｒｙらによる記載のように（Ｖｉｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、免疫蛍光標識のために使用した。スライドを、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔにマウントし、Ｗｉｌｄ Ｌｅｉｔｚ ＤＭ蛍光顕微鏡を用い解析した。
【００３４】
第１に、本出願人は、固有のＯ−２Ａ前駆体が、ＧａｌＣなどの分化したオリゴデンドロサイトマーカーを発現している細胞の非存在下、成熟ラットＮＨに存在することを示した。これらのＯ−２Ａ細胞は、下垂体後葉細胞とは異なる。
結果は以下のようである。突起担持ビメンチン−（図１ａ，赤）又はＳ−１００−（図１ｂ，赤）陽性細胞として、成熟ラットＮＨの切片において、下垂体後葉細胞は明瞭に同定できた。ＮＧ２、即ち、初期グリア前駆体によって発現される内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９７）に対して陽性の細胞はまた、構造に存在していた（図１ａ及び１ｂ，緑）。ＮＧ２＋細胞（総細胞数の約９％）は、下垂体後葉細胞とは異なる細胞集団を表すビメンチン−（図１ａ）及びＳ−１００−（図１ｂ）陰性であることを、２重標識は示した。
【００３５】
対照条件下に維持された成熟ラットのＮＨに、Ｏ−２Ａ前駆体が存在することを明確に確認するために、Ａ２Ｂ５抗体を、この集団に対する第２マーカーとして使用した。
非特異的染色をさけるために、記載されたように、新鮮な非固定の成熟ラットＮＨ片で全体マウント標識を行った。Ａ２Ｂ５抗原を発現している丸形の２極性の、又は短突起担持の、多極細胞を、組織で観察した（図１ｃ）。更に、抗ＧａｌＣを用いる切片での免疫蛍光で、抗体は、ＮＨ中に標識を示さなかった（示さず）。
【００３６】
更に、脱水の刺激に応答して、発達中、又は成熟の両方のインビボで、Ｏ−２Ａは分裂できることを、本出願人は示した。
分裂Ｏ−２Ａ前駆体が、ＮＨ中にインビボで見出せることが最初に決定された。Ｐ３ラットにＢｒｄＵを注射し、４時間後に殺した。共焦点顕微鏡を用いて、全体マウント調製物で、分析した全てのＮＨ（ｎ＝３）で、Ａ２Ｂ５＋／ＢｒｄＵ＋細胞の存在を明瞭に我々は観察し（図１ｄ）た。このことは、これらの前駆体はＮＨ発育中に存在し、正常に分裂することを示した。
【００３７】
更に、成熟ラットにおいて、細胞増殖は、インビボで脱水刺激によって刺激されることが決定された。
飲用水の生理食塩水での置換の９日後、対の対照に対し、ＮＨで細胞増殖は増大した。これらの実験では、対照又は９日脱水成熟ラットは、殺される２日前に４回のＢｒｄＵ注射を受けた。抗ＢｒｄＵ抗体を用いる免疫染色を、対照及び脱水ラット（それぞれ、図１ｇ及び１ｈ）からのＮＨ切片で行った。以前に記載されたように（Ｍｕｒｕｇａｉｙａｎ ａｎｄ Ｓａｌｍ， １９９５）、対照動物と比較して、脱水では、ＢｒｄＵ＋細胞の密度は有意に増加していた（図１ｉ）。抗Ａ２Ｂ５又は抗ＮＧ２抗体と一緒にＢｒｄＵ抗体によって、全体マウント調製物と切片の両方で２重標識を行った。対照と刺激条件の両方で、Ａ２Ｂ５＋（図１ｅ及び１ｆ）及びＮＧ２＋（図１ｊ及びｋ）細胞が観察された。脱水ラットＮＨで、Ａ２Ｂ５＋／ＢｒｄＵ＋（図１ｆ）又はＮＧ２＋／ＢｒｄＵ＋（図１ｋ）細胞が明瞭に同定されたが、Ａ２Ｂ５＋／ＢｒｄＵ＋細胞は、対照サンプルでは殆ど見つからなかった（図１ｅ及び１ｊ）。
【００３８】
更に、他の神経領域からのＯ−２Ａ前駆体のインビトロ特徴を、Ｏ−２Ａ前駆体が見せることを示すために、培養システムを構築した。
インビトロで、成熟ラットＮＨからのＯ−２Ａ前駆体のキャラクタリゼーションは次のように行った。
成熟ＮＨ外植体を用いるインビトロアッセイをした。ミクロ切開前に、対照及び脱水成熟ラットにＢｒｄＵを注射した。
【００３９】
ＮＨを切取し、栄養因子の非存在下、合成培地で培養したとき、外植体の周りに細胞遊走は観察されなかった（示さず）。視神経Ｏ−２Ａ前駆体の遊走、増殖、生存を支持することが知られているｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＴ３（ＭｃＫｉｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０ ； Ｂａｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）が合成培地に加えられるとき、対照及び脱水ＮＨの両方で３日後、時々の細胞遊走が観察される。これらの可動性細胞は、２極性形態、丸形細胞体、２つの長い突起を有し（図２ａ）、Ａ２Ｂ５＋（図２ｂ）である。
対照ラット外植体では、Ａ２Ｂ５＋／ＢｒｄＵ＋細胞は、Ａ２Ｂ５＋遊走集団の間では決して観察されない（図２ｃ）。対照的に、脱水ラットからの外植体では、Ａ２Ｂ５＋／ＢｒｄＵ＋遊走細胞は観察される（図２ｄ）。
一緒に考えると、データは以下のことを示す。即ち、インビボで脱水後、Ａ２Ｂ５＋分裂細胞、及びインビトロで２極性の遊走細胞を与えることができる固有の細胞が、成熟ＮＨに存在する。
【００４０】
新生児ラットＮＨからのＯ−２Ａ前駆体のインビトロキャラクタリゼーションは以下のように行った。
成熟ＮＨ外植体は、遊走Ｏ−２Ａ前駆体の貧弱な源であるので、新生児ＮＨ外植体を用いて、これらの細胞のキャラクタリゼーションも行った。
第１セットの実験で、ＮＨ外植体は、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭで培養した。外植体の周りに線維芽細胞と内皮細胞の広範な出現が観察された（図３ａ）。この単層の上の細胞の大多数はＧＦＡＰ＋であることを免疫蛍光標識は示した。
第２セットの実験で、新生児ＮＨを、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＴ３を補充した合成培地で培養した。線維芽細胞、内皮細胞、２極性細胞（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）が、遊走細胞の中で観察され、Ａ２Ｂ５標識を用いて、これらの細胞の中でＯ−２Ａ前駆体を同定した（図３ｃ）。オリゴデンドロサイト系列に向かう分化は、段階特異的マーカーの発現を解析することによってモニターした。体外培養２４時間後、遊走２極性細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋（図３ｄ及び３ｅ）かつＡ２Ｂ５＋（図３ｆ）であったが、まばらな多極細胞はＯ４抗原を発現した（図３ｇ）。補充された合成培地での体外培養４８時間後、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋細胞がまれに見出されたが（示さず）、細胞の大部分は、多極性、Ａ２Ｂ５＋（図３ｈ及び３ｉ）、及びＯ４＋（図３ｊ）であった。１４日後、細胞は、成熟オリゴデンドロサイトの典型的形態を有し、Ｏ４（図３ｋ）及びＧａｌＣ（図３ｌ）抗原を発現し、ＭＢＰ標識（図３ｍ）を示した。これらの条件下、試験した時点のいずれでも、抗β−ＩＩＩチューブリン抗体又は抗ＮｅｕＮ抗体でモニターされるような、ニューロン表現型を発現する細胞は観察されなかった（示さず）。
従って、新生児ラットＮＨからのＯ−２Ａ前駆体は、インビトロで、成熟オリゴデンドロサイト又はアストロサイトを生じさせることができる。
【００４１】
更に、本出願人は、新生児ＮＨ由来Ｏ−２Ａ前駆体のインビボ遊走能及び分化能を示した。
新生児マウスＮＨ外植体をヘキスト標識し、上記方法のように、新生児マウス脳の周室部に移植した。１４のうち３つの移植脳はヘキスト＋細胞を欠いており、それ故、解析から除外された。異なるインキュベーション期間後、他のレシピエントは、注入部位の近く、即ち、脳室下帯（ＳＶＺ、ｎ＝５）、脳室背側側面壁（ｎ＝２）、ロストラル・ミグレートリィ・ストリーム（ｒｏｓｔｒａｌ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｓｔｒｅａｍ）の近位部（ＲＭＳ，ｎ＝１）、並びに、脳梁、及び脳室側面に接する線条（それぞれ、ｎ＝２及び１）で、ヘキスト＋細胞を含むのが見出された（表２）。ＳＶＺ近くに移植された、まばらなヘキスト＋細胞は、嗅球まで遊走した（図４）。各場合のヘキスト＋細胞の分布を表２に要約する。
【００４２】
【表２】
2004528019.tif 000003
【００４３】
注意。新生児マウスの脳室下帯近くに移植後の新生児ＮＨフラグメントからのヘキスト＋細胞の時空分布。移植された脳は、移植後１（ｎ＝１）、５（ｎ＝２）、１５（ｎ＝２）、２１（ｎ＝６）日に解析された。＋及び＋＋記号は、各脳領域で見出されるヘキスト＋細胞の数の半定量的表示を表す。Ｇは移植場所である。
【００４４】
移植ＮＨ ヘキスト＋細胞のグリア発生性質、免疫蛍光解析は、種々のマーカーを用いて行った。種々の脳場所でＣＮＰａｓｅ（図５ａ−５ｄ）又はＧＦＡＰ（図５ｅ−５ｈ）を発現するヘキスト＋細胞が見出された。
この結果は、ＮＨからの細胞は、アストロサイト及び成熟オリゴデンドロサイトの両方をインビボで生じさせることができることを示す。
非常に驚くべきことに、抗ＮｅｕＮ抗体（特異的ニューロンマーカー）を用い、ヘキスト＋細胞の一部はまた、ニューロンとして分化することが示された。これらの細胞は、神経性大脳皮質、時には脳梁に存在し、側面壁から皮質に遊走する（図５ｉ−５ｌ）。従って、新生児マウス脳に移植されたＮＨは、ニューロン前駆体の完全な非存在下、ニューロンを産生できた。新生児脳への神経下垂体の異型移植は、ニューロン、並びにアストロサイト及びオリゴデンドロサイトを産生できる多能性細胞の存在を示した。これらのニューロンが、Ｏ−２Ａ前駆体由来であるか、下垂体後葉細胞由来であるかは明瞭ではないが、いずれでも、単離された神経下垂体の断片の移植は、インビボでニューロンを産生する効率が高い。
【００４５】
本発明者によれば、ＮＨの神経外胚葉性及び局所性起源の両方は、この構造におけるＯ−２Ａ前駆体の存在と一致する。更に、分裂Ｏ−２Ａ前駆体は、神経葉が未だ発達中の新生児ラットに存在するが、これらの細胞は下垂体の形成にあずかることが示唆される。インビボとインビトロの両方の本研究は、Ｏ−２Ａ前駆体がＮＨの固有の細胞であり、この構造の主要細胞型、即ち、下垂体後葉細胞を生じさせ得ることが強く示唆されることを示した。支持として、本出願人は、ＮＨは、Ａ２Ｂ５＋／ＮＧ２＋ Ｏ−２Ａ前駆体より他のオリゴデンドロサイト系列細胞を含まないことを示した。更に、血清存在下、これらの細胞は、下垂体後葉細胞の特徴であるＧＦＡＰ＋細胞に分化する。興味深いことに、周産期構造からのＯ−２Ａ前駆体は、成熟ＮＨのそれよりも速く分裂することが観察された。
【００４６】
上記結果の他に、本発明者は、成熟した神経下垂体に存在する幹細胞集団の同定と精製に非常に良好な進歩をなした。実際、周知の、非常に良くキャラクタライズされた幹細胞集団を用いるとき、幹細胞の効率的な培養及び／又は移植が有意に増大する。このような知見は、単離実験を計画することを可能とし、成熟したＮＨ内の潜在性幹細胞の数を増大させるのを可能とする。図６〜９に示す以下の結果は、「更なるキャラクタリゼーション」といい、成熟したラットＮＨに存在するグリア細胞集団をキャラクタライズするのを可能とし、刺激が、構造中のグリア細胞とＯ−２Ａ前駆体の総数を調節し得る方法を解析するのを可能とした実験を要約する。
【００４７】
成熟ラットＮＨにおける細胞多様性
単離への予備的工程は、どの細胞が幹細胞能を有するかをＮＨで同定することである。本発明者は、亜集団が区別できるかどうかを決定する観点で、ＮＨからの通称「下垂体後葉細胞集団」をキャラクタライズした。この目的のために、グリア細胞系列の異なるマーカーを用い、共焦点顕微鏡を用い、免疫組織化学解析を行った。更に、細胞を計測し、偽陽性になり得る突起染色からサイトプラズムを明確に区別し得るために、核マーカーを用いた。
上記本文で記載したように、下垂体後葉細胞が十分に分化する時点で、Ｏ−２Ａ前駆体が成熟ラットＮＨに存在することを、本発明者は示した。この集団は、ＮＧ２ガングリオシドマーカーによって特徴付けられ、総細胞数の９％を表した（図６Ｄ）。ＧＦＡＰ陽性細胞は、突起担持細胞として成熟ラットＮＨの切片で明確に同定できた（図６Ａ）。アストロサイトマーカーＧＦＡＰ（図６Ａ）、Ｓ１００（図６Ｂ）、ビメンチン（図６Ｃ）は、構造内の総細胞のそれぞれ１５％、２２％、１３％を標識した。
【００４８】
２重免疫染色及び共焦点は、全集団の４％がＧＦＡＰを発現し、初期グリア分化マーカービメンチンに陽性であった（図７Ｂ）。Ｓ−１００集団のほんの９％及び７％が、それぞれＧＦＡＰとビメンチンマーカーに陽性であった。結果は、下垂体に存在するグリア集団の高度の不均一性を示唆し、Ｓ１００マーカーは、このグリア集団の大部分を標識するらしいことを示した。
表されたＮＧ２集団は、ＧＦＡＰ（示さず）陽性でもビメンチン（図７Ｄ）陽性でも決してなかった。まばらなＮＧ２細胞は、低レベルのＳ−１００を発現していた（図７Ｅ）。
成熟ＮＨでの下垂体後葉細胞集団は、不均一であるようであり、同一系列の成熟段階を表し得る（図７Ｆ）。
Ｇｕｄｉｎｏ−Ｃａｂｒｅｒａ及びＮｉｅｔｏ−Ｓａｍｐｅｄｒｏ（２０００）からの仕事は、下垂体の下垂体後葉細胞のマーカーとしてｐ７５  ＮＴＲを用いた。本発明者は、２重染色及び共焦点解析を用い、この発現を再試験した。ｐ７５  ＮＴＲ免疫染色は、ＮＨに存在する細胞の小部分を標識した（図８Ａ及びＤ）。この集団をより良くキャラクタライズするために、以前にキャラクタライズされたグリア集団のマーカーを用い、２重染色を行った；ｐ７５  ＮＴＲとＧＦＡＰの共存在は決して観察されなかった（図８Ｂ−Ｃ）。ｐ７５  ＮＴＲ集団からのまばらな細胞はＮＧ２＋であった（図８Ｅ−Ｆ）。
全体的にいって、これらの結果の示唆によれば、下垂体後葉細胞は、細胞の均一集団ではなく、各亜集団は、構造内で可能性のある幹細胞を表し得る。
【００４９】
脱水後及び再水分補給間の細胞増殖
全集団に対するＮＨの潜在性幹細胞の比を変える条件を見出すために、プロトコルを設計した。ＮＨ細胞増殖割合は、細胞に浸透圧挑をかけることによってモニターした。刺激されたラットを９日間脱水し、対照動物と比較した。この期間の間、ＢｒｄＵの毎日の注射を行い、両方の条件で増殖細胞を推定した。脱水９日後、対照条件の１１．２（＋／−０．７）と比較して、２９．４（＋／−２）細胞がフィールド当りＢｒｄＵ＋であった（図９）。増殖下垂体後葉細胞のパーセンテージは、Ｓ１００マーカーによる２重染色を行うことによって解析し、対照条件の４．１％（＋／−０．３）と比較して、脱水ラットの増殖細胞の１７．４％（＋／−１．５）が下垂体後葉細胞（Ｂｒｄｕ＋／ｓ１００＋）であることが示された。細胞増殖は、脱水３日後と６日後で、それぞれフィールド当り４０．９（＋／−０．９）及び２８．６（＋／−５．４）と推定された。対照動物で、増殖細胞の割合は、３日と６日でそれぞれ１１．４及び６．６（＋／−０．６）であった。脱水終了後３日と６日で対照動物のそれぞれ７％及び２．８％（＋／−２．８）と比較して、脱水動物で、分裂Ｓ１００＋細胞のパーセンテージは、１７．９％（＋／−１．２）及び２１．０％（＋／−１．０）であることが分かった。
【００５０】
この解析は、脱水により成熟ＮＨ内の細胞増殖の増大が起こり、下垂体後葉細胞（Ｓ１００陽性細胞）は増殖することを示す。次いで、本発明は、成熟ＮＨの脱水に作用することによって、精製前に潜在性幹細胞の数を調節する方法を提供する。
【００５１】
この「更なるキャラクタリゼーション」（図６〜９）に関連する結果のために使用された特別の材料及び方法は以下のようであった。
【００５２】
抗体。解析のために使用した異なる抗体を以下に列挙する。
【００５３】
【表３】
2004528019.tif 000004
【００５４】
全ての蛍光標識２次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ， 米国）からであった。
【００５５】
脱水、再水分補給及びＢｒｄＵ導入実験
１２匹の成熟ラットを個々に住まわせ、通常飲用水（６）又は２％ＮａＣｌ溶液（６）で、９日間維持した。この期間中、全てのラットは、ＢｒｄＵ（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ， 仏国）の毎日１回の注射（５０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。各々の対照群と脱水群で２匹のラットを殺した。全ての他の動物は通常飲用水を受け、再水分補給期間の開始後、３日又は６日で殺した。２匹の対照と２匹の脱水ラットを、各実験時点で用いた。再水分補給期間の間、ＢｒｄＵ注射は行わなかった。
【００５６】
組織処理
実験期間の最後に、ラットを深く麻酔し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦ）で灌流した。下垂体を、４℃で１時間、ＰＢＳ中４％ＰＦで後固定し、ＰＢＳで洗浄し、３０％シュークロースで低温保護した。
低温切片化を以下のように行った。水平連続切片（３５μｍ）をＰＢＳ中に集め、４切片毎に１個の１５μｍ切片をカバースリップに集めた。各下垂体からルーチンに得た３５μｍ及び１５μｍ切片の総数は約７〜９であった。
【００５７】
免疫組織化学及びＢｒｄＵ染色
切片を、４℃で一晩１次抗体とインキュベートし、洗浄し、室温で１時間、適切な蛍光２次抗体とインキュベートした。必要な場合、透過化処理を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて、室温で２０分間行った。インビトロ外植体培養物の標識は、全体マウント調製物に関し上記のように、ＰＢＳ中４％ＰＦ中での１０分間の固定後に行った。
ＢｒｄＵ標識のために、調製物を、漂流切片（３５μｍ）に関し、２Ｎ ＨＣｌと０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、３７℃で３０分間、又は組織片と外植体培養物に関し、２Ｎ ＨＣｌ中、室温で２０分間インキュベートした。０．１Ｍの４ホウ酸ナトリウム中で３回の洗浄後、抗ＢｒｄＵ抗体とのインキュベーションを、漂流切片に関し４℃で一晩行った。洗浄後、適切な蛍光２次抗体とのインキュベーションを行った。２重染色の場合、１次抗体インキュベーション後、ＢｒｄＵ標識を行った。必要な場合、実験に依存して、ＴＯＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， ＰＢＳ中 １：１０００）、又はヘキスト染色を用いて、マウント前に核染色を行った。
切片を、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ， ＵＳＡ）にマウントし、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、又はＣＡＲＶ Ｚｅｉｓｓ分析共焦点顕微鏡で検査した。
【００５８】
統計解析
所定のマーカーの陽性細胞の数を、成熟ラットからの少なくとも５個の無作為選択切片で計測し、実験セットアップに依存して、ＴＯＰＲＯ３又はヘキスト核マーカーで同定された細胞の総数と比較した。増殖は、２匹の対照ラットと２匹の脱水ラットの各々に関し５個の無作為選択切片でＢｒｄＵ陽性細胞を計測することによって推定した。表面積は、Ｖｉｓｉｏｌａｂ ２０００ソフトウエア（Ｂｉｏｃｏｍ）を用いて計算し、データは、フィールド当りＢｒｄＵ＋細胞の数として表した。１フィールドの表面は２５０μｍ２であった。
対照と他の条件との差異の有意性は、ＳｔａｔＶｉｅｗ−Ｓｔｕｄｅｎｔソフトウエアを用いてＡＮＯＶＡで計算した。
【００５９】
インビボとインビトロで、ＮＨ中のＯ−２Ａ前駆体をキャラクタライズした後、このような存在の神経生物学及び治療への適用の幾つかの例を、ここで記載する。
上記方法を用いることによって、本発明は、ＮＨから単離されたＯ−２Ａ前駆体の細胞集団を提供できる。Ｏ−２Ａ前駆体は、適切な条件下培養して再生、分化、即ち、オリゴデンドロサイト、アストロサイトに再生、分化できる。この培養は、適切な方法、例えば、米国特許５，６９３，４８２に記載などの適切なの方法によってなされよう。本発明は、ＮＨを意味するＯ−２Ａ前駆体の新規源の使用を可能とする。例えば、培養培地は以下のようであり得る。
【００６０】
基礎培地は、１００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、１００μＭプトレシン、２０ｎＭプロゲステロン、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（５０／５０）；（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ）からなる。この培地は、培養でＯ−２Ａ前駆体を維持するために、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ）で補充されている。Ｏ−２Ａ前駆体をアストロサイトに分化させるために、基礎培地は、１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）とＰＤＧＦ−ＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で補充される。Ｏ−２Ａ前駆体のオリゴデンドロサイトへの分化は、基礎培地で得られる。培養は、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％空気雰囲気中で維持される。
【００６１】
本発明は、ラット由来のＯ−２Ａ前駆体を用いて説明される。しかし、Ｏ−２Ａ前駆体及びそれらの子孫は、ヒト、及び非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなどからのＮＨから単離し得る。
本発明は、適切な培地でのＯ−２Ａ前駆体の培養、分化及び単離から得られるＯ−２Ａ前駆体又はそれらの子孫の濃縮集団を含む細胞調製物を提供する。得られる調製物は、選択された集団を大部分、又は少なくとも約７５％、好ましくは９０〜９５％含む。
神経下垂体外植体から前駆細胞を単離するために、前駆細胞の増殖を引き起こす薬剤が有用であるということが思い出させる。異なる技術を用いて、増殖を評価でき（ＤＮＡ合成測定、形態変化など）、外植体で増殖した前駆細胞を単離できる（機械的単離、外植体の酵素消化に続く特異的細胞表面マーカーに基く活性化前駆細胞集団の単離など）。（分化の特異的段階に付随する表面マーカーを同定できるモノクローナル抗体を用いて）Ｏ−２Ａ前駆体を起源とする異なる細胞集団が同定されると、分離方法には、磁気分離、クロマトグラフィ、蛍光活性化細胞選別、支持体と反応する磁気ビーズなどのマーカーを用いる直接的分離を用い得る。
【００６２】
遺伝子工学操作された哺乳動物多能性Ｏ−２Ａ前駆体及びそれらの子孫を調製することは、更に非常に有用であり得る。それは、インビトロ遺伝子導入のために十分な細胞数に増殖させ、次いで、インビボ移植のために、培養される。問題の遺伝子をコードする核酸配列は、遺伝子が発現する多能性Ｏ−２Ａ前駆体に導入される。これらの遺伝子として、神経栄養因子又は生存因子、不死化オンコジーン、マーカー遺伝子が挙げられる。
Ｏ−２Ａ前駆体は不死化され、細胞を所定の発達段階で維持し得る。不死化の現在の技術として、典型的には、細胞へのオンコジーンのトランスフェクションが挙げられる。オンコジーンのトランスフェクションは、組換えレトロウイルス、化学的又は物理的方法（リン酸カルシウム  カルシウム−リン酸−媒介トランスフェクション、ミクロインジェクション、リポソームに存在するプラスミドの挿入）の使用を含む適切なものによって、達成できる。
【００６３】
例えば、１つの方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）又はウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを用い、Ｏ−２Ａ前駆体に一過性的に感染又は形質転換することである。
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、レトロウイルスを含む種々のウイルスベクターを不死化のために利用できる。単一外来遺伝子が挿入できるレトロウイルスの例として、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ギボン類人猿白血病ウイルス（ＧａＬＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。幾つかの更なるレトロウイルスベクターは、多重遺伝子を組み込み得る。これらのベクターの全ては、選択可能マーカーの遺伝子を導入又は組み込み得、形質導入細胞は同定され得、産生でき得る。
【００６４】
ヘルペスウイルスをベースとするベクターはまた、Ｏ−２Ａ前駆体に遺伝子を導入するために用いられ得る：ヘルペスウイルスは、潜在性感染を確立でき、神経細胞の一部と明白な非病原性関係を確立できる。例えば、ＨＳＶ−１に基くようなベクターが使用できる。同様に、有用な送達及び発現ベクターを開発するために、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、他のパラミクソウイルス、そして、ヒト免疫不全レトロウイルス（ＨＩＶ）さえも、のようなＣＮＳ細胞に効率的に感染するヒト及び動物ウイルスを使用することが可能であり得る。
組換えレトロウイルスが、不死化オンコジーンを含むように操作されるとき、オンコジーンは、不死化すると知られているものの任意の１つであり得る。例えば、このような通常使用される不死化遺伝子として、ｍｙｃファミリー（ｃ−ｍｙｃ及びｖ−ｍｙｃ）、アデノウイルス遺伝子（Ｅｌａ１２ｓ及びＥｌａ１３ｓ）、ポリオーマラージＴ抗原及びＳＶ４０ラージＴ抗原の遺伝子が挙げられる。
【００６５】
Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子を、Ｏ−２Ａ前駆体に導入でき、これらの細胞及びそれらの子孫の同定を可能とする。ネオマイシン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ネオマイシン耐性）などの選択可能マーカー遺伝子を導入し、選択圧の存在下（即ち、ネオマイシン含有培地）、増殖できる能力によって同定される遺伝子工学操作されたＯ−２Ａ前駆体の集団を提供できる。
【００６６】
薬剤を同定するために、特に、レセプター分子の遺伝子を用いて、多数の有用な遺伝子をＯ−２Ａ前駆体及びそれらの子孫に導入できる。例えば、このようなニューロンのレセプターとして、ドーパミン、ＧＡＢＡ、アドレナリン、ノルアドレナリン、セロトニン、グルタメート、アセチルコリン、及び種々の他のニューロペプチドと結合するレセプターが挙げられる。特定の神経起源のＯ−２Ａ前駆体における特別のレセプターの導入及び発現は、Ｏ−２Ａ前駆体型やレセプターが関与する疾患の治療に有用であり得る神経活性薬剤や栄養因子の同定を可能としよう。例えば、神経伝達物質に擬似し、レセプターに結合し、アンタゴニスト効果又はアゴニスト効果を示し、よって、Ｏ−２Ａ前駆体における応答を阻害又は刺激する神経活性化合物が同定できる。
【００６７】
親が十分には発現しない遺伝子を組み込むＯ−２Ａ前駆体及びそれらの子孫の、処理される親での導入は、有用であり得る。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）などの神経栄養因子をコードする遺伝子は、コリン作動性ニューロンの変性を防ごう。特に、基底前脳のコリン作動性ニューロンの変性を特徴とするアルツハイマー病の治療においては、そうである。ドーパミンのプレカーサーであるＬ−ＤＯＰＡをコードする遺伝子は、中脳の黒質のドーパミンニューロンの喪失を特徴とするパーキンソン病の治療に有用であろう。
【００６８】
導入される遺伝子はまた、例えば、脳卒中の場合に、ある部位の細胞死の責を担う因子を阻害できる遺伝子、又は腫瘍に有効な遺伝子であり得る。
本発明はまた、ＣＮＳの細胞疾患の被験体の治療方法であって、被験体に、治療有効量のＯ−２Ａ前駆体又はそれらの子孫を投与することを含む方法を提供する。
ＣＮＳ疾患の被験体の治療方法は、疾患を有するＣＮＳの領域への、Ｏ−２Ａ前駆体、又は、Ｏ−２Ａ前駆体からの分化を誘導されたオリゴデンドロサイトもしくはアストロサイトもしくはニューロンの脳内移植を含む。
Ｏ−２Ａ前駆体移植は典型的には、ＣＮＳへの、又は脳室洞への、又は宿主脳表面の硬膜下への、細胞の移植を含む。移植のこのような方法は、Ｎｅｕｒａｌ Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＮＳ， Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ ａｎｄ Ｓｔｅｎｅｖｉ， ｅｄｓ．， （１９８５）（引用により本明細書に含まれるものとする）に記載されている。方法として特に、移植時に脳実質にくっつけられるように、宿主脳内に組織の注入、又は組織を置くことによって達成される実質内移植（即ち、宿主脳内に）が挙げられる。
【００６９】
レシピエント被験体の脳の選択領域へのＯ−２Ａ前駆体の投与は、
−マイクロシリンジの針が挿入できるように、孔を開け、硬膜を突き通すこと；
−Ｏ−２Ａ前駆体又は子孫調製物を、脊髄領域内に包膜内に注入し、脳又は脊髄の任意の所定部位へのＯ−２Ａ前駆体又は子孫の移植を可能とすること；
によってなされ得る。
【００７０】
同じ細胞懸濁液を用いて、又は異なる解剖学的領域から、幾つかの異なる部位に同時に、多重移植がなされ得る：例えば、Ｏ−２Ａ前駆体又は子孫（オリゴデンドロサイト又はアストロサイト）は、被験体のオリゴデンドロサイトが死んでしまった、多発性硬化症の被験体のＣＮＳに移植できる。
ＣＮＳ疾患の被験体の治療方法としてはまた、ＣＮＳ疾患の治療に有用な他の治療方法と組み合わせてのＯ−２Ａ前駆体の移植が考えられる。例えば、Ｏ−２Ａ前駆体は、増殖因子、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、トキシン、神経突起促進分子、及び代謝拮抗物質、及び、ドーパミンのプレカーサーであるＬ−ＤＯＰＡなどのこれらの分子のプレカーサーなどの薬剤と共投与できる。
【００７１】
ＮＨ外植体の移植後、分化すると非常に驚くべきことに見出されたニューロンに関し、ＮＨ外植体からの移植が、本明細書記載のように、現在なされ得る。移植は、種間、例えば、ブタニューロンからヒトへの移植、でなされ得る。
【００７２】
本発明はまた、Ｏ−２Ａ前駆体が、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロンへの増殖又は分化するのを阻害又は刺激することによってなどのように、Ｏ−２Ａ前駆体又は子孫に影響を与える組成物の同定方法を提供する。
【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｏ−２Ａ前駆体がＮＨ固有細胞であることを示す。
成熟ＮＨ切片での免疫組織化学を、固有細胞集団を同定するために行った。抗ビメンチン（ａ，赤）抗体又は抗Ｓ−１００（ｂ，赤）抗体による標識によって、下垂体後葉細胞は認識される。抗ＮＧ２抗体（Ｏ−２Ａ細胞のマーカー）を用いる２重染色は、下垂体後葉細胞とは異なる前駆体集団（ａ及びｂ，緑）の同定を可能とする。細胞核（ａ及びｂ，青）を同定するために、ＴＯＰＲＯ３マーカーを用いる。全体マウント調製物のＡ２Ｂ５標識は、新生児（ｄ，緑）及び成熟（ｃ及びｅ，緑）対照動物並びに成熟脱水（ｆ，緑）ラットでの前駆体の存在を示す。抗ＢｒｄＵ抗体による２重標識は、それらの前駆体は、発達中増殖し（ｄ，赤）、脱水後、大人で増殖し（ｆ，赤）、一方、ＢｒｄＵ標識は、成熟対照ラットで観察されない（ｅ，赤）。抗ＢｒｄＵ及び抗ＮＧ２を用いる切片での２重標識は、ＮＧ２＋細胞は、脱水後の成熟ラットで増殖するが（ｋ）、成熟ラット対照では増殖しない（ｊ）ことを示す。増殖は、ＢｒｄＵ組み込みと、抗ＢｒｄＵ抗体を用いる免疫組織化学によって解析される。成熟対照（ｇ）又は脱水（ｈ）ラット由来のＮＨ調製物は、脱水後増殖において３倍増加することを示す（ｉ）（対照動物でμｍ２当り３２２＋／−２０  ＢｒｄＵ＋細胞と比べて、脱水動物でμｍ２当り１１１１＋／−４５  ＢｒｄＵ＋細胞）。
スケールバー：ａ−ｂ，ｊ−ｋ，１３μｍ；ｃ−ｆ，１０μｍ；ｇ−ｈ，３２５μｍ。
【図２】
図２は、成熟ラットＮＨからのＯ−２Ａ前駆体のインビトロキャラクタリゼーションを示す。
インビトロで成熟ＮＨ外植体から遊走する２極性細胞（ａ）は、Ｏ−２Ａ前駆体と同定される、Ａ２Ｂ５に免疫陽性である（ｂ）。分裂細胞に組み込まれることができるＢｒｄＵが、外植前に、対照（ｃ）又は脱水（ｄ）成熟ラットに注入されるとき、２重陽性Ａ２Ｂ５＋（赤）／ＢｒｄＵ＋（緑）細胞が生理的刺激（脱水）ラット（ｄ）由来の外植体の増殖で観察されるが、これらは対照条件では決して見出されない（ｃ）。Ｅ：外植体。スケールバー，５８μｍ。
【図３】
図３は、新生児ラットＮＨからのＯ−２Ａ前駆体のインビトロ２能性を示す。
血清が培養培地に含まれるとき、線維芽細胞と内皮細胞の広範な増殖が、外植体の周りに観察される（ａ）。免疫蛍光標識は、この単層上の細胞の大部分は、ＧＦＡＰ＋、即ちアストロサイトであることを示す（ｂ）。合成培地で、２極性Ａ２Ｂ５＋細胞は、明瞭に同定され、外植体から外に遊走している（ｃ）。オリゴデンドロサイト系列に向かう分化は、段階特異的マーカーの発現の解析によって追跡された。外植２４時間後、遊走２極性細胞（ｄ）は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（ｅ）とＡ２Ｂ５（ｆ）の両方に免疫反応性であり、数個の細胞はＯ４抗原（ｇ）を発現する。外植４８時間後、細胞の大部分は、多極性、Ａ２Ｂ５＋（ｈ及びｉ）、及びＯ４＋（ｊ）である。１４日後、細胞は、成熟オリゴデンドロサイトマーカー、Ｏ４（ｋ）及びＧａｌＣ（ｌ）に免疫陽性であり、ＭＢＰ標識（ｍ）を示す。Ｅ：外植体。スケールバー：ａ−ｃ，ｆ−ｍ，５８μｍ；ｄ−ｅ，３７μｍ。
【図４】
図４は、宿主マウス前脳でのＮＨ由来細胞の遊走を示す。
核を同定するために、新生児下垂体の断片を、ヘキストで標識し、マウスに移植した。宿主脳番号１１（表２）の模式的前後方向図（ａ）は、移植後２１日のヘキスト陽性細胞の再分配を示す。ヘキスト＋細胞を含む部位を青点で図示する。部分的に点々で示された長方形（ａ）は、それぞれ、断面で、脳室下帯、ロストラル・ミグレートリィ・ストリーム、及び嗅球を示す（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）におけるヘキスト＋細胞の存在を示す。スケールバー：ｂ，３５０μｍ；ｃ−ｄ，１７５μｍ。移植片は、宿主脳で生存でき、遊走できる細胞を含んでいた。
【図５】
図５は、インビボにおける新生児マウス由来細胞の分化能を示す。
宿主脳切片の免疫蛍光解析は、表現型を同定するために、新生児マウスの脳周室部へのＮＨ由来細胞の移植後２１日目に行われた。
これらの切片は、ヘキスト＋細胞（青）、抗ＣＮＰａｓｅ（ａ−ｃ，緑）抗体標識細胞、抗ＧＦＡＰ（ｅ−ｇ，赤）抗体標識細胞、又は抗ＮｅｕＮ（ｉ−ｋ，緑）抗体標識細胞を含む。例は、脳梁（ａ−ｄ）及び線毛（ｅ−ｈ）での宿主脳番号９（表２）、及び脳梁（ｉ−ｌ）での宿主脳番号７（表２）から選択された。矢の頭は２重陽性細胞を示す。スケールバー：ａ，ｅ，ｉ，８３μｍ；ｂ−ｄ，ｆ−ｈ，ｊ−ｌ，３３μｍ。
【図６】
図６は、成熟ラット神経下垂体におけるグリア細胞の多様性を示す。
グリア細胞集団に特異的な種々の抗体である抗ＧＦＡＰ（Ａ）、抗Ｓ１００（Ｂ）、抗ビメンチン（Ｃ）、及び抗ＮＧ２（Ｄ）で免疫標識を行った。ＮＧ２抗体は、典型的なアストロサイト形態を示すＧＦＡＰ陽性細胞と比較して、小突起（Ｄ）を有する細胞集団を標識した。定量的解析の結果は、括弧内に記載されている。
【図７】
図７は、成熟ＮＨの下垂体後葉細胞集団は不均一であることを示す。
２重標識免疫染色の共焦点解析は、下垂体後葉細胞集団のグリアマーカーの分布を解析するために、行われた。グリアマーカーは以下の組合せで用いた：ＧＦＡＰ／Ｓ１００（Ａ）、ＧＦＡＰ／Ｖｉｍ５（Ｂ）、Ｖｉｍ／Ｓ１００（Ｃ）、ＮＧ２／ｖｉｍ（Ｄ）及びＮＧ２／Ｓ１００（Ｅ）。色コードは、どのマーカーが赤又は緑で示されるかを示すために図で使用される。青染色は、核標識に対応する。所定のマーカーの２重陽性細胞の数は、成熟ラットからの少なくとも５つの無作為選択切片で計測され、核標識で同定された細胞の総数と比較された。定量的解析の結果が脇に書かれている。
（Ｆ）同一系列の成熟段階を表すことができる、成熟ＮＨ中の下垂体後葉細胞集団の模式図。
【図８】
図８は、Ｐ７５  ＮＴＲ免疫染色がＮＨに存在する細胞の小部分を標識した（Ａ及びＤ）ことを示す。
グリア集団のマーカーとして、ＧＦＡＰ（Ｅ及びＦ，緑）を用いて行われた２重染色は、Ｐ７５  ＮＴＲ染色（赤）との重複を示さなかった。ｐ７５ ＮＴＲ集団からのまばらな細胞（Ｃ，赤）は、ＮＧ２陽性であった（Ｃ，緑）。
【図９】
図９は、刺激の間の分裂下垂体後葉細胞の割合を示す。
刺激された成熟ラット（Ａ）又はペアの対照動物（Ｂ）の切片を、抗ＢｒｄＵ（緑）抗体及び抗Ｓ１００（赤）抗体で標識した。矢は２重陽性細胞を示した。（Ａ）  脱水後９日目に、１１．２（＋／−０．７）と比較して、フィールド当り２９．４（＋／−２）細胞がＢｒｄＵ＋であることを我々は観察した。（Ｃ）  脱水後９日目（９Ｄ）、再水分補給期間の開始後３日目（３Ｒ）又は６日目（６Ｒ）での増殖細胞の定量的解析。増殖下垂体後葉細胞のパーセンテージは、暗黒で表されており、フィールド当り増殖細胞の総数と比較されている（２５０μｍ２×２５０μｍ）７．４％（＋／−１．５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528019.tif 000086
【国際調査報告】
2004528019.tif 000087
2004528019.tif 000088
2004528019.tif 000089
2004528019.tif 000090