(57)【要約】本発明は、新規Ｄ−カルバモイラーゼおよび有機体Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ  ＤＳＭ２０１１７から得られる該Ｄ−カルバモイラーゼをコードする遺伝子配列に関する。プラスミド、ベクター、特定のプライマーおよび本発明の酵素の特殊かつ可能な使用についても言及する。さらに本発明は、５’−置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を製造する過程で使用できる酵素を発見するための新規方法について記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｉｅｔｅｓ  ＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤ−カルバモイラーゼをコードする遺伝子配列。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子配列を含むプラスミドまたはベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子配列を含む微生物。
【請求項５】
請求項２に記載の遺伝子配列をＰＣＲにより製造するためのプライマー。
【請求項６】
エナンチオ濃縮されたアミノ酸を製造するための、請求項１に記載のＤ−カルバモイラーゼの使用。
【請求項７】
ヒダントインを、ヒダントイナーゼ／Ｄ−カルバモイラーゼの系で、場合によりヒダントインラセマーゼまたはカルバモイルアミノ酸をラセミ化できる酵素の存在下に変換することを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
遺伝子操作により修飾された酵素を製造するための、請求項１に記載のＤ−カルバモイラーゼまたは請求項２に記載の遺伝子配列の使用。
【請求項９】
５’−置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を製造するための方法に関与できる酵素をコードする、染色体にコードされた遺伝子の発見法において、この際、
ａ）５’−置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を産生できる有機体の染色体ＤＮＡをフラグメントに切断し、
ｂ）次にフラグメントをプラスミドへ入れてクローン化し、
ｃ）プラスミドを、ヒダントイナーゼまたはＤ−カルバモイラーゼの配列情報を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、
ｄ）ヒダントイナーゼの十分なハイブリダイゼーションが起こる場合はＤ−カルバモイラーゼ配列が、またはＤ−カルバモイラーゼが十分にハイブリダイゼーションされる場合はヒダントイナーゼ配列が、同一のプラスミド中で同定されることを特徴とする、５’−置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を製造するための方法に関与できる酵素をコードする、染色体にコードされた遺伝子の発見法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法により酵素を製造する方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の酵素を製造することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−カルバモイラーゼ、この酵素をコードする遺伝子配列およびその使用に関する。本発明はさらに、このＤ−カルバモイラーゼにより修飾されたプラスミド、ベクターおよび微生物、ならびに染色体にコードされている遺伝子を発見する方法に関する。
【０００２】
有機化合物の合成に酵素法を利用することは、生成物の選択性および収量が通常の化学法よりもしばしば優れている点で、大規模工業にとって非常に有利である。厳密にエナンチオ濃縮されたアミノ酸は酵素法を行うのに有利な標的であるが、実際、これらの方法は、例えばたんぱく質およびアルブミンの生合成にもたいへん重要である。また、エナンチオ濃縮されたアミノ酸は、生体活性化合物の合成または非経口的栄養補給に重要な生成物である。
【０００３】
カルバモイラーゼは、Ｎ−カルバモイルアミノ酸を立体選択的にＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸へ変換できる酵素であり、同時に、鏡像異性カルバモイルアミノ酸は維持される（式１）。
【０００４】
【化１】
2004526445.tif 000002
【０００５】
ラセミ体Ｎ−カルバモイルアミノ酸は、有利に、ヒダントイナーゼを用いるかまたはアミノ酸とＫＯＣＮとを反応させることにより、ヒダントインから非常に容易に製造でき、この理由から、このような方法は、エナンチオ濃縮されたアミノ酸を工業規模で製造するのに利用される（Drauz K, Kottenhahn M, Makryaleas K, Klenk H, Bernd M, Angew Chem, (1991). Chemoenzymatic synthesis of D−ω−ureidoaminoacids, 103, 704〜706.; 式２）。
【０００６】
【化２】
2004526445.tif 000003
【０００７】
Ｄ−カルバモイラーゼは文献からすでに公知であるであるが（Syldatk et al. "Enzymatic Catalysis in Organic Synthesis" eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1st and 2nd Ed）、その多くは十分効果的に作用しないかまたは不安定であり（Syldatk C, Mueller R, Pietzsch M, Wagner F (1992). Biocatalytic production of amino acids & derivatives; eds.; Rozzell D, Wagner F, Hanser Publishers, Munich; 129〜176; Louweier A, Knowles CJ (1996). The purification and characterization of a novel D-spedific carbamoylase enzyme from Agrobacterium sp. Enzyme Microb Technol. 19; 562〜571; Nanba H, Ikenaka Y, Yamada Y, Yajima K, Takano M, Takahashi S (1998). Isolation of Agrobacterium sp. Strain KNK 712 that produces N-carbamyl−D−amino acid amidohydrolase, cloning of the gene for this enzyme, and properties of the enzyme. Biosci. Biotechnol. BIochem. 62(5) 875〜881; Kim DM, Kim GJ, Kim HS (1994). Biotechnol Lett, (16) 11〜16）、そのため、さらに改良の進んだカルバモイラーゼが必要とされている。
【０００８】
従って本発明の課題は、場合により従来技術よりも改良されている、別のカルバモイラーゼを提供することである。
【０００９】
この課題は、請求項により解決される。請求項１は、Ａ．ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７由来の新規Ｄ−カルバモイラーゼを保護するものである。請求項２は、本発明のＤ−カルバモイラーゼをコードする遺伝子配列に関し、請求項３は、これらの遺伝子配列で修飾されたプラスミドおよびベクターに関し、他方、請求項４は、本発明により修飾された有価な微生物に関する。請求項５は、特定のプライマーに関し、他方、請求項６から８は、本発明のＤ−カルバモイラーゼの有利な使用を保護するものである。遺伝子を見出す方法について請求項９から１１項に記載する。
【００１０】
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ  ＤＳＭ２０１１７（配列番号２）由来のＤ−カルバモイラーゼを提供することにより、これをアミノ酸の製法に有利に使用することの可能性が開ける。このような方法は、原則として専門家に知られている（ＷＯ００５８４４９、ＷＯ０００８３７４、ＤＥ１０００５０１２３.０またはＤＥ１００５０１２４.９およびそこに引用された文献）。酵素は、未変性の酵素または有利に組換え法により製造された化合物の形で、記載の方法ために使用できる。本発明の組換え酵素の製造は、当業者に公知の遺伝子操作法により実施される（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press; Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. R. L. Rodriguez & D. T. Denhardt, eds; 205〜225）。一般的方法として（ＰＣＲおよびフュージョンＰＣＲ、逆ＰＣＲ、クローニング、発現等）、以下の文献およびそこに引用される文献が参照される：Riley J, Butler R, Finniear R, Jenner D, Powell S, Anand R, Smith JC, Markham AF (1990). A novel, rapid method for the isolation of terminal sequences from yeast artificial chromosome (YAC) clones. Nucl. Acids Res. 18, 8186; Triglia T, Peterson MG, Kemp DJ (1988). A Procedure for in bitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res. 16, 8186; Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press; Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses. R. L. Rodriguez & D. T. Denhardt, II）。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本発明のＤ−カルバモイラーゼ（例えば配列番号１）をコードする遺伝子配列に関する。アミノ酸配列をコードする遺伝子配列には、遺伝暗号の縮重により可能と思われる全ての配列が含まれる。
【００１２】
本発明の次の形態は、本発明の遺伝子配列を含むプラスミドまたはベクターに関する。
【００１３】
可能なプラスミドまたはベクターは、原則として、この目的のために専門家が入手できる全てのものである。このようなプラスミドおよびベクターはSturier et al., Methods Enzymol. 1990, 185, 61〜69またはNovagen、Promega、New England Biolabs、ClontechまたはGibco BRLのパンフレットに見出すことができる。さらに好ましいプラスミドおよびベクターは、以下に見出すことができる：DNA cloning: a practical approach. Volume I〜III（D. M. Gloverによる編集）IRL Press Ltd., Oxford, Washington DC,1985, 1987; Denhardt, D. T. およびColasanti, J.: A surey of vectors for regulating expression of cloned DNA in E. coli: Rodriguez, R. L. およびDenhardt, D. T(eds), Vectors, Butterworth, Stoneham, MA, 1987, p 179〜204; Gene expression technology.: Goeddel, D. V.(eds), Methods in Enzymology, volume 185, Academic Press, Inc., San Diego, 1990; Sambrook, J., Fritsch, E. F. およびManiatis, T. 1989. Molecular cloning: a loboratory manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harboe, N. Y.。
【００１４】
本発明の遺伝子配列を含む遺伝子構築物を非常に好ましい方法で宿主有機体へクローン化できるプラスミドは：ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（Roche Biochemicals）、ｐＢＴａｃ（Roche Biochemicals）、ｐＫＫ−２３３（Stratagene）またはｐＥＴ（Novagen）である。組み込み型カナマイシン耐性を有するＴＯＰＯシリーズを除く他の全てのプラスミドは、アンピシリン耐性のためにβ−ラクタマーゼを含むべきである。特に好ましいプラスミドは以下のものである。
【００１５】
【表１】
2004526445.tif 000004
【００１６】
本発明は同様に、本発明の遺伝子配列を含む微生物に関する。遺伝子配列をクローン化されている微生物を使用して、組み換え酵素を十分な量に増加させ、獲得する。このための方法は当業者に公知である（Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Balbas P & Bolivar F. 1990, Design and construction of expression plasmd vector in E. coli, Methods Enzymology 185, 14〜37）。使用できる微生物は、原則として、この目的のために当業者が利用できる全ての微生物である。Ｅ．Ｃｏｌｉ株をこの目的のために有利に使用する。特に以下のものが非常に有利である：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、ＪＭ１０９、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０−またはＨＢ１０１。それを使用することにより本発明の遺伝子配列を含む遺伝子配列が宿主有機体へ適切にクローン化されるプラスミドは、前記のものである。
【００１７】
本発明の以下の形態は、様々なタイプのＰＣＲにより本発明の遺伝子配列を製造するためのプライマーに関する。これらのプライマーは、相当のアミノ酸配列をコードするセンスおよびアンチセンスプライマーをも含む。
【００１８】
好適なプライマーは、原則として、当業者に公知の方法により取得できる。本発明のプライマーは、公知のＤＮＡ配列と比較することにより、または検討中のアミノ酸配列を当該微生物のコドンへ変換することにより、見出される（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの場合：Wright et al., Gene 1992, 113, 55〜65）。いわゆるスーパーファミリーのたんぱく質のアミノ酸配列の一般的な特徴をこの目的に利用することもある（Firestine et al., Chemistry & Biology 1996, 3, 779〜783）。これに関する更なる情報は、Oligonucleotide synthesis: a practical approach, M. J. Gaitによる編集; IRL Press Ltd, Oxford Washington DC, 1984; PCR Protocols: A guide to methods and applications, M.A. Innis, D. H. Gelfound , J. J. SninskyおよびT, J. Whiteによる編集、Academic Press, Inc., San Diego, 1920に見出すことができる。以下のプライマーが特に非常に有利である：
【００１９】
【表２】
2004526445.tif 000005
【００２０】
本発明の別の形態は、本発明のＤ−カルバモイラーゼの使用に関する。原則として、Ｄ−カルバモイラーゼは、当業者に利用可能な全ての方法、例えば、非経口的栄養補給または動物用栄養剤として有利に使用できるエナンチオ濃縮されたアミノ酸を製造するために使用できる。しかし、この方法で製造される光学的に濃縮されたアミノ酸は、さらに、生体活性化合物の合成に有利に使用される。エナンチオ濃縮されたアミノ酸の製法は、特に、ＷＯ００５８４４９、ＷＯ０００８３７４、ＤＥ１０００５０１２３．０またはＤＥ１００５０１２４．９ならびにそれらに引用される文献に記載される方法である。これらの方法は、本発明のＤ−カルバモイラーゼに対してもほぼ同様に実施できる。
【００２１】
先ほど言及したアミノ酸の製法は、有利に、ヒダントイナーゼ／Ｄ−カルバモイラーゼの系において、場合により、ヒダントインラセマーゼまたはカルバモイルアミノ酸をラセミ化できる酵素の存在下で、ヒダントインを出発材料にして実施される（ＷＯ００５８４４９、ＷＯ０００８３７４）。本発明の方法は、特に酵素膜反応装置で実施するのが有利である（ＤＥ１９９１０６９１．６）。
【００２２】
本発明のカルバモイラーゼは、遺伝子操作により修飾された酵素を製造するための更なる手段として使用できる。このような方法は、原則として当業者に公知である（Eigen M. and Gardinger W. (1984) Evolutionary molecular engineering based on RNA replication. Pure & Appl. Chem.56(8), 967〜978; Chen & Arnold (1991) Enzyme engineering for nona queous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073〜1077; Horwitz M. and L. Loeb (1986) "Promoters Selected Form Random DNA Sequences" Proceddings of The National Academy Of Science Of The United States Of America 83(19); 7405〜7409; Dube D. and L. Loeb (1989) "Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene" Biochemistry 28(14): 5703〜5707; Stemmer PC (1994). Rapid evolution of a protein in bitro by DNA shuffling. Nature. 370; 389〜391およびStemmer PC(1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA. 91; 10747〜10751）。
【００２３】
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ  ＤＳＭ２０１１７株を、Ａ．Ｍａｒｔｉｎ博士の合成（Stuttgart, 1997）におけるヒダントイン誘導体の変換について調査した。Ｄ−ヒダントイナーゼの均質な純化およびＮ末端の最初の３０個のアミノ酸決定が可能であった。
【００２４】
しかし、Ｄ−カルバモイラーゼが非常に不安定な酵素であることは明らかで、Ｄ−カルバモイラーゼをクロマトグラフィーによって精製することはできなかった。しかし、Ｄ−ヒダントイナーゼのクローニングという間接的な経路により、本発明のＤ−カルバモイラーゼのクローニングが可能となる。縮重ＰＣＲ（degenerated PCR）および逆ＰＣＲ（inverse PCR）を用いることにより、ｈｙｕ遺伝子集団の存在を確認し、ＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼ構造遺伝子の遺伝子配列を解読した。次に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでＤ−カルバモイラーゼの組換え製造が可能となり、該遺伝子産物は新規Ｄ−カルバモイラーゼとしてのその機能を特徴付けられた。
【００２５】
言及した酵素は、場合により別の酵素と組み合わせて（たとえばヒダントイナーゼ／ラセマーゼ、ＷＯ００５８４４９、ＷＯ０００８３７４参照）、遊離形の均質に精製された化合物として、または組換え法により製造された酵素の形で使用できる。さらに、未変性（ゲスト）有機体の要素として、または特定の宿主有機体の望ましい程度に精製された破砕細胞塊と組み合わせて使用することができる。固定化した形で酵素を使用することも可能である（Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey and Ralph A. Messing, "Immobilisierte Biomaterialiern-Thehniken und Anwendungen (Immobilized Biomaterials Techniques and Uses", Angew. Chem. 1982, 94, 836〜852）。固定は凍結乾燥により実施するのが有利である（Dordick et al. J. Am. Chem. Soc. 194, 116, 5009〜5010; Okahata et al. Tetrahedron Lett. 1997; 38, 1971〜1974; Adlercreutz et al. Biocatalysis 1992, 6, 291〜305）。界面活性物質、例えばエアロゾルＯＴ（Aerosol OT）またはポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＢｒｉｊ５２（ジエチレングリコールモノ−セチルエーテル）の存在下での凍結乾燥が、特に非常に有利である（Goto et al. Biotechnol. Techniques 1997, 11, 375〜378）。ＣＬＥＣとしての使用も想定できる（Vaghjiani et al., Biocat. Biotransform. 2000, 18, 157 et seq）。
【００２６】
様々なＮ−カルバモイルアミノ酸をＤ−カルバモイラーゼを用いて変換した結果、種々の基質が首尾よく変換できることがわかる。ここでは、本発明の酵素のアラニンに対する活性が顕著である。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ  ＤＳＭ２０１１７由来のＤ−カルバモイラーゼは、これまで記載されてきたＤ−カルバモイラーゼと、最大５３％が一致している。
【００２７】
次なる態様において、本発明は、５’−置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を製造する方法に関与できる酵素をコードする、染色体にコードされた遺伝子を発見するための方法に関し、この際、
ａ）５’−置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を製造できる有機体の染色体ＤＮＡをフラグメントに切断し、
ｂ）次にフラグメントをプラスミドへ入れてクローン化し、
ｃ）プラスミドを、ヒダントイナーゼまたはＤ−カルバモイラーゼの配列情報を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、
ｄ）ヒダントイナーゼの十分なハイブリダイゼーションが起こる場合はＤ−カルバモイラーゼ配列が、またはＤ−カルバモイラーゼが十分にハイブリダイゼーションされる場合はヒダントイナーゼ配列が、同一のプラスミド中で同定される。
【００２８】
相応にコードされた酵素は、このような方法で同定された配列を用いて、当業者に公知の方法により製造できる。ここに記載する本発明の酵素はこの戦略で得られるのが望ましい。
【００２９】
記載の方法は、一方で、未変性酵素の単離が困難であるかまたは精製によっても単離できない場合に、他方で、問題の反応に関与する酵素機構が随伴形態で存在する、例えばオペロン上に存在する場合に、首尾よく使用できる。オペロン中のＤ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバモイラーゼの機構はすでに述べられており、特に、Ｍａｒｔｉｎ  Ｈｉｌｓ博士の合成において記載されている（Stuttgart, 1998）。ここで、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＩＰ  Ｉ−６７１およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒＮＲＲＬ  Ｂ１１２９１で同定されたオペロンは染色体ＤＮＡに由来していないが、単離が困難とされることの多い特定の有機体の、自然発生的プラスミド上に位置している。同様のことが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種ＮＳ６７１にも当てはまり、この株では、選択的にヒダントインを崩壊させる経路の酵素がその自然発生的プラスミド上にコードされている（Watabe, K.; Ishiwaka, T.; Nakamura, H. 1992, Cloning and sequencing of the genes involved in the conversion of 5-substituted hydantoins to the corresponding L-amino acids from the native plasmid of Pseudomonas sp. NS671, J. Bacteriol. 174: 962〜969）。従って、このようなＤ−選択的酵素を発見するために、記載の染色体ＤＮＡを使用することは当然でない。むしろ、相当する有機体のプラスミドＤＮＡを、Ｄ−選択的ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンのクローニングのための出発材料として使用することが好ましい。それ故、Ｄ−ヒダントイナーゼの配列情報を出発点として、染色体Ｄ−カルバモイラーゼを見出すことができたのは意外である。この知識は、現在、工業的に利用され、その際、ヒダントイナーゼの配列情報またはその活性は、単離の容易な染色体ＤＮＡ（土壌サンプルに由来するものも含む）からＤ−カルバモイラーゼを単離するために使用できる。Ｄ−カルバモイラーゼ配列またはその活性の知識は、染色体ＤＮＡからＤ−ヒダントイナーゼを単離するためにも使用できる。
【００３０】
本発明の方法は、ここで、５’−置換ヒダントインをＤ−アミノ酸へ変換できる有機体の染色体ＤＮＡを出発材料とする。これを当業者に公知の方法によりフラグメントへと切断する（制限切断はここで、例えば制限キット（Roche diagnostics）の説明書に従って実施される）。次に、ＤＮＡフラグメントを、公知の方法と同様に、好適なプラスミドへ入れてクローン化する（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press）。前記プラスミドを好適なものと見なしてよい。次に、プラスミドＤＮＡと好適な酵素のＤＮＡとのハイブリダイゼーションを、順に、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術により実施し（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecualr Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press）、この際、例えばＤＮＡ増幅（ＰＣＲ）、オリゴヌクレオチドの標識（蛍光、放射線）または発現ライブラリーと活性検出とにより、十分なハイブリダイゼーションが行える。ハイブリダイゼーションシグナルを出発点とし、隣接領域を同定し、Ｄ−ヒダントイナーゼまたはＤ−カルバモイラーゼの存在について、例えば、慣用のＤＮＡシークエンスおよび配列比較または活性検出を介し、ハイブリダイズされた公知遺伝子のＩＰＣＲ（Genetidc applications of an inverse polymerase chain reaction Ochman H, Gerbert A S, Hartl D L, GENETICS (1988 Nov), 120(3), 621〜3; The polymerase chain reaction, Arnheim, Norman, Genet. Eng. (N. Y.) (1990), 12 115〜37）を行うことにより分析する。このことは、専門家が精通している方法、すなわちＤＮＡシークエンスおよび適切なプログラム、例えばＧＣＧプログラムによるＤＮＡ配列分析を用いる方法でも実施される（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Joseph Sambrook and Dabid W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000）。
【００３１】
本発明の内容において、光学的に濃縮された（エナンチオ濃縮された、エナンチオマー濃縮された）化合物とは、もう一方の化合物との混合物として、＞５０ｍｏｌ％を占める光学対掌体が存在することを意味すると理解される。
【００３２】
ヒダントインは、２，４−ジオキソイミダゾリジンに由来し、アミノ酸のα−置換基に由来していてよい置換基で５位を置換されている化合物を意味する。
【００３３】
アミノ酸のα−置換基は、α−アミノ酸のα−Ｃ原始上の置換基を意味すると理解される。これは、Beyer Walter, Lehrbuch der organischen Chemie (Textbook of Organic Chemistry), S. Hirzel Verlag Stuttgart, 22nd edition, 1991, p. 822 et seqに記載されるように、天然のアミノ酸に由来していてよい。しかし、さらに、ＤＥ１９９０３２６８．８に記載されるように非−天然α−アミノ酸の相当のα−置換基を意味すると理解されることもある。
【００３４】
有機体Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）に、相当の番号で寄託され、公的に入手される。
【００３５】
本発明の酵素に言及するに当たり、この酵素は未変性の均質に精製された酵素と組換え法により製造された相当の酵素との両方を意味するものとする。この酵素には、同一のペプチド配列を有しかつ反応に影響する配列が同等の活性を示すものの、修飾を受けているあらゆる種類の酵素、例えばＨｉｓ−ｔａｇ−修飾された酵素または開始コドン−修飾された酵素が含まれる。
【００３６】
Ｉ．Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７のバイオマスの獲得
全細胞活性試験、染色体ＤＮＡの単離およびＤ−ヒダントイナーゼの酵素単離用の出発材料として、まず、生理学的に均質なＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７の細胞塊を十分な量で準備する。Ｂｒａｎｓの作業に即して（博士論文、TU Braunschweig, 1991）、この目的のために、５０リットルのバイオリアクター中の、炭素源としてＤ，Ｌ−ラクテート、別の栄養分としてイーストエキストラクトおよび培養誘導質としてヒダントインを含む半合成培地を使用する。
【００３７】
【表３】
2004526445.tif 000006
【００３８】
最初の前培養物（ｖ＝２０ｍｌ）を、３０℃および１１０ｒｐｍで一晩インキュベートした。前培養物全体を次に第２前培養（ｖ＝２ｌ）のための接種物として使用した。２日間のインキュベーションの後、第２前培養物１.５ｌを、発酵（ｖ＝２０ｌ）のための接種物として使用した。増殖中に、誘導質であるヒダントインが消費されるので、ヒダントインを輸送ポンプを用いて連続的に測り入れ、この結果、培地中のヒダントイン濃度は０.２ｇ／ｌと一定であった。細胞回収後、ＤＦＭ２０５ｇをアリコットに分け、−２０℃で貯蔵した。
【００３９】
ＩＩ．Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７由来Ｄ−ヒダントイナーゼの精製
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７由来Ｄ−ヒダントイナーゼの精製プロトコールは、Ｍａｒｔｉｎの記載するＤ−ヒダントイナーゼのたんぱく質精製（博士論文、UniStuttgart, 1997）に幾つかの変更を加えたものである。精製ステップは、可能であれば４℃で実施され、フラクションのヒダントイナーゼ活性の測定は、最初、Ｅｈｒｌｉｃｈ法による光度検出で速やかに試験された。陽性のサンプルのアリコットを、標準物質であるＤ，Ｌ−ベンジルヒダントインと共にインキュベートし、正確な活性をＨＰＬＣにより測定した。
【００４０】
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７の培養物から得られたバイオマス（Ｉ．参照）を、最初に、攪拌ボールミル中のガラスビーズで破砕して、３０％の細胞懸濁液とした。破砕動態を記録した後、２０分の破砕時間後に、１６.５ｇ／ｌまでのたんぱく質濃度となった。次いで、細胞破砕屑および不溶性成分を遠心分離により分別し、透明な上清をその後の硫酸プロタミン沈殿に使用した。これにより、流線形ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーを実施する前に、溶液の粘度を減少させることができた。
【００４１】
カラムに結合したたんぱく質を、濃度勾配をかけた塩化ナトリウムを用いて溶離した。同量の２Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を、プールされた活性な流線フラクションへ添加し、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）により更に引き続き分離した。もっとも高いヒダントイナーゼ活性を示すフラクションを合わせ、ＭｏｎｏＱカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを行って、他のたんぱく質から分離した。
【００４２】
ヒダントイナーゼの精製データを表２に要約し、精製されたＤ−ヒダントイナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、この酵素は５０＋／−５ｋＤａの分子量を示した（ＭｏｎｏＱフラクションの濃縮後に精製されたＤ−ヒダントイナーゼの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施、分子量マーカーはＰｒｏＳｉｅｖｅであり、内部標準として４９.７ｋＤａのＡ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓＤＳＭ３７４５由来Ｌ−ヒダントイナーゼを用いた（May, 学術論文 Uni Stuttgart, 1998））。
【００４３】
【表４】
2004526445.tif 000007
【００４４】
ＩＩＩ．Ｄ−ヒダントイナーゼのトリプシン切断
Ｎ−末端の配列決定で最初の３０個のアミノ酸のみに関して確かな配列結果が得られた。しかし、Ｍａｒｔｉｎの方法で得られたこの配列からはプライマーを得られなかった。従って、たんぱく質は、更なる配列情報を得るために、プロテアーゼ切断により幾つかのペプチドへ分断されなければならなかった。酵素切断のために、アミノ酸リシンおよびアルギニンの後ろで特異的に切断するエンドペプチダーゼをトリプシンと一緒に使用した。しかし、酸性アミノ酸が続く場合は活性の低下を予期すべきであり、プロリン残基が続く場合は、加水分解が起こらないことも予期すべきである。たんぱく質中でのリシンおよびアルギニンの平均的な出現率はそれぞれ５.７％および５.４％であり、切断が完全な場合、平均的なペプチド長さが約９アミノ酸となると予測される。ペプチド混合物を次に定量的ＨＰＬＣにより分離した。
【００４５】
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７由来のヒダントイナーゼをトリプシンで切断するために、これを記載のようにＭｏｎｏＱフラクションまで精製し、次にＡｍｉｃｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ（３０ｋＤａまでを除去）で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。たんぱく質がＤ−ヒダントイナーゼであることを確認するために、ゲルの一部をウェスタンブロッティングにより膜へ移行し、切り出し、最初の８個のＮ−末端アミノ酸を決定した。位置２を除いて、決定されたすべてのアミノ酸はＭａｒｉｎにより決定されたＮ−末端と一致し（学術論文、University of Stutttgart, 1997）、従って、ここで単離されたたんぱく質はＭａｒｉｎによってすでに記載され特徴づけの成されたものと同一の酵素であると推測された。
【００４６】
ヒダントイナーゼバンドを次に、分離したＭｏｎｏＱフラクションのポリアクリルアミドゲルから直接切り出し、説明書に従い（Sigma, Steinheim）その場でトリプシン切断した。アセトニトリルを用いてゲルからペプチドを抽出し、分取ＨＰＬＣにより個々に分離した。フラクションをＳｐｅｅｄ−ｖａｃで乾燥させ、次にエドマン分解によりＮ−末端を配列決定した。
【００４７】
全体として、Ｎ−末端に加えて、９個のペプチドが明確に配列決定された。ペプチドフラグメントの１つは、活性中心の亜鉛原子の結合に関与する環状アミダーゼの共通モチーフＧＸＸＤＸＨＸＨを有した（Abendroth et al., Acta Cryst. 2000, D56, 1166〜1169）。リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）で終了しないペプチド配列は、技術的な問題やサンプルの質または量の落度が原因で、早いうちにシークエンスが中断された。
【００４８】
ＩＶ．ｈｙｕ遺伝子集団のクローニング
１．Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７由来の染色体ＤＮＡの単離
ラクテート培地中でＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７を培養することにより得られた湿潤バイオマス（Ｉ参照）を、染色体ＤＮＡの単離にも使用した。細胞溶解および塩化セシウムを用いた密度勾配遠心分離の後に、非常に純度の高いゲノムＤＮＡを単離できた。吸収スペクトルを記録して質を試験することにより、この方法におけるフェノールのコンタミが防止できた。光度測定によるＤＮＡの濃度は６０μｇＤＮＡ／ｍｌであった。ｃＤＮＡは、制限切断のために利用されかつＰＣＲ用のマトリクスとして使用された。
【００４９】
２．縮重プライマーによるＰＣＲ
Ｄ−ヒダントイナーゼのＮ−末端に加えて、トリプシン切断で得られたペプチドの配列決定により更なる配列情報が得られた（ＩＩＩ参照）。ペプチドは、ＣｌｕｓｔａｌＸプログラムの結果、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＩＰ  Ｉ−６７１のたんぱく質の公知配列と一致した（Thompson et al. 1997, The CLustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysisi tools. Nucleic Acids Research. 24, 4876〜4882）。
【００５０】
公知のペプチド配列から縮重プライマーを誘導するためには、アミノ酸組成に関する縮重が少ない２種類のペプチドの配列の一部を選択しなければならなかった。ペプチド６１.６１および７３.３１をこのために選択した。プライマー６１.６１ａはプラス鎖と対になり、プライマー７１.７３ｂはＤＮＡのマイナス鎖と対になる。
【００５１】
【表５】
2004526445.tif 000008
【００５２】
プライマー６１.６１ａの縮重の程度を低下させるために、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種に由来するコドンの頻度分布をＧＵＴＧデータバンクを基に再考した（Nakamura et al., Nucl. Acids Res. 1999, 27, 292）。アミノ酸バリンに関して“ＧＴＡ”コドンが１０.４％の低い頻度であることから、このオリゴヌクレオチドの第３位の三つ組み塩基“ＧＴＡ”は、結果的に、プライマー構築物において無視することができた。
【００５３】
ＰＣＲアンプリコン（増幅産物）の長さを確認するために、２種類のプライマーをＡｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＩＰ  Ｉ−６７１由来のＤ−ヒダントイナーゼに対してアラインメント試験に課した。アラインメント試験中、２種のオリゴ間の距離は６９アミノ酸であるので、縮重プライマー６１.６１ａおよび７３.３１ｂによるＰＣＲは約２０７ｂｐの長さのＰＣＲ産物を導くはずである。
【００５４】
ＰＣＲは、４２℃のアニーリング温度で標準バッチに即した温度プロファイルに設定され、２ｍＭのマグネシウム含量濃度で至適化された。ＰＣＲバッチを次に、３％アガロースゲルで分離し、バンドの大きさをＩｍａｇｅｍａｓｔｅｒ画像分析ソフトウェアを用いて決定した（Novex社製、分子量マーカーＤ−１５）。計算値が２１８ｂｐの大きさのバンドをゲルから溶出し、ｐＣＲ  ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩベクターへ連結させた（図３）。得られたプラスミドは、ｐＪＷ１と呼称された（図４）。ベクターの後続配列は、すでに知られているジヒドロピリミジナーゼと相同性を示したので、ＤＮＡの最初の部分は、従って、Ｄ−ヒダントイナーゼの構造遺伝子上にクローン化した形で存在した。
【００５５】
３．ｈｙｕ遺伝子集団の逆ＰＣＲによるシークエンス
ＤＮＡの隣接領域から更なる配列情報を得るために、逆ＰＣＲ（ＰＣＲ）の技術を利用した。
【００５６】
制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、ＭｕｎＩおよびＭｌｕＩを使用して、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７由来のゲノムＤＮＡの切断を行った。切断産物を１％のアガロースゲル上で分離し、サザンブロットによりナイロン膜上に固定した。
【００５７】
好適なプローブを製造するために、ＭｕｎＩの線状プラスミドｐＪＷ１（図４）をニックトランスレーション法により３２Ｐ−α−ＡＴＰで放射線標識し、（Roche Diagnostics社製、Nick Tranlation Kit）、ブロットでハイブリダイズするために使用した（分子量マーカーＭＷＭ  ＶＩＩ）。
【００５８】
サザンブロットで得られたハイブリダイゼーションシグナルの大きさを基に、ゲノムＰｓｔＩ切断産物（約２０００ｂｐ）を以下のＩＰＣＲのマトリクスとして使用した。このために、切断産物をアガロースゲル上で分離し、１５００〜２８００ｂｐの範囲でゲルから溶出し（分子量マーカーＭＷＭ  ＶＩＩ）、次に再連結し、ＭｕｎＩで直線化した。ヒダントイナーゼ遺伝子の公知の配列から、ＩＰＣＲのためのプライマーＩＰＣＲ１＋（配列番号３）およびＩＰＣＲ１−（配列番号４）が誘導できた。６０℃のアニーリング温度はオリゴの融点に由来するものであった。
【００５９】
単一のバンドがアンプリコンとして生じ、これを次に溶出し、ＴＯＰＯ系にクローン化した（図３）。形成されたプラスミドはｐＪＷ２と呼称された（図１）。ｐＪＷ２の配列決定後に再構築されたｈｙｕ遺伝子集団は、Ｄ−ヒダントイナーゼｈｙｕＨのオープンリーディングフレームおよびＤ−カルバモイラーゼｈｙｕＣＤのオープンリーディングフレームの一部を有する。
【００６０】
次のステップで、Ｄ−カルバモイラーゼの完全な読み枠を、ＩＰＣＲの技術により同様にクローン化すべきである。ここで、ＩＰＣＲの要求に合致しかつＤ−カルバモイラーゼ遺伝子の５’末端で可能な限り切断のできる制限酵素を、Ｄ−カルバモイラーゼ公知の配列切片から見つけることができた。最後に、制限酵素ＳａｃＩ、ＮａｅＩ、ＳｆｕＩ、ＮａｒＩおよびＳｐｈＩを用いてゲノム切断を行い、アガロースゲルでの分離後、ナイロン膜上でブロッティングを実施した。
【００６１】
ｐＪＷ１のＮａｒＩ／ＢａｍＨＩによる二重切断で得られる小さなフラグメントは、プローブとして好適であった（図４）。ゲルでの分離、溶出およびニックトランスレーション法による放射線標識（Roche Diagnositcs社製Nick Translation Kit）を実施し、生成物をハイブリダイゼーションに使用した。
【００６２】
ハイブリダイゼーションシグナルを基に、再連結したＮａｒＩ切断産物（１.４ｋｂ）を第２のＩＰＣＲ用のＤＮＡ鋳型として選択した。オリゴＩＰＣＲ５＋（配列番号５）およびＩＰＣＲ５−（配列番号６）をアニーリング温度５７℃でプライマーとして使用した。
【００６３】
バンドをＴＯＰＯベクターへクローン化し（図３）、形成されたＴＯＰＯプラスミドはｐＲＷと呼称された（図２）。挿入物の配列決定後、ｈｙｕ遺伝子集団をある程度再構築して、Ｄ−カルバモイラーゼの読み枠が完全に存在するようにした。
【００６４】
Ｖ．Ｄ−カルバモイラーゼの発現
ｈｙｕ遺伝子集団のシークエンスの終了後、潜在的な読み枠のためのＤＮＡ配列の調査が行われた。ａｔｇ開始コドンに加えて、ここでは、珍しいｔｔｇ開始コドンもＤ−カルバモイラーゼの翻訳開始が可能であり、このコドンは５個のアミノ酸でＮ−末端が伸長されるように誘導する。記載したものの、珍しいｔｔｇ開始コドンの存在が確実に証明されていないので、ｔｔｇ−Ｄ−カルバモイラーゼおよびａｔｇ−Ｄ−カルバモイラーゼの両方をクローン化し、Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるその発現と活性とを試験した。
【００６５】
このために、Ｄ−カルバモイラーゼをＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ  ＤＳＭ２０１１７のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ここで、異なるプライマー対を使用することにより、３種の異なるＤ−カルバモイラーゼをクローン化できた。１つは、Ｈｉｓ−ｔａｇを有さないａｔｇ開始コドンによるＤ−カルバモイラーゼであり、２つは、ｔｔｇ開始コドンによるＤ−カルバモイラーゼであった。このうち１つはＨｉｓ−ｔａｇを有し、他方はＨｉｓ−ｔａｇを有さなかった。プライマー構築において、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ配列のｔｔｇ三塩基対を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で、ａｔｇコドンにより置換した（表４）。
【００６６】
【表６】
2004526445.tif 000009
【００６７】
アンプリコンをベクターｐＣＲ  ＴＯＰＯ  ＢｌｕｎｔＩＩへ入れてクローン化し（図３）、形成されたプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで二重に切断した。ラムノース発現ベクターｐＪＯＥ４０３６（図７）を、９４７ｂｐの大きさに形成されたフラグメントのサブクローニングに使用した。プラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９中で形質転換し、対数増殖初期に０．２ｇ／ｌのラムノースで細胞を感応させた。
【００６８】
Ｄ−カルバモイラーゼ（３４ｋＤａ）のレベルでのたんぱく質バンドの増殖は、ａｔｇ開始コドンでは見られず、他方、ｔｔｇ開始コドンによるＤ−カルバモイラーゼでは明らかな増殖が記録された。２０時間の感応後に、組み換えたんぱく質のバンドの強度は再び減少したが、これはたんぱく質の加水分解切断によるものであると考えられる。
【００６９】
ホモジナイザーで２種類のクローンの細胞破砕をした後、Ｄ−カルバモイラーゼ活性はｔｔｇ開始コドンのクローンでのみ見出されたが、ｐＭＷ３での活性は検出限界を下回ったままであった。
【００７０】
Ｄ−カルバモイラーゼは、上清に多く存在する。発現したたんぱく質の分子量は、Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  ｐｒｏｇｕｒａｍ（Amersham Life Sciences, Freiburg）により３４.６ｋＤａであると特定できた。この分子量は、Ｈｉｓ−ｔａｇを有するＤ−カルバモイラーゼで算出された値とよく一致した（３５．４ｋＤａ）。このプログラムの助けにより、上清中のＤ−カルバモイラーゼの含有量が総たんぱく質の３０％以上であることが分かった。発現プロファイルを記録した後、約６時間の誘導時間後に発現が最大に達することが分かった。特異的活性もこの時間に最大であることが分かる（ＤＬ−Ｃ−Ｐｈｅで２Ｕ／ｍｇ）。
【００７１】
ＶＩ．Ｄ−カルバモイラーゼの精製
Ｄ−カルバモイラーゼを特徴付けることができるように、これを精製した。精製過程において、相当の組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株のバイオマスを最初に培養し、細胞懸濁液をホモジナイザーで破砕した（ＩＩ参照）。上清に含まれるＤ−カルバモイラーゼを金属親和性クロマトグラフィーにより精製した（Stratagene社製Talon（Ｒ）カラム）。０.１ＫＰＢ、ｐＨ８．０中で再度緩衝させることにより、ゲルろ過の手段で（Pharmacia社製、ＰＤ−１０カラムを用いる）、Ｔａｌｏｎカラムの溶離バッファー中に含まれるイミダゾールを除去した。個々の精製ステップをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００７２】
ＶＩＩ．Ｄ−カルバモイラーゼの特徴付け
均質に精製したＨｉｓ−ｔａｇおよびｔｔｇ開始コドンを有するを有するＤ−カルバモイラーゼ（ｐＭＷ１−図１）を使用して、この方法で得られた酵素の特徴付けを行った。酵素は０.１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ８．０）中に存在した。
【００７３】
１．至適ｐＨの決定
精製したＤ−カルバモイラーゼの至適ｐＨを決定するために、６.５〜９.０の範囲の様々なｐＨ値において、基質としてＤＬ−Ｃ−フェニルアラニンを使用し、３０℃で変換した。濃度の影響を除くことができるように、使用する全てのバッファーの濃度（Ｔｒｉｓ、リン酸カリウムおよびＴｒｉｓ−グリシン）を、１００ｍＭの値に調節した。Ｄ−カルバモイラーゼの活性最大はｐＨ８であった。
【００７４】
２．熱安定性
４℃でのＤ−カルバモイラーゼの熱安定性を調査するために、０.１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ８）中で４日間、冷蔵庫に貯蔵し、測定値を２４時間毎に記録した。この温度では、酵素の半減期は約１００時間であった。
【００７５】
２０、３０および４０℃での熱安定性を決定するために、酵素を特異的温度で４０分インキュベートし、活性を５分毎に測定した。結果を図８に示す。
【００７６】
３．至適温度の決定
至適温度を決定するために、Ｄ，Ｌ−カルバモイル−フェニルアラニンの変換を、標準アッセイの条件下に、種々の温度で実施した。至適反応温度は約３０℃である。
【００７７】
４．動態パラメーターの決定
ＶｍａｘおよびＫｍを決定するために、反応速度ｖを基質濃度の関数としてプロットした。Ｄ−カルバモイル−トリプトファンのためのプロットを図９に示す。動態パラメーターの計算をＥｎｚｙｍｆｉｔプログラムを用いて実施した（Institute of Bioprocess Technology, University of Stuttgartで開発）。Ｄ−カルバモイル−トリプトファンの場合、Ｋｍ値は７.５ｍＭであり、ｖｍａｘは２.４Ｕ／ｍｇである。反応はミハエリス−メンテンの動態式で表すことができる（式１参照）。
【００７８】
【化３】
2004526445.tif 000010
【００７９】
５．分子量の決定
ＳＤＳゲルでの変性条件下にＩｍａｇｅｍａｓｔｅｒプログラムを用いて（Amersham Life Sciences, Freiburg）決定した分子量は３４.６ｋＤａであった。この値は、Ｈｉｓ−ｔａｇを有するＤ−カルバモイラーゼのアミノ酸配列を基に算出した値と良く一致した（３５.４６ｋＤａ）。未変性状態で酵素がモノマーで存在するかオリゴマーで存在するかを確認するために、均質に精製したＨｉｓ−ｔａｇ酵素を用いて、７.５質量％のアクリルアミド濃度で未変性ゲル電気泳動を実施した。この濃度における分離の一次範囲は１６〜９１ｋＤＡである。たんぱく質マーカーＰｒｏＳｉｅｖｅによるゲルの目盛り付けの後、Ｄ−カルバモイラーゼの分子サイズは、Ｉｍａｇｅｍａｓｔｅｒプログラムを用いて７５ｋＤａと決定された。従って、酵素は、未変性状態で二量体として存在する。
【００８０】
６．コファクター依存性
２５℃および１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で、精製されたＤ−カルバモイラーゼをインキュベートする際に、酵素の不活化は見られなかった。しかし、１０ｍＭ  ８−ヒドロキシキノリンスルホン酸（８−ＨＱＳＡ）でインキュベートすると２時間足らずで酵素が完全に疎外された。錯化剤による不活化と熱不活化とを区別することができるように、酵素溶液のアリコットを８−ＨＱＳＡなしでコインキュベートし、時間に関する活性を観察した。結果？酵素を再活性化するために、８−ＨＱＳＡをゲルろ過により酵素から除去し、２ｍＭの金属イオンの存在下でインキュベーションを実施した。しかし、Ｃｕ２＋、ＣＯ２＋、Ｍｎ２＋，Ｍｇ２＋，Ｆｅ２＋およびＺｎ２＋のいずれも酵素の再活性化を導かなかった。
【００８１】
酵素に添加した１ｍＭ濃度のスルフヒドリル試薬（イオジンアセテート、２−ニトロベンゾエートおよびパラ−クロロ−水銀ベンゾエート）は、Ｄ−カルバモイラーゼを完全に不活化した。
【００８２】
７．基質特異性
基質スペクトルを決定するために、３０℃の反応温度で、０.１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）の存在下に、特定の基質を用いて、酵素をインキュベートした。Ｄ−異性体が同一濃度であることを保証するために、基質が異性体混合物の場合には濃度を２０ｍＭとし；基質が純粋な異性体として存在する場合は濃度を１０ｍＭとした。Ｄ，Ｌ−カルバモイル−フェニルアラニンを対照基質として使用し、相対活性の算出において１００％に設定した（２Ｕ／ｍｇに対応）。表５に示す構造式を有するＤ−カルバモイラーゼを特異的な活性により変換した。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓＤＳＭ２０１１７由来Ｄ−カルバモイラーゼは、脂肪族基および芳香族基を有するカルバモイル化合物を変換でき、後者はより速やかに変換される。見出されたＤ−カルバモイラーゼの特異的特徴は、例えば、基質Ｄ−カルバモイル−アラニンに対して非常に好ましく機能し、この基質は他の基質と比べて少なくとも５倍早く変換されている。試験化合物中の唯一の非掌性基質であるカルバモイル−グリシンは、脂肪族基を有するカルバモイル−アミノ酸と同様の反応速度で変換される。
【００８３】
【表７】
2004526445.tif 000011
【００８４】
非天然基を有するアミノ酸、例えば、Ｄ，Ｌ−パラ−クロローフェニルアラニン、Ｄ，Ｌ−カルバモイル−ｔｅｒｔ−ロイシンまたはＤ，Ｌ−カルバモイル−ピリジルアラニンは、相当の基質の変換後に反応生成物として検出された。
【００８５】
Ｄ，Ｌ−、Ｄ−およびＬ−カルバモイル−フェニルアラニンの変換を比較すると、酵素がこの基質に対してエナンチオ特異的であり、純粋なＤ−異性体と比べてラセミ混合物を再現性を持ってゆっくりと変換することが分かる。従って、Ｄ−異性体が、Ｄ−およびＤ，Ｌ−カルバモイル−フェニルアラニンのいずれのバッチにも同一濃度で存在するのであるから、Ｌ−異性体が、１０ｍＭの濃度で、酵素触媒に僅かな阻害活性を有すると考えられる。
【００８６】
別の純粋なＬ−カルバモイル−アミノ酸、たとえばＬ−カルバモイルバリンまたはＬ−カルバモイル−トリプトファンも変換されなかった。β−ウレイドプロピオネートおよびβ−ウレイドサクシネート（Ｄ，Ｌ−カルバモイル−アスパルテート）を、さらに可能な生理学的基質として試験した。いずれの化合物も選択されたアッセイ条件で変換されない。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、プラスミドｐＪＷ２を表す図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＲＷを表す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩを表す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＪＷ１を表す図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＭＷ１を表す図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＭＷ２を表す図である。
【図７】図７は、プラスミドｐＪＯＥを表す図である。
【図８】図８は、相対活性および特異活性を示すグラフである。
【図９】図９はＤ−カルバモイル−トリプトファンのためのプロット示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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