(57)【要約】本発明は、非ウサギ種における感染症を治療及び／または予防するためのベクターワクチンの製造における、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスの使用に関する。本発明は更に、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれ、非ウサギ病原体の少なくとも１つの抗原をコードすることを特徴とする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスに関する。宿主範囲が限定されているために、前記した組換えレポリポックスウイルスは非ウサギ脊椎動物のような非感受性宿主では非病原性である。前記した組換えレポリポックスウイルスを用いてワクチン接種すると、ワクチン接種した非ウサギ宿主においてウイルスの生産的複製が認められなかったとしても前記宿主において抗原または免疫原性応答が生じた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ウサギ種における感染症を治療及び／または予防するためのベクターワクチンの製造における、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む、生組換えレポリポックスウイルスの使用。
【請求項２】
ネコまたはイヌにおける感染症を治療及び／または予防するためのベクターワクチンの製造における請求の範囲第１項に記載のウイルスの使用。
【請求項３】
少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルス及び医薬的に許容され得る担体を含み、前記外来性ＤＮＡが非ウサギにおいて感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードするワクチン。
【請求項４】
少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含み、前記外来性ＤＮＡが非ウサギ病原体の少なくとも１つの抗原をコードする生組換えレポリポックスウイルス。
【請求項５】
レポリポックスウイルスが粘液腫ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第４項に記載のウイルス。
【請求項６】
外来性ＤＮＡがネコまたはイヌ病原体の少なくとも１つの抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載のウイルス。
【請求項７】
外来性ＤＮＡがネコまたはイヌウイルスの少なくとも１つの抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載のウイルス。
【請求項８】
外来性ＤＮＡがネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）キャプシドタンパク質、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）ＶＰ２タンパク質及び／またはイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２をコードすることを特徴とする請求の範囲第４項から第７項のいずれかに記載のウイルス。
【請求項９】
外来性ＤＮＡ及び発現調節因子がウイルスゲノムのＭＧＦ  ＯＲＦに挿入されていることを特徴とする請求の範囲第４項から第８項のいずれかに記載のウイルス。
【請求項１０】
外来性ＤＮＡに作動可能に結合する発現調節因子が合成ポックスウイルスプロモーターであることを特徴とする請求の範囲第４項から第９項のいずれかに記載のウイルス。
【請求項１１】
プロモーターは初期／後期プロモーターであることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非感受性宿主種におけるレポリポックスウイルスベクターワクチンの使用及び生組換えレポリポックスウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
オルトポックス及びアビポックスウイルスをベースとするベクターワクチン及びこれらのワクチン接種時の組換えウイルスベクターとしての可能性は公知である。米国特許第５，７５９，８４１号明細書には、少なくとも１つの糖タンパク質をコードするモルビリウイルスＤＮＡ及び該ＤＮＡの発現のためのプロモーターをワクチンウイルスゲノムの非必須領域に含む組み換えワクシニアウイルスが記載されている。前記組換えワクシニアウイルスはイヌにおいてモルビリウイルスに対する免疫応答を誘発させるためのワクチン中に使用され得る。しかしながら、前記の組換えワクシニアベクターウイルスはヒトを含めた多数のいろいろの種において許容性であり、よってここに記載されているワクシニアベクターウイルスはワクチン接種宿主を無拘束に感染させたり、ワクチン接種宿主から非ワクチン接種宿主へ伝染させるという危険性を有している。
【０００３】
国際特許出願公開第９５２７７８０号パンフレットには、宿主範囲が制限されているために非トリ宿主において弱毒化病原性を有している組換えアビポックスウイルスが開示されている。この組換えアビポックスウイルスはウイルスゲノムの非必須領域に外来性ＤＮＡを含み、この外来性ＤＮＡはイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）抗原、ハシカウイルス（ＭＶ）ＭまたはＮ抗原の少なくとも１つをコードする。前記ウイルスはネコ及び他の肉食動物並びにヒトにおいて抗原または免疫学的応答を誘発させるために使用され得る。組換えアビポックスベクターウイルスは天然宿主に限定され、非トリ種に前記ベクターウイルスをワクチン接種すると、ウイルスを生産的に複製させることなく外来性抗原が発現する。しかしながら、アビポックスウイルスベクターをワクチン接種した後も外来性抗原の発現レベルは低いままである。よって、外来性抗原の発現レベルを向上させる必要がある。更に、アビポックスウイルスベクターでの免疫化により必ずしも外来性抗原に対して十分な中和抗体が生ずるわけではない。ネコにカナリア痘ベースのＦｅＬＶベクターワクチンを接種しても中和抗−ＦｅＬＶ抗体は生成しなかつた（Ｊ．Ｔａｒｔａｇｌｉａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：２３７０−２３７５（１９９３））。生まれたばかりの子猫は特にＦｅＬＶ感染を受けやすい。生まれたばかりの子猫は生後１週間の間成熟免疫系を持っていないので、ＦｅＬＶ感染に対する防御のために母親由来抗体に頼らざるを得ない。中和抗体を持つ母猫にワクチン接種しなかったら、子猫はＦｅＬＶから防御されず、ＦｅＬＶ感染されるであろう。
【０００４】
驚くことに、少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスがレポリポックスウイルスの生産的感染に対して通常感受性でない宿主において抗原または免疫原性応答を誘発するために使用され得ること、すなわちレポリポックスウイルスが複製後前記宿主において複製し得ないことが知見された。レポリポックスウイルスの生産的複製はウサギ種でしか生じない。従って、非ウサギ種にレポリポックスウイルスを感染させてもレポリポックスウイルスは複製されない。よって、他の接触動物へのウイルスベクターの発散が起こらない事実から明らかなように、生組換えレポリポックスウイルスは非感受性宿主を感染させ、前記宿主において組換えウイルスの生産的複製の非存在下で抗原を発現させ得るという驚くべき知見を得た。より驚くことに、非ウサギ種にレポリポックスウイルスを感染させると、前記宿主においてウイルスの生産的複製は見られなかったとしても外来性ＤＮＡによりコードされる抗原の発現レベルは高かった。数種の哺乳動物細胞株ではウイルスベクターはインビトロで増殖しない。更に、前記した非感受性宿主ではレポリポックスウイルスベクターの生産的複製が存在しないために、レポリポックスウイルスは非ウサギ種では非病原性であり、これらのウイルスベクターはワクチン接種のためにより好適となる。
【０００５】
外来性ＤＮＡを含む組換え粘液腫ウイルスを用いるワクチン接種はフランス国特許公開第２７３６３５８号明細書に記載されている。前記組換え粘液腫ウイルスは粘液腫症や他の家兎病原体により引き起こされる感染症に対して家兎をワクチン接種するために使用した。しかしながら、フランス国特許公開第２７３６３５８号明細書には、非感受性種、特に非ウサギ種において抗原または免疫原性応答を誘発させるためのウイルスベクターとして生組換え粘液腫ウイルスを使用することは示唆されていない。
【０００６】
本発明は、非ウサギ種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造における、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスの使用に関する。少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換え粘液腫ウイルスを非ウサギ種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造において使用することが好ましい。より具体的には、本発明は、トリ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ及びヒト種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造における前記した生組換えレポリポックスウイルスの使用に関する。好ましくは、本発明の生組換えレポリポックスウイルスはイヌまたはネコ種における感染症の治療のためのベクターワクチンを製造するために使用される。
【０００７】
本発明は更に、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し、非ウサギにおいて感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスを提供する。より具体的には、前記外来性ＤＮＡがヒト、ウシ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマまたはヒツジ種において感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードすることが好ましい。好ましくは、外来性ＤＮＡはネコまたはイヌ病原体の抗原をコードする。本発明によれば、病原体は患者にワクチン接種しなければならない病気に応じてウイルス、バクテリアまたは寄生虫起源であり得る。病原体がＲＮＡゲノムを有するならば、当該抗原は遺伝子に相当するｃＤＮＡによりコードされ得る。外来性ＤＮＡは同一の病原体または異なる病原体に由来し得る２つ以上の抗原をコードし得る。
【０００８】
組換えレポリポックスウイルス中に使用するための好適な外来性ＤＮＡは、好ましくはウイルス糖タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスマトリックスタンパク質、バクテリア外膜タンパク質、バクテリアエンテロトキシン、バクテリアフィンブリアまたは寄生虫タンパク質をコードする。外来性ＤＮＡは、具体的にはネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５８：８２５−８３４（１９８６））またはマトリックスタンパク質（Ｄｏｎａｈｕｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：７２２−７３１（１９８８））、ネコ−またはヒツジクラミジア主要外膜タンパク質（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰＦＰＮＭＯＭＰ及びＣＨＴＭＯＭＰＸ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）ＶＰ２タンパク質（Ｊ．Ｃａｒｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５５：５７４−５８２（１９８５））、ネコカリシウイルスキャプシドタンパク質（Ｍ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒら，Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１２２：２２３−２３５（１９９２））、ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）Ｇａｐ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＴａｔまたはＶｉｆタンパク質（Ｒ．Ｉ．Ｔａｌｂｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５７４３−５７４７（１９８９）；Ｔ．Ｒ．Ｐｈｉｌｉｐｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：４６０５−４６１３（１９９０）；Ｋ．Ｍ．Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２６１：２５−３０（１９９９））、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）膜−、ヌクレオキャプシド−またはスパイクタンパク質（Ｒ．Ｊ．ｄｅＧｒｏｏｔら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：２６３９−２６４６（１９８７）；Ｈ．Ｖｅｎｎｅｍａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１：３２７−３３５（１９９１））、イヌジステンパーウイルスＥｎｖ、ＨＡ、融合−またはヌクレオキャプシドタンパク質（Ｍ．Ｓｉｄｈｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９３：６６−７２（１９９３）；Ｕ．Ｇａｓｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１０７３７−１０７４４（２０００））、イヌパルボウイルスＶＰ２タンパク質（Ｐ．Ｒｅｅｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））、家兎ウイルス糖タンパク質Ｇ（Ｔ．Ｊ．Ｗｉｋｔｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１９４−７１９８（１９８４））、イヌコロナウイルススパイクタンパク質（Ｂ．Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８４９−２８６４（２０００））をコードする。非ウサギ病原体由来の免疫原性タンパク質をコードする遺伝子に加えて、外来性ＤＮＡは、ＩＮＦγ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ３０６１９）、ＩＬ−１β（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９２０６０）、ＩＬ−２／１５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５４６０１）、ＩＬ−４、ＩＬ−５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２５４３６）、ＩＬ−６、ＩＬ−１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８３１８４及びＵ８３１８５）、ＩＬ−１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００３７０１）またはＩＬ−１８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４６２１１）のようなサイトカイン、またはα−ケモカインＩＬ−８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ００３５０１）、ＧＲＯα、Ｇ���Ｏβ、ＮＡＰ−２、ＰＦ−４、ＩＰ１０、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、β−ＴＧ及びβ−ケモカインＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００２９８２）、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ０１２６５６）、ＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２５１１９０）、ＭＣＰ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００６２７３）、ＭＣＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２５１９１）のような化学走化性サイトカインをコードする遺伝子をも含み得る。本発明の好適なサイトカインをコードする遺伝子がワクチンを投与する同一種から誘導されることが好ましい。
【０００９】
外来性ＤＮＡは少なくとも１つの発現調節因子に作動的に結合しており、前記発現調節因子により該外来性ＤＮＡの発現が調節、制御される。好ましい実施態様において、外来性ＤＮＡ中に存在する各遺伝子は個別の発現調節因子により調節される。発現調節因子は当業界で公知であり、その中にはプロモーターが含まれる。本発明の外来性ＤＮＡの発現のために好適なプロモーターは、細胞質における発現を調節し得るウイルスまたは合成プロモーターである。本発明において有用なプロモーターはポックスウイルスプロモーター、好ましくはワクシニアプロモーター（ドイツ国特許公開第１９６２７１９３号明細書；Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，「ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)第３巻」，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．（１９８５年）発行参照）である。本発明の好ましいプロモーターは合成プロモーターであり、合成の初期−または初期／後期プロモーターがより好ましい。合成ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターはＣｈａｋｒａｂａｔｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，６：１０９４−１０９７（１９９７）に記載されている。前記プロモーターは当業界の一般的方法、例えば上掲のＣｈａｋｒａｂａｔｉら（１９９７）に記載されているような方法を用いて合成され得る。
【００１０】
本発明に従って使用され得る好適なレポリポックスウイルスの例には粘液腫ウイルス及びショープ線維腫ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。好適な粘液腫ウイルス株には、Ｌａｕｓａｎｎｅ株（ＡＴＣＣから入手可能）、ＳＧ３３（Ｍ．Ｄ．Ｍａｉｎｉｌら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２２：１１５−１２２（２０００））、Ｂｏｒｇｈｉ及びＢｏｅｒｌａｇｅ（Ｆｅｎｎｅｒ  ＆  Ｆａｎｔｉｎｉ，「脊椎動物害虫の生物学的防除(Biological control of Vertebrate Pests)」，ＣＡＢＩ（１９９９年）発行，ＩＳＢＮ  ０  ８５１９９  ３２３  ０及びここに引用されている文献）が含まれる。好適なショープ線維腫ウイルス株には、Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１１２）及びＫａｓｚａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−３６４）が含まれる。本発明の生組換えレポリポックスウイルスが粘液腫から誘導されることが好ましい。宿主がウサギ種に限定されているために、レポリポックスウイルスは非ウサギ宿主においては非病原性である。しかしながら、本発明の生組換えウイルスを生成するために弱毒化レポリポックスウイルスを産生することが好ましい。本発明では、弱毒化レポリポックスウイルスは病気を引き起こすことなく標的のウサギ宿主において生産的に複製し得るレポリポックスウイルスと定義される。レポリポックスウイルスの弱毒化は株を連続経代させるかまたはウイルス複製のために必須でない１つ以上の病原性遺伝子を欠失させることにより実施され得る。レポリポックスウイルスゲノムの完全ＤＮＡ配列、そのゲノムの構築及びすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置はＣａｍｅｒｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６４：２９８−３１８（１９９９）に記載されている。ショープ線維腫ウイルスゲノムの完全ＤＮＡ配列、そのゲノムの構築及びすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置はＷｉｌｌｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６４：３１９−３４３（１９９９）に記載されている。
【００１１】
好ましくは、本発明の外来性ＤＮＡはレポリポックスウイルスゲノムの非必須遺伝子領域に挿入される。より好ましくは、外来性ＤＮＡはレポリポックスウイルスの病原性に関与する非必須遺伝子領域に挿入される。粘液腫ウイルスゲノムまたはショープ線維腫ウイルスゲノムの好適な非必須遺伝子領域はチミジンキナーゼをコードするＴＫ遺伝子、Ｍ１１Ｌ  ＯＲＦ、ＳＥＲＰ−１、−２及び−３  ＯＲＦ及びＭＧＦ  ＯＲＦである（上掲のＣａｍｅｒｏｎら（１９９９）；上掲のＷｉｌｌｅｒら（１９９９））。本発明の好ましい実施態様では、１つ以上の非必須ウイルス遺伝子を欠失させた後外来性ＤＮＡ及びプロモーターを挿入させる。ＭＧＦ  ＯＲＦは病原性因子をコードし、インビトロまたはインビボでの増殖に必須でないので、このＯＲＦの少なくとも一部を欠失させることが特に好ましい（Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９１：１１２−１２４（１９９２））。ＭＧＦ  ＯＲＦを欠失させると、レポリポックスウイルスの病原性が低下する。
【００１２】
本発明の生組換えレポリポックスウイルスは、外来性ＤＮＡのレポリポックスウイルスゲノムへの部位特異的組換えによる挿入を含むインビボ組換え方法を用いて産生され得る。これは、組換えワクシニアウイルス及び組換え鶏頭ウイルスの産生について記載している方法（米国特許第４，６０３，１１２号明細書；米国特許第５，０９３，２５８号明細書参照；Ｐ．Ｘ．Ｇｕｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：４１８９−４１９８（１９９０）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)第３巻中のＭａｃｋｅｔｔら，「外来性遺伝子を発現するワクシニアウイル組換え体の構築及びキャラクタリゼーション(Construction And Characterization Of Vaccinia Virus Recombinants Expressing Exogenous Genes)」，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．（１９８５年）発行）と同様にして実施し得る。通常、本発明の生組換えレポリポックスウイルスは少なくとも１つの発現調節因子の制御下で外来性ＤＮＡを有するＤＮＡベクターと親レポリポックスゲノムの間での部位特異的組換えにより産生され得る。部位特異的組換えに使用するための適当なＤＮＡベクターは複数のクローニングサイトを含むプラスミドから誘導され得る。ＤＮＡベクターは、少なくとも１つの発現調節因子に結合し且つ外来性ＤＮＡが導入されるレポリポックスゲノムの領域に相同のウイルスＤＮＡ配列間にある外来性ＤＮＡを含む。外来性ＤＮＡに隣接するウイルスＤＮＡ配列はレポリポックスウイルスの複製に必須でない領域から選択されることが好ましい。レポリポックスウイルスとの組換えのためのＤＮＡベクターは更に、ポックスウイルスプロモーターの制御下で選択マーカーをコードする遺伝子を含み得る。追加の遺伝子及びプロモーターもレポリポックスゲノム由来のウイルスＤＮＡ配列間にある。親レポリポックスウイルスを感染させた宿主細胞にＤＮＡベクターをトランスフェクトさせる。好適な宿主細胞は、レポリポックスウイルスに対して許容的であり且つＤＮＡベクターによりトランスフェクトされ得る真核細胞である。宿主細胞の例は、家兎腎臓細胞ＬＬＣ−ＲＫ１及びＲＫ１３、家兎肺細胞Ｒ９ａｂ、家兎皮膚細胞ＳＦ  １  Ｅｐ、ＤＲＳ及びＲＡＢ−９、家兎角膜細胞ＳＩＲＣ、家兎癌腫細胞Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ、家兎皮膚／癌腫細胞ＣＴＰＳ、Ｖｅｒｏ細胞であり、これらの細胞はすべてＡＴＣＣから入手可能である。
【００１３】
本発明の生組換えレポリポックスウイルスを産生するのに適した親レポリポックスウイルスは粘液腫ウイルス株、例えばＬａｕｓａｎｎｅ株（ＡＴＣＣより入手可能）、ＳＧ３３（Ｍ．Ｄ．Ｍａｉｎｉｌ，ら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２２：１１５−１２２（２０００））、Ｂｏｒｇｈｉ及びＢｏｅｒｌａｇｅ（Ｆｅｎｎｅｒ  ＆  Ｆａｎｔｉｎｉ，「脊椎動物害虫の生物学的防除(Biological control of Vertebrate Pests)」，ＣＡＢＩ（１９９９年）発行，ＩＳＢＮ  ０  ８５１９９  ３２３  ０及びここに引用されている文献）、並びにショープ線維腫ウイルス株（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１１２）及びＫａｓｚａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−３６４）を含む）である。本発明の生組換えレポリポックスウイルスを産生するために粘液腫ウイルス株を使用することが好ましい。好ましい親レポリポックスウイルスが弱毒化ウイルス、すなわち病気を生じさせることなく標的のウサギ宿主において生産的に複製し得るレポリポックスウイルスである。レポリポックスウイルス株の弱毒化は、株を連続経代させるかまたはウイルス複製に必須でない１つ以上の病原性遺伝子を欠失させることにより実施され得る（完全なゲノム配列及び遺伝子の局在化については、上掲のＣａｍｅｒｏｎら（１９９９）及び上掲のＷｉｌｌｅｒら（１９９９））。
【００１４】
ＤＮＡベクター上のレポリポックスＤＮＡ配列と親レポリポックスゲノム上の対応ＤＮＡの間で組換えが起こっている間にウイルスは宿主細胞において複製する。前記組換えにより、１つ以上の発現調節因子に結合した外来性ＤＮＡがレポリポックスゲノムに挿入される。組換えレポリポックスウイルスは当業界で公知の標準の選択またはスクリーニング方法を用いて選択、精製される。前記公知方法には、外来性ＤＮＡに相同のプローブを用いるハイブリダイゼーションによる外来性ＤＮＡの検出、外来性ＤＮＡを一緒に組み込んだ選択マーカーの発現の検出、外来性ＤＮＡを挿入した欠失レポリポックス遺伝子の発現産物の不在の検出が含まれる。組換えレポリポックスウイルスゲノムへの外来性ＤＮＡの挿入はポリメラーゼ連鎖反応分析により確認され得る。
【００１５】
本発明の組換えレポリポックスウイルスベクターは、インビボで宿主を免疫化するのに十分な抗原レベルに達し得るので非ウサギにおいて免疫化剤として使用するのに特に適している。宿主範囲が制限されているので、ウイルスは非ウサギ宿主において弱毒化され、よってレポリポックスウイルスにより病気が発症する危険性はない。宿主範囲が制限されていることから、本発明のレポリポックスウイルスがワクチン接種の標的でない宿主中に広がることが防止される。よって、更なる態様では、本発明は医薬組成物、より好ましくは少なくとも１つの発現調節因子に作動的に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれ、非ウサギにおいて感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスを医薬的に許容され得る担体と共に含むワクチンを提供する。本発明のワクチンが少なくとも非ウサギ病原体の免疫原タンパク質を発現する本発明の生組換え粘液腫ウイルスを医薬的に許容され得る担体と共に含むことが好ましい。２つ以上の免疫原性タンパク質を発現する本発明の組換えレポリポックスウイルスが多価ワクチンを製造するのに特に適している。
【００１６】
本発明のワクチン組成物は標準的手順に従って製造され得る。組換えレポリポックスウイルスは該ウイルスが許容性である細胞培養物、例えばいずれもＡＴＣＣから入手可能である家兎腎臓細胞ＬＬＣ−ＲＫ１及びＲＫ１３、家兎肺細胞Ｒ９ａｂ、家兎皮膚細胞ＳＦ  １Ｅ  ｐ、ＤＲＳ及びＲＡＢ−９、家兎角膜細胞ＳＩＲＣ、家兎癌腫細胞Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ、家兎皮膚／癌腫細胞ＣＴＰＳ、Ｖｅｒｏ細胞において増殖され得る。こうして増殖させたウイルスを組織細胞培養液及び／または細胞を集めることにより収集され得る。場合により、収集中に増殖基質からの感染粒子の遊離を改善する技術、例えば超音波や凍結融解を適用することによりウイルスの収率を増加させ得る。生ワクチンは懸濁液の形態で製造されても凍結乾燥されてもよい。
【００１７】
本発明のワクチン中に使用するのに適した医薬的に許容され得る担体は滅菌水、食塩水、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）等である。加えて、本発明のワクチンは他の添加剤、例えばアジュバント、安定剤、酸化防止剤等を含み得る。
【００１８】
好適な安定剤の例は、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストラン及びグルコース）、タンパク質及びその分解生成物（非限定例には、アルブミン及びカゼインが含まれる）、タンパク質含有物質（例えば、ウシ血清または脱脂乳）、緩衝液（非限定例には、アルカリ金属ホスフェートが含まれる）である。凍結乾燥ワクチン組成物中には１つ以上の安定剤を添加することが好ましい。
【００１９】
好適なアジュバントの非限定例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、アンフィゲン、トコフェノール、モノホスフェニル脂質Ａ、ムラミルジペプチド、オイルエマルション、グルカン、カルボマー、ブロックコポリマー、サイトカイン及びサポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）が含まれる。アジュバントの添加量はアジュバントの種類に依存する。ＩＮＦγ、ＩＬ−１２やＩＬ−１８のようなサイトカインが本発明のワクチン中に使用するのに非常に適している。
【００２０】
好ましくは、本発明の組換えレポリポックスウイルスは非ウサギ種に対して非経口投与ルートにより投与される。前記投与ルートの非限定例には、筋肉内、皮内または皮下ルートが含まれる。また、ワクチンを経口、スプレー、眼内、鼻内または卵内投与のような経口投与により投与してもよい。
【００２１】
通常、本発明の組換えレポリポックスウイルスは、十分な発現レベルの外来性タンパク質を誘発させるのに有効な量で投与される。その用量は通常投与ルート、投与時期、ワンチン接種する動物の年令、健康状態及び食餌に依存する。組換えレポリポックスウイルスは１０２〜１０１１ｐｆｕ／用量／動物、好ましくは１０４〜１０９ｐｆｕ／用量／動物、より好ましくは１０６〜１０７ｐｆｕ／用量／動物の量で投与され得る。ここで、ｐｆｕはプラーク形成単位である。
【００２２】
本発明のワクチンを他の生または不活化ワクチンと同時にまたは付随的に投与してもよい。これらの追加ワクチンは非経口または経口投与ルートで投与され得る。好ましくは、追加ワクチンの非経口投与が推奨される。
【００２３】
下記実施例は本発明を説明するものであって、本発明は本明細書に記載の特定実施態様に限定されない。
【実施例１】
【００２４】
中間体ＤＮＡプラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬの作成
この方法の出発プラスミドは、家兎出血性疾患ウイルスのｃＤＮＡ（Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８４：６６４−６７６（１９９１））を含有する市販のプラスミドｐＣＩＴＥ２−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）をベクターのＳａｌＩ及びＨｉｎｃＩＩサイトに挿入したものであった。このプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤと称する。
【００２５】
第１ステップはＭＧＦフランキング配列の導入であった。５’フランキング配列を増幅させるためにＰＣＲプライマーｍｙｘ  ａ及びｍｙｘ  ｂを使用した。
【００２６】
【化１】
2004528833.tif 000002
【００２７】
組織培養で増殖させたＭＲ２４（１０６ｐｆｕ／ｍｌ）の２μｌサンプルをＰＣＲ反応の鋳型として使用した。このＰＣＲ反応はＰＣＲビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、製造業者の指示に従って実施した。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩ／平滑断片として一般的な実験方法に従ってｐＣＩＴＥ／ＲＨＤにクローン化した。まず、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した後ＮｃｏＩで消化することによりｐＣＩＴＥ／ＲＨＤを作成した。生じたプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂと称した。
【００２８】
第２ＰＣＲ反応を同一の鋳型調製物で下記プライマー
【００２９】
【化２】
2004528833.tif 000003
を用いて実施して、３’フランキング配列を作成した。ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／Ｘｂａｌ断片としてＸｈｏＩ／Ｘｂａｌ切断ｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂにクローン化した。生じたプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂｃｄと称した。
【００３０】
次いで、以下のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより合成ポックスウイルスプロモーターを作成した。
【００３１】
【化３】
2004528833.tif 000004
【００３２】
これらの２つの相補オリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングすると、ＫｐｎＩ及びＮｃｏＩ制限サイトと相容性の付着末端が生ずる。同様に、以下の２つのオリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングすると、ＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ相容性断片が生ずる。
【００３３】
【化４】
2004528833.tif 000005
【００３４】
Ｖｐ５及びＶｐ６は一緒になって初期／後期プロモーターを構成し、Ｖｐ３及びＶｐ４は一緒になって後期プロモーターを構成する（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２３：１０９４−１０９４（１９９７））。次いで、アニーニングしたオリゴヌクレオチド対の１方または他方をＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ切断ｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂｃｄにクローン化すると、ｐＶＰ／ＲＨＤ（後期プロモーター）またはｐＥＬ／ＲＨＤ（初期／後期プロモーター）が生ずる。ＲＨＤキャプシド遺伝子は２つの構築物（ｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤ）のいずれかの第１メチオニンの枠に入っていないので、発現させるためにはＲＨＤキャプシド遺伝子（Ｖｐ６０）を再度クローン化し、介在配列を除去しなければならなかった。プラスミドｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、Ｖｐ６０コード配列及び初期ＡＴＧに対して５’の非コード配列を除去した。次いで、Ｖｐ６０遺伝子を以下のオリゴヌクレオチドを用いて作成したＰＣＲ生成断片で置換した。
【００３５】
【化５】
2004528833.tif 000006
【００３６】
ＰＣＲ反応の鋳型はｐＣＩＴＥ／ＲＨＤであった。ＰＣＲ生成断片をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、作成したｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤにクローン化した。生じたプラスミドをｐＶＰ／Ｖｐ６０及びｐＥＬ／Ｖｐ６０と称した。他の制限サイトに隣接する遺伝子を導入するために、ｐＶＰ／Ｖｐ６０及びｐＥＬ／Ｖｐ６０中のユニークなＮｃｏＩサイトの下流に複数のクローニングサイトを導入した。以下のオリゴヌクレオチド
【００３７】
【化６】
2004528833.tif 000007
をアニーリングすると、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼサイトと相容性の懸垂末端が生じる。ＲＨＤ関連配列をすべて有するＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ断片をアニーリングしたオリゴヌクレオチドで置換すると、２つのプラスミド、すなわちｐＶＬ及びｐＶＥＬ（図１参照）が生ずる。
【００３８】
プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬを用いて、それぞれ家兎出血性疾患キャプシドタンパク質ＶＰ６０（上掲のＭｅｙｅｒｓら（１９９１））、緑色蛍光タンパク質（米国カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ネコ白血病エンベロープ糖タンパク質ｇｐ８５（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，５８：８２５−８３４（１９８６））、ネコ白血病マトリックス（ｇａｇ）タンパク質（Ｄｏｎａｈｕｅら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２：７２２−７３１（１９８８））、ネコカリシウイルスキャプシドタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１１５３６及びＮＣ  ００１４８４１）、ネコ汎白血球減少症ウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２（Ｃａｒｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，５５：５７４−５８２（１９８５））、ネコパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２（Ｒｅｅｄ，Ｐ．ら，Ｊ，Ｖｉｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））の遺伝子を含む各種組換えＤＮＡプラスミドを構築した。表１には、本発明の組換え粘液腫ウイルスを生成するために構築した各種ＤＮＡプラスミドがリストされている。各組換えプラスミドは同一方法で構築したが、標的遺伝子は既存のプラスミドから切断したかまたは遺伝子末端の制限酵素サイトがｐＶＬ及びｐＶＥＬのｍｃｓ中のサイトと相容するようにＰＣＲで増幅させた。
【００３９】
ＤＮＡプラスミドｐＶＬＧＦＰの作成
ＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドは米国カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から購入し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、プラスミドからＧＦＰ遺伝子を切除した。この遺伝子をｐＶＬに挿入すると、ｐＶＬＧＦＰが生じた。
【００４０】
ＤＮＡプラスミドｐＶＥＬＦｅＬＶｅｎｖの作成
エンペロープ遺伝子をｐＦＧＡ５（上掲のＳｔｅｗａｒｔ（１９８６））から以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅させた。
【００４１】
【化７】
2004528833.tif 000008
【００４２】
ＰＣＲ断片をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＶＥＬに挿入すると、ｐＶＥＬＦｅＬＶｅｎｖが生じた。
【００４３】
ＤＮＡプラスミドｐＶＥＬＦＰＬの作成
以下のプライマーを用いるＰＣＲにより複製型（ｒｆ）ＤＮＡからＰＣＲ増幅することによりＦＰＬキャプシド遺伝子を得た。
【００４４】
【化８】
2004528833.tif 000009
【００４５】
ｒｆ  ＤＮＡは一般的方法（Ｐ．Ｒｅｅｄら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））によりＦＰＬのワクチン株を感染させたネコ腎臓細胞（ＣＲＦＫ）から作成した。
【００４６】
ＤＮＡプラスミドｐＶＥＬＦＣＶの作成
ネコ腎臓細胞（ＣＲＦＫ）に０．１ｐｆｕ／細胞の多重度でＦＣＶ株Ｆ９を感染させた。３６時間後、細胞を収集し、全ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート（ＧｉｂＣｏ  ＢＲＬのＴＲｌｚｏｌ試薬）を用いて作成した。ｏｌｉｇｏｄｔプライマー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  ＧｉｂＣｏ  ＢＲＬ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。完全ヌクレオチド配列及びＦＣＶのＦ９株のゲノムの構築は報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８６３７９）。第２鎖ＤＮＡ合成を刺激し、その後キャプシド遺伝子をＰＣＲ増幅させるためにオリゴヌクレオチドを合成した。以下のオリゴヌクレオチドを用いてＦＣＶ（Ｆ９株）のＶｐ６０キャプシドタンパク質遺伝子を作成した。
【００４７】
【化９】
2004528833.tif 000010
【００４８】
Ｖｐ６０キャプシド遺伝子をｐＶＬ及びｐＶＥＬのｍｃｓに挿入すると、それぞれｐＶＬＦＣＶ及びｐＶＥＬＦＣＶが生じた。
【００４９】
ＤＮＡプラスミドｐＶＥＬＣＰＶの作成
キャプシドタンパク質ＶＰ２をコードする遺伝子をＮｏｂｉｖａｃ  Ｐａｒｖｏ（登録商標）のＣＰＶワクチン株からＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＶＥＬに挿入した。
【実施例２】
【００５０】
組換え粘液腫ウイルスの生成
家兎腎臓細胞（ＲＫ１３）において長期間経代することにより弱毒化させた粘液腫ウイルスの非毒性株（ＭＲ２４と命名）を選択した。この弱毒化粘液腫ウイルス（ＭＲ２４）は、家兎に対して皮下、皮内または筋肉内投与したときに家兎では非毒性（死亡率０％）であることが分かった。ＭＲ２４は家兎において使用される粘液腫症ワクチン株の候補である。ウイルス滴定及び増幅はすべて家兎腎臓（ＲＫ−１３）細胞において実施した。
【００５１】
組換え粘液腫ウイルスは、組換えワクシニアウイルスの生成について記載している方法（上掲のＭａｃｋｅｔｔ（１９８５））に従って作成した。このためには、家兎腎臓細胞（ＲＫ１３）に０．１ｐｆｕ／細胞の多重度で粘液腫ウイルスＭＲ２４を感染させた。２時間後、細胞にリポフェクタミントランスフェクション試薬（ＧｉｂｏＣｏ  ＢＲＬ）を用いてプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。組換えウイルスは、限界希釈及び免疫フルオレッセンスに基づいて選択した。
【００５２】
トランスフェクションから７２時間後、感染／トランスフェクトした細胞培養物を３回凍結融解してウイルスを遊離させた。この野生型及び組換え型ウイルスの一次ミックスを組織培養培地を用いて５０倍希釈した後、予めＲＫ１３細胞を接種した９６ウェル組織培養プレートの各ウェルを感染させるためにウイルスミックス１０μｌを使用した。次いで、９６ウェルプレートを７２時間インキュベートして、ウイルスの感染及び増殖を進行させた。この後、プレートの各ウェルの個々の状態を維持しながらプレートに対して凍結融解サイクルを３回実施した。こうすると、第１の丸いマスタープレートとなった。その後、各ウェルからのウイルス含有培地５μｌを１対のＲＫ１３細胞を接種した９６ウェルプレートにおいて平板培養した。４８時間後、１対のプレートを氷冷メタノールで固定し、プレートを免疫フルオレッセンスにより組換えタンパク質の発現についてスクリーニングした。
【００５３】
例えば、ｐＶＥＬＦｅＬＶｅｎｖを感染させ、トランスフェクトした細胞を、以下のようにしてＦｅＬＶエンベロープタンパク質の産生についてスクリーニングした。マウスモノクローナル抗体３−１７（オランダ国ウールデンに所在のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）腹水を１０００倍希釈した後、固定９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、次いでＦＩＴＣ標識家兎抗−マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）とインキュベートし、更に１時間インキュベートを続けた。最後に、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて検査した。感染の蛍光フォーカスを含むウェルを同定し、記録した。次いで、第１の丸いマスタープレートからの対応ウェルをより多くのＲＫ−１３接種９６ウェルプレート上に希釈した。こうすると、第２の丸いマスタープレートとなった。組換えウイルスが全ウイルスの２０〜５０％を占めるまで漸進濃縮プロセスを続けた。他の組換え粘液腫ウイルスの組換えタンパク質の発現を同様にスクリーニングした。
【００５４】
【表１】
2004528833.tif 000011
【００５５】
最後に組換え体を、寒天重層培養物から感染の各フォーカスをピッキングすることにより精製した。
【実施例３】
【００５６】
ニワトリにおけるｍｙｘｏ／ＲＨＤ
組換え粘液腫瘍ウイルスを感染させた非ウサギ種が抗体応答を誘発するかを調べるために、ニワトリにｍｙｘｏ／ＲＨＤを皮下または筋肉内投与してニワトリを免疫化した。ニワトリには免疫化スケジュールの０日目及び１４日目に１０５ｐｆｕのウイルスを与えた。０日目、１４日目及び２８日目に血液サンプルを採取し、ＲＨＤＶに対する抗体について分析した。結果を表２に示す。すべてのニワトリが実験中臨床的には正常のままであった。
【００５７】
【表２】
2004528833.tif 000012
【実施例４】
【００５８】
ネコにおけるｍｙｘｏ／ＦＣＶ
粘液腫／ネコカリシウイルスキャプシド組換えウイルス（ｍｙｘｏ／ＦＣＶ）が中和抗体応答を誘発させ、病原性のネコカリシウイルスの攻撃からネコを防御する効果を確立するために実験を実施した。１群４匹のネコ（第１群）には、５×１０６フォーカス形成単位（ｆｆｕ）のｍｙｘｏ／ＦＣＶを皮下投与して免疫化した。第１免疫化から３週間目に免疫化を繰り返した。４匹のワクチン接種していない対照動物（第２群）を試験動物と同じハウスに収容した。第２免疫化から４週間後、すべてのネコに対して１０５．３ＴＣＩＤ５０のネコカリシウイルスの病原性株を鼻内攻撃した。０．５ｍｌの攻撃ウイルスを各鼻孔に滴下した。
【００５９】
【表３】
2004528833.tif 000013
【００６０】
実験開始時に、口腔咽頭にネコカリシウイルスが存在している動物はいないことを確かめるためにスワブを採取した。また、実験の開始前に抗−ＦＣＶ抗体を持っている動物はいないことを確かめるために血液サンプルを採取した。スワブはウイルスの排泄を調べるために攻撃後にも採取した。
【００６１】
実験中に採取した血液サンプルはウイルス中和アッセイで使用した。このアッセイにより、ネコにおける循環抗体レベルを測定する。血清抗体抗体が回復期の動物中に存在すること及びワクチン接種の結果生ずる既存の中和抗体が病気からの防御を与えるのに役立つことは公知である（Ｈｏｈｄａｔｓｕら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６１：２９９−３０１（１９９９））。
【００６２】
【表４】
2004528833.tif 000014
【００６３】
ｍｙｘｏ−ＦＣＶをワクチン接種後の結果（表４）と従来のワクチンを用いた結果（表５）を比較すると、第１回ワクチン接種後第１群の動物は多くの市販ワクチンを２回投与した動物に匹敵する抗体応答を示すことが明らかであり、ネコは病気から保護されるであろうと示唆される。第２回ワクチン接種後、抗体価は市販のワクチン調製物で得られる値よりかなり高い（Ｈｏｈｄａｔｓｕら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６１：２９９−３０１（１９９９）；ＤｅＳｉｌｖｅｒら，第１回カリシウイルス国際シンポジウム議事録ＥＳＶＶ  １３１−１４３）。
【００６４】
【表５】
2004528833.tif 000015
【００６５】
Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９８８）が報告しているように、ＦＣＶ抗原を発現するネコヘルペスウイルスベクターも攻撃前非常に低い血清中和抗体価（２．５〜３．０）を誘発する。
【００６６】
【表６】
2004528833.tif 000016
【実施例５】
【００６７】
ブタ及びウシにおけるｍｙｘｏ／ＦＣＶを用いる中和実験
非天然宿主、すなわちウシ及びブタにおいて防御免疫応答を誘発するための真核発現ベクターとしての粘液腫ウイルスの使用を皮内及び筋肉内注射により試験した。
【００６８】
成熟型のキャプシド抗原をコードするネコカリシウイルス遺伝子断片を含む粘液腫ウイルスベクターをウシ及びブタにおいて使用した。本研究には、１２週令のウシ４匹からなる群及び６週令のブタ４匹からなる群を含めた。
【００６９】
本研究の開始の１週間前に、動物がネコカリシウイルスに対して血清ネガティブであることを調べるために血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取した。その後、動物に対して１×１０８ＦＦＵの組換え粘液腫ウイルス／投与ルート／動物を含有するＰＢＳ  １ｍｌを皮内及び筋肉内注射した。動物は種毎に１群として収容した。４週間後、血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取し、動物に対して同用量の粘液腫ウイルス、すなわち１×１０８ＦＦＵの組換え粘液腫ウイルス／投与ルート／動物を再び皮内及び筋肉内注射した。最後に注射してから２週間後、血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取し、動物をインビボでのＧＭＯ試験に関するガイドラインに従って殺した。採取した血液サンプルについて、インビトロでのウイルス中和アッセイ方法に従ってカリシウイルスに対する抗体の存在を調べた。
【００７０】
【表７】
2004528833.tif 000017
【００７１】
ＦＣＶ血清中和アッセイ方法
ＣｒＦＫ細胞に対するｃ．ｐ．ｅにより血清中和を調べた。２００ＴＣＩＤ５０のウイルスの５倍複製物を最終容量６００μｌで血清の連続希釈物（１：４〜）と混合した。次いで、ウイルス／血清混合物を無菌の５ｍｌ希釈管において３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、試験混合物１００μｌを、増殖培地１００μｌ中にＣｒＦＫ細胞を接種した９６ウェル組織培養皿に添加した。インキュベーションを５日間続けた。ＴＣＩＤ５０値をＲｅｅｄ及びＭｅｕｎｃｈ［１］：Ｌ．Ｊ．Ｒｅｅｄ及びＨ．Ｍｅｕｎｃｈ，「５０％終点を推定する簡単な方法(A simple method of estimating fifty percent end points)」，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，２７：４９３−４９７（１９８３）の方法に従って計算した。
【００７２】
【表８】
2004528833.tif 000018
【実施例６】
【００７３】
インビトロで各種細胞タイプにおける粘液腫ウイルス株の増殖
２つの異なる粘液腫ウイルス菌株から構築した緑色蛍光タンパク質を発現する組換え粘液腫ウイルスで細胞を感染させた。蛍光細胞の数の増加により増殖を経時的にアッセイした。
【００７４】
表８に示すように、ｍｙｘｏ／ＧＦＰ組換えウイルスを各種細胞タイプで平板培養したときに蛍光が見られた。このことは、ウイルスは非ウサギ細胞においてＧＦＰ遺伝子をエントリーし、発現させることができたことを示している。表８から、インビトロでのウイルスの増殖が幾つかの細胞タイプにおいて見られ、試験した２つの構築物でパターンが異なっていたことが分かる。
【００７５】
【表９】
2004528833.tif 000019
【実施例７】
【００７６】
イヌパルボウイルスワクチン接種に対する応答のＥＬＩＳＡ
イヌパルボウイルスキャプシドタンパク質Ｖｐ２を発現する組換え粘液腫ウイルスをイヌにワクチン接種することにより誘発される免疫応答を調べるために、ＥＬＩＳＡを実施した。ワクチン接種に対する応答を従来のワクチンを接種したイヌで見られた応答と比較した。
【００７７】
（材料及び方法）
材料
ＴＢＳ（５０ｍＭ  トリス緩衝食塩水）：
５０ｍＭ  トリス緩衝食塩水（ｐＨ７．５），トリス−ＨＣｌ（６．３５ｇ），トリス塩基（１．１８ｇ），ＮａＣｌ（８．７７ｇ），ｄＨ２Ｏ（８００ｍｌ）
ｐＨを７．５に調整し、ｄＨ２Ｏで容量を１Ｌとする。
ＴＢＳ−ツイーン：
ＴＢＳを上記したように調製した後ツイーン２０を添加する。十分に混合する。
【００７８】
方法
１．抗ＣＰＶモノクローナル抗体を０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）中に５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で懸濁させた。ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ／ウェルの抗体懸濁液と共に４０℃で一晩インキュベートした。
２．過剰の抗原コーティング溶液を振盪除去した後、ＴＢＳ中１％  ＢＳＡ及び２％  粉ミルク２００μｌと室温で１時間インキュベートすることにより各ウェルにおいて残りの結合サイトをブロックした。
３．ブロック溶液を振盪除去した後、約１０７ｐｆｕ／ｍｌの力価のイヌパルボウイルスを含有する組織培養懸濁液１００μｌと置換した。室温でインキュベーションを１〜２時間実施した。
４．プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
５．被験血清をＴＢＳ中で連続希釈した。希釈物１００μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加し、室温でインキュベーションを１〜２時間続けた。
６．その後、プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
７．抗−イヌアルカリホスファターゼ結合第２抗体（例えば、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓのカタログ番号６７５０７１）を製造業者が指示する希釈度で添加した。室温でインキュベーションを１〜２時間実施した。
８．プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
９．基質ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート，例えばＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙのカタログ番号Ｎ２７７０）を添加することによりＥＬＩＳＡを展開した。
１０．分光光度計を用いて４２０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７９】
結果を表９に示す。
【００８０】
【表１０】
2004528833.tif 000020
【００８１】
ＥＬＩＳＡ結果は、従来のワクチンを接種したイヌの血清の１：４０希釈物は吸光度のバックグラウンドレベル、すなわちワクチン接種していないイヌ血清で見られるレベルを示すことを明らかに示している。一方、粘液腫−ＣＰＶ（Ｖｐ２）をワクチン接種したイヌの血清では、同じバックグラウンドレベルとするためには１：１２８０希釈物が必要である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１−１】中間体プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬの構築の概略図。ＲＨＤは家兎出血性ウイルスのｃＤＮＡを表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。プロモーターはそれぞれ合成の後期または初期／後期プロモーターを表す。“ｍｃｓ”は外来性ＤＮＡを導入するために複数のクローニングサイトを含むヌクレオチド配列を表す。
【図１−２】中間体プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬの構築の概略図。ＲＨＤは家兎出血性ウイルスのｃＤＮＡを表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。プロモーターはそれぞれ合成の後期または初期／後期プロモーターを表す。“ｍｃｓ”は外来性ＤＮＡを導入するために複数のクローニングサイトを含むヌクレオチド配列を表す。
【図２】構築したｐＶＬ及びｐＶＥＬをベースとする各種組換えＤＮＡプラスミド。Ｐは合成の後期（ｐＶＬ）または初期／後期（ｐＶＥＬ）プロモーター領域を表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。ＲＨＤＶ  Ｖｐ６０はＲＨＤＶ  Ｖｐ６０タンパク質をコードする遺伝子を表す。ＦｅＬＶ  ｇｐ８５はネコ白血病ウイルスｅｎｖ遺伝子を表す。ＦＣＶ  Ｖｐ６０はネコカリシウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を表す。ＦＰＬ  Ｖｐ２はネコ汎白血球減少症ウイルスｖｐ２遺伝子を表す。ＣＰＶ  Ｖｐ２はイヌパルボウイルスｖｐ２遺伝子を表す。ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を表す。プラスミドはすべて選択マーカーとしてＡｍｐｒを含む（図示せず）。
【図２】
2004528833.tif 000021
【図１−１】
2004528833.tif 000022
【図１−２】
2004528833.tif 000023
【国際公開パンフレット】
2004528833.tif 000024
2004528833.tif 000025
2004528833.tif 000026
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2004528833.tif 000028
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2004528833.tif 000032
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2004528833.tif 000049
2004528833.tif 000050
2004528833.tif 000051
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528833.tif 000052
【国際調査報告】
2004528833.tif 000053
2004528833.tif 000054
2004528833.tif 000055