(57)【要約】本発明は、イムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物を含む組成物、免疫抑制剤を増加させる方法、及び免疫抑制性のギンゴライド化合物についてスクリーニングする方法を特徴とする。ギンゴライド化合物は、ホスホジエステラーゼ阻害剤、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）拮抗剤、及びフリーラジカル捕捉剤からなる群より選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物を含む組成物であって、該ギンゴライド化合物がホスホジエステラーゼ阻害剤、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）拮抗剤、及びフリーラジカル捕捉剤からなる群より選択される組成物。
【請求項２】
ギンゴライドがホスホジエステラーゼ阻害剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ギンゴライドがＰＡＦＲ拮抗剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ギンゴライドがフリーラジカル捕捉剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
ギンゴライドがＢＮ５２０２１である、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
ギンゴライドがＢＮ５０７３０である、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
ギンゴライドがＥＧｂ７６１である、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
イムノフィリン結合性化合物がラパマイシンである、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
イムノフィリン結合性化合物がカルシニューリン阻害剤である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
カルシニューリン阻害剤がＦＫ５０６またはシクロスポリンＡである、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
免疫細胞を請求項１記載の組成物と接触させる段階を含む、免疫細胞の活性化を阻害する方法。
【請求項１２】
イムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における同種移植の拒絶反応を阻止する方法であって、前記ギンゴライド化合物がホスホジエステラーゼ阻害剤、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）拮抗剤、及びフリーラジカル捕捉剤からなる群より選択される方法。
【請求項１３】
イムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における心臓肥大を阻止する方法であって、該ギンゴライド化合物がホスホジエステラーゼ阻害剤、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）拮抗剤、及びフリーラジカル捕捉剤からなる群より選択される方法。
【請求項１４】
イムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物を哺乳動物に投与する段階を含む、自己免疫疾患の症状を軽減させる方法であって、前記ギンゴライド化合物がホスホジエステラーゼ阻害剤、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）拮抗剤、及びフリーラジカル捕捉剤からなる群より選択される方法。
【請求項１５】
症状が慢性炎症である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
イムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物を哺乳動物に投与する段階を含む、喘息症状を軽減させる方法であって、該ギンゴライド化合物がホスホジエステラーゼ阻害剤、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）拮抗剤、及びフリーラジカル捕捉剤からなる群より選択される方法。
【請求項１７】
相乗的な免疫抑制を誘導するのに有効な量のイムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物を哺乳動物に投与する段階を含むその哺乳動物における免疫反応を抑制する方法であって、該ギンゴライド化合物がホスホジエステラーゼ阻害剤、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）拮抗剤、及びフリーラジカル捕捉剤からなる群より選択される方法。
【請求項１８】
イムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物が同時に投与される、請求項１２、１３、１４、１６、または１７記載の方法。
【請求項１９】
イムノフィリン結合性化合物がギンゴライド化合物よりも前に投与される、請求項１２、１３、１４、１６、または１７記載の方法。
【請求項２０】
ギンゴライド化合物がイムノフィリン結合性化合物よりも前に投与される、請求項１２、１３、１４、１６、または１７記載の方法。
【請求項２１】
免疫細胞群を候補ギンゴライド化合物と接触させる段階と、Ｔ細胞の活性化を測定する段階とを含む、免疫抑制剤を同定する方法であって、該化合物が存在するときのＴ細胞の活性化が該化合物が存在しないときのそのレベルに比較して減少することで、該化合物が免疫抑制剤であると示される方法。
【請求項２２】
細胞表面のＣＤ２５の発現を検出することによって、Ｔ細胞の活性化が測定される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）免疫細胞をイムノフィリン結合性化合物と接触させる段階、
（ｂ）免疫細胞を候補ギンゴライド化合物と接触させる段階、
（ｃ）免疫細胞をイムノフィリン結合性化合物及び候補ギンゴライド化合物の両方と接触させる段階、および
（ｄ）Ｔ細胞の活性化を測定する段階、
を含む、免疫抑制化合物の相乗的な組み合わせを同定する方法であって、
（ａ）及び（ｂ）で検出されたＴ細胞の活性化に比較して（ｃ）で検出されたＴ細胞の活性化が相加的な減少よりも大きく減少することで、該ギンゴライド及び該イムノフィリン結合性化合物が相乗的に免疫抑制すると示される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景
本発明は免疫抑制に関する。
シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）及びＦＫ５０６のような免疫抑制剤は、移植臓器の拒絶反応を阻害したり、また自己免疫疾患を治療するために臨床的に用いられてきた。多くの場合、移植受容者及び自己免疫疾患にかかっている人は長期間の免疫抑制を必要としている。ＣｓＡ及びＦＫ５０６のような免疫抑制剤は高毒性プロフィールにより、臨床的な恩恵が制限される。副作用には腎毒性、高血圧、糖尿病のリスク増加、及び神経学的毒性が含まれる。
【０００２】
発明の概要
本発明は、有害な副作用を軽減させた免疫抑制性組成物を特徴とする。この免疫抑制性組成物は、カルシニューリン阻害剤のようなイムノフィリン結合性薬剤とギンゴライドを含む。ギンゴライド組成物は好ましくは、抗酸化剤またはフリーラジカル捕捉剤を含む。さらに好ましくはギンゴライドは、血小板活性化因子受容体（ＰＡＦＲ）拮抗作用を有している。最も好ましくはこの組成物は、ＰＡＦＲ拮抗作用と、少なくとも二つの抗酸化剤を含んでいる。その組成物には、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤が含まれる。例えばギンゴライド組成物は以下の活性を有している：ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性、ＰＡＦＲ受容体拮抗活性、及び抗酸化またはフリーラジカル捕捉活性。
【０００３】
フリーラジカル捕捉剤は、フリーラジカルの量を減少させる組成物である。例えばフリーラジカル捕捉剤は、酸化性の圧力の一因となる酸素ラジカルのレベルを減少させる。フリーラジカルのレベルは、フリーラジカルを指向的に捕捉することによって、またはフリーラジカルの捕捉作用を持つ組成物の生成を誘導することによって減少する。ホスホジエステラーゼ阻害剤は、ホスホジエステラーゼ酵素の活性を阻害したり、選択的に減少させたりする組成物である。例えばこの化合物はｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの酵素活性を阻害する。この化合物はＩＩＩ型ホスホジエステラーゼまたはＩＶ型ホスホジエステラーゼを阻害する。ＰＡＦＲ拮抗剤は、ＰＡＦ（１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホリルコリン）がその受容体に結合するのを阻害する化合物である。ＰＡＦは強力な炎症性リン脂質メディエーターであり、例えばＰＡＦＲ拮抗剤等によってＰＡＦＲへのＰＡＦの結合を阻害し、炎症を軽減させる。
【０００４】
イムノフィリン結合性化合物には、ラパマイシンまたはその類似体と、ＦＫ５０６及びシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその類似体等のカルシニューリン阻害剤とが含まれる。
【０００５】
本発明はまた、哺乳動物において免疫抑制を誘導する（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞のような免疫細胞の活性化を阻害する）方法を含む。この方法は、カルシニューリン阻害剤のようなイムノフィリン結合性化合物とギンゴライドとを、相乗的な免疫抑制作用をもたらすことのできる量で同時投与することによって行われる。好ましくはギンゴライドは、Ｔ細胞の活性化を好適に阻害する用量で投与される。イムノフィリン結合性化合物（例えば、カルシニューリン阻害剤）及びギンゴライドは、同時に、または連続して投与される。例えばギンゴライドが始めに投与され、続いてイムノフィリン結合性化合物が投与される。またイムノフィリン結合性化合物がまず投与され、その後でギンゴライドが投与される。このような同時投与法は、哺乳動物における同種移植組織の拒絶反応を阻害するのに有用である。例えばカルシニューリン阻害剤及びギンゴライドは、同種組織を移植する前か後に投与される。
【０００６】
免疫細胞の活性を阻害する方法は、免疫細胞をイムノフィリン結合性化合物及びギンゴライド化合物と接触させることによって行われる。ギンゴライド化合物は、ホスホジエステラーゼ阻害剤、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）拮抗剤、及びフリーラジカル捕捉剤からなる群より選択される。治療法には、哺乳動物における同種移植片の拒絶反応を阻害する方法、哺乳動物における心臓肥大を阻害する方法、自己免疫疾患の症状、例えば慢性炎症を軽減させる方法、及び喘息症状を軽減させる方法が含まれる。哺乳動物において免疫反応を抑制する方法は、相乗的な免疫抑制を誘導できる有効量のイムノフィリン結合性化合物とギンゴライド化合物とを哺乳動物に投与することによって行われる。これらの化合物は、同じ経路もしくは異なる経路で同時に、または連続的に投与される。
【０００７】
また、治療用化合物をスクリーニングするための方法も本発明に含まれる。免疫抑制剤を同定する方法は、免疫細胞群を候補ギンゴライド化合物と接触させる段階、及びＴ細胞の活性化を測定する段階によって行われる。その化合物が存在するときのＴ細胞の活性化がその化合物が存在しないときのレベルに比較して減少する場合、その化合物が免疫抑制剤であることを示している。例えばＴ細胞の活性化は、細胞表面のＣＤ２５の発現を、またはＩＬ−２のようなサイトカインの産生を検出することによって測定される。免疫抑制性化合物の相乗的組み合わせを同定するために、以下の段階が行われる：（ａ）免疫細胞をイムノフィリン結合性化合物と接触させる段階、（ｂ）免疫細胞を候補ギンゴライド化合物と接触させる段階、（ｃ）免疫細胞をイムノフィリン結合性化合物及び候補ギンゴライド化合物の両方と接触させる段階、及び（ｄ）Ｔ細胞の活性化を測定する段階。段階（ｃ）の細胞培養物で検出されたＴ細胞の活性化が（ａ）及び（ｂ）の細胞培養物で検出されたＴ細胞の活性化に比較して相加的な減少よりも大きく減少する場合、試験したギンゴライド及びイムノフィリン結合性化合物が相乗的に免疫抑制することを示している。
【０００８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【０００９】
詳細な説明
本明細書に記載の組成物は移植臓器の拒絶反応を抑制するため、心臓性高血圧を抑制するため、および虚血性心疾患を患う患者に対する臨床上の予後を改善するために有用である。この組成物はまた、自己免疫疾患を治療するのにも有用である。ＦＫ５０６のようなマクロライド系免疫抑制剤とイチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）抽出物の一つまたはそれ以上の成分とを組み合わせた作用によって、ギンゴライドを用いずに免疫抑制作用を達成するのに必要とされる量よりもマクロライド系免疫抑制剤の用量を少なくすることが可能になる。
【００１０】
免疫抑制剤
ＩＬ−２は、Ｔ細胞を刺激し、増殖させるように誘導するシグナル伝達経路における重要な伝達物質である。一旦、Ｔ細胞が活性化されると、細胞質と核における一連のシグナルによってＩＬ−２及びＩＬ−２受容体の産生が誘導される。シグナル伝達カスケードにおける段階の一つは、カルシニューリンによる転写因子、Ｔ細胞活性化因子（ＮＦＡＴ）の活性化である。本明細書に記載された免疫抑制剤はＴ細胞の活性化を阻害する。
【００１１】
カルシニューリン阻害剤には、ＦＫ５０６（タクロリムス）、Ｌ−７３２，５３１（ＦＫ５０６の半合成類似体）、ＦＫ５２０、Ｌ−６８３，５９０（ＦＫ５０６の類似体）、Ｌ−６８５，８１８（Ｃ１８−水酸基、ＦＫ５０６のＣ２１−エチル誘導体）、Ｌ−７３２，５３１（ヒドロキシエチルインドール置換基を含むＦＫ５０６の類似体）、９−デオキソ−３１−Ｏ−デメチルＦＫ５０６、３１−Ｏ−デメチルＦＫ５０６、ＦＫ１０１２、アスコマイシン（抗炎症性のマクロラクタム系）、Ａ−１１９４３５（１０倍高い治療指数を持ち、腎毒性を減らしたアスコマイシンの類似体）、ＳＤＺ ＡＳＭ ９８１（アスコマイシン誘導体）、インドリルＡＳＣ、２位の炭素連結鎖（ｔｅｔｈｅｒ）を持つアスコマイシン、２位の炭素連結鎖を９個有し、酸素を有する置換基を連結したアスコマイシンが含まれ、ここで「連結鎖」＝Ｃ３２−Ｏ−アリールエチルエーテル、Ｃ２４−デオキシアスコマイシン、ＡＢＴ−２８１、ＡＫＡＰ７９（イムノフィリン結合領域とは異なる部位を介してカルシニューリンを阻害する類似体）、チルホスチンＡ８（ＡＧ１０とも命名されている）、チルホスチンＡ２３（ＡＧ１８とも命名されている）、チルホスチンＡ４８（ＡＧ１１２とも命名されている）である。
【００１２】
シクロスポリンＡ及び類似体：
シクロスポリンＡは、真菌種のトリポクラジーム−インフラツム−ガムズ（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ Ｇａｍｓ）による代謝産物として産生される。化学的にシクロスポリンＡは、［Ｒ−［Ｒ，Ｒ−（Ｅ）］］−サイクリック−（Ｌ−アラニル−Ｄ−アラニル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−３−ヒドロキシＮ，４−ジメチル−Ｌ−２−アミノ−６−オクテノイル−Ｌ−ａ−アミノ−ブチリル−Ｎ−メチルグリシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル）を意味する。シクロスポリンＡは経口投与の形態で、または静脈内投与の形態で市販されている。シクロスポリンは細胞質でシクロフィリンと複合体を形成し、続いてカルシニューリン、カルシウム・カルモジュリン依存性ホスファターゼにカルシウム依存性の形態で結合する。カルシウム活性が阻害されると、インターロイキン−２遺伝子を転写させるＩＬ−２エンハンサーに結合するＮＦＡＴの活性化及び／または転位に影響を与える。インターフェロンγ及び数種の他のインターロイキンを含むいくつか他のサイトカインの転写もＣｓＡによって阻害される。
【００１３】
ＣｓＡは、移植後の移植片を許容させるのに必要とされるレベルで毒性である。主要な悪影響は腎毒性である。例えば腎臓の血管抵抗の増加、Ｎａ＋の尿からの排泄の減少、また腎臓ストレスについての他の指標は、ヒト被検者に４及び５ｍｇ／ｋｇを投与した後に有意となった（Ｂｕｔｔｅｒｌｙら、１９９５、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４８： ３３７−３４３）。Ｔリンパ球の活性化の特異的抑制は単に、５ｍｇ／ｋｇかそれ以上に引き続いて観察されただけであった（Ｄｅ Ｎｉｃｏｌａら、１９９５、Ｎｅｐｇｒｏｌｏｇｙ， Ｄｉａｌｙｓｉｓ， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １０： １７３９−４４）。免疫抑制を達成するためには通常、毒性用量のＣｓＡを用いる必要がある。対照的にＥＧｂ７６１をＦＫ５０６と組み合わせると、補足なしで必要とされる用量よりも、包括的な心臓保護作用が達成されるのに必要なＦＫ５０６の用量を３〜５分の１だけ減少させることがわかった。ＣｓＡまたはＦＫ５０６のようなイムノフィリン結合性の免疫抑制剤がギンゴライドと同時投与される免疫抑制治療計画によれば、移植後の免疫抑制作用で現在用いている（即ちギンゴライドを含まない場合の）量よりも３〜５分の１少ないイムノフィリン結合性薬物の用量で達成させることが可能になる。Ｔリンパ球活性の阻害によって免疫抑制作用を増加させることとは別に、ギンゴライドとカルシニューリン阻害剤とを組み合わせて、イムノフィリン結合性免疫抑制剤の既知の副作用である血管収縮と手術後の再灌流障害とを緩和する。この組み合わせ治療のアプローチは、主要な臓器系に起こる手術後の再灌流障害に対する現在の治療アプローチを増大させることに役立つ。
【００１４】
シクロスポリンＡ及び関連する化合物には、（γ−ＯＨ）ＭｅＬｅｕ（４）−Ｃｓ（２１１−８１０）、Ｄ−Ｓａｒ（α−ＳＭｅ）（３）Ｖａｌ（２）−ＤＨ−Ｃｓ（２０９−８２５）、シクロスポリンＧ（２位でα−アミノ酪酸に置換されているノルバリン）、Ａ２３８Ｌ（シクロスポリンＡ様に作用するアフリカブタ熱ウイルス由来のウイルスタンパク質）、ＳＤＺ ２１１−８１１、カイン（２４０ｋＤａの内因性細胞質タンパク質）、ＰＤ １４４７９５（抗ＨＩＶの性質を有するカルシニューリン阻害剤）、オルトバナジン酸ナトリウム、ＳＤＺ ＡＳＭ ９８１、シクロリノペプチドＡ（ＣＬＡ、アマニに存在する環状疎水性ナノペプチド）、Ａ４５７−４８２（カルシニューリンの自己阻害性ペプチド）、及びシペルメトリンが含まれる。
【００１５】
ＦＫ５０６及び類似体：
大環状の免疫抑制剤ＦＫ５０６（タクロリムス）は、臓器移植手術の際、また乾癬やリウマチ性関節炎の治療のために臨床的に用いられてきたカルシニューリン阻害剤である。ＦＫ５０６は細胞の細胞質に入り、イムノフィリンＦＫ結合性タンパク質−１２（ＦＫＢＰ−１２）と複合体を形成する。このタンパク質−薬物複合体は、カルシニューリン、即ちカルシウム及びカルモジュリン依存性ホスファターゼがＮＦＡＴを産生することを抑制し、それによってＩＬ−２産生を阻害する。
【００１６】
ラパマイシン及び類似体：
ラパマイシンは免疫抑制剤ＦＫ５０６に関連する大環状化合物である。ラパマイシンはＦＫ５０６と同様にＴ細胞のサイトゾルでＦＫＢＰ−１２に結合するが、ラパマイシンは異なる機構を経てＴ細胞のシグナル伝達経路の異なる地点でＴ細胞の増殖を阻害する。ラパマイシン−ＦＫＢＰ−１２複合体は、ＩＬ−２が誘導したｐ７０ Ｓ６キナーゼの活性化を遮断することによってその地点でのシグナル伝達経路を妨害する。続いてこの複合体はリボソームＳ６のリン酸化を阻止し、それによってＴ細胞の増殖を抑制する。
【００１７】
薬物（例えば、ＣｓＡ、ＦＫ５０６、ラパマイシン、及びその誘導体）とイムノフィリン（例えば、及びＦＫＢＰ）の複合体が形成されることは免疫抑制活性に対して必要である。この薬物は単独では作用できず、またイムノフィリンも単独では作用できない。例えばＣｓＡ／シクロフィリン複合体が形成すると、ＣｓＡの疎水性領域が露出することになるようにＣｓＡに構造上の変化を起こさせる。疎水性領域がカルシニューリンに結合して阻害する。ＦＫ５０６とラパマイシンはこの点でＣｓＡに似ている。これらの薬物はそれぞれ、対応するイムノフィリンとそれらが作用する特定のシグナルタンパク質との両方に結合することを可能にする二つの別個のタンパク質結合領域を含んでいる。
【００１８】
ギンゴライド：
イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ Ｂｉｌｏｂａ Ｌ．）は、何世紀もの間医療目的で用いられてきた植物、葉、根、及び実である。この植物の種々の部分の抽出物は市販されている。ギンゴライドはイチョウの抽出物、その合成誘導体、またはその精製成分である。ギンゴライドは好ましくは、抗酸化剤成分、ＰＡＦＲ拮抗剤成分、またはホスホジエステラーゼ阻害成分のような一つまたはそれ以上の免疫学的に活性な成分を含む。例えば抽出物はイチョウの葉から得られ、約２４〜２５％のギンゴ（ｇｉｎｋｇｏ）フラボングリコシドを含む濃度で用いられる。またこの抽出物はＥＧｂ７６１またはＬＩ−１３７０のようなテルペノイドを含んでいてもよい。例えば調製物には、２４％のギンゴフラボングリコシドと６％のテルペノイドとが含まれる。ギンゴフラボングリコシドは時にヘテロシドと呼ばれることがある。ＥＧｂ７６１は市販されているイチョウの葉の抽出物であって、ＧＡ、ＧＢ、ＧＣ、ＧＪ、ＧＭ及びビロバライドを含んでいる。
【００１９】
天然に存在するギンゴライド化合物は、物質から取り出される際に精製される。例えば、精製されたギンゴライド化合物は、組成物の少なくとも８５重量％である。好ましくは、成分が、組成物の少なくとも９０％、９５％、９９％、または１００％である。
【００２０】
天然に存在するイチョウは、（Ａ）アメントフラボン（ａｍｅｎｔｏｆｌａｖｏｎｅ）、ビロベチン（ｂｉｌｏｂｅｔｉｎ）、セコイアフラボン（ｓｅｑｕｏｉａｆｌａｖｏｎｅ）、ギンゲチン（ｇｉｎｋｇｅｔｉｎ）、イソギンゲチン（ｉｓｏｇｉｎｋｇｅｔｉｎ）、シアドピチシン（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓｉｎ）のようなビフラボン類、（Ｂ）フラボノールグリコシド類、（Ｃ）ギンゴライドＡ、ギンゴライドＢ、ギンゴライドＣ、ギンゴライドＪ、ギンゴライドＭ及びビロバライドのようなテルペントリラクトン類、（Ｄ）ルチン、（Ｅ）クエルセチン、並びに（Ｆ）Ｎ−グリカン類を含むβ１→２キシロースに対する抗血清と反応する３０ｋＤａのイチョウ糖タンパク質を含む。それぞれの成分またはその組み合わせは、当技術分野で既知の方法を用いて植物の粗抽出物から単離される。
【００２１】
αベット順に標識された一連のギンゴライド誘導体は、以下のようにさらに特徴づけられる。ギンゴライドＡ（ＧＡ）は、テルペントリラクトンを含む葉の抽出物である。このギンゴライドはＰＡＦＲ拮抗剤であるが、明らかな抗酸化性は持っていない。ギンゴライドＡはＢＮ５２０２０、ＣＡＳ １５２９１−７５−５としても知られている。ギンゴライドＢ（ＧＢ）は、テルペントリラクトンを含む葉の抽出物である。ギンゴライドＢはＰＡＦＲの拮抗剤であって抗酸化剤の性質を有し、ＢＮ５２０２１またはＣＡＳ １５２９１−７７−７とも呼ばれる。ＧＣ、即ちギンゴライドＣはテルペントリラクトンを含む葉の抽出物であり、抗酸化の性質を有するＰＡＦＲ拮抗剤である。ギンゴライドＪ（ＧＪ）は、テルペントリラクトンを含む葉の抽出物であり、ＰＡＦＲ拮抗活性と抗酸化の性質とを有する。ギンゴライドＭ（ＧＭ）は、テルペントリラクトンを含む根の抽出物である。このギンゴライドはＰＡＦＲ拮抗活性と抗酸化の性質とを有する。ビロバライド（セスキテルペントリラクトン）は本来抗酸化剤である。イチョウ抽出物（ＥＧｂ ７６１）は臨床的に安全で、毒性がなく、応用が広範囲に及び、容易に生成される生成物である。合成のギンゴライド化合物であるヘトラゼピン誘導体ＢＮ５０７３０（Ｇｕｉｎｏｔ， Ｐ．、１９９４、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｗｉｅｗｓ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ １２、３９７−４１７、米国特許第６，１２４，２６６号）は、ＢＮ５２０２１に比較してより強力なＰＡＦＲ拮抗活性（数十倍まで）を示す。ギンゴライドの他の抽出物及び調製法は、例えばチェン（Ｃｈｅｎ）らの１９９８、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｚ ＆　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ８： １２９１−６に記載されているように、当技術分野で既知である。
【００２２】
投与すべきギンゴライド組成物は、ギンゴライドの生物学的利用可能性が最大になる形態である。例えばその組成物は、２７％のギンゴフラボノールグリコシド類、７％のテルペンラクトン類を含むＥＧｂ７６１の変形物である。この組成物は、薬学的に活性なギンゴライド成分の生物学的利用可能性を拡張することが示されている（Ｌｉら、１９９７、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ． ６３： ５６３−５）。
【００２３】
ＰＡＦＲの拮抗作用は、例えば酵素５−リポキシゲナーゼを阻害する化合物の能力を評価するために用いられる生物アッセイ法等の既知の方法を用いて測定する。例えばアラキドン酸がマウスの耳に局所的に適用される。応用する場合にはアラキドン酸は５−リポキシゲナーゼによって種々のロイコトリエン類に変換し、それによって血流を変化させ、紅斑を誘導し、血管拡張と血管の透過性とを増加させる。候補ＰＡＦＲ拮抗剤が同様に投与される。生じた浮腫は、処理した耳の厚みを対照の耳（候補化合物を含まない）の厚みと比較することによって測定する。その化合物が存在した場合に浮腫の反応が減少することは、その化合物がＰＡＦＲ拮抗作用を有することを示している。他のアッセイ法には、ゴーザル（Ｇｏｚａｌ）らの１９９８、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７５ （２ Ｐｔ ２）： Ｒ６０４−１１に記載されたアッセイ法が含まれる。
【００２４】
ホスホジエステラーゼ活性を測定し、ｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの阻害剤は当技術分野で既知の方法、例えばバーデル（Ｂａｒｄｅｌｌｅ）らの１９９９、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７５： １４８−５５の方法を用いて同定する。酸素フリーラジカル捕捉／抗酸化活性も、例えばバリツ（Ｂｕｒｉｔｓ）らの２００１、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ． Ｒｅｓ． １５： １０３−８の方法のような当技術分野で既知の方法を用いて測定する。
【００２５】
ＢＮ５２０２１はＰＡＦＲ拮抗活性と抗酸化活性の両方を持っているが、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ作用は持っていない。ＥＧｂ７６１は、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性、ＰＡＦＲ拮抗活性、同様にフリーラジカル捕捉（抗酸化）活性を持っている。
【００２６】
ギンゴライドビフラボノイド組成物
ビフラボンまたはビフラボノイド化合物は維管束植物で発見されたポリフェノール性の化合物である。これらの化合物は鎮痛作用を持っていて、抗炎症剤として有用である。
【００２７】
アメントフラボンは抗真菌作用と抗ウイルス作用（ＨＩＶに対する作用を含む）を持っている。それは細胞に入り込まず、膜に結合したままであり、その場合には膜の安定性に寄与することが明らかとなっている。アメントフラボンはカフェインに似ており、断片化されたウサギ骨格筋の筋小胞体の重画分からのＣａ２＋の放出において、濃度に依存した増加を引き起こす。アメントフラボンのＣａ２＋放出活性は、カフェインのその活性よりも約２０倍効力が大きい。それは抗炎症剤であって、リポキシゲナーゼに影響を与えることなくシクロオキシゲナーゼ（モルモットの表皮由来）を阻害することがわかっている。このビフラボノイドは、群ＩＩホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ−２）の活性を阻害する。
【００２８】
ビロベチンはＰＬＡ−２を阻害し、さらにＴＮＦα、ｉＮＯＳ及び誘導性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）の産生を阻害する。さらに別のギンゴ誘導性ビフラボノイドはセコイアフラボンである。
【００２９】
ギンゲチンはＰＬＡ−２を阻害し、さらにＴＮＦα、ｉＮＯＳ及び誘導性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）の産生を阻害する。この画分は関節炎の病因を阻害する。
【００３０】
他のギンゴライドビフラボノイド類には、イソギンゲチン、シアドピチシン、ルチン、及びクエルセチンが含まれる。
【００３１】
ギンゴライドビフラボノイド類はｃＡＭＰホスホジエステラーゼの阻害剤である。イチョウのビフラボン類はｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼを、以下の効力の順番で阻害する：アメントフラボン＞ビロベチン＞セコイアフラボン＞ギンゲチン＝イソギンゲチン。シアドピチシンはほとんど不活性である。（Ｓａｐｏｎａｒａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ６１： １３８６−７）。
【００３２】
ギンゴライドビフラボノイド類は心臓保護作用を有することが明らかである。冠状動脈の流れ、心拍速度、及び左心室の圧力に対するサンザシ（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ）種（Ｈａｗｔｈｏｒｎ、Ｒｏｓａｃｅａｅ）から得られる主なフラボノイド類の影響が研究された。心臓保護作用は、Ｏ−グリコシド ルテオリン−７−グルコシド（１８６％）、ハイパーオシド（６６％）及びルチン（６６％）の処理を行って観察した。このデータは３’，５’−サイクリックアデノシンモノホスフェートホスホジエステラーゼの阻害作用を示すとともに、この酵素の阻害作用がフラボノイドルテニウムの心臓保護作用の機構であることを示唆している（Ｓｃｈｕｓｓｌｅｒら、１９９５、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４５： ８４２−５）。
【００３３】
ＥＧｂ７６１のビフラボノイド成分はｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性を有していることが示されているが、これに対してＢＮ５２０２１はｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害活性を有していない。ＢＮ５２０２１はビフラボノイド類、ビロテチン（ｂｉｌｏｔｅｔｉｎ）及びギンゲチンを含んでおらず、それらはＥＧｂ７６１に存在している。ＰＬＡ−２、ＴＮＦα、ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの阻害作用は、例えばＥＧｂ７６１といったビフラボノイド含有ギンゴライドの免疫抑制作用に寄与する。ＢＮ５２０２１はビフラボノイド類を含んでいない。
【００３４】
免疫抑制剤の組み合わせ
例えばＦＫ５０６といったカルシニューリン阻害剤の用量−応答曲線は、ギンゴライドの存在で好ましく変えられることがわかった。したがって同種移植の拒絶反応は、低用量のカルシニューリン阻害剤で阻害される。
【００３５】
本明細書に記載の組み合わせ薬物治療計画は、イムノフィリンと複合化した場合にギンゴライドとともにＴ細胞を抑制できる化合物の薬学的作用に基づいている。イムノフィリン結合性化合物としては、ＦＫ５０６（及び構造的に関連するマクロライド類）、並びにラパマイシン（及び、構造的に関連するＴＯＲの阻害剤）及びＣｓＡ（及び構造的に関連するウンデカペプチド類）を含むカルシニューリン阻害剤が挙げられる。ギンゴライド組成物はＥＧｂ７６１のようなイチョウの抽出物を含む。ギンゴライド単独、またはイムノフィリン結合性免疫抑制剤とギンゴライドとの組み合わせが移植後の免疫抑制のために用いられる。薬物の組み合わせは、この目的で用いられる現在入手できる薬物よりも実質的に毒性が小さい。例えば臨床的な免疫抑制作用を達成するのに必要とされるイムノフィリン結合性免疫抑制剤の用量は、ギンゴライドを用いないで免疫抑制の同じレベルを達成するのに必要とされる用量よりも少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、そして最も好ましくは少なくとも５０％少ない。免疫抑制は、例えばＴ細胞の活性化（ＩＬ−２産生もしくは活性化関連細胞表面マーカーの発現により示される）の阻害を検出することにより、または同種移植片の生存する時間を測定することにより、当技術分野で既知の方法を用いて測定した。またこの組み合わせ薬物治療計画は手術後の心臓保護剤としても、また心臓肥大にならないよう長期間予防するためにも有用である。
【００３６】
カルシニューリン阻害剤／ギンゴライドの組み合わせ薬物は、ほとんどまたは全く副作用がなく移植組織を健康的で機能的な状態に維持するのに充分な免疫抑制効果を達成するための方法を提供する。本発明の利点としては、移植外科手術に対する結果（薬物が関連する病的状態だけでなく移植断片生存期間においても）の改善、二次的な入院の必要性の減少、及び移植受容者に対する保健医療費支出の削減が挙げられる。例えばカルシニューリン阻害剤の心臓保護効果において、カルシニューリン阻害剤／ギンゴライドの組み合わせは、カルシニューリン阻害剤単独を用いて心臓保護の同じ度合いを達成するのに必要とされる量の５分の１である。組み合わせ治療法の相乗的な効果が免疫抑制に適用可能である。
【００３７】
心臓肥大の治療
毎年５０万人以上ものアメリカ人が心不全であると診断されており、その約半分がその症状により死亡する。心臓異常の原因は多様であるが、大部分のケースに至る一般的な因子は種々の遺伝因子と環境因子に応じて心臓が進行的に拡張することである。拡張は保護的な反応として始まるが、最終的に鬱血性の心不全と不整脈とを引き起こす状態にまで進行する。ＦＫ５０６は動物における心臓肥大の開始と影響とを抑制するために用いられてきた。しかしながらこの薬物が、肥大を抑制するのに必要とされる用量で持続的に使用されることは有害であり、日常的にヒトが使用するにはふさわしくない。ＦＫ５０６によって影響を受ける生物学的な経路はまた、ギンゴライド類にも反応する。したがって本発明の組成物及び方法は、イムノフィリン結合性化合物またはカルシニューリン単独の心臓保護作用に比較して心臓保護作用が改善されている点で有用である。
【００３８】
ギンゴライドＥＧｂ７６１とＦＫ５０６との組み合わせは、ＦＫ５０６単独よりも５分の１のＦＫ５０６の量で心臓肥大を阻害することが判明した。同時投与戦略は心臓肥大を最小にするとともに、虚血／再灌流が関連する不整脈の発生率を減少させる。
【００３９】
毒性を減少させた、免疫抑制及び心臓保護作用の組成物
本明細書に記載の組成物は、カルシニューリン阻害剤（「ＴＯＲ」阻害性化合物としても知られている）と、ギンゴ抽出物であるＥＧｂ７６１の一種またはそれ以上の成分との組み合わせ作用に基づいている。
【００４０】
カルシニューリン阻害物質に、ギンゴライド誘導性のＰＡＦＲ拮抗剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、または抗酸化剤をプラスして臨床的に投与すると、臓器移植後の動物に望まれる免疫抑制効果を達成するのに必要とされるカルシニューリン阻害剤の投与量が減少できる。カルシニューリン阻害物質に、ギンゴライド誘導性のＰＡＦＲ拮抗剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、または抗酸化剤をプラスして臨床的に投与することはまた、免疫抑制を仲介する同じカルシウム依存性のシグナル経路によって哺乳動物の心機能に良い影響を与える。共通の生化学的な経路が移植の拒絶反応及び心不全の臨床的な状態の根底にある。Ｔリンパ球または心筋細胞のいずれかにおいてカルシウムが増加すると、それぞれホスファターゼカルシニューリンのカルモジュリン依存性活性化を引き起こす。カルシニューリンが活性化すると結果的に、あるクラスの転写因子前駆体、ＮＦＡＴｎがプロセシングされ、それは後に核に転位する。Ｔリンパ球においてこれらの因子は免疫の活性化と最終的な移植拒絶反応とを結果的に引き起こす遺伝子を発現させる。心臓組織ではＮＦＡＴｎ因子は、結果的に心不全を起こさせる細胞変化を引き起こす。
【００４１】
血小板活性化因子（ＰＦＡ）／カルシウム／カルシニューリン依存性保護作用
カルシニューリンに対するカルシウムの利用可能性は、イチョウの一種またはそれ以上のサブ成分（例えばＥＧｂ７６１）とともにカルシニューリン阻害剤を用いて被検者を補充治療することによって減少する。ギンゴライドはＰＡＦという強力な生物活性リン脂質のための受容体に対する拮抗剤として作用する。ＰＡＦＲは、ＰＡＦが結合した場合、細胞内のカルシウムの増加を引き起こすシグナル経路を活性化する。ギンゴライド化合物は細胞質のカルシウムがＰＡＦの仲介で増加することを阻害し、それによってＦＫ５０６またはＣｓＡのようなカルシニューリン阻害剤によるカルシニューリン阻害を増強させる。ギンゴライドが低毒性であるため、ほとんどまたは全く副作用を伴わない免疫抑制作用（即ち心臓保護作用）を得るために必要とされるカルシニューリン阻害剤の用量を実質的に減少させる用量でギンゴライドを投与すればよい。
【００４２】
ＰＡＦ／ＣＯＸ−２が仲介する作用の抑制
ＰＡＦは炎症性の損傷に関わるＣＯＸ−２（誘導性のプロスタグランジン合成酵素）の転写を刺激する。いかなる組織の虚血もＰＡＦ過剰産生を促進する。ＰＡＦ活性は、ギンゴライドＢＮ５０７３０を用いて遮断される。
【００４３】
抗酸化剤が仲介する保護作用
本明細書に記載のデータは、心臓の再灌流誘導性不整脈がフリーラジカルの存在に依存することを示している。不整脈は抗酸化性酵素またはギンゴライド（例えば、ＥＧｂ７６１）のいずれかを投与することによって減少した。正常の心臓機能は、イオン種の分離された違いを維持するという細胞膜の能力に依存している。再灌流障害で生成したフリーラジカルは膜の成分と反応するため、イオン分離の完全性を喪失させることになり、不整脈や他の病原的な作用を起こすに至る。抗酸化剤により、重要なイオン種の区画化を維持するという心臓膜の能力について心臓膜は安定化する。イチョウ（例えば、ＥＧｂ７６１のテルペン成分）の抗酸化性の性質は心臓保護効果を有している。ＥＧｂ７６１の抗酸化剤はまた、フリーラジカルの捕捉剤として作用することによる免疫抑制性も備えていて、それによって同種移植片に関連した炎症性損傷の程度を軽減させる。
【００４４】
ギンゴライドの生物学的利用可能性を増加させることによる薬学的作用の増幅
ＥＧｂ７６１は、ギンゴフラボノールグリコシド類を２４％、ギンゴライドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｊ及びビロバライドのようなテルペンラクトン類を６％（２４／６）で含む、イチョウの乾燥葉の標準的な抽出物である。ＰＡＦＲ拮抗剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、及び抗酸化作用のＥＧｂ７６１は、単独で、またはカルシニューリン阻害剤と組み合わせた場合に臨床的な恩恵を与える。例えば免疫抑制化合物には、カルシニューリン阻害剤を、２７％のギンゴフラボノールグリコシド類、７％のテルペンラクトン類（２７／７）の比率でギンゴライドＢが富化されたイチョウの抽出物がともに含まれる。この組成物のギンゴライド部分の調製方法は、例えばリ（Ｌｉ）らの１９９７、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ． ６３ （６）： ５６３−５の方法のように当技術分野で既知である。
【００４５】
カルシニューリン阻害剤とギンゴライドの同時投与が移植後の問題点の改善をもたらす
カルシニューリン阻害剤である例えばＦＫ５０６は、ＥＧｂ７６１と共同作用的に働くことによって心臓保護作用を仲介できることがわかった。同様の機構は移植後の免疫抑制作用も仲介する。イチョウの免疫学的効果を評価した。その結果は、例えばＥＧｂ７６１等のギンゴライドが活性培養物においてＣＤ２５及びＣＤ５４を抑制することにより明らかにされたようにＴリンパ球の活性化の減少を引き起こすことを示している。ギンゴライドＢＮ５２０２１は抗炎症効果を示すことが判明した。抗炎症効果の機構は、シクロスポリンＡの免疫抑制機構とは異なっている。その結果は、イムノフィリン結合性免疫抑制剤とギンゴライドを組み合わせ投与すると、付随して起こる毒性の増加を起こさずに、効果的な免疫抑制作用の増加がもたらされることを示している。同時投与戦略は、移植の拒絶反応を含む炎症性疾患を治療するために用いられる。
【００４６】
免疫抑制の機構
本明細書に記載の免疫抑制作用及び心臓保護作用のための組成物は、（１）カルシニューリン阻害剤、（２）ＰＡＦＲ受容体阻害剤、（３）細胞膜安定化剤、及び（４）酸素のフリーラジカル捕捉剤を含む。カルシニューリン阻害作用は、結果的にＴ細胞活性化を抑制したり、または別の場合では心臓の病状発生を抑制する。ギンゴライド成分によってＰＡＦＲを阻害すると、結果的に細胞内のカルシウム利用可能性を低下させることになり、Ｔ細胞活性化を抑制したり、または別の場合では心臓の病状発生を抑制する。ギンゴライド抗酸化剤によって心臓膜を安定化させると、結果的にイオン種の区画化を改善し、かつ心臓の病状発生を抑制することになる。ギンゴライド抗酸化剤は、移植拒絶反応の病状に関連して炎症性白血球により放出された酸素ラジカルを捕捉し、炎症障害を軽減する。
【００４７】
治療的投与
この結果は、イムノフィリン結合性免疫抑制剤（例えばカルシニューリン阻害剤）とギンゴライドとの組み合わせは、移植の拒絶反応の阻害、心臓肥大の治療、及び自己免疫疾患の治療に有用であることを示している。この組成物は、液状の溶液剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、ポリマー製のマイクロカプセルまたは微小胞、リポソーム、及び注射用または注入用の溶液等の治療用組成物に製剤される。好ましい形態は、投与形態及び標的とされる特定の適応症に依存している。この組成物にはまた、薬学的に許容される媒質または担体も含まれる。適当な媒質は例えば水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びその組み合わせである。このような組成物を調製するための実際的な方法は当業者に既知である（例えば、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１８版、１９９０）。
【００４８】
この組成物は、静脈内、腹腔内、経口または皮下投与といった通常の供給形態を用いて投与される。全身性投与だけでなくその組成物は、例えば同種移植した組織の部位または炎症を起こした部位に局所的に投与される。
【００４９】
イムノフィリン結合性免疫抑制剤は当技術分野で既知の方法によって投与される。治療的に有効な用量が知られている。例えば移植の拒絶反応を抑制するためにＦＫ５０６を用いて治療する場合には、全血レベルが０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌ（例えば、５−２０ｎｇ／ｍｌ）の治療範囲に維持できるように誘導される。これは、移植後の体重１ｋｇあたり約０．１〜５．０ｍｇの範囲のＦＫ５０６で、ある種類の患者では用量を０．７６ｍｇ／ｋｇほどの低量にまで減らして投与することによって達成される。ほとんどの患者に対して低用量（０．１ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下）と同程度でこの薬物を用いて治療することは、１０ｎｇ／ｍｌ位の血中レベル、即ち治療した患者の＞７０％が結果的に１年以上移植片が生存する結果を生じる血中レベルに維持するのに有効である。低用量であるにもかかわらずＦＫ５０６は、有意の少数の患者において高血圧、震え、糖尿病、下痢及び腎毒性を含む慢性の副作用を生じさせる。重篤な急性のＧＶＨＤに陥っている患者は、比例して重篤な副作用を伴うのであるが、結果的に２５〜３５ｎｇ／ｍｌ程度の高い血漿濃度になるような、ＦＫ５０６の連続的な静脈内注入を長期間にわたって必要とする場合がよくある。本発明はギンゴライドを同時投与することによってＦＫ５０６またはＣｓＡの有効用量を減少させるという利点を提供する。薬物を組み合わせると、ＣｓＡの仲介による効果が増大し（一方毒性は減少する）、毒性の副作用の比例的な軽減を伴いつつ、ＦＫ５０６の用量を現在処方されている３〜５分の１にまで減少させる。イムノフィリン結合性薬物の（及びギンゴライドの）用量は、疾患の重症度及び経過、患者の健康及び治療に対する反応性、並びに治療を行う医者の判断に応じて変化する。
【００５０】
ギンゴライド及びカルシニューリン阻害剤（またはラパマイシン組成物）は同時または連続的に投与される。例えばカルシニューリン阻害剤は、０．１〜１２．０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．５〜６．０ｍｇ／ｋｇ／日、及びさらに好ましくは約１．０〜３．０ｍｇ／ｋｇ／日という用量で投与される。選択された用量が一日に１〜６回、免疫抑制を行う必要のある哺乳動物に投与され、投与は、局所、経口、直腸、注射、または連続的な注入である。ヒトに投与する際の経口投与の一回量は、好ましくは０．１〜５００ｍｇのそれぞれの活性化合物を含む。低用量のカルシニューリン阻害剤を用いた経口投与が好ましい。より高い用量での非経口投与も利用できる。
【００５１】
ギンゴライド組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ／日〜６０ｍｇ／ｋｇ／日）。投与経路は、カルシニューリン阻害剤のようなイムノフィリン結合性化合物に対して用いられる経路と同等である。
【００５２】
この組成物は同種移植片を移植する前または後に投与される。選択的に、この同種移植組織は免疫抑制性組成物の溶液に浸漬し、及び／またはその組織はそのような溶液で灌流する。この方法は、同種細胞または実質臓器である例えば心臓、肺、心肺複合、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚または腸の移植物の受容者、並びに急性の拒絶反応；例えば外来移植の拒絶反応が関わる超急性の拒絶反応；及び例えば移植血管疾患が関わる慢性の拒絶反応が生じているか、またはそのリスクを有する者を治療する際に有用である。この組成物は、例えば骨髄移植の後で発症する可能性のある移植対宿主疾患の発症を治療したり、阻止するために用いられる。
【００５３】
免疫抑制性組成物は、自己免疫疾患並びに喘息、関節炎（例えば慢性関節リウマチ、慢性関節炎プログレジエント（ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）及び変形関節炎）、及びリウマチ性疾患等の炎症性症状の治療または抑制に用いられる。本発明の組成物を用いうる特定の自己免疫疾患には、血液学的な自己免疫疾患（例えば溶血性貧血、再生不良性貧血、赤血球性貧血及び突発性血小板減少症）、全身性紅斑性狼瘡、多発性軟骨症、浮腫性硬化症、ヴェグナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症性筋無力症、乾癬、スチーブン−ジョンソン症候群、突発性スプルー、自己免疫炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、内分泌性眼病、グラーブス病、類肉腫症、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、角結膜炎及び春季角結膜炎、間質性肺繊維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎（例えば突発性ネフローゼ症候群または最小変化腎症を含むネフローゼ症候群を伴う場合及び伴わない場合）並びに若年性皮膚筋炎が含まれる。
【００５４】
治療すべき個体には、ヒトと、チンパンジー並びに他の類人猿およびサル種；畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマのような家畜動物；イヌ及びネコのような愛玩動物；マウス、ラット、モルモットのような齧歯類を含む実験動物等の非ヒトの霊長類とを含む哺乳類綱のいずれかの個体が含まれる。好ましくは哺乳動物はラットのような齧歯類ではない。この組成物及び方法は、哺乳動物の成体、新生児及び胎児の治療に適している。治療には、不都合な臨床症状（例えば移植の拒絶反応）の抑制と、疾患の症状または不都合な臨床的状態の軽減または排除が含まれる。免疫抑制性組成物とは望ましくない免疫応答を抑制したりまたは阻止したりする、例えば移植臓器の免疫系拒絶反応を抑制する何らかの組成物のことを意味する。好ましくはこの組成物はＴ細胞の活性度を低下させる。
【００５５】
本明細書に記載の組み合わせ薬物治療法は、イムノフィリン結合性免疫抑制剤（例えば、ＣｓＡ、ＦＫ５０６、またはラパマイシン）、及びＰＡＦＲ拮抗活性と抗酸化活性とを含むギンゴライド組成物を用いる。好ましくはギンゴライド組成物は、ＧＭのような一つの成分単独ではなく、例えばＧＢ、ＧＣ、ＧＪ、またはＧＭといったイチョウの抗酸化性分の少なくとも二種を含む。例えばギンゴライド組成物は、ＰＡＦＲ拮抗活性を有する成分の他にイチョウの数種の抗酸化成分を含むＥＧｂ７６１である。ＥＧｂ７６１は植物の葉によって産生される全種類の抗酸化剤とＰＡＦＲ拮抗剤とを含む。免疫損傷から臓器を保護する場合、ＥＧｂ７６１は高度合に膜を安定化（酸素ラジカル吸収に起因する）し、その結果イオン流（特にカルシウム）の調節が改善され、フリーラジカルの仲介による組織損傷がＢＮ５２０１が唯一のギンゴライド成分である場合に予測されるよりも小さくなる。ギンゴライドの一つであるＧＢ（ＢＮ５２０１）はＣｓＡによって誘導される腎機能の変化を最小にすることがわかっており、ここでの組成物と方法は、ギンゴライド組成物が免疫抑制する（例えばＴ細胞の活性化を阻害する）用量で投与される現存する方法とは識別される。
【００５６】
実施例１：
ＥＧｂ７６１によるＴ細胞活性化の抑制
ＢＮ５２０２１の免疫抑制活性をＣｓＡの免疫抑制活性と比較した。ＢＮ５２０２１はＥＧｂ７６１の成分である。ＢＮ５２０２１はＰＡＦＲ拮抗活性を持っている。ＢＮ５２０２１について免疫調節作用を調べ、ＥＧｂ７６１で刺激したヒトＰＢＭＣにおけるインビトロでの免疫応答パラメータをＰＨＡまたはＰＭＡ／Ｉのような陽性の対照の刺激物と比較した。ＢＮ５２０１をＰＢＭＣ培養物の非接着性画分（即ち、主にＴ及びＢリンパ球）とともにインキュベートした。
【００５７】
２×１０６個のヒトＰＢＭＣの培養物を静脈血から単離し、５０μｇ／ｍｌのＰＨＡ、または５０μｇ／ｍｌのＰＨＡに５０μｇ／ｍｌもしくは１００μｇ／ｍｌのいずれかのＥＧｂ７６１（イチョウ抽出物）をプラスした培地を用いて２４時間刺激した。ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）及びＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）の誘導は、それぞれの培養物の細胞分画において、それぞれの抗原に特異的なフルオロフォアを複合化したモノクローナル抗体とともにインキュベートし、さらにアイソタイプの対照でも行い、続いてそれぞれのマーカーの発現についてフローサイトメトリー分析を行うことによって測定した。結果は、ＣＤ２５またはＣＤ５４のいずれかに対する陽性の細胞を割合（％）として示し、それぞれの測定値は、５人の研究協力者から得られた値の平均±ＳＥである。
【００５８】
【表１】インビトロにおいて末梢血の単核細胞によるリンパ球表面活性抗原ＣＤ２５及びＣＤ５４のＰＨＡ誘導性発現に対するＥＧｂ７６１の効果
2004510694.tif 000002
＠ ｐ＝０．０５８　刺激されたＰＨＡに対して
＊　  ｐ＝０．０１８　刺激されたＰＨＡに対して
＊＊　ｐ＝０．０１２　刺激されたＰＨＡに対して
【００５９】
実施例２：
ギンゴライド及びカルシニューリン阻害剤を用いた、喘息に対する組み合わせ治療法
喘息患者由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインビトロでの活性化反応に対するギンゴライドＢ（ＢＮ５２０２１）の効果を測定した。例えば活性化に関連する細胞表面抗原の２チャンネル式フローサイトメトリー分析、またはＥＬＩＳＡアッセイ法等の標準的な方法を、Ｔ１またはＴ２の免疫学的活性化が起こる際にＰＢＭＣによって発現することが知られているサイトカインを検出するために用いた。ＢＮ５２０２１はイチョウの抗炎症性抽出物であって治療的に用いられてきた。ＢＮ５２０２１は喘息の病因論で重要なＰＡＦを阻害する。本明細書に記載のデータは、ギンゴライドが喘息患者の病的な免疫活性化を阻害するためにＣｓＡと共同作用することを示している。
【００６０】
喘息患者のＰＢＭＣの活性化に対する、ＢＮ５２０２１及びＣｓＡ（それぞれ１μＭ／Ｌ）の阻害作用を測定した。この細胞をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とカルシウムイオノホア（ＩＯＭ）によって刺激し、ギンゴライド及び／またはＣｓＡと接触させた。ＢＮ５２０２１によるサイトカインＩＬ−４及びＩＬ−５産生の阻害は、ＣｓＡと比較してわずかであった。しかしながら、ＢＮ５２０２１は活性化が関連するＣＤ４５ＲＡの発現の増加を有意に逆転させ、ＨＬＡ−ＤＲの発現が減少する傾向を伴っていた。リンパ球の活性化マーカーはＣｓＡによって有意に変化しなかった。ギンゴライドの免疫抑制機構はカルシニューリン阻害剤とは異なり、ギンゴライトとカルシニューリン阻害剤とを同時投与すると結果的には少なくとも相加的な免疫抑制作用が引き起こされる。ある場合にはその効果は相乗的である。
【００６１】
患者
この研究のための被検者には、４人の男性と５人の女性で、年齢範囲が１９才〜３２才（平均２６±１．７２）のアトピー性喘息と診断された９人のクエート人の患者が含まれていた。疾患の持続期間は２年〜１５年であった。アトピーは、２０種に及ぶアレルゲンに対して行った一回またはそれ以上の陽性皮膚刺針試験に基づいて明らかにした。血液採集の前の少なくとも６週間の間に全身性の治療を受けた患者はいなかった。平均的な血清ＩｇＥは３５０（１７２−５２０）ＩＵ／ｍｌであった。
【００６２】
細胞培養物
午前９時〜１０時に静脈血を、ＥＤＴＡを含むポリエチレン管中に収集した。ＰＢＭＣをフィコール・パック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心分離法によって分離した。細胞を洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に２×１０６細胞／ｍｌで懸濁した。ＰＢＭＣを２０ｎＭのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）及び１μＭのイノマイシン（ＩＯＭ）（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． ＣＡ、ＵＳＡ）で刺激した。この細胞を２４時間後に回収し、上清は使用するまで−７０℃で凍結した。ＣｓＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＢＮ５２０２１（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＣＡ、ＵＳＡ）（それぞれ１μＭ）を培養の開始時に添加した。この濃度が結果的にＣｓＡによるＩＬ−５の発現の完全な抑制をもたらす。ＢＮ５２０２１については、１×１０−９Ｍ〜１×１０−４Ｍで用いられた。試験した患者の３人において１×１０−５Ｍ及び１×１０−７Ｍを用いた場合リンパ球の活性化マーカーに変化は起こらなかった。このデータに基づいて、有意の変化を生成する用量である１×１０−６Ｍの用量が以下の実験で用いられた。
【００６３】
サイトカイン発現アッセイ法
培養物の上清に含まれるサイトカイン発現（ＩＬ−４及びＩＬ−５）を、酵素結合性免疫吸着アッセイ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）によって評価した。検出範囲はそれぞれ１０〜４００ｐｇ／ｍｌ及び７．８〜５００ｐｇ／ｍｌであった。上清のサイトカイン濃度に比例する比色定量分析の変化は、モデル２５５０ ＥＩＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。すべてのアッセイ法は二重に行った。
【００６４】
フローサイトメトリー分析
二色のフローサイトメトリーは、コールターエピックスプロフィールＩＩ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＩＩ）フローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、ＵＳＡ）を用いて行った。対象の抗原を検出するために用いたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に対するアイソタイプの対照をそれぞれの細胞に設けた。特異的表面抗原を発現する細胞についての陽性の分析領域をアイソタイプの対照に照らして示し、フルオロフォア結合ｍＡｂの特異的結合を標準法に従ってサイトフルオログラフィーによって分析した。リンパ球の亜集団は、前方と側方の分散プロットの位置によって同定し、ライブゲートをかけた。アイソタイプが適合した抗体は、非特異的蛍光のための対照に用いられる。喘息患者由来の抹消血単核細胞は、フルオロフォアを結合した非特異的抗体、即ち特定のアッセイ法で用いられる抗体と鎖が適合する非特異的抗体を用いて標識した。アッセイ法で用いた抗体についてのバックグラウンドの値は、非特異的抗体の蛍光に基づいていた。ヒトＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５４、ＨＬＡ−ＤＲに対して特異的なモノクローナル抗体は、Ｄａｋｉｐａｔｔｓ、Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋより購入した。それぞれの抗原の発現は、特定の表面マーカーに対する陽性な細胞の割合（％）に標準偏差をプラスまたはマイナスして示している。
【００６５】
統計的分析
統計的分析は独立ｔ検定を用いて行った。すべての統計的分析は、ウインドウズ統計パッケージ用のＳＰＳＳ（Ｎｏｒｕｓｉｓ／ＳＰＳＳ， Ｉｎｃ．）を用いて行った。ｐ＜０．０５という値は統計上有意であると考えられる。
【００６６】
サイトカインの発現に対するＣｓＡ及びＢＮ５２０２１の効果
図１及び表２は、それぞれの刺激条件下で細胞により産生された培養物上清中のサイトカインレベルを示している。ＰＢＭＣをＰＭＡ及びＩＯＭで処理すると、すべての被検者から抽出された細胞によるサイトカインの発現は有意に増加するよう誘導され、最終的に結果を平均するとＩＬ−４の発現が約３倍に増加する（ｐ＝０．０１３）とともに、ＩＬ−５の増加が約４倍になった（ｐ＝０．０００５）。ＰＭＡ／ＩＯＭ−刺激した培養物におけるＣｓＡの割合（％）から、両方のサイトカインの発現が抑制されることが認められた（ＩＬ−４及びＩＬ−５に対してそれぞれｐ＝０．００８及びｐ＝０．０００５）。対照的にＢＮ５２０２１では、いずれかのサイトカインの発現に対して統計上有意な効果は得られなかった。
【００６７】
表２に示されたデータは、静脈血から単離され、培地、即ち２０ｎＭのＰＭＡ＋１．０μＭのイノマイシン（ＰＭＡ／Ｉ）、１．０μＭのシクロスポリンＡ＋ＰＭＡ／ＩＯＭ、または１μＭのギンゴライドＢＮ５２０２１＋ＰＭＡを用いて２４時間刺激された２×１０６個のヒトＰＢＭＣの培養物を用いて得られた。インターロイキン４及び５の発現は、ＰＢＭＣの培養物上清で抗体捕捉ＥＬＩＳＡによって測定した。対象の表面抗原の誘導は、それぞれの培養物の細胞画分においてＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５４及びＨＬＡ−ＤＲに特異的なフルオロフォア結合モノクローナル抗体とともにアイソタイプの対照を加えてインキュベートし、続いてそれぞれのマーカーの発現についてフローサイトメトリー分析を行うことによって測定した。サイトカイン分析の結果はｐｇ／ｍｌ＋／−標準偏差（ＳＥ）で得られており、またリンパ球の表面マーカーの発現は特定の表面マーカーに対してポジティブな細胞の％＋／−ＳＥで報告された。
【００６８】
【表２】末梢血単核細胞によるＩＬ−４及びＩＬ−５の発現及び喘息患者におけるリンパ球表面抗原の発現
2004510694.tif 000003
￥　　 ｐ＝０．０１３　　非刺激の細胞に対する
￥￥￥　 ｐ＝０．０００５　 非刺激の細胞に対する
＊　　 ｐ＝０．０４２　　ＰＭＡ／ＩＯＭ処理した培養物に対する
＊＊　　ｐ＝０．００８　　ＰＭＡ／ＩＯＭ処理した培養物に対する
＊＊＊　 ｐ＝０．０００５　 ＰＭＡ／ＩＯＭ処理した培養物に対する
¶　　ｐ＝０．０６７　　ＰＭＡ／ＩＯＭ処理した培養物に対する
【００６９】
リンパ球活性マーカーの発現に対するシクロスポリンＡ及びＢＮ５２０２１の効果
図２及び表２において示されたように、ＰＭＡ／ＩＯＭを用いて培養物を刺激すると結果的に、非刺激の対照に対してＣＤ２５、ＣＤ５４及びＨＬＡ−ＤＲの発現が増加するが、これに対してＣＤ４５は影響されなかった。それにもかかわらずこの試薬に対する個々の応答は異なり、９人の被検者のうちの４人から得られた細胞はＣＤ２５及びＨＬＡ−ＤＲの上方制御が応答し、３人の被検者から得られた細胞ではＣＤ２５またはＨＬＡ−ＤＲのいずれかの画分に及んで示されたが、ＰＭＡ／ＩＯＭを用いて処理した場合ではどちらにも起こらず、２人の被検者から得られた細胞はＰＭＡ／ＩＯＭに応答してＣＤ２５またはＨＬＡ−ＤＲのいずれかの上方制御が欠けていた。しかしながら細胞の活性化は、ＰＭＡ／ＩＯＭで刺激した培養物すべてについて芽細胞が実質的に大きく増殖することによって確認された。これらの結果により、ＰＭＡ／ＩＯＭは各変化に対する実証された陽性対照刺激であることが示される。ＣｓＡは、細胞表面の活性化抗原の発現に変化を引き起こさなかった。ＢＮ５２０２１を用いて処理した細胞におけるＣＤ２５及びＣＤ５４の発現は影響されなかったが、ＣＤ４５ＲＡの発現はＢＮ５２０２１で有意に（ｐ＝０．０４２）減少し、またＨＬＡ−ＤＲの発現を減少させる傾向（ｐ＝０．０６７）が示された。
【００７０】
ＣｓＡに比較してＢＮ５２０２１では、ＰＭＡ及びイノマイシンを用いて刺激した喘息患者からのＰＢＭＣによるサイトカインの産生及び表面抗原の発現に対して異なる作用を示した。ＣｓＡではＩＬ−４及びＩＬ−５の産生が完全に阻害されるが、これに対してＢＮ５２０２１ではほとんど効果がなかった。ＣｓＡでなくＢＮ５２０２１はＣＤ４５ＲＡを有意に減少させ、そしてＨＬＡ−ＤＲの発現を減少させる傾向を示した。ＣＤ２５、ＣＤ５４は、いずれかの試薬を用いても有意に変化しなかった。ＩＬ−４及びＩＬ−５の発現に対するＣｓＡの充分な作用は、カルシニューリンの直接的阻害によって仲介される。ＢＮ５２０２１は、ＩＬ−４及びＩＬ−５のカルモジュリン／カルシニューリン依存性の発現を効率的に抑制することはできないが、対照的にＣＤ４５ＲＡの発現を抑制し、またはどちらの場合でもＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の頻度は非刺激の細胞についての値よりも減少することが明らかになった。この効果はＣｓＡでは見られなかった。ギンゴライドのＰＡＦＲ拮抗作用は、ＩＬ−４及びＩＬ−５の連続的な産生が可能になるようにカルシニューリンが実質的に阻害されるレベルにまで細胞内カルシウムを減少させることができなかった。この化合物が細胞の活性化に対して作用を及ぼす経路は、ＣｓＡ感受性経路、特に細胞表面抗原の発現に対する広範な対照的な作用を後に誘導するような経路とは異なる。
【００７１】
強力なＰＡＦ受容体拮抗剤であるＢＮ５２０２１は、ＰＡＦによって仲介される喘息の病因の局面に対して有効な臨床的作用を持つことがわかった。リンパ球が活性化する際に表面抗原の発現を調節する機構は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の選択的排除によるか、またはＣＤ４５ＲＯ＋リンパ球側に平衡化するようシフトすることによるらしい。リンパ球活性化のある状態は、ＣＤ４５ＲＯとＲＡとの二重発現性が高くなることと関連し、ＲＡ発現の減少による抑制的な免疫調節効果が示される可能性がある。アトピー性喘息で増加した循環するＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞は遷移的な細胞表現型であり、それは最終的に病原性のＴ細胞に至る。このデータは、ＣＤ４５ＲＡ及びＨＬＡ−ＤＲの阻害によって、ＢＮ５２０２１がこれらの細胞の発生を抑制し、臨床的な利点を発揮することを示している。
【００７２】
非常にわずかな毒性しかギンゴライドには関与しておらず、これらの化合物に応答して報告された有害な免疫作用はない。このクラスの免疫抑制性試薬は、喘息のような炎症性の疾患、ＰＡＦの発現及びフリーラジカルの生成が関与する免疫学的過程によって実質的な組織損傷の起きている疾患を治療するために、単独で用いたり、他の免疫抑制剤と組み合わせて用いたりされる。
【００７３】
ＢＮ５２０２１は喘息患者のリンパ球の活性化を調節する。それぞれの刺激条件の反応をグループ分けして考察すると、このデータは、ギンゴライドＢＮ５２０２１がシクロスポリンの方式とは異なる方式で喘息患者から得られる白血球の免疫学的作用を阻害することを示している。これらのデータは、このクラスの薬物がＴ細胞活性を阻害したり、またはＣｓＡ及び他のカルシニューリン阻害剤によって仲介されるＴ細胞活性の阻害を増強するために有用であることを示している。
【００７４】
実施例３：
カルシニューリン阻害剤及びギンゴライドの心臓保護作用
悪性の心室性不整脈は、突然の心臓死を引き起こすことが多く、特に持続性の狭心症によって特徴づけられる場合に心臓疾患の二次的な虚血後の再灌流障害の結果として起こること、および血管形成術、伏在静脈のバイパス移植術、冠状動静脈の痙攣の緩和、及び血栓治療を含む何らかの臨床的な介入を行った結果として起こることが観察されている。虚血後の再灌流の際に心筋層に放出されたフリーラジカルは、不整脈の発生および心臓機能の障害に関わる重要な誘因である。心臓の機能不全及び不整脈はまた、高血圧、内分泌性の疾患及び遺伝的な突然変異に引き続いて発生する心筋肥大症の結果としても起こる可能性がある。心臓筋肉細胞による肥大性の応答の発生の一因となるそれぞれの因子は、細胞内のカルシウムレベルの増加を引き起こすことがわかる。この増加によって、結果的に転写因子ＮＦＡＴ３の細胞質前駆体に対して作用することによって核内への転位が可能になるカルシニューリンのカルモジュリン依存的活性化が起こり、そこで心臓制限的なジンクフィンガー転写因子ＧＡＴＡ４と相互作用して最終的に心臓肥大が起こる。
【００７５】
イムノフィリン結合性の免疫抑制剤とギンゴライドが投与されると結果として相乗的な心臓保護作用が起こる。カルシニューリン阻害剤であるＦＫ５０６、ＰＡＦ拮抗剤であってフリーラジカル捕捉剤であるイチョウ抽出物のＥＧｂ７６１、及びそれらの組み合わせの、再灌流誘導性の心室細動（ＶＦ）、心室性頻脈（ＶＴ）及び心臓機能の回復に対する作用は、単離したラットの心臓において３０分間の大規模な虚血を起こした後、２時間までの再灌流を行って研究した。第１番目の一連の研究では、ラットに対し、一日あたりの用量（経口）が０、１、５、１０、２０または４０ｍｇ／ｋｇ／日のＦＫ５０６を１０日間投与した。ＦＫ５０６は用量依存的に、再灌流誘導性の総（不可逆性と可逆性の）ＶＦ発生率を、非治療の動物では９２％という値だが、それぞれ１〜４０ｍｇ／ｋｇ／日の用量において９２％（ＮＳ）、８３％（ＮＳ）、６７％（ＮＳ）、３３％（ｐ＜０．０５）、及び２５％（ｐ＜０．０５）にまで減少させ、それは同じパターンを示すＶＴ発生率に対する作用も伴っていた。２０ｍｇ／ｋｇ／日と４０ｍｇ／ｋｇ／日の間のＦＫ５０６はまた、虚血後の心臓機能の有意な回復も引き起こした。第２番目の一連の研究では、ラットをＥＧｂ７６１単独で、またはＦＫ５０６と組み合わせて処理した。一方、不整脈の有意な減少及び心臓機能の改善はＥＧｂ７６１を２５ｍｇ／ｋｇ／日で単独で介入させても得られなかったが、これに対して２５ｍｇ／ｋｇ／日のＥＧｂ７６１と１ｍｇ／ｋｇ／日または５ｍｇ／ｋｇ／日のＦＫ５０６とを組み合わせて処理すると結果的に、非処理の対照動物に対して９２％と９２％だった総ＶＦと不可逆性のＶＦが、それぞれ４２％（ｐ＜０．０５）と３３％（ｐ＜０．０５）、２５％（ｐ＜０．０５）と８％（ｐ＜０．０５）にまで減少し、それはＶＴ発生率で見られ、かつ虚血後の心臓機能に有意な改善によって達成される類似の作用と平行して起こる。この結果は、ＦＫ５０６の心臓保護的な特徴を証明しており、ＦＫ５０６にＥＧｂ７６１を加えて用いる組み合わせ治療によれば、再灌流誘導性のＶＦ及びＶＴの発生率を減少させつつ虚血後の心臓機能を相乗的に改善することを示している。ＦＫ５０６及びギンゴライドの相乗的な作用があるため、移植受容者及び自己免疫疾患にかかっている人に対し、現在用いられているよりも低用量のＦＫ５０６で免疫抑制を行えるだけでなく、心臓保護作用に対してもＦＫ５０６を用いた治療が可能になる。
【００７６】
動物
雄のスプレーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットをすべての研究で用いた。
【００７７】
摘出した作動中の心臓の準備
ラットは腹腔内のペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ体重）と、続いて静脈内投与されたヘパリン（５００ＩＵ／ｋｇ）を用いて麻酔した。開胸手術を行ってから心臓を摘出し、氷冷した灌流緩衝液に入れた。準備直後、大動脈にカニューレを挿入し、そしてその心臓を、１００ｃｍの水に等価な一定の灌流圧（１０ｋＰａ）で５分間洗浄するランゲンドルフ法に従って灌流した。この灌流培地は、修飾されたクレブス−ヘンセライト（Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ）炭酸水素緩衝液：１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．７ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．３６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、及び１０ｍＭのグルコースからなる。左心房にカニューレを挿入し、ランゲンドルフシステムを１７ｃｍの緩衝液からなる左心房充填圧力（１．７ｋＰａ）、及び１００ｃｍの緩衝液からなる動脈の後富化圧力（１０ｋＰａ）を用いた作動方式に切り替えた。目盛りを定めたロタメーターによって動脈流を測定し、冠状動脈の流速を、心臓から滴下する冠状動脈の灌流液を経時的に採集することによって測定した。
【００７８】
虚血及び再灌流の誘導
心臓に１０分の好気性灌流を行った後、心室への流入経路と大動脈への流出経路を動脈カニューレの元に近い点で締め付けた。再灌流は、心室への流入経路と大動脈への流出経路の締め付けをはずすことによって開始した。大規模な虚血の間に心筋が乾燥してしまうのを抑えるために、サーモスタット式のガラスカバー（その中に心臓を浮遊させる）で覆い、湿度を一定レベル（９０％〜９５％）に維持した。
【００７９】
測定される指標
心外膜のＥＣＧは、二個の銀電極を心臓に直接的に取り付け、実験を行う間中ポリグラフによって記録した。ＥＣＧは心室細動（ＶＦ）及び心室性頻脈（ＶＴ）の発生率並びに、ＶＦが非持続性（自発的に調節律動を取り戻す）であるか、または持続性（最初の３分間の再灌流の間持続する）であるかを検出することによって分析した。３分後、心室細動（持続性ＶＦ）が起きた後で心臓の細動を止め、心筋機能を記録した。不規則な波形のベースラインがＥＣＧ上に現れれば心臓はＶＦを起こしていると考えられた。ＶＴは、５回またはそれ以上の連続的で未熟な心室性の複合状態として定義され、そしてこの分類は、急速ＶＴと区別することが困難な反復性の単一ＶＴを含んでいた。それぞれの例ではＶＴは自然に洞律動またはＶＦに切り替わるため、ＶＴは非持続性であると考えられた。規則正しい律動において正常の洞複合状態がＥＣＧ上に出現した場合、心臓は洞律動であると考察された。虚血前及び再灌流の間の心臓速度（ＨＲ）、冠状動脈の流れ（ＣＦ）及び大動脈流（ＡＦ）の速度を記録した。左心室の最大血圧と最後の最小血圧との間の差として定義される左心室で発生した圧力（ＬＶＤＰ）、及びＬＶＤＰの一次微分係数（＋ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ）も、左心房と僧帽弁を左心室に挿入することによって記録した（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｒｉａ、ＵＫ）。
【００８０】
実験時間の経過
この第１の一連の研究では、ラット（それぞれの群においてｎ＝１２）をさまざまな用量のＦＫ５０６（０、１、５、１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇ／日）を用いて１０日間経口で処理した。最後の処理の２４時間後に心臓を切り取って単離し、３０分間の全体的な虚血を起こした後２時間再灌流した。第２の一連の研究ではラットを、２５ｍｇ／ｋｇ／日のＥＧｂ７６１、１ｍｇ／ｋｇ／日のＦＫ５０６を加えた２５ｍｇ／ｋｇ／日のＥＧｂ７６１、５ｍｇ／ｋｇ／日のＦＫ５０６を加えた２５ｍｇ／ｋｇ／日のＥＧｂ７６１を用いてそれぞれ１０日間、経口で処理した。最後の処理を行った２４時間後に心臓を摘出し、虚血／再灌流プロトコール（３０分間の虚血、及び２時間の再灌流）を誘導した。不整脈（ＶＦ及びＶＴ）の発生率、及び心臓機能（ＨＲ、ＣＦ、ＡＦ、ＬＶＤＰ、及び＋ｄｐ／ｄｔｍａｘ）を記録した。
【００８１】
除外基準
この研究に対して予め選択した除外基準により、（Ｉ）心室性不整脈が全体的な虚血を誘導する前に起こった場合、（ＩＩ）冠状動脈流と大動脈流の速度が虚血を誘導する前にそれぞれ１７ｍｌ／分以下及び４０ｍｌ／分以下であった場合の心臓は除外することを推奨された。これらの基準により、研究では９個の心臓が排除され、置き換えられた。
【００８２】
統計
心臓機能のデータ（ＨＲ、ＣＦ、ＡＦ、ＬＶＤＰ、及びＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ）は、平均±ＳＥＭとして表した。すべての群の平均値の間の差異について調べるために、一方向だけの変異分析をまず行った。差異が明らかであれば、対照、即ち薬物不含の群の値を、ボンフェロニー（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正（Ｗａｌｌｅｎｓｔｅｉｎらの１９８０、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ４７： １−９）を用いた両側ｔ検定によって薬物処理された群の値と比較した。類似の手法を、ＶＦ及びＶＴの発生率等の識別変数の分布に対して続けて行った。２×ｎ表に対して全体的なカイ二乗検定を作成した後、個々の群を比較するために２×２のカイ二乗検定のシークエンスを行った。ｐ＜０．０５の変化は有意であると考えられた。
【００８３】
不整脈及び心臓機能へのＦＫ５０６の効果
最大の目的は、ＦＫ５０６およびＦＫ５０６とＥＧｂ７６１との組み合わせが抗不整脈的に作用することを証明することであるため、対照の群は、再灌流誘導性の不整脈に対して高い脆弱性を示すように選択された。この研究のために定義された実験時間の経過と条件でこれを確実にするために、３０分間の平熱での全体的な虚血の後、２時間の再灌流を行うことが選択された。結果は、異なる用量のＦＫ５０６を用いて処理したラットでは、再灌流誘導性の不整脈の発生率が用量依存的に減少することを示している（図３Ａ〜Ｂ）。したがって１、５、１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇのＦＫ５０６を用いると総（不可逆性と可逆性の）ＶＦの発生率が、薬物不含の対照の値である９２％から、それぞれ９２％（ＮＳ）、８３％（ＮＳ）、６７％（ＮＳ）、３３％（ｐ＜０．０５）、及び２５％（ｐ＜０．０５）まで減少した（図３Ａ）。不可逆性のＶＦ（図３Ａ、黒塗りの柱状グラフ）の発生率とＶＴ（図３Ｂ）の発生率は同じパターンを示した。動物では、ＦＫ５０６を用量範囲の高い方で用いても、目立った毒性の証拠は観察されず、ＦＫ５０６の優れた耐性が示された。
【００８４】
薬物不含の群では、ＨＲ、ＣＦ、ＡＦ、ＬＶＤＰ及び＋ＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘの虚血前の値がそれぞれ、３０５±８拍動／分、２７．３±０．８ｍｌ／分、４９．９±１．４ｍｌ／分、１８．２±０．３ｋＰａ及び８０７±２１ｋＰａ／ｓであった。ＦＫ５０６処理の結果としてこれらの値に有意な変化は観察されなかった。表３は、薬物不含の対照とＦＫ５０６処理した群における虚血後の心臓機能についての絶対値を示している。このようにそれぞれ２０及び４０ｍｇ／ｋｇを用いて処理した群では、ＦＫ５０６虚血後の心臓機能（ＣＦ、ＡＦ、ＬＤＶＰ、及びＬＶｄｐ／ｄｔｍａｘ）の有意な回復が観察された。心臓の速度は、虚血前または再灌流を行っている間のいずれかで、薬物不含の対照の値と比較して処理を行った群では有意な変化が見られなかった。
【００８５】
【表３】３０分間の虚血、続いて再灌流を行った後での心臓機能に対するＦＫ５０６の効果
2004510694.tif 000004
【００８６】
ＦＫ５０６及びＥＧｂ７６１を用いた組み合わせ治療：不整脈及び虚血後の心臓機能に対する効果
図４Ａ〜Ｂは、２５ｍｇ／ｋｇのＥＧｂ７６１と１ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇのＦＫ５０６のどちらも再灌流誘導性の不整脈の発生率（％）を有意に減少させなかった。２５ｍｇ／ｋｇのＥＧｂ７６１を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＦＫ５０６と組み合わせると、再灌流誘導性のＶＦ（図４Ａ）及びＶＴ（図４Ｂ）の発生率が有意に減少するという結果が得られた。このように２５ｍｇ／ｋｇのＥＧｂ７６１を１及び５ｍｇ／ｋｇのＦＫ５０６と同時投与すると（図４Ａ）総ＶＦと不可逆性のＶＦの発生率が、対照の９２％と９２％から、それぞれ４２％（ｐ＜０．０５）と３３％（ｐ＜０．０５）、２５％（ｐ＜０．０５）と８％（ｐ＜０．０５）に有意に減少する。この減少は再灌流誘導性ＶＴの発生率でも同じパターンであった（図４Ｂ）。
【００８７】
表４は、再灌流の間に単独の介入で処理した群では心臓機能が有意に変化しなかったことを示している。２５ｍｇ／ｋｇのＥＧｂ７６１を１及び５ｍｇ／ｋｇのＦＫ５０６と組み合わせると、再灌流の際に心臓機能（ＣＦ、ＡＦ、ＬＶＤＰ、及び＋Ｐ／ｄｔｍａｘ）の回復を有意に改善した（表４）。心臓速度は虚血の導入前と再灌流時のいずれでも、組み合わせ群においては有意に変化しなかった（表４）。
【００８８】
【表４】虚血に続いて再灌流を行った後での心臓機能に対する、ＥＧｂ７６１と組み合わせたＦＫ５０６の効果
2004510694.tif 000005
【００８９】
本明細書に記載の結果は、抗不整脈剤としてのＦＫ５０６の役割を支持するとともに、さらに心臓機能を改善する能力を証明している。心臓機能の用量−依存的な改善（表３）及び虚血後の不整脈の阻害（図３Ａ〜Ｂ）は、ＦＫ５０６を用いてラットを前処理することで得られた結果である。この作用はカルシニューリン／ＮＦＡ Ｔ３／ＧＡＴＡ４の下流に起こる事象をＦＫ５０６を仲介して遮断された結果であると思われる。ＦＫ５０６のカルシニューリン−非依存的な性質はまた、心臓保護作用においても役割を果たしうる。生理学的条件下ではＦＫ５０６は、至るところで発現する１２ｋＤａのイムノフィリンタンパク質であるＦＫＢＰ１２と複合体を形成することが観察されており、それは続いてＦＫ５０６の存在下でカルシニューリンに結合して細胞質のＮＦＡＴ３を脱リン酸化するカルシニューリンの能力を阻害するとともに、ＮＦＡＴ３依存性遺伝子発現を遮断する。ＦＫＢＰ１２は、リアノジン受容体のカルシウム放出チャンネル（ＲｙＲ）の調節性構造成分であることが証明された。もっぱらＲｙＲからなるカルシウムチャンネル（ＦＫＢＰ１２は関与しない）は筋形質膜を横切るカルシウム流の変化を明らかにし、さらにＦＫ５０６結合性ＦＫＢＰ１２を導入するチャンネルは異常なカルシウムゲート性能を示す。したがってＦＫＢＰ１２に対する主要な役割は、ＲｙＲチャンネル複合体を経てカルシウム流を調節することにある。この機能は、ＦＫ５０６が付加的に導入されると妨害されてＦＫＢＰ１２のチャンネル安定化作用の逆転を起こし、カフェインのようなチャンネル開口リガンドに対してチャンネル選択性が増加するといった効果を奏し、カルシウム流および筋小胞体を横切るイオンの漏出を増加させる。ヒトでＦＫ５０６を臨床的に使用する場合、用量レベルではあまりに少なすぎて有意な量のＦＫＢＰと結合できないが、かなり高い用量、おそらく毒性用量のＦＫ５０６で、ＶＦ、ＶＴまたは２０ｍｇ／ｋｇ以下の血行力学的回復に注目される影響を伴わずに、効果が観察された。これらのデータは、ＦＫ５０６がカルシニューリン阻害作用（０．１５ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量で効率的に起こることがわかっている）とは別の薬学的作用方式を持っている可能性を示している。ＦＫ５０６の存在で起こるカルシウムの漏出が増加すると、心臓の興奮状態に至る正常の経路を変化させ、不整脈の発生に至る。しかしながら比較的低用量のカルシニューリンホスファターゼの効率的阻害作用に基づくと、この効果はＦＫＢＰ１２のようなＣａ＋＋チャンネルのタンパク質とＦＫ５０６とが相互作用した結果である可能性がある。
【００９０】
ＦＫ５０６と他の治療法との組み合わせは、心臓保護の性質を減少させることなく必要とされる用量を少なくし、心臓異常の抑制及び治療におけるＦＫ５０６の臨床的利用を可能にする。最大容量のギンゴライドは２５ｍｇ／ｋｇであるが、それはＶＦまたはＶＴのいずれかを有意に減少させる結果を生じなかった。同様に１〜５ｍｇ／ｋｇの間のＦＫ５０６用量も、これらのパラメータに影響を与えることができなかった。両方の薬物を用いた組み合わせ治療では、虚血後の不整脈の発生率を相乗的かつ用量応答的に減少させ、さらに心臓機能の有意な改善を引き起こす結果を生じた。これらの作用に寄与する分子機構には、心筋細胞膜への酸素ラジカル誘導性の損傷レベルの減少が含まれ、それはＥＧｂ７６１について証明された抗酸化性の性質から得られる結果であって、安定な区画化とＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋の膜通過流を回復させることに寄与する。ＥＧｂ７６１に抗酸化性酵素（ＳＯＤまたはカタラーゼ）をプラスしてラットに同時投与すると、再灌流誘導性の不整脈が用量依存的に減少するのを導き出し（ギンゴライド−ＦＫ５０６の組み合わせほど劇的ではないが）、心臓の再灌流緩衝液でＤＭＰＯ付加体形成によって測定されるように、フリーラジカル濃度の減少が平行して起こった。このデータは、心臓肥大の発生がイムノフィリン結合性免疫抑制剤とギンゴライドを投与することによって抑制されることを示している。この組み合わせによってイムノフィリン結合性化合物、例えばＦＫ５０６を、ギンゴライドの同時投与によって毒性用量以下にすることが可能になる。
【００９１】
実施例４：
インビトロ末梢血単核細胞によってリンパ球表面活性化抗原ＣＤ２５がＰＨＡ誘導性発現することに対する、ＥＧｂ７６１及びシクロスポリンの効果
イチョウ抽出物とシクロスポリンの両方を用いて組み合わせ処理すると、ヒト組織の免疫活性化を相乗的に阻害する。発達の第一段階にあるヒト末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）をギンゴライドとシクロスポリンとで処理し、免疫の活性化を標準的な方法である例えばフローサイトメトリー分析を用いて測定した。
【００９２】
２×１０６個のヒトＰＢＭＣの培養物を静脈血から単離し、以下の条件で２４時間培養した。（ｉ）刺激剤を用いない場合、（ｉｉ）ＰＨＡ、５０μ／ｍｌとともなった場合、（ｉｉｉ）ＰＨＡに２００μｇ／ｍｌのＥＧｂ７６１（イチョウ抽出物）を添加した場合、（ｉｖ）ＰＨＡに４００μｇ／ｍｌのＥＧｂ７６１を添加した場合、及び（ｖ）ＰＨＡに４００μｇ／ｍｌのＥＧｂ７６１を添加し、１．０μＭのシクロスポリンを添加した場合である。ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）の誘導は、フルオロフォアが複合化されていてＣＤ２５に特異的なモノクローナル抗体とともにアイソタイプの対照を加えてインキュベートし、続いてフローサイトメトリー分析を行うことによって、それぞれの培養物の細胞画分中で測定した。結果（表５に示されている）は、ＣＤ２５に対して陽性の細胞を割合（％）として表した。それぞれの測定値は、５個体から得られた値の平均値±ＳＥである。
【００９３】
【表５】ＰＨＡを用いて刺激し、ギンゴライド（ＥＧｂ）及び／またはシクロスポリンＡ（ＣｙＡ）を用いて処理した後でＣＤ２５（ＩＬ−２受容体）を発現する細胞の割合（％）
2004510694.tif 000006
【００９４】
表５に示されたデータは、ギンゴライド調製物、ＥＧｂ７６１が単独でヒト白血球による免疫活性を抑制することを示している。シクロスポリンはさらに、ＣＤ２５の発現を現象させる。ギンゴライドおよびシクロスポリンの作用は付加的以上であり、シクロスポリンを添加することで、これらの薬物の組み合わせの相乗的な免疫抑制作用が明らかになる。この結果はまた、免疫抑制性の能力に対する大量の候補のプレパラートをスクリーニングするためにこの特定のアプローチを用いることについての利点も証明している。このアッセイ法は容易に行われ、大量のサンプルを同時に処理することを可能にする。
【００９５】
免疫抑制剤は、ギンゴライドの候補化合物を用い、Ｔ細胞の活性化を測定して免疫細胞集団、例えばＰＢＭＣ、またはＴ細胞株によって同定される。この細胞は、例えばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のような免疫刺激化合物の存在下で細胞を培養することによって培養物中において活性化する。その化合物が存在する場合でのＴ細胞の活性化がその化合物が存在しない場合の活性化に比べて減少することは、その化合物が免疫抑制剤であることを示している。免疫細胞の活性化は既知の方法、例えば細胞増殖、ＣＤ２５のような細胞表面のマーカーの発現、またはＩＬ−２のようなサイトカインの合成を用いて測定した。免疫抑制性化合物の相乗的な組み合わせを同定するための方法は、（ａ）イムノフィリン結合性化合物が存在する場合、（ｂ）ギンゴライドの候補化合物が存在する場合、及び（ｃ）イムノフィリン結合性化合物とギンゴライドの候補化合物の両方が存在する場合に、免疫細胞の培養物を同様に活性化させて行われる。（ａ）及び（ｂ）で検出されたＴ細胞の活性化に比べて（ｃ）で検出されたＴ細胞の活性化の減少が相加的以上に大きくなることは、試験したギンゴライドとイムノフィリン結合性化合物が相乗的免疫抑制性であることを示している。
【００９６】
他の態様は特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、喘息患者から得られたＰＢＭＣによるインビトロでのサイトカイン発現応答を示す棒グラフである。ＣｓＡ及びＢＮ５２０２１に対して活性または非活性のヒトＰＢＭＣによるインターロイキン４及び５の発現が測定された。細胞は培地（黒塗りのカラム）、２０ｎＭのＰＭＡ＋１．０μＭのイオノマイシン（ＰＭＡ／Ｉ）（濃い斜線を付けたのカラム）、１．０μＭのＣｓＡ＋ＰＭＡ／Ｉ（灰色のカラム）、または１μＭのＢＮ５２０２１＋ＰＭＡ／Ｉ（薄い斜線を付けたカラム）とともに培養した。ＩＬ−４及びＩＬ−５の濃度（免疫活性の基準として）は抗体捕獲ＥＬＩＳＡによって培養液上清で測定し、ｐｇ／ｍｌで表した。活性な細胞は両方のサイトカインの抑制によってＣｓＡ処理に応答し、ＢＮ５２０１を用いて処理して得られる抑制に指向する傾向を伴っていた。
【図２】図２は、喘息患者から得られるＰＢＭＣに含まれるリンパ球の活性マーカーがインビトロで発現することを示す棒グラフである。活性または非活性のヒトＰＢＭＣによるリンパ球表面活性マーカーの発現が測定された。細胞は培地（黒塗りのカラム）、２０ｎＭのＰＭＡ＋１．０μＭのイノマイシン（ＰＭＡ／Ｉ）（濃い斜線を付けたカラム）、１．０μＭのＣｓＡ＋ＰＭＡ／Ｉ（グレーのカラム）、または１μＭのＢＮ５２０２１＋ＰＭＡ／Ｉ（薄い斜線を付けたカラム）を用いて刺激した。２４時間後に行われるフローサイトメトリー分析は、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５４及びＨＬＡ−ＤＲの発現について進行させた。結果は３つの独立したアッセイ法についての表示であり、それぞれのサンプルに含まれる特定の表面抗原を発現しているリンパ球の割合（％）として示される。
【図３】図３Ａは、総（可逆性と不可逆性）再灌流誘導性心室細動（ＶＦ）の発生率（白抜きのカラム）と、ＦＫ５０６の用量に関連する不可逆性ＶＦの発生率（黒塗りのカラム）を示す棒グラフである。
図３Ｂは心室性頻脈（ＶＴ）の発生率を示す棒グラフである。不整脈の発生率は、再灌流の際にＶＦ及びＶＴを示す１２個の心臓の割合（％）を示す。各群においてＮ＝１２。薬物不含の対照と比較してｐ＜０．０５。
【図４】図４Ａは、総（可逆性と不可逆性）再灌流誘導性心室細動（ＶＦ）の発生率（白抜きのカラム）と、ＦＫ５０６及びＥＧｂ７６１の用量に関連する不可逆性ＶＦの発生率（黒塗りのカラム）を示す棒グラフである。
図４Ｂは心室性頻脈（ＶＴ）の発生率を示す棒グラフである。不整脈の発生率は、再灌流の際にＶＦ及びＶＴを示す１２個の心臓の割合（％）を示す。各群においてＮ＝１２。薬物不含の対照と比較してｐ＜０．０５。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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