(57)【要約】本発明は、植物、動物またはヒトの細胞中への、例えばＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡを含むキメラオリゴヌクレオチドのインビボ送達を高めるための方法であって、該キメラオリゴヌクレオチドを含む組成物を、該細胞を含んだ組織またはその組織に隣接する組織へ局所適用またはその中へ注入するステップ、次いで、或いはそれに先立ち、またはそれと同時にイオントホレシスにより該細胞中へ該キメラオリゴヌクレオチドを輸送するステップを含んでなる方法を提供し、並びにキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡのイオントホレシス輸送からなる遺伝子療法に関する。本発明は、眼機能に関与する特定遺伝子の発現を、その特定遺伝子で変異を誘導または復帰させることにより誘導または抑制しうる、具体的なキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ、並びに、眼疾患を予防または治療するための治療用組成物としてのそれらの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物またはヒト組織の標的細胞中へインビボでキメラオリゴヌクレオチドを送達するための方法であって：
ａ）該キメラオリゴヌクレオチドを含む組成物を、上記標的細胞を含んだ患者組織またはその患者組織に隣接する患者組織へ局所適用またはその中へ注入し；および
ｂ）イオントホレシスにより上記標標的細胞中へ該キメラオリゴヌクレオチドを輸送する；
ステップを含んでなる方法。
【請求項２】
ステップｂ）がステップａ）の前、中または後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）が組成物を注入するステップである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
組成物中に含まれたキメラオリゴヌクレオチドが、標的細胞に含まれたゲノムＤＮＡの配列と特異的にハイブリッド形成しうる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
組成物中に含まれたキメラオリゴヌクレオチドが、標的細胞の標的遺伝子の発現産物を修飾しうるキメラオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物中に含まれたキメラオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子で挿入、欠損または置換させることが望まれる少くとも１つのヌクレオチドを除いて、細胞の標的遺伝子にワトソン‐クリック規則に従い相補的な配列を少くとも含んだオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組成物中に含まれたキメラオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであり、該ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部が、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組成物中に含まれたキメラオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡであり、該ＤＮＡ／ＲＮＡ配列の少くとも一部が、標的遺伝子で復帰させることが望まれる変異を除き、細胞の標的変異遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補的であって、該変異が遺伝病に関与している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標的細胞を含む組織が、眼組織、骨格筋組織、表皮および真皮組織からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的細胞を含む組織が眼組織からなる群より選択され、組成物中に含まれたキメラオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補的な配列を少くとも含み、該標的遺伝子が変異すると眼遺伝病に少くとも一部関与しうる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞を含む眼組織が網膜である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）が、キメラオリゴヌクレオチドを含有した組成物の硝子体内注入のステップである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
キメラオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであり、該オリゴヌクレオチドの配列の少くとも一部が、該オリゴヌクレオチドの配列の該一部でＣに入れ替わる変異ヌクレオチドＡ以外では、遺伝子の一部のｃＤＮＡのコドン３４７におけるナンセンスＣ→Ａ変異を示し、色素性網膜炎に至るｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードするネズミ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
キメラオリゴヌクレオチドが：
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１を有するキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプ；および
‐動物またはヒトでｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードするネズミ遺伝子のｃＤＮＡのコドン３４７においてナンセンスＣ→Ａ変異を復帰させうる配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の必須要素を含んだ、ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプキメラオリゴヌクレオチド配列
からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
キメラオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであり、該オリゴヌクレオチドの配列の少くとも一部が、転写因子ＨＩＦ１αをコードするマウスまたはヒト遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補性であるが、但し少くとも１つのヌクレオチドはその相補性オリゴヌクレオチドの該一部で欠損、挿入または置換されており、該配列によりコードされた発現ＨＩＦ‐１αタンパク質において、該断片がヒトまたはマウスで低酸素誘導性新生血管形成を促せない上記の少くとも１つの欠損、挿入または置換ヌクレオチドを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプキメラオリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドが：
‐ネズミまたはヒト転写因子ＨＩＦ１αで変異Ｅ１４２‐ＳＴＯＰを誘導しうるオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２を有するオリゴヌクレオチド、または同変異を誘導しうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
キメラオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであり、該オリゴヌクレオチドの配列の少くとも一部が、ネズミまたはヒトＲＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補性であるが、但し少くとも１つのヌクレオチドはその相補性オリゴヌクレオチドの該一部で欠損、挿入または置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプキメラオリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドが：
‐ヒトＲＰ１タンパク質で変異Ｋ２９６ＥまたはＲ６７７‐ＳＴＯＰを復帰させうるオリゴヌクレオチド；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３を有するオリゴヌクレオチド、または同変異Ｋ２９６Ｅを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４を有するオリゴヌクレオチド、または同変異Ｒ６７７‐ＳＴＯＰを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプキメラオリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドが：
‐ネズミＲＰ１タンパク質配列で変異Ｋ２９６ＥまたはＥ３４８‐ＳＴＯＰを誘導しうるオリゴヌクレオチド配列；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５を有するオリゴヌクレオチド、または同変異Ｋ２９６Ｅを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６を有するオリゴヌクレオチド、または同変異Ｅ３４８‐ＳＴＯＰを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ）で用いられるイオントホレシスシステムが、次の特許：１９７９年２月２７日付で発行されたＵＳ４，１４１，３５９；１９８１年１月１７日付で発行されたＵＳ４，２５０，８７８；１９８１年１１月２４日付で発行されたＵＳ４，３０１，７９４；１９８８年４月３１日付で発行されたＵＳ４，７４７，８１９；１９８８年６月２１日付で発行されたＵＳ４，７５２，２８５；１９９０年４月１０日付で発行されたＵＳ４，９１５，６８５；１９９０年１２月２５日付で発行されたＵＳ４，９７９，９３８；１９９３年１０月５日付で発行されたＵＳ５，２５２，０２２；１９９４年１２月２０日付で発行されたＵＳ５，３７４，２４５；１９９６年３月１２日付で発行されたＵＳ５，４９８，２３５；１９９８年３月２４日付で発行されたＵＳ５，７３０，７１６；１９９９年１２月１４日付で発行されたＵＳ６，００１，０８８；２０００年１月２５日付で発行されたＵＳ６，０１８，６７９；２０００年１０月３１日付で発行されたＵＳ６，１３９，５３７；２０００年１１月１４日付で発行されたＵＳ６，１４８，２３１；２０００年１１月２８日付で発行されたＵＳ６，１５４，６７１；および２０００年１２月２６日付で発行されたＵＳ６，１６７，３０２で開示された装置からなる群より選択される装置である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）で用いられるイオントホレシスシステムが、２０００年１１月２８日付で発行されたＵＳ特許６，１５４，６７１で開示された装置からなる群より選択される装置である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療の必要なヒトまたは動物宿主における、標的細胞の標的遺伝子で変異を復帰または誘導しうるキメラオリゴヌクレオチドの投与を含んでなり、その遺伝子発現が疾患に関連するものであって、該キメラオリゴヌクレオチドをインビボで該標的細胞中へ送達するために用いられる方法が、請求項１に記載された方法である、疾患の治療方法。
【請求項２３】
疾患が遺伝病である、請求項２２に記載の疾患の治療方法。
【請求項２４】
疾患が遺伝性網膜症である、請求項２２に記載の疾患の治療方法。
【請求項２５】
動物の標的細胞の標的遺伝子で変異を復帰または誘導しうるキメラオリゴヌクレオチドの投与を含んでなり、該キメラオリゴヌクレオチドをインビボで該標的細胞中へ送達するために用いられる方法が、請求項１に記載された方法である、動物モデルを得るための方法。
【請求項２６】
標的細胞の標的遺伝子が該標的遺伝子で変異を復帰または誘導しうるキメラオリゴヌクレオチドの投与により修飾されており、該キメラオリゴヌクレオチドをインビボで該標的細胞中へ送達するために用いられる方法が、請求項１に記載された方法である、動物モデルの使用を含んでなる医薬または化粧用化合物のスクリーニングのための方法。
【請求項２７】
ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされており、ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部が、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性である、キメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであって、
その標的遺伝子に相補的な配列の少くとも該一部が：
‐ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードするネズミ遺伝子のｃＤＮＡのコドン３４７においてナンセンスＣ→Ａ変異を復帰させうるオリゴヌクレオチド配列
からなる群より選択されることで特徴付けられる、キメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプ。
【請求項２８】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１を有する、請求項２７に記載のキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプ。
【請求項２９】
ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされており、ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部が、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性である、キメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであって、
その標的遺伝子に相補的な配列の少くとも該一部が：
‐変異ＨＩＦ１α遺伝子により発現されるタンパク質が機能性でないように、ネズミまたはヒト転写因子ＨＩＦ１αをコードするＤＮＡにおいてナンセンス変異ＳＴＯＰを誘導しうるオリゴヌクレオチド配列；
‐マウス転写因子ＨＩＦ１αでコードされるタンパク質において変異Ｅ１４２‐ＳＴＯＰまたはヒトＨＩＦ１αタンパク質配列で対応する変異を誘導しうるオリゴヌクレオチド配列；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２を有するオリゴヌクレオチド配列または同変異を誘導しうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されることで特徴付けられる、キメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプ。
【請求項３０】
ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされており、ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部は、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性である、キメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであって、
その標的遺伝子に相補的な配列の少くとも該一部が：
‐ヒトＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡで変異を復帰させうるオリゴヌクレオチド配列：該変異は非機能性タンパク質の発現に関与する；
‐ヒトオプシンまたはＲＰ１タンパク質配列で変異Ｋ２９７ＥまたはＲ６７７‐ＳＴＯＰを復帰させうるオリゴヌクレオチド配列；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３を有するオリゴヌクレオチドまたは同変異Ｋ２９７Ｅを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４を有するオリゴヌクレオチドまたは同変異Ｒ６７７‐ＳＴＯＰを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されることで特徴付けられる、キメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプ。
【請求項３１】
ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされており、ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部は、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性である、キメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであって、
その標的遺伝子に相補的な配列の少くとも該一部が：
‐ネズミＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡで変異を誘導しうるオリゴヌクレオチド配列：該変異は非機能性タンパク質の発現に関与する；
‐ネズミオプシンまたはＲＰ１タンパク質配列で変異Ｋ２９７ＥまたはＥ３４８‐ＳＴＯＰを誘導しうるオリゴヌクレオチド配列；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５を有するオリゴヌクレオチドまたは同変異Ｋ２９７Ｅを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６を有するオリゴヌクレオチドまたは同変異Ｅ３４８‐ＳＴＯＰを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されることで特徴付けられる、キメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプ。
【請求項３２】
請求項２７〜３０に記載されたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプを含有する医薬組成物。
【請求項３３】
宿主ＲＰ１ゲノムＤＮＡを請求項３０に記載されたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡとインビボで接触させることを含んでなる、ＲＰ１遺伝子で変異の存在により誘導される網膜症を有したヒト宿主の治療方法。
【請求項３４】
宿主ＨＩＦ１αゲノムＤＮＡを請求項２９に記載されたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡとインビボで接触させることを含んでなる、正常転写因子ＨＩＦ１α遺伝子の発現により誘導される眼新生血管形成を有するヒトまたは動物宿主の治療方法。
【請求項３５】
変異がキメラオリゴヌクレオチドのインビボ投与により誘導されたものであって、該キメラオリゴヌクレオチドが請求項３１に記載されたキメラオリゴヌクレオチドである、ＲＰ１遺伝子に変異を含んだ動物モデル。
【請求項３６】
ヒトまたは動物網膜症を治療しうる医薬化合物のスクリーニングのための、請求項３５に記載の動物モデルの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、植物、動物またはヒトの細胞中への、例えばＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡを含むキメラオリゴヌクレオチドのインビボ送達を高めるための方法を提供し、その方法は、該キメラオリゴヌクレオチドを含む組成物を、上記細胞を含んだ組織またはその組織に隣接する組織へ局所適用またはその中へ注入するステップ、次いで、或いはそれに先立ち、またはそれと同時にイオントホレシス(iontophoresis)により上記細胞中へ該キメラオリゴヌクレオチドを輸送するステップからなる。
【０００２】
特に、本発明は、眼組織細胞中へのキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡのイオントホレシス輸送からなる、ヒト眼疾患、特に遺伝性網膜症を治療する遺伝子療法に関する。
【０００３】
本発明は、眼機能に関与する特定遺伝子の発現を、その特定遺伝子で変異を誘導または復帰させることにより誘導または抑制しうる、具体的なキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ、並びに、視覚に関与する、ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードする遺伝子に存在する変異（その変異はネズミ色素性網膜炎に至る）、またはＲＰ１もしくはオプシン遺伝子に存在する変異のような、変異の存在に特に起因する眼疾患を予防または治療するための治療用組成物としてのそれらの使用にも関する。
【発明の背景】
【０００４】
遺伝子療法は、インビボまたは半ビボでの細胞または組織中への核酸の導入である。一部の場合において、核酸は、機能欠失内在遺伝子を入れ替える（またはその代わりに働く）または修正する、治療ポリペプチドを生産しうる能力を宿主に付与する、望ましくない遺伝子産物を抑制する、または免疫応答を刺激するためのものである。
【０００５】
真核細胞で機能欠失内在遺伝子を修正するか、または望ましくない遺伝子を不活性化させるプロセスの中で、キメラプラスティ(chimeraplasty)は最近の関心事であり、ヒト疾患の治療と有用な遺伝子工学植物および動物株の開発とをなしうるプロセスとして挙げられた（例えば、２０００年１月４日付で発行された特許文献ＵＳ６，０１０，９０７参照）。
【０００６】
例えば１９９６年１０月１５日付で発行された特許文献ＵＳ５，５６５，３５０で記載されたキメラプラスティは、標的ＤＮＡの配列がオリゴヌクレオチドのＤＮＡ部分のものへ変換されるように、細胞の相同的組換えおよび修復系により処理することになる、オリゴヌクレオチドを導入することによる標的細胞のＤＮＡの特定部位における指示改変の導入に関するものである。遺伝子変化を行わせるために、相同性領域内には１以上の非対応塩基対（“異種”または“ミューテーター”塩基対）がある。相同的組換えのような細胞プロセスは、ミューテーターヌクレオチドを標的ゲノム部位中へ挿入させると考えられている。こうして、これらのオリゴヌクレオチド（以下“キメラオリゴヌクレオチド”）は、異種塩基対を遺伝子中へ導入することにより、対象遺伝子を特異的に改変するために用いうる。異種塩基対は、対象遺伝子のものを変える塩基対でも、または対象遺伝子に存在するものに追加（挿入）される塩基対でもよく、あるいは異種塩基対は対象遺伝子でみられる塩基対の不在（欠損）を誘導するものでもよい。
【０００７】
キメラオリゴヌクレオチドは、通常、互いにハイブリッド形成するようにデザインされた、リボタイプ、例えば２′‐Ｏ‐メチルリボヌクレオチド、およびデオキシリボタイプヌクレオチドを含んでいる。これらキメラオリゴヌクレオチドの中で、化学および熱安定性並びにヘリカーゼとＲＮＡおよびＤＮＡヌクレアーゼに対する耐性のために、ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′‐Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされており、ＲＮＡ／ＤＮＡ配列の一部が標的遺伝子のものに相補性であるが、但し、相同的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチに少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを含んでいる、キメラオリゴヌクレオチドが特に挙げられる。
【０００８】
キメラプラスティを用いた真核細胞における機能欠失（内在）遺伝子の修正に関する、次のような様々な文献が発表されている：
‐肝臓／骨／腎臓タイプアルカリホスファターゼをコードする遺伝子で変異を修正する（Yoon,K.,et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.93,2071）；
‐鎌状赤血球症を引き起こすヒトβ‐グロビン遺伝子で変異を修正する（Cole-Strauss,A.,et al.,1996,Science,273,1386）；および
‐造血細胞の遺伝病、例えば鎌状赤血球症、サラセミアおよびゴーシェ病の治療（１９９８年６月２日付で発行されたＵＳ特許５，７６０，０１２；１９９７年１１月６日付で出願されたＰＣＴ出願ＷＯ９７／４１１４１；および１９９９年３月３０日付で発行されたＵＳ特許５，８８８，９８３）
【０００９】
通常、キメラプラスティと称される戦略は、ゲノムＤＮＡで単一ヌクレオチド変異を修正または作製するために用いられてきた。この場合には、標的遺伝子のものに相補的なＲＮＡ／ＤＮＡ配列の一部は、相同的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、ＤＮＡストレッチに単一のミス対合ヌクレオチドを含んでいる。この非対合ヌクレオチドは内在修復系により見かけ上認識されるため、標的変異（野生型）遺伝子のＤＮＡ配列をその修正（変異）体へ逆変換する。
【００１０】
このように、これらのキメラオリゴヌクレオチドは、下記表１のような病理プロセスに関与するいくつかの遺伝子中へ単一ヌクレオチド変換を導入する上で有効なことが既に示されている：
【表１】
2004532844.tif 000002
【００１１】
それにもかかわらず、遺伝子療法にキメラプラスティを用いるこれら上記の方法において、細胞のゲノムで特異的改変の導入は、患者から欠失遺伝子を含む細胞を取出し、（場合により、取出した細胞を培養するステップで）キメラオリゴヌクレオチドを導入し、その細胞を患者に再導入することにより、通常行われている。
【００１２】
例えば、組織中への局所適用または注入、エレクトロポレーション、イオントホレシスのような技術の使用、リポソームまたは他の化学的キャリアでの核酸の調製、あるいはウイルスまたは非ウイルスベクターの使用による、核酸のような薬物を標的細胞または組織中へ導入するための方法が知られている。
【００１３】
多くの知識が長年にわたり蓄積されてきたが、しかしながら従来法による真核細胞中への核酸のインビボ導入には多くの問題がよく伴う。典型的には、異種核酸でトランスフェクトされることが望まれる標的細胞のうちわずかな割合が、満足しうるレベルで対象の遺伝子、特に対象のタンパク質を実際に発現するのみである。加えて、一部の治療用組成物、例えば合成オリゴヌクレオチドを含有したものは、非常に高価で、毒性および分解性であるため、結果的に標的細胞中への非常に局所的な適用および効率的なインターナリゼーション(internalization)を要する。それらすべての治療法では、永久遺伝子修飾を誘導するようにデザインされたキメラプラスティとは反対に、頻繁な投与を要する。
【００１４】
標的細胞中への核酸のインビボ輸送を高める方法の中では、エレクトロポレーションが特に挙げられる。エレクトロポレーションは、核酸のような化学物質に対する、細胞膜および／または標的組織の細胞の少くとも一部の透過性増加を意味し、その透過性増加は細胞または組織の少くとも一部に通される高パルス電圧の適用により生じる。組織または細胞が適切な化学物質の存在下にあるならば、透過性増加により組織または細胞膜から細胞中への化学物質の輸送または移動を行える。こうして、エレクトロポレーションが核酸を組織へ送達するために最近用いられている。
【００１５】
エレクトロポレーション法を用いた核酸送達の例は、例えば次の特許文献で開示されている：
‐メラノーマの治療のためにエレクトロポレーションにより局所適用した後における、表皮中へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達について開示している、１９９８年５月１２日付で発行されたＵＳ特許５，７４９，８４７；および
‐遺伝免疫のためのエレクトロポレーションによる表皮中への注入後におけるＤＮＡの送達について開示している、２０００年８月２９日付で発行されたＵＳ特許６，１１０，１６１
【００１６】
エレクトロポレーションは、組織表面へ適用された一対の電極間で高電圧パルスをかけることにより、典型的に行われる。電圧は電極間の距離に比例して適用されねばならない。電極間のスペースが大きすぎるとき、生じた電場は組織中へ深く浸透して、不快な神経および筋肉反応を引き起こす。
【００１７】
イオントホレシスは、Verratiにより１７４７年に提案された技術であり、小さな電圧による電場を用いた組織から体内への、特に薬物の投与である。電極は治療される部位に配置され、電気回路をつなぐための第二電極が体の別な部位に置かれる。電場は活性産物の移動を促し、および／または、好ましくイオン化された産物に対する細胞透過性を増加させる。この技術は皮膚またはリウマチ疾患の治療に常用されており、この目的のために様々な装置が開示されている（それらの一部は市販されている）（例えば、１９７９年２月２７日付で発行された特許文献ＵＳ４，１４１，３５９；１９８１年１月１７日付で発行されたＵＳ４，２５０，８７８；１９８１年１１月２４日付で発行されたＵＳ４，３０１，７９４；１９８８年４月３１日付で発行されたＵＳ４，７４７，８１９；１９８８年６月２１日付で発行されたＵＳ４，７５２，２８５；１９９０年４月１０日付で発行されたＵＳ４，９１５，６８５；１９９０年１２月２５日付で発行されたＵＳ４，９７９，９３８；１９９３年１０月５日付で発行されたＵＳ５，２５２，０２２；１９９４年１２月２０日付で発行されたＵＳ５，３７４，２４５；１９９６年３月１２日付で発行されたＵＳ５，４９８，２３５；１９９８年３月２４日付で発行されたＵＳ５，７３０，７１６；１９９９年１２月１４日付で発行されたＵＳ６，００１，０８８；２０００年１月２５日付で発行されたＵＳ６，０１８，６７９；２０００年１０月３１日付で発行されたＵＳ６，１３９，５３７；２０００年１１月１４日付で発行されたＵＳ６，１４８，２３１；２０００年１１月２８日付で発行されたＵＳ６，１５４，６７１；および２０００年１２月２６日付で発行されたＵＳ６，１６７，３０２参照）。
【００１８】
遺伝子の誘導向けにウサギの目への半ビボオリゴヌクレオチド輸送に関する別の公開文献も挙げられる（Asahara et al.,Nippon Ganga Gakkai Zasshi,103(3),178-185,1999）。
【００１９】
低電圧が広間隔の電極間にかけられたイオントホレシスは、現存経路および／または作成経路から荷電分子を輸送しうることが知られている。しかしながら、輸送される分子の量が非常に少なく、特定組織へのインビボ適用には不十分であることも知られている。残されたこの問題を解決するために、１９９９年１２月２８日付で発行された特許文献ＵＳ６，００９，３４５では、核酸送達用にエレクトロポレーションおよびイオントホレシス双方の同時使用からなる方法が特に開示された。
【００２０】
上記のことから、特に眼遺伝子療法向けに、標的細胞中へのキメラオリゴヌクレオチドのような核酸のインビボ送達を高めるための簡単で効率的な方法を提供することが、技術上の進歩であることは明らかであろう。
【００２１】
このような方法が、ここで開示されている本発明の目的である。
【００２２】
実際に、イオントホレシスは、特にキメラオリゴヌクレオチドの組織内注入後、中または前に、インビボで標的細胞中へのキメラオリゴヌクレオチド浸透性を効率的に高めるためだけに用いられ、こうしてインビボで遺伝子療法向けにキメラプラスティの更に簡単、効率的で広範な使用を行えることを、本発明者らは初めて示したのである。
【発明の要旨】
【００２３】
本発明は、生物、好ましくは哺乳生物の標的細胞中へ、核酸、好ましくはキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプをインビボで送達するための新規方法に関し、その方法は、上記の望ましい核酸を含む組成物を、上記の標的細胞を含む生物組織またはそれに隣接する組織へ局所適用またはその中へ注入するステップ、次いで、或いはそれに先立ち、またはそれと同時にイオントホレシスにより上記の細胞中へ上記の核酸を輸送するステップからなる。
【００２４】
好ましい態様において、上記の望ましい核酸を含む組成物は、標的細胞を含む組織またはその標的細胞に隣接する結合空隙もしくは組織中へ注入される。
【００２５】
好ましい態様において、上記の標的細胞は眼組織、骨格筋の細胞、皮下細胞または表皮細胞である。
【００２６】
別な好ましい態様において、本発明により標的細胞中へインビボで核酸を送達するための方法は、上記標的細胞の遺伝子で少くとも１つの変異（その変異遺伝子の発現は眼疾患に関与している）の存在に起因した、遺伝性網膜症のような眼疾患を治療または予防するために用いられる。この方法において、上記の核酸は、上記の標的変異遺伝子で復帰させることが望まれる変異を除いて、上記細胞の標的変異遺伝子のゲノムＤＮＡ断片配列に相補性である。
【００２７】
もう１つの好ましい態様において、本発明により標的細胞中へインビボで核酸を送達するための方法は、眼疾患を研究するまたは眼疾患を治療しうる化合物をスクリーニングするためのモデルとして役立つ動物、または動物もしくはヒト組織もしくは生物を得るために、動物の標的細胞の遺伝子で変異（その変異遺伝子の発現は眼疾患に関与している）を自発的に誘導するために用いられる。
【００２８】
本発明は、組成物、特に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜６の群から選択される配列を有するまたは含むキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプを含有した医薬組成物にも関し、そのＤＮＡ／ＲＮＡ配列の少くとも一部は、標的遺伝子で復帰、修飾、付加または挿入されることが望まれる変異、ヌクレオチドまたは配列断片を除いて、好ましくは変異される、標的遺伝子のゲノムＤＮＡ断片配列に相補性であり、上記の標的遺伝子は：
‐ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードする遺伝子：この遺伝子の一部のｃＤＮＡのｎｔ３４７位におけるナンセンスＣ→Ａ変異はネズミ色素性網膜炎に至る；
‐ＲＰ１遺伝子：そのロドプシン遺伝子におけるミスセンスまたはナンセンス変異は、オプシンタンパク質のような非機能性タンパク質を生産する；および
‐炎症および新生血管形成に関与するいくつかの遺伝子の発現を支配して、誘導されたナンセンス変異が低酸素誘導性新生血管形成を促せないタンパク質に至るような、転写因子ＨＩＦ１αをコードする遺伝子
からなる群より選択される。
【００２９】
本発明は、最後に、本発明によるキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプのインビボ投与からなる、変異の存在に伴う疾患、またはこれら上記標的遺伝子の
中で誘導される変異により治療されうる疾患を治療するための方法に関する。
【００３０】
本発明は、動物またはヒト組織の標的細胞中へ、インビボで核酸、好ましくはキメラオリゴヌクレオチドを送達するための方法に関し、その方法は：
ａ）上記の核酸を含む組成物を、上記の標的細胞を含んだ患者組織またはその患者組織に隣接する患者組織へ局所適用またはその中へ注入し；および
ｂ）イオントホレシスにより上記の標的細胞中へ上記の核酸を輸送する；
ステップからなる。
本発明の方法において、ステップｂ）はステップａ）の前、中または後に行える。
【００３１】
本明細書において、“核酸”という用語は、場合により修飾された、少くとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００のヌクレオチドが正しく連続する、天然および／または非天然ヌクレオチドを含んだ、単離された天然または合成のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片を意味すると理解されている。上記の核酸は直線状または環状の一本鎖、二本鎖またはそれ以上の形態をとり、最終的には閉環される。
【００３２】
本明細書において、“キメラオリゴヌクレオチド”という用語は、１９９６年１０月１５日付で発行されたＵＳ特許５，５６５，３５０（参考のためここに組み込まれる）で記載されているように、生真核細胞中へ特異的遺伝子改変を導入しうる核酸化合物を意味すると理解されている。上記の“キメラオリゴヌクレオチド”は、第一鎖に、修飾されたまたはされていないリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの双方、および第二鎖にデオキシリボヌクレオチド単独を有するポリヌクレオチドとして定義され、その鎖はワトソン‐クリック相補性を有して、そのポリヌクレオチドが多くて１つの３′および１つの５′末端を有するようにオリゴヌクレオチドでリンクされており、ポリヌクレオチドが単一の連続環状ポリマーとなるようにこれらの末端は連結されうる。
【００３３】
ＵＳ特許５，５６５，３５０において、標的遺伝子で特異的改変を誘導するために用いられるこれらの“キメラオリゴヌクレオチド”は、その特許の請求項１によると、次のように定義することもできる。
【００３４】
核酸が更に：
ａ）非対合領域が核酸を第一鎖および第二鎖へ分けるように配置された隣接非対合塩基の少くとも１つの領域を含み；
ｂ）隣接非対合塩基の上記領域により、長さが少くとも１５塩基対のワトソン‐クリック核酸の領域を連結させ、第一鎖の塩基が第二鎖の塩基に相当して；
ｃ）２′‐Ｏまたは２′‐ＯＭｅリボースから構成される少くとも３つの隣接ヌクレオチドの領域を第一鎖が含み、こうしてワトソン‐クリック核酸の領域内にハイブリッド二重鎖を形成している；
ような、多くて１つの３′末端および１つの５′末端を有する混合リボデオキシリボ核酸。
【００３５】
このように、キメラオリゴヌクレオチドは、ワトソン‐クリック規則に従い相補的な、リボタイプ、例えば２′‐Ｏ‐メチル‐リボヌクレオチドと、デオキシリボタイプヌクレオチドとを通常含んでいる。これらキメラオリゴヌクレオチドの中では、化学および熱安定性並びにヘリカーゼとＲＮＡおよびＤＮＡヌクレアーゼとに対する耐性のために、好ましくはペンタマーのＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、好ましくは１０の２′‐Ｏ‐メチルＲＮＡ残基の２ブロックでデザインされており、ＲＮＡ／ＤＮＡ配列の一部が標的遺伝子のものに相補性であるが、但し相同的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチに少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを含んでいる、キメラオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３６】
参考のためここに組み込まれる、キメラプラスティを用いた真核細胞における、機能欠失遺伝子の修正または欠失遺伝子の作製に関する、前記の文献で開示された“キメラオリゴヌクレオチド”も好ましく（Yoon,K.,et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.93,2071；Cole-Strauss,A.,et al.,1996,Science,273,1386；１９９８年６月２日付で発行されたＵＳ特許５，７６０，０１２；１９９７年１１月６日付で出願されたＰＣＴ出願ＷＯ９７／４１１４１；１９９９年３月３０日付で発行されたＵＳ特許５，８８８，９８３；およびKren et al.,1998,Nature Medicine,4,285-290）、そこでは、上記文献で対象の標的遺伝子のものに相補的な開示キメラオリゴヌクレオチドの配列部分が、ミューテーター部分で改変させるべき標的遺伝子のミューテーター部分以外の配列に入れ替わっている。
【００３７】
好ましい態様において、本発明は、ステップａ）が、上記の核酸を含む組成物を、上記の細胞を含んだ組織または上記の細胞を含んだ患者組織に隣接する組織中へ注入するステップである、本発明による方法からなる。
【００３８】
組成物中に含まれた上記の核酸が、標的核酸、好ましくは標的遺伝子（ゲノムＤＮＡ）または上記の標的細胞に属する標的タンパク質の一部と特異的にハイブリッド形成しうる、本発明による方法も、本発明の一部を形成している。本発明の方法により送達しうる核酸の中では、上記細胞の標的遺伝子の発現産物を調整しうるオリゴヌクレオチドセンスもしくはアンチセンスまたは三重らせんが、下記のように、上記の文献または本明細書で開示された機能欠失遺伝子の修正または欠失遺伝子の作製に関するキメラオリゴヌクレオチドに加えて挙げられる。
【００３９】
例えば、ｍＲＮＡとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、タンパク質合成であるｍＲＮＡの正常機能により妨げられることがある。
【００４０】
“特異的なハイブリッド形成”とは、安定な特異的結合が核酸標的、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的と本発明の方法により送達しうる核酸との間で生じるような、十分な程度の相補性を示すために用いられている用語である。
【００４１】
別の好ましい態様において、本発明は、組成物中に含有される上記の核酸、特に上記のようなキメラオリゴヌクレオチドが、上記の標的遺伝子で挿入、欠損または置換させることが望まれる少くとも１つのヌクレオチドを除いて、上記細胞の標的遺伝子に相補的な配列を少くとも含んだポリヌクレオチドである、本発明による方法に関する。
【００４２】
“標的遺伝子に相補的な配列”とは、標的遺伝子配列の一部と理論上ワトソン‐クリック塩基対を形成しうる配列を意味し、その標的遺伝子配列の一部は、本発明の関係では、挿入（または欠損）または変更させることが前記の少くとも１つのヌクレオチドで望まれる標的配列の断片を特に含んでいる。グアニン／シトシンまたはアデニン／チミン（または／ウラシル）が、それらの間で水素結合を形成することが知られた相補的塩基の例である。
【００４３】
別の好ましい態様において、本発明は、組成物中に含有される上記のキメラオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであり、上記ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部が、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、上記細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性である、本発明による方法に関する。
【００４４】
別の好ましい態様において、本発明は、組成物中に含有される上記の核酸がキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであって、そのＤＮＡ／ＲＮＡ配列の少くとも一部が、標的変異遺伝子で復帰させることが望まれるその変異を除いて、上記細胞の標的変異遺伝子のゲノムＤＮＡ断片配列に相補性である、本発明による方法に関する。
【００４５】
好ましい態様において、標的変異遺伝子に存在する上記の変異は遺伝病に関与している。
【００４６】
本明細書において、“変異遺伝子”という用語は、配列が野生型遺伝子と比較して少くとも１つの変異（少くとも１つのヌクレオチドの欠損、付加または置換）を含んでおり、野生型機能性遺伝子によりコードされたタンパク質の正常機能の喪失を特に伴う病気または疾患にその変異が少くとも一部関与している遺伝子を意味すると理解されている。
【００４７】
別の好ましい態様において、本発明は、上記細胞を含む組織が眼組織、骨格筋組織、表皮および真皮組織からなる群より選択される、本発明による方法に関する。
【００４８】
別な好ましい態様において、本発明は、上記の標的細胞を含む組織が眼組織からなる群より選択され、組成物中に含有される上記のキメラオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補的な配列を少くとも含み、その標的遺伝子が変異すると眼遺伝病に少くとも一部関与しうる、本発明による方法に関する。
【００４９】
更に好ましい態様において、本発明は、上記の標的細胞を含む眼組織が網膜である、本発明による方法に関する。
【００５０】
別な好ましい態様において、本発明は、上記の標的細胞を含む組織が眼組織、特に網膜であり、ステップａ）が、上記の核酸を含有した組成物の硝子体内、眼周囲（結膜下、眼球周囲、眼球側部、テノン下）、網膜下または脈絡膜上、好ましくは硝子体内注入（intravitreal injection）のステップである、本発明による方法に関する。
【００５１】
本発明の方法で選択しうる標的遺伝子の中では、世界中で個体２０００例中約１例にかかる遺伝子的かつ表現型的に様々な疾患群である遺伝性網膜症に関与する遺伝子が特に挙げられる（Sohocki et al.,Hum Mutat,2001,17(1):42-51）。
【００５２】
これら標的遺伝子の中では、遺伝子の一部のｃＤＮＡのコドン３４７におけるナンセンスＣ→Ａ変異が色素性網膜炎に至る、ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードするネズミ遺伝子が挙げられる。
【００５３】
変異が色素性網膜炎および他の遺伝性網膜症を引き起こすこれら標的遺伝子の中では、ＲＰ１遺伝子が特に挙げられる。実際に、そのＲＰ１遺伝子において、そのロドプシン遺伝子における活性部位Ｌｙｓ‐２９６のミスセンス変異、例えばＫ２９６Ｅは、発色団結合部位を有さず光で活性化されないために常染色体優性色素性網膜炎（ＡＤＲＰ）を引き起こすオプシンを生産することがわかり、またはナンセンス変異Ｒ６７７‐ＳＴＯＰも、ＲＰ１遺伝子座とリンクした家族では、色素性網膜炎を伴うことがわかった（Payne et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,2000,41(13):4069-4073；Guillonneau et al.,Hum.Mol.Genet.,1999,8(8):1541-1546；Pierce et al.,Nat.Genet.,1999,22(3):248-254；Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995,92(8):3551-3555）。
【００５４】
低酸素誘導性因子‐１（ＨＩＦ‐１）は、ＨＩＦ‐１αおよびＨＩＦ‐１βサブユニットから構成される転写因子である。ＨＩＦ‐１は、酸素ホメオスタシスで重要な役割を果たす多数の遺伝子を転写促進する（Ozaki et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,1999,40(1):182-189）。そのため、例えば、炎症および新生血管形成に関与するいくつかの遺伝子の発現を支配する、転写因子ＨＩＦαをコードする遺伝子は、眼新生血管形成、主に網膜新生血管形成の患者を治癒する上で、標的にしうる（Wenger,J.Exp.Biol.,2000,203,1253-1263）。その正常配列ＰＣＤＨＧはヒト（４３９‐４６４）およびマウス（６６９‐６９３）で保存されている。コドン停止をもたらすキメラプラスト（キメラオリゴヌクレオチドも表わすために本明細書で用いられている用語）は、発現タンパク質がヒトまたはマウスで低酸素誘導性新生血管形成を促せないようにデザインしうる。
【００５５】
このように、別な好ましい態様において、本発明は、上記のキメラオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであり、上記オリゴヌクレオチドの配列の少くとも一部が、上記オリゴヌクレオチドの配列の上記一部でＣに入れ替わる変異ヌクレオチドＡを除いて、遺伝子の一部のｃＤＮＡのコドン３４７におけるナンセンスＣ→Ａ変異で色素性網膜炎に至るｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードするネズミ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補性である、本発明による方法に関する。
【００５６】
特に更に好ましい態様において、本発明は、上記のキメラオリゴヌクレオチドが：
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１を有するキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプ：
ＣＣＴＴＣＣＡＡＣＣＴＡＣＧＴＡＧＣＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＣＵＵＵＣＵＧＣＵＡＣＧＴＡＧＧＵＵＧＧＡＡＧＧＧＣＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＣ；および
‐マウスまたはヒトのような動物でｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードするネズミ遺伝子のｃＤＮＡのコドン３４７においてナンセンスＣ→Ａ変異を復帰させうる配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の必須要素を含んだ、ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプキメラオリゴヌクレオチド配列
からなる群より選択される、本発明による方法に関する。
【００５７】
本明細書において、“配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の必須要素”という用語は、この配列が、ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′‐Ｏ‐メチルＲＮＡ残基を含み、ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードする標的遺伝子に相補的なＲＮＡ／ＤＮＡ配列の一部が変更しえて、機能性ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニット遺伝子の相同的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで単一のミス対合ヌクレオチドを含んでいることを意味する。
【００５８】
別な好ましい態様において、本発明は、上記のキメラオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであり、上記オリゴヌクレオチドの配列の少くとも一部が、転写因子ＨＩＦ１αをコードするネズミまたはヒト遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補性であるが、但し少くとも１つのヌクレオチドはその相補性オリゴヌクレオチドの上記一部で欠損、挿入または置換されており、その配列によりコードされた発現ＨＩＦ‐１αタンパク質において、上記の断片がヒトまたはマウスで低酸素誘導性新生血管形成を促せない上記の少くとも１つの欠損、挿入または置換ヌクレオチドを含んでいる、本発明による方法にも関する。
【００５９】
特に更に好ましい態様において、転写因子ＨＩＦ１αをコードするマウスまたはヒト遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補的なＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプキメラオリゴヌクレオチドの上記オリゴヌクレオチドは：
‐ネズミまたはヒト転写因子ＨＩＦ１αで変異Ｅ１４２‐ＳＴＯＰを誘導しうるオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２：ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＡＧＡ  Ｇを有するオリゴヌクレオチド、または同変異を誘導しうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される。
【００６０】
変異Ｅ１４２‐ＳＴＯＰが誘導されうるネズミＨＩＦ１α遺伝子の配列の正常部分はＣＣＡ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＡＧＡ  Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）である。ヒトまたはマウスでその変異Ｅ１４２‐ＳＴＯＰを誘導しうるキメラプラストは、Ｃｈｉ  Ｈ／Ｍ  Ｅ１４２‐ＳＴＯＰと称される（“Ｃｈｉ”キメラプラスト、“Ｈ”ヒト、“Ｍ”マウス）。
【００６１】
別な好ましい態様において、本発明は、上記のキメラオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプであり、上記オリゴヌクレオチドの配列の少くとも一部が、ネズミまたはヒトＲＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補性であるが、但し少くとも１つのヌクレオチドはその相補性オリゴヌクレオチドの上記一部で欠損、挿入または置換されている、本発明による方法にも関する。
【００６２】
特に更に好ましい態様において、ネズミまたはヒトＲＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補的なＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプキメラオリゴヌクレオチドの上記オリゴヌクレオチドは：
‐ヒトＲＰ１タンパク質で変異Ｋ２９６ＥまたはＲ６７７‐ＳＴＯＰを復帰させうるオリゴヌクレオチド；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３：ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＧＣＡを有するオリゴヌクレオチド、または同変異Ｋ２９６Ｅを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４：ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  Ａを有するオリゴヌクレオチド、または同変異Ｒ６７７‐ＳＴＯＰを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される。
【００６３】
変異Ｋ２９６Ｅがヒトでオプシン変異を修正するために復帰させうるＲＰ１変異ヒト遺伝子の配列の一部はＧＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）である。
【００６４】
ヒトで変異Ｋ２９６Ｅを復帰させうるキメラプラストは、Ｃｈｉ  ＨＯＰＳ  Ｅ２９６Ｋと称される（“ＯＰＳ”オプシン）。
【００６５】
変異Ｒ６７７‐ＳＴＯＰがヒトでＲＰ１変異を修正するために復帰させうるＲＰ１変異ヒト遺伝子の配列の一部はＡＡＧ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＴＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）である。
【００６６】
ヒトで変異Ｒ６７７‐ＳＴＯＰを復帰させうるキメラプラストは、Ｃｈｉ  ＨＲＰ１  Ｒ６７７‐ＳＴＯＰと称される。
【００６７】
特に更に好ましい態様において、ネズミＲＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列断片に相補的なＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプキメラオリゴヌクレオチドの上記オリゴヌクレオチドは：
‐ネズミＲＰ１タンパク質配列で変異Ｋ２９６ＥまたはＥ３４８‐ＳＴＯＰを誘導しうるオリゴヌクレオチド配列；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５：ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  Ａを有するオリゴヌクレオチド、または同変異Ｋ２９６Ｅを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６：ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  Ａを有するオリゴヌクレオチド、または同変異Ｅ３４８‐ＳＴＯＰを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される。
【００６８】
マウスのオプシンで非常に有害な変異を誘導するようにデザインされたこれらのキメラプラスト“Ｃｈｉ  ＭＯＰＳＫ２９６Ｅ”、および“Ｃｈｉ  ＭＲＰ１  Ｅ３４８‐ＳＴＯＰ”は、マウスで変異のモデル、特にヒトでオプシンの変異が急激な網膜変性に至るという以前の知識に従う網膜変性のモデルを作製するために用いうる。
【００６９】
変異Ｋ２９６Ｅが誘導されうるマウスＲＰ１遺伝子の配列の正常部分はＧＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）である。
【００７０】
イオントホレシスによる治療剤の経皮送達のための装置は皮膚または眼疾患を治療するために常用されており、そのため既に開示されている。そのため、当業者であれば、イオントホレシス装置およびその使用条件、特に、核酸輸送の実施が望まれる標的細胞を含んだ組織へ適用される電流密度、電流を適用する期間、電極形態および位置などを容易に選択および決定しうるであろう。
【００７１】
既に開示されたイオントホレシス装置の中では、次の特許文献で開示された装置が挙げられる：１９７９年２月２７日付で発行されたＵＳ４，１４１，３５９；１９８１年１月１７日付で発行されたＵＳ４，２５０，８７８；１９８１年１１月２４日付で発行されたＵＳ４，３０１，７９４；１９８８年４月３１日付で発行されたＵＳ４，７４７，８１９；１９８８年６月２１日付で発行されたＵＳ４，７５２，２８５；１９９０年４月１０日付で発行されたＵＳ４，９１５，６８５；１９９０年１２月２５日付で発行されたＵＳ４，９７９，９３８；１９９３年１０月５日付で発行されたＵＳ５，２５２，０２２；１９９４年１２月２０日付で発行されたＵＳ５，３７４，２４５；１９９６年３月１２日付で発行されたＵＳ５，４９８，２３５；１９９８年３月２４日付で発行されたＵＳ５，７３０，７１６；１９９９年１２月１４日付で発行されたＵＳ６，００１，０８８；２０００年１月２５日付で発行されたＵＳ６，０１８，６７９；２０００年１０月３１日付で発行されたＵＳ６，１３９，５３７；２０００年１１月１４日付で発行されたＵＳ６，１４８，２３１；２０００年１１月２８日付で発行されたＵＳ６，１５４，６７１；および２０００年１２月２６日付で発行されたＵＳ６，１６７，３０２；それらの文献は参考のためここに組み込まれる。
【００７２】
本発明による方法で、核酸、特に上記のようなキメラオリゴヌクレオチドの眼内送達（“眼キメラプラスティ”）に用いうるイオントホレシス装置の中では、２０００年１１月２８日付で発行された特許文献ＵＳ６，１５４，６７１で開示されたイオントホレシスシステムが本方法のステップｂ）では好ましい。
【００７３】
（特許文献ＵＳ６，１５４，６７１で開示された）上記装置は、上記の核酸がステップａ）でイオン化溶液で局所適用または可能であれば注入される場合には、上記の核酸を含有した組成物、または上記の核酸がステップａ）で注入される場合には水溶液を収納するように成形されたリザーバーを特に装備して、内壁、外壁および内壁と外壁をつなぐ端壁を有しており、内壁および外壁は環状であって、眼球へ適用しるうように成形された自由端を有し、上記の装置はリザーバーに配置された少くとも１本の活性電極、別な電極および電流発生器を更に有しており、その少くとも１本の電極は端壁の内表面に配置された表面電極であり、内壁は既定の直径と少くとも等しくなるように形成された外径を有し、ここで既定の直径とはヒト角膜の直径を表わしている。
【００７４】
別な面において、本発明は、治療の必要なヒトまたは動物宿主における、標的細胞の標的遺伝子で変異を復帰または誘導しうる核酸、好ましくは上記のようなキメラオリゴヌクレオチドの投与からなる疾患の治療方法に関し、ここで、その遺伝子発現はその疾患に関連しており、上記の核酸をインビボで上記の標的細胞中へ送達するために用いられる方法は、本発明により核酸をインビボで送達するための方法である。
【００７５】
好ましい態様において、本発明に従い疾患を治療する方法において、上記の疾患は遺伝病である。
【００７６】
更に好ましい態様において、本発明に従い疾患を治療する方法において、上記の疾患は遺伝性網膜症である。
【００７７】
別な面において、本発明は、動物の標的細胞の標的遺伝子で変異を復帰または誘導しうる核酸、好ましくは上記のようなキメラオリゴヌクレオチドの投与からなる、動物モデルを得るための方法に関し、ここで、上記の核酸をインビボで上記の標的細胞中へ送達するために用いられる方法は、本発明により核酸をインビボで送達するための方法である。
【００７８】
別な面において、本発明は、動物モデルの使用からなる医薬または化粧用化合物のスクリーニングのための方法に関し、その標的細胞の標的遺伝子は、核酸、好ましくは上記のようなキメラオリゴヌクレオチド、即ち標的遺伝子で変異を復帰または誘導しうるキメラオリゴヌクレオチドの投与により修飾されており、ここで、上記の核酸をインビボで上記の標的細胞中へ送達するために用いられる方法は、本発明により核酸をインビボで送達するための方法である。
【００７９】
別の異なる面において、本発明は、ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′‐Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプに関し、上記ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部は、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、上記細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性であって、その標的遺伝子に相補的な配列の上記少くとも一部が：
‐ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットをコードするネズミ遺伝子のｃＤＮＡのコドン３４７においてナンセンスＣ→Ａ変異を復帰させうるオリゴヌクレオチド配列
からなる群より選択されることで特徴付けられる。
【００８０】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１を有する請求項２７によるキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプが好ましい。
【００８１】
別な面において、本発明は、ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′‐Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプに関し、上記ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部は、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、上記細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性であって、その標的遺伝子に相補的な配列の上記少くとも一部が：
‐変異ＨＩＦ１α遺伝子により発現されるタンパク質が機能性でないように、ネズミまたはヒト転写因子ＨＩＦ１αをコードするＤＮＡにおいてナンセンス変異ＳＴＯＰを誘導しうるオリゴヌクレオチド配列；
‐マウス転写因子ＨＩＦ１αでコードされるタンパク質において変異Ｅ１４２‐ＳＴＯＰまたはヒトＨＩＦ１αタンパク質配列で対応する変異を誘導しうるオリゴヌクレオチド配列；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２を有するオリゴヌクレオチド配列または同変異を誘導しうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されることで特徴付けられる。
【００８２】
別な面において、本発明は、ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′‐Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプに関し、上記ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部は、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、上記細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性であって、その標的遺伝子に相補的な配列の上記少くとも一部が：
‐ヒトＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡで変異を復帰させうるオリゴヌクレオチド配列：その変異は非機能性タンパク質、ＲＰ１またはオプシンタンパク質の発現に関与する；
‐ヒトオプシンまたはＲＰ１タンパク質配列で変異Ｋ２９７ＥまたはＲ６７７‐ＳＴＯＰを各々復帰させうるオリゴヌクレオチド配列；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３を有するオリゴヌクレオチドまたは同変異Ｋ２９７Ｅを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４を有するオリゴヌクレオチドまたは同変異Ｒ６７７‐ＳＴＯＰを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されることで特徴付けられる。
【００８３】
別な面において、本発明は、ＤＮＡ、ポリ（Ｔ）ヘアピンループおよびＧ‐Ｃクランプのストレッチに隣接する、２ブロックの２′‐Ｏ‐メチルＲＮＡ残基でデザインされたキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプに関し、上記ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列の一部は、標的ゲノムＤＮＡ配列と並べられたときに、そのＤＮＡストレッチで少くとも単一のミス対合ヌクレオチドを除き、上記細胞の標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に相補性であって、その標的遺伝子に相補的な配列の上記少くとも一部が：
‐ネズミＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡで変異を誘導しうるオリゴヌクレオチド配列：その変異は非機能性タンパク質、ＲＰ１またはオプシンタンパク質の発現に関与する；
‐ネズミオプシンまたはＲＰ１タンパク質配列で変異Ｋ２９７ＥまたはＥ３４８‐ＳＴＯＰを各々誘導しうるオリゴヌクレオチド配列；
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５を有するオリゴヌクレオチドまたは同変異Ｋ２９７Ｅを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド；および
‐配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６を有するオリゴヌクレオチドまたは同変異Ｅ３４８‐ＳＴＯＰを復帰させうるその断片を含んだオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されることで特徴付けられる。
【００８４】
別の異なる面において、本発明は、本発明によるキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプを含有した医薬組成物に関する。
【００８５】
別の異なる面において、本発明は、本発明に従い、ヒトオプシンまたはＲＰ１タンパク質配列で変異Ｋ２９７ＥまたはＲ６７７‐ＳＴＯＰを各々復帰させうるキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡと、宿主ＲＰ１ゲノムＤＮＡをインビボで接触させることからなる、ＲＰ１遺伝子で変異の存在により誘導される網膜症を有するヒト宿主を治療するための方法に関する。
【００８６】
別の異なる面において、本発明は、変異ＨＩＦ１αヒトまたは動物遺伝子により発現されるタンパク質が機能性でないように、本発明に従い、ヒトまたはネズミ転写因子ＨＩＦ１αをコードするＤＮＡにおいてナンセンス変異ＳＴＯＰを誘導しうるキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡ配列と、宿主ＨＩＦ１αゲノムＤＮＡをインビボで接触させることからなる、正常転写因子ＨＩＦ１α遺伝子の発現により誘導される眼新生血管形成を有するヒトまたは動物宿主を治療するための方法に関する。
【００８７】
別の異なる面において、本発明はＲＰ１に変異を含んだ動物モデルに関し、その変異はキメラオリゴヌクレオチドのインビボまたは半ビボ投与により誘導されたものであって、そのキメラオリゴヌクレオチドは本発明に従いＲＰ１変異を誘導しうるキメラオリゴヌクレオチドである。
【００８８】
ヒトまたは動物網膜症を治療しうる医薬化合物のスクリーニングのための本発明による動物モデルの使用も、本発明の一部を形成する。
【００８９】
本発明の理解を助けるために、一連の実験の結果を記載した下記例が掲載されている。本発明に関するこれらの例は説明のためであり、もちろん本発明を特に限定するものと解釈すべきではない。更に、現在知られているかまたは後で開発される、当業者の認識範囲内に属するような、本発明のこのようなバリエーションも、後の請求項で記載された本発明の範囲内に属するとみなされる。
【００９０】
例Ｉ：インビボでキメラオリゴヌクレオチドを網膜細胞中へイオントホレシス輸送することによるｒｄマウスの網膜変性の治療
Ｉ：ｒｄマウスにおける網膜変性の分子ベース
ｒｄ変異でホモ接合のマウスは遺伝的網膜変性を示し、ヒト色素性網膜炎のモデルとして役立つ。罹患動物において、網膜桿状体光受容体細胞は生後約８日目に変性し始め、４週目までに錐体は残されていない。変性は網膜でサイクリックＧＭＰの蓄積により先行され、桿状体ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼの活性不足と関連している。この酵素欠乏は、ｒｄ  β‐ＰＤＥ遺伝子でナンセンスＣ→Ａ変異の存在に起因している。そのナンセンス変異はエキソン７内でオーカー停止コドン（３４７位）を作製し、得られるｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼβ‐サブユニットで端部切欠きに至る。ｒｄ／ｒｄマウスで機能性ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼタンパク質の不在は、網膜変性に関与する。
【００９１】
ｒｄ  β‐ＰＤＥ遺伝子の停止変異の復帰が光受容体で機能性タンパク質をもたらして、疾患が治癒される、と考えられる。キメラオリゴヌクレオチドを用いた戦略は、点変異による遺伝病の他のモデルでも有効であることがわかっており、この挑戦向けに選択された。そこで、キメラプラスティがｒｄマウスの網膜変性に関与するナンセンス変異を修正するために用いられた。
【００９２】
キメラオリゴヌクレオチドは、局所注入およびイオントホレシス双方の組合せを用いて標的組織中へ送達された。
【００９３】
例II：物質および方法
物質
１）キメラオリゴヌクレオチド
ＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドを合成して、GensetOligos（フランス）による高圧液体クロマトグラフィーにより精製した。そのオリゴヌクレオチドを蒸留水に再懸濁し、２６０ｎｍで紫外線吸収により定量した。キメラオリゴヌクレオチドの配列は次のとおりである：
【００９４】
下記配列（配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）を有する特定キメラオリゴヌクレオチド（名称Ｃｈｉ）（２′ＯＭｅＲＮＡヌクレオチドは下線部分である）：
５′ＣＣＴＴＣＣＡＡＣＣＴＡＣＧＴＡＧＣＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＣＵＵＵＣＵＧＣＵＡＣＧＴＡＧＧＵＵＧＧＡＡＧＧＧＣＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＣ３′
【００９５】
コントロールキメラオリゴヌクレオチド（名称Ｃｔｒ）（配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）（２′ＯＭｅＲＮＡヌクレオチドは下線部分である）：
５′ＣＴＡＣＣＡＡＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴＡＵＵＵＣＵＧＵＣＣＡＴＣＡＧＧＵＡＧＧＡＧＵＧＧＧＣＴＣＧＣＧＴＧＣＧＴＴＣ３′
【００９６】
２）動物
ナンセンス変異（３４７位）を有するＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを購入した（Iffa Credo）。ｒｄ／ｒｄ変異の不在または存在を確認するための遺伝子型検査を、テールバイオプシーからのＤＮＡのＰＣＲ、その後で制限断片分析により行った。動物に食物および水を随意に与え、それを１２ｈ明／１２ｈ暗の無病原体条件下で維持した。
【００９７】
３）クーロン制御イオントホレシス（ＣＣＩ）システム
（２０００年１１月２８日付のＵＳ特許６，１５４，６７１で開示されているような）OPTIS Franceによりデザインされた薬物送達装置を用いてイオントホレシスを行った。容器は経角強膜イオントホレシスを行うようにデザインした。白金電極を容器の底に置き、２本のシリコーンチューブを側面に置いた。１本のチューブは緩衝液を注入するため、他は泡を吸引するために用いた。ＣＣＩ電子ユニットは６００ｓｅｃにわたり２５００μＡまで供給しうる。視聴覚アラームは電気回路の各破壊を示して、産物の検量および制御送達を保証する。イオントホレシス処理を続けるために、ＣＣＩ眼用カップを目の上に置き、他の電極を動物に接触させたままで維持した。
【００９８】
方法
１）注入およびイオントホレシス
眼科および視覚検査で動物の使用に関するＡＲＶＯ発表に従い実験を行った。次の処理は生後（Ｐ）７日目に投与し、Ｐ９に繰り返した：マウスをクロルプロマジンおよびケタミンの腹腔内注入で麻酔した。顕微鏡でみながらガラスマイクロキャピラリーを用いて硝子体中へ眼注入を行った。硝子体内注入直後に、クーロン制御イオントホレシスを行った。イオントホレシスパラメーターは３００ｓｅｃで３００μＡであった。負電荷電極を目の上に置いた。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の溶液を薬物容器中へ連続ポンプ導入した。
【００９９】
２）ビオチニル化キメラオリゴヌクレオチドを用いたオリゴヌクレオチドトランスフェクション分析
ビオチニル化キメラオリゴヌクレオチドを、上記のように注入し、次いでイオントホレシスした。処理１時間後に目を摘出し、直ちにＯＣＴ（Tissue Tek,ＵＳＡ）で凍結させ、切片（１０μｍ）に切り取った。それらをメタノール中−２０℃で１０分間固定した。次いで、その切片を１％Triton X-100 ＰＢＳで洗浄し、１／１００ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼＰＢＳ溶液中室温で２時間インキュベートした。切片を洗浄し、Ｈ２Ｏ２の存在下で３，３′‐ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドを用いて、その複合体を顕在化させた。最後に、切片をヘマランで対比染色した。
【０１００】
３）ＲＴ‐ＰＣＲ産物の制限断片分析によるｒｄ変異試験
全ＲＮＡを、酸グアニジニウムチオシアネート‐フェノール‐クロロホルム法により、最終処理から１８日目（Ｐ２７）にｒｄ／ｒｄマウスの単一網膜から抽出した。網膜全ＲＮＡ（１μｇ）を鋳型として用い、容量２０μＬ中でマロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素２００Ｕを用いてｃＤＮＡを合成した（２１℃で１０分間、４２℃で１時間、５５℃で５分間、４２℃で１０分間）。オリゴヌクレオチドプライマーは、β‐ｃＧＭＰ‐ホスホジエステラーゼｃＤＮＡのヌクレオチド９２１‐９４３および１２５８‐１２７９位に各々位置する、配列５′‐ＧＧＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣ‐３′（配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）および５′‐ＣＣＣＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡ‐３′（配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）を含んでいた。ＲＴ産物を容量１００μＬ中でＴａｑポリメラーゼ３Ｕおよび上記のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた。９４℃で５分間の初期変性、１分間にわたる９４℃の変性温度、１分間にわたる５５℃のアニーリング温度、１分間にわたる７２℃の伸長温度および７２℃で１０分間の最終伸長からなる３０回のＰＣＲサイクルをサーマルサイクラーで行った。ＰＣＲ緩衝液はα‐３２Ｐ  ｄＣＴＰを含有していた。各ＰＣＲ反応後、産物を所定の緩衝液中３７℃で一夜かけて２．５単位ＢｓａＡＩおよび／または５単位ＤｄｅＩで消化し、次いでエタノール沈降させ、洗浄し、ゲルローディング緩衝液１０μＬに再懸濁した。産物を５００ボルトで３時間にわたり８％非変性ポリアクリルアミドゲル上でランした。ゲルをフィルムに３日間曝露した。＋／＋網膜および未処理ｒｄ／ｒｄ網膜からのＲＮＡはコントロールとして用いた。
【０１０１】
４）平坦固定網膜の免疫組織化学検査
コントロールおよびコントロール処理動物で桿状体光受容体の残存率を分析するために、我々は全固定網膜でオプシン免疫組織化学検査を行った。我々の抗体Ｒｈｏ４Ｄ２は、桿状体光受容体の光色素であるオプシンを特異的に認識する。目を摘出し、ＰＢＳ／パラホルムアルデヒド４％中で３０分間固定させた。網膜を切片化し、メタノール中−２０℃で１０分間固定させ、１％Triton X-100 ＰＢＳで３回洗浄し、１／１００Ｒｈｏ４Ｄ２、１％Triton X-100 ＰＢＳ溶液中室温で一夜インキュベートした。次いで網膜を洗浄し、１／２５０抗マウスAlexa 40抗体と共に室温で２時間インキュベートし、洗浄し、グリセロール／ＰＢＳで平坦固定させた。それらを蛍光顕微鏡で観察および写真撮影した（図３Ｂ）。撮影はすべて同一のフィルム（lllford 400ASA）、露出時間（１時間３０分）で行い、全く同様にして現像した。平坦固定網膜の写真を走査した。桿状体光受容体の数はコンピューター画像分析システム（ＮＩＨ）を用いて測定した。
【０１０２】
５）統計分析
結果は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表示した（図３Ａ参照）。統計分析は非母数Man Whitney Ｕ検定を用いて行った。
【０１０３】
例III：結果および考察
キメラプラストデザイン
キメラプラスティ規則を用いて、マウスｒｄ  β‐ＰＤＥ遺伝子でコドン３４７内に位置するＣ→Ａ点変異を復帰させうる可能性を有したＤＮＡ／ＲＮＡ２′ＯＭｅオリゴヌクレオチド（名称Ｃｈｉ）をデザインした。コントロールオリゴヌクレオチド（名称Ｃｔｒ）は、異なる配列であるが、活性キメラオリゴヌクレオチドと同様の塩基組成を有している。
【０１０４】
キメラオリゴヌクレオチドによる光受容体トランスフェクション
ビオチニル化オリゴヌクレオチドによる実験では、その硝子体内注入のみと比較して、イオントホレシスが網膜細胞中へのオリゴヌクレオチド取込みを高めることを、明らかに証明している。特に、光受容体への取込みは図１Ａ〜１Ｃで明確にみられる。
【０１０５】
ｒｄ  β‐ＰＤＥ  ｍＲＮＡによる点変異修正
ＲＴ‐ＰＣＲを摘出網膜でｒｄ  β‐ＰＤＥ  ｍＲＮＡ特異的プライマーにより行った。コドン３４７のｒｄナンセンス点変異はＤｄｅＩ制限部位を生じて、野生型配列からＢｓａＡＩ部位を取り除く。ＢｓａＡＩまたはＤｄｅＩによる３５９ｂｐ  β‐ＰＤＥ  ｃＤＮＡの消化で、１２０ｂｐおよび２３９ｂｐの２つの診断用断片を得る。この方法により、ｍＲＮＡレベルで変異配列（ＤｄｅＩ感受性）と野生型配列（ＢｓａＡＩ感受性）との識別を行える。
【０１０６】
硝子体内注入およびイオントホレシスを生後７および９日目のマウスで行った。ＲＴ‐ＰＣＲ実験と次の制限切断とは、生後２７日目にｒｄ  β‐ＰＤＥ  ｍＲＮＡ修正におけるキメラオリゴヌクレオチドの効果を調べるために、異なる条件下で行った。
【０１０７】
図２のゲルは次のことを示した：
・ｒｄ／ｒｄ  β‐ＰＤＥ  ｃＤＮＡはＤｄｅＩのみで全体的に切断され、これは変異配列のみを認識した（４〜６列目）；
・＋／＋β‐ＰＤＥ  ｃＤＮＡはＢｓａＡＩで全体的に切断され、これは野生型配列のみを認識した（１〜３列目）。それにもかかわらず、ＢｓａＡＩ切断産物のわずかな存在がＢｓａＡＩの特異性のわずかな欠如を示した；
・キメラプラスト特質化マウスからのβ‐ＰＤＥ  ｃＤＮＡは、硝子体内注入に次いでイオントホレシスが行われたときのみ、ＢｓａＡＩおよび一部ＤｄｅＩで切断された（１３〜１５列目）。それは、キメラオリゴヌクレオチドＣｈｉがｒｄ点変異を野生型ヌクレオチドへ復帰させうることを証明していた。更に、それは双方の技術（硝子体内注入およびイオントホレシス）の組合せのみがキメラプラスト媒介遺伝子修正を行いうることを示した；
・コントロールキメラプラスト特質化マウスからのβ‐ＰＤＥ  ｃＤＮＡは、ＤｄｅＩおよびわずかにＢｓａＡＩで切断された（１６〜１８列目）。ＢｓａＡＩ反応性は、ｒｄ／ｒｄ  β‐ＰＤＥ  ｃＤＮＡ切断後に既に観察されていた特異性の欠如により説明できた（５列目）；および
・水特質化マウスからのβ‐ＰＤＥ  ｃＤＮＡはＤｄｅＩのみで切断され、遺伝子修正がキメラオリゴヌクレオチドの存在下のみで生じることを示した（７〜９列目）。
【０１０８】
光受容体救済
桿状体光受容体の量を、Ｐ２７で、キメラプラスト処理動物およびコントロールの平坦固定網膜で計測した。未処理動物およびコントロール処理動物と、硝子体内水注入に次ぎイオントホレシスで処理された動物において、疾患のその段階における残存量は無視しうる。桿状体光受容体残存量の極めて大きな増加は、キメラプラスト／イオントホレシス処理動物のみで観察しうる。
【０１０９】
イオントホレシスは、低強度電流を用いて薬物を送達する非侵襲性プロセスであることが知られている。イオン性薬物を組織中へ輸送するためには、薬物の荷電と同極性の電極を用いる。眼内または周囲注入後に細胞組織中、特に眼細胞中への核酸、例えばキメラオリゴヌクレオチドＤＮＡ／２′ＯＭｅＲＮＡタイプの浸透を高めるために、および眼内注入後、前またはそれと同時に網膜輸送または浸透を高めるために、イオントホレシスが用いうることを、本発明者らはこうして証明したのである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ：ヘマランで染色されたラット網膜の組織切片
図１Ａ：コントロール網膜
図１Ｂ：ビオチニル化キメラプラスト(chimeraplast)の硝子体中への注入後における網膜。染色は網膜またはＲＰＥで観察されず、キメラプラストが網膜中へ浸透しなかったことを示している。
図１Ｃ：キメラプラストの硝子体中への注入、次いで塩水のイオントホレシス後における網膜。網膜層、ＲＰＥおよび脈絡膜で透明な褐色ＤＡＢ染色があり、キメラプラストの浸透が電流の適用により高められたことを示している。
【図２】図２：β‐ｃＧＭＰホスホジエステラーゼｃＤＮＡの制限断片長分析
ＲＴ‐ＰＣＲは、生後２７日目に摘出網膜でｒｄ  β‐ＰＤＥ  ｍＲＮＡ特異的プライマーにより行われた（但し、４〜７列目は生後１０日目に分析された）。コドン３４７のｒｄナンセンス点変異はＤｄｅＩ制限部位を作製して、野生型配列からＢｓａＡＩ部位を取り除く。ＢｓａＡＩまたはＤｄｅＩによる３５９ｂｐ  β‐ＰＤＥ  ｃＤＮＡの切断で、１２０ｂｐおよび２３９ｂｐの２つの診断用断片を得る。この方法で、ｍＲＮＡレベルで変異配列ｒｄ／ｒｄ（ＤｄｅＩ感受性）と野生型配列＋／＋（ＢｓａＡＩ感受性）との識別を行える。
図２のゲルは、電気泳動分離による制限断片長分析を表わしている：
‐１〜３列目：未処理の野生型ｃＣＤＡ配列（＋／＋）；および
‐４〜１８列目：未処理（４〜６列目）、水注入処理（７〜９列目）、イオントホレシス輸送を伴わないキメラプラスト注入（１０〜１２列目）、イオントホレシス輸送を伴うキメラプラスト注入（１３〜１５列目）、イオントホレシス輸送を伴うコントロールキメラプラスト注入（１６〜１８列目）の変異配列（ｒｄ／ｒｄ）
【図３】図３Ａおよび３Ｂ：免疫染色による桿状体残存量
図３Ａ：桿状体光受容体の量が、生後２７日目（Ｐ２７）に、キメラプラスト処理動物（“活性キメラ”）およびコントロール（“寄せ集めキメラ”）の平坦固定網膜で計測された。結果は平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表示された。
図３Ｂ：オプシン免疫組織化学検査が全固定網膜で行われた。キメラプラスト処理動物（“活性キメラ”、右図）およびコントロール（“寄せ集めキメラ”、左図）の平坦固定網膜の蛍光顕微鏡観察による走査写真
【図２】
2004532844.tif 000003
【図３Ａ】
2004532844.tif 000004
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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