(57)【要約】本発明は、マッピング方法に使用するためのマーカーを同定する方法であって、該マーカーが該マッピングパネル自体に由来するものを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を分析する方法であって、
ａ）２つ以上のメンバーを含む核酸試料のマッピングパネルを供するステップであって、各メンバーが核酸断片セットを含むステップと、
ｂ）該マッピングパネルの２つ以上のメンバーをプールし、その中の１つ以上の核酸断片を特徴づけて１つ以上のプローブを同定するステップと、
ｃ）ｂ）で同定した１つ以上のプローブを用いてマッピングパネルをスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記マッピングパネルの全てのメンバーがプールされる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
既知のマーカーと連鎖する１つ以上のマーカーを作製する方法であって、
ａ）２つ以上のメンバーを含むマッピングパネルを供するステップであって、各メンバーが核酸断片セットを含むステップと、
ｂ）第１のマーカーを含有する該マッピングパネルのメンバーを同定するステップと、
ｃ）該第１のマーカーを含有する該マッピングパネルの２つ以上のメンバーを選択し、該２つ以上のメンバー間に共通の核酸断片について該２つ以上のメンバーを濃縮するステップと、
ｄ）該２つ以上のメンバー間に共通の１つ以上の断片を特徴づけて、該第１のマーカーと連鎖する１つ以上のマーカーを提供するステップと
を含む方法。
【請求項４】
マーカーが、配列決定によって特徴付けられる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記マッピングパネルが、ＨＡＰＰＹマッピングパネルまたはＲＨマッピングパネルである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記マッピングパネルが、２、４、８、１６、３２、６４、９６、１００、１１０、１２８または２５６のメンバーを含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記核酸断片が、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって濃縮される請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸をマッピングする際のマッピング方法に使用するためのマーカーを作製する技術に関する。特には、本発明は、ＨＡＰＰＹマッピングまたは放射線ハイブリッド（ＲＨ:radiation hybrid）マッピングに適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＰＰＹマッピングは、任意の生物のゲノムの連鎖マッピングのために開発された方法である。それは、当初、Dearらによって1989年に、ＤＮＡ源として１つの一倍体精子を使用して記載され(DearおよびCook、(1989)Nucleic Acids Res.17:6795)、後に、ＤＮＡ源として多数の二倍体細胞を使用し、次にＤＮＡ希釈し、各々が理想的には０．６９一倍体当量(0.69 haploid equivalents)を含有するマッピングパネルメンバーに分割し、評価することができるマーカー連鎖を使用するように適合された。この技法はいくつかの文献において総説され、使用されている（例えば、DearおよびCook、(1993)Nucleic Acids Res.21:13-20、Piperら、(1998)Genome Res.8:1299-130およびそこに引用されている種々の文献）。
【０００３】
基本的には、ＨＡＰＰＹマッピングは、ゲノムＤＮＡを物理的に分離された断片に切断し、試料パネルであって、各々が当該ゲノムの１一倍体当量（理想的には、バルクゲノムＤＮＡからサンプリングする場合には、０．６９一倍体当量）以下に等しい量のＤＮＡを含有するものを提供することに関する。次いで、一連のマーカーの存在について試料をスクリーニングする。ゲノム内で接近して位置するマーカーは、ゲノム内で距離をおいて位置するマーカーと比べて、より多く同時分離(cosegreagte)する。マーカーパネルを用いて得られる同時分離の表を分析することによって、ゲノム内のマーカーの順序および空間的位置を推定することができる。
【０００４】
ＨＡＰＰＹマッピングの主な用途には、ゲノムおよび遺伝子マッピング、菌株の多様性の検出、集団解析、疫学、遺伝子発現、ならびに系統発生学的および分類学的関係の証明が挙げられる。
【０００５】
当技術において使用される核酸をマッピングする別の技法が、放射線ハイブリッド（ＲＨ）マッピングとして知られている。一倍体ＲＨマッピングでは、宿主（例えば、げっ歯類）−ドナー（例えば、ヒト）体細胞ハイブリッドであって、１つのヒト染色体を含有するものにＸ線を致死的に照射し、染色体をいくつかの断片に切断する。照射された細胞は生存能力がないが、正常なげっ歯類細胞株と融合することができる。種々の選択方法（典型的には、選択培地における増殖、照射細胞によってだけ産生される酵素を要求する生存に関係する）を使用して、照射細胞と未照射げっ歯類細胞の融合によって生じるハイブリッドを選択することができる。このようなハイブリッドは、無傷のげっ歯類染色体セット以外に、体細胞ハイブリッドの断片状の染色体を有し、培養中に、このような断片の多くは失われ、サブセットだけがハイブリッド内に保持される。このようなハイブリッドは各々元のヒト染色体由来の独自の断片セットを含有し、ヒトマーカーの有無についてクローンを分類することができる。ＲＨマッピングの基本的な前提は、２つの遺伝子座が染色体上で近いほど、照射が両者間の切断を生じさせる可能性は低いということである。従って、染色体上で接近しているマーカーは、ハイブリッドクローン内で関連のある保持パターンを示すが、離れている遺伝子座はほぼ独立に保持される。
【０００６】
一倍体ＲＨマッピングは、分類エラーが存在しない場合には、各ハイブリッドクローン内の各ヒトマーカーのコピー数を観察できるという利点を有する。クローンが陽性の試験結果の場合には、１コピーのマーカーが存在し、陰性の試験結果の場合には、コピーは存在しない。一倍体方法の主な欠点は、それが労働集約的であるということである。ドナー染色体の各々をマッピングするためには、ハイブリッドの別個のパネルを構築しなければならない。この問題に対処するために、全ゲノムＲＨマッピング方法が開発された。この手法は、げっ歯類−ヒトハイブリッド細胞株ではなく、二倍体ヒト細胞株を照射することに関する。全ゲノム方法の利点は、１セットのハイブリッドを使用してヒトの染色体全てをマッピングすることができるということである。二倍体ハイブリッドの欠点は、ハイブリッド内にマーカーが存在するかどうかを判定することだけが可能であるということである。マーカーが存在する場合には、１コピーまたは２コピーが存在するかどうかは不明である。いくつかの二倍体ハイブリッドからのさらに予備的な試験結果によると、ヒト染色体断片は、二倍体ハイブリッドでは、一倍体ハイブリッドと比べてより低い割合で保持されていることが示唆されている。
【０００７】
ＨＡＰＰＹまたはＲＨマップを作製する際に遭遇する大きな困難の１つは、ゲノム内の好適なマーカーの同定である。ＨＡＰＰＹマッピングの適用は、最初に、種々の技法を使用してマッピングパネルの全てのマーカーを同時に「事前増幅(pre-amplification)」し、次いで、特定のプライマーを使用して事前増幅した試料を事前に定めたマーカーについてＰＣＲによってスクリーニングすることに関係している。ＨＡＰＰＹマッピングについて記載している早期の理論的な論文(Dearら、1989)において、短鎖で任意のプライマーを用いた低いストリンジェンシーのＰＣＲ増幅で生じる多数の産物がマーカーとして働き、費用のかかるマーカー特異的プライマーの必要性がなくなることが示唆された。しかし、マッピング方法に使用するマーカーを作製する方法の必要性がある。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、マッピングパネルそのものからマーカーを作製するステップを含む、核酸をマッピングする方法を提供する。このような方法で得られるマーカーは従来のマーカーを上回るいくつかの利点を有し、マッピング対象の核酸の任意の特定の領域を精密にマッピングする際の助力となる。
【０００９】
従って、第１の態様において、本発明は、核酸を分析する方法であって、
ａ）２つ以上のメンバーを含む核酸試料のマッピングパネルを供するステップであって、各メンバーが核酸断片セットを含むステップと、
ｂ）該マッピングパネルの２つ以上のメンバーをプールし、その中の１つ以上の核酸断片を特徴づけて１つ以上のプローブを同定するステップと、
ｃ）ｂ）で同定した１つ以上のプローブを用いてマッピングパネルをスクリーニングするステップと
を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明によると、マーカーは、マッピングパネルそのものに由来する。これには数多くの利点がある。例えば、ある種のドナー配列は、ＲＨパネルにおいて、より首尾よく保持されていることや、ＨＡＰＰＹマッピングパネルの事前増幅に使用されるある種の方法は、ある種の配列を増幅できないことがあることが知られている。どちらの場合も、効率的にマッピングできないマーカーがある。マッピングパネルの全てのメンバーを組み合わせて、このプールのＤＮＡ断片を配列決定し、後のマッピング（同じパネルを使用する）のマーカーとして使用する場合には、マーカー配列は、首尾よくマッピングパネルへ表されているものに、自然に濃縮される。従って、この方法で得られるマーカーを特徴づける成功率は、このマッピングパネルを参照しないで規定されるマーカーより高い。
【００１１】
さらに、より精密にマッピングすることが望ましい領域の既知のマーカーの周囲に存在するが、さらなる情報を入手できないマーカーを得ることが望ましい状況もある。従って、第２の態様では、本発明は、既知のマーカーと連鎖する１つ以上のマーカーを作製するであって、
ａ）２つ以上のメンバーを含むマッピングパネルを供するステップであって、各メンバーが核酸断片セットを含むステップと、
ｂ）第１のマーカーを含有する該マッピングパネルのメンバーを同定するステップと、
ｃ）該第１のマーカーを含有する該マッピングパネルの２つ以上のメンバーを選択し、該２つ以上のメンバー間に共通の核酸断片について該２つ以上のメンバーを濃縮するステップと、
ｄ）該２つ以上のメンバー間に共通の１つ以上の断片を特徴づけて、該第１のマーカーと連鎖する１つ以上のマーカーを提供するステップと
を含む方法を提供する。
【００１２】
第１のマーカーを含有することが見出されているマッピングパネルの任意のメンバーは、このマーカーを保有するＤＮＡ断片を含有しなければならず、一方または両方の側の隣接ＤＮＡ配列を保有する。しかし、このようなパネルメンバーはまた、マーカーから離れたゲノム部分の多数の他のＤＮＡ断片も含有する。各々がマーカーを含有する２つのパネルメンバーを選択し、両方のメンバーに共通のＤＮＡ配列だけを考慮する場合には、マーカーに隣接する配列は、そこから離れた配列より濃縮される。例えば、各パネルメンバーが正確に半分のゲノム等量の断片を含有する場合には、マーカーから離れた配列が両方のメンバーに存在する確率はわずか２５％であるが、マーカーに隣接する配列が両方に存在する確率は１００％に近い。３、４またはそれ以上のパネルメンバーに共通のＤＮＡ配列を考慮する場合には（その各々がマーカーを含有することが知られている）、マーカーに近い配列はマーカーから離れたものより明らかに濃縮される。相対的な濃縮は、考慮するパネルメンバーの数と共に増加し、マーカーからの距離が増すと低下する。従って、本発明は、マーカー連鎖を示す配列の相対的な濃縮(relative enrichment for sequences showing marker linkage)を提供し、ＲＥＡＬ  ＨＡＰＰＹマッピングという。
【００１３】
問題のマーカー、それに連鎖するさらに別のマーカーを含有する断片について、核酸断片プールを濃縮したことは、プール内の断片を特徴づけて、マーカー配列を同定することによって簡単に同定することができる。例えば、断片を少なくとも部分的に配列決定し、配列に相補的であると選択したプローブを同定することができる。このようなプローブは、濃縮のために使用した第１のマーカーに密接に連鎖するマーカーを同定する。
【００１４】
本発明に使用するマッピングパネルは、マッピングすることが意図されているゲノムＤＮＡまたは任意の他の起源に由来するＤＮＡ断片を含有する任意のマッピングパネルであってもよい。有利なことに、それはＨＡＰＰＹまたはＲＨマッピングパネルである。パネルは少なくとも２つのメンバーを含み、有利には、約４、８、１６、３２、６４、９６、１００、１１０、１２８、２５６以上のメンバーを含む。さらに別のメンバーが対照試料として存在してもよい。
【００１５】
断片を選択するために選ぶ第１のマーカーは任意の既知のマーカーであってもよい。有利なことに、それは、より精密にマッピングすることが望ましい領域のマーカーである。本発明の方法によって得られるさらに別の任意のマーカーは、第１のマーカーと密接に連鎖する可能性が高い。
【００１６】
マーカーの検出は、任意の技法、例えば、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって実施することができる。
【００１７】
第１のマーカーを含有することが見出されているパネルメンバーを、共通の配列について濃縮する。種々の方法でこれを実施することができ、例えば、１つの試料を固相に固定して、変性させ、第２の試料を変性させ、第１の試料にハイブリダイゼーションさせ、未結合の配列を粗い流すサブトラクティブハイブリダイゼーションを含む。結合した配列は両方の試料に共通であり、回収される。同じ方法を反復して使用し、３つ以上の試料に共通の配列を単離することができる。
【００１８】
マーカーは、適当である任意の形態の特徴によって、濃縮した断片において同定することができる。例えば、断片を配列決定して、プローブとして使用することができるまたは相補的なプローブの鋳型として使用することができるマーカー配列を同定することができる。しかし、マーカーを配列決定する必要はないこともある。ＰＣＲを使用して、精製して、プローブとして直接使用することができる断片の核酸を増幅しても、または断片を単にショットガンクローニングして、回収した挿入物をプローブとして使用してもよい。しかし、プローブが得られ、試料が共通の配列について濃縮される場合には、プローブは第１のマーカーと密接に連鎖するマーカーを検出する可能性が高い。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、マイクロタイタープレートの内容物をさらに別の手法および操作により追跡できるように、それらをコード化する方法に関する。マイクロタイタープレートの内容物を別のプレートに移したりもしくは別のプレートの試料と合わせたりまたはゲルにロードしても、本発明の方法により、マイクロタイタープレートの内容物を追跡することができる。
【００２０】
本発明のこの態様の第１の実施態様において、不活性な蛍光マイクロスフェア（例えば、Molecular Probes A3703）などの固相マーカーをプレートのウェルのいくつかに添加する。このように標識したウェルのパターンは、プレート内容物の独自の「サイン」となる。例えば、マーカーの位置は二進数でコード化することができる。
【００２１】
好ましい実施態様において、ＰＣＲを目的とするマイクロタイタープレートにマイクロスフェアを添加する。粒子は反応を妨害せず、試料をその後分析する場合には、ゲルにロードされる。マイクロタイタープレートの「コード」はゲルに移され、蛍光粒子を含有するウェルは、ゲルをＵＶ光線下で撮影すると光る。粒子は電気泳動中ゲル内に移動しない。これは、電気泳動中に試料を追跡する際の一般的な問題を克服する。すなわち、マイクロタイタープレート上のバーコード等をプリントすることは容易であるが、ゲルにコード番号を移すことは困難である。別の実施態様において、ＤＮＡをゲルの未使用のウェルのいくつかにロードして、２進コード化する。しかし、これにより、ユーザーは、マイクロタイタープレートの数を読み取り、同じ数がゲル上にコード化されるように配列しなければならない。本発明のシステムによると、ＰＣＲを開始するロボットは、蛍光粒子を添加することもでき、さらなる介入やエラーの発生を生じることなく、ロード時に「コード」はゲルに移される。
【００２２】
本発明は、さらに別の実施態様にさらに適用可能である。例えば、１つのプレートの試薬セット（例えば、ＰＣＲ鋳型セット）および別のプレートの別のセット（例えば、ＰＣＲプライマーセット）によって反応液を調製する場合には、ウェルに粒子を固定することによって各起源−プレートをコード化することができる。便利なことに、コード化は１つのプレートの最初の列のウェルを占め、他のプレートの最後の列を占めることができる。（２つの起源のプレートの内容物を含有する）反応プレートは両方のセットのコード用マーカーを保有する。ＵＶ照射下でプレートを画像化することによって、コードを見ることができ、確証することができる。または、試料をゲル電気泳動で分析するとき、コードが見られる。
【００２３】
より複雑なコードを提供するためまたは同一セットのウェル内に２つ以上のコードを重複させられるように、多数の色を使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
［発明の詳細な説明］
本明細書に記載する一般的な技法は当技術上既知であるが、特に、Sambrookら、分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)(1989)およびAusubelら、分子生物学の簡単なプロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)(1999)第4版John Wiley & Sons, Inc（並びに、分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)の完全版）を参照することができる。
【００２５】
１．定義
本明細書において言及される「マッピングパネル」は、別個の試料またはメンバーに分離されている核酸断片のパネルである。パネルの各メンバーは、Dear&Cook(1989)におけるように、１つの一倍体細胞から単離された断片状ＤＮＡのいくつかの分画（典型的には、１／２または１／３）からなってもよい。さらに一般的には、各メンバーは、２つ以上の一倍体細胞または１つ以上の二倍体細胞から調製され、理想的には質量が０．６９ゲノムに等しい量のＤＮＡ（すなわち、０．６９一倍体当量）を含有する断片状ＤＮＡ試料からなってもよい。この量は、バルクＤＮＡからサンプリングされた配列のポアゾン分布とすると、全てのマーカーの約半分が各試料に提供されるが、約０．０５〜２、好ましくは０．２〜１．５の量のＤＮＡも許容可能な範囲内である。２コピーを超える使用は不利であるが、使用することができるコピー数に決まった下限はない。各マーカー配列が少なくとも１つの（好ましくは２つ以上の）メンバーにおいて確実に発現されるのに十分なパネルメンバーが分析されれば、本発明の原則は、分割量あたり任意に低い量のＤＮＡに適用することができる。
【００２６】
「マーカー」は、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション分析によって連鎖検討において同定することができる核酸配列である。有利なことに、それは分析中のゲノム内で実質的に独自であり、（ＲＨマッピングに使用する場合には）宿主細胞に存在する全ての配列と実施的に異なるので、その同定は明白である。
【００２７】
核酸断片の「特徴づけ」は、マーカーの同定を可能にする任意の過程をいう。従って、一実施態様において、核酸配列は配列決定によって特徴づけることができる。または、それらはＰＣＲ、クローニング等によって特徴づけることができる。
【００２８】
「プローブ」は、マーカーを検出するために使用することができる核酸分子である。例えば、プローブは、マーカーと相補的な核酸であっても、またはマーカーを増幅するために使用することができるプライマーであってもよい。
【００２９】
「濃縮」は、総集団に対する集団中のメンバーの割合を増加する手法をいう。従って、本発明において、２つ以上の試料に存在する配列は、試料をプールし、両方の試料に共通でない配列を排除するかまたは具体的には共通の配列を増幅することによって濃縮することができる。
【００３０】
２．ＨＡＰＰＹマッピング
ＨＡＰＰＹマッピングの一般的な技法は当技術上既知であり、文献に広範に記載されている。ＨＡＰＰＹマッピングの詳細な説明を含む以下の開示内容は全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている：Konfortovら、Genome Res.2000 Nov;10(11):1737-42、WilliamsおよびFirtel,Genome Res.2000 Nov;10(11):1658-9、Piperら、Genome Res.1998 Dec;8(12):1299-307、Lynchetら、Genomics.1998 Aug 15;52(1):17-26、Dearら、Genomics.1998 Mar 1;48(2):232-41、Walterら、Nucleic Acids Res.1993 Sep 25;21(19):4524-9、Dearおよびcook、Nucleic Acids Res.1993 Jan 11;21(1):13-20、DearおよびCook、Nucleic Acids Res.1989 Sep 12;17(17):6795-807。本発明は、有利なことに、ＨＡＰＰＹマッピングに使用する新規マーカーを作製するために使用される。
【００３１】
３．プローブ
本明細書において言及するプローブは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物である単位を含む。一般的にいうと、ヌクレオチド類似物は、ヌクレオチド残基の鎖に組み込まれることができ、相補的な核酸鎖の塩基と、塩基特異的な方法でハイブリダイゼーションすることができる化合物である。本発明に有用な類似物は、好ましくは、鎖伸長酵素によって認識される。
【００３２】
ヌクレオチド類似物は、例えば、塩基対形成特性に影響するように、塩基が改変されている、および／または例えば、ＰＮＡのアミド結合骨格におけるように、糖または骨格部分が改変されている、および／またはリン酸部分が改変されている、改変されたヌクレオチドであってもよい。
【００３３】
骨格が改変された核酸には、メチルホスホネート、非架橋酸素の両方が硫黄で置換されているホスホロジチオエートおよびホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル並びにボラノホスフェートが挙げられる。アキラルホスフェート誘導体には、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ2−５’−Ｏ−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートが挙げられる。ペプチド核酸は、ホスホジエステル骨格全体がペプチド結合で置換されている。
【００３４】
安定性および親和性を増強するために、糖改変も使用される。塩基が天然のβ−アノマーに対して逆であるデオキシリボースのα−アノマーを使用してもよい。リボース糖の２’−ＯＨを変更して、親和性を損なうことなく分解されにくい２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成してもよい。
【００３５】
複素環塩基の改変は、好ましくは、適切な塩基対形成を維持する。いくつかの有用な置換には、デオキシウリジンとデオキシチミジン、５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンとデオキシシチジンが挙げられる。５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピニル−２’−デオキシシチジンは、それぞれ、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと置換されると、親和性および生物学的活性を増加することが示されている。
【００３６】
プローブは、好ましくは、鎖長全体が７〜４０残基である。通常、１５〜２５残基の短いプローブが使用されるが、３０残基以下もしくは４０残基以下プローブも有用である。
【００３７】
プローブは、天然の塩基の２つまたは３つと塩基対形成する能力を有することによって、または一般的には、区別することなしに天然の塩基の各々と塩基対を形成することによって、変性結合(degenerate binding)を促進する塩基類似物を組み入れることができる。このような類似物は、プローブを製造する際に従来のランダム化技法と併用して使用することができる。しかし、プローブは結合の際に配列−特異性が高く、ハイブリダイゼーションして配列を変性しないことが好ましい。
【００３８】
鎖伸長ステップにおいて付加するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物は検出を容易にするために標識されてもよい。好適な標識の例には、放射性同位体、蛍光部分、ハプテンおよび発色または化学発光酵素システムの成分が挙げられる。
【００３９】
追加の方法としてまたは別の方法として、規定の配列のプローブを容易に同定させられる特定のタグを使用して規定の配列のプローブを標識することができる。例として、質量分析計で分離可能な異なる質量のタグ、適当な検出装置を使用して「読む」ことができる分子バーコード、特定のサインの放射を生じる蛍光タグの組み合わせ等が挙げられる。
【００４０】
標識の性質は、各試料中に存在するマーカーを検出するための最良の方法を決定する。断片が未標識である場合または全てが同様に標識されている場合には、従来のＨＡＰＰＹマッピングと同様に、増幅された断片は、有利なことに、ゲル電気泳動によって検出される。
【００４１】
しかし、特定の標識を使用することにより、ＦＡＣＳまたは質量分析計などによって断片を選別することができる。例えば、Griffinら、(1997) Nature Biotechnology 15:1368参照。標識が各プライマーに対して特異的に作製される場合には、増幅の必要なしに、特定の断片の存在について個々の分割量の試料を選別することができる。
【００４２】
４．共通配列の濃縮
共通の配列を濃縮する方法は当技術上既知である。例えば、１つの試料を固定して使用して、両方の試料に共通の第２の試料の配列をハイブリダイゼーションによって保持するサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用することができる。第１および第２の試料間で異なる配列は廃棄する。この過程を反復して、第１のパネルから共通でない配列を除去することができる。このような手法では、第１のステップは、１つのパネルメンバーの固定、第２のパネルメンバーへのハイブリダイゼーション（その結果、共通の配列が保持される）、次に通常強力な変性条件下において溶出による結合した共通の配列の回収である。この過程全体を反復して、第３のパネルメンバーに共通なものに配列をさらに制限することができる。これは、第３のメンバーを固定し、第１のステップで保持された配列をハイブリダイゼーションし、再度変性および溶出して、第３のメンバーに存在する第１のパネルメンバーのサブセットを回収するか、または第１のステップで保持された配列を固定し、第３のパネルメンバーをハイブリダイゼーションすることによって実施することができる。
【００４３】
本発明の方法をＲＨマッピングに適用する場合には、マッピングパネルの全メンバーに共通の「宿主」配列を排除する必要もある。これは、サブトラクティブハイブリダイゼーションを使用して、共通の配列を排除して実施することができる。または、ドナーゲノムだけに存在する特徴的な配列に相補的なプライマーを使用する場合には、ＤＮＡ試料のドナー配列だけを増幅するためのＰＣＲ方法を使用することができる。例えば、ＲＨパネルが、げっ歯類のバックグラウンドにヒト断片を保有する場合には、サブトラクティブハイブリダイゼーションを使用して、２つ以上のメンバーに共通な断片のプールを作製することができる。これらは、げっ歯類の配列全ておよび小さいセットのヒト配列を含んでもよい。ヒト「Ａｌｕ」配列に相補的なプライマーを使用した増幅により、Ａｌｕ要素間に存在するヒト由来の配列だけが産生される。
【００４４】
プールを共通の配列についてより迅速に濃縮するために、サブトラクティブハイブリダイゼーションは、増幅技法により補完することができる。ＰＣＲを実施して、ゲノムＤＮＡに見られる自己−再連結の第２次動力学(the 2nd order kinetics of self-reassociation)を利用することができ、それによって、最初のサブトラクションにより、標的配列は非標的配列に対して濃縮され、その後のハイブリダイゼーションにおいて、これらの標的配列はより迅速に相補鎖を見つける。Ｓ１ヌクレアーゼなどの１本鎖特異的ヌクレアーゼを使用して１本鎖配列を除去することにより、２本鎖配列を優先的に増幅することができる。こうすることにより、最初のサブトラクティブハイブリダイゼーションおよびその後の増幅を使用して、標的配列が指数的に濃縮される。
【００４５】
５．マッピングのスクリーニング
マッピングパネルは、ゲル電気泳動およびＰＣＲを含む、当技術上既知の任意の標準的な方法によりスクリーニングすることができる。ＨＡＰＰＹマッピングパネルを標準的な手法（上記参照）によりスクリーニングして、連鎖の程度を評価することができる連鎖表を作製する。マッピングパネルのスクリーニングおよび連鎖の分析は自動化することができる。
【００４６】
ＲＨパネルのスクリーニングは、以前に記載したように実施することができる。例えば、Goss S. J.、Harris H.,「ヒト染色体の遺伝子をマッピングする新規方法(New method for mapping genes in human chromosomes)」Nature.1975. 225巻、680-684ページ、Goss S. J.、Harris H.、「細胞融合による遺伝子導入Ｉ．放射線誘導性遺伝子分離の分析によるヒトＸ−染色体の統計学的マッピング(Gene transfer by means of cell fusion.I.Statistical mapping of the human X-chromosome by analysis radiation-induced gene segregation)」J.Cell Sci.1977.25巻、17-37ページ、Goss S. J.、Harris H.、「細胞融合による遺伝子導入．ＩＩ．体細胞ハイブリッドにおける遺伝子各種の統計学的分析によるヒト第１染色体の第８座のマッピング(Gene transfer by means of cell fusion. II. The mapping of 8 loci on human chromosome 1 by statistical analysis of gene assortment in somatic cell hybrids)」、J.Cell Sci.1977.25巻、39-57ページ、Goss S. J.、「合成遺伝子の放射線誘導性分離：ヒト遺伝子マッピングの新規方法(Radiation-induced segregation of synthetic loci:a new approach to human gene mapping)」、Cytogenet. Cell Genet.1976.16巻、138-141ページ参照。有利なことに、ＲＨパネルは、マーカー配列のＰＣＲ検出によって分類される。Stewart,E.A.およびCox,D.R.、「ゲノムマッピング：実践方法(Genome Mapping: A Practical Approach)における放射線ハイブリッドマッピング(Radiation hybrid mapping)」Dear,P.H.編、IRL Press,1997。
【００４７】
上記明細書に記載されている全ての文献は、参照として本明細書に組み入れられている。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載されている方法およびシステムに種々の改良および変更を加えることができることは、当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施態様に関連して記載されているが、主張されている本発明はこのような具体的な実施態様に不当に限定されるべきではない。実際、分子生物学または関連の分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載されている様式の種々の改良は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【国際公開パンフレット】
2004532048.tif 000002
2004532048.tif 000003
2004532048.tif 000004
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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