(57)【要約】本発明は、ＭＲＰ−ファミリーの輸送体タンパク質のＬ０−特異的インヒビターを試験し、かつＬ０領域の予想された両親媒性ヘリックス領域に特異的なインヒビターを試験する方法、試験したインヒビターＬ０ペプチド、それらの変異体、これらのペプチドをコードしているポリペプチド、このポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらのインヒビターを試験および開発する試薬キットに関する。本発明は、癌患者および関連研究分野において多剤耐性を克服するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のＬ０−機能が保持されるかもしくは少なくとも部分的に喪失されているかを決定するために、可能性のあるインヒビターの作用に曝されたＬ０ペプチドをアッセイする工程を含む、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のＬ０−特異的インヒビターを試験する、アッセイ法。
【請求項２】
Ｌ０ペプチドを発現すること、および任意にＬ０ペプチドを可能性のあるインヒビターの作用に曝し、その後その天然型構造を最終的に形成する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｌ０ペプチドのアッセイが、発現により調製された欠失変異体タンパク質またはその機能断片を用いる工程であり、該タンパク質または断片が、ＭＲＰ−ファミリー輸送体タンパク質コア領域を含む工程；ならびに、コア領域との接触時にのみそれ自身が顕在化する少なくとも１種のＬ０−機能をアッセイする工程を含む、請求項１または２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
Ｌ０ペプチドおよびコア領域もしくはその機能断片の両方を発現する、または任意に同時発現することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｌ０ペプチドをアッセイし、膜結合、生理的膜コンパートメントへのこのタンパク質のコア領域のレスキューおよび／または輸送体タンパク質機能の回復のような機能の少なくとも１種が維持されたかどうかを決定することを含む、請求項３または４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
コア領域との接触時のみにそれ自身顕在化する少なくとも１種のＬ０−機能が、膜調製物におけるヌクレオチド捕獲；好ましくは極性化された細胞の特異的膜領域への、膜ルーティング；ＡＴＰ−ａｓｅ活性；膜輸送、好ましくは小胞内外の基質取込み；極性化された細胞へまたは細胞からの方向性のある膜輸送から選択される、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質の可能性のあるインヒビターをスクリーニングするためのアッセイ法であり、該インヒビターが、両親媒性ヘリックスであると予想されたＬ０領域のセグメントについて特異的であり、可能性のあるインヒビターが両親媒性ヘリックスであると予想されるセグメントに対し親和性を示すかどうかを決定する工程を含む、アッセイ法。
【請求項８】
両親媒性ヘリックスであると予想されるＬ０領域セグメントに特異的であるＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のインヒビターを試験するアッセイ法であり、
可能性のあるインヒビター；Ｌ０領域を含む機能性輸送体タンパク質断片；または、Ｌ０ペプチドおよび輸送体タンパク質コア領域からなるタンパク質（またはそれらの機能断片）であり、該ペプチドおよび該タンパク質が共有結合されていないものの作用に曝されたＭＲＰファミリー輸送体タンパク質を、以下に関してアッセイする工程を含み；
ａ）タンパク質またはその断片の特異的な膜ルーティングおよび／またはグリコシル化に関して、および
ｂ）いずれか他の機能、好ましくはタンパク質の輸送能、Ｌ０ペプチドの膜結合および／またはＬ０ペプチドのＭＲＰ機能回復能に関して、ならびに
ａ）のアッセイされた機能が維持される場合、およびｂ）のアッセイされた機能が少なくとも一部喪失される場合、これが両親媒性ヘリックスであると予想されるセグメントに特異的なインヒビターの選択的阻害作用の結果と見なされる、方法。
【請求項９】
多剤耐性の研究においてまたはバリデーションされた薬剤標的として、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のＬ０−特異的インヒビターの試験、設計または開発において使用するための、Ｌ０ペプチドまたは少なくとも部分的に少なくとも１種のＬ０−機能を維持しているそれらの変異体もしくはホモログ。
【請求項１０】
ＭＲＰ１ Ｌ０ペプチドのアミノ酸２２１〜２２７を含む、請求項９記載のＬ０ペプチドまたはその変異体。
【請求項１１】
両親媒性ヘリックスであると予想されるペプチドセグメント、好ましくはアミノ酸２２１〜２２７からなるセグメントに変異を保有し、該変異は好ましくは欠失または置換である、変異体Ｌ０ペプチド。
【請求項１２】
Ｌ０ペプチドの発現において使用するための、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のＬ０領域をコードしている配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクター、好ましくは細菌、昆虫および／または哺乳類細胞において機能することが可能である発現ベクターである、請求項１２記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３記載のベクターを保有する宿主細胞。
【請求項１５】
ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質の特異的インヒビターを開発もしくは試験するためまたは多剤耐性研究のための試薬キットであり：
請求項９〜１１のいずれか１項記載のペプチド、請求項１２〜１３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、または請求項１４記載の宿主細胞を備え、
ならびに、任意に更に
輸送体タンパク質またはそれらの機能変異体、好ましくは、実質的に輸送体タンパク質のコア領域からなる欠失変異体の発現に適した、発現ベクター、
そこで発現ベクターが機能可能である宿主細胞、好ましくは細菌、昆虫および／または哺乳類細胞、ならびに
発現および／または発現されたＬ０ペプチド機能のアッセイのための試薬および緩衝液を備える、試薬キット。
【請求項１６】
ベクターがＥ． ｃｏｌｉ、Ｓｆ９および／またはＭＤＣＫＩＩ細胞において機能可能であるベクターであり、かつ宿主細胞がＥ ｃｏｌｉ、Ｓｆ９および／またはＭＤＣＫＩＩ細胞である、請求項１５記載の試薬キット。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法でアッセイした場合に、ＭＲＰファミリータンパク質のＬ０−特異的インヒビターとして挙動する、薬剤。
【請求項１８】
前記薬剤が、両親媒性ヘリックスであると予想されたＬ０領域セグメントまたはその一部と接触することにより、作用することが可能である、インヒビターとして挙動する請求項１７記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＭＲＰ−ファミリー輸送体タンパク質のＬ０−特異的インヒビターを試験するアッセイ法、インヒビターを試験・開発するためのＬ０ペプチドおよび試薬キット、ならびに本発明の方法または試薬キットを用いて提供されるＭＲＰ−ファミリーのＬ０−特異的インヒビターに関する。
本発明は特に、多剤（ｍｕｌｔｉｄｒｏｇ）耐性の研究および癌治療の分野において有用である。
【０００２】
ＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質）およびＭＲＰ１（多剤耐性タンパク質１）は、ＡＴＰに依存した様式で腫瘍細胞から化学療法薬を排出することができるＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送体ファミリーの一員である。ＭＤＲ１は、疎水性でわずかに正荷電分子を優先的に輸送するのに対し、ＭＲＰ１は、グルタチオン抱合体（例えば、ロイコトリエンＣ４）ならびに硫酸塩およびグルクロニドのような負帯電したリガンドに抱合された他の巨大な疎水性分子を輸送する［Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｍ．Ｍ．およびＰａｓｔａｎ， Ｉ．、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２：３８５−４２７ （１９９３）；ＭｃＧｒａｔｈ， Ｔ．、Ｌａｔｏｕｄ， Ｃ．、Ａｒｎｏｌｄ， Ｓ．Ｔ．、Ｓａｆｈ， Ａ．Ｒ．、Ｆｅｌｓｔｅｄ， Ｅ．Ｒ．、およびＣｅｎｔｅｒ， Ｍ．Ｓ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３８：３６１１−３６１９ （１９８９）；Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．、Ｍｅｉｊｅｒ， Ｃ．、Ｚａｍａｎ， Ｇ． Ｊ． Ｒ、Ｂｏｒｓｔ， Ｐ．、Ｓｃｈｅｐｅｒ， Ｒ． Ｊ．、Ｍｕｌｄｅｒ， Ｎ． Ｈ．、ｄｅ Ｖｒｉｅｓ， Ｅ． Ｇ． Ｅ．、およびＪａｎｓｅｎ， Ｐ． Ｌ． Ｍ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１：１３０３３−１３０３７ （１９９４）；Ｊｅｄｌｉｔｓｃｈｋｙ， Ｇ．、Ｌｅｉｅｒ， Ｉ．、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ， Ｕ．、Ｃｅｎｔｅｒ， Ｍ．Ｓ．、およびＫｅｐｐｌｅｒ， Ｄ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５４：４８３３−４８３６ （１９９４）；Ｊｅｄｌｉｔｓｃｈｋｙ， Ｇ．、Ｌｅｉｅｒ， Ｉ．、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ， Ｕ．、Ｂａｒｎｏｕｉｎ， Ｋ．、Ｋｕｒｚ， Ｇ．、およびＫｅｐｐｌｅｒ， Ｄ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６：９８８−９９４ （１９９６）；Ｌｏｅ， Ｄ． Ｗ．、Ａｌｍｑｕｉｓｔ， Ｋ． Ｃ．、Ｃｏｌｅ， Ｓ． Ｐ． Ｃ．、およびＤｅｅｌｅｙ， Ｒ． Ｇ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ、２７１：９６８３−９６８９ （１９９６）］。ＭＲＰ１は、未修飾の中性および塩基性の有機化合物も、おそらくグルタチオンとの共輸送メカニズムにより輸送する［Ｌｏｅ， Ｄ． Ｗ．、Ａｌｍｑｕｉｓｔ， Ｋ． Ｃ．、Ｃｏｌｅ， Ｓ． Ｐ． Ｃ．、およびＤｅｅｌｅｙ， Ｒ． Ｇ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１：９６７５−９６８２ （１９９６）；Ｌｏｅ， Ｄ． Ｗ．、Ｄｅｅｌｅｙ， Ｒ． Ｇ．、およびＣｏｌｅ， Ｓ． Ｐ． Ｃ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５８：５１３０−５１３６ （１９９８）；Ｅｖｅｒｓ， ｒ．、ｄｅ Ｈａｎｓ， Ｍ．、Ｓｐａｒｉｄａｎｓ， Ｒ．、Ｂｉｊｎｅｎ， Ｊ．、Ｗｉｅｌｅｎｇａ， Ｐ． Ｒ．、Ｌａｎｋｅｌｍａ， Ｊ．、およびＢｏｒｓｔ， Ｐ． Ｂｒ．、Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、印刷中］。ＭＤＲ１ ＰｇｐおよびＭＲＰ１は、多くの形の癌の化学療法耐性における主要なプレーヤーであるように見えるが、これら２種の輸送体のホモログに加え、最近同定された乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ、または別名ＡＢＣＧ２）も、この臨床現象に関与しているであろう［Ｄｏｙｌｅ， Ｌ． Ａ．、Ｙａｎｇ， Ｗ．、Ａｂｒｕｚｚｏ， Ｌ． Ｖ．、Ｋｒｏｇｍａｎｎ， Ｔ．、Ｇａｏ， Ｙ．、Ｒｉｓｈｉ， Ａ． Ｋ．、およびＲｏｓｓ， Ｄ． Ｄ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５：１５６６５−１���６７０ （１９９８）］。
【０００３】
ＭＲＰ１は、グルタチオン−抱合されたエイコサノイドであるロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）の高親和性一次性能動輸送体であること［Ｌｅｉｅｒ， Ｉ．、Ｊｅｄｉｔｓｃｈｋｙ， Ｇ．、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ， Ｕ．、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ．Ｃ．、Ｄｅｅｌｅｙ， Ｒ． Ｃ．、およびＫｅｐｐｌｅｒ， Ｄ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、９６９：２７８０７−２７８１０ （１９９４）、ならびにＭｕｌｌｅｒ， Ｍ．（１９９４）前掲参照］、ならびにグルタチオン、硫酸塩またはグルクロニドに抱合された様々な他の化合物を輸送すること［Ｌｅｉｅｒ， Ｉ． （１９９４）、Ｊｅｄｌｉｔｓｃｈｋｙ， Ｇ． （１９９６）、Ｌｏｅ， Ｄ． Ｗ． （１９９６）、Ｚａｍａｎ， Ｇ．Ｊ． Ｒ．、Ｃｎｕｂｂｅｎ． Ｎ． Ｈ． Ｐ．、ｖａｎ Ｂｌａｄｅｒｅｎ， Ｐ．Ｊ．、Ｅｖｅｒｓ， Ｒ．およびＢｏｒｓｔ， Ｐ．、ＫＢＳ Ｌｅｔｔ．、３９１：１２５−１３０ （１９９６）］が示されている。ＭＲＰ１の生理的機能は、炎症反応の媒介からある種の生体異物の排除にまでおよび［Ｈｏｌｌｏ， Ｚｓ．、Ｈｏｍｏｌｙａ Ｌ．、Ｈｅｇｅｄｕｓ， Ｔ．、およびＳａｒｋａｄｉ Ｂ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３８３：９９−１０４ （１９９６）；Ｇｒａｎｔ， Ｃ．Ｅ．、Ｖａｌｄｉｍａｒｓｓｏｎ， Ｇ．、Ｈｉｐｆｎｅｒ， Ｄ．Ｒ．、Ａｌｍｑｕｉｓｔ， Ｋ． Ｃ．、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ．Ｃ．、およびＤｅｅｌｅｙ， Ｒ．Ｇ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１：３５７−３６１ （１９９４）；Ｗｉｊｎｈｏｌｄｓ， Ｊ．、Ｅｖｅｒｓ， Ｒ．、ｖａｎ Ｌｅｕｓｄｅｎ， Ｍ．Ｒ．、Ｍｏｌ． Ｃ．Ａ．、Ｚａｍａｎ， Ｇ．Ｊ．、Ｍａｙｅｒ， Ｕ．、Ｒｅｉｊｎｅｎ， Ｊ． Ｍ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａｌｋ， Ｍ．、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ， Ｐ．、およびＢｏｒｓｔ， Ｐ．、Ｎａｔ． Ｍｅｄ、３：１２７５−１２７９ （１９９７）；Ｌｏｒｉｃｏ， Ａ．、Ｒａｐｐａ Ｇ．、Ｆｉｎｃｈ， Ｒ．Ａ．、Ｙａｎｄ． Ｄ．、Ｆｌａｖｅｌｌ， Ｒ． Ａ．、およびＳａｒｃｏｒｅｌｌｉ， Ａ．Ｃ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７：５２３８−５２４２ （１９９７）；Ｒａｐｐａ Ｇ．、Ｌｏｒｉｃｏ， Ａ．、Ｆｌａｖｅｌｌ． Ｒ．Ａ．およびＳａｒｔｏｒｅｌｌａ． Ａ．Ｃ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７：５２３２−５２３７ （１９９７）］、かつこのタンパク質はいくつかの種類の癌の化学療法耐性において役割を果たし得る。
【０００４】
バナジン酸（ｖａｎａｄａｔｅ）は、ＭＤＲ１およびＭＲＰ１の両方によるＡＴＰ−依存型薬物輸送を阻害し［Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ Ｇ． Ａ．、Ｊ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇ Ｂｚｏｍｅｍｂｒ．、２７：３７−４１ （１９９５）；Ｂａｋｏｓ， Ｅ．、Ｅｖｅｒｓ， Ｒ．、Ｓｉｎｋｏ， Ｅ．、Ｖａｒａｄｉ， Ａ．、Ｂｏｒｓｔ， Ｐ．、およびＳａｒｋａｄｉ， Ｂ．、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５７：７６０−７６８ （２０００）；Ｍａｏ， Ｑ．、Ｌｅｓｌｉｅ， Ｅ． Ｍ．、Ｄｅｅｌｅｙ． Ｒ．Ｇ．、およびＣｏｌｅ， Ｓ．Ｐ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４６１：６９−８２（１９９９）；Ｃｈａｎｇ， Ｘ． Ｂ．、Ｈｏｕ， Ｙ． Ｘ．、およびＲｉｏｒｄａｎ， Ｊ． Ｒ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７３：２３８４４−２３８４８ （１９９８）］、ならびにバナジン酸の存在下において、これらのタンパク質中のアデニンヌクレオチドの捕獲が明らかにされている［Ｕｒｂａｔｓｃｈ， Ｉ． Ｌ．、Ｓａｎｋａｒａｎ， Ｋ．、Ｗｅｂｅｒ， Ｊ．およびＳｅｎｉｏｒ， Ａ．Ｅ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７０：１９３８３−１９３９０ （１９９５）；Ｔａｇｕｃｈｉ， Ｙ．、Ｙｏｓｈｉｄａ， Ａ．、Ｔａｋａｄａ， Ｙ．、Ｋｏｍａｎｏ， Ｔ．、およびＵｅｄａ， Ｋ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４０１：１１−１４ （１９９７）］。輸送された化合物は、ＭＲＰ１におけるバナジン酸−依存型ヌクレオチド捕獲の速度を特異的に増大し［Ｔａｇｕｃｈｙ Ｙ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４０１：１１−１４ （１９９７）］、これはＭＤＲ１ Ｐｇｐの場合に疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｇｉｃ）薬剤に関して示されたものに類似している［Ｓｚａｂｏ， Ｋ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７３：１０１３２−１０１３８ （１９９８）］。バナジン酸依存型の、薬剤で刺激されたヌクレオチド捕獲は、多剤輸送体の部分的反応を反映しており、その結果それらの機能上の特徴を調べるために使用することができる。
【０００５】
別のＭＲＰ１インヒビターも当該技術分野において公知である。
そのひとつは、Ｃ−Ａ１２０−細胞およびＫＢ／ＭＲＰ細胞において濃度１０ｎＭでＣＰＴ−１１−およびＳＮ−３８−蓄積を効率的に増大するＰＡＫ−１０５Ｐである［Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５５（５）：９２１−８ （１９９９）］。
【０００６】
Ｄｒａｐｅｒら［Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、７５（６）：８１０−１５ （１９９７）］は、ＭＲＰを発現しているマウスおよびヒト細胞において、シクロオキシゲナーゼおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの公知のインヒビターであり、かつアニオン輸送のモジュレーターであることがわかっている、インドメタシンの作用を試験し、インドメタシンが蛍光色素ＢＣＥＣＦの流出を効果的に阻害しかつその蓄積を増大することを発見した。更なる測定およびＭＤＲ１タンパク質との比較は、この阻害がＭＲＰ１−特異的であることを示したが；しかし、インドメタシンはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの阻害を介して作用するのか、それとも輸送部位において輸送された薬剤に直接拮抗するのかという疑問は、解決されていない。
【０００７】
薬剤耐性の低下は、ＭＲＰ１に対する可能性のあるインヒビターの作用の結果ではないという問題点は、ＣｕｒｔｉｎおよびＴｕｒｎｅｒの研究においても言及されている［Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、３５（６）：１０２０−５ （１９９９）］。筆者らは、ヌクレオシド輸送のインヒビターであるジピリダモール（ＤＰ）の、ＭＲＰ１を過剰発現している細胞に対する増感作用を研究し、増感は、ＭＲＰ１が媒介した薬剤流出の変更よりもむしろ細胞ＧＳＨレベルの低下に起因することを発見した。Ｖｅｒｓａｎｔｖｏｏｒｔら［Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、７２（１）：８２−９ （１９９５）］は、グルタチオン合成のインヒビターであるブチオニンスルホキシド（ｂｕｔｈｙｏｎｉｎｅ−ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を研究し、同様の結論に到達した。
【０００８】
前述の問題点は、生存細胞において、薬剤の流出または蓄積を介して、間接的にＭＲＰ１活性を検出することを目的とした試験の場合に明らかになることがある。しかし当該技術分野の状況において、このような試験が最も頻繁に適用される。
【０００９】
最も良く知られているＭＲＰ１インヒビターのひとつは、ロイコトリエン−Ｄ４−受容体アゴニストであるＭＫ−５７１である。Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｌｋら［Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４（７）：１７２７−３６ （１９９８）］は、ＭＲＰ１によるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）輸送およびＭＫ−５７１によるその阻害を基にＭＲＰ１活性を測定する、機能アッセイを行った。この方法は、加えて他のＭＲＰ１インヒビターの作用の試験に適していることが明らかになったが、筆者らはこの可能性については言及していない。
【００１０】
当該技術分野のこれらのインヒビターは、目的のあるデザインにより開発されたものではなく、従ってそれらの作用機序は不明である。更にこれらは、おそらく生体の他の生化学的経路にも影響を及ぼすであろう。従って、ＭＲＰ機能を定義するための可能性のあるインヒビターを試験するアッセイ法または試験システムが必要である。
【００１１】
ＭＲＰファミリーのタンパク質においてこれを目的とすると、インヒビターが特異的である重要な構造領域が機能的に識別されるか、もしくはその機能は、この特定の重要な構造領域に特異的なインヒビターを試験することができるように検出可能でなければならない。
しかし、これまでのところ、この分子の様々な領域に関連した機能の検出に適した試験は、わかっていない。
このような試験を提供するためには、複合化された（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ）ドメイン−ドメイン相互作用により特徴付けられたこの巨大分子の個々の領域またはドメインの機能および相互作用に関する情報が必要である。
【００１２】
ＭＲＰ１のいくつかの重大な構造単位の機能および「協力作用」に関する当該技術分野の関連データを、以下に簡単にまとめる。
ＭＤＲ１およびＭＲＰ１は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および細胞質ＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）領域の縦列反復を含む類似したコア構造を共有している。しかし、ＭＲＰ１およびいくつかのホモログは、３種の膜−結合したドメイン構造により特徴付けられたＡＢＣ−輸送体のサブファミリーを形成する。これらは、２個のＡＢＣ単位および２個の膜−結合ドメイン（ＴＭＤ１およびＴＭＤ２）を含むＭＤＲ１−様コア領域、ならびに細胞質ループおよび膜−結合ドメインを形成する約２８０個のアミノ酸のＮ−末端ポリペプチド領域であり（各々、Ｌ０およびＴＭＤ０、図１Ａ参照；［図１．ａ、およびＴｕｓｎａｄｙ， Ｇ．Ｅ．、Ｂａｋｏｓ， Ｅ．、Ｖａｒａｄｉ， Ａ．、およびＳａｒｋａｄｉ， Ｂ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４０２：１−３ （１９９７）、ならびにＢａｋｏｓ， Ｅ．、Ｅｖｅｒｓ， Ｒ．、Ｓｚａｋａｃｓ， Ｇ．、Ｔｕｓｎａｄｙ， Ｇ．Ｅ．、Ｗｅｌｋｅｒ， Ｅ．、Ｓｚａｂｏ， Ｋ．、ｄｅ Ｈａａｓ， Ｍ．、ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒ， Ｌ．、Ｂｏｒｓｔ， Ｐ．、Ｖａｒａｄｉ， Ａ．、およびＳａｒｋａｄｉ， Ｂ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７３：３２１６１−３２１７５ （１９９８）参照）。
【００１３】
無傷の全ＭＲＰ１は、バキュロウイルス感染昆虫細胞において発現され［Ｂａｋｏｓ， Ｅ．、Ｈｅｇｅｄｕｓ， Ｔ．、Ｈｏｌｌｏ， Ｚｓ．、Ｗｅｌｋｅｒ， Ｅ．、Ｔｕｓｎａｄｙ， Ｇ．Ｅ．、Ｚａｍａｎ， Ｇ．Ｊ．Ｒ．、Ｆｌｅｎｓ， Ｍ．Ｊ．、Ｖａｒａｄｉ， Ａ．、およびＳａｒｋａｄｉ， Ｂ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１：１２３２２−１２３２６ （１９９６）；Ｇａｏ， Ｍ．、Ｌｏｅ， Ｄ．Ｗ．、Ｇｒａｎｔ， Ｃ．Ｅ．、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ．Ｃ．およびＤｅｅｌｅｙ， Ｒ．Ｇ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１：２７７８２−２７７８７ （１９９６）；ならびに、Ｇａｏ， Ｍ．、Ｙａｍａｚａｋｉ， Ｍ．、Ｌｏｅ， Ｄ．Ｗ．、Ｗｅｓｔｌａｋｅ， Ｃ．Ｊ．、Ｇｒａｎｔ， Ｃ．Ｅ．、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ．Ｃ．、およびＤｅｅｌｅｙ， Ｒ．Ｇ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７３：１０７３３−１０７４０ （１９９８）］、このタンパク質は、この発現システムにおいてはグリコシル化されていることが証明されているにも関わらず、その基本的構造および輸送特性は、哺乳類細胞において認められるものと同じであった［Ｇａｏ， Ｍら（１９９６）、前記参照］。更にＭＲＰ１変異体は昆虫細胞において発現され、この変異体は該タンパク質のＮ−末端ＴＭＤ０Ｌ０領域を含まず、かつこれは活性がないが、そのＮ−末端ＴＭＤＯＬ０領域がＣ−末端コア領域と同時発現された場合には、機能性ＬＴＣ４輸送体が得られた［Ｇａｏ， Ｍら（１９９６）、前記参照］。
【００１４】
極性化された細胞において、ＭＤＲ１は、頂端側細胞膜にルーティング（ｒｏｕｔｉｎｇ）されるが、ＭＲＰ１は側底側細胞膜へルーティングされる［Ｂａｋｏｓ， Ｅ．、Ｅｖｅｒｓ， Ｒ．、Ｓｚａｋａｃｓ， Ｇ．、Ｔｕｓｎａｄｙ， Ｇ．Ｅ．、Ｗｅｌｋｅｒ， Ｅ．、Ｓｚａｂｏ， Ｋ．、ｄｅ Ｈａａｓ， Ｍ．、ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒ， Ｌ．、Ｂｏｒｓｔ， Ｐ．、Ｖａｒａｄｉ， Ａ．、およびＳａｒｋａｄｉ， Ｂ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７３：３２１６１−３２１７５ （１９９８）；Ｅｖｅｒｓ， Ｒ．、Ｚａｍａｎ， Ｇ．Ｊ．、ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒ， Ｌ．、Ｊａｎｓｅｎ， Ｈ．、Ｃａｌａｆａｔ， Ｊ．、Ｏｏｍｅｎ， Ｌ．Ｃ．、Ｏｕｄｅ Ｅｌｆｅｒｉｎｋ， Ｒ．Ｐ．、Ｂｏｒｓｔ， Ｐ．、およびＳｃｈｉｎｋｅｌ， Ａ．Ｈ．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、９７：１２１１−１２１８１ （１９９６）］。これらの刊行物において、本発明の推敲直前に、ＭＲＰ１のＮ−末端領域の役割およびヒトＭＲＰ１の形質膜への送達が研究された。ＭＤＲ様コア領域は、実際的な輸送活性およびヌクレオチド封入活性を有さないことが示された［Ｂａｋｏｓら（１９９８）、前記参照］。しかし全Ｎ−末端ＴＭＤ０Ｌ０領域およびＭＤＲ１−様コア領域の同時発現により、輸送機能は回復した［同じく前掲のＧａｏら（１９９８）、参照］。
【００１５】
更にＢａｋｅｓ， Ｂ．とその同僚らは、変異体を用いる実験を行い、コア領域およびＬ０領域を含むがＴＭＤ０ドメインを含まない変異体ＭＲＰ１は、正しい、すなわち側底側細胞膜ルーティングを伴う能動輸送体分子であることが証明された［Ｂａｋｏｓら（１９９８）、前記参照］。この比較的初期の研究は、「分子中」のＬ０領域の存在が、極性化された細胞における、タンパク質のＭＲＰ１が媒介した輸送活性および側底側細胞膜ルーティングに必要であることを示唆している。
しかし、ＴＭＤ０領域の役割およびＬ０領域それ自身の分子活性に対する可能性のある重要性に関して先行技術は、かなりの混乱または多義性（ａｍｂｉｑｕｉｔｙ）がある。
【００１６】
すなわち、Ｇａｏら［Ｇａｏら（１９９８）、前記参照］は、全ＴＭＤ０ドメインまたはその第一のＮ−末端膜貫通ヘリックスのみの除去は、ＭＲＰ１機能を取除くことを発見した（Ｇａｏらは、この説明において定義した様に、全ＴＭＤ０領域を取除く場合には、Ｌ０領域の非常に短い部分を取除いた。）。これにより、全ＴＭＤ０Ｌ０領域が輸送活性に必須であるとこの筆者らは結論した。このことは、Ｌ０ΔＭＲＰタンパク質は完全に機能性であるという仮定につながる先の結果と明らかに対立している。前記結果は、分子の構造領域の一部の機能の完全な特性（すなわち、前記機能が保持されるか否か）は、分子環境およびその分子の他の部分もしくは領域との相互作用に大きく左右されることを強力に示唆している。従って、Ｌ０は、識別可能な構造単位を形成し、かつそういうものとしてそれ自身試験することができ、更にその分子の他の構造単位もそれら自身試験することができるとは予想できなかった。
【００１７】
当該技術分野の状況では、Ｌ０の役割に関する明確な提案はない。初期にはこれは、２個の巨大な構造単位、コア領域およびＮ−末端膜貫通ドメインを単に連結している（従ってその名称はリンカー領域）細胞質（または時には細胞外とさえも）ループと考えられた。更に、Ｌ０領域に限定的構造特徴は指定されていない。
【００１８】
最初に、本発明の推敲を目的として、本発明者らは更に、Ｌ０領域に特異的なインヒビターを試験するための方法または試験システムを開発するために、Ｌ０領域は、タンパク質（例えばＭＤＲ）またはドメインに「共有結合されている」が、ＭＲＰの天然型構造単位とは機能上無関係である、キメラタンパク質の形で発現されることを提唱した。本発明者らは、これによりＬ０領域の重要性が明らかになるとことを期待していた。これらの実験は以下に説明する。
【００１９】
予想に反して、Ｌ０領域が、個別の分子（Ｌ０ペプチド）として使用、好ましくは発現され任意に他のＭＲＰ領域と同時発現される場合、その機能は、特異的に検出またはアッセイされかつそれら自身試験することができ；更に、新規機能を発見することができることがわかった。従って、Ｌ０ペプチドは、インヒビターを試験する適当な道具であり得る。
【００２０】
更に驚くべきことに、Ｌ０領域の比較的短いセグメントは、Ｌ０ペプチドおよび全輸送体タンパク質の機能特性に関し特に重要であり、ならびに該セグメントが中和または不能化されるならば、ほとんどのＬ０−機能（またはＭＲＰ−機能）が損傷を受けることがわかった。
【００２１】
従って本発明の目的は、ＭＲＰ−ファミリー輸送体タンパク質のＬ０領域に特異的インヒビターを試験するのに適した方法を提供することである。
本発明の別の目的は、セグメントがそれ自身その分子の活性（機能可能性）に重要であるような、Ｌ０領域内の比較的小さいセグメントを提供することである。
更なる本発明の目的は、インヒビターの試験および例えば多剤耐性の研究のような、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質の研究において有用である道具、例えばペプチド、組換え構築体、発現ベクター、適当な宿主細胞および試薬のキットなどを提供することである。
【００２２】
従って、本発明は、少なくとも１種のＬ０−機能が維持されるかもしくは少なくとも一部が喪失されたかを決定するために、可能性のあるインヒビターの作用に曝されたＬ０ペプチドをアッセイすることを含む、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のＬ０−特異的インヒビターを試験するためのアッセイ法に関する。好ましくは、Ｌ０ペプチドが発現され、任意にＬ０ペプチドはその天然型構造が最終的に形成される（プロセシング）前に、可能性のあるインヒビターの作用に曝される。
【００２３】
更に好ましい態様に従い、Ｌ０ペプチドのアッセイは、コア領域との接触時にのみそれ自身顕在化する少なくとも１種のＬ０−機能を機能化およびアッセイすることが可能である、ＭＲＰ−ファミリー輸送体タンパク質コア領域またはその断片を含む欠失変異体タンパク質を用いて実行される。好ましくは、Ｌ０ペプチドおよびコア領域は両方とも、発現、または任意に同時発現により調製される。
【００２４】
Ｌ０−機能として、例えば下記の機能を、アッセイまたは決定することができる：膜結合、生理的膜コンパートメントへのこのタンパク質のコア領域のレスキューおよび／または輸送体タンパク質機能の回復。好ましくは、この輸送体タンパク質機能が、Ｌ０ペプチドにより回復されるか否かが疑問である場合は、全輸送体タンパク質の下記の機能の少なくとも１種が維持されたかもしくは少なくとも部分的に喪失されたかどうかが決定される：膜調製物におけるヌクレオチド捕獲；好ましくは極性化された細胞特異的膜領域への、膜ルーティング；ＡＴＰ−ａｓｅ活性；基質の膜輸送、好ましくは小胞内外の基質取込み；極性化された細胞へまたは細胞からの方向性のある膜輸送。
【００２５】
本発明は更に、両親媒性ヘリックスであると予想されたＬ０領域のセグメントについて特異的であるＭＲＰファミリー輸送体タンパク質の可能性のあるインヒビターをスクリーニングするためのアッセイ法であり、可能性のあるインヒビターが両親媒性ヘリックスであると予想されるセグメントに対し親和性を示すかどうかを決定することを含む方法に関する。
【００２６】
更に好ましい態様において、本発明は、両親媒性ヘリックスであると予想されるＬ０領域セグメントに特異的であるＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のインヒビターを試験するアッセイ法に関し、これは可能性のあるインヒビター；Ｌ０領域を含む機能性輸送体タンパク質断片；または、Ｌ０ペプチドおよび輸送体タンパク質コア領域からなるタンパク質（またはそれらの機能断片）であり、該ペプチドおよび該タンパク質が共有結合されていないものの作用に曝されたＭＲＰファミリー輸送体タンパク質を、以下に関してアッセイする工程を含み；
ａ）タンパク質またはその断片の特異的な膜ルーティングおよび／またはグリコシル化に関して、および
ｂ）いずれか他の機能、好ましくはタンパク質の輸送能、Ｌ０ペプチドの膜結合および／またはＬ０ペプチドのＭＲＰ機能回復能に関して、ならびに
ａ）のアッセイされた機能が維持される場合、およびｂ）のアッセイされた機能が少なくとも一部喪失される場合、これが、両親媒性ヘリックスであると予想されるセグメントに特異的なインヒビターの選択された阻害作用の結果と見なされる方法に関する。
【００２７】
更なる局面においては、本発明は、多剤耐性の研究においてまたはバリデーションされた薬剤標的として、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のＬ０−特異的インヒビターの試験、設計または開発において使用するために、Ｌ０ペプチドまたは少なくとも部分的に少なくとも１種のＬ０−機能を維持しているそれらの変異体もしくはホモログに関する。このペプチドまたはその変異体は、好ましくは、ＭＲＰ１のＬ０ペプチドの両親媒性ヘリックスのアミノ酸またはその一部、例えばアミノ酸２１６〜２２７またはその一部、例としてアミノ酸２２１〜２２７、２２０〜２２８、２１９〜２３０、もしくは２２３〜２３２などを含むセグメントを含む。
更に、本発明は、両親媒性ヘリックスであると予想されるペプチドのセグメント、好ましくは２２１〜２２７セグメントに変異を有し、該変異は好ましくは欠失または置換であるような、変異体Ｌ０ペプチドに関する。
【００２８】
本発明は、Ｌ０ペプチドの発現において使用するための、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のＬ０領域をコードしている配列を含む、ポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、発現ベクター、好ましくは細菌、昆虫および／または哺乳類細胞において機能することが可能である発現ベクターであることができる。本発明は更に、本発明のベクターを有する宿主細胞にも関する。
【００２９】
本発明は更に、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質の特異的インヒビターを開発もしくは試験するためまたは多剤耐性研究のための試薬キットに関し、このキットは、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、または宿主細胞を備え、ならびに任意に更にこの輸送体タンパク質またはそれらの機能変異体、好ましくは、実質的にこの輸送体タンパク質のコア領域からなる欠失変異体の発現に適した発現ベクター、および／またはそこで発現ベクターが機能可能である宿主細胞、好ましくは細菌、昆虫および／もしくは哺乳類細胞、ならびに／または発現および／もしくは発現されたＬ０ペプチドの機能アッセイのための試薬および緩衝液を備える。好ましくは、本発明の試薬キットにおいて、ベクターは、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓｆ９および／またはＭＤＣＫＩＩ細胞において機能することが可能であるベクターであり、かつ宿主細胞は、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｓｆ９および／またはＭＤＣＫＩＩ細胞である。
【００３０】
本発明のアッセイ方法を用い、インヒビターを得ることができる。従って、本発明は、本発明の方法でアッセイされる場合に、ＭＲＰファミリータンパク質のＬ０−特異的インヒビターとして挙動する薬物に関する。好ましくはこの薬物は、両親媒性ヘリックスであると予想されるＬ０領域セグメントまたはその一部に接触されることにより、インヒビターとして作用することが可能である。
【００３１】
定義
「ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質」は、ＭＲＰ１から６のいずれか、好ましくはＭＲＰ１のドメイン構造を有する輸送体タンパク質であり；特にドメイン構造に関し現在本発明者らの知る限り、輸送体タンパク質は、コア領域、Ｌ０−様、典型的には細胞質ループ領域、および必ずしもではないが多くの場合はＮ−末端ＴＭＤ０領域を有する。このようなタンパク質は、例えばＳＵＲタンパク質である。最も新しくは、ＨＧＮＣ遺伝子ファミリー命名法に従い、ＭＲＰファミリーは、ＡＢＣＣファミリーとも称される。従って別の局面において、ＭＲＰファミリーは、例えばゲノム配列決定時に、ＡＢＣＣファミリーの一員であると分類されるそれらの輸送体タンパク質も含む。
【００３２】
ＭＲＰファミリータンパク質の「コア領域」は、そのタンパク質のＭＤＲ−様コア領域、特に２個のＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）および２個の膜結合ドメイン（ＴＭＤ１およびＴＭＤ２ドメイン）を含む領域を意味する。
同じファミリーのタンパク質の「対応する領域」とは、相同性を基に配列を整列した場合に相同であることが証明された配列領域を意味する。
【００３３】
本願明細書において、タンパク質またはその断片の「機能」は、野生型と同じ配列を有する変種の特徴でもある、いずれかの能力、適合性または非−構造的特色または特性を意味する。「機能」は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで出現することができる。好ましくは機能は、（少なくとも原則として）機能する際にそれ自身顕在化する検出可能な特色または特性である。この意味において、機能することは、タンパク質またはその断片の、その合成から分解までの全生存期間中の周囲の作用に対する反応と考えられる。従って「機能」は、例えば、タンパク質またはその断片の適切にグリコシル化されまたは折畳まれる能力、その標的化、タンパク質の集成またはこのような集成への断片の参加、活性または部分活性であるが、これらに限定されるものではない。従って用語「Ｌ０−機能」「ＭＲＰ１−機能」は、この意味で使用される。
【００３４】
ＭＲＰファミリータンパク質の機能の例は、以下のものである：
用語ＭＲＰの「活性」は、例えば薬物のＭＲＰタンパク質を保有する膜を通しての輸送、ＡＴＰ−ａｓｅ活性などを含む。広い意味で「活性」は、酵素の全反応サイクルの部分反応（例えば基質結合）に加え、部分的に損傷した活性、例えばヌクレオチド封入（捕獲）を含む。
【００３５】
更なるＭＲＰ−機能は、所定の膜領域への「ルーティング」である。機能は、例えば、輸送された薬剤のＭＲＰタンパク質を含む膜小胞への取込みまたは極性化された細胞の膜を通してのそれらの輸送のような、アッセイ法の特定の環境において顕在化される一般的機能の形であることができる。
【００３６】
例えばＭＲＰファミリーのようなタンパク質の断片は、例えば、膜結合；形質膜（または、特異的な膜コンパートメント）へのＬ０ペプチドまたはＮ−末端領域によるコア領域のレスキュー；もしくは、ＭＲＰタンパク質の活性の回復のような、典型的機能を示すことができる。。
【００３７】
本願明細書において、「機能することが可能な断片」または「機能断片」の意味は、タンパク質における限定された機能（ｆｕｃｔｉｏｎ）を有する領域の断片、その少なくとも１種の機能が検出可能である該断片のホモログまたは変異体である。
【００３８】
「Ｌ０ペプチド」は、ＭＲＰファミリータンパク質のＬ０領域のアミノ酸配列とそのアミノ酸配列が同じであるペプチド分子、またはそのアミノ酸配列の断片、ホモログもしくは変異体である。好ましくは、Ｌ０ペプチドは、機能することが可能であるＬ０領域断片である。好ましくは、Ｌ０ペプチドは、ＭＲＰ１の２０４〜２８１アミノ酸配列と相同であるが、これはより多いもしくはより少ないアミノ酸を含んでもよいことは理解されるはずである。
【００３９】
Ｌ０ペプチドの「両親媒性ヘリックスと予想されるセグメント」は、ヘリックスの円形投影法により両親媒性ヘリックスであると予想されるセグメントまたは対応する領域である。本発明者らの結果に従い、この領域は、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のＬ０領域の膜結合において役割を果たす。より詳細に述べると、配列相同性を基に、「両親媒性ヘリックスと予想されるセグメント」は、ＭＲＰ１の約２２０〜２３２アミノ酸に相当する保存領域またはセグメント、もしくはこのセグメントのヘリックス部分または該領域に典型的な特徴を有するセグメントの一部を含む領域である。
【００４０】
発明の詳細な説明
以下に、いくつかの例を参照し、本発明をより詳細に説明する。
本発明のアッセイ法を開発するために、ヒトＭＲＰ１のおよそ２８０個アミノ酸長のＮ−末端領域の機能特性を分析した。ＭＲＰ１のいわゆるＴＭＤ０およびＬ０領域（図４Ａ参照）は、ＳＵＲタンパク質を含むいくつかのＭＲＰファミリー中に存在し、一部ＣＦＴＲ中にも存在するが、ＭＤＲファミリー（ＭＤＲ１、ＭＤＲ３およびｓＰＧＰ）のタンパク質には存在しない。本発明者らは、ＭＲＰ１のＮ−末端領域をヒトＭＤＲ１タンパク質へ融合すること、ならびに様々な変異および同時−発現試験を行うことにより、これらの領域のプロセシング、形質膜標的化および多剤耐性タンパク質輸送における役割を研究した。タンパク質は、Ｓｆ９昆虫細胞およびＭＤＣＫＩＩ哺乳類細胞の両方で発現した。第一のシステムにおいて、異種細胞型における高レベルの発現のために、機能試験および都合の良い生化学アッセイを、無関係のタンパク質からの少ない妨害で、単離された膜において行うことができた。これらのアッセイは、標識されたグルタチオン−抱合体およびロイコトリエンＣ４輸送の測定に加え、単離された膜小胞におけるバナジン酸依存型ヌクレオチド封入の測定を含んだ。極性化されたＭＤＣＫＩＩ細胞単層は、過剰生成されたタンパク質の膜ルーティングおよび経細胞輸送特性を効果的に試験する可能性を提供した。
【００４１】
ＭＲＰ１のＮ−末端領域の役割を試験するために、本発明者らは、キメラＭＲＰ１−ＭＤＲ１タンパク質を構築したが、ここではＭＤＲ１は、ＭＲＰ１の完全長Ｎ−末端領域（ＴＭＤ０＋Ｌ０）、またはこの領域の２種の個別の亜−成分（ＴＭＤ０またはＬ０）領域のいずれかに及んでいた。これらの実験の目的は、Ｌ０−機能を、ＭＲＰ１−分子の他の部分の機能とは別に研究し、これによりＬ０−特異的インヒビターを試験することができるようなアッセイシステムを作成することであった。しかしこれらのタンパク質は全て適切にＳｆ９細胞およびＭＤＣＫＩＩ細胞の両方において発現されるにもかかわらず、野生型ＭＤＲ１の輸送、ヌクレオチド封入および頂端細胞膜ルーティングの特徴を本質的に保存していることがわかった。この予想外の結果、すなわちＭＤＲ１タンパク質（そのコア領域はＭＲＰ１のものに非常に似ているにもかかわらず）いずれの特徴に関してもＭＲＰ１に転用されないということの可能性のある説明は、特異的ドメイン間の相互作用がＭＲＰ１内のこの領域の機能に必要であるということである。
【００４２】
疑いなくＬ０領域は重要な役割を有しているが、前述の結果から、これを個別に発現することは有用であり、かつ該Ｌ０領域はそれ独自の機能を有する個別の分子として試験することができることは予想することができなかった。それにもかかわらず、本発明者らは、Ｓｆ９細胞における個別のＬ０−分子の発現のための構築体を調製した。それ自身機能を持たないＭＲＰ１コア領域は、個別のＬ０ペプチドと同時発現された場合に、野生型タンパク質と実質的に同じ輸送およびヌクレオチド捕獲の特徴を有する機能性ＭＲＰ１タンパク質を生じることが期せずしてわかった。従って、Ｌ０ペプチドおよびＭＲＰ１のコア領域の間に共有結合は必要はない。同時発現されたＬ０およびΔＭＲＰ１から集成された複合体は、Ｌ０ＭＲＰ１と同様の反応速度論的特性を有した［Ｂａｋｏｓら（１９９８）、前記参照］。
【００４３】
ΔＭＲＰ１が極性化されたＭＤＣＫＩＩ細胞においてＬ０領域と同時発現される場合、本発明者らは、Ｌ０が、たいていはΔＭＲＰ１と共に、側膜（ｌａｔｅｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）へルーティングされる（図６）ことを発見した。同様の結果が、本発明者らがΔＭＲＰ１およびＴＭＤ０Ｌ０の形質膜への部分的な再局在を示すことができたＴＭＤ０Ｌ０領域との同時−発現実験において得られた（データは示さず）。ＭＤＣＫＩＩ細胞においては、技術的な理由により、これらの同時−生成されたタンパク質による輸送は測定できなかったが、これらの結果は、単離されたＴＭＤＯＬ０およびＬ０ペプチドは、適切に折り畳まれ、細胞膜へ付着し、ΔＭＲＰ１と会合し得ることを示唆している。Ｓｆ９およびＭＤＣＫＩＩ細胞における同時−発現試験は全て、Ｌ０領域が、ＭＲＰ１のコア領域と特異的会合で作用するＭＲＰ１タンパク質内の区別可能なタンパク質ドメインであることを示している。
【００４４】
本発明による解決とは無関係に、Ｌ０領域は、ΔＭＲＰ１断片の側方ルーティングを誘導するのに十分であるルーティングシグナルを含むことが提唱されている。しかし、本発明者らは、ΔＭＲＰ１単独では、ＭＤＣＫＩＩ細胞において適切に折り畳まれず、その結果小胞体中で動けなくなる点を除外することができない。Ｌ０との会合は、適切な折畳みおよび形質膜への輸送をもたらすであろう。
【００４５】
「実施例」に記したように、更にＭＲＰ１のＬ０ペプチドを、細菌発現システム（Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞）において調製し、コア領域から、チオレドキシン（ＴＲＸ）に結合した融合ペプチドとして可溶性の形状で、分離した。この溶解液が、異なる発現システム（Ｓｆ９細胞）において調製された不活性ΔＭＲＰ１に添加された場合、後者の輸送活性は、Ｓｆ９−小胞内外で回復される。この結果は、細菌システムにおいて作出されたＬ０ペプチドは、機能する可能性を確実にする典型的構造を有することを示し、更にＬ０領域はＭＲＰ１内では区別可能なドメインであることを示唆している。細菌発現システムを用い、容易に精製するための天然型機能性ペプチドを調製することは可能である。得られたＬ０ペプチドは、ＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のこの領域との相互作用をモニタリングし、かつより効果的に特異的インヒビターを開発または試験する機会を提供する。
【００４６】
従って、前述の実験セットと共に、他方ではペプチド分子、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞を開発することにより、実際にＭＲＰファミリー輸送体タンパク質のＬ０−特異的インヒビターを試験するアッセイ法を作出し、これは、少なくとも１種のＬ０−機能が維持されるかもしくは少なくとも部分的に喪失されたかを決定するために、可能性のあるインヒビターの作用に曝されたＬ０ペプチドをアッセイすることを含む。好ましくは、可能性のあるインヒビターの存在または非存在下において、少なくとも１種のＬ０−機能が維持されたかどうかが決定され、各場合において得られた結果が比較される。好ましい態様において、Ｌ０ペプチドが発現される。試験した機能が翻訳、折畳みまたはプロセシングとは無関係である（最終的に天然型構造を生じる）ならば、このインヒビターは、これらの期間中に該システムに添加されなければならない。更に好ましい態様において、Ｌ０−機能をアッセイする場合、ＭＲＰ−ファミリー輸送体タンパク質のコア領域または機能することが可能なその断片も、コア領域との接触時にのみそれ自身顕在化する少なくとも１種のＬ０−機能に関して試験される。更に好ましい態様において、コア領域またはそれらの機能断片を含むタンパク質も発現される。アッセイされることが好ましいＬ０−機能は、例えば、膜結合、タンパク質のコア領域の生理的膜コンパートメントへのレスキューおよび／または輸送体タンパク質機能の回復である。
【００４７】
好ましくは、コア領域との接触時にのみそれ自身顕在化する少なくとも１種のＬ０−機能が回復されるか否かが試験される。このような機能は、例えば以下のものである：膜調製物中へのヌクレオチド捕獲（封入）；好ましくは極性化された細胞の特異的膜領域への、膜ルーティング；ＡＴＰ−ａｓｅ活性；膜輸送、好ましくは小胞内外への基質取込み；極性化された細胞へまたは細胞からの方向性のある膜輸送。
【００４８】
このアッセイ法は、Ｌ０ペプチドおよびコア領域を異なる発現システム（例えば、各々、細菌細胞および昆虫細胞）中に調製し、その後これらを接触することによっても行うことができる。次に可能性のあるインヒビターが、回復されているまたは回復されたＭＲＰ−機能をブロック（先に添加された場合）または無効化（後で添加された場合）することができる。
【００４９】
機能試験以外に、本発明のＬ０ペプチドまたはその変異体もしくは断片を用い、可能性のあるインヒビターを、Ｌ０ペプチドまたはその両親媒性ヘリックスへの結合または親和性に関して試験することも役立つ。この目的に有用な技術、例えば分光法（例えば赤外、紫外またはＣＤ分光法）、沈降測定、光散乱、移動度などを基にした測定、または核磁気共鳴実験などは、当業者に周知である。
【００５０】
本発明に関して説明されたペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞も請求されている。これらの例証となる例の一部は、「実施例」の項に記されている。本発明の分子およびアッセイ法は、インヒビターとして挙動する薬剤の開発および試験、ならびにインヒビター設計を促進するために有用である。先の説明されたＭＲＰ−ファミリータンパク質の重要な領域の具体的試験のために、それに関する詳細な構造情報を得、これにより強力な親和性で結合することが可能な分子を調製することが可能になる。
【００５１】
前述のことを基に、請求したペプチド、 ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞は、本願明細書に記したように、輸送体タンパク質に特異的なインヒビターの開発および／または試験のための試薬キットと組合せることができる。
【００５２】
Ｓｆ９膜を使用する実験において、本発明者らは、細胞質に局在化すると予想される、単離されたＬ０ペプチドは、膜に付着し、尿素または界面活性剤で処置した際にのみ可溶化されることを発見した。この膜のＬ０との相互作用には、ΔＭＲＰ１タンパク質の存在は必要なかった。コンピュータを用いた二次構造予測は、Ｌ０領域が、２個のα−ヘリックス領域を有し、そのひとつ（アミノ酸２２１−２３３）は両親媒性ヘリックスを特徴とし、ＭＲＰファミリーの全てのメンバーにおいて保存されていることを示した（図７Ｃ）。このような両親媒性ヘリックスは、疎水性相互作用により、細胞膜の脂質相へ、または他の膜タンパク質の疎水性領域と結合する。
【００５３】
Ｌ０内の予想された両親媒性α−ヘリックスの役割を分析するために、この領域が欠失した変異体を作出した。本発明者らは、ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）がＳｆ９およびＭＤＣＫＩＩの両細胞で発現された場合、この欠失は、ＭＲＰ１輸送機能を排除するが、グリコシル化または膜ルーティングには影響を及ぼさないことを発見した。更に単離したＬ０Δ（２２３−２３２）がＳｆ９細胞において作出された場合、この変異は、Ｌ０領域の疎水膜付着を無効化し、かつΔＭＲＰ１構築体のあらゆる機能の再活性化を排除した。
【００５４】
ＭＲＰ１の両親媒性ヘリックスが、別のＭＲＰ−ファミリータンパク質（ＭＲＰ２）のＬ０領域の両親媒性ヘリックスと交換された場合に、同様の結果が得られた。この方法で得られかつ前述のＥ． ｃｏｌｉ発現システムにおいて発現されたキメラＬ０を、ΔＭＲＰ１に追加したが、その活性は回復しなかった。しかし、提唱された親水性部位のアミノ酸のみがＭＲＰ２ Ｌ０両親媒性ヘリックスの親水性部位の対応するアミノ酸と交換された場合には、輸送活性が回復された。
【００５５】
従って、これらの実験は、予想されかつ実験的に提唱されたＬ０領域において発見された両親媒性ヘリックスは、膜結合に参加し、ＭＲＰ１の機能特性を維持するためには絶対必要であることを示した。従ってこの領域は、インヒビターの試験に特に有用である。この領域の機能を特異的にブロックするインヒビターは、特に全ＭＲＰ１分子の特異的および効果的インヒビターであると予想することができる。好ましくは、このインヒビター構造の設計は、このセグメントの構造を基にすることができる。このペプチドセグメントは、ＭＲＰ型タンパク質の研究、従って多剤耐性の研究において特に有用である。
【００５６】
両親媒性ヘリックスであると予想されたセグメントに関するアッセイされたインヒビターの特異性は、前述の方法を用い、以下のように、評価することができる：Ｌ０領域を含む輸送体タンパク質または機能性輸送体タンパク質断片（もしくは、例えば同時発現により、その機能が回復された輸送体タンパク質）は、以下に関してアッセイされ：
ａ）タンパク質またはその断片の特異的な膜ルーティングおよび／またはグリコシル化に関して、および
ｂ）いずれか他の機能、好ましくはタンパク質の輸送能、Ｌ０ペプチドの膜結合および／またはＬ０ペプチドのＭＲＰ１機能回復能に関して、ならびに
ａ）のアッセイされた機能が維持される場合、およびｂ）のアッセイされた機能が少なくとも一部である場合、このインヒビターは両親媒性ヘリックスであると予想されるセグメントに特異的な選択的阻害作用を有すると見なされる。理解されるように、このヘリックスへの親和性は、この態様においても優先的にアッセイされ得る。
【００５７】
更に、試薬キットを容易に提供することができ、該キットは、変異体Ｌ０領域の発現に有用な発現ベクターを備え、ここで該Ｌ０領域のセグメントは両親媒性ヘリックスまたはその一部であると予想され、好ましくは、ＭＲＰ１アミノ酸２２１〜２３２に対応するセグメントもしくはそのいずれかの部分は、欠失または置換されている。
本発明は更に、下記の詳細な実験的例において説明される。
【００５８】
実施例
１．材料および方法
１．１ ＭＲＰ１変種および組換えバキュロウイルスの作出
ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラ構築体を作出するために、完全長ＭＤＲ１ ｃＤＮＡを、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲｉ（ｎｔ−８−１１７７）断片を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＭＤＲ１から取り出し、Ｍ１３ｍｐ１８にサブクローニングし、ＸｂａＩ部位を、位置−指定突然変異誘発によりＭＤＲ１のｎｔ４に導入した。この構築体のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＭＤＲ１のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ（ポリクローニング部位のＮｏｔＩ）断片を一緒に、ｐＶＬ１３９３バキュロウイルス伝達ベクターへ連結し、ｐＶＬ１３９３ＭＤＲ１を得た。先に、ＸｂａＩ部位を、Ｍ１３ＳＢＭＤＲ１中ＭＲＰ１ ｃＤＮＡのｎｔ６０６に導入した［Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］。ＴＭＤ０ＭＤＲ１キメラｃＤＮＡを得るために、ＤｒａＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（ｎｔ８７−８４０）を、ｐＡｃＳＧ２ＭＲＰから取り出し［Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前掲参照］、Ｍ１３ＳＢＭＲＰ１のＤｒａＩＩＩ−ＢａｍＨＩ挿入断片と交換した。ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片（ｎｔ５−６０６）を、ｐＶＬ１３９３ＭＤＲ１のＸｂａＩ部位へサブクローニングした。ＴＭＤ０Ｌ０ＭＤＲ１を作出するために、ｐＡｃＳＧ２ＭＲＰリンカーＩＩ［Ｂａｋｏｓ Ｅら（１９９８）、前記参照］を、停止コドンおよび−５位のＸｂａＩ部位の前方のリンカーＩ内のＮｈｅＩで消化した。この断片を、ｐＶＬ１３９３ＭＤＲ１のＸｂａＩ部位にサブクローニングした。Ｌ０ＭＤＲ１を得るために、リンカーＩ［Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］を、ｐＡｃＳＧ２ＭＲＰリンカーＩＩの独自のＢａｍＨＩ部位に挿入した。ｐＡｃＳＧ２ＭＲＰリンカーＩＩ／リンカーＩを、リンカーＩおよびＩＩ内のＮｈｅＩにより消化した。この断片は、ｐＶＬ１３９３ＭＤＲ１のＸｂａＩ部位へサブクローニングした。
【００５９】
ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）変異体は、ｐＪ３Ω−ＭＲＰ１（２３）を鋳型として使用する重複ＰＣＲにより作出した。下記のプライマーを使用した：５’−ｇａｔｇｔｃｇａｃａｃｃｇｇｃａｔｇｇｃｇｃｔｃｃｇｇｇｇｃｔｔｃ−３’（プライマー１；ＳａｌＩ部位に下線）、５’−ｃａｃｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｇｇｇｃｔｇｇｃｇｃｃａｇａａｇｇｔｇａｔｃｃｔｃｇａｃａｇｇ−３’（プライマー２）、５’−ｃｃｔｇｔｃｇａｇｇａｔｃａｃｃｔｔｃｔｇｇｃｇｃｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｇｇｃａｇｔｇ−３’（プライマー３、アミノ酸２１６−２２２および２３３−２３９をコードし、プライマー２と相補的である）、５’−ｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｇｃａｔｃｃａｃｃｔｔｇｇａａｃｔｃｔｃ−３’（プライマー４、アミノ酸２８７−２９７）。上流断片をプライマー１および２を用い、下流断片をプライマー３および４を用い作出した。両断片を、ゲル精製し、一緒にし、かつプライマー１および４によりＰＣＲ反応を行った。増幅した重複産物を、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩで消化し、この断片を、当初のｐＪ３Ω−ＭＲＰ１のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片と置換し、ｐＪ３Ω−ＭＲＰ１（Δ２２３−２３２）を得た。
【００６０】
単離されたＬ０を作出するために、ｐＡｃＳＧ２ＭＲＰリンカーＩＩ／リンカーＩ構築体を、リンカーＩＩ中のＮｈｅＩおよびリンカーＩ中のＳｐｅＩで部分消化した。この断片（アミノ酸ＭＡＬ＋２０４−２８１＋ＬＬＡ＋Ｓｔｏｐをコードしている）を、ｐＶＬ１３９２のＸｂａＩ部位にサブクローニングした。Ｌ０Δ（２２３−２３２）断片を得るために、アミノ酸２０４−２８１をコードしている断片を、鋳型としてｐＪ３ΩＭＲＰ１（？２２３−２３２）を用い、ＰＣＲ増幅した。使用したフォワードプライマーは、５’−ｔａｇｇｃｔａｇｃｃｇｇｃａｔｇｇａｃｃｃｔａａｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｇａ−３’であり、使用したリバースプライマーは、５’−ｃｇｇｃｔａｇａｔｃｔａａｔｃｃｔｔｇｇａｇｇａｇｔａｃａｃ−３’であった。これらのプライマーは、各々、ＮｈｅＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位を含んだ。このＰＣＲ断片を、ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、この断片を、ｐＶＬ１３９３にクローニングした。全ての構築体を配列解析し証明した。
【００６１】
Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を培養し、既報のようにバキュロウイルスで感染した（１１）。組換えバキュロウイルスは、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎｅ社）を用いて作出した。
【００６２】
１．２ ＭＲＰ１変種を発現するＭＤＣＫＩＩ細胞の作出
ＭＤＣＫＩＩ細胞におけるＭＲＰ１変種の発現のために、Ｌ０ＭＤＲ１キメラ、ΔＭＲＰ１、およびＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）を平滑断端断片として、既述のようにレトロウイルスベクターｐＣＭＶ−ｎｅｏへ挿入した［Ｂａｋｏｓ Ｅら（１９９８）、前記参照］。同時−発現実験のために、Ｌ０断片を、ｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶベクター（Ｄｒ． Ｊ． Ｗｉｊｎｈｏｌｄｓ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、アムステルダム、オランダ）のご厚意により入手）へクローニングした。このベクターを、ｐＣＭＶ−ｎｅｏからの平滑−断端ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＣＭＶ初期プロモーターを含む）を、ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏベクターの平滑−断端ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより作出した［Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ， Ｊ．Ｐ．およびＬａｎｄ， Ｈ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：３５８７−３５９６ （１９９０）］。細胞を、既述のように、レトロウイルスで誘導した［Ｅｖｅｒｓ， Ｒ．、Ｋｏｏｌ， Ｍ．、ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒ， Ｌ．、Ｊａｎｓｓｅｎ， Ｈ．、Ｃａｌａｆａｔ， Ｊ．、Ｏｏｍｅｎ， Ｌ．Ｃ．、Ｐａｕｌｕｓｍａ， Ｃ．Ｃ．、Ｏｕｄｅ Ｅｌｆｅｒｉｎｋ， Ｒ．Ｐ．、Ｂａａｓ， Ｆ．、Ｓｃｈｉｎｋｅｌ， Ａ．Ｈ．、およびＢｏｒｓｔ， Ｐ．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１：１３１０−１３１９ （１９９８）］。ｐＢａｂｅ−ＰｕｒｏまたはｐＣＭＶ−ｎｅｏベクターで安定して誘導されたＭＤＣＫＩＩ細胞は、各々、プロマイシン（３μｇ／ｍｌ）含有培地で４〜６日間またはＧ−４１８（８００μｇ／ｍｌ）含有培地で７日間選択した。
【００６３】
１．３ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞におけるＭＲＰ１ Ｌ０ペプチドの発現
Ｌ０ペプチドとチオレドキシンの融合タンパク質を作出するために、ＭＲＰ１のアミノ酸２０４〜２８１をコードしている断片を、鋳型としてｐＶＬ１３９３−Ｌ０を用い、ＰＣＲ−増幅した。「フォワード」プライマー「ａ」の配列は、５’−ａｔｔｇｇｔａｃｃｃｇａｃｃｃｔａａｔｃｃｃｔｇｇ−３’であり、「リバース」プライマー「ｄ」の配列は、５’−ａａｇａａｇｃｔｔａａｔｃｃｔｔｇｇａｇｇａｇｔａｃａｃ−３’であった。これらのプライマーは、各々、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位を含んだ。ＰＣＲ断片は、酵素 ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＣＬＴＲＸベクター（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ社）のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＣＬＴＲＸ−Ｌ０を得た。
【００６４】
ＭＲＰ１−ＭＲＰ２キメラＬ０は、ＭＲＰ２の両親媒性ヘリックスを含むが、これを重複ＰＣＲ法により調製した。鋳型としてｐＶＬ１３９３−Ｌ０を使用した。５’断片は、フォワードプライマー「ａ」およびリバースプライマー「ｂ」（５’−ｔｃａｇａ ａｔｇａｔ ｇｃｔｇｔ ｃａｔａｃ ｃａｇｃｔ ｇｔａｇｇ ｔｇａｔｃ ｇｔｃｇａ ｃａｇｇ−３’）を用いて調製した。プライマー「ｂ」の相補体は、ＭＲＰ１のアミノ酸２１６〜２２０およびＭＲＰ２のアミノ酸２０６〜２１４をコードした。３’断片は、フォワードプライマー「ｃ」（５’−ｔｇａｃａ ｇｃａｔｃ ａｔｔｃｔ ｇａａａｇ ｇｃｔａｃ ａａｇｃａ ｇｃｃｃｃ ｔｇｇａｇ ｇｇｇ−３’）およびリバースプライマー「ｄ」を用いて調製した。プライマー「ｃ」は、ＭＲＰ２ のアミノ酸２１０〜２１８およびＭＲＰ１のアミノ酸２３４〜２３８をコードしている。断片を単離・プールし、次に更なるＰＣＲを、プライマー「ａ」および「ｄ」により行った。得られた産物をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ｐＣＬＴＲＸベクターへクローニングした。
【００６５】
得られたｐＣＬＴＲＸ−Ｌ０ベクターを、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞へクローニングし、これを次にＴＹＢＧ抗生物質ブロス（トリプトン１０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、ブドウ糖４ｇ、ｐＨ７．２、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ）中で３７℃で増殖した。ＯＤ（６００）が１．１を超えた時点で、細胞を遠心によりペレットとし、Ｍ９培地中に浮遊させ、２８℃で３０分間インキュベーションした。その後、発現を、ＩＰＴＧにより２時間誘導した。誘導が終了した時点で、遠心により細胞をペレット化し、このペレットを２０％ショ糖で洗浄し、その後２０％アガロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび０．１μｇ／ｍｌリゾチーム（ｐＨ７．２）を含有する溶液に懸濁し、４℃で３０分間インキュベーションし、その後音波処理した。溶解した細胞を、遠心（２００００ｇ、２０分間）によりペレット化した。こうして得られた溶解液を、輸送活性の回復を試験するための更なる実験に使用した。
【００６６】
１．４  膜調製およびイムノブロッティング
ウイルス−感染したＳｆ９細胞を収集し、それらの膜を単離・貯蔵し、膜タンパク質濃度を既報のように決定した［Ｓａｒｋａｄｉ Ｂ．（１９９２）、前記参照］。イムノブロッティング、ヒトＭＲＰ１のＲ１およびＭ６モノクローナル抗体による検出、ならびに好感度化化学発光法を使用するタンパク質−抗体相互作用の検出を、既報のように行った［Ｂａｋｏｓ Ｅら（１９９６）、前記参照］。
【００６７】
１．５  膜小胞内の微量取込みおよびバナジン酸−依存型ヌクレオチド捕獲
（３Ｈ）ＬＴＣ４（１３５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ社から入手し；（３Ｈ）ＮＥＭ−ＧＳは、（３Ｈ）ＮＥＭ （６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）から、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中のアイソトープを、新たに溶解したＧＳＨとモル比１：１．１で混合することにより調製した。（３Ｈ）ＮＥＭ−ＧＳおよび（３Ｈ）ＬＴＣ４の輸送の測定について、単離した膜（タンパク質２００μｇ）を、輸送緩衝液（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、〜４０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＫＣｌ）の５００μｌ中の４ｍＭ ＡＴＰまたはＡＭＰ存在下で、２３℃（ＬＴＣ４）または３７℃（ＮＥＭ−ＧＳ）でインキュベーションした。この懸濁液の１００μｌアリコートを、氷冷した輸送緩衝液１ｍｌに指示された時点で添加し、その後迅速にニトロセルロース膜（孔径０．２５μｍ）を通して濾過した。濾液を０．５ｍｌの冷輸送緩衝液で２回洗浄し、フィルターに結合した放射能をシンチレーション溶液（Ｏｐｔｉｆｌｕｏｒ， Ｐａｃｋａｒｄ社）で測定した。ＡＴＰ−依存型輸送を、ＡＭＰで得た活性値を、ＡＴＰ存在下で得た値から減じることにより算出した。バナジン酸−依存型ヌクレオチド捕獲は、基本的に別所記載のように測定した［Ｓｚａｂｏ， Ｋ．ら（１９９８）、前記参照］。
【００６８】
１．６  共焦点レーザー走査型顕微鏡
免疫蛍光実験のために、細胞を、微多孔質ポリカーボネートフィルター（孔径３μｍ、直径２４．５ｍｍ、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）３４１４；Ｃｏｓｔａｒ社、ケンブリッジ、ＭＡ）上で、密度４ｘ１０５個細胞／ウェルで３日間増殖した。ｍＡｂ Ｍ６およびＲ１による抗体インキュベーションは、先に記したように行った［Ｂａｋｏｓ， Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］。抗−ＭＤＲ１ ｍＡｂ ＭＲＫ１６によるインキュベーションを、細胞をＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過性としなかった点を変更した以外は、既述のように行った。ＦＩＴＣ−標識した二次抗体を、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、およびＲｏｃｈｅ社から入手した。
【００６９】
１．７ ＭＤＣＫＩＩ細胞の輸送アッセイ
輸送アッセイを、［１４Ｃ］ＤＮＰ−ＧＳ輸送実験において、Ｈａｎｋｓ緩衝した生理食塩水［Ｅｖｅｒｓら（１９９８）、前記参照］を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ変更Ｅａｇｌｅ培地の代わりに使用した点を変更した以外は、既報のように行った［Ｅｖｅｒｓら（１９９６）および（１９９８）、前記参照］。
１−クロロ−２，４−ジニトロ［１４Ｃ］ベンゼン（１０Ｃｉ／ｍｏｌ）、および［３Ｈ］ビンブラスチン（９．４ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社から得た。
【００７０】
２．  キメラＭＲＰ１−ＭＤＲ１変種、それらの発現および機能
本発明者らは、ｃＤＮＡを、バキュロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターに挿入し、下記の分子を得た：（ｉ）ＭＤＲ１のＮ−末端に共有結合した、ＭＲＰ１のＬ０（アミノ酸 ２０４−２８１） （Ｌ０ＭＤＲ１）；（ｉｉ）ＭＤＲ１のＮ−末端に共有結合した、ＭＲＰ１のＴＭＤ０（アミノ酸１−２０３）（ＴＭＤ０ＭＤＲ１）；ならびに、（ｉｉｉ）ＭＤＲ１のＮ−末端に共有結合した、ＭＲＰ１の完全Ｎ−末端領域（ＴＭＤ０Ｌ０、アミノ酸１−２８１） （ＴＭＤ０Ｌ０ＭＤＲ１；図１Ａ参照）。ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラを、バキュロウイルスで感染したＳｆ９細胞およびレトロウイルスで感染したＭＤＣＫＩＩ細胞において発現した。この後者のシステムについて、本発明者らは、Ｌ０−特異的インヒビター検出のためのアッセイ法の開発に焦点を当てているので、Ｌ０ＭＤＲ１キメラに関するデータのみを示す。
【００７１】
様々な変異体のタンパク質レベルおよび輸送特性を、無傷の細胞および単離された膜調製物において試験した。図１（パネルＢ、ＣおよびＤ）は、各々、Ｓｆ９細胞の膜調製物中およびレトロウイルス−誘導したＭＤＣＫＩＩ細胞中の検出可能なタンパク質のイムノブロットを示している（実施例１．４参照）。ｍＡｂ Ｒ１のエピトープは、Ｌ０領域［アミノ酸２３８−２４７］内にあるが［Ｈｉｐｆｉｉｅｒ， Ｄ． Ｒ．、Ｇａｏ， ｍ．、Ｓｃｈｅｆｆｅｒ， Ｇ．、Ｓｃｈｅｐｅｒ， Ｒ．Ｊ．、Ｄｅｅｌｅｙ， Ｒ．Ｇ．、およびＣｏｌｅ， Ｓ． Ｃ． Ｐ．、Ｂｒ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、７８：１１３４−１１４０ （１９９８）］、ポリクローナル抗体４０７７およびｍＡｂ Ｃ２１９に関するものは、ＭＤＲ１ Ｐｇｐ内にある。本発明者らは、キメラＭＲＰ１−ＭＤＲ１タンパク質の有意な発現を得、これは同じ発現システム中の野生型分子のものと同等であった。人工的に構築された連結領域に密接した部位での、少量の部分的タンパク質分解性の切断が、バキュロウイルス発現システムにおいて産生されたタンパク質中で明らかであった（図１Ｂ）。しかし産生されたタンパク質の大部分は、完全長キメラに相当する分子量の値が認められた。ＭＤＣＫＩＩ細胞において、Ｌ０ＭＤＲ１タンパク質は、ＭＤＲ１同様、グリコシル化され、かつこの細胞のツニカマイシンによる処理は、このグリコシル化を無効化した（図１Ｄ）。
【００７２】
これらのキメラタンパク質の機能特性を試験するために、本発明者らは最初に、単離したＳｆ９細胞膜小胞中における、ＡＴＰ−依存型ＬＴＣ４およびＮＥＭ−ＧＳ輸送を測定した（実施例１．５参照）。小胞内の検出可能なタンパク質の量は感知可能であるにもかかわらず、本発明者らは、対照のβ−ガラクトシダーゼ含有膜小胞において認められるものを超えるようなＭＲＰ１−様ＧＳ−抱合体輸送活性を認めなかった（図２Ａ）。
【００７３】
いかなるＭＲＰ１−様輸送活性も存在しない場合、ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラが、ＭＤＲ１−様疎水性薬物輸送能を維持するかどうかを決定することは重要である。疎水性ＭＤＲ１基質による直接的な小胞輸送の測定は実行が困難であるので、本発明者らは、単離したＳｆ９膜中のＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラタンパク質の基質−刺激したＡＴＰａｓｅおよびヌクレオチド捕獲活性を調べた。
【００７４】
本発明者らは、キメラＭＲＰ１−ＭＤＲ１タンパク質を含有する全ての膜において、有意なベラパミルが刺激したＡＴＰａｓｅ活性を認めた（示さず）。しかしこの活性は、このキメラの部分的タンパク質分解の結果であり（図１Ｂ参照）、完全長ＭＤＲ１を生じ、従ってヌクレオチド捕獲は、これに関してより情報に富むと考えられた。タンパク質の共有的光親和性標識は、捕獲剤としてのバナジン酸の存在下で、Ｍｇ−８−アジド−［α−３２Ｐ］−ＡＴＰを用い行った（「材料および方法」参照）。ＭＤＲ１タンパク質は、疎水性化合物（例えばベラパミル）で刺激された場合に、ヌクレオチド捕獲が可能であること、およびこれはＬＴＣ４により影響を受けないことは知られている。ＭＲＰ１のこの活性は、ＬＴＣ４により有意に刺激されるが、ベラパミルによっては刺激されない［Ｓｚａｂｏ， Ｋ．らおよびＢａｋｏｓ，Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］。
【００７５】
図２Ｂに示したように、ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラのヌクレオチド捕獲は、容易に測定可能であり、かつバナジン酸−依存型であった。ベラパミルによる刺激は、完全長ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラを表すタンパク質バンドに加え、ＭＤＲ１コアを示すタンパク質分解性断片の両方において認められた。全ての場合において、完全なヌクレオチド捕獲の阻害が、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドによる前処理により得られた（データは示さず）。これらの機能アッセイは、ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラは、それらのＭＤＲ１−様ヌクレオチド捕獲機能を維持していることを明らかにしている。
【００７６】
下記の実験において、本発明者らは、レトロウイルスにより誘導したＭＤＣＫＩＩ細胞単層において、Ｌ０ＭＤＲ１キメラタンパク質の膜局在化および輸送機能を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）により、試験した。Ｌ０ＭＤＲ１は、ＭＤＲ１ Ｐｇｐの細胞外ループ上のコンホメーションエピトープを認識する抗体である、ｍＡｂ ＭＲＫ１６を用いて検出した［Ｈａｍａｄａ， Ｈ．、およびＴｓｕｒｕｏ， Ｔ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８３、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、７７８５−７７８９ （１９８６）］。図３Ａに示したように、Ｌ０ＭＤＲ１は、ＭＤＣＫＩＩ細胞単層の頂端側細胞膜に優先的に局在化していた。頂端側局在化に従い、ＭＤＣＫＩＩ−Ｌ０ＭＤＲ１およびＭＤＣＫＩＩ−ＭＤＲ１細胞は、ビンブラスチンの頂端側輸送の増大を示した（図３Ｂ）。Ｌ０ＭＤＲ１の方向性のある輸送活性は、ＭＤＲ１の値と比べそのタンパク質レベルに相関していた（図１Ｃ）。本発明者らは、ＭＤＣＫＩＩ−Ｌ０ＭＤＲ１細胞による、有機アニオン、より詳細にはＤＮＰ−ＧＳの輸送増大はを認めなかった（データは示さず）。
【００７７】
これらの結果を組合せると明確に、ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラが、昆虫および哺乳類の両細胞において作出されたこと、およびこのキメラタンパク質は、ＭＤＲ１タンパク質の特徴を維持していたことを示している。Ｌ０は、ＭＤＲ１タンパク質に結合された場合に、機能の変更を生じないので、その機能性の挙動は、前述のシステムにおいて試験することはできない。従って、Ｌ０−特異的インヒビターの試験に適したアッセイシステムは、本実施例において説明されたキメラ構築体を用いて作成することはできない。
【００７８】
３．  変異体ＭＲＰ１変種、それらの発現および機能
ＭＲＰ１のＮ−末端リンカー領域の特異的役割をより詳細に分析するために、本発明者らは、下記の変異体ＭＲＰ１構築体を、Ｓｆ９およびＭＤＣＫＩＩの両細胞で発現した：（ｉ）２個のＡＢＣ単位および２ｘ６ ＴＭ（膜貫通）ヘリックスを含む、Ｎ−末端が切断されたＭＲＰ１（アミノ酸２８１−１５３１）［ΔＭＲＰ１；Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］；（ｉｉ）ＭＲＰ１のＮ−末端リンカー領域を示す、アミノ酸２０４−２８１（Ｌ０） （図４Ａ）。
【００７９】
下記実験において、ＭＲＰ１機能の存在を各機能について試験し、ΔＭＲＰ１および同時−発現するΔＭＲＰ１およびＬ０ペプチドにおいて、Ｌ０それ自身の挙動およびこれによりいかなる機能が回復されるかを分析した。
【００８０】
３．１ Ｓｆ９細胞における発現
図４Ｂは、抗−ＭＲＰ１モノクローナル抗体Ｒ１およびＭ６を用いる、Ｓｆ９細胞における、ΔＭＲＰ１およびＬ０変種のイムノブロット検出を説明している。ｍＡｂ Ｍ６のエピトープは、ＭＲＰ１のＣ−末端に位置した［アミノ酸１５１１−１５２０；Ｈｉｐｆｎｅｒら（１９９８）、前記参照］。全てのこれらの分子について、本発明者らは、野生型ＭＲＰ１に類似した認知可能な発現を得た（図４Ｂ）。野生型ＭＲＰ１およびΔＭＲＰ１のように、Ｌ０ポリペプチドは、細胞溶解液の膜画分にほとんど完全に存在することがわかったことは重要である（下記参照）。この膜−結合したＬ０の量は、Ｓｆ９ 細胞膜中のΔＭＲＰ１の存在または非存在とは無関係であった。様々な膜調製物中のこれらの変異体タンパク質の発現レベルのわずかな変動が依然認められ、その結果この機能データは、特異的タンパク質の発現レベルに相関していた（下記参照）。
【００８１】
３．２ ＭＲＰ１基質の輸送［ＬＴＣ４およびＮＥＭ−ＧＳ、Ｍｕｌｌｅｒ． Ｍ．ら（１９９４）、Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］
様々なＭＲＰ１タンパク質の輸送機能を正確に決定するために、本発明者らは、Ｓｆ９膜調製物中の輸送−コンピテントな小胞内外の相対量を概算し［Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］、輸送速度を、イムノブロットにより決定した相対ＭＲＰ１発現レベルに従い補正した。
【００８２】
図４、パネルＣおよびＤは、ＭＲＰ１、ΔＭＲＰ１、または同時発現されたＬ０およびΔＭＲＰ１を含む、Ｓｆ９膜小胞における［３Ｈ］ＬＴＣ４（５０ｎＭ）および［３Ｈ］ＮＥＭ−ＧＳ（５０μＭ）の時間−依存型の取込みを示した。完全長ＭＲＰ１は、小胞放射能のＡＴＰ−依存型の増加を生じ、これはＬＴＣ４については、２３℃で約３０秒間直線であり、ＮＥＭ−ＧＳについては、３７℃で約３分間直線であった。ＭＲＰ１含有膜によるＡＴＰ−依存型ＬＴＣ４輸送の初速度は、これらの条件下で約６０ｐｍｏｌ／ｍｇ／分であったが、ＮＥＭ−ＧＳ輸送のそれは、約２５０ｐｍｏｌ／ｍｇ／分であった。既報のように（２０）、冷した基質−含有溶液による小胞の迅速な洗浄は、小胞のＬＴＣ４およびＮＥＭ−ＧＳレベルを変更しなかったが、培地への濃ショ糖（１Ｍ）または低濃度Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．０２％）の添加は、ＡＴＰ−依存型の微量蓄積を排除した。
【００８３】
図４ＣおよびＤに示されたように、本発明者らは、ΔＭＲＰ１の発現がいかなる輸送活性も生じないことを認めた（対照β−ガラクトシダーゼ発現小胞で測定した輸送と比較して）。しかしΔＭＲＰ１およびＬ０領域の同時発現は、ＬＴＣ４（５０ｎＭでＭＲＰ１の約９０％）およびＮＥＭ−ＧＳ（５０μＭのＮＥＭ−ＧＳでＭＲＰ１の約４０％）の顕著な取込みを生じた。再度、これら全ての場合において、小胞内の微量取込みは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００または１Ｍショ糖の添加により排除された。
【００８４】
ΔＭＲＰ１およびＬ０の同時発現によるＬＴＣ４輸送に関する反応速度論的パラメータの試験は、Ｋｍ値が、野生型ＭＲＰ１（約１４０ｎＭ）に類似していることを示した。しかしＮＥＭ−ＧＳの輸送に関して、野生型ＭＲＰ１のＫｍは１５０μＭであったが、同時発現されたΔＭＲＰ１＋Ｌ０のそれは約４００μＭであった。後者の場合の最大輸送速度は、ＭＲＰ１について認められたレベルに達していた（データは示さず）。
【００８５】
従って、Ｌ０領域およびΔＭＲＰ１の同時発現は、Ｌ０−機能を個別に決定する可能性を提供し、すなわち、Ｌ０は、ＭＲＰ１基質に関してΔＭＲＰ１活性の回復が可能である。従って、このシステムは、予想外のことだが、Ｌ０−特異的インヒビターの試験における将来性を提供している。
【００８６】
３．３ Ｓｆ９細胞膜におけるバナジン酸感受性ヌクレオチド捕獲
次に本発明者らは、様々なＭＲＰ１変種を含むＳｆ９細胞膜における基質が刺激したバナジン酸感受性ヌクレオチド捕獲を試験した（図５）。先に報告されたように［Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］、ΔＭＲＰ１は、いかなるヌクレオチド捕獲も示さなかった。しかし図５に示されたように、Ｌ０ペプチドがΔＭＲＰ１領域と同時発現される場合、完全な活性が回復され、野生型ＭＲＰ１において認められるのと同様の、ＬＴＣ４によるヌクレオチド捕獲の刺激が認められた。再度、全ての場合において、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドによる前処理により、ヌクレオチド捕獲の完全な阻害が得られた。
【００８７】
従って、再度、ＭＲＰ１活性を回復するＬ０−機能を試験し、これによりＬ０−特異的インヒビターの有効性を評価するのに適した追加の方法が提供された。
【００８８】
３．４  ΔＭＲＰ１の形質膜へのレスキュー
ＭＤＣＫＩＩ細胞におけるΔＭＲＰ１は、細胞内コンパートメント、おそらく小胞体に局在していることが先に示された［Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］。Ｌ０ペプチドがΔＭＲＰ１を形質膜へレスキューすることができるかどうかを調べるために、本発明者らはＭＤＣＫＩＩ−ΔＭＲＰ１細胞を、ｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶ−Ｌ０構築体で誘導した（実施例１．２）。プロマイシン選択時に、Ｌ０の局在化を、ｍＡｂ Ｒ１を用い決定した。プロマイシン耐性細胞のプールにおいて、明確な側形質膜染色が、細胞の小さい群において認められたが、これらの細胞において若干の細胞内染色も存在した（図６）。細胞の低い割合のみがｍＡｂ Ｒ１による染色を示したので、単独のクローンを単離することは不可能であった。従ってイムノブロッティングおよび経上皮輸送の測定は、行うことができなかった。野生型細胞のＬ０含有構築体による感染後に、シグナルは得られず、これはおそらく、ΔＭＲＰ１の非存在下においてこの小タンパク質は迅速に分解したためであろう。
【００８９】
先に記した試験は、単離されたＬ０ポリペプチドは、ΔＭＲＰ１と会合することができることおよびその結果、このタンパク質は再度その機能を獲得し、側膜へルーティングすることを強力に示唆している。Ｌ０−特異的インヒビターは、この機能をおそらく最も阻害するであろう。
【００９０】
３．５ Ｌ０ペプチドの膜会合
前述のように（図４Ｂ参照）、Ｓｆ９細胞において産生された有意な量のＬ０タンパク質が、細胞膜に会合していることがわかった。図７Ａは、Ｓｆ９細胞溶解液中で、Ｌ０タンパク質のほとんどが、膜画分中に認められ、かつ小画分のみが細胞質にあること説明している。Ｓｆ９細胞膜の１Ｍ ＫＣｌによる洗浄は、このＬ０ペプチドの膜に結合した局在を変更しなかった。しかし、この膜の５Ｍ尿素または１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による洗浄は、完全にＬ０ペプチドを可溶化した（図７Ｂ）。同じ細胞内におけるΔＭＲＰ１の同時−発現は、Ｌ０の膜への結合または尿素もしくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理に対する感受性に影響を及ぼさなかった。膜の尿素による処理は、ＭＲＰ１またはΔＭＲＰ１の膜局在化には影響を及ぼさなかったが、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による処理であっても、これらの膜に広がるタンパク質のわずかに２０〜４０％の可溶化を示したのみであった（データは示さず）。
【００９１】
従って、Ｌ０ペプチドの膜会合は、個別に試験することができ、かつ阻害することができるＬ０−機能であると見なすことができる。
前記に従い、Ｌ０ペプチドの機能は、先に説明した１種または複数種の方法を含むシステムにおいてアッセイすることができる。予想されるように、ＭＲＰ−ファミリーの各輸送体タンパク質について、ＭＲＰ１のＬ０領域と相同なまたは機能的に相当するＬ０領域を有することは真実である。
【００９２】
３．６  細菌発現システムにおけるＬ０ペプチドの発現
Ｌ０ペプチドを、ＢＬ２１細菌細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）において機能可能な発現ベクターを用い、融合タンパク質として、可溶性型で発現した。ＭＲＰ１ Ｌ０領域を、チオレドキシン（ＴＲＸ）融合タンパク質のコード配列を含むｐＣＬＴＲＸベクター（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ社）にクローニングし、ｐＣＬＴＲＸ−Ｌ０を得た。このベクターを用い、タンパク質をＢＬ２１細胞において作出した（「材料および方法」参照）。細胞は、リゾチームで可溶化し、その可溶性画分を遠心により分離した。クーマシー染色したゲルの写真は、ＴＲＸ−Ｌ０が可溶性型で作出されたことを示している（図１０）。
【００９３】
ＴＲＸ−Ｌ０のΔＭＲＰ１の輸送活性に対する作用もアッセイした。ＴＲＸ−Ｌ０を含有する細胞溶解液を、ΔＭＲＰ１を含有する膜小胞へ添加し、その後ＡＴＰ依存型小胞ＬＴＣ４取込みを測定した。不活性ΔＭＲＰ１の輸送活性は回復した。
【００９４】
３．７ Ｌ０ペプチドの保存的疎水性膜結合セグメントの試験
Ｌ０領域の塩−不応性であるが変性剤または界面活性剤に感受性の膜付着は、Ｌ０内に膜−付着した両親媒性領域（例えばヘリックス）が存在する可能性を生じた。実際図７Ｃに示したように、二次構造の推定は、現在公知のＭＲＰホモログ全てにおいて、このような保存された両親媒性ヘリックスの存在を示した（このようなヘリックスは、ＭＲＰ−関連したＣＦＴＲおよびＳＵＲタンパク質にも存在する；データは示さず）。
【００９５】
この両親媒性ヘリックスのＬ０領域内での役割を試験するために、本発明者らは、単離されたＬ０断片の状況および完全長ＭＲＰ１分子の両方において、この予想されるヘリックス内に１０個のアミノ酸欠失（Δ２２３−２３２）を構築した。図８Ａは、ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）が、Ｓｆ９細胞において野生型ＭＲＰ１タンパク質に類似した量で産生されることを示した。図８Ｂは、単離されたＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）を発現しているＳｆ９細胞におけるＬＴＣ４輸送実験を示し、図８Ｃは、Ｌ０Δ（２２３−２３２）の膜相互作用を示している。野生型ＭＲＰ１とは対照的に、ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）は、認知可能な輸送活性を示さず、Ｌ０Δ（２２３−２３２）は細胞膜へ付着しなかった。Ｌ０Δ（２２３−２３２）がΔＭＲＰ１と同時発現される場合、またはＬ０Δ（２２３−２３２）を含有する濃縮された上清が単離されたΔＭＲＰ１含有−膜へ添加される場合は、ＬＴＣ４の輸送活性は認められなかった（データは示さず）。
【００９６】
図９は、ＭＤＣＫＩＩ単層において産生されたＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）タンパク質の発現、局在化および機能を示している。図９Ａに示されたように、ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）タンパク質は、効果的に発現され、ＭＲＰ１同様、これらの細胞においてほとんど完全にグリコシル化された。ツニカマイシン処理は、ＭＲＰ１およびＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）発現細胞の両方においてグリコシル化の喪失を生じた（図９Ｂ）。野生型ＭＲＰ１［Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］同様、ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）は、ＭＤＣＫＩＩ細胞の側膜に局在化していた（図９Ｃ）。しかし、ＭＲＰ１およびＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）の輸送活性を極性化した細胞単層において比較した場合、ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）タンパク質によるＤＮＰ−ＧＳの排出において（図９Ｄ）、細胞のベースライン排出活性と比べ検出可能な増加は存在しなかった。更なる実験セットにおいて、ＭＲＰ１の両親媒性ヘリックスを、ＭＲＰ−ファミリーの別の要員（ＭＲＰ２）のＬ０領域の両親媒性ヘリックスと交換した。こうして得られたキメラＬ０をΔＭＲＰ１に追加した場合には、ΔＭＲＰ１活性は回復しなかった。
この説明において明らかにした発現システムおよび構築体は、例証であり、限定ではない。
【００９７】
両親媒性ヘリックスであり重要な役割をもつと予測されたＬ０ペプチドのセグメント、好ましくはアミノ酸２２１〜２３２に相当するセグメントは、該セグメントに特異的なインヒビターのデザインに特に適している。前述の構築体を用いかつ適当なＬ０−機能をアッセイすることにより、可能性のあるインヒビターを、膜結合について特に重要であるこのＬ０内の保存領域に関するその特異性についても試験することができる。このような好ましいインヒビターが同定されるならば、膜結合において非常に重要であるこの領域が欠失されるかまたはそれが不活性化される変異構築体を作成することができる。このような変異体は、本願明細書に記したものとは異なる種類の機能を有することができる。
【００９８】
より短いまたはより長いアミノ酸セグメントの欠失または置換により、実質的に同じ原理で変異された分子が調製され、これはインヒビターの試験または開発のため、ＭＲＰ−ファミリーのタンパク質のより狭い範囲の重要なセグメントまたは重要なアミノ酸を見つけるため、構造上の相関を理解しこれにより機能を明らかにするために使用することができることが理解される。この方法で得られた情報は、インヒビターまたは薬剤のデザインにおいて使用することができる。
【００９９】
ＭＲＰ１はヒト腫瘍の臨床での化学療法に対する耐性において重要な役割を果たしていることはわかっているので［Ｈｉｐｆｎｅｒ， Ｄ． Ｋ、Ｄｅｅｌｅｙ， Ｋ Ｄ、およびＣｏｌｅ， Ｓ． Ｐ． Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１４６１：３５９−３７６ （１９９９）］、本発明の特異的かつ有効なアッセイ法、分子および宿主細胞は、ＭＲＰ−ファミリー輸送体タンパク質の研究、それらのインヒビターの試験およびデザイン、これによる多剤耐性の克服において重要な役割を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】概略的表現（パネルＡ）ならびにＳｆ９細胞（パネルＢ）およびＭＤＣＫＩＩ細胞（パネルＣおよびＤ）において発現されたＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラタンパク質のイムノブロット検出
パネルＡ：ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラタンパク質の概略的表現。
パネルＢ：ＭＤＲ１、Ｌ０ＭＤＲ１、ＴＭＤ０ＭＤＲ１、ＴＭＤＯＬ０ＭＤＲ１またはＭＲＰ１を含むＳｆ９細胞膜のウェスタンブロット分析。Ｓｆ９細胞の単離された膜（５μｇ）に、６％Ｌａｅｍｍｌｉ−型ゲルにおいて電気泳動を施し、「材料および方法」の項に記したようにイムノブロットを行った。レーン１−５は、ヒトＭＤＲ１に特異的なポリクローナル抗体４０７７で染色し、レーン６−１０は、ヒトＭＲＰ１に特異的なｍＡｂ Ｒ１で染色した。タンパク質−抗体相互作用は、高感度化学発光法を用いて可視化した。
パネルＣ：ＭＤＣＫＩＩ野生型細胞ならびにＬ０ＭＤＲ１、ＭＤＲ１、またはＭＲＰ１産生細胞の溶解液によるウェスタンブロット。タンパク質２０μｇを、変性７．５％ポリアクリルアミドゲルにおいてサイズ分画した。電気ブロット後、ブロットを、ヒトＭＤＲ１を認識するＣ２１９（レーン１−４）またはｍＡｂ Ｒ１（レーン５−８）のいずれかと共にインキュベーションした。細胞株の同一性が、これらのレーンについて示された。
パネルＤ：ツニカマイシン（３μｇ／ｍｌ）で０、１２、２５または４０時間処理したＭＤＣＫＩＩ−ＭＤＲ１細胞（レーン１−４）およびＭＤＣＫＩＩ−Ｌ０ＭＤＲ１細胞（レーン５−８）を示すウェスタンブロット。ＭＤＲ１は、ｍＡｂ Ｃ２１９で可視化し、Ｌ０ＭＤＲ１はｍＡｂ Ｒ１で可視化した。
【図２】ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラタンパク質を含むＳｆ９細胞膜におけるＬＴＣ４輸送（パネルＡ）およびヌクレオチド捕獲（パネルＢ）
パネルＡ：ＭＲＰ１、ＭＤＲ１、ＴＭＤ０ＭＤＲ１、ＴＭＤ０Ｌ０ＭＤＲ１、Ｌ０ＭＤＲ１またはβ−ガラクトシダーゼを発現しているＳｆ９ 膜小胞におけるＡＴＰ−依存型ＬＴＣ４取込みの時間経過。膜調製物を、５０ｎＭ ＬＴＣ４と共に２３℃でインキュベーションし、４ｍＭ ＡＴＰ存在時に得られた値から４ｍＭ ＡＭＰ存在時に得られた値を減じ、ＡＴＰ−依存型の取込みを算出した。試料は指示した時点で採取した。
パネルＢ：ＭＲＰ１−ＭＤＲ１キメラタンパク質によるバナジン酸−依存型ヌクレオチド捕獲。ＭＲＰ１（レーン１−３）、ＭＤＲ１（レーン４−６）、Ｌ０ＭＤＲ１（レーン７−９）、ＴＭＤ０ＭＤＲ１（レーン１０−１２）、およびＴＭＤ０Ｌ０ＭＤＲ１（レーン１３−１５）を発現しているＳｆ９細胞から単離した膜を、「材料および方法」の項に記したように、バナジン酸の存在下、Ｍｇ−８−アジド−［α−３２Ｐ］−ＡＴＰで標識した［更に、前記Ｓｚａｂｏ， Ｋ．ら（１９９８）参照］。反応緩衝液は、レーン２、５、８、１１および１４に示した実験においては３０μＭベラパミルを、ならびにレーン３、６、９、１２および１５では６００ｎＭ ＬＴＣ４を含有した。
【図３】ＭＤＣＫＩＩ細胞におけるキメラＬ０ＭＤＲ１の局在化および輸送特性
パネルＡ：共焦点レーザー走査型顕微鏡によるＭＤＣＫＩＩ単層におけるＬ０ＭＤＲ１の免疫局在化。Ｌ０ＭＤＲ１は、ｍＡｂ ＭＲＫ１６による間接免疫蛍光により検出した（グリーンシグナル、図において明シグナル）。上側部分は、単層の平面図を示し、下側部分は、Ｘ／Ｚ縦断面を示している。矢印は、切断が行われた位置を示している。核酸は、ヨウ化プロピジウムにより対比染色した（赤色シグナル）。
パネルＢ：ＭＤＣＫＩＩ−由来の単層による［３Ｈ］ビンブラスチンの輸送。ＭＤＣＫＩＩ、ＭＤＣＫＩＩ−ＭＤＲ１およびＭＤＣＫＩＩ−Ｌ０ＭＤＲ１細胞によるビンブラスチンの輸送を示した。輸送は、反対側のコンパートメントに出現している、実験開始時（ｔ＝０）に添加された総放射能の割合として示している。これらの細胞に内在性に存在するＭＤＲ１ Ｐｇｐ存在を阻害するためには、ＰＳＣ８３３（０．１μＭ）を両コンパートメントに入れた［Ｂａｋｏｓ Ｅ．ら（１９９８）、前記参照］。□：頂端から基底への転位。○：基底から頂端への転位。これらの実験は、二つ組で行い、２回繰り返した。
【図４】Ｓｆ９細胞膜におけるＭＲＰ１変種の検出および機能
パネルＡ：ＭＲＰ１タンパク質および欠失によりＭＲＰ１から得られた変異体タンパク質の概略的表現。
パネルＢ：ＭＲＰ１（レーン１および５）、ΔＭＲＰ１（レーン２および６）、ΔＭＲＰ１＋Ｌ０（レーン３および７）またはＬ０（レーン４および８）を発現している細胞から調製したＳｆ９細胞膜のウェスタンブロット分析。Ｓｆ９細胞から単離した膜（５μｇ）を、４−２０％Ｌａｅｍｍｌｉ−型ゲルにおいて電気泳動を施し、イムノブロットを行った。ブロットは、各々、ｍＡｂ Ｒ１およびＭ６と共にインキュベーションした。
パネルＣおよびＤ：ＭＲＰ１、ΔＭＲＰ１、ΔＭＲＰ１＋Ｌ０、またはβ−ガラクトシダーゼを含むＳｆ９細胞膜小胞における、ＡＴＰ−依存型ＬＴＣ４（パネルＣ）およびＮＥＭ−ＧＳ（パネルＤ）取込みの時間経過。
パネルＢ：膜は、５０ｎＭ ＬＴＣ４と共に２３℃でインキュベーションし；パネルＣ：膜は、５０μＭ ＮＥＭ−ＧＳと共に３７℃でインキュベーションした。ＡＴＰ−依存型取込みは、４ｍＭ ＡＴＰ存在時に得られた値から４ｍＭ ＡＭＰ存在時に得られた値を減じ算出した。試料は、指定された時点で採取した。
【図５】ＭＲＰ１変種によるバナジン酸−依存型ヌクレオチド捕獲
ＭＲＰ１（レーン１−３）、ΔＭＲＰ１＋Ｌ０（レーン４−６）、またはΔＭＲＰ１（レーン７−９）を発現しているＳｆ９細胞から単離した膜を、「材料および方法」項に記したように、バナジン酸の存在下、Ｍｇ−８−アジド−［α−３２Ｐ］−ＡＴＰで標識した［更に、前記Ｓｚａｂｏ， Ｋ．ら（１９９８）参照］。反応緩衝液は、６００ｎＭ ＬＴＣ４（レーン２、５、および８）、または５００μＭ ＮＥＭ（レーン３、６、および９）を含んだ。
【図６】共焦点レーザー走査型顕微鏡によるＭＤＣＫＩＩ単層におけるΔＭＲＰ１と同時−発現されたＬ０の免疫局在化
Ｌ０は、ｍＡｂ Ｒ１による間接免疫蛍光により検出した（グリーンシグナル、側膜において明シグナル）。上側部分は、単層の平面図を示し、下側部分は、Ｘ／Ｚ縦断面を示している。矢印は、切断が行われた位置を示している。核酸は、ヨウ化プロピジウムにより対比染色した（赤色シグナル）。
【図７】Ｓｆ９細胞において発現されたＭＲＰ１のＬ０領域の膜付着
パネルＡ：ウェスタンブロットによるＳｆ９細胞において発現されたヒトＭＲＰ１のＬ０領域の検出。試料は、２０％Ｌａｅｍｍｌｉ−型ゲルにおいて分画し、イムノブロッティングし、ｍＡｂ Ｒ１と共にインキュベーションした。Ｃ：細胞抽出物（５μｇ）；Ｍ：膜画分（５μｇ）；ＣＰ：細胞質画分、膜画分と比較して等容量の細胞質を表している。
パネルＢ：ＭＲＰ１のＬ０領域の膜付着に対する、ＫＣｌ（１Ｍ、レーン２、３）、尿素（５Ｍ、レーン４、５）、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１％、レーン６、７）の作用。膜試料は、各試薬により洗浄し、その後パネルＡのようにサイズ分画した。レーン１：単離したＳｆ９細胞膜、レーン２−７：各試薬で洗浄した膜。Ｐ：膜ペレット画分、Ｓ：上清画分。試料は、各画分の等しい初期容量を示している。
パネルＣ：様々なＭＲＰタンパク質のＬ０領域内の両親媒性のヘリックスのコンピュータで推定した概略的表現。ＭＲＰ１の残基２２１−２３３、ＭＲＰ２の２１６−２２８、ＭＲＰ３の２２０−２３２、ＭＲＰ４の２４−３６、ＭＲＰ５の１１２−１２４、およびＭＲＰ６の２１６−２２８のヘリックス円形投影図。疎水性残基は丸で囲んだ。
【図８】Ｓｆ９細胞におけるＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）およびＬ０Δ（２２３−２３２）の特徴決定
パネルＡ：ＭＲＰ１またはＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）を含むＳｆ９細胞膜のウェスタンブロット分析。Ｓｆ９細胞の単離した膜（５μｇ）に、６％Ｌａｅｍｍｌｉ−型ゲルにおいて電気泳動を施し、「方法および材料」の項に記されたように、ヒトＭＲＰ１に特異的なモノクローナル抗体Ｒ１でイムノブロッティングした。
パネルＢ：ＭＲＰ１、ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）、またはβ−ガラクトシダーゼを発現しているＳｆ９細胞膜小胞における、ＡＴＰ−依存型ＬＴＣ４取込みの時間経過。膜調製物は、５０ｎＭ ＬＴＣ４と共に２３℃でインキュベーションし、ＡＴＰ−依存型取込みは、４ｍＭ ＡＴＰ存在時に得られた値から４ｍＭ ＡＭＰ存在時に得られた値を減じ算出した。試料は、指定された時点で採取した。
パネルＣ：Ｓｆ９細胞において発現されたヒトＭＲＰ１のＬ０Δ（２２３−２３２）変異体領域の検出。試料は、「方法および材料」の項に記されたように、２０％Ｌａｅｍｍｌｉ−型ゲルにおいて分画し、Ｒ１抗体によりイムノブロットした。Ｃ：細胞抽出物（５μｇ）；Ｍ：膜画分（５μｇ）；ＣＰ：細胞質画分、総膜画分と比較して同じ初期用量を表している。
【図９】ＭＤＣＫＩＩ細胞におけるＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）の特徴決定
パネルＡ：ＭＤＣＫＩＩ野生型、ＭＤＣＫＩＩ−ＭＲＰ１およびＭＤＣＫＩＩ−ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）細胞からの溶解液のウェスタンブロット。タンパク質４または２０μｇを、サイズ画分した。ブロットを、ｍＡｂ Ｒ１と共にインキュベーションした。細胞株の同一性が、これらのレーンについて示された。
パネルＢ：ツニカマイシン（３μｇ／ｍｌ）で０、１２、２５または４０時間処理したＭＤＣＫＩＩ−ＭＲＰ１およびＭＤＣＫＩＩ−ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）細胞からの溶解液のウェスタンブロット。ブロットは、ｍＡｂ Ｒ１と共にインキュベーションした。
パネルＣ：ＭＤＣＫＩＩ単層におけるＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）の免疫局在化。ＭＲＰ１Δ（２２３−２３２）は、図６に示したように、ｍＡｂ Ｒ１により検出した。
パネルＤ：ＭＤＣＫＩＩ由来の単層によるＤＮＰ−ＧＳ輸送。細胞は、頂端および基底コンパートメントの両方において、［１４Ｃ］ＣＤＮＢ（２μＭ）と共にインキュベーションした。この疎水性化合物は、形質膜を超えて拡散し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの媒介により、細胞内でグルタチオンへと反応した。試料は、ｔ＝０、１、３、６および２０分で、両コンパートメントから採取し、酢酸エチルで抽出し、細胞内で形成されたＤＮＰ−ＧＳから遊離のＣＤＮＢを分離した。□：基底コンパートメントへの輸送。○：頂端コンパートメントへの輸送。この実験は、二つ組で行い、２回繰り返した。
【図１０】Ｅ． ｃｏｌｉ細胞におけるＬ０ペプチドの発現
図１０は、ＢＬ２１細胞による、細胞溶解液および様々な細胞画分における、ＭＲＰ１ Ｌ０ペプチドおよびチオレドキシン（ＴＲＸ）からなる、融合タンパク質の発現を示している。ＴＲＸ−ＭＲＰ−Ｌ０は、ＩＰＴＧによる誘導により産生され、細胞の可溶性画分中に出現したことを認めることができる。
【図１１】ＭＲＰ１ Ｌ０ペプチドのアミノ酸配列
図１１は、ＭＲＰ１ Ｌ０ペプチドのアミノ酸＋いくつかの別のアミノ酸の配列を示している。アミノ酸の番号は、ＭＲＰ１配列の番号に対応している。
【図１】
2004523208.tif 000002
【図２】
2004523208.tif 000003
【図３】
2004523208.tif 000004
【図４】
2004523208.tif 000005
【図５】
2004523208.tif 000006
【図６】
2004523208.tif 000007
【図７】
2004523208.tif 000008
【図８】
2004523208.tif 000009
【図９】
2004523208.tif 000010
【図１０】
2004523208.tif 000011
【図１１】
2004523208.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004523208.tif 000013
2004523208.tif 000014
2004523208.tif 000015
2004523208.tif 000016
2004523208.tif 000017
2004523208.tif 000018
2004523208.tif 000019
2004523208.tif 000020
2004523208.tif 000021
2004523208.tif 000022
2004523208.tif 000023
2004523208.tif 000024
2004523208.tif 000025
2004523208.tif 000026
2004523208.tif 000027
2004523208.tif 000028
2004523208.tif 000029
2004523208.tif 000030
2004523208.tif 000031
2004523208.tif 000032
2004523208.tif 000033
2004523208.tif 000034
2004523208.tif 000035
2004523208.tif 000036
2004523208.tif 000037
2004523208.tif 000038
2004523208.tif 000039
2004523208.tif 000040
2004523208.tif 000041
2004523208.tif 000042
2004523208.tif 000043
2004523208.tif 000044
2004523208.tif 000045
2004523208.tif 000046
2004523208.tif 000047
2004523208.tif 000048
2004523208.tif 000049
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004523208.tif 000050
【国際調査報告】
2004523208.tif 000051
2004523208.tif 000052
2004523208.tif 000053
2004523208.tif 000054
2004523208.tif 000055