(57)【要約】本発明には、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）のｐｇ４１タンパク質およびその使用方法に関連する新規なタンパク質が包含される。例えば、本発明のタンパク質は抗ＨＩＶ化合物のスクリーニングにおいて用いることができる。
2004528011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる精製されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載される前記単離されたヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項５】
請求項６に記載される前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を単離する工程、
ｂ）１）工程（ａ）の前記ヌクレオチド配列を、２）プロモーターに機能的な様式で連結されて含むベクターを構築する工程、
ｃ）前記タンパク質を発現させるために好適な時間および条件で、工程（ｂ）の前記ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、を含む、非占有のＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅポケットを有するタンパク質を製造する方法。
【請求項７】
ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、前記化合物とを、化合物／ポリペプチドの複合体を形成させるために十分な時間および条件で接触させる工程、および
ｂ）前記複合体の存在を検出する工程で、検出により、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物の存在が示される工程、を含む、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物を検出する方法。
【請求項８】
請求項３に記載される前記ポリペプチドに対する抗体。
【請求項９】
ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに、測定可能なシグナルを生じさせ得る指示体試薬を、指示体試薬／ポリペプチドの複合体を形成させるために十分な時間および条件で加える工程、
ｂ）前記指示体試薬／ポリペプチド複合体を、指示体試薬／ポリペプチド／化合物の複合体を形成させるため十分な時間および条件で、前記化合物と接触させる工程、および
ｃ）前記指示体試薬により生じる測定可能なシグナルで、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物の存在を示す測定可能なシグナルを検出する工程、を含む、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物を検出する方法。
【請求項１０】
ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号９からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを、ポリペプチド／化合物の複合体を形成させるために十分な時間および条件で、前記化合物混合物と接触させる工程、
ｂ）サイズ分画された特定分子量の分子のみを通過させることができる細孔を有する手段に前記混合物を通す工程、および
ｃ）前記細孔を通過しなかった保持されているポリペプチド／化合物の複合体で、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物が存在する複合体を検出する工程、を含む、未知の結合特性を有する化合物の混合物から、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明には、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）のｇｐ４１タンパク質およびその使用方法に関連する新規なタンパク質が包含される。例えば、本発明のタンパク質は抗ＨＩＶ化合物のスクリーニングにおいて用いることができる。
【０００２】
（背景情報）
後天性免疫不全症候群（Ａ．Ｉ．Ｄ．Ｓ．）の原因病原体は、１型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１）と呼ばれるエンベロープウイルスである。このウイルスエンベロープは、感染可能な細胞へのウイルス進入に不可欠なタンパク質複合体を含有する。このエンベロープ複合体により、どの細胞が感染されるかが決定され、ウイルスゲノムの浸入を可能にする、宿主の形質膜とのウイルス膜の融合が媒介される。このエンベロープ複合体はまた、感染細胞が付近の未感染の細胞と融合するときに生じるシンシチウム形成にも関わっている。
【０００３】
エンベロープ複合体は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の２つのウイルスタンパク質から構成される。これらの２つのタンパク質は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を生じさせる細胞の変換酵素によって切断されるｇｐ１６０と呼ばれる、共通の前駆体に由来する（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１８８１頁〜１９５２頁）。これらの切断産物は、ビリオン表面においてオリゴマー形態（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）で非共有結合的に互いに結合している。ｇｐ１２０／ｇｐ４１は、ＣＣＲ−５およびＣＸＣＲ−４と呼ばれる２つのケモカイン共受容体のいずれか一方と一緒に、宿主の受容体（ＣＤ４）に結合すると、ウイルスｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体の立体配座変化が生じ、ｇｐ４１がウイルス膜と宿主の膜との融合を媒介する。
【０００４】
ｇｐ４１タンパク質は、多面的なエクトドメインを有する膜貫通タンパク質である。そのＮ末端には、膜融合に極めて重要な疎水性の融合ペプチドが存在する。次には、コイルドコイルの形成に関与する２つの４，３疎水性（ヘプタド）反復が存在する。Ｎ末端のヘプタド反復はＮ−ヘリックスと呼ばれ、Ｃ末端のヘプタド反復はＣ−ヘリックスと呼ばれる。ループ領域がこれらの２つのヘリックスの間に存在する。これらのヘプタド領域は逆平行二量体のらせん状三量体を形成する（Ｌｕら、１９９５、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２、１０７５頁〜１０８２頁）。
【０００５】
ｇｐ４１の結晶構造は、ｇｐ４１のコアが、３分子のｇｐ４１によって形成された６つのらせんからなる束であって、Ｎ−ヘリックスおよびＣ−ヘリックスが３つのヘアピンに配置されていることを明らかにしている（Ｃｈａｎら、１９９７、ＰＮＡＳ、９４、１４０３６〜１４３１３；Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ、３８７、４２６〜４３０）。内部のＮ−ヘリックスは、Ｃ−ヘリックスがコイルドコイルの外側に沿って逆平行様式で３つのよく保存された疎水性の溝に充填される三量体状のコイルドコイルを形成する。この状態で、ｇｐ４１は、ウイルス膜および宿主膜を非常に接近した並置状態にすることによる、膜融合に対するエネルギー障壁に打ち勝つ融合活性な立体配座になる（Ｃｈａｎら、１９９７、ＰＮＡＳ、９４、１４０３６〜１４３１３；Ｆｕｒｕｔａら、１９９８、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５、２７６〜２７９；Ｈｕｇｈｓｏｎ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７、Ｒ５６５〜Ｒ５６９；Ｗｅｉｓｓｎｈｏｒｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ、３８７、４２６〜４３０）。
【０００６】
ｇｐ４１は、宿主細胞に結合する前は、非融合性の状態にあると言われているが、ＣＤ４／ＤＤＲ−５またはＣＤ４／ＣＸＣＲ−４に結合したとき、立体配座の変化がｇｐ４１に生じ、ｇｐ４１は、融合性の状態に変換する。ｇｐ４１の疎水性のＮ末端ペプチドが宿主の膜内に挿入される。この状況では、ｇｐ４１は、ウイルス膜および宿主膜の両方に存在する。この一時的な分子種はプレヘアピン中間体と呼ばれる（Ｍｕｎｏｚ−Ｂａｒｒｏｓｏら、１９９８、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４０、３１５〜３２３；ＣｈａｎおよびＫｉｍ、１９９８、Ｃｅｌｌ、９３、６８１〜６８４；Ｆｕｒｕｔａら、１９９８、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５、２７６〜２７９；Ｊｏｎｅｓら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、４０４〜４０９）。ヘリックスの三量体にＣ−ヘリックスがＮ−ヘリックスと会合することにより、ｇｐ４１の融合活性な状態が表される。Ｃ−ヘリックスを表す合成ペプチドは、細胞培養実験においてナノモル濃度でＨＩＶ感染およびシンシチウム形成の阻害剤であることが見出されている（Ｊｉａｎｇら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６５、１１３；Ｗｉｌｄら、１９９４、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９１、１２６７６〜１２６８０；Ｌｕら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２、１０７５〜１０８２；Ｃｈａｎら、１９９８、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５、１５６１３〜１５６１７；Ｒｉｍｓｋｙら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、９８６〜９９３）。これらのペプチドは、プレヘアピン中間体における一時的に露出したＮ−ヘリックスのコイルドコイルに結合する。これらのペプチドの１つ（Ｔ２０）が、ヒトにおける抗ウイルス活性を示すことが示されている（Ｋｉｒｂｙら、１９９８、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４、１３０２〜１３０７）。このことはこの処置方法の有用性を示している。
【０００７】
Ｎ末端のコイルドコイル三量体の結晶構造により、Ｃ−ペプチドに見出されるＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅの保存されたモチーフと結合する３つのポケットがその表面に対称的に存在していることがわかる。Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅモチーフのペプチド模倣体（Ｅｃｋｅｒｔら、１９９９、Ｃｅｌｌ、９９、１０３〜１１５；国際特許出願公開ＷＯ／０６５９９もまた参照のこと）は抗融合活性および抗ウイルス活性を示す。従って、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ結合ポケットと結合し、かつ薬物発見におけるリードとして役立ち得る小さい有機分子を発見することが望ましい。本発明のタンパク質はそのような発見をもたらす。
【０００８】
そのような化合物を発見するための様々なコンピューター使用法が開示されている（Ｄｅｂｎａｔｈら、１９９９、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２、３２０３〜３２０９）。このようなコンピューター使用は、占有されたＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅポケットを有するタンパク質からの研究から導かれる。しかし、薬物発見作業のためには、非占有のＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅポケットを有するタンパク質がより有用であろう。ＨＩＶ−１のｇｐ４１のＮ−ヘリックスのわずか１７残基に２９残基の酵母ＧＣＮ４タンパク質アナログが融合したそのようなタンパク質が報告されている（Ｅｃｋｅｒｔら、１９９９、Ｃｅｌｌ、１０３〜１１５）。本発明において記載されるタンパク質は、ＨＩＶ−１のｇｐ４１のＮペプチド部分およびＣ−ペプチド部分の両方に由来する残基が使用され、薬物発見に有用な非占有のＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅポケットをもたらす点で、この酵母構築物とは大きく異なる。さらに、Ｅｃｋｅｒｔらのタンパク質は、予期されない結合特性および／または望ましくない結合特性を生じさせ得るＧＣＮ４の露出したＮ−ヘリックス領域を有する（国際特許出願公開ＷＯ００／５５３７７もまた参照のこと）。対照的に、本明細書中に記載されるタンパク質のＮ−ヘリックス部分は、そのＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅポケットのみが露出しているだけであり、Ｎ−ヘリックスの残り部分は、結合しているＣ−ヘリックス領域によって保護されている。従って、本発明のタンパク質は、Ｅｃｋｅｒｔらのタンパク質に関連して観測され得る予期されない結合特性および／または望ましくない結合特性を何ら有しない（国際特許出願公開ＷＯ００／５５３７７もまた参照のこと）。
【０００９】
さらに、このポケット（すなわち、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ）が薬物の標的として重要である理由がいくつかある。第１に、変異誘発研究により、このポケットを形成するＮペプチド残基が膜融合に極めて重要であることが示される（Ｄｕｂａｙら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、４７４８〜４７５６；Ｃａｏら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、２７４７〜２７５５；Ｃｈｅｎら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、３６１５〜３６１９；Ｗｉｌｄら、１９９４、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９１、１２６７６〜１２６８０；ＷｅｎｇおよびＷｅｉｓｓ、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、９６７６〜９６８２）。第２に、Ｃ−３４ペプチド変化体により、Ｃ−３４の阻害活性は、ポケットに対する結合能に依存していることが示されている（Ｃｈａｎら、１９９８、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５、１５６１３〜１５６１７）。第３に、このポケットを含む残基は高度に保存されているので、ＨＩＶ−１にとって、このポケットを標的にする薬物に対して耐性となることは難しいであろう。これらの残基をコードするｍＲＮＡセグメントはＲｅｖ応答エレメントの一部であり（Ｍａｌｉｍら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３８、２５４〜２５７；ＺａｐｐおよびＧｒｅｅｎ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、７１４〜７１６）、ポケット結合残基を有しないＣ−ペプチドは、ポケット結合残基を有するＣ−ペプチドよりも耐性ウイルスの出現を受けやすい（Ｒｉｍｓｋｙら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、９８６〜９９３）。ｇｐ４１コアの疎水性ポケットに結合する小さい分子は、Ｃ−ペプチドと同じ優性ネガティブ様式で阻害剤として機能することが予想され得る（Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ、８９、２６３〜２７３）。従って、ポケットに結合する能力を有し、それによりウイルスに対するアンタゴニストとして作用する薬学的化合物がスクリーニングされ得るように、ポケットの構造および配列を理解することが強く求められている。
【００１０】
本明細書中で参照されるすべての米国特許および刊行物は、その全体が参照して本明細書に組み込まれる。
【００１１】
（発明の要約）
本発明は、抗ＨＩＶ活性について化合物をスクリーニングするために有用なＨＩＶ−１のｇｐ４１タンパク質に関連する新規なタンパク質に関する。具体的には、本発明には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される単離されたヌクレオチド配列が含まれる。
【００１２】
本発明にはまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる精製されたポリペプチドが含まれる。
【００１３】
さらに、本発明には、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性（好ましくは少なくとも７５％の類似性、より好ましくは少なくとも９０％の類似性）を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチドが包含される。
【００１４】
さらに、本発明にはまた、上記ヌクレオチド配列のいずれかを含むベクター、ならびにそのようなベクターを含む宿主細胞が含まれる。
【００１５】
本発明にはまた、非占有のＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅポケットを有するタンパク質を製造する方法で、下記の工程を含む方法が包含される：ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を単離する工程；ｂ）１）工程（ａ）の前記ヌクレオチド配列を、２）プロモーターに機能的な様式で連結されて含むベクターを構築する工程；およびｃ）前記タンパク質を発現させるために好適な時間および条件で、工程（ｂ）の前記ベクターで宿主細胞を形質転換する工程。
【００１６】
さらに、本発明には、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物を検出する方法で、下記の工程を含む方法が含まれる：ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、目的とする化合物とを、化合物／ポリペプチドの複合体を形成させるために十分な時間および条件で接触させる工程；およびｂ）複合体の存在を検出する工程で、検出により、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物の存在が示される工程。工程（ａ）のポリペプチドは、工程（ａ）を行う前に固相に結合させることができる。さらに、固相は、例えば、多孔性もしくは非多孔性の材料、ラテックス粒子、磁気粒子、マイクロ粒子、ビーズ、メンブラン、マイクロタイターウエルまたはプラスチックチューブであり得る。
【００１７】
本発明にはまた、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物を検出する方法で、下記の工程を含む方法が含まれる：ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに、測定可能なシグナルを生じさせ得る指示体試薬を、指示体試薬／ポリペプチドの複合体を形成させるために十分な時間および条件で加える工程；ｂ）前記指示体試薬／ポリペプチド複合体を、指示体試薬／ポリペプチド／化合物の複合体を形成させるため十分な時間および条件で、前記化合物と接触させる工程；およびｃ）前記指示体試薬により生じる測定可能なシグナルで、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物の存在を示す測定可能なシグナルを検出する工程。指示体試薬は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素、発光性化合物、放射性元素、視覚的標識、または化学発光化合物であり得る。
【００１８】
さらに、本発明にはまた、上記に記載されたポリペプチドのいずれかに応答して産生される抗体、または上記に記載されたポリペプチドのいずれかに対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得る。
【００１９】
本発明にはまた、ｇｐ４１タンパク質に対する抗体を製造するための方法が包含される。この方法は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを、免疫応答を生じさせるために十分な量で哺乳動物に投与することを含む。
【００２０】
さらに、本発明にはまた、１型ヒト免疫不全症ウイルス（またはそれにより引き起こされる後天性免疫不全症候群）を処置するためのワクチンが含まれる。このワクチンは、上記に記載された抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【００２１】
また、本発明には、未知の結合特性を有する化合物の混合物から、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物を検出する方法で、下記の工程を含む方法が包含される：ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号９からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを、ポリペプチド／化合物の複合体を形成させるために十分な時間および条件で、前記化合物混合物と接触させる工程；ｂ）サイズ分画された特定分子量の分子のみを通過させることができる細孔を有する手段に前記混合物を通す工程；およびｃ）前記細孔を通過しなかった保持されているポリペプチド／化合物の複合体で、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物が存在する複合体を検出する工程。手段は、例えば、フィルターであり得る。
【００２２】
さらに、本発明には、未知の結合特性を有する化合物の混合物から、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物を検出する方法で、下記の工程を含む方法が包含される：ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ならびに配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号９からなる群から選択される配列に対して少なくとも６５％の類似性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを、ポリペプチド／化合物の複合体を形成させるために十分な時間および条件で、前記化合物混合物と接触させる工程；ｂ）大きい方の分子サイズの分子または複合体を小さい方の分子サイズの分子または複合体よりも速く通過させる手段に混合物を通す工程；およびｃ）小さい方の分子または複合体よりも速く前記手段を通過した分離されたポリペプチド／化合物の複合体で、ｇｐ４１タンパク質に結合する化合物が存在する、より速い速度で前記手段を通過した複合体を検出する工程。このような手段は、例えば、サイズ排除樹脂であり得る（Ｄｕｎａｙｅｖｓｋｉｙら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、１１：１１７８〜１１８４（１９９７）；Ｋａｕｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６（５）：５０５〜５１１（１９９７）を参照のこと）。
【００２３】
（図面の簡単な説明）
図１は、本発明のタンパク質が構築された方法（すなわち、アニーリング反応、フィルイン処理、連結およびその後のＰＣＲ反応）を例示する。オリゴのヌクレオチド配列がアニーリング反応において示される。それぞれのオリゴは、反応温度を９５℃から２５℃に下げたとき、別のオリゴの相補的な配列と水素結合した（例えば、ｇｐ４１アンチセンス＃２がｇｐ４１センス＃１およびｇｐ４１アンチセンス＃３と水素結合した）。
【００２４】
図２は、本発明のタンパク質の単離されたヌクレオチド配列を表す。具体的には、ｇｐ４１クローン１のヌクレオチド配列（配列番号１）、ｇｐ４１クローン１ａのヌクレオチド配列（配列番号２）、ｇｐ４１クローン１ｂのヌクレオチド配列（配列番号３）およびｇｐ４１クローン１ｃのヌクレオチド配列（配列番号４）が示される。各クローンに対するリンカーコドン、（ＧＧＧＧ）Ｒ＊、（ＧＤＧ）Ｒ、（ＧＳＧ）Ｐおよび（ＧＳＮＤＧ）Ｒ（それぞれ、配列番号１８から配列番号２１）が太字で示される。＊Ｒ残基は天然のｇｐ４１配列に存在する。これはクローン１Ｂの配列においてＰ残基に変更された。
【００２５】
図３は、ｐＮＬ４−３のアミノ酸配列（配列番号１７、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ１９９２１）、クローン１のアミノ酸配列およびコンセンサスなＨＩＶｇｐ１（ＨＸＢ２株）のアミノ酸配列の配列アラインメントを表す。野生型配列ｐＮＬ４−３は、このアラインメントのための改良されたタンパク質（すなわち、Ｃ−ヘリックス（リンカー）Ｎ−ヘリックス）の状況において再配列された。
【００２６】
図４は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を表す（すなわち、クローン＃１＝配列番号５、クローン＃１ａ（ＧＤＧ）Ｒ＝配列番号６、クローン＃１ｂ（ＧＤＧ）Ｐ＝配列番号７、クローン＃１ｃ（ＧＳＮＤＧ）Ｒ＝配列番号８）。
【００２７】
図５は、クローン１ｂの１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、およびＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅペンタペプチド（配列番号２８）を付加したときの共鳴の選択的シフト化を表す。
【００２８】
図６は、クローン１Ｂの結晶に取り込まれたトリメチル鉛アセタートの結晶構造を示す。
【００２９】
図７は、ｇｐ４１クローン４構築物の沈降平衡研究の結果を表す。
【００３０】
図８は、遠心分離エンハンストアフィニティー選択によって調べられた、ｇｐ４１に対する環状Ｄ−ペプチドの結合を例示する。
【００３１】
図９は、クローン４のヌクレオチド配列（配列番号９）を表す。４個のＧｌｙリンカーコドン（配列番号２２）が太字で示される。
【００３２】
図１０は、ｇｐ４１クローン４のヌクレオチド配列（配列番号９）、ｇｐ４１クローン４ａのヌクレオチド配列（配列番号１０）、ｇｐ４１クローン４ｂのヌクレオチド配列（配列番号１１）およびｇｐ４１クローン４ｃのヌクレオチド配列（配列番号１２）を表す。リンカーコドンが太字で示される。＊Ｒ残基は天然のｇｐ４１配列に存在する。これはクローン４Ｂの配列においてＰ残基に変更された。
【００３３】
図１１は、クローン４のアミノ酸配列（配列番号１３）、クローン４ａのアミノ酸配列（配列番号１４）、クローン４ｂのアミノ酸配列（配列番号１５）およびクローン４ｃのアミノ酸配列（配列番号１６）を例示する。ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫ（配列番号２７）として示される配列はＨｉｓ標識／大腸菌切断部位を表す。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、抗ヒト免疫不全症（ＨＩＶ）化合物についてスクリーニングするために用いることができるタンパク質に関する。そのような化合物は、ＨＩＶ罹患者またはＨＩＶに感染しやすい人を処置または防止するために使用することができる。
【００３５】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードする単離されたヌクレオチド配列が図２に示される。本発明には、これらのヌクレオチド配列だけでなく、そのフラグメント、その完全な配列の相補体、および相補体のフラグメントもまた包含される。さらに、本発明には、図２に示されるヌクレオチド配列の少なくとも約６５％（好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％）に対応する配列（すなわち、図２に示されるヌクレオチド配列の少なくとも約６５％（好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％）に対する同一性を有する配列）、または図２に示されるヌクレオチド配列の少なくとも約６５％（好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％）に対して相補的な配列が含まれる。さらに、本発明には、これらの完全な配列のフラグメント、これらの配列の相補体、ならびに相補体のフラグメントが含まれる。
【００３６】
本発明のために、ヌクレオチド配列の「フラグメント」は、示されたヌクレオチド配列の一領域に対応する少なくとも約１２０ヌクレオチド（好ましくは少なくとも約１４０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１６０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチド）の連続した配列として定義される。
【００３７】
さらに、本発明のために、「相補体」は、塩基対形成則に基づいて所与の配列に対して対を形成する配列として定義される。例えば、１つのヌクレオチド鎖における配列Ａ−Ｇ−Ｔは、もう一方の鎖におけるＴ−Ｃ−Ａに対して「相補的」である。
【００３８】
配列の同一性またはパーセント同一性は、短い方の配列の長さによって除され、１００が乗ぜられた、２つのアラインメントされた配列の間における正確な一致の数である。核酸配列に対する近似的なアラインメントが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２：４８２〜４８９（１９８１））の局所的な相同性アルゴリズムによってもたらされる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５増補、３：３５３〜３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、米国）により作製され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５〜６６７６３（１９８６））により正規化されるスコア化行列を使用して、ペプチド配列またはタンパク質配列ととに使用するために拡張することができる。核酸配列およびペプチド配列に対するこのアルゴリズムの実施が、ＢｅｓｔＦｉｔ汎用アプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によってもたらされる。具体的には、ウイスコンシン配列分析パッケージプログラムマニュアル（バージョン８（１９９５）、これはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能である）に記載されるように、８のキャップ付加ペナルティーおよび２のギャップ延長ペナルティーの設定済みのパラメーターが使用された。配列間のパーセント同一性またはパーセント類似性を計算するための他の同等に好適な様々なプログラムがこの分野では広く知られている。
【００３９】
本発明のヌクレオチド配列に関連する配列は、ヒト以外の供給源（例えば、細菌、ウイルス、哺乳動物など）に由来してもよく、これらもまた本発明により包含される。上記配列の機能的等価体（すなわち、ポケットの二次構造および三次構造と一致する能力を有する配列）もまた本発明により包含され、そのような機能的等価体は、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする。
【００４０】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が温度およびイオン強度の適切な条件のもとで別の核酸分子にアニーリングし得るとき、その核酸分子に「ハイブリダイゼーション可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決定される。「ハイブリダイゼーション」は、２つの核酸配列が相補的な配列を含むことが必要である。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが生じ得る。核酸をハイブリダイゼーションさせるために適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。そのような変数はこの分野では十分に知られている。より詳細には、２つのヌクレオチド配列の間における類似性または相同性の程度が大きいほど、そのような配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴｍ値が大きくなる。長さが１００ヌクレオチドを越えるハイブリッドの場合、Ｔｍの計算式が得られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）を参照のこと）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さにより、その特異性が決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）を参照のこと）。
【００４１】
さらに、本発明には、図２に例示されるヌクレオチド配列によってコードされる精製されたポリペプチドまたはタンパク質が包含される。これらのタンパク質のアミノ酸配列が図４に示される。本発明にはまた、図２に示されるヌクレオチド配列の翻訳から生じるアミノ酸配列に対して少なくとも約６５％のアミノ酸類似性（好ましくは少なくとも約７５％のアミノ酸類似性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性）を有するそのようなペプチドもしくはポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらのフラグメントが含まれる。本発明のために、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか、または電荷もしくは疎水性などの類似する化学的性質および／または物理的性質を有する適切なところにおける２つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較として定義される。「パーセント類似性」は、この分野で知られている様々なプログラム（上記参照）を使用して、比較されるポリペプチド間で計算される。
【００４２】
本明細書中に記載されるクローンは、開始Ｍｅｔコドン（ＡＴＧ）が遺伝子の５’末端において操作されていることにもまた留意しなければならない。これらのｃＤＮＡクローンを有する大腸菌から精製されたｇｐ４１タンパク質はＮ末端の開始因子のメチオニン残基が切り取られている。この現象は、細菌宿主内における翻訳プロセス時に生じる。原核生物（例えば、大腸菌）におけるポリペプチドの開始Ｍｅｔ残基に存在するホルミル基は、一般に、「デホルミラーゼ」酵素によって生合成時に迅速に除かれる。多くの場合、Ｍｅｔ残基は、特異的なアミノペプチダーゼによってもまた除かれる。従って、タンパク質がこのように合成されるとしても、すべての成熟タンパク質がＭｅｔをアミノ末端残基として有するとは限らない。
【００４３】
本発明のタンパク質の使用に関して、そのような精製されたタンパク質は多くの目的のために利用することができる。例えば、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の「Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ」ポケットに結合し、それゆえ従ってｇｐ４１のポケットに結合する組成物についてスクリーニングするために使用することができる。具体的には、ｇｐ４１に結合する化合物を同定することができる場合、ＡＩＤＳに関連するウイルスのさらなる複製およびＡＩＤＳに関連する生じる病理生理学的変化（例えば、消耗、痴呆、肝臓障害など）を妨げることができる。Ｉ型ＨＩＶによる初期感染もまた妨げることができる。
【００４４】
本発明のタンパク質を使用することによる、ｇｐ４１に結合する化合物の同定は、例えば、薬物スクリーニングアッセイの使用によって行うことができる。しかし、最初には、アッセイにおいて使用されるタンパク質を製造しなければならない。
【００４５】
タンパク質の発現：
本発明のタンパク質を発現させるために、目的とする完全なタンパク質（１つまたは複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列の少なくとも１つを含むベクターが最初に構築される。ベクターは、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはコスミドであり得る。その後、ベクターは、この分野で広く知られている方法によって、タンパク質の産生に好適な時間および条件のもとで真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞および細菌細胞（例えば、大腸菌））に導入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと）。
【００４６】
タンパク質は、タンパク質を発現する宿主細胞から、例えば、硫酸アンモニウム、分画カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲルろ過、電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィー）を含むこの分野で知られている手順に従って、最終的には結晶化によって単離することができる（例えば、「酵素精製および関連技術（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２、２３３〜５７７（１９７１）を参照のこと）。
【００４７】
当然のことではあるが、本発明のタンパク質またはその一部分はまた、この分野で十分に知られている様々な技術の使用による化学合成によって、例えば、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５４）または均一溶液での合成（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｅ．Ｗａｎｓｃｈ編、第１５巻、ＩおよびＩＩ、Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）などによって調製することができる。
【００４８】
薬物スクリーニングアッセイ
目的とする「最終」タンパク質が製造されると、薬物スクリーニングアッセイを、本発明のタンパク質のアンタゴニスト、従って、ｇｐ４１に結合する化合物を同定するために行うことができる。１つのそのようなアッセイでは、シグナルを生成する化合物または標識（例えば、発色体、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１３Ｃ）、蛍光化合物（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、化学発光化合物、粒子（可視または蛍光）、核酸、複合体化剤、または発色性基質もしくは蛍光生成性基質もしくは発光性基質の添加により検出可能なシグナルをもたらす酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）などの触媒）を、リンカードメインおよび非天然ドメインを含む「最終タンパク質」に付加することが含まれる。標識されたタンパク質は、その後、目的とする組成物に加えられる。タンパク質と目的とする組成物との間で結合したとき、シグナルが、そのようなシグナル生成化合物により視覚的または装置使用のいずれかでもたらされる。そのようなシグナルにより、目的とする組成物がインビトロまたはインビボでｇｐ４１に結合することが示される。
【００４９】
タンパク質は、所望する場合には最初に固相に付加され得ることに留意しなければならない。固相の例には、多孔性および非多孔性の材料、ラテックス粒子、磁気粒子、マイクロ粒子、ビーズ、メンブラン、マイクロタイターウエル、ならびにプラスチックチューブが含まれる。
【００５０】
さらに、本発明のタンパク質を使用して、ｇｐ４１に結合する組成物を同定するために、当業者に知られているアフィニティー選択法を利用することができる（例えば、米国特許第５，８９１，７４２号；米国特許第５，８９１，７４２号；米国特許第５，６７０，３２６号を参照のこと）。簡単に記載すると、本発明の精製されたタンパク質の１つ以上が、目的とするいくつかの試験化合物と混合される。この混合物は、結合した化合物と会合したタンパク質を保持し、かつ結合していない化合物を通過させるフィルターに通される。有用な典型的なメンブランは５０００ダルトンから１００００ダルトンのメンブランである。タンパク質（１つまたは複数）、特にタンパク質のＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅポケットに結合する組成物がフィルターによって保持される。結合していない化合物はフィルターによって保持されず、従って、結合した組成物から分離され得る。保持された組成物（すなわち、タンパク質に結合した組成物）は、例えば、ＡＩＤＳを防止または処置することにおいて利用することができる。あるいは、５０００ダルトン以下の排除限界を有するサイズ分画カラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５など）を用いることができる。結合した分子および結合していない分子を分離するためのさらに別の方法は、遠心分離エンハンストアフィニティー選択である（例えば、スピンスクリーニング（米国特許出願第０９／２７０，４２７号を参照のこと；これはその全体が参照して本明細書中に組み込まれる））。
【００５１】
本発明のタンパク質は、薬物スクリーニングアッセイにおいて、またはアフィニティー選択以外の方法において使用され得ることにもまた留意しなければならない。例えば、ＣｒｙｓｔａＬｅａｄ技術を、ｇｐ４１に結合する能力を有する薬学的化合物を同定するために、ＳＡＲｂｙＮＭＲ技術（国際特許出願公開ＷＯ９８／４８２６４を参照のこと）と同様に利用することができる（国際特許出願公開ＷＯ９９／４５３７９を参照のこと）。本発明のタンパク質の使用による薬物スクリーニングはまた、ハイスループットスクリーニングを使用して達成することができる（Ｅｃｋｅｒｔら、国際特許出願公開ＷＯ００／０６５９９を参照のこと）。コンピューター計算ドッキングもまた、目的とする医薬品についてスクリーニングするために使用することができる（Ｄｅｂｎａｔｈら、１９９９、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２、３２０３〜３２０９；Ｋｕｎｔｚら、１９９４、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２７（５）、１１７〜１２３を参照のこと）。
【００５２】
本発明のタンパク質に結合する化合物、従ってｇｐ４１に結合する化合物をスクリーニングするために利用され得る別の方法は、「スピンスクリーニング」と呼ばれる（例えば、Ｈｏｌｚｍａｎら、アブストラクト、「Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」セミナー（１９９９年８月１６日〜１９日、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で発表された「スピンスクリーニングによるリガンドの同定：リードの発見および精密化法」を参照のこと）。
【００５３】
ｇｐ４１に結合する能力を有する化合物が同定されると、そのような組成物は、例えば、自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）またはその前駆段階を有する患者に投与することができ、またはそのような疾患の防止において利用することができる。さらに、ｇｐ４１タンパク質を含むウイルスによって引き起こされる何らかの状態もまた、本発明のタンパク質および方法によって同定された、ｇｐ４１に結合する化合物を投与することによって処置することができる。
【００５４】
薬学的組成物は、上記で発見された活性な薬物の治療効果的な量と、適切な生理学的に受容可能なキャリア（例えば、水、緩衝化液または生理的食塩水）とを含むことができる。薬学的組成物の投薬量、形態（例えば、懸濁物、錠剤、カプセルなど）および投与経路（例えば、経口的、局所的、静脈内、皮下など）は、医師によって容易に決定することができ、例えば、患者の年齢、体重、免疫状態および全体的な健康状態のような要因に依存し得る。
【００５５】
抗体の作製
本発明にはまた、本発明のタンパク質に応答して作製される抗体（例えば、モノクローナルもしくはポリクローナル）またはその一部分が包含される（モノクローナル抗体作製の議論については米国特許第４，１９６，２６５号を参照のこと；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６：４９５〜４９７もまた参照のこと。ポリクローナル抗体作製の議論については、例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと）。これらの抗体は、例えば、哺乳動物（例えば、マウスまたはヤギ）に本明細書中に記載されるタンパク質またはその一部分を注射することによって作製することができる（例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（上記）を参照のこと；米国特許第４，１９６，２６５号もまた参照のこと）。さらに、フロイントアジュバントなどのアジュバントもまたタンパク質と一緒に注射することができる。その後、免疫応答が誘発され、抗体が動物から製造される。その後、そのような抗体を哺乳動物の血液から精製することができる。
【００５６】
本発明の抗「タンパク質」抗体は、ｇｐ４１とのそれらの交差反応性のためにｇｐ４１を検出するための免疫アッセイにおいて顕著な有用性を有する。従って、そのような抗体は、ｇｐ４１の存在により示されるようにＨＩＶの診断ならびに予後モニタリングのために利用することができる。本発明に含まれる免疫アッセイには、米国特許第４，３６７，１１０号（二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ）および米国特許第４，４５２，９０１号（ウエスタンブロット）に記載される免疫アッセイが包含されるが、これらに限定されない。他のアッセイには、例えば、標識されたリガンドの免疫沈殿、および免疫細胞化学（インビトロおよびインビボの両方）が含まれる。好ましいアッセイは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）であり、これらはともにこの分野では十分に知られている。
【００５７】
さらに、本発明には、上記に記載された抗体またはその一部分を含むワクチンが含まれる。抗体は、個体（例えば、ＨＩＶに最近感染した個体、ＡＩＤＳを有する個体、または非感染者）に、例えば、適切なキャリア（例えば、水、緩衝化液または生理的食塩水）とともに投与することができる。ワクチン投与後、抗体は、複合体を形成するために体内の発現したｇｐ４１に結合し、それにより、ウイルスのさらなる複製を防止するか、または最近「感染」した患者におけるウイルスの初期複製さえも防止して、症状が決して現れないようにする。
【００５８】
本発明は、下記の非限定的な実施例の使用によって例示され得る。
【００５９】
実施例Ｉ
ｇｐ４１遺伝子に対応するヌクレオチド配列の構築
改良されたｇｐ４１遺伝子に対応するヌクレオチド配列を一連の４つの重なるオリゴヌクレオチドとして合成した。これらのオリゴヌクレオチドは下記の配列を有した：
【００６０】
【化１】
2004528011.tif 000003
【００６１】
【化２】
2004528011.tif 000004
【００６２】
【化３】
2004528011.tif 000005
【００６３】
【化４】
2004528011.tif 000006
これらのオリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化され、アニーリングされ、ギャップを埋めるためのＴ４ＤＮＡポリメラーゼに対するテンプレートとして使用された（図１）。具体的には、１０ｐｍｏｌの各プライマーを製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））の説明書に従ってバクテリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでキナーゼ処理した。１ｐｍｏｌの各キナーゼ処理プライマーを２０ｕｌのアニーリング反応において一緒に混合した。最終的な緩衝液組成は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌであった。これらの反応物を含有するエッペンドルフチューブを密封して、１００℃に加熱されたＨ２Ｏの２リットルビーカーにおいて逆さにした。これらの反応物は、水が室温に達するまで１リットルビーカーにおいて保たれた。この後、ＤＮＡをエタノール沈殿して、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。アニーリングされたＤＮＡを製造者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））の説明書に従ってＴ４ポリメラーゼ緩衝液に溶解した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを反応物に加えて、反応物を１時間にわたり３７℃に置いた後、一本鎖のギャップを埋めた。その後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））を、テンプレート内に生じたニックを修復するために加えた。
【００６４】
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結の後、得られたＤＮＡ分子を、適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＴ１９ｂまたはｐＥＴ２１ａ）へのクローニングのために、改良された配列を増幅するＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。陽性のクローンを配列決定し、その後、タンパク質発現および精製の研究を行った。細菌ＢＬ２１［ＤＥ３］を、０．６のＯ．Ｄ．６００読み取り値を有する１リットルのＬＢ培養物において０．１ｍＭの最終濃度にイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによってｇｐ４１を発現するように誘導した。ＩＰＴＧの添加により、細菌の染色体ＤＮＡに組み込まれているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現が誘導された。その後、このＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより、組換えプラスミドＤＮＡ（例えば、ｐＥＴ２１ａおよびｐＥＴ１９ｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるＴ７プロモーター配列が特異的に認識され、ｇｐ４１のｍＲＮＡの転写が行われた。その後、このｍＲＮＡは、大腸菌のリボソームによって高レベルに翻訳された。
【００６５】
３７℃で２時間の発現を行った後、細菌を遠心分離によって集め、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１００ｍＭのＮａＣｌの緩衝液で洗浄し、再び遠心分離によって集めて、細胞ペレットを−８０℃で保存した。ＩＰＴＧ添加前および回収時に、１ｍＬ部分が、予想される分子量の発現タンパク質が存在するかどうかを確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析のために採取された。ｇｐ４１の発現を示す細菌ペレットを、フレンチ圧力セルに通すことによって溶解した。この溶解物を１０，０００ｘｇで遠心分離して、不溶物（Ｐ１０）を可溶物（Ｓ１０）から分離した。硫酸アンモニウムをＳ１０に加えて、３５％の最終飽和度にした。この処理から沈殿したタンパク質を１２，０００ｒｐｍで集めた。タンパク質ペレットを５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび５％グリセロール）に溶解し、２回の１リットルの緩衝液交換で溶解緩衝液に対して透析した。その後、このタンパク質をＵｎｏＱ６カラム（カチオン交換樹脂、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に負荷し、０．１ＭのＮａＣｌから１．０ＭのＮａＣｌまでの直線グラジエントによって溶出した。ピーク画分をまとめて、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび５％グリセロールに対して透析した。沈殿したタンパク質を遠心分離によって集め、１０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ７．７）に溶解した。
【００６６】
実施例ＩＩ
ポケット形成を生じさせるために使用されるリンカー
様々な長さのリンカーを、ｇｐ４１をコードするＤＮＡ配列に操作して入れた（ヌクレオチドおよび４つのペプチド配列については図２を参照のこと）。具体的には、Ｎ−ヘリックスおよびＣ−ヘリックスの２つの末端の近傍を視覚的に調べることによって、３アミノ酸、４アミノ酸および５アミノ酸の長さのペプチドが必要な距離に広がり得ることが示された。
【００６７】
ＧＧＧＧリンカーをコードするヌクレオチドを含有する最初のクローン（クローン１）を最初のオリゴアニーリングフィルイン実験において設計した（図１ａ）。クローン１ａ、クローン１ｂおよびクローン１ｃを標準的なＰＣＲによって構築した。このＰＣＲにおいて、センスプライマーは、リンカー領域を含むために十分に長かった（すなわち、クローン１ａおよびクローン１ｂについては１１７ヌクレオチドのセンスプライマー、クローン１ｃについては１２３ヌクレオチドのセンスプライマー）。アンチセンスプライマーはそれぞれのクローンについて同じであった。ＰＣＲ後、それぞれのリンカー誘導体の増幅されたＤＮＡを、適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＴ２１ａ）へのクローニングのために制限エンドヌクレアーゼで切断した。ＤＮＡ挿入物について陽性のクローンを配列決定して、配列決定されたリンカーにおける変化を確認した。その後、これらのプラスミドＤＮＡを使用して、上記に記載されるように発現および精製のために大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］を形質転換した。
【００６８】
実施例ＩＩＩ
クローン１ｂの１次元１Ｈ−ＮＭＲおよびペンタペプチド付加時の共鳴の選択的シフト化
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法は、タンパク質に対するリガンド結合を検出するための実証された技術である。スクリーニングのためにこの技術を適用すること、すなわち、ＮＭＲによる構造活性関係（ＳＡＲ）（Ｓｈｕｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５３１〜１５３４（１９９６））は、いくつかのタンパク質に対する薬物リードを同定するために成功している（国際特許出願公開ＷＯ９７／１８４７１（１９９７年５月２２日公開）および同ＷＯ９７／１８４６９（１９９７年５月２２日公開）、これらはともに参照して本明細書中に組み込まれる）。この技術は、ペプチド骨格の化学的環境の変化により生じるアミドプロトンおよび窒素原子の化学シフト（例えば、リガンドが結合したときに生じる化学シフトなど）を検出することに基づく。
【００６９】
技術の感度に基づいて、実験を、配列ＷＲＷＲＩを有するペプチドのＧＰ４１のクローン１Ｂに対する結合を評価するために設計した。ＧＰ４１のクローン１ｂによってコードされるタンパク質を大腸菌において塩化１５Ｎ−アンモニウムで同位体標識して、精製した。このタンパク質を、Ｈ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（９：１）での１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）において０．４ｍＭに濃縮した。アミドプロトンおよび窒素の化学シフトの測定値をＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ５００ＮＭＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で４５℃において１５Ｎ異核一量子コヒーレンス実験から得た。ＷＲＷＲＩペプチドのＧＰ４１に対する結合を検出するために、上記に記載される同じ緩衝液条件を使用して、ＮＭＲ実験を０．５ｍＭのＷＲＷＲＩペプチドの存在下で繰り返した。このペプチドの存在下および非存在下におけるｇｐ４１タンパク質の１５Ｎ異核一量子コヒーレンススペクトルを図５に示す。ＷＲＷＲＩペプチドの存在下における化学シストの変化および線幅の広域化はともに、これらの２つの分子の結合が生じていることを示している。
【００７０】
実施例ＩＶ
クローン１ｂの結晶構造
ｇｐ４１のクローン１Ｂのタンパク質を、上記に記載されるように発現させ、精製した。タンパク質を２０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）において約７ｍｇ／ｍｌに濃縮した。この溶液において、タンパク質は４℃で数ヶ月間安定であった。最初の結晶を、Ｈａｍｐｔｏｎ結晶スクリーニングＩ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５４３１  Ｃａｂｏｔ  Ｒｄ．、Ｓｕｉｔｅ２０５、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ、９２６５３−５５２７）から、条件番号２３（０．２Ｍ塩化マグネシウム六水和物、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３０％ＰＥＧ４００）および様々な他の関連する条件から同定した。結晶の成長を、０．２Ｍ塩化マグネシウム六水和物および０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）の条件下での１７℃におけるハンギングドロップ気相拡散を用い、７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で３３％から４０％のＰＥＧ４００をスクリーニングして最適化した。結晶は、約１週間から２週間で、４００×４００×２００ミクロンの平均サイズに成長する。
【００７１】
結晶は、２３％ＰＥＧ４００、０．１５Ｍ塩化マグネシウム六水和物、０．０８Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）および１０％グリセロールに少なくとも１時間にわたって結晶を浸漬することによりオックスフォードクライオシステムを使用して、データ収集のために１５０ケルビン度で凍結することができる。これらの条件のもとで、結晶は、シンクロトロン放射源において１．９オングストロームの分解能で回折する。２．８Ａｎｇまでの生データを集めた。結晶は空間群Ｐ３２１に属し、単位胞パラメーターは、ａ＝ｂ＝９６．９、ｃ＝７２．７、α＝β＝９０およびγ＝１２０である。構造は、タンパク質データバンドエントリー１ＥＮＶに由来する座標に基づく分子モデルを使用し、分子置換プログラムＡＭＯＲＥ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、第４号、１９９４、「ＣＣＰ４セット：タンパク質結晶学用プログラム」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０、７６０〜７６３）を使用して分子置換によって解かれた。構造は、シミュレーションされたアニーリング最大尤度精密化および個々のＢ因子精密化の組み合わせてを使用するＣＮＸ（Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ、「フリーＲ値：結晶構造の正確性を評価するための新しい統計学量」、Ｎａｔｕｒｅ、３５５、４７２〜４７４（１９９２））を使用して精密化された。電子密度マップを、プログラムパッケージＱＵＡＮＴＡ９８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＩＮＤＩＧＯ２ワークステーションで調べた。
【００７２】
天然の構造は、非対称ユニットにおいてｇｐ４１クローン１Ｂの４つのモノマーを含有する（１つのモノマーは１対のＮ−ヘリックス／Ｃ−ヘリックスからなる）。３つのモノマーにより、１つの天然様のｇｐ４１三量体が形成され、残りのモノマーが結晶学的な３回回転軸上に存在し、これにより、結晶学的三量体がもたらされる。天然の構造は２．８Ａｎｇ．の分解能に精密化され、Ｒ＝２８％であり、Ｒｆｒｅｅ＝３４％であった。
【００７３】
ｇｐ４１の結晶は、その後、鉛重原子誘導体を得るために、３６％ＰＥＧ４００、０．２Ｍ塩化マグネシウム六水和物、０．１Ｍビスートリスプロパンにおいて、１日間から２日間、１００ｍＭトリメチル鉛アセタートで浸漬することができる。剛体精密化後の計算されたＦｏ−Ｆｃマップにおいて、７つのトリメチル鉛アセタート部位を同定することができる。これらの部位の１つが、天然型Ｃ−ペプチドのＴｒｐＴｒｐＩｌｅによって通常的に占有される標的部位の中心部に位置した。従って、上記のデータは、化合物が結合部位内に浸漬され得ることを示している。
【００７４】
実施例Ｖ
ｇｐ４１のクローン４構築物の沈降平衡研究
ｇｐ４１のクローン４のタンパク質（下記のアミノ酸配列を参照のこと）を、８℃で、１０ｍＭ  ＰＯ４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ７．４）において、１５Ｋｒｐｍ、２０Ｋｒｐｍ、２５Ｋｒｐｍおよび３０Ｋｒｐｍで分析した（クローンのヌクレオチド配列については図９を参照のこと）。これらの異なる速度から得られたデータを、Ｏｒｉｇｉｎ５．０（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｍ、ＭＡ）で実施されるようなＭａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇアルゴリズムを使用して半径濃度プロフィルの非線形最少二乗曲線近似によって全体的に分析した。離散粒子の沈降挙動を記述する使用者定義の関数を使用した（Ｈｏｌｚｍａｎらの式１（「Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ（現代の分析超遠心分離）」、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１９９４、２９８頁〜３１４頁）を参照のこと）。それぞれのデータセットに対する基準および固定された半径シグナル値は独立的に変化させることができるが、分子量は広域パラメーターとして保たれた。タンパク質の部分比容を、ＣｏｈｅｎおよびＥｄｓａｌｌの方法によってアミノ酸組成から０．７２９ｃｍ３／ｇｍであると計算した（ＣｏｈｅｎおよびＥｄｓａｌｌ、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｉｏｎｓ（イオンおよび双極イオンとしてのタンパク質、アミノ酸およびペプチド）」、Ｒｈｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９４３、第４章、１５７頁）。緩衝液の密度は、８℃で、Ｍｅｔｔｌｅｒ−ＫＥＭ  Ｄａ−３１０密度計（Ｍｅｔｔｌｅｒ、Ｈｉｇｈｓｔｏｗｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）において１．０１４５６ｍ／ｃｍ３であると測定された。黒丸（図７参照）は吸光度のデータ点である。近似された点および白丸は残差である。初期濃度は０．６５ｍｇ／ｍｌであった。
【００７５】
この分析から決定された分子量は３３，０００＋／−２８０であり、三量体について予想される分子量とよく一致している。このことは、ｇｐ４１のＣ末端ヘリックスの一部、その後にリンカー、その後にＮ末端ヘリックスを有する構築物は、予想される四次構造を、無傷のタンパク質と類似する様式で形成し得ることを示している。
【００７６】
【化５】
2004528011.tif 000007
【００７７】
実施例ＶＩ
遠心分離エンハンストアフィニティー選択によるｇｐ４１に対する環状Ｄ−ペプチドの結合
ペプチド（Ｄ１０−Ｐ１−２Ｋ、アミノ酸配列Ａｃ−ＫＫＧＡＣＥＡＲＨＥＷＡＷＬＣＡＡ−ＮＨ２、２４４μＭ）およびタンパク質（Ｄ１０−Ｐ５−２Ｋ、Ａｃ−ＫＫＧＡＣＥＬＬＧＷＥＷＡＷＬＣＡＡ−ＮＨ２、２００μＭ）を遠心分離チューブ内で混合し、ボルテックスして、３０９，８８０の平均ｇ力（ＴＬＡ−１００ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）における１０００，０００ｒｐｍ）で２時間遠心分離した。５個の画分（各２０マイクロリットル）をメニスカスの下からピペットで注意深く取り出し、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって調べた。ペプチドの量は、クロマトグラムにおける関連するピークのピーク面積によって示される。それぞれの画分における関連ピーク面積は、全５画分におけるピーク面積の和によって除された。結果が、それぞれの画分の累積容量に対してプロットされる（図８ＡはＤ１０−Ｐ１−２Ｋの結合を表し、図８ＢはＤ１０−Ｐ５−２Ｋの結合を表す）。タンパク質およびペプチドの初期濃度はそれぞれ２４４μＭおよび２００μＭであった。黒四角は、ｇｐ４１のクローン１ｂの存在下での遠心分離後のそれぞれの画分におけるペプチドの量を示す。白丸は、ｇｐ４１のクローン１ｂの非存在下での遠心分離後のそれぞれの画分におけるペプチドの量を示す。
【００７８】
タンパク質の存在下におけるペプチドの動きに差があることによって明かであるように、両ペプチドはｇｐ４１のクローン１ｂに非常によく結合する。タンパク質の非存在下での動きがないことによって明かであるように、両者は、調べられた条件のもとでは極めて可溶性であるようである。ｇｐ４１のクローン１ｂに対する親和性の差は、このアッセイからは観測することができなかった。タンパク質の存在下および非存在下におけるペプチドの回収は良好であった。このことは、リガンドが実験中に失われなかったことを示している。
【００７９】
さらに、上記の結果は、本発明のｇｐ４１構築物が、本発明の構築物に含有されるＮ末端ヘリックスの領域に結合することがその後で示されているペプチドに結合する能力を有することを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
本発明のタンパク質が構築された方法を示す。
【図１Ｂ】
本発明のタンパク質が構築された方法を示す。
【図２】
本発明のタンパク質の単離されたヌクレオチド配列を表す。
【図３】
ｐＮＬ４−３のアミノ酸配列（配列番号１７、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ１９９２１）、クローン１のアミノ酸配列およびコンセンサスなＨＩＶｇｐ１（ＨＸＢ２株）のアミノ酸配列の配列アラインメントを表す。
【図４】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列を表す。
【図５】
クローン１ｂの１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、およびＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅペンタペプチド（配列番号２８）を付加したときの共鳴の選択的シフトを表す。
【図６】
図６は、クローン１Ｂの結晶に取り込まれたトリメチル鉛アセタートの結晶構造を示す。
【図７】
図７は、ｇｐ４１クローン４構築物の沈降平衡研究の結果を表す。
【図８Ａ】
遠心分離エンハンストアフィニティー選択によって調べられた、ｇｐ４１に対する環状Ｄ−ペプチドの結合を示す。
【図８Ｂ】
遠心分離エンハンストアフィニティー選択によって調べられた、ｇｐ４１に対する環状Ｄ−ペプチドの結合を示す。
【図９】
図９は、クローン４のヌクレオチド配列（配列番号９）を表す。
【図１０】
図１０は、ｇｐ４１クローン４のヌクレオチド配列（配列番号９）、ｇｐ４１クローン４ａのヌクレオチド配列（配列番号１０）、ｇｐ４１クローン４ｂのヌクレオチド配列（配列番号１１）およびｇｐ４１クローン４ｃのヌクレオチド配列（配列番号１２）を表す。
【図１１】
図１１は、クローン４のアミノ酸配列（配列番号１３）、クローン４ａのアミノ酸配列（配列番号１４）、クローン４ｂのアミノ酸配列（配列番号１５）およびクローン４ｃのアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１Ａ】
2004528011.tif 000008
【図１Ｂ】
2004528011.tif 000009
【図２】
2004528011.tif 000010
【図３】
2004528011.tif 000011
【図４】
2004528011.tif 000012
【図５】
2004528011.tif 000013
【図６】
2004528011.tif 000014
【図７】
2004528011.tif 000015
【図８Ａ】
2004528011.tif 000016
【図８Ｂ】
2004528011.tif 000017
【図９】
2004528011.tif 000018
【図１０】
2004528011.tif 000019
【図１１】
2004528011.tif 000020
【国際公開パンフレット】
2004528011.tif 000021
2004528011.tif 000022
2004528011.tif 000023
2004528011.tif 000024
2004528011.tif 000025
2004528011.tif 000026
2004528011.tif 000027
2004528011.tif 000028
2004528011.tif 000029
2004528011.tif 000030
2004528011.tif 000031
2004528011.tif 000032
2004528011.tif 000033
2004528011.tif 000034
2004528011.tif 000035
2004528011.tif 000036
2004528011.tif 000037
2004528011.tif 000038
2004528011.tif 000039
2004528011.tif 000040
2004528011.tif 000041
2004528011.tif 000042
2004528011.tif 000043
2004528011.tif 000044
2004528011.tif 000045
2004528011.tif 000046
2004528011.tif 000047
2004528011.tif 000048
2004528011.tif 000049
2004528011.tif 000050
2004528011.tif 000051
2004528011.tif 000052
2004528011.tif 000053
2004528011.tif 000054
2004528011.tif 000055
2004528011.tif 000056
2004528011.tif 000057
2004528011.tif 000058
2004528011.tif 000059
2004528011.tif 000060
2004528011.tif 000061
2004528011.tif 000062
2004528011.tif 000063
2004528011.tif 000064
2004528011.tif 000065
2004528011.tif 000066
2004528011.tif 000067
2004528011.tif 000068
2004528011.tif 000069
2004528011.tif 000070
2004528011.tif 000071
2004528011.tif 000072
2004528011.tif 000073
2004528011.tif 000074
2004528011.tif 000075
2004528011.tif 000076
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528011.tif 000077
2004528011.tif 000078
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004528011.tif 000079
2004528011.tif 000080
【国際調査報告】
2004528011.tif 000081
2004528011.tif 000082
2004528011.tif 000083