(57)【要約】本発明は、複製コンピテントベクター又はウィルスの生成に対して改良された安全性を有する、改良された条件下で複製するベクターを提供する。そのようなベクターの製造、増殖及び選択的パッケージング、修飾及び使用方法がまた開示される。改良されたベクターとの使用のための改良されたヘルパー構成体、宿主細胞、前記ベクターを含んで成る医薬組成物及び宿主細胞、薬剤をスクリーニングするためへのベクター含有宿主細胞の使用、及び遺伝子機能を決定するためへのベクターの使用方法が包含される。前記方法はまた、疾病、特にウィルス感染及びＨＩＶ感染の予防及び治療処理を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現される遺伝子及び１又は複数の第１ヌクレオチド配列を含んで成る、条件付けで複製するウィルスベクターであって、
（ａ）前記１又は複数の第１ヌクレオチド配列の存在に対してそれぞれ感受性である、ウィルス、ヘルパーウィルス又はヘルパーベクターの野生型株による補完に基づいてのみ、宿主細胞において複製し；
（ｂ）前記第１ヌクレオチド配列の存在に対して耐性であり；そして
（ｃ）複製コンピテントベクターを生成する可能性を低下させる、１又は複数の置換、挿入又は欠失を含む；
ことを特徴とするベクター。
【請求項２】
前記１又は複数の置換が、ヒト細胞において選択されるコドンへの縮重である請求項１記載のベクター。
【請求項３】
前記ベクターが、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２からの配列を含んで成るキメラベクターである請求項１記載のベクター。
【請求項４】
前記ベクターが、ウィルス補助タンパク質をコードしないか、又は発現しない請求項１記載のベクター。
【請求項５】
前記ベクターが、ＨＩＶ−１由来であるか、又ＨＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質をコードする請求項１記載のベクター。
【請求項６】
前記１又は複数の第１ヌクレオチド配列が、１又は複数のリボザイム又はアンチセンス配列である請求項１記載のベクター。
【請求項７】
前記ベクターが、Ｔａｔタンパク質をコードしないか、又は発現しない請求項１記載のベクター。
【請求項８】
宿主細胞中に存在する場合に、ウィルス感染を低め、最少にし、もしくは妨げる核酸配列、又は前記細胞を毒性剤に対して耐性にする核酸配列をさらに含んで成る請求項１記載のベクター。
【請求項９】
前記第１核酸配列が、トランスドミナント表現型（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）をコードする請求項１記載のベクター。
【請求項１０】
前記ベクターがさらに、インスレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）配列を含んで成る請求項１記載のベクター。
【請求項１１】
前記ベクターに存在する核酸配列の発現を調節するために、ＬＴＲ又は修飾されたＬＴＲをさらに含んで成る請求項１記載のベクター。
【請求項１２】
ＨＩＶスプライス部位又はＩＲＥＳをさらに含んで成る請求項１記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のベクターを補完することができるヘルパーベクター。
【請求項１４】
前記ベクターが、前記条件付けで複製できるベクターをさらに擬似分類することができる請求項１３記載のヘルパーベクター。
【請求項１５】
前記条件付けで複製するベクターを標的にする１又は複数のリボザイム又はアンチセンス配列をさらに含んで成る請求項１３記載のヘルパーベクター。
【請求項１６】
前記ベクターが、ＨＩＶ−２由来である請求項１３記載のヘルパーベクター。
【請求項１７】
１又は複数のキメラ性エンベロープタンパク質を含んで成るウィルス粒子にパッケージされた請求項１〜１２のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のベクターを補完することができる、タンパク質であるヘルパー。
【請求項１９】
請求項１〜１２又は１７のいずれか１項記載のベクターを用いて、注目の１又は複数の核酸を発現する方法。
【請求項２０】
超遠心分離ではなく、高速遠心分離を含んで成る、請求項１〜１２又は１７のいずれか１項記載のベクターを生成する方法。
【請求項２１】
請求項１〜１２又は１７のいずれか１項記載のベクターにより細胞を形質導入することを含んで成る、殺細胞方法。
【請求項２２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）の選択方法であって、前記細胞が請求項１〜１２又は１７のいずれか１項記載のベクターと接触された後、ＨＳＣを含む細胞集団と細胞毒性剤とを接触することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野：
本発明は、改良された条件付けで複製する（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）ベクター、条件付けで複製するベクター及びレンチウィルスベクターを製造し、増殖し、そして選択的にパッケージングし、修飾し、そして使用する方法を提供する。重要なことには、前記ベクターは、複製コンピテントになる低められた能力を有し、そして従って、使用に対して高められた安全性を有する。また、前記ベクターに対して適切な特定されたヌクレオチド及びアミノ酸配列、前記ベクターを含んで成る医薬組成物及び宿主細胞、薬物をスクリーンするためへのそのような宿主細胞の使用、及び遺伝子機能を決定するためへの前記ベクターの使用方法が提供される。
【０００２】
前記方法はまた、疾病、特にウィルス感染及び特にＨＩＶ感染の予防及び治療処理も包含する。本発明はまた、新規ワクチンを生成するための、感染性疾病、癌及び他の遺伝子関連の疾病の処理のための、及び診断方法のための直接的且つ間接的方法にも向けられる。本発明の他の方法及び組成物は、条件付けで複製するベクター及びレンチウィルスベクターの遺伝子療法及び他の用途への使用を包含する。
【０００３】
発明の背景：
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因としてのヒト免疫欠損ウィルス（ＨＩＶ）、すなわちレンチウィルスの発現は、ウィルス感染周期及びウィルス病因の根本的機構への過剰の研究を促進して来た。それらの機構に対する研究は、ＨＩＶに対してだけでなく、ＨＩＶ生成物、そのゲノム及び他のウィルスに対しても効果的である抗ウィルス剤の開発のための絶えず上昇する数の標的を研究者に提供して来た。それらの抗ウィルス剤、特にＨＩＶに対して向けられたそれらの剤は、それらの作用の態様に依存して、グループに分類され得る。そのようなグループは、逆転写酵素のインヒビター、細胞中へのウィルス侵入の競争体、ワクチン及びプロテアーゼインヒビター、並びに“遺伝子抗ウィルス剤”（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ）として本明細書において言及されるつい最近のグループを包含する。
【０００４】
一般的に、個々のタイプの抗ウィルス剤は、それ自体関連する利点及び限界を有し、そして特定の処理情況の緊急性に関して評価されるべきである。抗ウィルス剤、例えばジドブジン（ＡＺＴとしても知られている３’−アジド−３’−デオキシチミジン）、プロテアーゼインヒビター及び同様のものは、比較的容易に患者の身体の細胞中に供給され得、そして広範囲に研究されて来た。ウィルス感染周期における１つの特定の因子を標的化したが、そのような剤は、ＨＩＶに対して比較的効果的でないことがわかっている。
【０００５】
これは主に、ＨＩＶの株が急速に変化し、そして効果の単一の位置を有する剤に対して耐性になる事実のためである（Ｒｉｃｈｍａｎ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ａｎｄ Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．， ８， １０６５−１０７１ （１９９２））。従って、ＨＩＶゲノムにおける遺伝的変異及び急速な突然変異の問題は、ＨＩＶ感染を処理するために新規抗ウィルス方法の考慮を強制する。それらの系統の中で、遺伝的抗ウィルス剤が、多くの異なったレベルで細胞内に作用するので、好都合である。
【０００６】
遺伝的抗ウィルス剤は、それらが、ウィルス感染から細胞を保護する標的細胞中に分子要素としてトランスファーされることにおいて、他の治療剤とは異なる（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ３２５， ３９５−３９６ （１９８８）； 及びＤｒｏｐｕｌｉｃなど．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ．， ５， ９２７−９３９ （１９９４））。遺伝的抗ウィルス剤は、いずれかの遺伝子配列であり得、そしてアンチセンス分子、ＲＮＡデコイ、トランスドミナント変異体、インターフェロン、トキシン、免疫原及びリボザイムを包含するが、但し、それらだけには限定されない。特に、リボザイムは、ＨＩＶ ＲＮＡを包含する標的ＲＮＡを、配列特異的態様で分解するアンチセンス様遺伝的抗ウィルス剤である。
【０００７】
標的ＲＮＡのリボザイム介在性分解の特異性は、ＨＩＶ複製を包含するウィルス複製の治療インヒビターとしてのリボザイムの可能な使用を示唆する。異なったタイプのリボザイム、例えばハンマーヘッド及びヘアーピンリボザイムが、抗−ＨＩＶ方法に使用されて来た（例えば、アメリカ特許５，１４４，０１９号、第５，１８０，８１８号及び第５，２７２，２６２号、及びＰＣＴ特許出願ＷＯ９４／０１５４９号及びＷＯ９３／２３５６９号を参照のこと）。ハンマーヘッド及びヘアーピンリボザイムの両者は、ＧＵＣ配列を含むいずれかの標的ＲＮＡを分解するために構築され得る（Ｈａｓｅｌｏｆｆなど．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４， ５８５−５９１ （１９８８）； Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４， ５８５ （１９８７）； Ｈａｍｐｅｌ など．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ２９９−３０４ （１９９０）； 及びＳｙｍｏｎｓ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１， ６４１−６７１ （１９９２））。
【０００８】
一般的に言えば、ハンマーヘッドリボザイムは、２種のタイプの機能的ドメイン、すなわち２種のハイブリダイゼーションドメインを両端に有する保存された触媒ドメインを有する。ハイブリダイゼーションドメインは、ＧＵＣ配列を取り囲む配列に結合し、そして触媒ドメインはＧＵＣ配列の３’側のＲＮＡ標的物を分解する（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７）、前記；Ｈａｓｅｌｏｆｆなど． （１９８８）， 前記；及びＳｙｍｏｎｓ （１９９２）， 前記）。
【０００９】
多くの研究は、リボザイムが組織培養細胞におけるＨＩＶの増殖の阻害において少なくとも部分的に効果的であり得ることを確かめている（例えば、Ｓａｒｖｅｒなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７， １２２２−１２２５ （１９９０）； Ｓａｒｖｅｒなど．， ＮＩＨ Ｒｅｓ．， ５， ６３−６７ （１９９３ａ）； Ｄｒｏｐｕｌｉｃなど．， Ｊ． Ｖｉｒａｌ．， ６６， １４３２−１４４１ （１９９２）； Ｄｒｏｐｕｌｉｃ など．， Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ｃｏｍｐ． Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ５， ４２−４９ （１９９３）； Ｏｊｗａｎｇ など．， ＰＮＡＳ， ８９， １０８０２−１０８０６ （１９９２）； Ｙｕ など．，ＰＮＡＳ， ９０， ６３４０−６３４４ （１９９３）； 及びＷｅｅｒａｓｉｎｇｈｅなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６５， ５５３１−５５３４ （１９９１） を参照のこと）。特に、Ｓａｒｖｅｒなど． （１９９０），前記）は、ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子の転写された領域内を分解するよう企画されたハンマーヘッドリボザイム、すなわち抗−ｇａｇリボザイムがインビトロで、ＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡを特異的に分解することを示している。
【００１０】
さらに、抗−ｇａｇリボザイムを発現する細胞系がＨＩＶ−１により攻撃される場合、ＨＩＶ複製の５０〜１００倍の阻害性が観察された。同様に、Ｗｅｅｒｏｓｉｎｇｈｅなど． （（１９９１）， 前記）は、ＨＩＶ−１ ＲＮＡのＵ５配列内を分解するよう企画されたリボザイムをコードするレトロウィルスベクターが、ＨＩＶによる続く攻撃に基づいて、形質導入された細胞に対してＨＩＶ耐性を付与することを示している。形質導入された細胞の異なったクローンは、リボザイム発現を駆動するために使用されるプロモーターシステムにより決定されるように、攻撃に対して異なったレベルの耐性を示したが、ほとんどのリボザイム発現細胞系は、培養における限定された時間の後、ＨＩＶ発現に屈服した。
【００１１】
リボザイム、すなわちＨＩＶのＵ５領域に対して特異的にであるハイブリダイゼーションドメインが導入されているｒｅｆ遺伝子（組織培養におけるウィルス複製のためには必須でない）中へのプロウィルスによる組織培養細胞のトランスダクションは、野生型プロウィルスにより形質導入された細胞に比較して、形質導入された細胞内でのウィルス複製を１００倍、阻害することが示されている（例えば、Ｄｒｏｐｕｌｉｃなど． （１９９２） 及び（１９９３）、前記を参照のこと）。同様に、ヘアーピンリボザイムは、Ｕ５ヘアーピンリボザイムを含むベクターにより形質導入され、そしてＨＩＶにより攻撃されたＴ−細胞におけるＩＨＶ複製を阻害することが示されている（Ｏｊｗａｎｇなど． （１９９２）， 前記）。他の研究は、ｔＲＮＡプロモーターから発現されたリボザイムを含むベクターはまた、種々のＨＩＶ株を阻害することを示している（Ｙｕなど． （１９９３）， 前記）。
【００１２】
ＨＩＶ感染の細胞標的物（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ−細胞及び単球性マクロファージ）へのリボザイム又は他の遺伝的抗ウィルス剤の供給は、ＡＩＤＳの効果的遺伝的治療処理のための主要ハードルであった。造血システムの細胞（すなわち、ＨＩＶ感染のための１次標的物）を標的化するための現在のアプローチは、分化に基づいて、成熟Ｔ−細胞を生ぜしめる前駆体多機能幹細胞中への、又は他方では、成熟ＣＤ４＋ Ｔリンパ球中への治療遺伝子の導入を必要とする。
【００１３】
しかしながら、幹細胞の標的化は、その細胞がインビトロで培養し、そして形質導入するのに困難であるので、問題がある。循環Ｔリンパ球の標的化はまた、それらの細胞が現在のベクター供給システムを用いてすべての標的細胞に達するのに困難であるほど広く散在されるので、問題がある。さらに、マクロファージは、他の器官へのウィルス拡張のための主要レザバーであるので、細胞標的物として見なされる必要がある。しかしながら、マクロファージは、最終的に分化され、そして従って、細胞分裂を受けないので、それらは通常使用されるベクターにより容易に形質導入されない。
【００１４】
従って、ＨＩＶ処理への優先的な現在のアプローチは、ウィルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）に対して敏感である細胞中に、ウィルス複製を特異的に妨害するか、又は感染された細胞の死を引き起こす（Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ （１９９３）， 前記により再考される）外来性遺伝子を導入するために、複製−欠陥ウィルスベクター及びパッケージング（すなわち、“ヘルパー”）細胞系を利用する（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ， ＪＡＭＡ， ２６９ （２２）， ２８８０−２８８６ （１９９３）； Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５６， ８０８−８１３ （１９９２）； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５７， ４５５−４６０ （１９９２）； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０， ９２６−９３１ （１９９３）； Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４， １２７５−１２８１ （１９８９）； 及びＣｏｕｒｎｏｙｅｒなど．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１， ２９７−３２９ （１９９３） を参照のこと）。
【００１５】
そのような複製−欠陥ウィルスベクターは、興味ある外来性遺伝子の他に、必須ウィルスタンパク質をコードする配列ではない、ウィルス複製のために必要なシス−作用配列を含む。結果的に、そのようなベクターは、ウィルス複製周期を完結することができず、そしてそのゲノム内にウィルス遺伝子を含み、そして連続的にそのウィルス遺伝子を発現するヘルパー細胞系がそれを増殖するために使用される。ヘルパー細胞系中への複製−欠陥ウィルスベクターの導入に続いて、ウィルス粒子形成のために必要とされるタンパク質が、トランスでベクターに供給され、そして標的細胞を感染し、そしてそこにおいて、ウィルス複製を妨げるか又はウィルス感染をされた細胞の死を引き起こす遺伝子を発現することができるベクターウィルス粒子が生成される。
【００１６】
そのような複製−欠陥レトロウィルスベクターは、アデノウィルス及びアデノ−髄半ウィルス、及びＨＩＶ遺伝子療法の臨床試験に使用されるそれらのレトロウィルスベクター並びに特に、Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）として知られているマウス両向性レトロウィルスベクターを包含する。それらの欠陥ウィルスベクターは、遺伝的抗ウィルス剤、例えば抗−ＨＩＶリボザイムによりＣＤ４＋細胞を、種々の成功の程度、形質導入するために使用されて来た（Ｓａｒｖｅｒなど． （１９９０）、前記；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅなど． （１９９１）， 前記；Ｄｒｏｐｕｌｉｃなど． （１９９３）， 前記； Ｏｊｗａｎｇなど． （１９９２）， 前記；及びＹｕなど． （１９９３） 前記）。しかしながら、それらのベクターは、ＨＩＶ遺伝子療法適用のためには、本質的に制限される。
【００１７】
例えば、高い形質導入は時折、疾病の臨床学的“潜伏”段階の間、ＨＩＶによりすでにほとんど感染されている、まれなＣＤ３４＋前駆体造血幹細胞又は広範囲に広まった標的ＤＣ＋ Ｔ−細胞を、ベクターが形質導入すべきである、ＨＩＶの処理において特に重要である。しかしながら、ＭｕＬＶベクターは、高い力価で得ることは困難であり、そしてそして従って、良好でない形質導入をもたらす。さらに、形質導入されたＤＮＡの長期発現は、特に、成熟Ｔリンパ球への分化の後、ＣＤ３４＋前駆体幹細胞において得られたことはない。さらに、欠陥ウィルスベクターの使用は、高価であり、且つ一般的対象群の費用以上であるエクスビボ遺伝子トランスファー方法（例えば、アメリカ特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）を必要とする。
【００１８】
ＡＩＤＳの遺伝子療法処理のための現在入手できるベクターの使用に関するそれらの欠点は、研究者による新規ウィルスベクターの探究を導いて来た。１つのそのようなベクターは、ＨＩＶ自体である。ＨＩＶベクターは、感染性研究（Ｐａｇｅなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６４， ５２７０−５２７６ （１９９０））、及びＣＤ４＋細胞、特にＣＤ４＋ ＨＩＶ−感染された細胞中への遺伝子（例えば、自殺遺伝子）の導入（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒなど．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｒ． Ｔｈｅｒ．， ３， ３９１−３９７ （１９９２）； Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ６７， ３９９７−４００５ （１９９３）； Ｃａｒｒｏｌｌなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ６８， ６０４７−６０５１ （１９９４）； 及びＰａｒｏｌｉｎなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６８， ３８８８−３８９５ （１９９４） を参照のこと）のために使用されて来た。それらの研究戦略は、ＣＤ４＋ Ｔ−細胞及び単球細胞中に遺伝子を導入するためにＨＩＶベクターを使用することである。
【００１９】
しかしながら、今日まで、それらのベクターは非常に複雑である。それらのベクターの使用は、細胞内組換えを通して野生型ＨＩＶを生成する危険性を付随する。欠陥ベクター配列及びヘルパーウィルスの同時トランスフェクション／同時感染が、ウィルスゲノムの相同領域間での組換えをもたらすことが観察されている（Ｉｎｏｕｃなど．， ＰＮＡＳ， ８８， ２２７８−２８２ （１９９１））。インビトロでの観察される相補性は、類似する複製−欠陥ＨＩＶベクターがインビボで組換えでき、従って、すでに存在するＨＩＶ感染を悪化することを示す。レトロウィルスが１つのビリオン中に２種のＲＮＡゲノムをパッケージする事実は、レトロウィルスが相補性及び／又は組換えにより引き起こされるいずれかの遺伝子欠陥を回避するために２種のウィルスＲＮＡを担持する提案を研究者に導いた（Ｉｎｏｕｅなど． （１９９１）， 前記）。
【００２０】
細胞内組換えの危険性、それによる野生型ＨＩＶをもたらす危険性の他に、ＨＩＶベクターは、ウィルスベクターの病因性を高める、インビボでの突然変異の関連する危険性を有する。これは、複製−コンピテントで、さらに非病因性である、第２世代組換えＨＩＶベクターの開発に関してのＳａｒｖｅｒなど． （ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ａｎｄ Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．， ９， ４８３−４８７ （１９９３ｂ）） による推測を導いて来た。そのようなベクターは、優先的に使用される非複製ベクター（すなわち、複製欠陥ベクター）に比較して、患者において複製し続け、従って、野生型ＨＩＶとの一定した競争を提供する。しかしながら、これまで、そのようなベクターは入手されていない。
【００２１】
理想的には、感染された個人を処理する最良の機会は、ウィルスが宿主を感染する前、接種の時点で存在する。しかしながら、これは、多くの個人が、彼らが、疾病の臨床学的潜伏期間まで、ＨＩＶにより感染されたようになっていることを十分に理解しない限り、達成するには困難である。これに基づけば、抗ウィルス介在性が強く必要とされる段階は、臨床学的潜伏性の間である。この段階での治療は、ウィルスゲノムを有する、多数のすでに感染されたＣＤ４＋リンパ球により提供される攻撃が直面することを欠かせない。
【００２２】
これは、今日まで、ＨＩＶが不治の病であり、そして現在入手できる治療によりほとんど治療できない事実により明らかなように、つまらない挑発ではない。効果的なワクチンはやがて入手できるようには思われず、そして逆転写酵素及びプロテアーゼのインヒビターはこの組織培養においてＨＩＶ複製を妨げることが示されているが、インビボでのウィルス耐性の開発が処理の失敗を導いて来た。従って、ＨＩＶ遺伝子治療は、今日まで、３×１０７以上である、大部分のＨＩＶ−感染された個人に対してはほとんど効果的ではない。
【００２３】
上記の観点においては、特にＡＩＤＳ及び癌において、特定の病原体に対する長期の及び持続的に免疫学的応答を開発することが、ますます重要になって来た。複製−コンピテントであるが、しかし非病原性であるウィルスを用いての生存−弱毒化された（ＬＡ）ワクチンが考慮されて来た（Ｄａｎｉｅｌなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８， １９３８−１９４１ （１９９２）； 及びＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． ＆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．， １０， ３３１−３３２ （１９９４））。しかしながら、１又は複数の遺伝子の欠失によりその対応する野生型ウィルスとは異なるそのような非病原性ウィルスは、（ｉ）抗原は持続性ではないので（ＬＡ−ウィルスは効果的に複製しないので）、保護免疫応答を誘発することができないか、又は（ｉｉ）若い動物モデルにおいて疾病を引き起こすＬＡ−ウィルスの能力により示されるように（Ｂａｂａなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７， １８２３， １８２３−１８２５ （１９９５））、ＬＡ−ウィルスは複製し、そして他の病原可能性を有する。
【００２４】
前記理由のために、特にＡＩＤＳ及び癌においてのウィルス感染の予防及び治療処理様式についての必要が存続する。本発明は、条件付けで複製するベクターを提供することにより、そのような他の方法を提供する。本発明はまた、そのようなベクターが使用され得る追加の方法も提供する。その複製、及びウィルス粒子及びビリオンとしてのパッケージングを可能にするために、条件付けで複製するベクターを補足するヘルパーベクター構造体が、本発明によりさらに提供する。そのようなヘルパーベクターは、条件付けで複製するベクターが最少にされるよう修飾される。そのようなヘルパー−ベクター構造体の種々の態様が記載される。本発明のそれらの及び他の目的及び利点、並びに追加の本発明の特徴は、本明細書に示される本発明の記載から明らかであろう。
【００２５】
発明の簡単な要約：
本発明は、改良された条件付けで複製するベクター及び改良された組成物、並びに前記ベクターの生成及び使用方法を提供する。条件付けで複製できるベクターは、ベクターの複製を可能にする宿主細胞においてのみ複製する能力により特徴づけられる。それにより提供される改良されたベクターは、回復する複製能力を低められた危険性で存在することにより、安全性を高めた。それ自体、ベクターはまた、“低められた組換え”ベクター（ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）としても言及され得る。
【００２６】
本発明の１つの観点においては、改良された条件付けで複製するベクターは、少なくとも１つの核酸配列を含んで成り、その存在、転写又は翻訳は、複製−許容宿主細胞におけるベクターに、ベクターが由来するウィルスに対応するウィルスの野生型株よりも選択的利点を付与する。好ましくは、改良された条件付けで複製するベクターは、いずれかの他の競争ゲノム又はゲノム要素よりも、複製のための選択的利点をベクターに付与する少なくとも１つの核酸配列を含んで成る。
【００２７】
本明細書において使用されるようなゲノム要素は、ベクター又はいずれかの野生型ウィルスのいずれにも由来せず、そして宿主細胞におけるベクター複製と競争し、それを妨げるか又はそれに影響を与えることができる、宿主細胞における核酸配列として定義される。ゲノム要素はまた、完全なゲノム、例えば、宿主細胞又はもう１つのベクター又はウィルスのゲノムではない。複製のための選択的利点は、前記核酸配列の存在、転写又は翻訳により付与される。
【００２８】
もう１つの好ましい態様においては、条件付で複製するベクターは、レトロウィルス、特にレンチウィルスであり、そして少なくとも１つの核酸配列を含んで成り、その存在、転写又は翻訳は、ベクターにより感染される宿主細胞に、ベクターが由来するウィルスに対応するウィルスの野生型株により感染された細胞よりも選択利点を付与する。他方では、前記ベクターは、野生型株に完全に由来しないが、しかし１つよりも多くの野生型ウィルスに由来する成分を含むキメラ性である。１つよりも多くの野生型ウィルスは、異なった（又は異種の）ウィルスであるか、又は１つのウィルスの異なった株又は単離物であり得る。好ましくは、前記核酸配列は、前記宿主細胞において予防効果を提供するために発現され得る。これは、核酸配列が、細胞死を引き起こすレベルへのいずれかの感染性ウィルスの複製を妨げるので、生存利点を付与される細胞をもたらす。
【００２９】
もう１つの好ましい態様は、いずれかの他の競争ベクター又はプラスミド分子よりも、複製に関して選択的利点をベクターに付与する少なくとも１つの核酸配列を含んで成る改良された条件付で複製するプラスミドベクターである。例えば、そのようなベクターは、ベクターと共に同時局在化される場合、競争ベクター又はプラスミドを分解し、又は破壊し、又はその分解又は破壊をもたらし、すなわちその分解をもたらすことができる配列（例えば、リボザイム又はアンチセンス配列）を含んで成ることができる。競争ベクター及びヘルパーが破壊される予定である場合、本発明のベクターは、複製のための全体的な選択的利点をそれに提供するために他の配列を含むよう構築される。
【００３０】
例えば、本発明のベクターは、競争ベクター及びヘルパーの両者を破壊するアンチセンス配列を含むことができ、さらに、前記ベクターは、それがさらに、全体的な選択的利点を、条件付きで複製するベクターに付与する第２の第１−ヌクレオチド配列（例えば、競争ベクターＲＮＡよりもよりベクターＲＮＡを生成するプロモーター（形質導入された細胞における前記ベクターのコピー数は競争ゲノムよりも高い）、又はベクターに存在するが、しかしヘルパーには存在しないパッケージングシグナル）を含むので、複製に関して選択的利点を有するであろう。
【００３１】
従って、前記少なくとも第１のヌクレオチド配列はさらに、２種の第１のヌクレオチド配列（すなわち、第１の第１−ヌクレオチド配列は競争ベクター及び／又はヘルパーを標的化し、そして第２の第１−ヌクレオチド配列は複製のための選択利点を提供する）は、全体的な選択利点効果を達成するために共に作用するので、この態様においては、全体的な選択的利点の本発明者のベクターの複製を提供する。従って、複製の第１−ヌクレオチド配列の相乗効果は、いずれかの個々の第１−ヌクレオチド配列が競争ゲノムよりも差別的に選択を提供する、条件付きで複製するベクターのための十分な選択条件を誘導することができる。
【００３２】
競争ベクター又はプラスミドの分解又は破壊はまた、ベクターとの十分な長さの組換えの機会を減じ、従って、前記ベクターは“低められた組換え”性質を有する。前記ベクターは、リボザイム又はアンチセンス配列により標的化されないようその配列を縮重することによって、分解から保護され得る。ベクターはさらに、そのゲノムベクターＲＮＡが競争ベクター又はヘルパーにより有意に分解されないよう、ＲＮＡを特異的に追跡するためにベクター又はベクターのゲノム部分を構築することによって、分解から保護され得る。
【００３３】
他方では、ヘルパーは、例えば、未スプライスであるが、しかしスプライスされていないベクターＲＮＡにおいてのみ存在する第１の核酸配列を含むベクターゲノムＲＮＡを構築すると共に、ヘルパーをスプライスソーム中に強制するためにスプライシング要素を挿入することによって、同様にして又は単独で構築され得る。改良されたベクターのそのような非制限例は、ウィルスベクター又はプラスミドベクターの生成、及び核酸配列のそのようなベクター中へのクローニング又はサブクローニングの間に、並びに突然変異誘発、誘発性遺伝子発現及び同様のことへのそれらの使用の間に使用される場合、特に好都合である。
【００３４】
本発明の条件付きで複製するベクター及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物がまた、本発明により提供される。条件付きで複製するウィルスベクターを含んで成る宿主細胞がさら提供される。ベクター（ここで、前記ベクターは、ＤＮＡで存在する場合、配列番号２，３，４，５，６，１４（ここで、少なくとも１つのＮは突然変異誘発され）、１５及び１６から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成り、そして前記ベクターは、ＲＮＡで存在する場合、配列番号２，３，４，５，６，１４（ここで、少なくとも１つのＮは突然変異誘発され）、１５及び１６から成る群から選択されたヌクレオチド配列によりコードされるヌクレオチド配列を含んで成る）はまた、本明細書に示されるような単離され、そして精製された核酸分子としても提供される。同様に、リボザイムによりベクターを構築する方法、ベクターの修飾方法、及びパッケージング細胞系を用いないで、条件付きで複製するベクターを増殖し、そして選択的にパッケージングする方法が提供される。
【００３５】
本発明のさらにもう１つの観点においては、ウィルス感染について宿主細胞を治療的に及び予防的に処理する方法が提供される。特に好ましい態様においては、そのような処理は、ウィルス感染を阻害する優性表現型を付与することにより、又は他のウィルスによる感染を阻害する表現型を付与することにより、前記宿主においてもたらされる。好ましくは、阻害される他のウィルスは、広範囲のウィルス株を包含する。
【００３６】
そのような方法はさらに、適切な場合、“ヘルパーベクター”又は“ヘルパーベクター構造体”としても言及されるヘルパー−誘発ベクター、細胞毒性薬剤、タンパク質／因子、又はプロテアーゼ／逆転写酵素インヒビターの使用を包含することができる。前記方法は例えば、ウィルスの複製を阻害するために、疾病（例えば、癌、遺伝的、感染性、血管性及び他の疾病）を処理するために、効果的なエクスビボ及びインビボ遺伝子トランスファーを行うために、安全なベクター生成を可能にするために、遺伝子の機能を決定するために、又は宿主細胞において興味ある遺伝子を発現するために使用され得る。
【００３７】
本発明のさらにもう１つの観点においては、薬物／因子とタンパク質との間の相互作用を検出するために本発明の条件付で複製するベクターを含んで成る宿主細胞を用いる方法が提供される。そのような方法は、タンパク質特徴化、及びベクターによりコードされる所定のタンパク質に関しての活性又は物理的相互作用についての薬剤、因子又は他のタンパク質のスクリーニングを可能にする。前記方法はさらに、ベクターによりコードされる所定のタンパク質に機能的に関連するタンパク質の同定及び特徴化を可能にする。例えばコードされるタンパク質が転写因子である場合、本発明のベクターによるその発現は、転写因子により調節される遺伝子の同定を可能にする。
【００３８】
本発明はまた、組成物類、及びそれらの使用の前、種々の条件下でのベクターの貯蔵のための条件を提供する。そのような条件の例は、種々のキャリヤーの存在下での−８０℃、−２０℃及び４℃での貯蔵を包含する。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、一般的なレンチウィルスベクター、すなわち複製コンピテントベクター又はウィルスを生成するために条件付きで複製するベクターとのヘルパー−ベクターの組換えを低め、最少にするか又は排除するよう作用するヘルパー−ベクター構成体の修飾を包含する。従って、本発明は、“低められた組換え”ベクターを調製するよう作用するヘルパー−ベクターを包含する。本発明のヘルパーベクターはまた、好ましくは、生成される条件付で複製するベクター−の力価を、１０７の形質導入単位／ｍｌ以上のレベルに高める。他の態様は、濃縮及び精製のための高速（超ではない）遠心分離、及びクロマトグラフィー、限外濾過及びダイアフィルトレーション方法を用いてのベクターの濃縮を包含する。
【００４０】
本発明のヘルパーベクター修飾は、リボザイム、例えば抗−Ｕ５リボザイム、又は条件付で複製するベクターを分解するか、又はその破壊又は不活性化をもたらすアンチセンス配列の挿入を包含し、結果的に、ヘルパーベクター及び条件付で複製するベクターは同時局在化されるか、又は同時パッケージされる。１つの態様においては、ヘルパー成分は、１０７の形質導入単位／ｍｌ以上の上清液力価に、濃縮されていないベクターを効果的に生成する２種のプラスミド機能的ベクター−ヘルパーシステムを創造するために１つのプラスミド構成体上に完全に組み込まれる（本明細書における図３を参照のこと）。
【００４１】
もう１つの態様においては、ヘルパー−ベクターのヌクレオチド配列は、条件付で複製するベクターとの組換えを最少にするために縮重される。さらにもう１つの態様においては、ヘルパー−ベクターは、条件付で複製するベクターのパッケージングへの使用のための異種トランス−作用要素を含んで成る。そのような要素の例は、次のものを包含するが、但し、それらだけには限定されない：水疱性口内炎ウィルスエンベロープタタンパク質ＶＳＶ−Ｇ、ＲＤ１１４エンベロープタンパク質、狂犬病ウィルスエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウィルスエンベロープタンパク質（ＧＡＬＶ）及びキメラエンベロープタンパク質。さらなる修飾はまた、異種ｒｅｖ−応答性要素（ＲＲＥ）、後−転写調節要素（ＰＲＥ）又は構成輸送要素（ＣＴＥ）を包含する。
【００４２】
さらにもう１つの態様においては、ヘルパー−ベクター構成体は、さらに、スプライス部位、スプライス受容体部位、又は縮重された又はヒト適合されたヌクレオチド配列のための部位を含んで成る。例えば、前記スプライス部位は、パッケージングシグナル及び／又はＲＲＥがスプライシングの現象により、転写されたＲＮＡから除去され得るよう位置決定され得る。さらに、ベクター又はヘルパー構成体中へのイントロン挿入のための部位は、条件付で複製するベクターとヘルパー、又は他の競争ゲノム又はゲノム要素との間での二量体化、同時局在化又は組換えが最少にされるよう供給される。イントロンの挿入は、スプライスソーム中への及びベクターＲＮＡからのヘルパーＲＮＡのトラフィッキングをもたらすよう方向づけされ得る。驚くべきことには、いくつかのヘルパーベクター構成体は、条件付で複製するベクターの力価を高めることが見出された。
【００４３】
好ましい態様の記載：
本発明は、改良された条件付で複製するベクター、レンチウィルスベクター及びそれらの使用を提供する。選択的に複製される他に、ベクターは、複製コンピテントになるベクターをもたらすために組換えの傾向を低めるための特定の修飾を含む。野生型株のウィルスの複製を阻害する方法、及びそのような改良されたベクターを含んで成る細胞中への遺伝子供給方法が包含される。前記方法は、感染され得、感染される危険性で存在するか、又は好ましくは実際、野生型株のウィルスにより感染され得る宿主と、ベクター（すなわち、非病原性の、又は非疾病生成の条件付で複製する（ｃｒ）ベクター）の複製を可能にする宿主においてのみ増殖される改良されたベクターとを接触することを含んで成る。
【００４４】
さらに本明細書に記載されるように、前記方法の特定の目的は、非病原性の条件付で複製するベクターにより、宿主における競争感染を確立することである。一般的に、本発明の条件付で複製するベクターは、野生型ウィルスに比較して、条件付で複製するベクターに、複製及び拡張のための選択的利点を付与する少なくとも１つの核酸配列、及び／又は野生型ウィルスを含む宿主細胞に比較して、条件付で複製するベクターを含む宿主細胞に、ウィルス粒子の増殖のための選択的利点を付与する少なくとも１つの核酸配列を含んで成る。
【００４５】
本発明の好ましい態様においては、ベクターは、ＨＩＶ配列を含んで成り、そしてＨＩＶ感染の処理のために使用される。従って、ベクター、又は前記ベクターを含む宿主細胞は、（１）子孫ビリオン（すなわち、それらが両者とも存在する細胞における）中へのパッケージングに関して、野生型ＨＩＶゲノムよりも選択的利点を、ｃｒＨＩＶゲノムに提供し、そして／又は（２）野生型ウィルスを生成する宿主細胞に比較して、ｃｒＨＩＶビリオンの生成に関して、選択的利点を、条件付きで複製するベクター（ビリオン）を生成する宿主細胞に提供する少なくとも１つの核酸配列を含んで成る。１つの方法（本発明が制限されない）は、野生型ＨＩＶゲノムを分離することができる１又は複数のリボザイムを、ｃｒＨＩＶゲノムに提供することによって、パッケージングのための選択的利点をそれらのゲノムに付与することである。
【００４６】
本発明のもう１つの観点においては、前記ベクターは、複製コンピテントベクターをもたらすために、野生型及びヘルパー構成体との組換えの低められた傾向を付与される。さらに、組換えの低下にまた寄与する、ヘルパーベクター、細胞及びパッケージングシステムは、ベクターをもはや条件付で複製しなくするために、生産性組換え現象の機会をさらに低めるために提供される。
【００４７】
野生型ウィルス：
本発明によれば、“ウィルス”とは、タンパク質及び核酸を含み、そしてウィルス核酸により特定されるウィルス生成物を生成するために宿主細胞遺伝子機構を使用する感染剤である。“核酸”とは、一本鎖又は二本鎖の直線状又は環状であり、そして任意には、ＤＮＡ又はＤＮＡポリマー中に組み込まれ得る、合成、非天然又は修飾されたヌクレオチドを含むＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを言及する。ＤＮＡポリヌクレオチドは好ましくは、ゲノム又はｃＤＮＡ配列から構成される。
【００４８】
“ウィルスの野生型株”とは、本明細書に記載されるような人工突然変異誘発のいずれも包含しない株、すなわち天然から単離され得るいずれかのウィルスである。他方では、野生株は、実験室において培養されて来たが、しかしさらに、いずれか他のウィルスの不在下で、子孫ゲノムはビリオン、例えば天然から単離されたそれらを生成することができるいずれかのウィルスである。
【００４９】
例えば、次の例に記載されるｐＮＬ４−３ ＨＩＶ−１分子クローンは、ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｃａｔａｌｏｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ から入手できる野生型株である（Ａｄａｃｈｉなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ５９， ２８４−２９１ （１９８６） を参照のこと）。ｐＰＳＸＢは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ 出のＤｒ． Ｓｕｒｅｓｈ Ａｒｙａから得られ、そしてＡｒｙａなど．， Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９８ Ｊｕｎ １０； ９ （９）： １３７１−８０に記載されるＨＩＶ−２分子クローンである。
【００５０】
一般的に本発明の方法は好ましくは、ウィルス感染に起因するウィルス疾病を処理するために使用される。所望には、ウィルス（及び下記に論じられるようなベクター）は、ＲＮＡウィルスであるが、しかしＤＮＡウィルスでもあり得る。ＲＮＡウィルスは、原核生物（例えば、バクテリオファージ）及び多くの真核生物、例えば哺乳類及び特にヒトを感染する種々のグループである。ほとんどのＲＮＡウィルスは、少なくとも１つのファミリーは、遺伝材料として二本鎖ＲＮＡを有するが、それらの遺伝子材料として一本鎖ＲＮＡを有する。
【００５１】
ＲＮＡウィルスは、次の３種の主要グループに分けられる：陽性−鎖ウィルス（すなわち、ウィルスにより、トランスファーされるゲノムがタンパク質に翻訳され、そして除タンパク質化された核酸が感染を開始するのに十分であるそれら）、陰性−鎖ウィルス（すなわち、ウィルスによりトランスファーされるゲノムがメッセージセンスに対して相補的であり、そして翻訳が生じる前、ビリオン関連酵素により転写されるべきであるそれら）、及び二本鎖ＲＮＡウィルス。本発明の方法は好ましくは、陽性−鎖ウィルス、陰性−鎖ウィルス及び二本鎖ＲＮＡウィルスを処理するために使用される。
【００５２】
本発明において使用される場合、ＲＮＡウィルスは、シンドビス様ウィルス（例えば、ドガウィルス、ブロモウィルス、ククモウィルス、ドバモウィルス、イラルウィルス、ドブラウィルス及びポテクスウィルス）、ピコルナウィルス様ウィルス（例えば、ピコルナウィルス、カリシウィルス、コモウィルス、ネポウィルス及びポチウィルス）、負の鎖ウィルス（例えば、パラミクソウィルス、ラブドウィルス、オルトミクソウィルス、ブンヤウィルス及びアレナウィルス）、二本鎖ウィルス（例えば、レオウィルス及びビルナウィルス）、フラビウィルス様ウィルス（例えば、フラビウィルス及びペスチウィルス）、レトロウィルス様ウィルス（例えば、レトロウィルス）、コロナウィルス、及び他のウィルスグループ、例えばノダウィルスを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００５３】
本発明の好ましいＲＮＡウィルスは、フラビウィルス科のウィルス、例えばフィロウィルス属のウィルス、及び特にマールブルグ又はエボラウィルスである。好ましくは、フラビウィルス科のウィルスは、フラビウィルス属のウィルス、例えば黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、西ナイルウィルス、セントルイス脳炎ウィルス、日本脳炎ウィルス、ムレイバレイ脳炎ウィルス、ロシオウィルス、マダニ担持の脳炎ウィルス及び同様のウィルスである。
ピコマウィルス科のウィルス、好ましくはＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＡ）又は非Ａ又は非Ｂ肝炎ウィルスが好ましい。
【００５４】
もう１つの好ましいＲＮＡウィルスは、レトロウィルス科（すなわち、レトロウィルス）、特に、オンコウィルス属又は亜科、スプマウィルス及びレンチウィルスのウィルスである。オンコウィルス亜科のＲＮＡウィルスは所望には、ヒトＴ−リンパ球向性ウィルス１型又は２型（すなわち、ＨＴＬＶ−１又はＨＴＬＶ−２）又はウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）、鳥類白血症−肉腫ウィルス（例えば、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、鳥類の骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）、鳥類の赤芽球症ウィルス（ＡＥＶ）及びラウス関連ウィルス（ＲＡＶ；ＲＡＶ−０〜ＲＡＶ−５０）、哺乳類Ｃ型ウィルス（例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）、Ｈａｒｖｅｙネズミ肉腫ウィルス（ＨａＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏネズミ白血病ウィルス（Ａ−ＭｕＬＶ）、ＡＫＲ−ＭｕＬＶ、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、サル肉腫ウィルス、網内症ウィルス（ＲＥＶ）、脾臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）、Ｂ型ウィルス（例えば、マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ））、及びＤ型ウィルス（例えば、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒモンキーウィルス（ＭＰＭＶ）及び“ＳＡＩＤＳ”ウィルス）である。
【００５５】
レンチウィルス亜科のＲＮＡウィルスは、所望には、ヒト免疫欠損ウィルス１型又は２型（すなわち、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２；ここでＨＩＶ−１はこれまで、リンパ節症関連ウィルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）−関連ウィルス（ＡＲＶ）と呼ばれている）、又はＡＩＤＳ又はＡＩＤＳ様疾病により同定され、そしてそれに関連するＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に関連するもう１つのウィルスである。頭字語“ＨＩＶ”又は用語“ＡＩＤＳウィルス”又は“ヒト免疫欠損ウィルス”が、一般的に、それらのＨＩＶウィルス及びＨＩＶ−関連及び連結ウィルスを言及するために、本発明において使用される。さらに、レンチウィルス亜科のＲＮＡウィルスは好ましくは、ビスナ／マエディウィルス（例えば、羊を感染する）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウィルス、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）及びヤギ関節炎−脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）である。
【００５６】
本発明のウィルスはまた、所望には、ＤＮＡウィルスである。好ましくは、ＤＮＡウィルスは、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス、アデノウィルス、ヘルペス単純ウィルス、乳頭腫ウィルス、ワクシニアウィルス及び同様のものである。
それらのウィルスの多くは、最大の汚染施設がすべての実験室作業のために必要とされる、“生物安全性レベル４”（すなわち、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ （ＷＨＯ） “危険グループ４”）として分類される。しかしながら、当業者は、それらのウィルスを良く知っており、そしてそれらについてのこの安全性を注意して考慮することができる。
【００５７】
“宿主細胞”とは、いずれの細胞でもあり得、そして好ましくは、真核細胞である。所望には、宿主細胞は、リンパ球（例えば、Ｔリンパ球）又はマクロファージ（例えば、単球マクロファージ）であり、又はそれらの細胞のいずれかの前駆体、例えば造血幹細胞である。好ましくは、細胞は、細胞表面上のＣＤ４＋糖タンパク質を含んで成り、すなわちＣＤ４＋である。しかしながら、所望には、ＡＩＤＳウィルスにより感染されたＣＤ４＋ Ｔリンパ球はまだ活性化されたことはない（すなわち、好ましくは、ｎｅｆの発現はまだ生ぜしめられておらず、そしてさらにより好ましくは、ＣＤ４遺伝子発現は、さらに下記で論じられるように、ダウンレギュレートされたことはない）。
【００５８】
さらに、宿主細胞は好ましくは、ＣＤ４マーカーを欠き、そしてさらに、本発明のウィルスにより感染され得る細胞である。そのような細胞は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：星状細胞、皮膚線維芽細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、樹状突起細胞、ランゲルハンス細胞、単球、造血幹細胞、胚幹細胞、精子又は卵子を生ぜしめる細胞、間質細胞、粘膜細胞及び同様のもの。好ましくは、宿主細胞は、真核細胞、多細胞種（例えば、単細胞酵母細胞とは対照的に）のものであり、そしてより好ましくは、哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。
【００５９】
細胞は、単一の存在物として存在するうことができるか、又は細胞の大きな集合体の一部であり得る。そのような“細胞の大きな集合体”は、例えば、細胞培養物（混合されているか又は純粋）、組織（例えば、内皮、上皮、粘膜又は他の組織、例えば上記ＣＤ４欠失細胞を含む組織）、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、筋肉、胆嚢、膀胱、生殖腺、眼、及び他の器官）、器官系（例えば、循環系、呼吸系、胃腸系、泌尿系、神経系、外皮系、又は他の器官系）、又は生物（例えば、鳥、哺乳類、又は同様のもの）を包含する。
【００６０】
好ましくは、標的化される器官／組織／細胞は、循環系（例えば、心臓、血管、及び血液、例えば白血球細胞及び赤血球細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない）、呼吸系（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺及び同様のもの）、胃腸系（例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢、及び他のもの）、泌尿系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道及び同様のもの）、神経系（例えば、脳及び脊椎、及び特定の知覚器官、例えば眼）、及び外皮系（例えば、皮膚、上皮、及び皮下又は経皮組織の細胞）のものである。
【００６１】
さらにより好ましくは、標的化される細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱及び眼細胞から成る群から選択される。標的細胞は、正常細胞である必要はなく、そして疾病細胞であり得る。そのような疾病細胞は、腫瘍細胞、遺伝的異常細胞、又は異常組織、例えば腫瘍血管内皮細胞近くか又はそれに隣接する細胞であり得るが、但しそれだけには限定されない。
【００６２】
ベクター：
“ベクター”とは、パッセンジャー核酸配列（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主細胞中にトランスファーするよう作用する核酸分子（典型的には、ＤＮＡは又はＲＮＡ）である。３種の通常型のベクターは、プラスミド、ファージ及びウィルスを包含する。好ましくは、ベクターは、ベクター核酸の封入された形を含むウィルス、及びベクター核酸がパッケージングされているウィルス粒子である。
【００６３】
所望には、ベクターは、それが人工的な突然変異又は修飾を包含する限り、ウィルスの野生型株ではない。従って、ベクターは典型的には、さらに本明細書に記載されるように、条件付で複製するウィルスを含むよう遺伝子操作（すなわち、欠失による）により野生型ウィルス株から誘導される。最適には、ウィルスベクターは、処理される感染を引き起こす野生型ウィルスと同じ型のものである（好ましくは、前記野生型ウィルスの１つである）ウィルス株を包含する。従って、好ましくは、ベクターは、ＲＮＡウィルスに由来し、さらにより好ましくは、ベクターはレトロウィルスに由来し、そして最適には、ベクターはヒト免疫欠損ウィルスに由来する。ヒト免疫欠損ウィルスに由来するそのようなベクターは、一般的に本明細書においては、“ｃｒＨＩＶ”ベクターとして言及される。
【００６４】
ベクターはまた、好ましくは、“キメラベクター”、例えばウィルスベクターと他の配列との組み合わせ、例えば、ＨＩＶ配列と１又は複数の他のウィルス（所望には、条件付で複製するベクターを含むよう野生型ウィルス株から誘発される）との組み合わせである。特に、ＨＩＶ配列は所望には、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、アルファビリダエ（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、フラビビリダエ（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、ヘパドナビリダエ（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）空のウィルス、パポバビリダエ（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、パルボビリダエ（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、ヘルパスビリダエ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、ポックスビリダエ（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、パラミクソビリダエ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、ラブドビリダエ（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、又はレトロビリダエ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）からのウィルス、例えばオンコレトロウィルス、Ｓｐｕｍａ−レトロウィルス及びＬｅｎｔｉ−レトロウィルスの修飾された（すなわち、非野生型）株の配列により連結され得る。それらのウィルス科由来の又はそれに関連するウィルス又はウィルス様ゲノムがまた、包含される。
【００６５】
好ましいキメラベクターは、非レンチウィルス由来のベクター配列（すなわち、タンパク質をコードする配列、フラグメント又は非コード配列）がレンチウィルスベクター中に挿入される場合である。好ましくは、非ＨＩＶ配列は、ＨＩＶ由来のベクター中に挿入される。
本明細書に包含される場合、ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを含んで成ることができる。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターのいずれかが、ウィルスを誘導するために使用され得る。同様に、ｃＤＮＡコピーは、ウィルスＲＮＡゲノムから製造され得る。他方では、ｃＤＮＡ（又はウィルスゲノムＤＮＡ）成分は、ＲＮＡを生成するために、インビトロで転写され得る。それらの技法は、当業者に良く知られており、そしてまた、次の例に記載される。
【００６６】
“条件付で複製するウィルス”とは、一定の条件下でのみ欠陥がある複製−欠陥ウィルスである。特に、ウィルスは許容できる宿主細胞においてその複製周期を完結することができ、そして制限宿主細胞においてはその複製周期を完結することができない。“宿主細胞”は、感染され得るか、又は実際、野生型ウィルス又は偽型ベクター（ｐｓｅｕｄｏ ｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒ）により感染するウィルスによる感染の前又は後で存在することができる。他方では、“宿主細胞”は、ウィルス複製のために必要な野生型ウィルス又はヘルパー遺伝子生成物をコードする細胞である。従って、本発明の条件付で複製するベクターは、野生型ウィルス株（又はヘルパー）との相補性に基づいて、又は野生型ウィルスが条件付で複製するベクターゲノムを含む細胞を感染する場合のみ、複製するウィルス（好ましくは、処理される感染と同じタイプのウィルスである）である。
【００６７】
好ましい態様においては、ベクターは、ＤＮＡの形で導入されるＲＮＡウィルス（例えば、条件付で複製するＨＩＶウィルス）を含んで成る。この好ましい態様は、病原性野生型ＨＩＶゲノムよりも選択的利点を非病原性ｃｒＨＩＶ−１ベクターゲノムに付与する複製ＨＩＶ−１（ｃｒＨＩＶ）ベクター方法を提供する。特に、野生型ＨＩＶ及びｃｒＨＩＶゲノムの両者を含む細胞においては、ｃｒＨＩＶ ＲＮＡは、それらが例えば、ｃｒＨＩＶ ＲＮＡではなく、野生型ＲＮＡを分解するリボザイムを含むので、ビリオン中へのパッケージングのための選択的利点を有する。そのような非病原性ｃｒＨＩＶは、野生型ヘルパーウィルスの存在下でＨＩＶ感染に対して敏感である感染されていない細胞（例えば、ＣＤ＋細胞）に拡張することができる。この態様においては、ｃｒＨＩＶの選択的パッケージング及び拡張は、野生型ＨＩＶ複製を妨げる。
【００６８】
さらなる好ましい態様は、それがベクターを病原性にするであろうウィルス補助タンパク質配列（例えば、Ｖｉｆ， Ｖｐｕ， Ｖｐｒ又はＮｅｆ， 又はそれらの組合せ又はフラグメント（但し、それらだけには限定されない））のいずれかの組合せを含まないので、非病原性である非病原性ｃｒＨＩＶベクターである。他方では、配列は存在することができるが、しかし転写的にサイレントであるか、又は翻訳され得ない。任意には、ベクターは、ベクターを病原性にするであろう調節タンパク質配列（例えば、Ｔａｔ又はＲｅｖ、又はそれらのフラグメント（但し、それらだけには限定されない））のいずれの組合せも含まない。他方では、それらの配列は、存在するが、しかし、転写的にサイレントであるか、又は翻訳されない。
【００６９】
しかしながら、ベクターは好ましくは、転写的に活性的であるか又はサイレントであり得る形で、構造タンパク質配列（例えば、ｇａｇ、又はそのフラグメント）、酵素タンパク質配列（例えば、ｐｏｌ， 又はそのフラグメント）、及び／又はエンベロープタンパク質配列（例えば、ｅｎｖ、又はそのフラグメント）のいずれかの組合せを含む。従って、条件付で複製するベクターは複製できるが、しかし所定の宿主において病原性であるレベルまでは複製できない。
【００７０】
あるいは、ベクターは、必要とされる治療、予防又は生物学的効果を誘発するための十分なレベルまで複製するために、野生型ウィルス由来の必要な配列を含むヘルパー成分（例えば、ヘルパーベクター）との相補性を必要とする。最適な生物学的効果を提供するための、ベクター及びヘルパーに存在するタンパク質又はヌクレオチド配列の正確な組み合わせの決定は、ベクター又はヘルパー構成体中へのヌクレオチド配列の種々の組合せの追加及び控除を包含する、当業者に通常の単純なスクリーニング方法の直接的な適用のみを包含する。
【００７１】
さらに、上記ヌクレオチド配列は、生物学的効果を改良するために、又は例えば、ヘルパー構成体との組換えのための機会を低めるために修飾又は突然変異誘発され得る。より最適化された構成体を得るためにベクター又はヘルパー構成体の修飾又は突然変異誘発のための多くのプロトコールは、当業界において良く知られている（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ａｎｄ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ， ２０００； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９； 及びＳｏｏｎｇなど．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５： ４３６−４３９， ２０００；それらは引用により本明細書に組み込まれる）。
【００７２】
上記ベクターにより可能にされるアプローチは、補助タンパク質を欠いている複製−コンピテントウィルスを用いる生存−弱毒化された（ＬＡ）ワクチンの使用とは異なる（Ｄａｎｉｅｌなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８， １９３８−２９４１ （１９９２）； 及びＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． ＆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．， １０， ３３１−３３２ （１９９４） を参照のこと）。なぜならば、ＬＡワクチンに関しては、効果的な免疫応答の効果的な生成を妨げ、そして安全性をまだ維持している、欠損を補足するための努力が行われないからである。例えば、複数の欠失されたＬＡ ＳＩＶワクチンは効果的な免疫応答を誘発することができないが、ところが単独の欠失された（Ｎｅｆ陰性）ＬＡ ＳＩＶワクチンは若いアカゲザルにおいては病原性であることが知られている（Ｂａｂａなど．， １９９５）。
【００７３】
上記のように、本発明により提供されるＬＡ ＨＩＶワクチンへのもう１つのアプローチは、少なくとも２種のベクターを使用することであり、ここで少なくとも１つのベクターは複数の欠失されたＨＩＶベクターであり、そして第２の（ヘルパー）ベクターはＮｅｆを除くすべての補助タンパク質を発現する。従って、複数の弱毒化されたＨＩＶベクターは、制御された態様で、ヘルパーベクターからのＶｉｆ， Ｖｐｒ及びＶｐｕにより補充されながら、疾病を引き起こさないで条件付態様で複製するであろう。
【００７４】
前記第１のベクターは、野生型ＨＩＶ複製及び拡張を妨げるために、遺伝的抗ウィルスを含むよう構成され得る。他方では、そのような第１のベクターは、野生型ウィルスに対する効果的な免疫応答を誘発するために使用され得る。単純なスクリーニング方法は、第１のベクターから欠失されているが、しかしヘルパーベクターには存在する配列の実際の組み合わせが、前記第１のベクターの、最適な治療又は予防応答の提供、及びさらに、非病原性であることによる安全性の維持を可能にする評価を可能にするであろうことは、当業者に明白であろう。
【００７５】
条件付で複製するベクター−ヘルパーシステムのさらなる好ましい態様は、ｇａｇ， ｐｏｌ， ｅｎｖ， ｔａｔ及びｒｅｖを発現するためにＨＩＶ−１ベクターを使用し、そしてＶｉｆ， Ｖｐｕ， Ｖｐｒ及び任意には、Ｎｅｆ遺伝子を発現するためにＨＩＶ−２由来のヘルパーベクターを用いるであろう。本発明は、逆転されたＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、又はキメラＨＩＶ形式を包含する、いずれかの適合性ベクターの組合せで配置される上記遺伝子のいずれかの組み合わせが同時に可能であるので、この例によっては制限されない。
【００７６】
ＨＩＶ−１骨格からのＴａｔの発現は、ＨＩＶ−１ベクターゲノム又はＨＩＶ−２ベクターゲノムのいずれかを含むベクター粒子を生成するために、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ＬＴＲの両者を、お互いの相補性のためにトランス活性化する。しかしながら、２種のゲノムＲＮＡは効果的にニ量体化せず、従って、１つのビリオン粒子中にパッケージングされる両ベクター及びヘルパーゲノムの同時局在化を妨げる。同じビリオン粒子中に同時パッケージングされる場合、複製コンピテントベクター（ＲＣＶ）を生成するためのベクターとヘルパーゲノムとの間の組換えは、前記粒子が続く標的細胞を感染した後、逆転写の間、生じ得る。
【００７７】
同時パッケージングされた構成体の可能な生成をさらに取り組むために、ベクターはさらに、いずれかの組換え危険性を低める１又は複数の核酸配列を含むことができる。例えば、第１のベクターは、ヘルパーベクターの分解に対して特異的なリボザイム（又はアンチセンス／リボザイム）を含むことができる。そのようなベクターの同じ細胞、非細胞又は細胞外位置における同時局在化は、組換えの後、不活性ゲノムをもたらす、ベクターのニ量体化又は同時局在化を破壊することによって安全性を高めるために、又は他方では、出現するＲＣＶの生成を妨げるために、ヘルパーベクターの分解をもたらすであろう。このアプローチは、代わりに、ヘルパーベクター上にリボザイムを含むことによって変更されるか、又はさらに、追加の安全性を提供するために両ベクターへのリボザイムの包含により改良され得る。
【００７８】
他方では、アンチセンス分子は上記リボザイムを置換するために使用され、その結果、二本鎖ＲＮＡハイブリッドの形成が細胞エンドヌクレアーゼにより急速に分解されるであろう。さらなる好ましい態様は、アンチセンス配列が標的化のために使用されるリボザイムＲＮＡの約１６個の塩基位置よりも長いであろうことである。
【００７９】
修飾されるアプローチにおいては、上記例のヘルパーベクターは、異種ウィルス（例えば、上記のではあるが、しかし好ましくは、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ネズミオンコレトロウィルス又は非ＨＩＶレンチウィルス由来のウィルス及びウィルスファミリーのいずれか）に起因し、それにより、タンパク質は構成的に発現され得る。他方では、異種ヘルパーベクターは、ＨＩＶ−１ベクター発現をトランス活性化するために、Ｔａｔの誘発性又は自動調節された発現のためにＨＩＶ−ＬＴＲを用いて構成され得る。異種ウィルスヘルパーベクターにより提供される利点は、第１及び第２ベクターのゲノム間の制限的会合であり、従って、可能性あるＲＣＶを生成するために組換えの機会をさらに低める。
【００８０】
もう１つの態様においては、ベクターは、ヘルパーゲノム上に存在するか、又はヘルパーゲノム中に挿入されるアンチセンス配列を含む。非制限的例は、ｐＮ１ｃｐｔＡＳｅｎｖベクターに類似する（但し、アンチセンス配列は、野生型ＨＩＶ上に存在するｅｎｖ配列の他に、又はその代わりに、ヘルパーベクター上に存在するｇａｇ配列に向けられる）、ｐＮ１ｃｐｔＡＳｇａｇベクターにより見出される。抗−ｇａｇアンチセンス配列は、ベクターに存在するＲＲＥ配列の下流に存在するスプライス受容体部位の上流に配置される。従って、ｇａｇ配列は、ベクターＲＮＡのゲノム性であり、且つ非ゲノム性ではなく、又はスプライスされた種においてのみパッケージングされる。従って、ヘルパーを含むイントロンのヘルパーゲノム、例えばＶＩＲＰＡＣシステムのそれらのゲノムは、細胞のスプライスソームに選択的に標的化され、ところが、抗−ｇａｇアンチセンス配列を含むゲノムベクターＲＮＡはスプライシング機構を選択的に迂回する。
【００８１】
細胞におけるベクター及びヘルパーゲノムの差別的トラフィキングは、ベクター力価に対して最少の効果をもたらすべきであり、さらにベクター及びヘルパーゲノムが思いがけず同時局在化されるべきである場合、ベクター及びヘルパーゲノムの塩基対合ハイブリダイゼーションは、そのようなベクター及びヘルパーゲノム含有粒子の不活性化又は破壊をもたらし、そしてＲＣＶを生成するベクター−ヘルパー組換えを妨げるべきである。
【００８２】
他の態様においては、ヘルパーが、条件付で複製するベクターに見出されるＵ５配列に向けられる抗−Ｕ５ベクターアンチセンス配列を含むよう構築され得る。本発明のこの観点の性質を制限しない場合、抗−Ｕ５アンチセンス配列が、ヘルパーコード配列から遠位に、但し転写終結部位の前に挿入され得る。従って、ベクター及びヘルパーＲＮＡが思いかけず、同時局在化され、そして同時パッケージング及びたぶん組換えを受ける場合、アンチセンス配列は、そのような同時パッケージされたウィルス粒子を破壊するか又は不活性化し、そして組換えを妨げるであろう。
【００８３】
さらにもう１つの態様においては、ヘルパーは、ベクター上に存在する第１−ヌクレオチド配列のための標的配列を含むことができる。非制限的例は、ｐＮ１ｃａｐｔＡＳｅｎｖベクターを含む２−プラスミド対のヘルパー中にセンスｅｎｖフラグメントを配置することによる。従って、ベクター及びヘルパーＲＮＡが同時局在化されるべきである場合、ヘルパーにおけるｅｎｖセンス配列は、組換えを妨げるためにベクターにおけるｅｎｖアンチセンス配列との塩基−対合を受けるであろう。
【００８４】
上記に提供される例は、１又は２種のタイプの遺伝的抗ウィルス配列に本発明を制限することを意味しない。多くの遺伝的抗ウィルス配列及びそれらの同起源の標的配列がベクター及び／又はヘルパー構成体中に挿入され得ることは、当業者に明らかであろう。さらなる非制限的例として、センスｇａｇ及びｅｎｖフラグメント配列を含む、ｐＮ１ｃｐｔＡＳｇａｇＡＳｅｎｖベクター及びヘルパーは、ＲＣＶを生成する同時パッケージング及び組換えの傾向を低めることによって、安全性を高めるために、お互いとの組換えに使用され得る。
【００８５】
ベクター又はヘルパー成分の発現についてのもう１つの好ましい態様においては、前記成分は過渡的に発現される。ベクター又はヘルパーのそのゲノム又はゲノム成分を過渡的に発現する１つの手段は、例えばインテグラーゼ陰性Ｐｏｌ遺伝子を用いて、ベクター又はヘルパーベクターを構成することである。そのようなレンチウィルスインテグラーゼ変異体は、当業界において知られており、そして感染性でないことが報告されている（Ｈｉｒｓｃｈなど．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４１； ５７３−５７４）。従って、インテグラーゼ陰性生成体細胞から生成されるベクター及び／又はヘルパーゲノムは、組み込まないが、しかしベクター又はヘルパー複製の量を調節するために過渡的態様で発現され得る。ベクター又はヘルパーのいずれかからの過渡的発現のためのさらにもう１つの手段は、ベクターＬＴＲにおけるＡＡＴ部位を破壊することである。それらの部位は、宿主細胞の染色体中への逆転写されたゲノムベクターＤＮＡの活性組み込みを担当できる。
【００８６】
上記を達成するさらなる手段は、ウィルス粒子中に機能的インテグラーゼ分子をパッケージするために融合タンパク質を用いる。この態様においては、条件付で複製するベクター、例えばレンチベクター又はヘルパーベクターはインテグラーゼをいずれもコードしないが、しかし機能的インテグラーゼ融合タンパク質は、もう１つのプラスミド構成体、例えばヘルパーベクター、又はヘルパー構成体の生成又はパッケージングの間、従って感染に基づいて機能的インテグラーゼ活性の供給の間、使用されるパッケージング細胞における組み込まれたコピーからの発現により入手できるであろう。
【００８７】
他方では、インテグラーゼタンパク質は、それをコードするヘルパー構成体からの発現を通してトランス形で提供される。本発明のこの態様においては、条件付で複製するベクター又はレンチベクターは、インテグラーゼをコードしないであろう。前記融合タンパク質は、ｖｐｒとインテグラーゼアミノ酸配列との間の連結部でプロテアーゼ分解部位を含むｖｐｒ−インテグラーゼ融合タンパク質を包含するが、但しそれだけには限定されない。
【００８８】
２種のベクター−ヘルパーシステムの上記の記載は、２種のベクター又はヘルパー構成体に本発明を決して制限するべきでない。ベクターの生成のために必要な成分を提供するためには、２，３又はそれ以上のベクター及び／又はヘルパーのいずれかの組合せが使用され得る。必要なゲノム要素をより多くのベクター又はヘルパー成分に分割することは、複数のベクター及びヘルパーゲノムが組換えを通してＲＣＶを生成することはより困難であるので、安全性を高める効果を有するであろう。安全性は、さらなる好ましい態様である、ベクターとヘルパーとの間の相同性の領域をほとんど含まないか又はまったく含まないようそれらを構成することによって、さらに増強され得る。
【００８９】
必要なゲノム要素を複数の成分に分割することはまた、わずか２種のゲノムに比較して、２種よりも多くのゲノムが宿主細胞内に同時に存在することはまれであるので、条件付で複製するベクターの複製をさらに制限することができる。必要とされる最適な数のベクター及びヘルパーは、異なった組み合わせの単純なスクリーニングにより容易に決定され得、そして使用される特定のウィルスベクターシステムに依存して変化することができる。
【００９０】
ベクターとヘルパーとの間の相同性の領域を制限するか又は除去する１つの単純且つ非制限的な手段は、当業界においては知られているが、ヌクレオチド配列を単純に縮重することによってである。配列を縮重する技法は、当業界において知られている。１つの好ましい方法は、治療使用がヒトにおいてである場合、配列をヒト適合することである。コドン使用法はプライマーについて表にされており、そして引用により本明細書に組み込まれるＷａｄａなど．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ． １８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ： ２３６７−２４１１， １９９０に記載されている。
【００９１】
縮重はまた、ヘルパーによりパッケージングされるベクターを標的化するために企画された剤の効果からヘルパー構成体を保護するために使用され得る。これは、存在するなら、ヘルパー構成体上に見出される同起源の標的配列を縮重することによって単純に達成され得る。さらに、ベクター及びヘルパー構成体の両者の縮重は、他のウィルス配列、例えば細胞におけるベクター又はヘルパー配列と共に同時に見出され得る他の野生型配列のそれらとの組換えを低めるよう企画され得る。
【００９２】
例えば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に基づいてのパッケージングシステムへのベクター及びヘルパー対の使用は、そのベクター及びヘルパー対が内因性レトロ−要素に関して縮重されるよう修飾され得る。従って、ベクター又はヘルパーのいずれかのヌクレオチド配列の縮重は、推定上の組換えの同時局在化を低め、そして従って、ベクターとヘルパーゲノムとの間での、又はベクター又はゲノムと競争ゲノム、例えば内因性レトロ−要素との間での複製コンピテントウィルスを生成する危険性を低める。
【００９３】
特に、ｃｒＨＩＶゲノムは、実質的に感染された細胞又は感染されていない細胞中に導入される。感染された細胞は、子孫ビリオンの封入及び生成のために必要とされるタンパク質をｃｒＨＩＶゲノムに供給する。ｃｒＨＩＶゲノムは、形質導入（例えば、これは、ｃｒＨＩＶ ＤＮＡのリポソーム介在形質導入により、又はキメラウィルスベクターを用いることにより行われ得る）により、又は野生型ＨＩＶ−感染された細胞のトランスフェクションに起因するｃｒＨＩＶ粒子の感染により直接的に、感染されていない細胞中に導入される。
【００９４】
本発明の改良されたｃｒＨＩＶベクターを含む、感染されていない細胞は、宿主に対して病原性である多量のｃｒＨＩＶ粒子を生成しない。ｗｔ−ＨＩＶにより重感染されていないｃｒＨＩＶベクター細胞は、いくらかではあるが、しかし宿主に対して病原性ではないレベルでｃｒＨＩＶ粒子を生成するであろう。本発明のいずれかのベクターを含む細胞は、ｃｒＨＩＶ粒子のさらなる生成のために必要とされるタンパク質を供給する野生型ウィルスによる感染に対して敏感のまま存続することができる。
【００９５】
この場合、相補的野生型重感染の存在下での本発明の条件付きで複製するベクターはまた、１つのタイプの“ウィルス供給ベクター”として機能し、それにより、例えば、複数回のｃｒＨＩＶ感染（すなわち、野生型ＨＩＶによる同時感染の存在下での）が確保され得る。そのようなベクターは、１回以上のウィルス複製、及び従って、他の細胞の感染、又は生物学的応答、例えば免疫応答を誘発するレベルまで複数回の複製を、ウィルス源に提供する。この改良点は、他のベクター、例えば、標準のパッケージング細胞系により使用され、そして１回のみの複製、又は適切な生物学的応答を誘発するのに不十分であるか、又は宿主に対して病原性である複数回の複製を提供するそれらのベクターと対照をなす。
【００９６】
所望には（例えば、インビトロでベクターの使用を促進するためには）、野生型ウィルス遺伝子は、条件付きで複製するベクターにより感染された細胞に同時供給され得る。野生型ウィルス遺伝子生成物は、野生型ウィルス株（又はｃＤＮＡ又はＲＮＡウィルスのプロウィルス）による同時感染によってのみならず、また、配列（調節又は構造）の転写又は翻訳を宿主細胞に対して付与することができる、発現ベクター、例えばヘルパー発現ベクター（“ヘルパー”又は“ヘルパーベクター”）によりサブクローン化されたそれらの遺伝子の形で細胞にそれらを供給することによって供給され得、又は他方では、遺伝子生成物は、外因的に、すなわち、タンパク質生成物を細胞に付加することによって供給され得る。
【００９７】
例えば、Ｔａｔコード配列を除く、野生型ＨＩＶからのすべてのタンパク質を含むｃｒＨＩＶベクターが構成され得る。Ｔａｔを発現するヘルパー発現構成体を使用する代わりにＴａｔタンパク質自体がヘルパーとして使用され得る。ヘルパー構成体の代わりにタンパク質を用いる利点は、核酸配列が組換えのために存在しないので、野生型ウィルスを生成する理論的可能性が存在しないことである。従って、ｃｒＨＩＶは、ヘルパー核酸構成体自体によってではなく、Ｔａｔタンパク質を用いることによって増殖され得る。Ｔａｔ１又はＴａｔ２（それぞれ、Ｔａｔの第１のエキソン、又は第１及び第２エキソンに対応する）がヘルパーとして使用され得る。そのようなタンパク質を生成し、そして精製するための方法は、当業者において良く知られている。
【００９８】
１つの好ましい態様においては、キメラＴａｔタンパク質が使用される。Ｔａｔは、融合タンパク質（例えば、Ｔａｔ−ＶＰ１６）に製造され、そしてＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターのそのトランス活性化する活性を保存することが示されている。他のキメラＴａｔタンパク質は、所望する生物学的効果を増強するために創造され得る。例えば、所望する生物学的効果が免疫応答を増強することである場合、Ｔａｔ−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質が構成され得る。このアプローチは、１つのタイプのキメラタイプ質に限定されず、そしてそれは、付加されるべき第２のキメラ（又はキメラ）Ｔａｔタンパク質（例えば、Ｔａｔ−ＩＦＮ−α、Ｔａｔ−ＴＮＦ−α、Ｔａｔ−ＩＬ−４、Ｔａｔ−Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α）のために所望される。
【００９９】
他の同等のキメラタンパク質を構成し、そして試験し、そしてそれらを、ベクターにヘルパー機能を、同時に提供しながら、免疫応答を増強する能力についてスクリーンすることは、当業者に容易に明らかであろう。もう１つの好ましい態様は、Ｔａｔ−Ｒｅｖ融合タンパク質構成体、又は生来のＨＩＶ Ｔａｔ−Ｒｅｖ融合タンパク質、例えばＴｒｅｖである。従って、キメラＴａｔタンパク質についての上記の記載は、サイトカイン又は細胞タンパク質の包含に限定されないが、しかしウィルスタンパク質（相同又は異種ウィルス融合タンパク質を生成する）はまた、所望する生物学的効果に依存して、本発明に使用され得る。
【０１００】
“ヘルパーベクター”に関しては、その発現は、細胞特異的であっても、又は細胞特異的でなくても良く、そしてそれは、本明細書において定義されるように、条件付で複製するウィルスベクターと共に宿主細胞中に導入され得、そしてそれにより、条件付きで複製するウィルスベクターの連続した複製を可能にする。
【０１０１】
本発明の“ヘルパーベクター”は、単一のベクター又は複数のベクターのいずれかにより複製のための必要な遺伝子生成物を供給することができる。そのようなベクターは好ましくは、過渡的トランスフェクションシステムに使用される。他方では、遺伝子生成物はまた、宿主細胞又は細胞系のゲノム中に組み込まれ得る。本発明によれば、単一のベクター又はプラスミド（宿主細胞において一、二又は多シストロン性であり得る）は好ましくは、同じ細胞中にヘルパーベクターを同時トランスファーし、そしてベクターを条件付で複製することの増強された傾向に起因する高められたベクター力価による。
【０１０２】
同じ細胞中に２種よりも多くの異なったベクターを同時にトランスフェクトすることの低められた傾向は、単一のヘルパーベクターの使用をより所望にする。トランスフェクションシステムに包含されるベクター又はプラスミドの数の低下はまた、レトロウィルス構成体をパッケージングするために従来の３種のプラスミドトランスフェクションシステムに比較して、少ないプラスミドが生成される場合、費用効果がある。
【０１０３】
本発明において使用される場合、“相補性”とは、細胞における異なった源からのウィルス遺伝子生成物の非遺伝的相互作用を言及する。特に、混合された感染により、相補性は片方の又は両方の親ゲノムのウィルス収率の増強を包含し、そして親ゲノムの遺伝子型は未変化のまま存続する。相補性は、非対立遺伝子性（すなわち、遺伝子間性、ここで異なった機能に欠陥がある変異体は、他のウィルスにおいて欠いている機能を供給することによってウィルス複製においてお互いを助ける）、又は対立遺伝子性（すなわち、遺伝子内性、ここで両方の親は多量体タンパク質の異なったドメインに欠陥を有する）であり得る。
【０１０４】
所望には、ｃｒＨＩＶ ＤＮＡにより（すなわち、上記のように、リポソームにより、又はキメラベクターを製造するために異種ベクターを用いることにより）トランスフェクトされ得る細胞型は、ＨＩＶ感染されているか又は感染されていない細胞のいずれかであり得る。ＨＩＶ感染された細胞は、活性化され得るか、又は未活性のままであり得る。それらが活性化される場合、それらはすぐに、野生型ＨＩＶ ＲＮＡ及びｃｒＨＩＶ ＲＮＡを転写し、子孫ビリオン中へのｃｒＨＩＶ ＲＮＡの選択的パッケージングをもたらすであろう。
【０１０５】
ＨＩＶ−感染された細胞が活性化されない場合、ｃｒＨＩＶ ＤＮＡはそれらが活性化されるまで（例えば、マイトジェン、抗原及び同様のものによる刺激を通して）、それらに存在し、子孫ビリオン中へのｃｒＨＩＶ ＲＮＡの選択的パッケージングを再びもたらすであろう。ｃｒＨＩＶ ＤＮＡによりトランスフェクトされる、活性化された及び活性化されていない、感染されていない細胞は、それらが野生型ＨＩＶにより重感染され、そして刺激により活性化されるまで、ビリオンを生成せず、子孫ビリオン中へのｃｒＨＩＶ ＲＮＡの選択的パッケージングを再びもたらすであろう。
【０１０６】
本発明のベクターにより形質導入された宿主細胞の１つの態様は、前記細胞が、その宿主細胞又はそれを含む宿主生物に対して有意に毒性でない最大数のベクターコピーを含む場合である。ベクターにより形質導入された宿主細胞のもう１つの態様は、前記細胞がベクターの少なくとも１つのコピーを含み、好ましくは、生物学的効果を生成するために必要とされる最少数のベクターコピーを含む場合である。細胞におけるコピー数は、例えばＴａｑＭａｎ ＰＣＲにより決定され得、そして所望する生物学的効果及び毒性の欠失の両者のために適切な、許容できるコピー数の範囲は、当業者により容易に決定され得る。許容できるコピー数は、形質導入される細胞型、ベクター（例えば、ウィルス起源）の性質及び所望する生物学的効果を包含する因子に依存して変化するが、しかし当業者による通常のスクリーニングにより容易に決定され得る。
【０１０７】
ｃｒＨＩＶゲノムを含む（トランスフェクション又は感染の結果として）細胞の重感染は、ｃｒＨＩＶゲノムが重感染を阻止するウィルスタンパク質（例えば、ｅｎｖ及びｎｅｔ）をコードしないので、存在する。得られるｃｒＨＩＶビリオンは、感染されていない細胞を感染することができる。なぜならば、ウィルス粒子は、それらがそれらのゲノムＲＮＡからＤＮＡプロウィルスを創造できるように、すべてのＨＩＶ粒子が担持する逆転写酵素分子を含むからである。この工程は、逆転写と呼ばれる。ｃｒＨＩＶビリオンが感染されていない細胞を感染するとすぐに、それらは逆転写を受け、そしてそれらのゲノムＲＮＡからプロウィルスを生成する。
【０１０８】
従って、それらの細胞は、ｃｒＨＩＶ ＤＮＡにより直接的に形質導入されるそれらの感染されていない細胞に相当する。それらは、それらの細胞が野生型ＨＩＶにより重感染され、そして活性化され、次に再び、子孫ビリオン中へのｃｒＨＩＶ ＲＮＡの選択的パッケージングが生じるまで、ｃｒＨＩＶ粒子を生成できない。ｃｒＨＩＶ粒子はまた、ＨＩＶによりすでに感染されているいくらかの細胞を感染することが可能である（例えば、Ｙｕｎｏｋｉなど．， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １１６， １４３−１５８ （１９９１）； Ｗｉｎｓｌｏｗなど．， Ｖｉｒｏｌ．， １９６， ８４９−８５４ （１９９３）； Ｃｈｅｎなど．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０， ４５８１−４５８９ （１９９２）； 及びＫｉｍなど．， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． ＆ Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．， ９， ８７５−８８２ （１９９３）を参照のこと）。
【０１０９】
しかしながら、それらのＨＩＶ−感染された細胞は、ＣＤ４発現をダウン−レギュレートするタンパク質を発現すべきでない。なぜならば、これは、それらの細胞の感染からｃｒＨＩＶビリオンを保護するであろうからである。活性化された、ＨＩＶ−感染された細胞は一般的に、ＣＤ４発現をダウンレギュレートする。従って、活性化されていない、ＨＩＶ−感染された細胞は、ｃｒＨＩＶ重感染に対して実質的に敏感であり、そして従って、ｃｒＨＩＶ粒子生成のためのもう１つの源であり得る。
【０１１０】
本発明の好ましいｃｒＨＩＶベクターに関しては、前記ベクターは、ＲＮＡ転写、ｔＲＮＡプライマー結合、二量体化及びパッケージングのために必要とされる配列を含んで成り、そして野生型ＨＩＶにより重感染を阻止するタンパク質（例えば、ｎｅｆ又はｎｅｖタンパク質）をコードする配列を欠いているか、又はそのような配列を含んで成るが、しかしそれらは、それらの発現が“サイレン”であると思われるので、機能的タンパク質に転写されても又は翻訳されてもいない。
【０１１１】
さらにより好ましくは、ベクターは、ｇａｇコード配列内からｎｅｆ遺伝子までの野生型ＨＩＶの領域をコードする領域又は配列を欠いている。しかしながら、最適には、ベクターは、欠失の領域又はいくらかの他の便利な領域にベクターをクローン化されるｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含んで成る。そのような好ましいＨＩＶベクターは、このベクターが、前で記載されたように、そのＲＮＡ明示で、又は他方ではＤＮＡとして投与される限り、“前記領域、又はその領域をコードする配列を欠いている”と言われる。
【０１１２】
本発明によれば、条件付きで複製するベクターと共にヘルパーベクターを利用するシステムにおいて好都合の相補性を達成するためには、ウィルスパッケージングのために必要であるが、しかし条件付で複製するベクターから発現されないいずれかのウィルス成分は、ヘルパーベクターにより供給されるべきである。従って、複数の異なったベクターが必要なウィルス成分の十分な補体を共に有する限り、個々のベクターの組成は多くの過突然変異を受ける。それらの過突然変異の個々は、本発明内に包含される。例として、好都合なパッケージング及び複製のために必要なｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は、ヘルパーベクター又は条件付きで複製するベクター上に両者とも組み込まれ、又は前記２種の遺伝子は、個々のベクターの１つ上に個々に存在することができる。
【０１１３】
さらに、単一のヘルパーベクター構成体は、プロモーターを包含する１組の転写調節要素の制御下で、又は別々のプロモーター要素の制御下で、異種ｅｎｖ配列を包含する、ｇａｇ／ｐａｌ及びｅｎｖ配列の両者を含むことができる。例えば、ＬＴＲは、本発明のベクターにより遺伝子生成物を発現するために使用され得る。誘発性プロモーターを包含する異なったプロモーターの使用は、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖ配列の示差的調節の可能性を可能にする。従って、ｅｎｖ配列、特に異種ｅｎｖ配列、例えばＶＳＶ−Ｇエンベロープ配列が、高いレベルで発現され得る。
【０１１４】
ベクター構成は、当業界者に良く知れている。それらの技法は、条件付で複製するベクター及びヘルパーベクターの両者を構成するために使用され得る。従って、本明細書において使用される場合、用語“ベクター”は、両ベクタータイプを言及することができる。さらに、用語、ベクターは、必ずしも条件付で複製するベクターである必要はないが、いずれかのレンチウィルスベクターを包含する。そのようなベクターはまた、遺伝的レンチウィルスベクターとして言及され得る。しかしながら、好ましい態様においては、ベクターは条件付きで複製するレンチウィルスベクターである。
【０１１５】
例えば、及び例１に記載されるように、ＲＮＡウィルス、例えばＨＩＶのＤＮＡ明示は、ｎｅｆ遺伝子に続いて、ｇａｇコード領域内からＵ３領域内までのＨＩＶコード配列を切断するために制限酵素を用いて分解される。複数の制限部位を含むポリリンカーから成るクローニングカセットが、ベクター中へのクローニングのための便利な制限部位を供給するために、連結の前、欠失の領域中に挿入される。ＲＲＥを含むＤＮＡフラグメントは、それらの部位の１つ中にサブクローン化される。得られるベクターは、切断されたｇａｇ転写を生成し、そして野生型Ｇａｇタンパク質又はいずれか他の野生型ＨＩＶタンパク質を生成しない。さらに、ベクターは、ｇａｇ翻訳開始配列がその翻訳を妨げるために突然変異誘発され得る限り、切断されたｇａｇタンパク質を発現することは必要ではない。
【０１１６】
同じアプローチを用いて、ｃｒＨＩＶ配列が、上記のようにして、キメラベクターを誘導するために、他の配列、例えばウィルス又は他のベクターのそれらの配列に連結され得る。例えば、ｃｒＨＩＶ配列は、シンドビスウィルス、ＡＡＶ、アデノウィルス又は両向性レトロウィルスのそれらに連結され得る。使用され得る追加のウィルス配列は、ｃｒＨＩＶ配列を供給するために使用され得るいずれかのウィルスを包含する、本明細書に記載されるヘルペス、ポックス及び他のウィルスのそれらを包含する。そのようなキメラベクターは、細胞侵入についての結合されたウィルスの機構（例えば、アデノウィルスについての受容体−介在性エンドサイトーシス）、又は他の手段、例えばリポソームを用いて、細胞中に導入され得る。
【０１１７】
好ましくは、本発明によれば、ベクター（すなわち、好ましくはｃｒＨＩＶベクターである、条件付きで複製するウィルス）は、少なくとも１つの核酸を含んで成り、その所有（すなわち、存在、転写又は翻訳）は、選択的利点を付与する。ベクターへの包含のために企画される次の２種のタイプのそのような核酸配列が存在する：（１）核酸配列、その所有は、最適には、野生型ウィルス株（すなわち、好ましくは、ベクターが由来し、そして前記配列を含まない野生型株）よりも、そのような配列を含んで成るベクターに、ウィルス複製及び拡張のための選択的利点を付与する、及び
【０１１８】
（２）核酸配列、その所有は、最適には、所望する予防、治療又は生物学的結果を達成するために、細胞存在性を促進し、ベクター粒子生成及び／又は増殖を促進し、アポプトシスを包含する、ｃｒＨＩＶベクター生成細胞からのｃｒＨＩＶベクタービリオンの生成を促進し、タンパク質生成を促進し、又は免疫学的機能又は標的化を促進することによって、野生型ウィルス株（すなわち、好ましくは、ベクター（及びまた、感染されていない宿主細胞においてベクター複製及び／又は機能を促進するヘルパー発現ベクター）が由来し、そして前記配列を含まない野生型株）により感染された細胞又は感染されていない細胞に比較して、前記配列を含んで成るベクターにより感染された細胞に、選択的利点を付与する。
【０１１９】
それらの配列の個々、又は多くのそれらの配列の個々、すなわち単独で、又はもう１つの因子と組合して、ベクターの増殖を促進し、そして／又は好ましい予防、治療及び／又は生物学的結果を可能にするために特定の宿主細胞機能を促進する配列は、他の配列の不在又は存在下でベクターに含まれ得、すなわち前記ベクターは、“少なくとも１つの核酸配列”及び“少なくとも１つの追加の核酸配列”を含んで成ることができる。
【０１２０】
第３タイプの核酸配列は、ウィルス感染を低め、最少にし、又は妨げる、宿主細胞に基づいて表現型を付与する配列である。そのような核酸配列は、発現される場合、ウィルス感染から宿主細胞を保護する遺伝子生成物をコードするそれらの配列である。例えば、ＣＣＲ５タンパク質のΔ３２対立遺伝子に対してホモ接合性の個人は、それらの細胞表面上で切断されたＣＣＲ５タンパク質を発現する細胞中へのＨＩＶ−１侵入のための主要補−受容体の欠失のために、ＨＩＶ−１感染に対して保護される。ヘテロ接合性個人に関する研究は、Δ３２対立遺伝子が野生型（ｗｔ）ＣＣＲ５細胞表面発現に対してトランスドミナント効果を有することを示している。これは、ｗｔタンパク質と二重体化し、そして細胞表面上でのその正しい発現を妨げるΔ３２対立遺伝子の能力のためであり得る。
【０１２１】
Δ３２対立遺伝子は、切断されたＣＣＲ５タンパク質をもたらすためにフレームシフト突然変異を引き起こす３２個のヌクレオチドの欠失を含む。この切断は、ｗｔタンパク質に存在せず、そして細胞表面上に存在する場合、所望しない免疫応答を生ぜしめることができる、Δ３２対立遺伝子のＣ−末端における３１個のアミノ酸を生ぜしめるので、本発明は、実験的に抗原性の３１個のアミノ酸を欠いている、切断されたＣＣＲ５Δ３２変異体タンパク質（ＣＣＲ５Δ３２Ｔ）の発現を包含する。このタンパク質は、ＨＩＶ感染に対する保護を細胞に提供するためにトランスドミナント効果を付与するその能力を保持する。ＣＣＲ５Δ３２Ｔをコードする配列は、ｗｔ ＣＣＲ５及びＣＣＲＲ５Δ３２の両者に共通する最後のアミノ酸の直後（位置１８４でのチロシンの後）に、停止コドンを導入することによって容易に生成される。
【０１２２】
さらなる態様においては、もう１つの第３タイプの核酸配列は、ウィルス感染を低め、最少にするか又は妨げる、付与された表現型をさらに増強する配列である。そのような核酸配列は、例えば細胞遺伝子に標的化される遺伝的抗ウィルス剤をコードすることができる。例えば、ベクターは、上記ＣＣＲ５Δ３２Ｔ変異体タンパク質を発現し、そしてさらに、野生型ＣＣＲ５分子に標的化される、Ｕ１プロモーターからの、及びＵ１ ｓｎＲＮＡ（アメリカ特許第５，８１４，５００号に記載される）内に含まれるアンチセンス又はリボザイム分子を発現する。野生型ＣＣＲ５を標的化するアンチセンス領域は、抗−ＣＣＲ５アンチセンス又はリボザイム分子の効果に対してトランスドミナント変異体ＲＮＡを耐性にするが、しかし機能的ＣＣＲ５Δ３２Ｔタンパク質を生成するために正しいアミノ酸配列に翻訳されるよう、ＣＣＲ５Δ３２Ｔ配列担持のベクターにより縮重される。
【０１２３】
遺伝子生成物に対して標的化されるリボザイム又はアンチセンスを同時発現し、そしてリボザイム又はアンチセンス結合又は分解を阻止するために、標的化された部位における遺伝子を縮重する上記方法は、ＣＣＲ５、又はさらに、ウィルス複製を最少にする分子に制限されない。治療用途のためのもう１つの非制限的例は、腫瘍遺伝子タンパク質、例えばＣｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａのための病原剤であるＢｃｒ−Ａｂ１融合タンパク質の標的化である。
【０１２４】
Ｂｃｒ又はＡｂ１遺伝子、又は両者を含むベクター構成体は、Ｂｃｒ−Ａｂ１転写にそっていずれかの部位に標的化されるアンチセンス又はリボザイムの発現を伴なって、それらの遺伝子を同時に発現することができた。従って、異常Ｂｃｒ−Ａｂ１融合転写体は破壊されるが、ところが生来のＢｃｒ又はＡｂ１、又は両者は、異常欠損を救済するために発現される。従って、Ｂｃｒ又はＡｂ１遺伝子は、野生型又は異常Ｂｃｒ−Ａｂ１融合遺伝子よりも、増幅に関して選択的利点を有する。好ましいベクターは、それらの生来のプロモーターからＢｃｒ及び／又はＡｂ１構造体を発現するが、ところが抗−Ｂｃｒ−Ａｂ１リボザイム又はアンチセンスはＵ１プロモーターから発現され、そしてＵ１ ｓｎＲＮＡ配列内に含まれるであろう。
【０１２５】
上記Ｂｃｒ−Ａｂ１の例は、腫瘍遺伝子を標的化することに本発明を制限せず、そしてこのアプローチが、いずれかの発現された異常遺伝子、所望しない遺伝子、又はさらに、興味有る所望の遺伝子の治療的又は予防的置換のために使用され得ることは、当業者に明らかであろう。標的遺伝子は、遺伝的抗ウィルス分子の効果に対して耐性である修飾された遺伝子に対して相同であるか又は異種であり得る。この方法により標的化され得る他の疾病状態は、当業者に明白である。例えば、本明細書に開示される本発明の実施により血液疾患を処理するための分子標的物は、”Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ” （Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ， Ｍａｊｅｒｕｓ， Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ ＆ Ｖａｒｎｕｓ， ３ｒｄ ｅｄ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔｅｄ １９８７， １９９４及び２００１；すべては、引用により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【０１２６】
本発明は臨床学的用途に制限されるべきではない。アプローチは、興味ある遺伝子配列の機能を決定するために使用され得る。例えば、興味あるドメインにおける修飾された興味ある遺伝子配列は、対応する修飾されていない領域を標的化することによって、いずれかの修飾されていない遺伝子配列の発現を阻害するか又は破壊するアンチセンス又はリボザイムと共に同時に発現され得る。従って、興味ある修飾された遺伝子配列は、修飾されていない遺伝子配列よりも、増幅された発現に関して、選択的利点を有し、当業者に知られているアッセイ方法による、修飾された遺伝子配列又はそのコードされた遺伝子生成物の機能の決定を可能にする。
【０１２７】
“核酸”とは、前に記載された通りである。特に、“核酸配列”とは、実質的にいずれかのサイズ（すなわち、もちろんベクターにより付与されるいずれかのパッケージング強制により制限される）のいずれかの遺伝子又はコード配列（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含んで成り、この所有は、本明細書においてさらに定義されるように、選択的利点を付与する。“遺伝子”とは、タンパク質又は新生ｍＲＮＡ分子をコードするいずれかの核酸配列である（前記配列が転写され、そして／又は翻訳されるかどうかにかかわらず）。遺伝子はコード配列及び非コード配列（例えば、調節配列）を含んで成るが、“コード配列”はいずれの非コードＤＮＡも包含しない。
【０１２８】
１．核酸配列、その所有は、野生型ウィルス株、又はベクター増幅を妨げるか又は影響を及ぼす競争ゲノム配列よりも、そのような配列を含んで成るベクターに、宿主細胞における選択的利点を付与する。
【０１２９】
野生型ウィルス株よりも、宿主細胞におけるベクターに選択的利点を付与する核酸配列は好ましくは、野生型ウィルスから増殖されるウィルス粒子に比較して、ベクターから増殖されるウィルス粒子の選択的生成又はパッケージングを可能にするいずれかの配列である。そのような配列は、野生型ゲノムに比較して、細胞内生成されるベクターゲノムの数の上昇をもたらす配列、及び抗ウィルス核酸配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。そのような配列はまた、同種野生型ウィルスに起因しない野生型ゲノムに比較して、細胞内生成されるベクターの数、性質又は状態の上昇をもたらす配列を包含するが、但しそれだけには限定されない。
【０１３０】
野生型ウィルス株に比較して、第１カテゴリーの核酸配列を含むベクターに、宿主細胞における選択的利点を付与する前記配列は、プロモーターのような配列である。“プロモーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を方向づけ、そしてそれにより、ＲＮＡ合成を促進し、そして１又は複数のエンハンサーを含んで成る配列である。“エンハンサー”とは、隣接する遺伝子の転写を刺激するか又は阻害するシス−作用性要素である。転写を阻害するエンハンサーには、“サイレンサー”と呼ばれる。サイレンサーはまた、ニワトリ赤芽インスレーター要素のＤＮアーゼ過敏性部位に見出されるように、“インスレーター”要素でもあり得る。エンハンサーは、エンハンサーがいずれかの配向において、及び転写された領域の下流の位置から、数キロ塩基対（ｋｂ）までの距離にわたって機能をすることにおいて、プロモーター（また、“プロモーター要素”とも呼ばれる）においてのみ見出される配列−特異的ＤＮＡ結合タンパク質のためのＤＮＡ−結合部位とは異なる。
【０１３１】
従って、及び好ましくは、条件付で複製するＨＩＶベクターのプロモーター（例えば、長い末端反復体（ＬＴＲ））は、前記ベクターが野生型ＨＩＶ株よりも一定のサイトカインに対してより応答性であるよう修飾される。例えば、インターロイキン−２の存在下で高められた転写活性を示す、修飾されたＨＩＶプロモーターが入手できる。ベクター中へのこのプロモーターの導入及び野生型のＨＩＶ−感染された細胞中へのベクターの導入は好ましくは、野生型ＨＩＶゲノムに比較して、ベクターゲノムからの子孫ビリオンの高められた生成及びパッケージングをもたらす。
【０１３２】
他のサイトカイン及び／又はケモカイン（例えば、インターフェロン−α、腫瘍壊死因子−α、ＲＡＮＴＥＳ及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない）は同様に、ベクターによりコードされるビリオンの選択的パッケージングを促進するために使用され得る。サイトカインに対してＨＩＶ−ＬＴＲを応答性にする要素の配置は、本発明の範囲をそのような態様に決して制限しない。いずれかのヌクレオチド配列が、このプロモーターの応答を修飾するためにＨＩＶ−ＬＴＲ中に挿入され得る。ＨＩＶ−ＬＴＲにおいて挿入され得るＤＮＡ部位に結合する一連の因子は、本明細書に引用により組み込まれる、２０００年９月８日にアクセスされたｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ｔＲＡＮＳＦＡＣ／ｌｉｓｔｓ／ｂｒｏｗｓｅ．ｈｔｍｌで見出され得る。人類のための一連のＤＮＡ結合因子は、同様に引例により本明細書に組み込まれる、２０００年９月８日にアクセスされたｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ ＴＲＡＮＳＦＡＣ／ｌｉｓｔｓ／ｆａｃｔｏｒ／ ｓｐｅｃｉｅｓ／ｈｕｍａｎｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ．ｈｔｍｌで見出される。
【０１３３】
同様に、サイレンサー又はインスレーターはまた、生来の又は修飾されたレトロウィルスＬＴＲ、例えばＨＩＶ−ＬＴＲのプロモーター又はエンハンサー中に、このプロモーターからの発現を強く調節するために挿入され得る。ある場合、ＨＩＶ−ＬＴＲ中への要素の挿入は、野生型ウィルスによる感染に関しての選択的欠点でベクターを配置することができる。しかしながら、このタイプのベクターの適用は、子孫ビリオン中へのパッケージングのために野生型ウィルスと競争することではないが、しかしむしろ、例えば競争を伴なわないで、ＨＩＶ複製を阻害する興味ある（又は“ペイロード遺伝子（ｐａｙｌｏａｄ ｇｅｎｅ）”）核酸配列を発現することがあり得る。この場合、第１の核酸配列は、ベクターに選択的利点を与えないが、しかしベクター生成の工程の間、ベクターとヘルパーとの間の組換えを非常に最少に阻害すべきである。
【０１３４】
野生型ウィルス株に比較して、第２カテゴリーの核酸配列を含むベクターに選択的利点を付与するその第２カテゴリーの核酸配列は、好ましい核酸配列として、抗ウィルス核酸配列を包含する。“抗ウィルス剤”は、それらの作用の態様、例えば逆転写酵素のインヒビター、細胞中へのウィルス侵入のための競争体、ワクチン、プロテアーゼインヒビター及び遺伝的抗ウィルス剤により分類される。“遺伝的抗ウィルス剤”は、細胞中にトランスファーされ、そしてそれらの細胞内標的物に、直接的に（すなわち、細胞内導入される場合）、又はＲＮＡ又はタンパク質のいずれかへのいずれかへのそれらの転換の後、影響を及ぼすＤＮＡ又はＲＮＡ分子である（Ｄｒｏｐｕｌｉｃなど．， （１９９４）、前記により総説される）。
【０１３５】
遺伝的抗ウィルス配列はまた、好ましい核酸配列である。遺伝的抗ウィルス剤は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アンチセンス分子、ＲＮＡデコイ、トランスドミナント変異体、トキシン、ＲＮＡ及びタンパク質スプライシングのモディファイアー及びモジュレーター、ＥＧＳ（単独で、又はＭ１、Ｕ１、ＰＲＥ又はＣＴＥ要素との直接的な結合による）、免疫原、ＲＮＡ１（Ｚａｍｏｒｅなど．， Ｃｅｌｌ １０１： ２５−３３， ２０００を参照のこと）、スプライシングを修飾するが、又は調節するヌクレオチド配列又は分子、構成輸送要素（ＣＴＥ）、核輸入及び輸出因子、ＤＮＡ組み込み因子、ＲＮＡ安定化又は不安定化要素、後−転写調節要素（ＰＲＥ）、ウィルス複製を妨げるタンパク質、インターフェロン、トキシン、免疫原（免疫学的に関連するいずれかの遺伝子により定義される）、抗体（完全な抗体、一本鎖抗体又はリガンド表示分子）、リボザイム、又はベクター又は野生型ウィルス複製のいずれかの点に影響を及ぼすいずれかの要素。
【０１３６】
所望には、遺伝的抗ウィルス剤は、アンチセンス分子、トランスドミナント変異体、免疫原及びリボザイムである。従って、野生型ウィルス株によりベクターに選択的利点を付与する好ましい核酸配列は、アンチセンス分子、免疫原及びリボザイムから成る群から選択された遺伝的抗ウィルス剤の配列である。
【０１３７】
本発明に使用されるような遺伝子的抗ウィルス剤は、特に、それらが条件付で複製するウィルスベクターに配置されない場合、ウィルス配列を標的化することのみに制限される。非制限例として、遺伝的抗ウィルス配列は、前記剤がウィルス又は非ウィルス標的物、例えば細胞、細菌又は寄生標的物に向けられるように、レンチウィルスベクターに配置され得る。この場合、レンチウィルスベクターは、修飾されていないか又は修飾されたＨＩＶ−ＬＴＲに（発現されたスプライシングされていないか又はスプライシングされたＲＮＡに）、操作可能的に連結される興味ある剤を含み、そしてさらに、ＨＩＶ−ＬＴＲに操作可能的に連結されないプロモーター配列に連結される遺伝的抗ウィルス剤又は配列を含む。好ましい配列は、ｓｎＲＮＡ、好ましくはＵ１， Ｕ２， Ｕ３， Ｕ４， Ｕ５又はＵ６ ｓｎＲＮＡとキメラ化するアンチセンス又はリボザイムである。
【０１３８】
また、遺伝的抗ウィルス剤は、ベクター又はヘルパー配列のいずれかに存在する単一又は単一タイプの配列に制限されない。複数の剤は、ベクター又はヘルパー構成体に同時に存在し、離れて位置し、又は好ましくはタンデムで連結され得る。好ましくは、複数の異なった遺伝的抗ウィルス剤は、タンデムで連結される。本発明への使用のための追加の遺伝的抗ウィルス剤は、２種の異なったタイプの遺伝的抗ウィルス剤を連結するいずれかの剤である。
【０１３９】
“アンチセンス分子”とは、塩基対合規則、及び“不安定（ｗｏｂｂｌｅ）”塩基対、すなわちその発現が阻止される遺伝子の短いセグメントの利用性に基づいて、映す分子である。ＨＩＶに対して向けられたアンチセンス分子は、野生型ＨＩＶ ＲＮＡにハイブリダイズし、細胞ヌクレアーゼによるその選択的縮重を可能にする。アンチセンス分子は好ましくは、約２０〜約２００個の塩基対の長さ、好ましくは約２０〜約５０個の塩基対の長さ、及び最適には、２５個以下の塩基対の長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドである。アンチセンス分子は、ゲノム野生型ＲＮＡに選択的に結合し、それにより結合し、子孫ビリオン中へのパッケージングのための選択的利点をｃｒＨＩＶ ＲＮＡに提供するｃｒＨＩＶ ＲＮＡから発現され得る。
【０１４０】
ＲＮＡとしてベクターにおいて発現されるアンチセンス分子は好ましくは、少なくとも２０個の塩基対〜いずれかのサイズであるが、しかし好ましくは２０００個までの塩基対の長さ、より好ましくは約５０〜５００個の塩基対の長さである。そのようなアンチセンス分子は好ましくは、ゲノム野生型ＲＮＡに結合し、そしてベクターＲＮＡには結合せず、野生型ウィルスよりも選択的利点を有するベクターを供給する。ＨＩＶ由来のベクターは例えば、エンベロープ領域（ｅｎｖ）、Ｔａｔ又はＲｅｖタンパク質を供給する。ＨＩＶ由来のベクターは例えば、エンベロープ領域（ｅｎｖ）、Ｔａｔ又はＲｅｖタンパク質領域、補助遺伝子領域（Ｖｉｖ， Ｎｅｆ， Ｖｐｒ， Ｖｐｕ）、ｐＮＬ４−３上のＮｓｉ Ｉ制限酵素部位に対して３’側に存在するＧａｇの領域、及び下記に示されるように、ｐｏｌにおける５４５塩基領域を含まないｐｏｌの領域からである。
【０１４１】
“免疫原”とは、いずれかの免疫学的に関連する遺伝子及びそのコードされる遺伝子生成物を言及する。従来、用語“免疫原”は、ワクチンのために使用されるアジュバントに関して使用されたが、用語“免疫−”及び“−原”が、免疫学的に関連する遺伝子及びそのコードされる遺伝子生成物を言及するために使用される。例えば、免疫原は、ウィルス構造タンパク質に方向付けされる一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）をコードすることができるか、又はそれは、細胞により細胞外分泌される抗体をコードすることができる。免疫原は、核酸としてトランスファーされ、そして細胞内発現される。同様に、免疫原はまた、ベクター及び／又は宿主細胞選択を促進する、いずれかの抗原、表面タンパク質（分類制限されるそれらを包含する）、又は表示―様抗体をコードすることができる。
【０１４２】
好ましいベクターにおいては、核酸配列は、野生型ＨＩＶ Ｒｅｖタンパク質に結合するｓｃＡｂコード配列を含んで成る。これは好ましくは、小胞体におけるその抑制をもたらすことによって、Ｒｅｖタンパク質の突然変異を妨げる。特に、Ｒｅｖタンパク質は、単独で又は他の細胞因子と組合して、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答性要素と呼ばれる、Ｒｅｖのための高く構造体化されたシス−作用性ＲＮＡ標的配列）に結合し、そして次に、ＨＩＶ ＲＮＡを取り囲むことによりオリゴマー化することによって、核からのスプライスされていない及び単独でスプライスされたＨＩＶ ＲＮＡを、細胞質に輸送する。Ｒｅｖと複合体化されるＨＩＶ ＲＮＡは、細胞質中に輸送され、そして細胞のスプライシング機構を回避する。従って、野生型Ｒｅｖが野生型ＲＲＥに結合しない場合、野生型ＨＩＶ ＲＮＡは、細胞質中に輸送され、そして子孫ビリオン中に封入されない。
【０１４３】
最適には、ｓｃＡｂ核酸配列を含むベクターはさらに、修飾されたＲＲＥ配列を含んで成り、そして修飾されているが、しかし野生型ではないＲＲＥを認識する、突然変異誘発されたＲｅｖタンパク質をコードする。従って、野生型ＨＩＶ、及びｓｃＡｂ核酸配列を含んで成るベクターを含む細胞においては、前記ベクターは好ましくは、ビリオン中にパッケージングされる。野生型ＨＩＶマトリックス又はヌクレオカプシドのタンパク質（すなわち、又はウィルスＲＮＡの封入した影響を及ぼすタンパク質／ＲＮＡ相互作用に包含されるいずれかのタンパク質）がｓｃＡｂの標的物である類似する方法が好ましくは使用される。
【０１４４】
“リボザイム”とは、触媒活性を有するアンチセンス分子であり、すなわちＲＮＡを結合し、そして翻訳を阻害するかわりに、リボザイムはＲＮＡを結合し、そして結合されたＲＮＡ分子の部位―特異的分解をもたらす。一般的に、次の４種のリボザイムグループが存在する：テトラヒメラグループＩ介在配列、ＥＳＧ（外部ガイド配列）及びハンマーヘッド及びヘアーピンリボザイム。しかしながら、追加の触媒モチーフがまた、他のＲＮＡ分子、例えば肝炎デルタウィルス及び菌類ミトコンドリアにおけるリボソームＲＮＡに存在する。
【０１４５】
好ましいリボザイムは、触媒ドメインが３’−ヌクレオチドＮＵＨ配列（ここで、Ｎはいずれかのヌクレオチド（すなわち、Ｇ， Ａ， Ｕ及びＣ）であり、そしてＨはＡ、Ｃ又はＵのいずれかである）を分解するリボザイムである。しかしながら、そのようなリボザイムにより最も効果的に分解される配列がＧＵＣ部位である限り、好ましくはＮＵＨ配列はＧＵＣ部位を含んで成る。
【０１４６】
所望には、そのようなリボザイムは野生型ウィルス株又はその転写体の領域において分解するが、しかしベクター又はその転写体の領域においては分解しない。リボザイムは、そのようなウィルス又はベクターが、前に記載されたように、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る態様で、ウィルス又はその転写体を分解する。“領域における”分解とは、標的化された領域、すなわち好ましくは、ウィルス増殖のために必要であるウィルスの領域における分解を意味する。所望には、ベクターは、標的化されるこの特定の領域（すなわち、少しでもベクターに存在する場合）がリボザイムにより分解されるよう修飾された。任意には、リボザイムは、分解がウィルス、例えばｃｒＨＩＶ粒子の増殖のために必要とされる領域に存在しない限り、ベクターを分解することができる。
【０１４７】
最適には、リボザイムは、配列番号３（すなわち、ＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＡ）及び配列番号４（すなわち、ＡＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＣ）からなる群から選択された配列によりコードされる。配列番号３は、野生型ＨＩＶ Ｕ５領域の＋１１５部位（すなわち、転写の開始から下流の塩基の数による）に標的化されるリボザイムを含んで成るが、配列番号４は、野生型ＨＩＶ Ｕ５領域の＋１３３部位に標的化されるリボザイムを含んで成る。
【０１４８】
そのようなリボザイムは、ベクターＵ５配列が、当業界において知られており、そして例１に記載されるように、インビトロでの特定部位の突然変異誘発により修飾される限り、野生型ＨＩＶゲノム（又はその転写体）内で分解することができるが、しかしベクターゲノム（又はその転写体）内では分解することができない。特に、ベクター配列は好ましくは、ベクターが配列番号２（すなわち、ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＣ）、配列番号５（すなわち、ＧＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣ）、配列番号６（すなわち、ＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣ）、配列番号１４（ここで少なくとも１つのＮは突然変異誘発されている）、配列番号１５及び配列番号１６から成る群から選択された配列を含んで成るより修飾される。
【０１４９】
ＲＮＡの形においては、ベクターは好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号１４（ここで少なくとも１つのＮは突然変異誘発されている）、配列番号１５及び配列番号１６から成る群から選択された配列によりコードされる配列を含んで成る。対照的に、野生型ＨＩＶは、配列番号１（すなわち、ＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣ）の配列によりコードされるＵ５配列を含んで成る。全体の修飾及び野生型Ｕ５配列（ＤＮＡの形での）に対する比較は、図２に示されている。
【０１５０】
さらに、ウィルス及び特にＨＩＶゲノムの他の領域に標的化される他のリボザイムは、単独で又は組合して使用され得る。例えば、リボザイムは、ウィルス複製のために必要とされる他のＲＮＡ配列内で、例えば逆転写酵素、プロテアーゼ、又はトランス活性化因子タンパク質で、Ｒｅｖ内で、又は記載されるような他の必要な配列内で分解され得る。好ましくは、ベクターは、例えば複数の部位に対して標的化される複数のリボザイムを含んで成る。そのような場合、ベクターにおける類似する配列は、そのようなリボザイム分解に対して耐性であるベクターを誘導するために、特定部位の突然変異誘発、又は当業界において知られているいくつかの他の手段により修飾される。
【０１５１】
ベクターはヒト免疫欠損ウィルスである場合、好ましくはベクターは、ｔａｔ遺伝子及びその５’スプライス部位を欠いており、そしてその位置に、三成分抗−Ｔａｔリボザイムカセットを含んで成り、ここで前記三成分リボザイムカセットの個々のリボザイム中の触媒ドメインが、野生型ヒト免疫欠損ウィルス核酸分子上の異なった部位、特にｔａｔ内の異なった部位を分解する。好ましくは、個々のリボザイムの触媒ドメインは、ベクターにおいてそれ自体、リボザイム感受性相対物が存在しない野生型ヒト免疫欠損ウィルスの核酸分子の領域におけるヌクレオチド配列を分解する。
【０１５２】
遺伝的抗ウィルス剤としてのリボザイムのさらなる態様は、ワトソン−クリック塩基対合によってのみならず、またＧ−Ｕゆらぎ塩基対合によっても配列を標的化するリボザイムによって入手できる。これまでの研究は、二本鎖ＲＮＡにおけるＧ−Ｕゆらぎがワトソン−クソック塩基対合と類似する特徴を有することを示している。高い突然変異割合が与えられる場合、高く保存された領域においてさえ、すなわち異なったＨＩＶ株を生ぜしめるＨＩＶにおいて、複数の株を標的化するリボザイムを企画する能力は本発明に劇的な利点を提供する。
【０１５３】
例えば、本発明のリボザイムのための標的配列として使用され得る、Ｔａｔ遺伝子における高く保存された標的領域は、４０の十分に定義されたＨＩＶ−１株において“Ｇ”又は“Ａ”のいずれかを有する。従って、この領域を標的化するリボザイムは、“Ｇ”又は“Ａ”残基のいずれかとの対合を可能にするために適切な標的化配列において“Ｃ”の代わりに“Ｕ”を含むよう企画され得る。これは、その対応する位置に“Ａ”を有するＨＩＶ−１株を標的化するリボザイムの能力を低める標的化配列への“Ｃ”の使用と比較され得る。リボザイム認識のための標的位置でＧ， Ａ変異が存在する“Ｕ”を用いてのこのアプローチは、本発明のリボザイムの利用性を有意に高める。
【０１５４】
開示される発明の実施のためのさらなる態様は、ベクターにおける直接的に反復された配列ではないよう、縮重されたリボザイムカセット（タンデム連結される１個よりも多くのリボザイムを含む）を使用することである。縮重された配列の存在は、レトロウィルスベクター及び他の核酸において観察されるように、反復された配列の欠失を妨げる。従って、タンデムに配置された直接的反復体配列から構成されるリボザイムカセットは、複数の複製周期の間、欠失され得る。縮重されたリボザイム配列がこの問題を克服するために使用され得る。
【０１５５】
なぜならば、ハンマーヘッドリボザイムオ触媒ドメインにおける配列が、活性の有意な損失を伴なわないで、ゆらぎ塩基対合に基づいて、他のヌクレオチドにより置換され得るからである。ハンマーヘッドリボザイムの突然変異誘発はこれまで行われており、そして縮重され得る部位は決定されている（Ｒｕｆｆｎｅｒ ＤＥ， Ｓｔｏｒｍｏ ＧＤ， Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ ＯＣ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ＲＮＡ ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖａｇｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９０ Ｎｏｖ． ２７； ２９ （４７）： １０６９５−７０２）。欠失の傾向を低めるもう１つの手段は、標的ＲＮＡの異なった部位を標的化するために、カッセイト中の個々のリボザイムを方向付けることによってである。従って、カセットは、直接的な反復配列の存在を含まないであろう。
【０１５６】
“トランスドミナント”又は“ドミナント陰性”核酸配列は、野生型（ｗｔ）配列の存在下でさえ、そのコードされる表現型を付与する。切断されたＣＣＲ５タンパク質（上記）の論議は１つの例である。他の例は、トランスドミナント表現型を付与するいずれかの変異レトロウィルス又はレンチウィルス配列を包含する。例は、ｒｅｖ及びｇａｇ遺伝子を包含する。
【０１５７】
選択的利点、及び感染性野生型ウィルスの阻害を提供することへの使用のための１つの例は、たぶん、カプシドアセンブリーを妨げることによって、ＨＩＶ−１複製を阻害するために示されたトランスドミナントｇａｇ配列に関する。従って、そのような配列は好ましくは、トランスドミナント配列からの阻害を伴なわないで、その複製及びパッケージングを可能にするために、非ＨＩＶ−１に基づくレトロウィルスベクターと組合して使用される。
【０１５８】
例えば、ＨＩＶ−２ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含むレトロウィルスベクターは、トランスドミナントＨＩＶ−１ｇａｇ配列を含むことができる。そのようなベクターは、適切なＨＩＶ−２ヘルパーベクター構成体との相補性を通して、複製され、そしてパッケージングされ得る。しかし、ＨＩＶ−１感染を受けやすい細胞における増殖の後、トランスドミナントｇａｇ配列は、ＨＩＶ−１ウィルスの移動を阻止するために、ＨＩＶ−１感染に基づく発現のために利用できる。しかしながら、ＨＩＶ−２ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子をコードするレトロウィルスベクターは、ベクターを封入し、そして移動するためにまだ利用できる。
【０１５９】
２．核酸配列、この所有は、野生型ウィルス株により感染された細胞に比較して、前記配列を含んでなるベクターにより感染されているか、又は感染されていない細胞に選択的利点を付与する。
【０１６０】
野生型ウィルス株（すなわち、前記配列を欠いている）を含むか、又は含まない細胞よりも、前記配列を含んでなるベクターを含む細胞に選択的利点を付与する核酸配列は好ましくは、野生型ウィルスを含む細胞、又は前記核酸配列を有さない細胞に比較して、ウィルス粒子（すなわち、ｃｒＨＩＶウィルス粒子）の、前記ベクターを含む細胞による生存及び増殖を可能にするいずれかの配列である。そのような配列は、細胞又はその細胞に含まれるベクターによる破壊の回避を可能にするいずれかの配列、細胞生存性を促進する配列、アポプトシスを誘発する配列、タンパク質生成を促進する配列、又は免疫機能又は標的化を促進する配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６１】
例えば、好ましくは、ベクター上に含まれるそのような核酸配列は、複数薬物耐性のための遺伝子をコードする（例えば、Ｕｅｄａなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４１， ９５６−９６２ （１９８６）； Ｕｅｄａなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２， ５０５−５０８ （１９８７）； 及びＵｅｄａなど．， ＰＮＡＳ， ８４， ３００４−３００８ （１９８７） を参照のこと）。付加される細胞毒性薬物（例えば、癌化学療法のために使用されるような）の存在下で、これは、前記ベクターを含む細胞の存在を可能にするが、ところが野生型ウィルス、例えばＨＩＶを含む細胞はそうではない。そのような細胞毒性薬物は、アクチノマイシンＤ、硫酸ビンブラシチン、硫酸ビンクリスチン、ＢＣＮＵ（ＢＧ条件付きを伴なって又はそれを伴わないで）、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ＶＰ−１６及びＡＭＳＡを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６２】
そのような核酸配列のもう１つの例は、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）のいずれかの配列変異体である。ＭＧＭＴは、アルキル化剤の毒性から造血前駆体を保護するために使用され得る。野生型ＭＧＭＴは、アルキル化剤毒性を強化するＯ６−ベンジルグアニン（ＢＧ）により阻害される。ＢＧ介在性不活性化に対して耐性であり、そしてアルキル化剤に対して保護できるＭＧＭＴ変異体は、本発明によりいずれかの細胞型に付与され得る。そのような変異体の例は、Ｇ１５６Ａ ＭＧＭＴである。
【０１６３】
例えば、本発明を通してそのような変異体により形質導入された造血前駆体細胞は、ＢＧ及びＯ６−グアニンメチル化剤又はクロロエチル化剤の投与に基づいて選択され得る。本発明への使用のためのそのようなメチル化剤の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：臨床学的に適切なテモゾロミド、ニトロソウレア、テトラジン、トリアジン、ダカバジン、テモゾロミド、ストレプトゾトシン、プロカルバジン。クロロエチル化剤の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＢＣＮＵ（１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア）、ＣＣＮＵ（３−シクロヘキシル−１−クロロエチル−ニトロソウレア）、ＡＣＮＵ（１−（４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジニル）メチル−３−（２−クロロ）−３−ニトロソウレア）、及びＭｅＣＣＮＵ（１−（２−クロロエチル）−３−（４−メチルクロロヘキシル）−１−ニトロソウレア。好ましくは、アルキル化剤はＢＣＮＵである。
【０１６４】
ＢＣＮＵは、静止及び細胞周期細胞の両者において永久的共有鎖間ＤＮＡ架橋損傷を形成することが示されている。それらの損傷は、ＤＮＡ複製の間、細胞に対して細胞毒性である。ＭＧＭＴは、ＢＣＮＵ損傷のＤＮＡ修復の主要機構である。静止細胞に対するその毒性が与えられる場合、本発明のレンチウィルスベクターにより供給されるＭＧＭＴ変異体による選択はまた、細胞周期のＧ０において優先的であるが、しかしより幹細胞及び血液前駆体細胞の生成のために断続的に循環する全能性幹細胞（ＨＳＣ）のための選択を可能にすることができる。幹細胞は一般的に、レトロウィルス形質導入に対して耐性であるが、しかしそれらがＧ０周期状態において単独で存在しない場合、レトロウィルスベクターにより形質導入され得る。
【０１６５】
腫瘍レトロウィルスのように、本発明のレンチウィルスベクターは、造血幹細胞、例えばアッセイできる造血ＥＬＴＣ−ＩＣ及びＮＯＤ−ＳＣＩＤ又はＳＣＩＤ−ｈｕ再集団細胞を形質導入するため使用され得る。しかしながら、腫瘍レトロウィルスとは異なって、幹細胞をそれらの分化を伴なわないで形質導入するために必要とされるサイトカイン条件は、レンチウィルス（例えば、ＨＩＶ）が感染の時点で活動的に分裂しない細胞を感染することができるので、たぶんレンチウィルスベクターを好む。ＨＳＣ選択は、細胞周期造血前駆体について選択する他の手段を可能にしない。従って、ＭＧＭＴ変異体及び本発明のレンチウィルスベクターにより介在される選択は、選択のための延長された薬物投与の必要性を伴なわないで、形質導入された全能性ＨＳＣの存在を高めることができる。
【０１６６】
上記論議は、インビトロ及びエクスビボ、並びにインビボでの造血細胞において考察される。従ってＭＧＭＴ変異体によるインビボでの細胞の形質導入の他に、対象の造血細胞は、エクスビボで形質導入され、続いてエクスビボ又はインビボでの薬物処理を伴なう。次に、そのようなエクスビボ処理された細胞は、任意には、形質導入された細胞による骨髄の再集団化の一部として、対象中に注入され得る。
【０１６７】
上記実施の前、アルキル化剤ＢＣＮＵがまた、ＨＩＶ陽性対象において、ＨＩＶ感染されたＣＤ４＋細胞を一般的に減じるために使用され得る。上記で言及されたように、ＢＣＮＵ（内因性ＭＧＭＴの消耗の後）は、静止及び増殖細胞の両者において細胞毒性損傷を形成する。そのような損傷は、薬剤が機能的ＡＧＴタンパク質のレベルを低める場合、ＭＧＭＴの強制された消耗を伴なわないでさえ形成する。ＢＣＮＵによる反復性組織的処理は、累積する骨髄抑制及び汎血球減少を引き起こす。従って、レトロウィルス感染された対象、例えばＨＩＶ感染された患者においては、所望には、骨髄抑制を回避するために低用量でのＢＣＮＵ投与は、全体的にＣＤ４＋細胞集団を低め、そして従って、ウィルス負荷を減じる。このアプローチに続いて、上記で論じられたように、造血前駆体の注入を伴なうことができる。
【０１６８】
ＢＣＮＵは、休止細胞においてさえ、細胞毒性損傷を形成することによって、“秘密（ｓｔｅａｌｔｈ）”態様で作用することができるので、このアプローチは、反復された処理のための必要性を低める追加の利点を有する。もちろん、このアプローチは、ＢＣＮＵの効果を増強するためにＢＧの使用と組合され得る。他方では、このアプローチは、形質導入されたＣＤ４＋細胞のための保護を提供するために本発明のベクターによるＭＧＭＴ変異体の導入と組合して使用され得る。
【０１６９】
この後者の手段は、上記で論じられたように、造血細胞の処理に無関係であるか、又はその処理と共に存在することができる。従って、本発明の好ましい態様は、抗−ＨＩＶアンチセンス又はリボザイム（第１の核酸配列）を含むベクターにより変異ＭＧＭＴ（第２の核酸）を発現することであり、その結果、それぞれ野生型ＨＩＶ感染された細胞よりも選択的利点を、及び野生型ＨＩＶウィルスよりも選択的利点を提供する。さらなる好ましい態様は、ベクターがスプライスされたｍＲＮＡとして、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターからＭＧＭＴ遺伝子（又は第２の核酸配列）を発現することがある。
【０１７０】
最終的に、ベクターは抗−ＨＩＶリボザイム又はアンチセンス配列を発現するが、本発明は、当業者は特定の治療、予防又は生物学的効果のためにベクター中にいずれかの阻害ヌクレオチド配列を容易に挿入することができるので、制限されない。阻害配列を発現する好ましい方法は、Ｄｉｅｔｚ（アメリカ特許第５，８１４，５００号）により記載されるように、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ／プロモーターカセットにそれを含むことである。
【０１７１】
他方では、そのような核酸配列は所望には、突然変異誘発された（すなわち、変異）プロテアーゼの配列（又はそれをコードする配列）、及び突然変異誘発された（すなわち、変異）逆転写酵素の配列（又はそれをコードする配列）からなる群から選択された配列を含んでなる。好ましくは、突然変異誘発された逆転写酵素は、ヌクレオシド及び非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターに対して耐性であるよう構築され、そして突然変異誘発されたプロテアーゼは、通常使用されるプロテアーゼインヒビターに対して耐性であるよう構築される。
【０１７２】
前記ベクターと共に、宿主へのそれらのプロテアーゼ又は逆転写酵素インヒビターの投与が、野生型ウィルスを生成する細胞とは対照的に、前記ベクターを生成する細胞について選択するために使用される。同様に、このアプローチは、ウィルスが阻害を回避するために突然変異誘発され得るよう、ウィルス複製を阻害するいずれかの薬剤による使用のために修飾される。従って、ＨＩＶの処理に関しては、ベクター中に組み込まれる選択的核酸配列は、好ましくは、突然変異誘発されたＨＩＶ配列を含んでなる。しかしながら、最適には、それらの配列は、野生型ＨＩＶによる重感染を妨げない。
【０１７３】
好ましくは、ベクターは、上記に示されるそれらの１つ、及び特に、図１Ａ−１Ｋに示される改良された条件付で複製するベクターである。もちろん、本発明の方法に使用される場合、ＧＦＰコード配列は、欠失され得るか、又は他の配列により置換され得る。ＧＦＰコード配列は、ベクター又はベクターからの遺伝子発現の存在のマーカー又はインジケーターとして、それらの典型的なベクター態様において存在する。
【０１７４】
本発明の好ましいベクターは、本明細書の開示に記載される種々の要素を含むことができる。特に、レンチウィルスベクターは、ｔａｔ遺伝子を欠くことができ、そして少なくとも１つのアンチセンス配列を含むことができる。さらに、ベクターは、１つの配列、例えばＨＩＶの中央ポリピリミジン系、又はそれを含む大きな核酸フラグメントを含むことができる。
【０１７５】
最適には、ベクターは、それが導入される細胞と適合でき、例えばベクターコードの核酸配列の細胞上での発現を付与することができる。所望には、ベクターは、細胞において機能的な複製の起点を含んでなる。核酸配列がそのＤＮＡコード配列の形で（例えば、それ自体のプロモーターを含んでなる完全な遺伝子の形でに対して）トランスファーされる場合、最適には、ベクターはまた、コード配列の発現を誘導することができ、そしてコード配列に操作可能的に連結されるプロモーターを含む。コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を方向づけることができる場合、プロモーターに“操作可能的に連結される”（例えば、コード配列及びプロモーターの両者が、生来の又は組換え遺伝子を一緒に構成する）。
【０１７６】
本発明の組換えベクターによれば、好ましくはすべての適切な転写（例えば、開始及び停止シグナル）、翻訳（例えば、リボソーム侵入又は結合部位及び同様のもの）、プロセッシングシグナル（例えば、必要なら、スプライスドナー又は受容体部位、及びポリアデニル化シグナル）、トランスロケーション、アセンブリー、組み込み部位、リボ核酸複合体侵入、安定性及びトランスロケーション要素（シス又はトランスでの）は、いずれかの遺伝子又はコード配列が、ベクターが導入される細胞において適切に転写されるよう（そして／又は所望には、翻訳される）、ベクター上に正しく配置される。宿主において適切な発現を確保するためのそのようなシグナル操作は、当業者の知識及び専門知識の十分に範囲内である。
【０１７７】
好ましくは、ベクターは、宿主細胞ゲノムにおけるベクターの組み込まれたコピーとして定義される、安定して形質導入の効果を高めるＰｏｌ配列を含む。中央ＤＮＡフラップ（ｐＮＬ４−３上の位置４７５７〜４７３５に対応する、ｐＬＡＩ３上の位置４７９３〜４９７１からの１７８個の塩基対フラグメント）としてＺｅｎｎｏｕなど．， （Ｃｅｌｌ １０１： １７３−１８５ （２０００）） によりこれまで同定された配列は、形質導入効率を高めることが報告されているが、安定した形質導入の効率を有意に高めるには不十分であることが見出された。本発明は、この小さなフラグメントが安定した形質導入の効率を高めるために十分でないが、アメリカ特許第５，８８５，８０６号に記載されるように、大きな５４５個の塩基対降るグメント（ｐＮＬ４−３における位置４５５１〜５０９６）又はそれを含むまだ大きなフラグメントが、本発明の一部として、安定した形質導入を高めることができた発見を包含する。安定した形質導入効率の上昇は、ベクターゲノムの組み込まれたコピーのＧＦＰ発現及びＦＡＣＳ分析、及びＴａｑｍａｎ分析により検出された。
【０１７８】
形質導入効率を高めるさらなる手段は、引用により本明細書に組み込まれる、アトニー事件整理番号３９７２７２０００４００号として、２０００年８月３１日に出願された同時継続出願アメリカ特許出願（まだ、付与されている）に記載される。
【０１７９】
本発明に使用されるウィルスベクターはまた、“偽性型”形成に起因することができ、ここで異なったウィルスによる細胞の同時感染がもう１つのウィルスの１又は複数のエンベロープタンパク質を含む外層内に封入される１つのウィルスのゲノムを含む子孫ビリオンを生成する。この現象は、興味あるウィルスベクター、及びもう１つのウィルスの少なくとも１つのエンベロープタンパク質又は細胞表面分子をコードする遺伝子材料の両者によりパッケージングの細胞を同時トランスフェクト又は同時感染することにより、“偽性型”ビリオンにおける興味あるウィルスベクターをパッケージングするために使用されて来た。アメリカ特許第５，５１２，４２１号を参照のこと。
【０１８０】
そのような混合されたウィルスは、使用される１又は複数の異種エンベロープタンパク質に対する抗血清により中和され得る。偽性型形成に通常使用される１つのウィルスは、ラブドウィルスである水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）である。偽性型分類の使用は、使用される本発明の異種ウィルスのウィルス侵入機構の要素を包含することによってウィルスの宿主細胞範囲を広範にする。本発明の使用のためのウィルスベクター及びＶＳＶの偽性型分類は、ＶＳＶ Ｇタンパク質を含む膜により取り囲まれるヌクレオカプシドに封入されるウィルスベクター核酸を含むウィルス粒子をもたらす。
【０１８１】
前記ヌクレオチドカプシドは好ましくは、ウィルスベクターに通常、関連するタンパク質を含む。前記周囲のＶＳＶ Ｇタンパク質含有膜は、ウィルスベクターをパッケージングするために使用される細胞からのその出現に基づいて、ウィルス粒子の一部を形成する。パッケージング細胞の例は、アメリカ特許第５，７３９，０１８号に記載される。本発明の好ましい態様においては、ウィルス粒子は、ＨＩＶに起因し、そしてＶＳＶ Ｇタンパク質により偽性型分類される。ＶＳＶ Ｇタンパク質を含む偽性型ウィルス粒子は、両向性ウィルスベクターよりも高い効率を有する種々の細胞型を感染することができる。宿主細胞の範囲は、哺乳類及び非哺乳類種、例えばヒト、囓歯動物、魚類、両生類及び昆虫を包含する。
【０１８２】
好ましくは、ベクターはまた、前記ベクター又はその含まれるサブクローン化された配列が同定され、そして選択されるいくつかの手段を含んでなる。ベクター同定及び／又は選択は、当業者に知られている種々のアプローチを用いて達成される。例えば、特定遺伝子又はコード配列を含むベクターは、ハイブリダイゼーション、ベクター上に存在するマーカー遺伝子によりコードされる、いわゆる“マーカー”遺伝子機能の存在又は不在、及び／又は特定配列の発現により同定される。
【０１８３】
第１のアプローチにおいては、ベクターにおける特定配列の存在は、適切な配列に対して相同である配列を含んで成るプローブを用いてのハイブリダイゼーション（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによる）により検出される。第２のアプローチにおいては、組換えベクター／宿主システムは、ベクター上に存在するそれらの機能をコードする特定の遺伝子により引き起こされる、一定のマーカー遺伝子機能、例えば抗生物質に対する耐性、チミジンキナーゼ活性、及び同様のものの存在又は不在に基づいて同定され、そして選択される。第３のアプローチにおいては、ベクターは、そのベクターによりコードされる特定の遺伝子生成物についてアッセイすることによって同定される。そのようなアッセイは、遺伝子生成物の物理的、免疫学的又は機能的性質に基づかれる。
【０１８４】
従って、本発明はまた、ＤＮＡである場合、配列番号２， ４， ５， ６， １５， １６， １７及び１８から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成り、そしてＲＮＡである場合、配列番号４， ５， ６， ７から成る群から選択されたヌクレオチド配列によりコードされるヌクレオチド配列を含んで成るベクターを提供する。
【０１８５】
本発明はさらに、野生型ヒト免疫欠損ウィルス由来であり、そして前記ベクターの複製のために許容できる宿主細胞においてのみリボザイムを複製することができるベクターの生成方法を提供する。ベクター内に含まれるか、又はそのベクターによりコードされるリボザイムは、野生型ヒト免疫欠損ウィルスの核酸を分解するが、しかしそのベクター自体及びその転写体は分解しない。前記方法は、野生型ヒト免疫欠損ウィルス由来であり、そしてベクターの複製のために許容できる宿主細胞においてのみ複製でき、そしてリボザイム（その触媒ドメインが野生型ヒト免疫欠損ウィルスの核酸を分解するが、しかし存在するなら、ベクター自体及びその転写体を分解しない）を含んで成るか又はそれをコードする核酸配列をベクター中に組み込むことができるベクターを獲得することを含んで成る。
【０１８６】
そのような方法においては、野生型ヒト免疫欠損ウィルスのＵ５配列を含んで成るか又はそれをコードするヌクレオチド配列が、ベクターから欠失され、そしてベクターがＤＮＡである場合、配列番号２， ５， ６， １４（ここで少なくとも１つのＮが突然変異誘発されている）、１５及び１６から成る群から選択されたヌクレオチド配列、及びベクターがＲＮＡである場合、配列番号２， ５， ６， １４（ここで少なくとも１つのＮが突然変異誘発されている）、１５及び１６から成る群から選択されたヌクレオチド配列によりコードされるヌクレオチド配列により置換される。好ましくは、ベクターは、前記ベクターの複製を可能にする宿主細胞において、１度よりも多く複製する。
【０１８７】
ベクターを修飾するための方法がまた、本発明により提供される。前記方法は、１つのベクターを獲得し、そして前記ベクターがＤＮＡである場合、配列番号２， ３， ４， ５， ６， １４（ここで少なくとも１つのＮが突然変異誘発されている）、１５及び１６のＤＮＡ配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列、及び前記ベクターがＲＮＡである場合、配列番号２， ４， ５， ６， ７， １５， １６， １７及び１８から成る群から選択されたヌクレオチド配列によりコードされるヌクレオチド配列を、前記ベクター中に導入することを含んで成る。
【０１８８】
パックージング細胞系を用いないで、条件付で複製するベクターを増殖し、そして選択的にパッケージングする方法が、本発明によりさらに提供される。前記方法は、条件付で複製するベクターと、前記条件付で複製するベクターと同じタイプのベクターであり、そして複製能力に関して、野生型であることにより、前記条件付で複製するベクターとは異なるもう１つのベクターにより感染され得る細胞とを接触し；続いて、前記細胞と他のベクターとを接触し；そして次に、前記条件付で複製するベクターの増殖の助けとなる条件下で前記細胞を培養することを含んで成る。上記で及び下記でより詳細に論じられるヘルパーベクターは、１つのそのような相補的ベクターである。
【０１８９】
配列番号２， ５， ６， １４（ここで少なくとも１つのＮは突然変異誘発されている）、１５及び１６から成る群から選択されたヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ分子、及び配列番号２， ６， ７， １５， １６， １７及び１８から成る群から選択されたヌクレオチド配列によりコードされるヌクレオチド配列を含んで成るＲＮＡ分子から成る群から選択された、単離され、そして精製された核酸分子がまた、提供される。
【０１９０】
使用方法：
上記ベクターは好ましくは、ウィルス感染の予防及び治療のために、ベクター維持の容易さのために、及び他の理由のために宿主細胞中に導入される。従って、本発明は、本発明のベクターを含んで成る宿主細胞を提供する。宿主細胞の単離、及び／又は培養における、それらに由来するそのような細胞又は細胞系の維持は、通常のことに成っており、そして当業者は十分に精通している。
【０１９１】
特に、上記に記載されるような、条件付で複製するウィルスベクター、又は好ましくはレンチウィルスベクターは好ましくは、ウィルス感染の予防及び治療処理に、好ましくは前記感染が野生型ウィルス、好ましくは野生型ＲＮＡウィルス、さらにより好ましくは野生型レトロウィルス及び最適には、野生型ＨＩＶからである場合に使用される。
【０１９２】
前記方法は、野生型ウィルスにより感染され得る宿主細胞と、ベクター（その存在、転写又は翻訳は、宿主細胞における野生型ウィルス株の複製を阻害する）の複製のために許容される宿主細胞においてのみ複製できる、条件付で複製するベクターとを接触することを含んで成る。所望には、ベクターは、１度よりも多く複製し、そして少なくとも１つの核酸配列を含んでなり、その所有（すなわち、存在、転写又は翻訳）は、最適には、ベクターが由来する株である野生型ウィルス株よりも、ベクターに、宿主細胞における選択的利点を付与する。
【０１９３】
この方法によれば、核酸配列は好ましくは、前記ベクター以外のウィルスの複製及び／又は発現に都合良く影響を及ぼす遺伝的抗ウィルス剤を含んで成るか、又はそれをコードするヌクレオチド配列を含んで成る。所望には、遺伝的抗ウィルス剤は、アンチセンス分子、リボザイム及び免疫原から成る群から選択される。最適には、遺伝的抗ウィルス剤は、リボザイムであり、好ましくはこの触媒ドメインは３’ヌクレオチドＮＵＨ配列（すなわち、特にＧＵＣ配列）を分解する。任意には、リボザイムは、配列番号３及び４から成る群から選択された配列により、少なくとも部分的にコードされる。
【０１９４】
所望には、リボザイムは、野生型ウィルス株又はその転写体の領域において分解するが、しかしベクター又はその転写体の領域においては分解しない。好ましくは、これは、野生型ウィルス株が配列番号１によりコードされる配列を含んで成る理由のためであり、ところがベクターは、ＤＮＡである場合、配列番号２， ５， ６， １４（ここで少なくとも１つのＮは突然変異誘発されている）１５及び１６から成る群から選択されたヌクレオチド配列、及びＲＮＡである場合、配列番号２， ５， ６， １４（ここで少なくとも１つのＮは突然変異誘発されている）、１５及び１６から成る群から選択されたヌクレオチド配列によりコードされるヌクレオチド配列を含んで成る。
【０１９５】
ベクターが少なくとも１つの核酸配列を含んで成る方法がまた、所望には行われ、この所有（すなわち、存在、転写又は翻訳）は、最適には、ベクターが由来するウィルス株である野生型ウィルス株により感染された細胞よりも、前記ベクターにより感染された宿主細胞に対して選択的利点を付与する。これに関しては、ベクターは、前記ウィルスにより感染された宿主細胞に選択的利点を付与する少なくとも１つの核酸配列、及びベクターが由来するウィルスに対応するウィルスの野生型株よりも前記ベクターに選択的利点を付与する少なくとも１つの核酸配列を含んで成ることができる。
【０１９６】
従って、核酸配列が多薬剤耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含んで成る方法が好ましくは行われる。他方では、核酸配列が、予防的に又は治療的に処理されるウィルス感染がレトロウィルスである場合、突然変異誘発された（変異）プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列、及び突然変異誘発された（変異）逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列を含んで成る方法が行われる。
前記方法は好ましくは、さらに、細胞毒性薬剤、プロテアーゼインヒビター及び逆転者酵素インヒビターから成る群から選択された剤（すなわち、ベクターの投与の他に）を、宿主細胞に投与することを含んで成る。
【０１９７】
従って、ベクターは、ウィルス感染を治療的に処理するためにのみならず、ウィルス感染から可能性ある宿主細胞を保護するために、上記方法、すなわちウィルス感染を治療的に処理する方法、又は興味あるウィルス、例えばＲＮＡウィルス、特にレトロウィルス、例えばＨＩＶに対する“予防接種”に従って使用され得る。前記方法は、宿主細胞が野生型ウィルス株と接触する前、野生型ウィルス株の複製を実質的に阻害する。これに関して、前記ベクターは、野生型ウィルスによる重感染を阻害するタンパク質を含んで成るか、又はコードすることができる。前記方法は、宿主細胞と、上記に記載されるような条件付で複製するベクター、及び“ヘルパー発現ベクター”、すなわち感染されていない宿主における“ベクター”の複製を促進するウィルスゲノムとを接触することを含んで成る。
【０１９８】
前記条件付で複製するベクターは、パッケージング及び／又は増殖のための選択的利点を含んで成る。さらに、前記ベクターは、細胞生存性を増強し、ウィルス精製を促進し、アポプトシスを誘発し、タンパク質生成を促進し、そして／又は免疫機能及び／又は標的化を促進する配列を含むことができる。前記“ヘルパー−発現ベクター”構成体は、“ベクター”の複製を無能にするために補助するいずれかの発現ベクターである。そのようなヘルパー−発現ベクターは、通常のものであり、そして当業者により容易に構成される。ヘルパー−発現ベクターは、ベクターのようなビリオン中にパッケージングされ得るか、又はパッケージングの必要条件を伴なわないで、発現され得る。
【０１９９】
“ベクター”はパッケージング及び／又は増殖のために選択的利点を有するので、このシステムは、生存弱毒化されたウィルスが潜在的に引き起こす可能な病原性効果を伴なわないで、ウィルスの高い複製を達成するために安全な手段を提供する。さらに、ベクターは、免疫原性を高めるために、非特異的アジュバントと共に混合され得る。そのようなアジュバントは、当業者に知られており、そしてフロイント完全又は不完全アジュバント、細胞及びミコバクテリア細胞壁成分から成るエマルジョン、及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２００】
本発明の条件付で複製するウィルスベクター又は好ましくはレンチウィルスベクターがまた、ウィルス感染の処理における免疫治療、又は腫瘍遺伝子疾患の処理のために使用され得る。樹状突起細胞又はそれらの前駆体（例えば、ＣＤ３４＋造血細胞又は血液単球、但しそれらの細胞型に限定されない）、及び他の抗原提供細胞は、ＨＩＶタンパク質、又は宿主が外来性剤、例えばウィルスに対する免疫応答を開始する主要エピトープを含むタンパク質配列を発現するベクターにより形質導入され得る。
【０２０１】
ＨＩＶのためのそのようなタンパク質エピトープは、”ＨＩＶ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｄａｔａｂａｓｅ”， １９９８， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ＆ Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＨＩＶエピトープタンパク質についての好ましい態様は、下記例１４に示される組み込まれた又は構成成分ＣＴＬ配列（又はそのフラグメント）である。同様に発現され得る他のエピトープは、他のウィルス、細菌、菌類、寄生体、腫瘍細胞及び遺伝子的に修飾された細胞から誘導される。
【０２０２】
１つよりも多くのエピトープが、１つのタンパク質配列中に統合され、その結果、非免疫原性部位が、タンパク質コード配列が重度に中断されるので、高められた安全性を伴なって、ベクターを創造するために排除される。不連続配列の好ましい態様は、免疫学的に適切なエピトープをコードする、変性された不連続配列（必要なら、タンパク質構造体を安定化するために適切なリンカーアミノ酸配列を有するか、又は有さない）である。縮重配列の使用は、組換えの危険性を低める。もう１つの好ましい態様は、レトロウィルスＬＴＲ、例えばＨＩＶ−ＬＴＲにより駆動される、スプライシングされたメッセージを通しての、前期記載されるタンパク質の配列（又はそのフラグメント）の発現である。
【０２０３】
しかしながら、ヒト感染及び疾病の処理へのレトロウィルスベクターの使用に関する関心は、複製コンピテントウィルス（ＲＣＶ）の生成の可能性である。ヘルパーベクターと条件付で複製するベクターとの間の相同組換えの可能性を最小限にするか又は排除するためのヘルパーベクター構成体の修飾を提供する。ヘルパーベクター及び条件的に複製するベクターの二量体化、同時パッケージング及び／又は組換えの可能性を低めるよう作用するいずれかの修飾が、本発明により企画される。
【０２０４】
本発明の態様は、ヘルパー遺伝子コード配列の３’末端、但し転写終結部位の５’に、１又は複数の抗−ベクターリボザイム又はアンチセンス配列（任意には、リボザイムに関しては、タンデムに連結される少なくとも２種のそのような配列として定義され、そしてアンチセンス配列に関しては、タンデムに連結され、そして標的化されたベクター核酸の不連続領域に標的化された少なくとも２種の配列として定義されるカセットの形での）を、挿入することである。ベクター中へのヘルパーゲノムの非特異的パッケージングが存在するが、そのようなパッケージングはたぶん、ベクター依存性である。従って、多くの方法が、他方ではＲＣＶの可能な生成における最初の段階である、ベクター粒子中へのヘルパーベクターのパッケージングを低めるために使用され得る。
【０２０５】
好ましいヘルパー構造体は、構造タンパク質コード配列又はエンベロープ（相同又は異種）コード配列の３’末端に、抗−ベクターリボザイム又はアンチセンス分子を含む。より好ましいヘルパー構造体は、構造タンパク質コード配列及びエンベロープコード配列の３’末端に抗−ベクターリボザイム又はアンチセンス分子を含む。核酸配列がアンチセンス分子である場合、それは、細胞ヌクレアーゼを通して、同時局在化される二本鎖ベクター−ヘルパー分子を破壊するために両細胞内に作用する。ヘルパーがウィルス粒子中にベクターＲＮＡによりパッケージングされる場合、それらの分子は、ＲＣＶを生成するために完全な逆転写を受けることはできない。
【０２０６】
もう１つの好ましい態様は、ベクターの核酸から離れて、ヘルパー核酸の示差的追跡又は局在化を促進する配列をヘルパー構造体上に配置することである。例えば、ヘルパー構成体、例えば図６に示されるような構成体中への異種イントロン及びポリＡ配列の包含が存在するが、但しそれだけには限定されない。それらの配列は、異なった細胞又は非細胞位置に対するベクター及びヘルパーアミノ酸の示差的追跡を促進する。好ましくは、生成されるベクターの力価は、そのようなヘルパー修飾により、１００倍以上、より好ましくはわずか１０倍しか影響されず、そして最も好ましいくは、影響されない。
【０２０７】
図７は、１つのリボザイム（ｐＶｉｒＰａｃ１． ２Ｒｚ）、又はヘルパーＲＮＡの細胞トラフィキングに影響を及ぼすよう企画されたリボザイム及びイントロン（ｐＶｉｒＰａｃ１． ２ＲｚＩｎ）の存在がベクター力価に対する有意な効果を有さなかったことを示す。図１２は、同時パッケージングされたヘルパー構成体についての力価サンプルのＰＣＲ分析がリボザイムの不在下での高い同時パッケージング−対−リボザイムの存在下での低められた同時パッケージングを示したことを示す。２種のリボザイムの存在は、ベクターウィルス粒子中へのヘルパーベクターの同時パッケージングを完全に妨げた。従って、本発明は、高いベクター力価を生成し、そしてヘルパーベクターの同時パッケージングを低めるか又は排除することによって、そのようなベクターの完全性を改良するために、２種のプラスミドパッケージングシステムを用いる効果的な手段を包含する。
【０２０８】
データは、ビリオン中へのヘルパーパッケージングがランダムではなく、ベクター依存性であることを示唆する。ベクターの核酸によるヘルパー核酸の同時パッケージングを妨げる他の好ましい態様は、ヘルパー及びベクター配列の会合のために重要である領域におけるヘルパー構成体を縮重することである。このアプローチは、ヘルパー及びベクター配列の同時パッケージングを妨げるためにヘルパー配列を完全に変性することによって、さらに修飾され得る。
【０２０９】
例えば、ヘルパーベクターのヌクレオチド配列は、部分的に又は完全に変性され得る。そのような縮重はヘルパーベクター及び条件付で複製するベクターの相同対合及び組換えの傾向を相当に低めるか又は排除するが、それは、ウィルス複製及びパッケージングのために必要なタンパク質生成物をコードするヘルパーベクターの能力に影響を及ぼさない。この縮重は、ヘルパーと条件付きで複製するベクターとの間で相同である、あらゆる可能な遺伝子又は読み取り枠（ＯＲＦ）に、又はヘルパーベクター内の特定の遺伝子又はＯＲＦ内に方向づけられ得る。
【０２１０】
完全な縮重は、１８個よりも多くの長さのヌクレオチドの配列相同性の欠失が十分であるので、相同組換えの傾向を低めるために必要はないことが注目されるべきである。従って、わずか１８， １７， １６， １５， １４， １３， １２， １１， １０， ９， ８， ７又は６個のヌクレオチドが配列間で同一であるレベルへの縮重が、組換えを制御するか又は妨げるであろう。前記配列は、所望には、ヒト又は特定の細胞型での選択的発現を有するコドンを用いて縮重され得る。
【０２１１】
例として、ｇａｇ，ｒｅｖ及び／又はｔａｔをコードするヌクレオチド配列は、完全に又は部分的に、縮重され得る。他の例は、ｇａｇ配列の最初の４２個のヌクレオチド、ｒｅｖ配列の最初の２０８個のヌクレオチド、ｔａｔ配列の最後の１８３個のヌクレオチド、及びＰｏｌ配列の最後の５４５個のヌクレオチドの縮重を包含する。そのような縮重を有するヘルパーベクターの例は、ｐＶｉｒＰａｃ１．２， ｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ， ｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ２及びｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎ又はそれらの融合体である。もちろん、いずれか他のウィルス遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列はまた、本発明に従って縮重され得、それにより、相同組換えの傾向を低めるか、最少にするか又は排除する。
【０２１２】
本発明の他の態様は、２種のベクターが同時局在化され、同時パッケージングされるか、又は他方では一緒に対合される場合、条件付で複製するベクターを標的化し、そして変性するヘルパーベクターへの１つの要素の組み込みである。条件付きで複製するベクターを選択的に標的化するリボザイムが、本発明により企画される。多重リボザイム、例えば本明細書に記載されるような二重又は三重リボザイムカセットがまた使用され得る。例えば、リボザイムは、条件付きで複製するベクターのＵ５領域（例えば、ＨＩＶ−１， ＨＩＶ−２， 又は条件付で複製するベクターに使用されるもう１つのレトロウィルス）を標的化することができる。前記条件付で複製するベクターの分解は、２種のベクターが同時パッケージングされる場合に存在する、ＲＣＶを生成することから条件付で複製するベクターによる組換え現象を妨げる。リボザイムを含むヘルパーベクターの例は、図６に示されるように、ｐＶＩＲＰＡＣ−１．１Ｒｚ及びｐＶＩＲＰＡＣ−１．２Ｒｚ２である。
【０２１３】
本発明のさらにもう１つの態様は、ヘルパーベクターにおけるいずれかのレトロウィルスＲＲＥ、しかし好ましくはもう１つのレンチウィルスＲＲＥを包含する異種ＲＲＥの置換、例えばＨＩＶ−１ ＲＲＥ， ＣＴＢ又はＰＲＥによるＨＩＶ−２ ＲＲＥの置換である。このアプローチは、異なった配列を有する異なったＲＲＥに基づいての相同組換えの可能性を低めるか、最少にするか又は排除することに寄与する。本発明のそのような置換のさらなる利点は、約５倍ほどに、条件付で複製するベクターの生成の驚くべき且つ予想できない上昇である。
【０２１４】
理論により結び付けられないが、ヘルパーベクターと条件付で複製するベクターとの間での異なったＲＲＥの存在は、量的に制限され得る１又はそれよりも異なった細胞因子により結合され得る。従って、異なったＲＲＥの使用は、制限された細胞因子についての２種のベクター間での競争を減じることができる。レトロウィルスベクターに基づいてＨＩＶ−１をパッケージングするためにＨＩＶ−２ ＲＲＥ要素を含むヘルパーベクターの例は、図６に示されるようにｐＶＩＲＰＡＣ−１．２及びｐＶＩＲＰＡ−１．２Ｒｚ２である。
【０２１５】
さらにもう１つの態様は、異種ｅｎｖタンパク質、例えば水疱性口内炎ウィルスからのＶＳＶ−Ｇ、ラビエスＧタンパク質、ＧａＬＶ、アルファウィルス１／２糖タンパク質又はＲＤ１１４、ネコ内因性ウィルスからのｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列のヘルパーベクターの組み込みである。これは、異種ｅｎｖタンパク質と共に条件付で複製するベクターの粒子中へのパッケージングを可能にする。さらに、リガンドが、所望は、形質導入の間、標的細胞の刺激を促進するために、エンベロープタンパク質中に任意には挿入され得る。エンベロープタンパク質の修飾は、その結合能力を破壊するので、好ましい態様は、生成の間、就職されていない偽性型分類されたエンベロープタンパク質と共に、キメラエンベロープタンパク質を含む修飾されたリガンドを発現することである。
【０２１６】
従って、両タイプのエンベロープタンパク質が細胞の表面上に存在し、１つは標的細胞を刺激し、他の１つは結合及び侵入を介在する。細胞刺激のためのキメラ受容体をまた発現する好ましい偽性型分類されたレンチウィルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質及びキメラＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質である。より好ましいキメラエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ／ＲＤ１１４キメラエンベロープタンパク質である（図１４Ａ及び１４Ｂを参照のこと）。ＶＳＶ−Ｇと共にキメラを創造する他の好ましいタンパク質（又はそのフラグメント）は、切痕、デルタ、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯ、Ｋｉｔリガンド、ＣＤ３を結合するリガンド、ＣＤ２８を結合するリガンド、及びＧＭ−ＣＳＦを結合するリガンドを包含する。
【０２１７】
異種ｅｎｖタンパク質をコードする配列は、ウィルスパッケージングのためのｅｎｖタンパク質のより多くの供給を確保するために第２の誘発可能プロモーターにより操作可能的に連結され得る。このアプローチは、特にｅｎｖタンパク質生成が速度制限因子である条件下で、ウィルス生成を高めることができる。前記異種ｅｎｖタンパク質コード配列は、他の相補性ウィルスタンパク質コード配列と同じヘルパーベクター上に、又は別のベクター上に含まれ得る。任意には、それはまた、生成宿主細胞又は細胞系中に組み込まれ得る。
【０２１８】
本発明のさらなる態様は、一定のウィルス成分からの選択的スプライシングが条件付での複製を伴なっての相同組換えの可能性を最少にするか又は排除するために作用するよう、ヘルパーベクター上でのスプライスドナー及び受容体部位の選択的位置決定である。例えば、スプライス部位は、スプライス現象の結果としてＲＲＥ及び／又はパッケージング又は二量体化シグナルの欠失を可能にするよう位置決定され得る。従って、核酸が発現されるどうかの情況は、ベクターにおけるスプライス部位の配置により調節され得る。例えばスプライス部位は、リボザイム又はアンチセンス配列から遠位に配置することができ、その結果、リボザイム又はアンチセンスはスプライスされていないＲＮＡに組み込まれるが、しかしスプライスされたＲＮＡには組み込まれない。他方では、リボザイム又はアンチセンスは、目的がすべてのｍＲＮＡ分子からリボザイム又はアンチセンス分子を発現し、そして特定のサブタイプを発現しない場合、スプライス部位の下流に配置され得る。
【０２１９】
ベクターがウィルス感染の予防処理として上記の方法に従って使用される場合、ベクターは野生型ウィルスによりコードされないタンパク質、例えば変異ウィルスタンパク質又は非ウィルスタンパク質の抗原をコードすることができる。従って、ベクターによりコードされる抗原は、細菌起源のもの、又は癌細胞起源のものであり得る。さらに、条件付で複製するウィルスベクター、又は好ましくはレンチウィルスベクターはまた、ヒト免疫系への抗原の正しい提供のためのＭＨＣ遺伝子をコードすることができる。従って、そのようなベクターは、種々の可能性ある病原体は、及び／又は異常細胞において選択的に発現される内因性タンパク質（例えば、腫瘍−特異的抗原）に対して永続的免疫学的応答を促進するために使用され得る。
【０２２０】
上記は、免疫治療のために樹上突起細胞への抗原の供給のためのへの本発明の使用を限定しない。それとは対照的に、本発明は、興味あるいずれかの遺伝子がいずれかの所望する細胞で供給され、そして発現される手段及び方法を提供する。さらに、本発明の単一のベクターを通しての多重遺伝子の供給及び発現を可能にする。多重遺伝子は、遺伝子発現のためのいずれか適切な手段を用いて発現され得る。非制限例は、発現される必要がある第１遺伝子から遠位に配置され得る内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用である。
【０２２１】
好ましい例は、変異体ＭＧＭＴ遺伝子に対して遠位に存在するＩＲＥＳに興味ある遺伝子を発現することである。より好ましいベクター態様は、興味ある遺伝子、及びスプライスされたメッセージから修飾されていないか又は修飾されたＨＩＶ−ＬＴＲからの興味あるＩＲＥＳ結合された遺伝子を発現することである。さらなる好ましいベクターは、修飾される場合、転写因子を結合する配列において修飾される、修飾されていないか又は修飾されたＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターから興味ある２種の遺伝子を発現する。もちろん、いずれかの修飾されていないか又は修飾されたレンチウィルスＬＴＲが、ＨＩＶ ＬＴＲの他に使用され得る。
【０２２２】
もう１つの非制限例は、ＨＩＶに由来するスプライシング部位を用いてＨＩＶ−ＬＴＲから興味ある遺伝子を発現することである。例えば、興味ある１つの遺伝子がＮｅｆスプライス受容体部位からの発現され、そして興味ある第２の遺伝子は、Ｔａｔスプライス受容体部位から発現される。この場合、２種の遺伝子が、ＩＲＥＳ要素を必要としないで、発現され得る。いずれかのスプライス部位、例えばＴａｔ， Ｒｅｖ， Ｖｉｆ， Ｖｐｒ， Ｖｐｕ， Ｎｅｆ及びＥｎｖ遺伝子のそれらの部位が使用され得る。Ｅｎｖタンパク質は単一のスプライスされたメッセージから発現され、その結果、このスプライス部位を通しての興味ある遺伝子の発現は、興味ある遺伝子の有意な発現が必要とされる場合、Ｒｅｖを必要とする。さらに、ＨＩＶ−ＬＴＲからの発現は、所望には、Ｔａｔ及びＲｅｖ依存性にされ得る。
【０２２３】
さらに、“ヘルパー−ウィルス”（また、本明細書において、“ヘルパー”として言及される）発現ベクターは、細胞特異的発現複製及び拡散を可能にする。特定の遺伝子要素／因子（ベクター又はヘルパー−ウィルス発現構成体において）の付加又は排除により、特定の細胞型（例えば、幹細胞、特定の抗原提供細胞及び腫瘍細胞）においてのみ発現するよう構築され得る。従って、ベクターは、ヘルパー−ウィルス構成体との相補性によりまだ拡張するが、しかしこの拡張は、一定の遺伝子要素／因子が付加されるか、又はベクター又はヘルパー−ウィルス発現構成体から排除されるか依存して、細胞特異的である。これは、単独で、又は上記に言及された手段の他のものと組合して使用され得る。
【０２２４】
例えば、条件的で複製するＨＩＶベクターが、Ｔ−細胞よりもむしろ、マクロファージにおいて特異的にマクロファージの形で複製するよう企画され得る。Ｔａｔ−欠損ＨＩＶを構成するベクター（ベクターは他のＨＩＶタンパク質をコードするが、しかしそれは、Ｔａｔ転写トランス活性の不在のために、発現されない）は、野生型ＨＩＶを分解するが、しかし条件付で複製するＨＩＶ ＲＮＡを分解しないリボザイムをコードすることができる。このベクターのためのヘルパー発現ベクターは、マクロファージ特異的プロモーターから発現されるｔａｔ遺伝子をコードすることができる。従って、ｃｒＨＩＶはマクロファージ細胞おいてのみ、条件付で複製するが、ところがＴ−細胞又は他の細胞においては複製することができない。
【０２２５】
他方では、ｔａｔ遺伝子は、腫瘍特異的プロモーターに操作可能に連結され得；従って、ｃｒＨＩＶは腫瘍ＣＤ４細胞においてのみ複製し、そして正常なＣＤ４細胞においては複製しない。遺伝子要素／因子はまた、ベクターのプロモーター配列の修飾であり得、その結果、それは特定の細胞型においてのみ発現され、そして“ヘルパ−ウィルス”発現構成体と協力して他の細胞型においては発現されない。
【０２２６】
もう１つの態様においては、ヘルパー−発現構成体又はベクター構成体エンベロープタンパク質（そのような構成体がエンベロープタンパク質を含むよう構築される場合）が修飾され、その結果、ベクター−ビリオンは一定の細胞型（例えば、腫瘍細胞）を特異的に感染するが、ところが他の細胞型（例えば、正常細胞）を感染することができない。さらにもう１つの態様においては、複製のための１又はいくつかのキー因子を欠いているアデノウィルスは、腫瘍特異的プロモーターに連結されるそのような因子を提供するヘルパー構成体を用いることによって補足され得る。従って、アデノウィルスの複製を補足する因子は腫瘍細胞において単に発現され、それにより、腫瘍細胞におけるウィルス複製を可能にするが（細胞殺害のために必要とされるタンパク質の発現を伴なう）、しかし正常細胞においては可能ではない。
【０２２７】
さらなる態様においては、ベクターは、Ｏ６−グアニンアルキル化剤、例えばＢＣＮＵ（又はＢＣＮＵの機能的類似体）（但し、これだけには限定されない）を、負の選択薬剤として用いることによって、細胞の殺害のための負の選択遺伝子を発現することができた。ＭＧＭＴ遺伝子に標的化されるアンチセンス又はリボザイムを発現するレンチウィルスベクターは、正常な細胞に供給され得る。後での所望する時点で、細胞はベクター形質導入された細胞を殺害するために、エクスビボ又はインビボで、ＢＣＮＵ又はその類似体により処理され得る。
【０２２８】
好ましい態様においては、正常細胞は、ベクターを予防的に発現するＭＧＭＴアンチセンスにより形質導入され、そして細胞が異常に成った場合、後で殺害される。この後者のアプローチの例は、形質導入された細胞が、ＢＣＮＵ又はその機能的類似体による細胞の処理により殺害され得る癌細胞になる場合である。もう１つの好ましい態様は、Ｕ１プロモーターからの及びＵ１ ｓｎＲＮＡ内に含まれる抗−ＭＧＭＴアンチセンス又はリボザイム分子を発現することである。さらにより好ましい態様は、造血細胞、例えばリンパ球幹細胞及び樹状突起細胞の集団中に抗−ＭＧＭＴレンチウィルスベクターを形質導入することである。
【０２２９】
もう１つの好ましい態様においては、正常細胞は、同種宿主中への移植の前、ベクターにより形質導入される造血細胞、好ましくはＴ細胞である。そのような細胞は、その細胞が宿主に対して有害に成る場合（例えば、移植片対宿主の反応が生じる場合）、ＢＣＮＵ又はその機能的類似体による処理により殺害され得る。さらにもう１つの態様においては、同じ抗−ＭＧＭＴアンチセンス又はリボザイム発現レンチウィルスベクターが、混合された細胞集団から所望しない細胞をパージするために使用され得る。非制限例は、移植のために容易である、癌細胞汚染された骨髄の場合である。
【０２３０】
腫瘍細胞は、１回の形質導入において比較的低いＭＯＩで非常に効果的に形質導入されることが観察されている（図１３Ａを参照のこと）。対照的に、正常細胞、特にＣＤ３４＋造血幹細胞（但し、それだけには限定されない）は、効果的に形質導入するには困難であり、高い効率のためには複数回の形質導入を必要とする（図１３Ｂを参照のこと）。
【０２３１】
従って、好ましいパージ方法は、正常細胞ではなく、汚染腫瘍細胞を効果的に形質導入するＭＯＩを用いて、抗−ＭＧＭＴアンチセンス包含ベクターによる、汚染された骨髄の形質導入を通してである。この例は、エクスビボ使用、又は単に癌関連用途に本発明の範囲を制限しない。１つの用途は、インビボ選択遺伝子供給、特に本発明により標的化するため開発され得る、疾病細胞と正常細胞との間に形質導入の示唆的効率が存在する、脳癌及びいずれか他の疾病の処理を包含するが、但しそれだけには限定されない。
【０２３２】
従って、本発明はまた、癌の処理方法、及び特にＴ−細胞白血病の処理方法を提供する。本発明の“癌の処理”とは、治療応答をもたらすために本明細書に示されるような追加の修飾されたベクターを宿主に投与することを含んで成る。そのような応答は、例えば腫瘍増殖の弱体化及び／又は腫瘍緩解をモニターすることによって評価され得る。“腫瘍増殖”とは、腫瘍サイズ及び／又は腫瘍の数の上昇を包含する。“腫瘍緩解”とは、腫瘍質量の低下を包含する。
【０２３３】
本発明の“癌”とは、腫瘍形成により明白であり得る、異常細胞増殖及び接触阻害の不在により特徴づけられる癌を包含する。前記用語は、腫瘍に局在化される癌、及び腫瘍に局在化されない癌、例えば侵入により局部的に又は転移により全身的に拡張するそれらの癌細胞を包含する。理論的には、いずれのタイプの癌でも、本発明に従っての処理のために標的化され得る。しかしながら、好ましくは、癌はウィルス起源のものである。
【０２３４】
最終的に、上記ベクターは、インビボ遺伝子療法のために直接的に使用され得る。遺伝子療法のための現在の方法は、それらが高い割合で細胞への遺伝子供給を介在することができないので、欠点を有し；一定の割合の細胞のみが感染される。これは、全腫瘍集団の遺伝子形質導入が決定的である抗−腫瘍方法において特に重要である。“ヘルパー”と共に“ベクター”を付加することによって、すぐに、形質導入された細胞は、隣接する細胞感染することができ、そして従って高く且つ可能な完全な形質導入効率を可能にするウィルス粒子を生成するであろう。
【０２３５】
本発明の１つの態様においては、ヒトレトロウィルス（ＨＩＶ又はレトロトランスポゾン要素であり得る）又は、“ヘルパー”構成体と共に、組織（又はインビトロでの細胞）中に供給され得る。ベクター及びヘルパーを含む細胞はすぐに、ウィルスを生成し、そして条件付でビリオン中にベクターをパッケージングするであろう。それらのビリオンは、隣接する細胞の高い効率の形質導入を介在することができるであろう（細胞−細胞接触が細胞を形質導入するための最も効果的な手段であるので）。形質導入された細胞は、ベクター／ヘルパーの組み合わせが細胞溶解感染をもたらすかどうかに依存して、死亡するか又は死亡しない。
【０２３６】
レトロトランスポゾンの場合、ヘルパーは、正常又は腫瘍細胞がビリオン中への封入のために必要なタンパク質／因子を含むことができるので、構造タンパク質を含む必要はない。この場合、ヘルパーは単に、レトロトランスポゾン封入のために必要とされる因子の転写を活性化するトランス活性化因子タンパク質であり得るが、但しそれだけには限定されない。ＨＩＶの場合、他の因子は、細胞の感染／形質導入のために子孫ビリオン中へのＨＩＶゲノムの封入のために必要とされるが、しかし必ずしも必要ではない。
【０２３７】
上記ベクターはまた、反−生物学的及び反−化学的治療方法に使用され得る。例えば、条件付で複製するベクターは、高い病原性のウィルス又は細菌、又は化学剤（例えば、トキシン）により細菌感染された個人中に供給され得る。ベクターは、これまで記載されたように、病原性ウィルスの複製を妨げるであろう。しかしながら、条件付きで複製するベクターはまた、ヘルパー発現ベクター（“ヘルパー”）と協力して、抗菌又は抗−化学物質方法のために使用され得る。
【０２３８】
例えば、条件付で複製するベクターは、“ヘルパー”がその発現及び増殖を可能にした後、抗菌又は抗―トキシン抗体を分泌することができる。“ヘルパー”は、菌類、サイトカイン（抗菌感染に応答して）、抗生物質（テトラサイクリン誘発性プロモーターシステムに関する（Ｐａｕｌｕｓ など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０， ６２−６７ （１９９６））、又は化学物質（例えば、トキシン、それ自体）による活性化に基づいて、その発現を可能にする誘発性プロモーターから駆動され得るが、しかし必ずしもそうではない。従って、条件付きで複製するベクターは、侵入性病原体又はトキシンに応答して“ヘルパー”の助けにより選択的に増殖するのみならず（ヘルパーの活性化の結果として）、また腫瘍抗原、病原体又は化学物質（例えば、トキシン）の病理学的効果を阻害するために、抗−病原体又は抗−トキシン抗体を分泌することができる。
従って、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質のいずれかに転写され得る、いずれかのタンパク質、因子又は、遺伝的要素は、その選択的増殖及び発現を促進する“ヘルパー”と協力して、病原体応答を阻害するために、条件付で複製するベクター中に挿入され得る（ヘルパーの生成物は条件付きで発現されるので、選択的であり、例えば、
【０２３９】
（ａ）誘発性プロモーターシステム、すなわち腫瘍細胞における因子は、ヘルパー因子の生成を活性化し、トキシン応答配列はヘルパー因子を発現し、又はサイトカイン応答性プロモーターはヘルパー因子の生成を誘発し、
（ｂ）ヘルパーＲＮＡ／タンパク質／因子は一定の細胞において選択的に安定化され、そして他の細胞においては安定化されず、そして
（ｃ）第３パーティーの遺伝子の間接的誘発がヘルパーウィルスタンパク質生成、付随性、標的化、構造又はもう１つのニ官能性に影響を及ぼすが、但しこれらだけには限定されない）。そのような方法は、病原体からトランスジェニック植物及び動物を保護するためにそれらに使用され得る。同様に、そのような方法は、価値ある異種タンパク質／因子を生成するためにトランスジェニックシステムに使用され得る。
【０２４０】
本発明の方法のもう１つの態様においては、１つの細胞が、そのタンパク質／因子の一部が特定の機能のために重要であることを決定するために、薬剤／因子のスクリーニングのために開発され得る。ベクターは、所定の細胞系内に興味ある突然変異誘発されたタンパク質を発現するために創造され得る。しかしながら、突然変異誘発されたタンパク質をコードするＲＮＡは、サイレント点突然変異の挿入によりリボザイムに対して耐性にされる。しかしながら、野生型タンパク質発現は、細胞系内で阻害される。
【０２４１】
興味あるタンパク質に対するリボザイムを発現するベクターがまた、変異試験タンパク質を発現するために構成され得る。ベクターが細胞中に形質導入される場合、正常タンパク質をコードする生来のＲＮＡのほとんどが分解されるが、ところが変異試験タンパク質は発現される。この方法は、所定のタンパク質がいかにして機能するか、そして所定の因子／薬剤がタンパク質といかにして相互作用するかを決定するために早く且つ強力な技法として、最近開発された供給及び選択技法と共に使用され得る。
【０２４２】
血液由来の疾病を処理するためへのベクターの適用についてのさらにもう１つの態様においては、患者は、血液から十分な量の白血球細胞を抽出するために白血球搬出を受ける。白血球搬出の後、所望する細胞が単離され、ベクターにより形質導入され、そして次に、培養において、所望する細胞数に拡張される。所望する細胞型のエクスビボ拡張の間、所望する細胞型上の細胞表面タンパク質に対して標的化された抗体が患者に注入され、そして十分な量の所望する細胞型の拡張と同時に一定期間、それらの細胞を破壊する。次に、形質導入された細胞が、細胞インビボ抗体介在性損失を補充するために患者中に再び注入される。
【０２４３】
上記のことを実施する好ましい手段は、白血球搬出された材料からのＣＤ４＋ Ｔ細胞の単離、及び次に、エクスビボ拡張のために抗−ＨＩＶアンチセンス又はリボザイム配列を含むＨＩＶベクターによる前記細胞の形質導入を包含する。細胞のエクスビボ拡張の間、患者の内因性ＣＤ４＋ Ｔ細胞が、例えば抗−胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｓｅｒｕｍｓ ｅｔ Ｖａｃｃｉｎｓ， Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ， ＳａｎｇＳｔａｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ， ＵＳＡにより供給される）、又はＡｔｇａｍ（Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｋａｌａｍａｚｏｏ， ＭＩ， ＵＡＳ）の投与により破壊されるが、しかしいずれかの細胞減少抗体が、当業者に明らかである適切なスクリーニングの後、使用され得る。拡張の後、形質導入されたＣＤ４＋ Ｔ細胞は、患者に戻される。好ましい態様においては、ＣＤ４＋細胞の単離の間に得られるＣＤ４陰性細胞が、保持され、凍結され、そして形質導入されたＣＤ４＋細胞が患者に戻される時点での注入のために融解される。
【０２４４】
上記例は、本発明の範囲をＡＴＧにもＣＤ４＋ Ｔ細胞にも制限しない。いずれかの細胞型が、前記細胞上の細胞表面タンパク質を結合し、そして殺細胞性である抗体の使用により標的化され得る。前記抗体は、患者中に外因的に導入されるか、又は抗体を分泌する第２ベクターが身体中に導入され得る。このベクターは、抗体を、構成的に（細胞の生命のために）、過渡的に（例えば、但し、インテグラーゼ陰性ベクターに制限されない）、又は誘発的に（例えば、但し、テトラサイクリン誘発性プロモーターシステムに制限されない）、生成することができた。
【０２４５】
インビトロでの本発明の方法及びベクターの多くの使用がまた存在する。例えば、ベクターは、ウィルス複製及びリボザイム機能のあるニュアンスを確かめるために使用され得る。同様に、リボザイム含有ベクターは、疾病細胞に存在する突然変異を評価するために、又は遺伝的浮動を試験するために、診断手段として使用される。ベクターはまた、遺伝子の機能がこれまで知られているか、未知であるか、又は単に提案されているか又は企画されているかにかかわらず、その機能を決定するか又は確かめるために使用され得る。この前述の議論は、本発明の使用に関して、決して包括的ではない。
【０２４６】
発明の利点：
ＡＩＤＳ及び他の疾病の遺伝子治療処理のためにｃｒＨＩＶ方法を用いる利点が考慮できる。例えば、ＨＩＶにより感染された細胞にベクターを標的化する問題が解決された。感染されたＣＤ４＋細胞中へのｃｒＨＩＶのインビボトランスフェクションの後、ｃｒＨＩＶは、内因性感染ＨＩＶエンベロープタンパク質を用いて、子孫ビリオン中にパッケージされるようになる。従って、ｃｒＨＩＶ ＲＮＡは、内部子孫ビリオンにそって標識し、そしてＨＩＶの特定株により通常感染される細胞型を感染し、非病原性ビリオンを生成する。これは、中枢神経系のＨＩＶ感染のための主要レザバーである細胞、例えば小グリア細胞の標的化の困難性を包含する。ウィルスタンパク質はｃｒＨＩＶベクターによりコードされないので、感染されていないＣＤ４＋細胞を感染するｃｒＨＩＶベクターに関連する毒性はたぶんほとんど存在しない。
【０２４７】
さらに、野生型ＨＩＶとのｃｒＨＩＶベクター競争の結果は、低められたウィルス負荷をもたらす非病原性粒子の生成をもたらす。低下する病原性ＨＩＶ−１負荷は、ｃｒＨＩＶ粒子はまた全身的に拡張することができるので（すなわち、感染性ＨＩＶと同じように）、感染された個人の生存時間を高めることができるのみならず、また感染されていない個人への伝達速度を低めることができる。血液における低められた病原性ＨＩＶ−１負荷は、ｃｒＨＩＶの生成がまた、感染された母からのＨＩＶの彼らの子宮における胎児への伝達を低めることができるので、妊娠したＨＩＶ−感染された個人において特に重要であり得る。
【０２４８】
宿主細胞中にｃｒＨＩＶベクターを導入するために使用され得るプラスミドＤＮＡ／脂質混合物は、生成するのに安定し且つ安価であるべきであり、高価なエクスビボ方法を回避する。もちろん、本発明の方法は、それがまたエクスビボ遺伝子供給のために使用される限り、本質的に柔軟であり、これが所望されるべきである。それにもかかわらず、リポソーム介在性アプローチの利用性は一般集団（すなわち、現在の遺伝子療法により、実施できない）の処理のための可能性を開く。ｃｒＨＩＶベクターはまた、ＨＩＶゲノム上の異なった標的物に製造され得るいくつかのリボザイムを含むよう構築され得る。これは、感染性ＨＩＶが突然変異誘発し、そして抗−ＨＩＶリボザイムの効果をのがれる可能性を低める。さらに、条件付き複製コンピテントウィルス方法は、他のウィルス感染、特にウィルスターンオーバーが高いそれらを処理するために適用され得る。
【０２４９】
ｃｒＨＩＶベクターの特に有する特徴は、それらが遺伝的抗ウィルス剤、例えばリボザイムを、後−転写的に発現するために使用され得ることである。従って、ｃｒＨＩＶベクターによる、感染されていない細胞の感染は、ほとんどの発現はＴａｔタンパク質の不在下で、ＨＩＶの長い末端反応（ＬＴＲ）プロモーターから生じるので、低い毒性をもたらす。高レベルのｃｒＨＩＶ発現及びその結果として生じる抗ウィルス活性は、Ｔａｔタンパク質が野生型ＨＩＶとの相補性により提供される場合のみ存在する。従って、ｃｒＨＩＶベクターは、ＨＩＶ感染から細胞を保護するようには企画されておらず、しかし非病原性ｃｒＨＩＶ粒子の選択的蓄積を通して全体的な野生型ＨＩＶウィルス負荷を低めるよう企画される。
【０２５０】
本発明の操作又は機能に関していずれの特定の理論によっても結び付けられないが、リボザイムは、次の２種の有用な性質の理由から、選択的利点をｃｒＨＩＶゲノムに提供するために次の例において確かめられるように使用され得ると思われる：（１）それらは高い程度の特異性を有し、そして（２）それらは標的ＲＮＡと共に同時局在化するそれらの能力に依存して、相対的効率を有する（Ｃｅｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３６， １５３２−１５３９ （１９８７））。リボザイムの特異性は、ＸＵＹ部位を含む相補的標的配列に対するそれらの特異的ハイブリダイゼーションにより付与される。リボザイムは、それらが標的ＲＮＡと効果的に同時局在化する場合のみ、それらは高い効力で標的ＲＮＡを分解するので、比較的効果的である。
【０２５１】
混合されたＨＩＶ／ｃｒＨＩＶ感染においては、野生型ＨＩＶ ＲＮＡとリボザイム含有ｃｒＨＩＶとの同時局在化が、ＨＩＶ ＲＮＡゲノムは子孫ビリオン中へのパッケージングの前、二量体化するので、生じるべきである。ウィルスタンパク質の生成のために必要とされる、野生型ＨＩＶ ＲＮＡのゲノム種の分解は、たぶん、非ゲノムＨＩＶ ＲＮＡが二量体化しない限り、ゲノム野生型ＨＩＶ ＲＮＡの分解よりも低い効果を有する。ｃｒＨＩＶ ＲＮＡに付与される選択的利点はウィルスウィルス粒子中へのｃｒＨＩＶの選択的ペッケージングのためであった。それらの結果は、最も効果的な分解が、二量体化の間、細胞内で生じ、宿主ヌクレアーゼによる野生型ＨＩＶ ＲＮＡの選択的破壊をもたらすことを示唆する。これは、ウィルス粒子中へのｃｒＨＩＶ ＲＮＡの選択的パッケージングを可能にする。
【０２５２】
ＨＩＶ治療のためへのｃｒＨＩＶベクターの適用は、ｃｒＨＩＶのゲノム選択にみならず、またｃｒＨＩＶ粒子を生成する細胞の細胞選択も包含することができる。他方では、野生型ＨＩＶを生成する細胞は、ｃｒＨＩＶ粒子を生成する細胞よりも選択的利点で野生型ＨＩＶ粒子を生成し、そして急速に卓越するであろう。選択的利点は、野生型ＨＩＶを発現する細胞よりも、生存性利点を有する。ｃｒＨＩＶ発現細胞（薬剤存在下で）を付与するｃｒＨＩＶゲノム（例えば、多重薬剤性遺伝子）中に１つの遺伝子を挿入することによって、ｃｒＨＩＶ発現細胞に付与され得る。それらの条件下で、野生型ＨＩＶ発現細胞は前進的に死亡するが、しかしまだ、いくらかの野生型ＨＩＶを生成し、ところがｃｒＨＩＶを選択的に生成するｃｒＨＩＶ発現細胞が存在する。
【０２５３】
残存する野生型ＨＩＶによるｃｒＨＩＶ含有細胞の感染は、ウィルス粒子を含むｃｒＨＩＶのさらなる生成をもたらすであろう。従って、ウィルスゲノムシフトは、ｃｒＨＩＶゲノムによるＣＤ４＋細胞の累積感染に起因し、それにより病原性野生型ＨＩＶ非病原性ｃｒＨＩＶゲノムへの宿主におけるウィルスバランスを変更する。そのような方法は、ＨＩＶゲノムのバランスが野生型ＨＩＶからｃｒＨＩＶに選択的にシフトすると、野生型ＨＩＶのクリアランスをもたらすことができる。ウィルス複製は、ｃｒＨＩＶは野生型ＨＩＶヘルパーゲノムの存在下で複製することができるので、結果的に停止する。従って、そのような相互に制限的条件下で野生型ＨＩＶを低めるのみならず、またＨＩＶ感染された宿主からウィルスをクリアランスすることが可能である。
【０２５４】
生成の手段：
ベクターは、細胞系、好ましくは良く知られている２９３Ｔ細胞中へのベクター及びヘルパーゲノムの過渡的トランスフェクションを用いることによって、又はパッケージング細胞系を用いることによって、相補性工程により生成され得る。好ましくは、細胞は、トランスフェクション試薬、好ましくはリン酸カルシウム、エレクトロポレーション又は脂質トランスフェクション試薬を用いて、高いトランスフェクション効率で過渡的にトランスフェクトされる。トランスフェクションが生じるとすぐに、ベクターは、トランスフェクションの後、１２時間〜７日で上清液から収穫される。ベクターは任意には、所望には、沈殿又は超遠心分離を伴なわないで、高速遠心分離により濃縮され得る。好ましい遠心分離条件は、約５０００〜１２，０００×ｇ、より好ましくは約１０，０００×ｇである。より好ましい条件は、４℃で一晩の遠心分離である。
【０２５５】
ベクター精製のための方法：
方法１：
１．ウィルスの上清液の透明化；
２．限外濾過による濃縮；
３．ベンゾナーゼ処理を伴なって又は伴なわないでのダイアフィルトレーション；
４．イオン−交換クロマトグラフィー；
５．サイズ排除クロマトグラフィー又はダイアフィルトレーション；
６．任意には、限外濾過による濃縮。
【０２５６】
方法２：
１．ウィルス上清液の透明化；
２．イオン交換クロマトグラフィー；
３．ダイアフィルトレーション又はサイズ排除クロマトグラフィー；
４．任意のベンゾナーゼ処理；
５．サイズ排除クロマトグラフィー又はダイアフィルトレーション；
６．任意には、限外濾過による濃縮。
異なった樹脂が、上記方法、例えばＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ ５０ＨＱのために使用され得る。中空繊維カートリッジが、限外濾過又はダイアフィルトレーション、例えばＡ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ からのカートリッジ（ＵＦＰ−７５０シリース）のために使用され得る。
【０２５７】
投与の手段：
本発明によれば、ベクターは、これまでに記載されるように、ウィルス感染のために遺伝子治療の必要な宿主細胞中に導入される。導入の手段は、本発明によれば、感染され得る宿主と、ウィルスとを接触することを含んで成る。好ましくは、そのような接触は、ベクターが宿主細胞中に導入されるいずれかの手段を含んで成り；前記方法は、いずれか特定の導入手段に依存せず、そしてそのような解釈されるべきではない。導入の手段は、当業者に良く知られており、そしてまた、本明細書に例示される。
【０２５８】
従って、導入は、例えばインビトロで（例えば、遺伝子療法のエクスビボ型方法で）、又はインビボでもたらされ得、そしてエレクトロポレーション、形質転換、形質導入、接合又は三親対合、トランスフェクション、感染、カチオン性脂質による膜融合、ＤＮＡ被覆されたマイクロプロジェクチルによる高速度衝撃、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、単一の細胞中への直接的マイクロインジェクション、及び同様のものの使用を包含する。他の方法もまた入手でき、そして当業者に知られている。
【０２５９】
しかしながら、好ましくはベクター又はリボザイムは、カチオン性脂質、例えばリボソームにより導入される。そのようなリボソームは、市販されている（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄにより供給されるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ， ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ及び同様のもの）。さらに、インビボで高められたトランスファー能力及び／又は低められた毒性を有するリポソーム（ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９５／２１２５９号において再考されるように）が、本発明において使用され得る。リポソーム投与に関しては、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９３／２３５６９号に同定される推薦に従う。一般的に、そのような投与に関しては、製剤は、３７℃で８時間以内に大部分のリンパ球により取り込まれ、そして注入された用量の５０％以上が、静脈内投与の１時間後、脾臓に検出される。同様に、他の供給ビークルは、ヒドロゲル及び調節された開放性ポリマーを包含する。
【０２６０】
宿主細胞中に導入されるベクターの形は、ベクターがインビトロで又はインビボで導入されるかどうかに一部依存して、変化することができる。例えば、核酸は、ベクターがゲノム外（すなわち、自律的に複製するベクターの場合）維持されるかどうかに依存して、環状に閉環され、ニック化され、又は線状化され、プロウィルス又はプロファージとして組み込まれ、過渡的にトランスフェクトされ、複製−欠損又は条件的に複製するウィルスの使用により過度的に感染され、又は二重又は１回の交差組換え現象を通して宿主ゲノム中に安定して導入され得る。
【０２６１】
宿主への導入の前、本発明のベクターは、治療及び予防処理方法への使用のために種々の組成物中に配合され得る。特に、ベクターは、適切な医薬的に許容できるキャリヤー又は希釈剤と組合すことにより医薬組成物に製造され、そしてヒト又は家畜適用のために適切であるよう配合され得る。
【０２６２】
従って、本発明の方法への使用のための組成物は、好ましくは、医薬的に許容できるキャリヤーと組合して、１又は複数の前記ベクターを含むことができる。医薬的に許容できるキャリヤーは、適切な投与方法である場合、当業者に良く知られている。キャリヤーの選択は、特定のベクター、及び組成物を管理するために使用される特定の方法により、一部決定されるであろう。当業者はまた、組成物の種々の投与路が利用でき、そして１よりも多くの経路が投与のために使用され得るが、特定の経路がもう１つの経路よりも、より即効性を提供することができることを理解するであろう。従って、本発明の組成物の広範囲の種類の適切な配合が存在する。
【０２６３】
本発明のベクターを、単独で又は他の抗ウィルス化合物と組合して構成される組成物が、非経口投与、好ましい腹腔内投与のために適切な配合物に製造され得る。そのような配合物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び意図された受容体の血液とを等張性にする溶質を含むことができる、水性及び非水性、等張滅菌注射用溶液、及び沈殿防止剤、溶解剤、増粘剤、安定剤及び保存剤を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液を包含することができる。配合物は、単位用量又は多用量密封容器、例えばアンプル及びバイアルに供給され、そして凍結乾燥される条件下で貯蔵され、使用の直前、滅菌液体キャリヤー、例えば水の添加により使用される。即座に注射できる溶液及び懸濁液は、本明細書において記載されるように、無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【０２６４】
ベクターは、所望により、いずれかの適切な溶液、緩衝液又は凍結乾燥形で貯蔵され得る。好ましい貯蔵用緩衝液は、ダルベッコリン酸緩衝液；水中、トレハロース（１：１）の１〜５０％溶液、好ましくは水中、トレハロース（１：１）の１０％溶液と共に混合されたダルベッコリン酸緩衝溶液（最終濃度は５％トレハロースである）；水中、グルコース（１：１）の１〜５０％溶液、好ましくは水中、グルコース（１：１）の１０％溶液と共に混合されたダルベッコリン酸緩衝溶液（最終グルコース濃度は５％である）；水中、トレハロース（１：１）の１〜５０％溶液、好ましくは水中、トレハロース（１：１）の１０％溶液と共に混合された２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−緩衝溶液（最終トレハロース濃度は５％である）；又は水中、マンニトール（１：１）の１〜５０％溶液、好ましくは水中、マンニトール（１：１）の５％溶液と共に混合されたダルベッコリン酸緩衝溶液（最終マンニトール濃度は２．５％）である。
【０２６５】
経口投与のために適切な配合物は、液体溶液、例えば希釈剤、例えば水、塩溶液、又は果物ジュースに溶解された有効量の化合物；固体又は顆粒として予定された量の活性成分をそれぞれ含むカプセル、サケット又は錠剤；水溶液での溶液又は懸濁液；及び水中、油エマルジョン又は油中、水エマルジョンから成ることができる。錠剤形は、１又は複数のラクトース、マンニトール、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、微晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化珪素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、保湿剤、保存剤、風味剤及び薬理学的に適合できるキャリヤーを含むことができる。
【０２６６】
吸入を通しての投与のために適切なエアロゾル配合物がまた製造され得る。エアロゾル配合物は、加圧された許容できる推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素及び同様のもの中に配置され得る。
同様に、経口投与のために適切な配合物は、風味剤、通常スクロース及びアカシア又はトウガカント中、活性成分を含んで成るロゼンジ形；不活性基材、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアにおいて活性成分を含んで成る香錠；及び適切な液体キャリヤーにおいて活性成分を含んで成るマウスウォッシュ；並びに活性成分の他に、当業界において知られているキャリヤーを含む、クリーム、エマルジョン、グル及び同様のものを包含する。
【０２６７】
局部投与のために適切な配合物は、クローム、軟膏又はローションの形で存在することができる。
直腸投与のための配合物は、例えばココアバター又はサリチレートを含んで成る適切な基材を含む坐剤として提供され得る。膣内投与のために適切な配合物は、活性成分の他に、当業界において知られているキャリヤーを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体又はスプレーとして提供され得る。同様に、活性成分は、コンドーム上の被膜として滑剤と組合され得る。
【０２６８】
本発明における、動物、例えばヒトに投与される用量は、感染された個人において、適切な時間にわたって治療応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、処理のために使用される特定ベクターの能力、疾病状態の重症度、並びに感染された個人の体重及び年齢により決定されるであろう。用量のサイズは、使用される特定のベクターの使用を伴なういずれかの副作用の存在により決定されるであろう。副作用を最少に維持することが、可能な場合いつでも、常に所望される。
【０２６９】
用量は、単位用量形、例えば錠剤又はカプセル形で存在することができる。用語“単位用量形”とは、本明細書において使用される場合、ヒト及び動物対象のための単位容量として適切な物理的に分離した単位を言及し、個々の単位は、前もって決定された量のベクターを、単独で又は医薬的に許容できる希釈剤、キャリヤー又はビークルと共に、所望する効果を生成するのに十分な量で計算された他の抗ウィルス剤と組合して含む。本発明の単位用量形についての規格は、使用される特定の化合物及び達成される効果、並びに宿主における個々の化合物に関連する薬物動力学に依存する。投与される用量は、“抗ウィルス有効量”、又は個々の患者において“効果的レベル”を達成するのに必要な量であるべきである。
【０２７０】
“有効レベル”とは、投与のための好ましいエンドポイントとに使用されるので、実際の用量及びスケジュールは、薬物動力学、薬剤分布及び代謝における個人の差異に依存して変化することができる。“有効レベル”とは、例えば化合物の臨床学的抗ウィルス活性について予測するアッセイにおいて、ウィルス、例えばＨＩＶを阻害する本発明の１又は複数のベクターの濃度に対応する、患者において所望される血液又は組織レベルとして定義され得る。本発明の化合物についての“効果的レベル”は、本発明の組成物がジドブジン又は他の既知抗ウィルス化合物又はその組合せと共に使用される場合、変化することができる。
【０２７１】
当業者は、個々の患者における所望の“有効レベル”を達成するために、使用される組成物の正確な配合物についての適切な用量、スケジュール及び投与方法を容易に決定することができる。当業者はまた、適切な患者サンプル（例えば、血液及び／又は組織）の直接的（例えば、分析化学分析）又は間接的（例えば、ウィルス感染の代理インジケーター、例えばＡＩＤＳ又はＡＩＤＳ様疾病の処理のためのｐ２４又は逆転写酵素による）分析により、本発明の化合物の“有効レベル”の適切なインジケーターを容易に決定し、そして使用することができる。
【０２７２】
さらに、ＡＩＤＳ又はＡＩＤＳ様疾病の処理のための患者における有効レベルの決定に関しては、特に適切な動物モデルが利用でき、そして種々の遺伝子療法プロトコールのＨＩＶに対するインビボ効率を評価するために広く実施されて来た（Ｓａｒｖｅｒなど． （１９９３ｂ）、前記）。それらのモデルは、マウス、サル及びネコを包含する。それらの動物がＨＩＶ疾病に対して天然において敏感でない場合でさえ、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ節、胎児肝臓／胸腺又は他組織により再構成されるキメラマウスモデル（例えば、ＳＣＩＤ、ｂｇ／ｎｕ／ｘｉｄ， ＮＯＤ／ＳＣＩＤ， ＳＣＩＤ−ｈｕ， イムノコンピテントＳＣＩＤ−ｈｕ， 骨髄−除去されたＢＡＬＢ／ｃ）が、ベクター又はＨＩＶにより感染され得、そしてＨＩＶ病原及び遺伝子療法のためのモデルとして使用され得る。同様に、サル免疫欠損ウィルス（ＳＩＶ）／モンキーモデルが、ネコ免疫欠損ウィルス（ＦＩＶ）／ネコモデルと同じように使用され得る。
【０２７３】
それらのモデルはまた、臨床試験のためのベクターシステムの評価のためにベクターの安全性を決定するために使用され得る。重要な適用は、生分布研究のためのそれらの動物モデルの使用である。形質導入された細胞、好ましくはベクターを含むヒト細胞（但し、これだけには限定されない）が、非ヒト動物モデル中に注入され、そしてベクターの安定性は動物組織におけるベクター遺伝子材料の不在により決定される。動物組織におけるベクター遺伝子材料の不在は、ベクターがヘルパー又は野生型ウィルスの存在を伴なわないで自律的に複製せず、そして従って、ヒトにおける臨床使用のために安全であると思われる。
【０２７４】
ヘルパーベクター又はヘルパーウィルスの不在下でのベクターの存在は、そのベクターが自律的に複製することが予測されない場合、安全性危険と思われる。しかしながら、ベクターが自律的に複製することが予測される場合、安全性についての他の基準、例えば一定の組織における複製の欠乏又は動物における複製のレベルが確立される必要がある。ベクターの存在又は不在は、ＰＣＲにより、又は試験されるベクターがＦＡＣＳにより可視化され得るマーカー遺伝子を発現する場合、ＦＡＣＳ分析により決定され得るが、しかしそのような検出手段に制限されない。
【０２７５】
一般的に、約５μｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日、特に約１０μｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与されるリボザイム（又はベクター）の組織濃度を達成するのに十分なベクターの量が好ましい。一定の適用、例えば局部、眼又は膣適用においては、複数回の毎日の容量が好ましい。さらに、用量の数は、供給の手段及び投与される特定ベクターに依存して、変化するであろう。
【０２７６】
何人かのウィルス感染された個々の処理においては、“メガ−用量”レジメを用いることが所望され、ここで大きな用量のベクターが投与され、化合物の作用を可能にし、そして次に、適切な試薬が活性化合物を不活性化するために個人に投与される。本発明の方法においては、処理（すなわち、処理されるウィルスと競争してのベクターの複製）は必ず制限される。換言すれば、例えばＨＩＶのレベルが低下するにつれて、ベクターのレベルは、ビリオンの生成のためのＨＩＶに依存して、また低下するであろう。
【０２７７】
医薬組成物は、ＡＩＤＳを治療的に処理するために使用される場合、本発明のベクターと共に他の医薬を含むことができる。それらの他の医薬は、それらの従来の態様で（すなわち、ＨＩＶ感染を処理するための剤として）、及びより特定には、インビボでのｃｒＨＩＶウィルスの選択方法において使用され得る。本明細書に記載されるようなそのような選択は、条件付で複製するＨＩＶ拡散を促進し、そして野生型ＨＩＶ病原性を必ず制限するであろう、野生型ＨＩＶとの条件つきで複製するＨＩＶのより効果的競争を可能にする。
【０２７８】
特に、抗レトロウィルス剤、例えば好ましくはジドブジンが使用されることが企画される。これまで記載されたそれらの他に使用され得るそれらの追加の医薬のさらなる代表的な例は、抗ウィルス化合物、免疫モジュレーター、免疫刺激剤、抗生物質及び他の剤、並びにＡＩＤＳを処理するために使用され得る処理レジメ（他の薬剤として認識されるそれらを包含する）を包含する。
【０２７９】
抗ウィルス化合物は、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ガンシクロビル、弗素化されたジデオキシヌクレオチド、非ヌクレオシド類似体化合物、例えばネビラピン（Ｓｈｉｈなど．， ＰＮＡＳ， ８８， ９８７８−９８８２ （１９９１））， ＴＩＢＯ誘導体、例えばＲ８２９１３（Ｗｈｉｔｅなど．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １６， ２５７−２６６ （１９９１））、及びＢＩ−ＲＪ−７０（Ｓｈｉｈなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ９０ （Ｓｕｐｐｌ． ４Ａ）， ８Ｓ−１７Ｓ （１９９１））を包含する。免疫モジュレーター及び免疫刺激剤は、種々のインターロイキン、ＣＤ４、サイトカイン、抗体調製物、血液輸血及び細胞移入を包含するが、但しそれらだけには限定されない。抗生物質は、抗真菌剤、抗菌剤及び抗−ニューモシスティス・カリニ剤を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２８０】
他の抗−レトロウィルス剤及び特に、既知のＲＴインヒビター、例えばｄｄＣ、ジドブジン、ｄｄＩ， ｄｄＡ， 又は他のＨＩＶタンパク質に対して作用する他のインヒビター、例えば抗−ＴＡＴ剤と共に、ウィルス阻害化合物の投与は一般的に、ウィルス生命周期のほとんどの又はすべての複製段階を阻害するのであろう。ＡＩＤＳ又はＡＲＣ患者に使用されるｄｄＣ及びジドブジンの投薬は公開されている。ｄｄＣの静ウィルス範囲は、一般的に、０．０５μＭ〜１．０μＭである。約０．００５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲は、ほとんどの患者において静ウィルス性である。
【０２８１】
経口投与についての用量範囲は、幾分広く、例えば０．００１〜０．２５ｍｇ／ｋｇが、２， ４， ６， ８及び１２、等の時間の間隔で、１又は複数回の用量で与えられる。好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重のｄｄＣが８時間ごとに与えられる。組合された治療において与えられる場合、他の抗ウィルス化合物は、本発明のベクターと同じ時点で与えられるか、又はその用量は所望により変更され得る。ベクターはまた、組成物に組合され得る。個々の用量は、組合して使用される場合、単独で使用される場合よりも低い。
【０２８２】
実施例
本発明の化合物及び方法は、次の例にさらに記載される。それらの例は、本発明をさらに例示するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
例１．
この例は、本発明の条件付で複製するコンピテントベクターの構成を記載する。特に、この例は、ＨＩＶ、すなわちｃｒＨＩＶベクターに基づいての条件付で複製するベクターの構成を記載する。
【０２８３】
ＨＩＶ−１病原の最も卓越した観点の１つは、ウィルスの遺伝的変異体の生成である。インビボでのＨＩＶ変異体の急速な生成は、そのウィルスがダーウィン遺伝モデルの骨格内にあると思われることを示す（例えば、Ｃｏｆｆｉｎ， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７６， １４３−１６４ （１９９２）； 及びＣｏｆｆｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７， ４８３−４８９ （１９９５） を参照のこと）。変異体は、ウィルスゲノムＲＮＡからの、新しく転写されたプロウィルスにおいて突然変異を創造する、ＨＩＶ−１逆転写酵素分子の非複製の結果である。
【０２８４】
従って、有意な妨害のなく、且つ多くの複製周期のインビボ条件下で、実質的変動が、多くのウィルス変異体の生成を生ぜしめる。さらに、野生型ＨＩＶは、そのような非制限条件下で、それは最高の選択的利点を有するので、まだ、卓越している。しかしながら、インヒビター、例えばジドブジンの存在下で、野生型株よりも高い選択的利点を付与され、そして従って卓越しているウィルス変異体が選択されるであろう（Ｃｏｆｆｉｎ （１９９２） 及び（１９９５）、前記）。これに基づけば、本発明は、病原性野生型ＨＩＶ−１よりも選択的利点を、非病原性ＨＩＶ−１ゲノムに対する条件付で複製するウィルスベクター方法に提供する。
【０２８５】
それらの非病原性、条件付で複製するＨＩＶ（ｃｒＨＩＶ）ベクターは、野生型ＨＩＶにより感染される細胞においてのみ複製及びパッケージングを受ける欠陥ＨＩＶである。ｃｒＨＩＶゲノムは、病原性野生型ＨＩＶウィルス負荷と競争し、そしてそれを低める。感染された宿主における野生型ＨＩＶウィルス負荷の低下の効果は、高められた生命予測を導くべきである。それはまた、感染されていない個人に野生型ＨＩＶを伝達する、感染された宿主の能力を低めるべきである。野生型ＨＩＶ−１とｃｒＨＩＶとの都合良い競争のためには、次の２種の因子が重要であると思われる：（１）野生型ＨＩＶゲノム以上のｃｒＨＩＶゲノムの選択的利点、及び（２）野生型ＨＩＶを発現する細胞以上のｃｒＨＩＶ発現細胞の選択的利点（すなわち、野生型ＨＩＶを発現する細胞以上のｃｒＨＩＶ発現からのｃｒＨＩＶビリオンの生成についての選択的利点）。
【０２８６】
ｃｒＨＩＶベクターは、それらがＲＮＡ発現、二量体化及びパッケージングのために必要とされる配列を含むが、しかし機能的（すなわち、野生型）ＨＩＶ−１タンパク質を発現しない事実のために、条件付で複製する。選択的利点は、野生型ＨＩＶゲノムのＵ５領域において分解するが、しかしｃｒＨＩＶ Ｕ５ ＲＮＡにおいては分解しないリボザイムカセットを挿入することによって、ｃｒＨＩＶベクターに与えられる。
【０２８７】
ベクターに存在するリボザイムは、ｃｒＨＩＶ ＲＮＡのＵ５領域がそれらの部位の効果的結合及び分解からリボザイムを妨げるために、保存された塩基置換（他のＨＩＶ株に存在する塩基置換）により修飾されているので、ｃｒＨＩＶ ＲＮＡを分解しない。さらに、ｃｒＨＩＶは、それらがＣＤ４＋細胞死を担当すると思われるタンパク質をコードしていないので、非病原性である。ＨＩＶ感染された細胞（ｃｒＨＩＶベクターによりトランスフェクトされている）が活性化される場合、その細胞はｃｒＨＩＶゲノム死を補充することができるようにない、ｃｒＨＩＶ子孫ビリオンの生成をもたらす。
【０２８８】
一般的に、ｃｒＨＩＶゲノムを、十分な長さの感染性ＨＩＶクローン、すなわちｐＮＬ４−３ （Ａｄａｃｈｉなど． （１９８６）， 前記） から構成した。すべてのクローニング反応、及びＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質操作を、当業者に良く知られており、そして例えばＭａｎｉａｔｉｓなど．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ． （ｃａｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ （１９８２）） により記載される方法を用いて行った。それらの反応に使用される酵素及び試薬を、商業的供給者（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ． ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ． ； 及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｃ．， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ．）から得、そして製造業者の推薦に従って使用した。されに、ベクター維持及び増殖を、通常知られており、そしてこれまで記載された（例えば、Ｄｒｏｐｕｌｉｃ’ など． （１９９２）， 前記；及びＤｒｏｐｕｌｉｃ’など． （１９９３）、前記）、技法を用いて行った。
【０２８９】
ｐＮＬ４−３を、酵素Ｐｓｔ Ｉ （転写の開始から＋１０００の位置で、ｇａｇにおいて分解する）、及びＸｈｏＩ（転写の開始から＋８４００の位置で、ｎｅｆにおいて分解する）により分解し、そして便利な制限部位を含むポリリンカーを挿入した。Ｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）を含む、０．８６ｋｂのＢｇｌ ＩＩ〜ＢａｍＨＩフラグメントを、ポリリンカーに存在するＢａｍＨＩ部位中にクローン化した。それらの操作は、ｇａｇコード領域〜Ｕ３コード領域内のＨＩＶ野生型ゲノムの欠失（すなわち、従って、ｎｅｆ遺伝子の欠失）をもたらした。ベクターは切断されたｇａｇ転写体を生成することができるが、十分な長さの機能的Ｇａｇタンパク質はベクターによっては生成されない。しかしながら、野生型Ｇａｇ機能が本発明によって不必要である限り、ｇａｇ配列は、Ｇａｇタンパク質の翻訳を妨げるために突然変異誘発され得る。
【０２９０】
本発明に記載されるような単一又は複数のリボザイムを含むリボザイムカセットを、ＢａｍＨＩ部位から下流のＳａｌ Ｉ部位中に挿入した。これを達成するために、リボザイム配列をコードする相補的デオキシオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングし、そして次に、Ｓａｌ Ｉ部位中にクローン化した。ｃｒＨＩＶベクターの構成のために使用されるリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムであった。それらのリボザイムは２２個の塩基対から成る触媒ドメイン、及びそれぞれ９個の塩基対から成る２種のハイブリダイゼーションドメインを含んだ。リボザイムを、Ｕ５ ＲＮＡ配列の＋１１５又は＋１３３部位（すなわち、転写の開始から下流の塩基対の番号に対応する）のいずれかに標的した。
【０２９１】
＋１１５部位及び＋１３３部位に標的化されたリボザイムのハイブリダイゼーションドメイン及び触媒ドメイン（下線）は次の通りである：
ＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＡ（“＋１１５リボザイム”）配列番号３；及び
ＡＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＣ（“＋１３３リボザイム”）配列番号４。
【０２９２】
リボザイムカセットは、タンデムに配置された単一、二重又は三重リボザイムのいずれかから構成された。単一又は三重リボザイムを含むベクターを容易に構成し、そし位置＋１１５でＵ５ ＨＩＶ ＲＮＡの同じ部位に標的化することができる。二重リボザイムを含むベクターを容易に構成し、そしてＵ５ ＨＩＶ ＲＮＡの位置＋１１５での同じ部位、又は位置＋１１５及び＋１３３での異なった部位のいずれかに標的化することができる。
【０２９３】
ベクターの構成を完結するために、ｃｒＨＩＶベクターを、ｃｒＨＩＶのＵ５領域内に存在するハンマーヘッドリボザイムにより認識される部位を突然変異誘発することによって、リボザイム分解（すなわち、ＲＮＡとしてのそれらの表示において）に対して耐性にした。これを達成するために、図２の配列番号２に示される塩基置換を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（すなわち、ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣ配列番号１３）を、ベクター中に修飾された部位を導入するために使用した。特に、塩基置換を、塩基対１１５及び１３３でのリボザイムハイブリダイゼーション及び分解部位中に構築した。
【０２９４】
特に、図２に示されるように、突然変異を、塩基対１３３， １１４， １３２， １３４及び１４２で導入した。それらの部位を、いずれかの突然変異を包含するよう修飾することができる（すなわち、ＧＴＧＴＧＣＣＣＮＮＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＮＡＮＣＴＡＧＡＧＡＮＣ（ここでＮはいずれかの変異ヌクレオチドである）、配列番号１４）。しかしながら、好ましくは、配列を、例えば、部位＋１１３でのＧからＡへの置換（すなわち、配列はＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣ配列番号１５を包含する）；部位＋１１４配列番号５でのＵ（すなわち、ＤＮＡ配列番号によればＴ）からのＣへの置換；部位＋１３２配列番号６でのＵ（すなわち、ＤＮＡ配列によればＴ）からＣへの置換；部位＋１３４でのＡからＧへの置換（すなわち、配列は、ＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＧＣＴＡＧＡＧＡＴＣ配列番号１６を包含する）；及び部位＋１４２でのＵ（すなわち、ＤＮＡ配列によればＴ）からＡへの置換（突然変異は単独で又は組合して行われ得る）が存在するよう突然変異誘発する。
【０２９５】
特に、他のＵ５突然変異の不在下で、ｃｒＨＩＶ ＵＳ ＲＮＡにおける部位＋１１４配列番号５及び／又は部位＋１３２配列番号６でのＵ（すなわち、ＤＮＡ配列によればＴ）からＣへの置換は、リボザイムによりその切断を妨げる（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７）， 前記）。挿入された塩基−置換は、ＨＩＶの種々の他の株に存在し（Ｍｙｅｒｓなど．， ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔ． Ｌａｂ． （１９９４））、このことは、それらの置換がＨＩＶゲノムの複製機能を低めないことを示す。
【０２９６】
本発明に示されるような方法は、例えば異なったウィルスゲノム（例えば、異なったＲＮＡウィルス）からなるか、又は異なった遺伝的抗ウィルス剤から成る、他の条件付で複製するベクターを構成するために使用され得る。さらに、条件付で複製するベクターは、野生型ウィルスを含む宿主細胞よりも選択的利点を、ベクターが導入される宿主細胞に付与するためにさらに修飾され得る。例えば、そのようなベクターは、多重薬剤耐性、又は突然変異誘発されたプロテアーゼ又は逆転写酵素をさらにコードするようり修飾され得る。
それらの方法はもちろん、本明細書に記載される種々のヘルパーベクター構成体を構成するために使用され得る。
【０２９７】
例２．
この例は、条件付で複製するベクター及び特にｃｒＨＩＶベクターのリボザイム分解に対する耐性を記載する。
ｃｒＨＩＶベクターのリボザイム分解に対する耐性を確かめるために、インビトロ転写を行った。これを達成するために、リボザイム配列を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ．） のＸｈｏＩ部位中にクローン化した。突然変異誘発されたｃｒＨＩＶ Ｕ５領域を含む、０．２１キロ塩基対（ｋｂ）のＢｇｌ ＩＩフラグメントを同様に、ｃｒＨＩＶベクターから切除し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩのＢａｍＨＩ部位中に挿入した。得られる修飾されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩベクターを、インビトロ転写の前、ＢａｓｓＨＩＩにより線状化した。野生型ＨＩＶ Ｕ５ ＲＮＡ （Ｍｙｅｒｓ など． （１９９４）， 前記に記載される）を発現する類似するプラスミドを、対照として使用した。それを、インビトロ転写の前、ＥｃｏＲＩにより線状化した。
【０２９８】
放射性ラベルされたＵ５ ＨＩＶ ＲＮＡ及びリボザイムＲＮＡを、これまで記載のようにして（Ｄｒｏｐｕｌｉｃ’など． （１９９２）， 前記）、ベクターのインビトロ転写により生成した。放射性ラベルされた転写体を、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５， ６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのスペルミジン及び１０ｍＭのＮａＣｌを含む１×転写緩衝液において一緒に（１：２のモル比での標的物：リボザイム）インキュベートした。サンプルを６５℃に加熱し、そして次に、９５％ホルムアミド、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のブロモフェノールブルー及び０．０５％キシレンシアノールＦＦを含む停止緩衝溶液の添加の前、３７℃に５分間にわたって冷却した。次に、生成物を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分解し、そしてオートラジオグラフィーにより検出した。
【０２９９】
野生型Ｕ５−ＨＩＶ ＲＮＡが部位＋１１５側に単一のリボザイムを含む転写体と共にインキュベートされる場合、分解は容易に観察された。そのそのような分解は、生成物Ｐ１及びＰ２をもたらす。分解はまた、野生型ＨＩＶ ＲＶＡが同じ部位又は異なった部位側の二重リボザイムを含むＲＮＡと共にインキュベートされる場合に見出され得る。２種の異なった部位に方向づけられる、リボザイム含有転写体が野生型ＨＩＶ ＲＮＡと共にインキュベートされる場合、生成物Ｐ１、Ｐ２及びＰ３が生成された。Ｐ３は、＋１３３部位での分解に起因する。
【０３００】
比較すると、修飾されたＵ５−含有ｃｒＨＩＶ ＲＮＡが、＋１１５部位に方向づけられた単一のリボザイム、又は＋１１５部位又は＋１３３部位のいずれかに方向づけられた二重リボザイムと共にインキュベートされる場合、分解生成物は検出され得なかった。従って、それらの結果は、ｅｒＨＩＶ Ｕ５ ＲＮＡはリボザイムに対して耐性であるが、ところが野生型ＨＩＶ−Ｕ５ ＲＮＡは抗−ＵＳリボザイムにより分解されることを確かめる。さらに、前記結果は、本発明のアプローチが、野生型ウィルス株に比較して、宿主細胞中に導入される場合、複製のための選択的利点を、条件付で複製するベクター（ｃｒＨＩＶベクター以外のベクターを包含する）に付与するために使用され得ることを確認する。
【０３０１】
例３．
この例は、本発明のヘルパーベクター構成体の生成におけるキー段階を手短に説明する。特にことわらない限り、種々のレトロウィルス要素をコードする核酸配列を、公的な入手源から得た。すべての記載される段階は、必要なら誤りを検出し、そして補正を指図するために完全なコード領域の配列決定を必要とした。
【０３０２】
ｔａｔ配列を縮重し、そして抗−ｔａｔリボザイムによるその標的化を可能にするために、プラスミドｐＴＡＴを、抗−ｔａｔリボザイムカセットのための標的化部位を含むよう、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ からのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを用いて突然変異誘発した。続いて、突然変異誘発されたｔａｔ配列を、ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎからのｐＭＧプラスミドに基づいて、発現ベクター中にクローン化した。ｔａｔ配列を、ＮｃｏＩ部位を用いて、最初のＡＴＧでＩＲＥＳに融合せしめた。ベクターをさらに、アンピシリン耐性遺伝子及び複製のＳＶ４０起点を含むよう修飾した。
【０３０３】
ＨＩＶ−１ｒｅｖ及びＲＲＥ要素を含む配列を、ｐＮＬ４−３からＲＲＥと一緒にｒｅｖの第３エキソンを切除することによって得、そしてｐＬＩＴＭＵＳ３８プラスミド中にクローン化した。第２エキソン及びＢａｍＨＩ部位までの第３エキソンの一部を含む、ヌクレオチド２０８までのｒｅｖ配列を、ＥＴＲ及びＰＣＲを用いて、３個の合成ヌクレオチドからアセンブルした。ＰＣＲ生成物をｐＵＣ１８中にクローン化し、そして次に、ｐＬＩＴ／ＲＲＥｒｅｖ３中にサブクローン化した。ｒｅｖの２種の断片を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを用いて、融合した。ＨＩＶ−２からのＲＲＥを、ＨＩＶ−１ ＲＲＥにより置換し、そして両構成体を、ｇａｇ／ｐｏｌ／Ｚｚベクター中にクローン化した。縮重されたｒｅｖ配列をまた、ベクター、例えばｐＶＩＲＰａｃ−２のためのパッケージング構成体中にサブクローン化するために直接的に使用した。
【０３０４】
パッケージングのために必要とされ、そしてベクタープラスミドの一部であるべきである、ｇａｇの最初の４２個のヌクレオチドを縮重するために、ｐＮＬ４−３からのＢｓｓ ＨＩＩ／ＳｐｅＩフラグメントを、ｐＬＩＴＭＵＳ３８中にサブクローン化した。ｇａｇ配列を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅキットを用いて縮重し、その結果、パッケージングシグナルのすべての成分を排除し、そしてＨＩＶ主要スプライスドナーを、ｇａｇの最初のＡＴＧコドンの前に再挿入した。縮重されたｇａｇを、連続ｇａｇ配列を形成するために、５’ＬＴＲの代わりに、Ｄｒ． ＣｏｎｄｅからのｐＮｇｐプラスミド中にサブクローン化した。
【０３０５】
この得られる構成体は、ｖｉｆタンパク質を発現するために使用される、スプライス受容体（ＳＡ）及びスプライスドナー（ＳＤ）配列を含む。このスプライシングは、スプライスされたレトロウィルス（条件付で複製する）ベクターＲＮＡの可能な分解、及びパッケージングされた形質導入ベクターの力価の低下のために所望されない、スプライスされたｍＲＮＡにおけるリボザイムカセットの存在をもたらすことができる。オーバーラッピングＰＣＲが、ＳＡ及びＳＤ配列を突然変異誘発するために使用された。ＰＣＲ生成物を、ｇａｇ／ｐｏｌ構成体中に挿入し、クローン化し、続いて、抗−Ｕ５リボザイムカセット及びｒｅｖ及びＲＲＥ要素を挿入した。
【０３０６】
水疱性口内炎タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）ｅｎｖタンパク質を、ｐＭＧ−ｔａｔベクターの最初のＭＣＳ中にクローン化し、エンベロープ発現カセットを生成した。クローニング段階をさらに単純化するために、ＶＳＶ−Ｇを、ブラント末端化されたフラグメントとして、クレノウポリメラーゼによりフィルインされたＢｇｌ ＩＩ中にクローン化した。複製のＳＶ４０起点（ｏｒｉ）を有する構成体を生成した。ヘルパーベクターとしてパッケージングプラスミドを決定的にするために、ｒｅｖ配列を第２ＭＣＳ中にサブクローン化した。得られるプラスミドを、ｐＶＩＲＰＡＣ−２と命名した（図６を参照のこと）。
【０３０７】
いくつかのパッケージングプラスミドからヘルバーベクターを生成するために、ｇａｇ／ｐｏｌ／Ｒｚ／ＲＲＥ／ｒｅｖカセットを、ｐＭＧ−ｔａｔ−Ｇプラスミド（ＳＶ４０ｏｒｉを有さない）中にサブクローン化した。ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２のいずれかからのＲＲＥを有する構成体を製造した（図６におけるｐＶＩＲＰａｃ−１及び１．２Ｒｚ）。リボザイム機能を試験するための対照として、リボザイムカセットを、最終ＨＩＶ−２ ＲＲＥ含有構成体において欠失せしめ、ｐＶＩＲＰａｃ−１．２を生成した。最終的に、スプライシング機構中へのｇａｇ／ｐｏｌ ＲＮＡの強制がレトロウィルス（条件付で複製する）ベクターゲノムＲＮＡの分解を妨げることができる仮説を試験するために、β−グロビンからのイントロンを、ＳＶ４０ポリＡシグナル（ｐＶＩＲＰａｃ−１．２ＲｚＩｎ）の前に挿入した。もちろん、本発明の他の態様においては、挿入されたイントロンは、ＨＩＶ、好ましくは細胞スプライシング機構（例えば、スプリセソーム）中へのＲＮＡの方向付けを確保された完全なＨＩＶイントロンから誘導される。
【０３０８】
例４．
この例は、種々のヘルパーベクター構成体の効力を記載する。過渡的トランスフェクションによるレトロウィルスベクター生成のための標準化されたプロトコールを、それらの実験に使用した。プラスミドＤＮＡの多量生成物を、既知の技法を用いて生成した。ウィルスを生成するために、２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム方法を用いて、レトロウィルスベクター及びヘルパーベクタープラスミドにより同時トランスフェクトした。細胞上清液を、トランスフェクションの後、約４０時間で集め、０．４５μｍの注射器フィルターを通して濾過し、そしてＨＴ１０８０細胞上で滴下した。ベクター力価を、感染の約７２時間後、流動細胞計測法により測定されたその形質導入効率に基づいて計算した。任意式Ｎ＊４００，０００＊（ここでＮは形質導入された細胞画分であり；４００，０００は感染の時点での細胞のおおよその数であり；そしてＦは希釈因子である）を、力価計算のために使用した。
【０３０９】
レトロウィルスベクターに基づくＨＩＶ−１との組換えに基づいてＲＣＶを生成する可能性を低めることによってヘルパーベクターの安全性を増強するために、抗−Ｕ５リボザイムカセットを、一定のヘルパーベクター構成体中に挿入した。リボザイムを切断し、そしてビリオン中に同時パッケージングされる場合、レトロウィルスベクターＲＮＡを破壊する。しかしながら、リボザイムはまた、生成体細胞内のベクターＲＮＡを分解し、従ってウィルス生成を妨げることが可能である。安定性をさらに高めるために、ヘルパー構成体は、ウィルス粒子中に同時パッケージングされるヘルパー及びベクターの傾向をさらに低めるために、ＲＲＥ−２要素を含んだ。それらのヘルパーを、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰベクターをパッケージングするために使用した。
【０３１０】
図７に示されるように、ヘルパー構成体上でのリボザイムの存在は、ベクター力価に対してほとんど効果を有さなかった。重要なことには、ベクターＲＮＡから離れて、ヘルパーＲＮＡの細胞トラフィッキングに影響を及ぼすイントロンを含むヘルパー構成体（ｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎ）はまた、ベクター力価に対して有意な効果を有さなかった。ベクター力価は、従来の３−プラスミドトランスフェクションシステムを用いて得られた力価に匹敵するこの２−プラスミドシステムを生成した。ヘルパー構成体、すなわちｐＶｉｒＰａｃ１．１を含むＲＲＥ−１による類似する実験は、５倍低いパッケージング効率を示した。従って、ヘルパーベクター構成体中へのＲＲＥ−２の組み込みは、相同組換えの可能性を低めることによってその安定性を高めるのみならず、また、思いがけなく、パッケージングの効率を高めた。
【０３１１】
例５．
この例は、ＨＩＶ−ＬＴＲスプライスされたｍＲＮＡからのＭＧＭＴ遺伝子の発現が、ＢＧ及びＢＣＮＵによるＭＧＭＴ形質導入された細胞の効果的選択のために十分であるかどうかを試験する。図１０Ａは、使用されるベクターを示す。図１０Ｂは、殺細胞濃度のＢＧ／ＢＣＮＵの存在下での効果的細胞生存性及び拡張を示す。後者の名称は次の通りである：Ｍ， ＭＧＭＴ； Ｉ， ＩＲＥＳ； Ｇ， ＧＦＰ； Ｗ， Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ後−転写要素；及びＣ， ＣＭＶプロモーター。すべての上記要素を、スプライス受容体部位が遺伝子挿入部位から近位に位地するので、ＲＲＥ要素の３’側のいずれかの遺伝死がスプライスされたｍＲＮＡから発現されるよう、ＲＲＥ要素の下流のｐＮ１ベクター中にクローン化した。図は、レンチウィルスベクター（“ＣＧＦＰ”）により形質導入されなかった対照細胞は拡張も又は生存もしなかったが、ＭＧＭＴを発現するすべてのベクターは生存し、そして拡張したことを示す。
【０３１２】
ｐＮ１ＣＧＩＧにより形質導入された細胞は１４週後に死亡したが、ところがｐＮ１ＭＣＧにより形質導入された細胞は２１週後に死亡した。重要なことには、ｐＮ１ＭＩＧ及びｐＮ１ＭＩＧ−Ｗにより形質導入された細胞は２９週後、生存しており、このことは、挿入された内部ポロモーターを有さないベクターにより形質導入された細胞の長期生存性を示す。
【０３１３】
驚くべきことには、ＨＩＶ−ＬＴＲスプライスされたｍＲＮＡからのＭＧＭＴを発現するベクターを、非常に効果的に選択した。ＭＧＭＴの発現は、ＭＧＭＴ又は選択遺伝子のいずれかに負荷遺伝子の範囲を制限しない。それらの結果は、いずれかの遺伝子がＴ細胞におけるＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターから発現され得ることを示す。類似するデーターが非−Ｔ細胞において得られており、このことは、ＨＩＶ−ＬＴＲスプライスされたｍＲＮＡからの遺伝子の発現が多くの細胞型において遺伝子の発現のためにスプライスされ得たことを示す。
さらに、“ＭＩＧ”構成体のブシストロン性質は、複数の遺伝子が、ＩＲＥＳにより結合される場合に発現され得ることを示す。上記以外の例は、ケモカイン、インターフェロン又は他の遺伝的抗ウィルス剤によるＭＧＭＴ又は他の選択を包含する。
【０３１４】
例６．
ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＢＣ又はＢＣＮＵに対するそれらの感受性について試験した。ＣＤ１４消耗されたＣＤ４＋細胞を、末梢血液から、サイトカイン移動を伴なって又はそれを伴なわないで精製した。細胞を、ＢＣ及びＢＣＮＵ処理の前、４〜７日間、３μｇ／ｍｌのＩＬ−２において培養した。ＢＦＧ及びＢＣＮＵの不在下での適切な条件下で、ＣＤ４＋細胞を、培養において１０日間にわたって１００倍まで拡張した。試験される用量は、０， ０．２， ０．５， ２， ５， １０， ２０， ３０及び４０μＭのＢＣ、及び０， ２， ５， １０， ２０， ３０及び４０μＭのＢＣＮＵであった。一連の３回の実験を行った。
【０３１５】
図１１は上記からの代表的な結果を示す。拡張は、１０μＭのＢＣ及びμＭのＢＣＮＵ処理の後、２０倍に低められ、そして２０μＭ又はそれ以上のＢＣＮＵ処理の後、約１０倍又はそれ以下に低められた。ＢＣＮＵによるＣＤ４＋細胞の処理は、成長遅延をもたらさなかった。従って、上記例に使用されるＳｕｐ Ｔ１細胞とは異なって、ＣＤ４＋細胞は、単独での低用量のＢＣＮＵに対しては敏感ではない。これは、ＭＧＭＴ発現における変動がＴ細胞ドナー間での変動に基づいて予測されるが、高いＭＧＭＴ発現性一次ＣＤ４＋細胞を示す。
【０３１６】
ＢＧ及びＢＣＮＵの両者の１０μＭ又はそれ以上での存在がＣＤ４＋細胞の感作で最良であり、そして０．５μＭでのＢＧ及び１５μＭ又はそれ以上でのＢＣＮＵは同様に前記細胞を感作した。ＢＧ用量の上昇は、細胞殺害を高めなかったが、但しＣＤ４細胞に対する毒性はＢＣＮＵの用量と共に上昇した。
図１１に示されるように、選択のレベルは一般的に、基線２０％から１００％まで５倍に上昇した。１つの実験においては、選択率は３％〜９０％であった。１０〜１００倍の拡張が、選択及び１週の後、見出され；２０〜４００倍の拡張が、２．５倍の選択レベルで見出され、平均拡張は８０倍であった。
【０３１７】
例７．
これまでの研究は、自己由来の移植後、改良された疾病フリーの生存性を有する骨髄自己移植片のパージング間での相互関係を示唆する。また、自己由来の移植片からの正常Ｔ細胞のパージングは、対宿主性移植片病の危険性を低めるために使用された。図１３Ａは、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＡＳｅｎｖＧＦＰを用いての１回の形質導入による腫瘍細胞の形質導入の効率を示す。図１３Ｂは、腫瘍細胞は、ＣＤ３４＋幹細胞が１回の形質導入の後、有意な形質導入を示さないので、前記ＣＤ３４＋幹細胞よりも選択的且つ有効的に殺され得ることを示す。
【０３１８】
自己由来の骨髄からの腫瘍細胞のパージングへの上記の適用は、骨髄の収穫又は末梢血液幹細胞の収集で開始する。ＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３４抗体カラムを通して精製し、そして次に、条件付で複製するベクターにより、２〜４００のＭＯＩで２〜１６時間、形質導入する。細胞を任意には、１又は複数の細胞活性化因子、例えばサイトカインの存在下でインキュベートし、細胞の形質導入又は維持を助ける。次に、細胞を、処理される対象に移す。
【０３１９】
自己由来の移植片におけるＴ細胞を同様に標的化する能力は、Ｔ細胞を選択的に形質導入するために、アトニー事件を整理番号３９７２７２０００４００号として２０００年８月３１日に出願された同時継続アメリカ特許出願（まだ、割り当てられていない）における高い効率の安定した形質導入プロトコールと組合して、条件付で複製するベクターを使用する。
【０３２０】
例８．
図１４（パネルＢ）は、種々のエンベロープタンパク質による本発明のＨＩＶ−１ベクターの効果的偽性型分類を示す。
ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質により偽性型分類されたレンチウィルスベクターにより類似する初期力価は、高速遠心分離又はダイアフィルトレーションのいずれかを用いての精製を通して効果的に高められ得る。ベクターｐＮ１ （ｃＰＴ２） ＡＳｅｎｖＧＦＰを、ｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ２によりパッケージングした。下記表は、（ａ）サンプルにおける合計タンパク質、（ｂ）サンプルにおけるベクター力価、及び（ｃ）サンプルにおける外来性材料からのベクターの精製（倍率）を示す。
【０３２１】
【表１】
2004524813.tif 000002
【０３２２】
表から見出されるように、細胞残骸の透明化の後、ベクター上清液サンプルにおける合計のタンパク質は３０２７ｍｇであり、そしてその段階でのベクター力価は、５．９×１０６である。次に、サンプルは、限外濾過による濃縮を受け、この時までに、このサンプルにおける合成タンパク質は７２２ｍｇであり、そしてベクター力価は８．２×１０７に上昇し、６１．７倍の精製を伴なう。限外濾過による濃縮の後、サンプルをダイアフィルトレーションされ、この時までに、このサンプルにおける合計タンパク質はさらに、２２４ｍｇに低められ、そしてベクター力価は６．８×１０８／ｍｌに高められ、１６５０倍の精製を伴なう。これは、非ベクター外因性タンパク質が除去され、そしてＶＳＶ−Ｇにより偽性型分類されたレンチウィルスベクターが上記プロトコールを用いて精製され得ることを示す。
【０３２３】
上記のことは、図１６に示されるように、約１０１０の力価を生成するＨｅｌａ−ｔａｔ細胞系において生成されるベクターと組合して使用され得る。
【０３２４】
例９．
条件付で複製するベクターを偽性型分類するための他のヘルパー構成体は、Ｒｅｖ−依存性制御下にＶＳＶ−Ｇ発現を配置することによって開発されて来た。ＲＲＥ−含有ｍＲＮＡはＲｅｖの不在下で発現されないので、それらは、ｇａｇ／ｐｏｌ， ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子内に存在するシス抑制配列（ＣＲＳ）の存在のために欠陥性であることが推定された。ＣＲＳは、核におけるｍＲＮＡを閉じ込め、ｍＲＮＡを不安定化するか、又はリボソームとｍＲＮＡとの結合を妨げることが報告されている。従って、ｍＲＮＡスプライシングと組合される、トランスで供給されるＣＲＳ及びＲｅｖの存在は、遺伝子発現を調節するために使用され得る。
【０３２５】
Ｒｅｖ／ＲＲＥ／ＣＲＳシステムを用いて、Ｒｅｖ−依存性態様でＶＳＶ−Ｇ発現を制御した。このアプローチのためのヘルパー構造体は、５’スプライスドナー部位；ＨＩＶ−２ＲＲＥ及び３’スプライス受容体部位（好ましくは、ｔａｔ／ｒｅｖのための）；ＨＩＶ−１に基づくベクターとの組換えの傾向を低めるためのＨＩＶ−２ ｐｏｌ領域からのＣＲＳフラグメント；及びに任意には、いずれかの誘発性プロモーターの代わりの非誘発性プロモーター、例えばＣＭＶ直前（ＩＥ）プロモーターを含む。ＶＳＶ−ＧコードのＲＮＡは、誘発を伴なわないで生成されるが、スプライシングされていないＲＮＡのみがＲｅｖを伴なわないで細胞質に輸送され、そして発現され得るので、Ｒｅｖの存在により調節される。ＶＳＶ−Ｇ発現は、ＲｅｖがｍＲＮＡスプライシング及びＣＲＳにより制御される転写体の核残留を防げるので、Ｒｅｖ介在性のまま存在する。
【０３２６】
好ましくは、スプライスドナー部位は、合成５’β−グロビンドナー部位ではないが、しかし生来のＨＩＶ、又はＨＩＶ類似体、スプライスドナー部位である。ＨＩＶ−２ ＲＲＥは、ＨＩＶ−２ ＲＲＥ， 及びＴａｔ／Ｒｅｖのためのスプライス受容体部位の両者を含む２８０ｂｐのフラグメントであり；そしてＣＲＳはＨＩＶ−２ ｐｏｌ配列からの５５０ｂｐの内部フラグメントである。ＨＩＶ−２からのＣＲＳ及びＲＲＥ要素は、ＰＣＲにより調製され得る。そのようなヘルパー構成体の非制限例は、ｐＣＧＣＲＳＲＲＦ， ｐＣＧＣＲＳＲｚＲＲＥ， 及び図１５Ａ−１５Ｅに示される他のものを包含する。最終プラスミド構成体は、多重制限酵素消化により確かめられた。ｐＥＨ−ＧＰ及びｐＣＭＶ−ＧＰは、ｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質を構成的に発現する構成体であるが、レンチウィルス又はＨＩＶプロモーターを包含する他のプロモーターが、所望により使用され得る。
【０３２７】
図１７は、ＶＳＶ−ＧのＲｅｖ依存性発現のためへの多くの異なったスプライスドナー組合せの使用からの結果を示す。示されるように、テトラサイクリンの除去は、Ｒｅｖ依存性発現をもたらす。
スプライス−ドナー部位組合せ及びコンセンサス配列の追加の例が下記に提供される。すべてが使用され得るが、ＨＩＶ主要、ＨＩＶ−１ｅｎｖ、ＨＩＶ−２主要、及び類似体スプライス−ドナー組合せが好ましい。
【０３２８】
2004524813.tif 000003
【０３２９】
例１０．
使用の前、ベクターの貯蔵のための適切な条件を同定するために、種々の貯蔵緩衝液及び条件を試験した。その結果は図１８に示されている。ベクター回収の有意な損失を伴なわないで、−２０℃で及び医薬的許容できる緩衝液においてベクターを貯蔵する能力は、使用の前、ベクターの維持において莫大な利点のものであろう。もちろん、他の医薬的に許容できる組成物における、約−８０℃、約−２０℃、及び約４℃でのベクターの貯蔵はまた容易に実施され得る。
【０３３０】
例１１．
この例は、本発明の実施への使用のためのキメラＨＩＶ ＣＴＬエピトープのアミノ酸配列を記載する。配列は、翻訳を開始するための第１メチオニン（Ｍ）、続いて、それぞれｐ１７， ｐ２４， ｐ１５， ｐｏｌ， Ｒｅｖ， ｇｐ１２０ｅｎｖ， ｇｐ４１ｅｎｖ及びｎｅｆに対応する種々の連続副配列を含む。
【０３３１】
【表２】
2004524813.tif 000004
【０３３２】
例１２．
この例は、上記に記載されるような本発明の態様の要素を提供する。本発明は、発現される１つの遺伝子（又は他の核酸）、及び１又は複数の第１ヌクレオチド配列を含んで成る、条件付で複製するウィルスベクターを包含し、ここで前記ベクターは、（ａ）野生型ウィルス株、ヘルパーウィルス、又はヘルパーベクターとの相補性に基づいてのみ宿主細胞において複製し、それらの個々は前記１又は複数の第１ヌクレオチド配列の存在に対して敏感であり；（ｂ）前記１又は複数の第１ヌクレオチド配列に対して耐性であり、そして（ｃ）複製コンピテントベクターを生成する傾向を低める、１又は複数の置換、挿入又は欠失を含む。
【０３３３】
複製コンピテントベクターを生成する傾向を低めるために、本発明は、ヘルパー構成体、宿主細胞の核酸含有物、又は他の核酸の１又は複数の配列に関しての縮重された配列を含むベクターを提供する。さらに、ヘルパー構成体はまた、ベクター、宿主細胞の核酸含有物又は他の核酸の１又は複数の配列に関しての縮重された配列も含むことができる。
【０３３４】
本発明のベクターはまた、ヘルパー構成体を標的化する１又は複数の配列を含むことができる。そのような配列は、遺伝的抗ウィルス剤を包含し、そして好ましくは、リボザイム又はアンチセンス核酸である（又はコードする）。好ましくはリボザイム及びアンチセンス配列は、標準のＡ−Ｔ、Ａ−Ｕ及びＧ−Ｃ塩基対合の他に、Ｇ−Ｕ塩基対合を通して、それらのそれぞれの標的物との塩基対相補性を受けることができる。同様に、本発明のヘルパー構成体はまた、ベクターを標的化するために同じタイプの配列を含むことができる。
【０３３５】
本発明のヘルパーベクターはまた、ベクターに比較してヘルパーにより発現されるＲＮＡの局在化、又は細胞トラフィキングに影響を及ぼす１又は複数の配列を含むことができる。例えば、ヘルパーベクターは、ベクターに比較して、イントロン、異種ＲＲＥ、又はベクターに比較して異種ｇａｇ配列を含むことができる。ヘルパーベクターはまた、ヘルパー及びベクターＲＮＡがたぶん、同時局在化されるよう、ベクターに比較して、縮重されたｇａｇ及び／又はｐｏｌ配列を含むことができる。ヘルパーベクターはまた、ペッケージング及びＲＲＥシグナル（配列）が、ベクターＲＮＡとのそれらの同時局在化を妨げるためにＲＮＡから除去されるよう、スプライス−ドナー部位を含むことができる。そのようなスプライス−ドナー部位はまた、ヘルパーベクター又は野生型ウィルスに比較して、ベクターの示差的追跡をもたらすためにヘルパーベクターに存在することができる。
【０３３６】
本発明のヘルパーベクターはまた、本発明のベクターを偽性型分類することができる。典型的な例は、ＶＳＶ−Ｇ、ＲＤ１１４、狂犬病ウィルス、ＧＡＬＶ及びキメラ性エンベロープタンパク質を包含する。本発明のヘルパーベクターはまた、好ましくは、ベクターに関して、異種ウィルスに由来する。例としては、ＨＩＶ−２由来のヘルパーベクターである。本発明の方法は、本発明のベクターを複製するためへのそのようなヘルパーベクターの使用を包含する。
【０３３７】
本発明の典型的なベクターは、ＧＦＰ配列の除去又は置換を伴なって、図１Ａ〜１Ｋに示される一連のｐＮ１及びｐＮ２のそれらを包含する。好ましくは、ベクターは、少なくともアンチセンス配列及びｃＰＴ包含配列を保持する。本発明の典型的なヘルパー構成体は、リボザイムを伴なって及び伴なわないで、図６Ａ−６Ｇに示されるような一連のｐＶｉｒＰａｃのそれらを包含する。
【０３３８】
本発明のすべてのベクター及びヘルパーは、上記のようにして、又は必要なら、構成体の他の部分において縮重され得る。好ましい縮重は、ヒト細胞において選択的に使用されるコドンに対してである。ベクター及びヘルパーはまた、それが異なった天然に存在する核酸及び合成核酸に由来するよう、天然においてキメラ性であり得る。しかしながら、特に好ましいベクターは、ＨＩＶ−１由来するか、又はＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質をコードする。他方では、ベクターは、ヘルパーベクター、野生型ウィルス又は宿主細胞により供給される、ｔａｔタンパク質をコードしない。
【０３３９】
本発明のベクターはまた、好ましくは、ウィルス補助タンパク質をコードせず、又は発現しない。ベクターはまた、宿主細胞に存在する場合、ウィルス感染を低め、最少にするか又は妨げられるか、又は毒性剤に対して前記細胞を耐性にする核酸を含んで成ることができる。そのような核酸の例は、細胞表面タンパク質又は切断されたＣＣＲ５タンパク質、好ましくはＣＣＲ５Δ３２Ｔタンパク質を包含する。他の例は、薬剤又はＤＮＡ損傷剤に対する耐性、好ましくは多重薬剤耐性、又はＭＧＭＴ変異体、特にＧ１５６Ａ変異体をコードする核酸を包含する。追加の例は、トランスドミナント表現型をコードする核酸を包含する。典型的な例は、トランスドミナントＨＩＶ−１ｇａｇ配列である。
【０３４０】
本発明のベクターはまた、異種配列の発現を助ける配列を含むことができる。典型的な例は、インスレーター配列である。ベクターはまた、細胞中へのベクターの形質導入を改良する配列を含むことができる。典型的な例は、本明細書に記載されるｃＰＴを含む５４５塩基対の配列であるが、但しｃＰＴを含むより小さなフラグメント又はより大きなフラグメントでも使用され得る。ベクターはまた、そこに位置する転写結合部位において修飾されたＬＴＲを包含する、遺伝子及び核酸を発現するためにＬＴＲを含むことができる。好ましくは、そのような修飾されたＬＴＲは、レンチウィルスベクターに含まれる。本発明の方法は、そのようなベクターの使用を包含する。
【０３４１】
本発明のベクターはまた、適切に配置されたスプライス部位又はＩＲＥＳ要素を用いて、少なくとも２種の遺伝子を発現することができる。ベクターはまた、形質導入のために標的物又は宿主細胞を刺激する１又は複数のキメラ性エンベロープタンパク質によりウィルス粒子中にパッケージングされ得る。さらに、ベクターは、細胞にパッケージングされ得、ここでヘルパーはタンパク質を含むか、又はヘルパーは遺伝子発現を調節するためにＲｅｖ／ＲＲＥ／ＣＲＳシステムを含む。本発明の方法は、そのようなベクターの使用を包含する。
【０３４２】
本発明のベクターはまた、形質導入されていない細胞に対して通常、毒性でない、投与される剤と組合して、形質導入された細胞を選択的に殺害するために使用され得る。好ましくは、そのようなベクターは、タンパク質よりもむしろ核酸分子の生成により作用する。典型的な例は、抗−ＭＧＭＴアンチセンス又はリボザイム核酸分子の生成である。本発明の方法は、そのようなベクターの使用を包含する。
【０３４３】
本発明はまた、本発明のベクターの貯蔵方法を提供する。
本明細書に引用されるすべての引例、例えば特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組み込まれている。本明細書において使用される場合、単数形で表されるすべての用語は、単数形及び複数形の両者を包含するものである。  本発明は好ましい態様に基づいての強調により記載されて来たが、好ましい態様における変動が調製され、そして使用され得、そして本発明が特に本明細書に記載されるよりも他の方法で実施され得ることは、当業者に明らかであろう。本発明は、そのような変動及び他の実施の包含を意図する。従って、本発明は、本発明の範囲内に包含されるすべての修飾を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ−１Ｋは、本発明のにより包含される特定の改良された、条件付で複製するベクター：ｐＮ１（ｃＰＴ）ＡＳｅｎｖＧＦＰ（４５２）， ｐＮ１（ｃＰＴ２）ＡＳｅｎｖＧＦＰ， ｐＮ１（ｃＰＴ）ｃＧＦＰ， ｐＮ１ＧＦＰ（ｃＰＴ）Ｔ， ｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰＴＡＲ， ｐＮ１ＧＦＰ（ｃＰＴ）ＶＴ， ｐＮ２ＧＦＰ， ｐＮ２ＡＳｅｎｖＧＦＰ（４１８）及びｐＮ２（ｓｐｅ）ＡＳｅｎｖＧＦＰの図である。もちろん、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のためのマーカー遺伝子は、本明細書に記載される用途へのベクターの使用の前、除去され得る。表示：Ｎ１， ｇａｇ／ｐｏｌ配列を有さないが、しかしｇａｇ’又はｇａｇ’’として示されるｇａｇからのパッケージング配列、及びｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対の位置に配置される終結コドンを有する、最少ＨＩＶ−１由来のベクター；Ｎ２， ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現できる、ＨＩＶ−１由来のベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ， アンチセンス配向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ， ｐｏｌ及びｅｎｖ， それぞれウィルスコアー、逆転写酵素及びエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ， ｒｅｖ， ｒｒｅ及びｎｅｆ， 追加のウィルス遺伝子；ｃＰＴｃ，最少中心ポリピリミジン系配列；ｃＰＴ，約５４８個の塩基対の大きな挿入体を含む中心ポリピリミジン系；ｃＰＴ２，約４３８個の塩基対の配列を含む中心ポリピリミジン系（ｃＰＴと同様ｇａｇ配列を包含しない）；ｓｐｅ， ｇａｇ／ｐｏｌ配列が翻訳されない；ＧＦＰ、コードされる縁色蛍光タンパク質。
【図２】
図２は、野生型ＨＩＶ Ｕ５ ＲＮＡ配列番号１（Ａ）及び修飾されたｃｒＨＩＶ Ｕ５ ＲＮＡ配列番号（Ｂ）のＤＮＡ配列を示す。番号は、転写から下流の塩基の数を言及する。
【図３】
図３Ａ−３Ｅは、生成されるｃｒベクターの力価に対する、ヘルパーベクター：条件付で複製する（ｃｒ）ベクターの比の効果を示す。図３Ａは、ｐＮ１（ｃＰＴｃ）ＧＦＰについて最高力価をもたらすための１：０．５のモル比を示し；図３Ｂ及び３Ｃは、それぞれｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰ及びｐＮ１（ｃＰＴ２）ＡＳｅｎｖＧＦＰについて最高力価を提供するための１：０．７５のモル比を示し；そして図３Ｄ及び３Ｅは、それぞれｐＮ１ｃＧＦＰ及びｐＮ２ｃＧＦＰについての最高力価を提供するための１：１．５のモル比を示す。ベクターは図１に示されているが、但しアンチセンスｅｎｖ配列を欠いているｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰ， 及びＧＦＰを発現するために、挿入されたサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターを有するｐＮ１ｃＧＦＰ又はｐＮ２ｃＧＦＰを除く。図は、少なくとも１．５×１０７の形質導入単位／ｍｌの力価の生成のための条件が２種のプラスミドシステムにより達成されたことを示す。
【図４】
図４Ａ及び４Ｂは、２種のＨＩＶ−２に基づく条件付で複製するベクター；ｐＳ１ｃＧＦＰ及びｐＳ２ｃＧＦＰの地図を示す。表示ｐＳ１及びｐＳ２は、ｐＮ１及びｐＮ２について上記に記載されるようにｇａｇ／ｐｏｌ配列の不在又は存在を言及する。表示ｃは、ＧＦＰの発現を指図するためのＣＭＶプロモーターの存在を示す。
【図５】
図５Ａ及び５Ｂは、ｐＳ１ｃＧＦＰ及びｐＳ２ｃＧＦＰのパッケージングに対する異なったヘルパーベクター構成体の効果を示す。ヘルパーベクターと条件付で複製するベクターとの間の異なったモル比の効果が、ヘルパーベクターに対する異なったＲＲＥの効果と共に試験された。示されるように、１：１の比のヘルパーベクター：条件付で複製するベクターの使用は、試験された他の比よりも、機能的ベクター粒子の生成で、より効果的であった。
【図６】
図６Ａ−６Ｇは、次の種々ヘルパーベクター構成体、すなわち本発明により包含されるようなｐＶＩＲＰＡＣ−１， ｐＶＩＲＰＡＣ−２， ｐＶＩＲＰＡＣ−１．１Ｒｚ， ｐＶＩＲＰＡＣ−１．２， ＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ， ｐＶＩＲＰＡＣ−１．２Ｒｚ２及びｐＶＩＲＰＡＣ１．２ＲｚＩｎの構造を示す。Ｒｚは抗−Ｕ５リボザイムの存在を言及し、そして１．１及び１．２は、それぞれＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に由来するＲＲＥを有するヘルパーを言及する。
【図７】
図７は、ウィルスベクターの力価に対する１又は複数のリボザイムの影響を示す。ｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰは、ｐＶｉｒＰａｃ１．２（リボザイムを含まない）、ｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎ（１つのリボザイム及びイントロンを含む）、ｐＶＰ１．２Ｒｚ（１つのリボザイムを含む）又はｐＶＰ１．２Ｒｚ２（２種のリボザイムを含む）の存在下でＨｅｌａ−ｔａｔ細胞にパッケージングされた。グラフにより示されるように、１つのリボザイム（ｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ）、又はリボザイム、及びヘルパーＲＮＡ（ｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎ）の細胞トラフィッキングに影響を及ぼすよう企画されたイントロンの存在は、ベクター力価に対して有意な効果を有さなかった。同時パッケージングされたヘルパー構成体についての力価サンプルのＰＣＲ分析は、リボザイムの不在下での高い同時パッケージングに対するリボザイムの存在下での低い同時パッケージングを示した。インジケーター“ＶｉｒＰａｃ”はまた、“ＶＩＲＰＡＣ”又は“ＶＰ”として示され得る。
【図８】
図８は、Ｔ細胞における野生型ＨＩＶ複製に対する一連のｐＮ１及びｐＮ２からのベクターの阻害効果を示す。Ｔ細胞は、最初にベクターにより形質導入され、そしえ次に、形質導入された１００％の細胞に関して、０．１の多重感染で野生型ウィルスにより攻撃された。ウィルスの複製は、ｐ２４ ＥＬＩＳＡ抗原捕獲アッセイによりアッセイされた。ｐＮ２ＡＳｅｎｖＧＦＰは、野生型ウィルス複製の十分な阻害を示した。
【図９】
図９Ａ及び９Ｂは、ｐＮ１及びｐＮ２に基づくベクターによる野生型ＨＩＶ複製の有力な阻害を示す。図９Ａは、野生型ＨＩＶによる感染に基づく対照腫瘍細胞に比較して、ｐＮ１ＧＦＰ（ｃＰＴ）ＶＴ及びｐＮ２ＡＳｅｎｖＧＦＰによるヒトＴ細胞における野生型ＨＩＶの有力な阻害を示す。図９Ｂは、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＡＳｅｎｖＧＦＰ及びｐＮ２ＡＳｅｎｖＧＦＰに関して、Ｔ細胞において類似する結果を示す。
【図１０】
図１０Ａ及び１０Ｂは、形質導入された細胞を選択するためのベクター及びそれらの使用を示す。図１０Ａは使用されるベクターの機構を示し、ここでｐＮ１ＣＭＩＧ及びｐＮ１ＭＣＧは内部ＣＭＶプロモーターを含み、そしてｐＮ１ＭＩＧ及びｐＮ１ＭＩＧ−ＷはＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターを通してＭＧＭＴ遺伝子を発現する。図１０Ｂは、上記ベクターにより形質導入され、そして下記例５に記載のようにして、ＢＣ及びＢＣＮＵにより選択されたＳｕｐＴ１細胞の拡張のグラフを示す。
【図１１】
図１１（パネルＡ−Ｆ）は、ＢＧ及びＢＣＮＵによる、形質導入された一次ＣＤ４＋細胞の選択を示す。ｐＮ２ＭＩＧにより形質導入されたＣＤ４＋細胞が、示される濃度のＢＣＮＵと共に、０， ０．５， ２，５， １０及び１０μＭのＢＧ（それぞれ、パネルＡ−Ｆに示される）において培養された。パネルＦはさらに、形質導入された細胞の１：５倍での希釈、続いて、１０μＭのＢＧ及び示される濃度のＢＣＮＵによる処理の結果を示す。パネルＦにおける３％ＧＦＰ＋細胞の開始レベルは、少なくとも３２倍、９７％に上昇した（これまでに、インビトロでは見出されていない）。
【図１２】
図１２は、ベクター調製物中へのヘルパーＲＮＡの同時パッケージングの防止に対するリボザイムの効果を示す。ウィルス含有上清液が、“ブーム抽出”により抽出され、そしてＤＮアーゼＩ消化、続いて、ヘルパー構成体に見出されるＨＩＶ−１ ｇａｇ−ｐｏｌ領域の定性逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）検出にゆだねられた。示されるように、使用されるヘルパー構成体における１又は２種のリボザイム（ｐＶＰ１．２Ｒｚ又はｐＶＰ１．２Ｒｚ２）の存在は、リボザイム−ヘルパー（ｐＶＰ１．２）よりも同時パッケージングされたヘルパーベクターの量を有意に低めた。
【図１３】
図１３Ａ及び１３Ｂは、ＣＤ３４＋幹細胞から腫瘍細胞をパージする能力を示す。図１３Ａは、１０のＭＯＩで、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＡＳｅｎｖＧＦＰが、１回の形質導入の後、ＳｕｐＴ１腫瘍細胞の９８．５２％を形質導入したことを示す。図１３Ｂは、ＣＤ３４＋細胞の形質導入において、有意な形質導入が、１回の形質導入の後、見出されなかったことを示す。３回の後でのみ、有意に形質導入が観察された。表示：１／２／Ａは、１回の形質導入、２のＭＯＩ及び形質導入されたベクターでのウィルス補助タンパク質の存在を言及し、そして３／５０は、３回の形質導入及び５０のＭＯＩを言及する。
【図１４】
図１４Ａは、示される細胞外、トランスメンブラン及び細胞ドメインを有する、ＶＳＶ−Ｇ野生型、ＲＤ１１４野生型及びキメラエンベロープタンパク質の構造を示す。図１４Ｂは、異なったエンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ野生型、狂犬病ウィルスＧ， ＲＤ１１４野生型及びＲＤ１１４Ｅ、キメラＶＳＶ−Ｇ及びＲＤ１１４構成体）による、ＨＴ１０８０において偽性型分類されたＨＩＶ−１ベクターの力価を示す。
【図１５】
図１５Ａ−１５Ｅは、本発明により包含される特定のパッケージング系構成体の図である：ｐ（ＣＧＣＲＳＲＲＥ）， ｐ（ＴＲＥｔＴＡｐｕｒｏ）， ｐ（ＢＩ−ＲｅｖＴａｔ）， ｐ（ＥＨ−ＧＰ）及びｐ（ＣＭＶ−ＧＰ）。図１５Ｆは、ｒｅｖ依存性ＶＳＶ−Ｇ構成体の構成を示す。
【図１６】
図１６は、Ｈｅｌａ−ｔａｔ細胞における、濃縮の前及び後、細胞製造体当たりのｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰベクターの収量を示す。示されるように、その収量は、いずれかの組の条件下で約１０１０で存続する。
【図１７】
図１７は、ＶＳＶ−Ｇ発現を制御するためにＲｅｖ／ＲＲＥ／ＣＲＳシステムを用いることからの結果を示す。
【図１８】
図１８は、異なった温度での３〜５週間の貯蔵の後、ベクター回収率に対する貯蔵緩衝液の影響を示す。示されるように、Ｄ−ＰＢＳ又はＨＢＳのいずれかにおける、１０％トレハロース又は１０％グルコースの存在は、−２０又は−８０℃での貯蔵の後、ベクターの良好な回収率を提供した。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004524813.tif 000247
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