(57)【要約】本発明は、腎臓、肝臓、もしくは結腸の不全症、リンパ系細胞の不全症、または血液脳関門の不全症を発症する危険性の増大を診断する、インビトロの方法に関する。さらに、本発明はまた、腎臓、肝臓、もしくは結腸の不全症、リンパ系細胞の不全症、または血液脳関門の不全症を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用に関する。好ましくは、腎臓、肝臓、もしくは結腸の不全症、リンパ系細胞の不全症、または血液脳関門の不全症は癌によって引き起こされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において腎臓不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて腎臓不全症を診断する段階。
【請求項２】
被験体において肝臓不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて肝臓不全症を診断する段階。
【請求項３】
被験体において結腸不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【請求項４】
被験体においてリンパ系細胞の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【請求項５】
被験体において血液脳関門の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【請求項６】
ＰＣＲ、リガンドストリング反応、制限酵素消化、直接塩基配列決定法、核酸増幅技法、ハイブリダイゼーション技法、免疫アッセイ法、または質量分析を含む、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
被験体において腎臓不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて腎臓不全症を診断する段階。
【請求項８】
被験体において肝臓不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて肝臓不全症を診断する段階。
【請求項９】
被験体において結腸不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【請求項１０】
被験体においてリンパ系細胞の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【請求項１１】
被験体において血液脳関門の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【請求項１２】
免疫アッセイ法、抗体検出技法、組織学的技法、ＦＡＣＳ分析、酵素的技法、ＭＤＲ−１タンパク質を検出する技法を含む、請求項７から１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
腎臓不全症が癌によって引き起こされる、請求項１または７記載の方法。
【請求項１４】
癌が腎細胞癌（ＲＣＣ）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
肝臓不全症が癌によって引き起こされる、請求項２または８記載の方法。
【請求項１６】
癌が肝臓癌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
結腸不全症が癌によって引き起こされる、請求項３または９記載の方法。
【請求項１８】
癌が結腸癌である、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
リンパ系細胞の不全症が癌によって引き起こされる、請求項４または１０記載の方法。
【請求項２０】
癌が白血病である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
リンパ系細胞の不全症が癌によって引き起こされる、請求項５または１１記載の方法。
【請求項２２】
癌が血管腫である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
腎臓不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用。
【請求項２４】
腎臓不全症が癌によって引き起こされる、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
癌が腎細胞癌（ＲＣＣ）である、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
肝臓不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用。
【請求項２７】
肝臓不全症が癌によって引き起こされる、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
癌が肝臓癌である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
結腸不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用。
【請求項３０】
結腸不全症が癌によって引き起こされる、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
癌が結腸癌である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
リンパ系細胞の不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用。
【請求項３３】
リンパ系細胞の不全症が癌によって引き起こされる、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
癌が白血病である、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
血液脳関門の不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用。
【請求項３６】
血液脳関門の不全症が癌によって引き起こされる、請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
癌が血管腫である、請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
一塩基多型が、
（ａ）ＭＤＲ−１遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ０１６５３５）のエキソン２６の３４３５位に対応する位置での、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、もしくは置換および付加；
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ０１６５３５）のエキソン２６の３４３５位に対応する位置での、ＣからＴへの置換；または
（ｃ）ＭＤＲ−１遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ０１６５３５）のエキソン２６の３４３５位でのＣからＴへの置換
である、請求項１から２２のいずれか一項記載の方法または請求項２３から３７のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腎臓、肝臓、もしくは結腸の不全症、リンパ系細胞の不全症、または血液脳関門の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法に関する。さらに、本発明はまた、腎臓、肝臓、もしくは結腸の不全症、リンパ系細胞の不全症、または血液脳関門の不全症を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用に関する。好ましくは、腎臓、肝臓、もしくは結腸の不全症、リンパ系細胞の不全症、または血液脳関門の不全症は癌によって引き起こされる。
【０００２】
腎細胞癌（ＲＣＣ）は、米国において１９９５年に２８，０００件を占める３番目に多い泌尿器腫瘍である（ウィンゴ（Ｗｉｎｇｏ）ら、１９９５）。米国では約１１，０００人の患者が転移性ＲＣＣで毎年死亡している（ウィンゴら、１９９５）。この疾患は、腎臓に限定され、根治的腎摘出による外科的切除が可能な場合にのみ、治すことができる。腫瘍が離れた器官に広がっていれば、予後は不良であり、５年生存率は高くても２０％である（グイナン（Ｇｕｉｎａｎ）ら、１９９５、ディンネイ（Ｄｉｎｎｅｙ）ら、１９９２）。したがって、高い生存率を達成するために、この疾患を外科手術で治癒可能な初期段階で検出することが必要である。超音波スクリーニングは比較的高価で検査員に左右される方法であるが、適切で広く用いられている。超音波によって定期的に検査すべき危険要素群を規定するために、危険因子（例えば、フォン−ヒッペル−リンドー遺伝子変異、家族性素因、または多発性嚢胞腎（リネハン（Ｌｉｎｅｈａｎ）ら、１９９５、シュレホファー（Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ）ら、１９９６、レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）、１９９６））を使用することができる。
【０００３】
ＲＣＣ発生率は、米国ならびに欧州の中央部および北部の他の先進国において、人種および性別に依存して年に２．３％〜４．３％ずつ着実に増加してきている（チョウ（Ｃｈｏｗ）ら、１９９９）。ウンダーリヒ（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ）ら（１９９９）は、剖検において発見された全てのＲＣＣの合計に対する、臨床的に認められた腫瘍の割合が１２年間にわたってほぼ一定であったので、この増加が超音波の普及によって完全に説明できないことを示した。特に先進国における、この増加の理由はまだ完全に明らかになっていない。しかしながら、喫煙、脂肪および肉の消費、肥満ならびに高血圧とＲＣＣの発生との正の相関が示されているのに対して（ベニチョウ（Ｂｅｎｉｃｈｏｕ）ら、１９９８、シュレホファー（Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ）ら、１９９６、リンドブラド（Ｌｉｎｄｂｌａｄ）ら、１９９７、ヒース（Ｈｅａｔｈ）ら、１９９７）、果物、特に柑橘類、ビタミンＣおよびＥ、ならびにカロテンの摂取は危険性を減らす。食物および環境の毒素または代謝産物に対する腎臓細胞の防御に役割を果たす因子または遺伝子が、個体のＲＣＣ感受性に影響を及ぼしうると想定することが可能である。
【０００４】
ヒト多剤耐性（ＭＤＲ−１）遺伝子は近位尿細管の腎臓細胞において発現しており（アムブドカー（Ａｍｂｕｄｋａｒ）ら、１９９９、ゴテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）ら、１９９６）、その遺伝子産物であるＰ−糖タンパク質は、多くの毒性物質および代謝産物に対する細胞の保護に直接関与している。Ｐ−糖タンパク質は以下ＭＤＲ−１タンパク質とも呼ばれる。ＭＤＲ−１は、細胞内および膜から細胞外へ物質をポンプでくみ出す膜内在性タンパク質をコードする。このエネルギー依存性輸出機構は、ステロイド代謝にも役割を果たしうるが、この生理学的役割は細胞の保護である（メダ（Ｍｅｄａ）ら、１９８７、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９０）。ＭＤＲ−１は、様々な器官（例えば、腸、膀胱、前立腺、または白血球、ならびに血液／脳関門）において発現しており、これらの場所で物質の吸着および浸透を制御する（シンケル（Ｓｃｈｉｎｋｅｌ）ら、１９９９、ラオ（Ｒａｏ）ら、１９９９）。例えば、腎臓では、ＭＤＲ−１は近位尿細管にあり、尿細管細胞から尿への物質の効率的な排出に寄与する可能性が高い。
【０００５】
ＭＤＲ−１発現は、前述のいずれの器官または組織においても細胞の「解毒」能力と直接相関している。これは、癌治療において特に重要であり、ここではＭＤＲ−１の高発現によって癌細胞が難治性になる（アムブドカー（Ａｍｂｕｄｋａｒ）ら、１９９９）。同様に、非悪性組織または器官におけるＭＤＲ−１発現の程度は、細胞が損傷剤を除去する能力に影響を及ぼすと想定できる。したがって、ＭＤＲ−１発現が低い尿細管細胞は、ＭＤＲ−１発現が本来高い尿細管細胞と比較して、損傷物質により多く暴露されている可能性が非常に高い。
【０００６】
したがって、細胞の解毒能力の直接的または間接的な影響を受けている、前記不全症の１つを発症する危険性の増大を診断する手段および方法は今まで利用できなかったが、それにもかかわらず非常に望まれていた。
【０００７】
したがって、本発明の基礎をなす技術的問題は前記の必要を満たすことである。
【０００８】
この技術的問題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供することによって達成される。
【０００９】
したがって、本発明は、被験体において腎臓不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて腎臓不全症を診断する段階。
【００１０】
さらに、本発明は、被験体において肝臓不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて肝臓不全症を診断する段階。
【００１１】
さらに、本発明は、被験体において結腸不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【００１２】
別の態様において、本発明は、被験体においてリンパ系細胞の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【００１３】
本発明はまた、被験体において血液脳関門の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在することに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【００１４】
前記の態様に含まれる不全症の１つを「発症する危険性の増大」は、一部の被験体が、その被験体を含む集団の平均より、不全症の１つまたはその組み合わせを発症する可能性が統計学的に高いことを意味する。危険性の増大は、様々な異なる危険因子（例えば、不全症などの表現型の結果の直接的な原因である遺伝子の変異、ならびに間接的な原因であり、かつ外因性または内因性毒性物質などによる損傷から細胞を保護するのに必要とされる細胞機能をもたらす遺伝子の変異による、遺伝的素因）によって引き起こされ得る。危険因子の他の源は、毒性物質の頻繁な暴露などの環境要因、またはストレスおよび高い作業負荷などの生理学的要因がありうる。通常、これらの要因の組み合わせが前記不全症の１つの発症をもたらす。特に、これらの不全症は、例えば高レベルの代謝が活発な細胞および／または高レベルの増殖細胞（例えば、肝細胞、腸細胞、もしくはリンパ系細胞）により特徴付けられる高い生理学的活性を有する器官において、頻繁に観察することができる。
【００１５】
さらに、組織の恒常性に関与し、したがって関門機能を有し得る細胞もまた、不全症を発症する極めて重要な標的である。例えば、これらの細胞は腎臓細胞または血液脳関門の細胞であってよい。
【００１６】
本発明の前記の態様によれば、診断方法は、当技術分野において周知の標準的な分子生物学的技法によって、ＭＤＲ−１遺伝子に一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定することによって実施することができる。原則的に、一塩基多型を検出する任意の適切な方法が本発明に含まれる。このような方法の例は、サザン分析もしくはノーザン分析などのポリヌクレオチドハイブリダイゼーション技法、ＰＣＲに基づく技法、または質量分析などの物理化学的性質の変化を検出する技法を含んでもよい。一塩基多型を含むと推測されるＭＤＲ−１ポリヌクレオチドを検出する必要がある生物学的試料の性質に応じて、当業者は適切な技法を選択することができる。例えば、ゲノムＤＮＡを含む生物学的試料は、さらに処理することなくＰＣＲ技法に供することができるのに対して、ＲＮＡを含む生物学的試料は、例えば、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写することによって、ＰＣＲ法を適用する前にＤＮＡに転写することができる。記載した全ての技法は当技術分野において周知である。例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。本明細書で使用する用語「ＭＤＲ−１遺伝子」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその化学的、酵素的、もしくは代謝的に改変された形態でありうるポリヌクレオチドを意味する。「ＭＤＲ−１遺伝子」は、この遺伝子がゲノムＤＮＡまたは転写されたＲＮＡのいずれかとして提供されてもよいことを意味する。さらに、例えばＭＤＲ−１をコードするＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡを含む、ポリヌクレオチドの改変変種も本発明に含まれる。
【００１７】
一塩基多型が存在するか、または存在しないかを決定する技法は当技術分野において周知であり、例えば、サンブルックら（１９８９）、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹに記載されている。このような技法は、直接的または間接的に一塩基多型を含むポリヌクレオチドの視覚化を含んでもよい。例えば、一塩基多型を含むポリヌクレオチドまたはその断片は、ＰＣＲ技法などによって視覚化の前に増幅されてもよい。視覚化は、例えば標識されたポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、または一塩基多型を含むポリヌクレオチドの物理化学的性質の差によって達成することができる。後者の技法は、例えば一本鎖ＤＮＡ高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、または質量分析を含んでもよい。
【００１８】
例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、検出可能に標識される。生体分子の標識に利用可能な様々な技法が当業者に周知であり、本発明の範囲内であるとみなされる。このような技法は、例えば、ティジセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、「酵素免疫アッセイ法の実践および理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙｓ）」、バーデン（Ｂｕｒｄｅｎ）、ＲＨおよびフォン・クニペンバーグ（ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ）（編）、第１５巻（１９８５）、「分子生物学の基本法（Ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」；デイビス（Ｄａｖｉｓ）ＬＧ、ディブマー（Ｄｉｂｍｅｒ）ＭＤ；Ｂａｔｔｅｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９０）、メイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら（編）「細胞および分子生物学における免疫化学法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）、または「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」シリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。当業者に周知の多くの異なる標識および標識方法がある。一般的に用いられる標識は、とりわけ蛍光色素（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど）、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、放射性同位体（３２Ｐまたは１２５Ｉなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド金属、化学発光化合物または生物発光化合物（ジオキセタン、ルミノール、またはアクリジニウムなど）を含む。酵素またはビオチン基の共有結合、ヨウ素化、リン酸化、ビオチン化、ランダムプライミング、ニックトランスレーション、テーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）（ターミナルトランスフェラーゼを使用）などの標識手法が当技術分野において周知である。検出法は、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法、直接的および間接的酵素反応などを含むが、これらに限定されない。
【００１９】
ヒト血液ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物の直接ＤＮＡ配列決定法などによって、個体のＭＤＲ−１遺伝子型を決定する試み、および新規のＭＤＲ−１変種を同定する試みにおいて考慮しなければならない１つの重要な要素は、各ヒトが（通常、ごくわずかな異常を除いて）各常染色体遺伝子の２つの遺伝子コピーを有することである（二倍性）。そのために、ホモ接合配列変化だけでなくヘテロ接合変化もあいまいなところなく同定できるように、配列の評価において最大限の注意を払わなければならない。
【００２０】
有利なことに、本発明の方法を提供することによって、現在では低レベルのＭＤＲ−１遺伝子発現またはＭＤＲ−１タンパク質に基づいて、前記不全症の１つを発症する遺伝的素因を有し、したがって前記不全症の１つを発症する危険性が増大した被験体を同定することが可能である。前記のように、不全症の発症はさらなる危険因子に左右されうるので、本発明によって、被験体は予防手段および予防策を効率的に受けることができる。さらに、本発明により提供される方法によって、医薬療法（例えば、一塩基多型を含む被験体における化学療法）の副作用を減らすことが可能となりうる。副作用は、被験体の細胞の不十分な解毒能力により、例えば被験体の細胞に治療剤が有害な濃度まで蓄積することによって引き起こされうる。このような被験体は効率的かつ簡単に同定することができ、その後に、副作用の少ない別の有害でない治療を受けることができる。
【００２１】
本発明の他の態様のために本明細書において上記で使用した定義は、本明細書において以下に記載の態様にも適用される。
【００２２】
好ましい態様において、本発明の方法は、ＰＣＲ、リガンドストリング反応（ｌｉｇａｎｄ ｓｔｒｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、制限酵素消化、直接塩基配列決定法、核酸増幅法、ハイブリダイゼーション法、免疫アッセイ法、または質量分析を含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、被験体において腎臓不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて腎臓不全症を診断する段階。
【００２４】
本発明はまた、被験体において肝臓不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて肝臓不全症を診断する段階。
【００２５】
さらに、本発明は、被験体において結腸不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、被験体においてリンパ系細胞の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、被験体において血液脳関門の不全症を発症する危険性の増大を診断するインビトロの方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）生物学的試料においてＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定する段階；および
（ｂ）ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在しないことに基づいて結腸不全症を診断する段階。
【００２８】
本発明によれば、当技術分野において公知の任意の利用可能な標準的な分子生物学的技法によって、ＭＤＲ−１ポリペプチドが存在するか、または存在しないかを決定することができる。例えば、このような技法は、免疫アッセイ法、抗体検出技法（例えば、ウェスタンブロッティング）、組織学的技法（免疫組織学的方法および酵素組織学的方法を含む）、ＦＡＣＳ分析、酵素的技法、またはＭＤＲ−１タンパク質を検出する他の適切な技法を含んでもよい。好ましくは、このような技法において用いられる抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、霊長類化抗体、前記のペプチドもしくはポリペプチドに特異的に結合するキメラ抗体もしくはその断片（二重特異性抗体、合成抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、もしくはｓｃＦｖ断片）なども含む）、またはこれらの任意の化学修飾誘導体などの抗体でもよい。一般的な抗体産生法は周知であり、例えば、ケラー （Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５）、４９４に記載され、Ｊ．Ｇ．Ｒ．フュレル（Ｈｕｒｒｅｌ）、（編）、「モノクローナルハイブリドーマ抗体：技法および用途（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｃｏ Ｒａｒｏｎ、ＦＬ（１９８２）、ならびにＬ．Ｔ．ミムス（Ｍｉｍｍｓ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６（１９９０）、６０４−６１９により教示されたものに概説されている。さらに、前記ペプチドに対する抗体またはその断片は、例えばハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）「抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８に記載の方法を用いて入手することができる。このような技法は複数の化合物を含む生物学的試料に適用されてよく、またはこのような試料は、まず最初に選択過程（例えば、タンパク質精製技法）に供してもよい。前記技法の前に適用することができるさらなる技法も当技術分野において周知である。
【００２９】
ＭＤＲ−１タンパク質を決定するのに適した視覚化技法は前記方法に依存し、かつ本明細書上記の本発明の方法に含まれる。ＭＤＲ−１に結合することができるポリペプチド、例えば抗体、または他のポリペプチドは、好ましくは、検出可能に標識される。生体分子の標識に利用可能な様々な技法が当業者に周知であり、かつ本発明の範囲内であるとみなされる。このような技法は、例えば、ティジセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）「酵素免疫アッセイ法の実践および理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙｓ）」、バーデン（Ｂｕｒｄｅｎ），ＲＨおよびフォン・クニペンバーグ（ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ）（編）、第１５巻（１９８５）、「分子生物学の基本法（Ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」；デイビス（Ｄａｖｉｓ），ＬＧ、ディブマー（Ｄｉｂｍｅｒ），ＭＤ；Ｂａｔｔｅｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９０）、メイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら（編）「細胞および分子生物学における免疫化学法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）、または「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」シリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。当業者に周知の多くの異なる標識および標識方法がある。一般的に用いられる標識は、とりわけ蛍光色素（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど）、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、放射性同位体（３２Ｐまたは１２５Ｉなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド金属、化学発光化合物または生物発光化合物（ジオキセタン、ルミノール、またはアクリジニウムなど）を含む。酵素またはビオチン基の共有結合、ヨウ素化、リン酸化、ビオチン化、ランダムプライミング、ニックトランスレーション、テーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）（ターミナルトランスフェラーゼを使用）などの標識手法が当技術分野において周知である。検出法は、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法、直接的および間接的酵素反応などを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
前記のように、本発明は、低レベルのＭＤＲ−１発現を伴う一塩基多型間の相関に基づいて、前記不全症を発症する危険因子の効率的かつ信頼性の高い同定を可能にする。
【００３１】
他の危険因子に対する被験体の感受性が、低レベルのＭＤＲ−１発現により増大しうるので、本発明による一塩基多型の同定は重要な危険因子の同定とみなさなければならない。特に、解毒能力の欠如により被験体の細胞に毒性化合物が蓄積する可能性がある。通常、解毒能力の欠如の影響を受ける器官または組織は、前記不全症を発症する器官または組織である。このような器官または組織は全て被験体（例えば、ヒト）の生理機能に不可欠である。残念なことにほとんどの場合、複雑かつ有害な化学療法または臓器移植でしか治療できない、前記不全症の効率的な予防が、本発明の方法を提供することによって可能になる。
【００３２】
好ましい態様において、本発明の方法は、免疫アッセイ法、抗体検出技法、組織学的技法、ＦＡＣＳ分析、酵素的技法、ＭＤＲ−１タンパク質を検出する技法を含む。
【００３３】
本発明の方法の別の好ましい態様において、腎臓不全症は癌によって引き起こされる。
【００３４】
本明細書で使用する用語「癌」は、不全器官に存在する全ての細胞型に由来しうる癌を含む。このような細胞型は、前記器官の上皮細胞、間葉細胞、内皮細胞、または特殊化した細胞であってよい。したがって、癌は例えば、癌腫、肉腫、血管腫、または白血病と分類することができる。癌疾患の表現型的および生理学的な特徴は当技術分野において周知であり、スキレンベル（Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ）などの標準的な教科書に記載されている。
【００３５】
本発明の方法の最も好ましい態様において、癌は腎細胞癌（ＲＣＣ）である。
【００３６】
本発明の方法の好ましい態様において、肝臓不全症は癌によって引き起こされる。
【００３７】
本発明の方法の別の好ましい態様において、癌は肝臓癌である。
【００３８】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、結腸不全症は癌によって引き起こされる。
【００３９】
本発明の方法の特に好ましい態様において、癌は結腸癌である。
【００４０】
本発明の方法の好ましい態様において、リンパ系細胞の不全症は癌によって引き起こされる。
【００４１】
本発明の方法の最も好ましい態様において、癌は白血病である。
【００４２】
本発明の方法の別の最も好ましい態様において、リンパ系細胞の不全症は癌によって引き起こされる。
【００４３】
本発明の方法の特に好ましい態様において、癌は血管腫である。
【００４４】
本発明はまた、腎臓不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用に関する。
【００４５】
本発明によって提供される方法に関する態様で用いられる用語についての、本明細書前記で用いられた定義は、必要な変更を加えて、本明細書前記で記載した使用および本明細書以下で記載する使用に適用することができる。
【００４６】
本発明の診断用組成物は、前記および本明細書以下の態様において記載される不全症を診断するのに適したさらなる成分を含んでもよい。一塩基多型を含むポリヌクレオチド、またはポリペプチドもしくはタンパク質の検出に用いられる、本発明による診断用組成物は、画像化のためにインビボで適用することもできる。例えば、タンパク質のインビボ画像化用の抗体標識またはマーカーには、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものが含まれる。Ｘ線撮影の場合、適切な標識には、検出可能な放射線を発するが、被験体に表立った害のない放射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲ用の適切なマーカーには、検出可能な特徴的なスピンを有するもの（例えば、ジュウテリウム）が含まれ、これは関連するハイブリドーマの栄養素を標識することによって、抗体に組み込むことができる。
【００４７】
診断用組成物はキットに含まれてもよい。本発明のキットは、有利なことに、本発明の方法または使用を実施するために使用することができ、とりわけ様々な用途に（例えば、診断分野において、または研究ツールとして）利用することができる。本発明のキットの部品は１つ１つバイアルに入れて包装されるか、または組み合わせて容器またはマルチコンテナユニットに入れて包装されてもよい。キットの製造は、好ましくは当業者に周知の標準的な手順に従う。例えば、キットまたは診断用組成物は、本発明の前記方法のいずれか１つにしたがって（例えば、免疫アッセイ技法（例えば、放射性免疫アッセイ法もしくは酵素免疫アッセイ法）、または好ましくは、核酸ハイブリダイゼーションならびに／もしくは増幅技法（例えば、本明細書前記および実施例に記載のもの）を利用して）、一塩基多型を含むと推測されるＭＤＲ−１遺伝子の発現を検出するための方法または用途に使用することができる。
【００４８】
本発明の使用の好ましい態様において、腎臓不全症は癌によって引き起こされる。
【００４９】
本発明の使用の別の好ましい態様において、癌は腎細胞癌（ＲＣＣ）である。
【００５０】
本発明はまた、肝臓不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用に関する。
【００５１】
本発明の使用の好ましい態様において、肝臓不全症は癌によって引き起こされる。
【００５２】
本発明の使用のさらに好ましい態様において、癌は肝臓癌である。
【００５３】
さらに、本発明は、結腸不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用に関する。
【００５４】
本発明の使用の好ましい態様において、結腸不全症は癌によって引き起こされる。
【００５５】
本発明の使用の別の好ましい態様において、癌は結腸癌である。
【００５６】
本発明はまた、リンパ系細胞の不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用に関する。
【００５７】
本発明の使用の好ましい態様において、リンパ系細胞の不全症は癌によって引き起こされる。
【００５８】
本発明の使用のさらに好ましい態様において、癌は白血病である。
【００５９】
さらに、本発明は、血液脳関門の不全症を発症する危険性の増大を診断するための診断用組成物を調製するための、ＭＤＲ−１遺伝子一塩基多型の使用に関する。
【００６０】
本発明の使用の好ましい態様において、血液脳関門の不全症は癌によって引き起こされる。
【００６１】
さらに、本発明の使用の好ましい態様において、癌は血管腫である。
【００６２】
本発明の方法の好ましい態様において、一塩基多型は、
（ａ）ＭＤＲ−１遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ０１６５３５）のエキソン２６の３４３５位に対応する位置でのヌクレオチド置換、付加、欠失、もしくは置換および付加；
（ｂ）ＭＤＲ−１遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ０１６５３５）のエキソン２６の３４３５位に対応する位置でのＣからＴへの置換；または
（ｃ）ＭＤＲ−１遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ０１６５３５）のエキソン２６の３４３５位でのＣからＴへの置換である。
【００６３】
腸での発現およびＭＤＲ−１基質の吸収に影響を及ぼすＭＤＲ−１ Ｃ３４３５Ｔ多型は、腎臓でのＭＤＲ−１タンパク質発現とも相関する。例えば、Ｔ対立遺伝子がホモ接合の個体は、ヘテロ接合およびホモ接合のＣ対立遺伝子保有者と比較して、腎臓の近位尿細管において有意に低いＭＤＲ−１発現を示す（ｐ＝０．０６、Ｎ＝１９ＣＣおよび２８ＴＴ）。ＭＤＲ−１タンパク質は毒性物質の排出に役割を果たすので、低発現ホモ接合（Ｔ）対立遺伝子個体の尿細管細胞は毒性薬剤により多く暴露されている。有害または毒性の薬剤への暴露が腎細胞癌（ＲＣＣ）などの不全症の発症が促進するという仮説と一致して、ＭＤＲ−１ ３４３５Ｔ対立遺伝子が、ＲＣＣの感受性因子（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）であることが判明した。すなわち、ホモ接合Ｔ対立遺伝子保有者である個体（正常集団（Ｎ＞５００）の２４％であるが、ＲＣＣ（Ｎ＝２２２）においては３６％）は、Ｃ対立遺伝子のヘテロ接合保有者またはホモ接合保有者と比較してＲＣＣなどの不全症を発症する危険性が有意に増大している。このＭＤＲ−１多型遺伝子型（Ｔ／Ｔ）によりＲＣＣを発症するオッズ比（ＯＲ）は全年齢群について＜１．５であり（ｐ＝０．０２８）、５０歳を超える患者ではＯＲ＝２．１であった（ｐ＝０．００１）。対照集団における２５％と比較して、ＲＣＣ患者の１８％しか高発現Ｃ対立遺伝子をホモ接合で有していなかった一方で、対照集団における２６％と比較して、ＲＣＣ患者の３６％がＴ対立遺伝子をホモ接合で有していた。ＲＣＣ患者を、体細胞ＶＨＬ変異を有する患者（ｎ＝４５）と有さない患者（ｎ＝７６）に区別した時に、この差はより顕著であった。ＶＨＬ変異を有する患者の３６％がＴ対立遺伝子をホモ接合で有していた（正常対立遺伝子分布と比較して４０％の増加）。本発明者らの結果は、遺伝的に決定された腎臓ＭＤＲ−１発現変化はＲＣＣにおいて重要な役割を果たし、全ＲＣＣの１５％に寄与することを示す（Ｅｆ＝０．１５）。
【００６４】
本発明にしたがって同定される多型、ならびに前記の態様にしたがって使用することができる手段および方法のさらなる用途は、例えばＵＳ−Ａ−５，８５６，１０４（ここで記載された法医学、父子鑑定、多型と表現型形質との相関、表現型形質の遺伝子地図作成などのための手段および方法は、本発明にしたがって等しく適用することができる）に記載されているように、先行技術において見出すことができる。
【００６５】
これらの態様および他の態様は、本発明の説明および実施例によって開示されるか、または本発明の説明および実施例から明らかであり、かつ本発明の説明および実施例に含まれる。本発明にしたがって利用される方法、使用、および化合物の任意の１つに関するさらなる文献は、例えば、電子装置を用いて公立図書館から検索することができる。例えば、インターネット上で（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで）利用可能な公的データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。さらなるデータベースおよびアドレス（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／）が当業者に公知であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍなどを使用して入手することもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概要、ならびに遡及検索（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ）および現状認識に有用な特許情報の関連情報源の調査は、バークス（Ｂｅｒｋｓ）、ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４）、３５２−３６４で示されている。
【００６６】
本明細書に記載の方法および使用には動物の治療も含まれるが、本発明の組成物、方法、および使用は、望ましくはヒトにおいて利用することができる。
【００６７】
以下、単なる例示であって、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない、以下の生物学的実施例への参照によって、本発明を説明する。
【００６８】
実施例１
ＤＮＡ試料および遺伝子型判定
２２２人の白人ＲＣＣ患者由来の腫瘍および正常腎臓組織試料を、マンハイム大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）泌尿器科の腫瘍コレクションから、およびシュトゥットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）のマーガレット・フィッシャー・ボッシュ博士臨床薬理学研究所（Ｄｒ．Ｍａｒｇａｒｅｔｅ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂｏｓｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）から入手し、８１人の良性末期腎臓疾患患者由来の血液試料をドナウワース透析センター（Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｏｎａｕｗｏｒｔｈ）から入手した（表１）。Ｃ３４３５Ｔ多型が決定された公知の腎臓疾患または腫瘍を有さない個体の対照試料をエピダウロス（Ｅｐｉｄａｕｒｏｓ）ＤＮＡコレクションから入手した。ゲノムＤＮＡを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（ＱｉａＡｍｐ）キットを用いて組織および血液試料から調製した。プライマー
2004524822.tif 000002
を、エキソン２６ ＭＤＲ−１遺伝子断片のＰＣＲに使用した。２０μｌ体積中に、ゲノムＤＮＡ ２０ｎｇを、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０μＭ ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマー、および１Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを含む緩衝液に添加した。９５℃３分の初回変性の後に９４℃３０秒、６２℃３０秒、および７２℃３０秒の３０サイクルで、ＰＣＲを行った。Ｃ３４３５Ｔ多型を、Ｓａｕ３ＡＩもしくはＭｂｏＩを用いたＲＦＬＰによって（図１）、または遺伝子型の確認が必要とされる場合（一部のヘテロ接合体の場合）にはビッグダイターミネーター（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を用いた直接塩基配列決定用ＡＢＩ３７００シーケンサーによって検出した。
【００６９】
実施例２
腎臓におけるＭＤＲ−１発現の変化
正常組織におけるＭＤＲ−１発現は大きな個体間差を示しうる（例えば、腸において、グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）ら、１９９９）。腎臓発現の個体のばらつきの程度を測定するために、本発明者らは、マンハイム大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）泌尿器科からの患者に由来する腎臓試料中のＰＧＰレベルを決定した。全ての患者が腎細胞癌に罹患していた（詳細については表１を参照のこと）。腫瘍試料ならびに対応する健康な腎臓組織（腫瘍外科手術由来）を入手し、凍結組織片として保存した。ウェスタンブロットおよび定量免疫組織学によるＰＧＰレベルの分析のために、正常な非癌組織のみを使用した。これらの組織切片の顕微鏡検査では健康な正常形態が見られ、悪性腫瘍の徴候は見られなかった。これらの試料におけるＰＧＰレベルの分析（図２）によって、ＰＧＰ発現には大きな個体間のばらつきがあることが示された。免疫組織学によって、ＰＧＰは近位尿細管の多くの試料において、有意な量で特異的に発現することが見出された。対照的に、他の試料は弱い発現を示し、一部の試料ではＰＧＰ染色はほとんど目に見えなかった。染色強度の定量測定（ヒストアナライザー（Ｈｉｓｔｏａｎａｌｙｚｅｒ））によって、個体のＰＧＰ発現には６倍までの差があることが立証された（図３）。この個体間のばらつきはウェスタンブロット分析でも確認することができた（図２Ｂ）。ＰＧＰレベルは、腸での定量について記載されたように（グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）ら、１９９９）、５μｇ／ｍｌに希釈したマウスモノクローナル抗体ＪＳＢ−１（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、５０μｇ／ｍｌ）を用い、ウェスタンブロットおよび定量免疫組織化学によって分析された。組織学用切片を、ＤＡＢ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ｃｏｍｐｌｅｘ）を用いて染色し、ＨＥ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））を用いて対比染色した。ＰＧＰ特異的染色は、個体のＰＧＰ発現を決定するために、バックグラウンドに対する特異的シグナル（尿細管）の比を用い、ヒストアナライザー（グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）ら、１９９９）によって分析された。
【００７０】
実施例３
Ｃ３４３５Ｔ多型は腎臓ＭＤＲ−１発現と相関する
腸における低ＰＧＰ発現および機能に関連づけられるＣ３４３５Ｔ多型が、腎臓におけるＰＧＰレベルの変動とも相関するかどうかを分析するために、本発明者らはＲＣＣ患者を遺伝子型判定した（表１）。ＭＤＲ−１ Ｃ３４３５Ｔ遺伝子型は、これらの患者の腫瘍ならびに対応する健康な腎臓組織から単離されたゲノムＤＮＡから決定された。遺伝子型の違い（すなわち、遺伝子変換）は、健康試料群と癌試料群との間には見出されなかった。ＭＤＲ−１遺伝子型と腎臓におけるＰＧＰ発現の相関に関して、Ｃ３４３５Ｔ多型がホモ接合の個体（１９ＣＣ，２８ＴＴ）に対して定量免疫組織化学を行った。この分析の結果（図３）は、ＭＤＲ−１遺伝子型および腎臓ＰＧＰ発現の強い相関を示す（ｐ＝０．０６、クラスカル−ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定、ｐ＝０．０３９、中央値検定）。Ｃ対立遺伝子をホモ接合で有する群は、対応するＴ対立遺伝子を有する個体と比較してより高いＰＧＰレベルを示す。ヒストアナライザーからの測定値の比較（図３Ａ）によって、低発現個体は大部分がＴ対立遺伝子群（１と２の間の相対ＰＧＰシグナル）に見出されることが示され、最高値はホモ接合Ｃ対立遺伝子を有する個体に由来する（ＰＧＰシグナル＞６）。発現レベルにおける差は約２倍である（平均値０．９１、ＴＴ対１．７７、ＣＣ（非特異的シグナル比１．０を上回る））。免疫組織学実験において生じうるばらつきを考慮して、本発明者らはまた、組織学データをわずか３つの群にクラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）した後に遺伝子型分布を分析した（高発現個体（シグナル強度比＞３）、中発現個体（２〜３）、および低発現個体（シグナル強度＜２）、図３Ｂ）。ＭＤＲ−１遺伝子型とこれらの発現群の相関は、ホモ接合Ｔ対立遺伝子個体の大部分が低ＰＧＰレベルを有する一方で、Ｃ／Ｃ個体の大部分が高い腎臓ＰＧＰレベルを表すことを示す。
【００７１】
実施例４
Ｃ３４３５Ｔ低発現多型は腎細胞癌の危険因子である
腸ＰＧＰ濃度およびＰＧＰ依存性薬物輸送に相関するＣ３４３５Ｔ多型に関して、この対立遺伝子分布についての信頼性の高い情報を得るために、多数の白人が遺伝子型判定されている。以前の研究ならびに進行中の実験は、正常白人において、この多型は集団の２２％〜２６％においてホモ接合体で存在し、４８％〜５０％においてヘテロ接合体で存在することを一貫して示す（ホフメイヤー（Ｈｏｆｆｍｅｙｅｒ）ら、２０００）。この分布は、集団における対立遺伝子のハーディ−ワインベルク平衡に適合し、５００を超える試料において確認されている。これとは対照的に、ＲＣＣ集団のホモ接合およびヘテロ接合Ｃ３４３５Ｔ個体の頻度は異なる分布を示す。この集団において、Ｔ対立遺伝子のホモ接合保有者の頻度は、２６％（正常集団）から３５％〜３９％に有意に増加する（図４）。対照群として、さらに５７人の良性末期腎臓疾患患者（定期的な透析を受ける必要によって定義される、表１を参照のこと）の遺伝子型判定はＴ対立遺伝子頻度の増加を示さず、この群における対立遺伝子の不均衡を示さなかった。ＲＣＣ患者群は注目に値するサイズ（Ｎ＝２２２）を含み、対立遺伝子頻度の差は統計的に有意である。ＲＣＣ群において見出される対立遺伝子分布はまたハーディ−ワインベルク平衡と異なり、ＲＣＣにおいては、明らかにホモ接合Ｔ対立遺伝子保有者に富んでいる（図４）。これらの対立遺伝子の差の統計的評価（ＡＮＯＶＡ）は、ＭＤＲ−１ Ｃ３４３５Ｔ対立遺伝子が有意な危険因子を含み、ホモ接合Ｔ対立遺伝子保有者は、ＲＣＣが生じる最多の集団である５０歳を超える年齢群において、ＲＣＣを発症する確率が２倍増加していることを示す（ｐ＝０．００１、フィッシャー検定）。統計解析はＳＰＳＳ １０．０（ＳＰＳＳ、シカゴ、アメリカ合衆国）を用いて行った。腎臓組織におけるｐＧＰ発現の統計解析は、主としてノンパラメトリック法に基づいた。ＭＤＲ１ ｔｔ試料でのｐＧＰ発現と、ｃｃまたはｃｔ遺伝子型におけるｐＧＰ発現を比較するために、中央値検定を使用した。患者および対照における遺伝子型の頻度分布を分析するために、オッズ比近似値（ＯＲ）およびＣＩを使用し、比率の同等性（ｅｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）を検定するためにピアソンカイ二乗を計算した。
【００７２】
病因分数（ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を、
2004524822.tif 000003
として計算した。Ｐｅは感受性遺伝子型（ｔｔ）を有する被験体の比率である。
【００７３】
【表１】
2004524822.tif 000004
ＭＤＲ１ ＴＴを危険因子として考え、健康対照に対して計算した。
【００７４】
表１：患者群およびＭＤＲ１遺伝子型：
ＩＤＤＭ、インシュリン依存性糖尿病、ＡＰＫＤ、成人多発性嚢胞腎。未知群は、基礎疾患（ＩＤＤＭでない）についての任意のさらなる知識なく、定期的な透析を受ける必要によって診断された。
【００７５】
【表２】ＭＤＲ Ｃ３４３５Ｔ遺伝子型およびＶＨＬ変異
2004524822.tif 000005
【図面の簡単な説明】
本発明は図面によって例示される。
【図１】ＭＤＲ−１多型の検出。ＰＣＲ−ＲＦＬＰおよび配列分析によるＣ３４３５Ｔ多型のホモ接合保有者およびヘテロ接合保有者の同定。多型は、ＤＮＡ配列プロファイルにおいて直接検出するか、またはＣ対立遺伝子を１７２ｂｐおよび７２ｂｐに切断するがＴ対立遺伝子を切断しない、Ｓａｕ３ＡＩもしくはＭｂｏＩによる、２４４ｂｐの ＰＣＲ断片の制限酵素消化によって検出することができる。
【図２】腎臓におけるＰＧＰの発現変化。標準化した条件での抗ＰＧＰ抗体ＪＳＢ−１を用いた免疫組織学およびウェスタンブロットにより、尿細管ＰＧＰレベルにおける大きな変動を示す。（Ａ）免疫組織化学染色（試料のＭＤＲ−１対立遺伝子を示す）（Ｂ）ウェスタンブロットにより、１７０ｋＤａならびにより小さいサイズのバンド（分解産物）でのＰＧＰ特異的染色を示す。完全長タンパク質ならびにそれより小さい断片の強度は、一般的にＴ−Ｔ遺伝子型を有する試料と比較してＣ−Ｃ試料において強いことに留意のこと。
【図３】Ｃ３４３５Ｔ多型は腎臓ＭＤＲ−１発現と相関する。個々のＰＧＰレベルは、１８人のホモ接合Ｃ対立遺伝子保有者および３１人のホモ接合Ｔ対立遺伝子を有する個体由来の染色組織切片の、ヒストアナライザー分析によって得られた（図２、方法を参照のこと）。（Ａ）バックグラウンドに対する個々のシグナルの比：低発現個体は大部分が、相対ＰＧＰシグナルが１と２の間であるＴ対立遺伝子群において見出される。１．０の比は、バックグラウンドを超える特異的染色ではない。（Ｂ）組織学的データを３つの群（高発現、中発現、および低発現）にクラスタリングした後の遺伝子型−表現型の相関。ほとんどのＴ個体は低ＰＧＰレベルを有する一方で、Ｃ−Ｃ個体の大部分は高い腎臓ＰＧＰレベルを示す。
【図４】腎細胞癌における３４３５Ｔ多型。５００を超える対照、８１の良性末期腎臓疾患の試料、および２２２人のＲＣＣ患者において、白人におけるＣ３４３５Ｔ多型の分布が分析された。対照および良性腎臓疾患患者は「正常な」対立遺伝子分布（２２％〜２６％の３４３５Ｔホモ接合体）およびハーディ−ワインベルク平衡に適合する分布を示す。ＲＣＣ集団は、有意により多くのＴ対立遺伝子ホモ接合保有者を有する（３６％、ｐ＝０．００１〜０．０２８、フィッシャー検定）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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