(57)【要約】式（Ｉ）［式中、ＸはＯ、ＣＨ２、ＳまたはＮＨであるか、あるいはＸ−Ｒ１部分は水素であり；Ｙ１およびＹ２は、独立して、ＣＨまたはＮであり；Ｒ１は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロサイクリル、ヘテロサイクリルＣ１−６アルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールＣ１−６アルキルであり、水素を除くいずれの基も置換されていてもよく；Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、ヘテロサイクリルまたはヘテロサイクリルＣ１−６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３はそれらの結合する窒素原子と一緒になって４−ないし１０−員の単環または二環式環を形成し；Ａｒは、式ａ）またはｂ）（式中、Ａは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５から選択される２個までのヘテロ原子を含有していてもよい縮合５−ないし７−員環であり、ここでＲ５は水素またはＣ１−６アルキルであり、環はハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたはケトから選択される２個までの置換基により置換されていてもよい）で示される基であり；ＲａおよびＲ４は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、アリールＣ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アジド、アミノ、モノ−またはジ−Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ、アシルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシ塩、カルボキシエステル、カルバモイル、モノ−またはジ−Ｎ−Ｃ１−６アルキルカルバモイル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ウレイド、グアニジノ、Ｃ１−６アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−６アルキルアミジノ、スルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニルまたはＣ１−６アルキルスルホニルから選択され；およびＸ１およびＸ２の一方はＮであり、他方はＮＲ６であって、ここでＲ６は水素、Ｃ１−６アルキルまたはアリールＣ１−６アルキルである］で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
2004529967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004529967.tif 000010
（Ｉ）
［式中
ＸはＯ、ＣＨ２、ＳまたはＮＨであるか、あるいはＸ−Ｒ１部分は水素であり；
Ｙ１およびＹ２は、独立して、ＣＨまたはＮであり；
Ｒ１は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロサイクリル、ヘテロサイクリルＣ１−６アルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールＣ１−６アルキルであり、水素を除くいずれの基も置換されていてもよく；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、ヘテロサイクリルまたはヘテロサイクリルＣ１−６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３はそれらの結合する窒素原子と一緒になって４−ないし１０−員の単環または二環式環を形成し；
Ａｒは、式ａ）またはｂ）：
【化１】
2004529967.tif 000011
ａ）                                      ｂ）
（式中、Ａは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５から選択される２個までのヘテロ原子を含有していてもよい縮合５−ないし７−員環であり、ここでＲ５は水素またはＣ１−６アルキルであり、環はハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたはケトから選択される２個までの置換基により置換されていてもよい）
で示される基であり；
ＲａおよびＲ４は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、アリールＣ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アジド、アミノ、モノ−またはジ−Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ、アシルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシ塩、カルボキシエステル、カルバモイル、モノ−またはジ−Ｎ−Ｃ１−６アルキルカルバモイル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ウレイド、グアニジノ、Ｃ１−６アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−６アルキルアミジノ、スルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニルまたはＣ１−６アルキルスルホニルから選択され；および
Ｘ１およびＸ２の一方はＮであり、他方はＮＲ６であって、ここでＲ６は水素、Ｃ１−６アルキルまたはアリールＣ１−６アルキルである］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
Ｘ−Ｒ１が水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ＡがＯ、ＳおよびＮＲ５から選択される２個までのヘテロ原子を含有してもよい縮合環であって、ここでＲ５が水素またはＣ１−６アルキルであり、該環がハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたはケトから選択される２個までの置換基により置換されていてもよい、上記した請求項のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２およびＲ３が、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、アリール、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、ヘテロサイクリルまたはヘテロサイクリルＣ１−６アルキルであり、水素を除くいずれの基も置換することができ、あるいはＲ２およびＲ３がそれらの結合する窒素原子と一緒になって置換されていてもよい５または６員の単環または二環式環を形成する、上記した請求項のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項５】
実施例に記載されている化合物。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか一つに記載の化合物またはその医薬上許容される塩と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項７】
ヒトまたは他の哺乳動物にて、神経外傷性事象によって悪化または惹起される病態の予防的または治療的処置のための医薬の製造における、請求項１ないし５のいずれか一つに記載に化合物またはその医薬上許容される塩の使用。
【請求項８】
癌の予防的または治療的処置のための医薬の製造における、請求項１ないし５のいずれか一つに記載に化合物またはその医薬上許容される塩の使用。
【請求項９】
式（ＩＩ）：
【化１】
2004529967.tif 000012
（ＩＩ）
［式中、Ｘ、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ１、Ｒａ、Ａｒ、Ｘ１およびＸ２は式（Ｉ）の記載と同意義であり、Ｒは水素、Ｃ１−６アルキルまたはアリールＣ１−６アルキルである］
で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な化合物およびその医薬品としての、特に神経外傷性疾患の治療のためのＲａｆキナーゼ阻害剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒａｆ蛋白キナーゼは情報伝達経路の重要な構成要素であり、それによって特定の細胞外刺激が哺乳動物細胞にて的確な細胞応答を誘発する。活性化された細胞表面にある受容体は原形質膜の内面にあるｒａｓ／ｒａｐ蛋白を活性化し、その蛋白は、Ｒａｆ蛋白を順次強化して活性化させる。活性化されたＲａｆ蛋白は細胞内蛋白キナーゼＭＥＫ１およびＭＥＫ２をリン酸化して活性化させる。活性化されたＭＥＫは、順次、ｐ４２／ｐ４４ミトゲン活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化および活性化に触媒作用を及ぼす。環境の変化に対する細胞応答に直接的または間接的に寄与する、種々の活性化されたＭＡＰＫの細胞質および核の基質が知られている。Ｒａｆ蛋白をコードする３種の遺伝子；Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−ＲａｆおよびＣ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１としても知られている）が哺乳動物にて同定された；ｍＲＮＡのデファレンシャルスプライシングをもたらすイソ形態の変種も知られている。
【０００３】
Ｒａｆキナーゼの阻害剤は、腫瘍細胞増殖の崩壊に、すなわち癌、例えば組織球性リンパ腫、肺腺癌、小細胞肺癌ならびに膵癌および乳癌の治療に；さらに心停止後の脳虚血、脳卒中および多発脳梗塞性痴呆を含む、鬱血性事象をもたらす神経変性に付随する障害、およびまた脳虚血後事象、例えば、頭部損傷、手術および／または出産の間に由来するような事象の治療および／または予防にも有用であると示唆されている。
【０００４】
本発明者らは、Ｒａｆキナーゼの阻害剤、特にＢ−Ｒａｆキナーゼの阻害剤である、一群の新規な化合物を見出した。
本発明によれば、式（Ｉ）：
【化１】
2004529967.tif 000003
（Ｉ）
【０００５】
［式中
ＸはＯ、ＣＨ２、ＳまたはＮＨであるか、あるいはＸ−Ｒ１部分は水素であり；
Ｙ１およびＹ２は、独立して、ＣＨまたはＮであり；
Ｒ１は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロサイクリル、ヘテロサイクリルＣ１−６アルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールＣ１−６アルキルであり、水素を除くいずれの基も置換されていてもよく；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、ヘテロサイクリルまたはヘテロサイクリルＣ１−６アルキルであるか、またはＲ２およびＲ３はそれらの結合する窒素原子と一緒になって４−ないし１０−員の単環または二環式環を形成し；
【０００６】
Ａｒは、式ａ）またはｂ）：
【化１】
2004529967.tif 000004
ａ）                                      ｂ）
【０００７】
（式中、Ａは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５から選択される２個までのヘテロ原子を含有していてもよい縮合５−ないし７−員環であり、ここでＲ５は水素またはＣ１−６アルキルであり、環はハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたはケトから選択される２個までの置換基により置換されていてもよい）
で示される基であり；
ＲａおよびＲ４は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、アリールＣ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アジド、アミノ、モノ−またはジ−Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ、アシルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシ塩、カルボキシエステル、カルバモイル、モノ−またはジ−Ｎ−Ｃ１−６アルキルカルバモイル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ウレイド、グアニジノ、Ｃ１−６アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−６アルキルアミジノ、スルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニルまたはＣ１−６アルキルスルホニルから選択され；および
Ｘ１およびＸ２の一方はＮであり、他方はＮＲ６であって、ここでＲ６は水素、Ｃ１−６アルキルまたはアリールＣ１−６アルキルである］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩が提供される。
【０００８】
本明細書にて用いる場合、式（Ｉ）の点線で示される二重結合は、本発明の範囲内にある化合物の互変異性の環の形態の可能性を示し、二重結合は置換されていない窒素原子側にある。
ヒドロキシイミノ部分は、基ａ）およびｂ）の非芳香族環のいずれかの炭素原子上に位置付けることができる。
ヒドロキシイミノ部分はＥまたはＺ異性体のいずれかとしてまたはその両者の混合物として存在しうる。
個々に、またはより大きな基、例えば、アルコキシの一部として、本明細書にて言及するアルキルおよびアルケニル基は、６個までの炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖であってもよく、アリール、ヘテロアリール、ヘテロサイクリル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、アリールＣ１−６アルコキシ、アリールＣ１−６アルキルチオ、アミノ、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ、シクロアルキル、シクロアルケニル、カルボキシおよびそのエステル、アミド、スルホンアミド、ウレイド、グアニジノ、Ｃ１−６アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−６アルキルアミジノ、Ｃ１−６アシルオキシ、アジド、ヒドロキシ、ヒドロキシイミノおよびハロゲンからなる群より選択される１またはそれ以上の基によって置換されていてもよい。
【０００９】
本明細書にて言及するシクロアルキルおよびシクロアルケニル基は、３ないし７個の環炭素原子を有する基を包含し、アルキルおよびアルケニル基について上記したように置換されていてもよい。
本明細書にて用いる「アリール」なる語は、特記しない限り、各環が、適当には、４ないし７個、好ましくは５または６個の環原子を含有する単環または縮合環を包含し、当該環は、各々、置換されていなくてもよく、あるいは例えば、３個までの置換基で置換されていてもよい。
適当なアリール基は、フェニルおよび１−ナフチルまたは２−ナフチルなどのナフチルを包含する。
【００１０】
アルキル、アルケニル、シクロアルキルおよびシクロアルケニル基の任意の置換基は、アリール、ヘテロアリール、ヘテロサイクリル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、アリールＣ１−６アルコキシ、アリールＣ１−６アルキルチオ、アミノ、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ、アミノスルホニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、カルボキシおよびそのエステル、アミド、ウレイド、キアニジノ、Ｃ１−６アルキルキアニジノ、アミジノ、Ｃ１−６アルキルアミジノ、Ｃ１−６アシルオキシ、ヒドロキシおよびハロゲンまたはその組合せを包含する。
本明細書で用いる場合、「ヘテロサイクリル」なる語は、特記しない限り、各環が、その各々がＯ、ＮおよびＳから選択される、４個までのヘテロ原子を適宜含有する非芳香族の単環または縮合環を包含し、当該環は置換されていなくてもよく、あるいは例えば３個までの置換基で置換されていてもよい。各複素環式環は、適宜、４ないし７個、好ましくは５または６個の環原子を有する。縮合複素環式環系は炭素環式環を含んでいてもよいが、複素環式環を最低１個含むことが必要である。複素環基として、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、イミダゾリジンおよびピラゾリジンが挙げられる。
【００１１】
本明細書にて用いる「ヘテロアリール」なる語は、特記しない限り、その各々がＯ、ＮおよびＳから選択される、４個まで、好ましくは１または２個のヘテロ原子を含む、一または二環式ヘテロ芳香族環系を包含する。各環は４ないし７個、好ましくは５または６個の環原子を有していもよい。二環式ヘテロ芳香族環系は炭素環式環を包含しうる。ヘテロアリール基として、例えば、ピロール、キノリン、イソキノリン、ピリジン、ピリミジン、オキサゾール、チアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、イミダゾールおよびベンズイミダゾールが挙げられる。
アリール、ヘテロサイクリルおよびヘテロアリール基は、所望により、好ましくは３個までの置換基で置換されていてもよい。適当な置換基として、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、アリールＣ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、アジド、アミノ、モノ−またはジ−Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ、アシルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシ塩、カルボキシエステル、カルバモイル、モノ−またはジ−Ｎ−Ｃ１−６アルキルカルバモイル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ウレイド、グアニジノ、Ｃ１−６アルキルグアニジノ、アミジノ、Ｃ１−６アルキルアミジノ、スルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ヘテロサイクリル、ヘテロアリール、ヘテロサイクリルＣ１−６アルキル、ヒドロキシイミノ−Ｃ１−６アルキルまたはヘテロアリールＣ１−６アルキル、あるいはその組合せが挙げられる。
【００１２】
任意の置換基は一の可溶化基を含有するのが好ましく；適当な可溶化基は当業者に明らかであり、ヒドロキシおよびアミン基が含まれるであろう。さらに好ましくは任意の置換基はアミノ、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ、ヘテロサイクリル含有のアミン、およびヒドロキシまたはその任意の組合せを包含する。
ＸはＮＨであることが好ましく、またはＸ−Ｒ１は水素であることが好ましく、ＸがＮＨである場合、Ｒ１は、好ましくは、水素またはＣ１−６アルキルである。
Ｙ１およびＹ２がＣＨである場合、Ｘ−Ｒ１は好ましくは水素である。
Ｙ２がＮである場合、Ｘ−Ｒ１は好ましくはＮＨ２である。
好ましくは、Ｒ６は水素である。
最も好ましくは、Ｘ−Ｒ１は水素である。
【００１３】
Ａは、好ましくは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５（Ｒ５は水素またはＣ１−６アルキルである）から選択される２個までのヘテロ原子を含有していてもよい縮合５員環であり、当該環はハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシまたはケトから選択される２個までの置換基で置換されていてもよい。
さらに好ましくは、Ａは縮合５員環である。
好ましくは、Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、アリール、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、ヘテロサイクリル、ヘテロサイクリルＣ１−６アルキルであり、水素を除くそのいずれも所望により置換されていてもよく、あるいはＲ２およびＲ３はそれらが結合する窒素原子と一緒になって所望により置換されていてもよい５または６員の単環または二環式環、例えば、ピペリジンを形成する。
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、分子量が８００よりも小さい。
Ａ基の好ましい置換基は、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−６アルキル、ヒドロキシイミノ−Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−６アルコキシを包含する。
【００１４】
本発明が式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される誘導体を包含すること、およびこれらが本発明の範囲に含まれることが理解されよう。
本発明の個々の化合物は、実施例に記載されるものおよびその医薬上許容される塩を包含する。本明細書に用いる「医薬上許容される誘導体」は、受容者に投与すると、式（Ｉ）の化合物または活性代謝物またはその残基を提供する能力を有する、式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される塩、エステルまたはそのようなエステルの塩を包含する。
医薬に用いる場合、式（Ｉ）の化合物の塩は医薬上許容されなければならないことが理解されよう。適当な医薬上許容される塩は当業者に明らかであり、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸またはリン酸で形成される酸付加塩；および有機酸、例えば、コハク酸、マレイン酸、酢酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸とで形成される酸付加塩などの、J. Pharm. Sci.、１９７７、６６、１−１９に記載される塩を包含する。他の塩、例えば、シュウ酸塩を、例えば、式（Ｉ）の化合物の単離に用いてもよく、かかる塩も本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
本発明の化合物は結晶形態であっても非結晶形態であってもよく、結晶形態であるならば、所望により水和または溶媒和されていてもよい。本発明はその範囲内に化学量論的水和物ならびに可変量の水を含有する化合物を包含する。
本発明は、エナンチオマーおよびその混合物、例えば、ラセミ体を含め、式（Ｉ）の化合物の立体異性体および幾何異性体を含む、すべての異性体の形態にまで及ぶ。慣用的方法により、異なる異性体の形態を相互に分離するか、または分割し、あるいは慣用的合成方法により、または立体特異的もしくは不斉合成によりいずれか所定の異性体を得てもよい。
【００１６】
式（Ｉ）の化合物は医薬組成物にて用いることを目的とするため、当該化合物は実質的に純粋な形態にて、例えば少なくとも６０％の純度で、さらに適当には少なくとも７５％の純度で、好ましくは少なくとも８５％の、特に少なくとも９６％の純度（％は重量に対する重量を基礎とする）で提供されることが好ましいことが容易に理解されよう。当該化合物の不純な調製物は医薬組成物にて使用されるさらに純粋な形態を調製するのに用いることができる。
式（Ｉ）の化合物は、市販の、または周知方法と同様の方法を用いて調製することのできる、出発物質から、当業者に周知の、例えば、Comprehensive Heterocyclic Chemistry、Editors KatritzkyおよびRees、Pergamon Press、１９８４、５、４５７−４９７に記載の方法を用いて容易に調製することができるイミダゾール誘導体である。このような多数の合成における重要な工程は中心のイミダゾール核の形成にある。
【００１７】
【化１】
2004529967.tif 000005
【００１８】
本発明の化合物の好ましい調製方法を上記のスキームに示す。α−ジケトンが、例えば、４−置換ピリジン誘導体（Ｙ１＝Ｙ２＝ＣＨ、Ｒ１−Ｘ＝ＨおよびＲ４＝Ｒａ＝Ｈ）のアニオンを適宜保護された縮合二環式アリールアルデヒド（例えば、１−メトキシイミノ−インダン−５−カルボキシアルデヒド）と縮合させ、つづいて当該中間性生物を酸化することで調製される。そのジケトンを、メタノールおよびメチル−tert−ブチルエーテルの混合物中にて、グリオキシル酸エチルエステルなどのアルデヒドおよび酢酸アンモニウムと一緒に攪拌し、ＷＯ９８／５６７８８に記載の方法と同様の方法により、イミダゾール核を形成することができる。その後、そのエチルエステルを一般的アミド結合形成方法（かかる方法は当該分野にて周知であり、例えば、P.D. Bailey、I.D. CollierおよびK.M. Morgan、Comprehensive Organic Functional Group Transformation、Vol.５、C.J. Moody編、２５７頁、Elsevier Scientific、Oxford、１９９５に記載されている）を用いてアミドに変換し、ＰＧ基をヒドロキシイミノ基（ＨＯ−Ｎ＝）に変換してもよい。
【００１９】
イミダゾール窒素の（N. J. Livertonら；J. Med. Chem.、１９９９、４２、２１８０−２１９０に記載の方法の一つを用いて）式：Ｌ−Ｒ４（式中、Ｌは脱離基、例えば、ハロ、スルホナートまたはトリフラートを意味する）で示される化合物を用いての非選択的アルキル化は、化合物（Ｘ１またはＸ２はＮＲ６であり、Ｒ６は水素以外の基である）の両方の異性体を形成するであろう。その異性体はクロマトグラフィ操作により分離することができる。
式（Ｉ）の化合物の合成の間、その中間化合物にある不安定な官能基、例えば、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノ基を保護してもよい。種々の不安定な官能基を保護しうる方法およびその得られた保護誘導体を切断する方法の網羅的な議論が、例えば、Protective Groups in Organic Chemistry、T.W. GreeneおよびP.G.M. Wuts、（Wiley−Interscience、New York、第２版、１９９１）に示されている。
【００２０】
式（Ｉ）の化合物は、単独で、または少なくとも２個、例えば５ないし１０００個の化合物、より好ましくは１０ないし１００個の式（Ｉ）の化合物の化合物ライブラリとして調製することができる。式（Ｉ）の化合物のライブラリはコンビナトリアル「スプリットおよびミックス」法により、または当業者に周知の方法により液相または固相化学のいずれかを用いる多段階並行合成法により調製することができる。
このように、本発明のさらなる態様によれば、少なくとも２個の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩を含む、化合物ライブラリが提供される。
医薬上許容される塩は適当な酸または酸誘導体との反応により調製することができる。
【００２１】
式（Ｉ）の化合物の合成における中間体として用いられる式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の新規なカルボン酸エステルおよびその対応する酸もまた本発明の一部を形成する：
【化１】
2004529967.tif 000006
（ＩＩ）
［式中、Ｘ、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ１、Ｒａ、Ａｒ、Ｘ１およびＸ２は式（Ｉ）の記載と同意義であり、Ｒは水素、Ｃ１−６アルキルまたはアリールＣ１−６アルキルである］。
【００２２】
上記したように、式（Ｉ）の化合物およびその医薬上許容される誘導体は、Ｒａｆキナーゼ、特にＢ−Ｒａｆキナーゼが関与している障害の治療および／または予防に有用である。
本発明のさらなる態様によれば、Ｂ−Ｒａｆキナーゼの阻害剤としての式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩の使用が提供される。
上記したように、式（Ｉ）の化合物およびその医薬上許容される誘導体は、虚血性事象から由来の神経変性に付随する障害の治療および／または予防にて有用である。
本発明のさらなる態様によれば、その治療または予防を必要とする哺乳動物にて、かかる哺乳動物に有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される誘導体を投与することを含む、神経外傷性疾患の治療または予防方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは他の哺乳動物において、神経外傷性事象によって悪化または惹起される病態の予防的または治療的処置のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される誘導体の使用が提供される。
【００２３】
本明細書にて用いる神経外傷性疾患／事象は、手術で生じるような、開放性頭部または穿通性頭部外傷、あるいは頭部への損傷により惹起されるような、閉鎖性頭部外傷損傷の両方の外傷を包含する。また、虚血性発作、特に脳卒中、冠状動脈バイパス術後の一過性虚血性発作および他の一過性虚血性状態後の認識低下もこの定義の範囲に含まれる。
虚血性発作は、一般に、血管の塞栓、血栓または局所アテローム性閉塞の結果として、脳の特定領域に血液の供給が十分でないことに由来する、巣状の神経脱落障害として定義できる。この領域におけるストレス刺激（不安など）、レドックス損傷、過度のニューロン興奮性刺激および炎症性サイトカインの役割が明らかにされてきており、本発明はこれら損傷の潜在的治療手段を提供する。これらのような急性損傷に対しては利用できる治療方法が相対的にほとんどない。
【００２４】
本発明の化合物は癌の治療または予防に用いることもできる。
式（Ｉ）の化合物を治療に用いるためには、該化合物は、一般に、標準的薬務に従って、医薬組成物に処方されるであろう。
本発明のさらなる態様によれば、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される誘導体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００２５】
式（Ｉ）の化合物は、都合よくは、薬物投与に慣用的に使用されるいずれかの経路により、例えば、非経口的、経口的、局所的経路により、または吸入によって投与されうる。式（Ｉ）の化合物は、当該化合物を慣用的操作により標準的医薬担体と組み合わせることで調製した従来の投与形にて投与することができる。式（Ｉ）の化合物はまた、既知の第２治療活性化合物と組み合わせた従来の投与量にて投与することができる。これらの操作は、混合、造粒および圧縮を含み、あるいは成分を適宜所望の調製物に溶かすことを包含する。医薬上許容される担体の形態および特徴は、それと組み合わせる式（Ｉ）の化合物の量、投与経路および他の周知の変数によって決定されるであろう。担体は処方の他の成分と適合しうるという意味で、そして受容者に毒性がないという意味で「許容され」なければならない。
利用される医薬担体は、例えば、固体または液体のいずれであってもよい。固体担体は、例えば、ラクトース、白土、シュークロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等である。液体担体は、例えば、シロップ、落花生油、水等である。同様に、担体または希釈体は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの当該分野に周知の遅延性物質を単独でまたはワックスと一緒に含んでいてもよい。
【００２６】
多種の医薬形態を利用することができる。すなわち、固体担体を用いるとすれば、製剤は錠剤化され、粉末またはペレットの形態にて、あるいはトローチまたはロゼンジの形態にてハードゼラチンカプセルに入れることができる。固体担体の量は広範囲にわたって変化するが、好ましくは、約２５ｍｇから約１ｇの範囲であろう。液体担体を用いる場合、製剤はシロップ、エマルジョン、ソフトゼラチンカプセル、滅菌注射液、例えばアンプルまたは非水性液体懸濁液の形態であろう。
式（Ｉ）の化合物は、非経口的に、すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣腔内または腹腔内投与により投与されることが好ましい。非経口の静脈内投与形態が一般に好ましい。当該化合物は、ボーラスまたは連続的に注入して、例えば３日間にわたって投与することができる。このような投与の適当な投与形態は常套手段により調製することができる。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物はまた経口投与してもよい。かかる投与の適当な投与形態は常套手段により調製することができる。
式（Ｉ）の化合物はまた吸引により、すなわち、鼻腔内または口腔吸引投与により投与されてもよい。エアロゾル処方などのかかる投与の適当な投与形態は常套手段により調製することができる。
式（Ｉ）の化合物はまた、局所的に、すなわち、非全身性投与により投与してもよい。これは、化合物が有意に血流に入らないように、化合物を表皮または口腔に外部から塗布すること、かかる化合物を耳、目および鼻に注入することを包含する。
【００２８】
本明細書に開示されているすべての使用方法について、一日の経口用量は、全体重の１ｋｇ当たり好ましくは約０．１から約８０ｍｇであり、好ましくは約０．２ないし３０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは約０．５ｍｇないし１５ｍｇである。一日の非経口用量は、全体重の１ｋｇ当たり約０．１ないし約８０ｍｇ、好ましくは約０．２ないし３０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは約０．５ｍｇないし１５ｍｇである。一日の局所用量は、好ましくは、０．１ｍｇないし１５０ｍｇであり、一日に１ないし４回、好ましくは２または３回投与される。一日の吸引用量は、好ましくは、一日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇである。当業者であれば、当該阻害剤の最適用量および個々の投与の間隔が、治療すべき症状の特性および程度、投与の形態、経路および部位、治療される個々の患者により決定され、かかる最適用量は常套手段により決定され得ることが理解されよう。当業者であれば、治療の最適コース、すなわち、所定の期間に一日当たり服用される阻害剤の投与回数を、従来のコースの治療決定試験を用いて確認することができる。医薬上許容される塩の場合には、上記した数値を、式（Ｉ）の親の化合物の数値として換算する。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物を上記した投与量の範囲で投与した場合、毒物学的作用は指摘されるものではなく／予想もされない。
特許および特許出願（これに限定されない）を含め、本明細書にて引用されているすべての刊行物を、出典明示により本明細書の一部とする。
【００３０】
以下の実施例は本発明の薬理学的に活性な化合物の調製を示すものであり、以下の記載例はこれら化合物の調製に用いる中間体の調製を示す。
本明細書で使用する略語は以下のとおりである。
ＴＨＦはテトラヒドロフランを意味する。
ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味する。
ＬＤＡはリチウムジイソプロピルアミドを意味する。
ＴＢＡＦはフッ化テトラブチルアンモニウムを意味する。
ＤＭＳＯはメチルスルホキシドを意味する。
【００３１】
記載例１：４−(１−オキソ−インダン−５−イル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルボン酸
工程１  ５−ブロモ−インダン−１−オンＯ−メチル−オキシム
アルゴン下にある５−ブロモ−インダンオン（１００ｇ、０.４７４モル）のエタノール（６５０ｍｌ）中溶液に、メトキシルアミン塩酸塩（１９８ｇ、 ２.３８モル）およびピリジン（１２５ｍｌ）を添加した。その混合物を２．５時間還流し、室温に冷却し、飽和水性炭酸水素ナトリウム溶液に注いだ。ついで、混合物を酢酸エチルで抽出し、有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で濃縮した。粗物質をイソプロパノールから再結晶し、表記化合物を褐色固体として得た（１１０ｇ、９７％）；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  ７.５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ ８.３Ｈｚ）、７.４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ １Ｈｚ）、７.３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ８.３，１Ｈｚ）、３.９７（３Ｈ，ｓ）、２.９９（２Ｈ，ｍ）、２.８５（２Ｈ，ｍ）。
【００３２】
工程２  １−メトキシイミノ−インダン−５−カルボキシアルデヒド
アルゴン下、−６０℃の工程１の生成物（１１２ｇ、０.４６モル）のＴＨＦ（１５００ｍｌ）中溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（３２５ｍｌ、０.５２モル）を１時間にわたって添加した。−６０℃で１時間攪拌した後、ＤＭＦ（３９.７ｍｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ）中溶液を１時間にわたって滴下した。反応物を−６０℃で１時間攪拌し、室温まで加温した。１時間後、反応物を飽和水性炭酸水素ナトリウムでクエンチし、酢酸エチルで抽出した。ついで、有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィで精製し、黄色固体として表記化合物（５７ｇ、６５％）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  １０．０（１Ｈ，ｓ）、７.８３−７.７３（３Ｈ，ｍ）、４.０２（３Ｈ，ｓ）、３.１０（２Ｈ，ｍ）、２.９２（２Ｈ，ｍ）。
【００３３】
工程３  ５−(１、２−ジヒドロキシ−２−ピリジン−４−イル−エチル）−インダン−１−オン−Ｏ−メチル−オキシム
アルゴン下、−５０℃の４−(tert−ブチル−ジメチル−シリルオキシメチル）−ピリジン［T.F. Gallagherら、Bioorg. Med. Chem.、１９９７、５、４９］（７１.５ｇ、０.３２モル）のＴＨＦ（８００ｍｌ）中溶液に、ＬＤＡ（１６２ｍｌ、ヘプタン／ＴＨＦ／エチルベンゼン中２Ｍ、０.３２４モル）を１時間にわたって添加した。混合物を−４０℃でさらに１時間攪拌し、工程２の生成物（５５ｇ、０.２９モル）のＴＨＦ（６００ｍｌ）中溶液を１時間にわたって添加した。ついで、反応物を室温に一夜加温し、飽和水性炭酸水素ナトリウム溶液を添加してクエンチし、ついで酢酸エチルに抽出した。有機相を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、真空下で濃縮し、褐色油を得た（１２５ｇ）。
ついで、該油をＴＨＦ（１５００ｍｌ）に溶かし、ＴＢＡＦ（３５６ｍｌ、０.３５６モル）で処理し、１時間攪拌した。ついで、反応混合物を蒸発させ、残渣を水と酢酸エチルの間に分配させた。ついで有機相を乾燥させ（Ｎｓ２ＳＯ４）、濃縮して表記化合物を淡黄色固体として得（５７ｇ、６４％）、それをさらに精製することなく用いた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  ８．３８（２Ｈ，ｍ）、７．５７（１Ｈ，ｍ）、７.１２−６.９９（４Ｈ、ｍ）、４.８８（１Ｈ、ｍ）、４.６６（１Ｈ、ｍ）、３.９６（３Ｈ、ｓ）、２.９３（２Ｈ、ｍ）、２.８５（２Ｈ、ｍ）。
【００３４】
工程４  １−(１−メトキシイミノ−インダン−５−イル）−２−ピリジン−４−イル−エタン−１、２−ジオン
アルゴン下、−７０℃のＤＭＳＯ（４３ｍｌ、０.５６モル）およびジクロロメタン（８００ｍｌ）の混合物に、塩化オキサリル（４３.２ｇ）を加え、ついで工程３の生成物（５５ｇ、０.１８５モル）のジクロロメタン／ＤＭＳＯ（１０００ｍｌ／６０ｍｌ）の混合液中溶液を−６０℃で２時間にわたって加えた。−６０℃で２時間攪拌した後、トリエチルアミン（１５４ｍｌ）を滴下し、その混合物を室温まで一夜加温した。ついで、反応混合物を水でクエンチし、ついで分離した有機相を水で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、濃縮して表記化合物（５１ｇ、９４％）を黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  ８．８７（２Ｈ，ｄ）、７．８９−７．７７（５Ｈ，ｍ）、４.０３（３Ｈ、ｓ）、３.０９（２Ｈ、ｍ）、２.９３（２Ｈ、ｍ）。
【００３５】
工程５  ４−(１−メトキシイミノ−インダン−５−イル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルボン酸エチルエステル
５℃の工程４の生成物（４.３ｇ、１５ミリモル）およびグリオキシル酸エチルエステル（トルエン中５０％溶液、６ｍｌ、３０ミリモル）のtert−ブチル−メチルエーテル（１５０ｍｌ）中混合物を、酢酸アンモニウム（１１.２ｇ、１４５ミリモル）のメエタノール（５０ｍｌ）中溶液で処理した。室温で２時間攪拌した後、該溶液を真空下で蒸発させ、残渣をクロロホルムと飽和炭酸水素ナトリウム溶液の間に分配した。有機相を分離し、水およびブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をクロロホルム中５％メタノールで溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィで精製し、表記化合物を黄色固体として得た（１.０ｇ、１８％）；ＭＳ（ＡＰ＋）ｍ／ｅ  ３７７［Ｍ+Ｈ］＋。
【００３６】
工程６  ４−(１−オキソ−インダン−５−イル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルボン酸エチルエステルジ塩酸塩
工程５の生成物（１.０ｇ、２.７ミリモル）および５Ｍ ＨＣｌ（１５ｍｌ）のジオキサン（３０ｍｌ）／アセトン（３０ｍｌ）中混合物を１００℃に３時間加熱した。混合物を室温に冷却し、真空下で溶媒を蒸発させた。残渣をアセトン（２x２０ｍｌ）およびエタノール／アセトン（１：１、２０ｍｌ）と一緒に蒸発させ、表記化合物を得た（１.０ｇ、８８％）；ＭＳ（ＥＳ−）ｍ／ｅ  ３４６［Ｍ−Ｈ］−。
【００３７】
工程７  ４−(１−オキソ−インダン−５−イル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルボン酸
工程６の生成物（１.０ｇ、２.４ミリモル）の、１０％水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）を含有する、エタノール（１０ｍｌ）中溶液を、５０℃で一夜加熱した。冷却後、溶媒を真空下で除去し、残渣を水に溶かし、氷酢酸でｐＨを６に調整し、溶媒を再度蒸発させた。残渣を水（５０ｍｌ）に懸濁させ、固体を集め、水で洗浄して五酸化リン上で乾燥させ、粗表記化合物を灰白色固体として得た（０.７ｇ）；ＭＳ（ＡＰ−）ｍ／ｅ  ３１８［Ｍ−Ｈ］−。
【００３８】
実施例１：  ４−(１−ヒドロキシイミノ−インダン−５−イル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド
【化１】
2004529967.tif 000007
【００３９】
工程１  ４−(１−オキソ−インダン−５−イル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド
記載例１の生成物（１０５ｍｇ、０.３３ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６８ｍｇ、０.５ミリモル）およびＮ−シクロヘキシルカルボジイミド−Ｎ'−メチルポリスチレン（５００ｍｇ、０.６６ミリモル、樹脂負荷１.３２ミリモル／ｇ）のＤＭＦ（２ｍｌ）中混合物を室温で３０分間攪拌した。２−モルホリン−４−イル−エチルアミン（４３ｍｇ、０.３３ミリモル）のジクロロメタン（０.５ｍｌ）中溶液を加え、当該混合物を室温で２４時間攪拌した。その混合物をメタノールで、つづいてメタノール中１０％０．８８０アンモニア溶液で溶出するＳＣＸカチオン交換カラムを介して濾過し、生成物を溶出させた。濃縮後、残渣を０．８８０アンモニア溶液：メタノール：クロロホルムの１：９：９０の混合物で溶出するシリカゲルクロマトグラフィにより精製し、黄色固体として表記化合物（６５ｍｇ、４６％）を得た；ＭＳ（ＡＰ＋）ｍ／ｅ  ４３２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４０】
工程２  ４−(１−ヒドロキシイミノ−インダン−５−イル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド
工程１の生成物（６５ｍｇ、０.１５ミリモル）のエタノール（４ｍｌ）および水性ヒドロキシルアミン（１ｍｌ、水中５０％）中溶液を還流下で１時間加熱した。室温に冷却後、溶液を真空下で濃縮し、残渣をエタノール（３ｘ１０ｍｌ）と一緒に蒸発させた。当該残渣を０.８８アンモニア溶液：メエタノール：クロロホルム（１：９：９０）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィに付して精製し、黄色固体として表記化合物を得た（５０ｍｇ、７５％）；ＭＳ（ＡＰ＋）ｍ／ｅ  ４４７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００４１】
実施例１に記載の一般的な二段階方法から以下の実施例の化合物を調製した。
【表１】
2004529967.tif 000008
本発明は上記した個々のかつ好ましい下位群の組合せのすべてに及ぶことを理解すべきである。
【００４２】
生物学的実施例
式（Ｉ）の化合物のＢ−Ｒａｆ阻害剤としての活性は、以下のインビトロアッセイにより測定することができる。
蛍光異方性キナーゼ結合アッセイ
キナーゼ酵素、蛍光リガンドおよび種々の濃度の試験化合物を一緒にインキュベートし、一の条件下、すなわち、試験化合物の不存在の下で、蛍光リガンドが有意に（＞５０％）酵素と結合し、十分な濃度（＞１０ｘ Ｋｉ）の強力な阻害剤の存在下で、結合していない蛍光リガンドの異方性が結合している値と適度に異なるような条件下で熱力学的平衡になるようにする。
【００４３】
キナーゼ酵素の濃度は、好ましくは、＞１ｘＫｆとすべきである。必要な蛍光リガンドの濃度は使用する計器、ならびに蛍光および物理化学特性に依存するであろう。使用する濃度はキナーゼ酵素の濃度よりも小さくなければならず、そのキナーゼ酵素の濃度の半分よりも小さいことが好ましい。
【００４４】
典型的なプロトコルは、以下のとおりである：
すべての化合物を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２のバッファに溶かす。
Ｂ−Ｒａｆ酵素濃度：１ｎＭ
蛍光リガンド濃度：０．５ｎＭ
試験化合物濃度：０．５ｎＭないし１００μＭ
平衡に達するまで（３時間から３０時間まで）、ＬＪＬ ＨＥ３８４型Ｂブラックマイクロタイタープレート中、１０μｌの最終容量にてインキュベートする。
蛍光異方性はＬＪＬ Ａｃｑｕｅｓｔで読む。
定義：  Ｋｉ＝阻害剤結合についての解離定数
Ｋｆ＝蛍光リガンド結合についての解離定数
【００４５】
蛍光リガンドは以下の化合物であり：
【化１】
2004529967.tif 000009
５−[２−(４−アミノメチルフェニル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル]−２−クロロフェノールおよびローダミン・グリーンから誘導される。
本発明の化合物は１μＭよりも小さいなＫｄを有する。
【００４６】
Ｒａｆキナーゼアッセイ
放射性標識したホスフェートを、Ｂ−Ｒａｆの既知の生理学的基質である、組換えＭＡＰキナーゼ（ＭＥＫ）に組込むアッセイにより、ヒト組換えＢ−Ｒａｆ蛋白の活性をインビトロにて評価した。触媒的に活性なヒト組換えＢ−Ｒａｆ蛋白を、ヒトＢ−Ｒａｆ組換えバキュロウイルス発現ベクタに感染したｓｆ９昆虫細胞を精製することで得た。基質をリン酸化することでＢ−Ｒａｆ活性が得られたことを保証するために、触媒的に不活性な形態のＭＥＫを利用した。この蛋白はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合蛋白として細菌細胞発現変異体の不活性なＭＥＫ（ＧＳＴ−ｋｄＭＥＫ）から精製した。
【００４７】
方法：Ｂ−Ｒａｆ触媒活性の標準的なアッセイ条件は、合計３０μｌの反応容量にて、３μｇのＧＳＴ−ｋｄＭＥＫ、１０μＭ ＡＴＰおよび２μＣｉ３３Ｐ−ＡＴＰ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍシュークロース、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ジメチルスルホキシド（適宜、化合物を含有する）を利用した。反応物を２５℃で９０分間インキュベートし、５０μＭの最終濃度までＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。１０μｌの反応物をＰ３０リンセルロース紙にスポットし、風乾させた。氷冷１０％トリクロロ酢酸、０．５％リン酸中に４回洗浄した後、その紙を風乾させ、ついで液体シンチラントを加え、シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。
【００４８】
結果：実施例の化合物は、ＩＣ５０が＜３０μＭと、ＧＳＴ−ｋｄＭＥＫのＢ−Ｒａｆ介在リン酸化を阻害するのに効果的であることがわかった。
Ｒａｆ阻害剤としての化合物の活性はまた、ＷＯ９９／１０３２５；McDonald, O.B.、Chen, W.J.、Ellis, B.、Hoffman, C.、Overton, L.、Rink, M.、Smith, A.、Marshall, C.J.およびWood, E.R.（１９９９）A scintillation proximity assay for the Raf/MEK/ERK kinase cascade：high throughput screening and identification of selective enzyme inhibitors、Anal. Biochem. ２６８：３１８−３２９およびAACR meeting New Orleans １９９８ Poster ３７９３に記載のアッセイにより測定してもよい。
【００４９】
Ｂ−Ｒａｆ阻害剤の神経保護活性は以下のインビトロアッセイにより測定してもよい：
Ｂ−Ｒａｆ阻害剤のラット海馬スライス培養物における神経保護特性
器官型培養物は神経細胞を溶かした培養物と酸素およびグルコース欠乏（ＯＧＤ）のインビボ実験の中間物を提供する。大部分の膠神経細胞相互作用および神経細胞回路が海馬スライス培養物中に維持され、そのためインビボ状況に類似する実験にて種々の細胞型の間の細胞死のパターンの研究が容易となる。これらの培養物は、損傷から２４時間以上経過した後の細胞損傷および細胞死の遅れの研究を可能とし、培養条件下にある長期間の変性の結果の評価をも可能とする。多くの実験室は海馬の器官型培養物中のＯＧＤに対する反応における神経細胞損傷の遅れを報告した（Vornovら、Stroke、１９９４、２５、５７−４６５；Newellら、Brain Res.、１９９５、６７６、３８−４４）。ＥＡＡアンタゴニスト（Strasserら、Brain Res.、１９９５、６８７、１６７−１７４）、ナトリウムチャネルブロッカー（Taskerら、J. Neurosci.、１９９２、１２、９８−４３０８）およびカルシウムチャネルブロッカー（Pringleら、Stroke、１９９６、７、２１２４−２１３０）を含む、数種の化合物は、この実験にて、保護活性を有することがわかった。今日まで、この実験における神経細胞死の細胞内キナーゼ介在シグナル化経路の役割は相対的にほとんど知られていない。
【００５０】
方法：器官型海馬スライス培養物をStoppiniら、J. Neurosci. Methods、１９９５、３７、１７３−１８２の方法を用いて調製した。簡単に言えば、生後７−８日のスプレーグ・ドーリラットの海馬から調製した４００ミクロンの部分を半多孔質膜上で９ないし１２日間培養する。ついで、嫌気性チャンバー中の血清およびグルコース不含培地にて４５分間インキュベートすることでＯＧＤを誘導する。ついで、培養物を分析の２３時間前に空気／ＣＯ２インキュベーターに戻す。細胞死のインジケーターとしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いる。ＰＩは神経細胞に対して非毒性であり、多くの研究で細胞の生存を確認するのに用いられている。ＰＩは損傷を受けた神経細胞に入り込み、核酸と結合する。結合したＰＩは、５４０ｎｍで励起されると、６３５ｎｍでの発光が増加する。一のＰＩ蛍光画像と一の白色光画像を取り、細胞死の割合を分析する。ＣＡ１領域を白色光画像から限定し、ＰＩ画像と重ね合わせる。ＰＩシグナルが閾値で示され、ＰＩ損傷の領域がＣＡ１領域の割合として表される。ＰＩ蛍光と組織学的に確認された細胞死の間の相関関係はクレシルバイオレットを用いるNissl-染色法によって以前に確認されている（Newellら、J. Neurosci.、１９９５、１５、７７０２−７７１１）。
【００５１】
本発明が上記した個々のおよび好ましい基の組み合わせすべてに及ぶことを理解すべきである。
明細書および上記した特許請求の範囲全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」なる語は、いずれか他の整数または工程あるいは整数または工程の群を除外するものではなく、特定された整数または工程あるいは整数または工程の群を含むものを意味することが理解されよう。
この記載および特許請求の範囲で形成される出願はその後の出願の優先権の主張の基礎とすることができる。かかる後の出願の特許請求の範囲は本明細書に記載のいずれの特徴または特徴の組み合わせに関するものであってもよい。かかる特許請求の範囲は組成物、方法または使用クレームの形態とすることができ、一例として上記した特許請求の範囲を包含するが、それに限定されるものではない。
【国際公開パンフレット】
2004529967.tif 000013
2004529967.tif 000014
2004529967.tif 000015
2004529967.tif 000016
2004529967.tif 000017
2004529967.tif 000018
2004529967.tif 000019
2004529967.tif 000020
2004529967.tif 000021
2004529967.tif 000022
2004529967.tif 000023
2004529967.tif 000024
2004529967.tif 000025
2004529967.tif 000026
2004529967.tif 000027
2004529967.tif 000028
2004529967.tif 000029
2004529967.tif 000030
2004529967.tif 000031
2004529967.tif 000032
2004529967.tif 000033
2004529967.tif 000034
【国際調査報告】
2004529967.tif 000035
2004529967.tif 000036