(57)【要約】本発明は、生物学的バリヤーを透過性にし且つ腫瘍増殖を抑制するのに有用な分岐鎖状親油性分子の新規なホスホ誘導体を開示する。本発明は、上記分子を含んでなる医薬組成物及びそれらの使用も開示する。
2004505898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ
2004505898.tif 000014
（上記式中、
Ｒ１及びＲ２は２−３０個の炭素原子を含んでなる同一であるか又は異なっている飽和又は不飽和脂肪族鎖であり、
Ｒ３はＡ−［ＣＨ２］ｍ−Ｂ−［ＣＨ２］ｎ−Ｃ−［ＣＨ２］ｐ−Ｄであり、ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して０又は１−１２の整数であり、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ共有結合、アミノ、アミド、酸素、チオ、カルボニル、カルボキシル、オキシカルボニル、チオカルボニル、ホスファート、アミノホスファートモノ−、ジ−及びトリ−アミノホスファート基から独立して選択され、但し、２個の酸素原子は互いに直接結合せず、
Ｚ１及びＺ２は同一であるか又は異なっており、それぞれ存在しないか、あるいはａ）水素、ナトリウム、リチウム、カリウム、アンモニウム、モノ−、ジ−、トリ−及びテトラ−アルキルアンモニウムから独立して選択されるか、又はｂ）ホスホ基と一緒にグリセロール、コリン、エタノールアミン、イノシトール、セリン、モノ−又はオリゴ糖のホスホエステルを形成する）の化合物、又はその薬学上許容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ１の長さが３炭素原子であり、Ｒ２の長さが１２−１６炭素原子である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がプロピルであり、Ｒ２がドデシルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３がモノ−エチレングリコール又はジ−エチレングリコール残基を含んでなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２及びＲ３を一緒にした炭素原子の総数が６−２６である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２及びＲ３を一緒にした炭素原子の総数が１６−２２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｚ１がコリンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｚ１がナトリウムであり、Ｚ２が水素及びナトリウムから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
４−ヘキサデシルホスファート（３，１２−ＰＯ４）、
４−オクタデシルホスファート（３，１４−ＰＯ４）、
４−エイコサニルホスファート（３，１６−ＰＯ４）、
８−ペンタデシルホスファート（７，７−ＰＯ４）、
４−ヘキサデカノイルオキシエチルホスファート（３，１２−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−ヘキサデカニルオキシエチルホスファート（３，１２−（エーテル）−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−ヘキサデカニルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１２−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−ヘキサデシルホスホコリン（３，１２−ＰＣ）、
２−（４−ヘキサデカノイルオキシ）エチルホスホコリン（３，１２−ＭＥＧ−ＰＣ）、
２−（４−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１２−ＤＥＧ−ＰＣ）、
２−｛２’−［１０”−（ヘキサデシル−４−オキシ）デシル−ｌ−オキシ］エトキシ｝エチルホスファート（３，１２−Ｏ−Ｃ１０−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
２−｛２’−［１０”−（ヘキサデシル−４−オキシ）デシル−ｌ−オキシ］エトキシ｝エチルホスホコリン（３，１２−Ｏ−Ｃ１０−ＤＥＧ−ＰＣ）、
４−オクタデカノイルオキシエチルホスファート（３，１４−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−オクタデカノイルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１４−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−オクタデカニルオキシエチルホスファート（３，１４−（エーテル）−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−オクタデカニルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１４−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−オクタデシルホスホコリン（３，１４−ＰＣ）、
２−（４−オクタデカノイルオキシ）エチルホスホコリン（３，１４−ＭＥＧ−ＰＣ）、
２−（４−オクタデカノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１４−ＤＥＧ−ＰＣ）、
４−エイコサノイルオキシエチルホスファート（３，１６−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−エイコサノイルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１６−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−エイコサニルオキシエチルホスファート（３，１６−（エーテル）−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−エイコサニルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１６−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−エイコサニルホスホコリン（３，１６−ＰＣ）、
２−（４−エイコサノイルオキシ）エチルホスホコリン（３，１６−ＭＥＧ−ＰＣ）、
２−（４−エイコサノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１６−ＤＥＧ−ＰＣ）、
１０−（４’−ヘキサデカノイルオキシ）デカニルホスファート、
１０−（８’−ペンタデカノイルオキシ）デカニルホスファート、
２−［２’−（２”−プロピルエイコサノイルオキシ）−エトキシ］エチルホスファート（３，１８−ＤＥＧ−ＰＯ４）、及び
２−（２’−プロピルエイコサノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１８−ＤＥＧ−ＰＣ）
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
２−（４’−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスファート一ナトリウム塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
２−（４’−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスファート二ナトリウム塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
２−（４’−ヘキサデカニルオキシ）エトキシエチルホスファートである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
２−（４−ヘキサデカノイルオキシ）エチルホスホコリンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
２−（４−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
薬学上許容可能なキャリヤーと、一般式Ｉ
2004505898.tif 000015
（上記式中、
Ｒ１及びＲ２は２−３０個の炭素原子を含んでなる同一であるか又は異なっている飽和又は不飽和脂肪族鎖であり、
Ｒ３はＡ−［ＣＨ２］ｍ−Ｂ−［ＣＨ２］ｎ−Ｃ−［ＣＨ２］ｐ−Ｄであり、ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して０又は１−１２の整数であり、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ共有結合、アミノ、アミド、酸素、チオ、カルボニル、カルボキシル、オキシカルボニル、チオカルボニル、ホスファート、アミノホスファートモノ−、ジ−及びトリ−アミノホスファート基から独立して選択され、但し、２個の酸素原子は互いに直接結合せず、
Ｚ１及びＺ２は同一であるか又は異なっており、それぞれ存在しないか、あるいはａ）水素、ナトリウム、リチウム、カリウム、アンモニウム、モノ−、ジ−、トリ−及びテトラ−アルキルアンモニウムから独立して選択されるか、又はｂ）ホスホ基と一緒にグリセロール、コリン、エタノールアミン、イノシトール、セリン、モノ−又はオリゴ糖のホスホエステルを形成する）の化合物、又はその薬学上許容可能な塩を含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
一般式Ｉの化合物が請求項２−１４のいずれか一項で定義した通りである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
生物学的活性剤をさらに含んでなる、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
生物学的活性剤が治療薬である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
生物学的活性剤が抗癌剤である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
生物学的活性剤が診断薬である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
医薬品の製造を目的とする、請求項１−１４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２２】
生物学的バリヤーの透過性を増加させる方法であって、上記バリヤーを請求項１−１４のいずれか一項に記載の一般式Ｉの化合物の有効量に暴露することを含んでなる、上記方法。
【請求項２３】
生物学的バリヤーが皮膚、角膜、結膜、鼻、気管支、頬、膣及び消化器上皮、血液網膜関門、血液脳関門、血液精巣関門、血液腫瘍関門、及び血液腎間相（ｂｌｏｏｄ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
生物学的活性剤を特定の部位又は器官に投与する方法であって、上記部位又は器官を上記生物学的活性剤に請求項１５に記載の医薬組成物の有効量の存在下にて暴露し、特定の部位又は器官における生物学的活性剤の透過及び／又は蓄積を可能とし又は増加させることを含んでなる、上記方法。
【請求項２５】
上記の特定部位又は器官が脊髄、脳、眼、精巣、腺又は腫瘍である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
中枢神経系の疾患又は障害の治療方法であって、治療を必要とする対象に請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を治療薬と組み合わせて投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２７】
上記治療薬が抗腫瘍、抗ウイルス、抗微生物、抗真菌、抗炎症、神経保護薬、及び生物活性ペプチド及びタンパク質からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍の治療方法であって、治療を必要とする患者に請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２９】
治療を必要とする患者に抗癌剤の有効量を投与することをさらに含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記抗癌剤を別個の医薬組成物中で投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍が中枢神経系にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍が脳にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍が癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、リンパ腫、白血病、肉腫、及び黒色腫からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
上記腫瘍が原発性又は二次的腫瘍である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
眼科疾患又は障害の治療方法であって、治療を必要とする患者に請求項１５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項３６】
治療を必要とする患者に追加的生物学的活性剤の有効量を投与することを含んでなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
眼科疾患又は障害が類嚢胞斑状水腫（ＣＭＥ）、加齢性斑状変性（ＡＲＭＤ）、眼内感染症、眼内炎症、及び眼内悪性腫瘍から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
医薬組成物を経口、非経口又は局所投与により、あるいは局所灌流、浣腸又は器官内洗浄により投与する、請求項２４−３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
医薬組成物を動脈内に投与する、請求項２４−３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
医薬組成物を髄腔内に投与する、請求項２４−３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
生物学的バリヤーによって保護された器官中の診断薬の蓄積を増加させる方法であって、個体に上記診断薬を請求項１５に記載の医薬組成物の有効量と組み合わせて投与し、生物学的バリヤーによって保護された器官での診断薬の蓄積を増加させることを含んでなる、上記方法。
【請求項４２】
上記の生物学的バリヤーによって保護された器官が中枢神経系である、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、分岐鎖状親油性分子の新規なホスホ誘導体、それらの医薬組成物、及び生物学的バリヤー（関門）の透過性を可逆的且つ選択的に増加させるため、及び腫瘍増殖を阻害するためのそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多くの薬剤及び治療薬の使用における主要な制限は、生物学的バリヤーを通過する能力が不十分であることである。このことは、特に、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）のような特定部位での疾患及び障害の治療にとって重大な問題をもたらす。
【０００３】
密着結合によって結合された分化した微小血管内皮細胞からなる血液脳関門（ＢＢＢ）は、通常は脳のホメオスタシス環境の保持、及び脳の、循環系に存在する毒性物質及び分解生成物からの保護を担っている。しかしながら、ある種の病理学的状況では、ＢＢＢの存在によって治療物質の脳への輸送が妨げられ、腫瘍、感染症、膿瘍、及び変性疾患などの中枢神経系の病変の治療が妨げられることがある。
【０００４】
同様に、血液腫瘍関門（ＢＴＢ）の存在によって、化学療法薬の腫瘍への送達が妨げられ、これにより薬剤バイオアベイラビリティーが減少し、求められるところでの効率的な治療効果が妨げられる。病気に罹っているターゲットへの治療薬の接近が不十分であるという問題はＣＮＳ腫瘍の場合に特に深刻であり、悪性脳腫瘍患者は予後が良くない。
【０００５】
制限された部位である種の薬剤の臨床的に有用な濃度を達成するには、これらの化合物を高い全身用量で投与する必要があることが多い。また、高い全身濃度量は、さらに不都合な副作用や高レベルの毒性を伴う。
【０００６】
この問題を攻略するための一つの方法は、例えば親水性薬剤分子の生物物理学的特徴を、例えばこれらの薬剤を親油性担体に結合すること等によって変更することを含んでいる。このような生物学的膜を横切る薬剤透過性はその親油性によって変化するので、理論的には化合物の親油性を増加することによりそのバイオアベイラビリティーが向上し且つ治療効果を増すことになる。ターゲッティングのための神経学的に活性な化合物とのこのような共有結合性の極性脂質接合体は、Ｙａｔｖｉｎ　ｅｔ　ａｌの米国特許第５，８２７，８１９号明細書に開示されている。
【０００７】
ＢＢＢ不透過性を回避するもう一つの方法は、一時的にＢＢＢを開いて、特定の薬剤又は薬品が脳に入り易くする薬剤を用いることによる。マンニトールのような薬剤はこの望ましい効果を奏することが示されており且つ化学療法薬の悪性脳腫瘍への送達に用いられてきた（Ｈｉｅｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６），Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９：５０−５９）。しかしながら、脳腫瘍治療におけるこの種の高浸透圧性ＢＢＢの崩壊は、ＢＢＢを通過する薬剤の他に神経毒のような他の分子もはいることができるので、問題の多いものであった。これにより、浸透圧的開放法を用いる治療に関連した発作、痙攣、免疫学的反応及び眼毒性を説明することができる。
【０００８】
ブラジキニン作動薬（ＷＯ　９１／１６３５５号明細書、Ａｌｋｅｒｍｅｓ）及びある種の他のペプチド（ＷＯ　９２／１８５２９号明細書、Ａｌｋｅｒｍｅｓ）の使用、細菌細胞壁断片の使用（ＷＯ　９１／１６０６４号明細書、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ　Ｕｎｉｖ．）の使用、又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの糸状血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）又は脳の内皮のｘ−分子に対する抗体の使用（ＷＯ　９２／１９２６９号明細書、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ　Ｕｎｉｖ．）などを包含する血液脳関門の透過性を増加させる多種多様な他の治療法も開示されている。オレイン酸のようなある種の脂肪酸も、可逆的にＢＢＢを開くことが報告されている（Ｓｚｔｒｉｈａ　ａｎｄ　Ｂｅｔｚ（１９９１），Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．３３６：２５７−２６２）。
【０００９】
診断試薬（米国特許第５，０５９，４１５号明細書、Ｏｒｅｇｏｎ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉ．Ｕ．）又は治療試薬（ＷＯ　８９／１１２９９号明細書、Ｏｒｅｇｏｎ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉ．Ｕ．）を投与する前に血液脳関門の透過性を可逆的に増加する方法が有用であることが、開示されている。
【００１０】
分岐状脂肪酸及びそれらのある種の親油性誘導体が生体膜を可逆的に透過性にするのに有用であることが、本発明の発明者らによって以前に国際特許出願公開番号ＷＯ　９９／０２１２０号明細書に開示された。しかしながら、ホスファート残基を含んでなる化合物は開示されていない。更に、ホスファート残基の付加による分岐状脂肪酸の修飾によって、特異的且つ差別的に生物学的バリヤーの開放を調節することができることは開示されていない。
【００１１】
明らかに、生物学的膜及び関門を透過性にする目的でこれまでに開発された組成物は、重篤な副作用を生じる。従って、特定の部位に適正な量の治療及び診断薬を供給するための効果的且つ安全な手段を提供することが求められているが、達成されていない。
【００１２】
多数の組成物が様々な癌の治療に使用する目的で提案されており、それらには炭化水素鎖とホスホコリン残基を含んでなる化合物が包含される。Ｅｉｂｌの米国特許第４，８３７，０２３号及び第５，０４９，５５２号明細書には、癌の治療に有用な組成物及び方法が開示されている。これらの場合の活性物質は、既知物質であるヘキサデシルホスホコリン（ＨｅＰＣ）である。しかしながら、これらの特許明細書の開示内容によれば、試験した総ての化合物の中、ＨｅＰＣのみが実際に有用な抗腫瘍作用を有し、これより短いアルキル基を有する同族体は抗腫瘍作用を全く示さないか又は低すぎ、またこれより長いアルキル基を有する同族体は毒性が強すぎる。従来技術には、本発明の主題である化合物のいずれも全く開示も示唆もされていない。
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、一態様では、一般式Ｉ
2004505898.tif 000003
（上記式中、
Ｒ１及びＲ２は２−３０個の炭素原子を含んでなる同一であるか又は異なっている飽和又は不飽和脂肪族鎖であり、
Ｒ３はＡ−［ＣＨ２］ｍ−Ｂ−［ＣＨ２］ｎ−Ｃ−［ＣＨ２］ｐ−Ｄであり、ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立して０又は１−１２の整数であり、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ共有結合、アミノ、アミド、酸素、チオ、カルボニル、カルボキシル、オキシカルボニル、チオカルボニル、ホスファート、アミノホスファートモノ−、ジ−及びトリ−アミノホスファート基から独立して選択され、但し、２個の酸素原子は互いに直接結合せず、
Ｚ１及びＺ２は同一であるか又は異なっており、それぞれ存在しないか、又はａ）水素、ナトリウム、リチウム、カリウム、アンモニウム、モノ−、ジ−、トリ−及びテトラ−アルキルアンモニウムから独立して選択されるか、又はｂ）ホスホ基と一緒にグリセロール、コリン、エタノールアミン、イノシトール、セリン、モノ−又はオリゴ糖のホスホエステルを形成し得る）の化合物、又はその薬学上許容可能な塩を提供する。
【００１４】
好ましい態様では、一般式Ｉの化合物はα−分岐脂肪族分子であって、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ３個及び１２−１６個の炭素原子を有する炭化水素鎖であるものである。
【００１５】
もう一つの好ましい態様によれば、一般式Ｉの化合物のＲ３はモノ−又はジ−エチレングリコール残基を含んでなる。
【００１６】
本発明による一般に好ましい化合物は、
４−ヘキサデシルホスファート（３，１２−ＰＯ４）、
４−オクタデシルホスファート（３，１４−ＰＯ４）、
４−エイコサニルホスファート（３，１６−ＰＯ４）、
８−ペンタデシルホスファート（７，７−ＰＯ４）、
４−ヘキサデカノイルオキシエチルホスファート（３，１２−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−ヘキサデカニルオキシエチルホスファート（３，１２−（エーテル）−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−ヘキサデカニルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１２−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−ヘキサデシルホスホコリン（３，１２−ＰＣ）、
２−（４−ヘキサデカノイルオキシ）エチルホスホコリン（３，１２−ＭＥＧ−ＰＣ）、
２−（４−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１２−ＤＥＧ−ＰＣ）、
２−｛２’−［１０”−（ヘキサデシル−４−オキシ）デシル−１−オキシ］エトキシ｝エチルホスファート（３，１２−Ｏ−Ｃ１０−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
２−｛２’−［１０”−（ヘキサデシル−４−オキシ）デシル−ｌ−オキシ］エトキシ｝エチルホスホコリン（３，１２−Ｏ−Ｃ１０−ＤＥＧ−ＰＣ）、
４−オクタデカノイルオキシエチルホスファート（３，１４−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−オクタデカノイルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１４−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−オクタデカニルオキシエチルホスファート（３，１４−（エーテル）−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−オクタデカニルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１４−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−オクタデシルホスホコリン（３，１４−ＰＣ）、
２−（４−オクタデカノイルオキシ）エチルホスホコリン（３，１４−ＭＥＧ−ＰＣ）、
２−（４−オクタデカノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１４−ＤＥＧ−ＰＣ）、
４−エイコサノイルオキシエチルホスファート（３，１６−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−エイコサノイルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１６−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−エイコサニルオキシエチルホスファート（３，１６−（エーテル）−ＭＥＧ−ＰＯ４）、
２−（４’−エイコサニルオキシ）エトキシエチルホスファート（３，１６−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４）、
４−エイコサニルホスホコリン（３，１６−ＰＣ）、
２−（４−エイコサノイルオキシ）エチルホスホコリン（３，１６−ＭＥＧ−ＰＣ）、
２−（４−エイコサノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１６−ＤＥＧ−ＰＣ）、
１０−（４’−ヘキサデカノイルオキシ）デカニルホスファート、
１０−（８’−ペンタデカノイルオキシ）デカニルホスファート、
２−［２’−（２”−プロピルエイコサノイルオキシ）−エトキシ］エチルホスファート（３，１８−ＤＥＧ−ＰＯ４）、及び
２−（２’−プロピルエイコサノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１８−ＤＥＧ−ＰＣ）
である。
【００１７】
現在極めて好ましい化合物は、
２−（４’−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスファート一ナトリウム塩、
２−（４’−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスファート二ナトリウム塩、
２−（４’−ヘキサデカニルオキシ）エトキシエチルホスファート、
２−（４−ヘキサデカノイルオキシ）エチルホスホコリン、及び
２−（４−ヘキサデカノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン
である。
【００１８】
本発明の化合物は、生物学的バリヤーの透過性を増加するのに有用である。従って、もう一つの態様では、本発明は、上記一般式Ｉの化合物又はその薬学上許容可能な塩の有効量と薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、薬学上有効量の生物学的活性剤をさらに含んでなってもよい。
【００２０】
好ましい態様では、生物学的活性剤は治療薬である。この治療薬は、抗腫瘍、抗ウイルス、抗微生物、抗真菌、抗炎症、神経保護薬、及び生物活性ペプチド及びタンパク質から選択することができるが、これらに限定されない。
【００２１】
もう一つの好ましい態様では、本発明の医薬組成物は診断薬をさらに含んでなってもよい。
【００２２】
医薬組成物は、組織及び器官、特に生物学的バリヤーによって保護されている特定部位への生物学的に活性な分子、例えば治療及び診断薬の投与を促進する上で有用である。
【００２３】
特定の態様では、医薬組成物は、血液網膜関門（ＢＲＢ）、血液脳関門（ＢＢＢ）及び血液腫瘍関門（ＢＴＢ）を通る薬剤送達を増加させる上で有用である。医薬組成物は、本発明によれば、他の生物学的バリヤーの透過性を増加させ、従って、例えば皮膚、角膜、結膜、鼻、気管支、頬、膣及び消化器上皮を介する、及び血液精巣関門及び血液腎相間を通る吸収を促進するのにも有用であることがある。
【００２４】
医薬組成物は、経口、非経口又は局所投与によって、又は局所灌流、浣腸又は器官内洗浄によって投与することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、動脈内又は髄腔内に投与される。
【００２５】
更にもう一つの態様では、本発明は、生物学的バリヤーの透過性を増加させる方法を提供する。これらの方法は、上記関門を一般式Ｉの化合物又はその薬学上許容可能な塩の有効量に暴露することにより、生物学的バリヤーの透過性を可能にし又は増加させることを含んでなる。
【００２６】
更にもう一つの態様では、本発明は、特定の部位又は器官に生物学的活性剤を投与する方法であって、上記部位又は器官を本発明による化合物の有効量の存在下にて上記生物学的活性剤に暴露することによって、特定の部位又は器官における生物学的活性剤の透過及び／又は蓄積を可能にし又は増加させることを含んでなる、上記方法を提供する。
【００２７】
特定部位又は器官は、脊髄、脳、眼、精巣、腺及び腫瘍から選択することができるが、これらに限定されない。
【００２８】
更にもう一つの態様では、本発明は、腫瘍の治療方法であって、治療を必要とする患者に活性成分として本発明による一般式Ｉの化合物を含んでなる医薬組成物の治療上有効量を投与することを含んでなる方法を提供する。上記腫瘍は、癌（例えば、乳、結腸、直腸及び膀胱癌）、神経膠腫（例えば、星状細胞腫）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、眼内　悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、肉腫及び黒色腫から選択することができるが、これらに限定されない。腫瘍は、原発性又は二次的腫瘍であってもよい。
【００２９】
本発明は、中枢神経系の疾患又は障害の治療方法であって、治療を必要とする患者に一般式Ｉの化合物又はその薬学上許容可能な塩を含んでなる医薬組成物の治療上有効量を治療薬と組み合わせて投与することを含んでなる方法も提供する。治療薬は、一般式Ｉの化合物を含んでなる同一の医薬組成物に包含されていてもよく、又は別個の組成物に包含されていてもよい。
【００３０】
好ましい態様では、治療される中枢神経系の疾患は脳腫瘍であり、治療薬は抗癌剤である。もう一つの好ましい態様では、治療される疾患は眼科疾患又は障害、例えば類嚢胞斑状水腫（ＣＭＥ）、加齢性斑状変性（ＡＲＭＤ）、眼内感染症、眼内炎症及び眼内悪性腫瘍である。
【００３１】
更にもう一つの態様では、本発明は、生物学的バリヤーによって保護された器官での診断薬の蓄積を増加させる方法であって、個体に上記診断薬を上記で定義した一般式Ｉの化合物の有効量と組み合わせて投与することにより、生物学的バリヤーによって保護された器官での診断薬の蓄積を増加させることを含んでなる方法を提供する。診断薬は、一般式Ｉの化合物を含んでなる同一の医薬組成物に包含されていてもよいし、又は別個の組成物に包含されていてもよい。
【００３２】
一つの好ましい態様では、生物学的バリヤーによって保護された上記器官は中枢神経系である。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、生物学的バリヤーの透過性を増加させ且つ腫瘍増殖を阻害する化合物、組成物、及び方法に関する。
【００３４】
制限された部位（例えば、脳、眼、精巣など）への治療又は診断薬の送達を促進するための望ましい薬剤は、限定的生物学的バリヤーを透過性にすることができるものである。しかしながら、好ましい透過性化は、許容不可能な程度の副作用を生じることなく差別的に行われなければならない。例えば、脳腫瘍の治療の場合には、無傷の隣接脳組織におけるＢＢＢよりずっと大きな程度までＢＴＢを透過性にする薬剤を用いるのが有利である。この場合における特異的な透過性化により、病理組織に毒性薬剤を優先的に蓄積することができ、しかも周囲の健康な脳組織にはほとんど又は全く損傷を与えないのである。同様な考察は、他の生物学的バリヤーに適用される。例えば、皮膚及び腸関門を通って薬剤又は他の有益な分子の送達を一時的且つ特異的に増加させることができる薬剤を有するのが望ましい。
【００３５】
本発明は、新規化合物に関し、これらの化合物が生物学的バリヤーの透過性を可逆的且つ選択的に増加させることができるという予想外の知見に基づいている。本発明の教示によれば、新規化合物は上記で定義した一般式Ｉ又はそれらの薬学上許容可能な塩である。
【００３６】
本明細書において、一般式Ｉの化合物は、集合的に「ＤＰ−ＢＦＡ」と、又は一般名である分岐鎖状親油性分子のホスホ誘導体によって互換的且つ簡単に「Ｐ−ＢＦＡ」と表される。ホスファート残基を持たない分岐鎖状親油性分子は、「ＢＦＡ」又は「炭素−ＢＦＡ」と表される。
【００３７】
好ましい態様では、Ｐ−ＢＦＡは一般構造がＲ１（Ｒ２）−ＣＨ−のα−分岐状親油性分子のホスホ誘導体である。本発明による他の態様では、Ｐ−ＢＦＡは一般構造がＲ１（Ｒ２）ＣＨ−［ＣＨ２］ｍ−（式中、ｍは１−１２である）の分岐状親油性分子のホスホ誘導体であり、従って、例えばβ（ｍ＝ｌ）、γ（ｍ＝２）などの位置で分岐したω−分岐状親油性分子を指す。
【００３８】
特異的なＤＰ−ＢＦＡは、以下はそれぞれ分岐鎖親油性分子の側鎖及び主鎖上の炭素原子の数を表すＲ１及びＲ２によって表される。
【００３９】
Ｒ３がモノ−エチレングリコール又はジ−エチレングリコールである一般式Ｉの化合物は、それぞれＲ１，Ｒ２−ＭＥＧ−ＰＯ４及びＲ１，Ｒ２−ＤＥＧ−ＰＯ４と表される。場合によっては、分岐鎖残基と隣接化学基とを連結する結合は、例えば３，１２−Ｏ−Ｃ１０−ＤＥＧ−ＰＯ４、３，１２−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４などにおけるように具体的に表示される。Ｚ１がコリンである一般式Ｉの化合物は、Ｒ１，Ｒ２−ＰＣと表される。
【００４０】
本発明の教示によれば、一般式Ｉの化合物の構造中の各種成分を変更することによって分子の安定性及びそれらの生物学的バリヤーに対する透過性化効果を微調整することができる。例えば、アルキル基Ｒ１及びＲ２の炭素原子数及び飽和度を変化させると、分子の全般的疎水性に影響を及ぼし、従って特異的生物学的膜を通過する能力を最適化することができる。
【００４１】
現在好ましい本発明による化合物はＤＰ−ＢＦＡ分子であって、Ｒｌの炭素鎖の長さが２−１４であり且つＲ２とＲ３の炭素原子の総数が合計して６−２６であるものである。現在のところ更に好ましい化合物は、α−分岐鎖化合物であって、Ｒ１が３個の炭素原子であり且つＲ２が１２−１６個の炭素原子であるものである。一般式Ｉの好ましい化合物は、ホスファート基から分岐状親油性分子の分岐点まで数えた長さが２０炭素原子までの脂肪族鎖を含んでなる。上記で定義した一般式ＩのＲ３残基における炭素原子のこの推計数はＤＰ−ＢＦＡ分子による効果的な膜動揺（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）に、従って所望な透過性化効果を導き出すのに最適である。上記の脂肪族鎖は連続的な炭化水素鎖であってもよく、又はＲ３の定義に包含されているように、酸素、硫黄、窒素及びリン原子から選択される１個以上のヘテロ原子によって中断されていてもよい点に留意すべきである。
【００４２】
本発明による好ましい態様では、一般式Ｉの分子のＲ３は分岐鎖残基と少なくとも１個のグリコール残基をエステル結合を介して連結するカルボニル基を含んでいる。もう一つの好ましい態様では、Ｒ３は分岐鎖残基と少なくとも１個のグリコール残基をエーテル結合によって連結する共有結合を含んでいる。生理学的条件下では、エーテル結合は一般に酵素開裂をより受けにくいので、エステル結合よりも安定であると予想される。
【００４３】
各種の生物学的バリヤーを透過性化するＤＰ−ＢＦＡ化合物の能力に影響を与えることがあるもう一つの因子は、分子中の様々な化学基の極性である。これは、差別的な透過性化効果の微調整に寄与することもある。
【００４４】
本発明の好ましい化合物は、一般式Ｉの一又は二塩化合物のいずれかのような塩の形態である。適当な塩としては、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、モノ−、ジ−、トリ−及びテトラ−アルキルアンモニウムから選択されるが、これらに限定されない一価又は二価の対イオンを含んでなる任意の薬学上許容可能な塩が包含される。更に好ましい化合物は、一価塩を含んでなる。特に好ましいものは、一又は二ナトリウム塩のいずれかのようなナトリウム塩形態のＤＰ−ＢＦＡ分子である。
【００４５】
本発明の化合物は、当該技術分野で周知の化学的合成法によって調製することができる。これらの方法の幾つかを、以下の例で説明する。当業者に知られている代替法を用いることもできる。
【００４６】
本発明の化合物は、イン・ビトロで密着細胞結合を崩壊させ、イン・ビボで生物学的バリヤーの透過性化を増加させるのに有用であることが分かった。更に、本発明は、ホスホ−分岐鎖状親油性分子のある種の誘導体がＢＢＢ及びＢＴＢ関門の開放に差別的効果を有するという予想外の知見に基づいている。従って、本発明の様々なＰ−ＢＦＡ化合物は、毒性や副作用をできるだけ少なくしながら生物学的バリヤーを透過性化するのに用いることができる。
【００４７】
幾つかのＤＰ−ＢＦＡは、様々な大きさの分子に対する生物学的バリヤーを差別的に透過性化することができる点に関して選択的である。この特徴は、ホスホ−ＢＦＡ薬の安全性レベルが一層高いことによると考えることができる。幾つかのＤＰ−ＢＦＡはそれらの作用期間が異なり、限定的なバリヤーの一時的な選択的透過性化が望ましいある種の治療環境においてはもう一つの有益な因子であることが示され得る。
【００４８】
本発明の化合物及びそれらを含んでなる医薬組成物は、生物学的バリヤーを通る生物学的活性剤の送達を可能にし又は促進することができる。
【００４９】
「生物学的活性剤」という用語は、生物学的応答を誘導するか、生物学的系に効果を有するか、又は表示手段として働くことができる総ての天然に存在する及び合成化合物を包含するものと意図される。生物学的活性剤は、治療又は診断薬であってもよい。
【００５０】
治療薬としては、抗新生物、抗増殖、抗炎症、神経学的、抗細菌、抗マイコバクテリウム及び抗ウイルス薬が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物と組み合わせたこれらの化合物は、制限された部位の病理学的状態、疾患及び障害の治療に特に有用である。例えば、中枢神経系、及び腫瘍、感染症、膿瘍及び変性疾患などの病変の治療に有用である。
【００５１】
診断薬としては、イメージング薬、造影剤、及び染料が挙げられるが、これらに限定されない。診断薬の例としては、放射能標識物質（例えば、テクネチウム−９９ｍ及びフルオリド−１８を基剤とした薬剤）、及びガドリニウムを基剤とした化合物などの造影剤が挙げられる。本発明の化合物は、例えば、脳の病変を診断し、特性決定する方法に用いることができる。この場合、ＢＢＢ透過性を増加させるのに用いる本発明の化合物は、標識して観察を行うことができるようにした化学薬品と同時に（同一又は別個の組成物で）導入することができる。
【００５２】
観察を行う化学薬品は、例えば、脳細胞又は構造に対する一般的指示薬であるか、又は一定の脳の部分又は脳の病変に特異的且つ独占的に結合し又は蓄積するものであることができる。次に、脳を分析して、標識薬の存在を測定することができる。分析は、当該技術分野で知られている走査及びイメージング手段（例えば、磁気共鳴イメージング法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）及びコンピューター断層撮影法（ＣＴ））を用いて行うことができる。
【００５３】
本発明の他の態様では、ＤＰ−ＢＦＡ化合物を用いて腸での又は皮膚を通じての薬剤吸収を増加させることができる。腸及び皮膚における生物学的バリヤーは、消化器又は皮膚上皮を通る多数の物質の受動拡散を妨げ、従って、ある種の有用な化学物質、栄養及び薬剤の効果的吸収を妨げる。この障害は、所望な有用な化学物質、栄養及び薬剤をＤＰ−ＢＦＡ化合物と組み合わせて適用することによって克服することができる。
【００５４】
広汎な生物活性化合物が一般式Ｉの分岐状親油性分子と組み合わせて用いるのに適しており、従って、本発明による医薬組成物又は治療又は診断方法に有用な化合物として本発明の範囲内に包含されることは、当業者には容易に明らかになるであろう。本発明によれば、Ｐ−ＢＦＡ化合物は、所望な生物学的活性剤と組み合わせて投与すべきである。所望な生物学的活性剤は、一般式Ｉの化合物の同一医薬組成物中に含まれていてもよく、又は別個の組成物で投与してもよいことを理解すべきである。好ましくは、両方の活性薬剤、すなわち一般式Ｉの化合物及び所望な生物学的活性剤（複数でもよい）はいずれも、同時に又は互いに短い時間間隔で投与される。（複数でもよい）生物学的活性剤は、生物学的バリヤーに対するＰ−ＢＦＡの効果が関連薬剤の制限された部位への通過を促進するのに十分であるような時間範囲内にあるという条件で、Ｐ−ＢＦＡ化合物の投与前又は後に投与することができる。
【００５５】
所望な生物学的活性剤は、Ｐ−ＢＦＡの投与とほぼ同時には投与しないが、既に血液中に含まれている（体内で自然に生成されるか又は徐放性薬剤として製造される）ことも可能である。幾つかの例としては、神経伝達物質、増殖因子、ホルモン、抗体などの生物活性ペプチド及びタンパク質が挙げられる。この場合における要件は、生物学的効果を発揮するのに十分な量の所望な生物学的活性剤が存在する間に、標的とするバリヤー（関門）の透過性化効果が起こることである。
【００５６】
生物学的バリヤーの透過性化における本発明の化合物の活性が向上すると、投与された薬剤のバイオアベイラビリティーが増加し、薬剤の低めの用量には応答しない疾患状態に対するこれらの薬剤の治療上の有用性が増す。これは、制限された部位、例えば脳及び眼の疾患や障害の治療に特に関連している。
【００５７】
更に、本発明の化合物は、薬剤の有用な用量を減少させ、従って望ましくない全身性副作用を減らすことができるので有利である。更に、本発明の分子はバリヤーを選択的に透過性化することができるので、隣接細胞や組織での薬剤取り込みではなく特異的部位（例えば、腫瘍）での薬剤取り込みを優先的に増加させることができる。
【００５８】
腫瘍を有するラットでイン・ビボでのＰ−ＢＦＡの透過性化効果を検討したが、試験化合物の幾つかは、治療した腫瘍の増殖を有意に阻害するそれらの能力で明らかにされた、腫瘍に対する細胞毒性作用を示すことが意外にも見出された。従って、本発明のある種の化合物は、抗癌薬として用いることができることが証明された。更に、本発明の化合物の幾つかは、様々な正常細胞及び腫瘍細胞に対するイン・ビトロでのそれらの効果について試験したときには、差別的な細胞毒性作用を示した。
【００５９】
本発明の原理によれば、様々なＤＰ−ＢＦＡ分子は、特定の標的とする部位及び特定の適応症に適するように特異的に調整することができる。例えば、本発明の分子は、ＢＢＢ及びＢＴＢ関門の開放に差別的に作用することが見出された。この場合に、ある種のＤＰ−ＢＦＡによるＢＴＢの透過性化は、ＢＢＢへの効果と比較してより一層大きな程度である。幾つかのＤＰ−ＢＦＡ分子の効果のもう一つの有利な特徴は、通過が許容される化合物についてある程度の差別が維持されることである。従って、ＤＰ−ＢＦＡは、炭素−ＢＦＡ又はマンニトールのような高浸透圧薬と比較して一層選択的にバリヤー透過性化に影響を及ぼす。結果として、Ｐ−ＢＦＡ化合物は、当該技術分野で知られている他の透過性化剤と比較して毒性副作用が少ないことが予想される。更に、それらの透過性化効果は可逆的であることが分かっているので、本発明の化合物は薬剤の長期投与に用いることもできる。
【００６０】
本明細書に記載されているように、Ｐ−ＢＦＡの「有効量」は、本発明による望ましい有益な効果を発揮する本発明の化合物の量を表す。本発明の一態様によれば、これは、目的とする分子に対する関連バリヤーの透過性を有意に増加するＰ−ＢＦＡの量である。すなわち、関連バリヤーの透過性を増加して、目的とする分子の十分な量が生物学的バリヤーを通過して、その治療又は予防効果を発揮するか、又は診断処置を可能にするＰ−ＢＦＡの量である。本発明のもう一つの態様によれば、これは、抗癌剤として治療上有効であるＰ−ＢＦＡの量である。すなわち、制御されない細胞増殖を阻害するＰ−ＢＦＡの量である。
【００６１】
この有効量は、個体毎に決定され、少なくとも部分的には個体の大きさ、特定の疾患、治療を行う症状の重篤度などを考慮し決定される。従って、有効量は、当業者であればこれらの因子を用い且つ単なるルーチンの実験を用いて容易に確かめることができる。
【００６２】
用いる用量範囲及び計画は、投与経路、受容者の年齢、性別、健康及び体重、及び投与される特定のＤＰ−ＢＦＡ及び関連の有用な薬剤又は薬品の効能によって変化する。当業者であれば、ＤＰ−ＢＦＡの組成及び用量を調整して、作用の望ましい期間及び程度を得ることができる。
【００６３】
医薬組成物は、液状、エアゾール又は固形投与形態でよく、適当な投与経路について必要とされる通りに溶液、懸濁液、ミセル、エマルション、マイクロエマルション、エアゾール、軟膏、ゲル、座薬、カプセル、錠剤などを包含するが、これらに限定されない任意の適当な処方物に処方することができる。
【００６４】
経口、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、鼻内、局所、直腸又は他の既知の経路などの任意の適当な投与経路が本発明によって包含されるが、これらに限定されない。ＣＮＳに対する透過性化効果についての好ましい態様では、本発明の医薬組成物は動脈内又は髄腔内に投与される。抗癌薬として使用するためには、本発明の関連医薬組成物は、好ましくは経口又は静脈内投与され、又は局所的に又は局所灌流、浣腸又は器官内洗浄によって適用される。
【００６５】
本発明を、下記の非制限的例によって説明する。
【００６６】
例
Ｉ．化学薬品例
明快にするために、特定のＰ−ＢＦＡ分子及びその塩の合成手続きを、下記に例示する。しかしながら、同様な手続きは、飽和及び不飽和分岐鎖状分子及び化合物であって、Ｒ１及び／又はＲ２が（複数でもよい）環状アルキル基を含んでなる脂肪族鎖であるものなどを含むが、これらに限定されない本発明の他のＰ−ＢＦＡ分子の合成にも応用可能であることを理解すべきである。これらに限定されないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム及びアルキル−アンモニウム塩、ならびに二価の対イオンとの塩などを包含する、Ｐ−ＢＦＡ分子の様々な薬学上許容可能な塩を得ることもできた。
【００６７】
総ての合成した化合物は、ＮＭＲ、マススペクトロメトリー及び元素分析によって特性決定した。
【００６８】
例１：　アルキルリン酸塩の合成
一般式ＲＯ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２のリン酸塩を調製した。Ｒは、Ｒ１（Ｒ２）−ＣＨ構造（式中、Ｒ１は側鎖アルキルの炭素数を表し、Ｒ２は主鎖アルキルの炭素数を表す）の分岐鎖状アルキル残基を表す。
ＲＯ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２分子の合成は、三段階法である。
第一段階では、相当するアルコール（Ｒ−ＯＨ）を、アルデヒドと臭化アルキルからＧｒｉｇｎａｒｄ反応を用いて調製した（Ｖｏｇｅｌ著，「実践有機化学教本（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク，５３１頁，（１９９６））。
第二段階では、ジフェニルホスファートエステルを、アルコールとジフェニルホスホクロリデートから調製した。
ＲＯＨ＋Ｃ１Ｐ（Ｏ）（ＯＣ６Ｈ５）２＋Ｃ５Ｈ５Ｎ→ＲＯ−Ｐ（Ｏ）（ＯＣ６Ｈ５）２＋Ｃ５Ｈ５Ｎ・ＨＣｌ
第三段階では、リン酸二水素アルカニルをジフェニルエステルの水素化によって得た。
ＲＯ−Ｐ（Ｏ）（ＯＣ６Ｈ５）２＋２Ｈ２→ＲＯ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２＋２Ｃ６Ｈ６
【００６９】
４−ヘキサデカニルジフェニルホスファート
ジフェニルホスホロクロリデート（４．０ｇ，０．０１５モル）を、ヘキサデカン−４−オール（２．４ｇ，０．０１モル）の乾燥ピリジン（５ｍｌ）溶液に室温で振盪しながら徐々に加えた。フラスコに栓をして、４８時間放置した後、内容物を氷冷した１Ｎ塩酸（１００ｍｌ）に注いだ。分離した重い油状生成物を、エーテルで抽出した。エーテル層を１Ｎ塩酸（３回）、５％炭酸水素ナトリウム（５回）、及び水（５回）で洗浄した。乾燥後（ＭｇＳ０４）、エーテルを留去し、残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製した（石油エーテル（沸点３０−６０℃）：エーテル，１０：１）。溶媒を留去した後、液状生成物３．５ｇを得た。収率７４％。
【００７０】
４−ヘキサデカニルホスファート（３，１２−ＰＯ４）
酸化白金（Ａｄａｍｓ触媒）（０．３２ｇ）を氷酢酸（２０ｍｌ）に懸濁したものを、水素雰囲気下で吸収が止むまで振盪した。次に、Ａｄａｍｓ触媒を２Ｎ塩酸、水、及び最後に氷酢酸で傾瀉によって十分に洗浄した。４−ヘキサデカニルジフェニルホスファート（３．２ｇ）の氷酢酸（４０ｍｌ）溶解液を触媒に加え、溶液を水素下にて吸収が止むまで振盪した。触媒を濾別し、クロロホルムで洗浄した。溶媒を、濾液から真空留去した。残渣を石油エーテル（沸点３０−６０℃）から結晶化させ、６５℃で乾燥した。最終生成物２．０１ｇを得た。収率９２％。
【００７１】
４−ヘキサデカニル二ナトリウムホスファート（３，１２−ＰＯ４Ｎａ２）
４−ヘキサデカニルホスファート（１ｇ，０．００３１モル）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解した。ＮａＯＨ（０．２５ｇ，０．００６２モル）を加え、混合物を１時間攪拌した後、蒸発させた。エタノール（２ｘ１００ｍｌ）を加えて、蒸発させた。エーテル（１００ｍｌ）を加えて、蒸発させた。残渣をアセトン（３０ｍｌ）から結晶化させ、６５℃（１５ｍｍＨｇ）で乾燥した。最終生成物０．９ｇを得た。収率７９％。
ｌＨ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ０．８９（ｍ，６Ｈ），１．２７（ｓ，２２Ｈ），１．５８（ｍ，４Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　３６７．０６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７２】
４−ヘキサデカニル一ナトリウムホスファート（３，１２−ＨＰＯ４Ｎａ）
４−ヘキサデカニルホスファート（３．１３ｇ，０．００９７モル）をエタノール（１５０ｍｌ）に溶解した。ＮａＯＨ（０．３７ｇ，０．００９２モル）を加え、混合物を４８時間攪拌した後、蒸発させた。エタノール（２ｘ１５０ｍｌ）を加えて、蒸発させた。エーテル（２ｘ１００ｍｌ）を加えて、蒸発させた。得られた固形生成物をアセトン（１００ｍｌ）で粉砕し、１ｍｍＨｇ雰囲気下で一晩乾燥した。最終生成物２．９８ｇを得た。収率８７％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．８７（ｍ，６Ｈ），１．２５（ｓ，２２Ｈ），１．５１（ｍ，４Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　３４５．１１（Ｍ＋Ｈ）＋。
４−オクタデカニル二ナトリウムホスファート（３，１４−ＰＯ４Ｎａ２）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．８９（ｍ，６Ｈ），１．２７（ｓ，２６Ｈ），１．５８（ｍ，４Ｈ），４．１７（ｍ，１Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ３９５．２０（Ｍ＋Ｈ）＋。
４−オクタデカニル一ナトリウムホスファート（３，１４−ＨＰＯ４Ｎａ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９０（ｍ，６Ｈ），１．２８（ｓ，２６Ｈ），１．５６（ｍ，４Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　３７３．２９（Ｍ＋Ｈ）＋。
８−ペンタデカニル二ナトリウムホスファート（７，７−ＰＯ４Ｎａ２）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９０（ｍ，６Ｈ），１．３０（ｓ，２０Ｈ），１．６０（ｍ，４Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　３５２．９３（Ｍ＋Ｈ）＋。
８−ペンタデカニル一ナトリウムホスファート（７，７−ＨＰＯ４Ｎａ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ０．９０（ｍ，６Ｈ），１．３０（ｓ，２０Ｈ），１．６０（ｍ，４Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　３５３．０５（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【００７３】
例２：　２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エチルホスファートの合成
この化合物は、例１で上記したのと同一手続きによってアルコール：Ｃ３Ｈ７−Ｃ（Ｃ１２Ｈ２５）Ｈ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を用いて調製した。このアルコールは、２−プロピルペンタン酸の無水塩化物とエチレングリコールから得た（Ｖｏｇｅｌ著，「実践有機化学教本」，Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク，６９８頁，（１９９６））。
２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エチル二ナトリウムホスファート（３，１２ＭＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ３）：δ　０．８７（ｍ，６Ｈ），１．２４（ｓ，２２Ｈ），１．５４（ｍ，４Ｈ），２．３３（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｍ，２Ｈ），４．２６（ｍ，２Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　４３９．１９（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エチル一ナトリウムホスファート（３，１２ＭＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ３）：δ　０．８７（ｔ，６Ｈ），１．２４（ｓ，２０Ｈ），１．４２（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），４．２８（ｍ，２Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　４１７．１９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７４】
例３：　２−［２’−（２”−プロピルテトラデカノイルオキシ）−エトキシ］エチルホスファートの合成
この化合物は、例１で上記したのと同一手続きによってアルコール：Ｃ３Ｈ７−Ｃ（Ｃ１２Ｈ２５）Ｈ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を用いて調製した。このアルコールは、２−プロピルペンタン酸の無水塩化物とジエチレングリコールから得た（Ｖｏｇｅｌ著，「実践有機化学教本」，Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク，６９８頁，（１９９６））。
２−［２’−（２”−プロピルテトラデカノイルオキシ）−エトキシ］エチル二ナトリウムホスファート（３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９０（ｍ，６Ｈ），１．３０（ｓ，２０Ｈ），１．４４（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ）２．３９（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｍ，４Ｈ），４．０９（ｍ，２Ｈ），４．２４（ｍ，２Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　４８３．０３（Ｍ＋Ｈ）＋
２−［２’−（２”−プロピルテトラデカノイルオキシ）−エトキシ］エチル一ナトリウムホスファート（３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ０．９０（ｍ，６Ｈ），１．３０（ｓ，２０Ｈ），１．４４（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ）２．３９（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｍ，４Ｈ），４．０９（ｍ，２Ｈ），４．２４（ｍ，２Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　４６１．３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７５】
追加の化合物は、同様の方法で調製した。例えば、化合物２−［２’−（２”−プロピルエイコサノイルオキシ）−エトキシ］エチルホスファートは、アルコール：Ｃ３Ｈ７−Ｃ（Ｃ１８Ｈ３７）Ｈ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を用いて調製した。このアルコールは、２−プロピルエイコサン酸の無水塩化物とエチレングリコールから得た。
２−［２’−（２”−プロピルエイコサノイルオキシ）−エトキシ］エチル一ナトリウムホスファート（３，１８−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９０（ｍ，６Ｈ），１．３０（ｓ，３４Ｈ），１．４４（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ）２．３９（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｍ，４Ｈ），４．０９（ｍ，２Ｈ），４．２４（ｍ，２Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　５４４．３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７６】
例４：　２−｛２’−［１０”−（ヘキサデシル−４−オキシ）デシル−１−オキシ］エトキシ｝エチルホスファート一ナトリウム塩（３，１２−０−Ｃ１０−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ）
この化合物は、例１で上記したのと同一手続きによってアルコール：Ｃ３Ｈ７−Ｃ（Ｃ１２Ｈ２５）Ｈ−Ｏ−（ＣＨ２）１０−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ−を用いて調製した。このアルコールは、下記の二段階手続きで得た。最初に、４−ヘキサデカノールトシレート（Ｖｏｇｅｌ著，「実践有機化学教本」，Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク，６９８頁，（１９９６））を１，１０−デカンジオール一ナトリウムと反応させて、１０−（ヘキサデシル−４−オキシ）デカノールを生成する。第二段階では、アルコール２’−１０”（ヘキサデシル−４−オキシ）デシル−エチルオキシエタノールは、１０−（ヘキサデシル−４−オキシ）デカノールトシレート（段階１で生成）をナトリウム＝２−（２−ヒドロキシエチルオキシ）エチレートと反応させることによって調製した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９０（ｍ，６Ｈ），１．３０（ｓ，３８Ｈ），１．４４（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ），３．１５（ｍ，１Ｈ），３．３７（ｍ，４Ｈ），３，４５−３，６２（６Ｈ），３，９５（ｍ，２Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　５６５．４５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７７】
例５：　２−（４−ヘキサデカノキシ）エトキシエチルホスファートの合成
この化合物は、例１で上記したのと同一手続きによってアルコール：Ｃ３Ｈ７−Ｃ（Ｃ１２Ｈ２５）Ｈ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を用いて調製した。このアルコールは、ナトリウム＝２−（２−ヒドロキシエチルオキシ）エチレートと４−ヘキサデカノールトシレートから得た（Ｖｏｇｅｌ著，「実践有機化学教本」，Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク，６９８頁，（１９９６））。
【００７８】
４−ヘキサデカンスルホニルクロリド
４−ヘキサデカノール（１２．２９ｇ，０．０５１モル）とｐ−トルエンスルホニルクロリド（１２ｇ，０．０６３モル）をピリジン（１００ｍｌ）に溶解し、室温にて一晩攪拌した。ジクロロメタン（４００ｍｌ）を加えた。次に、ジクロロメタン溶液を水、Ｈ２Ｓ０４（３％）、水、ＮａＨＣＯ３（３％）、及び水で十分に洗浄し、無水硫酸マグネシウム（１０ｇ）で乾燥した。溶媒を留去した後、２０ｇの粗製４−ヘキサデカンスルホニルクロリドを得た。
【００７９】
２−（４−ヘキサデカノキシ）エトキシエタンスルホニルクロリド
ナトリウム（３．５ｇ，０．１５モル）を、ジ（エチレングリコール）（１４０ｍｌ，１．５モル）に小片で６０℃で加えた。得られた溶液に、４−ヘキサデカノールトシレート（粗製２０ｇ）をＴＨＦ（３００ｍｌ）に溶解したものを、同じ温度で加えた。溶液を、還流温度で６時間攪拌した。水（１００ｍｌ）を、混合物に室温で加えた。混合物を、酢酸エチル（３００ｍｌ）で抽出した。溶媒を留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製した（石油エーテル（沸点３０−６０℃）：エーテル，１：１）。２−（４−ヘキサデカノイル）エトキシエチル４ｇを得た。収率４−ヘキサデカノールから出発して２４％。
【００８０】
２−（４−ヘキサデカノキシ）エトキシエチル二ナトリウムホスファート（３，１２−エーテル−ＤＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９（ｍ，６Ｈ），１．２８（ｓ，２２Ｈ），１．４３（ｍ，４Ｈ），３．３０（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｍ，４Ｈ），３．６９（ｍ，２Ｈ），４．０７（ｍ，２Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　４５５．４５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８１】
例６：　２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エトキシエチル−ホスホコリンの合成
式Ｃ３Ｈ７−Ｃ（Ｃ１２Ｈ２５）Ｈ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ−（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３のホスホコリンは、下記のようにして調製した。
２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１２−ＤＥＧ−ＰＣ）
２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エトキシエタノール（１５．８ｇ，０．０４４モル）及びトリエチルアミン（１０ｍｌ，０．０７５モル）の乾燥エーテル（２５０ｍｌ）冷却溶液（０℃）に、２−クロロ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン（７ｍｌ，０．０７５モル）を乾燥エーテル２００ｍｌに溶解したものを加えた。混合物を、室温で２時間攪拌した。沈澱した結晶性の（Ｃ２Ｈ５）３Ｎ・ＨＣｌを濾別し、溶媒を真空留去した。残渣をトリメチルアミン（０．２７Ｍ）を無水アセトニトリルに溶解したもの５００ｍｌに溶解し、耐圧ボトルに移した。耐圧ボトルを、油浴中で６０−６５℃にて４８時間保持した。次に、ボトルを冷却して、開いた。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製した（ＣＨＣＩ３：ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ，１：９：１）。溶媒を留去した後に得られる油状生成物を、６５℃で７２時間凍結乾燥した。淡黄色ワックス状生成物１７．４ｇを得た。収率７５％。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９（ｔ，６Ｈ），１．２９（ｓ，２２Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），３．２５（Ｓ，９Ｈ），３．６９（ｍ，６Ｈ），３．９９（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｍ，４Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　５２４．６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８２】
下記の化合物を、上記の手続きと同様な方法によって合成した。
２−（２’−プロピルエイコサノイルオキシ）エトキシエチルホスホコリン（３，１８−ＤＥＧ−ＰＣ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９（ｔ，６Ｈ），１．２９（ｓ，３４Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），３．２５（Ｓ，９Ｈ），３．６９（ｍ，６Ｈ），３．９９（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｍ，４Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　６０８．６（Ｍ＋Ｈ）＋。
２−｛２’−１０”−（ヘキサデシル−４−オキシ）デシル−１−オキシ］エトキシ｝エチルホスホコリン（３，１２−Ｏ−Ｃ１０−ＤＥＧ−ＰＣ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９（ｔ，６Ｈ），１．２９（ｓ，３４Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），３．２５（Ｓ，９Ｈ），３．６９（ｍ，６Ｈ），３．９９（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｍ，４Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　６０８．６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８３】
例７：　２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エチルホスホコリンの合成
式Ｃ３Ｈ７−Ｃ（Ｃ１２Ｈ２５）Ｈ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯ−（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３のホスホコリンを、相当するアルコール、すなわち２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エタノールを２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エトキシエタノールの代わりに用いることを除き、例６で上記したのと同一手続きによって調製した。
２−（２’−プロピルテトラデカノイルオキシ）エチルホスホコリン（３，１２−ＭＥＧ−ＰＣ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９（ｔ，６Ｈ），１．２９（ｓ，２２Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ），２．３９（ｍ，１Ｈ），３．２４（Ｓ，９Ｈ），３．６６（ｍ，２Ｈ），４．０７（ｍ，２Ｈ），４．２８（ｍ，４Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　４８０．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８４】
例８：　アルキルホスホコリンの合成
式ＲＯ−ＰＯ−（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３のホスホコリン化合物は、始めの段階でＲ−ＯＨをアルコールとして用いたことを除き、例６で上記したのと同一手続きによって調製した。Ｒは、Ｒ１−Ｃ（Ｒ２）Ｈ−型の分岐鎖状アルキルを表す。
４−ヘキサデカニルホスホコリン（３，１２−ＰＣ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９１（ｔ，６Ｈ），１．２８（ｓ，２２Ｈ），１．５７（ｍ，４Ｈ），３．２１（Ｓ，９Ｈ），３．６２（ｍ，２Ｈ），４．２５（ｍ，３Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　４０８．６８（Ｍ＋Ｈ）＋。
４−オクタデカニルホスホコリン（３，１４−ＰＣ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９（ｔ，６Ｈ），１．２８（ｓ，２６Ｈ），１．５７（ｍ，４Ｈ），３．２１（Ｓ，９Ｈ），３．６１（ｍ，２Ｈ），４．２３（ｍ，３Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　４３６．９１（Ｍ＋Ｈ）＋。
８−ペンタデカニルホスホコリン（７，７−ＰＣ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ　０．９２（ｔ，６Ｈ），１．３２（ｓ，２０Ｈ），１．５９（ｍ，４Ｈ），３．２３（ｓ，９Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），４．２６（ｍ，３Ｈ）。
ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ　３９４．３５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８５】
例９：　ω−分岐Ｐ−ＢＦＡの合成
ω−分岐Ｐ−ＢＦＡ化合物は、例１及び６で上記したのと同一手続きによって関連ω−アルコールを用いて調製する。
【００８６】
ω−分岐ＢＦＡの調製は、六段階合成である。出発試薬は、１−ブロモ−ω−アルコール及びｎ−アルキル−ｍ−アルキルケトンである。
【００８７】
第一段階は、Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ著（「保護基」；Ｇｅｏｒｇ．Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．Ｎ−Ｙ，８３−８４頁（１９９４））に記載の手続きに準じるジヒドロピラン（ＤＨＰ）による１−ブロモ−ω−アルコールのヒドロキシル基の保護である。
段階１：　Ｂｒ（ＣＨ２）ωＯＨ＋ＤＢＰ→Ｂｒ（ＣＨ２）ωＯＴＨＰ
Ｉ　　　　　　　　　ＩＩ
ＴＨＰは、テトラヒドロピラニルエーテルを表す。
第二及び第三段階は、下記のような第三アルコールの標準的Ｇｒｉｇｎａｒｄ合成である（Ｖｏｇｅｌ著，「実践有機化学教本」，Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク，４７５，５３８頁，（１９９６））。
段階２：　Ｍｇ＋Ｂｒ（ＣＨ２）ωＯＴＨＰ→ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ωＯＴＨＰ
ＩＩＩ
段階３：　ＢｒＭｇ（ＣＨ２）ωＯＴＨＰ＋ＲＲ’−ＣＯ→ＲＲ’Ｃ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ωＯＴＨＰ
ＩＶ
Ｒ，Ｒ’は、アルキル基を表す。
第四段階は、Ｃａｒｅｙ　ａｎｄ　Ｔｒｅｍｐｅｒ．（ＪＡＣＳ，ｖ．９１，ｐ．２９６７，（１９６９））によって記載された手続きによる化合物（ＩＶ）の第三ヒドロキシ基のイオン性水素化反応による還元である。
段階４：　ＲＲ’Ｃ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ωＯＴＨＰ＋ＳｉＨＥｔ３→ＲＲ’ＣＨ（ＣＨ２）ωＯＴＨＰ
Ｖ
第五段階は、得られたω−分岐アルコール（Ｖ）の保護基の開裂である（「保護基」；Ｇｅｏｒｇ．Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．Ｎ−Ｙ，８３−８４頁（１９９４））。
【００８８】
最終段階である段階６は、ω−分岐アルコールの相当するω−分岐ＢＦＡへの酸化である。これは、Ｍａｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｅ（Ｔｅｔｒａｅｈｅｄｒｏｎ　ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖ．２２，Ｎ．１８，ｐ．１６５５，（１９８１））によって記載された手続きに従って行った。
段階６：　ＲＲ’ＣＨ（ＣＨ２）ωＯＨ＋［Ｏ］→ＲＲ’ＣＨ（ＣＨ２）ωＣＯＯＨ
【００８９】
ＩＩ．　物理化学的特性
例１０：　イン・ビトロでのＤＰ−ＢＦＡの親油性測定
分岐状脂肪酸の様々な誘導体の親油性値を、これらの化合物の有機溶液対水性溶液での溶解度を比較することによって評価した。オクタノール及び生理食塩水を、それぞれ有機溶液及び水性溶液として用いた。分配係数（Ｐｃ）値、すなわちオクタノール／食塩水分布を、振盪フラスコ法によって測定した。結果、すなわちオクタノール及び水中での溶解度ｍｇ／ｍｌ、及びＬｏｇＰｃ計算値を、表１に示す。
【００９０】
2004505898.tif 000004
【００９１】
例１１：　構造−機能相関
この検討では、分岐鎖分子の物理化学的特性とそれらの生物学的効果の相関を評価した。この検討は、分岐鎖分子の鎖長とラット脳でのそれらのＥｖａｎｓブルー（ＥＢ）溢出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）との間に相関があるかどうかを見出すことを目的とした（ＥＣ５０値の測定に用いた手続きについては、例１８を参照）。３，ｎ−型の様々な分岐状脂肪酸（一方の分岐鎖は３個の炭素原子のものであり、第二の炭化水素鎖ｎは７−１６個の炭素原子のものである）を用いた。結果を、図１においてグラフにして示す。
【００９２】
図１で分かるように、ＢＦＡ　３，１２、３，１４及び３，１６がＢＢＢの透過性化において活性であることが分かった。用いた実験条件下では、試験を行った分子の中で最も有効な化合物はＢＦＡ−３，１２である。
【００９３】
ＩＩＩ．　生物学的例：
ＩＩＩ−ａ）　イン・ビトロでの検討
例１２：　イン・ビトロ毒性の比較検討
様々なＤＰ−ＢＦＡ分子を、培養したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＡＡ８細胞系でスクリーニングして、それらの毒性を明らかにした。ＬＣ５０値、すなわち細胞個体数の５０％を死亡させる濃度を、用量応答曲線から計算した。ホスホ−ＢＦＡのＬＣ５０値を、相当する分岐状脂肪酸（＝炭素−ＢＦＡ）のものと比較した。
【００９４】
方法
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を、細胞膜の完全性及び従って毒性の推定のアッセイとして用いた。細胞（２ｘ１０５／ｍｌ）を、９６ウェルプレートで１０％　ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に播種した（１５０μｌ／ウェル）。２日後、試験を行ったＤＰ−ＢＦＡ化合物又は対照化合物であるミリスチン酸を、５００から１μｇ／ｍｌまでの減少濃度でプレートに加えた。細胞を、１時間後に回収した。回収の４５分前に、１６．５μｌのリーシス溶液を最初の６個のウェルに加え、リーシスが完全であり且つ細胞死を表す最大ラクテートデヒドロゲナーゼ放出を立証した。他の対照物は、２個のブランクウェルと、追加薬剤を含まない細胞を含む５個のウェルを包含した。遠心分離（１５００ｒｐｍ，５分）の後、上清７５μｌをＬＤＨアッセイミックス（Ｔｏｘ−７キット，Ｓｉｇｍａ）を含む新たなプレートに移した。室温で１０−２０分後、吸光度をＥｌｉｓａ　Ｒｅａｄｅｒ　４９０ｎｍを用いて測定した。
【００９５】
様々なＤＰ−ＢＦＡと共に１時間インキュベーションした後に得た毒性データーを、表２にまとめる。それぞれの実験は、３回ずつ行った。
【００９６】
2004505898.tif 000005
【００９７】
一般に、細胞は炭素−ＢＦＡには感受性が高く、試験したホスホ−ＢＦＡ誘導体には感受性が低いことが分かった。炭素−ＢＦＡの亜毒性用量は、１時間のインキュベーションの後に３０−１００μＭと算定された。同一条件下では、試験を行ったホスホ−ＢＦＡ誘導体の亜毒性用量は、１６０μＭから６４０μＭより大の範囲であると算定された。
結論：　一般に、ホスホ−ＢＦＡの毒性は、相当する炭素−ＢＦＡ分子の約２−５分の１であることが分かった。
【００９８】
例１３：　上皮細胞結合に対するＤＰ−ＢＦＡの効果
細胞−細胞結合に対する各種ＢＦＡ誘導体の効果を、ヒト腺癌細胞系（Ａ４３１）を用いて検討した。これらの細胞は、腸管細胞の分極構造の特徴を有する。
【００９９】
この検討では、密着結合複合体（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３），Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５：７７２−７７８）と結合したタンパク質であるＺＯ２の亜細胞分布の量的変化を観察した。
【０１００】
ガラスカバー−スリップ上で血清を含むＤＭＥＭで培養したＡ４３１細胞を、ＤＰ−ＢＦＡの亜毒性用量の存在又は非存在下で１時間インキュベーションした。細胞を３％パラホルムアルデヒドと０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００の混合物で２分間固定して透過性化した後、更に３％パラホルムアルデヒドのみで２０分間固定した。固定した細胞をウサギポリクローナル抗体ＺＯ２（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．米国）で室温にて４５分間すすぎ、そしてインキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光標識した二次抗体で４５分間インキュベーションした。染色したカバー−スリップをエルバノール（Ｍｏｗｉｏｌ　４−８８，Ｈｏｅｃｈｓｔ，フランクフルト，ドイツ国）に固定した後、顕微鏡により検討した。免疫蛍光標識したＺＯ２タンパク質の分布を観察した。
【０１０１】
ホスホトリプシンホスファターゼを阻害し、従って細胞結合を崩壊させる、ペルバナデート（ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）と１時間インキュベーションしたＡ４３１細胞を、ポジティブコントロールとして用いた。
【０１０２】
ＺＯ２の蛍光イメージングは、ＤＰ−ＢＦＡがＡ４３１細胞の密着結合の崩壊に明確な効果を有することを示している。
【０１０３】
例１４：　上皮細胞単層の透過性に対するＤＰ−ＢＦＡの効果
この検討の目的は、生物学的バリヤー、特に腸管関門のイン・ビトロモデル系として働く上皮細胞単層の透過性の調節におけるＤＰ−ＢＦＡ化合物の反応速度論及び全般的効果を評価することであった。
【０１０４】
２つのアプローチによって、生物学的バリヤーの透過性化に対するＤＰ−ＢＦＡの効果を測定した。一つのアプローチは、上皮細胞単層を通る放射性標識化合物の輸送を追跡することであった。第二の方法は、細胞層の透過性レベルを示す尺度としての電気抵抗の変化を観察することであった。
【０１０５】
上皮細胞を、膜フィルター（０．４ミクロン，１ｃｍ２）上で培養する。上皮細胞単層を有する膜を、供与体及び受容体室である２つの室の間に置く。試験を行った所定の非毒性濃度のＰ−ＢＦＡ化合物及び１４Ｃ−スクロース放射性トレーサー（１Ｃｉ、０．５ｍｌ緩衝液中）を、先端（供与体）側に加える。０．５ｍｌの試料を、実験中９０分間にわたり１０分間隔で基底外（受容体）側から集める。インキュベーションは、１％　ＦＣＳを含む組織培養培地中で、７０ｒｐｍで振盪しながら行う。先端室及び膜を、それぞれの採取時点で新たな受容体室に移す。これは、先端室におけるトレーサーの濃度を一定に保ち、両室の液体容積を一定に保つ目的で行う。採取試料中の放射性トレーサーの濃度は、Ｔｒｉｌｕｘミクロベーターカウンター（Ｗａｌｌａｃ，フィンランド国）を用いて評価する。トレーサー輸送速度を計算し、透過性係数として表す。
【０１０６】
実験に用いた上皮単層の完全性を、ミリセル（ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）−ＥＲＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することによってインキュベーションの開始時及び終了時に観察する。
【０１０７】
平行して行う組の実験は、放射性トレーサーを加えないことを除き、上記と同一実験系を用いて行う。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、９０分にわたり１０分ごとに観察した。
【０１０８】
結論：　ｉ）Ｐ−ＢＦＡは、上皮細胞単層を通るスクロースの通過を有意に増加し、ｉｉ）単層のＴＥＥＲを減少させるという事実は、Ｐ−ＢＦＡ化合物が生物学的バリヤーを透過性にするという結論を支持している。
【０１０９】
例１５：　正常及び悪性の種類の細胞に対する様々なＤＰ−ＢＦＡの細胞毒性活性
様々な分岐鎖状脂肪酸のホスホ誘導体（ＤＰ−ＢＦＡ）の細胞毒性活性を、正常及び悪性の種類の細胞を含む細胞培養物中でイン・ビトロでアッセイした。下記の細胞系を用いた：
原発性繊維芽細胞（ヒト）
正常な骨髄（ＢＭ）細胞（マウス）
原発性気管支上皮細胞（ヒト，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ製，カタログ番号ＣＣ−２５４１）
Ｃａｃｏ−２−結腸癌細胞系（ヒト，ＡＴＴＣ，ＨＴＢ−３７）
Ｃ６神経膠腫細胞系（ラット，ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−２１９９）
Ｎｅｕｒｏ２ａ−神経芽細胞腫細胞系（マウス，ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１３１）
ＳＫＢＲ−３−乳癌細胞系（ヒト，ＡＴＴＣ，ＨＴＢ−３０）
ＨＬ６０−骨髄性白血病細胞系（ヒト，ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−２４０）
Ｕ９３７−骨髄性白血病細胞系（ヒト）。
【０１１０】
細胞を、マイクロタイタープレートで２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％　ＦＣＳを含むＭＥＭ中に３７℃で播種した。培養細胞を、その線形増殖期中に、上記のように各種ＤＰ−ＢＦＡの非存在下（対照群）又は存在下にてインキュベーションした。試験したＤＰ−ＢＦＡの最終濃度は、１．５−２００マイクロモルであった。骨髄細胞については５日間であり、他の総ての細胞系については３日間であるインキュベーション期間の終了時に、細胞に対する添加したＰ−ＢＦＡの細胞毒性作用を比色ＭＴＴ分析法によって評価した。このＭＴＴ分析法（Ｍｏｓｍａｎｎ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６５：５５−６３）は、ミトコンドリアレダクターゼ活性を測定し、細胞生育力を定量的評価する。対照群と比較して細胞生育力を５０％減少させる薬剤濃度は、ＥＣ５０と定義される。試験したＤＰ−ＢＦＡ化合物のＥＣ５０値は、様々な分析を行った細胞系のそれぞれについて作製した用量応答曲線から計算した。
【０１１１】
結果を、表３にまとめる。それぞれのＥＣ５０値は、１−５回の独立した実験から誘導したＥＣ５０値の平均である。
【０１１２】
表３の結果から分かるように、各種のＤＰ−ＢＦＡ分子は、様々な細胞に対するそれらの細胞毒性効果では様々な程度まで活性であった。試験を行った化合物の中で、悪性細胞に対して最も強力な細胞毒性薬は３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４、３，１２−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４、３，１２−ＭＥＧ−ＰＣ、３，１２−ＤＥＧ−ＰＣ、３，１８−ＤＥＧ−ＰＣ、及び３，１４−ＰＣであった。これらの化合物の中の２種類、３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４及び３，１２−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４は、正常な上皮細胞に対して最低の細胞毒性作用を有することが分かった。もう一つの化合物である３，１２−ＤＥＧ−ＰＣは、正常な繊維芽細胞及び正常な骨髄細胞に対して最低の細胞毒性作用を有することが分かった。
【０１１３】
2004505898.tif 000006
【０１１４】
結論：　ホスホ−ＢＦＡ化合物は、細胞型に特異的な細胞毒性作用を有した。これらの化合物の僅かのものだけが、悪性細胞系で試験したときに極めて強力な細胞毒性薬として示されたが、様々な組織由来の正常細胞で試験したときには毒性はずっと低かった。これらのデーターは、これらの化合物が細胞毒性副作用の低い有効な抗癌剤となり得ることを示唆している。
【０１１５】
例１６：　３，１２−ＤＥＳＰＣは神経芽細胞腫細胞系におけるカスパーゼ−３の活性化及びＤＮＡ断片化を誘導する
様々なＤＰ−ＢＦＡによって発揮される細胞毒性効果の基礎をなす、可能性のある機構を更に検討するために、アポトーシス、カスパーゼ−３活性及びＤＮＡ断片化（Ｌｉｎｃｚ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．７６：１−１９）について作製した２種類のマーカーを検討した。
【０１１６】
Ｎｅｕｒｏ２ａ神経芽細胞腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１３１）を、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％　ＦＣＳを含むＭＥＭに３７℃で播種した。２４時間後に細胞が対数増殖期にあるとき、３，１２−ＤＥＧ−ＰＣを２５μＭ、５０μＭ又は１００μＭの最終濃度まで加えた。ビヒクルのみの存在下での細胞増殖を、対照群として用いた。
【０１１７】
カスパーゼ−３活性及びＤＮＡ断片化について、それぞれ薬剤と共に６及び２４時間インキュベーションした後に得られる細胞溶解生成物について分析した。カスパーゼ−３活性は、蛍光原性基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号６６０８１Ｕ）を用い、製造業者の指示に従って分析した。ＤＮＡ−断片化は、Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｅｌｉｓａプラスキット（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１７７４　４２５）を用い、製造業者の指示に従って定量した。
【０１１８】
結果を、表４にまとめる。測定したカスパーゼ活性は、タンパク質含量に対して規格化された対照プレートでの活性の百分率として表される。ＤＮＡ−断片化は、λ＝４０５ｎｍでのＯＤ値として表され、２個の細胞培養溶解生成物からの読みの平均である。
【０１１９】
2004505898.tif 000007
【０１２０】
表４の結果から分かるように、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を化合物３，１２−ＤＥＧ−ＰＣと共にインキュベーションすると、カスパーゼ−３活性が約５倍に増加し、ＤＮＡ断片化が有意に増加した。同様な結果は、この化合物をもう一つの悪性細胞系である結腸癌由来のｃａｃｏ−２で試験したときに得られた。
【０１２１】
結論：　アポトーシスは、ある種の悪性細胞におけるＢＦＡのホスホコリン誘導体の細胞毒性効果を発揮するための可能な機構である可能性がある。
【０１２２】
ＩＩＩ−ｂ）　イン・ビボでの検討
例１７：　ＢＢＢ透過性化に対するＤＰ−ＢＦＡの効果を測定するためのイン・ビボモデル系
ＤＰ−ＢＦＡによるＢＢＢの透過性化を、２種類のマーカーａ）Ｅｖａｎｓブルー染料（ＥＢ）、これはアルブミン（分子量７０ｋＤ）とイン・ビボで速やかに結合し、傍細胞輸送の指示薬である、及びｂ）フルオレセインナトリウム塩（Ｆ−Ｎａ）、分子量３７６Ｄ、これは細胞空間を介して輸送され、経細胞輸送を観察することを可能にする、の脳における蓄積を監視することによってラットモデル系で探求した。ＢＢＢ崩壊すると、Ｅｖａｎｓブルー−アルブミン複合体は、脳の細胞間空間に不可逆的に蓄積する。ずっと小さなトレーサーであるフルオレセインは、細胞内に輸送し、脳における細胞間及び細胞内空間を占めることができる。
【０１２３】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける血液脳関門の透過性化は、ＤＰ−ＢＦＡに短時間暴露することによって誘導された。これらの動物をＲａｍｐｕｎ−Ｉｍａｌｇｅｎで麻酔し、ＤＰ−ＢＦＡ試験化合物を脳へ逆行する外頸動脈を介して投与した（Ｓｍｉｔｈ，Ｑ．Ｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆｓｔｕｄｙ．「血液脳関門の生理学及び薬理学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ　Ｂａｒｒｉｅｒ）」Ｂｒａｄｂｕｒｙ　Ｍ．Ｗ．Ｂ．監修　Ｓｐｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−ＮＹ；１９９２：２４−５２）。翼状突起口蓋動脈（ｐｔｅｒｙｇｏ−ｐａｌａｔｈｉｎａ　ａｒｔｅｒｙ）を連結し、導入溶液の外頭部脈管構造への漏れを回避した。ＤＰ−ＢＦＡ溶液は、Ｈａｒｖａｒｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　Ｓｙｒｉｎｇｅ　Ｐｕｍｐを用いて３０秒間又は半時間にわたって注入した。頸部共通動脈を通る血流は、注入のときにのみ中断した。
【０１２４】
総ての試験したＤＰ−ＢＦＡ分子は、原液の水又はエタノール溶液を２００−１０００倍に希釈し、等張性マンニトール（５％）のＴｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）又はＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液とすることによって調製した。
【０１２５】
マーカーである、Ｅｖａｎｓブルー（ＥＢ，２５ｍｇ／ｍｌ）及びフルオレセイン（Ｆ−Ｎａ，１２．５ｍｇ／ｍｌ）の１ｍｌ溶液を、試験ＤＰ−ＢＦＡの投与直後、又は活性の可逆性を検討するときには特定の時間間隔の後に静脈内投与した。Ｆ−Ｎａの補強的な静脈内点滴（１２．５ｍｇ／ｍｌ−１００μｌ／分）を、８分間行った。頸動脈の「フラッシュ（ｆｌａｓｈ）」の１０分後に、脳を食塩水溶液（６０ｍｌ）で洗浄した。脳の両側性及び対側性半球及び腫瘍（応用可能な場合）を、個別に５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でホモジナイズした。皮質及び腫瘍（応用可能な場合）のマーカー濃度を分光蛍光法によって測定した（Ｕｙａｍａ，Ｏ．ｅｔ　ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ　ＦｌｏｗＭｅｔａｂ．８，２８２−２８４：Ａｂｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２０８，８５−８８）。マーカー含量は、１ｇ脳組織当たりのマーカーのμｇとして計算した。統計学的有意性については、標準誤差及びＳｔｕｄｅｎｔ検定を用いた。
【０１２６】
例１８：　様々な鎖長の分岐鎖脂肪酸のＢＢＢ透過性に対する効果
検討の第一段階では、異なる鎖長のＢＦＡ分子を、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性化におけるそれらの効果についてスクリーニングした。
【０１２７】
実験は、体重が２５０−３２０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで行った。例１７で上記した手続きを、行った。
【０１２８】
試験を行った化合物のＢＢＢ開放についての効果を２個のパラメーターによって評価した。
ａ）効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）−Ｅｖａｎｓブルーアルブミンの蓄積（μｇ　ＥＢ／ｇ脳組織）に関して計算したＢＢＢ開放の程度、及び
ｂ）効能（ｐｏｔｅｎｃｙ）−ＥＣ５０及び最小有効濃度（ＭＥＣ）値に関して測定。ＥＣ５０は、Ｅｖａｎｓブルー溢出の最大効果の５０％を生じる試験化合物の濃度である。ＭＥＣは、対照動物に蓄積したＥｖａｎｓブルーの量の３倍を蓄積することができる濃度と定義され、本発明者らの場合には、総量で３μｇ　ＥＢ／ｇ脳である。ＥＣ５０及びＭＥＣ値が低くなれば、試験化合物の効能は高くなる。
【０１２９】
様々なＤＰ−ＢＦＡのＢＢＢ透過性に対する効果の評価結果を、表５に示す。
【０１３０】
2004505898.tif 000008
【０１３１】
表５の結果から分かるように、ＤＰ−ＢＦＡ鎖長によってＥｖａｎｓブルー溢出の程度にはかなり変動が見られる。最短鎖長を有する分子は、このモデル系ではほぼ完全に無効である。最高の効力を有する分子はＢＦＡ　３，１２−Ｎａ及び３，１６−Ｎａであり、それぞれは３０μｇ　ＥＢ／ｇ脳を上回る蓄積を誘発する。用いた実験系では、３，１２−Ｎａが最も効能のある透過性化薬であり、試験化合物の中で最低ＥＣ５０及びＭＥＣ値を有する。
【０１３２】
結論：　用いた実験系の条件下では、ＢＦＡ　３／１２−Ｎａが効力及び効能のいずれについても最も効果的な透過性増加剤であることが分かった。従って、ＢＦＡ−３，１２に基づくＤＰ−ＢＦＡ誘導体を更に詳細に検討した。
【０１３３】
例１９：　様々なＤＰ−ＢＦＡのＢＢＢ透過性に対する効果
各種ＤＰ−ＢＦＡのＢＢＢ透過性に対する効果を、例１７で上記したラット脳のモデル系で試験した。効力、すなわちＢＢＢ開放の程度は、脳に蓄積したＥｖａｎｓブルーの量（μｇ　ＥＢ／ｇ脳）として表した。試験分子の効能は、それらのＥＣ５０計算値及び最小有効濃度（ＭＥＣ）値によって評価した。
【０１３４】
2004505898.tif 000009
【０１３５】
表６から分かるように、各種のＤＰ−ＢＦＡ分子は、Ｅｖａｎｓブルートレーサーに結合したアルブミンのＢＢＢの通過を促進する。試験化合物は、それらの効能及び効力が異なる。
【０１３６】
この実験の条件下では、３，１２−ＢＦＡの最も効能のある誘導体は３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２であり、ＥＤ５０値が２０μＭであり、最小有効濃度（ＭＥＣ）が３．３μＭであった。ＢＢＢ透過性の増加に最も有効な化合物は、３，１２−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２、３，１２−ＰＯ４Ｎａ２、及び３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２であった。ＥＣ５０濃度の３，１２−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２、３，１２−ＰＯ４−Ｎａ２、及び３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２化合物を用いた処理後のラット脳におけるＥｖａｎｓブルー染料の蓄積レベルは、それぞれ２６、２０及び１８μｇ　ＥＢ／ｇ脳であった。
【０１３７】
例２０：　ＤＰ−ＢＦＡのＥｖａｎｓブルーに結合したアルブミン及びフルオレセインのＢＢＢを通る輸送に対する効果
様々なＤＰ−ＢＦＡの様々な大きさの分子に対するＢＢＢ透過性化の効果を、正常なラット脳のモデル系でイン・ビボで検討した。
【０１３８】
２種類のマーカー、ａ）傍細胞輸送の指示薬としてのＥｖａｎｓブルーに結合したアルブミン（分子量７０ｋＤ）、及びｂ）大きさがより小さな分子であるフルオレセインナトリウム塩（分子量３７６　Ｄ）の輸送を追跡した。
【０１３９】
Ｅｖａｎｓブルー染料（ＥＢ）及びフルオレセインナトリウム塩（Ｆ−Ｎａ）を、例１７で上記したプロトコールに準じて外頸動脈に３０秒間かけて注入した。試験化合物は、それらのＥＣ５０濃度で用いた。対照動物は、ビヒクル溶液で処理した。
【０１４０】
Ｅｖａｎｓブルー溢出は、脳組織１ｇ当たりの蓄積したＥＢの総量の百分率として表される。フルオレセインの脳への輸送は、この分子の血清濃度によって変化し、血清中のＦ−Ｎａ濃度の百分率として表される。
【０１４１】
Ｆ−Ｎａ対ＥＢの脳における蓄積の比を計算し、結果を表７に示す。
【０１４２】
2004505898.tif 000010
【０１４３】
表７から分かるように、正常なＢＢＢ（＝対照）は、ＥＢ−アルブミン複合体よりフルオレセインに対して約１０倍透過性である。高張性透過性化剤であるマンニトールは、Ｆ−ＮａよりもＥＢに対して大幅にＢＢＢ透過性を増加した（Ｆ−Ｎａ／ＥＢ比は４）。同様に、試験を行った分岐状脂肪酸である３，１４−Ｎａ及び３，１２−Ｎａは、それぞれ４．７及び４．９のＦ−Ｎａ／ＥＢを示した。
【０１４４】
様々なＢＦＡのホスホ誘導体は、２個のマーカーに対するＢＢＢ透過性に差別的に影響を及ぼす。３，１２−ＰＯ４は、フルオレセインに対する透過性の増加よりもＥＢ−アルブミン複合体に対する透過性を約１．５倍増加することが分かった。一方、３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４は一層生理学的にＢＢＢの透過性を増加し、すなわちＦ−Ｎａ輸送をＥＢ溢出と同程度まで増加することが分かった。３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４に暴露したラット脳のＦ−Ｎａ／ＥＢ比は、約９であった。
【０１４５】
結論：　様々なＤＰ−ＢＦＡ化合物は、異なる方法でＢＢＢ透過性に影響を及ぼす。幾つかのＤＰ−ＢＦＡ、例えば３，１２−（エーテル）−ＤＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２及び３，１２−ＰＯ４（それぞれ、Ｆ−Ｎａ／ＥＢ比は１．１及び５．９）は、低分子量を有する分子と比較して大きな分子の輸送に有利なＢＢＢの選択的開放を誘導した。対照的に、他の分子、例えば３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４は、Ｆ−Ｎａのような小さな分子及びＥＢ−アルブミンのような大きな分子のいずれの輸送も同様に増加した。
【０１４６】
例２１：　ＤＰ−ＢＦＡのＢＢＢ開放に対する効果の期間
ラット脳でのＥｖａｎｓブルー及びフルオレセイン溢出に対するＤＰ−ＢＦＡの効果を、ＤＰ−ＢＦＡ投与後の様々な時点で検討した。
【０１４７】
様々なＤＰ−ＢＦＡ化合物を、例１７で上記した手続きに従って、Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラットの外頸動脈に３０秒間注入した。試験化合物は、それらのＥＣ５０濃度で用いた。脳におけるＥｖａｎｓブルー及びフルオレセイン溢出は、ＤＰ−ＢＦＡ投与から１０、３０、６０、１２０及び２４０分後に測定した。ラット脳におけるＥｖａｎｓブルー（μｇ／ｇ）及びフルオレセイン（血清の％）の含有量を、時点当たりの２−３の個体動物の平均値を用いて計算した。
【０１４８】
上記の実験系で得た結果は、ＢＢＢ透過性化に対するＤＰ−ＢＦＡの効果は可逆的であることを示している。更に、ＤＰ−ＢＦＡのＢＢＢ開放効果は寿命が比較的短いことが示唆されている。ＤＰ−ＢＦＡ−３，１２のほとんどの試験を行った誘導体は、ＢＢＢ透過性を１時間未満保持し、Ｄ１／２は約３０分である。Ｄ１／２は、試験を行った化合物のＥＣ５０濃度を用いるＢＢＢを少なくとも５０％開放する時間として定義される。２種類の化合物、３，１２−ＰＣ及び３，１２−ＭＥＧ−ＰＣは、いずれもホスホコリン残基を含んでなるが、Ｄ１／２は他の試験を行った３，１２−ＢＦＡ誘導体の４倍であり、すなわちＤ１／２は約１２０分であった。
【０１４９】
結論：　ＤＰ−ＢＦＡは、ラット脳でのＢＢＢ開放に可逆的に影響を及ぼすことが示された。様々なＤＰ−ＢＦＡは、透過性化効果の時間が異なっている。
【０１５０】
例２２：　毒物学及び安全性の検討
ＤＰ−ＢＦＡ分子を、安全性及び毒性について評価した。増加用量の試験化合物を、例１７で上記したプロトコールに従ってラットの動脈内に（ｉ．ａ．）投与した。動物の生存力を２４時間観察し、致死濃度（ＬＣ）を評価した。ＬＣは、死を引き起こす最小濃度と定義される。
【０１５１】
2004505898.tif 000011
【０１５２】
安全性指数は、致死用量（ＬＣ）と最小有効濃度（ＭＥＣ）の比として定義され、ＭＥＣは、ビヒクルのみを投与した対照動物で蓄積したＥｖａｎｓブルーの量の３倍の蓄積を誘発する試験化合物の濃度の計算値に相当し、すなわち、総蓄積量は３μｇ　ＥＢである。ＬＣ／ＭＥＣ比が高くなれば、安全性指数は高くなる。
【０１５３】
結論：　ホスファート基を導入することにより、安全性指数は２−３倍だけ増加し、効能は有意に妨げられなかった。
【０１５４】
例２３：　ＤＰ−ＢＦＡのＢＴＢ透過性化に対する効果を測定するためのイン・ビボモデル系（腫瘍を有するラット）
血液腫瘍関門（ＢＴＢ）を調節するＤＰ−ＢＦＡ化合物の能力を検討するために、Ｃ６神経膠腫を有するラットのモデル系を用いた。
【０１５５】
Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに、Ｂａｒｔｕｓ　ｅｔ　ａｌ．（Ｅｘｐ　Ｎｅｕｒｏｌ（１９９６）；１４２：１４−２８）によって記載された手続きに従ってＣ６神経膠肉腫細胞を接種した。定位固定装置に固定したラットの前頭骨に小さなバー孔（ｂｕｒｒ−ｈｏｌｅ）を設けた。Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いて、２．５ｘ１０５のＣ６神経膠肉腫細胞を含む培地１０μｌ又は５μｌを前頭皮質に接種した。座標は、ブレグマの１ｍｍ後方、２．５ｍｍ−側部、及び３ｍｍ−深さであった。針を、その場所に５分間止めた。針を除いた後、筋膜及び頭皮を縫合した。ラットを接種から６−８日後にチェックしたところ、十分な大きさの腫瘍（２０−６０ｍｇ）が発生した。Ｆ−Ｎａ可視化及び切開の後、腫瘍を秤量した。ラット脳の一部に組織学的検討を行い、同側腫瘍組織、腫瘍周囲組織及び対側性組織へのＥｖａｎｓブルー及びフルオレセイン取り込みを観察した。
【０１５６】
対照の腫瘍を有するラット（本発明の化合物を投与せず）に対して行った実験から得た結果（示さず）は、ＥＢ及びフルオレセインについての血液腫瘍関門（ＢＴＢ）の透過性が、完全なＢＢＢについて見出されたものよりそれぞれ約２倍及び４倍高いことを示した。．
【０１５７】
例２４：　様々なＢＦＡ分子のＢＢＢ及びＢＴＢ開放に対する効果（腫瘍を有するラットでの検討）
例２３で記載したＣ６神経膠腫を有するラットの両側性腫瘍モデル系を用いて、ＤＰ−ＢＦＡの各種誘導体の血液腫瘍関門（ＢＴＢ）への効果と比較してそれらの血液脳関門（ＢＢＢ）を透過性化する能力についてスクリーニングした。腫瘍を有するラットを更にＤＰ−ＢＦＡで処理したことを除き、例２３に記載の実験手続きに従った。試験化合物をそのＥＣ５０値附近の濃度で、例１７で記載した通りに３０秒間かけて外頸動脈に一側性注入した。ビヒクルのみを投与した動物を、対照群として用いる。透過性化効果を、腫瘍（Ｔ）対非腫瘍（ＮＴ）組織でのアルブミンと結合したＥｖａｎｓブルー染料の蓄積を測定することによって定量した。
【０１５８】
効力値及び特異性指数の計算値を、表９にまとめる。特異性指数は、腫瘍に蓄積したＥＢの濃度と非腫瘍脳組織に蓄積したものとの比（Ｔ／ＮＴ）として定義される。
【０１５９】
2004505898.tif 000012
【０１６０】
表９から分かるように、ほとんどの試験化合物は、腫瘍及び非腫瘍脳組織において同様なレベルのＥＢ蓄積、すなわち約１−２のＴ／ＮＴ比を有する。マンニトール（２５％）を用いると、腫瘍でのＥＢ蓄積は非腫瘍脳での蓄積の約２倍であった。用いた実験系では、化合物３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４は、腫瘍におけるＥＢ蓄積として表される腫瘍血液関門（ＢＴＢ）の開放について高い特異性を示し、非腫瘍組織でのＥＢレベルの２２倍であった（Ｔ／ＮＴ比＝２２）。
【０１６１】
結論：　３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４は、Ｃ６神経膠腫腫瘍におけるＢＴＢの開放について最も特異的な効果を示した。この化合物は、正常な血液脳関門（ＢＢＢ）よりも大幅にＣ６神経膠腫の血液腫瘍関門（ＢＴＢ）を透過性化する。従って、ＤＰ−ＢＦＡ誘導体は、ＢＴＢを特異的且つ選択的に開放することができる薬剤として作用することができる。
【０１６２】
例２５：　ＳＤ腫瘍を有するラットにおける一側性ＤＰ−ＢＦＡ投与
Ｅｖａｎｓブルー及びフルオレセインの神経膠腫への透過を、１０μＭ　３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ（図２Ａ）、４０μＭ　３，１２−Ｎａ　ＢＦＡ（図２Ｂ）又は２５％マンニトール（図２Ｃ）を外頸動脈に一側性注入した後に試験した。関連化合物を、例２３に記載した通りにＣ６神経膠腫細胞を接種してから９−１２日後にラット脳に注入した。
【０１６３】
図２Ａから明らかなように、両側性神経膠腫ラットに３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４を投与した後のＥｖａｎｓブルー染色は、同側半球での腫瘍組織だけにある。一方、ＤＰ−ＢＦＡの炭素対応物、すなわちＢＦＡ　３，１２、及び高張薬であるマンニトールは、腫瘍と非腫瘍脳組織を同様に透過性化した。
【０１６４】
例２６：　血液網膜関門（ＢＲＢ）の透過性化に対するＤＰ−ＢＦＡの効果
血液網膜関門（ＢＲＢ）のＤＰ−ＢＦＡによる透過性化を、ラットで、蛍光マーカーであるフルオレセインナトリウム塩（Ｆ−Ｎａ）の強膜における血管からの漏出を観察することによって検討した。
【０１６５】
体重が２５０−３５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをＫｅｔａｍｉｎ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）及びＸｙｌａｓｉｎｅ（２％）の溶液を０．ｌｍｌ／１００ｇ体重で注射することにより麻酔した。麻酔した動物の頸静脈に、０．２５ｍｌ　Ｆ−Ｎａ（１２．５ｍｇ／ｍｌ）を注射した。網膜血管を、眼科手術用のＩＮＡＭＩ　Ｌ−０９６０顕微鏡に対するｃ−マウントを取り付けた３−ＣＣＤカラーカメラ（ｔｅｌｉ　ＣＳ５８５０）で記録した。顕微鏡は、光源とＦ−Ｎａ検出用の適当なフィルターを備えている。１０分後、網膜をＦ−Ｎａから除いた。この時点で、Ｆ−Ｎａの二回目の静脈内投与と共に３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ　１．５ｍｌ（１２．５μｇ／ｍｌ）を３０秒かけて動脈内投与した。血管の写真を、ｔ＝０、及び薬剤投与から０．２５、０．５、１、２、４，８及び１０分後に撮影した。同じ実験を、３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａの代わりに１．５ｍｌのビヒクル（タブ−マンニトール５％）を動脈内投与した対照ラットの第二群で繰り返した。
【０１６６】
動物の眼の後部における、網膜レベルでの血管でのＦ−Ｎａの分布を観察することによって、Ｆ−Ｎａを単独で投与してから１０分後までに総ての蛍光染料は網膜血管の周囲部分から完全に除かれることが明らかにされた。しかしながら、３，１２−ＤＥＧＨＰＯ４Ｎａの動脈内投与と組み合わせてＦ−Ｎａを静脈内注射すると、網膜レベルでの血管の周囲にＦ−Ｎａが蓄積される。血管からのこのＦ−Ｎａの漏出は、３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａの存在下では、血液網膜関門の透過性化を指示するものである。ＤＰ−ＢＦＡ薬の代わりにビヒクルのみを投与した対照動物では、結果はＦ−Ｎａを単独で投与した動物の場合と同様であり、すなわち投与から１０分後までに、血管又は網膜レベルでのその周囲の部分には蛍光が検出されなかった。図３Ａ−Ｃに示される結果は、眼の血管造影法、すなわち、Ｆ−Ｎａを単独で（図３Ａ）、又は３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ（図３Ｂ）又はビヒクル（図３Ｃ）と組み合わせて投与してから３０秒及び１０分後に記録した網膜レベルで撮影した眼血液供給イメージングの写真である。
【０１６７】
この観察によれば、Ｆ−Ｎａの投与から１０分後には、Ｆ−Ｎａ及びビヒクルのみを注射した対照動物のガラス体よりも３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａで処理した動物のガラス体でより多量のＦ−Ｎａが検出された（図４Ａ−Ｂ）。ガラス体における蛍光シグナルの蓄積は、ＢＲＢ透過性化及び網膜レベルでの血管からのＦ−Ｎａ漏出による。
【０１６８】
結論：　３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａは、血液網膜関門を透過性化することができ、網膜及びガラス体におけるＦ−Ｎａの蓄積を生じる。
【０１６９】
例２７：　ＤＰ−ＢＦＡの抗腫瘍活性
様々なＰ−ＢＦＡの抗腫瘍効果を、上記例１７に記載のイン・ビボモデル系で検討した。試験を行ったＰ−ＢＦＡを、Ｅｖａｎｓブルー及びフルオレセイン溢出についてのＢＢＢ及びＢＴＢの透過性化に有効であるように以前に決定された濃度で動脈内投与した。例２３に記載した腫瘍接種についての実験手続きを行った。
【０１７０】
Ｃ６神経膠肉腫細胞の接種から３−４日目に、ラットの外頸動脈中にカニュレーションを行い、この実験ではマーカーを投与しなかったことを除き例１７に記載した通りに試験Ｐ−ＢＦＡを３０秒かけて注入した。処理したラットを７−９日まで保持した後、屠殺した。冠状切断を得て、エオシン−ヘマトキシリンによって染色し、組織学的検討を行い、腫瘍容積を決定した。ビヒクル単独を投与した動物を、対照として用いる。統計学的有意性については、標準誤差及びＳｔｕｄｅｎｔ検定を用いた。結果を、表１０にまとめる。
【０１７１】
表１０の結果から明らかなように、Ｐ−ＢＦＡ化合物はイン・ビボでの神経膠腫腫瘍増殖に細胞分裂抑制効果を示す。用いた実験条件下では、３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４化合物は、最も顕著な抗腫瘍効果を示した。他の化合物、例えば３，１２−ＭＥＧ−ＰＣも、程度はより小さいが有意な抗腫瘍活性を示した。
【０１７２】
結論：　Ｃ６神経膠腫を有するラットに動脈内投与したＰ−ＢＦＡは、腫瘍に対して細胞毒性効果を示す。
【０１７３】
2004505898.tif 000013
【０１７４】
例２８：　ＤＰ−ＢＦＡの抗腫瘍効果
ＤＰ−ＢＦＡの抗腫瘍効果を、Ｃ６神経膠腫を有するラットの腫瘍容積及び外観を観察することによって評価した。Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに、５μｌ　ＰＢＳ中２．５ｘ１０５個のＣ６神経膠腫細胞を、下記のようにして接種した。ラットを、定位頭部固定装置に頭蓋を平らな位置にして固定した。骨膜反射の後、バー孔（ｂｕｒｒ　ｈｏｌｅ）を１ｍｍドリルを用いて下記の座標で予備形成した：ブレグマ−１．０、左側の中線から３．５０ｍｍ横、及び深さ−３．５０ｍｍ。細胞懸濁液を、１０μｌ　Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いて３．５０ｍｍの深さに手動で注射した。腫瘍を有するラットに、接種から７２時間後に、５−２０μＭの３，１２−ジ−エチレングリコールホスファート（３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４；ナトリウム塩）又はビヒクル（等張緩衝液，ｐＨ＝７．４）を外頸動脈に３０秒間３ｍｌ／分の速度で単回用量で処理した。翼状突起口蓋動脈（ｐｔｅｒｙｇｏ−ｐａｌａｔｉｎａ　ａｒｔｅｒｙ）を連結し、頸部共通動脈は、注入のときにクランプした。
【０１７５】
Ｃ６腫瘍細胞の接種から５日後に、ラットをケタミン／キシラジン（１：１）０．ｌｍｌ／１００ｇ体重で麻酔し、食塩水を灌流し、４％ホルムアルデヒド溶液で固定した。脳を取り出して、スクロース溶液中で４８時間凍結保護した。次に、脳を冠状区画にスライスし、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、病理学的評価を行った。
【０１７６】
非処理動物と比較して処理動物では、腫瘍の大きさの有意な減少が観察された。腫瘍容積は、ビヒクル処理動物では８．１±２．２ｍｍ３（Ｎ＝７）であり、３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４処理した動物では１．６±０．２ｍｍ３（Ｎ＝１２）であった。更に、腫瘍増殖の微小環境及び性質も異なった。ビヒクル処理した腫瘍を有するラットでは、皮質、白質及び髄膜で顕著な局部的細胞膨張が見られた。Ｃ６神経膠腫は不規則且つ高度に浸潤性のようであり、血管周囲のリンパ空間を侵襲する高度の傾向を示した。対照的に、細胞接種後の３日目に１回投与したＤＰ−ＢＦＡによる処理では、腫瘍増殖の特徴が著しく変化した。Ｃ６神経膠腫の血管周囲空間を通じての侵襲は減少し、明確な縁を有する固形腫瘍が見られた。幾らかの限定的な侵襲が、接種部分及び表皮下の髄膜中へ見られた。
【０１７７】
結論：　３，１２−ＤＥＧ−ＰＯ４は、腫瘍の侵襲性及び増殖速度の阻害などの有意な抗腫瘍効果を示した。従って、ＤＰ−ＢＦＡ化合物は、腫瘍の拡張及び侵襲性の阻害に用いることができる。
【０１７８】
当業者であれば、本開示の原理は多くの態様及び変更又は修飾を行うことができ、これら総ては本発明の範囲内にあることを理解されるであろう。例は非制限的であると解釈すべきものであり、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義されるべきものであることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
３，ｎ−型のα−分岐脂肪酸の様々な鎖長と、これらの化合物のＥｖａｎｓブルー−アルブミン複合体のラット脳中への溢出におけるこれらの化合物の効力との相関を表すグラフ。
【図２】
下記の化合物、１０μＭ　３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ（図２Ａ）、４０μＭ　３，１２−Ｎａ（図２Ｂ）又は２５％マンニトール（図２Ｃ）の片側投与後の両側神経膠腫を有するラットの脳断片におけるＥｖａｎｓブルーの蓄積。
【図３】
Ｆ−Ｎａを単独で（図３Ａ）、又は３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ（図３Ｂ）又はビヒクル（図３Ｃ）と組み合わせて投与してから３０秒又は１０分後に記録したラットの眼後部のフルオレセインナトリウム塩（Ｆ−Ｎａ）による血管造影法。
【図４】
例２６に記載の手続きの後に３，１２−ＤＥＧ−ＨＰＯ４Ｎａ（図４Ａ）又はビヒクル（図４Ｂ）と共にＦ−Ｎａを投与してから１０分後に記録した眼の前部におけるＦ−Ｎａの蓄積。
【図１】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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