(57)【要約】標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングする方法に関する。該方法は、標的および指示薬を含み、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；各候補化合物が識別でき、かつ候補化合物サンプル中の候補化合物が該基板中の標的と相互作用するように該基板と該複数の候補化合物サンプルとを接触させること；該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により生成されたシグナルを検出すること；および、生成シグナルの量に基づいて該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定すること；を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）　標的および指示薬を含み、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；
（ｂ）　各候補化合物が識別でき、かつ候補化合物サンプル中の候補化合物が該基板中の標的と相互作用するように該基板と該複数の候補化合物サンプルとを接触させること；
（ｃ）　該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により生成されたシグナルを検出すること；および
（ｄ）　生成シグナルの量に基づいて該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定すること；
を含む、上記方法。
【請求項２】
基板が、生物学的マトリックス培地、合成マトリックス培地、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるマトリックスをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生物学的マトリックス培地が、アガロース、コラーゲン、ラミニン、基底膜に由来する複合体、これらの誘導体、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
アガロースが低融点アガロースである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
指示薬が、発光性化合物、蛍光性化合物、化学発光性化合物、発色性化合物、放射性標識化合物およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
基板が細胞をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞が標的もしくは指示薬または標的と指示薬の両方を発現する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞が２種以上の標的を発現する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞が、アフリカツメガエルメラニン細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
それぞれが１種以上の標的を発現する細胞の組合せをさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の：
（ａ）　候補化合物を装填した後、標的に対するリガンドに基板を接触させることにより、候補化合物をリガンドの存在下で所定のパターン内の標的と相互作用させること；
（ｂ）　標的とリガンドとの相互作用を遮断する際に指示薬により生成されるシグナルを、所定のパターン内で検出すること；および
（ｃ）　対照のサンプルと比較した生成シグナルの量に基づいて標的の生物学的活性のモジュレーターとしての候補化合物を同定すること；
をさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
基板全体に混合された複数の細胞をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
基板内で層を形成する複数の細胞をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項１４】
基板が、基板内の細胞の層の上に形成されたマトリックス層をさらに含み、該マトリックス層が複数の候補化合物サンプルを収容するように位置する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
マトリックス層が、生物学的マトリックス培地、合成マトリックス培地、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるマトリックスを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
生物学的マトリックス培地が、アガロース、コラーゲン、ラミニン、基底膜に由来する複合体、これらの誘導体、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
アガロースが低融点アガロースである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
基板が細胞を含まない基板である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
候補化合物がビーズに結合しており、ビーズから候補化合物が切り離されることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
ビーズが紫外光に曝露されることにより、候補化合物がビーズから切断される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ビーズを細胞とマトリックスとに混合し、該ビーズとマトリックスと細胞との混合物を支持体上に流し込んで基板にビーズを接触させることにより、支持体上に基板を形成することを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
複数の候補化合物サンプルが液体候補化合物サンプルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
複数の液体候補化合物サンプルが、ソースから得られる液体候補化合物サンプルの数の乗数に等しい数を含んでいる、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
乗数が１〜２５の範囲内の数である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ソースから得られる液体候補化合物サンプルが、９６、３８４または１５３６個である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約３８４個の液体候補化合物サンプルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約１２８０個の液体候補化合物サンプルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約１５３６個の液体候補化合物サンプルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
基板を複数の液体候補化合物サンプルに接触させた後、複数の時点でシグナルを検出する、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定するステップが、最終時点での候補化合物により生成されたシグナルから開始時点での候補化合物により生成されたシグナルを差し引くことを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
シグナルの直径、シグナルの体積、シグナルの範囲、シグナルの凹凸性、シグナルの真円度またはこれらの組み合わせを分析することにより、候補化合物により生成されたシグナルの量を評価する、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
複数の液体候補化合物サンプルに基板を接触させて、液体候補化合物サンプルが基板の表面に接触し、かつ液体候補化合物サンプルを基板に接近させるために用いる手段が基板に接触しないことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
複数の液体候補化合物サンプルに基板を接触させて、液体候補化合物サンプルと、該液体候補化合物サンプルを基板に送達するために用いる手段とがそれぞれに基板に接触することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）　標的を発現する細胞および指示薬を含み、少なくとも約３８４個の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；
（ｂ）　該基板と複数の液体候補化合物サンプルとを接触させて、該候補化合物サンプルの所定のパターンを基板上に形成することで、該候補化合物サンプル中の候補化合物を該基板中の該所定のパターン内の標的と相互作用させること；
（ｃ）　該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により該所定のパターン内で生成されるシグナルを検出すること；および
（ｄ）　対照サンプルと比較した生成シグナル量に基づいて、該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定すること；
を含む、上記方法。
【請求項３５】
基板が、生物学的マトリックス培地、合成マトリックス培地、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるマトリックスをさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
生物学的マトリックス培地が、アガロース、コラーゲン、ラミニン、基底膜に由来する複合体、これらの誘導体、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質をさらに含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
アガロースが低融点アガロースである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
指示薬が、発光性化合物、蛍光性化合物、化学発光性化合物、発色性化合物、放射性標識化合物およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
細胞が標的もしくは指示薬または標的と指示薬の両方を発現する、請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
細胞が２種以上の標的を発現する、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
細胞が、アフリカツメガエルメラニン細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項４２】
それぞれが１種以上の標的を発現する細胞の組合せをさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項４３】
以下の：
（ａ）　候補化合物を装填した後、標的に対するリガンドに基板を接触させることにより、候補化合物をリガンドの存在下で所定のパターン内の標的と相互作用させること；
（ｂ）　標的とリガンドとの相互作用を遮断する際に指示薬により生成されるシグナルを、所定のパターン内で検出すること；および
（ｃ）　対照サンプルに比較した生成シグナルの量に基づいて標的の生物学的活性のモジュレーターとしての候補化合物を同定すること；
を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項４４】
基板全体に渡って混合された複数の細胞をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項４５】
基板内で層を形成する複数の細胞をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項４６】
基板が、基板内の細胞の層の上に形成されたマトリックス層をさらに含み、該マトリックス層が複数の候補化合物サンプルを収容するように位置する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
マトリックス層が、生物学的マトリックス培地、合成マトリックス培地、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるマトリックスを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
生物学的マトリックス培地が、アガロース、コラーゲン、ラミニン、基底膜に由来する複合体、これらの誘導体、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質をさらに含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
アガロースが低融点アガロースである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
複数の液体候補化合物サンプルが、ソースから得られる液体候補化合物サンプルの数の乗数に等しい数である、請求項３４記載の方法。
【請求項５１】
乗数が１〜２５の範囲内の数である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
ソースから得られる液体候補化合物サンプルの数が、９６、３８４または１５３６個である、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約３８４個の液体化合物サンプルを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項５４】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約１２８０個の液体化合物サンプルを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項５５】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約１５３６個の液体化合物サンプルを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項５６】
基板を複数の液体化合物サンプルに接触させた後、複数の時点でシグナルを検出する、請求項３４記載の方法。
【請求項５７】
標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定するステップが、最終時点での候補化合物により生成されたシグナルから開始時点での候補化合物により生成されたシグナルを差し引くことを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
シグナルの直径、シグナルの体積、シグナルの範囲、シグナルの凹凸性、シグナルの真円度またはこれらの組み合わせを分析することにより、候補化合物により生成されたシグナルの量を評価する、請求項３４記載の方法。
【請求項５９】
複数の液体候補化合物に基板を接触させて、液体候補化合物サンプルが基板の表面に接触し、かつ液体候補化合物サンプルを基板に接近させるために用いる手段が基板に接触しないことを特徴とする、請求項３４記載の方法。
【請求項６０】
複数の液体候補化合物サンプルに基板を接触させて、液体候補化合物サンプルと、該液体候補化合物サンプルを基板に送達するために用いる手段とがそれぞれに基板に接触することを特徴とする、請求項３４記載の方法。
【請求項６１】
標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）　基板内に層を形成する、標的を発現する複数の細胞と指示薬とを含み、少なくとも約１５３６個の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；
（ｂ）　該基板と複数の液体候補化合物サンプルとを接触させて、該候補化合物サンプルの所定のパターンを基板上に形成することで、該候補化合物サンプル中の候補化合物を該所定のパターン内の標的と相互作用させること；
（ｃ）　該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により該所定のパターン内で生成されるシグナルを検出すること；および
（ｄ）　対照サンプルと比較した生成シグナル量に基づいて、該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定すること；
を含む、上記方法。
【請求項６２】
マトリックス層が、基板内の細胞の層の上に形成されたマトリックス層をさらに含み、該マトリックス層が複数の候補化合物サンプルを収容するように位置する、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
基板が、生物学的マトリックス培地、合成マトリックス培地、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるマトリックスをさらに含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
生物学的マトリックス培地が、アガロース、コラーゲン、ラミニン、基底膜に由来する複合体、これらの誘導体、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質をさらに含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
アガロースが低融点アガロースである、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
指示薬が、発光性化合物、蛍光性化合物、化学発光性化合物、発色性化合物、放射性標識化合物およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項６１記載の方法。
【請求項６７】
細胞が標的と指示薬の両方を発現する、請求項６１記載の方法。
【請求項６８】
細胞が２種以上の標的を発現する、請求項６３記載の方法。
【請求項６９】
細胞が、アフリカツメガエルメラニン細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６１記載の方法。
【請求項７０】
それぞれが１種以上の標的を発現する細胞の組合せをさらに含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
以下の：
（ａ）　候補化合物を装填した後、標的に対するリガンドに基板を接触させ、これにより、候補化合物がリガンドの存在下で所定のパターン内の標的と相互作用し；
（ｂ）　標的とリガンドとの相互作用を遮断する際に指示薬により生成されるシグナルを、所定のパターン内で検出し；および
（ｃ）　対照のサンプルに比較した生成シグナルの量に基づいて標的の生物学的活性のモジュレーターとしての候補化合物を同定すること；
を含む、請求項６１記載の方法。
【請求項７２】
複数の液体化合物サンプルが、ソースから得られる液体化合物サンプルの数の乗数に等しい数である、請求項６１記載の方法。
【請求項７３】
乗数が１〜２５の範囲内の数である、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
ソースから得られる液体候補化合物サンプルの数が、９６、３８４または１５３６個である、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約３８４個の液体化合物サンプルを含む、請求項６１記載の方法。
【請求項７６】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約１２８０個の液体化合物サンプルを含む、請求項６１記載の方法。
【請求項７７】
複数の液体候補化合物サンプルが少なくとも約１５３６個の液体化合物サンプルを含む、請求項６１記載の方法。
【請求項７８】
基板を複数の液体化合物サンプルに接触させた後、複数の時点でシグナルを検出する、請求項６１記載の方法。
【請求項７９】
標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定するステップが、最終時点での候補化合物により生成されたシグナルから開始時点での候補化合物により生成されたシグナルを差し引くことを含む、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
シグナルの直径、シグナルの体積、シグナルの範囲、シグナルの凹凸性、シグナルの真円度またはこれらの組み合わせを分析することにより、候補化合物により生成されたシグナルの量を評価する、請求項６１記載の方法。
【請求項８１】
複数の液体候補化合物に基板を接触させて、液体候補化合物サンプルが基板の表面に接触し、かつ液体候補化合物サンプルを基板に接近させるために用いる手段が基板に接触しないことを特徴とする、請求項６１記載の方法。
【請求項８２】
複数の液体候補化合物サンプルに基板を接触させて、液体候補化合物サンプルと、該液体候補化合物サンプルを基板に送達するために用いる手段とがそれぞれに基板に接触することを特徴とする、請求項６１記載の方法。
【請求項８３】
標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）　マトリックス、指示薬、および基板中に懸濁された、標的を発現する複数の細胞を含む、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；
（ｂ）　それぞれの候補化合物が識別でき、かつ候補化合物サンプル中の候補化合物が該基板中の該標的と相互作用するように、該基板を該複数の候補化合物サンプルと接触させること；
（ｃ）　該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により生成されるシグナルを検出すること；および
（ｄ）　生成シグナルの量に基づいて、該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定すること；
を含む、上記方法。
【請求項８４】
マトリックスが、アガロース、コラーゲン、ラミニン、基底膜に由来する複合体、これらの誘導体、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される物質をさらに含む、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
指示薬が、発光性化合物、蛍光性化合物、化学発光性化合物、発色性化合物、放射性標識化合物およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
指示薬が、細胞内で発現される、検出可能な遺伝子産物を発現するレポーター遺伝子である、請求項８３記載の方法。
【請求項８７】
指示薬が、レポーター遺伝子の発現およびマトリックスにおけるレポーター遺伝子産物のシグナル展開剤との反応により生成される、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項８３記載の方法。
【請求項８９】
細胞が２種以上の標的を発現する、請求項８３記載の方法。
【請求項９０】
それぞれが１種以上の標的を発現する細胞の組合せをさらに含む、請求項８３記載の方法。
【請求項９１】
それぞれが１種以上の標的を発現する、同種または異種の細胞の組合せをさらに含む、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
シグナルの検出を容易にするために、基板が色の着いた固相支持体を含む、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
固相支持体の色が白色である、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
候補化合物がビーズに結合しており、ビーズから候補化合物が切り離されることをさらに含む、請求項８３記載の方法。
【請求項９５】
ビーズが紫外光に曝露されることにより、候補化合物がビーズから切断される、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
ビーズを細胞とマトリックスとに混合し、該ビーズとマトリックスと細胞との混合物を支持体上に流し込んで基板にビーズを接触させることにより支持体上に基板を形成することを特徴とする、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
以下の：
（ａ）　所定の温度で所定の時間に渡って基板をインキュベートすること；および
（ｂ）　ステップ（ａ）のインキュベーションの後にシグナル展開剤に基板を接触させることにより、指示薬がレポーター遺伝子の発現およびシグナル展開剤とのレポーター遺伝子産物の反応により生成されること、
を含む、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
複数の候補化合物サンプルが液体候補化合物サンプルを含む、請求項８３記載の方法。
【請求項９９】
基板の画像を得ることによりシグナルを検出する、請求項８３記載の方法。
【請求項１００】
テレセントリックレンズを介してＣＣＤカメラにより基板に由来するシグナルに焦点を当てることによりシグナルの画像を得る、請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
シグナルの検出が：
（ａ）　画像をデジタル化すること；
（ｂ）　複数のグリッド単位からなるグリッドに画像を重ねること；
（ｃ）　シグナルの周囲の所定の数のグリッド単位をそれぞれスキャンし、所定の数のグリッド単位中の各グリッド単位のグレイ強度値の平均を求めることにより、平均グレイ強度値を決定すること；
を含む、請求項９９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、候補化合物を生物学的活性についてスクリーニングするためのハイスループット方法に概ね関する。特に、本発明は、目的の標的を含む基板を採用する、候補化合物を生物学的活性についてスクリーニングするためのハイスループット方法に関する。
【０００２】
略記表
λ　−　波長
７ＴＭ　−　７回膜貫通
ＡＣ　−アデニリルシクラーゼ
ＢＳＡ　−　ウシ血清アルブミン
ｃＡＭＰ　−　環状ＡＭＰ
ＣＦＭ　−　繊維芽細胞（またはカエル）ならし培地
ＣＨＯ　−　チャイニーズハムスター卵巣
ＣＲＥ　−　ｃＡＭＰ応答エレメント
ＣＲＨ　−　副腎皮質刺激ホルモン放出因子
ＣＲＨＲ１　−　副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体
ＤＭＥＭ／Ｆ１２　−　ダルベッコ改変型イーグル培地
ＤＭＳＯ　−　ジメチルスルホキシド
ＥＤＴＡ　−　エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ　−　酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＢＳ　−　ウシ胎仔血清
ＧＦＰ　−　緑色蛍光タンパク質
ＧＰＣＲ　−　Ｇタンパク質共役型受容体
ＧＬＰ−１　−　グルカゴン様ペプチド−１
ＦＬＩＰＲ　−　蛍光画像化プレートリーダー
ＨＤＲ　−　高密度レプリケーター
ＨＥＫ　−　ヒト胎児腎臓（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）
ＨＴＳ　−　ハイスループットスクリーニング
Ｌ−１５　−　リーボビッツ（ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）−１５培地
ＬＭＰ　−　低融点
ＭＣ１Ｒ　−　メラノコルチン−１受容体
ＭＤＳ　−　方法開発ソフトウェア
Ｍｉｎ．　 −　分
ｍｌ　−　ミリリットル
ｍＲＮＡ　−　メッセンジャーＲＮＡ
αＭＳＨ　−　αメラニン細胞刺激ホルモン
［ＮＤＰ］−αＭＳＨ　−　４−Ｌ−ノルロイシン−７−Ｄ−フェニルアラニン−αメラニン細胞刺激ホルモン
ｎｌ　−　ナノリットル
ＰＢＳ　−　リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤ　−　色素分散
ＰＬＣ　−　ホスホリパーゼＣ
ＲＴ−ＰＣＲ　−　逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＯＰ　−　標準的動作手順
Ｔｃｌ　−　ツールコマンド言語
ＴＰＡ　−　ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート
ＵＶ　−　紫外線
ＷＴ　−　野生型
背景技術
コンビナトリアル化学技術の出現により、治療薬として可能性のある多数の化合物の合成が可能になった。しかし、薬理学的活性を有する候補化合物を迅速かつ正確に同定できるアッセイは、合成のペースに遅れをとっている。その結果、多くの製薬会社は、薬理学的活性についてスクリーニングされていない候補化合物の膨大なライブラリーを所有している。
【０００３】
ＰＩＮツールシステムは、９６または３８４のサンプルをレザーバーから容器に移すために典型的に使用される市販のシステムである。現在、ＰＩＮツール技術は、膜上へのＤＮＡ／ＲＮＡスポッティングに適用されている。代表的なＰＩＮツールシステムは、３８４ウェルプレートにサンプルを移す装置の使用の記載と共に、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから出版されているＢｒａｎｔ， ”Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＢＩＯＭＥＫ（登録商標） ２０００ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ Ｔｏｏｌ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， Ｖｏｌ． ２（２）， （１９９７）に開示されている。
【０００４】
１９９７年２月１１日にＬｅｒｎｅｒらに発行された米国特許第５，６０１，９２２号（Ｂｕｎｓｅｎ ＲｕｓｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））は、ペプチドライブライリーフォーマットおよびそれに関連する方法を開示している。機能的応答を検出するために、細胞を覆うアガロース層へ合成ペプチドライブラリービーズを適用することが開示されている。
【０００５】
１９９９年１１月２日にＢｅｕｔｅｌら（譲受人：Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔ Ｐａｒｋ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））に発行された米国特許第５，９７６，８１３号は、連続形式ハイスループットスクリーニングアッセイを開示する。開示されているアッセイは、アッセイにおいて異なる物質サンプルからなる９６のサンプルを上回るサンプルがそれぞれ堆積される少なくとも１つの多孔性マトリックスを採用する。アッセイの細胞利用型実施形態では、目的の受容体を発現する細胞を、細胞マトリックス上で成長させるか、またはプレーティングする。受容体に対する標識化リガンドがマトリックス上または中に分注されるように多孔性マトリックスを作製する。次いで、テスト化合物またはサンプルを、リガンドまたは細胞マトリックス上に直接分注するか、あるいはまたは別のマトリックス上または中に分注する。この場合、サンプルマトリックスを、リガンドマトリックスと接触させて、サンプルをリガンドマトリックス中に拡散させる。適切なインキュベーション時間後、リガンドマトリックスを、細胞マトリックスと接触させて（好ましくはマトリックスの非細胞側）、リガンドおよびサンプルは、拡散により受容体と接触および反応する。従って、細胞利用型実施形態は、個別の細胞マトリックスの作成を必要とする。
【０００６】
上記文献の開示にも関わらず、薬理学的に活性な候補化合物についての改善されたハイスループットスクリーニング方法（特に液体サンプルを用いた使用および／または細胞利用型アッセイにおける使用のため）の開発の余地がかなりある。従って、様々な標的に対して薬理学的活性について候補化合物をスクリーニングする方法は、当該技術分野において長い間痛切に要望され続けてきた。
【０００７】
発明の要約
標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングする方法を開示する。本方法は、標的および指示薬を含み、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；各候補化合物が識別でき、かつ候補化合物サンプル中の候補化合物と該基板中の標的とが相互作用するように該基板と該複数の候補化合物サンプルとを接触させること；該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により生成されたシグナルを検出すること；ならびに生成されるシグナル量に基づいて該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定することを、包含する。
【０００８】
代替的な実施形態では、標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングする方法を開示する。本方法は、標的および指示薬を含み、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；該基板と複数の液体候補化合物サンプルとを接触させて、該候補化合物サンプルの所定のパターンを基板上に形成させることで、該候補化合物サンプル中の候補化合物を該基板中の該所定のパターン内の標的と相互作用させること；該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により該所定のパターン内で生成されるシグナルを検出すること；ならびに対照サンプルと比較した生成シグナルの量に基づいて、該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定することを、包含する。
【０００９】
代替的な実施形態では、本方法は：マトリックス、指示薬、および基板中に懸濁された、標的を発現する複数の細胞を含む、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；それぞれの候補化合物が識別でき、かつ候補化合物サンプル中の候補化合物が該基板中の該標的と相互作用するように、該基板を該複数の候補化合物サンプルと接触させること；該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により生成されるシグナルを検出すること；ならびに対照サンプルと比較した生成シグナルの量に基づいて、該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定することを、包含する。この実施形態では、細胞は哺乳動物細胞を含むことが好ましい。
【００１０】
従って、本発明の目的は、標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングするための新規アッセイ方法を提供することである。この目的は、その全体または一部が、本発明により達成される。
【００１１】
本発明の目的を上述したが、他の目的は、添付の図面、および以下本明細書に最も良く説明する実験例を合わせて考慮して記載が進むにつれて明らかになる。
【００１２】
発明の詳細な説明
標的の生物学的活性をモジュレートする能力について候補化合物をスクリーニングする方法を開示する。本方法は、標的および指示薬を含み、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；各候補化合物が識別でき、かつ候補化合物サンプル中の候補化合物と該基板中の標的とが相互作用するように、該基板と該複数の候補化合物サンプルとを接触させること；該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により生成されたシグナルを検出すること；ならびに対照サンプルと比較した生成シグナルの量に基づいて、該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定することを、包含する。
【００１３】
１つの代替的な実施形態では、本方法は、標的および指示薬を含み、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；該基板と複数の液体候補化合物サンプルとを接触させて、該候補化合物サンプルの所定のパターンを基板上に形成することで、該候補化合物サンプル中の候補化合物を該基板中の該所定のパターン内の標的と相互作用させること；該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により該所定のパターン内で生成されるシグナルを検出すること；ならびに対照サンプルと比較した生成シグナルの量に基づいて、該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定することを、包含する。
【００１４】
別の代替的な実施形態では、本方法は：マトリックス、指示薬、および基板中に懸濁された、標的を発現する複数の細胞を含む、複数の候補化合物を収容できるように適合された基板を得ること；各候補化合物が識別でき、かつ候補化合物サンプル中の候補化合物が該基板中の該標的と相互作用するように、該基板を該複数の候補化合物サンプルと接触させること；該標的と候補化合物との相互作用の際に該指示薬により生成されるシグナルを検出すること；ならびに対照サンプルと比較した生成シグナルの量に基づいて、該標的の生物学的活性のモジュレーターとして候補化合物を同定することを、包含する。
【００１５】
長年にわたる特許法の慣例に従い、請求の範囲を含む本出願において使用される単数表現の用語は「１または複数」を意味する。
【００１６】
Ｉ．概論
リポーター遺伝子構築物は、典型的に、測定し易い酵素活性または他のタンパク質（リポーター遺伝子）の発現を制御する誘導可能なプロモーターエレメントを含むプラスミドを含む。リポーター遺伝子自体は、典型的に、存在する他のタンパク質とは区別可能なようにユニークな活性または構造を有している。リポーター遺伝子産物またはリポーター遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の活性は、プロモーター配列の転写活性の間接的な測定を提供できる。誘導可能プロモーターエレメントは、プロモーターに結合して活性化させる転写因子自体が受容体仲介型シグナル形質導入の影響により活性化されるまでは、転写に関して不活性であるか、または活性が弱い。活性化プロモーターは、リポーター遺伝子の転写を駆動し、これはその後、ｍＲＮＡ、蛍光もしくは他の特性（最も多くの場合、タンパク質生成物の酵素活性）によりタンパク質産物自体、またはほとんどの場合はタンパク質産物の酵素活性をアッセイすることにより定量される。リポーター遺伝子の例としては、ホタルルシフェラーゼ、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼＳＥＡＰ、βガラクトシダーゼ、エクオリンおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられるがこれらに限定されない。リポーター遺伝子系および薬理学におけるそれらの使用のレビューに関しては、Ｋｅｎａｋｉｎ， Ｔ．， Ａｎｇｕｓ， Ｊ．Ａ．（編）， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｖｏｌ． １４８：３９１−４１２に掲載のＩｇｎａｒおよびＲｅｅｓ， （２０００）を参照のこと。
【００１７】
リポーター遺伝子アッセイは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）作戦（ｃａｍｐａｉｇｎ）における目的の標的に対するリガンドを同定するため、および化合物の二次薬理学的プロファイリングのために使用される。標的タンパク質としては、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、核受容体、キナーゼ、プロテアーゼ、イオンチャンネル、１回膜貫通型タンパク質、およびシグナル形質導入経路をモジュレートする他の任意のタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。標的タンパク質により調節される本質的にどのようなシグナリング事象も、リポーター遺伝子系を用いて評価できる。例えば、リポーター遺伝子は、Ｇαｓ、ＧαｑまたはＧαｉに共役するＧＰＣＲの薬理学を評価するために使用されてきた（Ｓｔｒａｔｏｗａら， （１９９５ａ） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：５７４−５８１；Ｋｅｎａｋｉｎ， Ｔ．， Ａｎｇｕｓ， Ｊ．Ａ．（編）， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｖｏｌ． １４８：３９１−４１２に掲載のＩｇｎａｒおよびＲｅｅｓ， （２０００））。Ｇαｓ連結受容体による細胞内環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のモジュレーションは、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を用いて評価できる（Ｈｉｍｍｌｅｒら， （１９９３） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：５７３−５８１）。プロテインキナーゼＣ依存型シグナリング事象のＧαｑ連結受容体仲介型調節は、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＴＰＡ）応答エレメントを用いて測定できる（Ｗｅｙｅｒら， （１９９３） Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｈａｎｎｅｌｓ １：１９３−２００；Ｓｔｒａｔｏｗａら （１９９５ｂ） Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔ． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ． Ｒｅｓ． １５：６１７−６３０）。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ調節のＧαｑまたはＧαｌ連結受容体モジュレーションは、Ｇａｌ４／ｅｌｋ−１またはＧａｌ４／ｓａｐ１ａリポーター系を用いて評価できる。Ｂｅｖａｎら （１９９８） Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ９：２７０３−２７０８。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、初めて、マトリックス、ならびに標的およびリポーター遺伝子を発現する複数の細胞を含む基板を提供する方法を開示する。複数の細胞を基板に懸濁し、該基板を複数の候補化合物を受けるように適合させる。基板を、各候補化合物を識別できるように、複数の候補化合物サンプルと接触させる。候補化合物サンプル中の候補化合物は、基板中の標的と相互作用し、標的と候補化合物との相互作用の際に、リポーター遺伝子により生成されるシグナルを検出する。候補化合物は、生成されたシグナルの量に基づき標的の生物学的活性のモジュレーターとして同定される。シグナルの量は、対照サンプルと比較されることが好ましい。
【００１９】
ＩＩ．アッセイ方法
好適な実施形態では、本発明のアッセイ法は、標的のモジュレーションにおける活性についての多数の候補化合物の高速スクリーニングに対する「ウェル無し（ｗｅｌｌ−ｌｅｓｓ）」アプローチに関する。「ウェル無し」という用語は、スクリーニングされる候補化合物を受けるための、標的もしくは指示薬またはその両方を含む基板の作成および使用を指すことを意図する。本明細書に開示するように、基板は、大きさ、形状および組成が多様であり得る。好ましくはＰＩＮツールシステムなどの自動化システムを使用することにより、基板上に所定のパターンを構築できる。ＰＩＮツールの使用は、所定のパターンを構築し易くし、そして所定のパターンは、候補化合物と標的との相互作用に対する応答を検出し易くする。
【００２０】
「候補化合物」という用語は、標的の生物学的活性をモジュレートする化合物の能力の特徴決定が望ましい任意の化合物を指すことを意図する。「モジュレート」とは、標的の任意または全ての生物学的活性または性質の増加、減少、または他の変化を意味することを意図する。
【００２１】
代表的な候補化合物としては、薬剤および他の治療剤、発癌性物質および環境汚染物質、天然産物、ペプチドおよび抽出物などの生体異物、ならびにステロイド、脂肪酸およびプロスタグランジンなどの生体内物質が挙げられる。本発明のアッセイ法により調査され得る候補化合物の他の例としては、細胞膜受容体および核受容体のためのアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピオイドペプチド、ステロイドなど）、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、レクチン、糖、オリゴヌクレオチドまたは核酸、オリゴ糖、タンパク質、ならびにモノクローナル抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
液体候補化合物サンプルを、本発明のアッセイ法への使用に好ましい。注目に値すべきなのは、本アッセイ方法での使用には、標準的ウェル利用型技術と比較して、各候補化合物の液体が小容量のみ必要なことである。例えば、ウェル利用型システムにおいて典型的に必要とされる１０マイクロリットル（μＬ）サンプルに対して、本発明によれば１０ナノリットル（ｎＬ）サンプルで使用できる。さらに、より多数の候補化合物が、液体形態で現在入手可能である。従って、ウェル形式スクリーニングに基づくものなど従来技術のシステムと比べて、本発明のアッセイ法を用いてより多くの化合物をスクリーニングできる。
【００２３】
別の実施形態では、候補化合物に結合したビーズと基板および細胞とを混合することで、候補化合物を基板上に堆積させる。また、ビーズ形式を使用してペプチドと受容体との相互作用もスクリーニングできるように、ペプチドライブラリーを構築することも可能である。
【００２４】
候補化合物は、従来の手法でビーズにコード（ｃｏｄｅ）する。アッセイを開始するために、ビーズを光源（好ましくは紫外線（ＵＶ）光源）に露光させ、ビーズから化合物を光切断（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖｅ）して、基板中に化合物を拡散させることが好ましい。ビーズを、溶融基質（例えばアガロース）に入った細胞との混合物として、空のトレイに装填し、ビーズが単一の位置に維持されるようにすることが好ましい。従って、ビーズに関連するシグナルが検出された場合にビーズを選定して化合物をデコードできる。ビーズ／ｍｍ２アプローチでビーズを基板上に装填する。従って、典型的に、単一の１，５３６フォーマットトレイに約１００，０００ビーズを含むことが可能である。
【００２５】
本発明のアッセイ法により提供される基板は、その上またはその中に候補化合物を堆積できるマトリックスコンポーネントを含む。マトリックスコンポーネントは、任意の適切な物質を含み得る。好適な実施形態では、アガロースを基板中のマトリックスコンポーネントとして採用する。任意に、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手可能な低融点アガロースを使用して基板を作成する。低融点アガロースは、室温にて凝固し、生存に有害な影響を与えることなく細胞をアガロース中に混合できる。また、低融点アガロースは、乾燥を容易にするために本発明の一部の実施形態に採用される。
【００２６】
本発明の開示を検討した当業者には明らかであろうが、アガロースが基板の好ましいマトリックスコンポーネントである一方、他の適切なマトリックスコンポーネントも、天然、合成またはそれらの組合せなどが、基板を作成するために使用できる。例えば、他の生物学的マトリックス物質（コラーゲン、ラミニン、およびＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）からＭＡＴＲＩＧＥＬの登録商標の下で販売されている基底膜に由来する生物学的細胞培養基質が挙げられるがこれらに限定されない）を使用して、基板を作成できる。合成ポリマー基板物質も基板を作成するために使用できる。
【００２７】
好適な実施形態では、基板の作製に関連する変数を綿密にモニターした。例えば、基板を作製および維持する際に、大きさ、凝固時間、乾燥時間および湿度をモニターした。代表的なモニターステップは、以下に示す実施例に開示する。また、基板は、標準的な大きさまたはカスタムオープンフォーマット（ｃｕｓｔｏｍ ｏｐｅｎ ｆｏｒｍａｔ）のアッセイトレイなどの固相支持体上または固相支持体中（例えば、標準的１，５３６ウェルアッセイトレイの蓋の上または内部）に形成または作製されて、基板の表面積が所望の１，５３６サンプルを収容する所定のパターンを許容するのに十分であることが好ましい。カスタム化トレイまたは他の支持体も使用でき、トレイのフットプリント（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）は１，５３６のサンプルを収容するのに十分な大きさであることが好ましい。カスタム化トレイのフットプリントの好ましい外部寸法は、３．３６５センチメートル（ｃｍ）×５．０２５ ｃｍである。カスタム化トレイの培養面積は９４ｃｍ２である。カスタム化トレイは、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＮａｐｅｒｖｉｌｌｅ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥの登録商標下で購入できる。固相支持体（例えば、ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイ）を着色して、シグナルを検出し易くすることが好ましい。固相支持体の色は白色であることがより好ましい。
【００２８】
代替的な実施形態では、候補化合物および対照を含む９，６００の液体スポットを、本明細書に記載する自動化システムを用いて基板上で所定のパターンに構築する。従って、本発明の方法の態様は、候補化合物をソースプレートもしくはレザーバーから移すのに使用可能なピンの数の任意の所望の乗数、またはソースプレートもしくはレザーバーから移すのに使用可能な候補化合物の数の任意の所望の乗数を、基板上の所定のパターン内に収容するのに十分な大きさの基板を提供することである。乗数は、例えば、１〜２５（好ましくは２、４、８、１６、２０および２５を含む）にわたることができ、例えば、４×９６＝３８４、４×３８４＝１，５３６；４×１，５３６＝６，１４４；および２５×３８４＝９，６００である。
【００２９】
好適な実施形態では、基板は、長方形または正方形を含む。しかし、本明細書に示す開示のレビュー後の当業者には明らかであろうが、特定のアッセイに適した任意の基板の形状も使用できる。従って、例えば、基板は、三角形、円形、台形、楕円形、または任意の他の適切な幾何学的形状から構成され得る。円形または丸い基板の場合、ペトリ皿を使用して基板を形成できる。
【００３０】
基板中で細胞を採用する本発明の一実施形態では、細胞をアッセイプレートの蓋または他の支持体に流し込む。任意に、蓋または支持体を、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）からＣＥＬＬ−ＴＡＫの登録商標の下で販売されているものなど、付着力を改善する組成物で処理してもよい。細胞は、蓋または支持体の表面全体を完全に覆って、蓋上に細胞の平板または層を形成することが好ましい。細胞平板を平らな表面上に置き、好ましくは細胞が表面に付着した後に、上記開示したアガロースなどのマトリックスコンポーネントを細胞平板の上に流し込む。マトリックスが凝固および乾燥するのに十分な時間、基板を静置して、候補化合物を装填できるようにする。一実施形態では、基板を４５分間静置する。従って、マトリックスコンポーネントは細胞平板上に層を形成し、本発明の一実施形態によれば、基板は細胞層およびマトリックス層の２層を含む。しかし、代替的な実施形態では、細胞はマトリックスコンポーネント中に混合でき、この場合、基板は細胞とマトリックスとの単層を含む。
【００３１】
別の実施形態では、細胞はマトリックスコンポーネント中に混合でき、この場合、基板は細胞とマトリックスとの単層を含む。マトリックスに入った細胞の懸濁液の場合、懸濁液を支持体（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥの登録商標の下で販売されているトレイなど）上に流し込むことができる。支持体またはトレイは、シグナルを検出する能力を向上させるために白色プラスチックで構成されることが好ましい。
【００３２】
細胞を基板全体に懸濁させる本発明の実施形態では、アガロースが３７℃で固形のままであることが好ましい。基板において、０．７５％〜１．５％（１．０％および１．２５％を含む）のアガロース濃度範囲が採用されることが好ましい。例えば、細胞を培地に希釈して、その後所望の最終濃度の２×濃度のマトリックス培地を培地中の細胞と混合できる。従って、１０ミリリットルサンプルの懸濁細胞を得る場合、１０ミリリットル（ｍＬ）の２％アガロースを細胞に添加し、細胞を含む２０ミリリットルの１％アガロースが作製される。アガロースの容量は、５ ｍＬ〜５０ ｍＬの範囲であることが好ましく、約５ ｍＬ〜約２０ ｍＬの範囲であることがより好ましい。より好ましい容量は、１０ ｍＬ、１５ ｍＬまたは２０ ｍＬであり、１２ ｍＬが最も好ましい容量である。細胞は、１ ｍＬのマトリックス（例えばアガロース）につき約０．５〜約１０×１０６の合計数で存在し得る。細胞は、１ ｍＬのマトリックス（例えばアガロース）につき約１．５〜約３．５×１０６の数で存在することが好ましい。シグナルおよび細胞培養の労力の点から、１ ｍＬのマトリックス（例えばアガロース）につき約２．５×１０６の細胞、すなわち１０ ｍＬのマトリックスにつき２５×１０６の細胞がより好ましい。
【００３３】
基板は標的も含む。「標的」という用語は、生物学的活性を有する任意の化学的または生物学的な物体であって、その生物学的活性をモジュレートする薬剤の同定が望ましいものを指すことを意図する。複数の標的が基板に含まれ得る。標的は、天然のものでも人工的な分子でもよい。また、それらは、未改変状態でも、または他の種との集塊としても採用され得る。標的は、結合メンバーに、直接または特異的な結合物質を介して共有的または非共有的に結合できる。本発明の細胞利用実施形態では、標的は細胞により発現され得、細胞はトランスフェクトされて標的を発現することが好ましい。実際、細胞は、複数の標的でトランスフェクトでき、一回の労力で１、２、３、４以上の標的をスクリーニングすることは、本発明の１つの態様である。さらに、異なる標的を発現する異なる細胞が、本発明により採用できる。本発明のアッセイ方法においてスクリーニングされ得る標的の例としては、抗体、細胞膜受容体、核受容体、特異的な抗原決定基（ウイルス、細胞または他の物質など）に反応するモノクローナル抗体および抗血清、薬剤、オリゴヌクレオチドまたは核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖、多糖類、細胞、細胞膜、および細胞小器官が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
基板は、候補化合物による標的の生物学的活性のモジュレーションを識別する指示薬をさらに含む。「指示薬」という用語は、明暗（ｄａｒｋ ｖｅｒｓｕｓ ｌｉｇｈｔ）検出、蛍光または化学発光分光測定法、シンチレーション分光法、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、比色分析法などの標準的検出技術を使用して検出し易い化学分子種または化合物を指すことを意図する。従って、代表的な指示薬化合物としては、発光性または蛍光性化合物、化学発光性化合物、発色性化合物、ＵＶ／ＶＩＳ吸収化合物、放射性核種、およびそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。基板内に供給される細胞が（例えば、リポーター遺伝子を介して）指示薬を発現してもよいし、または指示薬を基板内に供給もしくは添加してもよい。代表的なリポーター遺伝子系としては、ルシフェラーゼ−ＣＲＥ系；ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼ系；および／またはＧＡＬ４−ＥＬＫ１ルシフェラーゼ系が挙げられる。
【００３５】
場合によっては、指示薬は、リポーター遺伝子の発現、およびリポーター遺伝子産物とマトリックス中のシグナル展開剤（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から入手可能なＳＴＥＡＤＹ−ＧＬＯ（登録商標）試薬、または以下の実験例に記載するＬＵＣＩＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬）との反応により作成される。この場合、本方法は、基板を所定温度にて所定時間インキュベートするステップと；インキュベートステップ後に基板をシグナル展開剤と接触させるステップとを含んで、リポーター遺伝子の発現およびリポーター遺伝子産物とシグナル展開剤との反応により指示薬を生成する。代表的な「所定時間」および「所定温度」は、以下に示す実施例に開示する。概要的に言うと、代表的な所定時間は、基板中に存在してシグナル展開剤と反応するために十分な濃度のリポーター遺伝子産物を存在させるためのリポーター遺伝子の発現に十分な時間量である。一般的に、所定時間は、好ましくは２時間〜６時間、より好ましくは約４〜約６時間にわたる。好ましい所定温度は、基板中の細胞がよく成長し、細胞プロセスが通常どおりに実施される温度を含み得る（例えば、哺乳動物細胞を含むほとんどの細胞については３７℃）。好ましい所定環境としては、加湿環境中９５％酸素（Ｏ２）および５％二酸化炭素（ＣＯ２）が挙げられる。任意に、リポーター遺伝子産物とシグナル展開剤との相互作用を可能かつ／または容易にする必要性に応じて、細胞を溶解する。
【００３６】
本発明の細胞利用型アッセイにおいては、任意の適切な細胞が使用できる。代表的な細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞などの哺乳動物細胞；アルリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のメラニン細胞などの他の脊椎動物細胞；昆虫細胞；植物細胞；細菌細胞；酵母細胞；真菌類細胞が挙げられるがこれらに限定されない。上記細胞のいずれの組合せも、本発明の細胞利用型アッセイに使用でき、哺乳動物細胞の組合せが挙げられるがこれに限定されない。任意に、異なる細胞の組み合わせを採用する場合、本発明に従って異なる細胞は異なる標的を発現できる。細胞系は互いと混合することができ、用量応答曲線は単独でプレート化された単一の細胞系に類似することが見とめられた。
【００３７】
ビーズにコンジュゲートした候補化合物を採用する本発明方法の一実施形態では、メラニン細胞よりもＣＨＯ細胞が好ましい。なぜならＣＨＯ細胞は、化合物をビーズから切断するのに典型的に使用されるＵＶ光に対する感受性がメラニン細胞よりも低いと考えられているからである。従って、より多くのＵＶ光を適用して、より効率的な切断が得られる。実験例で議論するように、ＵＶ露光は、約１６分間の露光まではシグナルに影響を与えないと思われる。最大シグナルは、アゴニスト添加から約４時間後（すなわち、これが好ましい「所定時間」である）に得られる。ＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラシステムにおいて１８時間にわたり読み取られたシグナルは、少なくとも３時間は完全に安定したままであり、その後時間をかけて減少する。
【００３８】
本発明の本実施形態について続けると、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培地に希釈し、その後所望の最終濃度の２×濃度のマトリックス培地を培地中の細胞と混合する。例えば、懸濁細胞の１０ミリリットルサンプルを用意した場合、１０ミリリットルの２％アガロースを細胞に添加する。つまり、細胞を含む２０ミリリットルの１％アガロースを作製する。その後、この懸濁液を、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．から販売されているＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイなどの支持体上に流し込んだ。シグナルを検出する能力を向上させるために、ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイは白色プラスチックで構成されることが好ましい。
【００３９】
アガロースをマトリックス培地として使用する場合、アガロースは３７℃において固体のままであることが好ましい。アガロースが冷却して固化した後、目的の受容体のモジュレーター化合物についてのアッセイを以下により開始する：
１）９６もしくは３８４ウェルネイルツールを用いて化合物を添加する；または
２）ビーズに光連結（ｐｈｏｔｏｌｉｎｋ）した化合物を、トレイ（細胞と混合された溶融基板中）に添加し、平板をＵＶ光に露光させて化合物をビーズから切断する。
【００４０】
化合物の添加によりアッセイを開始した後、細胞をアガロース中で所定時間（好ましくは約４〜６時間）インキュベートすることが好ましい。所定時間（同じく好ましくは約４〜６時間）後、Ｐａｃｋａｒｄ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）から入手可能なＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬（ルシフェラーゼ活性の検出のためにルシフェリンを含有する安定化発光系）を、平板の上に流し込み、アガロース中で細胞を溶解させ、アガロースにルシフェリン基質を浸透させる。従って、リポーター遺伝子の発現、およびリポーター遺伝子産物とマトリックス中のシグナル展開剤（例えば、ＬＵＣＩＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬）との反応により、指示薬を生成する。シグナルは、基板溶液の添加後少なくとも１８時間安定したままであることが認められた。シグナルは、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）から入手可能なＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラシステム、または約−２０℃をちょうど上回る温度まで冷却されたまたは冷却可能な任意のＣＣＤカメラを用いて検出する。
【００４１】
従って、シグナルは、基板の画像を獲得することにより検出できる。任意に、基板の画像は、基板からのシグナルをテレセントリックレンズを介してＣＣＤカメラチップ上に焦点を合わせることによっても獲得できる。シグナルの検出は、画像の数値化、画像に複数のグリッド単位を含むグリッドを重ねあわせ、およびシグナルの周囲の所定数のグリッド単位をそれぞれ走査して、所定数のグリッド単位内の各グリッド単位のグレイ強度値を平均化して平均グレイ強度値を決定することをさらに含み得る。グリッド単位に関して使用する「所定の数」という用語は、妥当な信頼性をもって平均グレイ強度値が決定できるグリッド単位（例えば、グリッド内の個々の箱または長方形）の任意の適切な数を指す。平均グレイ強度値は、所与のシグナルのｚ値を表す。任意に、方法は、基板上のシグナルのｘおよびｙ座標を記録することをさらに含むことができる。発光または他の光利用シグナルを画像化するのに適したソフトウェアパッケージが利用可能であり、ＲＯＢＯＩＭＡＧＥＴＭソフトウェアパッケージ（Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ， Ｉｎｃ．， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ， ＵＳＡ）、ＦＯＶＩＡ ＰＲＯＴＭアドインを含むＡＤＯＢＥ（登録商標）ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（登録商標）パッケージ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）、およびＩＭＡＧＥ ＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳパッケージ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ， Ｌ．Ｐ．， Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）が挙げられる。
【００４２】
バックグラウンドノイズを無くし、シグナルの同定および定量を容易にするために、シグナル特性に他の限定を任意に課してしてもよい。シグナル特性としては、直径、強度、真円度（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ）、凹凸性および体積が挙げられ、これらは以下に記載するように決定される。また、シグナルの体積および直径を増加または減少させて、グリッド中で利用可能な長方形の数と、個別のシグナルの数との対応付けを容易にしてもよい。例えば、ノイズ等を最小限にするために最小体積および直径を設定できる。オペレータはまた、トレイの可視的見分の際およびピクセルで直径を定義する際に、他のシグナルをマニュアルで加えることができる。
【００４３】
追加の例として、各シグナルを１ピクセル離れた一連の平行弦（ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｈｏｒｄ）にスライスすることにより体積を決定できる。体積は、各弦の下の面積の合計である。直径は、（４＊面積／π）の平方根として計算できる。強度は、体積を面積で割ったものとして計算できる。真円度は、４π／（直径×直径）として計算できる。凹凸性は、囲まれた小さい凸領域の最大凹み（ｉｎｄｅｎｔｉｏｎ）として定義できる。
【００４４】
細胞を採用した場合、様々な指示薬系も使用できる。例えば、ルシフェラーゼタンパク質をコードするベクターで大腸菌をトランスフェクトできる。この場合、所定のパターンにおける明暗を比較することにより、生物学的活性モジュレーションを検出する。さらに、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能な蛍光画像化プレートリーダー）システムを使用して、カルシウム移動を蛍光色素を介して検出できる。カルシウム蛍光系において、細胞により放出されるカルシウムは検出可能な蛍光に変化を与える。色素凝集／分散、細胞増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）、細胞複製、細胞死、およびそれらの組合せの検出が採用できる点で、細胞自体も指示薬として採用できる。
【００４５】
本発明のアッセイ法の細胞利用実施形態では、細胞を複数の標的でトランスフェクトできる。可能な範囲で、標的間の相互作用が避けられるように標的を選択する。さらに、非トランスフェクト対照細胞がアッセイに含まれて、細胞により発現される内因性分子に実際には関連する見かけ上の正の「ヒット」が排除できるようにする。
【００４６】
従って、一実施形態では、基板中に細胞を懸濁し、ＰＩＮツールアプローチを用いるか、または候補化合物とコンジュゲートしたビーズを細胞および基板と混合して、平板を形成できるトレイまたは他の適切な物に混合物を流し込むかして候補化合物を平板に配置する。細胞は、標的受容体を発現するのに加えて、リポーター遺伝子系も含んで、リポーター遺伝子の転写が候補化合物と標的受容体との相互作用に機能的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）に関連することが好ましい。異なる受容体が関連する異なるリポーター系を使用することも可能である。これは、一回の労力で複数の受容体のスクリーニングを可能にする。好ましい受容体としては、Ｇタンパク質共役型受容体が挙げられ、従って、異なる受容体と異なるリポーター遺伝子とを共役させることにより、異なる受容体との相互作用を同定することが可能である。より好適な実施形態では、一回の労力で全ての７ＴＭ受容体をスクリーニングする。
【００４７】
本発明のビーズ利用実施形態では、アンタゴニスト化合物がスクリーニングされることが好ましい。アンタゴニスト化合物をスクリーニングする際、アンタゴニスト化合物を含むビーズと混合した細胞をプレート化し、平板を固化させる。平板をＵＶ光に露光させて、所望または所定時間（例えば、１５、３０、４５または６０分）後、例えばアゴニストの溶液を平板上に流し込むことにより（ただしこれに限定されない）、受容体アゴニストを平板の表面に添加する。例えば上記記載したｚ値計算を用いて決定できる実質的にシグナルの無い領域は、候補化合物がアンタゴニスト活性を有する場合に認められる。
【００４８】
本発明のアッセイ法は、適切な受容体遺伝子構築物と組み合わせられた、任意の標的（イオンチャンネル、核受容体、キナーゼ、プロテアーゼなど）に対して適用できる。リポーター遺伝子産物の生成を駆動する転写応答エレメントの変動は、異なる種類の標的に応答を与える。上記したように、Ｇｓ、Ｇｉ／ＧｑまたはＧｑ連結ＧＰＣＲにそれぞれ応答するＣＲＥ−ルシフェラーゼ、ＧＡＬ４／Ｅｌｋ−１−ルシフェラーゼ、およびＮＦ−ＡＴルシフェラーゼ系は代表的なリポーター遺伝子系である。
【００４９】
ここで図１を参照すると、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のメラニン細胞は、色素応答特性を維持したまま様々な標的分子（例えば、膜貫通７ＴＭ標的分子（７ＴＭ））でトランスフェクトできる点で好ましい細胞である。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）メラニン細胞は、細胞内で顆粒化されたメラニンを転位させることで外部刺激に応答する。例えば、色素分散（ＰＤ）はアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）またはホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の活性化を介して影響され得る一方で、色素凝集（図１に示さず）はアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の阻害により生じる。メラニン細胞は、リガンド（Ｌ）を介したモジュレーションのために外来７ＴＭ受容体（７ＴＭ）と共役できる幅広い範囲のＧα−およびＧβγタンパク質（例えば、ＧｓおよびＧｑ（図１に示す）ならびにＧｉおよびＧｏ（図１に示さず））を含む。
【００５０】
本発明の一実施形態では、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）メラニン細胞をアッセイプレートの蓋上に流し込む。細胞は、蓋の表面全体を好ましくは完全に覆って、蓋上に細胞の平板または層を形成する。その後、メラトニンを細胞平板に添加することにより細胞中の色素を凝集させる。細胞平板を平らな表面上に置き、その後細胞平板上にアガロースを流し込み、プレートを４５分間据える。従って、アガロースは細胞平板上に層を形成し、本発明の一実施形態によれば、基板は、細胞層およびアガロース層の２層を含む。
【００５１】
その後、ＰＩＮツールもしくは他のツールを用いるか、または本明細書に記載するようにビーズを用いて候補化合物をアガロース層に装填し、プレートの画像を時間＝０に撮る。その後、特定の時間（すなわち以下に開示する評価のための所定または予め選択した時間）にわたって予め選択した間隔で画像を再記録する。
【００５２】
本発明のアッセイ法は、色素の変化（すなわち、色素分散または色素凝集）を誘導させることを図って、基板中のメラニン細胞により発現される標的に対する公知のリガンドに基板を浸することをさらに含み得る。実際、メラニン細胞アッセイでは、アンタゴニスト候補化合物およびアゴニスト候補化合物の両方が、スクリーニングする標的に応じて色素分散または色素凝集のいずれかを生じ得る。次いで、画像を記録する。これらのステップは、候補化合物の１つが公知リガンドと標的との相互作用をモジュレート（すなわち阻害または促進、作用または拮抗）するか否かを評価するために採用される。
【００５３】
細胞内色素分布（分散または凝集）の両方の状態とも検出し易いため、リガンド仲介型色素転位をモニターすることにより、７ＴＭ受容体を含む多数の受容体を調査できる。従って、組換えメラニン細胞は、薬剤発見調査のための有力なツールを提供し、本発明のアッセイにおける使用のために好ましい。好適な標的は、メラニン細胞中の同じシグナリング系（メラノソーム分散または凝集）と共役し、従って、組み合わせられた場合には、任意の一方の受容体の活性は、同じまたは異なる化合物による他方の受容体の活性化を妨害しない。
【００５４】
他の細胞系では、メラニン細胞に関して上述した手法と同じように、アンタゴニストをスクリーニングする。例えば、候補化合物を装填した後に、基板を、標的に対するリガンドと接触させてもよい。候補化合物はリガンドの存在下で標的と相互作用し、シグナルが検出される。シグナルは、標的とリガンドとの相互作用を候補化合物でブロックする際に指示薬により生成されるかまたは生成されない。従って、対照サンプルと比較したシグナル量に基づき、標的の生物学的活性のアンタゴニストとしての候補化合物により候補化合物が同定される。例えば、発光指示薬を含む基板における暗い領域は、発光遺伝子産物を発現するリポーター遺伝子が発現されていないことを示し得る。
【００５５】
ここで図４を参照すると、哺乳動物細胞（ＭＣ）においてルシフェラーゼの転写を駆動するＣＲＥ応答エレメントのＧＰＣＲ活性の模式図が示されている。図４に示すように、哺乳動物細胞（ＭＣ）は、形質膜（ＰＭ）、形質膜（ＰＭ）内に結合したＧタンパク質共役型タンパク質受容体（ＧＰＣＲ）、形質膜（ＰＭ）内で結合したアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥＢ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫ−Ａ）、およびベクター構築物（ＶＣ）を含む。ベクター構築物（ＶＣ）は、ＣＲＥモチーフＣＲＥｍ（ＴＧＡＣＧＴＣＡ−配列番号３）、最小プロモーター（ＭＰ）、およびルシフェラーゼリポーター遺伝子（ＬＲＧ）を含む。本発明のアッセイ方法の代表的な実施形態では、候補化合物アゴニスト（ＡＧＴ）は、哺乳動物細胞（ＭＣ）と接触し、形質膜（ＰＭ）結合Ｇタンパク質共役型タンパク質受容体（ＧＰＣＲ）と相互作用し、次にこれがＧタンパク質サブユニットＧαｓを介してアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）を活性化する。アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）と相互作用し、次にこれがその調節／触媒カスケード（ＲＥＧ−ＣＡＴ）を介してプロテインキナーゼＡ（ＰＫ−Ａ）および環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥＢ）と相互作用して、ベクター構築物（ＶＣ）の転写（ＴＳ）を活性化する。つまり、ベクター構築物（ＶＣ）中のルシフェラーゼリポーター遺伝子（ＬＲＧ）の転写（ＴＳ）および翻訳（ＴＬ）により、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）が生成される。本発明の好適な実施形態に関して本明細書に開示する細胞溶解およびシグナル展開剤の投与（図４において集合的にＣＬＡと称する）の後、光シグナル（ＬＳ）を検出する。
【００５６】
続けて図４を参照すると、Ｇαｉタンパク質の活性化により、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の阻害が生じる。従って、本発明によれば、フォルスコリン（ＦＫ）によるアデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の刺激の阻害を見ることでＧαｉ共役型受容体のアゴニストについてアッセイできる。本実施形態では、受容体を含む基板を、所望の時間（例えば、３０分間）１つまたは複数の候補化合物とインキュベートし、その後フォルスコリン（ＦＫ）を添加する。
【００５７】
無細胞アッセイ方法も本発明により提供される。「無細胞」という用語は、基板が細胞を含まず、標的、指示薬および候補化合物が基板内の反応培地中に提供されるか、または所定のパターンで基板上に装填されて、標的、候補化合物、指示薬またはその他の提供される試薬の間の相互作用が検出可能になることを意味する。無細胞アッセイの好ましい例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００５８】
「所定のパターン」という用語は、本明細書において、候補化合物と標的分子との相互作用により生成されるシグナルを位置決定して、候補化合物が標的を調節する能力を解析し易くする任意のパターンを便宜的に指すために使用される。
【００５９】
好適な実施形態では、所定のパターンは、基板上に長方形パターンの「スポット」または「接触」を含む。長方形パターンは、このようなパターンを構築するために市販されているツール（例えばＰＩＮツール）が使い易いために都合が良く、好ましい。しかし、本明細書に示す開示をレビューした後の当業者には明らかであろうが、特定のアッセイに適したいかなる所定のパターンも使用できる。従って、例えば、所定のパターンは、三角形、円形、台形、正方形、楕円形、または他の適切な幾何学的パターンを含み得る。さらに、以下に記載するように、「スポット」または「接触」のために利用可能な位置の全てを、本発明の所定のパターンにおいて採用する必要はない。候補化合物にコンジュゲートしたビーズも、所定のパターンに装填できる。
【００６０】
所定のパターンは、基板上の候補化合物「接触」または「スポット」を位置決定し易くし、特定の「接触」または「スポット」における候補化合物の同定を達成できる。好ましくは以下に開示する画像化ステップを使用して、所定のパターンを有する基板の画像を記録し、標的および指示薬におけるわずかな変化を検出する。長方形パターンの場合、本明細書に記載する画像化ステップにおいて、長方形グリッドパターンを基板上に重ねることが好ましい。長方形グリッドパターンは、候補化合物および関連する対照サンプルを基板上に堆積させるためのスポット位置に対応しかつそれらを提供し、その後それらの画像化を提供する、１，５３６の長方形をさらに含むことがより好ましい。応答を時間的に検出して、基板におけるサンプルの分散によるあらゆる影響を回避する。
【００６１】
好適な実施形態では、本明細書に記載するように自動化システムを用いて、候補化合物および対照を含む１，５３６の液体スポットを、基板上に所定のパターンで構築する。代替的な実施形態では、本明細書に記載するように自動化システムを用いて、候補化合物および対照を含む９，６００の液体スポットを、基板上に所定のパターンで構築する。従って、本発明の方法の一態様は、候補化合物をソースプレートもしくはレザーバーから移すために利用可能なピンの数の任意の所望の乗数、またはソースプレートもしくはレザーバーから移すために利用可能な候補化合物の数の任意の所望の乗数を所定のパターン内へ収容することである。乗数は、例えば、１〜２５（好ましくは２、４、８、１６、２０および２５を含む）の範囲でよく、例えば、４×９６＝３８４、４×３８４＝１，５３６；４×１，５３６＝６，１４４；および２５×３８４＝９，６００である。
【００６２】
別の代替的な実施形態では、１，２８０の候補化合物および３２の標準試料を基板にスポットする。本実施形態では、基板の右端または左端付近の８列を、参照標準として取っておき、参照標準と候補化合物とを比較し易くする。各列は、３２の可能性のあるスポット位置を含む。従って、１，５３６スポットの開始数から、８列（各列は３２スポット位置を含む）を引くと、候補化合物のために１，２８０のスポット位置の収容量が残る。少なくとも１つの空のスポット位置が各参照標準に垂直および平行の両方向で隣接するように参照標準も基板上に装填されて、同じく参照標準と候補化合物とを比較し易くすることが好ましい。従って、本明細書で使用する「所定のパターン」という用語は、候補化合物を装填するためのこのアプローチを含むことも意図する。
【００６３】
マニュアルシステムも採用できる。好ましいマニュアルシステムは、候補化合物および対照を含む３８４のサンプルと共に使用され得る。これらのサンプル数を考慮し、かつ複数の標的を一度にスクリーニングする選択肢を考慮すれば、本アッセイ方法のハイスループット態様が明らかになろう。実際、所望であれば、本発明の方法を用いて１日当たり３００，０００を超える化合物（対照を含む）がスクリーニングできると想定される。
【００６４】
本発明のアッセイは、治療的価値があると同定されたが、リードも（また存在すれば）多くの可能性のあるモジュレーターも同定されることなくに１００，０００を超える分子に対してスクリーニングされた生物学的標的をスクリーニングするためにも好ましい。
【００６５】
ＩＩＩ．アッセイシステム
ここで図２Ａ、２Ｂおよび３を参照すると（これらの図中、同じ参照符号は同じ構成要素を指す）、本発明のアッセイにおいて使用するのに好ましいシステム、および本発明のシステムにおいて採用する好ましい画像化技術に関連するフローチャートを図示している。
【００６６】
特に図２Ａを参照すると、本発明のシステムは参照符号１０で示されている。好適な実施形態では、システム１０は、中央処理装置（ＣＰＵ）１２、目的地プレート１４、プレートホルダ１６、プレート輸送器１８、走査ステージ２０、カメラ２２、アーム２４、ＰＩＮツール２６、ＰＩＮツール格納領域２８、洗浄ステーション３０、ファン３２およびソースプレート３４を備えている。アーム２４は、本明細書に記載する本発明の方法に従って候補化合物を基板上に堆積するために使用される複数のピンを有するＰＩＮツール２６を含む。場合によっては、システム１０は、インキュベーターをさらに備えていてもよく、洗浄ステーション３０はブロットステーション（図２Ａに示さず）をさらに備えていてもよい。
【００６７】
本発明の方法における使用に適したシステム１０の完全バージョンは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されており、ＳＡＧＩＡＮＴＭの商標の下で販売されている。適切なＰＩＮツールシステムは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されており、ＢＩＯＭＥＫ ２０００の登録商標の下で販売されている。ＰＩＮツールシステムは、３８４ウェルソースプレートから１，５３６スポット収容目的地プレートへ候補化合物を移すために使用することが好ましい。ＭＵＬＴＩＭＥＫＴＭ９６自動化９６チャンネルピペッタ（同じくＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能）を、９６ウェルソースプレートから３８４スポット収容目的地プレートへ候補化合物を移すために使用できる。
【００６８】
続けて図２Ａを参照すると、ＣＰＵ１２は、ＰＩＮツールシステム１０の全てのコンポーネントに対して適切な制御信号を計算および伝達する。制御プロトコールは、例えば、Ｔｃｌ言語で書き込まれたコンピュータプログラムファイルを使用して構築し、その後、市販されているＰＩＮツールシステムにより採用される制御ソフトウェア（例えば、本明細書で言及するＢＩＯＭＥＫ（登録商標）２０００システムに採用されるＢＩＯＭＥＫ（登録商標）、ＢＩＯＷＯＲＫＳＴＭおよびＢＩＯＳＣＲＩＰＴＴＭソフトウェア）により実行する。Ｔｃｌプログラムファイルは、ｘ、ｙおよびｚ座標を、機械語フォーマットでのシステム動作のための他の値と共に含む。従って、以下に記載するように、Ｔｃｌプログラムファイルは、ＣＰＵ１２に入力され、制御ソフトウェアに使用されて、ＣＰＵ１２により実行される命令を生成するための変数を提供する。従って、ＣＰＵ１２により受け取られる入力、構築される値および手順、ならびに制御される動作に対する言及は、ＣＰＵ１２が備える１つまたは複数の制御ソフトウェアプログラムによりおよびそれらを介して実行されるＴｃｌプログラムファイルを指すことが理解される。好適な実施形態では、本発明のアッセイにおいて使用するための２枚のアッセイプレートに堆積される候補化合物の４枚のソースプレートについて制御信号を処理する。
【００６９】
続けて図２Ａを参照すると、アーム２４およびＰＩＮツール２６のｘ、ｙおよびｚ座標での位置を、（ＰＩＮツール２６により分注および吸引される液体の量の包括値（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ｖａｌｕｅ）と共に）ＣＰＵ１２に入力する。ソースプレート３４の数を、各ソースプレート３４のｘおよびｙ面における位置と共にＣＰＵ１２に入力する。アーム２４およびＰＩＮツール２６の安全な移動高さ（すなわち、システム１０内の構造のクリアランスを促す高さ）は、ソースプレート３４の上部高さおよびソースプレートから化合物溶液を得るための吸引深さと共に、ＣＰＵ１２により実行されるＴｃｌプログラムファイルにより設定される。標準的な３８４ウェルソースプレート３４のための典型的な吸引深さは、約２６６ミリメートル（ｍｍ）である。
【００７０】
続けて図２Ａを参照すると、基板を支持し、プレートホルダ１６に担持される目的地プレート１４の位置は、目的地プレート１４の上部高さおよび堆積深さと共に、ｘおよびｙ面で設定される。目的地プレート１４は、本明細書に記載するように作成される目的地プレートでも対照プレートでもよい。３８４のピンを受けることができるプレート用の堆積深さは、９６のピンを受けることができるプレートと比べて、異なり得る。さらに、基板の足場としてアッセイプレートの蓋を採用する実施形態については、約２６７ ｍｍの深さを設定する。
【００７１】
続けて図２Ａを参照すると、洗浄ステーション３０のｘおよびｙ面における位置をＣＰＵ１２に入力する。各洗浄ステーション３０の深さは、同じであると想定し、従って洗浄ステーション３０のｚ値もＣＰＵ１２に入力される。ＰＩＮツール２６をアーム２４およびＣＰＵ１２からの制御信号を介して洗浄ステーション３０に移動するように洗浄手順を構築する。洗浄ステーション３０の位置を定義し、個々の洗浄ステーション３０の上部および下部位置ならびに洗浄浸漬の回数と共にＰＩＮツール２６の高さを得ることで、洗浄手順がＣＰＵ１２において構築される。採用する洗浄ステーション３０の数、および洗浄ステーション３０への上下サイクル（すなわち浸漬）の回数もＣＰＵ１２に入力する。ＰＩＮツール２６のピンが洗浄される回数に応じて、洗浄手順はループされる。例えば、３回の洗浄上下サイクルを使用する場合、洗浄手順は３回ループされる。次いで、ＰＩＮツール２６を、ＣＰＵ１２によりファン３２へ移動し、ファン３２のｘおよびｙ座標、ならびにＰＩＮツール２６が沿って移動する安全なｚ座標経路を用いて乾燥させる。
【００７２】
図２Ａを続けて参照すると、ソースプレート３４および目的地プレート１４のｘおよびｙ位置を、目的地プレート１４上に化合物を堆積するための深さと共に識別することで、化合物をソースプレート３４から目的地プレート１４に移すための手順をＣＰＵ１２において構築する。ソースプレート３４および目的地プレート１４の間の移動は、適切な座標を用いてＣＰＵ１２により制御される。特に、ソースプレート３４のｘおよびｙ座標を、ＰＩＮツール２６の安全なｚ座標と共に使用する。さらに、目的地プレート１４のｘおよびｙ座標を、ソースプレート３４から目的地プレート１４へ化合物を分注するのに適したＰＩＮツール２６の深さと共に得る。好適な実施形態では、液体候補化合物サンプルは、目的地プレート１４上の基板の表面に接触するが、ＰＩＮツール２６は基板に接触しない。
【００７３】
ここで図２Ａおよび２Ｂを参照すると、好適な実施形態では、化合物移動プロトコールを、目的地プレート１４の四分区間Ｑ１〜Ｑ４に対して繰り返す。四分区間Ｑ１〜Ｑ４は、本質的に正方形または長方形であり、実質的に同じ大きさである。アーム２４は、ＣＰＵ１２により制御されて、四分区間Ｑ１において第１のセットのピン接触が生じ；四分区間Ｑ２において第２のセットのピン接触が生じ；四分区間Ｑ３において第３のセットのピン接触が生じ；四分区間Ｑ４において第４のセットのピン接触が生じるようにする。本実施形態では、各セットのピン接触は３８４の別々のピン接触から構成され、つまり１，５３６の接触が四分区間Ｑ１〜Ｑ４において得られる。従って、個々のピンの接触により所定のパターンが得られる。アーム２４もＣＰＵ１２により制御され、四分区間Ｑ１〜Ｑ４の接触の合間に、ＰＩＮツール２６のピンが洗浄ステーション３０で洗浄され、ファン３２で乾燥され、洗浄後かつ目的地プレート１４のそれぞれの接触の前にＰＩＮツール２６のピンがソースプレート３４と連絡するようにする。化合物移動および洗浄手順は、全ての所望の化合物がソースプレート３４から目的地プレート１４に移動されるまで必要に応じて繰り返される。
【００７４】
図２Ａのみを続けて参照すると、化合物移動および最終洗浄を終了した後、ＰＩＮツール格納領域２８のｘおよびｙ座標をＰＩＮツール２６の安全なｚ座標と共に用いて、ＣＰＵ１２によりＰＩＮツール２６が格納領域２８に戻される。ソースプレート３４、目的地プレート１４、格納位置２８、洗浄ステーション３０、ファン３２のｘ、ｙおよびｚ位置のために設定された変数は、ＣＰＵ１２において設定を外されるため、システム１０をその後の適用において使用できる。
【００７５】
図２Ａを続けて参照すると、化合物移動後に、目的地プレート１４を輸送器１８を介してまたはマニュアルで走査ステージ２０にすぐに移動させる。開口Ｆ２２に対して約６０ ｍｍの焦点長さに設定されたか、またはそれ以外に適切に設定されたレンズを有するＣＣＤカメラ２２（例えば、Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から入手可能なＭｏｄｅｌ １４）を用いて、予め選択された間隔（例えば５分）で画像を回収する。同じく使用できる代表的なカメラとして、ＳＤＲ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｏｖｅ， Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のＭＩＣＲＯＭＡＸＴＭの商標の下で販売されているデジタルＣＣＤカメラがある。別の代表的なカメラシステムは、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）から入手可能なＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラシステムである。
【００７６】
図２Ａを続けて参照すると、複数の獲得（例えば５フレーム）の平均として画像を記録する。画像回収の間、追加セットのプレート１４を走査ステージ２０に加えることができる。テストおよび対照目的地プレート１４は、任意の順番により走査され得るが、走査ステージ２０において交互に走査されることが好ましい。一旦画像を最終セットのテストプレートについて最終（例えば３０分）時点まで記録したら、走査過程を停止し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）オペレーティング・システムにおける「全てを閉じる」機能を用いるなどして全ての画像を閉じる。記録された画像は、以下に記載するようにＣＰＵ１２により処理される。
【００７７】
ここで図３を参照すると、本発明のシステム１０において使用する画像化プロトコールを、概して１１０として参照する。ボックス１１２では時間＝０にてテストおよび対照プレートについて画像を回収し、続いてボックス１１４では予め選択した第１の間隔（例えば５分）でテストおよび対照プレートについて画像を回収する。図３のボックス１１６は、２００／ミリ秒（ｍｓ）を開始点として使用し、１枚のテストプレートおよび１枚の対照プレートを用いて、最大グレイスケール（本明細書において８ビット画像のグレイ強度またはグレイ強度スケールとも称する）の約８０％のｚ値を得ることによる、露光時間の最適化を描く。ｚ値は、０〜２５５にわたる８ビット画像のグレイスケールを指す。暗いスポットについて８ビット画像の最大グレイスケールの約８０％のｚ値を設定することで、画像を「ホワイトアウト」となるまで露光させ過ぎることを回避でき、より簡単に検出可能な差が得られる。従って、グレイスケール値が０〜２５５にわたる場合、約２００のｚ値が得られるように露光を設定する。光スポットについては、ｚを最小グレイスケールの約２０％上に設定する。
【００７８】
従って、基板の画像を獲得することにより、シグナルを検出できる。任意に、基板の画像は、基板からのシグナルをテレセントリックレンズを介してＣＣＤカメラチップに焦点を合わせることによっても獲得できる。この場合、シグナルの検出は、画像を二値化すること、画像上に複数のグリッド単位を含むグリッドを重ねること、およびシグナルの周囲にある所定数のグリッド単位をそれぞれ走査し、所定数のグリッド単位にある各グリッド単位のグレイ強度値を平均化することにより平均グレイ強度値を決定することをさらに含み得る。グリッド単位に関して使用する「所定数」という用語は、妥当な信頼性をもって平均グレイ強度値を決定できる任意の適切な数のグリッド単位（例えば、グリッド内の個々の箱または長方形）を指す。任意に、本方法は、基板上のシグナルのｘおよびｙ座標を記録することをさらに含むことができる。
【００７９】
図３を続けて参照すると、ボックス１１８は、所定の合計時間（例えば３０分間）にわたり追加の予め選択された間隔（例えば５分）で画像を回収することを提供し、ボックス１２０は、画像を適切な見出し（「未加工画像」など）をつけて保存して経路およびファイル名を構築することで全ての画像を保存することを提供する。ファイル名形式は、以下のように設定できる：Ｍｒｘ＿ｄａｔｅ（月／日／年）Ａ（その日の最初の実験）。ここで、ｘはその日にスクリーニングされる標的の数と等しいか、またはｘは標的の名前に等しい。
【００８０】
図３を続けて参照すると、ボックス１２２では、走査されたテストプレート上のスポットの０分時画像を、３０分時画像から差引いてコントラストを高める。ボックス１２４では、１，５３６の長方形グリッドを加えてピン接触を識別し、ボックス１２６では、オペレータコマンド（好ましくは「スポット検索」コマンド）を可能にすることでピン接触または「スポット」を識別する。ボックス１２８では、スポット特性に対して限定を課して、バックグラウンドノイズを無くし、スポットの同定および定量を容易にする。スポット特性としては、直径、強度、真円度、凹凸性および体積が挙げられ、これらは以下に記載するように決定される。また、スポットの体積および直径も増加または減少させて、グリッド中で利用可能な長方形の数と、スポットの数との対応付けを容易にしてもよい。例えば、ノイズ等を最小限にするために最小体積および直径を設定できる。ボックス１３０は、「スポット検索」コマンドによりいずれかのスポットが抜かされた場合（すなわち、図３においてＹとして示されている「Ｙｅｓ、スポットが抜かされた」）、ボックス１３２において、プレートの可視的見分およびピクセルでの直径を定義して円を加える際に、オペレータはマニュアルでスポットを加えることができる。抜かされたスポットが無い場合（図３においてＮと称する）、画像化は直接ボックス１３４に進む。
【００８１】
図３を続けて参照すると、ボックス１３４ではテストおよび対照プレートから得た画像を比較し、ボックス１３６では１，５３６の長方形を含むグリッドをプレートの画像の上にかけ、必要に応じて画像を回転させ、グリッドを用いてピン接触を整列させ、グレイスケールを設定してコントラストを改善することで、正の「ヒット」を識別する。プレートを画像化し、グレイスケールを調節し、テストプレート内の標的のモジュレーター化合物についての正のヒットの閾値レベルを設定する。テストプレート上の正のスポットは分析し、テストおよび対照プレートの両方で見とめられたスポットは内因性ヒットと見なされそれ以上分析しない。ボックス１３８では、１，５３６の長方形を含むグリッド中でのヒットの位置を、その位置に堆積された候補化合物と相関させることで、正の「ヒット」を同定する。ボックス１４０では、画像を、適切なファイルに保存するか、または任意に光ディスクもしくはＣＤにアーカイブとして保存する。ボックス１４２では、画像情報を、適切なワードプロセッシング、スプレッドシート、または他のソフトウェアにエクスポートして、編成および提示する。
【００８２】
好適な実施形態では、各スポットを１ピクセル離れた一連の平行弦にスライスすることにより体積を決定できる。体積は、各弦下の面積の合計である。スポットの直径は、（４＊面積／π）の平方根として計算できる。強度は、体積を面積で割ったものとして計算できる。真円度は、４π／（直径×直径）として計算できる。凹凸性は、囲まれた小凸領域の最大凹みとして定義できる。
【００８３】
全ての未使用の画像を、３０分よりも長くメモリ内にある画像と同様に削除する。次いで、カメラ／プレート制御および画像化手順を上述したように作動させる。ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）オペレーティング・システムで駆動される適切なコマンドを備えることができる（「ファイル」、「開く」および「画像化」など）。「参照」という用語は、メモリから参照画像を選択することを可能にする。
【００８４】
ＩＶ．　実験例
以下の実験例は、本発明の好適なモードを例示するために含まれる。以下の実験例の特定の態様は、本発明を実施する上で上手く作用すると本発明者らが考えるまたは意味する技術および手順に関して記載する。これらの実験例は、本発明者らの標準的な実験実践を用いて例証されている。本開示および当該分野の一般的技術レベルを考慮して、当業者は、以下の実験例が例示だけのものであり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多数の変化、改変および変更が採用され得ることを理解するであろう。
【００８５】
実験例１〜６で使用する材料および方法
標的をコードするベクター
トランスフェクトする各標的について、Ｇｒａｍｉｎｓｋｉ， Ｇ．Ｆ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９３） ２６８：５９５７−５９６４に記載されるｐＪＧ３．６ベクター（または他の適切なベクター）に入ったｃＤＮＡを得る。いくつかの受容体を同時にトランスフェクトする場合、ストック溶液の最適濃度は通常５〜１０ ｍｇ／ｍＬの範囲とする。また、化合物セットに対してスクリーニングを開始する前に、化合物セット全体を完了するのに十分な標的コードｃＤＮＡを手元に有することが推奨される（３００Ｋ化合物セットには、受容体に応じて典型的には１０〜２０ ｍｇとする）。
【００８６】
他の材料および試薬
ＣＦＭ：繊維芽細胞（またはカエル）ならし培地。
【００８７】
０．７×トリプシン／ＥＤＴＡ：Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログ番号２５３００−０５４（１×ストックとして購入）。
【００８８】
０．７×ＰＢＳ（ｐＨ ７．３）：１０×ストック（８０ ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１１．５ ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．０ ｇ／Ｌ ＫＣｌ）として調製。
【００８９】
０．７×エレクトロポレーション用等級のＰＢＳ（ｐＨ ７．０）：ｐＨがｐＨ ７．０に調節されること以外は、上記ＰＢＳと同様。
【００９０】
０．７×Ｌ１５／０．１％ ＢＳＡ：カタログ番号Ｂ２７９９、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。
【００９１】
ＤＭＳＯ：カタログ番号Ｄ８７７９、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。
【００９２】
メラトニン：カタログ番号Ｍ５２５０、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。
【００９３】
８００ ｍＬエレクトロポレーションキュベット：モデル番号５８０１７−９００、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。
【００９４】
２２５−ｃｍ３組織培養フラスコ：モデル番号３０００、Ｃｏｓｔａｒ（Ｏｎｅｏｎｔａ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００９５】
１５ ｍＬおよび５０ ｍＬ円錐形遠心管。
【００９６】
エレクトロポレーター：ＥＬＥＣＴＲＯ ＣＥＬＬ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲＴＭ、モデルＢＴ ６００、ＢＴＸ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【００９７】
遠心分離機：ＳＯＲＶＡＬＬ ＲＴ６０００ＤＴＭ、Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｎｅｗｔｏｎ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）。
【００９８】
ＳＥＡＰＬＡＱＵＥ（登録商標）アガロース：カタログ番号５０１０１、ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。
【００９９】
蓋（ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥの登録商標の下で販売されているアッセイプレート用）：参照番号ＳＰＯ−１６１１８１、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＮａｐｅｒｖｉｌｌｅ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。
【０１００】
ＢＳＡ（Ｌ１５無し）：カタログ番号Ｌ−５５２０、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。
【０１０１】
実施例１
一過性受容体発現のためのメラニン細胞のエレクトロポレーション
トリプシン処理の１〜２時間前に、４０ ｍＬの新鮮な繊維芽細胞（またはカエル（ｆｒｏｇ））ならし培地（ＣＦＭ）を、トランスフェクトするメラニン細胞の２２５ ｃｍ３フラスコに入れる。各フラスコを、５ ｍＬ ０．７×ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で洗浄し、吸引する。５ ｍＬ ０．７×トリプシン／ＥＤＴＡを各フラスコに添加し、３〜５分間放置する。フラスコを振って細胞を動かし、１０ ｍＬ ＣＦＭを各フラスコに添加する。
【０１０２】
各フラスコの内容物を５０ ｍＬ円錐形遠心管に移す。９００ ｒｐｍで５分間室温にてスピンさせる。培地を吸引し、ＣＦＭを用いてペレットを１本の５０ ｍＬ円錐形遠心管にプールする。細胞を数えて、所与の濃度を得る。該管を９００ ｒｐｍにて５分間スピンさせる。ＣＦＭを吸引し、４０ ｍＬ ０．７×ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に再懸濁させる。９００ ｒｐｍにて５分間スピンさせる。ＰＢＳを吸引し、ペレットを冷たいエレクトロポレーション勾配０．７×ＰＢＳ（ｐＨ ７．０）に最終濃度１５×１０６細胞／ｍＬまで再懸濁させる。８００μＬ再懸濁細胞を、ｃＤＮＡの混合物を含む冷たい遠心管に加える。氷上で２０分間インキュベートし、インキュベーションの間にゆるやかに２回混合する。
【０１０３】
ｃＤＮＡ／細胞溶液を、冷たい８００μＬエレクトロポレーションキュベットに移す（泡が入らないように）。５００Ｖ、６２５ ｍＦ、７２０Ωでエレクトロポレートする。パスツールピペットを用いて、エレクトロポレートされた細胞をすぐに３０〜４０ ｍＬのＣＦＭに移す。最終濃度を４５ ｍＬ ＣＦＭとして、細胞を２２５ ｃｍ３フラスコに入れる（１つのフラスコにつき２つのキュベット）。細胞を、平らな作業台に約３時間置く。培地を吸引し、新鮮なＣＦＭに置き換える。細胞をインキュベーターに約２４時間置く。
【０１０４】
実施例２
細胞プレートの作成（２日目）
各フラスコを５ ｍＬ ０．７×ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で洗浄し、吸引する。５ ｍＬ ０．７×トリプシン／ＥＤＴＡを各フラスコに添加し、２〜３分間放置する。フラスコを振って細胞を動かし、１０ ｍＬ ＣＦＭを各フラスコに添加する。各フラスコの内容物を５０ ｍＬ円錐形遠心管に移す。９００ ｒｐｍで５分間室温にてスピンさせる。培地を吸引し、ＣＦＭを用いてペレットを１本の５０ ｍＬ円錐形遠心管にプールする。細胞を数える。３０，０００細胞／１００μＬ／ウェルで１枚の９６ウェルプレート（品質管理用）を作成するために十分な細胞を採取する。以下に記載するようにスクリーンプレートを作成する。
【０１０５】
残った細胞を、１本の管につき２７ ｍＬ ＣＦＭ中に約１〜１０×１０６の細胞が含有されるように５０ ｍＬ円錐形管に分ける。逆さにして管を混合する（ただし、可能であれば泡を作らないようにすること）。１つの管からアッセイプレートの蓋に細胞をゆるやかに流し込む（細胞は蓋の表面全体を完全に覆うことが好ましい）。今しがた装填した蓋の上に次に装填される蓋を置く。
【０１０６】
全ての管が空になるまで上記手順を繰り返す。最後に装填された蓋の上に空の蓋を置く。対照細胞（例えば、ＰＴＨ１−３−３０細胞）を用いて上記ステップを繰り返し、同じ枚数のアッセイプレートの蓋および１枚の９６ウェルプレート（品質管理用）を作成する。蓋およびプレートを平らな作業台に周囲温度（例えば２５℃）にて約２時間放置する。蓋および９６ウェルプレートを気密容器に入れ、インキュベーターに一晩（約１５〜２４時間）入れる。
【０１０７】
実施例３
品質管理プレート（３日目）
５ ｎＭメラトニンを含有する５０ ｍＬのメラニン細胞アッセイ緩衝液を調製する。ペプチド（スクリーニングする受容体に対する天然リガンド）を以下のように連続希釈する：各ペプチドの１００μＭストックの２μＬアリコートを、別々の１．５ ｍＬ遠心管に移す。９９８μＬメラニン細胞アッセイ緩衝液／５ ｎＭメラトニンを各管に添加し、渦流させる。それぞれ２０μＬを、９６ウェル丸底プレートの別々のウェルに移す（第１のペプチドを９６ウェルのウェルＡ１に、第２のペプチドをウェルＡ２に．．．）。１８０μＬメラニン細胞アッセイ緩衝液／５ ｎＭメラトニンを、これら同ウェルに添加する。１３７μＬを、上で２０μＬを移したのと同じだけ９６ウェルプレート上のウェルＢ１〜Ｂ８、Ｂ２〜Ｂ８．．．に添加する。行Ａを混合する。６３μＬを、行Ａから行Ｂに移して混合する。６３μＬを、行Ｂから行Ｃに移して混合する。この連続希釈をプレート全体にわたり続ける。
【０１０８】
上記希釈を終了した場合の作業用濃度（２×）は以下の通りである：
行Ａ　　２０ ｎＭ　　　　　　　 行Ｅ　　２００ ｐＭ
行Ｂ　　６３２ ｎＭ　　　　　　　行Ｆ　　６３．２ ｐＭ
行Ｃ　　２ ｎＭ　　　　　　　　行Ｇ　　２０ ｐＭ
行Ｄ　　６３２ ｎＭ　　　　　　　行Ｈ　　６．３２ ｐＭ
対照９６ウェルプレートからＣＦＭを吸引する。５ ｎＭメラトニンを含有する５０μＬ ０．７ Ｌ１５／０．１％ ＢＳＡ緩衝液を添加する。プレートを１〜２時間室温にて放置する。ＳＬＴ ＳＰＥＣＴＲＡ（登録商標）プレートリーダー（Ｋｏｌｌｍｏｒｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手可能）上でプレートを読み取る。連続希釈プレートから５０μＬを各ウェルに添加する。１時間インキュベートする。ＳＬＴ ＳＰＥＣＴＲＡ（登録商標）プレートリーダー上でプレートを読み取る。
【０１０９】
実施例４
化合物を受ける細胞プレートの作成（３日目）
１．２５ ｇのＳＥＡＰＬＡＱＵＥ（登録商標）アガロースを、重い１２５ ｍＬ囲い付き瓶（１２５ ｍＬ ｈｅａｖｙ ｗａｌｌｅｄ ｂｏｔｔｌｅ）に計り分ける。１００ ｍＬのＬ１５（リーボビッツ）培地（ＢＳＡ無し）を添加し、ＬＯＷ設定で約１５〜１８分間キャップを外して電子レンジで加熱する。最終溶液は、アガロースの完全な溶解を透明な溶液として示す。これを４２℃に予め加熱した水浴に入れる。２または４ ｍＬのアガロースを５０ ｍＬポリプロピレン管に入れ、それらを４２℃の水浴で保つ。管の数は、作成するプレートの数に等しいはずである。
【０１１０】
１８ ｎＭメラトニンを含有する２００ ｍＬの室温０．７×Ｌ１５／０．１％ ＢＳＡを調製する。上で作成した蓋上の培地を（１つずつ）注意深く流し、過剰量の培地を除去し、蓋を平らな表面に置く。ピペットで、１０ ｍＬの０．７×Ｌ１５／０．１％ ＢＳＡ／１８ ｎＭメラトニンを、２ ｍＬアガロースを含有する５０ ｍＬ管の１つに移すか（好ましい方法）、または８ ｍＬの０．７×Ｌ１５／０．１％ ＢＳＡ／１８ ｎＭメラトニンを、４ ｍＬアガロースを含有する５０ ｍＬ管の１つに移す。ピペットを攪拌棒として使用しながら、０．７×Ｌ１５／０．１％ ＢＳＡ／１８ ｎＭメラトニンを分注する。
【０１１１】
その直後に、１２ ｍＬ混合物をアッセイプレート蓋に、蓋の底全体が確実に覆われるように注意深く流し込む。全ての泡を乾燥した針でつぶす。上記ステップを各プレートについて繰り返す。アッセイプレート蓋を室温にて４５分間放置する。４５分後、アッセイプレート蓋を、化合物添加時まで保存するために、９５％加湿インキュベーター（２４℃）に入れる。これらのプレートは１２時間までは有効であるはずである。
【０１１２】
実施例５
候補化合物ソースプレートの作成
トランスフェクト細胞を含有する作成された蓋のそれぞれについて、液体候補化合物サンプルを含む４枚の３８４ウェルソースプレートを冷凍庫から出す。プレート上に蓋およびシールがあれば取る。プレートを４枚のスタックにして置く（プレートは、例えば実行する順番およびプレート番号の順番など、順番通りに保たれなければならない）。メラニン細胞アッセイ緩衝液に入った十分な１μＭαＭＳＨを調製して、４枚目の薬剤プレート毎に１０μＬ／ウェルで２列に入れる。これらの列は、テストプレートに対する対照サンプルを提供する。
【０１１３】
１０μＬの上記参照１μＭαＭＳＨ溶液を、各スタックの上にある全ての３８４ウェルプレートの列２２および２４にピペットすることで、プレートをマーキングする。１μＭαＭＳＨを入れられた各プレートの端をＳ（標準）でマーキングする。１０μＬの上記１μＭαＭＳＨ溶液を、各スタックの底にある全ての３８４ウェルプレートの列２１および２３にピペットして、１μＭαＭＳＨを入れられた各プレートの端をＳでマーキングすることによってもプレートをマーキングできる。つまり、４枚のスタック毎に１枚のプレートがαＭＳＨを含んでいるはずである。いかなる時もプレートの順番が確かに変わらないようにする。
【０１１４】
実施例６
化合物移動およびアッセイ
Ｂｅｃｋｍａｎ ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）２０００システムを使用し、４枚の異なる３８４ウェルソースプレートからのテスト化合物を、ＢＩＯＭＥＣＫ（登録商標）高密度複製（ＨＤＲ）ＰＩＮツール（Ｂｅｃｋｍａｎ部品番号２６７６１８−３８４ ＨＤＲ）を用いて２枚のメラニン細胞含有基板に移す。ＨＤＲ ＰＩＮツールは、３８４の浮動性ピン（柱（ｐｏｓｔ）またはネイルのいずれか）を含む。柱は、各化合物を約５０〜７０ ｎＬ移す；ネイルは１０〜３０ ｎＬ移す。化合物移動のためのプログラムはツールコマンド言語（Ｔｃｌ）で書き込まれており、これは、Ｂｅｃｋｍａｎ ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）システムのアームのｘ、ｙおよびｚ動作のためのｘ、ｙおよびｚ座標を提供する。全てのプレートをプレートホルダの右後ろに配置する。
【０１１５】
洗浄ステーションに５０ ｍＬ ＤＭＳＯ、５０ ｍＬ水および６０ ｍＬエタノールを装填して、ピンを十分に濯いだ。洗浄ステーションは、レザーバーの内部に二倍の厚さのペーパータオルを有するブロッティングステーションも含んでいる。全てのプレートを、プレートホルダの後ろかつ右側に配置する。テストプレートへの移動は順番通りである（図２Ｂも参照）：
１　　３
２　　４
メラニン細胞により発現される７ＴＭ受容体のＧｓ／Ｇｑアゴニストについては、時間経過と共に、ＨＤＲピン接触の直下で、暗いスポットがグレイ細胞平板上で発達した。上述したようにＣＣＤカメラ走査ステージ設定（画像ステーション）を用いて画像を５分間隔で回収した。画像回収および分析は、表１の走査ステージレイアウトに従って実施する。
【０１１６】
【表１】
2004503249.tif 000002
一旦最終セットのテストプレートについて３０分時点まで画像を記録したら、過程を停止し、画像化システムの「全て閉じる」コマンドを用いて全ての画像を閉じる。
【０１１７】
実施例７〜１０
哺乳動物平板リポーターアッセイ
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、６×ＣＲＥ−ルシフェラーゼ＋リポーター遺伝子でトランスフェクトさせた。安定した宿主細胞系を選択し、その中にクローニングされたヒト受容体を入れてトランスフェクトさせた。これらの受容体を発現する安定した細胞系を、スクリーニング目的のために選択した。
【０１１８】
実施例７〜１０で採用する材料
Ｔ−２２５組織培養フラスコ（＃３００１）は、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｓｅｔｔｓ）から得た。ＤＭＥＭ／Ｆ１２（＃３１１０３９−０２１）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（＃１６１４０−０７１）、Ｌ−グルタミン（＃２５０３０−０８１）、０．０５％トリプシン（＃２５３００−０５４）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（＃４１９０−１４４）、およびＬＭＰアガロース（＃５５１７ＵＢ）は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）から購入した。ＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３０１培地（＃１４３３１−７９Ｐ）は、ＪＲＨ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ， Ｋａｎｓａｓ）から得た。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイキット（＃６０１６９６５）は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）から購入した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から得た。ヒトＧＬＰ−１（７−３６）（＃６７９５）およびヒトＣＲＦペプチド（１−１４）（＃２４３５）は、Ｂａｃｈｅｍ（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から得た。４−Ｌ−ノルロイシン−７−Ｄ−フェニルアラニン−アルファメラニン細胞刺激ホルモン（［ＮＤＰ］−αＭＳＨ、＃８７６４）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から得た。透明および乳白色のＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイ（上記開示したようにＨＤＲピンツールを収容するためにフットプリントを変えた）は、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．から購入した。９６の０．０１５インチ直径移動ピン（＃６０９０８９）を有する高密度複製（ＨＤＲ）ツールは、Ｂｅｃｋｍａｎ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。ＡＢ−Ｍ Ｈ−１０００電源ボックスおよびＡＢ−Ｍ露光制御により制御されるＵＶ灯は、ＡＢＭ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。ＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラは、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）から得た。
【０１１９】
実施例７
複数受容体アッセイ
リポーター遺伝子およびＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の両方を発現する細胞系を、アガロース平板フォーマットでのアゴニストに対する応答についてアッセイした。ＧＰＣＲを発現する細胞を単独でプレート化し、異なるＧＰＣＲを発現するいくつかの細胞系を混合して、いくつかの受容体に対するアゴニストが同時にアッセイできるか否かを評価した。
【０１２０】
ルシフェラーゼの発現を駆動する６つの環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）（６×ＣＲＥ−ルシフェラーゼ＋）を含むリポーター構築物を安定して発現するリポーター遺伝子宿主細胞系を、Ｇｏｅｔｚら （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ５：３７７−３８４に記載されるように作製した。メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６５６３４）および副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体（ＣＲＨＲ１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ７２３０４）の完全長ｃＤＮＡを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により得て、発現ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にサブクローニングした。ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１００３７）の完全長ｃＤＮＡを、Ｄｒ． Ｊｏｓｅｐｈ Ｄｉｌｌｏｎ（Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供してもらい、ｐＣＤＮＡ３にサブクローニングした。ＭＣ１Ｒ、ＣＲＨＲ１またはＧＬＰ−１受容体を発現する安定したＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞系を、Ｇｏｅｔｚら， （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ５：３７７−３８４に記載されるエレクトロポレーションにより作製した。安定発現細胞系を、Ｔ−２２５組織培養フラスコに入った完全培地（５％ＦＢＳおよび２ ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で増殖させた。
【０１２１】
アッセイの３日前に、０．０５％トリプシンを用いて細胞を回収し、１〜３×１０５細胞／ｍｌの濃度で５％ＦＢＳおよび２ ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３０１培地中で洗浄および再懸濁した。細胞懸濁液を、スピンフラスコに入れ、組織培養インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２にて懸濁液中で増殖させた。アッセイの１８時間前に、細胞を、遠心分離により懸濁液から取り出し、５×１０５〜１．５×１０５細胞／ｍｌの濃度で２ ｍＭ グルタミンを含有する無血清含有ＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３０１培地中に再懸濁させた。
【０１２２】
１．５グラムのＬＭＰアガロースを、電子レンジで１００ ｍｌのアッセイ培地（２％グルタミンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に溶解した。アガロースは、使用時まで４７℃の水浴に入れた。細胞を懸濁培養液から回収し、６０ ｍｌのアッセイ培地に再懸濁させて、細胞量を決定した。次いで、細胞懸濁液を、２．５×１０７細胞／６ ｍｌの最終濃度までさらに希釈した。６ｍｌの細胞懸濁液および溶融アガロースを、１：１ｖ／ｖで混合し、その直後に混合物を白色ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイに流し込んだ。平板において３つの細胞系を混合した実験において、各細胞系について濃度は２．５×１０７細胞／２ ｍｌであり、細胞系を合わせた際には合計６ ｍｌの細胞懸濁液を得た。次いで、細胞のアガロース平板を、室温にて凝固させた。
【０１２３】
その後、約１０ナノリットル（ｎｌ）の溶液を送達するＨＤＲ ９６ピンツールを用いて、ペプチド溶液を平板に送達した。ペプチドの添加後、平板を、３７℃、５％ ＣＯ２にて組織培養インキュベーター中で４時間インキュベートする。１０ ｍｌのＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬および１ ｍＭ ＣａＣｌ２／１ ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳの１：１混合物を各ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイに室温にて抑制的光条件下で添加した。１０分後、アガロース平板の上部にある過剰量の液体を除去した。ＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラを用いて発光を検出した。
【０１２４】
ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイからの発光を、テレセントリックレンズを介してＣＣＤカメラチップに９０秒間焦点を合わせることで画像を獲得した。二値化画像を、コンピュータにダウンロードして、ＲＯＢＯＩＭＡＧＥＴＭ画像分析ソフトウェアパッケージを用いて画像分析した。簡単に言うと、５０×７５細胞グリッドを、画像の上に重ねて、平均グレイ強度値グリッド単位をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥＸＣＥＬ（登録商標）スプレッドシートに転送した。グレイ強度は、各グリッド単位を走査して、領域における最も高い点がどこに位置するかを決定することにより決定した。周囲の９つのグリッド単位を平均化し、これが所与の発光シグナルのｚ値を表す。ｘおよびｙ座標を記録して、データのグラフ図を作成し易くした。
【０１２５】
［ＮＤＰ］−αＭＳＨ（１−１３）、ＧＬＰ−１（７−３６）およびＣＲＨ（１−４１）に対する、ＭＣ１、ＧＬＰ−１またはＣＲＨ１受容体を発現するＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞の応答を、図５Ａ〜７Ｂに示す。図５Ａ、６Ａおよび７Ａは、溶液含有ペプチドが送達された平板の表面の位置から発せられる発光の画像を示す。行１、２および３（プレートの上から下）はそれぞれ、［ＮＤＰ］−αＭＳＨ、ＧＬＰ−１およびＣＲＨについての濃度曲線を含む。（左から右に）５×１０−４ Ｍ、１．５×１０−４ Ｍ、５×１０−５ Ｍ、１．５×１０−５ Ｍ、５×１０−６ Ｍおよび１．５×１０−６ Ｍペプチドを含有する約１０ナノリットル（ｎｌ）の溶液を、ＨＤＲピンツールを用いて、アガロース平板の表面に分注した。発光活性の濃度−応答曲線は、適切な受容体を発現する細胞系にペプチド（例えば、ＧＬＰ−１受容体を発現する細胞系に対してはＧＬＰ−１ペプチド）を適用した場合にのみ認められた。ペプチドの大きさが大きくなると発光面積は小さくなり、これは、より大きいペプチドの拡散が低いことによるものかもしれない。
【０１２６】
図５Ｂ、６Ｂおよび７Ｂは、各ペプチドの濃度曲線の線グラフである。ペプチドを送達した領域のｚ値から平板のバックグラウンドｚ値を引くことで応答値を計算した。これらのデータは、ＧＰＣＲアゴニストについてのアッセイにおけるＧＰＣＲおよびリポーター遺伝子構築物の両方を安定して発現する細胞系の平板フォーマットの使用を裏付ける。
【０１２７】
図８Ａおよび８Ｂは、ＭＣ１、ＧＬＰ−１またはＣＲＨ受容体を発現する３つの安定した細胞系を共に混合することで得られるデータを示す。細胞混合物で得られた濃度−応答曲線データは、図５Ａ〜７Ｂに示すデータに非常に類似していた。従って、ＧＰＣＲアゴニストについての同時アッセイのために、リポーター遺伝子およびＧＰＣＲを発現する安定した細胞系を平板フォーマットにおいて混合できる。
【０１２８】
実施例８
ビーズ利用型アッセイ
光リンカー（ｐｈｏｔｏｌｉｎｋｅｒ）によりペプチドまたは化合物を付着させたビーズを用いて、ＧＰＣＲのアゴニストをアッセイした。ビーズを、アガロースと混合させるか、平板の表面に適用した。付着した化合物またはペプチドをＵＶ光に露光させて切断した。
【０１２９】
細胞培養およびアッセイ方法は、実施例１に記載した通りであった。光切断可能リンカーにより、六量体ペプチドを、２００マイクロメートルＴＥＮＴＡＧＥＬＴＭ微小球ビーズ（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能な、ＴＥＮＴＡＧＥＬＴＭｐｅｇを有するポリスチレンコア）に連結させた。２つのペプチドを、検証目的のためにテストした：ペプチド１−Ａｃ−ＮＨ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ｄＨｉｓ−ｄＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（配列番号１）、およびペプチド２−Ａｃ−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ｄＨｉｓ−ｄＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（配列番号２）。ピンセットでビーズをアガロースに押し込むか、またはビーズを溶融アガロース／細胞混合物に懸濁させることにより、ビーズをアガロース平板に添加した。３６５ ｎｍの波長（λ）に設定されたＵＶ灯を用いて紫外線光に露光させることにより、ペプチドをビーズから切断した。
【０１３０】
［ＮＤＰ］−α−ＭＳＨの濃度増加へのリポーター遺伝子構築物およびＭＣ１受容体を発現する細胞系の応答に対する紫外線露光（λ＝３６５ ｎｍ）の影響の時間的経過を図９に示す。ペプチド濃度および送達は、実施例１に記載したものと同様であった。３２分までのＵＶ露光は、ペプチドに対する応答に有意に影響しなかった。
【０１３１】
ビーズに連結された（方法に記載）ＭＣ１Ｒアゴニストペプチド１および２の、ＣＨＯ−６ＣＲＥ−ｌｕｃ＋−ＭＣ１Ｒ細胞平板への送達の時間的経過を図１０Ａ〜１０Ｅに示す。ＵＶ露光の時間を増やすことで、ペプチドをビーズから切断した。図１０Ａ〜１０Ｅは、０、０．５、１、３および１０分間のＵＶ露光をそれぞれ示す。［ＮＤＰ］−α−ＭＳＨの濃度−応答曲線を、図９と同じ濃度にて、各平板上の行１において実行（ｒｕｎ）した。ペプチド１および２のそれぞれ５つのビーズを、ピンセットでアガロース層に押し込んだ。ペプチド１および２はそれぞれ、平板の左側および右側に存在した。
【０１３２】
図１１Ａは、各時点における５つのビーズの平均発光の線グラフ図である。ビーズを適用した各領域のｚ値から平板のバックグラウンドｚ値を引くことで、応答を計算した。応答の大きさは、リポーター細胞系の応答、およびビーズから放出され得るペプチドの量の両方により決定される。ウェル利用型リポーターアッセイにおいてテストした場合にペプチド１および２の両方ともＭＣ１Ｒの完全アゴニストであり、従って両方のペプチドが［ＮＤＰ］−α−ＭＳＨに類似した応答を引き出すことができる。
【０１３３】
図１１Ａは、図１０Ｅの［ＮＤＰ］−α−ＭＳＨ濃度曲線の線グラフ図である。最大応答値は約２５であった。ペプチド１および２の両方に対する応答は、３分の時点で横ばいになり始め（図１１Ｂ）、応答値は［ＮＤＰ］−α−ＭＳＨに対する最大応答をはるかに下回っていた（図１１Ａ）。従って、応答の大きさの横ばい状態は、これらの特定のビーズから放出され得るペプチドの量に大いに依存する。ペプチド１の場合、最大応答は、リポーター遺伝子系の最大応答にも依存していたかもしれない；ただし、これはペプチド２には明らかに当てはまらない。図１２は、１０分時点のデータの３次元図である。各円錐の上から下までの斜線バンドは、送達開始点からペプチドが拡散するのに伴うシグナルの弱化を表す。
【０１３４】
図１３Ａは、平板を流し込む前にペプチド１および２ビーズをアガロースおよび細胞と混合する実験を示す。その後、細胞およびビーズを含有する固化平板をＵＶ光に１０分間露光させる。発光の領域は、ビーズを含有する領域であった。図１３Ｂは、このデータの等高線グラフを示す。この種の図を使用することで、発光領域の中心の位置決定、従って活性ペプチドを含有するビーズの位置決定が容易になり、これらは再テストおよび確認のために採取できる。これらのデータは、ビーズからの放出により送達される化合物またはペプチドのアッセイを裏付ける。さらに、ビーズは、平板に適用されても、平板に流し込む前にアガロースおよび細胞と混合されてもよい。
【０１３５】
実施例９
白色ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイの評価
「方法」に記載する平板アッセイのために特別に設計された乳白色ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイを、市販の透明なＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイと比較した。白色トレイは、二酸化チタンを未加工のポリスチレン樹脂に添加して作成した。図１４に示すように、白色トレイを用いた場合に、透明トレイを用いたのに対してシグナル対ノイズ比が大幅に改善されたことが見とめられた。従って、上記実施例７および８では白色トレイを使用した。
【０１３６】
実施例１０
ＬＵＣＬＩＴＥＴＭ試薬の評価
ＬＵＣＬＩＴＥＴＭ試薬が、ビーズに連結した化合物またはコードのいくらかの破壊を生じ得るか否かという問題が提起された。この問題を扱うために、以下の実験を行った。
【０１３７】
コード部分（ユニークな比率の同位体標識化アミノ酸）および化合物部分を含むフェニル酢酸キャップド（ｃａｐｐｅｄ）分析構築物を含むビーズをテストした。構築物が連結したビーズを、希釈ＬＵＣＬＩＴＥＴＭ試薬（１：１ ＬＵＣＬＩＴＥＴＭ試薬：ＰＢＳ）で、０分間、１０分間、１時間、２時間、および一晩インキュベートした。次いで、ビーズをＤＭＦで５分間処理した。その後、トリフルオロ酢酸およびトリエチルシランでビーズから構築物を放出させた。質量分析法により、ＬＵＣＬＩＴＥＴＭ試薬溶液が、構築物のコード部分または化合物部分のいずれの完全性にも影響を及ぼさないことを決定した。
【０１３８】
本実施例は、ＬＵＣＬＩＴＥＴＭ試薬を添加した場合と、トレイを画像化した後にビーズを平板から取り出す必要がある場合とで長い時間の枠があることを示す。
【０１３９】
参考文献
以下に一覧する参考文献、ならびに本明細書で引用する全ての参考文献は、本明細書で採用する方法、技術および／または組成物を、補充、説明、背景を提供、または教示する範囲で、参照により本明細書に援用される。
【０１４０】
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Ｗｅｙｅｒ， Ｕ．， Ｓｃｈａｆｅｒ， Ｒ．， Ｈｉｍｍｌｅｒ， Ａ．， Ｍａｙｅｒ， Ｓ．Ｋ．， Ｂｕｒｇｅｒ， Ｅ．， Ｃｚｅｒｎｉｌｏｆｓｋｙ， Ａ．Ｐ． Ｓｔｒａｔｏｗａ Ｃ． （１９９３） Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＮＫ２ ａｎｄ ５−ＨＴ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ． Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｈａｎｎｅｌｓ １：１９３−２００．
本明細書および請求の範囲がその一部を構成する本出願は、任意の後続出願に関して優先権の基礎として使用され得る。このような後続出願の請求の範囲は、本明細書に記載した任意の特徴または特徴の組合せに関連し得る。これらは、製品、組成物、プロセスまたは使用クレームのいずれの形態を取ってもよく、例として限定するものではないが、本出願の請求項を１つまたは複数含み得る。
【０１４１】
本発明の様々な詳細部分が本発明の範囲から逸脱することなく変更できることが理解されよう。さらに、上記記載は、単に例示するものであり、限定を目的とするものではなく、本発明は請求の範囲により定義される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）メラニン細胞における７ＴＭ受容体シグナル形質導入の模式図である。
【図２】図２Ａは、本発明のアッセイ方法において使用するのに適したシステムのブロック図である。図２Ｂは、本発明のアッセイ方法で使用する、候補化合物を目的地プレートに適用する順番を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明のアッセイ方法により生成された画像を分析するステップを示すフローチャートである。
【図４】図４は、ルシフェラーゼの転写を駆動するＣＲＥ応答エレメントのＧＰＣＲ活性化の模式図である。
【図５】図５は、実施例７〜１０に記載するように、様々な濃度の４−Ｌ−ノルロイシン−７−Ｄ−フェニルアラニン−αメラニン細胞刺激ホルモン［ＮＤＰ］−αＭＳＨ（図５Ａの上段；図５Ｂにおいて◆）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（７−３６）（図５Ａの中段；図５Ｂにおいて■）、または副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＨ）（図５Ａの下段；図５Ｂにおいて▲）で処理された、ＭＣ１受容体を発現するＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞を含むアガロース平板を示す。図５Ａは画像、および図５Ｂはそれぞれのペプチドについての濃度応答曲線のグラフ図である。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬を添加してその後ＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラ上で画像化する前にトレイを４時間３７℃にてインキュベートした。ペプチドを送達した領域についてのｚ値からバックグランドｚ値を引いて応答を計算した。
【図６】図６は、実施例７〜１０に記載するように、様々な濃度の［ＮＤＰ］−αＭＳＨ（図６Ａの上段；図６Ｂにおいて◆）、ＧＬＰ−１（７−３６）（図６Ａの中段；図６Ｂにおいて■）、またはＣＲＨ（図６Ａの下段；図６Ｂにおいて▲）で処理された、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体を発現するＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞を含むアガロース平板を示す。図６Ａは画像、および図６Ｂはそれぞれのペプチドについての濃度応答曲線のグラフ図である。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬を添加してその後ＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラ上で画像化する前にトレイを４時間３７℃にてインキュベートした。ペプチドを送達した領域についてのｚ値からバックグランドｚ値を引いて応答を計算した。
【図７】図７は、実施例７〜１０に記載するように、表記する濃度の［ＮＤＰ］−αＭＳＨ（図７Ａの上段；図７Ｂにおいて◆）、ＧＬＰ−１（７−３６）（図７Ａの中段；図７Ｂにおいて■）、またはＣＲＨ（図７Ａの下段；図７Ｂにおいて▲）で処理された、副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体（ＣＲＨ１Ｒ）を発現するＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞を含むアガロース平板を示す。図７Ａは画像、および図７Ｂはそれぞれのペプチドについての濃度応答曲線のグラフ図である。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬を添加してその後ＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラ上で画像化する前にトレイを４時間３７℃にてインキュベートした。ペプチドを送達した領域についてのｚ値からバックグランドｚ値を引いて応答を計算した。
【図８】図８は、互いと混合され単一の平板としてプレーティングされた、ＭＣ１受容体、ＧＬＰ−１受容体およびＣＲＨ１Ｒを発現するＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞を含むアガロース平板を示す。これらの細胞は、実施例７〜１０に記載するように、様々な濃度の［ＮＤＰ］−αＭＳＨ（図８Ａの上段；図８Ｂにおいて◆）、ＧＬＰ−１（７−３６）（図８Ａの中段；図８Ｂにおいて■）、またはＣＲＨ（図８Ａの下段；図８Ｂにおいて▲）で処理した。図８Ａは画像、および図８Ｂはそれぞれのペプチドについての濃度応答曲線のグラフ図である。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬を添加してその後ＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラ上で画像化する前にトレイを４時間３７℃にてインキュベートした。ペプチドを送達した領域についてのｚ値からバックグランドｚ値を引いて応答を計算した。
【図９】図９は、表記された時間（すなわち、◆＝０分（Ｍｉｎ．）、■＝４ Ｍｉｎ．、▲＝８ Ｍｉｎ．、×＝１６ Ｍｉｎ．、＋＝２４ Ｍｉｎ．および・＝３２ Ｍｉｎ．）で紫外光（λ＝３６５ ｎｍ）に露光されたＭＣ１受容体を発現するＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞を含有するアガロース平板についての濃度応答曲線のグラフ図である。その後、図５Ａおよび５Ｂと同じように平板を［ＮＤＰ］−αＭＳＨで処理した。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬の添加およびその後のＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラ上での画像化の前に、トレイを４時間３７℃にてインキュベートした。ペプチドを送達した領域についてのｚ値からバックグランドｚ値を引いて応答を計算した。
【図１０】図１０は、ＭＣ１Ｒを発現するＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞を含むアガロース平板に挿入された、メラノコルチン−１受容体（ＭＣ１Ｒ）アゴニストペプチド１（左下にある５つのビーズ）またはペプチド２（右下にある５つのビーズ）を含有するビーズの画像を示す。次いで、トレイをＵＶ光（λ＝３６５ ｎｍ）に０、０．５、１、３または１０分間露光させた（ぞれぞれＡ〜１０Ｅ）。平板を、図５Ａ（上段）と同じ濃度の［ＮＤＰ］−αＭＳＨで処理した。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬の添加およびその後のＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラ上での画像化の前に、トレイを４時間３７℃にてインキュベートした。
【図１１】図１１Ａは、図１０Ｅの［ＮＤＰ］−αＭＳＨ濃度曲線の線グラフ図である。図１１Ｂは、図１０Ａ〜１０Ｅについて上述した５つのビーズの平均発光のグラフ図である。各時点（◆＝ペプチド１、■＝ペプチド２）を示す。ビーズをアプライした各領域のｚ値から平板のバックグランドｚ値を引いて応答を計算した。
【図１２】図１０Ｅに示す１０分時点から得たデータの３次元図である。ｚ値は、本明細書に記載するように計算した。
【図１３】図１３は、平板を流し込む前にアガロースおよび細胞と混合された、ペプチド１および２を含むビーズを示す。次いで、細胞およびビーズを含有する固化した平板を、ＵＶ光（λ＝３６５ ｎｍ）に１０分間露光させた。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬の添加およびその後のＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラ上での画像化の前に、トレイを４時間３７℃にてインキュベートした。画像を図１３Ａに、等高線グラフを図１３Ｂに示す。
【図１４】図１４は、白色（◆）または透明（■）ＯＭＮＩ ＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイにプレート化され、様々な濃度の［ＮＤＰ］−αＭＳＨで処理された、ＭＣ１受容体を発現するＣＨＯ−６×ＣＲＥ−ｌｕｃ＋細胞を含有するアガロース平板についての濃度応答曲線のグラフ図である。ＬＵＣＬＩＴＥ ＰＬＵＳＴＭ試薬の添加およびその後のＶＩＥＷＬＵＸ（登録商標）カメラ上での画像化の前に、トレイを４時間３７℃にてインキュベートした。ペプチドを送達した領域についてのｚ値からバックグランドｚ値を引いて応答を計算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004503249.tif 000105
2004503249.tif 000106