(57)【要約】gp120ウイルスタンパク質に高い親和性および特異性を示すペプチドのファミリーに関する。本発明のペプチドは、以下の配列(A):TPA-P1-Cys-P2-Cys-P3-Cys-AlaまたはGln-Glyまたは(D)AspまたはSerまたはHisまたはAsn-Xaaj-CysThrまたはAla-Cys-Xaak-NH2を含み、前式でTPAがチオプロピオン酸を表し、Xaajがβ-ナフチルアラニンまたはフェニルアラニンまたはジフェニルアラニンを表し、XaakがGly、ValまたはIleを表し、P1が3〜6個のアミノ酸を表し、P2が2〜4個のアミノ酸を表し、P3が6〜10個のアミノ酸を表し、P1、P2およびP3中のアミノ酸が天然あるいは人工のアミノ酸、同一あるいは異なるアミノ酸であり、P1、P2およびP3が共通の配列を有しているかあるいは有しておらず、前記ペプチドが、前記配列(A)のAlaまたはGln-GlyまたはCDAspまたはSerまたはHisまたはAsn-Xaakアミノ酸残基によってβターンが形成される、βヘアピン立体配座を有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列(I):
TPA-Xaaa-Xaab-AlaまたはGlnまたはHis-ArgまたはPhe-
Cys-Xaac-Xaad-Arg-Cys-Lys-Xaae-Xaaf-
Xaag-Xaah-LeuまたはLys-Xaai-Lys-Cys-Alaまたは
Gln-Glyまたは(D)AspまたはSer-SerまたはHisまたはAsn-
Xaaj-Cys-ThrまたはAla-Cys-Xaak-NH2を含み、
上式でTPAがチオプロピオン酸を表し、Xaaa、Xaab、Xaac、Xaad、Xaae、Xaaf、Xaag、XaahおよびXaaiが天然あるいは人工のアミノ酸で、同一あるいは異なるアミノ酸であり、Xaajがβ-ナフチルアラニンまたはフェニルアラニンまたはジフェニルアラニンを表し、XaakがGlyまたはValまたはIleを表すことを特徴とするペプチド。
【請求項２】
配列(I)が残基Xaakに連結したプロリン残基も含むことができる、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
XaaiがGlyである、請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項４】
添付の配列表の配列番号4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15および16から選択される配列を含むペプチド。
【請求項５】
請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドを生成するための方法であって、前記ペプチドの固相化学合成を含む方法。
【請求項６】
医薬品を調製するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項７】
抗ウイルス剤を調製するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項８】
AIDSの治療を目的とする医薬品を調製するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項９】
請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドとウイルスのエンベロープタンパク質の複合体を含むワクチン。
【請求項１０】
ウイルスがAIDSウイルスである、請求項9に記載のワクチン。
【請求項１１】
HIVのウイルスエンベロープの分子を検出するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
診断用製品を製造するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１３】
クロマトグラフィ用マトリックスを官能化するための固定化リガンドとしての、請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１４】
スクリーニング法における、請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスタンパク質gp120に関して高い親和性および特異性を示すペプチドのファミリー、これらのペプチドを生成するための方法、およびこれらのペプチドの使用に関する。
【０００２】
ウイルスタンパク質gp120は、免疫不全ウイルスのエンベロープの糖タンパク質である。このタンパク質は、ウイルスの複製サイクルの第1のステップ、すなわちウイルスのエンベロープによるリンパ球膜のCD4タンパク質の認識、およびヌクレオカプシドを該細胞内に取込むための膜の融合からなるステップを含む。実際このタンパク質は、ウイルスのエンベロープによってCD4タンパク質を認識するための部位の、最も外側のタンパク質である。
【０００３】
ウイルスタンパク質gp120と類似のエンベロープタンパク質を含む、多くの免疫不全ウイルスが存在する。これらの中では、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒツジ免疫不全ウイルス(VISNA)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)およびネコ免疫不全ウイルス(FIV)を述べることができる。
【０００４】
本発明のいくつかのペプチドは、ウイルスエンベロープのウイルスタンパク質gp120に結合すること、およびウイルスタンパク質gp120のCD4受容体への結合を阻害することができ、その配列に応じてIC50値は0.1nMと400nMの間である。これらの分子のいくつかは、HIVウイルスによるTリンパ球感染を阻害することができ、たとえばED50(50%有効量)は100nM〜900nMである。さらに、これらの分子の組み換えウイルスタンパク質gp120への結合は、可溶性CD4分子と同じ有効性で、その立体配座の変化を誘導し、これによって新しいエピトープが露出される。
【０００５】
本発明のペプチドには、治療用途およびワクチン用途を見出すことができる。本発明のペプチドによって、たとえばHIVのエンベロープタンパク質の検出、および精製においても、ならびに新しい抗AIDS剤の発見において有用な、新規な分子を設計することも可能である。
【背景技術】
【０００６】
免疫不全ウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)による感染用の有効な治療、および感染を予防する手段を発見するために、多くの研究が行われている。その主な難点は、有効であるワクチンおよび免疫療法による治療法の開発に関するものである。この難点は、特にウイルスの変異性、およびウイルスが標的細胞中に侵入する機構、およびウイルスによる感染に対して予防するために必要とされる免疫応答の機構を理解することが困難であることによるものである。
【０００７】
以下の記述では、角括弧の間の参照文献は、添付した参照文献のリスト中の文書のことを指す。
【０００８】
CD4-gpl20複合体の3次元構造の分析によって実証されるように[1](添付した参照文献を参照のこと)、ウイルス糖タンパク質gpl20へのその結合に必須であるCD4の構造要素には、アミノ酸Gly38、Gln40、Gly4l、Ser42、Phe43およびThr45があり、これらはCD4の領域36〜47、およびアルギニン-59中に含まれている。CD4の領域36〜47は、免疫グロブリンのCDR2領域と比較されてきており、整然としたヘアピン構造を示す。この構造は、配列36〜40に対応するβ鎖(C')次に配列43〜47に対応する第2のβ鎖(C")に第1の鎖と共にアンチパラレルβ構造を形成させることができる、配列40〜43に対応するターンからなっている。この構造は、第1のβ鎖の残基Gly38、Gln40、Phe43、Thr45およびGly47のアミド窒素と、第2のβ鎖の残基Thr45、Phe43、Gln40、Gly38およびIle36それぞれのカルボニル酸素の間の水素結合によって安定化する。このヘアピン構造には、CD4とウイルスタンパク質gpl20との相互作用において中心的な役割があり、二重の機能を果たす。第1に、ヘアピン構造によってアミノ酸Gly38、Gln40、Gly4l、Ser42、Phe43およびThr45は、ウイルスタンパク質gpl20の相互作用の表面と相補的な分子表面を形成することができ、特にウイルスタンパク質gpl20の分子表面中の疎水性空洞(cavity)の入り口にPhe43の側鎖を挿入することができる。第2に、ヘアピン構造によって、CD4のβ鎖C"のポリペプチド骨格とウイルスタンパク質gpl20のβ15鎖(残基365〜368)の間の、βシート型の相互作用が可能になる。アルギニン59(Arg59)にもCD4-gpl20相互作用において必須の役割がある。なぜなら、その側鎖のグアニジン基が、ウイルスタンパク質gpl20の残基Asp368の側鎖と二重の水素架橋を形成し、CD4のC"鎖とウイルスタンパク質gpl20のβ15鎖の間のβ構造型の相互作用を安定化させることができるからである。部位特異的突然変異導入法の実験によって、CD4のこれらすべての残基が、ウイルスタンパク質gpl20との相互作用において必須の役割を果たしていることが実証されている[2]、[3]。
【０００９】
この整然としたヘアピン構造、およびその残基の側鎖の立体配座を再現することは、CD4と相互作用する部位においてウイルスタンパク質gpl20と結合するに違いない分子では必須である。配列37〜53に対応する直鎖ペプチド、CD4の配列37〜46に対応する環状ペプチドなどの単純なペプチド構築体が、ウイルスタンパク質gpl20に関する測定可能な親和性を有していない事実は、このことを実証するものである[4]。
【００１０】
HIVによるCD4細胞の感染は、ウイルスエンベロープとCD4の間の親和性の高い相互作用によって仲介される。突然変異導入法と抗体を用いた競合からなる実験によって、CD4のドメインD1中の、ウイルスエンベロープのgpl20タンパク質と接する、表面の位置を特定することが可能となっている。CD4のドメインD1D2とモノクローナル抗体のFabフラグメントとの複合体において、機能的ではあるがループV1-V2-V3およびNおよびC末端領域が欠失している、gpl20糖タンパク質の組み換え形の3次元構造が、結晶学によって近年解明されている[1]。この構造中ではCD4が、免疫グロブリンのCDR2領域と比較されている領域の中心に位置する大きな分子表面(742Å2)を使用して、ウイルスタンパク質gpl20の分子表面(800Å2)において大きな窪みと相互作用する。ウイルスタンパク質gpl20の分子の窪みの中心では、「Phe43空洞」と呼ばれる狭くて深い空洞が開いており、そこへの入り口はCD4のCDR2領域上部のPhe43の側鎖によって占められている。この構造を解明することによって、突然変異導入法に関する前述のデータが確認され、これによって残基Phe43およびCDR2ループ全体が機能的に非常に重要であり、HIV-1ビリオンの細胞への結合を阻害するための考えられる標的として、後者が提案されることが示される。gp120-CD4相互作用によって、ウイルスを標的細胞の膜に結合させることができ、感染機構において第1のタンパク質-タンパク質相互作用が示される。しかしながら、他の補助受容体が、細胞へのHIVの効果的な侵入のために必要である。これらはリンパ指向性ウイルス株(X4)の侵入と関係があるCXCR-4、[5]、[6]、およびマクロファージ指向性株(R5)および最も主要な単離株の侵入と関係があるCCR-5である[7]、[8]。いくつかの証拠により、ウイルスタンパク質gpl20のCD4への結合によって、エンベロープ糖タンパク質中において立体配座の変化が生じると思われ、これによって特異的な抗体によって検出可能な、CD4iと呼ばれる新しい部位が露出し、ケモカイン受容体[9]、[10]、進入用の補助受容体に関するエンベロープの親和性が高まると思われることが示される。ウイルスタンパク質gpl20によるCD4および補助受容体の結合の後、他の立体配座の変化がgp4lの構造的認識をもたらすと思われ、これによってその膜融合ペプチドが露出されて、次いでウイルス膜と細胞膜が融合し、最後にウイルス量(viral load)が細胞に侵入すると思われる。
【００１１】
CD4と複合体を形成しているウイルスタンパク質gpl20の結晶学的構造によって、免疫応答を侵すためにHIVによって使用される、機構の1つを解明することが可能になっている。gpl20エンベロープタンパク質が、超可変性である非常にグリコシル化された領域を有していることは既に知られていた。実際この結晶学的構造によって、超可変性である領域および非常にグリコシル化された領域が、ビリオンのアクセス可能な表面にも対応する、ウイルスタンパク質gpl20の露出された分子表面を形成していることが実証される。ウイルスタンパク質gpl20の分子表面のわずか数箇所の領域が保存されており、これらの領域は抗体の標的となる可能性がある。これらの領域は正常ではアクセス可能ではなく、おそらくは超可変性ループ(V1-V2-V3)によって保護されており、結晶化タンパク質中では欠失しており、したがって眼には見えない。これらの領域の1つは、ケモカイン受容体に関する相互作用の部位に接しており、エンベロープがCD4に結合した後にCD4i抗体にアクセス可能な表面である。CD4結合部位は、露出および保存されている他の表面である。しかしながら、この表面はウイルスタンパク質gpl20の空洞中に存在し、したがって抗体にはアクセス可能ではないが、分子を認識するために2つのドメインを使用する抗体と異なり、1つの免疫グロブリンドメインを有するCD4を収容することができる。
【００１２】
エンベロープタンパク質(gP120)を認識するための、今日入手可能なツールは限られている。これらは、広範囲の主要なエンベロープに結合することができるCD4i抗体である[11]、[12]、[13]。しかしながら、ウイルスエンベロープに関するこれらの親和性は低く、CD4の存在下でのみ高まり、このことはこれらの抗体を容易にたやすく使用することはできないことを意味する。IgGlb12、F105または15eなどの他の抗体は、主要な単離株すべてを認識することができるとは考えられていない。ビオチンで標識したCD4分子が、1つの解決策となる可能性もある。この分子は市販されている(Intracel)。残念ながら、この分子は高価であり、ウイルスタンパク質gpl20の結合のその機能的性質は、ビオチン化反応によって大幅に(100倍)低下しており、これによってこの分子の使用が非常に制限される。
【００１３】
ウイルスタンパク質gpl20と侵入に関する主な受容体、CD4、組み換え可溶性CD4および/またはCD4ドメインを含む免疫グロブリンのキメラの相互作用の阻害は、HIV-1による感染の阻害に関して示唆され実験的に調べられた、第1の治療的手法の1つであった。これらの分子は、研究室用に適合させた株の場合のみ、ウイルス感染の阻害においてin vitroでは有効であるが、多くの主要な単離株の場合は無効である。これらのCD4由来の構築体がin vivoでは迅速に分解すること、および主要な単離株のウイルスエンベロープに関するこれらの親和性が低いことが、その無効性の主な原因として挙げられてきている。しかしながら、研究によって、いくつかの主要な単離株の組み換えモノマーgp120のCD4に関する親和性は、研究室用の株に由来するgp120sの親和性と著しく異なるわけではないことが実証されている。ウイルス表面でのウイルスタンパク質gpl20のオリゴマー的性質、許容細胞の表面でのCD4の密度および構造は、今だに明らかには解明されていない他の分子相互作用、または侵入の機構に重要な役割を果たしており侵入アンタゴニストとしての可溶性CD4タンパク質の無効性の他の原因である可能性がある、侵入に関する他の第2の分子が存在するためである可能性がある。ウイルスタンパク質gpl20を標的とする抗ウイルス剤の開発は重大な課題であり、エンベロープタンパク質の遺伝的変異性が大きいために、ウイルスタンパク質gpl20の多くの阻害剤の無効性を説明することができる要因である。しかしながら、CD4に関するウイルスタンパク質gpl20の結合部位のコアの形成に貢献する残基は、充分に保存された残基からなっているという事実によって、ウイルスタンパク質gpl20の阻害剤は、広範囲のHIV-1単離株に対して有効である可能性があることが示唆される。
【００１４】
CD4由来のペプチド構築体が、ウイルス感染の阻害剤として提案されている。これらの構築体は、フェニル基を取り込んでおり、Phe43[14]およびCD4のCDR3のループに対応し追加的な芳香族残基を取り込んでいる環状ペプチド[15]を模倣している、CD4のCDR2のループの構造模倣ペプチドである。しかしながら、これらの構築体は、研究室用の単離株に限られた低い抗ウイルス活性を示し、最初はCD4の構造模倣体として設計されたにもかかわらず、浸入ステップにおいては活性がない[16]。
【００１５】
現在、あるいくつかのgpl20-CD4相互作用の阻害剤が提案されており、これらには臨床的用途がある。たとえばこれらは、CD4のD1D2ドメインとIgG2免疫グロブリンの定常ドメインの遺伝的融合によって形成された、大きな組み換えタンパク質である[17]。この構築体PR0542は、臨床段階I/II中にある。この大きな組み換えタンパク質は、ヒトの身体によって充分寛容されるようであるが、その有効性は充分な循環量に依存し、これを得ることは難しい。より小さな分子がCD4-gpl20相互作用の阻害剤として提案されており、これらは臨床試験段階にある。これらの分子は、組み合わせ手法によって同定されたビスアゾ染料FP21399[18]、ホスホロチオネートオリゴヌクレオチドのジンテビル(zintevir)(AR177)[19]、ナフタレンスルホン酸系ポリマー、PR02000[20]およびデンプン誘導体、デキストリン2-硫酸(D2S)[21]であり、これらは細胞培養中にHIV-1化学的単離株を阻害するが、高濃度が必要である。侵入阻害剤の中には、CD4-gp120相互作用の阻害剤として最初に提案された、多分枝合成ペプチド構築体であるSPC3もあり[22]、これは細胞へのビリオンの結合に続く段階で活性を示すことがその後分かった。他の小さな分子:ビシクラム(bicyclam) AMD3100[23]、NSC651016[24]、ペプチドT22[25]、およびそのさらに近年型T134またはT140[26]、およびTAK779[27]が、侵入阻害剤として提案されてきている。これらの分子は、浸入CXCR4およびCCR5に関する補助受容体に活性があるウイルス浸入の阻害剤ではあるが、CD4-gp120相互作用には活性がない。gp41糖タンパク質のC末端領域の配列に由来するペプチド、ペプチドT20(またはDP178)[28]およびそのさらに近年の改良型DT1249[29]は、CD4へのウイルスエンベロープの結合の後、ウイルス細胞膜融合の前の、浸入の移行相を標的とする感染の他の阻害剤であり、これらのペプチドは、gpl20-CD4相互作用において不活性である。これらの製品の大部分は現在臨床試験段階I/II中にあるが、これらの療法上の有効性は依然として確認されていない。
【００１６】
現在臨床的に使用されている抗AIDS治療処方計画、三剤療法(tritherapy)は、2つのウイルス酵素、逆転写酵素およびプロテアーゼを標的とする3つの阻害剤の組み合わせを含む。三剤療法は、多くの患者のウイルス量を大幅に低下させることにおいては成功しているが、もっとも好ましい場合でさえも、病気を根絶することはできない。なぜなら、感染の潜在的な保有宿主は依然として存在し続けるからである[30]。一方では三剤療法の部分的な成功、および他方では、現在の療法プロトコルによってAIDS感染を止めることが不可能であることによって、他のウイルス標的に対して活性的であることができ、現代の臨床薬剤のレパートリーおよび有効性を増大させることができる新しい薬剤に関する需要が高まってきている。
【００１７】
J.H.Nunberg,Montana Biotechnology Center,The University of Montana,Missoula,USAの研究室での実験によって、ウイルス-細胞融合の前のステップにおいて存在する、タンパク質形の化学的架橋は、ウイルス中和抗体の形成を誘導することができる新しい免疫原であることが実証されている[31]。したがって、ウイルスエンベロープと浸入受容体の融合前の複合体は、現在最も興味深い構造である。なぜならこの構造は、AIDSに対するワクチンの作製におけるタンパク質形成の、最も重要な成分である可能性があるからである。A.DeVico,Institute of Human Virology,University of Maryland,Baltimore,USAの研究室での実験によって、化学的架橋によって安定化するgp120-CD4複合体は、すなわち組み換え融合タンパク質として、ウイルスタンパク質gpl20の隠れた抗原部位を露出させ中和抗体を誘導することができる、高分子形態であることが実証されている[32]、[33]。化学的架橋によってこの抗原複合体を得ることは、充分ではない。なぜなら、それは均質ではなく再現するのが難しいからである。組み換えタンパク質として複合体を得ることによって、構造的に安定した有効な形がもたらされるわけではない。しかしながら特に、これらの調製物中のCD4の存在によって、既に免疫抑制状態である生物において、自己免疫応答が誘導される危険が生じる可能性がある。
【００１８】
さらに、その組み換えモノマー形(gp120)、またはさらに元の状態に近い三量体形(gp140または類似体)のウイルスエンベロープを生成させることは、予防接種用に使用することができる可能性がある組み換え形の、探索および大規模な生成において非常に重要である。これらの組み換え形を精製することは容易ではなく、エンベロープタンパク質にそれほど特異的であるわけではない、リガンド、特にレクチンを用いて機能性にした、クロマトグラフィ用支持体の使用が必要である。共有結合した組み換えCD4を含むクロマトグラフィ用支持体を使用することによって、ウイルスタンパク質gpl20の精製に関してより特異的で有効なステップが導入されると思われるが、このような支持体は非常に高価であると思われ、このタンパク質はあらゆる使用条件下において充分安定しているわけではないと思われる。
【非特許文献１】
MOLECULAR CLONING,A'LABORATORY MANUAL,2nd edition
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、CD4を模倣したペプチドのファミリーを提供し、前述した従来技術の欠点を克服する。具体的には本発明は、AIDSウイルスのエンベロープ、特にgp120タンパク質に関して非常に高い親和性を示す、安定したペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明のペプチドは、以下の配列(A):
TPA-P1-Cys-P2-Cys-P3-Cys-AlaまたはGln-Gly
または(D)AspまたはSer-SerまたはHisまたはAsn-Xaaj-Cys Thr
またはAla-Cys-Xaak-NH2を含み、
上式でTPAがチオプロピオン酸を表し、Xaajがβ-ナフチルアラニンまたはフェニルアラニンまたはジフェニルアラニンを表し、XaakがGlyまたはValまたはIleuを表し、P1が3〜6個のアミノ酸を表し、P2が2〜4個のアミノ酸を表し、P3が6〜10個のアミノ酸を表し、P1、P2およびP3中のアミノ酸が天然あるいは人工のアミノ酸、同一あるいは異なるアミノ酸であり、P1、P2およびP3がおそらく共通の配列を有しており、前記ペプチドが、前記配列(A)のアミノ酸残基AlaまたはGln-GlyまたはDAspまたはSer-SerまたはHisまたはAsn-Xaajによってβターンが形成される、β-ヘアピン立体配座を示すことを特徴とする。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、本発明のペプチドは、以下の配列(I)を含み、
2004535366.tif 000002
上式でTPAがチオプロピオン酸を表し、Xaaa、Xaab、Xaac、Xaad、Xaae、Xaaf、Xaag、XaahおよびXaaiが天然あるいは人工のアミノ酸、同一あるいは異なるアミノ酸であり、XaajがNal、PheまたはDipを表し、XaakがGlyまたはValまたはIleを表すことを特徴とする。
【００２２】
残基(D)Aspはアスパラギン酸のD光学異性体を表し、Nalはβ-ナフチルアラニンを表し、Dipはジフェニルアラニンを表す。
【００２３】
本発明者らは、配列の位置1にチオプロピオン酸、配列の位置23にPhe、NalまたはDip残基(Xaaj)、および配列の位置27にGly、ValまたはIle残基(Xaak)を含む、配列(I)によって定義される本発明のペプチドは、免疫不全ウイルスのウイルスエンベロープのgp120タンパク質に関して、高い親和性および高い結合特異性を示すことを実証した。
【００２４】
このペプチドは、わずか27個または28個の残基を含み、4残基のβターンによって連結した2本のアンチパラレルβ鎖からなるヘアピン構造を有している。この2本のアンチパラレル鎖は、互いに一定の距離があり、これによって分子内の水素架橋の相互作用を与えることができるので、構造を安定化させる。詳細には、ペプチド結合のアミド窒素とカルボニル酸素原子の間の距離は、2.5〜3.6Åである。この明確に定義される安定した構造によって、CD4のgp120糖タンパク質への結合に必須である、CD4の構造要素が再現される。
【００２５】
本発明のペプチドの3次元構造は、核磁気共鳴(NMR)によって実験的に解明されてきている。この分析により、このペプチドの3次元編成によって、CD4のヘアピン構造のペプチド骨格が再現され、このペプチドの領域37〜46がわずか1.05Åというrms偏差でCD4の領域36〜37の上に載っている可能性があることが実証される。さらに、残基AlaまたはGln20、Ser22、Xaaj23(Nal、PheまたはDip)、およびThrまたはAla25の側鎖は、CD4の対応する残基、すなわちGln40、Ser42、Phe43およびThr45の配向に匹敵する配向を有している。特に、Xaaj23の側鎖は、ウイルスタンパク質gp120の疎水性空洞の入り口に挿入できるように、CD4のPhe43の立体配座と類似した立体配座中のヘアピンモチーフから突出しており、これによってgp120との連結が補強される。位置9および18のArgおよびLysは、CD4タンパク質の残基Arg59およびLys35と形態的に均等である。
【００２６】
ペプチドのTPAおよび5cysはジスルフィド架橋を形成し、これが1-3、2-4および3-6タイプの対を示し、ヘアピン構造を安定化させる。
【００２７】
ヘアピン構造のモチーフは、ウイルスエンベロープタンパク質とのその相互作用を促進することができる、溶媒および/またはタンパク質などの大きな分子にアクセス可能な表面を有する。
【００２８】
このモチーフの溶媒にアクセス可能な表面のアミノ酸の側鎖は空間的に接近しており、CD4-gp120タンパク質結合のために重要であるいくつかの残基の構造を再現する、連続的な分子表面を形成する。
【００２９】
ヘアピン構造のモチーフを含む構造プラットフォームは、ヘアピン構造のモチーフに対して明確に定義された空間的位置に、追加の化学官能基を受け入れることができる他の構造領域も含み、したがって結合というその生物学的機能を補い、かつ/あるいは標識基を与えることができる。たとえば、ビオチン基またはフルオレセイン基は、誘導体の生物学的活性のいかなる損失も引き起こすことなく、リジン11の側鎖に取り込まれている。以下に記載したように、これらの基を取り込ませることによって、エンベロープタンパク質との相互作用に関するアッセイにおいて、これらの誘導体を使用することが可能となっている。
【００３０】
本発明によれば、配列(I)は、残基Xaakに連結したプロリン残基も含んでよい。位置28に加えられるプロリン残基はC末端を安定させ、ヘアピン構造のモチーフのC末端β鎖をより柔軟性のないものにする。
【００３１】
本発明によれば、配列(I)中では、XaaiはGlyであってよい。
【００３２】
たとえば、本発明のペプチドは、添付の配列表の配列番号4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15および16から選択される配列を含むことができる。
【００３３】
本発明のペプチドは、固相化学合成によって、あるいは遺伝的組み換えによって得ることができる。したがって本発明は、前に定義した本発明によるペプチドを生成するための方法にも関するものであり、前記方法は前記ペプチドの固相化学合成を含む。化学合成は、たとえばApplied Biosystems,mod.433Aタイプの自動ペプチド合成機を用いて行うことができる。化学合成は、たとえばアミノ酸のα-アミノ機能を一時的に保護するためにフルオレニルメチルオキシカルボニル基を使用する、Fmoc化学法によって行うことができる。
【００３４】
本発明のペプチドは、以下のステップ:
a)核酸配列を発現ベクター中に組み込ませるステップであって、前記核酸配列が本発明のペプチドをコードしているステップ、
b)前記核酸配列を含む発現ベクターを宿主細胞中に導入するステップ、
c)前記ペプチドを合成することができる培養条件下で、前記核酸を含む宿主細胞を培養するステップ、
d)合成したペプチドを回収するステップ、および
e)TPAをC末端の位置にグラフトさせるステップ、
を含む方法によって生成させることもできる。
【００３５】
ペプチド合成のこの方法を行うための技術的要素は、当業者に知られている。たとえばこれらは、Sambrook,FritschおよびManiatisによる作品、MOLECULAR CLONING,A'LABORATORY MANUAL,2nd edition中に記載されている。ペプチドのC末端の位置にTPAをグラフトさせることは、ペプチドに適用可能な有機化学の従来的な方法によって行うことができる。
【００３６】
本発明者らは、免疫グロブリンのCDR2領域に似たCD4の領域の構造の一部分を再現しているペプチドのファミリーを合成しており、突然変異導入法および結晶学的な分析結果によって実証されるように、これらはCD4のウイルスタンパク質gp120への結合に必須である領域中にある。本発明のペプチドは、CD4、CD4標的細胞へのHIV-1の侵入に関する主な受容体と相互作用する、gp120糖タンパク質の領域に結合することができる。
【００３７】
本発明のペプチドは阻害剤のファミリーを構成しており、組み換えモノマーウイルス糖タンパク質gp120に関するその親和性は、0.1nM〜400nMの範囲のIC50値間で変化する。本発明のペプチドは、CD4の構造に基づくCD4-gpl20相互作用の特異的で強力な阻害剤である。組み換えウイルスタンパク質gp120との結合は、可溶性CD4と競合して起こり、正しく構造化された形に特異的である。
【００３８】
CD4の構造的および機能的模倣のために、これらのペプチドは以下に記載したさまざまな分野で使用することができる。
【００３９】
本発明のペプチドは、ELISAアッセイによって実証されたように、その組み換え形でHIV-1エンベロープに結合することができる。これらのペプチドによって、適切な蛍光プローブまたは放射性プローブで標識した後に、溶液中または細胞の表面のHIV-1エンベロープの存在を検出することが可能であり、したがって感染した細胞、したがってHIV-1感染の存在を検出することが可能である。
【００４０】
本発明のペプチドは、in vitroでの組み換えCD4-gpl20タンパク質間の相互作用を阻害し、これによって本発明のペプチドは、HIV-1LAIウイルス(主要な単離株)およびHIV-1LENウイルス(臨床単離株)の循環リンパ球への侵入を止めることもできる。実際、本発明の最も強力なペプチドは、100nMと900nMの間のED50でリンパ球感染を阻害することができる。したがってこれらの分子は、臨床用途が見出される抗ウイルス剤である。そのペプチド的性質のために、本発明のペプチドは、注射または注入によって、あるいは外部の局所的施用において使用することができる。
【００４１】
ウイルスタンパク質gpl20のCD4への結合を阻害する本発明のペプチドの能力は、ウイルス感染を阻害するこれらのペプチドの能力を実証するものである。なぜならこれらは、ウイルス侵入の第lステップのlつを妨げるからである。したがってこれらの侵入阻害剤は、抗ウイルス作用を有する成分である。したがって本発明のペプチドは、抗HIV療法において使用することができる分子である。
【００４２】
本発明のペプチドは、組み換えウイルスタンパク質gpl20およびエンベロープの立体配座の変化を誘導することができ、そのためCG10、17bおよび48Dなどの、CD4iと呼ばれる特異的なモノクローナル抗体により検出されることが可能である。したがって、これらの立体配座の変化は、CD4の結合によって誘導される変化と見かけ上類似している。したがって、本発明のペプチドが組み換えウイルスタンパク質gpl20およびウイルスエンベロープに結合することによって、正常ではCD4なしではアクセス可能ではない、エンベロープのエピトープが露出される。これらのエピトープは、HIV-1中和抗体を開発するために非常に重要である可能性のある、新規な抗原部位である。したがって本発明のペプチドは、ワクチン用途において、特にペプチドとウイルスエンベロープのタンパク質の複合体を含む調合物中に使用することができる。
【００４３】
本発明のいくつかのペプチドは、他のペプチドよりも、組み換えウイルスgpl20タンパク質に関して低い親和性を示す。これらのペプチドは、ウイルスエンベロープの機能形の精製においても、非常に広い実用性がある。具体的には、ウイルスタンパク質のこれらのペプチドへの結合は、より容易に可逆的である。このことを実証するために、本発明者らは、分子の活性表面に対向する側に結合した柔軟なアームを使用して、これらのペプチドの1つを、液体クロマトグラフィにおいて使用される親水性ポリマー支持体(セファロース4B)に共有結合させた。このようにして結合したこの分子は、依然として組み換えウイルスタンパク質gpl20と相互作用することができ、このウイルスタンパク質をポリマーマトリックス上に保持させることができる。したがってこの分子は、媒体を酸性化することによって分離させることができる。したがって、このようにして官能化した支持体は、組み換えウイルスタンパク質gpl20、および場合によっては他の形のウイルスエンベロープ、さらにウイルス全体を大規模な調製において精製することができる。
【００４４】
さらに本発明のペプチドを、ウイルスエンベロープタンパク質gpl20への結合に関する親和性を変えずに、たとえばフルオレセインまたはビオチンで標識、あるいは放射標識することができる。これらの標識したペプチドは、たとえば分子のスクリーニングを行うためのgpl20へのペプチドの結合に関しての競合に関する実験において、トレーサーとして使用することができる。使用することができる方法は、分子の相互作用の研究に関する文献中の、当業者に利用可能な方法である(たとえば[37、38、39および40]を参照のこと)。スクリーニング法では、本発明のペプチドとgpl20ウイルスタンパク質の間の相互作用を阻害することができる任意の分子が、CD4-gpl20相互作用の阻害剤、したがってウイルス感染の阻害剤であってよい。したがって、本発明のペプチドによって、gpl20タンパク質、またはgpl20と類似のタンパク質と相互作用することができる任意の分子、特に抗ウイルス活性がある分子または医薬品を製造するために使用される分子をスクリーニングすることが可能である。
【００４５】
したがって本発明は、医薬品を調製するための、前に定義した本発明によるペプチドの使用にも関する。
【００４６】
本発明は、抗ウイルス剤を調製するための、前に定義した本発明によるペプチドの使用にも関する。
【００４７】
本発明は、AIDSの治療を目的とする医薬品を調製するための、前に定義した本発明によるペプチドの使用にも関する。
【００４８】
本発明は、本発明によるペプチドとウイルスのエンベロープタンパク質の複合体を含むワクチンにも関する。ウイルスは前述したウイルスなどのAIDSウイルスであってよい。
【００４９】
本発明は、たとえばAIDSを診断するための診断用製品を製造するための、前に定義した本発明によるペプチドの使用にも関する。
【００５０】
本発明は、HIVのウイルスエンベロープの分子を検出するための、前に定義した本発明によるペプチドの使用にも関する。
【００５１】
本発明は、gpl20、またはその類似体とCD4分子の相互作用を阻害する分子をスクリーニングするため、抗ウイルス活性を有する分子をスクリーニングするため、および医薬品を製造するために有用である分子をスクリーニングするための、前に定義した本発明によるペプチドの使用にも関する。
【００５２】
本発明は、クロマトグラフィ用マトリックスを官能化するための固定リガンドとしての、前に定義した本発明によるペプチドの使用にも関する。
【００５３】
配列表および添付の図面を参照しながら、以下の実施例を読むことによって、より一層の利点が明らかになるであろう。
【００５４】
配列表の簡単な説明
添付の配列表によって、以下のペプチド配列を与える:
配列番号1はsCD4配列である。
配列番号2はシラトキシン(ScTX)の配列である。
配列番号3は、シラトキシン由来のペプチドのCD4M9配列であり、配列の位置1ではTPAを示さない。
配列番号4〜16は、本発明による、それぞれCD4M9T、CD4M26、CD4M27、CD4M27A、CD4M27B、CD4M27C、CD4M30、CD4M31、CD4M32、CD4M33、CD4M35、K15およびK16という名称の配列である。
配列番号17は、シラトキシン由来のCD4M3という名称の配列であり、配列の位置1ではTPAを示さない。
配列番号18は、カリブドトキシン由来のCD4MOという名称の配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
実施例１：本発明のペプチドの合成
この実施例では、Applied Biosystemsの自動ペプチド合成機、mod.433Aを用いた固相化学合成によって、およびアミノ酸のα-アミノ機能を一時的に保護するためにフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基を使用するFmoc化学法によって、本発明のペプチドを生成させた。このFmoc戦略において、アミノ酸の側鎖の副反応を防ぐために使用した保護基は、Ser、ThrおよびTyr残基に関しては第三級ブチルエーテル(tBu)、Asp、Gluに関しては第三級ブチルエステル(OtBu)、Gln、Asn、Cys、Hisに関してはトリチル(Trt)、Lysに関しては第三級ブチロキシカルボニル(Boc)、Argに関しては2,2,5,7,8-ペンタメチルクマロン-6-スルホニル(Pmc)であった。
【００５６】
樹脂(0.1mmol)に対して10当量過剰なアミノ酸(1mmol)を用いて、カップリング反応を起こす。1mlのN-メチルピロリドン(NMP)、およびNMP溶媒中に1Mの1-N-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)を溶かした1mlの溶液中に、保護アミノ酸を溶かす。次いで、1MのN,N'-ジシクロ-ヘキシルカルボノジイミド(DCC)溶液1mlを加える。40〜50分間かけて活性化させた後、形成された活性エステルを、樹脂を含む反応基中に移す。この移送のステップ、したがってカップリングの前に、NMP中に20%のピペリジンを溶かした溶液を用いて、そのFmoc基に関して樹脂を脱保護する。約5〜10分後に、過剰なピペリジンをNMPを用いた洗浄によって除去する。
【００５７】
脱保護中に、305nmでジベンゾフルベン-ピペリジン付加物を検出することによって、合成の正確な進行を追跡することができる。具体的には、付加物を定量化することによって、Fmoc基の脱保護、したがって取り込まれる最終的なアミノ酸のカップリングの有効性を評価することができる。
【００５８】
本発明のペプチド中に取り込まれる化学的修飾
蛍光プローブおよびビオチン基を、研究した本発明の2つのペプチド、CD4M9T(配列番号4)およびCD4M33(配列番号13)に結合させた。これら2つの化合物への取り込みは、残基リジン11上、ウイルスタンパク質gpl20の結合に関する部位に対向した表面上で起こった。リジンのこの選択は、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル基などの直交型と名付けられる保護基によって、リジンがその側鎖を保護する可能性によって条件付けした。実際このような基は、Fmoc基を脱保護するために使用される20%ピペリジンによる処理に関しては安定性があるが、2%ヒドラジン溶液による処理によって特異的に開裂する。ひとたびDde基が除去された後、フルオレセインおよびビオチンも結合させることができた。
【００５９】
フルオレセインの導入。本発明のペプチドCD4M33のリジン11の側鎖に、および、本発明のペプチドK15(配列番号15)またはK16(配列番号16)のリジン15または16それぞれの側鎖に、蛍光基を導入した。次いでDde基を使用して、ペプチド合成中にリジンの側鎖を保護し、次いでジメチルホルムアミド(DMF)中にヒドラジン2%を溶かしたものを用いた5分間の2回の処理によって切り離した。フルオレセイン分子は、合成したペプチドに直接、あるいは大きな分子で結合活性を害する可能性があるフルオレセインを引き離すために働くアームを介して結合させた。後者の場合、アームを導入することができる分子は、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸である。17当量のFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、60当量のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、および17当量の2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(HBTU)を、次いで1当量の樹脂に加える。周囲温度で1時間カップリングさせた後、20%ピペリジンを用いてFmoc基を脱保護する。次いで、N-ヒドロキシスクシンイミジルフルオレセイン5(6)-カルボン酸エステルを使用して、プローブのカップリングを行った。このために、4当量のフルオレセインの活性化エステルを、14当量のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)の存在下で、1当量の樹脂に加える。この反応は、NMP溶媒中で一晩行う。最後に、最終的な脱保護を行う。
【００６０】
ビオチンの導入。8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸というスペーサーアームを、第1ステップで、Dde基に関して事前に脱保護したリジン11に加えた。この反応は、前の段落に記載した反応と類似のものである。次いで、N-ヒドロキシスクシンイミジルビオチンアミド-カプロン酸エステルの形で、ビオチンを取り込ませる。4当量のビオチンの活性化エステルを、14当量のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)の存在下で、このようにして1当量の樹脂に加える。この反応は、周囲温度で一晩行う。その後、最終的な脱保護溶液を用いて処理する前に、樹脂を洗浄する。
【００６１】
チオール基の導入。前に記載した手順に従って、側鎖の保護基として位置11にDde基を有するリジンを有する、ペプチドCD4M9を合成する。このペプチドを合成した後、DMFに2%ヒドラジンを溶かした溶液を用いて、ペプチド-樹脂を5回処理する。リンカーアームのカップリングを、10当量のFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸を含むDMF中において、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で試薬HBTUを使用して、周囲温度において1時間行う。次いでFmoc基を、DMF中に20%のピペリジンを溶かしたものを用いて脱保護する。その後ペプチド-樹脂を、DIEAの存在下で、10当量のトラウト(Traut)試薬(2-イミノチオラン塩酸塩(Sigma))を用いて処理する。最後にペプチドを、以下に記載したように切り離し脱保護する。
【００６２】
樹脂の最終的な脱保護
樹脂の開裂、および側鎖中に存在する保護基の開裂を、樹脂に連結したペプチドをトリフルオロ酢酸(TFA)で処理することによって同時に行った。開裂を行う前に、樹脂をジクロロメタン(DCM)で数回洗浄し、最終的に乾燥させた。開裂において使用した試薬は、TFA81.5%、スカベンジャーフェノール(5%)、チオアニソール(5%)、水(5%)、エタンジチオール(2.5%)およびトリイソプロピルシラン(1%)を含む酸混合物である。周囲温度において攪拌しながら3時間、樹脂1グラム当たり溶液100mlの割合で、この混合物を用いて樹脂を処理した。このペプチドが遊離している溶液を、濾過によって回収した。次いでペプチドを沈殿させ、ジイソプロピルエーテル中において冷条件下で洗浄し、次いで20%酢酸中に溶かし凍結乾燥させた。
【００６３】
ジスルフィド架橋の形成による本発明のペプチドのフォールディング
凍結乾燥の後に回収したペプチド、合成原料は、還元された形である。すなわち、鎖内ジスルフィド架橋が形成されていない。これらの共有結合の形成は、酸化還元結合シスタミン/システアミンを使用して行った。合成原料は、2.0mg/ml-1にそれらを溶かすことを助長するために、0.1%(v/v)のTFAおよび6Mの塩酸グアニジンを加えた水中で採取した。次いでこの溶液を、0.2mg/ml-1に希釈して、100mMのTris/HC1、pH7.8、および5mMのシステアミンから構成される還元緩衝液に一滴ずつ加えた。反応後に45分間周囲温度で、0.5mMの最終濃度でシステアミン(酸化剤)を加えた。30分後に、培地をpH3.0にする。
【００６４】
システアミンによって、ペプチド上に存在するチオール基を還元することができる。野外では、システアミンは酸化し、システインの酸化、したがって鎖内ジスルフィド架橋の形成によるペプチドのフォールディングを可能にする。操作の終期に加えるシスタミンによって、フォールディングを完結させることができる。酸化の正確な進行は、粗生成物と酸化生成物の保持時間を比較する分析クロマトグラフィによって確認され、粗生成物の保持時間がより長い。
【００６５】
位置11にチオール基を示すペプチドCD4M9の酸化は、前章に記載した酸化とは若干異なる。pH7.8に調整した、200mMのNaClを含む20mMのリン酸緩衝液から構成されるフォールディング用の反応培地を、多量の時間をかけてアルゴンを用いて脱気し、次いで5mMのシステアミンおよび5mMのシスタミンを加える。次いで7つの遊離SH官能基を含むペプチドを加え、フォールディングおよび3つの本来のジスルフィド架橋を形成するには充分長く、充分な酸化状態に対応する副産物の形成を制限するには充分短い量の時間であるわずか10分後に、酸を加えることによって酸化反応を停止させた。
【００６６】
本発明のペプチドの精製
Vydac C18調製カラム(1.0×25.0cm)上での逆相高速液体クロマトグラフィによって、本発明のペプチドを精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液中のアセトニトリルの0〜60%直線勾配を、90分を超えて使用した。主要ピークの分画を分析HPLCによって分析し、ただ1つのピークを示す分画を保存し凍結乾燥させた。このようにして得た生成物を、質量分析法によって分析した。
【００６７】
実施例２：間接的ELISAによる競合アッセイ
rgpl20-CD4相互作用の阻害を、間接的ELISA(酵素免疫検定法)によって測定した。96ウエルのプレート(Maxisorb,Nunc)上に4℃で一晩、1ウエル当たり50ngの抗gp120抗体D7324を固定した。ウシ血清アルブミンを用いて受動免疫化し、洗浄用緩衝液(10mM Tris、pH 7.8、0.05% Tween20)で3回洗浄した後、1ウエル当たり15ngのrgp120H×B2を加えた。次いで、さまざまな濃度の競合剤を加え、3回洗浄した後、1ウエル当たり0.4ngの可溶性CD4も加えた。可溶性CD4のみを含む100%の対照を作製した。4℃で一晩培養し3回洗浄した後、5ngのマウス抗CD4抗体L120.3、次にペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗マウスIgG抗体(GAMPO)を1ウエル当たりに加えた。ペルオキシダーゼ用の蛍光基質、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを加えることによって、暴露を行った。2Mの硫酸を加えることによって30分後に、反応を停止させた。rgpl20-CD4相互作用の阻害は、450nmにおける吸光度Aを読み取ることによって計算した。競合剤を含まない対照によって、吸光度A100%(競合剤の不在下での吸光度)を決定することができた。それぞれの濃度の本発明のペプチドに関する阻害のパーセンテージは、以下の式を使用して計算した:
阻害のパーセンテージ=100×(A100%-A)/A100%。
【００６８】
これらのアッセイは全く同一に行い、その結果は実験の複製値の平均として表した。
【００６９】
カリブドトキシン由来のペプチドCD4MO(配列番号18)、およびシラトキシン(配列番号2)由来のペプチドCD4M3(配列番号17)の生物学的活性を、間接的ELISAアッセイによりアッセイした。これらのペプチドは、それぞれ4.0×10-5Mおよび2.0×10-5Mという50%阻害濃度(すなわちIC50)で、rgp120LAI-可溶性CD4相互作用を阻害する能力を示す(表1)[4]。これらの値は、可溶性CD4によって与えられるIC50(IC50=4.0×10-9M)より10000倍大きい[4]。
【００７０】
添付の図1は、本発明のペプチドに関して、この実施例で得られた結果を一まとめにしたものである。
【００７１】
これらの結果は、競合剤のモル濃度(C(M))の関数としてのウイルスタンパク質gp120H×B2-CD4の、すなわち本発明のペプチドの結合のパーセンテージ(%F)を表すものである。この図は、CD4-gp120H×B2の相互作用の阻害を示す。
【００７２】
CD4M9(配列番号3)を、ELISAの競合によってアッセイした。CD4M9は、4×10-7Mという50%阻害濃度(すなわちIC50)で、rgp120LAI-可溶性CD4相互作用を阻害する能力を示し(表1)、本発明のペプチドCD4M3(配列番号17)と比較して阻害能力が50倍増大している。本発明のペプチドCD4M9は、競合ELISAアッセイにおいて、0.1×10-6Mと1.0×10-6Mの間の50%阻害濃度(すなわちIC50)で、T細胞指向性ウイルスおよびマクロファージ指向性ウイルス:HIV-1IIIB、HIV-1MN、HIV-1Ba-L、HIV-1JR-FL、HIV-1W61Dを起源とする他の組み換えgp120タンパク質と、CD4の相互作用を阻害することもできる[4]。
【００７３】
このペプチドは、9×10-8MというIC50で、gp120H×B2-可溶性CD4相互作用を阻害する(図1、表1)。
【００７４】
Valを有するCD4M9のC末端配列Gly-Proの置換体を含む変異体CD4MVは、gp120LAI-CD4相互作用の阻害において3.0×10-7MというIC50を示し(表1)、これによって阻害能力のわずかな増大が示される。変異体CD4M9Dipは、CD4M9と比較して置換体Phe23Dipを含む。このペプチドは、gp120LAI-CD4相互作用の阻害において1.0×10-7MというIC50を示し(表1)、これによって阻害能力のさらなる増大が示される。C末端Cysアミノ酸の代わりとしてチオプロピオン酸を含む、変異体CD4M9T(配列番号4)は、gp120LAI-CD4相互作用の阻害において3.0×10-8MというIC50を示し(図1;gp120H×B2相互作用におけるIC50は1.1×10-8Mである、表1)、これによってCD4M9と比較して阻害能力の10倍近い増大が示される。
【００７５】
以下の変異体はすべて、それぞれN末端およびC末端位置に、チオプロピオン酸(TPA)残基およびバリン(ValまたはIle)残基を示し、これらはいずれもT細胞指向性ウイルスHIV-1H×B2およびHIV-1LAI由来のgp120を用いて試験した。
【００７６】
本発明のペプチドCD4M27(配列番号6)は変異Arg5Phe(非必須アルギニンを除去し、ジスルフィド架橋6〜24を保護するために)、およびGly27Val、およびC末端プロリン残基の欠失体(β構造により良い安定性を与えるため)を含む。CD4M27は、CD4-gp120H×B2結合を阻害するための能力の増大、7×10-9MというIC50を示す(図1、表1)。ペプチドCD4M27で始まる変異Gly2lSer(a)、Ser22His(b)およびSer22Asn(c)によって、ペプチドCD4M27A、BおよびCをそれぞれ得る。これらのペプチドは、ペプチドCD4M27の阻害能力に匹敵する阻害能力を示す。
【００７７】
本発明のペプチドCD4M32(配列番号12)は、CD4M9Tと比較して、C末端プロリン残基の欠失体、変異Gly27ValおよびPhe23からジフェニルアラニン(Dip)への変異を含む。変異Phe23Dipは疎水性の延長部がPhe23の側鎖に加えられており、したがってウイルスタンパク質gpl20の疎水性空洞との相互作用が高まる。CD4M32はCD4-gp120H×B2結合の阻害の増大を示す(8×10-8MというIC50、図1)。変異体CD4M30(配列番号10)は、CD4M32と比較して、分子の溶解度を増大させるために、変異Arg5Phe(CD4M27中に既に導入されている)およびAla4GInを含む。本発明のこのペプチドは、CD4-gp120LAI相互作用の阻害に関するアッセイにおいて、3.0nMというIC50を示す。変異体CD4M33(配列番号13)は、2つの前述のペプチド中に存在する変異、特にCys1TPA、Arg5Phe、Phe23Dip、GlY27Val、C末端位置の残基の欠失体、さらに変異Ala4His(分子の溶解度を増大させるため)を含む。これらの変異には追加的な効果があり、本発明のペプチドCD4M33が1.2×10-10Mおよび2.5×10-10MというIC50でCD4-gp120H×B2およびCD4-gp120LAI相互作用を阻害するのを可能にする(図1および表1)。すなわち、CD4M9と比較してCD4-gp120結合を阻害する能力が1000倍増大する。追加のペプチドCD4M35(配列番号14)を、本発明のペプチドCD4M33と比較して、変異Va1271leおよびGly2l(D)Aspを用いて合成した。これらの変異体によって、本発明のペプチドは、7.O×1O-11MというIC50でCD4-gp120H×B2相互作用を阻害することができる(図1、表1)。
【００７８】
2つの他のペプチド、K15(配列番号15)およびK16(配列番号16)を合成した。これらのペプチドは、本発明のペプチドCD4M33と比較して、置換体Gln7Val、Leu8G1nおよびLysllHis、および位置15または16にLys残基をそれぞれ含む。次いでフルオレセイン蛍光基を、実施例1に記載したプロトコルに従って、このリジン残基の側鎖に共有結合させた。蛍光性K15およびK16ペプチドは、gp120LAI-CD4相互作用の阻害において5.O×10-8Mおよび6.0×10-9MというIC50を示し、ウイルスタンパク質gp120に関する親和性が標識によって変わることはない。
【００７９】
結論として、本発明は、CD4-gpl20相互作用の強力な阻害剤であるペプチドのファミリーを提供する。
【００８０】
表１
ウイルスエンベロープタンパク質gp120LAIおよびgp120H×B2に関する、可溶性組み換えCD4の相互作用における、CD4模倣ペプチドの50%阻害濃度(IC50)。それぞれの値の標準偏差は30%未満である。
【００８１】
【表１】
2004535366.tif 000003
【００８２】
実施例３：表面プラズモン共鳴法による実験
表面プラズモン共鳴法による実験を、Biacore2000システム(Biacore,Uppsala,Sweden)を用いて行った。試験したペプチドは、ビオチンに結合させ(前に記載したように)、次いでストレプトアビジンを予め結合させたチップ上に固定した。
【００８３】
ストレプトアビジンは、以下のようにしてチップ上に固定した:製造者によって提供され、アミド結合を形成することができるカップリング剤:N-エチル-N'(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)/N-ヒドロキシ-スクシンイミド(NHS),50/50を50μL注入することによって、チップの表面を最初に活性化させ、次いで、10 mMの酢酸ナトリウム中にストレプトアビジン20μLを0.2 mg.mL-1で溶かしたもの、pH4.5を、5μL.min-1で注入し、次に2×20μLの1.0Mエタノールアミン、pH8.5で活性化したカルボキシル基を中和させた。次いでビオチン化させた分子を、チップの4つのレーンのうちの3つに注入した(10μL.min-1、0.3MのNaC1を含む10mM Hepes緩衝液中、pH7.4)。第1のレーンには、CD4M9(10-7M)を100というRU(共鳴単位)値まで固定させ、第2のレーンは未使用のままにしておき(対照)、第3のレーンは450RUという値まで可溶性CD4(10-7M)で覆い、第4のレーンには、100RUという値でCD4M33(10-7M)を固定させた。それぞれの分析用に、いくつかの濃度のさまざまなgp120(株HXB2、BALおよびJRFL)を、4分という会合時間で、25℃において50μL.min-1の割合で注入した。次いでチップをランニングバッファー、150mMのNaCl、3.4mMのEDTAおよび0.05%のP20を含む10mM Hepes、pH7.4ですすいで、解離相を分析する。それぞれの実験の後、1.0Mのギ酸25μLを用いて、チップを再生させる。解離定数は、Bia-evaluation 3.0ソフトウェアによって決定された反応速度定数から計算する。
【００８４】
実施例４：CD4模倣体の抗ウイルス活性
L3-タイプの安全性の高い研究室中において、感染性物質の取り扱いを行った。
生理病理学的条件にできる限り近づけるために、ヒト末梢血液中の単核細胞(PBMC)の初代培養物を使用して、この研究を行った。すべての実験において、新しい分子の影響をAZTのそれと比較した。
【００８５】
細胞の単離、培養および活性化
培地
培地Aは、+56℃で30分間かけて熱により補体除去した10%のウシ胎児血清(SVF,Roche Product)を補った、RPMI1640細胞培養基(Life Technologies)、2mMのL-グルタミン(Roche Product)、および3つの抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン;PSN,Life Technologies)の100pg/mlの溶液から構成されている。培地Bは、20UI/mlの組み換えヒトIL-2(Roche Product)を補った培地Aからなる。
【００８６】
PBMCの単離および活性化
フィコール(MSL2000,Eurobio)比重遠心分離法によって、血液の他の代表的な要素から、PBMCを分離する。3分の1に希釈した健康なドナーからの30mlの血液を、20mlのフィコールクッション上に堆積させる。850gで20分間遠心分離した後、PBMCの環を除去し、次いで750gで10分間、400gで5分間遠心分離した後、RPMI1640で2回洗浄する。次いで、1μg/mlのフィトヘマグルチニン-P(PHA-P;Difco Laboratories)を用いて48時間、PBMCを活性化させる。湿度が飽和状態である雰囲気中、5%C02下で、PBMCを+37℃で培養する。48時間の細胞分裂活動の終期に、細胞を培地B中で培養する。培養全体を通して、培養の上澄み液をサンプル採取し、培養基は3日または4日毎に再生させる。培養基を再生するたびに、細胞の生存能力を顕微鏡による観察によって評価する。
【００８７】
分子の抗ウイルス活性の評価
注入可能物質(Aguettant)用に、本発明の化合物CD4M30、CD4M33およびCD4M35を滅菌水中に溶かし、等分し、次いで-20℃で保存した。化合物SAH-CD4(Aventis(Vitry-sur-Seine)によって提供されるヒト血清アルブミンに結合した可溶性CD4)は、それを使用するまで-80℃で保存した。次いで溶液および希釈液を、培地Aにおいて必要に応じて調合した。これらの化合物を用いて1時間PBMCを前処理し、リンパ球指向性を有する参照単離株であるHIV-1LAI、または臨床単離株HIV-1LENによって次いで感染させた。この単離株の生物学的特徴は、シンシチア形成の誘導(SI)、X4が迅速/充分であることである。したがってこの単離株は、リンパ球を優先的に冒すことができる。1μg/mlのPHA-Pで前処理し培地B中で培養した、へその緒の血液中の単核細胞(UCBMC)を使用して、この株をin vitroで増幅させることによって、ウイルスストックを作製した。サイトカインなどの可溶性因子を除去するために、培養上澄み液を360000gで5分間超遠心分離にかけ、RPMI1640中にペレットを再懸濁させた。次いで、このようにして作製したウイルスストックを、PHA-P-活性型PBMCを使用して力価測定した。TCID50(50%組織培養感染用量)を、Karberの式を使用して計算した。PBMCをさまざまなウイルス用量、株HIV-1LAIの10〜100TCID50、および株HIV-1LENの50TCID50で感染させた(感染多重度m.o.i.=0.001)。
【００８８】
培養上澄み液中のウイルス複製のアッセイ
Innovagen社の推奨に従いRetroSys(登録商標)アッセイ用キットを使用して、培養上澄み液中の逆転写酵素の活性をアッセイすることによって、培養第7日目にウイルス複製を測定した。
【００８９】
結果の分析および50%有効量の決定
J.ChouおよびT.C.Chouによって開発されたソフトウェア「Dose-effects analysis with microcomputers」を使用して、50%有効量(ED50)を計算する。
【００９０】
実施例５：組み換えウイルスタンパク質gp120を生成するためのプロトコル
BamHI(ウイルスタンパク質gp120のKpnI部位の上流)およびPstI(ウイルスタンパク質gp120の配列の端に加えられた停止コドンの下流)部位を含む断片を生成させることができる2つのプライマーを使用して、プラスミドHIVTIIB/HXB2RにおいてPCR法により、ウイルスタンパク質gp120(アミノ酸V12〜R481)をコードする断片を増幅させた。このようにして得たBamHI/PstI断片をBluescriptベクター(pBS,Stratagene)にクローン化させ、プラスミドpBSm1を生成させた。ウイルスタンパク質gp120のN末端(T1〜G11)をコードしている配列、およびバキュロウイルスの核多角体のエクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼのシグナルペプチドをコードしている配列も、pBSm2を生成するpBSmlのBamHI部位とKpnI部位の間に挿入した。
【００９１】
次いでpBSm2のBamHI-PstI断片を、バキュロウイルスP10のトランスファーベクターp119PのBglII-PstI部位間に挿入した。Sf9昆虫細胞を、改変型バキュロウイルスAcSLPIOの精製したウイルスDNAおよび組み換えベクターp119Pgp120のDNAと共に、共トランスフェクトした。組み換えウイルスは、標準的な方法によって精製した。
【００９２】
血清を含まない倍地中のSf9scla細胞(パスツール研究所の収集所に寄託された、無血清で成長するようにした細胞系)を、スピナー中に保った。次いでこれらの細胞(5×105個の細胞/mL)を、細胞1個当たり1PFU(プラーク形成単位)の感染多重度で、組み換えウイルスを用いて感染させ、28℃で培養した。6日間培養した後、細胞を遠心分離(500g)にかけ、野生型gp120ウイルスタンパク質を濃縮させ、抗gp120抗体D7324に結合したブロモアセチル化セファロースのカラム上での、親和性クロマトグラフィによって培養上澄み液から直接精製した。
【００９３】
実施例６：ウイルスエンベロープの結合
その生物学的活性をより完全に特徴付けるために、実施例1に記載したようにビオチンおよびフルオレセイン蛍光プローブで、本発明のペプチドCD4M33(配列番号13)を、本発明のペプチドCD4M33の活性表面に対向する表面上に位置するLys-11において標識した。ELISAアッセイ中、その活性は変化しない(図2)。
【００９４】
図2は、この実施例で得られた結果を一まとめにしたものである。これらは、本発明のペプチドとウイルスタンパク質gp120H×B2の結合のパーセンテージ(%F)の展開を、これらのペプチドのモル濃度(C(M))の関数として示す曲線である。
【００９５】
これらの結果によって、ペプチドCD4M33は、その生物学的活性を変えることなく標識基を取り込むことができることが示される。
【００９６】
ウイルスタンパク質gp120に関する本発明のペプチドCD4M33の親和性の第1の評価を得るために、表面プラズモン共鳴法による検出に基づく、生物特異的な相互作用の分析(実施例3に記載)を使用した。この技法では、本発明のビオチン化ペプチドCD4M33(実施例1と同様に調製したもの)を、ストレプトアビジンを予めグラフトさせたチップのカルボキシル化デキストランマトリックスに特異的に結合させた。次いで、さまざまな組み換えgp120タンパク質(gp120H×B2、gp120BALおよびgp120JRFL)の溶液を、このマトリックスに注入し、特異的で充分親和的な会合を示すシグナルを次いで検出した。図3は、gp120H×B2タンパク質(異なる濃度のもの)と本発明のペプチドCD4M33が相互作用した後の、プラズモン共鳴シグナルの展開を、時間の関数として示す。
【００９７】
会合および解離曲線の非線形回帰を得た後、ウイルスタンパク質gp120H×B2に関しては2.4×10-9Mという解離定数KDを得て、ウイルスタンパク質gp120BALに関しては7.4×10-9Mという解離定数KDを得て、ウイルスタンパク質gp120JRFLに関しては8.5×10-9Mという解離定数KDを得る。これらの値は、CD4-gpl20相互作用に関して文献[34]中で報告される、KD=1.9×10-8Mという値に匹敵する。表面プラズモン共鳴法による検出に基づく、同じ技法も使用して、本発明のペプチドCD4M33がその元の形で、ウイルスエンベロープに結合することができたかどうか確認した。これを行うために、アルドリチオール-2を用いて不活性化させたウイルス粒子の懸濁液[35]を同じチップに注入し、抗体48dおよびCG10とグラフトさせた。したがって、活性がはるかに低いペプチドCD4M9と共に、あるいはペプチドの不在下でウイルス懸濁液を培養したときではなく、本発明のペプチドCD4M33と共に懸濁液を培養したときに、特異的で充分親和的な相互作用に関するシグナルをはっきりと検出した(図4)。
【００９８】
図4は、ウイルスエンベロープとウイルスエンベロープ特異的な抗体48dおよびCG10の相互作用にはペプチドCD4M33の存在が必須であり、HIV-1はペプチドCD4M33の不在下では抗体に結合しないことを示す。これは、ペプチドCD4M33のHIV-1のウイルスエンベロープへの結合を間接的に実証するものである。
【００９９】
これらの実験によって、標識型または非標識型の本発明のペプチドCD4M33は、単離および精製された組み換え形の、およびウイルスの表面に存在するその元の形である、HIVウイルスのエンベロープに結合する能力を有していることが実証される。
【０１００】
実施例７：HIV-1による感染の阻害
本発明のペプチドの抗ウイルス能力を評価するために、本発明者らは、HIV-1LAIウイルス、およびヒト末梢血液中の単核細胞(PBMC)の初代培養物の化学的単離株HIV-1LENによる感染からなる実験を行った。すべての実験において、新しい分子の影響をAZTのそれと比較した。さまざまな濃度のCD4M30、CD4M33、CD4M35およびSAH-CD4の存在下で、HIV-1LAIウイルスをさまざまなウイルス用量(10〜100TCID50、表2)で加えた。CD4M33の存在下で、TCID50でHIV-1LENウイルスを加えた(表4)。CD4模倣体の毒性試験も、同じ細胞に行った。
【０１０１】
a.CD4模倣体の毒性。試験した用量では、化合物AZT、SAH-CD4または抗CD4模倣体のいずれも、PHA-P活性化PBMCの生存能力を低下させることはなかった。
【０１０２】
b.CD4模倣体の抗HIV-1LAI活性
b.1.PBMC内の株HIV-1LAIの複製。株HIV-1LAIは、PHA-P活性化PBMC内で高レベルで複製する。ウイルス複製のピークは培養の第7日目であり、ペプチドCD4M30、CDM33およびCD4M35の影響を、感染後のこの期間に定量化した。
【０１０３】
b.2.PBMC内の株HIV-1LAIの複製に対するAZTの影響。AZTは、PHA-P活性化PBMC内の株HIV-1LAIの複製を強く阻害する(表2)。ED50は、3〜14nMに等しい。
【０１０４】
b.3.PBMC内の株HIV-1LAIの複製に対する化合物SAH-CD4の影響。PHA-Pを用いて活性化させ株HIV-1LAIによって感染させたPBMCに関する、化合物SAH-CD4の抗レトロウイルス活性によって、2.5μMの濃度でウイルス複製の85±15%の阻害がもたらされる。
【０１０５】
b.4.PBMC内の株HIV-1LAIの複製に対するCD4模倣体の影響。本発明のペプチドCD4M30、CD4M33およびCD4M35は、PHA-Pを用いて活性化させ株HIV-1LAIによって感染させたPBMCの培養物において、抗レトロウイルス活性を示した(表3)。化合物CD4M33は、試験したさまざまなウイルス用量において、3つの中で最も抗ウイルス性がある。CD4M33の活性は、AZT:ED50=100〜500nM対AZT:ED50=3nM(以下の表3を参照)の活性より少ないが、CD4受容体の誘導体SAH-CD4の活性よりも常用対数で少なくとも1大きい。
【０１０６】
図5A〜Cは、得られた結果、ペプチドの濃度(nM)の関数としての阻害のパーセンテージ(%I)を一まとめにしたものである。
【０１０７】
c.臨床単離株HIV-1LENに関する化合物CD4M33の抗レトロウイルス活性
c1.PBMC内の単離株HIV-1LENの複製に対するAZTの影響
AZTは、PHA-Pを用いて活性化させ株HIV-1LENによって感染させたPBMCにおいて、2.2nMに等しいED50で、株HIV-1LENの複製を強く阻害する(表4)。その阻害の程度は、リンパ球指向性を有する参照単離株であるHIV-1LAIに関して観察した阻害の程度と同一である。
【０１０８】
c2.PBMC内の臨床単離株HIV-1LENの複製に対する模倣体CD4M33の影響
PHA-Pを用いて活性化させ単離株HIV-1LENによって感染させたPBMCに関する、模倣体CD4M33のレトロウイルス活性は、用量依存性であるウイルス複製の低下と関係があり、ED50は367nMに等しい(表4)。したがって、模倣体CD4M33は、充分な抗HIV-1活性を維持しているが、ただしそれは株HIV-1LAIに関して観察される活性と比較してわずかに低いことが見出されている。
【０１０９】
これらの実験によって、本発明のこれらのペプチドは、高いウイルス用量でも、900〜35nMというED50値で、細胞の感染を阻害することができることが実証される(以下の表3)。本発明のペプチドCD4M33は最も抗ウイルス性であり、そのED50は、感染の標準的なウイルス用量に関しては約100nMである(図4a〜c、以下の表3)。
【０１１０】
さらにペプチドCD4M33は、他のCD4受容体の誘導体SAH-CD4に関して観察された活性よりも、常用対数で1大きい抗レトロウイルス活性を有しており、特に臨床単離株に関して充分な抗HIV活性を示した(表4)。
【０１１１】
結論として、2.4〜8.0nMのKd(表面プラズモン共鳴法による実験)で組み換えウイルスタンパク質gp120に結合することができ、ELISAにおいて120〜250pMというIC50値でCD4-gpl20組み換えタンパク質間の相互作用を阻害することができる、本発明のペプチドCD4M33は、ヒト細胞の初代培養物においてこの相互作用を阻害する能力、侵入の最初のステップを阻害する能力、したがってHIV-1臨床単離株の感染さえも遮断する能力も示す。
【０１１２】
表２
PHA-Pを用いて活性化させたPBMC内の株HIV-1LAIの複製に対するAZTの影響。これらの結果は、阻害のパーセンテージ±標準偏差として表す。
【０１１３】
【表２】
2004535366.tif 000004
【０１１４】
表３
フィトヘマグルチニン-P(PHA-P)を用いて活性化させ、さまざまな感染用量(TCID50:50%組織培養感染用量)の株HIV-1LAIによって感染させた、ヒト末梢血液中の単核細胞(PBMC)の培養物における、本発明のペプチドおよびAZTの50%有効量(ED50)。
【０１１５】
【表３】
2004535366.tif 000005
【０１１６】
表４
フィトヘマグルチニン-P(PHA-P)を用いて活性化させたヒト末梢血液中の単核細胞(PBMC)の培養物における、臨床単離株HIV-1LENの複製に対するAZTおよび模倣体CD4M33の影響。細胞は、50TCID50のウイルスによって感染させた。
【０１１７】
【表４】
2004535366.tif 000006
【０１１８】
実施例８：エンベロープの抗原部位の露出
中和抗体に感受性があるエピトープの露出によって特徴付けられるgpl20タンパク質の立体配座の変化を、本発明のペプチドCD4M33が誘導する能力を評価するために、48dおよびCGlOなどのヒト抗体とHIVエンベロープの相互作用を、CD4M33、および比較のために組み換えCD4の存在下で、表面プラズモン共鳴法による技法を使用して行わせた。抗体48dおよびCGlOは、チップ(バイオチップ)の表面に共有結合させ、CD4の不在下、および過剰なCD4およびCD4M33の存在下で、gp120の溶液を注入した。CD4M33を1.5倍および20倍モル過剰でウイルスタンパク質gp120H×B2に加えると、このウイルスタンパク質は、抗体との強い相互作用を示し(図6a〜b)、一方CD4M33の不在下(および可溶性CD4の不在下)では、エンベロープタンパク質は、抗体と非常に弱く相互作用する(図6a〜b)。さらに、抗体に関するウイルスタンパク質gpl20の相互作用の親和性の増大に対する、CD4M33を加えることの効果は、等量の可溶性CD4を加えることによって得られる効果に匹敵する。
【０１１９】
本発明者らは、HIV-1、株HXB2を直接使用する、類似の表面プラズモン共鳴実験も行った。図4は、これらの実験で得られた結果を示し、HIV-1H×B2ウイルス粒子の懸濁液と固定抗体48dおよびCGlOを陳列したチップが相互作用した後の、プラズモン共鳴シグナルの展開を、時間の関数として示すものである。本発明のペプチドCD4M33と共に培養した後でのみ、HIV-1は抗体と相互作用し、一方CD4M33の不在下、あるいは不活性ペプチド[Ala23]CD4M9の存在下では、この相互作用はほぼゼロである。
【０１２０】
したがって、表面プラズモン共鳴法による技法によって、CD4M33がエンベロープタンパク質gp120に結合することにより、後にいくつかの分子表面をHIV-1によって感染させた個体から単離した中和抗体(17b、CG10)に優先的に露出させる、ウイルスタンパク質の改変を誘導することができることを、実証することができた[11]、[12]、[13]。
【０１２１】
本発明のペプチドCD4M33によって誘導される、これらの被覆されたエピトープの露出は、組み換え形であるエンベロープのタンパク質、およびビリオンのエンベロープの両方において有効である。さらに、CD4と複合体形成したgp120タンパク質は、中和抗体の形成を誘導することができる分子形である可能性があることを示している[31、32、33]、近年の実験を鑑みると、したがってCD4M33-gp12O複合体は、中和抗体を誘導するための免疫原として、特にワクチン用途において非常に有利な候補である。
【０１２２】
CD4M33には、可溶性CD4と同様に、ウイルスタンパク質gp120のエピトープを露出させる性質があり、かつCD4M33はCD4に対する免疫応答を誘導することができず、さらにその小さなサイズのために、ウイルスタンパク質gp120の露出したエピトープへのさらに好ましいアクセスが可能であろうという利点がある。
【０１２３】
実施例９：HIVウイルスエンベロープを精製するためのクロマトグラフィ用支持体の合成
ウイルスタンパク質gp120を精製するためのクロマトグラフィ用マトリックスを官能化するための固定リガンドとして、本発明のCD4模倣体ペプチドを使用する可能性を評価するために、親水性ポリマー支持体、セファロース4B(Pharmacia,Uppsala,Sweden)に我々のCD4模倣体の1つを用いて機能性を与え、次いでウイルスタンパク質の培養基から直接のウイルスタンパク質gp120を結合させるためにこれを使用した。支持体からのgp120タンパク質の溶出中のあまりに苛酷な条件を使用することを避けるために、したがって変性の可能性を制限するために、ウイルスタンパク質gp120に関して親和性の低いリガンドを選択した。ELISAによって、HIV-1単離株に応じて、0.1μMと1.0μMの間のウイルスタンパク質gp120に関する親和性(IC50)を示すのはCD4M9である。前述の標識で既に使用した、CD4M9を位置リジン11において改変して、追加的なチオール基を含ませ(実施例1に記載)、次いで以下に記載したように、セファロース4B支持体上でのその共有的な固定用にこれを使用した。
【０１２４】
乾燥樹脂1ml当たり7〜12μmolの一級アミン官能基を含む樹脂EAH セファロース(商標)(Pharmacia Biotechによって市場に出されている)に、マレイミド基を用いて官能化する。このために、24mlの水中で予め平衡状態にした12mlの樹脂を、1.05mgの試薬スルホ-SMCC(4-(N-マレイミドエチル)-シクロヘキサン-l-カルボン酸の3-スルホ-M-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Sigma))で12時間処理し、pHを約4.5に保つ。置換の予想される程度は、乾燥樹脂1ml当たり200nmolのマレイミド官能基である。次いで、100mMのTris-HC1、500mM NaCl、pH8.0、さらに次いで500nMのNaClを含む100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0を用いた連続的な洗浄によって、過剰な試薬を除去する。次いで残りの遊離アミン官能基を、1%無水酢酸溶液を用いた2回の処理によってアセチル化させる。3.8mgのチオール化ペプチドCD4M9を、マレイミドを用いて官能化した樹脂に加える。この反応混合物を4℃で12時間攪拌する。次いで、この樹脂を洗浄し、緩衝液、20mMのリン酸ナトリウム、100mMNaC1、pH7.4を使用して平衡状態にする。このマトリックスを用いて、約0.1mg/mlの本発明による固定ペプチドCD4M9を含む、6.0mlのクロマトグラフィ用カラムを作製した。次いで、このカラムにgp120培養基を充填し、次いでカラムに保持されているウイルスタンパク質を、0.5Mの酢酸で処理することによってカラムから溶出させた。次いで酢酸を用いて溶出させた分画をSDS-PAGEにより分析し、次いで凍結乾燥させた。これらの分画を分析することによって、これらがウイルスタンパク質gp120を含んでいたことが実証された。
【０１２５】
図8は、この実施例で得られたクロマトグラフィの概略、分単位の時間(t(分))の関数としての280nmでの吸光度(A280)を示すグラフである。
【０１２６】
図8のクロマトグラフィの概略は、いくつかのエンベロープタンパク質の溶出ピークを示す。本発明者らは、さまざまなピークが、カラムからの溶出で使用される酢酸により引き起こされる変性の程度がさまざまである、ウイルスタンパク質gp120を示すと考えている。
【０１２７】
実施例１０：スクリーニング
本発明の分子を、ウイルスタンパク質gp120への結合に関する親和性を変えずに、フルオレセインまたはビオチンで標識した。
【０１２８】
この実施例では、蛍光ランタニド金属または放射性同位体を用いて、ウイルスタンパク質gp120に関する本発明のペプチドの結合活性を変えずに、標識を行った。これらの標識ペプチドは、これらのペプチドとウイルスタンパク質gp120の相互作用を競合的にスクリーニングすることからなる実験で、トレーサーとして使用する。
【０１２９】
第1の実験では、ウイルスタンパク質gp120を96ウエルのマイクロプレートに固定し、ランタニド系ユーロピウム(III)で標識したペプチドCD4M33を、CD4M33ペプチドとgp120タンパク質の間の相互作用を可能にする条件下で、このタンパク質と接触させる。シグナル測定(たとえば時間分解蛍光測定)によって、スクリーニングする分子が標識したペプチドに取って代わる能力を定量化することができる。
【０１３０】
第2の実験では、ペプチドCD4M33をフルオレセインで標識し、ウイルスタンパク質gp120に結合させ、小型化した系における溶液中での蛍光偏光度の測定によって保護する。
【０１３１】
CD4-gpl20相互作用を阻害することができる分子をスクリーニングするために使用する、これら2つの系は制限的なものではない。このスクリーニングによって検出される分子は、CD4-gpl20相互作用の阻害剤、したがってウイルス感染の潜在的な阻害剤である。
【０１３２】
この実施例で使用する実施技法は文献中、特に書物[37、38、39および40]中に記載されている。
「参照文献」
2004535366.tif 000007
2004535366.tif 000008
2004535366.tif 000009
2004535366.tif 000010
2004535366.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】競合ELISAによって得られた、本発明のペプチドに関する、CD4のウイルスタンパク質gp120への結合の阻害の曲線を示す図である。試験したペプチドはCD4M9、CD4M9T、CD4M27、CD4M32、CD4M33およびCD4M35である。実験データは、ペプチド濃度の関数としての結合のパーセンテージ(%F)として与える。
【図２】競合ELISAによって得られた、標識したペプチドCD4M33-フルオレセイン、CD4M33-Fに関する、CD4のウイルスタンパク質gp120への結合の阻害の曲線を示す図である。ペプチドCD4M9(配列番号3)、CD4M33(配列番号13)およびCD4M35(配列番号14)に関する曲線も、比較用に示す。実験データは、ペプチド濃度の関数としての結合のパーセンテージ(%F)として与える。
【図３】表面プラズモン共鳴法用装置のチップの表面に結合した、組み換えウイルスタンパク質gpl20-HXB2とペプチドCD4M33(配列番号13)の相互作用の曲線を示す図である。濃度13.2(l)、19.8(2)、29.6(3)、44.4(4)、66.6(5)および100(6)nMでウイルスタンパク質gpl20を注入した後に、会合(0〜300秒)および解離(300〜800秒)曲線を記録した。データは、秒単位の時間(t)の関数として共鳴単位(RU)で与える。
【図４】ペプチドCD4M33(10μg/ml)の存在下、不活性ペプチド(Ala23)CD4M9(CD4M9のペプチド配列中のAlaに代わるPhe23)(10μg/ml)の存在下、およびペプチドの不在下での、表面プラズモン共鳴法用装置のチップの表面に結合した、AT-2を用いて不活性化させたHIV-1[34]と、抗体48d[11](a)およびCG10[35](b)の相互作用の曲線を示す図である。20℃で1時間ペプチドと共に予め培養したHIV-1を注入した後に、会合(0〜180秒)および解離(180〜600秒)曲線を記録した。データは、秒単位の時間(t)の関数として共鳴単位(RU)で与える。
【図５】ペプチドCD4M30(配列番号10)(図4A)、CD4M33(配列番号13)(図4B)およびCD4M35(配列番号14)(図4C)の、PHA-Pを用いて活性化させたPBMC内のHIV-1LAI株の複製に対する影響を示す図である。データは、nMで表されるペプチドの濃度の関数として、培養上澄み液中の逆転写酵素(RT)活性の阻害のパーセンテージ(%I)として表す。
【図６】表面プラズモン共鳴法用装置のチップの表面に結合した、組み換えウイルスタンパク質gp120H×B2と抗体CG10(A)および48d(B)の相互作用に対する、可溶性CD4および本発明のペプチドの存在の影響を示す図である。ウイルスタンパク質gp120単独、およびCD4M27(1.5当量、配列番号6)、CD4M9(1.5当量)、不活性変異体(A1a23)CD4M9(1.5当量)および可溶性CD4(1.5当量)の存在下でのウイルスタンパク質gp120に関する、会合(0〜180秒)および解離(180〜400、180〜450秒)曲線を与える。データは、秒単位の時間(t)の関数として共鳴単位(RU)として与える。
【図７】アミノ酸残基に関して1文字のコードで表される、本発明のペプチド配列の例を示す図である。TPAおよびBは、チオプロピオン酸およびジフェニルアラニンをそれぞれ表し、「d」はアスパラギン酸のD光学形を表す。
【図８】本発明のペプチドCD4M9(配列番号3)を用いて官能化したセファロース4Bカラム(1.2×4cm)上での、組み換えタンパク質gp120H×B2の精製のクロマトグラフィの概略を示す図である。データは、0.5Mの酢酸を加えた後の、時間(分)の関数としての280nmでの吸光度として与える。
【図４】
2004535366.tif 000012
【図６】
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【国際公開パンフレット】
2004535366.tif 000014
2004535366.tif 000015
2004535366.tif 000016
2004535366.tif 000017
2004535366.tif 000018
2004535366.tif 000019
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2004535366.tif 000022
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535366.tif 000095
2004535366.tif 000096
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月7日(2003.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
ペプチド合成のこの方法を行うための技術的要素は、当業者に知られている。たとえばこれらは、Sambrook,FritschおよびManiatisによる作品、MOLECULAR CLONING,A'LABORATORY MANUAL,2nd edition中に記載されている。ペプチドのN末端の位置にTPAをグラフトさせることは、ペプチドに適用可能な有機化学の従来的な方法によって行うことができる。




【国際調査報告】
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