(57)【要約】ケモカイン受容体ＣＣＲ９は、胸腺細胞に、並びに小腸粘膜における循環腸ホーミング及び常在性Ｔ細胞に優位に発現していることが報告されている。そのリガンドＴＥＣＫ（胸腺発現ケモカイン）は、胸腺及び小腸の上皮で産生されている。ここで、我々は、循環ＣＣＲ９＋ナイーブＴ細胞（多くはＣＤ４＋）の相対的割合が、年齢に伴い、誕生時の全てのＴ細胞のうちのおよそ１５％から、成人では約１％に低下することを報告する。古典的な腸ホーミングマーカーα４β７が陰性のＣＣＲ９＋Ｔ細胞の集団は、成人よりも小児時期にはるかに高い。従って、循環ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ９＋細胞は、ごく最近まで胸腺に残存していたようである。新たな胸腺移出物に対する表現型マーカーの確立は、臨床評価、並びに造血幹細胞移植後及びＨＩＶ感染した患者の抗レトロウイルス処置の間の追跡における強力なツールを提供し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞をモニタリングする方法であって、特異的結合分子を使用して新たに形成されたＴ細胞を検出し、該新たに形成されたＴ細胞と該特異的結合分子との間の特異的結合が、該新たに形成されたＴ細胞を特異的結合分子の組合せに接触させることにより得られることを特徴とし、この又はこれらの特異的結合の検出が装置により行なわれる、方法。
【請求項２】
該Ｔ細胞がヒトＴ細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該Ｔ細胞が血液及び／又は骨髄あるいは他の組織に由来することを特徴とする請求項１〜２記載の方法。
【請求項４】
該特異的結合分子が抗体及び／又は抗体由来の分子であることを特徴とする請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
検出がフローサイトメーターを用いて行なわれることを特徴とする請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
該特異的結合分子が該Ｔ細胞上の細胞マーカーに対して使用されることを特徴とし、該特異的結合分子が、細胞マーカーＣＣＲ９に対する該特異的結合分子、及び細胞マーカーＣＤ４５ＲＡ又はα４β７の少なくとも１つに対するさらなる該特異的結合分子との組合せにおいて、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ７及び／又はＣＤ４又はＣＤ８を含む群より選択されるＴ細胞マーカーに対するものである、請求項１〜５記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞のモニタリングのための、新たに形成されたＴ細胞と抗体及び／又は他の特異的結合分子との間の特異的結合を提供する抗体及び／又は他の特異的結合分子の組合せの使用。
【請求項８】
新たに形成されたＴ細胞に特異的に結合し得る抗体及び／又は特異的結合分子の選択物を含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
請求項８記載のキットであって、該抗体及び／又は他の特異的結合分子の選択物を含むことを特徴とし、該抗体及び／又は特異的結合分子が請求項６記載の細胞マーカーに対するものである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（序論）
本発明は、Ｔ細胞の割合をモニタリングするインビトロの方法、及びＴ細胞をモニタリングするための抗体を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＧ蛋白質共役型受容体であるＧＰＲ−９−６／ＣＣＲ９は、胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）に対する受容体としてZaballosら１により記載されている。ＴＥＣＫは、胸腺の樹状細胞２及び上皮細胞３により、及び小腸の腸細胞３，４によってのみ産生されるようである。循環メモリー細胞上でのＣＣＲ９発現は、小腸の上皮及び固有層におけるほとんどのＴ細胞がＣＣＲ９を発現するという知見４，６と一致して、腸ホーミングサブセットを規定すると報告されている５。年齢に伴うＣＣＲ９の調節についてはほとんど知られていない。マウスでは、ＣＤ８＋胸腺細胞、及び末梢リンパ器官のＣＤ８＋細胞は、加齢に伴いＴＥＣＫへの移動が減少するＣＣＲ９＋ＣＤ６９低ＣＤ６２高サブセットを構成している７。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトでは、新たに移出した (recently emigrated) 胸腺細胞は、エピソームＤＮＡにおけるＴＣＲ再構成エクシジョンサークル (TCR-rearrangement excision circle) により循環細胞の中から同定することができるが８、我々の知識に適用できる表現型マーカーは全く記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで、我々は、小児におけるほとんどのＣＣＲ９＋Ｔ細胞が、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）表現型のものであることを報告する。この集団は、成人で非常に低下しており、最近胸腺摘除した小児で顕著に低下する。従って、我々は、循環ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ９＋Ｔ細胞が新たな胸腺移出物を主に示すと仮定する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の方法は、異なる疾患での免疫不全の程度の決定、及び処置の効果のモニタリングにおける優れたツールである。
【実施例】
【０００６】
（研究のデザイン）
小児患者（ｎ＝２０、４ヶ月〜１８歳）及び成人の健常ボランティア（ｎ＝９，２７〜５９歳）からの末梢血を用いた。本研究は、地方倫理委員会により承認され、署名されたインフォームドコンセントを親（又は１２歳を超える小児）から入手した。それらの疾患の診断又は追跡目的のために静脈穿刺を行なったときのみ、血液を本研究のために回収した。患者は、免疫抑制の処置を受けず、既知の免疫機能不全（例えば、便秘、神経症、癲癇、偏頭痛又は顎関節強直症）に罹患していなかった。血液はまた、心臓手術に関して行なわれた胸腺摘除の１週後（検査時の年齢：５歳）、６週後（年齢：４ヶ月）、１１週後（年齢：３ヶ月）、３年後（年齢：４歳）、及び４年後（年齢：４歳）の５人の小児から入手した。
【０００７】
ヘパリン添加血をLymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Norway) で分離し、２又は３回のインキュベーション工程による二色又は三色免疫蛍光染色に供した。以下の抗体試薬を用いた：マウス抗CD3-FITC (フルオレセインイソチオシアナート)、マウス抗CD4 (IgG1; SK3及びSK4)、マウス抗CD8 (IgG1, SK1)、マウス抗CD45RA-FITC、マウス抗CD3-PerCP (ペリディニンクロロフィル) (全てBecton Dickinson, San Jose, CAから)、マウス抗CCR9 (LS 129 3C3, IgG2b; Dr. Paul Ponath, LeukoSite Inc, Cambridge, MAからの好意)、マウス抗α4β7 (Act.1, IgG1, Dr. Andrew I. Lazarovits, Ontario, Canadaの好意)、ヤギ抗マウスIgG2b-PE (フィコエリトリン)、（Southern Biotechnology Associates, Birmangham, AL）及びヤギ抗マウスIgG1 PE/Cy5 (PE/インドジカルボシアニド)（Caltag Laboratories, Burlingame, CA）。コントロールは、特異性を有しないアイソタイプ及び濃度が一致した抗体であった。獲得は、Cell Quest解析プログラムを備えたFACScan又はFACS Vantage SEフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）で行なった。Windows, release 9.0.1 (Chicago, IL) 用のSPSSを、蓄積したフローサイトメトリーデータの統計学的解析に用いた。
【０００８】
（結果及び考察）
図１は、ＣＤ３＋でゲートされた細胞上のＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ９の発現を示す（図１Ａ〜１Ｇ）。胸腺摘除患者からのデータ（図１Ｃ）を除けば、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ９＋ＣＤ３＋細胞は、寿命の初めの１年間に比較的大きな画分（約１５％）を構成し、青年期迄に約５％に、成人では約１％に低下する。ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ９＋細胞の年齢依存的な減少は、年齢依存的な胸腺の退縮と対応し９（以下を参照）、それ故、循環ＣＣＲ９＋ナイーブＴ細胞は、新たな胸腺移出物を示す。Campbellら１０によれば、最も成熟した髄質の胸腺細胞のＣＣＲ発現は試験されていないが、これらの細胞は、ＴＥＣＫに向かってほとんど移動しない。年齢依存的な関係は、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ９＋Ｔ細胞集団について全く観察されなかった。平均蛍光強度は、Zabelら５のデータと一致して、ＣＤ４５ＲＡ−細胞よりもＣＤ４５ＲＡ＋細胞でより低くく（データ示さず）、ナイーブＣＣＲ９＋集団間のＣＤ４：ＣＤ８比は２．５：１であった（データ示さず）。この最後の結果は、末梢リンパ節で見出されるマウスＣＣＲ９発現細胞における報告されたＣＤ８＋優位性とは異なった７。
【０００９】
図１Ｃは、胸腺摘除１１週後の３ヶ月齢の患者からのデータを示す；ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ９＋Ｔ細胞集団の顕著な低下が、臍帯血（図１Ａ）及び１歳のドナー（図１Ｂ）に存在するものと比較して観察された；別の４ヶ月齢の患者は、胸腺摘除６週後に同じ顕著な低下を示した；誕生数日後に胸腺摘除された４歳の患者では、この集団は年齢が一致するコントロールと比べて７５％低下した（データ示さず）。反対に、ＣＣＲ９＋ナイーブＴ細胞集団の減少は、５歳の患者での胸腺摘除１週後では全くみられず、別の４歳の患者での胸腺摘除３年後に減少傾向のみがみられた（年齢が一致するコントロールにおける４．１％の中央値と比較して３．１％）。患者の年齢、胸腺摘除の程度（全体未満又は全体）、胸腺摘除後の時間は全て、観察された結果の一因となり得る。胸腺組織の残りは、機能的であり得、経時的に、胸腺細胞の代償性の再生を発揮する。従って、胸腺摘除３年以上後の胸腺摘除患者のＴＣＲ再構成エクシジョンサークル研究は、新たなＴ細胞がわずかに低下したレベルでも生じることを示した８。
【００１０】
図１Ｈ及び図１Ｉは、古典的な腸ホーミング受容体ａ４ｂ７が８歳のドナーではＣＤ３＋ＣＣＲ９＋細胞のうちおよそ５０％に存在しないが、４７歳のドナーのほとんどのＣＤ３＋ＣＣＲ９＋細胞で生じることを示す。同様のデータが、合計小児３人及び成人３人について図３Ｂに蓄積されている。循環Ｔ細胞上のＣＣＲ９＋は、小腸に対するホーミングと関連している［４，５］。しかしながら、上記の我々の結果によれば、ＣＣＲ９＋ａ４ｂ７-細胞は、むしろ胸腺由来であり得る。５から４７歳にかけてのＣＣＲ９＋ａ４ｂ７-Ｔ細胞における４倍の低下とは逆に、ＣＣＲ９＋ａ４ｂ７＋Ｔ細胞については２倍の低下がみられた（データ示さず）。これにより、２つの細胞集団の関連性がＣＣＲ９＋ａ４ｂ７-細胞及び加齢に関する知見を部分的にのみ説明することが示唆された。実際、ＣＣＲ９＋ａ４ｂ７-Ｔ細胞はまた、新たな胸腺移出物であり得る。また、この状況で特筆すべきことは、ＣＣＲ９発現Ｔ細胞の相対的な割合が寿命の最初の１０年で急速に減少し、その後、より緩慢に低下したということである（図２Ａ）。この採用された曲線は、式ｙ＝ａｘｂのべき関数の形状を呈し、他者はこのモデル関数を使用して胸腺皮質の退縮を記載した９。この自然ｌｏｇ変換百分率の変数は正規分布を有する；この変数を年齢に対してプロットする場合（図２Ｂ）、有意な逆相間が明らかとなった（ピアソンr=-0.79，P＜0.01）。図２Ｃは、初期の急激な低下がＣＣＲ９＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋集団に限られることを示す（１８人のドナーに基づく）；そして自然ｌｏｇ変換百分率の変数  対  年齢のプロット（図２Ｄ）は、有意な負の相関（r=-0.86，P＜0.01）を再度示した。
【００１１】
結論として、本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞に拘束される循環ＣＣＲ９＋Ｔ細胞の年齢に関連する有意な低下を観察した。ＣＤ３＋ＣＣＲ９＋ＣＤ４５ＲＡ＋集団は、胸腺摘除後に一様に大きな低下を示し、その後一定ではない期間後に再度上昇をみせたが、それは恐らく代償機構のためと思われる。従って、我々は、このナイーブＴ細胞集団が新たな胸腺移出物を示すことを示唆する。本発明の方法は、例えば、ＨＩＶ感染した患者の抗レトロウイルス処置に対する応答のモニタリング８、又は該患者の感染の程度の評価、若しくは例えば造血幹細胞移植１１における移植後のＴ細胞の再生の評価によって、胸腺から新たに移出したＴ細胞の割合（ＲＴＥ）をモニタリングするための、又は自己免疫疾患を患う患者での簡便なツールを提供する。癌患者の胸腺機能に対する、及び化学療法又は放射線照射後の癌関連抑制における効果、並びにＴ細胞再構成もまた、本発明の方法により研究でき、容易にモニターできる１２。本発明はまた、新たに移出したＴ細胞をモニターするために、例えば、蛍光色素に結合化し得る少なくとも１つのタイプの抗体を含むキットに関する。本発明の方法はまた、例えば、癌とＲＴＥ欠乏との関係、年齢とＲＴＥのシェアとの関係の研究による科学研究での、又は自己免疫疾患の分野での適用範囲を有する。
【００１２】
【表１−ａ】
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【００１３】
【表１−ｂ】
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【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】年齢に関するＣＣＲ９＋ナイーブＴ細胞の変動。図形Ａ〜Ｇの右上の四分割区画は、ＣＤ４５ＲＡマーカーにより規定されるＣＣＲ９＋ナイーブＴ細胞を示す。Ａ〜Ｆ：１歳後に、このサブセットの割合は、成人と同じ水準の減少を示す。同じサブセットは、胸腺摘除患者で著しく低下する（１Ｃ）。Ｇ：５９歳の血液ドナーにおけるＣＣＲ９＋ナイーブＴ細胞集団は、５１歳の被験体のものと比較して非常に低かった。これは、約６０歳からのナイーブＴ細胞の急激な減少と一致し、他者による報告の通りである８。Ｈ〜Ｉ：腸ホーミングマーカーα４β７が陰性のＣＣＲ９＋Ｔ細胞のより高い百分率が、成人のそれと比較して小児でみられた。
【図２】研究対象の年齢に関して蓄積したフローサイトメトリーデータ。Ａ：全てのＴ細胞におけるＣＣＲ９＋細胞の百分率は、年齢とともに減少する。Ｂ：同じデータの自然ｌｏｇ変換を年齢に対してプロットする場合、線形の関係が明らかになる。Ｃ，Ｄ：ＣＣＲ９＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞に対する比較データ。
【図３】正常（○）及び胸腺摘除（▼）被験体におけるＣＣＲ９＋ナイーブＴ細胞（Ａ）及びＣＣＲ９＋ａ４ｂ７−Ｔ細胞（Ｂ）について年齢に関して蓄積したフローサイトメトリーデータ。１０歳未満の年齢についての図２Ｃからのデータ、加えて、胸腺摘除患者からのデータ。胸腺摘除からの時間は、左下角に位置する患者についてはそれぞれ６及び１１週間であり、最低値の４歳の患者では４年である。他の４歳及び５歳の患者に対する各時間は３年及び１週間である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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