(57)【要約】本発明は哺乳動物転写因子ＦＯＸＣ２の単離プロモーター領域に関する。本発明はまた、ＦＯＸＣ２の発現をモジュレートし、それによって肥満に関連する医学的状態の処置に有用な可能性のある物質をスクリーニングする方法に関する。本発明はさらに、スプライシングによって明瞭なオープンリーディングフレームを生成する、選択的／代替的プロモーターの使用によって誘導された、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の以前未知の変異体に関する。選択的／代替的遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメインの一部を欠き、結果的に可能性のある調節機能を有するＦＯＸＣ２転写因子の変異体をコードする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１６９２ないし１７０３、またはＦＯＸＣ２プロモーター活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域。
【請求項２】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１２５０ないし１７４９、またはＦＯＸＣ２プロモーター活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１のヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域。
【請求項３】
（ａ）配列番号１の位置１２５０ないし２２３５に示すヌクレオチド配列、またはＦＯＸＣ２プロモーター活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸、
からなる群より選択される配列を含む、請求項２のヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかのヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域を含む組換え構築物。
【請求項５】
ヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域が、検出可能な産物をコードする核酸分子に作動可能に連結されている、請求項４の組換え構築物。
【請求項６】
該検出可能な産物がＦＯＸＣ２ポリペプチドである、請求項５の組換え構築物。
【請求項７】
レポーター遺伝子をさらに含む、請求項４の組換え構築物。
【請求項８】
請求項４ないし７のいずれかの組換え構築物を含むベクター。
【請求項９】
請求項４ないし７のいずれかの組換え構築物で安定的に形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節する物質の同定方法であって、
（ｉ）候補物質を、請求項１ないし３のいずれかに定義のヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域と接触させること、および
（ｉｉ）当該候補物質が、ＦＯＸＣ２プロモーター活性をモジュレートするか否か決定すること、
を含む当該方法。
【請求項１１】
請求項９の細胞中、候補物質の存在下および不存在下でのレポーター遺伝子発現をアッセイすることを含む、ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節する物質の同定方法であって、ここで該候補物質の不存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルと比較したときの、該候補物質の存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルに及ぼす影響は、該物質がＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節することを指摘する、当該方法。
【請求項１２】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド２２３ないし２３１、またはＦＯＸＣ２エンハンサー活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド３５９ないし３７５、またはＦＯＸＣ２エンハンサー活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域。
【請求項１４】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド３７８ないし４０２、またはＦＯＸＣ２エンハンサー活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域。
【請求項１５】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド４０３ないし４２３、またはＦＯＸＣ２エンハンサー活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸、
からなる群より選択される配列を含む単離ヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域。
【請求項１６】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド２１６ないし４７５、またはＦＯＸＣ２エンハンサー活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１２ないし１５のいずれかのヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域。
【請求項１７】
請求項１２ないし１５のいずれかのヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域を含む組換え構築物。
【請求項１８】
請求項１７の組換え構築物を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８の組換え構築物で安定的に形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
（ｉ）候補物質と、請求項１２ないし１６のいずれかに定義のヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域とを接触させること、および
（ｉｉ）当該候補物質が、ＦＯＸＣ２エンハンサー活性をモジュレートするか否か決定すること、
を含む、ＦＯＸＣ２エンハンサー活性を調節する物質の同定方法。
【請求項２１】
請求項１９で定義の細胞中、候補物質の存在下でのレポーター遺伝子発現をアッセイすることを含む、ＦＯＸＣ２エンハンサー活性を調節する物質の同定方法であって、ここで該候補物質の不存在下のレポーター遺伝子の発現レベルと比較したときの、候補物質の存在下のレポーター遺伝子の発現のレベルに及ぼす影響は、該候補物質がＦＯＸＣ２エンハンサー活性を調節することを指摘する、当該方法。
【請求項２２】
（ｉ）単離核酸配列と、候補物質とを接触させるステップであって、ここで該核酸配列が、配列番号５の位置１２５０ないし２２３５に示されるマウスＦｏｘＣ２プロモーターヌクレオチド配列を含む、ステップ、および
（ｉｉ）当該候補物質が、マウスＦｏｘＣ２プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現をモジュレートするか否か決定するステップであって、ここで、そのようなモジュレーションは、該物質が哺乳動物ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節することを指摘する、ステップ、
を含む、哺乳動物ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節する物質を同定する方法。
【請求項２３】
（ｉ）単離核酸配列と、候補物質とを接触させるステップであって、ここで該核酸配列が、配列番号５の位置２１６ないし４７５に示されるマウスＦｏｘＣ２エンハンサーヌクレオチド配列を含む、ステップ、および
（ｉｉ）当該候補物質が、マウスＦｏｘＣ２エンハンサーヌクレオチド配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現をモジュレートするか否か決定するステップであって、ここで、そのようなモジュレーションは、該物質が哺乳動物ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節することを指摘する、ステップ、
を含む、哺乳動物ＦＯＸＣ２エンハンサー活性を調節する物質を同定する方法。
【請求項２４】
（ｉ）単離核酸配列と、候補物質とを接触させるステップであって、ここで該核酸配列が、配列番号５の位置２１６ないし２２３５に示されるマウスＦｏｘＣ２エンハンサーヌクレオチド配列を含む、ステップ、および（ｉｉ）当該候補物質が、マウスＦｏｘＣ２エンハンサーヌクレオチド配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現をモジュレートするか否か決定するステップであって、ここで、そのようなモジュレーションは、該物質が哺乳動物ＦＯＸＣ２エンハンサー活性を調節することを指摘する、ステップ、
を含む、哺乳動物ＦＯＸＣ２エンハンサー活性を調節する物質を同定する方法。
【請求項２５】
（ａ）配列番号３またはその相補物、
（ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）に定義の核酸分子のポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列に、ハイブリダイズできる、かつＦＯＸＣ２転写因子の変異体形態をコードする核酸、
（ｃ）遺伝的コードの結果として（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列に縮重である、かつＦＯＸＣ２転写因子の変異体形態をコードする核酸、および（ｄ）配列番号４のポリペプチドをコードする核酸、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項２６】
請求項２５の核酸によってコードされる単離ポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号４のアミノ酸配列を含む請求項２６の単離ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２５の核酸分子を含むベクター。
【請求項２９】
請求項２５のヌクレオチド配列を有し、かつその発現を仲介することのできる複製可能発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２８または２９のベクターを含む培養宿主細胞。
【請求項３１】
ＦＯＸＣ２転写因子ポリペプチドの変異体形態の生産方法であって、請求項３０の宿主細胞を、該ポリペプチドを生産し、そして該ポリペプチドを回収する条件下で、培養することを含む方法。
【請求項３２】
請求項２５の核酸分子の発現を調節する物質を同定する方法であって、
（ｉ）当該核酸分子と候補物質とを接触させること、および
（ｉｉ）当該候補物質が、当該核酸分子の発現をモジュレートするか否か決定すること、
を含む方法。
【請求項３３】
請求項２５の核酸分子によって転写されるＲＮＡに特異的にハイブリダイズできる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、当該ＲＮＡの転写を防止する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
（ａ）レポーター遺伝子に作動可能に連結されたヒトＦＯＸＣ２ヌクレオチド配列で細胞株をトランスフェクトすること、
（ｂ）該細胞株を、複数のヒトｃＤＮＡ配列でトランスフェクトすること、
（ｃ）ヒトｃＤＮＡ配列でトランスフェクトされていない細胞と比較しときの、当該レポーター遺伝子の変化した発現レベルを有するトランスフェクトされた細胞を、同定および単離すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で単離した細胞からのｃＤＮＡを回収すること、および
（ｅ）ステップ（ｄ）で回収したｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを同定すること、
を含む、ＦＯＸＣ２ヌクレオチド配列の活性をモジュレートするポリペプチドの単離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、哺乳動物転写因子ＦＯＸＣ２の単離プロモーター領域に関する。本発明はまた、ＦＯＸＣ２の発現をモジュレートし、そしてそれによって肥満に関連する医学的状態を処置するために潜在的に有用である物質のスクリーニング方法に関する。本発明はさらに、選択的／代替的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）プロモーターの使用に由来する、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の以前未知の変異体に関し、これはスプライシングを介する明瞭なオープンリーディングフレームを生成する追加的エキソンを生産する。該選択的／代替的遺伝子は、ＦＯＸＣ２転写因子の変異体をコードし、これはＤＮＡ結合ドメインの一部を欠き、そして結果的に潜在的な調節機能を有する。
【０００２】
背景技術
３０歳以上の米国の男性および女性の半分より多くは、現在超過体重であると考えられ、そしてほとんど４分の１は臨床的に肥満である。この高度の罹患率は、しばしば肥満を伴う医学的状態、特に非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、高血圧、心臓血管障害、およびある種の癌の増加につながった。肥満は、エネルギー取りこみ（喫食）およびエネルギー消費の間の慢性的アンバランスに起因する。肥満につながる機構をより良く理解するため、および肥満を制御するためのある種の患者集団の戦略を開発するために、前脂肪細胞および幹細胞の脂肪組織の主要構成要素である脂肪細胞への分化を調節する分子事象のよりよい存在する知識を発展させる必要がある。
【０００３】
転写調節タンパク質のヘリックス−ループ−ヘリックス（ＨＬＨ）ファミリーは、広範囲の発達過程のキープレイヤーである（総説のために、Ｍａｓｓａｒｉ ＆ Ｍｕｒｒｅ（２０００Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：４２９−４４０参照）。２４０を超えるＨＬＨタンパク質が今日までに、コウボＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからヒトまでにわたる生物で同定された。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、およびマウスでの研究は、ＨＬＨタンパク質が、発達事象、例えば、細胞分化、系統制約（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）、および性決定に深く関係することを確証的に実証した。多細胞生物では、ＨＬＨ因子は、神経形成、筋肉発生、血液生成、および膵臓発達を含む多数の重要な発達過程に要求される。
【０００４】
ウイング型（ｗｉｎｇｅｄ）ヘリックス／フォークヘッドクラスの転写因子は、１００アミノ酸のモノマー性ＤＮＡ結合ドメインによって特徴付けられる。ＨＮＦ−３γ由来のフォークヘッドドメインのＸ線結晶学は、三次元構造の「ウイング型ヘリックス」であって、２ループ（ウイング）がヘリックス−ループ−ヘリックスのＣ末端側上に結合されているものを明かにした（総説のために、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｒ． Ｇ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４： ７７３−７７６； ａｎｄ Ｌａｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．９０： １０４２１−１０４２３参照）。
【０００５】
マウス間葉フォークヘッド−１（ＭＦＨ−１）および対応するヒト（ＦＫＨＬ１４）染色体遺伝子の単離がＭｉｕｒａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ３２６：１７１−１７６； ａｎｄ （１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４１： ４８９−４９２によって開示されている。マウスＭＦＨ−１遺伝子およびヒトＦＫＨＬ１４遺伝子のヌクレオチド配列が、それぞれ受託番号Ｙ０８２２２（配列番号５）およびＹ０８２２３（配列番号８）で、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓに寄託された。対応する遺伝子が、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３７２７３およびＵ９５８２３）において同定された。
【０００６】
国際特許出願ＷＯ９８／５４２１６は、Ｆｏｒｋｈｅａｄ−Ｒｌａｔｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＦＲＥＡＣ）−１１（またＳ２１として知られる）をコードする遺伝子を開示し、これはＭｉｕｒａ前掲によって開示のヒトＦＫＨＬ１４遺伝子によってコードされるポリペプチドと同一である。この転写因子は、脂肪組織で発現され、そして脂肪代謝および脂肪細胞分化に関係する（２０００年２月１８日出願スウェーデン特許出願番号００００５３１−４と比較）。
【０００７】
ウイング型ヘリックス／フォークヘッド型転写因子の命名法は、標準化され、そしてＦｏｘ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ Ｂｏｘ）が統一された表記として採用された（Ｋａｅｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０００）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４： １４２−１４６；またｈｔｐｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｐｏｍｏｎａ．ｅｄｕ／ｆｏｘ参照）。以前命名されたＭＦＨ−１およびＦＫＨＬ１４（並びにＦＲＥＡＣ−１１およびＳ１２）はＦＯＸＣ２と命名されるべきであることが、同意された。
【０００８】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の全体構造を示す。
【０００９】
図２は、表現型的フットプリンティング実験の結果を示す。Ｃｌｕｓｔａｌで作成されたアラインメントによる、マウスＦｏｘＣ２とヒトＦＯＸＣ２配列の間の保存された（１．０＝１００％）フラクションを示す。実線（太字）は、アラインメントでのヒト配列にわたる２００ｂｐ「ウィンドウ」内でマウスに同一であるヒト配列のフラクションを指摘する。薄い線（点による）は、スライドするウインドウがヒトエキソン配列を含むとき、−０．０５にセットされ、そしてウインドウが完全にエキソン配列からなるとき−０．１にセットされる。ローカル最大値を含む、または０．７の保存フラクションを超える領域は、「推定調節領域」として機能するようであり、そのように分類される。
【００１０】
図３は、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の推定「エンハンサー」領域を示す。下線を付した配列は、転写因子結合部位であるようである。ボックスした配列は、エキソン配列を示す。
スプライス＝選択的／代替的にスプライシングされた遺伝子中のスプライシング部位として推定される配列である。
Ｅ−ボックス様＝ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン（組織分化中の細胞型特異的遺伝子転写の活性化としばしば連関される。Ｍａｓｓａｒｉ ＆ Ｍｕｒｒｅ（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．２０：４２９−４４０参照）を含むＤＮＡ結合タンパク質の標的として既知である「Ｅ−ボックス」モチーフＣＡＮＮＴＧに似る配列である。
フォークヘッド様＝転写因子のウイング型ヘリックス／フォークヘッド型クラスの結合部位に似る配列である。
Ｅｓｔ様＝ＥＳＴドメイン転写因子ファミリー（Ｓｈａｒｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２９， １３７１−１３８７参照）のコンセンサス結合部位に似る配列である。
【００１１】
図４は、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の推定「プロモーター」領域を示す。下線を付した配列は、エキソン配列を示す。ボックスした配列は、保存された区画（可能性のある転写因子結合部位）を示す。
【００１２】
発明の記載
本発明にしたがって、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の部分的に既知の配列（配列番号８）を延長した。この遺伝子の以前未知の領域に、調節機能と矛盾しないディファレンシャルに保存された領域を同定した。さらに、選択的／代替的転写物を同定し、これは少なくとも２つのエキソンの使用を含む。推定調節エンハンサーは、新たに発見した選択的／代替的エキソンにすぐに隣接し、これが、転写物クラスの選択的／代替的選択において、役割を演じ得ることを示唆している。
【００１３】
ＦＯＸＣ２調節のモジュレーションは、２型糖尿病；肥満、高コレステロール血症および他の心臓血管疾患または脂質代謝異常の治療的価値を有することが期待される。
【００１４】
結果的に、第１の側面では、本発明は、
（ａ）配列番号１の位置１２５０ないし２２３５、例えば、位置１２５０ないし１７４９または位置１６９２ないし１７０３に示すヌクレオチド配列、またはＦＯＸＣ２プロモーター活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、
から選択される配列を含む単離ヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域を提供する。
【００１５】
「プロモーター領域」は、機能して１または２以上の遺伝子の転写を制御するＤＮＡの領域を意味し、そしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位の、および相互作用しプロモーター機能を調節する同じ分子上の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定される。
【００１６】
「単離」核酸分子は、その構造が天然に存在する核酸のそれ、または１遺伝子より多くにわたる天然に存在するゲノム核酸の任意のフラグメントのそれに同一ではない、核酸分子である。
【００１７】
「ストリンジェント」ハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣ中、約４５℃のハイブリダイゼーション、次いで０．２ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中で６５℃で１または２回以上の洗浄である。
【００１８】
本発明の別の側面は、前記のヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域を含む組換え構築物である。当該組換え構築物では、ヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域は、検出可能産物、例えば、ヒトＦＯＳＣ２遺伝子、またはレポーター遺伝子をコードする核酸分子に作動可能に連結されることができる。ここで使用するように用語「作動可能に連結され」は、プロモーターの制御下で構造遺伝子を正確なフレームで構造遺伝子と、プロモーターを機能的に融合することを意味する。ここで使用するように、用語「レポーター遺伝子」は、簡単、高価でない方法または試薬を使用して同定できる遺伝子産物をコードする遺伝子であって、ヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域またはその活性フラグメントに作動可能に連結されることができるものを意味する。レポーター領域、例えば、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子を使用し、本発明に従うスクリーニングアッセイの転写的活性を決定することができる（Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ．１８５， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）参照；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前掲参照）。
【００１９】
本発明はまた、前定義のような組換え構築物を含むベクター、並びにそのようなベクターで、または一般に本発明に従う組換え構築物で安定的に形質転換された宿主細胞を提供する。用語「ベクター」は、外生ＤＮＡを宿主細胞へ複製のために移入するために、および／または宿主細胞による外生ＤＮＡの適当な発現のために有用である外生ＤＮＡの任意のキャリアーを意味する。
【００２０】
別の側面では、本発明は、ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節する物質の同定方法であって、（ｉ）候補物質と前定義のヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域とを接触させること、および（ｉｉ）当該候補物質がＦＯＸＣ２遺伝子の発現をモジュレートするか決定すること、ここでそのようなモジュレーションが、ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節することのできる物質を指摘する、工程を含む当該方法を提供する。ここで使用するように、用語「物質」は、生物学的または化学的化合物、例えば、単純または複雑な有機性分子、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２１】
トランスフェクションアッセイは、ＦＯＸＣ２プロモーター活性をモジュレートおよび／または調節する有効な物質を同定するスクリーニングアッセイに特に有用であることができる。トランスフェクションアッセイでは、ヒトＦＯＸＣ２プロモーターまたはその活性フラグメントに作動可能に連結された遺伝子、例えば、レポーター遺伝子を望まれる細胞型にトランスフェクトする。レポーター遺伝子発現の試験レベルを、候補物質の存在下でアッセイし、そして発現のコントロールレベルと比較する。有効な物質を、レポーター遺伝子発現のコントロールレベル（これは該物質の不存在下で決定される発現のレベルである）と異なる発現の試験レベルという結果を生じる物質として同定する。
【００２２】
細胞をトランスフェクトする方法および種々の簡便なレポーター遺伝子は、当業界で周知である（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ．１８５， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）参照；またＳａｍｂｒｏｏｋ，前掲参照）。結果的に、当該方法は、例えば、ヒトＦＯＸＣ２プロモーターを含む組換え構築物で安定的に形質転換された、宿主細胞のレポーター遺伝子の発現レベルを、候補物質の存在下および不存在下でアッセイすることを含み、ここで発現のコントロールレベルと比較したときの発現の試験レベルに及ぼす影響は、ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節することのできる物質を指摘する。
【００２３】
ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節するポリペプチドの同定方法は、当業界で既知の種々の技法、例えば、ＦＯＸＣ２調節領域に由来するタンパク質結合特異的配列を同定する、コウボ１ハイブリッドシステム（Ｌｉ ＆ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２， １８７０−１８７４参照）、調節領域に結合するタンパク質の生化学的精製、「ファージライブラリー」で感染したバクテリアのプールを誘導し、コードされたタンパク質を発現させ、そしてＦＯＸＣ２調節領域からの放射性活性ＤＮＡ配列で探索し、結合タンパク質を同定する「サザンウェスタン」クローニングストラテジー（例えばＨａｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８９）Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２０８３−２０９０）の使用を含み得る。
【００２４】
さらなる側面では、本発明は、
（ａ）配列番号１の位置２１６ないし４７５、例えば、位置２２３ないし２３１、位置３５９−３７５、位置３７８ないし４０２、または位置４０３ないし４２３に示すヌクレオチド配列、またはＦＯＸＣ２エンハンサー活性を示すそのフラグメント、
（ｂ）（ａ）の相補鎖、および
（ｃ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）または（ｂ）に定義のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列、
から選択される配列を含む単離ヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域を提供する。
【００２５】
「エンハンサー領域」は、機能して１または２以上の転写を制御するＤＮＡの領域を意味する。
【００２６】
ヒトＦＯＸＣ２プロモーター領域についてここで記載するように、本発明はさらに、ヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域を含む組換え構築物、当該組換え構築物を含むベクター、並びに当該ベクターまたは当該組換え構築物で安定的に形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、ＦＯＸＣ２エンハンサー活性を調節する物質の同定方法であって、
（ｉ）候補物質と、前定義のヒトＦＯＸＣ２エンハンサー領域とを接触させること、および
（ｉｉ）当該候補物質が、ＦＯＸＣ２遺伝子の発現をモジュレートするか否か決定すること（ここでそのようなモジュレーションがＦＯＸＣ２エンハンサー活性を調節するこのできる物質を指摘する）を含む、当該方法を提供する。当業者は、既知の工程がそのような方法を実施するために利用可能であることを理解する。例えば、種々の突然変異および欠失を含む構築物の「パネル」を使用し、応答を、調節装置の単一塩基またはサブセグメントの特異的変化と連関させることができる。簡単なパネルは、エンハンサーとプロモーター、プロモーターのみ、エンハンサーと明瞭な遺伝子からの「最小」プロモーターを含む。前記の様に、好適な組換え構築物で安定的に形質転換された宿主細胞を使用するトランスフェクションアッセイは、有効な物質を同定するための、特に有用なスクリーニングアッセイであることができる。
【００２８】
さらなる側面では、本発明は、哺乳動物ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節することのできる物質の同定方法であって、
（ｉ）候補物質と、配列番号５の位置２１６ないし２２３５、例えば位置２１６ないし４７５または位置１２５０ないし２２３５として示すマウスＦｏｘＣ２プロモーターヌクレオチド配列とを接触させること、および
（ｉｉ）当該候補物質が哺乳動物ＦＯＸＣ２遺伝子の発現をモジュレートするか否か決定すること（そのようなモジュレーションが哺乳動物ＦＯＸＣ２プロモーター活性を調節することのできる物質を指摘する）、
工程を含む当該方法を提供する。
【００２９】
更なる重要な側面では、本発明は、
（ａ）配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）に定義の、およびＦＯＸＣ２転写因子の変異体形態をコードする核酸分子のポリペプチドコード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含む核酸分子、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に定義の、およびＦＯＸＣ２転写因子の変異体形態をコードするヌクレオチド配列へ、遺伝的コードの結果として縮重である核酸配列を含む核酸分子、
から選択される単離核酸分子を提供する。
【００３０】
本発明の好ましい形態では、当該核酸分子は、配列表の配列番号３と同一のヌクレオチド配列を有する。しかし、本発明に従う核酸分子は、配列番号３に示す配列に厳格に限定されることはない。むしろ本発明は、置換、小欠失、挿入または逆位のような修飾を有する核酸分子を含む。それにもかかわらずこれらは、本発明のＦＯＸＣ２ポリペプチドの生化学的活性を実質的に有するタンパク質をコードする。結果的に、ヌクレオチド配列が、配列表の配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
本発明はまたヌクレオチド配列が、遺伝的コードのために、配列番号３に示すヌクレオチド配列に縮重である核酸分子を含む。３ヌクレオチドの連続的群である「コドン」は、１アミノ酸をコードする。６４の可能なコドン、しかし２０の天然のアミノ酸があるが、ほとんどのアミノ酸は、１より多いコドンによってコードされる。遺伝的コードのこの天然「縮重」または「重複」は当業界で周知である。こうして配列表に示すヌクレオチド配列は、変異体ＦＯＸＣ２ポリペプチドをコードする配列の大きいが明確な群内の単なる例であることが、理解される。
【００３２】
本発明は、前定義の核酸によってコードされる単離ポリペプチドを含む。好ましい形態では、当該ポリペプチドは、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号４と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに厳密に限定されることはない。むしろ本発明は置換、小欠失、挿入または逆位のような修飾を有するポリペプチドを含む。それにもかかわらずこれらのポリペプチドは、変異体ＦＯＸＣ２ポリペプチドの生物学的活性を実質的に有する。
【００３３】
「単離され」たポリペプチドは、細胞性材料または、タンパク質が由来する細胞または組織源からの他の汚染タンパク質が実質的になく、または化学的に合成されたとき化学的前駆物質または他の化学物質が実質的にない。
【００３４】
１実施態様では、該ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはより多く同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明の更なる側面は、本発明の核酸分子を含むベクターである。当該ベクターは例えば、本発明のＤＮＡ分子を有し、およびその発現を仲介できる複製可能発現ベクターであることができる。現文脈では、用語「複製可能」は、ベクターが、導入された宿主細胞の所定の型で複製可能であることを意味する。ベクターの例は、ウイルス、例えば、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、および他の組換えベクターである。核酸分子は、当業界周知方法によってベクターゲノムに挿入する。
【００３６】
また本発明のベクターを含む培養宿主細胞が本発明に含まれる。そのような宿主細胞は、原核細胞、単細胞真核細胞または多細胞生物に由来する細胞であることができる。宿主細胞こうして例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞；コウボ例えば、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の細胞、または哺乳動物細胞であることができる。ベクターの宿主細胞へ導入を実施するために使用する方法は、組換えＤＮＡ方法に親密な者に周知の標準的方法である。
【００３７】
さらなる側面では、本発明は、前定義核酸分子の発現を調節できる物質を同定する方法であって、
（ｉ）候補物質質と、当該核酸分子を接触させること、および
（ｉｉ）当該候補物質が当該核酸分子の発現をモジュレートするか否か決定すること、
を含む当該方法を含む。
【００３８】
更なる側面では、本発明は、配列番号３に示す、選択的／代替的スプライシングされた核酸分子によって転写されるＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、当該ＲＮＡの翻訳を防止できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を提供する。選択的／代替的スプライシングされるＦＯＸＣ２遺伝子のためにコントロール配列に特異的に結合できるアンチセンス核酸（好ましくは１０ないし２０塩基対オリゴヌクレオチド）を、例えば、ウイルスベクターまたはコロイド分散系、例えばリポソームによって細胞に導入する。アンチセンス核酸は、細胞中の標的ヌクレオチド配列に結合し、そして標的配列の転写および／または翻訳を防止する。ホスホロチオエートおよびメチルホスフェートアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明による治療的使用のために具体的に企図する。転写または翻訳レベルのいずれかで、選択的／代替的スプライシングされるＦＯＸＣ２遺伝子の発現の抑制は、脂質代謝に関連する疾患／状態の細胞または動物モデルを作成するために有用である。
【００３９】
さらなる側面では、本発明は、脂質代謝および／または脂肪細胞分化を調節する生物学的経路に関係するヌクレオチド配列に結合するポリペプチドの同定のための方法であって、
（ａ）レポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（総説のために例えば、Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５８： ３１５−３４１参照）に連結されたヒトＦＯＸＣ２ヌクレオチド配列で宿主細胞株をトランスフェクトすること、
（ｂ）当該宿主細胞株を、種々のヒトｃＤＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡライブラリーに含まれる配列でトランスフェクトすること
（ｃ）当該レポーター遺伝子発現の変化レベルを有する（これは、付加されたｃＤＮＡが、脂質代謝および／または脂肪細胞分化を調節する生物学的経路に関係する少なくとも１遺伝子を上方または下方調節することを指摘する）細胞を、例えば、ＦＡＣＳ細胞ソーチングによって同定および単離すること、
（ｄ）工程（ｃ）で単離した細胞からｃＤＮＡを、標準的手法、例えば、ＰＣＲまたはＣＲＥ−ＬＯＸ仲介手法（例えばＳａｕｅｒ（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ １４： ３８１−３９２参照）によって回収すること、および
（ｅ）工程（ｄ）で回収したｃＤＮＡによって発現されるポリペプチドを、例えば、該ｃＤＮＡを配列決定し、そして取得した配列を、配列データベースに対して比較することによって同定すること
のステップを含む当該方法を提供する。
【００４０】
この記載を通じて、用語「標準的プロトコール」および「標準的手法」は、分子生物学技法の文脈で使用するとき、通常の実験室マニュアル、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｉｔｏｒｓ Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９４， またはＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ １９８９に見出されるプロトコルおよび手法として理解されるものとする。
【００４１】
実施例
実施例１：ＦＯＥＣ２ゲノム配列のコンピューター的同定
ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に存在する配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ　００５２１（配列番号９））を、ヒトＦＯＸＣ２ｃＤＮＡ配列への配列類似性についてスクリーニングする。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）を、配列同一性を決定するために使用する。ＢＬＳＡＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ）を介して公衆に利用可能である。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ染色体１６クローンＰＲ１１−４６３Ｏ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００９１０８；Ｖｅｒｓｉｏｎ ６； ＧＩ：７６８９９３０；ｒｅｌｅａｓｅｄ ４ Ｍａｙ ２０００）からの２５無秩序断片中の実施化草案ゲノム配列を、更なる研究のために選択した。
【００４２】
ＦＯＸＣ２ｃＤＮＡ配列ＮＭ　００５２５１の、配列ＡＣ００９１０８とマッチする部分の領域を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＵＷＧＣ／ａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍ）で開発されたＰＨＲＡＰソフトウェアを使用して組み合わせた。９７８０ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ００９１０８．６の位置１１６４４５ないし１２６２２４）および３７８４ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ００９１１０８．６の位置４２９２７ないし４６７１０）の２つのコンティグをそれぞれ組みたて、１３４５１ｂｐのヒトＦＯＸＣ２ゲノムフラグメントを作製する。
【００４３】
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ多重配列アライメントプログラムバージョン１．８（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２： ４６７３−４６８０）を次いで使用し、マウスｃＤＮＡ配列Ｘ７４０４０（配列番号６）との比較によって、６４５８ｂｐのヒトＦＯＸＣ２延長ゲノムＤＮＡ配列を同定した。まず、１３４５１ｂｐ配列中の位置１５００−７９５８に対応する６４５９ｂｐ配列を、選択した。この６４５９ｂｐ配列の位置１−２２８５は、ＡＣ００９１０８．６の４４４２６−４６７１０に対応し、一方、位置２１５１−６４５９は、ＡＣ００９１０８．６中の位置１２６２２４−１２１９１６（取得される逆相補物）に対応する。位置２１５１−２２８５のオーバーラップは、該コンティグをアセンブリプログラムによって結合することを可能とした。位置２６５５のＧ残基は、配列決定エラーであると考えられ、除去し、これにより配列番号１に示す６４５８ｂｐの配列を得た。配列番号１のオープンリーディングフレームは、配列番号１０に示す既知のヒトＦＯＸＣ２ポリペプチドと同一のポリペプチド（配列番号２）をコードする。
【００４４】
実施例２：ヒトおよびマウスＦＯＸＣ２ゲノム配列における可能性のある調節配列の同定
系統発生論的フットプリンティング（総説のために、Ｄｕｒｅｔ ＆ Ｂｕｃｈｅｒ（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７（３）：３９９−４０６参照）において、配列をアラインメントし、そして局所的配列同一性を、固定した任意の長さのそれぞれのウインドウについて決定する。これは、ゲノム配列中の潜在的な調節領域の同定を可能とする。進化の過程にわたり保存されている非エキソン配列は、調節的役割を果たしていることがありそうである。系統発生論的フットプリンティングを、２０のギャップオープニングペナルティおよび０．２のギャップエクステンジョンペナルティに調節したデフォルトパラメーターで、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ多重配列アラインメントプログラム、バージョン１．８（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２： ４６７３−４６８０）で作成したアラインメントに基づいて、Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＆ Ｆｉｃｋｅｔｔ（１９９８）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２７８， １６７−１８１に記載されたように、実施した。ヒト（配列番号１）とマウス（配列番号５）ゲノム配列を、アラインメントした。パーセンテージ同一性を、ヒト遺伝子のそれぞれ連続２００ｂｐについてプロットし、ディファレンシャルに保存されたセグメントを同定した（隣接する配列との比較において）（図２）。
【００４５】
公開されたエキソン配列のセグメントに加えて、２つのディファレンシャルに保存された領域または「フットプリント」を、ヒト遺伝子において同定した。これらの領域の両方はローカル最大値であり、そしてヒトとマウスゲノム配列の間の７０％ヌクレオチド同一性を超えるセグメントを含む。配列番号１の位置１２５０ないし２２３５、特に位置１２５０ないし１７４９に示す１の領域は、公開されたエキソン領域にすぐ隣接し、これは転写開始部位および近接するプロモーター調節配列を含むことがありそうである（図４）。配列番号１の位置２１６ないし４７５に示すもう１つの領域は、転写開始部位から近似的に１７００ｂｐ遠位であり、これは調節領域のいくつかの形態（エンハンサーまたはレプレッサーのいずれか）として機能することがありそうである（図３）。（延長ＦＯＸＣ２遺伝子の概略図は、図１に示す）
【００４６】
これらの調節領域のさらなる分析は、マウスとヒト遺伝子の間のより高度の保存の短いセグメントを同定し、これらの特異的セグメントが、転写因子結合部位として機能することを示唆している。ＴＲＡＮＳＦＡＣ転写因子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ）（Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（１）：３１６−３１９）を、既知の転写因子へのマッチについてスクリーニングした。コンセンサス部位（識別子Ｒ０５０６６；Ｒ０５０６７；Ｒ０５０６８；およびＲ０５０６９）は、ヒトＦＯＸＣ２とマウスＦＯＸＣ２遺伝子の間に保存された配列が、マッチすることを見出した。これは、遠位調節エンハンサー中の多重フォークヘッド様結合部位、およびそのタンパク質産物によるＦＯＸＣ２の可能性のある自己調節の存在を示唆している。
【００４７】
同じ分析を、マウスＦｏｘＣ２ゲノム配列（配列番号５）の２００ｂｐ連続セグメントを引用して実施した。以下の保存された領域が同定された：１９０ないし４２０；１０７０ないし１６４５；および５５８０ないし５８７５．これらはヒト配列について前に指摘した領域に相関があり、そしてオルトロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）領域であると考えられた。
【００４８】
実施例３：選択的／代替的ヒトＦＯＸＣ２ｃＤＮＡ配列の同定
クエリー配列としてヒトＦＯＸＣ２ｃＤＮＡ（配列番号９）を使用する、ＧｅｎＢａｎｋ由来のｄｂＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴＮスクリーニングは、利用可能なｃＤＮＡの部分を含むいくつかのＥＳＴｓオーバーラッピングを明かにした。ＥＳＴｓを使用するエキソン境界の予測のための、特殊化手段であるｅｓｔ　ゲノム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）を適用し、該ゲノム配列と、ＥＳＴ配列を比較した（Ｍｏｔｔ， Ｒ．（１９９７）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １３（４）：４７７−４７８参照）。２クラスのＥＳＴｓが観察された：３’非翻訳領域へと延長する配列および、スプライシングされ、以前記載された第１エキソンの内部で結合されている選択的／代替的第１エキソンを表す配列。
【００４９】
具体的には、受託番号ＡＷ２７１２７２（配列番号１１）を有するＥＳＴ中の位置３３ないし１８２のヌクレオチドが、延長ＦＯＸＣ２ゲノム配列（配列番号１）の位置６６ないし２１５と同一であったこと、および配列番号１１の位置１８３ないし３２７が配列番号１の位置２５１６ないし２６６０に同一であったこと、が見出された。同様に、受託番号ＡＷ７９３２３７（配列番号１２）を有するＥＳＴの位置５ないし５５が延長ＦＯＸＣ２ゲノム配列（配列番号１）の位置１６５ないし２１５と同一であり、そして配列番号１２の位置５６ないし１５７が配列番号１の位置２５１６ないし２６０７と同一であった。これらの結果は、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の選択的／代替的スプライシングパターンを明かにした。このスプライシングパターンにしたがって、選択的／代替的遺伝子配列（配列番号３）を、配列番号１の位置１−２１５および２５１６−６４５８に示す領域を結合することによって誘導した。選択的／代替的スプライシングパターンは、種々のペプチドおよびタンパク質の合成を調節することが知られている。それは完全に異なる機能を有するタンパク質という、または機能不全または阻害スプライシング産物という結果となり得る（総説のために、ＭｃＫｅｏｗｎ（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：１３３−１５５参照）。
【００５０】
公開されたＦＯＸＣ２転写因子（配列番号１０）の位置１ないし９４に対応するアミノ酸は、選択的／代替的プロモーター（配列番号４）から生成したスプライスされた変異体によってコードされたタンパク質を欠く。結果的に、該ＤＮＡ結合ドメインの完全領域Ｎ末端および該ＤＮＡ結合ドメインの一部（配列番号２の位置７２−９４に対応する）は、スプライスされた変異体に存在しない。この途切れ（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、欠乏「フォークヘッド」ＤＮＡ結合領域を有し、そしてＦＯＸＣ２タンパク質の生物学的活性に可能性のある阻害機能を有するタンパク質につながることが仮定される。この途切れＦＯＸＣ２タンパク質は、ＦＯＸＣ２の調節において役割、および脂肪細胞分化および脂肪細胞発生に関係を有し得る。
【００５１】
実施例４：ＦＯＸＣ２プロモーターのクローニングおよび配列決定
ヌクレオチド１７６ないしヌクレオチド２２３３に対応するＤＮＡ領域（配列番号１バージョン２）を、ヒトゲノムＤＮＡに基づくネスティッドＰＣＲを使用してクローニングした。ＰＣＲを、８−１０％ＤＭＳＯを含めてＨｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）プロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ＃６００２６０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｐｃｒ／ｈｅｒｃｕｌａｓｅ．ｈｔｍ）にしたがって実施した
【００５２】
当初の反応では、５’−プライマー
【化１】
2004510417.tif 000002
を、３’−プライマー
【化２】
2004510417.tif 000003
とともに使用し、２５０ｎｇのＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ＃６５５０−１をテンプレートとして使用した。ネスティッド反応を、当初ＰＣＲ反応物の１／１００で実施し、５’−プライマー
【化３】
2004510417.tif 000004
および３’−プライマー
【化４】
2004510417.tif 000005
を使用した。第２ＰＣＲ後、産物を、１．２％アガロースゲルにおける電気泳動によって分析し、そして予測された大きさのＰＣＲ産物を取得し、そして標準的クローニング手法によってＴＯＰＯ　ＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）へのライゲーションのために切断し、その後配列決定した。ＰＣＲ反応およびクローニング手法を、２つの平行別個実験で反復し、そして２つの別個反応物からの配列データを、生物情報科学的に組みたてた配列と比較した。
【００５３】
ｎｔ１１７９ないしｎｔ２２３３（配列番号１、バージョン２）に対応するプロモーターを含むＤＮＡ領域（図４）を、前記と同じ態様でネスティッドＰＣＲを使用してクローニングした。当初の反応では、テンプレートとして２５０ｎｇゲノムＤＮＡを使用して、５’−プライマー
【化５】
2004510417.tif 000006
を、３’−プライマー
【化６】
2004510417.tif 000007
とともに使用した。ＰＣＲ反応およびクローニング手法を、４つの平行する別個の実験で反復し、そして４つの別個の反応からの配列データを、生物情報学的に組みたてた配列と比較した。
【００５４】
実施例５：選択的／代替的転写物の組織発現プロファイリング
逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アプローチを使用して、ヒト脂肪組織およびヒト始原脂肪細胞中の選択的／代替的転写物の発現を検出した。ヒト脂肪組織からのＲＮＡサンプル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｄ６００５−０１）および始原脂肪細胞（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ， ＳＡ７５， Ｔｒｉｚｏｌ プロトコルにしたがって調製したＲＮＡ）を分析した。ＲＴ−ＰＣＲを、ＳＭＡＲＴ　ＰＡＧＥプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にしたがって実施した。第１の鎖ｃＤＮＡ合成を、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥキットで提供されるオリゴｄＴプライマーを使用して作成した。選択的／代替的転写物のＰＣＲ増幅のために、代替的／選択的転写物に特異的なネスティッド５’プライマーを使用した（当初のＰＣＲ工程
【化７】
2004510417.tif 000008
およびネスティッドプライマー
【化８】
2004510417.tif 000009
）一方、このネスティッド３’プライマーは、該選択的／代替的および通常の転写物にアニールする（当初ＰＣＲ工程
【化９】
2004510417.tif 000010
およびネスティッドプライマー
【化１０】
2004510417.tif 000011
）。ＰＣＲをＳＭＡＲＴ　ＰＡＣＥプロトコルを使用して実施した。該プライマーは、示唆されたスプライシング部位のいずれかの側の配列にアニールする。こうして選択的／代替的転写物に由来するｃＤＮＡを増幅するときに、２２３ｂｐの予測されたサイズのＰＣＲ産物を取得し、一方、イントロン配列を含む汚染ゲノムＤＮＡの増幅は、多くのより大きいサイズのＰＣＲ産物をもたらした。このアプローチを使用して、選択的／代替的転写物の発現を、ヒト脂肪組織および始原脂肪細胞中に検出した。脂肪細胞および脂肪組織中のこの選択的／代替的遺伝子産物（配列番号４）は、この細胞型の調節機能を指摘し得る。
【００５５】
実施例６：ｃＤＮＡウォーキングを使用する選択的／代替的エキソンの５’−ＵＴＲのマッピング
ｃＤＮＡウォーキング法を使用し、選択的／代替的エキソンの５’−ＵＴＲをマッピングした。ヒト脂肪細胞総ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｄ６００５−０１）から取得した。第１鎖５’　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈマニュアルに記載の標準的手法にしたがって合成した。ｃＤＮＡを、このマニュアルに従うが、遺伝子特異的プライマーを使用して増幅した。すべての反応で使用した３’−ＰＣＲプライマーは、スプライス部位の３’−末端にアニールする。汚染ゲノムＤＮＡの増幅は、より大きいサイズのＰＣＲ産物をもたらし、これはイントロン配列を含んでいるためのようである。５’−ＰＣＲプライマーは、近似的に１００ｂｐ間隔を有して、選択的／代替的エキソンの推定開始コドンの上流の配列にアニールする。ＰＣＲ産物を次に、マニュアルにしたがってＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｎ）でＴＡクローニングを使用してクローニングし、そして標準的手法を使用して配列決定した。
【００５６】
最長のＰＣＲ産物をもたらすＰＣＲ反応で、５’−プライマー（当初ＰＣＲ工程
【化１１】
2004510417.tif 000012
およびネスティッドプライマー
【化１２】
2004510417.tif 000013
）を、ネスティッド３’−プライマー（当初ＰＣＲ工程
【化１３】
2004510417.tif 000014
およびネスティッドプライマー
【化１４】
2004510417.tif 000015
）とともに使用した。これは、予測された配列を含む８７８ｂｐのＰＣＲ産物を生じた（配列番号１３）。配列
【化１５】
2004510417.tif 000016
の５’側にアニーリングするプライマーを使用するＰＣＲは、検出可能なＰＣＲ産物を生じない。これらの結果は、選択的／代替的転写物の転写開始部位が、示唆された翻訳開始の少なくとも８７８ｂｐ上流に位置することを示唆する。配列番号１３の位置６９２は、配列番号３の位置１に対応する。
【００５７】
実施例７：機能性分析
同定された調節領域を分析し、それらの、ＦＯＳＣ２遺伝子またはＦＯＸＣ２と置換されたレポーター遺伝子の転写への影響を決定する。ＰＣＲ反応を実施し、第１のメチオニンをコードするＡＴＧの開始に及ぶ配列を恐らく含む、公開されたエキソン配列に隣接するプロモーター領域を単離する。このＰＣＲ産物を、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）に近接するレポータープラスミドにクローニングする。該上流調節領域、すなわち上流およびプロモーター近接配列、または人工的に誘導された相違を有するこれらの配列を含む領域を、類似の態様でクローニングする。これらの構築物を、細胞培養モデル系にトランスフェクトし、そしてレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質のレベル／活性を決定する。これは、同定した領域の機能についての情報を提供し、そして異なる領域の転写調節に及ぼす影響を評価するために使用される。同様に、上流調節領域である、上流およびプロモーター近接配列を含む領域、または人工的に誘導された相違を有するこれらの配列をクローニングおよび使用し、これらの領域の、レポーター遺伝子の転写に及ぼす影響を評価することができる。
【００５８】
実施例８：モジュレート化合物を同定するためのレポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子アッセイは、細胞のシグナル転写活性への手段として周知である。（化学ルミネセンスおよび生物ルミネセンスレポーター遺伝子アッセイの総説のために、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１９， １６９−１８１参照）。例えば、発光タンパク質ルシフェラーゼは、プロモーター活性のモジュレーターについてのアッセイのための有用な手段を提供する。細胞を、ＦＯＸＣ２プロモーターおよびエンハンサー領域、またはＦＯＣＸ２活性を調節するそのフラグメントの下流のルシフェラーゼタンパク質についての遺伝子を含むレポーター構築物で一過性にトランスフェクトする。ルシフェラーゼ活性を、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から商業的に入手可能なルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して定量的に測定し得る。候補モジュレーター化合物の存在下対不存在下でのルミネセンスの差異は、モジュレート活性を指摘する。
【００５９】
【表１】
2004510417.tif 000017
【００６０】
【表２】
2004510417.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の全体構造を示す。
【図２】図２は、表現型的フットプリンティング実験の結果を示す。Ｃｌｕｓｔａｌで作成されたアラインメントによる、マウスＦｏｘＣ２とヒトＦＯＸＣ２配列の間の保存された（１．０＝１００％）フラクションを示す。実線（太字）は、アラインメントでのヒト配列にわたる２００ｂｐ「ウィンドウ」内でマウスに同一であるヒト配列のフラクションを指摘する。薄い線（点による）は、スライドするウインドウがヒトエキソン配列を含むとき、−０．０５にセットされ、そしてウインドウが完全にエキソン配列からなるとき−０．１にセットされる。ローカル最大値を含む、または０．７の保存フラクションを超える領域は、「推定調節領域」として機能するようであり、そのように分類される。
【図３】図３は、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の推定「エンハンサー」領域を示す。下線を付した配列は、転写因子結合部位であるようである。ボックスした配列は、エキソン配列を示す。
スプライス＝選択的／代替的にスプライシングされた遺伝子中のスプライシング部位として推定される配列である。
Ｅ−ボックス様＝ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン（組織分化中の細胞型特異的遺伝子転写の活性化としばしば連関される。Ｍａｓｓａｒｉ ＆ Ｍｕｒｒｅ（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．２０：４２９−４４０参照）を含むＤＮＡ結合タンパク質の標的として既知である「Ｅ−ボックス」モチーフＣＡＮＮＴＧに似る配列である。
フォークヘッド様＝転写因子のウイング型ヘリックス／フォークヘッド型クラスの結合部位に似る配列である。
Ｅｓｔ様＝ＥＳＴドメイン転写因子ファミリー（Ｓｈａｒｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２９， １３７１−１３８７参照）のコンセンサス結合部位に似る配列である。
【図４】図４は、ヒトＦＯＸＣ２遺伝子の推定「プロモーター」領域を示す。下線を付した配列は、エキソン配列を示す。ボックスした配列は、保存された区画（可能性のある転写因子結合部位）を示す。
【図１】
2004510417.tif 000019
【図２】
2004510417.tif 000020
【図３】
2004510417.tif 000021
【図４】
2004510417.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004510417.tif 000023
2004510417.tif 000024
2004510417.tif 000025
2004510417.tif 000026
2004510417.tif 000027
2004510417.tif 000028
2004510417.tif 000029
2004510417.tif 000030
2004510417.tif 000031
2004510417.tif 000032
2004510417.tif 000033
2004510417.tif 000034
2004510417.tif 000035
2004510417.tif 000036
2004510417.tif 000037
2004510417.tif 000038
2004510417.tif 000039
2004510417.tif 000040
2004510417.tif 000041
2004510417.tif 000042
2004510417.tif 000043
2004510417.tif 000044
2004510417.tif 000045
2004510417.tif 000046
2004510417.tif 000047
2004510417.tif 000048
2004510417.tif 000049
2004510417.tif 000050
2004510417.tif 000051
2004510417.tif 000052
2004510417.tif 000053
2004510417.tif 000054
2004510417.tif 000055
2004510417.tif 000056
2004510417.tif 000057
2004510417.tif 000058
2004510417.tif 000059
2004510417.tif 000060
2004510417.tif 000061
2004510417.tif 000062
2004510417.tif 000063
2004510417.tif 000064
2004510417.tif 000065
2004510417.tif 000066
2004510417.tif 000067
2004510417.tif 000068
2004510417.tif 000069
2004510417.tif 000070
2004510417.tif 000071
2004510417.tif 000072
2004510417.tif 000073
2004510417.tif 000074
2004510417.tif 000075
2004510417.tif 000076
2004510417.tif 000077
2004510417.tif 000078
2004510417.tif 000079
【国際調査報告】
2004510417.tif 000080
2004510417.tif 000081
2004510417.tif 000082
2004510417.tif 000083
2004510417.tif 000084