(57)【要約】本発明は、油中水型乳剤を含み、前記油中水型乳剤が、一般式Ａ−ＣＯＯ−Ｂ−ＯＯＣ−Ａ（式中、成分Ｂは、水溶性ポリアルキレングリコールの二価の残基であり、成分Ａは、油溶性複合モノカルボン酸の残基である）を有するブロックコポリマーであるポリマー乳化剤を含むことを特徴とする、ワクチンの調合に使用するためのアジュバントを提供する。こうしたポリマー乳化剤ならびにそれらの調製は、英国特許第２００２４００号および国際公開公報第９６０７６８９号に開示されている。好ましくは、式Ａ−ＣＯＯ−Ｂ−ＯＯＣ−Ａのブロックコポリマーにおいて、成分Ｂは、ポリエチレングリコールから誘導され、成分Ａは、ポリヒドロキシステアリン酸、好ましくは、ポリ（１２−ヒドロキシ−ステアリン酸）から誘導される。本発明のアジュバントに用いられる最も好ましい乳化剤は、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５、ＰＥＧ３０  ジポリヒドロキシステアレートである。本発明に伴い用いるためのもう一つの似たような乳化剤は、ＡＴＬＯＸ（登録商標）４９１２である。Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５およびＡＴＬＯＸ（登録商標）４９１２は、両方とも、ＩＣＩから市販されている分子量約５０００のポリエチレングリコールとポリヒドロキシステアリン酸のブロックコポリマー（Ａ−Ｂ−Ａ）である。これら乳化剤を使用して、代謝性油に基づいたものであってもよい、安定で低粘度のｗ／ｏ型乳剤に基づいたアジュバントが得られることが判明した。前記アジュバントは、卓越したアジュバント活性を有し、且つ、よく許容される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
油中水型乳剤を含み、前記油中水型乳剤が、一般式Ａ−ＣＯＯ−Ｂ−ＯＯＣ−Ａ（式中、成分Ｂは、水溶性ポリアルキレングリコールの二価残基であり、成分Ａは、油溶性複合モノカルボン酸の残基である）を有するブロックコポリマーであるポリマー乳化剤を含むことを特徴とする、ワクチンの調合に使用するためのアジュバント。
【請求項２】
成分Ａが、少なくとも５００の分子量を有し、成分Ｂが、少なくとも５００の分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
成分Ｂが、ポリエチレングリコールから誘導され、成分Ａが、ポリヒドロキシステアリン酸、好ましくはポリ（１２−ヒドロキシ−ステアリン酸）から誘導されることを特徴とする、請求項１または２に記載のアジュバント。
【請求項４】
ポリマー量乳化剤が、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５またはＡＴＬＯＸ  ４９１２であることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載のアジュバント。
【請求項５】
乳剤が、０．０１％（ｗ／ｗ）から１５％（ｗ／ｗ）のポリマー乳化剤を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のアジュバント。
【請求項６】
乳剤が、０．３％（ｗ／ｗ）から０．５％（ｗ／ｗ）のポリマー乳化剤を含むことを特徴とする、請求項５に記載のアジュバント。
【請求項７】
油が、代謝性油であることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のアジュバント。
【請求項８】
油が、半合成油、またはオレイン酸オレイルであることを特徴とする、請求項７に記載のアジュバント。
【請求項９】
水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型乳剤を含み、前記水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型乳剤が、一般式Ａ−ＣＯＯ−Ｂ−ＯＯＣ−Ａ（式中、成分Ｂは、水溶性ポリアルキレングリコールの二価残基であり、成分Ａは、油溶性複合モノカルボン酸の残基である）を有するブロックコポリマーであるポリマー乳化剤を含む油中水型乳剤に基づくことを特徴する、ワクチンの調合に使用するためのアジュバント。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のアジュバントと感染因子から誘導された抗原性成分とを含むワクチン。
【請求項１１】
抗原性成分が、乳剤の不連続水相に含まれる、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
アジュバントの調製における、一般式Ａ−ＣＯＯ−Ｂ−ＯＯＣ−Ａ（式中、成分Ｂが、水溶性ポリアルキレングリコールの二価残基であり、成分Ａが、油溶性複合モノカルボン酸の残基である）を有するブロックコポリマーを含むポリマー乳化剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油中水型乳剤を含むアジュバント、これらの乳剤を調製する方法、および前記アジュバントを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
油中水（ｗ／ｏ）型乳剤は、連続油相および前記油相中に小滴として分散されている水相（不連続相）、ならびに一つ以上の界面活性剤および乳化剤から成る二相系である。ｗ／ｏ型乳剤は、医薬品、化粧品および食品ならびに飲料業界において広く利用されている。医薬品において、ｗ／ｏ型乳剤は、治療薬、特に、水溶性または水感受性有効成分の場合の治療薬のビヒクルとして、医薬調合に一般に用いられる。ワクチン接種では、一つ以上の感染因子から誘導された標的抗原に対する免疫応答を刺激するために、ｗ／ｏ型乳剤がアジュバントとして一般にが用いられる。最も古いｗ／ｏ型乳剤の一つは、鉱物油中のマイコバクテリアおよび界面活性剤としてのＡｒｌａｃｅｌ  Ａ（登録商標）を含有するフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、またはマイコバクテリアを欠くフロイント不完全アジュバントである。鉱物油または代謝性油の他のｗ／ｏ型乳剤も開発されており、ワクチン接種におけるアジュバントとして恒常的に用いられている。
【０００３】
ｗ／ｏ型乳剤は、一般に注射によって適用される。注射可能であるためには、組成物は、実質的に流動性でなければならない。しかし、ｗ／ｏ型乳剤は、多くの場合、比較的粘稠であり、このことは、これらの乳剤の注射を非常に難しくする。特に、代謝性油のｗ／ｏ型乳剤に関しては、粘度が問題である。
【０００４】
ｗ／ｏ型乳剤において、一般に、粘度は、連続相、すなわち油相の粘度に依存する。
【０００５】
異なる油、鉱物油と非鉱物（代謝性）油の両方、をアジュバントに用いることができる。しかし、油をベースにしたアジュバントは、非油性ワクチンと比較してワクチンの免疫活性を上昇させるが、特に鉱物油が用いられる際、ワクチンの注射部位において局所反応を引き起こすことがある。これは、ワクチン接種を受ける生体が鉱物油を代謝できず、鉱物油が注射部位近くに留まる傾向があることから引き起こされることがある。
【０００６】
注射部位における局所反応の問題を考慮して、鉱物油の代わりに非鉱物（代謝性）油を用いることが望ましい。しかし、非鉱物油より鉱物油を用いた時のほうが、アジュバントの免疫活性は、高いままである。好ましくは、代謝性油に基づいたアジュバントの免疫活性は、鉱物油に基づいたアジュバントについての免疫活性と同程度に高くあるべきであり、同時に、局所耐性の問題は、事実上ない。
【０００７】
さらに、非鉱物油をベースにしたｗ／ｏ型乳剤に基づいたアジュバントは、安定でなければならず、且つ、許容可能な貯蔵寿命を有していなければならない。
【０００８】
しかし、代謝性油、ならびに特に（半）合成油および植物油は、室温で粘稠であり、ｗ／ｏ型乳剤におけるそれらの使用は、個々の油のものと同様の乳剤粘度を導く。しかし、含油率を低下させる（および結果として含水率が上昇する）と、多くの場合、注射がもはや可能でないほど乳剤粘度が上昇する。粘度に対する影響に加えて、ｗ／ｏ型乳剤の含油率の変化は、乳剤の安定性に影響を及ぼす。含油率を低下させると、結果として界面領域が拡大する。乳化剤の量（界面領域のサイズに依存する）が不足し、乳剤が壊れることになる。
【０００９】
界面領域のサイズは、分散相の小滴のサイズにも依存する。小滴サイズが低下すると、結果として界面領域が拡大する。機械的手段を用いて分散相の小滴サイズを低下または上昇させることができる。高剪断加工装置と比較して、低剪断加工は、結果として小滴サイズを上昇させ、従って、界面領域を低下させる。
【００１０】
これらの制限は、特に代謝性油に基づく時、安定で流動性のｗ／ｏ型乳剤を得ることが難しくなる。従って、安定な、同時に流動性であるｗ／ｏ型乳剤を得るために、他の方法および／または手段を見出す必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、代謝性油を用る時でさえ注射に非常に適する安定なｗ／ｏ型乳剤に基づいたアジュバントであって、良好なアジュバント活性を有するアジュバントを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
驚くべきことに、ある特定の乳化剤を用いると、ｗ／ｏ型乳剤を安定にすることができ、且つ、非鉱物代謝性油に基づく時でさえ卓越したアジュバント活性を提供することできることが判明した。本乳剤は、非常に低粘度であり、従って、注射に適する。
【００１３】
従って、本発明は、油中水型乳剤を含み、前記油中水型乳剤が、一般式Ａ−ＣＯＯ−Ｂ−ＯＯＣ−Ａ（式中、成分Ｂは、水溶性ポリアルキレングリコールの二価残基であり、成分Ａは、油溶性複合モノカルボン酸の残基である）を有するブロックコポリマーであるポリマー乳化剤を含むことを特徴とする、ワクチンの調合に使用するためのアジュバントを提供する。こうしたポリマー乳化剤ならびにそれらの調製は、英国特許第２００２４００号および国際公開公報第９６０７６８９号に開示されており、これらの内容は、参照として本明細書に取り入れる。英国特許第２００２４００号に開示されているような乳化剤は、Ａが、少なくとも５００の分子量を有し、油溶性複合モノカルボン酸、すなわち脂肪酸の残基である乳化剤である。これらの複合ものカルボン酸は、下記一般式：
【００１４】
【化１】
2004523551.tif 000002
（式中、
Ｒは、水素または一価炭化水素または置換炭化水素基であり；
Ｒ１は、水素または一価Ｃ１〜Ｃ２４炭化水素基であり；
Ｒ２は、二価Ｃ１〜Ｃ２４炭化水素基であり；
ｎは、０または１であり；
ｐは、０から２００の整数である。）
によって表すことができる。式１の各括弧単位は、すべて同じであってもよいし、Ｒ１、Ｒ２およびｎについて異なってもよい。量ｐは、前記複合酸のすべての分子について同じ一つの値を通常は有するが、高分子材料に一般的であるように、上記範囲内に存する平均値付近に統計学上分布する。ポリマー成分Ｂは、少なくとも５００の分子量を有し、且つ、下記一般式：
【００１５】
【化２】
2004523551.tif 000003
（式中、
Ｒ３は、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキル基であり；
ｑは、１０から５００までの整数である。）
を有する水溶性ポリアルキレングリコールの二価残基である。式ＩＩにおける繰り返し単位は、また、すべて同じであってもよいし、Ｒ３が異なっていてもよく、量ｑは、平均値付近で変化しうる。
【００１６】
炭化水素Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、直鎖であってもよいし、または分枝鎖であってもよい。
【００１７】
好ましくは、式Ａ−ＣＯＯ−Ｂ−ＯＯＣ−Ａのブロックコポリマーにおいて、成分Ｂは、ポリエチレングリコールから誘導され、成分Ａは、ステアリン酸、例えば、ポリヒドロキシステアリン酸、好ましくは、ポリ（１２−ヒドロキシ−ステアリン酸）から誘導される。
【００１８】
従って、Ｒは、ステアリン酸から誘導された直鎖Ｃ１７Ｈ３５−基でありうり、Ｒ１およびＲ２を含む単位は、１２−ヒドロキシ−ステアリン酸から誘導されうる。
【００１９】
この場合、ｐは、好ましくは、少なくとも２の値を有する。
【００２０】
好ましくは、ｑは、２０と６０の間、さらに好ましくは２３より上の値を有しうる。
【００２１】
併せた成分Ａの成分Ｂに対する重量比は、幅広く変化しうり、典型的には、９：１から１：９の範囲に存する。
【００２２】
本発明のアジュバントに用いられる最も好ましい乳化剤は、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５、ＰＥＧ  ３０ジポリヒドロキシステアレートである。本発明に伴い用いるためのもう一つの似たような乳化剤は、ＡＴＬＯＸ（登録商標）４９１２である。Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５およびＡＴＬＯＸ（登録商標）４９１２は、両方とも、ＩＣＩから市販されている分子量約５０００のポリエチレングリコールとポリヒドロキシステアリン酸のブロックコポリマー（Ａ−Ｂ−Ａ）である。
【００２３】
これらの重合ブロックコポリマーは、多種多様な油と相溶性であり、従って、注射による適用を確実なものにするために必要な安定性および流動性を有する、さらにずっと広い範囲のｗ／ｏ型乳剤をもたら、且つ、ワクチン接種を受ける被験者に非常によく許容されることが判明した。さらに、これらのＡＢＡ型ブロックコポリマーの使用は、保管中、優れた安定性を有するｗ／ｏ型乳剤を導き、従って、前記乳剤の貯蔵寿命を向上させる。得られたｗ／ｏ型乳剤は、低温、特に２５℃で安定であり、流動性であった。
【００２４】
最も重要なことは、上述のＡＢＡブロックコポリマー型乳化剤の使用に基づく本発明のアジュバントは、驚くべきことに、ワクチンに用いた時、卓越した免疫促進（アジュバント）活性を有し、同時に、注射部位において局所反応を誘導しなかったことである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明のｗ／ｏ型乳剤は、０．００１％（ｗ／ｗ）から１５％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５％（ｗ／ｗ）から１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）から３％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは０．３％（ｗ／ｗ）から０．５％（ｗ／ｗ）の本発明のポリマー乳化剤を含むことができる。最も好ましい実施態様において、本発明のｗ／ｏ型乳剤は、０．５％（ｗ／ｗ）の本発明のポリマー乳化剤を含む。必要な場合には、本発明のｗ／ｏ型乳剤に、本発明のポリマー乳化剤に加えて他の乳化剤を用いることもできる。
【００２６】
本発明のｗ／ｏ型乳剤は、３０重量％から９０重量％、好ましくは３５重量％から６０重量％、さらに好ましくは４０重量％から６０重量％の油を含むことができる。
【００２７】
本発明のｗ／ｏ型乳剤における使用に適する油は、非代謝性油、代謝性油、および代謝性油と非代謝性油の混合物である。本発明のアジュバントに用いることができる非代謝性油には、鉱物油およびパラフィン油が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２８】
本発明の代謝性油には、植物油、動物油、天然炭化水素、代謝性合成または半合成油（ＭｉｇｌｉｏｌおよびＣｅｔｉｏｌ）、プロピレングリコールの脂肪酸エステルおよびオレイン酸オレイルなどのＣ６〜Ｃ２４脂肪酸の脂肪酸エステル、カプリン酸またはカプリル酸のジエステル、ならびにこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。適する植物油は、ラッカセイ油、ダイズ油、ヒマワリ油およびこれらに類するものである。適する動物油は、スクアランおよびスクアレンならびにこれらに類するものである。
【００２９】
非代謝性油（鉱物油）は、注射部位おいて局所反応をもたらす傾向があるので、好ましくは、油相は、代謝性油または代謝性油の混合物である。好ましい油は、ＭｉｇｌｉｏｌおよびＣｅｔｉｏｌなどの半合成油、およびオレイン酸オレイル、オレイン酸エステルのエステル類、好ましくはオレイン酸エチルである。
【００３０】
本発明のアジュバントを用いると、低粘度を達成することができ、乳剤が安定であり、同時に、良好なアジュバント活性が得られ、注射部位において局所反応が発生しない。
【００３１】
本発明のアジュバントは、６０ｒ．ｐ．ｍで３０秒間、スピンドルタイプ６２番を用いてブルックフィールド  ＤＶ−Ｉ＋粘度計で試験した時、４５０ｍＰａ．ｓ未満、好ましくは２５０ｍＰａ．ｓ未満、さらに好ましくは１００ｍＰａ．ｓ未満の粘度を有するｗ／ｏ型乳剤を好ましくは含む。
【００３２】
本発明のｗ／ｏ型乳剤の水相は、水、生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液から通常は成る。
【００３３】
本発明のアジュバントは、ワクチンに用いることができる。ワクチンは、感染因子の抗原性物質を通常含むであろう。前記アジュバントを含むワクチン、および感染因子から誘導された抗原性成分は、同様に本発明の一部である。本発明のワクチンは、乳剤の不連続水相中に抗原性成分を含むことができる。
【００３４】
ワクチンに用いるためのアジュバントの調製において、一般式Ａ−ＣＯＯ−Ｂ−ＯＯＣ−Ａ（式中、Ｂは、水溶性ポリアルキレングリコールの二価残基であり、Ａは、油溶性複合モノカルボン酸の残基である）を有するブロックコポリマーであるポリマー乳化剤を用いること、およびワクチンにこれらの乳化剤を用いることは、同様に、本発明の一部である。
【００３５】
ワクチン接種によって免疫系を作動させ、その結果、感染要因に対する防御免疫応答を生じる。ワクチンは、抗原性成分として、生きている弱毒化した微生物に基づいたものであってもよいし、または殺した（不活化した）微生物に基づいたものであってもよいし、ならびに微生物のサブユニットに基づいたものであってもよい。特に、不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンの場合、アジュバントを用いて免疫応答を増大することができる。
【００３６】
抗原性物質をアジュバントと混合してもよい。このワクチンでは、抗原性物質は、添加すると、アジュバントの不連続水相中に存在するだろう。本発明のアジュバントに基づいたワクチン製剤は、この技術分野において既知の方法によって調製することができる。
【００３７】
本発明のアジュバントに用いるためのｗ／ｏ型乳剤を用いて、外側の水相中の上述のｗ／ｏ型乳剤の小滴に基づいた水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型乳剤を調製することができる。本発明のｗ／ｏ型およびｗ／ｏ／ｗ型乳剤は、ワクチン、特に、獣医学用ワクチンにおけるアジュバントとしての使用に適する。さらに、本発明のｗ／ｏ型乳剤は、治療薬、特に、水不溶性または水感受性有効成分、および栄養補助物質のためのビヒクルとしての使用に適する。従って、さらなる側面において、本発明は、本発明のｗ／ｏ型またはｗ／ｏ／ｗ型乳剤に基づいた医薬組成物を規定する。
【００３８】
本発明の乳剤は、標準的な技法を用いて調製することができる。一般に、水相、油相、本発明のポリマー乳化剤および場合によっては他の乳化剤を一緒にして、所望の低い粘度を有する安定な乳剤が得られるまで乳化する。乳剤を調製する時、油性相と水性相の間に界面を形成するためにエネルギーを費やさなければならない。従って、乳化装置には、多種多様なアジテーター、ホモジナイザー、コロイドミル、ジェットミキサーおよび超音波装置が含まれる。生産サイズのアジテーターは、通常２０００ｒ．ｐ．ｍ．以下の回転速度を有するプロペラ形またはパドル形攪拌システムでありうり、これらは、低剪断混合手法と考えられる。もう一つのタイプの生産現場用アジテーターは、コロイドミルである。コロイドミルの操作原理は、ステーターと２０００ｒｐｍから１８０００ｒｐｍの速度で回転する高速ローターとの間に乳剤処方の混合相を通過させることあり、これは、高剪断混合手法と考えられる。
【００３９】
油中水型乳剤は、内側および外側の水相が油相によって分離されている水中油中水型乳剤（「複乳剤」とも呼ばれる）に加工することができる。この方法は、適正な乳化剤を含有する水相に油中水型乳剤を混入することから成る。これらの系では、疎水性乳化剤と親水性乳化剤の両方を用いて、複乳剤を安定させる。
【００４０】
好ましくは、本発明のポリマー乳化剤を油相に溶解する。追加の乳化剤は、水相に添合してもよいし、または油相に添合してもよい。
【００４１】
ｗ／ｏ／ｗ型乳剤の場合、本発明のｗ／ｏ型乳剤を第一ｗ／ｏ型乳剤として調製し、その後、これを第二水相および第二乳化剤に添加し、均質化して、所望のｗ／ｏ／ｗ型乳剤を得る。ｗ／ｏ／ｗ型乳剤を作るために必要な第二乳化剤は、好ましくは、１０から１８のＨＬＢを有する乳化剤であるか、または所望のＨＬＢが得られるように二つ以上の乳化剤を組み合わせたものである。医薬用乳剤の製造に関する詳細は、例えば、「工業薬学の理論および実践（Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒｏｙ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」（Ｅｄｓ：Ｌａｃｈｍａｎ  Ｌ．ら，Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，米国，１９７０，第１６章）、および「レミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（Ｅｄｓ：Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国，１９９０，第１８版）において見出すことができる。
【００４２】
本発明のワクチンは、好ましくは、腸管外投与、例えば、筋肉内投与、皮下投与または静脈内投与される。しかし、必要な場合には、本ワクチンは、非腸管外投与、例えば、経口投与、スプレー、点眼剤または点鼻剤投与も可能である。本発明のアジュバントおよび／またはワクチンに用いられる乳剤の低い粘度は、腸管外投与に極めて適する。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を単に説明するためのものであり、特定の実施態様に本発明を制限するためのものではない。
【００４４】
実施例
【実施例１】
【００４５】
感染性気管支炎ウイルス（Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、マサチューセッツ株およびニューカッスル病ウイルス、クローン３０株の不活化抗原を含有する油中水型乳剤を５０／５０％（ｗ／ｗ）の水／油比で製造する。抗原に加えて、水相は、０．０１ｍのＰＢＳを含有する。有機相は、乳化剤として、中鎖トリグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８４０）および３％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−３０  ジポリヒドロキシステアレート（Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５）を含有する。攪拌しながら、６０℃で、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５をＭｉｇｌｙｏｌ  ８４０に溶解する。溶解したら、この油相を室温に冷ます。Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘタイプのホモジナイザーを用い、高剪断均質化状態で、ゆっくりと水相をこの油相に添加する。得られた水滴は、主として１μｍのサイズを有する。この乳剤の粘度は、２５℃で１１５ｍＰａ．ｓであり、３週間、３７℃での保管に基づく安定性加速試験において充分な安定性を示した。
【実施例２】
【００４６】
感染性気管支炎ウイルス、マサチューセッツ株およびニューカッスル病ウイルス、クローン３０株の不活化抗原を含有する油中水型乳剤を７０／３０％（ｗ／ｗ）の水／油比で製造する。抗原に加えて、水相は、０．０１ｍのＰＢＳを含有する。有機相は、乳化剤として、中鎖トリグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８４０）および３％（ｗ／ｗ）ののＰＥＧ−３０  ジポリヒドロキシステアレート（Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５）を含有する。攪拌しながら、６０℃で、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５をＭｉｇｌｙｏｌ  ８４０に溶解する。溶解したら、この油相を室温に冷ます。ＩＫＡ  Ｅｕｒｏｓｔａｒミキサーを用い、１１００ｒ．ｐ．ｍ．で攪拌しながら、ゆっくりと水相をこの油相に添加する。得られた水滴は、主として１μｍと５μｍの間のサイズを有する。この乳剤の粘度は、２５℃で４２４ｍＰａ．ｓであり、３週間、３７℃での保管に基づく安定性加速試験において充分な安定性を示した。このワクチン０．５ｍＬで、一度、ワクチン筋肉内接種を施した週齢３週のＳＰＦ雌ニワトリは、ワクチン接種の９週間後、７．０の平均２ｌｏｇ  ＨＩ−ＩＢＶ血清力価、および４．４の平均２ｌｏｇ  ＨＩ−ＮＤＶ血清力価を示した。
【実施例３】
【００４７】
ＰＥＧ−３０  ジポリヒドロキシステアレート（Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５）およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を乳化剤として用いて、水中油中水型乳剤を調製する。第一油中水型乳剤は、６０／４０％（ｗ／ｗ）の水／油比に基づく。水相は、感染性気管支炎ウイルス、マサチューセッツ株およびニューカッスル病ウイルス、クローン３０株の不活化抗原を含有する。抗原に加えて、水相は、０．０１ｍのＰＢＳを含有する。有機相は、乳化剤として、中鎖トリグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８４０）および３％（ｗ／ｗ）ののＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５を含有する。Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５は、攪拌しながら、６０℃で、Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８４０に溶解する。溶解したら、この油相を室温に冷ます。Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘタイプのホモジナイザーを用い、高剪断均質化状態で、ゆっくりと水相をこの油相に添加する。得られた水滴は、主として１μｍと５μｍの間のサイズを有する。第二乳剤は、６０／４０％（ｗ／ｗ）の油中水／水に基づく。外部の水相は、０．０１ｍのＰＢＳに加え、３％（ｗ／ｗ）のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７も含有する。Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘタイプのホモジナイザーを用い、中剪断均質化状態（１６．０００ｒ．ｐ．ｍ．）で、ゆっくりと油中水型乳剤をこの水相に添加する。得られた油中水小滴は、主として１μｍと５μｍの間のサイズを有する。このＷ／Ｏ／Ｗ型乳剤の粘度は、２５℃で１１０ｍＰａ．ｓであり、２℃から８℃で少なくとも６ヶ月間、安定性を示した。
【実施例４】
【００４８】
感染性気管支炎ウイルス、マサチューセッツ株およびニューカッスル病ウイルス、クローン３０株の不活化抗原を含有する油中水型乳剤を４０／６０％（ｗ／ｗ）の水／油比で製造する。抗原に加えて、水相は、０．０１ｍのＰＢＳを含有する。有機相は、乳化剤として、オレイン酸エチルおよび０．１％（ｗ／ｗ）ののＰＥＧ−３０  ジポリヒドロキシステアレート（Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５）を含有する。攪拌しながら、６０℃でＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５を溶解する。溶解したら、この油相を室温に冷ます。ＩＫＡ  Ｅｕｒｏｓｔａｒミキサーを用い、１３００ｒ．ｐ．ｍ．で攪拌しながら、水相をこの油相に混入する。得られた水滴は、主として１μｍと５μｍの間のサイズを有する。この乳剤の粘度は、２５℃で２５ｍＰａ．ｓであり、３週間、３７℃での保管に基づく安定性加速試験において充分な安定性を示した。
【実施例５】
【００４９】
低量のＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５を含有する油中水型乳剤
油中水型乳剤を６０／４０％（ｗ／ｗ）の水／油比で製造する。水相は、０．０１ｍの等張リン酸緩衝液を含有する。有機相は、乳化剤として、中鎖トリグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８４０）および０．５％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ−３０  ジポリヒドロキシステアレート（Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５）を含有する。攪拌しながら、６０℃で、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５をＭｉｇｌｙｏｌ  ８４０に溶解する。溶解したら、この油相を室温に冷ます。ＩＫＡ  Ｅｕｒｏｓｔａｒミキサーを用い、５分間、１１００ｒ．ｐ．ｍ．で攪拌しながら、水相をこの油相に添加する。得られた水滴は、主として１μｍと５μｍの間のサイズを有する。この乳剤の粘度は、２５℃で１２７ｍＰａ．ｓであり、３週間、３７℃での保管に基づく安定性加速試験において充分な安定性を示した。
【実施例６】
【００５０】
感染性気管支炎ウイルス、マサチューセッツ株およびニューカッスル病ウイルス、クローン３０株の不活化抗原を含有する油中水型乳剤を４０／６０％（ｗ／ｗ）の水／油比で製造する。抗原に加えて、水相は、０．０１ｍのＰＢＳを含有する。有機相は、乳化剤として、プロピレングリコールジカプリルカプリレートおよび０．１％（ｗ／ｗ）ののＰＥＧ−３０  ジポリヒドロキシステアレート（Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５）を含有する。攪拌しながら、６０℃で、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５をプロピレングリコールジカプリルカプリレートに溶解する。溶解したら、この油相を室温に冷ます。ＩＫＡ  Ｅｕｒｏｓｔａｒミキサーを用い、５分間、１３００ｒ．ｐ．ｍ．で攪拌しながら、水相をこの油相に混入する。得られた水滴は、主として１μｍと５μｍの間のサイズを有する。この乳剤の粘度は、２５℃で３５ｍＰａ．ｓであり、３週間、３７℃での保管に基づく安定性加速試験において充分な安定性を示した。
【実施例７】
【００５１】
油のタイプのバリエーション
試験した油のタイプは、鉱物油（米国、ＥｘｘｏｎからのＭａｒｃｏｌ  ５２）、Ｅｕｔａｎｏｌ  Ｇ（ドイツ、Ｈｅｎｋｅｌからの脂肪アルコール）、Ｃｅｔｉｏｌ  ＰＧＬ（ドイツ、Ｈｅｎｋｅｌからのヘキシルデカノール／ラウリン酸ヘキシルデシル）およびミリスチル酸イソプロピル（ドイツ、Ｍｅｒｃｋ）、Ｅｓｔｏｌ  １５２６（スペイン、Ｕｎｉｃｈｅｍａからの中鎖トリグリセリド）およびオレイン酸エチル（スウェーデン、ＡＫＺＯ−Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。この実施例ならびに後続の実施例８および９で用いるオレイン酸エチルおよびＥｓｔｏｌ  １５２６は、７．５％（ｗ／ｗ）のビタミンＥ酢酸塩を含有していた。（特に指示しない限り）濃度０．２５％（ｗ／ｗ）のＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５（英国、ＩＣＩ）を界面活性剤として用いた。６０℃まで加熱しながら、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５を油相に混入した。
【００５２】
試験したホルマリン不活化ウイルス鳥類抗原のタイプ：ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、クローン３０株（卵内で生産したもの）。用いたウイルス懸濁液の合計濃度は、最終ワクチンの８％（ｗ／ｖ）であった。ウイルス懸濁液を含む水相を０．０１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２で希釈した。
【００５３】
乳剤の調製
二つのタイプの調製物を試験した。低剪断乳剤については、プロペラ羽根を具備するＥｕｒｏｓｔａｒミキサー（ドイツ、ＩＫＡ）を用い、１１００ｒ．ｐ．ｍ．から１３００ｒ．ｐ．ｍ．で油相への水相の混合物を行った。高剪断乳剤については、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔｙｐｅ  Ｔ２５（ドイツ、ＩＫＡ）を用い、２０．０００ｒ．ｐ．ｍ．での高剪断力で混合を行った。試験した水／油比のバリエーションは、６０／４０および３０／７０（単位はすべて％（ｗ／ｗ））であった。乳剤の小滴サイズは、１０００倍で干渉顕微鏡（日本、オリンパス光学工業株式会社、モデルＢＸ５０）を用いて判定した。低剪断条件下で調製した乳剤の小滴サイズは、主に１μｍから５μｍであり、一方、高剪断条件下で調製した乳剤は、主に約１μｍであった。３週間、３７℃で乳剤を保管した後、外観を判定することによって、物理的安定性加速試験を行った。３７℃で三週間後、乳剤の破壊を示した試験サンプルはなかった。
【００５４】
動物の免疫化
週齢３週の特定病原体感染防止条件（ＳＰＦ）雌ニワトリのグループ（ｎ＝８〜１０）の胸筋に、０．５ｍＬのワクチンでのワクチン筋肉内接種を施した。ワクチン接種の３、６、９および１２週間後に、血清検査用の血液サンプルを採取した。ＮＤについてのウイルス血球凝集抑制（ＨＩ）試験を行って、抗ウイルス血清抗体力価のレベルを判定した。
【００５５】
ＮＤＶ特異的抗体の血清レベルを血球凝集抑制アッセイによって判定した。系列二倍血清希釈物をマイクロタイタープレート内で調製し、血球凝集単位８／ＮＤＶ抗原５０μＬを含有する等量のものと混合した。血球凝集の完全抑制をもたらす最高希釈度の逆数として力価を表した。サンプルは、希釈度＞１：２での血球凝集の抑制で、陽性であると評価した。
【００５６】
結果を以下の表に示す。
【００５７】
結果
【００５８】
【表１】
2004523551.tif 000004
【実施例８】
【００５９】
水−油比のバリエーション
材料
試験した油のタイプは、オレイン酸エチル（スウェーデン、ＡＫＺＯ−Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。０．５％（ｗ／ｗ）の濃度のＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５（英国、ＩＣＩ）を界面活性剤として用いた。試験した水／油比のバリエーションは、４０／６０、５０／５０、６０／４０および７０／３０（単位はすべて％（ｗ／ｗ））であった。
【００６０】
感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マサチューセッツ４１株（卵内で生産したもの）タイプのホルマリン不活化ウイルス鳥類抗原を試験した。用いたウイルス懸濁液の全濃度は、最終ワクチンの１０％（ｗ／ｖ）であった。ウイルス懸濁液を含む水相を０．０１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２で希釈した。
【００６１】
乳剤の調製：実施例７参照。
【００６２】
動物の免疫化
週齢３週の特定病原体感染防止条件（ＳＰＦ）雌ニワトリのグループ（ｎ＝８〜１０）の胸筋に、０．５ｍＬのワクチンでのワクチン筋肉内接種を施した。ワクチン接種の３、６、９および１２週間後に、血清検査用の血液サンプルを採取した。ＩＢＶについてのウイルス血球凝集抑制（ＨＩ）試験を行って、抗ウイルス血清抗体力価のレベルを判定した。
【００６３】
血清抗体についてのアッセイ
ＩＢＶ特異的抗体の血清レベルを血球凝集抑制アッセイによって判定した。系列二倍血清希釈物をマイクロタイタープレート内で調製し、血球凝集単位８／ＩＢＶ抗原５０μＬを含有する等量のものと混合した。血球凝集の完全抑制をもたらす最高希釈度の逆数として力価を表した。サンプルは、希釈度＞１：１６での血球凝集の抑制で、陽性であると評価した。
【００６４】
結果
【００６５】
【表２】
2004523551.tif 000005
【実施例９】
【００６６】
界面活性剤の量のバリエーション
材料
試験した油のタイプは、オレイン酸エチル（スウェーデン、ＡＫＺＯ−Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。試験した水／油比は、４０／６０％（ｗ／ｗ）であった。Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５（英国、ＩＣＩ）を界面活性剤として用いた。試験したＡｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５の量は、０．１％、０．２％、０．５％、１．０％、２．５％、５％、１０％（単位はすべて％（ｗ／ｗ））であった。試験したウイルス鳥類抗原のタイプは、ニューカッスル病ウイルス、ｄ−１２株（弱毒化したもの）であった。用いたウイルス懸濁液の合計濃度は、最終ワクチンの１０％（ｗ／ｖ）であった。ウイルス懸濁液を含む水性相を０．０１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２で希釈した。
【００６７】
乳剤の調製
攪拌しながら、６０℃で、Ａｒｌａｃｅｌ  Ｐ１３５をオレイン酸エチルに溶解する。溶解したら、この油相を室温に冷ます。プロペラ羽根を具備するＥｕｒｏｓｔａｒミキサー（ドイツ、ＩＫＡ）を用い、１１００ｒ．ｐ．ｍ．から１３００ｒ．ｐ．ｍ．で、油相への水相の混入を行った。乳剤の小滴サイズは、１０００ｘ倍で干渉顕微鏡（日本、オリンパス光学工業株式会社、モデルＢＸ５０）を用いて判定した。小滴サイズは、主に１μｍから５μｍであった。
【００６８】
結果
これらの乳剤を卵内（ｉｎ−ｏｖｏ）ワクチン接種に用いた。すべての乳剤が、許容可能な注射可能性を示した。孵化率試験の結果も許容可能であった（８０％と９５％の間）。
【国際公開パンフレット】
2004523551.tif 000006
2004523551.tif 000007
2004523551.tif 000008
2004523551.tif 000009
2004523551.tif 000010
2004523551.tif 000011
2004523551.tif 000012
2004523551.tif 000013
2004523551.tif 000014
2004523551.tif 000015
2004523551.tif 000016
2004523551.tif 000017
2004523551.tif 000018
2004523551.tif 000019
2004523551.tif 000020
2004523551.tif 000021
【国際調査報告】
2004523551.tif 000022
2004523551.tif 000023
2004523551.tif 000024