(57)【要約】キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体が開示される。種々の分子生物学の適用は、アトロプ異性体キサンテン蛍光色素を、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび炭水化物のような基質のための標識として利用する。本発明が利用され得る方法としては、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡフラグメント分析、ＰＣＲ、ＳＮＰ分析、オリゴヌクレオチド連結、増幅、ミニ配列決定、およびプライマー伸長が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１】
2004532805.tif 000022
を有する、実質的に純粋なアトロプ異性体化合物であって、
Ｚ１は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｚ２は、Ｏ、＋ＮＨ２、＋ＮＨＲ、または＋ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートであり；
そして該構造は、そのアリール置換形態を含む、化合物。
【請求項２】
Ｚ１がＯＨであり、Ｚ２がＯであり、そしてＸがカルボキシレートである、請求項１に記載の実質的に純粋なアトロプ異性体化合物。
【請求項３】
Ｚ１がＮＲ２であり、Ｚ２が＋ＮＲ２であり、そしてＸがカルボキシレートである、請求項１に記載の実質的に純粋なアトロプ異性体化合物。
【請求項４】
以下の構造：
【化２】
2004532805.tif 000023
を有する、請求項１に記載の実質的に純粋なアトロプ異性体化合物であって、
ここで、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｚ１、またはＺ２のうちの少なくとも１つが、アジド、一置換第１級アミン、二置換第２級アミン、チオール、ヒドロキシル、ハロゲン化物、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、カルボキシル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホン酸エステル、ハロゲン化シリル、クロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリル、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物、ヨードアセトアミドおよび活性化エステルからなる群より選択される連結部分である、化合物。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ１１のうちの１つが連結部分である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
１つ以上の置換基Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、およびＲ２０を含む、請求項４に記載の化合物であって、該置換基の各々が独立して、フッ素、塩素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、アルキルスルホネート、アミノメチル（−ＣＨ２ＮＨ２）、アミノアルキル、４−ジアルキルアミノピリジニウム、ヒドロキシメチル（−ＣＨ２ＯＨ）、メトキシ（−ＯＣＨ３）、ヒドロキシアルキル（−ＲＯＨ）、チオメチル（−ＣＨ２ＳＨ）、チオアルキル（−ＲＳＨ）、アルキルスルホン（−ＳＯ２Ｒ）、アリールチオ（−ＳＡｒ）、アリールスルホン（−ＳＯ２Ａｒ）、スルホンアミド（−ＳＯ２ＮＲ２）、アルキルスルホキシド（−ＳＯＲ）、アリールスルホキシド（−ＳＯＡｒ）、アミノ（−ＮＨ２）、アンモニウム（−ＮＨ３＋）、アミド（−ＣＯＮＲ２）、ニトリル（−ＣＮ）、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ（−ＯＲ）、フェノキシ、フェノール、トリル、フェニル、アリール、ベンジル、複素環、ホスホネート、ホスフェート、第４級アミン、スルフェート、ポリエチレンオキシ、および連結部分である、化合物。
【請求項７】
前記Ｒ１３およびＲ１４が一緒になってベンゾを形成する、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの少なくとも１つが、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダゾール、３−ピラゾール、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シンノリン、プタラジン、キナゾリン、キノキサリン、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−テトラゾリル、４−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、５−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、５−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンゾオキサゾール、２−ベンゾチアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾール、およびベンゾイミダゾールから選択される、電子不足複素環である、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの少なくとも１つが、フェニルまたは置換フェニルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの少なくとも１つが、ナフチルまたは置換ナフチルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの少なくとも１つが、フッ素または塩素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの少なくとも１つが、２−ピリジルまたは３−ピリジルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの少なくとも１つが、２−キノリルまたは３−キノリルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの少なくとも１つが、メトキシ（−ＯＣＨ３）である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの少なくとも１つが、アミノメチル（−ＣＨ２ＮＨ２）である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、およびＲ２０のうちの少なくとも１つが、塩素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、およびＲ２０のうちの少なくとも１つが、フッ素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、およびＲ２０のうちの少なくとも１つが、４−ジアルキルアミノピリジニウムである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、およびＲ２０のうちの少なくとも１つが、チオフェニルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、およびＲ２０のうちの少なくとも１つが、チオ−４−カルボキシフェニルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１８およびＲ１９のうちの１つがカルボキシルであり、そして他方が水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１８およびＲ１９のうちの１つが連結部分であり、そして他方が水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１７およびＲ２０が塩素であり；Ｒ１８およびＲ１９のうちの１つが連結部分であり、そして他方が水素であり；そしてＸがカルボキシルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項２４】
請求項４に記載の化合物であって、以下：
第１の架橋基であって、該第１の架橋基は、Ｚ１の窒素、Ｚ１に結合する炭素、およびＲ１に結合する炭素と一緒になって、４〜７員の第１の環構造を形成する、第１の架橋基；ならびに
必要に応じて、第２の架橋基であって、該第２の架橋基は、Ｚ２の窒素、Ｚ２に結合する炭素、およびＲ１１に結合する炭素と一緒になって、４〜７員の第２の環構造を形成する、第２の架橋基、
を含む、化合物。
【請求項２５】
前記第１の環構造および第２の環構造の一方または両方が、５員を有する、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
前記５員環構造が、１つのｇｅｍ置換された炭素を含む、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
前記ｇｅｍ置換基がＣ１〜Ｃ８アルキルである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項２８】
前記ｇｅｍ置換基がメチルである、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
前記５員環が、連結部分で置換されている、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３０】
以下の構造：
【化３】
2004532805.tif 000024
からなる群より選択される、実質的に純粋なアトロプ異性体化合物であって、該化合物が、アトロプ異性体的に濃縮されている、化合物。
【請求項３１】
エネルギー移動色素であって、以下：
第１の波長の光を吸収し得、そして該吸収に応答して励起エネルギーを放出し得る、ドナー色素；
該ドナー色素によって放出された該励起エネルギーを吸収し得、そして応答して第２の波長で蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに
該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するための、リンカー、
を含み、ここで、該ドナー色素およびアクセプター色素のうちの少なくとも一方が、以下の構造：
【化４】
2004532805.tif 000025
またはそのアリール置換形態を有する、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり；
ここで、Ｚ１およびＺ２は、Ｏ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲ２であり；Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートである、エネルギー移動色素。
【請求項３２】
前記ドナー色素が、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり、そして前記アクセプター色素が、シアニン色素、フタロシアニン色素、スクアレン色素、ｂｏｄｉｐｙ色素、ベンゾフェノキサジン色素、フルオレセイン色素、ジベンゾローダミン色素、またはローダミン色素である、請求項３１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項３３】
前記アクセプター色素が、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり、そして前記ドナー色素が、該キサンテン化合物およびポリヌクレオチドに連結されている、請求項３１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項３４】
前記ドナー色素が、前記ポリヌクレオチドの５’末端に連結されている、請求項３３に記載のエネルギー移動色素。
【請求項３５】
前記ドナー色素が、前記ポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、請求項３３に記載のエネルギー移動色素。
【請求項３６】
前記ドナー色素が、ポリヌクレオチドの核酸塩基に結合しており、ここで、該核酸塩基がプリンである場合、前記リンカーは、８位で結合しており、該核酸塩基が７−デアザプリンである場合、該リンカー、は７位または８位で結合しており、そして該核酸塩基がピリミジンである場合、該リンカーは、５位で結合している、請求項３３に記載のエネルギー移動色素。
【請求項３７】
前記リンカーが、以下の構造：
【化５】
2004532805.tif 000026
を有し、ここで、
Ｚは、ＮＨ、ＳおよびＯからなる群より選択され；
Ｒ２１は、前記ドナー色素に結合したＣ１〜Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ２２は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルジイル、少なくとも１つの不飽和結合を有する５員環または６員環、およびカルボニル炭素に結合した縮合環構造からなる群より選択される置換基であり；
Ｒ２３は、該リンカーを前記アクセプター色素に結合させる、官能基を含む、請求項３１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項３８】
前記リンカーが、以下の構造：
【化６】
2004532805.tif 000027
を有し、そしてｎが２〜１０の範囲である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
Ｒ２３が、以下の構造：
【化７】
2004532805.tif 000028
を有し、ここで、Ｒ２４は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである、請求項３７に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４０】
Ｒ２２が、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサジン、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレンからなる群より選択される、５員環または６員環である、請求項３７に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４１】
前記リンカーが、以下の構造：
【化８】
2004532805.tif 000029
を有する、請求項３１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４２】
前記リンカーが、以下の構造：
【化９】
2004532805.tif 000030
を有する、請求項３１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４３】
前記リンカーが、以下の構造：
【化１０】
2004532805.tif 000031
を有する、請求項３１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４４】
前記リンカーが、以下の構造：
【化１１】
2004532805.tif 000032
を有し、ここで、Ｄはドナー色素であり、Ａはアクセプター色素であり、そしてｎは１または２である、請求項３１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４５】
前記リンカーが、以下の構造：
【化１２】
2004532805.tif 000033
を有する前記実質的に純粋なアトロプ異性体キサンテン化合物のＲ１、Ｒ１１、Ｒ１８またはＲ１９において結合している、請求項３１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４６】
前記ドナーまたは前記アクセプターに対するリンカーが、Ｒ１またはＲ１１において結合しており、そしてポリヌクレオチドに対するリンカーが、Ｒ１８またはＲ１９において結合している、請求項４５に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４７】
前記リンカーが、前記実質的に純粋なアトロプ異性体キサンテン化合物のＺ１位またはＺ２位の１つにおいて結合している、請求項４５に記載のエネルギー移動色素。
【請求項４８】
以下の式：
【化１３】
2004532805.tif 000034
を有する、標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、ここで、ＤＹＥが、以下の構造：
【化１４】
2004532805.tif 000035
を有するキサンテン化合物の、実質的に純粋なアトロプ異性体であり、
Ｚ１は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｚ２は、Ｏ、＋ＮＨ２、＋ＮＨＲ、または＋ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートであり；
ＤＹＥは、エネルギー移動色素であって、該エネルギー移動色素は、第１の波長において光を吸収し得、そして該吸収に応答して励起エネルギーを放出し得る、ドナー色素；該ドナー色素によって放出された該励起エネルギーを吸収し得、そして該吸収に応答して、第２の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに該ドナー色素および該アクセプター色素を結合するための、リンカーを含み；ここで、該ドナー色素およびアクセプター色素のうちの少なくとも１つが、該キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ２５は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、またはホスフェートアナログであり；そして
Ｒ２６およびＲ２７は、単独の場合、それぞれ独立して、Ｈ、ＨＯ、Ｆ、またはポリメラーゼにより媒介される標的特異的重合をブロックする他の部分であるか、あるいは一緒になって、Ｒ２６およびＲ２７は、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成し；そしてここで、ＤＹＥは、必要に応じて、アリール置換されている、
標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項４９】
Ｂが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される、請求項４８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項５０】
Ｌが、以下：
【化１５】
2004532805.tif 000036
であり、ここで、ｎは、０、１、または２である、請求項４８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項５１】
酵素的に組み込み可能である、請求項４８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項５２】
ターミネーターである、請求項４８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項５３】
以下の構造：
【化１６】
2004532805.tif 000037
を有する、請求項５２に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、ここで、Ｒ２６およびＲ２７は、単独の場合、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、またはポリメラーゼにより媒介される標的特異的重合をブロックする他の部分であるか、あるいは一緒になって、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する、標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項５４】
酵素的に伸長可能である、請求項４８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項５５】
標識に共有結合したポリヌクレオチドを含む、標識されたポリヌクレオチドであって、ここで、該標識が、以下の構造：
【化１７】
2004532805.tif 000038
を有する、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり、
Ｚ１は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｚ２は、Ｏ、＋ＮＨ２、＋ＮＨＲ、または＋ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートであるか；
あるいは、エネルギー移動色素であって、以下：第１の波長の光を吸収し得、そして該吸収に応答して励起エネルギーを放出し得る、ドナー色素；該ドナー色素によって放出された該励起エネルギーを吸収し得、そして該吸収に応答して、第２の波長の蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに該ドナー色素および該アクセプター色素を結合するための、リンカーを含み；ここで、該ドナー色素およびアクセプター色素のうちの少なくとも１つが、該キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり；そして該キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体が、必要に応じて、アリール置換されている、
標識されたポリヌクレオチド。
【請求項５６】
以下の式：
【化１８】
2004532805.tif 000039
を有する、請求項５５に記載の標識されたポリヌクレオチドであって、
ここで、ＤＹＥは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはエネルギー移動色素であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ２７は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン化物、アジド、アミン、アルキルアミン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり；そして
Ｒ２８およびＲ２９は、単独の場合、それぞれ独立して、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；
ここで、該ポリヌクレオチドが、２〜１００のヌクレオチドを含む、標識されたポリヌクレオチド。
【請求項５７】
Ｂが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される、請求項５６に記載の標識されたポリヌクレオチド。
【請求項５８】
以下の式：
【化１９】
2004532805.tif 000040
を有する、請求項５５に記載の標識されたポリヌクレオチドであって、
ここで、ＤＹＥは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはエネルギー移動色素であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ２７は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン化物、アジド、アミン、アルキルアミン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり；そして
Ｒ２８は、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；
ここで、該ポリヌクレオチドが、２〜１００のヌクレオチドを含む、標識されたポリヌクレオチド。
【請求項５９】
Ｂが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される、請求項５８に記載の標識されたポリヌクレオチド。
【請求項６０】
Ｌが、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルジイルである、請求項５８に記載の標識されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
Ｌが、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−を含み、ここで、ｎは、１〜１００である、請求項５８に記載の標識されたポリヌクレオチド。
【請求項６２】
標識に共有結合したポリペプチドを含む、標識されたポリペプチドであって、ここで、該標識が、以下の構造：
【化２０】
2004532805.tif 000041
を有する、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり、
Ｚ１は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｚ２は、Ｏ、＋ＮＨ２、＋ＮＨＲ、または＋ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートであるか；あるいは
該ポリペプチドは、エネルギー移動色素に共有結合しており、該エネルギー移動色素は、以下：第１の波長において光を吸収し得、そして該吸収に応答して励起エネルギーを放出し得る、ドナー色素；該ドナー色素によって放出された該励起エネルギーを吸収し得、そして該吸収に応答して、第２の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するための、リンカーを含み；ここで、該ドナー色素およびアクセプター色素のうちの少なくとも１つが、該キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり；そして該キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体が、必要に応じて、アリール置換されている、
標識されたポリペプチド。
【請求項６３】
以下の式：
【化２１】
2004532805.tif 000042
を有する、ホスホロアミダイト化合物であって、ここで、ＤＹＥは、以下の構造：
【化２２】
2004532805.tif 000043
を有するキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり、
Ｚ１は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｚ２は、Ｏ、＋ＮＨ２、＋ＮＨＲ、または＋ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環、または連結部分であり；
Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートであるか；あるいは
ＤＹＥは、第１の波長において光を吸収し得、そして該吸収に応答して励起エネルギーを放出し得る、ドナー色素；該ドナー色素によって放出された該励起エネルギーを吸収し得、そして該吸収に応答して、第２の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するための、リンカーを含み；ここで、該ドナー色素およびアクセプター色素のうちの少なくとも１つが、該キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体であり；そしてここで、ＤＹＥは、必要に応じて、アリール置換されており；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ３０およびＲ３１は、別々に、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２シクロアルキル、およびアリールからなる群より選択されるか、またはＲ３０およびＲ３１は、窒素原子と一緒になって、飽和窒素複素環を形成し；そして
Ｒ３２は、亜リン酸エステル保護基である、
ホスホロアミダイト化合物。
【請求項６４】
Ｒ３２が、メチル、２−シアノエチル、および２−（４−ニトロフェニル）エチルからなる群より選択される、請求項６３に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項６５】
Ｒ３０およびＲ３１が、それぞれイソプロピルである、請求項６３に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項６６】
Ｒ３０およびＲ３１が、一緒になってモルホリノである、請求項６３に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項６７】
ＬがＣ１〜Ｃ１２アルキルジイルである、請求項６３に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項６８】
Ｌが、以下の構造：
【化２３】
2004532805.tif 000044
を有するＤＹＥのＲ１８またはＲ１９に結合している、請求項６３に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項６９】
以下の構造：
【化２４】
2004532805.tif 000045
を有する、請求項６８に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項７０】
Ｌが、以下：
【化２５】
2004532805.tif 000046
であり、そしてｎが、１〜１０の範囲である、請求項６３に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項７１】
標識された基質を形成する方法であって、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリペプチド、炭水化物、リガンド、エナンチオマー的に実質的に純粋な化合物、粒子、および表面からなる群より選択される基質を、請求項５に記載の化合物の連結部分、または請求項３１に記載のエネルギー移動色素と反応させ、これによって、標識された基質が形成する工程を包含する、方法。
【請求項７２】
前記連結部分がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記連結部分がホスホロアミダイトである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記基質がエナンチオマー的に実質的に純粋である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記エナンチオマー的に実質的に純粋な化合物が、（＋）メンチルクロロホルメートまたは（−）メンチルクロロホルメートである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記標識された基質が、以下の構造：
【化２６】
2004532805.tif 000047
を有する、Ｃ−１１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシルフルオレセインを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記粒子が、ナノ粒子、微小球、ビーズ、またリポソームである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記表面がガラスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７９】
標識されたポリヌクレオチドを合成する方法であって、請求項６３に記載のホスホロアミダイト化合物を、ポリヌクレオチドにカップリングさせ、これによって、標識されたポリヌクレオチドが形成される工程を包含し、ここで、該ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されている、方法。
【請求項８０】
Ｃ−１１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシルフルオレセイン化合物のアトロプ異性体を分離する方法であって、以下の工程：
（ａ）Ｃ−１１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシルフルオレセインを、活性エステルまたはカルボン酸の実質的に純粋なエナンチオマーと反応させて、ジアステレオマーカルバメートを形成する工程；
（ｂ）該ジアステレオマーカルバメートを分離する工程；および
（ｃ）該分離されたジアステレオマーを、水性の酸で加水分解する工程、
を包含する、方法。
【請求項８１】
前記活性エステルが、メンチルクロロホルメートである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ジアステレオマーカルバメートが、逆相ＨＰＬＣによって分離される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
標識された基質の混合物を分離する方法であって、ここで該標識された基質が、請求項１に記載の化合物、または請求項３１に記載のエネルギー移動色素からなり、該方法は、以下の工程：
（ａ）電気泳動によって、標識された基質の混合物を分離する工程；および
（ｂ）蛍光検出によって、該標識された基質を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項８４】
前記標識された基質が、標識されたポリヌクレオチドである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
標識された基質の混合物を分離する方法であって、ここで、該標識された基質が、請求項１に記載の化合物または請求項３１に記載のエネルギー移動色素からなり、該方法は、以下の工程；
（ａ）クロマトグラフィーによって、標識された基質の混合物を分離する工程；および
（ｂ）蛍光検出によって、該標識された基質を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項８６】
標識されたプライマー伸長産物を生成する方法であって、プライマー−標的ハイブリッドを、酵素的に組み込み可能なヌクレオチドで伸長させ、これによって、該プライマーが伸張する工程を包含し、ここで、該プライマーまたは該ヌクレオチドが、請求項１に記載の化合物、または請求項３１に記載のエネルギー移動化合物で標識されている、方法。
【請求項８７】
前記ヌクレオチドが、酵素的に伸長可能である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記プライマーが、以下の式：
【化２７】
2004532805.tif 000048
を含む標識されたポリヌクレオチドであり、ここで、
ＤＹＥは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはエネルギー移動色素であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ２７は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン化物、アジド、アミン、アルキルアミン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり；そして
Ｒ２８は、ヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログであり；
ここで、該ポリヌクレオチドは、２〜１００のヌクレオチドを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
Ｂが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記酵素的に組み込み可能なヌクレオチドが、以下の式：
【化２８】
2004532805.tif 000049
を有する標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドであり、ここで、
ＤＹＥは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはエネルギー移動色素であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ２５は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、またはホスフェートアナログであり；そして
Ｒ２６およびＲ２７は、単独の場合、それぞれ独立して、Ｈ、ＨＯ、およびＦである、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
ターミネーターヌクレオチドをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
Ｒ２６およびＲ２７は、単独の場合、それぞれ独立して、Ｈ、Ｆ、ポリメラーゼにより媒介される標的特異的プライマー伸長をブロックする部分であるか、あるいは一緒になって、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
ポリヌクレオチド配列決定の方法であって、以下の工程：  第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を形成する工程であって、その結果：
該第１のクラスの各ポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシアデノシンを含み、そして第１の色素で標識されており；
該第２のクラスの各ポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシシチジンを含み、そして第２の色素で標識されており；
該第３のクラスの各ポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシグアノシンを含み、そして第３の色素で標識されており；そして
該第４のクラスの各ポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシチミジンを含み、そして第４の色素で標識されており；
ここで、該第１、第２、第３、または第４の色素のうちの１つが、請求項１に記載の化合物、または請求項３８に記載のエネルギー移動色素であり、そして他の色素が、互いから分光学的に分解可能である、工程；ならびに
該ポリヌクレオチドを、大きさに基づいて分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項９４】
蛍光検出によって、前記分離されたポリヌクレオチドを検出する工程をさらに包含する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記色素の蛍光スペクトルによって、前記ポリヌクレオチドの３’−末端ヌクレオチドを同定する工程をさらに包含する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
オリゴヌクレオチドの連結の方法であって、２つのプローブを標的配列にアニーリングする工程、および一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間にホスホジエステル結合を形成する工程を包含し；
ここで、一方または両方のプローブが、請求項１に記載の化合物または請求項３１に記載のエネルギー移動色素で標識されている、方法。
【請求項９７】
フラグメント分析の方法であって、大きさに依存する分離プロセスによって、標識されたポリヌクレオチドフラグメントを分離する工程、および該分離プロセスに引き続いて、該分離された標識されたポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程を包含し；
ここで、該フラグメントが、請求項１に記載の化合物または請求項３１に記載のエネルギー移動色素で標識されている、方法。
【請求項９８】
前記フラグメントが、移動度改変標識で標識されている、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記フラグメントが、連結によって形成されている、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記大きさに依存する分離プロセスが、電気泳動であり、そして前記標識されたポリヌクレオチドフラグメントが、蛍光によって検出される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
増幅の方法であって、２つ以上のプライマーを標的ポリヌクレオチドにアニーリングする工程、ならびにポリメラーゼおよび酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって、該プライマーを伸張させる工程を包含し；
ここで、該プライマーのうちの少なくとも１つが、請求項５５に記載の標識されたポリヌクレオチドで標識されている、方法。
【請求項１０２】
増幅の方法であって、２つ以上のプライマーを標的ポリヌクレオチドにアニーリングする工程、ならびにポリメラーゼおよび酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって、該プライマーを伸張させる工程を包含し；
ここで、該ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、請求項４８に記載の標識されたヌクレオチドである、方法。
【請求項１０３】
増幅の方法であって、２つ以上のプライマーおよび蛍光色素−消光剤プローブを、標的核酸にアニーリングする工程、ならびにポリメラーゼおよび酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって、該プライマーを伸張させる工程を包含し；
ここで、該プローブが、請求項５５に記載の標識されたポリヌクレオチドである、方法。
【請求項１０４】
ポリヌクレオチドを標識するためのキットであって、請求項４に記載の連結部分およびポリヌクレオチドを含む化合物を備える、キット。
【請求項１０５】
ポリヌクレオチドを標識するためのキットであって、請求項３１に記載のエネルギー移動色素およびポリヌクレオチドを備える、キット。
【請求項１０６】
ポリヌクレオチドを標識するためのキットであって、請求項６３に記載のホスホロアミダイト化合物およびポリヌクレオチドを備える、キット。
【請求項１０７】
標識されたプライマー伸長産物を生成するためのキットであって、１つ以上の酵素的に組み込み可能なヌクレオチドおよびプライマーを備え、ここで、該プライマーが、請求項５５に記載の標識されたポリヌクレオチドである、キット。
【請求項１０８】
標識されたプライマー伸長産物を生成するためのキットであって、１つ以上の酵素的に組み込み可能なヌクレオチドおよびプライマーを備え、ここで、少なくとも１つのヌクレオチドが、請求項４８に記載の標識されたヌクレオチドである、キット。
【請求項１０９】
前記標識されたヌクレオチドがターミネーターである、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
４つの異なるターミネーターを備える、請求項１０９に記載のキットであって、１つは、標的Ａにおいて終結するターミネーターであり、１つは、標的Ｇにおいて終結するターミネーターであり、１つは、標的Ｃにおいて終結するターミネーターであり、１つは、標的ＴまたはＵにおいて終結するターミネーターである、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、不斉キサンテン蛍光色素の、特定のアトロプ異性体の形態、および蛍光色素標識試薬を用いた核酸配列決定および核酸分析の分野に関する。
【０００２】
（ＩＩ．発明の背景）
サイズまたは電荷に基づいて分離された後の、蛍光標識生体分子の分析法は、分子生物学の中心である。蛍光標識核酸を利用する方法の例としては、自動ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出、イムノアッセイなどが挙げられる。マルチカラー自動ＤＮＡ配列決定の場合、異なるサイズの標識核酸フラグメントは、電気泳動、代表的には、単一の電気泳動レーン、チャネルまたはキャピラリーでの電気泳動によって分離される。これらの方法を用いて、自動４色Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定は、分子レベルにおける遺伝子全体の特徴付けを可能にしてきた。
【０００３】
立体化学的純度は、薬学の分野において重要であり、この分野で最も処方される２０種の薬物のうち１２種がキラリティーを示す（米国特許第６，０７５，０２４号）。適例は、β−アドレナリン様ブロッキング因子のＬ形であるＲ（−）アルブテロールによって与えられ、これはＤエナンチオマーよりも１００倍強力であることが公知である（米国特許第５，７６０，０９０号）。さらに、特定の異性体は単に不活性というよりもむしろ実際に有害であり得るので、光学純度は重要である。
【０００４】
アトロプ異性体は、所定条件下での分離および単離が可能なほど十分に遅い相互変換を示す分子の立体異性体的立体配座である（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ，（１９８４），Ｓ．Ｐａｒｋｅｒ編，３６頁）。熱によるラセミ化へのエネルギー障壁は、キラル軸を形成する１本以上の結合の自由回転への立体障害により決定され得る。特定のビアリール化合物は、Ｃ２対称を欠く環内結合に関する回転が制限されているアトロプ異性を示す。鏡像異性化に対する自由エネルギー障壁は、回転に関する環内結合の安定性の尺度である。光学的励起および熱的励起は、電気的要因および立体的要因に依存して、ラセミ化を促進することができる（Ｔｅｔｒｅａｕ（１９８２）Ｎｏｕｖ．Ｊｏｕｒ．ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ，６：４６１−６５）。
【０００５】
オルト置換ビフェニル化合物は、アトロプ異性として公知であるこの種の立体配座的、回転異性を示し得る（Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．およびＷｉｌｅｎ，Ｓ．（１９９４）Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１１４２頁−５５頁）。このようなビフェニルはエナンチオマー的であり、ｓｐ２−ｓｐ２の炭素−炭素結合（フェニル環どうしの環内結合）が自由回転への十分に高いエネルギー障壁を有するキラルアトロプ異性体であり、置換基Ｘ≠Ｙおよび置換基Ｕ≠Ｖがこの分子に不斉性を与える。Ｘ−Ｕ、Ｘ−Ｖ、および／またはＹ−Ｖ、Ｙ−Ｕの立体相互作用は十分に大きいため、平面構造を最大エネルギーとする。下に示した、軸方向にキラルな２種の非平面エナンチオマーは、互いを含まずに単離できるほど十分に相互変換が遅い場合、アトロプ異性体として存在する。ある定義によると、アトロプ異性は、異性体が少なくとも１０００秒の半減期ｔ１／２を有する場合に存在すると定義され、これは３００Ｋにおいて自由エネルギー障壁２２．３ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１（９３．３ｋＪ  ｍｏｌ−１）である（Ｏｋｉ，Ｍ．（１９８３）「Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｔｒｏｐｉｓｏｍｅｒｉｓｍ」，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４：１）。下に示した図中の太線および破線は、分子の部分（ｍｏｉｅｔｙ）、または一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）を表し、これらは回転エネルギー障壁によって立体的に制限される。太線の部分は平面の上部に直交して存在し、破線の部分は分子の残りの平面の下部に直交して存在する。
【０００６】
【化２９】
2004532805.tif 000002
（ＩＩＩ．要旨）
本発明は、新規な組成物としての、アトロプ異性に富み実質的に純粋である、不斉キサンテン化合物のアトロプ異性体に関する。本発明はまた、単離方法、標識方法、および標識組成物の検出方法を含む。
【０００７】
第１の局面において、本発明は、構造ＩＩを有する実質的に純粋なアトロプ異性体化合物を包含する：
【０００８】
【化３０】
2004532805.tif 000003
ここで部位Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｚ１またはＺ２は、置換基によって置換され得る。少なくとも１つの置換基が連結部分であり得る。１個またはそれ以上の環が環構造ＩＩに縮合され得る。
【０００９】
本発明の別の局面としては、第１波長の光の吸収が可能であり、それに対する応答において励起エネルギーの放出が可能であるドナー色素；ドナー色素により放出された励起エネルギーの吸収が可能であり、それに対する応答において第２波長での蛍光を発することが可能であるアクセプター色素；ならびにドナー色素およびアクセプター色素を連結するためのリンカー；を含むエネルギー移動色素化合物が挙げられ、ここで少なくとも１種のドナー色素および少なくとも１種のアクセプター色素は、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体である。
【００１０】
本発明の別の局面は標識基質であり、これらとしては、標識がキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体を含むエネルギー移動色素である、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが挙げられる。
【００１１】
本発明の別の局面は標識試薬およびこれらの試薬による基質標準化方法であり、これらは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体のホスホロアミダイトおよび活性エステル連結部分を含み、これらは基質との共有結合を形成する。
【００１２】
本発明の別の局面は、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体の連結部分またはキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体を含むエネルギー移動色素の連結部分に基質を反応させる工程を含む、標識基質の形成方法である。
【００１３】
本発明の別の局面は、実質的にエナンチオマー的に純粋な化合物を用いたジアステレオマーの形成による、キサンテン化合物のアトロプ異性体の分離方法およびジアステレオマーの分離方法である。このジアステレオマーは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体に変換され得る。
【００１４】
本発明の別の局面は、標識がキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体を含むエネルギー移動色素を含む、標識基質の混合物の分離方法である。この標識基質は、プライマー伸長ポリヌクレオチドフラグメントであり得る。この標識基質は、電気泳動、クロマトグラフィー、またはその他の分離法によって分離され得る。この標識されたポリヌクレオチドの混合物は、標識プライマーまたは標識ターミネーターから形成され得る。この標識基質は、蛍光検出により検出され得る。
【００１５】
本発明の別の局面は、酵素的に導入可能なヌクレオチドを用いてプライマー−ターゲットハイブリッドを伸長することによる、標識されたプライマー伸長生成物の産生法である。このプライマーまたはヌクレオチドは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体を含むエネルギー移動色素を用いて標識され得る。
【００１６】
本発明の別の局面は、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体を含むエネルギー移動色素を用いて３’末端ヌクレオチドにおいて標識された、４クラスのポリヌクレオチドの混合物を形成することによる、ポリヌクレオチドの配列決定法であり、これらの標識はスペクトル的に分解可能である。これらのポリヌクレオチドはサイズによって分離される。
【００１７】
本発明の別の局面は、２本のプローブを標的配列へアニーリングし、そして一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間にリン酸ジエステル結合を形成することによるオリゴヌクレオチドの連結法であり、一方または両方のプローブは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体を含むエネルギー移動色素を用いて標識されている。
【００１８】
本発明の別の局面は、２本またはそれ以上のプライマーを標的ポリヌクレオチドへアニーリングし、そしてポリメラーゼおよび酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によりプライマーを伸長することによる増幅法であり、少なくとも１つのプライマーまたは少なくとも１つのヌクレオチドは、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体を含むエネルギー移動色素によって標識されている。
【００１９】
本発明の別の局面は、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体またはキサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体を含むエネルギー移動色素を含む、試薬キットである。
【００２０】
（Ｖ．例示的な実施形態の詳細な説明）
本発明の特定の実施形態の詳細への言及がここでなされ、これらの例は、添付の図に示される。本発明は、示された実施形態に関連して記述されるが、それらが、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図しないことは理解されるべきである。反対に、本発明は、全ての代替物、改変物および均等物を網羅することを意図し、これらは特許請求された本発明の範囲に含まれ得る。
【００２１】
（Ｖ．１  定義）
本明細書中で一般に用いられる立体化学的定義および立体化学的慣例は、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（１９８４）Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋならびにＳｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）；ならびにＥｌｉｅｌ，ＥおよびＷｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学活性な形態で存在し、すなわち、それらは平面偏光の平面を回転させる能力を有する。光学活性化合物の記述において、分子のキラル中心に関する分子の絶対配置を示すために、接頭語ＤおよびＬまたはＲおよびＳが用いられる。接頭語ｄおよびｌまたは（＋）および（−）は、その化合物による平面偏光の回転の符号を指定するために用いられ、（−）またはｌは、その化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄを接頭された化合物は右旋性である。所与の化学構造に対して、立体異性体と呼ばれるこれらの化合物は、それらが互いの鏡像であることを除き、同一である。特定の立体異性体はまた、エナンチオマーと呼ばれ得、そしてこのような異性体の混合物はしばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０の混合物は、ラセミ混合物またはラセミ化合物と呼ばれる。用語「ラセミ混合物」および「ラセミ化合物」とは、２つのエナンチオマー種による、光学活性を欠く等モル混合物を表す。
【００２２】
用語「キラル」とは鏡像パートナーと重なり得ない性質を有する分子を表し、一方、用語「アキラル」とは鏡像パートナーに重なり得る分子を表す。
【００２３】
用語「立体異性体」とは、同一の化学構成を有するが、原子または化学基の空間における配列に関して異なる化合物を表す。
【００２４】
「ジアステレオマー」とは、２つまたはそれ以上のキラル中心を有し、それらの分子が互いの鏡像でない立体異性体を表す。ジアステレオマーは異なる物性（例えば、融点、沸点、スペクトル的性質および反応性）を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動およびクロマトグラフィーのような高分解能の分析手順によって分離され得る。
【００２５】
「エナンチオマー」とは、互いに重なり得ない鏡像である、化合物の２つの立体異性体を表す。
【００２６】
用語「アトロプ異性体」とは、回転障壁が異性体種を単離し得るほど十分に高い、単結合の周りの制限された回転に起因する立体異性体を表す。アトロプ異性体は、単一の不斉原子を有さないエナンチオマーである。アトロプ異性体は、分子の他の部分との立体的相互作用の結果として分子中の単結合の周りの回転が阻害されるか、または非常に遅く、単結合の両末端の置換基が非対称である場合に生じる立体配座的立体異性体である。
【００２７】
用語「実質的に純粋なアトロプ異性体」および「実質的にその立体異性体を含まない」とは、その組成が少なくとも９０重量％の１種のアトロプ異性体および１０重量％以下の立体異性的アトロプ異性体を含むことを意味する。
【００２８】
用語「アトロプ異性に富む」とは、他のアトロプ異性体との関連において、その組成物がより大きな比率（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）またはより大きな割合（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）のキサンテン化合物のアトロプ異性体の１つを含むことを意味する。
【００２９】
「核酸塩基」とは、相補的な核酸塩基または相補的な核酸塩基アナログ（例えばプリン、７−デアザプリンまたはピリミジン）と対合してＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合を形成し得る、窒素含有複素環式部分を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、および天然に存在する核酸塩基のアナログ、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン（Ｋｕｔｙａｖｉｎ，米国特許第５，９１２，３４０号）、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドール、およびエテノアデニン（Ｆａｓｍａｎ（１９８９）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３８５頁−３９４頁，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ）である。
【００３０】
「ヌクレオシド」とは、リボース糖のＣ−１’炭素に連結した核酸塩基からなる化合物を意味する。このリボースは、置換されても良いし、置換されなくても良い。置換リボース糖としては、以下に限定されないが、１個またはそれ以上の炭素原子（例えば３’炭素原子）が、１個またはそれ以上の同一または異なる−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲまたはハロゲン基によって置換されたリボースが挙げられ、ここで各Ｒは独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ５〜Ｃ１４アリールである。リボースの例としては、リボース、２’−デオキシリボース、２’３’−ジデオキシリボース、３’−ハロリボース、３’−フルオロリボース、３’−クロロリボース、２’−Ｏ−メチルリボースのような３’−アルキルリボース、４’−α−アノマー性ヌクレオチド、１’−α−アノマー性ヌクレオチド、および、２’−４’連結およびそれ以外が「ロックされた」二環糖改変体（Ｉｍａｎｉｓｈｉ  ＷＯ  ９８／２２４８９；Ｉｍａｎｉｓｈｉ  ＷＯ  ９８／３９３５２；Ｗｅｎｇｅｌ  ＷＯ  ９９／１４２２６）が挙げられる。核酸塩基がプリン（例えばＡまたはＧ）である場合、リボース糖が核酸塩基のＮ９位に結合する。核酸塩基がピリミジン（例えばＣ、ＴまたはＵ）である場合、ペントース糖が核酸塩基のＮ１位に結合する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
【００３１】
「ヌクレオチド」とは、モノマー単位として、または核酸内の、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。ヌクレオチドは、時々、リボース糖の構造的特徴を特に指摘するために、「ＮＴＰ」または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」として表される。「ヌクレオチド５’−トリホスフェート」とは、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを表す。この三リン酸エステル基は、種々の酸素の硫黄置換体、例えばα−チオ−ヌクレオチド５’−トリホスフェートを含み得る。
【００３２】
本明細書で用いられているように、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は互換的に用いられ、ヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味し、これはヌクレオチド間ホスホジエステル結合連結によって連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはヌクレオチド間アナログ、ならびに会合する対イオン（例えばＨ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）を含む。ポリヌクレオチドは、全体的にデオキシリボヌクレオチドを含み得るか、全体的にリボヌクレオチドを含み得るか、またはそれらのキメラ混合物を含み得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間アナログ、核酸塩基アナログおよび糖アナログを含み得る。ポリヌクレオチドは、代表的には、サイズにおいて、少数のモノマー単位（例えば５個〜４０個）（このとき、それらはオリゴヌクレオチドと頻繁に呼ばれる）から、数千個のモノマー性ヌクレオチド単位にまで渡る。他に示さない限り、ポリヌクレオチド配列が表されている場合は常に、ヌクレオチドは、左から右へ、５’→３’の順であり、そして、他に示されていない限り、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示す。
【００３３】
「結合部位」とは、リンカーに共有結合する、標識上または基質（例えば、オリゴヌクレオチド）上の部位を意味する。
【００３４】
「リンカー」とは、標識をポリヌクレオチドに、またはある標識を別の標識に共有結合させる、共有結合または原子鎖を含む化学的部分を意味する。
【００３５】
「連結部分」とは、化学反応性の基、置換基または部分（例えば求核部分または求電子部分）を意味し、別の分子と反応して共有結合または連結を形成し得る。
【００３６】
「アルキル」とは、親のアルカン、アルケンまたはアルキンの単一の炭素原子から１個の水素原子を除去することに由来する、飽和または非飽和の、分枝、直鎖、分枝または環状の炭化水素ラジカルを意味する。代表的なアルキル基は１個〜１２個の飽和炭素および／または非飽和炭素からなり、これらとしては、以下に限定されないが、メチル、エチル、プロピルおよびブチルなどが挙げられる。
【００３７】
「アルコキシ」とは、Ｒが（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである−ＯＲを意味する。
【００３８】
「アルキルジイル」とは、親のアルカン、アルケンまたはアルキンの、同一のまたは異なる２個の炭素原子から２個の水素原子を除去することに由来する２個の一価のラジカル中心を有する、１個〜２０個の炭素原子の、飽和または非飽和の、分枝、直鎖または環状の炭化水素ラジカルを意味する。代表的なアルキルジイルラジカルとしては、以下に限定されないが、１，２−エチルジイル、１，３−プロピルジイルおよび１，４−ブチルジイルなどが挙げられる。
【００３９】
「アリール」とは、親の芳香環系の単一の炭素原子から１個の水素原子を除去することに由来する、６個〜２０個の炭素原子の、一価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。代表的なアリール基としては、以下に限定されないが、ベンゼン由来のラジカル、置換ベンゼン由来のラジカル、ナフタレン由来のラジカル、アントラセン由来のラジカルおよびビフェニル由来のラジカルなどが挙げられる。
【００４０】
「アリールジイル」とは、共役共鳴電子系を有し、そして親のアリール化合物の異なる２個の炭素原子から２個の水素原子を除去することに由来する少なくとも２個の一価のラジカル中心を有する、６個〜２０個の炭素原子の、非飽和の環状炭化水素ラジカルまたは多環式炭化水素ラジカルを意味する。
【００４１】
「置換アルキル」、「置換アルキルジイル」、「置換アリール」および「置換アリールジイル」とは、それぞれ、１個またはそれ以上の水素原子がそれぞれ独立して別の置換基で置換されている、アルキル、アルキルジイル、アリールおよびアリールジイルを意味する。代表的な置換基としては、以下に限定されないが、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−、−ＮＲ２、−ＮＲ３、＝ＮＲ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、ＮＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（Ｏ）Ｏ２ＲＲ、−Ｐ（Ｏ）Ｏ２ＲＲ−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲが挙げられ、ここで各Ｘは独立してハロゲンであり、そして、各Ｒは独立して−Ｈ、アルキル、アリール、複素環または連結基である。
【００４２】
「ヌクレオチド間アナログ」は、以下のような、オリゴヌクレオチドのリン酸エステルアナログを意味する：（ｉ）アルキルホスホネート（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキルホスホネート、特にメチルホスホネート）；（ｉｉ）ホスホラミデート；（ｉｉｉ）アルキルホスホトリエステル（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキルホスホトリエステル）；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエート。ヌクレオチド間アナログはまた、糖／ホスフェートサブユニットが骨格構造を含む非ホスフェートによって置換された非ホスフェートアナログを含む。ある型の非ホスフェートオリゴヌクレオチドアナログは、一般にＰＮＡ（Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００）と呼ばれる、２−アミノエチルグリシン単位のような、アミド結合を有する。
【００４３】
用語「標的配列」および「標的ポリヌクレオチド」とは、例えばプライマーまたはプローブのような相補的なポリヌクレオチドによるハイブリダイゼーションの対象である、ポリヌクレオチド配列を意味する。この配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらのアナログから構成され得、これらの組み合わせを含む。
【００４４】
用語「標識」とは、本明細書で用いられる場合、例えばオリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはヌクレオチド５’−トリホスフェートのような、基質に結合され得る任意の部分を意味し、そしてそれは以下のように機能する：（ｉ）検出可能な信号を発する；（ｉｉ）例えばＦＲＥＴのように、第２標識と相互作用して、第１標識または第２標識によって発せられた検出可能な信号を改変する；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション（すなわち、二重鎖形成）を安定化する；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状またはその他の物理的パラメーターにより、例えば電気泳動的易動度または細胞透過度のような易動度に影響を及ぼす；あるいは（ｖ）例えば親和性、抗体／抗原またはイオン性複合体形成のような捕捉部分を与える。
【００４５】
「複素環」とは、１個またはそれ以上の環原子が、例えば窒素、酸素および硫黄のようなヘテロ原子で置換された環系を有する分子を意味する。
【００４６】
「電子欠乏窒素複素環」とは、複素環を置換基として本発明の蛍光色素へと結合するために、環系の単一の原子から１個の水素原子を除去することによって誘導される、一価の電子欠乏窒素複素環である（Ｊｏｕｌｅ，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｔｈｏｒｎｅｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｌｔｄ．，Ｃｈｅｌｔｅｎｈａｍ，Ｕ．Ｋ．（１９９８）；Ａｃｈｅｓｏｎ，Ｒ．，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，第２版．Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓの一部門），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６７））。
【００４７】
「基質」とは、本発明の色素化合物が結合する実体である。基質としては、以下に限定されないが、（ｉ）ポリヌクレオチド、（ｉｉ）ヌクレオシドまたはヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリペプチド、（ｉｖ）炭水化物、（ｖ）リガンド、および（ｖｉ）前述の（ｉ）〜（ｖ）の任意のアナログが挙げられる。
【００４８】
「酵素的に導入可能」とは、新生のポリヌクレオチド鎖の末端（例えば３’）に、ポリメラーゼ酵素の作用を通じて酵素的に導入され得る、ヌクレオチドの性質である。
【００４９】
「ターミネーター」とは、得られるポリヌクレオチド鎖に対する引き続くヌクレオチドの導入を阻害し、それによってポリメラーゼ伸長を停止させる、酵素的に導入可能なヌクレオチドを意味する。代表的なターミネーターは、３’−ヒドロキシル置換基を欠き、これには、２’３’−ジデオキシリボース、２’３’−ジデヒドロリボース、および２’３’−ジデオキシ，３’−ハロリボース（例えば３’−フルオロリボース）が挙げられる。この代わりに、アラビノースのような、リボフラノースアナログが用いられ得る。例示的なヌクレオチドターミネーターとして、２’３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−アミノ−２’３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、および２’３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシルが挙げられる（Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：１６７１−１６８６；およびＣｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅ（１９８５）ＦＥＢ．Ｌｅｔｔ．，１８３：２７５−２７８）。ヌクレオチドターミネーターはまた、可逆的ヌクレオチドターミネーターを含む（Ｍｅｔｚｋｅｒ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（２０）：４２５９）。
【００５０】
「酵素的に伸長可能」とは、ヌクレオチドがポリヌクレオチドの末端に酵素的に導入可能であり、得られる伸長ポリヌクレオチドがヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの引き続く導入を起こし得る、ヌクレオチドの性質である。
【００５１】
（Ｖ．２  アトロプ異性体化合物）
本発明の組成物は、安定なアトロプ異性形態で存在する不斉キサンテン化合物である。アリール置換基は、次の構造Ｉ中のＣ−１０とＣ−１５との間の二環結合（矢印で示す）の周りの回転を制限し得る：
【００５２】
【化３１】
2004532805.tif 000004
本発明の不斉化合物は、一般構造ＩＩによって特徴付けられるキサンテン色素を含み：
【００５３】
【化３２】
2004532805.tif 000005
これらとしては、フルオレセイン（Ｚ１，Ｚ２＝Ｏ）、ロードル（ｒｈｏｄｏｌ）（Ｚ１＝Ｏ，Ｚ２＝ＮＲ２）およびローダミン（Ｚ１，Ｚ２＝ＮＲ２）が挙げられる。ここでＺ１またはＺ２はＮＲ２であり、Ｒは独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、フェニル、ベンジル、アリール、複素環または連結部分であり得る。
【００５４】
置換基Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０は独立して、フッ素、塩素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート（−ＳＯ３−）、アルキルスルホネート（−Ｒ−ＳＯ３−）、アミノメチル（−ＣＨ２ＮＨ２）、アミノアルキル、４−ジアルキルアミノピリジニウム、ヒドロキシメチル（−ＣＨ２ＯＨ）、メトキシ（−ＯＣＨ３）、ヒドロキシアルキル（−ＲＯＨ）、チオメチル（−ＣＨ２ＳＨ）、チオアルキル（−ＲＳＨ）、アルキルスルホン（−ＳＯ２Ｒ）、アリールチオ（−ＳＡｒ）、アリールスルホン（−ＳＯ２Ａｒ）、スルホンアミド（−ＳＯ２ＮＲ２）、アルキルスルホキシド（−ＳＯＲ）、アリールスルホキシド（−ＳＯＡｒ）、アミノ（−ＮＨ２）、アンモニウム（−ＮＨ３＋）、アミド（−ＣＯＮＲ２）、ニトリル（−ＣＮ）、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ（−ＯＲ）、フェノキシ、フェノール類、トリル、フェニル、アリール、ベンジル、複素環、ホスホネート、ホスフェート、第４級アミン、スルフェート、ポリエチレンオキシおよび連結部分であり得る。
【００５５】
本発明の化合物は、Ｒ１３およびＲ１４、あるいはＲ４およびＲ５が一緒になってベンゾを形成している縮合ベンゾ環を含み、この縮合ベンゾ基は置換基によって置換される。
【００５６】
置換基Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２０はまた、独立して電子欠乏複素環であり得、これらとして、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダゾール、３−ピラゾール、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−テトラゾリル、４−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、５−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、５−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンゾオキサゾール、２−ベンゾチアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾールまたはベンゾイミダゾールが挙げられる。
【００５７】
不斉フルオレセイン色素の例としては、以下の構造が挙げられる：
【００５８】
【化３３】
2004532805.tif 000006
本発明の化合物は、Ｚ１窒素、Ｚ１に結合された炭素およびＲ１に結合された炭素によって形成され、４員〜７員を有する第１環構造を形成する、環構造を有する、アトロプ異性不斉ローダミンを含む。この化合物は必要に応じて、Ｚ２窒素、Ｚ２に結合された炭素およびＲ１１に結合された炭素によって形成され同じく４員〜７員を有する、第２環構造を有し得る。例としては、構造ＩＩａが挙げられる：
【００５９】
【化３４】
2004532805.tif 000007
不斉性は、以下のどちらの場合でも生じる：（１）Ｒ１≠Ｒ１１、Ｒ４≠Ｒ１４、Ｒ５≠Ｒ１３またはＺ１≠Ｚ２、および（２）Ｒ１７≠Ｒ１９またはＲ２０≠Ｘ。換言すれば、二環ｓｐ２−ｓｐ２結合上の両方のアリール置換基は非対称であり、そしてこの化合物は二環結合軸に沿ったＣ２対称軸を欠く。ＩまたはＩＩにおける二環結合を軸としてとり、その軸の周りの１８０°の回転が同じ分子を与えることによってＣ２対称は規定される。Ｃ２対称を有する対称キサンテン化合物の例は、フルオレセイン（Ｒ１，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ１１，Ｒ１３，Ｒ１４，Ｒ１７，Ｒ１８，Ｒ１９，Ｒ２０＝Ｈ；Ｘ＝ＣＯ２Ｈ）である。Ｃ２対称を有さない不斉キサンテン化合物の例は、Ｃ−１１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシフルオレセイン（Ｒ１，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ１３，Ｒ１４，Ｒ１７，Ｒ１８，Ｒ２０＝Ｈ；Ｒ１１＝ＣＨ２ＮＨ２；Ｒ１９，Ｘ＝ＣＯ２Ｈ）である。Ｃ−１０からＣ−１５への二環結合に隣接する置換基が十分に嵩高いため、回転が妨げられるので、この化合物はアトロプ異性である。回転のエネルギー障壁は十分に高いため、以下に示すような、安定であり互いに重なり得ない鏡像のアトロプ異性形態２ａおよび２ｂが生じる：
【００６０】
【化３５】
2004532805.tif 000008
二環結合の周りの回転は、ラセミ化、およびアトロプ異性の減少を生じる。代表的には、加熱すると、不斉キサンテン化合物のラセミ化が起こる。
【００６１】
本発明の化合物は、当該分野において利用可能なあらゆる適切な方法によって調製され得る。種々の異なる不斉キサンテン化合物を調製するその例示的な方法は、下でより詳細に議論されるように、下の実施例の項で与えられ得る。
【００６２】
特定の例として、置換基Ｚ１および置換基Ｚ２への言及が、本明細書の全体に渡ってなされる。この命名法は、示された構造式に対応しており、この構造式が、化合物のいくつかの可能な互変異性形態（または共鳴構造）のうち１個だけを表すため、これらの言及が単なる便宜のためであること、および、このようなあらゆる言及が本明細書に記述される化合物の範囲を限定することを意図しないことは理解される。
【００６３】
当業者はまた、本発明の化合物が、周囲の環境の中でも特にｐＨに依存して、多くの異なるプロトン化状態で存在し得ることを認識する。本明細書中に与えられる構造式は可能ないくつかのプロトン化状態のうち１個だけを描写しているが、これらの構造が単なる例示であること、ならびに、本発明がいかなる特定のプロトン化状態にも限定されないこと（この化合物のあらゆる、および全てのプロトン化形態が、本発明の範囲に入ることを意図されていること）は理解される。
【００６４】
本発明の化合物は、複数の正電荷または負電荷を有し得る。本発明の色素の正味の電荷は、正または負のどちらかであり得る。この色素に会合する対イオンは、代表的には、この化合物が得られる合成方法および／または単離方法によって決定される。代表的な対イオンとして、以下に限定されないが、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、ハロゲン化物、アセテート、トリフルオロアセテートなど、および、これらの混合物が挙げられる。あらゆる会合対イオンの性質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が本発明の決定的な特徴ではないこと、および、本発明があらゆる型の対イオンに会合される色素を包含することは理解されるべきである。さらに、この化合物が種々の異なる形態で存在し得るため、対イオンに会合される形態の色素（例えば乾燥塩）だけでなく、対イオンに会合されない形態の色素（例えば水溶液または有機溶液）も包含することを本発明は意図する。
【００６５】
キサンテン色素は、核酸の検出可能な蛍光標識として重要な用途がある。（米国特許第５，１８８，９３４号；同第５，６５４，４４２号；同第５，８８５，７７８号；同第６，０９６，７２３号；同第６，０２０，４８１号；同第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；同第５，９４５，５２６号；同第５，８４７，１６２号；同第６，０２５，５０５号；同第６，００８，３７９号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０１５，７１９号）。不斉二環（ｂｉｎｎｕｌａｒ）結合を含むキサンテン化合物は、安定なアトロプ異性体形態として存在し得る。アトロプ異性キサンテン化合物とヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび炭水化物、などのキラル基質の結合体はジアステオマーを形成する。これらのジアステレオマー結合体は、電気泳動、クロマトグラフィー、および他の方法などの特定の条件下で分離し得る。ジアステレオマーの分離は、２重のピークまたはバンド、すなわち「２重ピーク（ｐｅａｋ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）」の表示によって検出を妨げ得る。従って、キサンテン色素のアトロプ異性体を富化したかまたは精製した形態は、検体の分離および検出に基づく方法のための標識として重要である。
【００６６】
不斉キサンテン化合物は、都合よく前駆体から合成され得る（米国特許番号第５，１８８，９３４号；同第５，６５４，４４２号；同第５，８８５，７７８号；同第６，０９６，７２３号；同第６，０２０，４８１号；同第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；同第５，９４５，５２６号；同第５，８４７，１６２号；同第６，０２５，５０５号；同第６，００８，３７９号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０１５，７１９号）。例示的な合成ルートは、Ｃ−１９  カルボキシフルオレセイン（Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒ（１９７８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：８９−１０１；米国特許第４，５１０，２５１号；ＥＰ２３２７３６；ＥＰ１１０１８６）のアミノメチル化で始まり、Ｃ−１（Ｃ−１１）アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシフルオレセインを与える。
【００６７】
実質的にその立体異性体を含まないアトロプ異性体は、光学活性な分割剤を用いたジアステレオマーの形成などの方法を用いた、キサンテン化合物の立体異性体の混合物の分割によって得られ得る（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌによる「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，」（１９６２），ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ；Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒ，Ｃ．Ｈ．，（１９７５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１１３：（３）２８３−３０２）。キサンテン色素のアトロプ異性体は、反応性の標識試薬を得るための誘導体化の前、または誘導体化の後に分離および単離され得る。ラセミ混合物からの本発明のアトロプ異性キサンテン化合物の分離は、任意の適切な方法で成され得る。その方法としては、以下が挙げられる：（１）キラル化合物とのイオン性ジアステレオマー塩の形成および分別結晶化または他の方法による分離、（２）キラル誘導体化試薬とのジアステレオマー化合物の形成、ジアステレオマーの分離、および純粋なアトロプ異性体への転換、ならびに（３）キラル条件下におけるアトロプ異性体の直接的な分離。
【００６８】
方法（１）の下で、ジアステレオマー塩は、ブルシン、キニーネ、エフェドリン、ストリキニーネ、α−メチル−β−フェニルエチルアミン（アンフェタミン）などの鏡像異性体として純粋なキラル塩基と、カルボン酸およびスルホン酸などの酸性官能基を有する不斉キサンテン化合物との反応によって形成され得る。ジアステレオマー塩は、分別結晶化またはイオンクロマトグラフィーによって分離するために誘導され得る。アミノ化合物の光学異性体の分離のために、キラルカルボン酸またはキラルスルホン酸（例えば、ショウノウスルホン酸、酒石酸、マンデル酸、または乳酸）の付加により、ジアステレオマー塩が形成され得る。
【００６９】
あるいは、方法（２）によって、分割される基質はキラル化合物の１つの鏡像異性体と反応し、ジアステレオマー対を形成する（Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．（１９９４）Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｐ．３２２）。ジアステレオマー化合物は、不斉キサンテン化合物を、メンチル誘導体などの純粋な鏡像異性体のキラル誘導体化剤と反応させて、次いでジアステレオマーを分離し、そして加水分解して鏡像異性体を富化された遊離のキサンテンを得ることによって形成され得る。光学純度を測定する方法は、ラセミ混合物のキラルエステル（例えば、メチルエステルまたはＭｏｓｈｅｒエステル、α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル  アセテート（Ｊａｃｏｂ  ＩＩＩ．（１９８２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：４１６５）および２つのアトロプ異性体ジアステレオマーの存在についてＮＭＲスペクトルを分析することを包含する。例えば、Ｃ−１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシフルオレセイン（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および他の蛍光色素に付着するために有用な不斉キサンテン化合物）は、塩基の存在化において（−）クロロギ酸メンチルと反応させて、メンチルカルバメート１ａおよび１ｂ（実施例１、図１ａ）のジアステレオマー混合物を形成した。アトロプ異性キサンテン化合物の安定なジアステレオマーは、アトロプ異性体のナフチル−イソキノリン（Ｈｏｙｅ，Ｔ．，ＷＯ９６／１５１１１）の分離方法に従って、順相クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによって分離および単離され得る。ジアステレオマー１ａおよび１ｂを、分取用の逆相ＨＰＬＣにより分離された（実施例２、図１ｂ）。
【００７０】
方法（３）により、２つの不斉鏡像異性体のラセミ混合物はキラル固定相を用いたクロマトグラフィー（「Ｃｈｉｒａｌ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」（１９８９）Ｗ．Ｊ．Ｌｏｕｇｈ，Ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｋａｍｏｔｏ，（１９９０）「Ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｅｎｙｌｃａｌｂａｍａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｓ  ａ  ｃｈｉｒａｌ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ」，Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５１３：３７５−３７８）により分離され得る。キサンテン化合物の鏡像異性体であるアトロプ異性体はキラル固定相でのクロマトグラフィーにより分離および単離され得る。ラセミの、Ｃ−１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシフルオレセインのサンプルは、キラル吸着カラムでのＨＰＬＣ分析により、アトロプ異性の立体異性体を分離する２つのピークを与えた（図２ｂ）。例えば、キラル誘導体化方法（実施例１）、分取ＨＰＬＣ分離（実施例２）およびキラルメンチル補助部の加水分解（実施例３、図２ａ）によってアトロプ異性体が分離される場合、分離されたアトロプ異性体２ａはキラル吸着剤カラムでのＨＰＬＣにより分析した場合、単一のピークを示す（図２ｃ）。
【００７１】
アトロプ異性体は、不斉炭素原子を有する他のキラル分子を識別するために用いられる方法（例えば、施光性および円偏光二色性）により識別され得る。
【００７２】
（Ｖ．３  エネルギー移動色素）
別の局面において、本発明は、構造式ＩＩで定義される化合物のようなアトロプ異性キサンテン化合物を含むエネルギー移動色素化合物を含む。通常、本発明のエネルギー移動色素は、第１の波長における光を吸収し、それに応じて励起エネルギーを放出するドナー色素、このドナー色素により放出された励起エネルギーを吸収し得、そしてそれに応じて第２の波長における蛍光を発生し得るアクセプター色素を含む。このドナー色素はリンカーを通じてアクセプター色素と結合し、そのリンカーは、ドナー色素とアクセプター色素との間の効率的なエネルギー移動を促進するために有効的である（Ｌｅｅ，「Ｅｎｅｒｇｙ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｙｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」、米国特許第５，８００，９９６号；Ｌｅｅ，「Ｅｎｅｒｇｙ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｙｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」、米国特許第５，９４５，５２６号；Ｍａｔｈｉｅｓ、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、米国特許第５，６５４，４１９号；Ｌｅｅ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２８１６−２２）。あるいは、ドナー色素およびアクセプター色素は、基質における異なる結合部位で標識され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、５’末端におけるドナー色素および３’末端におけるアクセプター色素で標識され得る。ポリペプチドは、カルボキシ末端におけるドナー色素および内部システインまたはリジン側鎖におけるアクセプター色素で標識され得る（Ｋｏｍｏｒｉｙａ、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、米国特許第５，６０５，８０９号）。本発明のエネルギー移動色素において、基質を標識するドナー色素およびアクセプター色素の少なくとも１つは、アトロプ異性キサンテン化合物である。エネルギー移動色素を含む他の色素は、アトロプ異性キサンテン化合物とのエネルギー移動プロセスを引き起こす任意の蛍光成分であり得、その例としては、フルオレセイン、ロードル（ｒｈｏｄｏｌ）、およびローダミンが挙げられる。他の色素としては、シアニン、フタロシアニン、スクアライン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、ベンゾフェノキサジン、フルオレセイン、ジベンゾローダミン、またはローダミンなどの蛍光色素類が挙げられる。
【００７３】
エネルギー移動色素は、ＤＮＡの配列決定のような、混合物中で複数標識された基質の同時検出における使用に利点を有する。単一ドナー色素は、一組のエネルギー移動色素で用いられ得、その結果、各々の色素は共通の波長において強い吸収を有する。次いで、エネルギー移動セット中のアクセプター色素を変えることによって、アクセプター色素は、個々の発光極大波長のスペクトルにおいて分解され得る。エネルギー移動色素はまた、非エネルギー移動色素よりも大きな有効ストークスシフトを与える。ストークスシフトは、ドナー色素が光を最大限吸収する波長である励起極大波長とアクセプター最大限の光を発する発光極大波長との間の差である。
【００７４】
通常、ドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーは次の構造を有する：
【００７５】
【化３６】
2004532805.tif 000009
ここでＺはＮＨ、Ｓ、およびＯからなる群から選択され；Ｒ２１はドナー色素と結合したＣ１〜Ｃ１２アルキルであり；Ｒ２２はＣ１〜Ｃ１２アルキルジイル、少なくとも１つの不飽和結合を有する５員環および６員環、ならびにカルボニル炭素と結合した縮合環構造からなる官能基から選択される；そしてＲ２３はリンカーをアクセプター色素に結合する官能基を含む。Ｒ２２は５員環または６員環であり、例としてシクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサジン、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドール、およびナフタレンが挙げられる。具体的には、リンカーは以下の構造を有し得る：
【００７６】
【化３７】
2004532805.tif 000010
ここでｎの範囲は２〜１０である。
【００７７】
また、通常、Ｒ２３は、以下の構造を有し得る：
【００７８】
【化３８】
2004532805.tif 000011
この中でＲ２４はＣ１〜Ｃ１２アルキルおよび
１つの実施形態において、ドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーは、官能基を含み、その官能基は、アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも１つの不飽和結合を有する５員環および６員環または縮合環構造のような、ある程度の構造剛性のリンカーを与える。エネルギー移動色素のドナー色素およびアクセプター色素は、以下の例示的な構造を有するリンカーによって結合され得る：
【００７９】
【化３９】
2004532805.tif 000012
ここＤはドナー色素であり、Ａはアクセプター色素であり、ｎは１または２である。フェニル環は、スルホネート、ホスホネート、および他の荷電基などの基で置換され得る。
【００８０】
エネルギー移動色素のドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーの結合部位は、ドナー色素およびアクセプター色素のうち一方または両方が本発明の化合物である場合、任意の位置であり得る。例示的な結合部位としては、Ｒ１、Ｒ１１、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｚ１およびＺ２が挙げられる。リンカーおよび結合部位の例は、末端ヌクレオチド２５、２６、３３、および３４で示され、この結合部位では、リンカーは、ドナーフルオレセイン色素のＲ１またはＲ１１において、およびアクセプターローダミン色素のＲ１８またはＲ１９において結合する。代替的な実施形態では、ドナー色素およびアクセプター色素が、Ｒ１８部位またはＲ１９部位を介してリンカーによって結合され、ドナー色素またはアクセプター色素のいずれかが、Ｒ１部位、Ｒ１１部位、Ｚ１部位またはＺ２部位を介して基質に結合される。別の代替的な実施形態では、ドナー色素およびアクセプター色素が、Ｒ１部位、Ｒ１１部位，Ｚ１部位またはＺ２部位を介してリンカーによって結合され、そしてドナー色素またはアクセプター色素のいずれかが、Ｒ１８部位またはＲ１９部位を介して基質に結合される。
【００８１】
エネルギー移動色素化合物は、リンカーを通して共有結合で基質と結合される。そのリンカーは、結合、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルジイルまたはＣ６〜Ｃ２０アリールジイルであり得る。そのリンカーは官能基を有し得、その官能基としては、アミド、カルバメート、尿素、チオ尿素、ホスフェート、ホスホネート、スルホネート、ホスホロチオエートなどが挙げられる。好ましいリンカーとしては、１，２−エチルジイルおよび１，６−ヘキシルジイルが挙げられる。エネルギー移動色素と基質との間のリンカーの結合部位は、エネルギー移動色素上の任意の位置であり得、その位置においてはドナー色素およびアクセプター色素のうちの１つまたはその両方が本発明の色素である。基質はヌクレオシドまたはヌクレオチドである場合、基質上の好ましい結合部位は核酸塩基上である。核酸塩基がプリンである場合、リンカーは８位で結合され得る。核酸塩基が７−デアザプリンである場合、リンカーは７位または８位で結合され得る。核酸塩基がピリミジンである場合、リンカーは５位で結合され得る。例えば、末端ヌクレオチドの例、２５および２６において、エネルギー移動色素は、Ｒ１９で核酸塩基に結合される。ここで基質はオリゴヌクレオチドであり、好ましい結合部位としては、３’末端（ｔｅｒｍｉｎｉｉ）および５’末端が挙げられる。他のオリゴヌクレオチド結合部位としては、ヌクレオチド間ホスフェート、またはホスフェート−アナログ連結、あるいは糖上の位置（例えば２’または４’）が挙げられる。基質はポリペプチド（ペプチドまたはプロテイン）である場合、好ましい結合部位としては、アミノ末端およびカルボキシル末端、ならびにリジン残基アミノ置換基が挙げられる。
（Ｖ．４  標識の方法）
本発明は、標識試薬を含み、その試薬中でアトロプ異性キサンテン化合物は、基質と反応するための反応性の形態である。別の局面において、本発明は、本発明の化合物（式Ｉ）で標識された（すなわち、結合された）基質を含む。基質は仮想的に、本発明の色素が結合体化され得る任意の分子または基質であり得、以下が挙げるが、それに限定しない：ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリペプチド、炭水化物、リガンド、実質的に純粋な鏡像異性体の化合物、粒子、表面、脂質、固体支持体、有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびにこれらの組み合わせおよび集合体（例えば、染色体、核、生存細胞（例えば、細菌または他の微生物、哺乳動物の細胞、組織など）など）。粒子としては、ナノ粒子、ミクロスフェア、ビーズ、またはリポソームが挙げられ得る。表面は、ガラスまたは非孔性の平面物質であり得る。本発明の化合物は、種々の手段によって任意のリンカーを経由して基質と結合され、その手段としては疎水性引力、イオン性引力、共有結合が挙げられる。
【００８２】
代表的には、当該分野で周知の方法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ．４０−５５、６４３−７１）を用いて、適切な溶媒中において、適切な反応性アトロプ異性キサンテンおよび結合体化されるべき基質を混合し、続いて、任意の結合体化されていない開始物質または望まれない副生成物から、標識された基質、結合体を分離することにより標識される。結合体は、後の使用のために、乾燥状態または溶液で貯蔵され得る。
【００８３】
アトロプ異性キサンテンのラセミ混合物は、上述の分離方法および単離方法（１）、（２）および（３）に従って、標識剤の合成おける任意の中間段階において、実質的に純粋なアトロプ異性体を単離するために分離され得る。
【００８４】
アトロプ異性キサンテンは、１つの置換基位置における連結部分または別の分子との色素の共有結合を含み得る。連結部分は、代表的には求電子性官能基であり、基質における求核性官能基との反応による共有結合の形成が可能である。求核性官能基としては、例えば、アルコール、アルコキシド、アミン、ヒドロキシルアミン、およびチオールが挙げられ得る。あるいは、連結部分は求核性官能基を含み得、その官能基は基質上の求電子性官能基と反応する。結合部分の例としては、アジド（ａｚｉｄｏ）、一置換の一級アミン、二置換の二級アミン、チオール、ヒドロキシル、ハライド、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、カルボキシル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホネートエステル、シリルハライド、クロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、アルキルハライド、アリルハライド、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物、ヨードアセトアミドおよび活性化エステルが挙げられる。
【００８５】
１つの連結部分は、アトロプ異性キサンテン化合物のカルボキシル基置換基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である（図３，６，１０，１１）。化合物のＮＨＳエステル形態は標識剤である。色素のＮＨＳエステルは、予備形成され、単離され、精製され、かつ／または特徴づけされ得るか、あるいは色素のＮＨＳエステルはインサイチュで形成され得、そしてオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドなどのような基質の求核性官能基と反応し得る（Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２−１３）。代表的に、カルボキシル形態の色素は、下記の組合せのいくつかとの反応によって活性化される：（１）カルボジイミド試薬（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド）、またはウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）試薬（例えば、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）；（２）１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などの活性化剤；および（３）色素のＮＨＳエステルを与えるためのＮ−ヒドロキシスクシニミド。ＮＨＳエステルの代表例は、構造は４ａおよび４ｂ（図３）、構造８（図４）、および構造１３（図５）である。
【００８６】
アトロプ異性キサンテン化合物上の官能基は、誘導体化および化合物上の他の官能基における反応の前に保護され得る。例えば、アトロプ異性体２ａおよび２ｂのアミノ基は、トリフルオロアセチル化され、それぞれ３ａおよび３ｂを与える（図２ａ、実施例５および６）。次いで、カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドおよびカルボジイミド試薬を用いて（例えば、ＤＡＥ）活性エステル（ＮＨＳ）に転換され、それぞれ４ａおよび４ｂを得た（図３、実施例７および８）。
【００８７】
いくつかの場合において、アトロプ異性キサンテン化合物および基質は、１つの工程においてアトロプ異性キサンテン基質結合体を形成するために化合物のインサイチュ活性化、および基質との反応によってカップリングされ得る。他の活性化試薬およびカップリング試薬としてはＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−１−イル）−１−１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチルウロニウム  ２−フルオロ−ヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＭＳＮＴ（１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール）およびアリールスルホニルハライド（例えば、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライド）が挙げられる。
【００８８】
別の好ましい反応性連結基は、不斉キサンテン化合物のホスホロアミダイトである。ホスホロアミダイト色素試薬は、特に本発明の色素で標識されたオリゴヌクレオチドの自動的な合成に有用である。最も都合のよいことに、ホスホロアミダイト色素試薬は、固相合成の通常の過程の間に固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドとカップリングされ得る。オリゴヌクレオチドは、通常、ホスホロアミダイト方法によって固体支持体上で合成される（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．「Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」，米国特許第４，４１５，７３２号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，米国特許第４，４５８，０６６号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３−２３１１）。
【００８９】
ホスホロアミダイトアトロプ異性キサンテン試薬は、ヌクレオシド形態または非ヌクレオシド形態であり得る。非ヌクレオシド形態のホスホロアミダイト試薬は、一般式ＩＩＩ：
【００９０】
【化４０】
2004532805.tif 000013
を有し、ここでＤＹＥは保護形態または非保護形態のアトロプ異性キサンテンＩＩ（エネルギー移動色素を含む）であり；Ｌはリンカーであり；Ｒ３０およびＲ３１は別々に、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ４〜Ｃ１０アリール、および１０個までの炭素原子を含むシクロアルキルであるか、または、Ｒ３０およびＲ３１はホスホロアミダイト窒素原子と共に、飽和窒素複素環を形成し；そしてＲ３２は、オリゴヌクレオチドの望まない伸長を妨げるホスファイトエステル保護基である。通常、Ｒ３２は、オリゴヌクレオチド合成条件に対して安定であるが、オリゴヌクレオチドまたは色素の完全性に不利に影響を及ぼさない試薬を用いて、合成オリゴヌクレオチド生成物から除去され得る。Ｒ３２は、以下であり得る：（ｉ）メチル、（ｉｉ）２−シアノエチル；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、または（ｉｉｉ）２−（４−ニトロフェニル）エチル；−ＣＨ２ＣＨ２（ｐ−ＮＯ２Ｐｈ）。ホスホロアミダイト試薬の実施形態としては、以下を含む：（ｉ）Ｒ３０およびＲ３１が、それぞれイソプロピルである場合、（ｉｉ）Ｒ３０およびＲ３１が、一緒になってモルホリノである場合（ｉｉｉ）Ｌが、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである場合（ｉｖ）Ｒ３２が、２−シアノエチルである場合、ならびに（ｖ）ＤＹＥがリンカーによってＲ１８またはＲ１９で結合される場合。そのリンカー、Ｌは代替的に以下：
【００９１】
【化４１】
2004532805.tif 000014
であり得、ここでｎの範囲は１〜１０である。ホスホロアミダイト試薬ＩＩＩの一例は、次の構造を有する：
【００９２】
【化４２】
2004532805.tif 000015
ホスホロアミダイト色素試薬ＩＩＩにより、単一であり実質的に純粋である本発明のアトロプ異性キサンテンを用いて基質が標識される。基質が、オリゴヌクレオチドである場合、色素は、典型的な３’から５’方向の合成の結果としてオリゴヌクレオチドの５’末端において結合され得るか、または５’から３’方向の合成方法が行われる場合、オリゴヌクレオチドの３’末端に結合される（Ｗａｇｎｅｒ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６：１６５７−６０）。試薬ＩＩＩは、固体支持体に（例えば、３’末端を介して）結合されるポリヌクレオチドとカップリングされ得る。他のホスホロアミダイト色素試薬（ヌクレオシド形態および非ヌクレオシド形態）は、オリゴヌクレオチドの他の部位（例えば、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間連結、糖）における標識を可能にする。核酸塩基部位、ヌクレオチド間連結部位、および糖部位は、蛍光色素による内部標識および多重標識を可能にする。
【００９３】
本発明のアトロプ異性キサンテン化合物は、３価のホスファイト化剤を用いた求核性官能基のホスファイト化の任意の公知の方法によって、非ヌクレオシドホスホロアミダイト標識試薬に転換され得る。例えば、キサンテンがカルボキシル基（例えば、Ｒ１９＝ＣＯ２Ｈ）を含む場合、このカルボキシルは（例えば、ＮＨＳへと）活性化され得、６−アミノ−１−ヘキサノールでアミド化され得る。得られたヒドロキシルは、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエチルホスファイトまたはクロロ−ジイソプロピルアミノ−シアノエチルホスフィンでホスファイト化されて、ホスホロアミダイト色素標識剤を与え得る（Ｔｈｅｉｓｅｎ（１９９２）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．２７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９９−１００）。あるいは、化合物のカルボキシル基はヒドロキシルに還元されて、ホスファイト化され得る。
【００９４】
そのホスホロアミダイト試薬ＩＩＩは、おだやかな酸活性化（ｍｉｌｄ  ａｃｉｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の下でヒドロキシル基（例えば、固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドの５’末端ＯＨ）と反応し、ヌクレオチド間ホスファイト基を形成し、このホスファイト基が、次いで酸化され、ヌクレオチド間ホスフェート基になる。ある場合に、キサンテン化合物は官能基（例えば、構造式ＩにおけるＺ１およびＺ２酸素）を含み得、その官能基は、ホスホロアミダイト試薬の合成の間かまたはオリゴヌクレオチドのような分子を標識するための次の使用の間のいずれかの間保護を必要とする。その保護基は官能基の性質によって決まり、当業者には明らかである（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。一般的に、使用される保護基は、５’−ヒドロキシル保護基（例えば、ジメトキシトリチル）を除去するためにオリゴヌクレオチド合成において通常用いられる酸性条件（例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸）下において安定であるはずであり、そして固体支持体から合成オリゴヌクレオチドを脱保護および／または切断するために用いられる塩基性条件（例えば、水酸化アンモニウム、水性メチルアミン）下においては不安定であるはずである。
【００９５】
アミノ酸およびアミノ酸アナログから構成される、ポリペプチド、抗体、および他のバイオポリマーは、本発明のアトロプ異性キサンテン化合物との結合体化によって共有結合で標識され得る。代表的に、その化合物は求電子性形態（例えば、ＮＨＳ反応性連結基）であり、ペプチドの求核性基（例えば、アミノ末端、またはリジンのようなアミノ酸のアミノ側鎖）と反応する。あるいは、色素は、求核形態（例えば、アミノ反応性連結基またはチオール反応性連結基）であり得、ペプチドの求電子性基（例えば、カルボキシル末端またはアミノ酸のカルボキシル側鎖のＮＨＳ）と反応し得る。標識されたポリペプチドは、細胞表面および細胞内成分との相互作用の際の、標識ポリペプチドの特異的な結合特性および認識特性を保持し得る。キサンテン化合物は色素として作用し、結合または認識事象を局在化、可視化、および定量化するための検出エレメントを提供する。ポリペプチドは、また、２つの部分（蛍光レポーターおよびクエンチャー）で標識され得、その２つの部分は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を共に受ける。その蛍光レポーターは、部分的にまたは有意にインタクトなポリペプチドのクエンチャー部分によってクエンチされ得る。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによるポリペプチドの切断の際に、検知できるほどの蛍光の増加が測定され得る（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．（１９９５）「Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２４８：１８−３４）。
【００９６】
（Ｖ．４Ａ  標識ヌクレオチド）
好ましい標識基質の種類としては、本発明の色素で標識されるヌクレオシドの結合体およびヌクレオチドの結合体が挙げられる。そのような標識ヌクレオシドおよび標識ヌクレオチドは、特に酵素合成で形成されるポリヌクレオチドの標識に有用である。例えばＰＣＲ増幅、Ｓａｎｇｅｒ型ポリヌクレオチドの配列決定、およびニックトランスレーション反応の状況で用いられる、標識されたヌクレオチド５’−トリホスフェート。
【００９７】
ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖部分上の部位または核酸塩基部分上の部位で標識され得る。好ましい核酸塩基標識部位としては、プリン核酸塩基の８−Ｃ、７−デアザプリン核酸塩基の７Ｃまたは８Ｃ、およびピリミジン核酸塩基の５位が挙げられる。ヌクレオシドまたはヌクレオチドと色素との間では、リンカーは任意の位置でアトロプ異性キサンテン化合物と結合し得る。
【００９８】
標識されたヌクレオシドまたは標識されたヌクレオチドは、酵素により組み込まれ得、酵素により伸長され得る。本発明の化合物で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、式ＩＶを有し得：
【００９９】
【化４３】
2004532805.tif 000016
ここでＤＹＥは、保護形態または非保護形態の化合物ＩまたはＩＩであり、エネルギー移動色素を含む。Ｂは、任意の核酸塩基であり得る（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）。Ｒ２５は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、またはホスフェートエステルアナログである。Ｒ２６およびＲ２７は、単独の場合、それぞれ独立してＨ、ＨＯ、Ｆおよびホスホロアミダイトである。Ｒ２６またはＲ２７がホスホロアミダイトである場合、Ｒ２５は、酸切断可能な（ａｃｉｄ−ｃｌｅａｖａｂｌｅ）ヒドロキシル保護基（例えば、ジメトキシトリチル）であり、この保護基によって自動合成条件下での次のモノマーカップリングが可能となる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，「Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」，米国特許第４，４１５，７３２号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，米国特許第４，４５８，０６６号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３−２３１１）。
【０１００】
標識されたヌクレオシドまたは標識されたヌクレオチドが、ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）である場合、Ｒ２６およびＲ２７は、ポリメラーゼ媒介テンプレート指向重合（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）をブロックするように選択される。ターミネーターヌクレオチドＲ２６およびＲ２７は、単独の場合、それぞれ独立してＨ、Ｆ、およびポリメラーゼ媒介テンプレート指向重合をブロックする部分であるか、またはＲ２６およびＲ２７が一緒になった場合は、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する。式ＩＶにおいて、Ｒ２６およびＲ２７の両方がヒドロキシルである場合、結果として生じる化合物は、標識されたリボヌクレオシドおよびリボヌクレオチド（ＮＴＰ）である。Ｒ２７が水素であり、かつＲ２６がヒドロキシルである場合、結果として生じる化合物は、標識された２’−デオキシリボヌクレオシドおよびヌクレオチド（ｄＮＴＰ）である。Ｒ２６およびＲ２７が各々水素である場合、結果として生じる化合物は２’，３’−ジデオキシリボヌクレオシドおよびヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）である。標識されたｄｄＮＴＰは、蛍光検出を利用するＳａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定方法におけるターミネーターとして特定の用途を見出す。標識された２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）は，ＤＮＡポリメラーゼ伸長産物を標識するための試薬として特定の用途を見出す（例えば、ポリメラーゼ鎖反応またはニックトランスレーション）。標識リボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（ＮＴＰ）は、ＲＮＡポリメラーゼ伸長産物を標識するための試薬として特定の用途を見出す。
【０１０１】
【化４４】
2004532805.tif 000017
アルキニルアミノ連結化合物ＩＶ（式中、Ｌがアルキンジイル基を含む）は、アトロプ異性キサンテン化合物をヌクレオシド、ヌクレオチド、およびそれらのアナログに結合体化するために有用である。それらの合成は、ＥＰ８７３０５８４４．０およびＨｏｂｂｓ，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３４２０に教示される。対応するヌクレオシドモノホスフェート、ヌクレオシドジホスフェート、およびヌクレオシドトリホスフェートは、標準的な技術（例えば、米国特許第５，８２１，３５６号；同第５，７７０，７１６号；同第５，９４８，６４８号；同第６，０９６，８７５号に記載される方法）によって得られる。改変プロパルギルエトキシアミドリンカーＬを有する化合物ＩＶの合成の方法もまた、これらの特許中に見出され得る。構造式ＩＶの化合物を合成する際の使用に適したさらなる合成手順は、例えば、Ｇｉｂｓｏｎ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６４５５−６４６７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４５１３−４５３５；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４８５６−４８７６；Ｎｅｌｓｏｎ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．５（３）：２３３−２４１；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：３７４−３７５；米国特許第４，８５５，２２５号、米国特許第５，２３１，１９１号、および米国特許第５，４４９，７６７号に記載され、これらは、本明細書中で参考として援用される。これらの手法のいずれも、本明細書に記載の全範囲の標識されたヌクレオシド、ヌクレオチド、およびアナログを合成するために、必要な場合に慣用的に適合され得るかまたは改変され得る。
【０１０２】
アルキニルリンカーＬの１つの実施形態は下記のようであり得る：
【０１０３】
【化４５】
2004532805.tif 000018
ここでｎは、０、１、または２である。
【０１０４】
エネルギー移動色素対は、核酸塩基アミノ基を介して以下に連結することによってヌクレオチド５’−トリホスフェートに結合体化され得る：（ｉ）エネルギー移動色素対の活性化エステル、または（ｉｉ）１つの色素（例えば、Ｒ１１−保護アミノメチル，Ｒ１８−カルボキシルフルオレセイン、次いで非保護Ｒ１１−アミノメチルの対の第２の色素へのカップリング）への段階的なカップリング。
【０１０５】
リンカー試薬は、公知の合成方法によって調製され得る。例えば、ホスフェートリンカー試薬５は、環状ホスホロアミダイト７から出発して合成される。メチルグリコレート６を用いた７のホスファイト化に、５価のホスフェート８へのインサイチュ酸化が続く。メチルエステル、トリフルオロアセテート基の加水分解および脱メチル反応により、９を得た。Ｆｍｏｃでのアミノ基の保護により、Ｎ−ヒドロキシスクシイミドエステルとして活性化された１０、リンカー試薬５を与えた（図４、実施例９）。
【０１０６】
アルキニルアミノ連結ヌクレオチドは、ＮＨＳリンカー試薬５と７−デアザ−７−プロパルギルアミノ−ｄｄＡＴＰ１２を最初にカップリングして１３を得、続いてＦｍｏｃ基を加水分解し、１１を得ることにより調製され得る（図５、実施例１０）。アミノアトロプ異性キサンテン１ａは、ｐ−アミノメチル安息香酸のＮ−Ｆｍｏｃ、ＮＨＳエステルとカップリングされ（実施例１１）、続いて１４を与えるためにＮＨＳエステルとして活性化される（図６）。１１と１４の反応によりアトロプ異性キサンテンｄｄＡＴＰ化合物１６を得た。Ｆｍｏｃ基を、水酸化アンモニウムで除去して、１５を得た（図６、実施例１２）。
【０１０７】
ＮＨＳ−ローダミン色素１７は、二環式アミン１８から合成された。１−ブロモ−３−クロロプロパンとの環化により、三環式エステル１９を得、１９は加水分解して三環式アミン２０とした（図７、実施例１３）。２０と無水物２１のフリーデル−クラフツアシル化により、ケトン２２を得、２２をもう１当量の２０と反応させて、対称ローダミンイソプロピルエステル２３を得た。２３のエステルは、切断され、カルボン酸２４はＮＨＳ−ローダミン色素１７に転換された（図８、実施例１３）。
【０１０８】
実質的に純粋なアトロプ異性キサンテンエネルギー移動ｄｄＡＴＰターミネーター２５は、１５と１７のカップリングによって形成され、次いで陰イオン交換ＨＰＬＣで精製された（図９、実施例１４）。
【０１０９】
異なる集束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）スキームを用いる、エネルギー移動ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドへの代替の合成ルートを実施し得る。基質、色素、およびリンカーサブユニット、またはシントンは、任意の順番でカップリングのために整理され得る。例えば、ドナー色素およびアクセプター色素のエネルギー移動対は、リンカーを介して共有結合で結合され得、次いでヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに結合され得る。多くの異なる合成ルートが実施され得、結果として本発明の色素でのヌクレオチドの標識に至る。反応性官能基（例えば、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基）は、有機合成方法論の莫大な技術を利用した、保護を必要とし得る。
【０１１０】
別のローダミン色素２８は、ビス−トリフルオロアセトアミド２９として保護され、ＮＨＳ化合物２７に転換された（図１０、実施例１５）。プロパルギルエトキシアミノｄｄＴＴＰ３０は、アトロプ異性キサンテン化合物１４とカップリングされ、Ｆｍｏｃアトロプ異性キサンテンｄｄＴＴＰ３１を得、３１を加水分解して３２を得た（図１１、実施例１６）。２７と３２の反応によってアトロプ異性体、エネルギー移動ターミネーターｄｄＴＴＰ２６を得、それらを、陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製した（図１２、実施例１７）。
【０１１１】
（Ｖ．４Ｂ  標識オリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチドは、市販のホスホロアミダイトヌクレオシド、支持体（例えば、シリカ、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（米国特許第４，４５８，０６６号）、およびポリスチレン（米国特許第５，０４７，５２４号および同第５，２６２，５３０号）および自動合成機（Ｍｏｄｅｌｓ  ３９２，３９４，３９４８ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるホスホロアミダイト法（米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，９７３，６７９号；同第４，４５８，０６６号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３−２３１１）により、通常、固体支持体上で合成される。
【０１１２】
別の好ましい標識基質の種類としては、オリゴヌクレオチドと本発明の化合物との結合体が挙げられる。そのような結合体は、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチドライゲーションプローブ、二重標識５’−エキソヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎＴＭ）プローブなどとしての有用性を見出し得る（Ｆｕｎｇ，米国特許第４，７５７，１４１号；Ａｎｄｒｕｓ，「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ｉｎ  ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３９−５４；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ．４０−５５，６４３−７１；Ｍｕｌｌａｈ（１９９８）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１０２６−１０３１）。標識オリゴヌクレオチドは式Ｖを有し得：
【０１１３】
【化４６】
2004532805.tif 000019
ここでこのオリゴヌクレオチドは、２〜１００のヌクレオチドを含有する。ＤＹＥは、保護形態または非保護形態の化合物ＩまたはＩＩであり、エネルギー移動色素を含む。Ｂは、任意の核酸塩基である（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）。Ｌはリンカーである。Ｒ２７は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。Ｒ２２は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。Ｒ２９は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。この実施形態において、構造Ｖは、核酸塩基標識オリゴヌクレオチドであり、核酸塩基を介して結合される本発明の複数の色素を有し得る。核酸塩基標識オリゴヌクレオチドＶは、以下により形成され得る：（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼによる、酵素により組込み可能なヌクレオチド試薬ＩＶ（Ｒ２５がトリホスフェートである）の酵素的組込み、および（ｉｉ）自動合成によるヌクレオシドホスホロアミダイト試薬のカップリング。それに対して、核酸塩基標識オリゴヌクレオチドＶは、１より多い組込み可能なヌクレオチドＩＶの組み込みによって多重標識され得、ＩＩＩのような色素標識試薬を用いる標識により、式ＶＩの５’−単独標識オリゴヌクレオチドを導き：
【０１１４】
【化４７】
2004532805.tif 000020
ここでＸは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；Ｒ２７は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり；Ｒ２８は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；そしてＬは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、アリール、または１００個までのエチレンオキシ単位のポリエチレンオキシである。
【０１１５】
式ＶもしくはＶＩのリンカーＬは、構造ＩのＲ１、Ｒ１１、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｚ１、およびＺ２を含む、本発明のアトロプ異性体のキサンテン化合物（ＤＹＥ）のあらゆる部位に付着し得る。
【０１１６】
合成オリゴヌクレオチドの標識化における第一の方法においては、求核官能性、たとえば第１級脂肪族アミンは、オリゴヌクレオチド標識付着部位、たとえば５’末端の、に導入される。自動化固体支持体合成が完了した後、オリゴヌクレオチドは支持体から切断され、そして全ての保護基は除去される。この求核オリゴヌクレオチドは、求電子部分を含む過剰量の標識試薬、たとえばイソチオシアネート、または活性エステル、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と均一溶液条件下で反応する（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ．４０−５５，６４３−７１；ならびにＡｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）  ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，  ｐｐ．３９−５４）。標識したオリゴヌクレオチドＶＩは、色素の反応性連結基形態、たとえばＮＨＳと５’−アミノアルキルオリゴヌクレオチドとを反応させることにより、形成され得る。
【０１１７】
第二の方法において、標識は、自動合成中もしくはその前に、たとえば支持薬（Ｍｕｌｌａｈ，「Ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ３’−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」；米国特許第５，７３６，６２６号；ならびにＮｅｌｓｏｎ，「Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」；米国特許第５，１４１，８１３号）もしくはホスホロアミダイト試薬ＩＩＩとして、直接オリゴヌクレオチドに取りこまれる。ある蛍光色素および他の標識は、５’標識のためのホスホロアミダイト試薬として官能基化された（Ｔｈｅｉｓｅｎ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．２７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９９−１００）。
【０１１８】
一般に、標識されたオリゴヌクレオチドが酵素合成により作製される場合、次の手順が用いられ得る。標的ＤＮＡが変性され、オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレートＤＮＡにアニール化される。酵素取りこみ可能なヌクレオチドもしくはプライムされた標的の継続的なテンプレート特異的酵素伸長の補助が可能なヌクレオチドアナログの混合物（たとえば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、もしくはｄＵＴＰを含む混合物）が、プライムされた標的へ添加される。少なくとも、ヌクレオチドの画分は、標識されたターミネーターＩＶであり、アトロプ異性体キサンテン色素ＩＩで標識される。ポリメラーゼ酵素は、ポリメラーゼ酵素が活性な条件下で、続いて混合物に添加される。標識されたオリゴヌクレオチドは、標識されたヌクレオチド、もしくはターミネーターの取りこみにより、ポリメラーゼにより媒介される鎖合成中に形成される。代替の酵素合成方法において、１つではなく２つのプライマーが用いられる。ひとつは標的の（＋）鎖に相補的であり、そしてもうひとつは、標的の（−）鎖に相補的であり、ポリメラーゼは熱安定性のポリメラーゼであり、そして反応温度は変性温度および伸長温度の間で循環される。これによって、ＰＣＲにより、標的配列に対する標識された補体を急激に合成する（Ｉｎｎｉｓ（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１１９】
ある好ましい合成後化学標識法において、オリゴヌクレオチドは、次のように標識される。構造Ｉに従うＮＨＳの形態の色素は、ＤＭＳＯ内で溶解もしくは懸濁され、０．２５Ｍ、約ｐＨ９のビカーボネート／カーボネート緩衝液中の５’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドに過剰量（５〜２０当量）で添加され、６時間反応される。（たとえば米国特許第４，７５７，１４１号）。アトロプ異性体キサンテンで標識されたオリゴヌクレオチドは、緩衝液、たとえば０．１モル濃度の酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）で溶出して、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを通すことにより、未反応色素から分離し得る。粗製の標識したオリゴヌクレオチドを含む画分は、勾配溶離を使用する逆相ＨＰＬＣによって、より一層精製される。
【０１２０】
本発明の、アトロプ異性体キサンテン化合物で標識されたポリヌクレオチドは、電気泳動の移動率に影響する部分、すなわち移動修飾標識で、さらに標識され得る。移動修飾標識は、ポリエチレンオキシ単位−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−を含み、ここでｎは１〜１００であり得る（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，米国特許第５，６２４，８００号）。望ましくは、ｎは２〜２０である。ポリエチレンオキシ単位は、リン酸基で分散され得る。不連続で既知の大きさであるポリエチレンオキシのさらなる標識で、アトロプ異性体キサンテン標識ポリヌクレオチドを特異的に標識することは、電気泳動による実質的に、ポリヌクレオチド内にあるヌクレオチドの数に非依存性の分離を可能にする。つまり、同じ長さのポリヌクレオチドは、分光的に分離可能な色素標識、および移動修飾標識の存在により選別され得る。色素標識および移動修飾標識の両方を保有するポリヌクレオチドは、単一標識したポリヌクレオチドおよびヌクレオチド成分のライゲーション、もしくはポリメラーゼ伸長により、酵素的に形成され得る。
【０１２１】
（Ｖ．５  方法）
特異的にオーバーラップする複数の分析物の同時検出を必要とする方法は、標識としての不斉キサンテン色素の実質的に純粋なアトロプ異性体から有利であり得る。本発明のアトロプ異性体キサンテン化合物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、ＤＮＡ配列決定、遺伝子発現のアンチセンス転写および翻訳制御、遺伝解析、およびＤＮＡプローブに基づく診断用試験などの、いかなる蛍光検出を利用した方法にも、よく適している（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．（１９９２）；Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．３−２８）。蛍光色素標識したオリゴヌクレオチドの蛍光検出は、５’エキソヌクレアーゼアッセイ（Ｌｉｖａｋ，米国特許第５，７２３，５９１号）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーション（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．および  Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．（１９９６）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ：Ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０３−０８）、遺伝子連鎖マッピング（Ｄｉｂ（１９９６）；「Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ５，２６４  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：１５２−５４）、およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Ｇｒｏｓｓｍａｎ（１９９４），「Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｏｄｅｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４５２７−３４）などのような核酸配列検出アッセイの基礎である。
【０１２２】
本発明は、電気泳動のような生化学的な分離手順に供される、異なって標識されたポリヌクレオチドのクラスを検出するために、特によく適している（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ編，Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８１）。電気泳動マトリックスは、たとえば架橋もしくは非架橋ポリアクリルアミド、または約２〜２０重量％の濃度（体積あたりの重量）を有する他のアミド含有ポリマーなどのふるい分け高分子であり得る（Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ，米国特許第５，５５２，０２８号、および米国特許第５，５６７，２９２号、および米国特許第５，９１６，４２６号）。電気泳動マトリックスは、スラブゲルもしくはキャピラリー形式で作製され得る（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３９２５−２９；Ｍａｔｈｉｅｓ，米国特許第５，２７４，２４０号）。
【０１２３】
（Ｖ．５Ａ  プライマー伸長）
「フラグメント解析法」もしくは「遺伝子解析法」のような、本明細書中で言及される方法の好ましいカテゴリー内において、実質的に純粋なアトロプ異性体キサンテン化合物を含む、蛍光色素で標識したポリヌクレオチドフラグメントは、たとえばライゲーションもしくはポリメラーゼ特異的プライマー伸長などの、標識されたプライマーもしくはヌクレオチドを使用するテンプレート特異的酵素合成を通してもたらされる。ポリヌクレオチドフラグメントは、たとえば電気泳動もしくはクロマトグラフィーなどの大きさに依存する分離プロセスに供され、そして、分離されたフラグメントは、分離に続いて、たとえばレーザー誘導蛍光などによって検出される（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，米国特許第４，８１１，２１８号）。複数のクラスのポリヌクレオチドは同時に分離され得、そして異なるクラスは、本発明の色素を含んだ、スペクトル的に分解可能な標識により識別される。電気泳動において、クラスは、電気泳動の移動率に基づいて分離される。
【０１２４】
（Ｖ．５Ｂ  ＤＮＡ配列決定）
好ましくは、ＤＮＡ配列決定の連鎖停止方法、すなわちジデオキシＤＮＡ配列決定、もしくはサンガー型配列決定、およびフラグメント解析が用いられる（Ｓａｎｇｅｒ（１９７７）；「ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７）。模範的な連鎖停止ヌクレオチドアナログは、３’から５’へのＤＮＡ鎖伸長に必要な３’ＯＨ基の不足した２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）を含む。プライマーもしくはｄｄＮＴＰは、本発明の実質的に純粋なアトロプ異性体キサンテン色素で標識され得、そして高分解能の電気泳動によるフラグメントの分離後、蛍光により検出される。色素はプライマーの５’末端上で、例えば、プライマーの核酸塩基上、もしくはジデオキシヌクレオチドの核酸塩基上のアミノ（Ｆｕｎｇ，米国特許第４，７５７，１４１号）で、例えばアルキルアミノ結合基を介して（Ｋｈａｎ，米国特許第５，７７０，７１６号、および米国特許第５，８２１，３５６号、ならびにＨｏｂｂｓ，米国特許第５，１５１，５０７号）官能基に結合され得る。
【０１２５】
おのおののターミネーターは、異なった蛍光色素を保持し、そして集合的に、実験でのターミネーターは、本発明の色素から１つ以上を含む色素のセットを保持する。好ましいフラグメント解析方法において、色素で標識されたフラグメントは、相対的な大きさ、すなわち配列の長さにより同定される。フラグメントの大きさと配列の対応は、４つの可能な末端ヌクレオチド（「ターミネーター」）ならびに、分光的に分解可能な色素のセットのメンバーの取りこみにより樹立される（Ｂｅｒｇｏｔ，米国特許第５，３６６，８６０号）。分光的に分解可能な色素のセットは、少なくとも１つの実質的に純粋なアトロプ異性体キサンテン化合物を含み得る。
【０１２６】
（Ｖ．６  ライゲーション）
リガーゼ酵素による核酸プローブの共有結合は、分子生物学者に利用可能な最も有益なツールのひとつである。２つのプローブが、２つのプローブが隣接し、そして介在性ギャップのないテンプレート核酸にアニール化されるとき、リン酸ジエステル結合は、リガーゼ酵素によって、片方のプローブの５’末端ともう一方のプローブの３’末端との間で形成され得る（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ，米国特許第４，８８３，７５０号；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，（１９８８）；「Ａ  ｌｉｇａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−８０；Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ＥＬＩＳＡ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓｓａｙ」（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：８９２３−２７）。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、標的ＤＮＡサンプル中の特異的な配列の存在を検出する。一方もしくは双方のプローブが色素で標識される場合、ライゲーション生成物が蛍光により検出され得る。一方もしくは双方のプローブは、実質的に純粋なアトロプ異性体キサンテン色素で標識され得る。ライゲーション生成物は、電気泳動、クロマトグラフィー、もしくは他の、「大きさ」もしくは「電荷」に基づいた分離方法により検出され得る。
【０１２７】
（Ｖ．７  増幅）
本発明のアトロプ異性体キサンテン化合物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ならびに他の核酸増幅および選択方法における、５’標識したオリゴヌクレオチドプライマー上での標識としての用途を見出す。ＰＣＲ用途は、繰り返しユニットの数が可変である特定の配列の隣接した複数のコピーを含む、２本鎖ＤＮＡの繰り返し領域の、可変数の縦列反復配列（ＶＮＴＲ）増幅法、短い縦列反復配列（ＳＴＲ）増幅法、およびマイクロサテライト増幅法による、遺伝子型決定のための、標識したオリゴヌクレオチドの使用を含む。好ましくは、このようなＰＣＲ遺伝子型決定方法において、ＰＣＲプライマーは、本発明のアトロプ異性体キサンテンで標識される。
【０１２８】
特に好ましい実施形態において、アトロプ異性体キサンテン化合物は、ＰＣＲ中の増幅生産物のリアルタイムまたは終点測定を供給する、定量的方法もしくは試薬において用いられ得る（米国特許第５，２１０，０１５号、および米国特許第５，５３８，８４８号）。蛍光色素失活剤プローブを用いたエキソヌクレアーゼアッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））は、ＰＣＲをおこなうために必要以上のサンプル処理のない、閉管システムにおけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の直接検出をもたらす（米国特許第５，７２３，５９１号；Ｍｕｌｌａｈ，（１９９８）：「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ  ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１０２６−１０３１）。Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて、プライマー伸長を導き、ポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼはまた、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によって、標的配列にアニール化されたプローブを置換し、切断する。Ｔａｑｍａｎ型アッセイにおいて、プローブは自己失活性であり、蛍光色素および失活剤部分で標識され、これらのどちらかが本発明の色素であり得る。分光のオーバーラップは、プローブが原形のままであるとき、効率的なエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を導く（Ｃｌｅｇｇ，（１９９２）；「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３−３８８）。標的配列にハイブリダイズされたとき、標的−プローブハイブリッドが存在する量に比例した蛍光シグナルを放出するために、プローブはＰＣＲ中に切断される（米国特許第５，５３８，８４８号、および米国特許第５，７２３，５９１号）。
【０１２９】
増幅の進行は継続的に、すなわちリアルタイム検出で観察され得る。本発明の分光的分解可能な、アトロプ異性体キサンテン色素は、標的のＰＣＲ増幅の後、遺伝子型決定実験において有益である。特に、各々異なる色素で５’末端を標識されたプライマーオリゴヌクレオチドのセットは、複数の遺伝子座を増幅し、一塩基多型（ＳＮＰ）および対立遺伝子を識別し得る。標準の大きさにおける色素で標識した増幅生成物の電気泳動分離は、プライマー配列に依存して、ある遺伝子型を示すプロフィール、もしくは特徴的なデータセットを構築する。
【０１３０】
（Ｖ．７Ａ  ハイブリダイゼーションアッセイ）
標的核酸にハイブリダイズする特定の蛍光色素−失活剤プローブは、ハイブダイゼーションアッセイにおいて有益である。プローブが標的にハイブリダイズされない場合、プローブは、蛍光色素と失活部分との間の空間的な接近を可能にするコンホメーションを得、蛍光失活を生じ得る。標的へのハイブリダイゼーションの際に、これらの部分は物理的に分離され、失活が停止もしくは減衰し、そして蛍光が増加する。蛍光が検出可能であるかまたは定量化される場合、サンプル中の標的配列の存在が推定される。本発明のアトロプ異性体色素は、蛍光色素もしくは失活部分としても用いられ得る。ヘアピン領域、いわゆる「分子ビーコン」（Ｔｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ）を形成する自己相補的な配列を有する蛍光色素−失活剤プローブは、相補的な標的配列へのハイブリダイゼーションの際に蛍光変化（たとえば生体細胞におけるｍＲＮＡのインサイチュ定量）を受ける。異なる蛍光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブは、本発明のアトロプ異性体キサンテン色素を含むが、複数かつ均一なハイブリダイゼーションアッセイが密封した反応チューブ内で実行されることを可能にする。
【０１３１】
（Ｖ．８  クロマトグラフィー）
実質的に純粋なアトロプ異性体キサンテン化合物で標識された基質を用いた前述の方法は、標識された基質がクロマトグラフィーにより検出される場合にも実施され得る（ＨＰＬＣ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第２版，Ｒ．Ｗ．Ａ．Ｏｌｉｖｅｒ編（１９９７）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。ＨＰＬＣの十分に確立された技術は、固定固相との吸着性のイオン交換相互作用もしくは疎水相互作用から水性の有機移動相内へ、サンプル基質が溶解され、そして溶出される逆相条件下において、ポリヌクレオチドなどの大きな基質の分離を可能にする。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは多糖類などのキラルな基質がアトロプ異性体キサンテン化合物のラセミ混合物で標識されると、ジアステレオマーとなる。本質的に、得られた過剰のセットの分析物が得られたが、これは、分析結果を不明瞭にし得る。得られるジアステレオマー混合物の分析は、ＨＰＬＣの高分解条件下で、ダブルピーク、ブロードピーク、および他の限定した人為的結果を引き起こし得る。この問題は、キラル基質が、サンガー配列決定法によりもたらされたポリヌクレオチドフラグメントの包接されたセットのような、密接に関連した化合物の混合物である場合、特に悪影響を及ぼす。キラル基質のための標識としての、キサンテン化合物の実質的に純粋なアトロプ異性体形態の使用は、ジアステレオマーのひとつを除去することにより、分析に対するこの不必要な妨害を抑制する。本発明の、驚くべき予期しない利点は、全体的に、よりシャープなピーク、より少数の割れたピーク、およびより高い分解能であることにより例証され得る。
【０１３２】
（Ｖ．９  キット）
本発明は、本発明の実質的に純粋なアトロプ異性体キサンテン化合物および／もしくはこれらの標識した複合体を含むキットを包含する。１つの実施形態において、キットは、別の分子、すなわち基質に対する連結部分とアトロプ異性体キサンテン化合物とを複合体化するため有益である。そのようなキットは一般に、任意の連結部分ならびに別の分子もしくは基質に色素を複合体化することに適した試薬、酵素、緩衝剤、溶媒などを含む本発明のアトロプ異性体キサンテンを備える。アトロプ異性体キサンテンは、エネルギー移動色素の受容体もしくは供与体となり得る。
【０１３３】
１つの実施形態において、キットは、酵素的に合成されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの本発明のアトロプ異性体キサンテンでの標識化に有益である。このようなキットは、一般的に、本発明による標識された酵素的に取りこみ可能なヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログ、継続したプライマー伸長の補助が可能な、酵素的に取りこみ可能であるヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログの混合物およびポリメラーゼ酵素を含む。好ましくは、標識した酵素的に取りこみ可能なヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログは、構造ＩＶに基づいた化合物であるが、最も好ましくは標識したターミネーターである。好ましいポリメラーゼは、熱安定性な、ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳである（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などである。
【０１３４】
あるいは、キットは１つ以上のプライマーを含み得る。プライマーは、アトロプ異性体キサンテンおよびアトロプ異性体キサンテンを含むエネルギー移動色素で標識され得る。
【０１３５】
（Ｖ．１０  実施例）
本発明は、以下実施例の考察によりさらに明らかにされ、これらの実施例は、純粋に本発明の模範とされることを意図しているのであり、いかなる方法においても本発明の範囲を制限するものではない。
【０１３６】
（実施例１）Ｃ−１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシフルオレセインのメンチルカルバメートジアステレオマー，１ａおよび１ｂの調製
Ｃ−１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシフルオレセインの塩酸塩（５．１６ｇ，１１．６ｍＭｏｌ，分子量４４１．８；Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：８９−１０１）を脱イオン化したホルムアミド５０ｍｌおよびジイソプロピルエチルアミン１０．２ｍｌに溶解した。（−）メンチルクロロホルメート（３．０６ｇ，３．０ｍｌ，１４ｍＭｏｌ，分子量２１９；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ；Ｊｏｕｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８７）４７０；Ｙｏｄｏ（１９８８）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３６：９０２）を、アルゴン下で室温にて攪拌しながら滴下した。１．５時間後、ＴＬＣ分析（酢酸エチル／ヘキサン：４／１）は、反応物のより高いＲｆスポットへの部分的な転換を示した。さらに（−）メンチルクロロホルムメート１ｍｌを添加し、さらに０．５時間攪拌を続けた。ＴＬＣ分析は、より高いＲｆの生成物への完全な転換を示した。飽和水性ＮａＨＣＯ３での反応混合物の希釈の後に、酢酸エチル５００ｍｌでの抽出をおこなった。水性画分をｐＨ３に酸性化し、酢酸エチルで抽出した。混合した有機画分をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮して、４．５ｇ、収率６６％の１ａおよび１ｂの混合物を黄色粉末状として得た（図１ａ）。
【０１３７】
（実施例２）ＨＰＬＣによるジアステレオマー１ａおよび１ｂの分離および単離
オープンカラム、フラッシュ逆相カラム上での大まかな分離、次に分取逆相ＨＰＬＣでの２段階クロマトグラフィー工程により、粗製のジアステレオマー１ａおよび１ｂを分離し、そして精製した。
【０１３８】
１ａおよび１ｂの混合物を酢酸エチルに溶解し、Ｃ−１８逆相シリカゲル上に吸着させた。減圧下で溶媒を除去し、そして、先に平衡させたＣ−１８逆相カラムの先端に、固体を充填した（長さ２１ｃｍ×直径６ｃｍ）。画分を回収することにより、１００ｍＭ  ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート）中２５％ＣＨ３ＣＮでジアステレオマーを分離し、溶出した。画分をＣ−１８カラム（Ｍｅｔａｃｈｅｍ  ＯＤＳ３，長さ２５ｃｍ×内径４．６ｍｍ）での分析逆相ＨＰＬＣにて、１００ｍＭ  ＴＥＡＡ中２５〜３５％のＣＨ３ＣＮの線状勾配で、０〜３０分、１．０ｍｌ／分の流速および２６０ｎｍＵＶ検出にて分析した。１番目に溶出される少なくとも純度７５％のジアステレオマーを含んだ画分を合わせ、減圧下において、オレンジ色油に濃縮した。１番目に溶出されたジアステレオマーを任意に構造１ａに割り当てた。２番目に溶出される少なくとも純度７５％のジアステレオマーを含んだ画分を合わせ、減圧下において、オレンジ色油に濃縮した。２番目に抽出したジアステレオマーを任意に構造１ｂに割り当てた。
【０１３９】
ジアステレオマー１ａを、フラッシュ工程により純度７５％に精製した１ａを６００〜８００ｍｇ、１００ｍＭ  ＴＥＡＡ  ５００ｍｌに溶解し、Ｍｅｔａｃｈｅｍ  ＯＤＳ３  ８μカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ＬＣ  ２０００  Ｓｙｓｔｅｍ）に充填し、４０ｍｌ／分の流速、および２６０ｎｍのＵＶ検出を用いて、ＴＥＡＡ  １００ｍＭ中０〜１０％のＣＨ３ＣＮの勾配で１６分、１０〜３５％のＣＨ３ＣＮの勾配で８０分溶出し、次いで３５％のＣＨ３ＣＮを３２分維持することにより、分取逆相ＨＰＬＣにて、９９％異性体純度に精製した。上記分析逆相ＨＰＬＣ条件で、画分を回収し、分析した（図１ｂ）。異性体純度が少なくとも９９％の画分を合わせ、６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル画分を飽和ＮａＣｌで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮し、ヘキサンで沈殿させ、濾過し、乾燥させて、収量３００〜５００ｍｇの１ａを明黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）δ９．８５，２Ｈ，ｂｒ；９．１０，１Ｈ，ｂｒ；８．３５，１Ｈ，ｄ；８．１５，１Ｈ，ｄ；７．８３，１Ｈ，ｓ；７．４３，１Ｈ，ｂｒ；６．９５，１Ｈ，ｓ；６．７０，４Ｈ，ｍ；４．６０，３Ｈ，ｍ；１．９０，２Ｈ，ｍ；１．６５，２Ｈ，ｍ；１．４５，１Ｈ，ｍ；１．３０，２Ｈ，ｍ；０．８９，３Ｈ，ｄ；０．８２，３Ｈ，ｄ；０．７８，３Ｈ，ｄ。電子スプレー質量分析：６１０（Ｍ＋Ｎａ），５８８．５（Ｍ＋Ｈ）
ジアステレオマー１ｂを同様の分取逆相ＨＰＬＣ工程にて精製する。
【０１４０】
（実施例３）アトロプ異性体アミン２ａの合成
ジアステレオマー１ａ（１．１ｇ，１．８７ｍｍｏｌｅ，分子量５８７．６）を、１００ｍｌの水に溶解し、そして０℃に冷却した。濃硫酸（１５ｍｌ）を滴下して、褐色溶液を得た（図２ａ）。室温に温度を上げ、混合物を一晩攪拌した。混合物を氷水１．５ｍｌにゆっくりと加え、次いで、先に平衡させたＣ−１８シリカゲルに吸着させた（長さ４ｃｍ×直径３ｃｍ）。溶出物のｐＨが中性になるまで、支持体を水で洗浄した。粗製生成物を２００ｍｌのＣＨ３ＯＨで溶出し、これを減圧下にて濃縮し、そして乾燥して、オレンジ色固体としてアトロプ異性体２ａ  Ｃ−１アミノメチルＣ−１９カルボキシフルオレセイン硫酸塩を得た（０．９３ｇ，収率９５％，分子量５０３．４）。１Ｈ  ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δ８．４３，１Ｈ，ｄ；８．３４，１Ｈ，ｄ；７．９２，１Ｈ，ｓ；７．２３，３Ｈ，ｍ；７．０６，１Ｈ，ｄ；６．９８，１Ｈ，ｄ；４．５８，２Ｈ，ｓ。
【０１４１】
加水分解し、精製した２ａのエナンチオ純度をキラルカラムＨＰＬＣ（Ｒｅｇｉｅｓ（Ｓ，Ｓ）Ｗｈｅｌｋ−０１  １０−１００Ｋｒｏｍａｓｉｌ  ＦＥＣ  カラム，長さ２５ｃｍ×ＩＤ４．６ｍｍ）で分析した。サンプル２ａを水に溶解し、０．１％酢酸含有水中のエタノール０〜３５％の勾配で、３０分間、１ｍｌ／分の流速で溶出し、２５４ｎｍ  ＵＶで検出し（図２ｃ）そしてラセミ混合物と選別した（図２ｂ）。
【０１４２】
（実施例４）アトロプ異性体アミン２ｂの合成
実施例３と同様の工程にて、ジアステレオマー１ｂを加水分解し、精製し、そして解析して、アトロプ異性体２ｂを得た（図２ａ）。
【０１４３】
（実施例５）アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ａの合成
硫酸塩であるアトロプ異性体２ａ（０．９３ｇ，１．８４ｍｍｏｌ，分子量５０３．４）をエタノール１５ｍｌに溶解した。トリエチルアミン（１．８ｍｌ，１３ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸エチル（２．２ｍｌ，１８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した（図２ａ）。この混合物を室温にてアルゴン下で２．５時間攪拌した。減圧下で揮発性物質を除去し、得られた残留物を酢酸エチル３００ｍｌに溶解し、５％ＨＣｌ  ５０ｍｌで２回洗浄した。酢酸エチル画分を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮して、オレンジ固体状としてアトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ａ（０．９２ｇ，収率１００％，分子量５０１．４）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δ８．３５，１Ｈ，ｄ；８．１５，１Ｈ，ｄ；７．８０，１Ｈ，ｓ；６．８２，１Ｈ，ｓ；６．６５，４Ｈ，ｍ；４．８２，２Ｈ，ｓ。
【０１４４】
（実施例６）アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ｂの合成
アトロプ異性体２ｂを、実施例５と同様の工程で、アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ｂに変換し、そして実施例５と同様の方法で分析した（図２ａ）。
【０１４５】
（実施例７）アトロプ異性体ＮＨＳエステル４ａの合成
アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ａ（０．９２ｇ，１．８３ｍｍｏｌ，分子量５０１．４）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．８５ｇ，７．３ｍｍｏｌ）、および１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＤＡＥ）（１．０５ｇ，５．５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル２４ｍｌおよび１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）１２ｍｌに溶解し、室温にてアルゴン下で２．５時間攪拌した（図３）。混合物を酢酸エチル３００ｍｌで希釈し、５％ＨＣｌ  ８０ｍｌで２回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、そしてシリカゲルに吸着させた。生成物を吸着させたシリカゲルを、シリカゲルの乾燥充填したカラムの先端に充填し（長さ１２ｃｍ×ＩＤ３ｃｍ）、酢酸エチル：ヘキサン／２：１で溶出した。アトロプ異性体ＮＨＳエステル４ａを含む画分を回収し、混合し、減圧下で濃縮し、ヘキサンから沈殿させ、明黄色固体として４ａを得た（０．７４ｇ，収率６７％，分子量５９８．４）１Ｈ  ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）δ８．４２，１Ｈ，ｄ；８．２２，１Ｈ，ｄ；７．９５，１Ｈ，ｓ；６．８１，１Ｈ，ｓ；６．６８，４Ｈ，ｍ；４．８２，２Ｈ，ｓ；２．８５，４Ｈ，ｓ。
【０１４６】
（実施例８）アトロプ異性体ＮＨＳエステル４ｂの合成
アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ｂを、実施例７と同様の工程で、アトロプ異性体ＮＨＳエステル４ｂに変換し、そして実施例７と同様の方法で分析した（図３）。
【０１４７】
（実施例９）２−［（２−Ｆｍｏｃ−アミノエトキシ）（ヒドロキシホスホリル）オキシ］酢酸ＮＨＳ５の合成
保護したホスホジエステルリンカーシントン５を、メチルグリコレート６（４．５当量）を環状ホスホロアミダイトＡｍｉｎｏ−ＬｉｎｋＴＭ７（１当量）（Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：３４２−３４８；米国特許第４，７５７，１５１号）および４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．１当量）と反応させることにより調製した。混合物を大気温度にて１時間攪拌した。反応が完了した後（ＴＬＣ分析）、溶液を氷浴で冷却し、塩化メチレン中、３−クロロ過安息香酸（４当量）溶液で処理した。氷浴を除去した。３０分後、ＮａＨＳＯ３水溶液（１０％）を添加した。混合物を酢酸エチルで希釈した。有機層をＮａＨＳＯ３（１０％）、飽和ＮａＨＳＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。粗製生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して、エステル８を得、これをメチルエチルケトンおよびＮａＩ（１０当量）中で３時間（３６ｍＭ、１当量）還流により熱した。粗製の脱メチル化したホスホジエステルを０．３ＭのＬｉＯＨ溶液（５当量）（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨ：１／３中）に溶解し、メチルエステルを切断するために一晩攪拌した。溶媒を除去して粗製の化合物９を得、これを次いで、水性Ｎａ２ＣＯ３（５％）に溶解した。ＴＨＦ中のＮ−（９−フルオレニルメトキシ−カルボニルオキシ）スクシンイミド（ＦｍｏｃＯＳｕ，１．５当量）を一度に添加し、大気温度にて３時間攪拌した。粗製生成物を酢酸エチルで希釈し、１０％ＨＣｌ水溶液で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーにて精製して、黄色油状物としてＦｍｏｃ酸１０を得た。
【０１４８】
Ｆｍｏｃ酸１０を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１当量）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４当量）を添加した。溶液を氷浴で冷却し、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，２当量）で処理した。氷浴を除去し、２次間攪拌を継続した（ＴＬＣ分析しながら）。反応が完了したとき、酢酸エチルを添加し、その溶液を５％ＨＣｌ水溶液で洗浄した。溶媒を除去することにより、２−［（２−Ｆｍｏｃ−アミノエトキシ）（ヒドロキシホスホリル）オキシ］酢酸ＮＨＳ５を得た（図４）。
【０１４９】
（実施例１０）７−プロパルギルホスホリルアミノ−７−デアザ−ｄｄＡＴＰ１１の合成
７−デアザ−７−プロパルギルアミノ−ｄｄＡＴＰ１２（７−（３−アミノ−１−プロピニル）−２’，３’−ジデオキシ−７−デアザアデノシン−５’−トリホスフェート（米国特許第５，０４７，５１９号および米国特許第５，１５１，５０７号）を２５０ｍＭビカーボネート（ｐＨ９．０）に懸濁させ、ＤＭＳＯ中の２−［（２−Ｆｍｏｃ−アミノエトキシ）（ヒドロキシホスホリル）オキシ］酢酸ＮＨＳ５溶液を添加した。１時間後、反応混合物をＨＰＬＣ（ＡＸ−３００陰イオン交換）で精製した。生成物画分を回収し、乾固するまで濃縮し、ＲＰ  ＨＰＬＣにより（Ｃ−１８逆相）精製して、ＦｍｏｃリンカーｄｄＡＴＰ１３を得た。濃水酸化アンモニウム（２８〜３０％）をＦｍｏｃリンカーｄｄＡＴＰ１３に添加し、溶液を５５℃で２０分間熱した。減圧下での濃縮により、７−プロパルギルホスホリルアミノ−７−デアザ−ｄｄＡＴＰ１１を得、これをＣ−１８逆相ＨＰＬＣにより精製した（図５）。
【０１５０】
（実施例１１）Ｆｍｏｃ−アミノメチル−ＮＨＳ−ＦＡＭ１４の合成
予測されたＮ−Ｆｍｏｃ誘導体を形成するための塩基の存在下で、ｐ−アミノメチル安息香酸ＨＣｌ塩と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのフルオレニルメトキシ−カルボニルオキシエステル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（双方とも市販されている）を反応させることにより、Ｆｍｏｃ−アミノメチル−ＮＨＳ−ＦＡＭ１４を調製した。次いで、この生成物を、ＤＣＣ存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、安息香酸のカルボキシル基のＮＨＳエステルを形成した。次いで、次の構造：
【０１５１】
【化４８】
2004532805.tif 000021
を有するこのＮＨＳエステルである、ｐ−アミノメチル安息香酸のＮ−Ｆｍｏｃ塩誘導体を、アトロプ異性体Ｃ−１アミノメチル，Ｃ−１９カルボキシフルオレセイン２ａと反応させ、実施例２の方法で精製し、次いでＤＣＣ存在下で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、実質的に純粋なアトロプ異性体であるＦｍｏｃ−アミノメチル−ＮＨＳ−ＦＡＭ１４を生成した（図６）。
【０１５２】
（実施例１２）アミノメチルベンズアミド−アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルホスホリルアミノ−ｄｄＡＴＰ１５の合成
ＤＭＳＯ中のＦｍｏｃ−アミノメチル−ＮＨＳ−ＦＡＭ１４溶液を、２５０ｍＭビカーボネート（ｐＨ９．０）に懸濁した７−プロパルギルホスホリルアミノ−７−デアザ−ｄｄＡＴＰ１１に添加した。反応混合物を、大気温度で暗所にて２時間放置した。Ｆｍｏｃ−アミノ保護された生成物１６をＨＰＬＣ（ＡＸ−３００陰イオン交換）で精製し、Ｆｍｏｃ基を加水分解するため、濃水酸化アンモニウム（２８〜３０％）中で２０分間、５５℃で加熱した。減圧下での濃縮により粗製の、実質的に純粋なアトロプ異性体である、アミノメチルベンズアミド−アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルホスホリルアミノ−ｄｄＡＴＰ１５を得て、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣにて精製した（図６）。
【０１５３】
（実施例１３）ＮＨＳ−ローダミン色素１７の合成
二環式アミン１８（１２．８ｇ，４７ｍｍｏｌｅ，米国特許第５，６８８，８０８号）、１−ブロモ−３−クロロプロパン（２９．３ｇ，１８７ｍｍｏｌｅ）、ヨウ化ナトリウム（５６．４ｇ，３７６ｍｍｏｌｅ）、ならびに炭酸水素ナトリウム（７．９ｇ，９４ｍｍｏｌｅ）を、ＣＨ３ＣＮ１５０ｍｌ中で１８時間還流した。混合物を室温で冷却し、濾過し、エバポレートした。濾過ケーキを、ヘキサン３００ｍｌで洗浄し、これを濾液と混合し、水５０ｍｌで２回および飽和ＮａＣｌ  ５０ｍｌで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。生成物を、シリカゲルにてクロマトグラフィーで精製し、ヘキサン／酢酸エチル：２０／１で溶出し、淡黄色油状物として三環式アミンピバル酸エステル１９を得た（９．５ｇ，３０ｍｍｏｌｅ，収率６４％）。エステル１９を、水１５ｍｌおよびメタノール１２０ｍｌ中の水酸化リチウム一水和物（２．６ｇ，６０ｍｍｏｌｅ）溶液で加水分解した。室温で１時間攪拌した後、混合物を減圧下で濃縮し、３０ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌに溶解した混合物を、１００ｍｌジエチルエーテルで３回抽出した。混合したエーテル抽出物を２００ｍＭ、ｐＨ７のリン酸緩衝液５０ｍｌで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮して、茶色固体として、三環式アミン２０を得た（図７）。三環式アミン２０および３，６−ジクロロ，４−イソプロピルカルボキシレート無水フタル酸２１をトルエン中で還流して、フリーデルクラフツアシル化生成物ケトン２２を得た（吸収極大４００ｎｍ）（図８）。
【０１５４】
ホスホリルトリクロライドおよびクロロホルム中で、還流による２０と２２の環化により、イソプロピルカルボキシレート位置異性体混合物として２３を得た。イソプロピル基の切断後、ローダミンカルボン酸２４をＮＨＳ−ローダミン色素１７に転換した（図８）。
【０１５５】
（実施例１４）ホスフェートリンカーであるエネルギー移動ターミネーターｄｄＡＴＰ２５の合成
実施例１２からのアミノメチルベンズアミド−アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルホスホリルアミノ−ｄｄＡＴＰ１５を、２５０ｍＭビカーボネート溶液（ｐＨ９．０）に懸濁させた。これにＤＭＳＯ中のＮＨＳエステル１７（合成に関しては米国特許第５，８４７，１６２号）の溶液を添加した。反応混合物を大気温度にて２時間、暗所に放置した。ＨＰＬＣ、ＡＸ−３００陰イオン交換、次いでＣ−１８逆相により精製し、純粋なエネルギー移動ｄｄＡＴＰターミネーター２５を得た（図９）。
【０１５６】
（実施例１５）ビス−トリフルオロアセトアミドローダミンＮＨＳ２７の合成
ローダミン色素２８を、ジエチルエーテル中トリフルオロ酢酸無水物およびトリエチルアミンで室温にて処理することにより、ビス−トリフルオロアセトアミド２９に転換した。カルボン酸を、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドで、ＮＨＳエステルに転換し、ビス−トリフルオロアセトアミドローダミンＮＨＳ２７を得た（図１０）。
【０１５７】
（実施例１６）アミノメチルベンズアミド−アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルエトキシアミノ−ｄｄＴＴＰ３２の合成
５−（３−アミノエトキシ−１−プロピニル）−２’，３’−ジデオキシチミジン−５’−トリホスフェート３０（米国特許第５，８２１，３５６号）を、実質的に純粋なアトロプ異性体であるＦｍｏｃ−アミノメチル−ＮＨＳ−ＦＡＭ１４と、実施例１２と同様の条件下で反応させ、Ｆｍｏｃ−アミノメチルベンズアミド−アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルエトキシアミノ−ｄｄＴＴＰ３１を得、陰イオン交換ＨＰＬＣにて精製した。３１のＦｍｏｃ基を切断して、純粋なアトロプ異性体であるアミノメチルベンズアミド−アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルエトキシアミノ−ｄｄＴＴＰ３２を得た（図１１）。
【０１５８】
（実施例１７）エネルギー移動ターミネーターｄｄＴＴＰ２６の合成
実施例１４の条件に従って、実質的に純粋なアトロプ異性体であるアミノメチルベンズアミド−アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルエトキシアミノ−ｄｄＴＴＰ３２を、２５０ｍＭビカーボネート溶液（ｐＨ９．０）に懸濁させた。これにＤＭＳＯ中のビス−トリフルオロアセトアミドローダミンＮＨＳエステル２７溶液を添加した。反応混合物を大気温度にて２時間、暗所に放置した。これに水酸化アンモニウムを添加して、トリフルオロアセトアミド基を切断した。ＨＰＬＣ、ＡＸ−３００陰イオン交換、次いでＣ−１８逆相により精製して、純粋なエネルギー移動ｄｄＴＴＰターミネーター２６を得た（図１２）。
【０１５９】
（実施例１８）ホスフェートリンカーであるエネルギー移動ターミネーターｄｄＡＴＰ２５を用いたｐＧＥＭの配列決定
米国特許第５，７７０，７１６号、米国特許第５，９４８，６４８号、および同第６０９６８７５号の条件に従って、単色自動ＤＮＡ配列決定実験に、他のサンガー型標準試薬とエネルギー移動ｄｄＡＴＰターミネーター２５を用いた。ターミネーターヌクレオチド２５をアトロプ異性体のラセミ混合物（上の電気泳動図）および実質的に純粋なアトロプ異性体（下の電気泳動図）として試験し、図１３ａおよび図１３ｂに示した。
【０１６０】
色素−ターミネーター配列決定反応を、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳを用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０２１１６）に供されたプロトコールに従っておこなった。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）テンプレートの配列決定を、非標識−２１Ｍ１３配列決定プライマー（順方向）を用いて実施した。緩衝液、非標識プライマー、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳを含む薬剤は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０２１１７）のものであった。ｄＮＴＰ混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＴＴＰ各２ｍＭからなった。反応成分の予備混合物を、以下のものを含有させて調製した：５×緩衝液４．０μＬ、ｄＮＴＰ混合物１．０μＬ、テンプレート：ｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚｆ（＋）０．２μｇ／μＬ、２．０μＬ、プライマー：−２１Ｍ１３（順方向）０．８ｐｍｏｌ／μＬ、４．０μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ０．５μＬ、およびＨ２Ｏ３．５μＬ、すべての量は、１回の反応に基づいて与えられる。
【０１６１】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ４８０  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  Ｎ８０１−１００またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００用のチューブ０．２ｍｌ）に適用された０．５ｍｌチューブ内で反応をおこなった。色素ターミネーターの１〜２５０ｐｍｏｌを各反応に添加した。鉱油３０μＬを各反応の頂部に添加して、蒸発を防止した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４８０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを使用する際）。反応体積は２０μＬであり、それは上記反応予備混合物の１５μＬを含有し、色素で標識したターミネーターの可変量および十分量の水で総全体反応体積を２０μＬにした。反応を次のように熱循環させた。９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、および６０℃で４分間を２５サイクル、続いて４℃に保つサイクル。
【０１６２】
すべての反応を、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラムでのスピンカラム精製により製造業者の指導書に従って精製した（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｐ／ｎ  ＣＳ−９０１）。カラム中のゲル材料を脱イオン水０．８ｍＬで少なくとも３０分間室温にて水和させた。カラムが水和し、気泡がゲル材料内にトラップされていないことが決定された後、上層および下層のカラムのエンドキャップを除去し、カラムを重力により排出させた。次いでカラムを、キットに供された洗浄チューブに挿入し、可変速度微小遠心機で２分間１３００ｇで遠心し、洗浄チューブから除去し、サンプル捕集チューブに挿入した。反応混合物を注意深く油の下から除去し、ゲル材料に充填し、チューブを再遠心した。次いで溶出したサンプルを減圧遠心して乾燥した。
【０１６３】
配列決定ゲルに充填する前に、乾燥したサンプルをＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０１６７４）２５μＬに再懸濁した。ボルテックスし、９５℃で２分間加熱して、氷で冷却し、再びボルテックスをし、遠心した（１３，０００×ｇ）。再懸濁したサンプル１０μＬをサンプルバイアル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０１９５７）に分注し、それをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３１０遺伝分析機に適用した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ３１０−００−１００／１２０）。ふるい分けポリマーおよびキャピラリー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｐ／ｎ  ４０２８３７もしくは４３１３０８７（ポリマー）およびｐ／ｎ４０２８４０（キャピラリー））をＤＮＡ配列決定分析に特に適応させて、３１０遺伝分析機で電気泳動をおこなった。おのおのの場合において、ふるい分けポリマーは、核酸変性剤を含有した。動電学的にサンプルをキャピラリーに３０秒２．５ｋＶで注入し、キャピラリーの外壁を５０℃に維持して、１０〜１２．２ｋＶで２時間まで流し、配列決定データとして電気泳動図を作成した（図１３ａ−ｄ）。
【０１６４】
図１３ａおよび１３ｂの電気泳動図は、単色配列決定反応中のポリヌクレオチドフラグメントのプライマー伸長に３’末端上での、エネルギー移動ターミネーター２５の特異的な取りこみを示している。電気泳動図は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３１０Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで行う電気泳動中に、約２０〜約６００のヌクレオチド長の間の標識されたフラグメントの受容体ローダミン色素によって発した蛍光強度（発光極大約６５０ｎｍ）を時間の関数としてプロットする。
【０１６５】
１１９〜２４２塩基対の溶出フラグメントは、図１３ａにプロットされている。各フラグメントは、エネルギー移動ターミネーター２５によって、３’ターミネートされている。図１３ｂは、１４８〜２０５塩基対のフラグメントの、より拡大された図を示している。図１３ａおよび図１３ｂ中の矢印下の３つの領域は、２５のラセミ混合物で標識されたフラグメントの分離と比較して、２５の実質的に純粋なアトロプ異性体形態（下のパネル）で標識したフラグメントの分離に、驚くべきおよび予期しない改良を例示している。２５のアトロプ異性体ラセミ混合物よりも、実質的に純粋なアトロプ異性体を用いた下の電気泳動図に、フラグメントのより良好な分解能が観察された。矢印で示された箇所は、２５の実質的に純粋なアトロプ異性体形態が、より良好な分解の予期しない利点を提供した、特定の遺伝子座である。対照的に、キラルプライマー伸長生成物を標識する際の２５のアトロプ異性体形態ラセミ混合物の使用により、上の電気泳動図中の矢印下で幅広、重複、および分裂したピークにより例示されたように、電気泳動的に異なった速度で移動するフラグメントのジアステレオマー集団が誘導された。
【０１６６】
さらに、下の電気泳動図は、配列決定ラダーを通して、２５のアトロプ異性体のラセミ混合物を用いた上の電気泳動図よりもさらに一様なピーク高さを示す。
【０１６７】
（実施例１９）スルホネートリンカーであるエネルギー移動ターミネーターｄｄＡＴＰ３３を用いたｐＧＥＭの配列決定
前記実施例の一般的な合成経路および条件に従って、実質的に純粋なアトロプ異性体の、スルホネートリンカーであるエネルギー移動ターミネーターｄｄＡＴＰ３３（図１４）を合成した。実施例１８のプロトコールおよび条件に従って、３３をｐＧＥＭ標的の単色配列決定に用いた。別に、３３のラセミ混合物もまた、同様の単色配列決定実験に用いた。１４８〜２４２塩基対の溶出フラグメントは図１３ｃにプロットされている。各フラグメントは、エネルギー移動ターミネーター３３により３’ターミネートされた。図１３ｃ中の矢印下の３つの領域は、３３のラセミ混合物で標識されたフラグメントの分離（上のパネル）と比較して、３３の実質的に純粋なアトロプ異性体形態で標識されたフラグメント（下のパネル）を分離する際の、驚くべきおよび予期しない改良を例示している。３３のアトロプ異性体のラセミ混合物よりも、実質的に純粋なアトロプ異性体を用いた下の電気泳動図において、フラグメントのより良好な分解能が観察された。
【０１６８】
（実施例２０）エネルギー移動ターミネーターｄｄＧＴＰ３４を用いたｐＧＥＭの配列決定
前記実施例の一般的な合成経路および反応条件に従って、エネルギー移動ターミネーターｄｄＧＴＰ３４（図１５）を合成した。アトロプ異性体形態は、逆相ＨＰＬＣにより合成の最終段階で分離され、すなわち化合物３４である。実施例１８のプロトコールおよび条件に従って、３４の実質的に純粋なアトロプ異性体をｐＧＥＭ標的の単色配列決定に用いた。別に、３４のラセミ混合物もまた、同様の単色配列決定実験に用いた。２４〜９９塩基対の溶出フラグメントは、５３５ｎｍで検出し、図１３ｄにプロットされている。各フラグメントは、エネルギー移動ターミネーター３４により３’ターミネートされた。図１３ｄにおいて矢印の下の領域は、３４のラセミ混合物で標識されたフラグメントの分離（上のパネル）と比較して、３４の実質的に純粋なアトロプ異性体形態で標識されたフラグメントの分離（下のパネル）は、驚くべきおよび予期しない改良を例示している。３４のアトロプ異性体のラセミ異性体よりも、実質的に純粋なアトロプ異性体を用いた下の電気泳動図において、事実上すべてのフラグメントのより良好な分解能が観察された。矢印で示された箇所は、３４の実質的に純粋なアトロプ異性体形態が、より良好な分解の予期しない利点を提供した、特定の遺伝子座である。ラセミ３４で標識された、下のパネルのすべてのフラグメントは、２つのピークに分かれ、データの有用性を下げる。
【０１６９】
いくつかの実施形態のみ上記に詳細に述べられてきたが、これらは、化学および分子生物学の当業者は、例示した実施形態において、その教示から逸脱することなく、多くの修正が可能であることを明確に理解する。すべてのそのような修正は、上記の請求項の範囲内に包含されることを意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
図１ａは、Ｃ−１アミノメチル、Ｃ−１９カルボキシフルオレセインおよび（−）メンチルクロロホルメートがメンチルカルバメートジアステレオマー１ａおよび１ｂを与える反応を示す。
【図１ｂ】
図１ｂは、メンチルカルバメートジアステレオマー１ａおよび１ｂの分離における、分取用ＨＰＬＣ画分の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。画分＃１および＃２は純粋な１ａを示す。画分＃３は１ａと１ｂとの混合物を示す。画分＃４および＃５は純粋な１ｂを示す。
【図２ａ】
図２ａは、以下の反応を示す：（ｉ）硫酸とメンチルカルバメートジアステレオマー１ａを反応させて、メンチルカルバメート基を加水分解し、アトロプ異性体アミン２ａを得る反応、（ｉｉ）エチルトリフルオロアセテートによって２ａをアミド化し、アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ａを得る反応、（ｉｉｉ）硫酸とメンチルカルバメートジアステレオマー１ｂを反応させてメンチルカルバメート基を加水分解し、アトロプ異性体アミン２ｂを得る反応、および（ｉｖ）エチルトリフルオロアセテートによって２ｂをアミド化し、アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ｂを得る反応。
【図２ｂ】
図２ｂは、キラルＨＰＬＣ条件下での、アトロプ異性体２ａおよび２ｂのラセミ混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２ｃ】
図２ｃは、キラルＨＰＬＣ条件下での、精製アトロプ異性体２ａのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】
図３は、以下の反応を示す：（ｉ）アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ａをＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＤＡＥカルボジイミドＨＣｌ塩と反応させ、アトロプ異性体ＮＨＳエステル４ａを得る反応、および（ｉｉ）アトロプ異性体トリフルオロアセトアミド３ｂをＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＤＡＥカルボジイミドＨＣｌ塩と反応させ、アトロプ異性体ＮＨＳエステル４ｂを得る反応。
【図４】
図４は、２−［（２−Ｆｍｏｃ−アミノエトキシ）（ヒドロキシホスホリル）オキシ］酢酸ＮＨＳ５の合成を示す。
【図５】
図５は、プロパルギルホスホリルアミノ−ｄｄＡＴＰ１１の合成を示す。
【図６】
図６は、アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルホスホリルアミノ−ｄｄＡＴＰ１５の合成を示す。
【図７】
図７は、３環式アミン２０の合成を示す。
【図８】
図８は、ＮＨＳ−ローダミン色素１７の合成を示す。
【図９】
図９は、エネルギー移動ｄｄＡＴＰターミネーター２５の構造を示す。
【図１０】
図１０は、ビス−トリフルオロアセトアミドローダミンＮＨＳ２７の合成を示す。
【図１１】
図１１は、アミノメチルベンズアミド−アミノメチル−ＦＡＭ−プロパルギルエトキシアミノ−ｄｄＴＴＰ３２の合成を示す。
【図１２】
図１２は、エネルギー移動ｄｄＴＴＰターミネーター２６の構造を示す。
【図１３ａ】
図１３ａは、ホスフェート−リンカー、エネルギー移動ターミネーターｄｄＡＴＰ２５、フラグメントサイズ１１９ｂｐ〜２４２ｂｐでのｐＧＥＭのＤＮＡ配列決定を示す。
【図１３ｂ】
図１３ｂは、ホスフェート−リンカー、エネルギー移動ターミネーターｄｄＡＴＰ２５、フラグメントサイズ１４８ｂｐ〜２０５ｂｐでのｐＧＥＭのＤＮＡ配列決定を示す。
【図１３ｃ】
図１３ｃは、スルホネート−リンカー、エネルギー移動ターミネーターｄｄＡＴＰ３３、フラグメントサイズ１４８ｂｐ〜２４２ｂｐでのｐＧＥＭのＤＮＡ配列決定を示す。
【図１３ｄ】
図１３ｄは、エネルギー移動ターミネーターｄｄＧＴＰ３４、フラグメントサイズ２４ｂｐ〜９９ｂｐでのｐＧＥＭのＤＮＡ配列決定を示す。
【図１４】
図１４は、スルホネートリンカー、エネルギー移動ターミネーターｄｄＡＴＰ３３の構造を示す。
【図１５】
図１５は、エネルギー移動ターミネーターｄｄＧＴＰ３４の構造を示す。
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004532805.tif 000147
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【国際調査報告】
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