(57)【要約】本発明は、抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸をアフィニティーマトリックスに結合させ、結合していない材料を結合した材料から分離することによって、抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸を単離する方法および装置に関する。アフィニティーマトリックスは支持体に固定化させた線維芽細胞成長因子でできている。本発明はまた、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体を線維芽細胞成長因子と接触させることによって、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体によって触媒される抗凝血作用を中和するための方法および組成に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞成長因子を含むアフィニティーマトリックスを抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸を含む混合物と接触させること、および
結合した材料から結合していない材料を分離することを含む、抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸を単離する方法。
【請求項２】
前記線維芽細胞成長因子が、抗凝血性でないヘパリンまたはヘパラン硫酸より優先的に抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸と結合する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記線維芽細胞成長因子がＦＧＦ７である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記線維芽細胞成長因子が融合タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記線維芽細胞成長因子がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＦＧＦ７融合タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物が、抗凝血性でないヘパリンをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物が粗ヘパリンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記混合物が低分子量ヘパリンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が抗凝血性薬剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アフィニティーマトリックスが、支持体に固定化させた線維芽細胞成長因子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アフィニティーマトリックスが、アガロースに固定化させた線維芽細胞成長因子を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
吸着していない材料を溶出させることによって、結合した材料から結合していない材料を分離する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗凝血性ヘパリンを回収することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗凝血性ヘパリンを溶出させることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
抗凝血性でないヘパリンまたは抗凝血性でないヘパラン硫酸より優先的に抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸と結合する線維芽細胞成長因子を含むアフィニティーマトリックスを、抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸および抗凝血性でないヘパリンまたは抗凝血性でないヘパラン硫酸を含む混合物と接触させること、
結合していない材料をアフィニティーマトリックスから溶出させることによって、結合していない材料を結合した材料から分離すること、および
結合した材料をアフィニティーマトリックスから脱着させて溶出させることを含む、抗凝血性でないヘパリンまたは抗凝血性でないヘパラン硫酸から抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸を分離する方法。
【請求項１６】
支持体に固定化させた線維芽細胞成長因子を含み、固定化させた線維芽細胞成長因子が固定化されていない線維芽細胞成長因子のヘパリン結合特異性を保持している、抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸を単離するためのアフィニティーマトリックス。
【請求項１７】
前記線維芽細胞成長因子が、抗凝血性でないヘパリンまたは抗凝血性でないヘパラン硫酸より優先的に抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸に結合する請求項１６に記載のマトリックス。
【請求項１８】
前記線維芽細胞成長因子がＦＧＦ７である請求項１６に記載のマトリックス。
【請求項１９】
前記線維芽細胞成長因子が融合タンパク質である請求項１６に記載のマトリックス。
【請求項２０】
前記線維芽細胞成長因子がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＦＧＦ７融合タンパク質である請求項１６に記載のマトリックス。
【請求項２１】
前記支持体がアガロースである請求項１６に記載のマトリックス。
【請求項２２】
抗凝血性でないヘパリンまたは抗凝血性でないヘパラン硫酸より優先的に抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸に結合する線維芽細胞成長因子を準備すること、および前記線維芽細胞成長因子を支持体に固定化させることを含む、抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸を単離するためのアフィニティーマトリックスを調製する方法。
【請求項２３】
前記線維芽細胞成長因子がＦＧＦ７である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記線維芽細胞成長因子が融合タンパク質である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記線維芽細胞成長因子がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＦＧＦ７融合タンパク質である請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記支持体がアガロースである請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＧＦ７タンパク質をコードする組換え核酸ベクターを用いて細菌を形質転換させること、および
塩を含む培地中で前記細菌を培養し、細菌にＦＧＦ７タンパク質を生成させることを含む、ＦＧＦ７タンパク質を細菌中で調製する方法。
【請求項２８】
前記核酸ベクターがＤＮＡベクターである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記塩がＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２である請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記培地中の塩の濃度が約５〜約１５０ｍＭである請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記培地中の塩の濃度が約１０〜約１００ｍＭである請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＦＧＦ７が融合タンパク質である請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸ベクターが、５’から３’の方向に作動可能に結合された
プロモーターと
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＦＧＦ７融合タンパク質をコードする核酸配列と
３’非翻訳領域とを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＦＧＦ７タンパク質がアミノ酸配列番号４を有する請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記組換え核酸ベクターが核酸配列番号３を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体を線維芽細胞成長因子と接触させることを含む、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体によって触媒される血液凝固を中和する方法。
【請求項３８】
前記血液凝固が動物内で起こる請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記血液凝固が哺乳動物内で起こる請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記線維芽細胞成長因子がシグナル非活性である請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記線維芽細胞成長因子が別のアミノ酸配列と融合されており、前記線維芽細胞成長因子がシグナル非活性である請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記線維芽細胞成長因子がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＦＧＦ７融合タンパク質である請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記動物に前記線維芽細胞成長因子を投与する請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
動物から特定のヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体を含む血液を取り出し、線維芽細胞成長因子と接触させ、動物に戻す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記動物がヒトである請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
ヘパリンを線維芽細胞成長因子と接触させることを含む、ヘパリンの生物学的活性を中和させる方法。
【請求項４７】
前記ヘパリンが動物内に含まれている請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
有効な量の線維芽細胞成長因子を動物に与えることによって前記生物学的活性を中和する請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本発明は、２０００年１１月２１日提出の米国仮出願第６０／２５２，２２５号、２００１年３月２１日提出の米国仮出願第６０／２７７，７３５号、２００１年９月２８日の米国仮出願第６０／３２５，６１３号および２００１年９月２８日提出の米国仮出願第６０／３２５，５０２号の優先権を主張し、これらの全内容を本明細書中に参照として組み込む。
【０００２】
（従来の技術）
ヘパリンは、肥満細胞の細胞内顆粒内に存在する高度に硫酸化された遊離型グリコサミノグリカンである。ヘパラン硫酸は、プロテオグリカン分子のより低度に硫酸化された部分で、細胞表面上に分布し、すべての哺乳動物細胞の細胞外基質における重要な構造的および機能的構成成分である。ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、直鎖状で多分散であり、（１→４）グリコシド結合によってウロン酸とヘキササミンが交互に結合した糖から構成される、高度に負の電荷を持つ多糖鎖である。これらは、約４０００〜約３００００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【０００３】
ヘパリンは、抗凝血剤および抗血栓剤として広く用いられている。ヘパリンの抗凝血作用は、特異的な五糖配列を介して抗トロンビンＩＩＩと相互作用することに起因し、血液凝固カスケードのセリンプロテアーゼ、トロンビン、Ｘａ因子に対する抗トロンビンの結合活性および阻害活性を促進する（Ｏｌｓｏｎ他、１９９１、Ｏｌｓｏｎ他、１９９２、Ｏｌｓｏｎ他、１９９４）。
【０００４】
ヘパリンには、その血液凝固作用に関連しない、他の有益な用途がある。その例には、肺梗塞、心筋梗塞、脳卒中、外傷性ショック、血栓溶解治療、固形臓器の移植および手術における炎症性の病変および虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害症候群の治療；気道のアレルゲン性気管支収縮や気管支喘息の治療；出血性ショック、低血液量性ショック、細菌性ショックおよび関連する症候群の治療；アテローム性動脈硬化症および癌の転移の治療；ウイルス感染および創傷の治癒が含まれる。ヘパリンの抗凝血性でない効果は、微小血管構造の破壊に対する保護、心筋収縮の維持、心臓、肺、肝臓、消化管、腎臓の機能の維持、脳傷害の減少、免疫機能の改善である。
【０００５】
ヘパリンは、薬用の用途として、ブタまたはウシの粘膜、またはウシの肺組織から単離される。ヘパリン／ヘパラン硫酸は、その生合成経路の複雑さおよび性質のため、非常に不均一である。さらに、ヘパリン／ヘパラン硫酸の組成は、源となる細胞ならびに成長および発達の段階に応じて著しく異なる。具体的には、単離したヘパリンのうち、約３０％未満だけが、抗トロンビンと相互作用するのに必要な特異的五糖配列を有する。残りのヘパリンは実質的に抗凝血活性を有さない。長さが異なるヘパリン分子のうちの１個の活性部分は、活性のより低いまたは活性の異なる広い領域に囲まれる。
【０００６】
このような不均一なヘパリンの抗凝血剤または抗血栓剤としての用途は、出血性合併症、血小板減少症、脱毛症、骨粗鬆症、有害な脂肪分解など副作用に関連している。６ヶ月以上の期間ヘパリンを投与される患者の半数もが、臨床的に顕著な骨粗鬆症を発生する。ヘパリンを用いて治療した実質的にすべての患者が過渡的な血小板減少を示し、そのうち約５％の患者で、治療期間中その状態が続く。ヘパリンのこのような副作用は、この重要な抗凝血剤の臨床使用を、特に長期間の使用において著しく制限する。
【０００７】
この問題を克服することを目的とした多くのヘパリン誘導体が研究されている。非分画の粗ヘパリンを解重合および分画することによって得る低分子量ヘパリン（Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｈｅｐａｒｉｎ、ＬＭＷＨ）は、より低い分子量平均（４０００〜６０００Ｄａ）を有し、非分画のヘパリンに比べて、改善された特性を有すると主張されている。これには、抗血栓作用／抗止血作用比が高いこと、注入部位からの生体利用度がより高いこと、効果の持続がより長いこと、急性期血漿タンパク質、マクロファージ、血管内皮、および多くの他組織タンパク質と結合する性向がより低いこと、副作用の減少が含まれる（Ｌａｎｅ  Ｄ．、１９８９、Ｌｏｎｄｏｎ：Ｅｄｗａｒｄ  Ａｒｎｏｌｄ；Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ他、１９９２）。しかし、分子量はかなり狭い範囲内ではあるがＬＭＷＨの組成は依然として非分画のヘパリンと同様に複雑であるので、主張されているこれらの改善された特性は、依然として論議を呼んでいる。
【０００８】
同様に、ヘパリンの抗凝血性分画も、ヘパリンの抗凝血性でない適用において、出血など合併症を生じさせる可能性がある。このことにより、ヘパリンの抗凝血活性を、その多くの抗凝血性でない特性から選択的に切り離すことへの関心が高まった。その戦略には、化学修飾によるＮ−脱硫化／Ｎ−アセチル化、Ｏ−脱硫化、およびカルボキシルの還元が含まれていた（米国特許第６，１２７，３４７号、第４，９１６，２１９号、第５，０９０，９１０、５，７９５，８７５号）。たいていは、抗凝血活性が著しく減少したとしても多少は残る。このことにより、感受性の高い患者に副作用をもたらす可能性が依然としてある。さらに、場合によっては、分画が原因で所望する活性が抗凝血活性と共に失われる。
【０００９】
（発明が解決しようとする課題）
したがって、ヘパリンの抗凝血性分画と抗凝血性でない分画を分離および単離する効率的な方法および装置が強く望まれている。選択肢の１つは、抗トロンビンを用いたアフィニティーによる精製である。しかし、安全問題およびスケールアップのコストの点から、天然血液由来の抗トロンビンの使用には手が届かない。現在、血液由来の抗トロンビンに代わる費用効率の高い代替物がない。安全で、安価で、入手が容易であり、使用が簡単であり、臨床的に有効なほど十分高いヘパリンまたはヘパラン硫酸収量を提供することができる、方法および装置が理想的である。
【００１０】
心肺の手術、心臓カテーテル法、血液透析、ならびに血液凝固を引き起こす他の種類の手術および治療を受ける患者は、血液凝固を防ぐためにしばしばヘパリン抗凝血剤を投与される。次いで、通常は、医学的処置が終わるときに第２の薬剤を投与して血液中のヘパリンを中和または除去し、オーバーシュート、および潜在的に有害である、血液凝固が欠落し続けることを防ぐ。この戦略は、ヘパリンの作用が継続することを抑え、また付随する深刻な副作用を防ぐ。これは、通常、サケの精子由来のアルギニンに富んだ塩基性ポリペプチドであり、ヒト細胞内には存在せず、ヘパリンと強力な複合体を形成するプロタミンを投与することで得られる。実際、今のところプロタミンはヘパリンを中和する唯一の手段である。しかし、プロタミンの投与には、血圧の緩やかな上昇、激しいアレルギー反応、低血圧、補体の活性化、白血球減少症、血小板減少症、肺水腫、肺血管収縮、アナフィラキシーショックを含むいくつかの望ましくない副作用がある。プロタミンの使用に対する軽い反応の発生率は１６％と高く、激しい反応の発生率は０．２％〜３％の間である（Ｈｏｌｌａｎｄ他、１９８４、Ｃｏｏｋ他、１９９２）。したがって、プロタミンに代わる安全で有効な代替物が強く必要とされている。
【００１１】
抗凝血効果を中和または無効にする捕捉剤として、ヘパリン結合性の血小板因子４（ＰＦ４）が提唱されている（米国特許第５，４８２，９２３号）。しかし、ＰＦ４は多機能性の血液系タンパク質であるので、数々の他の生物学的プロセスに影響を与える。これには、脈管形成および内皮細胞増殖の阻害、宿主免疫活性の変調、トロンボモジュリン抗凝血機能および炎症反応の亢進が含まれ、これらはヘパリンの結合および抗凝血作用の中和に付随する。このような複雑な機能は、その臨床への応用に対する大きな障害となる。ＰＦ４を患者に投与した結果、ヒトは深刻な顆粒求減少症を引き起こした（米国特許第５，８０１，０６３号）。
【００１２】
２−Ｏ−硫酸化イズロン酸残基との１−４結合を含む、高度に硫酸化されたヘパリン鎖を分解する酵素ヘパリナーゼＩも、ヘパリンを除去すると臨床的に評価されている。ヘパリナーゼＩは、重要な生物学的機能を有する、細胞表面上および細胞外基質中の天然ヘパラン硫酸も分解する。ヘパリナーゼは、細菌由来の遅効性の酵素であり、活性が有効であるためには安定でなければならない。その安定性および活性を最大にするためには、特定の条件が必要とされる。長期的には、免疫応答を引き起こす。これらの特徴があいまって、その広い用途への関心がそがれている。
【００１３】
ラクトフェリンまたはそのフラグメントは、ヘパリンを中和する潜在的な薬剤として提唱されている。ラクトフェリンは好中球二次顆粒由来の天然血液成分であり、乳、涙および唾液中にも検出されている。ラクトフェリンは鉄結合性のタンパク質であり、血清鉄輸送タンパク質トランスフェリンと５５％の相同性を示す。そのヘパリン結合能力は、部分的にしか特徴付けられていない。ラクトフェリンは、抗トロンビンに比べてより低い塩濃度で固定化ヘパリンから溶出し、このことはラクトフェリンがより低いアフィニティーを有し、抗凝血性ヘパリンと結合する特異性に欠けていることを示す。さらに、宿主の防衛および炎症の制御における、その生理学的な役割もはっきりしないままである。このことにより、ヘパリンを中和させるその臨床的な有用性が制限されると予想される。
【００１４】
体外循環中に血液全体からヘパリンを除去する固定化抗トロンビンを用いた装置も提唱されたが、不安定性、安全問題ならびに抗トロンビンの調製および生産のコストが、その使用を減退させた。要約すると、プロタミンに代わる数々の代替案が試みられたが、それにかなう費用便益比を示すものはなかった。ヘパリンの抗凝血効果を無効にするのに効能がある代替物は、生理活性があり多くの他の生理学的プロセスに影響を与え、一般的により高価であり、抗トロンビン結合性の抗凝血モチーフに対する特異性を欠く。安価で安全な、より有効な代替案があれば役に立つであろう。
【００１５】
（課題を解決するための手段）
本発明の一態様は、アフィニティーマトリックスを抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸を含む混合物と接触させること、および結合していない材料を結合している材料から分離することを含む、抗凝血活性および抗血栓活性を有するヘパリンを精製する方法である。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、支持体に固定化させた線維芽細胞成長因子を含む、抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸を精製するためのアフィニティーマトリックスである。
【００１７】
本発明の別の態様は、線維芽細胞成長因子を準備すること、およびそれを支持体に固定化することを含む、抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸を単離するためのアフィニティーマトリックスを作成する方法である。
【００１８】
本発明は、ＧＳＴ−ＦＧＦ７融合タンパク質をコードする組換えベクターを用いて細菌を形質転換すること、および塩を含む培地中で前記細菌を培養することを含む、細菌内でＦＧＦ７タンパク質を調製する方法を含む。
【００１９】
本発明はさらに、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体を線維芽細胞成長因子と接触させることを含む、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体によって触媒される抗凝血作用を中和する方法を提供する。
【００２０】
（発明の実施の形態）
（配列リスト）
配列番号１は、ラット由来の線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）をコードするヌクレオチド配列（ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号０２２１８２）である。
【００２１】
配列番号２は、配列番号１に対応するアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号３は、融合タンパク質グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−線維芽細胞成長因子７（ＧＳＴ−ＦＧＦ７）をコードするヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号４は、配列番号３に対応するアミノ酸配列である。
【００２４】
下記の図は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに明示するために組み込む。これらの図の１つまたは複数への参照を、本明細書中に提示する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせることによって、本発明をより良く理解することができるであろう。
【００２５】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＧＳＴ−ＦＧＦ７融合生成物のヘパリン結合性が損なわれていないことを示すグラフである。２００μｇの純粋なＧＳＴ−ＦＧＦ７および１０ｎｇの１２５Ｉ−ＦＧＦ７（３×１０６ｃｐｍ）を混合し、ファルマシアＦＰＬＣシステムでヘパリンアフィニティークロマトグラフィーに通した。ＧＳＴ−ＦＧＦ７は、２８０ｎｍの吸収によって主要なピーク（中実線）として検出された。λ線放射線測定器で各分画の放射活性を測定すると、１２５Ｉ−ＦＧＦ７でも単一の溶出ピーク（中実三角形）が示され、これは、アフィニティーマトリックスの形成に使用したＧＳＴ−ＦＧＦ７の主要な吸収ピークと一致した。
【００２６】
図２は、ＬＭＷＨヘパリンの抗血栓活性および抗凝血活性をアフィニティーにより向上させた場合の、ＧＳＴ−ＦＧＦ７と抗トロンビンの比較を示すグラフである。固定化させたＧＳＴ−ＦＧＦ７または抗トロンビンにシグマＬＭＷＨ（６０００ダルトン）を適用して、表示したＮａＣｌの濃度で溶出し、溶出液の抗Ｘａ因子活性または抗ＩＩａ因子活性を定量した。ａ、ｃ．１００ｎｇ／ｍｌのヘパリンを含む分画の活性である。ｂ、ｄ．ＧＳＴ−ＦＧＦ７または抗トロンビンアフィニティーによって精製した分画の抗Ｘａ因子活性（ｂ）または抗ＩＩａ因子活性（ｄ）の比較である。中実正方形、非分画のＬＭＷＨ；中空三角形、ＧＳＴ−ＦＧＦ７によって保持されなかった分画；中実三角形、抗トロンビンによって保持されなかった分画；中空菱形、ＧＳＴ−ＦＧＦ７によって保持された分画；中実菱形、抗トロンビンによって保持された分画である。活性は、抗トロンビンは存在するがヘパリンは存在しない場合の、Ｘａ因子活性またはＩＩａ因子活性のパーセンテージとして表した。データは、３回の個別の実験の平均値を示す。
【００２７】
図３は、ＧＳＴ−ＦＧＦ７による、エノキサパリンおよび粗ブタ腸管粘膜ヘパリンの抗凝血活性の濃縮を示すグラフである。ａ、ｃ．様々な塩濃度で溶出させた１００ｎｇ／ｍｌのヘパリンの抗Ｘａ因子および抗ＩＩａ因子活性である。ＰＩＭ  ＵＦＨは、ブタ腸管粘膜組織由来の非分画のヘパリン（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｔｉｓｓｕｅ）である。ｂ、ｄ．ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーによって精製したヘパリンの投与量依存活性である。中空正方形、非分画のＰＩＭ；中実正方形、ＰＩＭに保持された分画；中空三角形、保持されなかったエノキサプリン；中実三角形、エノキサパリンからの保持された分画。データは、３回の個別の実験の平均値を示す。
【００２８】
図４は、ＧＳＴ−ＦＧＦ７カラム（中実正方形）または抗トロンビンカラム（中実三角形）から溶出させた０．９Ｍ  ＮａＣｌの６０００Ｄａヘパリン（シグマ）分画の、ＦＧＦ７による抗凝血活性の中和を示すグラフである。ａ．０．３、１、３、１０、３０μｇ／ｍｌのＦＧＦ７を使用して０．９Ｍ溶出液の抗Ｘａ因子活性を中和した。ｂ．０．３、１、３、１０、３０μｇ／ｍｌのＦＧＦ７を使用して抗ＩＩａ因子活性を中和した。活性は、抗トロンビンおよびＦＧＦ７が存在するが、どのような量のヘパリンも存在しない場合のＸａ因子活性またはＩＩａ因子活性から、ＦＧＦ７を加えない場合の残留活性を減算した値のパーセンテージとして表した。ＧＳＴ−ＦＧＦ７は、ＦＧＦ７と同じ中和効果を有する。データは、少なくとも３回の個別の実験の平均を表す。
【００２９】
図５は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ７の組換え体の単独収量、ならびにｐＥＴ−３ＣおよびｐＧＥＸ−２Ｔ系でそれぞれ発現させたＧＳＴ−ＦＧＦ１およびＧＳＴ−ＦＧＦ７の組換え体の収量を示すグラフである。ｐＥＴ−３Ｃ内で発現させる場合は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ７をヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ｐＧＥＸ−２Ｔ内で発現させる場合は、ＧＳＴ融合タンパク質をＧＳＨ−セファロースまたはヘパリン−セファロースのどちらかによって精製した。データは、３回の複製の平均を表す。
【００３０】
図６は、組換えＧＳＴ−ＦＧＦ７の収量に対する塩化マグネシウムの影響を示すグラフである。ＦＧＦ７−ｐＧＥＸ−２Ｔ構築体を宿すＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの長時間培養中に、様々な濃度のＭｇＣｌ２を培地に加え、１ｍＭのＩＰＴＧで３時間、ＧＳＴ−ＦＧＦ７の生成を誘導させ、次いで細菌を集菌して記載のようにＧＳＴ−ＦＧＦ７を精製した。データは、３回の複製の平均を表す。
【００３１】
図７は、組換えＧＳＴ−ＦＧＦ７の収量に対する、様々な金属の２価陽イオンの塩の影響を示すグラフである。ＦＧＦ７−ｐＧＥＸ−２Ｔ構築体を宿すＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの長時間培養中に、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＺｎＣｌ２またはＣｕＣｌ２を培地に加え、１ｍＭのＩＰＴＧで３時間、ＧＳＴ−ＦＧＦ７の生成を誘導させ、次いで細菌を集菌して記載のようにＧＳＴ−ＦＧＦ７を精製した。データは、代表的な１回の実験から得たものである。
【００３２】
図８は、細菌中の組換えＦＧＦの収量に対する、菌株およびＭｇＣｌ２の影響を示す表である。通常培地での培養から同手順で回収した精製ＧＳＴ−ＦＧＦ９の収量は、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ菌株の両方で、１．０のＯＤ６００１リットルあたり１．５〜２．０ｍｇであった。１０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた結果、低かったＧＳＴ−ＦＧＦ９の収量が少し増加した。このことは、亢進は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ９に比べてＦＧＦ７で特異的であることを示唆する。ＭｇＣｌ２を補充することによる収量の増加は菌株に特異的であり、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳでのみ明白であった。
【００３３】
図９は、様々なＦＧＦ７アフィニティーで精製したヘパリン分画の抗Ｘａ因子活性の比較を示すグラフである。Ｘａ因子活性の１００％は、ヘパリンの非存在下での活性である。グラフ１、６、１１、１６：本文中に記載のゲル濾過によって分離した粗８重合体、１０重合体、１２重合体、１４重合体；グラフ２、７、１２、１７：０〜０．１４Ｍ  ＮａＣｌでイオン交換カラムに保持されなかった、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーで精製した８重合体、１０重合体、１２重合体、１４重合体調製物の分画；グラフ３、８、１３、１８：０．１４〜０．３Ｍ  ＮａＣｌで結合および溶出される、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーで精製した８重合体、１０重合体、１２重合体、１４重合体調製物の分画；グラフ４、９、１４、１９：０．３〜０．６Ｍ  ＮａＣｌで結合および溶出される、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーで精製した８重合体、１０重合体、１２重合体、１４重合体調製物の分画；グラフ５、１０、１５、２０：０．６〜１．０Ｍ  ＮａＣｌで結合および溶出される、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーで精製した８重合体、１０重合体、１２重合体、１４重合体調製物の分画；グラフ２１：合成ＡＴ  ＩＩＩ五糖；グラフ２２：ＡＴ  ＩＩＩカラムに保持されなかった１０重合体；グラフ２３：ＡＴ  ＩＩＩに結合した１０重合体；グラフ２４：ＡＴ  ＩＩＩに結合した１４重合体；グラフ２５：ＡＴ  ＩＩＩに結合した１４重合体（グラフ２２〜２５は、Ｌｉｎｈａｒｄｔ研究室から戴いた）；グラフ２６：粗ブタ腸管粘膜（ＰＩＭ）ヘパリン；グラフ２７：０．６から１．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出される、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーで精製したＰＩＭヘパリン分画；グラフ２８：０．６から１．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出される、ＡＴ  ＩＩＩアフィニティーで精製したＰＩＭヘパリン分画；グラフ２９：粗エノキサパリン；グラフ３０：０．６〜１．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出される、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーで精製したエノキサパリン；グラフ３１：粗６０００Ｄａ  シグマヘパリン；グラフ３２：０．６〜１．０Ｍ  ＮａＣｌで、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーで精製した６０００Ｄａ  シグマヘパリン分画である。エノキサパリンは、低分子量ヘパリン調製物の、臨床に応用される商業的なプロトタイプである。
【００３４】
（例示的実施形態の説明）
用語「発現」とは、遺伝子を転写して対応するｍＲＮＡを生成し、このｍＲＮＡを翻訳して対応する遺伝子産物、たとえばペプチド、ポリペプチド、タンパク質を生成することをいう。
【００３５】
用語「核酸」とは、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ分子をコードする他のＤＮＡ、および、発現の調節に関与するコード配列のフランキング領域をいう。
【００３６】
用語「組換え核酸構築体」または「組換え核酸ベクター」とは、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製配列、ファージ、直鎖または環状の１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列など、あらゆるソース由来のあらゆる作用物質であって、ゲノムの組込または自己複製ができ、１つまたは複数のＤＮＡ配列が機能的にかつ作動可能に結合されているＤＮＡ分子を含む作用物質をいう。このような組換え核酸構築体またはベクターは、ＤＮＡ配列が機能的なｍＲＮＡに転写され、そして翻訳され発現されるように、選択した遺伝子産物の５’制御配列またはプロモーター領域とＤＮＡ配列を、細胞に導入することができる。
【００３７】
用語「プロモーター」または「プロモーター領域」とは、通常はコード配列の上流（５’）で検出されるＤＮＡ配列であって、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または正しい位置で転写が開始されるために必要な他の因子を提供することによって、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生成を調節し、それによりコード配列の発現を調節する、ＤＮＡ配列をいう。本明細書によれば、プロモーターまたはプロモーター領域は、様々な制御配列との結合、ランダムまたは制御された突然変異誘発、およびエンハンサー配列の付加または複製によって誘導される、様々なプロモーターを含む。本明細書中で開示するプロモーター配列および生物学上機能的なその等価物は、適切な組換えベクターの一部として宿主に導入されたときに、その制御下でコード配列の転写を促進させる任を負い、それは、ｍＲＮＡを生成するその能力によって証明される。
【００３８】
「制御配列」とは、選択された遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列の上流（５’）、内部、および／または下流（３’）に位置するヌクレオチド配列をいう。そのＤＮＡ配列の転写および発現は、制御配列ならびに細胞のタンパク質合成機構によって制御される。
【００３９】
「形質転換」とは、１つまたは複数のレシピエント宿主にＤＮＡを導入することをいう。
【００４０】
「宿主」または「複数の宿主」とは、異種ＤＮＡを発現するのに使用される原核細胞または真核細胞をいう。適切な宿主の例には、昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞など細菌細胞を含む、真核細胞が含まれる。特に適した細胞には、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＤＨ５α菌株が含まれる。
【００４１】
「相同性」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置的な同一性をパーセントで表した、それぞれ核酸またはアミノ酸配列の間の類似性レベルのことをいい、すなわち配列の類似性または同一性である（Ｒｅｅｃｋ他、１９８７）。相同性とはまた、様々な核酸またはタンパク質の間の類似の機能特性のこともいう。
【００４２】
本明細書中では、ヘパリンに関する方法および装置は、ヘパラン硫酸にも関する。
【００４３】
本発明は、ＦＧＦ７またはＧＳＴ−ＦＧＦ７タンパク質をコードするＤＮＡセグメントに関する。一実施形態では、本発明は、ＦＧＦ７様の生成物をコードする、配列番号１または配列番号３を保有するクローン、ならびにこれらクローンの組換え体および突然変異体などのＤＮＡセグメントに関する。また、本発明は、上記ＤＮＡセグメントのどれかとハイブリッド形成させることによって検出することができる、関連するＤＮＡセグメントに関する。関連するセグメントはＦＧＦ７様タンパク質またはその一部をコードする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）。
【００４４】
本発明の一実施形態によれば、本発明のＤＮＡセグメントは適切な宿主細胞内で発現されることができ、したがってＦＧＦ７またはＦＧＦ７様タンパク質が生成される。本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントの有意な鎖の転写の結果として生成されるｍＲＮＡに関する。
【００４５】
本発明の別の態様は、本発明のベクターおよびＤＮＡを含む、組換えＤＮＡ分子に関する。これらの組換え分子は、ＦＧＦ７ｃＤＮＡと以下のベクターＤＮＡのいずれかを含む分子によって例示される。すなわち、バクテリオファージλクローニングベクター（典型的には、λｐＣＥＶ９）、ＤＮＡシーケンシングプラスミドベクター（たとえば、ｐＵＣ変異体）、細菌遺伝子発現ベクター（たとえば、ｐＫＫ２３３−２）、または哺乳動物遺伝子発現ベクター（ｐＭＴ２やｐＦａｓｔＢａｃなど）。このような組換え分子の構築は当業者には良く知られており、これらの構築を実現するのに必要な技法は、本明細書中に参照として組み込む、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓに出ている。
【００４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のＤＮＡを用いて形質転換した細胞、好ましくは細菌細胞を含む。さらに、本発明は、本発明のＤＮＡで形質転換した、昆虫細胞、酵母細胞を真核細胞、ならびに大腸菌や枯草菌細胞などの細菌細胞を含む。本発明の別の実施形態によれば、形質転換用のＤＮＡは前記細胞内で発現させることができ、それにより、このＤＮＡによってコードされるＦＧＦ７またはＦＧＦ７様タンパク質の、細胞内の量が増加する。
【００４７】
本発明の一実施形態によれば、新規のＦＧＦ７またはＦＧＦ７様タンパク質は、本発明の「改変していない」ＤＮＡおよびｍＲＮＡのタンパク質産物、あるいは改変したまたは遺伝子操作したタンパク質産物となる。ＤＮＡ配列を操作して突然変異させた結果、改変したＦＧＦ７またはＦＧＦ７様タンパク質は、対応する自然に存在する「野生型」タンパク質と、アミノ酸配列が１箇所または複数箇所異なる。本発明の一実施形態によれば、改変したＦＧＦ７またはＦＧＦ７様タンパク質は、ＦＧＦ７およびＦＧＦペプチドファミリーの少なくとも１つの他のメンバーのアミノ酸配列セグメント、またはＦＧＦ７および少なくとも１つの他の異種性タンパク質のアミノ酸配列セグメントを含む、「キメラ」分子を含む（Ｌｕｏ他、１９９８）。
【００４８】
同様に、改変したＦＧＦ７またはＦＧＦ７様タンパク質は、ＦＧＦ７またはＦＧＦファミリーの相同ペプチドのアミノ酸配列セグメント、およびそのＦＧＦファミリーの少なくとも１つの他のメンバーのアミノ酸配列セグメント、あるいは、ＦＧＦ７またはＦＧＦファミリーの相同ペプチドのアミノ酸配列セグメント、および少なくとも１つの他の異種性タンパク質のアミノ配列酸セグメントを含む、「キメラ」分子を含む。
【００４９】
ＦＧＦ７の構造をＦＧＦ１およびＦＧＦ２の構造と比較することにより、３つのＦＧＦポリペプチドに共通して高度に保存されているＣα主鎖、および一次受容体結合ドメインを形成する表面疎水性部分が明らかになる。その一方で、陽性の表面電荷密度の減少および多分散により、ＦＧＦ７の相同性ヘパリン結合ドメインが特徴付けられた。単純なヘパリン六糖（６重合体）は、ＦＧＦ１およびＦＧＦと共結晶し、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２をプロテアーゼから保護したが、ＦＧＦ７では同じ特性を示さなかった。ＦＧＦ１およびＦＧＦ２とは対照的に、ヘパリン６重合体、１０重合体、１４重合体および粗ヘパリンとＦＧＦ７の相互作用は、それらの抗Ｘａ因子のアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性に比例していた。
【００５０】
したがって、本発明の一態様は、線維芽細胞成長因子を、その特異的結合ドメインに適したオリゴ糖と結合させることによって、プロテアーゼによる分解から保護する方法である。一実施形態によれば、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で線維芽細胞成長因子はプロテアーゼから保護されている。
【００５１】
固定化ＦＧＦ７とのアフィニティーによって濃縮したヘパリンは、抗トロンビンアフィニティーマトリックス上で精製したヘパリンと同様の抗Ｘａ因子活性を示した。意外なことに、ＦＧＦ１アフィニティーマトリックスにより、低い抗Ｘａ因子活性を有する粗ヘパリン分画が濃縮された。これらの結果は、ＦＧＦ類と特異的ヘパラン硫酸モチーフとの相互作用における差異の、構造の根拠を提供する。またこれらは、変性していない配列の部位特異的突然変異の誘発、および構造関連の他の改変のために特異的な残基をターゲットにするのに必要である、有用な構造上の情報も提供する。
【００５２】
したがって、本発明の一態様は、シグナル伝達ドメインが改変されたＦＧＦタンパク質である。本発明の一実施形態は、「シグナル非活性」にさせたＦＧＦ７タンパク質である。本明細書中では、「シグナル非活性」とは、タンパク質はその特異的シグナル生成の細胞性受容体に結合しても結合しなくてもよいが、どちらにせよ、タンパク質はその受容体を活性化させて、改変していないまたは改変した「シグナル活性」のタンパク質によって引き出すことができるはずの、生物学的応答を引き出すことができないことを意味する。
【００５３】
用語「融合タンパク質」とは、２個以上の個別のタンパク質のコード配列が、これらの配列のそれぞれの翻訳領域が改変されないように、また１種のタンパク質の生成をもたらす１つの翻訳領域を作成するように、結合されたタンパク質をいう。融合タンパク質は、対象の配列のＮ末端またはＣ末端に付加することができる。その例には、ニッケルカラムに可逆的に結合するポリヒスチジンテール；固定化基質に結合するアルカリホスファターゼ酵素；固定化抗体に結合する免疫グロブリンのＣループ、または基質であるグルタチオンに結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ酵素などの結合性ペプチドと、当該タンパク質との融合が含まれる。本発明による融合タンパク質の一例は、Ｌｕｏ他（１９９８）に記載のＧＳＴ−ＦＧＦ７融合タンパク質である。本発明による融合タンパク質は、親ＦＧＦのヘパリン結合特性を保持していることが好ましい。一実施形態によれば、融合タンパク質はＦＧＦをシグナル非活性にさせる。
【００５４】
一実施形態によれば、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、その転写を開始させるプロモーター領域を５’末端に、またその転写を適切に終止させ、ｍＲＮＡにポリアデニル化テールを付加し、そのｍＲＮＡを転写機構に移動するターミネーター領域を３’末端に有するベクター内に含まれている。
【００５５】
本発明の一実施形態は、ＦＧＦ７またはＦＧＦ７様タンパク質をコードする組換えＤＮＡベクターを用いて細菌を形質転換し、塩の存在下、細菌内でベクターを発現させることによって、ＦＧＦ７およびＦＧＦ７様ｃＤＮＡを発現させる方法である。一実施形態によれば、前記塩は約５〜約１５０ｍＭ、より好ましくは約１０〜約１００ｍＭの濃度のＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２である。一実施形態によれば、発現されるタンパク質は配列番号４である。一実施形態によれば、細菌はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳである。
【００５６】
本発明は、抗凝血活性および抗トロンビン活性を向上させたヘパリンであって、低い抗凝血活性または抗血栓活性を有する粗製の材料に由来する過度の副作用が軽減されていない、または軽減されたヘパリンの精製に関する。本明細書中では、抗凝血性ヘパリンおよび抗凝血性ヘパラン硫酸とは、血液の凝固を軽減させる、あるいは他の任意の抗凝血特性または抗血栓特性を示す、ヘパリンまたはヘパラン硫酸をいう。本発明はまた、抗凝血活性を欠く、非変性ヘパリンを同時に単離することにも関する。
【００５７】
本発明の一実施形態は、アフィニティーマトリックスを凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸を含む混合物と接触させることによって、抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸をアフィニティーマトリックスに結合させ、結合していない材料を結合した材料から分離することによって、抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸を単離する方法である。本発明では、結合とは、吸着、ファンデルワールス相互作用、共有的および非共有的結合、物理吸着、化学吸着、特異的吸着を含むが、それだけには限らない、あらゆる誘引性の相互作用をいう。
【００５８】
一実施形態によれば、アフィニティーマトリックスは線維芽細胞成長因子を含む。好ましくは、線維芽細胞成長因子は、抗凝血性でないヘパリンまたは抗凝血性でないヘパラン硫酸により優先的に、抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性ヘパラン硫酸と結合する。一実施形態によれば、線維芽細胞成長因子はＦＧＦ７またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＦＧＦ７（ＧＳＴ−ＦＧＦ７）融合タンパク質である。
【００５９】
一実施形態によれば、線維芽細胞成長因子は支持体に固定化される。適切な支持体の一例は、架橋結合したアガロースである。他の例には、デキストラン、アガロースおよびポリアクリルアミドベースのソフトゲル、シリカベースのゲル、ならびにポリスチレンジビニルベンゼン、エチレングリコール、メタクリル酸ポリマーなど剛体物質上のポリマーベースのゲルが含まれる。
【００６０】
線維芽細胞成長因子は、共有結合的にまたは非共有結合的に支持体に固定化させることができる。一実施形態によれば、ＮＨＳ活性化させ架橋結合させたアガロースに、共有結合的に固定化させた線維芽細胞成長因子である。本発明の一態様は、固定化していない線維芽細胞成長因子によって提示されるヘパリン結合特異性を、線維芽細胞成長因子が保持するように、支持体に固定化させた線維芽細胞成長因子である。本明細書中では、ヘパリン結合特異性とは、抗凝血性ヘパリンが抗凝血性でないヘパリンより優先的に結合することをいう。
【００６１】
混合物をアフィニティーマトリックスに適用した後は、結合していない材料を結合した材料から、たとえば、適切な溶媒で溶出することによって分離することができる。一実施形態によれば、結合していない材料を、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２からなる群から選択される塩の水溶液を用いて溶出する。一実施形態によれば、結合していない材料は、塩濃度が約０．０１Ｍ〜０．４Ｍである水溶液を用いて溶出される。
【００６２】
一実施形態によれば、この方法は抗凝血性ヘパリンを回収するステップをさらに含む。抗凝血性ヘパリンは、適切な溶媒を用いて溶出することによって脱着することができる。他の方法には、マトリックスの温度を変え、抗凝血性ヘパリンを変性または置き換えることが含まれるが、それだけには限らない。適切な溶媒の一例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、または塩化マグネシウムからなる群から選択される塩の水溶液である。一般的に、吸着した材料を溶出するには、吸着していない材料の溶出に使用する濃度に比べて、より高い濃度の塩溶液が使用される。一実施形態によれば、約０．４５Ｍ〜１．０Ｍを有する水溶液を用いて溶出することによる抗凝血性ヘパリンである。
【００６３】
本発明による方法は、自然発生のヘパリンおよび合成ヘパリンの両方に適用できる。この方法は、ブタまたはウシ粘膜、ウシ肺組織、ウシ腸管組織を含む任意のソース由来の粗ヘパリンなどの混合物からの、抗凝血性ヘパリンの単離に使用することができる。この方法は、様々な化学的および酵素的処理によって精製した粗ヘパリンの混合物からの、抗凝血性ヘパリンの単離に使用することもできる。さらに、本発明の方法は、合成オリゴ糖の混合物由来の抗凝血性でない活性分画から抗凝血活性分画を抽出することに有用であり、他の方法ではきちんと分画することができない。
【００６４】
本発明の方法の特に有用な態様は、抗凝血性ヘパリンを非変性の抗凝血性でないヘパリンから分画することである。したがって、抗凝血性ヘパリン分画を、抗凝血性でない類似体に付随する副作用によって妨げられない抗凝血剤として使用するために、単離することができる。同様に、抗凝血性でない分画を、抗凝血性である副作用からの妨害なしに、抗凝血性でない用途に使用することができる。このことにより、個別のヘパリン出発物質バッチを必要とし、貴重な抗凝血性分画を破壊する、ヘパリンの抗凝血活性を抑制または排除するための化学的改変の必要性がなくなる。純粋で有効な抗凝血性ヘパリン、および最初の改変していない抗凝血性でないヘパリンを、ヘパリンまたは関連する材料の１つのバッチから単一処理で同時に単離することは、より簡単でより効率の良い、費用効率がより高い方法である。ヘパリン材料は、粗製の未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、ヘパリンオリゴマー、ヘパラン硫酸および他のタイプのグリカンを含む天然の模擬ヘパリン、または合成した模擬体とすることができる。
【００６５】
本発明の方法はまた、エノキサパリン（Ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）、イノヘップ（Ｉｎｎｏｈｅｐ）、ロジパリン（Ｌｏｇｉｐａｒｉｎ）、フラキシパリン（Ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ）、サンドパリン（Ｓａｎｄｏｐａｒｉｎ）、フラグミン（Ｆｒａｇｍｉｎ）、低分子量ヘパリンなど抗凝血性薬剤から、抗凝血性の部分を単離するのに有用である。
【００６６】
本発明のさらなる態様は、上に記載の実施形態のうちいずれかに従って支持体に固定化させた線維芽細胞成長因子を含む、抗凝血性ヘパリンまたはヘパラン硫酸の単離用のアフィニティーマトリックスである。本発明のさらなる態様は、さらに、本明細書中に記載したアフィニティーマトリックスを含む分離装置である。分離装置は当分野でよく知られており、クロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー紙、ビーズ、磁気ビーズ、ディップスティック、膜およびフィルターを含むが、それだけには限らない。本発明のさらなる態様は、上に記載の実施形態のいずれかに従ってアフィニティーマトリックスを作成する方法である。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体を線維芽細胞成長因子と接触させることを含む、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体によって触媒される抗凝血作用を中和する方法である。本発明の一実施形態によれば、線維芽細胞成長因子は抗凝血性でないヘパリンに比べて優先的に抗凝血性ヘパリンと結合する。一実施形態によれば、抗凝血作用は動物内で起こる。一実施形態によれば、有効な量の線維芽細胞成長因子をその動物に与えることによって、抗凝血作用が中和される。あるいは、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体を含む血液を動物から灌流し、線維芽細胞成長因子と接触させ、動物に戻すことができる。本実施形態によれば動物はヒトである。
【００６８】
本発明の一実施形態によれば、線維芽細胞成長因子はシグナル非活性である。前記線維芽細胞成長因子を別のアミノ酸配列と融合し、シグナル非活性にさせることができる。一例は、ＧＳＴ−ＦＧＦ７融合タンパク質である。あるいは、アミノ酸配列のシグナル部分を変化させることによって、線維芽細胞成長因子をシグナル非活性にさせることができる。
【００６９】
代替実施形態によれば、アフィニティーマトリックスは、抗凝血性でないヘパリンまたはヘパラン硫酸と選択的に結合する線維芽細胞成長因子を含む。この実施形態によれば、この方法は、マトリックスを抗凝血性でないヘパリンまたはヘパラン硫酸を含む混合物と接触させることによって、抗凝血性でないヘパリンまたはヘパラン硫酸をマトリックスに吸着させるステップと、吸着していない材料をマトリックスから分離するステップと、吸着した抗凝血性でないヘパリンまたはヘパラン硫酸をマトリックスから回収するステップとを含む。
【００７０】
本発明のさらなる態様は、抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性でないヘパリンを、上に記載したようにシグナル非活性にした線維芽細胞成長因子と接触させることを含む、抗凝血性ヘパリンまたは抗凝血性でないヘパリンのどちらかによって引き起こされた病態を軽減する方法である。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、線維芽細胞成長因子を含む、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体によって触媒された抗凝血作用を中和するのに有用な組成物である。より具体的には、線維芽細胞成長因子を含む、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体によって触媒された抗凝血作用を中和するのに有用な組成物であり、線維芽細胞成長因子はシグナル非活性である。シグナル非活性のＦＧＦ７は、ＦＧＦＲ膜貫通型チロシンキナーゼの外部ドメインとの結合で生物学的に活性のあるＦＧＦＲシグナル伝達複合体を形成しないので、それを投与しても、細胞の増殖の障害や活性化ＦＧＦ７によって誘発される分化は引き起こされない。さらに、活性または非活性のＦＧＦ７のいずれも、内皮細胞に作用したり、正常状態では血液中を循環したりしない。したがって、ＦＧＦ７の投与は、血管系または血液系の恒常性を妨害しない。ＦＧＦ７アフィニティーで精製した抗凝血性ヘパリンあるいは誘導体または模擬体を患者に投与した後、過剰の抗凝血活性を中和するのに必要なＦＧＦ７またはその変異体の量は、最初に適用した抗凝血剤の量に応じて容易に決定することができる。ＦＧＦ７アフィニティーによって精製した純粋で有効な抗凝血性ヘパリンの使用、および続いて起こる自己中和は、２重の利点となるであろう。
【００７２】
好ましい実施形態は、線維芽細胞成長因子がＧＳＴ−ＦＧＦ７である実施形態である。線維芽細胞成長因子を含み、さらに製薬的に許容される担体または希釈剤を含む、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体によって触媒される抗凝血作用を中和するのに有用な組成物もまた、視野に入れている。加えて、本発明は、線維芽細胞成長因子を含み、１つまたは複数の賦形剤またはアジュバントをさらに含む、ヘパリン、模擬ヘパリン、またはヘパリン誘導体によって触媒される抗凝血作用を中和するのに有用な組成物を含む。代替実施形態によれば、このＦＧＦ７は活性である。
【００７３】
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために組み込む。下記の実施例で開示する技法は、本発明の実施において十分に機能するような、本発明者によって発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成するとみなすことができることを、当業者は理解されよう。しかし、本発明の開示を考慮して、開示した特定の実施形態に多くの変更を加えても、それでも本発明の精神および範囲を逸脱することなしに同様のまたは類似の結果を得ることができることを、当業者は理解されよう。
【００７４】
実施例１
キメラＦＧＦ７／１およびＦＧＦ７の発現、精製および結晶化。組換えＦＧＦ７／１（ラットＦＧＦ７／ヒトＦＧＦ１、変異ＦＧＦ７ｍｌ）およびラットＦＧＦ７を細菌内で発現および精製する方法が記載されている（Ｌｕｏ他、１９９８）。セレノ−メチオニル（Ｓｅ−Ｍｅｔ）ＦＧＦ７／１キメラをメチオニン栄養要求株の大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）内で発現させた（Ｈｏｏｋ他、１９７６）。
【００７５】
精製したＳｅ−ＭｅｔＦＧＦ７／１キメラを１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、セントリコン１０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０）（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を使用して、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＤＴＴおよび０．２ｍＭのＥＤＴＡに移した。タンパク質溶液および保存液（１．７５Ｍのリン酸ナトリウム／リン酸カリウム、ｐＨ７．０、２０ｍＭのＤＴＴ）を同体積含むシッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐ）で、２０℃の蒸気拡散法によって結晶を成長させた。生じた結晶は、凍結させたとき六方晶空間群Ｐ６４２２に属し、単位胞がａ＝８９．８Å、ｃ＝６５．６Åであった。非対称単位中に１分子存在し、溶媒含有率は５７％である。
【００７６】
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）中１０ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ７によるシッティングドロップ蒸気拡散法を使用して、室温でＦＧＦ７の２種類の異なる結晶形が得られた。１８．５％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのクエン酸塩（ｐＨ４．７）を含む保存液で単斜晶を成長させた。これらは、凍結させたとき空間群Ｐ２１に属し、ａ＝６１．１Å、ｂ＝３５．５Å、ｃ＝１１５．３Å、β＝１０１．０°であり、非対称単位中に４分子含まれ、約４０％の溶媒を含んでいた。２．５６Ｍのリン酸ナトリウム／リン酸カリウム（ｐＨ５．０）、０．１Ｍクエン酸ナトリウムを含む保存液で正方晶結晶を成長させた。これらは、凍結させたとき空間群１４１２２に属し、ａ＝１６９．１Å、ｂ＝６２．６Åであり、非対称単位中に２分子含まれ、約６７％の溶媒を含んでいた。第１の条件下で、Ｓｅ−Ｍｅｔ  ＦＧＦ７の正方晶結晶も成長させた。単斜晶は成長中に崩壊する傾向があり、２〜３週間以内で分析に使用した。両方のＦＧＦ７結晶形の、回折する結晶を成長させるには、シーディングが必要不可欠であった。リガク（Ｒｉｇａｋｕ）ＲＵ２００回転陽極Ｘ線発生装置から発生させた通常の単色ＣｕＫα放射を使用すると、単斜晶形は４．５Å、正方晶形は３．８Åで回折した。
【００７７】
データ収集、構造決定および精製。ＣＨＥＳＳのＡＤＳＣ量子−４ＣＣＤ検出器、およびＳＳＲＬのＭＡＲイメージプレートを用いてデータを収集した。Ｓｅ−Ｍｅｔ  ＦＧＦ７／１キメラの結晶はＣＨＥＳＳのＦ−２ビームラインで２．３Åで回折した。逆ビームモードを使用してＳｅ吸収エッジ付近の３つの波長で、多波長異常分散（Ｍｕｌｔｉ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ、ＭＡＤ）データセットを収集した。Ｓｅ−Ｍｅｔ  ＦＧＦ７の正方晶は、ＣＨＥＳＳのＦ−２ビームラインで弱くでしか回折せず、ＭＡＲ位相調節の試みは断念した。非変性のＦＧＦ７結晶はＣＨＥＳＳのＦ−１ビームラインで３．１Åで回折した。その後、正方晶ＦＧＦ７調製物のデータを収集した。単斜晶ＦＧＦ７は、ＳＳＲＬのビームライン７−２で３．３Åで回折し、ネイティブデータセットも収集した。すべてのデータはＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ、１９９７）を使用して処理した。
【００７８】
ＦＧＦ７／１キメラのＭＡＤデータは、波長の１つ（λ３）を「ネイティブ」すなわち基準波長として扱い、他の波長を「誘導」波長として扱い、ベイズアプローチ（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用することによって同期させた。３つの波長を、単一の同形および異常分散寄与値に換算した（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ、１９９７）。ＳＯＬＶＥプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｌｖｅ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／参照）を使用して、自動的に、積分した測定強度を構造因子の換算し、基準波長に関する局所測定を行い、重原子について解き（ｓｏｌｖｅ）、重原子の位相を精緻化した。ＳＯＬＶＥによって生成された位相を用いて、ＣＣＰ４パッケージを使用して電子密度マップを計算し、溶媒含有率を５７％として、プログラムＤＭを使用して溶媒効果を消した（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）。溶媒効果を消した最終的なマップは高品質であった。ＦＧＦ７／１の１４０個のタンパク質残基のうち１３１個の初期モデルを、プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ他、１９９１）を使用して溶媒効果を消したマップに組み込むことができる。このアミノ酸配列セグメントの同定および当てはめは、セレノメチオニンの位置によって容易になった。タンパク質の精製には、リモート波長の２．３Åデータを使用した。このモデルを、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、１９９２）を用いて分子動力学および制限して精製し、手動で再構築するサイクルに数回かけた。Ｎ末端の最初の８残基およびＣ末端残基が無秩序（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）されていた。この座標を、ＲＣＳＢタンパク質データバンクに登録した（ＲＳＣＢ００９１５１）。
【００７９】
正方結晶形の前記ＦＧＦ７は、ＡｍｏＲｅ（Ｎａｖａｚａ、１９９４）を使用した分子置換法によって定量した。７２％一致したＦＧＦ７／１の構造を使用し、アラニンで切断された保存されていない側鎖をサーチモデルとして用いた、交差回転（ｃｒｏｓｓ−ｒｏｔａｔｉｏｎ）機能のソリューション（２０．０〜４．０Å）は、最初、明白なピークはなく、ノイズが多かった。しかし、変形（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）機能により、交差回転機能の第２のピークから、第１の分子のソリューション（相関係数、３３．５％、Ｒ因子４８．３％）が与えられた。第２の分子は、第１の分子を固定化（相関係数：４５．０％；Ｒ因子４４．５％）した交差回転機能の第６のピークから、部分変形機能で見つかった。さらなる精製を行い、Ｘ−ＰＬＯＲを使用してマップを計算した（Ｂｒｕｎｇｅｒ他、１９９２）。マップは、プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ他、１９９１）を使用して見た。側鎖密度が乏しいことが原因で、分子ＡのＡｓｐ−９、Ｌｙｓ−３２、Ｇｌｕ−６０および分子ＢのＬｙｓ−３２、Ｇｌｎ−３６、Ｇｌｕ−３６、Ｇｌｕ−６２、Ｌｙｓ−７７、Ｇｌｕ−７８、Ｌｅｕ−８８、Ｌｙｓ−１１６、Ａｒｇ−１２１、Ｌｙｓ−１２６はアラニンとしてモデル化された。２つの分子のＮ末端の最初の８残基、分子Ａの残基１０３〜１０５、分子Ｂの残基７９〜８１、残基１０６〜１０８、Ｃ末端残基はすべてタンパク質表面のループ内に位置しており、確かな密度を有しておらず、構造から喪失している。
【００８０】
ＦＧＦ７の最初の完全なＸ線データセットは、ＳＳＲＬで３．３Åの解像度で収集した。ＦＧＦ１およびＦＧＦ２をサーチモデルとしてＦＧＦ７の構造を決定する試みは失敗した。ＦＧＦ７は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２の両方と、３０％の配列一致を示す。失敗の理由は明確ではないが、不十分な解像度、不十分な相同性、および予測されている非対称単位中の４個の分子の組合せによる複雑さが原因と考えられる。最初、２．８Åの解像度のネイティブデータセットが、ＦＧＦ１と６０％の配列一致を共有するＦＧＦ７／１キメラのＰ６４２２結晶形から、通常の検出装置を用いて局所的に得られた。ＦＧＦ１モデルを用いた分子置換法による構造のソリューションは、非対称単位中に１分子含む、異なる空間群、より高い解像度、およびより高い配列相同性にもかかわらず、失敗した。ポリペプチドのＧＦファミリーの構造の高度な内部対称性もまた、分子置換法における困難の根源となる。ＦＧＦ７と７２％の配列一致を共有するＦＧＦ７／１キメラの構造は、分子置換法によってＦＧＦ７の構造を解く仲介を提供した。
【００８１】
ヘパリンおよびオリゴ糖とＦＧＦの相互作用。抗トロンビン結合十糖（１０重合体）を調製し、一様になるまで精製し（２８）、これはΔＵＡｐ２Ｓ（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＳ６Ｓ（１→４）−α−Ｌ−ＩｄｏＡｐ（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＡｃ６Ｓ（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡｐ（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＳ３Ｓ６Ｓ（１→４）−α−Ｌ−ＩｄｏＡｐ２Ｓ（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＳ６Ｓ（１→４）−α−Ｌ−ＩｄｏＡｐ２Ｓ（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＳ６Ｓの構造を有する。十四糖（１４重合体）は、＞９０％の純度で調製し、多次元ＮＭＲスペクトルによって特徴付けた（Ｔｏｉｄａ他、１９９６）。糖の組成および抗トロンビン結合部位の五糖配列の存在を確認することができたが、この十四糖内でのこの配列の正確な位置は解明できなかった。この配列は、ΔＵＡｐ２Ｓ（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＳ６Ｓ（１→４）−α−Ｌ−ＩｄｏＡｐ２Ｓ（１→］ｎ４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐｓ６Ｓ（１→４）−α−ＬＩｄｏＡｐ（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＡｃ６Ｓ（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡｐ（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＳ３Ｓ６Ｓ（１→４）−α−Ｌ−ＩｄｏＡｐ２Ｓ（１→［４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮｐＳ６Ｓ（１→４）−α−Ｌ−ＩｄｏＡｐ２Ｓ（ｌ→］ｍ４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮＳ６Ｓであり、ｎ＋ｍ＝３である。六糖（６重合体）、十糖（１０重合体）、および十四糖（１４重合体）の抗Ｘａ因子アミド分解活性は、低分子量ヘパリンを基準として定量するとそれぞれ０、３２００、および５８００単位／ｍｇであった（Ｔｏｉｄａ他、１９９６）。ヘパリンは、抗トロンビンアフィニティークロマトグラフィーによって分画した（Ｋａｎ他、１９９９）。プロテアーゼ保護検定（Ｌｕｏ他、１９９６）は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２およびＦＧＦ７に、表示（１〜４×１０５ｃｐｍ／ｎｇ）の１２５Ｉ−ＦＧＦを２ｎｇ、ならびにそれぞれ１５ｎｇ、７５ｎｇ、および１５０ｎｇのプロナーゼを用いて行った。検定には、１０ｍＭの塩化マグネシウムおよび１％のトリトンＸ−１００を含む１００μｌのＰＢＳ中、表示した量のヘパリンまたはヘパリンから誘導したオリゴ糖を含んでいた。３７℃、終夜インキュベートした後、残留するＦＧＦを定量するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを使用した。
【００８２】
ＦＧＦ７アフィニティーで精製したヘパリンによる抗Ｘａ活性の阻害。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させたラットＦＧＦ７およびヒトＦＧＦ１（Ｌｕｏ他、１９９８）を、まずヘパリン−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））上で精製した。次いで、これらの因子をＧＳＨセファロース（アマシャムファルマシアバイオテク）上に固定化させ、１Ｍ  ＮａＣｌの溶出緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて洗浄し、粗ヘパリン分画用のアフィニティーマトリックスとして利用した。
【００８３】
ブタ腸管粘膜ヘパリン（１０ｍｇ、１７９ＵＳＰ、シグマ）を２ｍｌのＧＳＴ−ＦＧＦ（２０ｍｇ）／ＧＳＨ−セファロースカラムに載せ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ  ７．４中の０．３、０．６、０．９、および１．３ＭのＮａＣｌで段階的に溶出させ、ＦＰＬＣ（Ｆｌｏｗ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）（アマシャムファルマシアバイオテク）を使用して２２６ｎＭの吸収で検出した。０．３Ｍ  のＮａＣｌ分画は非結合ヘパリンとみなし、完全なアフィニティー分離を保証するために繰り返してさらに２回分離した。ＧＳＴ−ＦＧＦ７からのヘパリンは０．６および０．９Ｍ  ＮａＣｌの結合分画に分離され、ＧＳＴ−ＦＧＦ１からのヘパリンは１．３Ｍ  ＮａＣｌの結合分画に溶出された。各ヘパリン分画は、Ｈ２Ｏに対して透析し、凍結乾燥し、カルバゾール検定によって量を定量した。
【００８４】
抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ）も、ヘパリン−セファロースのアフィニティークロマトグラフィーによって、ヒト血漿（血液センター、ヒューストン）から精製した。不純物は、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびｌｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中の０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４によって脱着させ、同緩衝液中の２．０Ｍ  ＮａＣｌによって溶出させ、血漿１Ｌにつき１５〜２０ｍｇの生成物を得た。精製したＡＴ  ＩＩＩ１０ｍｇを２ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク）に載せ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む上記の緩衝液を用いて平衡にした。次いでこのカラムを、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、その後０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液を用いて洗浄し、ＡＴ  ＩＩＩに結合していないヘパリンまたは結合したヘパリンを分離するのに使用した。０．３Ｍ  ＮａＣｌ分画は結合していない、２．０ｍ溶出分画は結合しているとみなした。量は、カルバゾール検定によって定量した。
【００８５】
Ｘａ因子活性の検定のために、１μｇ／ｍｌのヘパリン分画１０μｌを、ヒト血漿から精製した１．７μＭのＡＴ  ＩＩＩ１０μｌと混合し、３７℃で２分間インキュベートし、その後１０ｎＭのＸａ因子７０μｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を混合物に加えた。３７℃で５分間インキュベートした後、４ｍＭのＣｈｒｏｍｏｚｙｍ  Ｘ（ベーリンガーマンハイム、Ｂｏｅｒｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１０μｌを加えた。３７℃で５分間インキュベートした後、１０μｌの氷酢酸を加えることによって反応を停止させた。残留Ｘａ因子活性を、４０５ｎＭで５秒間、９６ウェルプレートリーダー（モレキュラーデバイス社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）で記録した。
【００８６】
ＦＧＦ７／１キメラおよびＦＧＦ７の構造。ＦＧＦ７／１キメラの結晶構造は、多波長異常分散（ＭＡＤ）によって決定し、２．３Åの解像度で、２３．７％および３２．８％のＲ因子およびＲｆｒｅｅで精緻化した。その後、ＦＧＦ７／１キメラの構造からのモデルを使用して、３．１Åの解像度でそれぞれ２３．３％および３２．４％のＲ因子およびＲｆｒｅｅで精緻化した正方晶結晶形のＦＧＦ７の３次元構造を、分子置換法によって解像するのに使用した。非対称単位中の２個の独立した分子は類似しており、α炭素間の約１．０１Åの二乗平均平方根偏差（ｒｍｓｄ）を用いてオーバーラップさせることができ、それらの電子密度は定義されている。これは、ＦＧＦ１のｒｍｓｄ０．２６〜０．８７Å（ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ他、１９９８、Ｚｈｕ他、１９９１）およびＦＧＦ２のｒｍｓｄ０．５７Å（Ｚｈｕ他、１９９１）を超え、ＦＧＦ７の構造で、より柔軟性があることを示した。非対称単位中に、ＦＧＦ７／１キメラには１個、ＦＧＦ７には２個の分子が存在する。分子Ａの３残基、および分子Ｂの１０残基の側鎖が無秩序化されていたので、ＦＧＦ７のモデリングおよび表面電位計算には分子Ａを選択した。ＦＧＦ７／１キメラおよびＦＧＦ７の両方の、Ｎ末端の最初の８残基は無秩序化されていた。ＦＧＦに特徴的な１２個のβ鎖は、約３回の内部対称を有するパターンで、１０個の定義された、および２個の定義されていない逆平行鎖に配列していた。ＦＧＦ７およびＦＧＦ７／１キメラの最初のβ鎖は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２のβ鎖よりアミノ酸３個分長かった。ＦＧＦ７のβ鎖６および７、ならびにＦＧＦ７／１キメラの最後のβ鎖は３残基しか長さがなく、これは４つの構造のうち一番短かった。Ｃｙｓ−１７は完全に埋まっており、Ｃｙｓ−８３は表面近くであった。これらは両方ともＦＧＦファミリー内に保存されている。むき出しで水分子に結合しているＣｙｓ−８３とＣｙｓ−７９間のＣβ−Ｃβ距離４．６Åは、ジスルフィド結合の形成に十分である。しかし、分子内および分子間のジスルフィド結合は見られなかった。
【００８７】
保存された疎水性部分および相同性ヘパリン結合ドメイン。ＦＧＦ７およびＦＧＦ７／１キメラの構造をＦＧＦ１およびＦＧＦ２の構造と比較することで、極性アミノ酸に隣接する特有の疎水性部分の４つの因子に共通の保存が明らかになった。疎水性部分の溶媒が接近可能な領域は、ＣＣＰ４のＳＵＲＦＡＣＥプログラムおよびプローブ半径１．４Åを用いて計算した。ＦＧＦ７では、Ｐｈｅ−１６、Ｔｙｒ−２２、Ｔｙｒ−９４、Ｌｅｕ−１３５、Ｍｅｔ−１３７、Ｇｌｎ−３５およびＡｓｎ−９２は４５２Åの領域を形成し、そのうち２４１Åは、すべてのＦＧＦ相同体に共通して保存されている５個の疎水性残基によって形成される。ＦＧＦ７／１キメラの比較されうる領域は、それぞれ４４３Åおよび２２２Åであった。疎水部分残基（Ｔｙｒ−２５、Ｐｈｅ−３２、Ｔｙｒ−１０４、Ｌｅｕ−１４１、Ｍｅｔ−１４３）、およびＦＧＦ−２のＡｒｇ−４５およびＡｓｎ−１０２は、突然変異による受容体結合に関係し（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ他、１９９４）、ＦＧＦＲＩおよびＦＧＦ−２のヘパリンに依存しない複合体の結晶構造中の免疫グロブリン（Ｉｇ）モジュールＩＩ間の相互作用を支配する（Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ他、１９９９）。疎水部分の保存は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２およびＦＧＦ７が、ヘパリンとＦＧＦＲＩおよびＦＧＦＲ２のＩｇモジュールＩＩとの複合体と、隣接する構造ドメインなしで相互作用するという知見と一致している（Ｗａｎｇ他、１９９５、Ｗａｎｇ他、１９９９、Ｕｅｍａｔｓｕ他、２０００）。
【００８８】
ヘパリン六糖とＦＧＦ１（ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ他、１９９８）およびＦＧＦ２（Ｆａｈａｍ他、１９９６）との複合体の構造と比べることによって、ＦＧＦ７は、残基Ａｒｇ−１８、Ａｓｎ−９２、Ａｓｎ−１１４、Ｇｌｎ−１１５、Ｖａｌ−１２０、Ｌｙｓ−１２４、Ｇｌｎ−１７９、Ｌｙｓ−１３０およびＴｈｒ−１３１を含む相同性ヘパリン結合ドメインを示す。ＦＧＦ７／１キメラ内の相対残基は、Ａｒｇ−１８、Ａｓｎ−９２、Ｌｙｓ−１１２、Ｌｙｓ−１１３、Ｌｙｓ−１１８、Ａｒｇ−１１９、Ａｒｇ−１２２、Ｇｌｎ−１２７およびＬｙｓ−１２８であった。
【００８９】
ＨＢドメインの独特な表面電荷分布および３−Ｏ硫酸化抗トロンビン結合ヘパリンの必要性。ＦＧＦ７の全体と矛盾することなく、ＦＧＦ７／１キメラおよびＦＧＦ７の相同性ＨＢドメインＣα主鎖は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２に類似していた（ｒｍｓｄ＜１Å）。しかし、ＦＧＦ７の相同性ドメインを囲む側鎖および表面電荷の分布は劇的に異なっていた。ＦＧＦ１、ＦＧＦ２およびＦＧＦ７／１キメラでは正の表面電荷が集中しているのに対し、ＦＧＦ７構造では分散している。ＦＧＦ１およびＦＧＦ２上の正の表面電荷に相同するＦＧＦ７上の領域は、分裂しており、残基Ｖａｌ−１２０、Ｔｈｒ−１２５およびＴｈｒ−１３１によって２つの部分に分かれている。Ｔｈｒ−１２５は、３つのＦＧＦに共通して保存されている。Ｖａｌ−１２０はヘパリンに接触するリシンであり、Ｔｈｒ−１３１はＦＧＦ１およびＦＧＦ２内のアラニンである。ＦＧＦ７のＶａｌ−１２０を置換することによって帯電リシン側鎖を失うと、残基Ｔｈｒ−１２５およびＴｈｒ−１３１がむき出しになり、電荷が集中する２つの領域を分離する空洞が生じる。ヘパリンに接触する残基リシンをバリンと置換すると電荷を失うが、この再構成により、３つの高電荷密度の領域に及ぶヘパリン鎖と空間的な衝突は生じない。負に帯電した、ＦＧＦ７に独特でＨＢドメイン付近にあるＧｌｕ−１２８は、ヘパリンの相互作用に負の大きな影響を与える可能性がある。これらの観察は、ヘパリンに対するＦＧＦ７の静電気的なアフィニティーが、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２に比べて著しく減少されることに一致している（Ｌｕ他、１９９９）。
【００９０】
ヘパリンオリゴ糖とＦＧＦ１（ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ他、１９９８）およびＦＧＦ２（Ｆａｈａｍ他、１９９６）の複合体の結晶構造の相互作用は、本実験によって示される硫酸基の必要性と矛盾していない。ヘパリンの２−Ｏ−硫酸基はＦＧＦ２結合に十分と考えられるが、ＦＧＦ１は２−Ｏ−硫酸基および６−Ｏ−硫酸基の両方を必要とする（Ｇｕｉｍｏｎｄ他、１９９３、Ｉｓｈｉｈａｒａ他、１９９７）。ＦＧＦ７を、２−Ｏ硫酸基および６−Ｏ硫酸基を含むが３−Ｏ硫酸基を含まず、ＦＧＦ２と共結晶した（Ｆａｈａｍ他、１９９６）ヘパリン六糖と共結晶化させる試みでは、ＦＧＦ７のみで結晶化させた、前記の結晶と同一の結晶が得られ、共結晶化の形跡はなかった。次いで、六糖が十分にＦＧＦ７と相互作用し、ＦＧＦ７をプロテアーゼに対して保護するかどうかを判定する実験を行った（Ｌｕｏ他、１９９６）。ＦＧＦを安定化させプロテアーゼに対して保護するのは、細胞周囲基質ヘパラン硫酸の機能のうちの１つと考えられており、ヘパリンオリゴ糖とＦＧＦの機能的相互作用をモニターするのに使用されてきた（Ｌｕｏ他、１９９６）。ＦＧＦ１／ＦＧＦ２結合六糖はプロテアーゼに対してＦＧＦ７を保護することができなかったが、十糖および十四糖はこの有効さの順序で保護することができた。加えて、抗トロンビン結合ヘパリン（ｂｏｕｎｄ  ｈｅｐａｒｉｎ、ＢＨ）は、非結合分画（ｕｎｂｏｕｎｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＵＨ）に比べて、ＦＧＦ７をプロテアーゼに対して保護するのに４分の１の濃度で３倍有効であった。結合および非結合ヘパリンは、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の保護では、ほとんど同等に有効であった。プロテアーゼ処理の後に残ったＴＣＡ−沈殿性１２５Ｉ−ＦＧＦ７の独立した分析によって、オートラジオグラフィーの結果が確証された。これらは、より長いオリゴ糖配列に加えて、またはそれとは独立に、ＦＧＦ７の独特なＨＢドメインと相互作用するヘパリン内の抗凝血性モチーフ、抗トロンビンの必要性を示唆する。抗トロンビンの結合および抗凝血活性に必要であるヘパリン内の構造的モチーフは、特異的五糖または六糖配列であり、分画されていないヘパリンの３０％までになることもあるが、細胞性ヘパラン硫酸の１０％未満である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ他、１９９７）。グルコサミン−Ｎ−アセチルまたはＮ−硫酸−６−Ｏ−硫酸およびグルコサミン−３−Ｏ−硫酸（±６−Ｏ−硫酸）は、抗トロンビンと結合する際に、１残基を間にはさんで、イズロン酸−２−Ｏ−硫酸およびグルコサミン−Ｎ−硫酸−６−Ｏ−硫酸からなる隣接する二糖と協力する。
【００９１】
ＧＳＴ−ＦＧＦ７融合体は、ＦＧＦと同じヘパリン結合活性を有する。ＧＳＨ−セファロース上に固定化させたこの融合タンパク質は、高濃度の塩化ナトリウムに耐性があり、ＦＧＦ結合ヘパリンを単離するのに使用した。０．９Ｍ  ＮａＣｌで溶出させたＦＧＦ７結合ヘパリンは、Ｘａ因子の抗トロンビン結合活性の向上を示し、それは１００ｎｇ／ｍｌの濃度の抗トロンビン結合ヘパリンの９０％であった。０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶出させたヘパリンは、より少ない阻害活性を示した。分画していない粗ヘパリンに比べて、抗トロンビンに結合していないヘパリンは実質的に阻害活性はなく、ＦＧＦ７に結合していないヘパリンは４８％の阻害活性を失った。逆に、ＦＧＦ１結合ヘパリンは抗トロンビン結合モチーフを拒絶するが、ＦＧＦ１非結合ヘパリンは阻害活性を向上させ、それは抗トロンビンの８２％であった。これらの結果は、ＦＧＦ７がヘパリンと相互作用するために抗トロンビン、抗凝血性モチーフ、または少なくとも３−Ｏ硫酸基が必要であり、また異なるＦＧＦは異なるヘパリン組成の必要性を有するため、ＦＧＦ−ヘパラン硫酸ＦＧＦＲシグナル伝達複合体を制御するために別の特異性レベルが潜在的に生じる。
【００９２】
３−Ｏ硫酸基および／またはヘパリンオリゴ糖長付加の必要性の構造的基礎。ＦＧＦ７のモデル複合体を、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２の共結晶で明らかになったヘパリン六糖構造を用いて構成した。このモデルは、（１）ＦＧＦ７のヘパリン結合部位はＦＧＦ１およびＦＧＦ２のヘパリン結合部位と相同であるという仮定、（２）ヘパリンポリマーに許される計算された範囲内のヘパリン六糖のねじれ角を、ＮＭＲデータに由来する値に近い角に維持すること（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ他、１９９７）、および、（３）六糖と４つのＦＧＦすべてに共通の主鎖の間の、３つの接触（ＦＧＦ１およびＦＧＦ２構造の両方で観察される）を維持すること、に基づく。共通の接触は、ヘパリン六糖の残基５の２−Ｎ−硫酸基とＧｌｎ−１１５の主鎖Ｎとの接触、残基４の２−Ｏ−硫酸基とＬｙｓ−１３０の主鎖Ｎとの接触、および残基４の２−Ｏ−硫酸基とＴｈｒ−１３１の主鎖Ｎとの接触である。このモデルは、ＦＧＦ１のヘパリン接触残基の対応物であるＦＧＦ７残基Ｌｙｓ−１１６およびＶａｌ−１２０が、ヘパリンの結合に関与できないことを示した。Ｌｙｓ−１１６は、ＦＧＦ１のヘパリン結合性Ａｓｎ−１１４と置換する。Ｖａｌ−１２０は、ＦＧＦ１のヘパリン結合性Ｌｙｓ−１１８と、およびＦＧＦ２のヘパリン結合性Ｌｙｓ−１２６と置換する。ＦＧＦ７内のβ鎖１およびβ鎖２の間のループは、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２より１残基短い。結果として、ＦＧＦ１（Ａｓｎ−１８）およびＦＧＦ２（Ａｓｎ−２８）のヘパリン結合性アスパラギンのＦＧＦ７対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）であるＴｈｒ−１９もまた、ＧｌｃＮ残基３の２−Ｎ−硫酸基およびＩｄｏＡ残基２の３−ＯＨと水素結合を形成するには、ヘパリンから離れすぎている。これらの接触は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２の共結晶内で観察された。
【００９３】
ヘパリン六糖の３つのグルコサミン−Ｎ−硫酸基のそれぞれに３−Ｏ硫酸基を手動で付加することによって、このモデルの３つの変形を作成した。３−Ｏ基の付加が、オリゴ糖またはＦＧＦ７のどちらにも著しいコンフォメーション変化を引き起こさないと仮定して、以下の３つのモデルのそれぞれで新規の理論的な荷電相互作用が注目された。モデル２は、抗トロンビン結合モチーフに適合するためにＧｌｃＮＳ−（６−Ｏ−硫酸）−ＧｌｃＡを非還元末端に必要とする、グルコサミン−Ｎ−硫酸−３−Ｏ−硫酸基を１位（Ｓ−１）に有し、２−Ｎ−硫酸基および３−Ｏ−硫酸基の両方がＡｒｇ−１８との塩橋に関与し、また２−Ｎ−硫酸基とＡｓｎ−９２が相互作用する、最も精巧なネットワークを示した。モデル３では、グルコサミン−Ｎ−硫酸−３−Ｏ−硫酸基の３−Ｏ−硫酸基が３位（Ｓ−３）にあれば、Ｌｙｓ−１３０は３−Ｏ硫酸基と新しい塩橋を形成することができる。しかし、このために、ＩｄｏＡ（１−２）の６−ＣＯＯ’との相互作用を失うという犠牲を払っており、従来の抗トロンビン結合モチーフを維持するためにはＧｌｃＡと置換しなければならない。このモデルの第４の変異体では、５位の３−Ｏ硫酸基は新しい接触を行わなかった。ＩｄｏＡ（１−４）をＧｌｃＡと置換することによって抗トロンビン結合モチーフを維持するために、Ｑ１２９との水素結合も失われる。記載したモデルは、ＦＧＦに結合した構造が知られている六糖主鎖に限られていた。ＩｄｏＡ−６残基からヘパリン二糖の反復で六糖を伸張することが、ＦＧＦ７とのさらなる荷電相互作用をＬｙｓ−１２４を開始点として引き起こすことは、個別のモデル化の実習から明らかであった。
【００９４】
このモデルは、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２のＨＢドメイン内に存在していた、相同性ＦＧＦ７ＨＢドメイン内のＦＧＦ１／ＦＧＦ２結合六糖との好ましい相互作用の損失を示す。このモデルでヘパリンの結合に関与しない、ＦＧＦ７の残基Ｔｈｒ−１９およびＶａｌ−１２０は、Ｔｈｒ−１２５およびＴｈｒ−１３１と一緒になって、ＦＧＦ−１ではヘパリン接触の残基Ａｓｎ−１８およびＡｌａ−１２９が占めている、ＦＧＦ７内の領域を占める。これらの残基は、相同性ＦＧＦ７ＨＢドメインにわたる陽電荷電位の破壊および低下に大きな影響を与える。これらの違いは、低下し二分された表面電荷を補償することができる、３−Ｏ−硫酸化およびオリゴ糖長の増加の必要性を潜在的に生じさせる。
【００９５】
ＦＧＦ７の結晶構造により、１９個以上の遺伝子的に明確に異なる哺乳動物相同体のファミリーの、第３のメンバーの姿が現れる。ＦＧＦ７は、発現および受容体への特異性の制限を示し、このことは、多くの柔組織の間質区画から上皮区画の方向性パラクリンシグナル伝達系に寄与する（Ｆｉｎｃｈ他、１９８９、Ｙａｎ他、１９９３、Ｆｅｎｇ他、１９９７、Ｍａｔｓｕｂａｒａ他、１９９８）。この系の破壊により、区画間の指令シグナルの損失が生じる（ＭｃＫｅｅｈａｎ他、１９９８、Ｙａｎ他、１９９３、Ｆｅｎｇ他、１９９７、Ｍａｔｓｕｂａｒａ他、１９９８）。上皮細胞のヘパラン硫酸ＦＧＦＲ２ｌｌｌｂの複合体に対するＦＧＦ７の特異性にもかかわらず、ＦＧＦ７のＣα主鎖および構造ドメインの並びは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２およびＦＧＦ７／ＦＧＦ１キメラの配置と非常に似ている。複合体とヘパラン硫酸、受容体キナーゼ、または両方との三元複合体に劇的なコンフォメーション変化が起こらない限り、特異性は側鎖残基の組成および配向性になければならない。現在のところ、ヘパリンとの複合体（ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ他、１９９８、Ｚｈｕ他、１９９１、Ｅｒｉｃｋｓａｏｎ他、１９９１、Ｆａｈａｍ他、１９９６）、またはＦＧＦ２とＦＧＦＲ１のヘパリンに依存しない複合体（Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ他、１９９９）で、Ｃα主鎖あるいはＦＧＦ１またはＦＧＦ２の大規模なコンフォメーション変化は起こらない。ＦＧＦ７の独特な側鎖によって引き起こされた著しい違いは、相同性ＦＧＦ７ＨＢドメインとは劇的に異なる表面構造であり、それは、相互作用するヘパリン／ヘパラン硫酸の構造に対するさらなる要求に関連する。これらの違いは、上皮細胞内でＦＧＦ７のＦＧＦＲ２ｌｌｌｂに対する特異性の主な決定因子として同定されたＧボックス内の残基を含む（Ｌｕｏ他、１９９８）。
【００９６】
これらの結果は、ＦＧＦＲに依存しないＦＧＦとの相互作用において、ヘパラン硫酸鎖の３−Ｏ硫酸化によって特徴付けられる抗凝血性モチーフが果たす役割を、初めて示唆する。ヘパラン硫酸とＦＧＦの、ＦＧＦＲに依存しない相互作用は、オリゴマー形成を促進し（Ｈｅｒｒ他、１９９７、Ｍｏｙ他、１９９７、ＤｉＧａｂｒｉｅｌｅ他、１９９８）、細胞周囲基質内のＦＧＦを隔離および保護（Ｌｕｏ他、１９９６、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ他、１９９６、Ｆｒｉｅｄｌ他、１９９７、Ｌｕ他、１９９９）するために提案された。ＦＧＦ７と相互作用するヘパラン硫酸の構造の制限は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２に比べて、その半減期、細胞周囲環境の限局化および細胞内輸送を制限する可能性がある。ＦＧＦ７のために前立腺上皮細胞によって発現される細胞周囲基質結合部位は、相同体ＦＧＦ１０の結合部位の一部であり、ＦＧＦ１０は、間質中でも発現され、上皮細胞ＦＧＦＲ２ｌｌｌｂとしても働く（Ｌｕ他、１９９９）。この抗凝血性モチーフは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ＭｃＫｅｅｈａｎ他、１９９９）、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０を結合させる能力がある外部ドメインであるＦＧＦＲと、ヘパリンまたは細胞性ヘパラン硫酸が２元複合体を形成するためにも必要とされる。ＦＧＦ７およびＦＧＦＲ２を同時に結合して（Ｋａｎ他、１９９９、ＭｃＫｅｅｈａｎ他、１９９９）活性のあるオリゴマーシグナル伝達複合体にするのに十分な特性を併せ有する１個のヘパラン硫酸オリゴ糖は、まれであり、ＦＧＦ７シグナル伝達の特異性における主な決定因子である。
【００９７】
実施例２
タンパク質の調製。ＦＧＦ７を、クロラミンＴ（Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ  Ｔ）（シグマ、セントルイス）法によってヨウ素化した。抗トロンビンは、ヒト血漿（血液センタ、ヒューストン）からヘパリンクロマトグラフィーによって精製した。手短に述べると、凍結血漿を氷上で解凍し、遠心分離によって分離した。上清を、２ｍｌのヘパリン−セファロース（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて４℃で３０分インキュベートした。ビーズを回収し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．７Ｍ  ＮａＣｌでよく洗い、２Ｍ  ＮａＣｌにより溶出させた。ＮａＣｌの直線濃度勾配０〜２Ｍを用いて、ヘパリン−セファロースＦＰＬＣ（ファルマシア、ニュージャージー州ピスカタウェイ）によってタンパク質を再度精製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｘａ因子活性検定によって試験した。
【００９８】
アフィニティーカラムの調製。１０ｍｇの純粋なＧＳＴ−ＦＧＦ７タンパク質を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％アジ化ナトリウムの緩衝液中で、０．３ｍｌ／分の流量で、ＧＳＨセファロースカラム（ファルマシア、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に添加した。固定化後、カラムを０．３〜１．２Ｍの直線濃度勾配の、次いで１．２〜０．３Ｍの直線濃度勾配のＮａＣｌでよく洗った。抗トロンビンにも同様の手順を使用した。１０ｍｇの純粋な抗トロンビンを、２０Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２％アジ化ナトリウムの緩衝液中で、０．３ｍｌ／分の流量で、コンカナバリンＡ−セファロース（ファルマシア、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に添加した。その後カラムを０．３〜１．５Ｍの直線濃度勾配の、次いで１．５〜０．３Ｍの直線濃度勾配のＮａＣｌでよく洗った。ＮａＣｌ勾配を適用する間に失われたタンパク質の推定量は、１０回の実行で約１〜５％であった。
【００９９】
抗凝血性ヘパリンの精製。ヘパリン試料を、ＧＳＴ−ＦＧＦ７および抗トロンビンについて上に記載した緩衝液に溶解した。このヘパリン溶液を、電荷を帯びていない０．２２μｍＴｕｆｆｒｙｎ膜（ポール社（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アナーバー）を用いて濾過した。分析の目的に、緩衝液１０ｍｌ中のヘパリン５ｍｇを、上記の緩衝液と一緒に０．４ｍｌ／分のアフィニティーカラムに注入した。その後カラムを、０．３、０．６、０．９、１．２および１．５  Ｍの段階的に増加するＮａＣｌ濃度で洗い、除去を保証するために一連の動作を５〜１０回繰り返した。各勾配の分画を回収し、５分間沸騰させ、１度凍結し、解凍して遠心分離または濾過した。この上清を、粗腸管ヘパリンまたはＬＭＷＨにそれぞれ２０００Ｄａまたは５００Ｄａの分子量のカットオフを使用して、３日間、２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析し、綿様の物質として凍結乾燥させた。１．５Ｍ  ＮａＣｌの分画は、ヘパリンをほとんど含んでいなかった。各分画の濃度は、Ｈ２ＳＯ４−フェノールカルバゾール検定（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ  ＧｍｂＨ、ミルウォーキー）および１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｌｔｄ．、アイルランド）検定によって決定した。
【０１００】
抗Ｘａ因子検定。未分画ヘパリン、ＬＭＷＨ（シグマ、セントルイス）、またはエノキサパリン（Ｌｏｖｏｎｅｘ、フランス）からのヘパリン試料を所定量含む１０μｌの溶液を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶かした１０μｇ／ｍｌ抗トロンビン１０μｌと混合した。２分間インキュベートした後、３００ｎｇ／ｍｌのＸａ因子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベバリー）７０μｌを加え、３７℃で３分間インキュベートした。次いで混合液を、２．３ｍｇ／ｍｌのＣｈｒｏｍｏｚｙｍ  Ｘ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）１０μｌと共に、３７℃で３分間インキュベートした。１０μｌの氷酢酸で反応を停止させた。残留Ｘａ因子活性を４０５ｎｍで測定した。抗トロンビンが存在するがヘパリンが存在しない場合のＸａ因子活性を１００％とした。
【０１０１】
抗ＩＩａ因子活性。ヘパリン試料１０μｌおよび１０μｇ／ｍｌの抗トロンビン１０μｌを、８００ｎｇ／ｍｌのＩＩａ因子６０μｌと一緒に、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌポリエチレングリコールの緩衝液中、３７℃で１分間インキュベートした。次いで１．２ｍｇ／ｍｌのＣｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＴＨ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）２０μｌを加え、３７℃で２分間インキュベートした。１０μｌの氷酢酸を加えて反応を停止させた。残留ＩＩａ因子活性を４０５ｎｍで記録した。抗トロンビンが存在するがヘパリンが存在しない場合のＩＩａ因子活性を１００％とした。
【０１０２】
中和検定。１μｇ／ｍｌの０．９Ｍ高アフィニティーＦＧＦ７または抗トロンビン結合の６０００Ｄａヘパリン（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）（シグマ、セントルイス）１０μｌおよび様々な濃度のＦＧＦ７１０μｌを、１０μｇ／ｍｌの抗トロンビン溶液１０μｌと一緒にインキュベートした。検定の残りの手順は、基本的に上に記載の抗Ｘａ因子または抗ＩＩａ因子の検定に従った。活性は、抗トロンビンおよびＦＧＦ７が存在するが、どのような量のヘパリンも存在しない場合のＸａ因子またはＩＩａ因子活性から、ＦＧＦを加えない場合の残留活性を減算した値のパーセンテージとして表した。
【０１０３】
ＦＧＦ７のＮ末端に可溶性かつ生産能が高い融合パートナーであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合させた場合、生物学的活性を保持した約３．２ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ７収量が細菌内で生成された。発現自体は、免疫反応によってほとんど検出できないレベルであった。純粋な融合タンパク質は、グルタチオン（ＧＳＨ）およびヘパリンアフィニティーマトリックスで続いて行ったクロマトグラフィーによって得られた（Ｌｕｏ他、１９９８、Ｌｕ他、１９９９、Ｊａｎｇ他、１９９７）。このことは、ＦＧＦ７のＮ末端は柔軟であり、コンパクトなコア構造の外にあり、ヘパリン結合ドメインが柔軟なＮ末端から離れていることを示す、ＦＧＦ７結晶構造と矛盾しない。ＦＧＦ７自体は、単純に、ｉｎ  ｖｉｖｏの切断現象を模倣するトリプシン消化を行うことによって放出された（Ｌｕｏ他、１９９８、Ｌｕ他、１９９９、Ｊａｎｇ他、１９９７）。図１は、融合体から単離したＧＳＴ−ＦＧＦ７およびＦＧＦ７が両方とも約０．９Ｍ塩化ナトリウムで溶出され、ほとんど同じヘパリン結合アフィニティーを有することを表す。このことは、ＧＳＴの導入がＦＧＦ７のヘパリン結合能力に作用しないことを示す（図１）。
【０１０４】
融合によってＦＧＦ７の組換え生成が改善されたが、創傷の治癒、表皮の回復、ＦＧＦ７特異的ヘパリンおよび抗凝血性ヘパリンの精製など、潜在的な商業的および臨床的用途には、依然として相当低い収量である。その後、ＦＧＦ７の生成量を約５倍と著しく向上させる方法が発見された。これは、大量のＧＳＴ−ＦＧＦ７またはＦＧＦ７の生成を可能にし、また大量の抗凝血性ヘパリンおよびＦＧＦ７特異的ヘパリンを生成するための有効なアフィニティーマトリックスとして、ＧＳＴ−ＦＧＦ７を利用することを可能にする。
【０１０５】
低分子量ヘパリンから抗凝血性分画を抽出するための、抗トロンビンとの比較。精製したＧＳＴ−ＦＧＦ７を、セファロースビーズに結合させたＧＳＨに非共有結合的に固定化、またはＮＨＳ活性化させたセファロースに共有結合的に架橋結合させた。前者の方法では、マトリックスからＧＳＴ−ＦＧＦ７が漏出する恐れがあり、後者の方法では、ヘパリン結合ドメインを介した架橋結合により吸着能力が減退する恐れがある。１．２Ｍ  ＮａＣｌを用いた溶出中にＧＳＨ／ＧＳＴ−ＦＧＦ７カラムから漏出するＧＳＴ−ＦＧＦ７の評価により、アフィニティーマトリックスを用いて１０回実行した後、約５％の固定化タンパク質が失われたことが示された。どちらのタイプの固定化手順でも、下に記載のようにＮａＣｌ濃度を増加させた際のヘパリンの捕捉、および続く特異的分画の回収において、固定化ＧＳＴ−ＦＧＦ７単位あたりの有効性は同等に思われた。
【０１０６】
ブタ腸管粘膜ヘパリン（分子量平均が約３０００〜３００００ダルトンの範囲であり、長さが１０〜１００個の単糖である）をヘパリナーゼＩ処理によって減少させて作成された、市販の低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）試料（シグマ化学（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ミズーリ州セントルイス）（平均分子量＝６０００ダルトン）を用いた。予備実験では、緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍＭ  ＤＴＴおよび０．０２％ＮａＮ３）中の粗ＬＭＷＨ５ｍｇを、ＧＳＨ−セファロース１ｍｌに固定化させたＧＳＴ−ＦＧＦ７１０ｍｇを含むカラムに、５回通した。０．３Ｍ  ＮａＣｌでは、ヘパリンの３０〜４０％がカラムに保持されなかった。保持された分画のうち、約４０％が０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶出され、２０〜３０％が０．９Ｍ  ＮａＣｌで溶出され、１〜５％が１．２Ｍ  ＮａＣｌで溶出された。
【０１０７】
Ｘａ因子プロテアーゼおよびＩＩａ因子プロテアーゼに対する、抗トロンビンによるヘパリン依存性阻害を利用して、アフィニティーで精製したＬＭＷＨの分画の抗凝血活性を評価した。検定の前に、各分画を沸騰させ、濾過し、２ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析し、凍結乾燥させて２ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。保持されなかったヘパリンの分画はほとんど完全に不活性であったが、ＧＳＴ−ＦＧＦ７によって捕捉され、０．６Ｍおよび０．９Ｍ  ＮａＣｌで溶出された分画はそれぞれ、１００ｎｇ／ｍｌの阻害されていないレベルの４５％および２１％で、Ｘａ因子を阻害した（図２ａ）。固定化させたヒト血液由来の抗トロンビンから０．６Ｍおよび０．９Ｍ  ＮａＣｌで溶出されたＬＭＷＨ分画はそれぞれ、１００ｎｇ／ｍｌの阻害されていないレベルの４７％および１６％で、Ｘａ因子を阻害した（図２ｂ）。最大の半分のＸａ因子阻害に必要な濃度（５０％阻害濃度）が、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーによって精製したＬＭＷＨでは１ｍｌあたり約１４ｎｇであったのに比べて、抗トロンビンアフィニティーによって精製したＬＭＷＨでは１ｍｌあたり８ｎｇであったことが、投与量応答曲線により示された（図２ｂ）。
【０１０８】
ヘパリンの抗凝血活性の第２のターゲットは、抗トロンビンによるＩＩａ因子（トロンビン）の阻害である。トロンビン−抗トロンビンと不活性の三元複合体を形成するためにはより長いオリゴ糖が必要であるため、前に述べたように、最近の証拠により鎖の長さもまたＸａ因子の阻害における要素である可能性が示唆されるが、ＬＭＷＨは、Ｘａ因子と比べて、ＩＩａ因子の阻害においてより低い有効性を示すと予想される。図２ｃは、抗Ｘａ因子活性に比べて抗ＩＩａ因子活性は全体的に減少しているが、１００ｎｇ／ｍｌでは、ＧＳＴ−ＦＧＦ７または抗トロンビンカラムによって捕捉されたＬＭＷＨ分画のどちらもが、同程度の抗ＩＩａ活性（それぞれ、阻害されていないレベルの３３％および２６％の阻害）を示すことを表す。このことは、ＩＩａ因子活性に対する５０％阻害濃度が、ＧＳＴ−ＦＧＦ７および抗トロンビンで精製したＬＭＷＨで、それぞれ３０ｎｇ／ｍｌおよび１３ｎｇ／ｍｌのときに起こったことを示す、投与量応答曲線によって確認された（図２ｄ）。抗Ｘａ因子活性と同様に、どちらのアフィニティーカラムで保持されなかった分画も、活性がなかった）。
【０１０９】
臨床的ＬＭＷＨ製品の抗凝血活性を向上させるための有用性。多様な化学的および酵素的処理によって作成し、次いで４０００〜６０００ダルトンにサイズ分別した、いくつかのＬＭＷＨ製品、たとえばエノキサパリン、イノヘップ、ロジパリン、フラキシパリン、サンドパリン、フラグミンは、診療室において抗凝血性薬剤として広く使用されているが、抗凝血活性に関して向上されていない。図３は、固定化ＧＳＴ−ＦＧＦ７によって捕捉された分画は、エノキサパリンの抗Ｘａ活性（図３ａ）および抗ＩＩａ活性（図３ｃ）が濃縮されることを表す。アルカリ処理によって作成されるエノキサパリンから濃縮させた抗Ｘａ活性および抗ＩＩａ活性は両方とも、ヘパリナーゼ処理によって生成したシグマ６０００ＬＭＷＨより少し低かった。１００ｎｇ／ｍｌでは、ＧＳＴ−ＦＧＦ７で０．９Ｍ  ＮａＣｌにより生成したエノキサパリンは、Ｘａ因子の阻害が対照の２６％（図３ｂ）、ＩＩａ因子の阻害が対照の３３％（図３ｄ）であり、両酵素はそれぞれ、５０％阻害濃度が２０ｎｇ／ｍｌおよび７５ｎｇ／ｍｌであった。０．３Ｍ  ＮａＣｌの保持されなかった分画は、活性がなかった。
【０１１０】
ブタ腸管粘膜組織（ＰＩＭ）由来の未処理未分画ヘパリン（ＵＦＨ）から抗凝血性分画を濃縮することに関する、ＧＳＴ−ＦＧＦ７アフィニティーの有用性および特異性を示した（図３）。１ｍｌあたり１００ｎｇでは、０．９Ｍ  ＮａＣｌで溶出されたＧＳＴ−ＦＧＦ７で精製した材料は、Ｘａ因子の阻害が対照の１２％であり、５０％阻害活性は１ｍｌあたり５ｎｇで促進された（図３ａおよびｂ）。同じ分画は、ＩＩａ因子の阻害が、１ｍｌあたり１００ｎｇである対照の１５％であり、５０％阻害活性は１ｍｌあたり３ｎｇで示した（図３ｃおよびｄ）。粗ＰＩＭヘパリンから濃縮した分画の抗ＩＩａ活性がＬＭＷＨに比べてより高いことは、不活性な抗トロンビン−ＩＩａ因子複合体を形成するため、また場合によってはＸａ因子と最適な阻害複合体を形成するための抗トロンビン結合モチーフを含む、より長いオリゴ糖が必要なことと矛盾しない。固定化ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＦＧＦ１を有する対照カラムは、粗ＰＩＭヘパリンから抗凝血活性を向上させることができなかったが、この分画におけるＦＧＦ７の特異性を確認した。
【０１１１】
これらの結果はすべて、ＧＳＴ−ＦＧＦ７が、粗ＵＦＨまたはヘパリンのサイズ分画した調製物（ＬＷＭＨ）から抗Ｘａ分画および抗ＩＩａ分画を抽出するアフィニティー剤としての抗トロンビンの、強力な代替物であることを示す。このことで、抗凝血性の分画を濃縮するために天然の哺乳動物抗トロンビンを必要とすることに関連する、コストおよび安全性の問題が回避される。臨床ヘパリン調製物を少数の抗凝血性分画に減少させれば、最適な抗血栓性効果を得るために必要な投与量が減少され、電解質、および不活性な多数の分画による他の生物学的影響によって引き起こされる副作用が減少され、過度の出血を引き起こす可能性があるオーバーシュートがより良く制御される見込みが高くなる。このことは、ヘパリン、その誘導体または模擬体による抗凝血性治療において改善をもたらす可能性がある。抗凝血性でない、（たとえば０．３Ｍ  ＮａＣｌの）ＦＧＦ非結合ヘパリンは、上に記載の抗凝血性に関連しない治療にも役立つ。シグナル伝達には活性がないが、ヘパリンとの相互作用には十分活性があるＧＳＴ−ＦＧＦ７または他の変異体は、残留ヘパリンの中和または投与量オーバーシュートの補償に利用することができる。シグナル非活性のＦＧＦ７構成物は、血液系または組織の恒常性を妨害する可能性が低い外部不活性因子であるという利点を有している。ＧＳＴ−ＦＧＦ７または他のＦＧＦ７変異体による抗凝血性ヘパリンの中和は、プロタミン、ＰＦ４、ヘパリナーゼ、ラクトフェリンなど非特異的な高分子電解質中和剤に比べてより大きな特異性を提供する。最後に、活性ＦＧＦ７は、柔組織の上皮に独特の特異性を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏで特別な創傷治癒特性を示す（本明細書中にその全体を参照として組み込む、米国特許第５，９６５，５３０号、第６，１８３，７８４号、第５，８４３，８８３号、第６，０７４，８４８号）。それ自体でまたは生物活性のあるＦＧＦ７と組み合わせて投与したＦＧＦ７特異的なヘパリンは、同一の病理学的または外科的手術の結果として必要となる、抗血液凝固／血液凝固両方の協調および創傷治癒の治療において二重に有用になる可能性がある。
【０１１２】
ＦＧＦ７による抗凝血活性の中和。いくつかの血液タンパク質、血小板因子４（ＰＦ４）、高ヒスチジン糖タンパク質（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＨＲＧ）、およびビトロネクチンやプロタミンなど血液性でないタンパク質が、抗凝血剤に対する中和活性を示した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、１９９２、Ｌｅｖｙ他、１９９５、Ｌａｎｅ他、１９８６）。中和機構はあまり明確ではないが、おそらくは立体妨害または直接置換による。ＦＧＦ７は主に間葉細胞によって生成され、組織の恒常性を維持するためにパラクリン様式で上皮細胞に作用すると報告されている（Ｆｉｎｃｈ他、１９８９、Ｌｕ他、１９９９、Ｙａｎ他、１９９３）。ＦＧＦ７はまた、エピデミック皮膚に現れ、創傷部位で増加され、創傷を治癒することが期待される（Ｆｉｎｃｈ他、１９８９、Ｌｕ他、１９９９、Ｙａｎ他、１９９３）。上に示したように、高アフィニティーＦＧＦ７結合ヘパリンは抗トロンビンに媒介された抗凝血活性を示すので、ＦＧＦ７は、ヘパリン鎖上の同一または同様のモチーフと結合するのに抗トロンビンと競合し、抗凝血剤の中和剤として作用する可能性がある。
【０１１３】
ＧＳＴ−ＦＧＦ７で精製した６０００ＤａシグマＬＭＷＨ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ溶出物）の存在下では、ＦＧＦ７は、抗トロンビンに媒介された抗Ｘａ活性および抗ＩＩａ活性を、それぞれの５０％阻害濃度である８μｇ／ｍｌおよび７μｇ／ｍｌのときに中和することができる（図４）。抗トロンビンで精製したＬＭＷＨの存在下では、これらの濃度は両方とも約１５μｇ／ｍｌであり、ＧＳＴ−ＦＧＦ７で精製したＬＭＷＨを使用したときより２倍高かった（図４）。このことは、ＦＧＦ７が、抗トロンビン結合モチーフを利用しながら、配列組成のある種の変動に耐えうることができる可能性を示す。これは、血液凝固に関連する疾病および外科手術の臨床処置における、ＧＳＴ−ＦＧＦ７で精製した抗凝血性ヘパリンを使用することの利点となり得る。股関節の手術や心肺バイパスなど外科手術後、またはヘパリンによる治療や予防の間に恐ろしいのは出血性合併症であり、また、出血斑、血小板減少症、皮膚壊死、骨粗鬆症など他の種類の健康問題も引き起こすことである。これは、粗材料であり様々な患者間で制御することが困難である、注入した外部ヘパリンによって引き起こされる。ＧＳＴ−ＦＧＦ７で精製した高レベルの抗凝血性ヘパリンを使用することで、その副作用は著しく減少すると予想できる。重度の出血が生じた場合、今度は純粋なＦＧＦ７を適用して、より簡単に過剰の抗凝血活性を中和または制御することができる。純粋なＦＧＦ７を大量に低コストで生産する方法が、現在利用可能である。また、ＦＧＦ７は、ＦＧＦ７自体、ＦＧＦ７／精製抗凝血性ヘパリンの複合体、または制御したＦＧＦ７／抗凝血性ヘパリンを特定の比で使用することによって創傷を治癒すると報告されているので、創傷治癒と血液凝固の両方を制御し、創傷治癒や外科手術の回復を加速することができる。そのヘパリンはＦＧＦ７に特異的なヘパリンであるので、ＦＧＦ／ＦＧＦＲに関連する疾病を治療するのに使用することもできる。
【０１１４】
実施例３
組換えＦＧＦの細菌中の発現。ＦＧＦ  ｃＤＮＡのクローニングおよび発現ベクターの構築は、詳細に記載されている（本明細書中に参照として特に組み込む、Ｌｕｏ他、１９９８）。大腸菌のＧＳＴ−ＦＧＦ７の発現では、誘導の前に、培地に様々な濃度のＭｇＣｌ２および１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを加えた。基本培地はＭｉｌｌｅｒｓ  Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ  Ｂａｓｅであり、２価の陽イオンは加えず、その陽イオン濃度は、生物ソースからキャリーオーバーされた生理的レベル（およそ１ｍＭ）であると推定される。手短に述べると、３７℃で終夜２５０ｒｐｍで振盪したＬＢブロス中の５００ｍｌの初期培養液を使用して、抗生物質を含む３リットルのＬＢブロスに接種した。２〜３時間、ＯＤ６００が１．０以上になるまでインキュベートを続け、１０〜１００ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＩＰＴＧを加え、その後、培養液を３０℃で３〜４時間維持した。細菌を集菌し、組換えＦＧＦを抽出および処理するまで凍結した。このバッチ調製手順は、５０リットルまでスケールアップし、比例した収量であった。
【０１１５】
ＦＧＦの回収および精製。すべての工程は４℃で行った。３リットルの培養液からの細菌ペレット（最終ＯＤ６００約１．６）を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、新しく加えたＰＭＳＦを含む２００ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁させた。この懸濁液に、１ｍｌあたり１０μｇのＤＮＡ分解酵素Ｉを加え、次いで、３０秒ごとに１５秒氷冷しながら、全部で５分間の超音波処理を行った。溶菌液を１３０００ｒｐｍの遠心分離によって分離した。上清をヘパリン−セファロースまたはグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースに載せてバッチクロマトグラフィーを行い、上記緩衝液でよく洗った。生成物は、それぞれの培養液から、１．５Ｍ  ＮａＣｌまたは２０ｎＭ還元ＧＳＨによってバッチで溶出させた。タンパク質濃度は、ＢＳＡ標準を用いた２８０ｎｍの吸収によって決定した。
【０１１６】
Ｎ末端ＧＳＴ部分から離れたＦＧＦ部分だけを単離するために、ＧＳＴ−ＦＧＦをヘパリンセファロースに固定化させてＦＧＦコアを消化から保護しながら、トリプシン処理した。固定化ビーズを洗うことによって懸濁緩衝液をリン酸緩衝液の生理食塩水に変えた。最終濃度が１ｍｌあたり２〜５μｇになるようにトリプシンを加えた。消化は、室温で３０〜５０分ゆっくり回転させながら行った。細胞溶解緩衝液でよく洗い、ＦＧＦを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムの緩衝液中の１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出させた。調製手順は、最初の固定化段階でバッチからカラムに適応させることもでき、ヘパリンセファロースからの、最終洗浄および溶出前の収量および純度が少し向上する。
【０１１７】
Ｎ末端融合によるＦＧＦ７生産の向上。２１Ａｓｎ−ＦＧＦ１および３０ａｌａ−ＦＧＦ７を、それぞれのｃＤＮＡがＮｄｅｌおよびＢａｍＨ１部位にクローニングされたｐＥＴ−３Ｃベクターから発現させた。この組換えベクターを使用して細菌宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換させ、溶菌液の可溶分画から回収した組換え生成物を上記のように精製した。２８０ｎｍの吸収から推定して、１．０のＯＤ６００１Ｌあたり約３０±４ｍｇの精製ＦＧＦ１が回収されたが、同条件下で、同じ方法で評価したＦＧＦ７抗原の回収は、ほとんど検出できなかった。細菌封入体と可溶分画の両方を含む完全な洗浄性抽出物を別に分析することにより、低レベルのＦＧＦ７生成物は溶解度に起因するのではなく、細菌内の発現が全体的に低いレベルであることと、ＦＧＦ１に比べてＦＧＦ７の安定性がより低いレベルであることにおそらく起因する回収中の損失とが組み合わさったことの結果であることが示された。ＦＧＦ７と質量が同じ融合パートナーの付加によって収量が向上するかを判定するために、ＦＧＦ１およびＦＧＦ７の両方をＧＳＴのＣ末端に融合した構築体を調製した。精製したＧＳＴ−ＦＧＦ１の収量は、１．０のＯＤ６００１リットルあたり２８±３ｍｇと両方の菌株の融合していないＦＧＦ１の収量に近かったが、ＧＳＴ−ＦＧＦ７の収量は、１．０のＯＤ６００１リットルあたり３．２±０．４ｍｇと著しく上昇した（図５）。
【０１１８】
ＧＳＴ−ＦＧＦ１とＧＳＴ−ＦＧＦ７のどちらも、ＦＧＦＲキナーゼ複合体と結合し活性化させて培養液中の細胞に分裂促進活性を示さず、両方とも、融合していない生成物と同様にヘパリンとのアフィニティーを保持する。Ｎ末端ＧＳＴ融合パートナーは、固相でヘパリン−セファロースに固定化させている間に制御したトリプシン処理を行うことによって、ＧＳＴ−ＦＧＦ１およびＧＳＴ−ＦＧＦ７の両方から除去することができ、１．０のＯＤ６００の培養液１リットルあたり１４ｍｇおよび１ｍｇの２１Ａｓｎ−ＦＧＦ１および５４ｓｅｒ−ＦＧＦ７を生じる。
【０１１９】
増殖培地中の高レベル塩化マグネシウムによる、ＧＳＴ−ＦＧＦ７生成の亢進。Ｎ末端融合パートナーをＦＧＦ７に利用することによってＦＧＦ７の収量は増加したが、その収量は依然として、同じ戦略で生成したＦＧＦ１の約１０パーセントであった。様々なプロモーター、プラスミドの改変および培地条件を単独で、またそれらを組み合わせてスクリーニングしたが、細菌発現レベルおよび精製した生成物の最終収量を向上させる試みは成功しなかった。これには、様々な市販の培養基、高細胞密度での発酵、シャペロンを含む発現プラスミドとの共感染、プロテアーゼ欠乏性株、培養温度、および誘導濃度と誘導の両方が含まれる。別の実験により、プラスミドの回収は、ＩＰＴＧで誘導する前と後の両方で類似していることが示されたが、それでも特にＦＧＦ７またはＧＳＴ−ＦＧＦ７をコードするプラスミドで形質転換した細胞をＩＰＴＧで誘導すると、細菌数の増殖速度の著しい減少を引き起こすことは明白であった。
【０１２０】
意外なことに、単純な細菌増殖培地（Ｍｉｌｌｅｒｓ  Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ  Ｂａｓｅ）に１０〜１００ｍＭのＭｇＣｌ２を補充すると、ＧＳＴ−ＦＧＦ７の生成が著しく向上した。３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２では、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株中のＧＳＴ−ＦＧＦ７の収量が１．０のＯＤ６００１リットルあたり１７±１．４ｍｇとなり、これは、追加のＭｇＣｌ２を含まない培地より約５〜６倍高かった（図６）。１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２では、収量が減少し始め、これは明らかに、細菌数が約１０パーセント減少することに起因していた。ＧＳＴ−ＦＧＦ１の収量は、３０ｍＭまで試験したすべての濃度のＭｇＣｌ２で、補充していない培地と同様であった。
【０１２１】
生成の亢進は、Ｍｇ２＋、ＦＧＦ７、および細菌株特異的である。ＧＳＴ−ＦＧＦ７の収量の向上における、１０ｍＭの他の２価陽イオンの影響をＭｇＣｌ２と比較して試験した。ＭｇＣｌ２が最も有効であったが、ＣａＣｌ２は約２倍収量を増加させ、１０ｍＭのＺｎＣｌ２またはＣｕＣｌ２はＧＳＴ−ＦＧＦ７の生成を激しく減少させた（図７）。様々な条件下における総細菌収量は、１０パーセント未満でしか変動しなかった。
【０１２２】
ＭｇＣｌ２の追加は、すでに高収量であったＧＳＴ−ＦＧＦ１の生成にあまり影響を与えなかったが、特にＧＳＴ−ＦＧＦ７の生成を、ＦＧＦポリペプチドのうち別の低収量メンバーであるＧＳＴ−ＦＧＦ９の生成と比較した（図８）。通常培地での培養から同じ手順で回収した、精製したＧＳＴ−ＦＧＦ９の収量は、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株の両方で、１．０のＯＤ６００１リットルあたり約１．５〜２．０ｍｇであった。１０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えることによって、ＧＳＴ−ＦＧＦ９の低かった収量が少し増加した。このことは、この亢進がＦＧＦ１およびＦＧＦ９に比べてＦＧＦ７に特異的であることを示唆する。
【０１２３】
細菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＤＨ５α中のＧＳＴ−ＦＧＦ７の相対収量を調べた（図８）。ＭｇＣｌ２を補充することによる収量の増加は菌株特異的であり、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳでのみ明らかであった。
【０１２４】
最後に、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を利用した改善された条件下で回収したＧＳＴ−ＦＧＦ７を、ヘパリンに固定化させてトリプシン処理することによってＧＳＴ部分を除去し、その後精製した、５４Ｓｅｒ−ＦＧＦ７の回収率および活性を試験した。前で説明したように、活性は、放射標識したＦＧＦ７生成物と、昆虫細胞の表面に示されるＦＧＦＲ２ｌｌｌｂとの高アフィニティー結合、非標識の材料と放射標識したＦＧＦ１との競合、および培養マウスケラチノサイト（ｍｏｕｓｅ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＭＫ）中の分裂促進活性によって評価した。結果は、純粋な５４Ｓｅｒ−ＦＧＦ７の収量が１．０のＯＤ６００１リットルあたり４．８±０．５ｍｇであることを示し、これは、モル濃度に基づくと、精製したＧＳＴ−ＦＧＦ７生成物から平均７０パーセントの収率を表す。分析の誤差内で、生成物の特異的活性は、融合パートナーなしでＦＧＦ７を発現する、またはＧＳＴ−ＦＧＦ７をもっと低い収量で発現する細菌から回収したＦＧＦ７の特異的活性と同等またはより高かった。別の実験により、高収量培養物からのＧＳＴ−ＦＧＦ７融合タンパク質は、ＦＧＦＲ複合体の結合および分裂促進活性に不活性であったが、ＧＳＨ−セファロースに固定化させたとき、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を結合し、粗ヘパリンのＦＧＦ７特異的で抗トロンビン結合性である抗凝血性分画を選択的に精製および中和するのに十分活性であったことが、さらに確認された。
【０１２５】
１０ｍＭのＭｇＣｌ２を宿主細菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに単純に加えることで、ＧＳＴ−ＦＧＦ７の収量および後の成熟５４Ｓｅｒ−ＦＧＦ７の回収率が、ＭｇＣｌ２を加えずに生成した場合の５倍以上に増加する。この改善は、宿主株およびＦＧＦ７に特異的である。培地中の高濃度のＭｇＣｌ２によって緩和される、ＧＳＴ−ＦＧＦ７またはＦＧＦ７の発現におけるＦＧＦ７に特異的な制限の、根底にある機構は不明確である。この制限は、ＦＧＦ７プラスミドで形質転換させた細菌の増殖または生存度がＦＧＦ１で形質転換させた細胞に比べて減少している、誘導段階で発生しているように思われる。しかし、この亢進には高濃度のＭｇＣｌ２は誘導段階でしか必要とされないにもかかわらず、ＦＧＦ１で形質転換させた細胞で誘導期間に生じる細胞数に匹敵するほどの細胞数の増加はない。このことは、ＦＧＦ７の発現は個体数の増殖を制限するが、ＭｇＣｌ２により、総細胞数ではなく細胞１個あたりの生成量が亢進されることを示す。ＦＧＦ７のｍＲＮＡまたは新生タンパク質鎖の独特の特性は、十分に厳しくタンパク質合成機構と競合またはそれを妨げて、増殖または細胞の生存度を制限し、高濃度のＭｇＣｌ２が、そのレベルの阻害を部分的に取り除く可能性がある。
【０１２６】
実施例４
ＦＧＦ特異的なオリゴ糖の単離および特徴付け。部分的ヘパリナーゼＩ切断、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、強陰イオン交換クロマトグラフィーを含む一連のステップを適用することにより、本発明者はＦＧＦ−７結合ヘパリンオリゴマー（８重合体、１０重合体、１２重合体、１４重合体）を単離した。ヘパリナーゼＩで部分的に消化したヘパリンの分画は、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０（バイオラッド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州）ゲル濾過カラム（１９０ｃｍ×２．６ｃｍ）で行った。約１００〜２００ｍｇの消化ヘパリン混合物を、０．２％ＮａＮ３中で添加し、次いで０．２Ｍの炭酸水素アンモニウムを添加し、流量は０．３ｍｌ／分の一定流量である。分離したヘパリンオリゴマーは、不飽和ウロン酸の紫外吸収２２６ｎｍで検出した。それぞれのタイプのオリゴマーからの溶液を、ピーク幅に応じて回収し、ＮＨ４ＨＣＯ３を分解するために６０〜８０℃で４時間加熱し、凍結乾燥させた。上記のステップを繰り返して、均一なサイズを得た。消化されていない材料のバルクピークから分離したピークを有する、最大サイズ１８重合体までの分離が得られた。より大きなオリゴマーをきれいに分離するには、より少ない粗出発材料を載せることになるので、収量を犠牲にしなければ起こらない。
【０１２７】
最終的な純粋オリゴマーをｓｕｐｅｒｆｉｎｅセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５で脱塩し、真空下で遠心蒸発して容積を調節し、２ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で保存した。アフィニティーカラムは、２×１ｍｌのＧＳＨ−セファロース上の３０ｍｇの純粋なＧＳＴ−ＦＧＦ７から調製した。０．１４Ｍ  ＮａＣｌを用いて、ヘパリンオリゴマーを０．３ｍｌ／分で添加した。結合した材料は、０〜０．１４Ｍ、０．１４〜０．３Ｍ、０．３〜０．６Ｍ、０．６〜１．０Ｍの濃度のＮａＣｌを用いて段階的に溶出させた。アフィニティー均一性を保証するために、上記のステップを少なくともさらに２回繰り返した。単独で、ＧＳＴ−ＦＧＦ７で精製し、０．６〜１．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出した８重合体、１０重合体、１２重合体および１４重合体は、抗Ｘａ因子活性を示し、それは、同じ量のＡＴ  ＩＩＩ結合合成五糖、あるいは他の実験室からの精製したＡＴ  ＩＩＩ結合１０重合体または１４重合体に比べて明らかに高かった。しかし、それは、ＧＳＴ−ＦＧＦ７で精製した粗ヘパリン、または０．６〜１．０Ｍ  ＮａＣｌで溶出した低分子量ヘパリンの抗Ｘａ因子活性より低い（図９）。残りの３つの分画は、実質的に活性がなかった。
【０１２８】
本明細書中で開示および請求する方法および／または装置は、本発明の開示を考慮に入れて、過度の実験なしに作成し実行することができる。本発明の組成および方法を好ましい実施形態で表したが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書中に記載した方法および／または装置、ならびにステップまたは一連のステップを変化させることができることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的におよび生理学的の両方に関連するある種の薬剤を、本明細書中に記載する薬剤の代わりに使用しても、同じまたは同様の結果が得られることになることが、明らかであろう。当業者に明らかであるこのような類似の置き換えおよび改変すべてが、添付の請求の範囲によって定義する本発明の精神、範囲、および概念に含まれるとみなされる。
【０１２９】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中で述べた例示的手順および他の詳細を補足することを提供する限りで、本明細書中に参考文献として特に組み込む。
【０１３０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＧＳＴ−ＦＧＦ７融合生成物のヘパリン結合性が損なわれていないことを示すグラフである。
【図２】
ＬＭＷＨヘパリンの抗血栓活性および抗凝血活性をアフィニティーにより向上させた場合の、ＧＳＴ−ＦＧＦ７と抗トロンビンの比較を示すグラフである。
【図３】
ＧＳＴ−ＦＧＦ７による、エノキサパリンおよび粗ブタ腸管粘膜ヘパリンの抗凝血活性の濃縮を示すグラフである。
【図４】
ＧＳＴ−ＦＧＦ７カラム（中実正方形）または抗トロンビンカラム（中実三角形）から溶出させた０．９Ｍ  ＮａＣｌの６０００Ｄａヘパリン（シグマ）分画の、ＦＧＦ７による抗凝血活性の中和を示すグラフである。
【図５】
ＦＧＦ１およびＦＧＦ７の組換え体の単独収量、ならびにｐＥＴ−３ＣおよびｐＧＥＸ−２Ｔ系でそれぞれ発現させたＧＳＴ−ＦＧＦ１およびＧＳＴ−ＦＧＦ７の組換え体の収量を示すグラフである。
【図６】
組換えＧＳＴ−ＦＧＦ７の収量に対する塩化マグネシウムの影響を示すグラフである。
【図７】
組換えＧＳＴ−ＦＧＦ７の収量に対する、様々な金属の２価陽イオンの塩の影響を示すグラフである。
【図８】
細菌中の組換えＦＧＦの収量に対する、菌株およびＭｇＣｌ２の影響を示す表である。
【図９】
様々なＦＧＦ７アフィニティーで精製したヘパリン分画の抗Ｘａ因子活性の比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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