(57)【要約】合成ＤＮＡのような合成オリゴヌクレオチドは、しばしば合成失敗物（例えば、副産物および／または短縮産物）に起因する配列エラーを含む。合成失敗物の分離可能な枯渇によって合成二本鎖オリゴヌクレオチドの配列忠実度を改善するための方法が、本明細書中に提供される。分離は、変性条件下での分取様式の方法論の利用によってもたらされる。この方法の好ましい使用は、遺伝子合成に関連する。この合成二本鎖オリゴヌクレオチドの配列忠実度を改善するための方法は、合成二本鎖オリゴヌクレオチドを２つの集団に分離するのに十分な変性条件下で合成二本鎖オリゴヌクレオチドを分取カラムクロマトグラフィーまたはゲルクロマトグラフィーに供する工程であって、一方の集団は合成失敗物が豊富であり、そして他方の集団は合成失敗物が枯渇している、工程、を包含する、方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成二本鎖オリゴヌクレオチドの配列忠実度を改善するための方法であって、
該方法は、合成二本鎖オリゴヌクレオチドを２つの集団に分離するのに十分な変性条件下で合成二本鎖オリゴヌクレオチドを分取カラムクロマトグラフィーまたはゲルクロマトグラフィーに供する工程であって、一方の集団は合成失敗物が豊富であり、そして他方の集団は合成失敗物が枯渇している、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記カラムクロマトグラフィーがＨＰＬＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カラムクロマトグラフィーがＤＨＰＬＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲルクロマトグラフィーが勾配ゲルクロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが合成二本鎖ＤＮＡを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡがより大きなＤＮＡ分子の１つ以上のフラグメントを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
分離された副産物が、ウリジン残基、アプリン残基、アピリミジン残基またはジアミノプリン残基を含む分子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが化学的に合成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記オリグヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡがより大きなＤＮＡ分子の１つ以上のフラグメントを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的に、合成二本鎖オリゴヌクレオチドの配列忠実度の改善に関する。より詳細には、オリグヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）の合成において作成された合成失敗物（ｆａｉｌｕｒｅ）（副産物（ｓｉｄｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ）および短縮産物を含む）の除去に関する。
【０００２】
（発明の背景）
製薬会社における発見探索の多くは、薬物開発のための標的としてか、またはそのタンパク質発現産物の形態での治療剤としての遺伝子に集中される。これらの会社は、主要なヒト遺伝子を入手できる。製薬会社は、潜在的な機会に当惑し、その競合会社が同じセットの可能性を探していることを明敏に（ａｃｕｔｅｌｙ）警戒し、そして現在、同定されている遺伝子の分画以上のものに取り組むことができない。この探索における進行を妨げる主要なものの１つは、詳細な分析のために遺伝子を調製するのに必要な時間および努力である。
【０００３】
遺伝子合成（化学合成されたＤＮＡからの部分的なまたは全体的なクローニング遺伝子の産生）は、この進行を妨げるもの（ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ）を克服する方法の１つである。原則として、遺伝子合成は、配列が公知である任意の遺伝子、および遺伝子の任意のバリエーションへの速やかなアクセスを提供し得る。信頼性のある、コスト効果的な自動遺伝子合成は、新しい遺伝子の操作および分析をスピードアップすることで生物医学的探索のプロセスに革命的な効果を有する。
【０００４】
遺伝子合成の自動化を限定する１つの本質因子は、プロセスの低い配列忠実性である：化学的に合成されたＤＮＡから作成された遺伝子クローンは、しばしば配列エラーを含む。これらのエラーは、以下の多くの段階のプロセスで導入され得る：成分オリゴヌクレオチドの化学合成の間、二本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的な構築の間、そしてＤＮＡの操作または単離の間またはクローニングプロセスの間に生じる化学損傷によって。
【０００５】
以下の４つの型の塩基修飾は、オリゴヌクレオチドがフォスフォアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を使用して合成される場合に、一般に生成される：（１）２，６−ジアミノプリン残基を形成するためのデオキシグアノシンのＯ６−酸素のアミノ基転移；（２）ウリジン残基を形成するためのデオキシシチジンのＮ４−アミンの脱アミノ（Ｅａｄｉｅ，Ｊ．Ｓ．およびＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：８３３３，１９８７）；（３）アプリン酸部位を得るためのＮ６−ベンゾイルデオキシアデノシンの脱プリン（Ｓｈａｌｌｅｒ，Ｈ．およびＫｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：３８２８，１９６３；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１）；（４）デオキシグアノシン上のＮ２−イソブチルアミン保護基の不完全な除去。これらの副産物（副生成物（ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ））の各々は、クローニングされた合成ＤＮＡにおける配列エラーに寄与し得る。
【０００６】
オリゴヌクレオチド合成の別の合成失敗物は、所望のオリゴヌクレオチドの全長未満の短縮産物の形態である。オリゴヌクレオチド合成に対する固相アプローチは、その３’ヒドロキシル基を介して固体支持体へアンカーされ、そしてその５’ヒドロキシル基へ結合することによって伸長されるオリゴマー鎖の構築に関与する。所定の鎖延長サイクルにおける各結合工程の収率は、一般的に＜１００％である。「ｎ」長のオリグヌクレオチドについて、ｎ−１結合が存在し、そして所望の結合の最大収率は［結合効率］ｎ−１である。２５マーについて、９８％の結合効率と仮定すると、全長産物の計算収率は、６１％である。他の３９％は、効率の悪いモノマー結合から生じる、可能性のあるより短い長さのオリグヌクレオチド（短縮産物）の全てからなる。所望のオリグヌクレオチドは、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを使用する精製工程によってこの混合物から部分的に精製され得る。これらの精製手順は、１００％有効ではなく、そしてこれらの集団を完全には排除しない。従ってそれらの最終産物は、ｎ−１の失敗配列ならびにある程度はｎ−２およびｎ−３の失敗配列を含む。オリゴヌクレオチド合成プロセスのこの型の所望されない産物はまた、合成遺伝子における配列エラーに寄与し得る。
【０００７】
別のクラスの合成失敗物は、所望のオリゴヌクレオチドの全長よりも長い「ｎ＋」産物の形態である（Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１３，１９８７、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。これらの産物の主な供給源は、ホスホルアミダイトモノマーが塩基を介して反応している、成長中のオリゴヌクレオチドの分枝（特にアデノシンのＮ−６およびグアノシンのＯ−６）である。ｎ＋産物の別の供給源は、固体支持体上の所望されない反応性部位からのイニシエーション（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）および伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）である。最後に、これらの産物はまた、５’トリチル保護基が結合工程の間に偶然に（ｉｎａｄｖｅｒｔｅｎｔｌｙ）脱保護される場合に形成される。この５’ヒドロキシルの早すぎる曝露によって、ホスホルアミダイトの二重付加が可能になる。オリゴヌクレオチド合成プロセスのこの型の合成失敗はまた、合成遺伝子における配列エラーに寄与し得る。
【０００８】
合成遺伝子の調製に対する一般的な別のプロセスは、より大きな合成二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するための合成二本鎖オリゴヌクレオチドの他の合成二本鎖オリゴヌクレオチドへのライゲーションである。インビトロ実験は、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼが不十分な忠実度である、３’Ａ／ＡまたはＴ／Ｔミスマッチおよび５’Ａ／ＡまたはＴ／Ｔミスマッチ（Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．、およびＷａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．、Ｇｅｎｅ　７６：２４５−５４，１９８９）、５’Ｇ／Ｔミスマッチ（Ｈａｒａｄａ，Ｋ．およびＯｒｇｅｌ．Ｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２１：２２８７−９１，１９９３）あるいは３’Ｃ／Ａ、Ｃ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ｔ／Ｃ、Ａ／Ｃ、Ｇ／ＧまたはＧ／Ｔミスマッチ（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．、Ｋａｉｓｅｒ，Ｒ．、Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｊ．、およびＨｏｏｄ，Ｌ．、Ｓｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−８０，１９８８）を有するニックをシーリングすることを示すことを示している。これらの型のミスマッチは、二本鎖核酸のより大きな二本鎖核酸へのライゲーションの間に生じ得る。
【０００９】
オリグヌクレオチド（例えば、遺伝子）の調製に対する最新のアプローチにおける困難性に起因して、合成オリグヌクレオチドの配列忠実度を改善する方法が当該分野において必要である。本発明は、この必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【００１０】
（発明の要旨）
簡略に述べると、本発明は、合成二本鎖オリゴヌクレオチドの配列忠実度を改善するための種々の方法を提供する。この方法は、合成二本鎖オリゴヌクレオチドを２つの集団へ分離するのに十分な変性条件下で合成二本鎖オリゴヌクレオチドを分取（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）カラムクロマトグラフィーまたは分取ゲルクロマトグラフィーに供する工程を包含し、ここで、一方の集団は合成失敗物が豊富であり、そして他方の集団は合成失敗物が枯渇している。１つの実施形態において、このカラムクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣである。好ましい実施形態は、ＤＨＰＬＣである。別の実施形態において、このゲルクロマトグラフィーは、勾配ゲルクロマトグラフィーである。任意の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、合成二本鎖ＤＮＡを含み得る。好ましい合成二本鎖ＤＮＡは、より大きなＤＮＡ分枝の１つ以上のフラグメントを含む。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な記載を参照して明らかとなる。さらに、種々の参考は、本明細書中に示される。これらの参考のそれぞれは、各々が個々に援用のために言及されるかのように、本明細書中に参考としてその全体が援用される。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明を示す前に、下に使用される特定の用語の定義を示すことは本発明の理解を助け得る。
【００１３】
ＤＮＡの天然塩基−アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）。ＲＮＡにおいて、チミンは、ウラシル（Ｕ）で置換される。
【００１４】
合成二本鎖オリグヌクレオチド−オリグヌクレオチドの一本鎖から構成される実質的な二本鎖ＤＮＡ。このオリグヌクレオチドは、より大きな合成二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するために化学合成によってまたは他の合成二本鎖オリゴヌクレオチドへの合成二本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーションによって産生される。
【００１５】
合成失敗物−オリゴヌクレオチド合成の所望されない産物；例えば、副産物、短縮産物または不適切なライゲーション由来の産物。
【００１６】
副産物−オリゴヌクレオチド合成の化学的な副生成物。
【００１７】
短縮産物−所望される長さより短い可能性のある全てのオリゴヌクレオチド；例えば、オリゴヌクレオチドの合成の間の効率の悪いモノマー結合から生じる。
【００１８】
ＴＥ−８．０のｐＨで、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡの水溶液。
【００１９】
ホモ二本鎖（ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ）オリゴヌクレオチド−塩基が完全に一致する二本鎖オリゴヌクレオチド；例えば、ＤＮＡについて、各ＡがＴと対となり、そして各ＣがＧと対となる。
【００２０】
ヘテロ二本鎖（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）オリゴヌクレオチド−塩基が誤対である二本鎖オリゴヌクレオチド、すなわち、１つ以上のミスマッチ塩基が存在する；例えば、ＤＮＡについて、ＡがＣ、ＧまたはＡと対となるか、あるいはＣがＣ、ＴまたはＡと対となる、など。
【００２１】
本発明は、合成オリゴヌクレオチドの混合物から配列エラー率が減少した二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する方法に関する。この方法は、所望の長さの二本鎖オリゴヌクレオチド（完全にマッチした天然塩基を含む）から、合成失敗物（副産物および短縮産物を含む）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを分離するのに十分な条件下での分取様式の技術の使用に基づく。
【００２２】
より詳細には、本発明の開示は、驚くことに、合成二本鎖オリゴヌクレオチドの集団が、変性条件下で分取様式で利用される場合の方法論によって２つの集団に分離され得ることを示す。一方の集団は、合成失敗物（例えば、副産物、不適切なライゲーション由来の産物および／または短縮産物）を含むオリゴヌクレオチドが豊富である。第二集団は、合成失敗物を含むオリゴヌクレオチドが枯渇し、そしてマッチした天然塩基のみを含む所望の長さの合成二本鎖オリゴヌクレオチドが豊富である。所望の二本鎖オリゴヌクレオチドからの合成失敗物の枯渇とは、一般に分離前の総集団と比較して少なくとも約２倍の枯渇をいう。代表的に、この枯渇は、本来の状態から約２倍〜３倍の変化である。この特定倍の枯渇は、単一分離の結果または多数の分離の累積結果であり得る。この第二集団は、例えば、オリゴヌクレオチドが遺伝子または遺伝子のフラグメントに対応する二本鎖ＤＮＡである場合、有用である。
【００２３】
本明細書中に開示される場合、天然塩基を含む合成分子は、合成失敗物（例えば、非天然塩基または短縮配列）を含む分子から分離され得る。二本鎖オリゴヌクレオチドにおける非天然塩基（ヘテロ二本鎖オリグヌクレオチドのミスマッチ塩基のような）は、二本鎖オリゴヌクレオチドを不安定にする。非天然塩基を含むかまたは全長より短い二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）は、ホモ二本鎖において天然塩基のみを含む全長配列よりより低い温度で融解する。温度を調整することによって、二本鎖合成オリグヌクレオチド失敗物は、融解するかまたは部分的に融解し、そして全長の合成ホモ二本鎖オリゴヌクレオチドよりもクロマトグラフィー上で異なって移動し得る。従って、種々の方法論（例えば、カラムクロマトグラフィーまたはゲルクロマトグラフィー）を、変性条件下で分取様式で使用して、所望の合成二本鎖オリグヌクレオチドから合成失敗物を分離し得る。
【００２４】
オリゴヌクレオチド合成（例えば、化学合成）は、種々の副産物を産生し得る。例えば、副産物としては、無塩基の残基（例えば、アプリン酸残基またはアピリミジン残基）、ジアミノプリン、不完全な脱保護Ｇ、およびウリジンが挙げられる。本発明の目的のため、副産物の一般的特性は、これらの非天然塩基が二本鎖オリゴヌクレオチドを不安定にすることである。ここで、この非天然塩基が二本鎖オリゴヌクレオチドに取りこまれて、その結果、これらの合成失敗物は、天然塩基のみを含む合成二本鎖オリゴヌクレオチドより低い温度で融解する。
【００２５】
変性条件は、分取（分析よりむしろ）目的のために使用されるかまたは適合される種々の方法論（クロマトグラフィーを含む）に適用され得る。カラムクロマトグラフィーおよびゲルクロマトグラフィーは、本発明における適切な方法論の例である。１つの実施形態において、カラムクロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）である。別の実施形態において、このカラムクロマトグラフィーは、Ｈａｔｃｈ、米国特許第６，２３８，５６５号に記載されるようなモノリシックマトリクスを使用する。別の実施形態において、このカラムクロマトグラフィーは、Ｔａｙｌｏｒ、ＷＯ０１／２７３３１　Ａ２に記載されるような「変性陰イオン交換（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　Ａｎｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ）ＨＰＬＣ」（ＤＥＡＨＰＬＣ）である。別の実施形態において、このカラムクロマトグラフィーは、Ｇｊｅｒｄｅ、米国特許第６，０２４，８７８号に記載されるようなアイソクラチック（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）ＨＰＬＣである。別の実施形態において、このカラムクロマトグラフィーは、「完全変性（Ｆｕｌｌｙ　Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）ＨＰＬＣ」（ＦＤＨＰＬＣ）である。好ましい実施形態は、「変性ＨＰＬＣ」（「ＤＨＰＬＣ」）と呼ばれる技術の使用である。別の実施形態において、このカラムクロマトグラフィーは、勾配ゲルクロマトグラフィーである。本明細書中で使用される場合、変性条件とは、部分的な変性条件（オリゴヌクレオチドが部分的に変性される条件下）、および完全な変性条件（オリゴヌクレオチドが完全に変性される条件下）の両方をいう。部分的な変性とは、二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチ塩基対（しかし、この二本鎖オリゴヌクレオチドの残りの部分または残りの全体はインタクトである）の分離をいう。これは、二本鎖が、塩基対ミスマッチの部位で、この鎖の残りを変性するのに必要とされるより簡単に（例えば、より低い温度で）変性することに起因して生じる。
【００２６】
本発明における使用に適切なオリグヌクレオチドは、任意の二本鎖配列である。好ましいオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡである。二本鎖ＤＮＡは、全長遺伝子および全長遺伝子のフラグメントを含む。例えば、このＤＮＡフラグメントは、結合された場合、この遺伝子のより大きな部分または全体遺伝子を形成する遺伝子の部分であり得る。
【００２７】
天然塩基のみを含む合成二本鎖ＤＮＡフラグメントのＤＨＰＬＣによる、合成副産物からの分離は、本発明の例示的な例として記載される。ＤＨＰＬＣは、天然供給源から単離されたＤＮＡに生じる変異を検出するために使用されている分析技術である。この技術は、ＰＣＲ増幅後に、ゲノムＤＮＡにおける多型性を検出する。この技術は、以下のように実行される。試験サンプルは、ゲノムＤＮＡにおける目的の領域を増幅するＰＣＲによって形成される。この試験サンプルは、多型性のないＤＮＡから得られる増幅されたコントロールサンプルと混合される。この試験サンプルおよびコントロールサンプルの混合物は、変性され、そして復元されて、両方のサンプルから増幅された鎖より構成される二本鎖を形成する。次いで、この試験混合物は、ＤＨＰＬＣによって分析される。Ｏｅｆｎｅｒおよび同僚は、ＤＨＰＬＣの２つのバリエーションを記載している：分離が特定の変性条件下でなされる第一バーション（Ｏｅｆｎｅｒ，Ｐ．Ｊ．、Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｐ．Ａ．（１９９８）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｂｙ　Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，米国特許第５，７９５，９７６号、およびＯｅｆｎｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｐ．Ａ．（１９９８）ＤＮＡ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，補遺１９，７．１０．１−７．１０．１２）ならびにＤＮＡ分子が完全に変性される第二バージョン（Ｏｅｆｎｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．７３９（２）：３４５−３５５，２０００）。本発明において、ＤＨＰＬＣを分取技術として使用して、合成副産物を含まない分子に対する集団合成ＤＮＡフラグメントを豊富にし得ることが発見された。１５塩基対〜１０，０００塩基対の範囲の二本鎖ＤＮＡフラグメントは、代表的に、大きなＤＮＡフラグメントの化学合成の間に産生される。本発明において、これらの中間体は、合成ＤＮＡの高純度のフラグメントの集団を単離し、従って配列エラー率を減少するのに十分な条件下で分取ＤＨＰＬＣ（Ｖａｒｉａｎ　Ｉｎｃ．Ｗａｌｎｕｔ　Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ製　ＰｒｏＳｔａｒ　Ｈｅｌｉｘ　ＨＰＬＣシステム、のような自動化システムを使用する）に供される。
【００２８】
各フラグメントを、ソフトウェア（例えば、ＤＨＰＬＣ　Ｍｅｌｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ；ＷＡＶＥＭＡＫＥＲＴＭ　Ｕｔｉｌｉｔｙ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｏｍａｈａ，ＮＥ；Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ、米国特許第６，１９７，５１６号に記載されるコンピュータ方法）を使用して分析して、所望の二本鎖オリゴヌクレオチド集団由来の合成失敗物を枯渇または初期枯渇するのに十分な特定の運転条件（例えば、温度および勾配条件）を計算する。このフラグメントは、ＨＰＬＣに注入され、そして特定の条件下で運転される。調整（例えば、温度の数℃の変化）がなされて、特定のフラグメントのための条件を最適化し得ることは当業者にとって明らかである。主なピークを収集し、そして溶媒を除去するために乾燥し、次いで遺伝子のアセンブリを続けるために使用する。合成副産物は、例えば、意図された相補的な天然塩基を有する塩基対を欠乏する。従って、副産物を含むＤＮＡ配列は、より低い融点を有し、そしてこれらの条件下で移動度の変化を示す。主要なピークにおけるＤＮＡ分子は全て、同じ融解プロフィールを有し、そして合成副産物を保持しないようである。
【００２９】
ＤＨＰＬＣは、容易に自動化され得、そして化学的に合成されたＤＮＡサンプル由来の合成副産物を物理的に減少するハイスループット方法を提供し得る。例えば、１０００ｂｐ長未満の合成ＤＮＡフラグメントは、部分的に、ＤＮＡ、収集された主要ピークおよび排出されたＨＰＬＣフロースルーの残渣を変性する条件下でカラムに注入される。このピークは、ＤＮＡフラグメントを含む；天然塩基の代わりに合成副産物を保有する本来の集団におけるほとんどの分子は、移動度の変化を示し、従って排出される。あるいは、１００ｂｐ長未満の合成ＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡ鎖を完全に変性する条件下でカラムに注入される。２つの主要ピークは収集され、そしてＨＰＬＣフロースルーの残渣は排出される。この２つのピークのそれぞれは、一本鎖の合成ＤＮＡを含む；天然塩基の代わりに合成副産物を保有する本来の集団におけるほとんどの分子は、移動度の変化を示し、従って排出される。この２つのピークは組み合わせられ。そして一緒にハイブリダイズされて、合成副産物を保有しそうになく、従ってクローニングされる場合、所望の配列を生じる可能性がさらに高い遺伝子合成のための中間体フラグメントを形成する。
【００３０】
上記のように、クロマトグラフィーは、所望の二本鎖ＤＮＡから合成失敗物を分離的に枯渇するのに適切な条件下で実行される。１つの実施形態において、温度および勾配条件は、ＤＨＰＬＣによる分離を可能にするように調整される。この温度および勾配条件は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能なＤＨＰＬＣ　Ｍｅｌｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｍｅｌｔ．ｈｔｍｌ）を使用して計算され得る。各二本鎖ＤＮＡは、二本鎖構造の強度の関数である温度で変性する。完全に天然塩基対のＤＮＡ配列は、最も安定な二本鎖を形成し、そして最もストリンジェントな条件下で変性する。塩基改変を有するＤＮＡ配列は、ほとんど安定な二本差を形成せず、より低い温度で変性し、従って、所定の温度および勾配プロフィールでの移動度の増加を示す。
【００３１】
ゲルベースの技術（例えば、二本鎖配座分析（ＤＳＣＡ））およびキャピラリーベースの配座感受性ゲル電気泳動（キャピラリーＣＳＧＥ）をまた使用して、核酸配列の集団において多数の正確な配列を豊富にし得る。ＤＨＰＬＣの様に、これらのゲルベースの方法は、非マッチング塩基対に起因する二本鎖における配座に基づく変異を検出するために使用されている分析技術である。これらの技術は、ホモ二本鎖とは異なるヘテロ二本鎖の電気泳動移動度に依存する。スラブゲルに基づくいくつかの他の変異検出技術［例えば、一定勾配ゲル電気泳動（ＣＧＧＥ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、および温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）］は、塩基対組成に依存するＤＮＡフラグメントの融点の微妙な差異におよびゲルにおける変異体フラグメントの移動度の結果として生じる差異に基づく。二本鎖核酸の分離された集団は、ゲルからバンドの切り出しによって単離され得る。
【００３２】
キャピラリーＣＳＧＥは、キャピラリー電気泳動に基づく（Ｒｏｚｙｃｋａ　Ｍ，Ｃｏｌｌｉｎ　Ｎ，Ｓｔｒａｔｔｏｎ　ＭＲ，Ｗｏｏｓｔｅｒ　Ｒ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　７０（１）：３４−４０，２０００）。ＤＳＣＡのように、この技術は、ヘテロ二本鎖核酸とホモ二本鎖核酸との間の配座差異に依存する。ＣＳＧＥについて、サイズ分画されたまたは形状分画されたＤＮＡフラグメントを含む画分は、移動親和性膜上またはサンプルチャンバへ収集され得る。収集工程の正確なタイミングは、キャピラリーの末端近くの２つの検出点間で測定される各個々のゾーンの速度を決定することによって達成される。
【００３３】
本発明の好ましい使用は、天然塩基のみを含む二本鎖ＤＮＡフラグメントのための画分を豊富にすることによる化学的な遺伝子合成に対してである。このようなフラグメントは、結合（例えば、ライゲーション）されて、完全遺伝子を形成する。
【００３４】
以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定のために提供されるものではない。
【００３５】
（実施例）
（実施例１）
（ｌａｃＩ遺伝子のオペレーター結合領域由来の２０５ｂｐ　ＤＮＡフラグメントの合成）
βガラクトシダーゼは、Ｘ−ｇａｌを無色の化合物からあでやかな青色（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ）の化合物へ変換し得る酵素である（Ｍａｎｎｉａｔｉｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。このｌａｃＩ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてβガラクトシダーゼ合成のリプレッサーをコードする。機能的なｌａｃリプレッサーを有する細胞において、βガラクトシダーゼの合成を抑制し、そしてＸ−ｇａｌプレート上で増殖するコロニーは、白色である。ｌａｃリプレッサー遺伝子が不活性である場合、βガラクトシダーゼを生成し、そしてコロニーは、明るい青（ｂｒｉｇｈｔ　ｂｌｕｅ）色である。ｌａｃリプレッサーの機能を簡単に測定し得るので、インビトロアッセイにおいて、広範囲な遺伝子解析の主体となっている（Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４０：４２１−３３，１９９４；Ｓｕｃｋｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６１：４２１−３３，１９９６）。この研究に基づいて、タンパク質を不活化せずに変更され得ない２０５塩基対フラグメント中の４つのＧ残基を選択した。従って、これらの残基の配列を、Ｌａｃリプレッサー機能についてアッセイすることで決定し得る。
【００３６】
以下：
【００３７】
【化１】
2004509609.tif 000002
の配列を有するｌａｃＩ遺伝子の２０５塩基対セグメントを、１セットの重複二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して合成する。
【００３８】
遺伝子を作成するために使用するオリゴヌクレオチドを、Ｂｅｃｋｍａｎ　３０ｎＭ　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｃｏｌｕｍｎを使用するＯｌｉｇｏ　１０００Ｍ　ＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて調製する。全ての標準的なホスホルアミダイトおよび補助合成試薬をＧｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から得る。オリゴヌクレオチドの化学的なリン酸化を、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ＩＩ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をもちいて行う。濃縮アンモニアを、Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＮＪ）から得る。４０％　Ｎ−メチルアミンを、Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から得る。固体支持体からの切断後、このオリゴヌクレオチドを、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈから提供された指示手引きに従ってＰｏｌｙ−Ｐａｋ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを使用してＴｒｉｔｙｌ　Ｏｎ精製する。Ｔｒｉｔｙｌ　Ｏｎ精製のための試薬は、Ｂｕｒｄｉｃｋ　＆　Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）から得られるＨＰＬＣグレードのアセトニトリルおよび水である。酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７．０）および３％トリフルオロ酢酸を含有する水を、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手する。精製後、合成されたオリゴヌクレオチドを、ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）中で乾燥するまでエバポレートしてＨＰＬＣグレード水に再懸濁する。オリゴヌクレオチドの濃度を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ　ＩＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）での２６０ｎｍ吸光度を読むことによって決定する。
【００３９】
オリゴヌクレオチドを使用して、５００ｐｍｏｌｅの相補的オリゴヌクレオチドのそれぞれをｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥して、そして１０μｌ　ＴＥ中に再懸濁することによって二本鎖フラグメントを形成する。この溶液（２５０ｐｍｏｌｅ）の５μｌのサンプルを、１０μｌの２×ＳＳＰＥ（Ｍａｎｎｉａｔｉｓに従って調製する）と混合し、９５℃まで加熱し、そして室温まで冷却する。
【００４０】
二本鎖を、全長産物を作成するまで、首尾良く一緒にライゲーションして、より長いフラグメントを作成する。各ライゲーションは、５００ピコモルの１対の二本鎖オリゴヌクレオチド、３μｌの１０×ライゲーション緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ　Ｉｎｃ．，Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、１０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（製品番号ＥＬ００１６、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および水からなり、３０μｌの総容積とする。全ての二本鎖を同じ条件かで一緒にライゲーションする。各ライゲーション混合物を、３７℃で６０分間インキュベートし、６５℃まで１０分間加熱し、そしてＨＰＬＣによってフラグメントを単離する。
【００４１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、２つの高精度高圧ポンプ（ＰｒｏＳｔａｒ　２１５　Ｓｏｌｖｅｎｔ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｍｏｄｕｌｅｓ）、カラムオーブン（ＰｒｏＳｔａｒ　５１０　Ａｉｒ　Ｏｖｅｎ）、ＵＶ検出器（ＰｒｏＳｔａｒ　３２０　ＵＶ／Ｖｉｓ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）および画分収集器（Ｄｙｎａｍａｘ　ＦＣ−１　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）（全ては、Ｓｔａｒ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．３１）によって制御される）からなるＶａｒｉａｎ　Ｉｎｃ．（Ｗａｌｎｕｔ　Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）製のＰｒｏＳｔａｒ　Ｈｅｌｉｘ　ＨＰＬＣシステムで実行する。使用するカラムは、インラインＧｕａｒｄ　Ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩＤ×１２．５ｍｍ、３．５ミクロン）を備えるＺｏｒｂａｘ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　ｄｓＤＮＡ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩＤ×７５ｍｍ、３．５ミクロン）（共にＡｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）製）である。以下の予め作成された緩衝液を、Ｖａｒｉａｎ　Ｉｎｃ．（Ｗａｌｎｕｔ　Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）から得る；Ｈｅｌｉｘ　ＢｕｆｆｅｒＰａｋ「Ａ」（１００ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）およびＨｅｌｉｘ　ＢｕｆｆｅｒＰａｋ「Ｂ」（１００ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ含有２５体積％アセトニトリル）。化学的に純粋な富化配列を単離するための温度および勾配条件を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能なＤＨＰＬＣ　Ｍｅｌｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｍｅｌｔ．ｈｔｍｌ）を使用して計算する。溶出プロフィールを、吸光度２６０ｎｍを用いてＵＶ検出器を使用してモニターする。
【００４２】
ライゲーションしたフラグメントを、ＨＰＬＣ緩衝液から乾燥し、そしてＴＥに再懸濁する。これらのフラグメントを、次のセットのライゲーション反応に使用する。数回のライゲーションについで精製およびフラグメント単離を使用して、ｌａｃＩ遺伝子の２０５塩基対フラグメントを構築する。
【００４３】
（実施例２）
（ｌａｃＩ遺伝子の２０５塩基対フラグメントの機能性試験）
実施例１で産生された合成フラグメントを、ｌａｃＩ遺伝子ヘクローニングして、その機能を試験する。３μｇのプラスミドベクターｐＷＢ１０００（Ｌｅｈｍｉｎｇら、ＰＮＡＳ，８５：７９４７−７９５１，１９８８）を制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩ、ならびに製造業者の指示に従ってＳｔｒａｔａ　Ｐｒｅｐ　ＤＮＡ抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　製品番号４００７６６）を使用して精製したベクターフラグメントゲルで消化し、そして１００μｌのＴＥ中に再懸濁する。１μｇのｌａｃＩフラグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでで処理し、フェノールで一度およびクロロホルムで一度抽出し、エタノール沈殿し、そして２０μｌのＴＥ中に再懸濁する。５μｌの切断ベクターおよび１μｌの合成ｌａｃＩフラグメントを、製造業者の指示に従って、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを使用して１００μｌの総容積でライゲーションする。このライゲーション混合物をＳｔｒａｔａｃｌｅａｎで一度抽出し、濃縮し、そして１／１０の濃度のＴＥで二回洗浄し、そして１／１０の濃度のＴＥに１０μｌの容量にする。１μｌのこの混合物を、製造業者の指示に従ってＢＴＸ　ＥＣＭ３９９エレクトロポレーター（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用するエレクトロポレーションによってプラスミドｐＷＢ３１０（Ｌｅｈｍｉｎｇら、ＥＭＢＯ，６：３１４５−３１５３，１９８７）を保有するＥ．ｃｏｌｉ株ＤＣ４１−２へトランスフェクトする。コロニーを、１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン、２００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、６０ｍｇ／ＬのＸ−ｇａｌおよび３００ｍｇ／ＬのＩＰＴＧの存在下でＬＢプレート上で一晩増殖させた。機能的ｌａｃＩ遺伝子を有するプラスミドを保有するコロニーは、白色である；機能的ｌａｃＩを有さないものは青色である。
【００４４】
（実施例３）
（塩基８６、８８、１３３、または１７８でジアミノプリンを含む２０５ｂｐ　ＤＮＡフラグメントの調製）
オリゴヌクレオチド合成の１つの一般的な副反応は、ＤＮＡ鎖におけるｄＧ残基からのジアミノプリンの形成である。２，６−ジアミノプリンを含む改変オリゴヌクレオチドを、Ｔｒｉｌｉｎｋ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得、そして２０５ｂｐ　ｌａｃＩ遺伝子フラグメントへ組み込む。４つのサンプルを、各サンプルにおけるｄＧ残基を置換した１つのジアミノプリン残基（下の標識Ｄ）を用いて実施例１に記載されるように調製した。
【００４５】
【表１】
2004509609.tif 000003
（実施例４）
（８６位または１３３位でｄＵを含む２０５ｂｐ　ＤＮＡフラグメントの調製）
オリグヌクレオチド合成の第二の一般的な副反応は、ＤＮＡ鎖におけるウラシル（ｄＵ）を形成するためのデオキシシチジンのＮ４−アミンの脱アミノ化である。ウラシル（ｄＵ）を含む改変オリゴヌクレオチドを、Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）から得、そして２０５ｂｐ　ｌａｃＩ遺伝子フラグメントへ組み込む。２つのサンプルを、各サンプルにおけるｄＣ残基を置換した１つのウラシル残基（下の標識ｄＵ）を用いて実施例１に記載されるように調製した。
【００４６】
【表２】
2004509609.tif 000004
（実施例５）
（１３４位または１８２位で無塩基部位を含む２０５ｂｐ　ＤＮＡフラグメントの調製）
オリゴヌクレオチド合成の第３の一般的副反応は、鎖延長の間の保護アデノシン残基の脱プリン化による無塩基部位の形成である。ウラシル（ｄＵ）を含む改変オリゴヌクレオチドを、Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）から得、そして２０５ｂｐ　ｌａｃＩ遺伝子フラグメントへ組み込む。２つのサンプルを、各サンプルにおけるｄＡ残基を置換した１つのウラシル残基（下の標識ｄＵ）を用いて実施例１に記載されるように調製した。
【００４７】
【表３】
2004509609.tif 000005
２０５塩基対フラグメントの合成およびＨＰＬＣ精製の後、ＤＮＡを、製造業者の指示に従ってウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理して、ウラシル塩基を除去し、ネイティブ２０５塩基対フラグメントにおいて対応するＡ残基の代わりにアプリン部位を残す。
【００４８】
（実施例６）
（ｌａｃＩ配列に対する温度条件および勾配ＨＰＬＣ条件の計算）
化学的に純粋な富化された配列を単離するための温度条件および勾配条件を、、Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能であり、かつ事件番号Ｓ９５−０２４と呼ばれるＳｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｏｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇからの許可のために利用可能なＤＨＰＬＣ　Ｍｅｌｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｍｅｌｔ．ｈｔｍｌ）を用いて計算する。２０５塩基対フラグメントの両末端のいずれかでの４塩基一本鎖領域を除去して、以下の１９７塩基対配列を得る。
【００４９】
【化２】
2004509609.tif 000006
勾配を、時間１、２および３での緩衝液Ｂパーセント（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）として、下に特定する。勾配を、０．５分でＢ１〜Ｂ２で実施し、次いで３．０分でＢ２〜Ｂ３で実施する。
【００５０】
【表４】
2004509609.tif 000007
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂは、実施例１に記載されるのと同様である。
【００５１】
（実施例７）
（ネイティブｌａｃＩフラグメントおよび８つの改変ｌａｃＩフラグメントの温度依存クロマトグラフィープロフィールの決定）
ネイティブｌａｃＩ　ＤＮＡおよび８つの改変ｌａｃＩ　ＤＮＡのクロマトグラフの動きを、勾配条件および温度条件の範囲に応じて測定する。ｌａｃＩ　ＤＮＡは、以下である：
【００５２】
【表５】
2004509609.tif 000008
。
【００５３】
２５ｐｍｏｌｅの各サンプルを、５μｌのＨＰＬＣグレードの水に懸濁し、そしてインラインＰｒｅ−Ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩＤ×１２．５ｍｍ、３．５ミクロン）を備えるＺｏｒｂａｘ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　ｄｓ　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩＤ×７５ｍｍ、３．５ミクロン）上で、１００ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる緩衝液Ａおよび１００ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する２５体積％アセトニトリルからなる緩衝液Ｂを用いて直接クロマトグラフィーする。各勾配条件および温度条件の詳細は、実施例６に記載するのと同様である。
【００５４】
各フラグメントは、二本鎖構造の強度の関数である温度で変性される。完全に塩基対であるネイティブｌａｃＩ配列は、最も安定な二本鎖を形成し、そして最もストリンジェントな条件下で変性する。塩基改変を有するフラグメントは、より不安定な二本鎖を形成し、より低い温度で変性し、従って所定の温度および勾配プロフィールでより早い溶出を示す。
【００５５】
（実施例８）
（改変塩基を保有するｌａｃＩ遺伝子の２０５塩基対フラグメントの機能性試験）
実施例３、実施例４および実施例５において産生した合成フラグメント（フラグメントＤ−Ｔ８６、Ｄ−Ｔ８８、Ｄ−Ｔ１３３、Ｄ−Ｔ１７８、Ｕ−Ｂ８６、Ｕ−Ｂ１３３、Ａ−Ｂ１３４、Ａ−Ｔ１８２）を、ｌａｃＩ遺伝子へクローニングして、その生物学的機能を試験する。１０μｇのプラスミドベクターｐＷＢ１０００（Ｌｅｈｍｉｎｇら、ＰＮＡＳ　８５：７９４７−７９５１，１９８８）を、制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩ、ならびに製造業者の指示に従ってＳｔｒａｔａ　Ｐｒｅｐ　ＤＮＡ抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　製品番号４００７６６）を使用して精製したベクターフラグメントゲルで消化し、そして１００μｌのＴＥ中に再懸濁する。１μｇの各ｌａｃＩフラグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、フェノールで一度およびクロロホルムで一度抽出し、エタノール沈殿し、そして２０μｌのＴＥ中に再懸濁する。５μｌの切断ベクターおよび１μｌの合成ｌａｃＩフラグメントを、製造業者の指示に従って、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを使用して１００μｌの総容積でライゲーションする。このライゲーション混合物をＳｔｒａｔａｃｌｅａｎで一度抽出し、濃縮し、そして１／１０の濃度のＴＥで二回洗浄し、そして１／１０の濃度のＴＥで１０μｌの容量にする。１μｌのこの混合物を、製造業者の指示に従ってＢＴＸ　ＥＣＭ３９９エレクトロポレーターを使用するエレクトロポレーションによってプラスミドｐＷＢ３１０（Ｌｅｈｍｉｎｇら、ＥＭＢＯ，６：３１４５−３１５３，１９８７）を保有するＥ．ｃｏｌｉ株ＤＣ４１−２へトランスフェクトする。コロニーを、１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン、２００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、６０ｍｇ／ＬのＸ−ｇａｌおよび３００ｍｇ／ＬのＩＰＴＧの存在下でＬＢプレート上で一晩増殖させる。機能的ｌａｃＩ遺伝子を有するプラスミドを保有するコロニーは、白色である；機能的ｌａｃＩを有さないものは青色である。各改変フラグメントを、実施例２に記載するようなネイティブ合成ｌａｃＩフラグメントのクローン由来の青色コロニーの頻度と比較した青色コロニーの頻度によって特徴付けする。
【００５６】
（実施例９）
（分取ＨＰＬＣによるネイティブｌａｃＩフラグメントおよび改変ｌａｃＩフラグメントの混合物からのネイティブｌａｃＩフラグメントの富化）
ＨＰＬＣ技術が副産物を含む合成ＤＮＡの存在下で「正確な」合成ＤＮＡを富化する能力を、８つの改変ｌａｃＩ　ＤＮＡのそれぞれを用いてネイティブｌａｃＩ　ＤＮＡをスパイクする（ｓｐｉｋｉｎｇ）ことによって、そしてＨＰＬＣを使用して混合物からネイティブＤＮＡを富化することによって示す。８つの間編ＤＮＡフラグメント（フラグメントＤ−Ｔ８６、Ｄ−Ｔ８８、Ｄ−Ｔ１３３、Ｄ−Ｔ１７８、Ｕ−Ｂ８６、Ｕ−Ｂ１３３、Ａ−Ｂ１３４、Ａ−Ｔ１８２）のそれぞれについて、ネイティブおよび改変フラグメントの等モルの混合物を、２０ｐｍｏｌｅの改変フラグメントと２０ｐｍｏｌｅのネイティブフラグメントを混合することによって調製する。各混合物の画分を、下記の機能性試験のために保持する。これらのサンプルのそれぞれの残渣を、ネイティブフラグメントと比較して改変フラグメントの移動度を変更する温度条件および勾配条件（実施例７と同一）を使用してクロマトグラフィーする。各サンプルについて、ピークを、実施例１に記載するように、実施例７で決定した溶出時間で画分収集器を用いて収集する。２つの画分（改変ＤＮＡフラグメントの移動度特性を有する画分、そしてネイティブＤＮＡフラグメントのより低い移動度特性を有する画分）を収集する。これらの画分を乾燥し、そして実施例８に記載するようにクローニングする。同時に、８つの未分画混合物のそれぞれの一部をクローニングし、そして同じ方法で試験する。「ネイティブ画分」フラグメントは、青色コロニーの頻度によって示すように、本来の混合物または初期溶出画分より少ない数の配列エラーを示す。
【００５７】
（実施例１０）
（ｎ−１、ｎ＋、Ｔ／ＧおよびＧ／Ｇ合成エラーを含む４８ｂｐ　二本鎖フラグメントの調製）
ライゲーションに起因するミスマッチのような合成エラーまたは化学オリゴヌクレオチド合成の間に形成されるｎ−１およびｎ＋副産物を含むＤＮＡからＨＰＬＣによって「正確な」合成ＤＮＡを分離する能力を、４つの改変４８マーのそれぞれを用いて正確な配列４８ｂｐ　二本鎖コントロールをスパイクすることによって、示す。４８ｂｐ二本鎖核酸のそれぞれを、１セットの重複二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して合成する。
【００５８】
コントロールおよび合成副産物を含む４つの配列を、以下に示す：
【００５９】
【化３】
2004509609.tif 000009
。
【００６０】
（実施例１１）
（４８マー配列についての温度条件および勾配ＨＰＬＣ条件の計算）
化学的に純粋な富化された配列を単離するための温度条件および勾配条件を、ＤＨＰＬＣ　Ｍｅｌｔ　Ｐｒｏｇｒａｍを用いて計算する。実施例１０のコントロール配列を、計算に対する入力として使用した。
【００６１】
勾配を、緩衝溶液Ｂパーセントとして下に特定する。勾配を０．５分でＢ１〜Ｂ２で、次いで３．０分でＢ２〜Ｂ３で実施する。
【００６２】
【表６】
2004509609.tif 000010
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂは、実施例１に記載するのと同様である。
【００６３】
（実施例１２）
（ｎ−１、ｎ＋、Ｔ／ＧおよびＧ／Ｇ合成エラーを含む４８ｂｐ二本鎖フラグメントからの正確な４８ｂｐ二本鎖コントロールフラグメントの分取ＨＰＬＣによる分離）
コントロールフラグメントおよびこのコントロールフラグメントと合成エラーを含む各フラグメントの１：１混合物をＨＰＬＣに供する。１２．５ｐｍｏｌサンプルをコントロールとして使用し、そして２５ｐｍｏｌｅの各混合サンプル（１２．５ｐｍｏｌのコントロール＋１２．５ｐｍｏｌのエラー含有フラグメント）を、５μｌのＨＰＬＣグレード水に懸濁し、そしてインラインＰｒｅ−Ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩＤ×１２．５ｍｍ、３．５ミクロン）と共に備えるＺｏｒｂａｘ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　ｄｓ　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍＩＤ×７５ｍｍ、３．５ミクロン）上で、１００ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる緩衝液Ａおよび１００ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する２５体積％アセトニトリルからなる緩衝液Ｂを用いて直接クロマトグラフィーする。勾配条件および温度条件の詳細は、実施例１１に記載するのと同様である。
【００６４】
使用するＨＰＬＣ条件下で、制御フラグメントは単一ピークとして溶出する。合成エラーを含むフラグメントとコントロールフラグメントの混合物の４つの分離物のそれぞれについて、コントロールピークの曲線下で少なくとも同様の面積を有するピークは、コントロールピークに対応する保持時間で溶出する。コントロールピークより早い時間で溶出する新しいピークは、混合物のクロマトグラムのそれぞれに存在する。
【００６５】
上由来のピークのそれぞれを、実施例１に記載される画分収集器によって収集する。これらの画分を、エバポレートし、そして１００μｌの水へ再懸濁する。５μｌのこれらのサンプルを、上記と同じ条件を使用してＨＰＬＣに再注入する。各ピークに対する保持時間は、同じままである。
【００６６】
使用するＨＰＬＣ条件によって、混合物をコントロールに対応する保持時間を有する集団およびコントロールとは異なる集団へ分離する。
【００６７】
前述から、本発明の特定の実施形態が、例示目的のために本明細書中に記載されているが、種々の改変は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、明らかである。
【国際公開パンフレット】
2004509609.tif 000011
2004509609.tif 000012
2004509609.tif 000013
2004509609.tif 000014
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2004509609.tif 000016
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2004509609.tif 000019
2004509609.tif 000020
2004509609.tif 000021
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2004509609.tif 000034
2004509609.tif 000035
【国際調査報告】
2004509609.tif 000036
2004509609.tif 000037
2004509609.tif 000038