(57)【要約】本発明は、細胞表面のＨＬＡ−Ｃｗ３分子およびＨＬＡ−Ｃｗ６分子に結合するペプチドエピトープを教示する。ペプチドをコードするＤＮＡ分子、そしてＨＬＡ／ペプチドの複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞と同様に、そのペプチドは診断および治療に有用である。さらに、本発明の一つの特徴は、異なるウイルスベクターを使用して刺激および再刺激を用いるシステムにおいて、本明細書中に記載されるような関連分子を同定する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ｃｗ３分子に結合する、単離されたペプチドであって、該ペプチドとＨＬＡ−Ｃｗ３分子の複合体に特異的なＴ細胞増殖を惹起させ、該ペプチドのアミノ酸配列が配列番号２からなる、単離されたペプチド。
【請求項２】
ＨＬＡ−Ｃｗ６分子に結合する、単離されたペプチドであって、該ペプチドとＨＬＡ−Ｃｗ６分子の複合体に特異的なＴ細胞増殖を惹起させ、該ペプチドのアミノ酸配列が配列番号３からなる、単離されたペプチド。
【請求項３】
ＨＬＡ−Ｃｗ３分子および請求項１に記載のペプチドの複合体に特異的な、単離された細胞溶解性Ｔ細胞。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ｃｗ６分子および請求項２に記載のペプチドの複合体に特異的な、単離された細胞溶解性Ｔ細胞。
【請求項５】
細胞表面にＨＬＡ−Ｃｗ３分子と請求項１に記載のペプチドとの複合体を提示する細胞と、Ｔ細胞を含有するサンプルとを接触させて、該複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞増殖の応答を刺激する工程を包含する、方法。
【請求項６】
細胞表面にＨＬＡ−Ｃｗ６分子と請求項２に記載のペプチドとの複合体を提示する細胞と、Ｔ細胞を含有するサンプルとを接触させて、該複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞増殖の応答を刺激する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞免疫学の状況において有益なペプチドに関する。さらに具体的には、本発明は細胞表面のＨＬＡ分子に結合するペプチドに関する。少なくとも、これらペプチドのいくつかはまた、それらの相手であるＨＬＡ分子と複合体を形成する場合、細胞溶解性Ｔ細胞の活性化を誘導する。また、本発明の一部は、例えばＨＬＡ−Ｃｗ３陽性細胞およびＨＬＡ−Ｃｗ６陽性細胞の同定、Ｔ細胞の活性化、細胞溶解性Ｔ細胞自身に加え、特定のＴ細胞の存在の決定などの領域での、これらペプチドの使用である。
（背景および従来技術）
宿主生物による癌細胞の認識の研究、あるいは癌細胞の認識の欠如の研究が多くの種々の方向性で進んできた。その分野の理解は、基礎免疫学および腫瘍学の両者のいくらかの理解になるかもしれない。
【０００２】
マウスの腫瘍に関する初期の研究は、マウス腫瘍が、同系動物に移植した場合に腫瘍細胞の拒絶を引き起こす分子を提示することを明らかにした。これら分子は、移植を受けた動物におけるＴ細胞によって「認識」され、そして移植された細胞の溶解を伴う細胞溶解性Ｔ細胞応答を惹起させる。この証拠は、最初は、例えばメチルコラントレンのような化学的発癌物質によりインビトロで誘導された腫瘍より得られた。腫瘍により発現され、そしてＴ細胞応答を誘導する抗原が、各々の腫瘍で異なっていることが見出された。化学的発癌物質を用いた腫瘍の誘導および細胞表面抗原の差異についての一般的な教示は、Ｐｒｅｈｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．１８：７６９−７７８（１９５７）；Ｋｌｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０：１５６１−１５７２（１９６０）；Ｇｒｏｓｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：３２６−３３３（１９４３）、Ｂａｓｏｍｂｒｉｏ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３０：２４５８−２４６２（１９７０）を参照のこと。この抗原分類は「腫瘍特異移植抗原」あるいは「ＴＳＴＡ」として知られるようになった。化学的発癌物質により誘導された場合のＴＳＴＡ抗原提示の観察に従って、同様の結果が紫外線照射によってインビトロで腫瘍を誘発させる場合に得られた。これについてはＫｒｉｐｋｅ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．５３：３３３−１３３６（１９７４）を参照のこと。
【０００３】
上記の腫瘍の型についてはＴ細胞媒介性免疫反応が見られたが、自然発生の腫瘍は一般的に非免疫原であると考えられていた。従って、以上のことにより、腫瘍を有する被験体において、腫瘍に対する反応を惹起させる抗原は存在しないと考えられていた。Ｈｅｗｉｔｔら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３３：２４１−２５９（１９７６）参照のこと。ｔｕｍ抗原を提示する細胞株のファミリーは、Ｂｏｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４−１１９３（１９８０）（その開示は参考として援用される）の文献に記載されるように、マウスの腫瘍細胞もしくは細胞株の変異誘発により得られた免疫原性の改変体である。詳しく述べると、ｔｕｍ抗原は、同系マウスにおいて免疫反応を起こさず、かつ腫瘍を形成する腫瘍細胞を変異させることにより得られる（つまり「ｔｕｍ＋」細胞）。これらのｔｕｍ＋細胞が変異誘発された場合、これらの細胞は同系マウスに拒絶され、そして腫瘍形成を起こさない（よって「ｔｕｍ−」）。Ｂｏｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：２７２（１９７７）を参照のこと。その開示は参考として援用される。多くの腫瘍の型は、この現象を表すことが示されている。これについては例えばＦｒｏｓｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：１２５（１９８３）を参照のこと。ｔｕｍ−改変体は免疫拒絶過程を開始するので進行性の腫瘍を形成することが出来ない。この仮説を支持する証拠として、腫瘍の「ｔｕｍ−」改変体（つまりそれらの細胞は通常は腫瘍を形成しない）が、致死未満の紫外線照射にて免疫系を抑制されたマウスにおいて腫瘍を形成する能力（Ｖａｎ  Ｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５２８２−５２８５（１９７９））；および肥満細胞腫Ｐ８１５というｔｕｍ−細胞は腹腔内注入されると、１２日〜１５日間は対数増殖を行い、そしてリンパ球とマクロファージが殺到する間の僅か数日で排除されるという観察（Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１７５−１１８３（１９８０））が挙げられる。更なる証拠としては、マウスが免疫記憶を獲得し、この免疫記憶により、次の腫瘍細胞のチャレンジとともに免疫抑制量の照射が行われた場合でも、次の同じｔｕｍ改変体に対するチャレンジに耐性になるという観察が挙げられる（Ｂｏｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：２７２−２７５（１９７７）；Ｖａｎ  Ｐｅｌら、前出；Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら、前出）。後者の研究により、自然発生の腫瘍が変異誘発に供される場合、実際に応答を引き起こす免疫原性改変体が生じることが分かった。実際、これらの改変体は元の腫瘍に対して免疫防御応答を導く事が可能であった。Ｖａｎ  Ｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：１９９２−２００１（１９８３）参照のこと。このように、同系統の拒絶応答の標的である腫瘍において、いわゆる「腫瘍拒絶抗原」の提示を導く事が可能であることが示された。外来遺伝子を自然発生の腫瘍にトランスフェクトすると、同様の結果が認められた。このことに関しては、Ｆｅａｒｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２９７５−１９８０（１９８８）参照のこと。
【０００４】
腫瘍細胞の表面に提示され、細胞溶解性Ｔ細胞により認識されて細胞溶解を招く抗原クラスが認められた。この抗原クラスは、「腫瘍拒絶抗原」あるいは「ＴＲＡ」と以下で称される。ＴＲＡは抗体反応を誘導してもよいし、誘導しなくてもよい。これらの抗原が研究されてきた範囲は、インビトロの細胞溶解性Ｔ細胞の特徴付けの研究、すなわち、特定の細胞溶解性Ｔ細胞（以下ＣＴＬ）サブセットによる抗原同定の研究を通してであった。提示された腫瘍拒絶抗原の認識に際してこのサブセットが増殖し、腫瘍拒絶抗原を提示する細胞が溶解される。腫瘍拒絶抗原を発現している細胞を特異的に溶解させるＣＴＬクローンが、特徴付けの研究により同定された。この業績の例としては、Ｌｅｖｙら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２４：１−５９（１９７７）；Ｂｏｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４−１１９３（１９８０）；Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：１６２７−１６３４（１９８０）；Ｍａｒｙａｎｓｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：１６２７−１６３４（１９８０）；Ｍａｒｙａｎｓｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４０６−４１２（１９８２）；Ｐａｌｌａｄｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４７：５０７４−５０７９（１９８７）に見出され得る。この種の分析には、非主要組織適合抗原、雄性特異的Ｈ−Ｙ抗原、そして本明細書に記載される「ｔｕｍ−」抗原と称される抗原クラスなどを含む、ＣＴＬにより認識される別種類の抗原が必要である。
【０００５】
上記に記載される主題の典型的な腫瘍としては、Ｐ８１５が公知である。ＤｅＰｌａｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２２７４−２２７８（１９８８）；Ｓｚｉｋｏｒａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０４１−１０５０（１９９０）、およびＳｉｂｉｌｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：３５−４５（１９９０）参照のこと。これらの開示は参考として援用される。Ｐ８１５細胞の腫瘍は脂肪細胞腫であり、ＤＢＡ／２マウスにおいてメチルコラントレンを用いて誘導され、インビトロで腫瘍としても細胞株としても培養される。Ｐ８１５株は変異誘発の後に多くのｔｕｍ改変体を導き、この例としては、Ｐ９１Ａ（ＤｅＰｌａｅｎ、上記）、３５Ｂ（Ｓｚｉｋｏｒａ、上記）、およびＰ１９８（Ｓｉｂｉｌｌｅ、上記）といわれる改変体が挙げられる。腫瘍拒絶抗原とは対照的に（そしてこれが対比の鍵となる）、ｔｕｍ抗原は腫瘍細胞が変異誘発を起こした後にのみ存在する。腫瘍拒絶抗原は変異誘発なしの所定の腫瘍細胞上に存在する。従って、文献を参照すると、細胞株は、例えば「Ｐ１」と称される株のように、ｔｕｍ＋であり得、ｔｕｍ−改変体を生じさせるために刺激され得る。ｔｕｍ−の表現型は親細胞株の表現型とは異なるので、ｔｕｍ細胞株はこれらのｔｕｍ＋の親細胞株と比較してＤＮＡに差異があると考えられ、そしてこの差異はｔｕｍ−細胞における目的の遺伝子を突き止めるために利用され得る。その結果、例えばＰ９１Ａ、３５ＢおよびＰ１９８のようなｔｕｍ改変体の遺伝子が、これらの通常の対立遺伝子とはｔｕｍ遺伝子コード領域の点変異により差異を生じることが見出された。ＳｚｉｋｏｒａおよびＳｉｂｉｌｌｅ、上記、およびＬｕｒｑｕｉｎら、Ｃｅｌｌ  ５８：２９３−３０３（１９８９）を参照のこと。このことは本発明のＴＲＡに関する場合ではないと分かった。これらの論文はｔｕｍ−抗原由来ペプチドが、ＣＴＬに認識されるようＨ−２ｄクラスＩ分子として提示されることもさらに実証した。Ｐ９１ＡはＬｄにより、Ｐ３５はＤｄにより、およびＰ１９８はＫｄにより提示される。
【０００６】
本出願と同一の譲受人に譲渡されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４号（１９９２年５月２２日出願）は、ＭＡＧＥファミリーと称されるヒト腫瘍拒絶抗原の前駆体をコードする遺伝子ファミリーを教示する。これらの遺伝子のいくつかは、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３（１９９１）にも論じられる。ＭＡＧＥファミリーの多様な遺伝子が腫瘍細胞で発現され、これらの遺伝子が、このような腫瘍の診断用マーカーとして、ならびに論文中で論じられている他の目的のためのマーカーとして役立ち得ることが今や明らかである。Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３５：１４５（１９９２）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３（１９９１）、およびＤｅ  Ｐｌａｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４０：３６０（１９９４）も参照のこと。タンパク質がプロセッシングされ、細胞表面に提示されるメカニズムは、現在ではかなりよく立証されている。その分野の発達のひととおりの総説は、Ｂａｒｉｎａｇａ，「Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｏｍｅ  ‘Ｂａｃｋｂｏｎｅ’：Ｈｏｗ  ＭＨＣ  Ｂｉｎｄｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：８８０（１９９２）に見出され得る；さらにＦｒｅｍｏｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９１９（１９９２）；Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９２７（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１８１−２０７（１９９４）；Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ  ７５：６９３−７０８（１９９３）；Ｒａｍｅｎｓｅｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２１３−２４４（１９９３）；Ｇｅｒｍａｉｎ、Ｃｅｌｌ  ７６：２８７−２９９（１９９４）もまた参照のこと。これらの論文は、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子に結合するペプチドが長さ９アミノ酸「ノナペプチド」であるという要件、およびこのノナペプチドの２番目と９番目の残基が重要であることを指摘している。Ｈ−２ｋｂでは、アンカー残基はオクタマーの５位および８位であり、Ｈ−２Ｄｂでは、アンカー残基はノナペプチド中の５位および９位であり、一方でＨＬＡ−Ａ１のアンカー残基は、ノナマー中の３位および９位である。一般的に、ＨＬＡ分子では２位および９位がアンカーである。
【０００７】
ＭＡＧＥファミリーの遺伝子に関する研究より、現在、特別なノナペプチドがいくつかの腫瘍細胞表面に実際に提示されること、およびノナペプチドの提示は提示分子がＨＬＡ−Ａ１であることを必要とすることが明らかになった。腫瘍拒絶抗原ＭＡＧＥ−１（「ＴＲＡ」または「ノナペプチド」）の複合体が、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による、この抗原を提示する細胞の溶解を導く。
【０００８】
例えば、米国特許第５，４０５，９４０号（１９９２年８月３１日出願）、および米国特許第５，５７１，７１１号に示される研究は、種々のＭＡＧＥ遺伝子の相同性領域を、関連ノナペプチドをコードするＭＡＧＥ−１遺伝子領域と比較した場合、多くの相同性があることを見出した。これらの観察結果が実際に開示され、それらの特許請求の範囲に記載される局面の一つを導き、その発明は、総じて同じＮ末端およびＣ末端のアミノ酸を有するノナペプチドのファミリーである。これらのノナペプチドは、単独でまたはキャリアーのペプチドと一緒のいずれかで、免疫原としての使用を含む種々の目的に有用であると記載された。ノナペプチドは抗原性エピトープを構成するために十分な大きさであり、そしてそれに対して作製された抗体は、それが単独で存在しても、あるいは大きなポリペプチドの部分であっても、このノナペプチドの同定に有用であると記載された。
【０００９】
関連文献の調査を進めると、通常は８アミノ酸、９アミノ酸または１０アミノ酸の長さの種々のペプチドは、ＭＨＣ分子と複合体となって、細胞溶解性Ｔ細胞によって認識される標的を提示することが示される。メラノーマについて数多くの研究が実施され、そして細胞溶解性Ｔ細胞に認識されるメラノーマ抗原は、今では３つの広範なカテゴリーに分けられる。第一カテゴリーは、上記で論じられている多くの抗原（例えばＭＡＧＥ）を含み、いくつかのメラノーマ、さらには他の腫瘍型、および正常の精巣ならびに胎盤において発現している。その抗原は、正常組織では通常サイレントな正常遺伝子の発現産物である。
【００１０】
第二ファミリーのメラノーマ抗原は、正常タンパク質の変異形態に由来する抗原を含む。このファミリーの例は、ＭＵＭ−１（Ｃｏｕｌｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７９７６−７９８０（１９５５））；ＣＤＫ４（Ｗｏｌｆｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１２８１−１２８４（１９５５））；Ｂｃａｔｅｎｉｎ（Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１８５−１１９２（１９９６））；およびＨＬＡ−Ａ２（Ｂｒａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５０１−２５０８（１９９６））である。第三カテゴリーとしては（上記でも論じられている）、メラノーマおよびメラノサイト両方によって発現される分化抗原が挙げられる。代表的なものは、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、およびＭｅｌａｎ  Ａ／Ｍａｒｔ−１である。Ｍｅｌａｎ−Ａについては、参考として援用される、米国特許第５，６２０，８８６号を参照のこと。チロシナーゼについては、Ｗｏｌｆｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：７５９（１９９４）、およびＢｒｉｃｈａｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２２４（１９９６）；ｇｐ１００については、Ｋａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１３４３（１９９５）；Ｃｏｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：７１６（１９９４）；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３９６１（１９９５）；ｇｐ７５については、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１３１（１９９６）を参照のこと。
【００１１】
ＨＬＡ拘束ペプチドの同定に利用可能なアプローチがいくつか存在する。例えば、Ｂｏｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：７２５−７２９（１９９６）は、自己のメラノーマ細胞に反応するＣＤ８＋Ｔ細胞のペプチド標的を同定する方法を記載する。この方法論は、コスミドベクターまたはｃＤＮＡベクターのいずれかから、抗原非発現細胞に抗原の発現を移すことを要する。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−１６５０（１９９１）；および、Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６４５８−６４９２（１９９４）をそれぞれ参照のこと。その両方とも参考として援用される。各々の場合において、トランスフェクションする分子は関連抗原をコードしなければならない。必要であれば、ＨＬＡクラスＩの拘束要素も使用され得る。Ｄｅ  Ｐｌａｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：１２５−１４２（１９９７）参照のこと。
【００１２】
Ｔ細胞に認識される腫瘍抗原のコード配列が定義される場合、例えばＦａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：２９０−２９６（１９９１）により提供されたＨＬＡ結合性モチーフの分析は、関連ペプチドを同定する上で非常に有用である。
【００１３】
Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−１２６３（１９９２）はＨＬＡ分子からペプチドを溶出し、ＨＰＬＣにて分画し、それから構造同定技術を用いることにより、ペプチドを同定する方法を記載している。この技術を利用した例は、Ｃｏｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：７１６−７１９（１９９４）；Ｓｋｉｐｐｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：５２７−５３４（１９９６）；およびＣａｓｔｅｌｌｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：３６３−３６８（１９９５）に見られる。このアプローチに関して技術的な難題があり、そして広く利用されてはいない。
【００１４】
ウイルスベクターを使用した、既知の腫瘍抗原のペプチド標的を同定するアプローチが公知である。その技術は、新たな刺激されていない（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞により、新たに特異的な応答を誘発させる工程（Ｃｈａｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２９２８−２９３６（１９９９）；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５６０７−５６１３（１９９８））；および感受性の高められたＴ細胞をインビボで刺激および増殖する工程を含む。例えば、Ｔｏｓｏら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５６：１６−２０（１９９６）；Ｙｅｅ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４０７９−４０８６（１９９６）；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０：２７６−２８６（１９９７）；Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：２４０６−２４１６（１９９７）参照のこと。それから、このＴ細胞は、Ｔ細胞応答を誘導する天然でプロセッシングを受けた腫瘍ペプチドを同定するために用いられる。
【００１５】
上記に記載される、研究の欠点の一つは、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、特にＨＬＡ−Ａ２の提示が強調されることである。他のＭＨＣ／ＨＬＡ分子に対するＭＨＣ／ＨＬＡの拘束についてはほとんど知られていない。ＨＬＡ−ＡのサブタイプではないＭＨＣ／ＨＬＡ分子の中では、ＨＬＡ−Ｂ２７分子は最も広く研究されてきた。例えば、Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３（１９９４）（参考として援用される）参照のこと。このような研究が頻繁に行われていることにより、ＭＨＣ／ＨＬＡのリガンドおよび／またはエピトープへとプロセッシングされる所定の分子において、ＨＬＡ−Ｂ２７結合分子が期待され得ることが示唆される。しかし、示されるように、このことは本明細書に記載される発明の場合ではなかった。
【００１６】
ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ２７とは対照的に、ＨＬＡ−Ｃ分子およびそれらの結合ペプチドに関する情報は僅かである。結合モチーフは十分には特徴付けられてはおらず、そして試験されたペプチドもほとんどない。ＨＬＡ−Ｃの発生頻度はＨＬＡ−Ａ分子およびＨＬＡ−Ｂ分子の発生に比べてずっと低い。そしてＨＬＡ−Ｃ分子は集団中では分析の第一選択肢どころではない。本明細書に記載した研究における予想外の知見の一つは、文献中で示唆されることはほとんどなく、そして本明細書にて実験設計から詳説される、二つのＨＬＡ−Ｃエピトーブの同定であった。
【００１７】
「ＮＹ−ＥＳＯ−１」と称された分子は、例えば米国特許第５，８０４，３８１号（参考として援用される）にて記載されるように、腫瘍抗原の最も免疫原性の抗原の一つとして認識される。進行性癌を患う患者の半数近くがこの抗原を発現し（Ｓｔｏｃｋｅｒｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１３４９−１３５４（１９９８））、そしてその発現は強力なＣＤ４＋Ｔ細胞および強力なＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を伴っている。Ｊａｇｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：６２５−６３０（２０００）；Ｊａｇｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：２６５−２７０（１９９８）；Ｊａｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：４７６０−４７６５（２０００）；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（印刷中）を参照のこと。ＨＬＡ−Ａ２エピトーブである分子由来のペプチドは公知である（Ｊａｇｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２６５−２７０（１９９８））；およびＷａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３５９８−３６００（１９９８）において、ＨＬＡ−Ａ３１結合性のエピトーブが記載された。
【００１８】
ＮＹ−ＥＳＯ−１が、例えばＨＬＡ−Ｃｗ３およびＨＬＡ−Ｃｗ６のようなＨＬＡ−Ｃ分子に結合するエピトーブも提示することが今回見出された。例えば、ｐ．７、１３行以降の、「．．．ＨＬＡ−Ｃｗ３  ａｎｄ  ＨＬＡ−Ｃｗ６．」を参照のこと。ＮＹ−ＥＳＯ−１はＬＡＧＥ−１（Ｌｅｔｈｅら、米国特許第５，８１１，５１９号）と称される別の腫瘍拒絶抗原と相同な配列を有する。ＭＡＧＥ−Ａ１／ＨＬＡ−Ａ１のペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ３／ＨＬＡ−Ａ１のペプチドについて公知の項目より、関連ノナペプチドをコードするＬＡＧＥ−１の相当領域は、例えばＨＬＡ−Ｃｗ３およびＨＬＡ−Ｃｗ６のようなＨＬＡ−Ｃ分子に結合するエピトープについても提示することが分かる。これらのペプチドおよびその発見から派生するものは、本発明の一部分である。また、本発明の一部分はそれらペプチド同定の方法論である。本発明の全ての局面は、後述の開示で詳説される。
【００１９】
（好ましい実施形態の詳細な解説）
（実施例１）
これらの実験は、以降の実験で用いるための細胞サンプルを調製する方法を記載する。
【００２０】
末梢血リンパ球（以下「ＰＢＬ」）を、癌患者から標準的方法を用いて収集した。次いで、それらを処理して、ＣＤ８特異的な抗体でコートした磁気ビーズ、および当該分野で認識されている技術を用いて、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を取り出した。一旦分離操作を行い、ＣＤ８＋細胞を、丸底の９６ウェルプレートに１ウェルあたり５×１０５細胞で、１０％のヒトＡＢ血清、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および１％非必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に播種した。
【００２１】
ＣＤ８＋細胞が取り除かれたＰＢＬを、抗原提示細胞（以下ＡＰＣ）として使用した。以下にさらに詳細に説明すると、これらの細胞を、１０μＭのペプチドを用いてパルスするか、あるいはこれらの細胞にアデノウイルス構築物を１０００ＩＵ／細胞の濃度で、一晩３７℃で３００μｌの無血清培地中で感染させた。
【００２２】
（実施例２）
ＣＤ８が除かれたＰＢＬにおけるＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の発現を決定した。ＣＤ８が除かれたＰＢＬを上に記載したように確保した。次いでこれらの細胞を、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むアデノウイルスベクター、あるいは「空の」アデノウイルスベクターのいずれかを用いてトランスフェクトした。ＰＢＬを健常なドナーおよび癌患者の両方から確保した。
【００２３】
ベクター作製のために、Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７）および米国特許第５，８０４，３８１号（両方とも参考として援用される）に記載されるプロトコルを使用した。簡潔に記載すると、両方の参考文献に記載されるベクターｐＢＫ−ＣＭＶ  ＮＹ−ＥＳＯ−１を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化し、ＮＹ−ＥＳＯ−１のｃＤＮＡを含む０．８ｋｂのフラグメントを得た。このフラグメントを単離して、そして市販のシャトルベクターｐＳＶ２−ＩＣＥＵ−１  ｐＡｄのＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩの部位にクローニングした。次いで、得られたシャトルプラスミド（ｐＳＶ２−ＩＣＥＵ−１  ＮＹ−ＥＳＯ−１と称する）をＩＣＥＵにて消化し、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｃＤＮＡおよびＢＧＨポリＡ配列を含む発現カセットを得た。次いで、このフラグメントを単離し、「ｐＡｄ  Ｑｕｉｃｋ」プラスミドの独特の部位であるＩＣＥＵ−１部位にクローニングした。次いで、このプラスミドをＳｍａＢＩで消化し、そして消化物を２９３細胞のトランスフェクトに使用し、その結果、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする組換えアデノウイルスベクターを得た。
【００２４】
ＰＢＬに、１０００  ＩＵ／細胞のアデノウイルス構築物を感染させ、次いで一晩３７℃でインキュベートした。細胞に透過処理を行い、そして１μｇ／ｍｌののＮＹ−ＥＳＯ−１特異的なモノクローナル抗体で染色した。このことはＳｔｏｃｋｅｒｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１３４９−１３５４（１９９８）（参考として援用される）、およびＰＣＴ出願第ＷＯ９９／５３９３８（両方が参考として援用される）にて記載される。
【００２５】
感染させたＰＢＬの８５％までが組換えＮＹ−ＥＳＯ−１細胞と判明し、このことは、そのアプローチがさらなる実験に使用され得ることを示す。
【００２６】
（実施例３）
これらの実験により、ＮＹ−ＥＳＯ−１組換えアデノウイルスに感染したＡＰＣを用いた刺激が、ペプチドをパルスしたＡＰＣでの刺激に匹敵するか否かが決定された。これらの実験はまた、癌患者におけるＮＹ−ＥＳＯ−１反応性Ｔ細胞の発生および頻度を分析する方法も提供する。さらに重要なことには、外因性ペプチド（例えば配列番号１）よりもむしろ、ＡＰＣにおいてＮＹ−ＥＳＯ−１の発現を形質導入するための組換えウイルスベクターを使用することで、この分析が、天然でプロセッシングされて提示されたペプチドエピトープの状況で行われ得る。
【００２７】
これらの実験では、細胞サンプルを、ＨＬＡ−Ａ２拘束ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）（Ｊａｇｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：２６５−２７０（１９９８）、およびＪａｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：４７６０−４７６５（２０００）にて記載され、両文献は参考として援用される）に対して自発的なＴ細胞応答を有することが予め識別された２人の患者よりから採取した。二人の患者から採取したＰＢＬを上記にのように処理して、ＰＢＬからＣＤ８＋細胞を分離した。次いで、ＣＤ８の除去されたＰＢＬに、１０μＭの配列番号１のサンプルをパルスするか、または上に記載したＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするアデノウイルスをトランスフェクトするか、または緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルスをトランスフェクトした。次いで、自己のＣＤ８＋細胞を、ＰＢＬで８日間刺激した。刺激を、上に記載するように、１ウェル当たり１×１０６個のＡＰＣをＣＤ８＋細胞に添加すること（すなわち、５×１０５個のＣＤ８＋細胞／ウェルを含むウェルにこれらを添加すること）により実行した。８時間の刺激の後、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）を添加し、同様にＩＬ−７（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。この手順を、３日間、細胞を試験用に収集するまで繰り返した。
【００２８】
１％ＦＣＳを含むＰＢＳ５０μｌ中でＣＤ８＋Ｔ細胞をフィコエリトリン（「ＰＥ」）で標識されたテトラマーを用いて染色することにより、細胞をテトラマーアッセイにて試験した。テトラマーの合成は、Ａｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６（１９９６）（参考として援用される）に従った。テトラマーを、配列番号１の配列を使用してペプチドとしてアセンブリした。細胞を、市販のＣＤ８特異的モノクローナル抗体（すなわち「Ｔｒｉｃｏｌｏｒ−ＣＤ８ｍＡｂ」）を氷上で１５分間添加した後、１５分間３７℃で染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにて分析した。
【００２９】
８日間の刺激の後、テトラマーに陽性の集団の発生頻度は等価であった。つまり、ペプチドおよびアデノウイルスがトランスフェクトされた細胞を用いた応答性は同等であった。応答性は、緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルスを用いる場合、テトラマー染色がネガティブであったので、ＮＹ−ＥＳＯ−１に特異的であった。
【００３０】
（実施例４）
これらの実験を、１名の被験体より得られたＣＤ８＋Ｔ細胞をより深く研究するために設計した。Ｊｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５９：１９７−２０７（１９９３）（参考として援用され、そして本明細書に記載されたように適合される）により記載される、サイトスポットアッセイを用いた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記のようにあらかじめ感作させ、自己のＥＢＶ−Ｂ標的細胞と１：２の比で３００μｌの無血清培地中で３０分間混合した。ブレフェルジンＡをサンプルに対して１０μｇ／ｍｌでさらに５時間添加した。上に記した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を、配列番号１のペプチドでパルスするか、あるいはワクシニアベクターの構築物にてトランスフェクトした。使用したワクシニアウイルスの構築物は、Ｇｒｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５９４８−５９５７（１９９０）（参考として援用される）に教示されるように、ワクシニアウイルス４０Ｋプロモーターの制御下に全長ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｃＤＮＡ、およびＪｅｎｋｉｎｓら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ７：９９１−９９８（１９９１）（参考として援用される）に教示されるように、鶏痘ウイルスＣ１プロモーター制御下に大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含んでいた。外来の配列は、Ｍａｚｚａｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５５７−５８１（１９９３）（参考として援用される）に従い、ワクシニアウイルスワイス株のゲノムのＨｉｎｄＩＩＩの領域に位置する、構築物中のチミジンキナーゼ遺伝子に組み込んだ。
【００３１】
細胞を、固定し、透過処理し、そして上記のＴｒｉｃｏｌｏｒ  ＣＤ８特異的ｍＡｂ、ＦＩＴＣ標識されたＩＦＮ−γ  ｍＡｂ、そしてＰＥ標識されたＴＮＦ−α特異的ｍＡｂを用いて１５分間室温で染色した。結果をフローサイトメトリーにて分析し、ＣＤ８＋リンパ球でゲートを掛けた。
【００３２】
結果は、アデノウイルスの構築物で刺激したエフェクター細胞が、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするワクシニアウイルスの構築物にてトランスフェクトした自己のＥＢＶ−Ｂに応答して、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α両方を多量に生産することを示した；しかし、野生型ワクシニアウイルスのトランスフェクタントには応答しなかった。感作に使用したアデノウイルスベクターと、読み取りに使用したワクシニアウイルスとの間には、交差反応は観察されなかった。感作されたエフェクターは、活性化メモリーＴ細胞の代表的な特徴（ＣＤ４５ＲＯの高発現およびＣＤ６２Ｌの低発現が挙げられる）を有した。そして、再度の刺激なしに一月以上にわたり培養において維持可能であった。
【００３３】
上記のテトラマーに対して陽性である任意のＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記の方法を用いてフローサイトメトリーにて分類した。二つの集団（すなわち、一つ目がテトラマー陽性の集団、二つ目が陰性の集団）が見出された。
【００３４】
（実施例５）
これらの実験は、上記の二つの亜集団のさらなる分析について詳説する。先の分別に続いて、同系異質遺伝子型のフィーダーＰＢＬと共に、０．１μｇ／ｍｌのＰＨＡ、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を刺激した。次いで、それぞれの亜集団を、その特性を決定するべくＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。具体的には、平底の９６ウェルニトロセルロースプレートを、ＩＦＮ−γ（２μｇ／ｍｌ）を用いてコートし、そしてその後４℃で一晩インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで洗浄し、１０％のヒトＡＢ血清を用いて１時間３７℃でブロッキングした。上記のように、前もって刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１×１０３細胞〜５×１０４細胞／ウェルの範囲の数量で、５×１０４個の標的細胞と共に添加した。標的細胞は、配列番号１のペプチドを用いてパルスしたＰＢＬ、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するワクシニアウイルスにてトランスフェクトしたＰＢＬ、または上記のＥＢＶ−Ｂ細胞であった。細胞を２０時間、ＩＬ−２およびヒト血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地でインキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳで徹底的に洗浄して細胞を剥がし、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（０．２μｇ／ｍｌ）をウェルに添加した。２時間３７℃にてインキュベートした後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン  アルカリホスファターゼ（１μｇ／ｍｌ）で１時間室温で発色させた。洗浄し、次いで基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルー  テトラゾリウム）を添加し、５分間インキュベートした。最終洗浄の後、プレートメンブレンは濃い紫色のスポットを表示しており、スポットの数を顕微鏡下で計測した。
【００３５】
上記のテトラマー陽性の亜集団を使用したさらなる実験は、ＮＹ−ＥＳＯ−１組換えアデノウイルスで予め刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、標的としてＮＹ−ＥＳＯ−１を発現しているＨＬＡ−Ａ２腫瘍細胞を特異的に認識するエフェクター細胞を起こし得る。このことは、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する別のメラノーマ細胞株を用いた上記のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの実施によって、確認した。ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現しない一つの細胞株を選択した。一つの細胞株を除いて、選択された細胞は全てＨＬＡ−Ａ２を発現していた。しかし、この細胞株は実際にＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している細胞だった。要約すると、試験した５つの系統のメラノーマ細胞の中で、３つがＮＹ−ＥＳＯ−１およびＨＬＡ−Ａ２分子の両方を発現しており、一つがＨＬＡ−Ａ２を発現し、かつＮＹ−ＥＳＯ−１を発現しておらず、一つがＮＹ−ＥＳＯ−１を発現し、かつＨＬＡ−Ａ２を発現していなかった。
【００３６】
その結果は、テトラマー陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞にとって、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＨＬＡ−Ａ２の両方の発現が認識に必要であることを示した。
【００３７】
（実施例６）
上記の通り、テトラマー陰性のＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団を分類した。しかしながら、驚くべきことに、この亜集団は、試験すると、組換えＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するワクシニアウイルスに感染した自己ＥＢＶ−Ｖ細胞に対して、実際に反応した。このことはＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質がＨＬＡ−Ａ２細胞以外にもＭＨＣによって提示されるエピトープにプロセッシングされていることを示した。上記の「背景」の章に記載したように、ＨＬＡ−Ｂ２７分子は幾らかの頻度で発現し、そして結合モチーフは、参考として援用される、Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３（１９９４）により公知である。これは、ノナマーまたはデカマーであり、２番目にアルギニンを、そしてＣ末端に疎水性残基を有する。Ｔ細胞が由来する患者がＨＬＡ−Ｂ２７を発現していたので、このＨＬＡ分子によってペプチド分子が提示され得ると考えることは妥当であった。
【００３８】
Ｐａｒｋｅｒらからのモチーフを使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１のアミノ酸配列の韻律分析を有する、ＨＬＡ−Ｂ２７分子に結合し、そしてＴ細胞のエピトープとして機能すると予想される１１のペプチド配列が得られた。ペプチドのそれぞれを合成し、そして上記のＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて試験した。全て陽性ではなかった。問題のペプチドは全てＮＹ−ＥＳＯ−１の配列に沿って見つかった。すなわち、アミノ酸４２位〜５０位、５１位〜６０位、７６位〜８５位、８０位〜８８位、８５位〜９４位、１０５位〜１１３位、１２４位〜１３３位、１３５位〜１４３位、１５７位〜１６５位、１５９位〜１６７位および１６３位〜１７１位である。例えば、このアミノ酸配列を提供するＷＯ９９／５３９３８（参考として援用される）を参照のこと。示されるように、どの配列も陽性の結果を与えなかった。
【００３９】
次いで、テトラマーに陰性の亜集団を、ＥＢＶ−Ｂ細胞のパネル（健常な提供者由来の細胞、およびＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する組換えウイルスで導入したが、種々のＨＬＡの特異性を有する細胞）に対して試験した。つまり：
【００４０】
【表１】
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これらＥＢＶ細胞のそれぞれのサンプルを、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするワクシニアウイルス、あるいは野生型のワクシニアウイルスのいずれかを用いてトランスフェクトした。サンプルは上記と同様に試験した。ＨＬＡ−Ｃｗ３陽性の細胞株は、テトラマー陰性の細胞亜集団に対してＮＹ−ＥＳＯ−１を提示することが可能であった。次いで、どのペプチドが関係するかを同定するための研究を実施した。このことを実施するために、当該分野で認識された技術を用いて、ＮＹ−ＥＳＯ−１の配列全体にわたる、長く、重複したペプチドを合成した。これらのペプチドを自己ＥＢＶ−Ｂ細胞上にパルスして、そして上記のようにＥＬＩＳＰＯＴを使用してアッセイした。アミノ酸８５位〜１０２位、および９１位〜１０８位に対応するペプチドがＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識された。ＨＬＡ−Ｃｗ３結合モチーフは、Ｆａｌｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１２００５−１２００９（１９９３）により記載されている。このモチーフを使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１のアミノ酸９２〜１００からなるペプチドを合成し、そして試験した。この試験を実施するために、細胞株７２１．２２１（ＨＬＡクラスＩ陰性）を、ＨＬＡ−Ｃｗ３をコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトし、次いでペプチドでパルスした。ＨＬＡ−Ｃｗ４を用いてトランスフェクトした後の比較試験では、結果は陰性であった。ＨＬＡ−Ｃｗ＊０３０３およびＨＬＡ−Ｃｗ＊０３０４の両サブタイプは適切にペプチドを提示した。実際に、１ｎＭ未満の濃度で認識された。そのペプチドの配列は：
ＬＡＭＰＦＡＴＰＭ（配列番号２）
であった。
【００４１】
（実施例７）
上記の開示を仮定して、ＨＬＡ−Ａ２が陽性でない個体におけるＮＹ−ＥＳＯ−１に対する自発的なＴ細胞の応答を研究するべく、これらの実験を設計した。
【００４２】
ＮＹ−ＥＳＯ−１に血清反応陽性の患者を選択した。その患者よりＰＢＬを採取し、そして上記のようにＣＤ８＋Ｔ細胞の分離が行われ、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするアデノウイルス構築物で感染されたＣＤ８が除かれたＰＢＬにより、エフェクター細胞をインビトロで刺激した。上記の方法を用いて９日間培養すると、感作したＣＤ８＋Ｔ細胞の４０％近くが、ワクシニアウイルスで感染された組織適合性ＥＢＶＢ細胞により発現されるＮＹ−ＥＳＯ−１に応じて、特異的にＩＦＮ−γを産生することが可能であった。上記の開示のように、ＮＹ−ＥＳＯ−１にまたがる重複するペプチドは、アミノ酸７３位〜９０位および７９位〜９６位からなるペプチドが、被験体由来の予め感作されたＴ細胞エフェクターにより認識されることを決定するために使用した。上記のＥＢＶ−Ｂ細胞を使用すると、ＨＬＡ−Ｃｗ６がこの応答についての拘束要素であることが同定された。ＨＬＡ−Ｃｗ６のアンカーモチーフは、上記のＦａｌｋらに記載される。アミノ酸８０〜８８からなるペプチド（ＡＲＧＰＥＳＲＬＬ；配列番号３）は関連するノナマーとして推定された。そのペプチドを合成し、上記のように試験し、そしてエフェクター細胞によりそのペプチドがＨＬＡ−Ｃｗ＊０６０２拘束様式で認識されることが確認された。
【００４３】
（実施例８）
これまでにＪａｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：４７６０−４７６５（２０００）の文献によると、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＮＹ−ＥＳＯ−１への反応性は、そのタンパク質に対する抗体を有する患者のみで見出されることが示された。このことが、本明細書に記載したアデノウイルス／ワクシニア交差感作手順を用いた場合の状況にも当てはまるかを決定するために研究を行った。このことを試験するため、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性腫瘍を有する３人の患者が研究された。一人の患者は血清反応陽性であり、他は血清反応陰性であった。血清反応陽性患者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記のＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするアデノウイルスベクターに感染したＣＤ８除去ＰＢＬで刺激した。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的応答が、ワクシニアウイルスベクターを介してＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する組織適合性ＥＢＶ−Ｂ細胞に対して観察された。ＨＬＡ−Ａ２拘束ペプチド（配列番号１）およびＨＬＡ−Ｃｗ３拘束ペプチド（配列番号２）は両方ともこの応答の標的であった。血清反応陰性の個体では、何も応答が見られなかった。
【００４４】
先の例は、本発明の特徴を示し、そしてこの特徴としては、とりわけＴ細胞、例えばペプチド／ＭＨＣ複合体（このペプチドは目的のタンパク質に由来する）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を同定する方法が挙げられる。この方法では、関連するＣＤ８＋細胞を含むと考えられるサンプルを、例えば樹状細胞のような、目的のタンパク質をコードする第一ウイルスベクターで感染された抗原提示細胞に接触させる。この接触に続いて、ＣＤ８＋細胞を、次いで目的のタンパク質をさらにコードする第二ウイルスベクターで感染させた抗原提示細胞の第二集団と接触させる。ここで、第二ウイルスベクターは第一ウイルスベクターとは異なる。このアプローチから得られると考えられる一つの利点は、抗原に標的化されるという点においてあらゆる免疫応答が、ウイルスのあらゆる局面よりもより洗練され得ることである。好ましい実施形態では、第一ウイルスベクターがアデノウイルスであり、好ましくは、それ自体が複製能が無く、そして第二ベクターはワクシニアベクターである。しかし、これらが入れ換えられ得ること、およびこれら二つの選択肢の一つのみが二つの選択肢のうちの一つとは異なる第二ウイルスとの組み合わせにて使用され得ることが、理解される。
【００４５】
示されるように、この方法は抗原提示細胞（例えば樹状細胞）またはＭＨＣもしくはＨＬＡ分子とペプチドの複合体を表面に提示する能力のある他のいくかの細胞型が必要である。実際には、この方法は自己細胞、つまり同一の患者由来の抗原提示細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の使用を伴うことが好ましい。しかしこの方法論は同種異型細胞であっても実施され得る。この方法の使用は、例に見られるように、当業者が、提示されているＭＨＣ／ＨＬＡ分子により拘束されるエピトープを同定することを可能にする。本明細書に見られるように、この方法は、例えばＨＬＡ−Ｃｗ３およびＨＬＡ−Ｃｗ６分子のようなＨＬＡ分子（配列番号２および配列番号３に定義されるペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）に結合したペプチドの同定を可能にする。これらのペプチドは、例えばＨＬＡ分子と、ＨＬＡ分子を提示する細胞を同定するためのペプチドとの複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞の産生を刺激するためなどに使用され得る。そのペプチドは、例えば免疫応答を増強するように設計された処方物の単一ペプチド成分として、あるいは一つを超える複数のペプチドの一成分として、治療用途に使用され得る。そのような組成物は、例えばアジュバントなどのさらなる成分を含み得る。そのようなアジュバントの一例はＧＭ−ＣＳＦであり、例えば参考として援用される、Ｊａｇｅｒら、米国特許第      号に教示される。
【００４６】
ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子およびコードされるタンパク質は、「ＬＡＧＥ」および「ＬＬ−１」と称される分子とに対して相同性を示す。例えば、参考として全体が援用されるＬｅｔｈｅら、米国特許第５，８１１，５１９号を参照のこと。配列番号２および配列番号３に対して相同性のあるＬＡＧＥペプチド、すなわち：
ＩＴＭＰＦＳＳＰＭ（配列番号４）
ＡＲＲＰＤＳＲＬＬ（配列番号５）
はまた、ＨＬＡ−Ｃｗ３、特にＨＬＡ−Ｃｗ＊０３０３およびＨＬＡ−Ｃｗ＊０３０４のサブタイプ、およびＨＬ−Ｃ２６のそれぞれに対するエピトープとして、本発明の一部である。
【００４７】
ＭＨＣリガンドとＭＨＣエピトープとの間には当該分野で認識される差異があることを心に留めなければならない。ＭＨＣリガンドに関しては、これらはＭＨＣ分子に結合するペプチドであるが、ＭＨＣに結合した場合でもＴ細胞の応答を誘発しない。ＭＨＣエピトープに関しては、これらはＭＨＣ分子と結合するペプチドであり、そしてペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞に提示される場合にＴ細胞を刺激する。上記のＦａｌｋらは、ＨＬＡ−Ｃｗ＊３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０３０１、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０３０４、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０６０１およびＨＬＡ−Ｃｗ＊０６０２に対する述べられた結合モチーフを実際に提供している。Ｆａｌｋらはリガンドとエピトープとの間の差異を明確にし、それが彼らの論文で証明される。これらの対立遺伝子のいずれについてもＴ細胞エピトープは同定されていないと理解される。
【００４８】
また、本発明の一部は、いわゆる「ミニ遺伝子」、つまり目的のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子、である。そのペプチドは、目的のエピトープをコードする、全て縮重配列の単純な構築を可能とする長さである。これらのコード配列は、当該分野で周知の方法にて、伸長された「ポリトピック（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ）」配列の一部を成し得、そしてミニ遺伝子または目的の遺伝子が宿主細胞における発現のためにプロモーターに作動可能に連結されるコードベクターに組み込まれ得る。
【００４９】
ミニ遺伝子はまた、例えばＨＬＡ−Ｃｗ３あるいはＨＬＡ−Ｃｗ６をコードする配列のような目的のＭＨＣ分子をコードする遺伝子と合わせて用いられ得る。二つの配列は、単一のベクター、または、一対のベクターなどを構成し得、これらのベクターは当業者がＴ細胞の応答を刺激するために使用することを可能とするキットあるいは他のいくつかの組み合わせで使用される。
【００５０】
本発明の他の特徴は当業者には明白であり、本明細書では改めて記す必要はない。
【００５１】
本発明は特定の実施形態について記載してきたが、発明の趣旨から逸脱すること無く、多くの改変および変更が当業者により行われ得ることは理解されるべきである。そのような改変、変更および相当物は本明細書に記載される特許請求の範囲の範囲内にあると意図される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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