(57)【要約】本発明は、本来の抗体の特異的に抗原と結合する生物学的機能を保存し、しかも同時に免疫原性が低いモノクロナール抗体を作成する目的を持って、DNA組換え技術により、登録番号ECACC  94113026でブダペスト条約に従って寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産されるマウスモノクロナール抗体P3（MAb  P3）及び寄託番号ECACC  97112901のハイブリドーマ細胞系によって生産される抗イディオタイプマウスモノクロナール抗体1E10（MAbai  1E10）から修飾抗体を得ることに関するものである。本発明のキメラ抗体はマウス免疫グロブリンの可変ドメイン及びヒト免疫グロブリンの定常領域を含む；そしてヒト化された抗体は、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含む他に、マウス骨格（FR）の領域、特にT細胞に対して抗原性を示し得る部分が修飾されており、FRのいくつかの位置はヒトと同じである。これらの抗体は種々のタイプの腫瘍の診断及び治療に使用することができる。本発明はまた治療及び診断の目的にこの抗体を使用することに関係している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その重鎖及び軽鎖超可変ドメインが以下の配列を含み：
重鎖
2004528033.tif 000044
軽鎖
2004528033.tif 000045
寄託番号ECACC94113026のハイブリドーマ細胞系により生産され、N-グリコリル化シアル酸を含有するガングリオシドを認識するマウスモノクロナール抗体Mab  P3に由来するキメラモノクロナール抗体。
【請求項２】
その重鎖及び軽鎖骨格領域（FR）が以下の配列：
重鎖
2004528033.tif 000046
軽鎖
2004528033.tif 000047
を含む請求項1に記載のキメラモノクロナール抗体。
【請求項３】
ヒト化及び抗原に対する結合性能を保持するために以下の置換：
軽鎖
2004528033.tif 000048
の少なくとも一つを含む請求項1及び2に記載のモノクロナール抗体。
【請求項４】
重鎖の定常領域がガンマ-1鎖のアミノ酸配列を含みそして軽鎖の定常領域がカッパ鎖のアミノ酸配列、いずれもヒト免疫グロブリン由来、を含む請求項1から3に記載のモノクロナール抗体。
【請求項５】
請求項1から4に記載のモノクロナール抗体のいずれかを生産する細胞系。
【請求項６】
請求項1から4に記載のモノクロナール抗体のいずれかを含む乳腺及び黒色腫の悪性腫瘍、その転移及び再発を治療するための医薬組成物。
【請求項７】
請求項1から4に記載のモノクロナール抗体のいずれかを含む乳腺及び黒色腫の悪性腫瘍、その転移及び再発の生体内部位及び同定のための医薬組成物。
【請求項８】
乳腺及び黒色腫の悪性腫瘍、その転移及び再発の治療に有用な医薬品の製造のために請求項1から4に記載のいずれか一つのモノクロナール抗体の使用。
【請求項９】
その重鎖及び軽鎖の超可変ドメインが以下の配列：
重鎖
2004528033.tif 000049
軽鎖
2004528033.tif 000050
を含み、寄託番号ECACC97112901のハイブリドーマ細胞系によって生産され、マウスMAb  P3を認識するマウス抗イディオタイプモノクロナール抗体1E10に由来するキメラモノクロナール抗体。
【請求項１０】
その重鎖及び軽鎖骨格領域（FR）が以下の配列：
重鎖
2004528033.tif 000051
軽鎖
2004528033.tif 000052
を含む請求項9に記載のモノクロナール抗体。
【請求項１１】
そのヒト化及び抗原に対する結合性を保持するために下記置換：
軽鎖
2004528033.tif 000053
重鎖
2004528033.tif 000054
の少なくとも一つを含む請求項9及び10に記載のモノクロナール抗体。
【請求項１２】
重鎖の定常領域がガンマ-1鎖のアミノ酸配列を含みそして軽鎖の定常領域がカッパ鎖のアミノ酸配列、いずれもヒト免疫グロブリン由来、を含む請求項9から11に記載のモノクロナール抗体。
【請求項１３】
請求項9から12に記載のモノクロナール抗体のいずれかを生産する細胞系。
【請求項１４】
請求項9から12に記載のモノクロナール抗体のいずれかを含む乳腺及び黒色腫の悪性腫瘍、その転移及び再発を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
請求項9から12に記載のモノクロナール抗体のいずれかを含む請求項のモノクロナール抗体のいずれかを含む乳腺及び黒色腫の悪性腫瘍、その転移及び再発の生体内部位及び同定のための医薬組成物。
【請求項１６】
乳腺及び黒色腫の悪性腫瘍、その転移及び再発を治療するために有用な医薬品の製造のために請求項9から12に記載のいずれか一つのモノクロナール抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明はバイオテクノロジーの分野、特に遺伝子操作により得られる新規組換え抗体、特にマウスモノクロナール抗体P3（MAb  P3）及びその抗-イディオタイプマウスモノクロナール抗体1E10（MAbai 1E10）から得られるキメラ及びヒト化抗体に関するものである。
【０００２】
特に、本発明は、N-グリコリル化シアル酸含有ガングリオシドに結合するが、ガングリオシドのアセチル化体とも中性グリコリピッドとも結合しない抗体に関するものである。N-グリコリル化シアル酸を含有するガングリオシドは乳癌及び黒色腫に広く発現する抗原である。他方、MAbai  1E10の抗腫瘍効果は実験モデルにおいて示されている。
【０００３】
本発明はまた、癌、特に乳癌及び黒色腫の診断と治療に有用な前記組換え抗体を含む医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
先行技術
ガングリオシドはシアル酸を含有するグリコスフィンゴリピッドであり、脊椎動物細胞の形質膜に存在する（Stults et al. (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179: 167-214）。この分子のいくつかは腫瘍に関係する抗原または腫瘍マーカーとして文献に報告されている（Hakomori et al. (1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens, Curr. Opin. Immunol., 3: 646-653）、そのために抗-ガングリオシド抗体は癌の診断及び治療に有用であると記述されている（Hougton et al. (1985): Mouse monoclonal antibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82: 1242-1246; Zhang et al. (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus on gangliosides, Int. J. Cancer, 73: 42-49）。
【０００５】
動物に頻繁に発現するシアル酸はN-アセチル体（NeuAc）及びN-グリコリル体（NeuGc）である（Corfield et al. (1982): Occurrence of sialic acids, Cell. Biol Monogr., 10: 5-50）。NeuGcは一般的に正常ヒト及びニワトリ組織には発現しないが、他の脊椎動物には広く分布している（Leeden and Yu, (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A and Shengtrund CL (Eds). Plenum Press, New York, 1-48; Kawai et al. (1991): Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma cell lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatography-mass spectrometry, Cancer Research, 51: 1242-1246）。しかし、抗-NeuGc抗体が一部のヒト腫瘍及び腫瘍細胞系を認識することを示す報告がある（Higashi et al. (1988): Detection of gangliosides as N-glycolylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79: 952-956; Fukui et al. (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated Hanganutziu-Deicher antigen in human gastric cancer cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154）。GM3（NeuGc）ガングリオシドのレベル上昇がヒト乳癌において認められており（Marquina et al. (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research,1996; 56: 5165-5171）、この結果はこの分子を癌治療の標的として使用することを魅力的にしている。
【０００６】
登録番号ECACC94113026（欧州特許EP 0 657 471 B1）で寄託されている細胞系により生産されるモノクロナール抗体（Mab）P3、はIgMアイソタイプのマウスモノクロナール抗体であり、GM3(NeuGc)及び破傷風毒素を含むリポソームで免疫したBALB/cマウスのマウス脾臓細胞とマウス骨髄腫であるP3-X63-Ag8.653細胞系を融合して得られる。このMab  P3はN-グリコリル化シアル酸を含むガングリオシドと強く反応するが、ガングリオシドのアセチル化体とも中性グリコリピッドとも反応しない。良性及び新生腫瘍の細胞系及び組織を使用して行なった免疫細胞化学及び免疫組織化学の研究により、Mab  P3は乳癌（Vazquez et al. (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14: 551-556）及び黒色腫を認識することが示された。
【０００７】
Mab  P3は、アジュバント及び担体タンパクがなくても、BALB/cマウス（同系モデル）において抗-イディオタイプ免疫応答（Ab2）を誘導した（Vazquez et al. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534）。この抗体の認識機能における陰性荷電基、（ガングリオシドの）シアル酸及び（スルファチドの）SO3-、の役割が免疫化学分析により示唆されている（Moreno et al. (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8: 695-705）。
【０００８】
サブタイプIgG1の抗-イディオタイプMab  1E10（Mabai  1E10）はKLHと共役したMab  P3で免疫したBALB/cマウスから得られた（米国特許6,063,379、登録番号ECACC 97112901で寄託された細胞系）。Mabai  1E10は特異的にMAb P3を認識し、他のIgM抗-ガングリオシド抗体とは結合しない。さらに、Mabai  1E10は、Mab  P3のGM3(NeuGc)及び乳管癌（Mab  P3結合陽性）由来細胞系MDA-MB-435への結合を阻害した。MAbai  1E10は、同系または異系モデルのマウスを免疫した場合に、Ab3抗体の免疫応答を強く誘導したが、Ab1抗体と同じイディオトープを持つにもかかわらず、このAb3抗体はMab  P3と同じ特異性を示さなかった（Vazquez et al. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534）。MAbai 1E10は同系並びに異系マウスにおいて強い抗腫瘍効果を誘導した。BALB/cマウスに免疫接種した場合に、乳癌細胞系F3IIの成長は、フロイントアジュバント中のKLHと共役したMAbai  1E10の反復投与により有意に減少した。また自然肺転移の数はワクチン接種の後に減少した。メラノーマ細胞B16の静脈内接種10から14日後に、接種したC57BL/6マウスにMabai  1E10を静脈内投与したところ、関係のないIｇGを投与したマウスと比較して肺転移数の劇的な減少を生じた。これらの結果は1つ以上の抗腫瘍効果の機序が誘発されたことを示している（Vazqez et al. (2000): Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolyl-containing gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751-756, 2000）。
【０００９】
ハイブリドーマ技術はこの15年間に発展し（Koehler y Milstein (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495-497）、そしてモノクロナール抗体は依然として診断及び研究において非常に重要であるけれども、それらはヒトにおける治療上の有効性を示すに至っていない。それは主に血中における短い半減期、そしてマウスのエフェクター機能がヒト免疫系に適合しないこと、そしてまたヒト抗-マウス抗体免疫応答（HAMA応答）のためである。
【００１０】
しかし、遺伝子操作技術は、免疫グロブリン遺伝子の操作により、MAb利用の可能性を革命的に拡大し、抗原性の少ない修飾抗体を得ることも、ある病因の治療または診断のためにエフェクター機能を改良することも可能である。免疫グロブリン免疫原性の減少方法は、抗原認識特異性を変化させることなくマウス抗体及びヒト免疫グロブリンの相違を減少させる必須の目的を持っている（Morrison y Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv Immunol., 44: 65-92）。
【００１１】
最近マウスまたはラット抗体をヒト化するための方法がいくつか開発され、ヒトに注入された時に外来タンパクに対する異種免疫応答を軽減する方法が開発された。免疫原性を軽減する最初の方法の一つはキメラ抗体であり、その中においてマウスタンパクの可変ドメインはヒト分子の定常ドメインに挿入されており、それは同じ特異性を示すが、マウス対応物に比較して免疫原性が減少しており、ヒトエフェクター機能はキメラ抗体により保存されている（Morrison et al. (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains, PNAS USA, 81: 6851-6855）。キメラ抗体がマウス対応物と同じ特異性を有すると言えども、げっ歯類可変領域に対する免疫応答はしばしば認められる。
【００１２】
キメラ抗体の免疫原性をさらに減少させる試みにおいて、げっ歯類モノクロナール抗体のCDRのみがヒト骨格領域に移植され、そしてこのハイブリッド可変領域はヒト定常領域を伴って発現された（Jones et al. (1986): Replacing the complementary-determining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321: 522-524; Verhoeyen et al. (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science 239, 1534-1536）。しかし、この方法にはいくつかの欠点がある：しばしば得られた抗体は親和性が低下しており、そして多数の骨格残基は対応するマウスのものに復帰変異し結合を回復してしまうにちがいない（Rietchmann et al. (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Nature, 332: 323-327; Queen et al. (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA, 86: 10029-10033; Tempest et al. (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266-272）。さらに、持続する免疫原性がCDR移植抗体にしばしば観察された。
【００１３】
Mateo及び共同研究者（米国特許番号US 5 712 120）はマウス抗体の免疫原性を減少させる方法を記述している。この方法によると、修飾は可変ドメイン、特にキメラ抗体のマウスFRに限定されている。さらに、置換は両親媒性配列を有するFRの領域のみに行われ、したがってそれらはT細胞によって認識される可能性のある抗原決定基である。この方法は、潜在的免疫原性抗原決定基に存在する数個のアミノ酸残基を最もヒト配列に近い残基で慎重に置換することを含んでおり、正規の構造に主として対応するアミノ酸及びCDRに直接隣接する残基またはVernier帯の中の残基は保存されていなければならない。
【００１４】
こうして得られた抗体は抗原結合特異性を保存し、そしてマウスまたはキメラ先駆体よりも免疫原性が減少していなければならず（Mateo et al. (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma 19: 463-71）、これらの性質はその治療上の有用性を増加させる。この新規方法を使用して、少ない突然変異及び勿論少ない遺伝子操作で行われなければならない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は遺伝子操作技術により得られる組換え抗体に関するものである。特に、本発明は、寄託番号ECACC94113026のハイブリドーマ細胞系によって生産されるマウスモノクロナール抗体P3に由来するキメラ抗体に関するものである。MAB  P3は乳癌細胞及び黒色腫に発現する抗原を認識する。MAb  P3は重鎖及び軽鎖の超可変領域（CDR）の下記配列により規定される：
重鎖：
2004528033.tif 000002
軽鎖：
2004528033.tif 000003
【００１６】
望ましくは、重鎖及び軽鎖のFRは下記である：
重鎖：
2004528033.tif 000004
軽鎖：
2004528033.tif 000005
【００１７】
望ましい態様において、本発明のキメラ抗体は、ヒトIgG1重鎖の定常領域及びヒトCk軽鎖の定常領域を含む。その他の態様において、本発明は、寄託番号ECACC94113026のハイブリドーマによって生産されるMab  P3に由来するヒト化抗体に関係しており、それはヒトIgG1重鎖の定常領域及びヒトCk軽鎖の定常領域を含むことにより規定されそして軽鎖のFR領域は下記の点突然変異のいずれかを含む：
軽鎖：
2004528033.tif 000006
【００１８】
その他の態様において、本発明は寄託番号ECACC97112901のハイブリドーマ細胞系によって生産されるマウスモノクロナール抗体1E10に由来するキメラ抗体に関係し、それは抗イディオタイプ抗体であり、MAb  P3を認識する。MAbai  1E10は重鎖及び軽鎖の超可変領域（CDR）の下記配列により規定される：
重鎖：
2004528033.tif 000007
軽鎖：
2004528033.tif 000008
【００１９】
望ましくは、重鎖及び軽鎖のFR配列は下記である：
重鎖：
2004528033.tif 000009
軽鎖：
2004528033.tif 000010
【００２０】
望ましい態様において、本発明のキメラ抗体は、ヒトIgG1重鎖の定常領域及びヒトCk軽鎖の定常領域を含む。その他の態様において、本発明は寄託番号ECACC 97112901のハイブリドーマ細胞系によって生産されるMab  1E10に由来するヒト化抗体に関係しており、それはヒトIgG1重鎖の定常領域及びヒトCk軽鎖の定常領域を含むことにより規定されそして重鎖及び軽鎖のFR領域は下記の点突然変異のいずれかを含む：
軽鎖：
2004528033.tif 000011
重鎖：
2004528033.tif 000012
【００２１】
その他の態様において、本発明は記述したキメラ及びヒト化抗体を発現する細胞系に関係している；さらに本発明は記述した抗体を含む医薬組成物に関係している。
【００２２】
望ましくは、乳腺、肺、消化器系、泌尿・生殖器系、黒色腫、肉腫及び神経外胚葉形成異常の腫瘍、それらの転移及び再発を治療するための、記述した抗体及び適当な賦形剤を含む医薬組成物に関係している。
【００２３】
本発明のその他の例において、記述した抗体を含む医薬組成物を乳腺、肺、消化器系、泌尿器・生殖器系、黒色腫、肉腫及び神経外胚葉形成異常の腫瘍、それらの転移及び再発の部位と診断のために使用することができる。
【００２４】
MAb  P3及びMabai  1E10の可変領域のcDNA合成及びPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）による遺伝子増幅。
P3（GM3  N-グリコリル化ガングリオシドを認識するマウスIgM  MAb）または1E10（抗イディオタイプ抗-P3抗体）の106ハイブリドーマ細胞から細胞質RNAを抽出した。RNAはTRIZOL試薬（GIBCO BRL, Grand Island, NY）を使用し、メーカー説明書に従い抽出した。
【００２５】
cDNA合成反応は、5μgのRNA、25 pmoleのVh（VHP3に対するマウスIgMの定常領域に相補的であり、VH1E10に対するマウスIgG1の定常領域を有する）またはVk（両抗体のマウスカッパー定常領域に相補的）、2.5 mMの各dNTP、50 mM Tris-HCl pH 7.5, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 8 mM MgCl2及び15単位のRNA分解酵素阻害剤の混合物を50μl反応混合物として行なった。10分間70℃に加熱した後、徐々に37℃にした。次いで、100単位のMLV逆転写酵素系を加え、42℃におけるインキュベーションを1時間行なった。
【００２６】
可変領域VK及びVHのcDNAをPCRで増幅した。簡単に述べると、5μlのVHまたはVKのcDNAを25 pmoleの特異的プライマー、2.5 mMの各dNTP、5μlのTaq DNAポリメラーゼの10×緩衝液及び1単位の酵素と混合した。試料を94℃、30秒;  50℃、30秒;  72℃、1分の加熱サイクル25回を行ない、最後に72℃で5分間インキュベートした。
【００２７】
増幅cDNAのクローニング及び配列分析
（それぞれP3及び1E10の）VH及びVKのPCR産物をTAベクター（TA Cloning kit. Promega, USA）中にクローニングした。得られたクローンをT7 DNAポリメラーゼを使用するジデオキシ法（T7 sequencing kit, Pharmacia, Sweden）により配列分析した。
【００２８】
キメラ遺伝子の構築
VH  VK遺伝子をTAベクターから酵素的消化により切り出し、それぞれの発現ベクターにクローニングした（Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104）。
【００２９】
VH遺伝子をTAベクターからEcoRV及びNheIを使用する酵素消化により切り出し、ヒトIgG1可変領域及びヒスチジノール耐性遺伝子を含む発現ベクター（PAH4604）にクローニングした。生成した構築はP3VH-PAH4604及び１E10VH-PAH4604であった。VK遺伝子をTAベクターからEcoRV及びSaIIを使用する酵素消化により切り出し、発現ベクター（PAG4622）にクローニングした。このベクターはマイコフェノール酸耐性遺伝子及びヒトカッパ定常領域を含んでいる。生成した構築はP3VK-PAG4622及び1E10VK-PAG4622であった。
【００３０】
Mab  P3及びMabid  1E10から得られるキメラ抗体の発現
NS-0細胞を10μgのP3VK-PAG4622または1E10VK-PAG4622を使用して電気穿孔し、ヒトカッパ軽鎖を発現するクローンに10μgのP3VH-PAH4604または１E10VH-PAH4604を導入した。
【００３１】
DNAをPvuI酵素で消化して直線化し、エタノールで沈殿し、50μlのPBSに溶解した。約107細胞を遠心分離により採取し、電気穿孔用キュベット中で消化したDNAとともに0.5 mlのPBSに再懸濁した。氷上に10分間置いた後、キュベットに200ボルト及び960μFのパルスを与えた後、さらに氷上に10分間置いた。細胞をD'MEM F12プラス10%胎児ウシ血清を入れた96ウエルプレートに分配した。2または4日後、選別培地（マイコフェノール酸0.45μg/mLまたはヒスチジノール10 mMをそれぞれ含むD'MEM F12）を加えた。遺伝子導入クローンは14日後には肉眼で認めることが出来た。
【００３２】
遺伝子導入クローンを含むウエルの培地中に存在するヒト抗体はELISAにより測定した。マイクロタイタープレートのウエルをヤギ抗-ヒトカッパ軽鎖（ヒトカッパ鎖生産クローンについて）または抗-ヒトIgG（ガンマ鎖特異的）（完全抗体生産クローンについて）でコートした。PBST（0.05% Tween 20含有リン酸緩衝食塩液）で洗った後、遺伝子導入細胞を含むウエルの希釈培養液を各マイクロタイターウエルに37℃で1時間加えた。ウエルをPBS-Tで洗い、西洋ワサビぺルオキシダーゼを結合したヤギ抗-ヒトカッパ軽鎖またはアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗-ヒトIgG（ガンマ鎖特異的）を加えて37℃で1時間インキュベートした。ウエルをPBS-Tで洗い、o-フェニレンジアミンまたはp-ニトロフェニルホスフェートを含む基質緩衝液をそれぞれ加えた。30分後、492または405 nmの吸光度をそれぞれ測定した。
【００３３】
T細胞抗原決定基のヒト化によるヒト化抗体P3 hu及び1E10 huの構築。T細胞抗原決定基の推定。
P3及び1E10可変ドメインの配列をアルゴリスムAMPHI（Margalit et al. (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138: 2213-2229）。T免疫原性に関係し、7または11アミノ酸残基のヘリカル両親媒性部分を調べた。プログラムSOHHAもまたヘリカル疎水性部分を推定した（Elliot et al. (1987): An hypothesis on the binding of an amphipatic, alpha helical sequence in li to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2949-2952)。両アルゴリスムともに、抗体P3及び1E10の可変領域配列の部分はT-ヘルパー細胞に対してMHCクラスII分子として提示され得ると推定した。
【００３４】
ヒト免疫グロブリンとの相同性分析。
マウス可変領域のアミノ酸配列をGeneBank及びEMBLデータベース（インターネットで入手可能）に含まれる免疫グロブリンと比較した。各抗体に最も近似するヒト可変領域配列が決定された。ソフトウエアPC-TWO  HIBIO  PROSIS  06-00（Hitachi）を配列相同性探索に使用した。
【００３５】
免疫原性減少の分析。
本方法の目的は、最小の変更で免疫原性発現を減少させることまたは潜在的免疫原性T抗原決定基をヒト化することにある。この方法はヘリカル両親媒性部分に局在する数個のアミノ酸残基を慎重に置換することを含んでいる。主として正規構造に必要なアミノ酸、CDRに直接隣接する残基またはVernier帯にある残基は保存されていなければならない。
【００３６】
この方法に従って、マウス可変領域配列を最も近似するヒト配列と比較し、FR中の残基のみを考慮して（Kabat (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health）、各位置においてマウスMAb及び最も近似するヒト配列の間で相違するアミノ酸を同定し、決定した残基を最も近似するヒト配列に存在する残基で置換した。置換は位置指定突然変異誘発技術により行なった。
【００３７】
結合部位の3次元構造に関係する残基は置換しなかった；それは抗原認識に影響する可能性がある。その他の置換による3次構造への影響に関する情報は抗原結合部位の分子模型により得ることができる。
【００３８】
ヘリカル両親媒性部分におけるプロリン残基の存在及びあるマウス残基は最も近似するヒト配列の同じ位置に認められないが他の免疫グロブリンにはしばしば存在することは記憶にとどめておかなければならない。そのために骨格の中において置換されるべき独特のマウスアミノ酸の組合せはない。種々の置換数を持つ修飾抗体の種々の変異体が得られる可能性がある。突然変異はPCRの重複により行われた。
【００３９】
ヒト化抗体P3hu及び1E10huのクローニング及び発現。
P3hu及び1E10huに対応する遺伝子構築は、キメラ抗体について記述した方法に従って発現ベクター中にクローニングした。生成した構築はP3VKhu-PAG4622または1E10Vkhu-PAG4622及びP3VHhu-PAH4604及び1E10VHhu-PAH4604であった。これらは既にキメラ抗体について記述したプロトコールに従ってNS-0細胞に導入した。
【００４０】
組換え抗体の精製。
組換え抗体はタンパクA（Pharmacia, Upssala, Sweden）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００４１】
生物活性。
ELISAにより測定する抗原への特異的結合により組換え抗体の生物活性を試験した。
【００４２】
組換えMAb  P3については、マイクロタイタープレートをメタノール中GM3(NeuGc)ガングリオシドでコートした。1時間乾燥後、非特異的結合を牛血清アルブミン（BSA）1%含有Tris-HCl緩衝液でブロックし、37℃で1時間インキュベートした。ウエルをPBSで洗い、精製組換えMab P3と37℃で1時間インキュベートした。ウエルをTris-HClで洗い、アルカリ性ホスファターゼを結合したヤギ抗-ヒト抗体を加えて37℃で1時間インキュベートした。最後に、ウエルを洗い、p-ニトロフェニルホスフェートを含む基質緩衝液を加えた。30分後、405又は492 nmで吸光度を測定した。
【００４３】
組換えMabai  1E10については、ウエルをMab  P3でコートし、PBS-0.05% Tween 20で洗浄した以外は、同様にELISA検定を行なった。
【００４４】
例
以下の例において使用した全ての酵素並びに試薬及び材料は、特記しない限り、市販品を使用した。
【００４５】
例1．キメラMAb  P3の調製。
cDNAの合成は、記述のようにMab  P3を生産するハイブリドーマのRNAから出発して、逆転写酵素を使用する反応により行なった。この反応に使用した特異的プライマーの配列を示す：
VHに対して：
2004528033.tif 000013
VKに対して：
2004528033.tif 000014
【００４６】
cDNA VHP3及びcDNA VKP3はTaqポリメラーゼ及び特異的プライマーを使用するPCRにより増幅した。このプライマーに含まれる制限部位はVHに対してECORV/NHEI、そしてVKに対してECORV/SALIであった。使用したプライマーの配列は下記の通りである：
VHに対して：
プライマー1（シグナルペプチド）：
2004528033.tif 000015
プライマー2（CH1）：
2004528033.tif 000016
VKに対して：
プライマー1（シグナルペプチド）：
2004528033.tif 000017
プライマー2（Ck）:
5'AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3'
【００４７】
PCR産物をTAベクター（TA cloning kit, Invitrogen）中にクローニングした。12個の個別クローンをT7 DNA Pol(Pharmacia)を使用するジデオキシ法により配列分析した。相同性分析により、VHP3及びVKP3に対する最も近似する配列グループを決定した。VHP3及びVKPの配列（図1及び2）はKabatの分類によりIBグループ及びVグループにそれぞれ高い相同性を有している。
【００４８】
VHP3に対しては制限酵素ECORV及びNHEIで、VKP3に対してはECORV及びSALIで消化した後、予め同じ酵素で消化した発現ベクター、VH及びVKに対してそれぞれPAH4604及びPAG4622中にクローニングした。これらの発現ベクターはSherie Morrison (UCLA, California, USA)から提供され、哺乳動物細胞における免疫グロブリン発現に適したものである。ベクターPAH  4604はヒト定常領域IgG1を含み、PAG  4622はヒト（Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104）。生成した構築はP3VH-PAH4604及びP3VK-PAG4622であった。
【００４９】
NS-0細胞に10μgのP3VK-PAG4622を導入し、軽鎖を発現するクローンに10μg  P3VH-PAH4604を導入した、両クラスのDNAは遺伝子導入前にPvuIで直線化し、エタノールで沈殿し、50μlのPBSに溶解した。
【００５０】
約107細胞を遠心分離により採取し、0.5 mlのPBSに再懸濁して消化したDNAと共に電気穿孔キュベットに入れた。氷上に10分間おいた後、細胞に200ボルト及び960μFのパルスを与え、そして氷上にさらに10分間置いた。細胞をD'MEM F12プラス10%胎児ウシ血清を入れた96ウエルプレートに分配した。2または4日後、選別培地（マイコフェノール酸0.45μg/mLまたはヒスチジノール10 mMをそれぞれ含むD'MEM F12）を加えた。遺伝子導入クローンは14日後には肉眼で認めることが出来た。
【００５１】
遺伝子導入クローンを含むウエルの培地中に存在するヒト抗体はELISAにより測定した。マイクロタイタープレートのウエルをヤギ抗-ヒトカッパ軽鎖（ヒトカッパ鎖生産クローンについて）または抗-ヒトIgG（ガンマ鎖特異的）（完全抗体生産クローンについて）でコートした。PBST（0.05% Tween 20含有リン酸緩衝食塩液）で洗った後、遺伝子導入細胞を含むウエルの希釈培養液を各マイクロタイターウエルに37℃で1時間加えた。ウエルをPBS-Tで洗い、西洋ワサビぺルオキシダーゼを結合したヤギ抗-ヒトカッパ軽鎖またはアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗-ヒトIgG（ガンマ鎖特異的）を加えて室温で1時間インキュベートした。ウエルをPBS-Tで洗い、o-フェニレンジアミンまたはp-ニトロフェニルホスフェートを含む基質緩衝液をそれぞれ加えた。30分後、492または405 nmの吸光度をそれぞれ測定した。
【００５２】
例2．ヒト化抗体P3の種々の変異体の調製。
マウスVHP3及びVKP3配列（図1及び2）をヒト配列と比較した。図3及び4は最も近似するヒト配列を示している。ヘリカル両親媒性領域または潜在的T細胞抗原決定基をマウスP3可変領域配列上で探索し、この方法に従ってマウス配列中の潜在的T細胞抗原決定基の破壊またはヒト化を行なうために、慎重なアミノ酸置換方法を行なった。
【００５３】
VHP3の分析により二つの両親媒性部分（図3）が示され、その第一はCDR1、FR2及びCDR2の一部の残基を包含し、第二はFR3の末端及びCDR3を包含している。最も近似するヒト配列と比較してマウス配列の主な相違はCDRまたは結合部位の3次元構造に含まれる残基に認められた。この理由により、マウスVHP3のいずれのアミノ酸も置換しないこととした。
【００５４】
VKP3の分析によりやはり2つの両親媒性部分（図4）が示され、第一の部分はFR1を包含し、第二はCDR2及びFR3の一部の残基を包含している。位置8，9，10，11及び13の残基を最も近似するヒト配列の同じ位置の残基で置換することとした。アミノ酸His，Lys，Phe，Met及びThrをそれぞれPro，Ser，Ser，Leu及びAlaで置換した。置換は下記に示す配列を持つプライマー1及び2及び3及び4を使用する重複PCRにより行なった（Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404）:
プライマー1：
2004528033.tif 000018
プライマー2：
2004528033.tif 000019
プライマー3：
2004528033.tif 000020
プライマー4：
2004528033.tif 000021
【００５５】
点突然変異は配列分析により確認した。生成した構築はP3Vkhuであり、それをPAG4622発現ベクター中にクローニングした。生成した構築はP3VKhu-PAG4622であった。ヒト化抗体P3を発現するために、NS-0細胞にP3VH-PAH4604及びP3VKhu-PAG4622を導入した。
【００５６】
P3hu抗体はキメラ抗体について既述した電気穿孔及び検出と同じ方法に従って導入した。
【００５７】
例3：キメラMAb P3の生物活性。
ELISAにより測定する抗原に対する特異的結合でキメラMab  P3の生物活性を調べた。
【００５８】
組換えMAb  P3に対して、マイクロタイタープレートをメタノール中GM3(NeuGc)ガングリオシドでコートした。37℃で1時間乾燥した後、非特異的結合をTris-HCl緩衝液中の1%牛血清アルブミン（BSA）で阻害し、37℃で1時間インキュベートした。ウエルをPBSで洗い、精製組換えMab  P3と37℃で1持間インキュベートした。ウエルをTris-HClで洗い、アルカリ性ホスファターゼを結合したヤギ抗-ヒト抗体を加え、37℃で1時間インキュベートした。最後に、ウエルをTris-HClで洗い、p-ニトロフェニルホスフェートを含む基質緩衝液を加えた。30分後405 nmにおける吸光度を測定した。
キメラMab  T1を陰性対照として使用した。
図5は抗原に対するキメラMab  P3の特異的結合を示す。
【００５９】
例4：キメラMAb  1E10の調製。
cDNA合成は、既述のように、Mab  1E10を生産するハイブリドーマのRNAから出発して、逆転写酵素との反応により行なった。この反応に使用した特異的プライマーの配列は以下の通りである：
VHに対して：
2004528033.tif 000022
VKに対して：
2004528033.tif 000023
【００６０】
cDNA  VH1E10及びcDNA  VK1E10をTaq  Pol及び下記特異的プライマーを使用するPCRで増幅した：
VHに対して：
プライマー１（シグナルペプチド）：
2004528033.tif 000024
プライマー2（CH1）：
2004528033.tif 000025
VKに対して：
プライマー1（シグナルペプチド）：
2004528033.tif 000026
プライマー2（Ck）：
2004528033.tif 000027
【００６１】
PCR産物をTAベクターにクローニングした（TA cloning kit, Invitrogen）。12個の個別のクローンをT7  DNA  Pol（Pharmacia）を使用するジデオキシ法により配列分析した（図7及び8）。相同性探索分析によりVH1E10及びVK1E10に最も近似する配列群を決定した。Kabatの分類によるとVH1E10及びVK1E10配列は種々の群及びV群とそれぞれ高い相同性を有している。VH1E10に対しては制限酵素ECORV及びNHEIによりそしてVK1E10に対してはHincII及びSALIによる消化の後、予め適当な酵素で消化した発現ベクター、VH及びVKそれぞれに対してPAH4604及びPAG4622中にクローニングした。これらの発現ベクターはSherie Morrison (UCLA, California, USA)から提供され、哺乳動物細胞中で免疫グロブリンを発現するのに適している。ベクターPAH4604はヒトIgG1定常領域を含んでおり、PAG4622はヒト（Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104）。生成した構築は1E10VH-PAH4604及び1E10VK-PAG4622であった。
【００６２】
NS-0細胞に10μgの1E10VK-PAG4622を導入し、軽鎖を発現するクローンに10μgの1E10VH−PAH4604を導入したが、両クラスのDNAは遺伝子導入の以前にPvuIで直線化し、エタノールで沈殿し、50μlのPBSに溶解した。
【００６３】
約107個の細胞を遠心分離により採取し、電気穿孔用キュベット中で消化したDNAと共に0.5 mlのPBSに再懸濁した。氷上に10分間置いた後、細胞に200ボルト及び960μFのパルスを与え、さらに10分間氷上に置いた。細胞をD'MEM F12プラス10%胎児ウシ血清を入れた96ウエルプレートに分配した。2または4日後、選別培地（マイコフェノール酸0.45μg/mLまたはヒスチジノール10 mMをそれぞれ含むD'MEM F12）を加えた。遺伝子導入クローンは14日後には肉眼で認めることが出来た。
【００６４】
遺伝子導入クローンを含むウエルの培地中に存在するヒト抗体はELISAにより測定した。マイクロタイタープレートのウエルをヤギ抗-ヒトカッパ軽鎖（ヒトカッパ鎖生産クローンについて）または抗-ヒトIgG（ガンマ鎖特異的）（完全抗体生産クローンについて）でコートした。PBST（0.05% Tween 20含有リン酸緩衝食塩液）で洗った後、遺伝子導入細胞を含むウエルの希釈培養液を各マイクロタイターウエルに37℃で1時間加えた。ウエルをPBS-Tで洗い、西洋ワサビぺルオキシダーゼを結合したヤギ抗-ヒトカッパ軽鎖またはアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗-ヒトIgG（ガンマ鎖特異的）を加えて室温で1時間インキュベートした。ウエルをPBS-Tで洗い、o-フェニレンジアミンまたはp-ニトロフェニルホスフェートを含む基質緩衝液をそれぞれ加えた。30分後、492または405 nmの吸光度をそれぞれ測定した。
【００６５】
例5．ヒト化抗体1E10の種々の変異体の調製。
マウスVH1E10  VK1E10配列（図6及び7）をヒト配列と比較し、図8及び9に最も近似するヒト配列を示した。ヘリカル両親媒性領域または潜在的T細胞抗原決定基をマウス1E10可変領域上で探索し、マウス配列中の潜在的T細胞抗原決定基を破壊またはヒト化するために慎重なアミノ酸置換方法を行なった。
【００６６】
VH1E10の分析により3個の両親媒性部分（図8）が示され、第一のものはFR1を、第二のものはFR2を、第三のものはFR3を包含する。位置5，40，42及び87（Kabatのナンバリングでは83）の残基を最も近似するヒト配列中の同じ位置の残基で置換した。アミノ酸Gln，Arg，GluをそれぞれVal，Ala，Gly及びArgで置換した。
【００６７】
置換は種々のプライマーのセットを使用する重複PCRにより行なった（Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404）。
【００６８】
重鎖の位置5における突然変異のためのプライマーは下記配列の1及び2及び3及び4であった：
プライマー1：
2004528033.tif 000028
プライマー2：
2004528033.tif 000029
プライマー3：
2004528033.tif 000030
プライマー4：
2004528033.tif 000031
【００６９】
配列分析によりチェックしたところ、位置5における点突然変異、位置40及び42における突然変異が導入されていた。
【００７０】
重鎖の位置40及び42における突然変異のためのプライマー：
プライマー1：
2004528033.tif 000032
プライマー2：
2004528033.tif 000033
プライマー3：
2004528033.tif 000034
プライマー4：
2004528033.tif 000035
【００７１】
配列分析により分析したところ、位置40及び42の点突然変異、位置87（Kabatのナンバリングでは83）における突然変異が導入されていた。
【００７２】
重鎖の位置87（Kabatのナンバリングでは83）における突然変異のためのプライマー：
プライマー1：
2004528033.tif 000036
プライマー2：
2004528033.tif 000037
プライマー3：
2004528033.tif 000038
プライマー4：
2004528033.tif 000039
【００７３】
その他の置換は、残基が結合部位の3次元構造に関係していたため、行なわなかった。
【００７４】
点突然変異は配列分析により確認した。生成した構築は1E10VHhuであり、PAH4604発現ベクターにクローニングした。生成した構築は1E10VH-PAH4604であった。
【００７５】
VK1E10の分析により3個の両親媒性部分も示され（図9）、第一の部分はFR1を、第二はCDR1を、第三はFR3を包含している。位置7，8及び15の残基を最も近似するヒト配列の同じ位置にある残基で置換することとした。アミノ酸Thr，Thr及びLeuをそれぞれSer，Pro及びValで置換した。置換は下記配列のプライマー1及び2及び3及び4を使用する重複PCRにより行なった（Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404）：
軽鎖の位置7，8及び15の突然変のためのプライマー：
プライマー1：
2004528033.tif 000040
プライマー2：
2004528033.tif 000041
プライマー3：
2004528033.tif 000042
プライマー4：
2004528033.tif 000043
【００７６】
点突然変異は配列分析により確認した。生成した構築は1E10VkhuでありそしてPAG4622発現ベクター中にクローニングした。生成した構築は１E10Vkhu-PAG4622であった。
【００７７】
ヒト化抗体1E10を発現するために、NS-0細胞に1E10VHhu-PAH4604及び1E10VKhu-PAG4622を導入した。
【００７８】
1E10hu抗体を、キメラ抗体について既述したのと同じ電気穿孔及び検出方法に従って、導入した。
【００７９】
例6：キメラMAb1E10の生物活性。
ELISAにより測定する抗原に対する特異的結合によりキメラMab  1E10の生物活性を試験した。
【００８０】
組換えMAb  1E10のために、マイクロタイタープレートをMab  P3でコートした。PBST（0.05% Tween  20を含むリン酸緩衝食塩液）で洗った後、非特異的結合をPBST中1%牛血清アルブミン（BSA）で阻害し、37℃で1時間インキュベートした。ウエルを洗い、精製組換えMab  1E10と37℃で1時間インキュベートした。ウエルをPBSTで洗い、アルカリ性ホスファターゼを結合したヤギ抗-ヒト抗体を加えて、37℃で1時間インキュベートした。最後に、ウエルをPBSTで洗い、p-ニトロフェニルホスフェートを含む基質緩衝液を加えた。30分後405 nmにおける吸光度を測定した。
キメラMab  C5を陰性対照として使用した。
図10はキメラMab  1E10のMab  P3への特異的結合を示す。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】VHP3  DNA及び推定アミノ酸配列。配列はKabatのナンバリングに従って整列しており（Kabat et al.(1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health）、CDRには点線を施した。
【図２】VKP3  DNA及び推定アミノ酸配列。配列はKabatのナンバリングに従って整列しており（Kabat and collaborators (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health）、CDRには点線を施した。
【図３】VHP3を最も近似するヒト配列と整列した。両親媒性部分にアンダーラインを施し、CDRを太字で示す。
【図４】VKP3を最も近似するヒト配列と整列した。両親媒性部分にアンダーラインを施し、CDRを太字で示す。
【図５】キメラMab  P3によるGM3(NeuGc)への特異的結合。Mab  P3及びMAb  T1（陰性対照）の種々の濃度においてELISAで試験した。マイクロタイタープレートをメタノール中GM3(NeuGc)及びGM3(NeuAc)（陰性対照）ガングリオシドでコートして特異的結合を測定した。
【図６】VH1E10  DNA及び推定アミノ酸配列。配列はKabatのナンバリングに従って整列しており（Kabat and collaborators (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health）、CDRには点線を施した。
【図７】VK1E10  DNA及び推定アミノ酸配列。配列はKabatのナンバリングに従って整列しており（Kabat et al.(1991）, Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health）、CDRには点線を施した。
【図８】VH1E10を最も近似するヒト配列と整列した。両親媒性部分にアンダーラインを施し、CDRを太字で示す。
【図９】VK1E10を最も近似するヒト配列と整列した。両親媒性部分にアンダーラインを施し、CDRを太字で示す。
【図１０】キメラMab  1E10によるマウスMab  P3への特異的結合。種々の濃度のMab  1E10及びMAb  C5（陰性対照）をELISAで試験した。マイクロタイタープレートをMab  P3及びMab  A3（陰性対照）でコートし、特異的結合を測定した。
【図５】
2004528033.tif 000055
【図１０】
2004528033.tif 000056
【国際公開パンフレット】
2004528033.tif 000057
2004528033.tif 000058
2004528033.tif 000059
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2004528033.tif 000061
2004528033.tif 000062
2004528033.tif 000063
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2004528033.tif 000068
2004528033.tif 000069
2004528033.tif 000070
2004528033.tif 000071
2004528033.tif 000072
2004528033.tif 000073
2004528033.tif 000074
2004528033.tif 000075
2004528033.tif 000076
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2004528033.tif 000079
2004528033.tif 000080
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2004528033.tif 000084
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2004528033.tif 000086
2004528033.tif 000087
【国際調査報告】
2004528033.tif 000088
2004528033.tif 000089
2004528033.tif 000090
2004528033.tif 000091
2004528033.tif 000092
2004528033.tif 000093
2004528033.tif 000094
2004528033.tif 000095
2004528033.tif 000096
2004528033.tif 000097