(57)【要約】本発明はまた、前脂肪細胞分化の刺激における、そしてしたがってまた、インスリン抵抗性症候群、または異脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、または２型糖尿病の治療における、ＬＸＲα活性もしくは発現の能動的モジュレーターの使用にも関する。
2004523231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において前脂肪細胞分化を刺激する方法であって、細胞にＬＸＲαアゴニストを投与することを含んでなり、該アゴニストが前脂肪細胞分化を刺激する、前記方法。
【請求項２】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１の方法。
【請求項３】
細胞が脂肪細胞、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞、または３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞である、請求項１の方法。
【請求項４】
ＬＸＲαアゴニストがコレステロールの酸化誘導体である、請求項１の方法。
【請求項５】
誘導体が、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
ＬＸＲαアゴニストがチアゾリジンジオン化合物である、請求項１の方法。
【請求項７】
チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン（ｄａｒｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
異常な前脂肪細胞分化と関連する障害を治療する方法であって、療法的有効量のＬＸＲαモジュレーターを哺乳動物に投与することを含んでなり、該ＬＸＲαモジュレーターが前脂肪細胞分化を刺激する、前記方法。
【請求項９】
ＬＸＲαモジュレーターがコレステロールの酸化誘導体である、請求項８の方法。
【請求項１０】
誘導体が、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
ＬＸＲαモジュレーターがチアゾリジンジオン化合物である、請求項８の方法。
【請求項１２】
チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
障害が、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）または２型糖尿病である、請求項８の方法。
【請求項１４】
ＬＸＲαモジュレーターを、薬剤的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤を含んでなる薬剤組成物中で、哺乳動物に投与する、請求項８の方法。
【請求項１５】
前脂肪細胞において、ＬＸＲα発現または活性レベルを増加させる方法であって、薬剤的有効量のＬＸＲαモジュレーターを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
ＬＸＲαモジュレーターがコレステロールの酸化誘導体である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
誘導体が、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
ＬＸＲαモジュレーターがチアゾリジンジオン化合物である、請求項１５の方法。
【請求項１９】
チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項１８の方法。
【請求項２０】
モジュレーターを哺乳動物に投与する、請求項１５の方法。
【請求項２１】
哺乳動物が、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病を有する、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前脂肪細胞分化を刺激する化合物を同定する方法であって：
レポーター遺伝子に機能可能であるように連結したＬＸＲα調節配列を含んでなる、前脂肪細胞または脂肪細胞を提供すること；
試験化合物を該細胞に導入すること；および
細胞におけるレポーター遺伝子の転写をアッセイすること、ここで、化合物の非存在下での転写に比較した、化合物の存在下での転写の増加が、該化合物が細胞において前脂肪細胞分化を刺激することの示標となる
を含んでなる、前記方法。
【請求項２３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
細胞が、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞、または３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフェイト、または蛍光タンパク質をコードする、請求項２２の方法。
【請求項２６】
ＬＸＲαのアゴニストを同定する方法であって：
ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片、ＬＸＲα活性化補助因子および化合物を接触させること；および
ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片とＬＸＲα活性化補助因子とが相互作用するかどうかを決定すること、ここで、ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片とＬＸＲα活性化補助因子との間の相互作用が、該化合物がＬＸＲαアゴニストであることの示標となる
を含んでなる、前記方法。
【請求項２７】
ＬＸＲα活性化補助因子がステロイド受容体活性化補助因子である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
ＬＸＲαのアゴニストを同定する方法であって：
ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片、ＬＸＲαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片、および化合物を接触させること；および
ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片とＬＸＲαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片とが相互作用するかどうかを決定すること、ここで、ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片とＬＸＲαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片との間の相互作用が、化合物がＬＸＲαアゴニストであることの示標となる
を含んでなる、前記方法。
【請求項２９】
ＬＸＲαへテロ二量体化パートナーがレチノイドＸ受容体である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
異常な前脂肪細胞分化と関連する障害の治療用の医薬品製造におけるＬＸＲαモジュレーターの使用であって、ＬＸＲαモジュレーターが前脂肪細胞分化を刺激する、前記使用。
【請求項３１】
ＬＸＲαモジュレーターがコレステロールの酸化誘導体である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
誘導体が、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
ＬＸＲαモジュレーターがチアゾリジンジオン化合物である、請求項３０記載の使用。
【請求項３４】
チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
障害が、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病である、請求項３０記載の使用。
【請求項３６】
ＬＸＲαモジュレーターを、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与する、請求項３０記載の使用。
【請求項３７】
異常な前脂肪細胞分化と関連する障害の治療において使用するための薬剤配合物。
【請求項３８】
ＬＸＲαモジュレーターがコレステロールの酸化誘導体である、請求項３７の薬剤配合物。
【請求項３９】
誘導体が、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールからなる群より選択される、請求項３８の薬剤配合物。
【請求項４０】
ＬＸＲαモジュレーターがチアゾリジンジオン化合物である、請求項３７の薬剤配合物。
【請求項４１】
チアゾリジンジオン化合物が、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩からなる群より選択される、請求項４０の薬剤配合物。
【請求項４２】
障害が、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病である、請求項３７の薬剤配合物。
【請求項４３】
ＬＸＲαモジュレーターを、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与する、請求項３７の薬剤配合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＬＸＲα活性もしくは発現のモジュレーターとしての試験化合物の活性を測定することによって、前脂肪細胞分化を刺激するその能力に関して、該化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、前脂肪細胞分化の刺激における、そしてしたがってまた、インスリン抵抗性症候群、または異脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、または２型糖尿病の治療における、ＬＸＲα活性もしくは発現の能動的モジュレーターの使用にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＰＰＡＲγは、脂肪細胞分化を駆動するための確立されたマスタースイッチである。非脂肪生成性である線維芽細胞株（ＮＩＨ−３Ｔ３）におけるＰＰＡＲγのレトロウイルス仲介発現は、この細胞に脂肪細胞表現型を与えた（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、１９９４）。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞をピオグリタゾン（チアゾリジンジオンクラスのＰＰＡＲγアゴニスト）で処理すると、インスリンもしくはインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）が調節する分化が増進されることが、脂質生成もしくはトリグリセリド集積速度によってモニターされた（Ｋｌｅｔｚｉｅｎら、１９９２）。ピオグリタゾンは、ＩＧＦ−Ｉに調節される細胞分化の左方移動および最大反応の増進の両方を引き起こしたが、これは、この薬剤がポリペプチドホルモンへの細胞の感度を増進するという考え方と一致する。したがって、ＰＰＡＲγアゴニストは、脂肪細胞分化促進因子およびインスリン増感因子であり、そして２型糖尿病を治療するのに臨床的に処方される。
【０００３】
ここで、我々は、チアゾリジンジオンであるダーグリタゾン（ｄａｒｇｌｉｔａｚｏｎｅ）が、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞およびヒト初代脂肪細胞において、核受容体ＬＸＲαの発現増加を導くことを示す。さらに、我々は、ＬＸＲαの活性化が、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を導くことを示す。
【０００４】
ＬＸＲ類は、核受容体スーパーファミリーのオーファンメンバーとして最初に同定され（Ｗｉｌｌｙら、１９９５）、そして２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールを含む、コレステロールの天然に存在する酸化誘導体の特定のクラスによって活性化されることが後に示された（Ｊａｎｏｗｓｋｉら、１９９６、Ｊａｎｏｗｓｋｉら、１９９９）。ＬＸＲファミリーの２つのメンバー：組織限定（主に肝臓、腸、腎臓および脂肪細胞）ＬＸＲαおよび遍在性ＬＸＲβが同定されている（Ｐｅｅｔら、１９９８、Ｒｅｐａ  ＆  Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ、１９９９）。コレステロールが過剰であり、そしてその酸化代謝産物が存在する場合、ＬＸＲαが活性化され、そして古典的な胆汁酸合成経路の律速酵素であるコレステロール７α−水酸化酵素をコードするＣｙｐ７ａ１遺伝子の転写を誘導する。コレステロール７α−水酸化酵素の上方制御によって、コレステロールの胆汁酸への変換が増進し、それによって循環コレステロール量が減少する。コレステロール恒常性の重要な調節因子としてのＬＸＲαの役割は、破壊されたＬＸＲα遺伝子に関してホモ接合体であるマウスで研究されてきている。これらの遺伝子修飾されたマウスは、通常の食餌を与えた際は、見かけ上健康でそして繁殖性である。しかし、高コレステロール含量の食餌（０．２％または２％）を与えた場合、コレステロール集積を伴う肝腫大が生じて、肝不全を導き、そしてまたＣｙｐ７ａ１転写誘導の失敗も検出された。これらの結果は、マウスにおいて、Ｃｙｐ７ａ１発現を調節するのにＬＸＲαが必要であり、そしてこれがコレステロール恒常性の維持に非常に重要であるという証拠を提供する。これらの観察がきっかけとなって、血中コレステロールレベルを低下させる手段として、胆汁酸合成を増加させるためのＬＸＲαアゴニストの使用が示唆された。
【０００５】
最近、ＡＴＰ結合カセット輸送体タンパク質１（ＡＢＣ−１）をコードする遺伝子が、ＬＸＲαによって転写的に調節されると報告された（Ｃｏｓｔｅｒら、２０００、Ｒｅｐａら、２０００）。ＡＢＣ−１輸送体は、コレステロールから高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）への細胞性流出に関与する。興味深いことに、この輸送体のいくつかの遺伝子欠陥はまた、多様な組織におけるコレステロール集積およびタンジール病コホートに属する患者における冠状動脈疾患のリスク増加によっても特徴付けられる。これによって、ＬＸＲαが、Ｃｙｐ７ａ１遺伝子を制御するのに加えて、コレステロールレベルを調節する際に、さらなる役割を有する可能性があることが示される。
【０００６】
ＷＯ  ９３／０６２１５（ＥＰ６０９２４０）、Ｔｈｅ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ。この出願は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーに属する５つの新規オーファン受容体のクローニングを記載するが、１つ（ＸＲ２）は後に、ヒトＬＸＲαであることが示された。
【０００７】
ＷＯ  ９６／２１７２６、Ｔｈｅ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ。この出願は、ＬＸＲαの性質決定を記載し、そして特定の反応要素、ＬＸＲ／ＲＸＲヘテロ二量体、およびＬＸＲに基づくアッセイを請求する。
【０００８】
ＷＯ  ９９／１８１２４（ＥＰ１０２１４６２）Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ。この出願は、核受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法を含む。請求される方法は、第一の蛍光試薬で標識した、核受容体またはそのリガンド結合ドメイン；第二の蛍光試薬で標識した、核受容体活性化補助因子またはその結合部分の使用；並びに第一および第二の蛍光試薬間のＦＲＥＴ測定を含んでなる。ＬＸＲは、請求される方法の核受容体の１つとして例示され、そしてＳＲＣ−１が活性化補助因子として例示される。
【０００９】
ＷＯ  ００／３４４６１  テキサス大学。この出願は、ＬＸＲαノックアウトマウスおよびスクリーニングにおけるその使用、胆汁酸合成を増加させる能力に関するＬＸＲαアゴニストのスクリーニング、コレステロールレベルを減少させるか、または胆汁酸合成を増加させる物質に関する、ＬＸＲαノックアウトを用いたスクリーニング、ＡＢＣ１発現のモジュレーターに関するスクリーニングなどの、コレステロール代謝をモジュレートする多様な側面を含む。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、ＬＸＲα活性のアゴニストが、前脂肪細胞分化を刺激するという発見に基づく。さらに、前脂肪細胞の分化には、ＬＸＲαの発現増加が伴う。前脂肪細胞分化の刺激は、インスリン抵抗性症候群、または異脂肪血症、または２型糖尿病の治療にもまた有用である。
【００１１】
１つの側面において、本発明は、細胞において、前脂肪細胞分化を刺激する方法であって、細胞にＬＸＲαアゴニストを投与することを含んでなり、該アゴニストが前脂肪細胞分化を刺激する、前記方法を特徴とする。１つの態様において、細胞は、脂肪細胞、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞、または３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞などの哺乳動物細胞である。１つの態様において、ＬＸＲαアゴニストは、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、ＬＸＲαアゴニストは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。
【００１２】
別の側面において、本発明は、異常な前脂肪細胞分化と関連する障害を治療する方法を特徴とする。該方法は、療法的有効量のＬＸＲαモジュレーターを哺乳動物に投与することを含み、該ＬＸＲαモジュレーターが前脂肪細胞分化を刺激する。１つの態様において、ＬＸＲαモジュレーターは、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、ＬＸＲαモジュレーターは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。障害は、異常な脂肪細胞分化を有するいかなる障害であることも可能であり、例えば、障害は、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病であることも可能である。ＬＸＲαモジュレーターは、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与を含む、当該技術分野に知られるいかなる方式で投与することも可能である。１つの態様において、薬剤的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤を含んでなる薬剤組成物中で、モジュレーターを哺乳動物に投与する。
【００１３】
別の側面において、本発明は、ＬＸＲα発現または活性レベルを増加させる方法であって、薬剤的有効量のＬＸＲαモジュレーターを投与することを含んでなる、前記方法を特徴とする。１つの態様において、ＬＸＲαモジュレーターは、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、ＬＸＲαモジュレーターは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。１つの態様において、モジュレーターを哺乳動物の前脂肪細胞に投与する。別の態様において、哺乳動物は、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病を有する。
【００１４】
本発明はさらに、受容体機能または発現モジュレーターを発見する際にＬＸＲα受容体を使用する多様な方法の使用に関連し、こうしたモジュレーターは、前脂肪細胞分化を刺激する際に使用可能であり、そしてしたがって、インスリン抵抗性症候群または異脂肪血症または２型糖尿病を変更するかまたは改善するのに使用可能である。
【００１５】
１つの側面において、本発明は、前脂肪細胞分化を刺激する化合物を同定する方法を特徴とする。該方法は次を含む：レポーター遺伝子に機能可能であるように連結したＬＸＲα調節配列を含んでなる細胞を提供し；試験化合物を該細胞に導入し；細胞におけるレポーター遺伝子の転写をアッセイする、ここで、化合物の非存在下での転写に比較した、化合物の存在下での転写の増加が、該化合物が前脂肪細胞分化を刺激することの示標となる。該細胞は、哺乳動物細胞などのいかなる細胞であることも可能である。１つの態様において、細胞は、脂肪細胞、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞、または３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞である。レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフェート、または蛍光タンパク質をコードすることが可能である。
【００１６】
別の側面において、本発明は、ＬＸＲαポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、ＬＸＲαポリペプチド、またはＬＸＲαポリペプチドを発現している細胞を、試験化合物と接触させ；そしてポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを決定することを含んでなる、前記方法を特徴とする。ポリペプチドへの試験化合物の結合は、ポリペプチドに結合した化合物の直接検出によって、または競合結合アッセイによって、検出可能である。
【００１７】
本発明はさらに、ＬＸＲαポリペプチド活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、ＬＸＲαポリペプチドと試験化合物を接触させ、そして試験化合物が前脂肪細胞分化を刺激する能力に関してアッセイする、ここで、ポリペプチドが前脂肪細胞分化を刺激する能力の増加が、該化合物がＬＸＲαポリペプチド活性をモジュレートすることの示標となることを含んでなる、前記方法を特徴とする。
【００１８】
別の側面において、本発明は、ＬＸＲαのアゴニストを同定する方法であって、ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片、ＬＸＲα活性化補助因子および化合物を接触させ；そしてＬＸＲαタンパク質もしくはその断片、およびＬＸＲα活性化補助因子が相互作用するかどうかを決定する、ここで、ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片、およびＬＸＲα活性化補助因子の間の相互作用が、該化合物がＬＸＲαアゴニストであることの示標となることを含む、前記方法を特徴とする。１つの態様において、ＬＸＲα活性化補助因子はステロイド受容体活性化補助因子である。
【００１９】
さらに別の側面において、本発明は、ＬＸＲαのアゴニストを同定する方法であって、ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片、ＬＸＲαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片、および化合物を接触させ；そしてＬＸＲαタンパク質もしくはその断片、およびＬＸＲαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片が相互作用するかどうかを決定する、ここで、ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片、およびＬＸＲαヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片の間の相互作用が、該化合物がＬＸＲαアゴニストであることの示標となることを含む、前記方法を特徴とする。１つの態様において、ＬＸＲαへテロ二量体化パートナーはレチノイドＸ受容体である。
【００２０】
本発明は、本出願に記載する方法によって発見したモジュレーターを含有する薬剤組成物、ならびに前脂肪細胞分化を刺激する際の、そしてしたがって、インスリン抵抗性症候群または異脂肪血症または２型糖尿病を変更するかまたは改善するのに用いる、該モジュレーターまたはこうしたモジュレーターを含んでなる薬剤組成物の使用に関連する。
【００２１】
１つの側面において、本発明は、異常な前脂肪細胞分化と関連する障害の治療用の医薬品製造におけるＬＸＲαモジュレーターの使用であって、ＬＸＲαモジュレーターが前脂肪細胞分化を刺激する、前記使用を特徴とする。１つの態様において、ＬＸＲαモジュレーターは、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、ＬＸＲαモジュレーターは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。障害は、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病などの、異常な前脂肪細胞分化に関連するいかなる障害であることも可能である。ＬＸＲαモジュレーターを、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与することが可能である。
【００２２】
さらに別の側面において、本発明は、異常な前脂肪細胞分化と関連する障害の治療における使用のための薬剤配合物を特徴とする。１つの態様において、ＬＸＲαモジュレーターは、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２４，２５（Ｓ）−エポキシコレステロールなどのコレステロールの酸化誘導体である。別の態様において、ＬＸＲαモジュレーターは、ダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾン、およびその薬剤的に許容しうる塩などのチアゾリジンジオン化合物である。障害は、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病などの、異常な前脂肪細胞分化に関連するいかなる障害であることも可能である。ＬＸＲαモジュレーターを、経口、局所、静脈内、経皮、直腸、または非経口投与することが可能である。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を、ＬＸＲαアゴニスト、２２−Ｒ−ヒドロキシコレステロールで処理すると、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の脂肪細胞分化が増進する。これは、ＬＸＲαがコレステロール恒常性の維持に非常に重要であるだけでなく、脂肪細胞分化の重要な調節因子に相当することを示す。ＬＸＲα活性モジュレーターまたはＬＸＲα発現モジュレーターで処理すると、前脂肪細胞分化の刺激につながる可能性があり、そしてインスリン感作を改善する際に有用性を有する可能性があり、そしてしたがって異脂肪血症およびインスリン抵抗性および２型糖尿病の新規治療を構成する。
【００２４】
本発明は、前脂肪細胞分化の刺激法であって、こうした治療が必要な患者に、ＬＸＲα活性モジュレーターまたはＬＸＲα発現モジュレーターの有効量を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２５】
化合物によるＬＸＲα発現のモジュレーション（好ましくは「上方制御因子」によるモジュレーション）は、例えば、改変された遺伝子発現レベルまたはメッセージ安定性を通じて引き起こすことが可能である。化合物によるＬＸＲα活性のモジュレーション（好ましくは「アゴニスト」によるモジュレーション）は、ＬＸＲα、ＬＸＲα／ＲＸＲαヘテロ二量体、ＬＸＲα／活性化補助因子またはＬＸＲα／ＲＸＲα／活性化補助因子複合体への化合物の結合を通じて、引き起こすことが可能である。
【００２６】
本発明のさらなる側面において、脂肪細胞分化剤の提供法であって、試験化合物がＬＸＲαをモジュレートする能力を測定する１以上の方法において、試験化合物としてＬＸＲα発現もしくは活性の推定上のモジュレーターを１以上用いて、そして前脂肪細胞分化を刺激可能な薬剤として使用する活性化合物を選択することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２７】
好適な試験法は、試験化合物の役割を試験するための動物モデルの使用を含む。これらは、典型的には、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口胃管栄養法、またはカニューレを介した実験動物の血流への直接注入による、化合物の投与を伴うであろう。インスリン感受性、脂質プロフィール、食物摂取、体温、代謝速度、行動上の活動（behavioural activity）および体重変化に対する影響は、すべて、標準法を用いて測定可能である。
【００２８】
適切なモジュレーターは、まず、単離ＬＸＲα受容体またはその断片もしくはキメラ型に対してスクリーニングすることによって、同定可能である。
好ましくは、以下からスクリーニングを選択する：
ｉ）ＬＸＲα、およびＬＸＲα反応要素にカップリングしたレポーター遺伝子を発現する細胞株を含んでなり、そしてレポーター遺伝子の発現に関してアッセイする、レポーター遺伝子アッセイを用いる、ＬＸＲα活性の測定。
【００２９】
ｉｉ）精製ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片と活性化補助因子もしくはその断片とを用いて、そして好ましくは時間分解蛍光共鳴エネルギー転移によるかまたはシンチレーション近接アッセイによって、ＬＸＲαと活性化補助因子との間の相互作用をアッセイする、ＬＸＲα活性の測定。
【００３０】
ｉｉｉ）精製ＬＸＲαタンパク質もしくはその断片およびヘテロ二量体化パートナーもしくはその断片を用いて、そして好ましくは時間分解蛍光共鳴エネルギー転移によるかまたはシンチレーション近接アッセイによって、ＬＸＲαおよびヘテロ二量体化パートナー間の相互作用をアッセイする、ＬＸＲα活性の測定。
【００３１】
ｉｖ）ＬＸＲαを発現している細胞株における、ＬＸＲα転写もしくは翻訳の測定。
ｖ）好ましくは時間分解蛍光共鳴エネルギー転移またはシンチレーション近接アッセイによる、ＬＸＲαへの直接化合物結合または競合的結合の測定。
【００３２】
適切なアッセイの例は、ＷＯ  ９９／１８１２４（ＥＰ１０２１４６２）Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．に見出すことが可能である。
適切な活性化補助因子の例は、限定されるわけではないが、ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２、およびＳＲＣ−３などのステロイド受容体活性化補助因子、ＮｃｏＡ−１、ＮｃｏＡ−２、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、ｐ３００、ｐ／ＣＩＰ、ＴＩＦ−１、ＴＩＦ−２、ＴＲＩＰ−１、およびＧＲＩＰ−１などの核受容体活性化補助因子である。
【００３３】
適切なヘテロ二量体化パートナーは、ＲＸＲα、ＲＸＲβおよびＲＸＲγなどのレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）であり、好ましくはＲＸＲαである。
好ましくは、細胞株は、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞または３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞または一般的に用いる他の哺乳動物細胞株いずれかである。
【００３４】
哺乳動物ＬＸＲα受容体は、商業的に入手可能なＲＮＡ、脳ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡライブラリーから、ライブラリースクリーニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの好適な分子生物学技術を用いて、好適に単離可能である。これらの技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓに広範囲にわたって詳述される。
【００３５】
こうして得られた哺乳動物ＬＸＲα受容体をコードするｃＤＮＡ類は、その後、ｐｃＤＮＡ３シリーズ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄなど。以下を参照されたい）などの商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターにクローニングする。別の哺乳動物発現ベクターが、Ｄａｖｉｅｓら，  Ｊ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ＆  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３３，  １５３−１５８に開示されている。標準的トランスフェクション技術を用いて、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａなどの一般的に入手可能な培養哺乳動物細胞株に、これらのＤＮＡ類を導入して、そして受容体を発現しているクローン性派生物を単離する。別の発現系は、我々の英国特許第２２５１６２２号に請求するＭＥＬ細胞発現系である。
【００３６】
これらの細胞への天然リガンドの適用は、トランスフェクションした受容体の活性化を引き起こし、この受容体の活性化は、ＡＢＣ−１またはａＦＡＢＰなどの内因性分子レベルに変化を引き起こす可能性がある。これらはすべて、標準的な公表された方法および商業的に入手可能な試薬を用いて測定可能である。さらに、これらのｃＤＮＡ類は、あらかじめ「レポーター」遺伝子でトランスフェクションしておいた、これらの細胞株の派生物にトランスフェクションすることが可能である。適切なレポーター遺伝子の例は、これらの細胞内変化を「レポート」するであろうエステラーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、およびＣＦＰなどの蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼである。
【００３７】
これらのトランスフェクション細胞株を用いて、これらの受容体を活性化する低分子化合物を同定することが可能であり、これらを「アゴニスト」と定義する。
さらに、またはあるいは、同じアッセイを用いて、ＬＸＲαリガンドの活性化効果をアンタゴナイズする低分子化合物を同定することが可能であり、これらを「アンタゴニスト」と定義する。アンタゴニストは、肥満症、異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群および２型糖尿病を治療する際に有用性を有する可能性がある。
【００３８】
試験化合物は、２アミノ酸以上、例えば最大６アミノ酸、最大１０または１２アミノ酸、最大２０アミノ酸、あるいは２０アミノ酸より大きい、例えば最大５０アミノ酸のポリペプチドでもよい。薬剤をスクリーニングする目的のために好ましい化合物は、低分子量でそして潜在的な療法剤である化学化合物である。これらは例えば、重量８００、６００または４００ダルトン未満などの、約１０００ダルトン未満のものである。所望により、試験化合物は化学物質ライブラリーのメンバーであってもよい。これは、適切な化合物、例えばペプチド、ペプトイドおよび他のオリゴマー化合物（環状または直鎖）、およびテンプレートに基づく、より小さい分子、例えばベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、炭素環および多環化合物（例えばナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、炭水化物およびアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリルおよび複素環化合物（例えばトリアジン、インドール、チアゾリジンなど）の、いかなる好適な数の、例えば数十から数百から数千から数百万などの、個々のメンバーを含んでなることも可能である。引用した数および列挙した化合物の種類は例であるが、限定的でない。好ましい化学物質ライブラリーは、低分子量でそして潜在的な療法剤である化学化合物を含んでなる。
【００３９】
本発明のさらなる側面において、前脂肪細胞分化を刺激し、そしてそれによってインスリン抵抗性症候群または異脂肪血症または２型糖尿病を変更するかまたは改善することが可能な薬剤としての、ＬＸＲα受容体の活性もしくは発現モジュレーターの使用を提供する。
【００４０】
本発明のさらなる側面において、インスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病を治療する方法であって、こうした疾患を患う患者に、ＬＸＲαの活性もしくは発現をモジュレートすることによって前脂肪細胞分化を刺激して、そしてそれによってインスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病疾患を変更するかまたは改善することが可能な薬剤であって、好ましくは本発明の１以上の方法を用いて同定した、前記剤の薬剤的有効量を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、異脂肪血症またはＩＲＳまたは２型糖尿病の治療用の医薬品調製における、ＬＸＲα活性をモジュレートすることによって前脂肪細胞分化を刺激可能な薬剤の使用を提供する。好ましくは、化合物はＬＸＲαアゴニストである。
【００４２】
本発明の別の側面にしたがって、薬剤組成物を調製する方法であって：
ｉ）本明細書記載の方法にしたがって、ある薬剤を前脂肪細胞分化の刺激に有用と同定し；および
ｉｉ）その薬剤またはその薬剤的に許容しうる塩を、薬剤的に許容しうる賦形剤または希釈剤と混合する
ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【００４３】
本発明がヒトＬＸＲα受容体の相同分子種および相同体の使用を含むことが認識されるであろう。
２型糖尿病、ＩＲＳまたは異脂肪血症の治療に必要な前脂肪細胞分化の度合いは、特定の疾患を患う患者で測定した際、既定レベルを超える刺激のほぼいかなるレベルであってもよく、好ましくは既定レベルを率にして少なくとも１０％超える増加である。好ましくは、単離受容体に対して測定した際、１００μＭ未満の、好ましくは１μＭ未満の、ＬＸＲαに対する親和性（Ｋｍ）を有する化合物を投与すべきである。
【００４４】
薬剤組成物はさらに、ＰＰＡＲγアゴニスト、好ましくはダーグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、またはトログリタゾンなどのチアゾリジンジオンを含んでなることが可能である。
【００４５】
用語「相同分子種」により、他の種における機能的に同等の受容体を意味する。
用語「相同体」により、同一または異なる種における、実質的に類似のおよび／または関連する受容体を意味する。
【００４６】
上記定義のいずれに関しても、受容体は例えば、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、そして特に少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば８５％、または９０％または９５％のペプチド配列同一性を有する可能性があると考えられる。相同受容体は、機能ドメインに相当する小領域に渡って、実質的により高いペプチド配列同一性を有する可能性があると認識される。ＤＮＡコード配列において、上記アミノ酸配列に関して概略したよりもより広い多様性を有するが、上記配列範囲内に属するペプチド配列同一性を有する受容体を生じるＤＮＡコード配列である、受容体を含む。ＬＸＲα受容体の好適な型には、公表された配列が含まれる。ヒトＬＸＲαのアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース、寄託番号Ｑ１３１３３（ＮＲＨ３＿ＨＵＭＡＮ）から得ることが可能であり、そしてｃＤＮＡ配列は、例えばＥＭＢＬデータベース寄託番号Ｕ２２６６２から得ることが可能である。ＬＸＲα受容体は、ヒト、サル、ラット、マウスおよびイヌを含む、哺乳動物種いずれか由来である。好ましくはヒトＬＸＲα受容体を用いる。
【００４７】
ＬＸＲα受容体の断片および部分的配列は、本発明のアッセイおよび解析法の有用な基質である可能性がある。これらに対する限定は実際的なもののみであって、これらは適切なアッセイおよび／または解析法で使用するのに必要な機能要素を含んでならなければならないと認識されるであろう。
【００４８】
本発明の薬剤は、治療が所望される状態のための標準的方式で投与可能であり、例えば経口、局所、非経口、頬側、鼻、または直腸投与によるか、あるいは吸入によって投与可能である。これらの目的のため、本発明の化合物は、当該技術分野に知られる手段によって、例えば錠剤、カプセル、水性もしくは油性溶液、懸濁物、エマルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、鼻スプレー、座薬、細分粉末または吸入用エアロゾルの形に、そして非経口使用（静脈内、筋内もしくは注入を含む）のため、無菌水性もしくは油性溶液または懸濁物または無菌エマルジョンに製剤可能である。
【００４９】
ＬＸＲα受容体の知識はまた、例えばアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの使用によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＸＲα受容体の発現を調節する能力も提供する。したがって、本発明のさらなる側面にしたがって、配列番号１、３および５に示すポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部に相補的なアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを含んでなる食欲制御剤を提供する。「相補的」によって、２つの分子が、ヌクレオチド塩基対相互作用による二本鎖分子を形成し他の分子相互作用を排除するように、ハイブリダイズ可能であることを意味する。
【００５０】
ＬＸＲα遺伝子のすべてもしくは一部に対応するポリヌクレオチド配列と協調するアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡは、標準的分子生物学によって、そして／または化学合成によって、慣用的手段を用いて産生可能である。アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡは、本発明の全長ＬＸＲα受容体遺伝子に相補的であるか、またはその断片に相補的であることが可能である。タンパク質コード領域に近接するかまたは該領域を含む遺伝子領域、あるいはその一部に相補的な、約１２〜約３０ヌクレオチドの範囲にあるオリゴマーを含んでなるアンチセンス分子は、本発明の好ましい態様である。所望により、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏの分解を予防するように、または細胞膜通過を促進するように、化学的に修飾可能であるし、そして／またはｍＲＮＡを不活性化することが可能な物質、例えばリボザイムをそこに連結することが可能であり、そして本発明はこうした構築物にも及ぶ。
【００５１】
ＬＸＲα受容体に相補的であり、そしてハイブリダイズ可能な配列を含んでなるオリゴヌクレオチドが、療法使用に意図される。ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示すオリゴヌクレオチド配列を同定する方法を完全に記載する、米国特許第５，６３９，５９５号、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、１９９７年６月１７日発行が、本明細書に援用される。
【００５２】
ＬＸＲα受容体をコードする核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を、アンチセンス療法のため合成することが可能である。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＤＮＡの安定な誘導体（ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートなど）、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定な誘導体（２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなど）、あるいは他のオリゴヌクレオチド擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）であることが可能である。生理学的に安定なアンチセンス分子の合成および効果を記載する、米国特許第５，６５２，３５５号、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ、１９９７年７月２９日発行および米国特許第５，６５２，３５６号、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７年７月２９日発行が、本明細書に援用される。ＬＸＲα遺伝子アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム被包によって、またはアンチセンス配列を宿するベクターからの発現によって、細胞に導入することが可能である。
【００５３】
新規実験モデルを提供し、異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群、２型糖尿病、肥満症および摂食障害の制御に対する試験化合物の効果を評価するのに有用な、トランスジェニック動物技術もまた、意図する。ＬＸＲαは、以下に簡略に概略するような、そして例えば“Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３に記載されるような、標準法を用いて、欠失させるか、不活性化するか、または修飾することが可能である。好ましくは、標的遺伝子またはその一部（例えばコード領域に隣接する相同配列）を、遺伝子機能を破壊するために遺伝子に挿入した選択マーカー（Ｎｅｏなど）と共にベクターへクローニングする。ベクターを直線化し、その後、胚性幹細胞（ＥＳ）（例えばマウスの１２９／Ｏｌａ株由来）に形質転換し（通常、エレクトロポレーションによる）、そしてその後、ある割合の幹細胞で、相同組換え事象が起こる。遺伝子破壊を含有する幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞（例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のもの）に注入し、そして発生のため、養母に移植する。キメラ子孫は、外皮の色マーカーによって同定可能である。キメラを、ＥＳ由来配偶子および宿主胚盤胞由来配偶子間の区別を可能にする遺伝子マーカーを持つマウスと交尾させることによって、交配して、生殖系列へのＥＳ細胞の寄与を確かめる。ＥＳ細胞由来配偶子の半数は遺伝子修飾を所持するであろう。子孫をスクリーニングして（例えばサザンブロッティングによって）、遺伝子破壊を持つもの（子孫の約５０％）を同定する。これらの選択された子孫は、ヘテロ接合体であろうし、そしてしたがって、別のヘテロ接合体と交配して、ホモ接合体子孫を生じることが可能である（子孫の約２５％）。
【００５４】
前核へのＤＮＡのマイクロインジェクション、スフェロプラスト融合またはＥＳ細胞の脂質仲介トランスフェクションなどの既知の技術によって産生したトランスジェニック動物と、標的遺伝子欠失（「ノックアウト」）を持つトランスジェニック動物を交配して、内因性遺伝子ノックアウトおよび外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝子置換を持つトランスジェニック動物を得ることが可能である。標的遺伝子破壊を含有するＥＳ細胞は、特定の改変を含有する標的遺伝子配列で形質転換することによって、さらに修飾することが可能である。相同組換え後、改変した遺伝子をゲノムに導入する。これらの胚性幹細胞を引き続き用いて、上述のようなトランスジェニック動物を生成可能である。適切な方法は、ＷＯ  ００／３４４６１  テキサス大学に記載される。
【００５５】
トランスジェニック動物は、食欲および肥満症を制御する際のＬＸＲαの役割を反映した表現型を示すであろうし、そしてしたがって試験化合物の効果を評価する、有用な実験モデルを提供するであろう。したがって、本発明のさらなる側面において、ＬＸＲαを欠失させるか、不活性化するか、または修飾して、そして異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群、２型糖尿病、食欲制御および肥満症における試験化合物の効果を評価するのに用いる、トランスジェニック動物を提供する。ＬＸＲα受容体はまた、例えば直接ＤＮＡ配列比較またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイによって、例えばヒト被験者における発現レベルを決定する、診断の基礎としても使用可能である。診断アッセイは、ＰＣＲおよび特に我々の欧州特許第０  ３３２  ４３５号に請求するような増幅不応突然変異系（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）などの核酸増幅技術の使用を伴うことが可能である。こうしたアッセイを用いて、遺伝子の対立遺伝子変異体、例えば挿入、欠失および／または１以上の点突然変異などの突然変異を決定することが可能である。こうした変異体は、ヘテロ接合体であることもまたはホモ接合体であることも可能である。肥満症患者において、類似の分子をコードする遺伝子の突然変異を同定するのに、他のアプローチが用いられてきている（Ｙｅｏら，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２０，  １１１−１１２）。
【００５６】
本発明のさらなる側面において、ＬＸＲα受容体は、他の細胞内および膜関連タンパク質との相互作用が維持されるが、そのエフェクター機能および生物学的活性が除去されるような方式で遺伝子操作することが可能である。この遺伝子修飾タンパク質は、優性ネガティブ突然変異体として知られる。適切な細胞種における優性ネガティブ突然変異体の過剰発現は、内因性タンパク質の影響を下方制御し、したがって、異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群、２型糖尿病における該遺伝子の生物学的役割を明らかにする。
【００５７】
同様に、ＬＸＲα受容体はまた、そのエフェクター機能および生物学的活性が増進されるように、遺伝子操作することも可能である。生じた過活性（overactive）タンパク質は、優性ポジティブ突然変異体として知られる。適切な細胞種における優性ポジティブ突然変異体の過剰発現は、内因性天然タンパク質の生物学的反応を増幅し、異脂肪血症、インスリン抵抗性症候群、２型糖尿病におけるその役割にスポットライトを当てる。これはまた、リガンドの非存在下で、恒常的に活性である受容体のアンタゴニストを検出するためのスクリーニングにおいても、有用性を有する。
【００５８】
したがって、本発明のさらなる側面において、ＬＸＲα受容体の優性ネガティブ突然変異体および優性ポジティブ突然変異体、並びにインスリン抵抗性症候群、異脂肪血症または２型糖尿病の制御におけるＬＸＲα受容体の生物学的役割を評価する際のそれらの使用を提供する。
【００５９】
本発明は、ここで、以下の特定の説明および配列表に言及することによって例示されるが、限定されないであろう［用いる多くの特定の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  １９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどの標準的な分子生物学の教科書に詳述される。その結果、本文中の適切な箇所で、この文献への言及がなされるであろう］。
【００６０】
（実施例）
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＬＸＲα発現に対するＰＰＡＲγ活性化因子の影響
増加する用量のＰＰＡＲγアゴニストで処理した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からの総ＲＮＡに対して、ノーザンブロット解析を行った。２４時間の期間に渡って、０．０１、０．１、および１ｍＭのダーグリタゾンで脂肪細胞を処理した。２０μｇの総ＲＮＡをノーザンブロッティングに供して、そして３２Ｐ標識したＬＸＲα  ｃＤＮＡプローブで探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。オートラジオグラムをスキャンすることによってシグナルを得て、そして１８Ｓ  ＲＮＡ発現に関して規準化した。結果は、ＬＸＲα  ｍＲＮＡのおよそ５倍の誘導を示した（図１）。これらの濃度は、レポーターアッセイにおいて、ＰＰＡＲγの活性化に必要な濃度と一致する（Ｌｅｈｍａｎｎら、１９９５）。したがって、選択的ＰＰＡＲγアゴニストで脂肪細胞を処理すると、ＬＸＲα  ｍＲＮＡレベルが増加する。
【００６１】
２２−Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびダーグリタゾンでの３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の処理
脂肪細胞分化に拘束された（committed）３Ｔ３−Ｌ１細胞を、ダーグリタゾン、ＬＸＲαアゴニスト２２−Ｒ−ヒドロキシコレステロールいずれか、または両方で処理した。２２−Ｒ−ヒドロキシコレステロール（２２−Ｒ）は、ＬＸＲαの天然存在アゴニストである（Ｊａｎｏｗｓｋｉら、１９９６）。２２−Ｒ、ダーグリタゾンまたは両方で刺激した細胞は、細胞のオイルレッド−Ｏ染色によって示されるように、次第により大きい脂質小滴を形成していた。これらの結果は、ＰＰＡＲγのダーグリタゾン刺激と共に、ＬＸＲαの２２−Ｒ刺激が、脂肪細胞におけるトリグリセリド貯蔵の増加を導くことを示す。平行して、総ＲＮＡのノーザンブロット解析は、ダーグリタゾンまたは２２−Ｒで処理した分化しつつある３Ｔ３−Ｌ１細胞における、ＬＸＲα  ｍＲＮＡの増加、並びにダーグリタゾンおよび２２−Ｒ両方での刺激による相加効果を示す（図２）。したがって、ＰＰＡＲγアゴニストまたはＬＸＲαアゴニストいずれかでの３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の処理は、脂肪集積およびＬＸＲα発現増加を導く。
【００６２】
２２−Ｒ−ヒドロキシコレステロールでのヒト脂肪細胞の処理
ヒト脂肪細胞は、乳房縮小術から得た。無菌条件下で、脂肪組織片（５〜６００ｍｇ）を調製し、そしてＯｔｔｏｓｓｏｎら（１９９４）に本質的に記載されるようにして、プラスチック試験管中でのインキュベーションに用いた。１μＭダーグリタゾン、５μＭ  ２２−（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、またはこれらの両方を、図の説明に示すように、４８時間添加した。ポリＡ＋  ＲＮＡを単離し、そしてノーザンブロット解析に供した（図３）。ダーグリタゾンおよび２２−（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールの両方での処理は、相加効果で、ＬＸＲα  ｍＲＮＡ発現レベル増加を導いた。したがって、選択的ＰＰＡＲγアゴニストまたはＬＸＲαアゴニストでの刺激は、ヒト脂肪細胞において、ＬＸＲα  ｍＲＮＡの上方制御を導く。
【００６３】
細胞および試薬
１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ中、３７℃で、３Ｔ３−Ｌ１細胞株（ＡＴＣＣ）を維持した。ＬｉｎおよびＬａｎｅ（１９９２）に記載されるようにして、細胞を集密まで増殖させて脂肪生成試薬に３日間曝露した後、インスリンのみを含有する培地中でさらに３日間培養した。インスリンは１μｇ／ｍｌの濃度で用い、デキサメタゾンは１μＭの濃度で用い、そしてイソブチルメチルキサンチンは０．５ｍＭの濃度で用いた。
【００６４】
ＲＮＡの調製および解析
分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞または脂肪組織からの総ＲＮＡは、製造者に推奨されるように、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）法によって抽出した。ＲＮＡのノーザンブロット解析は、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（１９９４）に先に記載されるように行った。ＬＸＲαおよびリボソームタンパク質１８Ｓ  ｍＲＮＡに関して、２０μｇの総ＲＮＡを解析した。
【００６５】
オイルレッドＯ染色
光学顕微鏡法およびオイルレッドＯ染色を用いて、分化中、これらの細胞における特徴的な細胞球状化および脂質小滴集積をモニターした。顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩＬ）および二色電荷結合素子カメラ（Ｌｅｉｃａ  ＭＰＳ  ６０）を用いて撮影した。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、分化３Ｔ３−Ｌ１細胞から単離した総ＲＮＡの、ＬＸＲαプローブで探査したノーザンブロット解析を示す、棒グラフを表す。
【図２】図２は、２２−Ｒ（５μＭ）単独、ダーグリタゾン（１μＭ）単独、または併用で２４時間刺激した、完全に分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞から得た総ＲＮＡ  ２０μｇの、ＬＸＲαプローブで探査したノーザンブロット解析を示す、棒グラフを表す。
【図３】図３は、１μＭ ダーグリタゾン（Ｄａｒ）、５μＭ  ２２−Ｒ−ヒドロキシコレステロール（２２−Ｒ−ＯＨ）または両方（Ｄａｒ＋２２−Ｒ−ＯＨ）の存在下で増殖させたヒト脂肪細胞から単離したポリＡ＋  ＲＮＡの、ＬＸＲαプローブで探査したノーザンブロット解析を示す、棒グラフを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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