(57)【要約】本発明は、エポキシドをアルコールに変換する方法に関する。本発明の方法は酵素的に触媒され、鏡像異性選択性およびレギオ特異性が高い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
2004504015.tif 000014
〔式中、Ｒ１は水素原子または置換されてもよい芳香族基もしくは脂肪族基を示す。〕
で表される、置換されてもよいエポキシドを、光学的に濃縮された一般式（Ｉ）で表されるエポキシドと、一般式
【化２】
2004504015.tif 000015
〔式中、Ｒ２はＩ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｎ３、ＮＯ２、ＮＯ３、ＳＣＮ、ＯＣＮ、ＯＲ’、ＮＨＲ’、ＳＲ’、ＳｎＲ’、ＳｅＲ’、ＰＲ’およびＣＯ２Ｒ’から選ばれる基である。Ｒ’は水素原子、アミノ基、水酸基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基から選ばれる基である。〕
で表される光学的に濃縮されアルコールとの混合物に酵素的に変換するための方法であって、ハロヒドリン　デハロゲナーゼの存在下に、該エポキシドとアニオン性求核剤（Ｒ２−）とを反応させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
光学的に濃縮されたアルコールを回収することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
光学的に濃縮されたエポキシドを回収することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ハロヒドリン　デハロゲナーゼが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその同族体もしくは機能性誘導体であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
同族体が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２のアミノ酸配列に少なくとも９０％が相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ハロヒドリン　デハロゲナーゼが、アグロバクテリウム　ラディオバクタ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（ＣＢＳ７５０．９７）、アースロバクタ属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）菌株ＡＤ２またはマイコバクテリウム属菌株ＧＰ１由来であることを特徴とする、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
エポキシドが、該エポキシドの両方の鏡像異性体を含む混合物から変換されることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
混合物がラセミ化混合物であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１が、置換されてもよいアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基およびアルコキシ基から選択されることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１が１〜２０の炭素原子を含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１がアミノ基、ハロゲン原子、水酸基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ハロアルキル基、アシル基、アルコキシ基、フェノキシ基およびカルボキシ基から選ばれる置換基を有していてもよいことを特徴とする、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
エポキシドが、一般式
【化３】
2004504015.tif 000016
〔式中Ｒ４は塩素、臭素またはヨウ素を示す。〕
で表されるエポキシドであることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
エポキシドがエピクロルヒドリン、エピヨードヒドリンまたはエピブロモヒドリンであることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アルコールが５０％よりも高い収率で得られることを特徴とする、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１が置換されてもよい芳香族基であることを特徴とする、請求項１〜１１のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
エポキシドが、一般式
【化４】
2004504015.tif 000017
〔式中Ｒ３は、基−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＯＯＨおよび−ＣＮから選ばれるｏ−、ｍ−またはｐ−位の置換基である。〕
で表されるエポキシドであることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
アニオン性求核剤が、Ｎ３−、ＮＯ２−またはＣＮ−であることを特徴とする、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
エポキシドが固形物、懸濁液、溶液または分散液の形態で反応に供されることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
エポキシドが、エポキシドと水性媒体との合計重量に対して０．０１〜２０重量％の量で水性媒体中に存在することを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
温度が０〜６０℃の間であることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ｐＨが３〜１２の間であることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エポキシドをアルコールに変換する方法に関する。特に具体的には、本発明は、求核置換反応によって、エポキシドをアルコールに変換する酵素的な方法に関する。
【０００２】
求核置換によって、エポキシドをアルコールに変換する反応は、以下のようにして表される。
【化５】
2004504015.tif 000002
この反応式において、Ｒは広い範囲の基を示し、たとえば、様々な置換基を有しまたは有さないアルキル基であり、一方、Ｘは求核基を示す。この変換による生成物は、たとえば、ある種の医薬品などの、種々のファインケミカル品の製造に非常に有用な成分である。この反応は、２種の異なる鏡像異性体を生成する。これらの生成物は、しばしば、鏡像異性純度が非常に重要になる用途に用いられるので、この反応を実施するための鏡像異性選択法を見つける多くの試みが、報告されている。
【０００３】
そのような反応の一例として、アジドイオン（Ｎ３−）によって、エポキシドを鏡像異性選択的に開環する、アジドライシスと呼ばれる反応が挙げられる。この反応の生成物である、光学的に活性なアジドアルコールは、たとえばアミノアルコール類などの、生物学的に活性な医薬品の前駆物質である。キラルのサレン錯体を用いる、メゾ−エポキシド類および種々の末端エポキシド類の高鏡像選択的なアジドライシスが、ヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）のグループによって記述されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，５８９７；Ｆａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８，７４２０）。生触媒反応による、光学的に活性な芳香族アジドアルコール類の合成もまた報告されている。たとえば、α−アジドケトンの還元（Ｂｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，５９，８２８８）、リパーゼによって触媒される光学的分割（Ｆｏｅｌｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，５５，１７４９）またはモノヒドロキシル化（Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９９６，７，１５５９）である。
【０００４】
酵素的に触媒される反応、特にハロヒドリン　デハロゲナーゼを利用した逆反応、すなわち、たとえばハロアルコールからのエポキシドの合成は、文献中で非常に注目されている。すべてのこれらの反応は、光学的に純粋なハロヒドリン類およびエポキシド類を得るために、たとえば、１，３−ジハロプロパノール、２，３−ジハロプロパノールおよび３−ハロ−１，２−プロパンジオールなどの脂肪族ハロヒドリン類を必要とした（Ｋａｓａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ：Ｂ，１９９８，４，２３７）。通常、ハロヒドリン　デハロゲナーゼ（ハロヒドリン　ハイドロゲンハライドリアーゼ、ハロヒドリン　エポキシダーゼまたはハロアルコール　デハロゲナーゼとも称される）は、ハロヒドリンの閉環を触媒し、エポキシドにする。限られた数のハロヒドリン類については、ハロヒドリン　デハロゲナーゼは逆反応をも触媒することが記述されている。両反応の平衡は以下のようにして表される。
【化６】
2004504015.tif 000003
〔式中Ｒは、置換基を有し若しくは有さないアリール基またはアルキル基などの広い範囲の基から選ばれ、Ｘは臭素、塩素またはヨウ素などのハロゲン原子を示す。〕
【０００５】
ハロヒドリン　デハロゲナーゼおよびハライドとは異なる求核剤を用いる１つの例が、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９４，５０，１１８２１に記載されている。この反応では、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の菌株Ｎ−１０７４由来のハロヒドリン　デハロゲナーゼを用い、シアン化物によってエポキシドを開環し、β−ヒドロキシニトリルを合成している。
【０００６】
ロードコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来の粗酵素を用い、アジドによって、エポキシドを非対称に開環することも記載されている（Ｆａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４，３５，８１参照）。この反応を請け負う酵素は、ハロヒドリン　デハロゲナーゼよりもむしろエポキシドハイドラーゼとされている。
【０００７】
化学的な触媒反応と比較すると、酵素の利用によって触媒される反応は、（有機）溶媒または、金属錯体などの環境的に疑わしい他の試薬の使用が少ない。たとえば、エポキシド類の触媒的な化学的アジドライシスは、典型的には、クロミウム、コバルトまたはチタニウムの錯体などの環境的に都合の悪い金属を用い、ジクロロメタン、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中にて行われる。さらに、酵素は、人工のその化学的対抗品に比べて、より選択的であり、かつより効率的な触媒であることがしばしばである。酵素触媒反応の利点をさらに完全に概観するには、Ｆａｂｅｒ，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７が参照される。
【０００８】
ファインケミカル産業において、光学的に純粋なハロヒドリン類およびエポキシド類は、種々の医薬品用の成分として使用される。ハロヒドリン類は、しばしば、エポキシド類の直接の前駆物質とみなされる。光学的に純粋なハロヒドリンの閉環は、通常、光学的に純粋なエポキシドを導く。最近、アグロバクテリウム　ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）ＡＤ１由来のハロヒドリン　デハロゲナーゼを用いる、２−クロロ−１−フェニルエタノールなどの、芳香族基を含有するハロヒドリンの動力学的光学分割について述べられている（Ｌｕｔｊｅ Ｓｐｅｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９９９，１０，２８６３）。
【０００９】
本発明は、置換されてもよいエポキシド類を、高鏡像異性選択的な手法で、アルコール類に変換する方法を提供する。所望の鏡像異性選択性が、一般式
【化７】
2004504015.tif 000004
〔式中、Ｒ１は水素原子または置換されることがある芳香族基もしくは脂肪族基を示す。〕
の、置換されてもよいエポキシド類を、光学的に濃縮された一般式（Ｉ）のエポキシドと、一般式
【化８】
2004504015.tif 000005
〔式中、Ｒ２はＩ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｎ３、ＮＯ２、ＮＯ３、ＳＣＮ、ＯＣＮ、ＯＲ’、ＮＨＲ’、ＳＲ’、ＳｎＲ’、ＳｅＲ’、ＰＲ’およびＣＯ２Ｒ’から選ばれる基である。Ｒ’は水素原子、アミノ基、水酸基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基から選ばれる基である。〕
の光学的に濃縮されたアルコールとの混合物に酵素的に変換することによって達成され、該方法は、ハロヒドリン　デハロゲナーゼの存在下での、上記エポキシドと陰イオン性求核剤（Ｒ２−）との反応を含むことを見出した。
2004504015.tif 000006
【００１０】
驚くべきことに、本発明にしたがってエポキシドを変換することによって、非常に高い鏡像異性的な過剰が得られる。出発原料が、エポキシドの両方の鏡像異性体のラセミ混合物であっても、主にその生成物の可能な鏡像異性体のうちの１つが得られる。したがって、本発明は、アルコールを製造するための非常に鏡像異性選択的な手法だけでなく、エポキシドの鏡像異性選択的な動的光学分割をも可能にする。たとえば、（置換基を有する）スチレンオキシドとアジドとの反応の場合には、アジドアルコールの（Ｒ）−鏡像異性体が主に形成され、エポキシドの未反応の（Ｓ）−鏡像異性体があとに残される。
【００１１】
しかも、本発明の方法は、レギオ特異性が高い。エポキシドの開環の場合、２つの異なる生成物が得られる。１つは、水酸基がＲ１基に隣接する炭素原子に存在しており、１つは、Ｒ１基から遠位の端の炭素原子に水酸基が存在している。本発明の方法では、主に、Ｒ１基に隣接する炭素原子に水酸基を有する異性体が得られる。
【００１２】
反応生成物である一般式（ＩＩ）のアルコールは、幅の広い変化に富んだ医薬品化合物の原料である。たとえば、アジ化ナトリウムとスチレンオキシドとの酵素的な反応によって得られる２−アジド−１−フェニルエタノールを、接触水素化によって、生化学的活性を有する２−アミノフェニルエタノールに変換することができる。
【００１３】
原則として、いずれの種のエポキシドを、本発明に従って変換してもよい。上記のように、Ｒ１基は水素原子または置換されることがある芳香族基もしくは脂肪族基であり、この芳香族基または脂肪族基は好ましくは１〜２０の炭素原子を含んでいる。好ましくは、Ｒ１は置換されることがあるアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基およびアルコキシ基から選択される。
【００１４】
Ｒ１で示されるアルキル基の好ましい具体例には、たとえば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基またはドデシル基などの直鎖状または分岐鎖状の炭素数１〜１５のアルキル基が含まれる。この基からの代表的なエポキシド類には、たとえば、１，２−エポキシプロパン、１，２−エポキシ−３−メチルペンタンおよび１，２−エポキシヘキサンが含まれる。アルキル基は、ハロゲン原子などの置換基を有することができ、これによって、たとえば、エピクロルヒドリン、エピフロロヒドリンまたはエピブロモヒドリンが導かれる。アルキル基は、水酸基などの置換基を有することができ、たとえば、グリコシドールが挙げられる。アルキル基は、アミノ、メチルアミノまたはジメチルアミノなどの非置換または置換アミノ基を有することができる。Ｒ１で示されるアリール基には、たとえば、フェニル基およびナフチル基が含まれる。フェニル基であるエポキシドの具体例としては、スチレンオキシドまたは、その芳香族環上に置換基または複数の置換基を有するスチレンオキシド類が挙げられる。エポキシド類の代表例としては、スチレンオキシド、４−ニトロスチレンオキシド、２−ニトロスチレンオキシド、３−ニトロスチレンオキシド、３−クロロスチレンオキシド、４−クロロスチレンオキシドまたは２，３−ジクロロスチレンオキシドが挙げられる。Ｒ１で示されるアラルキル基には、ベンジル基、２−フェニルエチル基および１−ナフチルメチル基が含まれる。Ｒ１で示されるアルケニル基には、ビニル基、アリル基および５−ヘキセニル基が含まれる。Ｒ１で示されるシクロアルキル基には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が含まれる。Ｒ１で示されるアルコキシ基には、フェノキシ基、４−ニトロフェノキシ基、ナフチロキシ基、メトキシ基、ヘキシルオキシ基およびビニルオキシ基が含まれる。
【００１５】
変換される好ましい種のエポキシド類は、一般式
【化９】
2004504015.tif 000007
で表される。この種のエポキシド類は、Ｒ１基が結合する炭素原子において基−ＣＨ２Ｒ４によって置換されてもよい。式中、Ｒ４基は独立して塩素、臭素およびヨウ素から選ばれる。この種のエポキシド類の好ましい具体例としては、たとえば、エピクロルヒドリン、エピブロモヒドリンおよび２−（クロロメチル）−２−メチルオキシランが挙げられる。アルコールに変換する際、特にアジドが求核剤として使用される場合に、変換されないエポキシドの鏡像異性体がラセミ化されることが判った。このラセミ化によって、エピクロルヒドリンの全体の変換が達成され、高い光学的純度で生成物が得られる。通常、動的な分割においては、生成物の最高収率は５０％に制限される。しかしながら、このラセミ化によって、５０％よりも高い収率を達成することができる。収率が増加する以外の、本発明方法の他の利点は、残存する基質から生成物を分離する必要がないので、生成物の回収がさらに簡単であるということである。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、エポキシドは置換または非置換のスチレンオキシドである。この変換が化学的、すなわち本発明のハロヒドリン　デハロゲナーゼの不存在下に行われる場合、得られる生成物は、その芳香環の炭素原子のαまたはβにそのアルコール官能基を有する２つの化合物の混合物である。たとえば、触媒作用無しで、スチレンオキシドをアジ化ナトリウムによって化学的に開環すると、α位およびβ位にアルコール官能基を有するレギオ異性体の混合物が、２：９８（α：β）のモル比で得られる。驚くべきことに、スチレンオキシドを本発明に従って変換する場合には、他のレギオ異性体（すなわちアルコール官能基が芳香環のα炭素原子上に存在する。芳香環のα炭素原子は、芳香環置換基が結合するエポキシド環中の炭素原子である。）が選択的に得られる。２種の可能性があるレギオ異性体を分離することは非常に困難であるので、このレギオ特異性は本発明の非常に大きな利点である。
【００１７】
特に好ましい実施形態では、エポキシドは、一般式
【化１０】
2004504015.tif 000008
〔式中Ｒ３は、基−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＯＯＨおよび−ＣＮから選ばれるｏ−、ｍ−またはｐ−置換基である。〕
で表される。これらのエポキシド類の変換におけるレギオ特異性が特に高いことが判った。
【００１８】
エポキシドは、濃度１〜３００ｍＭの溶解した形態で反応溶媒中に存在することができる。または、３００ｍＭまでの濃度で反応溶媒中に第２の固相または液相として存在することができる。エポキシド自体は、第２相であることができ、または第２有機相に溶解することができる。これは、エポキシドを、ヘキサンまたはオクタンなどの水と混合しない有機溶媒に溶解することによって行うことができる。それから、得られる溶液を、酵素を含む水相と接触させ、この２つの相を激しく混合する。このような第２相を使用すると、反応終了後のエポキシドとアルコールの分離を簡略化できるという利点がある。通常、アルコールは水相に溶解して残存すると予想され、エポキシドは典型的には有機層から回収されることができる。好ましくは、エポキシドは、その変換よりも前に水媒体中に移り、好ましくは、水媒体とエポキシドとの合計重量に対して０．０１〜２０重量％の量で水媒体中に存在している。
【００１９】
本発明の方法において、エポキシドを変換するために選択される求核剤の特性は、目的とする生成物の特性に依存している。適切な求核剤は、Ｉ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｎ３、ＮＯ２、ＮＯ３、ＳＣＮ、ＯＣＮ、ＯＲ’、ＮＨＲ’、ＳＲ’、ＳｎＲ’、ＳｅＲ’、ＰＲ’およびＣＯ２Ｒ’を含んでいる。Ｒ’は水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基から選ばれる。もちろん、置換された、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基をも含む。Ｒ’がアルキル基である場合、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜６の炭素原子を含んでいる。Ｒ’がアリール基である場合、それは好ましくはフェニル基またはナフチル基である。Ｒ’で示されるアラルキル基の好ましいものには、ベンジル基、２−フェニルエチル基および１−ナフチルメチル基が含まれる。Ｒ’で示されるアルケニル基の好ましいものは、ビニル基およびアリル基から選択される。Ｒ’がシクロアルキル基である場合、それは適切には３〜１２の炭素原子を有している。好ましいシクロアルキル基は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基である。
【００２０】
好ましくは、特にエポキシドがスチレンオキシドまたは置換されたスチレンオキシドである場合、求核剤はＮＯ２−またはＮ３−である。求核剤は、たとえばナトリウム塩またはカリウム塩のような塩の形態で使用してもよい。過剰の求核剤試薬は、目的生成物の必要でないレギオ異性体を非鏡像異性選択的に形成する。これを、より短い時間スケールで、より低い温度で、より多い量の酵素を用いて反応をおこなうかまたは求核剤をよりゆっくりしたやり方で反応混合物に添加するかのいずれかによって、回避してもよい。典型的には、求核剤は、エポキシドとアルコールとの平衡の位置に応じて、エポキシドに対して０．６〜１００モル当量の量が使用される。たとえば、求核剤がアジ化ナトリウムである場合は、平衡の位置でエポキシドからアルコールが形成されるので、動的分割を実質的に完了させるには、０．６モル等量で充分である。求核剤が塩化ナトリウムである場合、アルコールの形成を促すために、好ましくは過剰量（５０〜１００モル当量）が添加される。
【００２１】
反応は、好ましくは、緩衝水媒体中にて行われる。この緩衝水媒体にエポキシドを溶解するかまたはエポキシドを第２の固相もしくは液相として添加する。適切な緩衝液は、たとえば、トリス緩衝液（硫酸で所望のｐＨに調整した２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、グリシン緩衝液（水酸化ナトリウムによって所望のｐＨに調整したグリシン）、リン酸塩緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液（水酸化ナトリウムで所望のｐＨに調整した４−モルホリンプロパンスルホン酸）である。これらは、好ましくは、５０〜２５０ｍＭの濃度で使用される。
【００２２】
必要に応じて、エポキシドの溶解性を向上させるために、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランまたはアセトニトリルのような共溶媒を添加してもよい。共溶媒は、５〜５０体積％の量を添加してもよい。共溶媒の割合が増加すると、エポキシドが溶解する。しかしながら、共溶媒の濃度がより高くなると、酵素が不活性化するという不利な点が観察されうる。
【００２３】
溶媒のｐＨは、好ましくは３〜１２、より好ましくは６．５〜８である。反応が実施される温度は、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは２０〜３０℃である。
【００２４】
使用される酵素は、ハロヒドリン　デハロゲナーゼである。高適合性のハロヒドリン　デハロゲナーゼは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその同族体もしくは機能的誘導体である。本明細書において、「同族体」なる語は、少なくとも９０％が同構造である配列および同族体の配列に好ましくは少なくとも９０％が一致する配列を意味する。機能的誘導体は、その酵素的および触媒的特性に逆に作用することが実質的にないマイナーな誘導または修正を受けたペプチドである。使用できる適切な酵素としては、たとえば、アグロバクテリウム　ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（ＣＢＳ７５０．９７）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）菌株ＧＰ１（Ｐｏｅｌａｒｅｎｄｓ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１，１８１，２０５０）またはアースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）菌株ＡＤ２（ｖａｎ ｄｅｎ Ｗｉｊｎｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１，１２４）由来のハロヒドリン　デハロゲナーゼが挙げられる。特に良い結果を得るには、１９９７年５月７日、Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ ｄｅ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託番号ＣＢＳ７５０．９７で寄託されたアグロバクテリウム　ラディオバクター菌株ＡＤ１を用いればよい。この微生物から得られる別の酵素は、国際特許出願第９８／５３０８１号に、そのエポキシド　ハイドロラーゼ（ｅｐｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）活性について詳しく記述されている。
【００２５】
本発明で使用する酵素であるハロヒドリン　デハロゲナーゼは、エポキシド　ハイドロラーゼと区別されなければならないことに留意されたい。後者は、Ａｒｃｈｅｒ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５３（１９９７），ｐｐ．１５６１７−１５６６２に詳しく記述されている。両タイプの酵素の、唯一の共通点は、アグロバクテリウム　ラディオバクター菌株ＡＤ１から単離できるということである。また、Ｌｕｔｊｅ Ｓｐｅｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ， ９（１９９８）， ｐｐ． ４５９−４６６および欧州特許出願第０８７９８９０号は、エポキシド　ハイドロラーゼの用途に関している。
【００２６】
酵素は、細胞をそのまま添加することができ、粗製抽出物または精製された酵素として凍結乾燥品の形態で添加することができる。酵素は、たとえば、セルロース、セファデックスまたはデキストランなどの巨視的な担体に固定されることができる。酵素は、架橋された酵素結晶（ＣＬＥＣ’ｓ）として使用することもできるしまたは逆のミセルに閉じ込めることもできる。典型的な実験では、酵素溶液を、求核剤とエポキシドとを含む緩衝溶液と混合する。必要に応じて、酵素を安定化するために、メルカプトエタノールまたはグリセロールなどの添加剤を反応混合物に加えることができる。
【００２７】
反応終了後、反応混合物のすべてを、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ジクロルメタンまたはトルエンなどの有機溶媒を用いて抽出することができる。引き続き、エポキシドおよびアルコールを、たとえば、結晶化（固形物質の場合）、フラクション蒸留または、溶出媒としてたとえばヘプタン／酢酸エチル（比７：３）を用いるシリカ６０Ｈ上でのフラッシュクロマトグラフィーなどの技術によって分離されることができる。エポキシド類とアルコール類との鏡像異性性組成物は、キラルガスクロマトグラフィーまたはキラルＨＰＬＣを用いて定量することができる。
【００２８】
以下の実施例によって本発明を明らかにするが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
アグロバクテリウム　ラディオバクターＡＤ１の遺伝子ライブラリーは、コスミドベクターｐＬＡＦＲ３に構成された。生体内でのパッケージングのあと、該ライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１に移動した。転写複合体を、１，３−ジクロロ−２−プロパノールに対する、デハロゲナーゼ活性によってふるいわけした。ｈｈｅＣで示されるハロヒドリン　デハロゲナーゼ遺伝子を配列し、ついでＰＣＲによって増幅し、発現ベクターｐＧＥＦ＋のＴ７プロモーターの後ろにクローンし、ｐＧＥＦｈｈｅＣを調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ．ＢＬ２１（ＤＥ３）中にｐＧＥＦｈｈｅＣを導入することによって、ハロヒドリン　デハロゲナーゼ遺伝子を可溶性蛋白質の３０％まで過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）させた。ＨｈｅＣは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１に示される配列を有している。
【００３０】
記述された動的分割のために、精製された酵素を用いた。プラスミドＤＮＡを、受容能力をもつＥ．ｃｏｌｉ．ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に、エレクトロポレーションによって形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ．ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、テトラサイクリンを含むＬＢ培地にて、３０℃で一晩平板培養されていた。テトラサイクリンを含むＬＢ培地１００ｍｌに、初期ＯＤ６００が０．１のプレートから形質転換体を接種し、前培養を開始した。ＯＤ６００が１〜２になるまで、培養物を３０℃に保温し、テトラサイクリンを含むＬＢ培地１リットルで希釈し、２０℃で一晩保温した。ついで細胞を遠心分離し、洗浄しおよび再懸濁した。超音波破砕および細胞の遠心分離によって、粗抽出物を調製した。引き続き、リソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）　Ｑカラムを用いる精製行程を行い、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２を有する酵素を調製した。
【００３１】
上記の方法は、調製される酵素がエポキシド　ハイドロラーゼである国際特許出願第９８／５３０８１号により詳細に記述されている方法と類似している。該国際特許出願における、酵素の組み換え体調製の記述は、引用によってここに組み込まれているとみなされるべきである。
【００３２】
実施例２
ｐ−ニトロスチレンオキシド２ｍＭおよびＮａＮ３　１０ｍＭを含むトリス−ＳＯ４緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．３）１５ｍｌに、実施例１で得られた精製酵素２．８ｍｇを添加した。定期的に２００μｌのサンプルを採取し、そのサンプルをジメチルエーテル２ｍｌで抽出することによって、反応を監視した。残存する鏡像異性体のｅ．ｅ．が９９％よりも高くなった時点で反応を終了し、該溶液をジエチルエーテルで２度抽出した。有機層を、キラルパック（ｃｈｉｒａｌｐａｋ）ＡＳ（ダイセル製）を用いるキラルＨＰＬＣによって分析した。残存する（Ｓ）−ｐ−ニトロスチレンオキシドがｅ．ｅ．＞９９％で得られた。および生成物である（Ｒ）−２−アジド−１−（ｐ−ニトロフェニル）エタノールがｅ．ｅ．９４％で得られた。対応するＥ値を計算すると、該エポキシドおよび該アジドアルコールのｅ．ｅ．よりも２００を超えて高かった（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １９９７，２１，５５９）。他のレギオ異性体である２−アジド−２−（ｐ−ニトロフェニル）エタノールもまた、化学的な副反応によって、（Ｒ）−２−アジド−１−（ｐ−ニトロフェニル）エタノールに比べて１：１２の比率で得られた。
【００３３】
実施例３
ｐ−ニトロスチレンオキシド０．２５ｍＭおよびＮａＮ３　０．５ｍＭを含むトリス−ＳＯ４緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．３）１ｍｌに、実施例１で得られた精製酵素０．７ｍｇを加えた。１５分後に反応を停止し、反応溶液をジエチルエーテルで抽出した。有機層をキラルＨＰＬＣで分析した。残存する（Ｓ）−ｐ−ニトロスチレンオキシドをｅ．ｅ．＞９９％で、および生成物である（Ｒ）−２−アジド−１−（ｐ−ニトロフェニル）エタノールをｅ．ｅ．９６％で得た。他のレギオ異性体である２−アジド−２−（ｐ−ニトロフェニル）−エタノールを、（Ｒ）−２−アジド−１−（ｐ−ニトロフェニル）エタノールに対して１：２１７の比率で得た。このことから、酵素的なアジドライシスがほとんど絶対的にレギオ選択性であるとの結論に至った（β選択性＞９９％）。より長い時間スケールでの動的分割では、望まない化学的な副反応によって、観察された、より低いレギオ選択性が観察された。
【００３４】
実施例４
ＭＯＰＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）６０ｍｌに、ラセミ化ｐ−ニトロスチレンオキシド０．４７ｇ（３．２ミリモル）を加えた。この懸濁液を６０分間攪拌した。実施例１と同様にして得られたハロヒドリン　デハロゲナーゼ（緩衝液６ｍｌ中２９ｍｇ）を加えた。調製して貯蔵していた、ＭＯＰＳ緩衝液５ｍｌにＮａＮ３の０．１２ｇ（１．６ミリモル）を含む溶液を、２４時間かけてゆっくりと添加した。反応を停止し、懸濁液をジエチルエーテルで３回抽出した。分離後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、オレンジ色の油状物を得た。この混合物をジエチルエーテルに再溶解し、生成物の組成およびｅ．ｅ．をキラルＨＰＬＣで測定した。この混合物は、主に、（Ｓ）−ｐ−ニトロスチレンオキシド（収率４６％、９８％ｅ．ｅ．）と（Ｒ）−２−アジド−１−（ｐ−ニトロフェニル）エタノール（収率４７％、９７％ｅ．ｅ．）とからなっていた。化学的な副生成物である２−アジド−２−（ｐ−ニトロフェニル）エタノールは、反応混合物中に合計で４％形成されていた。エポキシドの化学的な加水分解生成物であるｐ−ニトロフェニルエタンジオールは３％形成されていた。上記の収率はすべて計算された収率である。溶出溶媒としてヘプタン／酢酸エチル（比７：３）を用いるシリカ６０Ｈ上でのフラッシュクロマトグラフィーによって、エポキシドおよびアジドアルコールの純品を得た。ＮＭＲデータは、合成されたラセミ化文献化合物と一致した。
【００３５】
実施例５
ｐ−クロルスチレンオキシド２ｍＭおよびＮａＮ３　１．２ｍＭを含むトリス−ＳＯ４緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．３）２０ｍｌに、実施例１と同様にして得られた精製酵素１．０ｍｇを加えた。変換率が５５％になった時点で反応を停止し、反応溶液をジエチルエーテルで抽出した。有機層をキラルＧＣで分析した。残存する（Ｓ）−ｐ−クロルエチレンオキシドが９９％よりも高いｅ．ｅ．で得られ、（Ｒ）−２−アジド−１−（ｐ−クロルフェニル）エタノールがｅ．ｅ．９８％で得られた。
【００３６】
実施例６
ｐ−クロルスチレンオキシド２ｍＭおよびＮａＮＯ２　１．２ｍＭを含むトリス−ＳＯ４緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．３）２０ｍｌに、実施例１と同様にして得られた精製酵素１．０ｍｇを加えた。変換率が５８％になった時点で反応を停止し、反応溶液をジエチルエーテルで抽出した。有機層をキラルＧＣで分析した。残存する（Ｓ）−ｐ−クロルエチレンオキシドが９９％よりも高いｅ．ｅ．で得られた。
【００３７】
実施例７
エピクロルヒドリン２０ｍＭおよびＮａＮ３　２０ｍＭを含むトリス−ＳＯ４緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．３）２０ｍｌに、精製酵素１．０ｍｇを加えた。変換率が６６％になった時点で反応を停止し、反応溶液をジエチルエーテルで抽出した。有機層をキラルＧＣで分析した。残存するエピクロルヒドリンのほかに、この混合物は、９２％ｅ．ｅ．の１−アジド−３−クロル−２−プロパノール、９２％ｅ．ｅ．の２−アジドメチルオキシランおよび非キラル化１，３−ジクロル−２−プロパノールからなっていた。
【００３８】
実施例８
エピクロルヒドリン２０ｍＭおよびＮａＮ３　２０ｍＭを含むトリス−ＳＯ４緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．３）２０ｍｌに、精製酵素１．０ｍｇを加えた。エピクロルヒドリンがすべて変換された時点で反応を停止し、反応溶液をジエチルエーテルで抽出した。有機層をキラルＧＣで分析した。生成物は、９２％ｅ．ｅ．の１−アジド−３−クロル−２−プロパノールと９２％ｅ．ｅ．の２−アジドメチルオキシランとの混合物からなっていた。（少量の水酸化ナトリウムの添加によって、２−アジドメチルオキシランが、単一生成物として９２％ｅ．ｅ．で得られた。）
【００３９】
実施例９
エピブロモヒドリン２０ｍＭ、ＮａＮ３　３０ｍＭ、ＮａＢｒ　５０ｍＭを含むトリス−ＳＯ４緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝６．５）２０ｍｌに、精製された酵素１．０ｍｇを加えた。反応終了後、得られた混合物をジエチルエーテルで抽出し、有機層をキラルＧＣで分析した。生成物である１−アジド−３−ブロモ−２−プロパノールが、＞９９％ｅ．ｅ．および収率７５％で得られた。
【００４０】
2004504015.tif 000009
【００４１】
2004504015.tif 000010
【００４２】
【配列表】
2004504015.tif 000011
2004504015.tif 000012
2004504015.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004504015.tif 000018
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2004504015.tif 000037
2004504015.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成14年3月20日(2002.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、置換されてもよいエポキシド類を、高鏡像異性選択的な手法で、アルコール類に変換する方法を提供する。所望の鏡像異性選択性が、一般式
【化７】
2004504015.tif 000039
〔式中、Ｒ１は水素原子または置換されることがある芳香族基もしくは脂肪族基を示す。〕
の、置換されてもよいエポキシド類を、光学的に濃縮された一般式（Ｉ）のエポキシドと、一般式
【化８】
2004504015.tif 000040
〔式中、Ｒ２はＩ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｎ３、ＮＯ２、ＮＯ３、ＳＣＮ、ＯＣＮ、ＯＲ’、ＮＨＲ’、ＳＲ’、ＳｎＲ’、ＳｅＲ’、ＰＲ’およびＣＯ２Ｒ’から選ばれる基である。Ｒ’は水素原子、アミノ基、水酸基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基から選ばれる基である。〕
の光学的に濃縮されたアルコールとの混合物に酵素的に変換することによって達成され、該方法は、ハロヒドリン　デハロゲナーゼの存在下での、上記エポキシドと陰イオン性求核剤（Ｒ２−）との反応を含むことを見出した。




【手続補正書】
【提出日】平成14年8月13日(2002.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
2004504015.tif 000041
〔式中、Ｒ１は水素原子または置換されてもよい芳香族基もしくは脂肪族基を示す。〕
で表される、置換されてもよいエポキシドを、光学的に濃縮された一般式（１）で表されるエポキシドと、一般式
【化２】
2004504015.tif 000042
〔式中、Ｒ２はＩ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｎ３、ＮＯ２、ＮＯ３、ＳＣＮ、ＯＣＮ、ＮＨＲ’、ＳＲ’、ＳｎＲ’、ＳｅＲ’、ＰＲ’およびＣＯ２Ｒ’から選ばれる基である。Ｒ’は水素原子、アミノ基、水酸基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基から選ばれる基である。あるいはＲ２はＯＲ’であり、Ｒ’はアミノ基、水酸基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基から選ばれる基である。〕で表される光学的に濃縮されアルコールとの混合物に酵素的に変換するための方法であって、ハロヒドリン　デハロゲナーゼの存在下に、該エポキシドとアニオン性求核剤（Ｒ２−）とを反応させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
光学的に濃縮されたアルコールを回収することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
光学的に濃縮されたエポキシドを回収することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ハロヒドリン　デハロゲナーゼが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその同族体もしくは機能性誘導体であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
同族体が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２のアミノ酸配列に少なくとも９０％が相同であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ハロヒドリン　デハロゲナーゼが、アグロバクテリウム　ラディオバクタ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（ＣＢＳ７５０．９７）、アースロバクタ属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）菌株ＡＤ２またはマイコバクテリウム属菌株ＧＰ１由来であることを特徴とする、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
エポキシドが、該エポキシドの両方の鏡像異性体を含む混合物から変換されることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項８】
混合物がラセミ化混合物であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１が置換されてもよいアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基およびアルコキシ基から選択されることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１が１〜２０の炭素原子を含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１がアミノ基、ハロゲン原子、水酸基、シアノ基、アジド基、ニトロ基、ハロアルキル基、アシル基、アルコキシ基、フェノキシ基およびカルボキシ基から選ばれる置換基を有していてもよいことを特徴とする、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
エポキシドが、一般式
【化３】
2004504015.tif 000043
〔式中Ｒ４は塩素、臭素またはヨウ素を示す。〕
で表されるエポキシドであることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
エポキシドがエピクロルヒドリン、エピヨードヒドリンまたはエピブロモヒドリンであることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アルコールが５０％よりも高い収率で得られることを特徴とする、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１が置換されてもよい芳香族基であることを特徴とする、請求項１〜１１のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
エポキシドが、一般式
【化４】
2004504015.tif 000044
〔式中Ｒ３は、基−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＨ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＯＯＨおよび−ＣＮから選ばれるｏ−、ｍ−またはｐ−位の置換基である。〕
で表されるエポキシドであることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
アニオン性求核剤が、Ｎ３−、ＮＯ２−またはＣＮ−であることを特徴とする、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
エポキシドが固形物、懸濁液、溶液または分散液の形態で反応に供されることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
エポキシドが、エポキシドと水性媒体との合計重量に対して０．０１〜２０重量％の量で水性媒体中に存在することを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
温度が０〜６０℃の間であることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ｐＨが３〜１２の間であることを特徴とする、先行する請求項のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ’がアミノ基、水酸基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アルケニル基およびシクロアルキル基から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【国際調査報告】
2004504015.tif 000045
2004504015.tif 000046
2004504015.tif 000047
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