(57)【要約】標識された配列と標的細胞中の標的配列をインサイチューハイブリダイゼーションさせる工程を含む非標的細胞からの標的細胞の同定並びにフローサイトメトリーによるハイブリダイズした標識された配列の検出による標的細胞の細胞同定を可能にする方法。
2004504036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞を同定するにあたり以下の工程：
−　標的細胞中の標的配列と相補的な標識された配列とのインサイチューハイブリダイゼーション及び
−　フローサイトメトリーによるハイブリダイズした配列の検出による標的細胞の細胞同定
を含む方法。
【請求項２】
直接的な遺伝分析にあたり以下の工程：
−　標的細胞中の標的配列と相補的な標識された配列とのインサイチューハイブリダイゼーション及び
−　フローサイトメトリーによるハイブリダイズした配列の検出による標的細胞の細胞同定
を含む方法。
【請求項３】
標識された配列が分子標識である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
蛍光活性化セルソーティングを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
標識された配列の少なくとも一部が標的胎児特異的ｍＲＮＡに対するものである、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
胎児特異的ｍＲＮＡを、胎児ヘモグロビンｍＲＮＡ、サイトケラチンｍＲＮＡ、絨毛性ゴナドトロピンのβ−サブユニットのｍＲＮＡ、絨毛性ソマトマンモトロピンｍＲＮＡ、妊娠特異的糖タンパク質ｍＲＮＡ、α−フェトプロテインｍＲＮＡ及びトランスフェリン受容体ｍＲＮＡからなる群から選択する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
標識された配列の少なくとも一部が標的特異的ＤＮＡ、ウイルス性核酸又は細菌性核酸又はその一部からなる群から選択される標的配列に相補的である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
密度勾配遠心分離、低張ショックによる溶解、補体系による分解、リソモトロピック剤による分解、電荷流動分離及び磁気活性化セルソーティングからなる群から選択される方法を適用する、非標的細胞のネガティブセレクションの少なくとも一つの工程を含む、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
電荷流動分離又は磁気活性化セルソーティングからなる群から選択される方法を適用する、標的細胞のポジティブセレクションの少なくとも一つの工程を含む、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
標的細胞の細胞内染色又は表面マーカーの染色の工程を含む、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
抗体染色を特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
胎児細胞及び母系細胞の識別のための、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項１３】
出生前診断のための、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項１４】
嚢胞性線維症の検出のための、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項１５】
染色体異常の検出のための、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項１６】
三染色耐性２１の検出のための、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項１７】
母系血液試料内の胎児ｍＲＮＡの定量にあたり以下の工程：
−　胎児細胞特異的ｍＲＮＡの増幅、
−　前記の増幅された胎児細胞特異的ｍＲＮＡに相補的又は部分的に相補的な配列を含む標識された配列の合成、
−　前記の標識された配列と前記の増幅された胎児細胞特異的ｍＲＮＡとのハイブリダイズ、及び
−　ハイブリダイズした標識された相補的配列の検出
を含む方法。
【請求項１８】
標識された相補的配列の少なくとも一部が分子標識である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
分子標識が第２表に列記される配列の少なくとも１つを有する、請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
増幅のためのプライマーが第１表に列記される配列の１つを有する、請求項１７から１９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
分子標識を有する少なくとも１つの区画を有する試験管を特徴とする、細胞同定及び／又は遺伝分析のためのキット。
【請求項２２】
少なくとも２つの区画を有し、それぞれの区画が異なる媒体を有する、請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
膜が区画を互いに分離する、請求項２１又は２２記載の試験管。
【請求項２４】
少なくとも２つの区画を有する試験管内のプローブを加工するにあたり以下の工程：
−　第１の区画でのプローブの処理、
−　前記のプローブについて第２の区画への通路の提供、及び
−　前記のプローブの第２の区画での処理
を含む方法。
【請求項２５】
１つの処理がプローブと少なくとも分子標識とのハイブリダイズである、請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は非標的細胞から標的細胞を、特に母系血液細胞から胎児の細胞を、出生前診断のために分離するための方法に関し、かつ本発明は欧州特許出願第００１１５２６８．５号の優先権を主張し、該出願はこれにより完全に内容が記載されたものとする。
【０００２】
公知又は未知の突然変異又は染色体異常によって引き起こされる性遺伝子疾患及び／又は潜在的な遺伝子疾患に関する胎児遺伝子状態の決定は胎児の細胞から単離される胎児の染色体の決定を必要とする。染色体決定は一般に細胞遺伝子工学を使用して実施され、これは胎児の生存細胞を採取し、引き続き細胞を数週間培養して、更なる分析のために充分な量を増殖させることが必要である。しかしながら少しの突然変異の検出は少量の細胞試料でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術をＰＣＲ配列決定又は他の後ＰＣＲ突然変異検出技術と組み合わせて使用して実施できる。生きている胎児の細胞の採取は通常は妊娠の第２の三半期の間に標準化された外科的な方法を使用して特定の外科診療所で行われる。少量の生検は胎盤の絨毛膜絨毛の組織（絨毛膜絨毛採取、ＣＶＳ）から、又は母体の腹壁に針を挿入することによって羊水から（羊水穿刺）のいずれかで採取される。第３の方法は臍帯の穿刺により妊娠１８週後の臍帯血から胎児の細胞を得ることを必要とする。
【０００３】
残念ながら、この侵襲性法を原因として約０．５〜１．５％の頻度で自発的流産が生じる。稀なケースでは、他の重篤な状態が生じて、母体及び胎児の健康を害する。
【０００４】
これらの侵襲性採取法の他に、胎児の染色体異常に関する非侵襲性の危険事前評価の方法、例えば母系血液におけるα−フェトプロテイン、ヒトの絨毛膜のゴナドトロピン及び非結合エストリオールに関する生化学的スクリーニング（“三重試験”として知られている）が一般的である。他の方法は母体の血流からの胎児の有核細胞の回収を含む胎児の細胞の分析を含む。母体の血液から抽出されて、これらの細胞は胎児の発生の遺伝状況についての情報源として提供でき、かつ従って出生前診断のために用いることができる。
【０００５】
胎児由来の種々の細胞型は妊娠の間に胎盤を通り、母系の末梢血内を循環する（Ｂｉａｎｃｈｉ， Ｄ， Ｗ． ａｎｄ Ｋｌｉｎｇｅｒ， Ｋ．Ｗ． ｉｎ： Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｅｔｕｓ： Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ／Ｌｏｎｄｏｎ： Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９２： Ｂ． Ｔｕｔｗｓｃｈｅｋ， Ｎｉｃｈｔｉｎｖａｓｉｖｅ Ｐｒａｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ａｎ ｆｅｔａｌｅｎ Ｚｅｌｌｅｎ ｉｍ ｍｕｅｔｔｅｒｌｉｃｈｅｎ Ｂｌｕｔ， Ｇｙｎａｅｋｏｌｏｇｉｅ （１９９５） ２８： ２８９−３０１）。
【０００６】
通常、出生前診断のための標的細胞は栄養膜、胎児の有核赤血球、顆粒球及び／又は白血球、すなわち多核リンパ球の特定細胞型群：好中球、好塩基球及び好酸球である（Ａｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ， Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， Ｖｏｌ． １５： ９２１−９３１（１９９９）： Ｇｅｒｍａｎ ｐａｔｅｎｔ ＤＥ ４２２２５７３； ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９６／２７４２０； ＵＳ−Ｐａｔｅｎｔ ５，７１４，３２５）。
【０００７】
あまり一般的でない胎児細胞を得るための他の方法は、大腿骨頚部細胞の採集である（Ｎｏｎ ｏｒ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｏｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｒ ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ， Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， Ｖｏｌ． １５： ８８９−８９６（１９９５））。
【０００８】
これらの細胞型の一般的な有用性は、母系血液中でのその限られた濃度（１０５循環細胞に１個〜１０８循環細胞に１個で推定される）の故に大きく妨げられる。ハマダ他によるより正確な推定（Ｆｅｔａｌ ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ： ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ａｇｅ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ． １９９３ Ｊｕｎｅ： ９１（５）４２７−３２）は、１ｍｌの母系血液につき６０〜６００又は典型的な２０ｍｌサンプル中に１２００〜１２０００の胎児の有核細胞の数を与えている。幾つかのレポートはこれらの数値を確認しているが、どれも高い回収率でそのような数の胎児の細胞を回収できていない。しかしながら幾つかのグループは異数性状態における胎児−母体細胞交通の高められた速度で報告している。これは胎児の細胞分離が正常状態下よりもかかる異常の存在においてより効果的であることを暗示している。
【０００９】
遺伝分析を行うために、少数の胎児の細胞は母系細胞の除去もしくは胎児の細胞の富化を必要とする。ほとんどの胎児の細胞型は形態学だけに基づいて母系細胞から区別できないので、密度勾配遠心分離又は電荷流動分離（ｃｈａｒｇｅ ｆｌｏｗ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）のような方法（ＤＥ−ＯＳ４２２２５７３号；ＷＯ９６／２７４２０号、ＷＯ９６／１２９４５号）が胎児の細胞の富化のために適用されている。電荷流動分離は、更なる分析のために異なる管に直接ソートされた関連の細胞の種々の表面電荷密度を利用する。それにもかかわらず、欠点としてこの技術は誤った陽性の結果はもちろんのこと誤った陰性の結果のリスクを含意する。
【００１０】
より特定の方法は血液試料を標的細胞特異的な蛍光標識された、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による標的細胞の選択を可能にする抗体と一緒にインキュベートすることに基づく。このシステムは、適当な検出システムを通過する各単一の細胞の蛍光を検出することに基づく。蛍光に応じて、細胞を荷電させ、かつ異なる部分に選択する。別の方法は金属ビーズでラベルされた標的細胞特異的な抗体が用いられ、これらの抗体は磁気活性化セルソーティング（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＭＡＣＳ）で同定される。これらの技術は、例えば国際特許出願ＷＯ９１０７６６０号又はドイツ国特許出願第４２２２５７３号から公知である。
【００１１】
しかしながらＦＡＣＳ及びＭＡＣＳはしばしばモノクローナル抗体の有用性に依存し、かつ相当の専門技術が必要である。抗体フラクションは他の細胞成分に非特異的結合を示すことがあり、これは高い信号対雑音比をもたらし、かつ後の検出に傷害をもたらす。更に胎児の細胞表面抗原、例えば胎児のヘモグロビンのγ−鎖と結合する抗体はしばしば母系細胞にも結合する。このように通常知られるセルソーティングによって得られる試料は汚染母系細胞を含有する。
【００１２】
前記の原理の１つ又は幾つかの組合せを使用する方法の例は、例えば胎児の栄養膜の単離のためのマウスモノクローナル抗体の使用に関してはＹｅｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ １１：１１７−１２３（１９９１）；Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３３６：１９７−２００（１９９０）に記載されている。Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ １６５：１７３１−３７（１９９１）は細胞サイズ及び粒状度、トランスフェリン受容体及びグリコホリンＡ細胞表面分子に基づく胎児の有核赤血球のフローソーティングの概要を示している。ＰＣＴ出願ＷＯ９１／０７６６０号は胎児の赤血球の細胞表面上に存在する抗原を使用する胎児の有核赤血球の単離のための方法を記載している。ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１６４５２号及び米国特許第５，１５３，１１７号は種々の蛍光色素で標識された胎児の細胞に対する種々の抗体の組合せを使用する方法を開示している。
【００１３】
米国特許第５，８５８，６４９号は母系の血液から胎児の細胞を富化する方法及びかかる細胞の同定方法を記載している。該方法は母系の血液の採取及び標的特異的、すなわち胎児細胞特異的なリボ核酸の増幅を含む。これらの細胞の後続のインサイチューハイブリダイゼーションは胎児の細胞の標的リボ核酸に相補的な標識されたリボ核酸プローブを含有するハイブリダイゼーション媒体で行われる。それにもかかわらず、ハイブリダイズされない標識されたリボ核酸プローブは細胞内に残留するので、これらは高い信号／雑音比をもたらし、そうして分析結果の低い信頼性をもたらす。
【００１４】
前記の方法はハイブリダイゼーションに先立つポジティブセレクション又はネガティブセレクションのいずれかによる胎児細胞の富化の工程、すなわち密度勾配遠心分離又はフローサイトメトリーを暗示している。しかしながら有利には胎児細胞は母系細胞からＦＡＣＳ又はＭＡＣＳ技術によって、胎児細胞表面上で富化されている１つ以上の胎児抗原に対する抗体を用いて分離される。ＵＳ５，８５８，６４９号によって暗示される細胞分離のための技術は前記に概要を示した欠点及び問題を示す。
【００１５】
Ｓｏｋｏｌ他（Ｄｅｂｏｒａｈ Ｌ． Ｓｏｋｏｌ， Ｚａｎｇｈ Ｘ．， Ｐｏｎｚｙ， Ｌ， Ｇｅｗｉｒｔｚ Ａ． Ｍ．；Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ・ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ； Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８， ９５ｐｐ． １１５３８−１１５４３）は標識された核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するための方法を提供している。標識された配列としてＳｏｋｏｌ他は、引き続いて分光蛍光計及び／又は共焦点レーザ走査型顕微鏡によって検出されるいわゆる分子標識を用いている。これらの検出システムは時間を消費し、従って高い質の試料を分析する日常の実施のために適当でない。更にこれらのシステムは非標的細胞から標的細胞を分離することを可能にしない。
【００１６】
従って本発明の第一の対象は細胞の同定及び／又は分離を改善する方法を提供し、かつ遺伝診断、特に生存細胞における直接的な遺伝診断を改善することである。本発明の更なる対象は調査される細胞のより良好な採取及び／又は処理のための装置及び方法を提供することによって診断を改善することである。
【００１７】
際立った問題は請求項１記載の細胞同定法を提供することによって解決される。
【００１８】
本発明の基礎的な観念は標的細胞を同定し、かつ標的細胞内でインビボに標的配列と、相補的又は部分的に相補的な標識された配列とのハイブリダイゼーションによって遺伝的変化を検出し、かつ引き続き細胞内のハイブリダイズした標識された配列をフローサイトメトリーによって検出することである。その後に、ハイブリダイズした分子標識の検出によるセルソーティングの工程及び更なる分析を行ってよい。
【００１９】
本発明の特定の利点は、特に不十分な特異性及び高い信号／雑音比の欠点を克服することによって母系の血液試料中の胎児細胞の同定を改善し、かつ従って母系細胞及び胎児細胞の間の識別を可能にすることである。同定してから細胞分離する前記の方法は殆ど時間を消費せず、かつ通常の実施に比べてあまり専門技術を要さない。
【００２０】
更なる利点において、本方法は患者あたりの血液試料内の標的細胞の全てのサンプリング速度を増大させることができる。
【００２１】
検出の他に、ハイブリダイズした標識された配列から得られるハイブリダイゼーションシグナルの定量を行ってよく、これは標的配列の発現速度についての情報を与える。従って定量は標的細胞と非標的細胞との間の更なる識別基準を提供することがある。稀な細胞でさえも検出することができる。
【００２２】
従って有利な態様において、本発明は、野生型細胞では発現されない遺伝子の転写を原因とするか又はそれを特徴とする疾患又は一定の遺伝子もしくはその一部の不在又は変更された発現又は発現速度に特徴付けられる疾患の診断を、転写生成物の発生量のレベルの定量によって可能にする。従って本発明による方法は出生前診断のために提供することができる。
【００２３】
検出及び／又は定量に引き続いて、標的配列を有する細胞の分離は、例えば胎児由来の細胞を母系の血液試料から単離することが有利な場合がある。細胞分離は、例えば写真法又は視覚法によって行ってよい。有利な態様においてセルソーティングは通常知られた蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ；例えば国際特許出願ＷＯ９１０７６６０号又はドイツ国特許出願第４２２２５７３号）で行われる。
【００２４】
一般に核酸ハイブリダイゼーション技術は一本鎖の核酸が相補的な核酸鎖と対になる能力に基づくものである。従ってハイブリダイゼーション反応は、標的配列に対する標識された相補的な特異的配列（引き続き標識された配列）又は相補的な特異的配列の組合せの発生を、遺伝子（ＤＮＡ）の標的配列及び／又はそれらの転写されたポリヌクレオチド配列（ＲＮＡ）の存在もしくは不在又は配列及び／又は転写された遺伝子産物の特異的な突然変異の存在でさえも同定するために規定している。標的配列は遺伝子的に改変された核酸である野生型であってよい。
【００２５】
本発明によれば、それぞれ特異的標的配列（野生型又は突然変異）に対する、それぞれ種々の蛍光色素で標識される少なくとも２つの相補的配列の混合物を使用してよい。これらの蛍光色素は有利には種々の蛍光放出を示す。これは１つのアッセイにおいて種々の標的配列の検出を可能にすることがある。従って種々の標的配列を有する細胞を１つのアッセイで同定及び／又はソートをすることができる（多重アッセイ）。
【００２６】
有利な態様において、選択された標識された配列は、例えば性特異的もしくは任意の胎児特異的遺伝子転写物又は標的細胞の他の遺伝的特性に関する、標的細胞の遺伝子マーカーに相補的であってよい。また標識された配列は、標的細胞中に含まれる細菌又はウイルス性の核酸又はその一部に対するものであってよい。ウイルス性標的物のための例はヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はヘルペス又は肝炎ウイルスであってよい。特に関心が持たれており、従って包含される他の検出標的はＸ染色体又はＹ染色体又は染色体１、染色体１３、染色体１６、染色体１８及び染色体２１のポリヌクレオチド転写物である。
【００２７】
有利な態様において、標的ヌクレオチドは相補的な標識された配列とハイブリダイズし、該配列は核酸標的に相補的であり親和性ペア又はアームのメンバーを端部に有し、該親和性ペア又はアームはアッセイ条件下（標的配列の不在下に）互いに相互作用してステム二本鎖を形成する。該配列と標的配列とのハイブリダイズは該配列においてアームを引き離し、かつステム二量体を排除するコンホメーション変化をもたらす。ステム二量体の排除により該配列は検出可能になる。
【００２８】
これらの検出できるように標識された二重コンホメーションオリゴヌクレオチド配列は米国特許第５，９２５，５１７号に開示されており、この記載によって全内容が記載されているものとする。
【００２９】
本発明の有利な態様において、前記のオリゴヌクレオチド（引き続き分子標識（ＭＢ）と呼称される）は５′末端及び３′末端においてドナー色基及びアクセプタ色基に適合する。相補的核酸鎖の不在下に、ＭＢはステムループ、すなわちステム二量体コンホメーションで保持され、その際、蛍光共鳴エネルギー移動はシグナル放出を妨げる。相補配列とのハイブリダイゼーションにおいて、ステムループ構造はドナー部及びアクセプタ部の間の距離を増大して開き、それにより蛍光共鳴エネルギー移動が低減し、かつＭＢが適当な波長の光によって励起された場合に検出可能な信号が放出される。ハイブリダイズなくしてドナー及びアクセプタは間隔を保持し、かつ前記の消光効果により蛍光信号は検出できない。このようにハイブリダイズされないＭＢは蛍光を放出しない。
【００３０】
前記の効果により、洗浄又はさもなくばハイブリダイズされない標識されたオリゴヌクレオチドの除去を回避できる。ハイブリダイズ媒体の非特異的な結合は関連のバックグラウンド信号をもたらさず、引き続いての細胞分離の間に信号対雑音比を減ずる。
【００３１】
本発明による方法はモノクローナル抗体の有用性を必要としないことが有利である。それにもかかわらず、標識された抗体と標識されたプローブとを交換して、ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳについて通常知られた細胞分離プロトコールを適用できる。
【００３２】
本発明の特定の態様において、胎児細胞は母系末梢血液、胎盤組織、絨毛膜絨毛及び胚組織を含む種々の試料献体から分離される。有利な検体は母系の末梢血液試料である。本発明は胎児の有核赤血球細胞を同定及びソートするために使用できるが、核を有し、かつ遺伝子転写活性を有する任意の他の胎児細胞型は更なる困難なく包含されうる。
【００３３】
胎児細胞を区別するために、質及び／又は量のいずれかにおいて胎児細胞又は胚細胞に対して特異的である少なくとも１つの適当な標的配列が細胞内で選択される。検出するために有利な標的配列は、本発明を制限するものでないメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）又はリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）のような胎児遺伝子特異的染色体転写物、例えば胎児のヘモグロビン（ＨｂＦ）又は胚ヘモグロビンのためのｍＲＮＡである。一般に、胎児細胞において特に活性である遺伝子の種々の発現レベルを用いることができる。
【００３４】
本発明の１つの態様において、細胞系統マーカ又は細胞型マーカに相補的な標識された配列は１つのアッセイにおいて遺伝子的に改変された標的配列に相補的な標識された配列と一緒に使用することができる。このように最大の情報が同時に得られる：ｉ）標的細胞型又は標的細胞系統の存在又は不在並びにｉｉ）遺伝子的に改変された標的配列の不在又は存在。従って細胞同定及び直接的な遺伝的診断は組み合わされたアッセイにおいて実施できる。
【００３５】
前記の組み合わされたアッセイにおいて、２組の分子標識を使用してよく、例えば１つは標的細胞系統に特異的なＲＮＡ、例えば胎児のヘモグロビンｍＲＮＡに対するものであってよく、かつ第２の組は関連のＤＮＡ配列、単一のヌクレオチド変化を有する配列に対するものである。両者の組は異なって着色された蛍光色素で標識されている。細胞同定及び考えられる引き続いての細胞分離はＦＡＣＳプロトコールにより行ってよい。一定の遺伝子異常の同定は遺伝子ＤＮＡの直接的な遺伝診断及び該遺伝子の発現レベルの同時の分析としてｍＲＮＡの定量によって可能である。このように遺伝子異常はＦＡＣＳプロセスの間に“オンライン”的に検出できる。胎児細胞の場合には、胎児の一定の遺伝状態を、母系細胞からの分離後に遺伝子試験を行わずに直接決定できる。
【００３６】
本発明の更なる態様において、種々の細胞型を検出して、例えば同じ起源を供給する多種の標的配列を選択してよい。該標的配列は、例えば多種の胎児細胞型を同時に母系血液試料から回収することを可能にし、それによって回収される細胞の全量は、有核赤血球（ＮＲＢＣ）のような特定の胎児由来細胞を回収するために最適化された方法と比較して増大する。
【００３７】
本発明の別の態様において、後続の細胞同定及び遺伝子分析のための血液試料を、少なくとも１つの群の標識された配列、有利には分子標識を含有するハイブリダイゼーション媒体を含有するインキュベーション媒体を有する少なくとも１つの区画を有する試験管中に取る。
【００３８】
前記の試験管は採取及びハイブリダイゼーションの間の期間を相当短縮させる利点を提供し、その利点は信頼性及び試験結果の質の増大をもたらすことができる。
【００３９】
有利には該試験管は、それぞれ種々のインキュベーション溶液又は試験溶液、例えば固定化溶液又は染色溶液及び／又は抗凝集剤を有する２つ以上の区画を有する。第一に該試料を１つの媒体と一緒にインキュベートし、規定の時間後に、第２の区画からの第２の媒体を、例えば区画を分離する膜を開放することによって試料に到達させることができる。
【００４０】
細胞同定及び／又は遺伝子分析の前に、定量的予備試験を行って、細胞試料中に期待されるべき標的細胞の大体の濃度を推定することが有利なこともある。胎児分析の場合において、また胎児細胞の性を細胞同定の前に、細胞同定及び遺伝分析の更なる工程のために適当な分子標識を選択するために決定することが有利なこともある。
【００４１】
有利な態様において、予備試験は胎児のヘモグロビンに関するＰＣＲのＣｔ値を決定する定量的なオンラインＰＣＲの試みとして実施され、その値は更に陽性及び陰性のブラインドサンプルと比較される。胎児の性は有利にはｚｆｙのｍＲＮＡ配列からのＰＣＲアンプリコンの中央部に相補的な分子標識を使用することによって決定できる。
【００４２】
１つの態様において、請求項１記載の方法は、陰性分離の近年の方法、例えば密度勾配遠心分離及び／又は抗体による不所望な細胞の磁気的分離（ＭＡＣＳ）のような技術並びに自由バッファー流電気泳動装置を使用することによる細胞表面電荷のような物理的パラメータに基づく陽性分離技術と組み合わされる。有利には母系細胞の陰性選択の工程は、インサイチューハイブリダイゼーション及び蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）の前に行われる。
【００４３】
不所望の細胞の陰性選択の方法は低張ショックの適用を含み、これは特にまず赤血球の溶解がもたらされる。溶解溶液は、例えばＰＡＲＴＥＣ、ＤＡＫＯ、Ｃａｌｔａｑ又はＭＥＤＡＣから直ちに商業的に入手される。
【００４４】
脱核した赤血球細胞を分離するための別の方法は補体系である。補体、抗体標識された細胞を破壊できる血清因子の群は厳密にネガティブセレクションのため、すなわち不所望の細胞の排除のために使用される。
【００４５】
選択的又は付加的に、特定の細胞、本願では単球をＬＭＥ処理によって低減させることができる。ＬＭＥ（Ｌ−ロイシン−メチルエステル）はリソモトロピック剤（ｌｙｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）であり、かつ単球を破壊する。
【００４６】
主集団の細胞群内の稀な細胞の低い絶対数により、ＦＡＣＳ又は他のソーティング法の前に稀な細胞を予め富化することが有利なこともある。このポジティブセレクションは、例えば細胞内染色技術（ＵＳ５，４２２，２７７号）又は磁気的セルソーティング（ＭＡＣＳ）を使用して実施できる。
【００４７】
ＭＡＣＳを使用して、複合細胞混合物、例えば末梢血液、造血組織又は培養された細胞からのセルソーティングが可能である。小さな磁性粒子（２０〜１５０ｎｍの直径）は細胞−ビーズ反応のより早いキネティック、より低い程度の非特異的細胞ビーズ相互作用、粒状凝集物における細胞の非特異的な捕捉の低い危険性並びに、標識された細胞の生存性及び光学的特性に対して、大きな磁性粒子（０．５〜５μｍの直径）と比較した場合に殆どない悪影響を示さないので、これらは有利に適用できる。特に微小の常磁性粒子及び高い勾配の磁界によるＭＡＣＳ技術が有利である。それにもかかわらず、大きな磁性粒子、例えばＤｙｎａｌからの大きな磁性ビーズ及びＭｉｌｔｅｎｙｉからのディプリーション（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）カラムとを組み合わせてよい。
【００４８】
更にＭＡＣＳはネガティブセレクションのために、例えば白血球のディプリーションのために使用できる。ＣＤ４５抗原は赤血球、血小板及びその前駆細胞の他の造血起源の全ての細胞で発現するので、ＣＤ４５マイクロビーズは末梢血液からのリンパ球のディプリーションのために使用できる。全てのリンパ球の充分なディプリーションを改善するために、ＣＤ４５及びＣＤ１５マイクロビーズの組合せは顆粒球／単球細胞系統におけるＣＤ４５の弱い発現により推奨される。従ってマイクロビーズの組合せは母系血液からの胎児の赤芽球の富化をもたらすことができる。
【００４９】
ＭＡＣＳの前に、再懸濁媒体、例えばＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は血清と関連するバッファーを供給して、細胞の充分な再懸濁が達成される。更に死細胞を除去することが推奨される。
【００５０】
ＦＡＣＳの前に細胞の予備選択を達成するために、特に米国特許第４，０６１，５６０号（これにより内容が完全に記載されたものとする）に記載されるような連続的なフリーフロー電気泳動における電荷流動分離技術を使用してよい。標的細胞特異的抗体（ＡＳＥＣ）での染色を伴わずに又は伴って使用してよい。後者はハンセン他（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， （Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（ＡＳＥＣＳ）：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ａｎｄ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１：１９７−２０８）によって論評されている。該方法は第１の抗体に対する第２の抗体をいわゆる“サンドウィッチ技術”において使用することによって改善することができる。なおも不十分であれば、第２の抗体に対する第３の抗体を使用してよい。
【００５１】
選択的に通常の抗体よりも高い負電荷を有する側基を有する特異抗体を使用してよい。更に非常に小さい磁性粒子と結合された抗体が有利なことがある。
【００５２】
最終的な細胞分離のためにフローサイトメトリーの工程が使用される。有利には蛍光活性化セルソーティングを行う。しかしながら、蛍光はたった１つの可能な染色系である。それというのも他の染料系を使用してよく（米国特許第４，９３３，２９３号）かつ光散乱測定又は電気的サイジングのためには染色は必要ないからである。
【００５３】
フローサイトメトリー装置は、例えばＭＩＣＲＯＣＹＴＥ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ’ｓ ＦＡＣＳｃａｎ、ＦＡＣＳｔｒａｋ、ＦＡＣＳｏｒｔ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＦＡＣＳｔａｒ、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ’ｓ ＢＲＹＴＥ−ＨＳ、Ｃｏｕｌｔｅｒ’ｓ ＰＲＯＦＩＬＥ及びＥＰＩＣＳ、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ’ｓ ＭｏＦｌｏｗ、Ｏｒｔｈｏ’ｓ ＣＹＴＯＲＯＮ及びＰａｒｔｅｃ’ｓ ＰＡＳ ｍａｃｈｉｎｅから市販されている。ＰＡＲＴＥＣ（ドイツ）からのＰＡＳシステムが有利である。
【００５４】
分子標識での標的配列の標識の他に抗体で染色されている標的細胞でフローサイトメトリーを実施することが有利である。これは染色前の細胞の固定を含む。抗体は細胞内物質又は表面マーカに対するものである。米国特許第５４２２２７７号及び同第６００４７６２号に記載されるような固定液での細胞の処理は抗体又は他の所望の成分を細胞膜を通して細胞中に導入することを可能にする。
【００５５】
特異的な細胞決定基に対する蛍光色素と結合した抗体での直接的な染色が有利である。免疫蛍光のための標識として適当な多くの種々の色素の有用性は１つの試料における多くの副集合の同時の測定を可能にする。免疫蛍光のための色素についての論評はＧｌａｚｅｒ他（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔａｎｄｅｍ ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｂｙ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． １９８３ Ｓｅｐ．． ４３（３）． Ｐ３８３−３８６）、Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ他（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｍｐｌｅｘ Ａｓ ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ． ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４８７６１９０． Ｏｃｔｏｂｅｒ２４， １９８９）、Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ他（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｉｇｍｅｎｔｓ Ａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｅ． Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇａｒｙ Ｃ． Ｓａｌｚｍａｎ， Ｅｄｉｔｏｒ， Ｐｒｏｃ． ＳＰＩＥ １２０６ Ｐ １０６−１１１， １９９０）、Ｗａｇｇｏｎｅｒ他（Ａ ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌａｂｅｌ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ − Ｃｏｌｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｅ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｌａｓｅｒ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９３ ６７７ Ｐ１８５−１９３）、Ｈａｕｇｌａｎｄ他（Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９４， ４２ Ｐｔ Ｂ Ｐ ６４１−６６３）及びＲｏｅｄｅｒｅｒ他（１０−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｅ １９９７， ２９（４）Ｐ３２８−３３９）に見られる。
【００５６】
また免疫蛍光をＤＮＡ染色、例えばＤＮＡを染色する蛍光色素であるヨウ化プロピジウム及びＤＡＰＩと組み合わせることも可能である。またＲａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ他（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｗｏ ｃｏｌｏｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｌａｓｅｒ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８６ Ａｐｒ． １５ １３６（８）． Ｐ ２７６９−２７７５）を参照のこと。
【００５７】
細胞内化合物に対する染色抗体を細胞膜に浸透させることを可能にするために、細胞を固定化し、かつ膜を透過性にすべきである。幾つかの適用　固定化及び細胞膜の透過化のために、サポニンはサイトカインの評価を含んで効果的に使用できる（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ： Ａｎ ａｔｌａｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ． Ｖｏｌ． ＩＩ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓも参照のこと）。架橋性固定液としてホルムアルデヒドを適用でき、その際、細胞形態の良好な保存を可能にする。選択的に他の界面活性剤、例えばＮＰ４０を、ホルムアルデヒドによる固定と組み合わせて又は有機溶剤、例えば７０％メタノール又はエタノール／酢酸（９５／５）の組合せで使用して細胞を１工程で固定化及び透過化できる。
【００５８】
特にＲＮＡ及びＤＮＡの染色のために、アルコールでの固定化が有利である。時として種々の固定化／透過化の工程の組合せでさえも有用なことがある、例えばＢｒｄＵ染色のために７０％アルコールに引き続いてホルムアルデヒド／Ｔｗｅｅｎ２０が有用である。
【００５９】
バックグラウンド染色に関する問題を克服するために、肝臓粉末（肝臓のアセトン沈殿物）又は無関係の細胞（２：１、抗体溶液の容量（１ｍｇ／ｍｌ）：充填細胞）におけるポリクローナル抗体の吸着は非特異的な染色を低減する。最適には、特異的染色はモル過剰の精製抗原との抗体のプレインキュベーションによってブロックすることができる。
【００６０】
定義：
核酸という用語は全ての種類のヌクレオチド配列を示し、従ってデスオキシリボヌクレオチドのオリゴマー及びポリマー並びに全ての種類のリボヌクレオチドを含む。類似体を有するヌクレオチド、染色体及びウイルス核酸もしくは細菌核酸又はその一部、プラスミド、組み換えヌクレオチド及び全ての種類の合成配列を含む。
【００６１】
標的細胞という用語はそれぞれ選択又は精製させるべきである関心がもたれた細胞を示す。標的細胞として胎児細胞の場合において、該細胞は特に栄養膜、胎児の有核赤血球、顆粒球及び／又は白血球の副集団、すなわち多形核リンパ球、例えば好中球、好塩基球及び好酸球を含む。
【００６２】
標的配列という用語は標識された相補的な配列とハイブリダイズすべきである全ての核酸を示す。この用語は質及び／又は量の点で標的細胞に特異的な配列を含む。野生型の配列並びに全ての種類の遺伝的に改変された核酸を含む。
【００６３】
標識された配列という用語は標的配列に相補的又は部分的に相補的な、少なくとも１つのマーカ、例えば後続の検出を可能にする色素、蛍光色素、磁性粒子又はその他で標識された核酸を示している。
【００６４】
分子標識という用語は米国特許５，９２５，５１７号の請求項１の１つによる標識された配列を示す。
【００６５】
ＲＮＡという用語はｍＲＮＡ及びｒＲＮＡ並びにその誘導体及び一部を含む全ての種類のＲＮＡを示す。
【００６６】
ＤＮＡという用語は自然に生じる又は合成によって得られたＤＮＡ並びにその誘導体及び一部の全ての種類を示す。
【００６７】
ハイブリダイゼーションという用語は一本鎖核酸又はその一部が相補的又は部分的に相補的な一本鎖核酸鎖と対を形成する現象を示している。インサイチューハイブリダイゼーションは、細胞を実質的にインタクトに維持する条件下にハイブリダイゼーションすることを示す。
【００６８】
蛍光という用語は放出される波長と異なる放射線での励起の結果として検出できる放射線の放出を示す。
【００６９】
例
例１
フローサイトメトリーにおいて分子標識を使用する染色体異常の検出（フローチャートＩ）
工程２）に記載される予備試験において得られた陽性のｚｆｙ結果の場合に、ｚｆｙ特異的分子標識（ＦＩＴＣ）を合成する（ポイント３）を参照）。
【００７０】
予備試験における陰性の結果は女性を示し、従ってＨｂＦｍＲＮＡ（ＦＩＴＣ）特異的分子標識が選択される。
【００７１】
分子標識を、工程６）で記載された富化された胎児細胞に輸送した後に、ＨｂＦ特異的抗体（ＰＥ）及びＤＡＰＩ（ＰＡＲＴＥＣ　ドイツ）での核染色は胎児細胞の決定を改善する（工程７参照）。
【００７２】
標的細胞を同定し、ゲートさせ、かつ自動的にＰＡＳ−ＩＩＩ（ＰＡＳ−ＩＩＩ： Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ； Ｐａｒｔｅｃ Ｇｅｒｍａｎｙ， 工程８も参照のこと）に関する作業マニュアルのプロトコールに従って分離する。
【００７３】
最後に診断を、工程９）に記載されるＦＩＳＨ分析によって、三染色体性２１の検出のために市販の部位特異的ラージインサートクローン（ｌａｒｇｅ−ｉｎｓｅｒｔ ｃｌｏｎｅ）（Ｖｙｔｈｉｓ， ＵＳＡ）を使用することによって実施する。
【００７４】
例２
フローサイトメトリーにおける嚢胞性線維症遺伝子特異的な分子標識を使用する直接的突然変異分析（フローチャートＩＩ参照）
胎児細胞の予備富化を工程１）に記載のように実施した。
【００７５】
フローチャートＩＩに記載されるように１つの分子標識を使用して母系細胞から胎児細胞を識別した。工程２）において陽性の結果である場合に、ｚｆｙ特異的ｍＲＮＡ分子標識（ＦＩＴＣ）を胎児細胞及び母系細胞の間の識別のために使用する。母系細胞から胎児細胞を識別するための第２のパラメータとして、ＨＢＦ遺伝子のための胎児特異的ｍＲＮＡ分子標識及びＤＡＰＩ核染色を適用する。
【００７６】
野生型配列の決定のための分子標識はＥＤＡＮＳで標識され、かつ突然変異特異的標識を蛍光ＨＥＸ（工程３による）で標識する。
【００７７】
胎児細胞をＦＩＴＣ及びＤＡＰＩ蛍光によって識別すべきである。遺伝状態は引き続いての可能な組合せ：１ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ陽性（胎児細胞）１ａ：ＨＥＸ陽性、ＥＤＡＮＳ陰性（胎児細胞野生型同型接合）、１ｂ：ＨＥＸ陽性、ＥＤＡＮＳ陽性（胎児細胞、野生型及び突然変異）、１ｃ：ＨＥＸ陰性及びＥＤＡＮＳ陽性（胎児細胞、突然変異同型接合）によって決定される。
【００７８】
例３
コントロールとして本来のＣＨＯ細胞を使用する、ＣＤ５９ｍＲＮＡ特異的分子標識を使用するＦＣ２細胞の同定
ＣＨＯ細胞の細胞系統ＦＣ２はヒトの染色体１１を有する。従ってＦＣ２細胞はその表面上でＣＤ５９を発現する。従ってＣＤ５９の発現は抗体反応によって証明できる。
【００７９】
ＣＤ５９ｍＲＮＡ特異的分子標識（ＤＡＢＣＹＬ−ＧＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣ−ＦＡＭ）をＦＣ２細胞に輸送する。引き続き、蛍光シグナルを分析する（図５）。標識を使用しないＦＣ２細胞（図６）及び標識を使用するＣＨＯ細胞（図７）をコントロールとして使用する。
【００８０】
蛍光の高い増大により、ＦＣ２細胞はＣＨＯ ＣＤ５９ネガティブ細胞から明らかに識別できる。
【００８１】
図５：ホルムアルデヒドで固定化され、“ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ”システムによって細胞中に輸送されたＣＤ５９特異的分子標識で染色されたＦＣ２
ＦＣＳ：相同細胞
ＳＳＣ：相同細胞
ＦＬ１：分子標識プローブでの特異的染色の後の高められた蛍光
ＦＬ３：チャネルＦＬ１グリーンからのノイズ
図６：固定化されていない染色されていないＦＣ２
ＦＣＳ＝前方散乱（細胞のサイズ）１つの細胞系統である場合にはそれは同型細胞のピークに違いない。
【００８２】
ＳＳＣ＝側方散乱（細胞の形態）１つの細胞系統である場合にはそれはＦＳＣピークとして相同であるに違いない。
【００８３】
ＦＬ１グリーン：蛍光標識された細胞の強度を示す。
【００８４】
ＦＬ３オレンジ／レッド：“フィコエリトリン”染色された細胞のために通常使用される。
【００８５】
図７：ホルムアルデヒドで固定化され、“ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ”（ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ， Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃａｔ＃Ｔ２０１０１５， １０１９０ Ｔｅｌｅｓｉｓ Ｃｏｕｒｔ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）システムで細胞中に輸送されたＣＤ５９特異的分子標識で染色されたＣＨＯ細胞。
【００８６】
ＦＳＣ：同型細胞
ＳＳＣ：同型細胞
ＦＬ１グリーン：標識染色されたＣＨＯ細胞の自己蛍光及びバックグラウンド　ＦＬ３オレンジ／レッド：チャネルＦＬ１グリーンからの重複ノイズ
プロセス工程の詳細な記載
１．血液試料
妊娠７〜１５週後の妊婦から約３０ｍｌの血液を、１つ以上の抗凝血剤、例えば酸−クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）、エチレンジアミン四酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン及び／又はクエン酸−リン酸−デキストロース−アデニン（ＣＰＤＡ−Ｓ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ、Ｓａｒｓｔｅｄ、ドイツ）を含有する真空試験管中に回収する。血液試料を処理し、かつ採取の４８時間以内に分析する。
【００８７】
２．母系血液における胎児ｍＲＮＡの定量（予備試験）
３００μｌの全血試料を、９００μｌのＲＢＣ溶解溶液（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ ＡｑｕａＰｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ＢｉｏＲａｄ）を含有する１．５ｍｌの小型遠心分離管に添加し、かつ該管をひっくり返すことによって室温で１０分間混合する。小型遠心分離機において１３０００〜１６０００×ｇでの２０秒間の遠心分離の後に、上清を、可視の白血球ペレット及び約１０〜２０μｌの残留液を残してピペットで除去する。白血球を、ペレットが見えなくなるまで渦動によって激しく再懸濁する。
【００８８】
３００μｌのＲＮＡ溶解溶液（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ ＡｑｕａＰｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ＢｉｏＲａｄ）を前記混合物に、３回上下にピペッティングすることによって添加する。１００μｌのＤＮＡ沈殿溶液（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ ＡｑｕａＰｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｏｎ， ＢｉｏＲａｄ）を細胞溶解物に添加し、管をひっくり返すことによって混合し、かつ１６０００×ｇでの遠心の前に５分間氷浴中に置く。沈殿したタンパク質及びＤＮＡは密なペレットを形成する。上清を３００μｌの純粋なイソプロパノールを含有する１．５ｍｌの透明な滅菌小型遠心分離管に入れる。試料を３０回ひっくり返すことによって混合し、１６０００×ｇで３分間遠心分離する。全ＲＮＡは少量の半透明のペレットとして確認できる。上清を流し、該管を吸着紙中で乾燥させる。ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、３０分間空気乾燥させ、使用するまで−８０℃で貯蔵する。
【００８９】
第１鎖相補性ＤＮＡを、ランダムヘキサマー（クロンテック）をプライマーとして用いて合成する。空気乾燥され、かつ凍結されたＲＮＡ試料を
１μｌの５０マイクロモル／ｌのランダムヘキサマー
０．２μｌの０．１モル／ｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ）
０．０５μｌのＲＮＡアーゼインヒビター（Ｒｎａｓｉｎ、プロメガ）及び
７．２５μｌのヌクレアーゼ不含の滅菌水
からなる８．５μｌの溶液中に再懸濁する。
【００９０】
ヘキサマーは、７０℃で５分間インキュベートすることによってアニーリングし、かつ氷上で急冷する。逆転写を
４μｌの２５ミリモル／ｌのＭｇＣｌ２
２μｌの１０×ＰＣＲバッファーＩＩ（パーキンエルマー）
４μｌの２ミリモル／ｌのｄＮＴＰ（アマシャム ファルマシア）
１μｌのＲＮＡアーゼインヒビター（プロメガ）及び
０．５μｌのモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍａｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（ギブコＢＲＬ）
を含有する１１．５μｌを添加することによって実施し、かつ３７℃で１時間インキュベートする。反応を９５℃への５分間の加熱によって停止させる。
【００９１】
ＲＴ−ＰＣＲで使用される前に、５μｌのＲＮＡハイブリダイゼーション溶液（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ ＡｑｕａＰｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ＢｉｏＲａｄ）を該ＲＮＡに添加する。該混合物を引き続き激しく渦動させ、かつ５μｌを５０μｌのＰＣＲ実験に使用する。
【００９２】
マルチプレックス化された定量的リアルタイムＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を、β−アクチン、ｚｆｙ及びＨｂＦのｍＲＮＡ配列からＰＣＲ増幅された断片の中央に相補的な分子標識を使用して実施する。分子標識のアーム配列の長さはＰＣＲのアニーリング温度（第１表）でステムを形成できるように選択されるが、ループの長さ及び配列は前記のＰＣＲ工程で安定なプローブ−標的物ハイブリッドが得られるように選択される。分子標識の設計はループ−アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリアルタイムサーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して熱変性プロフィールによって事前に試験している。所望の熱プロフィールを示す分子標識だけが増幅プライマーに類似の濃度で引き続いてのＰＣＲに含まれる。
【００９３】
ＰＣＲの変性工程の間に、分子標識はランダムコイルコンホメーション及び蛍光を呈する。温度が、一本鎖ＰＣＲ断片の標的配列に対する分子標識のアニーリングを可能にするほど低下されると、ループ−標的物ハイブリッドが形成し、これにより蛍光発光の継続が可能である。しかしながら余分の分子標識は迅速に、蛍光を止める安定な分子内ステム−ハイブリッドを形成する。温度がプライマー伸長を可能にするほど高まると、分子標識は標的配列から解離し、かつ重合工程と干渉しない。新規の分子標識ハイブリダイゼーション工程はＰＣＲサイクルの間の各アニーリング工程において行われるが、一方で得られた蛍光の増大がモニタリングされ、かつ推定される標的アンプリコンの量が示される。
【００９４】
多重化されたＰＣＲ実験において、少なくとも２つの異なる標的配列を１つの管中で同時に増幅される。少なくとも２つの分子標識を同時に使用し、該標識のそれぞれは放出波長でスペクトルの重複を有さない異なる蛍光色素で標識されている。得られる蛍光をＰＣＲのアニーリング工程の間に分子標識のそれぞれの適当な波長でモニタリングされる。
【００９５】
ＨｂＦ及びｚｆｙを多重化して、ＰＣＲを内部コントロールＰＣＲとしてのβ−アクチンＰＣＲと組み合わせる。β−アクチンは広く使用されており、そのｍＲＮＡは殆どのそれぞれの細胞型において至る所で豊富である。従ってβ−アクチン増幅は効果的なポリメラーゼ連鎖反応を示すだけでなく、ＰＣＲで使用される標的細胞の全量に高度に比例している。
【００９６】
プライマー及びリアルタイム定量的ＰＣＲ実験で使用される分子標識は第１表に示されている。１つのｑ−ＲＴ−ＰＣＲ実験において、ｚｆｙ遺伝子特異的ｍＲＮＡの量を定量し、かつその結果を、それぞれ男性又は女性の胎児を有する母親の血液試料からの全ｍＲＮＡであるポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料と比較する。
【００９７】
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲをｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）を使用することによって実施する。ｚｆｙのｍＲＮＡ及びＨｂＦのｍＲＮＡのためのＰＣＲを別個の反応で実施するが、β−アクチンに関するＰＣＲと多重化する。各５０μｌの反応は
５μｌの関連の鋳型ｃＤＮＡ
１．０μＭの、それぞれｚｆｙ又はＨｂＦを増幅するためのプライマー
０．２５μＭの、β−アクチンを増幅するためのプライマー
０．２μＭのｚｆｙ分子標識又は０．５μＭのＨｂＦ分子標識
０．２μＭのβ−アクチン分子標識
０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ
２．５ユニットのＡｍｐＩｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー）
４ｍＭのＭｇＣｌ２
５０ｍＭのＫＣｌ及び１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）
を含んでいた。
【００９８】
５０μｌの容量の反応を適当なＰＣＲ管に装入し、かつｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）に入れる。ｃＤＮＡを変性し、かつ９６℃への１０分間の加熱はＴａｑポリメラーゼを活性化する。更なる５０サイクルのＰＣＲにおいて、変性を９５℃で３０秒間で行い、６０〜６８℃で３０秒間プライマー及び分子標識をアニーリングし、かつ７２℃で３０秒間伸長を行う。蛍光データは反応のアニーリング工程の間に得られ、かつ蛍光のレベルをサイクル数の関数としてモニタリングする。
【００９９】
いかなる鋳型も使用しない反応は蛍光にいかなる増大も示さず、基線として機能する。広範な鋳型濃度にわたり、基線を検出的に超過している蛍光シグナルを有するサイクルは鋳型分子の初期数の対数に反比例している。各ウェルにおけるβ−アクチン蛍光のレベルはＰＣＲのために使用される全ｃＤＮＡの量を示す適当な更なるコントロールパラメータである。
【０１００】
各標的アンプリコンの合成から得られる蛍光シグナルを比較するために、各分子標識の蛍光強度（Ｆ）は計算式（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ−Ｆｍｉｎ）によって標準化される。こうして、値“０”は標的物の増幅の前の蛍光を表し、かつ“１”はＰＣＲ後の蛍光の最大レベルを表す。各分子標識のために、蛍光シグナルの強度がバックグラウンドの基線蛍光の標準偏差の１０倍を超える場合には閾値サイクルが規定される。標的物の定量のために、規定された閾値サイクルと標準曲線との比較を行う。
【０１０１】
３．分子標識の製造
２５〜３０個のヌクレオチドのオリゴデスオキシヌクレオチド（第２表参照）を相補的な５ヌクレオチドのアーム配列（ステム配列）によってサンドウィッチされた１５〜２０ヌクレオチドの標的配列（ｍＲＮＡに対してアンチセンス）からなり、蛍光色素（フルオレセイン又はＥＤＡＮＳ）に５′末端で、かつ消光色素としてのＤＡＢＣＹＬに３′末端で共有結合されている２５〜３０ヌクレオチドのオリゴデスオキシヌクレオチド（第２表を参照）を合成する。このプロトコールは以下の一般式：フルオレセイン−５′−ＧＣＧＡＧＣ−標的配列−ＧＣＴＣＧＣ−３′−ＤＡＢＣＹＬの分子標識をもたらす。
【０１０２】
前記の分子標識の合成のための初期のオリゴヌクレオチドはスルフヒドリル基をその５′末端に、かつ第一級アミノ基をその３′末端で有する。その合成は標準的なＡ−、Ｃ−、Ｇ−、Ｔ−ホスホアミデート化学で自動ＤＮＡシンセサイザ（パーキンエルマー３９４）で３′−アミノ修飾剤としての１−ジメトキシトリチロキシ−３−フルオレニルメトキシカルボニルアミノヘキサン−２−メチルスクシニル−長鎖アルキルアミノ調整多孔質ガラス（Ｃ７−ＣＰＧ， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施する。トリチル−ヘキシルチオールリンカー（（Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホアミデート　ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を最終工程としてヌクレオチドの５′末端に結合させる。
【０１０３】
引き続き該オリゴヌクレオチドを２８％のアンモニウムを使用して５５℃で６時間で支持体から解離させる。この処理は５′のスルフヒドリル末端のトリチル部を除いてアミノ基及びホスホネート基で保護部を除去する。解離されたオリゴヌクレオチドを逆相カートリッジカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって精製し、かつ次いで０．０５Ｍのトリエチルアンモニウム酢酸塩（ｐＨ７．０）中に溶解された５〜４０％のアセトニトリルの線形勾配でＣ１８カラム上でのＨＰＬＣによって１．０ｍｌ／分の流速において４０℃で３０分間作動させて分画し、かつ２５４ｎｍで検出する。
【０１０４】
約２００ナノモルの乾燥オリゴヌクレオチドを０．５ｍｌの０．１Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中に溶解させた。引き続き該混合物を０．１ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０ｍｇのＤＡＢＣＹＬ（４−（４′−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル（分子プローブ）と一緒に０．０１ｍｌのアリコートで２０分間隔でインキュベートする。該混合物を暗所において室温で３日間保持した。過剰のＤＡＢＣＹＬをこの混合物から、０．１Ｍのトリエチルアンモニウム酢酸塩（ｐＨ６．５）で平衡化されたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（Ｎａｐ−５， Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して除去する。殆どの溶出液を０．２μｍフィルタ（Ｃｅｎｔｒｅｘ ＭＦ−０．４， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を通して濾過し、かつＣ−１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上に、０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ６．５）中の７５％のアセトニトリル中の０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテートの２０〜７０％の線形溶出勾配を１ｍｌ／分の流速で２５分間使用して負荷する。ＤＡＢＣＹＬによる吸収を分光光度計によってモニタリングする。２６０及び４９１ｎｍで吸収するピークを収集する。
【０１０５】
５′末端でスルフヒドリル基からトリチル部を除去するために、乾燥させたかつＤＡＢＣＹＬ結合されたオリゴヌクレオチドを０．２５ｍｌの０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ６．５）中に溶解させ、かつ０．０１ｍｌの０．１５Ｍの硝酸銀と一緒に室温で３０分間インキュベートする。この溶液に０．０１５ｍｌの０．１５ＭのＤＴＴを添加する。上清を回転によってペレットから除去し、かつ０．２５ｍｌの０．１Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）中の４０ｍｇの５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（分子プローブ）からなる溶液中に移す。インキュベートは室温で暗所において１日間実施する。
【０１０６】
過剰のフルオレセインをゲル排除クロマトグラフィー（Ｎａｐ−５、アマシャム ファルマシア）によって除去し、かつオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣによって精製する。波長２６０ｎｍ及び４９１ｎｍで吸収するフラクションを回収する。それを沈殿させ、かつ０．１ｍｌのＴＥバッファー中に再溶解させる。収率は２６０ｎｍでの吸収を測定することによって推定する。
【０１０７】
４．密度勾配遠心分離
１５ｍｌの母系の末梢血液を１５．０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｒ）−１１１９（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する５０ｍｌのコニカル遠心分離管を室温で慎重に積層し、これを５００×ｇで正確に３０分間室温で遠心分離する。低温、例えば４℃での遠心分離によって細胞凝集及び乏しい回収がもたらされることがある。
【０１０８】
遠心分離の後に、単核細胞を有する乳白色の界面の０．５ｃｍ以内までの上層を吸引する。有核の赤血球系細胞及びリンパ球を含む白色のバンドは細胞質層の直下であり、広い拡散バンドを有するＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｒ）−１１９は他の有核の赤血球系細胞及び未成熟の赤血球を白色層より高いが成熟赤血球細胞ペレットよりも低い密度で含有し、これは管の極めて底部の有核細胞及び赤血球ペレットの直下である。
【０１０９】
これらの細胞を新しい管に移し、０．１％のＢＳＡを有するリン酸緩衝生理食塩溶液を添加して３０ｍｌにし、緩慢な吸引によって混合し、引き続き２５０×ｇで１０分間遠心分離する。上清を廃棄する。
【０１１０】
ペレットを０．１％のＢＳＡを有する１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩溶液で再懸濁し、かつ２５０×ｇで１０分間再び遠心分離する。洗浄工程を繰り返し、かつ上清を廃棄する。細胞ペレットを０．１％のＢＳＡを有する７５０μｌの緩衝生理食塩溶液中に再懸濁する。
【０１１１】
５．磁気活性化セルソーティング（ディプリーション、分離）
ディプリーション
リンパ球の効果的なディプリーションを改善するためにＣＤ４５及びＣＤ１５の組合せを使用する（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒａｍｎｙ；Ｏｒｄｅｒ Ｎｏ． ４５８−０１ ａｎｄ Ｎｏ． ４６６−０１）。
【０１１２】
凝集物の形成を減らすために、再懸濁バッファーにＥＤＴＡ及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は血清（２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳ ｐＨ７．２）を供給し、かつ死細胞を磁性標識の前に除去する。
【０１１３】
ＭＡＣＳ分離のために、該バッファーを真空の適用によって、有利には室温でバッファーを用いて脱ガスする。
【０１１４】
磁性標識を冷却器中で６℃〜１２℃の温度で１５分間実施する。
【０１１５】
凝集物を、細胞をナイロンメッシュ（３０μｍ）又はフィルタ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ； Ｏｒｄｅｒ Ｎｏ． ４１４−０７）に通すことによって除去する。
【０１１６】
前分離のために、フィルタをレザバー中で５００μｌの再懸濁バッファーを激しくピペッティングすることによって濾過プロセスの前に湿潤させ、かつ溶出液を廃棄する。引き続き１０８を有する最低の５００μｌの細胞懸濁液をフィルタに通し、これを５００μｌバッファーで２〜３回洗浄する。
【０１１７】
不所望の白血球細胞のディプリーション
フィルタ分離の後に、細胞を計数し、かつ適当なバッファー中で洗浄する。
【０１１８】
磁性分離
磁気活性化セルソーティングのために、ＬＤ分離カラム（オーダー番号４２９−０１）を含むＭｉｄｉＭＡＣＳシステムを使用する（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ； Ｏｒｄｅｒ Ｎｏ． ４２３−０１）。
【０１１９】
カラムを３ｍｌのバッファーで洗浄した後に、バッファー中で懸濁された磁性標識された細胞（５００μｌバッファー／１０８全細胞）をカラムに通す。溶出液を陽性フラクションとして回収する。この工程を繰り返してよい。該溶出液を収集し、かつ２００×ｇで１０分間遠心分離する。ペレットを１．５ｍｌのＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ中に更なる工程のために再懸濁する。
【０１２０】
胎児の赤血球の富化
前記のＭｉｄｅＭＡＣＳシステムを、グリコフェリンＡ（Ｇｌｙｃｏｐｈｅｒｉｎ Ａ）（ＧＰＡ；オーダー番号４２２−０１）及びＣＤ（オーダー番号４６２−０１）結合したＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ及びＭＡＣＳディプリーションで記載されるようなバッファー系（オーダー番号４２４−０１）を使用することによって胎児赤血球の富化のために作動させる。
【０１２１】
細胞懸濁液をカラムに通過させる。一方で溶出液を廃棄するが、カラム中に残留している細胞をしっかりと濯ぎだし、かつ陽性フラクションとして回収する。
【０１２２】
６．標的細胞への分子標識の輸送
富化された胎児細胞をＨＥＰＥＳ（１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、かつ遠心分離によって沈殿させる。２μｇの蛍光分子標識を２μｌの水中に溶解させ、かつ４００μｌのヌクレアーゼ不含の水中に懸濁された０．４ｍｇのＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムヨージド及び０．３ｍｇのＬ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる９μｌのリポソーム（Ｔｆｘ−５０ Ｒｅａｇｅｎｔ， Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合する。該混合物を緩慢に渦動させ、かつ室温で１０分間インキュベートする。引き続き細胞をＨＥＰＥＳ中で洗浄する。
【０１２３】
７．ＨｂＦ−ＰＥ（フィコエリトリン）及びＤＡＰＩ染色−フローサイトメトリープロトコール
染色手順：
試料内の赤血球細胞（ＲＢＣ）の量を計数した後に、２．５×１０７細胞を１ｍｌの０．０５％の冷グルタルアルデヒドに室温で１０分間添加する。この混合物を２ｍｌの冷ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で３回洗浄する。引き続き細胞を再懸濁し、かつ０．５ｍｌの０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００中で室温において３〜５分間インキュベートし、引き続き２ｍｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中で洗浄する。次いで細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中に渦動させるか又は緩慢にピペッティングすることによって取る。
【０１２４】
１０μｌの前記の懸濁液を１０μｌの抗体（Ｃａｌｔａｑ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ ９４０１０， Ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｄｅ： ＭＨＦＨ０４； Ｇａｍｍａ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び７０μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに添加し、かつ室温において暗中で１５分間インキュベートする。それぞれ２ｍｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡでの２工程の洗浄工程を次いで行う。
【０１２５】
ペレットを５００μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中で懸濁し、かつ１ｍｌのＤＡＰＩ染色溶液（ＰＡＲＴＥＣ、ドイツ）を添加する。インキュベーションを室温で１０分間実施する。ペレットを２ｍｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、かつ最後に０．５ｍｌの１％ホルムアルデヒド中に渦動させることによって再懸濁させる。細胞を管中で暗中に冷却器において貯蔵する。
【０１２６】
誤った陽性シグナルを低減させるために、非特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）−染色された抗体をサイトメトリー検出の間のネガティブコントロールとして使用する。
【０１２７】
８．細胞分離
細胞分離のために、ＰＡＳＩＩＩシステム（ＰＡＲＴＥＣ、ドイツ）を、４８８ｎｍのアルゴンレーザ及び紫外線ランプを適用して使用し、細胞内の種々の蛍光色素を識別する。
【０１２８】
９．ＦＩＳＨ
染色体又は間期（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）スライドの調製
細胞分離の後に、分子標識を使用してフローサイトメトリーにおいて胎児細胞を同定し、かつ染色体を有する細胞遺伝学的スライド又は核懸濁液を蛍光インサイチューハイブリダイゼーションのために製造する（Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎ， Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｍ． Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｄ． Ｒｉｃｋｗｏｏｄ： ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ： ｐａｇｅ ７９， Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ３． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ； ｐａｇｅ ７５， Ｐｒｏｔｏｃｏｌ １． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｉ ｆｒｏｍ ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ）。
【０１２９】
スライドを製造するために、一滴の染色体又は細胞核懸濁液を非常にクリーンなスライドガラス上に置く。これらのスライドを２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０中で５分間すすぐ。次いで１００μｇ／ｍｌのＲＮＡアーゼＡを含有する２×ＳＳＣ中で３７℃において少なくとも３０分間インキュベートする。引き続きスライドの洗浄を２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０中で３×５分間実施する。ＲＮＡアーゼ処理をして、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する相同のプローブＤＮＡ配列とハイブリダイズすることがある外因性ＲＮＡを除去する。これによりＤＮＡ標的物へのハイブリダイゼーションにおける信号対雑音比が改善される。
【０１３０】
スライドのインキュベーションを０．０１ＮのＨＣｌ中の０．０５％（ｗ／ｖ）ペプシン粉末中で３７℃において１０分間ペプシンで行う。スライドを１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３中で２×５分間すすぎ、かつ次いで５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１×ＰＢＳ中で２×５分間すすぐ。スライドの固定化は１％のホルムアルデヒド、１×ＰＢＳ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２によって室温で１０〜６０分間で達成される。スライドをＰＢＳ中で完全に洗浄する。ペプシン及び他のプロテアーゼ（すなわちプロテイナーゼＫ又はプロナーゼ）は標的ＤＮＡをパッケージ化する染色体タンパク質を消化させることによって到達性を増大させる。中期（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）及び核は延長されたプロテアーゼ処理の後にスライドから離れるので、スライドのホルムアルデヒドによる再固定化を使用する。
【０１３１】
エタノール組（７０％、８５％、１００％）におけるスライドの脱水をそれぞれ５分間、空気乾燥で実施する。次いで７０％の脱イオン化されたホルムアルデヒド及び２×ＳＳＣからなる２００μｌの変性溶液を各スライドに置き、かつカバーガラスで覆う。該スライドを９０℃の炉中に約６０分間置く。カバーガラスを引き離し、直ちに氷冷７０％エタノール中に入れる。脱水を氷冷エタノール組（７０％、８５％、１００％）中で再び行う。空気乾燥後に、スライドはインサイチューハイブリダイゼーションの準備ができている。
【０１３２】
プローブＤＮＡの製造及び標識
ＤＮＡテンプレートはスーパーコイル型又は直鎖型であってよい。ＤＮＡアーゼＩでのＤＮＡのニック付与の後に、ＤＮＡポリメラーゼの５′−３′エキソヌクレアーゼ活性はヌクレオチドを除去し、かつＤＮＡポリメラーゼ活性は標識されたヌクレオチドを含む反応混合物からｄＮＴＰで切り出されたヌクレオチドを置き換える。ビオチン、ジゴキシゲニン又は蛍光色素の導入のための手順はほぼ同一である。ニックトランスレーションされたプローブＤＮＡ断片の最終サイズは非常に重要である。標識されたプローブ配列は５００ｂｐ以下である。それというのも検体の透過が困難であり、ガラス及び細胞材料の両者に非特異的に付着する傾向にあり、信号を不明瞭にする高いバックグラウンドをもたらすからである。１００ｂｐより短い配列は通常のストリンジェントな条件下に効率的にハイブリダイズしない。
【０１３３】
ＤＮＡプローブを氷上で混合する、小型遠心分離管中：
ＤＮＡ（液体形で）　　　　　　　　　　　　　　　　　　１μｇ
１０×ニックトランスレーションバッファー　　　　　　　５μｌ
（トリス／ＨＣｌ １Ｍ、ｐＨ８；ＭｇＣｌ２ １Ｍ；ＢＳＡ１０％）
０．１Ｍのメルカプトエタノール　　　　　　　　　　　　５μｌ
１０×冷ｄＮＴＰ溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　５μｌ
（それぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）
１０×１：３標識されたｄＵＴＰ／冷ｄＴＴＰ溶液　　　　５μｌ
（０．１２５ｍＭ標識ｄＵＴＰ、すなわちビオチン−１６−ｄＵＴＰ又はジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ及び０．３７５ｍＭのｄＴＴＰ）
ニックトランスレーションされたＤＮＡにおけるそれぞれほぼ２０〜２５番目の位置での１つの変更されたヌクレオチドの標識密度は殆どのＦＩＳＨ実験のために適当である。
【０１３４】
１０×ＤＮＡアーゼＩ　　　　　　　　　　　　　　　　５μｌ
（１０Ｕ／μｌの活性を有するＤＮＡアーゼストック溶液を二回蒸留したＨ２Ｏで１：３０００〜１：４０００に希釈する）。添加された酵素の量に依存するプローブのサイズ分布として、最適なＤＮＡアーゼ濃度を定量によって測定せねばならない。ＤＮＡアーゼＩの各々の新しいストックを試験して適当な作業濃度を決定すべきである。
【０１３５】
ＤＮＡポリメラーゼＩ（５Ｕ／μｌ）　　　　　　　　１．３μｌ
ＤｄＨ２Ｏを必要であれば添加して、５０μｌの最終反応容量に到達させる。
【０１３６】
より大量のＤＮＡ（５μｇまで）を標識すべきであれば、反応容量は２５０μｌにスケールアップしてよい。
【０１３７】
反応混合物を１５℃で２時間インキュベートする。最適な導入のために、インキュベーション時間は少なくとも２時間であるべきであり、変更されたヌクレオチドの初期導入率は非置換のｄＮＴＰのそれより低い。ニックトランスレーションされたＤＮＡ断片のサイズを１．５％のアガロースゲル上で、適当なサイズマーカ（０．１〜１ｋｂ範囲）に沿って確認する。ＤＮＡ断片がなおも大きすぎる場合には、ＤＮＡアーゼ（場合により）の第２のアリコートを添加し、更に１５℃で３０〜６０分間インキュベートする。大部分の断片が１００塩基対〜５００塩基対の間のサイズになったら、５０μｌのニックトランスレーション混合物への停止バッファー（１．２５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡ及び０．５μｌの１０％ＳＤＳ）を添加することによって反応の停止を行う。管を６８℃に１０分間加熱する。
【０１３８】
ラージインサートクローンプローブのためには簡単なエタノール沈殿が効果的である。小さな単コピーＤＮＡプローブのためにはセファデックスＧ５０又は市販のカラムを通した遠心分離による精製が、導入されていないハプテン化された又は蛍光のヌクレオチドを除去するために推奨される。
【０１３９】
間接的な標識法において、ハプテンレポーター分子、すなわちＤＮＡプローブに導入されるビオチン−ｄＵＴＰ又はジゴキシゲニン−ｄＵＴＰはハイブリダイゼーション反応の後の親和性細胞化学によって検出される。蛍光（ストレプト）アビジン分子は特異的に結合して、特異的にビオチン標識されたプローブ−標的物ハイブリッドになる。蛍光抗ジゴキシゲニン抗体はジゴキシゲニン化されたプローブの検出のために使用される。間接的に標識されたプローブの蛍光シグナルは直接法によって生じるシグナルより１０倍まで強い。更に、小さいハプテン分子、例えばビオチンは殆どの蛍光ｄＮＴＰよりも効果的にＤＮＡ中に導入される。
【０１４０】
インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨプロトコール）
散在したリピートがゲノムＤＮＡの毎５ｋｂに存在し、殆どのラージインサートクローンがかなり多くの数の反復エレメントを有するので、それは、全ゲノムを通して密に関連するリピートとクロスハイブリダイズすることがある。従ってこれらのプローブはその特異的な標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするだけでなく、全ての染色体にハイブリダイズし、それにより不明瞭なＦＩＳＨシグナルが得られる。かかる非特異的ハイブリダイゼーションを回避するために、プローブＤＮＡ中の反復ＤＮＡ配列を未標識の全ゲノムＤＮＡ又は反復ｃｏｔ−１ＤＮＡとのプレハイブリダイゼーションによってブロックする。以下は、単コピーＤＮＡ配列の蛍光検出のために最適化されているサプレッションハイブリダイゼーションのための詳細なプロトコールである。
【０１４１】
ハイブリダイゼーション混合物
ニックトランスレーションされたＤＮＡプローブは約２０ｎｇ／μｌ（ニックトランスレーションバッファー中）の最終濃度を有する。まず、ヒトの検体にハイブリダイズされるべき多様に標識されたプローブを約５０倍過剰のｃｏｔ−１拮抗ＤＮＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）又は５００倍過剰の断片化された（１００〜５００塩基対）の全ゲノムＤＮＡ及び５０倍過剰の断片化されたキャリヤーとして使用されるサケ精子ＤＮＡと一緒に沈殿させる。ハイブリダイゼーション混合物（全スライドについて３０μｌ）中の最適なＤＮＡ濃度は主にプローブ型に依存する。ラージインサートクローンのためには、ハイブリダイゼーション混合物中の１０〜２０ｎｇ／μｌ（又はスライドあたり３００〜６００ｎｇ）が推奨される。
【０１４２】
市販の特異的なヒト染色体（２１及びＹ）のためのラージインサートクローン（Ｖｙｔｈｉｓ， ＵＳＡ）を使用する。
【０１４３】
以下に、２つの異なるＢＡＣ−ＤＮＡプローブを同じスライド上で一緒に三染色体性２１によって影響される男性の胎児細胞の同定のためにハイブリダイズさせる。
【０１４４】
2004504036.tif 000003
ＤＮＡを１／２０容量の３Ｍの酢酸ナトリウム及び２容量の１００％のＥｔＯＨ（ｐ．ａ．）で小型遠心分離管中で沈殿させる。試料をよく混合し、かつ−７０℃で少なくとも３０分間又は−２０℃で一晩インキュベートする。沈殿を４℃で１５０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離回転で行う。上清を廃棄し、かつペレットを真空システム中又は選択的に加熱ブロック中で３７℃において乾燥させる。
【０１４５】
ＤＮＡプローブを１５μｌの脱イオンされたホルムアミドで再懸濁し、少なくとも１５分間３７℃で振盪して、プローブＤＮＡを再懸濁させる。次いで等量の２×ハイブリダイゼーション混合物（２０％のデキストラン硫酸塩、４×ＳＳＣ）を添加して、引き続き少なくとも１５分間激しく振盪する。
【０１４６】
ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション混合物中５０％のホルムアミド、１０％のデキストラン硫酸塩、２×ＳＳＣである。ハイブリダイゼーション混合物（プローブＤＮＡを含有する）の変性を８０℃で１０分間実施する。プローブを凝縮水をペレット化するために２〜５秒間遠心分離する。
【０１４７】
反復ＤＮＡフラクションを再アニーリングさせるために、変性された拮抗物及びプローブＤＮＡを含有する管を３７℃で少なくとも１５分間インキュベートする。ＤＮＡプローブ（３０μｌ）を変性スライド上に置き、かつカバーガラスで覆う。縁部をラバーセメントでシールし、かつ湿室で３７℃において一晩（又はそれより長く）インキュベートする。
【０１４８】
３０μｌの変性され、かつ前アニーリングされたＤＮＡプローブ混合物を予熱されたスライド（スライド半分について１５μｌ）上にピペッティングする。該スライドを気泡が入らないようにカバーガラスで覆い、かつラバーセメントでシールする。ハイブリダイゼーションを湿気チャンバ中で３７℃において一晩行う。
【０１４９】
染色体又は細胞核にハイブリダイズするプローブＤＮＡの免疫細胞化学的検出　スライドの洗浄は５０％ホルムアルデヒド、２×ＳＳＣ中で４２℃において３×５分間で行い、かつ次いで０．１×ＳＳＣ中で６０℃において２×５分間で行う。洗浄溶液を異なる水浴で予熱する。スライドを有するコプリンジャー及び予熱された洗浄溶液をプラットホーム撹拌機（Ｐｌａｔｔｆｏｒｍ ｓｈａｋｅｒ）で撹拌する。
【０１５０】
プローブＤＮＡは標的ＤＮＡだけでなく、プローブ配列に部分的なホモロジーを有する配列にも非特異的にハイブリダイズする。かかる非特異的なハイブリッドは完全に一致するＤＮＡハイブリッドよりも安定ではないので、これらを種々の厳密性の後ハイブリダイゼーション洗浄によって解離させることができる。
【０１５１】
第２のインキュベーション及び洗浄はニックトランスレーションされたハプテン化されたＤＮＡプローブの可視化のために必要である。第２の試薬とのインキュベーションの前に、スライドを、４×ＳＳＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の５％のウシ血清アルブミンで処理することによってブロックする。新鮮なブロッキング溶液とのコプリンジャー中のスライドのインキュベーションを３７℃で少なくとも３０分間行う。ブロッキングによって、非特異的抗体結合が回避され、かつバックグラウンドが減少する。
【０１５２】
蛍光（ストレプト）アビジン及び抗ジゴキシゲニン抗体、すなわちＦＩＴＣ−アビジン及びＣｙ３結合された抗ジゴキシゲニンをそれぞれ１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、４×ＳＳＣ中で１：８００及び１：２００で（又は提供元の推奨により）希釈する。スライドを２００μｌの検出溶液及びカバーガラスで覆う。インキュベーションを湿室において３７℃で暗所において３０分間実施する。カバーガラスを引き離し、かつスライドをコプリンジャー中で０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、４×ＳＳＣで４２℃において３×５分間洗浄する。染色体及び細胞核を可視化するために、２×ＳＳＣ中の１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で１〜２分間スライドを後染色する。スライドの洗浄を蒸留水で完全に行い、空気乾燥し、かつ次いで耐フェード封入剤でそれらを封入する。ＤＡＢＣＯは蛍光にスライドを晒した後にも蛍光の消滅を阻止する。
【０１５３】
大きいインサートクローンは特異的な蛍光シグナルを発生し、これらは顕微鏡を通して明らかに目視できる。蛍光マウス抗ジゴキシゲニン抗体を結合するジゴキシゲニン化されたＤＮＡプローブを第２層の蛍光ウサギ抗マウス抗体及び、必要であれば第３層の蛍光ヤギ抗ウサギ抗体で増幅する。
【０１５４】
デジタルカメラの高い感度の故に、電子像増強の使用は免疫細胞化学的シグナル増幅に関して議論しうるように有利である。特化されたＦＩＳＨソフトウェアは染色体のプレーンなＤＡＰＩ蛍光をＧ様の横縞模様に変換することを可能にする。ＩＳＩＳ３蛍光写真システム及びＨＡＭＡＭＡＴＳＵのデジタルカメラシステム（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）を使用した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はフローサイトメトリーにおいて分子標識を使用する染色体異常の検出についてのフローチャートを示している。
【図２】
図２はフローサイトメトリーにおける嚢胞性線維症遺伝子特異的な分子標識を使用する直接的突然変異分析についてのフローチャートを示している。
【図３】
図３はＰＣＲプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを列記した第１表としての表である。
【図４】
図４は分子標識として使用されるオリゴヌクレオチドを列記した第２表としての表である。
【図５】
図５はホルムアルデヒドで固定化され、“ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ”システムによって細胞中に輸送されたＣＤ５９特異的分子標識で染色されたＦＣ２の蛍光シグナル分析を示している。
【図６】
図６は固定化されていない染色されていないＦＣ２の蛍光シグナル分析を示している。
【図７】
図７はホルムアルデヒドで固定化され、“ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ”システムで細胞中に輸送されたＣＤ５９特異的分子標識で染色されたＣＨＯ細胞の蛍光シグナル分析を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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