(57)【要約】本発明は、合成又は天然の荷電リン脂質を含む薬学的組成物であって、患者に投与するために投薬形態に処方され、又は食品添加物として添加される薬学的組成物を提供する。負に荷電したリン脂質組成物は血管内リポタンパク質上の総負電荷を増加させ、コレステロールのクリアランスを増強し、脂質分解酵素の機能を調節し、プロトロンビン形成を遅延させ、ウイルス及び細菌粒子のクリアランスを補助する。従って、高脂血症や血液凝固疾患を治療するために、及びウイルスのレベルを低下させるために、負に帯電した脂質組成物をヒト及び動物に投与することができる。正に荷電した脂質組成物は、血漿コンパートメントからのリポタンパク質のクリアランスを遅延させ、リポタンパク質と会合する薬物の活性をより長く持続させるために投与することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切な担体の存在下で荷電リン脂質を含む、患者に投与するための組成物。
【請求項２】
前記荷電リン脂質が単層小胞、多層小胞、多層シート、分散物、ミセル溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョンの少なくとも１つから選択された構造に調合された請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記荷電リン脂質が単層小胞に含有される請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記担体が薬学的に許容される担体である請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
経口投与、鼻腔内投与、経皮投与に適合するか、又は注射剤として適合する形態の請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、及び皮下注射から成る群から選択された注射に適合する形態の請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
食品に関連した食品添加物としての請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項８】
前記担体が食品である請求項１、２又は３の何れかに記載の組成物。
【請求項９】
前記担体が食用穀物である請求項１、２又は３の何れかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記担体が天然高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）である請求項１〜７の何れかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記担体が合成高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）である請求項１〜７の何れかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記荷電リン脂質が負に荷電したリン脂質である請求項１〜１１の何れかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸から成る群から選択される請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルイノシトールである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸のうち少なくとも２種の混合物から選択された請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記荷電リン脂質が正に荷電したリン脂質である請求項１〜１１の何れかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記正に荷電したリン脂質がジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
患者からのＨＤＬクリアランスを遅延させるための請求項１６又は１７に記載した組成物の使用。
【請求項１９】
ＨＤＬ又はｒＨＤＬに関連した薬剤の効果を延長させるための請求項１６又は１７に記載した組成物の使用。
【請求項２０】
正に荷電したリン脂質を患者に投与することを備えた患者からのリポ蛋白質クリアランスを遅延させる方法。
【請求項２１】
請求項１６又は１７の何れかに記載した組成物を患者に投与することを備えた患者からのリポ蛋白質クリアランスを遅延させる方法。
【請求項２２】
患者のコレステロールを減少させる薬物としての合成又は天然の負に荷電したリン脂質を含む組成物の使用。
【請求項２３】
患者のコレステロールを減少させる食品添加物としての合成又は天然の負に荷電したリン脂質を含む組成物の使用。
【請求項２４】
血漿中のプロトロンビンの凝固を遅延させるための請求項１２〜１５の何れかに記載の組成物の使用。
【請求項２５】
内毒素、ウイルス、ステロール及び細菌の群から選択される少なくとも１種の物質を患者の血流から排除するための請求項１２〜１５の何れかに記載の組成物の使用。
【請求項２６】
前記物質が内毒素である請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記物質がリポ蛋白質と会合する細菌である請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
前記物質がリポ蛋白質と会合するウイルスである請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
前記物質がステロールである請求項２５に記載の使用。
【請求項３０】
前記ステロールがコレステロールである請求項２５に記載の使用。
【請求項３１】
前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸又はそれらの混合物から成る群から選択される請求項２２又は請求項２３に記載の組成物の使用。
【請求項３２】
前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルイノシトールである請求項２２又は請求項２３に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
前記組成物が天然又は合成の高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）を含む請求項２２、２３、３１又は３２のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３４】
前記患者が高コレステロール血症患者である請求項２２、２３、３１、３２又は３３の何れかに記載の組成物の使用。
【請求項３５】
合成又は天然の負に荷電したリン脂質の有効量を前記患者に投与することを備えた患者のコレステロールを低下させる方法。
【請求項３６】
有効量の請求項１２〜１５の何れかに記載の組成物を前記患者に投与することを備えた内毒素、細菌、ステロール及びウイルスから成る群から選択された物質を患者の血流から除去する方法。
【請求項３７】
前記物質が内毒素である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記物質がリポ蛋白質と結合する細菌である請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記物質がリポ蛋白質と結合するウイルスである請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記物質がステロールである請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ステロールがコレステロールである請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
合成又は天然の負に荷電したリン脂質を含む有効量の組成物を前記患者に投与することを備えたウイルス粒子を患者の血流から除去する方法。
【請求項４３】
有効量の合成又は天然の負に荷電したリン脂質を前記患者に投与することを備えたリポ蛋白質に結合する細菌を患者の血流から除去する方法。
【請求項４４】
血漿中のプロトロンビンの形成を阻害する方法であって、前記血漿と合成又は天然の負に荷電したリン脂質とを混合することを備えた方法。
【請求項４５】
前記血漿が患者の血流中に存在する請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸及びそれらの混合物から成る群から選択される請求項３５又は請求項４２〜４５の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルイノシトールである請求項３５又は請求項４２〜４５の何れかに記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が薬学的に許容される担体を含む請求項３５又は請求項４２〜４７の何れかに記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が天然又は合成の高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）を含む請求項３５又は請求項４２〜４８の何れかに記載の方法。
【請求項５０】
前記患者が高コレステロール血症患者である請求項３５又は４１の何れかに記載の方法。
【請求項５１】
前記負に荷電したリン脂質を患者の体重１キログラム当たり５μＭから約１００μＭの用量で投与する請求項３５〜５０の何れかに記載の方法。
【請求項５２】
前記負に荷電したリン脂質を患者の体重１キログラム当たり５μＭから約２０μＭの用量で投与する請求項３５〜５０の何れかに記載の方法。
【請求項５３】
前記負に荷電でしたリン脂質を患者の体重１キログラム当たり５μＭから約１００μＭの用量で投与する請求項２２及び２４〜３４の何れかに記載の使用。
【請求項５４】
前記負に荷電でしたリン脂質を患者の体重１キログラム当たり５μＭから約２０μＭの用量で投与する請求項２２及び２４〜３４の何れかに記載の使用。
【請求項５５】
前記使用によって、投与後１分乃至２時間から開始する少なくとも１時間の一時的期間中、前記患者の血液のＨＤＬ画分の電気陰性度が２０％から８０％に増加する請求項２２及び請求項２４〜３４に記載の使用。
【請求項５６】
前記方法によって、投与後１分乃至２時間から開始する少なくとも１時間の一時的期間中、前記患者血液中のＨＤＬ画分の電気陰性度が２０％から８０％に増加する請求項３５〜５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、荷電脂質組成物に関する。ある側面では、本発明は、負に荷電した（陰イオン性）脂質組成物、並びにコレステロール及びその他の物質を血流から除去するために、インビボでリポ蛋白質の電荷を変更するための前記脂質組成物の使用に関する。別の側面では、本発明は、正に荷電した（陽イオン性）脂質組成物及び薬物活性を延長するための前記組成物の使用に関する。
【０００２】
【発明の背景】
冠血管疾患の原因となるアテローム動脈硬化は、先進国では死因の第一位である。アテローム動脈硬化のリスクが、血漿コレステロールレベルの上昇に直接的に関係することが証明されている。血漿中では、コレステロールの約７０％が、長鎖脂肪酸とエステル化してコレステリルエステルを形成し、これらのコレステリルエステルは血漿リポ蛋白質と結合する。コレステロール及びコレステリルエステルの輸送に関与する前記リポ蛋白質には、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）及び超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）がある。
【０００３】
ＬＤＬに付随するコレステロールレベルの増加は、アテローム動脈硬化発症のリスクと関連していることが明らかとなっているが（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９５年）、高レベルのＨＤＬコレステロールは心臓病の発症を予防することもある（Ｍｉｌｌｅｒら、１９７７年）。結果、動物のＬＤＬコレステロールレベルを効果的に減少させ、ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させる治療の開発に、多大な労力が費やされている。ＨＤＬは、体内からのコレステロールのクリアランスを促進して、アテローム生成に抗する役割を果たすこともある（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９８４年）。さらに、ＨＤＬ中のコレステロールが、特に、胆汁の形で肝臓によって体から排出される対象となっていることを、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９７８年）は開示している。しかし、ＬＤＬコレステロールレベルを下げ、ＨＤＬコレステロール濃度を上昇させることを目的とする現在の治療は、まだ成功していない。
【０００４】
肝臓へのコレステロールの流入を調節する因子についてはあまり理解されていないが、細胞のステロールの調節システム及び血管内輸送システムという二つの異なるシステムが関与している可能性がある。過剰な肝外コレステロールは、排出のために肝臓へＨＤＬ粒子で輸送される（Ｇｌｏｍｓｅｔ、１９６８年）。ＨＤＬは、また、細胞膜からコレステロール及びコレステリルエステル（ＣＥ）を吸収できることも証明されている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９８年）。さらに、第二のステロール輸送経路には、ＨＤＬから、急速に代謝回転するＶＬＤＬリポ蛋白質プールへのコレステロールの移動後、肝臓によるコレステロールの排除が含まれている（Ｔａｌｌ、１９９８年）。
【０００５】
血管内のステロール輸送のメカニズムも、あまり理解されていないが、複数の蛋白質及び酵素の協調作用が関与することもある。血管内のステロール輸送に関与すると考えられている２つの酵素は、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）とコレステロールエステル移動蛋白質（ＣＥＴＰ）である。現在、ＨＤＬ粒子上での遊離コレステロール（ＦＣ）からコレステロールエステル（ＣＥ）への転換を促進することによって、血漿コンパートメントの中へ及び血漿コンパートメントを通じてステロールを移動させる濃度勾配を、ＬＣＡＴが形成するのかもしれないと考えられている（Ｊｏｎａｓ、１９８７年）。その後、ＣＥＴＰは、新たに形成されたＣＥをＨＤＬからリポ蛋白質プールを含有するアポＢへと移動させて、この脂質流入を促進させる可能性がある（Ｌａｇｒｏｓｔ、１９９７年）。
【０００６】
アポリポ蛋白質成分及びその含有成分である荷電脂質のために、全ての種類のリポ蛋白質は正味の負の荷電を示す（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９４年）。しかし、リポ蛋白質の一部を成す個々の結合脂質は、正味の正または負の荷電のいずれかを前記リポ蛋白質にもたらすか、又は全く荷電をもたらさない。結合していないときには、リン脂質の中には負に荷電されるもの、正に荷電されるもの、及び電気的に中性のものがある。負に荷電したリン脂質の例には、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジン酸がある。電気的に中性のリン脂質の例には、ホスファチジルコリンがある。正に荷電した（陽イオン性）リン脂質の例には、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンがある。
【０００７】
Ｗｉｌｌｉａｍｓの米国特許第６，０７９，４１６号は、ステロールを実質的に含まないリン脂質を含有する高コレステロール血症の治療のための巨大リポソームの投与について教示している。Ｐａｒｋｅｒらの米国特許第５，６１４，５０７号は、電気的に中性な他の脂質とともに又は他の脂質なしに、内毒血症の治療のためのリン脂質のボーラス注入を解説する。 しかし、Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＰａｒｋｅｒらが開示した前記リン脂質組成物は、電気的に荷電されていないので、血流内でリポ蛋白質が荷電を変更するようには作用しない。代わりに、血液からコレステロール又は内毒素を回収及び除去するための単純な吸着剤として作用する。
【０００８】
米国特許第５，６５２，３３９号（Ｌｅａｒｃｈら）及び米国特許第５，１２８，３１８号（Ｌｅｖｉｎｅら）は、再構成した高密度リポ蛋白質（ｒＨＤＬ）粒子の調製を開示しており、薬物投与のために並びに脂質及び類脂質性物質に関連する疾患治療のためにｒＨＤＬ粒子を使用し得る可能性を示唆している。これらのｒＨＤＬ粒子はインビボ又はインビトロの両者で使用することができ、細胞又は体液からの脂溶性物質（例えば、コレステロール、内毒素）の除去、並びに高脂血症及び冠硬化の治療を補助するといわれている。しかし、全てのリポ蛋白質が上記のように正味の負の荷電を示すとはいえ、前記二つの特許は、正常ＨＤＬに存在する荷電を増加させることについては全く教示していない。
【０００９】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、全種類のリポ蛋白質で見られる負に荷電したリン脂質であり、ＨＤＬ中の総リン脂質（ＰＬ）の約４％を占める（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９４年）。血漿又はインビトロで単離したＨＤＬ、ＬＤＬ又はＶＬＤＬとＰＩとをインキュベートすると、これらのリポ蛋白質は、全て自然にＰＩを吸収できることが証明されている。しかし、様々なクラスのリポタンパク質中に存在するＰＩの量に影響を与え、又はこれを調節する因子はほとんど明らかとなっていない。
【００１０】
リポ蛋白質粒子の肝クリアランスを増強することによって、コレステロール及び組織コレステロール、内毒素、及びインビボでリポ蛋白質粒子に結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）する幾つかのウイルス及び細菌等のその他の脂溶性化合物を低下させる新規組成物に対する需要が存在する。また、このような組成物を使用する方法も必要とされている。特に、ＬＤＬに含まれるコレステロールを優先的に低下させる組成物及びかかる組成物の使用方法が必要とされている。また、このような薬物の効果持続時間を増加させるために、血流中のリポ蛋白質に結合する薬物を保持する組成物及びその使用方法も必要とされている。
【００１１】
【発明の概要】
本発明は、動物又は患者に投与した時に、インビボで負に荷電したリポ蛋白質を増加させる負に荷電した（陰イオン性）脂質の組成物を提供する。インビボで負に荷電したリポ蛋白質が増加するのに伴って、リポ蛋白質粒子の肝クリアランスが増大する。前記リポ蛋白質粒子のクリアランスは、コレステロールのクリアランスのために使用でき、その結果、アテロームの生成が著しく抑えられる。また、リポ蛋白質に随伴する細菌、内毒素、及びウイルスの血流からの除去、及び脂質関連疾患の治療にも使用できる。
【００１２】
本発明は、動物又は患者に投与した時に、インビボで負に荷電したリポ蛋白質を減少させる正に荷電した（陽イオン性）脂質の組成物も提供する。インビボで負に荷電したリポ蛋白質が減少するのに伴って、リポ蛋白質粒子の肝クリアランスが緩慢になる。この効果は、リポ蛋白質と結合する薬物のクリアランスを遅らせるために使用でき、これによって、このような薬物の効力を延長できる。
【００１３】
本発明は、患者に投与するために投薬形態（ｄｏｓａｇｅ　ｆｏｒｍ）に調合された合成又は天然に存在する負に荷電した（陰イオン性）リン脂質を含む薬学的組成物も包含する。所望であれば、前記組成物は、負に荷電した二つ以上のリン脂質の混合物を含むこともある。前記薬学的組成物は、動物又は患者内の脂質随伴化合物のレベルを調節できる。本発明は、血流からのコレステロールのクリアランスを増強させるために、並びに血中ＬＤＬ及びＶＬＤＬコレステロールレベルを減少させるために使用可能な薬物を製造するための負に荷電した上記リン脂質組成物の使用も含む。
【００１４】
単層小胞、多層小胞、多層シート、分散物、ミセル溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、純脂質混合物、又はこれらの構造物の任意の組み合わせを含む剤形で、上記薬学的組成物を提供できる。
【００１５】
本発明は、前記投薬形態を経口投与、鼻腔内又は経皮内に注入する上述の組成物にも関する。加えて、前記組成物は少なくとも一つの薬学的に許容される担体を、さらに含んでもよい。
【００１６】
本発明は、荷電リン脂質を含む経口投与食品添加物も包含する。前記荷電リン脂質が負に荷電したリン脂質である場合、患者が前記食品添加物を摂取すると、前記患者の血流中のコレステロール量を減少させることができる。特に好ましい食品添加物はホスファチジルイノシトールを含む。
【００１７】
本発明は、前記荷電リン脂質が、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及び／又ホスファチジン酸又はそれらの混合物から選択される負に荷電したリン脂質である上述の好ましい組成物に関し、前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルイノシトールである特に好ましい組成物に関する。
【００１８】
本発明は、少なくとも一つの負に荷電したリン脂質を投与して、インビボでリン蛋白質粒子のクリアランスを増強する方法にも関する。リポ蛋白質のクリアランスを増加することによって、リポ蛋白質粒子に付随する脂溶性化合物も効果的に除去される。例えば、本明細書の記述どおりに、荷電リン脂質を投与すると、ステロールが胆汁中に移動し糞便中に排出される。そのため、コレステロール、内毒素、又はリポ蛋白質に随伴する細菌又はウイルス粒子の除去が達成できる。理論に拘泥するものではないが、動物又は患者に薬学的荷電脂質組成物を投与すると、前記動物又は患者の血清総コレステロール濃度が低下し、コレステロールからコレステリルエステルへの変換を抑制すると考えられている。従って、リポ蛋白質の荷電は、リポ蛋白質随伴化合物（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、例えば遊離コレステロール等（これに制限されるものではない）の血清濃度を調整する役割を果たす。
【００１９】
本発明によれば、ＬＤＬに随伴する患者のコレステロールレベルを下げる方法、陰イオン性のリン脂質組成物を含む有効量の組成物を前記患者に投与することを備えた方法も提供されている。
【００２０】
本発明の別の側面は、負に荷電したリン脂質（特に好適な実施態様では、ＰＩ）を患者に投与した後における、細胞ステロールの動員の増強、及び血漿コンパートメントからのＦＣ及びＣＥの両者の急速なクリアランスの促進に関する。理論に拘泥するものではないが、リポ蛋白質の荷電がコレステロールの輸送に影響を与えること、及びリポ蛋白質の荷電を操作することによってこのプロセスを選択的に操作できることが提案されている。
【００２１】
本発明の別の側面は、負に荷電したリン脂質を動物又は患者に投与することによって、内毒素、細菌及びウイルス粒子を除去する方法、並びに高脂血症及びアテローム動脈硬化症等の動物の脂質関連疾患を治療する方法を提供する。
【００２２】
本発明の別の側面は、正に荷電したリン脂質を動物又は患者に投与することによって、前記動物又は患者の血流から、リポ蛋白質及びリポ蛋白質に随伴する薬物の除去を遅らせる方法を提供する。本発明は、このような方法に有用な正に荷電したリン脂質の組成物も包含する。
【００２３】
本発明のこれらの特徴胃および他の特徴は、添付図面を参照した以下の説明から更に明らかになるであろう。
【００２４】
【好ましい実施形態の説明】
リポ蛋白質の荷電は、荷電分子、ＰＩ及び非エステル型脂肪酸（ＮＥＦＡ）等の顕著な荷電脂質のリポ蛋白質の含有量によって影響を受ける。ＰＩは、全てのクラスのリポ蛋白質で見られる陰イオン性の脂質であり、ＨＤＬ中の総リン脂質の約４％を占める（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９４年）。
【００２５】
本発明は、天然、類縁体、又はその組み合わせの何れかの荷電リン脂質を含み、時には担体を含む薬学的組成物を提供する。適切な担体には、リン酸緩衝食塩水、コール酸ナトリウム、合成又は天然の無電荷両親媒性脂質（ａｍｐｌｉｐｈａｔｉｃ　ｌｉｐｉｄ）、ＨＤＬ粒子、又は一つ以上の荷電リン脂質を結合できる全ての蛋白質が含まれるが、これらに限定されない。前記担体は、前記リン脂質の遅延放出又は徐放を可能にするものであり得、担体の分野において周知である。
【００２６】
本発明における負に荷電した（陰イオン性）リン脂質には、インビボでリポ蛋白質の負電荷を増加させる全ての負に荷電したリン脂質が含まれる。本発明において好ましい負に荷電したリン脂質は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、又はこれらのリン脂質の任意の混合物である。特に好ましいリン脂質はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である。
【００２７】
本発明において正に荷電した（陽イオン性）リン脂質には、インビボでリポ蛋白質の負電荷を減少させる、正に荷電した全てのリン脂質が含まれる。好ましい正に荷電した好ましいリン脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）である。
【００２８】
コレステロール又は除去すべきその他の物質のクリアランスを増強する広範な投薬量で、前記負に荷電したリン脂質組成物を投与できる。薬学的組成物に使用される時には、動物又はヒト患者の体重１ｋｇに対して約５μＭ〜約１００μＭの量で投与するのが適切である。望ましくは、動物又はヒト患者に投与する荷電リン脂質のレベルは、単一用量又は短期間の投与（例えば、１時間）の何れかで投与する場合には、体重１ｋｇに対して約５μＭ〜約２０μＭである。限定を加えるものと解釈すべきではないが、例えば、動物又はヒト患者の体重１ｋｇに対して約５μＭ〜約１００μＭの量でＰＩが投与されると、本明細書に記述のとおりに、コレステロールの動員が増大する。
【００２９】
注入で投与する場合には、前記投与量は、少なくとも約２０％の血液中のＨＤＬ画分の表面に負の表面電位を増加させるのに十分であることが好ましいが、過渡的な期間中には、８０％以下（すなわち、約−１１〜−１２．２ｍＶの正常値乃至約−１８〜−２２ｍＶの値）であることが望ましい。個々の反応には差があるが、一般的に、前記期間は少なくとも１時間は継続し、前記動物又はヒト患者の体に運搬された後１分から２時間以内に始まる。負の表面電位は、前記動物又はヒト患者から採取した血液サンプルを除去し、本分野で周知の方法で、アガロースゲル中の前記リポ蛋白質の移動を観察することによって簡便に測定することができる。注入による投与よりも経口投与の方が、ＨＤＬ画分の荷電にあまり顕著な変化を起こさないが（限定するものと解釈してはならないが、例えば、約−１０．９ｍＶ〜約１２ｍＶ）、過渡期間は経口投与の方が長く継続することが認められている。
【００３０】
適切な期間にわたって低濃度で順次又は連続投与すると、単一用量の投与よりも長期間にわたって、負の表面電位の増加を維持することができる。
【００３１】
ある実施態様では、前記荷電リン脂質組成物は医薬の製造に使用できる。負に荷電したリン脂質を含有する前記医薬は、コレステロールのクリアランスを増大させるために、又は内毒素若しくはウイル粒子の除去に使用できる。正に荷電したリン脂質を含有する前記医薬は、血流からのリポ蛋白質のクリアランスを遅延させることによって、リポ蛋白質に随伴する薬物の血流からの除去を遅らせるために使用できる。前記医薬は、リポ蛋白質に随伴する薬物、例えばＨＤＬ又はｒＨＤＬ粒子に随伴する薬物等を必要に応じて含有することができる。
【００３２】
前記医薬は、注射によって、又は経皮（貼付又は皮下注射で）若しくは経口で与えることができる。当業者に周知のように、投与様式に合致するように前記担体は選択される。投与様式の中には、担体を必要としないものもある。
【００３３】
別の実施態様では、前記荷電リン脂質組成物を食物に含めることができる。その後、該食物は患者に投与され、患者のコレステロールのクリアランスを増強する。前記リン脂質組成物は、例えば、乾燥して固形食物に混合し、又は前記リン脂質組成物を中和しない流動食（例えば、ミルク）にエマルジョンとして混合し、又は固形食物（例えば、シリアル等）に噴霧し、食物を摂取する前に乾燥させて与えることができる。
【００３４】
リポ蛋白質の荷電がインビボでコレステロール代謝において果たす役割を証明するために、絶食させたウサギへの無電荷リン脂質 （ホスファチジルコリン、ＰＣ）又は荷電した陰イオン性リン脂質 ｛ホスファチジルイノシトール、（ＰＩ）又はホスファチジルセリン（ＰＳ）｝を静脈内注射して検査した。同様の効果が他の実験動物にも生じる。ＰＣを注入しても、リポ蛋白質の荷電及び組成物にごくわずかな効果しか現れず、生理食塩水を注入した動物で観察された効果と同様である。しかし、ＰＩを注入すると、全リポ蛋白質の正味の負の表面荷電に著しい増加を生じる（図１参照。以下でさらに説明）。かかる正味の負の表面荷電の変化は、速やかに（例えば約１０分後、但しこれに限定されるものではない）観察され、その後約２４時間までに通常レベルへと徐々に回復する。しかし、これらの時間は治療を受ける動物により異なる。ＰＩ又はＰＳの存在下で血漿をインキュベートする時に、リポ蛋白質の正味の荷電の変化も観察されている。ＰＩ及びＰＳは同様の結果を示す。
【００３５】
本明細書に記述のとおりに行った研究において、２４時間の代謝回転期間にわたってＨＤＬ又はＬＤＬのレベル又は組成に大きな変化は認められない。［３Ｈ］−ＦＣの同時注入によって、ＰＩを注入したウサギの血漿からの標識コレステロールのクリアランス速度の増加が明らかになった（図５参照、以下でさらに説明）。さらに、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼによるコレステロールエステル化の割合は、前記ＰＩ動物においてほぼ完全に抑制された（図３参照、以下でさらに説明）。
【００３６】
「荷電リン脂質」という用語は、中性ｐＨで電気的に荷電されている天然又は合成グリセロリン脂質を意味する。「負に荷電したリン脂質」（「陰イオン性リン脂質」としても知られる）は中性ｐＨで負の荷電を有する。「正に荷電したリン脂質」（「陽イオン性リン脂質」としても知られる）は中性ｐＨで正の荷電を有する。
【００３７】
水酸基のうちの一つが極性リン酸含有基に結合され、他の二つの水酸基が疎水基を結合されているグリセロール骨格をグリセロリン脂質が含むことを、当業者であれば理解できるであろう。また、当業者にとって明らかなことは、グリセリドの命名は、立体特異的な番号付け（ｓｎ、ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）システムの観点で定義されることが多いが、Ｄ／Ｌ及びＲ／Ｓ等の別の立体化学的規則が使用されることもあり、ほとんどの天然グリセロリン脂質はＲ又はＤ立体配置を有する。本発明では、Ｒ又はＳ（Ｄ又はＬと等しい）立体配置の何れかを有する荷電リン脂質を意図している。
【００３８】
ほとんどの天然グリセロリン脂質には、グリセロールバックボーンのｓｎ−１及びｓｎ−２の位置に付着した疎水基を有するが、リン酸塩は、通常、ｓｎ−３の位置に付着している。前記疎水基は、通常、エステル又はエーテル結合で結合している長鎖の炭化水素を含む。従って、本発明は、エステル又はエーテル結合を介して結合している疎水基を含む荷電リン脂質を十分に想定している。前記疎水基は本分野において周知である任意の疎水基であり得、限定を意図するものではないが、前記疎水基には、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等の飽和脂肪酸、又はパルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸又はこれらの任意の組み合わせ等の不飽和脂肪酸が含まれ得る。
【００３９】
グリセロリン脂質のリン酸基は、通常、グリセロール部分のｓｎ−３位に付着しており、このリン酸基は頭部基の部分に連結されている。ホスファチジルイノシトールでは頭部はイノシトールであるが、ホスファチジルセリンでは頭部はセリンである。本発明の前記荷電リン脂質は、グリセロールの何れかの水酸基とエステルを形成したリン酸基を有することができ、残りのグリセロール水酸基は、上述のように、疎水基とエステルを形成するか、またはエーテル結合を介して疎水基にエーテル付着している。さらに、前記頭部は必要に応じて置換してもよい。
【００４０】
「薬学的組成物」又は「荷電リン脂質組成物」という用語は、上記のように、荷電リン脂質を含む組成物を意味し、これは、患者に投与するために、適切な担体の存在下で適切な剤形に製剤される。前記担体は、緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（これに限定されない）、又は本明細書に記載の荷電リン脂質と会合可能な蛋白質からなり得る。例えば、当業者に周知であるリン酸緩衝食塩水等、ＨＤＬ粒子又は荷電リン脂質に会合又は結合できる任意の蛋白質の存在下で、単層小胞、多層小胞、多層シート、分散物、ミセル溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、又は任意のそれらの組み合わせなど（これらに限定されない）の構造物中に前記荷電リン脂質を製剤することができる。
【００４１】
上記製剤は水溶性製剤である。しかし、水溶液に添加する時に、固体、例えば、上記されている一以上の構造物を形成し得る粉末として（これらに限定されない）、前記荷電リン脂質を製剤できる。また、当業者に周知であるように、前記薬学的組成物は、薬剤的に許容される一以上の賦形剤の添加物を必要に応じて含んでもよい。例えば、前記薬学的組成物は、溶液中の小胞構造物の形成を容易にするために、その他の脂質を含むこともあるが、これに限定されない。或いは、荷電リン脂質がエマルジョン又はマイクロエマルジョンの形で運搬されるのであれば、親水相成分、疎水相成分、及び界面活性物質等の薬学的に許容される賦形剤（これらに限定されない）を必定に応じて含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤には、本分野において周知である溶媒、緩衝液、抗酸化剤、及び安定剤も含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、本分野において公知である任意の方法によって患者に投与可能である。例えば、前記薬学的組成物は経口投与できるか（これに限定されない）、又は前記薬学的組成物は、静脈内注射、筋肉内注射又は腹腔内注射（これらに限定されない）で注入されることもある。しかし、特定の投与様式に対しては一定の剤形がより適切であることが、当業者であれば理解できるであろう。例えば、前記薬学的組成物が小胞溶液として静脈内に投与されるのであれば、患者の微小血管中にとどまらないように、前記荷電リン脂質組成物は単層小胞の横断面を十分に小さくして投与されることが望ましい。
【００４３】
本発明の荷電リン脂質を食品添加物として投与する時には、任意の固形食又は流動食の一部として投与することが可能であり、前記荷電リン脂質はその荷電を喪失する態様で固形食又は流動食と反応し又は複合体を形成しない。別の食物も使用できるが、従来のシリアル製品上に乾燥した状態で、又はシリアル製品中に混ぜ合わせた状態で、荷電リン脂質または同一の荷電を有する荷電リン脂質の混合物を投与することが特に好ましい。薬剤又は食品のいずれかの場合には、少なくとも１０分間、血液のリポ蛋白質上に存在するインビボでの荷電を少なくとも２０％まで変化させるように、十分な量を投与する。負に荷電したリン脂質はリポ蛋白質の負の荷電を増加するが、正の荷電リン脂質はこれを減少させる。
【００４４】
本発明を、以下の例でさらに説明する。しかし、これらの例は例示のみを目的としたものであることを理解すべきであり、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するために使用すべきではない。
【００４５】
例の実施において使用した操作
ａ）リン脂質小胞の調製
各脂質４０μｍｏｌを１２ｘ７５ｍｍの培養チューブに入れ、Ｎ２下で完全に乾燥させることによって、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＣ）及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルイノシトール（ＰＩ）小胞を調製する。一定した作業サイクルで１分間の超音波処理を行うことによって、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）を含む３ｍＬの無菌生理食塩水中で、前記脂質を可溶化する。前記小胞を３７℃で１０分間インキュベートした後に、Ｎ２下で１０℃のウォーターバスに入れて、高出力にて４分間の超音波処理を行う。実験動物（ウサギ）からコレステロールのクリアランス速度を決定するために、前記ウサギに注入する前に、小胞調製物に放射性トレーサーを添加する。２００μＬの１μＣｉ／μｍｌ［３Ｈ］−ＦＣを、４０μｍｏｌのＰＩ又はＰＯＰＣとともに１２ｘ７５ｍｍ培養チューブに入れて乾燥させる。３ ｍｌのＰＢＳを前記乾燥脂質に添加して、前記混合物を上記のとおりに超音波処理する。このトレーサー／小胞の調製物を注入し、５分後に、前記ＰＩ又はＰＣ小胞を注入し、下記のように血液を採取する。
【００４６】
（ｂ）ウサギへの脂質注入
注入前にオスのニュージーランドホワイトウサギ（３．５−４．０ｋｇ）を１２時間絶食させ、最終時点のデータが得られるまでは絶食させたままにする。この期間中、ウサギは水を自由に摂取できる。カテーテルを辺縁耳静脈に挿入して、７．５ ％（Ｋ３）ＥＤＴＡ溶液を含有するチューブに血液サンプルを必要な時点で集める。注入前の血液サンプルを採取し、ＰＩ（ｎ＝４）、又はＰＣ（ｎ＝２）又は生理食塩水（ｎ＝１）のいずれかの前記小胞溶液を前記辺縁耳静脈に注入する。注入後１０分、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間に血液サンプルを採取する。全血液サンプルを氷の上に置き、続いて血漿を分離させるために４℃で１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離する。前記の貯蔵血漿中のレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）を確実に阻害するために、Ｇｕｅｒｉｎら（１９９４年）の教示に従って、ヨードアセトアミド（１５０ｍＭ）を血漿サンプルに添加する。
【００４７】
ＰＩに代えて、前記トレーサーを１ｍｇのＰＣ及び３ｍｌのＰＢＳと混ぜ合わせ、上述のように小胞を調製する比較実験を行う。これは、ＰＩが前記トレーサーの取り込み／クリアランスに影響しないことを確認するために行う。前記トレーサーの取り込み及びクリアランスが、前記ＰＩにより影響されないことが認められた。
【００４８】
（ｃ）：リポ蛋白質の性質決定
当業者周知のように、連続超遠心分離（ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ、ｄ＜１．０１９ｇ／ｍＬ； ＬＤＬ、ｄ＝１．０１９−１．０６３ｇ／ｍＬ；及びＨＤＬ、ｄ＝１．０６３−１．２１ｇ／ｍＬ）によってリポタンパク質画分を単離し、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ（ＬＡＶＡＬ、ＰＱ）のキットを使用して、リポ蛋白質脂質組成物（総コレステロール、遊離コレステロール（ＦＣ）、及びトリグリセリド（ＴＧ）濃度）を酵素的に測定する。単離した各リポ蛋白質をそれぞれＰＢＳ中に透析し、Ｓｐａｒｋｓ及びＰｈｉｌｉｐｓ（１９９２）の方法を使用して、プレキャストの０．５％アガロースゲル上で電気泳動させることによってその表面電荷の特性を決定した。
【００４９】
（ｄ）：コレステロールエステル化の測定
ヨードアセトアミドで処理していない血漿サンプルを使用して、ＬＣＡＴ活性に及ぼすＰＩの効果を検査する。各時点における血漿を４００μＬずつ、１０μＣｉの［３Ｈ］−ＦＣと一緒に濾紙盤（Ｄｏｂｉａｓｏｖａら、１９９１年）上で、３７℃で３０分間インキュベートし、２ｍＬエタノールを添加して前記反応を終わらせる。反応生成物をヘキサン中に抽出し、ＣＥ及びＦＣに含まれる［３Ｈ］量を薄層クロマトグラフィーで決定する。
【００５０】
（ｅ）： 胆汁のＦＣ排出及びステロール排出の刺激
４００μＣｉ［３Ｈ］−ＦＣを含有する４０μｍｏｌのＰＩ又はＰＣ小胞をウサギに注入する。３０分でウサギを屠殺し、胆嚢から胆汁を吸引する。さらに、肝臓を摘出、ホモナイズして、組織の放射活性を決定する。糞便中のコレステロール濃度を測定することを除いては、同様に糞便中のステロール排泄を９６時間にわたって測定する。
【００５１】
例１−８及び１１−１２では、負に荷電したリン脂質（ＰＩ又はＰＳ）の効果を対照群の効果と対比する。前記対照群は無電荷のリン脂質（ＰＣ）である。
【００５２】
例１−脂質小胞のリポ蛋白質表面電荷に及ぼす効果
図１には、ＰＩ及びＰＣ小胞の注入が、インビボのＨＤＬ、ＬＤＬ、及びＶＬＤＬ蛋白質の推定表面電位に及ぼす効果が示されている。ＰＣ又は生理食塩水を注入しても（図示せず）、アガロースゲルへのＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬ蛋白質の移動に大きな影響はなかったが、ＰＩの注入は、前記ゲルへの全リポ蛋白質画分の移動の増加を伴う。理論に拘泥するものではないが、恐らく前記ＰＩ荷電リン脂質種の結合が増加したために、ＰＩ注入後の前記リポ蛋白質画分の移動が増加して、前記リポ蛋白質の負の表面荷電が増加につながったことを前記結果は示している。ＰＣは中性リン脂質であるが、前記リポ蛋白質と結合することもある。しかし、ＰＣは中性リン脂質であるので、前記リポ蛋白質の移動に大きな変化は観察されていない。ゲル中のリポ蛋白質の移動特性の増加は、ＰＩ注入後に最高となり、約２４時間までに正常に戻る。このことは、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬリポ蛋白質に与えられる負の表面荷電の増加が、ＰＩ注入後の荷電リン脂質結合の結果であり、かかる負の表面荷電は一過性であり且つ可逆的であることを示す。患者から採取した後のリポ蛋白質のアガロースゲルにおける移動パターンに基づくと、ＰＩ注入前にＨＤＬ画分は約−１２．２ｍＶのバックグラウンド表面電位を示し、ＰＩ注入後約１０分で、約−１８．０ｍＶの最大負電荷に達すると推定される。同様に、前記ＶＬＤＬ画分の最初の表面電位は、約−８．８ｍＶであるが、１０分後には約−１１．２ｍＶに増加することが推定される。ＬＤＬの最初の表面電位は、約−３．９ｍＶであるが、ＰＩ注入後約６０分で約−８．０ｍＶの最高値に達することが推定される。
【００５３】
本明細書に記載されているように、リン脂質組成物中の表面荷電のかかる変化は、コレステロールを例に挙げると、以下にコレステロールに関して記載されているように、患者中のこれらの脂質可溶性化合物を低下させるような方法で、脂質及び脂質可溶性化合物の代謝を変化させる。
【００５４】
例２−負に荷電したリン脂質が血漿中の脂質移動に及ぼす効果
図２では、正常リポ蛋白を有する絶食患者の血漿から採取したリポ蛋白質の単離後における、ＨＤＬ（高密度リポ蛋白質）、ＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）及びＶＬＤＬ（超低密度リポ蛋白質）に付随するコレステロールの量に対するＰＩとのインキュベーションの効果がグラフで示されている。患者の血漿にＰＩを添加すると、ＬＤＬ及びＶＬＤＬのコレステロールの減少とＨＤＬコレステロールレベルの増加を伴うことが認められる。理論に拘泥するものではないが、前記結果は、ＬＤＬ及びＶＬＤＬからＨＤＬへのＣＥ及びＦＣの移動をＰＩが刺激することを示している。これは、コレステリルエステル移動蛋白質に対してリポ蛋白質のＰＩ濃度の上昇が有する静電気効果に起因するものと思われる。この蛋白質がリポ蛋白質間のコレステロール移動を制御し、リポ蛋白質の荷電により影響を受けることが以前の研究（Ｌａｇｒｏｓｔ、１９９７年）によって示されている。
【００５５】
例３−負に荷電したリン脂質によるコレステロールエステル化の阻害
図３のグラフは、インビボでＰＩ又はＰＣを注入した後の様々な時点で、ＰＣ又はＰＩの動物への注入がＬＣＡＴによるコレステロールエステル化の速度に及ぼす効果を示している。ＰＣ小胞の注入後には、ＬＣＡＴ活性の目立った変化は観察されていない。しかし、内因性のＬＣＡＴ活性は、ＰＩ注入から約１０分後に正常（ＰＣを注入した対照群）のＬＣＡＴ活性の約１８％に減少している。また、ＰＩ注入は、１時間当たり、初期値の約４５％から約８％までコレステロールエステル化の配分率を減少させる。図３に示すように、ＰＩ小胞注入後の期間後に、ＬＣＡＴ活性は正常値の約７５％まで回復する。理論に拘泥するものではないが、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）によってＰＩがＣＥ産生を阻害することを、これらの結果は示している。
【００５６】
血漿中のＣＥの前記産生及び輸送に及ぼすＰＩの効果を研究するために、放射性ＣＥの量を各時点で測定した（データ示さず）。ＰＩ及びＰＣを注入したウサギの［３Ｈ］−ＣＥ濃度は著しく異なっていた。最も顕著であったのは、最初の時点で、ＰＩ注入ウサギ群の［３Ｈ］−ＣＥは対照群と比較して８５％低かった。このことは、ＰＩウサギではＣＥの産生が損なわれる可能性を示しており、そのため、血漿中のＬＣＡＴの内因性活性を測定した（図３）。該データは、血漿リポ蛋白質のＰＩが増大すると、ＬＣＡＴによるコレステロールのエステル化をほぼ完璧に阻害することを示す。理論に拘泥するものではないが、前記結果はＰＩ注入動物の［３Ｈ］−ＣＥレベルの減少は、主としてＬＣＡＴによる生産減少に起因したことを前記結果は示す。血漿ＣＥレベルは、ＰＩの存在下（及びＬＣＡＴ抑制）で実際に上昇するので、ＬＣＡＴのみが血漿リポ蛋白質中のＣＥ量に関与しているわけではないことを前記データは示している。むしろ、細胞のコレステロールプールを動員させて、ＰＩが血管内コレステロールレベルを改変するようである。
【００５７】
例４−負に荷電したリン脂質がリポ蛋白質と赤血球の相互作用に及ぼす効果
図４には、ＰＩ又はＰＣ小胞がリポ蛋白質ＣＥ及びＦＣに及ぼす効果がグラフで示されている。全血をＰＣ小胞とともにインキュベートすると、前記リポ蛋白質のＣＥ含有量が６０％増加するが、ＦＣ含有量は約１０％減少する。一方、ＰＩ小胞を全血とともにインキュベートすると、リポ蛋白質ＣＥは約４０％減少するのに対して、ＦＣのレベルは約４０％増加することを示している。負に荷電したリン脂質は、赤血球とリポ蛋白質粒子間のＦＣとＣＥの相互交換を促進するようであった。しかし、ＣＥは赤血球細胞中に蓄積しなかったので、リポ蛋白質ＣＥを加水分解できるＣＥ加水分解酵素を伴う赤血球細胞を、ＰＩが刺激することを前記実験は示している。赤血球細胞がＣＥを貯蔵できず、そのために膜結合ＣＥ加水分解酵素を利用して、膜のＦＣレベルを維持することが、以前に教示されている。理論に拘泥するものではないが、従って、リポ蛋白質ＣＥの分解をＰＩが刺激することを前記結果は示している。
【００５８】
例５−ＰＩがウサギの血液からの［３Ｈ］−ＦＣのクリアランスに及ぼす効果 
図５には、ウサギに［３Ｈ］−ＦＣ及びＰＩ又はＰＣ小胞のいずれかを注入した後における、様々な時点での［３Ｈ］−ＦＣのクリアランスが示されている。ＰＩを注入したウサギの血漿中の［３Ｈ］−ＦＣが、約１時間後に最初の用量の約１５％に減少することを、図５は示している。これに比べて、ＰＣを注入したウサギは、注入した放射能の約９０％を１時間後の時点で含んでいる。さらに、同一の条件の下でＰＩを注入した動物と比較すると、前記ＰＣを注入したウサギの［３Ｈ］−ＦＣを同等の基底レベルまで除去するのに、約６時間以上を要する。前記ＰＩを注入したウサギの［３Ｈ］−ＦＣの半減期は約０．３時間と決定され、前記ＰＣを注入したウサギよりも約３０倍短い（約８．４時間）。
【００５９】
［３Ｈ］−ＦＣを様々な脂質と同時注入しても、［３Ｈ］−ＦＣが影響を受けないことを立証するために、［３Ｈ］−ＦＣを少量のＰＣと組み合わせてウサギに注入し、その後ＰＩ小胞を５分後に注入した。ＰＩ及び［３Ｈ］−ＦＣを同時注入した場合に見られたのと同じように、［３Ｈ］−ＦＣが速やかに除去されることをこれらの実験は示した。
【００６０】
例６−負に荷電したリン脂質が胆汁のＦＣ排出に及ぼす効果
図６には、［３Ｈ］−ＦＣを含有するＰＩ又はＰＣ小胞をウサギに注入した後、ＰＩが胆汁ＦＣの排出に及ぼす効果が示されている。ＰＣと比較すると、ＰＩ注入は血漿中の［３Ｈ］−ＦＣの減少及び肝臓における［３Ｈ］−ＦＣの上昇を伴う。理論に拘泥するものではないが、ＰＩは、血漿からのコレステロールのクリアランスを増強し、肝臓におけるその摂取及び蓄積を促進するのかもしれない。加えて、ＰＩ注入は胆汁へのコレステロールの排出増加に関連しているようである。胆汁へのコレステロールの排出が約２０倍増強されたことが観察されている（図６）。肝臓による摂取及び胆汁における遊離コレステロールの排出を刺激することによって、ＰＩは血漿コレステロールレベルを低下させることができることをこれらの結果は示唆している。
【００６１】
例７−負に荷電したリン脂質がステロールの排出に及ぼす効果
図７では、ステロールの排出に関連するＰＩ注入の効果がグラフで示されている。図７は、糞便中のコレステロールの排出をＰＩ注入が増強することを示唆する。ウサギにＰＣを注入してもコレステロールの排出には効果がなかったが、ＰＩ注入後２日で、糞便中のコレステロールの排出が約３００％増強した。コレステロールの排出の前記増加は、約４日目までに正常に回復した。これらの結果は、ＰＩがステロールの排出を刺激できることを示している。
【００６２】
例８−負に荷電したリン脂質が高コレステロール血症の治療に及ぼす効果
図８では、高コレステロール血症のウサギのリポ蛋白質コレステロールレベルにＰＩ注入が及ぼす効果がグラフで示されている。ウサギには４週間の期間、コレステロールを強化した食事を与えて、その血流中のＬＤＬ及びＶＬＤＬ粒子のコレステロールレベルを増加させた。その後、前記実験ウサギの半数に、７日間にわたって３６ｍｇのＰＩを１日に２回注入した。７日目に、血漿サンプルを採取して、２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、リポタンパク質を分画した。別のウサギの血漿のゲル濾過のプロフィールが示されており、様々なリポ蛋白質画分中のコレステロール濃度を示している。前記未処置の高コレステロール血症のウサギの血漿サンプルは、高レベルのＬＤＬ及びＶＬＤＬコレステロールを有することが示されている。ＰＩの注入によって、７日間にわたり、ＶＬＤＬコレステロールが７倍超減少し、ＬＤＬコレステロールレベルが約２．５倍超減少した。一方、ＨＤＬ粒子中のコレステロール量はＰＩでわずかに増加した。従って、高コレステロール血症を治療し、血漿ＬＤＬ及びＶＬＤＬコレステロール濃度を減少させるためにＰＩを使用することができる。
【００６３】
例９−経口投与された負に荷電した脂質がリポ蛋白質の荷電に及ぼす効果
図９では、ヒト患者に３００ｍｇのＰＳを経口投与した結果がグラフで示されている。ＰＳ投与の前、及びＰＳ投与後２４時間にわたって血漿サンプルを採取した。血漿サンプルを０．５％のアガロース上で電気泳動した後に、ＨＤＬの荷電を動電学的に決定した。６時間までにＨＤＬの荷電は−１０．９ｍＶから−１２ｍＶ以上まで徐々に増加し、その後注入後２４時間までに−１１．４ｍＶに低下した。ウサギの固形飼料上にＰＩを乾燥させてこれをウサギに与えた時にも、同様の結果が観察されている（データ示さず）。従って、負に荷電した脂質を経口投与すると、腸で吸収されて、血流中の荷電リポ蛋白質を変化させる。
【００６４】
例１０−リポ蛋白質の荷電がリポ蛋白質リパーゼ及び肝臓リパーゼに及ぼす効果
図１０には、リポ蛋白質の荷電が肝臓リパーゼに及ぼす効果が示されている。高密度リポ蛋白質粒子に様々な量の陰イオン性又は陽イオン性脂質を含むように濃縮した後、ヒトの純粋な肝臓リパーゼの基質とした。リポ蛋白質の正味の負の荷電の減少は、肝臓リパーゼの脂肪分解活性の減少と関連していた。リポ蛋白質の荷電は、リポ蛋白質リパーゼの調節にも使用できる。ＰＩで血漿を濃縮すると、リポ蛋白質リパーゼによる脂質の加水分解を刺激することが示されたが、陽イオン性の脂質であるＤＯＴＡＰを添加すると、逆の効果が現れ、脂質の加水分解を阻害した（図示せず）。肝臓又はリポ蛋白質リパーゼによる脂質の加水分解は、従って、血漿リポ蛋白質の荷電特性の変化に影響され得る。
【００６５】
例１１−荷電した脂質が血漿凝固時間に及ぼす効果
図１１では、荷電した脂質が血液凝固に及ぼす効果が示されている。様々な量の無電化の小胞、ホスファチジルコリン（ＰＣ）または陰イオン性小胞、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とともに、ヒトの血漿を４℃で２４時間インキュベートした。その後、市販のキットを使用してプロトロンビン時間を測定した。結果を図１１に示す。ＰＣの量を増加しても、血漿凝固時間には大きな影響はないが、ＰＩはプロトロンビン形成の阻害を引き起こした。
【００６６】
例１２−ウサギの血漿から採取したサイトメガロウイルスのクリアランスに荷電脂質が及ぼす効果
ウサギに８Ｘ１０１０サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）粒子を注入した後に、無電化小胞、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、又は陰イオン性小胞、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の何れかを３６ｍｇ注入した。一定の間隔をあけて血液サンプルを採取して、免疫測定分析によって前記血液サンプル中のウイルスの量を決定した。注入後１０分で採取した血液サンプルのＣＭＶｐ２８ウェスタンブロットで結果を実証した（本明細書では再現していない）。ＰＣで観察されたクリアランス速度と比べて、注入されたＣＭＶのクリアランス速度は、ＰＩによって１．７倍増加した。
【００６７】
例１３−陰イオン性及び陽イオン性脂質がヒト血漿中のリポ蛋白質の荷電に及ぼす効果
以下に示すように、様々な濃度の、負に荷電したリン脂質（ＰＩ）又は正に荷電したリン脂質（ＤＯＴＡＰ）をヒト血漿に添加して、リポ蛋白質上の表面荷電を決定した。ＰＩ又はジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）小胞とともに前記ヒト血漿を４℃で２４時間インキュベートした後に、０．５％アガロースで電気泳動させた。リポ蛋白質の荷電を動電学的分析から算出した。結果は以下のとおり。
【００６８】
【表１】
2004505035.tif 000003
例についての考察
例１−２では、ウサギ及びヒトの両者を実験モデルとして使用して、本発明の側面を説明している。しかしながら、その他の動物においても同様の結果が出ることが期待される。従って、脂質関連疾患を治療するためにコレステロールのレベルを低下させ、任意の動物又はヒト患者の内毒素、細菌、ウイルスを除去するために、負に荷電したリン脂質を含む薬学的組成物を使用することを本発明は想定している。動物には、サル、イヌ、ネコ、ブタなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する「患者」という用語は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、ヒト又は動物の被験者である。ヒトでの研究を含む前記実施例におけるヒトでの研究結果と同様の結果が動物実験で使用した動物によって得られたこと、及び動物の反応がヒトの反応と類似しているためにリポ蛋白質及びコレステロールなどの研究に前記動物を一般的に使用しているという理由から、前記動物結果は、ヒト患者に及ぼす効果を正確に予測すると考えられる。
【００６９】
さらに、前記例は、リン脂質組成物の表面荷電を媒介して、動物又は患者の脂溶性化合物のレベルを減少することができる負に荷電したリン脂質の代表的な例として、ＰＩとＰＳを使用しているが、その他の負に荷電したリン脂質も、記述されている特性と同様の特性を示すことが明らかとなっている。従って、動物又は患者中に存在するリポ蛋白質に会合した化合物の肝性クリアランスを調整することができる薬学的組成物又は食品添加物として、ＰＩに加えて、他の負に荷電したリン脂質、例えば、ＰＳ、ＰＧ及びＰＡ（これらに限定されない）を調製及び使用することを本発明は想定する。
【００７０】
ＰＩ小胞をウサギに注入すると、全てのクラスのリポ蛋白質の負の表面電位が劇的に増加した（図１）。これは、リポ蛋白質に荷電脂質が取り込まれたことに直接起因しているものと思われる。血漿とともに又はインビトロでの超遠心分離によって単離したＨＤＬ、ＬＤＬ又はＶＬＤＬとともにＰＩをインキュベートすると、超遠心分離したリポ蛋白質にはリン脂質移動蛋白質（ＰＬＴＰ）が存在しないので、リン脂質移動タンパク質（ＰＬＴＰ）非依存的と思われる態様で、全てのリポ蛋白質が自発的にＰＩを吸収できることを示している。
【００７１】
ＰＩのほとんどがＨＤＬ粒子に会合していること、及び１０分後には、ＰＩ濃度が初期の検出濃度以下の濃度から総ＨＤＬ−ＰＬの３０％まで急速に増加することをＰＩの集団測定が示している。この後、ＨＤＬ−ＰＩの含有量は、３時間までに前記ＨＤＬ−ＰＩの約５−１０％へと緩やかに減少した。リポ蛋白質−細胞質間の移動か、又は荷電リン脂質特異的なホスホリパーゼによる選択的な加水分解のいずれかによって、様々なリポ蛋白質からＰＩのクリアランスが生じたのかもしれない。
【００７２】
血漿からの［３Ｈ］−ＦＣのクリアランスをモニターすると、同等のＰＣ量を注入したウサギと比較して、ＰＩ注入後にトレーサーがはるかに急速に血漿から除去されることをデータは示している（図５）。非常に少量の［３Ｈ］−ＣＥが検出できるにすぎず、ＬＣＡＴは初期の時点でほぼ完全に抑制されているので、このクリアランスは、ＦＣからＣＥへの転換が増加した結果ではない。従って、血漿コンパートメントのコレステロールの急速な動員と排除をＰＩが刺激することを、これらの結果は示している。幾つかの証拠が示唆しているのは、このＦＣの排除が肝臓による本脂質の摂取の増加を伴うことを示唆している。理論に拘泥するものではないが、従って、ＰＩは、ＨＤＬレセプターであるＳＲ−ＢＩのカベオリンに富むドメインとの相互作用を直接的に増強し、このレセプターを通じてＦＣ及びＣＥの両者の選択的な排除を促進できると考えられている。
【００７３】
荷電したリン脂質を注入すると、インビボでのコレステロール輸送に劇的な効果があることをこれらの例は示している。負に荷電したリン脂質によってリポ蛋白質のコレステロール代謝に誘導された変化は、リポ蛋白質のリモデリング及び代謝に関係する血漿タンパク質との相互作用の変化のみならず、荷電したリン脂質が豊富なリポ蛋白質と特異的な細胞表面微小ドメインとの相互作用の変化の結果であることを、前記データは示している。ＣＥを生産する酵素をほぼ完全に阻害すると、ＶＬＤＬ粒子中のＣＥの量が大きく増加した。このことは、ＬＣＡＴの活性がコレステロールの逆輸送には不必要であることを示す。ＶＬＤＬへのコレステロール輸送は、代わりに、血漿リポ蛋白質の電荷及び構造的特徴によって支配されている可能性があり、これによって特異的なレセプターとの界面相互作用及び細胞表面上のコレステロール貯蔵所が調節がされているのかもしれない。細胞培養実験は、現に、ＰＩがＰＩ濃縮血漿からのコレステロールの摂取を増強することを示している。形質転換肝細胞 （ＨＥＰＧ２細胞）では、血漿又はＨＤＬのＰＩが増加すると細胞のコレステロール摂取を刺激するが、ＬＤＬのＰＩが増加しても刺激は起こらない。理論に拘泥することを意図するものではないが、ＰＩが増加したＨＤＬからのコレステロールの取り込みの増加は、スカベンジャーレセプターＢＩによって媒介される経路では促進されないが、蛋白質キナーゼＣ依存性の新規取り込み経路に関連していると考えられる。従って、荷電した化合物を投与してリポ蛋白質の荷電を制御することによって、細胞表面からのＦＣ及びＣＥの流入／流出を操作し、血漿コレステロール代謝を選択的に制御できるようになると考えられている。
【００７４】
本発明によれば、負に荷電したリン脂質を用いることによって、血流中のコレステロールを減少させ、コレステロール濃度の高い（高コレステロール血症）患者を治療するために、かかる電荷依存的なコレステロール輸送の調節を使用できると考えられる。この可能性を評価するために、例８において、コレステロールを摂取させたウサギ（広く受容されているアテローム性動脈硬化のモデルでもある）のモデルでＰＩがコレステロールを低下させる可能性を調べた。前記動物を僅か７日間治療するだけで、ＨＤＬ粒子からではなくＬＤＬ及びＶＬＤＬ粒子からコレステロールを選択的に除去することによって（図８）、血漿コレステロール濃度の大幅な減少が促進されることが証明された。前記結果は極めて顕著であり、コレステロールを摂取させたウサギにシンバスタチン又はＣＥＴＰ阻害薬を３ヶ月間投与して行った以前の研究で観察された程度が大きかった。（Ｏｋａｍｏｔｏら）。Ｏｋａｍｏｔｏらの研究は、長期（６ヶ月）にわたるコレステロールを減少させる処置によって、治療群のウサギの大動脈中のアテローム斑の発生が著しく減少することを示した。本発明はＯｋａｍｏｔｏが使用した組成物よりもさらに顕著な短期間の効果を有しているのであるから、高コレステロール血症のウサギ又はヒトを負に荷電したリン脂質を用いて長期治療すると、アテローム斑が沈着しやすい動脈へのアテローム斑の形成を予防できると予想される。
【００７５】
一方、正に荷電したリン脂質の存在は、リポ蛋白質成分の取り込みを遅らせる。通常の期間よりも長期間にわたって、リポ蛋白質に会合した薬物を血流中に保持することが必要な場合などに、必要に応じて摂取を遅らせるために短期間使用することができる。
【００７６】
従って、本発明は、合成又は天然に存在する荷電リン脂質を含む薬学的組成物を提供する。負に荷電したリン脂質を含有する前記薬学的組成物は、本明細書に記載されているように、陰イオン性リン脂質を含む適切な剤形で投与された時に、患者のコレステロール濃度を低下させるのに有用である。上述のとおり、負に荷電したリン脂質を投与すると、ステロールが胆汁中に動員され、糞便中に排出される。
【００７７】
好ましい実施態様に関連して本発明を説明してきたが、本明細書に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく多くの変形及び変更を為し得ることが当業者には明らかであろう。
【００７８】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）又はホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞をウサギに投与した後の、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬ蛋白質の負の表面荷電の変化をグラフで示す。
【図２】図２は、絶食させた正常リポ蛋白の患者の血漿中リポ蛋白コレステロール濃度に及ぼすＰＩの効果をグラフで表したものである。
【図３】図３は、ウサギにＰＣ又はＰＩを注入したときの血漿コレステロールエステル化に及ぼす効果を示す。
【図４】図４は、ヒトの血液中のＦＣ及びＣＥのリポ蛋白質濃度に及ぼすＰＣ又はＰＩとのインキュベーションの効果を示す。
【図５】図５は、［３Ｈ］−ＦＣを含有するＰＩ及びＰＣ小胞を投与した後の、ウサギの血流からの［３Ｈ］−ＦＣのクリアランス時間を示す。
【図６】図６は、胆汁のＦＣ排出に及ぼすＰＩの効果を示す。［３Ｈ］−ＦＣを含有するＰＩ又はＰＣ小胞をウサギに注入した後、３０分で屠殺した。
【図７】図７は、ウサギにＰＩ又はＰＣを注入したときの糞便中へのコレステロール排出に及ぼす効果を示す。
【図８】図８は、高コレステロール血症のウサギにＰＩを注入したときの、ＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬのコレステロール濃度に及ぼす効果を示す。
【図９】図９は、ＰＳの経口投与がヒト患者のＨＤＬの荷電に及ぼす効果を示す。
【図１０】図１０は、リポ蛋白質の荷電が肝臓のトリグリセリドリパーゼによる脂肪分解に及ぼす効果を示す。
【図１１】図１１は、荷電脂質が血漿の凝固時間に及ぼす効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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