(57)【要約】本発明は、前記の問題を解決し、既知の標的核酸のシングルコピーと推測される配列領域とハイブリダイゼーションする、標識されたシングルコピー核酸を含有する核酸（例えば、ＤＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブを提供するものである。概して、本発明のプローブは、標的核酸の配列を、標的がその一部分となっているゲノム中の既知の繰り返し配列と比較することにより、設計されている；標的中のシングルコピー配列（すなわち、特異性がないことにより、シングルコピー配列のハイブリダイゼーションシグナルをふさいでしまう可能性のあるような、繰り返し配列を全く含んでいない配列）と導出できる情報がある。想像されるように、この初期段階では、標的とゲノム上の繰り返し配列の知見が必要であり、これらの情報は、ヒトゲノム計画やそれに関連したバイオインフォマティックスの研究により、飛躍的に利用できるようになってきている。さらに、必要とするシングルコピー配列を検索するために、市販されているコンピューターソフトウェアを利用することができる。ここでいうプローブとは、標的配列に相補性であるものが最も好ましい；即ち、プローブであるヌクレオチドと標的である配列が、１００％相補性があるものである。さらに広く言えば、プローブが、標的である配列と適切にハイブリダイゼーションする限り、相補性が１００％より低いものも使用することができる；すなわち、プローブと標的配列の相補鎖である配列とが、少なくとも８０％の相同性があったほうがよい。より好ましくは、少なくとも約９０％である。シングルコピーと推測される配列に対応する核酸断片は、ＰＣＲ増幅、精製したゲノム断片の制限酵素やエクソヌクレアーゼ処理、または直接核酸を合成する等、様々な方法により調製することができる。その後で、シングルコピー核酸断片は、潜在的に混入している繰り返し配列を除去するために、例えば、電気泳動や高速液体クロマトグラフィーにより精製する；この過程は、関係のないゲノム配列の偽陽性によるハイブリダイゼーションや検出を排除するために行うことが、特に好ましい。それから、プローブ断片は、リコンビナントＤＮＡベクターにクローニングしたり、直接ラベルを入れたりできる。プローブは、修飾された、または直接標識されたヌクレオチドを使って、ニックトランスレーションにより、標識されるのが好ましい。その後で、好ましくはマイクロスライド上に固定された染色体のプレパラート、そうでなければ、メンブラン、スライド、ＤＮＡチップ、または他の物体上に固相化した精製核酸と、標識されたプローブは変性され、ハイブリダイゼーションする。プローブは、米国特許５９８５５４９や５４４７８４１号明細書に記載されているように、従来からの蛍光染色ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、染色体へハイブリダイズする； または、米国特許５１１０９２０や５２７３８８１号明細書に記載された技術により、固相化した核酸と結合させることもできる。プローブのシグナルは、蛍光、免疫学的、または酵素反応溶液を使用する等、色々な方法により視覚化することができる。本発明のプローブを使用すると、従来のｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションでは、達成できな��った解像能で、染色体の切断点を、さらに正確に決定することができる。そのような解析を行うに当たり、最初に用いるプローブ群は、切断点の反対側にあると考えられている領域を基に、調製することができる。切断点を決定する最初の実験の後で、シングルコピーの手法を使って、切断点の近傍に新たにプローブを設計することができる。この方法で、切断点の正確な領域を決定することが可能となる。シングルコピーと推測されるプローブを使って、今まで未知であったゲノム中の繰り返し配列の存在を決定することができることが明らかとなった。従来未知であった繰り返し配列のファミリーは、連続した核酸配列のデータベースの中に追加され、その後、シングルコピープローブの設計に利用することができるようになる。本発明のプローブは、標的配列の長くなった分、より強固にハイブリダイゼーションできるような、ゲノム中で２倍化または３倍化している配列を含んでいてもよいことが、明らかとなっている。また、このようなデュープリコンまたはトリプリコンは、例えば、シングルコピープローブを使用して確認することができ、上市されているプローブを用いた場合は困難である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の配列である標的核酸中のシングルコピーと導出された配列にハイブリダイゼーションする、標識されたシングルコピーである核酸を含有する核酸ハイブリダイゼーションプローブで、該核酸プローブが少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有することを特徴とするプローブ。
【請求項２】
前記プローブが、該標的核酸中の各々がシングルコピーであると導出された配列にハイブリダイゼーションする、複数の異なる標識された核酸を含有し、該核酸プローブのそれぞれが少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記核酸プローブが、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記核酸プローブが、少なくとも約２０００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
該標的核酸がＤＮＡ，ＲＮＡ，ｍＲＮＡからなる群の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
該標的核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項５に記載のプローブ。
【請求項７】
該核酸プローブが１本鎖であることを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項８】
前記プローブが、標的核酸がその一部となっているゲノムの繰り返し配列にハイブリダイゼーションする、ブロッキング核酸配列を必然的に含んでいないことを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項９】
前記核酸プローブが、蛍光色素応答性ラベル、蛍光色素、発色性化学物質、複合タンパク質、抗体、抗原、およびその混合物からなる群から選択される標識ラベルで標識されていることを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記核酸プローブが、蛍光色素応答性ラベルで標識されていることを特徴とする請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記プローブと該標識配列と相補的な配列とが、少なくとも約８０％の相同性を有することを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記プローブが、該標的配列に相補性であることを特徴とする請求項１１に記載のプローブ。
【請求項１３】
標的核酸配列および該標的配列の少なくとも一部にハイブリダイゼーションする核酸プローブを含有する反応溶液を調製し、前記プローブの該標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを引き起こす段階を含むハイブリダイゼーション方法において、既知の配列の標的核酸中のシングルコピーと導出された配列にハイブリダイズする標識されたシングルコピー核酸を、前記プローブとして使用し、核酸プローブが少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有するすることを含むことを特徴とするハイブリダイゼーションの改良方法。
【請求項１４】
前記プローブが、該標的核酸の各々がシングルコピーであると推論される配列間隔にハイブリダイズする、複数の互いに異なる標識された核酸を含有し、該核酸プローブのそれぞれが、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１５】
前記核酸プローブが、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１６】
前記核酸プローブが少なくとも約２０００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項１５に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１７】
該標的核酸がＤＮＡ，ＲＮＡ，ｍＲＮＡからなる群の中から選択されることを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１８】
該標的核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項１７に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１９】
前記核酸プローブが１本鎖であることを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２０】
前記プローブが、標的核酸がその一部となっているゲノムの繰り返し配列にハイブリダイゼーションする、ブロッキング核酸配列を必然的に含んでいないことを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２１】
該核酸プローブが、蛍光色素応答性ラベル、蛍光色素、発色性化学物質、複合タンパク質、抗体、抗原、およびその混合物からなる群から選択される標識ラベルで標識されていることを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２２】
前記核酸プローブが、蛍光色素応答性ラベルで標識されていることを特徴とする請求項２１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２３】
前記ハイブリダイゼーション方法が、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、核酸が固定されているその他の方法からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２４】
前記プローブと該標識配列の一部である配列に、少なくとも約８０％の相同性を有することを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２５】
前記プローブが、該標的配列に相補性であることを特徴とする請求項２４に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２６】
ゲノムの一部を形成している標的核酸配列に対するハイブリダイゼーションプローブを作製する方法であり、前記方法が、該標的配列の少なくとも１つのシングルコピーである配列のシークエンスを決定し、かつ該シングルコピー配列の少なくとも一部に、ハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブを構築する段階を含んでいることを特徴とするプローブ作製方法。
【請求項２７】
該標的核酸配列のシークエンスを決定し、該ゲノム中に見られる繰り返し配列を決定し、 および前記の少なくとも１つのシングルコピー配列のシークエンスを決定するために、該標的核酸配列と繰り返し配列のシークエンスを比較する段階を含むことを特徴とする請求項２６に記載のプローブ作製方法。
【請求項２８】
前記プローブ作製方法が、該シングルコピーである配列の少なくとも一部を取得し、かつ該シングルコピー配列の一部を精製する段階を含むことを特徴とする請求項２６に記載のプローブ作製方法。
【請求項２９】
前記精製方法が、ＰＣＲの実行を含むことを特徴とする請求項２８に記載のプローブ作製方法。
【請求項３０】
該ハイブリダイゼーションプローブを標識する段階を含んでいることを特徴とする請求項２６に記載のプローブ作製方法。
【請求項３１】
該標的核酸配列および前記プローブが、ＤＮＡであることを特徴とする請求項２６に記載のプローブ作製方法。
【請求項３２】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、該シングルコピー配列と、少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする請求項２６に記載のプローブ作製方法。
【請求項３３】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、シングルコピーである配列と相補性であることを特徴とする請求項３２に記載のプローブ作製方法。
【請求項３４】
配列表の配列番号４２９〜４４６からなる群から選択される１つの配列と、少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項３５】
前記ＤＮＡ配列が、少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項３４に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３６】
配列表の配列番号４２９〜４４６および４８０〜６１３からなる群から選ばれることを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項３７】
配列番号４２９で始まり、配列番号４２９〜４４６と４８０〜６１３として同定される配列の近傍の一対を、ＰＣＲプライマーとして使用し合成されたＰＣＲ増幅配列と、少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項３８】
少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項３７に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３９】
標識され、シングルコピー核酸と導出されたプローブが、ゲノムと反応し、する段階を含み、プローブのハイブリダイゼーションを引き起こし、かつ、もしプローブがゲノムの互いに異なる３つ以上の部位とハイブリダイズするならば、新規な繰り返し配列であると決定できる、ゲノム中の未知の繰り返し配列の存在を同定する方法。
【請求項４０】
プローブが１０ヶ所以上の部位とハイブリダイズするならば、新規な繰り返し配列であると決定できる段階を含むことを特徴とする請求項３９に記載の同定方法。
【請求項４１】
前記核酸が、２倍化または３倍化した配列部分に由来することを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項４２】
２倍化または３倍化した配列領域にハイブリダイゼーションするシングルコピーである核酸を選択する段階を含むことを特徴とする請求項１３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４３】
前記決定段階が、２倍化または３倍化した配列領域からのシングルコピーである配列を選択する段階を含んでいることを特徴とする請求項２６に記載のプローブ作製方法。
【請求項４４】
次に示される段階を含む染色体の切断点を同定する方法：
既知配列であり、それぞれ該切断点の両側にハイブリダイゼーションするように設計された、互いに異なり、標識されたシングルコピーである１対の核酸プローブを提供し；
該一対のプローブが、該切断点を含む染色体の標的配列と反応して、プローブの標的配列とのハイブリダイゼーションを引き起こし、
該切断部位を決定する手段として、前記のハイブリダイゼーションしたプローブを同定する。
【請求項４５】
該切断点の片側にハイブリダイズするように設計された、既知の配列に対する複数の互いに異なり、標識されたシングルコピーである核酸プローブを提供し、該切断点のもう一方にハイブリダイズするように設計された、既知の配列に対する複数の互いに異なり、標識されたシングルコピーである核酸プローブを提供することを特徴とする請求項４４に記載の染色体切断点の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、真核生物由来の試料中に含まれる特異的な核酸配列の存在を同定するために、細胞遺伝学および分子遺伝学の分野において有用なシングルコピーハイブリダイゼーションプローブを設計する方法に広く関する；例えば、そのようなプローブは、後天性または先天性の遺伝病の検出手段として、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、特異的な染色体位置を解析するのに用いることができる。詳しくは、そのようなプローブ、そのプローブを使用したハイブリダイゼーション方法、およびプローブを作製する技術に関する。プローブには、ゲノムの繰り返し配列が必然的に存在せず、従来のプローブでは必要とされていた繰り返し配列を不活化する必要がない。
【０００２】
背景技術
染色体異常は、後天性または先天性など、様々な遺伝病と関連している。このような染色体異常は、個々の染色体の過剰または欠損（異数性）、染色体の一部分の過剰または欠損（欠失、倍加、重複および標識染色体を含む）、または染色体の再構成の、主に３つのタイプに分類される。後者の範疇には、転座（染色体の一部が、ある染色体上から他の染色体上に移ること）、逆位（染色体の一部分の方向性が逆転すること）、挿入（染色体の一部が、ある染色体から他の染色体の中へ移ること）、および同腕染色体（相同染色体部分に由来する染色体腕）が含まれる。染色体異常は、一連の細胞のみ（モザイク現象）、または全ての細胞に存在しているのかもしれない。先天性または生まれつき保有する様々なタイプの染色体異常は、２５０人に約１人の頻度で発生するが、そうした異常は、本質的に良性、重篤または致死的なものであるかもしれない。染色体異常は、普遍的な現象であり、白血病やその他の癌といった後天性の病気の診断に役立つことが多い。
【０００３】
ハイブリダイゼーションプローブは、染色体の解析や染色体異常の診断のために、従来開発された。プローブは、クローン化、増幅されたゲノム配列、またはｃＤＮＡを含んでいる。例えば、米国特許５４４７８４１、５６６３３１９および５７５６６９６号明細書には、標的染色体ＤＮＡの中の核酸部分に相補性のある、標識された核酸を形成するハイブリダイゼーションプローブについての記述がある。しかし、これらのプローブは、繰り返し配列を含んでおり、それ故、標識されたプローブの中で、繰り返し配列に部分的に相補的なブロッキング核酸と組み合わせて使用しなければならない。つまり、この先行技術に記載されたプローブは、結合させてプローブの中にある繰り返し配列をブロックする、ブロッキング核酸とあらかじめ反応しておくか、ハイブリダイゼーションを行う反応溶液の中にそのようなブロッキング核酸を入れておく必要がある。もし、プローブの中の繰り返し配列が、何らかの形で不活化されないなら、プローブは、繰り返し配列が存在している標的である染色体ＤＮＡの複数の部位と反応し、目的であるシングルコピーである配列と特異的に反応しない。これは、ゲノム全体に広く散在した繰り返し配列では、特に顕著な問題となるが、ＤＮＡ分子上に塊状または連続している配列でも同様である。相補的なブロッキング核酸を使用して繰り返し配列を不活化する必要があると、存在しているプローブの感受性も低下してしまう。再現性があって、簡便にシグナルを検出しようとすると、約４０〜１００ｋｂのＤＮＡプローブを必要とする。
【０００４】
前記の先行技術では、シングルコピーである配列を含んでいると推測されるクローン化されたプローブは、放射線標識された全ゲノムＤＮＡには結合しないことにより、同定することができることが示されている。この他の研究において、ハイブリダイゼーションは、リコンビナントのＤＮＡが、シングルコピー配列、または繰り返しの非常に少ない配列に結合するように、独立して選択されるクローン群を含むプローブで、まず始めに実施される。この先行技術では、前段階として、候補となっているＤＮＡに対し、サザンハイブリダイゼーションやドットブロットにより、標識されたゲノムＤＮＡの実証的なハイブリダイゼーションを行い、シングルコピー配列であることを確認する。標識された全ゲノムＤＮＡを使って、ハイブリダイゼーションによるシグナルが出ると、候補となっているＤＮＡプローブは、繰り返し配列を含んでおり、シングルコピープローブとして候補から除かれる。さらに、全ゲノムＤＮＡとＤＮＡプローブとの、予備実験的なハイブリダイゼーションでは、コピー数の小さい（＜１００コピー）またはゲノム中に頻繁には出現しないマルチコピーである繰り返し配列は、検出できない可能性がある。
【０００５】
実験手法において、プローブから繰り返し配列を、物理的に除去することが提示されている（Ｃｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１００：４７２−４７６（１９９７）；Ｄｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４：８２０−８２５（１９９８））。この検出手法では、ＤＮＡ標的に対するプローブを加える前に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅されたゲノムプローブを、過剰の精製した繰り返し配列を有するＤＮＡとプレハイブリダイゼーションする過程を含んでいる。その結果、精製したプローブは、繰り返し配列を除去される。この手法は、本質的には、プローブ中の繰り返し配列のハイブリダイゼーションを不可能にする他の手法と非常に良く似ている、しかし、時間がかかることに加え、米国特許５４４７８４１および５７５６９６号明細書に記載されているプローブに対して、何ら進歩性がないものである。
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、繰り返し配列と相補的なブロッキング核酸と組み合わせて使用する必要がなく、過剰の精製した繰り返し配列を有するＤＮＡとプレハイブリダイゼーションする過程も要しないシングルコピーであるハイブリダイゼーションプローブを提供することを目的とする。
【０００６】
［課題を解決するための手段］
（１）既知の配列である標的核酸中のシングルコピーと導出された配列にハイブリダイゼーションする、標識されたシングルコピーである核酸を含有する核酸ハイブリダイゼーションプローブで、該核酸プローブが少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有することを特徴とするプローブを提供する。
【０００７】
（２）前記プローブが、該標的核酸中の各々がシングルコピーであると導出された配列にハイブリダイゼーションする、複数の異なる標識された核酸を含有し、該核酸プローブのそれぞれが少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする（１）に記載のプローブを提供する。
【０００８】
（３）前記核酸プローブが、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする（１）に記載のプローブを提供する。
【０００９】
（４）前記核酸プローブが、少なくとも約２０００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする（３）に記載のプローブを提供する。
【００１０】
（５）該標的核酸がＤＮＡ，ＲＮＡ，ｍＲＮＡからなる群の中から選択されることを特徴とする（１）に記載のプローブを提供する。
【００１１】
（６）該標的核酸がＤＮＡであることを特徴とする（５）に記載のプローブを提供する。
【００１２】
（７）該核酸プローブが１本鎖であることを特徴とする（１）に記載のプローブを提供する。
【００１３】
（８）前記プローブが、標的核酸がその一部となっているゲノムの繰り返し配列にハイブリダイゼーションする、ブロッキング核酸配列を必然的に含んでいないことを特徴とする（１）に記載のプローブを提供する。
【００１４】
（９）前記核酸プローブが、蛍光色素応答性ラベル、蛍光色素、発色性化学物質、複合タンパク質、抗体、抗原、およびその混合物からなる群から選択される標識ラベルで標識されていることを特徴とする（１）に記載のプローブを提供する。
【００１５】
（１０）前記核酸プローブが、蛍光色素応答性ラベルで標識されていることを特徴とする（９）に記載のプローブを提供する。
【００１６】
（１１）前記プローブと該標識配列と相補的な配列とが、少なくとも約８０％の相同性を有することを特徴とする（１）に記載のプローブを提供する。
【００１７】
（１２）前記プローブが、該標的配列に相補性であることを特徴とする（１１）に記載のプローブを提供する。
【００１８】
（１３）標的核酸配列および該標的配列の少なくとも一部にハイブリダイゼーションする核酸プローブを含有する反応溶液を調製し、前記プローブの該標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを引き起こす段階を含むハイブリダイゼーション方法において、既知の配列の標的核酸中のシングルコピーと導出された配列にハイブリダイズする標識されたシングルコピー核酸を、前記プローブとして使用し、核酸プローブが少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有するすることを含むことを特徴とするハイブリダイゼーションの改良方法を提供する。
【００１９】
（１４）前記プローブが、該標的核酸の各々がシングルコピーであると推論される配列間隔にハイブリダイズする、複数の互いに異なる標識された核酸を含有し、該核酸プローブのそれぞれが、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２０】
（１５）前記核酸プローブが、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２１】
（１６）前記核酸プローブが少なくとも約２０００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする（１５）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２２】
（１７）該標的核酸がＤＮＡ，ＲＮＡ，ｍＲＮＡからなる群の中から選択されることを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２３】
（１８）該標的核酸がＤＮＡであることを特徴とする（１７）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２４】
（１９）前記核酸プローブが１本鎖であることを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２５】
（２０）前記プローブが、標的核酸がその一部となっているゲノムの繰り返し配列にハイブリダイゼーションする、ブロッキング核酸配列を必然的に含んでいないことを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２６】
（２１）該核酸プローブが、蛍光色素応答性ラベル、蛍光色素、発色性化学物質、複合タンパク質、抗体、抗原、およびその混合物からなる群から選択される標識ラベルで標識されていることを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２７】
（２２）前記核酸プローブが、蛍光色素応答性ラベルで標識されていることを特徴とする（２１）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２８】
（２３）前記ハイブリダイゼーション方法が、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、核酸が固定されているその他の方法からなる群から選択されることを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００２９】
（２４）前記プローブと該標識配列の一部である配列に、少なくとも約８０％の相同性を有することを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００３０】
（２５）前記プローブが、該標的配列に相補性であることを特徴とする請求項２４に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００３１】
（２６）ゲノムの一部を形成している標的核酸配列に対するハイブリダイゼーションプローブを作製する方法であり、前記方法が、該標的配列の少なくとも１つのシングルコピーである配列のシークエンスを決定し、かつ該シングルコピー配列の少なくとも一部に、ハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブを構築する段階を含んでいることを特徴とするプローブ作製方法を提供する。
【００３２】
（２７）該標的核酸配列のシークエンスを決定し、該ゲノム中に見られる繰り返し配列を決定し、 および前記の少なくとも１つのシングルコピー配列のシークエンスを決定するために、該標的核酸配列と繰り返し配列のシークエンスを比較する段階を含むことを特徴とする（２６）に記載のプローブ作製方法を提供する。
【００３３】
（２８）前記プローブ作製方法が、該シングルコピーである配列の少なくとも一部を取得し、かつ該シングルコピー配列の一部を精製する段階を含むことを特徴とする（２６）に記載のプローブ作製方法を提供する。
【００３４】
（２９）前記精製方法が、ＰＣＲの実行を含むことを特徴とする（２８）に記載のプローブ作製方法を提供する。
【００３５】
（３０）該ハイブリダイゼーションプローブを標識する段階を含んでいることを特徴とする（２６）に記載のプローブ作製方法を提供する。
【００３６】
（３１）該標的核酸配列および前記プローブが、ＤＮＡであることを特徴とする（２６）に記載のプローブ作製方法を提供する。
【００３７】
（３２）前記ハイブリダイゼーションプローブが、該シングルコピー配列と、少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする（２６）に記載のプローブ作製方法を提供する。
【００３８】
（３３）前記ハイブリダイゼーションプローブが、シングルコピーである配列と相補性であることを特徴とする（３２）に記載のプローブ作製方法を提供する。
【００３９】
（３４）配列表の配列番号４２９〜４４６からなる群から選択される１つの配列と、少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とするＤＮＡ配列を提供する。
【００４０】
（３５）前記ＤＮＡ配列が、少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする（３４）に記載のＤＮＡ配列を提供する。
【００４１】
（３６）配列表の配列番号４２９〜４４６および４８０〜６１３からなる群から選ばれることを特徴とするＤＮＡ配列を提供する。
【００４２】
（３７）配列番号４２９で始まり、配列番号４２９〜４４６と４８０〜６１３として同定される配列の近傍の一対を、ＰＣＲプライマーとして使用し合成されたＰＣＲ増幅配列と、少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とするＤＮＡ配列を提供する。
【００４３】
（３８）少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする（３７）に記載のＤＮＡ配列を提供する。
【００４４】
（３９）標識され、シングルコピー核酸と導出されたプローブが、ゲノムと反応し、する段階を含み、プローブのハイブリダイゼーションを引き起こし、かつ、もしプローブがゲノムの互いに異なる３つ以上の部位とハイブリダイズするならば、新規な繰り返し配列であると決定できる、ゲノム中の未知の繰り返し配列の存在を同定する方法を提供する。
【００４５】
（４０）プローブが１０ヶ所以上の部位とハイブリダイズするならば、新規な繰り返し配列であると決定できる段階を含むことを特徴とする（３９）に記載の同定方法を提供する。
【００４６】
（４１）前記核酸が、２倍化または３倍化した配列部分に由来することを特徴とする（１）に記載のプローブを提供する。
【００４７】
（４２）２倍化または３倍化した配列領域にハイブリダイゼーションするシングルコピーである核酸を選択する段階を含むことを特徴とする（１３）に記載のハイブリダイゼーション方法を提供する。
【００４８】
（４３）前記決定段階が、２倍化または３倍化した配列領域からのシングルコピーである配列を選択する段階を含んでいることを特徴とする（２６）に記載のプローブ作製方法を提供する。
【００４９】
（４４）次に示される段階を含む染色体の切断点を同定する方法を提供する：  既知配列であり、それぞれ該切断点の両側にハイブリダイゼーションするように設計された、互いに異なり、標識されたシングルコピーである１対の核酸プローブを提供し；
該一対のプローブが、該切断点を含む染色体の標的配列と反応して、プローブの標的配列とのハイブリダイゼーションを引き起こし、
該切断部位を決定する手段として、前記のハイブリダイゼーションしたプローブを同定する。
【００５０】
（４５）該切断点の片側にハイブリダイズするように設計された、既知の配列に対する複数の互いに異なり、標識されたシングルコピーである核酸プローブを提供し、該切断点のもう一方にハイブリダイズするように設計された、既知の配列に対する複数の互いに異なり、標識されたシングルコピーである核酸プローブを提供することを特徴とする（４４）に記載の染色体切断点の同定方法を提供する。
【００５１】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、遺伝病や腫瘍の検出に有効な核酸（例えば、ＤＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブに関する。本発明のプローブは、標的配列へのハイブリダイゼーションを検出できる、標識した核酸断片または標識した核酸断片の集合体を形成している。本発明は、上記のプローブの設計、作製および標識する方法、ならびにそのプローブの使用方法に関する。
【００５２】
本発明の標識されたプローブは、繰り返し配列を含んでいるかもしれない、どのような標的核酸にも使用することが可能である。このような標的核酸としては、転写産物と一体化した構成要素として繰り返し配列を有する染色体または精製された核のＤＮＡ、ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。後述の本発明の詳細な説明の中で、ＤＮＡ標的配列やＤＮＡプローブの使用例が述べられている；しかし、この技術に精通した人であれば、（標的配列及びプローブの性質に従って、認識される技術が異なるだけで）これ以外の核酸にも、同様にして応用することができると解釈するであろう。
【００５３】
本発明のプローブの重要な特徴としては、目的となる標的ＤＮＡ領域の少なくとも一部に相補的で、かつ標的領域がその一部であるゲノムの繰り返し配列に相補的な配列が全くない、“シングルコピー” または“特有の” ＤＮＡ配列を有していることである。したがって、シングルコピーまたは特有の配列から作製された本発明のプローブは、対応するゲノム内の一つしかない配列と相補的である。
【００５４】
ごく最近になって、ヒトゲノムには、互いが対立遺伝子ではない２倍化したデュープリコンや、ゲノム中に３つのコピーが存在するトリプリコン呼ばれる高度に類似した領域があることが明らかとなった。そのような配列を含んだ染色体領域のデュープリコンやトリプリコンは、ヒト以外の霊長類の中には、これらの配列を複数保有していないものもいることや、遺伝子重複により生じた配列のそれぞれの間で、非常に相同性が高いことから、近年の進化で発生したものである。コピー数の少ないデュープリコン（またはトリプリコン）は、ゲノム全体にわたり散在したり、同一の染色体の中で連続して何百、何千も重複している従来の繰り返し配列ファミリーとは区別される；それ故、デュープリコンやトリプリコン由来のプローブは、“シングルコピー” プローブの範疇にあるとみなされ、本発明の目的の範囲内である。
【００５５】
このようなデュープリコンやトリプリコンは、非常に近年になって進化したため、ゲノム領域全体の配列や構成は（−複雑でほぼシングルコピー部分や、既知の繰り返し配列ファミリーと近縁なものを含む−）、それぞれのデュープリコンやトリプリコンで完全に保存されている。数ｋｂからｍｂの長さを有するデュープリコンやトリプリコンが、報告されている（国際ゲノム配列機構、Ｎａｔｕｒｅ， ４０９：８６０−９２２（２００１））。デュープリコン／トリプリコンは、しばしば縦列して並んでおり、ほとんど常に同一の染色体上に存在し、ゲノム中で塊を形成している。プローブ配列を分断している間隔は、デュープリコン／トリプリコン領域の大きさ、相互と関連したデュープリコン（またはトリプリコン）の方向（即ち、順行または逆向き）、およびどんな長さにせよ、デュープリコンまたはトリプリコンを分断しているそれ以外の配列の長さに規定される。
【００５６】
本発明の中で、核酸配列と関連して“シングルコピー” という用語は、厳密には独特な配列をさす（即ち、対応するゲノム中の１つおよびたった１つの配列と相補的である）が、デュープリコンやトリプリコンもこれに含まれることにする。後述の通り、好ましい態様における“シングルコピー” プローブは、ゲノムの３つまたはそれよりも少ない部位にハイブリダイゼーションするものである。
【００５７】
本発明で言うところの“繰り返し配列”とは、標的ＤＮＡがその一部であるゲノムに何度も現れる配列のことであり、それぞれの配列の間で少なくとも約６０％の相同性がある、より好ましくは、少なくとも約８０％の相同性がある配列のことである。この範囲であれば、繰り返し配列は十分な長さをもち、標的ＤＮＡに対する、プローブの望ましいハイブリダイゼーションを阻害するような性質をもつ（すなわち、プローブは繰り返し配列の複数のコピーとハイブリダイゼーションするということである）。概して、繰り返し配列はゲノム中に少なくとも約１０回（好ましくは少なくとも約５０回、より好ましくは少なくとも約２００回）現れ、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの長さがあることである。繰り返し配列には多様性（例えば、縦列、散在性、パリンドローム、または繰り返し配列を、標的核酸中のいくつかのコピーやゲノム中の何処かと、共有している状態）があり、染色体のセントロメアの近くにあったり、１つの染色体の全体、あるいは２つ以上または全染色体にわたり分散している。通常、いくつかの例外を除き、繰り返し配列は、生理的に機能するタンパク質を発現しない。
【００５８】
繰り返し配列は、２倍体ゲノムに複数存在するコピー中で発生する。コピー数は、少なくとも約１０〜数万単位までおよび、その中でも繰り返しＤＮＡのＡｌｕファミリーは、後者の数万コピーに及ぶ多様性のあるファミリーの典型例である。繰り返しのあるコピーは、塊状になっていたり、ゲノム全体に渡り散在している。繰り返し配列は、ゲノム中の１つまたは２つ以上の部位で塊状になっているが、例えば、各染色体のセントロメアの近くに生じた繰り返し配列や様々な数を有する縦列配列（ＶＮＴＲｓ）が挙げられる（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１６１６（１９８７））；繰り返し配列は，１つの染色体全体にわたり分散していることもあり、例えば、Ｂａｒｄｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，４６：５７５（１９８７））で述べられているように、Ｘ染色体上にだけ見られる繰り返し配列もある；例えば、Ａｌｕファミリーの繰り返し配列のように、全ての染色体にわたり分散している繰り返し配列もある。
【００５９】
それ程複雑ではない繰り返し配列は、遺伝子の中に見られるが、遺伝子をコードしていない配列にも共通して見られる。そのような繰り返し部分は、縦列単位に位置するモノ、ジ、トリ、テトラまたはペンタヌクレオチドのコア配列からなる。このような繰り返し配列を有する縦列要素の数は、異なる個体のゲノムの同一部位でも多様性がある。こうした繰り返しは、ゲノム配列中のコア配列要素の連続した並びを検索することで、見つけることができる。
【００６０】
本発明で言うところの“配列の相同性”とは、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち、対照となる配列とその配列と比較した目的の配列との関係に関するものである。配列の相同性は、目的の配列と対照となる配列を、最も配列間の類似の程度が高くなるように至適に調整した後で、両者を比較して決定される、つまり両配列間の一致の程度によって決めることができる。そうした並べ替えにあたっては、個々の位置を基にして配列の相同性を確かめることができる、例えば、ある特定の位置でヌクレオチドが同一であれば、配列はその位置で“相同的”である。そして、そのような位置相同性の合計数を、対照配列中のヌクレオチドまたは部分配列の合計数で割り算して、配列相同性（％）を求めることができる。配列相同性は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｌｅｓｋ  Ａ．Ｎ．著，ＥＤ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ」，Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｗ．著，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，ＰａｒｔＩＩＩ」、Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａ．Ｍ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｈ．Ｇ．著，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｇｅ  Ｇ．著，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．著，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏ  Ｈ．，Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｌｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているものを含め、公知の方法により迅速に計算することができるが、これらの方法に限定されるものではない。配列の相同性を決定する、より好ましい方法としては、検索した配列間で最も高い一致性を与えるような方法である。配列相同性を決める方法としては、特定の配列間の相同性を決定してくれる、上市されたコンピュータープログラムの類である。そのようなプログラムの一例としては、ＧＣＧ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．，１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩやその他（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））から提供されているものも、広く利用することができる。これらのプログラムは、特定の配列と対照配列との配列相同性を、最も高く算出できるように、デフォルトのギャップ荷重を使���して、至適に両配列を並べ替えることができる。例えば、対照配列との“相同性”が、少なくとも９５％ある、ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドに例示されるように、目的のヌクレオチドは、対照のヌクレオチドの１００塩基につき、多くとも５塩基しか違いがない点を除いては、対照の配列と同一である。言い換えれば、対照配列に対して少なくとも９５％相同性があるヌクレオチドを有するポリヌクレオチドにおいては、対照配列のヌクレオチドの５％までは欠失しているか、他の塩基に置き換わっている、その他、対照配列の全塩基の５％までは、ヌクレオチドの挿入が起こっている可能性もある。どちらかの配列の逆位は、相同的な試験配列のアンチセンスに対する、対照配列の類似性に基づき、コンピュータープログラムで検出することができる。このような対照配列の多様性は、対照となるヌクレオチド配列の３’または５’末端や、その末端で挟まれた配列、また対照配列のヌクレオチドで独立して、または参照配列内の一群または２つ以上の連続したグループ内に散在しているどんな部分にでも起こる可能性がある。
【００６１】
本発明のシングルコピープローブは、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さがあることが好ましい、より好ましくは、少なくとも約１００ヌクレオチドである。この範囲であれば、本発明のプローブは、サザンブロッティングを行うのに十分であるからである。しかし、ＦＩＳＨのような他の分析も行うのであれば、プローブはもう少し長いほうがよい、すなわち、少なくとも５００ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２０００ヌクレオチドの長さである。このようなプローブであれば、欠失、重複、挿入、付加、逆位または転座といった、事実上、どんな種類の染色体再編成を検出するのにも使用することができる。
【００６２】
本発明に従ってプローブを設計するためには、標的ＤＮＡ領域の配列が、公知である必要がある。標的領域は、染色体全体である場合も、その部分で再編成が同定された一部分である場合もある。こうした配列の知見があれば、標的領域内にある、シングルコピーまたは特有の配列の境界領域を決定する目的に用いることができる。このような結果は、好ましくは標的領域内の繰り返し配列がある部位から推論することにより得ることができる。通常、コンピューターソフトウェアを利用して、標的領域の配列を、対応するゲノム由来の既知の繰り返し配列と比較する。標的領域内に繰り返し配列が同定されると、その間に介在する配列（すなわち、前後にある繰り返し配列の間に存在する配列）は、シングルコピーであると推測される。
【００６３】
標的配列と繰り返し配列とを比較するための最適な並べ替えは、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所的な相同性検索法、 またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ４８：４４３（１９７０）の相同的並べ替え検索法により行うことができる。人間の目による検索手法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４（１９８８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０（１９９０））から得られた結果は、一般的にＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）やＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）の手法ほど、総括的なものではない。
【００６４】
一度シングルコピー配列の情報が得られると、シングルコピー配列のいくつか（普通は最も長いもの）が、ハイブリダイゼーションプローブを作製するために使用される。この点で、本発明のプローブは、Ｂｒｉｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２９：３６３（１９７４）で定義されたり、Ｃａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＰａｒｔＩＩＩ：Ｔｈｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｐｐ．１２２８−１２３０でも説明されているように、様々な“複雑性”があるのかもしれない。選択したプローブの複雑性は、応用するための（プローブの）設計方法に依存する。概して、標的範囲が大きくなればなるほど、プローブの複雑性も大きくなる。ハイブリダイゼーションの感度が高くなるにつれて、一連の配列を検出するために必要とされる、プローブの複雑性は小さくなる。高感度でかつバックグランドが低いほど、より小さくて複雑性の小さいプローブを使用できる。
【００６５】
従来のハイブリダイゼーションの技術を使用して、本発明に従った比較的小さいプローブで、再現性があり、容易に検出できるシグナルを得ることができる。ＦＩＳＨを用い、２ｋｂオーダーのプローブを使用して、簡便に検出できるシグナルを得た。本発明のプローブは、相同的なシングルコピー配列であるので、本発明の手法の感度は、先行技術（米国特許５７４６６９６号明細書）と比較して、向上している。しかし、それぞれが非繰り返し配列を含んでいる、比較的小さい増幅部分でも、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの正しいシグナルを得るためのプローブとして、組み合わせて使用することも可能である。２ヶ所または３ヶ所存在する標的にハイブリダイゼーションする、組み合わせて使用したシングルコピープローブは、ハイブリダイゼーションのシグナルを強くすることもある。
【００６６】
複数の断片化プローブを使用する応用方法の一例としては、異なる染色体間の転座を検出することにある。プローブの複雑性が増加するにつれて、ゲノムの複数のまとまった領域を、同時に解析することも可能である。１つの染色体に関して、融合または転座のある染色体は、１つの標識で検出され、両方の標識を有する変異のない正常な染色体と区別することができるので、切断点の一方を標的としたプローブの位置は、切断点のもう一方を標的としたそれと、互いに別々に標識し、検出することができる。
【００６７】
本発明では、従来のプローブよりもゲノム密度の高い、シングルコピープローブを作製するのが可能である。第２１および２２番染色体全体がシークエンスされ、シングルコピーである配列が、これらの染色体上に集中する傾向があることが明らかとなった。例えば、第２２番染色体では、シングルコピー配列の３９％が、たった５００〜１０００ｂｐの配列で分断されている。また、２．３ｋｂ以上のシングルコピー配列は、平均して、第２１番染色体では２９．２ｋｂ、第２２番染色体では２２．３ｋｂの配列で分断されている。
【００６８】
シングルコピープローブを作製するのに必要なゲノム配列の大きさを推定するために、染色体２１ｑおよび２２ｑ上の、重複のあり一定の長さをもつ、少なくとも１つのシングルコピー配列を検出できることが明らかとなった。２．０ｋｂ以上の長さをもつシングルコピー部分は、これらの染色体の１００ｋｂのゲノム配列の大部分（染色体２２ｑでは９６％、染色体２１ｑでは８８％の領域）に存在する。それ故、シングルコピープローブを、第２１および２２番染色体の全体に包括的に適用するために、多かれ少なかれ２ｋｂ（少なくとも１００〜１５０ｋｂに１つ）のシングルコピー配列である方がよい。シングルコピー配列が他の染色体でも同様に分布していると仮定すれば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、臨床的に非常に重要な染色体の再編成を解析するプローブを開発することが可能である。
【００６９】
一旦、目的の染色体領域中に適切なシングルコピー配列が同定されれば、適切なＤＮＡを増幅してプローブを得るために、ＰＣＲを利用するのが好ましい。ＰＣＲは、幾何級数的に特異的なＤＮＡ断片を増幅する非常に有名な技術で、増幅されるＤＮＡ断片の５’末端とその相補鎖の３’末端と相同性のある１対のオリゴヌクレオチドのプライマーを基にして、ＤＮＡポリメラーゼの伸張反応の繰り返しを原理とする。
【００７０】
ＰＣＲの鋳型として用いる核酸（例えば、ＤＮＡ）は、一本鎖、または二本鎖であるが、ＤＮＡが一本鎖である時には、二本鎖に変換するのが一般的である。鋳型ＤＮＡの長さは、５０ｂｐ位短いこともあるが、普通は少なくとも約１００ｂｐ、もっと一般的には少なくとも約１５０ｂｐの長さがあり、１００００ｂｐやそれ以上のこともあるが、多くの場合、５００００ｂｐを超えることはなく、２００００ｂｐを超えることもまれである。ＤＮＡは可溶で、一端または両末端が鋳型ではないＤＮＡになっていて、ＤＮＡがプライマー伸張反応に関与できる条件でのみ、プラスミドやそのようなクローニングベクター中に存在している。標的染色体ＤＮＡ配列または固定されたＤＮＡに相補的である限り、鋳型ＤＮＡは、様々な異なる起源に由来することもある。他の試薬と組み合わせた場合、鋳型ＤＮＡの量は、約１分子から１ｐｍｏｌまでのことが多く、たいていは約５０分子から０．１ｐｍｏｌまで、より多くの場合０．０１ｐｍｏｌから１００ｆｍｏｌまでである。鋳型の核酸と接触しているオリゴヌクレオチドプライマーは、アニーリングする条件下では、相補的な鋳型ＤＮＡとハイブリダイゼーションするのに十分な長さがあるが、伸張反応の条件では、鋳型ＤＮＡと安定した二重鎖を形成するのには、十分な長さではない。プライマーは、一般的に少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さがあり、普通は少なくとも１５ｎｔ、より多くの場合、少なくとも約１６ｎｔの長さがあり、３０ｎｔ前後またはそれ以上の長さがあることもある、その中でも、プライマーの長さは、一般的に１８〜５０ｎｔの長さであり、普通は約２０〜３５ｎｔの長さである。（米国特許５４３６１４９号明細書で記載されているように）３０〜３５ｎｔのプライマーおよび正確性の高いＤＮＡポリメラーゼを使用することで、比較的長い増幅産物の収率を上げることができる。
【００７１】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで得られるシグナルの強さを最大化するために、増幅の段階で、それぞれシングルコピーゲノム配列のほぼ全長のＤＮＡ断片を作り出す１対のプライマーが好ましい。それ故、連続した、または短い介在配列のある（ソフトウェアは、シングルコピー部分の７０％以下の長さで分断されたプライマーペアを排除する）プライマーペアは、一般的に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのプローブを作製するとは考えられていない。細胞遺伝学的な調製方法の例外に関して、一般的に、この条件は固定化、クローン化または合成核酸である標的にハイブリダイズするプロ−ブには当てはまらない。なぜなら、比較的短いプローブのシグナルの強さは、普通、標的分子の数が増加するに従い、強くなるからである。
【００７２】
しかし、ＰＣＲ反応での収率や反応速度を最適化するために、好ましいプライマーの配列は、この他の条件も満たした方が良い。まず、プライマーの配列は、実質的にプライマー中で相補的であったり、もう１つのプライマーと相補的であってはならない。特に、プライマーの３’末端と同じプライマーまたはもう一つのプライマー内のほかの配列が関与する安定したヘテロな二重鎖（６塩基対以上が関与するもの）の形成につながる潜在的なプライマー配列は排除した方がよい。さらに、一対のプライマーの１つのＴｍは、もう一方のプライマーとの差が、２℃以内であったほうがよい。それにより、ほぼ同時に変性したり、アニーリングしたりするのが可能となる。全ての好ましい条件を満たすプライマー配列を同定する技術分野において、有名なコンピューターソフトウェアもある（例えば：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｍｅｒ．０．５またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏ．ｎｅｔ／Ｏｌｉｇｏ＿６＿ｔｏｕｒ．ｈｔｍ等である）。
【００７３】
ＰＣＲ反応溶液は、通常さらに一価のイオン群、二価の陽イオン群および緩衝液を含むことができる。汎用されている一価のイオンとしては、塩化カリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等が挙げられ、溶液中に存在する一価のイオンの量の典型例としては、導電性能を発揮する約５００〜２００００、普通は約１０００〜１００００、より多くの場合は３０００〜６０００μΩの範囲の十分な量があればよい。二価の陽イオンとしては、マグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。典型的な陽イオンとしては、マグネシウムイオンである。汎用されるマグネシウムイオンとしては、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等である。緩衝液中に存在するマグネシウムイオンの濃度としては、 ０．５〜１０ｍＭの範囲でも可能だが、好ましくは約２〜４ｍＭ、より好ましくは、約２．２５〜２．７５ｍＭ、理想的には２．４５ｍＭである。緩衝液中に入っている可能性のある代表的な緩衝液の組成または塩としては、Ｔｒｉｓ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等が挙げられ、緩衝液の組成物の濃度は、典型的には、約５〜１５０ｍＭ、普通は約１０〜１００ｍＭ、より多くの場合は約２０〜５０ｍＭの範囲である。そのような好ましい態様の中でも、緩衝液の各成分は、ｐＨが約６． ０〜９．５の範囲になるのに、十分な量である、非常に好ましくは、７２℃でｐＨ７．３である。緩衝液中に存在している可能性のある他の試薬としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のようなキレート剤が含まれる。
【００７４】
ＰＣＲ反応溶液中にも存在し、融解温度を下げる成分もある、すなわち、ＤＮＡの融解温度を低下させる試薬である。融解温度を下げるのにふさわしい成分としては、２つのヌクレオチドの水素結合での相互作用を、阻害するような成分である。その中でも代表的な塩基対不安定化成分としては、ビタミン、フォルムアミド、尿素、硫化尿素、アセトアミド、メチルウレア、グリシンアミド等を含む、そのような中でも、ビタミンが好ましい。融解温度を下げる成分は、典型的には約２０〜５００ｍＭの範囲の濃度にあり、普通は約５０〜２００ｍＭ、より多くの場合は約８０〜１５０ｍＭの範囲である。
【００７５】
ＰＣＲの反応溶液を調製する時には、様々な組成の成分は、都合のよい濃度で組合わせてもよい。例えば、緩衝液には、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび鋳型ＤＮＡが入っていてもよいし、またはさまざまな組成の成分のすべてを、同時に入れて、反応溶液にしてもよい。
【００７６】
ＰＣＲの反応溶液の調製の後に、反応溶液は多様な反応サイクルを適用される。それぞれの反応サイクルは、： （１）変性段階、（２）アニーリング段階、および（３）ポリメラーゼ反応段階を含んでいる。反応サイクルの回数は、行う反応に合わせて、変化させることができるが、普通は少なくとも１５サイクル、より多くの場合は少なくとも２０サイクルであり、６０回前後やそれ以上のこともある。そのような様々な反応回数の中でも、典型的には約２０〜４０回の範囲である。約２０回以上、普通約３０回以上の方法については、酵素反応によるプライマー伸長に適した条件が維持されるように、反応溶液中にＤＮＡポリメラーゼを追加するのが便利、または好ましいこともある。
【００７７】
変性段階は、反応溶液を上昇した温度まで加熱し、反応溶液中に存在している、すべての二重鎖またはハイブリダイズした核酸が解離するのに十分な時間、その温度で維持する過程を含んでいる。変性するに当たって、反応溶液の温度を、約８５〜１００℃、普通は約９０〜９８℃、より多くの場合は約９３〜９６℃の範囲に上げて、その温度に約３〜１２０秒、普通は約５〜３０秒間維持する。
【００７８】
変性に続いて、ＰＣＲ反応溶液は、溶液中に存在している鋳型ＤＮＡとプライマーアニーリングするのに、十分な条件下に置かれる。このような条件になるように、反応溶液の温度は下げられ、至適な効率や特異性が達成されるような温度が、多くの場合選択される、そして一般的には、約５０〜７５℃、普通は５５〜７０℃、より多くの場合は６０〜６８℃の温度範囲である。アニーリングの条件は、約１５秒〜３０分、普通は約３０秒〜５分の範囲の時間に保持される。
【００７９】
プライマーのＤＮＡとのアニーリングの後、またはその間中、反応溶液は、プライマーは、鋳型としてハイブリダイゼーションしたＤＮＡを利用して、５’から３’方向に伸長されるような形態で、プライマー末端のヌクレオチドのポリメラーゼ反応を行うのに、十分な条件にある、すなわち、プライマー伸長反応産物の酵素的な産生に、十分な条件下にある。ポリメラーゼ反応の条件を作り出すのに、反応溶液の温度は、典型的には、約６５〜７５℃、普通は約６７〜７３℃の温度まで上げられ、約１５秒〜２０分間、普通は約３０秒〜５分間の範囲で保持される。
【００８０】
前記変性、アニーリングおよびポリメラーゼ反応のサイクルは、一般にはサーマルサイクラーとして知られている、自動化した機械を使用して行われる。使用することができるサーマルサイクラーとしては、米国特許５６１２２４３；５６０２７５６；５５３８８７１および５４７５６１０号明細書に記載されたものが挙げられる。
【００８１】
上記の全ての条件に基づいて、一連のプライマーが作製され、正常な個体のゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲにより検証される。適切なプライマーに関する知見は、必然的に本発明に対応したＰＣＲ産生プロ−ブの範囲を明確にする。このように、配列表の配列番号４２９で始まり、配列番号４２９〜４４６および４８０〜６１３として同定された、後述の一対の配列は、特異的で有用なプローブを調製するのに作製された、それぞれｆｏｒｗａｒｄとｒｅｖｅｒｓｅのＰＣＲプライマーである。それ故、ある有用なプローブは、配列番号４２９および４３０を組み合わせることにより調製することができ、その他のプローブは、その配列番号の続きにある一対によって、確定される。包括的に言うと、本発明の特定の好ましいプローブとは、前記に詳述した、連続したプライマー配列の一対によって規定されたプローブに対して、少なくとも８０％の相同性があるもので、好ましくは少なくとも約９０％の相同性があるものである。
【００８２】
ＰＣＲのほかに、特有の配列に対応するＤＮＡ断片は、ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ 、制限酵素反応、核酸合成およびＤＮＡライゲーションを含め、他の様々な方法によって得ることができるが、これらの方法に限定されない。
【００８３】
仮に、ゲノムＤＮＡ断片が、繰り返し配列を含むＤＮＡから増幅反応または精製により得られたら、その断片は、標識付加やハイブリダイゼーションの前に精製しておく必要がある。同一の大きさをもつＤＮＡ断片の精製は、電気泳動、高速液体クロマトグラフィーを含め、様々な方法により得ることができるが、これらの方法に限定されるものではない。好ましい方法において、増幅された断片は、トリス酢酸バッファーを使用して、シーケンＬＥアガロースゲルの中で、ゲル電気泳動により分子量に従って分離される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ， １９８９］）、次にエチジウムブロマイドまたはサイバーグリーンのような色素で染色し、紫外線（３００ｎｍ）で可視化し、メスを使ってゲルから切り出す。そしてＤＮＡ断片は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）を使用し，遠心によりゲル断片から回収される。
【００８４】
増幅されたＤＮＡのフェノール・クロロフォルム抽出は、精製するのに適切な方法ではない。この方法を行ってはみたが、この精製法では、全ての染色体の、その全長にわたり非特異的なハイブリダイゼーションがみられ、それは繰り返し配列のハイブリダイゼーションにより観察される像と一致している（図、省略）。なぜなら、もし、一番最初の鋳型が、ゲノムＤＮＡ配列を含んでいるのであれば、ＰＣＲ反応の間、ＤＮＡポリメラーゼは、もう一方のプライマーを通り越して、その後ろにある繰り返し配列に向かって、複製された鎖を伸長していくからである。増幅される産物よりも長い、このような伸長産物は、そのようなＰＣＲ反応中、存在している。本発明の方法では、繰り返し配列が増幅される領域の後ろにあるので、伸長産物はそうした配列を含んでしまうと考えられる。ＰＣＲ反応溶液のフェノール・ クロロフォルム抽出では、そのような伸長産物を除去できない。こうしたシークエンスを含んでいるＰＣＲ反応溶液は、標的配列のほかに、繰り返しゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションしてしまうかもしれない。それ故、精製したゲノム増幅断片の単離は、（ゲノムＤＮＡから直接に得られたり、ＰＣＲにより得るにせよ）本発明いｎ付随した好ましい態様であり、この分野の技術に熟知した人が容易に想像するものではない。
【００８５】
精製した断片を、大腸菌、酵母、他の種の中で増殖できるプラスミド、バクテリオファージ、または人工的な染色体クローニングベクターへ挿入しておくと、シングルコピーＤＮＡプローブを、繰り返し調製するのに必要なコスト労力を減らすことも可能である。様々なクローニングベクターは、ＰＣＲ産物を含んでいるベクターへの迅速なライゲーションや選択に、最適化されてきた（例えば、米国特許５４８７９９３および５７６６８９１号明細書参照）。もし、プローブが様々なハイブリダイゼーションに使用されるのであれば、クローン化されたリコンビナントは、同一のゲノムである鋳型ＤＮＡから、何度もＰＣＲで増幅するよりも、多量な産物を生み出すのには、安価である。さらに、クローン化されたプローブ中にゲノムを挿入しておけば、精製の過程で単離する必要がない。何故なら、ベクターと結合したＤＮＡ断片は、繰り返し配列を含んでいる可能性のある、他のどのようなゲノムＤＮＡもない状態で、増殖するからである。最後に、クローン化されたベクターは、無尽蔵なプローブ源を提供するのに等しい、しかし、ネイティブなゲノムＤＮＡを鋳型とすると、培養細胞または他のものから、単離し直さなければならないかもしれない。前記の通り、ＰＣＲ増幅で得られたシングルコピーＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動により分子量に従って単離したり、子の技術分野で既知のようにカラムで精製される。
【００８６】
その後で、これらの断片は、蛍光体、酵素との共有結合、またはビオチン、およびアビヂン、ストレプトアビヂン、および特異的な抗体によって認識されるそれ以外のものからなる群から選択される１つのような、非放射性の同定ラベルで標識される。非放射性の同定ラベルには、いくつかのタイプがある。１つは、化学的にプローブと結合したラベルであり、プローブを同定したり、局在化を調べる直接的な手段となる。こうしたタイプの例としては、それに適した波長の光を照射すると、高エネルギー状態に励起され、蛍光を放射するような蛍光色素の類である。プローブは、化学的に合成することができ、またはｄＡＴＰまたはｄＵＴＰのようなヌクレオチドに共有結合し、同定選択ラベルを含有する反応試薬を使用した従来からの方法の中で、ニックトランスレーション（Ｒｉｇｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ１１３：２３７−２５１，（１９７７））またはクレノウ標識（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ１３７：２６６−２６７，（１９８４））のような方法を用いて調製するのが好ましい（しかし、このような方法に限定されるものではない）。ＤＮＡ断片は、蛍光タグをもつヌクレオチドで直接標識したり、後に詳述するように、ＤＮＡ断片の中に組込まれた修飾核酸を認識する、蛍光標識された抗体と結合させて、二重標識して間接的にラベルすることができる。ニックトランスレーション（１００μｌ反応スケール）では、エンドヌクレアーゼを含有していないＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）およびＤＮａｓｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）を使用する。それぞれの断片は，ＤＮＡポリメラーゼ（２０ｕｎｉｔｓ／ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ＤＮＡ）、ＤＮａｓｅＩ（１０ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／１００μｌ反応溶液）、標識されたヌクレオチド（最終濃度で０．０５ｍＭ）およびニックトランスレーション緩衝溶液と一緒になっている。反応は、１５℃で４５分から２時間行い、１００〜５００ｂｐの範囲で、様々な異なる大きさの標識プローブ断片を得る。
【００８７】
一般的に使われている、他のプローブの標識方法や検出方法も、本発明の方法により作製されたシングルコピーＤＮＡプローブに適用できることもある。これらの方法は、次のようなものを含んでいる：蛍光色素標識（ハイブリダイゼーションが間違いなく起こったという確認として用いられ、そしてさらに、いくらか距離があるというよりも、ハイブリダイゼーションの部位を正確に検出できる個々の染色分体上の標識を決定する）、適切な反応物と組み合わされた時、識別できるような変化を起こす化学薬品（例えば、アルカリフォスファターゼ、からしのペルオキシダーゼおよびガラクトシダーゼが挙げられ、それぞれ反応して、標的配列の存在とその位置を、色の変化で検出できる。）、および（従来からの方法に従い、プローブがビオチンに適切に結合し、そしてプローブに蛍光色素または酵素を繋げて特異性を付与する、アビヂンまたはストレプトアビヂンが共有結合した蛍光色素または酵素を添加するビオチン−アビヂンシステムのように）特異的に結合している物質を間接的に繋がらせる機構。
【００８８】
その他の同定ラベルが、上述のプローブと共に使用される可能性があることは、当然のことである。同定ラベルは、エネルギー転移基、複合タンパク質、抗体・抗原、または放射性同位体のような、蛍光性混合物を含んでいる。
【００８９】
染色体へのハイブリダイゼーションや検出は、本発明により作製されたＤＮＡプローブの好ましい使用法である。本発明の方法により作製されたＤＮＡプローブは、（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで）細胞中の相補的な核酸や、基質上に固定された核酸と直接的にハイブリダイゼーションすることもある。本発明の好ましい使用法としては、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションであり、それはこの分野では公知で、米国特許５９８５５４９；５４４７８４１；５７５６６９６；５８６９２３７号明細書に記載されている。ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅの以前の研究（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ６３：３７８−３８３， １９６９）を基礎にして、放射性物質を使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、１９７０年代に確立され（例示として、Ｇｅｒｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ７８：３７５５−３７５９１９８１およびＨａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ． ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ７８：４４５８−４４６０，１９８１参照）、それに続いて、放射性物質を使用しないｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの技術が確立された。放射性標識を使わないｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの技術は改良され、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，Ｖｏｌ．１，Ｕｎｉｔ４．３，（Ｇｒｅｅｎ−Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）や米国特許５９８５５４９号明細書の中で、ＫｎｏｌｌおよびＬｉｃｈｔｅｒにより、染色体ハイブリダイゼーションに用いられる実験手法が、提供されている。これらの技術は、二本鎖の核酸種の形成に依存し、その片方の鎖は標識されたプローブに由来し、もう一方の鎖は検出される標的を含有している。標的分子は、染色体または細胞由来の核酸を含有していてもよい。本発明のプローブを標識して、二本鎖を視覚化するために、非常に多くの方法が開発された。
【００９０】
本発明の方法は、繰り返し配列を含む、どんな核酸標的にも使用されることが予定されている。標的核酸配列を含んでいる試料は、細胞核、形態的に普通の細胞（または組織）、染色体、その他の細胞成分、または人工的に合成した核酸から調製することができる。そのような試料は、哺乳動物、好ましくは、生体組織検査や術後、または移植患者のいずれかで、病気または異常に苦しんでいる疑いのある人の体液や組織から得ることができる。
【００９１】
一例として、染色体のプレパラートは、次のような方法で作られる：フィトヘマグルチニン刺激した末梢リンパ球を、１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ１６４０培養液で、３７℃で７２時間培養する。その後に、（終濃度で１００μｇ／１０ｍｌになるように）エチジウムブロマイドを、ハーベストの１．５時間前に添加する。エチジウムブロマイドを加えてから、４０分後にコルセミド（１μｇ／１０ｍｌ、終濃度）を添加して培養する。それから、細胞を遠心してペレットの状態にし、３７℃で約２０分間、０．０７５Ｍの塩化カリウム濃度の中で培養するのが好ましい。遠心して、再び細胞をペレットの状態にし、公知の細胞遺伝学的な技法を用いて、カルノー固定液（メタノールと酢酸を３：１の容量比で混合したもの）を、３回変えることで固定する。［末梢赤球からの染色体の調製法については、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，Ｖｏｌ．１，Ｕｎｉｔ４．３，（Ｇｒｅｅｎ−Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）のＤｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌの中のＢａｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｎｌｏｎの項を参照］。溶解した核または細胞を、染色体の伸長を促すように、湿気のある環境で透明なガラス製のカバースライドや顕微鏡用のスライドガラスの上に滴下する。その後で、カバースライドや顕微鏡用のスライドガラスは、一晩風乾したほうが良く、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用されるまで、何年も貯蔵しておくことができる。
【００９２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの過程で、染色体を変性する直前に、乾燥して貯蔵してあった染色体のプレパラートは、あらかじめ温めてあった２×ＳＳＣ（組成はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ， １９８９］に載っている）で、３７℃で３０分間、前処理をし、その後で、一連のエタノール溶液で（７０％，８０％，９０％および１００％エタノール溶液に、それぞれ２分間）、脱水する。
【００９３】
標的核酸配列がＤＮＡであるなら、試料中のＤＮＡは、熱処理やアルカリ溶液で変性することができる。［アルカリ変性およびＧａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ６３：３７０−３８３（１９６９）に関しては、Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ． ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ７８：４４５８−４４６０（１９８１）参照］。ＤＮＡ鎖のシェアリング、デグラデーションまたは酸化が、最小限で済むように分離され、変性が行われる。
【００９４】
現在通用する本発明の好ましい方法では、標識されたシングルコピープローブを、脱イオン化したホルムアミドに再溶解し、７０〜７５℃で変性する。鋳型となる染色体は、２×ＳＳＣ中で７０％となるホルムアミドを含む溶液（ｐＨ７．０）で変性し、その後、一連のエタノール溶液で（冷えた７０％エタノール溶液、室温の８０％、９０％および１００％エタノール溶液で、それぞれ２分間）脱水する。標識したプローブの、その鋳型へのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ／１０％デキストランサルフェイト／ＢＳＡ［牛血清アルブミン；１ｍｇ／ｍｌ終濃度］を含んでいる溶液中で行う。ハイブリダイゼーションの時間は、使用するプローブの複雑さに依存する。ハイブリダイゼーションの後で、ハイブリダイゼーションしていない過剰のプロ−ブは、洗浄過程で除去される。二本鎖を形成しているものについては、１５〜３０分間の洗浄処理を行う：まず始めに、３９〜４５℃の５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ溶液、次に、３９〜４５℃の２×ＳＳＣ溶液、その後で、室温の１×ＳＳＣ溶液で１５〜３０分間行う。ハイブリダイゼーションした配列は、関連性のある手段により検出できる。例えば、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰは、ローダミンや蛍光試薬が共有結合した抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のように、ジゴキシゲニンに対する抗体によって検出することができるが、このような方法に限定されるものではない。擬陽性に検出された反応物を、様々なＳＳＣやＳＳＣ／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ濃度の溶液で洗浄して除去した検出操作の後で、染色体はＤＡＰＩのような色素で対比染色され、ハイブリダイゼーションしているプレパラートを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）のような褪色防止溶液で固定する。細胞は、適当なフィルターを使用して蛍光顕微鏡で観察し、電荷結合素子（ＣＣＤ）で撮影される。
【００９５】
本発明で重要なのは、プローブまたは標的ＤＮＡは、精製した繰り返しＤＮＡのような非特異的な核酸の競争阻害剤と、前もって反応しておく必要がないということ、また、本発明のプローブは、シングルコピー断片、またはリコンビナントのクローン化プローブが、繰り返し配列を含んでいないということを、実験的に証明する必要がないとうことである（米国特許５９８５５４９；５４４７８４１；５６６３３１９；５７５６６９６号明細書参照）。何故なら、本発明のプローブは、繰り返し配列のないシングルコピーだからである。これにより、ノイズに対するシグナル比が、極めて向上するのである。ノイズに対するシグナル比とは、標識したプローブの非特異的な結合により起こる、バックグラウンドを検出する確率に対し、プローブが標的核酸配列のハイブリダイゼーションのシグナルを正しく検出する確率の比として定義される。
【００９６】
本発明のプローブを使用して実施されたハイブリダイゼーション反応自体は、まさしく公知のものである。示唆されたように、ハイブリダイゼーションの２つの典型例は、サザンブロッティングとＦＩＳＨで、この技術分野に精通した人達には公知である。しかし、本発明のプローブを使用して得られる視覚的な像、指標像と言われるものは、細胞遺伝学的解析、とりわけ分子細胞遺伝学的解析に対して、非常に有効な手段である。このような指標像は、正常および異常な染色体の、顕微鏡および／またはフローサイトメトリックによる同定や、ならびに遺伝子異常の特性決定に有効である。プローブを視覚化する、多様で適用範囲の広い方法が利用でき、異なるプローブ成分の結合像は、例えば、色によって区別することができる。このように、本発明の方法は、１つまたは２つ以上の色（複数色による指標像）および／またはその他の指標方法を用いて視覚化された染色体上に、どんな目的の指標像でも具体的に現すことができる。
【００９７】
本発明のプローブを使用して得られる好ましい指標像とは、１つまたは複数の“バンド”を含有しているものであり、ここで言う“バンド”とは、標的ＤＮＡ配列に結合したプローブを有する、その配列を含有しているゲノム中の参照点を意味し、その結果、形成される二重鎖は、何らかの指標により検出することができる。ハイブリダイゼーションでの洗浄処理や検出条件に依存して、１つのバンドは、単一の染色体領域上で再現性のあるシグナルを与える配列の狭い部分から、単一または複数の染色体上にある複数の領域まで、拡張させることができる。このプローブ由来の指標バンドは、前処理および化学染色により観察されるバンドとは区別される。本発明のプローブによるバンドは、ＤＮＡ配列との相補性に基づいているが、化学染色により観察されるバンドは、（構造やタンパク質の構成のような）染色体本来の性質に依存する、しかし、そのＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションによるバンドではそのようなことはない。さらに、化学染色技術は、メタフェーズの染色体との関連でのみ有用であるが、本発明のプローブによるバンドは、メタフェーズでもインターフェーズのいずれの染色体に対しても有効である。
【００９８】
後述の実施例では、ゲノム中の標的ＤＮＡ配列に対してハイブリダイズするように設計された特異的なＤＮＡプローブを、開発、作製、標識および使用するために用いられる好ましい技法を示している。しかし、このような実施例は、写真像により明示され、どの例示も、本発明の全体像の限界としてみなされるものではない。
【００９９】
［実施例］
実施例１、ＨＩＲＡ遺伝子プローブの開発
ヒトの第２２番染色体上の有名な遺伝子の異常は、染色体のバンド２２ｑ１１．２にある、ＨＩＲＡ遺伝子の１つの欠損と関連している、すなわち、正常な個体では、ＨＩＲＡ遺伝子は２つ存在しているが、異常がある個体では、１つしか存在していない。この欠損は、ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏ−Ｆａｃｉａｌ−症候群（ＶＣＦＳ）のような、半欠損症候群の１つの原因であると考えられている。何故なら、遺伝子産物の量が不十分だと、正常な胎児の発達に支障をきたすからである（Ｆｉｂｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４６：８８８−９５（１９９０）；Ｃｏｎｓｅｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，７７：１０２３−１２０５（１９９６））。ネコ眼症候群を含む他の病気や、融合した第２２番染色体に関連した症候群は、この領域由来のゲノム配列が過剰なことに原因がある（Ｍｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，５５：１３４−１４２（１９９４）；Ｋｎｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，５５：２２１−２２４（１９９５））。このような症候群を持つ個体は、典型的に、第２２番染色体の短腕が過剰である。
【０１００】
まず最初に、“ＨＩＲＡ”という用語をもとに、国立医学図書館ウェブサイトにあるＥｎｔｒｅｚ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅソフトウェアを使用して、コンピューターによる検索を実施した。これにより、ＧｅｎＢａｎｋの中に、ＨＩＲＡ遺伝子の一連のｃＤＮＡ配列が同定された。３８５９ｂｐの長さを有するｃＤＮＡの全長（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ８１８４４）を選択した。次に、このｃＤＮＡ配列を、国立医学図書館のＤＲＡＦＴ配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？Ｆ＝ＨｓＢｌａｓｔ．ｈｔｍｌ＆＆ＯＲＧ＝Ｈｓ）を含んでいるゲノム配列と比較した。これは、十分な長さを有するゲノム配列がプローブを作製するのに利用できるかどうかを決定するために行った。このように比較することで、ＨＩＲＡゲノム配列全体は公知であり、コーディング配列部分は、染色体中で１００８３６ｂｐにわたり広がっていることが明らかとなった。ＧｅｎＢａｎｋで利用できる隣接したゲノム配列は、コーディング部分を越えたところまであるので、５’末端の遺伝子プロモーター領域や、３’末端の非翻訳配列やポリＡ付加シグナル由来の配列を含ませる目的で、コーディング領域よりも、もっと長い部分を選択することも可能である。このようにして、おおよそ１０３ｋｂある全ゲノム部分が選択された。第１塩基から１０３ｋｂにわたる部分は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＮＴ＿００１０３９の７９８３３４塩基に対応する。
【０１０１】
次に段階では、選択した１０３ｋｂゲノム部分は、対象となるゲノム配列（配列番号の１〜４２８）と関連して並べ替えられ、既知の複雑性の高い繰り返し配列ファミリーまたはコンセンサス配列、およびヒトゲノム中に存在していることが知られている、少なくとも１７ヌクレオチドの長さ（モノ、ジ、トリおよびテトラヌクレオチド単位の）の複雑性の小さい繰り返し配列（配列番号４４７〜４７９）と比較した。この比較には、遺伝子情報研究所のウェブサイト、ｗｗｗ．ｇｉｒｉｎｓｔ．ｏｒｇに見られる、広く利用されているＣＥＮＳＯＲプログラムを使用した。このプログラムでは、ゲノム部分中にある繰り返し配列の部位や分散状態を決定するために、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  グローバル・アライメント・比較アルゴリズムを利用する。ゲノム配列に関して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントを繰り返し行うには、次に示すようなパラメーターを使用した：マージン配列の長さ：５０ヌクレトチド，挿入断片を抽出する最小の長さ：１２ヌクレオチド，適合断片を組み合わせる最小マージン：３０，類似性の限度：２２，常に一致している類似性の限度：３５，割合限度：２．８，相対的な類似性：２．８，ギャップ・コンスタントＤ１：２．９５，ギャップ・コンスタント  Ｄ２：１．９０，ミスマッチ・ペナルティー：−１．０。このような解析結果に基づき、ヒトＨＩＲＡ遺伝子のコーディング配列の中、およびその近傍にある繰り返し配列ファミリーの詳細を表す、下記の表を作成した。
【０１０２】
【表１】
2004523201.tif 000002
【０１０３】
【表２】
2004523201.tif 000003
【０１０４】
【表３】
2004523201.tif 000004
【０１０５】
【表４】
2004523201.tif 000005
【０１０６】
非繰り返し部分の長さを、これらのデータを元に計算した。例えば、５３５８ｂｐの非繰り返し配列部分は、その前後にあるＡｌｕ−ＳｚおよびＡｌｕ−Ｓｘ繰り返し要素との境界となる、８５３７７９番目と８５９１３７番目の塩基の間に存在することが決定された。次に、非繰り返し部分は、それぞれの長さに応じて並べ替えられた。これらの非繰り返し部分のうち、４つ、すなわち、前記で詳述した５３５８ｂｐ配列、３８４７ｂｐ配列（８１９７５７から８２３６０４に対応する）、３７８５ｂｐ配列（８４３２７１から８４７０５６に対応する）、および３１３０ｂｐ配列（８７４９９０から８７８１２０に対応する）が、プローブを作製するために選ばれた。
【０１０７】
次の段階では、同定した４つのシングルコピー部分を増幅するために、ｌｏｎｇ  ＰＣＲの手法を用いた。５３５８ｂｐの増幅産物に対して行った手法について、下記に詳細に記述する。同様の手法で、残りの３つのシングルコピー部分の増幅も行った。
【０１０８】
最大限長いプローブが、ＦＩＳＨの実験には好ましかった。しかし、これらのプローブを作製するＰＣＲ反応を至適化するためには、他の制約も満たさなければならなかった。それにより、非繰り返し配列部分全体よりも、いくらか短い増幅された産物が生じた。Ｐｒｉｍｅコンピュータープログラムは、ＰＣＲのためのプローブの選択を至適化するために用いられた（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。ロングＰＣＲの至適化したＰＣＲプライマーには、次のような制約があった：長さ３０〜３５のヌクレオチド、ＧＣ含量が５０〜８０％；融解温度が６５〜７０℃；プライマーが、８ヌクレオチドより長いヘアピン構造を持つように、３’末端でセルフアニ−リングしない；プライマーが、そのどの位置でも１４ヌクレオチドよりも大きいセルフアニーリングをしないこと；プライマーが、標的配列のたった一つの位置でしかアニーリングをしないこと；そしてプライマーの３’末端では８ｂｐより短い長さ、プライマーのどの位置でも１４ｂｐより短い長さで、プライマー同士のアニーリングが起きないことである。さらに、ロングＰＣＲを至適化するためには、次のような制約が増幅されるＰＣＲ産物にあてはまった：長さが５１００〜５３５８ヌクレオチドであること；ＧＣ含量が４０〜６０％であること；融解温度が７０〜９５℃であること；ｆｏｒｗａｒｄプライマーとｒｅｖｅｒｓｅプライマーの融解温度の差が、２℃以下であること。この制約から、５１７のｆｏｒｗａｒｄプライマーと３８２のｒｅｖｅｒｓｅプライマーができて、その組み合わせにより９２８通りのＰＣＲ産物が可能である。上述の制約順位を用いたＰｒｉｍｅプログラムは、プライマー対となり得る配列を与えてくれた。後述の第２表の中で示されているように、高順位のプライマーが、合成のために選ばれる。このようなプライマーは、商業目的で生産された（Ｏｌｉｇｏｓ，Ｅｔｃ．，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）。
【０１０９】
【表５】
2004523201.tif 000006
【０１１０】
このようなプライマーを使用して、５１７０ｂｐのプローブを増幅するために、（フェノール抽出で精製された）１μｇの高分子量ゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドのプライマーの濃度がそれぞれ２００μＭのプライマーとを用いて、ロングＰＣＲ反応（５０μｌスケール）を行った。下記に示すＰＣＲ条件下で、特異性があり、フィデリティーが高いＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ−Ｔａｑ，宝酒造株式会社）を使用した。
Ｓｔｅｐ１−９４℃−５分
Ｓｔｅｐ２−９８℃−２０秒
Ｓｔｅｐ３−６５℃−７分
Ｓｔｅｐ４−Ｓｔｅｐ２に戻って、１４サイクル繰り返す
Ｓｔｅｐ５−９８℃−２０秒
Ｓｔｅｐ６−６５℃−７分＋１サイクルにつき１５秒追加
Ｓｔｅｐ７−Ｓｔｅｐ５に戻って、１４サイクル繰り返す
Ｓｔｅｐ８−７２℃−１０分
Ｓｔｅｐ９−０℃
Ｓｔｅｐ１０−終了
【０１１１】
５１７０ｂｐのプローブを増幅するのは、それより短いフラグメントを増幅するのに比べて効率が低いので、最初に行ったＰＣＲ反応では、多様なハイブリダイゼーション実験に使用できる、十分な量のプローブを得られなかった。そこで、増幅した反応溶液の４μｌを、次に示す方法によりもう一度増幅させた：Ｓｔｅｐ１−９４℃−１．５分、その後は最初に行ったＰＣＲ反応のＳｔｅｐ２〜１０を行う。十分な量の５１７０ｂｐのプローブが得られた。再増幅反応を行う代わりに、Ｓｔｅｐ７を少なくとも１０サイクル増やすこともできる。
【０１１２】
増幅した産物は、ゲル電気泳動により精製し、その後カラムクロマトグラフィーを行った。まずはじめに、増幅した産物は、１×変成ＴＡＥバッファー中で、０．８％Ｓｅａｋｅｍ  ＬＥ  アガロースゲル（ＦＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）上に分離された。それからゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光で視覚化した。適切な長さに相当するＤＮＡ断片を切り出して、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の中に入れ、５０００ｇで１０分間遠心する。ＤＮＡは、溶液中に回収され、１／１０倍容量の酢酸ナトリウムと２．５倍容量のエタノールを加えて、−２０度の条件下で沈殿させた。次に、沈殿したＤＮＡを遠心し、７０％の冷エタノールでリンス、風乾後、滅菌した２０μｌの脱イオン水に溶解した。ＤＮＡ断片は、濃度を決定するために、０．８％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）で確認した。
【０１１３】
プローブの標識方法、ハイブリダイゼーション法、非特異的に結合したプローブの除去方法およびプローブの検出方法については、ＫｎｏｌｌとＬｉｃｈｔｅｒにより提示されている、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ） 、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １”，Ｕｎｉｔ４．３（Ｇｒｅｅｎ−Ｗｉｌｌｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）。プローブを標識するために、標識としてジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを使用して、手短に標準的なニックトランスレーションを行った（Ｒｉｇｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３：２３７−２５１，（１９７７））。これにより、一連の重複のある３００〜５００ｂｐの標識されたＤＮＡ断片が得られ、その中には，５１７０ｂｐのプローブも含まれていた。
【０１１４】
それから、標識されたプローブ断片は、１／１０容量の酢酸ナトリウム、２．５倍容量のエタノールおよびキャリアＤＮＡを加えることにより（一晩、−２０℃で）沈殿させた。翌日、沈殿したＤＮＡを遠心し、凍結乾燥し、１２５ｎｇ／２０μｌの濃度で脱イオン化した滅菌水中に溶解した。
【０１１５】
米国特許５４４７８４１，５６６３３１９および５７５６６９６号明細書に記載されているタイプのブロッキング核酸有無の条件で、標識したプローブ断片を使用し、変性した正常なヒトのメタフェーズ染色体を用いて、ハイブリダイゼーションの対照実験を実施した。溶解した標識プローブの２０μｌを凍結乾燥させ、１０μｌの脱イオン化したフォルムアミドに溶解し、１本鎖の核酸にするために７０〜７５℃で５分間変性した。対照として、プローブは、Ｃ０ ｔ１ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１０μｇに対し、１２５ｎｇ（または２０μｌ）の標識プローブを加えて、その混合溶液を凍結乾燥させることで、精製した繰り返しＤＮＡと前反応させた。それから、この混合溶液を、７０℃、５分間変性させ、その後、プローブ中の一本鎖繰り返し配列を二重鎖核酸にするために、３７℃、３０分間の前反応（すなわちプレアニ−リング）を行った。これにより、繰り返し配列と標的の鋳型ＤＮＡのような染色体とのハイブリダイゼーションができなくなる。
【０１１６】
その後、精製した繰り返しＤＮＡ（例えば、Ｃ０ ｔ１）と混合した、または混合していない変性したプローブは、等量のあらかじめ温めておいたハイブリダイゼーション溶液（４×ＳＳＣ／２ｍｇ／ｍｌヌクレアーゼフリーの牛血清アルブミン／２０％デキストランサルフェイト／３０％滅菌した脱イオン水）と混ぜて、変性した標的ＤＮＡ上にかけた。顕微鏡用のスライドに固定された染色体の標的ＤＮＡは、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ中で、７２℃５分間変性した。カバースライドを、スライドのプローブハイブリダイゼーション混合溶液上において、蒸発を防ぐためにマニキュア液でシールし、一晩３９℃の湿気のある入れ物の中に静置した。
【０１１７】
ハイブリダイゼーションの後に、非特異的に結合したプローブは、塩濃度および温度といった様々な厳しい条件下で、洗い流された。繰り返し配列がハイブリダイゼーションしないように、前反応を行った標識したプローブおよびそのような前反応を行っていないプローブは、従来からあるＦＩＳＨ法（ＫｎｏｌｌおよびＬｉｃｈｔｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｅｔｉｃｓ  、Ｖｏｌ  １，Ｕｎｉｔ４．３  Ｇｒｅｅｎ−Ｗｉｌｌｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）を用いて、ローダミンラベルされたにジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ対する抗体で検出された。染色体ＤＮＡは、ＤＡＰＩで対比染色した。そして、マイクロスライド上の細胞プレパラートを、（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡのような）褪色防止溶液で固定し、適当な蛍光フィルターのセットを用いて蛍光顕微鏡を使用して視覚的に観察した。第１図および第２図は、ハイブリダイゼーションを比較して結果を図示した写真であり、第１図はブロッキング繰り返し配列を使用したハイブリダイゼーションで、一方、第２図は精製した繰り返し配列と前反応を行っていないハイブリダイゼーションの結果である。これらの写真は、２つの正常な染色体２２ｑ１１．２領域上の両方のＨＩＲＡアレルへのハイブリダイゼーションを示している。これらの写真を比較して、ブロッキング繰り返し配列の存在は、本発明のプローブを使用するにあたり、必須ではないことが示されている。
【０１１８】
第２表に特定されている残りの３つのプローブは、上述のようにＰＣＲで増幅され標識された。これらのプローブは、プローブの有効性を決定するために一連のＦＩＳＨ実験の中で使用された。このように４つのプローブのすべてが、潜在的な繰り返し配列とのプレアニ−リング無しに使用され（第６図）、短いほうから数えて３つのプローブを組み合わせて、欠失していることがあらかじめ明らかとなっているＤｉＧｅｏｒｇｅ／ＶＣＦＳに罹患した患者から採取した細胞に対して使用された（第１２図）。第６図の写真の中で、プローブは、正常な個体の両方の第２２番染色体の単一領域とハイブリダイゼーションしている（矢印）。第１２図では片方の第２２番染色体としかハイブリダイゼーションしていない（矢印）。星印で示されているように、もう一方の第２２番染色体は、この領域に欠失があり、プローブとはハイブリダイゼーションしない。
【０１１９】
実施例２
ＮＥＣＤＩＮおよびＣＤＣ２Ｌ１遺伝子のプローブの開発
実施例１で記載された開発技術は、第１番染色体上の既知の遺伝子異常（染色体性の１ｐ３６．３症候群；Ｓｌａｖｏｔｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，３６：６５７−６３（１９９９））および第１５番染色体上の既知の遺伝子異常（プレーダー−ウィリまたはアンゲルマン症候群）を検出するために、一連のプローブの開発に用いられた。プレーダー−ウィリまたはアンゲルマン症候群の患者のおおよそ７０％の人達は、ＮＥＣＤＩＮ遺伝子を含む核酸配列の片方の欠損を示す（Ｋｎｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，３２：２８５−２９０（１９８９）；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，３３：６６−７７（１９８９））。この遺伝子が過剰に存在すると、介在性の複製、過剰なファミリー、２つの動原体がある第１５番染色体を有する患者は、異常な形質を示す（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，５５：７５３−７５９，（１９９４）；Ｒｅｐｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，７９：８２−８９，（１９９８））。後述の第３表には、シングルコピーと導出された部分、ＰＣＲのプライマーを設計した部分、配列番号および合成されてくるプローブの長さが表示されている。
【０１２０】
【表６】
2004523201.tif 000007
【０１２１】
ＰＣＲ増幅反応は、第３表のＣＤＣ２Ｌ１プライマーを使用して行われ、増幅産物は、実施例１で述べられたように、標識、ハイブリダイゼーションを行い、検出された。標識されたプローブは、一連のＦＩＳＨで使用され、そのハイブリダイゼーションの結果の写真は、第７図〜第１０図で示されている。第７図で示されている実験では、最も長い４８２３ｂｐのプローブが使用され、鋳型中の潜在的なハイブリダイゼーション繰り返し配列は、精製した繰り返しＤＮＡとプレアニ−リングすることにより、不活化されていた。対照実験としては、同じプローブが、精製した繰り返しＤＮＡとプレアニ−リングすることなしに使用された（第８図）。このハイブリダイゼーションの結果は、繰り返し配列へのハイブリダイゼーションを防ぐために、精製した繰り返しＤＮＡは必要ではないことを示している。両方の実施例において、ハイブリダイゼーションした１つまたは両方の染色分体を有する染色体は、矢印で示されている。第９図および第１０図で示されている実験の中では、精製した繰り返しＤＮＡのプレアニ−リングを行う（第９図）、または行わない条件で（第１０図）で、４８２３および４７２４ｂｐの長さのプローブが使用された。また、精製した繰り返しＤＮＡの前反応は、本発明のプローブの使用にあたり必要ないことが示された。
【０１２２】
第３図〜第５図および第１１図で例示されているように、ＮＥＣＤＩＮプローブも、一連のＦＩＳＨの実験で使用された。これらのプローブは、ＮＥＣＤＩＮ遺伝子の３６〜６２ｋｂ末端のＤＮＡ配列を検出した。３５４４ｂｐのプローブ（配列番号４３７〜４３８）は、ＭＡＧＥＬ２遺伝子の３’末端を検出した。第３図の中で、３５４４ｂｐのプローブは、精製した繰り返し配列を用いてプレアニ−リングをし、正常な個体から採取したメタフェーズの細胞に対して使われた。第４図は、プレアニ−リングをしていない対照実験である。第１１図では、片方の第１５番染色体上の１５ｑ１１−ｑ１３配列の欠失を含んでいることが知られている、プレーダー−ウィリ症候群の患者のメタフェーズの細胞に対して、３つのプローブのすべてを組み合わせて使用した。正常な相同染色体は、矢印によって示され、片方の染色分体に対するハイブリダイゼーションを示している。欠失のある染色体の部位は、星印で示されている。それは、プローブのハイブリダイゼーションを示したものではない。
【０１２３】
前述の実施例は、ＤＮＡ断片を組み合わせて使用しても、ＤＮＡ断片をそれぞれ別々に使用したときと比較して、同一の結果を示すことを表している。これにより、ＤＮＡ断片のどれも個々に、または組み合わせて使用しても、ゲノムの他のどの部位にもハイブリダイゼーションしない、それ故、繰り返し配列を必要としていないことが確立されている。この事実は、シングルコピーのゲノムプローブを設計・作製する本発明の方法の有効性を、さらに確かなものにしている。
【０１２４】
このような異常を検出する商業的かつ研究中のゲノムプローブを使用するには、今までは、メタフェーズまたはインターフェーズの染色体に対するプローブのアニ−リングの前に、繰り返し配列のハイブリダイゼーションを不可能にしておく必要がある。これにより、実験方法を実施するのに必要な操作段階を増加させ、操作ミスが起こる確率を増加させてしまうが、そのいずれも臨床診断を行う研究室には、受け入れがたいものである。第７図で見られる結果は、このような異常を検出する、この分野で商業的に利用されるゲノムプローブを使用して得られる結果と、同等のものである。それ故、これらのプローブは、このような遺伝病を検出するのに有用である。プローブは、単独でも、ハイブリダイゼーションや検出に必要な他の試薬と組み合わせても、こうした遺伝病を検出するキットとして、臨床試験を行う研究室に提供することもできる。
【０１２５】
本明細書の中で引用された実施例で例示されている以外に、ゲノム配列から作製されたプローブは、先天性、突発性、または後天性の染色体の再構成を検出するのにも利用できる。これらの再構成は、上記で例示した以外に、（腫瘍形成を含め）様々な他の公知の遺伝子異常や疾病に対応している可能性がある。それ故、本発明は、商業的に利用されていなかったり、適切なプローブが作製できないゲノム領域からプローブを、作製するのにも有効である。
【０１２６】
原則として、本発明の作製方法は、ＤＮＡ配列が利用でき、ゲノム中の広い意味での繰り返し配列部分が分類化されている、どんなゲノム部分に対するシングルコピーゲノムプローブでも、設計、開発および作製に利用することが可能である。そのような同定されている配列は、現在、次に示すような種のゲノムに対し利用できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｉｒｉｎｓｔ．ｏｒｇ）：ヒト、マウス、シロイヌナズナ、線虫、ショウジョウバエ、ダニオ。
【０１２７】
実施例３
この実施例の中で、さらに遺伝子疾患や細胞遺伝学的な異常に特異的な沢山のプローブが、本発明の原理に基づいて作製された。ソフトウェアも開発され、シングルコピープローブを設計する過程を迅速に処理するのに貢献した（ｆｉｎｄ．ｐｌ，ｐｒｉｍ＿ｗｋｇ，ａｎｄ  ｐｒｉｍ，前記および添付されているＣＤ−Ｒ参照）。その後、本発明のプローブの試験を行い、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりその有効性を確認した。
【０１２８】
シングルコピー配列の同定
シングルコピープローブ配列の位置は、連続した長いゲノムＤＮＡ配列から直接同定される。この位置は、標的のゲノム配列から繰り返し配列ファミリーの配列を検索するソフトウェアによって決定された。標的配列と前もって同定されている繰り返しファミリーの配列とを比較することにより、標的配列に中にある繰り返し配列の境界を同定し明確にできた。コンピューターソフトウェアの「ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇ−ｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ＲｅｐｅｅｔＭａｓｋｅｒ．ｈｔｍｌ：ＳｍｉｔＡ．Ｆ．Ａ．＆ＧｒｅｅｎＰ．，結果は未公開である）は、連続したゲノム配列中にある繰り返し配列ファミリーの位置、たいてい１００ｋｂまでの長さを決定するために使用された。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、ゲノム配列と、ヒトゲノム中に複数のコピーが存在する繰り返し配列ファミリーとを、コンパイルすることで比較している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｉｒｉｎｓｔ．ｏｒｇ／〜ｓｅｒｖｅｒ／ｒｅｐｂａｓｅ．ｈｔｍｌ）。この繰り返し配列のデータベースには、代表的で共通性のあるヒトの繰り返し配列ファミリーの大部分の配列が登録されている。データベースは、（実施例６で示すように）新たに繰り返し配列ファミリーが発見されても、それを追加登録することにより、増やしていくことができる。
【０１２９】
Ｐｅｒｌ言語（ｆｉｎｄｉ．ｐｌ）は、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒの出力結果から、繰り返し部分の境界と実質的に同等の部分を解明し、パラメーターとして入力した限界（多くの場合は、２ｋｂまで）以上の大きさの、近接したシングルコピー部分を推測し、検索してくれる。このプログラム言語により、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒより出てきた（識別子：．ｏｕｔのついた）出力ファイルから、大きさにより並べ替えられたシングルコピー部分の位置と長さが決定される、この出力ファイルには、繰り返しファミリーの部分の位置と長さの情報の一覧表も含まれている。近接したシングルコピー部分の境界は、繰り返し部分の上流側の境界にある１つのヌクレオチドを除去し、前記繰り返し部分の下流側の境界に、１つのヌクレオチドを追加することにより導出された。同一の上流および下流に変化物（１ｂｐの長さ）を有するシングルコピー部分は、近接した繰り返し配列とみなされた。そして、プローブの配列は、ヒトゲノム配列のデータベース（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））と比較されて、ゲノム中のどこかに相同性があるかどうか（例えば、デュープリコン、トリプリコン、またはもっと相同性の低い配列）が、同定された。ゲノム中のどこかに、弱いながらも保存されているプローブ配列は、標的配列とクロスしてハイブリダイゼーションしない。
【０１３０】
最も長いシングルコピー部分のＰＣＲ増幅反応に対して、オリゴヌクレオチドプライマーが選択された。Ｕｎｉｘ  ｗｒａｐｐｅｒ言語（Ｐｒｉｍ＿ｗｋｇ）は、プライマー（ｐｒｉｍ）を設計するコマンドを含んでいるファイルのスイッチを、何度も変化させ、このようにして、プログラム（Ｐｒｉｍｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））に入力される後述のパラメーターを変化させることにより、プライマー選択を最適化する：Ｔｍ（７０〜６０℃）、Ｇ／Ｃ含量（５５〜４０％）、最小限の間隔配列の長さ（シングルコピー部分の長さの９０〜８０％）。
【０１３１】
プローブの作製および染色体に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション  ＤＮＡ断片は、製造メーカー（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により推奨されているように、ＬＡ−Ｔａｑ用いてロングＰＣＲ（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：５６９５−５６９９（１９９４））で増幅された。ＲｏｃｈｅＭｏｌｕｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａｊｏｌｌａ，ＣＡ；およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡによって製造されている酵素を含め、ロングＰＣＲ用の他の酵素でも同様の結果が得られることが分かった。増幅産物は、低温融解性アガロースゲル電気泳動、その後に、マイクロコン１００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＢｅｄｆｏｒｄＭＡ）を用いたクロマトグラフィーを行って精製した。この操作により、繰り返し配列を含め、混入しているＰＣＲの伸長反応産物を除去することができた。
【０１３２】
プローブ断片は、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰやｂｉｏｔｉｎ−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のような修飾ヌクレオチドを用いて、ニックトランスレーションにより標識された。標識したプローブを変性し、前記条件下（Ｋｎｏｌｌ  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１，Ｕｎｉｔ４．３，Ｇｒｅｅｎ−Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９４）、プローブを（Ｃ０ ｔ１ＤＮＡのような）繰り返しＤＮＡとプレアニ−リングする手法を、一連のハイブリダイゼーションにおいて使用しなかったことを除く）で、顕微鏡のスライドに固定した染色体プレパラートにハイブリダイゼーションさせた。非特異的な結合を除去するために、約１００ｋｂまでの片方の染色体領域由来のプローブを、個々または組み合わせて使用しても、ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、２×ＳＳＣで５０％のホルムアミド中、４２℃で行われ、続いてさらに３９℃２×ＳＳＣで１回、室温の１×ＳＳＣで１回行われた。ゲノム中に至る所にある類似の関係配列への、プローブのハイブリダイゼーションを排除するために、必要に応じて、洗浄条件を厳しくした。ハイブリダイゼーションしたプローブは、修飾ヌクレオチドに対する（ローダミンやフルオロセインのような）蛍光色素が結合した抗体で検出された。染色体の同定は、細胞性のＤＮＡを４’、６−ジアミヂノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色することで行われた。ハイブリダイゼーションした染色体は、ディスプレイが付属し、複数の励起蛍光フィルター機器を備えた蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）で視覚化された。Ｃ０ ｔ１ＤＮＡとのプレアニ−リング有無の条件ごとに、個々のプローブまたはそれらの組み合わせについて、少なくとも２０のメタフェーズ細胞（５０〜１００の核）へのハイブリダイゼーション像を計数した。細胞は、ＣＣＤカメラ（Ｃｏｈｕ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＣｈｒｏｍｏＦｌｕｏｒ  ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して映像化された。
【０１３３】
第４表には、前記の方法を使用して作製した、既知の疾患や細胞遺伝子に関する異常に特異的な、多くのプローブに関するデータを示している。遺伝子異常の診断は、１９９５ＩＳＣＮ（国際ヒト細胞遺伝学会（１９９５），ＭｉｔｔｅｌｍａｎＦ，編）に挙げられるように、有名な学会でも利用されている。
【０１３４】
【表７】
2004523201.tif 000008
【０１３５】
【表８】
2004523201.tif 000009
【０１３６】
【表９】
2004523201.tif 000010
【０１３７】
実施例４
この実施例の中では、本発明のプローブを使用して、染色体の切断点を、さらに正確に決定することが行われた。構造的な染色体の再構成は、ある種のガンの場合と同様に、遺伝子疾患や後天性の病気において遺伝性である可能性が高い。そのような再構成は、（逆位、欠失、重複のような）単一の染色体内や（例えば、転座のように）相同染色体間または非相同染色体間の中で起こることもある。本発明のプローブについては、切断が起きている正確な領域を、従来にはない解像度で決定することができる。そのレベルの解像度があると、再構成が起こる段階で散在してしまった遺伝子や核酸配列の検出が可能となり、病因、予後および／または治療において洞察を与えてくれる。遺伝的に関係のある遺伝子疾患において、染色体の切断点を正確に位置付けすることは、欠失または重複の範囲を明らかにし、それ故、遺伝子異常の予後を決定付ける（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，５５：７５３−７５９（１９９４））。
【０１３８】
次の実施例では、シングルコピープローブが、同一の染色体領域の上市されているクローン化プローブより、正確な情報を提供してくれることを、例示している。
【０１３９】
慢性成人骨髄性白血病の多くの場合（ＣＭＬ；９０％）および急性リンパ球性白血病の症例の中には（ＡＡＬ；２５〜３０％の成人；２〜１０％の小児）（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．，９６（１）：６４−８０（１９９７）；Ｒｕｂｉｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２０（１）：１−１１（１９９８））、染色体９ｑ３４と２２ｑ１１．２の間での相互転座が明らかとなっている（Ｒｏｗｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２４３：２９０−３９２（１９７３））。この転座の結果、異常のある、または派生した第２２番染色体は、第２２番染色体のＢＣＲ（切断点集中領域）プロモーターのところで、第９番染色体上の癌遺伝子ＡＢＬ１と融合する。癌遺伝子ＡＢＬ１は，択一的にスプライシングされた、それぞれエキソン１ｂ，１ａと呼ばれる第１エキソンを有し、共通のエキソン２−１１と接合した、６ｋｂまたは７ｋｂのｍＲＮＡのいずれかを発現する。エキソン１ｂは、エキソン１ａの２５０ｋｂ位の近傍にあり、この非常に長いイントロンが転座の絶好の標的となる。ＣＭＬにおいて、ＡＢＬ１遺伝子は、第９番染色体から第２２番染色体のＢＣＲ遺伝子のプロモーター領域に、ＢＣＲ−ＡＢＬ１キメラタンパク質を産生するように転座してくる（Ｂｅｒｎａｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３２３１−３２３６；（１９８７））。ＢＣＲ遺伝子は、２４のエキソンを有し、１６０ｋＤのタンパク質をコードしている。ＢＣＲ遺伝子の切断点は、ＣＭＬとＡＬＬとで異なる。ＣＭＬでは、大部分の切断点は、エキソン１２から１７の間（すなわち、ｂ１からｂ５）に相当する、５．８ｋｂのメジャー切断点集中領域（Ｍ−ＢＣＲ）の中で起こる；しかし、多くのＡＬＬの場合、ＢＣＲ遺伝子は、エキソン１と２の間（マイナー切断点集中領域、すなわちｍ−ＢＣＲ）で切断される。このように、異なる分子再構成により、異なる大きさのタンパク質が生じ、それぞれ異常を引き起こす。このように遺伝子の再構成を、本発明のプローブにより区別することができる。
【０１４０】
ＤＮＡレベルでは、２つの色と２つのプローブによる蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の手法が、メタフェーズおよびインターフェーズの核上のＢＣＲ−ＡＢＬ１転座部位を検出するのに利用できる（Ｂｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ、８３：１９２２−１９２８（１９９４）；Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ９０：１３９５−１４０２（１９９７）；Ｂｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ９２：２３１５−２３２１（１９９８））。従来のＦＩＳＨに関して、その技術は、癌遺伝子ＡＢＬ１の領域（切断点および２００ｋｂまでの長さ）を、ある色（例えば、赤色）で検出するプローブと、（切断点の近傍にある）ＢＣＲ領域を、別の色（例えば、緑色）で検出するプロ−ブとを有するものである。このように、融合した第２２番染色体陽性細胞では、赤色と緑色のシグナルが同じ位置にあって、結果として第２２番染色体の存在を示すように黄色のハイブリダイゼーションシグナルを与える。しかし、正常な第９番と第２２番染色体は、それぞれ独立に、赤色と緑色のシグナルのままになっている。最近では、ＡＢＬ１遺伝子転座切断点の両側にわたる、もっと大きなＤＮＡプローブが転座部位を検出するために利用されている。この手法では、切断点の近くにあるプローブ部分は、異常のある第９番染色体上に残っており、切断点から遠くにある部分は、従来の検出方法と同様に、ＢＣＲ領域の部位にある。このため、転座した第９染色体上に余分なシグナル（ＥＳ）が観察され、多くの臨床的細胞遺伝学の研究室が使用しているＢＣＲ−ＡＢＬ１  ＥＳの２つの色による転座プローブ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，ＤｏｗｎｅｒｓＧｒｏｖｅ，ＩＬ）より劣った手法である（Ｈｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．，１１０（１）：２１４−２１６（２０００）：Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，９５（３）：７３８−７４４（２０００））。このＥＳシステムにおいて、ＡＢＬ１遺伝子プローブカクテルは、ＡＢＬ１遺伝子よりもはるかに大きいゲノム上の標的を覆う。このカクテルは、ＡＢＬ１遺伝子の約２５０ｋｂ上流にあるアルギノスクシネート合成酵素の遺伝子から、ＡＢＬ１遺伝子を通って、その数ｋｂ下流まで伸びている。
【０１４１】
ＢＣＲ、ＡＢＬ１遺伝子のローカスのシングルコピー部分の境界を同定して、いくつかのシングルコピープローブが作製された。第１３および第１４図は、それぞれＢＣＲ、ＡＢＬ１遺伝子のローカス内のシングルコピープローブ部分の位置を示している。２ｋｂを越える１１の部分が、ＢＣＲ遺伝子全体にわたり分布し、これまでに、そのうちの５つをプローブとして作製した。さらに、より正確に転座切断点を明確にするために、この遺伝子中の同程度の比較的短いシングルコピー領域（１．５〜２．０ｋｂ）を、組み合わせて使用することができた。
【０１４２】
ＢＣＲ遺伝子（第１３図）およびＡＢＬ１遺伝子（第１４図）に対する多様なシングルコピープローブが導出され、オリゴヌクレオチドプライマーセットが導き出された。ＢＣＲ遺伝子に関して、これらのプローブは、マイナー切断点とメジャーな切断点（第１３図および配列番号５１０〜５１５）を区別する。ＢＣＲ−ＡＢＬ１のＥＳプローブを用いた従来のＦＩＳＨ試験では、ＢＣＲ遺伝子のメジャー（Ｍ）な切断点とマイナー（ｍ）な切断点での再構成を区別できない。ＡＬＬの患者でよく観察されるマイナーな切断点を検出するｍ−ＢＣＲプローブと、Ｍ−ＢＣＲ（配列番号５１０〜５１５）を明示するプローブとを組み合わせることで、ＣＭＬの大部分の患者で明らかとなっているメジャーな切断点を検出できる。もし、Ｍ−ＢＣＲのプローブだけが、第２２番染色体から、融合した第９番染色体に転座し、ｍ−ＢＣＲプローブが、融合した第２２番染色体上に残るなら、遺伝子は、メジャーな切断点のところで分断されているのである。
【０１４３】
ＡＢＬ１遺伝子に関して、プローブのうち２つは、切断点の近傍にあると推測され（配列番号５１６／５１７および５１８／５１９）、他のプローブは切断点から遠く離れたところにある（配列番号５２０および５３１）。ＣＭＬの切断点の遠位にある３つのＡＢＬ１のプローブのハイブリダイゼーションから、プローブは融合した第２２番染色体側に移動したことが示され（第１５図）、切断点部分にまたがる５つのＡＢＬ１のプローブを組み合わせた結果から、いくつかのプローブは融合した第９番染色体側に残り、他のプローブは、融合した第２２番染色体側に移動している（第１６図）ことが示されている。これらの結果とこれらのプローブの位置関係から、切断点部分は第１４図の１１００４ｂｐから６５９５１ｂｐの位置にまたがっているという結論を導くことができる。分断点の領域を、配列番号５１９と５２０間のシングルコピー部分由来のハイブリダイゼーションプローブで、より明確することができるということは、この技術分野に熟知した人にはあきらかである。そして、切断点の正確な位置は、正確な分断点領域のゲノム配列から決定することができる。
【０１４４】
上市されているＥＳプローブを使用している最近の研究（Ｈｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ， ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．， １１０：２１４−２１６（２０００））から、おおよそ１０％のＣＭＬの患者では、融合した第９番染色体上で、余分にハイブリダイゼーションしないことが示されている。（プローブの）配列が、ＡＢＬ１遺伝子の欠失した上流側であるからである。症例の中には、欠失部分が、ＡＳＳ遺伝子と同じ方向まで及んでいることもあり、そのような欠失は、予後が悪いこと（すなわち、白血病の急性転化）と関連している。約１００ｋｂから２００ｋｂまでの、比較的短いプローブがハイブリダイゼーションする、約１／３のＣＭＬの患者では、欠失部分の検出率が上昇することから明らかなように、上述の長いＦＩＳＨプローブは、ＡＳＳとＡＢＬ１の間の領域に存在する介在性の欠失を検出するのに有効ではない（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９５（３）：７３８−７４４（２０００））。患者の中には、元のまたは転座した第９番染色体上のＡＢＬ１切断点近傍の配列が欠失している人もいるので、シングルコピープローブは、この染色体領域中の半接合の範囲を明らかにするために使用されている。欠失切断点と臨床的な症例との相関により、この染色体部分の特定の遺伝子欠損が、初期の急性転化のような臨床的な症状の予後兆候であるかどうかが決まってくる。
【０１４５】
実施例５
この実施例では、増幅されたハイブリダイゼーションプローブのシグナルが、二倍化したゲノム領域由来のプローブ配列を使用して発生していることが示されている。いくつかのシングルコピープローブ配列が設計されたが、それは上述の通り、非常に類似したデュープリコンまたはトリプリコンの一部である。
【０１４６】
急性骨髄性白血病−タイプＭ４の逆位による切断点部位に近い、染色体１６ｐ１３．１（配列番号５３６〜５４３）由来のいくつかのプローブでは、この領域内の配列の、ほとんど完全に３倍重複した配列を含んでいる。ゲノムのドラフト配列において、これらのドメインの２つは一列に位置し、プローブ配列が４０ｋｂの配列で分断されている。そして３番目の末端部分は、１．２ｍｂで分断されている。３つの部分の配列は、１．５％しか違っていない。このプローブを用いたハイブリダイゼーションは、２つの領域に集中しているが、明確に区別できるシグナルではない。一方のハイブリダイゼーションは、連続している始めと２番目のパラログに対応しており、もう一方はこの配列の３番目のコピーに対応している。
【０１４７】
Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群において、一般に欠失している染色体１７ｐ１１．２（配列番号５８６−５８７）由来のプローブは、ほとんど完全なトリプリコンを含んでいる。このプローブは、ＳＨＭＴ１遺伝子のＩＶＳ４に存在する、ほぼシングルコピーである配列の中の欠失を検出するようにできている。しかし、ＳＭＨＴ１配列と９９．８％の相同性を示す、おおよそ１５ｋｂの配列で分断されている２つのパラローガスなサブ配列は、動原体側に約２．７ｍｂ離れたＺＮＦ１２７とＰＡＩＰ１遺伝子間のゲノムドラフト中にも検出され、この異常のある患者で、共通して欠失している遺伝子配列でもある。これらの配列の第１７番染色体の動原体（高度に凝集した領域）までの距離に従い、シングルハイブリダイゼーション部位が観察された。
【０１４８】
ダウン症候群で重要な領域（配列番号５０４／５０５−５０８／５０９）由来のプローブはそれぞれ、同じく大きな、８０ｋｂ以上の長さがある、デュープリコン中に結合した。これらの２倍重複した配列は、１．１ｍｂ離れており、それぞれ染色体２１ｑ２２．２バンドの動原体側およびテロメア側に存在している。２倍重複した配列は、１．１ｍｂの配列で分断されているにも関わらず、それぞれに対するプローブを使用しても、１つのハイブリダイゼーションシグナルしか、第２１番染色体のこの領域には検出されなかった。それ故、染色体１７ｐ１１．２と同じように、第２１番染色体のこの領域は、同じ位の距離で分断された２倍重複した領域を区別できる染色体１６ｐ１３．１よりも、メタフェーズの染色体中では凝縮しているように思われる。
【０１４９】
そのような領域から作製されたシングルコピープローブは、当然だが、既知の繰り返し配列要素を欠いている。しかし、それぞれのコピーは、最も厳しいハイブリダイゼーション洗浄条件下でもハイブリダイゼーションしたままなので、プローブは、概してパラローガスなコピーのすべてにハイブリダイゼーションする。染色体上の多数のきつく塊状になった部位は、特異的な部分にハイブリダイゼーションするので、このようなハイブリダイゼーション由来のシグナルは、１倍体ゲノムごとに１つ存在するプローブ配列との比較から予想されるよりも、はっきりしている。このように、ゲノム内のデュープリコンまたはトリプリコンは、本発明のプローブで好適な標的の大きさを長くできる。このことは、そのような領域由来の比較的短いプローブは、比較的長いプローブと比較して、同等な強度のシグナルを与えることができることを意味している。２倍重複したゲノムドメイン由来の比較的短いプローブを選択することは、長いシングルコピー部分と予想していたゲノム領域に対するプローブの開発に、特に役に立つ。
【０１５０】
実施例６
正確なヒトゲノム配列の草案が急速に利用できるようになると、本発明の方法に従い、今までは利用できなかった数多くの染色体領域に対して、シングルコピープローブの開発が進んだ。現在、最新の総合的なＤＮＡ配列のデータベースは、ドラフト配列に存在する繰り返し部分を検出するために利用されているが（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｉｒｉｎｓｔ．ｏｒｇ／ｒｅｐｂａｓｅ）、メタフェーズの染色体に対するシングルコピープローブのハイブリダイゼーションの結果から、これまでに判明していない繰り返し配列を含むプローブもあることが示されている。このことは、草案のゲノム配列中には見つかっていない他の位置と同様にマップされることが知られている、相同染色体バンドへのプローブのハイブリダイゼーションを記述することで明確になった。
【０１５１】
ドラフトゲノム配列は不完全であり、ユークロマチンゲノムの９０％位までが、配列決定されている（国際ヒトゲノムシークエンス学会、Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：８６０−９２２，（２００１））。いくつかの繰り返し配列ファミリー、とりわけ未知の配列の中に存在しているものがあっても、検出されないことが期待された。既知の繰り返し配列の検索にも関わらず、いくつかのユークロマチンシングルコピープローブは、末端動原体染色体（第１３，１４，１５，２１および２２番染色体）の短腕上に、多数のコピーが優勢的に見つかる、繰り返し配列のホモログを含むように思われる。これらのプローブは、第２１番染色体のダウン症候群で重要な領域由来の３つの配列（配列番号５０４／５０５，５０６／５０７および５０８／５０９で増幅される）と、急性骨髄性白血病−タイプＭ４で、染色体の逆位の部位に広がっている染色体１６ｐ１３．１由来の２つの配列（配列番号５３６／５３７および５３８／５３９で増幅される）を含んでいる。
【０１５２】
核小体形成領域と呼ばれる、染色体ドメインは、連続して一列に並んだ何千ものコピーのリボソームＲＮＡを含んでいることが知られている（Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，；７３：１９３−８（１９８６））。ヒトゲノムの配列決定されたゲノム配列には、染色体領域由来の連続配列が欠けている。国際シークエンス会議は、このような配列や、その他の連続した繰り返し配列（例えば、ヘテロクロマチン）を含むクローンを、シークエンス当初の事情を配慮して排除している。何故なら、そのようなクローンからの配列を集めても、不明瞭で、信頼できないと認識しているからである。同じ位置にあるが、リボソームＲＮＡ遺伝子とは区別される他の配列も、恐らく染色体の核小体形成領域中に、一列に並んで存在している。このような部分についての配列情報がないので、ゲノム中のどこかにある配列に関係した領域内の配列の分布を、あらかじめ予測することはできない。このようなプローブを用いたシングルコピーＦＩＳＨは、予測通りにユークロマチン部分への局在化を示しているが、さらに、末端動原体を有する染色体の短腕への、注目すべきハイブリダイゼーションが観察される。ハイブリダイゼーションの前にＣ０ ｔ１ＤＮＡを添加すると、繰り返し配列へのクロスハイブリダイゼーションを除去できた。このような付随的なシグナルは、末端動原体を有する染色体の短腕上のプローブと関係して、一列に並んだマルチコピーの配列と一致している。
【０１５３】
さらに、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒソフトウェアを用いて繰り返し配列を排除したプローブであるにも関わらず、シングルコピーと導出されたプローブの、介在性の繰り返し配列ファミリーに対するハイブリダイゼーションが検出された。Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｇｅｎｉｓ症候群で共通して欠失している部分にあり、染色体１７ｐ１１．２にマッピングされる、１つのプローブでは、介在性の繰り返し配列とクロスしてハイブリダイゼーションするのが観察された。染色体９ｑ３４の転座切断点の近傍の配列（配列番号５１８／５１９および５２６／５２７で増幅される）も、これらのプローブをこの領域由来の別のプローブと組み合わせてハイブリダイゼーションさせた結果から、潜在的に介在性の繰り返し配列を含んでいる。これらのプローブ部位にマップされるハイブリダイゼーションシグナルは、クロスしてハイブリダイゼーションしている配列のそれより強くはないが、洗浄処理を厳しい条件にしても、クロスしてハイブリダイゼーションする配列を排除することはできない。この実験事実は、プローブは、非常に多コピーの公知の介在性繰り返し配列というよりは、（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒによって認識されないので、作製されたプローブの中に、偶然に含まれてしまう）今までに判明にしていない繰り返し配列ファミリーを含んでいることがわかる。
【０１５４】
このようなプローブは全部、これまでに発見されていない繰り返し配列ファミリーの類を含んでいるように思われるが、プローブ自体は、シングルコピーと繰り返し配列の両方で構成されることが多い。染色体ＤＮＡに対して、ＰＣＲで産生された異なるプローブ配列のセットを何度もハイブリダイゼーションして、これらの配列要素を分離することができる。しかし、それぞれの全プローブ配列は既に判明しているので、さらに新規のシングルコピープローブを作製するために用いられる繰り返し配列のデータベースに、その配列を追加することができる。プローブの配列は長くないので（実際には、介在性繰り返し配列の中には、最も長いシングルコピープローブよりも長いものもある；例えば、Ｌ１）；それ故、これらの配列をヒト繰り返し配列ファミリーのデータベースに追加することにより、最小限の計算機のオーバーヘッドで済ませられる。このような以前には未知である繰り返し配列ファミリーを追加することにより、より利用価値のある繰り返し配列データベースを構築でき、シングルコピープローブの設計を向上させることができる。以後、さらに大きな繰り返し配列データベースを用いて設計されたシングルコピープローブは、こうした新規の繰り返し配列を含むことはないであろう。発見的アルゴリズムにより、シングルコピープローブ中のシングルコピー部分の配列の割合を向上させることができる。
【０１５５】
慨して、このように本発明は、ゲノム中で未知であった繰り返し配列ファミリーの存在を決定する手法を提供する。この手法は、標識され、シングルコピーと推測されてる核酸プローブが、ゲノムと反応しプローブのハイブリダイゼーションを引き起こす過程と関連している。もし、プローブが、３つ以上の異なる部位（そして、好ましくは１０以上の部位）とハイブリダイゼーションするなら、新規で未知の繰り返し配列が見つかったと判断してよい。
【０１５６】
上記で引用されたすべての参考文献は、本明細書中に参考文献として、適宜引用されている。さらに、２０００年３月２７日に出願された公開文書４７１４４９号明細書の主な記載事項も、本明細書中の参考文献で引用されている。
【０１５７】
関連出願
この出願は、２０００年５月１６日に出願されたシリアル番号０９／５７３０８０の関連出願である。
【０１５８】
［配列表］
本発明に関連して， コンピューターで読み込むことができるＡＳＣＩＩファイルの形式で、６１３の配列を含む配列表が、参照資料として本発明に引用されている、また、３７ＣＦＲ１． ８２１（ｃ）と関連した１枚（１）のオリジナルのコンパクトディスク、３７ＣＦＲ１． ８２１（ｅ）と関連した同じ内容の１つの書面、および３７ＣＦＲ１． ５２と関連した同じ内容の１つの書面が添付されている。
【０１５９】
本発明で使用する可能性のあるコンピュータープログラムのソースコードを含むコンピュータープログラムの一覧が、参考資料として本発明に引用されている、また、後記の全３つの電子ファイルを含んでいる１枚（１）のコンパクトディスクおよびそれと同じ内容の書面が添付されている。
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【図面の簡単な説明】
第１〜１２図は、それぞれＦＩＳＨの結果を、ＣＣＤカメラで撮影した写真である。その中で、様々な遺伝子特異的ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識プローブは、メタフェーズの細胞にハイブリダイゼーションしており、ローダミンが共有結合したジゴキシゲニンに対する抗体により検出された。また、染色体を、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で、対比染色した。染色体の片方または両方にハイブリダイゼーションしている染色体は、矢印によって示されており、一方星印は、通常であれば予想されるハイブリダイゼーションが見られないことを示している。以下に、図面について詳細に説明する。
【図１】第１図は、実施例１で記載されている５１７０ｂｐのＨＩＲＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行った結果を示した写真である。このプローブは、精製した繰り返しのあるＤＮＡ配列とあらかじめ反応させたものである。
【図２】第２図は、第１図の対照実験に対応するハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。同一の５１７０ｂｐのＨＩＲＡプローブを使用しているが、精製した繰り返しのあるＤＮＡとの前反応を行っていないものである。
【図３】第３図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、あらかじめ反応させた３５４４ｂｐの１５ｑ１１−ｑ１３プローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行った結果を示した写真である。
【図４】第４図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、前もって反応させていない３５４４ｂｐの１５ｑ１１−ｑ１３プローブを使用した、対照実験の結果を示した写真である。
【図５】第５図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、前もって反応させていない、実施例２で記載された４１６６ｂｐ、３５４４ｂｐおよび２２９０ｂｐの１５ｑ１１−ｑ１３プローブを使用して行ったハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。
【図６】第６図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、前もって反応させていない、実施例１で記載された５１７０ｂｐ、３６９１ｂｐ、３３４４ｂｐおよび２８４８ｂｐのＨＩＲＡプローブを使用して行ったハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。
【図７】第７図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、あらかじめ反応させた、実施例２で記載されている４８２３ｂｐの１ｐ３６．３プローブを用い、メタフェーズのそれぞれ正常な細胞に対してハイブリダイゼーションを行った結果を示した写真である。
【図８】第８図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、前もって反応させていない４８２３ｂｐの１ｐ３６．３プローブを使用した、対照実験であるハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。
【図９】第９図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、あらかじめ反応させた、実施例２で記載されている４７２４ｂｐおよび４８２３ｂｐの１ｐ３６．３プローブを使用して行ったハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。シングルコピーハイブリダイゼーションは、相同な第１番染色体の短腕上に観察された。
【図１０】第１０図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、前もって反応させていない、実施例２で記載されている４７２４ｂｐおよび４８２３ｂｐの１ｐ３６．３プローブを使用した対照実験であるハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。第９図と同様のシングルコピーハイブリダイゼーションであることが示されている。
【図１１】第１１図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、前もって反応させていない、実施例２で記載された４１６６ｂｐ、３５４４ｂｐおよび２２９０ｂｐの１５ｑ１１−ｑ１３プローブを、染色体アレルの１５ｑ１１−ｑ１３の欠失に原因があることが知られているプレーダー−ウィリ症候群に罹患した患者のメタフェーズの細胞に対して使用したハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。図の中で、星印は欠失した染色体の位置でハイブリダイゼーションが見られないことを示しており、矢印は染色体に１ヶ所だけハイブリダイゼーションしていることを示している。
【図１２】第１２図は、精製した繰り返し配列を有するＤＮＡと、前もって反応させていない、実施例１で記載された３６９１ｂｐ、３３４４ｂｐおよび２８４８ｂｐのＨＩＲＡプローブを、染色体アレルの２２ｑ１１．２配列の欠失に原因があることが知られているＤｉＧｅｏｒｇｅ／Ｖｅｌｏ−Ｃａｒｄｉｏ−Ｆａｃｉａｌ症候群（ＶＣＦＳ）に罹患した患者のメタフェーズの細胞に対して使用したハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。図の中で、星印は欠失した染色体の位置でハイブリダイゼーションが見られないことを示しており、矢印は正常な対立染色体を示している。
【図１３】第１３図は、第２２番染色体にあるＢｒｅａｋａｇｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｒｅｇｉｏｎ遺伝子（ＢＣＲ）プロモーターにみられる、シングルコピープローブ全長に対応する、スキャッタープロットである。この領域の異常は、実施例４で記載されているように、慢性成人骨髄性白血病の症例で共通して見られ、急性リンパ球白血病でも観察される。
【図１４】第１４図は、第９番染色体にあるＡＢＬ１遺伝子にみられる、シングルコピープローブ全長に対応する、スキャッタープロットである。この領域の異常は、実施例４で記載されているように、慢性成人骨髄性白血病で共通して見られ、急性リンパ球白血病でも異常が観察される。
【図１５】第１５図は、ＡＢＬ１癌遺伝子（配列番号５２０〜５２５）由来の染色体である、９ｑ３４−特異的ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識プローブを使用し、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者から採取したＤＡＰＩ染色メタフェーズ細胞にある、ローダミンが共有結合したジゴキシゲニンに対する抗体により検出したＦＩＳＨの結果を、ＣＣＤカメラで撮影した写真である。実施例４で詳述したように、染色体切断点を正確に決定するために、ＡＢＬ１遺伝子とＢＣＲ遺伝子の間の融合領域の下流にあるプローブを使用していることが例示されており、融合した第２２番染色体と正常な第９番染色体が示されている。
【図１６】第１６図は、ＡＢＬ１癌遺伝子（配列番号５１６〜５２５）由来の染色体である、９ｑ３４−特異的ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識プローブを使用し、ＣＭＬの患者から採取したＤＡＰＩ染色メタフェーズ細胞を用い、ローダミン（ｒｅｄ）が共有結合したジゴキシゲニンに対する抗体により検出したＦＩＳＨの結果を、ＣＣＤカメラで撮影した写真である。実施例４で詳述したように、染色体領域９ｑ３４の切断点を正確に決定するために、ＢＣＲ遺伝子とＡＢＬ１遺伝子間の融合部位の、それぞれ由来のプローブを使用していることが例示されており、融合した第２２番染色体、融合した第９番染色体および正常な第９番染色体が示されている。
【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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