(57)【要約】本発明は、ヒトＮＩＭ１キナーゼをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、発現に関連する疾患の特徴付け、診断、評価、治療、または予防における本核酸分子、その断片、その変異体、及びその相補体、更に本タンパク質、その一部、並びにその抗体の利用法を提供する。本発明は更に、本タンパク質を発現させるための発現ベクター及び宿主細胞、並びに遺伝子組換え生物またはモデル系を提供する。
2004503211.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含むタンパク質またはその一部をコードする実質的に精製された核酸分子またはその一部。
【請求項２】
請求項１のポリヌクレオチド、その断片、またはその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む組成物。
【請求項３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４−３０から選択された請求項１の核酸分子の哺乳動物変異体。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−３０またはそれらの相補配列から選択される少なくとも１８の連続するヌクレオチド断片。
【請求項５】
請求項４の断片を含む基板。
【請求項６】
請求項４の断片を含むプローブ。
【請求項７】
請求項１の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）前記タンパク質が発現する条件下で、請求項８の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞から前記タンパク質を回収するステップとを含むことを特徴とするタンパク質生産方法。
【請求項１０】
サンプルにおける核酸分子を検出するための方法であって、
（ａ）請求項４の断片を前記サンプルの少なくとも１つの核酸分子とハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップとを含み、
前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプルにおける前記核酸分子の存在を示すことを特徴とする核酸分子の検出方法。
【請求項１１】
前記断片を脳疾患または癌の治療に用いることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイゼーションの前に、前記サンプルの前記核酸分子を増幅するステップを更に含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
核酸分子を用いて分子または化合物のライブラリをスクリーニングするための方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１の核酸分子を前記分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）特異的な結合を検出して、前記核酸分子に特異的に結合する分子または化合物を同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、人工の染色体作製物、ペプチド、及びタンパク質から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む単離され精製されたタンパク質またはその一部。
【請求項１６】
タンパク質を用いて分子及び化合物のライブラリをスクリーニングする方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１５のタンパク質を前記分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）特異的な結合を検出して、前記タンパク質に特異的に結合する分子または化合物を同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、ペプチド、タンパク質、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、及び薬剤から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体を準備する方法であって、
（ａ）抗体反応が起こる条件下で、請求項１５のタンパク質またはそのタンパク質の抗原性を有する部分で動物を免疫化するステップと、
（ｂ）動物抗体を単離するステップと、
（ｃ）単離した抗体を前記タンパク質でスクリーニングして、前記タンパク質に特異的に結合する抗体を同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
ＮＩＭ１キナーゼに特異的に結合する抗体を用いて疾患を診断する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、前記抗体をサンプルと結合させるステップと、
（ｂ）結合した抗体を検出するステップと、
（ｃ）知られている標準的な方法で発現を比較して、疾患の存在を確認するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記疾患が脳疾患または癌であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、ヒトＮＩＭ１キナーゼをコードする核酸分子に関連し、また、脳疾患及び癌、特に乳癌の特徴付け・診断・予防・治療に、この核酸分子及びこの核酸分子がコードするタンパク質を利用することに関連する。
【０００２】
（発明の背景）
生物間の系統発生的な関係は何度も実証されており、様々な原核生物及び真核生物の研究結果は、分子、生化学的及び生理学的機構、及び代謝経路の漸進的な進化を示している。異なった進化圧力にもかかわらず、線虫、ハエ、ラット、及びヒトのプロテインキナーゼは、共通の化学的及び構造的特徴を有し、同一の一般的な細胞活性を調節する。構造及び／または機能が分かっている生物の核酸配列及びタンパク質配列を比較することにより、ヒト配列の分析が進み、ヒトの病態、疾患、及び障害のための診断薬及び治療薬を検査するためのモデル系の作製が可能となる。
【０００３】
プロテインキナーゼは、タンパク質にリン酸基を付加することにより多くの異なった細胞増殖、細胞分化、及びシグナル伝達を調節する。制御のきかないシグナル伝達は、炎症、癌、動脈硬化、及び乾癬を含む様々な病態に関係することが分かっている。可逆的なタンパク質リン酸化は、真核細胞の活性を調節するための主な方法である。典型的な哺乳動物細胞における１０，０００のタンパク質活性の内の１，０００以上がリン酸化であると推定される。活性化させる高エネルギーのリン酸は、一般にプロテインキナーゼによりアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）から特定のタンパク質に導入され、プロテインホスファターゼによりそのタンパク質から除去される。リン酸化は分子スイッチをオンにするのに類似しており、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、成長及び分化因子などの分子によって仲介される）、細胞周期チェックポイント、及び環境または栄養のストレスに応答して起こる。スイッチがオンになると、適当なプロテインキナーゼが代謝酵素、調節タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャネルまたはポンプ、または転写因子を活性化させる。
【０００４】
プロテインキナーゼは、多様な機能及び特性を有する酵素のスーパーファミリーである最も大きな既知のタンパク質群を構成している。プロテインキナーゼは、通常はそれらの基質、それらの調節分子、または変異表現型の或る特徴によって命名される。基質について述べると、プロテインキナーゼは、チロシン残基をリン酸化する群（プロテインチロシンキナーゼ、ＰＴＫ）とセリンまたはトレオニン残基をリン酸化する群（セリン／トレオニンキナーゼ、ＳＴＫ）との２つの群に概ね分類される。僅かであるがプロテインキナーゼの中には、トレオニン及びチロシン残基の両方をリン酸化する二重特異性を有するものもある。
【０００５】
プロテインキナーゼは、触媒ドメインのいずれかの側に位置するアミノ酸残基の違い（通常は５〜１００残基の間）または触媒ドメインのループ内に挿入されたアミノ酸残基の違いによって複数のファミリーに分類され得る。これらの残基により、標的タンパク質を認識して相互作用する時の各キナーゼの調節が可能となる。殆んど全てのキナーゼは、２つのローブに亘って分布する１１のサブドメインを有する２５０〜３００のアミノ酸からなる類似した触媒ドメインを含む。サブドメインＩ−ＩＶを含むＮ末端ローブは、ＡＴＰ供与体分子と結合しそのＡＴＰ供与体分子を方向付ける。サブドメインＶＩＡ−ＸＩを含む大きなＣ末端ローブは、タンパク質基質と結合し、γリン酸をＡＴＰからセリン、トレオニン、またはチロシン残基の水酸基へ転移させる。サブドメインＶは、Ｎ末端ローブ及びＣ末端ローブに亘っている。
【０００６】
１１のサブドメインのそれぞれは、サブドメインの特徴であって高度に保存されている特異的なアミノ酸残基及びモチーフ、またはアミノ酸パターンを含む（Ｈａｒｄｉｅ及びＨａｎｋｓ （１９９５） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋｓ， Ｖｏｌ Ｉ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ， ｐｐ． ７−２０）。具体的には、２つのプロテインキナーゼシグネチャ配列がキナーゼドメインにおいて同定された。第１のシグネチャ配列は、ＡＴＰ結合に関与する活性部位リシン残基を含み、第２のシグネチャ配列は、触媒活性に重要なアスパラギン酸残基を含む。タンパク質が２つのプロテインキナーゼシグネチャを含む場合、そのタンパク質がプロテインキナーゼである可能性はほぼ１００％である（ＭＯＴＩＦＳ 検索プログラム、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ； Ｂａｉｒｏｃｈら（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：１８９−１９６）。
【０００７】
ＳＴＫファミリー
セカンドメッセンジャー依存性プロテインキナーゼは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ、イノシトール三リン酸、ホスファチジルイノシトール、３，４，５−三リン酸、サイクリックＡＤＰリボース、アラキドン酸、ジアシルクリセロール及びカルシウム−カルモジュリンなどのセカンドメッセンジャーの効果を主に仲介する。サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）はＳＴＫファミリーの重要なメンバーである。ｃＡＭＰは、研究した全ての真核細胞及び動物細胞におけるホルモン作用の細胞内メディエーターである。このようなホルモン誘導性細胞応答には、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾル分泌、プロゲステロン分泌、グリコーゲン分解、骨再吸収、心拍数の調節、及び心筋収縮力の調節が含まれる。ＰＫＡは全ての動物細胞に見られ、これらほとんどの細胞におけるｃＡＭＰの効果に関係すると思われる。ＰＫＡ発現の変化は、癌、甲状腺疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び心血管疾患に関連する（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ， Ｋ． Ｊ．ら，（１９９４） Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｐｐ． ４１６−４３１， １８８７）。
【０００８】
カルシウム−カルモジュリン（ＣａＭ）依存性プロテインキナーゼもまたＳＴＫファミリーのメンバーである。カルモジュリンは、カルシウムの結合に応答して標的タンパク質に結合することにより、多くのカルシウム調節性プロセスを仲介するカルシウム受容体である。これらのプロセスの主な標的タンパク質はＣａＭ依存性プロテインキナーゼである（ＣａＭＫ）。ＣａＭＫは、平滑筋の収縮、グリコーゲン分解（ホスホリラーゼキナーゼ）、及び神経伝達（ＣａＭキナーゼＩ及びＣａＭキナーゼＩＩ）の調節に関与する。ＣａＭＫ Ｉは、神経伝達物質関連タンパク質であるシナプシンＩ及びＩＩ、遺伝子転写調節因子であるＣＲＥＢ、及び嚢胞性繊維コンダクタンス調節タンパク質であるＣＦＴＲを含む様々な物質をリン酸化する（Ｈａｒｉｂａｂｕ， Ｂ．ら，（１９９５） ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １４：３６７９−３６８６）。ＣａＭＫ ＩＩもまた、様々な部位においてシナプシンをリン酸化し、チロシンヒドロキシラーゼのリン酸化及び活性化によって脳におけるカテコールアミンの合成を調節する。ＣａＭの多くは、ＣａＭに結合するのに加えてリン酸化により活性化される。ＣａＭＫは、キナーゼカスケードの一部として他のキナーゼによりリン酸化されたり、自己リン酸化し得る。
【０００９】
もう１つのリガンド活性化プロテインキナーゼは、５’−ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼである（ＡＭＰＫ；Ｇａｏ， Ｇ．ら，（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７１： １７９９８−１７８０３）。哺乳動物ＡＭＰＫは、酵素であるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ及びヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼのリン酸化による脂肪酸及びステロールの合成の調節因子であって、熱ショックやグルコース及びＡＴＰの枯渇などの細胞内ストレスに対するこれらの経路の応答を仲介する。ＡＭＰＫは、触媒αサブユニット、並びにこのαサブユニットの活性を調節すると考えられている２つの非触媒βサブユニット及びγサブユニットからなるヘテロ三量体複合体である。ＡＭＰＫのサブユニットは、脳、心臓、脾臓、及び肺などの非脂肪性組織において予想以上に広く分布している。この分布から脂質の代謝の調節以外にもある役割を果たしていると考えられる。
【００１０】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）もまた、ＳＴＫファミリーのメンバーである。ＭＡＰＫは、リン酸化カスケードを介して細胞表面から核へのシグナル伝達を仲介する。いくつかのサブグループが同定されており、それぞれが異なった基質特異性を有し、固有の細胞外刺激に応答する（Ｅｇａｎ 及び Ｗｅｉｎｂｅｒｇ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６５： ７８１−７８３）。ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は、哺乳動物細胞及び酵母に存在する。哺乳動物経路を活性化する細胞外刺激には、上皮成長因子、紫外線、高浸透圧媒体、熱ショック、内毒素性リポ多糖、腫瘍壊死因子及びインターロイキン−１などの前炎症性サイトカインが含まれる。ＭＡＰＫの発現の変化は、癌、炎症、免疫疾患、及び成長及び発達に影響を及ぼす疾患を含む様々な疾患に関与する。
【００１１】
血清／サイトカイン誘導性ＳＴＫである増殖関連キナーゼ（ＰＲＫ）は、ヒト巨核細胞における細胞サイクル及び細胞増殖の調節に関与する（Ｌｉら （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：１９４０２−８）。ＰＲＫは、細胞分裂に関係するＳＴＫのｐｏｌｏファミリーに関連する。ＰＲＫは肺腫瘍組織においてダウンレギュレートされ、正常組織における抑制の効かないその発現が発癌に繋がるプロトオンコジーンであると思われる。
【００１２】
サイクリン依存性プロテインキナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期を介して細胞の進行を調節するＳＴＫの別の群である。サイクリンは小さな調節タンパク質であって、ＣＤＫに結合してＣＤＫを活性化させる。次に、そのＣＤＫが有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質をリン酸化及び活性化することにより、細胞周期の様々な相を開始させる。ＣＤＫは、活性化するのに複数の入力が必要であるという点でユニークである。サイクリンの結合に加えて、ＣＤＫの活性化には、特定のトレオニン残基のリン酸化及び特定のチロシン残基の脱リン酸が必要である。
【００１３】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（ｈＮＩＭ）をコードする核酸分子の発見により、脳疾患及び癌、特に乳癌の特徴付け、診断、予防、治療に有用な新規の組成物を提供する。
【００１４】
（発明の要約）
ヒトＮＩＭ１キナーゼをコードする実質的に精製された核酸分子の発見に基づき、脳疾患及び癌、特に乳癌の特徴付け・診断・予防・治療に有用な組成物を提供することで当分野の要望に応える。
【００１５】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含むヒトＮＩＭ１キナーゼをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、または断片や相補配列を含む組成物を提供する。本発明は更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４−３０から選択される核酸分子の哺乳動物変異体を提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチドの約４１４〜約１４１４、またはそれらの相補配列から選択される少なくとも１８の連続するヌクレオチド断片を提供する。一実施態様では、本発明はこれらの断片の少なくとも１つを含む基板を提供する。第２の実施態様では、本発明は、検出、スクリーニング、及び精製に用いることができる断片を含むプローブを提供する。更なる実施態様では、このプローブは一本鎖相補ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子である。
【００１６】
本発明は更に、サンプルにおける核酸分子を検出する方法であって、プローブ即ち相補的な核酸分子をそのサンプルの少なくとも１つの核酸分子とハイブリダイズするステップと、ハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、そのハイブリダイゼーション複合体を検出するステップとを含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在がそのサンプルに核酸分子が存在することを示す方法を提供する。一実施態様では、この方法は更に、ハイブリダイゼーションの前にサンプルの核酸分子を増幅するステップを含む。この核酸分子、その断片、またはその相補配列が、アレイ上のエレメントを構成し得る。
【００１７】
本発明はまた、核酸配分子、またはその断片や相補配列を用いて、分子または化合物のライブラリをスクリーニングして、その核酸分子と特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定する方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、その核酸分子をその分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、その核酸分子に対する特異的な結合を検出して、その核酸分子と特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含む方法を提供する。一実施態様では、このような分子及び化合物のライブラリには、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド、ＰＮＡ、及びタンパク質等が含まれる。
【００１８】
本発明はまた、宿主細胞内に含まれている本核酸分子の少なくともある断片を含む発現ベクターを提供する。本発明は更に、タンパク質が発現する条件下で宿主細胞を培養するステップと、そのタンパク質をその宿主細胞から回収するステップとを含むタンパク質の生産方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む単離され精製されたタンパク質またはその一部を提供する。更に、本発明はまた、医薬用担体と共に実質的に精製されたタンパク質またはその一部を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明は更に、本タンパク質の少なくとも一部を用いて抗体を産生させる方法を提供する。本発明はまた、タンパク質を用いて分子または化合物のライブラリをスクリーニングして、そのタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定する方法を提供する。この方法は、特異的な結合が許容される条件下で、そのタンパク質を分子または化合物のライブラリと結合させるステップと、結合したタンパク質を検出して、そのタンパク質と特異的に結合したリガンドを同定するステップとを含む。このような分子及び化合物のライブラリには、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、免疫グロブリン、薬剤化合物、擬態、ペプチド、医薬品、及びその他のリガンドが含まれる。本発明は更に、本タンパク質を用いてリガンドを精製する類似の方法を提供する。この方法は、特異的な結合が許容される条件下で、本タンパク質をサンプルと結合させステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、そのリガンドから本タンパク質を分離して、精製されたリガンドを得るステップとを含む。
【００２１】
本発明は更に、ヒトＮＩＭ１キナーゼに対して作製された抗体を用いるスクリーニング法により同定された抗体を提供する。抗体を作製する方法は、抗体反応が起こる条件下で、ヒトＮＩＭ１キナーゼ若しくは抗原性を有するその一部で動物を免疫化するステップと、動物抗体を単離するステップと、単離した抗体をＮＩＭ１キナーゼでスクリーニングして、Ｎｉｍ１キナーゼに特異的に結合する抗体を同定するステップとを含む。一実施態様では、これらの抗体は、脳疾患及び癌の存在の確認における診断用組成物として有用である。別の実施態様では、この抗体を医薬組成物として、ヒトＮＩＭ１キナーゼの過剰な発現に関連する脳疾患及び癌の治療に用い得る。
【００２２】
本発明は更に、哺乳動物のゲノムＤＮＡの中にマーカー遺伝子を挿入して、その天然の核酸分子の発現を阻止する方法を提供する。本発明はまた、核酸分子を用いて哺乳動物モデル系を作製する方法を提供する。この方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−３０から選択される核酸分子を含むベクターを作製するステップと、そのベクターを胚性幹細胞に形質転換するステップと、形質転換された胚性幹細胞を選択するステップと、この形質転換した肺性幹細胞を哺乳動物胚盤胞の中に微量注入して、キメラ胚盤胞を作製するステップと、偽妊娠メスにキメラ胚盤胞を移植して、このメスから、その生殖細胞系の中にこの核酸分子を含むキメラ子孫が出産されるようにするステップと、そのキメラ哺乳動物を交配してホモ接合性哺乳動物モデル系を作製するステップとを含む。
【００２３】
（本発明の実施方法について）
本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いるものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は当業者には周知の複数の宿主細胞を含む。
【００２４】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【００２５】
（定義）
「ＮＩＭ１キナーゼ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などの任意の種（ウシ、ヒツジ、ブタ、齧歯類、イヌ、サルを含むが好ましくはヒトである哺乳動物）から得られる実質的に精製された酵素を指す。
【００２６】
「生物学的に活性」は、構造的または免疫学的、調節的、化学的な機能を有する、天然或いは組換え、または合成分子であるタンパク質を指す。
【００２７】
「相補的な」は、プリン塩基とピリミジン塩基との自然な水素結合による塩基対形成を指す。例えば、配列Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔは、その相補配列Ｔ−Ｇ−Ｃ−ＡまたはＵ−Ｇ−Ｃ−Ａと水素結合する。２つの一本鎖分子の相補性は、ヌクレオチドの幾つかのみが結合する部分的な相補性と、ヌクレオチドの殆ど全てが結合する完全な相補性とがある。核酸鎖間の相補性の程度は、ハイブリダイゼーション及び増幅反応の効率及び強度に影響する。
【００２８】
「誘導体」は、化学修飾された核酸分子やタンパク質配列を指す。化学修飾には、分子や配列の生物学的活性または寿命を維持或いは増大する、アルキル基またはアシル基、アミノ基による水素の置換や、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、または類似の任意のプロセスが含まれる。
【００２９】
「断片」は、有用な機能的特性を維持する核酸分子の任意の一部またはインサイト社クローンを指す。有用な断片は、一般にその長さが少なくとも１８の連続するヌクレオチドであり、ハイブリダイゼーション、増幅、またはスクリーニング、更に複製、転写、または翻訳の調節に用いられ得るオリゴヌクレオチドを含む。
【００３０】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリン塩基とピリミジン塩基との間の水素結合の形成による２つの核酸分子の複合体を指す。
【００３１】
「リガンド」は、核酸分子やタンパク質の相補部位に特異的に結合する任意の分子や物質、または化合物を指す。このようなリガンドは、核酸及びタンパク質、炭水化物、脂肪、脂質を含む無機及び有機物質の少なくとも１つからなり、本発明の核酸分子やタンパク質の活性を安定化させたり、調節したりする。
【００３２】
「核酸分子」は、核酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ分子、またはそれらの任意の断片や相補配列を指す。また、「核酸分子」は、ゲノム若しくは合成起源の二本鎖若しくは一本鎖のＤＮＡ或いはＲＮＡが可能であり、炭水化物または脂質、タンパク質、その他の物質と結合して、形質転換などの特殊な作用を起こしたり、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の有用な組成物を形成する。核酸分子はまた、非翻訳５’または３’調節領域またはイントロンを含み得る。核酸分子の大きさは、好ましくは約１５〜１０，０００ヌクレオチドであり、より好ましくは約６０〜６，０００ヌクレオチドであり、最も好ましくは約４００〜５０００ヌクレオチドである。「オリゴヌクレオチド」は、アンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）、プライマー、オリゴマー、エレメント、標的、及びプローブと実質的に同一であり、好ましくは一本鎖であって、その長さは好ましくは約２２〜２５ヌクレオチドである。
【００３３】
「タンパク質」は、天然或いは合成のアミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはそれらの一部を指す。
【００３４】
ここで用いる「一部」は、あらゆる目的に用いられるタンパク質の任意の一部を指すが、特に、分子や化合物のライブラリをスクリーニングしてそのタンパク質の一部と特異的に結合する分子を同定するために、または抗体の産生のために用いられる。
【００３５】
「レポーター遺伝子」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体を標識するために用いられる化学成分または生化学成分である。レポーター遺伝子には、限定するものではないが、放射性核種、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光剤、色素剤、化学発光剤、及び磁石粒子等が含まれる。レポーター分子は、特定のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体に特異的に結合させ、その存在を確認し、それらを定量することができる。
【００３６】
「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体などを含むサンプルは、体液や、細胞が成長する細胞溶液、即ち培養液の可溶性画分や、細胞から単離或いは抽出した染色体、細胞小器官、または膜や、溶液中に存在する或いは基板に結合されたゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡや、組織、細胞、組織プリント、またはフィンガープリント、皮膚、髪等を含み得る。
【００３７】
ポリヌクレオチド配列における「類似性」とは、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つの配列間の一致する残基数から求められる。このようなプログラムは、２つの配列間のアラインメントを最適化するべく、標準的かつ再現性のある方法で比較する配列内にギャップを挿入可能なため、２つの配列間のより有意な比較を達成することが可能である。
【００３８】
「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、２つの分子間の相互作用を指す。ポリヌクレオチドの場合、特異的な結合には、センス鎖とアンチセンス鎖との間の水素結合、複製または転写に影響を与える一本鎖とタンパク質との間の水素結合、ＤＮＡ分子の主溝または副溝への分子または化合物の挿入、転写因子、エンハンサー、及びリプレッサー等として機能する少なくとも１つの分子との相互作用が含まれる。ポリペプチドの場合、特異的な結合には、上記したようなポリヌクレオチドとの相互作用、或いはアゴニスト、抗体、またはアンタゴニストなどの分子や化合物との相互作用が含まれる。特異的な結合は、分子間の好適な化学的相互作用または分子相互作用を許容する構造的特性の存在に左右される。
【００３９】
「実質的に精製された」は、その自然環境から切り離されてから分離或いは単離された、自然環境では結合しているその他の成分が少なくとも約６０％、好適には約７５％、最も好適には、約９０％取り除かれた核酸分子またはタンパク質を指す。
【００４０】
「基板」は、核酸分子またはタンパク質が結合した任意の固体或いは半固体の支持物を指し、膜またはフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、毛細管または他のチューブ、プレート、ポリマー、微小粒子が含まれる。この基板は、孔または溝、ピン、チャネル、細孔を含む様々な表面形態を有する。
【００４１】
（発明）
本発明は、ヒトＮＩＭ１キナーゼをコードする新規の核酸分子の発見に基づき、脳疾患及び癌の特徴付け・診断・治療・予防においてこの核酸分子やその断片、またはタンパク質やその一部を直接、或いは組成として用いることに関する。
【００４２】
本発明のＮＩＭ１キナーゼをコードする核酸分子は、小脳ライブラリ（ＣＲＢＬＮＯＴ０１）のインサイト社クローン６７０２７９と受精卵の分裂及び分化の極性にとって重要な線虫の推定上のＳＴＫ（Ｇ７３３１２２）との間のＢＬＯＣＫ ＩＩ相同性一致によってキナーゼとして始めに同定された。完全長の核酸分子であるインサイト社クローン３３１７６０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、インサイト社ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（１９９９年３月公表）テンプレート２００７００．１、アセンブリ６７０２７９ＣＢ１及びインサイト社クローン（ライブラリ）：３３１７６０８Ｈ１ （ＰＲＯＳＢＰＴ０３）、４３１３７１３Ｈ１ （ＢＲＡＦＮＯＴ０１）、４６１７０８２Ｈ１ （ＢＲＡＹＤＩＴ０１）、４７１１６４４Ｈ１ （ＢＲＡＩＨＣＴ０１）、２２８６３２４Ｈ１ （ＢＲＡＩＮＯＮ０１）、２２８６８１６Ｈ１ （ＢＲＡＩＮＯＮ０１）、２２８７２１７Ｈ１ （ＢＲＡＩＮＯＮ０１）、２２８６８１６Ｒ６ （ＢＲＡＩＮＯＮ０１）、２２８６８１６Ｔ６ （ＢＲＡＩＮＯＮ０１）、３３１７６０８Ｔ６ （ＰＲＯＳＢＰＴ０３）、４２０１８９６Ｔ６ （ＢＲＡＩＴＵＴ２９）、４６２４８１１Ｔ６ （ＦＩＢＲＴＸＴ０２）、６５５９８３４Ｈ１ （ＢＲＡＦＮＯＮ０２）、６７０２７９Ｆ１ （ＣＲＢＬＮＯＴ０１）、６７０２７９Ｈ１ （ＣＲＢＬＮＯＴ０１）、６７０２７９Ｒ１ （ＣＲＢＬＮＯＴ０１）、６７０２７９Ｒ６ （ＣＲＢＬＮＯＴ０１）、６７０２７９Ｔ６ （ＣＲＢＬＮＯＴ０１）、及び４９３６４４６Ｈ１ （ＢＲＡＸＮＯＴ０３）、即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２３を用いてシークエンシングし、構築した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をコードするポリヌクレオチドの有用な断片には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の約４１４番目のヌクレオチドから約１４１４番目のヌクレオチド、またはそれらの相補配列から選択された少なくとも１８の連続するヌクレオチドの断片が含まれる。
【００４３】
図１Ａ−図１Ｆは、本核酸分子配列及び推論されるアミノ酸に翻訳された配列を示す。ヒトＮＩＭ１キナーゼのコード領域を含むインサイト社クローン番号３３１７６０８は、Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）に保管され、特許保管指定（Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ： ＰＴ−１２１７）を受けている。
【００４４】
図２に示すように、電子的ノーザン分析は、ＮＩＭ１キナーゼをコードする転写物の神経系における極めて特異的な発現を示す。これらのライブラリの全ては脳に由来し、その内の５つは癌に関連し、３つは発作に関連し、２つはハンチントン病に関連し、１つは癲癇に関連する。この転写物は、１０３９のライブラリ及び５００万を超える配列を含むＬＩＦＥＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）において、脳以外のライブラリでは癌性乳房繊維芽細胞ＦＩＢＲＴＸＴ０２及び癌性前立腺ＰＲＯＳＢＰＴ０３の２つのライブラリにおいてのみ発現が確認された。
【００４５】
図３に示すように、ノーザン分析はまた定量ＰＣＲを用いて実験室でも行った。ヒトＮＩＭ１キナーゼ転写物の発現は、Ｈ４６０、Ａ２７８０、Ａ３７５、ＨＤＦ、ＨＥＬＡ、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、Ｕ８７−ＭＧ、及びＢＸ−ＰＣ３細胞系、並びに脳、結腸、子宮、及び胎盤の組織に見られた。注目すべきは、ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ２３１及び脳組織はそれぞれ、ヒトＮＩＭ１キナーゼ転写物の発現が約１００倍及び１５５倍を示し、脳、子宮頚、結腸、肺、卵巣、及び前立腺の癌を示す細胞系、並びに正常な子宮及び胎盤において５倍以上の発現が見られた。
【００４６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むＮＩＭ１キナーゼは、アミノ酸４３６個の長さであり、Ｍ１からＡ１８までの可能性のあるシグナル配列、及びＳ５６、Ｔ１０８、Ｔ１１４、Ｓ１２３、Ｓ１６９、Ｓ２２１、Ｓ２８２、Ｙ２８８、Ｔ３１１、Ｔ３３２、Ｔ３４９、Ｓ３５９、Ｓ４２０、及びＴ４２９残基における潜在的なリン酸化部位を有する。図４に示すように、ヒトＮＩＭ１キナーゼを基準として用いて、アラインメントにおけるキナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１−３６）の触媒領域の保存された残基、モチーフ、及びサブドメインを調べた。分かった保存された残基、モチーフ、及びサブドメインは、Ｇ８１からＶ８８残基までのサブドメイン１、保存されたＡ１０１及びＫ１０３残基を有するサブドメイン２、インバリアントなＥ１２１残基を有するサブドメイン３、Ｅ１５１からＥ１５７残基まで延在するインバリアントな残基Ｍ１５０及びＹ１５２を共有するサブドメイン５、Ｈ１９４からＮ２０１までの触媒ループであるサブドメイン６Ｂ、高度に保存されたトリプレットＤ２１４、Ｆ２１５、及びＧ２１６を有するサブドメイン７、Ａ２３８、Ｐ２３９、Ｅ２４０モチーフを含むＴ２２９からＦ２４２までのサブドメイン８、インバリアントＤ２５３を有するサブドメイン９、サブドメイン８のＡＰＥモチーフと相互作用するインバリアントＲ２４４を有するサブドメイン１１である。触媒ドメインのＣ末端境界は、Ｈ２４８、Ａ２４９、及びＦ２５０で始まる。ＰＦＡＭ及びＰＲＩＮＴＳの両方により、キナーゼドメインが確認された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドの有用な断片には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の約１から約２９５番目までの残基から選択された少なくとも６個の連続するアミノ酸断片が含まれる。
【００４７】
図５は、ヒトＮＩＭ１キナーゼアッセイを示す。ｈＮＩＭ１キナーゼ−ＧＳＴの自己リン酸化がレーン１、レーン２、及びレーン４に見られ、その基質ＭＢＰの自己リン酸化がレーン２に見られ、ＨＩＳＴ．１の自己リン酸化がレーン４に見られる。キナーゼが存在しない基質ＭＢＰのレーン３及びＨＩＳＴ．１のレーン５は自己リン酸化を示さない。レーン６はポジティブコントロールＺＡＰ７０を示す。
【００４８】
ヒトＮＩＭ１キナーゼをコードする核酸分子の哺乳動物変異体を、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ： Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５： ３３８９−３４０２； Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６： ２９０−３００； 及びＡｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３−１０， ｗｉｔｈ ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を用いて同定し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−２３と整列するクローンをＬＩＦＥＳＥＱまたはＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）において同定した。哺乳動物変異体は、ＺＯＯＳＥＱデータベーステンプレート（１９９９年１２月に構築）２１６１５０．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２４）及びインサイト社クローン：ラットに由来する７０１９２５４４１Ｈ１ （ＲＡＬＩＴＸＳ０３）、７０１９１０６３２Ｈ１ （ＲＡＢＹＵＮＮ０２）、７０１９０５５１４Ｈ１ （ＲＡＢＹＵＮＳ０９）、７０１２９３８２６Ｈ１ （ＲＡＢＸＮＯＴ０４）、及び７００９４９５４３Ｈ１ （ＲＡＳＰＮＯＮ０２）、並びにサルに由来する７００７０６９５０Ｈ１ （ＭＮＢＦＮＯＴ０１）、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５−３０である。これらの核酸分子は、ヒト疾患モデルとなる遺伝子組替え生物を作成するために特に有用であり、このようなヒト疾患モデル動物を用いてこのような疾患に対する有望な治療方法を研究することが可能である。
【００４９】
核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそれらの断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−３０）を、ハイブリダイゼーション、増幅、及びスクリーニングに用いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とサンプルの類似分子との間の同定及び区別をすることが可能である。ヒト分子及びそれらの哺乳動物変異体を用いて、ヒト疾患モデルとなる遺伝子組替え生物を作製して、このヒト疾患モデルを用いて有望な治療方法を研究することができる。毒学的研究、臨床トライアル、及び被験動物／患者の治療プロフィールを、本核酸分子、タンパク質、並びに本発明の核酸分子及びタンパク質を用いて同定された抗体、分子、及び化合物を用いて作成し、モニタリングすることができる。
【００５０】
（本発明の特徴及び使用）
ｃＤＮＡライブラリ
ここに開示する特定の実施例では、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物の細胞及び組織からｍＲＮＡを単離し、これを用いてｃＤＮＡライブラリを作製する。上記したインサイト社クローンは、哺乳動物ｃＤＮＡライブラリから単離された。本発明の代表的な３つのライブラリの作製方法を後述する実施例に示す。コンセンサス配列は、Ｐｈｒａｐ （Ｐ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）及びＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、ＡＵＴＯＡＳＳＥＭＢＬＥＲアプリケーション（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）などのコンピュータプログラムを用いて、インサイト社クローンを含む断片、伸長、及び／またはショットガン配列から化学的かつ／または電子的に構築した。クローン、伸長配列及び／またはショットガン配列は、クラスター及び／または主クラスターの中にに電子的に組み入れられた。
【００５１】
シークエンシング
核酸をシークエンシングする方法は当分野で周知であり、そのような方法を用いて本発明の任意の実施例を実施することができる。これらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩであるクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び熱耐性Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （ＡＰＢ）， Ｐｉｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）に用いられるような校正エクソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせを用いることができる。配列の準備は、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）、及びＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）などの装置を用いて自動的に行うのが望ましい。シークエンシングに用いる装置には、ＡＢＩ ３７００、３７７または３７３ＤＮＡシークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（ＡＰＢ）等がある。当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて、シークエンシングした配列を解析することができる。これらのアルゴリズムは、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９７； Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７） 及びＭｅｙｅｒｓ（１９９５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３）に記載されている。
【００５２】
ショットガンシークエンシングを用いて、目的の特定のクローニングしたインサートを完全な配列にすることが可能である。ショットガン法は、元のインサートを様々な大きさのセグメントにランダムに分割して、これらの断片をベクターにクローニングする。これらの断片を、元のインサートの全配列が分かるまで重複した端部を用いてシークエンシング即ち再構築する。ショットガンシークエンシング方法は当分野で周知であり、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼや非熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ、及び目的の核酸分子に隣接する代表的な領域から選択されたプライマーを用いる。当分野で周知のＣＯＮＳＥＤ（Ｇｏｒｄｏｎ （１９９８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ８：１９５−２０２）などの様々なアルゴリズムやプログラムを用いて、組み立てが不完全な配列を調べる。ベクターやキメラ配列、または欠失配列を含む汚染配列を除去して、組み立てが不完全な配列を完全な配列に組み立てる。
【００５３】
核酸配列の伸長
本発明の配列は、当分野で周知の様々なＰＣＲ法を用いた方法で伸長することができる。例えば、ＸＬ−ＰＣＲキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び入れ子プライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）、市販のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリ用いてヌクレオチド配列を伸長することが可能である。全てのＰＣＲ系の方法に用いることができるように、プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）等の市販のソフトウエアを用いて、ヌクレオチドの長さが約２２〜３０個、ＧＣ含量が約５０％以上、約５５〜６８℃の温度で標的配列とアニールするように設計することが可能である。調節エレメントを復活させるために配列を伸長する場合は、ｃＤＮＡライブラリよりゲノムライブラリを用いる方が良い。
【００５４】
（本哺乳動物核酸分子の使用）
ハイブリダイゼーション
本核酸分子及びその断片は、様々な目的のための様々なハイブリダイゼーション技術に用いることができる。プローブは、５’調節領域や非保存領域（即ち、本タンパク質の保存された触媒ドメインをコードするヌクレオチドの５’や３’）などのユニークな領域から作製可能であり、これらのプローブを、ヒトＮＩＭ１キナーゼ、アレル変異体、または関連分子をコードする天然の分子を同定するためのプロトコルに用いることができる。このプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる一本鎖が可能であって、任意の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−３０）と少なくとも５０％の配列同一性を有すべきである。ハイブリダイゼーションプローブは、レポーター分子の存在下でのＰＣＲ増幅、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、または末端標識化を利用して作製することができる。この核酸分子またはその断片を含むベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加えてｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡプローブを作製することができる。これらの方法はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＡＰＢ）社が販売するキットを用いて行うことができる。
【００５５】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（厳密性）は、プローブのＧＣ含量、塩濃度、及び温度によって決まる。特に、塩濃度を下げる、またはハイブリダイゼーションの温度を上げて、ストリンジェンシーを高めることができる。あるメンブレンを用いるハイブリダイゼーション用の溶液にホルムアミドなどの有機溶媒を加えて、反応が低い温度で起こるようにすることができる。ハイブリダイゼーションは、低いストリンジェンシーの緩衝液（５×ＳＳＣ、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で、６０℃で行うことができるが、核酸配列間に不適正塩基対を含む複合体の形成を許容し得る。続く洗浄は、４５℃（中程度のストリンジェンシー）或いは６８℃（高いストリンジェンシー）の何れかの温度、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなどの高いストリンジェンシーで行う。高いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、完全に相補的な核酸分子部分のみが安定して保持される。あるメンブレンを用いるハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは３５％、最も好ましくは５０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げたり、または、ＳａｒｋｏｓｙｌやＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤及び変性したサケ精子ＤＮＡなどのブロッキング試薬を用いてバックグラウンドシグナルを低減することが可能である。ハイブリダイゼーションの条件や要素の選択については当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出） 及びＳａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ．に記載されている。
【００５６】
当分野で周知の方法でアレイを準備して分析することができる。オリゴヌクレオチドをアレイのプローブや標的として用いることができる。アレイを用いて、同時に極めて多数の遺伝子の発現レベルをモニタリングし、遺伝子変異体、突然変異及びＳＮＰ（一塩基多型）を同定することができる。このようなデータを用いて、遺伝子機能の解明や、症状及び疾患、または障害における遺伝子原理の解明や、症状及び疾患、障害の診断または治療、治療薬の開発、並びにこれらの治療薬の活性のモニタリングが可能である（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ他（１９９５） 米国特許第５，４７４，７９６号； Ｓｃｈｅｎａ他（１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ他（１９９５） ＰＣＴ出願 ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ他（１９９５） ＰＣＴ出願ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； ａｎｄ Ｈｅｌｌｅｒ他（１９９７） ５，６０５，６６２を参照）。
【００５７】
ハイブリダイゼーションプローブはまた、天然のゲノム配列のマッピングに有用である。このプローブを、（１）特定の染色体、（２）染色体の特定の領域、（３）ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１作製物、または単一の染色体ＤＮＡライブラリなどの人工染色体作製物にハイブリダイズさせることが可能である。
【００５８】
発現
ＮＩＭ１キナーゼをコードする多数の核酸分子をベクターにクローニングして、このタンパク質若しくはその一部を宿主細胞で発現させることができる。この核酸配列を、ＤＮＡシャフリング（米国特許第５，８３０，７２１号）や部位特異的変異誘発などの方法によって、新規の制限部位を作り出したり、グリコシル化パターンを変えたり、優先コドンを変えて特定の宿主における発現を増大させたり、スプライスバリアントを作り出したり、半減期を延長する等の操作が可能である。この発現ベクターは、特定の宿主における各要素の効率に基づいて選択された様々なサンプルに由来する転写及び翻訳調節エレメント（プロモーター及びエンハンサー、特定の開始シグナル、ポリアデニル化３’配列）を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術を組み合わせて、このベクターに核酸配列と調節エレメントをつなぐことができる。このような技術は、当分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出、ｃｈ． ４， ８， １６ ａｎｄ １７）に記載されている。
【００５９】
様々な宿主系を発現ベクターで形質転換することができる。以下に限定するものではないが、これらの中には組換えバクテリオファージやプラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌と、酵母発現ベクターで形質転換された酵母と、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換された昆虫細胞系と、ウイルスエレメント及び／または細菌エレメントを含む発現ベクターで形質転換された植物細胞系や動物細胞系が含まれる（Ａｕｓｕｂｅｌ前出、ｕｎｉｔ １６）。例えば、アデノウイルス転写／翻訳複合体を哺乳動物細胞に用いることができる。配列をウイルスのゲノムのＥ１若しくはＥ３領域に結合させた後、この感染ウイルスを用いて形質転換させ、宿主細胞でタンパク質を発現させることができる。また、ラウス肉腫ウイルスエンハンサーやＳＶ４０、またはＥＢＶ系のベクターを用いてタンパク質を高発現させることができる。
【００６０】
核酸配列のルーチンのクローニング及びサブクローニング、増殖は、多機能ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行うことができる。核酸配列をこれらのベクターの多数のクローニング部位に導入すると、ｌａｃＺ遺伝子が破壊され、形質転換された細菌を確認するための比色法によるスクリーニングが可能となる。更に、これらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写及びジデオキシ法によるシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の調整、入れ子状欠失の作製において有用である。
【００６１】
長期に渡って組換えタンパク質を産生させるために、同一或いは別のベクター上の選択マーカー遺伝子或いは可視マーカー遺伝子と共にこのベクターを持続的に細胞株に形質転換することができる。形質転換後、細胞を強化培地で約１〜２日間増殖させてから選択培地に移す。選択マーカー、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性遺伝子は、関連する選択薬に対する抵抗性を与え、導入配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどの可視マーカーの発現によって同定された、或いは選択培地に生存することによって同定された耐性クローンを、培養技術を用いて増殖することができる。また、可視マーカーを用いて、導入された遺伝子によって発現するタンパク質を定量することができる。宿主細胞が目的の哺乳動物核酸分子を含むか否かの決定は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、或いはＰＣＲ増幅技術に基づいて行うことができる。
【００６２】
宿主細胞は、組換えタンパク質を目的の形に修飾する能力に基づいて選択することができる。このような修飾には、アセチル化及びカルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化等が含まれる。「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングを利用して、タンパク質のターゲッティング、折り畳み及び／または活性を特定することができる。翻訳後活性のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有するＡＴＣＣから得られる様々な宿主細胞から、組換えタンパク質の適当な修飾及びプロセシングが確実に行われるように好適な宿主細胞を選択することができる。
【００６３】
細胞培地からのタンパク質の回収
精製を容易にするために、ベクターに導入する異種部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ等を含む。ＧＳＴ及びＣＢＰ、６−Ｈｉｓはそれぞれ、グルタチオン及びカルモジュリン、金属キレート樹脂が結合した市販のアフィニティーマトリックスを用いて精製される。ＦＬＡＧ及びＭＹＣは、市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて精製される。目的のタンパク質配列と異種部分との間にタンパク分解切断部位を設けて、生成の後の分離が容易にすることができる。組換えタンパク質の発現及び精製の方法はＡｕｓｕｂｅｌ（前出、ｕｎｉｔ １６）に記載され市販されている。
【００６４】
ペプチドの化学合成
タンパク質若しくはその一部は、組換え方法以外の当分野で周知の化学的方法によって合成することもできる。固相技術を用いるペプチド合成は、バッチ式或いは連続的なフロープロセスによって行うことができる。連続的なフロープロセスでは、αアミノ保護及び側鎖保護アミノ酸残基をリンカーを介して不溶性の高分子支持物に連続的に追加する。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカーを、ポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）に結合させて支持レジンを形成する。このアミノ酸残基は、酸不安定Ｂｏｃ（ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）法若しくは塩基不安定Ｆｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）法によって保護されたＮ−α−である。保護されたアミノ酸のカルボキシル基をリンカーのアミンに結合して、この残基を固相支持レジンに結合させる。Ｂｏｃ若しくはＦｍｏｃを用いた場合、トリフルオロ酢酸若しくはピペリジンを用いて保護基を除去する。カップリング試薬若しくは予め活性化されたアミノ酸誘導体を用いて、追加する各アミノ酸を結合された残基に付加してから、レジンを洗浄する。完全長のペプチドは、連続的な保護の停止、即ち誘導体化アミノ酸を結合させて合成し、ジクロロメタン及び／またはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄する。このペプチドは、ペプチドカルボキシル末端とリンカーとの間で切断され、ペプチド酸またはペプチドアミドが作られる（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ １９９７／９８ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ ｐｐ． Ｓ１−Ｓ２０）。ＡＢＩ ４３１ Ａ ペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの装置を用いて、ペプチドを自動合成することができる。タンパク質またはその一部は調整用の高性能液体クロマトグラフィーによって実質的に精製し、その組成をアミノ酸解析またはシークエンシングによって確認することができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【００６５】
抗体の準備及びスクリーニング
ヤギ及びウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む様々な宿主は、ヒトＮＩＭ１キナーゼ若しくはその任意の一部を注入して免疫することができる。フロイントなどのアジュバント及びミネラルゲルと、リゾレシチン及びｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノールなどの表面活性物質とを用いて免疫反応を高めることができる。オリゴペプチドやペプチド、またはタンパク質の一部を用いて、少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは１０個の天然のタンパク質の一部と同一のアミノ酸を含む抗体を誘発させる。キメラ分子に対する抗体を産生させるために、オリゴヌクレオチドをＫＬＨなどのタンパク質と融合させることができる。
【００６６】
モノクローナル抗体は、培地の連続細胞株によって抗体を産生させる任意の技術を用いて準備する。以下に限定するものではないが、このような技術には、ハイブリドーマ技術及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ他（１９８５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２： Ｃｏｔｅ他（１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； ａｎｄ Ｃｏｌｅ他（１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０．を参照）。
【００６７】
別法では、当分野で周知の方法を用いる上記した一本鎖抗体を生産する技術で、エピトープ特異的一本鎖抗体を生産する。ヒトＮＩＭ１キナーゼのエピトープに対して特異的に結合する部位を含む抗体断片を生産することが可能である。限定するものではないが、このような断片には、例えば、抗体分子のペプシン消化によって作製されたＦ（ａｂ’）２断片及びこのＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させて作製したＦａｂ断片が含まれる。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製して、目的の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の高速かつ容易に同定できるようにする（例えば、Ｈｕｓｅ他（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）。
【００６８】
ヒトＮＩＭ１キナーゼまたはその一部を用いて、ファージミドまたはＢリンパ球免疫グロブリン・ライブラリをスクリーニングして、目的の特異性を有する抗体を同定する。確立された特異性を有するモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のいずれか一方を用いる、競合的結合またはイムノアッセイの様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイムノアッセイは通常、このタンパク質とその特異的な抗体との複合体形成の測定を行う。２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合によるアッセイを用いることもできる（Ｐｏｕｎｄ （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【００６９】
アッセイのための分子の標識化
多様な標識化及び接合技術は当分野で周知であり、様々な核酸やアミノ酸、及び抗体のアッセイに用いることができる。標識した分子の合成は、３２Ｐ−ｄＣＴＰまたはＣｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰなどの標識したヌクレオチドや３５Ｓメチオニンなどのアミノ酸を組み込むためのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈキットまたはＰｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて行うことができる。ヌクレオチド及びアミノ酸は、ＢＩＯＤＩＰＹまたはＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）などの試薬を用いて分子中に存在するアミン及びチオール基または他の基に化学的に結合させることで、様々な物質（蛍光剤または化学発光剤、色素産生剤など）で直接標識することができる。
【００７０】
（診断）
本核酸分子、断片、オリゴヌクレオチド、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡを用いて、遺伝子発現の変化、ｍＲＮＡの過剰な発現の不在／存在の検出及び定量、または治療期間中のｍＲＮＡレベルのモニタリングを行うことができる。同様に、ヒトＮＩＭ１キナーゼに特異的に結合する抗体を用いて本タンパク質を定量することもできる。発現の変化に関連する疾患には、静坐不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、不安、遺伝性運動失調、脳性麻痺、痴呆、皮膚筋炎、ジストニー、ダウン症候群、癲癇、虚血性脳血管障害、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、ハンチントン病、細菌性及びウイルス性髄膜炎、多発性硬化症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、脳腫瘍、神経線維腫症、パーキンソン病、ピック病、多発性筋炎、色素性網膜炎、分裂病、発作、並びに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮などの癌が含まれる。診断アッセイにハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて、遺伝子発現の変化を検出するべく、患者からの生体サンプルの遺伝子発現レベルを標準的なサンプルの値と比較する。質的または量的なこのような比較法は当分野で周知である。
【００７１】
例えば、本核酸分子またはプローブを標準的な方法で標識して、これをハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者からの生体サンプルに加える。インキュベーションの後、このサンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に関連する標識（シグナル）の量を定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおける標識の量が標準値と著しく異なっている場合は、関連する症状や疾患、または異常症の存在が示唆される。
【００７２】
遺伝子発現に関連する症状や疾患、または異常症の診断のための基準を設けるために、正常或いは標準的な発現プロフィールを確立する。この発現プロフィールは、動物かヒトの正常な被験体から採取した生体サンプルを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、プローブと結合させることによって確立することができる。標準的なハイブリダイゼーションの量を、正常な被験者から得た値と、実質的に精製された標的配列を所定量用いた実験値とを比較することによって求めることができる。このように求めた標準値を、特定の症状や疾患、または異常症を示す患者のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と特定の症状に関連する値との偏差からその症状を診断する。
【００７３】
またこのようなアッセイを用いて、動物実験や臨床検査における特定の治療計画の効果を評価したり、患者個人の治療をモニタリングすることができる。病態が確認されると治療プロトコルを開始し、通常ベースで診断アッセイを繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたか否かを調べることが可能である。連続して行ったアッセイの結果から、数日から数ヶ月に渡る期間の治療効果を調べることができる。
【００７４】
免疫学的方法
特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体の何れかを用いるタンパク質の検出及び定量は当分野で周知である。このような技術には、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーター法（ＦＡＣＳ）が含まれる。２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ 他 （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ； 及び Ｐｏｕｎｄ 前出）。
【００７５】
（治療）
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の所定の領域と図４Ａ−図４Ｃに示すキナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１−３５）の所定の領域との間に、キナーゼ触媒ドメインの文脈における化学的及び構造的な類似性が存在する。加えて、遺伝子発現が、図２及び図３に示されているように、脳、前立腺、及び乳房、並びに癌に密接に関連する。ヒトＮＩＭ１キナーゼは、脳及び神経系の疾患、特に脳腫瘍、発作、癲癇、ハンチントン病、並びに脳、子宮頚、結腸、肺、卵巣、及び前立腺の癌において或る役割を果たしていると思われる。脳腫瘍及び乳癌などの発現の大幅な上昇に関連する症状の治療においては、発現またはタンパク質活性を低下させることが望ましい。
【００７６】
一実施例では、発現若しくは活性の上昇に関連する疾患の治療または予防のために、ヒトＮＩＭ１キナーゼのインヒビター、アンタゴニスト、または抗体を投与し得る。発現の変化に関連する疾患には、静坐不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、不安、遺伝性運動失調、脳性麻痺、痴呆、皮膚筋炎、ジストニー、ダウン症候群、癲癇、虚血性脳血管障害、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、ハンチントン病、細菌性及びウイルス性髄膜炎、多発性硬化症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、脳腫瘍、神経線維腫症、パーキンソン病、ピック病、多発性筋炎、色素性網膜炎、分裂病、発作、並びに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮などの癌が含まれる。
【００７７】
別の実施例では、医薬用担体と共にＮＩＭ１キナーゼのインヒビター、アンタゴニスト、または抗体を含む医薬組成物を患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこの内在性タンパク質の発現または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【００７８】
更なる実施例では、本核酸分子またはその断片の相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む本タンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【００７９】
本核酸分子、またはそれに相補的な分子やその一部、本タンパク質またはその一部の内の任意のもの、これらの核酸分子やタンパク質を運ぶベクター、及びそれらのリガンドをその他の薬剤と共に投与することが可能である。併用療法に用いる薬剤の選択は、当業者が従来の薬学原理に従って行うことができる。薬剤を併用することによって、少量の各薬剤で特定の症状の予防または治療において相乗的な効果をあげることが可能である。
【００８０】
核酸を用いる遺伝子発現の調節
遺伝子の発現は、ＮＩＭ１キナーゼをコードする遺伝子の５’または３’調節領域、或いは他の調節領域に対して相補的或いはアンチセンス分子を設計することで調節することが可能である。転写開始部位に対して設計されたオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合を阻止する三重螺旋塩基対合で遺伝子発現を阻止することができる（Ｇｅｅ 他 Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｒ （１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ ＮＹ， ｐｐ． １６３−１７７）。また、リボソームとｍＲＮＡとの結合を阻止して翻訳が行われないように、相補的な分子を設計することも可能である。或るいは、核酸分子またはその断片のライブラリをスクリーニングして、翻訳されない調節配列に特異的に結合する核酸分子または断片を同定することも可能である。
【００８１】
また、酵素活性をもつＲＮＡ分子であるリボザイムを用いて、ＲＮＡの特異的な切断を触媒してもよい。リボザイム作用のメカニズムは、まずリボザイム分子と相補的な標的ＲＮＡとの配列特異的なハイブリダイゼーションが起こり、次にＧＵＡ及びＧＵＵ、ＧＵＣなどの部位においてヌクレオチド鎖が切断される。このような部位が一旦同定されたら、オリゴヌクレオチドを機能不全にしうる二次構造特性について、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドを評価することができる。また、候補標的としての適合性は、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査して評価することができる。
【００８２】
本発明の相補的な核酸及びリボザイムは、固相ホスホラミダイト化学合成法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの組換え発現によって調製することが可能である。更に、ＲＮＡ分子は、その５’及び／または３’末端に隣接配列を付加して、或いは分子のバックボーンのホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネートまたは２’Ｏ−メチルを用いて、細胞内の安定性及び半減期が増大するように改変することができる。この改変はＰＮＡの作製に固有であるが、他の核酸分子にも適用することができる。例えばイノシン、ｑｕｅｏｓｉｎｅ、ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅなどの伝統的でない塩基を含めて、またはアセチル基、メチル基、チオ基でウリジン、アデニン、シチジン、グアニン、及びチミンを修飾して、内在性エンドヌクレアーゼに対する分子の有効性を低くする。
【００８３】
スクリーニング及び精製アッセイ
ヒトＮＩＭ１キナーゼをコードする核酸分子を用いて、分子または化合物のライブラリをスクリーニングして特異的な結合親和性を調べることが可能である。このライブラリは、生物系において本核酸分子の活性、複製、転写、または翻訳を調節するアプタマー、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、及びその他のリガンドを含み得る。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、本核酸分子またはその断片を分子のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出して、一本鎖または二本鎖の本核酸分子と特異的に結合する少なくとも１つの分子を同定するステップとを含む。
【００８４】
一実施例では、本発明のポリヌクレオチドを、単離され精製された分子または化合物のライブラリと共にインキュベートし、当分野で周知の、例えばゲル遅延アッセイ（ｇｅｌ−ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（米国特許第６，０１０，８４９号）または網状赤血球溶解産物転写アッセイを用いて結合活性を測定することができる。別の実施例では、本ポリヌクレオチドをバイオプシー及び／または培養細胞及び培養組織に由来する核抽出物でインキュベートしてもよい。本ポリヌクレオチドとこの核抽出物における分子または化合物との間の特異的な結合を、まずゲルシフトアッセイ（ｇｅｌ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）を用いて測定し、後にこれらの分子または化合物に対する抗体のレベルの上昇により確認することが可能である。これらの抗体をアッセイに加えると、ゲル遅延アッセイにおいてスーパーシフトが起こる。
【００８５】
別の実施例では、本ポリヌクレオチドを用いて、当分野で周知のアフィニティクロマトグラフィ法を用いて分子または化合物を生成することが可能である。一実施例では、本ポリヌクレオチドを、ポリマー樹脂またはジェル上で臭化シアン基と化学的に反応させる。次に、サンプルを流して本ポリヌクレオチドと反応すなわち結合させる。本ポリヌクレオチドと結合した分子または化合物を、流す培養液の塩濃度を上昇させて本ポリヌクレオチドから遊離させて回収する。
【００８６】
更なる実施例では、本タンパク質またはその一部を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物タンパク質またはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下で、このタンパク質またはその一部をサンプルと結合させ、このタンパク質とリガンドとの間の特異的な結合を検出し、結合したタンパク質を回収し、適当なカオトロピック剤を用いてこのタンパク質を精製したリガンドから分離することを含む。
【００８７】
好適な実施例では、あらゆるスクリーニングアッセイにおいて、ヒトＮＩＭ１キナーゼまたはその一部を用いて、分子または化合物のライブラリをスクリーニングすることが可能である。このようなスクリーニングアッセイに用いるタンパク質の一部は、溶液中に遊離させるか、非生物基板または生物基板（例えば細胞表面上）に固定させるか、または細胞内に局在化させることができる。例えば、ある方法では、組替え核酸分子で安定的に形質転換され、ポリペプチドを発現してその細胞表面上にポリペプチドが存在する生存可能すなわち安定した真核宿主細胞をスクリーニングアッセイに用いることができる。この細胞をリガンドのライブラリすなわち複数のライブラリに対してスクリーニングし、発現ポリペプチドとそのリガンドとの間の複合体の結合すなわち形成の特異性を測定することができる。このタンパク質と分子との間の特異的な結合を測定することができる。スクリーニングするライブラリの種類によって、このタンパク質と特異的に結合するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、ペプチド、タンパク質、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、及び薬剤またはその他のあらゆるリガンドをこのアッセイで同定することができる。
【００８８】
一実施態様では、本発明は、言及することをもって本明細書の一部とする米国特許５，８７６，９４６号に記載されているような極めて微量のアッセイ量及び極めて微量の検査化合物を用いるハイスループットのスクリーニング方法を提供する。この方法を用いて、特異的な結合により多数の分子及び化合物をスクリーニングすることができる。別の実施態様では、本発明はまた、競合的薬剤スクリーニングアッセイの方法を提供する。このアッセイでは、本ポリペプチドと結合可能な中和抗体が、本ポリペプチド、そのオリゴペプチド、或いはその一部と結合可能な検査化合物と特異的に競合する。スクリーニングアッセイによって同定された分子または化合物を用いて、哺乳動物モデル系を作成して、それらの毒性、診断、または治療の可能性を評価することができる。
【００８９】
薬理学
医薬組成物とは、所望の目的を達成するのに効果的な量の活性成分を含んでいる物質である。効果的な薬用量の決定は、当分野の技術者の能力による部分が大きい。どんな化合物であっても、初めは細胞培養アッセイ或いは動物モデルの何れかによって治療効果のある薬用量を推定する。また、動物モデルを使って、好適な濃度範囲及び投与経路を決定する。次に、このような情報を用いて、ヒトへの効果的な投与経路及び薬用量を決定する。
【００９０】
治療効果のある薬用量とは、症状または病態を改善するタンパク質またはインヒビターの量である。このような薬剤の薬用効果及び毒性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に医薬的効果がある投与量）及びＬＤ５０（集団の５０％に致命的である投与量）などの細胞培養または実験動物における標準的な製薬方法によって決定することができる。或る投与量における毒性効果と治療効果との比率が治療指数となり、ＬＤ５０／ＥＤ５０と示すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを用いて、ヒトへ適用する薬用量の範囲を決定する。
【００９１】
モデル系
動物モデルを用いて、ヒトの暴露に相当する暴露条件にして、動物モデルがヒトに類似の表現型反応を示すバイオアッセイを行うことができる。哺乳動物が最も一般的な動物モデルである。大抵の感染症、癌、薬剤、及び毒物の研究には、ラットやマウスなどの齧歯類が用いられる。これは、低コスト、入手の容易性、寿命、生殖能、及び参考文献の豊富さからである。齧歯類近交系及び非近交系は、目的の遺伝子の過剰或いは過少な発現の生理学的な原因を調査するのに有用なモデルであり、疾患の診断及び治療方法の開発にも有用である。特定の遺伝子を大量に発現する（例えば、乳汁中に分泌される）同系哺乳動物は、その遺伝子によって発現されるタンパク質の便利な供給源となり得る。
【００９２】
中毒学
中毒学とは、生物系における物質の影響を研究する学問である。殆どの毒物研究はラットまたはマウスを用いて行われる。ラットまたはマウスの生理機能、行動、恒常性プロセス、及び致死率における質的及び量的変化を観察して、毒性プロフィールを作成し、その物質に曝露された後に生じるであろうヒトの健康状態を調べる。
【００９３】
遺伝子毒物学は、内因性または自然発生的に誘導される遺伝子変異の速度に物質が与える影響を特定し分析する。遺伝毒性物質は通常、核酸との相互作用を促進する共通の化学的或いは物理的特性を有し、突然変異した染色体が子孫に受け継がれるのが最大の害である。毒物研究によって、受胎前の両親のどちらか一方、または妊娠中の母、発生段階の生物に投与された場合の、子孫の組織における構造的或いは機能的な異常の頻度を増加させる物質を同定することが可能である。マウス及びラットは生殖周期が短く、統計的必要性を満たす多数の子孫を出産する能力から、これらの試験にはマウス及びラットが用いられる場合が最も多い。
【００９４】
急性毒物の検査は、被験体への物質の一回の投与に基づき、その物質による症状または致死率を決定する。この検査では、（１）初めの投与量の範囲を決定する実験と、（２）有効な投与量の範囲を狭める実験と、（３）用量応答曲線を確立する実験の３つの実験が行われる。
【００９５】
中期に亘る毒性検査では繰り返し物質を投与する。このような検査には、ラットやイヌが一般的に用いられ、分類学上異なった種からデータを収集する。物質を高い投与濃度で３〜４ヶ月間、毎日投与することで、発癌を除く、成体動物における殆どの毒性の種類が明らかになるという研究結果が多数報告されている。
【００９６】
一年或いはそれ以上の長期に渡る慢性毒性検査は、物質に毒性がないこと、或いは物質の発癌の可能性の何れかを実証するために行われる。ラットで検査が行われる場合、少なくとも３つの検査グループと１つの対照グループが用いられ、最初から最後まである間隔で検査及びモニタリングが行われる。
【００９７】
遺伝子組換え動物モデル
目的の遺伝子を過剰或いは過小に発現する遺伝子組換え齧歯類を同系交配し、それを用いてヒト疾患モデルを作製したり、治療薬検査や毒物検査を行う（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、同第５，１７５，３８３号、及び同第５，７６７，３３７号を参照）。場合によっては、導入遺伝子が、胚発生中若しくは出生後の特定の時期に特定の種類の組織で活性化され得る。導入遺伝子の発現は、実験的薬剤治療を施す前、その最中、またはその後の、遺伝子組換え動物における表現型、組織特異的なｍＲＮＡの発現、または血清や組織のタンパク質レベルの分析からモニタリングすることができる。
【００９８】
胚性幹細胞
齧歯類胚から単離された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚組織を形成する可能性を維持している。ＥＳ細胞がキャリアとなる胚の中に導入されると、正常な発生が再開され、生まれる動物の組織の一部を担うことになる。ＥＳ細胞は、実験用のノックアウト及びノックイン齧歯類系を作製するのに好適な細胞である。マウス１２９／ＳｖＪ細胞株などのマウスＥＳ細胞は、マウスの初期胚から採取されてから当分野で周知の培養条件下で増殖されたものである。遺伝子組換え系の作製に用いるベクターは、疾患候補遺伝子及びマーカー遺伝子配列を含み、このマーカー遺伝子により導入された疾患遺伝子の存在を確認することができる。このベクターを、当分野で周知の方法でＥＳ細胞に形質転換され、この形質転換されたＥＳ細胞を特定し、Ｃ５７ＢＬ／６マウス株などからのマウス細胞胚盤胞内に微量注入する。この胚盤胞を複数の偽妊娠メスに外科的に導入して、生まれてくるキメラ子孫のそれぞれがその遺伝子型を有するようにして、それらを交配してヘテロ接合系またはホモ接合系を作り出す。
【００９９】
ヒト胚盤胞に由来するＥＳ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作して８個の異なった細胞系譜に分化することが可能である。これらの細胞系譜を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、様々な細胞型及び組織の分化を研究する。細胞型には、神経細胞、造血系、及び心筋細胞に分化する内胚葉、中胚葉、外胚葉の細胞型が含まれる。
【０１００】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、哺乳動物遺伝子のある領域が、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非哺乳動物遺伝子を含むように酵素によって改変される（ｎｅｏ ； Ｃａｐｅｃｃｈｉ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）。改変された遺伝子が培養ＥＳ細胞に形質転換され、相同組換えにより内在性のゲノムに組み込まれる。挿入された配列は、内在性遺伝子の転写及び翻訳を阻害する。この形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、この胞胚を偽妊娠メスに移植する。この遺伝子組換え子孫をクロス交配して、この哺乳動物遺伝子の機能的な複製物が存在しないホモ接合近交系を作り出す。
【０１０１】
ノックイン分析
ＥＳ細胞を用いてノックインヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換えヒト疾患動物モデル（マウスまたはラット）を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ＥＳ細胞に注入し、そのヒト配列が動物細胞のゲノムの中に組み込まれるようにする。形質転換ＥＳ細胞を胞胚に注入し、この肺胞を上記したように注入する。類似のヒトの症状の治療についての情報を収集するべく、遺伝子組換え子孫即ち近交系を有望な医薬品で処置して観察する。これらの方法を用いて、幾つかのヒト疾患モデルを作り出す。
【０１０２】
更なる実施例では、限定するものではないが、トリプレット遺伝子コード及び特異的な塩基対相互作用などの特性を含む、現在知られている核酸配列の特性に新しい技術が依存する場合は、本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を、開発中のあらゆる分子生物学技術に用いることが可能である。
【０１０３】
【実施例】
本発明は、記載した特定の装置及び物質、方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例について説明するが、同等の実施例を用いて本発明を具現することも可能である。本発明の範囲は、前記請求の範囲によってのみ限定されるものであって、記載した実施例によって限定されるものではない。また、以下に記載の実施例は、本発明を例示するためのものであって本発明を限定するものではない。例示目的で、ヒト小脳ライブラリ（ＣＲＢＬＮＯＴ０１）、前立腺ライブラリ（ＰＲＯＳＢＰＴ０３）、及び標準化された脳ライブラリ（ＢＲＡＩＮＯＮ０１）の作製方法を記載する。
【０１０４】
１　ｃＤＮＡライブラリの作製
小脳
小脳ライブラリの作成に用いた組織は６９歳の白人男性から得た（ＲＴ９５−０５−０３０１； Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｅｘｔｏｎ ＰＡ）。この凍結組織を、ＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（ＰＴ−３０００； Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＪ）を用いてホモジナイズして溶解した。試薬及び抽出方法は、ＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に含まれているものを用いた。この溶解物を、Ｌ８−７０Ｍ超遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ ＣＡ）において、ＳＷ２８ローターを用いて５．７Ｍ ＣｓＣｌクッションに対して室温で１８時間、毎分２５，０００回転で遠心分離を行った。ＲＮＡをフェノールクロロホルム、ｐＨ８．０で２回、酢酸フェノール、ｐＨ４．０で１回抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ、水中で再懸濁し、ＤＮアーゼで３７℃で１５分間処置した。このＲＮＡをＯＬＩＧＯＴＥＸキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）で単離し、ｃＤＮＡライブラリの作製のために用いた。
【０１０５】
前立腺
５９歳の白人男性から根治前立腺切除の際に採取した病変前立腺組織を用いてＰＲＯＳＢＰＴ０３ライブラリを作製した。病理学的には、この腫瘍は、Ｇｌｅａｓｏｎグレード３＋３の腺癌であって、左右の周辺に及ぶ微視的な病巣を伴っていた。この腫瘍は限定的で胸膜には及んでいなかった。進行した前立腺上皮内癌が、右側の周囲で確認された。この患者には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の上昇が見られた。家族歴には、両親の脳血管疾患、並びに兄弟の前立腺癌が含まれていた。
【０１０６】
ｃＤＮＡライブラリを作製するために、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の推奨プロトコルに従って２．４μｇのポリＡ ＲＮＡを用いた。一本鎖ｃＤＮＡの合成には、オリゴｄ（Ｔ）プライミングを用い、二本鎖の合成には、ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌リガーゼ、及びＲＮアーゼＨを組み合わせて用いた。このｃＤＮＡをＴ４ポリメラーゼで平滑化し、このｃＤＮＡの平滑末端にＳａｌ Ｉリンカーを付加した。Ｓａｌ Ｉが付加された二本鎖ｃＤＮＡを、Ｎｏｔ Ｉで消化し、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂ カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分画した。
【０１０７】
４００ｂｐを超えるこれらの小脳ｃＤＮＡをｐＳＰＯＲＴ Ｉプラスミドに繋ぎ、このプラスミドをＤＨ５αコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。４００ｂｐを超えるこれらの前立腺ｃＤＮＡをｐＩＮＣＹプラスミド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のＮｏｔＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位に繋ぎ、このプラスミドをＤＨ５αまたはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１ＯＢコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。
【０１０８】
脳ライブラリの標準化
例を示すために、ヒト脳ライブラリ（ＢＲＡＩＮＯＮ０１）の標準化について説明する。大腸菌株ＤＨ１２Ｓコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるＢＲＡＩＮＯＴ０３プラスミドライブラリの約４．９×１０６の独立したクローンを、カルベニシリン（２５ｍｇ／ｌ）及びメチシリン（１ｍｇ／ｍｌ）選択下で、培地で成長させ、その後に電気穿孔法により形質転換を行った。ライブラリの存在レベルに従って余剰のｃＤＮＡ複製物の数を減らすために、ｃＤＮＡライブラリを以下の変更点を除きＳｏａｒｅｓ他（１９９４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１： ９２２８−９２３２）の方法に従って１回標準化した。変更点は次の通りである。プライマー伸長反応における鋳型に対するプライマーの比率を２：１から１０：１に高めた。反応液のｄＮＴＰ濃度を、より長いプライマー伸長物（４００〜１０００ヌクレオチド）が形成できるように各ｄＮＴＰを１５０μＭまで低下させた。アニーリングハイブリダイゼーションを１３時間から４８時間に延長した。標準化したライブラリの一本鎖ＤＮＡサークルを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーで精製し、ランダムプライミングにより部分的な２本鎖に変換し、大腸菌株ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の中に電気穿孔法により導入した。
【０１０９】
２　ｐＩＮＣＹプラスミドの作製
このプラスミドは、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）で消化し、オーバーハングした端部を、クレノウ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び２’−デオキシヌクレオチド５’−三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を用いて二本鎖に合成した。このプラスミドが自己連結した後、このプラスミドで細菌宿主となる大腸菌株ＪＭ１０９を形質転換した。
【０１１０】
細菌（ｐＳＰＯＲＴ １−△ＲＩ）によって生成された中間プラスミドは、ＥｃｏＲＩでは消化されず、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、オーバーハングした端部をクレノウ酵素及びｄＮＴＰｓで二本鎖にした。リンカー配列をリン酸化し、５’平滑末端に繋ぎ、ＥｃｏＲＩで消化し、自己連結させた。ＪＭ１０９宿主細胞を形質転換した後、プラスミドを単離し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩではなくＥｃｏＲＩで選択的な消化の検査を行った。この基準を満たす１つのコロニーをｐＩＮＣＹプラスミドとを呼ぶ。
【０１１１】
ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて作製したライブラリからｃＤＮＡを取り込むプラスミドの能力を検査した後、いくつかのクローンをシークエンシングし、約０．８ｋｂのインサートを含む１つのクローンを選択し、そのクローンから大量のプラスミドを生成した。ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化した後、ライブラリの作製に用いるためにこのプラスミドをアガロースゲル上で分画し、ＱＩＡＱＵＩＣＫカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【０１１２】
３　ｃＤＮＡクローンの単離及びシークエンシング
プラスミドＤＮＡを細胞から遊離し、ＭＩＮＩＰＲＥＰキット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）またはＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを用いて精製した。このキットには、９６ウェルブロック、及び９６０回の精製を行うための試薬が含まれている。以下の変更点を除き、推奨プロトコルに従った。（１）細菌を、２５ｍｇ／ｌのカルベニシリン及び２．４％のグリセロールと共に１ｍｌの滅菌Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養した。（２）接種後、細胞を１９時間培養してから、０．３ｍｌの溶解バッファで溶解した。（３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡのペレットを０．１ｍｌの蒸留水で再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを９６ウェルブロックに移し、４℃で保管した。
【０１１３】
ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）及びＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、シークエンシングするためにｃＤＮＡを調整した。このｃＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７シークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＭＥＧＡＢＡＳＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＳａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ （１９７５； Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９４： ４４１−４４８）の方法でシークエンシングした。単離したもののほとんどを、標準的なＡＢＩプロトコル及びキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、０．２５×〜１．０×の濃度の溶液容量でシークエンシングした。別法では、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した溶液及び色素を用いてｃＤＮＡをシークエンシングした。
【０１１４】
４　ｃＤＮＡ配列の伸長
本核酸分子は、ｃＤＮＡクローン及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いて伸長した。一方のプライマーは既知の断片の５’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）若しくは別の好適なプログラムを用いて、約２２〜約３０個のヌクレオチドの長さ、約５０％以上のＧＣ含量で、６８５〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を形成するヌクレオチドのストレッチは排除した。
【０１１５】
選択されたｃＤＮＡライブラリを鋳型として用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要な場合は、追加の或いは入れ子状のプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を設計した。好適なライブラリは、大きなｃＤＮＡを含むように大きさが選択されたライブラリである。また、ランダムプライミングしたライブラリも、遺伝子の５’及び上流領域を備えた多くの配列を含むため好適である。ランダムプライミングライブラリは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長のｃＤＮＡを形成しなかった場合に特に有用である。ゲノムライブラリは、調節エレメントを得るためにプロモーター結合領域の５’を伸長する際に有用である。
【０１１６】
米国特許第５，９３２，４５１号に開示されているような方法を用いてＰＣＲ法で高い忠実度の増幅を達成した。ＰＣＲは、ＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて９６ウェルプレートで行った。反応混合液には、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、反応緩衝液（Ｍｇ２＋、（ＮＨ４）２ＳＯ４、β−メルカプトエタノールを含む）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含まれている。プライマーの組、ＰＣＩ Ａ及びＰＣＩ Ｂ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【０１１７】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（１×ＴＥにおける試薬０．２５％ （ｖ／ｖ）； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分注して、ＤＮＡがその試薬と結合できるようにして測定した。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ）でスキャンして、サンプルの蛍光を測定してＤＮＡの濃度を定量化した。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上で電気泳動して解析し、何れの反応がより長い配列の伸長に成功したかを決定した。
【０１１８】
伸長したヌクレオチド配列を脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理または切断した。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチド配列を低濃度（０．６％〜０．８％）のアガロースゲル上に分離させ、断片を切断し、ゲルをＡＧＡＲＡＣＥ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて伸長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してから、大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。形質転換細胞が抗生物質を含む培地で選択され、それぞれのコロニーを切りとって、ＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の入った３８４ウェルプレートの中で、３７℃で一晩培養した。
【０１１９】
この細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡを増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣエネルギー移動シークエンシングプライマー及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴサイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０１２０】
５　ｃＤＮＡクローン及びそれらから導き出されたポリペプチドの相同性検索
配列表の核酸分子及びそれらから導き出されたアミノ酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳなどのデータベースにおいて検索する。すでに同定されアノテーションの付けられた配列またはドメインを含むこれらのデータベースを、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２ （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出； Ａｌｔｓｃｈｕｌ、前出）を用いて検索し、アラインメントを作成し、完全に一致する或いは相同な配列を決定する。このアラインメントは、原核生物（細菌）または真核生物（動物、真菌、または植物）を起源とする配列に対するものである。或いは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９２， Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５： ３５−５１）に記載されているようなアルゴリズムを用いて、一次配列パターン及び二次構造ギャップペナルティを処理することが可能である。本明細書に記載した全ての配列は、その長さが少なくとも４９ヌクレオチドであり、不要な塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、或いはＴではなくＮと記載）は１２％以下である。
【０１２１】
Ｋａｒｌｉｎ （前出） に詳述されているように、問い合わせ配列とデータベース配列との間のＢＬＡＳＴによる一致を統計学的に評価し、ヌクレオチドに対しては１０−２５、ペプチドに対しては１０−１４の閾値を満たす一致のみを記録した。相同性はまた、以下のように計算した積スコアによって評価した。まず、ＢＬＡＳＴにおける核酸またはアミノ酸同一性（問い合わせ配列と参照配列との間の）のパーセントに、最大可能ＢＬＡＳＴスコアのパーセント（問い合わせ配列及び参照配列の長さに基づく）を乗じてから、１００で除した。実験室で用いられるハイブリダイゼーション法と比べ、完全一致に対する電子的なストリンジェンシーを７０と設定し、完全一致に対する保守的な下限を約４０に設定した（不要な塩基対による１〜２％のエラーを有する）。
【０１２２】
無料で利用可能な配列比較アルゴリズムであるＢＬＡＳＴソフトウエア一式（ＮＣＢＩ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）は、既知の核酸分子を整列するために用いる“ｂｌａｓｔｎ”、及び核酸分子或いはアミノ酸分子のいずれかの直接ペアワイズ比較に用いられるＢＬＡＳＴ２を含む様々な配列分析プログラムを含む。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般に、例えば以下のようにデフォルト設定されたギャップ及びその他のパラメーターで実行される。
【０１２３】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性或いは類似性を、配列の全長或いは配列の一部に対して測定することができる。Ｂｒｅｎｎｅｒらが（１９９８； Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９５： ６０７３−６０７８、言及することをもって本明細書の一部とする）、配列同一性により構造の相同性を同定するＢＬＡＳＴの能力を分析した。この分析により、少なくとも１５０残基の配列アラインメントに対して３０％の同一性が信頼できる閾値であり、少なくとも７０残基の配列アラインメントに対して４０％の同一性が信頼できる閾値である。
【０１２４】
本明細書の哺乳動物核酸分子を、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベースで見出した構築されたコンセンサス配列または鋳型と比較した。ｃＤＮＡ、伸長、完全長、及びショットガンシークエンシングプロジェクトに由来するコンポーネント配列をＰＨＲＥＤで分析し、質のスコアを割り当てた。許容できる質スコアを有する全ての配列に対して様々なプリプロセシング及び編集を行い、質の低い３’末端、ベクター及びリンカー配列、ポリＡ尾部、Ａｌｕリピート、ミトコンドリア及びリボソーム配列、及び細菌汚染配列を除去した。編集した配列は少なくともその長さが５０ｂｐでなければならない。情報の少ない配列、並びにジヌクレオチドリピート、Ａｌｕリピートなどの繰り返しエレメントはＮで置換するかマスクした。
【０１２５】
編集した配列を、配列が遺伝子ビンに割り当てられる構築処理を行った。それぞれの配列は１つのビンにのみ属し、鋳型を形成するべく各ビンにおける配列を構築した。新規にシークエンシングしたコンポーネントをＢＬＡＳＴ及びＣＲＯＳＳＭＡＴＣＨを用いて存在するビンに加えた。ビンに加えるためにはこのコンポーネント配列は、ＢＬＡＳＴ質スコアが１５０以上であって、少なくとも８２％の局所的な同一性のアラインメントでなければならない。それぞれのビンにおける配列を、ＰＨＲＡＰを用いて構築した。いくつかの重複するコンポーネント配列を有するビンはＤＥＥＰ ＰＨＲＡＰを用いて構築した。それぞれの鋳型の向きは、そのコンポーネント配列の数及び向きに基づいて決定した。
【０１２６】
それぞれのビンを互いに比較して、局所類似性が８２％以上のビンを１つにまとめて再構築した。局所同一性が９５％未満の鋳型を有するビンは分けた。鋳型は、ＳＴＩＴＣＨＥＲ／ＥＸＯＮ ＭＡＰＰＥＲアルゴリズムで分析した。このＳＴＩＴＣＨＥＲ／ＥＸＯＮ ＭＡＰＰＥＲアルゴリズムは、スプライスバリアント、択一的スプライシングエキソン、スプライスジャンクション、並びに組織の種類或いは疾患の状態により発現が異なる択一的にスプライシングされた遺伝子などの存在の確率を分析することができる。構築処理を繰り返し行い、ＧＢｐｒｉなどのＧｅｎＢａｎｋデータベースに対してＢＬＡＳＴを用いて鋳型にアノテーションを付けた。完全一致は、２００塩基対に対する９５％以上の局所同一性から１００塩基対に対する１００％の局所同一性を有すると定義し、相同一致は、≦１×１０−８のＥ値（確率スコア）を有すると定義した。また鋳型を、ＧＥＮＰＥＰＴに対してフレームシフトＦＡＳＴｘ分析を行い、相同一致を≦１×１０−８のＥ値を有すると定義した。鋳型の分析及び構築については、１９９９年３月２５日に出願された米国特許出願第０９／２７６，５３４号に開示されている。
【０１２７】
構築の後に、鋳型をＢＬＡＳＴ、モチーフ、及びその他の機能分析法で分析し、１９９７年３月６日に出願の米国特許出願第０８／８１２，２９０号及び同第０８／８１１，７５８号、１９９７年１０月９日に出願の米国特許出願第０８／９４７，８４５号、及び１９９８年３月４日に出願の米国特許出願第０９／０３４，８０７号に記載されている方法を用いてタンパク質を階層に分類した。次に鋳型を、３つ全ての前方読み枠にそれぞれの鋳型を翻訳して、それぞれの翻訳を、ＨＭＭＥＲソフトウエアパッケージ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ； ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）を用いて隠れマルコフモデルをベースにしたタンパク質ファミリー及びドメインのＰＦＡＭデータベースにおいて検索した。
【０１２８】
本核酸分子を、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウエア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて更に分析し、ＧｅｎＢａｎｋの齧歯類、哺乳類、脊椎動物、原核生物、及び真核生物のデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＰＦＡＭ、及びＰｒｏｓｉｔｅなどの公共のデータベースに対して問い合わせた。
【０１２９】
６　染色体マッピング
Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ （ＳＨＧＣ）、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＷＩＧＲ）、及びＧｅｎｅｔｈｏｎなどの公共の情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝子マッピングデータを用いて、マッピングできる配列表の核酸分子が存在するかを調べた。ＮＩＭ１キナーゼをコードする核酸分子のマッピングされた全ての断片が、同じ位置にマッピングされた全ての関連する調節及びコード配列に割り当てられた。遺伝子マップ位置は、ヒト染色体の範囲すなわち区間として表される。センチモルガン（ｃＭ）（ヒトＤＮＡの１００万塩基対に概ね相当する）で表されるマップ位置の範囲は、染色体ｐ腕の末端から測定する。
【０１３０】
７　ハイブリダイゼーション技術及び分析
核酸分子の基板への固定
核酸分子を以下に示す方法で基板に固定する。核酸分子の混合液をジェル電気泳動により分画後、毛細管輸送によってナイロン膜に移す。別法では、核酸分子を個別にベクターに結合して、それを細菌宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次に核酸分子を以下の方法で基板に配列する。第１の方法では、個別のクローンを含む細菌細胞を機械的に摘み上げてナイロン膜に整列させる。このナイロン膜を、選択薬（用いるベクターによって異なるが、カルベンシリン、カナマイシン、アンピシリン、またはクロラムフェニコールなど）を含むＬＢ寒天培地に載置し、３７℃で１６時間インキュベートする。この膜を寒天培地から取り除き、次にこの膜をコロニー側を上にして１０％ＳＤＳ、変性溶液（１． ５ Ｍ ＮａＣｌ、０． ５ Ｍ ＮａＯＨ）、中和液（１． ５ Ｍ ＮａＣｌ、１ Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８． ０）に入れ、２×ＳＳＣにおいて１０分間づつ２回インキュベートする。次にこの膜を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でＵＶ照射する。
【０１３１】
第２の方法では、インサートに隣接したベクター配列に相補的なプライマーを用いて、ＰＣＲを３０サイクル行い細菌ベクターから核酸分子を増幅する。ＰＣＲ増幅により、拡散の濃度を開始時の１〜２ ｎｇから最終的に５μｇまで増大させる。約４００ ｂｐ〜約５０００ ｂｐの増幅した拡散をＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。精製した拡散を、手動で或いはドット／スロットブロッティングマニフォールド及び吸入装置でナイロン膜に配列し、上記した変性、中和、及びＵＶ照射によって固定する。精製した拡散を、米国特許第５，８０７，５２２号に開示された方法でポリマーコートスライドガラスに機械的に配列して固定する。ポリマーコートスライドガラスは、顕微鏡スライドガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）を０．１％ＳＤＳ及びアセトンで超音波洗浄した後、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）においてエッチングし、次に９５％エタノールにおいて０．０５％アミノプロピルシランでコーティングし、オーブンで１１０℃で硬化させて準備する。処理中及び処理後にこのスライドガラスを蒸留水で十分に洗浄する。次に、核酸分子をスライド上に配列し、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてこの核酸分子のアレイをＵＶ照射してスライド上に固定する。次にこのアレイを、室温で０．２％ＳＤＳで洗浄し、蒸留水で３回すすぐ。非特異的な接合部位を、アレイをリン酸バッファー（ＰＢＳ：Ｔｒｏｐｉｘ， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）に於ける０．２％カゼインにおいて６０℃で３０分間インキュベートしてブロックし、次にこのアレイを０．２％ＳＤＳで洗浄し、前記したように蒸留水で洗い流す。
【０１３２】
メンブレンを用いるハイブリダイゼーションのためのプローブの準備
本配列表の核酸分子に由来するハイブリダイゼーションプローブは、メンブレンハイブリダイゼーションにおいてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。プローブを準備するために、核酸分子を４５μｌ ＴＥバッファにおいて４０〜５０ ｎｇの濃度に希釈し、１００℃で５分間加熱して変性し、短時間遠心分離する。次に、変性した核酸分子をＲＥＤＩＰＲＩＭＥチューブ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加え、青色が十分に拡散するまで軽く混合し、短時間遠心分離する。５μｌの［３２Ｐ］ ｄＣＴＰをチューブに加え、その内容物を３７℃で１０分間インキュベートする。この標識化反応を５μｌの０． ２Ｍ ＥＤＴＡを加えてストップし、ＰＲＯＢＥＱＵＡＮＴ Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてプローブを組み込まれなかったヌクレオチドから精製する。精製したプローブを１００℃で５分間加熱してから氷上で２分間冷却し、以下に記載するようにメンブレンハイブリダイゼーションに用いる。
【０１３３】
ポリマーコートスライドを用いるハイブリダイゼーションのためのプローブの準備
サンプルから単離したｍＲＮＡに由来するハイブリダイゼーションプローブを用いて、アレイハイブリダイゼーションにおいて本配列表の核酸分子をスクリーニングする。プローブは、ＧＥＭｂｒｉｇｈｔキット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いて、ｍＲＮＡを９μｌ ＴＥバッファにおいて２００ ｎｇの濃度に希釈し、５μｌの５×バッファ、１μｌの０．１ Ｍ ＤＴＴ、３μｌのＣｙ３またはＣｙ５標識混合物、１μｌのＲＮアーゼインヒビター、１μｌの逆転写酵素、及び５μｌの１×酵母コントロールｍＲＮＡを加えて準備する。酵母コントロールｍＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡ（Ｗ． Ｌｅｉ， ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成する。量的コントロールとして、０．００２ ｎｇ、０．０２ ｎｇ、０．２ ｎｇ、及び２ ｎｇのコントロールｍＲＮＡからなるセットを、サンプルｍＲＮＡに対してそれぞれ１：１００，０００、１：１０，０００、１：１０００、及び１：１００ （ｗ／ｗ）の比率で逆転写反応液に希釈する。ｍＲＮＡの異なった発現パターンを検査するために、第２のセットのコントロールｍＲＮＡを、１：３、３：１、１：１０、１０：１、１：２５、及び２５：１ （ｗ／ｗ）の比率で逆転写反応液に希釈する。反応液を混合し、３７℃で２時間インキュベートする。次に反応液を８５℃で２０分間インキュベートし、２つの連続したＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ＋ＴＥ ３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてプローブを精製する。精製したプローブを、ＤＥＰＣ処理水で９０μｌに希釈して、２μｌの１ｍｇ／ｍｌグリコーゲン、６０μｌの５Ｍ酢酸ナトリウム、３００μｌの１００％エタノールを加えてエタノール沈殿させる。このプローブを２０，８００×ｇにおいて２０分間遠心分離し、ペレットを１２μｌの再懸濁バッファに再懸濁させ、６５℃で５分間加熱し、完全に混合する。上記したようにプローブを加熱及び混合してから氷上で保管する。プローブを以下に記載するように高密度のアレイハイブリダイゼーションに用いる。
【０１３４】
メンブレンを用いるハイブリダイゼーション
メンブレンを、１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ及び１×高リン酸バッファ（０． ５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７）を含むハイブリダイゼーション溶液において５５℃で２時間プレハイブリダイゼーションする。１５ｍｌの新しいハイブリダイゼーション溶液に希釈したプローブをメンブレンに加える。５５℃で１６時間、メンブレンにプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８． ０）、１％Ｓａｒｋｏｓｙｌにおいて２５℃で１５分間洗浄し、１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８． ０）において２５℃で１５分間づつ４回洗浄する。ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、ＸＯＭＡＴ−ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）をメンブレンに一晩−７０℃で露出し、現像して目で確認する。
【０１３５】
ポリマーコートスライドを用いるハイブリダイゼーション
プローブを６５℃で５分間加熱し、５４１５Ｃマイクロ遠心分離器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）を用いて毎分９４００回転で５分間遠心分離し、アレイの表面に１８μｌのアリコットを載せカバースリップで覆う。このアレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水容器に移す。この容器の角から１４０μｌの５×ＳＳＣを加えてその内部を１００％の湿度に保つ。アレイを含む容器を６０℃で約６時間半インキュベートする。このアレイを、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて４５℃で１０分間洗浄し、０．１×ＳＳＣにおいて４５℃で１０分間づつ３回洗浄した後、乾燥させる。
【０１３６】
ハイブリダイゼーション反応を、絶対ハイブリダイゼーション（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方式またはディファレンシャルハイブリダイゼーション方式で行う。絶対ハイブリダイゼーション方式の場合、１つのサンプルからのプローブをアレイの要素にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体が形成された後にシグナルを検出する。シグナルの強度がサンプルにおけるプローブｍＲＮＡのレベルに相関する。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合、２つの生体サンプルにおける遺伝子のセットの異なった発現を分析する。２つのサンプルからのプローブを準備し、異なった標識成分で標識する。２つの標識したプローブの混合物をアレイ要素にハイブリダイズさせ、２つの異なった標識からの蛍光シグナルをそれぞれ別に検出できる条件下でシグナルを検査する。アレイ上の要素に、２つの生体サンプルに由来するプローブのそれぞれが実質的に同数ハイブリダイズする場合、明瞭な複合蛍光が得られる（Ｓｈａｌｏｎ Ｗ０９５／３５５０５）。
【０１３７】
ハイブリダイゼーション複合体をＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０Ｗレーザーを備えた顕微鏡（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）で検出する。この顕微鏡は、Ｃｙ３を励起するために４８８ｎｍのスペクトル線を発生し、Ｃｙ５を励起するために６３２ｎｍのスペクトル線を発生することができる。励起レーザー光を２０倍の顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いてアレイに集束させる。アレイを含むスライドを顕微鏡上のコンピュータ制御されたＸＹステージ上に載せ、２０μｍの解像度で対物レンズを通してラスタースキャンする。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合、２つの蛍光物質を順番にレーザーで励起する。波長に応じて放出された光を２つの蛍光物質に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に分割する。アレイと光電子増倍管との間に配置された好適なフィルターを用いてシグナルをフィルタリングする。用いられる蛍光物質の最大発光波長は、Ｃｙ３が５６５ｎｍであり、Ｃｙ５が６５０ｎｍである。スキャンの感度は、プローブ混合物に加えられた酵母コントロールｍＲＮＡによって生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイのある位置に相補的なＤＮＡ配列が含まれていると、その位置におけるシグナルの強度が、ハイブリダイズ種（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅｓ）の重量比で１：１００，０００の関係となり得る。
【０１３８】
光電子増倍管の出力をＩＢＭ互換性パーソナルコンピュータにインストールした１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈ アナログ／デジタル変換ボードを用いてデジタル化する（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）。このデジタル化したデータを、イメージとして表示する。この場合、シグナル強度を、２０色線形変換を用いて、青（弱いシグナル）から赤（強いシグナル）の疑似色スケールにマッピングする。データはまた量的にも分析する。２つの異なった蛍光物質が同時に励起されて測定された場合、データを、各蛍光物質に対する発光スペクトルを用いて蛍光物質間の光学クロストーク（発光スペクトルの重複による）をまず補正する。各スポットからのシグナルがグリッドの各要素の中心に来るように、蛍光物質シグナル強度の上にグリッドを重ね合わせる。各要素内の蛍光シグナルを統合して、シグナルの平均強度に対応する数値を求める。シグナル分析に用いるソフトウエアはＧＥＭＴＯＯＬＳプログラム（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。
【０１３９】
８　ノーザン分析
電子的
ＢＬＡＳＴに適用するコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋまたはＬＩＦＥＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などのヌクレオチドデータベースにおいて同一或いは関連する分子を検索した。ヒト及びラットの配列に対する積スコアを以下のように計算した。ＢＬＡＳＴスコアをヌクレオチド同一性のパーセントで乗じて、その値を２つの配列の内の短い方の長さの５倍で除した。したがって、短い方の配列の長さに対する１００％のアラインメントが積スコア１００となる。積スコアは、２つの配列間の類似性の程度及び一致する配列の長さを考慮している。例えば、積スコアが４０では、一致は正確でエラーは１％〜２％であり、７０以上の積スコアではその一致は完全である。類似分子すなわち関連分子は、通常は積スコアが８〜４０の範囲の分子を選択することによって同定することができる。
【０１４０】
７０の積スコアで実施した電子的ノーザン分析の結果が図２に示されている。この分析では、ｃＤＮＡライブラリを系、器官／組織、及び細胞の種類によって幾つかのカテゴリーに分類した。そのカテゴリーには、心血管系、結合組織（特に癌性の乳房線維芽細胞）、消化系、胚、内分泌系、外分泌腺、女性及び男性生殖器（特に癌性の前立腺）、生殖細胞、血液及び免疫系、肝臓、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、未分類／混合、及び尿管が含まれる。各カテゴリーにおいて、実際に本配列を数をカウントし、そのカテゴリーの合計ライブラリ数に対する発現したライブラリ数を示した。
【０１４１】
定量ＰＣＲ
定量ＰＣＲを用いて、様々な細胞系及び組織におけるヒトＮＩＭ１キナーゼの発現を調べた。ＡＴＣＣなどから得られる細胞系には、Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌、Ａ２７８０ヒト卵巣癌系、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞系、ＨＤＦヒト上皮繊維芽細胞、ＨＥＬＡヒト子宮頚癌、ＤＵ１４５アンドロゲン誘導性前立腺癌細胞系、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞、Ｕ８７グリア芽腫腫瘍細胞、及びＢＸ−ＰＣ３膵臓癌細胞がある。これらの細胞系を培養皿に載置し、１０％のウシ胎児血清、及び５％ＣＯ２における２ｍＭグルタミンを９０％のコンフルエントになるまで加えたＲＰＭＩにおいて成長させた。組織、脳、結腸、子宮、及び胎盤をＣｌｏｎｔｅｃｈ社のＭＴＮブロット（Ｈｕｍａｎ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ）として得た。
【０１４２】
ノーザン分析は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００シークエンシングシステム及びＴＡＱＭＡＮアッセイ試薬（ＴＡＱＭＡＮ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）を用い、製造者による取扱説明書に従って定量ＰＣＲにより行った（すべてＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。全ての反応を３通り行った。
【０１４３】
反応に用いたプライマーには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７−３９が含まれる。相対的な定量は、標準として１８ｓ ＲＮＡを用いて行った。この標準化方法の直線性は、Ｓｐｉｅｓｓ ａｎｄ Ｉｖｅｌｌ（１９９９； Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２６： ４６−５０、言及することをもって本明細書の一部とする）に記載されている。
【０１４４】
９　相補的な核酸分子
本核酸分子に相補的な配列或いはその断片を用いて、遺伝子の発現を検出したり、低下させたり、阻害することができる。約１５〜約３０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、それより小さい或いは大きい配列の断片、またはその誘導体（ＰＮＡ）の場合でも同じ方法を用いることができる。好適なオリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選択した。プロモーターの結合を阻害して転写を阻止するために、最も好ましくはオープンリーディングフレームの開始コドンの前の約１０個のヌクレオチドである最もユニークな５’配列に結合するように相補的なヌクレオチドを設計する。翻訳を阻害するために、本哺乳動物ポリペプチドをコードするｍＲＮＡへのリボソームの結合を阻害するべく相補的なオリゴヌクレオチドを設計する。
【０１４５】
転写または翻訳を阻害するために作製したアンチセンス分子を用いるのに加えて、ゲノム配列（例えばエンハンサーやイントロン）或いはトランス作動性調節性遺伝子に対するアンチセンス分子を設計して遺伝子発現を変化させることができる。同様に、三重らせん塩基対形成として知られているＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対形成法を用いてアンチセンス阻害を行うことができる。三重らせんの塩基対形成に関与するアンチセンス分子は、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子と結合するために二本鎖の間を広げる二重らせんの能力を損なわせる。
【０１４６】
このようなアンチセンス分子を発現ベクターに導入して、好適な細胞または組織を形質転換する。これには、効果を検査するために細胞系への発現ベクターの導入、一過性或いは短期の治療のための器官、腫瘍、滑液キャビティ、または血管系への発現ベクターの導入、または長期或いは安定した遺伝子治療のための単細胞または他の生殖系への発現ベクターの導入が含まれる。一過性の発現は、ベクターの複製を伴わない場合には１ヶ月以上持続し、ベクターの複製を引き起こす好適なエレメントが形質転換／発現系に用いられている場合には３ヶ月以上持続する。
【０１４７】
アンチセンス分子をコードするベクターで好適な分裂細胞を安定的に形質転換することにより、遺伝子組換え細胞系、遺伝子組換え組織、または遺伝子組換え器官を作製することができる（米国特許第４，７３６，８６６号）。ベクターを取り込んで十分な量のベクターを複製するこれらの細胞により、安定した組み込みが可能となり、本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子の活性を弱める或いは完全に消失させる十分なアンチセンス分子を産生させることができる。
【０１４８】
１０　ＮＩＭ１キナーゼの発現
ヒトＮＩＭ１キナーゼの発現は、サル及び昆虫細胞系の発現系を用いて行った。ｃＤＮＡを、ＱＩＡＰＲＥＰスピンミニプレップキット及びＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩキット（共にＱｉａｇｅｎ）を用いて取扱説明書に従って精製した。
【０１４９】
一過的な発現の場合、ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（−）／ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）にクローニングして、ベクターｐｃＤＮＡ３−Ｎｉｍ１を、ＣａＰＯ４トランスフェクションキット２−４６３３３５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−５ Ｐｒｉｍｅ， Ｂｏｕｌｄｅｒ ＣＯ）を用いてＣＯＳ １−１細胞に形質転換した。形質転換する前に、４×１０６の細胞を１０ｃｍの組織培養皿に撒いて２４時間培養した。形質転換の日に、５００ ｍｌの２×ＤＮＡ沈殿バッファ、６２ ｍｌのＭ ＣａＣＬ２、１０ ｍｇ （１０ ｍｌ）のｐｃＤＮＡ３−Ｎｉｍ１、及び４２８ ｍｌの水でＣａＰ０４−ＤＮＡを沈殿させた。この混合液を室温で２０分間インキュベートし、次にゆっくりと９ ｍｌの培養液（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミン、１０ ｍｇ／ｍｌのペニシリン、及び１０ ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を加えた。細胞を５％ ＣＯ２で、３７℃で４時間インキュベートした。培養液を新しい培養液に替え、細胞を更に４８時間インキュベートした。
【０１５０】
Ｓｆ２１昆虫細胞を、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄトランスフェクションキット（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に付属の取扱説明書に従って同時形質転換した。２×１０６の細胞を６ ｃｍの組織培養皿に蒔き、２７℃で１５分間インキュベートした。４ ｍｇ （４ ｍｌ）のｐＶＬ１３９２／ＧＳＴ−ＮＩＭ１発現ベクターを０．５ ｍｇ （０．５ ｍｌ）のＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡと共に室温で５分間インキュベートした。細胞培養液（ＴＮＭ−ＦＨ）を除去して１ｍｌのバッファＡに替えた。ＤＮＡ混合物を１ ｍｌのバッファＢで希釈し、一滴ずつコンフェクションプレートに加えた。プレートを２７℃で４時間インキュベートした後、培養液を替え細胞を５日間インキュベートした。組換えウイルスを３回増幅して１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルスストックを得た。１．２×１０７のＳｆ２１昆虫細胞を１０ ｍｌのウイルスストックで感染させ、２７℃でインキュベートした。３日後に、細胞を溶解してタンパク質を精製した。
【０１５１】
１１　タンパク質の精製
Ｈｉｓ精製
ＣＯＳ−１細胞を毎分１０００回転で遠心分離し、４ ｍｌの溶解バッファ（５ ｍＭ イミダゾール＋０．５ ｍＭ ＮａＣＩ＋２０ ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ、（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ））において再懸濁し、超音波処理した。毎分１００００回転の回転数で、４℃で１０分間遠心分離して可溶性画分を回収した。組換えＮｉｍ１キナーゼを、製造者の取扱説明書に従って固定した金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製した。精製度を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びクーマーシー青色染色により測定した。タンパク質の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
【０１５２】
ＧＳＴ精製
Ｓｆ２１細胞を、毎分８００回転で遠心分離し、１０ ｍｌの溶解バッファ（ＰＢＳ＋１ ｍＭ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ＋２０ ｍＭ ＤＴＴ＋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））において再懸濁し、超音波処理した。可溶性画分を、毎分１００００回転、４℃で１０分間遠心分離して回収した。組換えＮｉｍ１キナーゼを、製造者の取扱説明書に従ってグルタチオン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上でのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
【０１５３】
ウェスタンブロット分析の場合は、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、標準的な材料及び技術（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、免疫ブロッティング（ＧＳＴ−ＨＲＰ結合抗体またはＨｉｓ−ＨＲＰ結合抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の何れかを用いて）により分析した。
【０１５４】
１２　本タンパク質の特徴付け
インサイトクローン番号３３１７６０８のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳は、ＴＮＴ Ｔ７クイック結合転写／翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造者の取扱説明書に従って行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、４８ ｋｄのタンパク質が存在することが分かった。タンパク質の大きさは、鋳型としてｐｃＤＮＡ３−Ｎｉｍ１を発現させて確認した。
【０１５５】
先述したように、Ｎｉｍ１キナーゼは哺乳動物細胞及び昆虫細胞の両方において発現した。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、５０ ｋｄのタンパク質（ｍｙｃ−Ｈｉｓタグを含む）及び８０ｋｄのタンパク質（ＧＳＴタグを含む）のそれぞれが確認された。
【０１５６】
１３　ヒトＮＩＭ１キナーゼアッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを、１００ ｎｇの組換えＮｉｍ１−ＧＳＴを１０μＣｉの［ｙ−３２Ｐ］−ＡＴＰ （３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む２０μｌのキナーゼバッファ（５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．５、３ ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２、１０ ｍＭ ＤＴＴ、及び６μＭ ＮａＯＶａ）において、２μｇのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはヒストン（ＨＩＳＴ）と共に３７℃で３０分間インキュベートして行った。反応は、サンプルバッファを加え１００℃で５分間加熱して停止させた。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ゲルを乾燥させてオートラジオグラフィー分析を行った。
【０１５７】
１４　ＮＩＭ１キナーゼに特異的な抗体の生産
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法でＮＩＭ１キナーゼを精製し、これを用いてマウスやウサギを免疫する。抗体は、以下の標準的なプロトコルを用いて生産する。別法では、ＮＩＭ１キナーゼのアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析し、免疫原性の高い領域を決定する。通常はＣ末端付近或いは親水性領域内に存在する免疫原性エピトープを選択して合成し、これを用いて抗体を増大させる。通常は１５残基程度の長さのエピトープを、Ｆｍｏｃ法でＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、これをＮ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応でＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合させて免疫原性を高める。
【０１５８】
エピトープ−ＫＬＨ複合体をフロイントの完全アジュバントと共に投与してウサギを免疫する。その後、間隔を置いてフロイントの不完全アジュバントで免疫化を繰り返す。マウスの場合は少なくとも７週間、ウサギの場合は少なくとも１２週間が経過した後、抗血清を採取して抗ペプチド活性を検査する。この検査には、このペプチドをプラスチックに結合し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。当分野で周知の方法を用いて抗体力価及び形成された複合体の収量を測定する。
【０１５９】
１５　特異的な抗体を用いる天然タンパク質の精製
天然或いは組換えの哺乳動物タンパク質を、このタンパク質に特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィで実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、この抗体をＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に共有結合させて作製する。このタンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、このタンパク質を優先的に吸着できるように、界面活性剤の存在下で高イオン強度緩衝液でそのカラムを洗浄する。結合後、緩衝液（ｐＨ ２〜３）或いは高濃度の尿素やチオシアネートイオンを用いてそのカラムからこのタンパク質を溶離させて抗体とこのタンパク質との結合を切断し、このタンパク質を回収する。
【０１６０】
１６　本核酸分子若しくはタンパク質と特異的に結合する分子のスクリーニング
本核酸分子やその断片、或いは本タンパク質やその断片を、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはＢＩＯＤＩＰＹやＦＩＴＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でそれぞれ標識する。予め基板上に配列した候補分子または化合物のライブラリを、標識した核酸分子またはタンパク質の存在下でインキュベートする。核酸分子或いはアミノ酸配列の何れかが存在する条件下でインキュベートした後、その基板を洗浄し、特異的な結合或いは複合体形成を示唆する標識が保持されている基板上の全ての部分をアッセイし、リガンドを同定する。様々な濃度の核酸若しくはタンパク質で得られたデータを用いて、標識した核酸またはタンパク質と結合した分子との親和性を計算する。
【０１６１】
１７　２−ハイブリッドスクリーン
酵母２−ハイブリッド法、即ちＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ＬｅｘＡ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて、本発明の哺乳動物タンパク質と結合するペプチドをスクリーニングする。本タンパク質をコードする核酸分子をｐＬｅｘＡベクターの複数のクローニング部位に挿入し、連結して大腸菌に形質転換する。ｍＲＮＡから調整したｃＤＮＡを、ｐＢ４２ＡＤベクターの複数のクローニング部位に挿入して、結合させ、大腸菌に形質転換させてｃＤＮＡライブラリを作製した。ｐＬｅｘＡプラスミド及びｐＢ４２ＡＤ−ｃＤＮＡライブラリ作製物を大腸菌から単離し、これらを２：１の比率で用いて、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ／ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅプロトコルに従ってコンピテント酵母ＥＧＹ４８ ［ｐ８ｏｐ−ｌａｃＺ］細胞を同時形質転換した。形質転換した酵母細胞をヒスチジン、トリプトファン、及びウラシルを含まない合成ドロップアウト（ＳＤ：ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｒｏｐｏｕｔ）培地（‐Ｈｉｓ、‐Ｔｒｐ、‐Ｕｒａ）に移し、コロニーが成長してカウント出来るまで３０℃でインキュベートした。このコロニーを１×ＴＥ（ｐＨ ７．５）の最小容量にプールし、２％アガロース（Ｇａｌ）、１％ラフィノース（Ｒａｆ）、及び８０ ｍｇ／ｍｌ のＸ−Ｇａｌ （５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｒｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加えたＳＤ培地（‐Ｈｉｓ、‐Ｌｅｕ、‐Ｔｒｐ、‐Ｕｒａ）に移し、青いコロニーの成長を調べた。発現したタンパク質とｃＤＮＡ融合タンパク質との間の相互作用により、ＥＧＹ４８におけるＬＥＵ２レポーター遺伝子の発現が活性化され、ロイシンを含まない培地（‐Ｌｅｕ）でコロニーが成長した。また、相互作用により、ｐ８ｏｐ−ｌａｃＺ レポーター作製物からのβ−ガラクトシダーゼの発現が活性化され、Ｘ−Ｇａｌ上で成長したコロニーにおいて青色コロニーが生成される。
【０１６２】
発現タンパク質とｃＤＮＡ融合タンパク質との間のポジテブな相互作用は、個々のポジティブコロニーを分離して、これらのコロニーをＳＤ液体培地（‐Ｔｒｐ、‐Ｕｒａ）で３０℃で２日間成長させるて確認することができる。培養物のサンプルをＳＤ培地（‐Ｔｒｐ、‐Ｕｒａ）に移して、コロニーが現れるまで３０℃でインキュベートする。このサンプルを、ＳＤプレート（‐Ｔｒｐ、‐Ｕｒａ）及びＳＤプレート（‐Ｈｉｓ、‐Ｔｒｐ、‐Ｕｒａ）上でレプリカ培養する。ヒスチジン含有ＳＤ培地で成長するがヒスチジンを含まない培地では成長しないコロニーは、ｐＬｅｘＡプラスミドが欠損している。ヒスチジンを必要とするコロニーをＳＤ（Ｇａｌ、Ｒａｆ、Ｘ−Ｇａｌ、‐Ｔｒｐ、‐Ｕｒａ）上で成長させ、白いコロニーを単離して成長させた。本哺乳動物タンパク質と物理的に相互作用するタンパク質をコードする核酸分子を含むｐＢ４２ＡＤ−ｃＤＮＡプラスミドを、酵母細胞から単離して特徴付けることが可能である。
【０１６３】
本明細書に記載した全ての特許及び刊行物に言及することを以って本明細書の一部とする。本発明の範囲及び概念から逸脱することなく本発明の方法及びシステムの種々の改変が可能であることは当業者には明らかであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれることが容易に理解できよう。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウエア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｂ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウエア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｃ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウエア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｄ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウエア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｅ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウエア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｆ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウエア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図２】
脳組織（７４％）、乳癌（結合組織）、及び前立腺（男性生殖器）におけるヒトＮＩＭ１キナーゼの高度に特異的な発現の電子的ノーザン分析を示す。電子的ノーザン分析は、ＬＩＦＥＳＥＱ Ｇｏｌｄデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図３】
様々な細胞系及び組織における定量ＰＣＲを用いて作成した転写物発現のグラフを示す。ｘ軸は発現の倍数を示し、ｙ軸は、細胞系（Ｈ４６０、Ａ２７８０、Ａ３７５、ＨＤＦ、ＨＥＬＡ、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、Ｕ８７−ＭＧ、及びＢＸ−ＰＣ３）及び組織（脳、結腸、子宮、及び胎盤の組織）を示す。
【図４Ａ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（３３１７６０８ＣＤ１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、線虫ＳＴＫ （ｇ３８７７３２９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ドブネズミＳＴＫ （ｇ２０５２１８９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、ヒトＣ−ＴＡＫ１ （ｇ３０８９３４９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ドブネズミ塩誘導性キナーゼ（ｇ５６７２６７６ ； ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３４）、キイロショウジョウバエＫ７８プロテインキナーゼ（ｇ２５６４６８０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、及びヒトＥＭＫ１ （ｇ１７４９７９４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）の間の保存された化学的及び構造的類似性を実証する。このアラインメントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成した。
【図４Ｂ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（３３１７６０８ＣＤ１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、線虫ＳＴＫ （ｇ３８７７３２９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ドブネズミＳＴＫ （ｇ２０５２１８９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、ヒトＣＴＡＫ１ （ｇ３０８９３４９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ドブネズミ塩誘導性キナーゼ（ｇ５６７２６７６ ； ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３４）、キイロショウジョウバエＫ７８プロテインキナーゼ（ｇ２５６４６８０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、及びヒトＥＭＫｌ （ｇ１７４９７９４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）の間の化学的及び構造的類似性を実証する。このアラインメントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成した。
【図４Ｃ】
ヒトＮＩＭ１キナーゼ（３３１７６０８ＣＤ１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、線虫ＳＴＫ （ｇ３８７７３２９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ドブネズミＳＴＫ （ｇ２０５２１８９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、ヒトＣＴＡＫ１ （ｇ３０８９３４９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ドブネズミ塩誘導性キナーゼ（ｇ５６７２６７６ ； ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３４）、キイロショウジョウバエＫ７８プロテインキナーゼ（ｇ２５６４６８０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、及びヒトＥＭＫｌ （ｇ１７４９７９４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）の間の化学的及び構造的類似性を実証する。このアラインメントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成した。
【図５】
ヒトＮＩＭ１（ｈＮＩＭ１）キナーゼアッセイを示す。酵素がｈＮＩＭｌ−ＧＳＴ、基質がミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及びヒストン（ＨＩＳＴ． １）、ポジティブコントロールがＺＡＰ７０（７０ ｋｄのζ‐鎖（ＴＣＲ）関連プロテインキナーゼ）である。符号の「＋」及び「−」はそれぞれ、各レーンにおけるヒトＮＩＭキナーゼ及び基質の存在及び不在を表す。ゲルの右側に沿った大きさの指標はキロダルトンである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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