(57)【要約】本発明は、毒性学的応答を決定するのに有用である一組の毒性学的に関連あるラット遺伝子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用物質の毒性を評価する方法であって、
（ａ）作用物質に試験動物を曝露するステップ、
（ｂ）作用物質に応答する、試験動物における表６、７、８、９及び１０の部分遺伝子配列に対応する遺伝子からなる群から選択された１つ又は複数の毒性応答遺伝子の発現を測定し、それによって試験発現プロファイルを生成するステップ、及び
（ｃ）試験発現プロファイルと、毒性を示す参照発現プロファイルとを比較するステップであって、試験発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間に有意な相関関係が存在するかどうかを決定することによって、作用物質の毒性を評価するステップ、
を含む上記方法。
【請求項２】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が腎臓で応答する請求項１記載の方法。
【請求項３】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が肝臓で応答する請求項１記載の方法。
【請求項４】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が脾臓で応答する請求項１記載の方法。
【請求項５】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が心臓で応答する請求項１記載の方法。
【請求項６】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が脳で応答する請求項１記載の方法。
【請求項７】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が肺で応答する請求項１記載の方法。
【請求項８】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が精巣で応答する請求項１記載の方法。
【請求項９】
試験動物がラットである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試験動物がイヌである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
試験動物がヒト以外の霊長類である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
試験動物がヒトである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
作用物質を、様々な投与量で又は様々な時間で投与する請求項１記載の方法。
【請求項１４】
作用物質の毒性を評価する方法であって、
（ａ）作用物質に試験動物を曝露するステップ、
（ｂ）作用物質に応答する、試験動物における表６、７及び８の部分遺伝子配列に対応する遺伝子からなる群から選択された１つ又は複数の毒性応答遺伝子の発現を測定し、それによって試験発現プロファイルを生成するステップ、及び
（ｃ）試験発現プロファイルと、毒性を示す参照発現プロファイルとを比較するステップであって、試験発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間に有意な相関関係が存在するかどうかを決定することによって、作用物質の毒性を評価するステップ、
を含む上記方法。
【請求項１５】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が腎臓で応答する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が肝臓で応答する請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が脾臓で応答する請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が心臓で応答する請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が脳で応答する請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が肺で応答する請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が精巣で応答する請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
試験動物がラットである請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
試験動物がイヌである請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
試験動物がヒト以外の霊長類である請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
試験動物がヒトである請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
作用物質を、様々な投与量で又は様々な時間で投与する請求項１４記載の方法。
【請求項２７】
作用物質の毒性を評価する方法であって、
（ａ）作用物質に試験動物を曝露するステップ、
（ｂ）作用物質に応答する、試験動物における表４の部分遺伝子配列に対応する遺伝子からなる群から選択された一組の毒性応答遺伝子の発現を測定し、それによって試験発現プロファイルを生成するステップ、
（ｃ）試験発現プロファイルと、毒性を示す参照発現プロファイルとを比較するステップであって、試験発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間に有意な相関関係が存在するかどうかを決定することによって、作用物質の毒性を評価するステップ、
を含む上記方法。
【請求項２８】
一組の毒性応答遺伝子が少なくとも２５個の遺伝子からなる請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
一組の毒性応答遺伝子が少なくとも５０個の遺伝子からなる請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
一組の毒性応答遺伝子が少なくとも１００個の遺伝子からなる請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
表６、７、８、９及び１０の部分遺伝子配列に対応する遺伝子又はそれらの少なくとも２０ヌクレオチドの断片からなる群から選択された１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項３２】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が腎臓で応答する請求項３１記載のアレイ。
【請求項３３】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が肝臓で応答する請求項３１記載のアレイ。
【請求項３４】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が脾臓で応答する請求項３１記載のアレイ。
【請求項３５】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が心臓で応答する請求項３１記載のアレイ。
【請求項３６】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が脳で応答する請求項３１記載のアレイ。
【請求項３７】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が肺で応答する請求項３１記載のアレイ。
【請求項３８】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が精巣で応答する請求項３１記載のアレイ。
【請求項３９】
表６、７及び８の部分遺伝子配列に対応する遺伝子又はそれらの少なくとも２０ヌクレオチドの断片からなる群から選択された１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項４０】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が腎臓で応答する請求項３９記載のアレイ。
【請求項４１】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が肝臓で応答する請求項３９記載のアレイ。
【請求項４２】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が脾臓で応答する請求項３９記載のアレイ。
【請求項４３】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が心臓で応答する請求項３９記載のアレイ。
【請求項４４】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が脳で応答する請求項３９記載のアレイ。
【請求項４５】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が肺で応答する請求項３９記載のアレイ。
【請求項４６】
部分遺伝子配列に対応する遺伝子が精巣で応答する請求項３９記載のアレイ。
【請求項４７】
表４の部分遺伝子配列に対応する遺伝子又はそれらの少なくとも２０ヌクレオチドの断片からなる群から選択された１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項４８】
一組の毒性応答遺伝子が少なくとも２５個の遺伝子からなる請求項４７記載のアレイ。
【請求項４９】
一組の毒性応答遺伝子が少なくとも５０個の遺伝子からなる請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
一組の毒性応答遺伝子が少なくとも１００個の遺伝子からなる請求項４７記載のアレイ。
【請求項５１】
表６、７及び８の部分遺伝子配列に対応する遺伝子からなる群から選択された一組の毒性応答遺伝子に実質的に相同な、長さが少なくとも２０ヌクレオチドに相当するポリヌクレオチドの組を含むアレイ。
【請求項５２】
請求項３１記載のアレイのポリヌクレオチドに相同である、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項５３】
ポリヌクレオチドがヒト遺伝子に対応する請求項５２記載のアレイ。
【請求項５４】
ポリヌクレオチドがネズミ遺伝子に対応する請求項５２記載のアレイ。
【請求項５５】
ポリヌクレオチドがヒト以外の霊長類遺伝子に対応する請求項５２記載のアレイ。
【請求項５６】
ポリヌクレオチドがイヌ遺伝子に対応する請求項５２記載のアレイ。
【請求項５７】
請求項３９記載のアレイのポリヌクレオチドに相同である、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項５８】
ポリヌクレオチドがヒト遺伝子に対応する請求項５７記載のアレイ。
【請求項５９】
ポリヌクレオチドがネズミ遺伝子に対応する請求項５７記載のアレイ。
【請求項６０】
ポリヌクレオチドがヒト以外の霊長類遺伝子に対応する請求項５７記載のアレイ。
【請求項６１】
ポリヌクレオチドがイヌ遺伝子に対応する請求項５７記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年１月２９日及び２００１年７月２６日にそれぞれ出願された米国仮出願第６０／２６４，９３３号及び第６０／３０８，１６１号の優先権を主張するものであり、これらを共に参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、毒性学の分野に関する。より詳細には本発明は、様々な作用物質に対する毒性学的応答を評価するのに有用な、１組のラット遺伝子配列を提供する。
【背景技術】
【０００３】
毎年、多くの新たな薬物及び化合物が発見され、生成され、公有財産として取り入れられている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により示された指針では、新たな薬物又は化合物のヒトに対する使用を認可する前に、毒性試験を実施することを求めている。毒性学的試験は薬物開発の重要な部分であるが、毒性試験は従来から、動物モデルとヒトの両方を使用した長期にわたる臨床試験を必要とし、実施にかかるコストがかなり頻繁に高くなる。ラットを用いた２年間にわたる毒性試験は、約８００，０００ドルかかる可能性がある。例えば、Ｃａｓａｒｅｔｔ及びＤｏｕｌｌの毒性学（Ｃａｓａｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄｏｕｌｌ’ｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、第４版、Ｍ．Ｏ．Ａｍｄｕｒ他編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．第３７頁（１９９１）を参照されたい。さらに、コンビナトリアルケミカルライブラリーのハイスループットスクリーニングから得られた非常に多くの化合物があるので、従来の毒性学試験は、薬物又は化合物の毒性を評価するのにもはや十分ではない。さらに、従来の毒性学的方法では、毒性の分子メカニズムがほとんど明らかにされず、動物モデルからの毒性の結果をヒトに当てはめて推定することが困難である。さらに、従来の毒性方法では、薬物の開発の次の段階及び発売後にしばしば非常に数多くの不首尾が生じている。
【０００４】
近年、薬物又は化合物に対する毒性学的応答を、例えば差次的遺伝子発現などの分子レベルで調査する、新たな分野の毒性遺伝学が台頭してきた。毒性遺伝学の１つの主な焦点は、化学又は環境ストレスに対する応答として誘発される差次的遺伝子発現の研究である。ほとんどの応用毒性学試験の１つの主な目的は、薬物又はその他の環境要因に曝されることで損傷をうけた１つ又は複数の器官、１つ又は複数の系を識別することである。いくつかの主な毒性標的の器官の例には、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、脳、胸腺、及び視床下部が含まれるが、これらに限定されない。主な毒性標的の系の例には、免疫系、神経系、消化器系、及び循環系が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子発現のパターンを調べることによって、毒性学者は化学物性毒性の基本的なメカニズムを非常に詳細に知ることができる。さらに、遺伝子発現を測定することにより、健康上のリスクがほとんどない閾値濃度を特定することが可能である。
【０００５】
毒性を決定するためのいくつかの方法及びキットが報告されている。例えば、ＷＯ００／４７７６１、米国特許第５，５８５，２３２号、第５，５８９，３３７号、及び第５，８１１，２３１号と、係属中の米国仮特許出願第６０／２２０，０５７号、及び第６０／２５４，２３２号を参照されたい。しかし毒性遺伝学によって、器官及び系の毒性メカニズムをよりよく理解できるようになり、労力及び時間をさらに費やして検出する前に、有害な結果を予測することが容易になった。器官レベルで明らかにされる毒性が、関連する遺伝子の発現の変化によってもたらされる場合、遺伝子発現の変化の検出は、次に生ずる有害な結果を早期に警告する役割を果たすことができる。遺伝子発現の変化は、その結果が器官又は系に現れるまで、数週間、数カ月、又は数年もかかる。早期の遺伝子発現の変化と遅れて現れる毒性との間に因果関係があることが示される限り、遅れて顕在化する毒性の観察に対する依存度を、遺伝子発現の変化を測定することによって低減することができる。毒性遺伝学により分子のメカニズムをよりよく理解することで、動物モデルからヒトへの、またｉｎ  ｖｉｔｒｏ系からｉｎ  ｖｉｖｏ状態への予測精度も改善することができる。毒性学に対する分子による手法では、時間、金、及び動物資源を節約することができる。
【０００６】
分子及び組換え技術の出現に伴い、遺伝子及び分子の分析により、毒性を測定することができる別の方法が提供される。差次的遺伝子発現の技術は、様々な刺激に曝された細胞の遺伝子発現の変化を検出することを含む。この刺激は、増殖因子、受容体−リガンド結合、転写因子、又は薬物や化学物質、医薬品化合物などの外来因子の形をとるものでよい。
【０００７】
差次的遺伝子発現を検出するためのいくつかの方法が報告されている。ある方法では、例えば完全長ｃＤＮＡが正確に配列決定されている遺伝子や、ランダムｃＤＮＡクローンのハイスループットシングルパス配列決定によって規定される遺伝子を含む、ポリヌクレオチドアレイを使用して、発現配列タグ（ＥＳＴ）を生成する。個々のｍＲＮＡの発現の変化を検出することに焦点を当てる研究者は、遺伝子発現の変化を検出するのに種々の方法、例えばマイクロアレイやゲル電気泳動法などを使用することができる。その他の方法は、タグを画定し差次的に発現した遺伝の検出を試みるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び／又は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用することに焦点を当てていた。多くのグループは、種々の組織で遺伝子発現を比較するのに使用できると考えられるｍＲＮＡ配列タグのデータベースを確立するために、ＰＣＲ法を使用してきた（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．Ｋ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６５３１、１９９０；Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８：７２１３、１９９０；Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｓ．Ｒ．、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ、３：７３、１９９２；Ｎａｄｅａｕ，Ｊ．Ｈ．、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ３：５５、１９９２）。この方法は、ｍＲＮＡディフェレンシャルディスプレイ法と呼ばれるプロセスでｍＲＮＡ集団を比較するのにも応用されている。
【０００８】
薬物や化学物質などの刺激に曝された細胞又は組織からｍＲＮＡを単離し、ゲル電気泳動法により発現を分析するプロセスは、労力を要し冗長なものとなる可能性がある。その目的のために、マイクロアレイの技術により、差次的遺伝子発現を検出する、より速くより効率的な方法が提供される。マイクロアレイによる差次的遺伝子発現の分析は、基質に固定化したヌクレオチドを必要とし、刺激に曝された細胞からのヌクレオチドを固定化したヌクレオチドに接触させてハイブリダイゼーションパターンを生成することができる。このマイクロアレイ技術は、分泌及び膜関連遺伝子生成物の検出、癌に関する薬理学的情報の収集、熱帯熱マラリア原虫によるマラリアでの段階特異的な遺伝子発現、真核生物での翻訳生成物、及びいくつかのその他の科学的調査に使用されてきた。例えば、Ｄｉｅｈｎ  Ｍ他のＮａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２５（１）：５８〜６２（１９９３）；Ｓｃｈｅｒｆ，Ｕ．他のＮａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２４（３）２３６〜４４（１９９３）；Ｈｅｙｗａｒｄ，Ｒ．Ｅ．他のＭｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３５（１）：６〜１４（１９９３）；Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｇ．他のＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（２３）１３１１８〜２３（１９９３）を参照されたい。マイクロアレイ技術は、ヒト型結核菌での遺伝子発現において、薬物で誘発される変化について調査するのにも使用されてきた。例えばＷｉｌｓｏｎ  Ｍ．他のＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９６（２２）：１２８３３〜８（１９９９）を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
素早く効率的で費用効果があり大量の毒性学的データを生成することができ、実験室での試験に用いられる多くの動物を節約することのできる方法が求められている。また、試験される作用物質と毒性学的に関連があり、細胞、器官、又は系レベルの毒性を予測することのできる遺伝子を、効果的に選択する方法も求められている。また、試験される１種又は複数の作用物質に関する情報を得ることができ、その作用物質が特定の器官又は系にどのように影響するかという情報を得ることができる毒性学的情報データベースと、毒性学的に関連ある遺伝子を特定し、作用物質と標的遺伝子との間の相関する毒性を特定するのに使用できるアルゴリズムも求められている。
【００１０】
分子毒性学的分析又は毒性遺伝学は、毒性学的分析に有用と考えられる毒性学的応答データの収集から、データベースの形で莫大な量の情報を提供することができる。本明細書に示される本発明及びその実施形態は、前述の必要性を満たすものである。
【００１１】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、及び刊行物の開示は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、毒性応答遺伝子とその使用を提供する。
【００１３】
一態様で、本発明は、（ａ）作用物質に試験動物を曝すこと、（ｂ）その作用物質に応答する、試験動物における表６、７、８、９、及び１０の部分遺伝子配列に対応する遺伝子から選択された１つ又は複数の毒性応答遺伝子の発現を測定し、それによって試験発現プロファイルを生成すること、及び（ｃ）試験発現プロファイルと、毒性を示す参照発現プロファイルとを比較することによって作用物質の毒性を評価する方法であって、試験発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間に有意な相関関係が存在するかどうかを決定することによりその作用物質の毒性を評価する方法を提供する。一実施形態で、部分遺伝子配列に対応する遺伝子の群は、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺、精巣、又は脳で応答する。別の実施形態で、試験動物はラット、イヌ、ヒト以外の霊長類、又はヒトである。別の実施形態で、作用物質は、様々な用量で又は様々な時間で投与される。
【００１４】
別の態様で、本発明は、（ａ）作用物質に試験動物を曝すこと、（ｂ）その作用物質に応答する、試験動物における表６、７、及び８の部分遺伝子配列に対応する遺伝子から選択された１つ又は複数の毒性応答遺伝子の発現を測定し、それによって試験発現プロファイルを生成すること、及び（ｃ）試験発現プロファイルと、毒性を示す参照発現プロファイルとを比較することによって作用物質の毒性を評価する方法であって、試験発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間に有意な相関関係が存在するかどうかを決定することによりその作用物質の毒性を評価する方法を提供する。一実施形態で、部分遺伝子配列に対応する遺伝子の群は、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺、精巣、又は脳で応答する。別の実施形態で、試験動物はラット、イヌ、ヒト以外の霊長類、又はヒトである。別の実施形態で、作用物質は、様々な用量で又は様々な時間で投与される。
【００１５】
別の態様で、本発明は、（ａ）作用物質に試験動物を曝すこと、（ｂ）その作用物質に応答する、試験動物における表４の部分遺伝子配列に対応する遺伝子から選択された１つ又は複数の毒性応答遺伝子の発現を測定し、それによって試験発現プロファイルを生成すること、及び（ｃ）試験発現プロファイルと、毒性を示す参照発現プロファイルとを比較することによって作用物質の毒性を評価する方法であって、試験発現プロファイルと参照発現プロファイルとの間に有意な相関関係が存在するかどうかを決定することによりその作用物質の毒性を評価する方法を提供する。一実施形態で、毒性学的に関連のある遺伝子の組は、少なくとも２５個の遺伝子からなる。別の実施形態で、毒性学的に関連のある遺伝子の組は、少なくとも５０個の遺伝子からなる。別の実施形態で、毒性学的に関連のある遺伝子の組は、少なくとも１００個の遺伝子からなる。
【００１６】
別の態様で、本発明は、表６、７、８、９、及び１０の部分遺伝子配列に対応する遺伝子又はその少なくとも２０ヌクレオチドの断片から選択された、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイを提供する。一実施形態で、部分遺伝子配列に対応する遺伝子の群は、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺、精巣、又は脳で応答する。
【００１７】
別の態様で、本発明は、表６、７、及び８の部分遺伝子配列に対応する遺伝子又はその少なくとも２０ヌクレオチドの断片から選択された、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイを提供する。一実施形態で、部分遺伝子配列に対応する遺伝子の群は、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺、精巣、又は脳で応答する。
【００１８】
別の態様で、本発明は、表４の部分遺伝子配列に対応する遺伝子又はその少なくとも２０ヌクレオチドの断片からなる群から選択された、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイを提供する。一実施形態で、毒性応答遺伝子の組は、少なくとも２５個の遺伝子からなる。別の実施形態で、毒性応答遺伝子の組は、少なくとも５０個の遺伝子からなる。別の実施形態で、毒性応答遺伝子の組は、少なくとも１００個の遺伝子からなる。
【００１９】
別の態様で、本発明は、表６、７、及び８の部分遺伝子配列に対応する遺伝子から選択された１組の毒性応答遺伝子に実質的に相同な、長さが少なくとも２０ヌクレオチドに相当するポリヌクレオチドの組を含むアレイを提供する。
【００２０】
別の態様で、本発明は、表６、７、及び８の部分遺伝子配列に対応する遺伝子又はその少なくとも２０ヌクレオチドの断片から選択された１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイに含有されたポリヌクレオチドに相同な、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むアレイを提供する。一実施形態で、ポリヌクレオチドは、ヒト、ネズミ、ヒト以外の霊長類、又はイヌの遺伝子に対応する。
【００２１】
表１は、いくつかの個体で非常に高い毒性応答を潜在的に引き起し得る医薬品物質のリストである。
【００２２】
表２は、いくつかの個体で非常に高い毒性応答を潜在的に引き起し得る工業用薬品のリストである。
【００２３】
表３は、表７、８、９、及び１０に示したデータを生成するのに使用した薬物及び化学物質のリストである。これらの化合物は、下記の病態を誘発するその能力に応じて選択した。すなわち、肝臓の変性／壊死、肝細胞肥大、肝細胞空胞、腎細管の変性／壊死、腎糸球体壊死、心筋の変性、心筋の炎症、脾臓リンパ球枯渇／アポトーシス、脾臓リンパ球過形成、神経毒性、骨格筋の変性及び炎症、多重組織壊死及び炎症、修復であって、増殖を含むものである。
【００２４】
表４は、毒性応答遺伝子と決定された７００個のラット遺伝子及び／又は遺伝子配列のリストである。
【００２５】
表は、３つのセクションに分れている。第１のセクションは、遺伝子をＧｅｎＢａｎｋデータベースで検索した場合に既知の完全なラット遺伝子に一致する、１７，２４１個の遺伝子の組からの実験的なデータを使用して発見された遺伝子を列挙している。第２のセクションは、遺伝子をＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースで検索した場合に既知の完全なラット遺伝子に一致しない、１７，２４１個の遺伝子の組からの実験的なデータを使用して発見された遺伝子を列挙している。これらの遺伝子を、フェーズ１  ＲＣＴナンバーによって番号順に列挙する。第１及び第２のセクションにおける遺伝子のクローンは、ｐＴ７Ｔ３Ｄ−ＰＡＣベクターを使用する。この表の遺伝子配列は、配列にベクターの小さい部分を含んでよい。下記のベクター配列の部分は、表４に列挙された配列に含めることができるものであり、また遺伝子又は遺伝子配列そのものを参照する場合には含めるべきではないものである。Ｍ１３リバースプライマーを使用する配列は、
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号７０１）があり、その後にインサートを入れることができ、その後に
ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＡＧＧＧＴＴＡＡＴ（配列番号７０２）も続けることができるものを含む。相補鎖の配列は下記の通りであり：
ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号７０３）があり、その後にインサートを入れることができ、その後に
ＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＡＡＡＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ（配列番号７０４）も続けることができるものである。
【００２６】
この表の遺伝子の第３の組は、重要な細胞経路での可能性ある役割及び実験データの毒性応答性に基づいて選択された遺伝子を指す。この第３の組の遺伝子に関するクローンは、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターを使用した。この表４の遺伝子配列は、配列にベクターの小さい部分を含んでよい。下記のベクター配列の部分は、表４に列挙された配列に含めることができるものであり、また遺伝子又は遺伝子配列そのものを参照する場合には含めるべきではないものである。プライマーとしてＴ７プロモーターを使用する配列は、ＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴ（配列番号７０５）を含み、その後にインサートがあり、その後にＡＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴ（配列番号７０６）を続けることができるものを含む。逆相補鎖の配列は、ＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴ（配列番号７０７）を含み、その後にインサートを入れることができ、その後にＡＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴ（配列番号７０８）も続けることができるものを含む。「フェーズ１  ＲＣＴ」と示される遺伝子を、表５にさらに詳細に示す。
【００２７】
表５は、フェーズ１  ＲＣＴ遺伝子とそのホモロジーのリストであり、既知の遺伝子（ラット、マウス、ヒト）がＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴサーチによって識別されたものである。「既知の完全な遺伝子に対して有意なホモロジーが見出されない」という文言は、ＢＬＡＳＴサーチによって、任意の既知の完全な遺伝子に対して有意な（＞９７％）ホモロジーが明らかにされなかったことを示す。
【００２８】
表６は、１７，２４１遺伝子マイクロアレイ上で１７，２４１個の遺伝子を試験することによって発見された遺伝子と、各遺伝子を選択する根拠を提供した応答データのリストである。これら４００個の遺伝子は、許容可能な誘導倍率値（＞２）、変異係数（ＣＯＶ、＜３０）、及び蛍光値（ｆｌｕｏｒ、＞４００）に関して全ての遺伝子データを最初にフィルタリングした後に選択し、次いでこれらの基準を満たす遺伝子を、遺伝子が応答する実験の数、二枚のスライド間のＣＯＶ、及び誘導倍率によってランク付けした。遺伝子の名称の後に、許容可能な応答を誘発する化合物（フィルタを通過したもの）と、評価した組織、薬物又は化学物質の用量、及びその化合物を腹腔内注射した後に動物を殺した時点に関する詳細のリストを続けた。
【００２９】
表７は、１７，２４１個の遺伝子の組から実験により選択された毒性学的遺伝子の、組織に特異的な応答を示すリストである。この組織応答に関して評価したデータは、表３に列挙した化合物をラットに投与し、次いで差次的遺伝子発現を決定することによって得られ、それによって約２５００回の実験によるデータベースが構築される（すなわち、１つのマイクロアレイからのデータ）。組織応答は、肝臓及び腎臓に関する特定の組織では実験の１％で２倍よりも大きく、心臓、肺、脾臓、精巣、及び脳に関する特定の組織では実験の２％で２倍よりも大きい。この表は、各遺伝子に関するデータによってまとめられる。
【００３０】
表８は、表７の毒性学的遺伝子の、組織に特異的な応答を、その組織ごとに示すリストである。
【００３１】
表９は、重要な細胞経路でのその役割の詳細によって選択された毒性学的遺伝子の、組織に特異的な応答を示すリストである。この組織応答に関して評価したデータは、表３に列挙した化合物をラットに投与し、差次的遺伝子発現を決定することによって得られ、それによって約２５００回の実験によるデータベースが構築される。組織応答は、肝臓及び腎臓に関する特定の組織では実験の１％で２倍よりも大きく、心臓、肺、脾臓、精巣、及び脳に関する特定の組織では実験の２％で２倍よりも大きい。この表は、各遺伝子に関するデータによってまとめられる。
【００３２】
表１０は、表９の毒性学的遺伝子の、組織に特異的な応答を、その組織ごとに示すリストである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、薬物、化学物質、及び／又は化合物に対する毒性応答を評価するのに使用することができる、毒性学的に関連のある１組のラット遺伝子を提供する。
【００３４】
Ｉ．一般的な技法
本発明を実施する際、他に特に示さない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来の技法であって当業者の技術範囲に包含される技法を使用する。そのような技法は、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）及び分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、２００１）、（合わせて本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と呼ぶ）；分子生物学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編、１９８７、２００１年までの増補版を含む）；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、（Ｍｕｌｌｉｓ他編、１９９４）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）抗体を使用して：実験室マニュアル（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（合わせて本明細書では「Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ」と呼ぶ）、Ｂｅａｕｃａｇｅ他編、核酸化学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００などの文献で十分に述べられている。
【００３５】
ＩＩ．定義
本明細書で使用する「毒性」は、低用量又は平均用量の作用物質に対する細胞、組織、器官、又は系の、強調された微視的又は巨視的応答を指す。これらの応答は、眩暈又は悪心などの観察可能な症状に至り、また中毒症状ももたらす可能性がある。毒性はしばしば、その程度又は種類において、推奨される用量での大多数の個体の応答とは異なる有害な副作用をもたらす。
【００３６】
「明白な毒性」は、肉眼で応答を観察することができる毒性を指す。明白な毒性応答の例には、臨床観察、血清化学値、血液学的検査値、尿検査値、病理組織検査結果、又は剖検での組織及び器官の肉眼所見が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
「毒性学的応答」は、作用物質に曝露したときの細胞、組織、器官、又は系レベルでの応答を指し、そのような遺伝子のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションの両方を包含する遺伝子及び／又はタンパク質の差次的発現；細胞障害の修復又は制御に関連するタンパク質をコードする遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション；又は作用物質の存在に応答する遺伝子の制御を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で使用する「毒性遺伝子」、「毒性学的に関連ある遺伝子」、及び「毒性応答遺伝子」という用語は、互いに置き換えて使用可能である。これらの用語は、そのメッセージ又はタンパク質レベルが有害な刺激を受けることによって変化する遺伝子と定義することができる。細胞が誘発する特定の遺伝子の組は、とりわけその作用物質によって引き起こされる損傷又は有毒な危険性のタイプと、どの器官が最も脅かされるかによって様々である。
【００３９】
本明細書で使用する「毒性学的応答を示す遺伝子発現」は、毒性遺伝子又は毒性応答遺伝子の相対的な発現レベルを指す。遺伝子発現プロファイルのプロファイルは、様々な細胞タイプ、種々の組織、種々の器官、又は流体（例えば血液や尿、脊髄液、血清）を含むサンプルなどのサンプル中で測定することができる。これらのプロファイルは、「試験発現プロファイル」及び「参照発現プロファイル」を含むことができる。
【００４０】
「実質的に相同な」又は「実質的に同一な」は、下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定又は目視検査によって、最大対応箇所を比較しそれに合わせて並べた場合に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチド又はアミノ酸残基が一致している配列ホモロジーを指す。２つの配列（アミノ酸又はヌクレオチド）は、その完全長全体を比較することができる（例えばそれらが大幅に異なる長さである場合は、２つのうち短いほうの長さ）。配列の比較では、一般に１つの配列が基準配列としての役割をし、それと試験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、部分列座標を指定し、必要なら配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで配列比較アルゴリズムを用い、基準配列に対する試験配列の同一性パーセントを、指定されたプログラムパラメータに基づいて計算する。比較に最適な配列位置合わせは、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジー位置合わせアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化による実現によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、又は目視検査（一般に前掲の、Ａｕｓｕｂｅｌ他による分子生物学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）によって行うことができる。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、ウィンドウの長さやギャップペナルティなどのデフォルトパラメータを使用する。また、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることは、第１のポリペプチド（例えば第１の核酸によってコードされたポリペプチド）が、第２のポリペプチド（例えば第２の核酸によってコードされたポリペプチド）に対して免疫学的に交差反応性を有することを示している。このためポリペプチドは一般に、２つのペプチドが同類置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。
【００４１】
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、タンパク質生成物をコードしてＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、相補的な鎖、及びこれらの断片を包含するポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、イントロン及びエクソンを含むことができる。
【００４２】
「遺伝子配列」という用語は、遺伝子、完全長遺伝子、又はこれらの一部を指す。
【００４３】
本明細書で使用する「アレイ」及び「マイクロアレイ」は相互に置き換えて使用可能であり、中心位置でヌクレオチド配列を集めたものの配列を指す。アレイは、スライドガラスなど固体の基体上、又はニトロセルロース膜など半固体の基体上に配置することができる。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの任意の並べ替えでよく、ヌクレオチド類似体を含む。ヌクレオチド配列は、遺伝子の部分配列、プライマー、全遺伝子配列、非コード配列、コード配列、公表された配列、既知の配列、又は新規の配列でもよい。
【００４４】
個体が毒性学的応答を示すことのできる「作用物質」には、例えば薬物や医薬品化合物、家庭用化学物質、工業用化学物質、環境化学物質、並びに個体を曝露することができるその他の化学物質及び化合物を含めることができる。吸入や環境曝露など、作用物質への曝露によって物理的接触並びに二次接触が生じる。
【００４５】
本明細書で使用する「差次的発現」は、作用物質に曝露したときの、細胞、組織、器官、又は系における遺伝子及び／又は前記遺伝子でコードされたタンパク質の発現レベルの変化を指す。本明細書で使用する差次的遺伝子発現は、差次的な転写及び翻訳、並びにメッセージの安定化を含む。差次的遺伝子発現は、遺伝子発現のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションの両方を包含する。
【００４６】
「ラット」という用語はＲａｔｔｕｓ属の哺乳類を指し、かなり大きいサイズで構造上の詳細（例えば歯のサイズ）も関連するマウスとは異なる数多くの齧歯類（Ｒａｔｔｕｓ及び関連する属）のいずれか１種を含むことができる。使用することができるラットの系統には、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ、及びＦｉｓｈｅｒが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用する「サンプル」という用語は、個体によって供給される物質を指す。サンプルには、細胞、組織、組織の一部、器官、器官の一部、又は流体（例えば血液や尿、血清）を含めることができる。サンプルは、少なくとも２個の異なる遺伝子を含むことによって好ましい実施形態で特徴付けられ、多細胞タイプからの遺伝子を含んでもよい。サンプルには、真核、哺乳動物、又はヒト由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は本明細書で互いに置き換えて使用可能であり、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは線状でも分岐状でもよく、修飾アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって分断される。また、自然に又は介入によって、ジスルフィド結合形成やグリコシル化、ミリスチル化、アセチル化、アルキル化、リン酸化、脱リン酸化によって修飾することもできる。また、この定義には、１つ又は複数のアミノ酸類似体（例えば非天然のアミノ酸を含む）を含有するポリペプチド、並びに当技術分野で知られるその他の変形例も含まれる。
【００４９】
本明細書で使用する「有意な相関関係」という用語は、当技術分野での通常の意味を有し、偶然に生じる観察される相違の可能性（ｐ値）（又は「同様の」測定値の場合は、観察される相違が見られない可能性）が、およそ所定のレベル未満であり、すなわちｐ値＜０．０５であり、好ましくはｐ値＜０．０１であり、より好ましくはｐ値＜０．００１であることを意味する。様々な適切な統計的手法が当業者に周知であり、統計的有意性の測定に使用することができる（例えばスチューデントのｔ検定｛２つのサンプルの比較用｝やＡＮＯＶＡ｛分散分析｝、信頼区間分析などの標準的な統計方法；ＳＡＳシステム  バージョン８（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）などのソフトウェアを分析に使用することができる）。
【００５０】
「個体」は脊椎動物であり、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはヒトである。哺乳類には、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、マウス、及びラットが含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
ＩＩＩ．毒性学的に関連ある１組の遺伝子の同定
毒性学的に関連ある１組の遺伝子の同定は、いくつかの方法によって実現することができる。使用することができる１つの方法は、前述のように遺伝子をクローニングして、毒性学的に潜在的な関連性があるようにすることである。例えば文献やＧｅｎＢａｎｋにより公表されている配列を使用して、プライマーを作製し、次いでこれを使用して、関連あるライブラリーからＰＣＲ増幅し、問題となっている毒性学的に関連ある候補遺伝子を得ることができ、次いでこれを、所望の用途に応じてプラスミド又は発現ベクターにクローニングすることができる。遺伝子配列（完全又は部分）は、以下に開示するハイスループット試験のため、マイクロアレイ中の、その他の毒性学的に関連ある遺伝子の間に配置することができる。
【００５２】
あるいは、コピー数が高くなるよう複製するために、プラスミドを使用して、問題となっている毒性学的に関連ある候補遺伝子のコピー数を増大させ、次いでこれを任意の市販のキット（例えばＱｉａｇｅｎやＰｒｏｍｅｇａ製）で精製することができる。精製された、毒性学的に関連ある候補遺伝子を使用してマイクロアレイに「スポット」し、あるいは、その後精製した核酸を発現ベクターに挿入し、哺乳動物の細胞、例えばラットの細胞にトランスフェクトして、その細胞を化合物に曝露し、毒性学的応答を観察することができる。明白な毒性は、顕微鏡下での試験によって決定することができる細胞の形態又は細胞骨格の再配列変化を観察することによって、あるいは細胞アポトーシス又は細胞壊死を観察することによって、確認することができる。別の代替例では、以下に詳細に述べる「トランスクリプトームプロファイリング」を使用することができるが、この場合、曝露された細胞と曝露されていない細胞の両方から核酸を単離して、どのレベルの化合物が、問題となっている毒性学的に関連ある遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを引き起こすのか決定するよう試験をすることができる。
【００５３】
毒性学的に関連ある１組の遺伝子を同定するのに使用することができる別の方法は、約１７，４２１個の既知のラット遺伝子が存在する入手可能なラット遺伝子の試験を行い、ラットの毒性試験からの組織を使用して遺伝子の応答を調べ、差次的発現をするものを選択することである。差次的発現は、任意の数の方法によって評価することができる。使用することができる１つの方法は、マイクロアレイ分析によるものである。本明細書では、差次的遺伝子発現を決定するのにマイクロアレイ分析を使用する方法を示す。差次的遺伝子発現を決定する別の方法は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）であり、例えばＴａｑｍａｎ（登録商標）の技術である。本明細書では、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）技術を使用する方法を示す。差次的遺伝子発現の検出に使用できる別の方法は、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅからの、商用として利用可能なＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）技術である。差次的発現の決定に使用できる別の方法は、ノーザンブロット分析である。使用することができるその他の方法には、ＡＦＬＰ及びＳＡＧＥを含めることができる（Ｋｌｅｉｎ，Ｐ．Ｅ．他、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０（６）：７８９〜８０７（２０００）；Ｗａｎｇ，Ｘ．及びＦｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｚ．、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．３５（３）：４１４〜２１（１９９７））Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｚ．及びＷａｎｇ  Ｘ．Ｃａｎ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５（６）：７３１〜４（１９９７）；Ｈｏｕｇｈ，Ｃ．Ｄ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０（２２）：６２８１〜７（２０００）；Ｙｅ，Ｓ．Ｑ．他、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８７（１）：１４４〜５２（２０００））。
【００５４】
毒性学的に関連ある１組の遺伝子を同定するのに使用することができる１つの方法は、対照ラットの遺伝子発現プロファイルと、作用物質で処理したラットの遺伝子発現プロファイルとを比較するのに「オープンシステム」を使用し、それによって応答遺伝子が選択されるようにすることである。あるいは、対照ラット細胞（又はラット細胞系）からの遺伝子発現プロファイルと、作用物質で処理したラット細胞（又はラット細胞系）からの遺伝子発現プロファイルとの比較を使用して、応答遺伝子を選択することができる。これを、本明細書では「トランスクリプトームプロファイリング」と呼ぶ。この方法は、差次的遺伝子発現を分析することによって、どの遺伝子が毒性学的に関連あるものか実験を行って決定する。一実施形態では、実験用ラットを２つのグループに分ける。一方のグループは、１種又は複数の作用物質に、種々の濃度で種々の時間にわたって曝露する。他方のラットのグループはいかなる作用物質にも曝露せず、対照群としての役割を果たす。次いでラットを殺し、肝臓や脾臓、腎臓、精巣、心臓、肺、胸腺などの器官を採取してそこから細胞を得、遺伝子発現の分子分析を行う。さらに、循環血液中の血清タンパク質を分析して別の測定値を得ることができ、曝露していないラットと比較することができる。
【００５５】
実験群を少なくとも１種の作用物質に曝露してから、両群のＲＮＡを単離し、ＰＣＲ反応で逆転写してｃＤＮＡを生成し、これを増幅して２本鎖ＤＮＡを生成する。ＰＣＲは放射性ＤＮＡ基質の存在下で行い、これは２本鎖ＤＮＡに組み込まれる。ポリアクリルアミドゲル上では、処理された細胞から得られたＤＮＡを、未処理の個体群から得られたＤＮＡの隣で、長さによって分離する。得られた１つ又は複数のバンドの強度を、処理済みの細胞群と未処理の細胞群との間で比較する。異なる放射性強度を示すバンドをゲルから切り取り、ＰＣＲで増幅し、クローニングし、配列決定する。その配列を、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開されているデータベースの既知の遺伝子配列と比較する。このようにして、類似性の程度が様々な既知のラット遺伝子の他、毒性学的に関連ある新規のラット遺伝子が発見され同定される。本明細書で開示する実施例は、本発明のこの態様を当業者がどのように実施できるかを例示する。
【００５６】
公に利用可能な任意の遺伝子配列データベースに一致しないラット遺伝子の部分配列が発見された場合、当業者が利用可能な技術、テキスト（下記のＳａｍｂｒｏｏｋ他参照）、及び情報源によって、必要以上に実験を行うことなく、遺伝子の残りの配列を決定して完全長の遺伝子を得ることが可能である。一実施形態で、完全長遺伝子は、プライマーとなることが知られているラット遺伝子配列の一部を使用することによって得られるが、このプライマーは、ラットｃＤＮＡライブラリーとのＰＣＲ反応でランダムプライマーと組み合わせて使用する。ＰＣＲ反応は標準のアガロースゲル上で行い、増幅したバンドを特定し、ゲルから切り取って配列決定をする。
【００５７】
これらの方法のそれぞれを、以下により詳細に開示する。毒性学的に関連ある遺伝子を同定する際に考慮されるその他のファクタには、１種又は複数の作用物質の選択と、投与される用量と、投与経路が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
ＩＶ．作用物質の選択
試験される作用物質は、異なる基準に基づいて選択することができる。一態様で、試験をする化合物の基準は、特定の器官で観察される損傷である。一実施形態では、腎尿細管上皮性細胞障害を引き起こすことが観察されることからシスプラチン、アンホテリシンＢ、及びゲンタマイシンを選択する。別の実施形態では、肝臓ペルオキシソームの増殖がクロフィブレート、ゲムフィブロジル、及びＷＹ１４６４３の影響を受けることが観察されることから、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、及びＷＹ１４６４３を選択する。別の態様で、選択の基準は機能である。例えば、シスプラチンはアポトーシス及び反応性酸素種を引き起こし、アンホテリシンＢはイオンに対する細胞膜の透過性を増大させかつ腎性血管収縮を引き起こし、ゲンタマイシンはリソソームでリン脂質の蓄積を引き起こす。
【００５９】
その他の毒素は一般に器官に影響を及ぼし、例えばいくつかの腎臓毒素にはシスプラチンやゲンタマイシン、プロマイシン、アンホテリシンＢが含まれるがこれらに限定されない。肝臓毒素にはクロルプロマジン、クロフィブレート、ジフルニサル、テトラサイクリン、エリスロマイシン、及びエタノールが含まれるが、これらに限定されない。免疫毒素にはサイクロスポリンＡ、リポ多糖（ＬＰＳ）、ヒドロキシ尿素、フェニルヒドラジン、デキサメタゾン、エストラジオール、及びタモキシフェンが含まれるがこれらに限定されない。心臓毒素にはドキソルビシンが含まれるがこれらに限定されない。多器官の毒素にはメトトレキセート及び塩化カドミウムが含まれるがこれらに限定されない。
【００６０】
試験される作用物質を選択するその他の基準は、処方等又は市販薬によってその環境で定期的に個体が曝露されるそれらの作用物質を選択することである。作用物質の試験をする別の基準は、ＦＤＡの認可を得るためあるいは例えば前臨床試験又は臨床試験におけるその他の毒性要件のため、毒性に関して試験をする必要がある作用物質である。表１及び２に、上記基準により選択することができるいくつかの作用物質を列挙する。
【００６１】
Ｖ．用量の決定
ラットの実験で使用する作用物質の用量は、いくつかの方法を使用して決定することができる。一態様では、報告されている用量を出発点として使用し、その報告された用量から徐々に増やしまた徐々に減らして投与する。増分は、少なくとも約±１％、５％、１０％、２５％、３５％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である。血清化学値及び血液学的検査値を含むがこれらに限定されない値を含む血液中のマーカーのアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを使用して、毒性に達したかどうか決定することができる。別の態様では、特に、問題となっている化合物に特異的な標的である器官の組織病態を検査して、化合物の投与に応答して病態変化が生じたかどうかを決定することができる。一実施形態で、病態変化には、肝臓の変性／壊死、肝細胞肥大、肝細胞空胞、腎細管の変性／壊死、腎糸球体壊死、心筋の変性、心筋の炎症、脾臓リンパ球枯渇／アポトーシス、脾臓リンパ球過形成、神経毒性、骨格筋の変性及び炎症、多重組織壊死及び炎症、修復であって、増殖を含むものが含まれる。一実施形態で、別の態様では、種々の用量の１種又は複数の作用物質の投与に応答した分子変化は、そのような作用物質への曝露に伴う遺伝子発現を分析することによって決定される。
【００６２】
細胞培養を使用した実験による用量決定は、作用物質の性質やその効力、作用機序、作用物質の標的である細胞のタイプ、細胞の数といった多くのファクタの影響を受ける。実験で必要とされる用量を決定するには、低用量レベルの作用物質を加え、次いで段階的にその用量を増大させると共に、作用物質への曝露時間も長くする。作用物質が親油性であり容易に細胞の脂質二重層を透過する場合は、より低い初期濃度を使用することができ、かつ／又は作用物質に対する曝露時間をより短くすることができる。作用物質が細胞障壁を容易に透過できずまた細胞膜を透過して能動的に又は受動的に輸送される必要がある場合は、わずかに高い初期濃度を使用することができ、かつ／又は作用物質に対する曝露時間をより長くすることができる。毒性学的応答及び細胞の形態をモニタしながら段階的に用量を増やすことによって、当業者は、細胞死の速度及び増殖パターンから、毒性学的応答が生じるときの用量を決定することができる。しかし、細胞の物理構造及び完全性（例えばモルホロジーや増殖パターンなど）を含めるがこれらに限定されない目に見える変化である毒性学的応答が生じることに留意されたい。例えば細胞毒性応答並びに分子毒性応答をモニタすると、差次的遺伝子発現によって、好ましい用量を見出す可能性が増大する。
【００６３】
遺伝子発現の変化は、処理を取りやめ又は少なくしてももはや正常の状態には戻らないときの用量、すなわち化合物で処理する前に存在した細胞、器官、又は系の状態に戻らない用量で、毒性学的に有意になる。ある用量又は時間を超えた処理によって、細胞は毒性学的に関連あるものになる。この中毒量は、その中毒量よりも少ない用量で観察されるパターンとは全く異なる識別可能な遺伝子発現パターンによって示される。遺伝子発現を分析してどのように遺伝子発現データとの相関をとるかという方法について、以下に述べる。
【００６４】
ＶＩ．作用物質の投与
問題となっている作用物質の投与は、様々な経路で行うことができる。その経路は様々でよく、腹腔内、静脈内、皮下、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、筋肉内、経腸的、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、経粘液的、徐放性ポリマー組成物（例えばラクチドポリマーやコポリマー微粒子又はインプラント）、潅流、肺（例えば吸入）、鼻、経口などによって行うことができることが、当業者に容易に理解されよう。注射可能な物質は、溶液又は懸濁液、溶液又は懸濁液に適する固体の形であって、注射前に液体に溶かすもの、又はエマルジョンなど、従来の形に調製することができる。作用物質は、医薬品として許容される形、例えば賦形剤と共に投与することができる。適切な賦形剤には、例えば水や生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどが含まれる。１種又は複数の作用物質を非経口的に、また経口的に送達するための製剤は当技術分野で知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：薬剤の科学及び実施（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に、より詳細に記載されている。
【００６５】
作用物質を投与するのに担体を使用する場合、その担体は、試験される作用物質に対して相溶性があり、かつ処理されるラットに有害ではない（すなわち害を与えない）という意味で、受け入れられるものでなければならない。固体組成物の場合、従来の無毒性担体には、例えばマンニトールや乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、ペクチン、デキストリン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどが含まれ、これらと同様のものを使用することができる。上記定義した活性化合物は、例えばポリアルキレングリコールを使用し、担体として例えばプロピレングリコールを使用することにより、坐薬として配合することができる。
【００６６】
一態様で、投与する作用物質は、分子レベル又は生理的レベルで、ラットにある種の毒性学的応答をもたらすのに十分な量の作用物質を含有することが好ましい。
【００６７】
ＶＩＩ．既知のラット遺伝子を使用した、毒性学的に関連ある遺伝子を同定する方法
一態様では、当技術分野又は公に利用可能なデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋにおいて、毒性学的に関連ある候補遺伝子であるラット遺伝子について述べた。毒性学的に関連ある候補ラット配列を使用して、プライマーを設計し、これをＰＣＲ反応で使用して、ｃＤＮＡライブラリーからラット遺伝子を増幅する。ｃＤＮＡライブラリーは、生体外で得られ又は商業上の供給元、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られた種々のラット細胞から作製することができる。ｃＤＮＡの生成は、単離したＲＮＡの逆転写を伴い、これは当技術分野で周知である（例えば前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ他参照）。ＰＣＲによって増幅されたラット遺伝子断片を、数多くの商業上の供給元（例えばＰｒｏｍｅｇａ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓなど）から得ることができる任意の標準的なプラスミド発現ベクターにクローニングし、配列決定する。次いで得られた配列情報をＧｅｎＢａｎｋデータベースと比較し、クローニングしたＤＮＡが、特定のラット遺伝子、すなわちその遺伝子に適うようプライマーが設計された特定のラット遺伝子であることを確認する。配列が明らかに確認されたら、増幅した遺伝子を遺伝子のパネルに加えてアレイに含める。
【００６８】
別の態様では、毒性学的に関連ある候補遺伝子である非ラット（例えばヒト）遺伝子の配列に付いて述べた。これらの毒性学的に関連ある非ラット遺伝子に対するプライマーを設計し、合成し、引き続きラットｃＤＮＡライブラリーとのＰＣＲ反応で使用して、相同なラット遺伝子を増幅する。相同なラット遺伝子は、プライマーがそれに合わせて設計された非ラット遺伝子に対して全く正確な配列であってもそうでなくてもよい。次いで増幅したラット遺伝子を遺伝子パネルに加えて、アレイに含める。
【００６９】
別の態様では、毒性学的に関連があり又は毒性学的に関連ある候補遺伝子であるラット遺伝子又は遺伝子配列を使用して、他の齧歯類、例えばマウスでの毒性学的に関連ある遺伝子を決定する。ラットとマウスの遺伝子配列のホモロジーが高く、約９７％であると考えられる場合、必要以上の実験を行わずに、非ラットの毒性学的関連性を高い信頼性で特定することができる。
【００７０】
別の態様では、ラットアレイに含める標的配列を、例えばスライドガラスなどの基体上に固定化したヌクレオチドを新たに合成することによって得る。標的配列は、１種又は複数の毒性学的応答を示すことができる遺伝子からのものである。
【００７１】
ＶＩＩ．（Ａ）ディフェレンシャルディスプレイ法
いくつかのディフェレンシャルディスプレイ法を使用して、問題となっている遺伝子を同定することができる。差次的遺伝子発現は、ゲル電気泳動、及びポリヌクレオチドマイクロアレイ、又は商業的に利用可能な技術、例えばＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）又はＴａｑｍａｎ（登録商標）を含む技法を使用して観察することができる。
【００７２】
一態様では、処理されたラット及び対照ラット又はそれらの細胞系の組織から単離したｍＲＮＡ（ＰＣＲ前にｃＤＮＡに変換される）のＰＣＲ合成の結果を、ゲル電気泳動にかけ、これらｍＲＮＡ集団によって生成されたバンドを比較する。１つのｍＲＮＡ集団からの１つのゲルの画像に示されるバンドであって他には示されていないバンドは、１つの集団に特定のｍＲＮＡが存在しかつ他には存在しないことを示し、したがって差次的に発現し易い遺伝子が示される。対照ラット及び処理したラット又はこれらの細胞系から得られたメッセンジャーＲＮＡは、５’プライマーとして１０個のヌクレオチド（ランダム十量体）の任意のオリゴヌクレオチド配列を使用し、３’蛍光標識「アンカープライマー」としてポリＡテールに相補的な１組の１２個のオリゴヌクレオチドを使用することによって、比較することができる。次いでこれらのプライマーを使用して、デオキシリボヌクレオチドの付加と共にｍＲＮＡの部分配列を増幅する。次いで増幅したこれらの配列を配列決定ゲル上で分解し、各配列決定ゲルが、５０〜１００個のｍＲＮＡ配列を有するようにする。次いでこれらの配列決定ゲルを互いに比較して、増幅させたどのセグメントが差次的に発現するかを決定する（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．他サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５７：９６７、１９９２；Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０：４９６５、１９９２；Ｌｉａｎｇ，Ｐ．他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１（１４）：３２６９〜７５（１９９３））。
【００７３】
ＶＩＩ（Ｂ）トランスクリプトームプロファイリング
オープンシステムを使用して、ラット細胞を薬物及び／又は化学物質に種々の濃度で曝露し、次いで種々の時点で採取することができる。ラット細胞は、組織サンプル、器官、血液、皮膚、生体液（例えば尿や脊髄液、精液など）、細胞系を含むがこれらに限定されない様々な供給源から得ることができる。トランスクリプトームプロファイリングも生体内で投与されたラットで得ることができる。固定化した細胞系は、商業上の供給元、例えばＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得られ、又はその他の供給元、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる。ラット細胞を得るその他の方法には、組織生検、血液、皮膚、又は生体液から得られた細胞であって、例えば生体内で投与されたラットからのものを単離することが含まれる。当業者に周知のように、組織サンプルからの細胞の単離は、任意の様々な技法を使用して行うことができる。
【００７４】
細胞を得ることができる供給源は、肝臓、肺、心臓、精巣、腎臓、脾臓、胸腺、及び脳を含むがこれらに限定されない任意のいくつかの器官でよい。一実施形態では、毒性試験に肝臓細胞を使用することができ、この場合、投与される作用物質は既知のものであり、あるいは肝臓機能不全又は肝臓毒性を引き起こすと考えられるものである。他の実施形態では、作用物質によって送達される作用の標的がわかっている場合、標的器官から得られる細胞を使用することによって、組織をランダムに選択した場合よりも毒性学的応答に関してより有益な情報がもたらされる。試験される作用物質が未知の効果をもたらす別の実施形態では、種々の供給源から単離した細胞のパネルを使用することができる。代替例では、作用物質の作用標的に関する知識がない状態で肝臓細胞を使用することができるが、それは肝臓が多くの毒素を処理することが知られているからである。毒性学的応答は、作用物質の作用の標的組織を使用した場合に当業者が得ることのできる結果に比べて最も理想的なものでなくてよいが、肝臓細胞を使用する利点は、毒性学的に関連ある遺伝子を同定し、次いで引き続き他の器官に関して試験をして、他の器官における毒性を決定できること、あるいはどの器官が作用物質の標的か特定できることと考えられる。多くの組織供給源から細胞を単離するのではなく、１つの組織供給源（この状態では肝臓）からの細胞を試験することにより、時間が節約される。
【００７５】
生体外で得られ、あるいは商業的又は非商業的な供給源から得られたラット細胞であって、剖検直後又は貯蔵用に冷凍した状態のものを使用し、実験時間中、培地で培養することができる。広く様々な基底細胞支持培地を使用して、液体のｐＨを、ラット細胞の生存を促進させる範囲内に保つことができる。非限定的な例には、Ｆ１２／ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、ＣＭＲＬ−１０６６、Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、及びＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＥＭ）が含まれる。さらに、Ｈａｍ及びＷａｌｌａｃｅのＭｅｔｈ．Ｅｎｚ．、５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ及びＳａｔｏのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２：２５５（１９８０）に記載されている基礎栄養培地のいずれかも含まれる。細胞は、プレートで又はフラスコ内で増殖させることができる。細胞を増殖し、ＤＮＡ又はＲＮＡの単離に望ましくかつ必要なレベルまで増やす。細胞をプレート又はフラスコから取り出して、ＤＮＡ又はＲＮＡを単離する。細胞が付着している場合は、トリプシン又は別の同等なものを使用して、細胞をプレート又はフラスコから離すことができる。ＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として、好ましくは少なくとも約１×１０2個の細胞、より好ましくは少なくとも約１×１０3個の細胞、より好ましくは少なくとも約１×１０4個の細胞、より好ましくは少なくとも約１×１０5個の細胞、より好ましくは少なくとも約１×１０6個の細胞、さらにより好ましくは少なくとも約１×１０7個の細胞を使用する。一実施形態では、ラットに投与して、中毒量の薬物／化学物質に生体内で曝露した後に組織を採取する（核酸を分離）。この実施形態については実施例でさらに述べる。
【００７６】
次いで単離した核酸を増幅して、基体に付着することのできる生成物を生成する。好ましい実施形態で、基体は固体の基体である（例えばスライドガラス）。増幅プロセスは、プライマーの一端に反応基（例えばアミン基又はその誘導体）を有するプライマーを使用することを含み、このプライマーが増幅生成物に組み込まれる。使用することのできる反応性プライマーの一例は、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎから得られるアミンプライマーである。スライドガラスに付着される遺伝子断片の長さは様々でよい。遺伝子のヌクレオチドがアレイ中に多く存在するほど、結合をより緊密にし、結合における特異性をより大きくすることができる。しかし、断片が長いほどその増幅が難しくなり、点突然変異又はその他の増幅に関連する誤りが含まれる可能性があることを考慮することが重要である。したがって、アレイに含まれる遺伝子又はその断片の所望の長さは、長い（例えば＞１ｋｂ）遺伝子配列で得られた結合の高い特異性と、より長い断片に関連のある高い突然変異率とのバランスを考慮に入れるべきである。スライドガラスに付着させた遺伝子断片は、少なくとも約２５塩基対（ｂｐ）の長さであり、少なくとも約５０ｂｐの長さであり、より好ましくは少なくとも約１００ｂｐの長さであり、より好ましくは少なくとも約２００ｂｐであり、さらに好ましくは少なくとも約３００ｂｐであり、さらに好ましくは少なくとも約４００ｂｐであり、さらに好ましくは少なくとも約５００ｂｐの長さである。好ましい実施形態で、遺伝子断片の長さは約５００ｂｐである。固体の基体に付着してアレイを生成するのに使用される遺伝子の領域は、遺伝子の任意の部分でよく、コード部分、非コード部分、５’末端、３’末端などでよい。好ましい実施形態では、毒性学的応答に関係するラット遺伝子の３’末端の約５００塩基対を選択してアレイに含める。
【００７７】
ＶＩＩ（Ｃ）マイクロアレイの作製
遺伝子又はその断片をスライドガラスなど固体の基体に付着させるいくつかの技法が当業者に周知である。１つの方法は、アミン基、アミン基の誘導体、正電荷を有する別の基、あるいは遺伝子又は遺伝子断片の増幅に使用されるプライマーの一端に反応する別の基を付着させてアレイに含めることである。次いで引き続きＰＣＲ生成物を増幅することにより、この反応性基が生成物の一端に組み込まれることになる。次いで増幅した生成物を、スライドガラスなど固体の基体に接触させるが、この基体は、アルデヒド、又は増幅したＰＣＲ生成物の反応性基と共有結合する別の基で被覆したものであり、したがってスライドガラスに共有結合するようになる。アミノプロプリルシリカン表面化学を使用するその他の方法及びマイクロアレイを作製するその他の方法が開示されている。例えば、Ｎｕｗａｙｓｉｒ，Ｅ．Ｆ．他の分子発癌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、２４：１５３〜１５９（１９９９）；Ｋａｎｅ，Ｍ．Ｄ．他のＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（２２）：４５５２〜７（２０００）；ＭａｃＢｅａｔｈ  Ｇ．及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．のサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８９（５４８５）：１７６０〜１７６３（２０００）；Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．及びＷｉｎｚｅｌｅｒ，Ｅ．Ａ．のネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４０５（６７８８）：８２７〜８３６（２０００）；Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｊ．Ｄ．のサイエンティスト（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ）１４（１７）：２５（２０００）；及びＣｏｒｔｅｓｅ，Ｊ．Ｄ．のサイエンティスト（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ）１４（１１）：２６、（２０００）を参照されたい。本発明のその他の実施形態は、実施例でさらに述べる。
【００７８】
アレイを使用するその他の方法が知られており、例えば固体の基体に固定化した核酸などのポリマーのアレイが、例えば米国特許第５，７４４，３０５号、第５，５１０，２７０号、第５，６７７，１９５号、第５，６２４，７１１号、第５，５９９，６９５号、第５，４５１，６８３号、第５，４２４，１８６号、第５，４１２，０８７号、第５，３８４，２６１号、第５，２５２，７４３号、及び第５，１４３，８５４号、並びにＰＣＴ  ＷＯ９２／１００９２、ＰＣＴ  ＷＯ９３／０９６６８、及びＰＣＴ  ＷＯ９７／１０３６５に開示されている。各プローブ配列が支持体の非常に小さい部位、例えば数ミクロンを占めることのできるフォトリソグラフィ及び製作技法が、米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。ポリヌクレオチドのアレイが付着される表面を有する基体には、シリコン又はガラスが含まれる。例えば米国特許第５，５４５，５３１号に記載されるように、光を通し、光学検出が可能な基体を使用することができる。
【００７９】
ＶＩＩＩ．毒性学的に関連ある遺伝子の分析及び評価用アルゴリズム
ラット遺伝子、例えば１７，４２１個の１組のラット遺伝子であって、本明細書では「１７Ｋアレイ」と呼ばれる遺伝子からの候補遺伝子のランク付けでは、総合毒性（ＣＴ）アレイに含めることができるようにするため、多段階手法を使用することができる。第１に、１７Ｋアレイを使用してどのような実験が行われようとも、個々の遺伝子の値に対して３つのカットオフ基準を定めることができる。すなわち１）誘導倍率／抑制レベル、２）複製スポットの平均蛍光レベル（発現レベルの反映）、及び３）複製スポットの変異係数である。この「カット」を得るための初期スクリーニングは、発現レベル及び測定品質に基づく。
【００８０】
第２に、カットが得られる遺伝子の値を集めて全体的なスコアにし、各遺伝子ごとにランク付けしたが、これは６つのランキング基準に基づく。すなわち１）遺伝子がカットオフ基準を満たすスライドの数（ＮＣ）、２）スライド同士の一致性％（最初のスライドに対し、２枚目のスライド上で遺伝子の値がカットオフ基準を満たす回数の％）（ＣＣ）、３）遺伝子がカットオフ基準を満たす全ての場合での誘導倍率の平均の大きさ（絶対値）（ＦＩ）、４）これら誘導倍率スコアの変異係数（他の全てのランキング基準とは異なり、より低いものがより良いと考えられる）（ＣＶ）、５）遺伝子がカットオフ基準を満たす場合の全ての複製スポットの平均蛍光値（ＦＬ）、及び６）組織の一致性（遺伝子がカットオフ基準を満たす場合の何パーセントかが同じ組織内であった）（ＣＴ）。
【００８１】
各遺伝子を、各ランキング基準ごとに０から１００までのスコアに割り当てた。各ランキング基準スコアは、以下のように計算した。すなわち、全てのスコア中の最低値を最高値から差し引くことによって、全ての遺伝子の範囲を基準に合わせて計算した。次いで各遺伝子に対するスコアを、その遺伝子に対する値から、存在する最低値を差し引くことによって計算し、次いで上記範囲で割って１００を掛けた。言い換えれば、各遺伝子に対するスコアは、存在する最小値の最大値に対する割合である。例えば遺伝子のスコアが、その基準での最大値と存在する最小値との差の４分の３である場合、そのスコアは７５％になる。ＣＶファクタ（誘導倍率の変異係数）の場合、より低い値がより良いと考えられるので、計算されるスコアを１００から差し引いてパーセンテージに変換した。
【００８２】
各遺伝子に対する最終ランキングは、６つのランキング基準に基づくそのスコアの重み付け組合せを介して計算することができる。スコアを特定の基準に合わせて計算できない場合、その基準の値全体を方程式から取り除き、したがってランキングは残りのファクタのみに基づいて行われる。
【００８３】
ＩＸ．毒性学的に関連ある遺伝子を使用する方法
一態様で、本発明は、試験動物（例えばラット）を作用物質に曝露し、試験動物での毒性学的に関連ある１個又は複数の遺伝子の発現を測定することによって、特定の作用物質に対する毒性を決定する方法を提供する。このため、後に参照発現プロファイルと比較して作用物質の毒性を決定することのできる、試験発現プロファイルが生成される。これは、例えば試験発現プロファイルと参照発現プロファイルとの通常の統計的分析により、例えば有意な相関関係を決定することによって、行うことができる。一実施形態では、作用物質を表１又は２から選択する。別の実施形態で、作用物質は、薬物、薬物候補、又は医薬品化合物である。中毒量に達するのに必要とされる毒物投与量及び曝露時間は、本明細書で述べる方法を使用して決定する。別の実施形態で、試験発現プロファイルには、表４、６、７、８、９、又は１０からの遺伝子又は遺伝子配列が含まれる。別の実施形態で、参照プロファイルには、例えば表４、６、７、８、９、又は１０から実験により得られた１つ又は複数の発現プロファイルが含まれる。別の実施形態では、試験遺伝子発現プロファイルを、データベース、例えば総合毒性（ＣＴ）データベースに記憶された参照遺伝子発現プロファイルと比較することができる。別の実施形態で、遺伝子発現プロファイルは、特定の器官での応答性、例えば腎臓や肝臓、脾臓、心臓、肺、精巣、脳での応答性に関連付けられる。
【００８４】
別の実施形態では、毒性学的に関連あるラット遺伝子を使用して、毒性学的に関連ある遺伝子の部分遺伝子配列に対応する遺伝子から選択されたポリヌクレオチドを含むアレイを得る。一実施形態で、アレイは、それぞれ少なくとも２０個のヌクレオチドの遺伝子又は部分遺伝子配列を含む。別の実施形態で、アレイは、それぞれ少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、少なくとも３００個のヌクレオチド、又は少なくとも５００個のヌクレオチドの遺伝子又は部分遺伝子配列を含む。別の実施形態で、アレイは、表４の部分遺伝子配列に対応する、毒性学的に関連ある遺伝子を含む。その他の実施形態で、アレイは、表６、７、８、９、又は１０の部分遺伝子配列に対応する、毒性学的に関連ある遺伝子を含む。さらに別の実施形態で、アレイは、特定の器官での応答性、例えば腎臓や肝臓、脾臓、心臓、肺、精巣、脳での応答性に関連する部分遺伝子配列に対応した、毒性学的に関連ある遺伝子を含む。
【００８５】
別の態様では、実質的に相同な配列を選択するため、本明細書で述べるアレイを使用することによって、ラット以外の動物（例えばヒトやイヌ、ヒト以外の霊長類）からの毒性学的に関連ある遺伝子配列を得ることができる。当業者に知られるように、上述の計算された配列アライメントを使用することによって、又はハイブリダイゼーション技法によって、ホモロジーを決定することができる。核酸ハイブリダイゼーションは、その相補性の程度やハイブリダイゼーション反応条件のストリンジェンシーなどのファクタに依存する。緊縮状態を使用して、相補性の程度が高い核酸二重鎖を同定することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを調節する手段は当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他の「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ他の「分子生物学における現行プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９６及び定期改訂版；及びＨａｍｅｓ他の「核酸ハイブリダイゼーション：実用的手法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、１９８５を参照されたい。一般に、ストリンジェンシーを増す条件（すなわちより緊密に一致する二重鎖を形成するため選択する）には、高温、低イオン強度、及び溶媒の有無が含まれ、より低いストリンジェンシーの場合は、温度を低くし、イオン強度を高くし、溶媒濃度を高くし又は低くする。その他の非ラット動物での、毒性学的に関連ある遺伝子の同定は、どの種が最も毒性応答を引き起こし易いか評価することによって、どの種が最も動物モデルに適するか決定するのを助けることができる。
【００８６】
別の態様では、ある薬物を投与したときにラットの遺伝子発現プロファイルを比較することができ、別の薬物を投与したときには第２の遺伝子発現プロファイルと比較することができる。毒性学的に関連あるデータは、本明細書に開示するアルゴリズムを使用して相関関係をとることができる。薬物同士の相互作用の影響により、同様の組の遺伝子をアップレギュレートし又はダウンレギュレートすることができる。この作用は相加的又は相乗的でよい。別の実施形態では、薬物同士の相互作用の影響により、機能に関係ない異なる遺伝子の組を誘発することができる。別の実施形態では、本明細書に開示する方法及び毒性学的に関連ある遺伝子の組によって、表７、８、９、及び１０に示されるように、標的器官及びその内部への中毒量を決定することが可能になる。これは、薬物が目的とする標的器官が１つであって多器官に毒性を及ぼさないものである場合の薬物設計に有用である。別の実施形態では、方法及び毒性学的に関連ある遺伝子の組を使用して、作用物質に対する毒性応答を予測することができるが、この場合、明白な毒性が現れる期間中繰り返し曝露する。そのような作用物質の例には、ワンヒット発癌性物質（例えばアフラトキシンＢ１、ジメチルニトロサミン、ＥＮＵなど）、又はマルチドーズ発癌性物質（例えばフェノバルビタールやＷＹ１４６４３）がある。これら発癌性物質に対する分子毒性応答は、これら作用物質への曝露に応答して生じる任意の巨視的変化に先んじて決定することができる。
【００８７】
Ｘ．毒性学的データベースを生成するために毒性学的応答データを使用する方法
種々の投与量及び／又は種々の時点で１種又は複数の作用物質に応答してラットから細胞、組織、又は器官のデータを収集することにより、毒性学的応答に関する情報、例えば参照発現プロファイルを収集したデータベースを構築することができる。このデータベースでは、特定の作用物質又はそれらの組合せに対する毒性学的応答を評価することが可能になる。
【００８８】
毒性遺伝学の１つの実用的な適用例は、遺伝子発現に基づいて一連の作用物質のランク付けを助けることである。初期ランク付けは、特定のストレス又は損傷、例えばＤＮＡ損傷を示す１組の遺伝子に関する最大変化の平均パーセントを決定することによって行われる（例えばｗａｆ−１、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  β、ｃ−ａｂｌ、サイクリンＧ、Ａｐｅ、及びＭｇｍｔ）。
【００８９】
リード作用物質の優先順位を付けるために遺伝子発現データを使用する別の方法は、問題となっている全ての遺伝子に関して完全な用量−応答曲線を構成することである。閾値レベルを超えて引き起こされる各遺伝子のＥＣ50を決定する（ＥＣ50は、作用物質に対し、最大５０％の遺伝子に応答が生じる濃度である）。次いで作用物質を、問題となっている遺伝子に関するＥＣ50平均によってランク付けすることができる。ＥＣ50が最も低い作用物質は、より毒性が高いと考えられる。
【００９０】
ラット遺伝子アレイは、ある特定の作用物質がどの経路に影響を及ぼすかといった、誘導効果を予測するのに使用できる情報も生成することができる。これは、差次的遺伝子発現を観察して、どの経路が毒物応答遺伝子を含みどの経路に遺伝子が影響を及ぼすかを分析することによって実現される。この情報は、組織応答、全器官応答、及び／又は系応答を予測するのに使用することができる。全器官応答を予測する能力は、薬物、医薬品化合物の開発、及び化学物質の使用においてさえ、非常に大きい可能性を有すると考えられる。
【００９１】
下記の実施例は例示を目的とし、本発明をいかなる方法によっても限定するものではない。当業者なら、本発明の趣旨及び範囲を保持しつつ、修正が可能であることは明白であろう。
【実施例１】
【００９２】
実験データによる、毒性学的に関連ある遺伝子の発見及び特徴付け
セクション１  調製及びマイクロアレイ上のプリント可能なラット遺伝子
ａ．ポリメラーゼ連鎖反応
１７，２４１個のラット遺伝子を、Ｍ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。Ｍ１３フォワードプライマーの配列はＣＴＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣ（配列番号７０９）であり、Ｍ１３リバースプライマーの配列はＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ（配列番号７１０）であった。Ｍ１３リバースプライマーは、ＰＣＲ生成物のセンス鎖（５−３’）とガラスマイクロアレイスライドとの結合が確実になるよう結合されたＣ１２アミン結合を有していた。アミンリンカーは、いくつかの任意の商業上の供給元、例えばシンセゲン（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ）で、プライマーの合成中に付加することができる。
【００９３】
ＰＣＲ反応用に以下の成分を合わせた：Ｈ2Ｏ  ２１リットル、１０×ＰＣＲ緩衝液２．５リットル、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．１２リットル、２５ｎｇ／ｌ  Ｍ１３フォワードプライマー  １リットル、２５ｍｇ／ｌ  Ｍ１３リバースプライマー  １リットル、グリセロールストックからのクローンのサンプル、及びＴａｑポリメラーゼ  ０．５リットルを合わせて全体積を２５リットルにした。この混合物の反応を９５℃で５分間行い、次いで９５℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、その後７２℃で５分間という条件下のサイクルを３５回繰り返し、最後に、サンプルがサーモサイクラから除去されるまで４℃で行った。約４リットルのＰＣＲ生成物が除去され、１％アガロースゲル上で実施してＰＣＲ反応が確実に首尾良く行われるようにした。
【００９４】
ｂ．毒性学的に関連ある遺伝子のスライドガラスへの結合
増幅した生成物を、標準的なエタノール沈殿法によって、あるいは市販のＰＣＲクリーンアップキット、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｑｉａｇｅｎなどによって精製した。次いで清浄化したＰＣＲ生成物を、増幅生成物のアミン基と反応することができかつ共有結合を形成することができるスライドガラスに、固定化し又は「スポット」した。ＰＣＲ生成物は、ＭＤジェネレーションＩＩアレイスポッターを使用して被覆スライドガラス上にスポットした。この実施例で使用する用語及び装置は下記の通りであった。
スポッター：ＭＤジェネレーションＩＩアレイスポッター主要機器
スポットチャンバ：ピン、プレート、トレイ、及びほとんどのスポッター機械類を収容する、ガラスに包封されたスポッターの領域
制御器：スポッターユニットの右側にある専用Ｄｅｌｌコンピュータ及びモニタ
ピン：標的を持ち上げスポットする、スポッターユニット内の（６）本の微細なチューブ
スライド：片面に特殊コーティングが施された、標準サイズの顕微鏡用スライドガラス
プレート：スポットされる標的溶液を保持する、プラスチックの９６ウェルプレート
標的：スポッターによってスライド上に付着される、ＰＣＲ生成物溶液
Ｎ２タンク：「窒素、圧縮（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ）」というラベルが付いた、高さ約１．５ｍ（５フィート）の鋼製ガスタンク
Ｎ２：Ｎ２タンクからのＮ２ガス
空調装置：スポットチャンバの窓に設置されたＫｅｎｍｏｒｅ空調装置
加湿装置１：窓に対するＥｓｓｉｃｋ２０００蒸発冷却器
加湿装置２：スポッターユニット内への白色柔軟ダックを有するＢｅｍｉｓ  Ａｉｒｆｌｏｗ
加湿装置３：壁面に対するＢｅｍｉｓ  Ａｉｒｆｌｏｗ
加湿装置４：Ｋｅｎｍｏｒｅ  ＱｕｉｅｔＣｏｍｆｏｒｔ  ７
真空ポンプ：Ｇａｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  オイルレスピストン真空ポンプ
ダンプボックス：ＮａＣｌ／水のスラリが入っているプラスチック封止可能容器
【００９５】
試薬溶液に使用される材料は、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水、０．２Ｍ  ＫＣｌ（ストック２Ｍ  ＫＣＬを水に溶かした１／１０希釈液）、及び９５％ＥｔＯＨであった。温度制御は６０°に調節した。スポッターチャンバは、相対湿度が３９％よりも高くなるように、かつ６５℃未満になるように調節した。スポットピンは、２０サイクル予洗した。スライドガラスには、まずＮ２ガスをそれぞれ片面に約２秒間吹き付けた。このスライドを、アレイスポッター実行値に従ってスポッターに挿入した。清浄な細い棒をスライドの中央右端に合わせ、スライドが金属製のピンに対して垂直に配置されるまで、静かに左に押すことによって、スライドを位置合わせした。スライドを載せて真っ直ぐにした後、目視検査をして破片が落ちていないことを確認した。湿度については、相対湿度が３９％よりも高いことを確認した。ＭＤスポッターは、１回の操作で最大限１６枚のプレートを認識し、８枚のプレートの後に自動的に休止する。またＭＤスポッターは、不変の順序でプレートを順次進んで行き、ただ１つのプレートを供給するスキームに対応するようプログラムされていない。したがって、ラットアレイに対してスポット操作を行うため、プレートを手動で回転（又はシャッフル）させることが重要であった。各スライド上に遺伝子（ＰＣＲ生成物）を２回スポットし、合計で３０００個の遺伝子を１枚のスライド上にプリントした（合計６０００スポット）。１７，２４１個の全ての遺伝子を含めるため、１組６枚のスライドを用いた。位相差顕微鏡を用い、品質管理の目的で、プリント（スポット）したマイクロアレイの試験を行い、スポットのモルホロジー及び全ての遺伝子の存在を評価した。
【００９６】
ｃ．ブロッキング（スポット後のスライド調製）
このブロッキング手順は、非特異的なバックグラウンド信号を低減するので重要である。このプロトコルで得られる量はスライド１９枚分であるが、当業者なら適宜変更を加えることができるであろう。１９枚よりも多いスライドをブロックする場合は、より多くの染色シャーレ及びスライドラックが必要になる。清浄なガラス容器を得て、Ｎａｎｏｐｕｒｅ  Ｈ２０を満たした。その容器をホットプレート上に置き、高温に加熱した。５００ｍＬのブロッキング溶液ボトルに２０％ＳＤＳを２．５ｍｌ添加することによって、ブロッキング溶液を作製した。ブロッキング溶液をマイクロ波で２．５分間温め、温度が５０℃に達したかどうか決定するための確認をした。溶液の温度がまだ５０℃ではない場合、所望の温度に達するまでその溶液をマイクロ波で１０秒間隔で温めた。４×ＳＳＣ溶液を入れたオービタルシェーカーに１個の染色シャーレを配置して、撹拌速度７５ｒｐｍにした。スライドを金属ラックに置き、沸騰水に数分間（例えば２分）入れた。スライドを沸騰水から出して、短時間冷却した。次いでスライドを、４×ＳＳＣ溶液が入っている染色容器に移し、オービタルシェーカー上に数分間（例えば２分）置き、染色容器内でナノピュア水で濯ぎ、次いで簡単に、ブロッキング溶液中に約１５分間置いた。１５分後、スライドをブロッキング溶液から出し、ナノピュア水が入っている３個の別々の容器にそれぞれ浸漬することによって３回濯いだ。スライドの上面に組織を軽く押し当て、そのスライドを約５分間、１０００ｒｐｍの速度で遠心分離にかけた。
【００９７】
セクション２  遺伝子の差次的発現を決定する試験のためのラットｃＤＮＡを得るための毒性試験
ａ．ラットの投与、及び生体内で中毒量の薬物／化学物質に曝露した後の組織の採取
約２．５カ月齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙオスラットを使用して、毒性試験を実施した。中毒量の薬物／化学物質にラットを曝露する実験の設計には、毒物投与量及び化合物の投与経路を決定することが含まれる。ラットを、特定濃度の化合物を投与した処理済みのラットと、化合物を溶液又は懸濁液（例えば生理食塩水）に混合したビークルのみ投与した対照ラットに分ける。可能な場合は、生理食塩水をビークルとして使用した。体重１ｋｇ当たり１０ｍｌの体積の薬物、化合物、又は適切なビークルを、ラットの腹腔内に注射した。投与される各薬物又は化学物質の濃度は、毒性が従来の毒性学的方法（例えば組織病理学、血清化学、血液学）によって記録されている用量であり、第２の用量は中毒量の２５％である。食物を与えずに１０時間経過した後のラットに投与し、次いで６時間、２４時間、及び７２時間後に殺した。３匹の対照ラット及び３匹の処理済みラットを、各薬物ごとに各時点で安楽死させる。各ラットは、吸入によるＣＯ2過剰摂取により非常に鎮静作用が効いており、次いで最大量の血液を抜いた。この血液を、血清単離用としてクロットチューブに分取し、血液リンパ球単離用としてヘパリン化チューブに分取する。この血液の抜き取りによるラットの瀉血によって、ラットを殺す。組織の採取方法は非常に重要であり、組織内のｍＲＮＡの品質が確実に保たれるようにする。次いでラットの体を切開し、何人かの解剖者により特定の器官／組織を素早く取り出して、すぐに液体窒素中に置く。血液リンパ球、血清、尿、肝臓、肺、心臓、精巣、脾臓、骨髄、脳、及び薬物／化学物質の特定の標的になり得るその他の標的を採取した。器官／組織の全てを動物が死んでから３分以内で完全に冷凍して、ｍＲＮＡが確実に分解しないようにする。次いで器官／組織を、十分にラベルが付されたプラスチックフリーザークオリティバッグにパックし、器官／組織サンプルの一部からｍＲＮＡを単離する必要が生じるまで、−８０度で保存する。
【００９８】
血清化学的な変化は２４時間と７２時間で評価した。病理組織学的評価は、毒性評価のため７２時間後に病理学者が実施した。血液学的検査及び尿の分析は７２時間後に評価した。
【００９９】
ｂ．動物からの全ＲＮＡの単離
高品質及び高純度の全ＲＮＡを組織サンプルから単離するため、以下の材料、すなわちＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙミディキット、２−メルカプトエタノール、液体Ｎ2、組織ホモジナイザー、ドライアイスを使用する。
【０１００】
ＲＮａｓｅによってＲＮＡの分解が生じるというリスクを最小限に抑えるため、予防策をとることが重要である。サンプルは、指定された場合は氷上で保持すべきであり、常に作業領域内では手袋をはめ、装置はリボヌクレアーゼ阻害剤、例えばＲＮａｓｅ  Ｚａｐ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で処理する。ＲＮＡの分解を防止するために、作業領域及びこの手順で使用される材料を清浄にし、リボヌクレアーゼを存在させないことが非常に好ましい。チップ及び遠心管をオートクレーブ処理してもリボヌクレアーゼは除去されない。下記のプロトコルは、最適な結果が得られるよう修正を加えたＱｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミディキットを基にする。この全ＲＮＡ単離技法は、動物組織からＲＮＡを単離するのに使用され、より小さいサンプルに適応するよう修正を加えることができる。
【０１０１】
組織を破壊する必要がある場合、少量の液体窒素を入れた秤量ボート内に配置した、２層のアルミニウム箔上に組織を置くことができる。アルミニウム箔を組織の周りに配置し、次いでその組織に、箔で包んだ小さいハンマで鈍い力を加えた。
【０１０２】
肝臓又は腎臓に関しては、約０．１５〜０．２０ｇの組織を計り取り、１５ｍｌのコニカルチューブに入れた。他のサンプルを計量しているときは、全ての組織をドライアイス上に保持した。
【０１０３】
ＲＬＴ緩衝液約３．８ｍｌを、サンプルが入っているチューブに添加した。ＱｉａｇｅｎのＲＬＴ緩衝液（登録商標）は、必要とされる溶解緩衝液各１．０ｍｌにβメルカプトエタノール１０μｌを添加することにより、前もって調製することができる。組織は、ロータ−ステータホモジナイザーを４５秒間使用して均質化した。Ｓ２５Ｎ−１０Ｇ吐出要素を備え速度４に設定したＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５ホモジナイザーを使用することができる。あるいは、Ｖｉｒｔｉｓｈｅａｒ  Ｃｙｃｌｏｎｅ  ７５０Ｗ  ローター／ステータホモジナイザー（Ｖｉｒｔｉｓ製品＃２７８０７７）を、７ｍｍの極微小鋸歯軸及び発電器（長さ１９５ｍｍ、処理範囲０．２５ｍｌ〜２０ｍｌ、製品＃３７２７１８）と共に使用することができる。均質化後、全てのサンプルが均質化されるまでサンプルを氷上で保存した。サンプル間で均質化チップを清浄にするため、チップをまず数秒間、９５％エタノール中で作動させ、次いで新たに９５％エタノールを吹き付けることによって濯いだ。このプロセスを、ナノピュア水で繰り返した。
【０１０４】
Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６（又は同等のもの）遠心装置を用い、組織溶解産物を室温で１０分間、３７００〜３８００ｒｐｍで遠心分離して、核を除去し、したがって、ＤＮＡ汚染を低下させた。
【０１０５】
溶解産物の上澄みを、いかなるペレットもまたいかなる脂肪層も含まれないようにまた混合されないように慎重に、ＤＥＰＣ処理したＨ2Ｏに溶かした等体積の７０％ＥｔＯＨが入っている清浄な１５ｍｌのコニカルチューブに移した。サンプル約３．８ｍｌを、１５ｍｌの遠心管内に配置したＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、３０００×ｇ（３６９０〜３７１０ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６）で５分間遠心分離した。素通り画分は廃棄した。残りのサンプルを適切なカラムに添加し、３０００×ｇで５分間回転させ、その素通り画分を廃棄した。
【０１０６】
緩衝液ＲＷ１（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））約４．０ｍｌをカラムに添加し、以前のように回転させ、次いで緩衝液ＲＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））約２．５ｍｌをカラムに添加して３０００×ｇ（３６９０〜３７１０ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６）で２分間回転させた。この実施例では、ＲＰＥ緩衝液を濃縮液として供給し、したがって使用前に９５％ＥｔＯＨを４体積量添加した。ミディキットでは、９５％ＥｔＯＨ約２２０ｍｌをＲＰＥ  ５５ｍｌに添加する。緩衝液ＲＰＥ  ２．５ｍｌをさらに添加し、５分間回転させて、同様にカラムを完全に乾燥した。チップを含むカラムは、次の溶離ステップに向けて乾燥すべきである。
【０１０７】
溶離では、清浄な１５ｍｌのチューブに結合したＲＮＡを有するカラムを移し、リボヌクレアーゼを含まない水２００μｌをそのカラムに添加して、１分間静置し、３０００×ｇ（３６９０〜３７１０ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６）で３分間回転させた。このステップを、リボヌクレアーゼを含まない水２００μｌを用いる以外、同じチューブ内で繰り返した。
【０１０８】
ｃ．汚染ＤＮＡの除去
単離したＲＮＡサンプルは、定量のため吸光度の読取りを測定する前又は後に、下記の塩化リチウム（ＬｉＣｌ）プロセスを使用して沈殿させることができる。サンプルの体積を測定した。このため、Ａｍｂｉｏｎ製（カタログ＃９４８０）の約１／３の体積のＬｉＣｌ  ＰＰＴ溶液を添加し、チューブを逆さにすることによって混合した。ＬｉＣｌは溶解状態であるべきである。そうではない場合、ｐＨを８．０に調節することが必要と考えられる。この溶液を、−２０℃で３０分間置き、４℃で１０分間、１３，０００ＲＰＭで遠心分離した。目に見えるペレットがない場合、サンプルを一晩、−２０℃に戻し、次いで遠心分離を繰り返すのに役立つ。上澄みを分離管に移し、ＤＥＰＣ処理した水に溶かして氷冷した７０％エタノール１ｍｌを添加することによって洗浄し、静かに逆さにした。次いでこのチューブを４℃で１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、ペレットを風乾した。ペレットをＲＮＡ貯蔵緩衝液（Ａｍｂｉｏｎカタログ＃７０００）に再懸濁した。
【０１０９】
あるいは、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ミディキット手順に、このキットの取扱い説明書に記載されるようＤＮＡｓｅステップを組み込むことによって、汚染ＤＮＡを除去した。
【０１１０】
ｄ．ＲＮＡの量の測定
収量を測定するため、２６０ｎｍでＯ．Ｄ．を得て、約２．０μｌのＲＮＡを９８μｌのＨ2Ｏに添加した。下記の式を計算に使用した。
（吸光度）×（希釈係数）×（４０）／１０００＝ＲＮＡの量μｇ／ｍｌ
サンプルの計算では、
吸光度＝０．４５
希釈係数＝５０
（０．４５×５０×４０）／１０００＝ＲＮＡ濃度μｇ／ｍｌ
【０１１１】
ｅ．マイクロアレイ逆転写反応
上記開示したように、まず対照細胞及び処理済み細胞からＲＮＡを単離することによって、トータル又はｍＲＮＡから、蛍光標識したファーストストランドｃＤＮＡプローブを作製した。毒性学的に関連ある遺伝子に特異的なＤＮＡをスポットしたマイクロアレイのスライドに、このプローブをハイブリダイズする。この実施例を実施するのに必要な材料は、トータル又はメッセンジャーＲＮＡ、プライマー、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ緩衝液、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ヌクレオチドミックス、Ｃｙ３又はＣｙ５染料、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＲＴ）、酢酸アンモニウム、７０％ＥｔＯＨ、ＰＣＲ機、及び氷である。
【０１１２】
トータルＲＮＡ  ２０μｇ（又はｍＲＮＡ  ２μｇ）を含有する各サンプルの体積を計算した。各ＲＮＡサンプルの全体積を１４μｌにするのに必要なＤＥＰＣ水の量も計算した。ＲＮＡを希釈しすぎた場合、スピードバック内で加熱せずにサンプルを濃縮して、１４μｌ未満の体積にする。スピードバックは、サンプルをこれらの条件下で凍結乾燥できるように、０ミリトルの真空を発生させることができなければならない。十分な体積のＤＥＰＣ水を添加して、各ＲＮＡサンプルの全体積を１４μｌにした。各ＰＣＲチューブに、サンプル又は対照反応の名称のラベルを付けた。適切な体積のＤＥＰＣ水と、アンカーオリゴｄＴミックス（−２０℃で保存）８μｌを、各チューブに添加した。
【０１１３】
次いで適切な体積の各ＲＮＡサンプルを、ラベル付きのＰＣＲチューブに添加した。サンプルをピペットで分取することによって混合した。次のステップに向けて全てのサンプルの準備ができるまで、チューブを氷上で保持した。チューブは、次のステップに進める状態になるまで氷上で保持することが好ましい。サンプルをＰＣＲ機内で１０分間、７０℃でインキュベートし、その後サンプルチューブを取り出すことができるようになるまで４℃でインキュベートした。サンプルチューブを少なくとも２分間、４℃で放置した。
【０１１４】
Ｃｙ染料は感光性であり、したがってＣｙ染料を含有するいかなる溶液又はサンプルも、このプロセスのこの時点以降はできる限り光が届く範囲外に保つべきである（例えば箔で覆う）。十分な量のＣｙ３及びＣｙ５逆転写混合物を、下記の配合表に従い規模を拡大することによって、実際に行われるよりも１つ又は２つ多い反応に関して調製した。
Ｃｙ３で標識する場合
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ用５×ファーストストランド緩衝液  ８ｕｌ
０．１Ｍ  ＤＴＴ  ４ｕｌ
ヌクレオチドミックス  ２ｕｌ
Ｃｙ３の１：８希釈液（例えば０．１２５ｍＭ  ｃｙ３ｄＣＴＰ）  ２ｕｌ
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ２ｕｌ
Ｃｙ５で標識する場合
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ用５×ファーストストランド緩衝液  ８ｕｌ
０．１Ｍ  ＤＴＴ  ４ｕｌ
ヌクレオチドミックス  ２ｕｌ
Ｃｙ５の１：１０希釈液（例えば０．１ｍＭ  ｃｙ５ｄＣＴＰ）  ２ｕｌ
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ２ｕｌ
【０１１５】
ピンク色のＣｙ３混合物約１８μｌを各処理済サンプルに添加し、青色Ｃｙ５混合物１８μｌを各対照サンプルに添加した。各サンプルを、ピペットで分取することにより混合した。サンプルをＰＣＲ機内に４５℃で２時間置き、その後、サンプルチューブを取り出す準備ができるまで４℃にした。エタノール沈殿混合物６００μｌが入っているエッペンドルフチューブにサンプルを移した。ＥｔＯＨ沈殿混合物の一部を使用してＰＣＲチューブを濯いだ。このチューブを逆さにして混合した。サンプルを、−８０℃の冷凍器内に少なくとも２０〜３０分間置いた。望むなら、サンプルを−２０℃で一晩又は週末にかけて放置することができる。
【０１１６】
ｆ．逆転写反応からの不純物の除去
所望のｃＤＮＡ生成物の他、完全なＲＴ反応は、除去しなければならない不純物を含有する。このような不純物には、過剰なプライマー、ヌクレオチド、及び染料が含まれる。不純物を除去する１つの方法は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットの取扱い説明書（Ｑｉａｇｅｎカタログ＃１２００１６）に従って行った。
【０１１７】
あるいはエタノール沈殿及び樹脂ビーズ結合によって、完全なＲＴ反応から不純物をなくした。サンプルを１５分間、２０８００×ｇ（エッペンドルフ型５４１７Ｃの場合は１４０００ｒｐｍ）で遠心分離にかけ、上澄みを慎重にデカントした。目視可能なペレットが見えた（Ｃｙ３の場合はピンク／赤、Ｃｙ５の場合は青）。チューブは、固定位置で遠心分離にかけることが好ましく、したがってペレットは、チューブの既知の領域に存在することになる。ごくまれに、緊密なペレットではなくプローブがチューブの片側に広がっているのが見える。ペレットが白色か又は存在しない場合、反応は最大の効率で生じない。氷冷した７０％ＥｔＯＨ（チューブ１本当たり約１ｍｌ）を使用してチューブを洗浄し、そのチューブを引き続き逆さにして、チューブ及びペレットを清浄にした。このチューブを１０分間、２０８００×ｇ（エッペンドルフ型５４１７Ｃの場合は１４０００ｒｐｍ）で遠心分離にかけ、次いで上澄みを慎重にデカントした。チューブをフラッシュ回転させ、残っているＥｔＯＨの全てをピペットで除去した。光から保護した状態で、チューブを約５〜１０分間風乾した。乾燥時間長さは、環境の自然の湿度に応じて異なる。例えばサンタフェの環境では、約２〜５分の乾燥時間が必要である。ペレットは乾燥しすぎないことが好ましい。ペレットを乾燥したら、そのペレットを８０ｕｌのナノピュア水に再懸濁する。ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドを、９５℃のヒートブロック内で５分間加熱することにより変性させ、フラッシュ回転させた。次いで「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＨＶ  Ｎ４５」９６ウェルプレートの蓋に、適切なサンプル番号を付けた。青色ガスケット及びウェイストプレート（Ｖ字底部９６ウェル）を取着した。Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ結合樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ＃Ａ１１５１）を、再懸濁に使用する直前に振盪させた。Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ結合樹脂約１６０μｌを、使用されるフィルタプレートの各ウェルに添加した。これをマルチチャネルピペットで行う場合は、詰まるのを防止するために、広いオリフィスピペットチップを使用する。フィルタの膜にはピペットチップが接触せず、又はピペットチップで穿刺されないことが非常に好ましい。結合樹脂が入っている適切なウェル（８０μｌのｃＤＮＡサンプル）にプローブを添加した。ピペットを１〜１０回上下させることによって反応物を混合する。このステップでは、規定の、フィルタ処理されていないピペットチップを使用することが好ましい。プレートを、２５００ｒｐｍで５分間、遠心分離にかけ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６又は同等のもの）、次いで濾液をデカントした。８０％イソプロパノール約２００μｌを添加し、プレートを２５００ｒｐｍで５分間回転させ、濾液を廃棄した。次いで８０％イソプロパノールによる洗浄及び回転ステップを繰り返した。フィルタプレートを清浄な収集プレート（ｖ字底部９６ウェル）上に配置し、ナノピュア水８０μｌ（ｐＨ８．０〜８．５）を添加した。ｐＨをＮａＯＨで調節した。フィルタプレートを、テープで収集プレートに固定して、最終の回転中にプレートが確実に滑らないようにした。プレートを５分間静置し、２５００ｒｐｍで７分間遠心分離にかけた。
【０１１８】
ｇ．ｃＤＮＡプローブの蛍光読取り及びマイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション
任意選択で、ｃＤＮＡプローブへの蛍光の取込みを、半定量的に評価する。この蛍光の取込みにより、清浄化されたＲＴ生成物のｃＤＮＡに取り込まれた染料の量を測定することができ、酵素作用又は染料の取込みが失敗したかどうかの証拠を示すことができる。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ＃１２００１６）を使用して清浄化されたＲＴ生成物の色を目視評価することは、ＲＴ反応が失敗したかどうかを判断する代替の方法である。
【０１１９】
読取りは体積によって変わるので、一貫した量のｃＤＮＡを、３８４ウェルの１００μｌアッセイプレート（Ｆａｌｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔカタログ＃３５−３９８０）プレートの各ウェルにピペットで分取することが好ましい。このステップでは、必要なら対照又は同一のサンプルを溜めるべきである。プローブを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ９６ウェルプレートから、３８４ウェルアッセイプレートのウェルに１つおきに移した。これは、マルチチャネルピペットを使用して行った。溜めた複製サンプルについては、６０μｌのアリコートをアッセイプレートのウェルに移した。３８４ウェルフォーマットでＣｙ３−Ｃｙ−５を読み取るためにプログラムされたＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンタワークステーションを使用して、Ｃｙ−３及びＣｙ−５の蛍光を分析し、そのデータをディスクに保存した。Ｃｙ−３（２０μｇ）の典型的な範囲は、２５０〜７００，０００蛍光単位である。Ｃｙ−５（２０μｇ）の典型的な範囲は、１００〜２５０，０００蛍光単位である。Ｗａｌｌａｃ  １４２０蛍光分析器の設定は下記の通りであった。
Ｃｙ３
ＣＷランプエネルギー＝３０４４５
ランプフィルタ＝Ｐ５５０スロットＢ３
エミッションフィルタ＝Ｄ５７２ジスプロシウムスロットＡ４
エミッションアパーチャ＝ノーマル
カウント時間＝０．１秒
Ｃｙ５
ＣＷランプエネルギー＝３０４４５
ランプフィルタ＝Ｄ６４２サマリウムスロットＢ７
エミッションフィルタ＝Ｄ６７０スロットＡ８
エミッションアパーチャ＝ノーマル
カウント時間＝０．１秒
【０１２０】
ｈ．ドライダウンプロセス
ｃＤＮＡプローブを適切な体積でハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁できるように、ｃＤＮＡプローブの濃度がしばしば必要である。対照ｃＤＮＡ（Ｃｙ−５）のサンプルを各試験ｃＤＮＡ（Ｃｙ−３）と混合する。これは、処理済み及び適切な対照ｃＤＮＡサンプルを同じマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションすることが可能になるので、非常に重要である。エッペンドルフチューブに各試験サンプルごとにラベルを付け、混合したｃＤＮＡサンプルを適切なチューブに添加した。これらのチューブをスピードバック内に置き、スピードバックのどの窓も箔で覆った状態でドライダウンした。このとき、熱（４５℃）を使用して乾燥プロセスを迅速化することができる。時間は機械により様々に変化する。乾燥プロセスは、１５０μｌのサンプルをＳａｖａｎｔで乾燥する場合、約１時間を要する。サンプルは、乾燥した形で、−２０℃で最長１４日間保存することができる。
【０１２１】
ｉ．マイクロアレイハイブリダイゼーション
標識ｃＤＮＡプローブを、スライドガラスマイクロアレイ上で１本鎖共有結合ＤＮＡ標的遺伝子にハイブリダイズするために、下記の材料を使用した。すなわちホルムアミド、ＳＳＣ、ＳＤＳ、２μｍのシリンジフィルタ、サケの精子のＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｄ−７６５６）、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１５２７９−０１１）、ポリＡ（４０量体、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、特注合成）、酵母ｔＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１５４０１−０４）、ハイブリダイゼーションチャンバ、インキュベータ、カバースリップ、パラフィン、ヒートブロックである。アレイを完全に覆って、適正なハイブリダイゼーションが確実に行われるようにすることが好ましい。
【０１２２】
ハイブリダイゼーション緩衝液を、１つのｃＤＮＡサンプル（対照ラットｃＤＮＡに処理済みのラットｃＤＮＡを加えたもの）当たり約３０μｌ調製した。全ハイブリダイゼーションに対して作製される全体積約１００μｌは、濾過中に失われる可能性があるので、必要とされるよりもやや多く作製すべきである。
2004535776.tif 000002
【０１２３】
０．２μｍシリンジフィルタを用いて溶液を濾過し、次いでその体積を測定した。緩衝液１００μｌ当たり、サケの精子のＤＮＡを約１μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）添加した。
【０１２４】
あるいは、ハイブリダイゼーション緩衝液を以下のように作製した。
2004535776.tif 000003
【０１２５】
０．２μｍシリンジフィルタを用いて溶液を濾過し、次いでその体積を測定した。緩衝液１００μｌ当たり、サケの精子のＤＮＡ  １マイクロリットル（９．７ｍｇ／ｍｌ）、ヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ  ０．５μｌ（５μｇ／μｌ）、ポリＡ  ０．５μｌ（５μｇ／μｌ）、酵母ｔＲＮＡ  ０．２５μｌ（１０μｇ／μｌ）を添加した。
【０１２６】
ハイブリダイゼーションに使用した材料は、２つのエッペンドルフチューブラック、ハイブリダイゼーションチャンバ（１つのチャンバ当たり２つのアレイ）、スライド、カバースリップ、及びパラフィルムであった。各ハイブリダイゼーションチャンバに、ナノピュア水を約３０μｌ添加した。スライド及びカバースリップを、Ｎ2の流れを使用して清浄にした。ハイブリダイゼーション緩衝液約３０μｌを乾燥したプローブに添加し、５秒間静かに撹拌した。プローブを、暗所に室温で１０〜１５分間そのままにし、次いで数秒間静かに撹拌し、次いで微量遠心管でフラッシュ回転させた。プローブを５分間煮沸し、２０８００×ｇ（１４０００ｒｐｍ、エッペンドルフ型５４１７Ｃ）で３分間遠心分離にかけた。プローブを７０℃のヒートブロック内においた。ハイブリダイゼーションの準備ができるまで、各プローブをこのヒートブロック内に残した。
【０１２７】
カバースリップ上に２５μｌをピペットで分取した。チューブの底部に材料が触れないようにし、気泡が生じないようにすることが非常に好ましい。これは、ピペットチップに約１μｌが残ったままであることを意味する。スライドの表面を下に向けた状態で、サンプル上に静かに下ろし、アレイを含むスライド部分がカバースリップで覆われるようにした。スライドをハイブリダイゼーションチャンバ内に配置した（１つのチャンバ当たり２）。チャンバの蓋をパラフィルムで包み、スライドを、４２℃のインキュベータ内にある４２℃の湿度チャンバ内に配置した。プローブ又はスライドは、長期間にわたり室温にしないことが好ましい。スライドを、１８〜２４時間インキュベートした。
【０１２８】
ｊ．ハイブリダイゼーション後の洗浄
アレイ上の標的ｃＤＮＡのセンス鎖に緊密に結合している１本鎖ｃＤＮＡプローブのみ得るには、全ての非特異的に結合しているｃＤＮＡプローブをアレイから除去すべきである。全ての非特異的に結合しているｃＤＮＡプローブの除去は、アレイを洗浄して、以下の材料、すなわちスライドホルダ、ガラス洗浄シャーレ、ＳＳＣ、ＳＤＳ、及びナノピュア水を使用することによって行った。標準的な洗浄条件下では、そのばらつきによってデータが大きく影響を受ける可能性があるので、慎重に行うことが非常に好ましい。
【０１２９】
６個のガラス緩衝チャンバ及びスライドガラスホルダは、２×ＳＳＣ緩衝液を３０〜３４℃に加熱してガラスシャーレの３／４の体積を満たすように、又はマイクロアレイを浸すのに十分な体積を満たすように設定した。温度が３５℃よりも高くなるとプローブが外れる可能性があるので、２×ＳＳＣ緩衝液の加熱の際には注意を払うことが重要である。スライドをチャンバから取り出し、スライドガラスホルダに配置した。スライドは、完全に乾燥させないことが好ましい。スライドを２×緩衝液中に配置するが、スライドは、１つのシャーレに対して４枚以下にするとよい。カバースリップは、２〜４分以内に落とすべきである。カバースリップを２〜４分以内で落とさない場合は、非常に静かに撹拌を行えばよい。ステンレス鋼製スライドキャリアを第２のシャーレに配置し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで満たした。次いでスライドをスライドガラスホルダから外し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中に沈めたステンレス鋼ホルダに配置し、５分間浸漬した。ステンレス鋼スライドキャリア内のスライドを、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳが入っている次のガラスシャーレに５分間移した。次いでステンレス鋼キャリア内のスライドを、０．１×ＳＳＣが入っている次のガラスシャーレに５分間移した。依然としてスライドキャリア内にあるスライドを、ナノピュア水（１８メガオーム）中に１秒間移した。スライドを乾燥させるため、下に折り畳んだペーパータオルを置いたマイクロキャリアプレート上に、ステンレス鋼スライドキャリアを配置した。スライドの上面に、組織を静かに押し当てた。次いでスライドを遠心機ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＧＳ−６又は同等のもの）に入れて、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。スライドを風乾するとバックグラウンドの増大につながるので、風乾ではなくスピン乾燥することが非常に重要である。
【０１３０】
セクション３  毒素に曝露したラットにおける１７，２４１遺伝子の差次的発現の評価
ａ．毒性学的に関連あるラット遺伝子の同定
生後約２．５カ月のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙオスラットを使用して、毒性試験をした。毒性試験のセクション（ａ）で述べたように、３匹のラットに対し、殺す時点に合わせてそれぞれの用量で薬物／化学物質を腹腔内注射し、別の３匹のラットを対照動物として使用した。１７，２４１遺伝子アレイの試験用に投与された薬物／化学物質は、下記の通りであった。
【０１３１】
2004535776.tif 000004
【０１３２】
ビークルを注射したラットの対応組織と共に上記表に示す組織サンプルを、セクション２で述べたように、染料を取り込ませてｃＤＮＡ用に処理した。これらｃＤＮＡサンプルをハイブリダイズした６枚のマイクロアレイスライドの組は、セクション１で述べた通りであり、それらにスポット付けした標的は、１７，４２１個の遺伝子からのＰＣＲ生成物であった。洗浄し乾燥したハイブリダイズ済みのスライドを、アキソン・インスツルメンツ社製（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）ジーンピクス（ＧｅｎｅＰｉｘ）４０００Ａマイクロアレイスキャナ上でスキャンし、このスキャンからの蛍光の読取りを、ジーンピクス（ＧｅｎｅＰｉｘ）ソフトウェアを使用してコンピュータで定量化ファイルに変換した。
【０１３３】
ｂ．毒性学的に関連ある遺伝子を同定し、選択し、評価するアルゴリズムの使用
総合毒性（ＣＴ）アレイに含めることができるようにするため、本明細書では「１７ｋアレイ」と呼ぶ約１７，４２１個のラット遺伝子を含んだアレイからの候補遺伝子をランク付けする際、２段階手法を使用した。
【０１３４】
まず、１７，４２１個のラット遺伝子の発現分析を含む実験から、個々の遺伝子の値に対して３つのカットオフ基準を定めた。その３つのカットオフ基準とは、誘導倍率／抑制レベル、発現レベルの計算に使用される複製スポットの平均蛍光、及び複製スポットの変異係数であった。誘導倍率／抑制レベルを計算するため、特定の実験で記録された遺伝子の誘導／抑制レベルを以下のように計算した。
【０１３５】
１）遺伝子に関する処理スコアの達成。処理スコアは、マイクロアレイスライドの相補的な標的ＤＮＡスポットに結合させた、処理済み供給源（例えば化合物を投与した実験室用動物）からのＣｙ３標識ｃＤＮＡの量で表した。Ｃｙ３標識ｃＤＮＡの量は、波長５３２ｎｍのマイクロアレイレーザスキャナで検出した。
【０１３６】
２）遺伝子に関する対照スコアの達成。対照スコアは、マイクロアレイスライドの相補的な標的ＤＮＡスポットに結合させた、未処理の供給源からのＣｙ５標識ｃＤＮＡの量で表した。Ｃｙ５標識ｃＤＮＡの量は、波長６３５ｎｍのマイクロアレイレーザスキャナで検出した。測定の単位は、マイクロアレイレーザスキャナから伝えられる、マイクロアレイスライド上の座標での画素強度又はいくつかの画素強度の平均であった。その位置での画素強度は、蛍光プローブで標識した標的ＤＮＡのスポットに、染料が感応する波長のレーザを照射したときの、光電子増倍管によって検出された光子の数に比例していた。これらの実験で使用したＡｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ａマイクロアレイスキャナの場合、これらの値は０〜６５５３５の間である。
【０１３７】
３）処理スコアを対照スコアで割ることによって、処理済みのものと対照との正規化していない比を計算する。
【０１３８】
４）非正規化状態の比を何らかの正規化因子で割ることによって、最終的な「正規化」誘導スコアを計算する。例えば、上記４ステップ手順を使用して、遺伝子Ａの計算を以下のように行う。１）その処理済みのものに関する４つの生の値の組の平均を１００，０００とする。２）その対照に関する生の値の組の平均を２５，０００とする。３）したがって正規化していない比は４になり、最後に、４）正規化因子（環境要因を考慮に入れるよう設計された）が２になる場合、最終の正規化誘導スコア（しばしば誘導倍率と呼ばれる）は４を２で割ることによって得られ、すなわち２になる。この実施例で、遺伝子Ａは２倍誘導された。本発明に関して実施された全ての実験では、各遺伝子に４つの複製物があり、各複製物は、処理値及び対照値を有していた。したがって、１つの実験で各遺伝子の発現レベルを計算する際、８個のデータポイントを総合することが必要である。
【０１３９】
発現レベルの計算に使用される複製スポットの平均蛍光レベルは、遺伝子の発現レベルを計算するために任意の実験で使用された４個の処理済み複製値の単純平均によって実現される。
【０１４０】
複製スポットの変異係数は、変動性に関する従来の測定値でありパーセントで表され、この場合は、４つの複製物の処理済のものと対照との比の標準偏差を、４つの複製された処理済みのものと対照との比の平均で割ることによって、導き出されたものである。後者の基準は、データ品質の有用な尺度を表す。したがって初期スクリーニングは、発現レベル及び測定品質に基づいている。
【０１４１】
アルゴリズムは、１７ＫアレイからＣＴアレイに含められる遺伝子をランク付けする全プロセスが実行されるよう、特に書き込んだ。プログラムの初期部分では、上記３つの基準を一緒に「終わらせ」、したがって「第１のカット」を作製するために、遺伝子は３つの基準全てを満たさなければならないと考えられる。これは、プログラムの第１層と考えられた。
【０１４２】
基準は、アルゴリズム内で調整可能である。１７Ｋアレイの実際のランク付けでは、以下の基準を使用した。すなわち、誘導／抑制レベル：２、蛍光レベル：４００、及び変異係数：３０％である。第１のカットを作製し、かつ潜在的な毒性学的に関連ある遺伝子として選択するには、遺伝子は、１７Ｋデータウェアハウスに記憶された１つの実験において３つの基準を満たすだけでよい。同様に、遺伝子に関連する値は、異なる実験において基準を満たすたびに含められる。カットを作製した遺伝子に関するデータ（したがって潜在的な毒性学的に関連ある遺伝子として選択された）、及び遺伝子がカットを作製するごとに、ランク付けのための個別の一時的なデータテーブルに記憶した（プロセスの第２層）。遺伝子のデータは複数回、すなわち遺伝子が３つの基準を満たす各実験ごとに１回含めることができる。
【０１４３】
下記の表に列挙したファクタのそれぞれは、示されるように相対的な重み付けとして与えられた。
【０１４４】
2004535776.tif 000005
【０１４５】
次に、カットを作製した遺伝子の値を総合的なスコアにまとめた。遺伝子の値が上述の３つのカットオフ基準を満たす各実験ごとに、特定の遺伝子に関するデータを含ませたので、遺伝子に関する潜在的な複数の値を総合的なスコアに「まとめる」ことが必要であった。総合的なスコアは、上記の表に示すように、６つのファクタごとにまとめ、６つのランク付け基準に基づいて各遺伝子ごとにランク付けした。１）遺伝子がカットオフ基準を満たすスライドの数（ＮＣ＝化合物の数）。述べたように、遺伝子は、１７Ｋウェアハウスに記憶された複数の実験で、上述の３つのカットオフ基準を満たすことができた。ＮＣは、遺伝子が３つの基準を満たす種々の化合物の数を単純にカウントしたものであり（実験ではない。各化合物ごとに重複実験を行っている）、２）スライド間の一致性のパーセント（その初期スライドに関し、複製したスライド上で、遺伝子の値がカットオフ基準を満たした時間の％）（ＣＣ）。上述のように、各化合物ごとに重複実験を行った。ＣＣは、重複して行った一組の実験の両方で、遺伝子がカットオフを作製した回数をカウントしたものである。したがって、遺伝子のＮＣ（化合物の数）は３であるがＣＣ（化合物の一致性）は２であり、これは、３つの化合物のうち２つについては重複実験のそれぞれでカットオフが作製され、残りの１つについてはカットオフが作製されなかったことを意味する。３）遺伝子がカットオフ基準を満たす、全ての場合に関する誘導倍率（ＦＩ）の平均の大きさ（絶対値）。これは、特定の遺伝子に関するデータ値の各組での発現／抑制レベルの大きさを、単純に平均したものである。４）これら誘導倍率スコアの変異係数（その他全てのランク付け基準とは異なり、より低い変異係数がより良いものと考えられる）（ＣＶ）。そのスコアの変動性を評価するために、特定の遺伝子に関する発現値の組に、変異係数を適用した。５）遺伝子がカットオフ基準を満たす場合の全ての複製スポットの平均蛍光（ＦＬ）。これは、カットを作製した遺伝子のそれぞれの場合に関する処理済みの値の蛍光レベルを単純に平均したものである。６）組織の一致性、すなわち遺伝子のカットオフを満たした場合の何パーセントが同じ組織内にあるか（ＣＴ）。発現レベルは、いくつかの化合物だけではなくいくつかの組織（肝臓や腎臓など）においても同様に測定した。同じ組織内で、カットオフを作製した遺伝子データ値を測定した時間のパーセンテージとして、ＣＴを計算した。例えば、遺伝子が４回の実験でカットを作製した場合、すなわち肝臓で２回、腎臓で２回作製した場合、その組織の一致性は５０％になる。
【０１４６】
ＣＴアレイに含めるために遺伝子をランク付けする実際のプロセスでは、下記の重み付け、すなわちＮＣ＝３、ＣＣ＝１、Ｆｌ＝５、ＣＶ＝０、ＦＬ＝０、ＣＴ＝０を使用した。したがって最後の３つの基準には、この場合重みが付けられていなかった。
【０１４７】
各ランク付け基準ごとに、０〜１００のスコアを各遺伝子に割り当てた。各ランク付け基準のスコアは、以下のように計算した。全スコアの最低値を最高値から差し引くことによって、基準に対し、全ての遺伝子の値の範囲を計算した。１７Ｋウェアハウスから作成された一時的なデータテーブルは、初期の３つのカットオフ基準を満たす各遺伝子のスコアを含んでいた。遺伝子は、３つのカットオフ基準を満たし又は超える各実験ごとの値が、そのテーブルに示される。次いでスコアを、各遺伝子の遺伝子出現から、上述の６つの基準のそれぞれに対してその遺伝子に関する総合的なスコアにまとめた。例えば遺伝子Ａが３回の実験でカットを作製し、それぞれの誘導スコアが４、６、及び８であった場合、遺伝子Ａに関してまとめた誘導スコアは６になる（３つの値の平均）。さらに、例えば誘導因子に関して最高の総合的スコアを有する遺伝子の総合的スコアが１０であり、総合的スコアの最低値を２とする。この場合、そのスコアは最高値と最低値の中間になるので、遺伝子Ａは、５０％の格付けを得ることになる。次いで示される最低値をその遺伝子に関する値から差し引き、次いで範囲で割って、１００を掛けることにより、各遺伝子ごとのスコアを計算した。言い換えれば、各遺伝子ごとのスコアは、最小値を０とし、最大値を１００とした百分率である。例えば遺伝子のスコアが、その基準に関し、示される最小値と最大値の４分の３である場合、そのスコアはその基準に関して示される最小値と最大値の間になり、そのスコアは５％になる。ＣＶファクタ（誘導倍率の変異係数）に関してはより低い値がより好ましいので、そのように計算されるスコアを１００から差し引いて、そのパーセンテージの逆数をとった。
【０１４８】
各遺伝子ごとの最終ランク付けスコアは、６つのランク付け基準に関するそのスコアの重み付け組合せを介して計算した。特定の基準に対してスコアを計算することができない場合、その基準の全ての値を等式から外し、残りのファクタにのみ基づいてランク付けを行った。ランク付け基準のそれぞれは、０〜５の間に重み付けされ、その重み付けは相対的なものであり、したがって２：２：２：２：２：２は４：４：４：４：４：４などと同じである。重み付けがゼロであると、そのファクタは等式から外される。例えば遺伝子Ａが、以下のスコア、すなわちＮＣ：７５％、ＣＣ：５０％、ＦＩ：８０％、ＣＶ：２５％、ＦＬ：５０％、及びＣＴ：３０％を有するとする。上述の重み付け（３、１、５、０、０）を使用すると、遺伝子Ａに関する最終スコアは以下のように計算される。
（７５×３＋５０×１＋８０×５＋２５×０＋５０×０＋３０×０）／９（注記：９は「重み付け」を合計した数、すなわち３＋１＋５である）
（２２５＋５０＋４００＋０＋０＋０）／９
６７５／９
７５が遺伝子Ａの最終スコアになる。
【０１４９】
次いで遺伝子が初期カットを作製する１つ又は複数の実験からの、その遺伝子に関する個々の値をまとめることに基づいて、個別の各遺伝子ごとにスコアを計算した。次いで遺伝子のリストを、最終スコアに基づいてランク順に並べ替えた。ＣＴアレイに付加するためにリストの上位からいくつの遺伝子を得るかという目標とされる決定は、遺伝子が応答を示す実験の数に基づいて行われた。ランク順に並べた遺伝子のリスト上で、遺伝子数４５０程度では、遺伝子が応答を示す実験の数は、しばしばわずか１回の実験又は１つの化合物から始まる。アレイ上のほとんどの遺伝子は、毒性の異なるメカニズム又は種々の組織の相違に応答することが望ましい。したがって、ランク順に並べた遺伝子リストの上位から選択された遺伝子の数は４５０であった。既に社内で確立済みの、ラット遺伝子の組（実施例２参照）に加えた重複遺伝子の数を最小限にしたいので、重複が原因で排除された５０個の遺伝子がある。最終的に、特定の毒物による毒性及び特定の組織での毒性に対する応答をさらに評価するための新たな遺伝子として、マイクロアレイの１７，２４１個のラット遺伝子の組から４００個の遺伝子を、実験により選択した。これら４００個の遺伝子を表４に列挙する。
【０１５０】
セクション４  １７，２４１個の遺伝子の組から発見された、部分配列に対応するラット遺伝子の、特定の組織応答に関する実験データの評価
ａ．実験により発見された遺伝子のさらなる評価のための毒性試験
材料及び方法に関するセクション２の記述に従って、オスのＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを表３に列挙した薬物及び化学物質に曝露し、組織を採取し、さらにｃＤＮＡサンプルを調製して、ハイブリダイズした。
【０１５１】
ｂ．マイクロアレイ
材料及び方法に関するセクション１の、ＰＣＲ及びスライドのスポット付けに関する記述に従って、実験により発見された４００個の遺伝子をマイクロアレイにプリントした。洗浄し乾燥してハイブリダイズしたスライドを、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ａマイクロアレイスキャナでスキャンし、このスキャナから得られた蛍光の読取りを、ＧｅｎｅＰｉｘソフトウェアを使用してコンピュータの定量化ファイルに変換した。
【０１５２】
ｃ．毒性学的に関連ある遺伝子を評価するための、定量化ファイルの分析
定量化ファイルを、差次的遺伝子発現データの分析用に設計されたフェーズ１Ｍａｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアに取り込んだ。同じスライド上にハイブリダイズした処理済み及び対照のｃＤＮＡサンプルの蛍光値の比を、各スポットごとに決定し、誘導倍率の値を定めた（遺伝子応答の誘導に関しては正の値、遺伝子応答の抑制に関しては不の値）。次いで誘導倍率を、中心誘導倍率値で正規化した。各遺伝子に関する誘導倍率は、各遺伝子に関するスライド上の４つのスポットの、誘導倍率の平均である。４つのスポットの変異係数が５０％よりも大きい場合、その遺伝子のデータをスライド上の遺伝子には入れない。Ｍａｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアによって、複数の実験から（マイクロアレイ）誘導倍率データを含んだウェアハウスを開発することが可能になる。ウェアハウスは、定量化ファイルを取り込んで、表３に列挙する薬物及び化学物質で処理したラットの誘導倍率を分析することによって構築した。さらに、ほとんどのサンプルを二重にハイブリダイズし、２枚の高品質スライドから得られたデータをアウェアハウス内で平均した。どの化合物で処理したラットも、肝臓及び腎臓を処理して遺伝子発現に関して評価した。脾臓、心臓、精巣、肺のサンプルでは、多器官毒素に関して評価した。脾臓は、全ての免疫毒素及び５つの非免疫毒素について評価し、心臓サンプルは、全ての心臓毒素について評価し、精巣は、フルタミド及び全てのステロイド化合物について評価し、肺は、全ての肺毒素について評価し、脳は、全ての脳毒素について評価した。このウェアハウスは、遺伝子の、組織に特異的な応答を評価するとき、約２５００の最終実験（１回の最終実験を行うのに主に平均２回同じ実験をする）を含んでいた。
【０１５３】
遺伝子は、肝臓サンプルに対する実験の１％を超える実験において誘導倍率が２の場合に（刺激又は抑制）、肝臓で応答すると判断した。同様に遺伝子は、腎臓サンプルに対する実験の１％を超える実験において誘導倍率が２の場合に、腎臓で応答すると判断した。これらの器官を全ての毒素（非肝性又は腎性の毒素を含む）に関して評価したので、１％のカットオフは、肝臓及び腎臓では十分なカットオフであった。心臓、脾臓、肺、精巣、又は脳については、それぞれの器官に対する実験の２％を超える実験で誘導倍率が２である場合に、遺伝子はこれらの器官に応答すると判断した。心臓、脾臓、肺、精巣、及び脳のカットオフは、１％に比べて２％のほうが高かったが、その理由は、これらの器官のそれぞれに対するウェアハウスでの全実験数が少ないからであり、また、このように少数の実験を取り扱う場合にはカットオフが高いと偽陽性結果が最小限に抑えられるからである。
【０１５４】
結果
４００の毒性応答遺伝子の発見
特定の毒素による毒性及び特定の組織での毒性に対する応答をさらに評価するための新たな遺伝子として、マイクロアレイの１７，２４１ラット遺伝子の組から４００個の遺伝子を実験により選択した。これら４００個の遺伝子を表４に列挙する。
【０１５５】
特異的な組織応答を実証するデータベースを形成するための、４００個の毒性学的に応答する遺伝子の使用
毒性学データベースは、遺伝子の、組織に特異的な応答を評価するときに、表３に列挙した化合物に基づいて約２５００の最終実験を含んでいた（１回の最終実験を行うのに主に平均２回同じ実験を行う）。表７は、各遺伝子に関して実証された１７，２４２個の遺伝子の組から実験により選択された毒性学的遺伝子の、組織に特異的な応答を示し、表８は、表７からの同様の情報であって、組織に特異的な応答をする遺伝子を、組織ごとに示したものである。図１から６までは、この毒性学データベースからの毒性化合物を投与したラットの差次的遺伝子発現を示す。時間に対する複製マイクロアレイ同士、器官同士、異なる化合物同士の差次的発現がこれらの図で実証されており、一組の毒性学的に関連ある遺伝子がラットの毒性試験を実施する力を示している。
【実施例２】
【０１５６】
毒性応答に対する既知の遺伝子の生成及び特徴付け
セクション１  クローンの生成
ａ．ラット又はヒトのデータベースからの、毒性学的に関連ある遺伝子の同定及び単離
ラットアレイに含めるために毒性学的に関連ある遺伝子を同定しかつ単離するのに使用した１つの方法は、公のデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）を検索して、クリティカルな細胞経路（例えば代謝やＤＮＡ合成）の一部として識別された遺伝子を探すことであった。これらの遺伝子を識別した後、プライマーを設計して、ラットの肝臓細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリーとの増幅プロセスに使用した。増幅生成物を発現ベクターにクローニングし、配列決定して、その配列が、ＧｅｎＢａｎｋから得られた遺伝子配列情報に一致しており、又は実質的に同様であることを確認した。次いで確認された増幅遺伝子生成物を、実施例１のセクション１で述べた方法を使用してラットアレイに組み込んだ。このように同定し単離した、潜在的な毒性学的に関連ある遺伝子を、表４に含める。
【０１５７】
ｂ．新規プライマーを使用した遺伝子の同定及び単離
クリティカルな細胞経路での役割に関する何らかの証拠に基づいて遺伝子を同定し単離するのに使用した別の方法は、最初に公のデータベース（例えばジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ））で配列を見つけることであり、これらの遺伝子に対応する配列を新規に合成し、増幅反応に使用した。増幅した生成物を発現ベクトルにクローニングし、配列決定して、その配列がＧｅｎＢａｎｋから得られた遺伝子配列情報に一致し又は実質的に同様であることを確認した。次いで確認された増幅遺伝子生成物を、本明細書で開示した方法を使用してラットアレイに組み込んで、遺伝子生成物又は標的配列を、スライドガラスに固定化した。
【０１５８】
セクション２  既知の遺伝子の特異的な組織応答に関する実験データの評価
ａ．実験により発見された遺伝子をさらに評価するための毒性試験
材料及び方法に関する実施例１、セクション２の記述に従って、オスのスプラクー・ドーリー（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを表３に列挙した薬物及び化学物質に曝露し、組織を採取し、ｃＤＮＡサンプルを調製し、ハイブリダイズした。
【０１５９】
ｂ．マイクロアレイ
マイクロアレイに、この実施例２の材料及び方法のセクション１で述べたように生成した３００個の遺伝子をプリントした。洗浄し乾燥してハイブリダイズしたスライドを、アキソン・インスツルメンツ社製（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）ジーンピクス（ＧｅｎｅＰｉｘ）４０００Ａマイクロアレイスキャナでスキャンし、このスキャナから得られた蛍光読取りを、ジーンピクス（ＧｅｎｅＰｉｘ）ソフトウェアを使用してコンピュータの定量化ファイルに変換した。
【０１６０】
ｃ．潜在的な毒性学的に関連ある遺伝子を評価するための、定量化ファイルの分析
表３の、中毒用量の薬物及び化学物質に曝露したラットからの組織サンプルから生成された、約２５００の実験のウェアハウスにおける実験の分析は、実験１のセクション４で述べたものと同様である。
【０１６１】
結果
このように同定し単離された、潜在的な毒性学的に関連ある遺伝子を、表４に含める。表９は、各遺伝子ごとに実証されたクリティカルな細胞経路での潜在的な役割を有する遺伝子の、組織に特異的な応答を示し、表１０は、表９からの情報と同様であって、組織に特異的な応答をする遺伝子を組織ごとに列挙したものを示す。図１から６までは、この毒性学的データベースからの毒性化合物を投与したラットの、差次的遺伝子発現を示す。時間に対する複製マイクロアレイ同士、器官同士、異なる化合物同士の差次的発現がこれらの図で実証されており、一組の毒性学的に関連ある遺伝子がラットの毒性試験を実施する力を示している。
【実施例３】
【０１６２】
トランスクリプトームプロファイリングによる新規な毒性応答遺伝子の発見
セクション１  遺伝子の同定及び単離
ａ．ＲＮＡ単離のための、処理済み及び対照の組織サンプルの加工
中毒量のアフラトキシンＢ１（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した２４時間後に殺したラットからの肝臓組織と、生理食塩水を注射したビークル対照ラットからの適切な肝臓組織を使用して、肝臓毒素（アフラトキシン）に曝露したラットで差次的に発現した遺伝子を決定した。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）製ＲＮＡ単離キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット）を使用し、その後、Ｇｅｎｈｎｔｅｒ（登録商標）製Ｍｅｓｓａｇｅｃｌｅａｎ（登録商標）キットを使用して、両方の肝臓サンプルからＲＮＡを単離した。ＭｅｓｓａｇｅＣｌｅａｎ（登録商標）キットからのプロトコルに修正を加えて、ＤＮＡ汚染物質を除去するのにより最適な条件を生成した。次いでこれらの成分、すなわちトータルＲＮＡ  ５０リットル、１０×反応緩衝液５．７リットル、ＤＮａｓｅ  Ｉ  １．０リットル（１０ユニット／ｌ）を加えて全体積を５６．７リットルにした。これらの成分を十分混合し、摂氏３７度で３０分間インキュベートした。次いでフェノール／クロロホルム混合物（１：１体積）４０リットルを添加し、その混合物を３０秒間撹拌して、氷上に１０分間静置した。次いでこの混合物を入れたチューブを、４度で５分間、最大速度でエッペンドルフ遠心器で回転させた。上相を収集して新しいチューブに移し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ５リットルと９５％エタノール２００リットルをこの上相に添加した。混合物を少なくとも１時間、−８０℃で静置し、次いで約１０分間、４℃で回転させた。上澄みを除去し、ＲＮＡを数分間乾燥させた。その後、ＲＮＡを、ＤＥＰＣ  Ｈ2Ｏ  １１リットルに懸濁した。１リットルを、Ｈ2Ｏ  ５０リットル中でＡ260/280を測定するのに使用した。ＲＮＡを、−８０℃で１〜２ｇのアリコートとして保存した。ディフェレンシャルディスプレイの直前に、適切な量のＲＮＡを、ＤＥＰＣ  Ｈ2Ｏで０．１ｇ／ｌに希釈した。希釈したＲＮＡを凍結融解サイクル後に使用することは避けることが重要である。
【０１６３】
ＲＮＡｉｍａｇｅ（登録商標）キットを使用し、ＲＮＡｉｍａｇｅ（登録商標）キットからのプロトコルに修正を加えて、より成果の上がるｍＲＮＡディフェレンシャルディスプレイを最適なものとした。以下のセクションでは、これを実現した方法について述べる。
【０１６４】
ｂ．逆転写
チューブ内で、以下の成分、すなわちｄＨ2Ｏ  ９．４リットル、１５×ＲＴ緩衝液４．０リットル、ｄＮＴＰ（２５０Ｍ）１．６リットル、ＤＮａｓｅを含まない０．１ｇ／ｌの新たに希釈したトータルＲＮＡ  ２．０リットル、Ｈ−Ｔ11Ｍ（２Ｍ）２．０リットルを添加して、全体積を１９リットルにした。これらの成分を十分混合して、６５℃で５分間、３７℃で６０分間、７５℃で５分間インキュベートし、４℃で保持した。チューブを３７℃で１０分間保持した後、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（ライフ・テクノロジー社製（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．））１リットルを各反応に添加し、チューブを指で軽く叩いて素早く混合し、その後、インキュベーションを続けた。逆転写の終わりに、チューブを短時間回転させて、凝縮物を収集した。ＰＣＲを行うためにチューブを氷上にセットし、又は後で使用するためにチューブを−２０℃で保存した。
【０１６５】
ｃ．ポリメラーゼ連鎖反応
以下の成分、すなわちｄＨ2Ｏ  １０リットル、１０×ＰＣＲ緩衝液２リットル、ｄＮＴＰ（２５Ｍ）１．６リットル、２Ｍ  Ｈ−ＡＰプライマー  ２リットル、２Ｍ  Ｈ−Ｔ11Ｍ  ２リットル、上述のＲＴ−ミックス（ＰＣＲ用に同じＨ−Ｔ11Ｍを含有しなければならない）２リットル、α−33Ｐ  ｄＡＴＰ（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）０．２リットル、ＰＥバイオシステムズ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．２リットルを合わせて全体積を２０リットルにし、これを用いてＰＣＲ反応を行った。ピペットを上下させることによって、これらの成分全てを入れたチューブを十分に混合し、９５℃のサーモサイクラ内に５分間配置し、次いで９４℃で３０秒間、４０℃で２分間、７２℃で３０秒間という条件下で４０サイクル実行して増幅し、最後に、サンプルをサーモサイクラから取り出すまで４℃で保持した。
【０１６６】
ｄ．ゲル電気泳動
ＴＢＥに溶かした６％変性ポリアクリルアミドゲルを調製し、使用前に少なくとも２時間重合した。次いでゲルを約３０分間流し、その後、任意のサンプルを導入した。ウェルに任意のサンプルを導入する前に、ゲルの全てのサンプルウェルをフラッシュして全ての尿素を除去することが重要である。各サンプル約３．５リットルを、導入した染料２リットルと混合して、８０℃で２分間インキュベートした直後に、６％ゲル上に導入した。この実施例で、導入した染料はキシレンであり、数回行ったＰＣＲから得られたサンプルをゲルに導入した後、キシレン染料がゲルの底部から約１５ｃｍ（約６インチ）になるまで、そのゲルを定電力６０ワットで流した。電力を止めた後、１枚の大きな露光済みオートラジオグラフフィルム上にゲルをブロットした。ゲルをプラスチックラップで覆い、暗所条件下で、向きを示す印を付けた１枚の新しい未露光フィルムを備えた大型のオートラジオグラフカセット内にゲルを配置し、−８０℃でフィルムをゲルに曝露した。曝露時間は、一晩から７２時間の間であればどの程度でもよい。フィルムを現像した後、現像済みフィルムとのアライメント操作を行うことによって、問題となっているバンドを同定し、その後、清浄なメスを用いてポリアクリルアミドゲルから問題となっているバンドを切り出すことによって、単離した。単離したバンドを水１００リットル中に入れ、９５％で５分間沸騰させた。
【０１６７】
ｅ．ゲルバンドを増幅するためのＰＣＲ
ゲルバンドを増幅するためにＰＣＲを設定した。再増幅は、ｄＮＴＰ濃度を２０Ｍにすること以外、同じプライマーの組及びＰＣＲ条件を使用して行うべきである。ＰＣＲ反応を行うため、以下の成分、すなわちＨ2Ｏ  ２０．４リットル、１０×緩衝液４リットル、２５０Ｍ  ｄＮＴＰ  ３．２リットル、２ＭのＨ−ＡＰプライマー  ４リットル、２ＭのＨ−Ｔ11Ｍ  ４リットル、テンプレート（ゲルバンドを含有する１００リットルから）４リットル、Ｔａｑポリメラーゼ０．５リットルを合わせて全体積を４０リットルにした。これらの成分を９５℃で５分間加熱し、次いで９４℃で３０秒間、４０℃で２分間、７２℃で３０秒間という条件下で４０サイクル繰り返し、最後に、サーモサイクラからサンプルを取り出すまで４℃で保持した。ＰＣＲ反応物約４リットルを取り出し、１％アガロースゲル上に流して、ＰＣＲ反応が上首尾に行われたことを確認した。
【０１６８】
セクション２  増幅した断片のクローニング及びコロニーのスクリーニング
ａ．増幅した断片のクローニング
増幅した断片をクローニングするには、種々の供給元（例えばＧｅｎＨｕｎｔｅｒやＩｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得られた製品を使用して、所望のクローニング生成物を実現すればよい。この実施例では、Ｉｎ  ＶｉｒｔｒｏｇｅｎのＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（登録商標）を使用し、以下の材料、すなわち新たに流すＰＣＲ生成物２リットル、滅菌Ｈ2Ｏ  ２リットル、ＰＣＲ−ＴＯＰＯベクター  １リットルをチューブ内で合わせて最終体積を５リットルにした。合わせた成分を静かに混合して、室温で５分間インキュベートした。次いで６×ＴＯＰＯクローニング停止溶液１リットルを添加し、合わせた全ての成分を室温で約１０秒間混合し、次いで氷上に設置した。Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）細胞を氷上で融解した。ＴＯＰＯクローニング反応物２リットルをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）細胞に添加し、混合し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞に、振盪することなく４２℃で３０秒間熱ショックを与え、氷上で２分間インキュベートした。次いで熱ショックを与えた細胞に、室温のＳＯＣ  ２５０リットルを添加し、混合した。次いで細胞を３０分間３７℃にした。１００ｇ／ｍｌのアンピシリン及びＸ−ｇａｌを載せた２枚のＸＹＴプレート上に、細胞約５０〜１００リットルを塗布した。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌朝、３つの白色コロニーを選択して分析にかけた。
【０１６９】
ｂ．正しい組換えプラスミドのためのコロニーのスクリーニング
ＰＣＲを使用して、選択された白色コロニーが正しい組換えプラスミドを含んでいるかどうか確かめた。ＰＣＲ反応を行うため、以下の成分、すなわちＨ2Ｏ  ２１リットル、１０×ＰＣＲ緩衝液２．５リットル、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．１２リットル、２５ｎｇ／ｌ  Ｔ７プライマー  １リットル、２５ｎｇ／ｌの遺伝子特異的左又は右プライマー  １リットル、テンプレート（形質転換プレートからチューブにコロニーを移すのに楊枝を使用し、その際、反応混合物中で楊枝をさっと動かして行った）、及びＴａｑポリメラーゼ０．５リットルを合わせて、全体積を２５リットルにした。反応混合物を９５℃で５分間流し、次いで９５℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、その後７２℃で５分間という条件下で３５回繰り返し、最後に、サーモサイクラからサンプルを取り出すまで４℃で保持した。ＰＣＲ生成物約４リットルを取り出し、１％アガロースゲル上に流して、ＰＣＲ反応が上首尾に行われたことを確かめた。肯定的なＰＣＲ結果をもたらしたコロニーに対応する細菌コロニーを、１００ｇ／ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で一晩、３７℃で振盪しながら増殖させた。プラスミドＤＮＡを、一晩培養したものから単離し、Ｔ７プライマーを使用して配列決定した。次いで配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の配列と比較して、正しい遺伝子断片がクローニングされたことを確認した。次いで遺伝子断片を、プラスミドＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。組み込まれていないプライナー及びｄＮＴＰを除去し、フェーズ１分子毒性学的マイクロアレイ製品を使用して差次的遺伝子発現を測定するために、得られた遺伝子断片をスライドガラス上に並べた。
【０１７０】
結果
ＲＣＴ−２８９及びＲＣＴ−２９０は、この実施例で開示した方法を使用して同定された毒性学的に関連ある２個の遺伝子である。遺伝子配列を表４に列挙する。
【実施例４】
【０１７１】
実時間ＰＣＲ反応
材料及び方法
実施例１、セクション３に列挙した毒性化合物を投与したラットの組織及び／又は器官から、トータルＲＮＡを単離し、次いでこのトータルＲＮＡ内のｍＲＮＡを、トータルＲＮＡ  ３μｇ及びランダムヘキサマープライマー  １．５μｌを使用してｃＤＮＡに変換した。７０℃で１０分間インキュベートした後、反応混合物に以下の成分、すなわち５×ファーストストランド緩衝液６μｌ、０．１  ＤＴＴ  ３μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １．５μｌ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ酵素１．５μｌ、及びＤＥＰＣ処理水６．５μｌを添加した。反応物を４５℃で２時間インキュベートし、この反応物１μｌを使用して実時間ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを行った。ＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、Ｒｎａｓｅを含まない水、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから入手可能）、標的、及び対照プライマー／プローブ、及びｃＤＮＡを用いて５０μｌの反応物を調製した。この方法では、二重標識蛍光原プローブを用いてＰＣＲ生成物の蓄積を測定する。プローブは、５’末端を６−ＦＡＭで、３’末端をＴＡＭＲＡで標識した。ＴＡＭＲＡは消光染料である。このアッセイでは、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼの性質を活用する。プローブをその標的にハイブリダイズする場合、レポーター染料（ＦＡＭ）をＴａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性によって切断し、蛍光信号を放出することができる。増幅サイクルが増大するにつれ、より多くの信号が放出され、ＡＢＩ  ７７００配列検出器を使用して検出される。各遺伝子ごとに、２個のプライマー及び蛍光原プローブの一組を設計し合成する。ｍＲＮＡの定量化では、プローブ及びプライマーを最適に設計するために、プライマーをエクソン−イントロン接合部上に位置決めする必要がある。このステップでは、汚染ゲノムＤＮＡの増幅を不可能にする。本発明者等の研究では、本明細書で「総合的毒性アレイ」又は「ＣＴアレイ」とも呼ばれる毒性学的に関連ある７００のラット遺伝子アレイの一部である、１６個の遺伝子用に、プライマーとプローブの組を設計した。これらの遺伝子は、生体内で曝露したラット又は培養で曝露したラット細胞で、毒性薬物／化学物質によりアップレギュレーション又はダウンレギュレーションがなされた。プローブとプライマーの組を、そのゲノムＤＮＡ増幅能力に関して試験した。ゲノムＤＮＡが増幅された場合、その特定の遺伝子に対するプローブ及びプライマーを、ＲＴ−ＰＣＲアッセイに使用しなかった。
【０１７２】
結果
ＣＴアレイ調査に使用された様々な毒性化学物質／薬物を投与した、同じラットからのＲＮＡを使用して、実時間ＰＣＲ分析を行った。図７、８、及び９は、４２種の毒性学物質／薬物に関するＴａｑＭａｎ対ＣＴアレイデータの線形回帰分析結果を示す。シトクロムＰ４５０  １Ａ２に関するＴａｑＭａｎデータとＣＴアレイデータとの間には、優れた相関関係（ｒ＝０．９７３９５）がある（図７）。脂肪酸シンターゼに関するＴａｑＭａｎ及びＣＴアレイデータの分析では、相関関係が０．８６３４６であることを示している（図８）。多剤耐性タンパク質−１に関するＴａｑＭａｎデータとＣＴアレイデータの比較では、０．７３４１４の相関関係が生成された（図９）。
【実施例５】
【０１７３】
付着培養細胞からのトータルＲＮＡの単離
高品質高純度のトータルＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミディキット及び２−メルカプトエタノールを使用して、培養細胞から単離した。リボヌクレアーゼによってＲＮＡの分解が生じるというリスクを最小限に抑えるため、手袋をはめ、作業領域及び装置を例えばＲＮａｓｅ  Ｚａｐ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）などのリボヌクレアーゼ阻害剤で処理し、サンプルを氷上で保持することによって、予防措置をとった。このトータルＲＮＡ単離技法は、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミディキットをベースにしたものであり、若干の修正を加えて、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞）細胞に関してはＴ−７５フラスコ内で、細胞のマキシキットＲＮＡ単離に関してはＴ−１７５フラスコ内で使用した。
【０１７４】
細胞を顕微鏡下でチェックして、それらが生存可能であることを確認した。細胞が６０〜８０％集密状態に達した場合、その細胞に、薬物、化学物質、又は医薬品組成物などの薬剤を投与した。１００％の集密状態に達したフラスコからはＲＮＡを単離しないことが好ましい。
【０１７５】
付着細胞では、培地を廃棄して、１×の低温ＰＢＳで２回フラスコを洗浄した（Ｔ−７５フラスコの場合は２０ｍｌ次いで１０ｍｌ；Ｔ−１７５フラスコの場合は４０ｍｌ次いで２０ｍｌ）。２回目のＰＢＳ洗浄後、残っているＰＢＳをピペットで除去した。新たに調製したＲＬＴ緩衝液（ＲＬＴ緩衝液は、ＲＬＴ  １．０ｍｌごとに、１０μｌのβメルカプトエタノールを添加する必要がある）を細胞培養フラスコに直接添加した。Ｔ−７５フラスコには３ｍｌのＲＬＴ緩衝液を入れ、Ｔ−１７５フラスコには５．０ｍｌのＲＬＴ緩衝液を入れた。この時点で、フラスコを軽く撹拌することが好ましい。フラスコを軽く撹拌してＲＬＴ緩衝液を分散させ、細胞をゲル状の層にする。細胞を４分間静置し、次いで流体を引き抜いて、ＲＮａｓｅを含まないチューブに入れる。等体積の７０％エタノールを各チューブに添加し、撹拌して均等に分散させた。ストリング状の外観を有する沈殿物が形成される場合は、このストリング状の沈殿物を除去し廃棄してよい。流体をスピンカラムに加え、Ｂａｃｋｍａｎ  ＧＳ−６を用いて３６５０ｒｐｍで５分間回転させた。素通り画分は廃棄した。ＲＷ１緩衝液約４ｍｌ又は１５ｍｌ（それぞれＴ−７５又はＴ−１７５）を加え、３６５０ＲＰＭで５分間回転させた。素通り画分は廃棄した。ＲＰＥ緩衝液約２．５ｍｌ（中カラム）又はＲＰＥ緩衝液１０ｍｌ（大カラム）を加え、３分間遠心分離にかけた。素通り画分は廃棄した。緩衝液ＲＰＥをさらに２．５ｍｌ又は１０ｍｌ加え、５分間遠心分離にかけてカラムを完全に乾燥した後、溶離ステップに進めた。チップを含めたカラムは、次のステップに向けて乾燥すべきである。
【０１７６】
溶離を行うため、ＲＮＡが結合しているカラムを清浄なチューブに移した。次いでＲＮａｓｅを含まない水１５０μｌを中カラムに添加し、ＲＮａｓｅを含まない水５００μｌをカラムに添加して、２〜４分間静置し、３０００×ｇで３分間回転させた（３６９０〜３７１０ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６又は同様の遠心器）。ＲＮａｓｅを含まない水をさらに１５０μｌ又は５００μｌ同じチューブに入れて、溶離を繰り返した。溶離液は、実施例２に例示されるＬｉＣｌ沈殿プロトコルを使用して沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵緩衝液に再懸濁した。
【０１７７】
収量を測定するため、Ｏ．Ｄ．の読取りを２６０ｎｍで行った。約２．０μｌのＲＮＡを９８μｌのＨ2Ｏに添加し、Ｏ．Ｄ．の読取りを行って以下のように計算した。
（吸光度）×（希釈係数）×（４０）／１０００＝ＲＮＡの量μｇ／ｍｌ
例：吸光度＝０．４５
希釈係数＝５０
（０．４５×５０×４０）＝ＲＮＡ濃度μｇ／ｍｌ
収量は、Ｔ−７５フラスコからのトータルＲＮＡが、集密度５０％超で２００〜４００μｇの間にあるべきである。このサンプルを、−８０℃の冷凍器内で保存した。
【０１７８】
【表１−１】
2004535776.tif 000006
【表１−２】
2004535776.tif 000007
【表１−３】
2004535776.tif 000008
【表１−４】
2004535776.tif 000009
【表１−５】
2004535776.tif 000010
【０１７９】
【表２】
2004535776.tif 000011
【０１８０】
【表３】
2004535776.tif 000012
【０１８１】
2004535776.tif 000013
【０１８２】
2004535776.tif 000014
【０１８３】
2004535776.tif 000015
【０１８４】
2004535776.tif 000016
【０１８５】
2004535776.tif 000017
【０１８６】
2004535776.tif 000018
【０１８７】
2004535776.tif 000019
【０１８８】
2004535776.tif 000020
【０１８９】
2004535776.tif 000021
【０１９０】
2004535776.tif 000022
【０１９１】
2004535776.tif 000023
【０１９２】
2004535776.tif 000024
【０１９３】
2004535776.tif 000025
【０１９４】
2004535776.tif 000026
【０１９５】
2004535776.tif 000027
【０１９６】
2004535776.tif 000028
【０１９７】
2004535776.tif 000029
【０１９８】
2004535776.tif 000030
【０１９９】
2004535776.tif 000031
【０２００】
2004535776.tif 000032
【０２０１】
2004535776.tif 000033
【０２０２】
2004535776.tif 000034
【０２０３】
2004535776.tif 000035
【０２０４】
2004535776.tif 000036
【０２０５】
2004535776.tif 000037
【０２０６】
2004535776.tif 000038
【０２０７】
2004535776.tif 000039
【０２０８】
2004535776.tif 000040
【０２０９】
2004535776.tif 000041
【０２１０】
2004535776.tif 000042
【０２１１】
2004535776.tif 000043
【０２１２】
2004535776.tif 000044
【０２１３】
2004535776.tif 000045
【０２１４】
2004535776.tif 000046
【０２１５】
2004535776.tif 000047
【０２１６】
2004535776.tif 000048
【０２１７】
2004535776.tif 000049
【０２１８】
2004535776.tif 000050
【０２１９】
2004535776.tif 000051
【０２２０】
2004535776.tif 000052
【０２２１】
2004535776.tif 000053
【０２２２】
2004535776.tif 000054
【０２２３】
2004535776.tif 000055
【０２２４】
2004535776.tif 000056
【０２２５】
2004535776.tif 000057
【０２２６】
2004535776.tif 000058
【０２２７】
2004535776.tif 000059
【０２２８】
2004535776.tif 000060
【０２２９】
2004535776.tif 000061
【０２３０】
2004535776.tif 000062
【０２３１】
2004535776.tif 000063
【０２３２】
2004535776.tif 000064
【０２３３】
2004535776.tif 000065
【０２３４】
2004535776.tif 000066
【０２３５】
2004535776.tif 000067
【０２３６】
2004535776.tif 000068
【０２３７】
2004535776.tif 000069
【０２３８】
2004535776.tif 000070
【０２３９】
2004535776.tif 000071
【０２４０】
2004535776.tif 000072
【０２４１】
2004535776.tif 000073
【０２４２】
2004535776.tif 000074
【０２４３】
2004535776.tif 000075
【０２４４】
2004535776.tif 000076
【０２４５】
2004535776.tif 000077
【０２４６】
2004535776.tif 000078
【０２４７】
2004535776.tif 000079
【０２４８】
2004535776.tif 000080
【０２４９】
2004535776.tif 000081
【０２５０】
2004535776.tif 000082
【０２５１】
2004535776.tif 000083
【０２５２】
2004535776.tif 000084
【０２５３】
2004535776.tif 000085
【０２５４】
2004535776.tif 000086
【０２５５】
2004535776.tif 000087
【０２５６】
2004535776.tif 000088
【０２５７】
2004535776.tif 000089
【０２５８】
2004535776.tif 000090
【０２５９】
2004535776.tif 000091
【０２６０】
2004535776.tif 000092
【０２６１】
2004535776.tif 000093
【０２６２】
2004535776.tif 000094
【０２６３】
2004535776.tif 000095
【０２６４】
2004535776.tif 000096
【０２６５】
2004535776.tif 000097
【０２６６】
2004535776.tif 000098
【０２６７】
2004535776.tif 000099
【０２６８】
2004535776.tif 000100
【０２６９】
2004535776.tif 000101
【０２７０】
2004535776.tif 000102
【０２７１】
2004535776.tif 000103
【０２７２】
2004535776.tif 000104
【０２７３】
2004535776.tif 000105
【０２７４】
2004535776.tif 000106
【０２７５】
2004535776.tif 000107
【０２７６】
2004535776.tif 000108
【０２７７】
2004535776.tif 000109
【０２７８】
2004535776.tif 000110
【０２７９】
2004535776.tif 000111
【０２８０】
2004535776.tif 000112
【０２８１】
2004535776.tif 000113
【０２８２】
2004535776.tif 000114
【０２８３】
2004535776.tif 000115
【０２８４】
2004535776.tif 000116
【０２８５】
2004535776.tif 000117
【０２８６】
2004535776.tif 000118
【０２８７】
2004535776.tif 000119
【０２８８】
2004535776.tif 000120
【０２８９】
2004535776.tif 000121
【０２９０】
2004535776.tif 000122
【０２９１】
2004535776.tif 000123
【０２９２】
2004535776.tif 000124
【０２９３】
2004535776.tif 000125
【０２９４】
2004535776.tif 000126
【０２９５】
2004535776.tif 000127
【０２９６】
2004535776.tif 000128
【０２９７】
2004535776.tif 000129
【０２９８】
2004535776.tif 000130
【０２９９】
2004535776.tif 000131
【０３００】
2004535776.tif 000132
【０３０１】
2004535776.tif 000133
【０３０２】
2004535776.tif 000134
【０３０３】
2004535776.tif 000135
【０３０４】
2004535776.tif 000136
【０３０５】
2004535776.tif 000137
【０３０６】
2004535776.tif 000138
【０３０７】
2004535776.tif 000139
【０３０８】
2004535776.tif 000140
【０３０９】
2004535776.tif 000141
【０３１０】
2004535776.tif 000142
【０３１１】
2004535776.tif 000143
【０３１２】
2004535776.tif 000144
【０３１３】
2004535776.tif 000145
【０３１４】
2004535776.tif 000146
【０３１５】
2004535776.tif 000147
【０３１６】
2004535776.tif 000148
【０３１７】
2004535776.tif 000149
【０３１８】
2004535776.tif 000150
【０３１９】
2004535776.tif 000151
【０３２０】
2004535776.tif 000152
【０３２１】
2004535776.tif 000153
【０３２２】
2004535776.tif 000154
【０３２３】
2004535776.tif 000155
【０３２４】
2004535776.tif 000156
【０３２５】
2004535776.tif 000157
【０３２６】
2004535776.tif 000158
【０３２７】
2004535776.tif 000159
【０３２８】
2004535776.tif 000160
【０３２９】
2004535776.tif 000161
【０３３０】
2004535776.tif 000162
【０３３１】
2004535776.tif 000163
【０３３２】
2004535776.tif 000164
【０３３３】
2004535776.tif 000165
【０３３４】
2004535776.tif 000166
【０３３５】
2004535776.tif 000167
【０３３６】
2004535776.tif 000168
【０３３７】
2004535776.tif 000169
【０３３８】
2004535776.tif 000170
【０３３９】
2004535776.tif 000171
【０３４０】
2004535776.tif 000172
【０３４１】
2004535776.tif 000173
【０３４２】
2004535776.tif 000174
【０３４３】
2004535776.tif 000175
【０３４４】
2004535776.tif 000176
【０３４５】
2004535776.tif 000177
【０３４６】
2004535776.tif 000178
【０３４７】
2004535776.tif 000179
【０３４８】
2004535776.tif 000180
【０３４９】
2004535776.tif 000181
【０３５０】
2004535776.tif 000182
【０３５１】
2004535776.tif 000183
【０３５２】
2004535776.tif 000184
【０３５３】
2004535776.tif 000185
【０３５４】
2004535776.tif 000186
【０３５５】
2004535776.tif 000187
【０３５６】
2004535776.tif 000188
【０３５７】
2004535776.tif 000189
【０３５８】
2004535776.tif 000190
【０３５９】
2004535776.tif 000191
【０３６０】
2004535776.tif 000192
【０３６１】
2004535776.tif 000193
【０３６２】
2004535776.tif 000194
【０３６３】
2004535776.tif 000195
【０３６４】
2004535776.tif 000196
【０３６５】
2004535776.tif 000197
【０３６６】
2004535776.tif 000198
【０３６７】
2004535776.tif 000199
【０３６８】
2004535776.tif 000200
【０３６９】
2004535776.tif 000201
【０３７０】
2004535776.tif 000202
【０３７１】
2004535776.tif 000203
【０３７２】
2004535776.tif 000204
【０３７３】
2004535776.tif 000205
【０３７４】
2004535776.tif 000206
【０３７５】
2004535776.tif 000207
【０３７６】
2004535776.tif 000208
【０３７７】
2004535776.tif 000209
【０３７８】
2004535776.tif 000210
【０３７９】
2004535776.tif 000211
【０３８０】
2004535776.tif 000212
【０３８１】
2004535776.tif 000213
【０３８２】
2004535776.tif 000214
【０３８３】
2004535776.tif 000215
【０３８４】
2004535776.tif 000216
【０３８５】
2004535776.tif 000217
【０３８６】
2004535776.tif 000218
【０３８７】
2004535776.tif 000219
【０３８８】
2004535776.tif 000220
【０３８９】
2004535776.tif 000221
【０３９０】
2004535776.tif 000222
【０３９１】
2004535776.tif 000223
【０３９２】
2004535776.tif 000224
【０３９３】
2004535776.tif 000225
【０３９４】
2004535776.tif 000226
【０３９５】
2004535776.tif 000227
【０３９６】
2004535776.tif 000228
【０３９７】
2004535776.tif 000229
【０３９８】
2004535776.tif 000230
【０３９９】
2004535776.tif 000231
【０４００】
2004535776.tif 000232
【０４０１】
2004535776.tif 000233
【０４０２】
2004535776.tif 000234
【０４０３】
2004535776.tif 000235
【０４０４】
2004535776.tif 000236
【０４０５】
2004535776.tif 000237
【０４０６】
2004535776.tif 000238
【０４０７】
2004535776.tif 000239
【０４０８】
2004535776.tif 000240
【０４０９】
2004535776.tif 000241
【０４１０】
2004535776.tif 000242
【０４１１】
2004535776.tif 000243
【０４１２】
2004535776.tif 000244
【０４１３】
2004535776.tif 000245
【０４１４】
2004535776.tif 000246
【０４１５】
2004535776.tif 000247
【０４１６】
2004535776.tif 000248
【０４１７】
2004535776.tif 000249
【０４１８】
2004535776.tif 000250
【０４１９】
2004535776.tif 000251
【０４２０】
2004535776.tif 000252
【０４２１】
2004535776.tif 000253
【０４２２】
2004535776.tif 000254
【０４２３】
2004535776.tif 000255
【０４２４】
2004535776.tif 000256
【０４２５】
2004535776.tif 000257
【０４２６】
2004535776.tif 000258
【０４２７】
2004535776.tif 000259
【０４２８】
2004535776.tif 000260
【０４２９】
2004535776.tif 000261
【０４３０】
2004535776.tif 000262
【０４３１】
2004535776.tif 000263
【０４３２】
2004535776.tif 000264
【０４３３】
2004535776.tif 000265
【０４３４】
2004535776.tif 000266
【０４３５】
2004535776.tif 000267
【０４３６】
2004535776.tif 000268
【０４３７】
2004535776.tif 000269
【０４３８】
2004535776.tif 000270
【０４３９】
2004535776.tif 000271
【０４４０】
2004535776.tif 000272
【０４４１】
2004535776.tif 000273
【０４４２】
2004535776.tif 000274
【０４４３】
2004535776.tif 000275
【０４４４】
2004535776.tif 000276
【０４４５】
2004535776.tif 000277
【図面の簡単な説明】
【０４４６】
【図１】表４に列挙した７００個のラット遺伝子をスポットした２つのマイクロアレイでの、差次的遺伝子応答の一致性を示す。差次的発現として、７２時間にわたり１ｍｇ／ｋｇでアフラトキシンに曝露したラットの肝臓からのｃＤＮＡ標本をスライドとハイブリダイズさせ、スライド上に同時にハイブリダイズした適切な対照ラットからのｃＤＮＡ標本と比較した。示される９個の遺伝子のそれぞれについて、１つの棒グラフは１つのマイクロアレイからのものであり、２番目の棒グラフは第２のマイクロアレイからのデータである。
【図２】曝露６時間後のリポ多糖類（ＬＰＳ）で処理したラットの同じ処理をした２匹のラットからの、２つの異なる器官における同様の差次的遺伝子発現応答を示す。示したデータは、２匹のラットから得られた肝臓データであり（第１及び第２の棒グラフはそれぞれの遺伝子に関するもの）及び２匹のラットから得られた腎臓データである（第３及び第４の棒グラフはそれぞれの遺伝子に関するもの）。示した５個の遺伝子のうち２個については、差次的発現が肝臓よりも腎臓で増大し、これらの遺伝子のうち３個については、差次的発現が腎臓よりも肝臓で増大した。
【図３】ラットの肝臓の、毒性誘発型差次的遺伝子発現の経時的な進行を示す。ラットを、１回の腹腔内注射によってリポ多糖類で処理した（８ｍｇ／ｋｇ）。示したデータは、６時間後に殺した２匹（第１及び第２の棒グラフはそれぞれの遺伝子に関する）、２４時間後に殺した２匹（第３及び第４の棒グラフはそれぞれの遺伝子に関する）、７２時間後に殺した２匹（第５及び第６の棒グラフはそれぞれの遺伝子に関する）からのものである。示した５個の遺伝子に関し、差次的発現は、肝臓の場合２４時間後よりも６時間後に多く、７２時間後には差次的発現がほとんどない。
【図４】ラットの心臓の、毒性誘発型差次的遺伝子発現の経時的な進行を示す。ラットを、１回の腹腔内注射によってリポ多糖類で処理した（８ｍｇ／ｋｇ）。示したデータは、６時間後に殺した２匹（第１及び第２の棒グラフはそれぞれの遺伝子に関する）、２４時間後に殺した２匹（第３及び第４の棒グラフはそれぞれの遺伝子に関する）、７２時間後に殺した２匹（第５及び第６の棒グラフはそれぞれの遺伝子に関する）からのものである。示した１３個の遺伝子に関し、差次的発現は、心臓の場合２４時間後よりも６時間後に多く、７２時間後には差次的発現がほとんどない。
【図５】ラットの、エリスロマイシンエストレート及びテトラサイクリンでｉｎ  ｖｉｖｏ処理したラットのこれらの作用物質処理した肝臓の相関関係を示す。白い四角形は、実験同士の相関関係が最も高い領域を示している。ラットにエリスロマイシンエストレートを投与した実験同士での相関関係が高く（白い四角形）、ラットにテトラサイクリンを投与した実験同士での相関関係が高かった。１つの化合物の実験ともう一方の化合物の実験の相関関係はそれほど高くなく（濃灰色及びボックス）、これら２種の毒素に曝露されたラットの肝臓で発現した７００個の遺伝子は異なるものであることが示された。これは、エリスロマイシンとテトラサイクリンが異なる肝臓毒性メカニズムを有することから予測される。
【図６】メカニズムから４種に分類される毒性化合物の相関関係マトリックスを示す。ラットの肝臓で試験をしたラットＣＴアレイからの遺伝子発現データを、逐次対合遺伝子同定によって識別した。白いボックスの領域は、相関関係がより高いことを示す。略語は下記の通りである：ＰＡＨ：ポリ芳香族炭化水素、ＴＣＤＤ、ベンゾ（ａ）ピレン、ジメチルベンズアントラセン；ＰＰ：ペルオキシソーム増殖剤、ゲムフィブロジル、ジエチルヘキシルフタレート、Ｗｙ１４，６４３；ＣＳ：コルチコステロイド、プレドニゾン、トリアムシノロン；ＮＭ：ナイトロジェンマスタード、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル。
【図７】マイクロアレイプラットフォーム（記号Ｏ及び破線）及びＴａｃＭａｎ実時間ＰＣＲプラットフォーム（記号及び実線）を使用した、遺伝子シトクロムＰ４５０  １Ａ２の、非常に類似している応答を示す。
【図８】マイクロアレイプラットフォーム（記号Ｏ及び破線）及びＴａｃＭａｎ実時間ＰＣＲプラットフォーム（記号及び実線）を使用した、遺伝子脂肪酸シンターゼの、非常に類似している応答を示す。
【図９】マイクロアレイプラットフォーム（記号Ｏ及び破線）及びＴａｃＭａｎ実時間ＰＣＲプラットフォーム（記号及び実線）を使用した、遺伝子多剤耐性型タンパク質−１の、非常に類似している応答を示す。
【図１】
2004535776.tif 000278
【図２】
2004535776.tif 000279
【図３】
2004535776.tif 000280
【図４】
2004535776.tif 000281
【図７】
2004535776.tif 000282
【図８】
2004535776.tif 000283
【図９】
2004535776.tif 000284
【国際公開パンフレット】
2004535776.tif 000285
2004535776.tif 000286
2004535776.tif 000287
2004535776.tif 000288
2004535776.tif 000289
2004535776.tif 000290
2004535776.tif 000291
2004535776.tif 000292
2004535776.tif 000293
2004535776.tif 000294
2004535776.tif 000295
2004535776.tif 000296
2004535776.tif 000297
2004535776.tif 000298
2004535776.tif 000299
2004535776.tif 000300
2004535776.tif 000301
2004535776.tif 000302
2004535776.tif 000303
2004535776.tif 000304
2004535776.tif 000305
2004535776.tif 000306
2004535776.tif 000307
2004535776.tif 000308
2004535776.tif 000309
2004535776.tif 000310
2004535776.tif 000311
2004535776.tif 000312
2004535776.tif 000313
2004535776.tif 000314
2004535776.tif 000315
2004535776.tif 000316
2004535776.tif 000317
2004535776.tif 000318
2004535776.tif 000319
2004535776.tif 000320
2004535776.tif 000321
2004535776.tif 000322
2004535776.tif 000323
2004535776.tif 000324
2004535776.tif 000325
2004535776.tif 000326
2004535776.tif 000327
2004535776.tif 000328
2004535776.tif 000329
2004535776.tif 000330
2004535776.tif 000331
2004535776.tif 000332
2004535776.tif 000333
2004535776.tif 000334
2004535776.tif 000335
2004535776.tif 000336
2004535776.tif 000337
2004535776.tif 000338
2004535776.tif 000339
2004535776.tif 000340
2004535776.tif 000341
2004535776.tif 000342
2004535776.tif 000343
2004535776.tif 000344
2004535776.tif 000345
2004535776.tif 000346
2004535776.tif 000347
2004535776.tif 000348
2004535776.tif 000349
2004535776.tif 000350
2004535776.tif 000351
2004535776.tif 000352
2004535776.tif 000353
2004535776.tif 000354
2004535776.tif 000355
2004535776.tif 000356
2004535776.tif 000357
2004535776.tif 000358
2004535776.tif 000359
2004535776.tif 000360
2004535776.tif 000361
2004535776.tif 000362
2004535776.tif 000363
2004535776.tif 000364
2004535776.tif 000365
2004535776.tif 000366
2004535776.tif 000367
2004535776.tif 000368
2004535776.tif 000369
2004535776.tif 000370
2004535776.tif 000371
2004535776.tif 000372
2004535776.tif 000373
2004535776.tif 000374
2004535776.tif 000375
2004535776.tif 000376
2004535776.tif 000377
2004535776.tif 000378
2004535776.tif 000379
2004535776.tif 000380
2004535776.tif 000381
2004535776.tif 000382
2004535776.tif 000383
2004535776.tif 000384
2004535776.tif 000385
2004535776.tif 000386
2004535776.tif 000387
2004535776.tif 000388
2004535776.tif 000389
2004535776.tif 000390
2004535776.tif 000391
2004535776.tif 000392
2004535776.tif 000393
2004535776.tif 000394
2004535776.tif 000395
2004535776.tif 000396
2004535776.tif 000397
2004535776.tif 000398
2004535776.tif 000399
2004535776.tif 000400
2004535776.tif 000401
2004535776.tif 000402
2004535776.tif 000403
2004535776.tif 000404
2004535776.tif 000405
2004535776.tif 000406
2004535776.tif 000407
2004535776.tif 000408
2004535776.tif 000409
2004535776.tif 000410
2004535776.tif 000411
2004535776.tif 000412
2004535776.tif 000413
2004535776.tif 000414
2004535776.tif 000415
2004535776.tif 000416
2004535776.tif 000417
2004535776.tif 000418
2004535776.tif 000419
2004535776.tif 000420
2004535776.tif 000421
2004535776.tif 000422
2004535776.tif 000423
2004535776.tif 000424
2004535776.tif 000425
2004535776.tif 000426
2004535776.tif 000427
2004535776.tif 000428
2004535776.tif 000429
2004535776.tif 000430
2004535776.tif 000431
2004535776.tif 000432
2004535776.tif 000433
2004535776.tif 000434
2004535776.tif 000435
2004535776.tif 000436
2004535776.tif 000437
2004535776.tif 000438
2004535776.tif 000439
2004535776.tif 000440
2004535776.tif 000441
2004535776.tif 000442
2004535776.tif 000443
2004535776.tif 000444
2004535776.tif 000445
2004535776.tif 000446
2004535776.tif 000447
2004535776.tif 000448
2004535776.tif 000449
2004535776.tif 000450
2004535776.tif 000451
2004535776.tif 000452
2004535776.tif 000453
2004535776.tif 000454
2004535776.tif 000455
2004535776.tif 000456
2004535776.tif 000457
2004535776.tif 000458
2004535776.tif 000459
2004535776.tif 000460
2004535776.tif 000461
2004535776.tif 000462
2004535776.tif 000463
2004535776.tif 000464
2004535776.tif 000465
2004535776.tif 000466
2004535776.tif 000467
2004535776.tif 000468
2004535776.tif 000469
2004535776.tif 000470
2004535776.tif 000471
2004535776.tif 000472
2004535776.tif 000473
2004535776.tif 000474
2004535776.tif 000475
2004535776.tif 000476
2004535776.tif 000477
2004535776.tif 000478
2004535776.tif 000479
2004535776.tif 000480
2004535776.tif 000481
2004535776.tif 000482
2004535776.tif 000483
2004535776.tif 000484
2004535776.tif 000485
2004535776.tif 000486
2004535776.tif 000487
2004535776.tif 000488
2004535776.tif 000489
2004535776.tif 000490
2004535776.tif 000491
2004535776.tif 000492
2004535776.tif 000493
2004535776.tif 000494
2004535776.tif 000495
2004535776.tif 000496
2004535776.tif 000497
2004535776.tif 000498
2004535776.tif 000499
2004535776.tif 000500
2004535776.tif 000501
2004535776.tif 000502
2004535776.tif 000503
2004535776.tif 000504
2004535776.tif 000505
2004535776.tif 000506
2004535776.tif 000507
2004535776.tif 000508
2004535776.tif 000509
2004535776.tif 000510
2004535776.tif 000511
2004535776.tif 000512
2004535776.tif 000513
2004535776.tif 000514
2004535776.tif 000515
2004535776.tif 000516
2004535776.tif 000517
2004535776.tif 000518
2004535776.tif 000519
2004535776.tif 000520
2004535776.tif 000521
2004535776.tif 000522
2004535776.tif 000523
2004535776.tif 000524
2004535776.tif 000525
2004535776.tif 000526
2004535776.tif 000527
2004535776.tif 000528
2004535776.tif 000529
2004535776.tif 000530
2004535776.tif 000531
2004535776.tif 000532
2004535776.tif 000533
2004535776.tif 000534
2004535776.tif 000535
2004535776.tif 000536
2004535776.tif 000537
2004535776.tif 000538
2004535776.tif 000539
2004535776.tif 000540
2004535776.tif 000541
2004535776.tif 000542
2004535776.tif 000543
2004535776.tif 000544
2004535776.tif 000545
2004535776.tif 000546
2004535776.tif 000547
2004535776.tif 000548
2004535776.tif 000549
2004535776.tif 000550
2004535776.tif 000551
2004535776.tif 000552
2004535776.tif 000553
2004535776.tif 000554
2004535776.tif 000555
2004535776.tif 000556
2004535776.tif 000557
2004535776.tif 000558
2004535776.tif 000559
2004535776.tif 000560
2004535776.tif 000561
2004535776.tif 000562
2004535776.tif 000563
2004535776.tif 000564
2004535776.tif 000565
2004535776.tif 000566
2004535776.tif 000567
2004535776.tif 000568
2004535776.tif 000569
2004535776.tif 000570
2004535776.tif 000571
2004535776.tif 000572
2004535776.tif 000573
2004535776.tif 000574
2004535776.tif 000575
2004535776.tif 000576
2004535776.tif 000577
2004535776.tif 000578
2004535776.tif 000579
2004535776.tif 000580
2004535776.tif 000581
2004535776.tif 000582
2004535776.tif 000583
2004535776.tif 000584
2004535776.tif 000585
2004535776.tif 000586
2004535776.tif 000587
2004535776.tif 000588
2004535776.tif 000589
2004535776.tif 000590
2004535776.tif 000591
2004535776.tif 000592
2004535776.tif 000593
2004535776.tif 000594
2004535776.tif 000595
2004535776.tif 000596
2004535776.tif 000597
2004535776.tif 000598
2004535776.tif 000599
2004535776.tif 000600
2004535776.tif 000601
2004535776.tif 000602
2004535776.tif 000603
2004535776.tif 000604
2004535776.tif 000605
2004535776.tif 000606
2004535776.tif 000607
2004535776.tif 000608
2004535776.tif 000609
2004535776.tif 000610
2004535776.tif 000611
2004535776.tif 000612
2004535776.tif 000613
2004535776.tif 000614
2004535776.tif 000615
2004535776.tif 000616
2004535776.tif 000617
2004535776.tif 000618
2004535776.tif 000619
2004535776.tif 000620
2004535776.tif 000621
2004535776.tif 000622
2004535776.tif 000623
2004535776.tif 000624
2004535776.tif 000625
2004535776.tif 000626
2004535776.tif 000627
2004535776.tif 000628
2004535776.tif 000629
2004535776.tif 000630
2004535776.tif 000631
2004535776.tif 000632
2004535776.tif 000633
2004535776.tif 000634
2004535776.tif 000635
2004535776.tif 000636
2004535776.tif 000637
2004535776.tif 000638
2004535776.tif 000639
2004535776.tif 000640
2004535776.tif 000641
2004535776.tif 000642
2004535776.tif 000643
2004535776.tif 000644
2004535776.tif 000645
2004535776.tif 000646
2004535776.tif 000647
2004535776.tif 000648
2004535776.tif 000649
2004535776.tif 000650
2004535776.tif 000651
2004535776.tif 000652
2004535776.tif 000653
2004535776.tif 000654
2004535776.tif 000655
2004535776.tif 000656
2004535776.tif 000657
2004535776.tif 000658
2004535776.tif 000659
2004535776.tif 000660
2004535776.tif 000661
2004535776.tif 000662
2004535776.tif 000663
2004535776.tif 000664
2004535776.tif 000665
2004535776.tif 000666
2004535776.tif 000667
2004535776.tif 000668
2004535776.tif 000669
2004535776.tif 000670
2004535776.tif 000671
2004535776.tif 000672
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535776.tif 000673
【国際調査報告】
2004535776.tif 000674
2004535776.tif 000675
2004535776.tif 000676
2004535776.tif 000677
2004535776.tif 000678
2004535776.tif 000679