(57)【要約】流体の粘度における変化を電気化学的に検出するための方法および装置を提供する。本発明の方法において、流体サンプルが対向して離間している作用電極および基準電極を有する電気化学的セルの中に導入される。一定の電位がこのセルに印加されて、安定な状態のセル電流が最初に形成される。その後、この安定状態のセル電流における減少が検出されて上記サンプルの粘度における変化に関連付けられる。多くの実施形態において、上記サンプルは血液であり、その粘度における変化がこの血液サンプルにおける凝固の開始、さらに多くの場合において当該血液サンプルのＰＴに関連付けられる。さらに、本発明の実施において使用するための試験片、これらのキットおよび計器を提供する。
2004515784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体サンプルの粘度における変化を検出するための方法において、
（ａ）対向して離間している作用電極および基準電極を有する電気化学的セルの中にサンプルを導入する工程と、
（ｂ）前記対向して離間している各電極の間において一定の安定な状態の電流を生成するために前記反応セルに一定の電位を印加する工程と、
（ｃ）前記安定な状態の電流における変化を検出する工程と、
（ｄ）前記安定な状態の電流における変化を前記流体サンプルの粘度における変化に関連付ける工程を含む方法。
【請求項２】
前記安定な状態の電流における変化が当該安定な状態の電流における減少である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粘度における変化が増加である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記流体サンプルが生理学的サンプルである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生理学的サンプルが血液である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法がさらに前記粘度における変化を前記血液のプロトロンビン時間（ＰＴ）に関連付ける工程を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記電気化学的セルがレドックス対を有している請求項１に記載の方法。
【請求項８】
血液サンプルの凝固の開始を検出するための方法において、
（ａ）（ｉ）対向して離間している作用電極および基準電極と、
（ｉｉ）レドックス対を含む試薬混合物を有する電気化学的セルの中に前記血液サンプルを導入する工程と、
（ｂ）前記対向して離間している各電極の間において一定の安定な状態の電流を生成するために前記反応セルに一定の電位を印加する工程と、
（ｃ）前記安定な状態の電流における変化を検出する工程と、
（ｄ）前記安定な状態の電流における変化を前記血液サンプルにおける凝固の開始に関連付ける工程を含む方法。
【請求項９】
前記変化が減少である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬が凝固触媒性物質を含有している請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記凝固触媒性物質がトロンボプラスチンを含有している請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、前記凝固の開始を前記血液サンプルのプロトロンビン時間に関連付ける工程を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
電気化学的試験片において、
（ａ）対向して離間している作用電極および基準電極と、
（ｂ）（ｉ）レドックス対、および
（ｉｉ）凝固触媒性物質を含有している試薬混合物を有する電気化学的セルを備えている試薬試験片。
【請求項１４】
前記対向して離間している作用電極および基準電極が約５０μｍ乃至７５０μｍの範囲の距離で分離している請求項１３に記載の試薬試験片。
【請求項１５】
前記凝固触媒性物質がトロンボプラスチンを含有している請求項１４に記載の試薬試験片。
【請求項１６】
前記レドックス対がフェリシアニドおよびフェロシアニドを含有している請求項１３に記載の試薬試験片。
【請求項１７】
前記電気化学的セルが約０．１μＬ乃至１０μＬの範囲の容積を有している請求項１３に記載の試薬試験片。
【請求項１８】
流体サンプルの粘度における変化を検出するための計器において、
（ａ）対向して離間している作用電極および基準電極により形成されていて前記流体サンプルを収容している電気化学的セルに一定の電位を印加するための手段と、
（ｂ）前記対向して離間している作用電極と基準電極との間におけるセル電流を測定するための手段と、
（ｃ）前記測定したセル電流における変化を検出するための手段と、
（ｄ）前記測定したセル電流における変化を前記流体サンプルの粘度における変化に関連付ける手段を備えている計器。
【請求項１９】
さらに、前記粘度における変化を前記流体サンプルのプロトロンビン時間に関連付けるための手段を備えている請求項１８に記載の計器。
【請求項２０】
血液サンプルにおける凝固発生の検出において使用するためのキットにおいて、
（ａ）（ｉ）対向して離間している作用電極および基準電極、および
（ｉｉ）レドックス対および凝固触媒性物質を含有している試薬混合物を有する電気化学的セルを含む少なくとも１個の電気化学的試験片と、
（ｂ）較正手段およびサンプルを入手するための手段の少なくとも一方を備えているキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は凝固であり、特に凝固試験である。
【０００２】
背景
凝固は液体または溶液の軟質で半固体状または固体状の物質への形質転換として定義される。血液は外傷的または病理学的な状況が脈管の損傷を生じている時に関門（バリア）を形成するために自然に凝固する。２種類の十分に認識されている凝固経路、すなわち、外因性またはトロンボプラスチンにより調整される凝固通路および内因性またはプロトロンビン／フィブリノゲンにより調整される凝固経路が存在している。これらの外因性および内因性の両方の経路は結果としてトロンビンを生成し、蛋白分解性酵素が触媒作用によりフィブリノゲンをフィブリンに変換する。
【０００３】
クロットまたは凝固物を形成する血液サンプルの能力を測定する凝固試験が血液サンプルのプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定するために開発されて用いられている。このような試験を一般的にＰＴ試験と言う。このＰＴ試験は多数の異なる用途において有用であることが分かっている。例えば、ＰＴ試験は抗凝固薬治療を受けている患者のモニターにおいて有用であることが知られている。さらに、このＰＴ試験が有用であることが知られている別の状況は後天性血小板機能欠損症、先天性血小板機能欠損症、先天性プロテインＣまたはＳ欠損症、深脳内出血、ＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群）、第ＩＩ因子欠損症、第Ｖ因子欠損症、第ＶＩＩ因子欠損症、第Ｘ因子欠損症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、血友病Ａ、血友病Ｂ、出血性発作、肝性脳障害、肝腎症候群、高血圧性脳内出血、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、脳内出血、葉性脳内出血、胎盤剥離、一過性脳虚血（ＴＩＡ）、ウィルソン病等を決定するための試験を含む。このように、ＰＴ試験は種々の異なる用途において有用であることが知られている。
【０００４】
多数の異なるＰＴ決定試験および装置が開発されている。これらの装置およびプロトコルはＲ． Ｓｈａｒｔｌｅに発行されている米国特許第６，０８４，６６０号において記載されている装置のような光学に基づく装置、および全てＡ． Ｊｉｎａに発行されている米国特許第６，０４６，０５１号、同第６，０６０，３２３号および同第６，０６６，５０４号において記載されている装置のような電気化学に基づく装置の両方を含む。これらの特許の後者のグループにおいて、サンプル中の流体粘度の変化の電気化学的な決定に適している装置が開示されており、この装置は横並びの電極の存在により特徴付けられている。この形態は比較的に大容量のサンプルおよびバックグラウンド応答の時間依存的逆重畳、すなわち、信号が経時的に測定された後にバックグラウンド上において識別される処理を実行する測定プロトコルの使用を必要とする。従って、上記Ｊｉｎａ（特許）の装置と共に採用されているこれらのプロトコルは比較的に複雑であり、以下に説明する本発明において使用される各プロトコルよりも労力を要すると考えられる。
【０００５】
多数の異なるＰＴ決定試験および装置がこれまでに開発されているが、さらに別のプロトコルおよび装置に対する要望が依然として存在し続けている。特に重要な事は廃棄可能な試薬片等の安価な装置部品を使用している少ないサンプル量による迅速で正確なＰＴ決定を行なうＰＴシステムの開発であると考えられる。さらに重要な事は上記の望ましい各パラメーターを示し、少ないサンプル量による使用に適していて、一定の安定な状態の値に変換する解釈容易な信号を提供できる電気化学的な装置およびプロトコルの開発であると考えられる。
【０００６】
関連の文献
関連の米国特許は米国特許第６，０８４，６６０号、同第６，０６６，５０４号、同第６，０６０，３２３号、同第６，０４６，０５１号、同第５，９４２，１０２号、同第５，９１６，５２２号、同第５，６２８，９６１号、同第５，５５４，５３１号、および同第５，３００，７７９号を含む。また、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９７／１８４６５号、同第ＷＯ  ９５／０６８６８号、欧州特許（ＥＰ）第９７４８４０号、および英国特許（ＧＢ）第１２９９３６３号も関連している。
【０００７】
発明の概要
流体の粘度における変化を電気化学的に検出するための方法および装置が提供される。本発明の方法において、流体サンプルが対向して離間している作用電極および基準電極を有する電気化学的セルの中に導入される。一定の電位がこのセルに印加されて、安定な状態のセル電流が最初に形成される。その後、この安定状態のセル電流における減少が検出されて上記サンプルの粘度における変化に関連付けられる。多くの実施形態において、上記サンプルは血液であり、その粘度における変化がこの血液サンプルにおける凝固の開始、さらに多くの場合において当該血液サンプルのＰＴ（プロトロンビン時間）に関連付けられる。さらに、本発明の実施において使用するための各試験片、これらのキットおよび計器が提供される。
【０００８】
特定の実施形態の説明
流体の粘度における変化を電気化学的に検出するための方法および装置が提供される。本発明の方法において、流体サンプルが対向して離間している作用電極および基準電極を有する電気化学的セルの中に導入される。一定の電位がこのセルに印加されて、安定な状態のセル電流が最初に形成される。その後、この安定状態のセル電流における減少が検出されて上記サンプルの粘度における変化に関連付けられる。多くの実施形態において、上記サンプルは血液であり、その粘度における変化がこの血液サンプルにおける凝固の開始、さらに多くの場合において当該血液サンプルのＰＴ（プロトロンビン時間）に関連付けられる。さらに、本発明の実施において使用するための各試験片、これらのキットおよび計器が提供される。
【０００９】
本発明をさらに説明する前に、本発明が以下に説明する本発明の特定の各実施形態に限定されないこと、およびこれらの特定の実施形態の変更が本明細書において記載されている特許請求の範囲内において可能であり当該範囲内にさらに含まれることが理解されるべきである。さらに、使用している各用語が特定の各実施形態を説明することを目的としていて、限定することを目的としていないことも理解されるべきである。その代わりに、本発明の範囲は本明細書において記載されている特許請求の範囲により確立される。
【００１０】
本明細書および本明細書において記載されている特許請求の範囲において、特別に明示しない限り、単数の表現が複数の表現を含むこともある。また、特別に定めない限り、本明細書において使用されている全ての技術的および科学的な用語は本発明が属している技術分野における通常の熟練者において一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。
【００１１】
方法
上記において概説したように、本発明は流体サンプルの粘度における変化を決定するための方法を提供する。多くの場合において、本発明の方法は流体サンプルの粘度における増加を決定または検出するための手段を提供する。本発明の方法は大きさが約１ｃｐｓよりも低い、さらに多くの場合において約０．５ｃｐｓよりも低い粘度における増加を検出するために十分に感度が高い。従って、本発明の方法は流体サンプルの粘度における変化を検出するための高感度な方法である。
【００１２】
本発明の方法の別の特徴は当該方法が流体サンプルの粘度における変化、さらに多くの場合において増加を決定するための電気化学的な方法であることである。この電気化学的方法とは、上記本発明の方法が作用電極および基準電極を使用していることを意味する。特に、本発明の方法は作用電極と基準電極との間に生成される電流および当該電流における変化を利用して、以下に詳述するように、流体サンプルの粘度における変化を決定する。
【００１３】
上記本発明の方法における第１の工程はアッセイまたは定量を行なう一定量の流体、すなわち、流体サンプルを対向して離間している作用電極および基準電極を含む電気化学的セルの中に導入することである。この流体の性質は、当該流体が導電体、例えば、電解質である限りにおいて、変更可能である。多くの実施形態において、この流体は水性流体であり、生理学的流体が特に重要である。上記流体が生理学的サンプルである場合に、多くの実施形態においてこの流体は全血、または凝固／クロット時間、すなわち、ＰＴ時間を導き出すことのできるその誘導体である。
【００１４】
上記電気化学的セルの中に導入される流体、例えば、血液の量は変更可能であるが、一般に少量である。すなわち、この電気化学的セル内に導入される流体の量は一般的に約０．１μＬ乃至１０μＬ、通常的に約０．２μＬ乃至５．０μＬ、さらに通常的に約０．３μＬ乃至１．６μＬの範囲である。このサンプルは任意の従来的なプロトコルにより上記電気化学的セル内に導入され、この場合に、このサンプルは当該電気化学的セルの中に注入されて、適宜に且つ本発明を実施する装置／システムの性質に応じて、この電気化学的セル等の中に保持できる。
【００１５】
本発明の方法は、原理的に、対向して離間している作用電極および基準電極を有するあらゆる種類の電気化学的セルと共に使用可能であるが、多くの実施形態において、本発明は電気化学的試験片を採用している。本発明のこれらの実施形態において採用されている各電気化学的試験片は薄いスペーサー層により分離されている２個の対向している金属電極により形成されており、これらの実施形態は上記電気化学的セルを形成している一定の反応領域または反応区域を定めている。
【００１６】
上記電気化学的試験片の特定の実施形態において、上記作用電極および基準電極は一般に細長い長方形の部材片の形態で構成されている。一般的に、これらの電極の長さは約１．９ｃｍ乃至４．５ｃｍ、通常的に約２．０ｃｍ乃至２．８ｃｍの範囲である。また、これらの電極の幅は約０．０７ｃｍ乃至０．７６ｃｍ、通常的に約０．２４ｃｍ乃至０．６０ｃｍの範囲である。さらに、これらの作用電極および基準電極は一般的に約１０ｎｍ乃至１００ｎｍ、通常的に約１０ｎｍ乃至２０ｎｍの範囲の厚さを有している。図１は本発明による電気化学的試験片の分解図を示している。
【００１７】
さらに、上記作用電極および基準電極は少なくとも上記電気化学的セルの反応領域に面しているこれらの電極の表面部分が金属であることに特徴付けられており、この場合の関連の金属はパラジウム、金、プラチナ、銀、イリジウム、炭素（導電性炭素インク）、ドーピングした酸化錫、ステンレス・スチール等を含む。多くの実施形態において、この金属は金またはパラジウムである。原理的に上記電極の全体を金属により作成することが可能であるが、これらの電極はそれぞれ一般に不活性な支持材料により形成されており、当該支持材料の表面において各電極の金属成分の薄い層が存在している。これらのさらに一般的な実施形態において、上記不活性な支持材料の厚さは一般的に約２５μｍ乃至５００μｍ、通常的に約５０μｍ乃至４００μｍ、例えば、約１２７μｍ乃至１７８μｍの範囲であるが、上記金属層の厚さは一般的に約１０ｎｍ乃至１００ｎｍ、通常的に約１０ｎｍ乃至４０ｎｍの範囲の、例えば、スパッターリング処理した金属層である。本発明の各電極において任意の従来的な不活性な支持材料が使用可能であり、この場合の材料は一般的に各電極、さらに全体としての電気化学的試験片に対して構造的な支持を賦与できる剛性材料である。上記支持体として採用できる適当な材料は、例えば、ＰＥＴ、ＰＥＴＧ、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレン等のプラスチック、およびシリコン、セラミック、ガラス等を含む。
【００１８】
上記本発明の方法の各実施形態において使用する各電気化学的試験片の特徴は上記作用電極および基準電極が互いに対向していて僅かな距離だけ分離していて、上記電気化学的試験片の反応領域または反応区域内におけるこれら作用電極および基準電極の間の距離が極めて小さいことである。このような本発明の各試験片における作用電極および基準電極の最小の間隔はこれらの作用電極と基準電極との間に配置または挟まれている薄いスペーサー層の存在の結果による。このスペーサー層の厚さは約５０μｍ乃至７５０μｍの範囲にすることができ、多くの場合において５００μｍよりも薄いかこれに等しく、通常的に約１００μｍ乃至１７５μｍ、例えば、１０２μｍ乃至１５３μｍの範囲である。このスペーサー層は上記反応領域内に入る少なくとも１個の入口ポート、および一般に当該反応領域から出る出口ポートも伴う反応領域を形成するために切断されている。また、このスペーサー層は側方の入口および出口の各穴またはポートを伴う円形の反応領域の切断部分、あるいは、別の形態の、例えば、正方形、三角形、長方形、および不規則な形状の反応領域等を有することができる。また、このスペーサー層は任意の従来的な材料により製造可能であり、この場合の代表的な適当な材料はＰＥＴ、ＰＥＴＧ、ポリイミド、ポリカーボネート等を含み、このスペーサー層の各表面は上記各電極に対して接着性を示すように処理することができ、これにより、上記電気化学的試験片の構造が維持できる。特に重要な事は上記スペーサー層としての打抜式両面接着片の使用である。
【００１９】
本発明の上記各実施形態において使用する各電気化学的試験片は上記作用電極、基準電極およびスペーサー層により定められている一定の反応領域または反応区域を備えており、これらの構成要素は上記において既に説明されている。特に、作用電極および基準電極は上記反応領域の上部および下部を定めており、スペーサー層は当該反応領域の各壁部を定めている。この反応領域の容積は一般的に約０．１μＬ乃至１０μＬ、通常的に約０．２μＬ乃至５．０μＬ、さらに通常的に約０．３μＬ乃至１．６μＬの範囲である。上述したように、この反応領域は一般に少なくとも１個の入口ポートを有しており、多くの実施形態において出口ポートも有している。これらの入口ポートおよび出口ポートの断面積は上記反応領域における効果的な流体の流入または流出が行なわれるために十分に大きいことを条件として変更可能であるが、一般に約９×１０−４ｃｍ２ 乃至５×１０−３ｃｍ２ 、通常的に約１．３×１０−３ｃｍ２ 乃至２．５×１０−３ｃｍ２ の範囲である。
【００２０】
多くの実施形態において、試薬システムが上記反応領域の中に存在しており、この場合の試薬システムはアッセイ中に上記流体サンプル中の各成分に対して相互作用する。例えば、本発明が、例えばサンプルのＰＴを測定するための、凝固発生を検出するために用いられる場合の各実施形態において、上記反応領域または反応区域は少なくともレドックス（試薬）対を含有している、さらに多くの場合において凝固触媒性物質も含有している試薬システムを備えている。
【００２１】
上記試薬組成物におけるレドックス対は、存在している場合に、１種類以上のレドックス対物質により形成されている。種々の異なるレドックス対物質が当該技術分野において知られており、フェリシアニド（フェリシアン化物）、フェナジン・エトサルフェート、フェナジン・メトサルフェート、フェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジン・メトサルフェート、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、フェロセン誘導体、オスミウム−ビピリジル錯体、ルテニウム錯体等を含む。多くの実施形態において、特に重要なレドックス対はフェリシアニド等である。
【００２２】
多くの実施形態において、上記試薬組成物はさらに凝固触媒性物質も含有している。この凝固触媒性物質とは、上記流体サンプル、例えば、全血の中に存在している各成分に対して関係または相互作用して当該血液サンプルにおける凝固プロセスを開始する１種類以上の成分または反応物質を意味する。ＰＴアッセイの場合に、上記凝固触媒性物質は一般にトロンボプラスチンを含み、この場合のトロンボプラスチンは、例えば、アセトン乾燥した脳組織の水性抽出物等の天然の供給源、または合成の組換えトロンボプラスチン（ｒ−ＤＮＡトロンボプラスチン）から精製可能であり、このトロンボプラスチンは一般に精製された組換え組織因子タンパク質および精製された人工脂質成分を含む。代表的な凝固触媒性物質はフロリダ州マイアミのＤａｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社により商品名をＩＮＮＯＶＩＮ（登録商標）として販売されているカルシウムを伴うトロンボプラスチン−ＸＳである。
【００２３】
上記試薬領域において存在できる別の試薬は、例えば、シトラコン酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸（塩）、マレイン酸（塩）、リン酸塩、「Ｇｏｏｄ」緩衝液等の緩衝剤を含む。さらに、存在可能な別の物質は塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム等の二価のカチオン、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｍａｃｏｌ、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ、Ｓｉｌｗｅｔ、Ｚｏｎｙｌ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ等の界面活性剤、およびアルブミン、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびラクトース等の安定化剤を含む。
【００２４】
上記試薬システムは、存在している場合に、一般に乾燥している形態である。種々の成分の各量は変更可能であるが、その酸化された状態のレドックス対成分の量は一般的に約５ｍＭ乃至１０００ｍＭ、通常的に約９０ｍＭ乃至９００ｍＭの範囲であり、還元された状態のレドックス対成分は一般的に約１ｍＭ乃至２０ｍＭ、通常的に約５ｍＭ乃至１５ｍＭの範囲であり、緩衝剤の量は一般的に約０乃至３００ｍＭ、通常的に約５０ｍＭ乃至１００ｍＭの範囲であり、凝固触媒性物質の成分の量は一般的に約０．００５ｍｇ／ｃｍ２ 乃至５０ｍｇ／ｃｍ２ 、通常的に約０．０５ｍｇ／ｃｍ２ 乃至５ｍｇ／ｃｍ２ である。さらに、上記各実施形態における反応領域または反応区域の中に存在している乾燥した試薬の全量は一般に約４ｎｇ／ｃｍ２ 乃至７００ｎｇ／ｃｍ２ 、通常的に約８ｎｇ／ｃｍ２ 乃至３５０ｎｇ／ｃｍ２ の範囲である。
【００２５】
本発明の代表的な試験片を図１における分解図において説明する。
【００２６】
上記電気化学的セルの中へのサンプル導入に続いて、一定の電位がこのセルの作用電極と基準電極との間に安定な状態の電流を生成するために十分な様式で当該セルに印加される。特に、上記作用電極と基準電極との間に安定な状態の電流を生成する様式でこれら２個の電極の間に一定の電位が印加される。この印加される電位の大きさは一般に約０乃至−０．６Ｖ、通常的に約−０．２Ｖ乃至約−０．４Ｖの範囲である。上記のように、電気化学的セルがレドックス対を含む多くの実施形態において、上記のような一定の電位の印加により以下の式により表される安定な状態の電流が生成される。
ｉｓｓ＝ｎ２ＦＡＤＣｏ／Ｌ
この式において、
ｎは移動する電子の数に等しく、
Ｆはファラデー定数、すなわち、９．６４８５×１０４ Ｃ／モルであり、
Ａは作用電極の面積であり、
Ｄはセルの拡散係数であり、この場合の係数は、フィックの第１法則、すなわち、Ｊ（ｘ，ｔ）＝−ＤｄＣｏ（ｘ，ｔ）／ｄｘにより決定され、この場合のｊはフラックスであり、ｘは上記電極の位置であり、ｔは時間であり、さらに、
Ｃｏはレドックス対濃度、例えば、フェロシアニド濃度であり、
Ｌは上記各電極の間の距離、例えば、上記スペーサーの厚さである。
【００２７】
上記のような所要の安定な状態の電流を得るために必要とされる全体の時間は特定の各実施形態において比較的に短い。このような実施形態において、上記安定な状態の電流を得るために必要とされる時間の全体の量、すなわち、上記セルに対するサンプルの供給から当該安定な状態の電流の設定までの時間は約１５秒よりも短く、通常的に約１０秒よりも短く、多くの場合において約４秒乃至１５秒の範囲である。
【００２８】
図２は血液を試験片内に導入して電流を経時的にモニターした場合の典型的なデータの組の時間−電流プロットを示している図である。
【００２９】
本発明の方法における次の工程は上記安定な状態の電流を検出してその変化をサンプルの粘度における変化に関連付けることである。多くの実施形態において、上記の検出される変化は上記安定な状態の電流における減少である。この工程において検出される上記安定な状態の電流における変化の大きさは少なくとも約２％、通常的に少なくとも約１０％であり、この場合に、多くの実施形態におけるこの減少の大きさは約２％乃至９０％の範囲である。また、別の実施形態においては、１個の電流が凝固発生の前で別の１個の電流が当該凝固発生の後に生じる、２種類の安定な状態の電流の間の変化率、および当該変化率の凝固発生の存在への関連付けが関係している。
【００３０】
その後、上記安定な状態の電流における減少の検出結果が上記電気化学的セル内の流体サンプルの粘度における増加に関連付けられる。比較的に小さい粘度増加により上記安定な状態の電流における検出可能な減少が生じるので、この減少が本発明の方法により検出することができ、この場合の粘度増加の大きさは特定の各実施形態において０．５ｃｐｓ程度またはそれ以下でもよい。
【００３１】
上記電気化学的セル内に存在しているサンプルが全血であり、上記試薬組成物が凝固触媒性物質を含有している多くの実施形態において、上記の粘度増加がさらに当該全血における凝固の開始、すなわち、凝固状態の発生または血液サンプル中の血液凝固の発生に関連付けられる。
【００３２】
特定の実施形態において、上記の粘度増加およびこれに付随するアッセイされている血液サンプルにおける凝固開始の検出がこの血液サンプルのＰＴの決定に用いられる。これらの実施形態において、上記反応領域または反応区域内への初期的なサンプル導入および／または上記安定な状態の電流の設定および上記粘度増加／凝固開始までの時間が決定され、この時間内に血液サンプルのＰＴが導き出される。この電気化学的セル内へのサンプルの導入時間は任意の好都合なプロトコルにより検出可能であり、この場合に用いられる特定の各プロトコルは、少なくとも部分的に、上記電気化学的セルと共に使用する計測装置（計器）の性質に依存する可能性がある。特定の実施形態において、上記反応セル内にサンプルを直接的に導入する時間は手動により記録できる。あるいは、上記計器が、例えば、上記セルの作用電極と基準電極との間において一定の電流を達成するために必要とされる電圧における初期的な減少を検出することにより、電気化学的セル内へのサンプル導入を自動的に検出できる（本明細書に参考文献として含まれる１９９９年６月１５日に出願されている米国特許出願第９／３３３７９３号を参照されたい）。さらに、上記セル内のサンプル検出のための別のプロトコルも採用可能である。
【００３３】
上記本発明の方法におけるコンピューターの使用による各工程、例えば、サンプル導入から凝固開始までの時間の血液サンプルのＰＴへの関連付けは手動により達成可能であり、あるいは、自動化した計算手段の使用により行なうこともでき、この場合の多くの実施形態において、その自動化した計算手段の使用が、以下に説明する本発明の装置との関連において説明されているように、重要である。
【００３４】
上記プロトコルは室温において、あるいは、昇温条件下において実行できる。一般的に、上記プロトコルは約２０℃乃至４０℃の範囲内の温度、例えば、約３７℃において行なわれる。
【００３５】
上記の方法は流体サンプルにおける粘度変化の決定が望ましい場合のあらゆる用途において有用であることが知られている。それゆえ、血液サンプルのＰＴの決定における使用に適している本発明の方法は当該ＰＴの決定が望まれる場合のあらゆる用途、例えば、上記発明の背景において記載されている各用途において有用であることが分かっている。
【００３６】
装置
本発明により、当該発明の実施において使用するための計器も提供される。この本発明の計器は一般的に流体サンプルの粘度における変化を測定するための計器であり、多くの実施形態において血液サンプルのＰＴを測定するための計器である。本発明の計器は一般的に（ａ）サンプルが導入されている電気化学的セルに一定の電位を印加するための手段、（ｂ）上記セル内の安定な状態の電流を含む当該セル内におけるセル電流を測定するための手段、（ｃ）上記セル内の安定な状態の電流における変化、例えば、当該セルの安定な状態の電流における減少を検出するための手段、および（ｄ）上記安定な状態の電流における変化を上記セルの粘度における変化に関連付けるための手段、例えば、当該セル内の安定な状態の電流における減少を当該セル内の流体の粘度における増加に関連付けるための手段を備えている。
【００３７】
上記電気化学的セルに一定の電位を印加するための手段、当該セル内の安定な状態の電流を測定するための手段、および当該セル内の安定な状態の電流における変化を検出するための手段は任意の従来的な手段とすることができ、代表的な各手段がＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９７／１８４６５号および米国特許第５，９４２，１０２号において記載されており、これらの各開示は本明細書に参考文献として含まれる。さらに、米国特許第６，０６６，５０４号、同第６，０６０，３２３号、同第６，０４６，０５１号も参照されたく、これらの各開示も本明細書に参考文献として含まれる。また、上記安定な状態の電流における変化を粘度における変化に関連付けるための手段は一般的に上記計器内に存在している計算手段であり、この手段は上記安定な状態の電流において測定された変化を流体サンプルの粘度における変化に関連付けることができる。多くの実施形態において、この手段はさらに上記電流／粘度における変化を凝固の開始に関連付けるための手段でもあり、多くの場合において血液サンプルのＰＴを決定するための手段である。例えば、米国特許第６，０６６，５０４号を参照されたく、この開示は本明細書に参考文献として含まれる。
【００３８】
キット
さらに、本発明の方法の実施において使用するためのキットも提供される。この本発明のキットは少なくとも、上記のような、電気化学的試薬試験片を備えている。さらに、本発明のキットは生理学的サンプルを入手するための手段を備えることもできる。例えば、この生理学的サンプルが血液である場合に、本発明のキットはさらに指を突き刺すためのランス、ランス作動手段等の血液サンプルを入手するための手段を備えることができる。加えて、本発明のキットは、例えば、対照溶液または基準の、例えば、既知のＰＴ時間を有している凝固対照溶液等のような器具を較正するための較正手段を備えることができる。特定の実施形態において、これらのキットはさらにサンプル供給および検出した生成物のサンプル中の分析物量への関連付けに続いて試験片において生成された生成物の量の検出を行なうための、上記のような、自動化した器具も備えている。さらに、これらのキットは生理学的サンプル中の分析物濃度の決定において本発明のキットの各構成部品を使用するための指示または説明を備えている。これらの指示または説明は１個以上の包装、ラベル・インサート、各キット内に存在している各容器等において存在させることができる。
【００３９】
以下の各実施例は例示を目的として記載されており、限定を目的としていない。
【００４０】
実験
Ｉ．電気化学的試験片の調製
サンドイッチ状の形態で配向されている２個の金属化した電極により構成されている電気化学的試験片を以下のように調製した。この試験片の上部層は金をスパッターリングしたマイラー（Ｍｙｌａｒ）片である。中間層は上記反応領域または反応区域を定めているパンチ孔あけ処理した穴を有する両面接着剤である。このパンチ孔あけ処理した穴は２個の並列に配置されている長方形の入口および出口の各チャンネルを有する一定の円である。さらに、上記試験片の下部層はマイラー上にスパッターリング処理したパラジウムである。シトラコン酸塩緩衝剤、フェリシアニド、フェロシアニドおよび再脂質化（ｒｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ）した組換え組織因子の試薬を上記パラジウム・スパッターリング処理した表面にインク・ジェット処理により供給した。このパラジウム・スパッターリング処理した表面上にインク・ジェット処理された試薬の量は５９７ｎｇ／ｃｍ２ であった。この結果、シトラコン酸塩緩衝剤の量は１２０ｇ／ｃｍ２ 、フェリシアニドは４６０ｎｇ／ｃｍ２ 、フェロシアニドの量は８ｎｇ／ｃｍ２ 、および組換え組織因子の量は９ｎｇ／ｃｍ２ であった。この試験片の分解図が図１において示されている。
【００４１】
ＩＩ．ＰＴの検出
上記試験片を用いて以下のように血液サンプルのＰＴを決定した。１．５μＬの血液サンプルを上記試験片の反応領域または反応区域の中に導入して、このサンプル導入時間を記録した。−０．３Ｖの一定電位を作用電極と基準電極との間に印加して、これら２個の間において結果として生じた電流をモニターした。安定な状態の電流の出現を先ず検出し、続いて、この安定な状態の電流における減少を検出した。上記の初期的なサンプル導入からこの安定な状態の電流における減少までの時間を決定した後に、この時間を上記血液サンプルのＰＴに関連付けた。図２は血液を試験片内に導入して電流を経時的にモニターした場合のデータの組の時間−電流プロットを示している図である。
【００４２】
上記の各結果および説明により、本発明が血液サンプルのＰＴを決定するために単純で有効な工具を提供していることが分かる。非電気化学的な手段に基づく凝固検出法に優る本発明の方法の各利点は低コストの各材料の使用および血漿に基づく各対照物質を含む広範な種々の対照物質を使用する機会を含む。本発明のさらに別の各利点は少ないサンプル量を使用する能力、本発明により成される上記電気化学的測定が一定の安定な状態の値に変換する解釈容易な信号を提供するという事実を含む。また、さらに別の利点は有意義なコスト削減を実現する低コストの電気化学に基づく各計器を使用する能力である。従って、本発明は当該技術分野に有意義な貢献を提供する。
【００４３】
本明細書において引用した各公告および特許は、それぞれの公告または特許が特別に且つ個別に本明細書に参考文献として含まれることが示されているように、本明細書に参考文献として含まれる。これらのあらゆる公告の引用はその出願日よりも前におけるそれぞれの開示について引用されているのみであり、（この引用を）本発明が先の発明の効力により当該公告よりも先行する権利がないという承認として解釈すべきでない。
【００４４】
以上において、本発明をその理解の明瞭化のために図示および実施例により幾分詳細に説明したが、当該技術分野における通常の熟練者においては、本発明のこれらの教示に鑑みて、特定の変形および変更が本明細書に記載されている特許請求の範囲から逸脱することなく行なえることが容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による試薬試験片の分解図を示している。
【図２】
血液を試験片内に導入して電流を経時的にモニターした場合の典型的なデータの組の時間−電流プロットを示している。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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