(57)【要約】本発明は複数の感染症の同時検出診断キットおよびその製造方法に関する。このキットは金標識免疫ろ過試験装置、緩衝液と金コロイド標識物の混合液を含み、上記金標識免疫ろ過試験装置は、膜上にＨＢｓＡｇモノクローナル抗体、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原、ＨＩＶ抗原およびヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体が添加されたニトロセルロース膜を含む。本発明はまた、上記診断キットの製造方法を開示する。本発明は金標識免疫ろ過試験に基づき、１つの担体上でＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒およびＡＩＤＳの同時検出を実現する。操作が簡単、迅速および正確であり、複数の疾患の検出、特に、大規模の血液予備検査に適している。これはまた、感染症の検査に新たな発想を提供するものである。
2004538489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金標識免疫ろ過試験装置、緩衝液、金コロイド標識物の混合液からなる、複数感染症の同時検出診断キットであって、
（１）上記金標識免疫ろ過試験装置が、一定の距離を置いて、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原、ＨＩＶ抗原および品質管理の対照としてのヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体が膜上に分離して点在するニトロセルロース膜を含み；
（２）金コロイド標識物の混合液が、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原およびＨＩＶ抗原の金コロイド標識物を含む４種の金コロイド標識物を含み；金コロイド標識物を形成するために用いられるとき、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原、およびＨＩＶ抗原の蛋白質濃度が、それぞれ、２０〜５０μｇ／ｍｌ、９０〜１２０μｇ／ｍｌ、９０〜１２０μｇ／ｍｌ、および８０〜１２０μｇ／ｍｌであり；また各金コロイド標識物の製造に用いる金コロイド粒子の直径が、２０〜３０ｎｍであり；これら４種の標識物が、１：１：１．２〜２．５：１．２〜２．５の容量比で混合されて、上記金コロイド標識物の混合液が形成されていることを特徴とするキット。
【請求項２】
上記梅毒抗原が、単一の梅毒抗原または複数の梅毒抗原の混合物であり；上記ＨＩＶ抗原が、ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原またはＨＩＶ−１抗原とＨＩＶ−２抗原の混合物である、請求項１記載の複数感染症の同時検出診断キット。
【請求項３】
上記緩衝液が、０．０３〜０．０５％ツイーン２０を含むｐＨ７．２〜８．８のＰＢＳ緩衝液である、請求項１記載の複数感染症の同時検出診断キット。
【請求項４】
請求項１に記載の複数感染症の同時検出診断キットの製造方法であって、上記方法が下記：
Ａ．金標識免疫ろ過試験の分析装置の製造であって、下記の工程を含む：
１）膜上に点在させる標本の調製
ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原およびＨＩＶ抗原をそれぞれＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解させ；４℃で一夜透析し；透析した各蛋白質をそれぞれ、ＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）で０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌに希釈し；
２）膜上に標本を塗布
上記ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原およびＨＩＶ抗原のそれぞれをピペットで採取し、注意深くそれらをニトロセルロース膜の特定の位置に、各蛋白質の点ごとに０．３〜３μｌの容量の点をつけ；同じニトロセルロース膜上の上記各点から離れた位置に、点、線または他の形態であってもよいが、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体をピペットで採取し目印の点をつけ；
３）膜の後処理
このニトロセルロース膜を３７℃のオーブンで３０分間乾燥させ；２０分間室温にて放置し；５〜１０分間室温にて洗浄液中で洗浄・振盪させ；上記洗浄工程を数回反復し；上記膜を空気乾燥させ；
４）装置の集成
上記ニトロセルロース膜の下に２層の吸水ろ紙を敷き；ろ紙と膜を一緒にプラスチック反応装置中に入れ固定する；
Ｂ．金コロイド標識物の混合液の調製
１）金コロイド粒子の製造
０．０１％クロロ金酸溶液を沸点まで加熱し；１％クエン酸ナトリウム溶液をすばやく添加し；煮沸を５分間続け、金コロイド粒子の大きさを２０〜３０ｎｍとし；
２）金コロイド標識物の製造
２．１）ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体の金コロイド標識物の製造
粒径が２０〜３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が２０〜５０μｇ／ｍｌになるように、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を磁気攪拌下ゆっくりと添加し；室温にて３０分間攪拌し；１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗体０．２〜１．０％とし；混合物を室温にて５分間攪拌し；１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗体０．１〜０．５％とし；混合物を室温にて５分間攪拌し、混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離し；上澄液を捨て；沈殿物を保存液に溶解させ；０．４５μｍのろ紙でろ過し；混合物を将来の使用のために４℃で保存し；
２．２）ＨＣＶ抗原の金コロイド標識物の製造
粒径が２０〜３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が抗原９０〜１２０μｇ／ｍｌになるように、ＨＣＶ抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加し；
室温にて３０分間攪拌し；１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗原０．２〜１．０％とし；混合物を室温にて５分間攪拌し；１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗原０．１〜０．５％とし；混合物を室温にて５分間攪拌し、混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離し；上澄液を捨て；沈殿物を保存液に溶解させ；溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し；混合物を将来の使用のために４℃で保存し；
２．３）梅毒抗原の金コロイド標識物の製造
粒径が２０〜３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が９０〜１２０μｇ／ｍｌになるように、梅毒抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加し；室温にて３０分間攪拌し；１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗原０．２〜１．０％とし；混合物を室温にて５分間攪拌し；１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗原０．１〜０．５％とし；混合物を室温にて５分間攪拌し、混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離し；上澄液を捨て；沈殿物を保存液に溶解させ；溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し；混合物を将来の使用のために４℃で保存し；
２．４）ＨＩＶ抗原の金コロイド標識物の製造
粒径が２０〜３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が８０〜１２０μｇ／ｍｌになるように、ＨＩＶ抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加し；室温にて３０分間攪拌し；１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗原０．２〜１．０％とし；混合物を室温にて５分間攪拌し；１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗原０．１〜０．５％とし；混合物を室温にて５分間攪拌し、混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離し；上澄液を捨て；沈殿物を保存液に溶解させ；溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し；混合物を将来の使用のために４℃で保存し；
３）金コロイド標識物の製造
上記で別々に製造した金コロイド標識物を、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体：ＨＣＶ抗原：梅毒抗原：ＨＩＶ抗原を、１：１：１．２〜２．５：１．２〜２．５の容量比で混合し；
Ｃ．緩衝液の調製
ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜８．８）中に、最終濃度が０．０３〜０．０５％になるようにツイーン２０を添加する
工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の複数感染症の同時検出診断キットの製造方法。
【請求項５】
Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒およびＡＩＤＳの同時検出のための請求項１に記載の複数感染症の同時検出診断キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はバイオテクノロジー分野に関する。より具体的には、複数感染症の同時検出診断キットおよびその製造方法に関する。
【０００２】
発明の背景
Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒およびＡＩＤＳは４つとも世界的な感染症である。中国衛生部の２０００年統計年報によると、これらの４つの感染症は、感染症の総罹病率の約２７．５７％であり、社会と人民の生活にきわめて大きい危害を与えている。
【０００３】
Ｂ型肝炎は薬物、毒物およびウイルスにより引き起こされる肝臓の炎症である。中国では人口総数の約１０〜１５％がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染者である。ＨＢＶは、輸血、血漿、血液製剤または注射針、注射筒および血液採取および血液透析用の器具に接触することによって感染する。中でも、輸血による感染経路は、高い罹病率、短い潜伏期間から特に重視されてきた。
【０００４】
Ｃ型肝炎の伝染源は主として急性臨床患者と症状のない無症候性患者、慢性患者およびウイルス保有者である。ウイルスは疾患発病１２日前に検出され、１２年以上保有される。Ｃ型肝炎の伝染源は主として輸血によって引き起こされる。大多数の先進国で、Ｃ型肝炎は輸血後に感染する肝炎中の最もよくある種類の１つである。輸血によって引き起こされる肝炎の３０〜９０％は外国ではＣ型肝炎であるが、中国では、輸血後に感染した肝炎中の３分の１はＣ型肝炎である。
【０００５】
梅毒患者は、梅毒トレポネーマの感染が唯一の感染源である。梅毒の伝染の約９５％は性的接触によるものである。輸血する場合、供血者が梅毒患者であると、受血者に梅毒が伝染する。献血者が梅毒にかかり、また梅毒トレポネーマ血症の段階にあると梅毒が伝播する。梅毒トレポネーマは体外での生存の能力は低く、４℃で４８〜７２時間生存し、４０℃で感染力はなく、１００℃ですぐ死滅する。近年中国で性病が増加しているために、輸血による梅毒の感染の予防に細心の注意を払うべきである。
【０００６】
ＨＩＶウイルスはＡＩＤＳの病原体であり、主として血液、精液、腟分泌液、母乳によって感染する。ＨＩＶを保有する血液が輸血されると、患者はＨＩＶに感染する可能性が９０％を超えるとみられている。これに対して、一度の性交によるリスクは１％以下である。さらに、輸血は大量のＨＩＶウイルスを送り込む。３〜５年（児童では約２年）の間に急速にＡＩＤＳが蔓延する。
【０００７】
従って、輸血によって感染し得るＨＩＶ、梅毒、ＨＢＶおよびＨＣＶを含む血液および血液製剤のウイルスを厳格に検査する必要がある。１９９８年に中国衛生部が発表した「献血者の健康検査の準則」に規定されている、検査されるべき９項目は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＨｇ）、Ｃ型肝炎抗体（ＨＣＶ抗体）、ＡＩＤＳ抗体（ＨＩＶ抗体）および梅毒抗体を含む。現在、梅毒の検出には、一般に迅速な血漿反応抗体試験（ＲＰＲ法）または梅毒血清学試験（ＴＲＵＳＴ法）が採用されている。ＨＩＶ、ＨＢＶとＨＣＶの検査には、酵素標識免疫吸着試験法（ＥＬＩＳＡ法）が採用されている。この方法は一度の検査に、血清４００μｌが必要であり、１〜２時間がかかる。現在、献血者の血液について迅速、完璧かつ同時に複数の疾患を検出する検査方法がないため、多くの人が輸血によって、肝炎、ＡＩＤＳおよび梅毒など感染症に感染している。これが受血者の身心の健康と社会の安定に大きな影響を及ぼしている。
【０００８】
金コロイド標識免疫ろ過試験法は酵素標識免疫吸着試験法（ＥＬＩＳＡ）に基づいている。まず、複合物は酵素によってラベルされ、この試験法は酵素免疫ろ過試験法と呼ばれている。９０年代の初め、金コロイドが標識として採用され、この方法は金標識免疫ろ過試験法（ｉｍｍｕｎｏ ｇｏｌｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ：ＩＧＦＡ）と称される。
【０００９】
金標識免疫ろ過試験法の原理は、ニトロセルロース膜を担体とし、微孔性濾膜の毛管現象と透過性を利用し、特殊なろ過装置の上で、抗原と抗体を反応させて洗浄する。反応は膜を通過するろ液と同様に急速に完結する。
【００１０】
この試験法は簡単で、迅速、試薬以外の器械設備も必要ではなく、結果が数分間で肉眼で観察し得るため、臨床的に広く用いられている。この方法は、免疫学の検査の殆どすべての方面に応用でき、特に、正常な体液中に存在しない抗原性物質、例えば感染症の抗原または抗体、および物質、例えば、その量が正常では低いが特定の症状では異常に増加するＨＣＧ、アルファ−フェトプロテインの検査に用いられる。近年来、試剤の原料の精選と調製技術の改良によって、この方法の適用範囲はさらに広がっている。しかし、複数の感染症の抗原または抗体の同時検出のための金コロイド標識免疫ろ過試験法は未だ報告されていない。
【００１１】
発明の要約
本発明の目的は、金コロイド標識免疫ろ過試験法技術を利用する複数の感染症の同時検出のための、感度が高く、正確で、迅速な、多目的診断キットの提供である。
【００１２】
本発明によれば、複数の感染症の同時検出のための診断キットは、金標識免疫ろ過試験装置、緩衝液および金コロイド標識物の混合液からなり、上記金標識免疫ろ過試験装置が、一定の距離を置いて、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（マウス抗−ヒト）、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原、ＨＩＶ抗原および品質管理の対照としてのヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体がその膜上に点在するニトロセルロース膜を含み；各標本点の容量は０．３−３μｌである。
【００１３】
上記金コロイド標識物の混合液は、金コロイド標識ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（マウス抗−ヒト）、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原およびＨＩＶ抗原を含む４種の金コロイド標識物を含み；金コロイド標識ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体の濃度は２０〜５０μｇ／ｍｌであり、金コロイド標識ＨＣＶ抗原の濃度は９０〜１２０μｇ／ｍｌであり、金コロイド標識梅毒抗原の濃度は９０〜１２０μｇ／ｍｌ、および金コロイド標識ＨＩＶ抗原の濃度は８０〜１２０μｇ／ｍｌである。上記金コロイド粒子の直径は、２０〜３０ｎｍであり；これら４種の標識物は、１：１：１．２〜２．５：１．２〜２．５の容量比で混合される。
【００１４】
この緩衝液は、０．０３〜０．０５％ツイーン２０およびのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２〜８．８、これは、燐酸二水素カリウム、または燐酸二水素ナトリウムおよび燐酸水素二ナトリウムから調製される）を含む。
【００１５】
本発明によれば、上記梅毒抗原は、単一の梅毒抗原または複数の梅毒抗原の混合物である。上記ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ−１（Ｉ型ＨＩＶ）抗原、ＨＩＶ−２（ＩＩ型ＨＩＶ）抗原、またはＨＩＶ−１抗原とＨＩＶ−２抗原の混合物である。
【００１６】
本発明の他の目的は、上記診断キットの製造方法の提供である。
【００１７】
本発明によれば、複数の感染症を同時検出する診断キットは下記の工程を含む：
【００１８】
工程Ａ）金標識免疫ろ過試験装置の製造であって、下記の工程を含む：
１）膜上に添加する標本の調製
ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（マウス抗−ヒト）をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解させ、４℃で一夜透析する。ついで、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）で０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、将来の使用のために保存する。
【００１９】
ＨＣＶ抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解させ；４℃で一夜透析する。ついで、ＨＣＶ抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）で０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、将来の使用のために保存する。
【００２０】
梅毒抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解させ、４℃で一夜透析する。ついで、梅毒抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）で０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、将来の使用のために保存する。
【００２１】
ＨＩＶ抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解させ、４℃で一夜透析する。ついで、ＨＩＶ抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）で０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、将来の使用のために保存する。
【００２２】
ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体をＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解させ、４℃で一夜透析する。ついで、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体を、ＰＢＳ（０．０２Ｍ，ｐＨ８．０）で０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、将来の使用のために保存する。
【００２３】
２）膜上に標本の点をつける
上記ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体、ＨＣＶ抗原、梅毒抗原およびＨＩＶ抗原のそれぞれをピペットで採取し、注意深くそれらをニトロセルロース膜の特定の位置に、各蛋白質の点ごとに０．３〜３μｌの容量の点をつける。
【００２４】
さらに、ニトロセルロース膜上の上記各点から離れた位置に、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体をピペットで採取し、目印の点をつける。上記目印は点、線またはなんらかの他の形式であってもよい。
【００２５】
３）膜の後処理
上記ニトロセルロース（ＮＣ）膜を３７℃のオーブンで３０分間乾燥させ、２０分間室温にて放置する。３７℃にて２０分間遮断液中に浸漬し、洗浄液中で５−１０分間室温にて洗浄・振盪させる。洗浄液を換えた後、上記洗浄工程を数回反復する。ついで、膜を取り出し、室温にて空気乾燥させ、将来の使用のために、乾燥状態で４℃にて保存する。
【００２６】
上記遮断液は０．０１〜０．０３％ツイーン２０および０．０５ＭＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２〜８．０）を含む。上記洗浄液は０．０３〜０．０５％ツイーン２０および０．０１ＭＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２〜８．０）を含む。
【００２７】
４）装置の集成
上記ニトロセルロース膜の下に２層の吸水ろ紙を敷く。ろ紙と膜を一緒にプラスチック反応装置中に入れ固定する。
【００２８】
工程Ｂ）金コロイド標識物の混合液の調製
１）金コロイド粒子の製造
０．０１％クロロ金酸溶液を沸点まで加熱し、１％クエン酸ナトリウム溶液をすばやく添加する。溶液の煮沸を５分間続け、金コロイド粒子の大きさを２０〜３０ｎｍにする。
【００２９】
２）金コロイド標識物の製造
２．１）金コロイド標識ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（マウス抗−ヒト）の製造
粒径が２０〜３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が２０〜５０μｇ／ｍｌになるように、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体を磁気攪拌下ゆっくりと添加する。室温にて３０分間攪拌後、１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗体０．２〜１．０％とし、混合物を室温にて５分間攪拌する。１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗体０．１〜０．５％とし、混合物を室温にて５分間攪拌する。混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離する。上澄液を捨て、沈澱物を保存液に溶解させる。溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し、将来の使用のために４℃で保存する。
【００３０】
２．２）金コロイド標識ＨＣＶ抗原の製造
粒径が２０〜３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が９０〜１２０μｇ／ｍｌになるように、ＨＣＶ抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加する。室温にて３０分間攪拌後、１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗原０．２〜１．０％とし、混合物を室温にて５分間攪拌する。ついで、１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗原０．１〜０．５％とし、混合物を室温にて５分間攪拌する。混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離する。上澄液を捨て、沈澱物を保存液に溶解させる。溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し、将来の使用のために４℃で保存する。
【００３１】
２．３）金コロイド標識梅毒抗原の製造
粒径が２０〜３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が９０〜１２０μｇ／ｍｌになるように、梅毒抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加する。室温にて３０分間攪拌後、１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗原０．２〜１．０％とし、混合物を室温にて５分間攪拌する。ついで、１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗原０．１〜０．５％とし、混合物を室温にて５分間攪拌する。混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離する。ついで、上澄液を捨て、沈澱物を保存液に溶解させる。溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し、将来の使用のために４℃で保存する。
【００３２】
金コロイド標識液中の梅毒抗原が複数の梅毒抗原の混合物であるとき、各金コロイド標識梅毒抗原は別々に製造しなければならない。ついで将来の使用のためにそれらを混合し保存する。
【００３３】
２．４） 金コロイド標識ＨＩＶ抗原の製造
粒径が２０〜３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が８０〜１２０μｇ／ｍｌになるように、ＨＩＶ抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加する。室温にて３０分間攪拌後、１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗原０．２〜１．０％とし、混合物を室温にて５分間攪拌する。ついで、１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗原０．１〜０．５％とし、混合物を室温にて５分間攪拌する。混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離する。上澄液を捨て、沈澱物を保存液に溶解させる。溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し、将来の使用のために４℃で保存する。
【００３４】
３）金コロイド標識物の製造
別々に製造した各金コロイド標識物を、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体：ＨＣＶ抗原：梅毒抗原：ＨＩＶ抗原を１：１：１．２〜２．５：１．２〜２．５の容量比で充分に混合する。
【００３５】
工程Ｃ）緩衝液の調製
ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜８．８）中に、最終濃度が０．０３〜０．０５％になるようにツイーン２０を添加する。
【００３６】
本発明のもう１つの目的は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒およびＡＩＤＳの同時検出のために上記診断キットの使用である。
【００３７】
本発明に述べたキットの検査方法は次のとおりである：
１．金標識免疫ろ過試験装置をテーブル上に水平に置く；
２．装置のサンプルウェルに緩衝液を２滴添加し、膜の表面をぬらす；
３．サンプルウェルに血清試料を５０μｌ添加し、それが完全に膜内に浸透するまで待つ；
４．緩衝液を３滴添加し、それが完全に浸透するまで待ち、ついで金コロイド標識液を２滴添加する；
５．緩衝液を３滴添加する；
６．１分間後、サンプルウェル内に赤い班点が現れるかどうかを観察する。赤い班点が現れると、対応するウイルスが陽性であるという結果を示し、赤い班点がないと、対応するウイルスが陰性であることを示す。
【００３８】
ＨＢｓＡｇ、ＨＣＶ抗体、梅毒抗体、ＨＩＶ抗体からの１種または数種が含まれている血清試料が、ニトロセルロース膜と接触するとき、膜上の抗原（または抗体）は血清中の対応する抗体（または抗原）と反応する。ついで複合体が対応する金コロイド標識物と反応し、呈色する。したがって、呈色によって、患者がどんなウイルスに感染しているか判断することができる。ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体は、ヒト血清の抗体と反応しないが、金コロイド標識液中のＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（マウス抗−ヒト）はヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体と反応することができ、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体の対応する位置が発色して肉眼で識別できる。したがってある種の構成要素の質的問題でキットを用いることができないとき、膜上にヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体に対応する位置が発色しない。従って、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体はキットについての品質管理の対照として役立つ。
【００３９】
本発明の検査キットは、金コロイド標識免疫ろ過試験法の原理を利用し、複数の感染症に対応する抗原または抗体を同じろ過装置（ニトロセルロース膜）の上で反応させ、洗浄後肉眼で各点の発色を観察して検出する。
【００４０】
従来の金標識キット、ＰＲＰ診断キット、ＴＲＵＳＴ診断キットと比較して、本発明のキットには下記の優れた利点がある。
（１）複数の疾患を同時に検査する。
１つの装置で、同時に４種の感染症を検査できる。
（２）複数の抗原および抗体を同時に検出する。
１つの装置で、複数の抗原または抗体を検出でき、異なる蛋白質の検出条件の統一を実現した。
【００４１】
ＥＬＩＳＡキットと比べたら、本発明のキットには下記の優れた利点がある。
（１） 複数の疾患を同時に検査する。
１つの装置で、同時に４種の感染症を検査する。
（２）複数の抗原または抗体を同時に検出できる。
１つの装置で、複数の抗原および抗体を検出でき、異なる蛋白質の検出条件の統一を実現した。
（３）反応時間が短い。
試験全体が２工程：試料の添加および反応からなり、全試験はろ過によって行われ、３〜５分間しかかからない。大規模に迅速に血液検体を検出するのにふさわしい。検査のすべての工程は数分間しかかからない。しかし、感度は、反応に１〜２時間かかるＥＬＩＳＡ試験と同じである。
（４）採血量が少ない。
本発明のキットは５０μｌの血清しか必要でなく、指先または耳たぶから得られる。しかし、ＥＬＩＳＡは１回の試験に１００μｌ、４種類の試験には４００μｌの血清が必要である。従って、本発明のキットは子供または幼児に都合が良い。さらに、ＥＬＩＳＡ法は、静脈から採血しなければならないので、乳児には困難である。
（５）検査結果は器械または反応環境の影響を受けない。
（６）金コロイド標識物を添加すると、すぐ発色し得る。操作は簡単であり、またキットは室温にて長期に保存できる。
【００４２】
本発明のキットは金コロイド免疫ろ過試験法の原理を利用し、１つの担体上で複数の抗原および抗体の同時検査を実現する。それは操作が簡単、迅速、正確かつ、種々の血液検体の複数の感染症の検査、特に大規模な血液検査に適している。それは感染症の検査に新しい構想を提供するものである。
【００４３】
実施例
Ａ．材料
本発明を実施するための好ましい方法では、マウス抗−ヒトＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｓ１およびＳ２は、Ｂｅｉｅｅｒｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ．により提供された。ＨＣＶ抗原、ＴＰ４７梅毒抗原、ＴＰ１５梅毒抗原、ＴＰ４７／ＴＰ１５梅毒混合抗原、ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、ＨＩＶ−１／２混合抗原は、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｓａｃｏ， Ｍａｉｎｅ ＵＳＡ）により提供された。ニトロセルロース膜がＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｇｅｒｍａｎｙ）により提供された。血清検体が上海市疾病控制中心により提供された。
【００４４】
Ｂ．金標識免疫ろ過試験装置の製造方法は次の通りである：
（１）マウス抗−ヒトＨＢｓＡｇモノクローナル抗体Ｓ２（マウス抗−ヒト）をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）に溶解し、４℃で一夜透析した。透析したＨＢｓＡｇモノクローナル抗体Ｓ２（マウス抗−ヒト）をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、４℃で保存した。
（２）ＨＣＶ抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）に添加し、４℃で一夜透析した。透析したＨＣＶ抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）で０．４ｍｇ／ｍｌに希釈し、４℃で保存した。
（３）ＴＰ４７／ＴＰ１５梅毒混合抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）に添加し、４℃で一夜透析した。透析したＴＰ４７／ＴＰ１５混合抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、将来の使用のために４℃で保存した。
（４）ＨＩＶ−１／２混合抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）に溶解し、４℃で一夜透析した。透析したＨＩＶ−１／２混合抗原をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）によって０．６ｍｇ／ｍｌに希釈し、将来の使用のために４℃で保存した。
（５）ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）に溶解し、４℃で一夜透析した。透析したヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体をＰＢＳ（０．０２Ｍ、ｐＨ８．０）で０．６ｍｇ／ｍｌに希釈し、将来の使用のために４℃で保存した。
（６）図１に示すように、ニトロセルロース膜の上に、１、２、３および４の位置にそれぞれＴＰ４７／ＴＰ１５梅毒混合抗原、ＨＩＶ−１／２混合抗原、ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（マウス抗−ヒト）Ｓ２、ＨＣＶ抗原の４種の蛋白質をマイクロピペットを用いて塗布した。点ごとの容量は１．０μｌであった。ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体を０．２ｍｍ絵筆で吸い取り、ニトロセルロース膜の上のＣで示される２点の間に横線を描いた。
（７）このニトロセルロース膜を３７℃のオーブに３０分間におき、取り出した後それを室温にて２５分間放置した。ついで、それを３７℃の遮断液に２０分間浸漬し、ついで、それを洗浄液中で室温にて５分間、洗浄・振動させた。洗浄工程を数回繰り返した後、室温にて空気乾燥した。
（８）上述ニトロセルロース膜の下に２層の吸水ろ紙を敷き、ろ紙と膜を一緒にプラスッチク反応装置内に入れて固定した。
【００４５】
Ｃ．緩衝液は等容量の０．１０Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．８）および０．３０％ツイーン２０を混合して得られた溶液であった。
【００４６】
Ｄ．金コロイド標識液は、金コロイド標識ＨＢｓＡｇ Ｍａｂ Ｓ１（マウス抗−ヒト）、金コロイド標識ＨＣＶ抗原、金コロイド標識ＴＰ４７／ＴＰ１５梅毒混合抗原、および金コロイド標識ＨＩＶ−１／２混合抗原を容量比１：１：１．２〜２．５：１．２〜２．５で混合して調製した。各金コロイド標識物の製造に用いる金コロイドの平均粒径はおよそ３０ｎｍであった。金コロイド標識物の製造方法は次の通りであった。
【００４７】
（１）金コロイド標識ＨＢｓＡｇＭａｂ Ｓ１（マウス抗−ヒト）の製造
粒径が３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が２０μｇ／ｍｌになるように、ＨＢｓＡｇＭａｂ Ｓ１（マウス抗−ヒト）を磁気攪拌下ゆっくりと添加した。室温にて３０分間攪拌後、１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗体０．６％とし、混合物を室温にて５分間攪拌した。１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗体０．２％とし、混合物を室温にて５分間攪拌した。混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離した。上澄液を捨て、沈澱物を保存液に溶解させた。溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し、将来の使用のために４℃で保存した。
【００４８】
（２）金コロイド標識ＨＣＶ抗原の製造
粒径が３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が９０μｇ／ｍｌになるように、ＨＣＶ抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加した。室温にて３０分間攪拌後、１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗体０．６％とし、混合物を室温にて５分間攪拌した。ついで、１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗体０．２％とし、混合物を室温にて５分間攪拌した。混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離した。上澄液を捨て、沈澱物を保存液に溶解させた。溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し、将来の使用のために４℃で保存した。
【００４９】
（３）金コロイド標識ＴＰ４７／ＴＰ１５梅毒抗原の混合物の製造
粒径が３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が９０μｇ／ｍｌになるように、ＴＰ４７梅毒抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加した。室温にて３０分間攪拌後、１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗体０．６％とし、混合物を室温にて５分間攪拌した。ついで、１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗体０．２％とし、混合物を室温にて５分間攪拌した。混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離した。上澄液を捨て、沈澱物を保存液に溶解させた。溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し、将来の使用のために４℃で保存した。
【００５０】
金コロイド標識ＴＰ１５抗原の製造は、ＴＰ４７標識物の製造と同じである。
【００５１】
金コロイド標識ＴＰ４７抗原を、同容量の金コロイド標識ＴＰ１５抗原と混合し、将来の使用のために保存した。
【００５２】
（４）金コロイド標識ＨＩＶ−１／２抗原の製造
粒径が３０ｎｍである金コロイドの溶液に、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように、ＨＩＶ−１抗原を磁気攪拌下ゆっくりと添加する。室温にて３０分間攪拌後、１０％ＢＳＡ溶液を添加し、最終濃度を抗体０．６％とし、混合物を室温にて５分間攪拌した。ついで、１０％ＰＥＧ２００００溶液を添加し、最終濃度を抗体０．２％とし、混合物を室温にて５分間攪拌した。混合物を１２０００〜１５０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離した。上澄液を捨て、沈澱物を保存液に溶解させた。溶液を０．４５μｍのろ紙でろ過し、将来の使用のために４℃で保存した。
【００５３】
金コロイド標識ＨＩＶ−２抗原の製造は、ＨＩＶ−１標識物の製造と同じである。
【００５４】
金コロイド標識ＨＩＶ−１抗原を、同容量の金コロイド標識ＨＩＶ−２抗原と混合し、将来の使用のために保存した。
【００５５】
金コロイド標識液中のＨＩＶ抗原が、数種のＨＩＶ抗原の混合物であるとき、各金コロイド標識ＨＩＶ抗原は別々に製造しなければならず、その後、ある一定の比率で希釈し、混合し、将来の使用のために保存する。
【００５６】
上記の分析キットは種々の血清検査に用いられた。病院からの結果は下記のようなものであった。血清検体Ｎｏ．１の提供者は上記４種類の感染症のいずれの感染症にもかかっていなかった。血清検体Ｎｏ．２の提供者はＣ型肝炎のみにかかっていた。血清検体Ｎｏ．３の提供者はＡＩＤＳおよび梅毒にかかっていた。血清検体Ｎｏ．４の提供者はＢ型肝炎および梅毒にかかっていた。図２、図３、図４および図５にそれぞれ上記の検査結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ニトロセルロース膜上にスポットされた標本の概略図であり、１、２、３、４の符号は標本のそれぞれの位置を示す。２つのスポット（点）の間の”Ｃ”は、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体のための位置を示す。
【図２】血清検体Ｎｏ．１の検査結果を示す概略図であり、検査結果は全て陰性である。
【図３】血清検体Ｎｏ．２の検査結果を示す概略図であり、検査結果はＣ型肝炎抗体が陽性である。
【図４】血清検体Ｎｏ．３をの検査結果を示す概略図であり、検査結果は梅毒抗体、ＡＩＤＳＨＩＶ−１および２抗体が陽性である。
【図５】血清検体Ｎｏ．４の検査結果を示す概略図であり、検査結果は梅毒抗体、ＡＩＤＳＨＩＶ−１および２抗体、Ｂ型肝炎表面抗原が陽性である。
図２〜５における、横線”Ｃ−Ｃ”は、ヒツジ抗−マウスＩｇＧ抗体が陽性である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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