(57)【要約】本発明は、（エイズの発症に対する感受性（ヒト）または抵抗性（チンパンジー）を含む）疾患または増強された胸部発達のような、生理的状態と関連することがあり得る、ヒトおよび／または非ヒト霊長類におけるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。当該方法は、統計的方法を用い、ヒトおよび非ヒト霊長類配列の比較を採用する。このように同定された配列は、宿主治療標的としておよび／またはスクリーニング検定において、有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける生理的形質と関連づけられてきたヒトポリヌクレオチド配列が、当該生理的形質をもっと少ない程度に示す非ヒト霊長類に比べて、進化的に有意な変化を受けたかどうかを決定する方法であって、
ａ．　何らかのヌクレオチド変化を同定するために、ヒトポリヌクレオチド配列を対応する非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較すること；および
ｂ．　前記ヒトヌクレオチド変化が進化的に有意かどうかを決定すること：を含む、前記方法。
【請求項２】
当該生理的形質が増強された胸部発達である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ヒトポリヌクレオチド配列がＢＲＣＡ１をコードする、請求項２の方法。
【請求項４】
前記進化的に有意なヌクレオチド変化がエキソン１１に起きる、請求項３の方法。
【請求項５】
当該非ヒト霊長類がヒト科群のメンバーである、請求項１の方法。
【請求項６】
当該非ヒト霊長類がチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびオランウータンより成る群から選ばれる、請求項５の方法。
【請求項７】
当該非ヒト霊長類がチンパンジーである、請求項６の方法。
【請求項８】
当該ヌクレオチド変化の進化的有意性が当該ヌクレオチド配列の非同義置換速度（ＫＡ）に従って決定される、請求項１の方法。
【請求項９】
当該ヌクレオチド変化の進化的有意性が当該ヌクレオチド配列の同義置換速度（ＫＳ）に対する非同義置換速度（ＫＡ）の比により決定される、請求項１の方法。
【請求項１０】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約０．７５である、請求項９の方法。
【請求項１１】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．００である、請求項９の方法。
【請求項１２】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．２５である、請求項９の方法。
【請求項１３】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．５０である、請求項９の方法。
【請求項１４】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約２．００である、請求項９の方法。
【請求項１５】
請求項１の方法に従って同定された進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヒトＢＲＣＡ１タンパク質中のアミノ酸変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＢＲＣＡ１タンパク質上の標的部位を同定するための方法。
【請求項１６】
請求項１の方法に従い進化的に有意であるヌクレオチド変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＢＲＣＡ１ポリヌクレオチド上の標的部位を同定するための方法。
【請求項１７】
生理的形質を変調することがあり得る作用物質を同定する方法であって、前記方法が、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、請求項１のヒトポリヌクレオチド配列で形質移入されている細胞に接触させることを含み、作用物質が当該ポリヌクレオチド配列の機能を変調するその能力により同定される、前記方法。
【請求項１８】
当該生理的形質が肥大した胸部であり、当該ポリヌクレオチドがＢＲＣＡ１遺伝子であり、そして当該変調機能がＢＲＣＡ１遺伝子によりコードされるポリヌクレオチドの有効性の増加である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
請求項１７の方法により同定された作用物質。
【請求項２０】
生理的形質を変調することがあり得る作用物質を同定する方法であって、前記方法が、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、請求項１のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む組成物に接触させることを含み、作用物質が当該ポリヌクレオチド配列の機能を変調するその能力により同定される、前記方法。
【請求項２１】
当該生理的形質が肥大した胸部であり、当該ポリヌクレオチドがＢＲＣＡ１遺伝子であり、そして当該変調機能がＢＲＣＡ１ポリペプチドの有効性の増加である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項２０の方法で同定された作用物質。
【請求項２３】
ＢＲＣＡ１ポリヌクレオチドの機能を変調する作用物質。
【請求項２４】
ＢＲＣＡ１ポリペプチドの機能を変調する作用物質。
【請求項２５】
進化的に有意なヒトヌクレオチド変化をヒトにおける生理的状態へ相関させるための方法であって、
機能性作用の存在が当該進化的に有意なヌクレオチド変化と当該生理的状態との間の相関関係を示す、適当なモデル系で請求項１で同定された進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該ポリヌクレオチド配列の、もしあれば、機能性作用を分析すること：を含む前記方法。
【請求項２６】
進化的に有意なヒトヌクレオチド変化をヒトにおける生理的状態へ相関させるための方法であって、
機能性作用の存在が当該進化的に有意なヌクレオチド変化と当該生理的状態との間の相関関係を示す、適当なモデル系で請求項１で同定された進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの、もしあれば、機能性作用を分析すること：を含む前記方法。
【請求項２７】
請求項１９、２２、２３または２４の作用物質を含む医薬組成物。
【請求項２８】
非ヒト霊長類における生理的形質と関連づけられてきた、または関連することがあり得る非ヒト霊長類のポリヌクレオチド配列が、当該生理的形質をもっと少ない程度に示すヒトに比べて、進化的に有意の変化を受けたかどうかを決定する方法であって、
ａ．　何らかのヌクレオチド変化を同定するために、当該非ヒトポリヌクレオチド配列を対応するヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較すること；および
ｂ．　前記非ヒトヌクレオチド変化が進化的に有意かどうかを決定すること：を含む、前記方法。
【請求項２９】
当該生理的形質が完全発症エイズへの進行に対する増強した抵抗性である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記非ヒトポリヌクレオチド配列がＣＤ５９をコードする、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記進化的に有意なヌクレオチド変化がＧＰＩリンクの重複を含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記非ヒトポリヌクレオチド配列がＤＣ−ＳＩＧＮをコードする、請求項２９の方法。
【請求項３３】
当該非ヒト霊長類がヒト科群のメンバーである、請求項２８の方法。
【請求項３４】
当該非ヒト霊長類がチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびオランウータンより成る群から選ばれる、請求項３２の方法。
【請求項３５】
当該非ヒト霊長類がチンパンジーである、請求項３３の方法。
【請求項３６】
当該ヌクレオチド変化の進化的有意性が当該ヌクレオチド配列の非同義置換速度（ＫＡ）に従って決定される、請求項２８の方法。
【請求項３７】
当該ヌクレオチド変化の進化的有意性が当該ヌクレオチド配列の同義速度（ＫＳ）に対する非同義置換速度（ＫＡ）の比により決定される、請求項２８の方法。
【請求項３８】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約０．７５である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．００である、請求項３６の方法。
【請求項４０】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．２５である、請求項３６の方法。
【請求項４１】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．５０である、請求項３４の方法。
【請求項４２】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約２．００である、請求項３４の方法。
【請求項４３】
請求項２８の方法に従って同定されたチンパンジーＣＤ５９の進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヒトＣＤ５９タンパク質中のアミノ酸変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＣＤ５９タンパク質上の標的部位を同定するための方法。
【請求項４４】
請求項２８の方法に従いチンパンジーＣＤ５９の進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヌクレオチド変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＣＤ５９ポリヌクレオチド上の標的部位を同定するための方法。
【請求項４５】
請求項２８の方法に従って同定されたチンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮにおけるアミノ酸変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチド上の標的部位を同定するための方法。
【請求項４６】
請求項２８の方法に従いチンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヌクレオチド変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＤＣ−ＳＩＧＮポリヌクレオチド上の標的部位を同定するための方法。
【請求項４７】
生理的形質を変調することがあり得る作用物質を同定する方法であって、前記方法が、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、請求項２８のヒトポリヌクレオチド配列で形質移入されている細胞に接触させることを含み、作用物質が当該ポリヌクレオチド配列の機能を変調するその能力により同定される、前記方法。
【請求項４８】
当該生理的形質がエイズの進行に対する抵抗性であり、当該ポリヌクレオチドがヒトＣＤ５９遺伝子であり、そして当該変調機能がエイズの進行に対する抵抗性の増加である、請求項４７の方法。
【請求項４９】
請求項４８の方法により同定された作用物質。
【請求項５０】
当該生理的形質がエイズの進行に対する抵抗性であり、当該ポリヌクレオチドがＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子であり、そして当該変調機能がエイズの進行に対する抵抗性の増加である、請求項４７の方法。
【請求項５１】
請求項５０の方法により同定された作用物質。
【請求項５２】
生理的形質を変調することがあり得る作用物質を同定する方法であって、前記方法が、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、請求項２８のヒトポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む組成物に接触させることを含み、作用物質が当該ヒトポリペプチド配列の機能を変調するその能力により同定される、前記方法。
【請求項５３】
当該生理的形質がエイズの進行に対する抵抗性であり、当該ポリヌクレオチドがヒトＣＤ５９遺伝子であり、そして当該変調機能がエイズの進行に対する抵抗性の増加である、請求項５２の方法。
【請求項５４】
請求項５３の方法で同定された作用物質。
【請求項５５】
当該生理的形質がエイズの進行に対する抵抗性であり、当該ポリヌクレオチドがヒトＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子であり、そして当該変調機能がエイズの進行に対する抵抗性の増加である、請求項５２の方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法で同定された作用物質。
【請求項５７】
ヒトＣＤ５９ポリヌクレオチドの機能を変調する作用物質。
【請求項５８】
ヒトＣＤ５９ポリペプチドの機能を変調する作用物質。
【請求項５９】
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮポリヌクレオチドの機能を変調する作用物質。
【請求項６０】
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチドの機能を変調する作用物質。
【請求項６１】
非ヒト霊長類における進化的に有意なヌクレオチド変化を非ヒトにおける生理的状態へ相関させるための方法であって、
機能性作用の存在が当該進化的に有意なヌクレオチド変化と当該生理的状態との間の相関関係を示す、適当なモデル系で請求項２８で同定された進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該ポリヌクレオチド配列の、もしあれば、機能性作用を分析すること：を含む前記方法。
【請求項６２】
非ヒト霊長類における進化的に有意なヌクレオチド変化を非ヒト霊長類における生理的状態へ相関させるための方法であって、
機能性作用の存在が当該進化的に有意なヌクレオチド変化と当該生理的状態との間の相関関係を示す、適当なモデル系で請求項２８で同定された進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの、もしあれば、機能性作用を分析すること：を含む前記方法。
【請求項６３】
複数のＧＰＩリンクを含むように修飾されたヒトＣＤ５９タンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項４９、５１、５４、５６、５７、５８、５９または６０の作用物質を含む、医薬組成物。
【請求項６５】
請求項６３のヒトＣＤ５９を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、独特のまたは増強したヒト脳機能、より長いヒト寿命、（エイズ（ＡＩＤＳ）およびＣ型肝炎のような）感染症の発生に対する感受性または抵抗性、癌の発生に対する感受性または抵抗性のようなヒトの疾患または状態に関係することがあり得る進化した形質、および毛髪生長、ざ瘡（にきび）に対する感受性または抵抗性、または増強した筋肉量のような審美的形質、に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための分子技術および進化技術の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトは、ヒトの健康および安寧に重要な分野に関係するいくつかの生理的および機能的形質において、チンパンジーのような、ヒトの最も近縁な進化的親類である非ヒト霊長類とも異なる。例えば、（１）ヒトは、チンパンジーに比べて、独特のまたは増強した脳機能（例えば、認知技能など）をもつ；（２）ヒトは、非ヒト霊長類よりも長い寿命をもつ；（３）チンパンジーは、エイズおよびＣ型肝炎のようなヒトを苦しめるいくつかの感染症に対して抵抗性がある；（４）チンパンジーは、ヒトよりも、ある種の癌の発生率が低いようである；（５）チンパンジーはざ瘡（にきび）または脱毛症（はげ）に罹らない；（６）チンパンジーは脂肪に対する筋肉の比率が高い；（７）チンパンジーはマラリアに対する抵抗性が高い；（８）チンパンジーはアルツハイマー病に罹りにくい；そして（９）チンパンジーはアテローム硬化症の発生率が低い。今のところ、上記のヒト／チンパンジーの相違の基になる遺伝子はわかっておらず、さらに大切なことだが、これらの能力を提供するように、これらの遺伝子で進化した特定の変化も、わかっていない。ヒトとヒトに近縁な進化上の親類との間のこれらの相違の基盤を理解することは、関連のヒト容態および疾患のための有効な治療法の開発に有用な情報を提供するであろう。
【０００３】
動物の解剖学的特徴を主に比較する古典的進化分析は、ヒトと非ヒト霊長類との間に劇的な形態的および機能的な相違を明らかにしてきた；にもかかわらず、ヒトゲノムは、他の霊長類のものと著しい配列類似性を共有することが知られている。例えば、ヒトＤＮＡ配列は、チンパンジーＤＮＡにほぼ９８．５％同一であり、そしてゴリラＤＮＡに対しても僅かに低いだけであると、一般に結論されている。ＭｃＣｏｎｋｅｙおよびＧｏｏｄｍａｎ（１９９７）ＴＩＧ　１３：３５０−３５１。ヒトと近縁霊長類との間のゲノム差が比較的低い比率であるとすると、ゲノム配列中のの比較的少数の変化が、上に記載されたもののような、ヒトの健康および安寧について関心のある形質の原因である可能性が、たとえ高くはなくても、あり得ることである。したがって、ヒトの健康および安寧に利する可能性のある治療法を開発するために、これらの形質の基になる遺伝子を同定し、そしてそれらがコードするタンパク質中の進化した変化からの情報を収集することが、望ましく、かつ実行可能である。これらの配列変化を同定し、特徴解明することは、疾患を排除するかあるいは最小限度にしてきた、または独特のあるいは増強した機能を提供する、進化的解答から利益を得るために、非常に大切である。
【０００４】
ヒトゲノムプロジェクトにおける最近の発展は、ヒト遺伝子配列に関するすさまじい量の情報を提供してきた。さらに、多くのヒト遺伝子およびそれらのタンパク質産物の構造および活性は、培養ヒト細胞で直接、または線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、およびマウスのようないくつかの動物モデル系で、調べられてきた。これらのモデル系は、比較的単純であること、操作が容易であること、および短い世代時間をもつことなど、大きな長所がある。多くの重要な遺伝子の基本的構造および生物活性は、進化を通じて保存されてきたので、高分子配列を比較することにより、多くの種で相同遺伝子を同定できる。重要な遺伝子産物および機能性ドメインについて下等生物種から得られた情報は、ヒトにおける相同遺伝子や機能性ドメインを同定する助けに用いることが可能である。例えば、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで最初に発見されたＤＮＡ結合活性をもつホメオドメインは、同様な活性をもつヒト相同体の同定に利用された。
【０００５】
ヒトと下等モデル生物との間の相同遺伝子またはタンパク質の比較は、進化的に保存された分子配列および機能特徴に関して有用な情報を提供する可能性があるが、このアプローチは、自然淘汰のために配列が変化した遺伝子を同定するために使うには、限界がある。洗練されたアルゴリズムと分析方法の開発の進歩に伴って、もっと多くの情報を、ＤＮＡ配列変化から、ひねり出せるようになっている。これらの方法のうち最も強力な“ＫＡ／ＫＳ”は、
2004503251.tif 000002
の比のアラインされたタンパク質コードヌクレオチド配列間のペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）比較を含む（ここで、非同義はコードされるアミノ酸を変える置換を意味し、同義はコードされるアミノ酸を変えない置換を意味する）。“ＫＡ／ＫＳ型方法”は本法および同様な方法を包含する。これらの方法は、相同タンパク質にアミノ酸差異をもたらすダーウィン的分子レベル正の淘汰の存在を証明するために、使われてきた。複数のグループがそのような方法を用いて、特定のタンパク質は中立置換速度より速やかに進化したことを実証し、そのようにダーウィン的分子レベル正の淘汰の存在を裏付けている。例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄおよびＫｒｅｉｔｍａｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５１：６５２−６５４は、ある遺伝子座のコード領域中の同義置換に対するアミノ酸交換置換の数の比較に基づく、中立タンパク質進化仮説の統計検定を提案している。彼らは、この検定を３種のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡｄｈ遺伝子座に適用し、それが当該遺伝子座が選択的に有利な突然変異の適応固定を受けたことの代わりに、大部分のタンパク質進化の説明として、適応変異の選択的固定が、中立突然変異の時計のように正確な蓄積に代る現実的なものらしいことをも、示すと結論している。Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ２６１：２０３−２０７は、ＭｃＤｏｎａｌｄ　＆　Ｋｒｅｉｔｍａｎ検定を用い、適応進化が配列制御転写（非コード配列）で生じているかどうかを検討している。
【０００６】
Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９２：５６０６−５６０９は、ＭｉｙａｔａおよびＹａｓｕｎａｇａの方法を用い、２種のヘビからの１０種のＰＬＡ２アイソザイム遺伝子のヌクレオチド配列のペアワイズ比較を行っている；この方法は、イントロンを含む非コード領域についての部位当りのヌクレオチド置換の数（ＫＮ）およびＫＡとＫＳを、比較するものである。当該タンパク質コード領域は、イントロンを含む非コード領域より、ずっと速い速度で進化してきたと、彼らは結論している。その高く加速された置換速度は、ＰＬＡ２アイソザイム遺伝子のダーウィン的分子レベル進化が、餌を捕獲するために、あるいは捕食者に対する防御のために、強い選択有利性を提供したはずの新しい生理的活性を産み出す、原因になっている。Ｅｎｄｏら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（５）：６８５−６９０は、ｄＮが非同義置換の数でｄＳが同義置換の数であるＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉの方法を、正の選択が作動する候補遺伝子を同定する目的のために、用いている。ＭｅｔｚおよびＰａｌｕｍｂｉ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（２）：３９７−４０６は、ＭｃＤｏｎａｌｄ　＆　Ｋｒｅｉｔｍａｎ検定ならびにＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉ，ＮｅｉおよびＪｉｎ，およびＫｕｍａｒ，Ｔａｍｕｒａ，およびＮｅｉに帰属する方法を用い；ウニ類におけるバインディン遺伝子類に対する正の選択の証拠を探すために、交換部位当たりの交換置換Ｐｎおよびサイレント部位当りのサイレント置換Ｐｓの平均比率を調べ、それらが種形成の準備行為として急速に進化したかどうかを検討している。Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（２）：３４６−３５８は、同様な方法を用いて、特定のマウス遺伝子ファミリーの進化を調べ、実験的に操作可能な系においてどうのように選択が遺伝的分岐を駆動するかについて、それらの方法が重要な基本的洞察を提供すると結論している。Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９５）は、縮重プライマーを用いて鳥類およびアメリカワニ（ａｌｌｉｇａｔｏｒ）のさまざまな種類からＭＨＣ遺伝子座を引出し、次いでそれらをＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉ法（ｄＮ：ｄＳ比）により分析し、ＭＨＣ研究を非哺乳類脊椎動物に拡張している。Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６４：７１３−７１５は、ＫＡ／ＫＳ分析を用い、（雄性を決定する）ＳＲＹ遺伝子における保存領域に隣接する領域中の方向性選択を探している。彼らは、ＳＲＹの急速な進化が、新種をもたらす生殖的隔離の有意の原因になり得ることを、示唆している。Ｗｅｔｔｓｅｔｉｎら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（１）：５６−６６は、Ｋｕｍａｒ，ＴａｍｕｒａおよびＮｅｉのＭＥＧＡプログラムおよび系統学的分析を適用し、リスおよび類縁のげっ歯類におけるＭＨＣクラスＩ遺伝子類の多様化をを研究している。ＰａｒｈａｍおよびＯｈｔａ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：６７−７４は、選択についての検定ならびに遺伝子変換および中立変異についての検定を含む、集団生物学的アプローチが、ヒトＭＨＣクラスＩ多形の産生および維持を分析するためには、必要だと述べている。Ｈｕｇｈｅｓ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１４（１）：１−５は、ＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉ（ｄＮ：ｄＳ比）の方法を用いて、脊椎動物免疫系中の細胞で発現されるタンパク質は異常に速く進化するという仮説を検証するために、１００以上のオルソログ免疫グロブリンＣ２ドメインを比較した。ＳｗａｎｓｏｎおよびＶａｃｑｕｉｅｒ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８１：７１０−７１２は、ｄＮ：ｄＳ比を用い、ライシンとライシンに対する卵受容体との間の協調進化を証明し、新種形成（種分化）におけるそうした協調進化の役割を論考している。
【０００７】
ヒトとこれらの下等動物のと間の遠い進化関係のために、自然淘汰により固定された適応的に価値のある遺伝的変化は、長い間の中立ランダム突然変異の蓄積によりマスクされることが多い。さらに、タンパク質によっては、エピソディック（ｅｐｉｓｏｄｉｃ；遺伝子副体的）な仕方で進化する；もし比較される２つのゲノムが十分に近くなければ、そうしたエピソディックな変化はマスクされ、要領を得ない結果をもたらす可能性がある。ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１５１−１５４。事実、タンパク質進化における適応選択の存在は、極めて遠縁な配列を比較する場合、低く見積られ易いことが、複数の研究で明らかにされている。Ｅｎｄｏら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３７：４４１−４５６；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１５１−１５４。
【０００８】
霊長類科内の分子進化研究も報告されているが、これらは、少数の既知の個々の遺伝子および遺伝子産物の比較に主に焦点を合わせ、分子変化の速度およびパターンを査定し、そうした変化を起す進化的機構を探索している。一般的には、Ｌｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ミネソタ、１９９７を参照されたい。さらに、配列比較データが系統学的分析に使われるが、そこでは、霊長類の進化史が、異なる霊長類からの調べられた分子間の配列類似性の相対的程度に基づき、再構築されている。例えば、異なる霊長類からの酵素リゾチームについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列データを用いて、霊長類におけるタンパク質進化および特定の系列内の適応選択の存在が研究された。Ｍａｌｃｏｌｍら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ　３４５：８６−８９；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）。霊長類における分子進化研究の対象にされた他の遺伝子には、ヘモグロビン、シトクロムｃオキシダーゼおよび主要組織適合複合体（ＭＨＣ）が含まれる。ＮｅｉおよびＨｕｇｈｅｓ：Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｅｖｅｌ，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ミネソタ、中、２２２−２４７、１９９１；ＬｉｅｎｅｒｔおよびＰａｒｈａｍ（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．７４：３４９−３５６；Ｗｕら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４４：４７７−４９１。多くの非コード配列も、霊長類の分子系統分析で使われてきた。Ｌｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ミネソタ、１９９７。例えば、霊長類系列間の遺伝的距離を、ベータ型グロビン遺伝子座およびそれらの隣接領域のオルソログ非コードヌクレオチド配列から推定し、そのヌクレオチド配列オルソログについて構築した進化系統樹は、形態的特徴の系統学的分析からの画像と概ね一致する分岐パターンを描いた。Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３０：２６０−２６６。
【０００９】
ＺｈｏｕおよびＬｉ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（６）：７８０−７８３は、霊長類遺伝子にＫＡ／ＫＳ分析を適用した。ヒト進化の際に、赤色および緑色網膜色素遺伝子間のイントロン２および４で、遺伝子変換事象が起ったらしいと、以前に報告されている。しかし、ある一人のヨーロッパ人の赤色および緑色網膜色素遺伝子のイントロン４配列は完全に同じで、最近の遺伝子変換事象であることを示唆していた。当該遺伝子変換事象が、その個人、またはヨーロッパ人の共通の祖先、またはもっと初期のヒト科祖先、のどこで起ったかを明らかにするために、前記著者らは、アジア人男性、雄チンパンジー、および雄ヒヒ（ｂａｂｏｏｎ）からの赤色および緑色色素遺伝子のイントロン４の配列を決定し、そしてＫＡ／ＫＳ分析を適用した。彼らは、当該２遺伝子間の分岐が、周囲のエキソンよりイントロン４で有意に低く、配列均質化に対して強い自然淘汰が働いたことを示唆していることを、観察した。
【００１０】
Ｗｏｌｉｎｓｋｙら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７２：５３７−５４２は、ＨＩＶウイルス自身（すなわち、当該宿主種でなく）が、個々のヒト患者内で適応進化を受けることを証明するために、同義に対する非同義塩基置換の比較を用いた。彼らの目的は、短期の枠（ヒト患者の疾患経過の期間）内で正の選択の存在を単に実証することであった。ＮｉｅｗｉｅｓｋおよびＢａｎｇｈａｍ（１９９６）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｅｖｏｌ　４２：４５２−４５８は、Ｄｎ／Ｄｓアプローチを用いて、ＨＴＬＶ−１ウイルスに関する関連質問、すなわち、当該ウイルス自身に働く選択力が何かを、検討した。多分試料サイズが不十分なためと思われるが、彼らは、当該選択力の本質を解明できなかった。これら両方の場合、ヒトウイルスに関してＫＡ／ＫＳ型方法を用いているが、これらの方法を（本出願におけるように）治療目的に使う試みは何ら行っておらず、むしろ狭い学問的目的を追究している。上記に引用した報告類に見られるように、急速に進化する遺伝子を同定するための分子進化の分析方法（ＫＡ／ＫＳ型方法）は、多くの異なる目的を達成するために、最も普通にはダーウィン的分子レベル正の選択の存在を確認するために、しかしまたダーウィン的分子レベル正の選択の頻度を査定するために、系統的関係を理解するために、新種が形成する機構を解明するために、または、特定遺伝子多形に対する単一または複数起源を確立するために、適用可能である。上記に引用した報告類および文献中の他の報告類から明らかなことは、著者の誰一人として、ヒトの状態または疾患を予防または治療するための、あるいは独特のまたは増強したヒト機能を変調するための、治療法の開発に模倣または利用する可能性がある進化解答である特定の進化変化を同定するためにＫＡ／ＫＳ型方法を適用しなかったことである。彼らは、進化的に有意の配列変化を含むヒトまたは非ヒト霊長類遺伝子を同定すること、およびそうした遺伝子および同定された変化をヒトの状態または疾患の治療法の開発に利用すること、のための系統的な道具としてＫＡ／ＫＳ型分析を使用したことはない。
【００１１】
チンパンジー相同遺伝子に比較して、独特のまたは増強したヒト機能を与えるように進化したヒト遺伝子の同定は、これらの独特のヒト機能を変調するための、または当該遺伝子に欠陥がある場合に機能を回復するための、作用物質を開発するのに適用可能であろう。その基盤を成すチンパンジー（または非ヒト霊長類）遺伝子および進化した特定のヌクレオチド変化の同定、およびこれらの進化遺伝子によりコードされるタンパク質中の物理的および生化学的変化のさらなる特徴解明は、例えば、エイズのような感染症に対する感受性および抵抗性を何が決めるのか、ある種の癌の発生に対する感受性および抵抗性を何が決めるのか、にきびに対する感受性および抵抗性を何が決めるのか、毛髪生長はどのように制御可能なのか、そして脂肪対筋肉の形成をどのように制御するか、に関して貴重な情報提供を可能にするであろう。この貴重な情報は、ヒトのタンパク質をそれらのチンパンジー相同体により似せて挙動させる作用物質の開発に適用可能であろう。
【００１２】
本明細書に引用されたすべての参考文献は、そっくりそのまま参考文献として本明細書に援用される。
発明の開示
本発明は、医学的容態を含む生理的状態に関連する進化的に有意な変化をもつポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。本発明は、医学的にまたは商業的に関連する進化した形質のような、生理的状態に関連し、またそのための原因になることがあり得る特定の遺伝子変化を同定するために、またこれらの進化した遺伝子からの情報を使ってヒトの治療法を開発するために、比較霊長類ゲノミクスを適用する。本明細書に記載される方法中で採用される非ヒト霊長類配列は、いずれの非ヒト霊長類でもよく、また好ましくはヒト科群のメンバーであり、より好ましくはチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよび／またはオランウータン、そして最も好ましくはチンパンジーである。
【００１３】
１つの好ましい実施態様で、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、正の進化的に有意の変化をもたらした自然淘汰を受けたことがある（すなわち、当該非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒトに存在しない正の属性をもつ）。本態様では、その正に選択されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある種の疾患に対する感受性または抵抗性と、または他の商業的に関係がある形質と、関連することがあり得る。本態様の事例は、感染症および癌に対する感受性または抵抗性に関連することがあり得る、非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーにおいて正に選択されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、非限定的に含む。商業的に関係がある形質の事例は、毛髪生長、筋肉量、にきびに対する感受性または抵抗性のような審美的形質を含んでもよい。本態様の事例は、ＨＩＶの播種、伝播および／またはエイズの発生に対する感受性または抵抗性に関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。本発明は、したがって、ＨＩＶの播種、伝播および／またはエイズの発生に対する抵抗性の基礎になる分子機構への洞察の獲得に役立つことも可能であり、エイズの発生を防ぎ、および／または、遅らせる薬剤のような作用物質を発見および／または設計するのにも役立つことが可能な情報を提供する。エイズまたは他の感染症に関係することがあり得る、チンパンジーで正に選択されてきた特定の遺伝子は、ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２，ＩＣＡＭ−３，ＭＩＰ−１−α，ＣＤ５９およびＤＣ−ＳＩＧＮである。１７−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＶ型は、癌に関係することがあり得る、チンパンジーで正に選択されてきた特定の遺伝子である。
【００１４】
もう１つの好ましい実施態様で、ヒトのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、正の進化的に有意な変化をもたらした自然淘汰を受けたことがある（すなわち、当該ヒトポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、非ヒト霊長類に存在しない正の属性をもつ）。本態様の１つの事例は、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、非ヒト霊長類に比較して、ヒトの脳の独特のまたは増強した機能性能力と関連することがあり得る、ことである。もう１つは、非ヒト霊長類に比較して、ヒトの長い寿命である。３番目は、商業的に重要な審美的形質（例えば、正常なまたは増強された胸部の発達）である。本発明は、したがって、独特のまたは増強したヒトの機能または生理的形質の基礎になる分子機構への洞察の獲得に役立つことも可能であり、そうした独特のまたは増強したヒトの機能または形質を変調する薬剤のような作用物質を設計するのに、またヒトに関係する疾患または状態の治療法を設計するのに、役立つことも可能な情報を提供する。事例として、本発明は、したがって、ヒトの認知機能の基礎になる分子機構への洞察の獲得に役立つことも可能であり、ヒトの脳機能を増強する薬剤のような作用物質を設計するのに、またヒトの脳に関係する疾患の治療法を設計するのに、役立つことも可能な情報を提供する。非ヒト霊長類に比較した場合、正の進化的に有意な変化をもつヒト遺伝子の特定な事例は、チロシンキナーゼ遺伝子ＫＩＡＡ６４１である。もう１つの事例で、本発明は、ヒトにおける正常な胸部の発達の基礎になる分子機構に関する情報を得るのに有用であり、胸部発達を増強することがあり得る作用物質の設計に役立つ情報を提供する。胸部発達に関与し、正に選択されてきた、特定のヒト遺伝子はＢＲＣＡ１である。
【００１５】
したがって、１つの側面では、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法を提供するが、そこでの当該ポリペプチドは、（医学的にまたは商業的に関係する正の進化的に有意な変化のような）生理的状態と関連してもよい。当該正の進化的に有意な変化は、ヒトまたは非ヒト霊長類で見い出されることがあり得る。
【００１６】
本発明の１つの側面において、ポリペプチドをコードする非ヒトポリヌクレオチド配列を同定するための方法が提供されるが、そこでの当該ポリペプチドは、（エイズのようなウイルス性疾患を含む）感染症または癌のような、医学的に関連する病状の発生に対する感受性または抵抗性のような、上記の（および本明細書全般の）それらの生理的状態を非限定的に含む、非ヒト霊長類における生理的状態と関連してもよい。いくつかの態様では、ａ）非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーのタンパク質コードポリヌクレオチド配列を、当該ヒトが前記生理的状態をもたない、ヒトのタンパク質コードポリヌクレオチド配列と比較すること；ｂ）当該ヒトの対応配列に比較して、ヌクレオチド変化であって、当該変化が進化的に有意であるものを含む、非ヒトポリヌクレオチド配列を選択すること、の工程を含む方法が提供される。いくつかの態様では、前記非ヒトタンパク質コード配列はｃＤＮＡに対応する。前記ヌクレオチド変化、および当該ヌクレオチド変化の性質（類）を査定するのに使われる方法は、本明細書に記載されており、そしていずれの、またすべての実施態様に適合する。これらの方法における（本明細書に記載されている他の同じような方法におけるように）、非ヒトタンパク質コード配列（および／またはそこでコードされるポリペプチド）は、生理的形質の発生および／または維持に関連してもよい。
【００１７】
本発明のどの態様についても、当該生理的状態は、例えば、癌のような疾患（疾患に対する感受性または抵抗性を含む）、感染症（エイズのようなウイルス性疾患を含む）；寿命；認知機能を含む脳機能；および増強された胸部発達のような審美的または化粧的特性、のような本明細書に掲載されたものを含む、いかなる生理的状態であってもよい。
【００１８】
本発明の１つの側面において、ヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法が提供されるが、そこでの当該ポリペプチドは、ａ）ヒトのタンパク質コードポリヌクレオチド配列を、当該非ヒト霊長類が前記生理的状態をもたない（またはそれをずっと低い程度にもつ）、非ヒト霊長類のタンパク質コードポリヌクレオチド配列と比較すること；そしてｂ）非ヒト霊長類の対応配列に比較して、ヌクレオチド変化であって、当該変化が進化的に有意であるものを含む、ヒトポリヌクレオチド配列を選択すること、の工程を含み、ヒトに存在する生理的状態と関連していてもよい。いくつかの態様では、当該ヒトタンパク質コード配列（および／またはそこでコードされるポリペプチド）は、生理的状態または形質または生体機能の発生および／または維持に関連してもよい。いくつかの態様では、当該生理的状態または生体機能は、寿命、脳または認知機能、または胸部発達（脂肪、腺、および管の発達を含む）であってもよい。前記ヌクレオチド変化、および当該ヌクレオチド変化の性質（類）を査定するのに使われる方法は、本明細書に記載されており、そしていずれの、またすべての実施態様に適合する。
【００１９】
他の実施態様では、（ａ）ヒトのタンパク質コードヌクレオチド配列を、特定の医学的に関連する疾患状態に抵抗性のある、非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーのタンパク質コードヌクレオチド配列と比較することで、そこでの当該ヒトのタンパク質コード配列は当該疾患の発生と関連している；そして（ｂ）ヒトの対応する配列に比較して、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む非ヒトポリヌクレオチド配列を選択することであって、そこでの当該変化が進化的に有意である、工程を含む方法が提供される。これらの方法により同定された配列は、それらが疾患状態または容態の発生と関連することを確認するため、さらに特徴解明および／または分析を行ってもよい。これらの方法に適用可能な最も好ましい疾患状態は、癌、およびエイズ、Ｃ型肝炎およびらい病を含む感染症である。
【００２０】
もう１つの側面において、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法を提供するが、そこでの当該ポリペプチドは、（ａ）エイズ抵抗性非ヒト霊長類タンパク質コード配列を、ヒトタンパク質コード配列に比較することであって、そこでの当該ヒトタンパク質コード配列はエイズの発生と関連する；そして（ｂ）対応するヒト配列に比較して、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含むエイズ抵抗性非ヒト霊長類配列を選択することであって、そこでの当該ヌクレオチド変化が進化的に有意である：工程を含み、エイズの発生に対する抵抗性と関連してもよい。本明細書で指摘されているように、これらの方法は、例えば、それらの配列相同性に従って配列をアラインすること、そしてヒトの対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの独特なヌクレオチド変化を含み、そこでの当該独特なヌクレオチド変化が進化分析に従って正に選択される（本明細書に記載のように）、非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列を同定すること、によりなしとげることが可能である。
【００２１】
いくつかの実施態様では、非ヒトにおけるエイズ進行に対する抵抗性増強と関連づけられてきた非ヒト霊長類のポリヌクレオチド配列が、ヒトに関係ある進化的に有意な変化を受けたかどうかを決定するための、方法が提供されるが、それは、ａ）何らかのヌクレオチド変化を同定するために、非ヒトポリヌクレオチド配列を、対応するヒト霊長類ポリヌクレオチド配列に比較すること；そしてｂ）当該非ヒトヌクレオチド変化が進化的に有意かどうかを決定すること、を含む。エイズ進行に対する抵抗性と関連づけられている、または可能性があり、そして正の選択を受けたことが見い出されている、特定の非ヒトポリヌクレオチドは、チンパンジーのＣＤ５９およびＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子である。
【００２２】
もう１つの側面において、ヒト脳タンパク質コードポリヌクレオチド配列中の進化的に有意な変化を同定するための方法が提供されるが、それは、ａ）ヒト脳タンパク質コードポリヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類の対応する配列に比較すること；そしてｂ）当該非ヒト霊長類の対応する配列に比較した場合、ヌクレオチド変化を含み、そこでの当該が進化的に有意である、ヒトポリヌクレオチド配列を選択すること、の工程を含む。いくつかの態様で、当該ヒト脳タンパク質コードヌクレオチド配列は、ヒト脳ｃＤＮＡｓに対応する。
【００２３】
もう１つの側面において、本発明は、ヒトにおいて正常なまたは増強された胸部発達と関連するとされてきたヒトポリヌクレオチド配列が、（妊娠／授乳以前には増強された胸部を示さない）非ヒト霊長類に相対的に進化的に有意な変化を受けたかどうかを決定するための方法を提供するが、それは、ａ）何らかのヌクレオチド変化を同定するために、ヒトポリヌクレオチド配列を、対応する非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列に比較すること；そしてｂ）当該ヒトヌクレオチド変化が進化的に有意かどうかを決定すること：を含む。正常なまたは増強された胸部発達と関連づけられてきた、そしてヒトで正に選択されるヒト遺伝子は、ＢＲＣＡ１である。
【００２４】
本発明のもう１つの側面は、正に選択されたヒトの進化的に有意な変化を同定するための方法を含む。これらの方法は、（ａ）ヒトタンパク質コードヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類のタンパク質コードヌクレオチド配列に比較すること；そして（ｂ）当該非ヒト霊長類の対応する配列に比較して、少なくとも１つの（すなわち、１つまたは１つより多い）ヌクレオチド変化を含むヒトポリヌクレオチド配列であって、そこでの当該変化が進化的に有意であるものを選択する：工程を含む。この方法により同定された配列は、ヒトで独特なまたは増強された、生体的にまたは医学的に関係する機能または形質とのそれらの可能性ある関連について、さらに特徴解明および／または分析を行ってもよい。
【００２５】
本発明のもう１つの態様は、ヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列と非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーからのタンパク質コードポリヌクレオチド配列との間の大規模配列比較のための方法で、それは、（ａ）配列相同性に従って、ヒトポリヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類からの対応するポリヌクレオチド配列と共にアラインすること；そして（ｂ）当該非ヒト霊長類からの相同配列に比較して、当該ヒト配列内に何らかのヌクレオチド変化であって、そこでの当該変化が進化的に有意であるものを同定すること：を含む。いくつかの態様で、前記タンパク質コード配列は、脳からである。
【００２６】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法のいずれかにより同定されたヌクレオチド変化は、非同義置換である。いくつかの態様では、当該ヌクレオチド変化の進化的有意性は、当該ヌクレオチド配列の非同義置換率（ＫＡ）に従って決定される。いくつかの態様では、前記進化的に有意な変化は、ヒト遺伝子と非ヒト霊長類（チンパンジーのような）からの相同遺伝子との間のＫＡ／ＫＳ比を決定することにより査定され、そして好ましくはその比は、少なくとも約０．７５であり、より好ましくは約１（単位）より大きく（すなわち、少なくとも約１），より好ましくは少なくとも約１．２５，より好ましくは少なくとも約１．５０，そしてより好ましくは少なくとも約２．００である。他の態様では、正に選択された遺伝子がヒトと非ヒト霊長類（チンパンジーのような）との間で同定されている場合、当該ヒトまたは非ヒト霊長類（チンパンジーのような）遺伝子が、正の選択を受けたかどうかを確認するため、他の非ヒト霊長類とのさらなる比較を行う。
【００２７】
もう１つの側面において、本発明は、進化的に有意なヒトヌクレオチド変化を、ヒト（またはヒト達）における生理状態に相関させるための方法を提供するが、それは、本明細書記載の方法のいずれかにより同定されたポリヌクレオチド配列（の存否）の、もしあれば、（機能性作用の存在を決定することを含む）機能性作用を分析することを含み、そこでの機能性作用の存在は、当該進化的に有意なヌクレオチド変化と生理状態との間の相関関係を指す。あるいは、これらの方法では、機能性作用は（あるとすれば）、本明細書記載の方法のいずれかにより同定されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列（または当該ポリペプチド配列の一部）を用いて査定することも可能である。
【００２８】
本発明はまた、前記進化的に有意な変化の構造的または生化学的結果を決定するために、技術分野で広く使われる物理的および生化学的方法による、前記同定ポリペプチドの比較を提供する。物理的方法は、適応進化を受けたことが見い出された遺伝子によりコードされるタンパク質に対する構造変化を調べるのに使われる方法を、含むことを意味する。あるタンパク質（ヒトまたは非ヒト霊長類のいずれか）および進化した相同タンパク質（それぞれ非ヒト霊長類またはヒトのいずれか）の三次元構造の並行比較は、関係するヒトの状態および疾患に対する治療法を開発するための貴重な情報を提供するであろう。例えば、本発明の方法を用いて、チンパンジーＩＣＡＭ−１遺伝子は、ヒトＩＣＡＭ−１に比べて、正の進化的変化をもつと同定された。ヒトＩＣＡＭ−１タンパク質の２つの機能性ドメインの三次元モデルで、チンパンジーで変化した６つのアミノ酸のうち５つは、ＩＣＡＭ−１の対抗（ｃｏｕｎｔｅｒ）受容体ＬＦＡ−１に結合するためにきわめて重要なことがわかっているアミノ酸残基に直ぐ隣にある（すなわち物理的に触れている）ことが見られる；いずれの場合にも、当該ヒトアミノ酸は、チンパンジーＩＣＡＭ−１では、より大きなアミノ酸により交換されていた。そのような情報は、適切な治療介入（類）の設計への洞察を可能にする。
【００２９】
したがって、もう１つの側面において、本発明は、治療介入のために適切であり得る（１つまたは１つより多い標的部位置を含む）標的部位を同定するための方法を提供するが、それは、本明細書に記載の方法のいずれかにより同定された配列中にコードされるヒトポリペプチド（または当該ポリペプチドの一部）を、対応する非ヒトポリペプチド（または当該ポリペプチドの一部）と比較することを含み、そこでは、分子的相違の位置が、もしあれば、標的部位を示す。もう１つの側面において、本発明は、治療介入のために適切であり得る（１つまたは１つより多い標的部位置を含む）標的部位を同定するための方法を提供するが、それは、本明細書に記載の方法のいずれかにより同定された配列中にコードされる非ヒトポリペプチド（または当該ポリペプチドの一部）を、対応するヒトポリペプチド（または当該ポリペプチドの一部）と比較することを含み、そこでは、アミノ酸差異のような分子的相違の位置が、もしあれば、標的部位を示す。標的部位はまた、本明細書に記載の方法のいずれかにより同定された正に選択されたポリペプチド中の非同義ヌクレオチド変化であってもよい。
【００３０】
生化学的方法は、適応進化を受けたことがある遺伝子によりコードされるタンパク質に対して、結合特異性、結合強度、または最適結合条件のような機能的相違を調べるのに使われる方法を、含むことを意味する。あるタンパク質（ヒトまたは非ヒト霊長類のいずれか）および進化した相同タンパク質（それぞれ非ヒト霊長類またはヒトのいずれか）の生化学的特徴の並行比較は、関係するヒトの状態および疾患に対する治療法を開発するための貴重な情報を明らかにするであろう。
【００３１】
もう１つの側面において、本発明は、生理的状態を変調することがあり得る作用物質を同定することの方法を提供するが、当該方法は、ある作用物質（すなわち、試験される少なくとも１つの作用物質）を、本明細書に記載の方法のいずれかにより同定されたポリヌクレオチド配列で形質移入された細胞と接触させることを含み、そこでは、作用物質が、当該ポリヌクレオチド配列の機能を変調するその能力により同定される。他の態様では、本発明は、生理的状態を変調することがあり得る作用物質を同定することの方法を提供するが、当該方法は、試験される作用物質（すなわち、少なくとも１つの作用物質）を、本明細書に記載の方法のいずれかにより同定されたポリヌクレオチド中にまたは内にコードされるポリペプチド（またはポリペプチドの断片および／またはポリペプチドまたはポリペプチドの断片を含む組成物））と接触させることを含み、そこでは、作用物質が、当該ポリペプチドの機能を変調するその能力により同定される。本発明はまた、本明細書に記載のスクリーニング法を用いて同定される作用物質を提供する。
【００３２】
もう１つの側面において、本発明は、エイズのような疾患の発生に対する感受性または抵抗性のような、独特のまたは増強されたヒト機能または形質を変調する、あるいは興味ある非ヒト霊長類形質を模倣する、いずれかのために、ヒトポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性を変調することがあり得る作用物質をスクリーニングすることの方法を提供する。これらの方法は、ポリヌクレオチド配列で形質移入された細胞を試験される作用物質に接触させること、および当該ポリヌクレオチドの機能を変調するそれらの能力に基づく作用物質を同定すること、または、ポリペプチド調製物を試験される作用物質に接触させること、および当該ポリペプチドの機能を変調するそれらの能力に基づく作用物質を同定すること、を含む。
発明の詳細な説明
本発明は、医学的にまたは商業的に関係がある進化した形質のような生理的状態に、関連する、そしてそのため寄与したり、または責任となり得る、特定の遺伝子変化を同定するために、比較ゲノミクスを適用する。本発明は、ヒトを、他の非ヒト、特に霊長類、そして最も好ましくは既知２種、普通のチンパンジーおよびボノボ（ピグミーチンパンジー）を含むチンパンジー、から区別する、機能および疾患における相違の責任となり得る特定の遺伝子変化を同定するための、比較ゲノミクスアプローチを含む。例えば、チンパンジーとヒトとは、ＤＮＡ配列レベルで９８．５％同一であり、そして本発明は、独特なまたは増強したヒトの認知能力あるいは生理的形質およびエイズおよびある種の癌に対するチンパンジーの抵抗性を含む、多くの領域における種間の相違の基になる適応分子変化を、同定可能である。遺伝子を同定するだけの従来のゲノミクスと異なり、本発明は、疾患を排除する、あるいは独特なまたは増強した機能または形質を提供する進化的解答に関する正確な情報を、提供する。本発明は、進化的利点をおよび特定の進化変化を付与するように進化した遺伝子を、同定する。
【００３３】
本発明は、ヒトタンパク質コードポリヌクレオチドが、進化の際の適応選択の結果として、ヒトに見られるが、非ヒト霊長類のような他の進化的近縁種に見られない、配列変化を含むことがあり得るという観察からの、結果として生じる。
【００３４】
本発明はさらに、非ヒト霊長類の遺伝情報が、進化の際の適応選択の結果として、特定の非ヒト霊長類に見られるが、ヒトには見られない変化を含むことがあり得るという観察からの、結果として生じる。本態様では、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、正の進化的に有意な変化をもたらした自然淘汰を受けた（すなわち、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒトには存在しない正の属性をもつ）。本態様では、正に選択されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある種の疾患に対する感受性または抵抗性または他の商業的に関係ある形質と、関連することがあり得る。本態様の医学的に関係する事例は、非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーで正に選択され、感染症および癌に対する感受性または抵抗性と関連することがあり得る、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを非限定的に含む。本態様の事例は、ＨＩＶ感染からエイズの発生への進行に対する感受性または抵抗性と関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。したがって本発明は、ＨＩＶ感染からエイズの発生への進行に対する抵抗性の基礎を成す分子機構への洞察の獲得に役立つことも可能であり、エイズの発生を防ぎ、および／または、遅らせる薬剤のような作用物質を発見および／または設計するのにも役立つことが可能な情報を提供する。商業的に関係がある事例は、非ヒト霊長類において正に選択され、毛髪生長、にきび、または筋肉量のような審美的形質と関連することがあり得る、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、非限定的に含む。
【００３５】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列における正に選択されたヒトの進化的に有意な変化は、独特なまたは増強したヒト脳機能のような、特に、最も近縁の進化的類縁であるチンパンジーに比較した場合、ヒトに競争的利点を提供するヒトの能力に帰すことも可能である。本発明は、独特なまたは増強したヒト認知能力を提供するように進化したヒト遺伝子を同定し、そして機能性差異を付与する実際のタンパク質変化は、一般集団に対する認知増強のみならず認知欠陥を治療するための治療アプローチにきわめて有用であろう。
【００３６】
他の正に選択されたヒトの進化的に有意な変化は、増強した胸部発達を含め、チンパンジーのような近い進化的類縁に比べて増強したまたは独特なヒトの生理的形質または状態に帰すことも可能である、それらの配列を含む。本発明は、増強した胸部発達と関連することがあり得るヒトのポリヌクレオチド配列が、近縁の非ヒト霊長類における対応するポリヌクレオチド配列に比べて進化的に有意な変化を受けたかどうかを決定する方法、を提供する。独特なまたは増強したヒト生理的形質の発生に関与するヒトポリヌクレオチドにおける進化的に有意な変化の同定は、ヒトポリヌクレオチドまたはそのコードされたポリペプチドの活性または機能を変調できる作用物質または薬剤の開発において重要である。
【００３７】
本発明の実行は、特に指定しない限り、当該技術分野の範囲内にある、分子生物学、遺伝学、および分子進化の慣用技術を採用する。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔら，１９８４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”，（Ｌｉ，１９９７）のような文献に十分に説明されている。
定義
本明細書で使われる場合、「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体の任意の長さのヌクレオチドの重合体型を指す。本用語は、前記分子の一次構造を指し、それ故、二本および一本鎖ＤＮＡならびに二本および一本鎖ＲＮＡを含む。それはまた、メチル化および／またはキャップ形成ポリヌクレオチドのような修飾ポリヌクレオチドを含む。用語「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は互換的に使用される。
【００３８】
本明細書で使われる場合、「遺伝子」は、タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部を指す。遺伝子はまた、（プロモーター、エンハンサー、リプレッサーおよび他の調節配列のような）５´および３´フランキング配列ならびにイントロンのような非コード配列も含むことは、当該技術分野では言うまでもない。
【００３９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合体を指す。これらの用語はまた、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含む反応を通じて翻訳後修飾されるタンパク質も含む。
【００４０】
「生理的状態」は、当該技術分野では十分理解されている用語で、測定および／または観察される任意の容態または状態を意味する。「生理的状態」は、体脂肪の程度、脱毛症（はげ）、にきび、または増強された胸部発達のような身体状態；平均余命；癌および感染症のような（疾患に対する感受性および／または抵抗性を含む）疾患状態を、非限定的に含む。生理的状態の事例は以下に（例えば、「ヒトの医学的に関係する医学的状態」、「ヒトの商業的に関係する状態」、「医学的に関係する進化した形質」および「商業的に関係する進化した形質」の定義を参照されたい）、また本明細書のいたるところに、提示する、そしてこれらの用語および事例は生理的状態を指すことは無論である。生理的状態は、必ずしもそうとは限らないが、複数の要因の結果であってもよく、そのいずれもが、やはり生理的状態であると考えてもよい。ヒトまたは非ヒト霊長類に「存在する」生理的状態は、一定の集団内に生じ、別の集団に比較した場合、一定集団中で独特なおよび／または増強されるそうした生理的状態を含む。
【００４１】
用語「ヒトの医学的に関係する状態」または「ヒトの商業的に関係する状態」は、医学的または非医学的調停が望まれるヒトの状態を指すために、本明細書では使われる。
【００４２】
用語「医学的に関係する進化した形質」は、その分析が、ヒトの医学治療法の開発に関する情報（例えば、物理的または生化学的データ）を提供できると思われるヒトまたは非ヒト霊長類で進化した形質を指すために、本明細書では使われる。
【００４３】
用語「商業的に関係する進化した形質」は、その分析が、ヒトに使用するための医学的または非医学的産物または治療法の開発に関する情報（例えば、物理的または生化学的データ）を提供できると思われるヒトまたは非ヒト霊長類で進化した形質を指すために、本明細書では使われる。
【００４４】
用語「ＫＡ／ＫＳ型方法」は、（非同義および同義部位を決定する、より厳密な方法を含め）相同遺伝子における非同義置換および同義置換の数の間の、比率として（常にではないが）しばしば示される差を評価する方法を意味する。これらの方法は、非限定的にＫＡ／ＫＳ，ｄＮ／ｄＳ，ＤＮ／ＤＳを含む、いくつかのシステムの術語を用いて設計される。
【００４５】
用語「進化的に有意な変化」または「適応的進化性変化」は、正の選択圧力に帰されることがあり得る２種間の１つまたは１つより多いヌクレオチドまたはペプチド配列変化を指す。進化的に有意な変化の存在を決定するための１つの方法は、ＫＡ／ＫＳ比を測定することのような、ＫＡ／ＫＳ型分析法を適用することである。典型的には、少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０，より好ましくは少なくとも約１．２５，より好ましくは少なくとも約１．５，そして最も好ましくは少なくとも約２．０であるＫＡ／ＫＳ比は、正の選択の作用を示し、そして進化的に有意な変化であると考えられる。
【００４６】
用語「正の進化的に有意な変化」は、他の関係種と比較した場合に正である適応変化を結果として生じる、特定の種における進化的に有意な変化を意味する。正の進化的に有意な変化の事例は、ヒトで増強した認知能力または増強したあるいは独特の生理的状態を結果として生じる変化、および完全発症エイズへの進行に抵抗性である、ＨＩＶに感染したチンパンジーの能力を結果として生じたチンパンジーにおける適応変化である。
【００４７】
用語「増強した胸部発達」は、非ヒト霊長類に比べてヒトに観察される拡大した胸部を指す。前記拡大したヒト胸部は、他の霊長類に比べて脂肪、管、および／または腺組織の増加を示し、そして最初の妊娠および授乳の前に発達する。
【００４８】
用語「抵抗性の」は、チンパンジーのような生物が、好ましくは、非抵抗性生物、典型的にはヒトと比較した場合、疾患状態および／または当該疾患の発生を避ける、あるいはそれらの程度を減らす、能力を示すことを、意味する。例えばチンパンジーは、ＨＩＶおよび他のウイルス感染のある種のインパクトに対して抵抗性であり、および／または、それは、最終的疾患であるエイズを発症しない。
【００４９】
用語「感受性」は、ヒトのような生物が、好ましくは、チンパンジーのような非ヒト霊長類のように、抵抗性であることがわかっている生物と比較した場合、疾患状態および／または当該疾患状態の発生を避ける、あるいはそれらの程度を減らす、ことができないことを、意味する。例えばヒトは、ＨＩＶおよび他のウイルス感染のある種のインパクト、および／または最終的疾患であるエイズの発症、に対して感受性がある。
【００５０】
抵抗性および感受性は個体ごとに変動すること、また本発明の目的のために、これらの用語は種内の個体の群にも適用すること、は言うまでもない、そして抵抗性および感受性の比較は、種内比較に使われることもあるが、一般には種間の総合的な平均差を指す。
【００５１】
用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は、当該技術分野では知られており、また十分理解されており、そして共通祖先を共有する関係配列を指し、また配列同一性の程度に基づき決定される。これらの用語は、１つの種に見られる遺伝子と、もう１つの種の対応または相当する遺伝子との間の関係を叙述する。本発明の目的のために、相同配列が比較される。「相同配列類」または「相同体類」または「オルソログズ」は、機能的に関係があると、考えられ、信じられ、または知られている。機能的関係は、（ａ）配列同一性の程度；（ｂ）同一のまたは同様な生物機能、を非限定的に含む多くの仕方の何れか１つで示してもよい。好ましくは（ａ）および（ｂ）の両方で示される。配列同一性の程度は、変動してもよいが、（当該技術分野で知られる標準配列アラインメントプログラムを用いる場合）好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％である。相同性は、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）補遺３０，節７．７１８，表７．７１で論考されているような、当該技術分野で容易に入手できるソフトウエアプログラムを用いて決定可能である。好ましいアラインメントプログラムは、Ｍａｃ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｔｄ，オックスフォード、英国）およびＡＬＩＧＮ　Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ペンシルバニア）である。もう１つの好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを用いるＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，ミシガン）である。
【００５２】
用語「ヌクレオチド変化」は、当該技術分野でよく理解されているように、ヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を指す。
用語「エイズに対する感受性に関連する」ところの「ヒトタンパク質コードヌクレオチド配列」は、本明細書で使われる場合、ＨＩＶの播種（当該生物内、すなわち生物内感染性）、伝播および／またはエイズの発生に関連するタンパク質をコードするヒトヌクレオチド配列を指す。ＨＩＶ感染からエイズの発生に至る進行の基になる機構における広範な研究のために、多数の候補ヒト遺伝子が、これらの現象の１つまたは１つより多くと関連すると、信じられ、あるいは知られている。エイズに対する感受性と関連するポリヌクレオチド（その中でコードされる任意のポリペプチドを含めて）配列は、ＨＩＶの播種、複製、および／または完全発症エイズへのその後の進行に役割を演じることが知られる、あるいは推定されるものである。そうした候補遺伝子の事例は、以下に提示される。
【００５３】
「エイズ抵抗性の」は、チンパンジーのような生物が、好ましくは、エイズ感受性のヒトと比較した場合、（伝播および播種のような）ＨＩＶ感染および／またはエイズの発生の結果を避ける、あるいはそれらの程度を減らす、能力を示すことを、意味する。
【００５４】
エイズに対する「感受性」は、ヒトのような生物が、好ましくは、チンパンジーのような非ヒト霊長類のような、エイズ抵抗性であることがわかっている生物と比較した場合、（伝播および播種のような）ＨＩＶ感染および／またはエイズの発生の結果を避ける、あるいはそれらの程度を減らす、ことができないことを、意味する。
【００５５】
用語「脳タンパク質コードヌクレオチド配列」は、本明細書で使われる場合、タンパク質をコードする、脳で発現されるヌクレオチド配列を指す。当該「脳タンパク質コードヌクレオチド配列」の１つの事例は、脳ｃＤＮＡ配列である。
【００５６】
本明細書で使われる場合、用語「ヒトに独特のまたは増強した脳機能」または「ヒト脳の独特な機能性能力」または「ヒトで独特のまたは増強されている脳機能性能力」は、他の非ヒト霊長類に比較して、種類または程度のいずれかで、ヒトで増強されていることが確認されるおよび／または観察される、任意の脳機能を指す。そうした脳機能は、高容量情報処理、貯蔵および検索能力、創造性、記憶、言語能力、脳仲介感情応答、移動運動、疼痛／快楽感覚、嗅覚、および気質を、非限定的に含む。
【００５７】
「ハウスキーピング遺伝子」は、当該技術分野ではよく理解されている用語で、成長、分裂、静止、代謝、および／または死を、非限定的に含む、一般的な細胞機能に関連するそうした遺伝子を意味する。「ハウスキーピング」遺伝子は、一般に、１つ以上の細胞型で見られる機能を遂行する。それに対して、細胞特異的遺伝子は、一般に、（ニューロンのような）特定の細胞型および／または（神経細胞のような）クラスで機能を遂行する。
【００５８】
用語「作用物質」は、本明細書で使われる場合、単純または複合の有機または無機分子のような生物学的または化学的化合物、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドを意味する。膨大な一連の化合物、例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマーは合成が可能であり、またさまざまなコア構造に基づく合成有機および無機化合物があり、そしてこれらも、用語「作用物質」に含まれる。加えて、さまざまな天然源は、植物または動物抽出物および同類物のような、スクリーニング用の化合物を提供することも可能である。化合物は、単独で、または相互に組合わせて、試験してもよい。
【００５９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「機能を変調すること」という用語は、作用物質を添加しない場合に比較して、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が変更されることを意味する。変調は、機能に影響する任意のレベルで生じることがあり得る。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は、直接的または間接的であってもよく、そして直接的にまたは間接的に測定してもよい。
【００６０】
「ポリヌクレオチドの機能」は、複製；翻訳；および発現パターン（類）を非限定的に含む。ポリヌクレオチド機能はまた、当該ポリヌクレオチド内でコードされるポリペプチドに随伴する機能を含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用して、タンパク質発現、立体配座、折りたたみ（または他の物理的特徴）、（リガンドのような）他の部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）への結合、活性（または他の機能性特徴）、タンパク質の構造または機能の調節および／または他の側面、に働く作用物質は、ポリヌクレオチド機能を変調したと考えられる。
【００６１】
「ポリペプチドの機能」は、立体配座、折りたたみ（または他の物理的特徴）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能性特徴）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、を非限定的に含む。例えば、ポリペプチドに作用して、その立体配座、折りたたみ（または他の物理的特徴）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能性特徴）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、に働く作用物質は、ポリペプチド機能を変調したと考えられる。有効な作用物質がポリペプチドの機能を変調するように働く仕方は、１）立体配座、折りたたみ、または他の物理的特徴を変えること；２）その天然リガンドに対する結合強度を変えること、またはリガンドに対する結合の特異性を変えること；および３）当該ポリペプチドの活性を変更すること、を非限定的に含む。
【００６２】
用語「エイズの発生に対する感受性を変調する」および「エイズの発生に対する抵抗性を変調する」は、本明細書で使われる場合、生物内でのＨＩＶの細胞間伝播または感染性を変調することを含む。当該用語はさらに、エイズの発生および／またはＨＩＶの細胞間伝播または感染性に対する感受性を低減させることも含む。当該用語はさらに、エイズの発生および／またはＨＩＶの細胞間伝播または感染性に対する抵抗性を増加させることも含む。ある作用物質がエイズの発生に対する感受性または抵抗性を変調するものであるかどうかを査定する１つの手段は、本明細書に記載されたような細胞基盤系を用い、適切な対照と比較しながら、ＨＩＶ感受性の少なくとも１つの指標が影響されるかどうかを決定することである。ＨＩＶ感受性のしるしは、非限定的に、ＨＩＶに感染された細胞の総数により測定されるような当該ウイルスの細胞間伝播、およびシンシチウム（融合細胞）形成を含む。
【００６３】
用語「標的部位」は、１つまたは１つより多いアミノ酸であってもよく、および／または、構造性および／または機能性モチーフ、例えば、結合部位、二量体化ドメイン、または触媒活性部位の一部である、ポリペプチド中の場所を意味する。それはまた、タンパク質コード領域中の１つまたは１つより多い非同義ヌクレオチド変化があるポリヌクレオチド中の場所を含み、あるいはまた、正に選択された遺伝子の調節領域を指すこともあり得る。標的部位は、治療剤のような作用物質との直接的または間接的相互作用に役立つことがあり得る。
【００６４】
用語「分子差」は、任意の構造性および／または機能性差異を含む。そうした差異を検出するための方法ならびにそうした差異の事例は、本明細書に記載されている。
【００６５】
「機能性効果」は、当該技術分野では周知の用語で、直接的であれ間接的であれ、活性の任意のレベルで示される任意の効果を意味する。
当該技術分野で知られる一般的手順
本発明の目的のための、ヒトおよび非ヒトポリヌクレオチドの来源は、任意の適当な来源、例えば、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列であってもよい。好ましくは、ヒトおよび非ヒト霊長類からのｃＤＮＡ配列が比較される。ヒトタンパク質コード配列は、ｔｈｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　ＢａｎｋおよびＧｅｎＢａｎｋのような公開データベースから入手可能である。これらのデータベースは、進行中の研究努力により産生された分子配列データの貯蔵所として役立つ。あるいは、ヒトタンパク質コード配列は、例えば、ヒト細胞中で発現されたｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの配列決定から、または当該技術分野で周知の方法に従って、ＰＣＲ増幅後に、得てもよい。あるいは、ヒトゲノム配列を、配列比較のために使ってもよい。ヒトゲノム配列は、公開データベースから、または商業的に入手可能なヒトゲノムＤＮＡライブラリーの配列決定から、またはＰＣＲ後にゲノムＤＮＡから、入手可能である。
【００６６】
非ヒト霊長類タンパク質コード配列は、例えば、非ヒト霊長類ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択されるｃＤＮＡクローンを配列決定することにより、得ることが可能である。当該非ヒト霊長類ｃＤＮＡライブラリーは、当該技術分野での標準的技術を用いて、霊長類細胞中で発現された全ｍＲＮＡから構築可能である。いくつかの態様では、当該ｃＤＮＡは、一定の発生段階における組織、または当該霊長類をある環境条件にさらした後に得た組織から、得たｍＲＮＡから調製する。本発明の配列比較に用いられるｃＤＮＡライブラリーは、当該技術分野の文献に十分に説明されている慣用のｃＤＮＡライブラリー構築技術を用いて、構築可能である。全ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ類を逆転写するための鋳型として使われる。転写されたｃＤＮＡ類は、適切なベクター中へサブクローン化し、ｃＤＮＡライブラリーを確立する。確立されたｃＤＮＡライブラリーは、完全長ｃＤＮＡ含量のために最大化可能であるが、完全長に達しないｃＤＮＡ類も使用してよい。さらに、配列頻度は、例えば、Ｂｏｎａｌｄｏら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：７９１−８０６に従って、標準化可能である。当該構築ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択されたｃＤＮＡクローンは、標準自動配列決定技術を用いて配列決定可能である。好ましくは、完全長ｃＤＮＡクローン類を配列決定に使用する。ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローン類の全体または大きな部分を配列決定してもよいが、できるだけ少なく単一ｃＤＮＡ、または数ｃＤＮＡクローンを配列決定することにより、本発明のいくつかの態様を実行することも可能である。
【００６７】
本発明の１つの好ましい実施態様において、配列決定予定の非ヒト霊長類ｃＤＮＡクローン類を、それらの発現特異性に従って、前選択可能である。特異的に発現される活性遺伝子に対応するｃＤＮＡ類を選択するには、当該ｃＤＮＡ類は、同一動物の他の器官、組織または細胞から得られるｍＲＮＡ類を用いて、差引きハイブリッド形成法にかけることが可能である。適切な厳格性および濃度をもつ二三のハイブリッド形成条件下で、非組織特異的ｍＲＮＡ類とハイブリッド形成し、したがって「ハウスキーピング」遺伝子を表すらしいそれらのｃＤＮＡ類は、当該ｃＤＮＡプールから排除されよう。したがって、配列決定予定の残るｃＤＮＡ類は、組織特異的機能と関連している可能性が一層高い。差引きハイブリッド形成の目的のために、非組織特異的ｍＲＮＡ類は、１つの器官から、または好ましくは異なる器官および細胞の組合わせから、得ることが可能である。当該組織特異的ｃＤＮＡ類を飽和させるため、非組織特異的ｍＲＮＡ類の量を最大化する。
【００６８】
あるいは、オンライン公開データーベースからの情報を使って、特定の機能と関連している可能性が一層高いｃＤＮＡ類に対する優先順位を選択する、または与えることが可能である。例えば、配列決定のための非ヒト霊長類ｃＤＮＡ候補は、候補ヒトｃＤＮＡ配列から設計されたプライマーを使ってＰＣＲにより選択可能である。候補ヒトｃＤＮＡ配列は、例えば、脳または胸部のような特定の組織にのみ見られるもの、あるいは脳機能または胸部組織脂肪または腺発達のような特定の機能に重要であるらしい遺伝子類に対応するものである。そうしたヒト組織特異的ｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ配列についての発現プロファイルおよび／または生物活性に関する情報が指定されている、ＧｅｎＢａｎｋのようなオンラインヒト配列データベースを検索することにより、得ることが可能である。
【００６９】
既知ヒト遺伝子に相同な非ヒト霊長類の配列（例えばエイズ抵抗性非ヒト霊長類からの）は、ＧｅｎＢａｎｋのような公開データベースから、またはＰＣＲ法（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００　ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．）を用いて）のような当該技術分野での標準法を用いて得てもよい。例えば、配列決定用の非ヒト霊長類ｃＤＮＡ候補は、候補ヒトｃＤＮＡ配列から設計されたプライマーを使ってＰＣＲにより選択可能である。ＰＣＲのために、プライマーは、ＰＲＩＭＥＲＲ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のような公共的に入手可能なプライマーデザインプログラムを含む、当該技術分野の標準法を用いて、ヒト配列からプライマーを作ってもよい。増幅された配列は、次に、自動配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）のような当該技術分野の標準的な方法および装置を用いて、配列決定してもよい。
発明の一般的方法
本発明の一般的方法は次のとおりである。要するに、ヌクレオチド配列は、ヒト源および非ヒト源から得る。当該ヒトおよび非ヒトヌクレオチド配列を相互に比較し、相同である配列を同定する。当該相同配列を分析して、当該２種間で核酸配列差をもつものを同定する。次に分子進化分析を実施して、当該差の進化的有意性を定量的におよび定性的に評価する。２種、例えばヒトおよびチンパンジー間で、正に選択された遺伝子については、当該差が他の非ヒト霊長類にあるかどうかを、決定するのが有用である。次いで、当該配列は、分子的／遺伝的同一性および生物活性に関して特徴解明をする。最後に、当該情報を使って、ヒトの医学的にまたは商業的に関係ある状態の診断および治療に有用な作用物質の同定が可能である。
【００７０】
本発明の一般的方法は、ヒトのタンパク質コードヌクレオチド配列を、非ヒト、好ましくは霊長類、そして最も好ましくはチンパンジーのタンパク質コードヌクレオチド配列と比較すること、を設定する。他の非ヒト霊長類の事例は、ボノボ、ゴリラ、オランウータン、ギボン、旧世界猿、および新世界猿である。ヒト科群内の霊長類についての系統樹を図１に示す。バイオインフォマティクスを当該比較に適用し、進化的に有意な変化（類）であるヌクレオチド変化または変化類を含む配列を選択する。本発明は、何らかの進化的利点を与えるように進化した遺伝子の同定およびその特定の進化した変化の同定を可能にする。
【００７１】
ヒトおよびもう１つの非ヒト霊長類のタンパク質コード配列を比較して、相同配列を同定する。特定の生体機能をもつことが知られるまたは疑われているタンパク質コード配列は、当該比較の出発点として役立ててもよい。この比較を完結するための任意の適切な機構が、本発明により思量される。アラインメントは、手作業で、またはソフトウエア（適当なアラインメントプログラムの事例は当該技術分野で知られている）により実施してもよい。好ましくは、非ヒト霊長類からのタンパク質コード配列を、データベース検索、例えばＢＬＡＳＴ検索を経由してヒト配列に比較する。高スコア“ヒット”すなわちＢＬＡＳＴ分析後に有意の類似性を示す配列を回収し、分析することになる。有意の類似性を示す配列は、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の配列同一性をもつものでもよい。好ましくは、約８０％より大きな同一性を示す配列が、さらに分析される。データベース検索を経由して同定された相同配列は、普通に用いられる単純なアラインメントプログラムＨｉｇｇｉｎｓら（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ　８：１８９−１９１によるＣＬＵＳＴＡＬ　Ｖのような、当該技術分野で知られそして入手可能な配列アラインメント方法およびプログラムを用いて、それらの全体を整列してもよい。
【００７２】
あるいは、ヒトおよび非ヒト霊長類間のタンパク質コード配列の配列決定および相同性比較は、新たに開発されたシークエンシングチップ技術を用いることにより、同時に実施してもよい。例えば、Ｒａｖａら　米国特許第５，５４５，５３１号を参照されたい。
【００７３】
ヒトおよびもう１つの非ヒト霊長類の整列されたタンパク質コード配列は、特定部位におけるヌクレオチド配列差異を同定するために、分析される。ここでも、本分析を達成するために任意の適当な方法が、本発明により思量される。ヌクレオチド配列差異が全くなければ、当該非ヒト霊長類タンパク質コード配列は、通常それ以上分析されない。検出された配列変化は、普通、そして好ましくは、最初に正確さをチェックされる。好ましくは、最初のチェックは、当該技術分野でいずれもまたすべて知られている、１つまたは１つより多くの下記の工程の実施を含む：（ａ）非ヒト霊長類およびヒト配列間に変化がある点を見い出すこと；（ｂ）非ヒト霊長類に独特と思われる塩基が、当該コールド（ｃａｌｌｅｄ）塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、当該配列フルオログラム（クロマトグラム）をチェックすること；（ｃ）配列変化に対応する１つ以上のヒト配列があるかどうかを見るために、当該ヒトヒットをチェックすること。非ヒト霊長類配列中に異なるヌクレオチドがある位置に同じヌクレオチドをもつ同じ遺伝子についての複数のヒト配列エントリーは、当該ヒト配列が正確であること、そしてその変化が有意であること、の独立した裏付けを提供する。そうした変化は、これらのヌクレオチド配列変化が、そのコードタンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかどうかを決定するために、公開データベース情報および当該遺伝暗号を用いて、調べられる。「ヌクレオチド変化」の定義が明らかにしているように、本発明は、非ヒト霊長類からの対応配列に比較した場合に、ヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列に、置換、欠失、または挿入のいずれか、少なくとも１つのヌクレオチド変化を包含する。好ましくは、当該変化はヌクレオチド置換である。さらに好ましくは、その同定されたヒト配列中に１つ以上の置換が存在し、そして分子進化分析にかけられる。
【００７４】
数種の異なる分子進化分析すなわちＫＡ／ＫＳ型方法のいずれかを採用して、ヒト遺伝子配列と非ヒト霊長類のものとの間の前記同定ヌクレオチド変化の進化的有意性を定量的にまた定性的に評価することが可能である。ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＡｋａｓｈｉ（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｃｏｌ．Ｓｙｓｔ．２６：４０３−４２２；Ｌｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ミネソタ、１９９７。例えば、タンパク質への正の選択（すなわち、分子レベル適応進化）は、同義部位当りの同義置換（ＫＳ）に対する非同義部位当りの非同義ヌクレオチド置換（ＫＡ）の比のペアワイズ比較により、タンパク質コード遺伝子中に検出可能である（Ｌｉら，１９８５；Ｌｉ，１９９３）。ＫＡおよびＫＳの任意の比較を用いてもよいが、これら２つの変数を比として比較するのが、特に便利であり、そして最も有効である。配列は、標準的な統計方法を用いて、ＫＡおよびＫＳ間の統計的に有意な差を示すことにより同定する。
【００７５】
好ましくは、ＬｉらによるＫＡ／ＫＳ分析を用いて本発明を実行するが、種間の正に選択された遺伝子を検出できる他の分析プログラムも使用可能である。Ｌｉら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２：１５０−１７４；Ｌｉ（１９９３）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：９６−９９も参照；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１５１−１５４；Ｎｅｉ（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ニューヨーク，Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）。比に換算して遺伝子の相同タンパク質コード領域間で同義部位当りの同義置換の割合と非同義部位当りの非同義置換の割合との比較を含むＫＡ／ＫＳ法は、進化の際の中立選択とは異なり適応選択により駆動されることがあり得る配列置換を同定するのに使われる。同義（「サイレント」）」置換は、遺伝暗号の縮重のため、コードされるアミノ酸配列に変化をもたらさないものであり；非同義置換はアミノ酸交換を生じる。各タイプの変化の程度は、それぞれ同義部位置当りの同義置換および非同義部位当りの非同義置換の数である、ＫＡおよびＫＳとして推定可能である。ＫＡ／ＫＳの計算は、手作業でも、あるいはソフトウエアを用いることによっても実施可能である。適当なプログラムの例はＭＥＧＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）である。
【００７６】
ＫＡおよびＫＳを推定する目的のために、完全または部分ヒトタンパク質コード配列を使って、非同義および同義部位ならびに同義および非同義置換の総数を計算する。分析するポリヌクレオチド配列の長さは、任意の適切な長さでよい。好ましくは、何らかのおよびすべての有意な変化を決定するためには、全コード配列を比較する。Ｌｉ９３（Ｌｉ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：９６−９９）またはＩＮＡのような公共的に入手可能なコンピュータープログラムを使って、すべてのペアワイズ比較についてＫＡおよびＫＳ値を計算することが可能である。本分析は、少数の重要な変化が全体配列によりマスクされないように、「スライディングウインドウ（引違い窓）」方式で配列を調べるのに、さらに適用してもよい。「スライディングウインドウ」は、当該遺伝子の連続重複サブセクションの検査を指す（サブセクションは任意の長さでよい）。
【００７７】
非同義および同義置換の割合の比較は、ＫＡ／ＫＳ比により表される。ＫＡ／ＫＳは、検討中の配列に適応進化が働いた程度の反映であることが、示されている。コード配列の完全長または部分セグメントを、ＫＡ／ＫＳ分析に使用可能である。ＫＡ／ＫＳ比が高ければ高いほど、配列は適応進化を受けてきたこと、そして当該非同義置換は進化的に有意であることの、可能性が多い。例えば、ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）を参照されたい。好ましくは、ＫＡ／ＫＳ比は、少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０，より好ましくは少なくとも約１．２５，より好ましくは少なくとも約１．５０，またはより好ましくは少なくとも約２．００である。好ましくは、統計分析は、ステューデントのｔ検定およびＹａｎｇ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ　Ｅｖｏｌ．３７：４４１−４５６により記載された同様な比検定のような、標準法を非限定的に含み、すべての高ＫＡ／ＫＳ比について実施する。
【００７８】
１より有意に大きいＫＡ／ＫＳ比は、偶然だけの結果として予測されるより、また当該比が１より小さいか等しい場合に普通観察されるパターンに対比して、正の選択が、より多数のアミノ酸交換を固定したことを、強く示唆している。Ｎｅｉ（１９８７）；ＨｕｇｈｅｓおよびＨｅｉ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３５：１６７−１７０；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌ．４：９１１−９１３；ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＡｋａｓｈｉ（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｅｃｏ．Ｓｙｓｔ．２６：４０３−４２２；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）。１より少ない比は、負の、または精製選択の役割を一般には表している：すなわち、機能的で、有効なタンパク質の一次構造を変えないままにする強い圧力がある。
【００７９】
ＫＡ／ＫＳ比を計算するすべての方法は、関係種からの相同遺伝子のタンパク質コード領域についての同義部位当りの同義置換の数に対する非同義部位当りの非同義置換の数のペアワイズ比較に基づいている。各方法は、「多重ヒット」（すなわち、同一部位における１つ以上のヌクレオチド置換）を推定するために、異なる補正を履行している。各方法はまた、進化的時間に亘ってどのようにＤＮＡ配列が変化するかについて、異なるモデルを用いている。それ故、好ましくは、異なるアルゴリズムからの結果の組合わせを用いて、正に選択された遺伝子の検出のための感度のレベルおよび当該結果における信頼度を増加する。
【００８０】
好ましくは、ＫＡ／ＫＳ比は、パラソロガス遺伝子ペア（すなわち、遺伝子重複の結果である遺伝子ではなく、種分化の結果生じる遺伝子）ではなく、オルソロガス遺伝子ペアについて計算するべきである；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）。この区別は、系統樹構築を可能にする、ゴリラおよびオランウータンのような他の非ヒト霊長類との追加比較を実施することにより、行ってもよい。樹構築に使われる場合、オルソロガス遺伝子は、既知「種樹」を生じるはずである、すなわち、既知の生物学的樹を回復する樹を産生するはずである。それに対して、パラソロガス遺伝子は、既知の生物学的樹に違反するであろう樹を生じるはずである。
【００８１】
本明細書に記載された方法は、ヒトタンパク質コード配列に機能的に関係するヒトポリヌクレオチド配列の同定をもたらすことがあり得るのは、言うまでもない。そうした配列は、非限定的に、ヒトタンパク質をコードしない非コード配列またはコード配列を含むこともあり得る。これらの関係配列は、イントロンまたは（プロモーターおよびエンハンサーのような調節エレメントを含む）５´および３´フランキング配列のような、ヒトゲノム中のヒトタンパク質コード配列に、例えば、物理的に隣接する可能性もある。これらの関係配列は、ＧｅｎＢａｎｋのような公開ヒトゲノムデータベースの検索を経由して、または、別途、プローブとしてタンパク質コード配列でヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、配列決定することにより、得てもよい。関係コード配列を用いて非コード配列を得るための方法および技術は、当業者には周知である。
【００８２】
ＫＡ／ＫＳ分析のような分子進化分析により検出される進化的に有意なヌクレオチド変化は、ヒト（または非ヒト霊長類）におけるそれらの独特な存在またはこれらの変化がヒト（または非ヒト霊長類）において独特である程度について、さらに検定することも可能である。例えば、同定された変化は、他の非ヒト霊長類配列における存在／不在について試験してもよい。ヒトと１つの非ヒト霊長類との間の少なくとも１つの進化的に有意な変化をもつ配列は、他の非ヒト霊長類タンパク質コード配列のＰＣＲ分析のためのプライマーとして使用可能であり、そして結果として生じるポリヌクレオチドを配列分析して、同じ変化が他の非ヒト霊長類に存在するかどうかを見る。これらの比較は、当該適応進化的変化が、他の非ヒト霊長類に比較した場合、ヒト系列に独特であるかどうか、または当該適応変化が、ヒトおよび他の非ヒト霊長類に比較した場合、当該非ヒト霊長類（すなわち、チンパンジー）に独特であるかどうか、についてのさらなる識別を可能にする。ヒトで検出されるが、他の霊長類で検出されないヌクレオチド変化は、ヒトの適応進化的変化を表す可能性がさらに高い。あるいは、非ヒト霊長類（すなわち、チンパンジー）で検出され、ヒトまたは他の非ヒト霊長類で検出されないヌクレオチド変化は、チンパンジーの適応進化的変化を表す可能性が高い。比較に使われる他の非ヒト霊長類は、ヒトとのそれらの系統発生関係に基づいて選択可能である。近縁霊長類は、チンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびオランウータンのようなヒト科亜系列内のものであってもよい。非ヒト霊長類はまた、ヒト科群外にあり、したがって、旧世界猿および新世界猿のような、ヒトにそれほど近縁でないものであってもよい。そうした比較の統計的有意性は、確立された入手可能なプログラム、例えばＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１５１−１５４により使われるようなｔ検定を用いて決定してもよい。統計的に高いＫＡ／ＫＳ比を示すそれらの遺伝子は、適応進化を受けた可能性が非常に高い。
【００８３】
有意な変化をもつ配列は、異なるヒト集団からのゲノムにおいてプローブとして用いて、当該配列変化が１つ以上のヒト集団により共有されているかどうかを見ることが可能である。異なるヒト集団からの遺伝子配列は、例えば、ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，ヒトゲノム多様性プロジェクトにより、または、別途、多数の血縁関係のない多様なヒト集団からのＰＣＲ増幅ＤＮＡの直接配列決定から、入手可能になっているデータベースから得てもよい。異なるヒト集団において同定された変化の存在は、当該変化の進化的有意性をさらに示すはずである。有意な変化をもつチンパンジー配列は、当該配列変化が多くのチンパンジー間で共有されているかどうかを決定するために、同様な方法を用いて、入手し、評価することが可能である。
【００８４】
種間に有意の変化をもつ配列は、当業者に知られた方法および技術を用いて、それらの分子的／遺伝的同一性および生体機能の点で、さらに特徴解明が可能である。例えば、当該配列は、公共的に入手可能なバイオインフォーマティクスプログラムを用いて、ヒトゲノム内で遺伝子的におよび物理的に位置づけが可能である。当該ヌクレオチド配列内に新たに同定された有意な変化は、ヒト進化における当該遺伝子の顕在化の可能性がある役割およびヒト独特の機能性能力との顕在化の可能性がある関連とを示唆することがあり得る。当該同定配列をもつ推定遺伝子は、例えば、相同体検索により、さらに特徴解明してもよい。当該推定遺伝子と既知遺伝子との共通の相同性は、同じような生体役割または機能を示す可能性がある。推定遺伝子配列を特徴解明するもう１つの模範的方法は、既知配列モチーフに基づくものである。ある種の配列パターンは、シグナル配列、ＤＮＡ結合ドメイン、または膜貫通ドメインのような、特定の生体特徴をもつタンパク質の領域をコードすることが知られている。
【００８５】
有意な変化をもつ同定ヒト配列はまた、当該遺伝子が組織または細胞型特異性によって発現される場所を見ることによって、さらに評価が可能である。例えば、当該同定コード配列をプローブとして用いて、当該配列の発現パターンを明らかにするはずのｉｎ　ｓｉｔｕ　ｍＲＮＡハイブリッド形成法を実施可能である。ある組織で発現される遺伝子は、その組織、例えば脳組織に関連する重要なヒト機能に関連するものなので、より優れた候補になる可能性がある。ヒト発生の各段階における当該遺伝子発現のタイミングも決定可能である。
【００８６】
配列特徴解明のもう１つの模範的方法として、有意な変化をもつ同定ヌクレオチド配列の機能性役割は、酵母、線虫、ショウジョウバエ、およびマウスのようなモデル系で、同定された遺伝子の異なる対立遺伝子について機能検定を実行することにより、査定可能である。モデル系は、細胞基盤のものでも、またはトランスジェニック動物のようなｉｎ　ｖｉｖｏでもよい。好ましくは、トランスジェニックマウス系が使われる。細胞基盤系および／またはトランスジェニック動物系を作製する方法は、当該技術分野で知られており、本明細書で詳細に記載する必要はない。
【００８７】
配列特徴解明のもう１つの模範的方法として、コンピュータープログラムの使用は、ヒトおよびチンパンジーからの相同タンパク質の三次元構造のモデリングおよび視覚化を可能にする。チンパンジータンパク質（類）においてどのアミノ酸が交換されているかの特定の正確な知識は、機能的な相違と関連することがあり得る構造変化の検出を可能にする。このように、モデリング技術の利用は、前項で論考した機能性役割の同定と密接に関連している。これらの技術の個別のまたは組合わせたものの使用は、本発明の一部を構成する。例えば、チンパンジーＩＣＡＭ−３は、ヒトＩＣＡＭ−３がプロリンを含む部位（Ｐ１０１）に、グルタミン残基（Ｑ１０１）を含む。当該ヒトタンパク質は、このところで鋭く曲がることがわかっている。チンパンジータンパク質でのグルタミンによるプロリンの交換は、その点での曲がりをずっと鋭くなくしている可能性がある。これは、ＨＩＶビリオンへのＩＣＡＭ−３チンパンジータンパク質のパッキングに明白な意味をもつ。
【００８８】
本明細書に記載の方法により同定された配列は、医学的にまたは商業的に関係するヒトの状態の診断および治療に重要な用途がある。したがって、本発明は、ヒト独特のまたはヒトで増強された機能性能力を変調すること、および／または、これらの配列を用いてこれらの能力における欠陥を補正すること、に役立つ作用物質を同定するための方法を提供する。これらの方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系、細胞基盤発現系、およびトランスジェニック動物系のような、当該技術分野で知られるスクリーニング技術を採用する。本発明により提供されるアプローチは、急速に進化した遺伝子を同定するだけなく、それらがもう１つの種に存在すので、あまりに毒性が強くないと思われるタンパク質にするようにできる変調を示す。
スクリーニング法
本発明はまた、上記の方法を用いて同定され、そして特徴解明されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いるスクリーニング法も、提供する。これらのスクリーニング法は、ヒトの治療に役立つであろう仕方で当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能（類）を変調することも可能な作用物質を同定するのに有用である。一般に、当該方法は、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、上記の方法により同定されたポリヌクレオチド配列で形質移入してある細胞、あるいはそうしたポリヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドの調製物、のいずれかと接触させることを設定するが、そこでの作用物質は、当該ポリヌクレオチド配列または当該ポリペプチドのいずれかの機能を変調する能力により同定される。
【００８９】
本明細書で使われる場合、用語「作用物質」は、単純または複雑な有機または無機分子のような生物学的または化学的化合物、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドを意味する。膨大な一連の化合物、例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマーは合成が可能であり、またさまざまなコア構造に基づく合成有機および無機化合物があり、そしてこれらも、用語「作用物質」に含まれる。加えて、さまざまな天然源は、植物または動物抽出物および同類物のような、スクリーニング用の化合物を提供することも可能である。化合物は、単独で、または相互に組合わせて、試験してもよい。
【００９０】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「機能を変調する」ことは、作用物質を添加しないことに比較した場合に、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が変更されることを意味する。変調は、機能に影響する任意のレベルで生じることがあり得る。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は、直接的または間接的であってもよく、そして直接的にまたは間接的に測定してもよい。ポリヌクレオチドの「機能」は、複製、翻訳、および発現パターン（類）を非限定的に含む。ポリヌクレオチド機能はまた、当該ポリヌクレオチド内でコードされるポリペプチドに随伴する機能を含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用して、タンパク質発現、立体配座、折りたたみ（または他の物理的特徴）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能性特徴）、タンパク質の構造または機能の調節および／または他の側面、に影響する作用物質は、ポリヌクレオチド変調機能をもつと考えられる。有効な作用物質がポリヌクレオチドの発現を変調するように働く仕方は、非限定的に、１）当該ポリヌクレオチド中の転写因子応答配列に対する転写因子の結合を修飾すること；２）当該ポリヌクレオチドの発現に必要な２つの転写因子間の相互作用を修飾すること；３）当該ポリヌクレオチドの発現に必要な転写因子が核に入るための能力を変更すること；４）当該ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を阻害すること；５）普通はリガンドと相互作用し、そして当該リガンドのその結合が当該ポリヌクレオチドの発現をもたらす、細胞表面受容体を修飾すること；６）当該ポリヌクレオチドの発現に至るシグナル伝達カスケードの成分の不活性化を阻害すること；そして７）当該ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を増強すること、を含む。
【００９１】
ポリペプチドの「機能」は、非限定的に、立体配座、折りたたみ（または他の物理的特徴）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能性特徴）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、を含む。例えば、ポリペプチドに作用して、その立体配座、折りたたみ（または他の物理的特徴）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能性特徴）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、に影響する作用物質は、ポリペプチド変調機能をもつと考えられる。有効な作用物質がポリペプチドの機能を変調するように働く仕方は、１）立体配座、折りたたみ、または他の物理的特徴を変えること；２）その天然リガンドに対する結合強度を変えること、またはリガンドに対する結合の特異性を変えること；および３）当該ポリペプチドの活性を変更すること、を非限定的に含む。
【００９２】
ポリヌクレオチドの「機能」は、その発現、すなわち、複製および／または翻訳を含む。それはまた、（限定されずに）その立体配座、折りたたみ、および他の部分への結合も含むことがあり得る。
【００９３】
一般に、スクリーニングされる作用物質の選択は、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的、その認知された機能、その三次元構造（もしわかっているか、推測されるなら）、および合理的薬剤設計の他の側面のような、いくつかのパラメーターにより支配される。候補物質の多数順列を作製するために、コンビナトリアルケミストリーの技術を利用することも可能である。当業者は試験用の適当な作用物質を工夫および／または入手可能である。
【００９４】
本明細書に記載のｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング検定法は、慣用の薬剤スクリーニング検定法よりいくつかの利点をもつと思われる：１）作用物質が、所望の治療効果を達成するために、細胞内に入らなければならない場合、ｉｎ　ｖｉｖｏ検定は、当該作用物質が細胞に入れるかどうかの表示を与えることができる；２）ｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング検定法は、作用物質が当該検定系へ添加された状態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能の変調に関連する、少なくとも１つの特徴を発揮する効果がないが、一旦細胞内部では、それらが有効な作用物質になるような仕方で、細胞成分により修飾される、前記作用物質を同定できる；３）最も大切なことだが、ｉｎ　ｖｉｖｏ検定系は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能に関連する特徴を最終的には生じる経路の任意の成分に影響する作用物質の同定を可能にする。
【００９５】
一般に、スクリーニングは、本発明の方法を用いて同定されたポリヌクレオチドで形質移入しておいた適切な細胞の試料に作用物質を添加し、そしてその作用、すなわち当該ポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチド内でコードされたポリペプチドの機能の変調、をモニターすることにより実施可能である。当該実験は、好ましくは、候補作用物質を加えない対照試料を含む。次いで、当該処理および無処理細胞を、顕微鏡分析、生死判別試験、複製する能力、組織学的試験、当該細胞に随伴する特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、当該細胞または細胞可溶化物により発現される酵素活性のレベル、ＨＩＶのような感染性媒介物に曝された場合の当該細胞の相互作用、および他の細胞または化合物と相互作用する当該細胞の能力を、非限定的に含む任意の適当な表現型基準により比較する。例えば、前記形質移入された細胞は、試験される作用物質に曝露可能で、当該作用物質での処理の前に、間に、後に、当該細胞は、ＨＩＶのようなウイルスを感染させ、そして、例えば、細胞間ウイルス感染に対する当該細胞の感受性、当該ウイルスの複製、ウイルスタンパク質の産生、および／または当該ウイルス感染後の融合細胞形成を含む、ウイルス感染に対する当該細胞の感受性の任意の指標について試験可能である。処理および無処理細胞間の差異は、当該候補作用物質に起因する作用を示す。最適には、当該作用物質は、対照細胞に対するより、実験細胞に対してより大きな作用をもつ。適切な宿主細胞は、非限定的に、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞を含む。細胞の選択は、意図される検定の性質に少なくとも一部は依存するはずである。
【００９６】
あるポリヌクレオチドの発現を上方制御する作用物質を試験するために、当該ポリヌクレオチドが発現される（本明細書で使われる場合、発現は転写および／または翻訳を含む）ように、興味あるポリヌクレオチドで形質移入された適当な宿主細胞は、試験される作用物質と接触させられる。作用物質は、ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの発現増加をもたらすその能力について試験されることになろう。ベクターの作製および形質移入の方法は、当該技術分野で周知である。「形質移入」は、例えば、リポフェクション、形質導入、感染、またはエレクトロポレーションを含む、外因性配列を導入する任意の方法を包含する。当該外因性ポリヌクレオチドは、（プラスミドのような）非組込みベクターとして維持してもよく、または宿主ゲノム中へ組込まれてもよい。
【００９７】
転写を特異的に活性化する作用物質を同定するために、転写調節領域をレポーター遺伝子に連結し、そして当該構築体を適切な宿主細胞に添加することも可能である。本明細書で使われる場合、用語「レポーター遺伝子」は、同定可能な遺伝子産物（すなわち、レポータータンパク質）をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を非限定的に含む。レポーター遺伝子の産物に対する同定方法は、酵素検定法および蛍光測定検定法を非限定的に含む。レポーター遺伝子およびそれらの産物を検出するための検定法は、当該技術分野では周知で、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）および最新の定期刊行物に記載されている。レポーター遺伝子類、レポーター遺伝子検定法、および試薬キットも商業源から、容易に入手可能である。適切な細胞の事例は、真菌、酵母、哺乳類、および他の真核生物の細胞を非限定的に含む。通常技術の熟練者は、ウイルスベクターのような適当なベクターに調製を含む真核生物細胞を形質移入すること；エレクトロポレーションによるようなベクターを細胞中へ搬入すること；そしてレポーターまたは薬剤感受性エレメントを用いることによるような形質転換されている細胞を選択すること、のための技術に十分習熟しているはずである。
【００９８】
これらの構築体中の調節領域からの転写への作用物質の作用は、当該レポーター遺伝子産物の活性を通じて査定されるはずである。
上述の通常は抑制されている条件下での発現の増加に加えて、正常では維持または増加されるはずの場合に、発現が減少されることもあり得る。転写速度の減少を介して作用物質がこれを達成することがあり得るし、また上記のレポーター遺伝子系は、このための検定をする手段になるはずである。その種の作用物質を査定するための宿主細胞は、発現が許容状態にある必要があろう。
【００９９】
（興味のあるポリヌクレオチドから）ｍＲＮＡを転写する細胞は、ｍＲＮＡの半減期および／またはｍＲＮＡの翻訳を特異的に変調する作用物質を同定するのに使用できよう。そうした細胞は、プロセシングおよび／または当該ポリペプチドの翻訳後修飾への作用物質の作用を査定するのにも使えるはずである。作用物質が、当該ポリペプチドの代謝回転を修飾する（すなわち、その半減期を増やすか、減らす）ことにより、細胞中のポリペプチドの量を変調することもあり得る。ｍＲＮＡおよびポリペプチドに関する当該作用物質の特異性は、当該作用物質の不在下で当該産物を調べることにより、および無関係なｍＲＮＡおよびポリペプチドの産物をしらべることにより、決定されるはずである。ｍＲＮＡ半減期、タンパク質プロセシング、およびタンパク質代謝回転を調べる方法は、当業者には周知である。
【０１００】
ｉｎ　ｖｉｖｏスクリーニング法は、ポリペプチドとの相互作用を通じてポリペプチド機能を直接変調する作用物質の同定にも有用なことがあり得る。そうした作用物質は、正常なポリペプチド・リガンド相互作用を、もしあれば、遮断できるであろうし、あるいはそうした相互作用を増強または安定化できるであろう。そうした作用物質はまた、当該ポリペプチドの立体配座も変更できるであろう。当該作用物質の影響は、免疫沈澱反応を用いて決定可能であろう。適切な抗体は、当該ポリペプチドおよびそれと堅く会合した任意のタンパク質を沈澱させるのに使われるはずである。処理細胞からと無処理細胞から免疫沈澱されたポリペプチドを比較することによって、ポリペプチド・リガンド相互作用を、もしあれば、増大または阻害するであろう作用物質を同定可能であろう。ポリペプチド・リガンド相互作用はまた、ポリペプチド間の緊密ではあるが非共有結合相互作用を共有結合相互作用へ変換する、架橋形成試薬を用いて査定可能である。タンパク質・タンパク質相互作用を調べる技術は、当業者に周知である。タンパク質立体配座を査定する技術も、当業者に周知である。
【０１０１】
スクリーニング方法が、無細胞転写または翻訳系のようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ方法を含むことがあり得ることも、言うまでもない。それらの系では、転写または翻訳が生じるようにし、作用物質が機能を変調するその能力について試験される。ある作用物質がｍＲＮＡまたはポリヌクレオチドの翻訳を変調するかどうかを決定する検定のために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を用いてもよい。これらの系は商業的に入手可能で、関心のあるポリヌクレオチド配列に対応するｍＲＮＡを産生するｉｎ　ｖｉｔｒｏ手段を提供する。ｍＲＮＡが作られたら、それをｉｎ　ｖｉｔｒｏで翻訳し、そしてその翻訳産物を比較することも可能である。如何なる作用物質も含まないｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現系（負の対照）と、作用物質を含むｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現系との間の翻訳産物の比較は、当該作用物質が翻訳に影響するかどうかを示す。対照および試験ポリヌクレオチド間の翻訳産物の比較は、当該作用物質が、もしこのレベルで作用しているなら、（一般的な非選択的または非特異的な仕方で、翻訳に影響するのと異なり）、選択的に翻訳に影響するかどうかを示す。ポリペプチド機能の変調は、上記のｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ検定を、非限定的に含む多くの仕方で、ならびにタンパク質調製物を用いるｉｎ　ｖｉｔｒｏ検定で、達成可能である。ポリペプチド類は、天然源または組換え源から抽出および／または精製して、タンパク質調製物を作出可能である。作用物質をタンパク質調製物の試料に加え、そしてその影響をモニター可能である；すなわち、当該作用物質が、ポリペプチドに働いて、その立体配座、折りたたみ（または他の物理的特徴）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能性特徴）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、に影響するかどうか、そしてどのように影響するかで、それはポリペプチド変調機能をもつと考えられる。
【０１０２】
本明細書に記載された方法によって同定されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドに結合する作用物質についての検定のための事例では、ポリペプチドはまず、原核生物または真核生物発現系で、未変性タンパク質として、または（上に記載されたように同定されたポリヌクレオチドによりコードされた）ポリペプチドが十分特徴が解明されたエピトープまたはタンパク質と共役された融合タンパク質として、組換え的に発現される。次に、組換えポリペプチドは、例えば、適切な抗体または抗エピトープ抗体を用いる免疫沈澱により、または当該抱合体の固定化リガンドへの結合により、精製される。次いでポリペプチドまたは融合タンパク質から作られたアフィニティーカラムを用いて、適切に標識された化合物の混合体を選別する。適当な標識は、蛍光色素、放射性同位体、酵素、および化学発光化合物を、非限定的に含む。非結合および結合化合物は、当業者により日常的に使われるさまざまな条件（例えば、高塩、界面活性剤）を用いる洗浄によって分離可能である。当該アフィニティーカラムへの非特異的結合は、単に当該抱合体またはエピトープだけを含むアフィニティーカラムを用いて、当該化合物混合体を前洗浄することにより、最小限にすることも可能である。同様な方法は、ポリペプチドに対する結合に競合する作用物質（類）についてのスクリーニングに使用可能である。アフィニティークロマトグラフィーに加えて、溶融温度の変化、または別の分子に結合すると変化するタンパク質の蛍光異方性を測定するような他の技術がある。例えば、ポリペプチドに共役的に結合するセンサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｓｔｉｔｔら（１９９５）Ｃｅｌｌ　８０：６６１−６７０）を用いるＢＩＡコア検定法は、異なる作用物質の結合活性を決定するのに実施してもよい。
【０１０３】
本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏスクリーニング法は、ポリペプチドのアミノ酸配列、三次元原子構造、または他の性質（または性質類）が、ポリペプチドに結合すると予想される作用物質を設計するための基礎を提供する、構造的な、または合理的な薬剤設計を含むことも、また言うまでもない。一般に、このような関係における作用物質の設計および／または選択は、ヒトおよび相同非ヒト霊長類ポリペプチドの構造の並行比較、当該ポリペプチド標的の認知された機能、その三次元構造（もしわかっているか、推測されるなら）、および合理的薬剤設計の他の側面ような、いくつかのパラメーターにより支配される。候補作用物質の多数順列を作製するために、コンビナトリアルケミストリーの技術を利用することも可能である。
【０１０４】
また本発明のスクリーニング法では、当該技術分野で知られるトランスジェニック動物系も思量される。
上記のスクリーニング法は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を変調する活性を示すことがあり得る任意の作用物質を検出するために設計された、一次選別を表す。当業者は、作用物質をさらに評価するためには、二次試験が必要らしいことを、認識するだろう。例えば、二次試験は、当該技術分野で知られるマウスおよび他の動物モデル（ラットのような）を用いる感染性検定で、当該作用物質（類）を試験することを含む。加えて、細胞毒性検定は、一次選別で陽性と試験された作用物質が生きている生物での使用に適するであろうことの、さらなる確証として実施されはずである。例えば、ＭＴＴ検定法（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む、細胞毒性のための任意の検定法が、本目的に適するはずである。
【０１０５】
本発明はまた、本明細書に記載されたスクリーニング法により同定された作用物質を含む。
正に選択された非ヒト形質を同定するのに有用な方法
本発明の１つの側面で、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、正の進化的に有意な変化をもたらした自然淘汰を受けたことがある（すなわち、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒトに存在しない正の属性をもつ）。本発明のこの側面では、正に選本択されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある種の疾患に対する感受性または抵抗性、または商業的に関係がある形質と関連する可能性がある。本態様の事例は、感染症、癌またはにきびに対する感受性または抵抗性と関連する可能性があるか、あるいは毛髪生長または筋肉量のようなヒトに関心がある審美的状態と関連する可能性がある、非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーで正に選択されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、非限定的に含む。本態様の事例は、エイズへのＨＩＶ進行に対する感受性または抵抗性と関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。したがって本発明は、エイズの発症へ進行しているＨＩＶ感染に対する抵抗性の基礎を成す分子機構への洞察の獲得に役立つことも可能であり、エイズの発症を防ぎ、および／または、遅らせる薬剤のような作用物質を発見および／または設計するのにも役立つことが可能な情報を提供する。例えば、その機能が、身体のＭＡＣ（膜侵襲複合体）防御系（Ｍｅｒｉら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６１６：９２３−９３５）の補体アームからこれらの細胞を保護することにある、白血球および赤血球タンパク質として同定されたＣＤ５９は、チンパンジーで正に選択されていることが見い出された（実施例１６参照）。チンパンジーに見られるＣＤ５９は、ヒトに見られない、エイズの進行に対する抵抗性を付与すると信じられている。したがって、正に選択されたチンパンジーＣＤ５９は、実施例に記載されているように、ヒトにおけるエイズの進行を停止するのに有用な作用物質または薬剤の開発に役立つ可能性がある。
【０１０６】
商業的に関係がある事例は、毛髪生長、にきび、または筋肉量のような審美的形質と関連することがあり得る、非ヒト霊長類で正に選択されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、非限定的に含む。
【０１０７】
したがって、１つの側面において、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定する方法を提供するが、そこでの当該ポリペプチドは、医学的にまたは商業的に関係ある正の進化的に有意の変化と関連することがあり得る。当該方法は、（ａ）ヒトタンパク質コードヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類のタンパク質コードヌクレオチド配列と比較すること；そして（ｂ）ヒトの対応する配列に比較して、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む、非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列を選択することであって、そこでの当該変化が進化的に有意である：工程を含む。この方法により同定された配列は、非ヒト霊長類で独特なまたは増強した生体的にまたは医学的に関係ある機能との潜在的関連について、さらに特徴解明および／または分析を行ってもよい。
正に選択されたヒト形質を同定するのに有用な方法
本発明は、ヒトの独特のまたは増強した機能性能力または形質、例えば、脳機能またはより長い寿命と関連することがあり得るヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を具体的に提供する。より詳細には、これらの方法は、高容量情報処理、貯蔵および検索能力、創造性、および言語能力のような脳機能を非限定的に含む、ヒトにおいて独特でありまたは増強した能力と関連することがあり得る、それらの遺伝配列を同定する。さらに、これらの方法は、他の非ヒト霊長類に比較した場合、ヒトの脳が増強したレベルで実施することに関する、他の脳機能特徴に関連することがあり得るそれらの配列を同定する；これらの相違は、脳仲介感情応答、移動運動、疼痛／快楽感覚、嗅覚、気質、および長寿を含むことがあり得る。
【０１０８】
本方法において、本発明の一般的方法は、上記のように適用される。一般的には、本明細書に記載の方法は、（ａ）ヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類のものと比較すること；そして（ｂ）非ヒト霊長類のそれにに比較した場合、ヒトの独特のまたは増強した機能性能力に関連することがあり得る進化的に有意な変化をもつそれらのヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列を選択すること、を設定する。
【０１０９】
本実施態様では、ヒト配列は、進化的に有意な変化を含む（すなわち、ヒト配列は、そうした変化が選択圧に応答していることを示唆する仕方で、１つ以上の非ヒト霊長類種配列と相違する）。当該進化的に有意な変化を含む遺伝子によりコードされるタンパク質の本体および機能を特徴解明し、そして当該タンパク質が、独特のまたは増強したヒトの機能に関与する可能性があるかどうかの決定を行う。もし当該タンパク質が独特のまたは増強したヒトの機能に関与するならば、当該情報は、その独特のまたは増強したヒトの機能を補足する、または別途変調する、ことができる作用物質を同定するような仕方で利用される。
【０１１０】
本発明の非限定的事例として、ヒト脳の機能的独特さの基礎になる遺伝的（すなわち、ヌクレオチド配列）差異を同定することは、ヒトの脳機能を変調でき、および／または機能的欠陥を修正するのを助ける作用物質を設計するための基盤を提供することがあり得る。これらの配列は、診断試薬および／または生物医学研究道具の開発にも利用できよう。本発明はまた、ヒト脳タンパク質コード配列と非ヒト霊長類からのものとの大規模比較のための方法を提供する。
【０１１１】
同定されたヒト配列変化は、ヒト脳機能に関与する可能性がある候補ヒト遺伝子のデータベースを確立するのに使用可能である。候補は、当該遺伝子が、チンパンジーまたは他の非ヒト霊長類に比較して、ヒト脳に見られる独特のまたは増強した機能性能力の責任になっている確度に従ってランク付けされる。さらに、当該データベースは、候補遺伝子類の順位付けされたコレクションを提供するだけでなく、ヒトおよびチンパンジー（および他の非ヒト霊長類）との間に存在する正確な分子配列差も提供し、それにより当該機能差の基になる変化を規定する。この情報は、医薬剤のための有用な標的として役立つ可能性がある当該タンパク質上の潜在的部位の同定に有用な可能性もある。
【０１１２】
したがって、本発明はまた、（ａ）上記の方法に従って、ヒトヌクレオチド配列を同定すること；および（ｂ）モデル系において、同定された配列の存在または不在の機能的影響を分析すること、を含む、進化的に有意のヌクレオチド変化をヒトにおいて独特のまたは増強した脳機能能力に関連させるための方法も提供する。
【０１１３】
さらなる研究を、推定機能を確認するために行ってもよい。例えば、当該推定機能は、一時的にまたは安定的に形質移入された哺乳動物培養細胞を用いる、または、そのコードされたポリペプチドの発現の不在の効果を査定するために、同定されたポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンスクローンで形質移入された哺乳動物細胞を用いる、適切なｉｎ　ｖｉｔｒｏ検定法で検定可能である。１ハイブリッドおよび２ハイブリッド研究のような研究は、例えば、当該ポリペプチドがどのような他の高分子と相互作用するかを決定するために、実行してもよい。トランスジェニック線虫またはショウジョウバエは、行動研究を含む、さまざまな機能検定に使用可能である。適切な研究は、同定されたポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチド内でコードされたポリペプチドの性質に依存し、当業者には自明なはずである。
エイズ実施態様の説明（正に選択された非ヒト形質の事例）
エイズ（後天性免疫不全症候群）流行病は、世界中で３千万もの人々を脅していると推定されてきた（ＵＮＡＩＤＳ／ＷＨＯ，１９９８，「世界ＨＩＶ／エイズ流行病に関する報告書」）。先進国でも百万をはるかに上回る人々が感染しており、そしてサハラ砂漠以南のアフリカの一部では、現在、成人の４人に１人が当該ウイルスをもっている（ＵＮＡＩＤＳ／ＷＨＯ，１９９８）。ワクチンを開発する努力はなされているものの、有効なワクチンについての近い将来の見込みは立っていない。ＢａｌｔｅｒおよびＣｏｈｅｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８１：１５９−１６０；ＢａｌｔｉｍｏｒｅおよびＨｅｉｌｍａｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍ．２７９：９８−１０３。治療法の開発を一層複雑化しているのは、ＨＩＶ（エイズに責任のあるヒト免疫不全症ウイルス）の急速な突然変異速度で、それはウイルスタンパク質に急速な変化を生成する。これらの変化は、ウイルスタンパク質を標的とする、現行の治療法をウイルスが結局逃れることを可能にする。Ｄｏｂｋｉｎ（１９９８）Ｉｎｆ．Ｍｅｄ．１５（３）１５９。当初非常に有望とされた薬剤カクテルさえも、薬剤耐性変異株の出現を受けている。ＢａｌｔｅｒおよびＣｏｈｅｎ（１９９８）；Ｄｏｂｋｉｎ（１９９８）。このように、ＨＩＶ感染者におけるエイズの進行を遅らせるまたは阻止する治療法の開発に対してなお切実な要請がある。Ｃｈｕｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：１３１９３−１３１９７；Ｄｏｂｋｉｎ（１９９８）。
【０１１４】
ヒトに最も近縁なチンパンジー（Ｐａｎ　ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）は、ＨＩＶ−１による感染後の疾患経過の研究のためには、よくないモデルであることが、意外にも判明した。Ｎｏｖｅｍｂｒｅら（１９９７）；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（５）：４０８６−４０９１。ＨＩＶ−１に感染しても、チンパンジーは病気の進行に抵抗性を示す。１００頭以上の捕獲チンパンジーが感染されたが、今までのところ、僅か１頭のチンパンジーだけが完全発症エイズまで進行したことが知られている。Ｎｏｖｅｍｂｒｅら（１９９７）；Ｖｉｌｌｉｎｇｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．２６（１−２）：１１−１８。明らかに、チンパンジーで当該疾患の進行に抵抗性を付与する機構（類）を理解することは、ＨＩＶ感染ヒトに対する治療剤を開発する努力のために貴重なことが、判明する可能性がある。
【０１１５】
ヒトへのその近年の種横断伝播の前に、（恐らく何千年間も）野生のチンパンジー集団はＨＩＶ−１ウイルスを宿していたと、一般に信じられている。Ｄｕｂｅら（１９９４）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２０２：３７９−３８９；ＺｈｕおよびＨｏ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ　３７４：５０３−５０４；Ｚｈｕら（１９９８）；Ｑｉｎｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：２４０７−２４１４。この長い期間に、ウイルス／宿主共進化が明らかに順応をもたらし、それがエイズ進行に対するチンパンジー抵抗性を説明している。ＢｕｒｎｅｔおよびＷｈｉｔｅ（１９７２）；Ｎａｔｕｒａｌ　Ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ（ケンブリッジ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）；Ｅｗａｌｄ（１９９１）Ｈｕｍ．Ｎａｔ．２（ｉ）：１−３０。本明細書に引用されたすべての文献は、全部が参考文献によって本出願に援用される。
【０１１６】
本発明の１つの側面は、（ａ）チンパンジー（Ｐａｎ　ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）が、ＨＩＶ感染に感受性があるにもかかわらず、エイズ発症に対して抵抗性を示してきたが（Ａｌｔｅｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２６：５４９−５５２；Ｆｕｌｔｚら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：１１６−１２４；Ｎｏｖｅｍｂｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（５）：４０８６−４０９１）、一方ヒトは、この恐ろしい疾患の発症に罹り易いので、チンパンジーにおけるある種の遺伝子がこの抵抗性に寄与している可能性がある；そして（ｂ）（チンパンジーのような）他種からの相同遺伝子に比較した場合、ヒト遺伝子における変化が進化的に有意である（すなわち、正の選択的圧力を示す）かどうかを評価することが可能である、という観察から生じる。したがって、タンパク質コードポリヌクレオチドは、進化の際の正の適応選択の結果としてらしいが、チンパンジー（ならびに他のエイズ抵抗性霊長類）に見られるが、ヒトには見られない配列変化を含む可能性がある。さらに、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列におけるそうした進化的に有意な変化は、エイズの発症に抵抗するための、（チンパンジーのような）エイズ抵抗性非ヒト霊長類の能力に起因する可能性がある。本発明の方法は、エイズに対する感受性または抵抗性に関連することがあり得る候補遺伝子を同定するために、選択的比較分析を採用するが、それは、治療的調停のための新しい宿主標的ならびに抵抗性を付与するように進化した変化に関する特定の情報を提供することも可能である。（ウイルスタンパク質および／または機構と違って）宿主タンパク質を含む治療方法の開発は、抵抗性ウイルス変異体の出現を遅らせたり、あるいは回避したりすることさえあり得る。当該発明はまた、同定された配列および構造差異を用いるスクリーニング法も提供する。
【０１１７】
本発明は、エイズの感染後の発症に対する感受性に関連することがあり得るヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。逆に、本発明はまた、エイズの発症に対する抵抗性に関連することがあり得る（チンパンジーのような）エイズ抵抗性非ヒト霊長類からのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法も提供する。エイズの発症に対する感受性または抵抗性の基礎にある遺伝的（すなわち、ヌクレオチド配列）およびその結果生じるタンパク質の構造的および生化学的差異を同定することは、エイズへ進行するＨＩＶ感染に対する予防および／または治療を提供できる作用物質を発見するおよび／または設計するための基盤を提供することがあり得る。これらの差異は、診断試薬および／または生物医学研究道具の開発にも利用できよう。例えば、抵抗性を付与するタンパク質の同定は、当該抵抗性タンパク質が一部かかわる疾患経路の分裂に基づく診断試薬または生物医学研究道具の開発を可能にするであろう。
【０１１８】
一般的に、本明細書に記載の方法は、（ａ）ヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列を、そこでは当該ヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列がエイズの発症と関連する、（チンパンジーのような）エイズ抵抗性非ヒト霊長類のものと比較すること；そして（ｂ）エイズの発症に対する感受性と関連することがあり得る進化的に有意な変化をもつそれらのヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列を選択すること、を設定する。もう１つの態様において、当該方法は、（ａ）ヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列を、そこでは当該ヒトタンパク質コードポリヌクレオチド配列がエイズの発症と関連する、（チンパンジーのような）エイズ抵抗性非ヒト霊長類のものと比較すること；そして（ｂ）エイズの発症に対する抵抗性と関連することがあり得る進化的に有意な変化をもつそれらの非ヒト霊長類タンパク質コードポリヌクレオチド配列を選択すること、を設定する。
【０１１９】
明らかなように、本明細書に記載の方法は、他の感染症に適用できる。例えば、非ヒト霊長類が有意な期間（すなわち、正の選択を可能にした十分な時間）当該感染症を宿してきたことが、わかっておりまたは信じられており、そして当該疾患の発症に対して抵抗性があるような、状況で使用可能であろう。それ故、他の態様で、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法を提供するが、そこでの当該ポリペプチドは、（ａ）感染症抵抗性非ヒト霊長類タンパク質コード配列を、ヒトタンパク質コード配列に比較することであって、そこでの当該ヒトタンパク質コード配列は当該感染症の発症と関連する；そして（ｂ）対応するヒト配列に比較して、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む感染症抵抗性非ヒト霊長類配列を選択することであって、そこでの当該ヌクレオチド変化が進化的に有意である：工程を含み、感染症の発症に対する抵抗性と関連してもよい。もう１つの態様において、本発明は、ポリペプチドをコードするヒトポリヌクレオチド配列を同定するための方法を提供するが、そこでの当該ポリペプチドは、（ａ）ヒトタンパク質コード配列を感染症抵抗性非ヒト霊長類のタンパク質コードポリヌクレオチド配列に比較することであって、そこでの当該ヒトタンパク質コード配列は当該感染症の発症と関連する；そして（ｂ）感染症抵抗性非ヒト霊長類の対応する配列に比較して、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含むヒトポリヌクレオチド配列を選択することであって、そこでの当該ヌクレオチド変化が進化的に有意である：工程を含み、感染症の発症に対する感受性と関連してもよい。
【０１２０】
本発明において、エイズ抵抗性非ヒト霊長類からの相同体と比較されるヒト配列は、ＨＩＶ伝播（すなわち、複製）、播種および／またはその後のエイズへの進行とのそれらの既知のまたは推測される関連に基づいて選択される。そうした知識は、例えば、出版された文献および／または公開データベース（ＧｅｎＢａｎｋのような配列データベースを含む）から得る。（ウイルス複製を含む）エイズの発症に関与する経路は多くの遺伝子を含むので、多数の適当な候補は、本発明の方法を用いて試験してもよい。表１は、調べられる遺伝子の典型的なリストを含む。それらの配列は当該技術分野で一般に知られている。
表１：調べられる／られたヒト遺伝子のサンプルリスト
遺伝子　　　　　　　　　　　　　機能
ｅＩＦ−５Ａ　　　　　　　　　　開始因子
ｈＰＣ６Ａ　　　　　　　　　　　プロテアーゼ
ｈＰＣ６Ｂ　　　　　　　　　　　プロテアーゼ
Ｐ５６ｌｃｋ　　　　　　　　　　　シグナル伝達
ＦＫ５０６結合タンパク質　　　　イムノフィリン
カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）　　？
Ｂａｘ　　　　　　　　　　　　　ＰＣＤプロモーター
ｂｃｌ−２　　　　　　　　　　　アポトーシスインヒビター
ｌｃｋ　　　　　　　　　　　　　チロシンキナーゼ
ＭＡＲＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）
プロテインキナーゼ
ＣＤ４３　　　　　　　　　　　　シアロ糖タンパク質
ＣＣＲ２Ｂ　　　　　　　　　　　ケモカイン受容体
ＣＣＲ３　　　　　　　　　　　　ケモカイン受容体
Ｂｏｎｚｏ　　　　　　　　　　　ケモカイン受容体
ＢＯＢ　　　　　　　　　　　　　ケモカイン受容体
ＧＰＲ１　　　　　　　　　　　　ケモカイン受容体
ストロマ由来因子１（ＳＤＦ−１）　ケモカイン
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）　　　ＰＣＤプロモーター
ＴＮＦ受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）　受容体
インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）　サイトカイン
インターロイキン１α（ＩＬ−１α）　サイトカイン
インターロイキン１β（ＩＬ−１β）　サイトカイン
インターロイキン２（ＩＬ−２）　　サイトカイン
インターロイキン４（ＩＬ−４）　　サイトカイン
インターロイキン６（ＩＬ−６）　　サイトカイン
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）　サイトカイン
インターロイキン１３（ＩＬ−１３）　サイトカイン
Ｂ７　　　　　　　　　　　　　　　シグナル伝達タンパク質
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）
サイトカイン
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子　サイトカイン
ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）
キナーゼ
ホスファチジルイノシトール４キナーゼ（ＰＩ４−キナーゼ）
キナーゼ
ＨＬＡクラスＩα鎖　　　　　　　　組織適合性抗原
β２ミクログロブリン　　　　　　　リンパ球抗原
ＣＤ５５　　　　　　　　　　　　　崩壊促進因子
ＣＤ６３　　　　　　　　　　　　　糖タンパク質抗原
ＣＤ７１　　　　　　　　　　　　　　　？
インターフェロンα（ＩＦＮ−α）　サイトカイン
ＣＤ４４　　　　　　　　　　　　　細胞接着
ＣＤ８　　　　　　　　　　　　　　糖タンパク質
既に調べられた遺伝子（１３）
ＩＣＡＭ−１　　　　　　　　　　　免疫系
ＩＣＡＭ−２　　　　　　　　　　　免疫系
ＩＣＡＭ−３　　　　　　　　　　　免疫系
白血球会合機能１分子α（ＬＦＡ−１）　免疫系
白血球会合機能１分子β（ＬＦＡ−１）　免疫系
Ｍａｃ−１α　　　　　　　　　　　免疫系
Ｍａｃ−１β（ＬＦＡ−１βに相当）　免疫系
ＤＣ−ＳＩＧＮ　　　　　　　　　　免疫系
ＣＤ５９　　　　　　　　　　　　　補体タンパク質
ＣＸＣＲ４　　　　　　　　　　　　ケモカイン受容体
ＣＣＲ５　　　　　　　　　　　　　ケモカイン受容体
ＭＩＰ−１α　　　　　　　　　　　ケモカイン
ＭＩＰ−１β　　　　　　　　　　　ケモカイン
ＲＡＮＴＥＳ　　　　　　　　　　　ケモカイン
ヒトおよびチンパンジーのようなエイズ抵抗性非ヒト霊長類の整列タンパク質コード配列を分析し、特定の部位におけるヌクレオチド配列差を同定する。検出された配列変化は、一般的に、また好ましくは、上記のように最初に正確さをチェックする。ＫＡ／ＫＳ分析のような分子進化分析により検出される進化的に有意なヌクレオチド変化は、当該非ヒト霊長類遺伝子またはヒト遺伝子が正の選択を受けていたかどうかを決定するために、さらに査定可能である。例えば、その同定された変化は、他のエイズ抵抗性非ヒト霊長類配列における存否について試験が可能である。ヒトおよび１種のエイズ抵抗性非ヒト霊長類との間に少なくとも１つの進化的に有意の変化をもつ配列は、他の非ヒト霊長類タンパク質コード配列のＰＣＲ分析のプライマーとして使うことが可能で、そして結果として生じたポリヌクレオチドを配列決定し、同じ変化が他の非ヒト霊長類に存在するかどうかを見る。これらの比較は、当該適応進化的変化が、他の非ヒト霊長類に比較した場合に、（チンパンジーのような）エイズ抵抗性非ヒト霊長類に独特であるかどうかにつき、さらなる識別を可能にする。例えば、チンパンジーに検出されるが、他の霊長類に検出されないヌクレオチド変化は、当該チンパンジー遺伝子への正の選択を一層表しているようである。比較に使われる他の非ヒト霊長類は、ヒトとの系統分類的関係に基づき選択可能である。近縁の霊長類は、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、およびオランウータンのようなヒト科亜系列内のものであってもよい。非ヒト霊長類はまた、当該ヒト科群の外部にあるもので、したがって旧世界猿および新世界猿のようなヒトにそれほど近縁でないものでもよい。そうした比較の統計的有意性は、確立された入手可能なプログラム、例えばＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１５１−１５４により使われたようなｔ検定、を用いて決定してもよい。
【０１２１】
さらに、有意な変化をもつ配列は、当該配列変化が１つ以上の個体に共有されてているかどうかを見るため、異なるヒトからのゲノムにおけるプローブとして使用可能である。例えば、個人によっては、エイズへの進行が遅い者（「遅進行者」）があり、（ａ）チンパンジー配列と遅進行者ヒト個人からの相同配列との間の、および／または（ｂ）エイズ感受性個人と遅進行者個人との間の、比較は興味深いものであろう。異なるヒト集団からの遺伝子配列は、例えば、ヒトゲノム多様性プロジェクトにより入手可能なデータベースから、あるいは別途多数の無血縁の多様なヒト集団からのＰＣＲ増幅ＤＮＡの直接配列決定から、得ることができる。ヒト遅進行者で同定された変化の存在は、当該変化の進化的有意性をさらに示すものと考えられる。
【０１２２】
本明細書に例示されるように、エイズの進行に対するチンパンジーの抵抗性と関連づけられているＣＤ５９タンパク質は、ヒトＣＤ５９に比べて進化的に有意のヌクレオチド変化を示す。ＣＤ５９（プロテクチン、１Ｆ−５Ａｇ，Ｈ１９，ＨＲＦ２０，ＭＡＣＩＦ，ＭＩＲＬおよびＰ−１８としても知られる）は、末梢血液の白血球および赤血球上に発現され、そして補体によるヒト細胞の溶解を制限するように機能する（Ｍｅｒｉら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：９２３）。より具体的には、ＣＤ５９は、細胞膜に穴様の損傷をつくる補体タンパク質である膜侵襲複合体の阻害物質として、働く。このようにＣＤ５９は、それ自身の防御系の補体アームから身体の細胞を保護する（Ｍｅｒｉら、上記）。当該ヒト相同体は感染者におけるエイズの進行に関係するとされていたので、本タンパク質のチンパンジー相同体が調べられた。ＣＤ５９は、ＨＩＶビリオンにより選択的に取上げられる宿主細胞由来タンパク質の１つであることが、明らかにされた（Ｆｒａｎｋら（１９９６）ＡＩＤＳ　１０：１６１１）。加えて、宿主細胞ＣＤ５９を取込んだＨＩＶビリオンは、補体の作用から保護されることが、明らかにされた。このようにヒトでは、ＨＩＶは、犠牲者の免疫系による攻撃から自身を保護するために、そしてそれにより感染過程を推進するために、ＣＤ５９を利用する。当該事例で理論づけされるように、正に選択されたチンパンジーＣＤ５９は、病気の進行を阻止する適応変化を構成している可能性がある。当該ウイルスはチンパンジーＣＤ５９の防御性役割を強奪できず、それにより当該ウイルスがチンパンジーの免疫系に感受性をもつようになるらしい。
【０１２３】
本明細書にさらに例示されるように、ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質も、ヒトおよびゴリラに比較した場合、チンパンジーで正に選択されていることが明らかにされた。ＤＣ−ＳＩＧＮは、樹状細胞上で発現され、そしてＨＩＶ−１ウイルスが未分化のＴ細胞に感染する場所の、リンパ節への当該ウイルスの移動のための機構を提供すると記載されている（Ｇｅｉｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．Ｈ．ら（２０００）Ｃｅｌｌ　１００：５８７−５９７）。当該Ｔ細胞の感染は、最終的に免疫系を危なくし、次いで完全発症エイズをもたらすことになる。ＨＩＶ−１ウイルスは、ＤＣ−ＳＩＧＮの細胞外部分に結合し、そして次にそれらのＣＤ４タンパク質を経由してＴ細胞に接近する。ＤＣ−ＳＩＧＮは、非常に高いＫＡ／ＫＳ比をもつＩＣＡＭ−３をそのリガンドとしてもつ。チンパンジーＩＣＡＭ−３への正の選択は、ＤＣ−ＳＩＧＮへの持続的結合を許容するための代償性変化の結果であったらしい。当該事例で理論づけされるように、正に選択さたチンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮは、病気進行を阻止するもう１つの適応変化を構成するらしい。チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの三次元構造の解明および、ＨＩＶ−１がＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を妨げられる機構の解明が行われれば、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮの正常な機能を分裂させずに、チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの作用を模倣する薬剤を設計することが可能になるだろう。
胸部増強態様の説明（正に選択されたヒト形質の事例）
非ヒト霊長類に比べて、女のヒトは、前妊娠、前授乳性の肥大した胸部組織を示す。実施例で論考されているように、この二次性徴は、乳児との長期の対偶結束および長期の養育に伴って、ヒトでの進化行動を容易にするためと考えられている。本発明の１つの側面は、肥大胸部の発生で正に選択されてきた、それらのヒト遺伝子を同定することに関する。具体的には、本発明は、ヒトでの肥大胸部に関連してきたヒトポリヌクレオチド配列が、肥大胸部を示さない非ヒト霊長類に比べて、進化的に有意な変化を受けたかどうかを決定する方法を含むが、それは、ａ）何らかのヌクレオチド変化を同定するために、当該ヒトポリヌクレオチド配列を、対応する非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較すること；そしてｂ）当該ヒトヌクレオチド変化が進化的に有意かどうかを決定すること：を含む。
【０１２４】
ヒトにおける正常な胸部発達と関連づけられてきたヒトＢＲＣＡ１遺伝子は、チンパンジーおよび他の非ヒト霊長類のＢＲＣＡ１遺伝子に比べて、正に選択されていることが、見い出された。それらの同定された進化的に有意なヌクレオチド変化は、ＢＲＣＡ１遺伝子またはタンパク質の機能を変調できる作用物質の開発に役立つ可能性があろう。
作用物質を含有する治療組成物
本明細書に記載されるように、作用物質は、対象方法に従って同定された、正に選択されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドの有効性を増加または減少する能力について、選別可能である。例えば、胸部発達を増強するのに適当であり得る作用物質は、ＢＲＣＡ１タンパク質またはそのリガンドと直接相互作用するもの、またはＢＲＣＡ１タンパク質の阻害剤を遮断するもの、を含む可能性がある。あるいは、ある作用物質は、ＢＲＣＡ１発現を増加させることにより、胸部発達を増強することもあり得る。ＢＲＣＡ１の機構がさらに解明されれば、その効能を増強する戦術が考案されるだろう。
【０１２５】
もう１つの例で、エイズの進行を低減させるために適当であり得る作用物質は、ヒトＣＤ５９をビリオン粒子中へパッキングするのを不適当にすることによるか、または細胞膜に関する当該タンパク質の定位を変えること（または何か別の機構を経由して）によるか、恐らくいずれかにより、ＨＩＶビリオンに対して当該タンパク質を役立たなくする仕方で、ヒトＣＤ５９タンパク質と直接に相互作用するものを含む。当該候補作用物質は、融合細胞形成またはエイズの進行の他の証印が低減するかどうかを決定するために、当該作用物質を、ヒトＣＤ５９を発現するＨＩＶ感染細胞と接触させる検定法を用いて、ＣＤ５９機能を変調するそれらの能力について選別可能である。当該検定法は、ＨＩＶビリオンが、ＭＡＣ複合体による侵襲を阻止するために、ＣＤ５９を効果的にパックできる、および／またはＣＤ５９を利用できるかどうかの検出を可能にする。
【０１２６】
エイズ進行を遅らせることがあり得る１つの作用物質は、複数のＧＰＩリンクをもつように修飾されたヒトＣＤ５９である。本明細書に記載されているように、ヒトＣＤ５９に見られる単一ＧＰＩリンクに比較して、３つのＧＰＩリンクを含むチンパンジーＣＤ５９は、チンパンジーにおけるＨＩＶ感染の進行を遅らせる。好ましくは、当該修飾ヒトＣＤ５９は、３つのＧＰＩリンクを縦列に含む。
【０１２７】
エイズ進行を低減させるために適当であり得る作用物質のもう１つの例は、ＨＩＶ−１に結合し、それをリンパ節へ輸送するその能力を低減させるため、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮと直接に相互作用する化合物である。その種の作用物質は、ＤＣ−ＳＩＧＮ上のＨＩＶ−１結合部位に直接結合できるらしい。候補作用物質は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞と、またはＤＣ−ＳＩＧＮの精製細胞外断片と、接触させ、そしてＨＩＶ−１結合を阻害するそれらの能力について試験することが可能である。
【０１２８】
対象方法に従って同定された作用物質を投与するのに使用可能なさまざまな送達システムは、当該技術分野では知られている。そうした送達システムは、水溶液、リポソーム中のカプセル封入、微粒子またはマイクロカプセル、または細胞内進入を容易にする部分への共役を含む。
【０１２９】
作用物質を含む治療組成物は、注射により非経口的に投与が可能であるが、関節内注射、吸入剤混合物、経口活性処方、経皮イオン導入、または坐薬のような他の有効な投与形式も考えられる。担体は、当該処方物のｐＨ，浸透圧、粘度、透明度、色、無菌、安定性、溶解速度、または臭い、を修飾または維持するための医薬的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。当該担体はまた、当該作用物質の安定性、溶解速度、放出または吸収を修飾または維持するための他の医薬的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。そうした賦形剤は、単一用量または多回用量いずれかの形式で非経口投与のための投与量を処方するために、通常および習慣的に用いられるような物質である。
【０１３０】
治療組成物が処方されたら、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、乾燥または凍結乾燥された粉末として無菌バイアル中に貯蔵してもよい。そうした処方物は、直ぐ使える、または投与直前に再構成を要する、いずれかの形で貯蔵してもよい。全身送達用の作用物質を含む処方物を投与する仕方は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、または膣または直腸坐薬によることも可能である。あるいは、処方物は、標的器官（例えば、胸部）に直接投与してもよい。
【０１３１】
特定の障害または状態の治療に有効なはずの作用物質の量は、当該障害または状態の性質に依存し、それは標準的臨床技術により同定可能である。加えて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ検定は、最適投与量範囲の決定を助けるために、随意に用いてもよい。当該処方物中に用いられる正確な用量も、投与の経路、および疾患または状態の重度または進行度、に左右されるはずで、担当医師および各患者の状況に従って決められるべきである。有効用量は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から外挿してもよい。例えば、対象方法に従って同定された作用物質の有効量は、本発明の二価化合物の勾配づけされた用量を投与し、そして所望の効果を観察することにより、容易に決定される。
【０１３２】
下記の実施例は、普通の当業者をさらに援助するために、提供される。それらの実施例は、例示的であることを意図しており、したがって、本発明を限定すると見なすべきではない。多数の典型的な修飾および変更が本出願に記載されており、そのほかも当業者には明白になろう。そうした変更は、本明細書に記載されそして請求されている本発明の範疇内に該当するものと考える。
【０１３３】
【実施例】
実施例１：ｃＤＮＡライブラリー構築
チンパンジーｃＤＮＡライブラリーは、チンパンジー組織を用いて構築する。全ＲＮＡを当該組織から抽出する（ＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔ，Ｑｕｉａｇｅｎ；ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ　Ｒａｐｉｄ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｋｉｔ，５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）、そして当該ＲＮＡの完全性および純度を慣用の分子クローニング方法に従って決定する。ポリＡ＋ＲＮＡを単離し（Ｍｉｎｉ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ，５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）、プライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）とともに、ｃＤＮＡの逆転写用の鋳型として使用する。合成されたｃＤＮＡは、商業的に入手可能なキットを用いて、クローニング用に処理し、修飾する。次に、組換え体をパッケージし、宿主細胞株中で増殖させる。パッケージングミックスの一部を増幅し、そして残りは増幅前の状態で保留する。当該ライブラリーは標準化可能で、当該ライブラリー中の独立組換え体の数を決定する。
【０１３４】
実施例２：配列比較
候補ヒト遺伝子に基づく適当なプライマーを調製し、ｃＤＮＡライブラリーから、またはｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡから、のいずれかのチンパンジーｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用に使用する。当該ｃＤＮＡライブラリーからの選択されたチンパンジーｃＤＮＡクローンは、ＡＢＩ３７７のような自動シークエンサーを用いて配列決定する。当該配列決定を行うには、Ｍ１３　ＵｎｉｖｅｒｓａｌおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー類のようなクローニングベクター上に普通に使われるプライマー類が使用される。末端シークエンシングにより完全には配列決定されない挿入断片については、色素標識ターミネーターを用いて、残りのギャップに充填する。
【０１３５】
検出された配列差異は正確さについて最初にチェックするが、それは例えば、チンパンジーおよびヒト配列間に差異がある点を見い出すこと；ヒトに独特と思われる塩基が、当該コールド塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、当該配列フルオログラム（クロマトグラム）をチェックすること；配列変化に対応する１つ以上のヒト配列があるかどうかを見るために、当該ヒトヒットをチェックすること；および必要なら、当該技術分野で知られる他の方法、による。異なるチンパンジーヌクレオチドがある位置に同じヌクレオチドをもつ同じ遺伝子についての複数のヒト配列エントリーは、当該ヒト配列が正確であること、そしてそのチンパンジー／ヒト差異が本物であること、の独立した裏付けを提供する。そうした変化は、これらのＤＮＡ配列変化が、そのコードタンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかどうかを決定するために、公開データベース情報および当該遺伝暗号を用いて、調べられる。当該配列はまた、当該コードタンパク質の直接配列決定によっても調べることができる。
【０１３６】
実施例３：分子進化分析
比較されているチンパンジーおよびヒト配列はＫＡ／ＫＳ分析に付す。本分析では、Ｌｉ９３およびＩＮＡのような、公共的に入手可能なコンピュータープログラムを使って、上記のように検討中の各配列について、部位当りの同義変化の数（ＫＳ）により部位当りの非同義変化の数（ＫＡ）を割って決定する。コード配列の完全長コード領域または部分セグメントを使用可能である。ＫＡ／ＫＳ比が高ければ高いほど、配列は適応進化を受けてきたことの可能性が多い。ＫＡ／ＫＳ値の統計有意性は、ｔ検定のような確立された統計的方法および入手可能なプログラムを用いて決定する。
【０１３７】
高ＫＡ／ＫＳ比の有意性に対する支持をさらに与えるために、検討中の当該配列を、複数のチンパンジー個体で、および他の非ヒト霊長類、例えばゴリラ、オランウータン、ボノボで、比較してもよい。これらの比較は、当該適応進化的変化が、他の非ヒト霊長類に比較して、ヒト系列に独特であるかどうかについての、さらなる識別を可能にする。当該配列はまた、ヒト種に当該配列がどの程度保存されているかを査定するために、いくつかの多様なヒト集団の代表者からの関心ある当該遺伝子の直接配列決定によって、調べることも可能である。
【０１３８】
実施例４：正に選択されたＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３の同定
本明細書に記載の本発明の方法を用いて、細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３は、強く正に選択されていることが、明らかにされている。ＩＣＡＭ分子は、いくつかの免疫応答相互作用に関与し、ＨＩＶに感染されたヒトでエイズへの進行にかかわっていることが知られている。ＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＩＣＡＭタンパク質類は、インテグリン白血球会合機能１分子（ＬＦＡ−１）に対するリガンドである。Ｍａｋｇｏｂａら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８６−８８。ＬＦＡ−１は大部分の白血球の表面で発現されるが、ＩＣＡＭ類は白血球および他の細胞型の両方の表面で発現される。Ｌａｒｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０８：７０３−７１２。ＩＣＡＭおよびＬＦＡ−１タンパク質類は、Ｔ細胞機能、および炎症の領野への白血球の標的化を含むいくつかの免疫応答相互作用に関与する。Ｌａｒｓｏｎら（１９８９）。
【０１３９】
全ＲＮＡは、ｔｈｅ　ＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）またはｔｈｅ　ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ　Ｒａｐｉｄ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｋｉｔ（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）のいずれかを用いて、霊長類組織（チンパンジーの脳および血液、ゴリラの血液および脾臓、オランウータンの血液）から、または次のＢリンパ細胞株：ＣＡＲＬ（チンパンジー），ＲＯＫ（ゴリラ），およびＰＵＴＩ（オランウータン）から収穫した細胞から、調製した。ｍＲＮＡは全ＲＮＡから、ｔｈｅ　Ｍｉｎｉ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、単離した。ｃＤＮＡは、オリゴｄＴおよび／またはランダムプライミングとともにｍＲＮＡから、ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて合成した。霊長類ＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質コード領域は、ｃＤＮＡから、公表されたヒト配列から手作業で設計したプライマー類（濃度＝１００ｎｍｏｌｅ／μｌ）を用いて増幅した。ＩＣＡＭ−１増幅のＰＣＲ条件は、９４℃初期前溶融（４分）、続いて９４℃（１５秒）の３５サイクル、５８℃（１分１５秒）、７２℃（１分１５秒）、そして１０分間の最終７２℃エクステンションであった。ＰＣＲは、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ−　ＰＣＲ　ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、５０マイクロリットルの全反応容量中で完成した。適量の産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから精製した。当該増幅産物の両鎖は、ｔｈｅ　Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて直接配列決定し、３７３Ａ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）上で分析した。
【０１４０】
ヒト、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ　ｇｏｒｉｌｌａ）、およびオランウータン（Ｐｏｎｇｏ　ｐｙｇｍａｅｕｓ）ＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質コード部分の、チンパンジーのものとの比較は、統計的に有意なＫＡ／ＫＳ比を生じた（表２）。ヒトおよびチンパンジーＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質コード部分は以前に公表され、そしてゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ　ｇｏｒｉｌｌａ）、およびオランウータン（Ｐｏｎｇｏ　ｐｙｇｍａｅｕｓ）ＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質コード部分は、それぞれ図３および４に示す。
【０１４１】
本実験については、Ｌｉ（１９８５；１９９３）のアルゴリズムを用いて、当該成熟タンパク質についてペアワイズＫＡ／ＫＳ比を計算した。統計的に有意な比較（ｔ検定により決定）は太字で示す。ゴリラとヒトに対する比較は、チンパンジーＩＣＡＭ−１が正に選択されていることを証明するのに十分であったが、オランウータンＩＣＡＭ−１についても比較したが、それは、アフリカにおけるゴリラの仮定される歴史的分布範囲は、ゴリラがＨＩＶ−１ウイルスにさらされていた可能性を示唆するからである。ＮｏｗａｋおよびＰａｒａｄｉｓｏ（１９８３）Ｗａｌｋｅｒ´ｓ　Ｍａｍｍａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ（ボルチモア、メリーランド、Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）。しかしオランウータンは常に東南アジアに限られてきており、したがって進化的時間枠にわたってＨＩＶにさらされたことはありえない。（ＮｏｗａｋおよびＰａｒａｄｉｓｏ，１９８３）（ゴリラはヒトおよびチンパンジーに最も近縁であるが、オランウータンはずっと遠縁である。）
表２．　ＫＡ／ＫＳ比：ＩＣＡＭ−１全タンパク質比較
比較種　　　　　　　　　　　　ＫＡ／ＫＳ比
チンパンジー対ヒト　　　　　　２．１（Ｐ＜０．０１）
チンパンジー対ゴリラ　　　　　１．９（Ｐ＜０．０５）
チンパンジー対オランウータン　１．４（Ｐ＜０．０５）
ヒト対ゴリラ　　　　　　　　　１．０
ヒト対オランウータン　　　　　０．８７
ゴリラ対オランウータン　　　　０．９５
正の選択が証明されたそうしたタンパク質の間でさえも、これらのＩＣＡＭ−１比較ほどに高いＫＡ／ＫＳ比を示すものはほとんどない。ＬｅｅおよびＶａｃｑｕｉｅｒ（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．１８２：９７−１０４；ＳｗａｎｓｏｎおよびＶａｃｑｕｉｅｒ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：４９５７−４９６１；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）；Ｓｈａｒｐ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１１１−１１２。当該結果は、チンパンジーＩＣＡＭ−１分子に適応変化をもたらしている強い選択圧と一致している。
【０１４２】
ＬＦＡ−１に結合するＩＣＡＭ−１分子のドメイン（Ｄ１およびＤ２）が記録されている。Ｓｔａｕｎｔｏｎら（１９９０）Ｃｅｌｌ　６１：２４３−２５４。霊長類ＩＣＡＭ−１遺伝子間のペアワイズＫＡ／ＫＳ比較。ＫＡ／ＫＳ比は、Ｌｉ（１９８５；１９９３）のアルゴリズムを用いて、ドメインＤ１およびＤ２のみについて計算した（表３）。統計的に有意な比較（ｔ検定により決定）は太字で示す。ドメインＤ１およびＤ２についての非常に高い統計的に有意なＫＡ／ＫＳ比は、当該タンパク質のこれらの領域が、非常に強く正に選択されたことを示唆している。チンパンジーＩＣＡＭ−１のこれらの領域は、前記全タンパク質比較について見られたより、さらに一層顕著なＫＡ／ＫＳ比（表３）を示すことから、それ故、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用は異常に強い選択圧を受けてきたことを示唆している。
表３．　ＫＡ／ＫＳ比：ＩＣＡＭ−１のドメインＤ１＋Ｄ２
比較種　　　　　　　　　　　　ＫＡ／ＫＳ比
チンパンジー対ヒト　　　　　　３．１（Ｐ＜０．０１）
チンパンジー対ゴリラ　　　　　２．５（Ｐ＜０．０５）
チンパンジー対オランウータン　１．５（Ｐ＜０．０５）
ヒト対ゴリラ　　　　　　　　　１．０
ヒト対オランウータン　　　　　０．９０
ゴリラ対オランウータン　　　　１．０
実施例５：ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３の正に選択された配列の特徴解明
本発明の方法により同定された配列は、細胞トランスフェクション実験によって、さらに試験し、特徴解明することも可能である。例えば、ヒト培養細胞は、本明細書に記載の方法により同定されたチンパンジーポリヌクレオチド（ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）のような；下記参照）を形質移入された場合、当該技術における標準的検定法を用いて、ウイルス播種および／または伝播の低減について試験し、対照細胞に比較することも可能であろう。試験されるポリヌクレオチド／ポリペプチドの感知されたまたは見掛けの機能性質次第で、他の証印についても測定しもよい。例えば、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）の場合、融合細胞形成を測定し、対照（非形質移入）細胞に比較してもよい。これは、当該抵抗性が、感染細胞における融合細胞形成の阻止から生じるかどうかを試験することになる。
【０１４３】
本発明の方法により同定された配列およびＨＩＶ−１による細胞間感染へのそれらの作用の特徴解明に有用な細胞は、例えば、Ｈ９およびＨＵＴ７８細胞株を含む、ＨＩＶ−１による感染に許容性のあるヒトＴ細胞株で、それらはＡＴＣＣから入手できる。
【０１４４】
細胞トランスフェクション検定のために、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡ（または本明細書に記載の方法により同定された任意のｃＤＮＡ）を、適切な発現ベクター中へクローン化可能である。最大発現を得るために、当該クローン化ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）コード領域は、例えば、ＩＬ−２プロモーターのようなヒトＴ細胞中で活性なプロモーターに操作し易いように連結する。あるいは、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡは、強い構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの転写制御下に置かれてもよい。発現系は、発現ベクターを細胞中へ導入するための方法と同様に、当該技術分野ではよく知られている。例えば、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡを含む発現ベクターは、ＤＥＡＥデキストランにより、またはエレクトロポレーション、または任意の他の既知の方法により、細胞中へ導入可能である。クローン化されたＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）分子は、次いで、当該細胞の表面上に発現される。ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡが当該細胞表面に発現されるかどうかの決定は、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）に特異的な抗体（類）を用いて、果すことが可能である。ヒトＴ細胞の表面で発現されるチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）の場合、チンパンジーおよびヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）間を識別する抗体を使ってもよい。この抗体は、蛍光色素のような、検出可能な標識で標識可能である。それらの表面にチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）を発現する細胞は、十分確立された技術を用い、蛍光活性化細胞選別および適切に標識された抗ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）抗体とを用いて、検出可能である。
【０１４５】
それらの細胞表面にチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）を発現する形質移入ヒト細胞は、次いで、融合細胞形成について、および／またはＨＩＶ複製について、および／または細胞間感染性の指標として感染された細胞の数について、試験可能である。当該チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞は、適切な用量、例えば組織培養感染用量５０、すなわち当該細胞の５０％を感染できる用量で、ＨＩＶ−１により感染可能である。細胞は、適切な組織培養培地中、約５ｘ１０５細胞／ｍｌの密度でプレート可能で、そして感染後、融合細胞形成、および／またはウイルス複製、および／または対照の非感染細胞に比較した感染細胞の数、についてモニター可能である。チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）で形質移入していない細胞も、対照として役に立つ。融合細胞形成は、ＨＩＶ−１感染細胞（それらはチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）を発現していない）において、感染後ほぼ１０日で、一般的に観察される。
【０１４６】
ＨＩＶ複製をモニターするには、細胞上清を、ｐ２４抗原の存在および量について、検定してもよい。ウサギ抗ｐ２４抗体を捕捉抗体として使い、ビオチニル化ウサギ抗ｐ２４抗体を検出抗体として用い、そして当該検定はアビジン・西洋ワサビペルオキシダーゼで現像する、エライザ検定を、例えば、含む、任意の検定法をｐ２４の検出に使用可能である。感染細胞の数を決定するには、間接免疫蛍光法を含む、任意の既知法を使用可能である。間接免疫蛍光法では、ヒトＨＩＶ陽性血清を、感染細胞に結合する抗ＨＩＶ抗体の源として使用可能である。結合された抗体は、ＦＩＴＣ共役抗ヒトＩｇＧを用いて検出可能で、当該細胞は蛍光顕微鏡により視覚化し、計数する。
【０１４７】
ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）のような分子の役割を査定するためのもう１つの方法は、ＨＩＶによる細胞の逐次感染を含む。ヒト細胞株、好ましくは内因性ＩＣＡＭを発現しないもの（ただし内因性ＩＣＡＭを発現する細胞株も使用可能である）に、ヒトまたはチンパンジーいずれかのＩＣＡＭ−１または−２または−３を形質移入する。第１組の実験では、ＨＩＶ感染ヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞の上清から、ＨＩＶを集め、チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞またはヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞に感染するために使用する。当該チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）およびヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞の両方の、上記のように測定された、初期感染性は、高いと予測されるはずである。数回の複製後、細胞間感染性は、もしチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）が抵抗性を付与するのであれば、当該チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞で減少すると予測されるはずである。第２組の実験では、ＨＩＶを、ＨＩＶ感染チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞の上清から集め、そしてヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞に感染させるために使用する。この場合、初期感染性は、もしＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）がＨＩＶ進行の感受性に関与するのであれば、第１組の実験におけるよりずっと低いと推測されるはずである。。数回の複製後、細胞間感染性は増加することが予測されるはずである。
【０１４８】
同定されたヒト配列は、エイズ感受性または抵抗性を付与する、または、に寄与することに関与することがあり得る候補ヒト遺伝子のデータベースを確立するのに使用可能である。さらに、当該データベースは、候補遺伝子の定序コレクションを提供するだけでなく、ヒトおよび（チンパンジーのような）エイズ抵抗性非ヒト霊長類間に存在する正確な分子配列差異も提供し、それによって機能差の基になる変化を規定する。
【０１４９】
実施例６：ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３の分子モデリング
ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３の三次元構造のモデリングは、エイズ進行に対するチンパンジー抵抗性を説明する際のこれらのタンパク質の役割について付加的な証拠を提供してきた。
【０１５０】
ＩＣＡＭ−１の場合、チンパンジー系列に独特である６アミノ酸交換のうち５つが、ＬＦＡ−１結合に極めて重要と変異誘発研究により同定された、そうしたアミノ酸の直ぐ隣にある（すなわち、物理的に触れている）。これら５アミノ酸交換は、ヒトＬ１８のチンプＱ１８へ、ヒトＫ２９のチンプＤ２９へ、ヒトＰ４５のチンプＧ４５へ、ヒトＲ４９のチンプＷ４９へ、およびヒトＥ１７１のチンプＱ１７１へである。この位置決めは、当該一次構造（すなわち、アミノ酸の実際の配列）からは予知できない。結合に極めて重要なアミノ酸残基はいずれも、チンパンジーＩＣＡＭ−１タンパク質では変化していない。
【０１５１】
そうした位置決めは、チンパンジーＩＣＡＭ−１タンパク質の基本的機能が、ヒト類とチンパンジー類との間で変わっていない；しかし進化は、エイズの進行に対するそれらの抵抗性をチンパンジーに付与するのを助けるであろう微妙な変化を細工したことを、強く証している。当該アミノ酸交換の性質は、治療介入用の作用物質を開発するための三次元構造情報の利用を可能にするために、現在調べが進められている。きわだって、当該５チンパンジー残基のうち４つは、Ｎ結合糖鎖形成部位と同定されている極めて重要な結合残基に隣接している。このことは、差異が、ヒトおよびチンパンジーＩＣＡＭ−１について、（ＬＦＡ−１に対する）結合定数に存在することを、示唆している。これらの結合定数の定量が、現在進められている。もし当該結合定数がチンパンジーＩＣＡＭ−１でより低いことが判明したら、ＨＩＶ感染ヒトに対する可能性ある治療戦術として、結合定数の当該変化を（立体障害によって）模倣するための低分子作用物質を工夫することが可能である。同じように、より強い結合定数が、もしチンパンジーＩＣＡＭ−１に観察されたなら、それは、ＨＩＶ感染ヒトに対する治療介入を開発するための別の戦術を示唆することになろう。
【０１５２】
ＩＣＡＭ−３の場合、（７人のヒトで観察された）プロリンから（３頭のチンパンジーで観察された）グルタミンへの極めて重要なアミノ酸残基交換は、ヒトおよびチンパンジーＩＣＡＭ−３のドメイン２および３間の位置角度を有意に変えることが、われわれのモデリング研究から予知される。当該ヒトタンパク質は、この接合点で急角度を示す。Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎら、，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７：２３９　２０−２７。この鋭角（曲がり）の消失は、ＨＩＶ−１ビリオン中へチンパンジーＩＣＡＭ−３をパッケージされにくくすると推測される（感染ヒトでは、ＩＣＡＭ類がＨＩＶ−１ビリオン中へパッケージされた後、細胞間感染性は劇的に増加する。Ｂａｒｂｅａｕ，Ｂ．ら，１９９８　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７１２５−７１３６）。ＨＩＶ−１ビリオン中へチンプＩＣＡＭ−３を容易にパッケージすることに、このように失敗すれば、次には感染ヒトに見られる細胞間感染性の増加が阻止できることになろう。するとこれは、エイズ進行に対するチンパンジー抵抗性を説明することになろう。
【０１５３】
前記ヒトプロリン残基への適切に設計された小分子の結合は、（立体障害の結果として）ヒトＩＣＡＭ−１タンパク質に、チンパンジーＩＣＡＭ−３のより大きな（すなわち、鋭さの少ない）角度を真似させる、小分子治療介入が可能である。極めて重要な結合残基（およびヒトとチンパンジー間の免疫応答の全般的類似性）の当該２種タンパク間における保存は、本角度の変更が、ヒトＩＣＡＭ−３の基本的機能を危なくしないことを、証している。しかし、当該ヒトＩＣＡＭ−３タンパク質は、ＨＩＶ−１ビリオン中へのパッケージングに抵抗化されるようになるであろうし、そのようにして、感染チンパンジーがエイズへの進行に抵抗すると、仮定されている経路を（ＨＩＶ−１感染ヒトで）模倣することになろう。
【０１５４】
本質的には同じ手順を用いて、正に選択されたチンパンジーＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３を同定した（表４参照）。正の選択が当該タンパク質のいたるところにアミノ酸交換を生じたＩＣＡＭ−２および−３に対比して、ＩＣＡＭ−１のリガンド結合ドメインは、特に顕著な正の選択を示すように、局在されている。このように、本比較ゲノム分析は、チンパンジーにおけるＩＣＡＭ類上の正の選択が、例えば、重要な結合ドメイン中で当該タンパク質の一次構造を変えたことを、明らかにしている。これらの変更は、チンパンジーにおけるエイズ進行に対する抵抗性を付与した可能性がある。
表４．　ＫＡ／ＫＳ比：ＩＣＡＭ−２および３全タンパク質比較
比較種　　　　　　　　　　　　　　　　ＫＡ／ＫＳ比
チンパンジー対ヒトＩＣＡＭ−２　　　　２．１（Ｐ＜０．０１）
チンパンジー対ヒトＩＣＡＭ−３　　　　３．７（Ｐ＜０．０１）
ＩＣＡＭ−１，−２，および−３の結合は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＨＩＶ感染細胞における融合細胞（すなわち、巨大な多核細胞）の形成に必須の役割を果すことが証明されている。Ｐａｎｔａｌｅｏら（１９９１）Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ．１７３：５１１−５１４。融合細胞形成には、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＣＤ＋細胞の枯渇が続く。Ｐａｎｔａｌｅｏら（１９９１）；Ｌｅｖｙ（１９９３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：１８３−１８９；Ｂｕｔｉｎｉら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２１９１−２１９５；ＦｉｎｋｅｌおよびＢａｎｄａ（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６０５−６１５。融合細胞形成をｉｎ　ｖｉｖｏで検出するのは難しいが、感染細胞のクラスターは感染された個人のリンパ節に見られる。Ｐａｎｔａｌｅｏら（１９９３）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：３２７−３３５；ＦｉｎｋｅｌおよびＢａｎｄａ（１９９４）；Ｅｍｂｒｅｔｓｏｎら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６２：３５９−３６２；Ｐａｎｔａｌｅｏら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６２：３５５−３５８。融合細胞は身体から急速に取り除かれるために検出できないだけかも知れない。Ｆｏｕｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２１９：８７−９５。ｉｎ　ｖｉｖｏでのＣＤ＋細胞の融合細胞仲介消失が、起ることは、推測されてきた；これは、免疫系を危なくする直接の原因となり、日和見感染および完全発症エイズをもたらす可能性がある。Ｓｏｄｒｏｓｋｙら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２２：４７０−４７４；ＨｉｌｄｒｅｔｈおよびＯｒｅｎｔａｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０７５−１０７８；ＦｉｎｋｅｌおよびＢａｎｄａ（１９９４）。このように、チンパンジーＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３における極めて重要な変化が、チンパンジーにおける融合細胞形成を妨げ、エイズ進行へのチンパンジー抵抗性を説明するのに役立つ可能性がある。ＩＣＡＭ類の多機能性からして、ＩＣＡＭ遺伝子類におけるこれらの正に選択された変化は、他の感染症に抵抗性を別途付加する可能性があり、あるいは、ヒト治療法の開発で有用とも思われる他の炎症過程において一役買っていることもあり得る。ＩＣＡＭ−１、−２、および−３のポリペプチド配列アラインメントは、それぞれ図５、６、および７に示す。
【０１５５】
実施例７：ＭＩＰ−１αの正の選択を同定すること
ＭＩＰ−１αは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒト細胞中のＨＩＶ−１複製を抑圧することが示されているケモカインである（Ｃｏｃｃｈｉ，Ｆ．ら，１９９５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：１８１１−１８１５）。ヒトＭＩＰ−１α遺伝子のチンパンジー相同体をＰＣＲ増幅し、配列決定した。ＫＡ／ＫＳ比（２．１，Ｐ＜０．０５）の計算およびゴリラ相同体への比較は、当該チンパンジー遺伝子が正に選択されてきたことを、明らかにしている。本明細書で論考されたその他の遺伝子については、当該チンパンジータンパク質を治療介入に利用する方法を決定するために、当該チンパンジーアミノ酸交換の性質につき現在調査中である。
【０１５６】
実施例８：１７−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの正の選択を同定すること
本発明の方法を用いて、脳で発現されるチンパンジー遺伝子が、そのヒト相同体（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．＃Ｘ８７１７６）に比較した場合、正に選択されている（ＫＡ／ＫＳ＝１．６）ことが同定された。当該ヒト遺伝子、１７−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＶ型は、２つの最も強力なエストロゲンであるβ−エストラジオールおよび５−ジオールを分解することが知られているタンパク質をコードする（Ａｄａｍｓｋｉ，Ｊ．ら　１９９５　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．３１１：４３７−４４３）。エストロゲン関係癌（例えば、乳癌および前立腺癌を含む）は、ヒト癌の約４０％に当る。興味深いことに、文献中の報告は、チンパンジーが腫瘍形成、特にエストロゲン関係であるもの、に対して抵抗性であることを、示唆している。このタンパク質は、エストロゲンのより効率的な分解を可能にし、それによってそうした癌に対してチンパンジーに抵抗性を付与すように、チンパンジーにおいて正に選択されてきたらしい。そうであれば、当該チンパンジータンパク質で観察された特定のアミノ酸交換は、ヒト癌における治療介入に重要な情報を供給することになるだろう。
【０１５７】
実施例９：チンパンジー脳組織についてのｃＤＮＡライブラリー構築
チンパンジー脳ｃＤＮＡライブラリーをチンパンジー脳組織を用いて構築する。チンパンジー脳組織は自然死後に得ることができるので、動物を殺すことは本研究に必要ではない。しかし、脳で発現された無傷のｍＲＮＡを得るチャンスを増すためには、当該動物の死後できるだけ速やかに脳を入手する。好ましくは、死ぬ前に当該動物の体重および年令を明らかにしておく。ｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用する脳組織は、脳全体で発現されたｍＲＮＡの細胞含有物を最大にするために、全脳が好ましい。脳組織は、標準的な外科手順に従って、当該動物から切除する。
【０１５８】
全ＲＮＡを脳組織から抽出し、当該ＲＮＡの完全性および純度を慣用の分子クローニング法に従って決定する。ポリＡ＋ＲＮＡを選択し、プライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）とともにｃＤＮＡの逆転写用の鋳型として使用する。合成されたｃＤＮＡは、商業的に入手可能なキットを用いて、クローニングのために処理し、修飾する。次に組換え体は、パッケージし、宿主細胞株中で増殖させる。当該パッケージングミックスの一部を増幅し、残りは増幅前に保留する。当該ライブラリーは標準化可能で、ライブラリー中の独立組換え体の数を決定する。
【０１５９】
実施例１０：チンパンジーおよびヒト脳ｃＤＮＡの配列比較
当該ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択されたチンパンジー脳ｃＤＮＡクローンは、ＡＢＩ３７７のような自動シークエンサーを用いて配列決定する。当該配列決定を行うには、Ｍ１３　ＵｎｉｖｅｒｓａｌおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー類のようなクローニングベクター上に普通に使われるプライマー類が使用される。末端シークエンシングにより完全には配列決定されない挿入断片については、色素標識ターミネーターを用いて、残りのギャップに充填する。
【０１６０】
その結果得られたチンパンジー配列は、データベース検索、例えば、ＢＬＡＳＴ検索を通してヒト配列に比較する。高得点「ヒット」、すなわち、ＢＬＡＳＴ分析後、有意な（例えば、＞８０％）類似性を示す配列を、検索し、そして分析する。次に２つの相同配列は、Ｈｉｇｇｉｎｓらにより開発されたアラインメントプログラムＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて整列する。ヌクレオチド置換、挿入、および欠失を含む、如何なる配列ダイバージェンスでも、当該アラインメントにより検出され、そして記録されることが可能である。
【０１６１】
検出された配列差異は正確さについて最初にチェックされるが、それは、チンパンジーおよびヒト配列間に差異がある点を見い出すこと；ヒトに独特と思われる塩基が、当該コールド塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、当該配列フルオログラム（クロマトグラム）をチェックすること；配列変化に対応する１つ以上のヒト配列があるかどうかを見るために、当該ヒトヒットをチェックすること；および必要なら、当該技術分野で知られる他の方法、による。異なるチンパンジーヌクレオチドがある位置に同じヌクレオチドをもつ同じ遺伝子についての複数のヒト配列エントリーは、当該ヒト配列が正確であること、そしてそのチンパンジー／ヒト差異が本物であること、の独立した裏付けを提供する。そうした変化は、これらのＤＮＡ配列変化が、そのコードタンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかどうかを決定するために、公開データベース情報および当該遺伝暗号を用いて、調べられる。当該配列はまた、当該コードタンパク質の直接配列決定によっても調べることができる。
【０１６２】
実施例１１：他の霊長類に比べたヒト脳配列の分子進化分析
比較されているチンパンジーおよびヒト配列はＫＡ／ＫＳ分析に付す。本分析では、Ｌｉ９３およびＩＮＡのような、公共的に入手可能なコンピュータープログラムを使って、上記のように検討中の各配列について、部位当りの同義変化の数（ＫＳ）により部位当りの非同義変化の数（ＫＡ）を割って決定する。本比、ＫＡ／ＫＳは、検討中の配列で適応進化、すなわち正の選択が働いた程度の反映であることが、示されている。典型的には、完全長コード領域が、これらの比較分析では使われてきた。しかし、コード領域の部分セグメントも、有効に使用可能である。ＫＡ／ＫＳ比が高ければ高いほど、配列は適応進化を受けてきたことの可能性が多い。ＫＡ／ＫＳ値の統計有意性は、ｔ検定のような確立された統計的方法および入手可能なプログラムを用いて決定する。チンパンジーおよびヒト遺伝子間で統計的に高いＫＡ／ＫＳ比を示すそうした遺伝子は、適応進化を受けた可能性が非常に高い。
【０１６３】
高ＫＡ／ＫＳ比の有意性に対する支持をさらに与えるために、検討中の当該配列を、他の非ヒト霊長類、例えばゴリラ、オランウータン、ボノボで、比較してもよい。これらの比較は、当該適応進化的変化が、他の非ヒト霊長類に比較して、ヒト系列に独特であるかどうかについての、さらなる識別を可能にする。当該配列はまた、ヒト種に当該配列がどの程度保存されているかを査定するために、いくつかの多様なヒト集団の代表者からの関心ある当該遺伝子の直接配列決定によって、調べることも可能である。
【０１６４】
実施例１２：選択されたヒト脳配列のさらなる配列特徴解明
進化的に有意な変化を含むヒト脳ヌクレオチド配列は、分子および遺伝的性質、ならびにそれらの生体機能に関して、さらに特徴解明する。同定されたコード配列は、当該配列が発現されるどのような組織および細胞型、および発生の過程の間の、または細胞周期の間の何時それらが発現されるか、のいずれかまたは両方に関して、当該遺伝子の発現パターンを明らかにする、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｍＲＮＡハイブリッド形成法を実施するためのプローブとして、使用する。脳で発現される配列は、重要なヒト脳機能と関連するので、より優れた候補となり得る。さらに、同定された配列をもつ推定遺伝子は、当該配列がどのような機能クラスに属するかを決定するために、相同検索を受ける。
【０１６５】
さらに、タンパク質によっては、同定されたヒト配列変化は、当該変化の機能的結果を推定するのに有用な可能性もある。そうした基準を用いることによって、候補遺伝子のデータベースを作製可能である。高性能情報処理、貯蔵および検索能力、言語能力、ならびにその他のような、チンパンジーまたは他の非ヒト霊長類に比べて、ヒト脳に見られる独特のまたは増強した能力に、当該遺伝子が責任を負う確度について候補をランクづけする。このように、本アプローチは、それによってそうした遺伝子が同定できる新しい戦術を提供する。最後に、当該データベースは、候補遺伝子の定序コレクションを提供するだけでなく、ヒトとチンパンジー（および他の非ヒト霊長類）との間に存在する正確な分子配列差も提供し、そのようにして当該機能差の基になる変化を明らかにする。
【０１６６】
場合によって、機能差は、長期増強（ＬＴＰ）の証印のようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析、およびトランスジェニック動物または他の適当なモデル系の使用を、非限定的に含む、適当なモデル系で評価する。これらは、当業者には直ぐに明らかになるだろう。
【０１６７】
実施例１３：ヒトチロシンキナーゼ遺伝子における正の選択の同定
本発明の方法を用いて、そのチンパンジー相同体に比較して正に選択されている、脳で発現されるヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．＃ＡＢ０１４５４１）が同定されている。チロシンキナーゼをコードする本遺伝子は、ＡＡＴＹＫと呼ばれるその遺伝子産物がアポトーシスを誘発することが知られる、よく特徴解明されたマウス遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．＃ＡＦ０１１９０８）に相同的である（Ｇａｏｚｚａ，Ｅ．ら　１９９７　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１５：３１２７−３１３５）。文献は、本タンパク質が、発生中のマウス脳でアポトーシスを制御する（したがって、事実上、発生中の脳を「彫刻する」）ことを、示唆している。本タンパク質のチロシンキナーゼドメインは、（大半のチロシンキナーゼ類と同様に）マウス、チンパンジーおよびヒトの間で高度に保存されている。しかし興味深いことに、シグナル伝達タンパク質類が結合する当該タンパク質の領域は、ヒトで正に選択されているが、チンパンジーおよびマウスいずれでも強く保存されている。シグナル伝達タンパク質類が結合する当該ヒトタンパク質の当該領域は、ヌクレオチド点変異の結果として正に選択されているだけでなく、さらに加えて、マウスおよびチンパンジーでは単コピーとしてだけ存在する、いくつかのＳＨ２結合ドメインの重複を示す。これは、異なるセットのシグナル伝達タンパク質が当該ヒトタンパク質に結合する可能性を示唆しており、次いでそれは、マウスおよびチンパンジーのものと比較して、発生中のヒト脳におけるアポトーシスについての異なる経路を誘発することも可能であろう。そのような遺伝子は、したがって、独特なまたは増強したヒト認知能力に寄与することがあり得る。
【０１６８】
実施例１４：正に選択されたヒトＢＲＣＡ１遺伝子
数種の霊長類のＢＲＣＡ１遺伝子の比較進化分析は、ヒトＢＲＣＡ１遺伝子が正の選択を受けてきたことを明らかにしている。最初に、ヒトおよびチンパンジーＢＲＣＡ１遺伝子のエキソン１１の１１４１コドン（Ｈａｃｉａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１８：１５５−１５８）を比較したところ、Ｌｉの方法（Ｌｉ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：９６−９９；Ｌｉ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２：１５０−１７４）により計算した場合、３．６という著しく高いＫＡ／ＫＳ比が見い出された。事実、用いられた特定のアルゴリズムにかかわらず、本比較については統計的に有意な高い比が得られた（表５Ａ参照）。これ程の大きさの比を示す遺伝子（または遺伝子の部分）はほとんど報告されていない（Ｍｅｓｓｉｅｒら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１５１−１５４；Ｅｎｄｏら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３：６８５−６９０；およびＳｈａｒｐ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１１１−１１２）。そこでわれわれは、当該ヒト遺伝子の完全長タンパク質コード配列に比較するため、チンパンジーＢＲＣＡ１遺伝子の完全タンパク質コード領域（５５８９塩基対）を配列決定することを選んだ。多くの場合、たとえ正の選択が特定の遺伝子の限られた領域に働いたことを示すことができても、完全長タンパク質コード配列のＫＡ／ＫＳ分析は正の選択の証拠を明らかにできない（Ｍｅｓｓｉｅｒら（１９９７）、上記）。これは恐らく、ある遺伝子の小領域だけが正に選択されている場合、選択圧が特に強くなければ、正の選択のシグナルがノイズによりマスクされる可能性があるためと、思われる。しかし、完全長ヒトおよびチンパンジーＢＲＣＡ１配列の比較は、採用したすべてのアルゴリズムにより、１を超えるＫＡ／ＫＳ比をやはり生じた（表５Ａ）。これは、ＢＲＣＡ１への選択圧が強烈であったことを示唆する。ヒトＢＲＣＡ１遺伝子内の選択のパターンを明らかにするため、さまざまな長さの間隔（１５０から６００塩基対まで）を調べる、スライディングウインドウＫＡ／ＫＳ分析も実施した。本分析は、正の選択が、エキソン１１に集中していたらしいことを、示唆している。
表５Ａ：ヒト・チンパンジーＫＡ／ＫＳ比較
2004503251.tif 000003
表５Ｂ：追加霊長類からのＢＲＣＡ１のエキソン１１のＫＡ／ＫＳ
2004503251.tif 000004
表５Ｂの比は、Ｌｉ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：９６；Ｌｉら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２：１５０に従って計算した。全比較について、統計的有意性を、Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：３７０８に示唆されたように、ｔ検定により計算した。統計的に有意な比較は、１つまたはそれ以上の星印により示し、そのＰ値は次のとおりである：＊，Ｐ＜０．０５，＊＊，Ｐ＜０．０１，＊＊＊，Ｐ＜０．００５。エキソン配列は、Ｈａｃｉａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１８：１５５からである。ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ヒト，ＮＭ＿００００５８．１、チンパンジー，ＡＦ０１９０７５、ゴリラ，ＡＦ０１９０７６、オランウータン，ＡＦ０１９０７７、アカゲザル，ＡＦ０１９０７８。
ヒトおよびチンパンジーＢＲＣＡ１配列のペアワイズ比較により明らかにされた高ＫＡ／ＫＳ比は、正の選択の作用を証明しているが、しかしそうした比較だけでは、比較された２つの遺伝子、ヒトまたはチンパンジー、のどちらが正に選択されたかは明にしていない。しかし、当該霊長類ＢＲＣＡ１配列を適切な系統枠組みの中で考察すれば、当該ヒト遺伝子を含むそうしたペアワイズ比較だけが１より大きな比を示しており、当該ヒト遺伝子のみが正に選択されたことを指摘している（表５Ｂ）。正の選択が、専らヒト系列内でＢＲＣＡ１のエキソン１１に働いたことを確かめるために、Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：３７０８−３７１３により提案された正の選択の統計検定を用いた。本検定は、この場合（３４２３塩基対）のように、ヌクレオチドの数が大きい場合には、特に適切である。この手順は、系統樹の個別の各枝について、非同義部位当たりの非同義ヌクレオチド置換（ｂＮ）および同義部位当たりの同義置換（ｂＳ）をまず決定する（Ｚｈａｎｇら（１９９８）、上記）。正の選択は、ｂＮ−ｂＳが統計的に有意であると示すことができるそうした枝でのみ、裏付けられる（Ｚｈａｎｇら（１９９８）、上記）。ＢＲＣＡ１については、これは、図９に示された霊長類樹の１枝のみに当てはまる：すなわち、当該枝は、ヒト／チンパンジー共通祖先から現代ヒトに至るもので、そこではｂＮ／ｂＳ＝３．６である。したがってわれわれは、ＢＲＣＡ１遺伝子の場合、正の選択がヒト系列に直接的にかつ独占的に働いたと、信じる。
【０１６９】
高ＫＡ／ＫＳ比は、正の選択の効果よりもむしろ、（例えば、ＧＣ含量における等積（ｉｓｏｃｈｏｒｉｃ）差によるＫＳの抑圧のような）何らかの遺伝子座または染色体特異的変則を反映するかも知れないことは、形式的には可能であるが、いくつかの理由から、この場合には、これはありそうもない。第一に、ヒトを含むヒト科ＢＲＣＡ１遺伝子についての推定ＫＳ値を、リゾチーム（Ｍｅｓｓｉｅｒら（１９９７）、上記）およびＥＣＰ（Ｚｈａｎｇら（１９９８）、上記）を含む、他のよく研究されているヒト科遺伝子座について従来推定されている値に比較した。これらの値には、統計的に有意な差についての証拠は全くない。このことは、ヒトＢＲＣＡ１でＫＳの何か異常な抑圧とは、相容れない。第二に、霊長類ＢＲＣＡ１遺伝子のＧＣ含量（Ｓｕｅｏｋａ，Ｎ．Ｅｖｏｌｖｉｎｇ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　（Ｂｒｙｓｏｎ，Ｖ．およびＶｏｇｅｌ，Ｈ．Ｊ．編）、４７９−４９６（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク、１９６４）中およびコドン使用頻度パターン（Ｓｈａｒｐら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：８２０７−８２１１）の検討は、哺乳動物平均値と何ら有意差を示さない。
【０１７０】
ヒトＢＲＣＡ１遺伝子への強い正の選択の本証明は、人類学者によりずっと以前に出されていた学説に対する最初の分子的裏付けを成すものである。ヒト乳児は、われわれの近縁霊長類のどれにおけるよりも長い、長期間の生後ケアを必要とし、また受ける。Ｓｈｏｒｔ，Ｒ．Ｖ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ　１９５：３−２４は、ヒト女性が、助力を提供する男性パートナーとの長期のつがいのきずな（ｐａｉｒ　ｂｏｎｄ）の状況でのみ、そうした行き届いたケアをヒト乳児に供与できると、はじめて仮定した。長期のつがいのきずなの維持は、肥大した女性胸部を含む、（われわれの近縁霊長類に比較した場合）誇張されたヒト二次性徴の発達により強化された（Ｓｈｏｒｔ（１９７６）、上記）。このように、強い選択圧は、われわれのヒト科親類で見られるパターンと違って、最初の妊娠および授乳の前に発達する肥大したヒト胸部の発生をもたらした（Ｄｉｘｓｏｎ，Ａ．Ｆ．Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｓｅｘｕａｌｉｔｙ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｓｉｍｉａｎｓ，Ｍｏｎｋｅｙｓ，Ａｐｅｓ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｅｉｎｇｓ．２１４（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード、１９９８）中。
【０１７１】
癌抑制因子としてのその機能（Ｘｕら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　３（３）：３８９−３９５；Ｓｈｅｎら（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１７（２４）：３１１５−３１２４；Ｄｅｎｎｉｓ，Ｃ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２２：１０；Ｘｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２２：３７−４３）に加えて、ＢＲＣＡ１タンパク質は、胸部組織の正常な発達（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｃ．（１９９９）、上記；Ｘｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２２：３７−４３；およびＴｈｏｍｐｓｏｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　９：４４４−４５０）、特に典型的な乳腺および管サイズの到達に重要な役割を果している（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｃ．（１９９９）上記；およびＸｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２２：３７−４３）。これらの事実は、ヒトにおける本遺伝子への正の選択が、ヒト女性の胸部の肥大を促し、最終的には、依存性ヒト乳児の長期ケアの促進に役立ったことを、示唆している。ヒト乳児のこの長期依存性は、複雑なヒト文化の発達と伝達のために必須であった。正の選択はＢＲＣＡ１のエキソン１１に集中していたようなので、エキソン１１によりコードされるＢＲＣＡ１タンパク質の当該領域が、正常な胸部発達に特異的に役立っているという推測を伴う。ここに提供されたデータは、ヒト進化の際の強い選択圧が、ヒト女性に独特のパターンの胸部発達を促進したＢＲＣＡ１におけるアミノ酸交換をもたらし、それがいくつかのヒト行動の進化を容易にしたことを、示唆している。
【０１７２】
実施例１５：ＢＲＣＡ１ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの特徴解明
ＢＲＣＡ１遺伝子に進化的に有意なヌクレオチド変化およびＢＲＣＡ１タンパク質に対応するアミノ酸変化を同定したので、次のステップは、適当なモデル系でこれらの分子を試験し、当該モデル上で当該ヌクレオチドおよびアミノ酸変化の機能性作用を分析することである。例えば、ヒトＢＲＣＡ１ポリヌクレオチドを、脂肪細胞のような培養宿主細胞へ形質移入して、細胞成長または複製へのその効果を明らかにすることが可能である。
【０１７３】
実施例１６：正に選択されたＣＤ５９の同定
いくつかの霊長類種のＣＤ５９遺伝子の比較進化分析は、チンパンジーＣＤ５９遺伝子が正の選択を受けてきたことを、明らかにしている。ＣＤ５９タンパク質は、プロテクチン、１Ｆ−５Ａｇ，Ｈ１９，ＨＲＦ２０，ＭＡＣＩＦ，ＭＩＲＬ、およびＰ−１８としても知られる。ＣＤ５９は、すべての末梢血液白血球および赤血球上に発現される（Ｍｅｒｉら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：９２３−９３５）。その機能は、補体によるヒト細胞の溶解を制限することである（Ｍｅｒｉら（１９９６）、上記）。より具体的には、ＣＤ５９は、膜侵襲複合体（ＭＡＣｓ）の阻害物質の１つとして働く。ＭＡＣｓは、細胞膜に穴様の損傷をつくる２０いくつかの補体タンパク質の複合体である（Ｍｅｒｉら（１９９６）、上記）。これらのＭＡＣｓは、適切な制限エレメント（すなわちＣＤ５９および二三の他のタンパク質）の非存在下では、侵入病原体のみならず宿主細胞をも破壊することになる。すると本質的には、ＣＤ５９は、それ自身の防御系の補体アームから身体の細胞を保護する（Ｍｅｒｉら（１９９６）、上記）。当該ヒト相同体は感染個人におけるエイズへの進行に関係するとされていたので、本タンパク質のチンパンジー相同体を調べた。ＣＤ５９は、ＨＩＶビリオンにより選択的に取上げられる宿主細胞由来タンパク質の１つであることが、明らかにされた（Ｆｒａｎｋら（１９９６）ＡＩＤＳ　１０：１６１１−１６２０）。加えて、宿主細胞ＣＤ５９を取込んだＨＩＶビリオンは、補体の作用から保護されることが、明らかにされた（Ｓａｉｆｕｄｄｉｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：５０１−５０９）。このようにヒトでは、ＨＩＶは、犠牲者の免疫系による攻撃から自身を保護するために、そしてそれにより感染過程を推進するために、ＣＤ５９を利用する。
【０１７４】
霊長類ＣＤ５９　ｃＤＮＡ配列を得るために、全ＲＮＡを、霊長類組織（チンパンジー、ゴリラ、およびオランウータンからの新鮮な全血）から、（ｔｈｅ　ＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）またはｔｈｅ　ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ　Ｒａｐｉｄ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｋｉｔ（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）のいずれかを用いて）調製した。ｍＲＮＡは、ｔｈｅ　Ｍｉｎｉ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、全ＲＮＡから単離した。ｃＤＮＡは、オリゴｄＴおよび／またはランダムプライミングとともにｍＲＮＡから、ｔｈｅ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いて合成した。当該霊長類ＣＤ５９遺伝子のタンパク質コード領域は、公表されたヒト配列から設計したプライマー類（濃度＝１００ｎｍｏｌｅ／μｌ）を用いて、ｃＤＮＡから増幅した。ＣＤ５９増幅のＰＣＲ条件は、９４℃初期前溶融（４分）、続いて９４℃（１５秒）の３５サイクル、５８℃（１分１５秒）、７２℃（１分１５秒）、そして１０分間の最終７２℃エクステンションであった。ＰＣＲは、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ−　ＰＣＲ　ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、５０μｌの全反応容量中で完成した。適量の産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから精製した。当該増幅産物の両鎖は、ｔｈｅ　Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて直接配列決定し、３７３Ａ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）上で分析した。
【０１７５】
表６に示すように、チンパンジーＣＤ５９配列に対するすべての比較は、１より大きいＫＡ／ＫＳ比を示し、正に選択されたのはチンパンジーＣＤ５９遺伝子に他ならないことを証明している。
表６：選択された霊長類ＣＤ５９　ｃＤＮＡ配列に対するＫＡ／ＫＳ比
比較した遺伝子　　　　　　　　　　　ＫＡ／ＫＳ比
チンパンジー対ヒト　　　　　　　　　　　１．８
チンパンジー対ゴリラ　　　　　　　　　　１．５
チンパンジー対オランウータン　　　　　　２．３
チンパンジー対ミドリザル　　　　　　　　３．０
実施例１７：ＣＤ５９正に選択された配列の特徴解明
強い選択圧は、当該ウイルスがＣＤ５９の防御的役目を己のために強奪できないので、疾患の進行が遅れるという具合に、チンパンジーＣＤ５９分子に適応変化をもたらしたとする仮説があれば、次には、他の近縁な非ヒト霊長類のＣＤ５９遺伝子の当該ヒト遺伝子に対する比較は、進化的期間にわたってＨＩＶ−１ウイルスに対決されなかったような種については、１以下のＫＡ／ＫＳ比を示すはず、ということになる。逆に、当該チンパンジー遺伝子に対するすべての比較は、１より大きいＫＡ／ＫＳ比を示すはずである。これら２つのテストを総合すれば、チンパンジーまたはヒト遺伝子が正に選択されたかどうかが、明確になるだろう。ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ　ｇｏｒｉｌｌａ）はヒトおよびチンパンジーに最も近い親戚であるが、アフリカにおけるその仮定される歴史的分布域は、ゴリラが、ある時期にＨＩＶ−１ウイルスに曝された可能性があることを示唆している。そこでわれわれは、ゴリラおよびオランウータン（Ｐｏｎｇｏ　ｐｙｇｍａｅｕｓ）の両者からのＣＤ５９遺伝子を調べた。東南アジアに限られる後者の種は、進化的時間枠を通じて、ＨＩＶ−１に曝されたとは考えられない。ヒトおよびオランウータン遺伝子のヌクレオチド配列は、これら２種から採取した新鮮な全血から予め単離されたＲＮＡから調製されたｃＤＮＡの直接配列決定により、決定した。
【０１７６】
次のステップは、培養細胞中でＨＩＶ複製の検定法を用いて、チンパンジーＣＤ５９が、完全発症エイズへの進行に対するチンパンジー抵抗性にどのように寄与しているかを、決定することである。チンパンジーＣＤ５９タンパク質を形質移入され、また発現するヒト白血球細胞株は、非形質移入ヒト細胞の対照株に比較した場合、（当該技術分野の専門家にはよく知られる標準的検定法を用いて）ウイルス複製の速度の低下を示すはずである。これに対して、ヒトＣＤ５９を発現するチンパンジー白血球細胞株は、対照の非形質移入チンパンジー細胞株に比較した場合、ウイルス負荷の増加を示すはずである。
【０１７７】
実施例１８：ＣＤ５９の分子モデリング
ヒトの既知三次元構造に基づくＣＤ５９の推定チンパンジータンパク質のモデリング（Ｍｅｒｉら　１９９６　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．３１６：９２３−９３５）は、エイズ進行に対するチンパンジー抵抗性を説明する本タンパク質の役割にさらなる証拠を提供した。ヒトＣＤ５９において、残基Ａｓｎ７７はＧＰＩアンカーのためのリンクで（Ｍｅｒｉら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．３１６：９２３−９３５）、それは当該タンパク質の機能に必須であることが、明らかにされた。当該ＧＰＩアンカーは、当該タンパク質を細胞膜に係留する役目をしている（Ｍｅｒｉら（１９９６）、上記）。チンパンジーＣＤ５９遺伝子のわれわれの配列決定は、チンパンジーＣＤ５９の推定タンパク質構造が、ＧＰＩリンク、すなわち、ＮＥＱＬＥＮＧＧを含む当該タンパク質の当該区分の重複を含むことを、明らかにしている（表７および図１０参照）。
表７：ヒトおよびチンパンジーＣＤ５９アミノ酸配列の比較
【０１７８】
【表１】
2004503251.tif 000005
【０１７９】
イタリック／下線はアミノ酸における変異を示す。
これは、ＣＤ５９の基本的機能は、チンパンジーとヒトの間でほとんど保存されているようであるが、若干の変化が細胞膜に関する当該タンパク質の定位に生じたらしいことを、示唆している。これが、当該ビリオンにより取込まれた場合に、当該チンパンジータンパク質をＨＩＶビリオンには役立たないものにしている可能性がある。あるいは、当該チンパンジータンパク質は、ヒトＣＤ５９と異なり、ＨＩＶビリオンによる取込みを受けないのかも知れない。これらの（検証可能な）代案のいずれでも、チンパンジーではＨＩＶビリオンが、ＭＡＣ複合体の攻撃を受けることを、意味するらしい。したがってこれは、複製に利用可能なウイルスの量を減らし、それによって、完全発症エイズへの進行に対するチンパンジー抵抗性に寄与するのだろう。これらの代案のいずれが正しいかを決める検証が行われたならば、その時には当該情報は、完全発症エイズへの進行に対するチンパンジー抵抗性を模倣する、感染ヒトに対する治療介入を設計するために利用できる。
【０１８０】
実施例１９：正に選択されたＤＣ−ＳＩＧＮの同定
ヒト、チンパンジーおよびゴリラのＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の比較進化分析は、チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子が正の選択を受けたことを、明らかにした。図１１−１３（配列番号６−８）は、それぞれヒト、チンパンジーおよびゴリラＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。表７は、ヒト、チンパンジーおよびゴリラＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子のペアワイズ比較により計算されたＫＡ／ＫＳ値を提示する。チンパンジーとのそうした比較だけが、１より大きいＫＡ／ＫＳ値を示し、当該チンパンジー遺伝子が正に選択されたことを明らかにしているのに、注目されたい。
表７：選択された霊長類ＤＣ−ＳＩＧＮ　ｃＤＮＡ配列に対するＫＡ／ＫＳ比
比較した遺伝子　　　　　　　　　　　ＫＡ／ＫＳ比
チンパンジー対ヒト　　　　　　　　　　　１．３
ヒト対ゴリラ　　　　　　　　　　　　　　０．８７
チンパンジー対ゴリラ　　　　　　　　　　１．３
本明細書に論考されているように、ＤＣ−ＳＩＧＮは、樹状細胞上で発現され、リンパ節へのＨＩＶ−１ウイルスの輸送のための機構を提供することが知られている。ＨＩＶ−１は、ＤＣ−ＳＧＮの細胞外部分に結合し、それらのＣＤ４タンパク質を経由して、リンパ節中の未分化Ｔ細胞に感染する。感染のこの拡大は、最終的に免疫系の屈従をもたらし、続いて完全発症エイズに至る。興味深いことに、ＤＣ−ＳＩＧＮの主なリガンドはＩＣＡＭ−３であるらしい。本明細書に記載のように、チンパンジーＩＣＡＭ−３は、既知のエイズ関係タンパク質のどれよりも高いＫＡ／ＫＳ比を示す。チンパンジーＩＣＡＭ−３への正の選択が、ＩＣＡＭ−３にＤＣ−ＳＩＧＮへ結合するその能力を保留させることを可能にする代償性変化の結果であったかどうかは、まだ明らかでない。
【０１８１】
完全発症エイズへの進行に対するチンパンジー抵抗性は、リンパ節への輸送のためにチンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮへ結合するためのＨＩＶ−１の不能に、一部はよる可能性もあると、考えられる。当業者に知られるｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験を用いて、チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ−１の付着を妨げ、それによってリンパ節への輸送を阻止するように、進化的に変えられたという考えを確認できる。チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮへのＨＩＶ−１の結合が阻害される特定の方法は、既知の方法により決定可能である。いくつかの可能性がある機構が想像できるが、それらしき１つは立体障害である。その特定の機構の解明に役立てるため、タンパク質構造分析を用いて、チンパンジーとヒトＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質を比較することが可能である。ＤＣ−ＳＩＧＮの三次元構造を決定した後に、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮの正常な機能を妨害せずに、チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの作用を模倣するために、合理的薬剤設計アプローチを用いることも可能である。これらの目標は、小分子治療薬により達成される可能性が非常に高いはずである。
【０１８２】
上記の発明は、明瞭性および理解のために、例証および事例によって若干詳細に説明してきたが、ある種の変更および修飾が実行可能なことは、普通の当業者には明らかであろう。それ故、当該説明および事例は、付帯の請求事項により叙述される、本発明の範疇を制限するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒト科群内の霊長類についての系統樹を図解している。分枝順序は、十分に裏付けられたミトコンドリアＤＮＡ系統発生に基づいている。ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：１５１−１５４。
【図２】
図２（配列番号１−３）は、ヒトおよびチンパンジーＩＣＡＭ−１配列間のヌクレオチド配列アラインメントである（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ０６９９０およびＸ８６８４８）。チンパンジー配列のアミノ酸翻訳を当該アラインメントの下に示す。
【図３】
図３は、ゴリラＩＣＡＭ−１のヌクレオチド配列を示す（配列番号４）。
【図４】
図４は、オランウータンＩＣＡＭ−１のヌクレオチド配列を示す（配列番号５）。
【図５】
図５（Ａ）−（Ｅ）は、数種霊長類からのＩＣＡＭ−１のポリペプチド配列アラインメントを示す。
【図６】
図６（Ａ）−（Ｂ）は、数種霊長類からのＩＣＡＭ−２のポリペプチド配列アラインメントを示す。
【図７】
図７（Ａ）−（Ｄ）は、数種霊長類からのＩＣＡＭ−３のポリペプチド配列アラインメントを示す。
【図８】
図８は、ヒト／霊長類脳ポリヌクレオチドを比較すること、進化的に有意な変化をもつ配列を選択すること、および選択された配列をさらに特徴解明すること、のための手順の概略表示を図解している。図８は、本発明の好ましい実施態様を図解し、そしてその説明とともに、本発明の原理を、精巧化および自由選択の付加的工程を添えて、説明するのに役立つ。任意のヒト／霊長類ポリヌクレオチド配列は同様な手順で比較できること、および当該手順は脳ポリヌクレオチドに限定されないことは、言うまでもない。
【図９】
図９は、実施例１４で比較した種についての既知系統樹で、該当の枝上にマップしたｂＮおよびｂＳの値とともに、図解している。ｂＮおよびｂＳの値は、Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：３７０８−３７１３に記載の方法により計算した。値は当該枝の上に示す；明確化のため、値はすべて１００倍で示してある。統計的有意性は表５の比較について計算した（実施例１４）、そして統計的有意性の水準は、表５に示すとおりである。ヒト／チンパンジー共通祖先から現代ヒトに至る枝だけが、ｂＮ−ｂＳについて統計的に有意な値を示すことに注目されたい。
【図１０】
図１０は、最も濃い陰影をにより示した重複ＧＰＩリンク（Ａｓｎ）をもつヒトＣＤ５９のスペースフィリングモデルを図解している。チンプＣＤ５９は３つのＧＰＩリンクを含むように、本ＧＰＩリンクはチンパンジーでは重複している。図１０の中度陰影の３領域は、チンプとヒトとの間で相違する他の残基である。
【図１１】
図１１は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮのコード配列を示す（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｍ９８４５７）（配列番号６）。
【図１２】
図１２は、チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮのコード配列を示す（配列番号７）。
【図１３】
図１３は、ゴリラＤＣ−ＳＩＧＮのコード配列を示す（配列番号８）。
【図１】
2004503251.tif 000006
【図８】
2004503251.tif 000007
【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503251.tif 000150
【手続補正書】
【提出日】平成14年1月8日(2002.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける生理的形質と関連づけられてきたヒトポリヌクレオチド配列が、当該生理的形質をもっと少ない程度に示す非ヒト霊長類に比べて、進化的に有意な変化を受けたかどうかを決定する方法であって、
ａ．　何らかのヌクレオチド変化を同定するために、ヒトポリヌクレオチド配列を対応する非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較すること；および
ｂ．　前記ヒトヌクレオチド変化が進化的に有意かどうかを決定すること：を含む、前記方法。
【請求項２】
当該生理的形質が増強された胸部発達である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ヒトポリヌクレオチド配列がＢＲＣＡ１をコードする、請求項２の方法。
【請求項４】
前記進化的に有意なヌクレオチド変化がエキソン１１に起きる、請求項３の方法。
【請求項５】
当該非ヒト霊長類がヒト科群のメンバーである、請求項１の方法。
【請求項６】
当該非ヒト霊長類がチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびオランウータンより成る群から選ばれる、請求項５の方法。
【請求項７】
当該非ヒト霊長類がチンパンジーである、請求項６の方法。
【請求項８】
当該ヌクレオチド変化の進化的有意性が当該ヌクレオチド配列の非同義置換速度（ＫＡ）に従って決定される、請求項１の方法。
【請求項９】
当該ヌクレオチド変化の進化的有意性が当該ヌクレオチド配列の同義置換速度（ＫＳ）に対する非同義置換速度（ＫＡ）の比により決定される、請求項１の方法。
【請求項１０】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約０．７５である、請求項９の方法。
【請求項１１】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．００である、請求項９の方法。
【請求項１２】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．２５である、請求項９の方法。
【請求項１３】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．５０である、請求項９の方法。
【請求項１４】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約２．００である、請求項９の方法。
【請求項１５】
請求項１の方法に従って同定された進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヒトＢＲＣＡ１タンパク質中のアミノ酸変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＢＲＣＡ１タンパク質上の標的部位を同定するための方法。
【請求項１６】
請求項１の方法に従い進化的に有意であるヌクレオチド変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＢＲＣＡ１ポリヌクレオチド上の標的部位を同定するための方法。
【請求項１７】
生理的形質を変調することがあり得る作用物質を同定する方法であって、前記方法が、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、請求項１のヒトポリヌクレオチド配列で形質移入されている細胞に接触させることを含み、作用物質が当該ポリヌクレオチド配列の機能を変調するその能力により同定される、前記方法。
【請求項１８】
当該生理的形質が肥大した胸部であり、当該ポリヌクレオチドがＢＲＣＡ１遺伝子であり、そして当該変調機能がＢＲＣＡ１遺伝子によりコードされるポリヌクレオチドの有効性の増加である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
請求項１７の方法により同定された作用物質。
【請求項２０】
生理的形質を変調することがあり得る作用物質を同定する方法であって、前記方法が、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、請求項１のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む組成物に接触させることを含み、作用物質が当該ポリヌクレオチド配列の機能を変調するその能力により同定される、前記方法。
【請求項２１】
当該生理的形質が肥大した胸部であり、当該ポリヌクレオチドがＢＲＣＡ１遺伝子であり、そして当該変調機能がＢＲＣＡ１ポリペプチドの有効性の増加である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項２０の方法で同定された作用物質。
【請求項２３】
ＢＲＣＡ１ポリヌクレオチドの機能を変調する作用物質。
【請求項２４】
ＢＲＣＡ１ポリペプチドの機能を変調する作用物質。
【請求項２５】
進化的に有意なヒトヌクレオチド変化をヒトにおける生理的状態へ相関させるための方法であって、
機能性作用の存在が当該進化的に有意なヌクレオチド変化と当該生理的状態との間の相関関係を示す、適当なモデル系で請求項１で同定された進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該ポリヌクレオチド配列の、もしあれば、機能性作用を分析すること：を含む前記方法。
【請求項２６】
進化的に有意なヒトヌクレオチド変化をヒトにおける生理的状態へ相関させるための方法であって、
機能性作用の存在が当該進化的に有意なヌクレオチド変化と当該生理的状態との間の相関関係を示す、適当なモデル系で請求項１で同定された進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの、もしあれば、機能性作用を分析すること：を含む前記方法。
【請求項２７】
請求項１９、２２、２３または２４の作用物質を含む医薬組成物。
【請求項２８】
非ヒト霊長類における生理的形質と関連づけられてきた、または関連することがあり得る非ヒト霊長類のポリヌクレオチド配列が、当該生理的形質をもっと少ない程度に示すヒトに比べて、進化的に有意の変化を受けたかどうかを決定する方法であって、
ａ．　何らかのヌクレオチド変化を同定するために、当該非ヒトポリヌクレオチド配列を対応するヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較すること；および
ｂ．　前記非ヒトヌクレオチド変化が進化的に有意かどうかを決定すること：を含む、前記方法。
【請求項２９】
当該生理的形質が完全発症エイズへの進行に対する増強した抵抗性である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記非ヒトポリヌクレオチド配列がＣＤ５９をコードする、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記進化的に有意なヌクレオチド変化がＧＰＩリンクの重複を含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記非ヒトポリヌクレオチド配列がＤＣ−ＳＩＧＮをコードする、請求項２９の方法。
【請求項３３】
当該非ヒト霊長類がヒト科群のメンバーである、請求項２８の方法。
【請求項３４】
当該非ヒト霊長類がチンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびオランウータンより成る群から選ばれる、請求項３２の方法。
【請求項３５】
当該非ヒト霊長類がチンパンジーである、請求項３３の方法。
【請求項３６】
当該ヌクレオチド変化の進化的有意性が当該ヌクレオチド配列の非同義置換速度（ＫＡ）に従って決定される、請求項２８の方法。
【請求項３７】
当該ヌクレオチド変化の進化的有意性が当該ヌクレオチド配列の同義速度（ＫＳ）に対する非同義置換速度（ＫＡ）の比により決定される、請求項２８の方法。
【請求項３８】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約０．７５である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．００である、請求項３６の方法。
【請求項４０】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．２５である、請求項３６の方法。
【請求項４１】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約１．５０である、請求項３４の方法。
【請求項４２】
当該ＫＡ／ＫＳ比が少なくとも約２．００である、請求項３４の方法。
【請求項４３】
請求項２８の方法に従って同定されたチンパンジーＣＤ５９の進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヒトＣＤ５９タンパク質中のアミノ酸変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＣＤ５９タンパク質上の標的部位を同定するための方法。
【請求項４４】
請求項２８の方法に従いチンパンジーＣＤ５９の進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヌクレオチド変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＣＤ５９ポリヌクレオチド上の標的部位を同定するための方法。
【請求項４５】
請求項２８の方法に従って同定されたチンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮにおけるアミノ酸変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチド上の標的部位を同定するための方法。
【請求項４６】
請求項２８の方法に従いチンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの進化的に有意なヌクレオチド変化に対応する、ヌクレオチド変化を標的部位として同定することを含む、治療介入に適することがあり得るヒトＤＣ−ＳＩＧＮポリヌクレオチド上の標的部位を同定するための方法。
【請求項４７】
生理的形質を変調することがあり得る作用物質を同定する方法であって、前記方法が、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、請求項２８のヒトポリヌクレオチド配列で形質移入されている細胞に接触させることを含み、作用物質が当該ポリヌクレオチド配列の機能を変調するその能力により同定される、前記方法。
【請求項４８】
当該生理的形質がエイズの進行に対する抵抗性であり、当該ポリヌクレオチドがヒトＣＤ５９遺伝子であり、そして当該変調機能がエイズの進行に対する抵抗性の増加である、請求項４７の方法。
【請求項４９】
請求項４８の方法により同定された作用物質。
【請求項５０】
当該生理的形質がエイズの進行に対する抵抗性であり、当該ポリヌクレオチドがＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子であり、そして当該変調機能がエイズの進行に対する抵抗性の増加である、請求項４７の方法。
【請求項５１】
請求項５０の方法により同定された作用物質。
【請求項５２】
生理的形質を変調することがあり得る作用物質を同定する方法であって、前記方法が、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、請求項２８のヒトポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む組成物に接触させることを含み、作用物質が当該ヒトポリペプチド配列の機能を変調するその能力により同定される、前記方法。
【請求項５３】
当該生理的形質がエイズの進行に対する抵抗性であり、当該ポリヌクレオチドがヒトＣＤ５９遺伝子であり、そして当該変調機能がエイズの進行に対する抵抗性の増加である、請求項５２の方法。
【請求項５４】
請求項５３の方法で同定された作用物質。
【請求項５５】
当該生理的形質がエイズの進行に対する抵抗性であり、当該ポリヌクレオチドがヒトＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子であり、そして当該変調機能がエイズの進行に対する抵抗性の増加である、請求項５２の方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法で同定された作用物質。
【請求項５７】
ヒトＣＤ５９ポリヌクレオチドの機能を変調する作用物質。
【請求項５８】
ヒトＣＤ５９ポリペプチドの機能を変調する作用物質。
【請求項５９】
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮポリヌクレオチドの機能を変調する作用物質。
【請求項６０】
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチドの機能を変調する作用物質。
【請求項６１】
非ヒト霊長類における進化的に有意なヌクレオチド変化を非ヒトにおける生理的状態へ相関させるための方法であって、
機能性作用の存在が当該進化的に有意なヌクレオチド変化と当該生理的状態との間の相関関係を示す、適当なモデル系で請求項２８で同定された進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該ポリヌクレオチド配列の、もしあれば、機能性作用を分析すること：を含む前記方法。
【請求項６２】
非ヒト霊長類における進化的に有意なヌクレオチド変化を非ヒト霊長類における生理的状態へ相関させるための方法であって、
機能性作用の存在が当該進化的に有意なヌクレオチド変化と当該生理的状態との間の相関関係を示す、適当なモデル系で請求項２８で同定された進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの、もしあれば、機能性作用を分析すること：を含む前記方法。
【請求項６３】
複数のＧＰＩリンクを含むように修飾されたヒトＣＤ５９タンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項４９、５１、５４、５６、５７、５８、５９または６０の作用物質を含む、医薬組成物。
【請求項６５】
請求項６３のヒトＣＤ５９を含む、医薬組成物。
【請求項６６】
進化的に有意なヌクレオチド変化に対応するポリペプチド中のアミノ酸配列変化を同定することからなる、治療介入に適することがありうるポリペプチド上の標的部位の同定方法。
【請求項６７】
進化的に有意なポリヌクレオチド変化に対応するヌクレオチド変化を同定することからなる、治療介入に適することがありうるポリヌクレオチド上の標的部位の同定方法。
【国際調査報告】
2004503251.tif 000151
2004503251.tif 000152
2004503251.tif 000153
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