(57)【要約】伝達性海綿状脳症を検出する方法が記載され、これは（ａ）試験被験体からの組織、血液、または血液派生物のサンプルを、アルコールおよび洗浄剤で処理する工程、（ｂ）正常なプリオンタンパク質を分解する薬剤を添加する工程、（ｃ）異常なプリオンタンパク質を変性する薬剤を添加する工程、（ｄ）プリオン特異的抗体を添加する工程、ならびに（ｅ）サンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含する。また記載されるのは、異常なプリオンタンパク質を基質に固定する方法であり、（ａ）アルコールおよびアニオン性洗浄剤で異常なプリオンタンパク質を含むことが疑われるタンパク質またはサンプルを処理する工程、ならびに（ｂ）基質の存在下で、プロテアーゼを添加する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＳＥを検出する方法であって、（ａ）試験被験体か
らの組織、血液、または血液派生物のサンプルを、アルコールおよび洗浄剤で処理する工程、（ｂ）正常なプリオンタンパク質を分解する薬剤を添加する工程、（ｃ）異常なプリオンタンパク質を変性する薬剤を添加する工程、（ｄ）プリオン特異的抗体を添加する工程、ならびに（ｅ）サンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２】
異常なプリオンタンパク質を基質に固定する方法であって、（ａ）前記異常なプリオンタンパク質、または前記異常なプリオンタンパク質を含むことが疑われるサンプルを、アルコールおよび洗浄剤で処理する工程、ならびに（ｂ）その基質の存在下で、プロテアーゼを添加する工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで工程（ａ）がさらにタンパク質を添加を包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記タンパク質が高分子量タンパク質、好ましくは、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、動物起源の正常な血清、Ｐｒｉｏｎｅｘ（商標）のようなアルブミン基質、またはそれらの誘導体から選択される、方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法であって、前記タンパク質が５％以下の、好ましくは０．０５〜０．４％のタンパク質を含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ａ）において使用されるアルコールが、Ｃ1〜Ｃ24のアルコール、好ましくはＣ1〜Ｃ5アルコールである、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここでアルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、ペンタデカノール、セチルアルコール、ヘプタデカノール、ステアリルアルコール、ノナデカノール、エイコサノール、ドカサノール、ドデシルアルコール、ラウリルアルコール、オクタデカノール、および一次、二次、および三次誘導体を含む、それぞれの誘導体、好ましくはメタノールまたはエタノールから選択される、アルコールである、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、前記アルコールが３０％（重量基準）以下の、好ましくは１０〜２０、より好ましくは８〜１２％のアルコールを含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ａ）のアニオン性洗浄剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、サルコシル、ドデシル硫酸リチウム、コール酸、デオキシコール酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００、オクタン酸、Ｂｒｉｊ（商標）３５溶液、Ｎ−セチル-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチル臭化アンモニウム、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ジギトニン、ノナノイル-Ｎ-メチルグルクアミド、ｎ−オクチル-Ｂ-Ｄ-グルコピラノシド、アルキル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、１，２，３-オクタントリオール，３-ジメチルアミノ-１プロピン、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ナトリウムＩｎｏｐｈｏｒｅ  １、およびそれぞれの誘導体、最も好ましくはドデシル硫酸ナトリウムから選択される、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、前記洗浄剤が５〜３０％、より好ましくは１０〜２０％の洗浄剤を含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｂ）において、正常なプリオンタンパク質を分解する薬剤がプロテアーゼである、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記プロテアーゼが広い範囲のプロテアーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫ、サブチリシン  カールスバーグ、ペプシン、およびそれぞれの誘導体から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記プロテアーゼが１０ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｃ）において異常なプリオンタンパク質を変性する薬剤が、変性化塩溶液である、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記薬剤がグアニジン、尿素、例えばＭｅｒｃｋ変性化溶液のような標準変性化溶液、およびそれぞれの誘導体から選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法であって、前記変性化薬剤がさらに０．５Ｍ以下の水酸化ナトリウムを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法であって、前記変性化塩が０．１〜１０Ｍ、好ましくは２〜８Ｍ変性化塩を含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ａ）の緩衝液（ホモジナイズ緩衝液）が、５．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ７．０〜９．０、より好ましくはｐＨ７．５〜８．５を有するように作製される、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｂ）の緩衝液（特異的緩衝液）が、２．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ２．０〜８．５、より好ましくは７．５〜８．５に作製される、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｃ）の緩衝液（アッセイ誘発緩衝液）が、１〜１４、好ましくは９〜１２、最も好ましくは少なくとも１１のｐＨを有する、方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｂ）に続いて、反応混合物が、１０％以下の、好ましくは４〜６％の緩衝化溶液を含有する第１の洗浄緩衝液で洗浄される、方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法であって、前記アッセイ誘発緩衝液が、約５〜３０分間、好ましくは１０〜２０分間、反応混合物とともにインキュベートすることを許容される、方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法であって、前記アッセイ誘発緩衝液での処理後に、５．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ７．０〜８．０を有する第２の緩衝液で、混合物が洗浄される、方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法であって、前記第１の洗浄緩衝液が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記第２の洗浄緩衝液が、０〜５％のＴｗｅｅｎ  ２０の選択的な添加を伴なう、リン酸緩衝化生理食塩水を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法であって、前記血液または組織サンプルが支持体、適切にはマイクロタイタートレイ上に懸濁される、方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれかに記載の方法であって、ここでプリオン特異的抗体が、プリオン配列のアミノ酸番号６０の５'側にあるプリオン配列に対して反応する、方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれかに記載の試験方法であって、試験被験体から血液、または血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物のサンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、および標準的な免疫アッセイによってサンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含し、前記抗体を添加する前に、組織、血液、または血液派生物のサンプルが、約０．１Ｍ（ＴＲＩＳ/ＨＣＬ）またはリン酸緩衝液、最終ｐＨ７．０〜９．０を有する緩衝液中の用量に対して作製される、０〜３０％のＣ1〜Ｃ5アルコール、５〜３０％のドデシル硫酸ナトリウム、または５〜３０％のドデシル硫酸ナトリウムおよび０〜５％サルコシル、ならびに０〜５％ウシ血清アルブミンを含有する第１の緩衝液とともに混合される、試験方法。
【請求項２９】
伝達性海綿状脳症のための試験方法であって、試験被験体からの血液、または血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物サンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、ならびに標準的なイムノアッセイによってサンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含し、血液または組織サンプルは、不活性な支持体上に分注され、そして抗体との反応の前に、２．０〜１１．０、好ましくは２．０〜８．５、より好ましくは７．５〜８．５の最終ｐＨを伴う緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌ以下の、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌの、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌの、広い範囲のプロテアーゼ酵素を含有する緩衝液とともにインキュベートされる、試験方法。
【請求項３０】
伝達性海綿状脳症のための試験方法であって、試験被験体から血液、血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物のサンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、および標準的なイムノアッセイによってサンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含し、サンプルは、抗体との反応の前に、室温にて、少なくともｐＨ１１で、逆浸透圧蒸留水中で作製される、０．１〜１０Ｍ変性化溶液、好ましくは３〜６Ｍ、より好ましくは０．５〜３Ｍグアニジン（選択的範囲は２〜４Ｍ）または２〜８Ｍ尿素（選択的範囲は４〜６Ｍ）、および０．５Ｍ以下の、好ましくは０．１〜０．２Ｍ水酸化ナトリウムを含有する緩衝液とともにインキュベートされる、試験方法。
【請求項３１】
（１）５．０〜１１．０（選択的範囲は７．５〜８．５）の最終ｐＨを有する緩衝液中の容量に対して作製される、０〜３０％のＣ1〜Ｃ24アルコール（選択的範囲は１０〜２０％）、５〜３０％洗浄剤（選択的範囲は１０〜２０％）、および０〜５％プロテイナーゼ（選択的範囲は０．０５〜０．４％）；
（２）２．０〜１１．０（選択的範囲は２．０〜８．５）の最終ｐＨを有する緩衝液中の０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ（選択的範囲は０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌ）のプロテアーゼ酵素；
（３）０．１〜１０Ｍ変性化溶液（選択的範囲は２〜８Ｍ）
から選択される緩衝液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝達性海綿状脳症を検出する方法に関し、および特にＴＳＥを同定するために、生存するまたは死亡した動物またはヒトに対して行われ得る試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
海綿状脳症は、退行性神経学的疾患の１つの群である。ＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）、スクレイピー（Ｓｃｒａｐｉｅ）、クロイツフェルト-ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン-シェトロイスラー-シャインカー疾病、クールー（Ｋｕｒｕ）、伝達性ミンク脳症、シカの慢性疲労性症候群、猫海綿状脳症、およびヘラシカ、ｎａｙａ、より大きなシマカモシカ、ゲムスボック、およびトラのような動物において見出される他の海綿状脳症を含む海綿状脳症の多くの例がある。ＢＳＥが、実験室条件下で、マウスおよびブタに伝達され得ることがまた報告されている。感染因子による種の境界のこの交差は、ヒトへの移行が生じ得るという益々の懸念を導いた。
【０００３】
ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）は、「狂牛病」として一般に知られる牛の脳異常である。これは４または５年間までの、ゆっくりした潜伏期間を有し、ウシにおいて、協調性の喪失および千鳥足、それらの周囲への興味の喪失、食餌および水への無関心を含む、精神状態の漸進性退行の症状、または攻撃を含む予測できない挙動を伴う。罹患されたウシはそれらが３〜１０歳である場合に症状を示す。
【０００４】
１９８６年１１月、英国において最初に同定され、１０、０００を超える症例がそれ以来報告された。罹患されたウシの検死は、神経細胞の破壊に起因する脳組織における空砲形成の特徴的なパターン、および異常なタンパク質繊維の沈着を示し、これは脳をスポンジ（海綿状）組織にする。類似の疾患が、１００年にわたってヒトにおいて（例えば、クロイツフェルト-ヤコブ病あるいは（ＣＪＤ））、および２００年にわたってヒツジにおいて報告されている。伝達性の海綿状脳症を担うと考えられる因子は、プリオンとして知られる感染性タンパク質である。プリオンは感染性粒子であり、タンパク質のみを含み、および核酸は何ら含まない感染性粒子であり、核酸の存在は、従来のウイルスの症例において必要とされる。スクレイピーにおいて、特にプリオンタンパク質またはＰｒＰscとして知られる１つのタンパク質が、感染力を伴なって精製されることが見出され、そして実験室条件下でハムスターのような他の動物からの脳細胞クラスターにおいてスクレイピー様状態を生じ得る。ＰｒＰscはスクレイピーが感染されたヒツジの脳組織において沈着される特徴的なタンパク質繊維の唯一知られる成分である。このタンパク質、ＰｒＰscは、構造的改変を受けるようであるが、用語ＰｒＰscは、ＰｒＰscの通常の細胞対応物に関して使用される。ＰｒＰscの天然の機能は知られていないが、器官において必要不可欠な構造または機能的な役割を有するようである。
【０００５】
再利用される動物組織は、タンパク質補足物質としてウシに日常的に給餌されており、感染源として同定された。ＢＳＥは元来、スクレイピーで感染されたヒツジ脳から伝播されたこと、そしてその伝播がＢＳＥで感染されたウシから採集された脳組織の摂取によってはからずも加速されたと考えられる。それゆえ、英国政府は、１９８８年の初頭から、疑わしい動物およびそれらの屠体の強制的な破棄を導入した。ウシに対する動物組織の給餌は１９８８年６月、英国において禁止された。
【０００６】
クールー、関連性疾患が、ニューギニア部族民間の葬儀の際の人食い習慣によって伝播されることが知られるので、疾患の最初の報告以来、消費者は牛乳または牛製品を介してヒトに伝達されるかもしれないことを恐れた。１９９０年後半、ヒトへのＢＳＥの伝達を上回る消費者の懸念が、牛市場における崩壊を誘発した。類似の恐慌が１９９４年半ば、ドイツを襲った。
【０００７】
１９９６年、致死性ＣＪＤ（異型ＣＪＤ）の新しく記載されるタイプの１０症例が同定された。罹患者は、異なる脳組織徴候を有し、全て４２歳以下であり、および疾患の遺伝的記録を何ら有しなかった。疑わしい動物の根絶が効果を有する前に、罹患者はＢＳＥ感染されたウシとの接触を介して疾患と接触し得ることが提案された。異型ＣＪＤの同定は、英国において、牛消費の劇的な暴落に、ならびに世界中の種々の国において、英国のおよびいくつかの例においてアイルランドの牛輸入の禁止に導く。
【０００８】
それゆえ、獣医学的なおよび経済学的な両方の理由のために、生存ストック、動物屍体、および食肉において一般的に、ならびに薬品およびヒトにおいて、ＢＳＥ、スクレイピー、異型ＣＪＤ、および他の関連性の海綿状脳症での感染を診断するための方法、および検出するための診断キットを提供する緊急の必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の目的
従って、本発明の目的は、ＴＳＥを担う感染因子について動物、薬品、およびヒトを試験する方法を提供することである。血液または血液由来の物質および固体組織の両方において使用され得る複数組織の試験系を提供することはまた目的である。方法が迅速であり、結果が数時間で利用可能であること、これが安価で、信頼性があり、および使用者に親しみがあるべきであることは、本発明のさらなる目的である。
【００１０】
今回まで、血液または血液派生物に対して行われ得るＴＳＥを検出する方法は何らなかった。今まで、動物がＴＳＥを被るか否か、ヒトが関連性の疾患を被るか否かを検出する唯一の方法は、脳組織の病理学的な検死試験を行うことであった。従って、血液に対して行われ得る試験は、これが生存する動物またはヒトに対して行われ得るという莫大な利点を有する。このことは、集団中の他の動物への感染の伝播を防ぐ試みにおいて、感染された動物が集団から除去され得、そして屠殺され得るという可能性を生じる。これはまた、感染されたヒトが同定され得ることを意味し、医薬処置が導入され得、そして疾患についての可能性のある治癒が見出され得るという可能性を伴う。試験はまた、ヒト食物連鎖への感染された食肉の介入を防ぎ、従って、ヒトが、異型ＣＪＤまたは感染された食肉の摂食によって伝達され得る他の関連性の疾患を請け負う可能性を減少する。これはまた、食肉または食肉由来の製品における消費者信頼を回復し、これは概して農業社会および食肉産業の両方に対して有利である。
【００１１】
ＴＳＥについての試験が血液または血液由来の産物に対して行われ得ることが驚くべき事に今や見出された。試験は、これがまた固体組織サンプルに対して行われ得るという利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、ＴＳＥを検出する方法が提供され、（ａ）試験被験体からの組織、血液、または血液派生物のサンプルを、アルコールおよび洗浄剤で処理する工程、（ｂ）正常なプリオンタンパク質を分解する薬剤を添加する工程、（ｃ）異常なプリオンタンパク質を変性する薬剤を添加する工程、（ｄ）プリオン特異的抗体を添加する工程、ならびに（ｅ）サンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含する。
【００１３】
本発明はまた、異常なプリオンタンパク質を基質に固定する方法を提供し、（ａ）前記異常なプリオンタンパク質、または前記異常なプリオンタンパク質を含むことが疑われるサンプルを、アルコールおよび洗浄剤で処理する工程、ならびに（ｂ）その基質の存在下で、プロテアーゼを添加する工程を包含する。
【００１４】
工程（ａ）はさらにタンパク質、好ましくは、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、動物起源の正常な血清、Ｐｒｉｏｎｅｘ（商標）のようなアルブミン基質、またはそれらの誘導体などのような高分子量タンパク質の添加を包含し得る。タンパク質は、５％以下の、好ましくは０．０５〜０．４％タンパク質を含有する緩衝液中に処方され得る。
【００１５】
好ましくは工程（ａ）において使用されるアルコールは、Ｃ1〜Ｃ24アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、セチルアルコール、ヘプタデカノール、ステアリルアルコール、ノナデカノール、エイコサノール、ドカサノール、ドデシルアルコール、ラウリルアルコール、オクタデカノール、および一次、二次、および三次誘導体を含む、それぞれの誘導体などである。より好ましくはアルコールは、Ｃ1〜Ｃ5アルコールであり、最も好ましくは、メタノール／エタノールである。アルコールは、３０％（重量基準）以下の、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは８〜１２％アルコールを含有する緩衝液中に処方され得る。
【００１６】
好ましくは工程（ａ）の洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、サルコシル、ドデシル硫酸リチウム、コール酸、デオキシコール酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００、オクタン酸、Ｂｒｉｊ（商標）３５溶液、Ｎ−セチル-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチル臭化アンモニウム、ＣＨＡＰＳ（３-[(-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニノ]-プロパン-スルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３-[(-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニノ]-ヒドロキシプロパン-スルホネート）、ジギトニン、ノナノイル-Ｎ-メチルグルクアミド、ｎ−オクチル-Ｂ-Ｄ-グルコピラノシド、アルキル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハクサンナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、１，２，３-オクタントリオール，３-ジメチルアミノ-１プロピン、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｆｌｕｋａから入手可能）、ナトリウムＩｎｏｐｈｏｒｅ  １（Ｆｌｕｋａから入手可能）、およびそれぞれの誘導体など、最も好ましくはドデシル硫酸ナトリウムから選択される。洗浄剤は、５〜３０％、より好ましくは１０〜２０％の洗浄剤を含有する緩衝液中に処方される。洗浄剤はアニオン性洗浄剤であり得る。
【００１７】
工程（ｂ）において、正常なプリオンタンパク質を分解する薬剤は適切にはプロテアーゼ、適切には広い範囲のプロテアーゼであり得る。好ましくはプロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、ペプシン、およびそれぞれの誘導体などから選択される。プロテアーゼは、１０ｍｇ／ｍｌ以下の、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌタンパク質を含有する緩衝液中に処方され得る。
【００１８】
好ましくは、工程（ｃ）において異常なプリオンタンパク質を分解する薬剤は、変性化塩溶液である。適切には、薬剤は、グアニジン、尿素、標準変性化溶液、例えば、Ｍｅｒｃｋ変性化溶液（Ｍｅｒｃｋから市販される）、およびそれぞれの誘導体などから選択される。特に好ましい実施態様において、変性化剤はさらに０．５Ｍ以下の水酸化ナトリウムを含み得る。変性化塩は、０．１〜１０Ｍ、好ましくは２〜８Ｍ変性化塩を含有する緩衝液中に処方され得る。
【００１９】
工程（ａ）の緩衝液（ホモジナイズ緩衝液）は、５．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ７．０〜９．０、よリ好ましくはｐＨ７．５〜８．５を有するように作製され得る。工程（ｂ）の緩衝液（特異的緩衝液）は、２．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ２．０〜８．５、より好ましくは７．５〜８．５に作製され得る。工程（ｃ）の緩衝液（アッセイ誘発緩衝液）は、１〜１４のｐＨ、好ましくはｐＨ９〜１２、最も好ましくは少なくとも１１を有するのがよい。
【００２０】
好ましくは、工程（ｂ）に続いて、反応混合物は、蒸留水、または１０％以下の、好ましくは４〜６％の緩衝化溶液を含有する第１の洗浄緩衝液で洗浄される。
【００２１】
アッセイ誘発緩衝液は、約５〜３０分間、好ましくは１０〜２０分間、反応混合物とともにインキュベートすることを許容される。適切には、混合物は次いで、５．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ７．０〜８．０を有する第２の洗浄緩衝液で洗浄される。
【００２２】
第１の洗浄緩衝液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛などを含み得る。第２の洗浄緩衝液は、０〜５％のＴｗｅｅｎ  ２０などの任意の添加を伴なう、リン酸緩衝化生理食塩水などを含む。
【００２３】
好ましくは、血液または組織サンプルは、支持体、適切にはマイクロタイタートレイ上に分注され、次いで好ましくは、さらなるプロセシングのためにサンプルを澄明化または「洗浄」するために作用する遠心分離工程に任意に供され得る。
【００２４】
プリオン特異的抗体は、プリオン配列のアミノ酸番号６０の３'側にあるプリオン配列に対して反応する。
【００２５】
プリオン特異的抗体は、適切には、以下のプリオンペプチドに対して結合する。：
−プリオン配列Ｎ-末端
ＭＶＫＳＨＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴＧＧＳＲＹＰＧＱ-４４
ＧＳＰＧＧＮＲＹＰＰＱＧＧＧＧＷＧＱＰＨＧＧＧＷＧＱＰＨＧＧＧＷＧＱＰＨＧＧＧＷＧＱＰ-８７
ＧＧＧＧＷＧＱＧＧＳＨＳＱＷＮＫＰＳＫＰＰＫＴＮＭＫＨＶＡＧＡＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹ-１３１
ＭＬＧＳＡＭＳＳＰＬＩＨＦＧＮＤＹＥＤＲＹＹＴＲＥＮＭＹＲＹＰＮＱＶＹＹＲＰＶＤＲＹＳＱＮＮ-１７７
【００２６】
ここで、１文字アミノ酸コードが本明細書中で規定され、ならびに、誘導体および配列のフラグメント（当業者によって十分に理解されるようなＤ異性体アミノ酸を含み得るものを含む）、アミノ酸の置換、欠失、挿入によるこの配列の修飾は、同じ活性を伴うペプチドを生じ得る。
【００２７】
血液サンプルは全血サンプルであり得るか、または血清サンプル、または白血球もしくはリンパ球を含む軟膜調製物のような血液由来のサンプルであり得るかのいずれかである。試験が、固体組織サンプルに対して使用される場合、約０．３〜１．５ｇのサンプルが使用される。
【００２８】
適切には、血液または組織サンプルはホモジナイズされる。血液サンプルがゼラチン状である場合、酵素分解工程が含まれ得る。酵素分解工程は、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼの添加を包含し得る。
【００２９】
プリオン特異的抗体は、任意の種における多様な種特異的プリオン配列に対して惹起され得る。抗体は、例えば、ウサギにおいて惹起され得、そして免疫アッセイは二次抗体、適切には西洋ワサビぺルオキシダーゼと結合されたヤギ（種）抗ウサギ抗体の使用を包含し得る。
【００３０】
欠失法は適切には、増強された化学発光アッセイであるが、比色検出、蛍光検出、または放射免疫アッセイ検出がまた使用され得る。
【００３１】
特に好ましい実施態様において、伝達性の海綿状脳症についての試験が提供され、試験被験体からの血液または血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物サンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、および標準的な免疫アッセイによってサンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含し、ここでは組織、血液、または血液誘導体サンプルは、抗体の添加の前に、約０．１Ｍ  ＴＲＩＳ/ＨＣＬまたはリン酸緩衝液中の容量に対して作製される０〜３０％のＣ1〜Ｃ5アルコール、５〜３０％ドデシル硫酸ナトリウム、または５〜３０％ドデシル硫酸ナトリウムおよび０〜５％サルコシル、および０〜５％ウシ血清アルブミンを含有する第１の緩衝液と混合され、緩衝液は、７．０〜９．０の最終ｐＨを有する。
【００３２】
好ましくは、血液または組織サンプルは、支持体、より好ましくは不活性なプラスチック支持体上に、適切にはマイクロタイタートレイ上に懸濁され、そして７．５〜８．５の最終ｐＨを有する約０．１Ｍ  ＴＲＩＳ/ＨＣＬまたはリン酸緩衝液中に１〜１０ｍｇ／ｍｌの広い範囲のプロテアーゼ酵素を含有する第２の緩衝液が添加される。緩衝液は適切には５分の１に希釈されて、０．２ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ/ｍｌの作用強度を与える。次いで、サンプルは、好ましくは１０〜１８０分間、約３７〜７０℃にて、より好ましくは６０℃にてインキュベートされる。
【００３３】
インキュベーション後、支持体は適切には、０〜１０％塩溶液を含有する第１の洗浄緩衝液のある容量で洗浄される。好ましくは、室温にて少なくとも１１のｐＨを有する、逆浸透蒸留水中で作製される０．５〜３Ｍグアニジン、または２〜８Ｍ尿素のいずれか、および０．１〜０．２Ｍ水酸化ナトリウムを含有する第３の緩衝液が、支持体に添加される。適切には、支持体および第３の緩衝液は、約１５分間のインキュベートを許容され、そして０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水および０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（商標）を含有する洗浄緩衝液で洗浄される。
【００３４】
次いでサンプル調製物は完成し、そして免疫アッセイに備える。
【００３５】
本発明はまた、伝達性の海綿状脳症についての試験を提供し、試験被験体からの血液または血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物サンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、および標準的な免疫アッセイによってサンプルへの抗体の結合を検出する工程を包含し、ここでは血液または組織のサンプルは、不活性な支持体上に懸濁され、そして２．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ２．０〜８．５、より好ましくは７．５〜８．５を有する緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌ以下の、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌの広い範囲のプロテアーゼ酵素を含有する緩衝液とともに、抗体との反応の前に、インキュベートされる。好ましくは不活性な支持体は、サンプルの懸濁後、およびプロテアーゼ（特異的緩衝液）の添加の前に遠心分離される。プロテアーゼは０．１Ｍ  ＴＲＩＳまたはリン酸を含有する緩衝液中に処方され得る。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、伝達性の海綿状脳症についての試験を提供し、試験被験体からの血液または血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物サンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、および標準的な免疫アッセイによってサンプルへの抗体の結合を検出する工程を包含し、ここではサンプルは、室温にて少なくとも１１のｐＨを有する、逆浸透蒸留水中に作製される０．１〜１０Ｍ変性化溶液、好ましくは３〜６Ｍ、より好ましくは０．５〜３Ｍグアニジン（選択的範囲は２〜４Ｍ）または２〜８Ｍ尿素（選択的範囲は４〜６Ｍ）、および０．５Ｍ以下の、好ましくは０．１〜０．２Ｍ水酸化ナトリウムを含有する緩衝液とともに、抗体との反応の前に、インキュベートされる。
【００３７】
本発明はまた、以下から選択される緩衝液を提供する：
１．  ５．０〜１１．０（選択的範囲は７．５〜８．５）の最終ｐＨを有する緩衝液中の容量に対して作製される、０〜３０％のＣ1〜Ｃ24アルコール（選択的範囲は１０〜２０、好ましくは８〜１２％）、５〜３０％洗浄剤（選択的範囲は１０〜２０％）、および０〜２０％タンパク質（選択的範囲は０．０５〜０．４％）。
２．  ２．０〜１１．０（選択的範囲は２．０〜８．５）の最終ｐＨを有する緩衝液中の、０．０５ｍｇ/ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ（選択的範囲は０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌ）のプロテアーゼ酵素を含む緩衝液。
３．  ０．１〜１０Ｍ変性化溶液（選択的範囲は２〜８Ｍ）を含有する緩衝液。
【００３８】
全ての緩衝液は、Ｅｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄによって製造および供給される。
【００３９】
【表１】
2004524523.tif 000002
【００４０】
この緩衝液は必要とされる容量に作製され、０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣＬ緩衝液、８．０±１の最終ｐＨ中で攪拌する。
【００４１】
【表２】
2004524523.tif 000003
【００４２】
この緩衝液は、０．１ＭＴＲＩＳ/ＨＣＬ緩衝液、８．０±１の最終ｐＨ中で、必要とされる濃度に作製される。
【００４３】
【表３】
2004524523.tif 000004
【００４４】
【表４】
2004524523.tif 000005
【００４５】
この緩衝液は、逆浸透蒸留水中で必要とされる濃度に作製され、そして１１よりも大きいべきであるｐＨを確認する前に室温に達せられる。
【００４６】
【表５】
2004524523.tif 000006
【００４７】
この緩衝液は、逆浸透蒸留水中で必要とされる濃度に作製され、ｐＨは無関係である。
【００４８】
【表６】
2004524523.tif 000007
【００４９】
この緩衝液は、逆浸透蒸留水中で必要とされる容量に作製され、７．６±１のｐＨを有する。
【００５０】
本発明はさらに以下から選択される緩衝液を提供する：
１．  ０〜２０％のＣ2〜Ｃ5アルコール、１５〜３０％ドデシル硫酸ナトリウム、または５〜３０％ドデシル硫酸ナトリウムおよび０〜５％サルコシル、０〜０．５％ウシ血清アルブミン、約０．１Ｍ  ＴＲＩＳまたはリン酸緩衝化生理食塩水中の容量に対して作製され、緩衝液は７．０〜９．０の最終ｐＨを有する；
２．  ７．５〜８．５の最終ｐＨを有する、約０．１Ｍ  ＴＲＩＳまたはリン酸緩衝液中に１〜１０ｍｇ／ｍｌの広い範囲のプロテアーゼ酵素を含有する緩衝液；
３．  室温にて少なくとも１１のｐＨを有する、逆浸透蒸留水中に作製される、０．５〜３Ｍグアニジンまたは２〜８Ｍ尿素のいずれか、および０．１〜０．２Ｍ水酸化ナトリウムを含有する緩衝液。
【実施例１】
【００５１】
本発明は今や、以下の実施例を参照してより詳細に記載される。
ＴＳＥ免疫アッセイについての要件は以下のようである：
ａ）固体組織、血液、または血液由来の調製物のサンプル。
ｂ）一連の調製用サンプルの処理物
ｃ）プリオン特異的抗体
ｄ）検出の感度の高い方法
ａ）血液のサンプルは、抗凝固薬でコート化された管またはコードされていない血管のいずれかを使用して採取される。２つの選択肢が試験について利用可能である：
ｉ）全血サンプル
ｉｉ）血液由来のサンプル-血清サンプルまたは軟膜（白血球、リンパ球など）調製物。
【００５２】
固体組織のサンプルは、適切な方法、例えばバイオプシーまたは切開によって、動物またはヒトから採取される。
【００５３】
ｂ）実験室に届くと、サンプルはバーコードを使用して同定される。各サンプルに割り当てられたバーコードは、サンプルの起源の場所（屠殺設備、診療所、病院）、サンプルが採取された日付、および追跡可能な識別サンプル番号に対する情報を組込む。各サンプルのある量が、取出され、秤量され、そしてホモジナイズ（消化、超音波処理、またはボルテックス）のためにサンプルボトル／チューブ／ストマッカーバッグに置かれる。サンプルが特にゼラチン状である場合、酵素分解工程-供給社の指示に従って使用されるＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼの添加が包含され得る。ホモジナイズされた元来のサンプルを含有するこのサンプルボトルまたはバッグは、元来のサンプルに同一のバーコードを割り当てられる。このことは、システムにわたる十分な追跡可能性を可能にする。ホモジナイズ緩衝液の固定された容量：重量比（１:１〜１:２５）は、Ｅｎｆｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｓｔｌｅｂｌａｋｅ、Ｒｏｓｅｇｒｅｅｎ、Ｃａｓｈｅｌ、Ｃｏ．Ｔｉｐｐｅｒａｒｙによって供給され、サンプルボトルに添加され、そしてサンプルは、消化、ボルテックス、または超音波処理によってホモジナイズされる。サンプルが特にゼラチン状である場合、酵素分解工程−供給社の指示に従って使用されるＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、プロテアーゼ、またはリパーゼの添加が包含され得る。次いでサンプルは、ポリプロピレン９６ウェルマイクロタイタープレート上に２連で懸濁される（２００μｌ）。獣医学研究所（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｓｔｏｗｎ、Ｄｕｂｌｉｎによって提供されるブランク、ネガティブ、およびポジティブコントロールがまた、このプレートに添加される。このプレートはプレート遠心分離回転器において、４０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離される。Ｅｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｓｔｌｅｂｌａｋｅ、Ｒｏｓｅｇｒｅｅｎ、Ｃａｓｈｅｌ、Ｃｏ．Ｔｉｐｐｅｒａｒｙによって供給される、２０μｌの特異的緩衝液が、好ましくは、プラスチック性の、全く不活性のマイクロタイタープレート（例えば、イムロン１プラスチックから作製されるＤＹＮＥＸ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ  １プレート）に添加される。プレートは、任意のアッセイの完了のために不活性であるのがよい。荷電されたプレートの使用は成果を低減する。遠心分離されたサンプルおよびコントロールのそれぞれの１００μｌは次いで、ポリプレンの遠心分離されたプレートから特異的緩衝液の容量を含有する不活性なアッセイマイクロライトプレートに移され、そしてプレートカバーガラスがウェル上に置かれる。次いで、プレートは３７℃で６０分間インキュベートされ、カバースライドが除去され、そしてプレートは、Ｅｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｓｔｌｅｂｌａｋｅ、Ｒｏｓｅｇｒｅｅｎ、Ｃａｓｈｅｌ、Ｃｏ．Ｔｉｐｐｅｒａｒｙによって供給される、洗浄緩衝液１中で洗浄される。Ｅｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｓｔｌｅｂｌａｋｅ、Ｒｏｓｅｇｒｅｅｎ、Ｃａｓｈｅｌ、Ｃｏ．Ｔｉｐｐｅｒａｒｙによって供給される、アッセイ誘発緩衝液が２００μｌの容量にて各ウェルに添加される。プレートはカバーガラスで覆われ、そして３７℃にて１５分間インキュベートされる。カバーガラスは、インキュベーションの完了の際に除去され、そしてＥｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｓｔｌｅｂｌａｋｅ、Ｒｏｓｅｇｒｅｅｎ、Ｃａｓｈｅｌ、Ｃｏ．Ｔｉｐｐｅｒａｒｙによって供給される、洗浄緩衝液２が次いでプレート上のサンプルに添加されて、洗浄される。この工程はサンプル調製手順を完了する。
【００５４】
ｃ）サンプルは今や、イムノアッセイに備える。これはプリオン特異的抗体を必要とする。このような抗体についての例は、オボアルブミン結合化合成プリオンペプチド、Ｐｒｏｔｅｕｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＵＫによってＥｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃに認可されるペプチドでのウサギの注射によって惹起されるウサギ抗-ＰｒＰである。このペプチドは、分子モデリング技術、続いてウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ分析を使用してＰｒｏｔｅｕｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＵＫによって同定された。ペプチドは、固相ペプチド合成を使用して、大量に合成される。多様な種、任意の種における特異的なプリオン配列に対して惹起される他の抗ＰｒＰ抗体の使用はまた、このアッセイにおける満足の行く結果を生じる。本明細書中に記載されるペプチドは、アッセイにおいて成功した抗体のただ１つの例にすぎない。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方がアッセイについて使用され得る。洗浄緩衝液２中、至適な作用強度希釈にて、この特異的抗体の固定された容量（１５０μｌ）が、マイクロライトプレートに添加され、３７℃にて４０分間インキュベートされ、そして洗浄緩衝液２を使用して洗浄される。洗浄緩衝液２中、至適な作用強度希釈にて、ＤＡＫＯ、ＵＳＡによって供給される種抗ウサギ（種）-ＨＲＰの固定された容量（１５０μｌ）が、プレートに添加され、３７℃にて３０分間インキュベートされ、そして洗浄液２を使用して洗浄される。結果の検出が今や可能である．
【００５５】
ｄ）検出は、増強された化学発光の手段による。Ｊｏｎｓｏｎ  ＆  Ｊｈｏｎｓｏｎ、ＵＫによって供給される化学発光試薬-Ａｍｅｒｌｉｔｅ試薬（１５０μｌ）が、マイクロタイタープレートに添加され、そして３７℃にて３分間インキュベートされる。光シグナルが、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して読取られ、結果は対応するバーコードに割り当てられ、そして結果報告が印刷される。
【００５６】
詳細な調製プロトコル
１．ホモジナイズ化
１．１  血液または血液派生物または組織サンプルは、サンプルボトル／チューブ/バッグ中に置かれる。
１．２  １〜２５、好ましくは１０〜１５倍のサンプル重量のホモジナイズ緩衝液がサンプルに添加される。
１．３  この混合物は、２分間またはサンプルが完全にホモジナイズされるまで、ホモジナイズ（消化、超音波処理、ボルテックス）される。
１．４  酵素分解選択が、操作者の判断で、ここで適用され得る。
１．５  粒子物質がサンプル中に残存する場合、得られるホモジネートは濾過され得る。
【００５７】
２．プレーティング
２．１  Ｖ-９６-ウェルマイクロタイターポリプロピレンプレートは、２００μｌの各サンプルの遠心分離のために使用される。
２．２  プレート上の２００μｌのブランクコントロールは、遠心分離プレートのＡ１、２に位置する。
２．３  獣医学研究所、Ａｂｂｏｔｓｔｏｗｎ、Ｃａｓｔｌｅｋｎｏｃｋ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄによって供給される２００μｌのネガティブコントロール（公知のネガティブＢＳＥホモジネート）は、プレート上、Ｂ１、２およびＣ１、２の位置に、４複製物に懸濁される。
２．５  獣医学研究所、Ａｂｂｏｔｓｔｏｗｎ、Ｃａｓｔｌｅｋｎｏｃｋ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄによって供給される２００μｌのポジティブコントロール、（公知のポジティブＢＳＥホモジネート）は、プレート上、Ｄ１、２およびＥ１、２の位置に、４複製物に懸濁される。
２．６  ２００μｌの各（濾過された、酵素処理された）ホモジネートは、プレート上、残りの位置に、２連に懸濁される。
２．７  プレートは、４０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離される。
２．８  ２０μlの特異的緩衝液が、不活性なアッセイマイクロタイタープレート、例えば、ＤＹＮＥＸマイクロライト１プレートの各ウェルに添加される。
２．９  １００μｌの各遠心分離されたサンプルおよびコントロールが、遠心分離プレートから取出され、そして不活性なアッセイマイクロライトプレート上の同じ位置に懸濁され、ウェル容量を１２０μｌにする。
２．１０  プレートはマイクロタイタープレートシーラーで覆われ、そして３７℃にて６０分間インキュベートされる。
２．１１  次いで、プレートは、洗浄緩衝液１で４回洗浄される。
２．１１  Ｅｎｆｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｓｔｌｅｂｌａｋｅ、Ｒｏｓｅｇｒｅｅｎ、Ｃａｓｈｅｌ、Ｃｏ．Ｔｉｐｐｅｒａｒｙ、Ｉｒｅｌａｎｄによって供給される２００μｌのアッセイ誘発緩衝液は、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加され、そしてプレートは１５分間、３７℃にてインキュベートされる。
２．１２  プレートは洗浄緩衝液２で４回洗浄される。
【００５８】
３．免疫アッセイ
３．１  １５０μｌの一次抗体、ウサギ（種）抗-ＰｒＰ、ポリクローナル／モノクローナル抗体は、至適な希釈にて、プレート上に懸濁される。
３．２  プレートは３７℃で４０分間インキュベートされる。
３．３  プレートは洗浄緩衝液２で４回洗浄される。
３．４  １５０μｌの二次抗体、種-抗-ウサギ（種）-ＨＲＰが、至適な希釈にて、プレート上に懸濁され、そしてプレートは３７℃にて３０分間インキュベートされる。至適な希釈は、格子アッセイ、例えば、至適な光シグナルを決定するために多様な濃度の一次および二次抗体をプロッティングすることによって決定される（以下を参照のこと）。
３．５  プレートは洗浄緩衝液２で４回洗浄される。
【００５９】
４．検出
４．１  １５０μｌの増強された化学発光試薬-Ｊｈｏｎｓｏｎ  ＆  Ｊｈｏｎｓｏｎ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＫによって供給されるＡｍｅｒｌｉｔｅ試薬が、プレートに添加される。
４．２  プレートは３７℃にて３分間インキュベートされる。
４．３光シグナルは、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄによって供給されるＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して読み取られ、これは完全なＩＲ-Ｖｉｓｉｂｌｅ-Ｗスペクトルを走査し、そして結果を外挿することによってプレートの各ウェルからの発光を読み取る。
４．４  プレートからの光シグナルが、Ｇ．Ｋ．Ｓ．Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｄｕｂｌｉｎ  Ｉｒｅｌａｎｄによってカスタマイズされたソフトウェアパッケージに移される。
４．５  各光シグナルは、対応するバーコードに割り当てられ、そして結果がプリントされる。
４．６  結果が、化学発光光単位-Ｌ．Ｕにおいて引用される。
【００６０】
試薬の供給源
１．プリオン特異的抗体-抗-ＰｒＰ-は、Ｅｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．によって供給され、そしてポリクローナル抗体は以下の合成ペプチドに対して惹起される：
【００６１】
プリオン配列
Ｎ-末端
ＭＶＫＳＨＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴＧＧＳＲＹＰＧＱ-４４
ＧＳＰＧＧＮＲＹＰＰＱＧＧＧＧＷＧＱＰＨＧＧＧＷＧＱＰＨＧＧＧＷＧＱＰＨＧＧＧＷＧＱＰ-８７
ＧＧＧＧＷＧＱＧＧＳＨＳＱＷＮＫＰＳＫＰＰＫＴＮＭＫＨＶＡＧＡＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬＧＧＹ-１３１
ＭＬＧＳＡＭＳＳＰＬＩＨＦＧＮＤＹＥＤＲＹＹＴＲＥＮＭＹＲＹＰＮＱＶＹＹＲＰＶＤＲＹＳＱＮＮ-１７７
【００６２】
１文字アミノ酸コード：
Ａ-アラニン、Ｃ-システイン、Ｄ-アスパラギン酸、Ｅ-グルタミン酸、Ｆ-フェニルアラニン、Ｇ-グリシン、Ｈ-ヒスチジン、Ｉ-イソロイシン、Ｋ-リジン、Ｌ-ロイシン、Ｍ-メチオニン、Ｎ-アスパラギン、Ｐ-プロリン、Ｑ-グルタミン、Ｒ-アルギニン、Ｓ-セリン、Ｔ-トレオニン、Ｖ-バリン、Ｗ-トリプトファン、Ｙ-チロシン。
【００６３】
この２９アミノ酸ペプチドは、ＥＬＩＳＡ技術について抗-ＰｒＰ抗体を十分に惹起するために使用される。この配列は、Ｐｒｏｔｅｕｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｈｉｏｎａｌ  ＵＫによって、分子技術を使用して、ＴＳＥ検出に首尾良く使用され得る抗-ＰｒＰ抗体の産生に潜在的に有用なペプチドであるとして、同定された。強調された配列は、ウサギ抗-ＰｒＰ抗体を惹起するために使用される。ペプチド（ポリペプチド、タンパク質）は、活性化オボアルブミン、ＢＳＡ、またはＫＬＨに結合され、そしてＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント中で筋肉内または皮下に注射される。ブースター注射は皮下であり、およびＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバントが使用される。ウサギは、免疫化後３０および５０日目で、または十分な力価が活性されるまで、採血される。次いで、モノクローナル抗体が必要である場合に産生され得る。
【００６４】
２．Ｅｎｆｅｒ緩衝液１〜３が、Ｅｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって製造および供給される。
【００６５】
ホモジナイズ化緩衝液１：１６％メタノール／エタノール
１５％ドデシル硫酸ナトリウム
０．１％ウシ血清アルブミン
【００６６】
緩衝液は、必要とされる容量に作製され、０．１Ｍ  ＴＲＩＳ/ＨＣＬ緩衝液、８．０＋０．１最終ｐＨ中で攪拌される。この緩衝液は、１６〜２５℃にて保存され、１年間の使用期限をともなう。
【００６７】
特異的緩衝液２：プロテイナーゼＫ
【００６８】
この緩衝液は、０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣＬ緩衝液、８＋０．１の最終ｐＨ中で必要とされる濃度（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）に作製される。この緩衝液は、-２０℃にて保存され、１年間の使用期限をともなう。
【００６９】
アッセイ誘発緩衝液：３Ｍグアニジン、０．１Ｍ水酸化ナトリウムまたは６Ｍ尿素、０．１Ｍ水酸化ナトリウム
【００７０】
この緩衝液は、ＲＯＨ2Ｏ（逆浸透蒸留水）中で必要とされる濃度に作製され、そしてｐＨを確認する前に室温に達せられ、このｐＨは好ましくは１１よりも大きいべきである。この緩衝液は、１６〜２５℃にて保存され、１年間の使用期限を伴なう。
【００７１】
３．洗浄緩衝液１〜２は、Ｅｎｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって製造および供給される。
【００７２】
洗浄緩衝液１：５％塩化ナトリウム
この緩衝液は、ＲＯＨ2Ｏ中で必要とされる容量に作製される。ｐＨは無関係である。この緩衝液は室温にて保存され、１年間の使用期限を伴なう。
【００７３】
洗浄緩衝液２：０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０
この緩衝液は、ＲＯＨ2Ｏ中で必要とされる容量に作製され、７．６＋０．１のｐＨを伴なう。この緩衝液は室温にて保存され、１年間の使用期限を伴なう。
【００７４】
４．化学発光試薬は、Ｊｈｏｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｈｏｎｓｏｎ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＫによって供給され、そして結果は、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能であるＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して、読み取られる。
【００７５】
抗体濃度の測定-Ｇｒｉｄアッセイ
ネガティブおよびポジティブコントロールは、ウェルの第２のセット毎に２連でおかれる。一連の抗体希釈物が、表７において示されるように１／５００〜１／２０００まで作製され、そして試験が実行される。一次抗体添加段階にて、一次抗体の希釈物がネガティブおよびポジティブなサンプルウェル上におかれる。試験の終了時に、最も高いポジティブなコントロール値を与える抗体濃度が、高いネガティブコントロール結果を与えることを伴なわずに、使用される。
【００７６】
【表７】
2004524523.tif 000008
【実施例２】
【００７７】
抗体至適化アッセイが、以下のように行われる：獣医学研究所によって裏づけされる、ポジティブおよびネガティブな組織が使用される。これは、アッセイにおいてコントロールに使用される同じ材料である。
【００７８】
組織は、ホモジナイズ緩衝液中に１／１５希釈され、そして２分間、ホモジナイズされる。次いで、２００μｌのネガティブなホモジネートは、Ａ、Ｃ、Ｅ、およびＧ列に置かれる。２００μｌのポジティブなホモジネートは、Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＨに置かれる。プレートは１０分間、４００ｒｐｍにて遠心分離される。
【００７９】
２０μｌの特異的緩衝液が、アッセイプレートに添加され、そして１００μｌの各サンプルが対応するウェルに移される。
【００８０】
次いでプレートは密封され、そして１時間、３７℃にてインキュベートされる。
【００８１】
プレートは、洗浄緩衝液１で洗浄され、２００μｌの一次緩衝液が添加される。これは１５分間、３７℃でインキュベートされる。
【００８２】
一連の抗体溶液は、洗浄緩衝液中で作製され、すなわち、１／５００、１／１０００、１／１５００、および１／２０００、抗体が、この範囲よりも高い力価または低い力価を有する場合、より高い、または拡張される範囲が、最初のアッセイ後に試行され得る。
【００８３】
誘発緩衝液中でのインキュベーション後、プレートは洗浄液２で洗浄される。次いで、１５０μｌの各抗体濃度が適切なウェルに添加され、そして４０分間、３７℃にてインキュベートされる。プレートは洗浄緩衝液２で洗浄され、そして１５０μｌの二次抗体が全てのウェルに、３０分間３７℃にて添加され、次いでプレートは再度洗浄緩衝液２で洗浄され、そして１５０μｌの化学発光基質が全てのウェルに添加される。３７℃での３分間のインキュベーション後、ウェルは化学発光測定器で読み取られる。
【００８４】
最も良好な結果、すなわち低いネガティブな、好ましくは１．０未満であるが、良好なポジティブな結果、例えば５００を与える抗体濃度が、選択される濃度である。
【００８５】
以前に言及されるように、より高い希釈範囲が、抗体が使用される前に選択され得るが、このアッセイは抗体が使用され得ようがされ得なようが、良好な考えを与える。
【００８６】
【表８】
2004524523.tif 000009
【実施例３】
【００８７】
異なる組織、すなわち、中枢神経系（ＣＮＳ）、リンパ組織、および血液において、ならびに異なる種、ヒツジおよびウシにおいてＴＳＥを検出する手段としてのＥｎｆｅｒ  ＴＳＥのアッセイの適切性に対する実験データ。
【００８８】
２００１年における本発明のＴＳＥアッセイを使用する日常的な試験の結果。
【００８９】
2004524523.tif 000010
【００９０】
2004524523.tif 000011
【００９１】
2004524523.tif 000012
【００９２】
１つのリンパ組織サンプルを確認することが可能ではなかった。この組織は１４週齢の仔ヒツジであり、および感染の非常に初期の段階にあった。これは確認の困難性を説明し得る。
【００９３】
2004524523.tif 000013
【００９４】
これは、臨床的なスクレイピー症例に由来する新鮮な血液であった。全ての症例は、弱くポジティブであることが見出され、そして追跡分析を行うための確認方法は何ら存在しない。
【国際公開パンフレット】
2004524523.tif 000014
2004524523.tif 000015
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524523.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月17日(2003.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＳＥを検出する方法であって、（ａ）試験被験体からの組織、血液、または血液派生物のサンプルを、アルコールおよび洗浄剤で処理する工程、（ｂ）正常なプリオンタンパク質を分解する薬剤を添加する工程、（ｃ）異常なプリオンタンパク質を変性する薬剤を添加する工程、（ｄ）プリオン特異的抗体を添加する工程、ならびに（ｅ）サンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２】
異常なプリオンタンパク質を基質に固定する方法であって、（ａ）前記異常なプリオンタンパク質、または前記異常なプリオンタンパク質を含むことが疑われるサンプルを、アルコールおよび洗浄剤で処理する工程、ならびに（ｂ）その基質の存在下で、プロテアーゼを添加する工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで工程（ａ）がさらにタンパク質を添加することを包含する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記タンパク質が高分子量タンパク質、好ましくは、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、動物起源の正常な血清、加水分解されたコラーゲンのようなアルブミン基質、またはそれらの誘導体から選択される、方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法であって、前記タンパク質が５％以下、好ましくは０．０５〜０．４％のタンパク質を含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ａ）において使用されるアルコールが、Ｃ1〜Ｃ24のアルコール、好ましくはＣ1〜Ｃ5アルコールである、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、ペンタデカノール、セチルアルコール、ヘプタデカノール、ステアリルアルコール、ノナデカノール、エイコサノール、ドカサノール、ドデシルアルコール、ラウリルアルコール、オクタデカノール、および一次、二次、および三次誘導体を含む、それぞれの誘導体、好ましくはメタノールまたはエタノールから選択される、アルコールである、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、前記アルコールが３０％（重量基準）以下の、好ましくは１０〜２０、より好ましくは８〜１２％のアルコールを含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ａ）のアニオン性洗浄剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、サルコシル、ドデシル硫酸リチウム、コール酸、デオキシコール酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００、オクタン酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテルの３０％水溶液、Ｎ−セチル-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチル臭化アンモニウム、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ジギトニン、ノナノイル-Ｎ-メチルグルクアミド、ｎ−オクチル-Ｂ-Ｄ-グルコピラノシド、アルキル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、１，２，３-オクタントリオール，３-ジメチルアミノ-１プロピン、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ナトリウムＩｎｏｐｈｏｒｅ  １、およびそれぞれの誘導体、最も好ましくはドデシル硫酸ナトリウムから選択される、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、前記洗浄剤が５〜３０％、より好ましくは１０〜２０％の洗浄剤を含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｂ）において、正常なプリオンタンパク質を分解する薬剤がプロテアーゼである、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記プロテアーゼが広い範囲のプロテアーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫ、サブチリシン  カールスバーグ、ペプシン、およびそれぞれの誘導体から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記プロテアーゼが１０ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｃ）において異常なプリオンタンパク質を変性する薬剤が、変性化塩溶液である、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記薬剤がグアニジン、尿素、カオトロピックな薬剤の標準変性化溶液、およびそれぞれの誘導体から選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法であって、前記変性化薬剤がさらに０．５Ｍ以下の水酸化ナトリウムを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法であって、前記変性化塩が０．１〜１０Ｍ、好ましくは２〜８Ｍ変性化塩を含有する緩衝液中に処方される、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ａ）の緩衝液（ホモジナイズ緩衝液）が、５．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ７．０〜９．０、より好ましくはｐＨ７．５〜８．５を有するように作製される、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｂ）の緩衝液（特異的緩衝液）が、２．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ２．０〜８．５、より好ましくは７．５〜８．５に作製される、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｃ）の緩衝液（アッセイ誘発緩衝液）が、１〜１４、好ましくは９〜１２、最も好ましくは少なくとも１１のｐＨを有する、方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法であって、ここで工程（ｂ）に続いて、反応混合物が、１０％以下の、好ましくは４〜６％の緩衝化溶液を含有する第１の洗浄緩衝液で洗浄される、方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法であって、前記アッセイ誘発緩衝液が、約５〜３０分間、好ましくは１０〜２０分間、反応混合物とともにインキュベートすることを許容される、方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法であって、ここでアッセイ誘発緩衝液での処理後に、５．０〜１１．０の最終ｐＨ、好ましくはｐＨ７．０〜８．０を有する第２の緩衝液で、混合物が洗浄される、方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法であって、前記第１の洗浄緩衝液が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記第２の洗浄緩衝液が、０〜５％のＴｗｅｅｎ  ２０の選択的な添加を伴なう、リン酸緩衝化生理食塩水を含む、方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法であって、前記血液または組織サンプルが支持体、適切にはマイクロタイタートレイ上に懸濁される、方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれかに記載の方法であって、ここでプリオン特異的抗体が、プリオン配列のアミノ酸番号６０の５'側にあるプリオン配列に対して反応する、方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれかに記載の試験方法であって、試験被験体から血液、または血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物のサンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、および標準的な免疫アッセイによってサンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含し、前記抗体を添加する前に、組織、血液、または血液派生物のサンプルが、約０．１Ｍ（ＴＲＩＳ/ＨＣＬ）またはリン酸緩衝液、最終ｐＨ７．０〜９．０を有する緩衝液中の用量に対して作製される、０〜３０％のＣ1〜Ｃ5アルコール、５〜３０％のドデシル硫酸ナトリウム、または５〜３０％のドデシル硫酸ナトリウムおよび０〜５％サルコシル、ならびに０〜５％ウシ血清アルブミンを含有する第１の緩衝液とともに混合される、試験方法。
【請求項２９】
伝達性海綿状脳症のための試験方法であって、試験被験体からの血液、または血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物サンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、ならびに標準的なイムノアッセイによってサンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含し、血液または組織サンプルは、不活性な支持体上に分注され、そして抗体との反応の前に、２．０〜１１．０、好ましくは２．０〜８．５、より好ましくは７．５〜８．５の最終ｐＨを伴う緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌ以下の、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌの、より好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌの、広い範囲のプロテアーゼ酵素を含有する緩衝液とともにインキュベートされる、試験方法。
【請求項３０】
伝達性海綿状脳症のための試験方法であって、試験被験体から血液、血液派生物、または組織のサンプルを得る工程、組織、血液、または血液派生物のサンプルと、プリオン特異的抗体とを反応する工程、および標準的なイムノアッセイによってサンプルに対する抗体の結合を検出する工程を包含し、サンプルは、抗体との反応の前に、室温にて、少なくともｐＨ１１で、逆浸透圧蒸留水中で作製される、０．１〜１０Ｍ変性化溶液、好ましくは３〜６Ｍ、より好ましくは０．５〜３Ｍグアニジン（選択的範囲は２〜４Ｍ）または２〜８Ｍ尿素（選択的範囲は４〜６Ｍ）、および０．５Ｍ以下の、好ましくは０．１〜０．２Ｍ水酸化ナトリウムを含有する緩衝液とともにインキュベートされる、試験方法。
【請求項３１】
（１）５．０〜１１．０（選択的範囲は７．５〜８．５）の最終ｐＨを有する緩衝液中の容量に対して作製される、０〜３０％のＣ1〜Ｃ24アルコール（選択的範囲は１０〜２０％）、５〜３０％洗浄剤（選択的範囲は１０〜２０％）、および０〜５％プロテイナーゼ（選択的範囲は０．０５〜０．４％）；
（２）２．０〜１１．０（選択的範囲は２．０〜８．５）の最終ｐＨを有する緩衝液中の０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ（選択的範囲は０．２ｍｇ／ｍｌ〜０．６ｍｇ／ｍｌ）のプロテアーゼ酵素；
（３）０．１〜１０Ｍ変性化溶液（選択的範囲は２〜８Ｍ）
から選択される緩衝液。
【国際調査報告】
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