(57)【要約】非酵素性糖化およびタンパク質の架橋は、糖化最終生成物および長寿命のタンパク質の架橋が年齢とともに増加する、加齢プロセスの一部である。このプロセスは、糖尿病の時に生じるものなど、血液中および細胞内環境中において、還元糖が上昇したときに、増加する。影響を受けた分子の構造的および機能的完全性は、これらの修飾により混乱する様であり、そして重大な結果を生じうる。本発明の化合物を使用して、非酵素性糖化のこのプロセスを阻害し、そしてしたがって糖尿病によりまたは老化により生じる病的作用のいくつかを阻害することができる。化合物は、早期老化、食品中のタンパク質損傷を予防するために有用でもあり、そして歯の変色を防止することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物における糖化最終生成物またはタンパク質架橋の形成を阻害する方法であって、ここで前記方法は、有効量の化合物または薬剤的に許容可能な前記化合物の塩を、前記生物に対して投与することを含み、そして前記化合物がLR93、LR94、LR95、LR96、LR97、LR98、LR99、LR100、LR101およびLR102からなる群から選択される、前記方法。
【請求項２】
生物における老化の有害作用を遅らせる方法であって、ここで前記作用は糖化最終生成物またはタンパク質架橋の形成であり、前記方法は、有効量の化合物または薬剤的に許容可能な前記化合物の塩を前記生物に対して投与することを含み、前記化合物がLR93、LR94、LR95、LR96、LR97、LR98、LR99、LR100、LR101およびLR102からなる群から選択される、前記方法。
【請求項３】
糖尿病に起因して生じる合併症の患者における進行を遅らせる方法であって、前記合併症が糖化最終生成物またはタンパク質架橋の形成に起因し、前記方法が有効量の化合物または薬剤的に許容可能な前記化合物の塩を前記患者に投与することを含み、前記化合物がLR93、LR94、LR95、LR96、LR97、LR98、LR99、LR100、LR101およびLR102からなる群から選択される、前記方法。
【請求項４】
リウマチ様関節炎、アルツハイマー病、尿毒症、神経毒性、またはアテローム性動脈硬化の、患者における進行を遅らせる方法であって、前記方法は、有効量の化合物または薬剤的に許容可能な前記化合物の塩を前記患者に投与することを含み、前記化合物がLR93、LR94、LR95、LR96、LR97、LR98、LR99、LR100、LR101およびLR102からなる群から選択される、前記方法。
【請求項５】
食品におけるタンパク質の損傷を防止する方法であって、ここで前記方法は、有効量の化合物または薬剤的に許容可能な前記化合物の塩を、前記食品と混合することを含み、前記有効量が糖化最終生成物またはタンパク質架橋の形成を阻害し、前記化合物がLR93、LR94、LR95、LR96、LR97、LR98、LR99、LR100、LR101およびLR102からなる群から選択される、前記方法。
【請求項６】
LR93、LR94、LR95、LR96、LR97、LR98、LR99、LR100、LR101およびLR102からなる群から選択される、化合物または薬剤的に許容可能な前記化合物の塩。
【請求項７】
有効量のi）化合物または薬剤的に許容可能な前記化合物の塩、そしてii）薬剤的なキャリアとを含む薬剤組成物であって、前記化合物が請求項6の化合物である、前記薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、1999年4月５日に出願した仮出願シリアルNo. 60/127,835に関連する、2000年4月5日に出願した出願シリアルNo. 09/543,703の一部継続出願であり、これらの出願は参考文献として本明細書中に援用する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、一般的には、グルコースおよびその他の還元糖、例えばフルクトースまたはリボースなど、との反応を介するタンパク質の修飾および老化に関するものであり、そしてより具体的には、しばしば結果として後期糖化最終生成物（advanced glycation endproducts）および架橋を形成する、タンパク質非酵素性糖化の阻害に関する。
【０００３】
血中および細胞内環境中での還元糖の濃度の上昇の結果、糖化および後期糖化最終生成物（AGEs）として知られる脱水縮合複合体の非酵素性形成を生じる。これらの複合体生成物は、タンパク質上、脂質上およびDNA上の遊離アミノ基上に形成される（Bucala and Cerami, 1992；Bucala et al., 1993；Bucala et al., 1984）。この現象は、“褐変”または“メイラード”反応と呼ばれるものであり、そして20世紀初頭に食品産業により発見された（Maillard, 1916）。生物学における同様のプロセスの意味は、グリコシル化ヘモグロビンの発見および糖尿病患者におけるそれらの存在の増加の発見のあとにはじめて、明白になった（Rahbar, 1968；Rahbar et al., 1969）。ヒト糖尿病患者において、そして糖尿病の動物モデルにおいて、これらの非酵素性反応が加速され、そしてAGE形成の増加を引き起こし、およびヘモグロビンおよびアルブミンに加えて、コラーゲン、フィブロネクチン、チューブリン、レンズクリスタリン、ミエリン、ラミニンおよびアクチンなどの長寿命のタンパク質の糖化の増加およびLDL関連脂質およびアポタンパク質の糖化の増加もまた、引き起こす。さらに、後期メイラード生成物のスペクトル特性および蛍光特性と同様のスペクトル特性および蛍光特性を有する褐色色素は、老化個体由来のレンズクリスタリンタンパク質およびコラーゲンなどのいくつかの長寿命のタンパク質とin vivoで関連していることもまた見いだされた。年齢関連性の色素の直線的な増加は、20〜90歳のヒト硬膜コラーゲンにおいて見いだされた。
【０００４】
AGE修飾されたタンパク質は、加齢とともにゆっくりと増加し、そして正常組織リモデリングに寄与すると考えられる。それらのレベルは、持続性の高血糖レベルの結果として糖尿病患者において顕著に増加し、そして組織タンパク質構造および機能の変化、AGE特異的受容体を介した細胞反応の刺激、あるいは反応性酸素種（ROS）の生成を含む様々なメカニズムを介して、組織損傷を引き起こす（最近のレビューについては、Boel et al., 1995を参照）。細胞の機能においてしばしば主要な役割を果たす影響を受けた分子の構造的および機能的完全性が、これらの修飾により混乱するようになり、腎臓、眼、神経、および微小血管機能などの影響を受けた器官に対する重度な結果を引き起こす（Silbiger et al., 1993；Brownlee et al., 1985）。AGEsによる高分子の構造的変化は、正常な環境下で加齢とともに蓄積されることが知られている。この蓄積は、糖尿病により激しく加速され、そして高血糖症と強く関連している。例えば、内皮下基底膜におけるタンパク質上のAGE形成により、血管壁におけるタンパク質／タンパク質およびタンパク質／細胞相互作用の激しい構造的変化および機能的変化を引き起こす、広範な架橋形成が引き起こされる（Haitoglou et al., 1992；Airaksinen et al., 1993）。
【０００５】
後期糖化最終生成物（AGEs）の形成および蓄積の増加は、糖尿病合併症、正常な老化、アテローム性動脈硬化およびアルツハイマー病を引き起こす、主要な病理発生プロセスとして関連している。このプロセスは、糖尿病により加速され、そして腎障害（Nicholls and Mandel, 1989）、網膜症（Hammes et al., 1991）および神経障害（Cameron et al., 1992）を含むある範囲の糖尿病合併症の発症に寄与すると仮説が立てられた。特に、AGEsによる腎臓に対する組織損傷により、腎臓機能の進行性の低下および後期腎臓病（ESRD）（Makita et al., 1994）、およびESRDの患者の血清における（Makita et al., 1991）低分子量（LMW）AGEペプチド（糖毒素、グリコトキシン）の蓄積（Koschinsky et al., 1997）が引き起こされる。これらの低分子量（LMW)-AGEsは、血漿構成要素または組織構成要素、例えば低密度リポタンパク質（LDL)（Bucala et al., 1994）またはコラーゲン（Miyata et al., 1993）と新規な架橋を容易に形成することができ、そして糖尿病における組織損傷および病的状態の進行を加速することができる。
【０００６】
腎臓、ラットレンズおよびアテローム性動脈硬化での様々な病変の糖尿病合併症におけるAGEsの寄与を示唆する直接的な証拠が、最近報告された（Vlassara et al., 1994；Vlassara et al., 1995；Horie et al., 1997；Matsumoto et al., 1997；Soulis-Liparota et al., 1991；Bucala and Vlassara, 1997；Bucala and Rahbar, 1998；Park et al., 1998）。実際、健康なラットにおける前もって形成されたAGEsの注入により、腎糸球体肥大およびメサンギウム硬化、マトリクスタンパク質の遺伝子発現、および成長因子の産生が誘導される（Brownlee et al., 1991；Vlassara et al., 1995）。いくつかの系統の証拠から、反応性カルボニル中間体（メチルグリオキサル、グリコールアルデヒド、グリオキサル、3-デオキシグルコソン、マロンジアルデヒドおよびヒドロキシノネナール）の増加は、糖尿病における高血糖の結果である。“カルボニルストレス”がタンパク質および脂質の修飾の増加を引き起こし、それに続いてオキシダントストレスおよび組織損傷が引き起こされる（Baynes and Thorpe, 1999；Onorato et al., 1998；McLellan et al., 1994）。さらなる研究から、AGE形成阻害剤であるアミノグアニジン（AG）が、糸球体の組織機能障害を軽減し、および誘導糖尿病ラットにおけるアルブミン尿症を減少させることが示された（Soulis-Liparota et al., 1991；Itakura et al., 1991）。ヒトにおいて、糖尿病患者におけるアミノグアニジン療法の結果として、腎臓機能の改善に相伴うヘモグロビン（Hb)-AGEレベルの減少（Makita et al., 1992）により、糖尿病合併症の病因におけるAGEsの重要性に関するより多くの証拠が提供された（Bucala and Vlassara, 1997）。
【０００７】
世界的な真性糖尿病の流行、特に米国におけるもの、は、何百万もの人々を苦しめており、罹病率および死亡率は顕著に増大しており、合わせて米国における糖尿病合併症の治療のための大きな財政的負担も増大しているのだが、疾患の合併症を予防するかまたは治療する可能性を有する薬物を探索し、そして開発するための主要な動機付けとなっている。これまでのところ、糖尿病における高血糖症-誘導性組織損傷のメカニズムは十分に理解されていない。しかしながら、4つの病理学的メカニズムが提案され、その中には、ポリオール経路活性の増大、特異的タンパク質キナーゼC（PKC）アイソフォームの活性化、後期糖化最終生成物の形成および蓄積、そして反応性酸素種（ROS)の生成の増大が含まれる（Kennedy and Lyons, 1997）。2種の既知の糖化・酸化反応生成物であるカルボキシメチルリジン（CML）、ペントシジン、およびピラリンに対する特異的抗体を使用することにより、ESRD患者から得られた腎臓以外の組織（Hone et al., 1997）および糖尿病ラットレンズ（Matsumoto et al., 1997）に対する最も最近の免疫組織化学的研究の結果、腎臓およびラットレンズの異なる病変においてこれらのAGE成分を特定し、そして組織タンパク質の永久的かつ不可逆的な修飾を引き起こす際の主要な因子となるように、ROSの産生と緊密に関連して、タンパク質-AGE形成を指示するより多くの証拠が提供された。したがって、AGE形成の阻害剤および抗酸化剤は、糖尿病合併症を予防および治療する効果的な手段としての有望性を有する。
【０００８】
糖尿病コントロールおよび合併症試験（The Diabetic Control and Complications Trial；DCCT）、は、高血糖症を糖尿病合併症の発生の主要なリスク因子として特定した（The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, 1993）。説得力のある証拠により、高血糖症と糖尿病の長期合併症とのあいだの主要な病原性関連として、後期糖化最終生成物の形成が同定される（Makita et al., 1994；Koschinsky et al., 1997；Makita et al., 1993；Bucala et al., 1994；Bailey et al., 1998）。
【０００９】
還元糖とタンパク質、脂質およびDNAのアミノ基とのあいだの反応は、ジカルボニル中間体を介して一連の反応を行い、後期糖化最終生成物を生成する(Bucala and Cerami, 1992；Bucala et al., 1993；Bucala et al., 1984）。
【００１０】
ヒト糖尿病患者においておよび糖尿病の動物モデルにおいて、長寿命の構造タンパク質およびリポタンパク質のAGEの形成および蓄積が報告された。最も最近の報告では、糖化が代謝酵素を不活性化することが示されている（Yan and Harding, 1999；Kato et al., 2000；Verbeke et al., 2000；O'Harte et al., 2000）。細胞機能においてしばしば主要な役割を果たす、影響を受けた分子の構造的および機能的完全性は、これらの修飾により混乱させられ、腎臓、眼および神経などの影響を受けた器官、および微小血管機能に対して重大な結果を伴う（Boel et al., 1995；Silbiger et al., 1993）。イムノグロブリンGの糖化-誘導性変化は、特に興味深い。糖尿病患者におけるIgGのFabフラグメントの糖化についての最近の報告では、これらの患者において見られる免疫不全が、この現象により説明できることが示唆される（Lapolla et al., 2000）。さらに、糖化により損傷を受けたIgGに対するIgM反応とリウマチ様関節炎における疾患の活性とのあいだの関連性が、最近報告された（Lucey et al., 2000）。 また、糖化による高密度リポタンパク質機能の低下が、記載された（Hedrick et al., 2000）。
【００１１】
メチルグリオキサル（MG）は、最近、一般的なメディエーターとして、そしてAGEsを形成するための最も反応性のジカルボニルとして、かなり注目を集めている（Phillips and Thornalley, 1993；Beisswenger et al., 1998）。それは、糖化反応の過程における反応性酸素種（ROS)（フリーラジカル）生成の供給源でもある（Yim et al., 1995）。
【００１２】
自然は、“カルボニルストレス”の有害作用およびAGEsの蓄積から組織を防御するため、いくつかの体液性および細胞性の防御メカニズムを考案した。例えば、グリオキシラーゼシステム（IおよびII）およびアルドースレダクターゼは、MGのD-乳酸塩への解毒を触媒する（McLellan et al., 1994）。アマドリアーゼはまた、アマドリ生成物の脱糖化を触媒するAspergillusにおいて見いだされる新規なクラスの酵素でもある（Takahashi et al., 1997）。さらに、いくつかのAGE-受容体は、単球の表面膜上、およびマクロファージ、内皮細胞、メサンギウム細胞、および肝細胞上に特定された。これらの受容体の一つ、RAGEは、イムノグロブリンスーパーファミリーの構成分子であり、幅広い組織分布を有することが見出された（Schmidt et al., 1994；Yan et al., 1997）。糖化およびAGE形成に対する様々な天然の防御メカニズムの発見により、糖尿病における血管損傷および末梢神経損傷の病理におけるAGEsの重要な役割が示唆される。MGは、タンパク質のアルギニン残基およびリジン残基に結合し、不可逆的に修飾する。MGで修飾されたタンパク質は、AGE受容体に対するリガンドであることが知られており（Westwood et al., 1997）、このことからMGで修飾されたタンパク質は、AGEsにおいて見出されるタンパク質と類似していることが示される（Schalkwijk et al., 1998）。さらに、AGE形成における反応性の中間体であるグリコアルデヒドは、マクロファージスカベンジャー受容体に対する活性なリガンドを生成する（Nagai et al., 2000）。LDLに対するMGの作用は、in vivoおよびin vitroにおいて特定された（Bucala et al., 1993）。
【００１３】
ポリ不飽和脂肪酸（PUFA）、例えばアラキドン酸、の脂質過酸化により、カルボニル化合物もまた得られる；あるものは、MGおよびGOなどの炭水化物から形成されるものと同一であり（Al-Abed et al., 1996）、そしてまたあるものはマロンジアルデヒド（MDA）および4-ヒドロキシノネナール（HNE)などの脂質の特徴を有する（Requena et al., 1997）。後者2つのカルボニル化合物は、脂質過酸化生成物を産生する（Al-Abed et al., 1996；Requena et al., 1997）。最近の報告では、修飾されたコラーゲンの架橋におけるおよび真性糖尿病における、脂質-誘導性MDAの重要性が強調されている（Slatter et al., 2000）。蛍光物質および非蛍光物質の両方の多数のAGE化合物が、タンパク質の架橋に関与しており、そして特定された（Baynes and Thorpe, 1999）。グルコース誘導性AGE-タンパク質架橋に加えて、AGE架橋は、組織タンパク質とAGEタンパク質消化およびターンオーバーから形成されるAGE-含有タンパク質フラグメントとのあいだにも生じる。現在ではグリコトキシンと呼ばれているこれらの反応性AGE-ペプチドは、通常は腎臓により取り除かれる。糖尿病患者において、これらのグリコトキシンは、血清タンパク質と反応し、そして広範囲に及ぶ組織損傷に対する供給源である（He et al., 1999）。しかしながら、架橋構造の化学的性質についての詳細な情報は、知られていないままである。化学的解析およびスペクトロスコープ解析に基づくこれまでに特定された架橋構造は、in vivoにおいて生じるAGE架橋の小さな画分のみからなり、主要な（1または複数の）架橋構造はいまだ知られていない。最も最近、新規な酸-不安定性AGE-構造である、N-オメガ-カルボキシメチルアルギニン（CMA）、が、コラーゲンの酵素的加水分解により同定された。その濃度は、ペントシジン濃度の100倍であることが見出され（Iijima et al., 2000）、そしてそれは、主要なAGE架橋構造であると考えられる。
【００１４】
老化および糖尿病に加えて、AGEsの形成は、いくつかのその他の病理学的症状に関連している。IgM抗-IgG-AGEは、リウマチ様関節炎活性の臨床的測定に関連している様である（Lucey et al., 2000）。AGEsとリウマチ様関節炎との相関は、北アメリカインディアンにおいてもまた見られた（Newkirk et al., 1998）。AGEsはアルツハイマー病における脳斑中に存在し、そしてAGEsの存在は、アルツハイマー病の発症を促進するよう助長する可能性がある（Durany et al., 1999；Munch et al., 1998；Munch et al., 1997）。尿毒症患者では、年齢的に適合した対照と比較して、血清AGEsのレベルが上昇した（Odani et al., 1999；Dawnay and Millar, 1998）。AGEsはまた、神経毒性とも相関している（Kikuchi et al., 1999）。AGEタンパク質は、マウスにおけるアテローム性動脈硬化と関連しており（Sano et al., 1999）および血液透析を行った人々におけるアテローム性動脈硬化と関連していた（Takayama et al., 1998）。アミノグアニジンをウサギに対して給餌した研究により、アミノグアニジンの量を増加させることにより、大動脈における斑形成の減少が引き起こされ、このことから後期糖化がアテローム形成に関与している可能性があることが示唆され、そして後期糖化の阻害剤により、このプロセスが遅延させられうる可能性が上昇する（Panagiotopoulos et al., 1998）。後期糖化最終生成物であるN（ε)-カルボキシメチルリジン（CML）の顕著な沈着が、家族性筋萎縮性側索硬化症を有するヒトにおける星状細胞性ヒアリン封入体において見られるが、しかし正常対照サンプルにおいては見られない（Kato et al., 1999；Shibata et al., 1999）。タバコ喫煙は、血漿低密度リポタンパク質上、血管壁における構造タンパク質上、および眼のレンズタンパク質上でのAGEs蓄積の増加、アテローム性動脈硬化およびタバコを使用することに関連するその他の疾患の病因をもしかしたら引き起こすこれらの作用のうちのいくつかとも、関連している（Nicholl and Bucala, 1998）。最終的には、アミノグアニジンをラットに給餌する研究により、この治療が進行性心臓血管衰弱および腎臓衰弱から保護することが示された（Li et al., 1996）。
【００１５】
グリコシル化現象のカスケードにおけるアミノグアニジンの阻害性作用のメカニズムが調べられた。現在まで、AG-媒介性のAGE形成阻害の正確なメカニズムは、完全には知られていない。いくつかの系列のin vitro実験の結果、対照的な結果が引き起こされた。簡単に述べれば、還元糖濃度の上昇により、炭水化物カルボニルとタンパク質アミノ基とのあいだに自発性の反応が引き起こされ、以下の事象が生じる：
1. シッフ塩基の可逆性形成；その後
2. 高い反応性のジカルボニル化合物である3-デオキシグルカゾン（3-DG）などのアマドリ縮合／脱水生成物（Kato et al., 1990）；
3. 不可逆性かつ高い反応性の後期糖化最終生成物。初期アマドリ生成物の例はケトアミンであり、これはさらに縮合反応を行い後期AGEsを形成する、。多数のAGE生成物が精製され、そして最近特性決定されたが、これらのそれぞれのものは、in vivoで生成されたAGEsのわずかな画分のみを構成する。例としては、ピラリン、ペントシジン、カルボキシメチル-リジン（CML）、カルボキシエチル-リジン（CEL）、クロスリン（crossline）、ピロロピリジニウム、メチルグリオキサルリジン二量体（MOLD）、Arg-Lysイミダゾール、アルギニンピリジニウム、サイペントジン（cypentodine）、ピペリジンジノン（piperidinedinone）エノールおよびアルキル、ホルミル、ジグリコシル-ピロール（Vlassara, 1994）がある。
【００１６】
合成ペプチド上でin vitroで形成された糖化生成物の解析から、アミノグアニジンが初期アマドリ生成物の形成を阻害しないことが示された（Edelstein and Brownlee, 1992）。BSA上で形成された糖化生成物の解析により、同様の結論に達した（Requena et al., 1993）。両方の実験において、蛍光測定により、そしてマススペクトル解析により解析された場合に、AGE形成はAGにより強力に阻害された。マススペクトル解析では、複合体中へのAGの取り込みに対応する分子量では、ペプチド複合体は検出されなかった。NMR、マススペクトロスコープ、およびX-線回折を用いた詳細な機構的研究により、アミノグアニジンがAGE前駆体である3-DGと反応し、3-アミノ-5-置換トリアジンおよび3-アミノ-6-置換トリアジンを形成することが示された（Hirsch et al., 1992）。対照的に、レンズタンパク質と共に標識14C-AGを使用した他の実験により、AGが、タンパク質と結合するようになり、そしてまた遊離糖の活性なアルドース型と反応することも示される（Harding, 1990）。いくつかのその他のAGE阻害剤として可能性のある薬物候補が最近報告された。
【００１７】
これらの研究では、in vitroおよびin vivo評価を通じて、薬剤がAGE形成を阻害する能力およびAGE-タンパク質架橋を阻害する能力について、アミノグアニジン（AG）の能力と比較して評価した（Nakamura et al., 1997；Kochakian et al., 1996）。この分野における最近のブレークスルーは、選択的にAGE-誘導体化タンパク質架橋をin vitroおよびin vivoで切断する化合物、N-臭化フェナシルチアゾリウム（phenacylthiazolium bromide；PTB）の発見である（Vasan et al., 1996；Ulrich and Zhang, 1997）。不可逆的AGE-媒介性タンパク質架橋を破壊する薬学的能力により、可能性のある治療的使用が提供される。
【００１８】
高血糖症-誘導性架橋の長期予後に対する初期医薬的治療は、糖尿病の重度の後期合併症の発症を予防するということが、よく調べられている。組織および体液中のグルコース-媒介性架橋を完全に停止させる、非毒性かつ非常に効果的な薬物の開発は、非常に望まれる目的である。タンパク質上のAGEs形成を妨害するためにin vitroおよびin vivoの両方で研究された医薬化合物の原型は、小分子ヒドラジン様化合物のアミノグアニジン（AG）である（Brownlee et al., 1986）。しかしながら、多数の他の化合物がAGE形成に対してそのような阻害性作用を有することが見出された。例としては、D-リジン（Sensi et al., 1993）、デスフェリオキサミン（Takagi et al., 1995）、D-ペニシラミン（McPherson et al., 1988）、チアミンピロリン酸およびピリドキサミン（Booth et al., 1997）があるが、これらはアミノグアニジンと構造的には何ら類似性を有さない。
【００１９】
AGE形成を阻害することを目的とした最初の薬物候補としてのAGの臨床試験が、進行中である（Corbett et al., 1992）。多数のヒドラジン様化合物および非-ヒドラジン化合物が調べられた。これまで、従来技術における他の試験化合物と比較して、AGは、最も有用かつより副作用が低いことが見出された。しかしながら、AGは、一酸化窒素（NO）の周知の選択的阻害剤であり、そして抗酸化作用を有する可能性もある（Tilton et al., 1993）。
【００２０】
AGE阻害剤として使用されるべき多数の他の可能性のある薬物候補を最近発見し、そしてin vitroおよびin vivoの両方で評価した（Nakamura et al., 1997；Soulis et al., 1997）。アミノグアニジンおよび類似の化合物を用いた研究の成功が見込みのあるものであるのに対して、この活性の利用可能性および範囲および治療的有用性を拡大するために、さらなるAGEs阻害剤を開発する必要性が、依然として存在している。
【００２１】
発明の概要
アリールおよびヘテロ環式ウレイド誘導体およびアリールおよびヘテロ環式カルボキサミド誘導体を含むフェノキシイソ酪酸の誘導体および安息香酸の誘導体は、しばしば後期糖化最終生成物の形成と架橋という結果を引き起こす、タンパク質の非酵素性糖化を阻害することが見いだされた。多数のその他のフェノキシイソ酪酸誘導体ならびに以下に記載する特定のその他の化合物もまた、タンパク質の非酵素性糖化を阻害することが見出された。タンパク質の非酵素性糖化および架橋は、加齢とともに増加する長寿命のタンパク質の糖化最終生成物および架橋を伴う、老化プロセスの一部である。このプロセスは、糖尿病により生じるような血液中および細胞内環境中の還元糖濃度の上昇時に増加する。影響を受けた分子の構造的および機能的完全性は、これらの修飾により混乱させられ、そして重度の結果を引き起こす可能性がある。本発明の化合物を使用して、非酵素性糖化および架橋のこのプロセスを阻害し、その結果、糖尿病によりまたは老化により生じる病的作用のいくつかを阻害することができる。化合物は、早期老化、リウマチ様関節炎、アルツハイマー病、尿毒症、神経毒性、アテローム性動脈硬化、および食物中のタンパク質の損傷を予防するためにも有用であり、そして歯の変色を予防することができる。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明者らは以前に、アリール（およびヘテロ環式）ウレイドおよびアリール（およびヘテロ環式）カルボキサミドフェノキシイソ酪酸である新規クラスの化合物を報告し、および糖化阻害剤およびAGE形成阻害剤としての安息香酸誘導体および関連化合物もまた、報告した（Rahbar et al., 1999；Rahbar et al., 2000）。後期糖化最終生成物(AGEs）に対するそれらの化合物の阻害作用の可能性を研究するために様々なクラスの有機化合物をスクリーニングする過程において、本発明者らは、試験したフェニルウレイド置換フェノキシプロピオン酸誘導体のほとんどが、阻害作用を有し、そしてこれらの化合物いくつかは、同程度に阻害性のアミノグアニジン濃度よりもずっと低い濃度で、AGE-形成の強力な阻害剤であることを見いだした。本発明の研究の目的は、糖化、AGE形成およびAGE-架橋の新規クラスの阻害剤を開発すること、およびそれらの作用をin vitro化学的アッセイおよび免疫化学的アッセイを介して研究することであった。全部で102種の化合物を設計し、そして合成した。最初の92種の化合物は、他の場で報告した。最も強力な阻害剤の一つであることが以前に報告された、以前に以前に報告したLR23（4-（3,5-ジクロロフェニルウレイド)-フェノキシイソブチリル-1-アミドシクロヘキサン-1-カルボン酸)）に基づいて、ここで報告する10種の新規化合物を設計し、そして開発した（Rahbar et al., 1999；本明細書中に参考文献として援用するU.S. 特許出願シリアルNo. 09/543,703）。これらの化合物は、本明細書中に援用するLalezari and Lalezari（1989）中にその合成が報告されている、LR3（図16を参照）、に基づいている。阻害作用の顕著な増加、特にAGE-タンパク質架橋の阻害に対する阻害作用の顕著な増加、が、原型であるLR23と比較して3種の化合物、LR96、LR99およびLR102に見出され（以下を参照）、そしてそれはピリドキサミンと比較して2〜3倍より効果的である（Khalifah et al., 1999）。
【００２３】
このクラスの化合物が糖化、AGE-形成、および架橋を阻害するメカニズムは、まだ知られていない。本研究は、糖化の初期段階に特異的なアッセイであるδ-GluアッセイにおいてHbA1cレベルを低下させることにより証明されるように、これらの化合物が糖化およびAGE-形成の複数工程で、すなわち初期に、作用する強力な阻害剤であることを示している。（A型阻害剤またはB型阻害剤）。これらの化合物のほとんどは、BSA-グルコースアッセイおよびG. K.-リボースアッセイにより示されたように、ポスト-アマドリ糖化を強力に阻害し（D型阻害剤）、そしてそれらの十分な数が、特異的ELISAアッセイにより証明されるように、AGEタンパク質架橋の強力な阻害剤である（Baynesの分類により記載されるE型阻害剤（Khalifah et al., 1999)）。
【００２４】
2種の既知の糖化阻害剤（アミノグアニジンおよびメトホルミン）などのグアニジノ化合物阻害剤の阻害活性のメカニズムは、MGおよび糖化の他のα-ジカルボニル中間体を捕捉することと推測されることである。最も最近の研究では、メトホルミンのMGおよびグリオキサル（GO）との反応を実証し、グアニジノ-ジカルボニル付加化合物の形成がさらにこの概念をサポートする（Ruggiero-Lopez et al., 1999）。しかしながら、本発明者らの新規化合物の構造から、α-ジカルボニルを捕捉しないようであることが示唆される。それらは、アミノグアニジンのメカニズムとは全く別個の異なるメカニズムにより作用している可能性がある。.
糖化の初期（アマドリ）および後期（ポスト-アマドリ）段階に特異的な新規のアッセイ法を使用することにより、初期段階においてより大きな作用を有するいくつかの阻害剤および糖化の後期段階でより大きな作用を有するいくつかの阻害剤が示された。しかしながら、本発明者らが研究してきた阻害剤化合物の多くは、多段階阻害剤である。還元糖のタンパク質のα-アミノ基およびε-アミノ基との反応は、ランダムなプロセスではなく、むしろこれらの化学基の性質および近さに依存する部位特異的反応である。将来的な課題は、AGE形成および架橋を引き起こす一連の複雑な反応および中間体基質中の阻害剤化合物の相互作用部位（1または複数）を具体的に定義することである。
【００２５】
糖化、AGE形成、およびAGE-タンパク質架橋の新規阻害剤の開発は、糖尿病合併症の予防のための治療的用途を見出すことができる、糖化反応の阻害剤の存在する集積を拡張するのみでなく、タンパク質または脂質の糖化の増加に関連する他の疾患を阻害する。さらに、これらの化合物の利用可能性により、反応カスケード、およびAGE-形成およびAGE-タンパク質架橋のプロセスにおける中間体基質を研究するためのツールとして有用であることが証明されうる。
【００２６】
本発明において利用される化合物およびそれらの有用な組成物は、初期糖化生成物の非常に活性なカルボニル中間体と反応することができ、それによりそれらの初期生成物が、タンパク質架橋およびタンパク質老化を引き起こす、後期糖化最終生成物をより後期に形成することを防止することができる剤を含有する。
【００２７】
本発明のために想定される他の用途は：早期老化および食品中タンパク質損傷の予防（U. S. 特許5,661,139）である。本発明の薬剤は、それらが歯の変色を予防するように、口腔衛生の分野においても有用である。
【００２８】
化合物
本発明の化合物は、LR93〜LR102として図6〜15に示され、そしてタンパク質糖化およびAGE-形成に対する阻害作用についてそれらの化合物をスクリーニングした。
【００２９】
上記化合物は、標的タンパク質上での後期糖化最終生成物の形成および結果として生じるタンパク質架橋を阻害することができる。本発明の原理は、ポスト-糖化工程、すなわち蛍光発色基の形成（発色基の存在が、糖尿病および老化の不都合な続発症と関連しそしてそれを引き起こす）をブロックする薬剤を使用することである。理想的な薬剤は、発色基の形成およびタンパク質のその関連する架橋を妨害し、そして動脈および腎臓において生じるような、その他のタンパク質上でのタンパク質のトラッピングを妨害しうる。本発明の化合物をヒトを含むほ乳動物に対して投与し、タンパク質糖化および架橋（タンパク質老化）を防止しまたは減少させることができる。化合物をそれぞれの薬剤の活性に応じて、1回量でまたは個々の量で、様々な用量で経口的に投与することができる。さらに、化合物を非経口的にまたは直腸的に投与することができる。本発明の化合物、本発明の様々なアッセイ法を裏打ちする原理、そしてそれらの用途は、以下の実施例において説明する。
【００３０】
実施例1  ヘモグロビン-δ-グルコノラクトン（δ-Glu）アッセイ
δ-Gluアッセイは、糖化の初期段階の阻害剤を研究するための特異的な方法である。ヘモグロビン（HbA1C）上での初期糖化生成物（アマドリ）形成の評価を、赤血球を阻害剤化合物の存在下および非存在下にてグルコースの酸化型とともにインキュベートし、その後試験サンプルvs対照でHbA1cを測定することにより、行った（Rahbar and Nadler., 1999）。このテストは、Lindsayたち（1997）による最近の報告に基づく。グルコースの酸化型類似体であるδ-Gluは、赤血球中のヘモグロビンと急速に反応することができ、そしてHbA1Cレベルをインキュベーション開始後数時間以内に顕著に増加させる。対照的に、グルコースの場合には、対応する反応を生じさせるためには、数週間が必要である。本発明者らは、この知見を使用して、ヘモグロビンの初期段階糖化（アマドリ生成物）を測定するためのアッセイ法を考案しそして阻害剤がHbA1C形成を阻害する能力を評価するためのアッセイを考案した。簡単に述べると、新鮮血をカリウム-EDTA中に取り出し、そして200μLの血液を40μLのリン酸緩衝塩類溶液（PBS）、pH 7.4、単独、50ミリモル/L δ-Glu（Sigma）を含有するPBS、または50ミリモル/L δ-Glu＋1ミリモル/L阻害剤を含有するPBSのいずれかと混合することにより、採取から30分以内にインキュベーションンの用意をした。37℃にて16時間インキュベーションした後、存在する糖化ヘモグロビン％を測定した。糖化Hb（HbA1C）の％を、専用イオン交換HPLCシステム（BIORAD DIAMAT）を用いて測定した。血液サンプルは、3重にして解析した。化合物によるHbA1c形成の％阻害は、以下の式に従って計算した：
（（B-C)/（B-A)）×100
ここで、Aは、δ-Gluで処理していないベースライン対照チューブにおけるHbA1C濃度であり、Bは、δ-Gluとともにインキュベートした血液中のHbA1C濃度であり、Cは、δ-Gluおよび阻害剤化合物の両方で処理した試験チューブのHbA1C含量である。
【００３１】
1ミリモル/Lの化合物を使用した正常ボランティアから採取したδ-Glu処理した全血を用いる、（HbA1C）形成の量を、図1に示す。HbA1C形成の％阻害として計算されたこの結果を、表1に示す。δ-Glu処理血液中でのHbA1Cレベルは、ベースライン対照よりも2倍高い。様々な阻害剤（化合物LR93〜LR102）は、それらの阻害性可能性に依存するHbA1Cレベルを示す。新規化合物の半数は、原型LR23よりもよい阻害を示した。
【００３２】
【表１】
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上記実験から、このタイプの薬物治療は、後期糖化最終生成物形成における予備的段階である初期糖化生成物の形成と関連する病理を減少させることができることが示唆される。
【００３３】
実施例2 BSA-グルコースアッセイ
このテストを使用して、阻害剤がBSAの蛍光のグルコース-媒介性発色を阻害する能力を評価する（Ikeda et al., 1996）。Sigmaから入手し三重にしたBSAのサンプル（画分V、本質的に脂肪酸を含まない、低エンドトキシン）50 mg/mLおよびNaN3 0.2 g/Lを含有する1.5 Mリン酸バッファー、pH 7.4中800 mMのグルコース（144 mg/mL）を、様々な濃度の化合物の存在下もしくは非存在下にて、37℃にて7日間、無菌条件下でインキュベートした。インキュベーション7日後、それぞれのサンプルを、特異的な蛍光の発色について調べた（励起光330 nm；放射光410 nm）。対照と比較した試験サンプルにおけるAGE形成の％阻害を、それぞれの阻害剤化合物について計算した。アミノグアニジン（50 mM）を、陽性対照として使用した。結果を、表2に示す。
【００３４】
図2は、50ミリモル/Lのアミノグアニジンに対する、1ミリモル/Lの新規阻害剤の阻害作用を示す。このアッセイ法は、主として後期糖化およびAGE形成（ポスト-アマドリ）の阻害剤に対するものである。このアッセイにより得られた結果により、ここで調べた10種すべての化合物が、ポスト-アマドリ糖化、AGE形成およびAGE架橋に対する強力な阻害作用を有することが示される。
【００３５】
【表２】
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実施例3 N-アセチル-グリシル-リジンメチルエステル（G. K. ペプチド)-リボースアッセイ
新規阻害剤化合物による後期糖化生成物（AGEs）、およびAGE-阻害の評価は、試薬の存在下もしくは非存在下にて、リボース中でG. K. ペプチドをインキュベーションすることにより、そしてその後それらの特異的な蛍光の測定を介して、糖化およびAGE形成の経過において生成される発色基を測定することにより、試験した。本発明の化合物がリボースの存在下にてN-アセチルグリシル-リジンメチルエステルの架橋を阻害する能力を評価するために使用したNagarajたち（1996）の方法は、以下のとおりである：
保存溶液：
NaN30.2 g/Lを含有する0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）
0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）中、GK ペプチド（Sigma）80 mg/mL
0.5 Mリン酸バッファー中、リボース800 mM（120 mg/mL）
等量（0.1 mL）の3つのストック溶液のサンプルを混ぜ合わせ、0.2ミクロンフィルター（Corning）を介してろ過し、そして37℃にて24時間、無菌条件下でインキュベートした。阻害剤化合物を添加して、最終濃度を1ミリモル/Lとした。インキュベーション期間の最後に、サンプルをそれらの特異的な蛍光について解析した（励起：330 nm；放射：415 nm）。様々な濃度の阻害剤による％阻害を、上述したとおり計算した。アミノグアニジンを50 mMで、陽性対照として使用した。
【００３６】
図3は、G. K. ペプチド-リボースアッセイを使用して、化合物がこれらの別々の測定におけるタンパク質-AGEの特異的な蛍光をブロックする阻害作用を示す。結果を表3に示す。このアッセイの結果から、ここで調べた10種すべての化合物が、強力な阻害作用を有し、そしてこれらの別々の測定におけるタンパク質AGEの特異的な蛍光をブロックすることが示される。
【００３７】
【表３】
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実施例4 ELISAアッセイ
特別なELISA技術（Al-abed et al., 1999）を使用して、研究された化合物が、ラット尾-腱-コラーゲンでコートした96ウェルプレート（Biocoat Cell Environment, Becton Dickinson）に対する、糖化-BSA（AGE-BSA）の架橋を阻害する能力を評価した。AGE-BSAのラット尾-腱-コラーゲンでコートしたプレートに対する架橋は、所望の濃度の試験化合物の存在下および非存在下で行った。その後、非架橋AGE-BSAを、ウェルを洗浄することにより取り除いた。次に、尾-腱-コラーゲンでコートされたプレートに対するAGE-BSAの架橋を、本発明者らの研究室においてAGE-RNaseに対して生じさせたポリクローナル抗体により定量した。アッセイにおけるポジティブな結果から、阻害剤がコラーゲンと架橋するAGE-BSAの量を減少させることができることが示される。アミノグアニジンは、陽性対照として使用した。
【００３８】
化合物LR96、LR99およびLR102を使用した結果は、図4A〜Cに示す。これらの化合物は、AGE-タンパク質架橋の強力な阻害剤の中のものである。
上述の実施例から、このタイプの薬物治療が、非酵素性糖化生成物（初期生成物および後期生成物）およびタンパク質-タンパク質架橋の形成に関連する病理を減少させる際に利点を有する可能性があることが示される。本発明の化合物は、糖尿病合併症を予防するために第2/3相臨床試験の状態にあるアミノグアニジンと比較して、最大250倍、より強力なin vitroでのAGE-形成阻害剤であることが見出される。これらの化合物を、単回量および個々の量におけるそれぞれの薬剤の活性に依存して、様々な投与量で経口的に投与することができる。さらに、化合物は、非経口的または直腸的に投与することができる。
【００３９】
本発明は、発明の好ましい態様の詳細を参照することによりこの特許出願中に開示されたが、当業者は本発明の精神および添付した請求の範囲に記載した発明の範囲の範囲内において容易に修飾を行うことができることが企図されるため、開示は限定を意味するものではなく説明をするためのものであることが企図されることは理解すべきである。
【００４０】
参考文献のリスト
【００４１】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図1は、δ-GluアッセイにおけるLR93〜LR102による阻害を示す。A-ベースライン対照；B-δ-Glu処理血液；C〜Lはδ-Glu処理血液＋以下に示す阻害剤：C-LR93；D-LR94；E-LR95；F-LR96；G-LR97；H-LR98；I-LR99；J-LR 100；K-LR101；およびL-LR102。
【図２】図2は、BSA-グルコースアッセイにおけるLR93〜LR102による阻害を示す。A-AG（50 mM)；B-LR93；C-LR94；D-LR95；E-LR96；F-LR97；G-LR98；H-LR99；I-LR100；J-LR101；およびK-LR102。
【図３】図3は、G. K. ペプチド-リボースアッセイにおけるLR93〜LR102による阻害を示す。バーは、図2と同一である。
【図４】図4A〜Cは、ELISAアッセイにおける化合物LR23、LR96、LR99およびLR102についての結果を示す。図4Aは、コラーゲン-AGE-BSAの架橋の、それぞれ0.2 mMのLR23、LR99およびLR102による阻害を示す。図4Bは、コラーゲンAGE-BSAの架橋の0.1、0.2および0.5 mMの濃度のLR96による阻害を示す。図4Cは、コラーゲン-AGE-BSAの架橋の、0.1、0.2および0.5 mMの濃度のLR102による阻害を示す。
【図５】図5は、化合物LR23の構造を示す。
【図６】図6は、化合物LR93の構造を示す。
【図７】図7は、化合物LR94の構造を示す。
【図８】図8は、化合物LR95の構造を示す。
【図９】図9は、化合物LR96の構造を示す。
【図１０】図10は、化合物LR97の構造を示す。
【図１１】図11は、化合物LR98の構造を示す。
【図１２】図12は、化合物LR99の構造を示す。
【図１３】図13は、化合物LR100の構造を示す。
【図１４】図14は、化合物LR101の構造を示す。
【図１５】図15は、化合物LR102の構造を示す。
【図１６】図16は、化合物LR3の構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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