(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）により同定されうる細胞の分裂および増殖工程におけるいくつかのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子およびそれらの相当する遺伝子産物の顕著な機能的な役割、および、すべてのそれらの生物学的活性誘導体等の前記遺伝子の機能的オルトログの同定および単離に関連する。本発明は、抗増殖剤の開発または単離における（前記オルトログ等の）前記遺伝子および遺伝子産物の使用、特に適切なスクリーニングアッセイにおける使用、および増殖疾患の診断および処置のための使用に、さらに関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選ばれる核酸配列を含む、細胞の分裂および増殖に機能的に関与するポリペプチドをエンコードする単離された核酸分子およびそれらのフラグメント：
（ａ）  配列番号１から３、配列番号４から５、配列番号６から７、配列番号１２で表される核酸配列およびそれらのフラグメント並びにそれらの相補鎖、
（ｂ）  配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３の１００残基以上の少なくとも２５％と配列同一性を示すポリペプチドをエンコードする核酸配列、および／または、最大１０−３０のｅ値によりブラスト配列分析プログラムを用いたコンピューター検索により検出可能な核酸配列、
（ｃ）  中程度／高度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列にハイブリダイズできる核酸配列、
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）または（ｃ）で規定されるいずれかの配列に対する遺伝子コードの結果として縮退した核酸配列。
【請求項２】
検出可能なラベルを含む少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、請求項１に規定された核酸配列を含む核酸プローブ。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子またはそれらのフラグメントを中に取り込んで有する組み換えベクターまたは核酸構築物。
【請求項４】
発現ベクターである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された核酸分子または請求項３に記載の組み換えベクター若しくは核酸構築物を遺伝子工学によって中に取り込んだ宿主細胞。
【請求項６】
請求項４に記載の発現ベクターを中に取り込んで有する、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された核酸分子若しくはそれらのフラグメント、または請求項２に記載のプローブ、を適切な容器内に含むアッセイキット。
【請求項８】
細胞の分裂および増殖に機能的に関与するポリペプチドまたはそれらのフラブグメントを宿主細胞内で産生する以下の工程を含む方法：
（ａ）  請求項４に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞に移入すること、
（ｂ）  前記ポリペプチドまたはそれらのフラグメントの発現が起こる条件下で工程（ａ）の宿主細胞を培養すること、
（ｃ）  任意に、発現したポリペプチドを培地に分泌させること。
【請求項９】
配列番号１から３、配列番号４から５、配列番号６から７、配列番号１１で表される核酸配列を含む遺伝子のオルトログを単離するための、請求項２に規定されたプローブの使用。
【請求項１０】
細胞の分裂および増殖に機能的に関与するポリペプチドまたはそれらのフラグメントを産生するための、請求項１に規定された単離された核酸分子またはそれらのフラグメントの使用。
【請求項１１】
細胞の分裂または増殖を阻害し、刺激し、またはもたらす相互作用薬のスクリーニングアッセイにおける、請求項１に規定された核酸分子若しくはそれらのフラグメントまたは請求項２に記載のプローブの使用。
【請求項１２】
異常および／または過剰な細胞の分裂または増殖と関連した疾患の診断または処置のための方法における、請求項１に規定された核酸分子または請求項２に記載のプローブの使用。
【請求項１３】
疾患が、冠状動脈再狭窄または、リンパ腫、肺癌、結腸癌、卵巣癌および乳癌からなる群より選ばれる腫瘍性疾患である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
以下からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、細胞の分裂および増殖に機能的に関与するポリペプチドまたはそれらのフラグメント：
（ａ）  配列番号８、９、１０、１１および１３で表されるアミノ酸配列およびそれらのフラグメント、
（ｂ）  （ａ）の配列の１００残基以上の少なくとも２５％と配列同一性を示すアミノ酸配列、および／または、最大１０−３０のｅ値によりブラスト配列分析プログラムを用いたコンピューター検索により検出可能なアミノ酸配列、
（ｃ）  請求項１に規定された核酸配列（ｃ）−（ｄ）のいずれかによりエンコードされたアミノ酸配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリペプチドまたはそれらのフラグメントを含む融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリペプチドまたはそれらの免疫原部分に特異的に結合する能力を有する抗体またはそれらのフラグメント。
【請求項１７】
請求項１４に記載のポリペプチドまたはそれらの免疫原部分に特異的に結合する能力を有するヒト化抗体。
【請求項１８】
請求項１４に記載のポリペプチド、請求項１５に記載の融合タンパク質、請求項１６および／または１７に記載の抗体を、適切な容器内に含むアッセイキット。
【請求項１９】
細胞の分裂または増殖を阻害し、刺激し、またはもたらす相互作用薬のスクリーニングアッセイにおける、請求項１４に記載のポリペプチド、または、請求項１６若しくは１７に記載の抗体、の使用。
【請求項２０】
相互作用薬のスクリーニングアッセイが以下の工程を含む、請求項１９に記載のポリペプチドまたは抗体の使用：
１．宿主細胞内での前記ポリペプチドの組み換え発現
２．  工程１で組み換えにより発現したポリペプチドの単離および任意の精製
３．  任意に、前記ポリペプチドと相互作用することを試験される薬のラベル化、および／または、組み換えにより発現したポリペプチドのラベル化
４．  組み換えにより発現したポリペプチドの固相への固定化
５．  相互作用する可能性のあるパートナーまたはそれらの変種のポリペプチドへの結合
６．  任意に、１またはそれ以上の洗浄工程
７．  相互作用の、特にバックグラウンドレベルを超えて固相に結合して留まっているラベルの量をモニターすることによる、検出および／または定量。
【請求項２１】
異常および／または過剰な細胞の分裂または増殖と関連した疾患の診断または処置のための方法における、請求項１４に記載のポリペプチド、請求項１４に規定されたアミノ酸配列、または請求項１６若しくは１７に記載の抗体、の使用。
【請求項２２】
疾患が、冠状動脈再狭窄または、リンパ腫、肺癌、結腸癌、卵巣癌および乳癌からなる群より選ばれる腫瘍性疾患である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
コンピュータモデル、構造モデルまたは薬の結合および効果を評価するための他のモデルを開発するための、請求項１に規定された核酸配列または請求項１４に規定されたアミノ酸配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
第１の見地として、本発明は、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）により同定されうる細胞の分裂および増殖工程におけるいくつかのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子およびそれらに相当する遺伝子産物の顕著に機能的な役割に関連する。
【０００２】
第２の見地として、本発明は、他の真核種、特に人間に見出される前記遺伝子およびそれらの遺伝子産物の、それらのすべての生物学的活性誘導体を含む、機能的オルトログの同定および単離に関連する。
【０００３】
第３の見地として、本発明は、（前記オルトログを含む）前記遺伝子および遺伝子産物の抗増殖剤の開発または単離における使用、例えば、それらの適当なスクリーニングアッセイへの使用および増殖疾患の診断および処置の方法への使用、を含む。
【０００４】
第４の見地として、本発明は、前記遺伝子産物に対する抗体、並びに、抗増殖剤の開発若しくは単離および増殖疾患の診断および処置の方法へのそれらの使用に関連する。
【０００５】
第５の見地として、本発明は、構造モデルまたは薬の結合および効率を評価するための他のモデルを開発するためのこれらの遺伝子および遺伝子産物の使用、並びに、ここに記載される新しい機能に由来する他のいずれかの使用、および、本出願の開示からいずれの当業者に対しても明白となる他のいずれかの使用に関連する。
【背景技術】
【０００６】
後生動物の細胞分裂は、非常に複雑で、高度に制御された細胞工程の集合であり、娘細胞に細胞物質を正しく受け渡すことができるように、厳しく調整され、完全に時期を合わせ、厳密にモニターされる必要がある。これらの工程の欠陥は、すべての形態の癌を含む、幅広いいわゆる増殖疾患の原因となることが知られている。細胞分裂は数少ない細胞の１つで示されるので、すべての形態の癌の病因に共通する唯一の細胞工程ではなくても、その特異的阻害は、治療の介入の好ましい部位として認識されてきた。有糸分裂阻害剤は化学療法剤の最も有望な種類の１つとして認められているが、この種類の新しい医薬候補物質を見つけるスクリーニングの試みは、単一のタンパク質であるチューブリンを標的とする物質を同定するためのこのようなスクリーニングの強い固有の傾向により、徐々に害されてきた。チューブリンは、微小管を形成するように重合し、これは紡錘体の機能および染色体の分離に必要な主要な細胞骨格素子である。しかし、微小管の機能は、分裂しているかどうかにかかわらず、ほとんどすべての細胞型において遍在する必要があり、従って、抗チューブリン薬により引き起こされる多くの望まない副作用を示すという事実が示される。
【０００７】
チューブリンを標的とする非常に成功した抗腫瘍薬の最もよく知られた例は、おそらくパクリタキセル、およびブリストルマイヤーズスクイブから販売されたその誘導体である、タキソールである。その適用可能性は、問題のある副作用の広さのために、充分な投薬計画を決定することの困難性により、実際非常に制限される。タキソール処置は、臨床試験で２−４％の患者において、呼吸困難、処置を必要とする低血圧症、血管性浮腫、および全身性じんま疹により特徴づけられるアナフィラキシーおよび重篤な過敏症をもたらした。すべてのタキソールは、コルチコステロイドによる前処置の後に投与され、前処置にもかかわらず、致命的な反応が起こった。生命に関わる心臓性不整脈をもたらす重篤な誘導された異常が患者の１％以下において起こり、ペースメーカーの挿入により処置される必要がある。タキソールは、妊婦において胎児の傷害または胎児の死亡を引き起こす可能性がある。さらに、投与は、一般的に、頻脈、低血圧、潮紅、皮膚反応および息切れ（軽度の呼吸困難）を伴う。
【０００８】
これらの短所にもかかわらず、タキソールは、この３０年間における最も成功した新しい抗癌治療剤として、多くの人から認められてきた。確かに、癌を処置するために用いられる有糸分裂阻害剤の一覧に加える試みは、正当化される。しかし、チューブリンを標的とする、または微小管の動態を妨害するさらなる薬は、タキソールと同様の適用可能性および制限を有すると予期される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の課題は、有糸分裂の完結に不可欠なチューブリン以外の、治療薬に対する新しい可能性のある標的タンパク質／遺伝子を見つけることである。これらのタンパク質／遺伝子は、新しい抗腫瘍または細胞毒性抗癌剤をスクリーニングするための新規な標的を提供しうる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
残念ながら現在まで、後生動物において遺伝子スクリーニング方法を用いるこのような標的タンパク質／遺伝子の系統的な同定は困難であり、単細胞酵母の使用に強く依存してきた。ある後生動物モデル生物、特に線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓの使用におけるいくつかの主要な有利な点が、この溝の架け橋となる新しい方法を提供し始めている。
【００１１】
有糸分裂工程に関与するチューブリン以外の治療薬に対する新しい可能性のある標的タンパク質／遺伝子を見つけるための本発明の上述した課題は、胚細胞分裂の第１期を記録するための高く評価された顕微鏡アッセイと組み合わせた「ゲノムＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）」に基づくＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるスクリーニングアッセイにより解決される（Ｓｕｌｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓの胚細胞直系」、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１００，６４−１１９（１９８３）；Ｇｏｎｃｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，  「変異解析による１つの細胞段階のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ胚における細胞分裂工程の解剖」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４４，  ９２７−９４６  （１９９９））。こられの技術の組み合わせにより、選択された遺伝子および選択された遺伝子の変種は、前例のない速度および効率で機能的に特徴づけることができる。
【００１２】
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、その発育を通じてほとんど全体に透明な身体を示し、それにより胚形成の最も初期の段階でさえ、鋭敏で詳細な細胞学的記録のための比類ない顕微鏡によるアクセスを提供する。この重要な性質は、その短いライフサイクル（３−５日）、培養の容易さ、維持費の低さとともに、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓをおそらくすべての後生動物の中で最も研究されたものにすることを助けてきた。また、配列データは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノムの９７％以上が現在利用可能である（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  配列決定コンソーシアム、「線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノム配列：生物学の研究のためのプラットフォーム」、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，  ２０１２−２０１８  （１９９８））。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）の新しい技術を適用するための理想的な生物であることが証明された。この技術は、目的とするコード配列部分に対応する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の成虫への導入により媒介される、標的化された、遺伝子発現の配列特異的阻害にある（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおける２本鎖ＲＮＡによる有能な特異的遺伝子干渉」、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ８０６−８１１  （１９９８））。現在までに試験されているＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の大部分について、これが標的化された遺伝子発現の配列特異的阻害を生ずることが示され、処置された虫のＦ１後代（およびいくつかの場合には、処置された虫そのもの）において、明らかに検出可能な機能を失った表現型を伴う。
【００１３】
大規模なＲＮＡｉ技術に基づいたスクリーニングは、Ｇｏｎｃｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，「染色体ＩＩＩの遺伝子のＲＮＡｉを用いたＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける細胞分裂の機能的遺伝的分析」、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，  ３３１−３３６  （２０００）に詳細に記載されている、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの染色体ＩＩＩの予測されたオープンリーディングフレームの２，２３２（９６％であることを意味する）について行われた。この大規模スクリーニング実行のために、個々のオープンリーディングフレームに対応する２本鎖ＲＮＡが作成され、成虫のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ雌雄同体個体にマイクロインジェクトされ、得られた胚は経時的ＤＩＣ顕微鏡検査法を用いて２４時間後に分析された。
【００１４】
他に加え、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＩＤ：ＡＬ０２４４９９；配列番号１−３で提供される）、Ｃ０２Ｆ５．１（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＩＤ：Ｌ１４７４５；配列番号４および５で提供される）およびＦ１０Ｅ９．８（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＩＤ：Ｌ１０９８６；配列番号６および７で提供される）は、ＤＩＣアッセイにより検出可能な表現型を生じ、後生動物の細胞分裂工程におけるこれらの遺伝子の機能的役割を示した。
【００１５】
少なくとも１つの場合（Ｈ３８Ｋ２２．２）において、構造的および機能的に相同性の遺伝子、いわゆるオルトログ遺伝子を、他の種において、特にＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓにおいて、主としてヒトオルトログＲＰ４２を同定することも可能となった。
【００１６】
ＲＰ４２遺伝子のマウスオルトログについては、遺伝子が強く発育的に調節された発現を、特に新皮質ニューロンの起点となる神経芽細胞の増殖において、示すことが知られているにすぎなかった（Ｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，「新規遺伝子ＲＰ４２のクローニングおよび発現、６Ｑ１６の自閉感受性座へのマッピング」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １；  ６５  （１），  ７０−７４  （２０００））。増殖疾患の診断および／または治療に対する薬の開発または同定のための優秀な道具として使う細胞の分裂および増殖工程におけるＰＲ４２の機能的役割は、今までのところ知られていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
細胞の分裂および増殖における前記遺伝子の基本的な機能を用い、これらの新たに同定された標的遺伝子およびそれらに対応する遺伝子産物、それらのいずれもの相同体、オルトログおよび誘導体は、抗増殖剤等の幅広い治療の開発および単離、並びに増殖疾患の診断および処置の方法の開発、に使用する優秀な道具であることを示す。
【００１８】
従って、第１の見地として、本発明は、以下からなる群より選ばれる核酸配列を含む、細胞の分裂および増殖に機能的に関与するペプチドをエンコードする単離された核酸分子またはそれらのフラグメントに関する：
（ａ）  配列番号１から３、配列番号４から５、配列番号６から７で表される核酸配列およびそれらのフラグメント並びにそれらの相補鎖、
（ｂ）  配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１３の１００残基以上の少なくとも２５％と配列同一性を示すポリペプチドをエンコードする核酸配列、および／または、最大１０−３０のｅ値によりブラスト配列分析プログラムを用いたコンピューター検索により検出可能な核酸配列、
（ｃ）  中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列にハイブリダイズできる核酸配列、
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）または（ｃ）で規定されるいずれかの配列に対する遺伝子コードの結果として縮退した核酸配列。
【００１９】
上述した単離された核酸分子のフラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチドおよび好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドを含んでもよい。
【００２０】
さらに、上述の単離された核酸分子は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡ分子、同様に１本鎖または２本鎖ＲＮＡ分子でもよい。
【００２１】
（ａ）：
（ａ）で述べた細胞の分裂および増殖に機能的に関与するポリペプチドをエンコードするそれらの核酸分子の核酸配列は、
配列番号１−３（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＩＤ：  ＡＬ０２４４９９））、
配列番号４および５  （Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ０２Ｆ５．１（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＩＤ：  Ｌ１４７４５））、
配列番号６および７（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子  Ｆ１０Ｅ９．８（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ＩＤ：  Ｌ１０９８６））  および
配列番号１２（ヒトＨ３８Ｋ２２．２オルトログ、ＲＰ４２タンパク質  （ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ２９２１００）
として、配列表に提供される。
【００２２】
これらの標的遺伝子に対応した推定アミノ酸配列は、（Ｈ３８Ｋ２２．２ａに対して）配列番号８、（Ｈ３８Ｋ２２．２ｂに対して）配列番号９、（Ｃ０２Ｆ５．１に対して）配列番号１０、（Ｆ１０Ｅ９．８に対して）配列番号１１、および（ＲＰ４２に対して）配列番号１３に開示される。
【００２３】
（ｂ）：
さらに、本発明はまた、配列番号１から７または１２に開示された上記標的遺伝子の少なくとも１つの構造的および機能的相同性対（特にオルトログ）である単離された核酸分子を含む。
【００２４】
それらの相同性核酸分子は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３の１００残基以上の少なくとも２５％、好ましくは１００残基以上の少なくもと３０％、より好ましくは１００残基以上の少なくとも３５％、最も好ましくは１００残基以上の少なくとも４０％と、配列同一性を示すポリペプチドをエンコードしうる。
【００２５】
図５は、前述の配列同一性が、配列番号８−１１および１３で表される標的タンパク質のオルトログとしてのポリペプチドを同定するために適した顕著な相同性であることを示す。図５は、ブラスト配列分析プログラムにより得られたタンパク質レベルでのＨ３８Ｋ２２．２ａファミリーの多重配列アライメントを示す。このアライメントでは、２つのＣ．ｅｌｅｇａｎｓスプライス変種Ｈ３８Ｋ２２．２ａおよびＨ３８Ｋ２２．ｂを、キイロショウジョウバエ（ＣＧ７４２７）、マウス（ＡＡＦ０４８６３）およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ＡＡＨ０９４７８）におけるそれらに対応するオルトログと比較している。このアライメントの図５における統計値は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓクローンＨ３８Ｋ２２．２ａとそのヒトオルトログ（ＡＡＨ０９４７８）との間のタンパク質レベルにおける配列同一性が２９９残基以上で３６％であることを示す。同様に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓクローンＨ３８Ｋ２２．２ｂ（他のスプライス変種）とそのヒトオルトログとの間の配列同一性は、２３８残基以上で３６％である。これらの配列相同性が顕著な相同性であり、それゆえアクセッション番号ＡＡＨ０９４７８のヒトクローンがＣ．ｅｌｅｇａｎｓクローンＨ３８Ｋ２２．２ａおよびＨ３８Ｋ２２．ｂのヒトオルトログであると明確に同定されることは、当業者に明白である。
【００２６】
本発明はまた、最大１０−３０のｅ値、好ましくは最大１０−３５のｅ値、より好ましくは最大１０−４０のｅ値で、ブラスト配列分析プログラムの１つを用いたコンピュータ検索により検出可能な単離された核酸分子を含む。
【００２７】
図５は、前述のｅ値が、配列番号８−１１および１３で表される標的タンパク質のオルトログとしてのポリペプチドを同定するために適した顕著な配列相同性を特徴づけることを示す。
【００２８】
ブラスト配列分析プログラムは、公衆に利用可能で当業者のいずれにも知られた配列分析に用いられるプログラムである。配列アライメントがブラスト配列分析プログラムにより検索される場合、それらのプログラムのほとんどは、比較される配列間の相同性の程度を特徴づけるためのいわゆる「ｅ値」を計算する。一般的に、小さいｅ値は、高い配列同一性／相同性を特徴づけ、これに対して大きなｅ値は、低い配列同一性／相同性を特徴づける。
【００２９】
「相同性」は、２つの知られた配列間の同一性の度合いを意味する。上述したように、配列同一性を意味する相同性は、この分野で知られたコンピュータプログラムを用いて適切に決定されうる。配列変種に必要とされる相同性の度合いは、配列の意図される使用に依存しうる。配列の機能を改善するためや、または方法論的な有利な点を提供するために設計された変位、挿入および欠失の変位を実行することは、まさに当業者の能力範囲内のことである。
【００３０】
（ｃ）：
本発明は、中程度／高度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列にハイブリダイズできる単離された核酸配列またはそれらのフラグメントに、さらに関連する。
【００３１】
第１と第２の核酸分子間の配列同一性の程度は、第１の核酸分子がある条件下で第２の核酸分子にハイブリダイズする能力により特徴づけることもできる。
【００３２】
所定のＤＮＡやＲＮＡ配列が特定のポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドプローブに「ハイブリダイズ」するかどうかを決定するための適切な実験条件は、ハイブリダイゼーションを試験するためのＤＮＡまたはＲＮＡを含むフィルターを５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）バッファーに１０分間あらかじめ浸漬し、５×ＳＳＣ、５×デンハード溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性して超音波処理された鮭精子ＤＮＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）中においてフィルターのプレハイブリダイゼーションを行い、その後濃度１０ｎｇ／ｍｌの無作為にプライミングした（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，  Ａ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ．  （１９８３），  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３２：６−１３）、３２Ｐ−ｄＣＴＰラベル化された（特異活性＞１×１０９ｃｐｍ／μｇ）プローブを含む同じ溶液中で、約４５℃で１２時間ハイブリダイゼーションすることを伴う。その後、フィルターは、少なくとも５５℃で（低度のストリンジェンシー）、少なくとも６０度で（中程度のストリンジェンシー）、好ましくは少なくとも６５℃で（中程度／高度のストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも７０℃で（高度のストリンジェンシー）または最も好ましくは少なくとも７５℃で（非常に高度のストリンジェンシー）、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で３０分間２回洗浄される。選択された条件下でプローブがハイブリダイズする分子は、ｘ線フィルムを用いて検出される。
【００３３】
（ｄ）：
本発明は、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で規定されるいずれかの配列に対する遺伝子コードの結果として縮退した、単離された核酸配列またはそれらのフラグメントに、さらに関連する。
【００３４】
自動遺伝子合成の適用は、自然発生する遺伝子の配列変種を作成する機会を提供する。例えば、同じ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、ここで同定される自然発生するポリヌクレオチド配列に示されるコドンの代わりに同義のコドンを使うことにより作成しうることが、認識されるであろう。このような配列は、自然発生する配列に対する「縮退」と呼ばれる。さらに、対応するアミノ酸配列の合成変種をコードするポリヌクレオチドは、例えば、１またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加の結果として作成しうる。また、例えば反応性または検出可能な基等の望ましい特性を有する前記ヌクレオチド配列を提供する１またはそれ以上の（モーフォリノス等の）合成ヌクレオチド誘導体を含む核酸分子も、調製することができる。望ましい性質を有する合成誘導体には、対応するポリペプチドも含まれる。自然発生する配列の生物学的活性の少なくとも１部分を示し、または例えば相同性遺伝子若しくは遺伝子産物の同定のためのプローブ等の、なお使用するのに適した、上記に同定された遺伝子および遺伝子産物のすべてのこのような誘導体およびフラグメントは、本発明の範囲内に含まれる。
【００３５】
ここで提供された細胞の分裂および増殖に機能的に関与する種々の遺伝子のヌクレオチド配列を有することにより、遺伝子の合成および／または増幅の自動化技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記核酸分子を単離できることが認識される。いくつかのコード配列の長さのために、自動合成の適用は段階的な遺伝子構築を必要とし、ここで長さ約３００ヌクレオチドまでの遺伝子領域は個々に合成され、そして最終組立のために正しい順番で結紮される。個々に合成された遺伝子領域は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、組立の前に増幅することができる。ＰＣＲ増幅の技術を用いて、最終遺伝子／核酸分子のすべてまたは一部を直接作成してもよい。この場合、プライマーは、１つの片またはお互いに結紮しうるいくつかの片のいずれかで、最終産物のＰＣＲ増幅を開始できるものとして合成される。この目的のために、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかを、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いてもよい。ｃＤＮＡテンプレートは、市販のまたは自作のｃＤＮＡライブラリー由来のものでもよい。
【００３６】
第２の見地として、本発明は、検出可能なラベルを含む少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、（ａ）から（ｄ）の下で前記に特徴づけた核酸配列を含む核酸プローブに関連する。
【００３７】
これらの核酸プローブは、標準的な工程に従ってＤＮＡ合成器の使用により、または長い配列については好ましくは、選択されたテンプレート配列および選択されたプライマーを用いたＰＣＲ技術の使用により、合成してもよい。プローブとしてのヌクレオチド配列の使用においては、特定のプローブを、放射性および非放射性ラベル等の当業者に知られたいずれの適切なラベルを用いてラベル化してもよい。典型的な放射性ラベルには、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ等が含まれる。放射性同位体によりラベル化されたプローブは、ＤＮａｓｅおよびＤＮＡポリメラーゼを用いた通常のニックトランスレーション反応によりＤＮＡテンプレートから構築できる。非放射性ラベルには、例えば、ビオチンやチロキシンのようなリガンド、または、種々の発光または蛍光物質が含まれる。プローブは、両端を異なる型のラベルで、例えば一方の末端を同位体ラベルでもう一方の末端をビオチンラベルで、ラベル化してもよい。そして、ラベル化されたプローブおよびサンプルは、ハイブリダイゼーションバッファー溶液中で組み合わされ、アニーリングが起こるまで適切な温度に保持される。
【００３８】
本発明はまた、上記に規定された単離された核酸若しくはそれらのフラグメント、または上記に規定されたプローブのいずれかを適切な容器内に含むアッセイキットを含む。
【００３９】
２本鎖の形成および安定性は、ハイブリッドの２本鎖間の実質的な相補性に依存し、ある度合いのミスマッチが許容される。従って、前記配列変種が目的とする標的ヌクレオチド配列との安定なハイブリッドの形成を許容するもとの配列に対する実質的な配列相同性をなお有する限りは、本発明の核酸分子およびプローブには、上記に規定された配列の（単一および複数双方の）変位、欠失、挿入、およびこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００４０】
細胞の分裂および増殖またはそれらの１部に機能的に関与するポリペプチドをコードする上記に規定された核酸分子およびプローブは、相同体、特にオルトログ、同一若しくは異なる種の遺伝子、を同定するための使用、細胞の分裂若しくは増殖を阻害し、刺激し若しくはもたらす相互作用薬の同定のためのスクリーニングアッセイにおける使用、コンピュータモデル、構造モデルまたは薬の結合および効率を評価するための他のモデルの開発のための使用、異常および／または過剰な細胞の分裂または増殖に関連した疾患、特に充実性腫瘍および造血癌の双方等の腫瘍性疾患または冠状動脈再狭窄の検出または処置のための診断的または治療的使用、を含む幅広い有用な応用を有するであろう。例示的な腫瘍性疾患には、腺癌および黒色種のような癌腫；神経芽腫および網膜芽腫のような中胚様腫瘍；肉腫および種々の白血病；およびリンパ腫、が含まれる。特定の対象としては、乳房、卵巣、胃腸管、肝臓、肺、甲状腺、前立腺、脳、膵臓、尿路、および唾液腺の腫瘍がある。またより具体的には、乳房、卵巣、肺、結腸、およびリンパ腫の腫瘍が企図される。
【００４１】
第３の見地として、本発明は、診断の目的のための上記に同定した核酸分子およびプローブの使用に関連する。上記に同定した核酸分子およびプローブの診断的使用には、生物学的プローブ（好ましくは、限定されないが細胞抽出物、体液等）の前記標的遺伝子の発現の定量的検出、特に上記に特徴づけられた核酸配列（特にｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む内因性核酸分子への定量的ハイブリダイゼーションによる定量的検出が含まれるが、これらに限定されない。細胞分裂に関与する前記標的遺伝子の異常および／または過剰な発現は、その方法により診断してもよい。
【００４２】
第４の見地として、本発明は、治療目的のために上記に同定された核酸分子、プローブまたはそれらの対応するポリペプチドの使用に関連する。
【００４３】
上記に同定された核酸分子、プローブまたはそれらの対応するポリペプチドのこの治療への使用には、前記標的遺伝子の発現の直接または間接の阻害、および／または前記標的遺伝子の機能の阻害、のための前記核酸分子およびそれらの対応するポリペプチドの使用を含んでもよいが、これらに限定されない。特に遺伝子治療ベクター、例えば、上記に同定された配列を有するウイルス、裸のまたは包含されたＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、アンチセンスヌクレオチド配列）は、治療目的のために、増殖疾患または細胞分裂に影響する疾患を患っている個体の身体に導入するのに適しているであろう。
【００４４】
上記に同定された核酸分子またはプローブの特に好ましい治療への使用は、特にヒトまたはヒト細胞における、ＲＮＡｉ技術の治療への適用における使用に関連する。
【００４５】
２本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２本鎖におけるいずれのＲＮＡ鎖にも高度に相同性を有する遺伝子の発現の沈黙化をもたらす。最近の発見により、もともとはＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて発見された、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるこの効果が、細胞、特にヒト細胞においても観察されることが、明らかとなった。従って、本発明は、他の種の細胞、特にヒト細胞において、細胞の分裂または増殖に関与する遺伝子発現の治療的沈黙化のための、上記に同定された（（ａ）から（ｄ）で挙げられた）ヌクレオチド配列、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの、より好ましくは少なくとも２０ｎｔの長さの、２本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用をさらに含む。この治療の使用は、特に異常および／または過剰な細胞の分裂または増殖に関連する疾患、特に冠状動脈再狭窄またはリンパ腫、肺癌、結腸癌、卵巣癌および乳癌から成る群より選ばれる腫瘍性疾患を患っている個体の細胞に適用する。
【００４６】
第５の見地として、本発明は、（ａ）から（ｄ）で規定された核酸分子またはそれらのフラグメントを取り込んで有する核酸構築物または組み換えベクターをさらに含む。
【００４７】
「核酸構築物」は、ここで１本鎖または２本鎖のいずれかの、どのような核酸分子としても規定され、その核酸配列は自然に起こらない様式で組み合わされ、並列される。ベクターは、組み換えＤＮＡ工程に便利に用いることができるいずれのベクターでもよい。ベクターの選択は、取り込まれる宿主細胞に通常依存する。ベクターは、染色体外の独立体でもよく、例えばプラスミド等の、その複製が染色体の複製に独立なものでもよい。その代わりに、ベクターは、宿主細胞に導入される場合に、宿主細胞ゲノムに統合され、統合された染色体とともに複製されるものであってもよい。
【００４８】
ベクターは、好ましくは、（ａ）から（ｄ）で規定された核酸分子またはそれらのフラグメントが非相同性のまたは相同性の制御配列に操作可能に結合した、発現ベクターである。「制御配列」の用語は、ここでコード核酸配列の発現に必要なまたは有利なすべての成分を含むように規定される。このような制御配列には、プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止シグナルおよび、任意に、抑制遺伝子または種々の活性化遺伝子が含まれるが、これらには限定されない。制御配列は、目的とするコード核酸配列と自然に結合する場合は「相同性」と呼ばれ、これが起こらない場合は「非相同性」と呼ばれる。「操作可能に結合した」の用語は、配列がそれらの意図された目的、即ち望むタンパク質の発現、に対して協調して機能するように配置されていることを示す。
【００４９】
プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞に相同性または非相同性のいずれかのタンパク質をエンコードする遺伝子由来のいずれのＤＮＡ配列でもよい。
【００５０】
バクテリア宿主における転写を誘導するための適切なプロモーターの例は、例えば、ファージラムダＰＲまたはＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアルファアミラーゼ遺伝子である。
【００５１】
哺乳動物細胞の転写を誘導するための適切なプロモーターの例は、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １  （１９８１），  ８５４−８６４）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２  （１９８３），  ８０９−８１４）またはアデノウイルス２主要後期プロモーターである。
【００５２】
昆虫細胞における使用のための適切なプロモーターの例は、例えば、ポリヘドリンプロモーター（Ｖａｓｕｖｅｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｅｂｓ．  Ｌｅｔｔ  ３１１，  （１９９２），  ７−１１）、オートグラファカリフォニカポリヘドロシス基本タンパク質プロモーター（ＥＰ  ３９７  ４８５）、またはバキュロウイルス極初期遺伝子１プロモーター（ＵＳ  ５，１５５，０３７，  ＵＳ  ５，１６２，２２２）である。
【００５３】
酵母細胞における使用のための適切なプロモーターの例には、酵母解糖遺伝子からのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５  （１９８０），  １２０３−１２０８０；  Ａｌｂｅｒ  およびＫａｗａｓａｋｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．  １  （１９８２），  ４１９−４３４）およびＡＤＨ２−４ｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０４  （１９８３），  ６５２−６５４）が含まれる。
【００５４】
コード配列は、必要であれば、ヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２，  ８０９−８１４  （１９８３））のような適切なターミネーター、またはポリアデニル化配列に操作可能に結合させてもよい。また、発現したタンパク質の分泌ができるように、シグナル配列をコード配列の前に置いてもよい。
【００５５】
さらに、ベクターは、当該宿主細胞中でベクターが複製できるようにするＤＮＡ配列を含んでもよい。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１およびｐＩＪ７０２の複製起点である。このような配列のもう１つの例は、（宿主細胞が哺乳動物細胞の場合は）ＳＶ４０複製起点である。宿主細胞が酵母細胞の場合、ベクターが複製できるようにする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３および複製起点である。
【００５６】
ベクターはまた、選択マーカー、例えば、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子や、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンまたはハイグロマイシン等の薬に対する抵抗性を付与する遺伝子、のような、宿主細胞中の欠陥を補う産物をコードする遺伝子を含んでもよい。
【００５７】
原核または真核細胞での発現に適した多数のベクターはこの分野で知られており、それらのいくつかは市販されている。適したいくつかの市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐＸＴ１（ストラタジーン）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）が含まれるが、これらには限定されない。
【００５８】
第６の見地として、本発明は、核酸構築物または組み換えベクターを導入した宿主細胞を含む。これらの宿主細胞は原核または真核のものであり、これらには、バクテリア、酵母および糸状菌等の真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞系等の哺乳動物細胞、キイロショウジョウバエ誘導細胞系等の昆虫細胞、等が含まれるが、これらには限定されない。
【００５９】
適切な宿主細胞の選択は、この分野で認識される多数の要因に依存することとなる。これらには、例えば、選択されたベクターとの適合性、（副）産生物の毒性、望むタンパク質またはポリペプチドの回収の容易性、発現の特徴、生物学的安全性および費用が含まれる。
【００６０】
適切な原核細胞の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ等のようなグラム陽性バクテリア、またはＥ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性バクテリアである。
【００６１】
酵母宿主細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅの種から選んでもよい。有用な糸状菌は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種から選んでもよい。
【００６２】
適切であり、市販されている哺乳動物種由来の細胞系には、ＣＯＳ−１  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）  ＣＯＳ−７  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１  （ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３  （ＡＴＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、  ＨｅＬａ  （ＡＴＣＣＬ  ２）、およびＭＲＣ−５  （ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）が含まれるが、これらには限定されない。
【００６３】
組み換えベクターは、限定されないがトランスフォーメーション、トランスフェクション、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーション等の多数の技術のいずれか１つに従い宿主細胞に導入してもよい。
【００６４】
そして、組み換え宿主細胞は、目的とするタンパク質の発現が起こるような条件下で適切な栄養培地中で培養される。細胞を培養するために用いられる培地は、ミネラルや適切な補給物を含む複合培地のような宿主細胞の成長に適したいずれの通常の培地でもよい。適切な培地は、市販の販売者から入手でき、または公開されている処方（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログにある）に従い、調製してもよい。
【００６５】
非相同性ポリペプチドを発現している宿主細胞クローンの同定は、限定されないが特異的抗体による免疫学的反応性等のいくつかの手段により行ってもよい。
【００６６】
第７の見地として、本発明は、細胞の分裂および増殖に機能的に関与するポリペプチドまたはそれらのフラグメントを宿主細胞で産生する以下の工程を含む方法に関連する：
（ｉ）  （ａ）から（ｄ）で規定された操作可能に結合された核酸分子を有する発現ベクターを適切な宿主細胞に移入すること、および
（ｉｉ）  前記ポリペプチドまたはそれらのフラグメントの発現が起こる条件下で工程（ｉ）の宿主細胞を培養すること、および
（ｉｉｉ）  任意に、発現したポリペプチドを培地に分泌させること。
【００６７】
第８の見地として、本発明は、以下からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、細胞の分裂および増殖に機能的に関与するポリペプチドまたはそれらのフラグメントを含む：
（ａ）  配列番号８、９、１０、１１および１３で表されるアミノ酸配列およびそれらのフラグメント、
（ｂ）  （ａ）の配列の１００残基以上の少なくとも２５％、好ましくは１００残基以上の少なくとも３０％、より好ましくは１００残基以上の少なくとも３５％、最も好ましくは１００残基以上の少なくとも４０％と配列同一性を示すアミノ酸配列、および／または、最大１０−３０のｅ値、好ましくは最大１０−３５のｅ値、最も好ましくは最大１０−４０のｅ値によりブラスト配列分析プログラムを用いたコンピューター検索により検出可能なアミノ酸配列、
（ｃ）  （ａ）若しくは（ｂ）の核酸配列にハイブリダイズできる核酸分子によりエンコードされた、または（ａ）若しくは（ｂ）で規定された配列のいずれかについての遺伝子コードの結果として縮退した核酸分子によりエンコードされた、アミノ酸配列。
【００６８】
非相同性ポリペプチドは、目的とするポリペプチドまたはそれらのフラグメントのＮ−末端またはＣ−末端に他のポリペプチドが融合する融合ポリペプチドでもよい。融合したポリペプチドは、他のポリペプチドをエンコードする核酸配列（またはそれらの部分）を本発明の核酸配列（またはそれらの部分）に融合させることにより製造される。融合ポリペプチドを製造する技術はこの分野で知られており、それらがフレーム中にあり、融合ポリペプチドの発現が同じプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように、コード配列を結合することを含む。
【００６９】
目的とするポリペプチドの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造された合成ｍＲＮＡを用いて行ってもよい。合成ｍＲＮＡは、限定されないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物等の種々の細胞を含まない系で効果的に翻訳でき、また、限定されないがカエル卵母細胞、好ましくはＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞へのマイクロインジェクション等の細胞に基づいた系でも効果的に翻訳できる。
【００７０】
第９の見地として、本発明は、上記に同定されたポリペプチドに対する、およびそれらの免疫学的フラグメントに対する抗体に関連する。ここで用いられる「抗体」の用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方、並びに、抗原またはハプテンに結合できるＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントのような、それらのフラグメントが含まれる。本発明はまた、望む抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列をヒトアクセプター抗体の配列と組み合わせた「ヒト化」ハイブリッド抗体も企図する。ドナー配列は、通常少なくともドナーの抗原結合アミノ酸残基を含むが、他の構造的および／または機能的に等価なドナー抗体のアミノ酸残基を同様に含んでもよい。このようなハイブリッドは、この分野でよく知られたいくつかの方法により調製できる（例えば、ＷＯ  ８９／０９６２２；  ＷＯ  ９４／１１５０９；  Ｃｏｕｔｏ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３  （１９９４），  ２１５−２１９；  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７  （１９９７），  ４５９３−４５９９を参照のこと）。本発明の抗体は、対応する免疫学的（ポリ）ペプチドのアフィニティー精製のための使用、抗イデオタイプ抗体の調製のための使用、また、例えば診断や薬のスクリーニングアッセイ等の種々のアッセイにおける特異的結合剤としての使用、または上記で例示したような異常および／または過剰な細胞の分裂または増殖に関連した疾患の治療のための方法等の、幅広い有益な応用を有することとなる。特に、前記抗体または適切なそれらのフラグメント、特にヒト化形態のものは、上記に例示したような異常および／または過剰な細胞の分裂または増殖に関連した癌および他の疾患を処置するための方法における治療剤として用いてもよい。また、抗体は、上記に同定されたポリペプチドの最も特徴的な部分として製造され、結果として、他の起源並びに上記に同定されたポリペプチドの変異体および誘導体からの構造的および／または機能的に関連したポリペプチドを同定するために用いてもよい。
【００７１】
本発明のポリペプチドに対する抗体を製造するために、無傷のポリペプチドまたはそれらの免疫学的フラグメントのいずれかを免疫原として用い、上述したような適切な宿主細胞で、または標準的なペプチド合成技術を用いて製造される。
【００７２】
ポリクローナル抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等のような動物を、免疫アジュバントを用いるか用いないかのいずれかで、適切な濃度の目的とするポリペプチドまたはそれらのフラグメントにより免役することにより製造される。
【００７３】
許容される免疫アジュバントには、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン沈殿物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍおよびｔＲＮＡを含む油中水エマルジョンが含まれるが、これらには限定されない。
【００７４】
典型的な免疫プロトコルとして、各々の動物は、最初の免疫において、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、皮内またはこれらのいずれもの組み合わせのどれかにより、複数の部位に約０．１μｇから約１０００μｇの免疫原を受ける。動物は、最初の注射に続いて追加注射を受けても受けなくてもよい。追加注射を受けた動物は、一般的にフロイント不完全アジュバントと同量の免疫原を、同じ経路で最高の力価が得られるまで約３または４週間の間隔で与えられる。各々の追加免疫の約７―１４日後に、または単回の免疫の約１週間後に、動物を出血させ、血清を集め、部分標本を約−２０℃で保存する。
【００７５】
目的とするポリペプチドまたはペプチドフラグメントと反応するモノクローナル抗体は、基本的にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５−４９７  （１９７５）の技術を用いて調製される。まず、例えばＢａｌｂ／ｃマウス等の動物を、上述したものと同様のプロトコルを用いて免役する。抗体陽性動物、好ましくは脾臓細胞からのリンパ球を、この分野で知られてた標準的な工程により免疫された動物から脾臓を除去することにより得る。ハイブリドーマ細胞は、脾臓細胞を、適切な融合パートナー、好ましくはミエローマ細胞と、安定なハイブリドーマの形成ができるような条件下で、混合することにより作成される。融合パートナーには、マウスミエローマＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が含まれるが、これらには限定されない。融合したハイブリドーマ細胞は、選択培地中で成長させることにより選択され、抗体産生によりスクリーニングされる。陽性ハイブリドーマを成長させ、例えば、腹水生成のためにプリスタンでプライム化されたＢａｌｂ／ｃマウス中に注射する。腹水は、細胞移入の約１−２週間後に集められ、モノクローナル抗体は、この分野で知られた技術により精製される。代わりに、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの製造が、例えば、子ウシ胎児血清とともにＤＭＥＭ等の適切な培地中でハイブリドーマを培養し、この分野で知られた技術によりｍＡｂを回収することにより可能である。
【００７６】
そして回収された抗体は、この目的のために確立されたリンカー技術を用いて、放射性ラベル、酵素ラベル、発光ラベル、蛍光ラベル等のような検出可能なラベルに共有結合されることができる。
【００７７】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定されないが、沈殿、受動凝集、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術および放射性免疫アッセイ技術を含む種々の血清学的または免疫学的アッセイにより測定される。同様のアッセイを用いて、体液または組織および細胞抽出物中の上記に同定されたポリペプチドまたはそれらのフラグメントの存在を検出してもよい。
【００７８】
この応用において言及した種々のアッセイを実行するためのアッセイキットは、適切に単離された核酸または上記に同定された遺伝子または遺伝子産物のアミノ酸配列で、ラベル化されれてるものまたはラベル化されていないもの、および／またはそれらに対する特異的リガンド（例えば抗体）および適切なこの分野で知られた補助的試薬を含んでもよい。アッセイは、液相アッセイまたは固相アッセイ（即ち、担体に固定化された１またはそれ以上の試薬を有する）でもよい。
【００７９】
他に特定される以外は、核酸およびポリペプチド／タンパク質の操作は、分子生物学および免疫学の標準的な方法を用いて実行できる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９），  分子クローング：実験室マニュアル，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  「分子生物学の最新プロトコル」．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９５；  Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｐ．，  酵素イムノアッセイの実際と理論，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８５を参照のこと）。
【００８０】
本発明は、上記で規定されたポリペプチドまたはそれらのフラグメント、または上記に規定された前記ポリペプチドに対する若しくはそれらの免疫学的フラグメントに対する抗体のいずれかを含むアッセイキットをさらに含む。
【００８１】
これらの組み換えポリペプチド若しくはそれらのフラグメント、および、それらのポリペプチド若しくはそれらの免疫学的フラグメントに対する抗体は、細胞の分裂または増殖を阻害し、刺激しまたはもたらす相互作用薬のスクリーニングアッセイにおける使用、コンピュータモデル、構造モデルまたは薬の結合および効率を評価するための他のモデルを開発するための使用、異常および／または過剰な細胞の分裂または増殖、特に、充実性腫瘍および造血癌の双方等の腫瘍性疾患または冠状動脈再狭窄に関連する疾患の診断または処置のための方法における使用、等の、幅広い有用な応用を有することとなる。例示的な腫瘍性疾患には、腺癌および黒色種のような癌腫；神経芽腫および網膜芽腫のような中胚様腫瘍；肉腫および種々の白血病；およびリンパ腫、が含まれる。特定の対象としては、乳房、卵巣、胃腸管、肝臓、肺、甲状腺、前立腺、脳、膵臓、尿路、および唾液腺の腫瘍がある。またより具体的には、乳房、卵巣、肺、結腸、およびリンパ腫の腫瘍が企図される。
【００８２】
従って、第１０の見地として、本発明は、細胞の分裂または増殖を阻害し、刺激しまたはもたらす相互作用薬のスクリーニングアッセイにおける、上記に規定されたポリペプチド若しくはそれらのフラグメントの、または前記ポリペプチド若しくはそれらの免疫学的フラグメントに対する抗体の、使用を明らかに含む。
【００８３】
相互作用薬のこのようなスクリーニングアッセイは、限定されないが、特に以下の工程を含んでもよい：
１．  前記ポリペプチドまたはそれらの適切な誘導体の組み換え発現
２．  組み換えにより発現したポリペプチドまたはその誘導体の、特にアフィニティークロマトグラフィーによる、単離および任意の精製
３．  任意に、前記ポリペプチドまたはその誘導体と相互作用することを試験される化学物質のラベル化、および／または、組み換えにより発現したポリペプチドのラベル化
４．  組み換えにより発現したポリペプチドまたはその誘導体の固相への固定化
５．  相互作用する可能性のあるパートナーまたはそれらの変種の固定化されたポリペプチドまたはその誘導体への結合
６．  任意に、１またはそれ以上の洗浄工程
７．  相互作用の、特にバックグラウンドレベルを超えて固相に結合して留まっているラベルの量をモニターすることによる、検出および／または定量。
【００８４】
工程１は、適切な発現系、特に細胞を含まない翻訳、バクテリアによる発現、または昆虫細胞におけるバキュロウイルスに基づく発現、からの上記に同定されたポリペプチドまたはその誘導体の組み換え発現を含む。
【００８５】
工程２は、当業者によく知られている適切な生化学技術を用いた組み換えにより発現した前記ポリペプチドの単離およびそれに続く任意の精製を含む。
【００８６】
代わりに、これらのスクリーニングアッセイは、融合タンパク質または修飾タンパク質、特にＧＳＴ融合タンパク質またはいわゆる「タグ」配列を携えるタンパク質としての前記ポリペプチドの発現を含む上記に同定されたポリペプチド誘導体の発現を含んでもよい。これらの「タグ」配列は、「フレーム内で」前記標的遺伝子のコード領域のＮ−またはＣ−末端のいずれかに結紮される短いヌクレオチド配列からなる。組み換えにより発現した遺伝子をラベル化するために用いられる最も一般的なタグの１つは、ヒスチジンのみからなるホモポリペプチドをエンコードするポリ−ヒスチジン−タグである。この文脈において「ポリペプチド」の用語は、単に配列番号１から７の核酸配列によるポリペプチド、それらの自然発生する相同体、好ましくはオルトログ、より好ましくはヒトオルトログ、特にＲＰ４２遺伝子（配列番号１２）のみではなく、これらのポリペプチドの誘導体、特に融合タンパク質またはタグ配列を含むポリペプチドも含む。
【００８７】
これらのポリペプチド、特に適切なタグ配列（例えばＨｉｓ−タグ）またはＧＳＴによりラベル化されたものは、標準的なアフィニティークロマトグラフィーのプロトコル、特にいずれも市販の抗−Ｈｉｓ−タグ−抗体または抗−ＧＳＴ−抗体に結合したクロマトグラフィー樹脂を用いて、精製してもよい。抗−タグ−抗体若しくは抗−ＧＳＴ−抗体または他の「ラベル化特異的」抗体の使用の代わりに、精製は、前記ポリペプチドに対する抗体の使用を伴ってもよい。上述した組み換えにより発現した標的遺伝子の精製工程（工程２）を伴うスクリーニングアッセイは、本発明のこの見地の好ましい態様である。
【００８８】
第３の、任意の、工程において、相互作用を試験される物質は、放射性同位体の取り込み、または発光若しくは蛍光物質との反応によりラベル化してもよい。代わりに、またはさらに、組み換えにより発現したポリペプチドをラベル化してもよい。
【００８９】
第４の工程において、組み換えにより発現したポリペプチドは、固相、特に（限定されないが）クロマトグラフィー樹脂に固定化される。固相への結合は、それ故好ましくは共有結合を生じさせることにより行われる。
【００９０】
第５の工程において、前記組み換えポリペプチドまたはそれらの複合化した変種（特にドラッグライブラリー）の可能性のある相互作用するパートナーであり得る候補化学物質が、固定化されたポリペプチドと接触させられる。
【００９１】
第６の、任意の工程において、１またはいくつかの洗浄工程を行ってもよい。結果として、固定化されたポリペプチドと強く相互作用するその物質が、固（固定化）相に結合したまま留まる。
【００９２】
第７の工程において、ポリペプチドと特異的物質との相互作用が、特にバックグラウンドレベルを超えて固相に結合して留まっているラベルの量をモニターすることにより、検出される。
【００９３】
（配列プロトコルの説明）
配列番号１は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２のアイソフォームａおよびｂ双方に共通するスプラシングされていないＤＮＡ配列を示す（３１０４ｂｐ）。
配列番号２は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２ａアイソフォームのスプラシングされたＤＮＡ配列を示す（１０１１ｂｐ）。
配列番号３は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２ｂアイソフォームのスプラシングされたＤＮＡ配列を示す（８５２ｂｐ）。
配列番号４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ０２Ｆ５．１のスプラシングされていないＤＮＡ配列を示す（３３０８ｂｐ）。
配列番号５は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ０２Ｆ５．１のスプラシングされたＤＮＡ配列を示す（３０３３ｂｐ）。
配列番号６は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ１０Ｅ９．８のスプラシングされていないＤＮＡ配列を示す（７０９７ｂｐ）。
配列番号７は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ１０Ｅ９．８のスプラシングされたＤＮＡ配列を示す（３６２４ｂｐ）。
配列番号８は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２ａアイソフォームの推定アミノ酸配列を示す（３３６ａａ）。
配列番号９は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２ｂアイソフォームの推定アミノ酸配列を示す（２８３ａａ）。
配列番号１０は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ０２Ｆ５．１の推定アミノ酸配列を示す（１０１０ａａ）。
配列番号１１は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ１０Ｅ９．８の推定アミノ酸配列を示す（１２０７ａａ）。
配列番号１２は、Ｈ３８Ｋ２２．２のヒトオルトログのｃＤＮＡ配列を示す（７８０ｂｐ）。
配列番号１３は、Ｈ３８Ｋ２２．２のヒトオルトログの推定アミノ酸配列を示す（２６０ｂｐ）。
【００９４】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するためのものではない。
【実施例１】
【００９５】
（ＲＮＡｉ実験のためのｄｓＲＮＡ分子の作成）
まず、オリゴヌクレオチドプライマーペア配列を、標準的なＰＣＲ技術を用いて目的とするコード領域の遺伝子部分を増幅するために選択した。プライマーペアは、コード配列の少なくとも５００塩基、または５００塩基以下の遺伝子に対するコード塩基の最大を含むＰＣＲ産物を得るように選択された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの双方のＤＮＡ鎖からのＲＮＡ転写反応のためのテンプレートとしてのＰＣＲ産物のその後の使用ができるように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ」を、フォーワードプライマーの５’末端に加え、Ｔ３ポリメラーゼプロモーター配列「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ」を、リバースプライマーの５’末端に加えた。オリゴヌクレオチドプライマーの合成は、市販の供給者（シグマ−ジェノシス、イギリス、またはＭＷＧ−バイオテック、ドイツ）により行った。
【００９６】
ＰＣＲ反応は、０．８μＭのプライマーと約０．１μｇの野生型（Ｎ２株）ゲノムＤＮＡテンプレートを用いたＴａｑポリメラーゼにより、５０μｌの容積にて行った。ＰＣＲ産物は、ＥｔＯＨで沈殿させ、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、７．０μｌのＴＥに再懸濁させた。１．０μｌのＰＣＲ産物を、Ｔ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた５μｌの転写反応のために２つの新しい試験管に各々分注した。個別のＴ３およびＴ７転写反応を、製造者（アンビオン、メガスクリプトキット）の指示に従い実行し、各々をＲＮａｓｅを含まない水で５０μｌに希釈し、そして一緒にした。混合したＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキットを用いて、製造者（キアゲン）の指示に従い精製し、ＲＮａｓｅを含まない全量１３０μｌのＨ２Ｏ中に溶出させた。この５０μｌを１０μｌの６×注射バッファー（４０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．５、６ｍＭのクエン酸カリウム、ｐＨ７．５、４％のＰＥＧ６０００）と混合した。ＲＮＡを６８℃で１０分間アニールし、３７℃で３０分間保持した。最終ｄｓＲＮＡの濃度は、０．１−０．３μｇ／μｌの範囲で測定された。ＰＣＲ反応、Ｔ３およびＴ７転写反応の産物およびｄｓＲＮＡ種を、１％アガロースゲルに流し、品質管理の目的で試験した。２本鎖の完成は、非変性ゲルに流したときの、１本鎖ＲＮＡに応じたゲル移動性の変位を評点化することにより評価した。
【実施例２】
【００９７】
（ｄｓＲＮＡの注射および表現型のアッセイ）
ｄｓＲＮＡを野生型（Ｎ２株）の若い成虫の雌雄同体個体の両方の生殖腺の対向部分に左右対称に注射し、動物を２０℃で２４時間インキュベートした。そして、注射した動物から胚を解剖し、経時的示差干渉コントラストビデオ顕微鏡により細胞分裂工程における可能性のある欠陥を分析し、前述したように５秒ごとに１つの画像を捉えた（Ｇｏｎｃｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，「変異分析による細胞１個の状態のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ胚における細胞分裂工程の解剖」Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４４，  ９２７−９４６  （１９９９））。各々の実験では、少なくとも３つの異なる注射された虫からの胚を、細胞４個の段階まで受精後すぐから、この方法により撮影した。２つのさらなる注射された虫からの胚を、静止画像によっても記録し、それゆえ各々の実験において少なくとも５つの注射された虫の表現型の記録を得た。
【００９８】
いくつかの場合において、注射された動物の解剖の間の構造的な強固さの損失により明白となったような、胚は浸透圧の変化に対して鋭い感受性を示した。この制限を克服するため、注射された動物を解剖せず、むしろ、０．１％トリカインおよび０．０１％テトラミソールを含むＭ９溶媒で１０分間麻酔し、無傷のままアガロースパッドにのせ、胎内でＦ１胚形成を観察した（Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １４２，  ２０３−２１５  （１９９０））。体壁を通じて見ることにより達成された解像度は、解剖された胚を観察することにより達成されたものとは同じではなく、これらの場合限定された表現型の分析のみ行った。
【００９９】
３つの注射された動物を、ｄｓＲＮＡの注射の２４時間後に新しいプレートに移し、２０℃で放置した。２日後、プレートをステレオ顕微鏡を用いて（２０−４０×全倍率）Ｆ１幼虫（Ｌ２’ｓ−Ｌ４’ｓ）の存在、およびそれらの発育段階について確認した。その２日後、プレートをＦ１成虫の存在、並びにそれらの身体全体の形態およびＦ２後代の存在について検査した。
【実施例３】
【０１００】
（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２の特徴付け）
２つのｄｓＲＮＡ、「３００Ｃ３」および「３４０Ｇ１２」を設計し、これを用いてＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２の発現を特異的に沈黙化し、これにより、この後生動物種における胚細胞分裂の最初の２期に対するその機能的な関与を調べた。ｄｓＲＮＡをＨ３８Ｋ２２．２遺伝子のＰＣＲ増幅した野生型ゲノムＤＮＡフラグメントからｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲにおいて、２組のプライマー対を用いた：「ＴＣＡＡＴＣＡＧＴＡＴＧＴＣＧＡＣＣＣ」と「ＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＡ」を、それぞれフォーワードおよびリバースプライマーとしてｄｓＲＮＡ「３００Ｃ３」を作成するために、そして、「ＡＴＣＧＡＧＣＧＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＣ」と「ＴＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡ」を、それぞれフォーワードおよびリバースプライマーとしてｄｓＲＮＡ「３４０Ｇ１２」を作成するために用いた。ｄｓＲＮＡを精製し、成虫の雌雄同体虫に注射した。ＲＮＡｉ処理による表現型の結果を、経時的示差干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１後代において２４時間後に記録した。胚の記録は受精後〜２０分に始め、雌性前核がその減数分裂を完成さている間に、〜３０分後に、細胞４個の段階まで行った。
【０１０１】
注射されていないかまたは無関係のｄｓＲＮＡを注射したかのいずれかの対照虫のＦ１後代において、ＤＩＣ顕微鏡による観察により、胚細胞分裂の最初の２期の細胞事象が極めて限定された変異性しか示さないことがわかった。表現型の異常の可能性について試験され、評点付けされたすべての工程を、図１に並べて例示する。要約すると、胚の前後の極性を、卵子への進入の直後の（図１ａの右の矢印）、皮質における雄生前核の位置により最初に決定した。これは、胚の長軸に沿って雄性前核に向かう細胞質の中央部分を通じた明確で統制された卵黄顆粒の流れ、および胚の前方に進行する共同性の一連の皮質の波若しくはさざ波（図１の左側）、を伴う。その後直ぐに、雄性および雌性前核は、高度にパターン化された移動を受け（図１ａ、ｂのそれぞれ右および左の矢印）、胚の後半でそれらが接触することとなり（図１ｃ）、その後前核対の中心化と回転（図１ｄ）が起こり、胚の長軸に沿って将来の紡錘体を構成するための連結した中心体となる（図１ｂ−ｄの矢尻）。前核膜の同期した崩壊の後、明確に二極化した紡錘体は最初は短いが（図１ｅ）、後部極の明確な横方向の「揺れ」運動を示す間に伸びる（図１ｆ−ｈ）。これらの運動は、後部極の紡錘体のわずかな後部の置換を伴う一方、前部の紡錘体極はほぼ静止して留まる。そして、これは、後期および終期の間に紡錘体の非対称な位置決めをもたらし、それにより細胞質分裂溝の非対称な配置を生じ（図１ｉ、ｊの矢尻）、大きさの異なる娘細胞が生じ、小さい後部Ｐ１卵割球（図１ｋ−ｏの右の細胞）、および大きな前部ＡＢ卵割球（図１ｋ−ｎの左の細胞）となる。そしてＡＢ核がＡＢ細胞の中心に直接移動する一方（図１ｋ−ｌの左の矢印）、その複製された中心体の誘導の１つにより前部Ｐ１皮質に再移動する間の明確な９０°の回転を受ける前に（図１ｍの矢尻）、Ｐ１核は一般的にその細胞の後部にさらに移動する（図１ｋ−ｌの右の矢印）。これは、Ｐ１卵割球が胚の長軸に沿って、ＡＢ卵割球のものに対して垂直に、分割することを保証する（図１ｎの矢尻は中心体を示す）。これらの２つの分裂は非同期的に起こり、Ｐ１はＡＢに２−３分遅れる（図１ｎ−ｐ）。
【０１０２】
ｄｓＲＮＡ「３００Ｃ３」または「３４０Ｇ１２」を注射された虫のＦ１胚において、以下の高い再現性を有する表現型が観察される（図２）。まず、雌性前核の移動の力学はすべての場合で正常に見えるが、その開始はしばしば幾分遅い。２つの前核の接触および付着は、雌性前核が雄性前核に連結した２つの中心体の内の１つによってしか捉えられないという欠陥も一般的に示した（図２ａ−ｃを図１ａ−ｃと比較）。この欠陥は前核膜の崩壊が完了する前に通常修正されるが、これに続く胚内での紡錘体の位置決めもしばしば欠陥があるように見える。この表現型の弱い発現は、後期の間の後部紡錘体極の揺れを欠くように見え、一方より重篤な場合は、後部または横の皮質へ向けた全紡錘体の顕著な変動を示し、皮質そのものに到達しその長軸方向の配置が完全に失われる。後者の場合、極度に異常な紡錘体の位置は、切断溝形成の不適切な特異性を発生させ、異常な細胞質分裂を導く。紡錘体の位置が相対的に正常に見える場合でも、娘の核中心体複合体（ＮＣＣ）の位置が、後期の終了および切断溝の進入後直ぐに一般的に異常に見えるようになる。これは、しばしば特にＡＢ卵割球において見られ、ここではＮＣＣが、終期の開始において細胞の中心に向けて直接移動する代わりに、結局中心に行く前に横の皮質の極近傍の前部にまず移動する（図２ａ−ｋ）。この欠陥は、終期において領域間の紡錘体微小管の明らかな欠損および細胞質分裂の切断溝の顕著な二股または分岐を通常伴い（図２ｇの矢印）、異常な大きさの娘卵割球または溝の完全な進入による細胞質分裂の不全さえも導く（図２ｇ−ｍ）。核の移動およびＰ１核の位置決めも、ほとんどの場合異常があり、その予期された９０°の回転および前部皮質との連結の達成を顕著に遅らせ、またはいくつかの場合は完全に不全にする結果となる。Ｐ１卵割球の分裂は、このような胚でしばしば顕著に遅れる。最後に、複数の雌性前核の存在により証明されるように、雌性減数分裂の欠陥が時折観察され、１または両方の極性体をうまく押し出すのに失敗したことを示し、これは上記に示したものと同様の細胞質分裂の欠陥から生じるものであろう。
【０１０３】
観察されたすべての表現型は、有糸分裂の間、おそらく減数分裂の間も、ＮＣＣおよび紡錘体の微小管に依存する細胞の位置決めにおいて、Ｈ３８Ｋ２２．２遺伝子の機能を必要とすることを示している。この機能は後生動物全体を通じて細胞終期の進行および細胞分裂に不可欠なものであるので、この遺伝子、いずれかの相同体、およびそれらの誘導体は、抗増殖剤等の幅広い治療の開発に用いる優秀な道具であることを示す。Ｈ３８Ｋ２２．２遺伝子配列の分析により、ヒト（ＮＣＢＩアクセッション番号＃ＡＡＨ０９４７８）、マウス（ＮＣＢＩアクセッション番号＃ＡＡＦ０４８６３）およびキイロショウジョウバエ（ＮＣＢＩアクセッション番号＃ＣＧ７４２７）における明確なオルトログが見出され（図５参照）、これらのすべてが現在までのところそれらに起因したいずれの機能も知られていなかった。タンパク質レベルにおける配列保存の非常に高いレベルに基づき、これらの遺伝子のすべてがそれらのそれぞれの種において等価の機能を有するタンパク質をおそらくエンコードすると結論づけることができる。Ｈ３８Ｋ２２．２遺伝子アイソフォーム「ａ」によりエンコードされた３３６残基のタンパク質は、ＳＭＡＲＴまたはＣＣＤ分析のいずれかにより、知られていない構造モチーフまたはコンセンサスドメインを示す。
【実施例４】
【０１０４】
（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ０２Ｆ５．１の特徴付け）
ｄｓＲＮＡ、「３０７Ｃ１」を設計し、これを用いてＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ０２Ｆ５．１の発現を特異的に沈黙化し、これにより、この後生動物種における胚細胞分裂の最初の２期に対するその機能的な関与を調べた。ｄｓＲＮＡをＣ０２Ｆ５．１遺伝子のＰＣＲ増幅した野生型ゲノムＤＮＡフラグメントからｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲにおいて、配列「ＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＧＴＣＣＡＣＴ」と「ＡＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴ」を有するオリゴヌクレオチドを、それぞれフォーワードおよびリバースプライマーとして用い、精製したｄｓＲＮＡ「３０７Ｃ１」を作成し、成虫の雌雄同体虫に注射した。ＲＮＡｉ処理による表現型の結果を、経時的示差干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１後代において２４時間後に記録した。胚の記録は受精後〜２０分に始め、雌性前核がその減数分裂を完成さている間に、細胞４個の段階まで、〜３０分後まで行った。
【０１０５】
注射されていないかまたは無関係のｄｓＲＮＡを注射したかのいずれかの対照虫のＦ１後代において、ＤＩＣ顕微鏡による観察により、胚細胞分裂の最初の２期の細胞事象が極めて限定された変異性しか示さないことがわかった。表現型の異常の可能性について試験され、評点付けされたすべての工程を、図１に並べて例示する。
【０１０６】
ｄｓＲＮＡ「３０７Ｃ１」を注射された親虫からのＦ１胚は、一致して次の表現型を示すことが見出される（図３）。まず、有糸分裂に入るまでＤＩＣ顕微鏡により評点化できるすべての細胞工程は、一般的に野生型のパターンから区別できない。これらには、卵子の形状および大きさ、卵黄顆粒の大きさおよび密度、卵黄顆粒の流れおよび皮質のさざ波、疑似切断溝の形成および位置決め、前核の出現（図３ａの矢印）および移動（図３ａ、ｂ）、また、前核の中心化および回転（図３ｂ、ｃ）、並びに中心体の連結した対（図３ｂ、ｃの矢尻）、が含まれる。両極の紡錘体の形成および位置決めも正常に起こるが、紡錘体は野生型よりも最もしばしば薄く強固さが少なく、後期でのその揺れおよび伸長の間横に曲がる異常を示す（図３ｆ−ｉ）。細胞質分裂の完了後、正常に見えるものは、再形成された娘核が一般的に涙型であり、延長された期間新しく形成した皮質の近くに留まる（図３ａおよびｋ）。涙の形状と一致して、２つの核はしばしば異常なクロマチン架橋により物理的に接合したまま留まり、核片体も一般的に見られる（図３ｋおよびｌのアスタリスク）。この表現型は、これに続いてすべての場合において胚の致死をもたらした。
【０１０７】
前核の移動および両極の紡錘体の組立における欠陥の不存在は、より一般的な微小管の機能におけるこの遺伝子の役割に対して議論となる。観察された欠陥は、有糸分裂の染色体分離の、おそらく姉妹染色分体の分離の不全と一致し、クロマチン架橋の形成をもたらし、終期においてもそのままである。したがって、このデータは、有糸分裂の染色体分離におけるＣ０２Ｆ５．１遺伝子の機能に不可欠なものを示す。この機能は後生動物全体にわたり細胞終期の進行および細胞分裂に不可欠なものであるので、この遺伝子、いずれかの相同体、およびそれらの誘導体は、抗増殖剤等の幅広い治療の開発に用いる優秀な道具であることを示す。
【０１０８】
Ｃ０２Ｆ５．１配列の分析により、エンコードされた１０１０残基のタンパク質が、ラセンに巻いたラセン構造、即ちタンパク質−タンパク質相互作用ドメインのような構造、を形成すると予期される領域を含むことが明らかとなる。ブラストプログラムを用いた配列相同性分析は、現在のところ他の生物における明確なオルトログ配列を明らかにしていない。しかし、問題となる細胞工程の基本的でおよび高く保存された性質を考慮すると、この遺伝子／タンパク質の機能的オルトログは、すべての後生動物、おそらくすべての真核生物に存在すると強く考えられ、例えば実施例６に概説した方法論を用いて同定されることとなる。
【実施例５】
【０１０９】
（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ１０Ｅ９．８の特徴付け）
２つのｄｓＲＮＡ、「３０５Ａ１２」および「３４１Ｇ５」を設計し、これを用いてＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ１０Ｅ９．８の発現を特異的に沈黙化し、これにより、この後生動物種における胚細胞分裂の最初の２期に対するその機能的な関与を調べた。ｄｓＲＮＡをＦ１０Ｅ９．８遺伝子のＰＣＲ増幅した野生型ゲノムＤＮＡフラグメントからｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲにおいて、２組のプライマー対を用いた：「ＴＴＣＧＴＣＴＣＧＡＡＣＡＣＧＴＡＴＡＴＣＣＴ」と「ＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＧＧＣＡＴＴＧ」を、それぞれフォーワードおよびリバースプライマーとしてｄｓＲＮＡ「３０５Ａ１２」を作成するために、そして、「ＣＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＧ」と「ＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＣＣ」を、それぞれフォーワードおよびリバースプライマーとしてｄｓＲＮＡ「３４１Ｇ５」を作成するために用いた。ｄｓＲＮＡを精製し、成虫の雌雄同体虫に注射した。ＲＮＡｉ処理による表現型の結果を、経時的示差干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１後代において２４時間後に記録した。胚の記録は受精後〜２０分に始め、雌性前核がその減数分裂を完成さている間に、細胞４個の段階まで、〜３０分後まで行った。
【０１１０】
注射されていないかまたは無関係のｄｓＲＮＡを注射したかのいずれかの対照虫のＦ１後代において、ＤＩＣ顕微鏡による観察により、胚細胞分裂の最初の２期の細胞事象が極めて限定された変異性しか示さないことがわかった。表現型の異常の可能性について試験され、評点付けされたすべての工程を、図１に並べて例示する。
【０１１１】
ｄｓＲＮＡ「３０５Ａ１２」または「３４１Ｇ５」を注射された虫のＦ１胚において、以下の高い再現性を有する表現型が観察される（図４）。まず、細胞２個の段階までのＤＩＣ顕微鏡により評点化できるすべての細胞工程は、一般的に野生型のパターンから区別できない。これらには、卵子の形状および大きさ、卵黄顆粒の大きさおよび密度、卵黄顆粒の流れおよび皮質のさざ波、疑似切断溝の形成および位置決め、前核の出現（図４ａの矢印）および移動（図４ａ、ｂ）、また、前核の中心化および回転（図４ｂ、ｃ）、並びに中心体の連結した対（図４ｂ、ｃの矢尻）、が含まれる。分裂の第１期は、野生型から検出可能ないずれの異常も有さずに起こる（図４ｄ−ｈ）。単一の細胞胚における中心体若しくは紡錘体極の大きさ、数または位置決めに関係する欠陥が観察されないということは、特筆すべきである（図４ｂ−ｆの矢尻）。しかし、細胞２個の段階の胚において、核の位置決めは野生型と同等に留まっているが、中心体分裂の明らかな不全が２つの卵割球のうちの１つおよび時にはその両方において一致して観察される。単一の核周囲の中心体領域は、その卵黄顆粒の排除により見られ（図４ｈ−ｊの黒矢尻）、これは野生型胚および影響を受けていない卵割球の両方において通常見られる２つのものの代わりに観察される（図４ｉ、ｊの白矢尻）。中心体の分裂の明白な不全にもかかわらず、微小管に依存した工程は正常に持続し、その単一の中心体領域の誘導により、Ｐ１核の成功した前部の移動により例示される（図４ｈ−ｊの黒矢尻）。有糸分裂に入ると、核膜の崩壊により評点化されるように、欠陥ある卵割球が両極の紡錘体を生じさせるのに失敗し、その領域における卵黄顆粒の放射状配置により証明されるように、その代わりに微小管の単極アレイを形成する（図４ｋの点線の円）。その卵割球において細胞質分裂に失敗し、核片体として知られる、複数の不規則な大きさの核の再形成をもたらす（図４ｍ、ｎの矢印）。対照的に、細胞分裂のすべての見地が近くの卵割球において正常に起こり、正常な娘細胞をもたらし、各々は単一の同じ大きさの核を含む（図４ｌの矢印）。
【０１１２】
両極の紡錘体の形成の完全な不全は、影響を受けた細胞２個の段階の卵割球における２つのものの代わりに単一の中心体領域の存在を伴い、紡錘体の組立の複合工程においてＦ１０Ｅ９．８遺伝子の機能を必要とすることを明らかに示す。しかし、細胞１個の胚における前核の移動と紡錘体の機能を含む他の微小管に依存する工程の検出可能な欠陥を欠くことは、一般的な微小管に関連する機能を効果的に除外する。ＲＮＡｉ効果の母性の性質および卵子がその最初の中心体を父性により受け継ぐという事実を考慮すると、細胞１個の胚における両極の紡錘体の成功した発生は、Ｆ１０Ｅ９．８機能が、事実として、中心体の分裂または分離の何らかの見地のために必要とされうるということをさらに示唆する。
【０１１３】
実際、精子の成長は、ＲＮＡｉ処理の開始前に親の間に完全に完了するので、これは注射されたｄｓＲＮＡにより影響されずに留まる。これは、無傷の「野生型」中心体を受精に精子から卵子に与えることとなる。受精の後、このすでに２分割した中心体（即ち、２つの中心小体の存在により証明される、２つの「複製単位」を含む）は、分裂の１期を受け、これは各々存在する中心小体からの新しい中心小体胴の発芽により他の系において観察される。これは、２つの中心小体対と連結する中心小体周囲の物質との分離に続く。この工程は、以前の分裂事象には依存せず、胚細胞分裂の第１期に使用される両極の紡錘体の成功した形成を保証することのみが必要となる。したがって、Ｆ１０Ｅ９．８の機能は、この工程には必要とされないであろうと思われる。
【０１１４】
しかし、第１の分裂期が不全の場合は、両極の紡錘体の形成は、ここで見たように、分裂の第２期の間に不全となると予期される。興味深いことに、この不全が２つの卵割球のうちの１つのみにしばしば起こるという事実は、これらの場合もとの中心体の２つの「複製単位」のうちの１つのみが細胞１個の段階でその分裂の第１期において実際に失敗することを示唆する。この観察は、精子の中心体に含まれる２つの複製単位のうちの１つが実際に、１つの分裂期のためにすでに完全に装備されている卵子に入るが、もう一方がそれ自身の分裂ができるように卵子内の細胞質因子に依存することを示す、他の真核生物からの知見に一致する（Ｓｌｕｄｅｒ，  Ｇ．，  Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  ＥＨ．「中心体再生の制御：正しい時における正しい数」Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  ９１，  ４１３−２７  （１９９９）。
【０１１５】
したがって、この知見は、紡錘体の組立においてＦ１０Ｅ９．８の機能に必要とされるものが中心体の分裂工程においてこの遺伝子の基本的な役割からもたらされるであろうことを示唆する。
【０１１６】
紡錘体の組み立て工程は、後生動物全体を通じて細胞周期の進行および細胞分裂に不可欠なので、この遺伝子、いずれかの相同体、およびそれらの誘導体は、抗増殖剤等の幅広い治療の開発に用いる優秀な道具であることを示す。Ｆ１０Ｅ９．８配列の分析により、エンコードされた１２０７残基のタンパク質が、ラセンに巻いたラセン構造、即ちタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、および４つの予期された透過膜ドメインのような構造、を形成すると予期される１つの大きな領域を含むことが明らかとなる。ブラストプログラムを用いた配列相同性分析は、現在のところ他の生物における明確なオルトログ配列を明らかにしていない。しかし、問題となる細胞工程の基本的でおよび高く保存された性質を考慮すると、この遺伝子／タンパク質の機能的オルトログは、すべての後生動物、おそらくすべての真核生物に存在すると強く考えられ、例えば以下の方法論を用いて同定されることとなる。
【実施例６】
【０１１７】
（他の種における機能的オルトログを同定するためのプロトコル）
本発明は、モデル生物Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの細胞分裂において基本的な機能を有するものとして同定された遺伝子を記述する。モデル生物における研究を実行するための基礎は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの遺伝子について新たに発見された機能がヒトを含む他の種で保存されるであろうということである。細胞分裂は、進化の間で高度に保存され、したがってＣ．ｅｌｅｇａｎｓの遺伝子機能を発見し、ヒトオルトログについて機能を特徴付けまたは割り当てることにその情報を用いることによる手法は、非常に正当化される。進化の間の遺伝子の保存には２つの主題がある。遺伝子配列は保存されうる。これは、遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列が異なる種において非常に似ており、そして次にこれが遺伝子の機能が異なる種において同じであるということを示唆する。いずれの当業者にも知られているように、特定のレベル以上の配列同一性または相同性は、異なる種の２つの遺伝子が同じ遺伝子産物および遺伝子機能をコードすることを規定する。相同性の遺伝子は、適切なソフトウエアを用いたブラスト分析の実行や、他の手法により一般的に同定することができる。ブラスト検索では、１０−３０のｅ値により顕著に相同性の配列を抽出できる。さらに、系統発生的分析を行って、抽出されたどの配列がオルトログであるかを同定できる。
【０１１８】
したがって、オルトログの同定のための以下の例を提示することができる。ブラスト検索をブラスト配列分析プログラムを用いて１０−３のｅ値にて行う。代わりのパラメータとして、配列同一性の割合でもよい。１００残基以上において、３０％の配列同一性を相同性の遺伝子と規定する。ブラスト検索の完了後、複数の配列アライメントを適切なソフトウエア（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ）を用いて実行し、近隣を結合した系統学的ツリーを作成する。いずれの当業者も、系統学的ツリーからヒトオルトログを同定できる。本質的に、単一の種分化事象によりツリーにおいて分離している、またはツリーに最も近く関係しているヒトの配列は、オルトログでありうる。
【０１１９】
保存の第２の主題は、遺伝子の機能が配列の大きな多様性により保存できることである。本発明において、この保存の主題は規定されていない。しかし、他の遺伝子が、その遺伝子産物が本発明において請求されているものと同一の遺伝子産物であると同定される結果となる機能を有すると発見される場合は、本請求項はそのような遺伝子に対しても適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける胚細胞分裂の最初の２期の経時的検査記録から得たＤＩＣ顕微鏡画像を示す。
【図２】図２は、遺伝子Ｈ３８Ｋ２２．２に対して誘導されたｄｓＲＮＡ「３００Ｃ３」または「３４０Ｇ１２」により処理されたＦ０親からのＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＦ１後代における胚細胞分裂の最初の２期の経時的検査記録から得たＤＩＣ顕微鏡画像を示す。
【図３】図３は、遺伝子Ｃ０２Ｆ５．１に対して誘導されたｄｓＲＮＡ「３０７Ｃ１」により処理されたＦ０親からのＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＦ１後代における胚細胞分裂の最初の２期の経時的検査記録から得たＤＩＣ顕微鏡画像を示す。
【図４】図４は、遺伝子Ｆ１０Ｅ９．８に対して誘導されたｄｓＲＮＡ「３０５Ａ１２」により処理されたＦ０親からのＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＦ１後代における胚細胞分裂の最初の２期の経時的検査記録から得たＤＩＣ顕微鏡画像を示す。
【図５】図５は、Ｈ３８Ｋ２２．２ａファミリーの多重の配列アライメントを示す。ここで、２つのＣ．ｅｌｅｇａｎｓスプライス変種Ｈ３８Ｋ２２．２ａおよびＨ３８Ｋ２２．２ｂのアミノ酸配列は、キイロショウジョウバエ（ＣＧ７４２７）、マウス（ＡＡＦ０４８６３）およびｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ＡＡＨ０９４７８）のそれらのオルトログのアミノ酸配列と比較される。  「統計値」は、個々の配列間の相同性の程度を特徴づける値として参照され、ｅ値、配列同一性および保存的に変化した残基（陽性）として表される。
【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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