(57)【要約】本発明は、合成化合物を提供し、この合成化合物は、乳癌抗原ｈｅｒ−２（アミノ酸残基７７４〜７８２）の誘導体、これらの化合物を認識し、そして結合する抗体、これらの化合物をコードするポリヌクレオチド、およびこれらのエピトープの提示に応答して惹起される免疫エフェクタ細胞である。本発明は、さらに、免疫応答を誘導する方法、ならびに本発明のこの組成物を送達することによって、被験体に免疫両方を実施する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１】
2004505607.tif 000006
を有する、化合物。
【請求項２】
以下の構造：
【化２】
2004505607.tif 000007
を有する、化合物。
【請求項３】
以下の構造：
【化３】
2004505607.tif 000008
を有する、化合物。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドであって、ここで、アミノ酸７７４、７７５、７７６、７７７、７７９、および７８０が、それぞれ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｙ、Ｔ、およびＴである、ペプチド。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドであって、ここで、アミノ酸７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、および７８０が、それぞれ、Ｆ、Ｌ、Ｆ、Ｔ、Ｐ、Ｔ、およびＩである、ペプチド。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドであって、ここで、アミノ酸７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、および７８０が、それぞれ、Ｆ、Ｌ、Ｆ、Ｄ、Ｐ、Ｔ、およびＴである、ペプチド。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項４〜６のいずれかに記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を特異的に認識し、そして結合する、抗体。
【請求項１２】
被験体における免疫応答を誘導するための方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の有効量の化合物を該被験体に送達する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記化合物が、ＭＨＣ分子の状況下で送達される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＨＣ分子が、抗原提示細胞の表面上の前記化合物を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、該化合物をコードするポリヌクレオチドとして送達される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
免疫治療の方法であって、請求項１１に記載の有効量の抗体を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
ＭＨＣ分子の状況で請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を提示する抗原提示細胞の存在下で、該抗原提示細胞を使ってインビトロまたはインビボで生成された、免疫エフェクター細胞。
【請求項１８】
養子免疫療法の方法であって、請求項１７に記載の有効量の免疫エフェクター細胞を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、抗原特異的免疫応答を調節するのに有用な治療的抗原性化合物の分野に関する。
【０００２】
（発明の背景）
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される抗原性エピトープの認識は、哺乳動物免疫応答の確立、維持および実行において中心的役割を果たす。Ｔ細胞監視ならびに体細胞によって発現される細胞表面ＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原および抗原提示白血球の認識は、ウイルス、細菌、および寄生生物のような感染生物による侵襲を制御するために機能する。さらに、現在、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が特定の癌細胞抗原を認識し得、そしてこれらの抗原を発現する細胞を攻撃し得ることが示されている。このＴ細胞活性は、抗癌ワクチンに対する新規な戦略を開発するための基礎を提供する。さらに、不適切なＴ細胞活性化は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および喘息のような特定の衰弱させる自己免疫疾患において中心的な役割を果たす。このように、ＭＨＣ分子によって提示される抗原性エピトープの提示および認識は、複数の病理学的状態において免疫応答を媒介する中心的役割を果たす。
【０００３】
癌患者由来の腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍細胞に結合しそして溶解する。この特異性は、ＭＨＣクラスＩおよびいくつかの細胞型においてクラスＩＩ分子による腫瘍細胞の表面に提示される短いアミノ酸配列（エピトープ）を認識するそれらの能力に基づく。これらのエピトープは、腫瘍細胞または癌細胞において独特に発現されるかまたは異常に発現されるかのいずれかである遺伝子によってコードされる細胞内タンパク質（腫瘍抗原と呼ばれる）のタンパク質分解的分解から誘導される。
【０００４】
特異的抗腫瘍Ｔ細胞の有効性は、腫瘍抗原の識別および引き続く抗腫瘍免疫応答を生じるように設計された癌ワクチンの生成を可能にした。抗腫瘍Ｔ細胞は、血液（ここで、これらは末梢血単核細胞画分に見出され得る）内、一次および二次リンパ組織（例えば、脾臓）内、卵巣癌患者の腹水流体（腫瘍関連リンパ球すなわちＴＡＬ）内、または腫瘍自身（腫瘍浸潤リンパ球すなわちＴＩＬ）内を含む、癌患者内に局在する。これらのうち、ＴＩＬは、腫瘍抗原およびＴ細胞によって認識される腫瘍抗原誘導ペプチドの同定において最も有用であった。
【０００５】
ＴＩＬを産生するための通常の方法は、腫瘍生検組織を細かく刻み、そしてＴ細胞増殖因子インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で細胞懸濁液をインビトロで培養することを包含する。数日の期間に渡って、腫瘍細胞およびＩＬ−２の組み合わせは、腫瘍細胞を使用して腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖を刺激し得る。このように、Ｔ細胞集団は、増殖する。第一の増殖から誘導されるＴ細胞は、引き続いて、マイトマイシンＣ処理腫瘍細胞または照射腫瘍細胞のいずれかと混合され、そしてＩＬ２とともにインビトロで培養されて、腫瘍反応性Ｔ細胞のさらなる増殖および富化を促進する。数回のインビトロ増殖の後に、強力な抗腫瘍Ｔ細胞集団を回収し、そして従来の冗漫な発現クローニング方法論によって腫瘍抗原を識別するために使用し得る。Ｋａｗａｋａｎｉ　Ｙ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１（９）：３５１５−３５１９。
【０００６】
腫瘍特異的Ｔ細胞をインビトロで産生するために使用されるこの現在使用される方法論は信頼できず、この方法で識別される抗原は、抗腫瘍免疫応答を必ずしも誘発しない。多くの実験によって、成熟Ｔ細胞による抗原の遭遇がしばしば、無視、アネルギーまたは物理的欠失に起因する寛容の誘発を生じることが示されている。Ｐａｒｄｏｌｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．４（５）：５２５−５３１。
【０００７】
特定のペプチドがＴ細胞エピトープとして機能する能力は、そのペプチドがＭＨＣ分子の抗原提示ドメインに効果的に結合することを必要とし、そしてＴ細胞レセプター分子によって特異的に認識され得る適切なセットのアミノ酸を提示することも必要とする。抗原性ポリペプチド由来の天然のＴ細胞エピトープを同定することが可能であるが、これらのペプチドエピトープは、特定の免疫応答を誘導するために最適化される抗原を必ずしも表さない。実際、天然のエピトープの配列を変える単一のアミノ酸または複数のアミノ酸の置換を導入することによって、それらの天然のエピトープの効果を改善することが可能であることが示されている（Ｖａｌｍｏｒｉら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６４（２）：１１２５−１１３１）。従って、注意深く最適化された合成ペプチドエピトープの送達は、有用な免疫応答を誘導するための改善された方法を提供する可能性を有する。
【０００８】
抗原の動物への導入は、種々の目的のために、抗原に対する免疫応答を調節する（またはそれらを欠く）ために幅広く使用されている。これらには、病原体に対するワクチン接種、癌細胞に対する免疫応答の誘導、アレルギー性反応の減少、自己免疫障害の結果として生じる自己抗原に対する免疫応答の減少、同種移植拒絶の減少、および避妊のための自己抗原に対する免疫応答の誘導が挙げられる。
【０００９】
癌の処置において、腫瘍細胞を特異的に認識しそして溶解する細胞傷害性Ｔリンパ球の集団を産生するために種々の免疫療法的アプローチが取られている。これらのアプローチの多くが、腫瘍特異的抗原を同定することおよび特徴付けることに一部、依存する。
【００１０】
より最近、特定の病原体関連タンパク質および腫瘍関連タンパク質が、合成ペプチド（そのアミノ酸配列が、病原体関連タンパク質または腫瘍関連タンパク質の抗原決定ドメインのアミノ酸に対応する）を用いて免疫学的に模倣されている。これらの進歩にもかかわらず、ネイティブの配列に基づくペプチド免疫原は、一般的に、免疫応答を誘導することに関して最適未満で機能する。従って、増強した免疫調節特性を有する改変合成抗原性ペプチドエピトープに対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして関連した利点も提供する。
【００１１】
（発明の開示）
本発明は、新規な合成治療化合物を提供する。これらの化合物は、天然の対応物に比して、ＭＨＣ分子への結合を増強するために、そして免疫調節特性を強化するために設計されている。本発明の合成化合物は、合成化合物および天然に存在する化合物に対する免疫応答を調節するのに有用である。
【００１２】
さらに、本発明の化合物をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む遺伝子送達ビヒクル、およびこれらのポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明の化合物および組成物を送達することによって、ならびにＭＨＣ分子に関して、これらを送達することによって、被験体における免疫応答を誘導するための方法を提供する。
【００１４】
本発明の化合物はまた、これらの分子を特異的に認識し、そして結合する抗体を生成するために有用である。これらの抗体はさらに、被験体に投与された場合に免疫療法のために有用である。
【００１５】
本発明はまた、ＭＨＣ分子および養子免疫療法（被験体に対してこれらの免疫エフェクター細胞の有効量を投与する工程を包含する）の場合、本発明のペプチド組成物を提示する抗原提示細胞の存在下で、そしてそのおかげで、インビボまたはインビトロで惹起された免疫エフェクター細胞を提供する。
【００１６】
（配列表の説明）
配列番号１。ヒトチロシンキナーゼ型レセプターＨＥＲ２をコードするｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列。コード領域は、１５１位〜３９１８位まで伸びる。
【００１７】
配列番号２。ネイティブなヒトチロシンキナーゼ型レセプターＨＥＲ２のアミノ酸配列。本発明の化合物は、ネイティブなＨＥＲ２ペプチド７７４〜７８２に基づくバリエーションである。
【００１８】
配列番号３。化合物１のアミノ酸配列（ＦＬＹＹＧＴＴＹＶ）。
【００１９】
配列番号４。化合物１をコードするポリヌクレオチド配列。
【００２０】
配列番号５。化合物２のアミノ酸配列（ＦＬＦＴＰＴＩＹＶ）。
【００２１】
配列番号６。化合物２をコードするポリヌクレオチド配列。
【００２２】
配列番号７。化合物３のアミノ酸配列（ＦＬＦＤＰＴＴＹＶ）。
【００２３】
配列番号８。化合物３をコードするポリヌクレオチド配列。
【００２４】
（本発明を実行するための様式）
本開示を通して、種々の刊行物、特許、および公開特許明細書が、引例を特定することによって引用されている。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、本発明の関与する当該分野の状況をさらに完全に説明するために、本開示中に参考として援用されている。
【００２５】
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献中に完全に説明される。これらの方法は、以下の刊行物中に詳細に記載されている。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第二版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編（１９８７））；ｔｈｅ　ｓｅｒｉｅｓ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９１））；ＰＣＲ　２：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ編（１９８８））；ならびにＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））。
【００２６】
（定義）
本明細書において用いる場合、特定の用語は、以下に規定した意味を有し得る。
【００２７】
本明細書および特許請求の範囲において用いる場合、単数形「１つの（ａ）、（ａｎ）」、および「この、その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明確に他を示さない限りは、複数形の言及を包含する。例えば、用語「１つの細胞（ａ　ｃｅｌｌ）」は、複数の細胞を包含し、これは細胞の混合物を含む。
【００２８】
本明細書において用いる場合、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、その組成物および方法が、列挙された構成要素を含むが、それ以外のものも除外しないことを意味すると意図される。「本質的に〜からなる、〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）」は、組成物および方法を規定するために用いられる場合、この組み合わせに対してなんらかの必須の重要な他の構成要素を除外することを意味する。従って、本明細書において規定される場合、これらの構成要素から本質的に構成される組成とは、単離および精製方法からの微量の混入物、ならびに薬学的に受容可能なキャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、防腐剤（保存剤）など）を除外しない。「〜からなる、〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ）」とは、本発明の組成物を投与するための他の成分および実質的な方法工程の少なくない構成要素を除外することを意味する。これらの境界線の用語のそれぞれによって規定される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００２９】
「ネイティブな」抗原または「天然の」抗原とは、天然の生物学的供給源から単離され、そして被験体において、抗原レセプター、特にＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に特異的に結合し得るエピトープを含む、ポリペプチド、タンパク質、またはフラグメントである。
【００３０】
用語「抗原」とは、当該分野で十分理解されており、そして免疫原性である物質（すなわち、免疫原）、および免疫学的非応答性、またはアネルギーを誘導する物質（すなわち、アネルゲン（ａｎｅｒｇｅｎ））を含む。
【００３１】
「変更された（変化された）抗原」とは、対応する野生型抗原の一次配列とは異なる一次配列を有する抗原である。変更された抗原は、合成方法または組換え方法によって作成され得、そして翻訳中にまたは翻訳後に、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解性切断、抗体分子、膜分子、または他のリガンドとの結合によって、示差的に改変される抗原性ペプチドを含むが、これに限定されない（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２８５−３２０）。本発明の合成抗原または変更抗原は、天然のエピトープと同じＴＣＲに結合すると考えられる。
【００３２】
「自己抗原」とはまた、本明細書において、ネイティブ抗原または野生型抗原が、その抗原に対する自己寛容（ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）に起因して、被験体において、免疫応答をほとんど誘導しないかまたは全く誘導しない抗原性ペプチドであることを言う。自己抗原の例は、黒色腫特異的抗原ｇｐ１００である。
【００３３】
用語「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」とは、腫瘍に関連するか、または腫瘍に特異的である抗原をいう。公知のＴＡＡの例としては、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、およびＭＡＧＥが挙げられる。
【００３４】
用語「主要組織適合性遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」とは、Ｔ細胞への抗原提示に、そして迅速な移植拒絶に必要な、細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体をいう。ヒトにおいて、ＭＨＣはまた、「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」複合体として公知である。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、「ＭＨＣ分子」として公知であり、そしてクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ　ＭＨＣは、β２−ミクログロブリンと非共有結合的に連結されたＭＨＣ中にコードされたα鎖からなる、膜ヘテロ２量体タンパク質を含む。クラスＩ　ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核細胞によって発現され、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示において機能することがを示されている。クラスＩ分子は、ヒトにおいて、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを含む。クラスＩＩ　ＭＨＣ分子はまた、非共有結合的に関連したα鎖およびβ鎖からなる、膜ヘテロ２量体タンパク質を含む。クラスＩＩ　ＭＨＣ分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において機能することが公知であり、そしてヒトにおいて、ＨＬＡ−ＤＰ，ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲを含む。好ましい実施形態において、本発明の組成物およびリガンドは、任意のＨＬＡ型のＭＨＣ分子と複合体化し得る。当業者は、ＨＬＡの血清型および遺伝子型を熟知している。以下を参照のこと：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ＿ｖｉｅｗｉｎｇ＿ｐａｇｅ．Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ　Ｈ．Ｇ．，Ｂａｃｈｍａｎｎ　Ｊ．，およびＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ　Ｓ．ＭＨＣ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｍｏｔｉｆｓ（１９９７）Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ　Ｇ．Ｍ．Ｔｈら、Ｔｈｅ　ＨＬＡ　ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（１９９９）Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　５４：４０９〜４３７。
【００３５】
用語「抗原提示マトリックス」とは、本明細書において用いる場合、この抗原が、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞抗原レセプターによって結合され得る様式で、抗原を提示し得る分子を意味する。抗原提示マトリックスは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に、ＡＰＣの小胞調製物上に存在し得るか、またはビーズもしくはプレートのような固体支持体上の合成マトリックスの形態であり得る。合成の抗原提示マトリックスの例は、固体支持体に結合した、β２−ミクログロブリンに複合体化した精製ＭＨＣクラスＩ分子、このような精製ＭＨＣクラスＩ分子のマルチマー、精製ＭＨＣクラスＩＩ分子、またはこれらの機能的部分である。
【００３６】
用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、免疫系の特異的なエフェクター細胞によって認識可能な抗原−ＭＨＣ複合体の形態で、１つ以上の抗原を提示し得、そしてこれによって提示されている抗原に対して有効な細胞性免疫応答を誘導する細胞のクラスをいう。多くのタイプの細胞が、Ｔ細胞認識のためにその細胞表面上に抗原を提示し得るが、専門的ＡＰＣだけが、有効な量で抗原を提示し、そしてさらに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答のためにＴ細胞を活性化する能力を有する。ＡＰＣは、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞のようなインタクトな細胞全体；または天然に存在するかもしくは合成の他の分子（例えば、β２−ミクログロブリンに複合体化された精製ＭＨＣクラスＩ分子）であり得る。
【００３７】
用語「樹状細胞（ＤＣ）」とは、種々のリンパ組織および非リンパ組織において見出された形態学的に類似の細胞型の多様な集団をいう（Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜２９６）。樹状細胞は、生物体中で最も強力かつ好ましいＡＰＣを構成する。樹状細胞のサブセットは、全てではないが、骨髄前駆細胞に由来し、末梢血中を少数で循環し、そして未成熟ランゲルハンス細胞または最終分化した成熟細胞のいずれかとして現われる。樹状細胞は、単球から分化し得るが、別個の表現型を有する。例えば、特定の分化マーカーであるＣＤ１４抗原は、樹状細胞では見出されないが、単球に保有される。また、成熟樹状細胞は、食作用性ではないが、単球は強力に食作用する細胞である。ＤＣは、Ｔ細胞活性化および増殖に必要な全てのジグナルを提供することが示されている。
【００３８】
用語「抗原提示細胞補充因子（ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ　ｆａｃｔｏｒ）」または「ＡＰＣ補充因子」は、インタクトな細胞全体、および抗原提示細胞を補充し得る他の分子の両方を含む。適切なＡＰＣ補充因子の例としては、インターロイキン４（ＩＬ４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｓｅｐｒａｇｅｌおよびマクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰ３α）のような分子が挙げられる。これらは、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−ＰｌｏｕｇｈおよびＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手可能である。これらはまた、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編（１９８７））に開示の方法を用いて組換え産生され得る。上記の因子と同じ生物学的活性を有するペプチド、タンパク質および化合物が、本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】
用語「免疫エフェクター細胞」は、抗原に結合し得、そして免疫応答を媒介する細胞をいう。これらの細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（例えば、腫瘍、炎症性、または他の浸潤由来のＣＴＬ株、ＣＴＬクローン、およびＣＴＬ）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の疾患の組織は、特異的抗原を発現し、そしてこれらの抗原に特異的なＣＴＬが同定された。例えば、黒色腫の約８０％が、ＧＰ−１００として公知の抗原を発現する。
【００４０】
用語、「免疫エフェクター分子」は、本明細書において用いる場合、抗原特異的に結合し得る分子をいい、そして抗体、Ｔ細胞抗原レセプター、およびＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子を含む。
【００４１】
「ナイーブな」免疫エフェクター細胞とは、その細胞を活性化し得る抗原に暴露されたことのない免疫エフェクター細胞である。ナイーブな免疫エフェクター細胞の活性化は、増殖して、抗原特異的活性化（ａｒｍｅｄ）エフェクターＴ細胞に分化するために、専門的ＡＰＣによる、ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識および同時刺激シグナルの同時送達の両方を必要とする。
【００４２】
「免疫応答」とは、広義には、外来物質に対するリンパ球の抗原特異的応答をいう。免疫応答を惹起し得る任意の物質は、「免疫原性」であるといわれ、そして「免疫原」と呼ばれる。全ての免疫原が抗原であるが、全ての抗原が免疫原性であるというわけではない。本発明の免疫応答は、体液性（抗体活性を介する）または細胞媒介性（Ｔ細胞活性化を介する）であり得る。
【００４３】
用語「リガンド」とは、本明細書において用いる場合、別の分子上の特定の部位に結合する任意の分子をいう。言い換えれば、このリガンドは、免疫エフェクター細胞との反応において、タンパク質の特異性を付与する。これは、免疫エフェクター細胞上の相補的結合部位と直接結合するタンパク質内のリガンド部位である。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明のリガンドは、免疫エフェクター細胞上の抗原性決定基またはエピトープ（例えば、抗体またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ））に結合する。リガンドは、本発明の抗原、ペプチド、タンパク質またはエピトープであり得る。
【００４５】
本発明のリガンドは、抗体上のレセプターに結合し得る。１つの実施形態では、本発明のリガンドは、約４〜約８アミノ酸長である。
【００４６】
本発明のリガンドは、ＭＨＣクラスＩ分子上のレセプターに結合し得る。１つの実施形態では、本発明のリガンドは、約７〜約１１アミノ酸長である。
【００４７】
本発明のリガンドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上のレセプターに結合し得る。１つの実施形態では、本発明のリガンドは、約１０〜約２０アミノ酸長である。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語、「感作された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）抗原特異的免疫エフェクター細胞」は、上記で規定された免疫エフェクター細胞であり、この細胞は、抗原に以前に遭遇している。そのナイーブな対応物と対照的に、感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞の活性化は、同時刺激シグナルを必要としない。ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識は十分である。
【００４９】
Ｔ細胞に関して使用される場合、「活性化された」とは、この細胞がもはやＧ０期ではなく、そして細胞型（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋）に特徴的な、１つ以上の細胞毒素、サイトカイン、および他の関連の膜結合タンパク質を生成し始め、その表面上に特定の抗原を提示する任意の標的細胞を認識および結合し得、そしてそのエフェクター分子を放出し得ること意味する。
【００５０】
本発明の文脈において、用語「認識される」とは、１つ以上のリガンドを含有する本発明の組成物が、免疫エフェクター細胞によって認識され、そして結合され、ここで、このような結合が、効果的な免疫応答を開始させることを意図する。リガンドが免疫エフェクター細胞によって認識されるか否かを決定するためのアッセイは、当該分野において公知であり、そして本明細書中に記載されている。
【００５１】
用語「優先的に認識される」とは、本発明の組成物またはリガンドの特異性が、ネイティブなリガンドを認識し、そして結合する免疫エフェクターに制限されることを意図する。
【００５２】
用語「交差反応性」は、機能的にオーバーラップする本発明の化合物を記載するために使用される。より具体的には、ネイティブなリガンドおよび／またはこのリガンドによって活性化された免疫エフェクター細胞の免疫原性特性は、変更されたリガンドによってある程度まで共有され、その結果、この変更されたリガンドは、ネイティブなリガンドおよび／またはこのリガンドによって活性化された免疫エフェクターと「交差反応性」である。本発明の目的のために、交差反応性は、複数のレベルで明らかにされる：（ｉ）リガンドレベルにおいて、例えば、変更されたリガンドは、ネイティブなリガンドのＣＴＬのＴＣＲに結合し得、そしてネイティブなリガンドのＣＴＬを活性化し得る；（ｉｉ）Ｔ細胞レベルにおいて、すなわち、本発明の変更されたリガンドは、ネイティブなリガンドを提示する細胞を効果的に標的化および溶解し得るＴ細胞の集団（ネイティブなリガンドのＣＴＬの集団とは異なる）のＴＣＲを結合し、そしてこの集団を活性化する；および（ｉｉｉ）抗体レベルにおいて、例えば、「抗」変更されたリガンド抗体は、ネイティブなリガンドを検出し得、認識し得、そして結合し得、そして免疫応答においてエフェクター機構を開始させ得、これが最終的に、宿主からのネイティブなリガンドの排除を生じる。
【００５３】
本明細書中において使用される場合に、用語「被験体において免疫応答を誘導する」とは、当該分野において十分に理解される用語であり、そして抗原（またはエピトープ）を被験体に導入した後に、この抗原（またはエピトープ）をこの被験体に導入する前の免疫応答（もしあれば）に対して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、なおより好ましくは少なくとも約５００倍、なおより好ましくは少なくとも約１０００倍、またはそれより高い、抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答の増加が、検出または測定され得ることを意図する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答としては、抗原特異的（またはエピトープ特異的）抗体の産生、および抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子を表面で発現する免疫細胞の産生が挙げられるが、これらに限定されない。所定の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が誘導されたか否かを決定する方法は、当該分野において周知である。例えば、抗原特異的抗体は、当該分野において公知の種々の免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡが挙げられるがこれに限定されない）のいずれかを使用して、検出され得、ここで、例えば、サンプル中の抗体の、免疫された抗原（またはエピトープ）への結合は、検出可能に標識された二次抗体（例えば、酵素標識されたマウス抗ヒトＩｇ抗体）を用いて検出される。
【００５４】
「同時刺激分子」は、抗原提示細胞の表面に発現されるレセプター−リガンド対とＴ細胞との間の相互作用に関与する。過去数年間にわたって蓄積された研究は、休止Ｔ細胞が、サイトカイン遺伝子の発現および増殖を誘導するために、少なくとも２つのシグナルを必要とすることを確信的に実証した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｒ．Ｈ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１３４９−１３５６およびＪｅｎｋｉｎｓ　Ｍ．Ｋ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１３：６９−７３）。特異性を与えるシグナルである１つのシグナルは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と適切なＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用によって生じ得る。第２のシグナルは抗原特異的ではなく、そして「同時刺激」シグナルと称される。このシグナルは、最初は、マクロファージおよび樹状細胞のような骨髄由来のアクセサリー細胞（いわゆる「プロフェッショナル」ＡＰＣ）によって提供される活性であると定義された。いくつかの分子は、同時刺激活性を増強することが示された。これらは、熱安定抗原（ＨＳＡ）（Ｌｉｕ　Ｙ．ら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：４３７−４４５）、コンドロイチン硫酸で修飾されたＭＨＣ不変鎖（Ｉｉ−ＣＳ）（Ｎａｕｊｏｋａｓ　Ｍ．Ｆ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ　７４：２５７−２６８）、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（Ｖａｎ　Ｓｅｖｅｎｔｅｒ　Ｇ．Ａ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４５７９−４５８６）、Ｂ７−１、およびＢ７−２／Ｂ７０（Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｒ．Ｈ．（１９９２）Ｃｅｌｌ　７１：１０６５−１０６８）である。これらの分子は各々、Ｔ細胞上のこれらの同種のリガンドとの相互作用によって、同時刺激を補助するようである。同時刺激分子は、必要な同時刺激シグナルを、正常な生理学的条件下で媒介して、ネイティブなＴ細胞の完全な活性化を達成する。１つの例示的なレセプター−リガンド対は、ＡＰＣの表面上のＢ７同時刺激分子およびＴ細胞上のその対レセプターＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４である（Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２：９０９−９１１；Ｙｏｕｎｇら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：２２９およびＮａｂａｖｉら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３６０：２６６−２６８）。他の重要な同時刺激分子は、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、およびＣＤ８６である。用語「同時刺激分子」とは、Ｔ細胞表面のＴＣＲによって結合されるペプチド／ＭＨＣ複合体とともに活性化される場合に、このペプチドを結合するＴ細胞の活性化を達成する同時刺激効果を提供する、任意の単分子または分子の組み合わせを包含する。従って、この用語は、Ｔ細胞の表面のＴＣＲがペプチドを特異的に結合する場合に、ペプチド／ＭＨＣ複合体と一緒になって、同種リガンドに結合し、そしてＴ細胞の活性化を生じる、Ｂ７、またはＡＰＣのような抗原提示マトリックス上の他の同時刺激分子、それらのフラグメント（単独でか、別の分子と複合体化しているかまたは融合タンパク質の一部として）を包含する。同時刺激分子は、種々の供給源（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）が挙げられる）から市販されている。野生型かまたは精製された同時刺激分子（例えば、組換え的に産生されたかまたはそれらのムテイン）と類似の生物学的活性を有する分子が、本発明の意図および範囲において使用されることが意図されることが、常には明白に言及されないが、意図される。
【００５５】
本明細書中において使用される場合に、「固相支持体」または「固体支持体」は、互換可能に使用され、特定の型の支持体に限定されない。かなり多数の支持体が利用可能であり、そして当業者に公知である。固相支持体としては、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルが挙げられる。本明細書中において使用される場合に、「固体支持体」はまた、合成された抗原提示マトリックス、細胞、およびリポソームを含む。適切な固相支持体は、所望の最終用途および種々のプロトコルへの適合性に基づいて、選択され得る。例えば、ペプチド合成のためには、固相支持体とは、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ　Ｉｎｃ．，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＰＡＭ樹脂など）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（登録商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ，Ｃａｎａｄａから入手可能）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）、ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ　Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる）のような樹脂をいい得る。
【００５６】
用語「免疫調節因子」とは、本明細書中において使用される場合に、免疫応答を調節する分子、高分子複合体、または細胞であり、そして単独でかまたは本明細書中に記載される種々の処方物のいずれかにおける本発明の合成抗原性ペプチド；本発明の合成抗原性ペプチドを含むペプチド；本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（同時刺激分子の存在下または非存在下で）抗原提示マトリックス（ＡＰＣおよび合成抗原提示マトリックスを含む）上のクラスＩまたはクラスＩＩ　ＭＨＣ分子に結合する、本発明の合成抗原性ペプチド；別の分子または高分子構造に共有結合的にかまたは非共有結合的に複合体化した、本発明の合成抗原性ペプチド；ならびに本発明のペプチドに特異的な、感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞を包含する。
【００５７】
用語「免疫応答を調節する」は、免疫応答を誘導（増加、惹起）すること；および免疫応答を減少させる（抑制する）ことを包含する。免疫調節方法（またはプロトコル）は、被験体において免疫応答を調節するものである。
【００５８】
本明細書中において使用される場合に、用語「サイトカイン」とは、細胞に対して種々の効果（例えば、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）が挙げられる）を与える、多数の因子のいずれか１つをいう。本発明の実施において単独でかまたは組み合わせで使用され得るサイトカインの非限定的な例としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１Ｉ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびｆｌｔ３リガンドが挙げられる。本発明はまた、１つ以上のサイトカインが培地から特異的に排除される培養条件を含む。サイトカインは、いくつかの販売者（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ　Ｏａｋｓ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）およびＩｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のような）から市販されている。野生型かまたは精製されたサイトカイン（例えば、組換え的に産生されたかまたはそれらのムテイン）と類似の生物学的活性を有する分子が、本発明の意図および範囲において使用されることが意図されることが、常には明白に言及されないが、意図される。
【００５９】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、互換可能に使用されて、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはこれらのアナログを含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、そして既知かまたは未知の任意の機能を実施し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせんの分子、遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。核酸分子はまた、改変された核酸分子を含み得る。
【００６０】
用語「ペプチド」は、その最も広い意味において使用されて、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣物の化合物をいう。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合（例えば、エステル、エーテルなど）によって連結され得る。本明細書中において使用される場合に、用語「アミノ酸」とは、天然および／または非天然、あるいは合成のアミノ酸のいずれかをいい、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸のアナログおよびペプチド模倣物を含む。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、そのペプチド鎖が短い場合には、通常、オリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合には、そのペプチドは通常、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００６１】
用語「遺伝的に改変された」とは、外来遺伝子または核酸の配列を含み、そして／または発現し、これが次に、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を改変することを意味する。換言すれば、この用語は、細胞の内因性ヌクレオチドに対する任意の付加、欠失または破壊をいう。
【００６２】
本明細書中において使用される場合に、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、そしてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来である場合には、発現は、適切な真核生物宿主が選択される場合に、ｍＲＮＡのスプライシングを包含し得る。発現のために必要とされる調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼを結合するためのプロモーター配列、およびリボソーム結合のための転写阻害配列を含む。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター、ならびに転写の開始のために、シャイン−ダルガーノ配列および開始コドンＡＵＧを含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出）。同様に、真核生物発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する異種または同種のプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの脱着のための終止コドンを含む。このようなベクターは、市販で入手され得るか、または当該分野において周知の方法（例えば、ベクターの構築に関して一般的に以下に記載される方法）に記載される配列によって構築され得る。
【００６３】
「転写制御下」とは、当該分野において十分に理解される用語であり、そしてポリヌクレオチド配列（通常はＤＮＡ配列）の転写が、転写の開始に寄与するかまたは転写を促進するエレメントに作動可能に連結していることに依存することを示す。「作動可能に連結される」とは、エレメントが、機能することを可能にする配置にある並列をいう。
【００６４】
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞に運び得る任意の分子であると定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、生体適合性ポリマー（天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む）；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌またはウイルス（例えば、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターおよび当該分野において代表的に使用される他の組換えビヒクルであって、種々の真核生物宿主および原核生物宿主における発現に関して説明されており、そして遺伝子治療および単純なタンパク質発現のために使用され得るビヒクルである。
【００６５】
「遺伝子送達」、「遺伝子移入」などは、本明細書中において使用される場合に、導入のために使用される方法にかかわらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド（時々、「導入遺伝子」と称される）の導入をいう用語である。このような方法としては、ベクター媒介性遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々の他のタンパク質に基づくかもしくは脂質に基づく遺伝子送達複合体による）、および「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技術（例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達およびポリヌクレオチドの導入のために使用される他の種々の技術）のような、種々の周知の技術が挙げられる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定にかまたは一時的に維持され得る。安定な維持は、代表的に、導入されるポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起点を含むか、または宿主細胞のレプリコン（染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体）に統合するかのいずれかであることを、必要とする。多数のベクターが、当該分野において公知であるかまたは本明細書中に記載されるように、哺乳動物細胞への遺伝子の移入を媒介し得ることが、公知である。
【００６６】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エキソビボまたはインビトロのいずれかで、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換え的に産生されたウイルスまたはウイルス粒子であると定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。アルファウイルスベクター（例えば、Ｓｅｍｌｉｋｉ　Ｆｏｒｅｓｔウイルスに基づくベクターおよびＳｉｎｄｂｉｓウイルスに基づくベクター）はまた、遺伝子治療および免疫療法における使用のために、開発された。ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４−４３９およびＺａｋｓら（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：８２３−８２７を参照のこと。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される局面においては、ベクター構築物とは、レトロウイルスゲノムまたはその一部、および治療遺伝子を含む、ポリヌクレオチドをいう。本明細書中において使用される場合に、「レトロウイルスにより媒介される遺伝子移入」または「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を有し、そして遺伝子または核酸配列が細胞に入って、そしてそのゲノムを宿主細胞ゲノムに統合するウイルスの効力によって、宿主細胞に安定に移入されるプロセスをいう。このウイルスは、その正常な感染機構を介して、宿主細胞に入り得るか、または改変され得、その結果、このウイルスは、宿主細胞表面の異なるレセプターまたはリガンドに結合して、この細胞に入る。本明細書中において使用される場合に、レトロウイルスベクターとは、ウイルスまたはウイルス様の入口機構を介して外因性核酸を細胞に導入し得る、ウイルス粒子をいう。
【００６７】
レトロウイルスは、これらの遺伝情報を、ＲＮＡの形態で運ぶ；しかし、一旦このウイルスが細胞に感染すると、このＲＮＡはＤＮＡ形態に逆転写され、これが、感染された細胞のゲノムＤＮＡに統合する。この統合されたＤＮＡ形態は、プロウイルスと呼ばれる。
【００６８】
遺伝子移入がＤＮＡウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））により媒介される局面において、ベクター構築物とは、ウイルスゲノムまたはその一部、および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドをいう。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０を越える血清型を含む、比較的よく特徴付けされた相同群のウイルスである。例えば、ＷＯ９５／２７０７１を参照のこと。Ａｄは、増殖し易く、そして宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび生成の可能性を減少するベクターもまた構築されている。ＷＯ９５／００６５５およびＷＯ９５／１１９８４を参照のこと。野生型ＡＡＶは、宿主細胞のゲノムに組み込む高い感染性および特異性を有する。ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：６４６６〜６４７０およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８〜３９９６を参照のこと。
【００６９】
プロモーター、およびヌクレオチドが作動可能に連結され得るクローニング部位の両方を含むベクターは、当該分野で周知である。このようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写し得、そしてこのようなベクターは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のような供給源から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、このクローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更して、余分な潜在的に不適切な代替の翻訳開始コドン、または転写もしくは翻訳のレベルのいずれかにおいて発現を妨害するかもしくは発現を減少し得る他の配列を除去する必要があり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位が、開始コドンのすぐ５’に挿入されて、発現を促進し得る。
【００７０】
遺伝子送達ビヒクルはまた、いくつかの非ウイルスベクター（ＤＮＡ／リポソーム複合体、および標的ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体を含む）を含む。リポソーム（これもまた、標的化抗体またはそのフラグメントを含む）は、本発明の方法で使用され得る。細胞への送達を増大するために、本発明の核酸またはタンパク質は、抗体または細胞表面抗原（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３またはＣＤ４）に結合するその結合フラグメントに結合され得る。
【００７１】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応をいう。この水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合により生じ得るか、または任意の他の配列特異的な様式で生じ得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３個以上の鎖、１つの自己ハイブリダイズ鎖、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスにおける工程（例えば、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断）を構成し得る。
【００７２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、以下を含む：約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液の濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約６×ＳＳＣの洗浄溶液。中程度のハイブリダイゼーション条件の例は、以下を含む：約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液。高ストリンジェンシーの条件の例は以下を含む：約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分〜２４時間であり、１回、２回またはそれより多くの洗浄工程を用い、そして洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌおよび１５ｍＭ　クエン酸緩衝液である。他の緩衝系を使用するＳＳＣの等価物が用いられ得ることが理解される。
【００７３】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（あるいはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が、別の配列に対して特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有することは、整列された場合、この割合の塩基（またはアミノ酸）が２つの配列を比較して同一であることを意味する。この整列および相同性％または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、補遺３０、第７．７．１８節、表７．７．１に記載されるソフトウェアプログラム）を使用して決定され得る。好ましくは、整列のためにデフォルトパラメーターが使用される。好ましい整列プログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、これらは以下のデフォルトパラメーターを使用する：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示＝５０配列；分類＝ＨＩＧＨ　ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスに見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００７４】
「インビボ」遺伝子送達、遺伝子移入、遺伝子治療などは、本明細書中で使用する場合、外因性ポリヌクレオチドを含有するベクターの生物（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）の身体への直接的な導入（これにより、この外因性ポリヌクレオチドは、このような生物の細胞にインビボで導入される）を言及する用語である。
【００７５】
用語「単離された」とは、天然においてポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントが通常付随する成分（細胞性であれ他のものであれ）から分離されたことを意味する。例えば、ポリヌクレオチドについて、単離されたポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドが通常染色体において付随している５’および３’の配列から分離されたポリヌクレオチドである。当業者に明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、それを、その天然に存在する対応物から区別するために「単離」は必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそのフラグメントは、容量あたりの分子の濃度または数値が、その天然に存在する対応物のものより、より高い（濃縮された）またはより低い（分離された）点において、その天然に存在する対応物とは識別可能である。その一次配列においてまたは例えば、そのグリコシル化パターンにより、その天然に存在する対応物とは異なる、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、その単離された形態で存在する必要はない。なぜなら、それは、一次配列によりまたは代替的に別の特徴（例えば、グリコシル化パターン）により、その天然に存在する対応物から識別可能であるからである。本明細書において開示される本発明の各々について明示的には言及されないものの、以下に開示される組成物の各々についておよび適切な条件下での上述の実施形態のすべてが本発明により提供されることが理解されるべきである。従って、天然に存在しないポリヌクレオチドは、単離された天然に存在するポリヌクレオチドとは別個の実施形態として提供される。細菌細胞において生産されたタンパク質は、それが天然で生産される真菌生物細胞から分離された天然に存在するタンパク質とは別個の実施態様として提供される。
【００７６】
「宿主細胞」、「標的細胞」または「レシピエント細胞」は、ベクターあるいは外来性の核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の取り込みのためのレシピエントであり得るかまたはそうであった、任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことが意図される。これはまた、単一の細胞の子孫を含むことが意図され、そしてその子孫は、天然の変異、事故の変異または故意の変異に起因して、もとの親細胞とは（形態学的またはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において）必ずしも完全の同一ではなくてもよい。この細胞は、原核生物または真核生物であり得、そして細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞（例えば、マウス、ラット、サル、もしくはヒト）を含むがそれらに限定されない。
【００７７】
「被検体」とは、脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト、家畜、競技動物およびペットが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７８】
「コントロール」とは、比較の目的のための実験において使用される代替の被検体または　サンプルである。コントロールは、「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、その実験の目的が特定の型の癌を伴う遺伝子の変化した発現レベルの相関性を決定することがである場合、陽性のコントロール（そのような変化を有し、かつ、その疾患の特徴である症候群を示す被検体または被検体からのサンプル）、および陰性コントロール（変化した発現を欠如し、かつその疾患の臨床的症状を欠く被検体または被検体からのサンプル）を使用することが一般に好ましい。
【００７９】
用語「癌」、「新生物」および「腫瘍」は、互換可能に使用され、そして単数形または複数形のいずれかで使用され、宿主生物に対して細胞を病原性にする悪性の形質転換を受けた、その細胞をいう。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換の部位付近から得られた細胞）は、充分に確立された技術（特に、組織試験）によって非癌性細胞とは容易に識別され得る。本明細書において使用される癌細胞の定義には、原発性癌細胞のみならず、癌細胞の先祖に由来する任意の細胞もまた含まれる。これは、転移された癌細胞、ならびにインビトロ培養物および癌細胞に由来する細胞株を包含する。通常固形腫瘍として現れる癌の型をいうとき、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊のに基づいて検出可能であるものである（例えば、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波または触診のような手順）。生化学的または免疫学的な知見のみでは、この定義に合致するには不十分であり得る。
【００８０】
腫瘍増殖の「抑制」は、本明細書において記載される感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞と接触していない増殖に比較して、縮小した増殖状態を示す。腫瘍細胞増殖は、当該分野において公知の任意の手段によって評価され得、これには、腫瘍サイズの測定、３Ｈチミジン取り込みアッセイを用いた腫瘍細胞が増殖しているかを決定すること、または腫瘍細胞を計数することが含まれるがそれらに限定されない。腫瘍細胞増殖を「抑制すること」とは、以下の状態のいずれかまたはすべてを意味する：（速度の）緩除化、（時期の）遅延、および腫瘍増殖の「抑制」は、腫瘍増殖を止める場合に縮小される増殖状態ならびに腫瘍収縮を示す。
【００８１】
用語「培養する」とは、種々の種類の培地上または内における、細胞または生物のインビトロ増殖をいう。培養における細胞増殖の子孫は、親の細胞とは（形態学的、遺伝学的または表現型敵に）完全に同一でなくてもよいことが理解される。「拡張（拡大）される」とは、細胞の、任意の増殖または分割を意味する。
【００８２】
「組成物」は、活性な因子と、不活性（例えば、検出可能な因子または標識）または活性な（例えば、アジュバント）別の化合物または組成物との組み合わせを意味することが意図される。
【００８３】
「薬学的組成物」は、キャリア（不活性または活性）と活性因子との組み合わせであって、インビトロ、インビボまたはエキソビボでの診断もしくは治療上の使用のために適切なものとなった組成物を包含することが意図される。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、水、およびエマルジョン（例えば、油／水型エマルジョンもしくは水／油型エマルジョン））、ならびに様々なタイプの湿潤剤のいずれかを包含する。この組成物はまた、安定剤または保存剤を含み得る。キャリア、安定剤およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ　ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ　ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，第１５版（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照のこと。
【００８５】
「有効量」とは、利益があるかまたは所望の結果を発揮するに充分な量である。有効量は、１以上の投与、適用または投薬量で投与され得る。
【００８６】
本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する：
【００８７】
【化４】
2004505607.tif 000002
または
【００８８】
【化５】
2004505607.tif 000003
または
【００８９】
【化６】
2004505607.tif 000004
。
【００９０】
本発明はまた、ＭＨＣ分子に対する結合強化を示し、同族のネイティブリガンドおよびそれに対応するネイティブタンパク質と交叉反応し、それに対する免疫応答を調節するに有用である、組成物を提供する。
【００９１】
本発明はさらに、抗癌ワクチンの成分として、そしてＨＥＲ−２腫瘍抗原の発現によって特徴付けられる癌に特異的な免疫エフェクター細胞を拡張するために有用である組成物を提供する。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明の変化したリガンドは、ネイティブのリガンドと、ＭＨＣ結合について匹敵する親和性を有する。ペプチド：ＭＨＣクラスＩ結合特性が免疫原性と相関することが実証されている（Ｓｅｔｔｅ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６；ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｕｒｇ　Ｓ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３３０８）。好ましい実施形態において、本発明の改変されたリガンドは、その「天然の」リガンドのものより高い親和性でＴＣＲに結合する。ＭＨＣクラスＩ分子へのネイティブおよび本発明の改変リガンドの比較結合により、当該分野で公知の方法によって測定され得、そしてこの方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルゴリズムに基づいて親和性を決定すること（例えば、Ｐａｒｋｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７を参照のこと）および結合親和性を実験的に算出すること（例えば、Ｔａｎら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０９（１）：２５−３６を参照のこと）。例えば、クラスＩ分子へのペプチドの相対的な結合は、種々の濃度（例えば、１００ｍＭ〜１ｎＭの範囲）の試験ペプチドを使用して、放射標識された標準ペプチドの界面活性剤で可溶化されたＭＨＣ分子への結合に基づいて測定され得る。ＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ２−ミクログロブリンは、固定された濃度（例えば、５ｎＭ）の放射標識された標準（コントロール）ペプチドおよび種々の濃度の試験ペプチドとともに、プロテアーゼインヒビターの混合物の存在下において、室温で適切な期間（例えば、２時間〜７２時間）、同時インキュベートされる。コントロールチューブは、標準ペプチドおよびＭＨＣ分子を含むが、試験ペプチドを含まない。ＭＨＣ結合放射能の割合を、ゲル濾過によって決定する。ＩＣ５０（コントロールペプチドの結合の５０％の阻害を生じる試験ペプチドの濃度）が各ペプチドについて計算される。ＴＣＲへの結合親和性を決定するためのさらなる方法は、当該分野で公知であり、そしてこの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：ａｌ−Ｒａｍａｄｉら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：６６２−６７３；およびＺｕｅｇｅｌら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７０５−１７０９に記載される方法。
【００９３】
別の実施形態において、本発明の改変リガンドは、そのネイティブなリガンド対応物と比較して、匹敵する抗原特異的Ｔ細胞活性化を惹起する。好ましい実施形態において、本発明の改変リガンドは、そのネイティブなリガンドと比較してより強い抗原特異的Ｔ細胞活性化を惹起する。本発明のリガンドの免疫原性を決定するための方法は公知であり、そして本明細書中にさらに記述される。
【００９４】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、２種以上の本発明の免疫原性リガンドを含む。１つの局面において、このような組成物は、単一のリガンドの２つ以上のコピーを有し得る。別の局面において、このような組成物は、２種以上のリガンドを含み得、ここで、この２種以上のリガンドの各々は、この組成物中の他の全てのリガンドとは異なる。１つの実施形態において、この２種以上の免疫原性リガンドは、共有結合している。
【００９５】
本発明はまた、新規な合成抗原性ペプチドを提供し、このペプチドは、ＭＨＣ分子への結合を増強するように設計され、そしてこれらが由来する合成ペプチドエピトープおよび対応するネイティブなペプチドに対する免疫応答を調節するために有用である。本発明の合成抗原性ペプチドエピトープ配列は、それらがＭＨＣへの密接な結合を与えるように設計されたＭＨＣクラスＩ結合ドメインにおいて、ネイティブな配列と比較して、アミノ酸配列に改変を有する点で、それらの天然の対応物とは異なる。それらはさらに、Ｔ細胞抗原レセプターに対する親和性を増加するように設計された推定Ｔ細胞レセプター結合ドメインにおける変異を含む。ネイティブな配列からのこれらの差異は、本発明の合成抗原性ペプチドエピトープが増強された免疫調節特性を有するという点で、ネイティブな配列に関して本発明の方法に対して利点を付与するように設計される。
【００９６】
本発明は、新規な合成抗原性ペプチド配列を提供し、これらの配列は、抗癌ワクチンの成分として、そして乳癌抗原ＨＥＲ−２の発現によって特徴付けられる癌に特異的である免疫エフェクター細胞を拡張するために有用である。これらのペプチド、ＦＬＹＹＧＴＴＹＶ（配列番号３）、ＦＬＦＴＰＴＩＹＶ（配列番号５）、およびＦＬＦＤＰＴＴＹＶ（配列番号７）は、天然のエピトープＭＡＧＶＧＳＰＹＶ（配列番号２のアミノ酸７７４〜７８２）と、以下の点で異なる：（１）それらは、ＭＨＣへの密接な結合を与える推定ＨＬＡ−Ａ２結合ドメインにおける変異（特にアミノ酸残基１、２、３、４、５、６および８）を含み、そして（２）それらは、Ｔ細胞レセプターに対する増加したアビディティを生じる推定Ｔ細胞レセプター結合ドメインにおける変異（アミノ酸残基３〜８）を含む。
【００９７】
ＭＨＣクラスＩ分子に対する本発明の合成抗原性リガンドの結合が、当該分野で公知の方法によって測定され得、そしてこの方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルゴリズムに基づいて親和性を算出すること（例えば、Ｐａｒｋｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７を参照のこと）および結合親和性を実験的に決定すること（例えば、Ｔａｎら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０９（１）：２５−３６を参照のこと）。例えば、クラスＩ分子へのペプチドの相対的な結合は、種々の濃度（例えば、１００ｍＭ〜１ｎＭの範囲）の試験ペプチドを使用して、放射標識された標準ペプチドの界面活性剤で可溶化されたＭＨＣ分子への結合に基づいて測定され得る。ＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ２−ミクログロブリンは、固定された濃度（例えば、５ｎＭ）の放射標識された標準（コントロール）ペプチドおよび種々の濃度の試験ペプチドとともに、プロテアーゼインヒビターの混合物の存在下において、室温で適切な期間（例えば、２時間〜７２時間）、同時インキュベートされる。コントロールチューブは、標準ペプチドおよびＭＨＣ分子を含むが、試験ペプチドを含まない。ＭＨＣ結合放射能の割合を、ゲル濾過によって決定する。ＩＣ５０（コントロールペプチドの結合の５０％の阻害を生じる試験ペプチドの濃度）が各ペプチドについて計算される。
【００９８】
本発明の合成ペプチドは、「天然の」配列よりも高い親和性でＴＣＲに結合するように設計される。ＴＣＲへの結合親和性を決定するための方法は、当該分野で公知であり、そしてこの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：ａｌ−Ｒａｍａｄｉら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：６６２−６７３；およびＺｕｅｇｅｌら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７０５−１７０９に記載される方法。
【００９９】
用語「合成抗原性ペプチド」はさらに、本発明の合成抗原性ペプチドのマルチマー（コンカテマー）を包含し、必要に応じて、介在アミノ酸配列ならびに以下を含むポリペプチドを含む：ＦＬＹＹＧＴＴＹＶ（配列番号３）、ＦＬＦＴＰＴＩＹＶ（配列番号５）、およびＦＬＦＤＰＴＴＹＶ（配列番号７）。本発明はまた、これらの配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、これらのポリペプチドは、乳癌抗原ＨＥＲ−２特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって優先的に認識される。
【０１００】
本発明のペプチド配列を含むポリペプチドは、ネイティブな乳癌抗原ＨＥＲ−２ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を改変することによって調製され得る。このことは、当業者に周知である組換えＤＮＡ技術の方法によって達成される。例えば、部位指向変異誘発は、ネイティブな乳癌抗原ＨＥＲ−２配列をコードする組換えポリヌクレオチドに対して実施されて、ポリヌクレオチド配列に変化を導入し得、この結果、改変されたポリヌクレオチドは、本発明のエピトープをコードする。
【０１０１】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、市販の自動ペプチド合成機（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡによって製造されたもの（Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａまたは４３１Ａ）を使用する化学合成によって得られ得る。この合成されたタンパク質またはポリペプチドは沈降され得、そして例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製され得る。従って、本発明はまた、タンパク質および試薬（例えば、アミノ酸および酵素）の配列を提供すること、および適切な方向で直鎖状の配列でアミノ酸を連結することによる、本発明のタンパク質を化学的に合成するためのプロセスを提供する。
【０１０２】
あるいは、これらのタンパク質およびポリペプチドは、以下に記載される宿主細胞およびベクター系を使用して、本明細書中に記載されるような周知の組換え方法によって得られ得る。
【０１０３】
（ペプチドアナログ）
改変が本発明のペプチドに対してなされて、改変された特性を有するペプチドを提供し得ることは当業者に周知である。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然あるいは合成のいずれかのアミノ酸をいい、グリシンおよびＤまたはＬの光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む。３つまたはそれ以上のアミノ酸のペプチドは、このペプチド鎖が短い場合、通常、オリゴペプチドと呼ばれる。このペプチド鎖が長い場合、このペプチドは、通常、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【０１０４】
本発明のペプチドは、非天然のアミノ酸を含むように改変され得る。従って、これらのペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との組み合わせ、ならびに種々の「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、およびＮ−α−アミノ酸など）を含ませて、特別な特性をペプチドに付与し得る。さらに、特定のカップリング工程で特定のアミノ酸を割当てることによって、α−へリックス、β−ターン、β−シート、γ−ターンを有するペプチド、および環状ペプチドが生成され得る。一般に、α−へリックスの二次構造またはランダムな二次構造が好ましい。
【０１０５】
さらなる実施形態において、有用な化学的特性および構造的特性を付与するペプチドのサブユニットが、選択される。例えば、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドは、インビボで、Ｌ−アミノ酸特異的プロテアーゼに対して耐性である。Ｄ−アミノ酸を有する改変分子は、逆の順番で整列されたアミノ酸を用いて合成されて、本発明のペプチドを「後から逆の順番の（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）」ペプチドとして生成し得る。さらに、本発明は、より良好に規定された構造的特性を有するペプチドを調製すること、ならびに新規な特性を有するペプチドを調製するためのペプチド模倣物およびペプチド模倣結合（例えば、エステル結合）の使用を意図する。別の実施形態において、還元されたペプチド結合（すなわち、Ｒ１−ＣＨ２ＮＨ−Ｒ２）を組み込むペプチドが生成され得、ここで、Ｒ１およびＲ２は、アミノ酸残基またはアミノ酸配列である。還元されたペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入され得る。このような分子は、ペプチド結合の加水分解（例えば、プロテアーゼ活性）に対して耐性である。このような分子は、固有の機能および活性（例えば、代謝崩壊に対する耐性に起因するインビボでの延長した半減期、またはプロテアーゼ活性）を有するリガンドを提供する。さらに、特定の系において、制限されたペプチドが増強した機能的活性を有することは周知である（Ｈｒｕｂｙ（１９８２）Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　３１：１８９−１９９およびＨｒｕｂｙら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．２６８：２４９−２６２）；本発明は、他の全ての位置にランダムな配列を組みこむ制限されたペプチドを生成するための方法を提供する。
【０１０６】
（立体配座的制限を誘導する非古典的なアミノ酸）
以下の非古典的なアミノ酸が、特定の立体配座モチーフを導入するために、本発明のペプチドに組みこまれ得る：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Ｋａｚｒｎｉｅｒｓｋｉら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２２７５−２２８３）；（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ　ａｎｄ　Ｈｒｕｂｙ（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３２（４１）：５７６９−５７７２）；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（Ｌａｎｄｉｓ（１９８９）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｒｉｚｏｎａ）；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Ｍｉｙａｋｅら（１９８９）Ｊ．Ｔａｋｅｄａ　Ｒｅｓ．Ｌａｂｓ．４３：５３７６）；ヒスチジンイソキノリンカルボン酸（Ｚｅｃｈｅｌら（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．３８（２）：１３１−１３８）；およびＨＩＣ（ヒスチジン環状尿素）、（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａら（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．４２（１）：６８−７７）および（（１９９２）Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．，Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｓｔｒｕｃ．Ｃｏｍｍ．４８（ＩＶ）：１２３９−１２４１）。
【０１０７】
以下のアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物は、特定の二次構造を誘導または支持するために、ペプチドに組み込まれ得る：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロぺニドン−６−カルボン酸）、β−ターン誘導ジペプチドアナログ（Ｋｅｍｐら（１９８５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：５８３４−５８３８）；β−シート誘導アナログ（Ｋｅｍｐら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２９：５０８１−５０８２）；β−ターン誘導アナログ（Ｋｅｍｐら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２９：５０５７−５０６０）；α−へリックス誘導アナログ（Ｋｅｍｐら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２９：４９３５−４９３８）；γ−ターン誘導アナログ（Ｋｅｍｐら（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：１０９：１１５）；以下の参照文献によって提供されるアナログ：Ｎａｇａｉ　ａｎｄ　Ｓａｔｏ（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２６：６４７−６５０；およびＤｉＭａｉｏら（１９８９）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ．１６８７頁；Ｇｌｙ−Ａｌａターンアナログ（Ｋａｈｎら（１９８９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３０：２３１７）；アミド結合同配体（Ｃｌｏｎｅｓら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２９：３８Ｓ３−３８Ｓ６）；トレトラゾール（Ｚａｂｒｏｃｋｉら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：５８７Ｓ−５８８０）；ＤＴＣ（Ｓａｍａｎｅｎら（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｅｐ．Ｒｅｓ．３５：５０１：５０９）；Ｏｌｓｏｎら（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１２：３２３−３３３およびＧａｒｖｅｙら（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６：４３６に教示されるアナログ。β−ターンおよびβ−バルジの立体配座的に制限された模倣物、ならびにそれらを含むペプチドが、Ｋａｈｎに対し１９９５年８月８日に発行された米国特許第５，４４０，０１３号に記載される。
【０１０８】
本発明の合成抗原性ペプチドエピトープは、種々の処方物において使用され得、この処方物は、意図された使用に依存して変化し得る。
【０１０９】
本発明の合成抗原性ペプチドエピトープは、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に連結（複合体化）され得、これらの性質は、特定の目的に依存して変化し得る。例えば、本発明のペプチドは、高分子キャリアに共有結合的にまたは非共有結合的に複合体化され得、この高分子キャリアとしては、天然および合成のポリマー、タンパク質、多糖類、ポリペプチド（アミノ酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよび脂質が挙げられるがこれらに限定されない。ペプチドは、リポソームへの導入のために、脂肪酸に結合体化され得る。米国特許第５，８３７，２４９号。本発明の合成ペプチドは、固体支持体と共有結合的にまたは非共有結合的に複合体化され得、種々の支持体が、当該分野で公知である。本発明の合成抗原性ペプチドエピトープは、以下により詳細に記載されるように、同時刺激分子を伴ってかまたは伴わず抗原提示基質と会合され得る。
【０１１０】
タンパク質キャリアの例としては、スーパー抗原、血清アルブミン、破傷風トキソイド、オボアルブミン、サイログロブリン、ミオグロブリン、および免疫グロブリンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１１】
ペプチド−タンパク質キャリアポリマーは、従来の架橋剤（例えば、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）を使用して形成され得る。カルボジイミドの例は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル（ｄｉｍｅｔｈｙａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ））カルボジイミド（ＥＤＣ）および１−エチル−３−（４−アゾニア−４４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。
【０１１２】
他の適切な架橋剤の例は、臭化シアン、グルタルアルデヒドおよび無水コハク酸である。一般に、多くのホモ二官能性の薬剤（ホモ二官能性アルデヒド、ホモ二官能性エポキシド、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性マレイミド、ホモ二官能性アルキルハライド、ホモ二官能性ピリジルジスルフィド、ホモ二官能性アリールハライド、ホモ二官能性ヒドラジド、ホモ二官能性ジアゾニウム誘導体およびホモ二官能性光反応性化合物を含む）のいずれかが使用され得る。ヘテロ二官能性化合物（例えば、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有する化合物、アミン反応性基および光反応性基を有する化合物、ならびにカルボニル反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有する化合物）もまた含まれる。
【０１１３】
このようなホモ二官能性架橋剤の特定の例としては、以下が挙げられる：二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、スベリン酸ジスクシンイミジル、および酒石酸ジスクシンイミジル；二官能性イミドエステルジメチルアジピミデート、ジメチルピメリミデート、およびジメチルスベリミデート；二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン、ビスマレイミドへキサン、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン；二官能性アリールハライド１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンおよび４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン；二官能性光反応性薬剤（例えば、ビス−［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド）；二官能性アルデヒドホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびアジパルデヒド（ａｄｉｐａｌｄｅｈｙｄｅ）；二官能性エポキシド（例えば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）；二官能性ヒドラジドアジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、およびコハク酸ジヒドラジド；二官能性ジアゾニウムｏ−トリジン、ジアゾ化ベンジジンおよびビスジアゾ化ベンジジン；二官能性アルキルハライドＮ１Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ウンデカメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、ならびにベンジルハライドおよびハロマスタード（例えば、それぞれａ１ａ’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸およびトリ（２−クロロエチル）アミン）。
【０１１４】
タンパク質のペプチドへの結合体化をもたらすために使用され得る通常のヘテロ二官能性架橋剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｏｈｅｎｙｌ））酪酸ヒドラジド）、Ｍ２Ｃ２Ｈ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド）、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、およびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）。
【０１１５】
架橋は、カルボニル基を、アミン基またはヒドラジド基に、還元アミノ化によってカップリングすることによって達成され得る。
【０１１６】
本発明のペプチドはまた、イオン性、吸収性、または生体特異的な相互作用を介して、モノマーの非共有結合的な結合として処方され得る。高度に正または負に荷電した分子を有するペプチドの複合体は、低イオン強度環境（例えば、脱イオン水）下で塩架橋形成を介してなされ得る。大きな複合体は、荷電したポリマー（例えば、ポリ−（Ｌ−グルタミン酸）またはポリ−（Ｌ−リジン）、これらは、それぞれ多数の負電荷および正電荷を含む）を使用して生成され得る。ペプチドの吸着は、微粒子ラテックスビーズのような表面または他の疎水性ポリマーに対してなされ得、非共有結合的に会合したペプチド−スーパー抗原複合体を形成し、この複合体は、架橋したかまたは化学的に重合したタンパク質を効率的に模倣する。最後に、ペプチドは、他の分子間の生体特異的相互作用の使用を介して、非共有結合的に連結され得る。例えば、タンパク質（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンあるいはそれらの誘導体）に対するビオチンの強力な親和性の利用は、ペプチド複合体を形成するために使用され得る。これらのビオチン結合タンパク質は、溶液中でビオチンと相互作用し得るかまたは別の分子に共有的に結合し得る４つの結合部位を含む。Ｗｉｌｃｈｅｋ（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２。ペプチドは、タンパク質上の利用可能なアミン基と反応するＤ−ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ−ビオチン）のような通常のビオチン化試薬を使用して、ビオチン基を有するように改変され得る。次いで、ビオチン化ペプチドは、アビジンまたはストレプトアビジンと共にインキュベートされて、大きな複合体を生成し得る。このようなポリマーの分子量は、アビジンまたストレプトアビジンに対するビオチン化ペプチドのモル比の慎重な制御を介して調節され得る。
【０１１７】
本出願によって、診断方法において使用するための検出可能な因子に結合体化した本明細書中に記載のペプチドおよびポリペプチドもまた、提供される。例えば、検出可能に標識されたペプチドおよびポリペプチドは、カラムに結合され得、そして抗体の検出および精製のために使用され得る。これらはまた、以下に記載されるように、抗体の産生のための免疫原として有用である。
【０１１８】
本発明のペプチドはまた、種々の液相キャリア（例えば、滅菌溶液または水溶液、薬学的に受容可能なキャリア、懸濁液および乳濁液）と組合され得る。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油が挙げられる。抗体を調製するために使用される場合、このキャリアはまた、特定の免疫応答を非特異的に増強するために有用なアジュバントを含み得る。当業者は、アジュバントが必要であるか否かを容易に決定し得、そしてこれを選択し得る。しかし、例示目的のみのために、適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント、鉱物塩およびポリヌクレオチド。
【０１１９】
本発明はさらに、配列ＦＬＹＹＧＴＴＹＶ（配列番号３）、ＦＬＦＴＰＴＩＹＶ（配列番号５）、およびＦＬＦＤＰＴＴＹＶ（配列番号７）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドの相補体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび核酸模倣物を含む。上記で同定された配列（配列の例は、配列番号４、６および８に示される）またはその相補体に加えて、本発明はまた、アンチセンスポリヌクレオチド鎖（ｓｔａｎｄ）（例えば、これらの配列またはその相補体に対するアンチセンスＲＮＡ）を提供する。配列番号４、６および８に提供される配列ならびにＶａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８に記載される方法論を使用して、アンチセンスＲＮＡを入手し得る。
【０１２０】
本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲを使用して複製され得る。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，８００，１５９号；同第４，７５４，０６５号；および同第４，６８３，２０２号の主題であり、そしてＰＣＲ：ＴＨＥ　ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ　ＣＨＡＩＮ　ＲＥＡＣＴＩＯＮ（Ｍｕｌｌｉｓら編，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４））およびそこに列挙される参考文献に記載される。
【０１２１】
あるいは、当業者は、このＤＮＡを複製するために、本明細書中で提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用し得る。したがって、本発明はまた、ポリヌクレオチドの直線配列、適切なプライマー分子、化学薬品（例えば、酵素）、ならびにその複製およびこのポリヌクレオチドを得るために適切な配向でこのヌクレオチドを化学的に複製または連結するための指示を提供することによって、本発明のポリヌクレオチドを得るためのプロセスを提供する。別々の実施形態において、これらのポリヌクレオチドは、さらに単離される。なおさらに、当業者は、このポリヌクレオチドを、適切な複製ベクターに挿入し得、そして複製および増幅のために、このベクターを適切な宿主細胞（原核細胞または真核細胞）に挿入し得る。このように増幅されたＤＮＡは、当業者に周知の方法によって細胞から単離され得る。この方法によってポリヌクレオチドを得るプロセス、ならびにこのようにして得られたポリヌクレオチドは、さらに本明細書中で提供される。
【０１２２】
ＲＮＡは、最初に、ＤＮＡポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に挿入することによって得られ得る。このＤＮＡは、任意の適切な方法によって（例えば、適切な遺伝子送達ビヒクル（例えば、リポソーム、プラスミドまたはベクター）の使用によって、あるいはエレクトロポレーションによって）挿入され得る。この細胞が複製し、そしてこのＤＮＡがＲＮＡに転写される場合、このＲＮＡは、当業者に周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出に示されるような方法）を使用して単離され得る。例えば、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出に示されるような手順に従う種々の溶解酵素または化学溶液を使用して単離され得るか、または製造者によって提供される付随の指示に従う核酸結合樹脂によって抽出され得る。
【０１２３】
少なくとも４個連続したヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも５または６個連続したヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも１０個連続したヌクレオチドを有し、上記に同定されるポリヌクレオチドに対して配列相補性または相同性を示すポリヌクレオチド（例えば、配列番号４、６および８において提供される）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての有用性を見出す。
【０１２４】
「完全に一致した」プローブは、特異的ハイブリダイゼーションには必要とされないことが当該分野で公知である。少数の塩基の置換、欠失または挿入によって達成されるプローブ配列における小さな変化は、ハイブリダイゼーションの特異性に影響しない。一般に、２０％ほどの量の塩基対不一致（最適に整列される場合）が、許容され得る。好ましくは、上記ｍＲＡＮの検出のために有用なプローブは、上記に同定された以前に同定された配列ならびに配列番号４、６および８によって同定された配列の相同領域に対して、少なくとも約８０％の同一性である。より好ましくは、このプローブは、この相同領域の整列後に対応する遺伝子配列に対して８５％同一であり、なおより好ましくは、９０％の同一性を示す。
【０１２５】
これらのプローブは、これらの細胞を含む種々の細胞または組織を検出またはモニターするために、ラジオアッセイ（例えば、サザンブロット分析およびノーザンブロット分析）において使用され得る。これらのプローブはまた、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するための高スループットスクリーニングアッセイにおいて使用するために、固体支持体またはアレイ（例えば、チップ）に結合され得る。したがって、本発明はまた、高スループットスクリーニングにおける使用のために固体支持体に結合された、上記で規定されたような少なくとも１つのプローブおよび／またこれらの配列の１つの相補体を提供する。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、このポリヌクレオチドの宿主細胞への形質導入を確認するために、ＡＰＣ中で発現される遺伝子または遺伝子転写物の検出のためのプライマーとして役立ち得る。本文脈において、増幅は、適切な忠実度で標的配列を複製し得るプライマー依存的なポリメラーゼを利用する任意の方法を意味する。増幅は、天然または組換えのＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント、および逆転写酵素）によって行われ得る。このプライマーの好ましい長さは、上記のプローブについて同定された長さと同じである。
【０１２７】
本発明はさらに、ＲＮＡ転写のプロモーターならびにこのＤＮＡまたはＲＮＡの複製および／または一過性もしくは安定な発現のための他の調節配列に作動可能に連結した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、このプロモーターが、ＤＮＡ分子からＲＮＡの転写を指向する様式で位置されることを意味する。このようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４およびＴ７である。特定の実施形態において、細胞特異的プロモーターは、挿入されたポリヌクレオチドの細胞特異的な発現のために使用される。終止コドンおよび選択マーカー配列を有するプロモーターまたはプロモーター／エンハンサー、ならびにＤＮＡの挿入断片がこのプロモーターに作動可能に連結され得るクローニング部位を含むベクターは、当該分野で周知であり、そして市販されている。一般的な方法論およびクローニング戦略については、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９１））およびそこに列挙される参考文献、ならびにＶＥＣＯＴＲＳ：ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ　ＤＡＴＡ　ＳＥＲＩＥＳ（ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ編，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４））（これは、種々の適切なベクターについてのマップ、機能的特性、商業的供給業者およびＧｅｎＥＭＢＬ登録番号についての参照を含む）を参照のこと。好ましいことに、これらのベクターは、ＲＮＡをインビトロまたはインビボで転写し得る。
【０１２８】
これらの核酸を含む発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを産生するための宿主ベクター系を得るために有用である。これらの発現ベクターは、エピソームとしてかまたは染色体ＤＮＡの一体化部分としてかのいずれかで、宿主生物体において複製可能でなければならないことが意味される。適切な発現ベクターとしては、プラスミドおよびウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含む）、コスミドなどが挙げられる。アデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボの両方でのその高い発現レベルおよび細胞の効率的な形質転換のために、遺伝子を組織にインビボで導入するために特に有用である。核酸が適切な宿主細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）に挿入され、そしてこの宿主細胞が複製する場合、このタンパク質は、組換え的に産生され得る。適切な宿主細胞は、このベクターに依存し、そしてこの宿主細胞としては、周知の方法によって構築された哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞が挙げられ得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出を参照のこと。外因性核酸の細胞への挿入のためのウイルスベクターの使用に加えて、この核酸は、以下のような当該分野で周知の方法によってこの宿主細胞へと挿入され得る：細菌細胞についての形質転換；哺乳動物細胞についての、リン酸カルシウム沈澱を使用するトランスフェクション；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；またはマイクロインジェクション。この方法論については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出を参照のこと。したがって、本発明はまた、タンパク質またはポリペプチドあるいは抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、動物細胞（ラットもしくはマウス）、ヒト細胞または原核細胞（例えば、細菌細胞））を提供する。
【０１２９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを細胞（インビボ、エキソビボ、またはインビトロであろうと）に送達するために適切な送達ビヒクルを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、クローニングベクターまたは発現ベクター内に含まれ得る。これらのベクター（特に、発現ベクター）は、次に、多くの形態のいずれか（これは、例えば、細胞への送達および／または侵入を促進し得る）を推定するために操作され得る。
【０１３０】
これらのベクターがインビボまたはエキソビボの遺伝子治療に使用される場合、薬学的に受容可能なベクター（例えば、複製無能レトロウイルスまたはアデノウイルスベクター）が好ましい。本発明の核酸を含む薬学的に受容可能なベクターは、挿入ポリヌクレオチドの一過性発現または安定発現のためにさらに改変され得る。本明細書中に使用される場合、用語「薬学的に受容可能なベクター」としては、分裂細胞を選択的に標的化して核酸をこの細胞に導入する能力を有するベクターまたは送達ビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなベクターの例は、ウイルスタンパク質を産生し得ないその能力によって規定される「複製無能」ベクターである（感染した宿主細胞におけるこのベクターの広まりは除く）。複製無能レトロウイルスベクターの例は、ＬＮＬ６（Ｍｉｌｌｅｒ　Ａ．Ｄ．ら（１９８９）　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：９８０−９９０）である。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介遺伝子移入のために複製無能レトロウイルスを使用する方法論は、十分に確立されている（Ｃｏｒｒｅｌｌら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８９１２；Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８９１２−５２；Ｃｕｌｖｅｒ　Ｋ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：３１５５；およびＲｉｌｌ　Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ　７９（１０）：２６９４−２７００）。
【０１３１】
本発明のポリヌクレオチドを含むこれらの単離された宿主細胞は、このポリヌクレオチドの組換え複製およびペプチドの組換え産生に有用である。あるいは、これらの細胞は、本明細書中に記載される方法において被験体での免疫応答を誘導するために使用され得る。これらの宿主細胞が抗原提示細胞である場合、これらは、免疫エフェクター細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（これは次に、養子免疫療法に有用である））の集団を拡大するために使用され得る。
【０１３２】
本発明のポリペプチドと特異的に複合体を形成し得る抗体がまた、本発明によって提供される。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。これらの抗体としては、マウス抗体、ラット抗体、およびウサギ抗体またはヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体は、ポリペプチドおよびこのポリペプチドを発現するＡＰＣを同定および精製するために有用である。
【０１３３】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための実験方法、ならびにそれらの対応する核酸配列を推測するための実験方法は、当該分野で公知である。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）（前出）ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（前出）を参照のこと。本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質またはそのフラグメントを動物（例えば、マウスまたはウサギ）に導入することによって生物学的に産生され得る。動物中の抗体産生細胞は、単離され、そして骨髄腫細胞もしくはヘテロ骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリッド細胞またはハイブリドーマを産生する。従って、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞がまた、提供される。
【０１３４】
従って、タンパク質またはそのフラグメント、および周知の方法を使用することによって、当業者は、タンパク質またはポリペプチドに結合する能力を有する抗体に関して、本発明のハイブリドーマ細胞および抗体を産生しかつスクリーニングし得る。
【０１３５】
試験されるモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチドに結合する場合、試験される抗体および本発明のハイブリドーマによって提供される抗体は、等価である。試験される抗体が、本発明のモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチド（このモノクローナル抗体はこれらと正常に反応性である）に結合することを妨げるか否かを決定することによって、この抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有するか否かを、過度の実験なしに決定することがまた可能である。本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、試験される抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合する場合、これらの２つの抗体は、同じかまたは密接に関連するエピトープにおそらく結合する。あるいは、本発明のモノクローナル抗体をこのモノクローナル抗体が正常に反応性であるタンパク質とプレインキュベートして、試験されるモノクローナル抗体が抗原に結合するその能力を阻害されるか否かを決定し得る。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、多分、この抗体は、本発明のモノクローナル抗体と同じかまたは密接に関連するエピトープ特異性を有する。
【０１３６】
用語「抗体」はまた、全てのアイソタイプの抗体を含むことが意図される。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、最初の融合から直接選択することによって調製され得るか、または異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマからＳｔｅｐｌｅｗｓｋｉら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：８６５３またはＳｐｉｒａら（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７４：３０７に記載される手順を用いてクラススイッチ改変体を単離するための同胞選択技術を使用することによって二次的に調製され得るかのいずれかである。
【０１３７】
本発明はまた、上記のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生物学的に活性なフラグメントを提供する。これらの「抗体フラグメント」は、その抗原または免疫源と選択的に結合するいくらかの能力を保持する。このような抗体フラグメントとしては、以下：
（１）Ｆａｂ、
（２）Ｆａｂ’、
（３）Ｆ（ａｂ’）２、
（４）Ｆｖ、および
（５）ＳＣＡ
が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１３８】
「生物学的に活性な抗体フラグメント」の特定の例は、抗体のＣＤＲ領域である。これらのフラグメントを作製する方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）（前出）を参照のこと。
【０１３９】
本発明の抗体はまた、キメラ抗体およびヒト化抗体を作製するために改変され得る（Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４（３）：２１４）。キメラ抗体は、抗体の重鎖および軽鎖の種々のドメインが、１以上の種由来のＤＮＡによってコードされている抗体である。
【０１４０】
本発明のモノクローナル抗体の特異性を有する他のハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体の単離はまた、抗イデオタイプ抗体を産生することによって当業者によって達成され得る（Ｈｅｒｌｙｎら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２：１００）。抗イデオタイプ抗体は、目的のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体上に存在する特有の決定基を認識する抗体である。
【０１４１】
２つのハイブリドーマのモノクローナル抗体間のイデオタイプ同一性は、これら２つのモノクローナル抗体が、同じエピトープ決定基のそれらの認識に関して同じであることを実証する。従って、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する抗体を使用することによって、同じエピトープ特異性のモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することが可能である。
【０１４２】
エピトープを模倣するモノクローナル抗体を産生するために、抗イデオタイプ技術を使用することがまた可能である。例えば、第１のモノクローナル抗体に対して作製された抗イデオタイプモノクローナル抗体は、超可変領域に結合ドメインを有する（これは、第１のモノクローナル抗体によって結合された、エピトープの鏡像である）。従って、この例において、抗イデオタイプモノクローナル抗体は、これらの抗体の産生のための免疫に使用され得る。
【０１４３】
本発明に使用される場合、用語「エピトープ」は、本発明のモノクローナル抗体に対して特異的な親和性を有する任意の決定基を含むことを意味する。エピトープ決定基は、通常、化学的に活性な分子の表面群（例えば、アミノ酸または糖側鎖）からなり、そして通常、特定の３次元構造の特徴ならびに特定の電荷特徴を有する。
【０１４４】
本発明の抗体は、検出可能な因子または標識に連結され得る。当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法が存在する。
【０１４５】
低分子量ハプテンに対する抗体のカップリングが、アッセイの感度を増加し得る。そしてハプテンは、次いで、第２の反応によって特異的に検出され得る。例えば、ビオチン（これは、アビジンと反応する）またはジニトロフェリル（ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｒｒｙｌ）、ピリドキサル、およびフルオレセイン（これらは、特定の抗ハプテン抗体と反応し得る）のようなハプテンを使用することが一般的である。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）（前出）を参照のこと。
【０１４６】
本発明のモノクローナル抗体はまた、多くの異なるキャリアに結合し得る。従って、本発明はまた、抗体および別の物質（活性または不活性）を含む組成物を提供する。周知のキャリアの例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変のセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびに磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者は、モノクローナル抗体を結合するための他の適切なキャリアに精通しているか、または慣用的な実験を用いてこれらを確認し得る。
【０１４７】
抗体、そのフラグメント、またはこの抗体を産生する細胞株を含む組成物が、本発明によって含まれる。これらの組成物が薬学的に使用される場合、これらの組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと合わされる。
【０１４８】
別の実施形態において、本発明は、ＭＨＣ分子の状況において本発明の化合物および組成物を送達する工程を包含する、免疫応答を誘導する方法を提供する。従って、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載の方法を用いて抗原提示細胞にパルスされ得る。抗原提示細胞としては、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球または必要なＭＨＣ／同時刺激分子を発現する他の細胞型が挙げられるが、これらに限定されない。以下に記載の方法は、主に、最も強力で好ましいＡＰＣであるＤＣに焦点をあてている。ポリペプチドまたはタンパク質を含むこれらの宿主細胞が、さらに提供される。
【０１４９】
ＭＨＣ分子の状況において本発明のポリペプチドを提示する単離された宿主細胞はさらに、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団を拡大および単離することに有用である。免疫エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）は、ナイーブな免疫エフェクター細胞を抗原提示細胞（これは、ＭＨＣ分子の状況においてＡＰＣの表面上にポリペプチドを提示する）と共に培養することによって産生される。この集団は、当該分野で公知の方法（例えば、ＦＡＣＳ分析またはフィコール勾配）を用いて精製され得る。免疫エフェクター細胞およびそれによって産生される集団を作製および培養するための方法がまた、本発明者らの貢献であり、本発明である。細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物は、養子免疫療法に有用である。インビボでの投与前に、免疫エフェクター細胞が、黒色腫抗原ｇｐ１００を発現する腫瘍細胞を溶解するその能力に関してインビトロでスクリーニングされる。
【０１５０】
１つの実施形態において、免疫エフェクター細胞および／またはＡＰＣは、遺伝学的に改変される。標準的な遺伝子移入を使用することによって、同時刺激分子および／または刺激性サイトカインをコードする遺伝子が、免疫エフェクター細胞の拡大前、同時、またはこれに続いて、挿入され得る。
【０１５１】
本発明はまた、被験体中で免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、この被験体に上記のポリペプチドの有効量を、このポリペプチドに対する免疫応答を誘導する条件下で投与する工程を包含する。このポリペプチドは、処方物中に投与され得るか、またはこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして投与され得る。このポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクル中に投与されるか、または宿主細胞に挿入することによって投与され得る。この細胞は次に、コードされたポリペプチドを組換え的に転写、翻訳およびプロセシングする。従って、薬学的に受容可能なキャリア中の本発明のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞は、有効なワクチンレジメンのために、適切かつ有効量のアジュバント、サイトカインまたは同時刺激分子と合わされ得る。１つの実施形態において、宿主細胞は、樹状細胞のようなＡＰＣである。宿主細胞はさらに、サイトカインおよび／もしくは同時刺激分子のいずれかまたは両方の有効量をコードするポリヌクレオチドの挿入によって改変され得る。
【０１５２】
本発明の方法は、サイトカインまたは同時刺激分子の有効量の、被験体への同時投与によってさらに改変され得る。
【０１５３】
本発明はまた、任意の上記のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、抗体およびそのフラグメント、ならびに受容可能な固体もしくは液体キャリアを含む組成物を提供する。この組成物が薬学的に使用される場合、これらは、診断用途および治療用途のために「薬学的に受容可能なキャリア」と合わされる。これらの組成物はまた、疾患（例えば、癌）の診断および処置のための医薬を調製するために使用され得る。
【０１５４】
以下の材料および方法は、例示することが意図されるが、本発明を限定せず、そして上記の本発明を作製および使用する方法を例示することが意図される。
【０１５５】
（材料および方法）
（本発明のポリペプチドの産生）
最も好ましくは、本発明の単離されたペプチドは、適切な固体状態合成手順を用いて合成され得る。ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ、ＳＯＬＩＤ　ＰＨＡＳＥ　ＰＥＰＴＩＤＥ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｆｒｅｅｍａｎｔｌｅ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９６８）。好ましい方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄプロセスである。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６７）Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｓ．２３：４５１を参照のこと。これらのペプチドの抗原性活性は、例えば、本明細書中に記載のアッセイを用いて簡便に試験され得る。
【０１５６】
一旦本発明の単離されたペプチドが得られると、これは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的可溶性を含む標準的な方法によってか、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって精製され得る。免疫アフィニティークロマトグラフィーに関して、エピトープは、ペプチド（または本発明の関連するペプチド）に対して惹起された抗体を含むアフィニティーカラムにこのエピトープを結合させることによって単離され得、そして静止した支持体に貼り付けられ得る。
【０１５７】
あるいは、アフィニティータグ（例えば、ヘキサ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マルトース結合ドメイン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、インフルエンザコート配列（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊら（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：５０８−５０９）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）が、本発明のペプチドに結合されて、適切なアフィニティーカラムの通過による簡単な精製を可能にし得る。単離されたペプチドはまた、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびＸ線結晶学のような技術を用いて物理的に特徴付けられ得る。
【０１５８】
翻訳の間または翻訳後に差示的に改変された（例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解性切断、抗体分子、膜分子もしくは他のリガンドへの連結によって）抗原性ペプチドがまた、本発明の範囲内に含まれる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２８５−３２０）。
【０１５９】
（ＡＰＣ（樹状細胞を含む）の単離、培養および拡大）
以下は、ＡＰＣの単離のための２つの基本的アプローチの簡単な説明である。これらのアプローチは、（１）血液から骨髄前駆細胞（ＣＤ３４＋）を単離する工程、およびそれらを刺激してＡＰＣに分化させる工程；または（２）末梢血から予め決定付けられたＡＰＣを収集する工程、を包含する。第１のアプローチにおいて、患者をサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）で処置して、末梢血中の循環ＣＤ３４＋幹細胞の数をブーストしなければならない。
【０１６０】
ＡＰＣを単離するための第２のアプローチは、血液中に既に循環している比較的多くの予め決定付けられたＡＰＣを収集することである。ヒト末梢血から決定付けられたＡＰＣを単離するための以前の技術は、メトリザミド勾配および接着／非接着工程（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ　Ｐ．Ｓ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：７６９８−７７０２）；パーコール勾配分離（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：９９６−１００３）；および蛍光活性化細胞分析分離技術（Ｔｈｏｍａｓ　Ｒ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６８４０−６８５２）のような、物理的手順の組み合わせを含んだ。
【０１６１】
多くの細胞を互いに分離するための１つの技術は、向流遠心分離溶出（ＣＣＥ）として公知である。この技術において、細胞を、遠心分離および緩衝液の洗い流しに同時に供し、この洗い流しは、流速が一定して増加する。この一定して増加する緩衝液の向流は、ほぼ細胞のサイズに基づく分画性の細胞分離を導く。
【０１６２】
本発明の１つの局面において、このＡＰＣは、予め決定付けられた樹状細胞または成熟樹状細胞であり、これらは、哺乳動物（例えば、マウス、サルまたはヒト）の白血球画分から単離され得る（例えば、ＷＯ９６／２３０６０を参照のこと）。この白血球画分は、その哺乳動物の末梢血由来であり得る。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）当該分野で公知の方法（例えば、白血球搬出法）によって哺乳動物供給源から得られた白血球画分を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の白血球画分を向流遠心分離溶出によって４つ以上の部分画分に分離する工程；（ｃ）工程（ｂ）由来の１以上の画分中の単球の樹状細胞への変換を刺激する工程であって、これは、これらの細胞にカルシウムイオノフォア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１３またはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を接触させることによる、工程；（ｄ）工程（ｃ）由来の樹状細胞富化画分を同定する工程；ならびに（ｅ）工程（ｄ）の富化画分を（好ましくは、約４℃で）収集する工程。樹状細胞富化画分を同定するための１つの方法は、蛍光活性化細胞分析分離による。白血球画分は、他のサイトカイン（例えば、組換え（ｒｈ）ｒｈＩＬ−１２、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、またはｒｈＩＬ−４）の存在下で、カルシウムイオノフォアで処理され得る。白血球画分の細胞は、分離工程の前に、緩衝液中で洗浄されそして無Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋培地中に懸濁され得る。白血球画分は、白血球搬出法によって得られ得る。樹状細胞は、以下のマーカー：ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＢ７．２のうちの少なくとも１つの存在ならびに以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、５６、５７およびＣＤ１９、２０の同時の非存在によって同定され得る。これらの細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体は、市販されている。
【０１６３】
より詳細には、この方法は、白血球搬出法からの白血球および血小板の富化収集物を収集する工程を必要とし、次いで、これらは、向流遠心分離溶出（ＣＣＥ）（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ　Ｔ．Ｇ．ら（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ．６：４８−５３）によってさらに分画される。細胞サンプルを、特別な溶出ローターに置く。次いで、このローターを、例えば、３０００ｒｐｍの一定速度で回転させる。一旦ローターが所望の速度に達すると、圧縮空気を使用して、細胞の流速を制御する。この溶出器中の細胞は、遠心分離および緩衝液の洗い流しに同時に供され、この洗い流しの流れは、流速が一定して増加する。これは、細胞のサイズの差異にほぼ（しかし、排他的にではない）基づく、分画性の細胞分離を生じる。
【０１６４】
培養物中のＡＰＣおよびより詳細にはＤＣ収集物の質の制御ならびにそれらの首尾よい活性化の確認は、同時の多色ＦＡＣＳ分析技術に依存し、これは、単球および樹状細胞亜集団の両方ならびに起こり得る混入Ｔリンパ球をモニターする。これは、ＤＣが、以下のマーカーを発現しないという事実に基づく：ＣＤ３（Ｔ細胞）；ＣＤ１４（単球）；ＣＤ１６、５６、５７（ＮＫ／ＬＡＫ細胞）；ＣＤ１９、２０（Ｂ細胞）。同時に、ＤＣは、それらが血液中を循環している時には、多量のＨＬＡ−ＤＲ，有意なＨＬＡ−ＤＱおよびＢ７．２を発現する（しかし、Ｂ７．１はほとんど発現しないかまたは全く発現しない）（さらに、これらは、Ｌｅｕ　Ｍ７およびＭ９を発現し、これらはまた、単球および好中球によって発現される骨髄マーカーである）。
【０１６５】
死細胞の分析のための第３の比色試薬（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ））と組み合わせた場合、全ての細胞亜集団の陽性同定を行うことが可能である（表１を参照のこと）。
【０１６６】
【表１】
2004505607.tif 000005
さらなるマーカーは、さらなる分析のために置換され得る：
色番号１：ＣＤ３単独、ＣＤ１４単独など；Ｌｅｕ　Ｍ７またはＬｅｕ　Ｍ９；抗クラスＩなど。
【０１６７】
色番号２：ＨＬＡ−ＤＱ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ２５（ＩＬ２ｒ）、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ−３など。
【０１６８】
収集時のＦＡＣＳ分析の目的は、ＤＣが予測される画分中に富化されていることを確認すること、好中球混入をモニターすること、および適切なマーカーが発現されていることを確認することである。この臨床適用に適切なヒト末梢血由来の富化されたＤＣの迅速なバルク収集は、質の制御について上記の分析ＦＡＣＳ技術に絶対的に依存する。必要な場合、成熟ＤＣは、「カクテル陰性」細胞について蛍光選別することによって、この時点で単球から即座に分離され得る。単球からＤＣを従来的に分離することを必要としなくてもよい。なぜなら、以下に詳述するように、単球自体は、培養物中でＤＣまたは機能的なＤＣ様細胞になお分化し得るからである。
【０１６９】
一旦収集すると、ＤＣリッチ／単球ＡＰＣ画分（通常、１５０〜１９０）を、さらなる使用のためにプールおよび冷凍保存し得るか、または短期間培養に即座に配置され得る。
【０１７０】
あるいは、他者は、樹状細胞を上方調節（活性化）し、そして活性化された樹状細胞表現型へ単球を変換するための方法を報告する。この方法は、培養培地へのカルシウムイオノフォアの添加を包含し、これが、単球を活性化された樹状細胞に変換する。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７の添加は、２４〜４８時間の培養期間の開始時に、プールした「単球＋ＤＣ」画分の均一な活性化および樹状細胞表現型の変換を生じ：特徴的には、その活性化された集団は、均一にＣＤ１４（Ｌｅｕ　Ｍ３）陰性になり、そしてＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＢ７．２を上方調節する。さらに、この活性化されたバルク集団は、さらに精製したバルク集団と同様に、少数の基準で十分に機能する。
【０１７１】
サイトカインの特定の組み合わせは、カルシウムイオノフォアで達成された活性化／変換を増幅（または部分的に置換する）ために首尾よく使用さている：これらのサイトカインとしては、精製または組換え（「ｒｈ」）ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｒｈＩＬ−２およびｒｈＩＬ−４が挙げられるが、これらに限定されない。各サイトカインは、単独で与えられた場合、最適な上方調節に不十分である。
【０１７２】
（ＡＰＣへの抗原の提示）
免疫の目的のために、抗原性ペプチド（Ｎｏ．２、４および／または６）を、タンパク質／ペプチドとしてかまたはそのタンパク質／ペプチドをコードするｃＤＮＡの形態で抗原提示細胞に送達し得る。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、または必須のＭＨＣ／同時刺激分子を発現する他の細胞型からなり得る。以下に記載する方法は、主に最も強力な、好ましいＡＰＣであるＤＣに焦点を当てている。
【０１７３】
パルスは、本発明の抗原性タンパク質またはペプチドに対してＡＰＣを曝露することによって、インビトロ／エキソビボで達成される。このタンパク質またはペプチドは、約３時間、１〜１０μｍの濃度でＡＰＣに添加される。パルスしたＡＰＣは、その後、静脈内、皮下、鼻内、筋内または腹腔内の送達経路を介して宿主に投与され得る。
【０１７４】
タンパク質／ペプチド抗原はまた、静脈内、皮下、鼻内、筋内または腹腔内の送達経路を介して、アジュバントと共にインビボで送達され得る。
【０１７５】
Ｐａｇｌｉａら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：３１７−３２２は、タンパク質全体と共にインビトロでインキュベートしたＡＰＣがＭＨＣクラスＩ拘束ＣＴＬによって認識されること、およびこれらのＡＰＣでの動物の免疫がインビボでの抗原特異的ＣＴＬの発生を導くことを示した。さらに、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）のサイトゾル中での抗原の発現を導く、いくつかの異なる技術が記載されている。これらは、（１）腫瘍細胞から単離したＲＮＡのＡＰＣへの導入、（２）抗原の内因性発現を誘導するための組換えベクターでのＡＰＣの感染、および（３）リポソームを使用するＤＣサイトゾルへの腫瘍抗原の導入を包含する（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ　Ｄら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：４６５−４７２；Ｒｏｕｓｅら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５６８５−５６８９；およびＮａｉｒら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：６０９−６１２を参照のこと）。
【０１７６】
（養子（ｆｏｓｔｅｒ）抗原提示細胞）
養子抗原提示細胞は、標的細胞として特に有用である。養子ＡＰＣは、Ｔ２と呼ばれる、ヒト細胞株１７４×ＣＥＭ．Ｔ２から誘導される。この細胞株は、その抗原プロセシング経路に変異を含み、この変異が、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子との内因性ペプチドの会合を制限する（Ｚｗｅｅｒｉｎｋら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１７６３−１７７１）。これは、ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬへの抗原提示に必要な、遺伝子ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２を含むＭＨＣクラスＩＩ領域における大きいホモ接合性の欠失に起因する。結局、「空の」ＭＨＣクラスＩ分子のみが、これらの細胞の表面上に提示される。培養培地に添加された外因性ペプチドは、そのペプチドが対立遺伝子特異的結合モチーフを含む限り、これらのＭＨＣ分子に結合する。これらのＴ２細胞は、本明細書中で「養子」ＡＰＣと呼ばれる。これらは、抗原を提示するために、本発明と組み合わせて使用され得る。
【０１７７】
特異的組換えＭＨＣ対立遺伝子でのＴ２細胞の形質導入は、ＭＨＣ拘束プロフィールの変更（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）を可能にする。組換え対立遺伝子に対して合わせたライブラリーは、これらによって優先的に提示される。なぜなら、このアンカー残基は、その内因性対立遺伝子への効率的な結合を妨げるからである。
【０１７８】
ＭＨＣ分子の高レベルの発現は、ＡＰＣを、ＣＴＬに対してより明らかにさせる。強力な転写プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）を使用してＴ２細胞における目的のＭＨＣ対立遺伝子の発現は、より反応性のＡＰＣを生じる（これは、ほぼおそらく、細胞表面上の反応性ＭＨＣペプチド複合体のより高い濃度に起因する）。
【０１７９】
（免疫原性アッセイ）
本発明のリガンドの免疫原性は、周知の方法によって決定され得、これらの方法には、以下に例示の方法が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、このような方法を使用して、本発明の変更されたリガンドを、対応するネイティブリガンドと比較し得る。例えば、変更されたリガンドは、それが以下のアッセイの任意の１つにおいてネイティブリガンドの活性と有利に匹敵する場合に、「より活性」とみなされ得る。いくつかの目的のために（すなわち、処置目的および／または診断目的のために）、当業者は、別の免疫原性リガンドよりも高い活性を提示する免疫原性リガンドを選択する。しかし、いくつかの適用については、ネイティブリガンドと匹敵する免疫原性リガンドの使用が適切である。他の状況において、より活性が低い免疫原性リガンドを使用することが望ましくあり得る。このような活性のレベルは、免疫原性のレベルに陽性に相関することが示唆されている。
【０１８０】
１．（５１Ｃｒ放出溶解アッセイ）　抗原特異的Ｔ細胞によるペプチドパルスした５１Ｃｒ標識標的の溶解を、ネイティブリガンドまたは変更されたリガンドのいずれかをパルスした標的細胞について比較し得る。機能的に増強されたリガンドは、時間の関数として標的のより高い溶解を示す。溶解の速度および固定した時点（例えば、４時間）での全体の標的溶解を使用して、リガンド性能を評価し得る（Ｗａｒｅ　Ｃ．Ｆ．ら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１３１２）。
【０１８１】
２．（サイトカイン放出アッセイ）　リガンドパルスした標的の接触に際してＴ細胞によって分泌されるサイトカインの型および量の分析は、機能的活性の測定であり得る。サイトカインを、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し、サイトカイン産生の速度および全量を決定し得る（Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ　Ｋ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：１８１；Ｔａｎｑｕａｙ　Ｓ．およびＫｉｌｌｏｎ　Ｊ．Ｊ．（１９９４）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ．１３：２５９）。
【０１８２】
３．（インビトロＴ細胞誘発（ｅｄｕｃａｔｉｏｎ））　本発明のリガンドを、正常なドナー由来または患者由来のＰＢＭＣからリガンド反応性Ｔ細胞集団を誘発する能力について、対応するネイティブリガンドと比較し得る。この系において、誘発されたＴ細胞を、溶解活性、サイトカイン放出、ポリクローン性、およびネイティブリガンドに対する交差反応性について試験し得る（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ　Ｍ．Ｒ．ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９）。
【０１８３】
４．（トランスジェニック動物モデル）　免疫原性を、ＨＬＡトランスジェニックマウスを本発明のリガンドまたはネイティブリガンドのいずれかでワクチン接種し、そして誘導された免疫応答の性質および程度を決定することによって、インビボで評価し得る。あるいは、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルは、ヒトＰＢＬの養子移入によって、マウスにおいてヒト免疫系の再構成を可能にする。これらの動物を、以前に記載のように（Ｓｈｉｒａｉ　Ｍ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２７３３；Ｍｏｓｉｅｒ　Ｄ．Ｅ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：２４４３）、これらのリガンドでワクチン接種しそして免疫応答について分析し得る。
【０１８４】
５．（増殖）　Ｔ細胞は、反応性リガンドに応答して増殖する。増殖を、例えば、３Ｈ−チミジン取込みを測定することによって、定量的にモニターし得る（Ｃａｒｕｓｏ　Ａ．ら（１９９７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　２７：７１）。
【０１８５】
６．（テトラマー染色）　ＭＨＣテトラマーに、個々のリガンドをロードし得、適切なエフェクターＴ細胞集団に結合するその相対的能力について試験し得る（Ａｌｔｍａｎ　Ｊ．Ｄ．ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：５２８４）。
【０１８６】
７．（ＭＨＣ安定化）　特定の細胞株（例えば、Ｔ２細胞）をＨＬＡ結合リガンドに曝露すると、その細胞の表面上にあるＭＨＣ複合体の安定化をもたらす。その細胞表面上のＭＨＣ複合体の定量は、安定化されたＨＬＡ対立遺伝子についてのそのリガンドの親和性と関連付けられている。従って、この技術は、リガンドエピトープの相対的ＨＬＡ親和性を決定し得る（Ｓｔｕｂｅｒ　Ｇ．ら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６５３）。
【０１８７】
８．（ＭＨＣ競合）　リガンドが参照リガンドおよびその同族Ｔ細胞エフェクターの機能的活性に干渉する能力は、ＭＨＣ結合についてリガンドがどの程度競合し得るかの尺度である。阻害の相対的レベルを測定することは、ＭＨＣ親和性の指標である（Ｆｅｌｔｋａｍｐ　Ｍ．Ｃ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．４７：１）。
【０１８８】
９．（霊長類モデル）　最近記載された非ヒト霊長類（チンパンジー）モデル系を使用して、ＨＬＡ拘束リガンドのインビボ免疫原性をモニターし得る。チンパンジーは、ヒトＭＨＣ分子と重複するＭＨＣリガンド特異性を共有し、それにより相対的インビボ免疫原性についてＨＬＡ拘束リガンドを試験することが可能であることが、示されている（Ｂｅｔｒｏｎｉ　Ｒ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４４４７）。
【０１８９】
１０．（ＴＣＲシグナル伝達事象のモニタリング）　いくつかの細胞内シグナル伝達事象（例えば、リン酸化）は、ＭＨＣ−リガンド複合体による首尾良いＴＣＲの係合に関連する。これらの事象の定性的分析および定量的分析は、リガンドがＴＣＲ係合を介してエフェクター細胞を活性化する相対的能力と相関付けられている（Ｓａｌａｚａｒ　Ｅ．ら（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　８５：８２９；Ｉｓａｋｏｖ　Ｎ．ら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：３７５）。
【０１９０】
（免疫エフェクター細胞の増殖）
本発明は、これらのＡＰＣが抗原特異的免疫エフェクター細胞の富加集団の生成を刺激することを利用する。この抗原特異的免疫エフェクター細胞を、このＡＰＣを犠牲にして増殖させる。このＡＰＣは、この培養中で死ぬ。ナイーブ免疫エフェクター細胞が他の細胞によって感作されるようになるプロセスは、Ｃｏｕｌｉｅ（１９９７）Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ　３：２６１〜２６８に本質的に記載されている。
【０１９１】
上記のように調製したＡＰＣを、ナイーブ免疫エフェクター細胞と混合する。好ましくは、この細胞を、サイトカイン（例えば、ＩＬ２）の存在下で培養し得る。樹状細胞は、強力な免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ１２）を分泌するので、第１回および継続する回の増殖の間に、補充用サイトカインを添加する必要はないかもしれない。いずれにしろ、この培養条件は、この抗原特異的免疫エフェクター細胞がこのＡＰＣよりもかなり高速で拡張（すなわち、増殖）するような条件である。ＡＰＣおよび任意のサイトカインの複数回注入を、抗原特異的細胞の集団をさらに増殖するために実施し得る。
【０１９２】
１つの実施形態において、この免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。別の実施形態において、この免疫エフェクター細胞を、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１１、またはＩＬ−１３をコードする導入遺伝子を用いる形質導入によって、遺伝子改変し得る。インビトロ、エキソビボおよびインビボで導入遺伝子を導入するための方法は、当該分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（前出）を参照のこと。
【０１９３】
（遺伝的改変において有用なベクター）
一般に、異種抗原または変化した抗原をコードするポリペプチドまたは導入遺伝子を含むベクターを導入することによって、本発明において使用される細胞の遺伝的改変を達成する。種々の異なる遺伝子移入ベクター（ウイルス系および非ウイルス系を含む）を使用し得る。本発明の遺伝的改変において有用なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−レトロウイルスキメラベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＰＣ細胞および免疫エフェクター細胞を、下記の方法を使用してか、または当該分野で公知の他の任意の適切な方法によって、改変し得る。
【０１９４】
（組換えアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターの構築）　本発明の遺伝的改変において有用なアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを、当該分野で既に教示された方法に従って生成し得る。例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）ＥＭＢＯ　Ｊ．５：２３７７；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５３３〜５３９；Ｍｕｚｃｙｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９；ＧＥＮＥ　ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（１９９２）（Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照のこと。いくつかの異なるアプローチが可能である。好ましいのは、ヘルパー非依存性複製欠損ヒトアデノウイルス系である。
【０１９５】
ヒトアデノウイルス５に基づく組換えアデノウイルスベクター（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６３：６１４〜６１７（１９８８））は、そのアデノウイルスゲノムから必須の初期遺伝子（通常Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ）を欠いており、従って、その不足している遺伝子産物をトランスで提供する許容性細胞株において増殖されない限り、複製できない。その不足しているアデノウイルスゲノム配列の代わりに、目的の導入遺伝子をクローニングし得、そしてその複製欠損アデノウイルスに感染した細胞において発現させ得る。アデノウイルスに基づく遺伝子移入は、宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込みを生じないが（０．１％未満のアデノウイルス媒介トランスフェクションが、宿主ＤＮＡ中への導入遺伝子組み込みを生じる）、従って安定ではないが、アデノウイルスベクターを、高力価で増殖させ得、そしてそのアデノウイルスベクターで、複製中でない細胞をトランスフェクトし得る。ヒト２９３細胞（アデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子で形質転換したヒト胚性腎細胞である）は、有用な許容性細胞株の代表である。しかし、複製欠損アデノウイルスベクターが中で増殖することを可能にする他の細胞株（ＨｅＬａ細胞を含む）を使用し得る。
【０１９６】
本発明の方法において使用され得るアデノウイルスベクターおよび他のウイルスベクターを記載するさらなる参考文献としては、以下が挙げられる：Ｆｉｅｌｄｓ　Ｂ．ら（編），ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１６７９〜１７２１（１９９０）中のＨｏｒｗｉｔｚ　Ｍ．Ｓ．，ＡＤＥＮＯＶＩＲＩＤＡＥ　ＡＮＤ　ＴＨＥＩＲ　ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ；ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．７：ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ｍｕｒｒａｙ　Ｅ．（編），Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）中のＧｒａｈａｍ　Ｆ．ら，ｐｐ．１０９〜１２８；Ｍｉｌｌｅｒ　Ｎ．ら（１９９５）ＦＡＳＥＢ　Ｊ．９：１９０〜１９９；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ　Ｈ．（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ　Ａｃｔａ　Ｈｅｌｖｅｔｉａｅ　６８：１４５〜１５９；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　ａｎｄ　Ｆｒｅｎｃｈ（１９９３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８８：１９３７〜１９４２；Ｃｕｒｉｅｌ　Ｄ．Ｔ．ら（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．３：１４７〜１５４；Ｇｒａｈａｍ　Ｆ．Ｌ．ら，ＷＯ　９５／００６５５（１９９５年１月５日）；Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ　Ｅ．Ｓ．，ＷＯ　９５／１６７７２（１９９５年６月２２日）；Ｄｅｎｅｆｌｅ　Ｐ．ら，ＷＯ　９５／２３８６７（１９９５年９月８日）；Ｈａｄｄａｄａ　Ｈ．ら，ＷＯ　９４／２６９１４（１９９４年１１月２４日）；Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ　Ｍ．ら，ＷＯ　９５／０２６９７（１９９５年１月２６日）；Ｚｈａｎｇ　Ｗ．ら，ＷＯ　９５／２５０７１（１９９５年１０月１２日）。種々のアデノウイルスプラスミドはまた、商業的供給源から入手可能であり、そのような供給源としては、例えば、以下が挙げられる：Ｍｉｃｒｏｂｉｘ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｈｅｅｔ；Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｆｏｒ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，１９９６を参照のこと）。また、Ｖｉｌｅら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１５：８４０〜８４１およびＦｅｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１５：８６６〜８７０（遺伝的改変のために使用され得るアデノ−レトロウイルスキメラベクターの構築および使用を記載する）による論文も参照のこと。
【０１９７】
本発明の方法において使用され得るＡＡＶベクターを記載するさらなる参考文献としては、以下が挙げられる：Ｃａｒｔｅｒ　Ｂ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＰＡＲＶＯＶＩＲＵＳＥＳ，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐｐ．１６９〜２２８，１９９０；Ｂｅｒｎｓ，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｐｐ．１７４３〜１７６４（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９９０）；Ｃａｒｔｅｒ　Ｂ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５３３〜５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ　Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９２〜１２９；Ｆｌｏｔｔｅ　Ｔ．Ｒ．ら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７０：７９〜９０；Ｆｌｏｔｔｅ　Ｔ．Ｒ．ら，ＷＯ　９５／１３３６５（１９９５年５月１８日）；Ｔｒｅｍｐｅ　Ｊ．Ｐ．ら，ＷＯ　９５／１３３９２（１９９５年５月１８日）；Ｋｏｔｉｎ　Ｒ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：７９３〜８０１；Ｆｌｏｔｔｅ　Ｔ．Ｒ．ら（１９９５）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２：３５７〜３６２；Ａｌｌｅｎ　Ｊ．Ｍ．，ＷＯ　９６／１７９４７（１９９６年６月１３日）；およびＤｕら（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：２５４〜２６１。
【０１９８】
ＡＰＣは、関連するポリペプチドをコードするウイルスベクターで形質導入され得る。最も一般的ウイルスベクターとしては、組換えポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ウイルス（Ｂｒｏｎｔｅら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：３１８３〜３１８８；Ｋｉｍら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０：２７６〜２８６）および、優先的にはアデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３９３〜１４０３；Ｗａｎら（１９９７）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　８：１３５５〜１３６３；Ｈｕａｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２２５７〜２２６３））が挙げられる。レトロウイルスもまた、ヒトＡＰＣの形質導入に使用され得る（Ｍａｒｉｎら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２９５７〜２９６２）。
【０１９９】
最小量の無血清培地中で１６〜２４時間、感染多重度（ＭＯＩ）５００のアデノウイルス（Ａｄ）ベクターにヒトＤＣをインビトロ／エキソビボで曝露すると、９０〜１００％のＤＣにおいて、導入遺伝子の発現を確実に生じる。ＤＣまたは他のＡＰＣの形質導入の効率は、発現される腫瘍抗原に特異的な蛍光抗体を使用して免疫蛍光により評価され得る（Ｋｉｍら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０：２７６〜２８６）。あるいは、その抗体を、その基質との反応の際に着色した生成物を生じる酵素（例えば、ＨＲＰ）に結合させ得る。このＡＰＣにより発現される抗原性ポリペプチドの実際の量は、ＥＬＩＳＡにより評価され得る。
【０２００】
形質導入したＡＰＣを、その後、静脈内送達経路、皮下送達経路、鼻内送達経路、筋肉内送達経路または腹腔内送達経路を介して、宿主に投与し得る。
【０２０１】
ＤＣまたは他のＡＰＣのインビボでの形質導入を、種々の経路（静脈内送達、筋肉内送達、鼻内送達、腹腔内送達、または皮膚送達を含む）を介するＡｄ（または他のウイルスベクター）の投与によって達成し得る。好ましい方法は、総用量約１×１０１０〜１×１０１２ｉ．ｕ．を使用する、複数部位でのＡｄベクターの皮膚送達である。インビボ形質導入のレベルを、発現されるＡＰＣマーカーおよびＴＡＡに対する抗体を用いる同時染色によって、おおまかに評価し得る。染色手順は、投与部位由来の生検サンプルに対してか、あるいはＡＰＣ（特にＤＣ）が移動され得た流入領域（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節または他の器官由来の細胞に対して、実行し得る（Ｃｏｎｄｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．２：１１２２〜１１２８およびＷａｎら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．８：１３５５〜１３６３）。注入部位で発現されるか、または形質導入されたＡＰＣが移動され得た他の器官で発現される、抗原の量を、組織ホモジネートについてのＥＬＩＳＡによって評価し得る。
【０２０２】
ウイルス遺伝子送達の方がより効率的であるが、ＤＣもまた、非ウイルス遺伝子送達法（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはカチオン性脂質／プラスミドＤＮＡ複合体）（Ａｒｔｈｕｒら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，４：１７〜２５）によって、インビトロ／エキソビボで形質導入し得る。形質導入したＡＰＣを、その後、静脈内送達経路、皮下送達経路、鼻内送達経路、筋肉内送達経路、または腹腔内送達経路を介して、宿主に投与し得る。
【０２０３】
ＤＣ（または他のＡＰＣ）のインビボ形質導入は、静脈内投与経路、筋肉内投与経路、鼻内投与経路、腹腔内投与経路、または皮膚投与経路を介して送達される、カチオン性脂質／プラスミドＤＮＡ複合体の投与によって、潜在的に達成し得る。皮膚への裸のプラスミドＤＮＡの遺伝子銃送達または注入もまた、ＤＣの形質導入をもたらす（Ｃｏｎｄｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．２：１１２２〜１１２８；Ｒａｚら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：９５１９〜９５２３）。プラスミドＤＮＡの筋肉内送達もまた、免疫のために使用し得る（Ｒｏｓａｔｏら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．８：１４５１〜１４５８）。
【０２０４】
形質導入効率および導入遺伝子発現のレベルは、ウイルスベクターに関して上記したように評価し得る。
【０２０５】
（養子免疫療法およびワクチン）
本発明の抗原特異的免疫エフェクター細胞の増殖集団はまた、養子免疫療法レジメンにおける用途およびワクチンとして用途が見出される。
【０２０６】
養子免疫療法は、１つの局面において、上記のようにＡＰＣとともにナイーブ免疫エフェクター細胞を培養することによって生成した、感作された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）抗原特異的免疫エフェクター細胞の実質的な純粋な集団を、被験体に投与する工程を包含する。好ましくは、このＡＰＣは、樹状細胞である。
【０２０７】
１つの実施形態において、本明細書中に記載される養子免疫療法は、自系である。この場合、このＡＰＣは、単一の被験体から単離した親細胞を使用して作製する。この増殖集団はまた、その被験体から単離したＴ細胞を使用する。最後に、抗原特異的細胞の増殖集団を、同じ患者に投与する。
【０２０８】
さらなる実施形態において、ＡＰＣまたは免疫エフェクター細胞を、有効量の刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）または副刺激分子とともに投与する。
【０２０９】
本明細書中でその意図される目的のために有効であると同定された薬剤を、黒色腫抗原ｇｐ１００を発現する腫瘍を有する被験体に、および、またはそれに加えて、そのような腫瘍に対して感受性である個体もしくはそのような腫瘍を発症する危険がある個体に、投与し得る。その薬剤を、被験体（例えば、マウス、ラットまたはヒト患者）に投与する場合、その薬剤を、薬学的に受容可能なキャリアに添加し得、そしてその被験体に全身投与または局所投与し得る。有益に処置し得る患者を決定するために、腫瘍の後退をアッセイし得る。治療量は、経験的に決定し得る。そしてその治療量は、処置される病理、処置される被験体およびその療法の効率および毒性によって変化する。
【０２１０】
インビボでの投与を、処置過程全体を通して、１用量でか、連続的にかまたは間欠的に、行い得る。最も有効な投与手段および投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、そしてその方法は、治療に使用する組成物、その治療の目的、処置される標的細胞、および処置される被験体によって変化する。単回投与または複数回投与を、処置する医師により選択された用量レベルおよびパターンを用いて実行し得る。適切な投与処方物および薬剤投与方法は、下記にて見出され得る。
【０２１１】
本発明の薬剤および組成物を、医薬の製造において、および従来の手順に従う投与によりヒトおよび他の動物の処置のために（例えば、薬学的組成物における活性成分として）、使用し得る。
【０２１２】
より詳細には、本明細書中で活性成分とも呼ばれる本発明の薬剤を、任意の適切な経路（経鼻経路、局所経路（経皮経路、エアロゾル経路、経頬経路および舌下経路を含む）、非経口経路（皮下経路、筋肉内経路、静脈内経路および皮内経路）および肺経路を含む）によって、治療のために投与し得る。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変化することもまた、理解される。
【０２１３】
上記の議論および実施例は、技術を例証することのみが意図される。当業者には明らかであるように、種々の改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく上記に対して行い得る。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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