(57)【要約】本発明は、突然変異を誘導し得るかあるいはＤＮＡポリメラーゼまたはキナーゼを抑制し得る化合物（式Ｉ）を調製するための初期シントンとして用いられる反応性ヒドラジド官能基を含む新規ヌクレオチド類似体に関する。本発明は、前記ヌクレオチドおよびヌクレオシド類似体を含む核酸にも関する。このような化合物の中の１つとしては、特に式（Ｉ）の化合物が挙げられる。
2004503559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
2004503559.tif 000017
〔式中、
Ｒ１基は水素、あるいはホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート基から選択される基あるいはＤＭＴのような保護基を表し；
Ｒ２およびＲ２’は互いに別々にＨ、ＯＨ、ホスホルアミダイトおよびその誘導体、Ｈ−ホスホネート並びに延長ターミネーターＴから選択され；
Ｒ３およびＲ３’は互いに別々にＨ、ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基およびＯ−Ｒ５基から選択され、Ｒ５基は炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基を表し；
Ｒ４は式：
【化２】
2004503559.tif 000018
（式中、Ｅは炭素数０〜２０の飽和または不飽和炭素鎖から成るスペーサーアームを意味し、これは異種原子を含むこともあり、および／または任意に置換される）
の置換複素環（丸で表される）を表し、前記複素環が：
ａ）次式の５−原子複素環：
【化３】
2004503559.tif 000019
（式中、Ｘは互いに別々にＣＨ、Ｃ−Ｒ６またはＮ基を表し、Ｒ６はハロゲン（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基およびＯ−Ｒ７またはＳ−Ｒ７基から選択され、Ｒ７は水素または炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基を表す）であって、前記複素環は特にアゾールファミリー、例えば以下の環：
【化４】
2004503559.tif 000020
に属し、
ｂ）次式の６−原子環、特にピリミジン：
【化５】
2004503559.tif 000021
ｃ）次式のプリン類似体：
【化６】
2004503559.tif 000022
（式中、
Ｙ１はＮＨ２（シントンＸ０と称する）または：
【化７】
2004503559.tif 000023
基を表し、
Ｙ２およびＹ３は互いに別々にＨ、ＯＨ、Ｏ、ＮＨ２、ハロゲン（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、ＳＣＨ３、ＳＨ、アミン、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ方向で）、あるいは炭素数１〜６の分枝鎖または線状アルキル（−ＯＲ方向）から選択され、
Ｚ１およびＺ２は互いに別々にＨおよび有機基から選択される）
から選択される〕
により表される化合物。
【請求項２】
Ｒ１基がトリホスフェート基であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２’基のうちの少なくとも１つがＯＨ基を表すことを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
Ｔが好ましくはＦ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ３および炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｙ１がＮＨ２である一般式ＩＩ：
【化８】
2004503559.tif 000024
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’およびＥは式Ｉの基に対応する）
のシントン（シントンＸ０）に対応することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｙ１が下記の基：
【化９】
2004503559.tif 000025
（式中、Ｚ１およびＺ２は互いに別々に水素または有機基（シントンＸ１およびＸ１ＴＰ）を表す）から選択される基を表すことを特徴とする請求項１〜４記載の化合物。
【請求項７】
Ｙ１が下記の基：
【化１０】
2004503559.tif 000026
（式中、Ｚ１およびＺ２は互いに別々に水素または有機基（シントンＸ２およびＸ２ＴＰ）を表す）から選択される基を表すことを特徴とする請求項１〜４記載の化合物。
【請求項８】
Ｚ１およびＺ２基のうちの少なくとも１つが芳香族から、特に次式：
【化１１】
2004503559.tif 000027
の基から選択されることを特徴とする請求項６および７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
Ｚ１およびＺ２基のうちの少なくとも１つがチオール、アルキル、カルボニル、アミン、アルコール、アリールおよびアミノ酸基から選択されることを特徴とする請求項６および７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
Ｚ１またはＺ２がＹ３とともに環を形成することを特徴とする請求項６および７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
Ｚ１またはＺ２が蛍光または燐光マーカー、特にフルオレサミンを含むことを特徴とする請求項６および７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
それらがポリメラーゼ、逆転写酵素および／またはヌクレオチドキナーゼの基質であることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
それらが天然塩基とともに対を形成することを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
それらがポリメラーゼ、特にレトロウイルス逆転写酵素および／またはキナーゼを抑制することを特徴とする請求項１２記載の化合物。
【請求項１５】
以下の工程：
ａ）複素環として次式：
【化１２】
2004503559.tif 000028
（式中、Ｘは互いに別々にＣＨ、Ｃ−Ｒ６またはＮ基を表し、Ｒ６はハロゲン（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基およびＯ−Ｒ７またはＳ−Ｒ７基から選択され、Ｒ７は水素または炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基を表す）
の５−原子複素環を有し、前記複素環が特にアゾールファミリー、例えば以下の環：
【化１３】
2004503559.tif 000029
に属するヌクレオシドの調製、
ｂ）位置５’におけるアルコールの保護、およびヒドラジンの作用によるエチルエステル官能基のカルボヒドラジド官能基への転化、
ｃ）保護基、例えばベンジルオキシカルボニル基によるカルボヒドラジド基のアミン官能基の保護、位置３’におけるアルコールのアセチル化、
ｄ）位置５’におけるアルコールの脱保護化後のリン酸化、ならびに
ｅ）ベンジルオキシカルボニル基の水素化分解、
を包含することを特徴とする請求項５記載の一般式ＩＩの化合物の製造方法。
【請求項１６】
工程ａ）がＮ−トランスデオキシリボシラーゼにより実行されることを特徴とする請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
工程ｄ）がジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でシアノエチルホスフェートによるヌクレオシドのリン酸化；位置３’におけるアルコールのおよび５’ホスフェートのシアノエチル基の基本培地中での同時放出；次にモルホリデートの形態の５’活性化ホスフェートへのピロホスフェートの縮合から成ることを特徴とする請求項１５および１６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項５の一般式ＩＩの化合物がアルデヒドまたはケトンと縮合されることを特徴とする請求項６〜１１のいずれかに記載の一般式Ｉの化合物の製造方法。
【請求項１９】
請求項５の一般式ＩＩの１つまたはそれ以上の化合物がアルデヒドおよび／またはケトンのライブラリーと反応させられ、任意にその後還元されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれかに記載の方法を用いて生成され得る化合物。
【請求項２１】
請求項１９の方法を用いて生成され得る請求項１〜１１のいずれかに記載の一般式Ｉの化合物のライブラリー。
【請求項２２】
核酸中に突然変異を導入し得る化合物の同定方法であって、
ｉ）Ｙ１がＮＨ２基である請求項１記載の化合物を合成オリゴヌクレオチド中に組入れ、
ｉｉ）請求項１８または１９記載の方法にしたがって前記化合物を反応させ、任意にその後還元して、
ｉｉｉ）ポリメラーゼを用いて前記オリゴヌクレオチドを複製し、そして突然変異が新規合成鎖中に導入されていたか否かを確定することからなる過程を含む方法。
【請求項２３】
ｉ）請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物を含む合成オリゴヌクレオチドが合成され、ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドがポリメラーゼを用いて複製されることを特徴とする核酸の局在化突然変異のための方法。
【請求項２４】
核酸の増幅のための請求項１〜１１記載の少なくとも１つの化合物を含む反応混合物を用いることから成る過程を包含する核酸の無作為突然変異のための方法。
【請求項２５】
ＤＮＡエキソポリメラーゼが用いられることを特徴とする請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ポリメラーゼ、特に逆転写酵素およびキナーゼから選択される酵素を抑制し得る化合物の同定方法であって、前記酵素の活性が請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物の存在下で試験されることを特徴とする方法。
【請求項２７】
レトロウイルスの逆転写酵素を抑制し得る化合物の同定方法であって、請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物の作用がレトロウイルスに感染された細胞で試験され、前記化合物がヌクレオシド類似体の形態で見出されることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２１記載のライブラリーが用いられることを特徴とする請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物を含む核酸。
【請求項３０】
無作為突然変異誘発方法における請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項３１】
両意的塩基としての請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項３２】
標的核酸の増幅および／または検出のためのプライマーまたはプローブにおける請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項３３】
前記化合物がマークされることを特徴とする請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物を含む標的核酸または請求項２９記載の核酸の増幅および／または検出のためのキット。
【請求項３５】
薬剤の調製のための請求項２９記載の核酸の使用。
【請求項３６】
薬剤の調製のためのリボザイムとしての請求項２９記載の核酸の使用。
【請求項３７】
薬剤の調製のためのアンチセンスとしての請求項２９記載の核酸の使用。
【請求項３８】
Ｙ１がヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド類似体のライブラリーの調製のための初期シントンとしてのＮＨ２である請求項１〜５のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項３９】
薬剤の製造のための請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４０】
レトロウイルス感染の治療を意図された薬剤の製造のための請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
癌の治療を意図された薬剤の製造のための請求項３９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、突然変異を誘導し得るかあるいはＤＮＡポリメラーゼまたはキナーゼを抑制し得る化合物（式Ｉ）を調製するための初期シントンとして用いられる反応性ヒドラジド官能基（式ＩＩ）を含む新規のヌクレオチド類似体に関する。本発明は、前記のヌクレオチドおよびヌクレオシド類似体を含む核酸にも関する。
【０００２】
一般に利用可能なヌクレオチド阻害剤（アシクロビル、ガンシクロビル、ＡＺＴ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ）は、長期治療および反復投与の場合に望ましくない二次作用を生じる。一方で、これらのヌクレオチド類似体の固有の毒性は、特に、それらがポリメラーゼまたは既定の逆転写酵素に相対して特異性を欠き得るという事実から起こる。他方、一定期間後、用量が増大された場合でも、ウイルスはこれらの阻害剤に耐性になる。
【０００３】
新規のヌクレオチド阻害剤の合成は、ＨＩＶ、ＣＭＶおよびＨＳＶのようなウイルス感染の治療方法の更新に対する重要な寄与を示す。Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（１９９０）は、極大集団の修飾化ヌクレオチドの合成に関連づけられる多数の困難が存在することを示す。例えば、基の各付加または修飾を用いて塩基のまたはリボースの反応性官能基を保護することが必要であると思われる。
単一過程でライブラリーからヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を生成することを可能にする塩基性シントンのために、本発明はこれらの困難を克服することを可能にする。これらのライブラリーのおかげで、例えば高特異的ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤をスクリーニングすることができる。
【０００４】
不確かな（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）対合、即ちマトリックス鎖からの４つの塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのうちの１つより多くに応答するプライマー鎖中に組入れられ得る対合を用いる新規ヌクレオチドの調製も、突然変異誘発過程を遂行するのに不可欠である（Ｓａｌａ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｚａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｐｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。究極的突然変異誘発剤は、トリホスフェートとして組入れられる段階で、次にそれがマトリックスとしてコピーされる場合、４つのカノニカル塩基と対合し得るＤＮＡモノマーから成る。
【０００５】
このような不確かな（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）塩基のデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、ＤＮＡポリメラーゼによる複製中に３つの他の塩基のいずれかにより任意のカノニカル塩基を複製することを可能にする。さらに、不確かな（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）塩基の組入れによるｉｎ ｖｉｖｏ高突然変異誘発過程は、プラスミドにより保有される遺伝子の指向性進化プロトコールを単純化し、促進する一方、見当違いのＰＣＲによる費用のかかる取扱いの必要性をなくす。その他の用途における両意的塩基の使用を正当であるとする要約は、参考文献（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）中に見出され得る。
【０００６】
さらに、単純化されるがしかし４つのＤＮＡ塩基、言い換えればＡ、Ｃ、ＧおよびＴ置換基の各々と同じ１対１対合能力を付与される化学構造の発見は、種々の標的核酸増幅および検出技法に用いられ得る新規のプローブまたは新規のプライマーの調製を可能にする。
さらに、例えばアミノ酸のファミリー中に置かれ、したがってＤＮＡを官能化することを可能にする反応性分子を、式ＩＩ（以下参照）の初期シントン上にグラフトすることが可能である。
【０００７】
位置４および５で置換される単純イミダゾール核中に単純化プリンを保有するデオキシヌクレオシドは、Ｐｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９８に記載されている。これらのヌクレオシドは、グリコシド結合（シンおよびアンチ配座）およびカルボキサミド結合（「Ａ様」および「Ｇ様」）周囲の回転により、４つのカノニカル塩基と水素結合を固有に形成し得る（Ｐｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９５； Ｐｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９８）。ＤＮＡポリメラーゼによるこれらのヌクレオシドの組入れ（ＬｅＢｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７）およびそれらの対合の突然変異誘発作用は、Ｓａｌａ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｐｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ， １９９７に記載されている。
【０００８】
本発明の範囲内では、可変性側基が、カルボヒドラジド基を介して単純化ＤＮＡモノマー（以後、Ｘ０と呼ぶ）にグラフトされ得る。この初期シントンは、一工程でＤＮＡポリメラーゼの多重置換基を調製するのを可能にする。カルボヒドラジド基は、任意のアルデヒドまたはケトンと縮合し得る高反応性官能基を構成する。したがって同じ数のヒドラゾン誘導体（以後Ｘ１と呼ぶ）が、Ｘ０から生成され得る。Ｘ１の還元により、同じ数のヒドラジン誘導体（以後、Ｘ２と呼ぶ）が生成され得る。
【０００９】
したがって本発明は、一般式Ｉ：
【化１４】
2004503559.tif 000003
【００１０】
〔式中、
Ｒ１基は水素、あるいはホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート基から選択される基あるいはＤＭＴのような保護基を表し；
Ｒ２およびＲ２’は互いに別々にＨ、ＯＨ、ホスホルアミダイトおよびその誘導体、Ｈ−ホスホネート並びに延長ターミネーターＴから選択され；
Ｒ３およびＲ３’は互いに別々にＨ、ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基およびＯ−Ｒ５基から選択され、Ｒ５基は炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基を表し；
Ｒ４は式：
【００１１】
【化１５】
2004503559.tif 000004
【００１２】
（式中、Ｅは炭素数０〜２０の飽和または不飽和炭素鎖から成るスペーサーアームを意味し、これは異種原子を含むこともあり、および／または任意に置換される）
の置換複素環（丸で表される）を表し、前記複素環が：
ａ）次式の５−原子複素環：
【００１３】
【化１６】
2004503559.tif 000005
【００１４】
（式中、各Ｘは互いに別々にＣＨ、Ｃ−Ｒ６またはＮ基を表し、Ｒ６はハロゲン（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基およびＯ−Ｒ７またはＳ−Ｒ７基から選択され、Ｒ７は水素または炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基を表す）であって、前記複素環は特にアゾールファミリー、例えば以下の環：
【００１５】
【化１７】
2004503559.tif 000006
に属し、
【００１６】
ｂ）次式の６−原子環、特にピリミジン：
【化１８】
2004503559.tif 000007
【００１７】
ｃ）次式のプリン類似体：
【化１９】
2004503559.tif 000008
【００１８】
（式中、
Ｙ１はＮＨ２（シントンＸ０と称する）または：
【化２０】
2004503559.tif 000009
基を表し、
【００１９】
Ｙ２およびＹ３は互いに別々にＨ、ＯＨ、Ｏ、ＮＨ２、ハロゲン（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、ＳＣＨ３、ＳＨ、アミン、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ方向で）、あるいは炭素数１〜６の分枝鎖または線状アルキル（−ＯＲ方向）から選択され、
Ｚ１およびＺ２は互いに別々にＨおよび有機基から選択される）
から選択される〕
により表される化合物に関する。
【００２０】
「プリン」および「ピリミジン」という用語に関しては、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ， １９９７に示された定義を参照すべきである。これらの化合物の合成経路の例は、この文書の５４６〜５４７ページに記載されている。
Ｂ化合物に関しては、図２に示された合成例は、リボおよびデオキシシリーズのヌクレオシドに、ならびにリン酸化誘導体に通用する。ＸがＣＯＮＨＮＨ２である場合、シントンＸ０はスペーサー腕ＣＨ＝ＣＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎ（この例ではｎ＝６）を含む本発明にしたがって生成される。
【００２１】
シトシンＸ０、Ｘ１およびＸ２の中で、本発明は特に、Ｘ０ＴＰ、Ｘ１ＴＰおよびＸ２ＴＰと呼ばれるヌクレオシド類似体およびヌクレオチドトリホスフェート類似体に関する。本発明のヌクレオチド類似体は、好ましくは、本目的が核酸中へのそれらの組入れを包含する場合に用いられる。本発明のヌクレオシド類似体は、好ましくは、特に薬剤の製造のために、細胞中でｉｎ ｓｉｔｕでポリメラーゼを抑制するために用いられる。
【００２２】
式Ｉの化合物において、Ｒ１基は好ましくは前記で言及された目的によりトリホスフェート基または水素を表す。同様に、所望の目的によれば、Ｒ２およびＲ２’基の少なくとも１つはＯＨ基を表し、これは、その存在がポリメラーゼ阻害剤を生成するために望ましい場合には、ポリメラーゼまたはターミネーター基Ｔによる延長の継続を可能にする。したがってＲ２およびＲ２’基の少なくとも１つは、好ましくはＦ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ３および炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基から選択されるＴ基を表し得る。もちろん、延長ターミネーターとして機能する任意の等価基は、レトロウイルス逆転写酵素を抑制する化合物の調製のために意図される。
【００２３】
有益には、Ｙ１がＮＨ２である場合、本発明の目的は、一般式ＩＩ：
【化２１】
2004503559.tif 000010
【００２４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’およびＥは式Ｉの基に対応する）
の初期シントン（シントンＸ０）である。このような化合物の中で、本発明は特に、ｄＸ０ＴＰ（式中、Ｒ１はトリホスフェート基であり、そしてＲ３およびＲ３’はＨを表す）と呼ばれる化合物に関する。
【００２５】
上で説明された式ＩＩの化合物は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド類似体のライブラリーの調製のための初期シントンとして用いられ得る。それらのカルボヒドラジド基は、事実上、縮合後にＸ１シントンをまたは還元後にＸ２を生じるアルデヒドまたはケトン官能基を含む任意の分子と単一工程でこれらの化合物を結合することを可能にする。
【００２６】
アルデヒドまたはケトン官能基を含む任意の分子との式ＩＩの化合物（シントンＸ０およびＸ０ＴＰ）の縮合により、式Ｉの化合物が生成され、この場合、Ｙ１は一般式：
【化２２】
2004503559.tif 000011
【００２７】
（式中、Ｚ１およびＺ２は互いに別々に水素または有機基を表す）を表す。これらの化合物は、Ｘ１ＴＰ（ヌクレオチドトリホスフェート類似体）またはＸ１（ヌクレオシド類似体）と呼ばれる。
【００２８】
このような化合物を還元して、式Ｉの化合物（シントンＸ２およびＸ２ＴＰ）を生成し得るが、この場合、Ｙ１は一般式：
【化２３】
2004503559.tif 000012
【００２９】
を表す。例えばＺ１およびＺ２基の少なくとも１つが芳香族から、特に次式：
【化２４】
2004503559.tif 000013
【００３０】
の基から選択される化合物が言及される。Ｚ１およびＺ２基のうちの少なくとも１つは、チオール、アルキル、カルボニル、アミン、アルコール、アリールおよびアミノ酸基からも選択され得る。
【００３１】
別の局面から、本発明の化合物は、Ｚ１またはＺ２がＹ３とともに環を形成することを特徴とし得る。
特定の実施態様では、本発明は、Ｚ１またはＺ２が蛍光または燐光マーカー、特にフルオレサミンまたはフルオレセインを含む前記の化合物に関する。例えばフルオレサミンは、化合物をマークするために、または核酸内のその存在を検出するために反応され得る。
【００３２】
したがって化合物は、スペーサーアームおよびマーカー、例えば次式：
【化２５】
2004503559.tif 000014
の化合物を用いて調製され得る。
【００３３】
有益には、前記の化合物はポリメラーゼの基質であって、天然塩基と対合を形成し得るし、逆転写酵素および／またはヌクレオチドキナーゼの基質である。
さらに、前記の化合物は、特にＤＮポリメラーゼ、レトロウイルス逆転写酵素およびキナーゼにより、核酸中に突然変異を導入し得るし、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの合成を遮断し得る。キナーゼの中では、モノ−またはジ−ホスフェートヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化し得る任意のキナーゼ、特にデオキシシチジンキナーゼ、特に米国特許第５，９１４，２５８号に記載されたヒトＤＣＫ２、デオキシグアノシンキナーゼおよびチミジンキナーゼを意味する。
【００３４】
したがって、Ｙ１がＮＨ２である本発明の化合物は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド類似体のライブラリーの調製のための初期シントンとして用いられ得るし、ならびに前記の類似体のうち、突然変異を誘導し、および／またはＤＮＡまたはＲＮＡの合成を遮断し得るものが同定され得る。
本発明は、前記の一般式ＩＩの化合物の製造方法であって、以下の工程：
【００３５】
ａ）複素環として次式：
【化２６】
2004503559.tif 000015
【００３６】
（式中、Ｘは互いに別々にＣＨ、Ｃ−Ｒ６またはＮ基を表し、Ｒ６はハロゲン（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基およびＯ−Ｒ７またはＳ−Ｒ７基から選択され、Ｒ７は水素または炭素数１〜６の線状または分枝鎖アルキル基を表す）の５−原子複素環を有し、前記複素環が特にアゾールファミリー、例えば以下の環：
【００３７】
【化２７】
2004503559.tif 000016
に属するヌクレオシドの調製、
【００３８】
ｂ）５’アルコールの保護、ならびにヒドラジンの作用によるエチルエステル官能基のカルボヒドラジド官能基への転化、
ｃ）保護基、例えばベンジルオキシカルボニル基によるカルボヒドラジド基のアミン官能基の保護、位置３’におけるアルコールのアセチル化、
ｄ）位置５’におけるアルコールの脱保護化後のリン酸化、ならびに
ｅ）ベンジルオキシカルボニル基の水素化分解、
【００３９】
を包含することを特徴とする方法にも関する。工程ａ）は、好ましくは、デオキシリボースの場合にはＮ−トランスデオキシリボシラーゼにより実行され、そして工程ｄ）はジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でシアノエチルホスフェートによるヌクレオシドのリン酸化；位置３’におけるアルコールのおよび５’ホスフェートのシアノエチル基の基本培地中での共在放出；次にモルホリデートの形態の５’活性化ホスフェートへのピロホスフェートの縮合から成る。
【００４０】
一般式ＩＩの化合物から、アルデヒドまたはケトンと一般式ＩＩの化合物との縮合と、その後の還元により、前記の一般式Ｉの化合物を調製することが可能である。式Ｉの化合物のライブラリーを生成するために、一般式ＩＩの１つまたはそれ以上の化合物（単数または複数）をアルデヒドおよび／またはケトンのライブラリーと反応させ、任意にその後還元することが可能である。
【００４１】
図１に記載された合成経路は、本発明の方法の特定の実施態様を説明する。デオキシリボースの供給源としてチミジンを採用するライヒマン乳酸桿菌ラクトバチルス・ライクマニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）のタンパク質抽出物の形態で精製せずに用いられるＮ−トランスデオキシリボシラーゼの作用により、イミダゾール−４−カルボン酸のエチルエステルはそのデオキシヌクレオシドに転化された。ジメトキシトリチル基による位置５’におけるアルコールの保護後、エチルエステル官能基を保有するヌクレオシドは次に、ヒドラジンの作用によりそのカルボヒドラジド誘導体に転化された。カルボヒドラジド基のアミン官能基は次に、ベンジルオキシカルボニル基の縮合により保護された。
【００４２】
位置３’におけるアルコールのアセチル化および位置５’に置けるアルコールの放出後、生成されたシントンは以下のリン酸化過程に付された：即ち、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でのシアノエチルホスフェートによるリン酸化；位置３’におけるアルコールの、および５’ホスフェートの基本培地中での共在的放出；モルホリデートの形態の５’活性化ホスフェートへのピロホスフェートの縮合。カルボヒドラジドの反応性シントンデオキシヌクレオシドトリホスフェートｄＸ０ＴＰの製造は、ベンジルオキシカルボニル基の水素化分解により達成された。
【００４３】
Ｚ１−ＣＨＯおよびＺ１ＣＯ−Ｚ２とのｄＸ０ＴＰカルボヒドラジドの縮合は、ｄＸ１ＴＰヒドラゾン誘導体を、ついで還元後にｄＸ２ＴＰ化合物をもたらす。
本発明の他の局面は、前記の方法を用いて生成され得る化合物に、そして一般式ＩＩの１つまたはそれ以上の化合物がアルデヒドおよび／またはケトンのライブラリーと反応させられる場合に生成され得る一般式Ｉの化合物のライブラリーに関する。
【００４４】
本発明は、核酸中に突然変異を導入し得る化合物の同定方法であって、ｉ）Ｙ１がＮＨ２基である式Ｉの化合物を合成オリゴヌクレオチド中に組入れ、ｉｉ）少なくとも１つのアルデヒドおよび／またはケトンとの縮合により前記化合物を反応させ、任意にその後還元して、ｉｉｉ）ポリメラーゼを用いて前記のオリゴヌクレオチドを複製し、そして突然変異が新規合成鎖中に導入されていたか否かを確定することからなる過程を含む方法にも関する。
【００４５】
したがって別の実施態様では、本発明は、核酸の局在化突然変異の方法であって、ｉ）本発明の少なくとも１つの化合物を含む合成オリゴヌクレオチドが調製され、ｉｉ）前記のオリゴヌクレオチドがポリメラーゼを用いて複製されることを特徴とする方法に関する。
別の実施態様では、本発明は、核酸の増幅のための少なくとも１つの前記の化合物を含む反応混合物を用いることから成る過程を包含する核酸の無作為突然変異のための方法に関する。このような無作為突然変異誘発方法は、有意のポリペプチドの活性を修飾するのに特に有用である。
【００４６】
延長、複製および増幅のために、エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、クレノウ断片およびベントポリメラーゼを用いることができる。
しかしながらその存在が本発明の化合物をスクリーニングするために望ましい場合には、エキソ＋ＤＮＡポリメラーゼを用い得るが、これはエキソヌクレアーゼ活性に耐性である。このような化合物は、突然変異検出方法に特に有用である。
【００４７】
付加的局面は、ポリメラーゼ、特に逆転写酵素および／またはキナーゼ、特にモノ−またはジ−ホスフェートヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化し得る任意のキナーゼ（デオキシシチジンキナーゼ、デオキシグアノシンキナーゼおよびチミジンキナーゼ）から選択される酵素を抑制し得る化合物の同定方法であって、前記酵素の活性が本発明の少なくとも１つの化合物の存在下で試験されることを特徴とする方法に関する。
【００４８】
この方法では、レトロウイルスに感染した細胞に及ぼす少なくとも１つの前記の化合物の作用を試験し得るし、前記の化合物は、ヌクレオシドの形態で見出される。ヌクレオシドは、ホスフェート基の負電荷のために、実際、細胞の膜を通過し得るが、これはヌクレオチドを用いた場合にはそうではない。したがって大規模スクリーニングは、本発明のライブラリーを用いて実行され、そしてルーチン実験によるライブラリーの断片を用いた反復過程は、ウイルスの複製を遮断する１つまたはそれ以上の化合物（単数または複数）の同定をもたらす。
【００４９】
本発明は、前記の方法を用いて生成され得る化合物に関する。
さらに本発明の化合物は、標的核酸の増幅および／または検出のためにプライマーまたはプローブ中に用いられ得る。
【００５０】
「プローブ」または「プライマー」は、本発明の意味内で、１０〜１００、特に１５〜３５の天然または修飾ヌクレオチドを含む、前記の式Ｉに対応する少なくとも１つの化合物を含む、そして標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体を形成するための確定条件でハイブリダイゼーション特異性を保有するヌクレオチド断片であると定義される。本発明のプローブは、特異的であっても非特異的であっても、固体支持体上に直接または間接的に固定され得る。それらはその場合、「係留プローブ」と呼ばれる。さらに前記のプローブはマーカー剤を保有して、それらの検出を可能にする。それらはその場合、「検出プローブ」と呼ばれる。
【００５１】
「係留プローブ」は、任意の適切な手段により、例えば固体支持体上での共有原子価により、吸着により、または直接合成により、固体支持体上に固定されるかまたは固定可能である。これらの技法は特に、特許出願ＷＯ ９２／１００９２に記載されている。最も一般的な方法は、支持体（例えばニトロセルロース、ナイロンＴＭ、ポリスチレン）上に異なる組織の細胞からまたは培養細胞から抽出された核酸を固定し、そして十分に限定された条件下で、プローブと固定された標的核酸をインキュベートすることから成る。ハイブリダイゼーション後、余分のプローブが排除され、形成されたハイブリッド分子が、適切な方法（プローブと結合された放射能、蛍光または酵素活性の測定）を用いて検出される。
【００５２】
「検出プローブ」は、例えば放射性同位元素、酵素、特に色原性、蛍光原性または発光性基質に作用し得る酵素（特にペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）、発光団性化学化合物、色原性、蛍光原性または発光性化合物、ヌクレオチド塩基類似体およびリガンド、例えばビオチンから選択されるマーカーによりマークされ得る。本発明により生成されたプライマーまたはプローブのマーキングは、放射性元素または非放射性分子により実行される。非放射性物質は、リガンド、例えばビオチン、アビジン、ストレプタビジン、ジオキシゲニン、ハプテン、着色剤、発光剤、例えば放射性発光剤、化学発光剤、生物発光剤、蛍光剤（フルオレセインイソチオシアネートＦＩＴＣ、Ｒ−フィコエリトリンＰＥ、クアンタムレッドＴＭ（ＳＩＧＭＡ）およびフルオレサミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ））ならびに燐光剤から選択される。
【００５３】
特定の実施態様では、本発明は、式Ｉの有標化合物に関する。前記のように、式ＩＩの化合物は、アルデヒドまたはケトン官能基を含む分子と縮合され得る。この場合、前記の分子は、発色団型マーカー、色原性、蛍光原性または発光化合物あるいはリガンド、例えばビオチンを保有する。
【００５４】
式Ｉの少なくとも１つの化合物を含む核酸は、本発明の目的物である。それらは、ＰＣＲ型技法に利用され得る（Ｅｒｌｉｃｈ， １９８９； Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９０およびＲｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。この技法は、増幅される断片をフレーミングするオリゴヌクレオチドプライマーの対の選択を要する。例えば、米国特許第４，６８３，２０２号に記載された技法が参照され得る。その他の増幅技法は、有益には、ＰＣＲ（ＰＣＲ様）の代替物として、本発明のプライマー対の助けを借りて用いられ得る。「ＰＣＲ様」という用語は、核酸配列の直接または間接的再現を用いる、あるいはマーキング系が増幅されたすべての方法を意味するよう意図されており、これらの技法は当業者に周知である。
【００５５】
本発明は、本発明の化合物または本発明の核酸を含む標的核酸および製剤組成物の増幅および／または検出のためのキットに関する。本発明は、リボザイムとしての前記の核酸の使用にも関する。「リボザイム」という用語は、本発明の意味内では、触媒的特性、あるいはタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは遺伝子の活性または発現の調整という特性を有する核酸、核酸誘導体または核酸およびペプチド間の化学的ハイブリッドを指す。したがって本発明の核酸は、酵素の代わりに置換され得る。
【００５６】
別の局面から、本発明は、式Ｉの少なくとも１つの化合物を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。「アンチセンス」という用語は、転写または翻訳を遮断する標的ＤＮＡまたはＲＮＡの相補的オリゴヌクレオチドを指すことを意味する。使用例は、特にＷＯ９９５４４６３、ＷＯ９８３８２０４、ＷＯ９８２９４４８、ＷＯ９７３５９６０、ＷＯ９７１０８４０およびＷＯ９６２５４９７に示されている。それゆえ、本発明の前記の核酸は、薬剤として、ならびに治療方法として有用である。
本発明は、薬剤の製造のための、特にレトロウイルス感染および癌の治療を意図された薬剤の製造のための前記の化合物の使用にも関する。
【００５７】
実施例１．本発明の好ましい化合物の製造方法（図１）
トリホスフェート１の合成は、中性条件で放出され得るヒドラジン官能基上の一時的保護基の導入を包含する。この目的のために、ベンジルオキシカルボニル基を選択した。ＴｅｎｅｒとＭｏｆｆａｔｔが記載した手法にしたがって、３工程でトリホスフェート鎖を導入した。Ｐｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ． １９９５により以前記載されたように、Ｎ−デオキシリボシルトランスフェラーゼを用いて酵素的トランスグリコシル化により、化合物２からヌクレオシド３を生成した。
【００５８】
ピリジン中の化合物３の５’−ジメトキシトリチル化は、収率７３％で化合物４を生成するのを可能にした。６０℃での大余分量のヒドラジン水和物による化合物４の処理は、付加的精製なしで次の段階に用いられ得る化合物５を生じた。
化合物５をベンジルオキシカルボニルスクシンイミドと反応させることにより、ベンジルオキシカルボニル基を導入して、化合物６を収率８１％で生成した。ピリジン中の無水酢酸を用いたアシル化は、３’−Ｏ−アセチル化化合物７（２４％）および３’−Ｏ，Ｎ−ジアセチル化化合物８（３８％）に対応する２つの主要化合物の混合物を生じた。ＤＭＡＰにより触媒されたトリエチルアミンの存在下で無水酢酸（２．２当量）を用いてアセトニトリル中で完全アセチル化を迅速に生じて、収率８０％での化合物８の生成を可能にした。
【００５９】
化合物８の脱トリチル化後、ＤＣＣの存在下でピリジン中でのシアノエチルホスフェートとの化合物９の縮合と、その後のメタノール中の２％ナトリウムメチレートの溶液による処理は、５’モノホスフェート化合物１１（５２％）を生じた。モルホリデート化合物１２を介して、２工程でトリホスフェート化合物１３を得た（収率５０％）。Ｈ２の存在下でのＰｄ／Ｃ上での水素化分解により、保護ベンジルオキシカルボニル基の抑制を達成した。したがって化合物１１および１３の処理は、モノホスフェート１４およびトリホスフェート１誘導体の生成を可能にした。
【００６０】
実施例２．アルデヒドとの化合物１の縮合
芳香族および脂肪族アルデヒドを用いて、ヒドラジン官能基の誘導化を実行した。先ず、モノホスフェート化合物１４を、Ｈ２Ｏ／メタノール中の３−メチルチオプロピオンアルデヒドおよびベンズアルデヒドで処理して、化合物１５ａおよび１５ｂを得た。これらの生成物を逆相ＨＰＬＣにより単離し、マススペクトロメトリー法により、ならびにＮＭＲにより特性化した。同様に、ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．５）中の化合物１を４℃でメタノール中の余分量のアルデヒドで処理して、化合物１６ａおよび１６ｂを得た。トリホスフェート誘導体の構造を質量分析法により確証した。
【００６１】
０．１ ＭのＴＥＡＡ０．２ ｍｌ中の化合物１に、アルデヒド（０．１ ｍＬのメタノール中２５ μＬ）を付加した。２時間後、溶液を濃縮し、ＨＰＬＣによりλ＝２３０ ｎｍで精製した（１０ ｍＭ ＴＥＡＡ中０〜２５％アセトニトリル）。精製産物を含有する分画を凍結乾燥し、陽イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ）に通して、ナトリウム塩の形態のトリホスフェートを得た。
【００６２】
実施例３．核酸中のｄＸ０ＴＰおよびｄＸ１ＴＰ類似体の組入れ
類似体（ｄＸ０ＴＰ、ｄＸ１ＴＰ（ａ）およびｄＸ１ＴＰ（ｂ））を、エキソ−クレノウ断片により触媒されるプライマー延長実験に付した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの反応により、プライマーをその５’末端にマークをつけた。適切なマトリックスおよび有標プライマーを７５℃で１５分間インキュベートし、次に１時間、徐々に室温に冷却した。異なる反応混合物において、既定のｄＸ１ＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマーの延長を実行した。次に試料を変性し、次いでポリアクリルアミドゲル（２０％７ Ｍ尿素）上に載せた。電気泳動後、ホスホルイメージャーＴＭを用いてオートラジオグラフィーにより、ゲルを可視化した。
【００６３】
参考文献
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004503559.tif 000060
2004503559.tif 000061
2004503559.tif 000062
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