(57)【要約】本発明は、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン相互作用タンパク質の核酸分子、そのような核酸分子によってコードされるタンパク質、ならびに治療用および診断用の薬剤の調製における、タンパク質および核酸分子の使用に関する。タンパク質、核酸分子、および薬剤は、癌およびインスリン反応に関連する障害を含むがこれらに限定されない、タンパク質および核酸分子に関する病態および障害の診断、予防、および治療において用いられうる。
2004524802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質およびＳＴＡＴ転写因子を、それらと相互作用する受容体に動員して、タンパク質およびＳＴＡＴ転写因子をリン酸化する、単離されたプレクストリン（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同ドメイン相互作用タンパク質（「ＰＨＩタンパク質」）。
【請求項２】
インスリン受容体基質−１のＰＨドメインと相互作用することができる、高次コイル構造を予測するＮ末端のαヘリックス領域および、二つのブロモドメインを含む領域とを特徴とする、請求項１記載の単離されたプレクストリン相同ドメイン相互作用タンパク質（「ＰＨＩタンパク質」）。
【請求項３】
配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、または１７のアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４、または配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４の相補体の一つとハイブリダイズする少なくとも３０ヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項５】
以下を含む、単離された核酸分子：
（ｉ）配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、もしくは１７のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）と相補的な核酸配列；
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれとも異なる核酸配列；
（ｉｖ）配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４の核酸配列もしくはその縮重型とハイブリダイズすることができる、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドを含む核酸配列；
（ｖ）配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、もしくは１７のアミノ酸配列を含むタンパク質の切断型、類似体、対立遺伝子もしくは種間変種をコードする核酸配列；または
（ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の断片もしくは対立遺伝子もしくは種間変種。
【請求項６】
以下を含む、単離された核酸分子：
（ｉ）配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４の核酸配列と実質的な配列同一性もしくは配列類似性を有する核酸配列；
（ｉｉ）ＴがＵであることも可能である、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４の配列を含む核酸配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）と相補的な、好ましくは配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４の核酸配列全体と相補的な、核酸配列；
（ｉｖ）遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の核酸配列のいずれとも異なる核酸配列；または
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の断片もしくは対立遺伝子もしくは種間変種。
【請求項７】
請求項１、２または３記載のタンパク質の抗体に結合するタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
異種タンパク質をコードする核酸に融合した、請求項４から７のいずれか一項記載の単離された核酸分子の調節配列。
【請求項９】
請求項４から７のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項４から７のいずれか一項記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号：２、３、５または６記載のアミノ酸配列を含む、請求項１、２または３記載の単離されたタンパク質。
【請求項１２】
配列番号：２、３、５または６記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１または２記載の単離されたタンパク質。
【請求項１３】
請求項１記載のタンパク質を調製する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）請求項９記載のベクターを宿主細胞に移入する段階；
（ｂ）非形質転換宿主細胞から形質転換宿主細胞を選択する段階；
（ｃ）タンパク質の発現を可能にする条件下で、選択された形質転換宿主細胞を培養する段階；および
（ｄ）タンパク質を単離する段階。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法に従って調製されたタンパク質。
【請求項１５】
ＰＨドメイン結合領域、ＩＲ結合領域、またはＳＴＡＴ結合領域である、請求項１から３、１１、１２または１４のいずれか一項記載のタンパク質の結合領域。
【請求項１６】
請求項１から３、１１、１２、または１４記載のタンパク質またはその結合領域、および結合パートナーを含む複合体。
【請求項１７】
結合パートナーが、ＰＨドメイン含有タンパク質、ＰＨドメイン、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体、もしくはＰＨＩタンパク質と相互作用するその結合領域、または、ＳＴＡＴ転写因子、もしくはＰＨＩタンパク質と相互作用するその結合領域である、請求項１６記載の複合体。
【請求項１８】
請求項１から３、１１、１２、または１４のいずれか一項記載のタンパク質のエピトープに対して特異性を有する抗体。
【請求項１９】
検出可能な物質によって標識され、生体試料、組織、および細胞においてポリペプチドを検出するために用いられる、請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１から３、１１、１２、または１４のいずれか一項記載のタンパク質またはその一部をコードする配列を含むプローブ。
【請求項２１】
請求項４から８のいずれか一項記載の核酸分子または請求項１から３、１１、１２、または１４のいずれか一項記載のポリペプチドの存在を決定することによって、請求項１から３、１１、１２、または１４のいずれか一項記載のタンパク質によって媒介される病態を診断およびモニターする方法。
【請求項２２】
病態がインスリン反応に関連する、または病態が癌である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）物質とタンパク質との会合を可能にする条件下で、タンパク質と潜在的に会合できる少なくとも一つの物質とタンパク質とを反応させる段階、および（ｂ）会合したタンパク質および物質の検出により物質がタンパク質に会合することが示される、物質に会合したタンパク質を除去または検出する段階を含む、請求項１から３、１１、１２、または１４記載のタンパク質と相互作用する物質を同定する方法。
【請求項２４】
物質とタンパク質との複合体の形成を可能にする条件で、タンパク質と相互作用する物質および試験化合物をタンパク質と反応させる段階、ならびに複合体を除去および／または検出する段階を含む、請求項１から３、１１、１２、または１４記載のタンパク質の生物活性の調節能に関して化合物を評価する方法。
【請求項２５】
ＰＨＩタンパク質相互作用の阻害剤を同定する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）ＰＨＩタンパク質および結合パートナー、またはそれぞれの少なくとも相互作用する部分とを含む、反応混合物を提供する段階；
（ｂ）反応混合物を一つまたは複数の試験化合物に接触させる段階；ならびに
（ｃ）ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用を阻害する化合物を同定する段階。
【請求項２６】
以下の段階を含む、生体試料において配列番号：２、３、５、または６記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子を検出する方法：
（ａ）請求項４から７のいずれか一項記載の核酸分子を生物試料の核酸とハイブリダイズさせ、それによってハイブリダイゼーション複合体を形成させる段階；および
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在が、生体試料におけるタンパク質をコードする核酸分子の存在と相関する、ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階。
【請求項２７】
生体試料の核酸が、ハイブリダイゼーション段階の前にポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１８記載の抗体、または、請求項２３、２４、もしくは２５記載の方法に従って同定された物質、化合物、もしくは阻害剤の有効量を投与する段階を含む、請求項１から３、１１、１２、または１４記載のタンパク質によって媒介される病態を治療する方法。
【請求項２９】
病態がインスリン反応に関連する、または病態が癌である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項４から７のいずれか一項記載の核酸分子、請求項１から３、１１、１２、もしくは１４のいずれか一項記載のタンパク質、または請求項１から２９のいずれか一項記載の方法を用いて同定された物質もしくは化合物の一つまたは複数と、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む組成物。
【請求項３１】
請求項４から７のいずれか一項記載の核酸分子、請求項１から３、１１、１２、もしくは１４のいずれか一項記載のタンパク質、または請求項１から３０のいずれか一項記載の方法を用いて同定された物質もしくは化合物の一つまたは複数の、請求項１記載のタンパク質によって媒介される病態を治療するための薬物の調製における使用。
【請求項３２】
請求項１から３、１１、１２、または１４記載のＰＨＩタンパク質を発現せず、その結果ＰＨＩタンパク質関連病態が起こる、非ヒトトランスジェニック哺乳類。
【請求項３３】
以下の段階を含む、ＰＨＩタンパク質関連病態を減少させるまたは阻害する薬剤を調べるためのモデル系を提供する、トランスジェニック動物アッセイ系：
（ａ）請求項３２記載の非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する段階；および
（ｂ）該薬剤が、物質を投与されていない段階（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物と比較して、非ヒトトランスジェニック動物においてＰＨＩタンパク質関連病態を減少させるまたは阻害するか否かを決定する段階。
【請求項３４】
以下の段階を含む、医薬品発見ビジネスを行う方法：
（ａ）請求項１から３３記載のタンパク質と結合パートナーとの相互作用の阻害能または増強能によって薬剤を同定するための一つまたは複数のアッセイ系を提供する段階；
（ｂ）動物における有効性および毒性に関して、段階（ａ）において同定された薬剤またはそのさらなる類似体の治療プロフィール決定（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を行う段階；ならびに
（ｃ）許容される治療プロフィールを有すると段階（ｂ）において同定された一つまたは複数の薬剤を含む薬学的組成物を製剤化する段階。
【請求項３５】
販売用薬学的組成物を流通させるための流通系を確立する段階、および選択的に薬学的調製物をマーケティングするために販売グループを確立する段階をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
標的発見ビジネスを行う方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）請求項１から３５記載のタンパク質と結合パートナーとの相互作用の阻害能または増強能によって薬剤を同定するための一つまたは複数のアッセイ系を提供する段階；
（ｂ）選択的に、動物における有効性および毒性に関して、段階（ａ）において同定された薬剤の治療プロフィール決定を行う段階；ならびに
（ｃ）段階（ａ）において同定された薬剤またはその類似体のさらなる薬剤開発および／または販売のための権利を、第三者に認可する段階。
【請求項３７】
以下を含む、単離された核酸分子：
（ｉ）配列番号：３５、および３９〜６３の一つの核酸配列と実質的な配列同一性もしくは配列類似性を有する核酸配列；
（ｉｉ）ＴがＵであることも可能である、配列番号：３５、および３９〜６３の一つの配列を含む核酸配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）と相補的な、好ましくは配列番号：３５、および３９〜６３の一つの核酸配列全体と相補的な核酸配列；
（ｉｖ）遺伝コードの縮重のために、コドン配列における（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の核酸配列のいずれとも異なる核酸配列；または
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の断片もしくは対立遺伝子もしくは種間変種。
【請求項３８】
以下にコードされる、単離された神経分化関連タンパク質：
（ａ）配列番号：３９〜６３の一つを含む核酸分子；または
（ｂ）配列番号：３６を含むタンパク質をコードする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン相互作用タンパク質の核酸分子、そのような核酸分子によってコードされるタンパク質、ならびに治療用および診断用の薬剤の調製におけるタンパク質および核酸分子の使用に関する。タンパク質、核酸分子、および薬剤を、癌およびインスリン反応に関連する障害を含むがこれらに限定されない、タンパク質および核酸分子を含む病態および障害の診断、予防、および治療において用いてもよい。
【０００２】
発明の背景
インスリン受容体をリガンドによって刺激すると、インスリン受容体基質−１（「ＩＲＳ−１」）は多数のチロシン残基上で急速にリン酸化され、これは多くのインスリン依存的生体反応を誘発する際に機能するＳｒｃ相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）２（ＳＨ２）含有シグナル伝達タンパク質が集合して活性化するためのドッキング部位として作用する（１）。ＩＲＳ−１のＮ末端は、ＰＨドメインを含み、その後に生産的な受容体／基質相互作用の媒介において協調的に関与することが示されている構造的に相同なホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインを含む（２）。ＩＲＳ−１のＰＴＢドメインは、活性化インスリン受容体（ＩＲ）の膜近位領域におけるＮＰＥＹモチーフ内でリン酸化されたＴｙｒ９６０に直接結合する（３）。しかし、それによってＰＨドメインが受容体のカップリングを促進する正確な分子機構はわかっていない。これまでの研究から、ＰＨドメインを欠失させるとＩＲＳ−１リン酸化を減弱して、その後のインスリン媒介分裂誘発を減弱させることが証明されている（２）。その上、無関係なタンパク質からの異種ＰＨドメインは、インスリンに対する分裂誘発反応を回復させることができず、このことはＩＲＳ−１ ＰＨドメインが単なる膜ターゲティング装置ではなくて、特異的細胞リガンドと相互作用する可能性があることを示唆している（４）。
【０００３】
発明の概要
本出願人らは、ＩＲＳ−１をインスリン受容体に結合させるＩＲＳ−１の生理的リガンドである「ＰＨ相互作用タンパク質」または「ＰＨＩＰ」と呼ばれる新規タンパク質を単離した。出願人らは、ＰＨＩＰが、インスリン媒介遺伝子転写、分裂誘発、グルコース輸送、およびアクチンのリモデリングの極めて重要な成分であることを確立した。
【０００４】
特に、本発明者らは、ＰＨＩＰがインビトロでＩＲＳ−１のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインに選択的に結合して、ＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２にインビボで安定に会合することを発見した。ＰＨＩＰの過剰発現は、インスリン誘導転写反応を増強した。対照的に、ＰＨＩＰのドミナントネガティブ変異体は、インスリンによって誘導される分裂誘発シグナルを特異的に遮断して、インスリン誘導ＩＲＳ−１チロシンリン酸化を阻害した。さらに、ＤＮ−ＰＨＩＰは、Ｌ６筋芽細胞におけるアクチン細胞骨格のインスリンによるリモデリングを阻害し、これに伴ってインスリン刺激ＧＬＵＴ４膜転移が強く阻害された。異所発現されたＰＨＩＰタンパク質は、低密度ミクロソーム（ＬＤＭ）画分においてＩＲＳ−１と共に分離して、ＩＲＳ−１／ＬＤＭ相互作用において重要であることがわかっているＩＲＳ−１のホスホセリン／トレオニン含有量を調節した。出願人らは、ＩＲＳ−１ ＰＨドメインの生理的タンパク質リガンドを初めて同定したが、これはＩＲＳ−１の空間的区画化および細胞内経路を調節することによって、ＩＲに対するＩＲＳ−１のカップリングを増強する可能性があった。ＰＨＩＰをコードする遺伝子は第６染色体にマッピングされた。本発明者らは、ＰＨＩＰがＳＴＡＴ（シグナル伝達物質転写活性化物質）転写因子、特にＳＴＡＴ３に会合することも発見したが、これはＳＴＡＴ転写因子をインスリン受容体ファミリーに結合させる可能性がある。したがって、ＰＨＩＰは、シグナル伝達分子と相互作用してこれをリン酸化する活性化受容体にＩＲＳ−１およびＳＴＡＴ３のようなシグナル伝達分子を動員する、アダプタータンパク質である。
【０００５】
したがって、広い意味において本発明は、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質およびＳＴＡＴ転写因子を、タンパク質とＳＴＡＴ転写因子に相互作用してこれをリン酸化する受容体に動員するアダプタータンパク質を提供する。
【０００６】
本発明はまた、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＮＡを含むＰＨＩＰをコードする単離された核酸分子と共に、アンチセンス類似体、およびその生物学的、診断的、予防的、臨床的または治療的に有用な変種または断片、ならびにそれらを含む組成物を考慮する。
【０００７】
本発明はまた、その切断型、類似体、対立遺伝子もしくは種間変種、タンパク質の相同体もしくはその切断型、または活性化（例えば、リン酸化）ＰＨＩＰを含む、本発明の核酸分子によってコードされる単離されたＰＨＩＰも考慮する。（ＰＨＩＰおよびその切断型、類似体、対立遺伝子もしくは種間変種、相同体、および活性化ＰＨＩＰを、本明細書において集合的に「ＰＨＩタンパク質」と呼ぶ）。単離されたＰＨＩタンパク質は、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマを含む哺乳類、好ましくはヒトから、天然、合成、半合成、または組み換え型の任意の起源から得られる。ＰＨＩタンパク質は、高次コイル構造を予測するＮ末端αヘリックス領域と２つのブロモドメインを含む領域とを特徴とする。
【０００８】
本発明に従って、インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）のＰＨドメインと安定な相互作用を形成することができ、高次コイル構造を予測するＮ末端αヘリックス領域と２つのブロモドメインを含む領域とを特徴とする、単離されたプレクストリン相同ドメイン相互作用タンパク質（「ＰＨＩタンパク質」）が提供される。
【０００９】
成熟ＰＨＩタンパク質をコードする核酸分子は、成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列とさらなるコード配列（例えば、リーダーまたは分泌配列、プロポリペプチド配列）；成熟ポリペプチドのコード配列と（選択的にさらなるコード配列と）イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’の非コード配列のような非コード配列を含んでもよい。
【００１０】
したがって、「ＰＨＩタンパク質をコードする核酸分子」という用語は、さらなるコード配列および／または非コード配列を含む核酸分子と共に、ＰＨＩタンパク質のコード配列のみを含む核酸分子を含む。
【００１１】
本発明の核酸分子を適当なベクターに挿入してもよく、ベクターは、挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含んでもよい。したがって、本発明の核酸分子と、適当であれば、核酸分子に結合した一つまたは複数の転写および翻訳エレメントとを含むベクターを構築してもよい。
【００１２】
本発明の局面に従って、ＰＨＩタンパク質の少なくとも一つのエピトープをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子と、宿主細胞における発現を可能にする適した調節配列とを含むベクターが提供される。
【００１３】
ベクターを用いて、ＰＨＩタンパク質を発現するように宿主細胞を形質転換することができる。したがって、本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、その生殖細胞および体細胞が、本発明の核酸分子、特にＰＨＩＰの類似体またはＰＨＩＰの切断型をコードする核酸分子を含むベクターを含む、非ヒトトランスジェニック哺乳類も考慮する。
【００１４】
本発明のタンパク質は、天然の細胞起源からの単離体として得られうるが、好ましくは、組み換え技法によって産生される。一つの局面において、本発明は、本発明の単離された核酸分子を利用するＰＨＩタンパク質を調製する方法を提供する。一つの態様において、以下の段階を含むＰＨＩタンパク質を調製する方法が提供される：
（ａ）ＰＨＩタンパク質をコードする核酸配列を含む本発明のベクターを宿主細胞に移入する段階；
（ｂ）非形質転換宿主細胞から形質転換宿主細胞を選択する段階；
（ｃ）ＰＨＩタンパク質の発現を可能にする条件で、選択された形質転換宿主細胞を培養する段階；および
（ｄ）ＰＨＩタンパク質を単離する段階。
【００１５】
本発明はさらに、本発明の方法を用いて得られる組み換え型ＰＨＩタンパク質を広く考慮する。
【００１６】
本発明のＰＨＩタンパク質を、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを調製するために、ポリペプチドのような他の分子に結合させてもよい。これは、例えば、Ｎ末端融合ポリペプチドまたはＣ末端融合ポリペプチドの合成によって得てもよい。
【００１７】
本発明の一つの局面は、ＰＨＩタンパク質の結合領域に由来する分子（例えば、ペプチド）を提供する。
【００１８】
本発明はまた、本発明の核酸分子および／または本発明のタンパク質独特のヌクレオチドプローブの構築を可能にする。したがって、本発明はまた、ＰＨＩタンパク質、またはその一部（すなわち断片）をコードする配列を含むプローブにも関する。プローブを例えば、検出可能な物質によって標識してもよく、それを用いて、核酸分子の混合物から、ＰＨＩタンパク質の一つまたは複数の特性を示すポリペプチドをコードする核酸分子を含む本発明の核酸分子を選択してもよい。
【００１９】
本発明の一つの局面は、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域と、結合パートナーとを含む複合体を提供する。本発明の一つの態様において、ＰＨＩタンパク質またはＰＨドメイン結合領域と、ＰＨドメイン含有タンパク質またはＰＨドメインとを含む複合体が提供される。本発明はまた、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域、特にＩＲ結合領域と、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体またはその結合領域とを含む複合体を考慮する。さらにまた、本発明は、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域、特にＳＴＡＴ結合領域と、ＳＴＡＴ転写因子またはＰＨＩタンパク質と相互作用するその結合領域とを含む複合体を考慮する。
【００２０】
本発明はさらに、本発明のＰＨＩタンパク質または複合体のエピトープに対して特異性を有する抗体も考慮する。抗体を、検出可能な物質によって標識してもよく、生体試料、組織、および細胞において本発明のタンパク質または複合体を検出するために用いてもよい。抗体を、治療的応用において、例えば腫瘍細胞と反応させるために特に用いてもよく、化学療法剤、毒素、免疫応答修飾物質、酵素、および放射性同位元素を含む抗腫瘍効果を有する様々な薬剤の標的選択的担体として結合体および免疫毒素において用いてもよい。
【００２１】
本発明の一つの局面に従って、本発明の核酸分子、タンパク質、および複合体の有無を決定することによって、ＰＨＩタンパク質を含む病態を診断およびモニターするための方法および産物が提供される。
【００２２】
本発明は、物質とタンパク質または結合領域との複合体を形成させる条件で、タンパク質または結合領域を、タンパク質または結合領域と相互作用または結合する可能性がある少なくとも一つの物質と反応させる段階、および複合体の結合または回収を検出する段階を含む、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域（例えば、ＰＨドメイン結合領域、ＩＲ結合領域、またはＳＴＡＴ結合領域）に結合する物質を同定する方法を提供する。結合を、複合体、遊離の物質、または複合体を形成していないタンパク質もしくは結合領域に関してアッセイすることによって検出してもよい。本発明はまた、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域と相互作用する他の細胞内タンパク質に結合する物質を同定する方法も考慮する。ｐｈｉｐ核酸調節配列（例えば、プロモーター配列）に結合する化合物を同定する方法も同様に用いることができる。
【００２３】
またさらに本発明は、試験化合物が本発明のＰＨＩタンパク質の活性を調節するか否かを評価する方法を提供する。「調節する」とは、本発明のＰＨＩタンパク質の生物活性における変化または変質を意味する。調節は、活性の増加（すなわち、促進）もしくは減少（すなわち、破壊）、特徴の変化、またはタンパク質の生物学的、機能的、もしくは免疫学的特性の変化であってもよい。
【００２４】
例えば、ＰＨＩタンパク質の活性を減少または増強する物質を評価してもよい。ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの会合または相互作用は、ＰＨＩタンパク質の産生を増加させることによって、ＰＨＩタンパク質の発現を増加させることによって、ＰＨＩタンパク質と結合パートナー（例えば、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用するＰＨドメイン含有タンパク質または受容体）との相互作用を促進することによって、または会合もしくは相互作用の期間を持続することによって、促進または増強してもよい。ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの会合または相互作用は、ＰＨＩタンパク質の産生を阻害することによって、ＰＨＩタンパク質の発現を阻害することによって、またはＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用を阻害する、もしくは相互作用を妨害することによって破壊または減少させてもよい。方法は、シグナル伝達のレベル、およびＰＨＩタンパク質またはその結合領域と結合パートナーとの相互作用レベルを含む様々な特性を測定または検出する段階を含んでもよい。
【００２５】
一つの態様において、方法は、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域を、タンパク質またはその結合領域と相互作用するまたは結合する物質および試験化合物と、物質とタンパク質または結合領域との複合体を形成させる条件で反応させる段階、および複合体を除去および／または検出する段階を含む。
【００２６】
他の態様において、本発明は、以下を含むＰＨＩタンパク質の阻害剤を同定する方法を提供する：
（ａ）ＰＨＩタンパク質と、結合パートナーまたは相互作用するそれぞれの少なくとも一部とを含む反応混合物を提供する段階；
（ｂ）反応混合物を一つまたは複数の試験化合物と接触させる段階；
（ｃ）ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用を阻害する化合物を同定する段階。
【００２７】
特定の好ましい態様において、反応混合物は細胞全体である。他の態様において、反応混合物は細胞溶解物、または精製タンパク質組成物である。本発明の方法は、試験化合物のライブラリを用いて行うことができる。そのような薬剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、有機低分子、および動物、植物、真菌、および／または微生物から単離されたもののような天然物抽出物ライブラリとなりうる。
【００２８】
本発明のさらにもう一つの局面は、以下の段階を含む、医薬品発見ビジネスを行う方法を提供する：
（ａ）ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用の阻害能または増強能によって薬剤を同定するための一つまたは複数のアッセイ系を提供する段階；
（ｂ）段階（ａ）において同定された薬剤またはそのさらなる類似体の動物における有効性および毒性に関する治療プロフィールを決定する段階；ならびに
（ｃ）許容される治療プロフィールを有すると段階（ｂ）において同定された一つまたは複数の薬剤を含む薬学的組成物を製剤化する段階。
【００２９】
特定の態様において、本発明の方法はまた、販売用薬学的組成物を流通させるための流通系を確立する段階を含むことができ、選択的に、薬学的調製物を販売するための販売グループを確立することを含んでもよい。
【００３０】
本発明のさらにもう一つの局面は、以下の段階を含む標的発見ビジネスを行う方法を提供する：
（ａ）ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用の阻害能または増強能によって薬剤を同定するための一つまたは複数のアッセイ系を提供する段階；
（ｂ）（選択的に）動物における有効性および毒性に関して、段階（ａ）において同定された薬剤の治療的プロフィールを決定する段階；ならびに
（ｃ）段階（ａ）において同定された薬剤、またはその類似体に関するさらなる薬剤開発および／または販売の権利を第三者に認可する段階。
【００３１】
また、ＰＨＩタンパク質の生物活性を調節する化合物を、試験化合物の存在下および非存在下で生体試料、組織、および細胞における本発明の核酸分子またはタンパク質の発現のパターンおよびレベルを比較することによって、本発明の方法を用いて同定してもよい。
【００３２】
ｐｈｉｐ調節配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、負の調節配列）と相互作用する化合物または物質（例えば、ポリペプチド）を同定する方法も同様に考慮される。
【００３３】
本発明の複合体における分子間の相互作用の破壊または促進は、治療的技法において有用である可能性がある。したがって、本発明は、ＰＨＩタンパク質もしくはＰＨドメイン結合領域と、ＰＨドメイン含有タンパク質もしくはＰＨドメインとの相互作用；ＩＲ結合領域と、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体との相互作用；またはＰＨＩタンパク質もしくはＳＴＡＴ結合領域と、ＳＴＡＴ転写因子もしくはＰＨＩタンパク質と相互作用するその結合領域との相互作用、を含むシグナル伝達経路における異常を特徴とする病態を有する被験者を治療する方法を特徴とする。
【００３４】
本発明の核酸分子、タンパク質、複合体、ペプチド、および抗体、ならびに本発明の方法を用いて同定された物質、薬剤、および化合物は、本発明のＰＨＩタンパク質もしくは複合体の生物活性、または本発明のＰＨＩタンパク質もしくは複合体を含むシグナル伝達経路を調節するために用いてもよく、それらは、ＰＨＩタンパク質または本発明のＰＨＩタンパク質もしくは複合体を含むシグナル伝達経路によって媒介される病態の治療に用いてもよい。したがって、本発明の核酸分子、タンパク質、抗体、複合体、ならびに物質、薬剤、および化合物は、これらの病態の一つまたは複数を有する個体に投与するための組成物に調製してもよい。本発明の一つの態様において、病態は癌である。本発明のもう一つの態様において、病態は、インスリン反応に関連した障害である。したがって、本発明はまた、本発明のタンパク質、抗体、複合体、もしくは核酸分子、または本発明の方法を用いて同定された物質、化合物、もしくは薬剤の一つまたは複数と、薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤とを含む組成物に関する。本発明の組成物を、それを必要とする患者に投与する段階を含む、これらの病態を治療または予防する方法も同様に提供される。
【００３５】
本発明はまた、本発明の核酸分子、タンパク質、複合体、ペプチド、抗体、物質、薬剤、または化合物を、ＰＨＩタンパク質、または本発明のＰＨＩタンパク質もしくは複合体を含むシグナル伝達経路によって媒介される病態または障害を治療するための薬物の調製に用いることを考慮する。
【００３６】
本発明のさらなる局面に従って、本明細書記載のタンパク質、複合体、または核酸分子を、科学研究、ＤＮＡの合成、およびベクターの製造に関連したインビトロ目的のために利用するプロセスを提供する。
【００３７】
本発明の他の特徴および長所は以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明から当業者には様々な変更および改変が明らかとなるが、それらも本発明の精神および範囲に含まれるため、本発明の好ましい態様を示している詳細な説明および特定の実施例は、それらは説明のために限って示されると理解すべきである。本発明のこれらおよび他の局面、特徴、および長所は、以下の図面および詳細な説明から当業者に明らかとなるはずである。
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明に従って、当技術分野における従来の分子生物学、微生物学、および組み換え型ＤＮＡ技術を用いてもよい。そのような技術は文献に詳しく説明されている。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）；「ＤＮＡクローニング：実践アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；「転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」（Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；「動物細胞の培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；「固定化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ）」、ＩＲＬ出版（１９８６）；およびＢ． パーバル（Ｐｅｒｂａｌ）、「分子クローニングの実践ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（１９８４）を参照のこと。
【００３９】
１．用語解説
関係するタンパク質、例えばＰＨＩタンパク質の「アゴニスト」という用語は、タンパク質またはその一部に結合して、それが結合するタンパク質の活性を維持または増加させる化合物を意味する。アゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、またはタンパク質、複合体、または複合体分子（例えば、ＰＨＩタンパク質）に結合する他の任意の分子が含まれうる。アゴニストにはまた、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域（例えば、ＰＨ結合ドメイン領域、ＩＲ結合領域、またはＳＴＡＴ結合領域）に由来する分子（例えば、ペプチド）が含まれるが、野生型分子の完全長配列は含まれないであろう。特定のペプチドの構造的特徴を模倣するように設計された物理構造を有する合成分子であるペプチド模倣物も、アゴニストとして用いられうる。刺激は、直接、または間接的であってもよく、競合的または非競合的な機構によって行ってもよい。
【００４０】
本明細書において用いられる、関係タンパク質、例えばＰＨＩタンパク質の「アンタゴニスト」とは、タンパク質またはその一部に結合するが、それが結合するタンパク質の活性を維持しない化合物を意味する。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、またはタンパク質、複合体、もしくは複合体分子（例えば、ＰＨＩタンパク質）に結合する他の任意の分子が含まれうる。アンタゴニストにはまた、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域（例えば、ＰＨ結合ドメイン領域、ＩＲ結合領域、またはＳＴＡＴ結合領域）に由来する分子（例えば、ペプチド）が含まれるが、好ましくは野生型分子の完全長配列は含まれないであろう。特定のペプチドの構造的特徴を模倣するように設計された物理構造を有する合成分子であるペプチド模倣物も、アンタゴニストとして用いられうる。刺激は、直接、または間接的であってもよく、競合的または非競合的な機構によって行ってもよい。
【００４１】
「抗体」には、無傷のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、およびその免疫学的活性断片（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２断片）、抗体重鎖、ヒト化抗体、および抗体軽鎖、遺伝子操作された一本鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号）、または、例えばマウスの抗体の結合特異性を含むが残りの部分はヒト起源である抗体などの、キメラ抗体が含まれる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、断片およびキメラを含む抗体を、当業者に既知の方法を用いて調製してもよい。関係する免疫抗原を含む無傷のタンパク質、ペプチドまたは断片を用いて、本発明のタンパク質、複合体、またはペプチドに結合する抗体を調製することができる。動物を免疫するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドをＲＮＡの翻訳から得てもよく、または化学合成してもよく、望ましいならば担体タンパク質に結合させることができる。タンパク質またはペプチドに化学的にカップリングさせてもよい適切な担体には、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニンが含まれる。カップリングさせたタンパク質またはペプチドを用いて、動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫してもよい。
【００４２】
「結合領域」とは、もう一つの分子（例えば、ＰＨドメインもしくはＳＴＡＴ３）、もしくは本発明の複合体におけるもう一つの分子と直接もしくは間接的に相互作用または結合する本発明の複合体におけるＰＨＩタンパク質または分子のその部分である。結合ドメインは、分子の連続的な部分、すなわちアミノ酸の隣接配列であってもよく、または立体構造的であってもよい、すなわち分子がその本来の状態である場合に、複合体におけるもう一つの分子と相互作用する構造を形成する本発明のアミノ酸の非隣接配列の組み合わせであってもよい。
【００４３】
「相補的」という用語は、許容される塩および温度条件で塩基対形成による核酸分子の自然の結合を意味する。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。二つの一本鎖分子の間の相補性は、核酸のごく一部が結合するような「部分的」であってもよく、または一本鎖分子の間に完全な相補性が存在する場合には完全であってもよい。
【００４４】
「由来する」とは、ＰＨＩタンパク質または本発明の複合体における分子の本来の結合領域と同一または実質的に同等である任意の分子実体を意味する。特定の結合領域に由来するペプチドは、自然界に存在する結合部位のアミノ酸配列、その結合部位の任意の一部、または関連する分子に結合するように機能する他の分子実体を含みうる。そのような結合領域に由来するペプチドは、本来の結合領域を模倣するように、関連分子と直接または間接的に相互作用するであろう。そのようなペプチドには、競合的阻害剤、ペプチド模倣物等が含まれてもよい。
【００４５】
「相互作用」または「相互作用する」とは、タンパク質、脂質、炭水化物、ヌクレオチドおよび他の細胞代謝物のような他の分子の間の任意の物理的会合を意味し、これは共有結合であっても、非共有結合（例えば、静電気的結合、水素結合、およびファンデルワールス結合）であってもよい。相互作用には、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−脂質相互作用、およびその他のようなタンパク質と細胞分子との間の相互作用が含まれる。特定の相互作用分子は、それらの一つまたは複数が刺激された後に限って相互作用する。例えば、ＰＨドメイン含有タンパク質は、タンパク質がリン酸化されている場合に限ってリガンドに結合するであろう。タンパク質と他の細胞分子との相互作用は、直接または間接的であってもよい。間接的な相互作用の例は、調節物質によるＰＨＩタンパク質またはその結合ドメインの無関係な産生、刺激、または阻害である。当技術分野で既知の様々な方法を用いて、相互作用のレベルを測定してもよい。
【００４６】
「ＩＲ結合領域」とは、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体と相互作用するまたは結合する本発明のＰＨＩタンパク質の結合領域を意味する。好ましい態様において、相互作用は特異的であり、結合領域はそのような受容体でない分子とは相互作用しないか、またはより弱く相互作用する。ＩＲ結合領域と受容体との相互作用のＫｄは、好ましくは１０ μＭ未満であり、より好ましくは１，０００ ｎＭ、最も好ましくは５００ ｎＭである。本発明の態様において、ＩＲ結合領域は、タンパク質の一部として、単独で、またはタンパク質のアミノ酸配列の残りから単離されて、または脂質小胞に含めて、または遊離の可溶性低分子として提供してもよい。ＩＲ結合領域の例は、配列番号：２もしくは５のアミノ酸２３０位〜３４５位または配列番号：１５のアミノ酸配列を含むブロモドメインＢＤ１に対応する領域、または、配列番号：２もしくは５のアミノ酸３８７位〜５０３位、または配列番号：１７のアミノ酸配列を含むブロモドメインＢＤ２に対応する領域である。
【００４７】
「ＩＲＳタンパク質ファミリー」とは、多数の受容体複合体および様々なシグナル伝達タンパク質と、Ｓｒｃ相同性２ドメインとの界面を提供するドッキングタンパク質を意味する。タンパク質は、インスリン受容体、増殖因子受容体（例えば、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）受容体、成長ホルモンおよびプロラクチンの受容体）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１５の受容体、ＩＬ−６受容体ファミリーメンバー）、およびインターフェロン受容体（例えば、ＩＦＮα／βおよびＩＦＮγの受容体）を含むいくつかのクラスの受容体によって開始されるシグナル伝達事象に関係している。インスリン受容体基質であるＩＲＳ−１は、このクラスの分子の原型である。他のファミリーメンバーには、ＩＲＳ−２、Ｇａｂ−１、およびｐ６２ｄｏｋが含まれる。タンパク質は、ＮＨ２末端ＰＨドメインおよび／またはタンパク質−タンパク質相互作用を媒介するホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン；ＳＨ２含有タンパク質に結合する多数のＣＯＯＨ末端チロシン残基；ＳＨ３またはＷＷドメインと相互作用するプロリンリッチ領域；およびおそらくタンパク質−タンパク質相互作用を介してＩＲＳタンパク質の細胞内局在／移動を調節するセリン／トレオニンリッチ領域（Ｍ．Ｆ． ＷｈｉｔｅおよびＬ． Ｙｅｎｕｓｈ、１９９８、ならびにその引用文献）を含むいくつかの共通の構造を含む。ＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２は、ＮＨ２末端の最後部でＰＨドメインを有し、その直後に、リン酸化されたＮＰＸＹモチーフに結合するＰＴＢドメインが続く。ＩＲＳタンパク質ファミリーの活性化された、すなわちリン酸化されたタンパク質を、本発明の目的のために用いてもよい。
【００４８】
「ペプチド模倣物」とは、分子間の相互作用においてペプチドの代用物として作用する構造である（概説としてはＭｏｒｇａｎら、（１９８９）、Ａｎｎ． Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２４：２４３〜２５２を参照のこと）。ペプチド模倣物には、アミノ酸配列および／またはペプチド結合を含んでもよく含まなくてもよいが、本発明のペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニストの構造的および機能的特徴を保持している合成構造が含まれる。ペプチド模倣物には同様に、ペプトイド、オリゴペプトイド（Ｓｉｍｏｎら、（１９７２）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７）、および本発明のペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストに対応するアミノ酸の起こり得る全ての配列を表す所望の長さのペプチドを含むペプチドライブラリが含まれる。
【００４９】
「ＰＨドメイン」とは、当初プレクストリンにおいて同定され、多くのシグナル伝達タンパク質において起こることが知られている明確なアミノ酸約１００個の領域を意味する（Ｍ．Ｆ． ＷｈｉｔｅおよびＬ． Ｙｅｎｕｓｈ、１９９８、ならびにその引用文献）。ＰＨドメインは、サンドイッチを形成し、かつ一つの角が両親媒性ＣＯＯＨ末端αヘリックスによって覆われている、二つの逆平行βシートを特徴とする明確な構造モジュールを有する（Ｌｅｍｍｏｎら、１９９６、Ｃｅｌｌ ８５：６２１〜６２４）。ＰＨドメインを、配列アラインメント技術および三次元構造比較を用いて同定してもよい。好ましいＰＨドメインは、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質のＰＨドメイン、好ましくはＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２ ＰＨドメインである。本発明の態様において、ＰＨドメインを、タンパク質の一部として、単独で、タンパク質のアミノ酸配列の残りから単離して、脂質小胞に含めて、または遊離の可溶性低分子として提供してもよい。
【００５０】
「ＰＨドメイン結合領域」とは、ＰＨドメインと相互作用する、または結合するＰＨＩタンパク質の結合領域を意味する。好ましい態様において、相互作用は特異的であり、結合領域は、非ＰＨドメイン分子とは相互作用しないか、またはより弱く相互作用する。ＰＨドメイン結合領域とＰＨドメインとの相互作用のＫｄは、好ましくは１０ μＭ未満であり、より好ましくは１，０００ ｎＭ、最も好ましくは５００ ｎＭである。
本発明の態様において、ＰＨドメイン結合領域は、タンパク質の一部として、単独で、タンパク質のアミノ酸配列の残りから単離して、脂質小胞に含めて、または遊離の可溶性低分子として提供してもよい。ＰＨドメイン結合領域の例は、配列番号：２、５、８、または１０におけるアミノ酸８位〜２０９位、または配列番号：１２もしくは１３のアミノ酸配列に対応するＰＨドメイン結合領域である（本明細書において、「ＰＨ結合領域」または「ＰＢＲ」と呼ぶ）。
【００５１】
「ＰＨドメイン含有タンパク質」とは、ＰＨドメインを含む、または本質的にＰＨドメインからなるタンパク質またはペプチド、またはその一部を意味する。本発明の態様において、ＰＨドメイン含有タンパク質は、タンパク質の一部として、単独で、タンパク質のアミノ酸配列の残りから単離して、脂質小胞に含めて、または遊離の可溶性低分子として提供してもよい。そのようなタンパク質の例には、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質、好ましくはＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２が含まれる。
【００５２】
「ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体」とは、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用してリン酸化する受容体チロシンキナーゼおよびサイトカイン受容体を意味する。これらの受容体の例には、インスリン受容体、増殖因子受容体（例えば、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）受容体、成長ホルモンおよびプロラクチンの受容体）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１５の受容体、ＩＬ−６受容体ファミリーメンバー）、およびインターフェロン受容体（例えば、ＩＦＮα／βおよびＩＦＮγの受容体）が含まれる。好ましくは、本発明は、インスリン受容体（「ＩＲ」）およびインスリン様増殖因子Ｉ受容体（「ＩＧＦ−１Ｒ」）を用いる。
【００５３】
「配列類似性」または「配列同一性」という用語は、配列の比較によって決定した二つまたはそれ以上のアミノ酸または核酸配列間の関係を意味し、その関係は一般的に「相同性」として知られている。当技術分野における同一性は、場合によっては、そのような配列間の一致によって決定したアミノ酸または核酸配列の配列関連性の程度も同様に意味する。同一性と類似性はいずれも容易に計算されうる（「コンピューター分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；「バイオコンピューティング：インフォマティクスとゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；「配列データのコンピューター分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、第Ｉ巻、Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８７；ならびに「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編、Ｍ．、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９１）。二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列間の同一性および類似性を測定するためには多くの既存の方法があるが、いずれの用語も当業者に周知である（「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８７；「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．、ＳＩＡＭ． Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． ４８：１０７３、１９８８）。同一性を決定する好ましい方法は、調べた配列間の最大の一致を提供するように設計される。同一性を決定する方法は、コンピュータープログラムにおいて暗号化されている。二つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７、１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３、１９９０）が含まれるがこれらに限定されない。同一性または類似性はまた、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）らのアラインメントアルゴリズムを用いて決定されうる［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９１：５２４〜５４５（１９８３）］。
【００５４】
「シグナル伝達経路」とは、細胞外タンパク質からの細胞膜を通して細胞質にメッセージを伝達することを含む一連の事象を意味する。本発明において考慮されるシグナル伝達経路には、ＰＨＩタンパク質または本発明の複合体、またはその相互作用分子を含む経路が含まれる。特に、経路は、ＩＲＳタンパク質ファミリー、特にＩＲＳ−１、または、グルコース代謝、タンパク質合成、ならびに細胞の生存、増殖および形質転換の制御を含む細胞プロセスを調節するＳＴＡＴ転写因子（例えばＳＴＡＴ３）を含む経路である。そのような経路には、ｃ−ｆｏｓ遺伝子発現に至るＭＡＰキナーゼ経路；造血細胞のＩＲＳ−１調節ＩＬ−４刺激；ならびにＩＲＳ−１媒介ＧＨおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）シグナル伝達が含まれる。ＩＲＳ−１はまた、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼに依存する経路を媒介する。さらに、ＩＲＳタンパク質が活性化されると、分裂誘発および細胞の形質転換を刺激して、アポトーシスを阻害するＩＧＲ−Ｉ／ＩＧＲ−Ｒシグナル伝達経路を通して細胞プロセスを調節する。シグナル伝達経路における所定のシグナルの量および強度は、従来の方法を用いて測定することができる（本明細書の実施例１を参照のこと）。例えば、シグナル伝達経路における様々なタンパク質および複合体の濃度および位置を測定することができ、シグナルの伝達に関係するコンフォメーションの変化は、円偏光二色性および蛍光試験を用いて観察してもよく、シグナル伝達経路における異常に関連した病態の様々な症状を検出してもよい。
【００５５】
「ＳＴＡＴ転写因子」または「ＳＴＡＴ」とは、サイトカイン媒介シグナル伝達および免疫機能にとって必要なタンパク質ファミリーのメンバーを意味する（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：６２１〜６５１、１９９５）。サイトカインによる受容体ライゲーションの後、ＳＴＡＴファミリーメンバーは、ヤーヌスファミリーキナーゼ（ＪＡＫ）メンバーの作用を通してチロシンのリン酸化によって活性化されるようになる。活性化ＳＴＡＴタンパク質はホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成して、これは細胞質から核へと移動して、核でそれらはシス作用プロモーター配列に結合して、免疫応答に必要な多くの遺伝子の転写を調節する。ＳＴＡＴ転写因子の例には、ＳＴＡＴ１（αおよびβ）、ＳＴＡＴ３（αおよびβ）、ＳＴＡＴ４、およびＳＴＡＴ６、およびその全てのイソ型、ホモおよびへテロダイマー、好ましくはＳＴＡＴ３（αおよびβ）が含まれるがこれらに限定されない。ＳＴＡＴ３活性化は、組織の炎症に関連したＩＬ−６依存的反応にとって必要であり、ＩＬ−１０反応は、Ｔｈ２ヘルパー細胞機能に関連している（Ｉｎｏｕｅ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：９５５０〜９５５５、１９７５およびＷｅｂｅｒ−Ｎｏｒｔｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２７９５４、１９９６）。
【００５６】
「ＳＴＡＴ結合領域」とは、ＳＴＡＴ転写因子と相互作用するＰＨＩＰタンパク質の結合領域を意味する。好ましい態様において、相互作用は特異的であり、結合領域は、非ＳＴＡＴ転写因子である分子とは相互作用しないか、またはより弱く相互作用する。ＰＨＩタンパク質とＳＴＡＴ転写因子との相互作用のＫｄは、好ましくは１０ μＭ未満であり、より好ましくは１，０００ ｎＭ、最も好ましくは５００ ｎＭである。本発明の態様において、ＳＴＡＴ結合領域は、タンパク質の一部として、単独で、タンパク質のアミノ酸配列の残りから単離して、脂質小胞に含めて、または遊離の可溶性低分子として提供してもよい。
【００５７】
２．核酸分子
先に述べたように、本発明は、ＰＨＩタンパク質をコードする配列を含む、または本質的にそれらからなる単離された核酸分子を提供する。「単離された」という用語は、その本来環境から除去されて、精製もしくは分離され、または組み換えＤＮＡ技術によって産生される場合には細胞材料もしくは培養培地、または化学合成される場合には化学反応物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸（またはタンパク質）を意味する。好ましくは、単離された核酸は、それが自然界で会合する他の成分を少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％含まない。「核酸」という用語には、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを含む改変型もしくは非改変型のＤＮＡ、ＲＮＡ、または混合ポリマーが含まれると解釈され、一本鎖、二本鎖、または三本鎖のいずれかとなりうる。例えば、核酸配列とは、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域もしくは一本鎖、二本鎖および三本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、一本鎖であってもよく、より典型的には、二本鎖もしくは三本鎖であるＲＮＡ、または、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの双方を含む領域の混合物であってもよい。そのような領域における鎖は、同じ分子に由来してもよく、または異なる分子に由来してもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは一つまたは複数の改変塩基を含んでもよい。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡは安定性または他の理由から改変された骨格を有してもよい。核酸配列には、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドが含まれる。「核酸分子」という用語、および特にＤＮＡまたはＲＮＡは一次および二次構造のみを意味し、如何なる特定の三次構造にも制限されない。
【００５８】
本発明の一つの局面に従って、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６もしくは１８〜３４の一つ、または配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６もしくは１８〜３４の一つの相補体と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする、少なくとも３０ヌクレオチドの単離された核酸分子が提供される。
【００５９】
本発明の一つの態様において、以下を含む単離された核酸分子が考慮される：
（ｉ）配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、または１７のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）と相補的な核酸配列；
（ｉｉｉ）遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ｉ）または（ｉｉ）のいずれとも異なる核酸配列；
（ｉｖ）配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６もしくは１８〜３４の一つの核酸配列もしくはその縮重型とハイブリダイズすることができる、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドを含む核酸配列；
（ｖ）配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、もしくは１７のアミノ酸配列を含むタンパク質の切断型、類似体、対立遺伝子もしくは種間変種をコードする核酸配列；または
（ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の断片もしくは対立遺伝子もしくは種間変種。
【００６０】
特定の態様において、単離された核酸分子は以下を含む：
（ｉ）配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６もしくは１８〜３４の一つの核酸配列と実質的な配列同一性もしくは配列類似性を有する核酸配列；
（ｉｉ）ＴがＵであることも可能である、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６もしくは１８〜３４の一つの配列を含む核酸配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）と相補的な、好ましくは配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６もしくは１８〜３４の一つの核酸配列全体と相補的な核酸配列；
（ｉｖ）遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の核酸配列のいずれとも異なる核酸配列；または
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の断片もしくは対立遺伝子もしくは種間変種。
【００６１】
好ましい態様において、単離された核酸は、配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、もしくは１７のアミノ酸配列によってコードされる核酸配列を含み、またはＴがＵであることも可能である、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６もしくは１８〜３４の一つの配列を含む核酸配列を含む。もう一つの態様において、単離された核酸は、配列番号：７１、７３、７５、または７７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、またはＴがＵであることも可能である、配列番号：７０、７２、７４、もしくは７６の核酸配列を含む。
【００６２】
好ましくは、本発明の核酸分子は、本明細書に引用した好ましいコンピュータープログラムを用いて、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６または１８〜３４の一つの配列に対して実質的な配列同一性、例えば５０％を上回る核酸同一性；好ましくは６０％を上回る核酸同一性；およびより好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％を上回る配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００６３】
ＰＨＩタンパク質またはその一部をコードし、遺伝コードの縮重のために配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６または１８〜３４の一つの核酸配列とは異なる配列を含む単離された核酸も同様に、本発明の範囲内である。そのような核酸は、同等のタンパク質をコードする。一つの例として、本発明の核酸分子内のＤＮＡ配列多型によって、アミノ酸配列に影響を及ぼさないサイレント変異が起こる可能性がある。一つまたは複数のヌクレオチドにおける変動は、天然の対立遺伝子変種のために、集団内の個体に存在する。そのような任意のおよび全ての核酸変動が本発明の範囲内である。ＰＨＩタンパク質のアミノ酸配列の変化に至るＤＮＡ配列多型も同様に起こる可能性がある。これらのアミノ酸多型も同様に本発明の範囲内である。さらに、種間変動、すなわち異なる種の間で自然界に存在するヌクレオチド配列の変動も、本発明の範囲内である。
【００６４】
本発明のもう一つの局面は、選択的な条件下（例えば、高ストリンジェンシー条件）で、ＰＨＩタンパク質またはその一部をコードする配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸分子を提供しうる。配列は好ましくは、配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、または１７のアミノ酸配列をコードし、少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも５０個〜２００個のヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーションの選択性は、無作為であるよりむしろ特定の程度の特異性によって起こる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェントな条件条件は、当業者に既知であるか、または「分子生物学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョンウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｒｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ＮＹ（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に認めることができる。例えば、５０℃における２．０×ＳＳＣによる洗浄の前に、約４５℃の５．０〜６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）または０．５％ＳＤＳを用いてもよい。ストリンジェンシーを、洗浄段階において用いられる条件に基づいて選択してもよい。例として、洗浄段階における塩濃度は、約０．２×ＳＳＣで５０℃の高ストリンジェンシーから選択することができる。さらに、洗浄段階の温度は、高ストリンジェンシー条件である約６５℃となりうる。
【００６５】
本発明には、本発明のタンパク質の切断型、対立遺伝子および種間変種、ならびに本明細書に記載されるタンパク質の類似体を含む、ＰＨＩタンパク質をコードする核酸分子が含まれると認識されるであろう。特に、少なくとも１０個、１５個、１８個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、または４５個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも５０個〜２００個のヌクレオチドで２ｋｂ未満である、本発明の核酸の断片が考慮される。一つの態様において、ＰＨＩタンパク質の結合領域、例えば、ＰＨドメイン結合領域（例えば、配列番号：１１）またはＩＲ結合領域（例えば、配列番号：１４または１６）をコードする核酸配列を含む断片が提供される。本発明のｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡのもう一つのスプライシングによって生じた本発明の核酸分子の変種型は本発明に含まれるとさらに認識されるであろう。
【００６６】
ＤＮＡを含む本発明の単離された核酸分子を、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４の核酸配列の全てまたは一部に基づく標識核酸プローブを調製することによって単離することができる。標識核酸プローブを用いて、適当なＤＮＡライブラリ（例えば、ｃＤＮＡライブラリまたはゲノムＤＮＡライブラリ）をスクリーニングする。例えば、ｃＤＮＡライブラリを、標準的な技術を用いて標識プローブによってライブラリをスクリーニングすることによって、ＰＨＩタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離するために用いることができる。または、ゲノムＤＮＡライブラリを同様にスクリーニングして、ｐｈｉｐ遺伝子を含むゲノムクローンを単離することができる。ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリのスクリーニングによって単離された核酸は、標準的な技術によってシークエンシングすることができる。
【００６７】
本発明の単離された核酸分子はまた、本発明の核酸を選択的に増幅することによって単離されうる。「増幅する」または「増幅」とは、核酸配列のさらなるコピーの産生を意味し、一般的に、当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行われる（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ．Ｗ．およびＧ．Ｓ． Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）、「ＰＣＲプライマー、実験マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）。特に、ＰＣＲにおいて用いるために、配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４のヌクレオチド配列から合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが可能である。核酸を、これらのオリゴヌクレオチドプライマーおよび標準的なＰＣＲ増幅技術を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから増幅することができる。そのように増幅された核酸を適当なベクターにクローニングして、ＤＮＡ配列分析によって特徴を調べることができる。またｃＤＮＡを、多様な技術、例えば、チャーグウィンら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８、５２９４〜５２９９（１９７９））のグアニジニウム−チオシアネート抽出法を用いることによって、総細胞ＲＮＡを単離することによってｍＲＮＡから調製してもよい。次に、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから市販されているモロニーＭＬＶ逆転写酵素、またはＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、Ｓｔ． Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬから市販されているＡＭＶ逆転写酵素）。
【００６８】
ＰＨＩタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの転写を可能にし、ＰＨＩタンパク質をコードするＲＮＡ分子を産生させる、適当なベクターにクローニングすることによって、ＲＮＡである本発明の単離された核酸分子を単離することができる。例えばｃＤＮＡを、ベクターにおいてバクテリオファージプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）の下流にクローニングすることができ、ｃＤＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼによってインビトロで転写させることができ、得られたＲＮＡを従来の技術を用いて単離することができる。
【００６９】
本発明の核酸分子を、標準的な技術を用いて化学合成してもよい。ペプチド合成と同様に、市販のＤＮＡシンセサイザーにおいて完全に自動化されている固相合成を含むがこれらに限定されない、ポリデオキシヌクレオチドを化学合成する方法は既知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号；およびＩｔａｋｕｒａ、米国特許第４，４０１，７９６号および第４，３７３，０７１号を参照のこと）。
【００７０】
本発明の核酸分子を、ＰＨＩタンパク質のクローニング、プロセシング、または発現を修飾する改変を含む理由のためにＰＨＩタンパク質コード配列を変化させるために、当技術分野で一般的に既知の方法を用いて操作することができる。分子は、ランダム断片化によるＤＮＡシャッフリング、および遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構築を用いて操作されうる。定方向変異誘発を用いて変異を導入し、新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変化させ、コドン選択性を変化させ、スプライシング変種等を産生してもよい。
【００７１】
特定の核酸分子がＰＨＩタンパク質をコードするか否かの決定を、標準的な技術によって適当な宿主細胞にｃＤＮＡを発現させて、本明細書記載の方法において発現されたタンパク質を試験することによって行うことができる。ＰＨＩタンパク質をコードするＤＮＡは、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション（ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）またはマキサムギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）化学シークエンシングのような標準的な技術によってシークエンシングして、核酸配列およびコードされるタンパク質の予想アミノ酸配列を決定することができる。
【００７２】
本発明の核酸分子の開始コドンおよび非翻訳配列は、ＰＣ／Ｇｅｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、ＣＡ）のようなその目的のために設計されたコンピューターソフトウェアを用いて決定してもよい。本発明の核酸分子のイントロン−エキソン構造および転写調節配列は、ゲノムＤＮＡクローンライブラリをプロービングするために、本発明の核酸分子を用いて同定されうる。（ヒトＰＨＩＰおよびＮＤＲＰのイントロン／エキソン構造を示す配列番号：６９を参照のこと）。調節エレメントは、標準的な技術を用いて同定することができる。エレメントの機能は、これらのエレメントを用いて、エレメントに機能的に結合しているｌａｃＺ遺伝子のようなレポーター遺伝子を発現させて確認することができる。これらの構築物は従来の技法を用いて培養細胞に、または非ヒトトランスジェニック動物モデルに導入してもよい。ＤＮＡにおける調節エレメントを同定することの他に、そのような構築物はまた、当技術分野で既知の技術を用いて、エレメントと相互作用する核ポリペプチドを同定してもよい。
【００７３】
本発明は、適当なベクターに含まれるｐｈｉｐ遺伝子の調節配列を含む核酸分子を考慮する。ベクターは、異種ポリペプチドをコードする配列を含んでもよい。「異種ポリペプチド」は、細胞に本来存在しない、すなわち細胞に対して異物であるポリペプチドを意味する。
【００７４】
本発明のもう一つの局面に従って、本明細書記載の方法を用いて単離された核酸分子は、変異型ｐｈｉｐ遺伝子対立遺伝子である。例えば、変異体対立遺伝子は、特定の病態または疾患（例えば、インスリン反応に関連した障害、または癌）の症状に関与する遺伝子型を有することがわかっている、または提案される人から単離してもよい。変異体対立遺伝子および変異体対立遺伝子産物は、本明細書記載の治療法および診断法において用いてもよい。例えば、変異体ｐｈｉｐ遺伝子のｃＤＮＡは、本明細書記載のようにＰＣＲを用いて単離してもよく、変異体対立遺伝子のＤＮＡ配列は、変異体遺伝子産物の機能の喪失または変化に関与する変異（複数）を確認するために、正常な対立遺伝子と比較してもよい。ゲノムライブラリはまた、変異体対立遺伝子を有することが疑われる、またはわかっている人からのＤＮＡを用いて構築することができる、またはｃＤＮＡライブラリは、変異体対立遺伝子を有することが疑われる、またはわかっている組織からのＲＮＡを用いて構築することができる。次に、正常なｐｈｉｐ遺伝子またはその任意の適した断片をコードする核酸は、そのようなライブラリにおける対応する変異体対立遺伝子を同定するためのプローブとして用いてもよい。変異体配列を含むクローンを精製して、配列分析を行うことができる。さらに、変異体ｐｈｉｐ対立遺伝子を有することがわかっている、または疑われる人の組織から単離したＲＮＡからのｃＤＮＡを用いて発現ライブラリを構築することができる。推定の変異体組織からの遺伝子産物は、例えば、本明細書記載のＰＨＩタンパク質に対して特異的な抗体を用いて発現およびスクリーニングしてもよい。抗体を用いて同定されたライブラリクローンを精製して、配列分析を行うことができる。
【００７５】
本発明の核酸分子にはまた、センスＰＨＩＰ核酸分子に沿って戦略的な部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドおよびその断片、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが２ヌクレオチド塩基〜２００ヌクレオチド塩基であってもよく；より好ましくは１０塩基〜１００塩基、最も好ましくは１０塩基〜４０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、機能的ＰＨＩタンパク質の形成を阻害する本発明の核酸分子（例えば、ｍＲＮＡセンス鎖）に沿って戦略的な部位に対して相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチドから選択される。ＰＨＩタンパク質を調節するアンチセンス核酸分子の任意の組み合わせまたは副組み合わせが、本発明において用いるために適している。アンチセンスオリゴヌクレオチドにはまた、ＰＨＩＰ核酸分子に沿って戦略的な部位または他の部位に対して相補的または実質的に相補的な部位に隣接するヌクレオチドが含まれてもよい。隣接する部分は、好ましくは長さが約５塩基〜約５０塩基、好ましくは５塩基〜約２０塩基である。同様に、アンチセンス分子は、他の遺伝子をコードする核酸分子の相同性を最小限にするためにＰＨＩＰ核酸分子の非保存領域に対しても相補的であることが好ましい。
【００７６】
本発明のセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変された糖−ホスホジエステル骨格（または国際公開公報第９１／０６６２９号に記載されたような他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよい。そのような糖結合は、分子を内因性のヌクレアーゼに対して抵抗性にする可能性がある。これらのオリゴヌクレオチドはインビボで比較的安定である（すなわち酵素的分解に耐えることができる）が、標的ヌクレオチド配列に対する結合に関してその特異性を保持している。オリゴヌクレオチドは、ポリ（Ｌ−リジン）のような、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる分子に共有結合してもよい。標的配列に対する結合特異性を改変するために、エリプチシンのようなインターカレート剤、およびアルキル化剤または錯塩をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合してもよい。
【００７７】
本発明はまた、ＰＨＩＰタンパク質または本発明の複合体の一つもしくは複数の分子の翻訳を阻害するように機能する酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムを考慮する。
【００７８】
本発明の範囲内で考慮されるアンチセンス分子およびリボザイムは、核酸分子の合成に関する当技術分野で既知の任意の方法によって調製してもよい。例えば、固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学合成する技術を用いてもよい。ＲＮＡ分子も同様に、ＰＨＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボ転写によって作製してもよい。ＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６を含む適したＲＮＡポリメラーゼプロモーターと共にベクターに組み入れてもよい。代わりの方法において、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に産生するｃＤＮＡ構築物を細胞株、細胞、または組織に導入することができる。ＲＮＡ分子は、例えば分子の５’末端および／または３’末端で隣接する配列を加えることによって、または分子の骨格内でホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオエートもしくは２’ Ｏ−メチルを用いることによって、細胞内安定性および半減期を増加させるように改変することができる。分子はまた、イノシン、ケオシン、およびウィブトシンのような従来でない塩基、または内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および類似の改変型を挿入することによって改変することができる。
【００７９】
３．ＰＨＩタンパク質
ＰＨＩタンパク質は、高次コイル構造を予測するＮ末端αヘリックス領域と二つのブロモドメインを含む領域とを特徴とする。ＰＨＩタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、７１、７３、７５、または７７の配列を含む。「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列および自然界に存在する分子または合成分子を意味する。
【００８０】
本発明の態様において、タンパク質がインスリン受容体基質−１のＰＨドメインと安定な相互作用を形成することができる、以下から選択される核酸分子によってコードされる単離ＰＨＩタンパク質が提供される：
（ａ）配列番号：１、４、７、９、１１、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４を含む核酸分子；および
（ｂ）配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、または１７を含むタンパク質をコードする核酸分子。
【００８１】
本発明の好ましい態様において、配列番号：２、３または８を含む単離されたヒトＰＨＩＰが提供され、配列番号：５、６、または１０を含むマウスＰＨＩＰが提供される。配列番号：８および１０のＰＨＩＰは、ＰＨＩＰと神経分化関連タンパク質（ＮＤＲＰ）の融合体を含むＰＨＩＰの長い型である。配列番号：２、３、５および６の唯一の差は異なるエキソンによってコードされるＮ末端である。配列は、ヒトおよびマウス配列の双方において短い型（配列番号：２および５）のアミノ酸位置４位以降が異なる。長い型のＰＨＩＰは、Ｎ末端のもう一つのスプライシング配列を含む。
【００８２】
発達しつつあるニューロンにおいて主に発現され、神経の再生および分化に関係する可能性があるＰＨＩタンパク質ファミリーの第二のメンバーである神経分化関連タンパク質（ＮＤＲＰ）が同定された。ＮＤＲＰのプレカルボキシ末端領域は、ＰＨＩＰのアミノ末端領域（残基５位〜８０位）と同一である（図６および図７を参照のこと）。この領域は、ＮＤＲＰにおける保存された機能的ドメインに対応する可能性がある。図７および図８はそれぞれ、ヒトおよびマウスのＮＤＲＰのアミノ酸配列および核酸配列のアラインメントを示す。配列番号：６９は、ＰＨＩＰおよびＮＤＲＰのイントロンおよびエキソンを示す。示した配列は相補的配列である。イントロンを黒色で示し、ＰＨＩＰエキソンを青色で示し、ＮＤＲＰエキソンを赤色で示し、かつＰＨＩＰ／ＮＤＲＰ共通エキソンをピンク色で示す。
【００８３】
したがって、本発明はまた、以下を含む単離された核酸分子に関する：
（ｖｉ）配列番号：３５および３９〜６３の一つの核酸配列と実質的な配列同一性もしくは配列類似性を有する核酸配列；
（ｖｉｉ）ＴがＵであることも可能である、配列番号：３５および３９〜６３の一つの配列を含む核酸配列；
（ｖｉｉｉ）（ｉ）と相補的な、好ましくは配列番号：３５および３９〜６３の一つの核酸配列全体と相補的な核酸配列；
（ｉｘ）遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の核酸配列のいずれとも異なる核酸配列；または
（ｘ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の断片もしくは対立遺伝子もしくは種間変種。
【００８４】
以下によってコードされる単離された神経分化関連タンパク質も同様に提供される：
（ａ）配列番号：３５および３９〜６３の一つを含む核酸分子；または
（ｂ）配列番号：３６を含むタンパク質をコードする核酸分子。
【００８５】
本発明の好ましい態様において、配列番号：３６を含む単離ヒトＮＤＲＰが提供される。本発明はまた、本明細書に開示されたＮＤＲＰの切断型、類似体、実質的な配列同一性を有するタンパク質、イソ型および模倣物が含まれる。
【００８６】
「ＷＤＲ９」と呼ばれるＰＨＩＰの相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）も同様に同定されている。ＷＤＲ９の完全なアミノ酸配列は、Ｇｅｎ Ｂａｎｋアクセッション番号第Ｑ９ＮＳＩ６号であり、ＷＤＲ９の核酸配列は、Ｇｅｎ Ｂａｎｋアクセッション番号第ＡＬ１６３２７９号の核酸配列からスプライシングされる。ＷＤＲ９の部分的アミノ酸配列を配列番号：６４および６５に示す。ＷＤ反復タンパク質９とＰＨＩＰとのアミノ酸および核酸配列のアラインメントをそれぞれ、図１３および１４に示す。
【００８７】
配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、または１７のアミノ酸配列を含むタンパク質の他に、本発明のＰＨＩタンパク質には、本明細書に記載されるようにＰＨＩタンパク質の切断型、ＰＨＩタンパク質の類似体、ならびにＰＨＩタンパク質と配列同一性または類似性を有するタンパク質、およびその切断型が含まれる。切断型タンパク質は、例えばアミノ酸残基３個〜２７５個のペプチド、大きさの範囲がトリペプチド〜２７５量体であるタンパク質を含んでもよい。本発明の一つの局面において、配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、または１７の少なくとも５個の連続アミノ酸配列を有するＰＨＩタンパク質の断片が提供され、断片に存在する５個以上、６個以上、７個以上、または８個以上の連続アミノ酸のアミノ酸配列は、ＰＨＩタンパク質以外のポリペプチドには存在しない。本発明の一つの態様において、断片は配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、または１７の配列のような特定の配列からの少なくとも１２個〜２０個の連続アミノ酸のアミノ酸残基である。断片は免疫原性であってもよく、好ましくはＰＨＩタンパク質以外のポリペプチドに対して免疫反応性である抗体と免疫反応性ではない。一つの態様において、断片は、ＰＨＩタンパク質の結合領域、例えばＰＨドメイン結合領域（例えば、配列番号：１２または１３）、またはＩＲ結合領域（例えば、配列番号：１５または１７）のアミノ酸配列を含む（同様に、本明細書記載のペプチドに関する説明を参照のこと）。
【００８８】
本発明のタンパク質にはまた、ＰＨＩタンパク質の類似体、および／または本明細書記載の切断型が含まれてもよく、それらには、一つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含むＰＨＩタンパク質が含まれてもよいがこれらに限定されない。アミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換であってもよい。保存的アミノ酸置換は、ＰＨＩタンパク質アミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸を類似の荷電、大きさ、および／または疎水性特徴を有するアミノ酸に置換することを含む。保存的置換のみを行う場合、得られた類似体は好ましくはＰＨＩタンパク質と機能的に同等である。非保存的置換は、ＰＨＩタンパク質アミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸を異なる荷電、大きさ、および／または疎水性特徴を有する一つまたは複数のアミノ酸に置換することを含む。
【００８９】
一つまたは複数のアミノ酸挿入をＰＨＩタンパク質に導入してもよい。アミノ酸挿入は、単一のアミノ酸残基、または２アミノ酸長〜１５アミノ酸長の範囲の連続的なアミノ酸で構成されてもよい。
【００９０】
欠失は、ＰＨＩタンパク質配列からの、一つまたは複数のアミノ酸、または不連続な部分の除去からなる。欠失されるアミノ酸は連続であっても連続していなくてもよい。欠失変異を有する得られた類似体の長さの下限は、約１０アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸〜４０アミノ酸である（欠失変異体は、実施例２ならびに配列番号：６７および６８に記載されている）。
【００９１】
ポリペプチドレベルでの対立遺伝子変種は、もう一つのポリペプチドと比較してアミノ酸１個のみ、または多くても数個のアミノ酸置換によって異なる。本発明のＰＨＩタンパク質の種間変種は、異なる種の生物に本来存在する変種である。
【００９２】
本発明のタンパク質には、本明細書記載のようにＰＨＩタンパク質および／またはその切断型と配列同一性または類似性を有するタンパク質が含まれる。そのようなＰＨＩタンパク質には、そのアミノ酸配列が、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、ＰＨＩタンパク質を得るために用いられるプローブとハイブリダイズする他の種からのＰＨＩＰタンパク質領域のアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれてもよい（本明細書におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に関する考察を参照のこと）。これらのタンパク質は一般的に、ＰＨＩタンパク質の特徴である同じ領域を有するであろう。好ましくは、タンパク質は、配列番号：２、３、５、６、８、１０、１２、１３、１５、または１７のアミノ酸配列と実質的な配列同一性、例えば約６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の同一性、好ましくは９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性、および最も好ましくは９８％の同一性を有するであろう。アミノ酸配列相同性、類似性または同一性の割合は、本明細書記載の既知の方法を用いて、参照配列と一致した並置したアミノ酸の百分率として計算する。例えば、アミノ酸配列相同性または同一性の割合は、参照配列と一致する並置したアミノ酸の百分率として計算され、配列アラインメントはデイホフら（Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９１：５２４〜５４５、１９８３）のアラインメントアルゴリズムを用いて決定される。
【００９３】
本発明はまた、本発明のタンパク質のイソ型も考慮する。イソ型は、本発明のタンパク質と同じ数および種類のアミノ酸を含むが、イソ型は異なる分子構造を有する。本発明によって考慮されるイソ型は、好ましくは本明細書に記載されるように、本発明のタンパク質と同じ特性を有する。
【００９４】
さらにまた、本発明は、活性化ＰＨＩタンパク質を考慮する。例えば、ＰＨＩタンパク質はチロシンがリン酸化されているか、またはセリン／トレオニンがリン酸化されていてもよい。
【００９５】
本発明は、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域に由来する分子を提供する。分子は好ましくは、ＰＨドメイン結合領域、ＩＲ結合領域、またはＳＴＡＴ結合領域に由来するペプチドである。本発明の態様において、ペプチドは、本質的に配列番号：１２、１３、１５または１７からなる。ペプチドはまた、ＰＨドメイン含有タンパク質、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体、またはＰＨＩタンパク質結合領域と直接もしくは間接的に相互作用もしくは結合するＳＴＡＴ転写因子の結合領域に由来してもよい。
【００９６】
これらのペプチドは全て、これらのペプチドに対して実質的に相同な、相補的な、またはそうでなければ機能的もしくは構造的に同等である分子と共に、本発明の目的のために用いてもよい。完全長の結合領域（例えば、ＰＨドメイン結合領域、ＩＲ結合領域、またはＳＴＡＴ結合領域）の他に、ペプチドの切断型が考慮される。切断型ペプチドは、アミノ酸残基約５個〜２００個のペプチドを含んでもよく、好ましくはアミノ酸残基５個〜１００個、より好ましくはアミノ酸残基５個〜５０個のペプチドを含んでもよい。
【００９７】
本発明はまた、所望の細胞成分または細胞型もしくは組織に対してキメラタンパク質を向けることができる標的タンパク質および／またはターゲティングドメインに融合した、または組み入れられた本発明の少なくとも一つのＰＨＩタンパク質またはペプチドを含む新規キメラタンパク質にも関する。キメラタンパク質はまた、さらなるアミノ酸配列またはドメインを含んでもよい。キメラタンパク質は、様々な成分が異なる起源に由来するという点において、そしてそのようなタンパク質がいずれも本来存在しないという意味において（すなわち、異種である）組み換え型である。標的タンパク質は、ＰＨドメイン結合領域、ＩＲ結合領域、またはＳＴＡＴ結合領域を挿入するために選択されたタンパク質であり、例えば、疾患状態において変異しているまたは過剰発現されているタンパク質であってもよい。ターゲティングドメインは、膜貫通ドメイン、膜結合ドメイン、またはタンパク質を例えば小胞または核に会合させるように向ける配列となりうる。ターゲティングドメインは、キメラタンパク質を特定の細胞型または組織にターゲティングすることができる。例えば、ターゲティングドメインは、細胞表面リガンドまたは標的組織の細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体となりうる。
【００９８】
本発明のペプチドまたはキメラタンパク質の環状誘導体も同様に、本発明の一部である。環状化によって、ペプチドまたはキメラタンパク質は、他の分子と会合するためにより都合のよいコンフォメーションをとることができる可能性がある。環状化は、当技術分野で既知の技術を用いて行ってもよい。例えば、遊離のスルフヒドリル基を有する二つの空間的に適当に離れた成分の間でジスルフィド結合を形成してもよく、または一つの成分のアミノ基ともう一つの成分のカルボキシル基の間でアミド結合を形成してもよい。環状化はまた、ユリッセ（Ｕｌｙｓｓｅ），Ｌ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９５、１１７、８４６６〜８４６７に記載されるように、アゾベンゼン含有アミノ酸を用いて行ってもよい。結合を形成する成分は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸成分、または両者の組み合わせであってもよい。
【００９９】
上記のようなペプチド結合を含む環状ペプチドより柔軟である環状ペプチドを産生することが望ましい場合がある。より柔軟なペプチドは、ペプチドの左右の位置でシステインを導入して、二つのシステインの間でジスルフィド架橋を形成することによって調製してもよい。環状ペプチドの相対的な柔軟性は、分子力学のシミュレーションによって決定することができる。
【０１００】
特定の調製物と組み合わせると、ペプチドは有効な細胞内物質となりうる。しかし、ペプチドの有効性を増加するために、「トランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）」、すなわち上皮細胞によるペプチドの取り込みを促進する第二のペプチドを含む融合ペプチドを調製することができる。説明すると、本発明のペプチドは、ＨＩＶタンパク質ＴａｔのＮ末端ドメインの全てまたは断片、例えばＴａｔの残基１〜７２位、またはトランスサイトーシスを促進することができるより小さい断片との融合ポリペプチドの一部として提供されうる。他の態様において、本発明のペプチドは、アンテナペディアタンパク質の全てまたは一部との融合ポリペプチドとして提供することができる。さらに説明すると、本発明のペプチドは、ペプチドの細胞内移動を促進するために、ペプチド配列の細胞外型の細胞膜を超えての移動を促進する異種ペプチド配列（「内部移行ペプチド」）を含むキメラペプチドとして提供することができる。
【０１０１】
疎水性ポリペプチドも同様に、受容体媒介トランスサイトーシスによって膜を通過することができる輸送可能なペプチドにポリペプチドをカップリングまたは結合させることによって、膜障壁を超えて生理的に輸送してもよい。このタイプの内部移行ペプチドの例は、例えば、ヒストン、インスリン、トランスフェリン、塩基性アルブミン、プロラクチンおよびインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、または他の増殖因子の全てまたは一部を用いて作製することができる。
【０１０２】
別のクラスの移動／内部移行ペプチドは、ＰＨ依存的膜結合を示す。この点において、ｐＨ依存的膜結合内部移行ペプチドの例は、ａａ１−ａａ２−ａａ３−ＥＡＡＬＡ（ＥＡＬＡ）４−ＥＡＬＥＡＬＡＡ−アミドであり、これはスバラオ（Ｓｕｂｂａｒａｏ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：２９６４、１９８７のペプチド配列の改変体を表す。
【０１０３】
内部移行ペプチドには、アポリポタンパク質Ａ−１およびＢ；メリチン、ボンボリチン、デルタヘモリシスおよびパーダキシンのようなペプチドトキシン；アラメチシンのような抗生物質ペプチド；カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、βエンドルフィン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、膵ポリペプチドのようなペプチドホルモン；および多数の分泌型タンパク質のシグナル配列に対応するペプチドが含まれる。さらに、内部移行ペプチドは、酸性ｐＨで内部移行ペプチドのαヘリックス特徴を増強する置換基の結合によって改変してもよい。
【０１０４】
本発明に含まれるその他の適した内部移行ペプチドには、生理的ｐＨでは「隠れている」が、標的細胞のエンドソームの低いｐＨ環境では露出される疎水性ドメインが含まれる。そのような内部移行ペプチドは、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のエキソトキシンＡ、クラスリン、またはジフテリア毒素において同定された配列を模範として形成してもよい。
【０１０５】
孔を形成するタンパク質またはペプチドも同様に、内部移行ペプチドとして作用する可能性がある。孔形成タンパク質またはペプチドは、例えば、Ｃ９補体タンパク質、細胞溶解性Ｔ細胞分子またはＮＫ細胞分子から得てもよく、それらに由来してもよい。
【０１０６】
内部移行ペプチドの膜のインターカレーションは、ＣＰＤペプチドまたはペプチド模倣物の細胞膜を超えての転位にとって十分である可能性がある。しかし、転位は、細胞内酵素（すなわち、「アクセサリーペプチド」）の基質を内部移行ペプチドに融合させることによって改善される可能性がある。適したアクセサリーペプチドには、キナーゼ基質、一価の陽性荷電、および膜結合グリコトランスフェラーゼによってグリコシル化される配列を含むペプチドが含まれる。
【０１０７】
アクセサリーペプチドは、本発明のペプチドまたはペプチド模倣物を標的細胞との相互作用を増強するために用いることができる。この用途に適したアクセサリーペプチドの例には、配列「ＲＧＤ」を含む細胞接着タンパク質に由来するペプチド、配列ＣＤＰＧＹＩＧＳＲＣを含むラミニンに由来するペプチドが含まれる。
【０１０８】
内部移行ペプチドおよびアクセサリーペプチドはそれぞれ、独立して、化学的クロスリンクによってまたは融合タンパク質の形で、本発明のペプチドまたはペプチド模倣物に加えることができる。融合タンパク質では、ペプチド部分のそれぞれの間に非構造ポリペプチドリンカーを含めてもよい。
【０１０９】
内部移行ペプチドは一般的に、ポリペプチドの直接排出にとっても十分であろう。しかし、ＲＧＤ配列のような特定のアクセサリーペプチドを用いる場合、その宿主細胞から融合タンパク質を直接排出するために分泌型のシグナル配列を含める必要がある可能性がある。分泌型シグナル配列は、Ｎ末端最後尾に存在してもよく、そして（選択的に）分泌シグナルと融合タンパク質の残りとの間にタンパク質溶解部位が隣接してもよい。特定の場合において、本発明のペプチドの一部として核転位シグナルを含めることが望ましい可能性がある。
【０１１０】
本発明のペプチドを含む融合ポリペプチドの産生において、様々なペプチドドメインの適切な折り畳みを確実に行うために、非構造リンカーを含める必要がある可能性がある。多くの合成および天然のリンカー、例えば（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４リンカー）が当技術分野で既知であり、本発明において用いられるように適合させることができる。
【０１１１】
ペプチド模倣物を、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に系統的に置換することによって、側鎖を異なる電子特性を有する置換基に置換すること、およびペプチド結合をアミド結合に系統的に置換することによって得られる情報に基づいて設計してもよい。候補となるペプチド模倣物の活性に関するコンフォメーション要件を決定するために、局所コンフォメーション拘束も同様に導入することができる。模倣物は、逆折り返しコンフォメーションを安定化または促進するため、および分子の安定化に役立つように、等配電子アミド結合、またはＤ−アミノ酸を含んでもよい。環状アミノ酸類似体を用いて、アミノ酸残基を特定のコンフォメーション状態に拘束してもよい。模倣物はまた、阻害剤ペプチド二次構造の模倣物を含みうる。これらの構造は、アミノ酸残基の三次元方向をタンパク質の既知の二次コンフォメーションに形成することができる。Ｎ置換アミノ酸のオリゴマーであるペプトイドも同様に用いてもよく、これらは新規分子の化学的に多様なライブラリを作製するためのモチーフとして用いることができる。
【０１１２】
本発明のペプチドを、生物学的発現系を用いて開発してもよい。そのような系を用いることによって、ランダムペプチド配列の大きいライブラリを作製して、特定のタンパク質に結合するペプチド配列に関してこれらのライブラリをスクリーニングすることができる。ライブラリは、ランダムペプチド配列をコードする合成ＤＮＡを適当な発現ベクターにクローニングすることによって作製してもよい（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、１９９２、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７１１；Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８を参照のこと）。ライブラリはまた、重なり合うペプチドの同時合成によって構築してもよい（米国特許第４，７０８，８７１号を参照のこと）。
【０１１３】
本発明は、ペプチド模倣物、すなわち、ペプチドおよびタンパク質に基づくまたは由来する化合物を考慮する。本発明のペプチド模倣物は典型的に、非天然アミノ酸、構造的拘束、等配電子置換等を用いる既知のＰＨＩタンパク質配列の構造的改変によって得ることができる。ペプチド模倣物は、ペプチドと非ペプチド合成構造の間に連続的な構造的空間を構成する；したがって、本発明のペプチド模倣物はファーマコフォアの輪郭を描くために、そしてペプチドを親ＰＨＩペプチドの活性を有する非ペプチド化合物に翻訳する際に役立てるために有用となる可能性がある。
【０１１４】
その上、本発明のペプチドのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ）を提供することができる。そのようなペプチド模倣物は、非加水分解性（例えば、対応するペプチドを分解するプロテアーゼまたは他の生理的条件に対する安定性の増加）、特異性および／または強度の増加、およびペプチド模倣物を細胞内に局在させるための細胞の透過性の増加のような属性を有しうる。本発明のペプチド類似体は、例えば、ベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら、「ペプチド：化学と生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８を参照のこと）、置換γラクタム環（Ｇａｒｖｅｙら、「ペプチド：化学と生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、１２３頁）、Ｃ−７模倣物（Ｈｕｆｆｍａｎら、「ペプチド：化学と生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、１０５頁）、ケトメチレンシュードペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎら（１９８６）、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎら、「ペプチド：構造と機能（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、第９回全米ペプチドシンポジウム抄録、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、１９８５）、β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉら（１９８５）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ． Ｌｅｔｔ． ２６：６４７；およびＳａｔｏら（１９８６）、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、α−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎｅｔら（１９８５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ １２６：４１９；およびＤａｎｎら、（１９８６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）、ジアミノケトン（Ｎａｔａｒａｊａｎら（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ １２４：１４１）、およびメチレンアミノ改変（Ｒｏａｒｋら、「ペプチド：化学と生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、１３４頁）を用いて作製することができる（一般的には、「ペプチド：化学と生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８年の第ＩＩＩ章：分析と合成法を参照のこと）。
【０１１５】
ペプチド模倣物を作製するために実行することができる多様な側鎖置換の他に、本発明は特に、ペプチド二次構造のコンフォメーションが拘束された模倣物を用いることを考慮する。ペプチドのアミド結合の代わりに多くの代用物が開発されている。例としてのアミド結合代用物には、以下の群が含まれる（ｉ）トランスオレフィン、（ｉｉ）フルオロアルケン、（ｉｉｉ）メチレンアミノ、（ｉｖ）ホスホンアミド、および（ｖ）スルホンアミド。ペプチド模倣物はまた、ＰＨＩペプチドの骨格のより実質的な改変に基づくことができる。この範疇に入るペプチド模倣物には（ｉ）レトロ−インバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）類似体、および（ｉｉ）Ｎ−アルキルグリシン類似体（いわゆるペプトイド）が含まれる。
【０１１６】
バーディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）らの国際公開公報第９９４８８９７号と比較して、コンビナトリアルケミストリー法はまた、新しいペプチド模倣物の開発に生かしてもよい。例えば、広範囲のペプチド結合置換体を含むペプチド類似体のライブラリのランダムな作製に重点を置くいわゆる「ペプチド形成（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｒｐｈｉｎｇ）」戦略を用いてもよい。
【０１１７】
もう一つのクラスのペプチド模倣物誘導体には、ホスホネート誘導体が含まれる。そのようなホスホネート誘導体の合成は、当業者によって既知の方法から適合させることができる（例えば、Ｌｏｏｔｓら、「ペプチド：化学と生物学（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ＥＳＣＯＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｌｅｉｄｅｎ、１９８８、１１８頁）；Ｐｅｔｒｉｌｌｏら、「ペプチド：構造と機能（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、第９回全米ペプチドシンポジウム抄録、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、１９８５を参照のこと）。
【０１１８】
他の多くのペプチド模倣物構造が当技術分野において既知であり、本発明において用いられるように容易に適合させることができる。本発明のペプチド模倣物は、１−アザビシクロ［４．３．０］ノナン代用体（Ｋｉｍら、（１９９７）、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２：２８４７）、Ｎ−アシルピペラジン酸（Ｘｉら、（１９９８）、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２０：８０）、または２置換ピペラジン部分（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９６）、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９：１３４５〜１３４８）を拘束されたアミノ酸類似体として組み入れてもよい。特定のアミノ酸残基を、アリールもしくはビアリール部分、例えば単環式もしくは二環式芳香核もしくはヘテロ芳香核、または二芳香核、芳香核−ヘテロ芳香核、もしくは二ヘテロ芳香核に置換してもよい。
【０１１９】
本発明のペプチド模倣物を、例えば、ハイスループットスクリーニングと組み合わせた組み合わせ合成技術によって最適にすることができる。
【０１２０】
本発明にはまた、融合タンパク質を作製するために、選択されたタンパク質またはマーカータンパク質（下記参照）と結合させた本発明のＰＨＩタンパク質またはペプチドが含まれる。さらに、本発明のＰＨＩタンパク質またはペプチドの免疫原性部分も本発明の範囲に含まれる。
【０１２１】
本発明のタンパク質またはペプチドを、組み換えＤＮＡ方法を用いて調製してもよい。従って、本発明のタンパク質またはペプチドをコードする配列を有する本発明の核酸分子を、既知の方法で、タンパク質を確実に良好に発現させる適当な発現ベクターに組み入れてもよい。可能性がある発現ベクターには、用いる宿主細胞とベクターが適合性である限り、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が含まれるがこれらに限定されない。ヒトの人工染色体（ＨＡＣｓ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現されることができるより大きい断片のＤＮＡを輸送してもよい。
【０１２２】
したがって、本発明は、本発明の核酸分子と、挿入されたタンパク質配列の転写および翻訳のために必要な調節配列とを含む本発明の組み換え型発現ベクターを考慮する。適した調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類、または昆虫遺伝子を含む多様な起源に由来してもよい［例えば、ゴエッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）の「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）を参照のこと］。適当な調節配列の選択は、下記に考察するように選択した宿主細胞に依存し、当業者によって容易に行われるであろう。必要な調節配列は、本来のタンパク質および／またはその隣接領域によって供給されてもよい。
【０１２３】
本発明はさらに、発現ベクターにおいてアンチセンス方向にクローニングされた本発明のＤＮＡ核酸分子を含む組み換え型発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の転写によって本発明のタンパク質またはその断片の核酸配列に対してアンチセンスであるＲＮＡ分子を発現させるように、調節配列に結合している。多様な細胞型においてアンチセンスＤＮＡ分子の連続的な発現を指示するアンチセンス核酸に結合した調節配列、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができ、またはアンチセンスＲＮＡの組織もしくは細胞型特異的発現を指示する調節配列を選択することができる。
【０１２４】
本発明の組み換え型発現ベクターはまた、本発明の組み換え型分子によって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を促進するマーカー遺伝子を含んでもよい。マーカー遺伝子の例は、特定の薬物に対する抵抗性を付与するＧ４１８およびハイグロマイシンのようなタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分のような免疫グロブリンもしくはその一部をコードする遺伝子である。マーカーを、関係する核酸から異なるベクターに導入することができる。
【０１２５】
組み換え型発現ベクターはまた、組み換え型タンパク質の発現の増加；組み換え型タンパク質の溶解度の増加；およびアフィニティ精製におけるリガンドとして作用することによって標的組み換え型タンパク質の精製に役立つことを提供する融合部分をコードする遺伝子を含んでもよい。例えば、タンパク質溶解切断部位を標的組み換え型タンパク質に加えて、組み換え型タンパク質を融合部分から分離させて、その後の融合タンパク質を精製してもよい。典型的な融合発現ベクターには、ヒスチジンタグを有するｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ組み換え型タンパク質に融合させるｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）が含まれる。
【０１２６】
組み換え型発現ベクターを宿主細胞に導入して、形質転換宿主細胞を生じてもよい。「形質転換宿主細胞」には、本発明の組み換え型発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされている宿主細胞が含まれる。「形質転換される」、「トランスフェクトされる」、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、多くの標準的な技術の一つによって細胞に核酸（例えば、ベクター）を導入することを含む。原核細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介形質転換によって核酸によって形質転換することができる。核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションのような従来の技術によって哺乳類細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトする適した方法は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、および他の研究所のテキストに見ることができる。
【０１２７】
適した宿主細胞には、幅広い原核細胞および真核宿主細胞が含まれる。例えば、本発明のタンパク質は、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞、または哺乳類細胞において発現させてもよい。他の適した宿主細胞は、ゴエッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）の「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンジエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ（１９９１）に見ることができる。
【０１２８】
挿入された核酸配列の発現を調節する、またはタンパク質を所望のように改変する（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）および処置する（例えば、切断する）宿主細胞を同様に選択してもよい。タンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変のための特異的および特徴的な機構を有する宿主系または細胞株を選択してもよい。例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８を含む真核宿主細胞を用いてもよい。タンパク質の長期にわたって高い収率で安定な発現を得るために、遺伝子産物を安定に発現する細胞株および宿主系を操作してもよい。
【０１２９】
本発明に記載の方法を用いて産生された宿主細胞および特に細胞株は、ＰＨＩタンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングして評価するために特に有用である可能性がある。
【０１３０】
ＰＨＩタンパク質は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない非ヒトトランスジェニック動物において発現させてもよい［Ｈａｍｍｅｒら、（Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０〜６８３、１９８５）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９〜８１４、１９８３）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４４３８〜４４４２、１９８５）、ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ、（Ｃｅｌｌ ４１：３４３〜３４５、１９８５）、ならびに米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと］。当技術分野で既知の方法を用いて、ＰＨＩタンパク質をコードする本発明の核酸分子を動物に導入して、トランスジェニック動物の創始動物を作製してもよい。そのような技法には、前核マイクロインジェクション、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーション、および精子媒介遺伝子移入が含まれる。
【０１３１】
本発明は、その全ての細胞にｐｈｉｐ遺伝子を有するトランスジェニック動物、および全てではないがいくつかの細胞に導入遺伝子を有する動物を考慮する。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、またはコンカテマーにおいて組み入れられてもよい。導入遺伝子を、特定の細胞型に選択的に導入して活性化させてもよい（例えば、Ｌａｓｋｏら、１９９２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６２３６を参照のこと）。導入遺伝子を、遺伝子ターゲティングによって内因性の遺伝子の染色体部位に組み入れてもよい。導入遺伝子は、特定の細胞型に選択的に導入して、その細胞型において内因性の遺伝子を不活化してもよい（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３〜１０６を参照のこと）。
【０１３２】
トランスジェニック動物における組み換え型ＰＨＩタンパク質の発現を、標準的な技術を用いてアッセイしてもよい。導入遺伝子が組み入れられているか否かを分析するために、サザンブロット分析またはＰＣＲ法によって初回スクリーニングを行ってもよい。トランスジェニック動物の組織におけるｍＲＮＡ発現レベルも同様に、組織試料のノーザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション、およびＲＴ−ＰＣＲを含む技術を用いて評価してもよい。組織はまた、ＰＨＩタンパク質に対する抗体を用いて免疫組織化学的に評価されてもよい。
【０１３３】
本発明のタンパク質またはペプチドはまた、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ａｓｓｏｃ， ８５：２１４９〜２１５４）または均一溶液中での合成（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ、１９８７、「有機化学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、Ｅ． Ｗａｎｓｃｈ編、第１５巻ＩおよびＩＩ、Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）のようなタンパク質化学において周知の技術を用いる化学合成によって調製してもよい。
【０１３４】
タンパク質のような他の分子と結合させた本発明のタンパク質またはペプチドを含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質を、組み換え技法によってタンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端と、所望の生物機能を有する選択されたタンパク質またはマーカータンパク質の配列とを融合させることによって調製してもよい。得られた融合タンパク質は、本明細書記載の選択されたタンパク質またはマーカータンパク質に融合させたタンパク質またはペプチドを含む。融合タンパク質を調製するために用いてもよいタンパク質の例には、免疫グロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、血液凝集素（ＨＡ）、および切断型ｍｙｃが含まれる。
【０１３５】
４．本発明の複合体
本発明の複合体は、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域と、結合パートナーとを含む。結合パートナーには、ＰＨドメイン含有タンパク質、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体、およびＰＨＩタンパク質またはその結合領域と相互作用するＳＴＡＴ転写因子またはその結合領域が含まれる。本発明の局面において、（ａ）ＰＨＩタンパク質もしくはＰＨドメイン結合領域と、ＰＨドメイン含有タンパク質もしくはＰＨドメイン；（ｂ）ＰＨＩタンパク質もしくはＩＲ結合領域と、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体もしくはその結合領域；または（ｃ）ＰＨＩタンパク質もしくはＳＴＡＴ結合領域と、ＳＴＡＴ転写因子もしくはＰＨＩタンパク質と相互作用するその結合領域、とを含む複合体が提供される。複合体は、相互作用分子の領域と、複合体の活性を維持するために必要であるその他の隣接配列のみを含んでもよい。生理的条件において、複合体における相互作用分子は、複合体における他の分子との安定な非共有結合的相互作用を形成することができる。
【０１３６】
５．抗体
本発明のＰＨＩタンパク質、ペプチド、または複合体を、タンパク質、ペプチド、または複合体に特異的な抗体を調製するために用いることができる。本発明は、無傷のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、およびその免疫活性断片（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２断片、またはＦａｂ発現ライブラリ断片、およびそのエピトープ結合断片）、抗体重鎖および抗体軽鎖、ヒト化抗体、遺伝子操作された一本鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号）、またはキメラ抗体、例えばマウス抗体の結合特異性を含むが、残りの部分はヒト起源である抗体を用いることができる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、断片ならびにキメラを含む抗体は、当業者に既知の方法を用いて調製してもよい。
【０１３７】
ＰＨＩタンパク質の非保存領域において明確なエピトープを認識する抗体を調製することができる。タンパク質の非保存領域は、他のタンパク質と実質的な配列相同性を有しない領域である。十分に特徴が調べられたドメインのような保存領域からの領域も同様に、ＰＨＩタンパク質の保存領域に対する抗体を調製するために用いることができる。ＰＨＩタンパク質に対する特異性を有する抗体も同様に、本明細書に記載されたように細菌において融合タンパク質を発現させることによって作製された融合タンパク質から作製してもよい。一つの態様において、本発明の複合体においてＰＨＩタンパク質または分子の結合領域に対して特異的な抗体を調製する。
【０１３８】
複合体またはそのエピトープを特異的に認識することができる、特に、複合体の相互作用分子のいずれかの上でのエピトープ、特に分子が複合体とは離れて存在する場合に、抗体によって認識されないであろう特定のエピトープを特異的に認識することができる抗体を作製してもよい。抗体は、本発明の複合体の形成を妨害することができてもよく、下記のように、相互作用分子（例えば、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域、ＰＨドメインまたはＰＨドメイン含有タンパク質）と複合体を形成することができる分子を含む障害を治療するために投与してもよい。
【０１３９】
本発明のＰＨＩタンパク質または複合体に特異的な抗体は、組織におけるＰＨＩタンパク質または複合体を検出するため、およびその組織分布を決定するために用いてもよい。本発明の抗体を用いるインビトロおよびインサイチュー検出方法を用いて、本発明のＰＨＩタンパク質または複合体に関連した増殖および／または分化障害を含むがこれらに限定しないＰＨＩタンパク質、本発明の複合体、またはシグナル伝達経路を含む病態または疾患の予後および／または診断的評価に役立ててもよい。いくつかの遺伝子疾患は、本発明の複合体において相互作用分子の結合ドメイン領域で変異を含んでもよい。したがって、本発明の複合体が遺伝子障害に関係していれば、変異がドメインの一つに含まれるか否かを迅速にチェックするために、ＰＣＲを用いて、結合領域からＤＮＡを増幅してもよい。ドメインの隣接する領域に対応するプライマーを作製して、標準的なシークエンシング方法を用いて変異が存在するか否かを決定することができる。この方法は、罹患遺伝子の染色体マッピングを予め必要とせず、欠損タンパク質をコードする完全な遺伝子のシークエンシングを不必要にすることによって時間を節約することができる。
【０１４０】
６．適応
本発明の核酸分子、ＰＨＩタンパク質、抗体、ペプチド、複合体化合物、物質および薬剤は、ＰＨＩタンパク質、本発明の複合体、もしくはその個々の成分、またはシグナル伝達経路（例えば、癌またはインスリン反応に関連した障害）によって媒介される病態および疾患の予後的および診断的な評価、ならびにそのような病態または疾患に対する素因を有する被験者の同定において用いられうる（下記の６．１．１および６．１．２項を参照のこと）。本発明の核酸分子とＰＨＩタンパク質とを検出する方法を用いて、ＰＨＩタンパク質とＰＨＩタンパク質をコードする核酸分子とを検出することによって疾患および病態をモニターすることができる。同様に、本明細書記載の方法を用いて、ＰＨＩタンパク質の発達的発現を調べてもよいこと、したがって、ＰＨＩタンパク質の役割に関するさらなる洞察を提供するであろうことは、当業者に明らかとなるであろう。本発明の適応にはまた、本発明のＰＨＩＰをコードする核酸分子、ＰＨＩタンパク質、ペプチド、複合体、もしくはその成分の生物活性を調節する、またはシグナル伝達経路（例えば、ＩＧＦ−Ｒシグナル伝達経路）を媒介する化合物を同定するための方法が含まれる（６．２項）。化合物、抗体等はＰＨＩタンパク質、本発明の複合体、またはシグナル伝達経路（例えば、癌またはインスリン反応に関連した障害）によって媒介される疾患および病態を治療するために用いてもよい（６．３項）。
【０１４１】
６．１  診断方法
ＰＨＩタンパク質、本発明の複合体、もしくはその個々の成分、またはシグナル伝達経路（例えば、癌またはインスリン反応に関連した障害）によって媒介される疾患および病態を診断的および予後的に評価するために、そしてそのような疾患および病態に対して素因を有する被験者を特定するために多様な方法を用いることができる。そのような方法は、例えば、本発明の核酸分子およびその断片、ならびに本発明のペプチド断片または複合体を含むＰＨＩタンパク質に対して作製された抗体を利用してもよい。特に、核酸および抗体を、例えば（１）ＰＨＩＰ変異の有無を検出するため、非障害状態と比較してＰＨＩＰ ｍＲＮＡの過剰発現もしくは過小発現のいずれかを検出するため、または特定の病態もしくはそのような病態に対する感受性と相関する可能性があるＰＨＩＰ転写物のもう一つのスプライシング型を定性的もしくは定量的に検出するため；および（２）非障害状態に関連したＰＨＩタンパク質の過剰量もしくは過小量のいずれかの検出、または障害状態もしくは障害状態への進行に相関する改変された（例えば、完全長未満）ＰＨＩタンパク質の有無を検出するため、に用いてもよい。
【０１４２】
本明細書記載の方法は、患者をスクリーニングして診断するために、そして障害を発症する素因を示す患者を同定するために、例えば臨床の状況で簡便に用いられる可能性がある本明細書記載の少なくとも一つの核酸分子または抗体を含む予めパッケージングされた診断キットを利用することによって行ってもよい。
【０１４３】
核酸に基づく検出技術は下記の第６．１．１項に記載する。ペプチド検出技術は下記の第６．１．２項に記載する。本発明の方法を用いて分析してもよい試料には、ｐｈｉｐを発現するまたはＰＨＩタンパク質を含むことがわかっているまたは疑われる試料が含まれる。試料は、患者または細胞培養に由来してもよく、体液、組織抽出物、新しく採取した細胞、および細胞培養においてインキュベートした細胞溶解物が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４４】
本発明の任意の核酸分子に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイの標的として用いてもよい。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターして、遺伝子変種、変異、および多型を同定するために用いることができる。マイクロアレイからの情報は、遺伝子機能を決定するため、障害の遺伝的基礎を理解するため、障害を診断するため、および治療薬を開発してその活性をモニターするために用いてもよい。
【０１４５】
マイクロアレイの調製、用途、および分析は、当業者に周知である。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ．ら、１９９５、米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａら、（１９９６）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４〜１０６１９；Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら、（１９９５）、国際公開公報第９５／２５１１１６号；シャロン（Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．）ら、（１９９５）、国際公開公報第９５／３５５０５号；Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ．ら、（１９９７）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０〜２１５５；およびＨｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ．ら、（１９９７）、米国特許第５，６０５，６６２号を参照のこと）。
【０１４６】
６．１．１  本発明の核酸分子を検出する方法
本発明の核酸分子によって、当業者は本発明の核酸分子を試料中で検出するために用いられるヌクレオチドプローブを構築することができる。適したプローブには、ＰＨＩタンパク質の領域から少なくとも５個の連続したアミノ酸をコードする核酸配列に基づく核酸分子が含まれ、好ましくはプローブは１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドプローブを、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ等のような、適当なシグナルを提供して十分な半減期を有する放射活性標識のような検出可能な物質によって標識してもよい。用いてもよいその他の検出可能な物質には、特異的標識抗体によって認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗原に特異的な抗体、発光化合物が含まれる。適当な標識は、ハイブリダイゼーション速度および検出されるヌクレオチドに対するプローブの結合およびハイブリダイゼーションに利用できるヌクレオチドの量を考慮して選択されてもよい。標識したプローブを、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第二版）に一般的に記載されるように、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンメンブレンのような固相支持体上で核酸とハイブリダイズさせてもよい。核酸プローブを、好ましくはヒト細胞においてＰＨＩタンパク質をコードする遺伝子を検出するために用いてもよい。核酸プローブはまた、癌の診断において、ＰＨＩタンパク質、本発明の複合体、またはシグナル伝達経路（例えば、癌またはインスリン反応に関連した障害）によって媒介される疾患および病態の進行をモニターするため、または治療的治療をモニターするために有用となる可能性がある。
【０１４７】
プローブは、ＰＨＩタンパク質をコードする遺伝子を検出するためにハイブリダイゼーション技術において用いてもよい。技術は一般的に、核酸における相補的配列に対するプローブの特異的アニーリングに都合がよい条件で、患者の試料または他の細胞起源から得た核酸（例えば、組み換え型ＤＮＡ分子、クローニングした遺伝子）を本発明のプローブに接触させて、インキュベートする段階を含む。インキュベーション後、アニーリングしていない核酸を除去して、プローブとハイブリダイズした核酸がもし存在すれば、それを検出する。
【０１４８】
本発明の核酸分子の検出は、ＰＣＲのような増幅方法を用いて特異的遺伝子配列を増幅した後に、増幅された分子を当業者に既知の技術を用いて分析することを含んでもよい。適したプライマーは、当業者によって日常的に設計することができる。
【０１４９】
ゲノムＤＮＡは、点突然変異、挿入、欠失、および染色体再配列を含むｐｈｉｐ構造を含む異常を検出するために生体試料のハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて用いてもよい。例えば、直接シークエンシング、一本鎖構造多型分析、ヘテロ二本鎖分析、変性勾配ゲル電気泳動、化学的ミスマッチ切断、およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いてもよい。
【０１５０】
当業者に既知の遺伝子タイピング技術を用いて、ｐｈｉｐ遺伝子における変異に近位に存在する多型を分類することができる。多型を用いて、変異を有する可能性がある家系における個人を同定してもよい。多型が、ｐｈｉｐ遺伝子における変異と連鎖不平衡を示す場合、これを用いて変異を有する可能性がある一般集団における個体をスクリーニングすることができる。用いてもよい多型には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、一塩基多型、および単純配列反復多型（ＳＳＬＰ）が含まれる。
【０１５１】
本発明のプローブを、ＲＦＬＰを直接同定するために用いてもよい。本発明のプローブまたはプライマーは、さらに、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、ファージまたはプラスミドのようなゲノムクローンを単離するために用いることができる。クローンにおけるＤＮＡは、ハイブリダイゼーションまたはシークエンシング技法を用いてＳＳＬＰに関してスクリーニングすることができる。
【０１５２】
本明細書記載のハイブリダイゼーションおよび増幅技術を用いて、ｐｈｉｐ発現の定性的および定量的局面をアッセイしてもよい。例えば、ｐｈｉｐを発現することがわかっている細胞型または組織からＲＮＡを単離して、ハイブリダイゼーション（例えば、標準的なノーザン分析）または本明細書において言及したＰＣＲ技術を利用して調べてもよい。これらの技術を用いて、正常または異常な選択的スプライシングによる可能性がある転写物の大きさの差を検出してもよい。技術はまた、疾患または病態（例えば、癌またはインスリン反応に関連した障害）の症状を示す個体と比較して正常な個体において検出された完全長および／または選択的スプライシング転写物のレベルの定量的な差を検出するために用いられてもよい。
【０１５３】
プライマーおよびプローブを、上記の方法においてインサイチューで用いてもよい、すなわち生検または切除によって得られた患者組織の組織切片（固定および／または凍結）上で直接用いてもよい。
【０１５４】
６．１．２  ＰＨＩタンパク質を検出する方法
酵素結合体または標識誘導体のようなＰＨＩタンパク質または誘導体と特異的に反応する抗体を、様々な試料（例えば、生体材料）においてＰＨＩタンパク質を検出するために用いてもよい。それらは診断または予後的試薬として用いてもよく、そしてそれらを用いて、ＰＨＩタンパク質発現レベルの異常、ＰＨＩタンパク質の構造、および／または時間的、組織、細胞、または細胞内位置の異常を検出してもよい。抗体はまた、ＰＨＩタンパク質、本発明の複合体、またはシグナル伝達経路（例えば、癌またはインスリン反応に関連した障害）によって媒介される疾患および病態、ならびに他の病態に対するその影響を調べるために、インビトロで可能性がある治療化合物をスクリーニングするために用いてもよい。インビトロイムノアッセイも同様に、特定の治療の有効性をモニターするために用いてもよい。本発明の抗体をまた、ＰＨＩタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞においてｐｈｉｐ発現レベルを決定するためにインビトロで用いてもよい。
【０１５５】
抗体を、ＰＨＩタンパク質と抗体の抗原決定基との結合相互作用に依存する任意の既知のイムノアッセイにおいて用いられうる。そのようなアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集、血液凝集素、および組織化学試験である。抗体は、特定の細胞事象または病的状態におけるその役割を決定するために、ならびにそのような病的状態を診断および治療するために、試料中のＰＨＩタンパク質を検出して定量するために用いてもよい。
【０１５６】
特に、本発明の抗体を、例えば、ＰＨＩタンパク質を検出するために、それを特定の細胞、組織、および特異的細胞内位置に特定するために、ならびに発現レベルを定量するために、細胞および細胞内レベルで免疫組織化学分析において用いてもよい。
【０１５７】
光学顕微鏡と電子顕微鏡とを用いて抗原の位置を特定するための当技術分野で既知の細胞化学技術を用いて、ＰＨＩタンパク質を検出してもよい。一般的に、本発明の抗体を、検出可能な物質によって標識してもよく、ＰＨＩタンパク質を、検出可能な物質の存在に基づいて組織および細胞に位置特定してもよい。例えば、検出可能な物質には、以下が含まれるがこれらに限定されない：放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン）、ルミノールのような発光標識；酵素的標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ）、ビオチン分子団（標識したアビジン、例えば光学的または比色法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジンによって検出することができる）、二次レポーターによって認識される既定のタンパク質エピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの態様において、標識は、可能性がある立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームを通して結合する。抗体はまた、電子顕微鏡によって容易に可視化されるフェリチンまたは金コロイドのような電子密度の高い物質にカップリングさせてもよい。
【０１５８】
抗体または試料を、細胞を固定することができる担体または固相支持体、抗体等に固定してもよい。例えば、担体または支持体はニトロセルロース、またはガラス、ポリアクリルアミド、斑れい岩、および磁鉄鉱であってもよい。支持体材料は、球状（例えば、ビーズ）、円柱状（試験管または壁の内表面、棹の外表面）、または平板（例えば、シート、試験片）を含む任意の可能性な形状でありうる。一次抗原抗体反応を、ＰＨＩタンパク質に対して反応する抗体に対する特異性を有する二次抗体の導入によって増幅する間接法も同様に用いてもよい。例として、ＰＨＩタンパク質に対して特異性を有する抗体がウサギにＩｇＧ抗体である場合、二次抗体は、本明細書に記載されるように検出可能な物質によって標識したヤギ抗ウサギγグロブリンであってもよい。
【０１５９】
放射活性標識を検出可能な物質として用いる場合、ＰＨＩタンパク質をオートラジオグラフィーによって位置特定してもよい。オートラジオグラフィーの結果は、様々な光学的方法によって、または粒子を計数することによって、オートラジオグラフにおける粒子密度を決定することによって定量されうる。
【０１６０】
６．２  物質／化合物を同定または評価するための方法
本明細書記載の方法は、ＰＨＩタンパク質と相互作用もしくは結合する物質、またはＰＨＩタンパク質と相互作用する他のタンパク質と相互作用もしくは結合する物質、複合体におけるＰＨＩタンパク質もしくは相互作用分子の相互作用を妨害もしくは増強する化合物、およびＰＨＩタンパク質もしくはＰＨＩタンパク質と相互作用する他のタンパク質に結合する物質を含む、ＰＨＩタンパク質の生物学的活性を調節する物質をスクリーニングするために設計される。ｐｈｉｐ調節配列に結合する化合物を同定する方法も同様に用いられる。
【０１６１】
本発明の方法を用いて同定される物質および化合物には、Ｉｇテール融合ペプチドを含む可溶性ペプチドのようなペプチド、ランダムペプチドライブラリおよびＤ−立体配置アミノ酸および／またはＬ−立体配置アミノ酸、多糖類、オリゴ糖、単糖類、ホスホペプチドで構成されるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリのメンバー（ランダムまたは部分的縮重メンバー、定方向ホスホペプチドライブラリメンバーを含む）、抗体［例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、一本鎖抗体、断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、およびＦａｂ発現ライブラリ断片、ならびにそのエピトープ結合断片）］、ならびに有機または無機低分子が含まれるがこれらに限定されない。物質もしくは化合物は、内因性の生理的化合物であってもよく、または天然もしくは合成化合物であってもよい。
【０１６２】
物質を、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域との相互作用能または結合能に基づいてスクリーニングすることができる。したがって、本発明はまた、ＰＨＩタンパク質と相互作用または結合する物質を同定するための方法を提供する。本発明の方法を用いて同定された物質を、従来の技術を用いて単離、クローニング、およびシークエンシングしてもよい。本発明のタンパク質と相互作用する物質はＰＨＩタンパク質の生物学的または免疫学的活性のアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。
【０１６３】
ＰＨＩタンパク質と相互作用または結合することができる物質を、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域を、ＰＨＩタンパク質または結合領域とおそらく相互作用または結合する試験物質と、物質−ＰＨＩタンパク質または結合領域複合体の形成を可能にする条件で反応させること、および複合体を除去および／または検出することによって同定してもよい。複合体を、ＰＨＩタンパク質もしくは結合領域複合体、遊離の物質、または複合体を形成していないＰＨＩタンパク質もしくは結合領域に関してアッセイすることによって検出することができる。物質−ＰＨＩタンパク質または結合領域複合体の形成を可能にする条件を、物質とタンパク質の特性および量のような要因を考慮して選択してもよい。
【０１６４】
物質−タンパク質もしくは結合領域複合体、遊離の物質、または複合体を形成していないタンパク質もしくは結合領域を、従来の単離技術、例えば、塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル濾過、分画、吸収、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集、またはその組み合わせによって単離してもよい。成分のアッセイを容易にするために、ＰＨＩタンパク質もしくはその結合領域、または物質に対する抗体、または標識したＰＨＩタンパク質もしくは結合領域、または標識物質を利用してもよい。抗体、タンパク質、または物質を、上記のような検出可能な物質によって標識してもよい。
【０１６５】
本発明の方法において用いられるＰＨＩタンパク質、結合領域または物質は、不溶化されうる。例えば、ＰＨＩタンパク質、結合領域、または物質を、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチック管、ガラスビーズ、ポリアミン−メチルビニル−エーテルマレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹等のような適した担体に結合させてもよい。担体は、例えば、管、試験平板、ビーズ、円板、球等の形であってもよい。不溶化タンパク質、結合領域、または物質を、既知の化学的または物理的方法、例えば、臭化シアンカップリングを用いて適した不溶性担体と材料とを反応させることによって調製してもよい。
【０１６６】
そのような相互作用によって形成された複合体がシグナル伝達経路の一部である、ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用に化合物が影響を及ぼすか否かを調べることによって、シグナル伝達経路における異常を特徴とする疾患または病態を薬剤が治療できるか否かを調べることができるスクリーニングを行うことが可能である。
【０１６７】
ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用は、ＰＨＩタンパク質もしくは結合パートナーの産生を増加させることによって、ＰＨＩタンパク質もしくは結合パートナーの発現を増加させることによって、または相互作用の期間を持続させることによって、促進もしくは増加させてもよい。ＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用は、ＰＨＩタンパク質もしくは結合パートナーの産生を妨害することによって、ＰＨＩタンパク質もしくは結合パートナーの発現を妨害することによって、ＰＨＩタンパク質と結合パートナーの相互作用を妨害することによって、または相互作用を干渉することによって、破壊もしくは減少されうる。方法にはまた、シグナル伝達レベルおよびＰＨＩタンパク質と結合パートナーとの相互作用レベルを含む様々な特性を測定または検出する段階が含まれてもよい。存在する相互作用のタイプに応じて、様々な方法を用いて相互作用レベルを測定してもよい。例えば、共有結合の強度は、特定の数の結合を切断するために必要なエネルギーに関して測定されうる。非共有結合相互作用は、上記のように説明され、相互作用分子間の距離に関して記述されてもよい。間接的相互作用は、関係する中間物質の数、結合パートナーに対して行われた対照と比較してＰＨＩタンパク質に対して行われた対照の程度を含む異なる方法で説明されてもよい。
【０１６８】
本発明はまた、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域（例えば、ＰＨドメイン結合領域、ＩＲ結合領域、またはＳＴＡＴ結合領域）と、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域（例えば、ＰＨドメイン含有タンパク質、ＰＨドメイン、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体、またはＳＴＡＴ転写因子を含むがこれらに限定されない結合パートナー）と相互作用または結合する物質との相互作用または結合のアゴニストまたはアンタゴニストに関してアッセイすることによってスクリーニングする方法も考慮する。化合物が、ＰＨＩタンパク質もしくはその結合領域とタンパク質に結合する物質との相互作用または結合のアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを評価する基本方法は、試験化合物の存在下で物質−ＰＨＩタンパク質または結合領域複合体の形成を可能にする条件で、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域と物質とを含む反応混合物を調製することである。試験化合物は、最初に混合物に加えてもよく、またはＰＨＩタンパク質もしくは結合領域と物質とを加えた後に加えてもよい。試験化合物を含まないまたはプラセボを含む対照反応混合物も同様に調製する。複合体の形成を検出して、対照反応には複合体が形成されるが反応混合物には形成されなければ、または反応混合物と比較して対照反応においてより多く複合体が形成されれば、試験化合物がＰＨＩタンパク質または結合領域と物質との相互作用を干渉することを示している。反応は、液相で行ってもよく、またはＰＨＩタンパク質、結合領域、物質、もしくは試験化合物は本明細書記載のように固定してもよい。化合物が本発明のＰＨＩタンパク質または複合体の生物活性を調節できるか否かは、当技術分野で既知の技術を用いて細胞または生物に及ぼす生物作用を決定することによって調べてもよい。
【０１６９】
本発明の方法を用いてアッセイすることができるアゴニストおよびアンタゴニストは、アゴニスト結合部位、競合的アンタゴニスト結合部位、非競合的アンタゴニスト結合領域またはアロステリック部位を含むＰＨＩタンパク質または物質上の一つまたは複数の結合領域において作用する可能性があると理解される。
【０１７０】
本発明はまた、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域と、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域に結合することができる物質との相互作用のアゴニストの作用を阻害するアンタゴニストに関してスクリーニングすることができる。このように、本発明は、ＰＨＩタンパク質の同じ結合部位に関して競合する化合物に関してアッセイするために用いてもよい。
【０１７１】
本発明はまた、ＰＨＩタンパク質と相互作用するタンパク質に結合する化合物を同定する方法を考慮する。タンパク質−タンパク質相互作用を、同時免疫沈降、クロスリンク、および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製のような従来の方法を用いて同定してもよい。また、ＰＨＩタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定が得られる方法を用いてもよい。これらの方法には、標識したＰＨＩタンパク質によって発現ライブラリをプロービングすることが含まれる。さらに、Ｘ線結晶学研究を、物質とＰＨＩタンパク質との相互作用を評価する手段として用いてもよい。例えば、本発明の複合体における精製組み換え型分子は、適した形で結晶化するとＸ線結晶学によって分子内相互作用を検出されやすくなる。分光法も同様に用いて相互作用を検出してもよく、特にＱ−ＴＯＦ機器を用いてもよい。２ハイブリッド系も同様に、インビボでタンパク質相互作用を検出するために用いてもよい。
【０１７２】
融合タンパク質は上記の方法において用いてもよいと認識されるであろう。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合したＰＨＩタンパク質を方法において用いてもよい。
【０１７３】
同様に、本発明の複合体は組み換え型分子を用いてインビトロで再構成してもよく、試験物質の効果を再構成された系において評価してもよいと認識されるであろう。
【０１７４】
ＰＨＩタンパク質を調節する化合物を評価するために本発明の方法を適用するために適した試薬を、適した容器にパッケージングした必要な材料を提供する簡便なキットにパッケージングしてもよい。キットには同様に、本発明の方法を行うために有用な適した支持体が含まれてもよい。
【０１７５】
本発明のペプチドは、薬物開発のためのリード化合物を同定するために用いてもよい。本発明のペプチドの構造は、ＮＭＲまたはＸ線結晶学のような多くの方法によって容易に決定することができる。配列が類似であるが、標的分子においてそれらが誘発する生物活性が異なるペプチドの構造の比較は、標的の構造活性相関に関する情報を提供しうる。構造活性相関を調べて得られた情報を用いて、改変ペプチド、他の低分子、またはリード化合物のいずれかを設計することができ、それらを標的分子に関して予想される特性に関して調べることができる。
【０１７６】
構造活性相関に関する情報も同様に、共結晶化研究から得られうる。これらの研究において、標的分子に関連して所望の活性を有するペプチドを結晶化して、複合体のＸ線構造を決定する。次に、構造をその本来の状態で標的分子の構造と比較することができ、そのような比較からの情報を用いて、所望の活性を有すると予想される化合物を設計してもよい。
【０１７７】
本発明の局面において、ＰＨＩタンパク質、結合パートナー、または結合領域の三次元構造を決定する段階、およびＰＨＩタンパク質、結合パートナー、または結合領域に対して結合することができる低分子またはペプチドを提供する段階を含む、ＰＨＩタンパク質、結合パートナー、またはＰＨＩタンパク質もしくは結合パートナーの結合領域を用いて低分子模倣物、アゴニスト、またはアンタゴニストを設計する方法が提供される。当業者は、ＰＨＩタンパク質、結合パートナー、または結合領域の作用を模倣して、容易に細胞に入ることができる低分子またはペプチドを産生することができるであろう。分子が同定されれば、分子を、ＰＨＩタンパク質、結合パートナー、または結合領域との結合能に関してアッセイすることができる。相互作用の強度を、アミノ酸欠失、付加、もしくは置換体を作製することによって、または官能基を付加、欠失、もしくは置換することによって、最適にしてもよい。付加、欠失、または改変を、無作為に作製してもよく、またはＰＨＩタンパク質、結合パートナー、もしくは結合領域の大きさ、形状、および三次元構造に関する知識に基づいて作製してもよい。
【０１７８】
当技術分野で既知のコンピューターモデリング技術も同様に、ＰＨＩタンパク質もしくはその結合領域、または本発明の方法に従って同定された薬剤、物質もしくは化合物と、相互作用分子もしくは結合パートナー（例えば、ＩＲＳタンパク質ファミリーメンバー、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体、またはＳＴＡＴ転写因子もしくはその結合領域）との相互作用を観察するために用いてもよい。（例えば、Ｂｉｏ Ｓｙｍ／ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡから市販されているＨｏｍｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ ＆ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙを、モデリングのために用いてもよい）。コンピューターモデリングが強い相互作用を示せば、薬剤、物質、化合物またはペプチドを合成して、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域と、相互作用する分子または結合パートナーとの結合を妨害できるか否かを調べることができる。
【０１７９】
６．３  組成物および処理
本発明のＰＨＩタンパク質、ペプチド、および複合体、本発明に記載の方法によって同定された物質または化合物、本発明の抗体、ならびにアンチセンス核酸分子を、ＰＨＩタンパク質、本発明の複合体、複合体の個々の成分、またはシグナル伝達経路の生物活性を調節するために用いてもよく、それらをＰＨＩタンパク質、本発明の複合体、複合体の個々の成分、またはシグナル伝達経路によって媒介される疾患および病態の予後的および診断的評価において用いてもよい。
【０１８０】
ＰＨＩＰは、遺伝子発現および分裂促進、転写反応、ＤＮＡ合成、アクチンリモデリング、およびグルコース輸送体転位に及ぼすインスリンの影響を増強する。ＤＮ ＰＨＩＰ変異体は、インスリン媒介転写反応およびＤＮＡ合成を完全に遮断する。ＤＮ ＰＨＩＰのこの阻害作用は、インスリン受容体ファミリーに対して非常に特異的である。特に血清刺激転写および分裂促進反応は、ＤＮ ＰＨＩＰの効果に対して不応性である。このように、ＰＨＩＰは、インスリン反応に関連した病態または障害に治療的介入を行うための有用な標的である。
【０１８１】
このように、本発明のタンパク質、ペプチド、もしくは複合体、または本明細書記載の方法によって同定された物質もしくは化合物、本発明の抗体、およびアンチセンス核酸分子を、インスリン反応に関連した障害を予防または治療するために被験者に投与してもよい。これらの障害の例には、２型（インスリン非依存型）真性糖尿病、高血糖症、筋緊張性ジストロフィー、黒色表皮症、網膜症、腎症、アテローム性冠動脈疾患および末梢動脈疾患、ならびに末梢性および自律性ニューロパシーが含まれるがこれらに限定されない。
【０１８２】
本発明のタンパク質、ペプチド、もしくは複合体、または本明細書記載の方法によって同定された物質もしくは化合物、本発明の抗体、およびアンチセンス核酸分子を、癌を予防または治療するために被験者に投与してもよい。予防または治療される可能性がある癌には、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌、そして特に副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚部、膀胱、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌、好ましくは乳癌、前立腺癌、結腸癌、および卵巣癌が含まれるがこれらに限定されない。特に、本発明に従って予防または治療される可能性がある癌は、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体に依存する腫瘍、好ましくはＩＧＦ−１媒介癌である。
【０１８３】
本発明のタンパク質、ペプチド、もしくは複合体、または本明細書に記載される方法によって同定された物質、薬剤、もしくは化合物、本発明の抗体、およびアンチセンス核酸分子も同様に、感染疾患、自己免疫疾患、免疫欠損疾患、および炎症を含む他の病態を治療または予防するために有用となる可能性がある。
【０１８４】
一つの局面に従って、ＰＨＩタンパク質に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接、またはＰＨＩタンパク質を発現する細胞または組織に薬物を運ぶためのターゲティングまたは輸送機構として間接的に用いてもよい。もう一つの局面において、本発明のペプチド、またはＰＨＩタンパク質をコードする核酸分子の相補体を発現するベクター、すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチドを、癌を治療または予防するために被験者に投与してもよい。
【０１８５】
本発明の複合体における分子間の相互作用の破壊または促進も同様に、治療技法において有用である。したがって、本発明は、ＰＨＩタンパク質またはその結合領域と結合パートナーとの相互作用を含むシグナル伝達経路における異常を特徴とする病態を有する被験者を治療する方法を特徴とする。この方法の態様において、相互作用は、ＰＨＩタンパク質もしくはＰＨドメイン結合領域とＰＨドメイン含有タンパク質もしくはＰＨドメイン；ＰＨＩタンパク質もしくはＩＲ結合領域と、ＩＲＳタンパク質ファミリーのタンパク質と相互作用する受容体；またはＰＨＩタンパク質もしくはＳＴＡＴ結合領域と、ＳＴＡＴ転写因子もしくはＰＨＩタンパク質と相互作用するその結合領域を含む。
【０１８６】
異常とは、本発明の複合体における相互作用分子間の相互作用の異常なレベルを特徴とする。異常は、シグナルの過剰な量、強度、もしくは期間、またはシグナルの過小な量、強度、もしくは期間を特徴としてもよい。シグナル伝達における異常は、細胞機能、生存率、または分化状態における異常として認識されうる。方法は、インビボでの相互作用（またはシグナル）、または本発明の複合体の活性の破壊または促進を含む。本発明の複合体を含むシグナル伝達経路における異常を特徴とする疾患または病態を治療するために有用な化合物を、複合体における分子間の相互作用に化合物が影響を及ぼす（すなわち、破壊または促進する）か否かを調べることによって同定することができる。化合物は、ＰＨＩタンパク質の産生を増加させることによって、ＰＨドメインの発現を増加させることによって、または複合体における分子の相互作用を促進することによって、相互作用を促進してもよい。化合物は、ＰＨＩタンパク質の産生を減少させることによって、ＰＨドメインの発現を予防することによって、または複合体における分子の相互作用を特異的に予防することによって、相互作用を破壊してもよい。
【０１８７】
本発明の一つの態様において、本発明のＰＨＩタンパク質、ペプチド、および複合体、本明細書記載の方法によって同定された物質、薬剤、または化合物、本発明の抗体、ならびにアンチセンス核酸分子を用いて、ＩＧＦＲシグナル伝達経路を調節する。ＩＧＦ−１は、ＩＧＦＲ、受容体チロシンキナーゼの刺激を通して細胞プロセスに多面発現性の影響を及ぼす。活性化されたＩＧＦ−１／ＩＧＦＲ系は、様々な細胞型において分裂促進、トランスフォーム、および抗アポトーシス特性を示す。ＩＧＦＲシグナル伝達系の調節障害は、乳腺、結腸、前立腺、精巣、および卵巣の癌の発症および転移性播種に関与することが判明した。ＩＧＦ−１Ｒの抗アポトーシス作用も同様に、化学療法剤に対する感受性の減少を媒介する可能性がある。
【０１８８】
したがって、本発明は、本発明のＰＨＩタンパク質、ペプチド、複合体、薬剤、抗体、物質、または化合物、好ましくは本発明のペプチド、最も好ましくはＰＨドメイン結合領域を含むまたは本質的にそれからなるペプチドを、ＩＧＦＲの腫瘍形成特性を減少させるために、またはＩＧＦ−１媒介形質転換を減少もしくは阻害するために有効な量で投与する段階を含む、被験者における腫瘍細胞の増殖および転移を予防および治療する方法を提供する。
【０１８９】
本発明のもう一つの局面において、ＰＨＩタンパク質をコードする核酸分子の相補体を発現するベクター、すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＩＧＦＲの腫瘍形成特性を減少させることによって、またはＩＧＦ−１媒介形質転換を減少もしくは阻害することによって、腫瘍細胞の増殖および転移を治療または予防するために有効な量で被験者に投与してもよい。
【０１９０】
本発明のさらにもう一つの局面において、本発明のＰＨＩタンパク質、ペプチド、複合体、または核酸分子、好ましくは本発明のペプチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を投与する段階を含む、被験者における前アポトーシス物質に対する腫瘍細胞の感受性を増加させる方法が提供される。有効量とは、前アポトーシス物質に対するＩＧＦ−ＩＲの前アポトーシス作用を減少させるために必要な量である。前アポトーシス物質の例には、タキソール、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンブラスチン、メソトレキセート、５’フルオロウラシル、カンプトテシン、ミトキサントン、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、およびパクリタキセルが含まれる。
【０１９１】
本発明のタンパク質、本明細書記載の方法によって同定されたペプチド、複合体、物質または化合物、本発明の抗体およびアンチセンス核酸分子は、他の適当な治療物質と組み合わせて投与されうる（上記の前アポトーシス薬物に関する考察を参照のこと）。併用治療において用いるために適当な物質を、従来の薬学的原理に基づいて当業者によって選択することができる。薬物の併用は、本明細書記載の病態の治療および予防を行うために相乗的に作用する可能性がある。併用治療を行うと、各薬剤のより低用量で治療の有効性が得られ、それによって、可能性がある有害な副作用を減少させることを可能にしうる。
【０１９２】
タンパク質、物質、抗体、複合体、ペプチド、薬剤、抗体、および化合物を、そのまま被験者に投与することができ、またはそれらはインビボでの投与に適した生物学的に適合する型で被験者に投与するための薬学的組成物に製剤化することができる。「インビボでの投与に適した生物学的に適合する型」とは、如何なる毒性作用よりも治療効果が勝る、投与される活性物質の型を意味する。本発明の薬学的組成物の治療的活性量の投与は、所望の結果を得るために必要な用量および期間で有効である量として定義される。例えば、物質の治療的活性量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重、そして抗体が個人において所望の反応を誘発できるか否かのような要因に従って変化してもよい。用量レジメを、最適な治療反応が得られるように調節してもよい。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または用量は、治療状態の緊急性によって示されるようにそれに合わせて減少させてもよい。
【０１９３】
薬学的組成物または組成物に含まれる活性物質を、ヒトおよび動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、およびサル）を含む被験者に投与してもよい。好ましくは、それらはヒトおよび獣医学での患者に投与される。
【０１９４】
活性物質を、注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与のような簡便な方法で投与してもよい。投与経路に応じて、活性物質は、物質を不活化する可能性がある酵素、酸、および他の天然条件の作用から物質を保護するために材料においてコーティングされうる。
【０１９５】
本明細書記載の組成物は、活性物質の有効量が薬学的に許容される溶媒との混合物において組み合わせられるように、薬学的に許容される組成物の調製に関する本質的に既知の方法によって調製することができる。適した溶媒は、例えば、「レミントンの製薬化学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ、１９８５）に記載されている。これに基づいて、組成物には、排他的ではないが、一つまたは複数の薬学的に許容される媒体または希釈剤に関連した活性成分の溶液が含まれ、組成物は適したｐＨを有し、生理的液体と等張である緩衝液中に含まれる。
【０１９６】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはワクシニアウイルス、パポバウイルス、アデノ随伴ウイルスに由来するベクター、トリ、マウスもしくはヒト起源のベクター、または様々な細菌プラスミドからのベクターを用いて、本発明の核酸分子を標的臓器または細胞集団に輸送してもよい。当技術分野で周知の方法を用いて、本発明の核酸分子（例えば、ＰＨＩＰをコードする核酸分子、ＰＨドメイン結合領域、またはアンチセンス核酸分子）を発現する組み換え型ベクターを構築してもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）およびＡｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載の技術を参照のこと）。
【０１９７】
完全長のｃＤＮＡ配列および／またはその調節エレメントを含む核酸分子によって、当業者は、遺伝子機能のセンス調節（Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ ＨおよびＨ Ｆ Ｌｏｄｉｓｈ、１９９３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：９８〜１０４）、またはアンチセンス調節（Ｅｇｕｃｈｉら（１９９１）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６０：６３１〜６５２）における試験ツールとしてＰＨＩタンパク質をコードする配列を用いることができる。そのような技術は当技術分野で周知であり、センスオリゴマーもしくはアンチセンスオリゴマー、またはより大きい断片を、コード領域または制御領域に沿って様々な位置から設計することができる。
【０１９８】
ＰＨＩタンパク質をコードする遺伝子を、本発明の所望の核酸分子の高いレベルを発現するベクターを細胞または組織にトランスフェクトすることによって、オフに切り替えることができる。そのような構築物は、翻訳されないセンス配列またはアンチセンス配列によって細胞を充満させることができる。ＤＮＡに組み入れられなくとも、そのようなベクターは、全てのコピーが内因性のヌクレアーゼによって無能となるまでＲＮＡ分子を転写し続ける可能性がある。遺伝子発現の改変は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の調節領域、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンに対してアンチセンスである分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを設計することによって達成することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、転写開始部位、例えばリーダー配列の−１０〜＋１０領域の間に由来する。アンチセンス分子はまた、それらが転写物がリボソームに結合しないように妨害することによってｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計されうる。また「三重らせん」塩基対形成方法論を用いても阻害が達成されうる。三重らせん塩基対形成によって、二重らせんはポリメラーゼ、転写因子、または調節分子が結合するために十分に開くことができない。三重ＤＮＡの治療的用途は、ジー（Ｇｅｅ）Ｊ Ｅら（Ｈｕｂｅｒ ＢＥおよびＢ Ｉ Ｃａｒｒ（１９９４）「分子的免疫学的アプローチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）」、Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｍｔ Ｋｉｓｃｏ、ＮＹ）によって論評されている。
【０１９９】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒する酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡとリボザイム分子とが配列特異的にハイブリダイズして、その後エンドヌクレオチド分解による切断を行うことによって作用する。したがって、本発明は本発明のタンパク質をコードする配列のエンドヌクレオチド分解による切断を特異的かつ効率よく触媒することができる操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子を考慮する。
【０２００】
ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を、以下の配列を含むリボザイム切断部位に関して標的分子をスキャンすることによって当初同定してもよい：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ。部位が同定されたら、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５リボヌクレオチド〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを操作不能にする可能性がある二次構造特徴に関して評価してもよい。候補標的の適切性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する到達度を調べることによって決定されうる。
【０２０１】
ベクターを細胞または組織に導入する方法には、本明細書に記載し、そしてインビボ、インビトロ、およびエクスビボの治療にとって適した方法が含まれる。本発明のベクターは、本発明のＰＨＩタンパク質または複合体が欠損している、または存在しないことを特徴とする遺伝子状態を修正するために被験者に投与してもよい。被験者の細胞集団も同様に、タンパク質または複合体の活性を調節するために、本発明のＰＨＩタンパク質、その結合領域、または複合体の改変型を導入することによって改変してもよい。細胞において本発明のＰＨＩタンパク質または複合体を阻害すれば、シグナル伝達経路事象を減少、阻害、または逆転させて、病態または疾患に至る可能性がある。ＰＨＩタンパク質の他の分子との相互作用能を保持するがシグナル伝達におけるその機能を保持することができないＰＨＩタンパク質の欠失またはミスセンス変異体を用いて、異常な、有害なシグナル伝達経路事象を阻害してもよい。
【０２０２】
本発明は、そのような技術を行うための細胞株およびトランスジェニックマウス（すなわち、ノックアウトマウス）を含む、ＰＨＩタンパク質関連遺伝子治療および遺伝子移入技術を行うための産物および方法を考慮する。トランスフェクトされた系列、ベクター、および標的の選択を、マウスモデルにおいて確認してもよい。
【０２０３】
エクスビボ治療に関して、患者から得て、同じ患者への自己移植のためにクローン的に増殖させた細胞に、ベクターを導入してもよい（例えば、米国特許第５，３９９，４９３号および第５，４３７，９９４号）。トランスフェクションおよびリポソームによる輸送は当技術分野で周知である。したがって、本発明は動物からの細胞を除去する段階、細胞に核酸分子を形質導入する段階、および形質導入した細胞を動物に再度移植する段階を含む、本発明の核酸分子を被験者に投与する方法を考慮する。
【０２０４】
本発明はまた、静脈内注射、筋肉内注射、または核酸分子のカテーテル挿入による直接輸送からなる方法の群から選択される、核酸分子を被験者に直接投与する段階を含む、インビボアプローチを用いて本発明の核酸分子を投与する方法を提供する。核酸は、ヒトタンパク質またはペプチドをコードしてもよく、核酸が投与される被験者はヒトであってもよい。核酸を裸のＤＮＡとして投与してもよく、またはウイルスベクターに含めてもよい。核酸分子を、ウイルスベクターを生じるパッケージング細胞を投与することを含む二成分系で投与してもよい。パッケージング細胞をインビトロで細胞に投与してもよい。
【０２０５】
本発明の核酸分子をまた、新しい技術がトリプレット遺伝コードおよび特異的塩基対相互作用のような特性を含むがこれらに限定されないような現在知られているヌクレオチド配列の特性に依存する限り、まだ開発されていない分子生物学技術において用いてもよい。
【０２０６】
本発明はまた、本発明のタンパク質の機能を調べるための方法を提供する。本発明の核酸分子または遺伝子の発現を欠損する、または発現を部分的に欠損する細胞、組織、またはヒト以外の動物を、遺伝子に特異的欠失または挿入変異を有する本発明の組み換え型発現ベクターを用いて開発してもよい。組み換え型発現ベクターを用いて、相同的組み換えによって内因性遺伝子を不活化または変化させて、それによって欠損細胞、組織、または動物を作製してもよい。
【０２０７】
ヌル対立遺伝子を、胚性幹細胞のような細胞における欠失変異によって作製してもよい。組み換え型遺伝子も同様に、遺伝子を不活化させる挿入変異を含むように操作してもよい。次に、そのような構築物を、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インジェクション等の技術によって胚性幹細胞のような細胞に導入してもよい。次に、無傷の遺伝子を欠損する細胞を、例えばサザンブロッティング、ノーザンブロッティングによって、または本明細書記載の方法を用いてコードされたタンパク質の発現に関するアッセイによって、同定してもよい。次に、そのような細胞を胚性幹細胞と融合させて、本発明のタンパク質を欠損する非ヒトトランスジェニック動物を作製してもよい。変異の生殖系列伝幡は、例えば胚性幹細胞を８細胞胚のような初期胚とインビトロで凝集させる段階、得られた胚盤胞をレシピエント雌性動物に移入する段階、および得られた凝集キメラの生殖系列伝幡を作製する段階によって行われうる。そのような変異体動物を用いて、通常遺伝子発現に依存する特異的細胞集団、発達パターン、およびインビボプロセスを明確にしてもよい。
【０２０８】
本発明はこのように、その生殖細胞と体細胞の全てがＰＨＩタンパク質をコードする遺伝子を不活化または変化させる組み換え型発現ベクターを含む、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。一つの態様において、本発明は、その生殖細胞と体細胞の全てがＰＨＩタンパク質をコードする遺伝子を不活化または変化させて、その結果ＰＨＩタンパク質関連病態を引き起こす組み換え型発現ベクターを含む、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。さらに、本発明は本発明のＰＨＩタンパク質を発現しない非ヒトトランスジェニック哺乳類を提供する。一つの態様において、本発明は、本発明のＰＨＩタンパク質を発現せず、その結果ＰＨＩタンパク質関連病態を引き起こす非ヒトトランスジェニック哺乳類を提供する。ＰＨＩタンパク質関連病態は、ＰＨＩタンパク質ホモ接合またはヘテロ接合変異体について認められた表現型を意味する。
【０２０９】
非ヒトトランスジェニック動物には、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヤギ、およびサル、好ましくはマウスが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１０】
本発明はまた、以下を含む、ＰＨＩタンパク質関連病態を減少させるまたは阻害する薬剤に関して調べるためのモデル系を提供する非ヒトトランスジェニック動物アッセイを提供する：
（ａ）本発明の非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する段階；および
（ｂ）上記の薬剤が、物質を投与していない段階（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物と比較して、非ヒトトランスジェニック動物において病態（例えば、ＰＨＩタンパク質関連病態）を減少させるまたは阻害するか否かを決定する段階。
【０２１１】
薬剤は、本明細書において考察するように、癌またはインスリン反応に関連した障害のような病態の治療および予防において有用でありうる。薬剤はまた、本明細書に記載された薬学的組成物に組み入れられうる。
【０２１２】
本発明のタンパク質、ペプチド、複合体、物質、薬剤、化合物、抗体、核酸分子、薬剤、および組成物の活性を、動物実験モデル系において確認してもよい。治療的有効性および毒性は、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）、またはＬＤ５０（集団の５０％において致死となる用量）統計値を計算することによるような、細胞培養または実験動物を用いた標準的な薬学的技法によって決定してもよい。治療指数は、治療効果対毒性効果の用量比であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表記することができる。大きい治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。
【０２１３】
以下の非制限的な実施例は本発明を例示するものである。
【０２１４】
実施例１
材料と方法：
抗体：
細菌のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＰＨＩＰ融合タンパク質に対する抗ＰＨＩＰ抗体を作製した（３８）。抗ＩＲＳ−１ＰＣＴ（アミノ酸１６個のプレＣ末端ポリペプチド配列に対して作製）を、アップステートバイオテクノロジーインク（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、ＵＢＩ）から購入した。モノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）および抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体は、バブコ（Ｂｕｂｃｏ）およびサンタクルズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からそれぞれ得た。抗ＣＡＴ抗体およびＢｒｄＵに対するマウス抗体は、５プライム−３プライムインク（５ ｐｒｉｍｅ−３ ｐｒｉｍｅ Ｉｎｃ．）およびシグマ社（Ｓｉｇｍａ）からそれぞれ購入した。ローダミン結合ファロイジンは、モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）から得た。抗トランスフェリン受容体はザイメッド社（Ｚｙｍｅｄ）から購入する。
【０２１５】
細胞成分分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）アッセイ：
１０ ｃｍ２皿において増殖させたＣＯＳ−７細胞（条件ごとに皿４枚ずつ）を、リン酸カルシウム法を用いて、ＨＡ−ＰＨＩＰをコードするｐＣＧＮプラスミドまたは空ベクター対照で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞から血清を１２時間〜１８時間枯渇させ、非処理のまま、またはインスリン１００ ｎＭによって５分間処理した。次に、細胞分画をわずかに改変を加えた先述の方法で調製した（２７）。技法は全て、０℃〜４℃で行った。簡単に説明すると、細胞を洗浄して、２０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５５ ｍＭショ糖、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ ｍＭ ＮａＦ、１００ μＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＰＰｉ、１０ μｇ／ｍｌアプロチニン、および１０ μｇ／ｍｌロイペプチンを含む氷冷緩衝液Ａにおいてモーター駆動性のテフロン／ガラスホモジナイザーを２０回作動させてホモジナイズした。ホモジネートを１６，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を４８，０００×ｇで１時間遠心分離し、続いて２５０，０００×ｇで遠心分離して低密度膜（ＬＤＭ）ペレットを高密度膜（ＨＤＭ）から精製した。最終的なＬＤＭペレットを、熱２×ＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁した。２５０，０００×ｇの遠心段階由来の上清を、５％Ｔｗｅｅｎ８０で予め１時間ブロッキングして水で十分に洗浄し、微量の任意の洗浄剤を除去したＵＦＶ２ＢＧＣ４０フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。免疫沈降およびイムノブロッティングを行った（３８）。
【０２１６】
レポーター遺伝子アッセイ：
ＣＯＳ細胞を、１試料あたり３個ずつ５Ｘ ＳＲＥ−ｆｏｓルシフェラーゼレポーター遺伝子（５Ｘ ＳＲＥ−ＬＵＣ）および表記のプラスミドで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞の血清を１６時間枯渇させた。血清枯渇細胞を、非処理のままか、またはＭｅｋ−１阻害剤（５０ μＭ、ＮＥＢ）によって２時間処理した。細胞をインスリン（０．２ μＭ、Ｓｉｇｍａ）の存在下または非存在下で１０時間インキュベートした。次に、細胞溶解物（Ｒｏｃｈｅ）においてルシフェラーゼ活性を分析して、タンパク質濃度を標準化した。
【０２１７】
マイクロインジェクションアッセイ：
グリッド付のカバーガラス上に播種しかつ血清を３０時間枯渇させた、インスリン受容体（ＮＩＨ／ＩＲ）を過剰発現するＲａｔ−１またはＮＩＨ／３Ｔ３細胞に、表記のプラスミドを５Ｘ ＳＲＥ−ＣＡＴレポーター遺伝子の存在下または非存在下でマイクロインジェクションした。レポーターアッセイに関して、注入の２時間後、細胞を０．５ μＭインスリンまたは血清（２０％）によって表示のように処理して、５時間インキュベートしてから固定した。分裂促進アッセイに関して、注入の３時間後、細胞を１０ μＭ ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ）によって処理した後、０．５ μＭインスリンまたは２０％血清のいずれかを加えた。細胞を３６時間インキュベートしてから固定した。次に、抗ＣＡＴ抗体および抗ＢｒｄＵ抗体を用いてレポーター遺伝子発現またはＤＮＡ合成レベルをそれぞれ分析した。
【０２１８】
ＧＬＵＴ４ｍｙｃ転位アッセイ：
Ｌ６ＧＬＵＴ４ｍｙｃ安定細胞株を、既に記載されているように作製した（４９〜５１）。カバーガラス上で増殖している細胞を、エフェクテンプロトコールマニュアル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、表記の構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの４３時間後、培養培地中の細胞から血清を枯渇させ、非処理のままか、または１００ ｎＭインスリンによって２０分間処理した。ｃＤＮＡ構築物の発現およびＧＬＵＴ４ｍｙｃ転位に関する間接的免疫蛍光を、既に記述されているように無傷の細胞について行った（５３）。少なくとも三つの異なる実験のいくつかの代表的な画像を、ＮＩＨ（米国国立衛生研究所）画像ソフトウェアを用いて定量した。ＧＬＵＴ４ｍｙｃ転位に関する未加工データは、非トランスフェクト細胞における表面ＧＬＵＴ４ｍｙｃの基礎レベルと比較した刺激倍数として表記した。統計分析を、分散分析によって行った（フィッシャー、多重比較）。
【０２１９】
アクチンの標識：
カバーガラス上で増殖しているＬ６ＧＬＵＴ４ｍｙｃ細胞を、非処理のままか、または１００ ｎＭインスリンによって１０分間処理した後、血清を枯渇させた。細胞を氷冷ＰＢＳ（１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ ７．４）によってすすいでから、３％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液によって３０分間固定した（４℃で５分間によって開始し、直ちに室温まで移行させた）。技法の残りは室温で行った。次に、細胞をＰＢＳによって１回洗浄し、未反応の固定液を１００ ｎＭグリシンのＰＢＳ溶液によって１０分間失活させた。透過性にした細胞（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液中で３分間）をＰＢＳによって速やかに洗浄して、５％ヤギ血清のＰＢＳ溶液によって１０分間ブロックした。繊維状アクチンを検出するために、細胞を暗所でローダミン結合ファロイジンと共に１時間インキュベートした。すすいだカバーガラスをＬｅｉｃａＴＣＳ ４Ｄ蛍光顕微鏡に載せて分析した（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｓｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０２２０】
結果：
ＩＲＳ−１ ＰＨドメインの機能的パートナーを同定する試みで、ラットＩＲＳ−１由来のＰＨドメインをおとりとして用いてマウスの１０．５日胚ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする、酵母のツーハイブリッドスクリーニングを用いた（５）。ＩＲＳ−１ ＰＨドメインと最も強い相互作用を示したｃＤＮＡクローンＶＰ１．３２の配列分析によって、２０１アミノ酸のオープンリーディングフレームが明らかとなった。次に、ＶＰ１．３２を用いて、ヒト胎児脳およびマウス胸腺ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして（７）ヒトおよびマウスのＰＨＩＰ（ｈＰＨＩＰおよびｍＰＨＩＰ）の完全なコード領域をそれぞれ得た。構造上の翻訳により、相対分子量１０４ ｋＤａの９０２アミノ酸のタンパク質が予測される（図１Ａ）。
【０２２１】
ＰＨＩタンパク質は、如何なる既知のタンパク質とも配列相同性を有しない。ＩＲＳ−１ ＰＨ結合領域（ＰＢＲ）はタンパク質のアミノ末端に存在する（残基５位〜２０９位）。それらが有する唯一の既知の構造モチーフは、分子の中心に縦列に存在する２つのブロモドメイン、すなわちＢＤ１（残基２３０位〜３４５位）およびＢＤ２（３８７位〜５０３位）である（図１Ｂ）。ブロモドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することが提唱されている約１００アミノ酸の保存配列である（８）。相同性検索によって、ＰＨＩＰ ＢＤ配列が、転写共活性化因子であるマウスＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）のブロモドメインと最も相同である（同一性４４％、相同性６１％）ことが判明した（９）。成体マウス組織由来のＰＨＩＰ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析は、その発現が広範囲に存在する大きさ約７．０ ｋｂの転写物を検出した。
【０２２２】
細菌のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＰＨＩＰ融合タンパク質に対して作製した抗体（Ａｂｓ）によるウェスタンブロット分析は、免疫前血清によって沈殿されないＵ２６６細胞溶解物由来の１０４ ｋＤタンパク質を同定した（図２Ａ）。哺乳類細胞抽出物におけるＰＨＩＰ発現のさらなる分析によって、二つの型のＰＨＩタンパク質、長い１０４ ｋＤ型と短い９７ ｋＤ型が存在することが判明した（図２Ｂ）。双方の部位を含む完全長のｈＰＨＩＰの異所発現によって、ＰＨＩＰイムノブロットにおいて二重線が得られたことから、９７ ｋＤと１０４ ｋＤのポリペプチドは、おそらく、二つの推定の転写開始部位（Ｍｅｔ １およびＭｅｔ ４１、図１を参照のこと）を交互に利用した結果によるものである。
【０２２３】
インビトロでのＰＨＩＰとＩＲＳ−１ ＰＨドメインとの相互作用を再現して、ＰＨドメイン結合の特異性を評価するために、酵母クローンＶＰ１．３２から単離した残基８位〜２０９位を含むＧＳＴ−ＰＨＩＰを用いて、ＩＲＳ−１由来の、ならびに無関係なシグナル伝達タンパク質ｍＳｏｓ１（Ｒａｓヌクレオチド交換剤）、Ｅｃｔ−２（Ｒｈｏ／Ｒａｃ交換剤）およびＲａｓＧＡＰ（ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質）由来のＰＨドメインの血液凝集素抗原（ＨＡ）タグ誘導体を発現する酵母細胞溶解物をプロービングした（１２）。相互作用タンパク質を、抗ＨＡ Ａｂｓによるウェスタンブロッティングによって分析した（図２Ｃ）。ＧＳＴ−ＰＨＩＰはＩＲＳ−１ ＰＨドメインに結合したが、他のタンパク質のＰＨドメインと明確な関連はなく、このことはＰＨＩＰがＩＲＳ−１ ＰＨドメインの特異的リガンドとして機能する可能性があることを示唆している。
【０２２４】
次に、機能的ＰＨドメインまたはドメイン内のより小さいモチーフがＰＨＩＰ結合に関与するか否かを調べるために、本発明者らは、ＰＨの結合を破壊するＩＲＳ−１ ＰＨドメインの独立した三つの変異体を作製した：ＰＨＮＴはＩＲＳ−１ ＰＨドメインの最初の半分を含みかつ残基３位〜６７位に及び；ＰＨＣＴは、Ｃ末端残基５５位〜１３３位を含み；ＰＨＷ１０６Ａは、全てのＰＨドメインにおいて保存されている残基である１０６位のトリプトファンがアラニンに変換されている変異体を定義する。予想されるように、ＣＯＳ−１細胞において一過的に発現された三つすべてのＰＨドメイン変異体は、ＧＳＴ−ＰＨＩＰに対して検出可能に会合せず、無傷のＰＨドメインがＰＨＩＰ結合にとって必要であるという考え方と一致した（図２Ｄ）。
【０２２５】
インビボでＰＨＩＰとＩＲＳ−１の相互作用を調べるために、ＮＩＨ／ＩＲ細胞（インスリン受容体を過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞）からの溶解物をＩＲＳ−１のＣ末端に対して作製された抗ＩＲＳ−１ Ａｂｓと共に免疫沈降させた。内因性のＰＨＩＰは、非刺激細胞およびインスリン処理細胞の双方においてＩＲＳ−１に会合することが判明した（図２Ｅ、レーン１および２）。対照的に、ＩＲＳ−１ ＰＨドメインに対して作製された抗体を類似の共免疫沈降アッセイにおいて用いると、相互作用は検出されず、ＩＲＳ−１のＰＨドメイン内の構造決定因子がＰＨＩＰに対する結合を付与することが確認された。ＰＨＩＰはまた、抗ＩＲＳ−２免疫沈降物においても検出され（図２Ｅ、レーン７）、ＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２のＰＨドメインがＩＲによる基質認識の促進において機能的に互換性であることが示されたという知見と一致する（４）。このように、ＰＨＩＰは、活性化ＩＲ複合体に対するＩＲＳタンパク質ファミリーのメンバーを動員するために保存された機能を有する可能性がある。ＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１ ＰＨ相互作用の調節に及ぼすインスリン結合の影響を評価するために、ＰＨＩＰ ＰＨ結合領域（ＰＢＲ）に対する抗体を、インスリン刺激によって誘導されたこの領域におけるコンフォメーションの変化を測定するための間接的なスコアとして用いた。ＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１免疫複合体は、免疫沈降アッセイにおいてＰＨＩＰ Ａｂｓを用いてインスリン処理細胞に限って認められた（図２Ｆ）。これらの結果は、ＰＨＩＰ ＰＢＲ領域とＩＲＳ−１タンパク質が細胞において安定に会合しているにもかかわらず、ＰＨＩＰ領域とＩＲＳ−１ ＰＨドメインとの接触面はインスリンによって調節されることを示している。これは、インスリン刺激の際に認められたＰＨＩＰ ＰＢＲ−ＩＲＳ−１ ＰＨ界面での構造的変化が、ＩＲＳ−１ ＰＴＢとリン酸化されたインスリン受容体との相互作用に影響を及ぼす可能性があることを示している。この考え方に一致して、ＩＲＳ−１ ＰＨドメインをアドレナリン受容体キナーゼおよびホスホリパーゼＣからの異種ＰＨドメインに置換すると、リン酸化されたＮＰＥＹペプチドに対する縦列のＰＴＢドメインの結合が損なわれる（４）。
【０２２６】
ＰＨＩＰ配列には可能性があるチロシンリン酸化部位がいくつか存在することから、インビボでＰＨＩＰがＩＲの基質として機能するか否かを調べた。ＰＨＩＰの抗ホスホチロシンイムノブロットは、ＰＨＩＰの任意の識別可能なＩＲ調節リン酸化も示さなかった（図２Ｆ）。しかし、ＰＨＩＰは、顕著な１０３ ｋＤリンタンパク質（すなわち、ＳＴＡＴ３）に誘導的に会合した。
【０２２７】
ＩＲによって媒介される初期のシグナル伝達事象の一つは、ＭＡＰキナーゼの活性化である（１４）。その上、多くの細胞において、ＩＲＳ−１細胞は、インスリン刺激の際のＭＡＰキナーゼ活性化の上流メディエータであることが示されている。ＩＲＳ−１媒介ＭＡＰキナーゼ活性化に及ぼすＰＨＩＰの作用を評価するために、ＩＲＳ−１ ＰＨドメインに関して内因性のＰＨＩＰと競合することによって主に阻害的に機能すると予測されている、ＩＲＳ−１ ＰＨＩＰ ＰＢＲ領域（残基８位〜２０９位）のみをコードする血液凝集素抗原（ＨＡ）タグＰＨＩＰ構築物を用いた。実際、異所発現されたドミナントネガティブＰＨＩＰ（ＤＮ−ＰＨＩＰ）は、非処理およびインスリン刺激された細胞溶解物の双方において内因性のＩＲＳ−１に結合する（図４Ａ、パネル３）。ＣＯＳ細胞に、ＤＮ−ＰＨＩＰおよびＨＡタグｐ４４ＭＡＰＫを同時トランスフェクトして、血清枯渇させてインスリン刺激を行った細胞溶解物からの抗ＨＡ免疫複合体をミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）基質を用いてインビトロキナーゼアッセイを行った。図４Ｄに示すように、インスリン刺激ＭＡＰキナーゼ活性化は、ＤＮ−ＰＨＩＰ発現によって基礎レベルまで減少した。予想されるように、ＳＨＣリン酸化は、ＤＮ−ＰＨＩＰの作用に対して反応しないままで、これらの細胞において、ＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１シグナル伝達経路がインスリン刺激の際のＭＡＰキナーゼ活性化を促進するために必須であることを示唆している。インスリン媒介転写反応においてＰＨＩＰの関与を評価するために、ヒトｃ−ｆｏｓプロモーター（１５）由来の血清反応性要素（ＳＲＥ）５コピーを含む合成レポーターである５Ｘ ＳＲＥ−ＬＵＣからの転写の誘導能を調べた。ＣＯＳ−１細胞に５Ｘ ＳＲＥ−ＬＵＣレポーター遺伝子および増加量のｈＰＨＩＰを一過的にトランスフェクトすると、非処理細胞における転写の基礎レベルが用量依存的に増加し、これはインスリンに対する反応によってさらに増強された（図３Ａ）。ＰＨＩＰ改変遺伝子発現の下流のエフェクターとしてのＭＡＰキナーゼ経路の相対的重要性を調べるために、Ｍｅｋ１阻害剤であるＰＤ９８０５９を用いてＭＡＰキナーゼ活性化を阻害した（１７）。ＰＤ９８０５９に対するリガンド依存的ＰＨＩＰ ＳＲＥ−ＬＵＣトランス活性化の完全な感受性は、ＭＡＰキナーゼカスケードがインスリン刺激ＰＨＩＰ転写反応の重要な成分であることを示唆している。
【０２２８】
ＰＨＩＰのインスリン反応増強能にＩＲＳ−１ ＰＨ結合が必要であるか否かを決定するために、ＰＨＩＰ刺激ＳＲＥ−ＬＵＣトランス活性化に及ぼすＮ末端ＩＲＳ−１ ＰＨドメイン（ＩＲＳ−ＲＨ）を過剰発現する効果を評価した。ＩＲＳ−ＰＨの発現が増加すると、ＰＨＩＰシグナルが進行的に遮断され、このことは、ＰＨＩＰとＩＲＳ−１間のＰＨドメイン指示相互作用がＰＨＩＰ誘導遺伝子発現にとって必要であることを示している（図３Ｂ）。ＩＲＳ−１の過剰発現は、この阻害を用量依存的に克服して、このことは、ＩＲＳ−１ ＰＨドメインがＰＨＩＰ複合体形成に関して野生型ＩＲＳ−１と競合することを示している（図３Ｃ）。
【０２２９】
遺伝子発現に関するＩＲＳ−１／ＰＨＩＰ相互作用の生理的重要性をさらに確立するために、ＨＡタグＤＮ−ＰＨＩＰをインスリン反応性Ｒａｔ−１線維芽細胞にマイクロインジェクションした。レポータープラスミド５Ｘ ＳＲＥ−ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をマイクロインジェクションした親Ｒａｔ−１線維芽細胞をインスリンおよび血清処置すると、ＣＡＴタンパク質の発現が得られ、これは抗ＣＡＴ Ａｂｓによる免疫蛍光染色によって容易に検出可能である。しかし、ＨＡタグＤＮ−ＰＨＩＰを発現する構築物を同時注入した細胞はインスリン刺激ＣＡＴ発現を遮断したが血清刺激ＣＡＴ発現を遮断せず、このことは、ＰＨＩＰが遺伝子発現を調節するためにＩＲによって用いられるシグナル伝達経路の重要な成分であることを示している。これは、ＤＮ−ＰＨＩＰがインスリン処理細胞においてＭＡＰキナーゼ活性化に顕著な阻害作用を及ぼすという知見と一致する。ＩＲＳ−１をＤＮ−ＰＨＩＰと同時注射すると、ＳＲＥ−ＣＡＴ発現を完全に回復させるため、ＩＲＳ−１がインスリンシグナル伝達経路においてＰＨＩＰの下流に存在するという考察がさらに支持される。
【０２３０】
これまでの研究から、インスリンの増殖刺激効果がＩＲＳ−１とは無関係であることが示されている（１９、４５）。ＩＲＳ−１媒介分裂促進シグナル伝達におけるＰＨＩＰの役割を調べるために、ＤＮ−ＰＨＩＰを、ＩＲを過剰発現する線維芽細胞（ＮＩＨ／ＩＲ）にマイクロインジェクションして、新たに合成されたＤＮＡへの５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みに及ぼすその影響を調べた。血清の増殖刺激作用は、ＤＮ−ＰＨＩＰのマイクロインジェクションによって影響を受けないが、ＤＮＡ合成のインスリンによる刺激は、ＤＮ−ＰＨＩＰを注入したＮＩＨ／ＩＲ細胞において著しく減弱され、これはＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１ＰＨ相互作用がインスリンの増殖作用の促進において必須であるという考え方と一致する。
【０２３１】
ＤＮ−ＰＨＩＰがインスリン媒介遺伝子発現およびＤＮＡ合成を阻害する機構を確立するために、ＤＮ−ＰＨＩＰがインスリンに反応してＩＲＳ−１リン酸化を破壊するか否かを調べた。ＤＮ−ＰＨＩＰの一過性の発現は、インスリン処理細胞においてＩＲＳ−１チロシンリン酸化を有意に抑制した（＞５倍）が、完全長のＰＨＩＰは抑制しなかった。ＩＲＳ−１リン酸化の減少が受容体機能の妨害を通して起こるか否かを確認するために、免疫沈降したＩＲと活性化ＩＲの直接の基質であるＳｈｃとのホスホチロシンレベルの変化を調べた。結果は、ＩＲＳ−１チロシンリン酸化レベルの減少が少なくとも二倍の細胞バックグラウンドにおいてＩＲキナーゼ活性の阻害に帰因しなかったことを示した。次に、インスリン受容体とＰＨＩＰとの関連を調べた。同時免疫沈降アッセイは、ＩＲ免疫複合体においてＰＨＩＰを検出することができなかった。
【０２３２】
類似の結果は、ＩＲとＩＲＳ−１またはＳＨＣアダプターのいずれかとの関連について既に報告されており、ＩＲ／エフェクター相互作用が本来弱いまたは一過性であり、受容体免疫複合体において検出されないことを示唆している（７３〜７５）。
【０２３３】
脂肪および筋細胞に及ぼすインスリン作用の主な代謝的作用の一つは、グルコース輸送体であるＧＬＵＴ４の細胞内区画から細胞質膜への再分布を誘導することによるグルコース取り込みの調節である（４４）。ＩＲＳ−１上のホスホチロシン部位へのその動員を通してのＰＩ３−キナーゼのｐ８５／ｐ１１０イソ型の活性化は、インスリン刺激されたＧＬＵＴ４転位の必要な成分である（４５、４６）。このプロセスにおけるＩＲＳ−１の役割に関してはいくぶん議論が分かれており、ＩＲＳ−１チロシンリン酸化は、ＧＬＵＴ４輸送に如何なる影響も及ぼさずに遮断されうることを示す研究もある（４７〜４８）。ＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１複合体が、筋肉細胞においてＩＲをＧＬＵＴ４輸送に連結させるシグナル伝達経路に関与するか否かを調べるために、ｍｙｃタグＧＬＵＴ４構築物を安定に発現するＬ６筋芽細胞（Ｌ６ＧＬＵＴ４ｍｙｃ）（４９〜５１）を、野生型または優性干渉型のＰＨＩＰまたはＩＲＳ−１のいずれかで一過的にトランスフェクトした。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡとの同時発現を用いて、トランスフェクトした細胞を容易に認識できるようにした。これまでに示されているように、Ｌ６ＧＬＵＴ４ｍｙｃ筋芽細胞をインスリンによって処理して、外表面ｍｙｃエピトープの免疫蛍光標識によって検出すると、細胞表面のＧＬＵＴ４ｍｙｃが２倍増加した（５２、５３）。ＤＮ−ＰＨＩＰの異所発現は、ＰＩ ３−キナーゼのｐ８５サブユニット（Δｐ８５）のドミナントネガティブ変種について認められたものと同一のように、インスリン依存的ＧＬＵＴ４ｍｙｃ膜転位のほぼ完全な阻害を引き起こした（＞９０％）（４５、５４）。非刺激細胞における細胞表面ＧＬＵＴ４ｍｙｃの内容はＰＨＩＰ変異体によって変化しなかったため、ＤＮ−ＰＨＩＰの作用はインスリン刺激状態に対して特異的であった。ＩＲＳ−１ ＰＨドメインをコードするプラスミドからの発現も同様に、ＤＮ−ＰＨＩＰによって誘導されたものよりいくぶん弱かった（６０％）ものの、インスリン依存的ＧＬＵＴ４ｍｙｃ転位に有意な減少を引き起こした。不完全な阻害は、ＩＲＳ−１機能を部分的に代用する可能性がある他のＩＲＳタンパク質の存在によって部分的に説明される可能性がある。対照的に、完全長のＰＨＩＰも完全長のＩＲＳ−１もＧＬＵＴ４ｍｙｃ再分布において測定可能な変化を引き起こさなかった。併せて考慮すると、これらの結果は、ＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１複合体形成は、筋細胞におけるインスリンの代謝作用を促進するためには必要であるが十分ではないという考え方を支持する。
【０２３４】
最近の証拠から、ＧＬＵＴ４含有小胞に対するＰＩ ３−キナーゼのインスリン依存的再分布のみならず、ＧＬＵＴ４の細胞表面への動員を促進するために、アクチンマイクロフィラメントネットワークが関与する可能性があることが指摘されている（５５〜５７）。これまでの報告から、インスリン刺激アクチン細胞骨格再配列にとって機能的ＩＲＳ−１が必要であることが証明されているという事実を考慮して（４７）、このプロセスにおけるＰＨＩＰの役割を調べた。ローダミン結合ファロイジンを用いて、野生型ＰＨＩＰまたはＤＮ−ＰＨＩＰのいずれかを異所発現するＬ６ＧＬＵＴ４ｍｙｃ細胞における繊維様アクチンのパターンの変化を検出した。基礎状態でのアクチン染色は、細胞の縦方向の軸に沿って流れる繊維様パターンを示し、インスリン刺激によって筋繊維質全体に密な構造へのアクチンの著しい再構築が認められた。この効果は、ＤＮ−ＰＨＩＰの発現によって劇的に減少したが、空ベクターまたは野生型ＰＨＩＰでは減少しなかった。興味深いことに、野生型ＰＨＩＰの過剰発現は、基礎条件においてもアクチン細胞骨格のリモデリングを誘導するように思われた。併せて考慮すると、細胞骨格のリモデリングを促進し、筋細胞の細胞質膜表面でＧＬＵＴ４小胞の取り込みを伴うインスリン依存的プロセスの調節にＰＨＩＰが関係していることを明らかに示している。
【０２３５】
細胞の区画化およびＩＲＳ−１の細胞内移動は、それがインスリン反応を誘導できるために必須である（３０）。これまでの報告は、基礎条件では、インスリン受容体は細胞質膜に主に存在するが、ＩＲＳ−１分子の約３分の２は、ＬＤＭに会合し、３分の１は細胞質内に分布していることを示している（２７〜３０、５８）。培養脂肪細胞からのＬＤＭの生化学的分析は、ＩＲＳ−１がこの分画において膜に会合せず、むしろアクチンを含む細胞骨格エレメントに非常に富む不溶性のタンパク質マトリクスであるように思われるものに会合していることを示している（５７、５９）。ＰＨＩＰがＩＲＳ−１に安定に会合すると仮定すると、ＰＨＩＰがＬＤＭにおいてＩＲＳ−１と同時に存在するか否かを調べた。Ｌ６筋芽細胞における内因性ＩＲＳ−１および異所発現されたＩＲＳ−１のイムノブロット分析は、強い免疫反応シグナルを示すことができないため、異種の系を用いてＰＨＩＰとＩＲＳ−１の細胞分布を調べた。ＣＯＳ−７細胞の免疫蛍光顕微鏡から、ＰＨＩＰとＩＲＳ−１とが細胞質に免疫学的に存在することが示された（データは示していない）。その上、図５Ａに示すように、ＣＯＳ−７細胞の細胞成分分画を行うと、チロシンリン酸化されたＩＲＳ−１がＬＤＭ画分とサイトゾルの間に分布することが判明し、これまでに脂肪細胞において認められたＩＲＳ−１の分布と一致した。重要なことに、ＣＯＳ−７細胞において異所発現されたＨＡ−ＰＨＩＰは、主にＬＤＭ画分においてＩＲＳ−１と同時に局在することが判明した（図５Ａ）。さらに、インスリン処理は、ＬＤＭからサイトゾルへとＰＨＩＰの細胞内位置を検出可能に変化させなかった。したがって、ＰＨＩＰは、ＩＲＳ−１ ＰＨドメインとの会合を通して、ＩＲＳ−１タンパク質をＬＤＭ区画における細胞骨格エレメントにつなぐ働きをする推定のＩＲＳ−１結合成分を表す可能性がある。
【０２３６】
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における生化学研究は、ＩＲＳ−１がＬＤＭ区画において選択的にチロシンリン酸化されることを示している（２７、５８）。さらに、インスリン処理は、セリン／トレオニン（Ｓ／Ｔ）残基上での過リン酸化によってＩＲＳ−１の電気泳動移動度の著しい遅延を誘導し、これはＬＤＭからサイトゾルへのＩＲＳ−１の放出の引き金となる（２７、２８、５８、６０、および６１）。これによって、ＩＲＳ−１のＳ／Ｔリン酸化がＩＲＳ−１／ＬＤＭ相互作用を調節するという仮説が得られた。ＰＨＩＰがＬＤＭにおいてＩＲＳ−１と共に分離しかつＩＲ媒介ＩＲＳ−１チロシンリン酸化を調節することがわかっているので、ＩＲＳ−１ Ｓ／Ｔリン酸化に及ぼすＰＨＩＰ過剰発現の影響を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってＩＲＳ−１の電気泳動特性をモニターすることによって調べた。基礎条件において、異所発現されたＰＨＩＰの増加量は、ＩＲＳ−１の電気泳動移動度の用量依存的な増加を誘導した（図５Ｂ）。ＩＲＳ−１の低リン酸化型はＬＤＭ画分との会合の増加を示すので（２８、５８）、データはＰＨＩＰの過剰発現が、ＩＲＳ−１のＬＤＭ区画への分離を増強するＳ／Ｔリン酸化事象を調節する可能性があることを示唆している。対照的に、ＰＨＩＰトランスフェクタントの急性インスリン刺激（５分間）は、ＩＲＳ−１の移動度の有意な遅延を生じ、これはＩＲＳ−１のホスホ−Ｓ／Ｔ含有量の増加と一致した。このシフトは、典型的に持続的なインスリン処理によって認められた（１５分間〜６０分間）（２７、５８、および６２）。重要なことに、チロシンリン酸化ＩＲＳ−１の量は、タンパク質レベルに関して正常化すると、最も高いＰＨＩＰ発現においてわずかに増加したもののほとんど一定のままであった。これらの知見は、ＩＲＳ−１ Ｓ／Ｔ残基のＰＨＩＰ依存的リン酸化が、下流のシグナル伝達事象に対して正の調節作用を誘発する可能性があることを示している。最近の研究は、インスリン刺激ＰＫＢによるＩＲＳ−１のＰＴＢドメイン内のセリン残基のリン酸化によって、ＩＲＳ−１タンパク質がタンパク質チロシンホスファターゼの急速な作用から保護されて、それによって、セリンリン酸化されたＩＲＳ−１タンパク質がそのチロシンリン酸化活性化立体構造を維持できることが判明した（６３）。
【０２３７】
考察
これらの結果は、インスリン媒介分裂誘発および代謝反応の双方において明確な生理学的役割を有するＩＲＳ−１ ＰＨドメインのタンパク質リガンドを同定する最初のものである。ＰＨＩＰのドミナントネガティブＮ末端切断変異体であるＤＮ−ＰＨＩＰが記述されており、これはインスリン誘導転写および増殖反応を強く阻害する。血清誘導トランス活性化およびＤＮＡ合成はＤＮ−ＰＨＩＰによって影響を受けないことから、この阻害はインスリンに対して著しく特異的である。その上、この阻害はＩＲＳ−１の同時発現によって克服される。併せて考慮すると、データは、ＩＲＳ−１ ＰＨドメインとの相互作用に関係するＰＨＩＰの領域は、ＩＲＳ−１タンパク質からＩＲを分離させ、その後インスリンの増殖促進反応に対する感受性を減少させることを示している。
【０２３８】
インスリン作用におけるＩＲＳ−１タンパク質のグルコース輸送に及ぼす役割はあまり明らかではない。いくつかの証拠が、ＧＬＵＴ４外面化にＩＲＳ−１が関与していることを支持している。例えば、ラットＩＲＳ−１に対するアンチセンスリボザイムを発現させると、インスリンに反応したラット脂肪細胞の細胞質膜へのＧＬＵＴ４の転位が有意に減少する（６４）。その上、受容体キナーゼ活性を変化させないがＩＲＳ−１結合およびリン酸化にとって重要なＩＲ Ｔｙｒ９６０の変異は、グルコース輸送を消失させた（６５〜６７）。しかし、これらの知見とは対照的に、他の報告は、抗ＩＲＳ−１抗体のマイクロインジェクションまたはＩＲＳ−１の優性阻害ＰＴＢドメインの発現は、線維芽細胞においてインスリンの分裂誘発作用を遮断することができるが、培養脂肪細胞におけるＧＬＵＴ４の移動は遮断することができないことを示している（４７、６８）。脂肪細胞における結果の解釈は、ＩＲＳ−１チロシンリン酸化のみならずＩＲキナーゼ活性がほぼ完全に阻害されるにもかかわらず、グルコース取り込みがＩＲＳ−１ ＰＴＢ発現細胞において減少せずに進行するという知見によって混乱している（６８）。
【０２３９】
本研究において、筋細胞におけるグルコース輸送体の転位にＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１複合体が関与していることに関する強い根拠が提供される。効率のよいＩＲ／ＩＲＳ−１タンパク質相互作用、およびしたがってＩＲＳ−１からＰＩ ３−キナーゼへの生産的なシグナル伝達を妨害することが知られているＰＨＩＰまたはＩＲＳ−１構築物を用いると、Ｌ６筋芽細胞におけるインスリン刺激ＧＬＵＴ４転位を妨害することができる。その上、この阻害はＩＲの自己リン酸化状態の変化と一致しない。データはまた、筋細胞においてＰＨＩＰまたはＩＲＳ−１のいずれかのみを過剰発現させても、細胞質膜表面へのＧＬＵＴ４の輸送を促進するために十分ではなかったことを示している。これは、ＰＩ ３−キナーゼのようなＩＲＳ−１会合シグナル伝達エフェクターの活性化は、必要ではあるがＧＬＵＴ４活性化にとって十分ではないことを示す他の知見と一致する。特に、ＰＤＧＦおよびＩＬ４のような増殖因子は、インスリンと同程度に効率よくＰＩ ３−キナーゼを活性化することができるが、インスリン感受性細胞におけるグルコース輸送を刺激することができないままである（６９、７０）。考えられる一つの説明は、さらなるＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１／ＰＩ ３−キナーゼ非依存的経路がＧＬＵＴ４細胞内経路を協調させるために必要であるということである。実際に、最近の証拠は、フロチリン／ＣＡＰ／ＣＢＬ複合体を細胞質膜においてＩＲ会合脂質のいかだ（ｒａｆｔ）に動員する新規インスリン反応経路が存在することを指摘しており、これはインスリン受容体活性化後に細胞表面へのＧＬＵＴ４のドッキングを増強すると考えられている事象である（７１）。
【０２４０】
グルコース輸送に関するインスリンシグナル伝達の特異性を説明するために一般的に考えられる見解は、生物学的特異性が、シグナル伝達中間体の細胞区画レベルで付与されるという点である。実際に、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞およびＩＲ過剰発現ＣＨＯ細胞における細胞成分分画試験は、活性化ＰＩ ３−キナーゼ複合体がインスリン処理後のＬＤＭにおいて主に認められるが、一方で同じ細胞においてＰＤＧＦに反応したＰＩ ３−キナーゼの活性化は細胞質膜で起こることが判明した（５８、５９）。同様に、細胞内分布パターンの差は、ＩＲＳタンパク質ファミリー（ＩＲＳ１−ＩＲＳ４）の四つのメンバーにおいて報告されており、インビボで最終的にその機能的特異性に関与する可能性がある下流のシグナル伝達エレメントへの関与能の差を説明する可能性がある（２８、２９、７２）。細胞成分分画がＩＲＳシグナル伝達にとって重要であるという考え方を支持して、ＣＡＡＸ改変ＩＲＳ−１の移動の変化および強い膜会合は、インスリンシグナル伝達を劇的に障害することが証明されている。その上、本研究に基づいて、ＬＤＭ区画にＰＨＩＰとＩＲＳ−１とが同時に局在することは、ＩＲシグナル伝達に及ぼすＰＨＩＰの阻害作用の選択性および特異性における重要な決定因子となる可能性がある。
【０２４１】
内部低密度ミクロソーム画分へのＩＲＳ−１の分離に関する分子的基礎は不明である。一つの明白な候補はＩＲＳ−１ ＰＨドメインである。これまでの研究は、リン脂質に結合させることによる細胞膜へのタンパク質のターゲティングにおけるＰＨドメインの重要性を証明した（３３）。しかし、これらの相互作用の大部分は弱く、非選択的で、ＰＨドメインターゲティング機能の特異的細胞リガンドが存在することを示唆している。
【０２４２】
ＰＨＩＰは、ＬＤＭにおける細胞骨格要素に対してＩＲＳ−１を分離するための分子的足場構造として作用する可能性がある。これを支持するいくつかの知見がある。第一に、ＩＲＳ−１の大部分は膜成分に結合せずにむしろＬＤＭにおける不溶性のタンパク質マトリクスに結合している。このことはＩＲＳ−１が他のタンパク質（複数）と特異的に会合することによってこの位置を維持しなければならないことを示している。第二に、ＬＤＭのこのＴｒｉｔｏｎ不溶性画分は、沈降分析および電子顕微鏡によって決定されるアクチン細胞骨格の有意な画分を含む（５７、５９）。第三に、ＰＨＩＰは基礎条件でＬＤＭにおいてＩＲＳ−１と安定に会合して同時分画される。最後に、ＰＨＩＰの異所発現は筋繊維質の不連続な部位において繊維様のアクチン再構築を誘導することができ、アクチン集合の空間的制御にＰＨＩＰが関与していることを示している。これらのデータを併せて考慮すると、ＰＨＩＰはＩＲＳ−１ ＲＨドメインとの直接会合を通して、ＬＤＭにおける細胞骨格成分にＩＲＳ−１分子をつなぐことを調節する可能性があることを示唆している。このように、ＰＨＩＰはＩＲに富む脂質のいかだに非常に近位の細胞骨格足場構造にＩＲＳ−１タンパク質を予め集合させるために重要である可能性があり、受容体ライゲーションの後ＩＲＳ−１基質認識において速度論の長所を提供する。その上、ＰＨＩＰの異所発現はＩＲＳ−１タンパク質のＳ／Ｔリン酸化状態を調節するという知見は、ＬＤＭとサイトゾルの間のＩＲＳ−１の細胞内経路を調節することが知られている機構であり、ＰＨＩＰが同様に、ＩＲＳ−１のＩＲへのアクセスを終了させることによってインスリンシグナルの一時的な脱感作または抑制に関係する可能性があることを示唆している。ＩＲＳ−１のホスホ−Ｓ／Ｔ含有量に及ぼすＰＨＩＰ過剰発現のインスリン調節可能な効果は、キナーゼの活性化および／またはＩＲＳ−１に作用するセリン／トレオニンホスファターゼの阻害による可能性がある。
【０２４３】
結論として、ＰＨＩＰはＩＲＳ−１ ＰＨドメインの新規生理学的タンパク質標的を表し、これは、ＩＲＳ−１機能の特異性および選択性において極めて重要な役割を果たすＩＲＳ−１タンパク質複合体の空間的かつ時間的細胞内局在を調節することによって、ＩＲカップリングに寄与する可能性がある。
【０２４４】
実施例２
ＧＳＴおよびＨＩＳタグベクターの双方においてＤＮ−ＰＨＩＰの変異体を作製した。変異体の配列は以下の通りである。
ＤＮ−ｍＰＨＩＰ（アミノ酸５〜２０９位）（配列番号：６６）
2004524802.tif 000003
変異体ＤＮ−ｍＰＨＩＰ＃１（アミノ酸５位〜１７０位）（配列番号：６７）
2004524802.tif 000004
変異体ＤＮ−ｍＰＨＩＰ＃２（アミノ酸１９位〜１７０位）（配列番号：６８）
2004524802.tif 000005
変異体は、細菌において発現されると不溶性となった。このことは、これらの小さなＮ末端およびＣ末端の欠失が、ＰＢＲタンパク質モジュールの構造的完全性を乱すことを示している。
【０２４５】
本明細書に記載した特定の態様は、本発明の一つの局面の単なる説明を意図しており、機能的に同等な任意の態様が本発明の範囲に含まれるため、本発明はそのような態様によってその範囲を制限されるものではない。実際に、本明細書において示され説明された改変に加えて本発明の様々な改変が、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２４６】
本明細書において言及した全ての出版物、特許および特許出願は、本発明に関連して用いられうる、それらに報告されている細胞株、ベクター、方法論等を説明および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。本明細書において、先行発明の特徴により、本発明がそのような開示に穿孔する権利を持たないと認めていると解釈されるべきではない。
【０２４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、特に明記しない限り、単数形「一つの（ａおよびａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には、複数形が含まれることが留意されるべきである。したがって、例えば「宿主細胞」という言及には、そのような宿主細胞の複数が含まれ、「抗体」という言及には、当業者に既知の一つまたは複数の抗体およびその同等物が含まれる。
【０２４８】
参考文献および脚注
2004524802.tif 000006
2004524802.tif 000007
2004524802.tif 000008
2004524802.tif 000009
2004524802.tif 000010
【図面の簡単な説明】
本発明を、以下の図面に関連して説明する。
【図１】ＰＨＩＰの推定アミノ酸配列と略図を示す。（Ａ）マウス（ｍ）およびヒト（ｈ）のＰＨＩＰ配列のアラインメント。（Ｂ）ＰＨＩＰには二つのブロモドメインである、ＢＤ１（２３０位〜３４５位）およびＢＤ２（３８７位〜５０３位）が存在する。酵母クローンＶＰ１．３２から単離したＰＨＩＰ ＩＲＳ−１／ＰＨ結合領域（ＰＢＲ）（アミノ酸８位〜２０９位）を下線で示す。
【図２】ＰＨＩＰがインビトロおよびインビボの双方においてＩＲＳ−１に会合することを示すブロットである。（Ａ）ＰＨＩＰは、見かけの分子量１０４ ｋＤで移動する。ＰＨＩＰを多数の骨髄腫Ｕ２６６細胞溶解物によって免疫沈降させて、抗ＰＨＩＰ抗体（Ａｂｓ）によってイムノブロットした（１０）。（Ｂ）抗ＰＨＩＰにおいて観察された二つの型のＰＨＩＰ（９７ ｋＤおよび１０４ ｋＤ）は、Ｕ２６６、ヒトＡ４３１類表皮癌、Ｒａｔ−２およびマウスＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞の細胞溶解物から免疫沈降する。（Ｃ）ＰＨＩＰはＩＲＳ−１ ＰＨドメインとインビトロで選択的に相互作用する。ＩＲＳ−１、ＳＯＳ１、ＥＣＴ−２、またはＲａｓ−ＧＡＰ（ＧＡＰ）のいずれか由来のＨＡタグＰＨドメインを発現する酵母の細胞溶解物を、固定化ＧＳＴ−ＰＨＩＰ融合タンパク質と混合して、複合体を抗ＨＡ Ａｂｓを用いるウェスタンブロット分析に供した（１３）。（Ｄ）ＩＲＳ−１ ＰＨドメイン変異体のＰＨＩＰへの結合。左、一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞の全細胞溶解物（５０ μｇ）からのＨＡタグＩＲＳ−１ ＰＨドメイン変異体の免疫検出。ＰＨＷＴ（ＩＲＳ−１ ＰＨドメイン残基３位〜１３３位）、ＰＨＮＴ（残基３位〜６７位）、ＰＨＣＴ（残基５５位〜１３３位）、ＰＨＷ１０６Ａ（全てのＰＨドメインにおいて保存されていたＴｒｐ１０６残基をＡｌａに変更した）；右、表記のＩＲＳ−１ ＰＨドメイン変異体を発現する細胞溶解物（５００μｇ）を、ＧＳＴまたはＧＳＴ−ＰＨＩＰ（ＰＢＲ）タンパク質のいずれかと混合して、（Ｃ）のように処置した。（Ｅ）ＰＨＩＰは、インビボでＩＲＳ−１と安定に会合する。血清枯渇ＮＩＨ／ＩＲ細胞を、刺激しない、またはインスリン（２μＭ）によって５分間刺激した。細胞溶解物を抗ＩＲＳ−１ＰＣＴ Ａｂｓ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、ＵＢＩ）、抗ＩＲＳ−１ＰＨ Ａｂｓ、または抗ＰＨＩＰ Ａｂｓによって免疫沈降させ、表記のように、抗ＰＨＩＰ−１ Ａｂｓまたは抗ＩＲＳ−１ＰＣＴ Ａｂｓによるウェスタンブロッティングに供した。抗ＩＲＳ−２ Ａｂｓを用いて、非同期細胞からＩＲＳ−２／ＰＨＩＰ複合体を同時免疫沈降させた。（Ｆ）ＰＨＩＰはＩＲの基質ではない。ＰＨＩＰを、ＰＢＲ領域に対して作製した抗ＰＨＩＰ Ａｂｓを用いて、非処理の、およびインスリン処理した、ヒト腎２９３細胞抽出物から免疫沈降させた。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解して、抗ホスホチロシンＡｂｓ（抗ｐＴｙｒ、ＰＹ２０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によってイムノブロットした。ブロットを剥離して、抗ＩＲＳ−１ＰＣＴ Ａｂｓまたは抗ＰＨＩＰ Ａｂｓのいずれかによってリプローブ（ｒｅｐｒｏｂｅ）した。星印によって示される１０３ ｋＤのリンタンパク質はＳＴＡＴ３を表す可能性が高い。
【図３Ａおよび図３Ｂおよび図３Ｃ】インスリンのシグナル伝達に及ぼすＰＨＩＰの影響を示すグラフである。（Ａ）ヒトＰＨＩＰは、インスリンによる５Ｘ ＳＲＥ−ｆｏｓルシフェラーゼ発現の転写を増強する。ＣＯＳ−１細胞を、５Ｘ ＳＲＥ−ｆｏｓルシフェラーゼレポーター構築物（５Ｘ ＳＲＥ−ＬＵＣ）３μｇと共に、増加量のｐＣＧＮ／ｈＰＨＩＰ（６μｇ、９μｇ、１２ μｇ）または対照としての空ベクター（１２ μｇ）で一過的にトランスフェクトした。血清枯渇細胞は非処理のままか、またはＭｅｋ−１阻害剤（５０ μＭ）によって２時間処理した。細胞をインスリン（０．２ μＭ）の存在下または非存在下で１０時間インキュベートして、二重光システム（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いて細胞溶解物における相対的ルシフェラーゼ活性を測定した（１６）。結果は、３回の代表的な実験の平均値±ＳＤとして表記する。（Ｂ）ＩＲＳ−１ ＰＨドメインは、ＰＨＩＰ誘導ＳＲＥ−ＬＵＣ活性を阻害する。ＣＯＳ細胞を、ｐＣＧＮ／ｈＰＨＩＰ（４μｇ）と表記の量のｐＣＧＮ／ＩＲＳ−１ ＰＨとで５Ｘ ＳＲＥ−ＬＵＣ２μｇと共に同時トランスフェクトした。細胞をインスリン処理して、（Ａ）のように処置した。（Ｃ）ＰＨＩＰ刺激ルシフェラーゼ活性のＩＲＳ−１ ＰＨ媒介性阻害は、野生型ＩＲＳ−１によって用量依存的に回復する。ＣＯＳ細胞を、表記のようにｐＣＧＮ／ｈＰＨＩＰ（１μｇ）、５Ｘ ＳＲＥ−ＬＵＣ（２μｇ）、ｐＣＧＮ／ＩＲＳ−１ ＰＨまたはベクターＤＮＡのいずれか（１μｇ）、および増加量のｐＣＧＮ／ＩＲＳ−１ ｃＤＮＡで同時トランスフェクトした。次に細胞をインスリン処理して（Ａ）のように処置した。
【図４】ドミナントネガティブＰＨＩＰがＩＲＳ−１のインスリン誘導チロシンリン酸化を阻害することを示しているブロットを示す。（Ａ、Ｂ）Ｃｏｓ−７細胞をｐＣＧＮ／ＨＡ−ＤＮ−ＰＨＩＰ（ＤＮ／ＰＨＩＰ）、ｐＣＧＮ／ＨＡ−ＰＨＩＰ（ＰＨＩＰ）または空ベクターのいずれかで一過的にトランスフェクトした。細胞培養物をインスリン（０．２ μＭ）の存在下または非存在下で５分間処理した。全細胞溶解物または抗ＩＲＳ−１免疫沈降物を、表記のように抗ＩＲＳ−１ ＰＣＴ Ａｂｓ、抗ｐＴｙｒ Ａｂｓ、または抗ＨＡ Ａｂｓのいずれかによるイムノブロット分析に供した。抗ＩＲ免疫沈降物を抗ｐＴｙｒ抗体によってブロッティングした。膜を剥離して、抗ＩＲ抗体によってリプローブした。（Ｃ）Ｒａｔ−１線維芽細胞にｐＣＧＮ／ＨＡ−ＤＮ−ＰＨＩＰまたは空ベクターのいずれかを一過的にトランスフェクトした。細胞培養物をインスリン（０．２ μＭ）によって５分間処理した。細胞溶解物を抗ＩＲＳ−１ ＰＣＴまたは抗Ｓｈｃ抗体によって沈降させて、抗ｐＴｙｒ抗体によるイムノブロット分析を行った。Ｓｈｃ免疫複合体を含むメンブレンを剥離して、抗Ｓｈｃ抗体によって再プロービングした。（Ｄ）ＤＮ／ＰＨＩＰは、ＳＨＣアダプタータンパク質を通してではなく、ＩＲＳ−１を通してＭＡＰＫ活性を阻害する。ＣＯＳ細胞を、ｐＣＤＮＡ１／ＨＡ−ｐ４４ＭＡＰＫおよび、ｐＣＧＮ／ＨＡ−ＤＮ−ＰＨＩＰまたは空ベクターのいずれかで一過的にトランスフェクトした。細胞培養物をインスリンの存在下またはインスリンの非存在下で処理した。細胞溶解物を抗ＨＡ Ａｂｓによって沈殿させ、ＭＢＰを基質として用いるインビトロキナーゼアッセイに供した。ＨＡ枯渇溶解物をその後抗Ｓｈｃ Ａｂｓによって沈殿させ、抗ｐＴｙｒ Ａｂｓによる分析に供した。
【図５Ａおよび図５Ｂ】ＰＨＩＰの過剰発現は、ＩＲＳ−１電気泳動移動度を変化させることを示す。（Ａ）ＰＨＩＰおよびＩＲＳ−１はＬＤＭに共に局在する。ＬＤＭおよびサイトゾル画分を、２０ μｇのｐＣＧＮ／ｈＰＨＩＰ（ヒトＰＨＩＰ）または対照としての空ベクターで一過的にトランスフェクトした非刺激およびインスリン刺激ＣＯＳ−７細胞から調製した。各画分由来のタンパク質２００ μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解して、抗ＩＲＳ−１ＰＣＴ抗体（Ａｂｓ）を用いるイムノブロットによって分析する。抗ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）Ａｂｓおよび抗ＨＡ Ａｂｓを用いて、インスリン誘導チロシンリン酸化ＩＲＳ−１および異所発現ＰＨＩＰをそれぞれ検出する。抗トランスフェリン受容体 ＡｂｓをＬＤＭ区画のマーカーとして用いる。（Ｂ）ＰＨＩＰは、ＩＲＳ−１セリン／トレオニンリン酸化を調節することによってＩＲＳ−１細胞内局在性を調節する。抗ＩＲＳ−１ＰＣＴ抗体を用いたウェスタンブロット分析を、空ベクター（２０ μｇ）およびＨＡタグｈＰＨＩＰ（５μｇ、１０ μｇ、および２０ μｇ）を発現するプラスミドで一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞溶解物において行った。異所ｈＰＨＩＰ発現は抗ＨＡ抗体を用いてモニターされた。
【図６】ＰＨＩＰと神経分化関連タンパク質（ＮＤＲＰ）の略図である。ＰＨＩＰには二つのブロモドメインである、ＢＤ１（２３０位〜３４５位）およびＢＤ２（３８７位〜５０３位）が存在する。ＰＨＩＰ／ＩＲＳ−１ ＰＨ結合領域（ＰＢＲ）（アミノ酸５位〜２０９位）を下線で示す。
【図７】ヒトおよびマウスの神経分化関連タンパク質（ＮＤＲＰ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図８】ヒトおよびマウスの神経分化関連タンパク質（ＮＤＲＰ）の核酸配列アラインメントを示す。
【図９】ＷＤ反復タンパク質９およびＰＨＩＰのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１０】ＷＤ反復タンパク質９およびＰＨＩＰの核酸配列アラインメントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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