(57)【要約】本発明は、移植組織としてのゲルを包含する臨床応用、組織工学並びにバイオテクノロジーに有用な架橋したヒアルロン酸−ラミニンゲルを含む万能生体適合性マトリックスに関する。本発明によるゲルマトリックスは、それ自体又は細胞を担持した移植組織のいずれかで臨床に使用することができる。ゲルは、神経系に移植するための使用、或いはステントを包含する医療器具で使用するための被覆剤又は骨格として、特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来の架橋剤により架橋されているヒアルロン酸及びラミニンを含み、結合ゲルを形成している生体適合マトリックス。
【請求項２】
該外来性の架橋剤が、糖である請求項１記載のマトリックス。
【請求項３】
該ゲルが、４〜４８センチポアズの粘度を有する、請求項１記載のマトリックス。
【請求項４】
０．０５％乃至５％のヒアルロン酸を含む、請求項１記載のマトリックス。
【請求項５】
０．００５％乃至０．５％のラミニンを含む、請求項１記載のマトリックス。
【請求項６】
ラミニン１乃至ラミニン１２、無傷ラミニンの活性を保持しているラミニン断片、及び同活性を保持しているラミニン由来ペプチドからなる群から選択されるラミニンを含む、請求項１記載のマトリックス。
【請求項７】
該ヒアルロン酸成分が、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、架橋ヒアルロナンから選択される、請求項１記載のマトリックス。
【請求項８】
ホルモン、増殖因子、タンパク質分解酵素、抗線維形成剤、化学療法増殖抑制剤、凝固剤、抗凝固剤、免疫調節剤、又は増殖抑制剤からなる群から選択される生理活性化合物又は薬物を更に含む請求項１記載のマトリックス。
【請求項９】
細胞外マトリックス成分、天然高分子、合成高分子、又はそれらの混合物からなる群から選択される構造成分を更に含む、請求項１記載のマトリックス。
【請求項１０】
少なくとも一の高分子成分が、結合ヒアルロン酸ラミニンゲル内に複数の担体を形成している、請求項９記載のマトリックス。
【請求項１１】
架橋して結合ゲルを形成しているヒアルロン酸及びラミニンを含むマトリックス中又は該マトリックス上において培養された、複数の細胞を含む細胞培養物。
【請求項１２】
該細胞が、結合ヒアルロン酸ラミニンゲル内の複数の担体上で培養された、請求項１１記載の細胞培養物。
【請求項１３】
複数の細胞種を含む請求項１１記載の細胞培養物。
【請求項１４】
クローン細胞種を含む請求項１１記載の細胞培養物。
【請求項１５】
生物工学処理された細胞種を含む請求項１１記載の細胞培養物。
【請求項１６】
胚性幹細胞種を含む請求項１１記載の細胞培養物。
【請求項１７】
自己由来細胞種を含む請求項１１記載の細胞培養物。
【請求項１８】
請求項１記載のマトリックスを含む移植組織。
【請求項１９】
請求項１１記載の細胞培養物を含む移植組織。
【請求項２０】
ヒトに移植される生体適合マトリックスの作製方法であって、
ヒアルロン酸若しくはその塩、又はヒアルロナンを水和化し、
ラミニン溶液を選択し、
水和したヒアルロナン及びラミニンを架橋して結合ゲルを形成し、
任意に、生理活性成分又は構造成分をゲルに加える、
ことを含む方法。
【請求項２１】
該マトリックスを成型することを更に含む、請求項２０記載の生体適合マトリックス作製方法。
【請求項２２】
ゲル中又はゲル上に細胞を培養又は固定することを更に含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
培養した細胞がゲル内の複数の離散した担体上に付着している、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
請求項２０記載の方法を即座に実行するためのキットであって、生体適合マトリックスを形成するゲルを得るために必要な各構成溶液の少なくとも一投与量を含むキット。
【請求項２５】
架橋されたヒアルロン酸及びラミニンを含み、結合ゲルを形成している生体適合マトリックス中又は該マトリックス上の細胞を含む移植組織を移植するステップを含む、細胞を必要とする個体に細胞を移植する方法。
【請求項２６】
請求項１記載のゲルを含む医療機器。
【請求項２７】
請求項１１記載の細胞培養物を含む医療機器。
【請求項２８】
該ゲルが、機器の露出表面上を被覆している、請求項２６又は２７記載の医療機器。
【請求項２９】
生体適合性化合物又は薬物を更に含む、請求項２６又は２４記載の医療機器。
【請求項３０】
該機器が、ステントである請求項２３又は２７記載の医療機器。
【請求項３１】
該ステントが、冠動脈内ステントである、請求項３０記載の医療機器。
【請求項３２】
該ゲルの粘度が、内表面から外表面へと変化する、請求項３１記載の医療機器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、架橋ヒアルロン酸−ラミニンゲルを含む万能生体適合マトリックス、これらのゲルを作製する方法、並びに誘導された組織再生の移植組織、組織工学、及び医療機器の被覆のため等の臨床応用や生物工学におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
組織再生を誘導し導く能力は、特に、その機能喪失が重篤な衰弱又は死をもたらす中枢神経系や循環器系のような系において、まだ対処されていない医療用途である。
【０００３】
中枢神経系（ＣＮＳ）内の傷害、虚血或いは変性の結果としての神経細胞の死は、一般的に不可逆的であると考えられている。神経再生は、これらの種の細胞が生命の初期に起こる脳の成熟後に増殖が不可能なので、ＣＮＳ内においては、達成できない目標であると広く考えられている。また、中枢神経内の軸索の損傷も、軸索の切断を伴ったときには不可逆的であると一般に考えられている。動物モデルでの神経再生の成功に関する様々な報告は、おそらくヒト胚性幹細胞由来の生存能力のあるニューロン又はそれらの前駆細胞を含む移植組織又は移植片が、そのうち、ＣＮＳ再生を達成するための選択肢を提供することを予見させるものの、依然としてこの問題に対する満足ないかなる治療上のアプローチも導かれていない。
【０００４】
心筋及び心臓血管系は、心筋梗塞後に元の構造を再生することは不可能であると広く考えられており、それ故心臓における動脈閉塞は心筋機能に修復できない損傷をもたらす。この病理的減少を克服するためにとられる治療方法の一つは、冠状及び他の血管系の閉塞を防止するためのステントと呼ばれる医療用具の利用であり、これらの用具はステント自体の導入中に内皮細胞層を損傷することにより、しばしば二次的な再狭窄をもたらす。
【０００５】
これら及び他の主要な医学的問題は、もし移植組織、移植片或いは医療機器が、二次的損傷を引き起こすことなく損傷領域に組み込まれることができる生体適合性骨格或いは被覆が提供されれば、解決されると考えられている。それ故、冠状動脈内ステントは、再狭窄を惹起することを防止するような生体適合性マトリックスで被覆され、或いはＣＮＳ用の医療移植組織に保持される細胞に、必要とされる生存及び増殖を可能にするような機械的又は生物化学的性質が賦与されていればよい。
【０００６】
理想的な生体適合性マトリックスの特性は、インビボ又はインビトロで細胞増殖を支持する能力、広範な細胞種又は系列の増殖を支持する能力、必要とされる様々な程度の柔軟性又は剛直性を付与する能力、様々な程度の生分解性を有する能力、二次的損傷を誘発することなくインビボで所定の部位に導入される能力、及び所望の作用部位に薬物或いは生理活性物質を送達するための媒体又は貯蔵所としての要求を満たす能力を包含するものである。
【０００７】
組織再生を誘導するための、及び／又は、組織培養として有用な生体適合性表面としてのマトリックスはよく知られている。これらのマトリックスは、それ故、インビボ又はインビトロのいずれかにおいて細胞増殖のための基質であると考えられる。組織増殖及び／又は再生用に適したマトリックスは、生分解性物質及び生体安定性物質の両者を含む。組織増殖又は再生を支持することが要求される有用なマトリックスとして機能する多くの候補としては、ゲル、発泡体、シート、及び異なった形態及び形状の種々の多孔性微粒子状構造が包含される。
【０００８】
多くの例において、マトリックスは、ポリペプチド又はタンパク質を包含する生体高分子、及びプロテオグリカンその他を包含する種々の多糖類から構成されてよい。更に、これら生体高分子は、その物理化学的性質に影響するように選択或いは操作されてもよい。例えば、生体高分子は、酵素的、化学的又はその他の手段により架橋されてよく、それによってより大きい又はより少ない程度の剛直性又は分解に対する感受性をもたらす。
【０００９】
組織工学又は培養に有用であることが開示されている種々の天然高分子としては、フィブロネクチン、種々の型のコラーゲン、及びラミニン、並びにケラチン、フィブリン及びフィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、その他を包含する、細胞外マトリックスの種々の成分を列挙することができる。
【００１０】
米国特許第５，９５５，４３８号及び第４，９７１，９５４号は、組織再生に有用な、糖によって架橋されたコラーゲンを基本としたマトリックスを開示している。
【００１１】
米国特許第５，９４８，４２９号は、細胞外マトリックス微粒子を含む生体高分子発泡体の製造及び使用方法を開示している。
【００１２】
米国特許第６，０８３，３８３号及び第５，４１１，８８５号は、フィブリン又はフィブリノーゲン接着剤及びその使用方法を開示している。米国特許第５，２７９，８２５号及び第５，１７３，２９５号は、フィブリンを含む損傷神経の再生増強方法及び接着薬物製剤を開示している。米国特許第４，６４２，１２０号は、軟骨及び骨の欠損の治癒を促進するフィブリン又はフィブリノーゲンの使用を開示している。
【００１３】
米国特許第６，１２４，２６５号及び第６，１１０，４８７号は、ケラチンを基本としたフィルム及びシートの製造及び架橋方法、並びに多孔性ケラチン骨格の製造方法及びその製品を開示している。
【００１４】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンの繰り返し単位から構成されたグリコサミノグリカン系統に属する天然に存在する高分子量ポリマーである。ＨＡは、間隙を充填する物質として生体内で供される水和ゲルを容易に形成する。組織増殖を支持するための有益な成分としてのヒアルロン酸の利用は、ヒアルロン酸及び増殖因子で骨増殖を促進する方法を開示している米国特許第５，９４２，４９９号において例示されているように、当業界で十分確立されている。米国特許第５，１２８，３２６号及び第５，７８３，６９１号は、組織修復促進において、及び薬剤又は増殖因子を包含する生理活性物質の貯蔵所として、架橋ヒアルロナンの製造及び使用方法を開示している。
【００１５】
ラミニン（ＬＮ）は、主要細胞マトリックス結合成分として知られる高分子量の接着性糖タンパク質である。米国特許第４，８２９，０００号及び第５，１５８，８７４号は、ラミニンを含むゲル又はマトリックスの使用を例示している。
【００１６】
Ｓｈａｈａｒらの国際特許出願ＰＣＴ／ＩＬ第９９／００２５７号（ＷＯ第９９／５８０４２号として公開）は、ヒアルロン酸とラミニンからなるマトリックスゲル上で神経組織を培養することによる中枢神経系の障害を改善する方法を開示している。ＨＡとＬＮの組み合わせが、柔軟性のある弾性結合と堅固で剛直な結合の両者を有する細胞マトリックスを提供することは、以前から報告されていた。Ｇｏｌｄｍａｎら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３５，３０−５５，１９９７）は、この技術を使ったいくつかの予備的結果を開示しているが、これらのゲルを得る詳細又は方法を提供していない。
【００１７】
ヒアルロン酸及びラミニンのマトリックスがインビボにおける臨床的な応用に有用であること、或いはそのようなゲルが非神経細胞種との培養に有用であることは、どのような背景技術にも教示も示唆もされていない。更に、医療用具用の被覆として、或いは移植に適した移植組織において、これらの結合ＨＡ−ＬＮマトリックスの使用は、これまで開示されてもいないし、ゲルの安定化をもたらすために架橋剤が使用されることも開示されていなかった。
【００１８】
（発明の概要）
本発明の目的は、生体適合性であり、細胞接着、増殖、分化及び組織修復に便利な環境を供給する、万能のマトリックスを提供することである。本発明の別の目的は、多くの異なった細胞種に適し、インビトロ又はインビボのいずれにおいても適切に使用できるマトリックスを提供することである。本発明の更なる目的は、組織再生を促進する独特な特性によって、臨床応用に有用なゲルマトリックスを提供することである。又、更なる本発明の目的は、体腔への注入用として、或いは医療用具又は骨格の被覆用としてのゲルの使用を可能にする、弾性及び展性の独特な特性によって、臨床応用に有用なゲルマトリックスを提供することである。
【００１９】
本発明のこれら及びその他の目的は、本明細書でＨＡ−ＬＮゲルと称する、ラミニンと組み合わされたヒアルロン酸を含むマトリックスゲルによって達成される。ラミニン成分は、細胞を安定化し、細胞接着部位を提供し、そして特に、組織再生に使用するための細胞の生存能力を改善する。しかしながら、ラミニンはそれ自体において、その物理学的性質が組織移植に使用するには不適当であるという欠点を有している。ＨＡ成分は、ラミニンがその目的を達成するために必要な物理的特性を提供する。組み合わされたラミニン及びＨＡゲルは、生分解性を促進し又は遅らせるために、所望の程度までゲルの多孔性を増やすか又は制限するために、好適な水力学的性質を促進するために、及びこれらのゲルの、単独或いは医療細胞移植又は用具に関連した、臨床的有用性について要求される別の所望の性質を達成するために、所望の範囲に架橋することによって更に安定化される。
【００２０】
臨床応用における、インビボでのこれらゲルを使用する方法を開示する。本発明に記載のゲルマトリックスは、それ自体で、又は細胞を保持した組織移植として、或いは医療器具又は骨格に対する被覆として、様々な目的で臨床的に使用される。ゲルそれ自体は、細胞が全くない場合でも、インビボで細胞増殖を支持する媒体として供したり、限定されることなく、増殖因子、増殖阻害剤、接着分子、接着阻害剤等を包含する、種々の生理活性高分子量物質又は小分子量の薬剤を送達するための貯蔵所として役に立っている。
【００２１】
本発明に記載のゲルマトリックスは、インビトロ及びインビボにおける細胞選択、細胞増殖、細胞繁殖及び分化を支持するために適した基材として有利に使用される。
【００２２】
本発明は、新規組成物及びこれら組成物の製造方法を提供する。有利なことは、組成物の製造中に、製品の粘度及び弾性又は展性の程度、並びに限定はされないが生分解性、多孔性、その他の特性を包含する、臨床的有用性の別の性質を制御することが可能である。
【００２３】
架橋の程度は、架橋剤の選択によって、架橋剤の濃度によって、試薬への曝露の長さによって、温度によって、及び当業界で知られているようなその他のパラメータによって制御される。好適な架橋剤は、種々の糖、酵素的手段、及びホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及び当業界で公知のその他の試薬を包含する化学的架橋剤を包含するが、これらに限定されない。糖の使用は、これ迄のところ、これらの架橋剤が一般的に非毒性であるが故に最も好ましい例である。組織培養培地中に存在する糖の生理的レベルは、生理学的レベルを超える糖の添加によって達成される速度に比べると非常に遅い速度ではあるが、架橋を効果的にするのに十分である。
【００２４】
本発明に記載のゲルマトリックスは、ヒアルロン酸を約０．０５％乃至約５％（ｗ／ｖ）の範囲、及びラミニンを約０．００５％乃至０．５％（ｗ／ｖ）の範囲で含む。ヒアルロン酸のより好ましい範囲は、約０．２から約３％である。最も好ましいヒアルロン酸は、ゲルの約０．５乃至２％を含む。ラミニンのより好ましい範囲は、０．０５％乃至０．２％である。
【００２５】
意図された有用性によるゲルマトリックスの粘度は、４から４８センチポアズの範囲である。現時点で最も好ましい粘度は、２０乃至２５センチポアズの範囲に亘る。
【００２６】
本発明は、又、これらに限定されないが、ホルモン、成長因子、成長阻害剤、接着因子、接着阻害剤、抗線維症剤、再狭窄防止剤、抗凝固剤、凝固促進剤、抗炎症剤等を包含したヒアルロン酸及びラミニンを含むマトリックスに、有効成分を更に添加することを提供する。これらの任意の添加物は、所望の薬動力学的プロフィールを提供するように取り込まれる。本発明の範囲内において、インビボで生理活性成分の徐放性用のＨＡ−ＬＮゲルを使用する方法が提供される。別の例示において、添加物は、取り込まれている生理活性物質の短時間の最適局所濃度を提供するように取り込まれている。
【００２７】
本発明の組成物は、これらに限定されないが、当業界で公知の付加的細胞外マトリックス成分、或いは天然又は合成高分子を包含する追加の高分子構造成分を更に含む。いくつかの好ましい実施態様によれば、ゲル内に分散した複数の担体の形で合成又は天然高分子を包含することも可能である。別の好ましい実施態様によれば、ゲル内のメッシュ又は骨格として高分子を使うことが可能である。
【００２８】
本発明の組成物は、保存剤、抗生物質、等張剤、緩衝剤、当業界で公知のその他を包含する添加剤を更に含む。
【００２９】
限定されることなく、これらのゲルの物理的機械的特性を包含するゲルマトリックスの物理化学的パラメータは、ゲルの意図する使用に従って容易に最適化することができ、そして最適化の方法については、当業者への手引きを提供するように開示されている。ゲルの生物学的パラメータは、製品の細胞担持容量又は細胞負荷を含めて制御することができる。現時点で最も好ましい実施態様は、ゲル１ｍｌ当り１０５から１０７細胞の範囲の細胞密度を含む。
【００３０】
本発明のゲルを含む装置を、そのような装置の使用とともに開示する。
【００３１】
特に好ましい実施態様によれば、本発明のゲルで被覆された心臓用ステントが提供される。これらの装置を被覆するのに適用されるゲルは、細胞を更に含むことができる。本発明のゲルで被覆された装置は、増殖阻害剤、増殖因子、又は非限定的に再狭窄を予防又は低減する薬物を包含するホルモンのような増殖調節剤を非限定的に包含する薬物を更に含む。
【００３２】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明の本質により、ラミニンと結合されたヒアルロン酸を含む架橋ゲルが、非常に広範な種類の細胞種に適用できるとともに、ヒトへの移植を意図した医療器具又は移植組織の被覆に適するような独特な特質を有していることを、ここに開示する。本発明のゲルは、細胞と一緒に或いは細胞なしに、注入用、腔の充填用、或いは医療器具又は骨格用として、及びインビボ又はインビトロでの多くの他の応用のために適用することができる。ゲルは、種々の細胞密度で三次元的に細胞を培養するのに適していることが明らかに理解される。
【００３３】
当業界で公知の多くの他のマトリックスに対する本発明のゲルの特有の利点は、非限定的例示として、神経細胞種で例示されるように、満足できる増殖が容易に達成できないような、特別な細胞種の細胞増殖を支持する能力を含んでいる。重要な点は、本発明のゲルが、望ましくない細胞種を抑制し、望ましい細胞種の保持又は増殖を可能にするような各細胞種の異なった支持に寄与することである。この性質は、細胞系統特異的に、細胞増殖を促進又は抑制する公知の能力で選択される特定の添加物によって高めることができる。これらの添加物は、増殖因子、ホルモン、増殖調節剤、及び薬物を包含する。
【００３４】
本発明のゲルは、所望の架橋の程度を当業界で公知のいかなる手段によっても達成できるが、好ましくは糖又は酵素の使用によって架橋される。また、ゲルマトリックスに取り込まれる添加物は、ゲル成分に架橋されるか、或いは取り込まれ、それらの放出を適切な速度に制御する。それ故、ゲルに取り込まれた試薬の放出は、移植組織又はゲル被覆全体の生分解と同様に制御され得る。
【００３５】
Ａ）神経細胞種用のＨＡ−ＬＮゲルの開発
組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分は、細胞活性を支配し制御する重要な役割を有している。ニューロン及びグリアの培養のためのＥＣＭ環境を再現するために、現在述べられている手順を初めて開発した。
【００３６】
神経培養の保持、増殖及び分化の方法は、最も精巧なものとして知られている。それ故、神経細胞のインビボにおける基質及び必要条件をまねたＥＣＭ内部媒質が最も望まれる。
【００３７】
組織培養方法は、インビボ動物モデルの使用のための基材として注目を集めている。一つの方向は、培養細胞又は移植片のための細胞外マトリックス（ＥＣＭ）における生体内環境、性質及び組成をインビトロで創造及び再現することに向けられた。神経系の開発におけるＥＣＭ基材の役割の徹底した検討に基づき、二つの主な成分、即ち、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びラミニン（ＬＮ）が、特にニューロン及びグリア細胞培養についての必須の候補として浮かびあがった。
【００３８】
ある粘性の粘着性ゲル（ＨＡ−ＬＮゲル）へのＨＡ及びＬＡの組み合わせは、中枢及び抹消神経系の両者から由来した増殖しつつある細胞及び移植片用のバイオマトリックスを提供した。ＥＣＭの主要成分である、ＨＡ及びＬＮの組み合わせは、中枢及び末梢神経系の両者から由来する増殖しつつある神経細胞及び移植片用の基材として、本発明者らにより導入された。
【００３９】
インビトロで基材マトリックスを提供することに加えて、ＨＡ−ＬＮゲルが組織移植のための高度に有利な生体適合性媒介手段として役立つことを、ここに初めて開示する。
【００４０】
Ｂ）別の細胞種用のＨＡ−ＬＮゲルの開発
ニューロン細胞種によく適したマトリックスを提供することに加えて、本発明のゲルは、広い範囲の細胞種に高度に適していることを、ここに初めて開示する。以下に例示されるように、これらのゲルは、従来の細胞培養技術の多くの欠点を克服している。
【００４１】
神経及び内皮細胞に加えて、ＨＡ−ＬＮゲルは、組織移植片及び細胞の初代増殖培養及び二次増殖培養に好適のみならず培養中の株化細胞、及び形質転換若しくはバイオ工学処理された細胞に好適な基材を提供する。
【００４２】
このように、例示として、これらのゲルは、内皮細胞種、上皮細胞種、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の始原細胞、軟骨細胞、及び好適な内部媒質を得ることが困難なことが証明されている、多くの別の細胞種の培養の目的に適していることが明らかになっている。
【００４３】
Ｃ）医療器機被覆用のＨＡ−ＬＮゲルの開発
ゲルの有利な性質の故に、これらのゲルは医療器機を被覆するのに特に有用であり、それによって、不活性であろうと細胞を担持したものであろうと、種々の医療移植片の生体適合性を改善する。
【００４４】
一つの現時点でのより好ましい実施態様によれば、本発明のゲルは、細胞を含むか又は含まないでステントを被覆するのに使用される。ステントを被覆するのに使用されるゲルは、更に、内皮細胞を含む内部媒質として有利に役立つことが見出されている。これらの内皮細胞は、ステントの設置の後でしばしば生じる再狭窄を抑制又は低減させることができる。内皮細胞は、非限定的にヒト臍帯又はヒト胚性幹細胞を包含するその他の適合した起源から得られる。この目的のための本発明のゲルの特有の利点は、それらが柔軟であり、たわみ性を有しており、そして弾力性があることであり、そして所望の血管部位においてステントの設置が可能なように膨張させることができることである。
【００４５】
第１図に模式的に示すように、ゲルは、種々の方法でステント上に直接、或いはステント器具の骨格を被覆する弾性を有し伸張可能な管として、適用することができる。ゲルの粘度は均一であってよく、或いは、管の内部側から血管に接するであろう外部側まで変化させることができる。ステント骨格をすっぽり包むゲル及び担体物質は、種々の多孔性及び異なった生分解率を有するように作ることができる。これら二つの特徴は、ゲルマトリックス内から生理活性化合物又はその他の添加物の制御された放出速度を可能にする。放出速度は、遅い定常的な速度であってよく、或いは初期の爆発的放出を生じるように設計されたある種の状況とすることができる。
【００４６】
ステント用の薬物溶出高分子被覆が報告されており（例えば、Ｔａｏ  Ｐｅｎｇら、１９９６；欧州特許第７０１８０２号）、血性形成及び新内膜増殖を阻害する標的部位において、薬物を取り込み又は結合し、後で局所的に制御された送達を行うことができる高分子ステントを教示している。ウロキナーゼ、ヘパリン、タキソール及びヒルジンペプチドを包含する種々の薬物の局所投与が、血栓症及び再狭窄を予防するために提案されている。
【００４７】
ゲルは、それ自体で、或いは血管ステントの骨格又はその他の応用において被覆されたとき、有利な性質を有する物理的緩衝材として役立つことができる。例えば、ステントの被覆としてのゲルは、ステントの設置に際して、血管の内皮表面への損傷を防止する物理的緩衝材を提供する。
【００４８】
Ｄ）ＥＣＭ−ゲル成分の詳細な特徴
１）ヒアルロン酸（ＨＡ）：
ＨＡは、粘度の高い増殖許容性内部媒質として紹介された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９０）。それは、グリコサミノグリカン系列に属する天然に存在する高分子量のポリマー（２．５〜３．０×１０６ダルトン）である。この系統の化合物は、ウロン酸（グルクロン酸）及びＮ−アセチルヘキソサミン（Ｎ−アセチルグルコサミン）の繰り返し単位から構成されている。親水性条件では、ＨＡは、大量の水分子を吸収する（Ｌａｕｒｅｎｔ，１９６４；Ｒｕｏｈｓｌａｈｔｉ，１９８８；Ｐｒｅｓｔｏｎら、１９６５）。これらの条件下において、ＨＡは、制御可能な粘度に依存性の水和ゲルを形成していく。これらのゲルは、空間充填物質としてインビボで役に立つ（Ｌｏｎｇａｋｅｒら、１９８９）。胎仔の初期発生段階の間、ＨＡは、修復・再生及び創傷治癒のための最適環境であると考えられるＥＣＭの主要成分である。後の生存中では、ＨＡは、関節、関節液、生殖器官、並びに軟骨及び神経のようなその他のマトリックスにおいて見出されている（Ｇａｈｗｉｌｅｒ，１９８４；Ｙａｓｕｈａｒａら、１９９４）。ＨＡは、多くの細胞表面受容体及び細胞膜タンパク質のリガンドである（Ｋｎｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｎｕｄｓｏｎ，１９９３）。インビボでのＨＡに関連する更なる利点は、非抗原物質、湿度保持剤、弾力性のある流動性の潤滑液、抗血管新生剤及び抗酸化剤である（Ｂａｌａｚｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎｌｉｎｇｅｒ，１９８８；Ｔｏｏｌｅ，１９８２）。
【００４９】
インビトロで、ＨＡは、例えば、本発明の発明者の一人によって、イスラエル特許第９１０８０号に開示されたように、増殖環境として寄与し、イオン、細胞及び増殖因子を捕捉し、そして細胞運動を助ける。更に、ニューロン遊走及び神経突起増生を調節すると報告されている（Ｋａｐｆｈａｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｂ，１９９２；Ｔｈｏｍａｓら、１９９３）。ＨＡは、ヒアルロニダーゼ及びコンドロイチナーゼのような分解酵素に感受性を有する生分解性分子である。
【００５０】
２）ラミニン（ＬＮ）：
ＬＮは、殆ど全ての哺乳類の組織、例えば、細胞にメッセージを伝達する基底膜の構造的及び機能的な骨格の不可欠な部分を提供する、糖タンパク質のファミリーとして明確に定義される。ＬＮは、分子量９００，０００ダルトンを有する三つのサブユニットからなる粘着性糖タンパクリガンドである。ラミニンは、最も一般的なインテグリン（α５β１）の膜貫通構造によって認識されたＲＧＤＳ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）配列を有している。ＬＮ−インテグリンは、主要な細胞マトリックス結合構造として知られている。各ＬＮは、細胞関連細胞外マトリックスに分泌され、取り込まれているアルファ、ベータ及びガンマ鎖サブユニットから組み立てられたヘテロ三量体である。ＬＮの異なった型（現時点で１２の型が知られている）は、自己集合することができ、他のマトリックス巨大分子と結合することができ、及び／又はインテグリン受容体、ジストログリコン又はいかなる他の非インテグリン受容体さえも経由して、細胞と相互関連することができる。ＬＮ類は、細胞分化、細胞増殖、細胞の形、遊走及び運動、細胞組織の表現型及び伸張組織の生存に不可欠なものとして貢献している。異なったＬＮ類は、器官形成期の最終部位に対して多様な細胞種及び細胞遊走に多くの発生上の役割を調整し導くのに関与していることが見出されている（Ｃｏｌｏｇｎａｔｏ  ＆  Ｙｕｒｃｈｅｎｋｏ，２０００）。今迄のところ、ＬＮの１２の異性体が、５つのアルファ鎖、３つのベータ鎖、及び２つのガンマ鎖のレパートリーから組み立てられていることが同定されている（Ｍｉｎｅｒ  ＆  Ｐａｔｔｏｎ，１９９９）。ＬＮ類をよりよく理解することにより、いくつかの主要な病状、例えば、メロシン欠損先天性筋ジストロフィーへの治療の基礎を提供することができる。
【００５１】
要約すると、ＬＮ類は、顕著な範囲の機能を示し、最も重要なこととしては、構造的要素としての機能を示すことである。更にＬＮ類は、細胞の細胞骨格と細胞生合成機構を結ぶインテグリンのような接着分子に属する細胞表面成分と相互作用することによって、多様な情報を細胞に提供するシグナル伝達分子として役立っている。遊走ニューロンの発生において、最近、ＬＮ同族体に属する神経突起伸展因子（ＮＯＦ）に結合する活性を演じている、ギセリンと称される新しい細胞接着分子が発見された（Ｔａｉｒｕ，１９９９）。ギセリンは、胚発生の過程で神経突起の伸張を促進し、そして後に生命において、神経組織の形成及び組織形成に関与している。ギセリンは、神経系とは異なる他の組織における再生中においても同様に発現される（Ｔａｉｒｕ，１９９９）。
【００５２】
ＬＮ類は、軸索伸展の加速におけるインビボでの役割を反映して、インビトロでは神経突起接着及び伸展の強力な促進剤である（Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｋｌｅｉｎｍａｎ，１９９７）。
【００５３】
ＬＮは、ニューロンの分化及び増殖、及び成長円錐の行動を導き促進する、ＥＣＭの有力な糖タンパク質であることが証明されている（Ｌｕｃｋｅｎｂｉｌｌ  ＆  Ｅｄｄｓ，１９９７）。細胞表面のインテグリン発現の変化は、同様に、ニューロン接着及び神経突起伸展を制御している（Ｃｏｎｄｉｃ  ＆  Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ，１９９７）。ニューロンのＬＮ受容体は、同様に、ニューロン伸展における重要な役割を演じている（Ｅｄｇａｒ，１９８９；Ｍｅｃｈａｍ，１９９１）。ＬＮ類及びＬＮ受容体活性の操作は、リガンドに対する抗体（ラミニン）、又は最終的に軸索再生を決定するそれらの受容体（Ｉｖｉｎｓら、１９９８）、又はＬＮの神経突起伸展領域を使用することによって得ることができる（Ｌｉｅｓｉら、１９９２）。ＬＮ受容体の運動ニューロン選択的接着部位は、神経突起伸展を阻害するように作用する（Ｈｕｎｔｅｒら、１９９１）。
【００５４】
Ｅ）ゲルの特徴
ＨＡ及びＬＮの組み合わせは、明らかに細胞−マトリックスの柔軟で弾力性のある結合と堅固で剛直な結合を提供している。
【００５５】
本発明の原理によれば、どのようなＨＡでも又どのようなＬＮでも、本発明のゲルを調製するのに使用され得ることが明らかに理解される。ヒアルロン酸は、非架橋の形態、又は、非限定的に架橋ヒアルロナンを包含する、当業界で公知の多くの化学的に修飾されたヒアルロン酸誘導体の一つといった、特有の形態で使用することができる。
【００５６】
ゲル混合物の更なる化学処理として、糖又は追加の架橋剤、又は接着物質による架橋が挙げられる。例えば、非限定的例示として、好ましい実施態様によれば、非限定的に、１パーセントのＤ−リボース、Ｄ−キシロース又は他のいずれかの糖を含有する糖の溶液が、ゲルとともに冷却下（４℃）約２４時間保温される。非結合糖は、使用前にゲルからすすぎ落とされる。０．０１〜０．１％の少量のアルブミンが、ゲルの特徴を改善するために所望により加えられ、架橋に寄与する付加的な基を提供する。
【００５７】
架橋したゲルを得るために、その他の架橋剤又は酵素的方法（非限定的例示として、第ＸＩＩＩ因子又はリシルオキシダーゼ）を使用することが可能であるが、架橋のための糖の使用は、これらの天然に存在する試薬の非毒性の性質の故に、特に有利である。架橋剤の非毒性の性質、及びその結果としての産物の分子量の増加は、ゲルを安定化しそして最終産物を改善する。
【００５８】
また、架橋は、高分子量細胞接着分子、細胞増殖因子及び他の好適な添加物を含む添加物の貯蔵所又は補給所へ、ゲルを転化する手段として寄与する。これらのバイオマトリックス産物は、自然の細胞外環境を再現した、粘度の高い、接着性を有する、高度に水和した組織のものであり、それ故に、細胞増殖に対して高度に生体適合性かつ伝導性を有するものである。マトリックスの最適化は、二つの主要成分の好適な範囲を含むためのプロセスパラメータの選択を包含する。組成物は、得られる最終混合物の硬さ又は粘度に影響する。硬いゲルは、充填される開口内に、形成され又は成形された移植組織として移植するためにより適しているが、別の臨床応用には、より硬さの乏しい、即ち、より流動性又は弾力性の良好な、成形し易い移植組織又は被覆としてのマトリックスの導入が必要とされる。
【００５９】
重要なことは、更なる成分が必須成分の固有の性質を変更するために使用することができる。非限定的例示として、細胞がゲルマトリックス内で付着することができる粒状の担体を含有することは有利である。
【００６０】
ここにマトリックス成分の種々の基を架橋することが有利であることを開示する。架橋結合の最も単純な種類は、遊離アミノ基に結合するヘキソース又はペントースのような、単糖類を含む糖によって創成される。モノアミンオキシダーゼの酵素的結合（例えば、第ＸＩＩＩ因子及びリシルオキシダーゼ）は、遊離アミノ基から遊離アルデヒドを生成する。これらのアルデヒド及び炭水化物の還元末端のような糖アルデヒド、例えば、ヒアルロン酸は、共有結合で架橋したアルドール縮合及びシッフ塩基産物を生成することができる。それ故、各ＨＡは、その還元末端残基と一つの結合、及び水酸基との多くの相互作用を創成することができる。遊離アルデヒド類及び遊離アミノ基は、更に反応して架橋結合を形成することができる。
【００６１】
ＨＡ−ＬＮゲルの一つの主な特質は、ＨＡとＬＮの濃度、及び架橋剤その他の使用に依存して、所望の粘度又は硬さのゲルを形成する能力である。
【００６２】
本発明に記載のゲルマトリックスは、約０．０５％から約５％（ｗ／ｖ）の範囲のヒアルロン酸及び約０．００５％から約０．５％（ｗ／ｖ）の範囲のラミニンを含む。ヒアルロン酸のより好ましい範囲は約０．１％から２％である。好ましい範囲の選択は、意図する使用に依存する。
【００６３】
ラミニンのより好ましい範囲は約０．０５％から０．２％である。好ましい範囲の選択は、意図する使用に依存する。
【００６４】
意図する有用性に対応するゲルマトリックスの粘度は、４から４８センチポアズの範囲である。
【００６５】
現時点の例示的な好ましい実施態様において、組み合わせゲルは、１％のヒアルロン酸（ヒアルロン酸ナトリウムとして）及び０．０１％のラミニンを含む。
【００６６】
Ｆ）ゲル製剤
ＨＡ−ＬＮゲルは、組織移植用神経細胞性グリア細胞を培養するための基材として開発された。神経細胞の伸展を促進するためのインビトロ及びインビボの両方で使用するためのＨＡ−ＬＮゲルの更なる拡張及び改良は、以下の方向に沿ってここに開示される。即ち、ヒアルロン酸（ＨＡ）成分は、その最適分子量、濃度、粘度及び活性基の可能な修飾（例えば、ヒドロキシルからベンジル又は当業界で公知のその他の置換基へ）に関して試験されている。
【００６７】
第二の成分であるラミニン（ＬＮ）は、ラミニンの１２の型のいずれかの一つである。一つの現時点の好ましい実施態様によれば、ラミニン−１が、都合よく使用される。この型のラミニンは、細胞結合の基材として所望の生物活性を保持する、ラミニンの単離された断片、又はラミニンから誘導したペプチドで置換することができる。更に、二つの成分間の架橋は、当業界で公知の好適な手段、好ましくは糖分子を使用することによって誘導される。相互作用の結果は、非限定的に結晶学的解析を含む当業界で公知の好適な手段によって確認される。
【００６８】
追加の生理活性分子によるＨＡ−ＬＮの質を高めることは、本発明の範囲内に包含される。そのような生理活性成分の例は、他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン等）、接着分子（例えば、これに限定されないがニドゲンを含むインテグリン、ＣＤ−４４、ギセリン、ジストログリカン等）、増殖因子（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＰＤＧＦ、ＮＧＦ等）、ホルモン（例えば、エストロゲン、テストステロン等）、接着成分（例えば、フィブリン又はフィブリノーゲン、トロンビン等）、抗酸化剤、及び末梢神経系（ＰＮＳ）及び中枢神経系（ＣＮＳ）において行われる手術後の瘢痕組織を可溶化する酵素を包含する。そのような酵素の非限定的例示は、非限定的にトリプシン、パパイン又は植物起源のプロテアーゼ等を包含する。
【００６９】
ゲルの処方は高度に変化させることができ、特定の混合物を構成して広範なゲルを創造し、種々の細胞種の培養、種々の組織移植、及び種々の機能のための種々の応用の方法に使用するために調整される。
【００７０】
Ｇ）最適化手順
ゲルの成分の特定の組み合わせが、以下の種々の目的のために開発されている。
【００７１】
インビトロで神経組織を増殖するために最適なゲル
脳及び脊髄の組織における損傷部位への移植に適切な骨格（例えば、神経細胞用の骨格として使用される前処理胚性脾組織）に、増殖された神経複合移植組織を、固定する環境。
【００７２】
脊髄における誘導された組織再生用の鞘として使用するために意図された組織移植としてのＨＡ−ＬＮゲルの使用は、図２に模式的に描かれている。
【００７３】
例えば、損傷、血腫、又は腫瘍切除の結果として生ずる外傷後又は手術後の嚢胞を（外科的介入により、又は注入により）充填するためのＨＡ−ＬＮゲルに取り込まれた神経細胞の使用。
【００７４】
ＨＡ−ＬＮゲルと、非限定的であるが以下を包含する追加的な因子との組み合わせ：凝固因子、抗線維症剤、増殖因子、又は止血の促進、瘢痕組織の安定化及び軸索再生の増強の促進をそれぞれ導くタンパク質分解酵素。
【００７５】
えり抜きの細胞種に分化するように選択された胚性幹細胞と共に使用するための、ＨＡ−ＬＮゲルマトリックスの使用。
【００７６】
本発明の現時点での最も好ましい一の実施態様によれば、ゲルは、中枢神経系における脱落及び欠陥の改善に使用するのに適するように、神経細胞種との使用に最適化されていることが強調されなければならない。
【００７７】
別の最も好ましい実施態様によれば、ゲルは、一般に血管系において、及び特に心臓血管系における医用器具と共に使用される。
【００７８】
当業者は、ここに開示された方法の一般的な応用性を正しく認識するであろう。ヒトクローン化細胞株、多分化能性胚性幹細胞、自己細胞、挿入遺伝子又はアンチセンス部分を含む生物工学処理細胞、及び追加の細胞種の有用性は、本発明の方法及び組成物と一緒に使用するのに役立つ。それ故、例示として、ヒト胚性幹細胞が、本発明のゲルマトリックスを利用した移植に適するどのような所望する細胞種にも分化するように選択又は活性化される。
【００７９】
Ｈ）製品の好ましい使用
ＨＡ−ＬＮゲル製品は以下の目的に使用することができる。
１）組織培養
培養中に細胞及び組織スライスの固着用の最適環境を提供する接着性生物環境。
【００８０】
製品は、増殖因子、ホルモン、シグナル分子、細胞増殖の阻害剤、及び別の型の細胞増殖調節剤の所望の薬物動態学の貯蔵所として役立つ。
【００８１】
更に、ゲルは栄養成分の吸収を可能にし、そして、培養細胞の機械的及び生化学的防御を提供し、フリーラジカル等のような損傷した細胞代謝物の中和を可能にする。
【００８２】
２）移植のための送達媒体
その製品は、移植組織の移植用送達媒体として役立つ。移植組織は、処置される意図された医学的適応症に従って、生細胞を欠いてもよく、細胞を充てんしてもよい。
【００８３】
中枢神経系における使用のためには、移植は、好ましくは細胞を保持しており、骨又は軟骨修復での使用のためには、好ましくは細胞なしで使用される。
【００８４】
ゲル製品は、薬理学的、酵素的及びその他の薬剤、及び神経瘢痕の阻害剤、神経増殖促進剤、免疫抑制剤、化学療法剤、抗接着剤、抗線維症剤、及び必要により他の細胞増殖調節剤のための貯蔵所として役立つ。
【００８５】
３）医用機器の被覆
ゲルは、外部表面用の被覆として直接的に、或いは機器の開口又は管腔の被覆用として、或いは骨格として役立つ、機器を被覆する弾性のある伸張し得る管として、種々の方法で応用することができる。ゲルの粘度は、均一であってもよく、又は被覆の内側から機器が移植された組織と接触する外側まで変化させることができる。ゲル及び担持する骨格物質は、種々の多孔性、及び異なった生分解速度を有するように作ることができる。
【００８６】
Ｉ）ゲルの臨床応用の経路
ａ）患部への製品の注入、腔、嚢胞等の充填によって。
ｂ）患部の表面再構築のため生物学的接着剤として機能する製品で被覆する。
ｃ）神経再結合及び中枢神経系への移植において、間隙を充填する管又はカプセルそれぞれの中に製品を設置する。
ｄ）血管への使用及び血管形成のために、特に心臓血管への応用のために、ステント内に又はステントの露出表面の被覆として、製品を設置する。
【００８７】
Ｊ）製品（ＨＡ−ＬＮゲル）の神経臨床応用への示唆
ａ）末梢神経、脊髄及び脳損傷及び障害。
ｂ）脊髄、脳末梢神経再構築／移植。
ｃ）脳変性疾患及び脱髄性疾患（アルツハイマー、パーキンソン病、多発性硬化症等）における組織及び薬物投与。
ｄ）術後又は外傷後脳又は脊髄の嚢胞。
ｅ）障害後又は術後瘢痕化の防止又は低減。
ｆ）多発性硬化症の脊髄形成。
【００８８】
神経細胞培養及び移植細胞におけるＨＡ−ＬＮゲルの上記に挙げた利用は、広範な種々の損傷又は障害の治療用のための他の組織型に適合させることができる。本発明のマトリックスに関する使用のための好適な細胞又は組織種は、非限定的であるが、内皮細胞、肝臓、軟骨、骨、心臓、脾臓、肺、皮膚及び血管を含む。
【００８９】
いくつかの現時点での好ましい実施態様である以下の実施例は、例示的目的のためにのみ提供され、限定的に解釈されるべきではない。本発明の範囲は、前記の特許請求の範囲によって定義される。
【００９０】
実施例
材料
ＨＡ成分は、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｅｎｅｒａｌ社（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）によって提供された。ＨＡは、その最適分子量、濃度、粘度及び活性基の修飾の可能性（例えば、ヒドロキシルからベンジルへ）につき試験された。
【００９１】
使用したＨＡの詳細な成分は、以下のものを含有する：９０％ヒアルロン酸ナトリウム；分子量（メガダルトン）２．０１；タンパク質（ｍｇ／ｇ）０．２；２７５ｎｍにおける吸光度（１％溶液）０．０２；エンドトキシン（１％溶液）（ＥＵ／ｍｇ）＜０．１２５；（非炎症性物質）。
【００９２】
１．ＨＡゲルは、２５℃において粘度計の毛細管中の溶液の流れによって測定され、２から８×１０８ダルトンの間に変動し得る分子量に依存して８乃至４８センチポアズの間の粘度係数μとして表される動的固有粘度を有している（ＢａｇのＨＡは、２．５から３×１０６ダルトンの範囲である）。
【００９３】
第二の成分ＬＮを試験し、生物活性について、活性部位の周辺の異なったラミニンペプチドと比較する。最も特徴的なＬＮは、ＬＮ−１（１アルファ、１ベータ及び１ガンマから構成されている）であり、胚及び成人ニューロンにおける全ての発生段階で神経伸展を促進する。ＬＮ−１は、インビボにおいて軸索の誘導物質であると信じられている。
【００９４】
我々の実験で使用したネズミＬＮ−１は、Ｓｉｇｍａ社から入手した。
【００９５】
更に、二つの化合物間の架橋は、好ましくは糖分子を使用して誘導される。相互作用の結果は、結晶学的解析を含むいかなる適切な手段によっても確認される。
【００９６】
ゲルの処方は高度に変化させることができ、ゲルの組成、物理的及び生物学的特徴に関して広範なゲルを創造する特定の混合物を構成する。種々のゲルは、種々の細胞種の培養、種々の組織移植、及び種々の機能のために種々の意図した応用に使用するために調整される。
【００９７】
Ａ．最適化の手順
ゲル成分の特異的な組み合わせは、以下の種々の目的のために開発されている。
１．インビトロで増殖しつつある神経組織用の最適ゲル
３５ｍｍプラスチック皿の中心部を、以下のようにして調製したＨＡ−ＬＮによって被覆する。
【００９８】
１％溶液のＨＡ０．３ｍｌを、１００マイクログラムのＬＮを含有するハンクス緩衝塩類溶液０．６ｍｌで希釈する。このＨＡ−ＬＮ混合物０．９ｍｌは、３５ｍｍプラスチック皿（ＬＮ１２マイクログラムを含有する、１００マイクロリットル／皿）９個を被覆するのに充分である。ＨＡ−ＬＮ被覆皿は１時間放置し、そして、薄い液層で被覆した領域を覆うのに充分な、１皿当たり６００マイクロリットルの栄養培地を加える。
【００９９】
架橋は、好適な架橋剤、好ましくは糖を用いて、所望の程度の硬さ、多孔性、生分解性等を達成するために、適切な時間及び適切な濃度で行われる。
【０１００】
前もってマイクロキャリアー（ＭＣ類）に懸濁した、組織の外移植片（約５〜６／皿）又は解離した神経細胞集合体を、粘度の高い基材ゲルマトリックスに加え、ゲルによってしっかりと接着し被覆した。その後数日の間に、細胞移動及び新しい伸張と共に集中的な新芽形成が起こり、ニューロン及びグリア細胞の密なネットワークを形成する。
【０１０１】
２．適切な骨格に、増殖した神経複合移植組織を固定するための環境：神経組織スライス（厚さ３００ミクロン）又は解離した神経細胞、及び胚性幹細胞を正に帯電したマイクロキャリアーに付着させ、懸濁液を３〜４日増殖させる。静置培養又は複合移植組織片に移す前に、懸濁した外移植片又は細胞―ＭＣ集合体を、更に培養するため又は脳及び脊髄の損傷又は疾患領域に移植するために、ＨＡ−ＬＮゲル中に固定される。これらの培養の例は図３−６に提示されている。
【０１０２】
３．損傷、血腫又は腫瘍切除に起因する、外傷後又は手術後の嚢胞又は空洞を充填するためのＨＡ−ＬＮゲルに包埋された神経細胞の使用。
ａ）脊髄の治療手順：
この治療手順は、損傷、障害、外傷後／手術後の嚢胞又は先天性脊髄空洞症の症例において、及び脊髄の変性疾患及び脱髄疾患の症例において使用される。
【０１０３】
ＨＡ−ＬＮゲルの注入又は移植は、針、内視鏡手術、脳定位手術、ナビゲーター技術等、又は、脊髄切開術での標準的外科的アプローチの使用による注入又は移植によって導入される。
【０１０４】
ＨＡ−ＬＮゲルは、ＣＮＳ組織、幹細胞、シュワン細胞、増殖因子等のような生体物質と共に又はなしに、嚢胞腔又は疾患領域内に注入又は移植される。この手順は、損傷部位及び拡張硬膜形成における微視的な脊髄非係留を伴わなければならない。
【０１０５】
ｂ）脳の治療手順
この治療手順は、損傷、障害、外傷後／手術後の嚢胞、虚血及び実質内出血の発作の症例において、及び、変性疾患（パーキンソン病等）及び脱髄疾患（多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症）の症例において使用される。
【０１０６】
ＨＡ−ＬＮゲルの注入又は移植は、針、内視鏡手術、脳定位手術、ナビゲーター技術等、又は、標準的外科的アプローチの使用による注入又は移植によって導入される。
【０１０７】
ＨＡ−ＬＮゲルは、ＣＮＳ組織、幹細胞、シュワン細胞、増殖因子等のような生体物質と共に又はなしに、嚢胞腔又は疾患領域内に注入又は移植される。
【０１０８】
４．ＨＡ−ＬＮゲルは、脳及び脊髄の患部内へ、外移植片、ニューロン及びグリア細胞、薬物、因子等を曝露する可能性を提供する点でユニークである。
更に、ＨＡ−ＬＮゲルは、胚及び成人由来の稀突起神経膠細胞及びシュワン細胞の移植組織の再構築において重要な役割を演じている。培養中枢及び末梢ミエリン形成細胞からなるこれらの移植組織は、脱髄効果に終わる神経障害を治療するための移植を意図している。
【０１０９】
５．ＣＮＳに加えて、末梢神経の再構築は、それ自体で独特な臨床実体を提示する。
末梢神経又は腕神経叢又は馬尾は、露出されそして神経外剥離術及び／又は維管束間神経剥離術、一次縫合、又は神経移植、骨格又は管により顕微手術的に治療される。再構築の完了後に、露出した末梢神経は、ＨＡ−ＬＮゲル自体又は組織工学によって被覆され、そして、シュワン細胞、増殖因子、薬物等のような生体物質と共に又はそれなしに、管又は骨格を充填する。
【０１１０】
前記のいくつかの現時点での好ましい実施態様の実施例は、単に例示目的のために提供されるものであり、限定的に解釈されるべきでない。本発明の範囲は、前記の特許請求の範囲によって、唯一定義されるべきである。
【０１１１】
（引用文献）
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明に記載のＨＡ−ＬＮゲル内に被覆された例示的なステント（１）の概略図を示す。ゲル（２）は、内部に包埋されたステント（１）の周囲に、管又はスリーブを形成する。ゲルは、ステントの伸張により形成される開いた管腔（５）の周囲に、露出した表面（３）及び内部表面（４）を有する高粘度の外側部分を有する。ゲルで被覆されたステントは、縮んだ管腔内に設置されたバルーンによって、或いはＮｉｔｉｎｏｌ（ニッケル−チタン）形状記憶合金のような別の手段によって、伸張できる。
【図２】
図２は、内部に開いた管腔（５）を有する円筒型をなし、包埋された高分子又は金属メッシュ（３）を有するゲル（２）を含む、脊柱内に組織移植するための骨格（１）の模式図を示す。円筒は、例えば、脊柱の周りを包むことができるように一側（４）に沿って開放するように穴を開けるか、又は切り込みを入れられる。
【図３】
図３は、ＨＡ−ＬＮゲルで７日間増殖したラット胚（Ｅ−１４）からの脊柱の移植片を示す。図３Ａ及び３Ｂは、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅマイクロキャリアーでの培養を示す（位相差顕微鏡像）。図３Ｃは、ＤＥ−５２円筒形マイクロキャリアーでの培養を示す（銀染色）。
【図４】
図４は、ＨＡ−ＬＮゲルで１０日間培養したラット胚（Ｅ−１４）の脊柱から単離した単一ニューロンを示す（位相差顕微鏡像）。
【図５】
図５は、Ａ：２週間ＨＡ−ＬＮで増殖した単一ニューロン（銀染色）；Ｂ：ＨＡ−ＬＮゲルにおいてＤＥ−５３円筒形マイクロキャリアーで３週間増殖した脊柱の移植片内の有髄線維（矢印）（位相差顕微鏡像）を描く。
【図６】
図６は、ＨＡ−ＬＮゲル内のＤＥ−５３円筒形マイクロキャリアーで２週間増殖したＥ−１４ラット胚から分離した、脊柱ニューロンの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535836.tif 000046
【国際調査報告】
2004535836.tif 000047
2004535836.tif 000048