(57)【要約】本発明は、タンパク質溶解性応答プロモーターレポーター遺伝子と操作可能にリンクするポリヌクレオチド及びターゲットタンパク質についての発現構造とともにこれらのポリヌクレオチドを含む遺伝子レポーターシステムを提供する。本発明は本発明のポリヌクレオチド及び遺伝子レポーターシステムを含む細胞も提供する。これらの組成物は細胞内のターゲットタンパク質の溶解性をモニターし、そして細胞に対する変異体及びターゲットタンパク質の溶解性を変化させるターゲットタンパク質を符号化するポリヌクレオチドに対する変異体を同定するために有用である。本発明は、ターゲットタンパク質の溶解性を変化させるタンパク質生合成プロセスにおけるバリエーションを同定する方法、及び組換えクローンの発現ライブラリーをスクリーンして溶解性タンパク質を発現するクローンを同定する方法も提供する。最後に、本発明は抗生物質試薬を同定する新規な方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸；及び
ｂ）ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸；
を含むホスト細胞であって、不溶性形態におけるターゲットポリペプチドの発現がレポーター遺伝子の発現における変化を引き起こす該ホスト細胞。
【請求項２】
溶解性応答プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２２からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７５％が同一であるポリヌクレオチドシーケンスを含む請求項１のホスト細胞。
【請求項３】
溶解性応答プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−２２からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項２のホスト細胞。
【請求項４】
溶解性応答プロモーターが第１表に列挙された遺伝子の調整領域を含むポリヌクレオチドを含む請求項１のホスト細胞。
【請求項５】
溶解性応答プロモーターがＲｐｏＨ認識サイトを含むポリヌクレオチドを含む請求項１のホスト細胞。
【請求項６】
溶解性応答プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２３−４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも７５％が同一であるポリヌクレオチドを含む請求項５のホスト細胞。
【請求項７】
溶解性応答プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２３−４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項６のホスト細胞。
【請求項８】
溶解性応答プロモーターが、ターゲットポリヌクレオチドが不溶性形態で発現される場合にアップレギュレートされる請求項１のホスト細胞。
【請求項９】
溶解性応答プロモーターが、ターゲットポリヌクレオチドが不溶性形態で発現される場合にダウンレギュレートされる請求項１のホスト細胞。
【請求項１０】
ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドがホスト細胞に対し異種である請求項１のホスト細胞。
【請求項１１】
ターゲットタンパク質発現核酸が、ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドと操作可能にリンクするプロモーターを含む請求項１のホスト細胞。
【請求項１２】
ターゲットタンパク質発現核酸が、ホスト細胞に対し同種であるプロモーターを含む請求項１１のホスト細胞。
【請求項１３】
ターゲットタンパク質発現核酸が、ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドに対し異種であるプロモーターを含む請求項１１のホスト細胞。
【請求項１４】
タンパク質溶解性応答プロモーターが原核生物プロモーターである請求項１のホスト細胞。
【請求項１５】
タンパク質溶解性応答プロモーターがＧｒａｍネガティブバクテリアプロモーターである請求項１４のホスト細胞。
【請求項１６】
Ｇｒａｍネガティブバクテリアが家族性腸内細菌科である請求項１５のホスト細胞。
【請求項１７】
家族性腸内細菌科のメンバーが、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、クレブシエラ属及び腸内細菌属からなる群より選択される請求項１６のホスト細胞。
【請求項１８】
ＧｒａｍネガティブバクテリアがＥ．ｃｏｌｉである請求項１７のホスト細胞。
【請求項１９】
タンパク質溶解性応答プロモーターが、Ｇｒａｍポジティブバクテリアプロモーターである請求項１４のホスト細胞。
【請求項２０】
タンパク質溶解性応答プロモーターが、真核生物プロモーターである請求項１のホスト細胞。
【請求項２１】
プロモーターが哺乳動物、植物、昆虫、菌類又は酵母プロモーターである請求項２０のホスト細胞。
【請求項２２】
レポーター遺伝子が、選択可能又は検出可能なポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含む請求項１のホスト細胞。
【請求項２３】
選択可能又は検出可能なポリペプチドが代謝酵素、抗生物質耐性ファクター、化学蛍光タンパク質及び蛍光タンパク質からなる群より選択される請求項２２のホスト細胞。
【請求項２４】
検出可能なポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼである請求項２３のホスト細胞。
【請求項２５】
検出可能なポリペプチドが発光又は蛍光タンパク質である請求項２３のホスト細胞。
【請求項２６】
レポーター遺伝子が、検出可能なポリペプチドをホスト細胞の表面へ向ける信号ペプチドを符号化するポリヌクレオチドをさらに含む請求項２２のホスト細胞。
【請求項２７】
レポーター遺伝子が、レポーター遺伝子を発現しないホスト細胞からのレポーター遺伝子を発現するホスト細胞の分離を容易化する分子タグをさらに含む請求項２６のホスト細胞。
【請求項２８】
タンパク質溶解性応答プロモーターがホスト細胞と同種からのものである請求項１のホスト細胞。
【請求項２９】
ターゲットポリペプチドがより大きなポリペプチドのフラグメントを含む請求項１のホスト細胞。
【請求項３０】
フラグメントがより大きなポリペプチドのドメインを含む請求項２９のホスト細胞。
【請求項３１】
ドメインが、他のポリペプチドと同種のものにより、ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙプロットにより又は両方により同定される請求項３０のホスト細胞。
【請求項３２】
フラグメントがより大きなポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドのランダムフラグメントにより符号化されたポリペプチドを含む請求項２９のホスト細胞。
【請求項３３】
ターゲットポリペプチドが、ポリペプチドの変異した形態を含む請求項１のホスト細胞。
【請求項３４】
各集団のホスト細胞が、ホスト細胞により発現されるターゲットポリペプチドにおいて異なる請求項１のホスト細胞の２又はそれ以上のアレイ。
【請求項３５】
ポリペプチドが、参照アミノ酸シーケンスと比較して、アミノ酸置換、欠損又は挿入により異なる請求項３４のアレイ。
【請求項３６】
ホスト細胞の集団により発現されるターゲットポリペプチドがより大きなポリペプチドの異なるフラグメントを含む請求項３４のアレイ。
【請求項３７】
ａ）請求項１のホスト細胞を、ターゲットポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして
ｂ）レポーター遺伝子の発現が増加されるか又は減少されるかを測定し、それにより発現されたターゲットポリペプチドの溶解性を測定する、
ことを含むターゲットポリペプチドの溶解性を測定する方法。
【請求項３８】
ホスト細胞が原核生物細胞である請求項３７の方法。
【請求項３９】
ホスト細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である請求項３８の方法。
【請求項４０】
溶解性応答プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドシーケンスと少なくとも７５％が同一であるポリヌクレオチドシーケンスを含む請求項３７の方法。
【請求項４１】
溶解性応答プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドシーケンスを含む請求項４０の方法。
【請求項４２】
ホスト細胞が真核生物細胞である請求項３７の方法。
【請求項４３】
レポーター遺伝子の発現が定量アッセイを行うことにより測定され、そして細胞内の検出可能又は選択可能なポリペプチドの量を測定する請求項３７の方法。
【請求項４４】
ターゲットポリペプチドの発現がレポーター遺伝子の発現レベルを変化させない細胞からのレポーター遺伝子の増加又は減少した発現を有する細胞を分離するためにホスト細胞が細胞分類を受ける請求項３７の方法。
【請求項４５】
レポーター遺伝子が蛍光タンパク質を符号化し、そして細胞分類が蛍光活性化細胞分類を含む請求項４４の方法。
【請求項４６】
溶解性レポーター核酸が、さらに：
ａ）分子タグを符号化するポリヌクレオチド；及び
ｂ）信号ペプチドを符号化するポリヌクレオチド、
を含む請求項３７の方法であって、
信号ポリペプチド、分子タグ、及びレポーター遺伝子により符号化される検出可能又は選択可能なポリペプチドが融合タンパク質として発現され、そして信号ポリペプチドが細胞表面に対して検出可能又は選択可能なポリペプチドを向け；そしてさらに分子タグが結合できる固体支持体とホスト細胞を接触させ、レポーター遺伝子を発現する細胞が固体支持体上に固定される該方法。
【請求項４７】
ターゲットポリペプチドが不溶性形態で発現する場合に溶解性応答プロモーターがダウンレギュレートされ、そして不溶性形態でターゲットポリペプチドを発現するホスト細胞が固体支持体に結合しない請求項４６の方法。
【請求項４８】
ターゲットポリペプチドが不溶性形態で発現する場合に溶解性応答プロモーターがアップレギュレートされ、そして不溶性形態でターゲットポリペプチドを発現するホスト細胞が固体支持体に結合する請求項４６の方法。
【請求項４９】
分子タグが抗体用のエピトープ、ポリヒスチジンタグ又はＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを含む請求項４６の方法。
【請求項５０】
さらに：ターゲットポリペプチド発現後の非変性条件下でホスト細胞を分離し、ここでターゲットポリペプチドが溶解性形態で発現する場合は液相中にあり、不溶性形態で発現する場合には固相中にあり；そして、
液相中の溶解性ターゲットポリペプチドの量を測定する；
ことを含む請求項３７の方法。
【請求項５１】
ターゲットポリペプチドが分子タグを含み、そしてさらに：
細胞を分離後に液相の部分を除去し；
ターゲットポリペプチドを、分子タグと結合する検出試薬と接触させ、液相中の溶解性ターゲットポリペプチドの量を測定する、
ことを含む請求項５０の方法。
【請求項５２】
分子タグが抗体用のエピトープ、ポリヒスチジンタグ又はＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを含む請求項５１の方法。
【請求項５３】
該部分が、ポリペプチドを検出試薬と接触させる前にターゲットポリペプチドが結合する固体支持体上に静置される請求項５１の方法。
【請求項５４】
固体支持体がガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミックス及び有機体からなる群より選択される材料により構成される請求項５３の方法。
【請求項５５】
固体支持体がミクロ滴定プレート、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、誘導化ナイロン膜又はアガロース粒子を含む請求項５４の方法。
【請求項５６】
ターゲットポリペプチドの溶解性を変化させる細胞内の変異体を同定する方法であって：
ａ）細胞を変異原で処理し；
ｂ）ｉ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸；及び
ｉｉ）ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸；を細胞内へ導入し；
ｃ）細胞を、ターゲットポリペプチドの発現に適した条件下で培養し；
ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定し；そして
ｅ）細胞内のレポーター遺伝子の発現のレベルを溶解性レポーター核酸及びターゲットポリペプチド発現核酸を含む非変異細胞内で観察されるレベルと比較し、ターゲットポリペプチドの溶解性を変化させる変異体を含む細胞を同定する、
ことを含む該方法。
【請求項５７】
溶解性レポーター核酸及びターゲットポリペプチド発現核酸のいずれか又は両方を細胞内へ導入した後に、細胞が変異原を用いて処理される請求項５６の方法。
【請求項５８】
細胞が原核生物細胞である請求項５６の方法。
【請求項５９】
細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である請求項５８の方法。
【請求項６０】
細胞が真核生物細胞である請求項５６の方法。
【請求項６１】
溶解性が増幅された溶解性へ変化される請求項５６の方法。
【請求項６２】
溶解性が減少された溶解性へ変化される請求項５６の方法。
【請求項６３】
ターゲットポリペプチドの溶解性を変化させるターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドへの変化を同定する方法であって、
ａ）ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを変化させ、変化したポリヌクレオチドを形成させ；
ｂ）ｉ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸；及び
ｉｉ）変化したポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸；を細胞内へ導入し；
ｃ）細胞を、ターゲットポリペプチドの発現に適した条件下で培養し；
ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定し；そして
ｅ）レポーター遺伝子の発現のレベルをターゲットポリペプチドを符号化する非変性ポリヌクレオチドを有する細胞内で観察されるレベルと比較し、符号化されたターゲットポリペプチドの溶解性を変化させるポリヌクレオチドへの変化を同定する、
ことを含む該方法。
【請求項６４】
ターゲットポリペプチドの溶解性を変化させるターゲットポリペプチドの生合成用プロセスにおけるバリエーションを同定する方法であって、
ａ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸；及び
ｂ）ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸；を含むホスト細胞を、ターゲットポリペプチドが発現される選択的な条件下で培養し；
選択的な各条件下で成長したホスト細胞によりレポーター遺伝子の発現を比較する、
ことを含む該方法。
【請求項６５】
少なくとも２種の細胞が培養されそして各細胞におけるレポーター遺伝子の発現が比較され、それにより変化した量の溶解性ターゲットポリペプチドを発現する細胞を同定する請求項６４の方法。
【請求項６６】
ターゲットポリペプチドが不溶性形態で発現する場合にタンパク質溶解性応答プロモーターがアップレギュレートされ、そして低レベルでのレポーター遺伝子の発現が溶解性ターゲットポリペプチドのより大きな発現を生じるプロセス条件を表示する請求項６４の方法。
【請求項６７】
発現ライブラリーをスクリーニングし、溶解性ターゲットポリペプチドを発現するライブラリーメンバーを同定する方法であって、
ａ）ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドをそれぞれが含む複数の発現ベクターを、レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸を含む複数のホスト細胞中へ導入して発現ライブラリーを生成させ、
ｂ）ターゲットポリペプチドが発現される条件下でホスト細胞を培養し；そして
ｃ）レポーター遺伝子の発現を検出し、それにより溶解性ターゲットポリペプチドを発現するライブラリーメンバーを同定する、
ことを含む該方法。
【請求項６８】
ターゲットポリペプチドが不溶性形態で発現する場合にタンパク質溶解性応答プロモーターがアップレギュレートされ、そして溶解性ターゲットポリペプチドを発現するホスト細胞が、不溶性ターゲットポリペプチドを発現するホスト細胞と比較して減少したレベルでレポーター遺伝子を発現する請求項６７の方法。
【請求項６９】
ターゲットポリペプチドが不溶性形態で発現する場合にタンパク質溶解性応答プロモーターがダウンレギュレートされ、そして溶解性ターゲットポリペプチドを発現するホスト細胞が、不溶性ターゲットポリペプチドを発現するホスト細胞と比較して増加したレベルでレポーター遺伝子を発現する請求項６７の方法。
【請求項７０】
レポーター遺伝子が選択可能なマーカーを含み、そしてホスト細胞が選択的な条件下で成長され、それにより溶解性ターゲットポリペプチドを発現するホスト細胞について選択する請求項６９の方法。
【請求項７１】
抗生物質試薬を同定する方法であって、
レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸を含む細胞を候補抗生物質試薬と接触させ；そしてレポーター遺伝子の発現のレベルを検出し、ここで候補抗生物質試薬と接触される細胞内のレポーター遺伝子の発現レベルの変化は、候補抗生物質試薬と接触されない細胞内のレポーター遺伝子発現レベルと比較して、細胞内のタンパク質折りたたみを抑制する試薬を表す、
ことを含む該方法。
【請求項７２】
タンパク質溶解性応答プロモーターが第１表に列挙された遺伝子の調整領域を含むポリヌクレオチドを含む請求項７１の方法。
【請求項７３】
プロモーターを含むホスト細胞内の不溶性ポリペプチドの発現に応答して異なって調整されるプロモーターを同定する方法であって、
ａ）ｉ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクする推定タンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸；及び
ｉｉ）ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸；を含むホスト細胞を提供し；
ｂ）ターゲットポリペプチドが不溶性形態で発現される条件下でホスト細胞を培養し；
ｃ）レポーター遺伝子の発現が増加するか又は減少するかを測定し、それにより推定タンパク質溶解性応答プロモーターがホスト細胞中の不溶性ポリペプチドの発現に応答して異なって調整されるか否かを測定する
ことを含む該方法。
【請求項７４】
推定タンパク質溶解性応答プロモーターがヒートショックプロモーターである請求項７３の方法。
【請求項７５】
推定タンパク質溶解性応答プロモーターが真核生物プロモーターである請求項７３の方法。
【請求項７６】
推定タンパク質溶解性応答プロモーターが原核生物プロモーターである請求項７３の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の背景
発明の分野
本発明は医薬発見及び特に医薬発見プロセスを促進する組成物及び方法に関する。
【０００２】
背景
遺伝子工学技術は、選択された細胞における事実上任意のタンパク質符号化ポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力を提供するものであったが、遺伝子修飾された細胞におけるタンパク質生成の重要なマニピュレーションが、不適切に折りたたまれ生物的に不活性なタンパク質分子の形成をしばしば導くことが観察される。多くの場合、これらの誤って折りたたまれたタンパク質（ｍｉｓ−ｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、細胞の細胞質内に不溶性タンパク質集合体を形成する。ターゲットタンパク質の発現のマニピュレーションの目的が、細胞の表現型を変化させること、生物学的活性なタンパク質のソース若しくは構造分析に適したタンパク質のソースを提供することのいずれであっても、これらの不溶性集合体は生物学的に不活性であり、精製が困難で、そして活性な配列に再び折りたたまれることは困難である。
【０００３】
機能性タンパク質分子の生合成は、ポリペプチド符号化メッセンジャーＲＮＡ分子の翻訳を通じて起こる。発生期のポリペプチド鎖は、３次元分子へ折りたたまれる。生物学的に活性な配列に折りたたまれるためのタンパク質の能力は、タンパク質の特定のアミノ酸シーケンス及びタンパク質が生成される間の細胞内の条件により決定される。さらに、シャペロンと呼ばれるアクセサリータンパク質が発見され、タンパク質の生合成のプロセスにおいて関係し、適切に折りたたまれたタンパク質分子の形成を助けることができる。
【０００４】
Ｍａｘｗｅｌｌ等（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８：１９０８−１９１１は、数種の不溶性タンパク質ターゲットの溶解性を改良するために有用な融合タンパク質構造を記載する。しかし、このアプローチはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質を関心ある遺伝子へ符号化するポリヌクレオチドの融合へ依存することによりその有用性が限定された。それゆえ、遺伝子修飾細胞内へのターゲットタンパク質の折りたたみをモニター又はコントロールする技術の必要性がある。
【０００５】
ヒートショック応答タンパク質（Ｈｓｐ）の理解における最近の進歩は、これらのあるタンパク質とタンパク質折りたたみとの間に関連があることを示す。上昇した温度にされた細胞が、ヒートショック遺伝子として公知の遺伝子のセットの発現を誘導することにより応答することは公知である。これらの遺伝子より符号化されるタンパク質、ヒートショックタンパク質は、上昇した温度の有害な影響をコントロールすることを補助する機能を提供し、そしてシャペロン及びプロテアーゼ分子を含む。ヒートショック応答は、原核生物及び真核生物システムの両方において詳細に研究され、そして発展を通して、高度に維持される。ヒートショックにより誘導される遺伝子の詳細な分析は、グラム陰性菌Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムにおいて行われ、この刺激により誘導される遺伝子のセットを同定した（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ等（１９９９）Ｎｉｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７（１９）：３８２１−３８３５）。この応答の分子の基礎は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて詳細に研究されてきた（Ｌｉｂｅｒｅｋ及びＧｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１０１９−１１０２３；及びＭｃＣａｒｔｙ等（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：８２９−８３７）。変化するｐＨ、低酸素（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ（１９８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１５１−１１９１）又は不溶性タンパク質（Ｐａｒｃｅｌｌ及びＳａｕｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：１２２６−１２３２）のような別のストレスの多い刺激もヒートショックタンパク質誘導を引き起こすことが今般示された。ヒートショック遺伝子を誘導する別の条件の研究は、遺伝子の共通のセットが種々のストレスの多い刺激により誘導されることを示す。それゆえ、シャペロン及びプロテアーゼ分子を含むタンパク質の共通のセットを生成することにより、細胞が広範囲のストレスの多い条件に対し応答し、そしてこれらのタンパク質が有害条件の有害な影響を緩和するために機能することを表す（例えば、Ｐａｒｓｅｌｌ等（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７２（６５０５）：４７５−４７８参照）。
【０００６】
毒性の条件に対しモニター及び防御するヒートショック応答遺伝子の利点を獲得するための種々の努力が行われた。例えば、Ｆａｒｒ（米国特許第５，５８９，３３７）は、アッセイ可能な生成物を符号化し、化合物の毒性を特徴化及び定量する遺伝子に融合したストレス応答プロモーターを利用する方法を記載する。さらに、Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ（米国特許第５，８２７，６８５号は、酵母Ｈｓｐ１０４プロモーター並びに熱、アルコール及び重金属のような潜在的な毒性ストレス因子に対して細胞を防御する遺伝子の使用を記載する。これらの方法は所定の毒性刺激をモニターすることに有用であるが、それらは細胞内のタンパク質生成物の範囲の溶解性を測定又は改善する便利な手段を提供するものではない。それゆえ、細胞内のタンパク質の溶解性を測定及び改良する方法及び試薬についての要求がある。本発明はこれらの及び他の要求を満たすものである。
【０００７】
発明の要約
本発明は、細胞、試薬及びホスト細胞が関心あるポリペプチドを溶解性又は不溶性いずれかの形態で発現するのかを測定するための方法を提供する。ある具体例において、本発明は：ａ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸；及びｂ）ターゲットポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸；を含むホスト細胞を提供する。ターゲットポリペプチドの不溶性形態での発現は、レポーター遺伝子の発現における変化を引き起こす。本発明の数種の具体例において、ターゲットポリペプチドが不溶性形態で発現する場合、溶解性応答プロモーターはアップレギュレートされる；他の具体例において、ターゲットポリペプチドが不溶性形態で発現する場合、溶解性応答プロモーターは、ダウンレギュレートされる。そのようなホスト細胞の２種又はそれ以上の集合のアレイも提供される；各集団のホスト細胞はホスト細胞により発現されるターゲットポリペプチドにおいて異なる。
【０００８】
本発明は、ターゲットポリペプチドの溶解性を測定する方法も提供する。これらの方法は：ａ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸；及びｂ）ターゲットポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸；を含むホスト細胞を、ターゲットポリペプチドが発現される条件下で培養することを含む。それから、発現されたターゲットポリペプチドの溶解性は、レポーター遺伝子が増加又は減少するかを検出することにより、測定される。
【０００９】
本発明のさらなる具体例は、ターゲットポリペプチドの溶解性を変える細胞における変異体を同定する方法を提供する。これらの方法は：ａ）変異原を用いて細胞を処理し；ｂ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸並びにターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸を細胞内に導入し；ｃ）ターゲットポリペプチドの発現に有利な条件下で細胞を培養し；ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定し；ｅ）細胞内のレポーター遺伝子の発現レベルと溶解性レポーター核酸及びターゲットポリペプチド発現核酸をも含む非変異細胞中に観察されるレベルとを比較し、ターゲットポリペプチドの溶解性を変化させる変異体を含む細胞を同定する；ことを含む。
【００１０】
他の具体例において、本発明は、ターゲットポリペプチドの溶解性を変えるターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドに対する変化を同定する方法を提供する。これらの方法は、ａ）ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを変化させ、変化したポリヌクレオチドを形成させ；ｂ）細胞内に、レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸並びに変化したポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸を導入する；ｃ）ターゲットポリペプチドの発現に有利な条件下で細胞を培養する；ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定し；ｅ）レポーター遺伝子の発現レベルとターゲットポリペプチドを符号化する変化していないポリヌクレオチドを有する細胞中に観察されるレベルとを比較し、符号化されたターゲットポリペプチドの溶解性を変えるポリヌクレオチドの変化を同定する；ことを含む。
【００１１】
本発明は、ターゲットポリペプチドの溶解性を変えるターゲットポリペプチドの生合成のためのプロセスにおけるバリエーションを同定する方法をも提供する。これらの方法は、ターゲットポリペプチドが発現される別の条件下でホスト細胞を培養することを含む。ホスト細胞は、ａ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸；及びｂ）ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸；を含む。それからそれぞれ別の条件下で成長したホスト細胞によるレポーター遺伝子の発現が比較され、ターゲットポリペプチドの溶解性の所望のレベルを生じる条件を決定する。
【００１２】
本発明により、溶解性ターゲットポリペプチドを発現するライブラリーメンバーを同定するための発現ライブラリーをスクリーニングする方法も提供される。これらの方法は、ａ）それぞれがターゲットポリヌクレオチドを符号化するポリヌクレオチドを含む複数の発現ベクターを、レポーター遺伝子に操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸を含む複数のホスト細胞中へ導入し、発現ライブラリーを生成させ、；ｂ）ターゲットポリペプチドが発現される条件下でホスト細胞を培養し；及びｃ）レポーター遺伝子の発現を検出し、それにより溶解性ターゲットポリペプチドを発現するライブラリーメンバーを同定する；ことを含む。
【００１３】
本発明は抗生物質を同定する方法も提供する。本方法は：ａ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸を含む細胞と候補抗生物質試薬とを接触させ；レポーター遺伝子の発現レベルを検出する；ことを含む。候補抗生物質試薬と接触しない細胞中のレポーター遺伝子発現レベルと比較して、候補抗生物質試薬と接触する細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルにおける変化は、細胞内でのタンパク質折りたたみを抑制する試薬を表示する。
【００１４】
本発明は、検出可能又は選択可能な生成物を符号化するポリヌクレオチドに操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含むポリヌクレオチドも提供する。ポリヌクレオチドは、さらにターゲットタンパク質について発現構造を含む。本発明は、これらの溶解性レポーターポリヌクレオチドをターゲットタンパク質についての発現構造とともに有する溶解性レポーターシステムも提供する。本発明は、遺伝子デリバリービヒクル並びに発現ベクター及びホストを又は少なくとも本発明のポリヌクレオチド及び遺伝子レポーターシステムを含む遺伝子修飾された細胞も提供する。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１は不溶性タンパク質の発現中に誘導される公知のヒートショック遺伝子のプロモーターを示す。ヌクレオチドシーケンスは手動で整列され、シーケンス内に１つのギャップを許容する。シーケンスは、そのオペロンの最も高度に誘導されるメンバーの減少した誘導レベルにおいて列挙される。翻訳の誤った折りたたみにより引き起こされる非−ヒートショック遺伝子のプロモーターが、図の下部に表される。ＲｐｏＨ認識シーケンス内に保持されるヌクレオチドは、灰色の影で表される
【００１６】
図２Ａ−Ｃは、予め測定された発現特性を有する１８  Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａタンパク質についてのスクリーニング結果の概要を表す。平均的な相対β−ガラクトシダーゼ活性（図２Ａ）、Ｎｉ−ＨＲＰ活性（図２Ｂ）及び１８  Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａタンパク質について生じた溶解性スコア（図２Ｃ）が表される。１８タンパク質についての発現特性は、溶解性及び不溶性フラクションの両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより予め測定された。
【００１７】
図３は、レポーター株における１８６  Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａタンパク質の発現後に観察される相対Ｎｉ−ＨＲＰ活性に対する相対β−ガラクトシダーゼ活性を表す。溶解性、不溶性又は混合としての各タンパク質の分類は、スクリーン後の溶解性及び不溶性分離物において行われるＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく。
【００１８】
図４は、第二構造予測のアライメント、並びにＲｅｐ６８の予測された及び同定されたドメインの両方を表す。Ｒｅｐ６８の第一シーケンスに基づく疎水性のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットとともに整列するα−ヘリカル及びβ−シート構造のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ第二構造予測が示される。下に整列されたものは：完全長Ｒｅｐ６８タンパク質、Ｒｅｐ６８の３種の予測されるドメイン、及びｒｅｐ６８遺伝子のランダムに発生したフラグメントのスクリーニングにより同定されるＲｅｐ６８ドメインの相対的なサイズ及び位置を表すブロックである。タンパク質についての溶解性スコアが示される。
【００１９】
詳細な説明
定義
本開示を通して、種々の刊行物、特許及び発行された特許明細書が引用物を特定することにより参照される。これらの刊行物、特許及び公開特許明細書は参照として本開示中に導入され、これらの発明が関係する技術の状況を十分に記載する。
【００２０】
本発明の実施は、他に示さない限り、当業界の技術範囲内である慣用の分子生物学技術（組換え技術を含む）、ミクロ生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学を使用する。このような技術は、文献中で十分に説明される。これらの方法は、以下の刊行物中に記載される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３版（２００１）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編（１９８７））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）；ＰＣＲ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ等．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））；ＰＣＲ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．Ｈａｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８））；及びＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照されたい。
【００２１】
本明細書中で使用されるとき、所定の用語は以下に定義される意味を有する。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、その意味が他に明確に示されない限り、単数形“ａ” 及び“ｔｈｅ” は複数の意味も含む。例えば、用語“細胞（ａ  ｃｅｌｌ）” は複数の細胞を含み、それらの混合物を含む。
【００２３】
用語“ポリヌクレオチド” 及び“核酸分子” は交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び／又はそれらの同属体を含むことができる。ポリヌクレオチドは，任意の三次元構造を有することができ、そして公知又は非公知の任意の機能を実施できる。用語“ポリヌクレオチド” は、例えば一本−二本鎖及び三重螺旋分子、遺伝子又は遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意のシーケンスの単離ＤＮＡ、任意のシーケンスの単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。核酸分子は、修飾された核酸分子も含むことができる。
【００２４】
用語“ペプチド” は非常に広い意味で使用され、２種又はそれ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸同属体、ペプチド様物質の化合物を意味する。サブユニットは、ペプチド結合とリンクできる。他の具体例において、サブユニットは、例えばエステル、エーテル等のような他の結合によりリンクされることができる。本明細書中で使用されるとき、“アミノ酸” とは、天然及び／又は非天然或いは合成アミノ酸を意味し、グリシン及びＤ若しくはＬ光学異性体の両方、及びアミノ酸同属体又はペプチド様物質を含む。ペプチド鎖が短い場合、３種又はそれ以上のアミノ酸のペプチドは、一般的にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合（例えば約１０−２０アミノ酸より長い場合）、ペプチドは一般的にポリペプチド又はタンパク質と呼ばれる。
【００２５】
“遺伝子修飾される” とは、細胞の遺伝子型又は表現型又はその後代（ｐｒｏｇｅｎｙ）を順番に修飾する外部遺伝子又は核酸シーケンスを含むこと及び／又は発現することを意味する。言いかえれば、それは細胞の内因性ポリヌクレオチドに対する任意の付加、削除又は分裂を意味する。用語“異種” とは、特定の細胞又は細胞成分と天然には関連がないポリヌクレオチド又はポリペプチドも意味する。例えば、特定のホスト細胞に対して異種であるプロモーターは、その種の天然発生細胞においては見出すことができない。同様に、特定のタンパク質符号化ポリヌクレオチドに対して異種のプロモーターは、天然発生細胞における特定のポリヌクレオチドに対し、付着して見出されない。用語“組換え” は、組換え方法により非修飾化された細胞内において、互いに関連のないポリヌクレオチドを含む核酸を意味するものとしてしばしば使用される。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、“発現” とはポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、そしてペプチド、ポリペプチド又はタンパク質へ翻訳されるプロセスを意味する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから運ばれる場合、好適な真核生物ホストが選択された場合、発現はｍＲＮＡのスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を含む。発現に必要な調整エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させるプロモーターシーケンス及びリボゾーム結合用の翻訳開始シーケンスを含む。例えば、バクテリア発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーターを含み、そして転写及び翻訳開始用にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏシーケンス及び開始コドンＡＴＧを含む（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（２００１））。同様に、真核生物発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ用の異種構造又は同種構造プロモーター、下流ポリアデニル化信号、開始コドンＡＵＧ、及びリボゾームの分離用の終止（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）コドンを含む。このようなベクターは市販入手でき、そして当業界で公知の方法、例えば通常のベクターを構成する下記方法、により記載されるシーケンスにより集められる。
【００２７】
“プロモーター” とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合しそして転写を開始するＤＮＡ分子における領域である。プロモーターのヌクレオチドシーケンスは、付着する酵素の性質及びＲＩＮＡ合成の速度を決定する。本開示において、用語“プロモーター” とは、ＲＮＡポリメラーゼ結合サイトだけでなく、転写のインデューサー又はリプレッサーのような転写開始をモジュレートする因子と相互作用する他の全ての隣接シーケンスエレメントを含むポリヌクレオチドを意味するために使用される。それゆえ、本明細書中で定義される“プロモーター” は、染色体におけるネイティブなエレメントと同じ様式で、遺伝子発現を調整するために必要なシーケンス情報の全てを含むポリヌクレオチドである。
【００２８】
用語“タンパク質溶解性応答プロモーター” は、細胞質中の不溶性タンパク質の濃度増加に応答して細胞内で誘導又は抑制されるプロモーターエレメントを意味する。
【００２９】
“転写コントロール下” とは、当業界で良く理解された用語であり、そしてポリヌクレオチドシーケンスの転写、通常はＤＮＡシーケンス、が転写の開始又は促進に寄与するエレメントに操作可能にリンクすることに依存することを示す。“操作可能にリンクする” とは、エレメントを機能させるための配置にある近傍位置であることを意味する。
【００３０】
用語“発現構造” とは、遺伝子と操作可能にリンクするポリヌクレオチドを意味する。発現構造は遺伝子デリバリービヒクルにおけるような種々の様式でフォーマットされ、そして細胞の染色体に挿入できる。該用語は、限定するものではないが、組換えＤＮＡ技術、相同組換え、遺伝子又はプロモーターエレメントのターゲット化される挿入、或いは遺伝子又はプロモーターエレメントのランダム挿入を含む任意の方法により生成されるプロモーター遺伝子融合を意味することを意図する。
【００３１】
“遺伝子デリバリービヒクル” は、ホスト細胞内に挿入されたポリヌクレオチドを運搬できる任意の分子として定義される。遺伝子デリバリービヒクルの例は、リポソーム、天然ポリマー及び合成ポリマーを含むバイオコンパチブルポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、並びにバクロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスのようなバクテリア、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌性ベクター、並びに種々の真核生物及び原核生物ホストにおける発現について記載される技術において典型的に使用され、そして単純タンパク質発現用と同様に遺伝子治療用にも使用される他の組換えビヒクルである。
【００３２】
本明細書中で使用される“遺伝子デリバリー” 、“遺伝子運搬” 等は、導入に使用される方法にかかわりなく、外因のポリヌクレオチドのホスト細胞内への導入を意味する用語である（しばしば“導入遺伝子” と呼ばれる）。このような方法は、（エレクトロポレーション、“遺伝子銃” デリバリー及びポリヌクレオチドの導入に使用される種々の他の技術のような）“裸” ポリヌクレオチドのデリバリーを容易化する技術と同様に、（例えばウイルス感染／トランスフェクション、又は種々の他のタンパク質ベースの又は脂質ベースの遺伝子デリバリー複合物による）ベクター媒介遺伝子運搬のような種々の公知の技術を含む。導入されるポリヌクレオチドは、ホスト細胞中で安定に又は一時的に維持されることができる。安定な維持は、導入されたポリヌクレオチドがホスト細胞と相同性の複製の起源を含むか又は染色体外レプリコン（例えばプラスミド）のような或いは核若しくはミトコンドリア染色体のようなホスト細胞のレプリコン内に統合することを必要とする。多数のベクターが、公知或いは本明細書中で記載されるように、遺伝子の哺乳動物細胞への輸送を媒介できることが知られている。
【００３３】
“ウイルスベクター” とは、インビボ、半ビボ又はインビトロのいずれかで、ホスト細胞へ運ばれるポリヌクレオチドを含む組換え生成されるウイルス又はウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノアソシエイトウイルスベクター等を含む。遺伝子運搬がレトロウイルスベクターにより媒介される態様において、ベクター構造は、レトロウイルスゲノム又はそれらの一部及び治療遺伝子を含むポリヌクレオチドをいう。本明細書中で使用される場合、“レトロウイルス媒介遺伝子運搬” 又は“レトロウイルス遺伝子導入” とは同じ意味を有し、そして遺伝子又は核酸シーケンスが、細胞に入りそのゲノムをホスト細胞ゲノムへ統合するウイルスにより安定にホスト細胞中へ移すプロセスをいう。ウイルスはその通常の感染機構を介してホスト細胞内へ入ることができ、そしてそれが異なるホスト細胞表面レセプタ−又はリガンドに結合して細胞へ入るように修飾されることができる。本明細書中で使用される場合、レトロウイルスベクターは、ウイルス又はウイルス様の導入機構を通じて外因性核酸を細胞内へ導入することができるウイルス粒子をいう。
【００３４】
レトロウイルスは、それらの遺伝情報をＲＮＡの形態で運ぶ；しかし一度ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは、感染細胞のゲノムＤＮＡに統合されるＤＮＡ形態に逆転写される。統合されるＤＮＡ形態は、プロウイルスと呼ばれる。
【００３５】
遺伝子運搬がアデノウイルス（Ａｄ）又はアデノアソシエイトウイルス（ＡＡＶ）のようなＤＮＡウイルスベクターにより媒介される態様において、ベクター構造は、ウイルスゲノム又はそれらの部分並びに導入遺伝子を含むポリヌクレオチドをいう。アデノウイルス（Ａｄｓ）は、ウイルスの比較的良く特徴化された均質な群であり、５０を超える抗原型を含む。例えばＷＯ９５／２７０７１を参照されたい。Ａｄｓは成長させることが容易で、そしてホスト細胞ゲノム内への統合を必要としない。組換えＡｄ誘導ベクター、特に野生型ウイルスの組換え及び発生のためのポテンシャルを減じるものも構成されてきた。ＷＯ９５／００６５５及びＷＯ９５／１１９８４を参照されたい。野生型ＡＡＶは、高度の感染性及びホスト細胞のゲノム内に統合する特異性を有する。Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６４６６−６４７０及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６を参照されたい。
【００３６】
ポリヌクレオチドがプロモーター及び操作可能にリンクできるクローニングサイトの両方を含むベクターは、当業界で公知である。このようなベクターは、ＲＮＡをインビトロ及びインビボで転写することができ、そして例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）及びＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のようなソースから市販入手できる。発現及び／又はインビトロの転写を最適化するために、クローンの５’ 及び／又は３’ 非翻訳化部分を除去、付加又は変化させ、転写又は翻訳のレベルのいずれかにおいて、余分な、潜在的な不適当な別の翻訳開始コドン又は発現を妨げ又は減じ得る他のシーケンスを除去することができる。代わりに、一致するリボゾーム結合サイトは、開始コドンの５’ へ直ちに挿入され、発現を増幅することができる。
【００３７】
遺伝子デリバリービヒクルも、ＤＮＡ／リポソーム複合物を含む種々の非ウイルスベクター及びターゲット化されたウイルスタンパク質ＤＮＡ複合物を含む。ターゲット化抗体又はそれらのフラグメントも含むリポソームは、本発明の方法において使用され得る。細胞へのデリバリーを増幅させるために、本発明の核酸又はタンパク質は、抗体又は細胞表面抗原、例えばＴＣＲ、ＣＤ３若しくはＣＤ４へ結合するそれらの結合フラグメントへコンジュゲートされることができる。
【００３８】
本明細書中において使用される場合、“レポーター遺伝子” とは、細胞による発現が検出及び定量されるタンパク質を符号化するポリヌクレオチドである。それゆえ、レポーターの発現レベルの測定は、レポーター遺伝子の発現を指示するプロモーターエレメントの活性化のレベルを示す。このような検出は、例えば選択的な条件下でレポーター遺伝子を含む細胞を配置することによりレポーター遺伝子発現についての選択を含む。
【００３９】
“ハイブリダイゼーション” とは、１種又はそれ以上のポリヌクレオチドが反応し、ヌクレオチド残渣の塩基間の水素結合を介して安定化される複合物を形成する反応をいう。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対、Ｈｏｏｇｅｓｔｅｉｎ結合又は任意の他のシーケンス特異的な様式により生じることができる。複合物は、二重構造を形成する二本鎖、多重鎖複合物を形成する３本又はそれ以上の鎖、又はそれらの組合せを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始又はリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素開裂のような、より広範囲のプロセスにおける段階を続けることができる。
【００４０】
厳重なハイブリダイゼーション条件の例は：約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６ＸＳＳＣ〜約１０ＸＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度；約０％〜約２５％のホルムアルデヒド濃度；及び約６ＸＳＳＣの洗浄濃度、を含む。適度なハイブリダイゼーション条件の例は：約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９ＸＳＳＣ〜約２ＸＳＳＣのバッファー濃度；約３０％〜約５０％のホルムアルデヒド濃度；及び約５ＸＳＳＣ〜約２ＸＳＳＣの洗浄濃度、を含む。高度に厳重なハイブリダイゼーション条件の例は：約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約５５％〜約７５％のホルムアルデヒド濃度；及び約１ＸＳＳＣ〜約０．１ＸＳＳＣの洗浄濃度又は脱イオン水、を含む。一般的には、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は５分〜２４時間であり、１，２又はそれ以上の洗浄段階を伴い、及び約１、２又は１５分の洗浄インキュベーション時間を伴う。ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸塩バッファーである。他のバッファーシステムを使用する同等のＳＳＣが使用できるものと理解される。
【００４１】
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド若しくはポリペプチド領域）は、他のシーケンスに対して所定のパーセント（例えば８０％、８５％、９０％又は９５％）の“シーケンス同一性” を有し、それは整列されたときに塩基（又はアミノ酸）が２種のシーケンスを比較した場合に同一であることを意味する。このアライメント及びパーセント相同性若しくはシーケンス同一性は、例えばＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等．，ｅｄｓ．，１９８７）３０版セクション７．７．１８，表７．７．１に記載されるように、当業界で公知のソフトウェアプログラムを用いて測定できる。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドシーケンスを配列させ、パーセント相同性を測定する好ましいプログラムは、欠陥（ｄｅｆａｕｌｔ）パラメーターを使用するＣＬＵＳＲＡＬＷである。このプログラムは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ａｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（ｗｗｗ，ｉｂｃ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕｌｍｓａｌｃｌｕｓｔａｌ．ｈｔｍｌ）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ（ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｍｉｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）及びｔｈｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ（ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｃｌｕｓｒａｌｗ−ｓｉｍｐｌｅ．ｈｔｍｌ）のようなワールドワイドウェブ上の種々のサイトで入手できる。
【００４２】
参照ポリヌクレオチドの“生物学的に同等” とは、欠陥パラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）下でシーケンスアライメントプログラムを使用して測定した場合に、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のシーケンス同一性を有することにより特徴付けられ、機能を変化させないヌクレオチドシーケンスにおけるシーケンスデータ及び変化における曖昧さを補正する。“生物学的に同等” なポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにより、適当な又は厳重なハイブリダイゼーション条件下で単離され得る。シーケンス類似性又は参照ポリヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションに加え、生物学的に同等なポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドと同一又は類似の生物学的な機能を有する。
【００４３】
種々のソフトウェアプログラムが当業界において入手でき、過度の量の実験なしに生物学的に同等なポリヌクレオチドを同定する。これらのプログラムの非限定的な例は、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴファミリープログラム（ＢＬＡＳＴは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴＩにおいて、ワールドワイドウェブから入手できる）、ＦａｓｔＡ、Ｃｏｍｐａｒｅ、ＤｏｔＰｌｏｔ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＡＰ、ＦｒａｍｅＡｌｉｇｎ、ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＰｉｌｅＵｐである。これらのプログラムは、ＧＣＧ  Ｉｎｃ．’ ｓ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのようなシーケンス分析ソフトウェアの包括的なパッケージにおいて市販入手できる。他の類似の分析及びアライメントプログラムは、ＤＮＡ  Ｓｔａｒ’ ｓ  ＭｅｇＡｌｉｇｎ、又はＧｅｎｅＪｏｃｋｅｙにおけるアライメントプログラムのような種々のプロバイダーより購入できる。代わりに、シーケンス分析及びアライメントプログラムは、ｗｗｗ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／ＲｅｓＴｏｏｌｓ／ｃｍｓｈｐ．ｈｔｍｌにて、ＣＭＳ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅのようなサイトにおけるワールドワイドウェブを通じてアクセスできる。ＤＮＡ又は遺伝子若しくはそれらのセグメントに一致するタンパク質シーケンスを含む任意のシーケンスデータベースは、シーケンス分析に有用でありうる。一般的に利用されるデータベースは、限定するものではないがＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＥＳＴ、ＳＴＳ、ＧＳＳ及びＨＴＧＳを含む。シーケンス類似性は、ＤＮＡシーケンスデータベースに対してタグシーケンスを整列させることにより認識され得る。その代わりに、タグシーケンスは６種の読み枠（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）へ翻訳され得る；全ての可能な読み枠の予想されるペプチドシーケンスは、それからＢＬＡＳＴＸプログラムを使用するｓ  ｄｏｎｅのようなタンパク質データベースに保存される個々のシーケンスと比較される。
【００４４】
１種又はそれ以上の上記アライメントプログラムにより示される類似性の程度を想定するためのパラメーターは、当業界で良好に確立する。それらは限定するものではないが、ｐ値、パーセントシーケンス同一性及びパーセントシーケンス類似性を含む。Ｐ値は、アライメントが偶然に生成される可能性である。単一のアライメントについて、ｐ値はＫａｒｌｉｎ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２４６に従って計算できる。多重アライメントについては、ＢＬＡＳＴにおいてプログラムされたもののような機能的なアプローチを使用して計算できる。パーセントシーケンス同一性は、２種のものが最適に配列された場合、疑問のシーケンスと公知のシーケンス間で一致するヌクレオチド及びアミノ酸の数の比により規定される。パーセント類似性を計算する場合、異なってはいるがポジティブなものと類似するアミノ酸をスコアすることを除いては、パーセントシーケンス類似性はパーセント同一性と同じ方法にて計算される。
【００４５】
本明細書中で使用される“インビボ” 遺伝子デリバリー、遺伝子運搬、遺伝子治療等は、ヒト又はヒトでない哺乳動物のような有機体の体内へ、外因性ポリヌクレオチドを含むベクターを直接的に導入し、それにより外因性ポリヌクレオチドがそのような有機体にインビボで導入されることを意味する用語である。
【００４６】
用語“単離される” とは、成分、細胞及びその他から分離されることを意味し、通常はポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントが関連する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドとは、通常、染色体において結合する５’ 及び３’ シーケンスから分離されるものである。当業者に明らかであるように、非天然発生のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントは、その天然に発生した対照物から“単離され” 区別する必要はない。さらに、“濃縮され” 、“分離され” 又は“希釈された” ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントは、濃度又は体積当たりの数が、天然発生した対照物より“濃縮された” ものより大きく又は天然発生した対照物より“分離された” ものよりも小さいことで、その天然発生した対照物から区別できる。天然発生した対照物とはプライマリーシーケンスにおいて異なり又は例えばグリコシル化パターンにより異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はそれらのフラグメントは、単離された形態で存在する必要はない、なぜならそれは天然発生した対照物からそのプライマリーシーケンスにより、又はその代わりにグリコシル化パターンのような他の性質により区別できるからである。本明細書中に開示される各発明について明確に述べてはいないけれども、以下に開示される及び適切な条件下における各構成についての具体例が本発明により提供されることは理解されるであろう。それゆえ、非天然に発生するポリヌクレオチドは単離された天然発生ポリヌクレオチドから分離した具体例として提供される。バクテリア細胞中で生成されるタンパク質は、天然に生成される真核生物細胞から単離される自然発生タンパク質から、別個の具体例として提供される。
【００４７】
“ホスト細胞” 又は“遺伝子修飾された細胞” は、ベクターについての受容体又は或いは外因性核酸分子、ポリヌクレオチド及び／又はタンパク質の導入物であるか又はそれを有する任意の個々の細胞又は細胞培養物を含むことを意図する。それは単細胞の子孫を含むことを意図し、そして子孫は自然の、偶発的な又は計画的な変異のために、本来の親細胞と（形態学的に、又は遺伝学的に又は全体のＤＮＡ全数（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）完全に同一である必要はない。細胞は原核生物細胞又は真核生物細胞で良く、限定するものではないが、バクテリア細胞、酵母細胞、動物細胞、及び哺乳動物細胞、例えばハツカネズミ、ラット、シミアン又はヒト、を含む。
【００４８】
“対象” は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、限定するものではないがハツカネズミ、シミアン、ヒト、農場動物、スポーツ用動物及びペットを含む。
【００４９】
“コントロール” とは、実験において比較目的のために使用される代替の対象又は試料である。“コントロール” は、“ポジティブ” 又は“ネガティブ” であることができる。例えば、実験の目的が、特定型の癌を有する遺伝子の改変した発現レベルの相関関係を測定することである場合は、一般的にはポジティブコントロール（そのような改変をもたらし、そしてその疾患に特徴的な病状を示す対象又は対象からの試料）及びネガティブコントロール（改変した発現及びその疾患の重要な病状を欠く対象又は対象からの試料）を使用することが好ましい。
【００５０】
用語“培養” とは、広範囲の種類の媒体上で又はその中での細胞又は組織のインビトロの増殖を意味する。培地中で成長した細胞の子孫は親細胞と（形態学的に、遺伝学的に又は表原型が）完全に同一でないことは理解される。“拡張された” とは細胞の任意の増殖又は分裂を意味する。“組成物” とは活性試薬及び他の化合物及び組成物、補助剤のような不活性（例えば検出可能な試薬又はラベル）又は活性物質の組合せを意味する。
【００５１】
“医薬組成物” とは、組成物を診断又は治療上のインビトロ、インビボ又は半ビボでの使用に適したものにする不活性又は活性キャリアを有する活性試薬の組合せを含むことを意図する。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語“医薬的に許容されるキャリア” とは、リン酸塩緩衝化（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ）サリン溶液、水、並びに水／油又は油／水エマルジョンのようなエマルジョン、及び種々の型の湿潤剤を含む任意の標準的な医薬キャリアを含む。組成物は安定化剤及び防腐剤をも含むことができる。キャリア、安定化剤及び補助剤の例については、Ｍａｒｔｉｎ  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１５版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照されたい。
【００５３】
“効果的な量” とは、有益な又は所望の結果をもたらすに十分な量である。効果的な量が１又はそれ以上の投与、塗布又は服用により投与されることができる。
【００５４】
“固体成長媒体” とは有機体が培養されるに適した成長媒体であり、十分な濃度の寒天を含み、細胞のクローン集団用の培養物を培養する目的のために固体表面を提供するものである。
【００５５】
“指示染料” とは、レポーター遺伝子と反応し、容易にアッセイされる変化する特性を有する化合物を生成する化学物質である。好適な指示染料の例は、β−ガラクトシダーゼと反応するＸ−ｇａｌ、ｌａｃＺレポーターの遺伝子生成物であり、青い沈殿を生成する。
【００５６】
好適な具体例の説明
本発明は、タンパク質が細胞により溶解性の形態又は不溶性の形態のいずれかで生成されるかを直ちに区別できるようにする溶解性レポーター遺伝子構造を提供する。細胞内のタンパク質溶解性状態を測定する方法と同様に、溶解性の形態にて製造されるタンパク質又はタンパク質ドメインを同定することに使用されるレポーターホスト細胞も提供される。さらなる具体例において、本発明は細胞内で発現されるターゲットタンパク質の溶解状態を測定する高処理量の方法を提供する。
【００５７】
溶解性レポーター遺伝子構造
本発明は、プロモーターを含む細胞中に不溶性タンパク質が存在するか否かに依存して誘導又は抑制されるプロモーターを含む溶解性レポーター構造を含むホスト細胞を提供する。これらのタンパク質溶解性応答プロモーターは、好ましくは細胞内で発現される場合に直ちに検出できる遺伝子生成物を符号化するポリヌクレオチドと操作可能にリンクする。不溶性タンパク質によりアップレギュレートされるプロモーターを含む溶解性レポーター遺伝子構造が細胞内に存在する場合、例えば、不溶性タンパク質の存在は、レポーター遺伝子生成物のレベルの増加を生ずる。
【００５８】
特定の種における使用のために好適なプロモーターを同定するために、不溶性形態で発現されることが公知なタンパク質を発現する種の細胞からの遺伝子発現プロファイルを、不溶性タンパク質を発現しない細胞と比較できる。例えば、コントロール細胞は、溶解性形態で見出されるタンパク質を発現できる。ひとたび、不溶性又は溶解性タンパク質のいずれかが発現されるかにより１種又はそれ以上の遺伝子が異なって発現される場合、遺伝子の上流領域はクローン化されそして溶解性レポーター構造を構成することに使用できる。上流領域を含むポリヌクレオチドの長さは、特定の遺伝子及び／又は種に依存してしばしば変化する。ひとたび、上流領域がクローン化されると、その上流領域をレポーター構造遺伝子と操作可能にリンクすることにより、その機能を直ちに試験でき、該構造をホスト細胞中に導入し、そして不溶性の形態で発現することが公知なタンパク質を発現する。誤って折りたたまれたタンパク質に応答するプロモーターシーケンスは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）、ｃＤＮＡアレイ、レポータースクリーニング、及び当業者に公知の他のアプローチにより同定できる。
【００５９】
タンパク質溶解性応答プロモーターは、原核生物又は真核生物プロモーターであることができる。関心ある特定のホスト細胞において機能的であるプロモーターが利用される。例えば、バクテリアホスト細胞の使用について、Ｇｒａｍネガティブ又はＧｒａｍポジティブバクテリアからタンパク質溶解性応答プロモーターを単離できる。このようなＧｒａｍネガティブバクテリアは、例えば家族性腸内細菌科のメンバーを含む。腸内細菌科のメンバーの例は、エシェリキア属、サルモネラ属、シゲラ属、クレブシエラ属、又は腸内細菌属である。好適な原核生物は限定するものではないが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｏｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｌｉｖｉｄａｎｓを含む。ある好適な種は、ＧｒａｍネガティブバクテリアＥ．ｃｏｌｉから単離されるプロモーターエレメントである。好適なＥ．ｃｏｌｉプロモーターの特定の例は、例えば以下の遺伝子からのプロモーターである：ｋｇｔＰ遺伝子（ｂ２５８７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、遺伝子ｂ３９１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ｐｒｏＰ（ｂ４１１１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ｅｘｂＢ（ｂ３００６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ｙｅｇＧ（ｂ２８１２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ｙｏｊＨ（ｂ２２１０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｙｂｅＤ（ｂ０６３１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ｙｃｉＳ（ｂ１２７９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ｙａｇＵ（ｂ０２８７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ｆｔｓＪ（ｂ３１７９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ｇｒｐＥ（ｂ２６１４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ｈｔｐＸ（ｂ１８２９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ｃｌｐＢ（ｂ２５９２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ｆｘｓＡ（ｂ４１４０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ｈｓｌＶ（ｂ３９３２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ｃｌｐＰ（ｂ０４３７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ｈｔｐＧ（ｂ０４７３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ｄｎａＫ（ｂ００１４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ｙｃｃＶ（ｂ０９６６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ｙｒｆＧ（ｂ３３９９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ｉｂｐＡ（ｂ３６８７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、及びｙｈｄＮ（ｂ３２９３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）。
【００６０】
数種の具体例において、タンパク質溶解性応答プロモーターは、ＲｐｏＨ認識サイトを含む。このようなプロモーターの例は図１にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２３−４３として表される。
【００６１】
本発明は、Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏｓ．１−４３において提供されるシーケンスと生物学的に同等のポリヌクレオチドの使用も含み、それはシーケンス同属体サーチ又は上述のような穏やかな又は厳重なハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションにより同定される。生物学的に同等なポリヌクレオチドの種々の具体例は、例えばシーケンスデータにおける曖昧さについて較正する欠陥パラメーター下のシーケンスアライメントプログラム及び機能を変化させないヌクレオチドシーケンスにおける変化を用いて測定した場合に、少なくとも７５％又は少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％シーケンス相同性にて処理することにより特徴付けられる発明の視野の範囲内である。生物学的に同等とは、穏やかな又は厳重な条件下でＳｅｑ．ＩＤ．Ｎｏｓ．１−４３へハイブリダイズするもの又はそれらのそれぞれの捕体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に対してハイブリダイズする。そのようなポリヌクレオチドは、本発明の方法に従ってテストされ、所望のタンパク質溶解性応答を示すものを同定する。
【００６２】
真核生物細胞内における使用のために、タンパク質溶解性応答プロモーターは、通常は真核生物遺伝子から得られる。多くの真核生物ヒートショック及び他のストレス誘導遺伝子は当業者に公知である。
【００６３】
本発明は、これらの又は他の遺伝子からのプロモーターを試験し、細胞内の不溶性タンパク質の存在に応答して異なって調整されるかどうかを測定する方法を提供する。これらの方法は、レポーター遺伝子と操作可能にリンクする推定のタンパク質溶解性応答プロモーターを含む溶解性レポーター核酸を含むホスト細胞を培養することを含む。ホスト細胞は、ターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド発現核酸をも含む。ホスト細胞は、ターゲットポリペプチドが不溶性の形態で発現される条件下で培養される。それからレポーター遺伝子の発現のレベルが検出され、推定のタンパク質溶解性応答プロモーターがホスト細胞中の不溶性ポリペプチドの発現に応答して異なって調整されるかどうかを測定する。
【００６４】
好適な真核生物細胞は、例えば哺乳動物、昆虫又は植物細胞、或いは例えば酵母細胞又は菌細胞のような微生物を含む。好適な細胞の例は、特に例えばＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ種（例えばＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ種、Ｅｒｗｉｎｉａ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種を含む。酵母細胞は、多くの種類の中の任意のものであることができ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ（例えばＣ．ｕｔｉｌｉｓ，Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ，Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ，Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ，Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ，Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ，Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ，Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓ及びＣ．ｈｕｍｉｃｏｌａ）、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ及びＰ．ｏｈｍｅｒｉ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ（例えばＴ．ｃａｎｄｉｄａ，Ｔ．ｓｐｈａｅｒｉｃａ，Ｔ．ｘｙｌｉｎｕｓ，Ｔ．ｆａｍａｔａ及びＴ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ（例えばＤ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ，Ｄ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ，Ｄ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ，Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ及びＤ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＺ．ｒｏｕｘｉｉ及びＺ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ），Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（例えばＨ．ａｎｏｍａｌａ及びＨ．ｊａｄｉｎｉｉ）及びＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（Ｂ．ｌａｍｂｉｃｕｓ及びＢ．ａｎｏｍａｌｕｓ）を含む。好適な真核生物細胞のさらなる非限定的な例は、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む。
【００６５】
上記同定されたタンパク質溶解性応答プロモーターは、細胞質内の溶解性タンパク質の存在又は不存在を同定するために機能するレポーター遺伝子と操作可能にリンクする。レポーター遺伝子は、選択可能な又は検出可能なポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含む。“レポーター遺伝子” として有用な遺伝子の例は、限定するものではないが、代謝酵素、抗体耐性因子、発光タンパク質（例えばルシフェラーセ）、又は蛍光タンパク質を符号化する遺伝子を含む。このようなレポーター遺伝子は当業界で公知であり、そして特定の例はＷｏｏｄ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（１）：５０−５８に記載される。ある態様において、代謝酵素はβ−ガラクトシダーゼである。他の態様において、代謝遺伝子はホスト細胞中での栄養要求株変異体（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を補い、そして選択的な媒体上の遺伝子を発現する細胞の成長をさせる。
【００６６】
レポーター発現を検出及び定量する方法は、一般的にはレポーターにより符号化されるタンパク質の活性を測定することをベースとする。広範囲の検出可能なマーカーは当業界で公知であり、アビジン／ビオチンのような蛍光、放射性、酵素的又は他のリガンドを含み、それは検出可能な信号を与えることが可能である。好適な具体例において、放射性又は他の環境上非所望な試薬の代わりに、おそらく蛍光ラベル又はウレアーゼ、アルカリホスフェート、ペルオキシダーゼのような酵素タグを使用することが望ましい。酵素タグの場合、比色分析指示薬サブストレートは人の目に可視であるか又は分光測定法で可視である手段を提供するために使用でき、補助の核酸含有試料を用いて特定のハイブリダイゼーションを同定することが公知である。
【００６７】
レポーターが酵素の場合、代謝されて測定可能な生成物を生成する酵素用のサブストレートが使用できる。例えば、酵素により開裂されて青色の反応性生成物を生成するβ−ガラクトシダーゼサブストレートＸ−ｇａｌは、β−ガラクトシダーゼレポーター発現をアッセイすることに頻繁に使用される（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．ｅｄ．（１９９２）Ａ  ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。代わりに、β−ガラクトシダーゼにより代謝されるβ−ガラクトシダーゼサブストレートｏ−ニトロフィル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）が黄色を有する化合物を生成する。酵素の量は、着色化合物の光学密度を分光測定的に測定し又はＥＬＩＳＡリーダーを使用することにより、測定される。４２０ｎｍにおける吸収が読み取られる（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ。Ｈ．ｅｄ．（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。他の一般的に使用されるレポーター遺伝子は、抗体耐性ファクタークロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ遺伝子、及びクラゲ緑蛍光タンパク質である（Ｖａｌｄｖｉａ及びＦａｌｋｏｗ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（９）：３６０−３６３；Ｎａｙｌｏｒ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８（５）：７４９−７５７；Ｈｉｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｎｏｎ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：１６５−１７４）。さらに、種々の別のタンパク質も、検出及び定量される能力に基づきレポーターとして使用することができる。そのような遺伝子の発現レベルを測定するためのアッセイは、良好に改良されそして当業者により一般的に実施される（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２：７０４−７２０；Ｄａｖｅｙ等（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：１４３−１４８；及びＢｒｏｎｓｔｅｉｎ等（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９（２）：１６９−１８１）。
【００６８】
有用なレポーター遺伝子を符号化するポリヌクレオチドは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のような、分子生物試薬の種々の商業的なサプライヤーから入手できる。さらに、レポーター遺伝子シーケンスを含むプラスミドベクターは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ及びＹａｌｅ大学のＥ．ｃｏｌｉ菌株コレクションのような遺伝子貯蔵所より入手できる。
【００６９】
本発明の溶解性レポーター核酸は、リボゾーム結合サイト及びポリアデニル化サイトのようなエレメントをコントロールする同じ転写ユニット内のコーディングシーケンスのようなさらなるシーケンス、同じ又は異なるプロモーターのコントロール下でのさらなる転写ユニット、クローニング、発現及びホスト細胞の形質転換を許容するシーケンス、並びに本発明の具体例を提供する場合に所望であり得るそのような任意の構造を含むことができる。数種の具体例において、溶解性レポーター核酸は、レポーター遺伝子により符号化された検出可能なポリペプチドをホスト細胞の表面に向ける信号ペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含む。それから検出可能なポリペプチドは、例えばセルソーターにより検出できる。例えば、レポーター遺伝子が、発現において細胞表面に表示される蛍光タンパク質を符号化する場合は、蛍光活性化されたセルソーターを利用し、レポーター遺伝子を発現する細胞を、そうでない細胞から分離する。
【００７０】
溶解性レポーター核酸は、レポーター遺伝子を発現しないホスト細胞の分離を容易化する分子タグを符号化するポリヌクレオチドも含むことができる。例えば、抗体についてのエピトープは分子タグとして機能することができ；それからレポーター遺伝子を発現する細胞は、エピトープを特異的に認識する付着抗体である固体支持体と細胞を接触させることにより、固定できる。他の好適な分子タグは、当業者に公知であり、例えばポリヒスチジンタグ又はＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを含む。特定のタンパク質溶解性応答プロモーターが使用において不溶性形態のターゲットポリペプチドの発現に応答してアップレギュレートされる場合、不溶性ターゲットポリペプチドを発現する細胞が支持体上に固定される。逆に、特定のタンパク質溶解性応答プロモーターが、使用において不溶性形態のターゲットポリペプチドの発現に応答してダウンレギュレートされる場合、溶解性形態のターゲットポリペプチドを発現する細胞が支持体上に固定される。
【００７１】
本発明は、ａ）レポーター遺伝子と操作可能にリンクする少なくとも１種のタンパク質溶解性応答プロモーターを含む単離されたポリヌクレオチド、及びｂ）ターゲット遺伝子の発現を指示する発現構造、を含むレポーターシステムも提供する。発現構造はプロモーター及びレポーター遺伝子からの別々のポリヌクレオチドのいずれかにあり、又は発現構造はタンパク質溶解性応答プロモーター及びレポーター遺伝子をも含む単一のポリヌクレオチドの一部であることができる。それゆえ、本発明の特定の具体例において、レポーターシステムはレポーター遺伝子と操作可能にリンクするタンパク質溶解性応答プロモーターを含み、単離されたポリヌクレオチドは、さらに発現構造を含む。
【００７２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞内への、本発明のポリヌクレオチドのデリバリー及び／又は発現に適した遺伝子デリバリービヒクルも、（インビボ、半ビボ又はインビトロで）提供する。本発明のポリヌクレオチドは、クローニング又は発現ベクター内へ含まれることができる。これらのベクター（特に発現ベクター）は、順番にマニピュレートされ、例えば細胞内へのデリバリー及び／又は導入を容易化できる多数の形態のうち任意のものを仮定することができる。好適な発現又はデリバリービヒクルの例は上記に提供される。
【００７３】
本発明は、上記同定されたターゲットポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを含むターゲットポリペプチド−発現核酸と同様に、上述のタンパク質溶解性レポーター構造を含むホスト又は遺伝子修飾された細胞をも提供する。細胞のアレイも提供され、各集団の細胞は、細胞により発現されるターゲットポリペプチドにおいて異なる。例えば、ポリペプチドはアミノ酸置換、欠損又は挿入により参照アミノ酸シーケンスと比較して異なることができる。代わりに、ホスト細胞の集団により発現されるターゲットポリペプチドは、より大きなポリペプチドの異なるフラグメントであることができる。
【００７４】
本発明において具体化されるポリヌクレオチド及びシーケンスは、化学的な合成、組換えクローニング手段、ＰＣＲ、又はそれらの任意の組合せを使用して入手できる。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，８００，１５９号；第４，７５４，０６５号；及び第４，６８３，２０２号の課題であり、並びにＴＨＥ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＣＨＡＩＮ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ（Ｍｕｌｌｉｓ等編，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４））又はＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ等（１９９１）及び（１９９５）上、並びにそれらの中で引用される参考文献のＰＣＲに記載される。代わりに、当業者は本明細書中で提供されるシーケンス及びＤＮＡを複製するための市販のＤＮＡシンセサイザーを使用できる。従って、本発明は本発明のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの線状シーケンス、ヌクレオチド、適切なプライマー分子、酵素のような化学物質を提供することにより得るプロセス、並びにそれらの複製及び化学的複製又は適切な方向においてヌクレオチドをリンクさせポリヌクレオチドを得るための指示を提供する。別々の具体例において、これらのポリヌクレオチドはさらに単離される。さらに、当業者はポリヌクレオチドを好適な複製ベクター内へ挿入することができ、及び複製及び増幅用の好適なホスト細胞（原核生物又は真核生物）へ挿入できる。そのように増幅されるＤＮＡは、当業者に公知の方法により細胞から単離される。この方法によりポリヌクレオチドを得る方法は、そのようにして得られたポリヌクレオチド同様に、本明細書中においてさらに提供される。
【００７５】
ＲＮＡは、好適なホスト細胞へのＤＮＡポリヌクレオチドの第一挿入により得られる。ＤＮＡは任意の好適な方法、例えば好適な遺伝子デリバリービヒクル（例えばリポソーム、プラスミド又はベクター）の使用又はエレクトロポレーションにより導入できる。細胞が複製しそしてＤＮＡがＲＩＮＡ内へ転写される場合は；ＲＮＡは当業者に、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（２００１）上に記載されるような公知の方法で単離される。例えば、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（２００１）上に記載された種々の分解酵素又は化学溶液を使用して単離でき、又は製造者により提供される付随する指示を守って、核酸結合樹脂により抽出される。
【００７６】
単離された形態の又はベクター若しくはホスト若しくは遺伝子修飾された細胞に含まれる本発明のキャリア及びポリヌクレオチド及びシーケンスを含む組成物は、本明細書中でさらに提供される。これらの組成物が医薬的に使用される場合は、それらは医薬的に許容されるキャリアと組み合わされる。
【００７７】
ポリヌクレオチド、レポーターシステム及び細胞は、下記方法において有用である。
【００７８】
産業上の利用
本明細書中に記載される構造は、細胞中のターゲットタンパク質の溶解性を迅速に及び正確に測定するために有用である。この方法を行うために、本発明の構造を含む細胞は、ターゲットタンパク質が発現されそしてレポーター遺伝子の発現が誘導可能な条件下で培養される。本明細書中で使用される場合、用語“誘導可能” とは、レポーター遺伝子の転写が特定の刺激に応答して開始されることを意味する。タンパク質溶解性応答プロモーターの転写を誘導する特定の刺激は、細胞の細胞質内における不溶性のタンパク質である。ＧｒａｍネガティブバクテリアＥ．ｃｏｌｉの細胞を用いて、例えば細胞は寒天プレートよりも液体媒体中で成長され、誘導可能になる。
【００７９】
レポーター遺伝子の発現は、ターゲット遺伝子の発現に続き測定される。これは、蛍光タンパク質の蛍光を測定することにより又はＥＬＩＳＡアッセイのような免疫アッセイによりレポーター遺伝子を測定することによるように、タンパク質の量を直接的に測定することにより達成できる。その代わりに、レポーター遺伝子が酵素である場合は、生成されるレポーターの量はサブストレート化合物の例えばβ−ガラクトシダーゼによるＸ−ｇａｌ又はＯＮＰＧの代謝のような、酵素修飾により生成される生成物を定量するアッセイを使用して測定できる。生成されるレポータータンパク質の量は、細胞質内の不溶性ターゲットタンパク質の量に対して直接的に比例する。
【００８０】
特定の試料における不溶性タンパク質の量は、レポーター遺伝子発現レベルを用いてターゲットタンパク質不溶性に関する標準曲線を初めに作成することにより測定され得る。これは、ターゲット発現構造とともにレポーター構造を含むホスト細胞を培養し及び種々の量の不溶性ターゲットタンパク質が生成される一連の試料を生成することにより達成できる。タンパク質不溶性レポーターの発現は、それらの試料の各々において測定される。
【００８１】
溶解性及び不溶性ターゲットタンパク質の量は、ホスト細胞を溶解させ、例えば遠心分離及び濾過により溶解性及び不溶性物質を分離し、そして例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのような免疫アッセイにより各フラクションのターゲットタンパク質の量を測定することにより、定量的に測定される。ひとたびレポーター発現に対するタンパク質溶解性に関する標準曲線が作成されると、試験試料中に存在する不溶性タンパク質の量は、その試料中のタンパク質不溶性レポーターの発現を測定し、標準曲線から存在する不溶性タンパク質の量を計算することにより測定できる。
【００８２】
本発明は、タンパク質の溶解性を改善する細胞内の変異体についてスクリーニングする方法も提供する。これらの方法は、変異原を有する細胞集団を処理し、溶解性形態におけるターゲットタンパク質の発現の増加を示すこれらの細胞を同定することを含む。“変異原” は、限定するものではないが、イオン化放射（ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）のような物理的な試薬と同様に、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’ −ニトロソ−グアジニン及び亜硝酸のような化学的な変異原を含むことを意図する。別の具体例において、変異体は、ターゲットタンパク質を符号化するポリヌクレオチドシーケンス内へ導入できる。それから変化したポリヌクレオチドは試験され、ターゲットタンパク質の溶解性が変化するかどうか測定する。このような変異体は、例えば変異原により誘導される変異体である；システイン残渣の変異体のような特定のアミノ酸残渣を変化させ、二硫化物結合を除去する変異体を指示されたサイト；疎水性アミノ酸の連続的な伸張の欠損のような特定のアミノ酸のセットを除去する欠損；及び第二の、特に溶解性タンパク質へのターゲットタンパク質の融合、を含む。各場合において、ターゲットタンパク質の溶解性は、本明細書中に記載したようなタンパク質溶解性レポーター核酸の発現を測定することにより評価される。
【００８３】
ターゲットタンパク質の溶解性を変化させる変異体を同定するために、このタンパク質を符号化するポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子が不溶性タンパク質の発現に対して応答性であるような好適な条件で発現される。変異体がターゲットタンパク質の溶解性の増加を誘導する場合、タンパク質溶解性応答プロモーターが不溶性タンパク質の発現に応答してアップレギュレートされる場合には、それからレポーター遺伝子の発現のレベルは、変異を伴うこの細胞の処理前にホスト細胞中で観察されるレポーター遺伝子の発現レベルと比較して減少する。β−ガラクトシダーゼのように、個々の試料の大多数において発現が容易に測定されるレポーター遺伝子を選択することにより、この方法を使用して大多数の依存性変異体をスクリーンし、ターゲットタンパク質の溶解性を改良する変化を同定することができる。
【００８４】
本構造は、ターゲットタンパク質の生合成の方法におけるバリエーションを同定するためにも有用である。該方法は変化して、ターゲットタンパク質の溶解性を修飾することができる。タンパク質溶解性レポーター核酸を含む細胞は、ターゲットタンパク質が発現され及びレポーター遺伝子が誘導可能である別の条件下で培養され、そしてレポーター遺伝子の発現を測定し、発現されたターゲットタンパク質の溶解性を改良する培養条件におけるバリエーションを同定する。例えば、タンパク質溶解性は、細胞が培養される温度、媒体組成、又は酸素濃度により影響される。レポーターの発現が測定される便利な方法は、種々の別の条件が最少の努力で試験されることを許容し、最も高い比率の溶解性ターゲットタンパク質が生成されるこれらの条件を同定する。
【００８５】
本構造物は別の細胞を比較し、少なくとも２種の別の細胞を用いて本明細書中に特定される方法を行いそして発現されたレポーター遺伝子の量を比較して増加量の溶解性ターゲットタンパク質の発現する細胞を同定することにより、増加量の溶解性ターゲットタンパク質を合成する細胞を同定するために有用である。
【００８６】
本発明は、クローンの発現ライブラリーをスクリーニングし、溶解性タンパク質を発現するそれらのクローンを同定する方法も提供する。このライブラリーは、関心のあるターゲットタンパク質を発現する遺伝子における改変からなる。遺伝子の改変は、広範囲に使用される種々任意の方法により提供できる。これらは、遺伝子の中にトランケーションを作成すること、ランダム化学変異誘発、誤ったヌクレオチド導入を通じたランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発を含む。この改変のライブラリーは、タンパク質溶解性レポーターシステムを含む細胞内へ形質転換される。形質転換される細胞の個々のクローンは、それからターゲット遺伝子又はその改変が発現する条件下で培養される。各クローンにおけるレポーター遺伝子発現のレベルは、ターゲット遺伝子又はその改変の発現中に測定される。増加又は減少したレベルのレポーター遺伝子を発現するクローンは、各クローンのレポーター遺伝子レベルを測定し、そして改変されないターゲット遺伝子を発現するクローンと比較することにより同定される。そのように同定されたクローンは、より少ない不溶性タンパク質を発現し、そしてターゲットタンパク質のより溶解性のある誘導体を含むことができる。
【００８７】
タンパク質溶解性レポーターシステムについての適切なレポーター遺伝子の選択が種々の効率的な高処理量手順を可能とし、溶解性ターゲットタンパク質を生成する特定の試料を同定するために多数の別の培養物を急速にスクリーンすることは当業者に公知である。β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及び緑蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子の検出の容易性が、ターゲットタンパク質溶解性について細胞をスクリーンする自動化手順の発達のためにさらに提供される。
【００８８】
さらなる態様において、本明細書中に定義される構造は、抗生物質試薬を同定するために有用である。タンパク質溶解性レポーター構造を含む細胞は、候補試薬により接触される。タンパク質折りたたみプロセスを用いて妨げる潜在的な抗生物質試薬は、不溶性内因性細胞タンパク質の増加した発現を生じ、それにより、不溶性タンパク質の存在に応答してアップレギュレートされるプロモーターのコントロール下にあるレポーター遺伝子の発現を誘導する。レポーター遺伝子生成物の測定は、潜在的な抗生物質試薬を用いた処理後に行われる。コントロール物質に関して増加したレポーター活性を発現する細胞は、試験試薬が潜在的な抗生物質であることを示す。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、抗生物質治療の公知のターゲットである溶解性タンパク質をともに発現することを用いて上記プロセスを使用することである。公知のターゲットタンパク質の折りたたみを用いて妨げる試薬は、不溶性タンパク質及びレポーター遺伝子の増加した発現を生じる。そのように同定される試薬は、ネイティブなホスト内のこれらのターゲットタンパク質の適切な折りたたみを使用して妨げることにより、抗生物質として潜在的な有用性を有する。
【００９０】
例
以下の例証のために提供するが本発明を限定するものではない。
【００９１】
適切なタンパク質折りたたみは、構造決定用組換えタンパク質を生成するための鍵である。この例において、誤って折りたたまれた組換えタンパク質の、Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子発現での影響が試験される。発現パターンの比較は、翻訳の誤った折りたたみに応答する遺伝子のユニークなセットを示す。応答は部分的にヒートショックに類似し、そして調節に対する翻訳成分を提案する。我々はさらに発現情報を利用し、タンパク質の間違った折りたたみに応答するレポーターを発生させた。これらのレポーターは、適切に折りたたまれた組換えタンパク質を同定し、そして構造の研究のために不溶性タンパク質の溶解性ドメインを生成させた。
【００９２】
材料及び方法
クローニング
適切に折りたたまれ又は誤って折りたたまれたヒトタンパク質を発現するクローンを、ＧｅｎｅＳｔｏｒｍ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した。Ｕｎｉｇｅｎｅ受け入れ番号Ｌ３５５４５、Ｕ１８２９１、Ｍ９４８５６、Ｍ２２１４６、Ｄ８７１１６、Ｍ６３１６７、Ｍ６８５２０、Ｍ６０５２７、Ｍ３６８８１、Ｍ３６９８１、Ｕ３５００３、Ｓ７９５２２、Ｘ７３４６０、Ｄ１４９６８、Ｍ８６４００を含むクローンをｐＢＡＤＴｈｉｏ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に提供し、アラビノーズ（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）−誘導可能な発現を提供した。Ｔ．ｍａｒｔｉｍａ遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅し、そして生成及び検出用の６Ｘ−ヒスチジン繰返しを含む１２のアミノ酸Ｎ−末端タグを符号化する発現ベクターｐＭＨ１内へクローン化した。レポーターベクターは、ｐＡＣＹＣ１８４誘導体におけるベータ−ガラクトシダーゼの上流のｉｂｐＡＢ、ｙｂｅＤ、ｙｈｇＩ又はｙｒｆＧＨＩ遺伝子の３００ｂｐ上流のＰＣＲアンプリファーを挿入することにより構成した。
【００９３】
Ｒｅｐ６８を、ヒトアデノアソシエイトウイルス２（ＡＡＶ２）の全体のゲノムを含むプラスミドからクローン化した。塩基１−６４６、６４７−１４５６及び１４５７−１６１１を含む推定ドメインを完全長の鋳型から増幅させ、そしてｐＭＨ１へクローン化させた。上記鋳型を、フラグメント化用の完全長遺伝子の増幅においても使用した。２μｇのｒｅｐ６８増幅器を、Ｐｆｕポリメラーゼ及びｄＮＴＰと同様にＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｂｐｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の１、０．１、０．０１、０．００１又は０ユニットを含む５フラグメント化反応の各々において使用した。反応を氷上で、以下のＭＪ  Ｒｅｓｅｒａｒｃｈ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにおける温度循環前に即座に加えられるＤｎａｓｅを用いて行った：１０分＠２５℃、１５分＠９５℃、及び３０分＠７２℃。各反応を１％アガロースゲル上で行い、そして１６００−１０００ｂｐ、１０００−８５０ｂｐ、８５０−６００ｂｐ及び６００−３００ｂｐに対応するフラグメントを抽出した。各プールを上記平滑（ｂｌｕｎｔ）クローニング及び上述のようにｐＭＨ１内へのライゲーションについてのものとして使用し、そしてスクリーニング用にレポーター細胞株ＨＫ５７内へ導入した。
【００９４】
細胞成長及びタンパク質発現
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５（Ｆ  ｌａｍ  ｒｐｈ１）及びＫＹ１４２９（Ｆ−ａｒａＤ１３９Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｌａｍ  ｆｌｈＤ５３０１  ｆｒｕＡ２５  ｒｅｌＡ１  ｒｐｓＬ１５０  ｚｈｈ５０：：ｒｐｏＨ６０６（ｔｓ）ｄｅｏＣ１）を、発現プロファイリング用のＭ３６８８１（ＬＣＫ）又はＭ８６４００（ＰＬＡ）を符号化する発現プラスミドを用いて形質転換した。細胞を、アンピシリンを含むＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ中、３７℃で培養した。タンパク質発現を、Ｌ−アラビノースの、１時間での最終濃度０．１％までの添加により誘導した。ＫＹ１４２９細胞を、ｒｐｏＨ６０６の非許容発現のために、初期の成長を３２℃で行い続けて４２℃にシフトしたことを除き、上述のように培養した。ｉｂｐＡＢプロモーター融合（ｐＨＫ５７）を含むＴｏｐ１０細胞（ＦｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｄｅｏＲ  ｒｅｃＡ１  ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ  ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ）を、上記列挙された発現構造を用いて形質転換した。ベータ−ガラクトシダーゼアッセイを、本質的にＭｉｌｌｅｒ（２４）に記載されるように行った。溶解性及び不溶性タンパク質の分画を、遠心分離により行った。培養物を５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．９、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２   ３ｍＭのメチオニン中で再懸濁し、そして氷上で２分間超音波処理した。細胞片及び不溶性タンパク質凝集物を、１５分間の３０００ｘｇにおける遠心分離によりペレット化した。溶解性フラクションを除去し、そしてペレットを同等の量の溶解バッファー中で再懸濁した。
【００９５】
プローブ製造並びにラベル化ｍＲＮＡのハイブリダイゼーション及び分析
ラベル化ｍＲＮＡを製造し、そしてＥ．ｃｏｌｉ全体のゲノムアレイ（Ａｆｆｙｍｅｒｉｘ）へ、本質的に前述（２５，２６）のようにハイブリダイズした。標準的なＡｆｆｙｍｅｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析ソフトウェアを使用し、個々の遺伝子発現を測定し、そして予備誘導及び後誘導試料用の遺伝子発現レベルの態様比較を行うことに使用した。適切に折りたたまれ及び誤って折りたたまれた遺伝子を、個々のプローブセットについて分析した。
【００９６】
ミクロプレート溶解性スクリーニング
１００μｇ／ｍＬアンピシリンを有する２００μＬのＬＢ及び３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む９６ウェルミクロプレートを、上述からの単一のコロニーに植え付け、そして３７℃で振盪して一晩成長させた。２００μＬの同じ媒体を植え付け、０．５の平均ＯＤ６００ に到達するまで３７℃でインキュベートするのに、一晩の培養をした。培養は、最終濃度が０．２％のアラビノースを用いて誘導した。３０分後、各ウェルにｃｅｆａｔｒｉａｘｏｎｅ及びｃｅｆｏｔａｘｉｍｅのカクテルを、それぞれの最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるまで加え、そして該プレートをさらに１．５時間インキュベートした。１５分間の最大速度での遠心分離による全２時間の誘導後に培養物を採取し、ウェルの底の細胞残渣をペレット化した。溶解性の分離物を、それから２５μＬをβ−ガラクトシダーゼ活性スクリーン用のミクロプレート内へ分け、７５μＬをＮｉ−ＨＲＰスクリーニング用のＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレートへ分けた。
【００９７】
分離物のβ−ガラクトシダーゼ活性スクリーニングを、Ｍｉｌｌｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（１０）のバリエーションを使用して行った。５０μＬの４ｘＺ−バッファー及び５０μＬの４ｘＯＮＰＧバッファーを、２５μＬの溶解性分離物を含むミクロプレートへ加えた。ポジティブコントロールウェル内の黄色の進行後、反応を７５μＬの１Ｍ  Ｎａ２ ＣＯ３ ｐＨ８を用いて停止した。Ａ４２０ 、Ａ５５０ 及び反応時間を記録し、そしてＯＤ６００ データに沿って使用し、β−ガラクトシダーゼ活性を計算した。
【００９８】
Ｎｉ−ＨＲＰスクリーニングを、ＥＬＩＳＡと同様に行った。７５μＬの分離物と２５μＬのＴＢＳを、ミクロプレートへ、４℃で一晩中結合させ、そして２５℃、ＴＢＡ中１％ＢＳＡを用いて４時間ブロックした。それからプレートをＴＢＳＴで３ｘ洗浄し、１：２５００希釈で１００μＬのＮｉ−ＨＲＰコンジュゲート（ＫＰＬ  Ｌａｂｓ）を加え、そして２５℃で１時間インキュベートした。それからプレートをＴＢＳＴで洗浄し、そして１００μＬのＨＲＰサブストレート（ＫＰＬ  Ｌａｂｓ）を加え、色はポジティブコントロールウェルが深青色になるまで顕色された。反応を１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌで止め、そしてＡ４２０ を測定した。溶解性スコアを、β−ガラクトシダーゼ活性スコアの手段よりも一桁オーダーの強度が大きいようなＮｉ−ＨＲＰ  Ａ４２０ の読みを測り、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性によりＮｉ−ＨＲＰ吸収を割ることにより計算した。
【００９９】
結果
遺伝子発現の分析
間違って折りたたまれたタンパク質の結果として遺伝子発現を行うために、厳重に調整されたアラビノースプロモーターのコントロール下で、代表的な遺伝子を融合タンパク質としてチオレドキシンへクローン化した。ヒトホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ）は、細胞分離物及び遠心分離による分画により測定されるとき、ほとんど完全に溶解性である。このタンパク質の適切な折りたたみのさらなる証拠は、精製されたタンパク質のダイナミックスな光散乱及び単一の類似の精製ステップからのそれを結晶化する能力を通じて得られる。同等の発現条件下で、ヒト細胞特異的なタンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）は、不溶性タンパク質としてほとんど排他的に発現される。両方のタンパク質が優れた翻訳生成物になるために十分なレベルで発現する。誘導及び非誘導培養からのｍＲＮＡ製造物を製造し、そして遺伝子発現用のプローブを行うために使用した。
【０１００】
Ｅ．ｃｏｌｉ内での組換えタンパク質発現は、遺伝子発現における実質的な変化を引き起こすことが予測される。実際に、遺伝子発現の予め誘導されたコントロールとの比較は、両方の場合の発現において、全遺伝子の６％が＞３倍の差異を示した。不溶性組換えタンパク質の場合、溶解性組換えタンパク質の場合における１０の遺伝子と比較して、２７の遺伝子が発現において＞１０倍の変化を示した。２種のプロファイルの比較は、第１表に列挙される５３の遺伝子を特定し、＞３倍の差異を示し、それらは不溶性の場合においてユニークである。それから、これらの遺伝子はおそらく細胞内の誤って折りたたまれたタンパク質に対して応答性であり、そしてこれらの翻訳ストレスを扱うことにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉ内での役目を果たす。
【０１０１】
ヒートショック転写ファクターＲｐｏＨは、通常はシャペロンタンパク質ＤｎａＫとの相互作用により抑制される。誤って折りたたまれたタンパク質の存在において、ＤｎａＫはそのタンパク質と結合し、ＲｐｏＨにヒートショックプロモーター（７）の転写を刺激させる。第１表の誘導された遺伝子の多くの上流領域は、ＲｐｏＨ依存性プロモーターシーケンスの存在を示す。ＲｐｏＨにより果たされる重要な役割のさらなる証拠は、非発現コントロールと比較された誤って折りたたまれたＬＣＫタンパク質を発現するｒｐｏＨ６０６変異（ＫＹ１４２９）から行われる結果をプロファイルする発現により提供される。著しく異なる発現プロファイルは、ｒｐｏＨ６０６変異体の場合において見られる（第１及び２表）。野生型菌株内の誤って折りたたまれたタンパク質により誘導される遺伝子の集団は、直接的に又は間接的に転写ファクターのコントロール下にあることを示すｒｐｏＨ６０６変異内で不完全に誘導される。
【０１０２】
ヒートショック遺伝子の誘導
驚くべきことではないが、転写の誤った折りたたみにより誘導される遺伝子の多くは、公知のシャペロン活性である。これらは良好に特徴化されたｄｎａＪ、ｄｎａＫ及びｇｒｐＥ遺伝子を含む。対応するタンパク質は、ＡＴＰ依存性修復プロセスにおいて、誤って折りたたまれ又は変性されたタンパク質を有する複合物として相互作用する。同様に、ＧｒｏＥＬＳ折りたたみ修復複合物を形成するｍｏｐＡＢ遺伝子は、翻訳の誤って折りたたまれた条件下で誘導される。ＩｂｐＡＢは、組換えタンパク質（１３）の含有本体凝集物と結合する小さいヒートショックポリペプチドである。それらが直接的に折りたたまれるシャペロンとして振舞うことを示さなくとも、それらは誤って折りたたまれたタンパク質と結合しそしてシャペロンシステム（１４）としてＤｎａＪＫ  ＧｒｐＥタンパク質と相互作用する。Ｈｓｐ３３、ｙｒｆＩ遺伝子の遺伝子生成物は、酸化条件に応答するシャペロンタンパク質として最近同定された（１５）。変性タンパク質の分解において影響を受ける遺伝子は、翻訳の誤った折りたたみによっても誘導される。ｌｏｎ、ｃｌｐＢＰ及びｈｓｌＵＶプロテアーゼ遺伝子は、増加レベルにおいて発現される。通常の細胞成長下で、これらのプロテアーゼは、重要なリサイクル機能を行う。不溶性凝集物はタンパク質分解に対して比較的耐性であり、そしてリサイクル経路は組換えタンパク質発現について効果的ではない。
【表１】
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【表２】
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第２表  誤って折畳まれたタンパク質発現の誘導後のコールドショック
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【０１０３】
リボゾーム関連遺伝子の誘導
リボゾームに結合する他のヒートショック遺伝子は、翻訳の誤った折りたたみ条件下で誘導される。Ｈｓｐ１５（ｙｒｆＨ）はＲＮＡ（２４）と結合し、そして発生期のポリペプチド鎖を含む自由５０Ｓリボゾームサブユニットに結合する（１６）。ヒートショックは、５０Ｓ及び３０Ｓサブユニットの増加した分解を含むＨｓｐ１５−結合のレベルも増加させる。リボゾームの分解のさらなる提案は、ｆｔｓＪ（ｒｒｍＪ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）に由来する。ｆｔｓＪ遺伝子生成物は、５０Ｓリボゾームサブユニットにおいて含まれる場合のみ、２３ＳｒＲＮＡについて特異的なＲＮＡメチラーゼである（１７，１８）。この酵素は２３Ｓ  ｒＲＮＡをリボゾームのペプチジルトランスフェラーゼ中心内に位置する２５５２においてメチル化する（１７）。ｆｔｓＪのメチル化は２３Ｓ  ｒＲＮＡを欠き、そして５０Ｓ及び３０Ｓサブユニットの分裂に対応するリボゾーム活性の６５％までの減少を示す（１９）。ｒｐｏＨ変異体において特に顕著なものは、コールドショックタンパク質（ＣＳＰｓ）の転写における大きな増加である（第２表）。これらの遺伝子はヒートショックにより影響を受けないが（９）、翻訳の一時的な停止に関連する。ＣＳＰは、翻訳化されていないメッセージについてのシャペロンとして作用し（２０，２１）、そして抗末端化活性（ａｎｔｉ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を提供するＲＮＡ結合タンパク質である（２２）。シャペロン発現（ｒｐｏＨ６０６）を減少させる条件下でのＣＰＳの増加された発現は、休止した翻訳を表す。まとめて考えると、これらの結果は、或いは脱メチル化の結果として、翻訳の誤った折りたたみの結果として、翻訳の調整応答を提案する。この仮定は、最近の調査における興味深い調整機構である。
【０１０４】
他の誘発された遺伝子
ｙｃｃＶ、ｙｈｄＮ及びｙｒｆＧはヒートショック条件下で発現を増加することを示すが、機能が知られていないものである。これらの公知のヒートショック遺伝子に加え、ｙａｇＵ、ｙｃｉＳ、ｙｂｅＤ、ｙｅｊＧ及びｙｈｇＩは増加した発現を示した。これらのタンパク質のほとんどは比較的小さく、そして一般的に酸性である。ある推測では、これらのタンパク質のうち数種のものは直接的な認識及び誤って折りたたまれたタンパク質の封鎖においてＩｂｐＡＢに類似する役割を果たす。しかし、ＩｂｐＡＢだけが間違って折りたたまれそして凝集したタンパク質と結合する。ｉｂｐＡＢの誘導レベルは非常に高く、そしてこれらの他のタンパク質はより低いレベルで存在する。興味深いことには、ｉｂｐＡＢのノックアウト変異は、細胞成長及び生存力における比較的小さな影響を有し（１４）、そして細胞内の数種の機能的な余剰を意味する。
【０１０５】
タンパク質折りたたみの遺伝子レポーター
プロファイリング結果を確認し及び多数の組換えタンパク質の実験を容易化するために、ｉｂｐＡＢ、ｙｂｅＤ、ｙｈｇＩ及びｙｒｆＧＨＩからのプロモーター領域をベータ−ガラクトシダーゼレポーターベクター内へクローン化した。各場合において、増加されたベータ−ガラクトシダーゼ活性は、折りたたまれたタンパク質ＰＬＡが活性における増加しないにもかかわらず、誤って折りたたまれたタンパク質ＬＣＫの発現が誘導される場合に観察される。これらの結果は、ｉｂｐＡＢ−プロモーターベータ−ガラクトシダーゼ融合物の存在下でともに発現される（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）８の誤って折りたたまれたタンパク質及び６の適切に折りたたまれたタンパク質のセットを用いてさらに拡張された。各場合において、増加されたベータ−ガラクトシダーゼ活性は、誤って折りたたまれたタンパク質の発現に相当した。より詳細な説明を以下に示す。そして、観察された応答は、任意の特定のタンパク質に対する特異的な応答よりも、タンパク質の誤った折りたたみの通常の結果を示す。これらのレポーターは、感度の良い酵素アッセイを用いて誤って折りたたまれたタンパク質を同定する単純な方法を提供し、そしてさらなる研究のためのレポーターとしてｉｂｐＡＢプロモーター融合物が選択された。
【０１０６】
溶解性タンパク質についてのＥＬＩＳＡ様アッセイ
組換え環境において改良された折りたたみ特性を有するタンパク質誘導体を同定するために、高処理量スクリーニング機械と融和するＥＬＩＳＡ様アッセイも発展させた。高処理量システムにおける溶解性タンパク質レベルを評価するために、非変性細胞分離物は、ミクロプレートにおける迅速なスクリーニングと融和する条件を使用して製造されなければならない。洗浄剤又は有機リーシスの代わりに、我々は抗生物質カクテルを各ウェルに加え、リーシスを誘導した。溶解性タンパク質融合物を除去し、ミクロプレートに結合し、組換えタンパク質は６Ｘ−ヒスチジンＮ−末端融合物に対するＮｉ−ＨＲＰコンジュゲートの結合を介して検出した。Ｈｉｓ−Ｔａｇは組換えタンパク質間で不均一にアクセス可能ではないことがわかる。それゆえ、ネガティブＮｉ−ＨＲＰ応答は溶解性タンパク質の不存在を表示できないが、タンパク質折りたたみはＨｉｓ−Ｔａｇに対するアクセスを妨げることができる。しかし、我々はこれを観察する必要は無く、一般的な問題である。それからこのアッセイは、ＳＤＳゲルを行うことなく、そしてＨＴスクリーン及びβ−ガラクトシダーゼアッセイに融和する形態で、溶解性組換えタンパク質のレベルの測定を提供する。
【０１０７】
予め測定された発現特性を有するタンパク質の試験
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａの全プロテオームをクローニング、発現及び特徴化することにおいて意図する我々の試みの一部として、第３表に示される（６種の溶解性、６種の不溶性及び６種の混合溶解性）１８Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａタンパク質におけるレポーターの効果を試験した。アッセイパラメーターを最適化するために、菌株を９６ウェル内に整列させ、３種の誘導レベル（０．０２％、０．２％及び２％アラビノース）の３種類において及び溶解促進抗生物質添加について４種の後誘発時点（ｐｏｓｔ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）（アラビノース添加後のｔ＝０、３０分、６０分及び１２０分）においてアッセイした。図２は、０．２％アラビノース誘導について、３種のプレート（溶解性、不溶性及び混合）についての平均化された結果を示す。不溶性及び混合プールの両方が、溶解性プールよりも４倍以上β−ガラクトシダーゼ活性を示した（図２Ａ）。逆に、溶解性プールは、不溶性プールに対してＮｉ−ＨＲＰにおける１０倍以上高い応答を示した（図２Ｂ）。溶解性及び不溶性フラクションの両方においておよそ等しく発現されるタンパク質からなる混合プールは、溶解性プールの約半分強度でＮｉ−ＨＲＰ結合を示した。β−ガラクトシダーゼの欠損又はＮｉ−ＨＲＰ活性の存在のいずれかだけが、溶解性タンパク質の測定として使用されるが、良い効果的かつ便利なスクリーンを活性化する２つの比を選択する。
第３表：  予め測定された発現特性を有する Ｔ． ｍａｒｉｔｉｍａタンパク質
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【０１０８】
非公知の発現特性を有するタンパク質の試験
我々は、次にこのスクリーンを非公知の折りたたみ特性を有するタンパク質の大きなセットへ適用した。我々は、タンパク質が発現について前もって特徴化されない１８６Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａタンパク質において、上記最適条件下でスクリーンを行った。このスクリーンの結果を、第４表に要約する。ニッケル−キレーティング樹脂からの及び各クローンの溶解された不溶性フラクションからの溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、対応するβ−ガラクトシダーゼ活性、Ｎｉ−ＨＲＰ応答及び１８６クローンについての溶解性スコアに沿って行われる。ゲルの結果に基づき、５７のクローンは可視タンパク質バンドを過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）せず、６２のクローンは溶解性タンパク質を優勢に発現し、２７のクローンは不溶性凝集物を優勢に発現し、そして４６は溶解性及び不溶性フラクション両方に対しておよそ等しく発現される。Ｎｉ−ＨＲＰアッセイに対するβ−ガラクトシダーゼ活性の比較を、図３に示す。点は溶解性及び不溶性タンパク質フラクションのＳＤＳゲル分析により類別される。スクリーンは、６２の溶解性タンパク質の５４（８７％）をポジティブに同定した。ゲルに従って溶解性である８の残留タンパク質のうち７が、おそらくそれらの融合タンパク質におけるＨｉｓ−ｔａｇのアクセス不能性によって、低いＮｉ−ＨＲＰアッセイを有した。単独では、β−ガラクトシダーゼ活性測定は２７の不溶性タンパク質の２２（８１％）を同定した。部分的な溶解性を示すこれらのタンパク質は、種々の溶解性スコアを表し、部分的な折りたたみがレポーターを通じてβ−ガラクトシダーゼ活性を誘導することを示している。それから、このアッセイは折りたたみ特性を分類する効果的かつ便利な手段を提供する。
第４表：  Ｔ． ｍａｒｉｔｉｍａ タンパク質についての平均溶解性スクリーン値
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【０１０９】
溶解性タンパク質ドメインの同定
このシステムの有用性は、改良された性質に基づき完全長の遺伝子生成物の変異体、変異又はドメインを同定する能力にある。構造又は生化学的な研究のために、Ｒｅｐ６８（ＧＩ：２０９６１７）、ターゲットＤＮＡ内へのウイルスゲノムの統合に関連する種々の活性を有するアデノアソシエイトウイルス非構造性タンパク質の溶解性フラグメントを同定するためのこのスクリーンの能力を試験した。このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ内の折りたたまれない凝集体として優勢に発現することが、以前に見出された。我々は類似体に関してドメインの選択に基づくランダムなアプローチと合理的なアプローチの両方を行った。Ｒｅｐ６８の３種のドメインを、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ調査（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）がパルボウイルス非−構造性タンパク質ＮＰ−１に対して相同性を有する内部ドメインを同定した後に選択した。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙプロット（図４）と組み合わせた情報は、各ドメインについての５’ 及び３’ カットオフを整列させることに使用される。残存するＮ末端及びＣ末端残渣は他の２種のドメインを含み、そしてデータベースにおける他の任意のタンパク質に対する重要な相同性を有さない。Ｒｅｐ６８のランダムフラグメントも、ＤＮａｓｅフラグメントによりスクリーンニング用に発生させた。
【０１１０】
３種の予測されるドメイン及びランダムに発生したフラグメントを、Ｒｅｐ６８の溶解性フラグメントの同定に応答してスクリーンした。３種の予測されたドメインは溶解性として同定されたものはなかった（図４）。同時に、ｒｅｐ６８の５６４のランダムに発生したフラグメントもスクリーンした。あるフラグメントは非常に高い溶解性スコアを生じた（第４表）。このクローンは大規模な発現により証明され、そして溶解性及び不溶性フラクションの両方において発現を示した。続けて同定されたクローンのシーケンシングは、それがアミノ酸１−９５に対応するｒｅｐ６８のフラグメントからなることを証明した（図４）。この同定されたフラグメントは完全長タンパク質にわたる溶解性における実質的な改良を示し、結晶化の試みにおいて試験した。
【０１１１】
結論
インビボでのタンパク質折りたたみのほとんどの遺伝子発現の研究は、環境的なストレスの結果としての変性に焦点が当てられてきた。この応答は、常に変化する環境及び非理想的な成長条件を扱うためにインビボで必須である。翻訳の折りたたみの結果は、全てのタンパク質は翻訳されるときに必然的に折りたたまれていない状態であるので、細胞に対して等しく重要である。非天然のタンパク質の発現は、組換え手段又は変異のいずれかを通じ、それ自体においてストレスである。我々は、これらの遺伝子生成物が発生期のポリペプチドの折りたたみにどのように含まれるのかの明確な推理を用いて、ヒートショックのような翻訳の誤った折りたたみに対する細胞応答が公知のシャペロン遺伝子を含むことを示した。さらに、他のヒートショック遺伝子及び非公知の機能の遺伝子が誘導される。これらも折りたたみプロセスに含まれることができる。我々の結果は、転写及び翻訳調整の両方を提案する。ＤｎａＫ−ＲｐｏＨ相互作用は良好に特徴付けられ、転写応答の主要なレギュレーターであることを示す。翻訳ストーリングにおいて複製された遺伝子の変化した発現及びリボゾームの分裂は興味深く、そしてこれらの効果が翻訳で誤って折りたたまれたタンパク質の結果であり得ることを意味する。これらの遺伝子は、５０Ｓリボゾームサブユニットと結合するｙｒｆＨを含む（１６）。ｃｓｐＡＢＧＩは、誘導されるシャペロンの不存在下で、翻訳ストーリング（ｓｔａｌｌｉｎｇ）を提案するｒｐｏＨ６０６において誘導される。ｆｔｓＪも誘導され、それは互いについて２種のサブユニットのより高い親和力を生じる５０Ｓサブユニットの２３ＳｒＲＮＡをメチル化することが公知である（１９）。リボゾーム構造は、ｆｔｓＪのメチル化の位置、２３ＳｒＲＮＡの２５５２部分が興味深くペプチジルトランスフェラーゼ中心に対して閉じており（１８）、誤って折りたたまれたタンパク質用のリボゾームセンサー用の明確な潜在的レギュレーター機構にすることを表す。このようなリボゾームセンサーは、翻訳中にチャージされないｔＲＮＡに対して良好に特徴化された厳重な応答により例証されるように、新規なものではない（２３）。リボゾームストーリングはシャペロン合成及び補充のための時間を許容し、それにより不可逆性の凝集を妨げる機構を提供する。この方法において、細胞は、十分なシャペロンが補充されるまで翻訳リボゾームの比較的防御された環境において新たなタンパク質が折りたたまれるさらなる回収路を維持する。
【０１１２】
異なって調整された同定遺伝子は、細胞タンパク質の折りたたみ状態の新規なレポーターを、特に全体及び過剰に発現された組換えタンパク質として、提供するための価値ある機会を提供する。我々のレポーターアッセイは、ターゲットに対するレポーター遺伝子の直接的なカップリングに依存しないことにより、最近記載されたものとは異なり、それによりレポーターによる干渉を制限する。Ｎｉ−ＨＲＰ及びβ−ガラクトシダーゼアッセイの組合せは、高処理量方法で溶解性組換えタンパク質をアッセイする効果的な方法を提供する。我々は本システムを拡張し、別の誤って折りたたまれた凝集タンパク質の溶解性ドメインを同定するための方法として、単一の遺伝子生成物の変異体及びトランケーションを同定した。このアプローチを使用して、我々はＲｅｐ６８の溶解性フラグメントを同定し、そしてこのアッセイが構造／機能作用のために好適な組換えタンパク質を単離する一般的な手段を提供するものと推測した。
参考文献
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１５． Ｖｅｉｎｇｅｒ， Ｌ．， Ｄｉａｍａｎｔ， Ｓ．， Ｂｕｃｈｎｅｒ， Ｊ． ＆ Ｇｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆ， Ｐ． （１９９８） Ｊ． ＢＩＯＬ． Ｃｈｅｍ． ２７３， １１０３２−１１０３７．
１６． Ｋｏｒｂｅｒ， Ｐ．， Ｓｔａｈｌ， Ｊ． Ｍ．， Ｎｉｅｒｈａｕｓ， Ｋ． Ｈ． ＆ Ｂａｒｄｗｅｌｌ， Ｊ． Ｃ． Ａ． （２０００） Ｅｍｂｏ Ｊ． １９， ７４１−７４８．
１７． Ｃａｌｄａｓ， Ｔ．， Ｂｉｎｅｔ， Ｅ．， Ｂｏｕｌｏｃ， Ｐ．， Ｃｏｓｔａ， Ａ．， Ｇｅｓｇｒｅｓ， Ｊ． ＆ Ｒｉｃｈａｒｍｅ， Ｇ． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５，１６４１４−１６４１９．
１８． Ｐｕｇｌｉｓｉ， Ｊ． Ｄ．， Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｓ． Ｃ． ＆ Ｇｒｅｅｎ， Ｒ． （２０００） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ７，８５５−８６１．
１９． Ｃａｌｄａｓ， Ｔ．， Ｂｉｎｅｔ， Ｅ．， Ｂｏｕｌｏｃ， Ｐ． ＆ Ｒｉｃｈａｒｍｅ， Ｇ． （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍａ． ２７１，７１４−７１８．
２０． Ｗａｎｇ， Ｎ．， Ｙａｍａｎａｋｅ， Ｋ． ＆ Ｉｎｏｕｙｅ， Ｍ． （１９９９） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１，１６０３−１６０９．
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２４． ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９） ｅｄｓ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）， ｐ． １７３５．
２５． Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ． Ｊ．， Ｄｏｎｇ， Ｈ．， Ｂｙｒｎｅ， Ｍ． Ｃ．， Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ， Ｍ． Ｔ．， Ｇａｌｌｏ， Ｍ． Ｖ．， Ｃｈｅｅ， Ｍ． Ｓ．， Ｍｉｔｔｍａｎｎ， Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｃ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｍ．， Ｈｏｒｔｏｎ， Ｈ． ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｅ． Ｌ． （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４，１６７５−１６８０．
２６． Ｗｏｄｉｃｋａ， Ｌ．， Ｄｏｎｇ， Ｈ．， Ｍｉｔｔｍａｎｎ， Ｍ．， Ｈｏ， Ｍ． Ｈ．， ＆ Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ． Ｊ． （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５， １３５９−１３６７．
【０１１３】
本明細書中に記載された例及び具体例は例証のみの目的であり、それらの適切な種々の改変又は変化が当業者に提案され、そしてそれらは本出願の精神及び範囲並びに請求項の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、全ての目的について参考文献として本明細書中に導入される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は不溶性タンパク質の発現中に誘導される公知のヒートショック遺伝子のプロモーターを示す。
【図２】図２Ａ−Ｃは、予め測定された発現特性を有する１８  Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａタンパク質についてのスクリーニング結果の概要を表す。
【図３】図３は、レポーター株における１８６  Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａタンパク質の発現後に観察される相対Ｎｉ−ＨＲＰ活性に対する相対β−ガラクトシダーゼ活性を表す。
【図４】図４は、第二構造予測のアライメント、並びにＲｅｐ６８の予測された及び同定されたドメインの両方を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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