(57)【要約】本発明は、ヌクレオチドおよび／またはペプチド配列を分析するための電子マイクロ−センサー（チップ）の製造に関する。目的は、該チップの表面に、非常に多数の種々のプローブ配列を、容易にかつ経済的に固定することである。本願方法は、揮発性溶媒の存在下での固定および／または局所化学合成によって、支持体上に配列プローブのアレイを作製することを目的とする。該方法は、光硬化された（エポキシ）樹脂から作製された反応ウェルのグリッドがその上に作製されている支持体を使用すること；合成溶媒（アセトニトリル）の蒸気で飽和されている反応チャンバ内に該支持体を配置すること；最終的に、特定のプローブ−配列に対応する各ウェル中の液体／試薬の局在化供給を使用して、該ウェルにおけるプローブ配列の固定および必要に応じてインサイチュでの局在化化学合成を生じさせること、ならびに共通の液体／試薬を該ウェルに集合的に供給すること、および各局在化供給操作の前に各ウェルに含まれる液体の除去を確実にすることを含むことを特徴とする。本発明はまた、該方法を実行するための装置に関する。
2004532382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のポリ−、好ましくはオリゴ−ヌクレオチドおよび／またはペプチド配列をその面の１つに保有する支持体の製造方法であって、有利には互いに相違する該配列（ＯＧＮ配列）は、塩基対合によりそれらの相補体と対合し得、そしてこれらは揮発性溶媒の存在下での化学合成によって得られ；
該方法は本質的に、以下：
ａ）支持体（１）を使用すること［ここで、該ＯＧＮを保有するように意図される該面は、反応ウェル（４）のアレイを有し、各ウェル（４）は、所定のＯＧＮ配列の局在化固定および／または化学合成のためのシートとして機能し；該ウェルは、光硬化樹脂を適用し、該ウェルを規定するように意図される領域における化学線照射への暴露によって該樹脂を硬化させ、そして硬化されていない該樹脂を除去して、該ウェル（４）を規定する壁を形成する樹脂のグリッド（３）を得ることによって、得られる］；
ｂ）反応チャンバ（５）内に該支持体（１）を配置し、そして該ＯＧＮの局在化固定および化学合成において使用される揮発性溶媒の蒸気を使用して、好ましくは、該反応チャンバ（５）を通る好適な飽和蒸気を含むガス流を循環させることによって、該チャンバを飽和すること；
ｃ）該ウェルの少なくとも一部において該ＯＧＮ配列の（増加による）局在化固定および／または化学合成を行うこと；
を含み、そして
この操作は、以下：
（ｉ）対応のＯＧＮ配列を固定および／または合成するための試薬および液体消耗品を、関連する各ウェルへ、局所的および別個に供給すること；
（ｉｉ）全ての該ウェルにおいて行われるように意図される反応へ共通の試薬および／または液体消耗品を、関連する該ウェルへ、集合的に（非局所的に）供給すること；ならびに
（ｉｉｉ）該ウェル（４）への局在化供給のための各操作の前に、局在化様式で供給されるように意図される各ウェル中に含まれる任意の液体の少なくとも一部が、除去されることを確実にすること。
によって達成される：
【請求項２】
前記支持体が、ガラス、石英、必要に応じて少なくとも１つの層の酸化物または窒化物でコーティングされたシリコンによって構成される材料の群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記支持体の表面を処理して、その上に、ＯＧＮ配列のヘッドコモノマーと非不安定結合を形成し得る固定部位を作製し、該処理は、好ましくは、マイクロウェルアレイを作製する前および／または後にエポキシアルコキシシランを使用してのシラン化であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記光硬化性樹脂が、ポジティブまたはネガティブ樹脂によって構成される群から、好ましくはネガティブ樹脂を含むサブ群から、そしてより好ましくは、ラジカルおよび／またはカチオン経路によって光硬化され得る、（メタ）アクリレート、エポキシ、ポリエステルおよび／またはポリスチレン樹脂を含むクラスから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記反応チャンバのための飽和ガス流が、関連する溶媒の蒸気に加えて、少なくとも１つの中性ガスを含み、該ガス流は、好ましくは、周囲大気に対して該チャンバ中の過剰圧力を決定するようなものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウェルへの局在化供給および非局在化供給を確実にするために、対応の手段を使用し、該局在化供給手段および前記支持体が、移動手段により三次元（Ｘ、Ｙ、およびＺ）において互いに対して移動可能であること；ならびに、各々がｘ コモノマーを含むｎ ＯＧＮ配列を該支持体上において固定および／または合成するために、以下のこと：
・作製されるｎ ＯＧＮ配列のアレイの組成を、各々がコモノマーを含みそして各々が該支持体のｎ ウェルに局在化される試薬液体の除去、供給および堆積という一連のアクションに対応するｘ 連続ラングの構成に該組成を保存することによって、メモリーに記憶する［該液体は、該ｎウェルにおけるラングＲｉ＝１〜ｘの該コモノマーの性質を決定する］；
・そして第１に、該局在化供給手段および該移動手段に、前記に定義される種々の一連のアクションを行うように命令し、そして第２に、該非局在化供給手段に、該固定およびＯＧＮ配列合成手順において種々の時間で、該支持体の該ｎウェルへの、非局在化液体の除去、運搬および供給を行うように命令する［各局在化供給に続いて、該ウェル中そしてより一般的には該反応チャンバ中に存在する液体を排出するための工程が行われる］；
［それらが誘導する該命令および該アクションは、Ｒｉにおいてｉ＝ｘまで１ずつｉを増加させることによって繰り返される］
を特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記液体が、前記方法の工程３（ｉｉｉ）において除去され、その結果、関連する前記ウェルが、それらの容積の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、そしてより好ましくは少なくとも９８％の深さまで液体を含まないことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記液体が、乾燥によって、有利には、ガス（好ましくは、中性ガス）を前記反応チャンバへ注入することによって、および／または該反応チャンバおよび／または該支持体の温度を上昇させることによって、および／または該反応チャンバから除去される液体の蒸気圧を減少させることによって、除去されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下：
・少なくとも１つの支持体（１）［ここで、前記ＯＧＮを保有するように意図される前記面は、反応ウェル（４）のアレイを有し、各ウェルは、所定のＯＧＮ配列の局在化固定および化学合成のためのシートとして作用し、該ウェルは、光硬化性樹脂を適用し、該ウェルを規定するように意図される領域における化学線照射への暴露によって該樹脂を硬化させ、そして硬化されていない該樹脂を除去して、該ウェル（４）を規定する壁を形成する樹脂のグリッド（３）を得ることによって、得られる］；
・該支持体を含むように意図される少なくとも１つの反応チャンバ（５）；
・該支持体（１）のウェル（４）の各々における所定のＯＧＮ配列の固定および合成を可能にする、該反応ウェル（４）への特定の局在化液体（試薬／消耗品）の局在化供給のための手段（６）；
・該支持体（１）に対して該局在化供給手段（６）および／またはその反対を移動するための手段（７、３０）；
・該ウェルの全てまたは一部において行われるように意図される反応に共通の非局在化液体（生成物／消耗品）の該反応ウェルへの非局在化供給のための手段（８）；
・該非局在化供給手段（８）を移動させるための任意の手段（４０）；
・非局在化液体を排出するための手段（９、８８）；該排出手段（９、８８）は、該非局在化供給手段（８）と関連する；
・局在化ＯＧＮの固定および合成において使用される前記揮発性溶媒の蒸気を使用して該反応チャンバを飽和させるための装置（１０）；
・該局在化液体のための少なくとも１つの容器（１１、６２）；
・該非局在化液体のための少なくとも１つの容器（１２）；
・液体廃液を空にするための少なくとも１つの容器（１３）；
・該チャンバへガスを供給するための任意の装置；
・必要に応じて、該支持体上に固定されるおよび合成される種々のＯＧＮ配列のための少なくとも１つのメモリー（１５）；および
・必要に応じて、該メモリーを読み取りそしてシグナルを発生させて、流体の供給ならびに互いに対する該局在化供給手段および該支持体の移動を制御するための少なくとも１つの中央ユニット（１６）、
を含むことを特徴とする、請求項１〜８のずれか１項に記載の方法を行うための装置。
【請求項１０】
前記支持体１が、以下：
・ガラス、石英、必要に応じて少なくとも１層の酸化物または窒化物でコーティングされたシリコンによって構成される群から選択される材料から作製された、少なくとも１つの基体プレート（２）；
・該基体の面の１つと一体の光硬化された樹脂の、少なくとも１つのアレイ（３）（好ましくは、グリッド）［該アレイは、反応ウェル（４）と共にマトリックスを規定し、該フォトレジンは、好ましくは、カチオンおよび／またはラジカル経路によって光硬化可能なエポキシ樹脂または（メタ）アクリレート樹脂によって構成される群から選択される］、
を含むことを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記局在化供給手段（６）が、局在化液体の放出または配置のためのシステムを含み、該システムが、有利には、以下のシステム：
１）以下のタイプの装置を使用する機械的射出：
ａ）圧電効果を使用するドロップ−オン−デマンド；
ｂ）静電効果によって中断される連続ジェット；
２）マイクロバルブ装置を使用しての圧力下での射出、
から選択されることを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記反応チャンバ（５）を飽和するための前記装置（１０）が、使用される前記揮発性溶媒の蒸気および少なくとも１つの中性ガスを含む飽和ガス流の循環を可能にするように設計されていることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記反応チャンバ（５）が密封ベロー（５３）を備え、その一方の末端（５２）が前記局在化供給手段（６）をキャリー（ｃａｒｒｙ）し、そしてそのもう一方の末端（５１）が、該供給手段と向かい合って、該支持体（１）を受容するための反応部位を有しそして非局在化供給手段（８）を備え、該局在化供給手段をキャリーする該末端（５２）は、好ましくは固定されており、そして該支持体（１）をキャリーするもう一方の該末端（５１）は、好ましくは、移動手段（７）によって、三次元ｘ、ｙ、ｚにおいて移動可能であることを特徴とする、
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記局在化供給手段（６）が、該支持体（１）を受容するように意図されそして前記非局在化供給手段（８）と関連される前記反応チャンバ（５）の固定部分に対して、移動手段（７）の作用によって、三次元ｘ、ｙ、ｚにおいて動かされ得ることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
以下：
・前記支持体（１）が、移動手段（７）を使用して、軸ｘに沿う並進において移動可能であり、前記局在化供給手段（６）が、移動手段（３０）を使用して、軸ｙに沿う並進において移動可能であり、前記非局在化供給手段（８）が、移動手段（４０）を使用して、軸ｚに沿う並進において移動可能であり、ｘ、ｙ、およびｚが互いに垂直であること；
・該移動手段（７）、（３０）、（４０）の少なくとも一部が、前記密封化飽和可能反応チャンバ（５）の外側に配置され、該手段（７）、（３０）、（４０）の外部部分が、好ましくは少なくとも１つの電気モーター（７１）、（３１）、（４１）およびその電力供給を含む；
・ならびに、それが、該支持体（１）をロードおよびアンロードするための少なくとも１つのエアーロック（５０）を含むこと、
を特徴とする、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
請求項１および１０に定義されるＯＧＮ配列のアレイを支える支持体。
【請求項１７】
標的ＯＧＮ配列に対して相補的でありそして塩基対合により一緒に対合し得る、ＯＧＮ配列から作製されたプローブを含むバイオアレイを使用して、標的ＯＧＮ配列を検出および／または同定する方法であって、以下：
・請求項１６に記載のＯＧＮプローブのアレイを支える支持体を使用すること；
・および該プローブ／標的対合を、“ピコグリーン”タイプ蛍光マーカーを使用して明らにすること、
を特徴とする、方法。
【請求項１８】
標的ＯＧＮ配列に対して相補的でありそして塩基対合により対合し得る、ＯＧＮ配列から作製されたプローブを含むバイオアレイを使用して、標的ＯＧＮ配列を検出および／または同定する方法であって、以下：
・請求項１６に記載のＯＧＮプローブのアレイを支える支持体を使用すること；
・該支持体を、少なくとも１つの絶縁層Ｉｓ［該層は、その表面にＯＧＮプローブを有する］でその面の少なくとも１つがコーティングされた、少なくとも１つの半導体材料Ｓｃを含む少なくとも１つの構造を備える親和性アレイへ形成されること；
・該ＯＧＮプローブを、標的ＯＧＮ配列を含む導電液体媒体ＬＣと接触させること；そして
・以下の操作手順を適用すること：
ａ）標識されていないＯＧＮプローブを選択する；
ｂ）Ｓｃのフェルミ準位が、Ｓｃの固有表面レベルに実質的に対応するかまたはこれを超えることを確実にする；
ｃ）Ｓｃが、≧Ｓｃバンドギャップエネルギーであるエネルギーを有する光子での周期的な照射を受ける；そして
ｄ）Ｓｃのフラットバンド電圧Ｖｆｂにおける変化ΔＶｆｂを、直接的または間接的に測定し、この変化は、該ＯＧＮプローブの相補リガンドと該導電媒体ＬＣ由来の標的ＯＧＮ配列との特異的対合へ直接的かつ本質的に連結される電荷効果現象によって誘発され、以下を除く：
（ｉ）酵素により触媒される化学反応によって引き起こされる電荷効果および／または電荷移動効果から生じる変化（そしてここで、検出される物質の一部が消費される）；
（ｉｉ）および、ｐＨまたはレドックス電位における変化によって、および／またはマーカー［好ましくは放射吸収または放出タイプ（例えば、蛍光、放射活性、着色）］によって、明らかとされ得る少なくとも１つのトレーサー生成物の該媒体ＬＣにおける出現へ連結される光応答における変化；ならびに
・該ＬＣの標的ＯＧＮ配列を同定および／またはアッセイすることによって収集されるシグナルを解釈すること、
を特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、ヌクレオチドおよび／またはペプチド配列を分析する際の使用のためのマイクロアレイを作製する分野である。この型の分析は、より高度な生物学的実体（細胞、組織、細菌、ウイルス、真菌、酵母など）のマーカーであり得る遺伝子またはペプチドのいくつかまたは全てを検出および同定するための門戸を開放する。
【０００２】
本明細書において問題となる作製は、プローブのアレイを形成することを意図された支持体上におけるポリマープローブ（オリゴヌクレオチドおよび／またはペプチド）の局在化固定および／または化学合成であり、特定のプローブは、分析される媒体中に含まれる標的配列と対合し得る。前記対合は、蛍光、着色、または放射性マーカーを使用して、または電気トランスダクタンス（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｔａｎｓｄｕｃｔａｎｃｅ）によって明らかにされ得る。
【０００３】
より正確には、本発明は、有利には互いに異なりそして塩基対合によってそれらの相補体（標的配列）と対合し得る、複数のポリ−、好ましくはオリゴ−ヌクレオチドおよび／またはペプチド配列（ＯＧＮ配列）を、その面の少なくとも１つに支える支持体を作製する方法に関し、前記ＯＧＮ配列は、揮発性溶媒の存在下での局在化された化学合成によって得られる。
【０００４】
本発明はまた、前記方法を実行するための装置、および前記装置に含まれ、そして該方法において使用される支持体に関する。
【０００５】
本発明はまた、上記方法によって作製されるバイオアレイを使用して標的ＯＧＮ配列を検出および／または同定するための方法を提供する。
【０００６】
本明細書の文脈において、ＯＧＮ配列は、ポリ−、好ましくは、オリゴ−ヌクレオチドおよび／またはペプチド配列に対応する。言い換えると、これらは、以下であり得る：
・各々窒素含有ＡＴＣＧ塩基を保有するオリゴヌクレオチド；
・反復する単位がアミノ酸であるオリゴペプチド；
・またはペプチド核酸（ＰＮＡ）（これらは、例えば、アミド結合を介して共に結合されたＮ−（２−アミノエチル）グリシン反復ユニットを含むペプチド骨格を有するポリマーであり、各ユニットは、ピリミジンまたはプリン窒素含有塩基を保有する）；
・または混合核酸およびペプチド−核酸構造とのキメラ。
【０００７】
医学分野および産業全体における遺伝学、ゲノム学、および生物工学の急激な発達（ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ）は、核酸配列またはアミノ酸配列を分析するためのツールの必要性を創出してきた。このツールは、高分解能ツールでなければならず、そしてこれは、極度に迅速かつ確実でなければならない。核酸配列を使用して、効果的な分析ツールについてのこの必要性が、多数の用途（例えば、遺伝子突然変異の研究、病原菌検出、またはゲノム配列決定）において感じられる。
【０００８】
核酸配列および／またはペプチド配列を分析する原理は、比較的単純である。なぜなら、これは、ポリヌクレオチドおよびＰＮＡの場合に、４つのヌクレオチドコモノマー（ｃｏ−ｍｏｎｏｍｅｒ）のＡ、Ｃ、ＴおよびＧの配列、ならびにポリペプチドについて約２０アミノ酸の配列を読む工程を包含するからである。この単純な原理は、処理されるかなりの量のデータによって複雑にされる；細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ（最も短い細菌の１つ）についてのゲノムは、４７０万ヌクレオチドで４０００の遺伝子を含むが、ヒトゲノムは、約１００，０００遺伝子によって構成され、３０億ヌクレオチドを表す。それに加えて、遺伝子またはタンパク質を解読することは、生きている生物の正常な機構または異常な機構におけるこれらの核酸またはペプチドポリマーの複雑な作用を理解することとは比較にならないという事実が存在する。
【０００９】
このことは、多数の核酸またはアミノ酸配列を迅速かつ確実に分析し得る利用可能なツールまたはアレイを有することが特に有用であるという事実をさらに強調する。
【００１０】
（先行技術）
この必要性を満たすために、異なる分析ツールおよび前記ツールを作製するための技術が、先行技術において提案されている。
【００１１】
ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ−Ａ−８９／１０９７７（発明者：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）は、ポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置を記載する。その発明に従って、分析される媒体中に含まれる相補的な標的ＯＧＮ配列とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド配列（ＯＧＮプローブ）のアレイまたは完全なセットを含む支持体（例えば、ガラスプレート）が提供される。ＯＧＮアレイ上で生じ得るハイブリダイゼーションは、プローブおよび／または標的によって保有され得るマーカーを使用して明らかにされる。ＯＧＮプローブのアレイを有するバイオアレイの概念は、分析のための媒体の遺伝的内容物のデジタルインプリント（ｄｉｇｉｔａｌ ｉｍｐｒｉｎｔ）が、単一の分析工程で、前記遺伝的内容物の部分的または完全な配列決定と共に獲得されることを可能にする。理論上では、この概念は、ますます魅惑的である。なぜなら、互いに異なりそして多数（数百〜数百万）であるＯＧＮプローブのアレイ（写真術との類似によって「ピクセル」とも呼ばれ得る）を用いて、クローニングの必要性なしでポリヌクレオチド配列の複数の集団を含む媒体中で分析を実行することが可能であるはずだからである。しかし、明白な理論的興味とは別に、困難な実際的な問題、すなわち、各々１０マー長、２０マー長、または３０マー長であるプローブＯＧＮ配列のアレイを支える支持体の作製が生じる。マクロ分子ＯＧＮプローブは、各プローブについて既知の正確さで極度に小さい表面積を有するユニット上に固定されなければならない。
【００１２】
ＰＣＴ  ＷＯ−Ａ−８９／１０９７７の実施例において採用される実際的な問題に対する具体的な解決法は、以下の通りである。顕微鏡スライドを、支持体として使用した。これらのプレートは、シラン化（ｓｉｌａｎｉｚａｔｉｏｎ）を受ける（すなわち、これらを、ガラスの表面に接着する３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランで処理し、ＯＧＮ配列についての固定地点を形成する）。次いで、シラン部分は、酸処理を受け、ＯＧＮモノマーのヘッドモノマー（ラング１）と反応し得るヒドロキシル基を生成する。ＯＧＮオリゴヌクレオチドを、ホスホルアミダイト化学を使用して合成した。このヌクレオチドの５’末端を、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基によって保護し、そして３’末端を、β−シアノエチルホスホルアミダイトで保護した。ラング１における及びシラン上でのヌクレオチドのカップリング、およびラング２〜ｎにおけるヌクレオチドのカップリングは、テトラゾールを使用して実行した。溶媒は、アセトニトリルであった。反応を、密封した容器中の無水条件下で実行した。この容器は、単一の反応部位を規定するために縁のみを残すように中空にしたシリコーンゴムのストリップでコーティングした顕微鏡スライドを含んだ。ガラス支持体プレートと同じサイズおよび同じ厚さのテフロンプレートは、反応部分およびシリコーン境界をカバーした。短いプラスチックチューブは、反応容積を外側と連絡させ、そして反応液の注入および除去を可能にし、そしてまた、反応容積をアルゴンで充填することを可能にし、前記操作をシリンジを使用して実行した。各ヌクレオチドカップリング工程後、アセンブリを別々にし、次のカップリング工程を実行するための再アセンブリのための反応液または試薬中に支持体を浸漬することによって反応を続ける。
【００１３】
明らかに、ＯＧＮプローブのアレイを作製するための技術は、特に、使い扱い難く、そして複雑であるので、産業上利用可能でない。さらに、ＰＣＴ書類の実施例は、非常に少数のオリゴヌクレオチド（すなわち、２４ユニットおよび７２ユニット）を含むアレイを開示するのみである。これらのアレイは、ＰＣＴ出願の表１ａおよび１ｂに示される。ＯＧＮ配列の組成は、非常にわずかに変化し、そしてかなりの数の塩基が欠失している。従って、ＰＣＴ  ＷＯ−Ａ−８９／１０９７７に従うＯＧＮアレイを作製するための技術は、改善に理想的に適しているようである。
【００１４】
ＰＣＴ  ＷＯ−Ａ−８９／１０９７７の著者らは、コンピューターによって制御される印刷装置を含み、そしてインクジェット印刷ヘッドを含む自動装置を使用するアレイのセル中でオリゴヌクレオチドを合成することによってＯＧＮマトリクスを作製することが可能であるはずであると仮定する。しかし、これは、実用に移されていない単なるアイデアである。現実には、それを実用に移すことは、非常に困難であると証明されている。
【００１５】
実行される反応は、非常に複雑かつ多数であるので、ＯＧＮアレイの作製は、支持体上のオリゴヌクレオチドを固定および合成するための既知の技術の単なる採用ではあり得ない。
【００１６】
ＰＣＴ  ＷＯ−Ａ−８９／１０９７７に記載される技術は、「インサイチュ」と呼ばれ得る作製様式に由来し、これは、支持体のピクセルの組について同時に、一塩基づつ増加させることによって、基体上でプローブを合成することにある。
【００１７】
「エクスサイチュ（ｅｘ  ｓｉｔｕ）」と称され得る作製技術のさらなる群が存在し、これは、支持体の処理と独立したＯＧＮプローブのセットの予備作製に基づき、前記作製に続いて、支持体上に前記プローブを固定する。
【００１８】
これらの技術は、ＯＧＮプローブのセットが数十ユニットを超える場合、実行するのが困難となり、そして数百ユニットを超えると非実用的になる。
【００１９】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２５１巻、７６７−７７３、１９９１における論文に対応する、国際ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９２／１００９２（発明者：ＦＯＤＯＲら）は、光化学経路によって支持体上に位置するインサイチュ合成を開示する。この目的に対して、ヌクレオチド塩基は、ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）のような光不安定な基によって、その５’末端において保護され、これは、ホスホルアミダイト合成において使用される保護基（ＤＭＴ）を置換する。支持体は、ＮＶＯＣでもまた保護されるアミンまたはヒドロキシル基を有するガラスプレートである。基体上の局在化した光照射の作用は、光不安定な基の光化学的切断および照射された表面の脱保護を生じる。次いで、ＮＶＯＣ基によってもまた保護されるオリゴヌクレオチドの付加と共に局所的に進行することが可能である。支持体の異なる領域を照射し、次いでコンビナトリアル合成ストラテジーによって、ＦＯＤＯＲらは、ＯＧＮプローブのアレイを合成した。ＦＯＤＯＲらの技術の主な不都合は、合成収率に対するＮＶＯＣ基の有害な影響にある。それにより、配列決定の誤りを生じ、そしてアレイの有用な表面における減少を生じる。さらに、ＦＯＤＯＲの方法は、高価であり、そしてその実行において柔軟性がない（マスク、試薬は、市販されていない）。
【００２０】
この作製方法のさらなる不都合は、使用されるコンビナトリアルストラテジーが、１つのピクセルから次のピクセルまでほとんど変化しない組成のアレイを生じることであり；通常、プローブの組成は、１つのピクセルから次のピクセルまで１塩基のみ変化する。従って、近隣のピクセルにおけるハイブリダイゼーションを区別することは、困難であることが分かり得る。
【００２１】
光不安定なＮＶＯＣ型保護基を含むＯＧＮ合成技術はまた、国際ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９３／０９６６８において記載され、これは、基体上のヌクレオチドまたはペプチドポリマーのアレイを合成するためのコンビナトリアルストラテジーを記載する。このＰＣＴ出願は、基体の所定の領域における異なるＯＧＮモノマーの局在化されたインサイチュ合成に言及する。このＰＣＴ出願は、化学合成のための２つの型の技術を推奨する。
【００２２】
１−ブロック中に形成されるチャンネルの内側の反応液の流れを循環させ、ここでアレイの１つが規定の領域または所定の領域中に基体の表面によって形成される；
２−反応液の液滴を、基体の所定の領域に堆積または噴霧する；
３−技術１および２の組み合わせ。
【００２３】
技術１において、反応液が循環するチャンネルを規定するように、基体の表面と接触する平行の溝のセットを備える、チャンネルブロックが使用され、ここで反応液体は循環する。その結果、この方法は、ラング１の１つ以上の異なるモノマーを固定すること、洗浄工程および脱保護工程のために基体−チャンネルブロックアセンブリを取り除くこと、ラング２のモノマーおよびラングｎまでのモノマーを固定するためにアセンブリを再構築することにある。コンビナトリアルストラテジーは、回転（９０°）または並進のいずれかによって、チャンネルブロックに関して基体を移動させることからなる。
【００２４】
技術１のバリエーションにおいて、図１２に示されるように、複数の反応ウェル、ならびに試薬または反応液を支持体に分配するためのチューブのアセンブリを備える試薬分配器を備える支持体が提供される。この改変物において、支持体の所定の領域への反応液の供給を制御するために、分配器チューブと支持体ウェルとの間にマスクを挿入することが可能である。
【００２５】
技術２に関して、ＰＣＴ出願は、一般的な様式で、１平方センチメートル（ｃｍ２）あたり少なくとも１００００反応領域を含む支持体を開示する。このような支持体を具体化するための具体的な実施例は存在しない。このＰＣＴ出願はまた、支持体の前記反応領域において反応液を分配するための手段を記載する。インクジェット印刷ヘッドは、支持体の反応領域に反応液を分配するための手段の例として引用される。
【００２６】
支持体上で反応領域を作製するために提案された技術の１つは、親水性領域の周りに疎水性領域を作製することによって（例えば、保護された疎水性基を保有する親水性樹脂の層を適用し、そして表面張力ウェルの輪郭を形成するように意図された領域中でこれらの疎水性基を脱保護することによって）、支持体の表面上に表面張力ウェルを獲得することにある。代替において、反応領域は、図１２に示されるような壁によって規定される三次元ウェルによって形成され得る。
【００２７】
このＰＣＴ出願において、疎水性基は、光分解によって有利に脱保護される。
【００２８】
ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９３／０９６６８はまた、ＯＧＮ配列の合成に影響し得る溶媒エバポレーションでの問題をほのめかす。その困難性を克服するために、密封された反応チャンバーの使用が、蒸気圧（低温）を低下させることおよび／または揮発性溶媒を用いて反応チャンバーを飽和することと共に、提案される。
【００２９】
前記推測的一般性と実際に機能する実践的な実施形態との間のギャップは、無視できないことに注意すべきである。このことは、そのＰＣＴ出願において与えられる実施例が、反応流体循環チャンネルを使用する技術１の説明のみに関するという事実によって確認される。実施例において記載されるように、この技術は、２５００の反応領域を含むアレイが作製されるのを可能にする。ＯＧＮオリゴヌクレオチド配列は、反応領域の全てにおいて合成される。第７モノマーおよび第８モノマーを接着するために、使用される反応液循環チャンネルブロックは、各６マー長のＯＧＮ配列をすでに含む基体表面に対して固定される。第７ヌクレオチドは、所定の方向に平行であるチャンネルアセンブリによって分配され、そして第８ヌクレオチドは、第７ヌクレオチドを受容することを意図されたチャンネルの方向に垂直である方向のチャンネル中で循環する流れによって分配される。その実施例において、８マーのＯＧＮ配列は、チャンネル間の交差点においてのみ作製される。
【００３０】
出願ＰＣＴ  ＷＯ−Ａ−９３／０９６６８の方法は、異なる組成のオリゴヌクレオチドのアレイを、迅速に、確実に、そして容易に作製し得ないようである。チャンネルブロックに関する基体の各回転によって、装置は、取り除かれる必要があり、このことは、インサイチュＯＧＮ合成および局在化について、この方法を非常に扱いにくくする。
【００３１】
米国特許ＵＳ−Ａ−５  ６５８  ８０２（Ｄ．Ｊ．ＨＡＹＥＳら）は、圧電系を使用する、試薬の液滴の基体上への局所的射出に基づくエクスサイチュ合成方法およびインサイチュ合成方法に関する。実際に、ヌクレオチド塩基を希釈するために最も頻繁に使用される基体が、アセトニトリルであり、そしてこの溶媒が、低湿潤の接触角を有することを考慮すると、基体上に数百ミクロンを超える溶媒の液滴を広げることに関する問題が生じ、反応を適切な規模に局在化することを困難にする。さらに、この様式で使用されるアセトニトリルは、揮発性であり、従って、大規模なエバポレーションに供される。
【００３２】
ＵＳ−Ａ−５  ６５８  ８０２に記載される装置は、必要に応じてパターンを有する集積回路を作製するために使用される型の基体を備える。その特許において、非常に小さい表面積の反応部位を規定する問題は、存在しない。各圧電射出手段は、液体のリザーバに関連する。圧電射出手段およびこれらのリザーバは共に、分配アセンブリを形成する。この装置はまた、液体射出手段および／または基体を位置決めするための手段を提供する。
【００３３】
上記は、ＵＳ−Ａ−５  ６５８  ８０２に記載される方法および装置が、揮発性の溶媒を使用する局在化された化学合成によってＯＧＮ配列のアレイを作製する場合に、操作可能でないことを示す。
【００３４】
基体上に反応液の液滴の広がりを制御すること、および互いに離れている別々の複数の反応部位にこれらを限定することの問題に関して、前記の国際ＰＣＴ特許出願ＷＯ−Ａ−９３／０９６６８および表面張力ウェル技術の記載が参照されるべきであり、表面張力ウェル技術は、表面張力差異によって複数の反応部位を規定するために、約１００マイクロメートル（μｍ）の直径を有する親水性領域を囲む疎水性領域を作製することにある。Ａ．Ｐ．ＢＬＡＮＣＨＡＲＤらによる文献（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １１，６８７−６９０，１９６６）はまた、この技術を取り扱う。しかし、前記技術は、水溶性溶媒についてのみ満足のいく様式で問題を解決することが認識されるべきである。不都合なことに、水性溶媒は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド合成反応に適していない。
【００３５】
実際に、表面張力ウェル技術は、反応液がアセトニトリルのような揮発性の有機溶媒によって構成される場合に適切ではない。このような揮発性溶媒の表面張力特徴に起因して、表面張力差異によって反応部分を分離することは、あまり十分ではない。さらに、非常に少量で分配される溶媒の蒸発の問題は、表面張力ウェルを含む命題における主要な問題のままである。
【００３６】
国際ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９４／２７７１９は、支持体の表面上で化学反応アレイを作製するための方法および装置に関する。このＰＣＴ出願において、表面張力ウェルは、フェノール／ホルモール型またはポリメタクリレート型のフォトレジン（ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｎ）を使用して、支持体の表面上に作製される。このＰＣＴ出願は、反応液を分配するための圧電性インクジェット印刷ヘッド型手段を推奨する。
【００３７】
従って、先行技術はまた、支持体の表面上に、異なりそして種々の性質の大量のＯＧＮ配列を含むアレイを作製する、効率的かつ高性能な方法を提案しないことが認められなければならない。文献に記載される多数の方法および装置は、いずれの実際の適用も有さず、そして作製されていないようである。さらに、一般的な規則に対して例外であるものは、小数のピクセルを含むＯＧＮ配列アレイを生じるか、または多数の誤ったＯＧＮ配列を有する。この最後の点は、合成収率に関して、これらの方法の弱点を構成する。９２％の平均収率は、８マーのプローブについて５１％まで、そして１２マーのプローブについて３６％まで、各ピクセルの有用な表面を減少することが知られている。アレイの大部分にわたる、誤った配列の存在は、ハイブリダイゼーションまたは塩基対合の検出を複雑にし、そして重複するアレイの設計またはプローブ長の制限を必要とする。このような欠陥は、ＮＶＯＣ保護基を含む光化学方法について特に当てはまる。さらに、公知の作製方法は、アレイを容易に構成するＯＧＮ配列の組成を変更することは困難であるという点で、あまり柔軟性がない。
【００３８】
最後に、公知の方法は、一般に、複雑であり、信頼性が低く、あまり迅速でなく、高価であり、かつ最も重要なことに、産業上利用可能でないと考えられ得る。
【００３９】
これらの状況下で、本発明の本質的な目的は、複数のポリ−好ましくは、オリゴ−ヌクレオチドおよび／またはペプチド配列）をその少なくとも１つの面に保有する支持体を作製するための方法および装置を提供することであり、前記ＯＧＮ配列は、互いに異なり、そして塩基対合によってこれらの相補体と対合し得、そして揮発性溶媒の存在下での化学合成によって得られる：
・前記方法は、柔軟性があり、信頼性があり、迅速かつ単純であると同時に、実際に正確に機能することが必要とされる；そして
・前記方法はまた、良好な化学的収率を有し、そしてその次に配列中に低い割合で誤りを有する、数十〜数億のＯＧＮ配列を含むアレイを作製する。
【００４０】
さらなる本質的な局面において、本発明の目的は、上に概略される方法を実施するための、単純な、安価な、かつ産業的な装置を提供することである。
【００４１】
なおさらなる本質的な局面において、本発明は、前記の目的を有する方法および装置における使用のための支持体を提供することを目的とし、これは、作製するのが容易であり、そしてＯＧＮ配列アレイの作製を最適化する。
【００４２】
なおさらなる本質的な局面において、本発明は、標的ＯＧＮ配列を検出および／または同定する方法を提供することを目的とし、この方法は、前記目的を有する方法によって得られるＯＧＮプローブのアレイを支える支持体を備えるバイオアレイを包含し、このような検出および／または同定方法はまた、より確実かつより特異的である。
【００４３】
発明の開示
前記主題は、中でも、第１局面において、複数のポリ−、好ましくはオリゴ−ヌクレオチドおよび／またはペプチド配列をその面の１つに保有する支持体の製造方法を提供する本発明によって達成され、有利には互いに相違する該配列（ＯＧＮ配列）は、塩基対合によりそれらの相補体と対合し得、そしてこれらは揮発性溶媒の存在下での化学合成によって得られ；
前記方法は本質的に、以下：
１）支持体を使用すること［ここで、該ＯＧＮを保有するように意図される該面は、反応ウェルのアレイを有し、各ウェルは、所定のＯＧＮ配列の局在化固定および／または化学合成のためのシートとして作用し；該ウェルは、光硬化樹脂を適用し、該ウェルを規定するように意図される領域における化学線照射への暴露によって該樹脂を硬化させ、そして硬化されていない該樹脂を除去して、該ウェルを規定する壁を形成する樹脂のグリッドを得ることによって、得られる］；
２）反応チャンバ内に該支持体を配置し、そして該ＯＧＮの局在化固定および化学合成において使用される揮発性溶媒の蒸気を使用して、好ましくは、該反応チャンバ（５）を通って好適な飽和蒸気を含むガス流を循環させることによって、該チャンバを飽和すること；
３）該ウェルの少なくとも一部において該ＯＧＮ配列の（増加による）局在化固定および／または化学合成を行うこと；
を含み、そしてこの操作は、以下によって達成される：
ｉ．  対応のＯＧＮ配列を固定および／または合成するための試薬および液体消耗品を、関連する各ウェルへ、局所的および別個に供給すること；
ｉｉ．  全ての該ウェルにおいて行われるように意図される反応へ共通の試薬および／または液体消耗品を、関連する該ウェルへ、集合的に（非局所的に）供給すること；ならびに
ｉｉｉ．  該ウェル（４）への局在化供給のための各操作の前に、局在化様式で供給されるように意図される各ウェル中に含まれる任意の液体の少なくとも一部が、除去されることを確実にすること。、
本発明の方法は、先行技術方法よりも実用的要求をより良く満たす、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）（または、エクスサイチュ（ｅｘ ｓｉｔｕ））化学合成によってオリゴヌクレオチドのアレイを製造することに対応する。
【００４４】
本発明は多くの利点を有する。言及される例としては、ＯＧＮ配列のアレイを、単純かつ柔軟な様式で、非常に多種の組成、サイズおよび密度で製造され得るという事実が挙げられる。特に、それは、遺伝学研究の要求を満たす。更に、本方法は、非常に高価な試薬（特にＯＧＮ合成のために使用されるもの）の消費が特に低いようなスケールで行われる。このために、アレイを低コストで大量生産することが可能である。更に、本発明の方法は、商品である反応液体および装置のみを使用するということが、注意されるべきである。
【００４５】
更に、本発明の方法は、ＯＧＮアレイ技術を、そして特にオリゴヌクレオチドのそれを、医薬およびバイオ産業へ適用可能な全ての遺伝的分析へ広く普及させる。
【００４６】
本発明の方法は、数平方ミリメートルから３００ｃｍ２の支持体（例えば、シリコンウエハ）上で［１ピクセルの表面積は、１０００マイクロメートル（μｍ）×１０００μｍから１０μｍ×１０μｍの範囲内である］、広範な種々の組成を有するアレイを、柔軟な様式で、作製し得る（これは、コンビナトリアルであってもなくてもよい）。従って、ピクセル数は、数単位から数億単位の葉にであり得る。
【００４７】
支持体上にインサイチュで固定されそして必要に応じて製造されるＯＧＮ配列は、塩基対合により相補性標的と反応し得るプローブと考えられ得る。これらのＯＧＮ配列は、有利には、ヌクレオチドおよび／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）の繰り返し単位および／またはアミノ酸単位である、数コモノマーによって構成される。これらのポリマーまたはより正確にはオリゴマーの、ヌクレオチドコモノマーおよび／またはＰＮＡおよび／またはアミノ酸の数は、数単位から数十単位、好ましくは１５単位から２５単位の範囲であり得る。
【００４８】
好ましくは、本発明によれば、ＯＧＮの固定だけでなく局在化インサイチュ合成は、ウェルにおいて行われる。しかし、エクスサイチュでＯＧＮを合成すること、およびそれらを局在化様式で支持体のウェルへ個々に固定することがまた、予想され得る。
【００４９】
理想的には、支持体の構成材料は、以下によって構成される群から選択される：
ガラス、石英、必要に応じて少なくとも１つの層の酸化物または窒化物によってコーティングされたシリコン。
【００５０】
シリコンまたは他の半導体材料は、特に、支持体が、電子トランスダクタンスタイプ（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｔｒａｎｓｄｕｃｔａｎｃｅ ｔｙｐｅ）の対合を暴露することによって機能するバイオアレイへ一体化されるように意図される場合、好ましい。
【００５１】
更なる特徴において、該支持体の表面は、好ましくは、ポジティブまたはネガティブ樹脂によって構成される群から、好ましくはネガティブ樹脂を含むサブ群（ｓｕｂ−ｇｒｏｕｐ）から、そしてより好ましくは、ラジカルおよび／またはカチオン経路によって光硬化され得る、（メタ）アクリレート、エポキシ、ポリエステルおよび／またはポリスチレン樹脂を含むクラスから選択される、光硬化性樹脂のエッジング（ｅｄｇｉｎｇ）によって形成される反応ウェルのアレイを有する。
【００５２】
用語“ポジティブ樹脂（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｉｎ）”は、本発明において使用される場合、照射によって高度な溶解性になる樹脂を意味する。
【００５３】
用語“ネガティブ樹脂（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｉｎ）”は、本発明において使用される場合、照射によって不溶性になる樹脂を意味する。
【００５４】
ネガティブ樹脂が、好ましくは使用され、そして基体へ付着する厚い耐化学層を作製するという利点を有する。
【００５５】
有利には、ウェルに対応するマスクされていない領域における硬化されていない樹脂は、有機溶媒中に該樹脂を溶解させることによって除去される。それは、例えば、アセトン、γ−ブチロラクトン、プロピレン−グリコールメチルエチルアセテート（ＰＧＭＥＡ）、アセトニトリル、または当該分野に公知である他の溶媒であり得る。リソグラフィック樹脂におけるマイクロウェルのこのような形成は、支持体の洗浄、堆積、硬化、化学線照射（ａｃｔｉｎｉｃ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）（ＵＶ）への暴露、および硬化されていない樹脂の溶解という公知の実験プロトコルに従う。
【００５６】
以下の実施例および図面、特に図１および２に提供されるおよび例示は、支持体およびその製造の非限定的な説明の他の有用な詳細を提供する。
【００５７】
本発明の有利な変形において、支持体を表面処理して、その上に、ＯＧＮ配列のヘッドコモノマーと非不安定結合を形成し得る固定部位を提供し、該処理は、好ましくは、前記マイクロウェルアレイを作製する前および／または後にエステル官能基を有するアルコキシシランまたはエポキシアルコキシシランを使用してのシラン化（ｓｉｌａｎｉｚａｔｉｏｎ）である。
【００５８】
慣用的には、シラン化剤（ｓｉｌａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）は、グリシドキシプロピルトリメトキシシランである。引用され得る他のシラン化剤は、グリシドキシプロピルジメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランおよびカルボキシメチルトリエトキシシランである。
【００５９】
シラン化は、インサイチュで製造されるアレイのｎ  ＯＧＮ配列を構成するラング１のモノマー（例えば、ヌクレオチド）のセットに強固な（ｓｏｌｉｄ）固定ポイントを提供する。シランは、有利には、例えば、ヒドロキシル基により、ラング１のモノマー（ヌクレオチド）と架橋する。
【００６０】
固定反応およびＯＧＮ配列合成のために要求される不揮発性溶媒の蒸発が、本発明の方法において、完全に考慮される。従って、この方法において、好ましくは好適な飽和蒸気および中性ガスを含むガス流を使用して、飽和工程が提供される。これは使用される溶媒の蒸発速度を制御し、そしてアレイを作製するために必要な全てのマイクロ−反応が制御される。
【００６１】
蒸発が飽和によって制御される場合、溶媒の蒸発を生じさせて支持体上の局在化反応を停止させることが、予想され得る。
【００６２】
当然ながら、例えば（好ましくは支持体の）温度を低下させることによって、使用される全ての揮発性溶媒の蒸気圧を減少させることにより、蒸発を制限することもまた可能である。
【００６３】
有利には、飽和のために使用されるベクターガス（ｖｅｃｔｏｒ ｇａｓ）は、アルゴンまたはヘリウムである。
【００６４】
好ましくは、該ガス流は、それが反応チャンバにおける、周囲大気と比べて過剰圧力（ｏｖｅｒ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を決定するようなものである。
【００６５】
非限定的な例示において、ガス流は、大気圧に関して０．０１ｂａｒ〜３ｂａｒの圧力を決定する。
【００６６】
支持体上でのＯＧＮの局在化固定および／または化学合成に関して、本発明によれば、支持体の反応ウェルへの局在化供給（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｓｕｐｐｌｙ）のための手段および非局在化供給（ｎｏｎ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｓｕｐｐｌｙ）のための手段が、使用される。
【００６７】
有利には、局在化供給手段および支持体は、移動手段によって三次元Ｘ、ＹおよびＺにおいて互いに対して移動可能である。
【００６８】
本発明によれば、ｎ ＯＧＮ配列を該支持体上において固定および／または合成するために、各々はｘ コモノマーを含む：
・作製されるｎ ＯＧＮ配列のアレイの組成を、各々がコモノマーを含みそして各々が該支持体のｎ ウェルに局在化される試薬液体の除去、供給および堆積という一連のアクションに対応するｘ 連続ラングの構成に該組成を保存することによって、メモリーに記憶する［該液体は、該ｎウェルにおけるラングＲｉ＝１〜ｘの該コモノマーの性質を決定する］；
・そして第１に、該局在化供給手段および該移動手段に、前記に定義される種々の一連のアクションを行うように命令し、そして第２に、該非局在化供給手段に、該固定およびＯＧＮ配列合成手順において種々の時間で、該支持体の該ｎウェルへの、非局在化液体の除去、運搬および供給を行うように命令する［各局在化供給に続いて、該ウェル中そしてより一般的には該反応チャンバ中に存在する液体を排出するための工程が行われる］；
［それらが誘導する該命令および該アクションは、Ｒｉにおいてｉ＝ｘまで１ずつｉを増加させることによって繰り返される］。
【００６９】
ＯＧＮ配列（例えば、オリゴヌクレオチド）のアレイを製造するための種々の工程の間、反応チャンバに流体（ガス、溶媒など）および試薬（塩基、脱保護剤、カップリング剤など）を供給することが必要である。該流体（液体消耗品）および試薬は、２つのカテゴリーに分類され得る：
１）ピクセルごとに送られてアレイを得るように意図された流体および試薬（以下で、“局在化液体（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｌｉｑｕｉｄ）”と呼ばれる）；
２）全ての該ウェルに対して共通である様式で支持体の全てまたは一部へ、そしてより詳細には支持体の反応ウェルの全てまたは一部へ同時に送られるように意図された流体および試薬。該流体および試薬は、以下で“非局在化液体（ｎｏｎ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｌｉｑｕｉｄｓ）”と呼ばれる。
【００７０】
本発明の好ましい特徴によれば、該液体は、本方法の工程３（ｉｉｉ）において除去され、その結果、関連する該ウェルが、それらの容積の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、そしてより好ましくは少なくとも９８％の深さまで液体がない。
【００７１】
有利には、該液体は、乾燥によって、ガス（好ましくは、中性ガス）を反応チャンバへ注入することによって、および／または反応チャンバおよび／または支持体の温度を上昇させることによって、および／または反応チャンバから除去される液体の蒸気圧を減少させることによって、除去される。
【００７２】
これらの処理は、局在化液体を正確に射出（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）または堆積（ｄｅｐｏｓｉｔ）を可能にし、そして所定の局在化液体が提供されたウェルに隣接するウェル中に、特にはね（ｓｐｌａｓｈｅｓ）［これは、考慮される供給を開始する前に、ウェルが既に液体を含む場合に危険を構成する］によって、汚れ（ｓｍｅａｒｓ）を生じさせないことを目的とする。
【００７３】
中性ガスを使用しての乾燥による液体の前記除去はまた、ＯＧＮ合成および／または固定を弱め（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）得る微量の水をも除去し得る。反応液体として使用され得る塩基および溶媒は、無水媒体中に保存されなければならないことは、周知である。
【００７４】
反応チャンバはまた、部分的そして制御された真空下で静置され得る。
【００７５】
明らかなことに、本発明の方法は、以下を達成し得る：
・アレイのピクセルに対応するマイクロリアクターを規定して局在化液体の拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を制御する上部構造（ｓｕｐｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を、支持体に提供する；
・マイクロリアクター内の局在化液体の溶媒の蒸発速度を制御して、ＯＧＮ配列アレイを得るために必要な化学マイクロ反応（ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を制御する；
・アレイの製造を継続するために、該マイクロ反応の終了時に、使用された化学生成物を排出する。
【００７６】
更なる局面において、本発明は、前記に定義される方法を行うための装置を提供する。該装置は、以下：
・少なくとも１つの支持体［ここで、前記ＯＧＮを保有するように意図される前記面は、反応ウェルのアレイを有し、各ウェルは、所定のＯＧＮ配列の局在化固定および化学合成のためのシートとして作用し、該ウェルは、光硬化性樹脂を適用し、該ウェルを規定するように意図される領域における化学線照射への暴露によって該樹脂を硬化させ、そして硬化されていない該樹脂を除去して、該ウェルを規定する壁を形成する樹脂のグリッド（３）を得ることによって、得られる］；
・該支持体を含むように意図される少なくとも１つの反応チャンバ；
・該支持体のウェルの各々における所定のＯＧＮ配列の固定および合成を可能にする、該反応ウェルへの特定の局在化液体（試薬／消耗品）の局在化供給のための手段；
・該支持体に対して該局在化供給手段および／またはその反対を移動するための手段；
・該ウェルの全てまたは一部において行われるように意図される反応に共通の、非局在化液体（生成物／消耗品）の該反応ウェルへの非局在化供給のための手段；
・該非局在化供給手段を移動させるための任意の手段；
・非局在化液体を排出するための手段；該排出手段は、該非局在化供給手段と関連する；
・局在化ＯＧＮの固定および合成において使用される前記揮発性溶媒の蒸気を使用して該反応チャンバを飽和させるための装置；
・該局在化液体のための容器；
・該非局在化液体のための容器；
・液体廃液を空にするための容器；
・該チャンバへガスを供給するための任意の装置；
・該局在化供給手段に関して該支持体を移動するための手段および／またはその反対；
・必要に応じて、該支持体上に固定されるおよび合成される種々のＯＧＮ配列のための少なくとも１つのメモリー；および
・必要に応じて、該メモリーを読み取りそしてシグナルを発生させて、流体の供給ならびに互いに対する該局在化供給手段および該支持体の移動を制御するための少なくとも１つの中央ユニット、
を含むことを特徴とする。
【００７７】
本発明は、本方法の実行および装置の実施形態の好ましい非限定的実施例の以下の説明からよりよく理解されるであろう。
【００７８】
本発明を実施するベストモード
好ましくは、該支持体１は、以下を含む：
・ガラス、石英、および必要に応じて少なくとも１層の酸化物または窒化物でコーティングされたシリコンによって構成される群から選択される材料から作製された、少なくとも１つの基体プレート（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｌａｔｅ）２；
・該基体の面の１つと一体化して光硬化された樹脂の、少なくとも１つのアレイ３（好ましくは、グリッド）［該アレイは、反応ウェル４でマトリックスを規定し、該フォトレジン（ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｎ）は、カチオン性および／またはラジカル経路によって光硬化可能であるエポキシ樹脂および（メタ）アクリレート樹脂によって構成される群から選択され、エポキシ樹脂がより特に好ましい］。
【００７９】
有利には、樹脂グリッド３は、ラング１モノマー（ヌクレオチド）を固定するために基体上で行われる処理と適合性である。該グリッド３は、前記処理の前または後に製造され得る。樹脂の該グリッド３は、ＯＧＮ配列アレイ製造の間に、支持体プレート２へ付着する。グリッドは該バイオアレイにおけるアレイを読み取るための操作を妨げないが、それは、必要に応じて、バイオアレイにおいて使用される前に、除去され得る。
【００８０】
完全に硬化されていない樹脂中に形成されたグリッドが合成試薬を汚染しないこと、そして相互に、該試薬がグリッドを分解（ｄｅｇｒａｄｅ）しないまたはグリッド／基体分離を生じさせないことが、重要である。
【００８１】
前記グリッド３によって規定される反応ウェル４は、アレイ中のピクセルとなるのと同じぐらい多い反応部位を規定する。該ウェルは、アセトニトリルのような高度に湿潤化させる溶媒の塗布（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を制限する。反応ウェル４の前記アレイまたはグリッド３は、ポジティブまたはネガティブ樹脂を用いる慣用的なリソグラフィック技術を使用して、基体上に該樹脂を堆積させることによって、そして例えば、ネガティブ樹脂の場合には該壁に対応する領域を化学線照射（ａｃｔｉｎｉｎｃ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）へ暴露してそれらを硬化させ次いで硬化されていない領域を選択的に溶解させてウェルを形成させることによって、得られる。限定することなしに、本発明は、０．１μｍ〜１０００μｍの範囲、好ましくは５０μｍ〜５００μｍの範囲の深さ、１０μｍ×１０μｍ〜１０００μｍ×１０００μｍの範囲の表面を有するマイクロウェルを製造することを認識し得る。
【００８２】
本発明の方法の有利な配置において、反応マイクロウェル４のアレイまたはグリッド３は、化学反応を、支持体の性質および／または調製と独立して、局在化させ、その結果、不均質でありそして物理化学的な表面処理（酸化、シラン化、窒化など）を受けている、種々の性質の支持体を使用することが可能である。
【００８３】
図３に示される本発明の装置の第１実施形態は、樹脂グリッド３によって規定される、その表面上に規定される反応ウェル４を有する、支持体１を含み、該支持体１は、一般的な参照番号５によって示される反応チャンバ内に含まれている。図３の装置はまた、局在化供給手段６、局在化供給手段６に対して支持体１を移動するための手段７を含む。
【００８４】
手段８は、非局在化反応液体の非局在化供給を確実にするために提供される。該手段８は、非局在化液体を排出するための手段９と関連する。
【００８５】
前記装置はまた、中性ガスおよび溶媒が充填されたガス流を使用して、反応チャンバ５を飽和するための装置１０を含む。図３中の参照番号１１、１２、および１３は、それぞれ、局在化液体のための容器、非局在化液体のための容器、および廃液を空にするための容器を意味する。装置１４は、反応チャンバ５へガスを供給するために備えられる。
【００８６】
最後に、本発明の好ましい特徴において、本方法の自動化実施（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、メモリー１５、ならびにメモリー１５を読み取りそして制御シグナル（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉｇｎａｌｓ）（点線の矢印）を発するための中央ユニット１６によって確実にされる。
【００８７】
この装置の種々の構成エレメントは、好適なシャシ（ｃｈａｓｓｉｓ）および／またはフレームおよび／またはベースによって支持される。
【００８８】
この第１実施形態の第１実施において、該装置は、反応チャンバが、前記局在化供給手段をキャリーする（ｃａｒｒｙ）１つの末端と、該供給手段と向かい合って、該支持体を受容することを意図された反応部位を有する反対の末端とを有する密封ベロー（ｓｅａｌｅｄ ｂｅｌｌｏｗｓ）を備え、そして非局在化供給手段を備え、該局在化供給手段をキャリーする該末端（５２）は、好ましくは固定されており、そして該支持体をキャリーするもう一方の末端（５１）は、好ましくは、移動手段（７）を用いて、三次元ｘ、ｙ、およびｚにおいて移動可能であることを特徴とする。
【００８９】
第１実施形態の第２実施において、該装置は、局在化供給手段が、支持体を受容するように意図されそして非局在化供給手段と関連された反応チャンバの固定部分に対して、移動手段の作用下で、三次元ｘ、ｙ、およびｚにおいて移動され得ることを特徴とする。
【００９０】
図３は、第１実施形態の第１実施に従う装置の実施例に対応し、ここで、局在化供給手段は、支持体を受容するように意図された反応チャンバの移動部分（ｍｏｖｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）に対して固定されている。この移動部分は、方向ｘ、ｙ、およびｚにおける移動のための手段７によって提供される。
【００９１】
図３において示されるように、反応チャンバ５は、支持体１のためのレセプタクルとして使用される下部部分５１、局在化供給手段６を備えた上部部分５２、ならびに下部部分５１および上部部分５２と接続している密封ベロー（ｓｅａｌｅｄ ｂｅｌｌｏｗｓ）によって構成された中間部分５３から構成されている。反応チャンバの上部部分５２は、ベロー５３と一体化していても一体化していなくてもよい。密封ベロー５３は、有利には、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））のような化学的に不活性な材料から作製される。
【００９２】
本発明の好ましい特徴において、局在化供給手段６は、射出システム（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を備える。射出システムは、有利には、以下のシステムから選択される：
１）以下のタイプの装置を使用する機械的射出（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｅｊｅｃｔｉｏｎ）：
ａ）圧電効果を使用するドロップ−オン−デマンド（ｄｒｏｐ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ）；
ｂ）静電効果によって中断される連続ジェット；
２）マイクロバルブ装置を使用しての圧力下での射出。
【００９３】
図３に示される実施例において、射出システムは、タイプ１ａ）のものであり、そして局在化液体を射出または堆積するための少なくとも１つのノズル６１を備える。この圧電ノズル６１は、ライン６２を介して、１以上の局在化液体リザーバ（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ）１１へ接続されている。
【００９４】
圧電効果を使用するドロップ−オン−デマンド射出（ｄｒｏｐ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ ｅｊｅｃｔｉｏｎ）のためのシステム１ａ）は、Ｊ．Ｊ．ＥＬＴＧＥＮによる論文”Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｄ’ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄ’ｉｍａｇｅｓ ｎｕｍｅｒｉｓｅｅｓ” ［Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ］（ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ Ｄ’ ＩＮＧＥＮＩＥＵＲ − ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ｔｒｅａｔｉｓｅ Ｅ５６７０）に記載されている。
【００９５】
前記圧電システム１ａの利点の１つは、それらは、非常に小さな表面積のマイクロウェル４（例えば、７０μｍ×７０μｍ〜３００μｍ×３００μｍ）に渡って、非常に少ない容積の局在化液体（試薬）（例えば、５０ピコリットル）を、支持体１のマイクロウェル４へ堆積させ得るということである。
【００９６】
前記圧電システム１ａの更なる利点は、１〜１０ｋＨｚの周波数で独立して制御される６４から１２８のノズルを有するコンポーネント６１の商業的入手性である［例えば、ＭＯＤＵＬＡＲ  ＩＮＫ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（スウェーデン）のＰ６４およびＰ１２８システム］。次いで、このようなコンポーネントを用いて、アセトニトリルに希釈された試薬を射出することによって、複数のウェルに同時に供給することが可能である。
【００９７】
変形物として、射出システムは、タイプ１ｂ）のもの、前記で引用したＪ．Ｊ．ＥＬＴＧＥＮによる論文に記載されるような静電効果によって遮断される連続ジェットであり得る。このシステムは、高い分解能（典型的に、３０μｍ×３０μｍ）が得られ得る。
【００９８】
最後に、図３Ａに示されるようなタイプ２）射出システムを有する変形物は、圧電タイプノズル（６１）の代わりに、非局在化液体試薬に対して不活性である材料から作製される機械的部品（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐａｒｔｓ）２０を使用する。それは、ステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはポリアミド（ＮＹＬＯＮ（登録商標））から作製され得る。各部品２０は、チャンネル２１を通るフィン（ｆｉｎ）を含む。該チャンネル２１への入口開口部２２は、ライン２３を介して、部品２０のチャンネル２１への局在化液体の許可（ａｄｍｉｓｓｉｏｎ）を管理する電気制御バルブ（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｖａｌｖｅ）２４へ接続されている。このバルブ２４に、リザーバ２６を介して、局在化試薬液体２５が供給される。ライン２７は、リザーバ２６をバルブ２４へ接続している。中性ガス２８（例えば、アルゴン）は、過剰圧力で（例えば、０．５ｂａｒ）、液体２５をバルブ２４へ進ませる。例えば１ミリメートル（ｍｍ）の直径を有するライン２３、２７は、有利には、部品２０と同一の材料（例えば、ＰＴＦＥ）から作製される。
【００９９】
出口開口部２９、即ち部品２０のノズルは、フォトレジングリッド３によって規定されたマイクロウェル４を含む基体１と向かい合って配置される。
【０１００】
ノズル２９の直径は、例えば、１００μｍである。
【０１０１】
バルブ２４は、図３に示されるように、中央電子制御ユニット（ｃｅｎｔｒａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｎｉｔ）１６によって制御される（図３Ａには示されていない。このユニット１６は、短い制御期間（例えば、０．１ミリ秒（ｍｓ）〜１０ｍｓ）の間開口（ｏｐｅｎｉｎｇ）、次いでバルブ２４の閉鎖（ｃｌｏｓｉｎｇ）を制御して局在化試薬液体２５の少量３０を放出させ、そして支持体１のマイクロウェル４に供給し得る。
【０１０２】
１ｍｍ直径のライン２３、２７を用いて、０．５ｂａｒの過剰圧力のアルゴン、０．１ｍｓ〜１０ｍｓの開口期間の電気制御バルブ２４、直径１００μｍのノズル２９、送達された量３は、４００μｍ×４００μｍの表面積および４００μｍの深さを有するマイクロウェル４を備える支持体１に好適である。
【０１０３】
エレメント２０、２１、２９は、例えば、１００μｍ未満の直径を有するマイクロシリンジの構成エレメントであり得る。
【０１０４】
実際、バルブ２４は、ＬＥＥ  ＣＯＭＰＡＮＹ（ＵＳＡ）製のＩＮＫＸ  ０５１０１００バルブから構成され得、これはまた、参照番号ＩＮＺＸ  ０５１０１００を有する７のノズル２９を備えるシステムを作製する。アセトニトリルとのこのバルブの適合性を増加させるために、エラストマーフラップ（ｆｌａｐ）をフッ素化エラストマーフラップ（ＫＡＬＲＥＺ（登録商標）またはＣＨＥＭＲＡＺ（登録商標））で置き換えることが有利であるだろう。
【０１０５】
図３Ａに示される射出システムの変形物は、その削減された費用、機能の簡易性、および信頼性のために、有利である。
【０１０６】
図３において例として示される実施形態において、局在化供給手段６はまた、圧力下でガスを供給するためのライン６３を備え、これは、リザーバ１１に含まれる局在化液体を、ライン６２を介してノズル６１へ運搬し得る。このラインは、射出を制御する電気制御バルブ６４を備えている。局在化供給手段６を形成するエレメント６１〜６４は、有利にはバルブ６４の開閉を管理する中央制御ユニット１６によって制御される。中央ユニット１６はまた、ライン６３を介して高圧ガスの供給を制御する。局在化液体のために複数のリザーバ１１が存在する最も通常の場合、中央ユニット１６はまた、好適な装置を使用して射出される液体の選択を管理する。
【０１０７】
図３の例において、１つのみの射出ノズル６１が備えられているが、変形物において、射出される局在化液体が存在するのと同じぐらい多数の射出ノズルを有すると認識することが可能であることに注意すべきである。
【０１０８】
非局在化供給手段８は、支持体を含んでいる反応チャンバの下部部分５１へ非局在化液体を供給するためのライン８１を備えている。このライン８１は、反応チャンバ５の下部部分５１内に備えられた開口部８２を、局在化液体リザーバ１２へ接続する。このライン８１は、支持体に供給するように意図された非局在化液体流を制御するための、電気制御バルブ８３が備えられている。該非局在化供給手段８はまた、非局在化液体流をライン８１において発生させる高圧ガス（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ ｇａｓ）を供給するためのライン８４を含む。
【０１０９】
反応チャンバ５の下部部分へ導入される非局在化液体を選択するための手段を支持体１上へ提供することによって、前記非局在化供給手段８内に、他の非局在化液体リザーバ１２を含めることが可能であることが、容易に理解され得る。局在化供給手段６と同様の様式で、非局在化供給手段８は、中央ユニット１６（点線の矢印）によって制御され、これは、ライン８４およびバルブ８３を介して供給される高圧ガスによる非局在化液体の運搬を制御する。
【０１１０】
前記手段８は、手段８によって供給され、そして反応チャンバ５の下部部分５１に一時的に留まりそして支持体１を浸す、非局在化液体を排出するための手段９と関連する。該排出手段（ｅｖａｃｕａｔｉｏｎ ｍｅａｎｓ）９は、チャンバ５の下部部分５１に設けられた出口オリフィス（ｏｕｔｌｅｔ ｏｒｉｆｉｃｅ）９２を廃液リザーバ（ｅｆｆｌｕｅｎｔ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）１３へ接続するライン９１を含む。ライン９１には、好適な時間での廃液の排出を管理する、中央ユニット１６によって制御される、電気制御バルブ９３が備えられる。該排出のための駆動力は、例えば、ガスの過剰圧力および／または液体が除去されることを可能にする吸引ポンプ（図３に示されていない）の作用であり得る。
【０１１１】
飽和揮発性溶媒流（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｓｔｒｅａｍ）の循環を可能にする装置１０は、反応チャンバの下部部分５１へのおよび下部部分５１からの飽和ガス流のための、溶媒リザーバ１０１、入口１０２、および出口１０３を含む。該流れは、ライン１０４を介して溶媒リザーバ１０へ入りそしてそれと共に溶媒の蒸気をライン１０５へ運ぶ中性ガス（ｎｅｕｔｒａｌ ｇａｓ）（例えば、アルゴン）によって発生され、これは、入口１０２を介してチャンバへ入り、そして出口１０３（これは、排出ライン１０６によって延長されている）を介してそこから排出され得る。ライン１０５および１０６は、中央ユニット１６（従って、これは、飽和ガス流を制御する）によって制御される電気制御バルブ１０７および１０８を含む。
【０１１２】
好ましくは、反応チャンバ飽和装置１０は、使用される揮発性溶媒の蒸気および少なくとも１つの中性ガスを含む、飽和ガス流の循環を可能にするように設計される。
【０１１３】
任意のガス供給装置１４は、下部部分に備えられた入口を介して、反応チャンバと連絡する。この装置１４には、電気制御バルブ（示されず）が備えられており、そしてまた、中央ユニットによって制御される。
【０１１４】
手段６に対して支持体１を移動させるための手段７に関して、本発明の装置の第１実施形態の第１実施において、手段７が図３に象徴的に示されていることが理解され得、図３はまた、中央ユニット１６による該移動手段７の制御を、点線の矢印によって示す。一般的に、移動手段は、ＯＧＮ合成のために使用される試薬に対して、特に、飽和のために使用される溶媒に対して、十分な化学耐性を有する。溶媒は可燃性であり、従って、移動手段の設計は、火災の危険性を避けなければならない（従って、中性ガスの重要性）。これらの条件は、移動手段がベローのために化学リアクターの外側に配置されているので、図３の装置について満たされている。
【０１１５】
該移動手段７は、反応チャンバ５の下部部分５１を動かすために好適な任意の公知の手段によって構成され得る。ベロー５３のために、この下部部分５１は、射出ノズル６１を含むチャンバ５の上部部分５２に対してある程度の可動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）を有する。言及され得る例は、機械的に駆動され得る三次元におけるピン／ラックシステム（ｐｉｎ／ｒａｃｋ ｓｙｓｔｅｍｓ）、スライドシステム、あるいは交差運動を有する交差移動キャリッジ（ｃｒｏｓｓ−ｍｏｔｉｏｎ ｃａｒｒｉａｇｅｓ）および／または並進および／または回転に動力が付けられたマイクロメトリック移動盤（ｍｉｃｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｐｌａｔｅｎｓ）を備えるシステムが挙げられる。前記システムに対応する市販の商品は、ＭＩＣＲＯＣＯＮＴＯＬＥ、ＮＥＷＰＯＲＴ、ＯＷＩＳによって提供される。
【０１１６】
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、射出ノズル６１に関する、下部部分５１によってキャリーされる支持体１のｘ、ｙ、およびｚ軸に沿っての移動を示す。
【０１１７】
このような移動手段は、支持体１の反応ウェル４に局在化液体を供給し得る。
【０１１８】
図３に示される本発明の装置の第１実施形態のこの例は、局在化液体が、支持体１のマイクロウェル４へ非常に少ない容積の液滴で分配されることを可能にする。
【０１１９】
例として、図５および６は、１５０μｍ×１５０μｍの表面および約１００μｍの深さを各々が有する、数十のマイクウェル４を含む支持体１の拡大写真を示す。
【０１２０】
該マイクロウェルは、光硬化されたエポキシ樹脂のグリッド３によって規定されている。図５における写真は、マイクロウェル４のアレイ、特に、丸で囲んだマイクロウェル４’（これは、微量の局在化液体も含んでいない）を示す。図６の写真は、図５のアレイを示し、ここで、丸で囲んだマイクロウェル４’は、射出システムのドロップ−オン−デマンドタイプ圧電ノズル６１（１ａ）によって送られた、約５０ピコリットルのアセトニトリルの液滴Ｇを含有する。液滴Ｇを含有する支持体１は、図３（飽和）の装置によって提供される条件下で存在せず、該液滴は、別のフラクションで蒸発し、そしてそれは写真を撮ることが可能でなかった。対照的に、図３の装置を用いると、この液滴は、反応チャンバ内のアセトニトリルで飽和された容積で見られる。それは、５分（ｍｉｎ）から３０ｍｉｎ間そこに留まり、これは、化学固定および／またはＯＧＮ合成反応を生じさせるに十分な時間である。
【０１２１】
図３、３Ａおよび４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに記載の本発明の方法の実施は、フレキシブルＰＴＦＥベローを用いて行われるに容易であるという利点を有する。飽和された容積は低く、このことは、制御（化学組成、溶媒濃度、圧力、温度など）を容易にする。移動手段は、飽和容積の完全に外にあり、そして従って腐食から保護される。対照的に、マイクロ堆積（ｍｉｃｒｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）／ベロー手段の移動の幅は、ベローのスイープ（ｓｗｅｅｐ）に、即ち、数センチメートル（ｃｍ）に制限される。
【０１２２】
大きな支持体（ｓｕｐｐｏｒｔｓ）または基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）、例えば、４〜８インチシリコンウエハ（１０．１６ｃｍ〜２０．３２ｃｍ）上でアレイを作製するために、図７および９に記載の第２実施形態の装置が、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄにおいてより詳細に説明されるように、好ましく使用される。
【０１２３】
図７、８および９は、本発明の装置の第２実施形態を示す。図において理解され得るように、この第２実施形態と前記の第１実施形態との間の本質的な差異は、軸Ｘに沿って支持体１を移動するための手段７を使用して支持体を移動させることに加えて、局在化供給手段６はＹ軸に沿って移動可能であり、そして非局在化供給手段８は大きな移動を伴ってＺ軸に沿って、少なくともＸ、Ｙ軸に沿って、移動可能であり、大きな基体を加工する（ｗｏｒｋ ｏｎ）ことを可能にするという事実にある。
【０１２４】
支持体１を移動させるための手段７、ならびに局在化供給手段６と非局在化供給手段８のための移動手段３０および４０、は、反応チャンバ５内に少なくとも部分的に含まれる。このチャンバは、有利には、第１実施形態の装置よりも大きい（例えば、１．５メートル（ｍ）×１．５ｍ×１ｍ）。該チャンバ５は、例えば中性ガス（例えば、アルゴン）および揮発性溶媒蒸気で充填されたガス流で飽和され得るように設計される。このために、チャンバ５を飽和するための装置１０が提供される。それは、本発明の装置の第１実施形態について記載されたものと同一である。同一のエレメントは、同一の参照番号を有する。
【０１２５】
第２実施形態の装置が、工業的操作により好適である。ここで重要なポイントは、反応チャンバの飽和をコンスタントに維持することが可能であることである。飽和における中断は、チャンバの大容積に起因して、飽和を再開するために多大な時間を必要とすることが明らかであるからである。
【０１２６】
該装置のこの第２実施形態の更なる特徴は、チャンバ５の外側に配置された移動手段７、３０、４０の部分が、モーター３１、４１および７１、ならびに該モーターのための電力供給（図面には示されていない）であり、一方、移動手段７、３０、４０の５の内側の機械的部分（以下に、より詳細に記載される）が、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）（ＰＴＦＥ）、ステンレス鋼、過フッ素化エラストマー（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ ｅｌａｓｔｏｍｅｒｓ）（ＫＡＬＲＥＺ（登録商標）、ＣＨＥＭＲＡＺ（登録商標））、またはポリアミド（ＮＹＬＯＮ（登録商標））のような不活性材料から作製されるということである。
【０１２７】
チャンバ５の飽和を中断しないために、移動手段７によってキャリーされる支持体１をロードおよびアンロードする場合には、チャンバ５にサイドエアロック（ｓｉｄｅ ａｉｒｌｏｃｋ）５０を備える。
【０１２８】
図８は、Ｙ軸に沿う移動のためのそれらの手段３０からリフトされた局在化供給手段６、ならびに支持体１およびＸ軸に沿う移動のためのその手段７を詳細に示す。反応チャンバ５の壁は、ドッド−ダッシュ（ｄｏｔ−ｄａｓｈ）線によって、図８において印がつけられている。
【０１２９】
反応マイクロウェル４のアレイを規定する樹脂グリッド３を含む支持体または基体１の移動のための手段７は、トランスミッション・ワームスクリュー（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｗｏｒｍｓｃｒｅｗ）７４による並進（ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ）へ変形され得る回転運動を発生させ得るモーター７１の作用下で、ガイドレール７３上でスライドし得る並進キャリッジ（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃａｒｒｉａｇｅ）を含む。例えば、多角形または円形断面積の金属ロッドである、ガイドレール７３と、トランスミッション・ワームスクリュー７４とは、互いに平行である。スライド７３の各末端には、バッファーブロック（ｂｕｆｆｅｒ ｂｌｏｃｋ）７５が備えられている。モーター７１へ接続されている反対側のトランスミッション・ワームスクリュー７４の末端にはまた、バッファーブロック７６が備えられている。エレメント７３、７４の末端部分、バッファーブロック７５、７６、およびモーター７１は、チャンバ５の外側に配置される。
【０１３０】
有利には、チャンバの壁を通ってのガイドレール７３およびトランスミッション・ワームスクリュー７４のための経路は、例えば、ＫＡＬＲＥＺ製の形成されたＯ−リングによって密封される。本発明の有利な変形において、スライド７３のためのバッファーブロック７５は、チャンバ５の壁の一体化部品（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｐａｒｔ）を形成し得、気密でなければならない開口部を節約し得る。
【０１３１】
チャンバ５において少なくとも部分的に配置される部品の構成材料は、固定および／または合成化学試薬、特にＯＧＮに耐性である材料から選択される。引用され得る構成材料の例は、ＰＴＦＥ、ステンレス鋼、およびＫＡＬＲＥＺである。
【０１３２】
外部モーター７１は、化学試薬から保護されており、このことは、火災または爆発の危険性を回避させる。
【０１３３】
局在化供給手段６およびそれらの移動手段３０に関して、該移動手段３０は、支持体１上に配列されたマイクロウェル４への局在化液体または試薬のマイクロ堆積（ｍｉｃｒｏ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）のためのステーション６０のＹ軸に沿う並進の移動を確実にするように設計されることに注意されるべきである。
【０１３４】
上記に記載の移動手段７と同様に、移動手段３０は、バッファー３６によってもう一方の末端で終了されたトランスミッション・ワームスクリュー３４の一方の末端へ接続されたモーター３１を含む。上述のように、該エレメントのある部分および該エレメントの他の末端部分が、チャンバ５の外側に配置される。更なる詳細については手段７の前記の記載が参照されるべきである。
【０１３５】
ガイドレール３３に沿うワームスクリュー３４によって並進において運ばれ得るマイクロ堆積ステーション（ｍｉｃｒｏ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｉｏｎ）６０に関して、それは、試薬６２のボトルを支えるエレメント６１を備えたキャリッジからなり（図８において、１つだけが示される）、そしてＹ軸に平行であり、そして一連のマイクロ堆積装置６５を支持するラック６４による（図８において、１つだけが示される）。Ｙ軸に平行であるこのラック６４は、試薬ボトル６２を支えるエレメント６１と側面で向かい合っている。
【０１３６】
上述のように、飽和チャンバ５の内側に配置された手段６および３０のエレメントは、使用される試薬（例えば、アセトニトリル）に対して耐性である材料によって構成され、そして／または密封様式で該チャンバから分離される。耐性材料の例は、前記に与えられている。
【０１３７】
ボトル６２に含まれる試薬の対応のマイクロ−堆積装置６５への運搬は、ライン６６（図８において、１つだけが示される）により達成される。局在化試薬または液体は、ライン６７を介して供給された圧力下で運搬される、中性ガス（例えば、アルゴン）流によって、推進される。
【０１３８】
変形において、試薬ボトル６２は、反応チャンバ５によって規定される作業容積（ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）の外側に配置され得る。その場合、特定の（ａｄ ｈｏｃ）“流体”接続（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）が備えられるだろう。
【０１３９】
基体または支持体１とマイクロ堆積装置６５との間でのＺ軸に沿う距離は、Ｘおよび／またはＹ軸に沿うキャリッジ６０および／または７２の移動（ｍｏｖｅｍｅｎｔ）を使用して、局在化試薬の液滴を、支持体１の樹脂グリッド３によって規定されたマイクロウェル４のアレイのアセンブリへアドレスを決めるように調節される。
【０１４０】
（試薬ボトル６２および高圧ガスアップストリーム（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ ｇａｓ ｕｐｓｔｒｅａｍ）を備える）装置６５を使用する該マイクロ堆積およびキャリッジ６０、７２の移動によるこのアドレスを決めること（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）は、メモリー（コンピュータ）（図面に示されず）が備えられた中央制御によって制御および管理される。
【０１４１】
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄは、非局在化供給手段８、およびより詳細にはピストン８０によって構成されるその特定のエレメントの詳細を示す。図７に示されるように、非局在化供給手段８のためのピストン８０は、Ｚ軸に沿う並進において移動可能である。この目的のために備えられた移動手段４０は、上述の移動手段７および３０と類似する様式で、ワームスクリュー４４へ接続されたモーター４１を含み、該Ｚ軸およびワームスクリュー４４に平行である２つのガイドレール４３に沿うＺ軸に沿って並進でピストン８０を駆動する。ガイド４３およびワームスクリュー４４の下部末端は、バッファーブロック４５および４６を有する。同一のことが、ガイドレール４３の上部末端についても真である。より詳細には、前記の移動手段７および３０の説明が参照されるべきである。
【０１４２】
ピストン８０は、移動手段４０と協同するキャリッジ８１と一体化している。
【０１４３】
ピストン８０の垂直軸Ｚは、支持体１の移動について軸Ｘに対して、そしてマイクロ堆積ステーョン６０の移動について軸Ｙに対して垂直である。その結果、支持体１の中央とピストン８０の軸とを一致させてそしてピストン８０が支持体基体１を覆うことを確実にする様式で、移動手段７および４０を始動させることが可能となる。
【０１４４】
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄに示されるように、ピストン８０の下部面には、好ましくはＫＡＬＲＥＺで作製された、環状Ｏ−リング８２が備えらている。この環状Ｏ−リングは、ピストンと同軸であり、そしてその直径は、該ピストン８１の下部面の直径よりも実質的に小さい。
【０１４５】
図９Ｄに示されるように、この環状Ｏ−リング８２は、ピストン８１の下部面８４と支持体１（これに対して、該ピストン８１は、移動手段４０によって適用される）の表面との間の隙間スペース（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｓｐａｃｅ）８３を規定する。
【０１４６】
ピストン８１が支持体１に対して水平であるこの状況において、ピストン８１の支持体＋環状Ｏ−リング８２＋ピストン８１の下部面８４アセンブリは、非常に小さな寸法、例えば、４インチ直径（１０．１６ｃｍ）を有する基体のために、５立方センチメートル（ｃｍ３）〜１０ｃｍ３を有する密封チャンバ８３を形成する。
【０１４７】
ピストン８１は、中空内部容積（ｈｏｌｌｏｗ ｉｎｎｅｒ ｖｏｌｕｍｅ）８６を規定する、厚い下部末端部分を有する壁８５によって構成される。
【０１４８】
直径プレーン（ｄｉａｍｅｔｒｉｃａｌ ｐｌａｎｅ）に配置されている、壁８５の下部部分は、ピストン８１の下部面８４を形成する外面、ならびに角度位置（ａｎｇｕｌａｒ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）０°、９０°、１８０°および２７０°に配置された周辺管状エレメント（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）が備えられた内面８７を有する。該管状エレメント８８は、該外側と連絡して、そして特に隙間スペース８３と連絡して、ピストン８１の内部８６を配置する（図９Ｄに示されるように、ピストン８０が、支持体１に対して水平に配置される場合）。これらの管状エレメント８８は、管（ｔｕｂｅｓ）（図面に示されず）を介して非局在化試薬リザーバ（これもまた、図面には示されず、そして第１実施形態を示す図３のリザーバ１２および１３に対応する）へ接続されている。従って、反応チャンバアセンブリ５の飽和を中断することなく、遥かに減少された容積を有する隙間スペース８３へ非局在化試薬を供給することが可能である。非局在化試薬の供給に加えて、管状エレメント８８はまた、該非局在化試薬を排出し、そして／またはガス流を通すことによってもしくはポンプで汲み出す（ｐｕｍｐｉｎｇ ｏｕｔ）ことによって基体を乾燥させ得る。
【０１４９】
局在化供給手段６およびそれらの移動手段３０と同様に、基体１を移動させるための手段７、非局在化供給手段８およびそれらの移動手段４０は、本発明に従う局在化ＯＧＮ合成方法および／または印刷方法の文脈で使用される、供給、洗浄、リンス、排出および乾燥などについての手順の全てを管理し得る、中央制御ユニットによって制御される。
【０１５０】
当業者は、反応チャンバ５が密封されることを確実にするような多数のバリエーションを工夫し得るであろうことに注意されるべきである。特に、密封ボールレース（ｓｅａｌｅｄ ｂａｌｌ ｒａｃｅｓ）および種々の形状のシールが使用され得、これらの機械的構築エレメントは、ＭＥＭＯＴＥＣ，ＰＲＯＤＵＣＴＩＱＵＥ，ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ  ｅｔ  ｄｅｓｓｉｎｓ（Ｃ．Ｂａｒｌｉｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ）において記載される。
【０１５１】
更なる局面において、本発明は、上述のようなＯＧＮ配列のアレイを支える支持体を提供する。
【０１５２】
本発明はまた、標的ＯＧＮ配列に対して相補的でありそして塩基対合により一緒に対合し得る、ＯＧＮ配列から作製されたプローブを含むバイオアレイを使用して、標的ＯＧＮ配列を検出および／または同定する方法であって、以下：
・前記に記載のＯＧＮプローブのアレイを支える支持体を使用すること；
・および該プローブ／標的対合を、“ピコグリーン”タイプ蛍光マーカーを使用して明らにすること、
を特徴とする、方法を提供する。
【０１５３】
“ピコグリーン（ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）”は、二本鎖ＤＮＡの存在下で蛍光を発する分子である。ピコグリーンは、特定の反応を必要とせず、そして蛍光を測定する前の５分間二本鎖の存在へ持っていかなければならないだけである。次いで、この分子は、それらが蛍光マーカー（フルオレセイン、ローダミン、．．．）であるかまたはインターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）（臭化エチジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）であるかによらず、二本鎖を検出するための慣用的に使用される物質に対して多数の利点を有する。
【０１５４】
従って、ピコグリーンは、ＤＮＡアレイ（チップ）において使用される蛍光プローブとは対照的に、標識化反応を必要としない。
【０１５５】
その蛍光シグナルの線形性は、広範囲の濃度にわたって優れている。従って、それは、測定される溶液中、汚染物質（一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ）の存在下においてでさえ、慣用的なインターカレーターで測定され得るものよりも遥かに低い濃度で、二本鎖を検出し得る。ピコグリーンの感受性は、次に臭化エチジウムよりも感受性である、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ３３２５８よりも４００倍まで良い。
【０１５６】
この高感受性は、慣用的インターカレーターで測定され得ない、局所蛍光レベルが測定されることを可能にする。従って、ピコグリーンは、小さなサイズのハイブリダイゼーション単位を含む、高いかまたは中間の密度アレイにおけるハイブリダイゼーションを検出するために、インターカレーターよりも好適である。
【０１５７】
蛍光シグナルは、Ｈｏｅｃｈｓｔ産物とは対照的に、試験される配列の塩基組成と独立している。
【０１５８】
“ピコグリーン”は、フルオレセイン（４８０ナノメートル（ｎｍ）で励起、５２０ｎｍで放出）と同一の手段で励起され、これは、標準的な装置を用いての使用を非常に実用的とする。
【０１５９】
最後に、本発明は、標的ＯＧＮ配列に対して相補的でありそして塩基対合により対合し得る、ＯＧＮ配列から作製されたプローブを含むバイオアレイを使用して、標的ＯＧＮ配列を検出および／または同定する方法であって、以下：
・前記に記載のＯＧＮプローブのアレイを支える支持体を使用すること；
・該支持体を、少なくとも１つの絶縁層Ｉｓ［該層は、その表面にＯＧＮプローブを有する］でその面の少なくとも１つがコーティングされた、少なくとも１つの半導体材料Ｓｃを含む少なくとも１つの構造を備える親和性アレイへ形成されること；
・該ＯＧＮプローブを、標的ＯＧＮ配列を含む導電液体媒体ＬＣと接触させること；そして
・以下の操作手順を適用すること：
ａ）標識されていないＯＧＮプローブを選択する；
ｂ）Ｓｃのフェルミ準位が、Ｓｃの固有表面レベルに実質的に対応するかまたはこれを超えることを確実にする；
ｃ）Ｓｃが、≧Ｓｃバンドギャップエネルギーであるエネルギーを有する光子での周期的な照射を受ける；そして
ｄ）Ｓｃのフラットバンド電圧Ｖｆｂにおける変化ΔＶｆｂを、直接的または間接的に測定し、この変化は、該ＯＧＮプローブの相補リガンドと該導電媒体ＬＣ由来の標的ＯＧＮ配列との特定の対合へ直接的かつ本質的に連結される電荷効果現象によって誘発され、以下を除く：
（ｉ）酵素により触媒される化学反応によって引き起こされる電荷効果および／または電荷移動効果から生じる変化（そしてここで、検出される物質の一部が消費される）；
（ｉｉ）および、ｐＨまたはレドックス電位における変化によって、および／またはマーカー［好ましくは放射吸収または放出タイプ（例えば、蛍光、放射活性、着色）］によって、明らかとされ得る少なくとも１つのトレーサー生成物の該媒体ＬＣにおける出現へ連結される光応答における変化；ならびに
ｅ）該ＬＣの標的ＯＧＮ配列を同定および／またはアッセイすることによって収集されるシグナルを解釈すること、
を特徴とする、方法を提供する。
【０１６０】
この方法は、前記の方法に従って調製されたＯＧＮ配列のアレイ、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＷＯ−Ａ−９５／５７１５７（これは、本明細書中で参照として全体が援用される）に記載のような生物学的物質の同定および／または検出の方法を関連付ける。
【０１６１】
この関連付けは、特に効果的である標的ＯＧＮ配列を検出および／または同定する方法を生じさせる。
【０１６２】
以下の実施例は、本発明の方法および装置の操作、そして特に該装置の第１実施形態を例示する。
【０１６３】
（実施例）
（実施例１）
（１．１．試薬および方法論）
表１は、以下に使用されるホスホルアミダイト化学の場合の分類例を示す。多数のバリエーションが、本発明の範囲内で可能である。
【０１６４】
【表１】
2004532382.tif 000003
【０１６５】
（１．２．装置）
使用される装置は、図３を参照して上記に記載されるものである。
【０１６６】
この装置は、表１の試薬Ａ、ＣおよびＤを射出するために図３Ａに示される型の６つのマイクロバルブ装置から作製される射出システム６を包含する（試薬Ａについて１つのバルブ、試薬Ｄについて１つのバルブ、Ｃにおける４塩基についてのバルブ）。
【０１６７】
この装置はまた、表１の試薬Ａ、Ｂ、Ｅ、ＦおよびＧについて図３に示される型の６つの非局在化供給手段１０を備える。
【０１６８】
製品Ａ（アセトニトリル）は、局在化様式および非局在化様式の両方で送られ得る。この装置はまた、アルゴンガス（すなわち、表１の試薬Ｈ）で基体を乾燥するための手段を備える。
【０１６９】
支持体は、２５６のリソグラフィー樹脂ウェル（エポキシ）を備えるシリコンまたはガラスプレートによって構成される。
【０１７０】
各マイクロウェルは、４１５μｍ×４１５μｍの表面および約４１５μｍの深さを有した。
【０１７１】
ウェルの容量は、塩基の液滴および活性剤の液滴をあふれさせることなく射出することによって充填される必要がある。
【０１７２】
このサイズのシリコンに対するマイクロウェル作製プロトコルは、以下の通りである：
１．支持体を洗浄する（アセトン、アルコール．．．）
２．乾燥アルゴンで乾燥する
３．例えば、カチオン性重合エポキシ樹脂（例えば、γ−ブチロラクトンで異なる比で希釈して供給される、ＩＢＭによって開発された樹脂ＥＰＯＮ  ＳＵ８−１００）を使用する、スピナーを使用して基体上にリソグラフィー樹脂の層を堆積させる；スピナーの速度は、１μｍ〜１０００μｍ（代表的に、１００μｍ）の樹脂の厚みを制御する；例として引用された樹脂は、マイクロシステムを作製する際に使用され、そして１／２０までの形状係数（ｆｏｒｍ  ｆａｃｔｏｒ）で、厚い垂直なウェルを作製し得る；
４００μｍの深さのマイクロウェルを、以下：
・低い回転速度で単一の樹脂層をゆっくりと塗布するか；
・または２〜４の層を連続的に塗布し、そして各層について以下の工程４、５および６を繰り返すことによって、
のいずれかによって作製した；
４．樹脂および支持体の厚みに依存して、９０℃で５分〜３０分間硬化する；
５．ＵＶ供給源（１組のマスクを用いるＵＶランプまたはＵＶレーザーで直接）を用いて選択的に暴露する。基体によって吸収される１平方メートルあたりのマイクロジュール（ｍＪ／ｍ２）のエネルギー線量は、異なる硬化工程および現像（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）工程の間に優れた樹脂／基体接着を獲得するように調整されなければならない。マイクロウェルのサイズは、５μｍ×５μｍから１０００μｍ×１０００μｍ（代表的に、４１５μｍ×４１５μｍ）まで変化する；
６．樹脂および支持体の厚みに依存して、５０℃〜１００℃で５分〜３０分間二次硬化する；
７．任意の超音波活性化とともに溶媒（アセトン、γ−ブチロラクトン、ＰＧＭＥＡ．．．）を用いて非暴露樹脂を溶解する；
８．樹脂の架橋を増加させるために最終硬化する：９０℃〜１５０℃で５分〜３０分。この工程は、オリゴヌクレオチド合成試薬に対するマイクロウェルの挙動を決定する．
９．スルホクロム混合物で５分間、支持体を洗浄し、次いで二回蒸留した水でリンスする；
１０．ＧＰＴＳ／水混合物（１％ｖ／ｖ）中に４５分、次いで１２５℃で４５分間オーブン中で浸漬することによって、水性シラン化処理する。
【０１７３】
該方法のパラメーターが調整され、その結果：
・オリゴヌクレオチド合成において使用される溶媒（アセトニトリル、ジクロロメタン、ＴＨＦ、ピリジンなど）および試薬（ヨウ素など）は、樹脂上部構造（ｓｕｐｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分解を引き起こさないか、またはその分離を引き起こさない；
・上部構造がオリゴヌクレオチド合成に対して不活性であるように、樹脂の硬化を十分に促進する。
【０１７４】
【表２】
2004532382.tif 000004
【０１７５】
2004532382.tif 000005
【０１７６】
移動手段の制御は、ノズルの位置間の距離が、局在化された液体の射出の間に、ウェル４の開口部から約１ｍｍであるように調整される。局在化された試薬を含むボトル中の圧力は、以下の範囲で存在する：
・試薬が完全には射出されないが、塩基に接着する最小値から；
・ウェルの容量に対応する最大値まで。
【０１７７】
ウェルからウェルの汚染の危険を減少させるために、１つおきのウェルのみを使用し、その結果、基体中の２５６ウェルのうち６４のみが、ＯＧＮアレイについての交点（ｎｏｄｅ）を構成する。
【０１７８】
メモリー１５および中央ユニット１６を、以下のＯＧＮの以下のバリエーションの全てを含むアレイが作製されるように搭載する（３’から５’方向で）：
３’−ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＧ  ＴＡＴ−５’
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの６４のありうる組み合わせを形成する。特定の場合のＸ１Ｘ２Ｘ３＝ＡＣＧが生物学的関心（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）のＬ２２６  ＯＧＮであるので、この実施例を選択した。
【０１７９】
実際上、ハイブリダイゼーションの間の立体障害に関して、ＯＧＮは基体から空間をあけておくことが有用である。この目的に対して、配列を１０Ｃヘッダーで伸長し、例えば、以下を生じる：
３’−ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣ−５’
アレイの第一および第三の部分は、以下の配列である：
ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＴＧＧＴおよびＣＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣを、基体を使用し得るように改変されたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｘｐｅｒｔｉｓｅ  ＯＧＮ合成器を用いて作製した。
【０１８０】
中心部分Ｘ１Ｘ２Ｘ３を、図１０の関数として、図１〜４の装置で作製した。図１０は、ＯＧＮ  Ｌ２２６が中心位置にあり、そして非常に異なる組成を有するプローブによって囲まれ、その結果、ＡＣＧピン（ｐｉｎ）のハイブリダイゼーションは、検出するのが容易であることを示す。このようなアレイを用いて、Ｌ２２６に相補的なＵ２２６  ＯＧＮを検出することが可能であった。
【０１８１】
（産業上適用）
本発明の好ましい適用は、複数のポリヌクレオチド配列（好ましくは、オリゴヌクレオチド配列および／またはペプチドを保有する支持体を作製することであり、これらの配列は、互いに異なり、そしてその面の少なくとも一つの上でこれらの相補体と対合し得る。
【図面の簡単な説明】
この詳細な説明は、添付の図面を参照してなされる。
【図１】
図１は、その上に本発明のＯＧＮ配列アレイが製造される支持体の斜視図である。
【図２】
図２は、図１のラインＩＩ−ＩＩに沿う垂直断面図である。
【図３】
図３は、本発明の装置の第１実施形態の概略図である。
【図３Ａ】
図３Ａは、局在化試薬の液滴を射出するためのシステムの改良型の概略図である。
【図４Ａ】
図４Ａは、反応チャンバ、支持体および局在化供給手段を含む図３の詳細であり、そしてＸ軸に沿って局在化供給手段に対して該支持体および反応チャンバの一部の移動を示す。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、図４ＡのラインＩＶ−ＩＶに沿う断面図であり、そしてＹ軸に沿って局在化供給手段に対して該支持体および反応チャンバの一部の移動を示す。
【図４Ｃ】
図４Ｃは、図４Ａと同一のエレメントを繰り返すが、Ｚ軸に沿って局在化供給手段に対して該反応チャンバの下部および該支持体の移動を示す。
【図５】
図５および図６は、化学固定および／またはＯＧＮ合成反応のためのシートとして機能するように意図された数十のマイクロウェルを規定するフォトレジンのグリッド３を含む支持体１の拡大写真である。図５と図６との差異は、図６の支持体において円で囲まれたマイクロウェル中の局在化された試薬の液滴の存在にある。
【図６】
図５および図６は、化学固定および／またはＯＧＮ合成反応のためのシートとして機能するのうに意図された数十のマイクロウェルを規定するフォトレジンのグリッド３を含む支持体１の拡大写真である。図５と図６との差異は、図６の支持体において円で囲まれたマイクロウェル中の局在化された試薬の液滴の存在にある。
【図７】
図７は、本装置の第２実施形態の一般的な概略斜視図である
【図８】
図８は、支持体１およびその移動手段７および局在化供給手段およびそれらの移動手段３０を示す図７の詳細な斜視図である。
【図９Ａ】
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、非局在化供給手段を示す。図９Ａは、該非局在化供給手段８のピストン８０の正面図である。
【図９Ｂ】
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、非局在化供給手段を示す。図９Ｂは、図９Ａのピストンを通る直径の断面図（ｄｉａｍｅｔｒｉｃａｌ ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）である。
【図９Ｃ】
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、非局在化供給手段を示す。図９Ｃは、図９Ａおよび図９Ｂのピストン８０の上面図である。
【図９Ｄ】
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、非局在化供給手段を示す。図９Ｄは、支持体１へ適用されたピストン８０の部分直径断面図（ｐａｒｔｉａｌ ｄｉａｍｅｔｒｉｃａｌ ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）である。
【図１０】
図１０は、実施例において各々製造された３ｍｅｒ長オリゴヌクレオチドのアレイ６４を示す。
図１および図２は、本発明の装置の一体化部品を形成する支持体１を示す。
【国際公開パンフレット】
2004532382.tif 000006
2004532382.tif 000007
2004532382.tif 000008
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【国際調査報告】
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2004532382.tif 000069
2004532382.tif 000070
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