(57)【要約】本発明は、通常、生理的および病理学的なプロセスを調節する方法と、特に、細胞レベルの酸化体とそれによってこのような酸化体が参加するプロセスを調節する方法に関する。本発明は、また、このような方法で使用するための化合物と組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2004503556.tif 000008
（式中、Ｒ１−Ｒ８は、各々独立に、−Ｈ、アルキル、２−ヒドロキシアルキル、メトキシアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、トリアルキルアンモニウム、ホルミル、カルボン酸アミド、カルボン酸のアルキルエステル、カルボン酸、カルボン酸のグルクロニル又はグリセリルエステル、１，２−ジヒドロキシアルキル、アセチル、ビニル、グリコシル、またはタウレートであり、
β、γおよびδは、各々独立に、−Ｈ、アセチル、グリシル、ベンゾアート、フェニルスルホネート、２−，又は３−，又は４−Ｎ−アルキル−ピリジル、ニトロフェニル、ハロフェニル、メトキシアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、トリアルキルアンモニウム、ホルミル、カルボン酸アミドである。
ただし、前記化合物が式Ｉにおいて、β、γ及びβが−Ｈであり、且つ前記化合物が金属と錯体を形成していないときは、Ｒ１−Ｒ８は、各々、メチル、ビニル、メチル、ビニル、メチル、プロピオン酸、プロピオン酸およびメチルではない。）
の化合物、またはそれらの薬学的に許容され得る塩。
【請求項２】
式
【化２】
2004503556.tif 000009
（式中、Ｒ１−Ｒ８は、各々独立に、−Ｈ、アルキル、２−ヒドロキシアルキル、メトキシアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、トリアルキルアンモニウム、ホルミル、カルボン酸アミド、カルボン酸のアルキルエステル、カルボン酸、カルボン酸のグルクロニル又はグリセリルエステル、１，２−ジヒドロキシアルキル、アセチル、ビニル、グリコシル、またはタウレートであり、
β、γおよびδは、各々独立に、−Ｈ、アセチル、グリシル、ベンゾアート、フェニルスルホネート、２−，又は３−，又は４−Ｎ−アルキル−ピリジル、ニトロフェニル、ハロフェニル、メトキシアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、トリアルキルアンモニウム、ホルミル、カルボン酸アミドである。
ただし、前記化合物が式ＩＩＩにおいて、β、γ及びβが−Ｈであり、且つ前記化合物が金属と錯体を形成していないときは、Ｒ１−Ｒ８は、各々、メチル、ビニル、メチル、ビニル、メチル、プロピオン酸、プロピオン酸およびメチルではない。）
の化合物、またはそれらの薬学的に許容され得る塩。
【請求項３】
Ｒ１−Ｒ８が各々独立に、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル、２−ヒドロキシＣ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５カルボン酸のＣ１−Ｃ５アルキルエステル、Ｃ１−Ｃ５カルボン酸、Ｃ１−Ｃ５カルボン酸のグルクロニル又はグリセリルエステル、１，２−ジヒドロキシＣ１−Ｃ５アルキル、アセチル、ビニル、グリコシル、タウレート、クロロ、フルオロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリメチルアンモニウム、またはホルミルであり、
β、γおよびδは、各々独立に、−Ｈ、アセチル、グリシル、ベンゾアート、フェニルスルホネート、２−，３−又は４−Ｎ−Ｃ１−Ｃ５アルキルスルホネートピリジルである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が亜鉛、鉄、Ｎｉ、コバルト、銅、マンガンからなる群から選択される金属と錯体を形成している請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物がマンガンと錯体を形成している請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
請求項４に記載の化合物の二量体。
【請求項７】
前記金属がマンガンである請求項６に記載の二量体。
【請求項８】
前記二量体が下式で表される請求項７に記載の二量体。
【化３】
2004503556.tif 000010
【請求項９】
酸化体誘起毒性から細胞を保護する方法であって、請求項１または２に記載の化合物を保護量において前記細胞に接触させ、その結果前記保護が有効に作用することを含む方法。
【請求項１０】
前記化合物が、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、又は亜鉛からなる群から選択される金属と錯体を形成している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記金属がマンガンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が哺乳類の細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が孤立器官の細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が移植器官の細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酸化体誘起毒性に起因する、または酸化体誘起毒性により悪化する病状を患う患者の治療方法であって、請求項１またま２に記載の化合物を前記患者に有効量投与し、その結果前記治療に効果が及ぼされることを含む方法。
【請求項１６】
前記化合物がマンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケルまたは亜鉛からなる群から選択される金属と錯体を形成している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がマンガンと錯体を形成している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＮＯまたはその生物学的活性体の生産物または分解生産物の蓄積に起因する患者の病状を病理学的に治療する方法であって、請求項１または２に記載の化合物を有効量において前記患者に投与し、その結果前記治療に効果が及ぼされることを含む方法。
【請求項１９】
前記化合物が、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケルまたは亜鉛からなる群から選択される金属と錯体を形成している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物がマンガンと錯体を形成している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性の病状を有する患者を治療する治療する方法であって、請求項１または２に記載の化合物を有効量において前記患者に投与し、その結果前記治療に効果が及ぼされることを含む方法。
【請求項２２】
前記化合物が、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケルまたは亜鉛からなる群から選択される金属と錯体を形成している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がマンガンと錯体を形成している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
虚血性再灌流障害を有する患者を治療する方法であって、請求項１または２に記載の化合物を有効量において前記患者に投与し、その結果前記治療に効果が及ぼされることを含む方法。
【請求項２５】
前記化合物が、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケルまたは亜鉛からなる群から選択される金属と錯体を形成している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物がマンガンと錯体を形成している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記虚血性再灌流障害が発作に起因する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、参照により全内容を取り入れる出願番号６０／２１１，８７５に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、通常、生理的および病理学的なプロセスを調節する方法と、特に、細胞レベルの酸化体とそれによってこのような酸化体が参加するプロセスを調節する方法に関する。本発明は、また、このような方法で使用するための化合物と組成物にも関する。
【０００３】
【従来の技術】
酸化体はすべての細胞の正常な新陳代謝の一部として生成されるのみならず、多数の疾患プロセスの病因の重要な成分でもある。反応性酸素種は、例えば、肺、心臓血管系、胃腸系、中枢神経系、免疫系および骨格筋肉の疾患の病因の決定的な要素である。酸素フリーラジカルは、また、一酸化窒素（ＮＯ）の影響を調節する役割も果たす。この文脈において、これらは血管障害、炎症性疾患、自己免疫、がんおよび老化プロセスの病因となる。
【０００４】
正常な細胞および器官機能を維持するためには、酸化体に対する防御的な酵素の臨界的なバランスが必要とされる。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）はＯ２−のＨ２Ｏ２＋Ｏ２への細胞内および細胞外変換を触媒し、スーパーオキシドラジカルの有害な影響に対する第１線の防御を提示する金属酵素のファミリーである。哺乳動物は３つの明確に異なるＳＯＤを生産する。一つはすべての細胞の細胞基質に見出される二量体型の銅および亜鉛含有の酵素（ＣｕＺｎ　ＳＯＤ）であり、第２はミトコンドリアのマトリックス空間で見出される四量体型のマンガン含有のＳＯＤ（ＭｎＳＯＤ）であり、そして第３は細胞外液中に見出され、細胞外マトリックスに結合した四量体型のグリコシル化された、銅および亜鉛含有の酵素（ＥＣ−ＳＯＤ）である。カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼを含んで、いくつかの他の重要な抗酸化酵素が細胞内に存在することが知られている。細胞外液と細胞外のマトリックスはこれらの酵素を少量しか含有しないが、アスコルビン酸と尿酸などのラジカル捕捉剤と脂質過酸化の阻害剤を含んで、他の細胞外抗酸化体も存在することが知られている（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８０：１（１９９０））。
【０００５】
本発明は、通常、細胞内および細胞外のプロセスであって、部分還元された酸素種、例えば、スーパーオキシドラジカル、または過酸化水素、ペルオキシニトリルまたは脂質過酸化物などの他の酸化体が参加するプロセスを調節するのに使用するのに好適な低分子量テトラピロールに関する。本発明の化合物と方法は酸化ストレスが役割を演じる種々の生理学的および病理学的プロセスで応用を見出す。
【０００６】
【発明の実施の形態】
（発明の要約）
本発明はスーパーオキシドラジカル、ペルオキシニトリル、ヒドロキシルラジカルおよびチイルラジカルなどの細胞内および細胞外レベルの酸化体を調節する方法に関する。特に、本発明は低分子量抗酸化剤を用いるスーパーオキシドラジカル、一酸化窒素またはペルオキシニトリルが関与する正常な、あるいは病理学的なプロセスを調節する方法とこのような方法で使用するのに好適な置換テトラピロールに関する。
【０００７】
本発明の目的と利点は次の説明から明白になるであろう。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は酸化体、特に、スーパーオキシドラジカル、およびペルオキシニトリルの有害な影響に対して防御する方法と酸化ストレスが関与するか、あるいは酸化ストレスの結果起こる疾患と障害を予防し、治療する方法とに関する。本発明は、また、スーパーオキシドラジカル、一酸化窒素およびペルオキシニトリルを含む酸化体が関与する生物学的なプロセスを調節する方法にも関する。本発明は、更に、このような方法で使用するのに好適な低分子量抗酸化剤（例えば、ＳＯＤとカタラーゼの模擬製剤を含む反応性酸素種の捕捉剤の模擬製剤）とこれらの配合物を含む化合物と組成物に関する。
【０００９】
本発明の方法で使用するのに適切な反応性酸素種の捕捉剤の模擬製剤は置換テトラピロール、またはこれらの医薬として許容し得る塩を含む。本発明は金属を含まないテトラピロールと金属と結合したテトラピロールの両方、好ましくは金属イオンによって二量体型の環状構造の形成が可能となるテトラピロールを含む。マンガン誘導体が好ましいが、マンガン以外の金属、例えば鉄を使用することができる。ＮＯとＨ２Ｏ２並びに他の配位子結合が制約されるので、二量体型の環境におけるこのマンガンの５配位はこの金属部位のＯ２−に対する特異性を増大させる。同一の理由で、鉄金属中心のそうでなければ容易な軸方向ライゲーションは避けられる。結果として、アミノ酸残基との相互作用によるこの鉄化合物の毒性は低減される。また、Ｃｏ（ＩＩＩ／ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（Ｉ／ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）もテトラピロール錯体中の金属中心として使用することができる。
【００１０】
本発明の模擬製剤を図１に示すが、これはこれらの医薬として許容し得る塩とこれらの二量体型の形を含む（例えば、図２Ｃを参照）。本発明の模擬製剤は、ケト形のビリベルジンの誘導体を表す式１とするか、あるいはホルミルビリベルジンの誘導体を表す式ＩＩとすることができる（Ｆｕｈｒｈｏｐら、Ｌｉｅｂｉｇｓ、Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１４５０〜１４６６（１９７４））。ビリベルジンは一つのα−炭素結合の酸化的除去によりプロトポルフィリン−ＩＸから形式的に誘導される（図１を参照）。それゆえ、すべての天然起源の胆汁色素はこのβ置換基の配置がビリベルジン中の配置に対応する点でＩＸαであると想定される（Ｏ’Ｃａｒｒａら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．５０：４５８〜４６８（１９７０）、Ｇｒａｙら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３０８５〜３０９９（１９５８））。本発明は、メソポルフィリンＩＸ（ビニル基がエチルに還元されている）、ヘマトポルフィリン１Ｘ（ビニル基がα−ヒドロキシエチルにより置換されている）、重水素ポルフィリンＩＸ（２および４ベータ位に置換基がない）、オクタエチルビリベルジン（すべてのベータ置換基がエチル基である）、エチオポルフィリン（各ピロール単位上に一つのエチルと一つのメチル基）を含む、一つあるいはそれ以上のビリベルジン基が置換されたすべての関連化合物を含む。（図１の表１を参照）。本発明は、また、式ＩおよびＩＩの化合物の還元形であるビリルビンの誘導体も含む。このような化合物はメチン橋、式ＩおよびＩＩのβ、γおよびδにおいて還元される。本発明は、出願番号第０８／６６３，０２８号、出願番号第０９／２９６，６１５号および出願番号第０９／１８４，９８２号で開示されている模擬製剤の誘導体であって、アスコルビン酸／Ｏ２系による酸化開裂、その後のＫＯＨおよびＢＦ３／ＭｅＯＨ処理を行なうことができるものを更に更に含む（Ｂｏｎｎｅｔら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７〜２３８（１９７０））（メソ置換基が存在しない場合には）。メソ位にフェニル、または置換フェニル、またはピリジル、または置換ピリジル、または他の置換基がある場合には、このポルフィリンをタリウム（ＩＶ）およびセリウム（ＩＶ）塩により処理するにより、開裂を行なうことができる（Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ．Ｔｒａｎｓ．７６８〜７７３（１９７８））。
【００１１】
図１の式ＩおよびＩＩを参照すると：
Ｒ１からＲ８は、独立して、−Ｈ、アルキル、２−ヒドロキシアルキル、メトキシアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、トリアルキルアンモニウム、ホルミル、カルボン酸のアミド、カルボン酸のアルキルエステル、カルボン酸、グルクロニルまたはカルボン酸のグリセリルエステル、１，２−ジヒドロキシアルキル、アセチル、ビニル、グリコシルまたはタウレートであり、そして
β、γおよびδは、独立して、−Ｈ、アセチル、グリシル、ベンゾエート、フェニルスルホネート、２−、あるいは３−、あるいは４−Ｎ−アルキル−ピリジル、ニトロフェニル、ハロフェニル、メトキシアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、トリアルキルアンモニウム、ホルミル、カルボン酸のアミドである。
【００１２】
好ましくは、Ｒ１からＲ８は、独立して、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ５アルキル、２−ヒドロキシＣ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５カルボン酸のＣ１−Ｃ５アルキルエステル、Ｃ１−Ｃ５カルボン酸、グルクロニルまたはＣ１−Ｃ５カルボン酸のグリセリルエステル、１，２−ジヒドロキシＣ１−Ｃ５アルキル、アセチル、ビニル、グリコシル、タウレート、クロロ、フルオロ、ブロモ、ニトロ、シアノ、トリメチルアンモニウム、またはホルミルであり、そして
β、γおよびδは、独立して、−Ｈ、アセチル、グリシル、ベンゾアト、フェニルスホナト、２−、３−あるいは４−Ｎ−Ｃ１−Ｃ５アルキル−ピリジル、ニトロフェニル、ブロモ−、クロロ−またはフルオロフェニルまたは２−、３−あるいは４−Ｎ−Ｃ１−Ｃ５アルキルスホナトピリジルである。
【００１３】
化合物Ｉ’の文脈での表１と図２に示す式ＩおよびＩＩとＲ１−Ｒ８およびβ、γおよびδとを参照して、本発明の模擬製剤の具体的な例を図１に示す。図２Ｃの化合物は特に好ましい化合物である。図２Ｃにより示される二量体型の構造は、有利な金属中心のレドックス電位を生み出すのに、かくしてｋｃａｔ＝５．５×１０７Ｍ−１Ｓ−１の強力なＳＯＤ模擬製剤活性を生み出すのに重要である。図２Ｃの化合物はこの酵素それ自身の活性の約３倍高い１０，７００単位／ｍｇの比活性を有する。この特別な二量体型構造の特定な性状はこれによって、この＋４の金属酸化状態の安定化が行なわれるということである。これは他方のサブ単位のエノール酸素への一つのビリベルジンサブ単位の各マンガンの第５の配位により行なわれる。このように、この化合物の独自な特徴の結果として、水中でＥ１／２＝＋０．４５ＶｖｓＮＨＥであるＭｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＶ）レドックス対によりＯ２の不均化が触媒される。Ｍｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＩ）対はＥ１／２＝−０．２３ＶｖｓＮＨＥにある。後者の電位はあまり負であって、Ｏ２−の不均化を起こすことができない。これは、これまでに報告されたすべてのマンガンベースのＳＯＤ模擬製剤のようにＭｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（Ｉ１）対でなく、Ｏ２−不均化に対して金属（ＩＩＩ）／（ＩＶ）対を使用すると報告された第１の化合物である。更には、この二量体型の環境は、ＮＯとＨ２Ｏ２に対するこの化合物の反応性を制約し、そのＳＯＤ様の特異性を増進する。従って、この化合物のＨ２Ｏ２で誘導された分解は、ｋ＝６．４×１０−４Ｍ−１ｓ−１のマンガン（ＩＩＩ）テトラキス（Ｎ−メチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリンに対するよりも４桁遅く起こる。ＮＯに対する反応性は検出されなかった。２０μＭでは、この化合物は９００倍過剰のＥＤＴＡの存在下ｐＨ７．８で安定であり、このように生物学的キレート形成体に抵抗する。この化合物は好気性条件の下で増殖する場合、ＳＯＤ欠乏大腸菌の著しい防御を示した。このバクテリアモデルは、疾患のげつ歯類モデルにおけるこの化合物の効力を予測することが以前に証明された。
【００１４】
このマンガンビリベルジンジメチルエステルはＦｕｈｒｈｏｐにより以前に報告された（Ｌｉｅｂｉｇｓ．Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１１３１（１９７５））。しかしながら、エノール形プロトンがケト酸素に水素結合されているモノマー形のフロリンタイプ（ポルフィリンタイプ）の構造が示唆された。この構造によって、Ｍｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＩ）レドックスの存在のみが可能になるが、このビリベルジンのピロール基上の電子供与基により電位があまりに負であって、いかなる著しいＳＯＤ様の活性も許容されない。更には、このＭｎ＋２酸化状態が休止状態として示唆されたが、実際の原子価はＭｎ＋３である。
【００１５】
式ＩおよびＩＩの化合物の異性体（およびこれらの二量体型の形）が可能である場合には、この明細書で記述される模擬製剤のすべてのこのような異性体は本発明の範囲内にある。
【００１６】
ＳＯＤあるいはカタラーゼ活性に対して検定することにより、本発明の方法で使用するのに好ましい模擬製剤を選択することができる。また、模擬製剤をＯＮＯＯ−を捕捉する能力についてスクリーニングすることもできる（Ｓｚａｂｏらの、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．３８１：８２（１９９６））の方法により求められるように）。
【００１７】
ＭｃＣｏｒｄとＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：６０４９（１９６９）を用いて、ＥＤＴＡの存在および不在下でＳＯＤ活性をモニターすることができる。また、親株に対するＳＯＤゼロの大腸菌株の好気性成長に及ぼす模擬製剤の効果を測定することにより、模擬製剤の効能を求めることもできる。具体的には、親の大腸菌（ＡＢ１１５７）とＳＯＤゼロの大腸菌（ＪＩ１３２）を０．２％カザミノ酸と０．２％のグルコースを含有するＭ９媒体中ｐＨ７．０および３７℃で増殖させることができ、７００ｎｍで追跡される濁度の形で増殖をモニターすることができる。分岐鎖の、芳香族およびいおう含有アミノ酸をこの媒体（５つの必須アミノ酸に加えてグルコース最少の媒体（Ｍ９））から除外することにより、この検定をＳＯＤ模擬製剤に対して更に選択的なものとすることができる。
【００１８】
また、メチルビオロゲン（パラクアット）で誘導された毒性に対して哺乳動物の細胞を防御する能力を求めることにより、活性な模擬製剤の効能を評価することもできる。具体的には、下記に述べるように増殖させ、２４穴の皿の中に撒種したラットＬ２細胞を種々の濃度のＳＯＤ模擬製剤と共に予備インキュベーションし、次に、前に示したある濃度のメチルビオロゲンと共にインキュベーションして、コントロールＬ２細胞中でＬＣ７５を生産させることができる。この模擬製剤の効能をメチルビオロゲン誘導されたＬＤＨ放出の減少と相関付けすることができる（Ｓｔ．Ｃｌａｉｒら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２９３：１９９（１９９１）。
【００１９】
エアロゾル投与と非経口注射の両方を用いて、ＳＯＤ模擬製剤の効能をマウスおよび／またはラットモデルについてインビボで試験することができる。例えば、オスのＢａｌｂ／ｃマウスを各々８匹のマウスの４つの群にランダム化して、標準の２Ｘ２分割統計モデルを形成することができる。動物をパラクアット（４０ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ）または塩水のいずれかにより治療し、そして、ＳＯＤ模擬製剤またはビヒクルコントロールにより治療することができる。パラクアット治療の４８時間後に前述（Ｈａｍｐｓｏｎら、Ｔｏｘ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍ．９８：２０６（１９８９）；Ｄａｙら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４：１（１９９０）のように気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）損傷パラメーター（ＬＤＨ、蛋白および％ＰＭＮ）の分析により肺傷害を評価することができる。各群の２匹の肺を４％パラホルムアルデヒドにより滴注固定し、光学顕微鏡レベルでの組織病理学用に処理することができる。
【００２０】
過酸化水素の存在下で２４０ｎｍの吸光度を測定（ＢｅｅｒｓおよびＳｉｚｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５：１３３（１９５２）を参照）することにより、あるいは、クラーク酸素電極により酸素発生を測定（Ｄｅｌ　Ｒｉｏら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８０：４０９（１９７７））することにより、カタラーゼ活性をモニターすることができる。
【００２１】
Ｄａｙら、Ｆｒｅｅ　Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２６：７３０（１９９０）により記述されているように模擬製剤の脂質過酸化を阻害する能力を評価することができる。鉄とアスコルビン酸塩を使用して、組織ホモジネート中の脂質過酸化と測定されるチオバルビツール酸の反応性種（Ｔ　ＢＡＲＳ）の生成を開始させることができる。
【００２２】
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を測定することにより、活性模擬製剤を哺乳動物の細胞培養での毒性について試験することができる。具体的には、ラットＬ２細胞（肺タイプＩＩ様細胞（ＫａｉｇｈｎおよびＤｏｕｇｌａｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．５９：１６０ａ（１９７３））を１０％のウシ胎児血清サプリメント入りのハムのＦ−１２媒体中ｐＨ７．４および３７℃で増殖させることができ、細胞を２４穴の培養皿中に等密度で播種し、ほぼ９０％の集密まで増殖させることができ、ＳＯＤ模擬製剤を広範囲の濃度（例えば、最少必須媒体（ＭＥＭ）中のマイクロモルの投与）にわたってこの細胞に添加し、２４時間インキュベーションすることができる。形態により、そしてＤａｙら（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７５：１２２７（１９９５）；ＮＡＤＨの酸化は３４０ｎｍで測定）により記述されているように細胞基質性損傷マーカー、ＬＤＨ（例えば、熱力学的プレート読み取り器上で）の放出を測定することにより、毒性を評価することができる。
【００２３】
本発明の模擬製剤は多様な方法での使用に好適である。式ＩおよびＩＩの化合物、特にこれらの二量体型の金属結合形（有利には、マンガン結合形）は脂質過酸化を阻害する能力により特徴付けられる。従って、これらの化合物は脂質過酸化のレベルの上昇に関連する疾患または障害の治療での使用に好ましい。この化合物は酸化ストレスにより仲介される疾患または障害の治療での使用に更に好ましい。ぜん息、炎症性腸疾患、糖尿病、関節炎および脈管炎を含む炎症性疾患が例である。
【００２４】
また、戦略的な位置に対して上述のポルフィノイドを標的とすることにより、本発明の化合物（有利には、これらの二量体型の金属結合形）をＮＯレベルの調整に設計された方法で使用することもできる。ＮＯは細胞間の信号であり、従って、ＮＯは細胞外マトリックスを横断して、その効果を及ぼさなければならない。しかしながら、ＮＯは、細胞外空間に存在するＯ２−により仲介される不活性化に対して極めて敏感である。本発明の置換テトラピロールは、Ｏ２−による分解を防御することによってＮＯの生体利用度を増大することができる。
【００２５】
また、本発明の模擬製剤（特に、これらの二量体型の金属結合形）を反応性酸素種の触媒捕捉剤として使用して、心筋梗塞、心臓バイパス手術、発作、急性頭部外傷、移植の後の器官再灌流、腸虚血、出血ショック、肺梗塞、血流の手術による閉塞、および軟部組織傷害に関連する虚血再灌流障害に対する防御を行なうこともできる。模擬製剤（特に、二量体型金属結合形）を更に使用して、骨格筋肉の再灌流傷害に対する防御を行なうことができる。また、模擬製剤（特に、二量体型金属結合形）を使用して、日光による目（また、皮膚）への損傷並びに緑内障、白内障および目の黄斑変性に対して防御することもできる。また、模擬製剤（特に、二量体型金属結合形）を使用して、火傷と皮膚炎、乾癬および他の炎症性皮膚疾患などの皮膚疾患を治療することもできる。骨疾患もこの模擬製剤により治療できる。更には、コラーゲン合成における欠陥または分解に関連する連結組織障害は、老化の一般化された欠損のように本発明の模擬製剤（特に、二量体型の金属結合形）による治療に鋭敏であると期待され得る。肝硬変と腎臓疾患（糸球体腎炎、急性管状壊死、腎沈着および透析誘導された合併症を含む）もまた本発明の模擬製剤（特に、二量体型の金属結合形）により治療できる。
【００２６】
また、本発明の模擬製剤（特に、二量体型金属結合形）を反応性酸素種の触媒捕捉剤として使用して、移植された心臓、肝臓、肺、腎臓、皮膚および他の器官と組織の極めて制限された貯蔵生存性を増大させることもできる。本発明は、また、食品、医薬品、貯蔵血液などを含むＯ２−を生成する物質の自動酸化による損傷を阻害する方法も提供する。この目的を達成するために、本発明の模擬製剤は、酸化損傷を阻害あるいは防御し、それによって自動酸化反応の関連する分解を阻害あるいは防御するのに充分な量で食品、医薬品、貯蔵血液などに添加される。（本発明の模擬製剤の他の使用については、米国特許第５，２２７，４０５号を参照されたい）。特別な治療で使用され、あるいは特別な物質に関連する模擬製剤の量は当業者により決めることができる。
【００２７】
負に帯電したペルオキシニトリルアニオンは、また、このマンガンの５番目の配位部位に対して負に帯電したエノラートと競合することができるので、本発明の模擬製剤（特に、二量体型の金属結合形）を使用して、ペルオキシニトリルを捕捉することもできる。
【００２８】
本発明の模擬製剤、有利なものとして、二量体型の金属結合形を用いる治療に適切な具体的な疾患／障害の更なる例は、心臓血管系疾患（心筋症、虚血およびアテローム硬化型冠状動脈血管疾患を含む）、中枢神経系疾患（ＡＩＤＳ痴呆、発作、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病およびハンチントン病を含む）および筋系疾患（横隔膜疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患における呼吸の疲労、うっ血性心不全の心臓疲労、筋障害に関連する筋肉脱力症候群、ＡＬＳおよび多発性硬化症を含む）を含む。多数の神経性障害（てんかん、発作、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＬＳ、アルツハイマーおよびＡＩＤＳ痴呆を含む）は、グルタメート受容体の主要なサブタイプ、ＮＭＤＡ（またはＮ−メチルＤ−アスパルテート）サブタイプの過剰刺激と関連する。このＮＭＤＡ受容体を刺激した場合、過剰のニューロンのカルシウム濃度は、酸素フリーラジカルと一酸化窒素（ＮＯ）を生成させる一連の膜および細胞質のイベントに寄与する。酸素フリーラジカルとＮＯの間の相互作用はニューロン細胞の死に寄与することが示された。ＮＭＤＡ毒性の充分に確立したニューロンの皮質の培養モデルが開発され、薬物開発の基礎として使用されている。これらの同一の系においては、本発明の模擬製剤はＮＭＤＡ誘導の傷害を阻害する。Ｏ２−ラジカルの生成は皮質ニューロンの興奮毒性死において頂点に達する細胞内イベントにおける必須の段階であり、そして本発明の模擬製剤を使用して、Ｏ２−ラジカルを捕捉し、それにより興奮毒性傷害に抗する防御物質として機能することができることを更に示す。
【００２９】
本発明は、また、ＡＩＤＳを治療する方法にも関する。ＮｆカッパＢプロモータはＨＩＶウイルスにより複製に使用される。このプロモータはレドックス敏感性であり、それゆえ、酸化体はこのプロセスを調節することができる。このことは本発明の金属ポルフィリンと明確に異なる２つの金属ポルフィリンに対して以前に示されている（Ｓｏｎｇら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．８：８５（１９９７））。本発明は、また、全身的な高血圧症、アテローム性動脈硬化症、水腫、敗血症ショック、原発性肺高血圧症を含む肺高血圧症、インポテンス、不妊症、子宮内膜症、早期子宮収縮、微生物感染、痛風、がんの治療、またＩ型あるいはＩＩ型糖尿病の治療方法にも関する。本発明の模擬製剤（特に、二量体型の金属結合形）を使用して、膵島細胞への傷害を防御し、それゆえ、糖尿病の徴候の発症を防御あるいは遅延させることができる。類似の方法で、本発明の模擬製剤を使用して、膵臓に対する炎症性あるいは酸化性傷害を改善し、膵炎の防御と治療をすることができる。本発明の模擬製剤（特に、二量体型の金属結合形）を使用して、例えば、血管緊張を保存し、多器官系損傷を防御することにより、エンドトキシンと関連する毒性の影響を改善できる。
【００３０】
上記に示したように、炎症、特に肺の炎症は本発明の模擬製剤（特に、二量体型の金属結合形）を用いて治療できる（特に、肺気腫、ぜん息、酸素毒性を含むＡＲＤＳ、肺炎（特に、ＡＩＤＳ関連の肺炎）、嚢泡性線維症、慢性副鼻腔炎、関節炎および自己免疫性疾患（狼瘡またはリウマチ性関節炎などの）の炎症性ベースの障害）。肺線維症と筋肉、腱および靭帯の炎症性反応は本発明の模擬製剤（特に、これらの二量体型の金属結合形）を用いて治療することができる。ＥＣ−ＳＯＤは気道を取り囲む格子間空間と脈管構造の平滑筋細胞中に局在化される。ＥＣ−ＳＯＤとＯ２−は肺胞隔膜中の抗炎症性−炎症誘発性のバランスをとる。肺胞隔膜細胞により放出されるＮＯはＯ２−と反応して、ＯＮＯＯ−を生成することがなければ、炎症を抑制するように作用する。Ｏ２−を捕捉することにより、ＥＣ−ＳＯＤは肺胞隔膜中のバランスを傾け、炎症に抵抗する。ＥＣ−ＳＯＤが不足であるか、あるいはＯ２−放出が大きく増加する時にのみ著しい量のＯＮＯＯ−が生成する。この明細書で述べられた模擬製剤を使用して、過酸素症により引き起こされる破壊に対する防御を行なうことができる。
【００３１】
本発明は、更に、記憶障害を治療する方法に関する。一酸化窒素は長期記憶増強に関与する神経伝達物質であると考えられる。ＥＣ−ＳＯＤノックアウトマウスモデルを使用して（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６２６４（１９９５））、学習障害は脳の細胞外空間でのスーパーオキシド捕捉の低下と相関することが示された。捕捉の低下の結果、高い細胞外Ｏ２−レベルが生じる。Ｏ２−は一酸化窒素と反応し、それによって一酸化窒素仲介された神経伝達とそのための長期の記憶増強を妨害あるいは阻害すると考えられる。本発明の模擬製剤、特に、二量体型の金属結合形を使用して、痴呆および記憶／学習障害を治療することができる。
【００３２】
また、本発明の模擬製剤の入手し易さによって、Ｏ２−、一酸化窒素およびペルオキシニトリルにより仲介されるプロセスの研究も可能になる。
【００３３】
上述の模擬製剤は金属を結合している形、または金属を含まない形であれ、本発明の方法での使用に好適な医薬組成物に配合することができる。このような組成物は、医薬として許容し得る担体、賦形剤または希釈剤および他の添加剤（可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、およびジメチルスルホキサイド）などの）と一緒に活性剤（模擬製剤）を適当なだけ含む。リポソームベースの組成物も使用することができる。この組成物は投与単位の形、例えば、錠剤、カプセルまたは座薬中に存在することができる。例えば、腸溶性の被覆錠剤およびピルを使用することができる。この組成物は、また、注射または噴霧に好適な殺菌した溶液の形とすることもできる。組成物は、また、眼での使用に好適な形とすることもできる。本発明は、また、例えば、ローション、クリーム、ゲルまたは軟膏の形をとる組成物などの局所的投与用に配合された組成物を含む。この組成物中に入れられるべき活性剤の濃度は、この薬剤の性状、投薬計画および得たい結果に基づいて選択することができる。
【００３４】
投与されるべき本発明の組成物の投与量は、活性剤（金属を結合しているか、あるいは金属を含まないかを含めて）、投与経路、患者、および得たい結果を含んで過度の実験を行なわずに決定でき、これは種々の要素に依存する。ＩＶ投与あるいは局所的に投与されるべき模擬製剤の好適な投与量は、約０．０１から５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．１から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の中にあると期待され得る。エアロゾル投与に対しては、用量は、０．００１から５．０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．０１から１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲中にあることが期待される。模擬製剤の好適な用量は例えば、模擬製剤と得たい結果と共に変わる。
【００３５】
本発明のしかるべき局面を次の非限定的な実施例で更に詳細に説明する。ビリベルジンジメチルエステルリガンドの調製に関しては、Ｃｏｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７：２９２９（１９６８）、Ｇｒａｙら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２２６４（１９６１）、Ｎｉｃｈｏｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１７７：５９９（１９６９）およびＴｉｘｉｅｒ、Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｏｃｅａｎｏｇｒ．（Ｍｏｎａｃｏ）２２：３４３（１９４５）が注目される。
【００３６】
【実施例】
実施例の詳細（試薬および方法）
一般的試薬：ビリベルジンＩＸジメチルエステル（Ｈ３ＢＶＤＭＥ）、ビリルビンＩＸ（Ｈ４ＢＲ）およびビリルビンＩＸジメチルエステル（Ｈ４ＢＲＤＭＥ）を、ポルフィリン製品（ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ユタ州）から得た。更にビリベルジンＩＸジメチルエステル（Ｈ３ＢＶＤＭＥ）をクロロホルム／石油エーテル（１５／５０ｖ／ｖ比）で再結晶させた。石油エーテル（３５−６０℃ 画分）、クロロホルム、アセトン、ジエチルエーテル（無水物）、Ｈ２Ｏ２の３０％溶液、およびメタノールはマリンクロット（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、ジクロロメタンはイー・エム・サイエンス（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）であり、すべて最高純度のものである。酢酸マンガン（ＩＩ）（四水和物）（９９．９９％）、塩化マンガン（ＩＩ）（四水和物）（９９．９９％）、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（９９＋％）、フェロセンメタノール（９７％）、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、ブロモホルム（９９％＋、更に再蒸留した）、シュウ酸（９９＋％）、およびメチル−ｄ３アルコール−ｄ（９９．８原子％Ｄ）はアルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）である。ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＫＮＯ３、ＥＤＴＡ、グルコース、リン酸塩、無機塩及びＫＯＨはマリンクロット（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、カザミノ酸はジフコ（Ｄｉｆｃｏ）である。容積標準器（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）、１．０Ｍおよび０．１０Ｍ ＮａＯＨおよび水酸化リチウム（無水物）はフィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。２−メチル−２−プロパノール（ｔ−ＢｕＯＨ、９９．５＋％）、ウシ血清アルブミン、Ｐｉｐｅｓ 二ナトリウム塩一水和物（１，４−ピペラジンビス（エタンスルホン酸）、琥珀酸およびキサンチンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）である。酸化ジューテリウムＤ２Ｏ、９９．９％はケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からである。ウマ由来のシトクロムｃ（♯３０３９６）、ビリベルジンＩＸジヒドロクロリド（Ｈ３ＢＶＤＭＥｘ２ＨＣｌ）、（〜８０％）、４，４′−ビピリジル（９９％＋）、およびＮ，Ｎ′−ビス（サリチリデン）エチレンジアミン（Ｈ２ｓａｌｅｎ）（９９＋％）はフルカ（Ｆｌｕｋａ）である。キサンチンオキシダーゼはアール・ディー・ウィリー（Ｒ．Ｄ．Ｗｉｌｅｙ）により調製され、ケイ・ヴィー・ラジャゴパラン（Ｋ．Ｖ．Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ）により供給された（Ｗａｕｄ等、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． １９：６９５ （１９７５））。カタラーゼはベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）である。シュウ酸アンモニウムはジェー・ティー・べーカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）である。超高純度アルゴンはナショナル・ウェルダーズ・サプライ社（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｅｌｄｅｒｓ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏ．）であり、硝酸はマジソン・ガス・プロダクツ（Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）である。これ（超高純度）はＩＣＮ バイオメディカルズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ，）であり、ＮＯＮＯａｔｅＮＯＣ−９はカルバイオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）であり、ホスフェートバッファー塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ−ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳバッファー）はライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。琥珀酸水素リチウムは琥珀酸の１Ｍメタノール溶液を９．５モル当量のＬｉＯＨメタノール溶液で中和することにより調製した。ビリベルジンおよびビリルビンの１ｍＭ原料水溶液（ｐＨ〜１０）は終始用いられた。元素分析はアトランティック・マイクロラボ・インク、ノルクロス、ジー・エー（Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｌａｂ， Ｉｎｃ． Ｎｏｒｃｒｏｓｓ， ＧＡ）により行った。
【００３７】
ビリベルジン ＩＸ ジメチルエステル：ビリベルジンジメチルエステル配位子のスペクトル特性、図２Ａおよび２Ｂに示された、そのプロトン化されたケトおよびエノール型（Ｇｌａｙ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２２６４ （１９６１）； Ｂｏｎｎｅｔ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３８ （１９７０）； Ｎｉｃｈｏｌ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７７：５９９ （１９６９）； Ｏ’Ｃａｒｒａ等、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ５０：４５８ （１９７０）； Ｃｈａｅ等、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９７：４１７６ （１９７５））、Ｈ３ＢＶＤＭＥは文献データ（Ｇｒａｙ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２２６４ （１９６１）； Ｂｏｎｎｅｔ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３８ （１９７０）； Ｎｉｃｈｏｌ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７７：５９９ （１９６９）； Ｏ’Ｃａｒｒａ等、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ５０：４５８ （１９７０）； Ｃｈａｅ等、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９７：４１７６ （１９７５））に一致する。メタノール中の配位子ＢＶＤＭＥ３−のｕｖ／ｖｉｓデータ：ε６６６＝１．２８ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１およびε３７５＝４．４５ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１。Ｈ３ＢＶＤＭＥの元素分析、Ｃ３５Ｈ３８Ｎ４Ｏ６：
計算値：Ｃ、６８．８３％；Ｈ、６．２７％；Ｎ，９．１７％
実測値：Ｃ、６８．７２％；Ｈ、６．２５％；Ｎ，９．１７％。
【００３８】
ｍ／ｚ＝６１１におけるエレクトロスプレー質量スペクトルの基準ピークは、充分にプロトン化されたビリベルジンジメチルエステル、Ｈ４ＢＶＤＭＥ＋に帰属される。
【００３９】
ポルフィリンマンガン（ＩＩＩ）：ミッド・センチュリー・ケミカルズ（シカゴ、ＩＬ）から得られたＭｎＩＩＩＴＰＰＣｌおよびＭｎＩＩＩＴＳＰＰＮａ３、およびアルドリッヒから得られたＭｎＩＩＩＯＥＰＣｌを使用した。ＭｎＩＩＩＴＭ（Ｅ）−２（４）−ＰｙＰＣｌ５およびＭｎＩＩＯＢＴＭ−４−ＰｙＰＣｌ４上述したように調製した（Ｂａｔｏｍｏｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３８：４０１１ （１９９９）、Ｂａｔｏｍｏｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ２４５２１ （１９９８）、Ｂａｔｏｍｏｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ａｒｃｈ． Ｂｏｐｃｊｅ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３４３：２２５−２３３ （１９９７））。
【００４０】
Ｓａｌｅｎ マンガン（ＩＩＩ）：化合物を出版された手順に従い調製した（Ｂｏｕｃｈｅｒ、Ｊ． Ｉｎｏｇ． Ｎｕｃｌ． Ｃｈｅｍ． ３６：５３１ （１９７４）。水中のｕｖ／ｖｉｓ：ε２３５＝３．７０ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１、ε２７９＝１．７０ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１、ε３９７＝４．６０ｘ１０３ｃｍ−１Ｍ−１。ＭｎＩＩＩｓａｌｅｎＣｌの元素分析、Ｃ１６Ｈ１４Ｎ２Ｏ２ＭｎＣｌ：
計算値：Ｃ、５３．８８％；Ｈ、３．９６％；Ｎ，７．８５％
実測値：５４．０２％；Ｈ、４．０６％；Ｎ，７．８５％。
【００４１】
Ｍｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＩ）カップルの金属センターレドックスポテンシャル（サイクリックボルタメトリー（Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３８：４０１１ （１９９９））により前述したように決定される）は、メタノール中、Ｅ２／１＝−０．２３Ｖ 対Ａｇ／ＡｇＣｌと実測された。ＭｎＩＩＩＴＭ−２−ＰｙＰ５＋、フェロセンメタノール、および水及びメタノール中のＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６のＥ２／１に基づき、水中のＭｎＩＩＩｓａｌｅｎ＋のレドックスポテンシャルが、Ｅ２／１＝−０．１３Ｖ 対ＮＨＥ、と計算された。
【００４２】
マンガン（ＩＩＩ）ビリベルジンＩＸジメチルエステル、｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２：錯体を、同様の化合物の合成に利用される文献記載の方法を改良して調製した（Ｆｕｈｒｈｏｐ等、Ｌｉｅｂｉｇｓ． Ａｎｎ． Ｃｈｅｍ． １１３１ （１９７５）、Ｂｏｎｎｅｔｔ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ、３２２ （１９８１））。結果的に、５０ｍｇの再結晶化したビリベルジンジメチルエステルを少量のクロロホルムに溶解し、１５０ｍＬのメタノールを加えた。混合物を６０℃まで加熱し、次いで１５倍超の酢酸マンガン（ＩＩ）（１０ｍＬメタノール中０．３ｇ）を添加した。直ちに錯体が形成されたことが、６６６ｎｍにおける吸収の消失と８９８ｎｍにおけるバンドの発現により証明された。その後、溶媒の殆どを室温において直ちにロータリーエバポレーターで蒸発除去し、次いで残渣に２００ｍＬのクロロホルム（可溶化のために必要に応じて少量のメタノールが用いられる）および２００ｍＬの水を加えた。
【００４３】
（注意：〜６０℃においてさらされている状態が長時間になると、化合物は破壊する。）
混合物を分液漏斗に移し、酢酸マンガン（ＩＩ）を水相に残して金属錯体をクロロホルム層に抽出した。抽出を３回繰り返した。最終的に、クロロホルム層を５ｇの乾燥ＭｇＳＯ４を用いて振とうし、次いでろ過し、溶媒を殆ど蒸発させて乾燥した。残渣を三角フラスコに移し、４ｍＬのジクロロメタンに溶解した。石油エーテル〜４０ｍＬを添加して沈殿物を得、これをファインフリットグラスディスク（ｆｉｎｅ ｆｒｉｔｔｅｄ ｇｌａｓｓ ｄｉｓｃ）に集め、石油エーテルで洗浄し、室温真空下において一晩乾燥した。収率は＞８０％であった。得られたオリーブグリーン色の化合物エタノールおよびメタノールに可溶性であったが、水に対する溶解性は極めて低かった（〜１０−８Ｍ）。マンガン（ＩＩＩ）ビリベルジンジメチルエステルのｕｖ／ｖｉｓ特性（図３）は、同様の化合物における文献記載のデータと非常によく一致している（Ｆｕｈｒｈｏｐ等、Ｌｉｅｂｉｇｓ． Ａｎｎ． Ｃｈｅｍ． １１３１ （１９７５））。ベール−ランバートの法則（Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ ｌａｗ）によると、同じ構造が、２ｘ１０−８Ｍ〜８ｘ１０−５Ｍの濃度範囲におけるメタノール、ピリジンおよびクロロホルム溶液に存在することが示される。メタノール中のマンガン当たり計算されるモル吸収率（図３）：ε８９８＝１．１３ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１、ε３９０＝３．１３ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１、およびε３６２＝３．１３ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１；
ピリジン中：ε９０８＝０．９８ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１、ε３９３＝２．８０ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１およびε３６７＝２．８０ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１；
クロロホルム中：ε８９８＝１．０７ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１、ε３９４＝２．８０ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１およびε３６７＝２．８０ｘ１０４ｃｍ−１Ｍ−１。
【００４４】
｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の元素分析、Ｍｎ２Ｃ７０Ｈ７０Ｎ８Ｏ１２：
計算値：Ｃ、６３．４４％；Ｈ、５．３３％；Ｎ，８．４６％
実測値：６２．７８％；Ｈ、５．４１％；Ｎ，８．４０％。
【００４５】
Ｃ／Ｎ比：計算値：８．７４；実測値：８．７２。
【００４６】
ｕｖ／ｖｉｓ分光学：｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の形成および分離、並びに配位子のｐＨ＊（ｐＨ＊−ｐＨは、水中で無限に希釈されたというよりは、９０／１０メタノール／水性溶媒系において無限に希釈された溶液をいう。）滴定は、すべてメタノール／水性（９０／１０，ｖ／ｖ）溶液において、ＵＶ−２５０ＩＰＣ Ｓｈｉｍａｄｚｕ分光光度計を用い２５℃において研究された。また、ＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏ２、およびマンガン（ＩＩＩ）錯体の安定性に関するメタノール／水比についても試験が行われた。硝酸に対する｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の反応性は、上述したように、ガス状ＮＯとの反応およびメタノール／ＰＢＳ（５０／５０、ｖ／ｖ）溶液中におけるＮＯＮＯａｔｅＮＯＣ−９との反応に関して決定した（Ｓｐａｓｏｊｅｖｉｃ等、Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ： Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２０００））。ＨＣｌの１．０Ｍメタノール／水性（９０／１０）溶液といっしょにＴｒｉｓおよびＰｉｐｅｓバッファーを、メタノール／水溶液中でのｐＨ＊調整に用いた。ｐＨ＊示度は、メタノール／水（９０／１０、ｖ／ｖ）バッファー溶液中で目盛りを定められたデンバーインスツルメンツ（Ｄｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）コンビネーションガラス電極をそなえたＯａｋｔｏｎ ｐＨメーターで測定された：１０ｍＭシュウ酸／１０ｍＭシュウ酸アンモニウム（ｐＨ＊＝３．５９）および１０ｍＭ琥珀酸／琥珀酸水素リチウム（ｐＨ＊＝６．５５）（Ｄｅ Ｌｉｇｎｙ等、Ａ． Ｒｅｃ． Ｒｅｃ． Ｔｒａｖ． Ｃｈｉｍ． Ｐａｙｓ−Ｂａｓ ７９：６９９ （１９６０））。ビリベルジンおよびビリベルジンジメチルエステル、ならびにその還元形態ビリルビンおよびビリルビンジメチルエステルも研究された。
【００４７】
エレクトロスプレー質量分析：空気作用によりアシストされた、大気圧を操作する静電イオン源を具備するＭｉｃｒｏｍａｓｓ−Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ 質量スペクトロメーターで、ＥＳＭＳ測定を行った。ＢＶＤＭＥ３−および１／２｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２溶液の６００μＭ、６０μＭおよび６μＭメタノール溶液をメタノール流にループ（ｌｏｏｐ）注入により導入した。質量スペクトルは連続モードにおいて獲得され、３０Ｖ−１８０Ｖの範囲における異なるコーン電圧においてｍ／ｚ６００〜３０００からスキャンした。
【００４８】
凝固点降下：測定は、徐々に冷却された、ゴム形態の絶縁試験チューブ中において行われ、Ｎｏｒｍａｌｇｌａｓ精度のサーモメータ（１／１００℃）のバルブが６ｍＬの測定溶液に完全に挿入された。可変式スピードモータにフレキシブルに接続されたサーモメータのゆっくりした扁心的な動きで溶液を撹拌した。
【００４９】
溶液中の磁化率：磁化率は、エバンス法（Ｅｖａｎｓ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００３ （１９５９））により、４００ＭＨｚのＶａｒｉａｎ ＮＭＲスペクトロメータを用いて決定された。典型的に、０．０１Ｍｔ−ＢｕＯＨを含有する０．４ｍＬＤ２Ｏ又はＣＤ３ＯＤに溶解された〜２ｍｇの化合物を、同じ溶媒混合物を含有する毛管に加えてＮＭＲチューブ中に置いた。
【００５０】
固体状の磁化率：固体｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の磁化率を、プログラム化された温度および磁場インターバルにおいて明白な質量変化を記録するためにオートメーション化されたファラデーバランス（Ｆａｒａｄａｙ ｂａｌａｎｃｅ）（Ｓｅｎｆｔｌｅ等、Ｒｅｖ． Ｓｃｉ． Ｉｎｓｔｒｕｍ． ２９：４３９ （１９５８）、Ｔｈｏｒｐｅ等、Ｒｅｖ． Ｓｃｉ． Ｉｎｓｔｒｕｍ． ３０：１００６ （１９５９）、Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｅｄｕｃ． ４８：３４５ （１９７１）、Ｔｈｏｒｐｅ等、Ｃｏａｌ Ｇｅｏｌｏｇｙ ３６：２４３ （１９９８））において測定した。サンプル５ｍｇを、熱移動媒体としてＨｅガスを用い、カーン（Ｃａｈｎ）エレクトロバランスにおいて懸濁させた。
【００５１】
マンガン（ＩＩＩ）ビリベルジンジメチルエステルの電気化学：上述したようなＣＨインスツルメンツモデル６００ ボルタメトリックアナライザー（Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３８：４０１１ （１９９９））を用い測定した。小体積（０．５−３．０ｍＬ）における３電極システム、すなわち、３ｍｍ直径のガラス状ボタン機構電極（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａｇ／ＡｇＣｌリファレンス電極（３Ｍ ＮａＣｌ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および補助電極としてＰｔワイア（０．５ｍｍ）を用いた。サイクリックボルタメトリーを、検査した化合物の０．５ｍＭ（マンガン当たり）メタノール／水性（９０／１０，ｖ／ｖ）溶液において行った。イオン強度は０．１０Ｍ（ＮａＣｌ）に保ち、ｐＨ＊調整のために０．０５Ｍトリスバッファーを使用した。校正を目的として、親水性の異なる化合物、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６３＋、（Ｋｏｌｔｈｏｆ等、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ３９：９４５ （１９３５））フォロセンメタノールおよびＭｎＩＩＩＴＭ−２−ＰｙＰ５＋を、水溶液およびメタノール／水性（９０／１０、ｖ／ｖ）溶液双方について研究した（Ｉ＝０．１０Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ トリスバッファー、ｐＨ＊７．９）。すべての場合において、測定されたＥ１／２は水溶液中におけるよりもメタノール溶液における方が１７０ｍＶ超正であり、この値は、メタノール／水溶液中での測定から水溶液中でのレドックスポテンシャルを予測するために使用した。加えて、メタノール中における｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のサイクリックボルタメトリーを実行するときに、ＭｎＩＩＩＴＭ−２−ＰｙＰ５＋を内標準として添加した。
【００５２】
クロノクーロメトリー測定を、１／２｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２およびＭｎＩＩＩＴＭ−２−ＰｙＰ５＋の１ｍＭ メタノール／水性（９０／１０，ｖ／ｖ）溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ トリスバッファーｐＨ＊７．９）に浸されたガラス状炭素ボタン機構電極に印加された一定電位での電流−時間における変化を記録することにより、行った。
【００５３】
ＳＯＤ活性：Ｏ２−のディスミューテーティング（ｄｉｓｍｕｔａｔｉｎｇ）触媒が、インヴィトロにおいて、キサンチンオキシダーゼ／シトクロムｃ法により追随された（ＭｃＣｏｒｄ等、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４４：６０４９ （１９６９））。
【００５４】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける効果：Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＡＢ１１５７（ＳＯＤ活性を有する， ワイルドタイプ）およびＪＩ１３２（ＳＯＤ欠乏、ｓｏｄＡｓｏｄＢ）を、Ｊ． Ａ． Ｉｍｌａｙ（Ｉｍｌａｙ等、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：２９６７ （１９８７））から得た。これら菌株の成長におけるＢＶＤＭＥ３−および｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の効果は最小（５アミノ酸）培地において好気性で随行された（Ｆａｕｌｋｎｅｒ等、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２３４７１ （１９９４））。培養は上述したように行われた（Ｆａｕｌｋｎｅｒ等、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２３４７１ （１９９４）、Ｂｅｎｏｖ等、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ ：１０３１３ （１９９８））。化合物の水可溶性が低いため、培地中でアルブミンを用いて（１：１モル比）、化合物の溶解度を高めた。アルブミン自体は、用いられた濃度において清澄に影響を与えなかった。メタノールは、培地中に０．１５％存在するだけでもＳＯＤ欠乏の菌株に特性を有するため、化合物の貯蔵溶液はエタノール中で調製した。
【００５５】
結果
ｕｖ／ｖｉｓ分光学：ｐＨ＊７．９において、ビリベルジンジメチルエステルは充分にプロトン化された形態、ＢＶＤＭＥ３−である。ＢＶＤＭＥ３−のプロトン化が４以下のｐＨ＊領域において生じることがデータとして示され（図４に組み込まれた図面）、これはビリベルジン、Ｈ４ＢＶ＋についてｐＫａ〜３と報告されていることと一致する（Ｇｒａｙ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２２７６ （１９６１）、Ｋｕｅｎｚｌｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３０：１１４７ （１９７２）、Ｏ’Ｃａｒｒａ、Ｎａｔｕｒｅ ８９９ （１９６２））。カルボキシル基は２つのメチレン基により主発色団から分離されているため、そのイオン化は分光測光法的に検知することができない。従って、ビリベルジンおよびそのエステルのスペクトルは同じである（Ｇｒａｙ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２２７６ （１９６１）、Ｋｕｅｎｚｌｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３０：１１４７ （１９７２）、Ｏ’Ｃａｒｒａ、Ｎａｔｕｒｅ ８９９ （１９６２））。メタル対配位子比（２０μＭ）、１：１において、ｐＨ＊７．４（メタノール／水性、９０／１０、ｖ／ｖ）での錯体｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の形成は、４０分以内に完全に行われる。錯体形成中に観察される複数の等吸収点（図４）は、均衡において二つの軽い吸収種のみを示し、配位子の脱プロトン化と金属錯体の二量体であると解される。３０μＭのＢＶＤＭＥ３−と７５μＭまたは１５０μＭのＭｎＣｌ２との速混合時における動力学的軌道は、遮断のない１次方程式に適合する。これは、速度制限工程は錯体の単量体の形成であり、次いで短時間の二量体化により｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２が産出されることを示唆する。モノマー種は分光測光法的には観察することはできなかった。ｐＨ＊の減少時に、錯体の分離が生じている。６つの等吸収点が、脱プロトン化された配位子が主たる種として存在している７．９〜４．５のｐＨ＊領域においてのみ観察された。得られたスペクトルは、複合体の形成がｐＨ＊７．４において追随している図４に示されたスペクトルに似ている。
【００５６】
等吸収点は、複数の配位子プロトン化の結果として低ｐＨにおいて不明確になっている。
【００５７】
｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２と同型のマンガン（ＩＩＩ）錯体が、９０／１０メタノール／水溶液、ｐＨ＊７．９（トリスバッファー）中、および水（トリスバッファー、ｐＨ７．８）中において、塩化マンガン（ＩＩ）（またはアセテート）とビリベルジンジメチルエステルのカルボキシレート類似体、ビリベルジン（ＢＶ３−）との反応において分光測光法的に観察された。しかしながら、錯体は更なる特徴づけを可能にするほどには図意中において充分に安定ではなかった。
【００５８】
極めてゆっくりとした｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の加水分解が９０／１０メタノール／水溶液、ｐＨ＊７．９において生ずる。一週間後、２５℃、１４％の錯体のみが解離した。水含有率を４３％に上昇させたとき、半分の錯体が１週間後に解離した。９００倍超のＥＤＴＡ（０．９ｍＭ）の存在下、２５℃において２４時間、メタノール／水性（９０／１０、ｖ／ｖ）溶液中、０．０５Ｍトリス、ｐＨ＊７．９において、１μＭの｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２が安定であった。
【００５９】
μＭ濃度において、マンガン（ＩＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）ポルフィリン類はＨ２Ｏ２水溶液（ｐＨ７．８）により分解する（Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３８：４０１１ （１９９９）、Ｅｖｅｒｅｔｔ等、Ｊ． Ｔｒａｎｓ． Ｆａｒａｄａｙ Ｓｏｃ． ４９： ４１０ （１９５３））。｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２はＨ２Ｏ２に対してまだ優れた耐性を有していなかった。次いで、ｐＨ＊７．９においてメタノール／水溶液（９０／１０、ｖ／ｖ）中で反応を行った。｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２（１５μＭおよび３０μＭ）に対して過剰のＨ２Ｏ２（６ｍＭ〜１２０ｍＭ）存在下、２次速度定数ｋ＝６．４ｘ１０−４Ｍ−１ｓ−１が、観察された擬似的な１次速度定数−［Ｈ２Ｏ２］、ｋｏｂｓ＝ｋ［Ｈ２Ｏ２］のリニアプロットから決定された。Ｕｖ／ｖｉｓ分光学は、金属の損失により追随されるビリベルジンのビリルビンへの減少を介した解離を示した（Ｇｒａｙ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２２７６ （１９６１）、Ｋｕｅｎｚｌｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３０：１４７（１９７２）、Ｏ’Ｃａｒｒａ、Ｎａｔｕｒｅ ８９９ （１９６２））。ビリベルジンおよびビリルビンとＨ２Ｏ２との相互作用はまた、０．０５Ｍトリスバッファー、ｐＨ７．８中において追随された。その金属錯体が観察されたとき、ビリルビンを介したＨ２Ｏ２によるビリベルジンの解離が起こる。擬似的な１次状態下（６ｍＭ〜６０ｍＭＨ２Ｏ２、６０μＭビリベルジン）、２次速度定数はｋ＝３ｘ１０−３Ｍ−１ｓ−１であった。ビリルビンはビリベルジンまたはその金属錯体よりもＨ２Ｏ２に対する耐性が優れる。ビリルビンの消失は、４３５ｎｍにおいて追随された（Ｇｒａｙ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２２７６ （１９６１））。上記における状態および６０ｍＭＨ２Ｏ２において、約４０％のビリベルジンと約１４％の錯体が８０分以内に解離した。９０／１０メタノール／ＰＢＳ中９０倍超のＮＯの存在下、１時間後、１４μＭ｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のスペクトルに変化は観られなかった。
【００６０】
エレクトロスプレー質量分析：マンガン（ＩＩＩ）ビリベルジンジメチルエステルの二量体構造（図２）は中性であり、おそらくエノール酸素においてカチオンと会合することにより、あるいは毛管チップにおいて金属中心の電気化学的酸化により、ＥＳＭＳにおいてのみ観察され得る（Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｂｙ Ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ， Ｇ．Ｊ．ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ， Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｏｌｅ， Ｂ．Ｒ．， 出版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７， ｐｐ６５）。マンガン（ＩＩＩ）びぃべる仁ジメチルエステルは容易に利用可能なＭｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＩ）カップルを有しないが、容易に利用可能なＭｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＶ）レドックスを有する。対照的に、カチオン性のアクアマンガン（ＩＩＩ）および一水酸基鉄（ＩＩＩ） Ｎ−アルキルピリジルポルフィリンは容易にその正Ｅ１／２の結果として金属中心において還元され得る（Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３８：４０１１ （１９９９）、Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ｊ． Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４：２１７ （２０００））。結果として、その質量スペクトルはその強度が印加されたコーン電圧に起因する還元された種のピークを含む。
【００６１】
ＥＳＭＳスペクトルの例は図５Ａに示され、ピークが表２に示されている。図５Ｂにおいて、主たるイオンの強度は、コーン電圧関数として示されている。アイソトープ分布はイオン強度の計算において説明される。低コーン電圧（３０Ｖ）において、スペクトルは二つの同様な相対的強度のメジャーピークグループを示しており、一つは約ｍ／ｚ１３２５であり、他は約ｍ／ｚ６６２である。ｍ／ｚ１３２５における最も支配的なピークは、プロトン化された二量体構造｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ， ＭｎＩＩＩＨＢＶＤＭＥ＋｝に帰属され、ｍ／ｚ１３２４におけるピークは金属サイトにおいて酸化された種、｛ＭｎＩＶＢＶＤＭＥ＋， ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝に帰属される。コーン電圧が高くなるにつれ、ｍ／ｚ６６２およびｍ／ｚ６６３におけるそのイオンに関連するピークの強度は低くなる（図５Ｂ）。後者のイオンは、各々、酸化され、プロトン化された二量体の解離を引き起こす衝突の結果として観察される（表２）。コーン電圧が３０Ｖから１５０Ｖに増加するとき、プロトン、またはナトリウム又はカリウムいずれかを有するカチオン性種の相対強度は増加する。更に、コーン電圧が高くなるにつれ、プロトン化された種に対するナトリウム化された種は多くなり、カチオン性種の相対的安定性を反映している。また、カチオン性二量体に対する酸化体の比率（結果としてカチオン性モノマーに対する酸化体の比率）も増加する。二量体は１８０Ｖのコーン電圧において存続し、これはその高度な安定性を示唆し、および電子対を共有する性質を示唆する。１８０Ｖに近いコーン電圧において、ｍ／ｚ６１１においてより多くの配位子が検出されるようになる。ｍ／ｚ１９８７およびｍ／ｚ１９８８におけるピークは、各々、酸化され且つプロトン化された（モノマー＋二量体）クラスター、または酸化され且つプロトン化された三量体のいずれかに帰属され得る。｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のメタノール溶液が１０−１００倍に希釈されたとき、コーン電圧が高められたときと同様の態様において、フラグメンテーションの程度が増加した。また、希釈はプロトンに対するナトリウムおよびカリウムの比率を高め、従って、ナトリウム化、カリウム化された種の強度は増加する。１００倍希釈において、二量体種の相対強度は、いまだ高い。従って、６０Ｖのコーン電圧において、酸化されたイオンの約２０％およびナトリウム化されたイオンの約２０％が観られた。
【００６２】
コーン電圧に関する質量分析における変化に横たわるプロセスを更に理解するために、選択されたイオンが衝突細胞において断片に分解された。親イオンｍ／ｚ１３２４は、唯一の産出イオンとしてｍ／ｚ６６２を与えたのに対して、ｍ／ｚ１３２５はｍ／ｚ６６２およびｍ／ｚ６６３双方を与えた。ｍ／ｚ１３２５におけるピークはプロトン化された二量体および酸化された二量体の重同位元素（１３Ｃ）の双方に帰すべきものであるため、後者は、容易に説明される。
【００６３】
いくつかのイオンは最も低いコーン電圧（トレッシュオールド；ｔｒｅｓｈｏｌｄ）においてのみ観察された。例えば、ｍ／ｚ６７４、６９３、および１００５である。興味深いことに、これらイオンのアイソトープ分布は、二倍に充電されていることを示す０．５ｍ／ｚであった。従って、ｍ／ｚ６７４はプロトン化されたモノマーおよびナトリウム化されたモノマー、あるいは二倍に充電された二量体のいずれかである。同様に、二倍に充電されたｍ／ｚ１００５はモノマーのクラスターおよび二量体、あるいは三量体のいずれかである。このトレッシュオールドコーン電圧において観察されるイオンの殆どは、単一におよび複数回充電されたイオンに基づき説明され得る（表２）。７１７における持続性シグナルの源は知られていない。
【００６４】
最終的に、同様の親油性ポルフィリン、塩化マンガン（ＩＩＩ） オクタエチルポルフィリン、ＭｎＩＩＩＯＥＰＣｌのＥＳＭＳ挙動が比較された。基準ピークはｍ／ｚ５８７におけるＭｎＩＩＩＯＥＰ＋イオンであり、濃縮溶液（２ｍＭ）での最低コーン電圧（３０Ｖ）において二量体の２％未満が観察された。このことは、研究された全コーン電圧並びに希釈において二量体が存続した｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２との比較において驚きに値する。
【００６５】
凝固点降下：標準モノマー化合物として使用された４，４′−ビピリジルおよび｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のブロモホルムアルデヒドの１７ｍＭ溶液（マンガン当たりで計算された濃度）において測定は行われた。ブロモホルムは、１４．４℃ｍ−１の大きな凝固点降下を有するために選択され（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ およびＰｈｙｓｉｃｓ， Ｄ．Ｒ．， Ｌｉｄｅ， Ｅｄ．， ７４版．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３−１９９４； Ｌａｎｇｅ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃｏｍｐｉｌｅｄ ａｎｄ Ｅｄｉｔｅｄ， Ｌａｎｇｅ 編集、Ｎ．Ａ．， １０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９６６）、両化合物に対して優れた溶剤である。各化合物について独立して３回の測定を行った。データを図６に示す。正確に、凝固点降下を２回、等モルのマンガン（ＩＩＩ）ビリベルジンジメチルエステル（マンガン濃度あたり）よりも、その二量体の状態が明瞭である４，４−ビピリジル単量体について観察した。
【００６６】
溶液中の磁化率：１Ｈ ＮＭＲスペクトルが配位子およびそのマンガン錯体について独立に２５℃において得られ、測定された磁化率について、配位子の反磁性の寄与を校正した。グラム磁化率、化合物のＸｇを式１を用いて計算した。
【００６７】
Ｘｇ＝（３△ｖ）／（Ｑ２πｖ１ｍ）＋Ｘｏ　　　　（１）
式中、Ｑは超伝導磁石についての２であり、△ｖは挿入毛細管からシフトした共鳴とｔ−ＢｕＯＨレファレンスピーク間のＨｚにおける頻度差であり、ｖ１はＮＭＲ器により発生するラジオ波のＨｚにおける頻度であり、ｍは１ｍＬの溶媒中における化合物のグラム質量であり、Ｘｏは溶媒の質量磁化率であり、Ｄ２Ｏについて−０．７２ｘ１０−６、ＣＤ３ＯＤについて−０．６６ｘ１０−６である（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， Ｄ．Ｒ．， Ｌｉｄｅ， Ｅｄ．，第７４版、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３−１９９４、Ｌａｎｇｅ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｌａｎｇｅ編集発行、Ｎ．Ａ．， 第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９６６））。モル磁化率ＸＭは、ＸＭ＝ＸｇＭ，Ｍはモル質量である。効果的な磁性モーメントμｅｆｆが、式２から計算され、表３におけるＢＭ（ボーアマグネトロン）に与えられる。
【００６８】
μｅｆｆ＝２．８４（ＸＭＴ）１／２　　　　　（２）
｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２はメタノール可溶性であるため、その磁性モーメントがＣＤ３ＯＤ中で測定された。しかしながら、溶剤効果は用語Ｘｏ（式１）を通して説明され得るが、μｅｆｆ＝４．５７ＢＭが得られ、これはマンガンの＋３酸化状態について予想されるより低い。それゆえ、磁化率測定は、重水素が入れられた水中およびメタノール中の双方において、いくつかの公知金属酸化状態の化合物について行われたが、親水性率に対してチャージが異なる。ＭｎＩＩＩＴＭ−２−ＰｙＰ５＋およびＭｎＴＳＰＰ３−が高い正電荷および負電荷双方の調整化合物として使用された（マンガンは３価の状態として知られていた。）。一回チャージされたマンガン（ＩＩＩ）ｓａｌｅｎ（３価の状態におけるマンガンを含むものとして先に特徴づけられている）もまた調製された（Ｂｏｕｃｈｅｒ， Ｊ． Ｉｎｏｒｇ． Ｎｕｃｌ． Ｃｈｅｍ． ３６：５３１（１９７４））。最終的に、ＭｎＩＩＯＢＴＭ−４−ＰｙＰ４＋の磁化率が測定され、その金属は２価の状態である（Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３４３：２２５−２３３ （１９９７））。磁性モーメントを表３に示す。すべてのケースにおいて、化合物の合計チャージは、相互に依存することなく、μｅｆｆは水中においてよりメタノールにおける方が低い。これらの相違に基づき、水中における｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の磁性モーメントをμｅｆｆ＝５．１０ＢＭになるように仮定した。これはマンガンが＋３状態であることを示唆する。同じ酸化状態を、クロロホルム中の磁性モーメントに基づき、予め同様の化合物マンガン（ＩＩＩ）オクタエチルビリンジオンについて確率した。μｅｆｆ＝４．７ＢＭ。（Ｂａｌｃｈ等、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６：９１１４ （１９９４））
固体状の磁化率：測定された｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の磁化率（Ｘｇ）は、７７Ｋおよび２８６Ｋにおいて磁場強度３００−３０００Ｏｅで独立であり、化合物中に強磁性不純物が存在していないことを示す。６０Ｘｇ値は７７Ｋ〜２８６Ｋにおいて得られ、図７はＸｇおよび１／（Ｔ＋２７．１）間において、クーリエ−ワイス（Ｃｕｒｉｅ−Ｗｅｉｓｓ）法則（式３）に一致し直線関係を示す。
【００６９】
Ｘｇ＝Ｃ／（Ｔ＋θ）＋Ｘｄ　　　　　　　　（３）
ワイス定数θは−２７．１に等しく、クーリエ定数Ｃ＝（３．７３±０．０３）ｘ１０−３ｅｍｕ／ｇであった。反磁性グラム磁化率、切片から得られたＸｄは、（−１．１８±１．４４）１０−７ｅｍｕ／ｇであった。式４（式中、Ｎはマンガンｉｏｎｓ／ｇの数であり、βはボーア（Ｂｏｈｒ）マグネトロンユニットおよびｋはボルツマン定数である）から、μは４．４５ＢＭ（表３）と計算された。
【００７０】
Ｃ＝Ｎμ２β２／３ｋ　　　　　　　　　　　（４）
−２７．１Ｋのワイス定数は、固体マンガン中央間の反フェロ磁性相互作用を示す。４．４５ＢＭの温度非依存性モーメント、および「スピンオンリー」挙動との仮定から、ｄ４Ｍｎ（ＩＩＩ）イオンの７４％がハイスピン（Ｓ＝２）であり（Ｐｈｙｘｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ， Ｄｒａｇｏ， Ｒ．Ｓ．， 第２版、Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｆｔ． Ｗｏｒｔｈ （１９７７））、２６％がロースピン（Ｓ＝１）形態である。
【００７１】
電気化学：０．１Ｖ／ｓスキャン速度、＋０．６〜−０．４Ｖ領域において、金属フリー配位子ＢＶＤＭＥ−３との比較において｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のサイクリック・ボルタメトリーは、二つの新しい波形を示した。一つは可逆波であり、他方は非可逆波であった（図８）。可逆波はより負の電位において観られ、スキャン速度が速くなると可逆性になる（以下参照）。磁性モーメントμｅｆｆ＝５．１０ＢＭ（表３に示される）であり、溶液中｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の両中央金属の安定な酸化状体として＋３に確立される（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ， Ｄｒａｇｏ， Ｒ．Ｓ．， 第２版、Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ． Ｆｔ． Ｗｏｒｔｈ （１９７７））。＋３酸化状態はクロノクーロメトリー測定により一定電位において確認された（図９）。一つの波（＋０．４５Ｖ−Ａｇ／ＡｇＣｌ）よりも正の電位において酸化が生じ、他の波（−０．４０Ｖ−Ａｇ／ＡｇＣｌ）よりも負の電位において還元が生じているが、１００ｍＶ−Ａｇ／ＡｇＣｌにおいて、レドックス過程は検知されなかった（二つの中央金属波形の間において）。比較において、電気化学的に充分特徴づけられたマンガンポルフィリン ＭｎＩＩＩＴＭ−２−ＰｙＰ５＋が使用され、期待通り、−０．４０Ｖ−Ａｇ／ＡｇＣｌにおいて還元されたが、＋０．４０Ｖ−Ａｇ／ＡｇＣｌにおいては電気化学性は示さなかった（図９）。従って、＋０．３６Ｖ−Ａｇ／ＡｇＣｌにおけるボルタモグラムは、Ｍｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＶ）カップルに、−０．３２Ｖ−Ａｇ／ＡｇＣｌにおけるボルタモグラムは、Ｍｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＩ）カップルに帰属される。得られたボルタモグラムは、５９ｍＶ以上のｐｅａｋ−ｔｏ−ｐｅａｋ 分離を有する。これは、二量体｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２錯体において二つの中央金属におけるレドックス過程が独立に生じることを意味する。可逆性Ｍｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＶ）カップル（プロトン独立であることが見出された。図１０）は式５により表記され得る。
【００７２】
１／２｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ０｝２⇔１／２｛ＭｎＩＶＢＶＤＭＥ＋｝２＋ｅ−　（５）
準可逆性Ｍｎ（ＩＩＩ）／Ｍｎ（ＩＩ）カップルは、プロトン依存性であることが見出され（図１１）、式６により最もよく表記される。
【００７３】
１／２｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ０｝２＋Ｈ＋＋ｅ−⇔ＭｎＩＩＨＢＶＤＭＥ０　（６）
一プロトン（中央金属当たり）、一電子レドックス反応に当てはめられるネルンストの式は、ｐＨユニット当たり−５９ｍＶのレドックス電位における変化を予想させる（Ａｓｔｒｕｃ， Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｒａｄｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ−Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｐｐ１６２， ＶＣＨ 出版社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９５５））。従って、−１１５ｍＶのシフトが、ｐＨ＊が７．９から１０．０に増加したとき観察された。一度マンガンが＋２に還元されると、エノール酸素結合はもはや好ましくなく、二量体構造のエーテルが部分的に開くか、またはエノール酸素のプロトン化に伴い解離する。従って、電気化学的可逆性は図１１に示されるように高スキャン速度（３Ｖ／ｓ〜１０Ｖ／ｓ）においてのみ達成された。
【００７４】
スーパーオキシドアニオン、Ｏ２−の相互変換：０．０５Ｍ水性リン酸バッファー、ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、カタラーゼの±１５μｇ／ｍＬ、±アルブミンにおいてアッセイが行われた。Ｏ２−を用いた反応における速度定数は、化合物とシトクロムｃとの競争試験に基づいた。キサンチンとキサンチンオキシダーゼ間の相互作用も、またマンガン錯体によるシトクロムｃによる再酸化も観察されなかった。ビリベルジンにおいてもビリルビンにおいても、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ およびＦｒｉｄｏｖｉｃｈの先の研究に一致する如何なるＳＯＤ様活性も観察されなかった。アルブミンおよび化合物が１：１（アルブミン：化合物）の比において添加されたとき、アルブミンの否定的な効果は観察されなかった。化合物に対するアルブミンの比率が高い場合において、ＳＯＤ様活性が減少し、比が３のとき５０％低くなる。典型的に、｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の１μＭ貯蔵メタノール溶液が水性アッセイ溶液中でｎＭレベルに希釈された。プロット｛（Ｖｏ／ｖｉ）−１｝−１／２［｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２］（図１２）から、１０μＭシトクロムｃ（ｋｃｙｔ＝２．６ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１）（Ｂｕｔｔｌｅｒ等、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１０７４７ （１９８２））との競争試験に基づいて（Ｓａｗａｄａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ３２７：２５７（１９７３））、２５℃において、（マンガン当たり）ＩＣ５０＝４．７ｘ１０−８Ｍ、ｋｃａｔ＝５．５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１（表４）と計算された。ＳＯＤ様活性はＭｎＩＩＩＴＭ−２−ＰｙＰ５＋と等しい（Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ等、Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３８：４０１１ （１９９９）， Ｋａｃｈａｄｏｕｒｉａｎ等， Ｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３８：３９１ （１９９９））。
【００７５】
触媒、ＭｎＩＩＩｓａｌｅｎ＋のＳＯＤ様挙動もまた研究され、キレート化剤、ＥＤＴＡが存在しない場合にのみ観察された（Ｌｉｕ等、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３１５：７４ （１９９４））。キレート化剤の存在下において、中央金属の還元はマンガンの損失により行われた。
【００７６】
Ｅ ｃｏｌｉの効果：｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２が０．１〜１３μＭの濃度の最小培地に加えられるとき、ＳＯＤ欠乏のＥ ｃｏｌｉが驚異的に改善された。成長の１５時間後、ＳＯＤ活性のあるＥ ｃｏｌｉはその成長が１００％に達し、ＳＯＤ欠乏は１６％のみであるが、１３μＭの存在においては５０％であった（図１３）。配位子、ＢＶＤＭＥ３−自体は有益でも毒性を有するわけでもなく、Ｍｎ（ＩＩＩ）錯体はＳＯＤ活性のあるＥ ｃｏｌｉの成長に影響を及ぼさなかった。
【００７７】
実施例２
２つのメタロールテトラピロールについて抗酸化活性を、インヴィトロにおいて試験した。特に、キサンチンおよびキサンチンオキシダーゼを利用した非直接的方法において、スーパーオキシドフラックスの指示薬としてスーパーオキシドおよびシトクロムｃ還元を発生させるために、化合物はスーパーオキシドを相互変換する能力に関し評価分析された。両化合物は、スーパーオキシドをＭｎＢＲＤＴよりも高い薬効を有するＭｎＢＶＤＭＥと相互変換することができた（マンガン（ＩＩＩ）ビリルビンジタウレート−図１４参照）。化合物はまた、鉄またはアスコルビン酸塩によるラットの脳のホモジネートの脂質過酸化を阻止する能力について評価分析された。鉄およびアスコルビン酸塩の混合物は、生物学的脂質を酸化する反応性酸素種を発生させ、かかる酸化された脂質はビオバルビツル酸（ＴＢＡＲＳ）と反応する種として検知され得る。両化合物は、ＴＢＡＲＳの形成を抑制し得、この性能は、そのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性と相関する（表５）。
【００７８】
【表１】
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実施例３
式Ｉの化合物のＲ１およびＲ６がプロピオネートであるとき、ＭｎＩＩＩビリベルジン（ＭｎＩＩＩＢＶ）２二量体が形成される。その構造はそのジメチルエステル誘導体の構造と同様である（図２Ｃ）。同じことがそのＳＯＤ活性にもあてはまる。ＩＣ５０＝４．７ｘ１０−８Ｍ。しかしながら、この化合物は水溶液中における適切な安定性が欠落している。
【００７９】
上記において引用されたすべての文献の全内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００８０】
当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、形態や詳細における種々の変形がなされ得ることを本明細書の開示から理解することができる。
【００８１】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の式ＩおよびＩＩの化合物の構造。
【図２Ａ】「開いた」ケト形のビリベルジンジメチルエステル、Ｈ３ＢＶＭＤＥの図解的構造。
【図２Ｂ】「閉じた」エノール形のビリベルジンジメチルエステル、Ｈ３ＢＶＭＤＥの図解的構造。
【図２Ｃ】二量体型のマンガン（ＩＩＩ）錯体、｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２。
【図２Ｄ】わかりやすくするためにピロール置換基が省略されている｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のＣｈｅｍ−３Ｄ表示。
【図３】３９０ｎｍ、３６２ｎｍ、および８９８ｎｍでの吸光度がメタノール中２×１０−８Ｍから８×１０−５Ｍの範囲の｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の濃度に対してプロットされている。このデータは１ｃｍおよび１０ｃｍの分光光度計用セル中で得られているが、すべてが１０ｃｍのセル中で得られたように表示されている。
【図４】９０／１０（ｖ／ｖ）メタノール／水溶液中、リガンドに対する金属の比１：１（２０μＭのＭｎＣｌ２と２０μＭＢＶＤＭＥ３−）、ｐＨ＊７．４、０．０５Ｍのトリス緩衝液、２５℃での｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の生成。挿入図：ｐＨ＊に対する６６８．４ｎｍにおけるビリベルジンメチルエステルの吸光度、９０／１０メタノール／水溶液、０．０１ＭトリスおよびＰＩＰＥＳ緩衝液。
【図５Ａ】３０Ｖ（Ａ）、９０Ｖ（Ｂ）および１５０Ｖ（Ｃ）のコーン電圧でのメタノール中３００μＭの｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のエレクトロスプレー質量分析。
【図５Ｂ】コーン電圧の関数としての主要ピークのイオン強度：円、プロトン化されたＨ４ＢＶＤＭＥ＋；ダイアモンド、酸化された二量体｛ＭｎＩＶＢＶＤＭＥ＋，ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝；上向き三角形、カチオンの二量体｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ，ＭｎＩＩＩＸＢＶＤＭＥ＋｝、プロトン、ナトリウムおよびカリウムとしてＸを有する種を含む；四角、カチオンモノマー、ＭｎＩＩＩＨＢＶＤＭＥ＋；下向きの三角形、酸化されたモノマー、ＭｎＩＶＢＶＤＭＥ４＋。
【図６】図６Ａは純粋なブロモホルムと１６．８ｍＭのマンガン（ＩＩＩ）ビリベルジンジメチルエステルと１７．３ｍＭの４，４−ビピリジルの存在下のブロモホルムの凍結点測定したものであり、３つの独立な測定を行なった。図６Ｂは図６Ａをわかりやすくするために短時間の平均をとった。
【図７】固体の｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の磁化率測定。χｇと１／（Ｔ＋２７．１）の間の線形関係はキューリー・ワイス則、式３と一致する。
【図８】９０／１０（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液中、ｐＨ７．９（０．１ＭＮａＣｌ）、走査速度０．１Ｖ／秒での｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２とＢＶＤＭＥ３−のサイクリックボルタモグラム。
【図９】９０／１０（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中、ｐＨ＊７．９（０．１ＭＮａＣｌ）での０．５ｍＭの｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２およびＭｎＩＩＩＴＭ−２−ＰｙＰ５＋の固定電位時間電量測定。
【図１０】９０／１０ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中、ｐＨ＊５．８および７．９、走査速度２Ｖ／秒（０．１ＭＮａＣｌ）での０．５ｍＭの｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のサイクリックボルタモグラム。
【図１１】９０／１０ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中、ｐＨ＊７．９および１０．０、走査速度３Ｖ／秒（０．１ＭＮａＣｌ）での０．５ｍＭの｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２のサイクリックボルタモグラム。
【図１２】マンガン当りで表現した｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の濃度に対する｛（ｖ０／ｖｉ）−１｝のプロット。ｖｏはＯ２−による１０μＭのシトクロムｃの還元速度である。ｖｉはｐＨ７．８、０．０５Ｍトリス緩衝液中の０．１ｍＭＥＤＴＡ、４０μＭのキサンチン、〜２ｎＭのキサンチンオキシダーゼの存在下でポルフィリン触媒により２５℃で阻害されるシトクロムｃの還元速度である。このアッセイ溶液の全容積は３ｍＬである。
【図１３】（１３μＭ）の｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の存在下（ダイアモンド）および｛ＭｎＩＩＩＢＶＤＭＥ｝２の不在下（下向きの三角形）での最少の媒体（５種のアミノ酸）中、好気性条件下、ｐＨ７．８でのＳＯＤに慣れたＡＢ１１５７（円）およびＳＯＤ欠乏大腸菌ＪＩ１３２の成長曲線。化合物の２０ｍＭのエタノール／アルブミン溶液をこの媒体の中に希釈した。また、ＳＯＤ欠乏大腸菌の成長を０．１５％エタノールのみ（四角）の存在下で追跡した。
【図１４】マンガン（ＩＩＩ）ビリベルジンジタウトレートの構造。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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