(57)【要約】一過性の免疫抑制の存在下で、高度に増強された、安定で長期間の造血キメリズムを達成するために、骨髄移植の前にレシピエントを馴化する非致死性の方法が記載される。特に、非致死用量の、骨髄細胞を標的するための骨探索放射性医薬品（例えば、テトラホスホネート基に結合した放射性化合物である１５３サマリウム  レキシドロナン）の投与が本明細書中で開示される。本発明は、治療目的で骨髄を標的するために、ジホスホネート、ホスホネート、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはこれらの組み合わせのような種々の結合体および送達系と組み合わせての、放射性医薬品（サマリウムを含むが、これに限定されない）の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄移植のレシピエントにおいて免疫寛容を誘導するための造血キメリズムを達成するための放射性免疫結合体の使用であって、該使用は、該レシピエントが、ジホスホネート、ホスホネート、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群のうちの少なくともひとつのメンバーと結合体化した放射活性ランタニド化合物を含み、好ましくは、放射性サマリウム化合物を含む放射性免疫結合体に曝露されること；その後骨髄細胞がレシピエントに移植されることで特徴付けられる、
使用。
【請求項２】
請求項１に記載の、骨髄移植のレシピエントにおいて免疫寛容を誘導するための造血キメリズムを達成するための放射性免疫結合体の使用であって、該使用は、該免疫寛容が、同種抗原、自己抗原および異種抗原からなる群のうちの少なくとも１つのメンバーに対する寛容を含むことで特徴付けられる、
使用。
【請求項３】
請求項１に記載の、骨髄移植のレシピエントにおいて免疫寛容を誘導するための造血キメリズムを達成するための放射性免疫結合体の使用であって、該使用は、該放射性免疫結合体が、約６ｍＣｉ／Ｋｇ体重〜約１０ｍＣｉ／Ｋｇ体重の間の範囲である単回投与量で投与されることで特徴付けられる、
使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の、骨髄移植のレシピエントにおいて免疫寛容を誘導するための造血キメリズムを達成するための放射性免疫結合体の使用であって、該使用は、該放射性免疫結合体が、静脈内に投与されることで特徴付けられる、
使用。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の、骨髄移植のレシピエントにおいて免疫寛容を誘導するための造血キメリズムを達成するための放射性免疫結合体の使用であって、該使用は、前記放射活性サマリウム化合物が、エチレンジアミンテトラメチレンホスホネートに結合体化されていることで特徴付けられる、
使用。
【請求項６】
請求項５に記載の、骨髄移植のレシピエントにおいて免疫寛容を誘導するための造血キメリズムを達成するための放射性免疫結合体の使用であって、該使用は、前記放射活性サマリウム化合物が、１５３サマリウム  レキシドロナンであることで特徴付けられる、
使用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の、骨髄移植のレシピエントにおいて免疫寛容を誘導するための造血キメリズムを達成するための放射性免疫結合体の使用であって、該使用は、前記骨髄細胞が、細胞活性化に関与するリンパ球上で発現される抗原を認識する、少なくとも１つの抗体の存在下で、該レシピエントに移植されることで特徴付けられる、
使用。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の、骨髄移植のレシピエントにおいて免疫寛容を誘導するための造血キメリズムを達成するための放射性免疫結合体の使用であって、該使用は、前記少なくとも１つの抗体が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ５５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ２８およびＬＦＡ−１からなる群から選択される抗原を認識することで特徴付けられる、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、治療目的で骨髄を標的するために、ジホスホネート、ホスホネート、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはこれらの組み合わせのような種々の結合体および送達系と組み合わせての、放射性医薬品（サマリウムを含むが、これに限定されない）の使用に関する。これらの放射性医薬品は、特に、骨髄移植後のキメリズムの誘導に有用である。本発明の方法は、広範な適用を有する。この広範な適用としては、血液学的障害、血液学的悪性疾患、自己免疫疾患、細網内皮系の調節、感染症を処置するための骨髄細胞移植による造血性再構成の前のレシピエントの条件付けならびに固形組織移植片、細胞移植片および器官移植片に対する寛容の誘導が挙げられるが、これらに限定されない。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
長期間の免疫抑制のための必要性を有さない、他は十分に免疫応答性の宿主による移植片の完全な受け入れとして規定される移植寛容は、臨床的な器官移植の分野において、捕らえどころのない目的である。強い寛容が、骨髄細胞移植を利用したモデルにおいて、達成されてきた。骨髄細胞移植後に達成される安定な多系統キメリズムは、しばしばドナー特異的寛容誘導のための前提条件であると考えられている。しかし、長期間のキメリズムを誘導するために通常使用される致死性または致死量未満の放射線条件付けストラテジーは、しばしば、重度に毒性であるため、これらは、悪性腫瘍または他の生命にかかわる疾患以外のほとんどの臨床的条件におけるこれらのアプローチの使用を排除する。
【０００３】
骨髄移植は、悪性腫瘍を含む血液学的障害の処置のための通常利用される手順であり、治療抵抗性自己免疫疾患のための治療オプションとして最近提唱されている（１、２、３、４、５、６、７）。また、骨髄移植による造血キメリズムの誘導は、細胞、組織、および骨髄ドナー由来の固形器官の首尾良い移植を慢性免疫抑制の必要なしに可能にする、ドナー特異的免疫寛容を達成する（８、９、１０）。
【０００４】
移植寛容の首尾良い誘導は、器官、組織および細胞の移植における捕らえどころのない目的のままである。現在、慢性および急性の移植片拒絶は、新生物および器官毒性の発生を含む、重篤な合併症としばしば関連する非特異的免疫抑制レジメンの使用によって主に軽減される。
【０００５】
動物において、寛容を誘導するためのいくつかのモデルが確立されてきており、このモデルは、骨髄移植を介する造血キメリズムの達成を含む。論証できることには、造血キメリズムを生じる、ドナー骨髄移植を使用する寛容誘導は、これらの問題を克服するための最も強いアプローチである。このストラテジーは、混合多系統キメリズムが、ドナー由来の器官および組織の長期生存を生じた、いくつかの動物モデルにおいて有効であることが示された。しかし、多くの寛容誘導性プロトコルは、強力な細胞減少性（致死性または致死量未満の）条件付けプロトコルによるレシピエントの処置後のドナー骨髄注入の使用に基づき、このプロトコルは、臨床的設定よりもむしろ実験にこの方法論の使用を限定する（１１、１２、１３、１４）。
【０００６】
多くのストラテジーが、レシピエントの前条件付けレジメンとして使用されており、このレジメンは、致死性および致死量未満の全身照射、胸腺照射およびリンパ照射の使用、ならびに細胞障害性薬物の使用を含み、これらは全て、ドナー由来エレメントの移植のために「空間を作成する」ためおよび一過性の免疫抑制を誘導するための、レシピエント血液リンパ球産生細胞の除去を目的とする。骨髄は、サイトカインおよび増殖因子のネットワークを介して造血幹細胞を支持する「隙間」を有すること、ならびに前条件付けがドナー由来造血幹細胞の移植のために必要な「空間」を作成し得ることが以前に報告されている（１５、１６）。ここ数年、全身照射の使用によって「空間を作成する」という概念が試みられている。それどころか、同時刺激性遮断（抗ＣＤ１５４、Ｂ７、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）と組み合わせての大量のドナー骨髄細胞の単回注入または複数回注入、局所的胸腺照射による抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体の使用が提唱されている（１７、１８、１９、２０、２１、２２）。これらのアプローチは、非常に将来性があるが、非常に大きい用量のドナー骨髄細胞またはある形態の外部照射のいずれかという、臨床設定における実現が困難である方法になお依存する。
【０００７】
米国特許第５，２７３，７３８号は、細胞の特定のサブセットよりもむしろ骨髄における使用のために、リンパ造血性組織の標的化された照射において、放射標識抗体を利用する方法を開示する。この特許は、寛容の誘導におけるキメリズムの重要性を認識していない。
【０００８】
米国特許第５，５１４，３６４号；同第５，６３５，１５６号；および同第５，８７６，６９２号は、キメリズムを増強するためおよびドナー骨髄移植後の寛容誘導を増加させるための、全身照射と組み合わせて、細胞部分集合状に位置する抗原に対する細胞型特異的抗体を使用することを記載する。これらの特許は、造血キメリズムの誘導のための、リン酸化合物のような免疫学的に放射結合体化されていない化合物の使用を記載しない。
【０００９】
米国特許第５，９０２，８２５号（本明細書中で以下’８２５号特許）は、非放射性金属イオンおよび有機ホスホン酸リガンドから形成された活性薬剤複合体を含む治療組成物を開示し、ここで、金属イオンは、ランタニドであり得る。’８２５号特許は、このような組成物が、骨疾患の処置および骨の痛みを減少する方法に使用され得るが、骨髄移植に関連する問題は扱わないことを教示する。特に、移植片関連抗原に対する寛容の誘導のため、骨髄移植を介してキメリズムを達成するために、骨髄細胞を治療的に標的とする示唆はなされていない。
【００１０】
米国特許第５，６９７，９０２号（本明細書中以下で’９０２号特許）は、治療組成物および正常骨髄細胞を再移植する前に患者において骨髄細胞を破壊するのにその治療組成物を使用する方法を開示する。開示された方法は、骨髄細胞と関連するかまたは骨髄細胞によって産生されるマーカーに特異的な細胞毒性量の抗体または抗体フラグメントによって患者を処置することを含む。’９０２号特許によると、適切な抗体は、ＮＰ−２、ＭＮ３、および前駆体細胞型のような骨髄細胞と反応する他の抗体であるとして記載される。結合体化抗体を用いる治療用途に好ましい放射性同位体としては、１５３サマリウムが挙げられる。この特許は、自己骨髄の注入のためのプロトコルを開示するが、骨髄移植を介して造血キメリズムを達成するための移植寛容の首尾良い誘導にかかわる問題には取り組まれていない。
【００１１】
米国特許第６，２４１，９６１号（本明細書中以下で’９６１号特許）は、ヒト治療における使用のための治療用放射性免疫結合体およびそれらの生成物方法を開示する。’９６１号特許によると。放射性免疫結合体は、放射性同位体に結合体化された、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＬ２、ＨＬＡ、ＤＲ１０β、およびＣＤ６６に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体からなり得、そして造血性疾患の処置に有用である。しかし、’９６１号特許は、同種抗原、自己抗原および異種抗原に対する寛容のために骨髄移植を介してキメリズム誘導のための骨髄細胞の非抗体媒介標的化の使用を示唆しない。
【００１２】
従って、いかなる形態の外部照射も末梢免疫系の除去にも依存しない、低〜中程度の用量のドナー骨髄接種物の使用を可能にする適切なプロトコルの開発は、過酷な前処理レジメンを行使することなく、骨髄レシピエントにおける寛容を誘導させることを臨床的に実用的にすることが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（本発明の要旨）
本発明は、混合キメリズムを達成するために、レシピエント骨髄を選択的に標的することによって、著しい一過性の骨髄機能低下を達成する新規のアプローチに焦点をあてる。１つの実施形態において、リン酸誘導体を多くの放射性化合物に結合した結果としての生成される一連の安定な複合体が、それらの骨探求特性が原因で研究されている（２３）。このアプローチを使用すると、非常に選択的な標的、この場合は骨への高エネルギー放射化合物を送達することが可能になった。１５３サマリウムは、その物理的特性に基づいて、リン酸塩との複合化のために、最も有望なβ−放射およびγ−放射するヌクレオチドであることが見出された。１５３サマリウム（１５３Ｓｍ）は、１．９日の半減期を有する化合物である。エチレンジアミンテトラメチレンホスホネート（ＥＤＴＭＰ）に結合体化される場合、放射活性サマリウムは、高い骨取りこみおよび急速な血液クリアランスによって特徴付けられる（２４、２５）。これらの特徴に基づいて、有痛性の骨癌転移の待機療法としての１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰの使用が、ＦＤＡによって承認されている（２６、２７、２８、２９）。
【００１４】
臨床モデルおよび動物モデルの両方において実施された研究は、低い毒性および一過性の骨髄剥離を示した（２３〜２９）。これらのデータに基づいて、骨探索放射性化合物の使用は、外部照射も過酷な細胞障害性薬物も必要とせず、ドナー造血幹細胞移植に必要とされる「空間」を生成するための実行可能なアプローチを示す。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態は、寛容誘導プロトコル中のレシピエントの条件付けにおける１５３Ｓｍ−ジホスホネート結合体の使用に関する。特に、本発明に従って投与される１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ結合体は、同種骨髄投与の結果としてレシピエントにおいて首尾よい混合キメリズムを誘導する。しかし、骨細胞に放射性サマリウムを選択的に送達し得るホスホネート、ジホスホネート、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドが、本発明の方法に包含される。このような骨特異的キャリアは、当該分野において公知である。
【００１６】
別の好ましい実施形態は、細胞活性化に関与するリンパ球上で発現される抗原を認識する抗体を利用して、骨髄移植のレシピエントにおける免疫寛容の誘導のための造血キメリズムを達成する方法である。この実施形態に従って、混合キメリズムおよび免疫寛容を誘導する方法は、少なくとも１つの有機ホスホン酸リガンドまたはその塩と結合体化された、サマリウムのような放射性ランタニドを含む放射性免疫結合体にレシピエントを曝露する工程を包含する。その後、骨髄細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ５５、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ２８およびＬＦＡ−１からなる群から選択される抗原に対して惹起される少なくとも１つの抗体の存在下で、当業者に公知のプロトコルを介してレシピエントに移植される。
【００１７】
この研究の間に作成されるデータは、本発明の１つの局面を示し、ここで、十分な同種バリアを横切る、高レベルの安定な長期間のキメリズムは、同種骨髄細胞の注入の前に、１５３サマリウムレキシドロナン（Ｌｅｘｉｄｒｏｎａｍ）のような、骨探索性放射性化合物の単回投与によって達成され得る。例えば、同種骨髄細胞が、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の投与によって得られる一過性の同時刺激性遮断の存在下で注入され得る。骨髄移植後３１週目まで試験された動物の多くのパーセントは、これらの動物が、１５０日よりも長くドナー由来皮膚移植片を維持したので、ドナー特異的寛容を発生した。
【００１８】
このデータは、ドナー特異的反応低下を導く安定な長期間のキメリズムが、過酷な細胞障害性前処理レジメンなしに達成され得、そしてその結果、臨床的な設定における骨髄移植の使用のための拡張された可能性を開くことを示す。さらに、キメリズムレベルを増強するのに効果的であることが示された骨探索放射性化合物の使用は、血液学的な悪性腫瘍および障害、自己免疫疾患の処置のための造血キメリズムを達成するためのストラテジーを最適化することにおいて重要であることを証明し得る。
【００１９】
本発明に従う骨探索放射性結合体は、約６ｍＣｉ／Ｋｇ体重〜約１０ｍＣｉ／Ｋｇ体重の範囲の用量でヒト骨髄レシピエントに導入され得る。この放射性複合体の単回投与は、骨髄移植後のキメリズムを誘導するために良好であるが、必要な場合、複数回投与レジメンが使用され得る。放射能は、レシピエント骨にて残り、そして従って、その中の骨髄に、その同位体の寿命の間影響を及ぼす。従って、放射性サマリウムが好ましいが、比較的短いが臨床的に適切な半減期を有する他の放射性同位体もまた、本発明に記載される結合体に使用され得る。適切な複合体は、複合体形成を必要に応じて利用する公知のプロトコルに従って、組織内で調製され得るか、または商業的供給源から得られ得る。
【００２０】
移植前の骨髄減少のための従来の治療をこえる本発明に従うプロトコルの利点は、抗体への放射性同位体の結合体化のために必要とされる厄介な工程の排除である。従って、本発明の特定の好ましい実施形態に従う寛容誘導または免疫抑制は、当該分野で以前に認識されていない効率的な様式で首尾良く実行され得る。骨を標的とするための、放射活性結合体を使用する、本発明の方法のインビボ試験は、図面および実施例に記載されるように、高度に選択的な様式で骨髄抑制の誘導して、骨髄同種移植においてキメリズムを達成することにおいて驚くべき成功を収めた。
【００２１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、以下の非制限的な実施例においてさらに記載される。
【実施例】
【００２２】
（方法）
動物：全ての動物の手順を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の監督および承認の下で実行した。マウス（７〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６；Ｈ−２ｂ）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｃ３Ｈ；Ｈ−２ｋ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した。レシピエントＣ５７ＢＬ／６マウスを、９〜１０週齢で使用した。全ての動物を、オートクレーブした餌およびオートクレーブした酸性水と共に、滅菌したマイクロアイソレーター（ｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ）ケージ中で無菌室内で飼育した。
【００２３】
骨髄移植：ドナーとして使用した、Ｂａｌｂ／ｃマウス（８〜９週齢）を、移植の日に屠殺した。ＢＭＣを、以前に公開されたレジメンに従って調製した。手短には、大腿骨および脛骨を除き、そしてこれらを筋組織および軟骨から洗浄した後、ＢＭＣを、２３Ｇ針を用いて、０．８ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を補充した滅菌ＲＰＭＩ−１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）で洗った。ＢＭＣを、滅菌ナイロンメッシュを通してろ過し、そして計数した。９〜１０週齢の、完全なＭＣＨ−ミスマッチＣ５７ＢＬ／６レシピエントに、７日目または１４日目のいずれかで、それぞれ０．５ｍｌおよび１．０ｍｌのＨＢＳＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）に再懸濁した２０×１０６または１００×１０６いずれかの未操作ＢＭＣを静脈注射した。７日前に１５０μＣｉまたは５００μＣｉいずれかの１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｗａｙｎｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ），Ｉ．Ｖ．，からなる耐性誘導プロトコル、およびＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から購入した０．５ｍｇのハムスター抗マウスＣＤ１５４  ｍＡｂ（ＭＲ−１）を、−１、０、７、１４、２１および２８日目に腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与した。
【００２４】
皮膚移植片：全厚の皮膚ドナー（Ｂａｌｂ／ｃ）およびサードパーティー（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）移植片を、前記の技術を用いて、ＢＭＣ−Ｔｘの次の日か、またはＭＲ−１  ｍＡｂの最終投与の４週間後にレシピエントの外側胸範囲上に移植した。手短かには、正方形の全厚の皮膚移植片（１ｃｍ２）を、ドナーの尾の皮膚から調製した。移植片ベッドを、レシピエントマウスの右（ドナー特異的）および左（サードパーティー）外側胸壁上で調製した。移植片を、移植片の角で５．０シルクの４本の縫合糸でベッドに固定し、そして石油ゼリーコーティングされた（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  ｊｅｌｌｙ−ｃｏａｔｅｄ）ガーゼおよびギブスで覆った。移植片を、移植の８日後に最初に観察し、そしてその後３日毎に観察した。可視移植組織が視覚での観察によって検出されない場合、移植片拒絶を、完結したとみなした。ドナー特異的皮膚移植片が、１５０日未満の間完全な状態で生残する場合、レシピエントマウスを、耐性であるとみなした。
【００２５】
キメラの免疫血液型決定（ｉｍｍｕｎｏｈｅｍｏｔｙｐｉｎｇ）：実験間の複数の時点および屠殺時に、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入したＦＩＴＣ結合体化抗マウスＨ−２ＫｂまたはＨ−２Ｋｄ、およびＣｙ−Ｃｈｒｏｍｅ結合体化ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて染色した後、レシピエントの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、脾細胞、胸腺細胞および骨髄細胞のフローサイトメトリー分析（ＦＣＭ）によってドナー由来のＢＭＣの移植を確認した。細胞をまた、Ｉｇイソ型コントロール（ＦＩＴＣ結合体化マウスＩｇＧ２ａ、およびＣｙ−Ｃｈｒｏｍｅ結合体化ラットＩｇＧ２ｂ）を用いて非特異的染色について評価し、そしてこのＡｂで染色された細胞のパーセンテージを、特定のＡｂでの染色から得られた値から減算して陽性細胞の相対数を決定した。種々の細胞株の再構築を、ＦＩＴＣ結合体化抗マウスＨ−２ＫｂまたはＨ−２Ｋｄ、およびＢ細胞中のＰＥ−結合体化抗マウスＣＤ１９／ＣＤ２２、顆粒球中のＰＥ結合体化抗マウスＬｙ−６Ｇ、およびマクロファージ画分中のＰＥ結合体化抗マウスＭａｃ−３を用いて評価した。レシピエント動物を、最初にＢＭＣ−Ｔｘの１週間後に試験し、その後、２週間毎に６週間まで、そしてその後４週間毎に試験した。精製した抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）を、使用してＦｃレセプターへの非特異的結合をブロックした。ＦＣＭ分析を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入したＦＡＣＳｃａｎサイトメーター上のＣｅｌｌＱｕｅｓｔを用いて実行した。
【００２６】
種々のＴ細胞レセプターファミリーの分析：脾細胞を使用して、屠殺時のキメラにおけるＶｂ３＋、Ｖｂ５＋、Ｖｂ１１＋およびＶｂ１４＋ファミリーの発現を分析した。２色分析について、細胞を、精製した抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いてブロックし、次いでＦＩＴＣ結合体化Ｈ−２ＫｄおよびＰＥ結合体化抗Ｖｂ３＋、Ｖｂ５＋、Ｖｂ１１＋またはＶｂ１４＋（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と伴に氷上で３０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ結合体化マウスＩｇＧ２ａ、ＰＥ結合体化Ａｒｍｅｎｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ  ＩｇＧ、２群、マウスＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２ｂおよびラットＩｇＭ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、ネガティブコントロールとして使用した。
【００２７】
混合したリンパ球反応：赤血球の脾細胞消耗を、１０％熱不動化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）および０．０５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ組織培養培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｈ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）中のマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で処理した２×１０５の刺激因子を伴なう２×１０５の応答因子（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）を含む５連のウェル中で５％ＣＯ２存在下で３日間３７℃でインキュベートした。キメラマウスおよび刺激因子脾細胞由来の応答因子細胞、ＢＭＣおよびケラチノサイトを、９６丸底組織培養プレート中で３日間インキュベートし、次いで１μＣｉ［３Ｈ］チミジンでパルスし；［３Ｈ］チミジン組込みを８時間後に評価した。刺激指数を、自己に対する応答によって一分当たりの分割平均数（ｃ．ｐ．ｍ）によって計算した。
【００２８】
抗ドナー抗体の存在についての染色：ナイーブＢａｌｂ／ｃドナーから単離した１×１０６個の脾細胞を、キメラレシピエント由来の血漿のいくつかの異なる希釈（１：３、１：１０、１：３０、１：１００）で、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を、１％  ＢＳＡ、０．０２％  アジ化ナトリウムを補充したＰＢＳで洗浄し、次いでＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＰＥ結合体化抗マウスＣＤ２２と伴に氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、そしてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎで分析した。ナイーブＢａｌｂ／ｃドナー由来の脾細胞とともにインキュベートしたナイーブＣ５７ＢＬ／６由来の血漿を、基線として使用した。
【００２９】
（結果）
レシピエント動物（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｈ−２ｂ）を、単一ＩＶ用量としてもまた投与される、２０×１０６または１００×１０６個の異質遺伝子型ドナー骨髄細胞（ＢＭＣ）（ＢＡＬＢ／ｃ、Ｈ−２ｄ）の投与前に、１５０μＣｉまたは５００μＣｉの１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰの単一のＩＶ用量で処置した。ＢＭＣ移植（ＢＭＣ−Ｔｘ）を、−１、０、７、１４、２１および２８日にＭＲ−１（ハムスター抗マウスＣＤ１５４  ｍＡｂ）（０．５ｍｇ  ＩＰ）による一過性Ｔリンパ球同時刺激遮断の存在下で１５３Ｓｍの投与後７日または１４日目に実行した。低用量の１５３Ｓｍ、１５０μＣｉは、高い容量５００μＣｉと同じくらい効果的であることを証明した。１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰを用いた処置は、一過性の骨髄陥没（ｍｙｅｌｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を生じ、これは、化合物の投与の１週間後に生じ、そして図１に示されるように、投与の４〜６週間後に自然に解決した。１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰの１５０μＣｉおよび５００μＣｉの両方の用量は、血液リンパ産生のエレメントに対して同様の効果を有する。著しい骨髄陥没にも関わらず、減少した白血球細胞（ＷＢＣ）数によって評価されたように、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰの投与は、赤血球（ＲＢＣ）数、ヘモグロビン（Ｈｂ）数、および血小板（ＰＬＴ）数に対して有意な効果を有さない。同様のデータを、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰを用いて処置し、そして異質遺伝子型のＢＭＣを移植しなかった動物において得た（示されていない）。従って、１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰは、ＷＢＣ区画の一過性骨髄陥没を導き、これは異質遺伝子型のＢＭＣ−Ｔｘの存在下または非存在下のいずれかで自然に可逆的である。ＲＢＣ数、ＰＬＴ数またはＨｂ数における劇的な改変は、明白にならなかった。ＢＭＣの単回投与は、分析した全てのレシピエント動物においてＢＭ移植を生じた。図２は、１００×１０６  ＢＭＣ、抗ＣＤ１５４ｍＡｂおよび以下の４つの条件のアプローチの１つで処置したレシピエントにおけるドナー由来の細胞のパーセンテージを示す：ＢＭＣの投与７日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  １５０μＣｉ；ＢＭＣの投与７日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  ５００μＣｉ；ＢＭＣの投与１４日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  １５０μＣｉ；およびＢＭＣの投与１４日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  ５００μＣｉ。レシピエント動物から入手したＰＢＬの型別を、ドナー由来のＢＭ異質遺伝子型細胞での再構築後２週間で開始し、再構築後２週間毎に６週間まで、そしてその後４週間毎に、抗クラスＩＨ−２ｂ−ＦＩＴＣおよびＨ−２ｄ−ＦＩＴＣを用いて実行した。分析を、リンパ球ゲートで実行し、そしてその値を１００％に正規化した。ドナー起源のＣＤ３＋Ｔリンパ球もまた存在し、このことはリンパ系統の混合キメリズムをまた示唆する。
【００３０】
図３において、２０×１０６  ＢＭＣ、抗ＣＤ１５４ｍＡｂ、および以下の４つの条件のアプローチの１つで処置したレシピエントにおけるドナー由来の細胞のパーセンテージが示される：ＢＭＣの投与７日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  １５０μＣｉ；ＢＭＣの投与７日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  ５００μＣｉ；ＢＭＣの投与１４日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  １５０μＣｉ；およびＢＭＣの投与１４日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  ５００μＣｉ。レシピエント動物から入手したＰＢＬの型別を、ドナー由来のＢＭ異質遺伝子型細胞での再構築後２週間で開始し、再構築後２週間毎に６週間まで、そしてその後４週間毎に、抗クラスＩＨ−２ｂ−ＦＩＴＣおよびＨ−２ｄ−ＦＩＴＣを用いて実行した。分析を、リンパ球ゲートにおいて実行し、そしてその値を１００％に正規化した。ドナー起源のＣＤ３＋Ｔリンパ球もまた存在し、このことはリンパ系統の混合キメリズムをまた示唆する。
【００３１】
従って、同時刺激遮断の存在下での１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰの投与は、異質遺伝子型ＢＭＣのレシピエントにおける持続性造血キメリズムを導く。１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰ（１５０μＣｉ  対  ５００μＣｉ）の用量、および１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰ投与に対するＢＭＣ−Ｔｘのタイミングは、結果に余り影響しない。一方で、ＢＭＣ用量は、達成されたキメリズムのレベルに直接相関する。
【００３２】
図４に示されるように、１００×１０６  ＢＭＣ、および４つの条件アプローチの１つで処置したコントロール動物におけるドナー由来の細胞のパーセンテージを、評価した。この条件レジメンは以下のとおりであった：ＢＭＣの投与７日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  １５０μＣｉ；ＢＭＣの投与７日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  ５００μＣｉ；ＢＭＣの投与１４日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  １５０μＣｉ；およびＢＭＣの投与１４日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  ５００μＣｉ。同時刺激遮断を誘導する抗ＣＤ１５４ｍＡｂが使用されないために、この４つ目のレジメンは、前記とは異なる。レシピエント動物から入手したＰＢＬの型別を、ドナー由来のＢＭ異質遺伝子型細胞での再構築後２週間で開始し、再構築後２週間毎に６週間まで、そしてその後４週間毎に、抗クラスＩＨ−２ｂ−ＦＩＴＣおよびＨ−２ｄ−ＦＩＴＣを用いて実行した。分析を、リンパ球ゲートにおいて実行し、そしてその値を１００％に正規化した。
【００３３】
図５は、２０×１０６  ＢＭＣ、および４つの以下の条件アプローチの１つで処置したコントロール動物におけるドナー由来の細胞のパーセントを示す：ＢＭＣの投与７日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  １５０μＣｉ；ＢＭＣの投与７日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  ５００μＣｉ；ＢＭＣの投与１４日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  １５０μＣｉ；およびＢＭＣの投与１４日後の１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ  ５００μＣｉ（同時刺激遮断を誘導する抗ＣＤ１５４ｍＡｂが使用されないために、このレジメンは、前記とは異なる）。レシピエント動物から入手したＰＢＬの型別を、ドナー由来のＢＭＣ異質遺伝子型細胞での再構築後２週間で開始し、再構築後２週間毎に６週間まで、そしてその後４週間毎に、抗クラスＩＨ−２ｂ−ＦＩＴＣおよびＨ−２ｄ−ＦＩＴＣを用いて実行した。分析を、リンパ球ゲートにおいて実行し、そしてその値を１００％に正規化した。
【００３４】
従って、図４〜５からのデータは、同時刺激遮断の非存在下で、１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰに続くＢＭＣ−Ｔｘ投与は、ＢＭＣの用量（２０×１０６または１００×１０６）とは関係なく一過性のキメリズムのみを導く。
【００３５】
抗ＣＤ１５４ｍＡｂと共に２０×１０６  ＢＭＣまたは１００×１０６  ＢＭＣを用いて（１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ処置の非存在下で）処置したコントロール動物におけるドナー由来の細胞のパーセンテージは、図６に示される。レシピエント動物から入手したＰＢＬの型別を、ドナー由来のＢＭＣ異質遺伝子型細胞での再構築後２週間で開始し、再構築後２週間毎に６週間まで、そしてその後４週間毎に、抗クラスＩＨ−２ｂ−ＦＩＴＣおよびＨ−２ｄ−ＦＩＴＣを用いて実行した。分析を、リンパ球ゲートにおいて実行し、そしてその値を１００％に正規化した。この結果は、１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰの投与なしでのＢＭＣ−Ｔｘおよび同時刺激遮断での処置が、低用量（２０×１０６）ＢＭＣが投与される場合に、一過性のキメリズムを導き、そして１００×１０６  ＢＭＣが投与される場合に、低レベルの安定なキメリズムを導くことを示す。
【００３６】
図７は、２０×１０６  ＢＭＣ、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ、および抗ＣＤ１５４  ｍＡｂ（上のパネル）ならびに２０×１０６  ＢＭＣおよび抗ＣＤ１５４  ｍＡｂ（下のパネル）の非致死的条件レジメンを用いて調製した代表的混合キメラ中の、ドナー由来のリンパ系統（Ｂ細胞）、ＮＫ系統、および骨髄（顆粒球）系統の割合の２色フローサイトメトリー分析を示す。分析を、クラスＩＨ−２ｂ−ＦＩＴＣ、およびＣＤ２２（Ｂ細胞）、ＮＫ、またはＧＲＡＮ１（顆粒球）、全てのＰＥのいずれかを用いて実行した。分析を、リンパ球ゲートにおいて実行し、そしてその値を１００％に正規化した。
【００３７】
図８において、１００×１０６  ＢＭＣ、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ、および抗ＣＤ１５４  ｍＡｂ（上のパネル）、ならびに１００×１０６のＢＭＣおよび抗ＣＤ１５４  ｍＡｂ（下のパネル）の非致死的条件レジメンを用いて調製した代表的な混合されたキメラ中のドナー由来のリンパ系統（Ｂ細胞）、ＮＫ系統、および骨髄（顆粒球）系統の割合の２色フローサイトメトリー分析を示す。分析を、クラスＩＨ−２ｂ−ＦＩＴＣ、およびＣＤ２２（Ｂ細胞）、ＮＫ、またはＧＲＡＮ１（顆粒球）、全てのＰＥのいずれかを用いて実行した。分析を、リンパ球ゲートにおいて実行し、そしてその値を１００％に正規化した。
【００３８】
図７および８において示されるデータ由来の証拠のように、長期間、安定な複数系統のキメリズムは、ＢＭＣ−Ｔｘ、１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰ、および抗ＣＤ１５４  ｍＡｂの組み合わせを用いて処置された群において達成される。
【００３９】
２０×１０６  ＢＭＣ、１５３Ｄｍ−ＥＤＴＭＰ、および抗ＣＤ１５４  ｍＡｂ、または示されるコントロール群で処置されたレシピエント上に置かれた全厚の尾由来の皮膚移植片の生残は、図９に示される。移植片を、処置された動物における抗ＣＤ１５４  ｍＡｂの最終投与後３０日目に調製した。２つの異なるドナー系統の組み合わせであるＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）およびＣ３Ｈ／Ｊ（Ｈ−２ｋ）を使用した。各レシピエントは、以下の両方の系統から皮膚移植片を受けた：ドナー型ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）、およびサードパーティーＣ３Ｈ／Ｊ（Ｈ−２ｋ）。サードパーティーの移植片は、ナイーブレシピエント上に置かれたドナー特異的移植片を置いたのと同じ時間枠内で拒絶された。移植片を、最低１２８日未満にし、そして生組織が、移植部位でもはや検出されない場合に拒絶されると考えた。従って、１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰが処置の一部である場合に限り、動物が低用量のＢＭＣ（２０×１０６）を受ける場合、ドナー特異的皮膚移植に対する耐性が得られ、一方で、同時刺激単独（ＢＭＣを伴なう）は、同じ結果に達成するのには不十分であった。
【００４０】
１００×１０６  ＢＭＣ、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ、および抗ＣＤ１５４ｍＡｂ、または示されるコントロール群で処置されたレシピエント上に置かれた全厚の尾由来の皮膚移植片の生存率を、図１０に図示する。移植片を、処置された動物における抗ＣＤ１５４ｍＡｂの最終投与の３０日後に調製した。２つの異なるドナー株の組み合わせである、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）およびＣ３Ｈ／Ｊ（Ｈ−２ｋ）を使用した。各レシピエントは、以下の両方の系統から皮膚移植片を受けた：ドナー型、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）、およびサードパーティー、Ｃ３Ｈ／Ｊ（Ｈ−２ｋ）。サードパーティー移植片は、ナイーブレシピエント上に置かれたドナー特異的移植片と同じ時間枠内で拒絶された。移植片は、最低の１２８日後であり、そして生組織が移植部位でもはや検出されなくなった際に拒絶されると考えられた。従って、高い容量のＢＭＣ（１００×１０６）が得られる場合、１５３Ｓｍ−ＥＤＭＰ投与の効果を増大させることは、キメリズムレベルでなお観察可能であり、これは再現性がより高いが、同時刺激遮断のみ（＋ＢＭＣ−Ｔｘ）が、類似の効果を表すので、移植片生残を喪失している。
【００４１】
ランタニドと骨特異的キャリアとの間の放射性核種錯体は、任意の薬学的に受容可能な投薬形態（液状、乳濁物、懸濁物などを含む）に処方され得る。注射のために液状溶液が、特に好ましい。本発明に従う使用のための錯体の薬学的組成物はまた、適切な希釈剤、賦形剤、緩衝液、安定剤およびキャリアを含み得る。滅菌水または滅菌等張性生理食塩水溶液が、特に好ましい。
【００４２】
本発明が、上記の好ましい実施形態を介して例示されている一方で、本発明が、本明細書中に一般に記載され、そして添付の特許請求の範囲によってさらに記載されるような、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者に明らかな種々の改変が実行され得ることが、理解される。
【００４３】
【表１】
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本発明は、以下の図面によってさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、単回静脈内（ＩＶ）投与としての２０×１０６または１００×１０６個の同種異型ドナー骨髄細胞（ＢＭＣ）の投与前に、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ（１５０μＣｉまたは５００μＣｉ）の単回投与（ＩＶ）によるマウスの処理の結果を図示する。
【図２】図２は、ＢＭＣの単回投与が、分析された全てのレシピエントにおいて骨髄移植を生じたことを図示する。
【図３】図３は、２０×１０６ＢＭＣ、抗ＣＤ１５４ｍＡｂおよび４つの条件付けアプローチのうちの１つで処理されたレシピエント中のドナー由来細胞の割合、を図示する。
【図４】図４は、１００×１０６ＢＭＣおよび４つの条件付けアプローチのうちの１つで処理されたコントロール動物中のドナー由来細胞の割合を図示する。
【図５】図５は、２０×１０６ＢＭＣおよび４つの条件付けアプローチのうちの１つで処理されたコントロール動物中のドナー由来細胞の割合を図示する。
【図６】図６は、抗ＣＤ１５４ｍＡｂとともに（１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰ処理の非存在下で）２０×１０６ＢＭＣまたは１００×１０６ＢＭＣで処理されたコントロール動物中のドナー由来細胞の割合を示す。
【図７】図７は、２０×１０６ＢＭＣ、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰおよび抗ＣＤ１５４ｍＡｂ（上パネル）ならびに２０×１０６ＢＭＣおよび抗ＣＤ１５４ｍＡｂ（下パネル）の、非致死性条件付けレジメンを使用して調製された、代表的な混合キメラにおける、ドナー由来のリンパ（Ｂ細胞）系統、ＮＫ系統、および骨髄（顆粒球）系統の比率の、２色フローサイトメトリー分析を示す。
【図８】図８は、１００×１０６ＢＭＣ、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰおよび抗ＣＤ１５４ｍＡｂ（上パネル）ならびに１００×１０６ＢＭＣおよび抗ＣＤ１５４ｍＡｂ（下パネル）の、非致死性条件レジメンを使用して調製された、代表的な混合キメラにおける、ドナー由来のリンパ（Ｂ細胞）系統、ＮＫ系統、および骨髄（顆粒球）系統の比率の、２色フローサイトメトリー分析を示す。
【図９】図９は、２０×１０６ＢＭＣ、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰおよび抗ＣＤ１５４ｍＡｂ、または示されたコントロール群で処理されたレシピエントに配置された尾由来の全厚の皮膚移植片の生存を図示する。
【図１０】図１０は、１００×１０６ＢＭＣ、１５３Ｓｍ−ＥＤＴＭＰおよび抗−ＣＤ１５４ｍＡｂ、または示されたコントロール群で処理されたレシピエントに配置された尾由来の全厚の皮膚移植片の生存を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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