(57)【要約】デンプン分解酵素をコードする核酸分子が提供される。さらに、ベクター、本明細書において説明される核酸分子によって形質転換された、宿主細胞および植物細胞、ならびにそれらを含む植物が提供される。そのうえ、デンプン分解の増大または減少を示す、トランスジェニック植物を作製するための方法について説明される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される、デンプン分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子：
（a）配列番号：2、4、6または8において示されるアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのタンパク質の成熟形態をコードする核酸分子；
（b）配列番号：1、3、5または7において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（c）アミノ酸配列が、配列番号：2、4、6または8において示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも40％の相同性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（d）相補鎖が、(a)または(b)において定義される核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；
（e）(a)、(b)、(c)または(d)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子によってコードされる、タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
（f）ヌクレオチド配列が、(b)、(c)、(d)または(e)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子の配列から、遺伝暗号の縮重によって逸脱している核酸分子。
【請求項２】
請求項1記載の核酸分子と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項1記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
核酸分子が、原核細胞または真核細胞における、翻訳可能なRNAの転写および合成を確実にする調節因子に、センスの方向で連結されている、請求項3記載のベクター。
【請求項５】
請求項1記載の核酸分子、もしくは請求項3もしくは請求項4記載のベクターによって形質転換された宿主細胞、またはそのような細胞の子孫細胞。
【請求項６】
微生物の細胞である、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項７】
大腸菌の細胞である、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項８】
デンプンの分解に関与するタンパク質、または生物学的に活性なその断片を調製するための方法であって、請求項5から7のいずれか一項記載の宿主細胞が、タンパク質の合成を可能にする条件下において培養され、培養細胞および／または培養培地からタンパク質が単離される方法。
【請求項９】
請求項1記載の核酸分子によってコードされるか、または請求項8記載の方法に従って調製される、タンパク質または生物学的に活性なその断片。
【請求項１０】
請求項1記載の核酸分子、または請求項3もしくは請求項4記載のベクターによって形質転換された、トランスジェニック植物細胞またはそのような細胞の子孫細胞であって、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする該核酸分子が、植物細胞において翻訳可能なmRNAの転写を可能にする調節因子の制御下にある、トランスジェニック植物細胞またはそのような細胞の子孫細胞。
【請求項１１】
請求項10記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１２】
有用な植物である、請求項11記載の植物。
【請求項１３】
デンプン貯蔵植物である、請求項11または請求項12記載の植物。
【請求項１４】
ジャガイモの植物体である、請求項13の植物。
【請求項１５】
請求項10記載の植物細胞を含む、請求項11から14のいずれか一項記載の植物の繁殖材料。
【請求項１６】
請求項1記載のDNA分子の転写産物に対して、相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA分子。
【請求項１７】
請求項1記載のDNA分子の転写産物を特異的に切断する、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA分子。
【請求項１８】
共抑制効果を有するRNAをコードするDNA分子。
【請求項１９】
RNA干渉（RNAi）によって、植物細胞における発現の際に、請求項1記載の核酸分子の発現の減少を導くRNAをコードするDNA分子。
【請求項２０】
請求項16から19のいずれか一項記載のDNA分子を含むベクター。
【請求項２１】
DNA分子が、植物細胞における転写を確実にするDNA調節因子と組み合わされる、請求項20記載のベクター。
【請求項２２】
請求項16から19のいずれか一項記載のDNA分子、または請求項20もしくは請求項21記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
外来の核酸分子の存在または発現が、請求項9記載のタンパク質の内在性の活性の低下を導く、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２４】
内在性の活性の低下が、請求項9記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の阻害によるものである、請求項23記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２５】
外来の核酸分子が以下からなる群より選択される、請求項24記載のトランスジェニック植物細胞：
（a）請求項9記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の減少を導くことが可能である、アンチセンスRNAまたはRNAi構築物をコードするDNA分子；
（b）共抑制効果を介して、請求項9記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の減少を導くことが可能であるDNA分子；
（c）請求項9記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子の転写産物を、特異的に切断することができるリボザイムをコードするDNA分子；および
（d）インビボ突然変異誘発を介して導入される核酸分子であって、請求項9記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子における突然変異または非相同配列の挿入を導き、それによって、請求項9記載のタンパク質の発現の減少、または不活性化タンパク質の合成を導く核酸分子。
【請求項２６】
請求項23から25のいずれか一項記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項２７】
請求項16から19のいずれか一項記載のDNA分子の転写によって得られるRNA分子。
【請求項２８】
細胞において内在性の形態に合成される請求項9記載のタンパク質の量が、細胞において減少することを特徴とする、デンプン分解の減少を示すトランスジェニック植物細胞を生産するための方法。
【請求項２９】
細胞における請求項9記載のタンパク質の量の減少が、アンチセンス効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
細胞における請求項9記載のタンパク質の量の減少が、リボザイム効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
細胞における請求項9記載のタンパク質の量の減少が、共抑制効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
細胞における請求項9記載のタンパク質の量の減少が、インビボ突然変異誘発を介して導入される、このタンパク質をコードする内在性遺伝子における突然変異によって引き起こされることを特徴とする、請求項28記載の方法。
【請求項３３】
細胞における請求項9記載のタンパク質の量の減少が、RNA干渉（RNAi）効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項28記載の方法。
【請求項３４】
請求項28から33のいずれか一項記載の方法によって得られる植物細胞。
【請求項３５】
請求項34記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項３６】
請求項23から25のいずれか一項記載の植物細胞、または請求項34記載の植物細胞を含む、請求項35記載の植物の繁殖材料。
【請求項３７】
請求項9記載のタンパク質を含む、洗剤または洗浄剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプン分解酵素をコードする核酸分子に関連する。さらに、本発明は、ベクター、本明細書において説明される核酸分子によって形質転換された宿主細胞および植物細胞、ならびに前記の細胞を含む植物に関連する。さらに、説明される核酸分子によって形質転換されたトランスジェニック植物を作製するための方法が説明される。
【背景技術】
【０００２】
植物の器官におけるデンプンの分解は、幾つかの局面において植物産物の有用性に影響を与える過程である。植物種および器官のタイプに依存して、デンプンの分解を阻害することが望ましい可能性があるか、またはその逆に、増加させることが望ましい可能性がある。デンプンの分解の減少は、例えば、飼料植物において、特にサイレージまたは乾燥によって保存されるものにおいて望ましい可能性がある。デンプン含量の増加は、乾燥物質のかなりの増加を導き、それによりC：N比も同様に増加させ、それによって、乏しいC：N比がもたらす問題を解決することが可能になる。これらの問題には、乏しいC：N比がもたらす、植物の器官の高過ぎるpH値によって生じる可能性があり、サイレージを損なう、発酵過程が含まれる。そのうえ、反芻動物の第一胃におけるガスの蓄積、特に春に生じるものは、この生育期に成長し、かつ動物に給餌される牧草の、乏しいC：N比によって引き起こされる。
【０００３】
デンプン分解の減少はまた、果実においても望ましい可能性がある。多数の果実において、デンプンは一過的に蓄積され、果実の成熟中に動員される、即ち、糖類に転換される。もしこのデンプン分解の過程を阻害することが可能であれば、果実の乾燥物質の含量を増加させることが可能となる。さもなくば過剰な水分を蒸発させるために必要となる、エネルギーの量を減少させることから、これは特に、ケチャップの生産のために使用されるトマトの場合に望ましい。
【０００４】
デンプン含量の増加はブドウの糖含量に正の影響を与えるため、ブドウに関しても、デンプンの分解を減少させることが望ましい可能性がある。
【０００５】
そのうえ、デンプンの分解の減少または阻害は、ジャガイモの塊茎において、特に、発芽を抑制するための低温での塊茎の貯蔵中に生じる、いわゆる「低温糖化」に関して望ましい可能性がある。低温糖化は、油で揚げる過程において望ましくない褐変反応を導く、グルコースおよびフルクトース、いわゆる還元糖への、デンプンの転換によって生じるものである。
【０００６】
さらに、デンプンの分解の減少は、ハイブリッド種子の生産のための雄性不稔植物の作製に関して望ましい可能性もある。特に、花粉管の成長および卵細胞の受精は、ほとんどの植物においてはデンプンの分解によってエネルギーを与えられるエネルギー依存性のプロセスであるため、その原因となる遺伝子を抑制することにより、花粉におけるデンプンの分解を特異的に阻害することによって、雄性不稔植物を生産することが可能であり得る。
【０００７】
これに対して、例えば、植物の器官がアルコールの生産に使用される場合のように、植物の器官におけるデンプンの分解を増加させることが望ましい状況がある。しかし、これらの場合においては、デンプンの分解はある時期にのみ、即ち、実際の生産過程の間にのみ起こるべきである。
【０００８】
したがって、ある植物または植物の器官におけるデンプンの分解を改変できるということには関心が持たれる。
【０００９】
しかし、特に遺伝子操作によって、正または負の様式で、植物におけるデンプンの分解に影響を与えることを可能にするためには、特にデンプンの分解を改変しようとする器官において、デンプンの分解における役割を担うタンパク質をコードするDNA配列に接触することが必要である。
【００１０】
したがって、本発明の基礎にある技術的な課題は、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子を提供することである。
【発明の開示】
【００１１】
この課題は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供することによって解決される。
【００１２】
したがって、本発明は、以下からなる群より選択される、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子に関連する：
（a）配列番号：2、4、6または8において示されるアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのタンパク質の成熟形態をコードする核酸分子；
（b）配列番号：1、3、5もしくは7において示されるヌクレオチド配列、または対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（c）アミノ酸配列が、配列番号：2、4、6または8において示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも40％の相同性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（d）相補鎖が(a)または(b)において定義される核酸分子にハイブリダイズする核酸分子；
（e）(a)、(b)、(c)または(d)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子によってコードされるタンパク質の、生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
（f）ヌクレオチド配列が、遺伝暗号の縮重によって、(b)、(c)、(d)または(e)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子の配列から逸脱している核酸分子。
【００１３】
したがって、本発明は、好ましくは配列番号：2、4、6または8において示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子に関連する。
【００１４】
上記に言及される核酸分子、配列番号：1、3、5および7は、デンプンの分解に関与し、かつ強く影響するタンパク質をコードする。それらは、直鎖α-1,4-グルカンを蓄積する大腸菌株を使用した、機能的スクリーニングアッセイ法を用いることによって、同定され、単離された（実施例1を参照のこと）。これらの分子を活用して、植物細胞におけるデンプンの分解を（正または負に）改変することが可能となる。
【００１５】
今までのところ、デンプンの分解に関与するか、またはデンプンの分解を開始する酵素をコードする配列は、ほとんどの植物の器官について説明されていない。穀粒の胚乳は、この点において十分に理解されている唯一の植物系である。他の全ての植物器官については、今までのところ、どのタンパク質がデンプンの分解に寄与しているのかは知られていない。この主な理由は、植物の器官における優位なデンプン加水分解活性が、デンプンの全く生じない細胞内画分に局在することである。デンプンは、プラスチドにおいて合成および分解される。デンプンの加水分解によって遊離される産物は、その後、細胞におけるさらなる使用のために、プラスチドから輸送される。これに関して、胚乳組織は、細胞および細胞内の完全性が成熟中に緩むため、例外である。その結果、プラスチド外の酵素もデンプン顆粒に接触し、デンプンを分解することが可能となる。
【００１６】
「デンプンの分解に関与する」という用語は、各々の酵素がデンプンの分解作用において役割を担うことを意味する。そのような分解作用は、例えば、デンプンの多糖鎖の非還元末端または還元末端からの、グルコース残基、マルトースまたはマルトオリゴ糖の除去による、異なる手段で起こり得る。
【００１７】
この除去は、例えば加水分解によって、即ち、除去された基が水分子に転移されることによってか（例えばエンドヒドロラーゼ、エキソヒドロラーゼ）、または、加リン酸分解によって、即ち、除去された基がリン酸分子に転移されることによって（例えば、グルカン鎖の非還元末端からグルコース-1-リン酸分子を遊離する、α-1,4-グルカンホスホリラーゼのようなホスホリラーゼ）、達成することが可能である。
【００１８】
または、除去は、好ましくはグルカン鎖の非還元末端からのグルコース残基を、遊離される1,5-アンヒドロ-フルクトース分子に転換する、グルカンリアーゼにより使用される反応機構によって、達成することが可能である。
【００１９】
好ましくは、「デンプンの分解に関与する」という用語は、実施例1において説明される機能的アッセイ法において、デンプン分解活性を有するものとして同定することができるタンパク質を意味する。そのようなアッセイ法は特に、以下の段階を含む：
（a）グルコース含有培地上で増殖させた後に、大量のα-1,4-グルカンを蓄積する大腸菌株、好ましくは、グリコーゲン分枝酵素をコードするglgB遺伝子における挿入を有する突然変異体であり、かつ変化したアロステリック特性（Creuzat-Sigalら:Biochemistry of the glycoside linkage、Piras、Pontis編、Academic Press、New York(1972)、647〜680）を有するADP-グルコースピロホスホリラーゼの発現を与えるプラスミド（pACAG；KoBmannら、Planta 208(1999)、503〜511）で形質転換された、大腸菌株KV832（Kielら、Molecular & General Genetics 207(1987)、294〜301）を、タンパク質をコードする核酸分子によって形質転換する段階；
（b）グルコース含有培地上に形質転換細菌をまき、増殖させる段階；
（c）ヨウ素蒸気によって細菌コロニーを染色する段階；
（d）段階(a)において言及される核酸分子によって形質転換された細菌のコロニーが、直鎖状α-1,4-グルカンの存在によって、ヨウ素蒸気により濃い青色の染色を示す非形質転換対照コロニーよりも、薄い青色の染色を示すかどうか、または、それらが全く染色を示さないかどうかを決定する段階（より薄い青色の染色、または染色の欠如が、タンパク質の、デンプンまたはグルカンの分解活性の指標である）。
【００２０】
本発明は、特に、配列番号：1、3、5もしくは7のいずれか1つの下に示されるヌクレオチド配列またはその部分を含む核酸分子、および好ましくは、配列番号：1、3、5もしくは7のいずれか1つにおいて示されるコード領域または対応するリボヌクレオチド配列を含む分子に関する。
【００２１】
さらに、本発明は、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子、および上記の分子の1つとハイブリダイズする相補鎖に関する。
【００２２】
本発明は、配列番号：2、4、6または8のいずれか1つにおいて示される全アミノ酸配列に対して相同性を有する、即ち、少なくとも40％、好ましくは少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも80％、および、特に少なくとも90％の同一性を有するタンパク質であって、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする、核酸分子にも関連する。
【００２３】
本発明は、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子であって、その配列が遺伝暗号の縮重によって、上記の核酸分子のヌクレオチド配列から逸脱している核酸分子にも関連する。
【００２４】
本発明は、上述の配列の全体、または一部に相補的な配列を有する核酸分子にも関連する。
【００２５】
配列番号：1において示される核酸配列（本明細書においてはCSD12とも呼ばれる）は、277アミノ酸残基のポリペプチドをコードする、831塩基対のオープンリーディングフレームを有する、ジャガイモ由来の全長cDNA配列である。アミノ酸配列のコンピューター解析（Emanuelssonら、Protein Science 8(1999)、978〜984；http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）によって、プラスチド移行ペプチドが同定され、移行ペプチドと成熟タンパク質の間の切断部位がアミノ酸残基56と57の間にあることが示される。したがって、成熟タンパク質は、221アミノ酸を含むと考えられる。プロセシングされていないタンパク質の予測される分子量は31.9 kDaであり、成熟タンパク質の予測される分子量は25.5 kDaである。
【００２６】
配列番号：3において示される核酸配列（本明細書においてはCSD23とも呼ばれる）は、294アミノ酸残基のポリペプチドをコードする、882ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む、ジャガイモ由来の全長cDNAクローンである。ポリペプチドの予測される分子量は34.1 kDaである。
【００２７】
配列比較によって、機能が同定されていないシロイヌナズナESTを除く、データベースにおいて利用可能な既知の配列に対して、有意な相同性がないことが明らかになった。
【００２８】
配列番号：5において示される核酸配列（本明細書においてはSHIとも呼ばれる）は、790アミノ酸残基のポリペプチドをコードする、2370 bpのオープンリーディングフレームを含む、ジャガイモ由来の全長cDNAクローンである。コードされるタンパク質は、予測される86.6 kDaの分子量を有する。SHIタンパク質の最初の100アミノ酸残基、およびGFPタンパク質を含むキメラタンパク質の発現によって、キメラタンパク質が葉緑体に輸送されることから、プラスチドへの局在化のための移行ペプチドが最初の100アミノ酸に存在することが示され得る。配列番号：5のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列レベルで、トマト（AW 093761、AW 928571、AW 038351）、ワタ（AW 727818）、ハコヤナギ（AI 164445）、ダイズ（AI 988543）およびトウモロコシ（AW 566133）の未同定のESTに対して、いくらかの相同性を示す。
【００２９】
配列番号：5のアンチセンス構築物を含むトランスジェニックジャガイモ植物は、それらの葉における移動デンプンをもはや動員することができず、いわゆる「デンプン過剰」の表現型がもたらされる。大腸菌において発現される場合、SHI配列（配列番号：5）は、アミロペクチンを溶解し、SHIを発現する大腸菌細胞からの抽出物と共にインキュベートすると、アミロペクチンの迅速な分解を導く。薄層クロマトグラフィーによって、SHI活性が、マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオースのような、異なる長さのマルトオリゴ糖の遊離を導くことが明らかになった。
【００３０】
配列番号：7において示される核酸配列は、プラスチドβ-アミラーゼ（Laoら、Plant J. 20(1999)、519〜527）をコードする配列に対して相同性を示す。配列番号：7は、545アミノ酸残基のポリペプチドをコードする、1635 bpのオープンリーディングフレームを含む全長cDNAクローンである。予測される分子量は61 kDaである。コンピューター解析によって、プラスチド移行ペプチドは同定できなかったが、エンドウからの単離葉緑体を用いた輸送実験によって、タンパク質が確かに葉緑体に輸送されることが示される。したがって、それは、ジャガイモプラスチド指向性β-アミラーゼ（ppt-β-アミラーゼ）と呼ばれる。
【００３１】
配列番号：7のアンチセンス構築物を含む、トランスジェニックジャガイモ植物体は、いわゆる「デンプン過剰」の表現型を示し、つまり、もはやそれらの葉において生産された移動デンプンを動員することができない。
【００３２】
本発明内において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、例えばSambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYにおいて説明されるような、従来的なハイブリダイゼーション条件（「低いストリンジェンシー条件」とも呼ばれる）下における、好ましくはストリンジェントな条件（「高いストリンジェンシー条件」とも呼ばれる）下におけるハイブリダイゼーションを意味する。特に好ましい意味内においては、「ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションが以下の条件下において起こることを意味する：
ハイブリダイゼーション緩衝液：2×SSC；10×デンハルト溶液（フィコール400+PEG+BSA；比率1：1：1）；0.1％ SDS；5 mM EDTA；50 mM Na2HPO4；250μg/ml ニシン精子DNA；50μg/ml tRNA；または
0.25 M リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2；
1 mM EDTA
7％ SDS
ハイブリダイゼーション温度T = 60℃
洗浄緩衝液：2×SSC；0.1％ SDS
洗浄温度T = 60℃。
【００３３】
本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、原則として、そのようなタンパク質を発現する任意の生物体に由来する、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードすることが可能である。
【００３４】
本発明の分子とハイブリダイズする核酸分子は、例えば、植物のゲノムライブラリまたはcDNAライブラリから単離することができる。または、それらは遺伝子操作もしくは化学合成によって調製することができる。
【００３５】
そのような核酸分子は、例えば標準法（例えばSambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと）に従ったハイブリダイゼーションによって、本発明の分子、またはそのような分子の部分、またはそのような分子の逆相補鎖を使用することによって、同定し、単離することができる。
【００３６】
配列番号：1、3、5または7において示されるもの、またはその一部と同じかまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸分子は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして使用される断片は、その配列が本発明による核酸分子のものと実質的に一致する、通常の合成技術によって調製される合成断片であってもよい。
【００３７】
本発明の核酸分子とハイブリダイズする分子は、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする上記の核酸分子の断片、誘導体および対立遺伝子変異体をも含む。本明細書において、断片は、好ましくはデンプンの分解に関与する、説明されるタンパク質の1つをコードするのに十分に長い核酸分子の部分を意味するものと理解される。これに関連して、誘導体という用語は、これらの分子の配列が、1つまたは複数の位置において、上記の核酸分子の配列とは異なり、かつそのような配列に対して高度の相同性を示すことを意味する。これに関連して、相同性とは、少なくとも40％の配列同一性、特に少なくとも60％の同一性、好ましくは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも85％、さらに好ましくは少なくとも90％、および特に好ましくは少なくとも95％の同一性を意味する。最も好ましくは、相同性は、少なくともn％の配列同一性を意味し、nは40と100の間の整数である、即ち、40≦n≦100である。上記の核酸分子からの逸脱は、例えば、欠失、置換、挿入および／または組み換えによって生じたものであってよい。
【００３８】
好ましくは、相同性の程度は、配列番号：1、3、5または7のコード領域のヌクレオチド配列と各々の配列を比較することによって決定される。比較された配列が同じ長さを有さない場合、相同性の程度は、好ましくは、より長い配列におけるヌクレオチド残基と同一の、より短い配列におけるヌクレオチド残基の割合を指す。相同性の程度は、欧州分子生物学研究所（European Molecular Biology Laboratory、Meyerhofstrasse 1、D 69117 Heidelberg、Germany）のJulie Thompson（Thompson@EMBL-Heidelberg.DE）およびToby Gibson（Gibson@EMBL-Heidelberg.DE）によって頒布されているClustalWプログラム（Thompsonら、Nucleic Acids Research 22(1994)、4673〜4680）のような、既知のコンピュータープログラムを従来的に用いて、決定することができる。ClustalWは、IGBMC（Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire、B.P. 163、67404 Illkirch Cedex、France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/）、およびEBI（ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/）、および、EBI（European Bioinformatics Institute、Wellcome Trust Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、UK）の全てのミラーサイトを含む、幾つかのウェブサイトからダウンロードすることもできる。
【００３９】
特定の配列が、例えば、本発明よる参照配列に90％同一であるかどうかを決定するために、ClustalWプログラムバージョン1.8を使用する場合、DNA配列アラインメントのための設定を以下のように設定する：
KTUPLE = 2、TOPDIAGS = 4、PAIRGAP = 5、DNAMATRIX：IUB、GAPOPEN = 10、GAPEXT = 5、MAXDIV = 40、TRANSITIONS = 重み付けなし。
【００４０】
ClustalWプログラムバージョン1.8を用いた、タンパク質の配列アラインメントのための設定は以下の通りである：
KTUPLE = 1、TOPDIAG = 5、WINDOW = 5、PAIRGAP = 3、GAPOPEN = 10、GAPEXTEND = 0.05、GAPDIST = 8、MAXDIV = 40、MATRIX = GONNET、ENDGAPS(OFF)、NOPGAP、NOHGAP。
【００４１】
さらに、相同性とは、好ましくは、コードされるタンパク質が、配列番号：2、4、6または8の下で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも40％、より好ましくは少なくとも60％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、および特に好ましくは少なくとも95％の配列同一性を示すことを意味する。最も好ましくは、相同性は、少なくともn％の配列同一性があることを意味し、nは40と100の間の整数である、即ち、40≦n≦100である。
【００４２】
配列番号：1（CSD12）に関して、相同性とは、好ましくは、コードされるタンパク質が、配列番号：2のアミノ酸配列に対して、少なくとも62.5％、より好ましくは少なくとも65％、さらにより好ましくは少なくとも70％、および特に好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有することを意味する。
【００４３】
配列番号：3（CSD23）に関して、相同性とは、好ましくは、コードされるタンパク質が、配列番号：4のアミノ酸配列に対して、少なくとも87％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、および特に好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有することを意味する。
【００４４】
配列番号：5（SHI）に関して、相同性とは、好ましくは、コードされるタンパク質が、配列番号：6のアミノ酸配列に対して、少なくとも65％、より好ましくは少なくとも75％、さらにより好ましくは少なくとも86％、そのうえ好ましくは少なくとも95％、および特に好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有することを意味する。
【００４５】
配列番号：7に関して、相同性とは、好ましくは、コードされるタンパク質が、配列番号：8の配列と比較した場合に、少なくとも81％、より好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも95％、および特に好ましくは少なくとも97％の配列同一性を有することを意味する。
【００４６】
さらに、相同性は、対応する核酸分子、またはそれによりコードされるタンパク質間に、機能的な、および／または構造的な同等性が存在することを意味する。上記の分子の1つに対して相同であり、これらの分子の誘導体を表す核酸分子は、一般に、同じ生物学的機能を有する修飾を示す、これらの分子の変種である。それらは、例えば他の微生物に由来する配列のような、天然に生じる変異体か、または天然に形成されるか、もしくは意図的な突然変異誘発によって生産され得る、突然変異体のいずれかであってもよい。さらに、変異体は、合成によって生産された配列であってもよい。対立遺伝子変種は、例えば、天然に生じる変異体、または合成によって生産された変異体、または組み換えDNA技術によって生産された変異体であってよい。
【００４７】
本発明の核酸分子のうちの1つの、異なる変種によってコードされるタンパク質は、それらが共通にもつある特徴を有する。これらは、例えば、酵素活性、分子量、免疫学的反応性、コンフォーメーション等、および例えばゲル電気泳動における移動の挙動、クロマトグラフィーにおける挙動、沈降係数、可溶性、分光学的特性、安定性、最適pH、最適温度等の物理学的特性を含む。
【００４８】
本発明の核酸分子の1つによってコードされるタンパク質のある特徴は、それらがデンプンの分解に関与することである。この活性は、上記のアッセイ法によって評価することができる。
【００４９】
または、デンプン分解活性は、非変性条件下での、アミロースまたはアミロペクチン含有するゲルにおけるポリアクリルアミドゲル電気泳動により、タンパク質を発現する細胞のタンパク質、またはタンパク質抽出物を分離し、その後ルゴール溶液中でゲルを染色することによって試験することができる。デンプン分解活性を有するタンパク質が、ゲル中に存在するアミロースおよび／またはアミロペクチンを分解することによって、ゲルのそれらの位置においてはより薄い染色が導かれる。
【００５０】
その上、デンプン分解活性は、被験タンパク質を発現する細胞に由来する抽出物と、アミロースまたはアミロペクチン溶液をインキュベートし、続いてそれをヨウ素によって染色することにより、確証することができる。タンパク質がデンプン分解活性を有さない場合、溶液は紫色の染色を示す。タンパク質がデンプン分解活性を有する場合、紫色の染色は認められないか、または弱い紫色の染色のみが認められる。
【００５１】
配列番号：3によってコードされるタンパク質（CSD23）またはその相同体の場合、コードされるタンパク質は、加水分解活性を持つという特性を有する。そのうえ、そのようなタンパク質は、直鎖状グルカン、非分枝グルカンのみを分解し、アミロペクチンは分解しないということを特徴とする。この特性は、実施例3および7において説明されるように、例えば、アミロースおよびアミロペクチンを各々含むゲルを分離ゲルとして用いた不連続系PAGEにおいて、タンパク質を発現する細胞の可溶性タンパク質画分を分離し、ゲルをヨウ素によって染色することにより、試験することが可能である。配列番号：3によってコードされるタンパク質またはその相同体は、アミロースのみを分解することができ、アミロペクチンを分解することはできず、これはゲルの陰性染色によって検出可能である。（図11も参照のこと）。
【００５２】
配列番号：5によってコードされるタンパク質（SHI）またはその相同体の場合、コードされるタンパク質は、加水分解活性をもつという特性を有する。これは、実施例10および図14において説明されるように、不連続系PAGEにおいて示され得る。そのようなタンパク質は、アミロペクチン、特に溶解したアミロペクチンを分解する能力（図14および図15を参照のこと）によってさらに特徴付けられる。この特性は、タンパク質をアミロペクチン溶液とインキュベートし、その後それをヨウ素によって染色することにより、容易に試験することができる。青色の染色の減少は、アミロペクチンの分解を示すものである。そのうえ、SHIタンパク質は、その活性がデンプンからのマルトオリゴ糖、好ましくはマルトース、マルトトリオースおよび／またはマルトテトラオースの遊離を導くという特性を有する。これは、タンパク質を可溶性デンプンとインキュベートし、例えば、実施例3および実施例10において説明され、かつ図16において示されるように、薄層クロマトグラフィー（TLC）によってデンプン分解産物を分離することによって確証することができる。
【００５３】
SHIタンパク質は、好ましくは、α-アミラーゼ活性をも有する。この活性は、実施例において、特に実施例3および実施例11において説明されるように試験することができる。好ましくは、それは非還元末端においてブロックされたp-ニトロフェニル-マルトヘプタオース（PNPG7）を基質として用い、そのタンパク質によって基質として使用されるかどうかを決定することによって試験される。
【００５４】
SHIタンパク質はさらに、好ましくは、プラスチド標的配列を含むことによって、および葉緑体、特に単離葉緑体に輸送される能力によって特徴付けられる。後者の特性は、例えば実施例4および実施例12において説明されるように、輸送実験を行うことによって試験することが可能である。
【００５５】
配列番号：5の場合、コードされるタンパク質（SHI）は、好ましくは、アミノ酸配列から計算すると、80kDa〜90kDa、好ましくは82kDa〜88kDa、より好ましくは83kDa〜87kDa、および最も好ましくは約86 kDaの分子量を有する。配列番号：7によってコードされるタンパク質（ppt-β-アミラーゼ）またはその相同体の場合、コードされるタンパク質は、それがβ-アミラーゼ活性をもつことを特徴とする。この活性は、例えば、実施例3において説明されるように試験することができる。好ましくは、それは、そのタンパク質が、還元末端においてグルコシド結合によってp-ニトロフェニル基に連結された、マルトオリゴ糖を分解できるかどうかを評価することによって決定される。特に、β-アミラーゼの特異的な基質は、ブロックされていないp-ニトロフェニル-マルトペンタオース（PNPG5）である。β-アミラーゼ活性は、可溶化したデンプンまたは未精製のジャガイモのデンプン顆粒と共に、そのタンパク質をインキュベートし、薄層クロマトグラフィー（TLC）によって反応産物を分離することによって試験することもできる。α-アミラーゼは、例えば、一連のマルトオリゴ糖を生産する一方、β-アミラーゼ活性の産物はマルトースのみである（実施例3および図4を参照のこと）。
【００５６】
そのうえ、本発明によるβ-アミラーゼタンパク質は、好ましくは、プラスチド標的配列を含むこと、および葉緑体、特に単離葉緑体に輸送されるその能力によって特徴付けられる。後者の特性は、例えば実施例4において説明されるように輸送実験を行うことによって試験することが可能である。
【００５７】
さらに、コードされるタンパク質、特に配列番号：5および配列番号：7によってコードされるタンパク質およびその相同体は、例えばアンチセンス手法を介してその活性を低下させられた植物が、それらの葉において合成されるデンプン（移動デンプン）をもはや動員することができないことを意味する、いわゆる「デンプン過剰」の表現型を示すという特有な特性を示す。これは、そのような植物がその葉においてデンプンの蓄積を示すことを意味する。この特性は、例えば実施例5および実施例13において説明されるように試験されることが可能である。特に、異なる時間間隔で植物のソース葉を暗所に維持し、その後、それらのデンプン含量を決定するためにヨウ素によって染色する。暗所において移動デンプンを動員することができない植物の葉は青色に染色し、より長時間暗所においたものでは、少なくとも、これらの葉における青色の染色は、例えば、対応する野生型植物の葉において生じ得る染色と比較してより濃いものであるか、または染色が明らかである（図8、19、20および21を参照のこと）。
【００５８】
そのうえ、葉における移動デンプンの蓄積は、葉におけるデンプン含量を酵素により決定することによって試験することもできる。これは、例えばMuller-Roberら（EMBO J. 11(1992)、1229〜1238）において説明されるように行うことができる。本発明によるSHIタンパク質またはβ-アミラーゼの活性が低下している植物の葉は、対応する野生型植物の葉と比較した場合に、好ましくは、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも100％、さらにより好ましくは少なくとも200％、なお一層好ましくは少なくとも400％、および特に好ましくは少なくとも600％のデンプン含量の増加を示す（例えば図9および図23を参照のこと）。さらに、本発明によるSHIタンパク質またはβ-アミラーゼの活性が低下している植物の葉は、対応する野生型植物の対応する葉よりも長い暗期の間生存する（図22を参照のこと）。
【００５９】
本発明の核酸分子は、例えばゲノムDNAまたはcDNAのようなDNA分子であり得る。さらに、本発明の核酸分子は、RNA分子であってもよい。本発明の核酸分子は、例えば天然の供給源から得ることが可能であるか、または、合成によって、もしくは組み換え技術によって、生産することが可能である。
【００６０】
本発明の核酸分子により、デンプンの分解に関与する高純度かつ／または十分な量のタンパク質を生産し、かつこれらのタンパク質の改変された活性を有する遺伝子操作植物を生産する宿主細胞を調製することができる。本発明の枠内において、「高純度」という用語は、本発明によるタンパク質が、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％の純度を示すことを意味する。
【００６１】
好ましい態様において、本発明の核酸分子は、植物、好ましくはデンプン貯蔵植物、より好ましくはナス科の植物、特に好ましくはジャガイモ（Solanum tuberosum）に由来する。
【００６２】
本発明はまた、本発明の核酸分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにも関連する。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも10、特に少なくとも15、および特に好ましくは少なくとも50ヌクレオチドの長さを有する。それらは、本発明の核酸分子に特異的にハイブリダイズするということ、即ち、それらが他のタンパク質、特に他のデンプン分解酵素をコードする核酸配列にハイブリダイズしないか、または非常に低い程度でハイブリダイズすることを特徴とする。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、PCR反応のような増幅技術のためのプライマーとして、または、関連遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００６３】
さらに、本発明は、上記の本発明の核酸分子の1つを含むベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子技術において一般に使用される他のベクターに関連する。本発明の好ましい態様においては、本発明のベクターは、植物細胞の形質転換に適している。特に好ましくは、そのようなベクターは、おそらく隣接する制御領域と共に、本発明の核酸分子を植物細胞のゲノムに組み込ませることを可能にする。その例は、アグロバクテリウム媒介遺伝子転移において使用することができるバイナリーベクターであり、その幾つかは既に市販されている。
【００６４】
その他の好ましい態様においては、ベクターに含まれる核酸分子は、原核細胞または真核細胞における、翻訳可能な、または翻訳可能でない（例えばアンチセンスまたはリボザイム）RNAの転写および合成を確実にする調節因子に連結される。
【００６５】
原核細胞または真核細胞における、例えば大腸菌における本発明の核酸分子の発現は、これらの分子によりコードされる酵素の生物学的活性、および／または酵素活性のより正確な特徴付けを可能にするため、興味深い。さらに、干渉作用をもつ酵素を含まない、そのような原核細胞または真核細胞において、そのタンパク質を発現することが可能である。加えて、分子生物学における通常の方法（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと）によって、核酸分子に異なる突然変異を挿入し、改変された生物学的特性を有し得るタンパク質の合成を導くことが可能である。一方では、これに関連して、コードDNA配列の5'末端または3'末端からの連続的な欠失によって核酸分子が産生され、その核酸分子が対応して短くなったタンパク質の合成を導く、欠失突然変異体を生産することが可能である。ヌクレオチド配列の5'末端におけるそのような欠失により、例えば、おそらく存在し、かつタンパク質の分泌、またはプラスチド、液胞、ミトコンドリアもしくはアポプラストにおける局在化に寄与する、アミノ酸配列を同定することが可能になる。
【００６６】
これによって、対応する配列の除去によってもはや分泌はされないが、対応する宿主生物体の細胞内に残るか、または他のシグナル配列の付加によって、例えばプラスチド、ミトコンドリア、液胞のような他の画分に局在するタンパク質の、意図的な調製を可能にする。
【００６７】
これに対して、アミノ酸配列の修飾が、例えば生物学的活性および／または酵素活性、またはタンパク質／酵素の制御に影響を与える位置における、点突然変異の導入も考えられる。このようにして、例えば、改変された立体選択性および位置選択性、もしくは改変されたKm値を有する突然変異体、または細胞内に通常存在し、アロステリック制御もしくは共有結合修飾を介して実現される制御機構にもはや従わない突然変異体を作製することが可能である。
【００６８】
さらに、改変された基質特異性または産物特異性を有する突然変異体を調製することができる。そのうえ、改変された活性-温度プロフィールを有する突然変異体を調製することが可能である。
【００６９】
さらに、植物における発現の場合、本発明の核酸分子への突然変異の挿入は、遺伝子の発現率を増加させ、かつ／または、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の活性を上昇させる。
【００７０】
原核細胞における遺伝子操作のために、本発明の核酸分子またはそのような分子の一部を、DNA配列の組み換えによって突然変異誘発または配列の修飾を可能にするプラスミドに導入することができる。標準法（Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、USAを参照のこと）では、塩基の交換を行わせるか、または天然もしくは合成の配列を付加させる。DNA断片は、アダプターおよびリンカーを断片に適用することによって、互いに連結することができる。さらに、適切な制限部位を提供するか、または余分のDNAもしくは制限部位を除去する操作法を使用することができる。挿入、欠失または置換が可能である、それらの場合において、インビトロ突然変異誘発、「プライマー修復」、制限（restriction）またはライゲーションを用いることができる。一般に、配列解析、制限解析、ならびに他の生化学的および分子生物学的方法が、解析法として行われる。
【００７１】
本発明のその他の態様は、上記の本発明の核酸分子によって、または本発明のベクターによって形質転換された宿主細胞、特に原核細胞または真核細胞、ならびにそのような形質転換細胞に由来し、本発明の核酸分子またはベクターを含む細胞に関連する。
【００７２】
その他の好ましい態様によると、宿主細胞は微生物の細胞である。本発明に関しては、「微生物」という用語は、Schlegelの「Allgemeine Mikrobiologie」（Georg Thieme Verlag、1985、1〜2）において定義される、細菌および全ての原生生物（例えば、真菌類、特に酵母、藻類）を含む。本発明の好ましい態様は、藻類の細胞、およびコウジカビ属（Aspergillus）、バチルス属（Bacillus）、サッカロミセス属（Saccharomyces）またはピチア属（Pichia）（Rodriguez、Journal of Biotechnology 33(1994)、135〜146；Romanos、Vaccine、第9巻(1991)、901以下参照）に属する宿主細胞に関連する。本発明の特に好ましい態様は、大腸菌の細胞に関連する。組み換えタンパク質を生産するためのそのような宿主細胞の調製は、当業者に既知の方法によって実行することができる。
【００７３】
本発明の好ましい態様においては、本発明の宿主細胞は、多糖類形成酵素および／または多糖類分解酵素の活性のような、干渉する酵素活性を示さない。
【００７４】
異なる発現系の概観は、例えば、Methods in Enzymology 153(1987)、385〜516、Bitterら（Methods in Enzymology 153(1987)、516〜544）、およびSawersら（Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996)、1〜9）、Billman-Jacobe（Current Opinion in Biotechnology 7(1996)、500〜4）、Hockney（Trends in Biotechnology 12(1994)、456〜463）、Griffithsら、Methods in Molecular Biology 75(1997)、427〜440に含まれる。酵母の発現系の概観は、例えば、Hensingら（Antonie van Leuwenhoek 67(1995)、261〜279）、Bussineauら（Developments in Biological Standardization 83(1994)、13〜19）、Gellissenら（Antonie van Leuwenhoek 62(1992)、79〜93）、Fleer（Current Opinion in Biotechnology 3(1992)、486〜496）、Vedvick（Current Opinion in Biotechnology 2(1991)、742〜745）およびBuckholz（Bio/Technology 9(1991)、1067〜1072）によって与えられる。
【００７５】
発現ベクターは、文献において広範に説明されてきた。原則として、それらは、選択マーカー遺伝子、および選択された宿主における複製を確実にする複製起点のみならず、細菌またはウイルスプロモーターをも含み、ほとんどの場合には、転写についての終結シグナルを含む。プロモーターと終結シグナルとの間には、コードDNA配列の挿入を可能にする、少なくとも1つの制限部位またはポリリンカーが存在する。対応する遺伝子の転写を本来制御するDNA配列は、選択された宿主生物において活性である場合、プロモーター配列として使用することができる。しかし、この配列は、他のプロモーター配列と交換することも可能である。遺伝子の構成的な発現を生み出すプロモーター、および下流の遺伝子の発現の意図的な制御を可能にする誘導可能プロモーターを使用することが可能である。これらの特性を有する、細菌およびウイルスのプロモーター配列は、文献において詳細に説明されている。微生物（例えば大腸菌、出芽酵母(S.cerevisiae)）における発現のための調節配列は、文献において十分に説明されている。下流の遺伝子の特に高度な発現を可能にするプロモーターは、例えばT7プロモーター（Studierら、Methods in Enzymology 185(1990)、60〜89）、lacUV5、trp、trp-lacUV5（DeBoerら、RodriguezおよびChamberlin編、Promoters, Structure and Funciton；Praeger、New York(1982)、462〜481；DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1983)、21〜25）、lp1、rac（Borosら、Gene 42(1986)、97〜100）である。原則として、タンパク質量は、微生物の成長周期の対数期の中期からおよそ終期まで最高となる。したがって、好ましくは、誘導可能プロモーターがタンパク質の合成に使用される。これらのプロモーターは、しばしば、構成的なプロモーターよりも高いタンパク質収量を導く。高度に構成的なプロモーターの使用は、クローニングされた遺伝子の連続した転写および翻訳を導き、したがって他の必須な細胞の機能のためのエネルギーが失われ、その影響として細胞の成長が遅れるという結果がしばしばもたらされる（Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak、Molekulare Biotechnologie(1995)、Spektrum Akademischer Verlag GmbH、Heidelberg、Berlin、Oxford、p.342）。したがって、最適な量のタンパク質を得るために、二段階の工程がしばしば用いられる。第一に、最適な条件下において比較的高い細胞密度にまで宿主細胞を培養する。その後、第二段階において、使用するプロモーターのタイプに依存して転写を誘導する。これに関連して、ラクトースまたはIPTG（＝イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）によって誘導され得るtacプロモーターが特に適している（deBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80(1983)、21〜25）。転写についての終結シグナルも、文献において説明されている。
【００７６】
デンプンの分解に関与するタンパク質をコードするDNAによる、宿主細胞の形質転換は、原則として、例えばSambrookら（Molecular Cloning：A Laboratory Course Manual、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Press、New York；Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1990）において説明される、標準法によって実行することができる。使用される特定の宿主細胞の必要条件、特にpH値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素等に関する条件を満たす栄養培地において、宿主細胞を培養する。
【００７７】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質、および生物学的に活性なその断片、ならびにそのタンパク質の合成を可能にする条件下において本発明による宿主細胞が培養され、その後そのタンパク質が培養細胞および／または培養培地から単離される、タンパク質および生物学的に活性なその断片の調製のための方法に関連する。
【００７８】
好ましい態様によると、本発明のタンパク質は、組み換えによって作製されたタンパク質である。本発明に関しては、これは、タンパク質をコードするDNA配列を宿主細胞に挿入し、そこでそれを発現することによって調製されたタンパク質である。タンパク質はその後、宿主細胞および／または培養培地から単離することができる。
【００７９】
ここで、本発明の核酸分子によって、高純度かつ／または十分な量の、本発明の組み換えタンパク質を生産する宿主細胞を調製することが可能になる。本発明の枠内において、「高純度」という用語は、本発明によるタンパク質が少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％の程度の純度を示すことを意味する。
【００８０】
宿主細胞によって生産されるタンパク質は、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ゲルろ過、HPLC逆相クロマトグラフィー等の、従来的な精製法によって精製することができる。
【００８１】
宿主細胞において発現される本発明の核酸分子の修飾により、特定の特性によって、培養培地から単離するのがより容易であるポリペプチドの宿主細胞における生産が可能になる。したがって、発現されるタンパク質は、その特異的な結合特性によって親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離を可能にする、付加的なポリペプチド配列を有する融合タンパク質として発現され得る（例えば、Hoppら、Bio/Technology 6(1988)、1204〜1210；Sassenfeld、Trends Biotechnol. 8(1990)、88〜93）。
【００８２】
そのうえ、本発明は、本発明によるタンパク質を特異的に認識する抗体にも関連する。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよく、当技術分野において周知の方法に従って調製することができる。「抗体」という用語は、結合特異性をなおも保持する抗体の断片も含む。
【００８３】
本発明の核酸分子の提供により、遺伝子操作によって本発明の核酸分子を含み、かつ発現する、植物細胞を調製することが可能になる。
【００８４】
本発明は、したがって、本発明の核酸分子もしくは本発明のベクターによって形質転換されたトランスジェニック植物細胞、またはそのような細胞の子孫細胞であって、核酸分子が、植物細胞における翻訳可能なmRNAの転写を可能にする調節因子の制御下にある細胞にも関連する。
【００８５】
例えば、対応する核酸分子の発現により、本発明のタンパク質の活性を導入することによって、デンプンの分解を増加させた植物細胞を生産する可能性が開かれる。ゆえに、植物細胞における本発明の核酸分子の発現によって、野生型の細胞には以前には存在しなかったデンプン分解活性を発現すること、および、野生型の細胞に既に存在していたデンプン分解活性を、付加的な発現によって増加させることが可能である。これに関して、穀物、特にビールのようなアルコールの生産において使用される穀物の胚乳におけるデンプン分解活性を増加させることが特に興味深いものであり得る。一つの例は、特にオオムギにおけるものである。さらに、例えば改変された温度依存性、または基質特異性もしくは産物特異性を有する、本発明の酵素を得るために、当業者に既知の方法に従って本発明の核酸分子を改変することが可能である。そのような方法は、既に上記の異なる文脈においてより詳細に説明されている。
【００８６】
植物の宿主細胞にDNAを挿入することができる、多数の技術が利用可能である。これらの技術は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換因子として用いる、T-DNAによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、DNAの注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃手法によるDNAの挿入、および他の可能なものを含む。
【００８７】
植物細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換の使用については、広範に渡って研究され、欧州特許第120 516号；Hoekema、The Binary Plant Vector System、Offsetdrukkerij Kanters B.V.、Alblasserdam(1985)、第V章；Fraleyら、Crit.Rev.Plant Sci. 4(1993)、1〜46；およびAnら、EMBO J. 4(1985)、277〜287において十分に説明されている。ジャガイモの形質転換に関しては、例えば、Rocha-Sosaら（EMBO J.8(1989)、29〜33）を参照のこと。
【００８８】
アグロバクテリウムに基づくベクターによる、単子葉植物の形質転換についても説明されている（Chanら、Plant Mol.Biol. 22(1993)、491〜506；Hieiら、Plant J. 6(1994) 271〜282；Dengら、Science in China 33(1990)、28〜34；Wilminkら、Plant Cell Reports 11(1992)、76〜80；Mayら、Bio/Technology 13(1995)、486〜492；ConnerおよびDormisse、Int.J.Plant Sci.153(1992)、550〜555；Ritchieら、Transgenic Res. 2(1993)、252〜265）。単子葉植物を形質転換するための代替の系は、遺伝子銃手法による形質転換（WanおよびLemaux、Plant Physiol. 104(1994)、37〜48；Vasilら、Bio/Technology 11(1993)、1553〜1558；Ritalaら、Plant Mol.Biol. 24(1994)、317〜325；Spencerら、Theor.Appl.Genet. 79(1990)、625〜631）、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性にした細胞のエレクトロポレーション、グラスファイバーを介したDNAの挿入である。特に、トウモロコシの形質転換は、文献において繰り返し説明されている（例えば、国際公開公報第95/06128号、欧州特許第0 513 849号、欧州特許第0 465 875号、欧州特許第29 24 35号；Frommら、Biotechnology 8(1990)、833〜844；Gordon-Kammら、Plant Cell 2(1990)、603〜618；Kozielら、Biotechnology 11(1993)、194〜200；Morocら、Theor.Appl.Genet. 80(1990)、721〜726を参照のこと）。
【００８９】
他のタイプの穀物で成功した形質転換も、例えばオオムギ（WanおよびLemaux、前記；Ritalaら、前記；Krensら、Nature 296(1982)、72〜74）およびコムギ（Nehraら、Plant J. 5(1994)、285〜297）について説明されている。一般に、植物細胞において活性な任意のプロモーターが、植物細胞において核酸分子を発現するのに適している。プロモーターは、本発明の植物における発現が構成的に、または特定の組織においてのみ、植物の発育の特定の時期にのみ、または外部の影響によって決定される時期にのみ起こるように選択することができる。プロモーターは、植物に対して同種または異種であってもよい。
【００９０】
適切なプロモーターは、例えば、構成的な発現に役立つ、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAのプロモーター（例えば米国特許第5,352,605号を参照のこと）、およびユビキチンプロモーター（例えば米国特許第5,614,399号を参照のこと）、ジャガイモにおける塊茎特異的な発現に役立つ、パタチン遺伝子プロモーターB33（Rocha-Sosaら、EMBO J. 8(1989)、23〜29）、または、例えばST-LS1プロモーター（Stockhausら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84(1987)、7943〜7947；Stockhausら、EMBO J. 8(1989)、2445〜2451）のような、光合成活性組織のみにおける発現を確実にするプロモーター、Ca/bプロモーター（例えば米国特許第5,656,496号、米国特許第5,639,952号、Bansalら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89(1992)、3654〜3658を参照のこと）、およびRubisco SSUプロモーター（例えば米国特許第5,034,322；米国特許第4,962,028号を参照のこと）、またはコムギ由来のグルテリンプロモーターのような胚乳特異的な発現を確実にするプロモーター（HMWプロモーター）（Anderson、Theoretical and Applied Genetics 96(1998)、568〜576；Thomas、Plant Cell 2(12) (1990)、1171〜1180）、イネ由来のグルテリンプロモーター（Takaiwa、Plant Mol.Biol. 30(6)(1996)、1207〜1221；Yoshihara、FEBS Lett. 383(1996)、213〜218；Yoshihara、Plant and Cell Physiology 37(1996)、107〜111）、トウモロコシ由来の収縮（shrunken）プロモーター（Maas、EMBO J. 8(11) (1990)、3447〜3452；Werr、Mol.Gen.Genet. 202(3) (1986)、471〜475；Werr、Mol. Gen.Genet. 212(2) (1988)、342〜350）、USPプロモーター、ファゼオリンプロモーター（Sengupta-Gopalan、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82(1985)、3320〜3324；Bustos、Plant Cell 1(9) (1989)、839〜853）、またはトウモロコシ由来のゼイン遺伝子のプロモーター（Pedersenら、Cell 29(1982)、1015〜1026；Quatroccioら、Plant Mol.Biol. 15(1990)、81〜93）である。しかし、外部の影響によって決定される時点でのみ活性化されるプロモーターを使用することもできる（例えば国際公開公報第93/07279号を参照のこと）。これに関連しては、単純な誘導を可能にする熱ショックタンパク質のプロモーターが特に関心対象であり得る。さらに、ソラマメ（Vicia faba）および他の植物における種子特異的な発現を確実にする、ソラマメに由来するUSPプロモーターのような種子特異的プロモーターを使用してよい（Fiedlerら、Plant Mol.Biol. 22(1993)、669〜679；Baumleinら、Mol.Gen.Genet. 225(1991)、459〜467）。さらに、国際公開公報第91/01373号において説明される、果実特異的なプロモーターを使用してもよい。
【００９１】
さらに、転写を正しく終結させる役割を果たし、かつ転写産物の安定化における機能を有すると考えられるポリ-A尾部を、転写産物に付加する役割を果たす、終結配列が存在してよい。そのような因子については、文献において説明されており（例えばGielenら、EMBO J. 8(1989)、23〜29を参照のこと）、自由に置き換えることができる。
【００９２】
本発明のトランスジェニック植物細胞は、とりわけ、これらの細胞において天然には生じない本発明の核酸分子を含むことによって、または、これらの細胞においてそのような核酸分子が天然に生じる場合は、それが天然には生じない部位において、ゲノムに組み込まれるそのような核酸分子の1つまたは複数の付加的なコピーを含むことによって、天然に生じる植物細胞と区別することができる。これは、例えば、サザンブロット解析によって確証することができる。さらに、そのような本発明のトランスジェニック植物細胞は、それらのゲノムに安定して組み込まれた本発明の核酸分子の少なくとも1つのコピーを含むという点で、天然に生じる植物細胞と区別することができる。
【００９３】
さらに、本発明の植物細胞は、好ましくは、以下の特徴のうち少なくとも1つによって、天然に生じる植物細胞と区別することができる：挿入された本発明の核酸分子が植物細胞に対して異種である場合、トランスジェニック植物細胞は、挿入された本発明の核酸分子の転写産物を有することが見出される。後者は、例えば、ノーザンブロット解析によって検出することができる。本発明の植物細胞は、好ましくは、挿入された本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。これは、例えば、免疫学的方法、特にウエスタンブロット解析によって示され得る。
【００９４】
本発明による植物細胞は、好ましくは、対応する野生型植物細胞と比較した場合、本発明の核酸分子からの転写産物の量の、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、なお一層好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも100％の増加を示す。
【００９５】
さらに、植物細胞は、好ましくは、対応する野生型細胞と比較した場合、本発明のタンパク質の量の、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、なお一層好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも100％の増加を示す。
【００９６】
好ましい態様においては、本発明による植物細胞は、対応する野生型細胞と比較した場合、本発明によるタンパク質の活性の、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、なお一層好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも100％の増大を示すということをさらに特徴とする。デンプン分解活性は、上記のように決定することができる。
【００９７】
トランスジェニック植物細胞は、当業者に公知の方法に従って完全な植物体に再生することができる。
【００９８】
本発明はまた、本発明のトランスジェニック植物細胞の再生によって得ることが可能な植物にも関連する。さらに、本発明は、上記のトランスジェニック植物細胞を含む植物に関連する。
【００９９】
トランスジェニック植物は、原則として、任意の植物種の植物、即ち、単子葉植物および双子葉植物であってよい。好ましくは、植物は、商業的な目的のため、特に栄養目的または技術的な目的、特に産業上の目的のために、人間によって栽培される有用な植物、例えば、アルコールの生産において使用される植物である。それらは、好ましくは、例えば穀物種（ライムギ、オオムギ、オートムギ、コムギ、キビ、サゴ等）、イネ、エンドウ、インゲンマメ、キャッサバおよびジャガイモのような、デンプン貯蔵植物；トマト、ナタネ、ダイズ、アサ、アマ、ヒマワリ、ササゲまたはクズウコン、繊維形成植物（例えば、アマ、アサ、ワタ）、油貯蔵植物（例えば、ナタネ、ヒマワリ、ダイズ）、およびタンパク質貯蔵植物（例えば、豆類、穀物、ダイズ）である。本発明は、例えばブドウのような、果実植物または果樹およびヤシにも関連する。さらに、本発明は、飼料植物（例えば、牧草類、アルファルファ、クローバー、ライグラスのような飼料および牧草）、ならびに蔬菜植物（例えば、トマト、レタス、チコリー）、および観賞植物（例えば、チューリップ、ヒヤシンス）に関連する。デンプン貯蔵植物が好ましい。サトウキビおよびテンサイ、およびジャガイモの植物体、トウモロコシ、イネ、コムギおよびトマトの植物体は特に好ましい。
【０１００】
植物における核酸分子の発現において、原則として、合成されたタンパク質は植物細胞の任意の区画（例えば、細胞質ゾル、プラスチド、液胞、ミトコンドリア）、または植物の任意の区画（例えば、アポプラスト）に、局在化されうる可能性がある。特定の区画における局在化を達成するため、コード領域は、必要な場合、対応する区画における局在化を確実にするDNA配列に連結されなければならない。使用されるシグナル配列は各々、酵素をコードするDNA配列と同じ読み枠内に配置されなければならない。
【０１０１】
プラスチドにおける局在化を確実にするために、以下の移行ペプチドのうち1つを使用することが考えられる：プラスチドフェレドキシンの移行ペプチド：Jansenら（Current Genetics 13(1988)、517〜522）に含まれる、ホウレンソウのNADP+酸化還元酵素（FNR）の移行ペプチド。特に、5’非翻訳領域および移行ペプチドをコードする配列を含む、そこに開示されるcDNA配列のヌクレオチド-171〜165にわたる配列を使用することができる。その他の例は、成熟ロウ様（waxy）タンパク質の最初の34アミノ酸残基を含む、トウモロコシのロウ様タンパク質の移行ペプチドである（Klosgenら、Mol.Gen.Genet. 217(1989)、155〜161）。成熟タンパク質の最初の34アミノ酸を含まない、この移行ペプチドを使用することも可能である。さらに、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（Wolterら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85(1988)、846〜850；Nawrathら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91(1994)、12760〜12764）、NADPリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Gallardoら、Planta 197(1995)、324〜332）、グルタチオンレダクターゼ（Creissenら、Plant J. 8(1995)、167〜175）またはR1タンパク質（Lorberthら、Nature Biotechnology 16(1998)、473〜477）のシグナルペプチドを使用することができる。
【０１０２】
液胞における局在化を確実にするために、以下の移行ペプチドのうち1つを使用することが考えられる：パタチンタンパク質のN末端配列（146アミノ酸）（Sonnewaldら、Plant J. 1(1991)、95〜106）、または、MatsuokaおよびNeuhaus、Journal of Experimental Botany 50(1999)、165〜174；ChrispeelsおよびRaikhel、Cell 68(1992)、613〜616；MatsuokaおよびNakamura、Proc.Natl.Acad. Sci. USA 88(1991)、834〜838；BednarekおよびRaikhel、Plant Cell 3(1991)、1195〜1206；NakamuraおよびMatsuoka、Plant Phys. 101(1993)、1〜5によって説明されるシグナル配列。
【０１０３】
ミトコンドリアにおける局在化を確実にするために、例えば、Braunら（EMBO J. 11(1992)、3219〜3227）によって説明される移行ペプチドを使用することが考えられる。
【０１０４】
アポプラストにおける局在化を確実にするために、以下の移行ペプチドのうちの1つを使用することが考えられる：プロテイナーゼインヒビターII遺伝子（Keilら、Nucleic Acid Res. 14(1986)、5641〜5650；von Schaewenら、EMBO J. 9(1990)、30〜33）のシグナル配列、エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）に由来するレバンスクラーゼ遺伝子（GeierおよびGeider、Phys.Mol.Plant Pathol. 42(1993)、387〜404）のシグナル配列、最初の33アミノ酸をコードする、ジャガイモ（Solanum tuberosum）に由来するパタチン遺伝子B33（Rosahlら、Mol.Gen.Genet. 203(1986)、214〜220）の断片のシグナル配列、または、Oshimaら（Nucleic Acid Res. 18(1990)、181）によって説明されるもののシグナル配列。
【０１０５】
配列番号：1、5および7において示される核酸配列は、プラスチドタンパク質をコードする。
【０１０６】
本発明のさらなる対象は、本発明の核酸分子を用いて遺伝子操作され、かつ非形質転換野生型細胞／非形質転換野生型植物と比較して、デンプン分解活性の増大を示す、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を生産するための方法である。本方法において、対応する野生型細胞／野生型植物と比較して、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の発現および／または活性が増大する。特に、そのような方法は、植物細胞における、本発明による核酸分子の発現を含む。本発明による核酸分子は、好ましくは、植物細胞における発現を確実にするプロモーターに連結される。特に好ましい態様においては、本方法は、本発明による核酸分子の植物細胞への導入、およびこの細胞から植物体への再生を含む。
【０１０７】
発現の増加は、例えば、ノーザンブロット解析またはウエスタンブロット解析によって検出することができる。活性の増加は、植物細胞に由来するタンパク質抽出物を、それらのデンプン分解活性について試験することによって検出することができる。デンプン分解活性は、例えば、上記のように、または、本出願の実施例において説明されるように測定することができる。
【０１０８】
本発明は、本発明の植物の繁殖材料にも関連する。「繁殖材料」という用語は、栄養的にまたは生殖的に子孫を生産するのに適した植物の成分を含む。栄養繁殖のために適切な方法は、例えば、さし木、カルス培養、根茎または塊茎である。他の繁殖材料には、例えば、果実、種子、実生、プロトプラスト、細胞培養物等が含まれる。好ましい繁殖材料は、塊茎および種子である。本発明はまた、例えば果実、種子、塊茎または根茎のような、本発明の植物の収穫可能な部分にも関連する。
【０１０９】
そのうえ、本発明による核酸分子を活用して、本発明によるタンパク質の活性が低下し、それによりデンプン分解の減少を導く植物細胞および植物を生産することも可能である。この活性の低下は、例えば、本発明の核酸分子のアンチセンス発現、適切なリボザイムの発現、共抑制（cosuppression）効果、RNA干渉によって、いわゆる「インビボ突然変異誘発」、抗体の発現によって、または優性阻害突然変異体の発現によって達成することが可能である。好ましくは、活性の低下は、本発明のデンプン分解酵素をコードする内在性の遺伝子の発現を阻害することによって達成される。
【０１１０】
「デンプンの分解の減少」という用語は、好ましくは、対応する野生型細胞と比較した場合に、本発明の少なくとも1つの核酸分子の転写産物の量が、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらにより好ましくは少なくとも50％、なお一層好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも90％減少することを意味する。
【０１１１】
その他の好ましい態様においては、「デンプンの分解の減少」という用語は、対応する野生型細胞と比較した場合に、本発明の少なくとも1つのタンパク質の量が、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらにより好ましくは少なくとも50％、なお一層好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも90％減少することを意味する。
【０１１２】
「デンプンの分解の減少」はさらに、好ましくは、対応する野生型植物と比較した場合に、植物の実質的に全ての細胞、器官、組織もしくは部分においてデンプン分解が減少すること、または植物のある細胞、器官、組織もしくは部分のみにおいてデンプン分解が減少することを意味する。減少は、最も好ましくは、対応する野生型細胞と比較した場合に、本発明の少なくとも1つのデンプン分解酵素の活性が、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらにより好ましくは少なくとも50％、特に少なくとも70％、および最も好ましくは少なくとも90％減少することを意味する。特に好ましい態様においては、植物細胞または植物におけるデンプンの分解が、完全に阻害される。本発明のタンパク質のデンプン分解活性は、実施例において説明されるように決定することができる。
【０１１３】
配列番号：7によってコードされる本発明によるタンパク質またはその相同体に関して、そのようなタンパク質の活性の低下、好ましくは対応する野生型植物において検出可能な活性の、約50％未満のレベルまでの低下を示すトランスジェニック植物は、以下の特徴のうち少なくとも1つを示す：
（i）暗所において異なる時間間隔で維持された場合、ソース葉は、同じ条件下において栽培された対応する野生型植物の葉と比較して、より高いデンプン含量を有する（即ち、デンプン分解が減少している）；
（ii）明所において生長させた場合、植物のソース葉は、同じ条件下において生長させた対応する野生型植物の葉と比較して、より高いデンプン含量を有し、特に、野生型植物のものの少なくとも150％、より好ましくは少なくとも180％、さらにより好ましくは少なくとも240％のデンプン含量を有する。
【０１１４】
配列番号：5によってコードされる、本発明によるタンパク質またはその相同体に関して、対応する野生型植物と比較した場合に、そのようなタンパク質の活性の低下を示すトランスジェニック植物は、以下の特徴のうち少なくとも1つを示す：
（i）暗所において異なる時間間隔で維持された場合、ソース葉は、同じ条件下において栽培された対応する野生型植物の葉と比較して、より高いデンプン含量を有する（即ち、デンプン分解が減少している）；
（ii）明所において生長させた場合、植物のソース葉は、同じ条件下において生長させた対応する野生型植物の葉と比較して、より高いデンプン含量を有し、特に、野生型植物のものの少なくとも300％、好ましくは少なくとも350％、より好ましくは少なくとも400％、なお一層好ましくは少なくとも600％、および特に好ましくは少なくとも800％のデンプン含量を有する；
（iii）これらの植物の葉は、対応する野生型植物由来の葉と比較して、暗所においてより長く生存可能である。
【０１１５】
本発明のDNA分子の転写産物に対して、または対応するゲノム配列のイントロン配列に対して、相補的であるアンチセンスRNAをコードするDNA分子、ならびにこれらのアンチセンス分子もまた、本発明の対象となる。植物細胞において、転写中にアンチセンス効果を引き起こすためには、そのようなDNA分子は、少なくとも15 bpの長さ、好ましくは100 bpを超える長さ、および最も好ましくは500 bpを超える長さを有するが、通常は、5,000 bp未満、好ましくは2,500 bpより短いものである。
【０１１６】
本発明は、植物細胞における発現中に、植物細胞において、共抑制効果によって、説明されるタンパク質をコードする本発明の核酸分子の発現を減少させる、RNAの合成を導くDNA分子にさらに関連する。そのようなDNA分子は、本発明の核酸分子のコード領域もしくはその一部、および／または対応するゲノム配列のイントロン配列を含み得る。本発明は、それによりコードされるRNA分子にも関連する。共抑制および対応する方法の一般原則は、当業者に周知であり、例えば、Jorgensen（Trends Biotechnol. 8(1990)、340〜344）、Niebelら（Curr.Top.Microbiol.Immunol. 197(1995)、91〜103）、Flavellら（Curr.Top.Microbiol.Immunol. 197(1995)、43〜56）、PalaquiおよびVaucheret（Plant Mol.Biol. 29(1995)、149〜159）、Vaucheretら（Mol.Gen.Genet.248(1995)、311〜317）、およびde Borneら（Mol.Gen.Genet. 243(1994)、613〜621）、Smyth（Curr.Biol. 7(1997)、R793〜R795）およびTaylor（Plant Cell 9(1997)、1245〜1249）において説明されている。
【０１１７】
上記に説明されるアンチセンス手法を活用して、または共抑制手法を用いて、植物細胞における、本発明による核酸分子の発現を阻害するために、好ましくは、本発明によるタンパク質をコードする、内在する対応する遺伝子のヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、より好ましくは少なくとも93％、さらにより好ましくは少なくとも95％、および最も好ましくは少なくとも98％の相同性を示すDNA分子が使用される。
【０１１８】
本発明は、植物細胞における発現の際に、RNA干渉（RNAi）によって、説明されるタンパク質をコードする本発明の核酸分子の発現の減少を導くRNAをコードする、DNA分子にさらに関連する。コードされるRNAは同様に、本発明の範囲に属する。
【０１１９】
アンチセンス技術と同様の効果は、RNA干渉（RNAi）効果を媒介するために適切な構築物を発現する、トランスジェニック植物を作製することによって達成することが可能である。それにより、二重鎖RNAの形成によって、配列特異的な様式で遺伝子発現の阻害が導かれる。より具体的には、RNAi構築物において、不活性化される遺伝子（またはその一部であって、非翻訳領域を含むか、もしくは含まない）のコード領域を含むセンス部分に、対応するアンチセンス配列部分が続く。双方の部分の間には、必ずしも同じ遺伝子に由来しないイントロンを挿入することができる。転写後に、RNAi構築物は、典型的なヘアピン構造を形成する。本発明の方法に従い、RNAi技術は、Smith（Nature 407(2000)、319〜320）またはMarx（Science 288(2000)、1370〜1372）によって説明されるように実行することができる。
【０１２０】
さらなる態様において、本発明は、本発明のDNA分子の転写産物およびコードされるそれらのRNA分子を、特異的に切断するリボザイム活性を有するRNA分子をコードするDNA分子に関連する。
【０１２１】
リボザイムは、RNA分子および特異的な標的配列を切断できる、触媒活性のあるRNA分子である。組み換えDNA技術によって、リボザイムの特異性を変化させることが可能である。リボザイムには様々なクラスがある。ある遺伝子の転写産物の特異的な切断を目指す実用的な適用のためには、好ましくは、2つの異なるリボザイム群の代表的なものが使用される。第一の群は、グループIイントロンリボザイムタイプに属するリボザイムからなる。第二の群は、特有の構造的特徴として、いわゆる「ハンマーヘッド」モチーフを示すリボザイムからなる。標的RNA分子の特異的な認識は、このモチーフに隣接する配列を変化させることによって改変することができる。これらの配列は、標的分子における配列との塩基対合によって、触媒反応、したがって標的分子の切断が行われる位置を決定する。効率的な切断についての配列の要求性は低いため、原則として、実際に望まれる各々のRNA分子について、特異的なリボザイムを開発することが可能である。
【０１２２】
本発明のDNA分子の転写産物を特異的に切断するリボザイムをコードする、DNA分子を作製するために、例えば、リボザイムの触媒ドメインをコードするDNA配列を、標的酵素の配列に相同であるDNA配列と両側で連結する。触媒ドメインをコードする配列は、例えば、SCMoウイルスのサテライトDNAの触媒ドメイン（Daviesら、Virology 177(1990)、216〜224）、またはTobRウイルスのサテライトDNAの触媒ドメイン（Steineckeら、EMBO J. 11(1992)、1525〜1530；HaseloffおよびGerlach、Nature 334(1988)、585〜591）であってよい。触媒ドメインに隣接するDNA配列は、好ましくは、上記の本発明のDNA分子に由来する。リボザイムの発現およびその方法の一般原則は、例えば、欧州特許第1 0 321 201号において説明されている。植物細胞におけるリボザイムの発現は、例えば、Feyterら（Mol.Gen.Genet. 250(1996)、329〜338）において説明されている。
【０１２３】
植物細胞における、本発明によるタンパク質の活性の低下は、いわゆる「インビボ突然変異誘発」（「キメラプラスティ(chimeraplasty)」としても知られる）によって達成することもできる。本方法においては、ハイブリッドRNA/DNAオリゴヌクレオチド（キメロプラスト(chimeroplast)）が、細胞に導入される（Kippら、第5回国際植物分子生物学会(International Congress of Plant Molecular Biology、1997年9月21〜27日、シンガポール)におけるポスターセッション；DixonおよびArntzen、Metabolic Engineering in Transgenic Plantsについての会合報告書、Keystone Symposia、Copper Mountain、CO、USA、TIBTECH 15(1997)、441〜447；国際特許出願、国際公開公報第95/15972号；Krenら、Hepatology 25(1997)、1462〜1468；Cole-Straussら、Science 273(1996)、1386〜1389；Zhuら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96(1999)、8768〜8773）。RNA/DNAオリゴヌクレオチドのDNA成分の一部分は、植物細胞において内在的に生じ、かつ本発明によるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して相同であるが、突然変異を示すか、または相同領域内に位置する非相同部分を含む。内在性配列に対して相同であるRNA/DNAオリゴヌクレオチドの領域の、これらの配列との塩基対合、およびそれに続く相同的組み換えにより、オリゴヌクレオチドのDNA成分に含まれる突然変異を、植物細胞ゲノムに導入することができる。これは、本発明によるタンパク質の活性の低下を導く。
【０１２４】
さらに、植物細胞における、本発明によるタンパク質、即ち、そのようなタンパク質の特異的な断片またはエピトープを特異的に認識する抗体をコードする核酸分子を、このタンパク質の活性を阻害するために使用することができる。これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または合成抗体、および、Fab、FvまたはscFv断片等のような抗体の断片であることが可能である。モノクローナル抗体は、例えば、免疫化した哺乳動物個体に由来する脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞との融合を含む、KohlerおよびMilstein（Nature 256(1975)、495）およびGalfre（Meth.Enzymol. 73(1981)、3）において最初に説明された技術によって調製することができる。さらに、前述のペプチドに対する抗体またはその断片は、例えばHarlowおよびLane「Antibodies, A Laboratory Manual」、CSH Press、Cold Spring Harbor、1988において説明される方法を用いることによって得ることができる。植物における抗体または抗体様分子の発現は、当技術分野において周知の方法によって達成することが可能であり、例えば、完全なサイズの抗体（During、Plant Mol.Biol. 15(1990)、281〜293；Hiatt、Nature 342(1989)、469〜470；Voss、Mol.Breeding 1(1995)、39〜50）、Fab断片（De Neve、Transgenic Res. 2(1993)、227〜237）、scFv（Owen、Bio/Technology 10(1992)、790〜794；Zimmermann、Mol. Breeding 4(1998)、369〜379；Tavladoraki、Nature 366(1993)、469〜472）およびdAb（Benvenuto、Plant Mol.Biol. 17(1991)、865〜874）が、タバコ、ジャガイモにおいて（Schouten、FEBS Lett. 415(1997)、235〜241）またはシロイヌナズナにおいて、発現に成功し、総タンパク質の6.8％もの高い発現レベルに達している（Fiedler、Immunotechnology 3(1997)、205〜216）。
【０１２５】
加えて、本発明によるタンパク質の突然変異型をコードする核酸分子を、野生型タンパク質の活性を阻害するために使用することができる。そのような突然変異型は、好ましくは、そのデンプン分解活性が低下しており、タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換、および／または付加によって、対応する野生型タンパク質から誘導され得る。そのようなタンパク質の突然変異型は、キナーゼ活性の低下に加え、細胞における基質親和性の増加、および／または、例えば細胞環境においてタンパク質を安定化するアミノ酸の取り込みによる、安定性の上昇を示し得る。これらの突然変異形態は、天然に生じる突然変異体、または、好ましくは遺伝子操作された突然変異体であってよい。
【０１２６】
さらに、上記のアンチセンス、リボザイム、RNA干渉、共抑制、インビボ突然変異誘発、抗体発現および優性突然変異効果が、本発明のタンパク質の発現を制御する転写因子のような制御タンパク質をコードする遺伝子の発現、または、例えば本発明のタンパク質が活性となるために必要なタンパク質の発現を、減少させるために使用され得ることは、当業者には直ちに明らかとなる。
【０１２７】
細胞において、上記に説明される外来の核酸分子の1つまたは複数によって、対応する元の植物と比較してデンプン分解活性の低下を示す、トランスジェニック植物を作製するために、上記にて明らかにされた戦略の任意の組み合わせを使用することができることもまた、本発明の開示から明らかである。そのような組み合わせは、例えば、対応する核酸分子による植物細胞、植物組織もしくは植物体の（共）形質転換によってか、または本発明の上記の方法の異なる態様によって作製されたトランスジェニック植物の交配によって行うことができる。同様に、本発明の方法によって得られる植物は、デンプン蓄積の増加と、例えばストレス耐性または改変されたデンプン生合成のような、遺伝子操作された別の形質との組み合わせを達成できるように、他のトランスジェニック植物と交配することができる。
【０１２８】
さらなる態様においては、本発明は、植物細胞における発現が本発明のタンパク質の活性の低下を導く、上記のDNA分子を含むベクター、特に、説明されるDNA分子が、植物細胞における転写を確実にする調節因子と連結されるベクターに関連する。
【０１２９】
そのうえ、本発明は、説明されるDNA分子またはベクターを含む宿主細胞に関連する。宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞、または真核細胞であってよい。真核宿主細胞は、好ましくは植物細胞である。
【０１３０】
そのうえ、本発明は、外来の核酸分子の存在または発現により、本発明によるタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の減少、または完全な阻害を導く、トランスジェニック植物細胞に関連する。
【０１３１】
好ましい態様においては、外来の核酸分子は、以下からなる群より選択される：
（a）本発明によるタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の減少を導き得る、アンチセンスRNAまたはRNAi構築物をコードするDNA分子；
（b）共抑制効果を介して、本発明によるタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の減少を導き得るDNA分子；
（c）本発明によるタンパク質をコードする内在性遺伝子の転写産物を、特異的に切断することができるリボザイムをコードするDNA分子；および
（d）本発明によるタンパク質をコードする、内在性遺伝子における突然変異または非相同配列の挿入を導き、それにより、本発明によるタンパク質の発現の減少、または不活性タンパク質の合成を導く、インビボ突然変異誘発を介して導入された核酸分子。
【０１３２】
これらのトランスジェニック植物細胞は、周知の技術に従って、完全な植物体に再生することができる。したがって、本発明は、説明されるトランスジェニック植物細胞からの再生を通して得られる植物、および説明されるトランスジェニック植物細胞を含む植物にも関連する。
【０１３３】
そのうえ、本発明は、説明されるDNA分子によってコードされるアンチセンスRNA分子、ならびに、例えば転写によって得られる、リボザイム活性を有するRNA分子、および共抑制効果またはRNA干渉を導くRNA分子に関連する。
【０１３４】
本発明のさらなる対象は、非形質転換細胞と比較して、デンプン分解の減少を示す、トランスジェニック植物細胞を生産するための方法である。この方法において、細胞において内在性の形態で存在する、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の量、またはその活性が、植物細胞において減少する。
【０１３５】
好ましい態様においては、この減少は、アンチセンス効果によってもたらされる。この目的のため、本発明のDNA分子またはその部分は、アンチセンスの方向で、植物細胞における転写を確実にするプロモーターと連結され、かつ、おそらくは、転写の終結および転写産物のポリアデニル化を確実にする終結シグナルと連結され得る。対応するゲノム配列のイントロン配列の使用も可能である。植物細胞における、効率的なアンチセンス効果を確実にするために、合成されるアンチセンスRNAは、15ヌクレオチド、好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチドの、最低限の長さを示すべきである。さらに、アンチセンスRNAをコードするDNA配列は、形質転換される植物種に関して同種であるべきである。
【０１３６】
さらなる態様においては、本発明のDNA分子によってコードされるタンパク質の量の減少は、リボザイム効果によってもたらされる。リボザイム、およびそのようなRNA分子をコードするDNA分子の構築の基礎的な効果は、既に上記に説明されている。トランスジェニック細胞において、リボザイム活性を有するRNAを発現するために、リボザイムをコードする上記のDNA分子を、植物細胞における転写を確実にするDNA因子、特にプロモーターおよび終結シグナルと連結する。植物細胞において合成されたリボザイムは、植物細胞に内在性の形態で存在する、本発明のDNA分子の転写産物の切断を導く。
【０１３７】
本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の量を減少させるためにさらに可能なものは、共抑制である。したがって、本発明の方法によって得られる植物細胞は、さらなる対象である。これらの植物細胞は、本発明のDNA分子によってコードされるそれらのタンパク質の量が減少し、野生型細胞と比較して、デンプン分解の減少を示すことを特徴とする。
【０１３８】
同様に、そのようなデンプン分解の減少は、植物細胞においてRNA干渉効果を働かせることによって達成され得る。この目的のため、本発明の核酸分子の転写産物について特異的であり、かつ上記に説明されるRNA干渉の作用原則に従って調製され得るRNAi構築物をコードするDNA分子を、植物細胞における発現に必要な調節因子を含む適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１３９】
好ましくは、トランスジェニック細胞は、対応する非形質転換細胞と比較して、本発明によるタンパク質をコードする転写産物の量の、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、なお一層好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも90％の減少を示す。転写産物の量は、例えば、ノーザンブロット解析によって決定することができる。さらに、細胞は、好ましくは本発明によるタンパク質の量の対応する減少を示す。これは、例えばウエスタンブロット解析のような免疫学的方法によって決定することができる。
【０１４０】
または、植物細胞は、対応する非形質転換細胞と比較した場合に、本発明によるタンパク質の活性の、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、なお一層好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも90％の低下を示す。本発明のタンパク質の活性は、例えば、実施例において説明されるように決定することができる。
【０１４１】
細胞における本発明のタンパク質の量を減少させることによって、細胞は、背景の節において説明されるような、ある状況において望まれ得る、デンプン分解の減少を示す。適切なプロモーターを使用することによって、デンプン分解活性の低下を、植物の全てもしくは実質的に全ての細胞において引き起こすことができるか、または植物のある器官、細胞型または組織に限定することができるか、外部の因子によって誘導することができるか、または植物のある成長段階においてのみ生じさせることができる。
【０１４２】
そのうえ、本発明は、説明される植物細胞の再生によって得ることが可能な植物、ならびに本発明による、説明される細胞を含む植物に関連する。
【０１４３】
トランスジェニック植物は、原則として、任意の植物種の植物、即ちそれらは単子葉植物および双子葉植物であってよい。好ましくは、植物は、商業的な目的のため、特に、栄養目的、または技術的な目的、特に産業上の目的のために人間によって栽培される有用な植物、例えばアルコールの生産に使用される植物である。それらは好ましくは、例えば穀物種（ライムギ、オオムギ、オートムギ、コムギ、キビ、サゴ等）、イネ、エンドウ、インゲンマメ、キャッサバおよびジャガイモのような、デンプン貯蔵植物；トマト、ナタネ、ダイズ、アサ、アマ、ヒマワリ、ササゲまたはクズウコン、繊維形成植物（例えばアマ、アサ、ワタ）、油貯蔵植物（例えばナタネ、ヒマワリ、ダイズ）およびタンパク質貯蔵植物（例えば豆類、穀物、ダイズ）である。
【０１４４】
本発明は、例えばブドウのような、果実植物または果樹、およびヤシにも関連する。さらに、本発明は、飼料植物（例えば、牧草類、アルファルファ、クローバー、ライグラスのような、飼料および牧草）、および蔬菜植物（例えば、トマト、レタス、チコリー）、および観賞植物（例えば、チューリップ、ヒヤシンス）に関連する。デンプン貯蔵植物が好ましい。サトウキビおよびテンサイ、およびジャガイモの植物体、トウモロコシ、イネ、コムギおよびトマトの植物体は特に好ましい。
【０１４５】
本発明は、本発明によるトランスジェニック植物を含む本発明の植物の繁殖材料にも関連する。「繁殖材料」という用語の定義については、上記を参照のこと。
【０１４６】
最後に、本発明は、本発明によるタンパク質の、洗剤（washing agent）または洗浄剤（flushing agent）における、デンプン分解のための薬剤としての使用、および本発明によるタンパク質を含む洗剤または洗浄剤にも関連する。衣類の汚れはしばしば、食品によって引き起こされる。この食品は、共に付着し合う状態にあるデンプンを含み得る。デンプン分解酵素を含む洗剤は、デンプンを分解できるはずであり、分解されたデンプンはその後汚れた繊維から除去される。この機構は、洗濯の手順を支援する。同じ機構によって、特に食器洗浄機が使用される場合に、汚れた食器類の洗浄を支援することが可能である。食器洗浄機では、食器類は、乾燥した食品を食器から擦り落とすことによって機械的に洗浄されない。洗浄剤におけるデンプン分解酵素は、食器洗浄機の代わりに流しが使用される場合にも、食器類の洗浄を支援できるはずである。
【０１４７】
これらの態様および他の態様は開示され、当業者に明らかであり、本発明の説明および実施例によって包含される。本発明の意味の範囲内にて使用することができる、上記の方法、手段および適用の1つに関するさらなる文献は、技術の現状から、例えば公共の図書館から、例えば電子的手段の使用によって、得ることが可能である。この目的は、とりわけ、例えばアドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlにてインターネットを通してアクセス可能な「medline」のような、公共のデータベースによって達成され得る。他のデータベースおよびアドレスが当業者には公知であり、例えばアドレスhttp://www.lycos.comにて、インターネットから得ることが可能である。バイオテクノロジーにおける特許および特許出願に関する情報源および情報の概観は、Berks、TIBTECH 12(1994)、352〜364に含まれる。
【０１４８】
さらに、「および／または」という用語は、本明細書において現れる際は常に、「および」、「または」、および、「その用語によって連結される要素の全てまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【０１４９】
上記に引用された特許、刊行物、およびデータベースの入口の開示の全ては、各々のそのような特許、刊行物、またはデータベースの入口が、具体的にかつ個々に参照として組み入れられることが示された場合と同程度まで、全体が参照として本明細書に具体的に組み入れられる。
【０１５０】
以下の実施例は、本発明を例証するものである。
【０１５１】
実施例1
デンプン分解酵素をコードするcDNAのクローニング
デンプン分解酵素をコードするcDNAを単離するために、機能的スクリーニング手法を使用した。2つのジャガイモλZAPII cDNAライブラリを作製した。λZAPII cDNA合成キット（Stratagene）を用いて、一方はジャガイモソース葉mRNAから作製し（葉は、光の消える前の2時間、および付加的に後の2時間の、30分毎に収穫された）、もう一方は、4℃にて10日間貯蔵されたジャガイモの塊茎から作製した。製造業者のプロトコールに従った大量のインビボの切り出しによって、λZAPII cDNAライブラリをその後、プラスミドライブラリに転換した。
【０１５２】
機能的スクリーニングのために、グリコーゲン分枝酵素活性をもたない突然変異大腸菌株（KV832）を使用した。この菌株は、酵素ADP-グルコースピロホスホリラーゼの非制御形態をコードする、大腸菌glgC16遺伝子を含む、プラスミドpACYC-184（New England Biolabs）を用いて形質転換された（Creuzat-Sigalら：Biochemistry of the glycoside linkage、PirasおよびPontis編、New York、USA、Academic Press(1972)、647〜680）。このプラスミドはpACAGと名付けられ、その構築は、Kossmannら（Planta 208/1999、503〜511）において説明された。glgC16を発現すると、KV832は大量の直鎖状グルカンを蓄積し、このため、1％（w/v）のグルコースを添加したYT培地上にて増殖させた場合、ヨウ素蒸気に曝されるとコロニーは青色に染色する。
【０１５３】
pACAGを含むKV832細胞を、プラスミドライブラリによって形質転換して35000cfuを得、1％（w/v）のグルコース、1 mMのIPTG、および適切な抗生物質を含む固形YT培地上にて、37℃において一晩増殖させた。細胞はその後、ヨウ素蒸気によって染色させた。薄い青色の染色を示すか、または染色を全く示さなかったコロニー（例えば図1を参照のこと）を単離し、それらの中のプラスミドを抽出した。KV832::pACAGの再形質転換を通して、表現型を確認した。制限酵素による分解後、多くのプラスミドを同定し、異なるクラスに分けた。市販のサービスを用いて、各クラスの異なるプラスミド由来の挿入断片のDNA配列を確かめた。
【０１５４】
実施例2
ppt-β-アミラーゼをコードするジャガイモからのcDNAの単離
実施例1に従って単離されたプラスミドのうち1つの挿入断片を配列解析することにより、それがβ-アミラーゼをコードすることが示され、さらに解析された。プラスミドは、予測分子量61 kDを有するタンパク質をコードする、1635 bpのオープンリーディングフレームを含む（配列番号：7および8を参照のこと）。予測開始コドンの直前の5'非翻訳領域に停止コドンが認められたため、配列は全長であると考えられた。このタンパク質は、植物の葉緑体外β-アミラーゼと高度のアミノ酸類似性を共有するが、これらと比較して、N末端の伸長も有する。最近、シロイヌナズナ由来のβ-アミラーゼも、N末端の伸長を含むことが明らかにされた（Laoら、Plant J. 20(1999)、519〜527）。本研究の著者らは、このβ-アミラーゼが葉緑体を標的とすることを示すことができ、葉緑体標的化β-アミラーゼに関して、そのタンパク質をCT-BMYと称した。
【０１５５】
実施例3
機能解析により、ppt-β-アミラーゼは活性なβ-アミラーゼであることを示す
実施例2において説明されるppt-β-アミラーゼがβ-アミラーゼ活性を有するかどうかを確証するため、Hisタグを与える配列に融合された全長cDNAを大腸菌において高レベルにて発現させた。組み換えppt-β-アミラーゼタンパク質を単離するために、ppt-β-アミラーゼcDNAをpET発現系にクローニングした。ppt-β-アミラーゼタンパク質をコードする配列を、Pfu-Turbo DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、PCR（5'プライマー：
2004535789.tif 000002
；BamHI部位を作製するために、小文字のヌクレオチドを付加し；T7プライマーを3'プライマーとして使用した）によって増幅した。その結果生じたPCR産物を、BamHIおよびXhoIによって分解し、発現ベクターpET28a（Novagen）にライゲーションし、N末端に6×Hisタグを含むpHIS-ppt-β-アミラーゼを作製した。
【０１５６】
IPTGによる誘導を用いて、大腸菌BL21-CodonPlus（商標）RILコンピテント細胞（Stratagene）において、コードされるpHIS- ppt-β-アミラーゼ融合タンパク質の発現を37℃にて行った。空の発現ベクター単独か、またはベクターpHIS-ppt-β-アミラーゼのいずれかを含む、誘導された細胞から、総可溶性タンパク質を調製した。遠心分離後、100 mlの細胞培養物から大腸菌細胞を回収し、50 mM Mops-KOH、pH 7.5、20 mM MgCl2、2 mM CaCl2、1 mM EDTA、および0.1％（v/v）β-メルカプトエタノールを含む400μl緩衝液中で再懸濁した。およそ400μlのガラスビーズ（直径0.25〜0.5 mm）を加え、氷上で休止させながら細胞を30秒間4回ボルテックスにかけ、細胞を溶解した。4℃にて15分間、20,000 gの遠心分離後、可溶性タンパク質画分を含む大腸菌溶解産物をアッセイした。Megazyme（Sydney、Australia）からのアッセイキットを用い、還元末端におけるグルコシド結合によってp-ニトロフェニル基に連結された、マルトオリゴ糖の分解を検出することによって、β-アミラーゼおよびα-アミラーゼの活性を決定した。α-グルコシダーゼ活性を決定するために、p-ニトロフェニル-グルコシドを基質として使用した。
【０１５７】
大腸菌溶解産物におけるβ-アミラーゼ活性を決定するために、50μlの溶解産物を、225μlの100 mM Mes-KOH、pH 6.2、1 mM EDTA、および0.1％（v/v）β-メルカプトエタノールと混合した。25μlの基質、および共役する酵素（最終濃度0.4 mM オリゴ糖および2.5単位のα-グルコシダーゼ）を加えることによってアッセイを開始し、40℃にて10分後、1％（w/v）トリス（Sigma）を2.5容量加えることによって停止した。410 nmにおいて分光光度計によって検出される、遊離p-ニトロフェノール酸として活性を決定した。
【０１５８】
植物材料におけるβ-アミラーゼ活性の決定のために、凍結させたリーフディスクを、50 mM Mops-KOH、pH 7.5、20 mM MgCl2、2 mM CaCl2、1 mM EDTA、ならびに0.1％（v/v）β-メルカプトエタノール、3％（w/v）PEG-8000、および2％（w/v）ポリビニルポリピロリドンを含む150μlの緩衝液中で抽出した。サンプルを4℃、20,000 gにて10分間遠心分離し、上清をβ-アミラーゼ活性の測定に使用した。25μlの植物抽出物を、100 mM Mes-KOH、pH 6.2、1 mM EDTA、および0.1％（v/v）β-メルカプトエタノールを含む250μlの緩衝液と混合した。上記に説明されるようにアッセイを行った。還元末端においてグルコシド結合によってp-ニトロフェニル基に連結された、マルトオリゴ糖の分解を検出することによって、β-アミラーゼ活性を決定した。β-アミラーゼに対する特異的な基質は、非ブロックp-ニトロフェニルマルトペンタオース（PNPG5）である。結果は、pHIS-ppt-β-アミラーゼを含む、誘導された細胞由来の可溶性タンパク質画分がPNPG5と反応する一方、空のpET28aベクターを含む対照由来のものは反応しないことを示す。触媒活性をさらに研究するために、PNPG7およびp-ニトロフェニル-グリコシドも基質として使用した。PNPG7は、α-アミラーゼ活性の検出に使用された、非還元末端において化学的にブロックされたp-ニトロフェニル-マルトヘプタオースであり、p-ニトロフェニル-グリコシドは、α-グルコシダーゼ活性を決定するために使用することができる基質である。結果は、図3において示される。双方の基質については、pHIS-ppt-β-アミラーゼを含む、誘導された細胞と、空のベクターを含む、誘導された細胞の間に、差異は検出できなかった。これは、ppt-β-アミラーゼはβ-アミラーゼ活性のみを有し、他のデンプン分解活性を有しないことを示す。
【０１５９】
アミロペクチンを含む分離ゲルを用いた不連続系PAGEを介して、pHIS-ppt-β-アミラーゼの加水分解活性を示すことも可能であった。この目的のため、Hillら（Plant Cell Environ. 19(1996)、1223〜1237）によって説明されるように、酵素を、アミロペクチンを含む分離ゲルを用いた不連続系PAGEによって分離した。分離ゲル（0.75 mm）は、7.5％（w/v）ポリアクリルアミド（30：0.8 アクリルアミド：ビスアクリルアミド）、0.6％（w/v）ジャガイモアミロペクチンまたはアミロース（Sigma）、および375 mM Tris-HCl（pH 8.8）を含んだ。濃縮ゲル（stacking gel）は、3％（w/v）ポリアクリルアミドおよび63 mM Tris-HCl（pH 6.8）を含んだ。ゲルは4℃において（Mini Protean 2 system、Bio-Rad）、30 mAの定電流で1.5時間電気泳動した（2つのゲル）。電気泳動後、水中においてゲルを2回洗浄し、0.1 M Mes-KOH（pH 6.2）、2 mM CaCl2、および0.1％（v/v）β-メルカプトエタノールを含む緩衝液中において、20℃にて1.5時間インキュベートした。ゲルをその後水中にて10分間洗浄し、ヨウ素によって染色し、アミロペクチンまたはアミロースの分解を検出した。これらの実験の結果は、図2において示される。
【０１６０】
α-アミラーゼは、例えば一連のマルトオリゴ糖を生産する一方、β-アミラーゼ活性の産物は、マルトースのみである。pHIS-ppt-β-アミラーゼに関する場合にこのようであることを示すために、可溶性タンパク質画分を、可溶化されたデンプンか、または未精製のジャガイモデンプン顆粒と共にインキュベートし、TLC-プレート上において産物を分離した。この目的のため、50μlの大腸菌溶解産物を、100 mM Mes-KOH、pH 6.2、1 mM EDTA、0.1％（v/v）β-メルカプトエタノールを含む緩衝液中において、1％（w/v）の可溶性デンプン、未精製のジャガイモデンプン、またはアミロペクチン（Sigma）のいずれかと共にインキュベートした。反応混合物をTLCプレート（Silicagel F60、Merck）に適用した。イソプロパノール：ブタノール：水（12：3：4）を含む溶出剤を用いてプレートを2回展開した。グルコースおよびマルトオリゴ糖（2〜7個のグルコース残基）の混合物を標準として用いた。形成された産物は、10％（v/v）H2SO4で湿らせたプレートを焦がす（charring）ことによって可視化された。または、可溶性デンプンもしくはアミロペクチンの分解について、反応混合物をヨウ素溶液によって染色した。結果は、図4において示される。双方の場合において、加水分解産物はマルトースであり、pHIS-ppt-β-アミラーゼタンパク質が、可溶化されたデンプンおよびジャガイモのデンプン顆粒の双方を分解できることが示される。
【０１６１】
実施例4
ppt-β-アミラーゼは単離葉緑体に輸送される
ppt-β-アミラーゼタンパク質がプラスチド標的配列を含むかどうかを決定するために、インビトロのタンパク質輸送実験を行った。ppt-β-アミラーゼcDNAをインビトロにおいて転写し、35Sメチオニンを用いて、TNT網状赤血球ライセートシステム（TNT reticulocyte lysate system）において、製造業者（Promega）の使用説明書に従って産物を翻訳し、35S標識前駆ppt-β-アミラーゼを作製した。予測されるように、ppt-β-アミラーゼ前駆タンパク質は、約61 kDの分子量を有していた。Bartlettら（Methods in Chloroplasts Molecular Biology、Edelmann、HallickおよびChua編、Amsterdam、The Netherlands；Elsevier Biochemical Press(1982)、1081〜1091）によって説明されるように、エンドウの葉から葉緑体を単離した。最終容量300μl中に、放射性標識され、インビトロにて合成された前駆体タンパク質、および200μgの葉緑体と同等の精製細胞小器官を含む、輸送緩衝液（250 mM ソルビトール、10 mM メチオニン、25 mM グルコン酸カリウム、2 mM MgSO4、50 mM Hepes-KOH、pH 8.0、および0.2％（w/v）BSA）中において、明所、25℃にて30分間、タンパク質輸送アッセイを行った。
【０１６２】
2.5μlのサーモリシン（1 mg/ml）および10μlの0.1 M CaCl2を用いて、1つの画分を氷上にて20分間処理した。第二の画分は、付加的に、1％（v/v）Triton X-100を含んだ。10μlの0.5 M EDTAの添加によってプロテアーゼ処理を停止した。4500 gでの8分間の遠心分離により、45％（v/v）パーコールクッション（Percoll cushion）を通して、破砕されていない葉緑体を再単離し、50 mM Hepesおよび0.33 M ソルビトール、pH 8.0中で洗浄し、2×SDS試料緩衝液中にて再懸濁した。電気泳動（Laemmli、Nature 227(1970)、680〜685）、続いてオートラジオグラフィーによってタンパク質を解析した。結果は図5において示される。
【０１６３】
単離された完全なエンドウの葉緑体を、ATPの存在下、および適切な輸送条件下において35S標識PCT-BMYIとインキュベートすると、加えられたほとんど全ての前駆タンパク質が、およそ55 kDのタンパク質にプロセシングされることが見出された。反応混合物へのプロテアーゼサーモリシンの添加により、上清中の前駆タンパク質は分解された一方、葉緑体に輸送されてからプロセシングされた成熟タンパク質は保護され、維持された。プラスチドの完全な膜を破壊し、輸送タンパク質がタンパク質分解から保護されるのを妨げる、界面活性剤がサーモリシンと共に加えられた場合は、標識された全てのタンパク質が分解された。
【０１６４】
実施例5
ppt-β-アミラーゼ活性の低下したトランスジェニック植物は、デンプン過剰の表現型を示す
特に移動デンプンの分解に関する、ppt-β-アミラーゼの生理学的役割を研究するために、アンチセンス構築物（α-ppt-β-アミラーゼ）を用いて、ppt-β-アミラーゼ活性が低下したトランスジェニックジャガイモ植物を作製した；図24を参照のこと。この目的のため、pSkベクターから2.1 kbのppt-β-アミラーゼBamHI/Xhol断片を切り出した。T4 DNAポリメラーゼを用いて、この断片の末端を充填し、平滑末端を作製した。この断片をその後、植物発現ベクターpBinARにおいて、Smal制限部位を介して、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに関して逆の向きにクローニングし（HofgenおよびWillmitzer、Plant Sci. 66(1990)、221〜230）、アグロバクテリウム媒介遺伝子転移（Rocha-Sosaら、EMBO J. 66(1989)、23〜29）を用いて、品種Desireeのジャガイモ植物を形質転換した。ジャガイモ（Solanum tuberosum L. 品種Desiree）は、Saatzucht Fritz Lange KG（Bad Schwartau、Germany）から得た。組織培養における植物は、22℃において、2％（w/v）スクロースを添加したMS培地（MurashigeおよびSkoog、Physiol.Plant 15(1962)、473〜497）上にて、明所16時間／暗所8時間の体制下において維持された。組織培養からジャガイモの植物体を移植し、温室にて、昼16時間、夜8時間の体制下において、土壌で生長させた。4℃にて1日維持されたソース葉における、ppt-β-アミラーゼmRNAレベルの減少について、70個の植物体をスクリーニングした。これらの70個の植物体のうち、3つの系統（#8、#10、#11）は、非形質転換対照と比較して、mRNAレベルにおける著しい減少を示した一方、系統#27および#28は、これに関しては差異を示さない（図6aを参照のこと）。系統#8、#10、#11および#28を、さらなる研究のために選択した。ppt-β-アミラーゼのmRNAレベルの減少が、ppt-β-アミラーゼ活性の低下を導くことを示すため、特異的なβ-アミラーゼ基質としてPNPG5を使用した。PNPG5を用いた結果は、明期の2時間後に収穫された系統#8、#10、#11のソース葉におけるβ-アミラーゼ活性が、非形質転換対照のもののおよそ30％〜50％である一方、系統#28の活性は、対照と有意に異ならなかったことを示す（図6bおよび図7を参照のこと）。
【０１６５】
移動デンプンの分解における差異を評価するために、温室で生長させた15週齢の植物体のソース葉を、暗所に維持するために、アルミニウムホイルで被覆した。異なる時点で、デンプン含量について、葉をヨウ素によって染色した。特に、80℃、80％エタノール中において、葉を脱染し、その後、デンプン含量を可視化するために、ルゴール溶液によって染色した。野生型の葉および系統#28からの葉においては、36時間後にはデンプンは完全に分解されていた一方、系統#8、#10、#11からの葉は、それらがヨウ素の存在下で青色に染色するほど、十分なデンプンをなおも含んでいた。より長い72時間の暗期の後でさえも、ppt-β-アミラーゼ活性が最も著しく低下している系統（#10および#11）は、有意な量のデンプンを含んでいた（図8を参照のこと）。
【０１６６】
葉におけるデンプン含量はまた、酵素反応によっても決定される。α-ppt-β-アミラーゼ植物（系統#8、#10、#11）における葉のデンプン含量は、非形質転換対照と比較して、はるかに高い。明期の終了時に、非形質転換対照と比較して、系統#8の植物は180％、系統#10および#11の植物は約240％の、より多くのデンプンをソース葉に含んでいた。デンプン含量は、Muller-Roberら（EMBO J. 11(1992)、1229〜1238）によって説明されるように決定された。結果は、図9において示される。
【０１６７】
実施例6
デンプン分解酵素をコードするジャガイモからのcDNA（CSD23）の単離
CSD23 cDNAを単離するために、実施例1において説明される手順を用いた。このcDNAが、適切な条件下にて大腸菌株KV832において発現された場合、細胞はもはやヨウ素蒸気によって青色に染色しない（図10を参照のこと）。
【０１６８】
CSD23 cDNA挿入断片の配列解析によって、それが現在のところ未知のタンパク質をコードすることが示される。プラスミドは、予測分子量34.1 kDのタンパク質をコードする、882 bpのオープンリーディングフレーム（配列番号：3を参照のこと）を含む。予測される開始コドンの直前の5'非翻訳領域に停止コドンが認められたため、配列は全長であると考えられた。このタンパク質は、シロイヌナズナの未知のタンパク質T05165（アクセッション番号：T05165）に対して、高度のアミノ酸類似性（85.6％）を共有する。
【０１６９】
実施例7
CSD23は加水分解活性を有する
CSD23タンパク質が加水分解活性を有するかどうかを確証するため、大腸菌株DH5αにおいてCSD23タンパク質を発現させた。タンパク質の発現は、IPTGによる発現誘導を用い、37℃にて、大腸菌株DH5α（Bethesda Research Laboratories）において行った。空のpSKベクター単独か、またはタンパク質をコードする配列を含むpSKベクターのいずれかを含む、誘導された細胞から、総可溶性タンパク質を調製した。遠心分離後、100 mlの細胞培養物から大腸菌細胞を回収し、50 mM Mops-KOH、pH 7.5、20 mM MgCl2、2 mM CaCl2、1mM EDTA、および0.1％（v/v）β-メルカプトエタノールを含む、400μlの緩衝液中に再懸濁した。約400μlのガラスビーズ（直径0.25 mm〜0.5 mm）を加え、氷上において休止させながら細胞を30秒間、4回ボルテックスにかけ、細胞を溶解した。20,000 g、4℃にて15分間遠心分離した後、可溶性タンパク質画分を含む大腸菌溶解物をアッセイした。pSKベクター中にCSD23配列を含む細胞培養物を、IPTGによって誘導した後、可溶性タンパク質画分を単離した。対照として、空のpSKベクターのみを発現する細胞から、可溶性タンパク質画分を単離した（ppt-β-アミラーゼに関して説明された、可溶性タンパク質画分の単離）。アミロースを含む分離ゲルを用いた不連続系PAGEによって、CSD23の加水分解活性を検出するために、タンパク質画分を使用した。結果は図11において示される。対照の可溶性タンパク質画分とは対照的に、CSD23を発現する細胞の可溶性タンパク質画分は、ゲル中のアミロースを分解することが可能である。さらに、アミロペクチンを含む分離ゲルを使用したが、これらのゲルにおいては加水分解活性は検出できず、CSD23は直鎖状グルカンのみを分解し、分枝グルカンは分解しないことを示した。
【０１７０】
植物形質転換ベクターα-CSD23を構築するために、pSKベクターから1 kbのCSD23 Xbal/Asp718断片を切り出した。断片をその後、植物発現ベクターpBinARにおいて、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに関して逆の向きにクローニングした（HofgenおよびWillmitzer、上記引用文中）；図28を参照のこと。
【０１７１】
CSD23転写産物レベルの減少を示す、トランスジェニック植物を作製した。
【０１７２】
実施例8
デンプン分解酵素をコードするジャガイモ由来のcDNA（CSD12）の単離
CSD12 cDNAを単離するために、実施例1において説明される手順を用いた。適切な条件下にて、大腸菌株KV832においてCSD12が発現された場合、細胞はもはやヨウ素蒸気によって青色に染色しない（図12を参照のこと）。CSD12 cDNAの配列は、配列番号：1において示される。
【０１７３】
このCSD12タンパク質は、シロイヌナズナの未知のタンパク質（アクセッション番号：AAF01527）に対して、高いアミノ酸類似性（83％）を共有する。
【０１７４】
植物形質転換ベクターα-CSD12を構築するために、pSKベクターから900 bpのCSD12 EcoRI/Asp718断片を切り出した。断片をその後、植物発現ベクターpBinARにおいて、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに関して逆の向きにクローニングした（HofgenおよびWillmitzer、上記引用文中）；図27を参照のこと。
【０１７５】
実施例9
デンプン分解酵素をコードするジャガイモからのcDNA（SHI）の単離
SHI cDNAを単離するために、実施例1において説明される手順を用いた。適切な条件下にて、大腸菌株KV832においてSHIが発現された場合、細胞はもはやヨウ素蒸気によって青色に染色しない（図13を参照のこと）。単離されたcDNAは、全長cDNAを含まなかった。SHIショート（short）と呼ばれるこの断片は、植物形質転換ベクターα-SHIショートを構築するために使用された。SHIショート配列はその後、標準のスクリーニング法によって全長cDNA SHIを単離するためのプローブとして使用された。スクリーニングのために、作製されたジャガイモ葉λZapII cDNAライブラリ（上記に説明されるライブラリ）を使用した。全長SHI cDNAは、790アミノ酸のポリペプチドをコードする、2370 bpのオープンリーディングフレームを含む（配列番号：5を参照のこと）。コードされるタンパク質は、86.6 kDの予測分子量を有する。予測されるタンパク質は、未知のシロイヌナズナタンパク質F14O13.17（アクセッション番号：BAB03016）に対して高いアミノ酸類似性（53％）を共有する。
【０１７６】
実施例10
SHIは加水分解活性を有する
SHIタンパク質が加水分解活性を有するかどうかを確証するため、大腸菌株DH5αにおいてSHIタンパク質を発現させた。タンパク質の発現は、IPTGによる誘導を用い、37℃にて大腸菌株DH5α（Bethesda Research Laboratories）において行った。空のpSKベクターのみか、または、タンパク質をコードする配列を含むpSKベクターのいずれかを含む、誘導された細胞から、総可溶性タンパク質を調製した。遠心分離後、100 mlの細胞培養から大腸菌細胞を回収し、50 mM Mops-KOH、pH 7.5、20 mM MgCl2、2 mM CaCl2、1 mM EDTA、および0.1％（v/v）β-メルカプトエタノールを含む400μlの緩衝液中において再懸濁した。約400μlのガラスビーズ（直径0.25 mm〜0.5 mm）を加え、氷上において休止させながら細胞を30秒間、4回ボルテックスにかけ、細胞を溶解した。20,000 g、4℃にて15分間遠心分離した後、可溶性タンパク質画分を含む大腸菌溶解産物をアッセイした。SHIの加水分解活性を検出するために、タンパク質画分を使用した。
【０１７７】
アミロペクチンを含む分離ゲルを用いた不連続系PAGEによって、SHIタンパク質の加水分解活性を示すことが可能であった。結果は図14において示される。対照とは対照的に、SHIを発現する細胞の可溶性タンパク質画分は、ゲル中のアミロペクチンを分解することができる。そのうえ、組み換えSHIタンパク質が、溶解したアミロペクチンを分解できることが示せた。これを示すために、SHIを発現する細胞の可溶性タンパク質画分とアミロペクチン溶液をインキュベートした。対照として、空のベクターを発現する細胞のタンパク質画分を使用した。室温にて6時間インキュベートした後、アミロペクチンの分解を示すために、ヨウ素溶液によって溶液を染色した。この実験の結果は、図15において示される。
【０１７８】
組み換えSHIタンパク質は、可溶性タンパク質画分を可溶性ジャガイモデンプンとインキュベートした場合、一連のマルトオリゴ糖を産生する（図16を参照のこと）。これは、TLCプレート上にて産物を分離することによって示された。同様の一連のマルトオリゴ糖は、α-アミラーゼによって生産され、SHIタンパク質がα-アミラーゼ活性を有することが示される。ppt-β-アミラーゼに関して説明されたように、薄層クロマトグラフィーを行った。
【０１７９】
実施例11
SHIはα-アミラーゼ活性を有する
ppt-β-アミラーゼについて説明されたように、SHIタンパク質の加水分解活性について調べた。結果は図17において示される。結果は、SHIタンパク質を含む、誘導された細胞由来の可溶性タンパク質画分がPNPG7と反応する一方、空のpSKベクターを含む対照由来のものは反応しないことを示す。触媒活性についてさらに研究するために、PNPG5およびp-ニトロフェニル-グリコシドも基質として使用した。双方の基質については、SHIタンパク質を含む、誘導された細胞と、空のベクターを含む、誘導された細胞の間には差異が検出できなかった。これは、SHIがα-アミラーゼ活性のみを有し、他のデンプン分解活性は有さないことを示す。
【０１８０】
実施例12
SHIタンパク質は単離葉緑体に輸送される
SHIタンパク質がプラスチド標的配列を含むかどうかを決定するために、実施例4において説明されるようにインビトロのタンパク質輸送実験を行った。この実験のために、SHIの最初の100アミノ酸をコードするSHIの配列が、緑色蛍光タンパク質とインフレームで融合された構築物を使用した。この構築物がインビトロにおいて転写および翻訳された場合、放射性タンパク質産物が葉緑体に輸送されることを示すことが可能であった（図18を参照のこと）。これらのデータは、SHIの最初の100アミノ酸が輸送過程を媒介できることを示す。
【０１８１】
輸送実験は上記に説明されるように行われた。
【０１８２】
実施例13
SHI活性が低下したトランスジェニック植物は、デンプン過剰の表現型を示す
特に移動デンプンの分解に関する、SHIタンパク質の生理学的役割を調べるために、2つの異なるアンチセンス構築物を用いて、SHI活性が低下したトランスジェニックジャガイモおよびトランスジェニックタバコの植物体を作製した。第一の構築物は、35Sプロモーターの制御下にあるSHIショート配列を含む（α-SHIショート）。このベクターを構築するために、最初に単離されたSHI配列を含むpSKベクターから1.2 kbのSHI BamHI/Xhol断片を切り出した。断片の末端は、T4 DNA-ポリメラーゼによって充填し、平滑末端を作製した。断片をその後、SmaI制限部位を介して、植物発現ベクターpBinARにおいて、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに関して逆の向きにクローニングした（HofgenおよびWillmitzer、上記引用文中）；図26を参照のこと。第二の構築物は、葉特異的L700プロモーターの制御下にある全長SHI cDNAの2.3 kbの断片を含む（α-SHIL700）。このベクターを構築するために、SHIの全長配列を含むpSKベクターから2.3 kbのSHI Asp718/XbaI断片を切り出した。断片をその後、植物発現ベクターpBinAR L700において、L700プロモーターに関して逆の向きにクローニングした（HofgenおよびWillmitzer、上記引用文中）；図25を参照のこと。上記に説明されるようにジャガイモの植物細胞を形質転換するために、双方の構築物を使用した。タバコは、α-SHIショート構築物によってのみ形質転換された。
【０１８３】
（a）α-SHIショートジャガイモ植物体
移動デンプンの分解における差異を評価するために、温室で生長させた15週齢の植物体のソース葉を、暗所に維持するために、アルミニウムホイルで被覆した。異なる時点において、デンプン含量について、ヨウ素によって葉を染色した。野生型の葉および系統#46からの葉においては、暗所における64時間後、デンプンは完全に分解された一方、系統#51、#56および#58からの葉は、ヨウ素の存在下において青色に染色するほど、十分なデンプンをなおも含んでいた（図19を参照のこと）。
【０１８４】
葉におけるデンプン含量は、酵素によっても決定された。α-SHIショート植物（系統#51、#56および#58）の葉におけるデンプン含量は、非形質転換対照と比較してはるかに高い。明期の終了時において、非形質転換対照と比較して、系統#51の植物は412％、系統#56の植物は367％、および系統#58の植物は約814％のより多いデンプンを、それらのソース葉に含んだ（図23を参照のこと）。
【０１８５】
（b）葉の活性度
系統#51、#56および#58のα-SHIショートジャガイモ植物体の葉について、14日間の暗期後に、これらの系統の葉がなおも活力があることを示せた。これを示すために、葉は、指示された期間暗所に維持された。野生型植物の葉が死んだ一方、系統#51、#56および#58の葉はなおも活力があった。最良の結果を、系統#58の葉について示せた（図22を参照のこと）。
【０１８６】
（c）α-SHIショートタバコ植物体
移動デンプンの分解における差異を評価するために、温室で生長させた10週齢の植物体のソース葉を、暗所に維持するために、アルミニウムホイルで被覆した。12時間の暗期後、デンプン含量について、ヨウ素によって葉を染色した。野生型の葉においては、暗所における12時間後にデンプンは完全に分解された一方、系統#18、#31、#37、#46および#47からの葉は、ヨウ素の存在下において青色に染色するほど、十分なデンプンをなおも含んでいた（図20を参照のこと）。
【０１８７】
（d）α-SHI L700ジャガイモ植物体
移動デンプンの分解における差異を評価するために、温室で生長させた15週齢の植物体のソース葉を、暗所に維持するために、アルミニウムホイルで被覆した。異なる時点において、デンプン含量について、ヨウ素によって葉を染色した。野生型の葉においては、暗所における72時間後にデンプンは完全に分解された一方、系統#16、#41、#46、および#53の葉は、ヨウ素の存在下において青色に染色するほど、十分なデンプンをなおも含んでいた（図21を参照のこと）。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】ヨウ素蒸気による染色後の、ppt-β-アミラーゼ配列または空のpSKベクターを発現する大腸菌株KV832を示す。空のベクターを含む細胞が青色に染色する一方、ppt-β-アミラーゼを発現する細胞は染色しなかったことから、細胞内の直鎖状グルカンがppt-β-アミラーゼによって分解されていることが示唆される。
【図２】アミロペクチンを含む分離ゲルを用いた不連続系PAGEによる、ppt-β-アミラーゼの加水分解活性の決定を示す。陰性対象として、空のpET28aベクターを発現する大腸菌株BL21-CodonPlus（商標）RILから、総可溶性タンパク質を分離した（レーン1、2、7および8）。以下の4つのレーンにおいて、総可溶性タンパク質は、pHIS-ppt-β-アミラーゼを発現する大腸菌株BL21-CodonPlus（商標）RILから分離された（レーン3〜6）。ppt-β-アミラーゼの加水分解活性は、ヨウ素溶液による染色後のゲルの陰性染色によって検出可能であり、アミロペクチンが分解されたことが示唆される。矢印は、ppt-β-アミラーゼ活性を示す。
【図３】pHIS-BMY融合タンパク質のpHIS-ppt-β-アミラーゼ活性を示す。PNPG5をβアミラーゼ基質、PNPG7をα-アミラーゼ基質、およびp-ニトロフェニル-グリコシドをα-グルコシダーゼ基質とした、pHIS-ppt-β-アミラーゼ融合タンパク質を含む、誘導された細胞由来の大腸菌可溶性タンパク質画分の加水分解活性。対照として、空のベクターpET28aを含む、誘導された細胞由来の大腸菌可溶性タンパク質画分を使用した。
【図４】未精製および可溶性のジャガイモデンプンを、pHIS-ppt-β-アミラーゼ融合タンパク質とインキュベートした後の加水分解産物を示す。pHIS-ppt-β-アミラーゼ融合タンパク質を含む、誘導された細胞、および空のベクターpET28aを含む細胞由来の、大腸菌可溶性タンパク質画分を、10g/Lの未精製のジャガイモデンプンまたは可溶性デンプンのいずれかと共に、12時間インキュベートした。形成された産物はTLCによって分離され、硫酸によって焦がす（charring）ことにより染色された。標準化合物；G1、Glc；G2〜G7、2〜7個のGlc残基の鎖長を有するマルトオリゴ糖。レーン1；pHIS-ppt-β-アミラーゼタンパク質と未精製のデンプン、レーン2；空のベクターを含む細胞と未精製のデンプン、レーン3；pHIS-ppt-β-アミラーゼタンパク質と可溶性デンプン、レーン4；空のベクターを含む細胞と可溶性デンプン。
【図５】PPT-BMYIのプラスチド標的化を示す。エンドウの葉緑体を、35S標識PPT-BMYIタンパク質と共にインキュベートした。レーン1は、輸送アッセイにおいて使用される、インビトロにおいて翻訳された前駆タンパク質を含む。レーン2は、放射性標識されたインビトロ翻訳産物とのインキュベーション後に回収された、葉緑体から単離されたタンパク質を含む。レーン3は、標識前駆タンパク質とインキュベートし、プロテアーゼサーモリシンによって後処理した葉緑体由来のタンパク質を含む。レーン4は、葉緑体がサーモリシンおよび界面活性剤TritonX-100によって後処理されたことを除き、レーン3に関して与えられるとおりである。タンパク質のキロダルトンにおける分子量マーカーは右側に与えられる。pre、前駆タンパク質；m、成熟タンパク質。α-ppt-β-アミラーゼの葉は、デンプン過剰の表現型を示す。
【図６】PPT-BMYIアンチセンス系統が、mRNA量の減少およびβ-アミラーゼ活性の低下を表すことを示す。（a）4℃において1日貯蔵されたPPT-BMYIアンチセンス系統のソース葉におけるmRNA量のRNAゲルブロット解析。異なる組織から単離された20μgの全RNAは、ゲル分離、およびそれに続くRNAのナイロン膜への転写の後に、PPT-BMYI cDNAプローブとハイブリダイズされた。（b）暗期開始2時間後の、ジャガイモのソース葉におけるβ-アミラーゼ活性の決定。PPT-BMYIアンチセンス系統のソース葉由来の植物材料を、PNPG5を用いてβ-アミラーゼ活性についてアッセイした。結果は、5つの個々の酵素抽出物の平均±SEである。*は、5％レベル（スチューデントt検定）における、異なるトランスジェニック系統（#8、#10、#11および#28）の、対応する野生型（wt）の値からの有意差を示す。
【図７】非形質転換対照と比較した、PPT-BMYIアンチセンス系統におけるβ-アミラーゼ活性をパーセントで示す。
【図８】暗所に維持するためにアルミニウムホイルで72時間被覆された、α-ppt-β-アミラーゼ系統#8、#10、#11、#28の葉、および非形質転換対照の葉を示す。この後、ヨウ素溶液を用いてデンプンについて葉を染色した。72時間後、野生型の葉および系統#28の葉においてはデンプンは分解された一方、系統#8、#10および#11の葉はなおもデンプンを含んだ。
【図９】暗期／明期の終了時における、15週齢のPPT-BMYIアンチセンス系統#8、#10、#11、#28のソース葉、および野生型のソース葉におけるデンプン含量を示す。黒い棒は、暗期の終了時におけるデンプン含量を示す；白い棒は、明期の終了時におけるデンプン含量を示す。デンプン含量は、m2当たりのmmolヘキソース等量である。
【図１０】ヨウ素蒸気による染色後の、CSD23配列または空のpSKベクターを発現する大腸菌株KV832を示す。空のベクターを含む細胞は青色に染色する一方、CSD23タンパク質を発現する細胞は染色せず、CSD23タンパク質が細胞内の直鎖状グルカンを分解することを示す。
【図１１】アミロースを含む分離ゲルを用いた不連続系PAGEによる、CSD23タンパク質の加水分解活性の決定を示す。陰性対象として、空のpSKベクターを発現する大腸菌株DH5αから総可溶性タンパク質を分離した（レーン1〜3）。以下の4つのレーンにおいては、CSD23タンパク質を発現する大腸菌株DH5αから総可溶性タンパク質を分離した（レーン4〜7）。陽性対象として、ジャガイモの第二のβ-アミラーゼアイソフォーム（CF-β）（Scheidig、1987）を発現する大腸菌株DH5αから、総可溶性タンパク質を分離した（レーン8〜10）。SHIタンパク質およびβ-アミラーゼの加水分解活性は、ヨウ素溶液による染色後の、ゲルの陰性染色によって検出可能であり、アミロースが分解されていることを示す。
【図１２】ヨウ素蒸気による染色後の、CSD12配列または空のpSKベクターを発現する大腸菌株KV832を示す。空のベクターを含む細胞は青色に染色する一方、CSD12を発現する細胞はより薄い青色に染色し、CSD12タンパク質が細胞内の直鎖状グルカンを分解することを示す。
【図１３】ヨウ素蒸気による染色後の、SHI配列または空のpSKベクターを発現する大腸菌株KV832を示す。空のベクターを含む細胞は青色に染色する一方、SHIタンパク質を発現する細胞は染色せず、SHIタンパク質が細胞内の直鎖状グルカンを分解することを示す。
【図１４】アミロペクチンを含む分離ゲルを用いた不連続系PAGEによる、SHIタンパク質の加水分解活性の決定を示す。陰性対象として、空のpSKベクターを発現する大腸菌株DH5αから総可溶性タンパク質を分離した（レーン1〜3）。以下の4つのレーンにおいては、SHIタンパク質を発現する大腸菌株DH5αから総可溶性タンパク質を分離した（レーン4〜7）。陽性対象として、ジャガイモの第二のβ-アミラーゼアイソフォーム（CF-β）（Scheidig、1987）を発現する大腸菌株DH5αから、総可溶性タンパク質を分離した（レーン8〜10）。SHIタンパク質およびβ-アミラーゼの加水分解活性は、ヨウ素溶液による染色後の、ゲルの陰性染色によって検出可能であり、アミロペクチンが分解されていることを示す。
【図１５】SHIタンパク質または空のpSKベクターを発現する、大腸菌DH5α細胞の総可溶性タンパク質200μlを、アミロペクチン溶液200μlと共に24時間インキュベートした。その後、ヨウ素によって溶液を染色し、アミロペクチンの分解を示した。左側は、陰性対象（空のベクターを発現する大腸菌DH5α細胞の総可溶性タンパク質+アミロペクチン）、右側は、SHIタンパク質を発現する大腸菌DH5α細胞の総可溶性タンパク質+アミロペクチン。陰性対象においては、アミロペクチンがヨウ素によって染色する一方、SHIタンパク質とインキュベートされたアミロペクチンは分解され、ヨウ素によって染色しなかった。
【図１６】可溶性ジャガイモデンプンをSHIタンパク質とインキュベートした後の加水分解産物を示す。SHIタンパク質を含む誘導された細胞、および空のベクターpSKを含む細胞由来の、大腸菌可溶性タンパク質画分を、10 g/Lの可溶性のジャガイモデンプンと共にインキュベートした。形成された産物は、TLCによって分離され、硫酸によって焦がす（charring）ことにより染色された。標準化合物；G1、Glc；G2〜G7、2〜7個のGlc残基の鎖長を有するマルトオリゴ糖。陽性対象として、ジャガイモの第二のβ-アミラーゼアイソフォーム（CF-β）を発現する大腸菌株DH5α由来の総可溶性タンパク質を分離し、説明されるように可溶性デンプンと共にインキュベートした（Scheidig、1987）。1.  標準2.、5.および8.  空のベクターpSKを発現する大腸菌DH5α細胞の可溶性タンパク質抽出物+可溶性デンプン3.、6.および9.  SHIタンパク質を発現する大腸菌DH5α細胞の可溶性タンパク質抽出物+可溶性デンプン4.、7.および10.  CF-βタンパク質を発現する大腸菌DH5α細胞の可溶性タンパク質抽出物+可溶性デンプン11.  標準2、3および4についてのインキュベーション時間は、室温において4時間であり、5、6および7については6時間、ならびに8、9および10については8時間であった。
【図１７】SHIタンパク質がα-アミラーゼ活性を有することを示す。PNPG5をβ-アミラーゼ基質とし、PNPG7をα-アミラーゼ基質とし、かつp-ニトロフェニル-グリコシドをα-グルコシダーゼ基質とした、SHIタンパク質を含む、誘導された細胞由来の大腸菌可溶性タンパク質画分の加水分解活性。対照として、空のベクターpSKを含む、誘導された細胞由来の大腸菌可溶性タンパク質画分を使用した。
【図１８】SHIのプラスチド標的化を示す。35S標識したSHI100GFPタンパク質と共に、エンドウの葉緑体をインキュベートした。レーン1は、輸送アッセイにおいて使用される、インビトロ翻訳された前駆タンパク質を含む。レーン2は、放射性標識されたインビトロ翻訳産物とのインキュベーション後に回収された、葉緑体から単離されたタンパク質を含む。レーン3は、標識前駆タンパク質と共にインキュベートされ、プロテアーゼサーモリシンを用いて後処理された葉緑体由来のタンパク質を含む。レーン4は、葉緑体がサーモリシンおよび界面活性剤Triton X-100を用いて後処理されたことを除き、レーン3について与えられたとおりである。キロダルトンにおけるタンパク質の分子量マーカーは、右側に与えられる。pre、前駆タンパク質；m、成熟タンパク質。
【図１９】α-SHIショートジャガイモ植物体の葉における、移動デンプンの分解の決定を示す。3つの系統は、野生型と比較して、葉の移動デンプンを動員する能力における差異を示す。暗所に維持するために、α-SHIショート系統#46、#51、#56、#58、および野生型の葉を、アルミニウムホイルで64時間被覆した。この後、ヨウ素溶液によって、デンプンについて葉を染色した。64時間後、デンプンは、野生型の葉および系統#46の葉においては分解された一方、系統#51、#56および#58の葉は、デンプンをなおも含んだ。
【図２０】図20は、α-SHIショートタバコ植物体の葉における、移動デンプンの分解の決定を示す。3つの系統は、野生型と比較して、葉の移動デンプンを動員する能力における差異を示す。暗所に維持するために、α-SHIショート系統#18、#31、#37、#46、#47および野生型の葉を、アルミニウムホイルで12時間被覆した。この後、ヨウ素溶液によって、デンプンについて葉を染色した。12時間後、デンプンは、野生型の葉においては分解された一方、系統#18、#31、#37、#46および#47の葉は、デンプンをなおも含んだ。
【図２１】α-SHIL700ジャガイモ植物体の葉における、移動デンプンの分解の決定を示す。4つの系統は、野生型と比較して、葉の移動デンプンを動員する能力における差異を示す。暗所に維持するために、α-SHIL700系統#16、#41、#46、#53および野生型の葉を、アルミニウムホイルで72時間被覆した。この後、ヨウ素溶液によって、デンプンについて葉を染色した。72時間後、デンプンは、野生型の葉においては分解された一方、系統#16、#41、#46、#53の葉は、デンプンをなおも含んだ。
【図２２】α-SHIショートアンチセンスの葉は、暗所において、14日後に生存していることを示す。SHIショートアンチセンス植物（系統#51、#56および#58）のソース葉、ならびに非形質転換対照のソース葉を、アルミニウムホイルで14日間被覆した。非形質転換体の葉は死んだ一方、アンチセンス系統#51、#56および#58（左から右）の葉は、なおも生存可能であった。
【図２３】暗期／明期の終了時における、α-SHIショートアンチセンス系統#46、#51、#56、#58および野生型の、15週齢のソース葉におけるデンプン含量を示す。白い棒は、明期の終了時におけるデンプン含量を示し、黒い棒は、暗期の終了時におけるデンプン含量を示す。デンプン含量は、m2当たりのmmolヘキソース等量である。
【図２４】ppt-β-アミラーゼについてのアンチセンス構築物を概略的に示す。
【図２５】全長SHI cDNAの2.3 kb断片を含む、SHIタンパク質についてのアンチセンス構築物を概略的に示す。
【図２６】SHI cDNAの1.2 kb断片を含む、SHIタンパク質についてのアンチセンス構築物を概略的に示す。
【図２７】CSD12タンパク質についてのアンチセンス構築物を概略的に示す。
【図２８】CSD23タンパク質についてのアンチセンス構築物を概略的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2004535789.tif 000023
【図２２】
2004535789.tif 000024
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535789.tif 000138
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月25日(2003.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される、デンプン分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子：
（a）配列番号：2において示されるアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのタンパク質の成熟形態をコードする核酸分子；
（b）配列番号：1において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（c）アミノ酸配列が、配列番号：2において示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも40％の相同性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（d）相補鎖が、(a)または(b)において定義される核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；
（e）(a)、(b)、(c)または(d)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子によってコードされる、タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
（f）ヌクレオチド配列が、(b)、(c)、(d)または(e)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子の配列から、遺伝暗号の縮重によって逸脱している核酸分子。
【請求項２】
以下からなる群より選択される、デンプン分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子：
（a）配列番号：4において示されるアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのタンパク質の成熟形態をコードする核酸分子；
（b）配列番号：3において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（c）アミノ酸配列が、配列番号：4において示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の相同性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（d）相補鎖が、ストリンジェントな条件下において、(a)または(b)において定義される核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；
（e）(a)、(b)、(c)または(d)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子によってコードされる、タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
（f）ヌクレオチド配列が、(b)、(c)、(d)または(e)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子の配列から、遺伝暗号の縮重によって逸脱している核酸分子。
【請求項３】
以下からなる群より選択される、デンプン分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子：
（a）配列番号：6において示されるアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのタンパク質の成熟形態をコードする核酸分子；
（b）配列番号：5において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（c）アミノ酸配列が、配列番号：6において示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも40％の相同性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（d）相補鎖が、(a)または(b)において定義される核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；
（e）(a)、(b)、(c)または(d)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子によってコードされる、タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
（f）ヌクレオチド配列が、(b)、(c)、(d)または(e)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子の配列から、遺伝暗号の縮重によって逸脱している核酸分子。
【請求項４】
以下からなる群より選択される、デンプン分解に関与するタンパク質をコードする核酸分子：
（a）配列番号：8において示されるアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのタンパク質の成熟形態をコードする核酸分子；
（b）配列番号：7において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（c）アミノ酸配列が、配列番号：8において示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の相同性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
（d）相補鎖が、ストリンジェントな条件下において、(a)または(b)において定義される核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；
（e）(a)、(b)、(c)または(d)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子によってコードされる、タンパク質の生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
（f）ヌクレオチド配列が、(b)、(c)、(d)または(e)のいずれか1つにおいて定義される核酸分子の配列から、遺伝暗号の縮重によって逸脱している核酸分子。
【請求項５】
請求項1から4のいずれか一項記載の核酸分子と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1から4のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
核酸分子が、原核細胞または真核細胞における、翻訳可能なRNAの転写および合成を確実にする調節因子に、センスの方向で連結されている、請求項6記載のベクター。
【請求項８】
請求項1から4のいずれか一項記載の核酸分子、もしくは請求項6もしくは請求項7記載のベクターによって形質転換された宿主細胞、またはそのような細胞の子孫細胞。
【請求項９】
微生物の細胞である、請求項8記載の宿主細胞。
【請求項１０】
大腸菌の細胞である、請求項9記載の宿主細胞。
【請求項１１】
デンプンの分解に関与するタンパク質、または生物学的に活性なその断片を調製するための方法であって、請求項8から10のいずれか一項記載の宿主細胞が、タンパク質の合成を可能にする条件下において培養され、培養細胞および／または培養培地からタンパク質が単離される方法。
【請求項１２】
請求項1から4のいずれか一項記載の核酸分子によってコードされるか、または請求項11記載の方法に従って調製される、タンパク質または生物学的に活性なその断片。
【請求項１３】
請求項1から4のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項6もしくは請求項7記載のベクターによって形質転換された、トランスジェニック植物細胞またはそのような細胞の子孫細胞であって、デンプンの分解に関与するタンパク質をコードする該核酸分子が、植物細胞において翻訳可能なmRNAの転写を可能にする調節因子の制御下にある、トランスジェニック植物細胞またはそのような細胞の子孫細胞。
【請求項１４】
請求項13記載の植物細胞を含む植物。
【請求項１５】
有用な植物である、請求項14記載の植物。
【請求項１６】
デンプン貯蔵植物である、請求項14または請求項15記載の植物。
【請求項１７】
ジャガイモの植物体である、請求項16の植物。
【請求項１８】
請求項13記載の植物細胞を含む、請求項14から17のいずれか一項記載の植物の繁殖材料。
【請求項１９】
請求項1から4のいずれか一項記載のDNA分子の転写産物に対して、相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA分子。
【請求項２０】
請求項1から4のいずれか一項記載のDNA分子の転写産物を特異的に切断する、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA分子。
【請求項２１】
共抑制効果によって、植物細胞における発現の際に、請求項1から4のいずれか一項記載の核酸分子の発現の減少を導くRNAをコードするDNA分子。
【請求項２２】
RNA干渉（RNAi）によって、植物細胞における発現の際に、請求項1から4のいずれか一項記載の核酸分子の発現の減少を導くRNAをコードするDNA分子。
【請求項２３】
請求項19から22のいずれか一項記載のDNA分子を含むベクター。
【請求項２４】
DNA分子が、植物細胞における転写を確実にするDNA調節因子と組み合わされる、請求項23記載のベクター。
【請求項２５】
請求項19から22のいずれか一項記載のDNA分子、または請求項23もしくは請求項24記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
外来の核酸分子の存在または発現が、請求項12記載のタンパク質の内在性の活性の低下を導く、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２７】
内在性の活性の低下が、請求項12記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の阻害によるものである、請求項26記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２８】
外来の核酸分子が以下からなる群より選択される、請求項27記載のトランスジェニック植物細胞：
（a）請求項12記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の減少を導くことが可能である、アンチセンスRNAまたはRNAi構築物をコードするDNA分子；
（b）共抑制効果を介して、請求項12記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子の発現の減少を導くことが可能であるDNA分子；
（c）請求項12記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子の転写産物を、特異的に切断することができるリボザイムをコードするDNA分子；および
（d）インビボ突然変異誘発を介して導入される核酸分子であって、請求項12記載のタンパク質をコードする内在性遺伝子における突然変異または非相同配列の挿入を導き、それによって、請求項12記載のタンパク質の発現の減少、または不活性化タンパク質の合成を導く核酸分子。
【請求項２９】
請求項26から28のいずれか一項記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項３０】
請求項19から22のいずれか一項記載のDNA分子の転写によって得られるRNA分子。
【請求項３１】
細胞において内在性の形態に合成される請求項12記載のタンパク質の量が、対応する野生型の細胞と比較して、細胞において減少することを特徴とする、デンプン分解の減少を示すトランスジェニック植物細胞を生産するための方法。
【請求項３２】
細胞における請求項12記載のタンパク質の量の減少が、アンチセンス効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
細胞における請求項12記載のタンパク質の量の減少が、リボザイム効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
細胞における請求項12記載のタンパク質の量の減少が、共抑制効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
細胞における請求項12記載のタンパク質の量の減少が、インビボ突然変異誘発を介して導入される、このタンパク質をコードする内在性遺伝子における突然変異によって引き起こされることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
細胞における請求項12記載のタンパク質の量の減少が、RNA干渉（RNAi）効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
請求項31から36のいずれか一項記載の方法によって得られる植物細胞。
【請求項３８】
請求項37記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項３９】
請求項26から28のいずれか一項記載の植物細胞、または請求項37記載の植物細胞を含む、請求項38記載の植物の繁殖材料。
【請求項４０】
請求項12記載のタンパク質を含む、洗剤または洗浄剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2004535789.tif 000149
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2004535789.tif 000154
【図１７】
2004535789.tif 000155
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2004535789.tif 000162
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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2004535789.tif 000168
2004535789.tif 000169
2004535789.tif 000170
2004535789.tif 000171
2004535789.tif 000172
2004535789.tif 000173