(57)【要約】本明細書において開示される発明は、導入遺伝子に対して５’側にイントロンを含むアデノウイルスベクターを提供する。このようなアデノウイルスベクターは、タンパク質の発現に有用である。これらのアデノウイルスベクターの作製方法および使用方法を、本明細書中で提供する。詳細には、導入遺伝子に対して、５’側にイントロンを含むアデノウイルスベクターに由来するウイルスタンパク質の発現増大を得る方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物被験体における免疫応答を誘導する能力のある組成物（イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物を含む）を、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターであって、ここで該イントロンは、該異種の導入遺伝子に対して５’側に位置し、そして該ベクターは該異種の導入遺伝子を、異種の導入遺伝子を含みかつ該異種の導入遺伝子に対して５’側のイントロンを欠いている、比較可能なアデノウイルスベクターより高いレベルで発現し得る、アデノウイルスベクター。
【請求項２】
前記ベクターが哺乳動物のアデノウイルスベクターまたは鳥アデノウイルスベクターである、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３】
哺乳動物アデノウイルスベクターが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、イヌまたはヒツジのアデノウイルスベクターを含む、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４】
前記ベクターがウシアデノウイルスベクターである、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前記ウシアデノウイルスベクターが、ウシアデノウイルス亜群１またはウシアデノウイルス亜群２のメンバーである、請求項４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記ウシアデノウイルスベクターがＢＡＶ３である、請求項４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記導入遺伝子が真核生物タンパク質または原核生物タンパク質をコードする、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで前記導入遺伝子が、治療タンパク質もしくは治療ポリペプチド；成長ホルモンもしくは他の増殖エンハンサー；または免疫応答を惹起し得るタンパク質をコードする、アデノウイルスベクター。
【請求項９】
前記導入遺伝子が病原体由来のタンパク質をコードする、請求項７に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
前記タンパク質がＲＮＡウイルスタンパク質である、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
前記タンパク質がＤＮＡウイルスタンパク質である、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
前記タンパク質が細菌タンパク質である、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
前記タンパク質が寄生生物由来のタンパク質である、請求項９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
前記イントロンが哺乳動物のイントロンである、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで前記導入遺伝子が制御領域に作動可能に連結しており、前記イントロンが該制御領域に対して３’側に位置する、アデノウイルスベクター。
【請求項１６】
前記ベクターが複製性である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
前記ベクターが複製欠損性である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項１に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項１９】
薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１に記載のベクターを含む、組換えアデノウイルス。
【請求項２２】
イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを調製する方法であって、ここで該イントロンは、該異種の導入遺伝子に対して５’側に位置し、該方法が、アデノウイルスベクターを得る工程ならびに導入遺伝子およびイントロンを該ベクター中に挿入する工程を包含し、ここで該イントロンが該異種の導入遺伝子に対して５’側に挿入される、方法。
【請求項２３】
前記アデノウイルスベクターが、複製に必須の遺伝子中に欠失を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複製に必須の遺伝子がＥ１である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスを調製する方法であって、請求項１に記載のアデノウイルスベクターを有する哺乳動物宿主細胞を、アデノウイルスの複製およびパッケージングに適した条件下で培養する工程；および必要に応じて、産生された該アデノウイルスを回収する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで前記アデノウイルスが、複製に必須の遺伝子中に欠失を有し、該方法がさらに、前記哺乳動物宿主細胞を、前記複製に必須の遺伝子を有するヘルパー細胞株の存在下で培養する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記複製に必須の遺伝子がＥ１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項９に記載のアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項２９】
請求項１０に記載のアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項３０】
請求項１１に記載のアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項３１】
請求項１２に記載のアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項３２】
請求項１３に記載のアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項３３】
哺乳動物被験体において免疫応答を誘導し得る組成物であって、請求項２８に記載の免疫原性組成物を含む、組成物。
【請求項３４】
薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
哺乳動物宿主におけるＲＮＡウイルス感染の症状を処置または改善する方法であって、該宿主に、請求項２９に記載の免疫原性組成物の治療的有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
哺乳動物宿主におけるＤＮＡウイルス感染の症状を処置または改善する方法であって、該宿主に、請求項３０に記載の免疫原性組成物の治療的有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
哺乳動物宿主における細菌感染の症状を処置または改善する方法であって、該宿主に、請求項３１に記載の免疫原性組成物の治療的有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
哺乳動物宿主における寄生生物感染の症状を処置または改善する方法であって、該宿主に、請求項３２に記載の免疫原性組成物の治療的有効量を投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年７月１４日出願の米国仮出願番号６０／２１８，２８３号の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、アデノウイルス、アデノウイルスベクター、ならびにアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターの作製方法および使用方法に関する。特に、本発明は、アデノウイルスおよび導入遺伝子に対して５’側にイントロンを含むアデノウイルスベクター、ならびに特に、アデノウイルスにおけるタンパク質の発現および上記タンパク質をコードする導入遺伝子の５’側にイントロンを含むアデノウイルスベクターに関する。
【０００３】
（発明の背景）
近年の分子生物学的技術の出現は、組換えウイルスベクターの作製を可能にした。組換えウイルスベクターに関して提案される利用法としては、癌性細胞または感染細胞への毒性生成物の送達、嚢胞性線維症の処置、および免疫系の追加免疫が挙げられる。かなりの注目を受けている組換えウイルスベクターの１つの型は、アデノウイルスベクターである。
【０００４】
アデノウイルスは、ウイルス遺伝子発現の２段階（初期発現および後期発現）を有するＤＮＡウイルスである。いくつかのアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１遺伝子およびＥ２遺伝子のような）は、複製に必須である。Ｅ３遺伝子およびＥ４遺伝子の一部分のような他のアデノウイルス遺伝子は、必須ではないと考えられる。すなわち、アデノウイルスからのそれらの欠損は、複製を損なわない。アデノウイルスは一般的に、宿主細胞の感染に続いて溶解性の複製周期を経る。感染細胞を溶解するのに加えて、アデノウイルスの複製過程は、宿主細胞のｍＲＮＡの輸送および翻訳をブロックし、従って細胞タンパク質合成を阻害する。アデノウイルスおよびアデノウイルス複製に関する総論については、Ｓｈｅｎｋ、Ｔ．およびＨｏｒｗｉｔｚ、Ｍ．Ｓ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｆｉｅｌｄｓ、Ｂ．Ｎ．ら編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９６）、第６７章および第６８章のそれぞれを参照のこと。
【０００５】
アデノウイルスベクターは、複製欠損性群および複製性群の、２つの異なる群に分類される。複製欠損アデノウイルスベクターは、子孫を産生できず、そして代表的に、複製に必須の遺伝子の欠損している。複製欠損アデノウイルスベクターは、宿主細胞において複製するために、欠損した遺伝子活性を発現するヘルパー細胞株を必要とする。複製有能アデノウイルスベクターは、ヘルパー細胞株を伴わずに宿主細胞内で複製する能力がある。アデノウイルスおよびアデノウイルスベクター系の開発についての一般的な背景の引用文献については、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６−４６７；Ｔａｋｉｆｆら（１９８１）Ｌａｎｃｅｔ　１１：８３２−８３４；Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１：６００３−６０２０；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ　３：２９１７−２９２２；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６７：５９１１−５９２１；Ｂｅｔｔら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：８８０２−８８０６；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、米国特許出願第５，９９４，１３２号およびＨｅら、米国特許出願第５，９２２，５７６号を参照のこと。
【０００６】
種々の哺乳動物アデノウイルスは当該分野で公知であり、ヒトアデノウイルス、ブタアデノウイルス、ヒツジアデノウイルス、イヌアデノウイルス、およびウシアデノウイルスが挙げられる。ヒトアデノウイルスのうち少なくとも４７血清型が、記載されている。特定の疾患に関連する最も一般的なヒト血清型についての総説が、刊行されている。例えば、Ｆｏｙ　Ｈ．Ｍ．（１９８９）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　Ｉｎ　Ｅｖａｎｓ　ＡＳ（編）．「Ｖｉｒａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎｓ」．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，７７−８９頁およびＲｕｂｉｎ　Ｂ．Ａ．（１９９３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｉｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ａｃｔａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｈｕｎｇ　４０：３０３−３２３を参照のこと。
【０００７】
ブタアデノウイルスは、例えば、Ｔｕｂｏｌｙら、１９９３，Ｒｅｓ．ｉｎ　Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．５４：３４５−３５０；Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら、１９７５，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８５：４３７−４４３；Ｈｉｒａｈａｒａら、１９９０，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．５２：４０７−４０９；Ｒｅｄｄｙら、１９９３，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　３６：１６１−１６８；Ｒｅｄｄｙら、１９９５ｂ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１９５−２００に開示される。Ｖｒａｔｉら（１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０９：４００−４０８）およびＸｕら（１９９８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２４８：１５６−１６３）は、ヒツジアデノウイルスの配列を開示する。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９９７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：８７３−８７８）は、イヌアデノウイルス１型のＤＮＡ配列を開示する。
【０００８】
ウシアデノウイルス（ＢＡＶ）は、２つのサブグループに分けられた少なくとも１０個の血清型を含む。これらのサブグループは、固相酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイを用いた血清学的研究、ウイルス中和試験、免疫電子顕微鏡法に基づいて、それらの宿主特異性および臨床的症候群によって、特徴付けられている。サブグループ１ウイルスは、ＢＡＶ１、ＢＡＶ２、ＢＡＶ３、およびＢＡＶ９を含み、そしてそれぞれは、樹立したウシ細胞において、ＢＡＶ４、ＢＡＶ５、ＢＡＶ６、ＢＡＶ７、ＢＡＶ８およびＢＡＶ１０を含むサブグループ２と比較して相対的に良好に増殖する。
【０００９】
ＢＡＶ３は、１９６５年に最初に単離され、そしてＢＡＶ遺伝子型のうちで最も特徴付けられている。ＢＡＶ３のゲノムのヌクレオチド配列（約３５ｋｂ）、ゲノム組織、および転写地図は、Ｋｕｒｏｋａｗａら（１９７８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２８：２１２−２１８およびＲｅｄｄｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１３９４に開示されている。Ｒｅｄｄｙら（１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９１３７）は、発現ベクターとして複製欠損性ＢＡＶ３を開示する。ＢＡＶのサブグループ１の代表物であるＢＡＶ３（Ｂａｒｔｈａ　１９６９，Ａｃｔａ　Ｖｅｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｕｎｇ．１９：３１９−３２１）は、通常、無症状感染を生じる（Ｄａｒｂｙｓｈｉｒｅら（１９６５）．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７５：３２７−３３０）が、しかし時折、より重大な気道感染に関連する（Ｄａｒｂｙｓｈｉｒｅら、１９６６　Ｒｅｓ．Ｖｅｔ　Ｓｃｉ　７：８１−９３；Ｍａｔｔｓｏｎら、１９８８，Ｊ．Ｖｅｔ　Ｒｅｓ　４９：６７−６９）、ウシの一般的な病原体である。他のアデノウイルスのように、ＢＡＶ３は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子を含む直径７５ｎｍ（Ｎｉｉｙａｍａら　１９７５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１６：６２１−６３３）の非エンベロープ性正二十面体粒子である。ハムスター中に注入された場合、ＢＡＶ３は腫瘍を生じ得（Ｄａｒｂｙｓｈｉｒｅ、１９６６，Ｎａｔｕｒｅ　２１１：１０２）、そして培養物中でウシウイルスＤＮＡはマウス細胞、ハムスター細胞またはラット細胞の形態学的トランスフォーメーションを効率的にもたらし得る（ＴｓｕｋａｍｏｔｏおよびＳｕｇｉｎｏ，１９７２　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９：４６５−４７３；Ｍｏｔｏｉら、１９７２，Ｇａｎｎ　６３：４１５−４１８）。交差ハイブリダイゼーションは、ゲノムの大部分の領域において、ＢＡＶ３とヒトアデノウイルス２型（ＨＡｄ２）との間で観察された（Ｈｕら、１９８４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：６０４−６０８）。
【００１０】
発現系におけるイントロンの使用は開示されており、例えば、Ｃｈｏｉ　Ｔ．ら（１９９１，Ｍｏｌ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌ　１１（６）：３０７０−４，ＩｌｌらＷＯ９９／２９８４８およびＲｏｓｅら米国特許第５，８６１，２７７号を参照のこと。イントロンを含み得るサイトメガロウイルスプロモーターを有するαウイルスベクターは、ＰａｒｒｉｎｇｔｏｎらＷＯ９９／２５８５８に開示されている。イントロンを有するレトロウイルスベクターは、ＫｉｍらＷＯ００／００６２９に開示されている。イントロンまたは遺伝子発現の他の制御エレメントと組み合わせて遺伝子を含む、αウイルス−レトロウイルスＲＮＡベクターは、ＧａｒｏｆｆらＷＯ９８／１５６３６に開示されている。
【００１１】
ウシの病原体に由来する保護抗原の送達のためのベクターとしての、ウシアデノウイルス−３（ＢＡＶ−３）の使用が、開示されている（Ｂａｘｉ，Ｍ．ら、１９９９　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６１：１４３−１５２；Ｒｅｄｄｙら、１９９９　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，９１３７−９１４４；Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら、１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）。Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋらは、隣接する上流配列または下流配列をいずれも有さずに、複製有能ＢＡＶ−３ベクターにクローニングしたＲＮＡウイルス遺伝子の、高レベルの発現を得ようした試みの失敗を開示する（１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）。ＲＮＡウイルスであるウシコロナウイルス（ＢＣＶ）およびその特性が開示されている（ＫｉｎｇおよびＢｒｉａｎ，１９８２　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．４２，７００−７０７；Ｄｅｒｅｇｔら、１９８９　Ｊ　Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，９９３−９９８；Ｄｅｒｅｇｔ　＆　Ｂａｂｉｕｋ，１９８７　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６１，４１０−４２０）。ＢＡＶ−３に加えて他のアデノウイルスベクターが、遺伝子発現を改善する試みにおいて使用されている。例えば、ウシコロナウイルスＨＥ遺伝子を発現する、組換えヒトアデノウイルス−５（ＨＡＶ−５）は、Ｙｏｏら、１９９２　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５９１−２６００に開示された。さらに、ウシコロナウイルスＨＥ遺伝子を発現するＨＡＶ−５は、ＨＥ遺伝子の発現によって誘導される免疫原性を決定するために、コットンラットにおいて試験された。Ｂａｃａ−Ｅｓｔｒａｄａら、１９９５　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８６，１３４−１４０。
【００１２】
アデノウイルスベクターの産生および使用の進歩にかかわらず、タンパク質の発現を増強するアデノウイルスベクターを改善する必要が存在する。
【００１３】
本明細書中に引用される全ての特許および刊行物の開示は、その全体が本明細書によって参考として援用される。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。ここで、イントロンは、異種の導入遺伝子に対して５’側に位置され、上記ベクターは、異種の導入遺伝子を含み、かつ上記異種の導入遺伝子に対して５’側のイントロンを欠損する匹敵するアデノウイルスベクターよりも、異種の導入遺伝子のより強いレベルを発現する能力がある。
【００１５】
いくつかの実施形態において、このアデノウイルスベクターは、哺乳動物または鳥類のアデノウイルスベクターである。他の実施形態において、哺乳動物アデノウイルスとしては、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジまたはイヌのアデノウイルスが挙げられる。他の実施形態において、鳥類のアデノウイルスとしては、七面鳥、ニワトリおよび他の家禽が挙げられる。他の実施形態において、アデノウイルスベクターはウシアデノウイルスベクター（ＢＡＶ）であり、ＢＡＶのサブグループ１（ＢＡＶ１、ＢＡＶ２、ＢＡＶ３またはＢＡＶ９のような）、またはＢＡＶのサブグループ２（ＢＡＶ４、ＢＡＶ５、ＢＡＶ６、ＢＡＶ７、ＢＡＶ８またはＢＡＶ１０のような）のメンバーを含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、アデノウイルスベクターは、複製性であり、そしてさらなる他の実施形態において、アデノウイルスベクターは複製欠陥性である。
【００１７】
さらなる実施形態において、この導入遺伝子は、真核生物または原核生物の遺伝子であり、治療タンパク質または治療ポリペプチドをコードする遺伝子；増殖ホルモンまたは他の増殖エンハンサーをコードする遺伝子；および免疫応答を誘発させる能力のあるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＲＮＡウイルスタンパク質およびＤＮＡウイルスタンパク質を含む、ウイルスタンパク質のような病原体に由来するタンパク質をコードする。他の実施形態において、導入遺伝子は、細菌のタンパク質またはポリヌクレオチドをコードする。なおさらなる実施形態において、導入遺伝子は、寄生虫由来のタンパク質またはポリヌクレオチドをコードする。さらなる実施形態において、ＲＮＡウイルスタンパク質は、ウシコロナウイルス赤血球凝集素エステラーゼを含む。なお他の実施形態において、ＤＮＡウイルスタンパク質は、ウシ疱疹ウイルス−１糖タンパク質Ｄを含む。さらなる実施形態において、細菌タンパク質としては、ＬｐｐＢのようなＨａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ　ｓｏｍｍｕｓまたはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａに由来するタンパク質が挙げられる。さらなる実施形態において、寄生虫としては、マラリアに関連するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍを含むＣｏｃｃｉｄｉａサブクラスのメンバーが挙げられる。さらなる実施形態において、導入遺伝子は、宿主細胞内のスプライシング事象に対して感受性の核酸配列を含むものである。
【００１８】
本発明は、イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスを含む、宿主細胞ならびに組成物を提供し、ここで上記イントロンは、異種の導入遺伝子に対して５’側に位置する。本発明はまた、イントロンおよび異種の導入遺伝子を含む組換えアデノウイルスを含む宿主細胞を提供し、ここで上記イントロンは、異種の導入遺伝子に対して５’側に位置される。本発明はまた、このようなアデノウイルスベクター、組換えアデノウイルスおよび宿主細胞を作製する方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物被験体における免疫応答を誘導する能力のある組成物（イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物を含む）を、提供する。ここで、上記イントロンは異種の導入遺伝子に対して５’側に位置する。さらなる実施形態において、この組成物はさらに、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。さらなる実施形態において、この組成物はさらに緩衝液を含む。さらなる実施形態において、この免疫原性組成物は病原体由来のタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。なおさらなる実施形態において、この免疫原性組成物は、ＲＮＡウイルスタンパク質、ＤＮＡウイルスタンパク質、細菌タンパク質または寄生虫由来のタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。
【００２０】
本発明はまた、哺乳動物宿主においてＲＮＡウイルス感染の症状を処置する方法および改善させる方法を提供し、この方法は、イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物の治療有効量を上記宿主に投与する工程を含む。ここで、上記イントロンはウイルス遺伝子に対して５’側に位置し、そして上記導入遺伝子はＲＮＡウイルスタンパク質をコードする。本発明はまた、哺乳動物宿主においてＤＮＡウイルス感染の症状を処置する方法および改善させる方法を提供し、この方法は、イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物の治療有効量を上記宿主に投与する工程を含む。ここで、上記イントロンはウイルス遺伝子に対して５’側に位置し、そして上記導入遺伝子はＤＮＡウイルスタンパク質をコードする。本発明はまた、哺乳動物宿主において細菌感染の症状を処置する方法および改善させる方法を提供し、この方法は、イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物の治療有効量を上記宿主に投与する工程を含む。ここで、上記イントロンはウイルス遺伝子に対して５’側に位置し、そして上記導入遺伝子は細菌タンパク質をコードする。本発明はまた、哺乳動物宿主において寄生虫感染の症状を処置する方法および改善させる方法を提供し、この方法は、イントロンおよび異種の導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを含む、免疫原性組成物の治療有効量を上記宿主に投与する工程を含む。ここで、上記イントロンはウイルス遺伝子に対して５’側に位置し、そして上記導入遺伝子は寄生虫タンパク質をコードする。
【００２１】
（発明を実施するための形態）
本発明者らは、５’側に位置するイントロン（すなわち、導入遺伝子から上流に存在する）を含むアデノウイルスベクターを構築し、そして導入遺伝子に対して５’側に位置するイントロンを含むアデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現が、導入遺伝子を含みかつ導入遺伝子に対して５’側に位置するイントロンを欠いた匹敵するアデノウイルスベクターと比較した場合に、増大していることを実証した。本明細書中で例証される本発明のいくつかの実施形態において、導入遺伝子は、病原体由来のタンパク質をコードする。他の実施形態において、導入遺伝子は、ＲＮＡウイルスタンパク質、ＤＮＡウイルスタンパク質、細菌タンパク質または寄生生物由来のタンパク質をコードする。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本願導入遺伝子は、配列特有の特徴に起因する宿主細胞内でのスプライシング事象に感受性の核酸配列を含む、導入遺伝子である。宿主細胞内での導入遺伝子配列のスプライシング事象に感受性の核酸配列の存在は、不完全な導入遺伝子配列もしくは切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）導入遺伝子配列、またはそうでない場合には、異常な導入遺伝子配列の発現と関連した問題に寄与し得る。導入遺伝子配列（宿主細胞内でのスプライシング事象に感受性の核酸配列を含む）に対して５’側に位置するイントロンの存在は、導入遺伝子の増大した発現に関連する。
【００２３】
（一般的な技術）
本発明の実施には、他に記載しない限り、当業者の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、以下の文献に完全に説明されている：例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｎら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄａｖｉｄ　Ｗｉｌｄ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　ＮＹ、１９９４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗら編、１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　第三版（Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｃｈａｎｏｃｋら、ｐｕｂ　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．ＡｌｂｅｒｔおよびＮ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ編、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ　Ｖｅｒｌａｇｓ　ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｍｂＨ，１９９３）。アデノウイルスに関する技術については、特に、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３３７：３８７〜３８８；ＢｅｒｋｎｅｒおよびＳｈａｒｐ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：６００３〜６０２０；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３：２９１７〜２９２２；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６７：５９１１〜５９２１；Ｂｅｔｔら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：８８０２〜８８０６を参照のこと。
【００２４】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「イントロン」は、非コードＤＮＡまたは成熟ＲＮＡには存在しない前駆体ＲＮＡ配列をいい、単離された天然に存在するイントロンならびに合成イントロンおよびキメライントロン（すなわち、異なる核酸種に由来する部分を含むイントロン）を含む。本発明に含まれるイントロンとしては、真核生物起源のイントロンが挙げられる。イントロンは、一般的に、転写が生じる際にメッセンジャーＲＮＡからスプライシングされ、そして一般的にスプライス供与部位（ｄｏｎｏｒ　ｓｉｔｅ）およびスプライス受容部位（ａｃｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｔｅ）を含む。本明細書中で使用されるイントロンは、５’スプライス供与部位および３’スプライス受容部位を含む。本明細書中で使用される場合、「スプライス供与部位」は、イントロンの５’末端配列、すなわち、エキソン−イントロンの５’連結配列をいう。本明細書中で使用される場合、「スプライス受容部位」は、イントロンの３’末端配列、すなわち、イントロン−エキソンの３’連結部位をいう。スプライス供与部位およびスプライス受容部位は、Ｍｏｕｎｔ　Ｓ．、１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０：４５９〜４７１に開示されている。本発明のアデノウイルスベクター構築物において、イントロンが導入遺伝子に対して３’側に位置し、そして導入遺伝子プロモーターの開始コドンに対して５’側に位置することが好ましい。
【００２５】
「アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ）」「アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ）」（交換可能に使用される）は、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む。本発明のポリヌクレオチド構築物は、以下に挙げられるいくつかの形態のうちのいずれかであり得るが、これらに限定されない：ＤＮＡ、アデノウイルス外殻に被覆されたＤＮＡ、別のウイルスまたはウイルス様形態（例えば、単純ヘルペスウイルス、およびＡＡＶ）にパッケージングされたＤＮＡ、リポソームに被覆されたＤＮＡ、ポリリシンと複合体化したＤＮＡ、合成ポリカチオン分子と複合体化したＤＮＡ、トランスフェリンと結合体化したＤＮＡ、およびＰＥＧなどの化合物と結合体化したＤＮＡ（分子を免疫学的に「マスク」および／または半減期を増長させるため）、および非ウイルスタンパク質に結合体化したＤＮＡ。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧだけでなく、これらのアナログまたはこれらの塩基の改変された形態（例えば、メチル化されたヌクレオチド、ヌクレオチド間での改変（例えば、無電荷の連結およびチオエート（ｔｈｉｏａｔｅ））、糖アナログの使用、ならびに改変された骨格構造および／または代替的な骨格構造（例えば、ポリアミド））のいずれかを含む。用語アデノウイルスベクターは、標的細胞において複製能力のあるベクターおよび複製欠損ベクターを含む。イントロンを含むアデノウイルスベクターとイントロンを欠損するアデノウイルスベクターとを比較する場合、本明細書中で使用される用語「匹敵する」は、これらのアデノウイルスベクターが、イントロンの存在を除いて、同一であるか、または実質的に同一であることを意味する。
【００２６】
用語「導入遺伝子」は、アデノウイルス構築物を作製するために、アデノウイルスゲノムまたはベクター中に挿入される異種遺伝子をいう。導入遺伝子は、組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入されるか、または制限酵素によってアデノウイルスゲノムを切断し、そしてＤＮＡリガーゼを用いてアデノウイルスゲノム中に連結され得る。遺伝子またはエレメントに関して、用語「上流」は、その位置が参照点に対して５’側であることを意味する。例えば、エレメントＡが遺伝子Ｂの上流にあり、ゲノム配列を５’側からから３’側へ読む場合、エレメントＡは、遺伝子Ｂに対して５’側である。遺伝子またはエレメントに関して、用語「下流」は、その位置が参照点に対して３’側であることを意味する。例えば、エレメントＡが遺伝子Ｂの下流にあり、ゲノム配列を５’側からから３’側へ読む場合、エレメントＡは、遺伝子Ｂに対して３’側である。導入遺伝子は、配列特有の特徴に起因する宿主細胞内でのスプライシング事象に感受性の核酸配列を含み得る。このような導入遺伝子の例としては、ＲＮＡウイルス遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。本発明内に含まれる導入遺伝子としては、真核生物遺伝子および原核生物遺伝子（治療的タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子；成長ホルモンまたは他の成長エンハンサーをコードする遺伝子；ならびに免疫応答を惹起し得るタンパク質をコードする遺伝子を含む）が挙げられる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＲＮＡウイルスタンパク質またはＤＮＡウイルスタンパク質などのウイルスタンパク質をコードする。他の実施形態において、導入遺伝子は細菌遺伝子をコードする。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、１以上の細胞型を形質導入／トランスフェクションするために設計されたポリヌクレオチド構築物をいう。ベクターは、例えば、挿入ヌクレオチドを単離、増殖および複製するために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞で核酸配列を発現するために設計された「発現ベクター」、または組換えウイルスもしくはウイルス様粒子の産生をもたらすように設計された「ウイルスベクター」、または１を超えるベクターの型の性質を含む「シャトルベクター」であり得る。
【００２８】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書中で交換可能に使用され、任意の長さの多量体形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）をいう。これらの用語には、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、また三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、プリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的に改変された非天然の、生化学的に改変された非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチド骨格は、糖およびリン酸基（代表的にＲＮＡまたはＤＮＡに見出され得るような）、あるいは改変されたかもしくは置換された糖またはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチド骨格は、ホスホラミダイトなどの合成サブユニットのポリマーを含み得、従って、オリゴデオキシヌクレオシドホスホラミダイト（Ｐ−ＮＨ２）または混合されたホスホラミダイト−ホスホジエステル−オリゴマ−であり得る。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：１８４１〜８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：２３１８〜２３；Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：２９６６〜７３。ホスホロチオエート連結が、ホスホジエステル連結の代わりに使用され得る。Ｂｒａｕｎら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２０８４〜９；Ｌａｔｉｍｅｒら（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０５７〜１０６４。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、適切な条件下でこれらの鎖をアニーリングするか、または適切なプライマーと共にＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を新規合成するか、のいずれかによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から獲得され得る。
【００２９】
以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）、ウラシル、他の糖および連結基（例えば、フルオロリボース（ｆｌｕｏｒｏｒｉｂｏｓｅ）およびチオエート）、ならびにヌクレオチド枝鎖（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｂｒａｎｃｈ）を含み得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合体化によって、多量体化された後に、さらに改変され得る。この定義に含まれる他の型の改変は、キャップ、天然に存在する１以上のヌクレオチドのアナログでの置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体に結合するための手段の導入である。好ましくは、このポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧだけでなく、これらのアナログまたはこれらの塩基の改変された形態（例えば、メチル化されたヌクレオチド、ヌクレオチド間での改変（例えば、無電荷の連結およびチオエート（ｔｈｉｏａｔｅ））、糖アナログの使用、ならびに改変された骨格構造および／または代替的な骨格構造（例えば、ポリアミド））のいずれかを含む。
【００３０】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域は、別の配列に対して特定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有し、配列同一性は、整列された場合に、その割合の塩基が、比較している２つの配列で同一であることを意味する。この整列および相同性％または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）補遺３０、７．７．１８節に記載されるソフトウェアプログラム）を使用して決定され得る。好ましい整列プログラムは、ＡＬＩＧＮ　Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）であり、好ましくは、以下であるデフォルトパラメーターを使用する：ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）＝２；オープンギャップ（ｏｐｅｎ　ｇａｐ）＝０；エクステンドギャップ（ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）＝２。
【００３１】
「転写制御下」は、当該分野で十分に認識された用語であり、ポリヌクレオチド配列（通常、ＤＮＡ配列）の転写は、転写の開始または促進を担うか、または転写を促進するエレメントにその配列が作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）（作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ））連結されていることに依存することを示す。「作動可能に連結」は、エレメントが機能し得るように配列されている近接した域をいう。
【００３２】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然に他の分子と関連しては見出されない別のＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントであるか、またはこのようなＤＮＡ分子に結合した同定可能なＤＮＡセグメントである。従って、異種領域が、ウイルス遺伝子をコードする場合、この遺伝子は、通常、供給源であるウイルスまたはウイルス感染細胞のゲノム中のウイルス遺伝子に隣接しないＤＮＡに隣接する。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見出されない構築物（例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子改変体または天然に存在する変異事象は、本明細書中で使用されるような異種ＤＮＡ領域を生じない。
【００３３】
用語「異種遺伝子」または「異種導入遺伝子」は、野生型アデノウイルス中には存在しない任意の遺伝子である。好ましくは、この異種遺伝子は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターへの導入遺伝子の導入前にはアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターによって発現されない。本発明について、アデノウイルスベクターに挿入された異種領域は、アデノウイルスゲノム中で一般的に見出されるヌクレオチド配列を含まない。低い程度の配列相同性が、異種領域とアデノウイルスベクターの間（特に、異種領域が、アデノウイルスに関連するウイルスまたはアデノウイルスと同じファミリーのウイルス由来である場合）で生じ得ることが理解される。
【００３４】
「二本鎖ＤＮＡ分子」は、通常の二本鎖ヘリックスであるデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の多量体形態をいう。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみをいい、任意の特定の三次形態に限定されない。従って、この用語は、特に線状ＤＮＡ分子（例えば、ウイルス、プラスミド、および染色体由来のＤＮＡの制限フラグメント）で見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合、配列は、本明細書中において、一般的な慣例（ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに対して配列相同性を有する鎖）に沿って、５’から３’の方向の配列のみを規定する）に従って記載され得る。
【００３５】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合に、インビボで転写され、そしてポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、ウイルスＤＮＡ、さらに合成ＤＮＡ配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナル配列および転写終止配列は、通常、コード配列の３’側に配置される。
【００３６】
「転写プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そして下流（３’の方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を規定する目的に関して、プロモーター配列は、コード配列の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）によって３’末端で結合され、そしてバックグラウンドを越える検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’の方向）を伸長する。転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることによって規定される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）は、プロモーター配列内で見出される。真核生物プロモーターは、しばしば（しかし、常にではない）「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガーノ配列を含む。
【００３７】
ＤＮＡ「制御配列」は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エンハンサー、翻訳終止配列などを集合的にいい、これらは集合的に、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を提供する。
【００３８】
ＲＮＡポリメラーゼが、プロモーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写し、次にこのｍＲＮＡがこのコード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される場合に、コード配列またはコードする配列は、細胞の制御配列に「作動可能に連結」されるか、またはそのような配列の「制御下」にある。
【００３９】
「クローン」は、単一の細胞または共通の祖先由来の娘細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代にわたってインビトロで安定に増殖し得る初代細胞のクローンである。
【００４０】
「ウシ宿主（ｂｏｖｉｎｅ　ｈｏｓｔ）」は、任意に繁殖させた成体または幼年のウシ（ｃａｔｔｌｅ）をいう。
【００４１】
用語「タンパク質」は、他に記載されない限り、それぞれポリペプチドまたはグリコシル化されたポリペプチドを示すために、本明細書中で使用される。用語「ポリペプチド」は、その最も広範な意味で使用される（すなわち、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸の任意のポリマー（ジペプチド以上））。従って、用語「ポリペプチド」は、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク質フラグメント、アナログ、ムテイン、融合タンパク質などを含む。
【００４２】
「ネイティブな」タンパク質またはポリペプチドは、アデノウイルスまたはアデノウイルス感染細胞から回収されたタンパク質またはポリペプチドをいう。従って、用語「ネイティブなＢＡＶポリペプチド」は、天然に存在するＢＡＶタンパク質およびそのフラグメントを含む。「ネイティブでない」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ方法または直接的な合成によって生成されたポリペプチドをいう。「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって生成されたポリペプチド（すなわち、所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から生成されたポリペプチド）をいう。
【００４３】
「実質的に純粋な」タンパク質は、他のタンパク質を含まず、好ましくは少なくとも１０％同質、より好ましくは６０％同質、そして最も好ましくは９５％同質なタンパク質である。
【００４４】
「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して、体液性および／または細胞性の抗原特異的応答を生じさせる１以上のエピトープを含む分子をいう。この用語はまた、「免疫原」と交換可能に使用される。
【００４５】
「免疫学的応答」または「免疫応答」は、投与される組成物に対する細胞性および／または体液性免疫応答の、宿主における誘発および／または発生である。この組成物は、ワクチン、または代替的にウイルスもしくはウイルスベクターであり得る。一般的に、細胞性免疫応答は、サイトカイン（インターフェロン、ＴＮＦ、インターロイキンなど）もしくはケモカインを生成するか、または細胞傷害性Ｔ細胞による細胞傷害性の殺傷を示す宿主からなる。さらに、ヘルパーＴ細胞およびサプレッサーＴ細胞もまた、細胞性免疫応答に関連し得る。体液性免疫応答は、一般的に、目的の組成物またはワクチンに含まれる抗原またはエピトープを指向する抗体を生成するＢ細胞からなる。ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、および好塩基球による生得的な免疫応答もまた、免疫応答に含まれる。
【００４６】
用語「哺乳動物」は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、およびヒツジを含む任意の哺乳動物種を含む。
【００４７】
「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によって、形質転換されたか、または形質転換され得る細胞である。
【００４８】
細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に、外因性ＤＮＡによって「形質転換」されている。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合され）ても、されなくてもよい。原核生物および酵母において、例えば、外因性ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。安定に形質転換された細胞は、外因性ＤＮＡが染色体に組み込まれた細胞であり、その結果、外因性ＤＮＡは、染色体の複製を介して娘細胞に遺伝される。哺乳動物細胞について、このような安定性は、外因性ＤＮＡを含む娘細胞の集団を含む細胞株またはクローンを確立する細胞の能力によって実証される。
【００４９】
「複製」および「増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）」は、交換可能に使用され、本発明のアデノウイルスベクターが、再生または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）する能力をいう。これらの用語は、当該分野で十分に認識されている。本発明の目的のために、複製は、アデノウイルスタンパク質の生成を含み、一般的にアデノウイルスの再生に関する。複製は、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、バーストアッセイ（ｂｕｒｓｔ　ａｓｓａｙ）またはプラークアッセイ）を使用して測定され得る。「複製」および「増殖」は、ウイルス製造（ウイルス遺伝子発現；ウイルスタンパク質、核酸または他の成分の生成；完全ウイルスへのウイルス成分のパッケージング；および細胞溶解を含むが、これらに限定されない）のプロセスに直接的にか、または間接的に関連する任意の活性を含む。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「複製能力のある（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」アデノウイルスは、子孫を生成し得る、すなわち宿主細胞中で複製し得るアデノウイルスをいう。複製は、当該分野で標準的なアッセイ（例えば、バーストアッセイ、プラークアッセイ、または一工程増殖アッセイ）を使用して測定され得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「複製能力欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）」アデノウイルスは、子孫を生成し得ない、すなわち、宿主細胞中で複製し得ないアデノウイルウをいう。代表的には、複製に必須の遺伝子が、宿主細胞から欠損している。複製能力欠損アデノウイルスは、複製に必要な必須遺伝子を供給するヘルパー細胞株（すなわち、ＨＡＶのための２９３細胞、またはＢＡＶのためのＲ２細胞（Ｒｅｄｄｙら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９１３７〜９１４４）およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１５６）の存在下で増殖し得る。
【００５２】
用語「挿入部位」とは、アデノウイルスゲノム中の位置であって、導入遺伝子が挿入される位置をいう。挿入部位は、相同組換えによって導入遺伝子が挿入されるような、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクター中の相同配列の領域であり得る。あるいはこの挿入部位は、制限酵素切断のための部位であり得、ここで、導入遺伝子は、この切断された部位に挿入され、次いでＤＮＡリガーゼを用いることによってアデノウイルス構築物に一緒に連結される。
【００５３】
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明らかに指示するのでない限り、複数の言及を含む。
【００５４】
（一般的な方法）
（Ｉ．アデノウイルスベクター）
哺乳動物アデノウイルスベクターは開示されている（例えば、Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．およびＨｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第三版、Ｆｉｅｌｄｓ．Ｂ．Ｎ．ら編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９６），それぞれ第６７章および第６８章；Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６〜４６７；Ｔａｋｉｆｆら（１９８１）Ｌａｎｃｅｔ　１１：８３２〜８３４；Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１：６００３〜６０２０；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ　３：２９１７〜２９２２；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６７：５９１１〜５９２１；Ｂｅｔｔら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：８８０２〜８８０６；およびＣｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、米国特許第５，９９４，１３２号を参照のこと）。アデノウイルスベクターのいくつかの哺乳動物の形態が存在し、これには、ヒト、ブタ、ヒツジ、イヌ、およびウシのアデノウイルスが挙げられ、当業者は、本発明を実行する目的のためにここから選択し得る。
【００５５】
ヒトアデノウイルスＡｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ９およびＡｄ３５は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である。Ａｄ５についてのＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、Ｍ７３２６０／Ｍ２９９７８であり；Ａｄ９についてＸ７４６５９であり、そしてＡｄ３５についてＵ１０２７２である。Ｃｈｏｗら（１９７７、Ｃｅｌｌ　１２：１〜８）は、ヒトアデノウイルス２配列を開示し；Ｄａｖｉｓｏｎら（１９９３、Ｊ．Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．２３４：１３０８〜１３１６）は、４０型ヒトアデノウイルスのＤＮＡ配列を開示し；Ｓｐｒｅｎｇｅｌら（１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３７９〜３８９）は、１２型ヒトアデノウイルスＤＮＡについてのＤＮＡ配列を開示し；Ｖｒａｔｉら（１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０９：４００〜４０８）は、ヒツジアデノウイルスについての配列を開示し；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９９７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：８７３〜８７８）は、１型イヌアデノウイルスＤＮＡ配列を開示し；そしてＲｅｄｄｙら（１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５１：４１４）は、ブタアデノウイルスについてのＤＮＡ配列を開示する。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態において、このアデノウイルスベクターは、ウシアデノウイルス−３（ＢＡＶ３）のようなウシアデノウイルスを用いて構築される。Ｒｅｄｄｙら（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７２：１３９４は、ＢＡＶ３についてのヌクレオチド配列を開示する。ＢＡＶ３ゲノムのサイズ（３４，４４６ｂｐ）および全体的構成は、ＨＡＶのものと類似しているようであるが、特定の相違が存在する。Ｒｅｄｄｙら（１９９８）、前述。ＢＡＶ３ゲノムの特有の特徴の１つは、Ｅ３コード領域の比較的小さなサイズ（１５１７ｂｐ）である。Ｍｉｔｔａｌら（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３２９５〜３３００；Ｍｉｔｔａｌら（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２８２５；およびＲｅｄｄｙら（１９９８）前述。ＢＡＶ３　Ｅ３領域の配列およびそのＲＮＡ転写産物の分析は、ＢＡＶ３　Ｅ３が、少なくとも４つのタンパク質をコードし得、そのうちの１つ（１２１Ｒ）が、ＨＡＶ５の１４．７ｋＤａタンパク質との制限された相同性を示すことを示唆する。Ｉｄａｍａｋａｎｔｉ（１９９８）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅ３　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−３」，Ｍ．Ｓｃ．ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ，Ｓａｓｋａｔｏｏｎ，Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ。
【００５７】
次いで、アデノウイルスベクター構築物は、適切な宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションの前または後のいずれかで、インビトロまたはインビボで、ＢＡＶゲノムとの組換えを受け得る。
【００５８】
適切な宿主細胞としては、ＢＡＶゲノムとＢＡＶ配列を含むプラスミドとの間、または各々がＢＡＶ配列を含む２つ以上のプラスミドの間の組換えを支持し得る、任意の細胞が挙げられる。組換えは、一般にＥ．ｃｏｌｉのような原核生物細胞において実行されるが、ウイルス粒子を産生するために、ウイルスゲノムを含むプラスミドのトランスフェクションは、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはウシ細胞培養物、最も好ましくは、ＭＤＢＫまたはＰＦＢＲ細胞、およびそれらの等価物において実行される。細菌細胞培養物の増殖、ならびに真核生物細胞および哺乳動物細胞株の培養および維持は、当業者に周知の手順である。
【００５９】
（ＩＩ．イントロン）
導入遺伝子を含み、かつイントロンを欠く、同等のアデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現と比較した場合、所望の導入遺伝子に対して５’側のイントロンを含むアデノウイルスベクターが、導入遺伝子の増加した発現を示す限り、本発明は、真核生物起源のイントロンおよび種々の特徴を有するイントロンを含む。導入遺伝子の発現レベルの測定は、当業者にとって慣習的であるとみなされる。好ましい実施形態において、イントロンは、導入遺伝子のプロモーターに対して３’側に位置する、すなわち、好ましい実施形態において、アデノウイルスベクター内の順番は、プロモーター−イントロン−導入遺伝子であり、必要に応じてポリＡ配列が続く。本発明に含まれるイントロンは、種々のスプライスドナー／アクセプター部位の特徴を有するイントロンを含み、そして、任意のサイズのイントロンであり得る。一般に言えば、イントロンは、約３０塩基対（ｂｐ）〜約２ｋｂのサイズ、約１００ｂｐ〜約１ｋｂのサイズ、および約２００ｂｐ〜約７００ｂｐのサイズの間にある。そして、導入遺伝子を含み、かつイントロンを欠く、同等のアデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現と比較した場合、所望の導入遺伝子に対して５’側のイントロンを含むアデノウイルスベクターが導入遺伝子の増加した発現を示す限り、いずれの真核生物イントロンも、使用され得る。本明細書中に開示される実施形態において、導入遺伝子が、配列の元来の特徴に起因して、宿主細胞中のスプライシング事象に感受性である核酸配列（例えば、このような核酸配列を含むＲＮＡウイルス遺伝子）を含む場合、強力なドナー／アクセプター部位を含むイントロンは、構築物中で使用される。ドナー部位（これはまた、エキソン−イントロン境界配列と称される）、およびアクセプター配列（これはまた、イントロン−エキソン境界配列と称される）を含むスプライス連結配列のカタログは、Ｍｏｕｎｔ（１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　第１０巻：４５９〜４７２（これはその全体が参照として本明細書中に援用される）において提供される。Ｍｏｕｎｔらは、
【００６０】
【化１】
2004504035.tif 000002
のようなエキソン−イントロン境界（スプライスドナー）のコンセンサス配列および
【００６１】
【化２】
2004504035.tif 000003
のようなイントロン−エキソン境界（スプライスアクセプター）のコンセンサス配列を記載する。
【００６２】
宿主細胞中のスプライス事象に感受性の核酸配列を含む導入遺伝子は、導入遺伝子配列を、Ｍｏｕｎｔら（前述）において提供されるスプライス連結配列に対して比較することによって決定され得る。ＡＬＩＧＮ　Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）によって、Ｍｏｕｎｔらにおいて開示されたスプライス連結配列に対して、好ましくはデフォルトパラメータ（これは、以下の通りである：ミスマッチ＝２；開口ギャップ＝０；伸長ギャップ＝２）を使用して測定した場合、高度の配列同一性（例えば、８５％、９０％、もしくは９５％、またはそれより高い配列同一性）を有する核酸配列を含む導入遺伝子は、宿主細胞でのスプライス事象に感受性であり得る。
【００６３】
本発明は、アデノウイルス種に対して異種の真核生物種からのイントロン、アデノウイルス種に対して同種の真核生物種からのイントロン、および導入遺伝子配列に異種または同種の種からのイントロンを含む。例えば、ヒトゲノム配列からのイントロンは、ＲＮＡもしくはＤＮＡのウイルスタンパク質、細菌タンパク質または寄生生物からのタンパク質をコードする異種導入遺伝子を含むアデノウイルス構築物において使用される。別の実施形態において、ヒトゲノム配列からのイントロンは、非ヒト哺乳動物アデノウウイルスベクターと共に使用される。本発明は、天然に存在する供給源から単離されたイントロン、および合成的イントロンまたはキメライントロン（これは、２つの種、また同じ種からの異なるイントロン部分（例えば、ドナーおよびアクセプター部位）から構築されたハイブリッドイントロンである）を含む。本明細書中に例示される実施形態において、Ｓｅｎａｐａｔｈｙら　１９９０　Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２５２〜２７８に記載されるキメライントロン（これは、ヒトβグロブリン遺伝子の第１イントロンからの５’ドナー部位、およびブランチ、および免疫グロブリン重鎖可変領域のイントロンからの３’アクセプター部位を含む）は、ＲＮＡウイルスタンパク質を含むアデノウイルス構築物において使用される。
【００６４】
導入遺伝子が、スプライシング事象に感受性の核酸配列を含むと考えられる実施形態（例えば、ＲＮＡウイルスタンパク質）において、強力なアクセプター部位および／またはスプライスドナー部位を有するイントロンを使用することが好ましい。理論によって拘束されることを望まないが、ＲＮＡウイルスタンパク質を含むアデノウイルスベクターのための強力なスプライスアクセプタ部位およびドナー部位についての必要性の後ろの原理は、ＲＮＡウイルスタンパク質をコードする核酸配列は、スプライシング事象に感受性の核酸配列を含み得ることであり、なぜなら、ＲＮＡウイルス配列は、細胞スプライシング機構が存在しない場合、細胞質において転写されるからである。異種導入遺伝子におけるスプライシング事象に感受性の核酸配列の存在は、特に、異種導入遺伝子が、ＲＮＡウイルスタンパク質である場合、細胞スプライシング機構が、スプライシング事象に感受性の配列を認識し、そしてこれを使用すべきであるならば、タンパク質発現全体に影響し得る。推定スプライスドナー部位および／またはアクセプター部位の強さは、Ｍｏｕｎｔ（前述）によって提供される配列に対して、この推定スプライスドナー部位および／またはアクセプター部位を含む配列を比較することによって決定され得る。スプライスドナー／アクセプター部位の強さをアッセイする方法としてはまた、産生された転写産物のＲＴ−ＰＣＲ、続いてサイズを決定するためのゲル電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
アデノウイルスベクターにイントロンを付加することは、５’スプライスドナー部位および３’スプライスアクセプター部位を、所望の導入遺伝子に対して５’側に、そして好ましくは導入遺伝子プロモーター配列に対して３’側に付加することによって、達成される。アデノウイルスベクターにイントロンを付加することは、異種導入遺伝子の付加の前、異種導入遺伝子の付加の後、またはベクター構築物の設計を介して同時にかのいずれかでもたらされ得る。アデノウイルスゲノムの一部を取り除くようにイントロンが付加される場合、５’スプライスドナー部位は、取り除かれるアデノウイルスの部分の５’末端に配置され、そして３’スプライスアクセプター部位は、取り除かれるアデノウイルス部分の３’末端に配置される。好ましくは、細胞スプライシング機構は、スプライシング事象に感受性の、導入されたイントロン５’スプライスドナー部位および３’スプライスアクセプター部位を他の周囲のどの核酸配列（例えば、導入遺伝子において生じるような他の周囲の核酸配列）に対しても容易に選択する。
【００６６】
（ＩＩＩ．導入遺伝子配列）
本発明に含まれる導入遺伝子としては、治療用タンパク質または治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を含む真核生物遺伝子および原核生物遺伝子；成長ホルモンまたは他の増殖エンハンサーをコードする遺伝子；ならびに免疫応答を誘発し得るタンパク質（例えば、病原性生物由来の抗原）をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。所望の抗原、またはそれらの抗原性フラグメントをコードする導入遺伝子としては、哺乳動物において疾患を引き起こす生物体、特にウシ病原体（例えば、ウシロタウイルス（ＲＮＡウイルス）、ウシコロナウイルス（ＲＮＡウイルス）、ウシ１型ヘルペスウイルス（ＤＮＡウイルス）、ウシＲＳウイルス（ＲＮＡウイルス）、ウシ３型パラインフルエンザウイルス（ＢＰＩ−３）（ＲＮＡウイルス）、ウシ下痢ウイルス（ＲＮＡウイルス）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓなど）の導入遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、病原体からのタンパク質をコードする。他の実施形態において、導入遺伝子は、ＲＮＡウイルスタンパク質またはＤＮＡウイルスタンパク質のような、ウイルスタンパク質をコードする。他の実施形態において、導入遺伝子は、ＬｐｐＢのような細菌遺伝子をコードする。さらなる実施形態において、導入遺伝子は、寄生生物からのタンパク質（例えば、Ｃｏｃｃｉｄｉａのメンバーからのタンパク質）をコードする。
【００６７】
本明細書中に例示される実施形態において、導入遺伝子は、ウイルスタンパク質（例えば、ＲＮＡウイルスタンパク質またはＤＮＡウイルスタンパク質）である。ウイルスタンパク質は潜在的な抗原であるので、ウイルスタンパク質を含む組換えアデノウイルスで免疫した動物における免疫応答の質は、ウイルスタンパク質（すなわち、潜在的な抗原）の発現のレベルを用いて関連付けられ得る。さらに、免疫応答の質の発達は、組換えアデノウイルスベクターによって産生される抗原のレベルと相関するようであるので、アデノウイルス発現系におけるＲＮＡウイルス遺伝子発現を効果的に増加させる方法が、非常に所望される。例えば、ウシ抗原、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）の糖タンパク質の発現が所望される。なぜなら、ＢＣＶ感染は、仔ウシにおける、新生仔下痢を引き起こすからである。ＢＣＶ感染から生じる派生物は、死亡率および生存個体の減少した生産性に起因した、有意な経済的損失である。ＢＣＶに対する現在入手可能なワクチンは効果的ではないので（Ｗａｌｔｎｅｒ−Ｔｏｅｗｓら、１９８５　Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．４９，１〜９）、より良いワクチンが、経済的損失を減少させるために必要である。
【００６８】
ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）は、約３０ｋｂ長のポジティブ一本鎖ＲＮＡゲノムを含む。ＢＣＶゲノムは、３つの膜糖タンパク質、内在性膜タンパク質（Ｍ）、スパイクタンパク質（Ｓ）、およびヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）をコードする（ＫｉｎｇおよびＢｒｉａｎ、１９８２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４２、７００−７０７）。ＳおよびＨＥタンパク質は、主要な膜関連糖タンパク質であり、そしてウイルス中和抗体を誘導する（Ｄｅｒｅｇｔら、１９８９、Ｊ　Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０、９９３−９９８）。ＨＥタンパク質に対して惹起されたモノクローナル抗体は、細胞培養条件下でＢＣＶの感染を中和し、そしてウイルス感染からウシの腸上皮を保護した（Ｄｅｒｅｇｔ　＆　Ｂａｂｉｕｋ、１９８７　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６１、４１０−４２０）。
【００６９】
本発明のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子の上流および好ましくは導入遺伝子プロモーターの下流にイントロンを含む。アデノウイルスベクターがワクチン接種に用いられる場合、導入遺伝子の選択は、異種タンパク質に対する免疫応答を誘導するために重要になる。
【００７０】
所望される最終結果が導入遺伝子に対する免疫応答である場合、ワクチン接種目的で設計された多くのアデノウイルスベクターの場合と同様に、非免疫原性ではなく免疫原性のタンパク質をコードする導入遺伝子配列が選択され、そしてアデノウイルスゲノムの所望の挿入部位に挿入されるべきである。免疫原性ウイルスタンパク質の選択は、このウイルスで感染させた宿主から抗体を獲得し、次いでこのウイルスの種々のインビトロで翻訳されたタンパク質に対する結合アッセイにおいてこの抗体を用いて特異性を決定することにより決定され得る。例えば、Ｋｈａｔｔａｒ、１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２１３：２８−３７およびＩｄａｍａｋａｎｔｉら、１９９９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６５：３５１−３５９を参照のこと。一旦、宿主の抗体が結合する特異的なタンパク質が同定されると、その特異的タンパク質のヌクレオチド配列が、アデノウイルスベクターに挿入するための導入遺伝子として使用され得る。次いで、アデノウイルスベクターは、薬学的に受容可能な賦形剤中で宿主に投与され、次いで、その後の免疫応答がモニターされる。
【００７１】
他の実施形態において、異種導入遺伝子は、細菌タンパク質をコードする。細菌配列を単離するための方法は、当該分野で周知である。１つの実施形態において、細菌は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ　ｓｏｍｍｕｓであり、そしてそのタンパク質は、ＬｐｐＢである。別の実施形態において、細菌は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａである。異種導入遺伝子として使用するための細菌配列を選択する上で考慮する１つの局面は、細菌タンパク質の免疫原性である。細菌タンパク質は、宿主哺乳動物において免疫応答を誘導するそれらの能力について、当業者に公知の手段により試験され得る。
【００７２】
なおさらなる実施形態において、導入遺伝子は、寄生生物由来のタンパク質をコードする。寄生生物は、例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　＆　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　第３版、Ｌｉｖｉｎｓｏｎら著、ｐｕｂｌ．Ａｐｐｌｅｔｏｎ　＆　Ｌａｎｇｅ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ（特に、第６章２４９頁を参照のこと）に記載されている。寄生生物として、例えば、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｐｎｕｅｍｏｃｙｓｔｉｓ、およびＣｏｃｃｉｄｉａｅ亜綱のメンバーが挙げられる。異種導入遺伝子として使用するための寄生生物配列を選択する上で考慮する１つの局面は、コードされるタンパク質の免疫原性である。寄生生物由来のタンパク質は、宿主哺乳動物において免疫応答を誘導するそれらの能力について、当業者に公知の手段により試験され得る。
【００７３】
発現される導入遺伝子に対する免疫応答は、当該分野で公知のいくつもの方法によりモニターされ得る。体液性応答は、代表的に、導入遺伝子に対する抗体力価を測定することによりモニターされる。抗体は、血清中で測定され得るか、または任意の試験に供する前に血清から精製され得るかのいずれかである。抗体力価は、いくつもの方法（ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＰＣＲ、およびフローサイトメトリーが挙げられるがこれらに限定されない）により決定され得る。また、これらの方法により、導入遺伝子に対する特異性が決定され得る。細胞性免疫応答は、当該分野で公知のいくつもの方法（ＣＴＬ細胞またはＮＫ細胞を用いる細胞障害性アッセイ、サイトカインまたはケモカインに対するＥＬＩＳＡ、サイトカインまたはケモカインの転写からのメッセージを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー、または増殖アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）により決定され得る。
【００７４】
導入遺伝子の発現レベルまたは活性レベルは、いくつかの因子により制御され得る。発現の速度論（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、用いられるプロモーターの型に依存して変化し得る。例えば、本明細書で実証されるように、本発明のベクターの１つにおけるシミアンウイルス（ＳＶ）−４０プロモーターの包含により、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ＩＥプロモーターが使用される場合よりも、導入遺伝子のより早期の発現を引き起こす。導入遺伝子を選択する際に考慮するさらに別の因子は、導入遺伝子の大きさである。小さな遺伝子ほど、タンパク質への転写および翻訳が容易であり、それによって、規定された期間の終わりに、より多くのタンパク質が発現される。
【００７５】
アデノウイルスベクターのいくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、活性を決定するためのマーカーとして使用され得るクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含む。アデノウイルスベクターの他の実施形態において、ベクターは、リン酸化に対する推定標的を含む。導入遺伝子活性または発現の測定は、当該分野で公知のいくつもの方法（容易に入手可能なキット（すなわち、Ｂｉｏｒａｄ）を用いたタンパク質アッセイ（すなわち、Ｌｏｗｒｅｙアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイなど）、ゲル電気泳動、ＣＡＴアッセイ、およびリン酸化アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）により達成される。
【００７６】
本発明の別の局面において、導入遺伝子の上流にイントロンを含むアデノウイルスベクターを含む宿主細胞が提供される。異種導入遺伝子の上流にイントロンを含むアデノウイルスベクターの細胞への導入は、当該分野で公知のいくつもの方法（マイクロインジェクション、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポソーム、およびパーティクルボンバードメントが挙げられるがこれらに限定されない）により達成され得る。好ましい実施形態において、宿主細胞は、細胞性のスプライシング機構を提供し得る真核生物細胞である。別の実施形態において、アデノウイルスベクターは、宿主細胞に感染し得る感染性アデノウイルスとしてパッケージングされる。宿主細胞の選択において使用される基準は、宿主細胞が、アデノウイルスベクターまたはアデノウイルスの増殖および複製を支持し得るということの要求である。さらなる要求は、宿主細胞が、異種導入遺伝子の発現を支持し得る必要があるということである。
【００７７】
本発明の別の局面において、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを含む組成物および記載されるアデノウイルスベクターを含むキットもまた提供される。１つの実施形態において、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを含む組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む。アデノウイルスベクターは、生理学的に緩衝化された溶液（例えば、培地またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中のアデノウイルスにパッケージングされ得る。
【００７８】
（ＩＶ．アデノウイルスベクターの構築）
アデノウイルスベクターの構築の説明は、ＢＡＶを用いて例証されるが、アデノウイルスベクターの任意の哺乳動物種にも同様に適用される。
【００７９】
１つ以上の異種配列が、哺乳動物アデノウイルスゲノム（例えば、ＢＡＶゲノム）の１つ以上の領域に挿入され、組換えアデノウイルスベクター（ゲノムの挿入物収容能および挿入された異種配列を発現する組換えベクターの能力によってのみ限定される）を生成し得る。一般的に、アデノウイルスゲノムは、ゲノム長の約５％の挿入物を受け入れ得、そしてウイルス粒子にパッケージングされる能力を保持し得る。外来遺伝子物質の挿入物の大きさは、約１．８ｋｂ〜２ｋｂに限定されると考えられる。挿入される外来遺伝子配列が２ｋｂよりも大きい場合、アデノウイルス遺伝子の欠失が、より多くの外来配列のパッケージングを可能にする。挿入物収容能は、非必須領域の欠失および／または必須領域の欠失（その機能がヘルパー細胞株により提供される場合）により増加され得る。
【００８０】
アデノウイルスゲノムがＢＡＶゲノムである本発明のいくつかの実施形態において、挿入は、異種導入遺伝子の挿入が所望されるＢＡＶゲノムの領域を含むプラスミドを構築することによって達成され得る。本発明のいくつかの実施形態において、異種導入遺伝子は、ＲＮＡウイルスタンパク質、ＤＮＡウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質をコードするか、または導入遺伝子は、宿主細胞内でのスプライシング現象に感受性の核酸配列を含む導入遺伝子であり、そしてイントロンは導入遺伝子の５’側および導入遺伝子プロモーターの３’側に配置される。プロモーターは、その導入遺伝子の天然に存在するプロモーターであるか、または異種プロモーターであり得る。代替的には、所望の治療的タンパク質が、ＢＡＶに挿入され得る。次いで、このプラスミドは、このプラスミドのＢＡＶ部分に認識配列を有する制限酵素を用いて消化され、そして異種配列が、制限消化の部位に挿入される。挿入された異種配列を有するＢＡＶゲノムの一部を含むプラスミドは、ＢＡＶゲノムまたはＢＡＶゲノムを含む直鎖状プラスミドと共に細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に同時形質転換される。ここで、このＢＡＶゲノムは、全長ゲノムであり得るか、または１つ以上の欠失を含み得る。プラスミド間の相同組換えにより、挿入異種配列を含む組換えＢＡＶゲノムが生成される。Ｈｅら、米国特許第５，９２２，５７６号を参照のこと。
【００８１】
ＢＡＶ配列の欠失は、異種配列の挿入のための部位を提供するために、または異なる部位における挿入についてのさらなる収容能を提供するために、当業者に周知の方法によって達成され得る。例えば、プラスミドにクローニングされたＢＡＶ配列について、（ＢＡＶ挿入物中に少なくとも１つの認識配列を有する）１つ以上の制限酵素での消化、そしてその後の連結は、いくつかの場合において、制限酵素認識部位間の配列の欠失を生じる。あるいは、ＢＡＶ挿入物内の単一の制限酵素認識部位での消化、その後のエキソヌクレアーゼ処理、その後の連結は、制限部位に隣接したＢＡＶ配列の欠失を生じる。上記のように構築された、１つ以上の欠失を有するＢＡＶゲノムの１つ以上の部分を含むプラスミドは、相同組換えによって、１つ以上の特定の部位に欠失を有する組換えＢＡＶゲノムを含むプラスミドを生成するために、ＢＡＶゲノム（全長もしくは欠失した）または全長ＢＡＶゲノムもしくは欠失したＢＡＶゲノムのいずれかを含むプラスミドと共に、細菌細胞に同時トランスフェクトされ得る。次いで、欠失を含むＢＡＶビリオンは、組換えＢＡＶゲノムを含むプラスミドによる哺乳動物細胞（ＭＤＢＫ細胞またはＰＦＢＲ細胞およびこれらの等価物が挙げられるがこれらに限定されない）のトランスフェクションによって獲得され得る。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、挿入部位は、ＢＡＶプロモーターに隣接し、かつその（転写的なセンス方向の）下流に存在する。ＢＡＶプロモーターの位置および挿入部位として使用するためのＢＡＶプロモーターの下流の制限酵素認識配列は、ＢＡＶヌクレオチド配列から当業者によって容易に決定され得る。あるいは、種々のインビトロ技術が、特定の部位における制限酵素認識配列の挿入のために、または制限酵素認識配列を含まない部位に異種配列を挿入するために使用され得る。このような方法としては、１つ以上の酵素認識配列の挿入のためのオリゴヌクレオチド媒介ヘテロ二重鎖形成（例えば、Ｚｏｌｌｅｒら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９０）Ｒｏｕｘ’ｓ　Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：８９−９６；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５４：３６７−３８２を参照のこと）およびより長い配列の挿入のためのＰＣＲ媒介方法（例えば、Ｚｈｅｎｇら（１９９４）Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３１：１６３−１８６を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
異種配列が、真核生物細胞において活性である転写調節配列をさらに含む場合、ＢＡＶプロモーターの下流ではない部位に挿入された異種配列の発現を獲得することもまた可能である。このような転写調節配列としては、細胞性プロモーター（例えば、ウシｈｓｐ７０プロモーター）およびウイルスプロモーター（例えば、ヘルペスウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーターおよびパポバウイルスプロモーター）、ならびにレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）配列のＤＮＡコピーが挙げられ得る。
【００８４】
別の実施形態において、原核生物細胞における相同組換えを使用して、クローニングされたＢＡＶゲノムを生成し得る；そしてクローニングされたＢＡＶゲノムは、プラスミドとして増殖され得る。例えば、米国特許第５，９２２，５７６号を参照のこと。感染性ウイルスは、プラスミド含有細胞からレスキューされたクローニングされたＢＡＶゲノムによる哺乳動物細胞のトランスフェクションによって獲得され得る。
【００８５】
外来遺伝子を発現するアデノウイルスベクターは、種々の刊行物に記載されている。アデノウイルスに関連する技術については、特に、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３３７：３８７−３８８；ＢｅｒｋｎｅｒおよびＳｈａｒｐ（１９８３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：６００３−６０２０；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３：２９１７−２９２２；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６７：５９１１−５９２１；Ｂｅｔｔら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：８８０２−８８０６を参照のこと。
【００８６】
アデノウイルスベクターは、宿主または研究培養物のいずれかから単離されたアデノウイルスから構築される。宿主の非限定的な例として、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ（ｃｏｗ（ｂｏｖｉｎｅ））、およびブタ（ｐｉｇ（ｐｏｒｃｉｎｅ））が挙げられる。哺乳動物宿主からアデノウイルスを単離する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｄａｒｂｙｓｈｉｒｅら（１９６５）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７５：３２７−３３０を参照のこと。一般的に、組換えアデノウイルスベクターは、導入遺伝子の発現を改善する特定のエレメントをアデノウイルスのゲノムに挿入することにより、単離されたアデノウイルスから作製される。これらのエレメントの例として、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ＣａｒｓｗｅｌｌおよびＡｌｗｉｎｅ（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（１０）：４２４８−４２５８ならびにＨｕａｎｇおよびＧｏｒｍａｎ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８（４）：９３７−９４７を参照のこと。
【００８７】
アデノウイルスゲノムを含むプラスミドの構築は、前出の実施例１に記載される。ほぼ全長のアデノウイルスゲノム配列は、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４のような領域、およびＥ４とゲノムの右端との間の領域で欠失され得る。アデノウイルスゲノムは、必須機能がヘルパー細胞株により供給され得る場合、複製に必須の領域（すなわち、Ｅ１遺伝子）で欠失され得る。必須遺伝子の欠失は、一般的に、アデノウイルスゲノムに挿入され得る導入遺伝子の大きさを増加させるためになされる。なぜなら、アデノウイルスがパッケージングし得るゲノム物質の量における大きさの制限が存在するからである。必須機能を供給するために使用され得る、構成的にＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現するヘルパー細胞株の例として、ＨＡＶについては２９３細胞、９１１細胞、ならびにＰＥＲ細胞、およびＢＡＶについてはＲ２（Ｒｅｄｄｙら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９１３７−９１４４；ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−１５６）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７４およびＦａｌｌａｕｘら（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．９：１９０９−１９１７を参照のこと。
【００８８】
クローニングされた異種配列のウイルスゲノムへの挿入は、プラスミドベクター（アデノウイルスガイド配列に隣接する異種配列を含む）とアデノウイルスゲノムとの間のインビボ組換え、そしてその後の適切な宿主細胞への同時トランスフェクションにより起こる。アデノウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡ複製の開始に必要とされる逆末端反復（ＩＴＲ）配列、および複製したウイルスゲノムのパッケージングに関与する配列を含む（Ｒｅｄｄｙら（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２１２：２３７−２３９）。アデノウイルスパッケージングシグナルは、一般的に、左ＩＴＲとＥ１Ａプロモーターとの間に存在する。従って、クローニングされた異種配列のアデノウイルスゲノムへの組込みにより、異種配列が、ウイルス複製およびパッケージングシグナルを含むＤＮＡ分子中に配置され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る複数コピーの組換えアデノウイルスゲノムの生成を可能にする。あるいは、クローニングされた異種配列のアデノウイルスゲノムへの組込みにより、これらの配列が、適切なヘルパー細胞株において複製およびパッケージングされ得るＤＮＡ分子中に配置される。複数コピーの単一配列が挿入されて、異種遺伝子産物の収量を改善し得るか、または複数の異種配列が挿入されて、その結果、組換えウイルスが１つより多い異種遺伝子産物を発現し得る。異種配列へのガイド配列の取り付けもまた、インビトロでの連結により達成され得る。この場合、アデノウイルスガイド配列に隣接する異種配列を含む核酸が、アデノウイルスゲノムと共に、宿主細胞に同時導入され得、そして組換えが生じ、組換えアデノウイルスベクターを生成し得る。細胞への核酸の導入は、当該分野で公知の任意の方法（マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポソーム、パーティクルボンバードメントなどが挙げられるがこれらに限定されない）により達成され得る。
【００８９】
組換えアデノウイルス発現カセットは、アデノウイルス制限フラグメントを生成するための適切な制限酵素を用いて野生型アデノウイルスゲノムを切断することによって入手され得、このアデノウイルス制限フラグメントは、例えば、Ｅ１遺伝子領域配列またはＥ３遺伝子領域配列をそれぞれ含むゲノムの左末端または右末端を示す。アデノウイルス制限フラグメントは、クローニングビヒクル（例えば、プラスミド）に挿入され得、その後、少なくとも１つの異種配列（これは、外来タンパク質をコードしてもコードしなくてもよい）が、作動可能に連結される真核生物転写調節配列を伴ってかまたは伴わずに、Ｅ１領域またはＥ３領域に挿入され得る。組換え発現カセットは、相同組換えまたは他の従来の遺伝子操作方法を介して、アデノウイルスゲノムと接触され、所望の組換え体が獲得される。発現カセットがＥ１領域またはいくつかの他の必須領域を含む場合、発現カセットとアデノウイルスゲノムとの間の組換えは、適切なヘルパー細胞株（例えば、Ｅ１形質転換細胞株）内で生じ得る。Ｅ１領域またはＥ３領域を含むもの以外のアデノウイルスゲノムの制限フラグメントもまた、本発明の実施に有用であり、そしてクローニングヒビクルに挿入され得、その結果、異種配列が、アデノウイルス配列に挿入され得る。次いで、これらのＤＮＡ構築物は、インビトロまたはインビボで、適切な宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションの前後のいずれかで、アデノウイルスゲノムと組換えを起こし得る。
【００９０】
本発明の別の実施形態において、イントロンを含むアデノウイルスベクターの動力学がまた、アデノウイルスベクター構築物への、異なる型のプロモーターの挿入によって調節され得る。ＳＶ４０初期プロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期（ＩＥ）プロモーターの発現カセットへの導入は、実施例に例示されるように、ＨＥ発現の動力学を変更し得る。
【００９１】
本発明の別の局面において、本発明者らは、複製性（Ｅ３欠失）ＢＡＶ−３ベクターが３ｋｂまでの外来ＤＮＡをパッケージングし得ることを見出した。このことは、約１．５〜２ｋｂの外来ＤＮＡがアデノウイルスベクターに挿入され得ることを示唆する先行の研究から予期されなかった結果である。この知見により、１．５〜２ｋｂよりも長いサイズである他のＲＮＡウイルス遺伝子の発現に有用であることが証明されるはずであり、そして１．５〜２ｋｂよりも長い導入遺伝子をＢＡＶ−３発現系のＥ３領域中に配置することによって使用され得る。
【００９２】
（Ｖ．アデノウイルスベクターの使用および投与）
本発明の組換えアデノウイルス（すなわち、導入遺伝子の５’側イントロンを含むアデノウイルス）を使用して、ウシ、ヒトおよび他の動物を冒す広範な種々の疾患（例えば、ＲＮＡウイルス感染もしくはＤＮＡウイルス感染、細菌感染および／または寄生虫感染）に対する防御を提供し得る。生成される組み換え抗原もしくは免疫原または本発明の組換えアデノウイルスのいずれかが処方され得、そして抗原性決定基ワクチンまたは生ワクチンベクターについての記載と実質的に同じ様式で使用される。
【００９３】
本発明の別の局面において、本発明の組換えアデノウイルス（すなわち、導入遺伝子の５’側にイントロンを含むアデノウイルス）は、遺伝子を哺乳動物（例えば、ウシもしくはヒトまたはそれを必要とする他の哺乳動物）に送達するための方法に使用され得、遺伝子欠損を制御し、宿主哺乳動物に治療的遺伝子もしくは治療的ヌクレオチド配列を提供し、そして／または遺伝子変異を誘導するかもしくは補正する。この方法は、例えば、遺伝性疾患、感染性疾患、および心血管疾患を含むがこれらに限定されない状態の処置において使用され得る。この方法は、上記の動物にイントロンおよび異種導入遺伝子を含む本発明のアデノウイルスベクターを投与する工程を包含し、ここで、この異種導入遺伝子は、所望のタンパク質を発現し、そしてこのイントロンは、導入遺伝子の上流に挿入される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターゲノムは、哺乳動物ゲノムに組込まれるか、または独立して染色体外で維持され、哺乳動物宿主における異種導入遺伝子の発現を提供する。本発明の目的のために、本発明の方法によって調製されるベクター、細胞およびウイルス粒子は、エキソビボ（すなわち、細胞は患者から取り出される）でかまたは処置される体に直接インビボで被験体に導入され得る。
【００９５】
本発明はまた、本発明の方法に従って調製された治療有効量の組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノウイルスもしくは組換えタンパク質を、薬学的に受容可能なビヒクルおよび／もしくはアジュバントと組み合わせてかまたは緩衝液と組み合わせて含む、薬学的組成物を含む。このような薬学的組成物が調製され得、そして投薬量は、当該分野で周知である技術に従って決定される。本発明の薬学的組成物は、任意の公知の投与経路（全身性（例えば、静脈内、気管内、腹腔内、鼻腔内、腸管外、腸溶性、筋内、皮下、腫瘍内または頭蓋内）が挙げられるが、これらに限定されない）によって、またはエーロゾル投与もしくは肺内点滴注入によって、投与され得る。投与は、単回用量または特定の時間間隔後の１回以上反復される用量で実行され得る。適切な投与経路および投薬量は、状況に応じて変化する（例えば、処置される個体、処置される障害または目的の遺伝子もしくはポリペプチド）が、当業者によって決定され得る。
【００９６】
本発明はまた、疾患または病原体による感染と関連する症状の改善のための処置方法および方法を含み、この方法に基づき、治療有効量のアデノウイルスベクター、組換えアデノウイルス、または本発明の宿主細胞が、処置を必要とするかまたは疾患もしくは感染と関連する症状の改善が必要な哺乳動物被験体に投与される。改善は、状態（例えば、疾患または感染と関連する症状）の予防、低減または一時的緩和を意味する。
【００９７】
本発明において使用されるタンパク質抗原（例えば、ＲＮＡウイルスタンパク質もしくはＤＮＡウイルスタンパク質、細菌性タンパク質または寄生動物由来のタンパク質）は、特に、短いオリゴペプチドから構成される場合、ワクチンキャリアに結合体化され得る。ワクチンキャリア：例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、当該分野で周知である。好ましいキャリアタンパク質、ロタウイルスＶＰ６は、ＥＰＯ公開番号０２５９１４９において開示され、この開示は、本明細書中に参考として援用される。
【００９８】
アデノウイルスベクターに挿入され得る所望の抗原についての遺伝子またはそのコード配列としては、哺乳動物において疾患を引き起こす生物体の遺伝子が挙げられる。ウシについて、特に注目されるのは、ウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、１型ウシヘルペスウイルス、ウシＲＳウイルス、３型ウシパラインフルエンザウイルス（ＢＰＩ−３）、ウシ下痢ウイルス、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍなどのようなウシ病原性生物である。ヒト病原性生物の抗原をコードする遺伝子はまた、本発明の実施において有用である。異種遺伝子またはフラグメントを保有する本発明のワクチンはまた、適切な経口キャリア（例えば、腸溶性投薬形態）で経口投与され得る。経口処方物は、例えば、以下のような通常利用される賦形剤を含む：薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウムなど。経口ワクチン組成物は、約１０％〜約９５％の活性成分、好ましくは、約２５％〜約７０％の活性成分を含む、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性の処方物、または散剤の形態をとり得る。経口ワクチンは、全身性免疫とともに粘膜免疫（これは、胃腸管に感染する病原性生物に対する防御において重要な役割を果たす）を惹起するのに好ましくあり得る。
【００９９】
さらに、ワクチンは、坐剤中に処方され得る。坐剤について、ワクチン組成物は、慣用的な結合剤およびキャリア（例えば、ポリアルカリのグリコールまたはトリグリセリド）を含む。このような坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、約１％〜約２％の範囲内で活性成分を含有する混合物から形成され得る。
【０１００】
本発明のワクチン組成物を動物に投与するためのプロトコルは、本開示の観点から当業者の範囲内である。当業者は、抗原性フラグメントに対する抗体および／またはＴ細胞媒介免疫応答を惹起するのに有効な用量でワクチン組成物の濃度を選択する。広範な制限内において、投薬量が重要であるとは考えられない。代表的には、このワクチン組成物は、好都合な容量（例えば、約１〜１０ｃｃ）のビヒクル中約１〜約１，０００μｇの間のサブユニット抗原を送達する様式で投与される。好ましくは、単回免疫における投薬量は、約１〜約５００μｇのサブユニット抗原、より好ましくは、約５〜１０から約１００〜２００μｇ（例えば、５〜２００μｇ）のサブユニット抗原を送達する。
【０１０１】
投与のタイミングもまた、重要であり得る。例えば、最初の接種に続いて、好ましくは、必要な場合、次のブースター接種を行ってもよい。必要に応じてではあるが、最初の免疫から数週間から数ヶ月後に、動物に対して２回目のブースター免疫を投与することもまた好ましくあり得る。疾患に対する高レベルの防御が維持されることを保証するために、定期的な間隔で（例えば、数年毎に１回）、それらの動物にブースター免疫を再投与することが役立ち得る。あるいは、初回投薬が、経口投与された後に接種され得るか、またはその逆の場合も同様である。好ましいワクチン接種プロトコルは、慣例のワクチン接種プロトコル実験を通して確立され得る。
【０１０２】
インビボ組換えウイルスワクチンの投与経路全てについての投薬量は、以下に挙げられる種々の因子に依存し、そして当業者によって容易に決定され得る：患者のサイズ、予防が必要とされる感染の性質、キャリアなど。非限定例として、１０３ｐｆｕと１０８ｐｆｕとの間の投薬量などが用いられ得る。インビトロサブユニットワクチンを用いる場合、さらなる投薬量が、関連した臨床的因子によって決定されるように提供され得る。
【０１０３】
本発明はまた、遺伝子欠損を制御するために、遺伝子または遺伝子治療が必要な哺乳動物（例えば、ウシもしくはヒトまたは他の哺乳動物）に、遺伝子を送達するためまたは遺伝子治療を提供するための方法を含み、この方法は、組換えウイルスベクターゲノムは、上記哺乳動物のゲノムに組込まれるか、または個々に染色体外で維持されて、標的器官または組織における必要とされる遺伝子の発現を提供する条件下で上記遺伝子の非欠損形態をコードする外来ヌクレオチド配列を含む生組換えウシアデノウイルスを上記哺乳動物に投与する工程を包含する。これらの種類の技術は、欠損遺伝子またはその一部を置換するために当業者によって現在使用されている。
【０１０４】
本発明者らは、本明細書中に開示される方法および技術を使用して、導入遺伝子の増加した発現を示すアデノウイルスベクターを生成する。ウシヘルペスウイルス由来のウイルスタンパク質の発現が、本明細書中に例示される。この実施形態において、複製性（Ｅ３欠失）ウシアデノウイルス−３（ＢＡＶ−３）組換え構築物は、ウシヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１）（ＤＮＡウイルス）の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の有意な量を発現する導入遺伝子として糖タンパク質Ｄの選択を使用した。本発明の別の実施形態において、本発明者らは、ＲＮＡウイルス遺伝子の発現を最適化した。ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）（ＲＮＡウイルス）の血球凝集素エステラーゼ（ＨＥ）遺伝子は、外因性転写制御エレメントを伴ってかまたは伴わずに、Ｅ３領域に挿入されて、いくつかのＢＡＶ−３組換え構築物を作製する。ＨＥ　ｃＤＮＡ上流の１３７ｂｐキメライントロンの導入は、ＨＥ遺伝子発現の増加と関連した。キメライントロンは、ヒトβ−グロブリン遺伝子の第１イントロン由来の５’ドナー部位および分枝ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の３’アクセプター部位から構成される（Ｓｅｎａｐａｔｈｙら，１９９０　Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３，２５２−２７８）。
【０１０５】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を制限するために提供されない。
【０１０６】
（実施例）
（実施例１　Ｅ３移入ベクターの構築）
野生型ＢＡＶ−３アデノウイルスおよび組み換えＢＡＶ−３アデノウイルスを、Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞およびＲ２細胞（これは、形質転換したウシ胎仔網膜細胞である）中で培養した（Ｒｅｄｄｙら、１９９９　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９１３７−９１４４）。細胞を、５％までのウシ胎仔血清を補充したイーグル最少必須培地中で増殖させた。ウイルスＤＮＡを、Ｈｉｒｔの方法（１９６７　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，３６５−３６９）によって、ウイルス感染させた細胞の単層から抽出した。
【０１０７】
オリジナルのＥ３移入ベクターであるｐＢＡＶ−３００は、ヌクレオチド（ｎｔ）２６４５８〜２７７０３（ｎｔ番号は、ＢＡＶ−３ゲノム配列に基づく；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３０１５４）のＥ３領域の１２４５ｂｐが欠失したヌクレオチド２４４６５と２８５９３との間の、ゲノムＤＮＡ配列を有し、細菌プラスミドにクローン化されていた（Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら、１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）。この移入ベクターは、Ｅ３が欠失した全長クローンｐＦＢＡＶ−３０２を有するＥ．ｃｏｌｉ　ＢＪ　５１８３中での相同組換えのために、Ｅ３領域の左側に１９９２塩基対（ｂｐ）および右側に８８９ｂｐの重複を有する。（Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら、１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）。重複を増加させるために、最初に、ＢＡＶ−３ゲノムの右側を表すＫｐｎＩ−ＳｓｐＩフラグメント（ｎｔ２４４６４とｎｔ３４０６０との間）を、ｐＰＯＬＹＩＩ　ｓｎ　１４のＫｐｎＩ部位および平滑末端ＮｏｔＩ部位に導入し（Ｌａｄｈｅら、１９８７　Ｇｅｎｅ　５７：１９３−２０１）、プラスミドｐＢＡＶ−２９９を作製した。ｐＢＡＶ−２９９のＫｐｎＩ部位およびＸｂａＩ部位にわたる領域を、ｐＢＡＶ−３００のその領域と置換して、ｐＢＡＶ−３０１を作製した。プラスミドｐＢＡＶ−３０１をＫｐｎＩ（ｎｔ２４４６４）酵素およびＳｐｅＩ（ｎｔ３１５７０）酵素で消化し、ゲル電気泳動に供し、そしてゲル精製したフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＪ　５１８３における相同組換えのために使用した。この新規移入ベクターは、外来遺伝子のクローニングのための２つの特有制限酵素部位（ＳｒｆＩおよびＳａｌＩ）、およびプラスミドｐＦＢＡＶ−３０２との相同組換えに有効なＥ３領域の左側の１９９２ｂｐ重複および右側の３８６６ｂｐ重複を有し（Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら，１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）、この新規移入ベクターは、ＢＪ　５１８３細胞における組み換え頻度を劇的に増加した。
【０１０８】
プラスミドｐＢＡＶ３０１ｂを、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からＰＣＲによって増幅した１３７ｂｐ長のキメライントロンをｐＢＡＶ−３０１のＳｒｆＩ部位にクローニングすることによって構築した。イントロンは、ヒトβ−グロブリン遺伝子の第１イントロン由来の５’ドナー部位およびその分枝ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の３’アクセプター部位から構成される（Ｓｅｎａｐａｔｈｙら，１９９０　Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３，２５２−２７８）。ＢＣＶ　ＨＥ　ｃＤＮＡ配列内の可能性のある潜在的５’ドナースプライス部位（これは、スプライス事象を受け易い導入遺伝子中に存在する核酸配列である）の利用を回避するために、導入遺伝子をイントロンの下流に導入する。
【０１０９】
（実施例２　組み換えプラスミドの構築）
（（ａ）プラスミドｐＦＢＡＶ３０３およびｐＦＢＡＶ３３２の構築）
ＢＣＶ　ＨＥ遺伝子の完全コード配列を含むプラスミドｐＣＶＥ３（Ｐａｒｋｅｒら，１９８９　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，１５５−１６４）の１．３ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平滑末端に修復したＳｒｆＩ消化プラスミドｐＢＡＶ３０１に連結させてプラスミドｐＢＡＶ３０１．ＨＥを作製し、平滑末端に修復したＳａｌＩ消化プラスミドｐＢＡＶ３０１ｂに連結させてプラスミドｐＢＡＶ３０１ｂ．ＨＥを作製した。ＨＥをコードする遺伝子を含む組み換えＢＡＶ−３ゲノムを、プラスミドｐＦＢＡＶ３０３を作製する場合、Ｓｒｆｌで直鎖状にしたｐＦＢＡＶ３０２とｐＢＡＶ３０１．ＨＥの７．２　ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメントとの間のＥ．ｃｏｌｉ　ＢＪ５１８３における相同組換えによって、およびプラスミドｐＦＢＡＶ３３２を作製する場合、Ｓｒｆｆで直鎖状にしたｐＦＢＡＶ３０２とｐＢＡＶ３０１ｂ．ＨＥと７．３ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメントとの間の相同組換えによって生成した。
【０１１０】
（（ｂ）プラスミドｐＦＢＡＶ３３３およびｐＦＢＡＶ３３４の構築）
単一のＳａｌＩクローニング部位を含むプラスミドｐＳＶＰＩＡを、ＳＶ４０プロモーターの２０９ｂｐ（ｐＣＡＴ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）から単離した）、１３７ｂｐキメライントロンおよび２４０ｂｐ　ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナル（ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から単離した）をプラスミドｐＰＯＬＹＩＩｓｎに連結することによって構築した。プラスミドｐＣＭＶＰＩＡは、ＳＶ４０プロモーターが５１０ｂｐのＨＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離した）によって置換されていること以外は、それぞれプラスミドｐＳＶＰＩＡに類似している。ＨＥ遺伝子を含む１．３ｋｂの平滑末端に修復したＢａｍＨＩフラグメント（Ｐａｒｋｅｒら，１９８９　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，１５５−１６４）を、平滑末端に修復したＳａｌＩ消化プラスミドｐＳＶＰＩＡに連結してプラスミドｐＳＶＰＩＡ．ＨＥを作製し、そして平滑末端に修復したＳａｌＩ消化プラスミドｐＣＭＶＩＡに連結してプラスミドｐＣＭＶＩＡ．ＨＥを作製した。適切な転写エレメントの下でＨＥ遺伝子を含む、プラスミドｐＳＶＰＩＡ．ＨＥの１．９　ｋｂフラグメントおよびプラスミドｐＣＭＶＰＩＡ．ＨＥの２．０ｋｂフラグメントを単離し、そして個々に、平滑末端に修復したＳｒｆＩ消化プラスミドｐＢＡＶ３０１に連結して、それぞれプラスミドｐＢＡＶ３０Ｉ．ＨＥｓｖおよびｐＢＡＶ３０２．ＨＥｃｍｖを作製した。最終的に、組換えＢＡＶ−３ゲノムを、プラスミドｐＦＢＡＶ３３３を作製する場合、ＳｒｆＩで直鎖状にしたプラスミドｐＦＢＡＶ３０２とｐＢＡＶ３０１．Ｈｅｓｖの７．８ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメントとの間のＥ．ｃｏｌｉ　ＢＪ５１８３における相同組換えによって単離して、およびプラスミドｐＦＢＡＶ３３４を作製する場合、ＳｒｆＩで直鎖状にしたプラスミドｐＦＢＡＶ３０２とｐＢＡＶ３０１．ＨＥｃｍｖの８．１ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメントとの間の相同組換えによって単離した。
【０１１１】
（（ｃ）プラスミドｐＦＢＡＶ３３５、ｐＦＢＡＶ３３６およびｐＦＢＡＶ３３７の構築）
２９０３ｂｐ　ＢｇＩＩフラグメントとしてプラスミドｐＳＬＩＡｇＢから切除された、ウシヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１）の全長ｇＢ遺伝子は、修復された平滑末端であり、そしてｐＢＡＶ３０１のＳｒｆＩ部位にクローニングされて、プラスミドｐＢＡＶ３０１．ｇＢを作製した。ｐＢＡＶ３０１．ｇＢの８．８ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメントとＳｒｆＩ直線化ｐＦＢＡＶ３０２との間のＢＪ５１８３における相同組換えは、プラスミドｐＦＢＡＶ３３５を生じた。３０２０ｂｐ　ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラグメントとしてプラスミドｐＳＬＩＡｔｇＢから切除された、ＢＨＶ−１の短縮ｇＢ遺伝子は、修復された平滑末端であり、そしてｐＢＡＶ３０１のＳｆｔＩ部位にクローニングされてプラスミドｐＢＡＶ３０１．ｔｇＢを生じた。ｐＢＡＶ３０１．ｔｇＢの８．９ｋｂ　Ｋｐｎ−ＳｐｅＩフラグメントとＳｒｆＩ直線化ｐＦＢＡＶ３０２との間の相同組換えは、プラスミドｐＦＢＡＶ３３６を生じた。３２４６ｂｐ　ＳｍａＩ−Ｄｒａ　ＩフラグメントとしてプラスミドｐＣＭＶβから切除された、全長ＬａｃＺ遺伝子を、平滑末端を修復したｐＢＡＶ３０１ｂのＳａｌＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＢＡＶ３０１ｂ．ＬａｃＺを作製した。ｐＢＡＶ３０１ｂ．ＬａｃＺの９．３ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＳｐｅＩフラグメントとＳｒｆＩ直線化ｐＦＢＡＶ３０２との間の相同組換えは、プラスミドｐＦＢＡＶ３３７を生じた。
【０１１２】
（実施例３．組換えＢＡＶ−３の増殖、単離および特徴付け）
６０ｍｍディッシュ中のＲ２細胞単層（形質転換された胎児ウシ網膜細胞）を、リポフェクションを使用して、５〜１０μｇのＰａｃＩ消化ｐＦＢＡＶ３０３、ｐＦＢＡＶ３３２、ｐＦＢＡＶ３３３、ｐＦＢＡＶ３３４、ｐＦＢＡＶ３３５、ｐＦＢＡＶ３３６およびｐＦＢＡＶ３３７組換えプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。３７℃でのインキュベーション後、細胞変性効果を示すトランスフェクト細胞を、回収し、２回凍結融解し、そして組換えウイルスを、ＭＤＢＫ細胞においてプラーク精製した。
【０１１３】
（サザンブロットハイブリダイゼーション）
ビリオンＤＮＡの制限酵素消化後に得られたＤＮＡフラグメントを、記載されるように（Ｒｅｄｄｙら，１９９３　Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．３６，１６１−１６８）Ｎｙｔｒａｎ膜（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）にアガロースゲルから移した。ＢＣＶのＨＥまたはＢＨＶ−１のｇＢをコードする遺伝子を、ランダムプライマー標識技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ　１９８９、上述）によって３２Ｐ　ｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイゼーションを、５０％のホルムアミドの存在下において４２℃で実行した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび膜の洗浄を、（Ｒｅｄｄｙら，１９９３　Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．３６，１６１−１６８）に記載されるように実行した。
【０１１４】
（ノーザンブロットハイブリダイゼーション）
ペトリ皿中で増殖したＭＤＢＫ細胞を、組換えＢＡＶ−３の１細胞あたり５プラーク形成単位（ｐｆｕ）で感染した。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　＆　Ｓａｃｃｈｉ（１９８７　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９）によって記載されるように酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム混合物を用いて偽感染されたかまたは組換えＢＡＶ−３感染された細胞から抽出した。ＲＮＡ（１０μｇ）を、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離し、そしてＮｙｔｒａｎ膜に移した。このブロットを、記載されるように、焼き、プレハイブリダイズし、ハイブリダイズし、そして洗浄した。ＢＣＶのＨＥをコードする遺伝子を、ランダム標識技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ　１９８９、上述）によってα−３２Ｐ　ｄＣＴＰで標識し、そしてプローブとして使用した。
【０１１５】
（免疫沈降）
６ウェルディッシュ中のＭＤＢＫ細胞のコンフルエント単層を、少なくとも５つの感染の多重度でウイルスを用いて感染した。この細胞を、５０μｃｉの３５Ｓメチオニン（トランス（３５Ｓ）標識［１，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ］ＩＣＮ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆ）で４時間標識する前に、メチオニンおよびシスチンを欠いたＭＥＭにおいて２時間プレインキュベートした。この細胞を、ＰＢＳで一回洗浄し、スクレーピングによって回収し、次いで、氷冷改変放射免疫沈降アッセイ緩衝液で溶解した。この放射標識したタンパク質を、モノクローナル抗ＢＣＶウサギ抗体（Ｄｅｒｅｇｔ　＆　Ｂａｂｉｕｋ，１９８７　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６１，４１０−４２０）またはモノクローナル抗ｇＢ抗体（ｖａｎ　Ｄｒｕｎｅｎ　Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｈｕｒｋら，１９８４　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３５，４６６−４７９）で免疫沈降し、そして還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）において分析した。このゲルを、乾燥し、そしてタンパク質バンドを、オートラジオグラフィによって可視化した。
【０１１６】
（実施例４　ＢＣＶのＨＥ遺伝子を含む組換えＢＡＶの産生および特徴付け）　ＢＣＶ　ＨＥ遺伝子を含むプラスミドｐＢＡＶ３００（Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら，１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）のＫｐｎＩ−−ＸｂａＩフラグメント（Ｅ３領域の左側において１９９２ｂｐおよびＥ３領域の右側において８８９ｂｐの重複を有する）とＳｒｆＩ直線化プラスミドｐＦＢＡＶ３０２との間においてＥ．ｃｏｌｉ　ＢＪ５１８３おける相同組換えによってプラスミドｐＦＢＡＶ３０２（Ｅ３を欠失した全長ＢＡＶ−３ゲノムクローン；Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら，１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）のＥ３領域にＢＣＶ　ＨＥ遺伝子を挿入する試みは、失敗した。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＪ５１８３における相同組換えによってプラスミドｐＦＢＡＶ３０２のＥ３領域に外来遺伝子を挿入する効率を増大するために、発明者らは、改変移行プラスミドｐＢＡＶ３０１をはじめに構築した。このプラスミドは、プラスミドｐＦＢＡＶ３０２のＥ３領域の左側の１９９２ｂｐおよび右側の３８６６ｂｐの重複を含む。このプラスミドの使用は、劇的に、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＪ５１８３における組換えの頻度を増大し、そしてＢＣＶ　ＨＥを、首尾よくクローニングした。
【０１１７】
次いで、ＢＣＶ糖タンパク質ＨＥを発現する組換えＢＡＶ−３を構築した。全長ＨＥ遺伝子単独または異なる外来性転写エレメントを有する全長ＨＥ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉの相同組換え機構（Ｃｈａｒｔｉｅｒら，１９９６　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．７０，４８０５−４８１０）を使用してＥ３の同じ転写方向においてプラスミドｐＦＢＡＶ３０２のＥ３領域に個々に挿入した。Ｐａｃ−Ｉ消化されたｐＦＢＡＶ３０３プラスミドＤＮＡ、ｐＦＢＡＶ３３２プラスミドＤＮＡ、ｐＦＢＡＶ３３３プラスミドＤＮＡまたはｐＦＢＡＶ３３４プラスミドＤＮＡを、Ｒ２細胞（形質転換されてウシ網膜細胞）にトランスフェクトした。５０％の細胞変性効果を示す感染した単層を、回収し、凍結融解し、そして組換えウイルスを、プラーク生成し、そしてＭＤＢＫ細胞で増殖した。組換えウイルスを、ＢＡＶ３０３（外来性エレメントを伴わないＨＥ）、ＢＡＶ３３２（キメライントロンを伴うＨＥ）、ＢＡＶ３３３（ＳＶ４０プロモーターキメライントロンおよびＳＶ４０ポリＡを伴うＨＥ）ならびにＢＡＶ３３４（ＣＭＶプロモーター、キメライントロン、ＳＶ４０ポリＡを伴うＨＥ）と命名した（図１）。ウイルスＤＮＡを、Ｈｉｒｔ法（Ｈｉｒｔ，１９６７　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，３６５−３６９）によって感染した細胞から抽出し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動によって分析した。ＢａｍＨＩでの野生型ＢＡＶ−３ウイルスＤＮＡの消化は、５つのフラグメントを生じ、そしてフラグメントＤ（３．０１９ｋｂ）は、Ｅ３領域を含む（図２Ａ、レーン１）を含む。ＢＡＶ３．Ｅ３ｄ（図２Ａ、レーン２）、ＢＡＶ３０３（図２Ａ、レーン３）、ＢＡＶ３３２（図２Ａ，レーン４）、ＢＡＶ３３３（図２Ａ，レーン５）およびＢＡＶ３３４（図２Ａ、レーン６）の改変されたＢａｍＨＩ「Ｄ」フラグメントのサイズにおける差異は、予想通りであった。これを、野生型および組換えＢＡＶ３のＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡおよび組換えのサザンブロット分析によって確認した。図２Ｂを見た場合、組換えウイルス由来の同じ改変ＢａｍＨＩ「Ｄ」フラグメントは、サザンブロットハイブリダイゼーションにおいてα−３２Ｐ　ｄＣＴＰ標識ＨＥ遺伝子にハイブリダイズした（図２Ｂ、レーン３、レーン４、レーン５、レーン６）。これは、組換えＢＡＶ３０３、ＢＡＶ３３２、ＢＡＶ３３３およびＢＡＶ３３４が、ＢＣＶ　ＨＥ遺伝子を含むことを示唆した。
【０１１８】
（ＨＥ転写物のノーザン分析）
ＨＥ遺伝子の転写物を分析するために、ＲＮＡを、感染後１８時間および２８時間で偽感染したかまたは組換えＢＡＶ−３感染した細胞から調製した。このＲＮＡを、アガロースホルムアミドゲル上で分離し、Ｎｙｔｒａｎ膜に転写し、∝３２Ｐ標識ＨＥ遺伝子でプローブ化した。このプローブは、４つのＬ６　ｍＲＮＡ（１００Ｋ、３３Ｋ、２３ＫおよびｐＶＩＩＩ）、およびＥ３プロモーターおよびＭＬＰから転写されたＨＥのｍＲＮＡを検出すると期待された。ＨＡＶ−２（Ｚｉｆｆ　＆　Ｆｒａｓｅｒ，１９７８　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２５，８９７−９０６）とは異なり、ＢＡＶ−３のＬ６領域由来の転写物を、Ｅ３領域のポリ（Ａ）部位でポリアデニル化した（Ｒｅｄｄｙら，１９９８　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．７２，１３９４−１４０２）。従って、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を起源とするＬ６領域の全ての転写物は、共通の３’末端と重複する分子のネスティングされたセットを形成した。各ｍＲＮＡは、５’末端に次のより小さいｍＲＮＡおよび１つのさらなるＯＲＦにおいて全てのヌクレオチド配列を含んだ。ｍＲＮＡの５’末端におけるＯＲＦのみを、翻訳した。ＲＮＡを分析した場合、感染後２８時間に抽出したＲＮＡにおいて特にＨＥ配列を有するいくつかの豊富なｍＲＮＡを同定した（図３）。感染後２８時間後、より大きな転写物は、ＢＡＶ３０２（レーン２）およびＢＡＶ３３４（レーン６）に感染された細胞から抽出されたＲＮＡにおける主要な種であった。ＨＡＶ−５感染の初期工程の間、Ｅ３プロモーターを使用して、Ｅ３領域からのｍＲＮＡを発現し、そして後期工程の間、Ｅ３プロモーターからの転写は、減少し、そしていくつかのｍＲＮＡを、ＭＬＰから作製した（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎら，１９９２　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．６６，３６３３−３６４２）。３つからなるリーダー配列を含む主要な後期Ｅ３　ｍＲＮＡをまた、ＢＡＶ−３において産生した（Ｉｄａｍａｋａｎｔｉら，１９９９　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５６，３５１−３５９）。転写物のサイズは、Ｅ３プロモーターとＥ３領域のポリ（Ａ）部位との間のゲノムの距離よりもかなり大きい。これらの転写物は、ＭＬＰから産生される最初の転写物のスプライシングによって産生されたに違いない。
【０１１９】
（実施例５　ＭＤＢＫ細胞におけるＨＥ発現の反応速度論）
組換えＢＡＶ３でのＭＤＢＫ細胞の感染後の異なる時点で回収した、細胞溶解物由来のタンパク質を、ＢＣＶ特異的ポリクローナル抗血清を使用して免疫沈降アッセイによって分析した。ＢＣＶ（図４ＡＢＣＤ、レーン３）感染した細胞溶解物由来の代謝的に放射標識された免疫沈降物の電気泳動的な分析は、６５ｋＤａのタンパク質を検出した。このようなタンパクを、偽感染（図４ＡＢＣＤ、レーン１）またはＢＡＶ−３（図４ＡＢＣＤ、レーン２）感染した細胞溶解物から検出しなかった。この組換えＢＡＶ３０３は、内在性プロモーターからの発現を可能にするように平行方向において、ＢＡＶ−３　Ｅ３に置換されるＨＥ　ｃＤＮＡ配列を含んだ。ＢＡＶ３０３感染した細胞溶解物の免疫沈降分析は、わずかにＨＥ発現を示したか、または全くＨＥ発現を示さなかった（図４Ａ、レーン４、５、６）。組換えＢＡＶ３３２は、外来性キメライントロンの下流およびＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルの上流にＥ３中にＨＥ配列を含む。ＢＡＶ３３２感染した細胞溶解物の免疫沈降分析は、感染後３６時間で６５ｋＤａの特異的なバンドを検出した（図４Ｂ、レーン６）。組換えＢＡＶ３３３および組換えＢＡＶ３３４は、これらが、それぞれ、キメライントロンの上流にＳＶ４０プロモーターまたはＣＭＶ前初期プロモーターのいずれかを有すること以外ＢＡＶ３２２に類似した。ＢＡＶ３３３感染した細胞の免疫沈降分析はまた、感染後２４時間（図４Ｃ、レーン５）および３６時間（図４Ｃ、レーン６）において６５ｋＤａの特異的なバンドを検出した。同様に、ＢＡＶ３３４感染した細胞の免疫沈降分析は、感染後２４時間（図４Ｄ、レーン５）および３６時間（図４Ｄ、レーン６）において６５ｋＤａの特異的なバンドを検出した。
【０１２０】
ＳＶ４０プロモーターの制御下のＢＣＶ　ＨＥ遺伝子を、ＨＡＶ−５を使用してクローニングし、発現した（Ｙｏｏら，１９９２　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３，２５９１−２６００）。このＨＥの発現を、感染後６時間程早くに見出し、そして感染の間に産生した。しかし、ＢＡＶ−３は、複製反応速度論に関してＨＡＶ−５とは異なる。ＢＡＶ−３感染された細胞において、ウイルスＤＮＡ複製は、感染後２４時間後に開始し、そして４０時間後にピークに達するが、ＨＡＶ−５感染した細胞におけるウイルスＤＮＡ複製は、感染後１２時間程の早さで起こる（Ｎｉｉｙａｍａら，１９７５　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１６，６２１−６３３）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）についての遺伝子を、ＢＡＶ−３中のＥ３）領域におけるＣＭＶ前初期プロモーターの制御下において置換される場合、ＧＦＰ発現を、感染後１２時間で見出した（Ｒｅｄｄｙら，１９９９　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，９１３７−９１４４）。これは、ＢＡＶ−３のＥ３領域由来の外来遺伝子発現の反応速度論は、外来性転写エレメントだけでなく、外来遺伝子の性質にも影響を受け得ることを示唆する。
【０１２１】
（実施例６　Ｅ３欠失ベクターのパッケージング能力の決定）
ＢＡＶ３．Ｅ３ｄゲノムのパッケージング能力を決定するために、発明者らは、それぞれ、２９０３ｂｐ、３０２０ｂｐまたは３２４６ｂｐの外来ＤＮＡを含むｐＦＢＡＶ３３５、ｐＦＢＡＶ３３６またはｐＦＢＡＶ３３７と名付けられたＥ３欠失ＢＡＶ−３全長ゲノムクローンを構築した。各場合において、この挿入物の方向は、Ｅ３転写単位と同じであった。プラスミドｐＦＢＡＶ３３５、ｐＦＢＡＶ３３６またはｐＦＢＡＶ３３７のそれぞれの２つのクローンを、ＰａｃＩで消化し、Ｒ２細胞をトランスフェクトした。プラスミドｐＦＢＡＶ３３５　ＤＮＡをトランスフェクトした細胞のみが、細胞変性効果を生じた。ＢＡＶ３３５と名付けられた組換えウイルス（図１）を、ＭＤＢＫ細胞で増殖した。組換えウイルス感染された細胞から抽出されたＤＮＡを、制限酵素消化によって分析した（図５）。予想通り、ＢＡＶ−３のＢａｍＨＩ「Ｄ」フラグメントは、３．０１９ｋｂであり（レーン１）、ＢＡＶ３．Ｅ３ｄは、１．８ｋｂであり（レーン２）そしてＢＡＶ３３５は、４．６ｋｂである（レーン３）。これを、野生型および組換えＢＡＶ−３のＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって確認した。図５Ｂを見ると、組換えＢＡＶ３３５由来の同じ改変ＢａｍＨＩ「Ｄ」フラグメントは、サザンブロットハイブリダイゼーションにおいてα−３２ＰｄＣＴＰ標識ｇＢ遺伝子とハイブリダイズした（図５Ｂ、レーン３）。これは、組換えＢＡＶ３３５が、ｇＢ遺伝子を含むことを確認した。
【０１２２】
ｇＢタンパク質の発現を決定するために、組換えＢＡＶ３３５ウイルス感染した放射標識した細胞溶解物を、ｇＢ特異的ＭＡｂのプールで免疫沈降し（ｖａｎ　Ｄｒｕｎｅｎ　Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｈｕｒｋら，１９８４　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３５，４６６−４７９）、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図６に見られるように、組換えＢＡＶ３３５感染細胞の免疫沈降は、ＢＡＶ３３５感染細胞由来の１３０ｋＤａ、７４ｋＤａおよび５５ｋＤａの３つのバンド（レーン５，レーン６）を明らかにした。これらは、ＢＨＶ−１感染細胞において産生したｇＢと同時移行する（レーン３）。類似のバンドを、感染していない細胞（レーン１）または組換えＢＡＶ３．Ｅ３ｄで感染した細胞（レーン２）において観察しなかった。組換えｇＢを、感染後２４時間（レーン５）および３６時間（レーン６）で発現したが、１２時間（レーン４）で発現しなかった。
【０１２３】
任意のウイルスベクターの最も重要な特徴の１つは、パッケージング能力である。任意の他の正十二面体のウイルスベクターのように、アデノウイルスはまた、限定されたベクター能力を有する。アデノウイルスキャプシドは、野生型ゲノムのサイズの１０５％程大きなゲノムをパッケージングし得る（Ｇｈｏｓｈ−ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，１９８７　ＥＭＢＯ　Ｊ．６，１７３３−１７３９）。これらは、約１．８〜２．０ｋｂの過剰なＤＮＡの挿入を可能にする。アデノウイルスベクターに２．０ｋｂよりも大きな外来遺伝子をクローニングするために、代償的な欠失を、通常、ゲノムのＥ１領域およびＥ３領域に作製する。しかし、最近、ヒツジのアデノウイルスベクターのパッケージング能力が、５％のパッケージングルールを越えることを報告した（Ｘｕら，１９９７　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３０，６２−７１）。Ｅ３欠失したＢＡＶ−３ベクターのパッケージング能力を決定するために、ＢＨＶ−１の本物のｇＢ（２９０３ｂｐ）、短縮ｇＢ（３０２０ｂｐ）およびβ−ガラクトシダーゼ（３２４６ｂｐ）をコードする遺伝子を、全長プラスミド、ｐＦＢＡＶ−３０２のＥ３領域に導入した（Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら，１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）。ウイルスは、ＢＡＶ−３のベクター能力が、約２．９ｋｂであることを示す本物のｇＢ遺伝子を含む全長プラスミドからのみレスキューされ得る。ＨＡＶ−５の５％のパッケージングルール（Ｇｈｏｓｈ−ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，１９９７）にしたがって、Ｅ３欠失ＢＡＶ−３（Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら，１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）の理論的なパッケージング能力は、本研究において決定されたパッケージング能力に類似する。
【０１２４】
（実施例７　組換えウイルスの増殖）
Ｅ３への外来性転写調節エレメントの挿入が、ＭＤＢＫ細胞においてこれらの組換えを複製する能力に任意の注目すべき効果を有するかどうかを決定するために、ウイルス力価を決定した。Ｅ３領域の欠失は、ウイルスの収量において検出不可能な効果を有した。ＢＡＶ３０３、ＢＡＶ３３２、ＢＡＶ３３３およびＢＡＶ３３５は、ＢＡＶ３．Ｅ３ｄ（Ｅ３欠失）ウイルスとして類似の力価になった。しかし、ＢＡＶ３３４は、ＢＡＶ３．Ｅ３ｄよりも低い１．０ｌｏｇ１０であった最終力価になった（Ｅ３領域欠失ウイルス、Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら，１９９８　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２５０，２２０−２２９）。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、組換えＥ３欠損全長ＢＡＶ−３ゲノムクローンの模式図である。
【化３】2004504035.tif 000004
初期（Ｅ）領域のＥ１、Ｅ３およびＥ４の位置を描写する。矢印は転写の方向を表す。それぞれの組換えウイルスに付与された名称を右側に示す。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、組換えＥ３欠損全長ＢＡＶ−３ゲノムクローンの模式図である。図１Ｂ：組換えＥ３欠損ＢＡＶ３５５欠損の模式図、これは、ウシヘルペスウイルス１型糖タンパク質ｇＢ（ＢＨＶ−１のｇＢ）を含む。
【図２】
図２Ａ〜２Ｂは、組換えＢＡＶ−３ゲノムの制限酵素分析を示す。図Ａ　ＤＮＡを、Ｈｉｒｔの方法（Ｈｉｒｔ，１９６７　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，３６５−３６９）によって、ＢＡＶ−３（レーン１）、ＢＡＶ３．Ｅ３ｄ（レーン２）、ＢＡＶ３０３（レーン３）、ＢＡＶ３３２（レーン４）、ＢＡＶ３３３（レーン５）およびＢＡＶ３３４（レーン６）で感染させたＭＤＢＫ細胞から抽出し、ＢａｍＨＩを用いて消化した。図Ｂ　パネルＡに示されるフラグメントを、ナイロン膜に転写し、そして−α３２Ｐ−標識ＨＥプローブでプローブ化した。Ｌａｎｅ　Ｍ，１　Ｋｂ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡラダー（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）をウイルスＤＮＡフラグメントのサイジングに用いた。
【図３】
図３は、ＨＥ転写物のノーザンブロット分析を示す。総ＲＮＡを、モック（ｍｏｃｋ）（Ｍ）、ＢＡＶ３０３（レーン１、レーン２）、ＢＡＶ３３２（レーン３、レーン４）、ＢＡＶ３３３（レーン５、レーン６）およびＢＡＶ３３４（レーン７、レーン８）で感染させたＭＤＢＫ細胞から、感染の１８時間後（１、３、５、７）または２４時間後（２、４、６、８）に単離し、そしてプローブとしてｐＣＶＥ３プラスミド（Ｐａｒｋｅｒら、１９８９　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，１５５−１６４）の１．３Ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメント（ＨＥコード配列を含む）を用いて、本明細書中に記載のようにノーザンブロットによって分析した。右の数は、ＲＮＡの推定サイズ（Ｋｂ）を示す。
【図４】
図４Ａ〜４Ｄは、組換えＢＡＶ３ウイルスで感染させたＭＤＢＫ細胞におけるＨＥタンパク質の発現を示す。放射性標識したモック感染（レーン１）、ＢＡＶ−３感染（レーン２）、ＢＣＶ感染（レーン３）、ＢＡＶ３０３感染（図４Ａ、レーン４〜６）、ＢＡＶ３３２感染（図４Ｂ、レーン４〜６）、ＢＡＶ３３３感染（図４Ｃ、レーン４〜６）またはＢＡＶ３３４感染（図４Ｄ、レーン４〜６）のＭＤＢＫ細胞の溶解物由来のタンパク質を、ポリクローナル抗ＢＣＶ血清で免疫沈降し、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。細胞を感染の１２時間後（レーン４）、２４時間後（レーン５）および３６時間後（レーン６）に収集した。サイズマーカー（キロダルトン）の位置を各パネルの左に示す。
【図５】
図５Ａ〜５Ｂは、組換えＢＡＶ−３ゲノムの制限酵素分析を示す。図５Ａ．ＢＡＶ−３（レーン１）、ＢＡＶ３．Ｅ３ｄ（レーン２）およびＢＡＶ３３５（レーン３）で感染させたＭＤＢＫ細胞から、Ｈｉｒｔの方法（Ｈｉｒｔ，１９６７　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，３６５−３６９）によって、ＤＮＡを抽出し、そしてＢａｍＨＩを用いて消化した。図５Ｂ．図５Ａに示されるフラグメントを、ナイロン膜に転写し、そしてα３２Ｐ標識ｇＢプローブでプローブ化した。Ｌａｎｅ　Ｍ，１Ｋｂ　ＤＮＡ　Ｐｌｕｓラダー（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）をＤＮＡフラグメントのサイジングに用いた。
【図６】
図６は、ＭＤＢＫ細胞におけるｇＢタンパク質の発現を示す。放射性標識したモック感染（レーン１）、ＢＡＶ−３感染（レーン２）、ＢＨＶ−１感染（レーン３）または感染の１２時間後（レーン４）、２４時間後（レーン５）および３６時間後（レーン６）に収集したＢＡＶ３３５で感染させたＭＤＢＫ細胞の溶解物由来のタンパク質を、ＢＨＶ−１　ｇＢ特異的モノクローナル抗体のプールで免疫沈降し、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。サイズマーカー（キロダルトン）の位置をパネルの左に示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004504035.tif 000067
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