(57)【要約】小分子物質により細胞膜受容体の活性化を制御する方法が発明された。細胞膜受容体を、膜貫通領域における特定の単回点突然変異により、小分子物質による活性化に対して反応性とする方法もまた発明された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通ドメインが単回点突然変異でヒスチジンに修飾された、細胞膜受容体をコード化するＤＮＡ構築物。
【請求項２】
膜貫通ドメインが点突然変異でスレオニンおよびヒスチジンに修飾された、細胞膜受容体をコード化するＤＮＡ構築物。
【請求項３】
スレオニンとヒスチジンが３つ離れた残基であるところの、請求項２記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
請求項１ないし３に記載のＤＮＡ構築物によりコード化される細胞膜受容体。
【請求項５】
請求項１ないし３に記載のＤＮＡ構築物を含み、当該構築物の発現能を有する遺伝子工学による細胞。
【請求項６】
発現制御の下、請求項４に記載の受容体に対して反応性を示す転写調節因子の標的遺伝子を含む請求項５記載の細胞。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞を金属キレート化受容体アゴニストに曝すことを含む、細胞膜受容体の活性化方法。
【請求項８】
細胞を培地中で増殖させ、金属キレート化受容体アゴニストを当該培地に添加することで曝露を行う、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞が宿主生物内に存在しており、金属キレート化受容体アゴニストを宿主生物に投与することで曝露を行う、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
宿主生物が哺乳動物であり、金属キレート化受容体アゴニストが、医薬上許容される担体中、治療学的に効果的な用量で投与される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
金属キレート化受容体アゴニストが経口的に投与される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
金属キレート化受容体アゴニストが非経口的に投与される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
請求項１ないし３のいずれか一項記載の少なくとも１つのＤＮＡ構築物を含む、キット。
【請求項１４】
さらに、金属キレート化受容体アゴニストを含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
請求項５に記載の細胞を含む宿主生物。
【請求項１６】
哺乳動物を起源とする、請求項１５記載の宿主生物。
【請求項１７】
ヒト起源の請求項１６記載の哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、受容体の膜貫通ドメインにて特定の点突然変異を操作することにより、細胞表面受容体の小分子アゴニストでの活性化を調節する方法に関する。より具体的には、本発明は、亜鉛（II）のような金属イオンをキレート化しうる化合物を用いて、変異マルチ受容体のオリゴマー化を促進する方法について記載する。これらの修飾された受容体の宿主細胞内へのトランスフェクションは、遺伝子療法および形質導入細胞での誘導シグナル変換に関するその他の利用において、多数の治療学的機会を提供する。
【０００２】
（従来技術）
細胞表面受容体のダイマー化およびオリゴマー化は、細胞外分子の細胞内における増殖、分化およびアポトーシスなどの種々の生物学的反応を制御し得る、鍵となる生物学的過程である。このシグナル化メカニズムは、特定の細胞表面受容体の相互作用、その後の凝集を通じて生物学的機能を発揮する、サイトカイン、ホルモンおよび成長因子などの多数の可溶性蛋白によって利用されている。（Arai,K.-I.ら、Annu. Rev. Biochem. 1990, 59, 783；Bazan,J.F.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. 87, 6934；Ullrich A.およびSchlessinger,J.、Cell, 1990, 61, 203-212；Young,P.R.、”Protein hormones and their receptors”, Curr. Opin. Biotech. 1992, 3, 408-421；Heldin,C.H.、”Dimerization of cell surface receptors in signal transduction” Cell, 1995, 80, 213-223）。これらの受容体は、３つの別個のドメイン；細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内でのシグナル変換に関与する細胞質ドメインである。受容体のダイマー化は、受容体結合型チロシンキナーゼによって媒介されるシグナル化カスケードにおける最初の工程である。これらのキナーゼは自己リン酸化により活性化され、順次、受容体の細胞質ドメイン、アダプター蛋白およびＳＴＡＴ（シグナル変換物質および転写活性化物質）などの、多数の細胞内標的をリン酸化する。チロシンリン酸化蛋白は、他の細胞内蛋白への結合部位として作用することで、最終的に特定の応答遺伝子の転写開始をもたらすこととなる過程であるシグナル化カスケードを伝播させる。トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）および成長ホルモンの受容体などの、一つのポリペプチドサブユニットよりなる受容体も存在する。他方では、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−６の受容体のように、それぞれが、リガンド結合およびシグナル変換のような、より特異的な機能を発揮する２つまたは３つの異なった鎖よりなるものも存在する。受容体活性化のメカニズムは特定の受容体とリガンドの組み合わせにより多様であるものの、多数の１回膜貫通受容体の共通の特徴は、受容体に特異的なリガンドの結合に反応して細胞膜上に凝集することのようである。この凝集事象は、一つのサブユニットを有する受容体という状況でのホモダイマー化、または異なるサブユニットを有する受容体の状況でのヘテロダイマー化という形態をとり得る。
【０００３】
近頃、ＦＫ−５０６またはシクロスポリンＡ由来の小分子リガンドのダイマー形態によって、キメラ細胞膜受容体のダイマー化を可能にする技術が開発された。（Schreiber、Biorg. Med Chem. 1998, 6, 1127を参照のこと）。この研究において、ＦＫ−５０６の脂溶性のダイマー形態であるＦＫ−１０１２が、ＦＫＢＰ１２ドメインに融合された細胞膜受容体シグナル化ドメインよりなるキメラ蛋白をダイマー化するために用いられる。この融合蛋白をホモダイマー化する、ＦＫ１０１２の能力は、巨大環状天然産物であるＦＫ５０６と、全ての細胞に存在する細胞内細胞質蛋白であるＦＫＢＰ１２の間での強力な親和性に基づくものである。（Biererら、PNAS, 1990, 87, 9231）。この方法は、Ｔ細胞受容体（Spencerら、Science 1993, 262, 1019；Pruschyら、Chem. Biol. 1994, 1, 164）、Ｆａｓ受容体（Belshawら、Chem. Biol. 1996, 3, 731；Spencerら、Current Biol 1996, 6, 839）、ＴＧＦ−β受容体（Spencerら、Current Biol 1998,8,761）、ＥＰＯ受容体（Blauら、PNAS, 1997 94, 3076）、ｃ−ｋｉｔ受容体（Jinら、Blood 1998, 91, 890）のゼータ鎖のような、多数の膜貫通受容体の細胞内ドメインに使用される。この技術の転写調節への使用を記載する報告書は全て最近になって出されるようになった。（ＵＳ６１４０１２０、ＵＳ６０６３６２５、ＵＳ６０５４４３６、ＵＳ６０４６０４７、ＵＳ６０４３０８２、ＵＳ６０１１０１８、ＵＳ５９９４３１３、ＵＳ５８７１７５３、ＵＳ５８６９３３７、ＵＳ５８３４２６６、ＵＳ５８３０４６２）。
【０００４】
先に列挙した報告は全て、シグナル変換シグナルを含む細胞質ドメインと、ＦＫＢＰ１２またはシクロフィリンのいずれかに由来するリガンド結合ドメインの間の位置で融合する、キメラ膜貫通蛋白の構築物を含む。膜貫通受容体が、膜貫通ドメインでの特定の点突然変異を通して、小分子アクチベーターの作用に対して反応性とされ得る方法を示唆する報告はない。
本明細書に開示されるように、意外にも、膜貫通ドメインでの２つの特定の残基の単回変異によって、細胞膜受容体が、小分子金属キレート化リガンド、例えば、１９９９年４月１４日に国際特許出願番号ＷＯ９９／２２７３２として公開されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２３０４９で記載されたものによって特異的に活性化され得ることが見出された。
【０００５】
（発明の開示）
従って、本発明の一つの態様は、受容体の膜貫通ドメイン内に存在する特定のアミノ酸をヒスチジンへと変異させ、その後変異細胞表面受容体を金属キレート化受容体アゴニストと接触させることを含む、ダイマーまたはオリゴマー細胞表面受容体を活性化させる方法である。
本発明の他の態様は、受容体の膜貫通ドメイン内に存在する、好ましくは３つ離れた残基である、２個の特定のアミノ酸をスレオニンとヒスチジンへと変異させ、その後当該変異ダイマー細胞表面受容体を金属キレート化受容体アゴニストと接触させることを含む、ダイマーまたはオリゴマー細胞表面受容体を活性化させる方法である。
本発明の他の態様は、受容体の膜貫通ドメイン内に存在する特定のアミノ酸のヒスチジンへの１の点突然変異を含む、ダイマーまたはオリゴマー細胞表面受容体に関する。
【０００６】
本発明の他の態様は、受容体の膜貫通ドメイン内に存在する、好ましくは３つ離れた残基である、特定のアミノ酸の、スレオニンとヒスチジンへの２の点突然変異を含む、ダイマーまたはオリゴマー細胞表面受容体に関する。
本発明の他の態様は、受容体の膜貫通ドメイン内に存在する特定のアミノ酸のヒスチジンへの１の点突然変異を含む、ダイマーまたはオリゴマー細胞表面受容体を有する宿主細胞に関する。
本発明の他の態様は、受容体の膜貫通ドメイン内に存在する、好ましくは３つ離れた残基である、特定のアミノ酸の、スレオニンとヒスチジンへの２つの点突然変異を含む、ダイマーまたはオリゴマー細胞表面受容体を有する宿主細胞に関する。
【０００７】
（発明を実施するための最良の形態）
特許および特許出願を含むが、それに限定されず、本明細書で引用されている全ての刊行物は、出典明示により完全に説明されたものとして本明細書の一部とする。
本明細書で使用される「ヘテロ原子」なる語は、窒素、酸素または硫黄、好ましくは窒素を意味する。
本明細書で使用される「治療」なる語およびその派生語は、予防的または治療的療法を意味する。
本明細書で使用される「有機分子」なる語およびその派生語は、一般の有機化学者にとって当該分野にて標準的に使用されるもので、それ自体は無機分子およびペプチド分子を除くことを意味する。
【０００８】
本明細書で使用される「細胞膜受容体」なる語は、細胞膜に広がり、細胞外媒体からのシグナルを細胞内へと伝達し得る、蛋白巨大分子である。天然細胞膜受容体の大部分は、３つの領域：細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは特定のリガンドに対する認識部位として機能し、膜貫通ドメインは受容体の細胞膜へのアンカーとしての機能を有し、細胞内ドメインは、典型的には、外部からのシグナルを細胞の内部へと変換する認識配列を有する。さらには、本発明における細胞膜受容体は、わずか２つのドメインから構成され得る：典型的には、全体的に非極性である約１８ないし３０のアミノ酸の領域である、膜貫通ドメイン、およびＢｏｘ１、Ｂｏｘ２およびサイトカイン受容体にて見られるチロシン残基などの、典型的には、シグナル開始に関与する認識配列を含む４０ないし３００のアミノ酸領域である、細胞内ドメインである。（Fukunagaら、Cell, 1993, 74, 1079；Tannerら、J. Biol. Chem. 1995, 270, 6523；Gurneyら、Proc Nat. Acad. Sci. USA 1995, 92, 5292を参照のこと）。
【０００９】
本発明の範囲内にある受容体は全て、少なくとも点突然変異を一つ有する。
本明細書で使用される「金属キレート化受容体アゴニスト」なる語およびその派生語は、約１００ないし約８５０、好ましくは約２００ないし約７５０、最も好ましくは約３００ないし約６５０の分子量を有し、１つないし４つ、好ましくは１つまたは２つの金属結合モチーフを有する小有機分子を意味する。１つの具体例としては、金属キレート化は、ダイマーのような受容体結合機能基の対称的マルチマーを形成する。
【００１０】
本明細書で使用される「金属結合モチーフ」なる語およびその派生語は、次のような特徴を有する受容体結合部分内にある原子の連続体を意味する。
１）連続体は、各々、３ないし１０、好ましくは４ないし８、最も好ましくは４または５個の原子よりなり；
２）連続体は、各々、さらに２つまたはそれ以上の、好ましくは２つないし４つの、最も好ましくは２つないし３つのヘテロ原子よりなり、好ましくはそのヘテロ原子の内少なくとも１つは窒素であり、ここにそのヘテロ原子は、炭素、窒素、硫黄および酸素、好ましくは炭素または窒素よりなる群から選択された１ないし４つの付加原子、好ましくは２ないし４つの付加原子、最も好ましくは２つまたは３つの付加原子により相互に離されており；および
３）金属結合モチーフ内のヘテロ原子の配置が同時に１つの金属イオンに対して、少なくとも２つの配位結合、好ましくは２つまたは３つの配位結合を形成することで、亜鉛（II）、銅（II）、ニッケル（II）、鉄（II）、コバルト（II）およびマンガン（II）イオンなどの金属イオンへのキレート配位が可能となる。
【００１１】
本発明において有用である金属結合モチーフの例は、次のものを含むがこれに限定されない：-N-C-C-N-, -N-C=C-N-, -N-C-C=N-, -N=C-C=N-, -O-C-C-N-, -O-C=C-N-, -O-C-C=N-, -O=C-C=N-, -S-C-C-N-, -S-C=C-N-, -S-C-C=N-, -S=C-C=N-, -S-C-C-S-, -N=C-N-N-, -N-C-N-N-, -O=C-N-N-, -S=C-N-N-, -O-C-C=O-, -O-N-C=O-, -O=C-C=N-N-, -N=C-N-C=N-, -O=C-N-C=N-, -N=C-C-C=N-, -O-C=C-C=O-, -N-C-C-C-N-, -N-C-C=C-N-, -N=C-C=C-N-, -N=C-C=C-O-, -N-C-C=C-O-, -N=C-C=C-S-, -S=C-C=C-S-, -O=C-N-C=N-, -N-N-C-C=N-, -N-N-C-N-N-, -N-C=N-C=N-, -N=C-N-C=N-C-C-N-, -N=C-N-C=N-C-C=N-。さらに、本発明の好ましい金属結合モチーフは、組み合わせの一部として含まれ得る。例えば、８原子の亜鉛結合モチーフである-N=C-N-C=N-C-C=N-は、基本的に、５原子金属結合モチーフ（すなわち-N=C-N-C=N-）と４原子金属結合モチーフ（すなわち-N-C-C=N-）のオーバーラップしたものである。
【００１２】
本発明の好ましい受容体結合部分は、１またはそれ以上の、次の官能基、好ましくは１つまたは２つの次の官能基を含む：４−ヒドラゾノ−５−ピラゾロン、２−ヒドラジノフェノール、１−（２’−ヒドロキシフェニル）−チオセミカルバゾン、２−アリール−９−ヒドロキシ−１Ｈ−ナフト［１，２−ｄ］イミダゾール、２−グアニジノベンズイミダゾール、２−グアニジノベンズオキサゾール、２−グアニジノベンゾチアゾール、２−メルカプトメチルピリジン、アシルアセトン、アシルヒドラジン、２−アミノエタンチオール、２−（イミダゾール−４−イル）エチルアミン、２−（イミダゾール−２−イル）エチルアミン、２−（イミダゾール−４−イル）エチルイミン、２−（イミダゾール−２−イル）エチルイミン、２−ピコリルアミン、８−ヒドロキシキノリン、８−アミノキノリン、８−メルカプトキノリン、エチレンジアミン、ピリジン−２−カルボキシアルジミン、２，２’−ビピリジル、２−チオベンズアルジミン、２−ヒドロキシベンズアルジミンおよび３’−｛Ｎ’−［１−アリール−５−オキソ−１，５−ジヒドロピラゾ−ル−４−イリデン］ヒドラジノ｝−２’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸。
上記の官能基は、一般に、より大きい分子の一部を形成しており、さらには受容体結合部分の形成において置換されていてもよい。上記の官能基上にて自由に用いることができる、好ましい置換基は、次より選ばれる１つまたはそれ以上の基よりなる：アルキル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アシルオキシ、カルバモイル、アミノ、Ｎ−アシルアミノ、ケトン、ハロゲン、シアノ、チオ、カルボキシおよびカルボキシアミド。
【００１３】
２０００年６月２２日にＷＯ００／３５４４６として公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３７１で、ＴＰＯ受容体は式（I）の小分子リガンドによって活性化され得ることが開示されている。ＴＰＯ受容体（Vigonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5640-5644）の化合物活性での役割を評価するため、化合物に反応しなかった細胞系が、ヒトＴＰＯ受容体を発現させることで、化合物に対して反応性となりうるかどうかを試験した。ＳＴＡＴ反応性ルシフェラーゼレポーターを用いてトランスフェクトさせた場合、ヒトヘパトーマ細胞系ＨｅｐＧ２（Adenら、Nature, 1979, 282, 615）由来の細胞は、ＴＰＯにも式（I）の化合物にも反応しなかった。しかし、ヒトＴＰＯ受容体発現ベクターおよびレポーターと共にトランスフェクトさせた場合、ＴＰＯ処理に対して当該細胞はルシフェラーゼ発現において大きな増大を示す。さらには、これらの細胞はまた、式（I）の小分子アゴニストに対して反応性となり、これらの化合物の活性部位が受容体そのものであることを示す、ＴＰＯ受容体発現依存性である活性パターンが見られた。
【００１４】
【化１】
2004532614.tif 000002
【００１５】
さらに、式（I）の化合物の活性を調べるために、カニクイザルのＴＰＯ受容体のｃＤＮＡクローンを単離し、配列決定した。意外にも、ヒト受容体のアミノ酸同一性と比較した場合、高度のアミノ酸同一性（９６．５％）を有するものの、カニクイザルＴＰＯ受容体に対する、式（Ｉ）の化合物によって検出される活性はなかった。これらの実験より、式（Ｉ）の化合物がヒトＴＰＯ受容体に対して正確な特異性を示す、ということは明らかであり、この知見はヒトとカニクイザル由来の血小板のＳＴＡＴ活性化アッセイからも確かめられた。化合物の活性化に必要とされるＴＰＯ受容体の領域を試験するため、一連のヒト／カニクイザルＴＰＯ−Ｒキメラ受容体を、ＨｅｐＧ２細胞の中へトランスフェクトし、それらの式（Ｉ）の化合物に対する反応を試験した。これらの研究の結果によると、当該化合物はヒト膜貫通ドメインを有するキメラに対して活性であり、カニクイザル膜貫通ドメイン由来の化合物には活性でないことが明らかにされた。ヒトとカニクイザルのＴＰＯ受容体の膜貫通配列を比較すると、ヒト受容体の４９９番目のアミノ酸であるヒスチジンが、カニクイザルにおいてはロイシンへと変化していることが明らかとなる。式（Ｉ）の化合物の活性に対するこの特定の膜貫通ドメインの変異が有する役割を研究するために、２つの点突然変異：ａ）ヒト細胞外および細胞質ドメインとカニクイザル膜貫通ドメインを有する受容体を創製する、ヒトＴＰＯ受容体の膜貫通ドメイン中のＨ４９９Ｌ変化、およびｂ）カニクイザル細胞外および細胞質ドメインとヒト膜貫通ドメインを有するキメラを創製する、カニクイザル受容体の膜貫通ドメイン中のＨ４９９Ｌ変化、を構築した。ヒトＴＰＯ受容体のＨ４９９Ｌ点突然変異は、式（Ｉ）の化合物に対して受容体を非反応性としたが、ＴＰＯへの反応には殆ど影響を与えなかった。反対に、カニクイザルＴＰＯ受容体のＬ４９９Ｈ変異は、野生株ヒト受容体で見られるものに近い効力および効果で、ＴＰＯとこの化合物により受容体を活性化させる。膜貫通ドメイン内のアミノ酸１つの違いは、このシリーズの種特異性に関与していることが分かった。カニクイザル受容体と類似して、ネズミＴＰＯ受容体もまた、膜貫通ドメイン内のヒトＬｅｕ４９９に相当する位置にロイシンを有しており、予想通り、式（Ｉ）の化合物の作用にも非反応性である。
【００１６】
本発明のもう一つ別の例として、ネズミＧ−ＣＳＦＲを選択して、膜貫通ドメインにおけるヒスチジンの導入が、受容体を式（Ｉ）の化合物の作用に対して反応性となるかどうかを試験した。式（II）で示されるように、ｍＧＣＳＦ−Ｒ（Fukunagaら、Cell, 1990, 61, 341-350）は、膜貫通領域内にＨｉｓを含まず、その結果、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされた場合に化合物の効果には非反応性であった。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
しかしながら、図１に示されるように、膜貫通Ｃｙｓ６１０をＨｉｓに変えると、得られたｍＧＣＳＦ−Ｒ変異体は式（Ｉ）の化合物の作用に対して反応性となった。二重変異体Ｇ６０７Ｔ／Ｃ６１０Ｈ  ｍＧ−ＣＳＦＲもまた、化合物の作用に反応性になり、対応するＣ６１０Ｈ単回変異体より高度の感度を示した。これらの研究によると、シングルパス細胞表面受容体の膜貫通ドメインにヒスチジン残基を導入すると、該受容体は、式（Ｉ）の化合物による活性化に反応性となることが明らかである。さらに、好ましくはヒスチジンから３つ上流のアミノ酸に、スレオニンを同時に導入することにより、この効果は増幅されうる。ＥＤＴＡなどの金属キレート化物質の存在下では活性化が起きないという事実で示されるように、この効果は金属イオンで仲介される(図１参照)。金属イオン依存性は、式（Ｉ）の化合物と、膜貫通ドメインからのＨｉｓとＴｈｒ残基を含む受容体との間で、金属複合体が形成されることを示す。この複合体は、順次、細胞表面上での受容体サブユニットの凝集により、受容体の活性化をもたらす。
【００１９】
【表２】
2004532614.tif 000004
【００２０】
本発明の化合物のダイマー細胞表面受容体アゴニストとしての効果と効力を決定する場合、ＨｅｐＧ２細胞にて構成されるルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを利用した。（Tianら、Science 1998, 281, 257-259を参照のこと）。
さらに工夫することなく、当業者であれば、上記の記載を用いて、本発明を最大限に利用できるはずである。そのため、次の実施例は、単なる例示であって、何ら本発明の範囲を限定するものではないと解釈されたい。
【００２１】
実験の詳細
実施例１
ＴＰＯ−Ｒプラスミド構築物
ヒトＴｐｏ受容体（ｈＭＰＬ）をＰＣＲ法（フォワードプライマー：5'-ACG AAG CTT AGC CAA GAT GTC TCC TTG CTG GCA T-3'と、リバースプライマー：5'-AGC CTC GAG TCA AGG CTG CCA ATA GCT-3'）により、ＨＥＬ９２．１．７細胞（ATCC, Rockville, MD）からクローン化した。クローン化された全長ｃＤＮＡを、ＤＮＡ塩基配列決定分析により確認し、ついでＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ消化ｐＳＳＦベクターにサブクローン化した。カニクイザルＴｐｏ−Ｒ（ｃＭＰＬ）を、ヒト５’および３’の末端コード配列を使って、骨髄ｃＤＮＡよりクローン化した。全長ｃＤＮＡを配列決定し、ＥｃｏＲＩ消化ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Invitrogen, San, Diego, CA）にサブクローン化した。テンプレートとしてｈＭＰＬｃＤＮＡを用い、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（７８７−１８３６ヌクレオチド）を対応するカニクイザル断片と置き換えて、ｈ／ｃＭＰＬ−１を産生し、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（１４００−１８３６ヌクレオチド）を対応するカニクイザル断片と置き換え、ｈ／ｃＭＰＬ−２を産生した。ｃ／ｈＭＰＬ構築物は、ｃＭＰＬｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（７８７−１８３６ヌクレオチド）を対応するヒト断片と置換することで産生された。Ｔ（ＴＭｔ）ＧとＴ（ＴＭｇ）Ｇ構築物は両方共、ブリッジＰＣＲ法によりクローン化された。Ｔ（ＴＭｔ）Ｇ構築物の場合、キメラプライマー（フォワードプライマー：5'-CTG GGC CTG CTG CTG CTG AGC CCC AAC AGG AAG AAT-3'と、リバースプライマー：5'-ATT CTT CCT GTT GGG GCT CAG CAG CAG CAG GCC CAG-3'）を用いて、ｈＭＰＬ配列の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインとｈＧ−ＣＳＦ−Ｒ配列の細胞質ドメインとを結合させた。キメラＰＣＲプライマー（フォワードプライマー：5'-GCC ACC GAG ACC GCC TGG ATC ATC CTG GGC CTG GGT GGC-3'と、リバースプライマー：5'-GAA CAG GCC CAG GAT GAT CCA GGC GGT CTC GGT GGC-3'）を用いて、ｈＭＰＬ配列の細胞外ドメインと、ｈＧ−ＣＳＦ−Ｒ配列の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを結合させることで、Ｔ（ＴＭｇ）Ｇ構築物を産生した。膜貫通ドメインの単回点突然変異体であるｈＭＰＬ（ＴＭｃ）およびｃＭＰＬ（ＴＭｈ）は、ＰＣＲプライマーに所望の変異を組み込むことで産生され、クローン化産生物を塩基配列決定分析で確認した。
【００２２】
実施例２
ＨｅｐＧ２トランスフェクション
ＨｅｐＧ２細胞を、３セットの２４ウェルプレートで一晩平板培養した。ついで、当該細胞を、所定の受容体構築物、ルシフェラーゼレポーター、８ｘ１１８−ＴｋＬＵＣとＳＴＡＴ５ｂ発現ベクター（Dr.James Ihle, Memphis, TNから入手）を含有するＧＡＳ反応要素を用いて、製造業者の指示に従いＳｕｐｅｒｆｅｃｔ法（QIAGEN, Valencia, CA）によってトランスフェクトした。一晩回収した後、トランスフェクトされた細胞を、０．１％ＤＭＳＯ，ＴＰＯ、または実施例４の化合物と所定の濃度で４ないし５時間処理した。ついで、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ発現レベルをプレートリーダーで測定した。
【００２３】
実施例３
ＧＣＳＦ−Ｒプラスミド構築物
ネズミＧＣＳＦ受容体の膜貫通部を、次のプライマーを用いて変異させた：１）5'−CTA AAG CAT GTT GGC ACA AC−3';２）5'−CAT CTG ACC AGA AGG AAG TC−3';３）5'−AAC ATT TTC CTG ACC ATA CTT CAC TTA−3';４）5'−TAA GTG AAG TAT GGT CAG GAA AAT GTT−3'。プライマー１および２は、６１０番目のシステイン残基をヒスチジンと置換するよう設計された。第二の変異は、６０７番目のグリシン残基をスレオニンと置換するように、プライマー３および４でなされた。製造業者の指示に従い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ由来の部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５１８−５）であるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅを用いて、変異を誘発した。Ｈｉｓ変異誘発由来の８つのクローンからの膜貫通領域を、ＵＳＢ由来のＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ放射性標識シーケンスキット（カタログ番号７９７５０）を用いて配列決定を行った。７つのクローンが変異させられた。７つのクローンのうち、一つに由来する受容体の配列を完全に決定し、正しいことが判明した。ついで、遺伝子を突然変異誘発プロトコルに付していない哺乳動物発現ベクターに転移させた。（Ｈｉｓ）ＧＣＳＦ−ｒを用いて、スレオニン変異を誘発し、（Ｈｉｓ／Ｔｈｒ）二重変異体を産生した。再び、二重変異体の８つのクローンを、変異についてスクリーニングした。全てがＨｉｓ／Ｔｈｒ変異を含んだ。二重変異体のうち一つを完全に配列決定し、再び、突然変異誘発操作に付していない発現ベクターに転移させた。ＨｉｓおよびＨｉｓ／Ｔｈｒ  ＧＣＳＦ−ｒプラスミドを、製造業者プロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  ｃａｔ．１０９６４−０１３）を用い、８ｘ１１８Ｔｋ−Ｌｕｃレポーターと共に、ＨｅｐＧ２細胞に一晩トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、化合物またはＧＣＳＦと、保湿インキュベータで５ないし７時間３７℃で処理された。ついで、細胞を溶菌し、ルシフェラーゼ産生アッセイを行った。
【００２４】
実施例４
３−ヒドロキシ−４−［（１−ヒドロキシ−２−ナフタレニル）アゾ］−１−ナフタレンスルホン酸（化合物１）の調製
標記化合物は、Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WIより入手可能で、提供された通りに使用する。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ３９３［Ｍ−Ｈ］。
【００２５】
実施例５
３’−｛Ｎ’−［１−（３，４−ジメチルフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１，５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン］ヒドラジノ｝−２’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸（化合物２）の調製
ａ）２−ブロモ−６−ニトロフェノール
２−ブロモフェノール（３４．６ｇ、０．２モル）を、硝酸ナトリウム（３０．５ｇ、０．３６モル）の濃硫酸（４２ｇ）と水（７４ｍＬ）中冷（１０℃）溶液にゆっくりと加え、得られた混合物を室温で２時間攪拌した。水（２１０ｍＬ）を加れ、得られた混合物をジエチルエーテルで抽出し、抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過して濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、明黄色固体として、まず標記化合物（１０．９ｇ；２５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１１．１０（ｓ，１Ｈ）、８．１３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、６．９０（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）。
【００２６】
ｂ）２−ブロモ−６−ニトロアニソール
実施例５ａ）の化合物（１０．８ｇ；０．０４９５モル）、ヨウ化メチル（３．４ｍＬ；０．００５４５モル）および炭酸カリウムのアセトン（２５０ｍＬ）中混合物を攪拌し、２４時間還流しながら加熱した。混合物を蒸発させ、残りを水でトリチュレートし、標記化合物（８．７ｇ；７６％）を得た。融点５５−５６℃。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．８１−７．７４（ｍ，２Ｈ）、７．１３（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、４．０２（ｓ，３Ｈ）；元素分析（Ｃ７Ｈ６ＮＯ３Ｂｒとして）計算値（％）：Ｃ，３６．２４；Ｈ，２．６１；Ｎ，６．０４；測定値（％）：Ｃ，３６．３０；Ｈ，２．５９；Ｎ，５．７３。
【００２７】
ｃ）２’−メトキシ−３’−ニトロビフェニル−３−カルボン酸
実施例５ｂ）の化合物（４．０６ｇ；１７．５ミリモル）、３−カルボキシフェニルボロン酸（３．０４ｇ；１８．４ミリモル）、２Ｍ水性炭酸ナトリウム（１７．５ｍＬ；３５ミリモル）およびテトラキストリフェニルホスフィノパラジウム（０）（８７５ｍｇ）の１，４−ジオキサン（１０５ｍＬ）中溶液を攪拌し、窒素雰囲気下で２４時間還流しながら加熱した。
反応混合物は冷却し、蒸発させ、残渣を６Ｍ水性塩酸（１５０ｍＬ）で処理した。灰色沈殿物を濾過し、水、ついでシエチルエーテルでしっかりと洗浄し、標記化合物（２．１３ｇ；４７％）を黄褐色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ  ８．１２（ｓ，１Ｈ）、８．０３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．９４（ｄｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．８５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．７６（ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．６６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．４６（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．４６（ｓ，３Ｈ）。
【００２８】
ｄ）２’−ヒドロキシ−３’−ニトロビフェニル−３−カルボン酸
実施例５ｃ）の化合物（２．１３ｇ；０．００７７モル）の氷酢酸（２５．０ｍＬ）および４８％水性臭化水素酸（２５．０ｍＬ）中溶液を攪拌し、５時間還流しながら加熱した。混合物を冷却し、濾過して、標記化合物（１．５７ｇ；７９％）を黄褐色粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ  １３．９０（ｓ，１Ｈ）、１０．６６（ｓ，１Ｈ）、８．１２（ｔ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ）、８．０７（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．９８（ｄｔ，７．８，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．７９（ｄｔ，Ｊ＝８．１，１．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．７４（ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．６２（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．４，７．５Ｈｚ，１Ｈ）。
【００２９】
ｅ）４−アミノ−３’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸・塩酸塩
実施例５ｄ）の化合物（１．７１ｇ、６．６ミリモル）のエタノール（７５．０ｍＬ）、水（５０．０ｍＬ）および３Ｍ水性水酸化ナトリウム（２．１ｍＬ、６．８ミリモル）中溶液を、炭素上１０％パラジウム（２１０ｍｇ）上、室温および５０ｐｓｉで２時間、水素添加した。反応混合物は濾過し、３Ｍ水性塩酸（２５．０ｍＬ）で処理し、ついで蒸発させ、残渣を少量の水でトリチュレートし、標記化合物（１．５１ｇ；１００％）を褐色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ  １１．３−８．７（ｂｒ  ｓ，４Ｈ）、８．０８（ｓ，１Ｈ）、７．９５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．７４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．６１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．３４（ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．２４（ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．０４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）。
【００３０】
ｆ）１−（３，４−ジメチルフェニル）−３−メチル−３−ピラゾリン−５−オン
３，４−ジメチルフェニルヒドラジン塩酸塩（１７．７ｇ；０．１モル）、アセト酢酸エチル（１３．０ｇ；０．１モル）および酢酸ナトリウム（８．２ｇ；０．１モル）の氷酢酸（２５０ｍＬ）中溶液を攪拌し、２４時間還流しながら加熱した。混合物は冷却し、蒸発させ、残渣をジエチルエーテル（１Ｌ）に溶かし、飽和水性炭酸水素ナトリウム（５ｘ２００ｍＬ）で注意して洗浄した。エーテル層を蒸発させ、標記化合物（１５．４ｇ；７６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ  １１．３０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、７．４９（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．４３（ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．１４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．３１（ｓ，１Ｈ）、２．２０（ｓ，３Ｈ）、２．２２（ｓ，３Ｈ）、２．０８（ｓ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ２０３［Ｍ＋Ｈ］。
【００３１】
ｇ）３’−｛Ｎ’−［１−（３，４−ジメチルフェニル）−３−メチル−５−オキソ−１，５−ジヒドロピラゾール−４−イリデン］ヒドラジノ｝−２’−ヒドロキシビフェニル−３−カルボン酸・水和物
実施例５ｅ）の化合物（８９．０ｍｇ；０．３９ミリモル）の１Ｍ水性塩酸（１．３ｍＬ）中懸濁液を５℃まで冷却し、ついで硝酸ナトリウム（２８．４ｍｇ；０．４１ミリモル）の水（０．４５ｍＬ）中溶液を滴下処理した。黄色混合物を５℃でさらに１０分間攪拌し、ついで実施例５ｆ）（７８．２ｍｇ、０．３９ミリモル）の化合物と一度に反応させ、つづいて反応混合物の最終的なｐＨがおおよそ７ないし８となるように、炭酸水素ナトリウム（１６０ｍｇ；１．９５ミリモル）およびエタノール（１．８ｍＬ）を少しづつ添加した。ついで、赤色溶液を室温で２４時間攪拌した。混合物を濾過して赤色固体を得、それを水（４．５Ｌ）中でスラリー状にし、ついで濃塩酸で酸性にした。濾過により、標記化合物（０．０５５ｇ；３２％）を橙色固体として得た。融点２２８℃（分解）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ  １３．７６（ｓ，１Ｈ）、１３．１２（ｓ，１Ｈ）、９．７０（ｓ，１Ｈ）、８．１４（ｓ，１Ｈ）、７．９７（ｄｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．８１（ｄｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．７４−７．６０（ｍ，５Ｈ）、７．２２−７．１３（ｍ，３Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、２．２７（ｓ，３Ｈ）、２．２３（ｓ，３Ｈ）；元素分析（Ｃ２５Ｈ２２Ｎ４Ｏ４・１．０Ｈ２Ｏとして）計算値（％）：Ｃ，６５．２１；Ｎ，１２．１７；測定値（％）：Ｃ，６５．６０；Ｈ，４．９６；Ｎ，１２．０４。
【００３２】
実施例６
４−｛［１−(３，４−ジメチルフェニル)−５−ヒドロキシ−３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］アゾ｝−３−ヒドロキシ−１−ナフタレンスルホン酸（化合物３）の調製
１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホン酸（１３．３ｇ、５３．１ミリモル）と実施例５ｆ）の化合物（１０．７ｇ、５３．１ミリモル）の水（１７０ｍＬ）中攪拌溶液に、重炭酸ナトリウム（１３．３８ｇ、１５９．２ミリモル）をゆっくりと加えた。得られた溶液を６０℃で一晩攪拌しながら加熱した。該溶液を室温に冷却し、３Ｎ塩酸溶液でｐＨ＝１に調節した。紫色沈殿物を濾過により単離し、水で洗浄して、標記化合物（２３．３ｇ；９７％）を赤色固体として得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ４５１［Ｍ−Ｈ］。
【００３３】
本発明の好ましい具体例は上記したように説明されているが、本発明は本明細書に開示された説明そのものに限定されるものではなく、特許請求の範囲内とするすべての修飾する権利も保持されていることを理解すべきである。
【国際公開パンフレット】
2004532614.tif 000005
2004532614.tif 000006
2004532614.tif 000007
2004532614.tif 000008
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【国際調査報告】
2004532614.tif 000021