(57)【要約】本発明は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）が銅により不活性化されるという予期せぬ発見に基づいている。したがって、本発明は、銅によるＡＰＣの不活性化を抑制するために銅キレート剤を用いる、ＡＰＣにより治療可能な疾患および状態を治療する改善された方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による治療を必要とする動物を治療する方法であって、該動物に
有効量の銅キレート剤、および
有効量の
（ａ）ＡＰＣ、
（ｂ）プロテインＣ、該動物におけるプロテインＣの合成を増加させる物質、もしくはこれら両方、
（ｃ）プロテインＣの活性化剤、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうち１つもしくは複数の組合せ
のうちの１つを投与することからなる方法。
【請求項２】
前記キレート剤がヒトアルブミンまたはＮ末端銅結合性配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓを含むその断片である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キレート剤が下式を有するペプチドまたはその生理学的に許容できる塩である請求項１に記載の方法。
Ｐ１−Ｐ２
［式中、
Ｐ１は、
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓまたは
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であり、
Ｐ２は（Ｘａａ４）ｎであり、
Ｘａａ１はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、イソグルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ２はグリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ３はグリシン、アラニン、バリン、リシン、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンであり、
Ｘａａ４は任意のアミノ酸であり、
ｎは０〜１００である］
【請求項４】
Ｘａａ１がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｘａａ２がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、メチオニン、ヒスチジンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｘａａ３がリシンである請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｘａａ１がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、Ｘａａ２がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、メチオニン、ヒスチジンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、Ｘａａ３がリシンである請求項３に記載の方法。
【請求項８】
Ｘａａ１がアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２がアラニン、グリシン、バリン、トレオニン、セリン、ロイシンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｘａａ２がアラニン、トレオニン、ロイシンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘａａ１がアスパラギン酸であり、Ｘａａ２がアラニンである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｎが０〜１０である請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
ｎが０〜５である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｎが０である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｐ２が金属結合性配列を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｐ２が以下の配列のうち１つを含む請求項１４に記載の方法。
（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ３  Ｈｉｓ  Ｘａａ２  Ｘａａ５、
（Ｘａａ４）ｍ  Ｈｉｓ  Ｘａａ２  Ｘａａ５、
（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３または
（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ
［式中、Ｘａａ５は遊離の側鎖−ＮＨ２を有するアミノ酸であり、ｍは０〜５である］
【請求項１６】
Ｘａａ５がＯｒｎまたはＬｙｓである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｐ２が以下の配列のうち１つを含む請求項１４に記載の方法。
［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２ＨｉｓＸａａ３］ｒ、
［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２Ｈｉｓ］ｒ、
［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２ＨｉｓＸａａ３（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２Ｈｉｓ］ｒまたは
［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２Ｈｉｓ（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２ＨｉｓＸａａ３］ｒ
［式中、Ｘａａ５は遊離の側鎖−ＮＨ２を有するアミノ酸であり、ｍは０〜５であり、ｒは２〜１００である］
【請求項１８】
Ｐ２がＣｕ（Ｉ）に結合する配列を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
Ｐ２が以下の配列
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｍｅｔ、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｍｅｔ、
Ｃｙｓ  Ｃｙｓ、
Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号３］、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号４］、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ［配列番号５］または
γ−Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ
のうち１つを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｐ２がＧｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ［配列番号５］である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｐ２が、該ペプチドの細胞膜への浸透、標的組織への到達またはこれら両方の能力を増大させる配列からなる請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
Ｐ２が疎水性またはアルギニンオリゴマーである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
β−アラニン（存在する場合）以外のＰ１のアミノ酸のうち少なくとも１つがＤ−アミノ酸である請求項３に記載の方法。
【請求項２４】
Ｘａａ１がＤ−アミノ酸であるか、ＨｉｓがＤ−アミノ酸であるか、またはＸａａ１およびＨｉｓの両方がＤ−アミノ酸である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
β−アラニン（存在する場合）以外のＰ１のアミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｐ２のアミノ酸のうち少なくとも５０％がＤ−アミノ酸である請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
Ｐ２のアミノ酸のうち少なくとも５０％がＤ−アミノ酸である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
Ｐ２のアミノ酸のうち少なくとも５０％がＤ−アミノ酸である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
Ｐ１の少なくとも１つのアミノ酸、Ｐ２の少なくとも１つのアミノ酸、またはＰ１の少なくとも１つのアミノ酸およびＰ２の少なくとも１つのアミノ酸が、（ａ）銅イオンに結合するＰ１の能力を変化させることなく、該ペプチドの親油性を増加させる置換基、（ｂ）銅イオンに結合するＰ１の能力を変化させることなく、タンパク質分解酵素から該ペプチドを保護する置換基、または（ｃ）銅イオンに結合するＰ１の能力を変化させない非ペプチド金属結合性官能基である置換基、で置換されている請求項３に記載の方法。
【請求項３０】
ｎが０であり、Ｐ１が以下の式のうち１つを有する請求項２９に記載の方法。
【化１】
2004535461.tif 000002
【化２】
2004535461.tif 000003
［式中、
Ｒ１はアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ２は−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＲ１またはＲ１であり、
Ｒ３はＨ、非ペプチド金属結合性官能基であるか、または２つのＲ３基が一緒に非ペプチド金属結合性官能基を形成している］
【請求項３１】
前記キレート剤が次式を有するペプチド２量体である請求項１に記載の方法。
Ｐ３−Ｌ−Ｐ３
［式中、
各Ｐ３は同じであるか、または異なっていてよく、銅に結合することができるペプチドであり、
Ｌは２つのＰ３ペプチドにそれらのＣ末端アミノ酸を介して結合している化学基である］
【請求項３２】
各Ｐ３が２〜１０アミノ酸を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つのＰ３がＰ１であり、Ｐ１が
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓまたは
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であって、
Ｘａａ１はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、イソグルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ２はグリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ３はグリシン、アラニン、バリン、リシン、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンである請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
Ｘａａ１がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｘａａ２がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、メチオニン、ヒスチジンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
Ｘａａ３がリシンである請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｘａａ１がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、Ｘａａ２がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、アスパラギン、メチオニン、ヒスチジンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、Ｘａａ３がリシンである請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
Ｘａａ１がアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２がアラニン、グリシン、バリン、トレオニン、セリン、ロイシンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｘａａ２がアラニン、トレオニン、ロイシンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｘａａ１がアスパラギン酸であり、Ｘａａ２がアラニンである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
β−アラニン（存在する場合）以外のＰ１のアミノ酸のうち少なくとも１つがＤ−アミノ酸である請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
β−アラニン（存在する場合）以外のＰ１のアミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
両方のＰ３ペプチドがＰ１である請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
Ｐ３の少なくとも１つのアミノ酸が、（ａ）銅イオンに結合するＰ３の能力を変化させることなく、該ペプチドの親油性を増加させる置換基、（ｂ）銅イオンに結合するＰ３の能力を変化させることなく、タンパク質分解酵素から該ペプチドを保護する置換基、または（ｃ）銅イオンに結合する該ペプチドの能力を変化させない非ペプチド金属結合性官能基である置換基、で置換されている請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
Ｐ３が、Ｐ３の銅イオン結合能力をもたらす非ペプチド金属結合性官能基で置換されているアミノ酸配列を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
Ｌが中性である請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
Ｌが１〜１８個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルカンまたはアルケン残基である請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
Ｌが２〜８個の炭素原子を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｌが２〜８個の炭素原子を含む環式アルカン残基である請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】
Ｌが３〜５個の炭素原子を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｌが窒素含有複素環式アルカン残基である請求項３１に記載の方法。
【請求項５２】
Ｌがピペラジドである請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｌがグリセリルエステルである請求項３１に記載の方法。
【請求項５４】
前記銅キレート剤は非ペプチド金属結合性官能基を結合したペプチドであり、該ペプチドが銅結合性部位を含み、かつ／または該非ペプチド官能基が銅に結合する請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
該動物が後天性凝固性亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症に罹患しているためＡＰＣを必要としている請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
該動物が敗血症に罹患しているためＡＰＣを必要としている請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
該動物が血管内凝固を伴う疾患または状態に罹患しているためＡＰＣを必要としている請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
銅キレート剤を投与した後に、ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの活性化剤、またはこれらのうち１つもしくは複数の組合せを投与する請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
銅キレート剤を、ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質、プロテインＣの活性化剤、またはこれらのうち１つもしくは複数の組合せと配合してから動物に投与する請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による治療を必要とする動物を治療する方法であって、
有効量の銅キレート剤を以下の
（ａ）ＡＰＣ、
（ｂ）プロテインＣ、該動物におけるプロテインＣの合成を増加させる物質、もしくはこれら両方、
（ｃ）プロテインＣの活性化剤、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうち１つもしくは複数の組合せ
のうちの１つを含む組成物と接触させて、該組成物中に存在する全ての銅に結合させるようにするステップと、
有効量のＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質、プロテインＣの活性化剤、もしくはそれらのうち１つまたは複数の組合せをＡＰＣによる治療を必要とする動物に投与するステップと
からなる方法。
【請求項６１】
前記銅キレート剤がヒトアルブミンまたはＮ末端銅結合性配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓを含むその断片である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記銅キレート剤が次式を有するペプチドまたはその生理学的に許容できる塩である請求項６０に記載の方法。
Ｐ１−Ｐ２
［式中、
Ｐ１は、
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓまたは
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であり、
Ｐ２は（Ｘａａ４）ｎであり、
Ｘａａ１はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、イソグルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ２はグリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ３はグリシン、アラニン、バリン、リシン、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンであり、
Ｘａａ４は任意のアミノ酸であり、
ｎは０〜１００である］
【請求項６３】
Ｐ１の少なくとも１つのアミノ酸が、（ａ）銅イオンに結合するＰ１の能力を変化させることなく、ペプチドの親油性を増加させる置換基、（ｂ）銅イオンに結合するＰ１の能力を変化させることなく、タンパク質分解酵素からペプチドを保護する置換基、または（ｃ）銅イオンに結合するＰ１の能力を変化させない非ペプチド金属結合性官能基である置換基、で置換されている請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記銅キレート剤が次式を有するペプチド２量体である請求項６０に記載の方法。
Ｐ３−Ｌ−Ｐ３
［式中、
各Ｐ３は同じであるか、または異なっていてよく、銅に結合することができるペプチドであり、
Ｌは２つのＰ３ペプチドにそれらのＣ末端アミノ酸を介して結合している化学基である］
【請求項６５】
少なくとも１つのＰ３がＰ１であり、Ｐ１が
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓまたは
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であって、
Ｘａａ１はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、イソグルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ２はグリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ３はグリシン、アラニン、バリン、リシン、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンである、
請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
Ｐ３の少なくとも１つのアミノ酸が、（ａ）銅イオンに結合するＰ３の能力を変化させることなく、ペプチドの親油性を増加させる置換基、（ｂ）銅イオンに結合するＰ３の能力を変化させることなく、タンパク質分解酵素からペプチドを保護する置換基、または（ｃ）銅イオンに結合するＰ３の能力を変化させない非ペプチド金属結合性官能基である置換基、で置換されている請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記銅キレート剤は非ペプチド金属結合性官能基を結合したペプチドであり、該ペプチドが銅結合性部位を含み、かつ／または該非ペプチド官能基が銅に結合する請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの活性化剤、もしくはこれらのうち１つまたは複数の組合せを投与する前に、前記銅キレート剤を除去する請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）で治療可能な疾患および状態を治療する方法の改善に関する。特に、本発明は、銅によるＡＰＣの不活性化を抑制するための銅キレート剤を用いる、ＡＰＣにより治療可能な疾患および状態を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えヒト活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、重症敗血症の治療用に最近承認された（Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）、イーライ・リリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）［インディアナ州インディアナポリス所在］）が、ＡＰＣは、凝固障害および重症炎症の治療に有用であると思われる。（非特許文献１〜５）。ＡＰＣは、生理学的条件下で微小血管血栓症を予防し、敗血症のような疾患における血液凝固性反応および炎症性反応を制御する助けとなると考えられている。（非特許文献６、７）。敗血症の際のＡＰＣの作用機序は、抗凝固活性および抗炎症活性の組合せであると思われるが、完全には理解されていない。（非特許文献６）。
【０００３】
ＡＰＣは、プロテインＳに結合してタンパク質分解作用により第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を不活性化することにより、また、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターの中和により線維素溶解を刺激することにより、抗凝固因子として機能するセリンプロテアーゼである。（非特許文献８〜１０）。プロテインＣ前駆体は、主として肝臓で産生される。活性化は、プロテインＣの重鎖のＮ末端におけるドデカペプチドの除去により達成される。プロテインＣ経路は、トロンビンが内皮細胞表面タンパク質であるトロンボモジュリンに結合し、プロテインＣが内皮細胞のプロテインＣ受容体に結合するときに開始される。ＡＰＣは、第Ｖａおよび第ＶＩＩＩａ因子を不活性化することにより、生成するトロンビンの量を制限する。（非特許文献９）。
【０００４】
ＡＰＣの抗凝固活性は、急性および慢性疾患のいずれにおいても変動し得る。いくつかの報告によれば、ＡＰＣ活性の阻害は、血症性ショック、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、多臓器不全症候群およびアテローム動脈硬化症のような疾患と病原として関連している可能性があることが示唆されている。（非特許文献１１〜１４）。血漿ＡＰＣ活性の低下とＡＰＣによる有用な治療とが、敗血症性ショック、電撃性紫斑病、深部静脈血栓性静脈炎、ＤＩＣおよび臓器不全症候群のような重篤な疾患と関連づけられている。（非特許文献６、１１、１５）。ヘパリン依存性血漿セリンプロテアーゼプロテインＣ阻害物質（セルピン）、アンチトロンビンＩＩＩ、α１アンチトリプシン、α２マクログロブリンなどの数種のＡＰＣ阻害物質が同定された。（非特許文献９）、（非特許文献１２）、（非特許文献１６）、（非特許文献１７）、（非特許文献１８）、（非特許文献１９）。
【０００５】
知られている限り、銅阻害性のＡＰＣ抗凝固活性に関する既往の報告は存在しない。銅は通常、セルロプラスミン、アルブミンおよびマクログロブリンのような血漿担体タンパク質の非特異的（互換的）結合部位および密着（非互換的）結合部位の両方に平衡状態をなして結合している。（非特許文献２０）。しかし、敗血症のような重篤な疾病においては、銅イオンを放出し得る、全身性または限局性の虚血およびアシドーシスがしばしば引き起こされる。（非特許文献２１）、（非特許文献２２）、（非特許文献２３）、（非特許文献２４）、（非特許文献２５）、（非特許文献２６）、（非特許文献２７）、（非特許文献２８）。敗血症の際の虚血およびアシドーシスにより放出された遊離の銅は、内因性または治療で投与されたＡＰＣに対して結合可能となると思われる。
【特許文献１】
米国特許第６，１５６，７３４号
【特許文献２】
米国特許第６，２６８，３４４号
【特許文献３】
国際出願国際公開第９９／２０２９３号
【特許文献４】
米国特許第５，１５１，２６８号
【特許文献５】
国際出願国際公開第０１／７２３２８号
【特許文献６】
国際出願国際公開第０１／５６５３２号
【特許文献７】
米国特許第６，３９５，２７０号
【特許文献８】
米国特許第６，１６２，６２９号
【特許文献９】
米国特許第６，１５９，４６８号
【特許文献１０】
米国特許第６，１５６，７３４号
【特許文献１１】
米国特許第５，８３１，０２５号
【特許文献１２】
米国特許第５，３３０，９０７号
【特許文献１３】
米国特許第４，９８１，９５２号
【特許文献１４】
国際出願国際公開第８９／１２６８５号
【特許文献１５】
国際出願国際公開第９８／４８８１８号
【特許文献１６】
国際出願国際公開第０１／５６５３２号
【特許文献１７】
国際出願国際公開第０１／５９０８４号
【特許文献１８】
欧州特許第７２６，０７６号
【特許文献１９】
米国特許第５，４５３，３７３号
【特許文献２０】
米国特許第５，５１６，６５０号
【特許文献２１】
国際出願国際公開第９３／０９８０７号
【特許文献２２】
米国特許第４，９５９，３１８号
【特許文献２３】
米国特許第５，０９３，１１７号
【特許文献２４】
米国特許第５，５７１，７８６号
【特許文献２５】
米国特許第４，９９０，４４７号
【特許文献２６】
米国特許第５，０３７，７４４号
【特許文献２７】
米国特許第５，２５０，６６２号
【特許文献２８】
米国特許第５，２６０，２０２号
【特許文献２９】
米国特許第５，３８０，７１２号
【特許文献３０】
米国特許第５，４４０，０１８号
【特許文献３１】
米国特許第５，５０３，９９３号
【特許文献３２】
米国特許第５，５２１，２８７号
【特許文献３３】
米国特許第５，７０７，８２８号
【特許文献３４】
米国特許第５，７２８，５５３号
【特許文献３５】
米国特許第５，７５６，３１３号
【特許文献３６】
米国特許第５，７５９，８０２号
【特許文献３７】
米国特許第５，８４９，８７４号
【特許文献３８】
米国特許第５，８７９，９０７号
【特許文献３９】
米国特許第６，０３４，２２１号
【特許文献４０】
米国特許第６，１５０，５０４号
【特許文献４１】
国際出願国際公開第８４／０３５１１号
【特許文献４２】
国際出願国際公開第８９／０２４６７号
【特許文献４３】
国際出願国際公開第９６／３７５１５号
【特許文献４４】
国際出願国際公開第９７／３１９４７号
【特許文献４５】
国際出願国際公開第９９／６５９４３号
【特許文献４６】
国際出願国際公開第０１／７２９５９号
【特許文献４７】
欧州特許第７３６４６号
【特許文献４８】
欧州特許第２０６７３３号
【特許文献４９】
欧州特許第３０８３８１号
【特許文献５０】
米国特許出願第１０／            号、２００２年６月２７日出願
【特許文献５１】
米国特許出願第１０／０７６，０７１号、２００２年２月１３日出願
【特許文献５２】
米国特許出願公開第０９／６７８，２０２号、２０００年９月２９日出願
【特許文献５３】
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２６９５２号、２０００年９月３０日出願（国際公開第０１／２５２６５号）
【特許文献５４】
国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／０４２７５号、２００２年２月１３日出願
【特許文献５５】
米国特許第４，０２２，８８８号
【特許文献５６】
米国特許第４，４６１，７２４号
【特許文献５７】
米国特許第４，６６５，０５４号
【特許文献５８】
米国特許第４，７６０，０５１号
【特許文献５９】
米国特許第４，７６７，７５３号
【特許文献６０】
米国特許第４，８１０，６９３号
【特許文献６１】
米国特許第４，８７７，７７０号
【特許文献６２】
米国特許第５，０２３，２３７号
【特許文献６３】
米国特許第５，０５９，５８８号
【特許文献６４】
米国特許第５，１０２，９９０号
【特許文献６５】
米国特許第５，１１８，６６５号
【特許文献６６】
米国特許第５，１２０，８３１号
【特許文献６７】
米国特許第５，１３５，９１３号
【特許文献６８】
米国特許第５，１４５，８３８号
【特許文献６９】
米国特許第５，１６４，３６７号
【特許文献７０】
米国特許第５，５９１，７１１号
【特許文献７１】
米国特許第５，１７７，０６１号
【特許文献７２】
米国特許第５，２１４，０３２号
【特許文献７３】
米国特許第５，２５２，５５９号
【特許文献７４】
米国特許第５，３４８，９４３号
【特許文献７５】
米国特許第５，４４３，８１６号
【特許文献７６】
米国特許第５，５３８，９４５号
【特許文献７７】
米国特許第５，５５０，１８３号
【特許文献７８】
米国特許第５，６９０，９０５号
【特許文献７９】
米国特許第５，７５９，５１５号
【特許文献８０】
米国特許第５，８６１，１３９号
【特許文献８１】
米国特許第５，８９１，４１８号
【特許文献８２】
米国特許第５，９２８，９５５号
【特許文献８３】
米国特許第６，０１７，８８８号
【特許文献８４】
国際出願国際公開第９４／２６２９５号
【特許文献８５】
国際出願国際公開第９９／５７２６２号
【特許文献８６】
国際出願国際公開第９９／６７２８４号
【特許文献８７】
国際出願国際公開第００／３６１３６号
【特許文献８８】
欧州特許出願第３２７２６３号
【特許文献８９】
国際出願国際公開第００／３６１３６号
【特許文献９０】
米国特許第３，９４１，７６３号
【特許文献９１】
米国特許第５，７８６，３３５号
【特許文献９２】
ポーランド共和国特許第３１５４７４号
【特許文献９３】
米国特許第５，１０１，０４１号
【特許文献９４】
米国特許第５，６５０，１３４号
【特許文献９５】
米国特許第５，６５０，１３４号
【特許文献９６】
米国特許第５，４２２，０９６号
【特許文献９７】
米国特許第５，５２７，５２２号
【特許文献９８】
米国特許第５，６２８，９８２号
【特許文献９９】
米国特許第５，８７４，５７３号
【特許文献１００】
米国特許第５，９０６，９９６号
【特許文献１０１】
国際出願国際公開第９７／４４３１３号
【特許文献１０２】
国際出願国際公開第９７／４９４０９号
【特許文献１０３】
国際出願国際公開第９９／３９７０６号
【特許文献１０４】
米国特許第５，８０７，５３５号
【特許文献１０５】
米国特許第５，６５０，１３４号
【特許文献１０６】
国際出願国際公開第９３／２３４２５号
【特許文献１０７】
米国特許第５，７３９，３９５号
【特許文献１０８】
米国特許第５，９９４，３３９号
【特許文献１０９】
米国特許第５，０８７，６９６号
【特許文献１１０】
米国特許第５，６３７，３１１号
【特許文献１１１】
米国特許第６，００４，９５３号
【特許文献１１２】
米国特許第５，６８３，９０７号
【特許文献１１３】
米国特許第５，３８０，７４７号
【特許文献１１４】
米国特許第５，９２２，７６１号
【特許文献１１５】
米国特許第４，９１２，１１８号
【特許文献１１６】
米国特許第５，１０４，８６５号
【特許文献１１７】
国際出願国際公開第９８／５４１３８号
【非特許文献１】
バーナードら（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，２０５１−２０５９（２００１）
【非特許文献２】
バーナードら（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４，６９９−７０９（２００１）
【非特許文献３】
ミズタニら（Ｍｉｚｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｌｏｏｄ  ９５，３７８１−３７８７（２０００）
【非特許文献４】
テーラーら（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９，９１８−９２５（１９８７）
【非特許文献５】
シバタら（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３，１７９９−１８０５（２００１）
【非特許文献６】
エスモン（Ｅｓｍｏｎ），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，Ｓ４８−５１（２００１）
【非特許文献７】
ハックら（Ｈａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，Ｓ２１−２７（２００１）
【非特許文献８】
ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），ＦＡＳＥＢ  Ｊ．６，２５６１−２５６７（１９９２）
【非特許文献９】
エスモン（Ｅｓｍｏｎ），Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１２，１３５−１４５（１９９２）
【非特許文献１０】
ファン  ヒンスベルフら（ｖａｎ  Ｈｉｎｓｂｅｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｌｏｏｄ  ６５，４４４−４５１（１９８５）
【非特許文献１１】
フーリエら（Ｆｏｕｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｈｅｓｔ  １０１，８１６−８２３（１９９２）
【非特許文献１２】
フーゲンドーンら（Ｈｏｏｇｅｎｄｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｌｏｏｄ  ７８，２２８３−２２９０（１９９１）
【非特許文献１３】
マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，Ｓ９９−１０６（２００１）
【非特許文献１４】
メッザノら（Ｍｅｚｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１３，９０５−９１０（２００１）
【非特許文献１５】
マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，Ｓ９９−１０６（２００１）
【非特許文献１６】
エスパナら（Ｅｓｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｌｏｏｄ  ７７，１７５４−１７６０（１９９１）
【非特許文献１７】
ハーマンスら（Ｈｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９５，２３９−２４５（１９９３）
【非特許文献１８】
エスパナら（Ｅｓｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５９，５９３−６０８（１９９０）
【非特許文献１９】
ワタナベら（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６５，３５−４０（２０００）
【非特許文献２０】
リンダーら（Ｌｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｐｐｅｒ（プレナムプレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク、１９９１））
【非特許文献２１】
ミゾックら（Ｍｉｚｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０，８０−９３（１９９２）
【非特許文献２２】
パストアスら（Ｐａｓｔｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９１，１６９７−１７１０（１９９６）
【非特許文献２３】
マチエドら（Ｍａｃｈｉｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１２３，４２４−４２７（１９８８）
【非特許文献２４】
ベレンシュタインら（Ｂｅｒｅｎｓｈｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２９，３０２５−３０３４（１９９７）
【非特許文献２５】
ラムら（Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３３８，１２２−１２６（１９９４）
【非特許文献２６】
スリニバスら（Ｓｒｉｎｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４８，４９５−５００（１９８８）
【非特許文献２７】
サスマンら（Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８６，７１１−７２３（１９９０）
【非特許文献２８】
ハリウエルら（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８６，１−８５（１９９０）
【非特許文献２９】
フェントンら（Ｆｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，４，８０９−８１７（１９７４）
【非特許文献３０】
ミリナルツら（Ｍｌｙｎａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ  ９８：  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，４／２１／９８，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｔｅ．ｕｓｚｅｇｅｄ．ｈｕ／ｓｐｅｃ９８／ａｂｓｔｒ／ｍｌｙｎａｒ．ｈｔｍｌ）
【非特許文献３１】
ラッピンら（Ｌａｐｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１７，１６３０−３４（１９７８）
【非特許文献３２】
ボスら（Ｂｏｓｓｕ  ｅｔ  ａｌ．），Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１７，１６３４−４０（１９７８）
【非特許文献３３】
チャクラバルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，４，５７−６３（１９９０）
【非特許文献３４】
アドマン（Ａｄｍａｎ），Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２，１４５−９７（１９９１）
【非特許文献３５】
コテレら（Ｃｏｔｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４６，７−１５（１９９２）
【非特許文献３６】
カンタースら（Ｃａｎｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．），ＦＥＢＳ，３２５，３９−４８（１９９３）
【非特許文献３７】
レーガン（Ｒｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２２，２５７−２８１（１９９３）
【非特許文献３８】
ウエダら（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５，１２３−３０（１９９４）
【非特許文献３９】
ウエダら（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１８，９２９−３３（１９９５）
【非特許文献４０】
レーガン（Ｒｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．），ＴＩＢＳ，２０，２８０−８５（１９９５）
【非特許文献４１】
ウエダら（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４３，３５９−６１（１９９５）
【非特許文献４２】
バルら（Ｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１０，９０６−９１４（１９９７）
【非特許文献４３】
バルら（Ｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１０，９１５−２１（１９９７）
【非特許文献４４】
コッホら（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４，５４９−６０（１９９７）
【非特許文献４５】
コワリク−ジャンコウスカ（Ｋｏｗａｌｉｋ−Ｊａｎｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６６，１９３−９６（１９９７）
【非特許文献４６】
ハーフォードおよびサーカー（Ｈａｒｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｓａｒｋａｒ），Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３０，１２３−１３０（１９９７）
【非特許文献４７】
プリンスら（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．），ＴＩＢＳ，２３，１９７−９８（１９９８）
【非特許文献４８】
アイケン（Ａｉｔｋｅｎ），Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２，２４１−５３（１９９９）
【非特許文献４９】
ウィッタルら（Ｗｈｉｔｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９，３３２−３４３（２０００）
【非特許文献５０】
シュレンバーガーら（Ｓｈｕｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５，１１０３８−１１０３９（１９９３）
【非特許文献５１】
ピッケリングら（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５，９４９８−９５０５（１９９３）
【非特許文献５２】
ウィンゲら（Ｗｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．），ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｃｏｐｐｅｒ，ｐａｇｅｓ  １１０−１２３  Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔｙｅｋｌａｒ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９３）
【非特許文献５３】
コッホら（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ．，４，５４９−５６０（１９９７）
【非特許文献５４】
コビンら（Ｃｏｂｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．），ｉｎ  Ｃｏｐｐｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｐａｇｅｓ  １５３−２６４（Ｌｅｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｒｃｅｒ）ｅｄｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９９）
【非特許文献５５】
ロウチ（Ｒｏｕｃｈｉ），Ｃｈｅｍ．＆  Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ，４９−５０（Ｊａｎｕａｒｙ  １５，２００１）
【非特許文献５６】
メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ），ｉｎ  Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ，ｅｄｓ．１９７３）
【非特許文献５７】
メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９（１９６３）
【非特許文献５８】
デビスら（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ’ｌ，１０，３９４−４１４（１９８５）
【非特許文献５９】
スチュアートおよびヤング（Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）
【非特許文献６０】
フィンら（Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．），ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１０５−２５３（１９７６）
【非特許文献６１】
エリクソンら（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．），ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．２，ｐｐ．２５７−５２７（１９７６）
【非特許文献６２】
マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＶＣｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８６）
【非特許文献６３】
サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）
【非特許文献６４】
ラオおよびＰ．ウィリアムス（Ｒａｏ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ．６９３，６３３（１９９５）
【非特許文献６５】
ピーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ），Ａｌｌ  Ａｂｏｕｔ  Ａｌｂｕｍｉｎｅ：  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６）
【非特許文献６６】
サドラーら（Ｓａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０，１９３−２００（１９９４）
【非特許文献６７】
バル  オルら（Ｂａｒ−Ｏｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，４２−４７（２００１）
【非特許文献６８】
バル  オルら（Ｂａｒ−Ｏｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８４，８５６−８６２（２００１）
【非特許文献６９】
バル  オルら（Ｂａｒ−Ｏｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２，３５６−３６０（２００１）
【非特許文献７０】
フランシスら（Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．８７，６１９−６２５（１９８７）
【非特許文献７１】
ウーら（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５，９２８−９３１（１９９９）
【非特許文献７２】
ベレンシュタインら（Ｂｅｒｅｎｓｈｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２９，３０２５−３０３４（１９９７）
【非特許文献７３】
ルオら（Ｒｕｏｔ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２７９，Ｅ２４４−２５１（２０００）
【非特許文献７４】
ダウィドソンら（Ｄａｗｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８，６０−６６（１９９０）
【非特許文献７５】
ラコウら（Ｒａｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１１，８３９−８５０（１９８３）
【非特許文献７６】
オットソンら（Ｏｔｔｏｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７，７７２−７７９（１９８９）
【非特許文献７７】
モックら（Ｍｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｈｏｃｋ  ４，４２５−４３２（１９９５）
【非特許文献７８】
ユングら（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３３，３８７−３９４（２０００）
【非特許文献７９】
アンガスら（Ａｎｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，１３０３−１３１０（２００１）
【非特許文献８０】
バーナードら（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４，６９９−７０９（２００１）
【非特許文献８１】
バーナードら（Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，２０５１−２０５９（２００１）
【非特許文献８２】
グルーバーら（Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｓｌ．），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２，５７８−５８５（１９９０）
【非特許文献８３】
オカジマら（Ｏｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６３，４８−５３（１９９０）
【非特許文献８４】
ヤンら（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，Ｓ６９−７４（２００１）
【非特許文献８５】
グリンネルら（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９，Ｓ５３−６０；  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  Ｓ６０−１（２００１）
【非特許文献８６】
シャンブリエら（Ｃｈａｍｂｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６，１０８２４−１０８２９（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）で治療可能な疾患および状態を治療する方法を改善することである。特に、本発明の目的は、銅によるＡＰＣの不活性化を抑制するための銅キレート剤を用いる、ＡＰＣにより治療可能な疾患および状態を治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）が銅により不活性化されるという予期せぬ発見に基づいている。したがって、本発明は、銅によるＡＰＣの不活性化を抑制するために銅キレート剤を用いる、ＡＰＣにより治療可能な疾患および状態を治療する改善された方法を提供する。
【０００８】
本発明の１つの方法は、ＡＰＣによる治療を必要とする動物に有効量の銅キレート剤を投与して、銅によるＡＰＣの不活性化を抑制することからなる。有効量の、
（ａ）ＡＰＣ、
（ｂ）プロテインＣ、動物においてプロテインＣの合成を増加させる物質、またはこれら両方、
（ｃ）プロテインＣの活性化剤、もしくは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうち１つまたは複数の組合せ
のうち１つも該動物に投与する。プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣの活性化剤を動物に投与して、プロテインＣ（内因的に産生されたプロテインＣおよび／または該動物に投与されたプロテインＣ）からのＡＰＣのｉｎ  ｖｉｖｏ産生を増加させる。
【０００９】
本発明の第２の方法は、有効量の銅キレート剤を以下の
（ａ）ＡＰＣ、
（ｂ）プロテインＣ、動物におけるプロテインＣの合成を増加させる物質、またはこれら両方、
（ｃ）プロテインＣの活性化剤、もしくは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の１つまたは複数の組合せ
のうちの１つを含む組成物と接触させて、該組成物中に存在する銅に結合させるようにする方法からなる。次いで、有効量のＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質、プロテインＣの活性化剤、もしくはそれらの１つまたは複数の組合せをＡＰＣによる治療を必要とする動物に投与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、以下の疾患および状態の治療に有効であると報告されている。
（ａ）敗血症、敗血症性ショック、電撃性紫斑病、髄膜炎菌性敗血症、骨髄もしくはその他の移植、重症熱傷、妊娠、大手術、重症外傷または成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）に伴う後天性の凝固性亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症（例えば、特許文献１および特許文献２ならびに特許文献３参照）。
【００１１】
（ｂ）深部静脈血栓症、肺塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓もしくは末梢動脈を起源とする塞栓、急性心筋梗塞、血栓性卒中および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）のような血管内凝固に関係する疾患または状態（例えば、特許文献４参照）。
【００１２】
（ｃ）転移性癌および浸潤癌（例えば、特許文献４参照）。
（ｄ）アルツハイマー病、パーキンソン病、自己免疫疾患、ウイルス感染、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、血管炎、虚血性腎不全、インスリン依存性糖尿病、膵炎、乾癬、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、全身性エリテマトーデス、自己免疫性胃炎、線維化肺疾患、ＨＩＶ誘発性リンパ腫、劇症Ｂ型ウイルス肝炎、劇症Ｃ型ウイルス肝炎、慢性肝炎、慢性肝硬変、ヘリコバクター・ピロリ関連潰瘍、アテローム動脈硬化症、癌治療時の細胞保護、慢性糸球体腎炎、骨粗しょう症、再生不良性貧血および骨髄異形成などのようなアポトーシスに関連する疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
【００１３】
（ｅ）ニューロン変性疾患、移植片対宿主反応、急性炎症の状態、全身性炎症性反応、急性期反応、虚血性再灌流傷害、アテローム動脈硬化症、ＨＩＶ感染および癌のような核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）により誘発される疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
【００１４】
（ｆ）クローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、急性腹膜炎、心不全等の、ＴＮＦ−αが病理状態の主たるモジュレーターとなる疾患または状態。
（ｇ）臓器移植、感染性疾患および自己免疫疾患などの、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス１またはＨＬＡ−Ｂ無発現（ｎｕｌｌ）対立遺伝子が免疫機能のモジュレーターである疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
【００１５】
（ｈ）増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）またはＧｕタンパク質が細胞増殖および生存のレギュレータである、内皮細胞の細胞増殖および血管新生のような疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
【００１６】
（ｉ）冠動脈アテローム硬化症、バルーン血管形成術後の動脈の再狭窄、高血圧症、心不全、移植後の冠動脈疾患ならびに妊娠誘発の高血圧症および子癇前症のような、内皮細胞活性化および血小板接着に起因した疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
【００１７】
（ｊ）細胞−細胞接着が病態生理のモジュレーターである疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
（ｋ）虚血、虚血再灌流、アルツハイマー病、ハンチントン病または舞踏病、低酸素症、てんかんに起因する細胞死、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、精神遅滞、加齢に起因する神経変性性変化、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性腸炎）、ショック、糸球体腎炎、冠動脈閉塞、不整脈、うっ血性心不全、心筋症、気管支炎、急性アレルギー反応および過敏症、外傷、移植片／移植拒絶反応、心筋炎、インスリン依存性糖尿病、関節炎、皮膚の慢性炎症性状態およびＡＲＤＳのような、炎症および神経病理学的障害を伴う疾患または状態（例えば、特許文献５および特許文献６参照）。
【００１８】
（ｌ）抗カルレティキュリン抗体が病態生理のモジュレーターである、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、糸状虫症、慢性関節リウマチ、混合性結合組織病および先天性完全心ブロックのような疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
【００１９】
（ｍ）乳癌、胃腸悪性腫瘍、女性に特有な癌、肺癌、腎繊維症および心筋梗塞後の心臓肥大のような、トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）およびＴＧＦ−βのレベルの上昇に関連する疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
【００２０】
（ｎ）細菌感染、真菌感染、原虫感染およびウイルス感染、疼痛、癌、食欲不振、多食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大ならびに精神障害および神経障害（例えば、不安、精神分裂病、躁うつ病、せん妄、痴呆、重度精神遅滞、およびハンチントン病、ジルドラトゥーレット症候群等の運動障害）のような、ＲＤＣ１のレベルの上昇に関連する疾患または状態（例えば、特許文献５参照）。
【００２１】
ＡＰＣを調製する方法、ＡＰＣを含む適切な薬剤組成物、ならびに上記の疾患および状態に対するＡＰＣの有効用量および投与計画は、周知である。例えば、これらすべての完全な開示を本願明細書に援用する、特許文献７、特許文献２、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献４、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献３、特許文献１６、特許文献１７、特許文献５および特許文献１８を参照のこと。
【００２２】
特に、ＡＰＣは、当技術分野でよく知られている方法により、血漿から精製したプロテインＣまたは組換えＤＮＡ技術により調製したプロテインＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化により調製することができる。例えば、特許文献１３、特許文献４、特許文献１１、特許文献１０、特許文献２および特許文献７を参照のこと。あるいは、ＡＰＣは組換えＤＮＡ技術により直接調製することができる。例えば、特許文献１３、特許文献４、特許文献１０、特許文献２および特許文献７を参照のこと。ＡＰＣは、任意の種の動物由来であってよいが、ヒトＡＰＣが好ましい。ＡＰＣの断片および誘導体も、本明細書に記載する活性を示すならば、本発明の実施に用いることが可能である。例えば、特許文献４、特許文献１９、特許文献２０、特許文献１４、特許文献１６、特許文献１７および特許文献５を参照のこと。
【００２３】
ＡＰＣの適切な薬剤組成物は、ＡＰＣと製薬上許容できる担体とからなる。例えば、特許文献７、特許文献９、特許文献１５、特許文献１６および特許文献５を参照のこと。好ましい組成物は、充てん剤（ショ糖、マンニトール、トレハロースおよびラフィノースなど）、塩（塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなど）、緩衝液（クエン酸ナトリウム、トリス酢酸およびリン酸ナトリウムなど）およびＡＰＣからなる高純度の安定な凍結乾燥製品である。好ましい安定な凍結乾燥組成物は、重量比で約１部のＡＰＣ、約７〜８部の塩および約５〜７部の充てん剤からなる。そのような安定な凍結乾燥組成物の例は、バイアル当たり５．０ｍｇＡＰＣ、３０ｍｇショ糖、３８ｍｇＮａＣｌおよび７．５６ｍｇクエン酸、ｐＨ６．０である。
【００２４】
ＡＰＣは、好ましくは非経口的（好ましくは、静脈内）に、最も好ましくは静脈内持続注入により投与する。例えば、特許文献２および特許文献５を参照のこと。好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／時〜約５０μｇ／ｋｇ／時のＡＰＣ、より好ましくは約１μｇ／ｋｇ／時〜約４０μｇ／ｋｇ／時、さらに好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／時〜約３０μｇ／ｋｇ／時、最も好ましくは約２４μｇ／ｋｇ／時をヒト患者に約１時間〜約２４０時間かけて、より好ましくは約１時間〜約１４４時間かけて、最も好ましくは約２４時間〜９６時間かけて持続注入することにより投与する。ＡＰＣは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量を１〜１０日間、より好ましくは３日間にわたりＢ．Ｉ．Ｄ．（１日２回）注射して投与することもできる。他の別法として、ＡＰＣを１時間当たりの適切な用量の１部（１／３〜１／２）をボーラス注射として約５分間〜約１２０分間かけて注射した後、適切な用量を最長２４０時間にわたり持続注入することにより投与する。投与した量のＡＰＣから得られる好ましい血漿中濃度は、約０．０２ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約３５ｎｇ／ｍｌ〜約６５ｎｇ／ｍｌであろう。
【００２５】
他の別法において、ＡＰＣは、高リスク血管形成術（ステント留置術を伴う場合と伴わない場合があり、抗血小板薬を用いる、もしくは用いない併用抗血栓療法を伴う場合と伴わない場合がある）の補助剤として冠動脈内カテーテルを介しての局所送達により投与することが可能である。投与するＡＰＣの量は、持続注入、ボーラス注射またはそれらの組合せにより約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０．０ｍｇ／ｋｇ／日であろう。他の別法において、ＡＰＣを関節に直接注射することが可能である。さらに他の別法において、ＡＰＣは、血流へのより緩やかな放出を確実にするために０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０．０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で皮下投与することが可能である。皮下製剤の調合は、そのような薬剤組成物を調製する既知の方法を用いて行う。
【００２６】
ＡＰＣの特に好ましい製剤は、イーライ・リリー社（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）［インディアナ州インディアナポリス所在］によりＸｉｇｒｉｓという登録商標のもとに販売されている製品である。Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）は、静脈内注入用の無菌の凍結乾燥粉末として供給されている。Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）の５ｍｇバイアルは、５．３ｍｇ／バイアルのヒト型組換えＡＰＣ、３１．８ｍｇ／バイアルのショ糖、４０．３ｍｇ／バイアルのＮａＣｌおよび１０．９ｍｇ／バイアルのクエン酸ナトリウムを含み、Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）の２０ｍｇバイアルは、２０．８ｍｇ／バイアルのヒト型組換えＡＰＣ、１２４．９ｍｇ／バイアルのショ糖、１５８．１ｍｇ／バイアルのＮａＣｌおよび４２．９ｍｇ／バイアルのクエン酸ナトリウムを含む。バイアルをＵＳＰの注射用滅菌水で再構成して、約２ｍｇ／ｍｌのＡＰＣ濃度とし、この希釈したＡＰＣを０．９％塩化ナトリウム注射液に加えて、患者への投与用の濃度約１００〜約１０００μｇ／ｍｌのＡＰＣとする。重症敗血症においては、Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）を約１２μｇ／ｋｇ／時〜約３０μｇ／ｋｇ／時の速度で持続注入して、注入開始約２時間後に約４５ｎｇ／ｍｌＡＰＣの定常状態の血漿中濃度を得る。
【００２７】
上記の疾患および状態は、ＡＰＣの内因性産生を増加させることによっても治療することが可能である。例えば、特許文献２１を参照のこと。これは、種々の方法で達成することが可能である。例えば、これは、ＡＰＣを生産する内因性プロテインＣ経路により生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で活性化されるであろう有効な量のプロテインＣを投与することにより達成することが可能である。例えば、特許文献４および特許文献２１を参照のこと。上記のように、プロテインＣは、血漿から精製することが可能であり、あるいは、組換えＤＮＡ技術により作製することが可能である。例えば、特許文献２２、特許文献１３、特許文献２３、特許文献４、特許文献２４、特許文献１０、特許文献２および特許文献７を参照のこと。プロテインＣを含む適切な薬剤組成物は周知である（例えば、特許文献４および特許文献２４を参照）。プロテインＣを、ヒト患者に対して、好ましくは非経口的に、より好ましくは静脈内に、約１μｇ／日〜約５００ｍｇ／日または約１ＩＵ／ｋｇ／日〜約６０００ＩＵ／ｋｇ／日の用量で投与する。例えば、特許文献４および特許文献２４を参照のこと。１ＩＵは、正常血漿１ｍｌ中のＡＰＣアミド分解活性の当該量である。
【００２８】
ＡＰＣの内因性産生は、動物におけるプロテインＣの合成を増加させる量の薬剤を投与することによっても増加させることが可能である。例えば、特許文献２１を参照のこと。適切な薬剤は、タンパク質同化性ステロイド（例えば、ダナゾロール）などである。例えば、特許文献２１を参照のこと。
【００２９】
さらに、ＡＰＣの内因性産生は、内因的に合成されたプロテインＣからの、かつ／または、併用投与したプロテインＣからのｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＰＣの産生を引き起こすのに有効な量のプロテインＣ活性化剤を投与することによっても増加させることができる。例えば、特許文献２１を参照のこと。プロテインＣ活性化剤は、ＡＰＣの生成を引き起こす、または増加させる任意の化合物である。適切なプロテインＣ活性化剤としては、トロンビン、α−トロンビン、活性部位アシル化トロンビン、トロンビン類似体および突然変異体（例えば、トロンビンＥ１９２ＱおよびトロンビンＫ５２Ｅ）、可溶性トロンビン−トロンボモジュリン複合体、トロンビン−トロンボモジュリン複合体のクリアランスまたは崩壊を防ぐと思われる薬剤、トロンボモジュリンの合成を増大させるかクリアランスを遅延させる薬剤、毒（Ｐｒｏｔａｃ（商標）またはラッセルマムシ毒）、第Ｘａ因子、プラスミン、トリプシン、ならびにプロテインＣからのＡＰＣの生成を引き起こす、または増加させることができる他のあらゆる毒、酵素または化合物が挙げられる。例えば、特許文献２１を参照のこと。好ましいプロテインＣ活性化剤は、トロンビンおよび活性部位アシル化トロンビンである。プロテインＣ活性化剤を、好ましくは非経口的に、より好ましくは静脈内投与する。例えば、特許文献２１を参照のこと。ＡＰＣの血中濃度を正常レベルの３〜５倍増加させ、かつ／または、ＡＰＣの血中濃度が約１０ｎｇ／ｍｌ〜約７６０ｎｇ／ｍｌとなる量のプロテインＣ活性化剤を投与することが好ましい。特許文献２１を参照のこと。トロンビンについては、約０．０５Ｕ／ｋｇ／分〜約２Ｕ／ｋｇ／分の用量がこれらのＡＰＣレベルを達成するのに有効である。特許文献２１を参照のこと。活性部位アシル化トロンビンについては、活性部位がｉｎ  ｖｉｖｏで脱アシル化されるとき、約０．０５Ｕ／ｋｇ／分〜約２Ｕ／ｋｇ／分のトロンビン活性を（本質的に「放出制御」的に）もたらす用量を用いる。特許文献２１を参照のこと。１単位（Ｕ）のトロンビンとは、当技術分野で一般的に知られており、同じアッセイを用いた場合の１  ＮＩＨ単位の対照標準酵素と同等のフィブリノーゲン血液凝固活性を意味する。特許文献２１および本願明細書に引用する参考文献である非特許文献２９を参照のこと。
【００３０】
前述のことにもかかわらず、ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる薬剤および／またはプロテインＣ活性化剤の投与量は、用いる特定の化合物または化合物の組合せ、治療する疾患または状態、疾患または状態の重症度、投与経路、化合物の排泄速度、治療期間、該動物に投与する他の薬剤の同一性、該動物の年齢、大きさおよび種、ならびに医療および獣医学の技術分野で知られているような因子によって異なることは、当業者には当然のことである。一般的に、化合物または化合物の組合せの適切な１日投与量は、治療効果をもたらすのに有効な最低投与量である。投与量、投与形態および投与法は、担当の医師または獣医師が適切な医療上の判断の範囲内で決定するものとする。種々の化合物または化合物の組合せの有効な投与量、投与形態および投与法は、実験的に決定することが可能であり、そのような決定を行うことは、当技術分野の技術の範囲内にある。
【００３１】
本発明は、ＡＰＣにより治療可能な疾患または状態を治療する改善された方法を提供する。本発明は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）が銅により不活性化されるという予期せぬ発見に基づいており、本発明の改善された方法は、銅によるＡＰＣの不活性化を抑制するために銅キレート剤を用いている。本明細書で用いているように、「抑制する」およびその変形は、銅によるＡＰＣの不活性化を低減または予防すること、かつ／または銅により不活性化されたＡＰＣの活性を完全または部分的に再活性化または回復させることを意味する。本明細書で用いているように、「不活性化する」およびその変形は、ＡＰＣの活性を低下または完全に失わせることを意味する。
【００３２】
あらゆる銅キレート剤を本発明の実施に用いることができる。本明細書で用いているように、「銅キレート剤」は、Ｃｕ（ＩＩ）イオンに結合するあらゆる化合物を意味する。
本発明の実施に用いられる好ましい銅キレート剤は、親和性の高いＮ末端銅結合性部位を有する特定のアルブミン類および該Ｎ末端銅結合性部位を含むこれらのアルブミン類の断片などである。これらのアルブミン類は、ヒト、ラットおよびウシの血清アルブミンなどである。特に好ましいものは、高親和性のＮ末端銅結合性配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓを含むヒト血清アルブミンまたはその断片である。血漿／血清から、および組換えＤＮＡ技術により、アルブミンまたはアルブミンの断片を調製する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０、特許文献３１、特許文献３２、特許文献３３、特許文献３４、特許文献３５、特許文献３６、特許文献３７、特許文献３８、特許文献３９、特許文献４０、特許文献４１、特許文献４２、特許文献４３、特許文献４４、特許文献４５、特許文献４６、特許文献４７、特許文献４８および特許文献４９を参照のこと。
【００３３】
本発明の実施に用いられる他の好ましい銅キレート剤は、次式
Ｐ１−Ｐ２
［式中、
Ｐ１は、
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓまたは
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であり、
Ｐ２は（Ｘａａ４）ｎであり、
Ｘａａ１はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、イソグルタミン酸、グルタミン、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、ヒドロキシリシン（ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ）、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ２はグリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、ヒドロキシリシン（ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ）、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ３はグリシン、アラニン、バリン、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンであり、
Ｘａａ４は任意のアミノ酸であり、
ｎは０〜１００である］を有するペプチドまたは生理学的に許容できるその塩である。
【００３４】
Ｐ１は、元素の周期表の１ｂ〜７ｂまたは８族の遷移金属イオン（Ｖ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｂａ、Ｚｎ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｆｅ、ＮｉおよびＣｕを含む）ならびに他の金属イオン（Ａｓ、ＳｂおよびＰｂを含む）に結合する金属結合性ペプチド配列である。特に、Ｐ１は、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）およびＭｎ（ＩＩ）に高い親和力で結合するので、銅によるＡＰＣの不活性化を抑制するための特に有効な銅キレート剤である。さらに、Ｐ１による金属イオンの結合が、これらの金属イオンにより引き起こされる活性酸素種（ＲＯＳ）の産生および／またはＲＯＳの蓄積を抑制（すなわち、低減または予防）し、かつ／または該結合金属イオンにより依然として産生される可能性のあるＲＯＳによりなされるペプチド自体に対する損傷を標的にすることは、周知である。その結果、Ｐ１への金属イオンの結合が存在しない場合にＲＯＳにより引き起こされ得る損傷が低減する。したがって、これらのペプチドは、ＲＯＳの産生および／または蓄積にも関係するＡＰＣで治療可能な疾患および状態の治療においてさらなる利点を提供する。そのような疾患および状態としては、血管形成術、ＡＲＤＳ、血管形成性疾患、アテローム動脈硬化症、関節炎、喘息、自己免疫疾患、癌、大腸炎、クローン病、糖尿病、気腫、頭部損傷および外傷性脳損傷、感染性疾患、炎症および炎症性疾患、転移、虚血、腫瘍性疾患、神経疾患、神経外傷、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、多発性硬化症および老年痴呆）、膵炎、末梢性血管疾患、肺塞栓症、腎疾患、再灌流、敗血症、ショック、手術、移植、外傷、血管炎およびその他多くのものがある（例えば、特許文献５０、特許文献５１、特許文献５２、特許文献５３および特許文献５４参照、これらの完全な開示を本明細書に援用する）。
【００３５】
Ｐ１において、Ｘａａ１はＡｓＰであることが最も好ましく、Ｘａａ２はＡｌａであることが最も好ましく、Ｘａａ３はＬｙｓであることが最も好ましい（上を参照）。したがって、Ｐ１の好ましい配列は、Ａｓｐ  Ａｌａ  ＨｉｓおよびＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ（配列番号１）である。最も好ましくは、Ｐ１の配列はＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ（配列番号１）である。Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓは、Ｃｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）を高い親和性で結合するのに必要なヒト血清アルブミンのＮ末端金属結合性部位の最小配列であり、Ｌｙｓは、この部位へのこれらの金属イオンの結合に寄与していると報告されている。同様に、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ（配列番号１）は、Ｆｅ（ＩＩ）に結合し、血液脳関門のモデルを通過することが質量分析により見出されている。Ｐ１の他の好ましい配列としては、Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ（ヒトα−フェトプロテインのＮ末端配列）、Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ（ヒト精子プロタミンＨＰ２のＮ末端配列）およびＨＭＳ  ＨＭＳ  Ｈｉｓ（銅との極めて安定な錯体を形成すると報告された合成ペプチド；非特許文献３０を参照）などがある。
【００３６】
Ｐ２は（Ｘａａ４）ｎであり、式中Ｘａａ４は任意のアミノ酸で、ｎは０〜１００である。ｎが大きい場合（ｎ＞約２０）、該ペプチドは細胞外で有効であろう。小さいペプチドほど細胞に入る能力が高く、したがって、小さいペプチドほど細胞内および細胞外のいずれにおいても有効であり得る。小さいペプチドほど、タンパク質分解も受けにくい。したがって、Ｐ２においては、ｎは好ましくは０〜１０であり、より好ましくはｎは０〜５であり、最も好ましくはｎが０である。Ｐ２はなんらかの配列を有していてよく、Ｐ２は、（１）遷移金属に結合する、（２）細胞膜を透過し、かつ／または標的組織に到達するペプチドの能力（例えば、血液脳関門を通過する能力）を増大させる、または（３）別の方法でペプチドの能力を安定化または増大させる、配列からなることが好ましい。Ｐ２はＰ１とともに、ヒト、ラットまたはウシの血清アルブミンのような、銅およびニッケルに対して高い親和力を有するＮ末端金属結合性部位を有するタンパク質のＮ末端配列であってもよい。ｎ＝１００である場合、該ペプチドは、上記アルブミンのおおよそドメイン１の配列を有するであろう。
【００３７】
遷移金属イオンの結合性部位を含む多くのペプチドの配列が知られている。例えば、特許文献５５〜８６および特許文献８８、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献４０、非特許文献４１、非特許文献４２、非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６、非特許文献４７、非特許文献３０および非特許文献４８、非特許文献４９を参照のこと。Ｐ２は、１つまたは複数の、これらのペプチドの金属結合性部位の配列を含んでいてよい。
【００３８】
Ｐ１−Ｐ２が銅によるＡＰＣの不活性化を抑制し、かつ／またはＲＯＳの形成および／または蓄積を抑制する能力がより十分発揮されるように、Ｐ２は銅結合性部位および／または鉄結合性部位の配列を含むことが好ましい。銅結合性部位を含む多くのペプチドの配列は周知である。例えば、特許文献５５〜８８、非特許文献３１〜３４、非特許文献３６〜４７、非特許文献３０および非特許文献４８、非特許文献４９を参照のこと。鉄結合性部位を含むペプチドの配列は周知である。例えば、特許文献５５、特許文献５６、特許文献６４、特許文献６６、特許文献７３、特許文献７５、特許文献７７、特許文献７８、特許文献７９、特許文献８１、特許文献８２、特許文献８５、特許文献８６、特許文献８７および特許文献８８、非特許文献３１、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献４７および非特許文献４８、非特許文献４９を参照のこと
Ｐ２が金属結合性部位を含む場合、Ｐ１とＰ２の各金属結合性部位が協同して金属イオンを結合することが可能であるように（１：１の錯体よりも強固な結合をもたらす２：１のペプチド−金属錯体と同様）、Ｐ２が、Ｐ２の金属結合性部位とＰ１との間に短いスペーサー配列を含む配列を有することが好ましい。スペーサー配列は、１〜５個、好ましくは１〜３個の中性アミノ酸で構成されることが好ましい。したがって、スペーサー配列はＧｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ等であってよい。
【００３９】
Ｐ２が金属結合性部位を含む場合、Ｐ１とＰ２の各金属結合性部位が協同して金属イオンを結合することが可能であるように（１：１の錯体よりも強固な結合をもたらす２：１のペプチド−金属錯体と同様）、Ｐ２が、Ｐ２の金属結合性部位とＰ１との間に短いスペーサー配列を含む配列を有することが好ましい。スペーサー配列は、１〜５個、好ましくは１〜３個の中性アミノ酸で構成されることが好ましい。したがって、スペーサー配列はＧｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ等であってよい。
【００４０】
特に、Ｐ２が金属結合性部位を含む場合、Ｐ２は次の配列のうちの１つを含むことが好ましい。すなわち、（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３または（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓである。Ｘａａ２、Ｘａａ３およびＸａａ４は上で定義されており、ｍは０〜５、好ましくは１〜３である。Ｐ２がこれらの配列の１つを含むとき、銅に結合し得る。Ｘａａ４アミノ酸は、存在する場合、Ｐ１およびＰ２の各金属結合性部位が協同して銅および他の金属に結合することができるように、Ｐ２の金属結合性部位とＰ１との間に短いスペーサー配列を形成しており、かつＸａａ４は中性アミノ酸であることが好ましい（前段落参照）。Ｘａａ５は、δ−アミノ基を含むアミノ酸（好ましくはＯｒｎまたはＬｙｓ、より好ましくはＯｒｎ）であり、Ｘａａ４アミノ酸（存在する場合）またはＰ１をδ−アミノ基によって結合させている。非特許文献４６および非特許文献５０を参照のこと（この結合の手段の結果として、Ｘａａ５のα−アミノ基がＡＴＣＵＮモチーフによる銅およびニッケルとの結合に依然として関与することが可能である）。したがって、例えば、Ｐ１−Ｐ２は、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ
（δ）−Ｏｒｎ  Ａｌａ  Ｈｉｓ［配列番号２］であってよい。
【００４１】
さらに、Ｐ２は、以下の配列のうちの１つを含んでいてよい。すなわち［（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３］ｒ、［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ］ｒ、［（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ］ｒおよび［（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３］ｒであり、該配列中、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５およびｍは上で定義され記載されており、ｒは２〜１００である。このようにして、銅に結合することが可能な金属結合性ポリマーを形成することができる。
【００４２】
他の好ましい実施形態において、Ｐ２はＣｕ（Ｉ）に結合し得るペプチド配列を含む。Ｃｕ（ＩＩ）はアスコルビン酸または他の還元剤の存在下でＣｕ（Ｉ）に変換され、Ｃｕ（Ｉ）は酸素と反応してＲＯＳを生成する。Ｐ１は、Ｃｕ（ＩＩ）に強固に結合することが可能であり（上を参照）、銅をキレートし、ＲＯＳの生成を抑制することに関してそれ自体非常に有効である。しかし、Ｃｕ（Ｉ）に結合し得るＰ２を用いることも望ましいと思われる。
【００４３】
Ｃｕ（Ｉ）に結合し得るペプチド配列は、当技術分野で知られている。例えば、非特許文献５１、非特許文献５２、非特許文献５３、非特許文献５４を参照のこと。これらの配列としては、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｍｅｔ、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｍｅｔ、
Ｃｙｓ  Ｃｙｓ、
Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号３］
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号４］および
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ［配列番号５］があり、
該配列中、Ｘａａ４は上で定義されている。グルタチオン（γ−Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ）もＣｕ（Ｉ）に結合することが知られている。他のＣｕ（Ｉ）結合性ペプチド配列は、例えば、特許文献８７に記載されているような金属ペプチド・コンビナトリアル・ライブラリーを用いて同定することが可能である。Ｃｕ（Ｉ）結合性ペプチドは、配列Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ（例えば、Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号３］、より好ましくはＧｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号４］、最も好ましくはＧｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ［配列番号５］）を含むことが好ましい。
【００４４】
細胞膜を透過し、かつ／または標的組織に到達するＰ１−Ｐ２ペプチドの能力を増大させるために、Ｐ２は疎水性であるか、またはアルギニンオリゴマーであることが好ましい（非特許文献５５参照）。Ｐ２が疎水性である場合、１〜３個の疎水性アミノ酸（例えば、ＧｌｙＧｌｙ）、好ましくは、Ｄ−アミノ酸を含むことが好ましい。血液脳関門を通過しなければならないＰ１−Ｐ２の使用においては、疎水性Ｐ２が特に望ましいかもしれない。アルギニンオリゴマーは、好ましくは６〜９個のＡｒｇ残基、最も好ましくは６〜９個のＤ−Ａｒｇ残基を含む（非特許文献５５参照）。Ｐ１−Ｐ２を局所または経皮投与すべきである場合、アルギニンオリゴマーのＰ２の使用が特に望ましいと言える。
【００４５】
該ペプチドのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはそれらの組合せであってよい。β−Ａｌａ（存在する場合）を除き、Ｐ１のアミノ酸の少なくも１つはＤ−アミノ酸（好ましくは、Ｘａａ１および／またはＨｉｓ）であることが好ましい。β−Ａｌａ（存在する場合）以外のＰ１のアミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸であることが最も好ましい。同様に、Ｐ２のアミノ酸の約５０％がＤ−アミノ酸であることが好ましく、最も好ましくはＰ２のアミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸である。Ｄ−アミノ酸が好ましい理由は、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドが、動物（ヒトを含む）への投与時に遭遇するようなタンパク質分解酵素に対して抵抗性であるためである。また、Ｄ−アミノ酸を使用しても、銅に高い親和力で結合するペプチドの能力をはじめ、金属イオンに結合するペプチドの能力は変化しないであろう。
【００４６】
本発明のペプチドは、当技術分野でよく知られている方法により調製することができる。例えば、ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＬ−およびＤ−アミノ酸の組合せを含むかどうかを問わず、標準的固相ペプチド合成法により合成することができる。適切な技術は、当技術分野でよく知られており、非特許文献５６、非特許文献５７、非特許文献５８、非特許文献５９、特許文献９０および特許文献９１、非特許文献６０および非特許文献６１に記載されているものなどがある。また、特許文献９２（ＨＭＳを含むペプチドの合成）および非特許文献５０（δ−Ｏｒｎを含むペプチドの合成）を参照のこと。あるいは、ペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみを含む場合には、組換えＤＮＡ技術により合成することができる。組換えＤＮＡ法ならびにそれに用いられる適切な宿主細胞、ベクターおよび他の試薬は、当技術分野でよく知られている。例えば、非特許文献６２、非特許文献６３を参照のこと。
【００４７】
本発明はさらに、タンパク質分解酵素に対してより抵抗性が大きく、より脂溶性が高く（ペプチドが細胞膜をより容易に透過し、かつ／または脳のような標的器官に到達することを可能にする）、または両方の特性を有する、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＬ−およびＤ−アミノ酸の組合せのいずれかからなるペプチドＰ１−Ｐ２の誘導体を含む。図１Ａに示すように、Ｐ１を、Ｐ１の金属結合機能を変化させることなく、矢印で示した領域において修飾することが可能である。特に、Ｐ１を炭素１または２においてＲ１で置換することが可能であり、Ｐ１の末端−ＣＯＯＨを保護基Ｒ２で置換することが可能である（図１Ｂ〜Ｄ）。Ｐ２のタンパク質分解酵素に対する抵抗性をより大きくし、脂溶性をより高くし、あるいは両方の特性をもたせるために、Ｐ１について述べたのと同様な方法でＰ２を修飾することが可能である。
【００４８】
Ｒ１は、１〜１６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキルであってよく、「アルキル」という用語はＲおよびＳ異性体を含む。Ｒ１はまた、１または２個の環を含むアリールまたはヘテロアリールであってよい。「アリール」という用語は、少なくとも１つの芳香環（例えば、フェニル、ナフチルおよびジフェニル）を含む化合物を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１つの環が１つまたは複数のＳ、ＮまたはＯ原子を含むアリールを意味する。これらの置換は、金属イオンに結合するＰ１の能力を実質的に低下させない。特に、高親和力で銅に結合するＰ１の能力は、これらの置換により低下しない。例えば、炭素２に結合しているｎ−ブチル（図１Ｃ、Ｒ１はｎ−ブチル）のようないくつかの置換基は、該アルキル基の誘起効果のため、銅のような金属イオンに対するペプチドの親和力を増加させるはずである。炭素２（図１Ｃ）のアリール、ヘテロアリールまたは長鎖アルキル（炭素原子が約６〜１６個）による置換は、脂質膜を通過するペプチドの輸送を増加させるはずである。
【００４９】
上記のように、固相合成によりペプチドを合成する方法もよく知られている。これらの方法は、図１Ｂ〜Ｃに示す誘導体を調製するために修正することができる。例えば、Ｒ１がオクチルである、図１Ｃに示すＰ１の誘導体は、図２Ａに示すように調製することが可能である。図２Ａにおいて、楕円形エレメントはポリマー樹脂を表し、Ｒｐは標準的なカルボキシル保護基である。図２Ａに示すように、オクタン酸（新たに蒸留した）を乾燥臭素で、続いて三塩化リンで処理する。混合物を約１００℃に加熱し、その温度に４時間維持する。蒸留により、α−ブロモオクタン酸が無色液体として得られる。ブロモ酸のアミノ化は、この酸とアンモニア溶液を４０〜５０℃で３０時間放置することにより達成される。アミノ酸のオクチル誘導体は、臭化アンモニウムをメタノール洗浄により除去することにより得られる。古典的光学分割法により、所望の光学的に純粋なＤ形が得られる。Ｒ１がアルキル、アリールまたはヘテロアリールである他の誘導体は、図２Ａに示す方法で調製することが可能である。
【００５０】
さらに、Ｒ１がフェニルである、図１Ｂに示すＰ１の誘導体は、図２Ｂに示すように調製することが可能である。図２Ｂにおいて、ポリマーは樹脂であり、ｔ−Ｂｕはｔ−ブチルであり、Ｂｚはベンジルである。Ｒ１がアルキル、アリールまたはヘテロアリールである他の誘導体は、図２Ｂに示す方法で調製することが可能である。
【００５１】
Ｒ２は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＲ１またはＲ１であってよく（図１Ｄを参照）、Ｒ１は上で定義されている。これらの誘導体は、当技術分野でよく知られている方法によりペプチドを樹脂から除去する前に、固相ペプチド合成の最後の段階として調製することが可能である。Ｒ２による置換は、金属イオンに結合するＰ１の能力を実質的に低下させない。
【００５２】
さらに、Ｐ１およびＰ２を、金属イオンに結合する非ペプチド官能基で置換することが可能である。これらの金属結合性官能基は、ペプチドの１つまたは複数のペンダント基に結合させることが可能であり、得られるペプチド誘導体は、Ｐ１により与えられる結合性部位、および場合によりＰ２により与えられる結合性部位に加えて、金属イオンに結合することができる１つまたは複数の部位を有するであろう。その結果、当該ペプチド誘導体の金属イオンに結合する能力は、対応する未修飾ペプチドと比べて改善される。例えば、ペプチド誘導体は１つではなく２つの同じ種類の金属イオン（例えば、２つのＣｕ（ＩＩ））に結合することが可能であるし、ペプチド誘導体は１種ではなく２種の金属イオン（例えば、１種はＣｕ（ＩＩ）で、１種はＦｅ（ＩＩＩ））に結合することが可能であるし、またはペプチド誘導体は対応する未修飾ペプチドよりも良い状態で（例えば、より大きい親和力で）１つの金属イオンに結合することが可能である。
【００５３】
金属結合性官能基としては、銅に結合し得るポリアミン類（例えば、ジアミン類、トリアミン類等）が挙げられる。適切なジアミン類は、１，２−アルキルジアミン類、好ましくは、アルキルが２〜１０個の炭素原子を含むアルキルジアミン類（例えば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ｎ＝２〜１０）などである。適切なジアミン類としては、１，２−アリールジアミン類、好ましくは、ベンゼンジアミン類（例えば、１，２−ジアミノベンゼン）などもある。適切なジアミン類としては、さらに１，２−環状アルカンジアミン類などがある。「環状アルカン」は、それぞれが５〜７個の炭素原子を含む１〜３個の環を含む化合物である。好ましくは、環状アルカンジアミンは１，２−ジアミノシクロヘキサン（シクロヘキサンジアミン）である。
【００５４】
特に好ましいジアミンは、１，２−ジアミノシクロヘキサンである（図３Ａ〜Ｂ）。ラオおよびＰ．ウィリアムス（Ｒａｏ  ＆  Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ）（非特許文献６４）により実施された以前の試験により、シクロヘキサンジアミン誘導体（図３Ａ、ＰＹＲがピリジンである）が様々な金属イオンに結合することが示された。得られた金属キレート剤を用いてアミノ酸およびペプチドを分割することに成功し、この分子がα−アミノ酸に対して非常に高い親和力を有し、多くの点で特有な非常に安定な配位錯体を形成することが示された。１，２−ジアミノシクロヘキサンは、本発明のペプチドが結合することが可能である反応性アミノ官能基を有する。Ｍが金属イオンであり、少なくとも１つのＲ４が−アルキル−ＣＯ−ペプチド、−アリール−ＣＯ−ペプチド、−アリール−アルキル−ＣＯ−ペプチドまたは−アルキル−アリール−ＣＯ−ペプチドである図３Ｂを参照のこと（図３Ｃ〜Ｄも参照）。他のＲ４は、同じであるか、または−アルキル−ＣＯＯＨ、−アリール−ＣＯＯＨ、−アリール−アルキル−ＣＯＯＨもしくはアルキル−アリール−ＣＯＯＨであってよい。図３Ｂに示すタイプの誘導体はいくつかの金属結合性部位を有することになり、したがって非置換ペプチドよりも容易に金属イオンに結合することが期待できる。さらに、シクロヘキサンの機能が存在するため、該化合物は、脂質膜を通してのその輸送の助けとなる脂質様の特性を有するであろう。
【００５５】
本発明のペプチドのシクロヘキサンジアミン誘導体は、２つの別個の経路により調製することが可能である。第１の経路は、最初にアルデヒドと縮合してから還元を必要とする（図３Ｃを参照、図３ＣでＢｚはベンジルである）。多くのアルデヒド（アルキルおよびアリール）が室温でシクロヘキサンジアミンと容易に反応して、オキシムを生成する。オキシムは、嫌気的条件下で水素化ホウ素ナトリウムにより還元し、二酸誘導体を得ることが可能である。次いで、カルボキシル部分をカルボキシ保護Ｐ１に存在する遊離アミノ基と反応させて、ペプチドのシクロヘキサンジアミン誘導体を得る。第２の経路は、図３Ｄに示す直接アルキル化法である。例えば、シクロヘキサンジアミンをブロモ酢酸で処理して、二酢酸誘導体を得る。次いで、カルボキシル部分をカルボキシ保護Ｐ１に存在する遊離アミノ基と反応させて、誘導体を得る。図３Ｄにおいて、Ｒ５はＨまたは他のペプチドである。Ｒ５がＨである場合、当技術分野でよく知られている方法により、誘導体をさらに反応させてエステルのような一般的なカルボン酸誘導体を生成させることが可能である。金属結合実験で、この基が存在するか存在しないかは分子全体の金属結合能力に何らの関係もないことが示された。しかし、これらの基は、置換基によって分子を疎水性または親水性にし、これがひいては膜を通過する該分子の送達または標的組織への該分子の送達に影響を及ぼす可能性がある。これらの２つの合成経路は、上記の他のジアミン誘導体を用いるジアミンペプチド誘導体の合成に有効であろう。
【００５６】
他の適切なポリアミンおよびポリアミン誘導体とそれらをペプチドに結合させる方法は、完全な開示を本願明細書に援用する特許文献９３および特許文献９４に記載されている。ペプチドへの結合に適した他のポリアミンキレート剤が知られている。例えば、特許文献９６〜１０２を参照のこと。
【００５７】
隣接する二酸が金属イオンに結合し、銅に対する親和力が特に高いことはよく知られている。したがって、隣接二酸官能基を有するペプチドは、金属を結合するのに極めて有効であると予想される。適切な隣接二酸としては、二酢酸（コハク酸）のようなあらゆる１，２−アルキル二酸およびあらゆる１，２−アリール二酸が挙げられる。
【００５８】
ペプチドのアミノ基を二酢酸と反応させて、二酸誘導体を生成させることが可能である（図４を参照）。これは、樹脂に結合したペプチドのアミノ基をハロゲン化酢酸（例えば、ブロモ酢酸またはクロロ酢酸）またはハロゲン化酢酸誘導体（例えば、ベンジルオキシエステル）と反応させることにより都合よく実現することが可能である。固相合成法では、溶媒で洗浄することにより未反応物質を除去することが可能である。最終生成物は、加水分解切断により樹脂から遊離させる。本発明のペプチドの他の二酸誘導体を、同様な方法で調製することが可能である。
【００５９】
ポリアミノポリカルボン酸は、銅および鉄のような金属に結合することが知られている。本発明のペプチドの誘導体を調製するための適切なポリアミノポリカルボン酸およびこれらをペプチドと結合させる方法は、完全な開示を本願明細書に援用する特許文献１０４、特許文献１０５および特許文献１０６に記載されている。特許文献１０７も参照のこと。
【００６０】
隣接ポリヒドロキシ誘導体も本発明に含まれる。適切な隣接ポリヒドロキシ誘導体は、単糖類および多糖類（例えば、２糖類、３糖類等）などである。現在のところ、好ましいものは単糖類である。図７を参照のこと。単糖類は、２つの主なカテゴリー、すなわち、フラノースとピラノースに分類される。フラノース環系の主な例の１つは、グルコースである。グルコースのヒドロキシ基は、アルデヒドをテトラペプチドのアミン基（例えば、リシンのアミン基）と自由に反応するようにしたままで、ベンジルまたは活性なｔ−ブチルオキシ官能基として保護することが可能である。温和な還元／加水分解により、単糖ペプチド誘導体が生成する。他の単糖ペプチド誘導体をこの方法で調製することが可能である。
【００６１】
ビスピリジルエチルアミン誘導体は、２価金属イオンと強い錯体を形成することが知られている。ペプチドに結合するとき、この官能基は銅をはじめとする金属イオンをキレートする別の部位を与える。テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のビスピリジルエチル誘導体を図５に示す。このテトラペプチド誘導体の金属結合能力は、非誘導体化ペプチドと比較して少なくとも３倍増加すると期待される。このビスピリジルエチルアミン誘導体の調製には、二酸誘導体の合成といくつかの類似性がある。テトラペプチドの２つのアミノ基（１つはＡｓｐ、もう１つはＬｙｓ）が２−ブロモエチルピリジンと反応して、テトラ置換ペプチド誘導体が生成する。この反応は、樹脂に結合したテトラペプチドをブロモエチルピリジンと反応させた後、樹脂から生成物を切断して達成される。
【００６２】
フェナントロリンは、２価金属イオンに結合することができる他の複素環式化合物である。ペプチドのフェナントロリン誘導体は、ビスピリジルエチルアミン誘導体と同じ方法で合成することが可能である。
【００６３】
ポルフィリン類は、すべての生物に認められる化合物の一群であり、金属に結合することができるテトラピロール大員環を含む。ヘム、クロロフィルおよびコリンは、それぞれ鉄、マグネシウムおよびコバルトを含むこのクラスの化合物の主な例である。メソポルフィリンＩＸ（図６Ａ〜Ｂ、図中のＭは金属イオン）は、ヘムから誘導され、銅に対して特異的親和性を有することが認められている。本発明のペプチドへのこの構造の付加により、いくつかの銅結合性部位を有するポルフィリン−ペプチド誘導体が生成するであろう（図６Ｃを参照）。金属結合におけるそれらの役割に加えて、図６Ｃに示すテトラペプチドの位置３および３’のイミダゾール残基が銅以外の金属に結合性部位を与え、それにより、ポルフィリン−金属錯体を安定化する可能性がある。特に、シアノコバラミン（ビタミンＢ−１２）はポルフィリン核における金属としてコバルトを含み、この錯体はイミダゾール基により安定化されている。この類似に基づいて、ポルフィリン−テトラペプチド誘導体は、通常の生理的条件でポルフィリン核においてコバルト（または他の金属）に結合し、該錯体はＨｉｓイミダゾール基により安定化されることが予想される。
【００６４】
図６Ｃに示すポルフィリン−ペプチド誘導体を調製するために、標準的な固相ペプチド合成を用いて、メソポルフィリンＩＸのカルボキシル基を活性化し、ペプチドのアミノ基と結合させることが可能である。一般的に、樹脂に結合したペプチドのリシン残基の遊離アミノ基をカルボキシ活性化ポルフィリン核と結合させることが可能である。縮合生成物は、標準的方法を用いて樹脂から切り離すことができる。この方法を用いて、本発明のペプチドの他のポルフィリン誘導体を合成することが可能である。
【００６５】
他の適切なポルフィリンおよび大環状キレート剤ならびにそれらをペプチドに結合させる方法は、完全な開示を本願明細書に援用する特許文献１０８および特許文献１０９に記載されている。ペプチドに結合させることが可能と思われる他のポルフィリンおよび大環状キレート剤は周知である。例えば、特許文献９６、特許文献９７、特許文献９８、特許文献１１０、特許文献９９、特許文献１１１、特許文献１０１および特許文献１０３を参照のこと。
【００６６】
種々の別の金属キレート剤およびそれらをタンパク質に結合させる方法が、その完全な開示を本願明細書に援用する特許文献１１２に記載されている。
ジチオカルバメート類は、鉄などの金属に結合することが知られている。本発明のペプチドの誘導体を調製するための適切なジチオカルバメート類は、その完全な開示を本願明細書に援用する特許文献１１３および特許文献１１４に記載されている。
【００６７】
ヒドロキシピリドン類も鉄キレート剤として知られている。本発明のペプチドの誘導体を調製するための適切なヒドロキシピリドン類は、その完全な開示を本願明細書に援用する特許文献１１５〜１１７に記載されている。
【００６８】
別の非ペプチド金属キレート剤は当技術分野で知られているか、あるいは開発されるであろう。化合物をタンパク質およびペプチドに結合させる方法は当技術分野でよく知られており、本発明のペプチドに非ペプチド金属キレート剤を結合させることは、当技術分野の技術の範囲内である。例えば、そのような結合の方法を記載した上記の特許を参照のこと。
【００６９】
当然であるが、非ペプチド金属結合性官能基を、ペプチドＰ１−Ｐ２に対するのと同じ方法で他のペプチドに結合させることが可能であろう。得られるペプチド誘導体は、任意選択でペプチドの金属結合性部位（上記のように、銅結合性ペプチドを含む多くの金属結合性ペプチドの配列が知られている）を含みうるペプチドに結合した、１つまたは複数の非ペプチド金属結合性官能基を含むであろう。少なくとも１つの金属結合性官能基または任意選択のペプチドの金属結合性部位が銅に結合しなければならない。好ましくは、該ペプチドは２〜１０個、より好ましくは３〜５個のアミノ酸を含む。ペプチドは１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含むことが好ましく、ペプチドのアミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸であることが最も好ましい。これらのペプチド、およびそれらに１つまたは複数の非ペプチド金属結合性官能基が結合したそれらの誘導体は、ペプチドＰ１−Ｐ２およびそれらの類似の誘導体について上述したのと同じ方法で調製することが可能である。
【００７０】
本発明の方法の実施において好ましい他の銅キレート剤群は、次式のペプチド２量体である。
Ｐ３−Ｌ−Ｐ３
Ｐ３は銅に結合する能力のある任意のペプチドで、各Ｐ３は同じでも異なっていてもよい。各Ｐ３は、好ましくは２〜１０個、より好ましくは３〜５個のアミノ酸を含む。上記のように、銅結合性ペプチドは知られており、各Ｐ３はこれらのペプチドの１つまたは複数の銅結合性部位の配列を含んでいてよい。Ｐ３は、上記のように、非ペプチド金属結合性官能基を有するものなどのＰ１およびＰ２で置換されていてもよいが、Ｐ３ペプチドがいずれも置換されていないことが好ましい。Ｐ３はまた、Ｐ３の銅結合能力を確保するために、上記のように非ペプチド銅結合性官能基で置換された任意のアミノ酸配列を含んでいてもよい。好ましくは、各Ｐ３は置換されていない銅結合性ペプチドである（すなわち、銅に結合するペプチド配列を含む非置換ペプチド）。最も好ましくは、Ｐ３基の一方または両方がＰ１である（すなわち、２量体が配列Ｐ３−Ｌ−Ｐ１、Ｐ１−Ｌ−Ｐ３または最も好ましくはＰ１−Ｌ−Ｐ１を有する）。Ｐ１は上で定義されている。
【００７１】
Ｌは、各Ｐ３のＣ末端アミノ酸に結合しているリンカーである。Ｌは、２つのＰ３ペプチドにそれらのＣ末端アミノ酸を介して結合し得る生理学的に許容できる化学基であってよい。「生理学的に許容できる」は、ペプチド２量体にリンカーＬを含めた結果として、リンカーＬを含むペプチド２量体を投与する動物（ヒトを含む）または器官に対して該ペプチド２量体が有毒ではないことを意味する。Ｌは、２つのＰ３基が協同して金属イオンに結合し得るように（２：１のペプチド：金属錯体と同様に）それらを連結させることが好ましい。Ｌも好ましくは中性である。最も好ましくは、Ｌは、１〜１８個、好ましくは２〜８個の炭素原子を含む直鎖もしくは分枝鎖のアルカンもしくはアルケン残基（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨＣＨ−等）であるか、または３〜８個、好ましくは５〜６個の炭素原子を含む環状のアルカンもしくはアルケン残基（図１９Ａ、化合物Ｄ１を参照）であって、好ましくはアミド結合によりＰ３に結合している。そのようなリンカーは、ペプチド２量体に疎水性を与えるので、特に好ましい。他の好ましい実施形態において、Ｌは窒素含有複素環式アルカン残基（図１９Ａ、化合物Ｄ２、Ｄ３およびＤ４を参照）であり、好ましくは、ピペラジド（図１９Ａ、化合物Ｄ２を参照）である。他の好ましい実施形態において、Ｌはグリセリルエステルである（図１９Ａ、化合物Ｄ５を参照、式Ｄ５中、Ｒは好ましくは１〜６個の炭素原子を含むアルキルまたはアリールである）。最後に、Ｌは金属結合性ポルフィリンであり得る（図６Ｃを参照）。これらの好ましいリンカーＬは、２つのペプチドＰ３が協同して金属イオンに結合することを可能にし、かつ生体適合性であり、これらの好ましいリンカーを含むペプチド２量体は、容易に、しかも大量に調製することが可能である。「生体適合性」とは、リンカーＬを含むペプチド２量体が、ペプチド２量体を投与した動物（ヒトを含む）においてリンカーＬに起因する望ましくない副作用を引き起こさないことを意味する。
【００７２】
ペプチド２量体を合成する方法を図１９Ｂ〜Ｄに示す。一般的に、２つのＰ３基のＣ末端アミノ酸（保護の方法および保護基は当技術分野で知られている）をＬに結合させ、得られるアミノ酸２量体を用いて標準的ペプチド合成法によりペプチド２量体を作製する。
【００７３】
例えば、各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］を有するペプチド２量体は、保護されたリシンを、酸塩化物として、もしくはペプチド合成に用いられる標準的カップリング剤を用いて、遊離ジアミン官能基にカップリングすることにより合成することが可能である（図１９Ｂ〜Ｃを参照）。多くの適切なジアミンが市販されており、あるいは適切なジアミンを当技術分野で知られている方法により容易に合成することが可能である。
【００７４】
例えば、リシン２量体（２）（図１９Ｂ）を次のように調製することが可能である。９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｔ−ベンジルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護したＤ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）（２０ｍｍｏｌ）を乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１００ｍＬ、乾燥アルゴンでフラッシュ）に溶解した撹拌中の溶液に、ブタン−１，４−ジアミン（１）および２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，２，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＢＴＵ、０．５ｍｍｏｌ）を加える。該溶液を室温で３６時間撹拌する。ビス保護リシン（２）を、シリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにかけて酢酸エチル／メタノールの混合物で溶離することにより分離する。次いで、ペプチド２量体（３）を古典的ペプチド合成法を用いて保護リシン２量体（２）から調製する（図１９Ｂを参照）。
【００７５】
各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］を有する他のペプチド２量体は、次のように合成することが可能である。最初に、異なる保護リシン２量体（４）を、ピペラジン（５）の２つのアミノ中心をアシル化することにより合成する（図１９Ｃを参照、非特許文献８６も参照）。次いで、標準的ペプチド合成法を用いて残りのアミノ酸残基を付加して、ペプチド２量体（６）を得る（図１９Ｃを参照）。
【００７６】
各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］を有し、Ｌがグリセリルエステルであるペプチド２量体は、次のように合成することが可能である。図１９Ｄの式（７）の３−置換プロパン−１，２−ジオール（Ｒはアルキルまたはアリールである）は市販されている。Ｒがメチルであるリシンジエステル（８）は、次のように調製することができる（図１９Ｄを参照）。乾燥トルエン（１００ｍＬ、乾燥アルゴンでフラッシュ）に溶解したＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２０ｍｍｏｌ）の撹拌中の溶液に３−メトキシプロパン−１，２−ジオール（２００ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１５ｍｍｏｌ）を加える。該溶液を室温で３６時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、残留物を酢酸エチルに溶解する。この溶液をクエン酸溶液（２％）、水、０．５Ｎ  ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、再び水で洗浄し、次いで、有機層を硫酸マグネシウムで脱水する（溶媒の除去により、淡黄色の残留物が得られる）。ビス保護リシン（８）をシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにかけて酢酸エチル／メタノールの混合物で溶離することにより分離する。次いで、ペプチド２量体（９）を、古典的ペプチド合成法を用いて保護リシン２量体（８）から調製する（図１９Ｄを参照）。
【００７７】
金属結合性化合物の生理学的に許容できる塩も本発明に含まれる。生理学的に許容できる塩としては、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸等）または塩基（製薬上許容できる金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩等）から得られる塩のような通常の無毒性の塩が挙げられる。塩は、通常の方法、例えば、化合物の遊離塩基形を酸で中和させて調製する。
【００７８】
本発明の一実施形態では、ＡＰＣによる治療を必要とする動物に有効量の銅キレート剤を投与する。好ましくは、動物は、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマまたはヒトのような哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。キレート剤に加えて、有効な量のＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣ活性化剤を動物に投与する（上記を参照）。銅キレート剤は、ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣ活性化剤を投与する前、同時および／または後に投与することが可能である。銅キレート剤をＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣ活性化剤の投与の前に投与し、キレート剤の投与を、ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣ活性化剤の投与の間継続することが好ましい。銅キレート剤をＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣ活性化剤と同時に投与する場合、すべての化合物を互いに混合して、あるいは別個に投与することが可能である。
【００７９】
本発明の様々な銅キレート剤のための有効な剤形、投与方法および投与量は、実験的に決定することができ、そのような決定を行うことは、当技術分野の技術の範囲内である。有効な用量は約２〜約２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇであることが見出されている。しかし、当業者には当然のことであるが、投与量は、用いる個々のキレート剤、治療する疾患または状態、疾患または状態の重症度、投与経路、化合物の排泄速度、投与期間、その動物に投与されている何らかの他の薬物の同一性、動物の年齢、大きさおよび種、ならびに医療および獣医学の技術分野において知られている同様な因子によって異なる。一般的に、本発明のキレート剤の適切な１日投与量は、治療効果をもたらすのに有効な最低投与量であるキレート剤の量である。しかし、１日投与量は、担当の医師または獣医師が適切な医療上の判断の範囲内で決定するものとする。所望ならば、有効な１日投与量を、２、３、４、５、６またはそれ以上の分割量として１日をとおして適切な間隔で別個に投与してもよく、あるいは持続注入として投与してもよい。キレート剤の投与は、好ましい応答が達成されるまで、継続すべきである。
【００８０】
本発明のキレート剤は、経口、鼻腔内、直腸内、膣内、非経口（例えば、静脈内、脊髄内、腹腔内、皮下または筋肉内）、槽内、経皮、経粘膜、頭蓋内、脳内および局所（頬および舌下を含む）などの任意の適切な投与経路により、治療のために動物患者に投与することができる。好ましい投与経路は、非経口である。
【００８１】
本発明のキレート剤を単独で投与することは可能であるが、当化合物を医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。本発明の薬剤組成物は、１つまたは複数の製薬上許容できる担体、ならびに場合により１つまたは複数の他の化合物、薬物または他の物質との混合物中の有効成分として、本発明の１つのキレート剤または複数のキレート剤を含む。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、動物に対して有害でないという意味において「許容できる」ものでなければならない。製薬上許容できる担体は、当技術分野でよく知られている。選択する投与経路にかかわりなく、本発明の化合物を、当業者に周知の通常の方法により製薬上許容できる投与形態に調剤する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと。
【００８２】
非経口投与に適する本発明の薬剤組成物は、１つまたは複数の製薬上許容できる無菌の等張水性液剤または非水性液剤、分散剤、懸濁剤もしくは乳剤、または使用直前に無菌の注射用液剤または分散剤に再構成することができる無菌の散剤と配合されている本発明の１つまたは複数のキレート剤を含み、抗酸化剤、緩衝剤、該製剤を被投与者の血液と等張にするための溶質、または懸濁化剤もしくは粘稠化剤を含んでよい。
【００８３】
薬剤組成物に用いることができる適切な水性担体および非水性担体としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射用有機エステルなどがある。例えば、レシチンのようなコーティング材の使用、分散剤の場合には必要とする粒度サイズの維持、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することが可能である。
【００８４】
これらの組成物は、湿潤剤、乳化剤および分散化剤のような補助剤も含みうる。糖類、塩化ナトリウム等の等張性物質を組成物に含めることも望ましい。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる物質を含めることにより、注射剤の長期吸収をもたらすことができる。
【００８５】
場合によって、薬物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射による薬物の吸収を遅くすることが望ましい。これは、水に対する溶解度が低い結晶性または無定形物質の液体懸濁剤を用いることにより達成することができる。薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、ひいては結晶の大きさおよび結晶形に依存する。別例として、非経口投与する薬物の吸収の遅延は、該薬物を油性の媒体に溶解または懸濁することにより達成される。
【００８６】
デポ注射剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成させることにより調製する。薬物とポリマーとの比率、および用いる個々のポリマーの性質によって、薬物の放出速度を制御することが可能である。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）などがある。デポ注射剤は、生体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封じ込めることによっても調製することが可能である。注射用物質は、例えば、細菌保持フィルターを通してろ過することにより滅菌することが可能である。
【００８７】
製剤は、１回用量分または複数回用量分を密閉容器、例えば、アンプルまたはバイアルに入れて提供され、使用直前に無菌の液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。即時注射液剤および懸濁剤は、上記のタイプの無菌の散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【００８８】
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが有効成分として所定量の本発明のキレート剤（１つまたは複数）を含む、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤の形態で、または水性もしくは非水性液体中の液剤または懸濁剤として、または水中油型もしくは油中水型乳剤として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤（ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムのような不活性の基剤を用いる）として投与することができる。本発明の１つのキレート剤または複数のキレート剤は、巨丸剤（ボーラス）、舐剤またはペースト剤としても投与することができる。
【００８９】
経口投与用の本発明の固形剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、散剤、顆粒剤等）では、有効成分がクエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウム、および／または次のうちのいずれかなどの１つまたは複数の製薬上許容できる担体と混合されている。すなわち、（１）デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸のような賦形剤または増量剤、（２）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアラビアゴムのような結合剤、（３）グリセロールのような湿潤希釈剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩および炭酸ナトリウムのような崩壊剤、（５）パラフィンのような溶解遅延剤、（６）第四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、（７）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤、（８）カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤、（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物のような滑沢剤、ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、薬剤組成物は緩衝剤も含んでいてよい。ラクトースすなわち乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いたゼラチン軟カプセルおよび硬カプセル剤中の増量剤として、同様なタイプの固体組成物を用いることができる。
【００９０】
錠剤は、任意選択で１つまたは複数の補助成分とともに、圧縮または成形することにより調製することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性の希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散化剤を用いて調製することができる。成形錠剤は、不活性の液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形して調製することができる。
【００９１】
上記錠剤、ならびに糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤のような本発明の薬剤組成物のその他の固形剤形は、任意選択で溝を入れるか、もしくは腸溶コーティングおよび製剤調合技術分野においてよく知られている他のコーティングのようなコーティングおよび外皮を調製することができる。それらは、例えば所望の放出プロファイルを得るために様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、該製剤中の有効成分の徐放または放出制御が可能なように調合することもできる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通すろ過により滅菌することができる。これらの組成物は、任意選択で乳白剤を含んでいてもよく、胃腸管の特定の部分において有効成分のみを、または有効成分を優先的に、場合により遅延して放出する組成物であってもよい。使用可能な包埋用組成物の例は、ポリマー物質およびワックスなどである。有効成分は、マイクロカプセル剤に封入することも可能である。
【００９２】
本発明のキレート剤を経口投与するための液体剤形は、製薬上許容できる乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤などである。有効成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒のような当技術分野で一般的に用いられている不活性の希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、アメリカホドイモ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびにそれらの混合物のような可溶化剤および乳化剤を含んでいてよい。
【００９３】
不活性の希釈剤のほかに、経口組成物には、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味料、調味料、着色剤、香料および保存剤のような補助剤も含めることが可能である。
懸濁剤には、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントゴムならびにそれらの混合物のような懸濁化剤を含めてよい。
【００９４】
直腸または膣投与用の本発明の薬剤組成物の製剤は坐剤として提供することができるが、該坐剤は本発明の１つまたは複数の化合物と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチル酸などを含む１つまたは複数の適切な非刺激性賦形剤または担体とを混合することにより調製可能であり、かつ室温では固体であるが体温では液体であり、したがって直腸または膣腔内で融解して活性化合物を放出する。膣投与に適している本発明の製剤としては、当技術分野で適切であることが知られている担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡剤または噴霧剤などもある。
【００９５】
本発明のキレート剤の局所、経皮または経粘膜投与用の剤形は、散剤、噴霧剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤、点滴剤および吸入剤などである。１つまたは複数のキレート剤を、無菌条件下で、製薬上許容できる担体と、必要とする緩衝剤または噴射剤とともに混合することができる。
【００９６】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の１つまたは複数のキレート剤に加えて、動物脂肪および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはそれらの混合物のような賦形剤を含んでいてよい。
【００９７】
散剤および噴霧剤は、本発明の１つまたは複数のキレート剤に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物のような賦形剤を含んでいてよい。噴霧剤はさらに、クロロフルオロ炭化水素ならびにブタンおよびプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような通常の噴射剤を含んでいてよい。
【００９８】
有効成分（すなわち、本発明の１つまたは複数のキレート剤）は、通常の経皮薬物送達システム、すなわち、一般的に有効成分が皮膚に貼付される薬物送達装置としての役割を果たす積層構造内に含められている経皮パッチ剤を用いて皮膚を介して送達してもよい。そのような構造においては、有効成分は一般的に、上方の裏打層の下にある層、すなわち「リザーバー」に含まれている。積層装置は、リザーバーを１つだけ含んでいてもよく、あるいは複数のリザーバーを含んでいてもよい。一実施形態において、リザーバーは、薬物送達時に該システムを皮膚に貼付する役割を果たす製薬上許容できる接触粘着物質のポリマーマトリックスを含む。適切な皮膚接触粘着物質の例は、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリル酸、ポリウレタンなどを含むが、これらに限定されない。別例として、薬物含有リザーバーと皮膚接触粘着物質とが別個の異なる層として存在し、粘着物質はリザーバーの下にあり、この場合リザーバーは上述のようにポリマーマトリックスであるか、または液体もしくはヒドロゲルリザーバーであってよく、または他の形態であってもよい。
【００９９】
装置の上部面としての役割を果たす、上記積層物の裏打ち層は、積層構造の主要な構造エレメントとして機能し、装置にその可撓性の多くを与えている。裏打ち材料として選択される材料は、有効成分および存在する他のあらゆる物質に対して実質的に不透過性であるように選択すべきである。裏打ち層は、皮膚が薬物送達時に水和されることが望ましいかどうかによって、閉塞性か非閉塞性かのいずれかであってよい。裏打ちは、好ましくは柔軟な弾性材料のシートまたはフィルムからなっていることが好ましい。裏打ち層に適するポリマーの例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどがある。
【０１００】
貯蔵中および使用前には、積層構造は放出ライナーを含んでいる。使用直前にこの層を装置から除去して、その基底表面、すなわち薬物リザーバーまたは別個の接触粘着層のいずれかを露出させて、該システムを皮膚に貼付できるようにする。放出ライナーは、薬物／媒体に不透過性の物質で構成されなければならない。
【０１０１】
経皮薬物送達装置は、当技術分野で知られている通常の技術を用いて作製することができる。例えば、粘着物質、有効成分および媒体の液体混合物を裏打層上に成形（ｃａｓｔｉｎｇ）した後、放出ライナーを積層して作製することができる。同様に、粘着物質混合物を放出ライナー上に成形した後、裏打層を積層してもよい。別例として、薬物リザーバーを有効成分または媒体の非存在下で調製し、次いで、薬物／媒体混合物に「浸漬」して装てんしてもよい。
【０１０２】
積層経皮薬物送達システムは、さらに皮膚透過促進剤を含んでいてよい。すなわち、ある種の有効成分に対する皮膚本来の透過性が低すぎて、治療レベルの薬物が適度な広さの無傷の皮膚を経て通過できないので、そのような薬物と皮膚透過促進剤とを併用投与することが必要である。適切な促進剤は、当技術分野でよく知られている。
【０１０３】
本発明の薬剤組成物は、鼻腔エアゾール剤または吸入により投与することもできる。そのような組成物は、製剤調合技術分野でよく知られている手法に従って調製し、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生物学的利用能を増大させるための吸収促進剤、フルオロカーボンまたは窒素のような噴射剤、および／または他の通常の可溶化または分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【０１０４】
局所薬物送達用の好ましい製剤は、軟膏剤およびクリーム剤である。軟膏剤は、一般的にワセリンまたは他のワセリン誘導体に基づく半固体製剤である。選択した活性物質を含むクリーム剤は、当技術分野で知られているように、水中油型または油中水型の粘稠液体または半固体乳剤である。クリーム基剤は、水に可洗性で、油相、乳化剤および水相を含む。油相は、しばしば「内（ｉｎｔｅｒｎａｌ）」相とも呼ばれており、一般的にワセリンおよびセチルアルコールもしくはステアリルアルコールのような脂肪族アルコールからなっている。水相は、必ずではないが通常は油相より容積が大きく、一般的に湿潤剤を含む。クリーム剤中の乳化剤は、一般に非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性界面活性剤である。使用される特定の軟膏またはクリーム基剤は、当業者により認識されるように、最適の薬物送達を可能にする基剤である。他の担体または媒体と同様に、軟膏基剤は、不活性で、安定で、非刺激性かつ非感作性であるべきである。
【０１０５】
本発明の口腔内投与用製剤は、錠剤、トローチ剤、ゲル剤などである。別例として、口腔内投与は当業者に知られている経粘膜送達システムを用いて行うことができる。
本発明の他の実施形態において、有効な量のＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣ活性化剤を投与する前に、組成物中に存在するあらゆる銅をキレートするために、ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣ活性化剤を含む組成物を銅キレート剤と接触させる。適切な接触条件は、実験的に決定することが可能であり、それを行うことは当技術分野の範囲内にある。例えば、接触は、キレート剤の溶液と他の化合物の溶液とを単に合わせ、キレート剤を組成物中のすべての銅に結合させるに十分な条件（例えば、時間、温度およびｐＨ）を用いてインキュベートすることにより実現することが可能である。銅キレート剤は、投与前に除去することが可能であり（例えば、銅を含まない組成物の製造における銅キレート剤の使用）、あるいは、ＡＰＣ、プロテインＣ、プロテインＣの合成を増加させる物質および／またはプロテインＣ活性化剤とともに投与することが好ましい。銅キレート剤は、キレート剤に特異的な抗体を含むアフィニティカラムの使用などの様々な方法で除去することが可能である。
【０１０６】
「ａ」または「ａｎ」の付くものは、そのものが１つまたは複数であることを指すことに注意すべきである。「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」とは１つまたは複数の細胞を指す。
【実施例１】
【０１０７】
この実施例では、銅が活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の抗凝固活性を阻害するかどうかを検討したｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験について述べる。下記のように、３０分間のインキュベーション期間の後に、銅はＡＰＣの抗凝固活性を阻害した。
【０１０８】
ヒトアルブミンは、そのＮ末端に銅に対する１つの高親和性結合性部位と他所に多くの非特異的銅結合性部位とを有する。非特許文献２０、非特許文献６５、非特許文献６６、非特許文献６７。アルブミンは遊離銅イオンを封鎖し、そのＮ末端銅結合性部位は、銅により誘発される活性酸素種の形成を妨げることが示された。非特許文献６８、非特許文献６９。
【０１０９】
この実施例で述べるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験においても銅によるＡＰＣ阻害をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはヒトアルブミンＮ末端銅結合性部位の類似体Ｄ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓ（ｄ−ＤＡＨＫ）により抑制または逆転することが可能であるかどうかを検討した。以下に示すように、３０分間のインキュベーション期間の後に、ＨＳＡおよびｄ−ＤＡＨＫはいずれも銅によるＡＰＣ活性の阻害に対して防御効果を示し、銅のキレートによりＡＰＣ治療の有効性が増大することが示唆された。
【０１１０】
（材料）
ヒトアルブミンＮ末端類似体ｄ−ＤＡＨＫは、ボーマンリサーチ社（Ｂｏｗｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌｔｄ．）［英国ウェールズ  ニューポート（Ｎｅｗｐｏｒｔ，Ｗａｌｅｓ）所在］により合成された。ＡＰＣ抗凝固活性のアッセイは、Ａｃｃｕｃｏｌｏｒ（登録商標）比色アッセイ（シグマダイアグノスティックス（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）［米国ミズーリ州セントルイス所在］とした。ＡＰＣ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、製品番号Ｐ２２００）、ＨＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、製品番号Ａ１６５３）および他のすべての化学物質は（シグマ（Ｓｉｇｍａ）［米国ミズーリ州セントルイス所在］から入手した。ＡＰＣの銅含量は、黒鉛炉原子吸光（ガルブレースラボラトリーズ（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［米国テネシー州ノックスビル（Ｋｎｏｘｖｏｌｌｅ）所在］により測定した。
【０１１１】
（ＡＰＣ活性アッセイ）
最初に血漿試料についてデザインされたＡＰＣアッセイ（非特許文献７０）を清浄な水環境用に修正した。ＣｕＣｌ２、ＨＳＡおよびｄ−ＤＡＨＫの溶液を２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）を溶媒として調製した。実験は９６ウエルプレートで行った。ＡＰＣ（２ｍｇ／Ｌ）を次の溶液、すなわちａ）２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液単独、ｂ）１０μＭ  ＣｕＣｌ２、ｃ）４０μＭ  ＨＳＡ、ｄ）４０μＭ  ｄ−ＤＡＨＫ、ｅ）ＨＳＡ：ＣｕＣｌ２（１：４、１：２、１：１、２：１および４：１の比で）、ならびにｆ）ｄ−ＤＡＨＫ：ＣｕＣｌ２（１：４、１：２、１：１、２：１および４：１の比で）（ｎ＝３、それぞれについて２連）に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いでプロテインＣ基質（２ｍｇ／Ｌ）を各ウエルに加え、３７℃で１０分間インキュベートした。濃酢酸を各ウエルに加えて反応を停止させ、結果をマイクロプレート蛍光リーダー（ＦＬ６００型、バイオテクインスツルメンツ社（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）［米国バーモント州ウィヌースキー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ）所在］で４１０ｎｍで読み取った。銅単独、ＨＳＡ単独、ｄ−ＤＡＨＫ単独ならびにＨＳＡ：ＣｕＣｌ２およびｄ−ＤＡＨＫ：ＣｕＣｌ２のすべての組合せにおけるＡＰＣ活性を、緩衝液のみを用いたベースラインＡＰＣ活性からの平均変化率（±標準偏差）として表した。
【０１１２】
（ＡＰＣの銅による阻害）
２つの独立した実験においてＣｕＣｌ２をＡＰＣとともにインキュベートしたところ、ベースラインと比較してＡＰＣ活性が２７．９％±１５．５％（図１）および２４．１％±９．７％（図２）低下した（総平均で２６．０％±１１．８％低下）。銅はかつて金属アフィニティークロマトグラフィー法でＡＰＣを結合させるために使用されている。非特許文献７１。しかし、知られている限り、本試験は、銅がＡＰＣの抗凝固活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害するという証拠を初めて提供している。
【０１１３】
銅は、正常条件下では血漿タンパク質により厳格に制御されている必須微量元素である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酸性状態にすると遊離銅イオンがセルロプラスミンおよび他のタンパク質から放出されることが知られており、また、ｉｎ  ｖｉｖｏで虚血およびアシドーシスを伴う状態では遊離銅イオンが放出される。非特許文献２０、非特許文献７２、非特許文献２５。虚血およびアシドーシスは、しばしば敗血症性ショックを伴い、組織の酸素要求量の増加、酸素摂取の障害および血流の異常分布に起因して、敗血症における初期に起こることが多い。非特許文献２２。したがって、遊離の銅は敗血症時に容易に利用され得る状態にあり、内因性および治療的に投与されたＡＰＣの活性を阻害しうる。このことは、銅の封鎖（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）によりＡＰＣまたは内因的に不活性化されたＡＰＣの治療上の有効性が増大しうることを意味する。
【０１１４】
（ＨＳＡは銅によるＡＰＣ阻害を抑制する）
ＨＳＡをＡＰＣとともにインキュベートしたところ、ベースラインＡＰＣ活性と比べて２０２．１％±４８．１％に増加した（図１）。このようなＡＰＣ活性の劇的な増加は、実験に用いたＡＰＣが銅を含んでいた可能性のあることを示唆していた。本試験のすべての実験に用いたＡＰＣストック溶液（３００ｍｇ／Ｌ、５．４５μＭ）の銅含量を分析したところ、８８．５μｇ／Ｌ（１．３９μＭ）の銅を含むと測定された。ＨＳＡに存在する多数の銅結合性部位によりＡＰＣに結合した銅が除去されて、ＡＰＣ活性がベースラインと比べて増加したと思われる。非特許文献２０、非特許文献６５。ＡＰＣ上に活性部位を露出させるコンフォーメーション変化やＨＳＡの基質様活性のような、他の生じうるＨＳＡ−ＡＰＣ相互作用もＡＰＣ活性を増加させた可能性がある。種々の比率のＨＳＡ：ＣｕＣｌ２においてＡＰＣの銅による阻害が一貫して抑制され、ベースラインと比べて、１８０．０％±６８．２％〜２０７．１％±５３．３％の範囲のＡＰＣ活性の劇的な増加がもたらされた（図１）。
【０１１５】
低アルブミン血症は、敗血症においてしばしば報告されているが、アルブミン異化の増加、血管外漏出、およびそれほどではないがアルブミン合成の低下に起因している可能性がある。非特許文献７３。敗血症性ショックおよび腸虚血ショックに対してヒトアルブミンを投与することにより、電解質溶液単独投与と比較して、血行動態パラメーターおよび生存率が改善することが報告されている。非特許文献７４〜７６。銅および鉄をキレートするデフェロキサミンも敗血症の動物モデルにおいて有用であると報告された。非特許文献７７、非特許文献７８。理論的には、ここに示した結果を考慮すると、敗血症およびショックに対するアルブミンまたは金属キレート剤の投与の有用性の一部は、銅によるＡＰＣ阻害の抑制または内因的に不活性化されたＡＰＣの再活性化により説明できよう。
【０１１６】
（ｄ−ＤＡＨＫはＡＰＣの銅による阻害を抑制する）
ｄ−ＤＡＨＫをＡＰＣとともにインキュベートしたところ、ベースラインＡＰＣ活性と比べて１８．２％±１３．０％増加した（図２）。２：１および４：１のｄ−ＤＡＨＫ：ＣｕＣｌ２比では、ベースラインと比べてＡＰＣ活性が増加した（それぞれ１２．９％±１．１％および１４．８％±１２．７％）が、より低いｄ−ＤＡＨＫ：ＣｕＣｌ２比では銅によるＡＰＣ阻害に対する有意な防御は示されなかった（図２）。この所見は、ｄ−ＤＡＨＫが少なくとも２：１のｄ−ＤＡＨＫ：ＣｕＣｌ２比で遊離の銅と効果的に結合するという我々の以前の報告と一致している。非特許文献６７〜６９。ＡＰＣ単独に対するｄ−ＤＡＨＫの最大効果（図２）がベースラインと比べて１８．２％の活性の増加をもたらしたが、これは別途測定されたＡＰＣ中の銅の量（５．４５μＭのＡＰＣに対して１．３９μＭの銅、１：４）がｄ−ＤＡＨＫによりキレートされていることに相当する。
【０１１７】
救急救命診療が進歩したにもかかわらず、重症敗血症は比較的発症率が高く、しばしば致命的疾患となり、高齢患者で致命的である可能性がより大きい。非特許文献７９。重症敗血症の治療の第３相臨床試験において、組換えヒトＡＰＣは２８日死亡率を３１％から２５％に減少させたが、ＡＰＣの投与を受けた患者のうち多くは有用な効果がなかった。非特許文献８０。静脈内投与されたヒト組換えＡＰＣは、タンパク質分解酵素により１５分以内に健常被験者の血漿から除去される。製造業者によれば、重症敗血症の患者では最大５０％速く除去される。非特許文献８１〜８５。したがって、現行の臨床ガイドラインは、静脈内投与のＡＰＣは４日間にわたり連続的に投与することを推奨している。非特許文献８０。アルブミンまたはｄ−ＤＡＨＫを用いて遊離の銅を封鎖することによりＡＰＣの銅による阻害を抑制することは、ＡＰＣの臨床的有用性を維持または増強しつつ、ＡＰＣの投与をより低用量かつ短時間にすることを可能にするかもしれない。
【０１１８】
結論すると、これらの結果から、銅がＡＰＣ抗凝固活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで部分的に阻害し、ＨＳＡおよびｄ−ＤＡＨＫ（ヒトアルブミンの高親和性銅結合性部位の類似体）は銅によるＡＰＣ阻害を抑制することが示唆される。敗血症に伴う虚血およびアシドーシス時に動態化される遊離の銅は、ＡＰＣの不活性化に寄与し、その臨床的有用性を減少させる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１Ａ】置換可能な箇所を示す、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｂ】置換可能な箇所を示す、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｃ】置換可能な箇所を示す、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｄ】置換可能な箇所を示す、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図２Ａ】図１Ｃの式に含まれるテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の誘導体の合成の概略図。
【図２Ｂ】図１Ｂの式に含まれるテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の誘導体の合成の概略図。
【図３Ａ】シクロヘキサンジアミン誘導体の式。
【図３Ｂ】シクロヘキサンジアミン誘導体の式。
【図３Ｃ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のシクロヘキサンジアミン誘導体の合成の概略図。
【図３Ｄ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のシクロヘキサンジアミン誘導体の合成の概略図。
【図４】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のテトラ酢酸誘導体の式。
【図５】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のビスピリジルエチルアミン誘導体の式。
【図６Ａ】結合金属イオンＭを含まないメソポルフィリンＩＸの式。
【図６Ｂ】結合金属イオンＭを含むメソポルフィリンＩＸの式。
【図６Ｃ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のメソポルフィリンＩＸ誘導体の式。
【図７】単糖類の式。
【図８Ａ】本発明によるペプチド２量体の式。
【図８Ｂ】本発明によるペプチド２量体の合成を示す図。
【図８Ｃ】本発明によるペプチド２量体の合成を示す図。
【図８Ｄ】本発明によるペプチド２量体の合成を示す図。
【図９】銅（Ｃｕ）単独、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）単独および種々の比のＨＳＡ：Ｃｕの、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）抗凝固活性に対する影響を示すグラフ。データは、ベースラインＡＰＣ活性からの変化率（％）として表す（各バーについてｎ＝３、平均値±標準偏差）。
【図１０】銅（Ｃｕ）単独、テトラペプチドＤ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓ（ｄ−ＤＡＨＫ）単独および種々の比のｄ−ＤＡＨＫ：Ｃｕの、ＡＰＣ抗凝固活性に対する影響を示すグラフ。データは、ベースラインＡＰＣ活性からの変化率（％）として表す（各バーについてｎ＝３、平均値±標準偏差）。
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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2004535461.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004535461.tif 000083
2004535461.tif 000084