(57)【要約】患者に神経有益効果をもたらす方法及び組成物を提供する。これらの方法は、一般的に、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物、又はその類似体を治療上有効な量患者に投与することを含む。本発明の化合物、例えばＮ−キナーゼの活性を調節する化合物を含む医薬包装製剤も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物を治療上有効量投与することによって、前記患者に神経有益効果をもたらすことを含む方法。
【請求項２】
神経有益効果が、神経細胞の生存を調節することによって前記患者にもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
神経有益効果が、神経細胞の再生を調節することによって前記患者にもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
神経有益効果が、神経細胞の軸索成長を調節することによって前記患者にもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
神経有益効果が、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節することによって前記患者にもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
中枢神経系の神経細胞が網膜神経節細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物が、神経細胞損傷領域への導入によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物が、患者の脳脊髄液に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物が、患者のくも膜下に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物が、患者の脳室、腰椎部、及び大槽からなる群から選ばれる領域に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物が、医薬上許容しうる製剤の形態で患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
医薬上許容しうる製剤が分散系である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
医薬上許容しうる製剤が脂質ベースの製剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
医薬上許容しうる製剤がリポソーム製剤を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
医薬上許容しうる製剤が多胞リポソーム製剤を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
医薬上許容しうる製剤がポリマーマトリックスを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
医薬上許容しうる製剤がミニポンプ内に含有されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
医薬上許容しうる製剤が、医薬上許容しうる製剤を患者に投与後少なくとも１週間、該患者にＮ−キナーゼの活性を調節する化合物の持続送達を提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
医薬上許容しうる製剤が、医薬上許容しうる製剤を患者に投与後少なくとも１ヶ月間、該患者にＮ−キナーゼの活性を調節する化合物の持続送達を提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
患者が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者が神経障害を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経障害が脊髄損傷である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
脊髄損傷が、単麻痺、両麻痺、対麻痺、片麻痺及び四肢麻痺を特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経障害がてんかんである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記神経障害が脳卒中である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記神経障害がアルツハイマー病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物を、神経障害を患っている患者に治療上有効な量投与することによって、神経障害を患っている前記患者を治療することを含む方法。
【請求項２９】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物を患者に投与する前に神経系機能の第一回目の評価を行い、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物を患者に投与した後に神経系機能の第二回目の評価を行うことをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
神経系機能が、感覚機能、コリン性神経支配、又は前庭運動機能である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物の識別法であって、Ｎ−キナーゼ又はその生物活性フラグメントを試験化合物と接触させ、該試験化合物のＮ−キナーゼの活性を調節する能力を測定することによって、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物を識別することを含む方法。
【請求項３２】
Ｎ−キナーゼがヒトＮ−キナーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ヒトＮ−キナーゼが組換え製造されたＮ−キナーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｎ−キナーゼがウシＮ−キナーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ウシＮ−キナーゼがウシ原料から精製される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
試験化合物の、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する能力を測定することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
試験化合物がＮ−キナーゼの活性を阻害する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
試験化合物がＮ−キナーゼの活性を刺激する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する試験化合物の能力が、基質のＮ−キナーゼ依存性リン酸化を調節する試験化合物の能力を評価することによって測定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物の識別法であって、
Ｎ−キナーゼ又はその生物活性フラグメントを、試験化合物、Ｎ−キナーゼ基質、放射性ＡＴＰ、及びＭｎ＋２と接触させ；そして
基質のＮ−キナーゼ依存性リン酸化を調節する試験化合物の能力を測定することによって、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物を識別する、
ことを含む方法。
【請求項４１】
Ｎ−キナーゼ基質がヒストンＨＦ−１タンパク質である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
放射性ＡＴＰが［γ−３２Ｐ］ＡＴＰである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
Ｎ−キナーゼがヒトＮ−キナーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
ヒトＮ−キナーゼが組換え製造されたＮ−キナーゼである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｎ−キナーゼがウシＮ−キナーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
ウシＮ−キナーゼがウシ原料から精製される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
試験化合物の、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する能力を測定することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４０に記載の方法によって識別された、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物。
【請求項４９】
（ａ）新生児の脳組織に存在する；
（ｂ）６−チオグアニンの存在下で阻害される；
（ｃ）Ｍｎ＋２の存在下で活性化されるが、Ｍｇ＋２又はＣａ＋２によっては活性化されない；
（ｄ）約４９ｋＤａの分子量を有する；そして
（ｅ）ＮａＣｌ濃度１．５〜１．７５Ｍでシバクロンブルーカラムから溶離される、
種類の単離Ｎ−キナーゼポリペプチド。
【請求項５０】
請求項４９のＮ−キナーゼポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体。
【請求項５１】
抗体が細胞内抗体である、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
エピトープがＡＴＰ結合ドメインを含む、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５３】
フラグメントが少なくとも１５個の隣接アミノ酸を含む、請求項４９のＮ−キナーゼポリペプチドのフラグメント。
【請求項５４】
フラグメントが少なくとも３０個の隣接アミノ酸を含む、請求項５３に記載のフラグメント。
【請求項５５】
フラグメントが少なくとも５０個の隣接アミノ酸を含む、請求項５３に記載のフラグメント。
【請求項５６】
フラグメントが少なくとも１００個の隣接アミノ酸を含む、請求項５３に記載のフラグメント。
【請求項５７】
フラグメントが免疫応答を引き出すことが可能な、請求項４９のＮ−キナーゼポリペプチドのフラグメント。
【請求項５８】
配列番号１のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許出願第０９／６５６，９１５号、出願日２０００年９月７日に基づく優先権を主張し、前記出願特許の全内容を本引用によって本明細書に援用する。
【０００２】
発明の背景
末梢及び中枢神経系の障害は広く存在するが、これらの障害の多くは有効な治療的介入法がない。
【０００３】
発明の要旨
本発明は、患者、例えば神経障害を患っている患者に神経有益効果をもたらす方法及び組成物を提供する。そのような効果とは、患者の神経細胞の生存、軸索成長、神経細胞の再生、又は正常化神経機能を促進することを含む。本発明は、少なくとも一部は、正常な哺乳動物神経細胞組織からの高度に精製された形態のＮ−キナーゼポリペプチドの単離、その化学構造（アミノ酸配列を含む）の分子的特徴付け、プリン調節に対するその感受性の実証、及び当該キナーゼが、網膜の神経節神経細胞のような哺乳動物のＣＮＳ神経細胞を含むＣＮＳ神経細胞の軸索成長に積極的な役割を果たしているという発見に基づく。今般、Ｎ−キナーゼが軸索成長の重要な細胞内媒介物であることの確認、及びその構造の化学的特徴付けがなされたことにより、Ｎ−キナーゼの活性を調節することによって患者に神経有益効果をもたらす能力が提供されることになった。さらに、このＮ−キナーゼの精製及び特徴付けにより、患者に神経有益効果をもたらすことができる追加の化合物を識別するためのスクリーニングアッセイへの応用も可能となる。
【０００４】
従って、一側面において、本発明は、患者にＮ−キナーゼの活性を調節する化合物を治療上有効量投与することによって、該患者に神経有益効果をもたらすことを含む方法を提供する。
【０００５】
一側面において、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、本発明に従って、該化合物が患者の中枢神経系の神経細胞と接触するように患者に投与される。例えば、該化合物は、該化合物を脳室、腰椎部、又は大槽に導入することにより、くも膜下腔内の患者の脳脊髄液に投与できる。このような場合、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、神経有益効果をもたらすために、皮質神経細胞又は網膜の神経節細胞に局所的に投与できる。
【０００６】
ある態様において、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、医薬上許容しうる製剤を用いて患者に投与できる。医薬上許容しうる製剤は、持続送達を可能にするので、患者に有効量のＮ−キナーゼの活性を調節する化合物を、医薬上許容しうる製剤を最初に患者に投与してから少なくとも１週間、又は他の態様では少なくとも１ヶ月間提供できる。本発明の化合物の持続送達を達成するための方法は、本発明の化合物を分散させる緩徐放出ポリマーカプセル、生分解性マトリックス、又は注入ポンプの使用を含む。注入ポンプは、皮下、頭蓋内、又は医学的に望ましいと考えられる他の場所に埋め込んでもよい。ある態様では、本発明の化合物はカテーテルを介して注入ポンプで脳脊髄液又は局所送達が望ましい部位、例えば神経細胞損傷部位もしくは神経変性部位に分配される。
【０００７】
本発明の一態様において、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、小分子、Ｎ−キナーゼポリペプチドもしくはそのフラグメント、抗Ｎ−キナーゼ抗体、アンチセンスＮ−キナーゼ核酸分子、リボザイム、又はＮ−キナーゼ遺伝子もしくはそのフラグメントである。
【０００８】
さらに別の側面において、本発明は、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物を、神経障害を患っている患者に治療上有効な量投与することによって、神経障害を患っている該患者を治療することを含む方法にに関する。一態様において、該方法は、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物を患者に投与する前に神経系機能、例えば感覚機能、コリン性神経支配、又は前庭運動機能の第一回目の評価を行い、該化合物を患者に投与した後に神経系機能の第二回目の評価を行うことをさらに含む。
【０００９】
更なる側面において、本発明は、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物を、Ｎ−キナーゼ又はその生物活性フラグメントを試験化合物と接触させ、該試験化合物のＮ−キナーゼの活性調節能力を測定することによって識別する方法に関する。それによって、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物が識別される。好適な態様において、試験化合物のＮ−キナーゼの活性を調節する能力は、基質、例えばヒストンＨＦ−１タンパク質のＮ−キナーゼ依存性リン酸化を調節する試験化合物の能力を評価することによって測定される。
【００１０】
一態様において、本発明の方法に使用されるＮ−キナーゼは、ヒトＮ−キナーゼ、例えば組換え製造されたヒトＮ−キナーゼである。別の態様において、本発明の方法に使用されるＮ−キナーゼは、ウシＮ−キナーゼ、例えばウシ新生仔脳組織などのウシ原料から精製されたＮ−キナーゼである。
【００１１】
別の態様において、本発明のスクリーニング法は、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する試験化合物の能力を測定することをさらに含む。
別の側面において、本発明は、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物の識別法を提供する。該方法は、Ｎ−キナーゼ又はその生物活性フラグメントを、試験化合物、Ｎ−キナーゼ基質（例えばヒストンＨＦ−１タンパク質）、放射性ＡＴＰ（例えば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）、及びＭｎ＋２と接触させ；そして基質のＮ−キナーゼ依存性リン酸化を調節する試験化合物の能力を測定することによって、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物を識別することを含む。好適な態様において、本発明の方法は、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する試験化合物の能力を測定することをさらに含む。
【００１２】
別の側面において、本発明は、前述のいずれかの方法で確認された、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物を提供する。
更なる側面において、本発明は、（ａ）新生児の脳組織（例えばヒト、ウシ、ラット又はマウスの新生児脳組織）に存在する；（ｂ）６−チオグアニンによって阻害される；（ｃ）Ｍｎ＋２によって活性化されるが、Ｍｇ＋２又はＣａ＋２によっては活性化されない；（ｄ）約４９ｋＤａの分子量を有する；および（ｅ）ＮａＣｌ濃度１．５〜１．７５Ｍでシバクロンブルーカラムから溶離される種類の単離Ｎ−キナーゼポリペプチドを提供する。
【００１３】
更なる側面において、本発明は、Ｎ−キナーゼポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体、例えば細胞内抗体を提供する。好適な態様において、該抗体は、Ｎ−キナーゼのＡＴＰ結合ドメインを含むエピトープと反応する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、Ｎ−キナーゼポリペプチドのフラグメント、例えば、Ｎ−キナーゼポリペプチドの少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、又は２００個の隣接アミノ酸を含むフラグメントを提供する。好適な態様において、Ｎ−キナーゼポリペプチドのフラグメントは免疫応答を引き出すことが可能である。
【００１５】
更なる側面において、本発明は、配列番号１のポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。
本発明の組成物（例えばＮ−キナーゼの活性を調節する化合物）及び医薬上許容しうる担体を含む医薬組成物並びに包装製剤も本発明によって提供される。
【００１６】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及びクレームから明らかになるであろう。
詳細な説明
本発明は、患者、例えば神経障害を患っている患者に神経有益効果をもたらす方法及び組成物を提供する。本発明は、少なくとも一部は、哺乳動物由来のＮ−キナーゼポリペプチドの高度に精製された形態での単離、及び該キナーゼが、網膜神経節神経細胞又は皮質錐体細胞などの哺乳動物のＣＮＳ神経細胞を含むＣＮＳ神経細胞の軸索成長に積極的役割を果たしているという発見に基づく。
【００１７】
従って、本発明は、患者にＮ−キナーゼの活性を調節する化合物を治療上有効な量投与することによって、該患者に神経有益効果をもたらす方法に関する。
本明細書中で使用している“Ｎ−キナーゼ”という用語は、すべての形態のＮ−キナーゼを含む。例えばヒトＮ−キナーゼ、ウシＮ−キナーゼ、マウスＮ−キナーゼ、ラットＮ−キナーゼ、及びブタＮ−キナーゼを含むが、これらに限定されない。ヒトＮ−キナーゼのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、Ｚｈｏｕ  Ｔ−Ｈら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４）：２５１３−２５１９及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ０８３４２０に記載されており、これらの内容は引用によって本明細書に援用する。ヒトＮ−キナーゼのアミノ酸配列を図２及び配列番号１に示す。好適な態様において、用語“Ｎ−キナーゼ”は、６−チオグアニンによって阻害され、Ｍｎ＋２によって活性化されるが、Ｍｇ＋２又はＣａ＋２によっては活性化されない、約４９ｋＤａの分子量を有するＮ−キナーゼのアイソフォームを含む。
【００１８】
本明細書中で使用している“Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物”という表現は、例えば本明細書中に記載のアッセイによって測定されるＮ−キナーゼの活性を調節、例えば刺激又は阻害する能力を有する任意の化合物を含む。そのような化合物は次のうちの一つ以上を調節することが可能である：（ａ）基質、例えばヒストンＨＦ−１タンパク質をリン酸化するＮ−キナーゼの能力；（ｂ）非Ｎ−キナーゼ分子、例えば軸索成長のシグナリング経路の下流にある分子と相互作用、例えば結合するＮ−キナーゼの能力；（ｃ）ＡＴＰ又はＭｎ＋２を結合するＮ−キナーゼの能力；又は（ｄ）中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節するＮ−キナーゼの能力。
【００１９】
好適な態様において、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、軸索成長のシグナリング経路でＡＦ−１又は他の成長因子の下流で作用する。軸索成長のシグナリング経路でＡＦ−１又は他の成長因子の下流で作用する化合物の能力は、本明細書中に記載のアッセイの一つを用いて測定できる。例えば、化合物がＮ−キナーゼの活性を刺激（例えば基質のＮ−キナーゼ依存性リン酸化を刺激）できると判定されたら、Ｎ−キナーゼを当該化合物と６−チオグアニンの両方に接触させればよい。６−チオグアニンが該化合物の刺激作用を阻害できなければ、該化合物は軸索成長シグナリング経路において６−チオグアニンの下流で作用していることを示し、６−チオグアニンが該化合物の刺激作用を阻害できれば、該化合物はシグナリング経路の上流で（又は同じ点で）作用していることを示すことになろう。あるいは、化合物がＮ−キナーゼの活性を阻害（例えば基質のＮ−キナーゼ依存性リン酸化を阻害）できると判定されたら、Ｎ−キナーゼを当該化合物とイノシンの両方に接触させればよい。イノシンが該化合物の阻害作用を妨害できなければ、該化合物は軸索成長シグナリング経路においてイノシンの下流で作用していることを示し、イノシンが該化合物の阻害作用を妨害できれば、該化合物はシグナリング経路の上流で（又は同じ点で）作用していることを示すことになろう。
【００２０】
本発明のある態様において、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、プリン塩基（例えば、グアニン、イノシン、アデノシン、及びキサンチン）、例えばリボース、デオキシリボース並びにそれらの類似体及び誘導体などの糖に連結したプリン塩基でなければ、任意の化合物であってよい。本発明のその他のある態様では、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、プリン塩基の類似体又はその誘導体でなければ、任意の化合物であってよい。
【００２１】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物の例は、小分子、Ｎ−キナーゼポリペプチドもしくはそのフラグメント、抗Ｎ−キナーゼ抗体、アンチセンスＮ−キナーゼ核酸分子、リボザイム、又はＮ−キナーゼ遺伝子もしくはそのフラグメントである。
【００２２】
本明細書中で使用している“小分子”という用語は、ペプチド、擬似ペプチド、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１モルあたり約１０，０００ｇ未満の分子量を有する有機又は無機化合物（すなわちヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を含む）、１モルあたり約５，０００ｇ未満の分子量を有する有機又は無機化合物、１モルあたり約１，０００ｇ未満の分子量を有する有機又は無機化合物、１モルあたり約５００ｇ未満の分子量を有する有機又は無機化合物、並びにそのような化合物の塩、エステル、および他の医薬上許容しうる形態などを含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中で使用している“神経有益効果”とは、神経細胞、神経系の一部、又は神経系全般の健康又は機能に対して有益な応答又は結果を意味する。そのような効果の例は、神経細胞又は神経系の一部の、障害に抵抗する、再生する、望ましい機能を維持する、成長する又は生存するなどの能力に改善がみられることを含む。“神経有益効果をもたらす”という句は、神経系の構成成分内の機能又は回復力に、そのような応答又は改善をもたらす又は達成することを含む。例えば、神経有益効果をもたらすことの例として、神経細胞損傷後の軸索成長を刺激する；神経細胞にアポトーシスに対する抵抗性を持たせる；神経細胞にβ−アミロイド、アンモニア、又は他の神経毒などの毒性化合物に対する抵抗性を持たせる；加齢に伴う神経細胞の萎縮又は機能喪失を元に戻す；又は加齢に伴うコリン性神経支配を元に戻す、などが考えられる。
【００２４】
本明細書中で使用している“中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する”という表現は、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を様々なレベルに刺激又は阻害する能力を含むことを意味する。様々なレベルとは、例えば標的とする神経障害の治療を可能にするレベルである。
【００２５】
本明細書中で使用している“成長”（すなわち軸索成長）という用語は、軸索がＣＮＳ神経細胞から軸索が成長する過程に関して言う。この成長で、完全に新しい軸索又は部分的に損傷した軸索の修復がもたらされうる。成長は典型的には、軸索突起の長さが少なくとも細胞径の５倍伸びることで証明される。さらに、軸索成長はＧＡＰ−４３の発現（これは例えば免疫染色によって検出できる）によっても証明できる。
【００２６】
本明細書中で使用している“ＣＮＳ神経細胞”という用語は、神経成長因子（ＮＧＦ）に反応しない脳及び脊髄の神経細胞を含むことを意図する。この用語には、星状神経膠細胞、乏突起神経膠細胞、小グリア細胞、脳室上衣などの支持細胞又は保護細胞は含まれず、また末梢神経系（例えば体神経系、自律神経系、交感神経系、副交感神経系）の神経細胞も含まれないことを意図する。好適なＣＮＳ神経細胞は、哺乳動物の神経細胞、更に好ましくはヒトの神経細胞である。
【００２７】
患者に“投与する”という用語は、医薬製剤中の活性化合物を、患者体内の所望の場所に該活性化合物を送達するのにふさわしい任意の適切な経路によって患者に分配、送達又は塗布することを含む。例えば、非経口又は経口経路のいずれかによる送達、筋肉内注射、皮下／皮内注射、静脈内注射、頬内投与、経皮送達、及び直腸、結腸、膣、鼻腔内又は気道経路による投与などを含む。
【００２８】
本明細書中で使用している“接触させる”という表現は、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物が、ＣＮＳ神経細胞からの軸索突起の成長を調節することができるように、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物をＣＮＳ神経細胞に接近させるインビボ又はインビトロ両方の方法を含むことを意図する。
【００２９】
本明細書中で使用している“患者”という用語は動物を含むことを意図する。特別の態様において、患者は哺乳動物、ヒト又はヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ又は齧歯類である。
【００３０】
本明細書中で使用している“有効量”という用語は、必要な用量及び期間で、患者に神経有益効果をもたらすに足るような所望の結果を達成するための有効な量を含む。本明細書中に規定された活性化合物の有効量は、患者の病状、年齢及び体重などの要因、並びに患者に所望の応答を引き出す活性化合物の能力によって異なりうる。投与計画は最適な治療応答が提供されるように調整できる。有効量とは、活性化合物の有毒又は有害作用（あるとすれば）に治療上の有益効果が優る量でもある。
【００３１】
活性化合物の治療上有効な量又は用量は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であろう。本発明の他の範囲としては、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約２〜９ｍｇ／ｋｇ、約３〜８ｍｇ／ｋｇ、約４〜７ｍｇ／ｋｇ、約５〜６ｍｇ／ｋｇ体重などである。当業者であれば、ある種の要因が患者を効果的に治療するのに必要な用量に影響を及ぼしうることは分かるであろう。ある種の要因とは、疾患又は障害の重症度、過去の治療、患者の一般的健康状態及び／又は年齢、並びに他の既存疾患などを含むが、これらに限定されない。さらに、活性化合物の治療上有効な量で患者を治療するということには、１回の治療又は連続治療が含まれうる。一例では、患者を、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の活性化合物で、週１回、約１〜１０週間、あるいは２〜８週間、約３〜７週間、又は約４、５、もしくは６週間治療する。また、治療に使用する活性化合物の有効用量は、個々の治療期間中増減できることも理解されるであろう。
【００３２】
“神経障害”は、患者の神経系の正常な機能又は解剖学的所見に直接又は間接的影響を及ぼす疾患、障害又は状態を含むことを意図する。本発明の化合物及び方法で効果的に治療できる障害にさらされる神経系の要素は、神経系の中枢、末梢、体、自律、交感及び副交感成分、眼・耳・鼻・口又は他の器官内の神経感覚組織、並びに神経細胞及び構造に付随するグリア組織などである。神経障害は、機械的損傷又は毒性化合物による傷害などの神経細胞損傷によって、神経細胞の異常成長又は発生によって、又は神経細胞活性の調節不良（例えばダウンレギュレーション又はアップレギュレーション）によってもたらされる。神経障害は、感覚機能（体内及び外界の変化を感知する能力）；統合機能（変化を解釈する能力）；及び運動機能（解釈に応答して筋収縮又は腺分泌などの作用を開始する能力）などの神経系の機能に有害な影響を及ぼすことができる。神経障害の例は、末梢神経又は脳神経、脊髄に対する、又は脳、脳神経に対する外傷又は毒性傷害、外傷性脳傷害、脳卒中、虚血、脳動脈瘤、及び脊髄損傷などである。他の神経障害は、アルツハイマー病、アルツハイマーに関連する痴呆（ピック病など）、パーキンソン病及び他のびまん性レーヴィ小体病、老人性痴呆、ハンチントン病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性運動及び感覚ニューロパシー（シャルコー・マリー・ツース病）、糖尿病性ニューロパシー、進行性核上麻痺、てんかん、及びヤコブ・クロイツフェルト病などの認知及び神経変性障害などである。自律神経機能障害は、高血圧及び睡眠障害を含む。うつ、精神分裂病、分裂情動性障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害、又は恐怖障害、学習もしくは記憶障害（健忘及び加齢関連の記憶喪失など）、注意欠陥障害、自閉症、胸腺障害、大抑うつ障害、躁病、強迫性障害、精神作用性物質の使用による障害、不安、恐怖、パニック障害、双極性感情病、心因性疼痛症候群、及び摂食障害などの神経精神障害も本発明の化合物及び方法による治療の対象である。その他の神経障害の例は、感染症（髄膜炎、種々の病因による高熱、ＨＩＶ、梅毒、又は小児麻痺後症候群など）による神経系への傷害、電気（電気接触、電撃、及び電気痙攣による精神医学的療法に由来する合併症を含む）による神経系への傷害などである。発達中の脳は、妊娠の各期だけでなく乳幼児期にわたる中枢神経系の発達中、神経毒性の標的となり、本発明の方法は、神経学的な先天異常児を含め、子宮内の胚子又は胎児、未熟児、又はそのような治療を必要とする小児の神経障害の予防又は治療に利用できる。さらにその他の神経障害は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｒａｕｎｗａｌｄら、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，２００１）及びｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ’ｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ＤＳＭ−ＩＶ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載されているものなどである。この２文献は、その全内容を引用によって本明細書に��用する。
【００３３】
“脳卒中”は専門用語で、脳動脈の破裂又は閉塞（例えば血液凝固による）によって発生する意識、知覚、及び随意運動の突然の減退又は喪失を含むことを意図する。
【００３４】
“外傷性脳傷害”は専門用語で、頭部への外傷性打撃によって脳又は接続する脊髄が、多くは頭蓋骨の貫通なしに損傷される状態を含むことを意図する。通常、初期外傷で、拡張性血腫、くも膜下出血、脳水腫、頭蓋内圧上昇、及び脳低酸素が起き、ひいては脳血流低下による重篤な二次的事象に至る可能性がある。
【００３５】
別の側面において、本発明は、（ａ）新生児の脳組織（例えばヒト、ウシ、ラット又はマウスの新生児脳組織）に存在する；（ｂ）６−チオグアニンによって阻害される；（ｃ）Ｍｎ＋２によって活性化されるが、Ｍｇ＋２又はＣａ＋２によっては活性化されない；（ｄ）約４９ｋＤａの分子量を有する；そして（ｅ）ＮａＣｌ濃度１．５〜１．７５Ｍでシバクロンブルーカラムから溶離される種類の単離Ｎ−キナーゼポリペプチドを提供する。本明細書中で使用している“単離”Ｎ−キナーゼポリペプチドは、Ｎ−キナーゼタンパク質が誘導される原料の細胞又は組織に由来する細胞物質又は他の混入タンパク質が実質的に除去されている（すなわち除去率９５％超）、あるいは化学合成した場合には化学前駆体又は他の化学物質が実質的に除去されている。“細胞物質が実質的に除去されている”という表現は、Ｎ−キナーゼが単離又は組換え製造された細胞の細胞成分からタンパク質が分離されているＮ−キナーゼ調整品を含む。一態様では、“細胞物質が実質的に除去されている”という表現は、約２０％未満（乾燥重量）の非Ｎ−キナーゼタンパク質（すなわち混入タンパク質）、更に好ましくは約１０％未満の非Ｎ−キナーゼタンパク質、なお更に好ましくは約５％未満の非Ｎ−キナーゼタンパク質、最も好ましくは約３％未満の非Ｎ−キナーゼタンパク質しか含まないＮ−キナーゼタンパク質調整品を含む。Ｎ−キナーゼタンパク質又はその生物活性部分が組換え製造された場合、培養培地も実質的に除去されているのが好ましい。すなわち培養培地は、タンパク質調整品の体積の約２０％未満、更に好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【００３６】
更に別の側面において、本発明は、Ｎ−キナーゼポリペプチド、例えば配列番号１のＮ−キナーゼポリペプチドをコードする単離核酸分子も提供する。
本発明の様々な側面を以下の小節で更に詳細に説明する。
患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物の識別法
一側面において、本発明は、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物を、Ｎ−キナーゼポリペプチド又はその生物活性フラグメントを試験化合物と接触させ、該試験化合物のＮ−キナーゼの活性調節能力を測定することによって識別する方法を提供する。それによって患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物が識別される。
【００３７】
本発明の試験化合物は、当該技術分野で知られているコンビナトリアルライブラリー法の数多くの手法のいずれかを用いて得ることができる。例えば、生物ライブラリー；空間的にアドレス可能な並列固相又は溶液相ライブラリー；解析（デコンヴォルーション）を要する合成ライブラリー法；‘ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ’ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー法を含む。生物ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の四つの手法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は小分子の化合物ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【００３８】
分子ライブラリーの合成法の例は、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見つけることができる。
【００３９】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、又はビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）又はファージ上（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ  上記）に提供できる。
【００４０】
一態様において、アッセイは細胞ベースのアッセイである。すなわち、Ｎ−キナーゼタンパク質又はその生物活性部分を発現している細胞を試験化合物と接触させ、Ｎ−キナーゼの活性を調節する試験化合物の能力を測定する。Ｎ−キナーゼの活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えば、Ｎ−キナーゼを発現している細胞に産生された一つ以上の特異的代謝産物をモニタすることによって達成できる（例えば、Ｓａａｄａら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６９：３８２−３８６参照）。細胞は、例えば哺乳動物由来の、例えば神経細胞であり得る。
【００４１】
Ｎ−キナーゼの活性を調節する試験化合物の能力の測定は、さらに、例えば、Ｎ−キナーゼの基質リン酸化能力を測定することによっても達成できる。基質（例えばヒストンＨＦ−１タンパク質）をリン酸化するＮ−キナーゼの能力は、例えばインビトロキナーゼアッセイによって測定できる。簡単に述べると、Ｎ−キナーゼを、ＭｎＣｌ２、例えば５ｍＭのＭｎＣｌ２含有緩衝液中で、基質及び放射性ＡＴＰ、例えば［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰとインキュベートする。インキュベーション後、基質を免疫沈降又はＴＣＡで沈降又はフィルタ上に回収（他のキナーゼがない場合）し、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、膜、例えばＰＶＤＦ膜に転写し、オートラジオグラフィーで記録できる。オートラジオグラフ上に検出可能なバンドが出現したら、基質がリン酸化されたことを示す。あるいは、実施例１に記載のインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）アッセイを用いて、Ｎ−キナーゼの基質リン酸化能力を測定することもできる。リン酸化された基質のホスホアミノ酸分析を行えば、タンパク質のどの残基がリン酸化されたかを調べることもできる。簡単に説明すると、放射性リン酸化タンパク質のバンドをＳＤＳゲルから切り取り、部分酸加水分解を行う。次に、生成物を一次元電気泳動によって分離し、例えばホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）で分析し、ニンヒドリン染色ホスホアミノ酸標準と比較すればよい。
【００４２】
軸索成長のシグナリング経路の下流にあるような非キナーゼ分子に結合しているＮ−キナーゼを調節する試験化合物の能力も測定できる。非キナーゼ分子に結合しているＮ−キナーゼを調節する試験化合物の能力の測定は、例えば、非Ｎ−キナーゼ分子に放射性同位体又は酵素標識を連結し、非Ｎ−キナーゼ分子とＮ−キナーゼとの結合を、複合体中の標識非キナーゼ分子の検出によって測定することで達成できる。
【００４３】
Ｎ−キナーゼ又はその生物活性部分と相互作用する、例えば結合する試験化合物の能力の測定も本発明の範囲に含まれる。本発明のアッセイに使用されるＮ−キナーゼタンパク質の好適な生物活性部分は、非キナーゼ分子との相互作用に参加するフラグメント、例えば表面プロバビリティスコアの高いフラグメントを含む。Ｎ−キナーゼを結合する試験化合物の能力の測定は、例えば、化合物に放射性同位体又は酵素標識を連結し、化合物とＮ−キナーゼとの結合を、複合体中の標識Ｎ−キナーゼ化合物の検出によって測定することで達成できる。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで直接又は間接的に標識でき、放射性同位体は、放射発光の直接計数又はシンチレーション計数によって検出できる。あるいは、試験化合物を、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素標識してもよく、酵素標識は適当な基質の生成物への転換を測定することによって検出できる。
【００４４】
Ｎ−キナーゼと相互作用する試験化合物の能力の測定は、いずれの反応物も標識せずに達成できる。例えば、マイクロフィジオメーターを使用すれば、化合物又はＮ−キナーゼのどちらかを標識しなくても化合物とＮ−キナーゼとの相互作用が検出できる。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２。本明細書中で使用している“マイクロフィジオメーター”（例えばＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレス可能電位計測法（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物とＮ−キナーゼ間の相互作用の指標として使用できる。
【００４５】
Ｎ−キナーゼ又はその生物活性部分に結合する試験化合物の能力の測定は、リアルタイム生体分子間相互作用解析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＢＩＡ）のような技術を用いても達成できる。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．及びＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５並びにＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５。本明細書中で使用している“ＢＩＡ”は、いずれの反応物も標識せずに生物特異的な相互作用をリアルタイムで研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を、生物分子間のリアルタイム反応の指標として使用できる。
【００４６】
代替の態様では、試験化合物のＮ−キナーゼの活性調節能力の測定は、Ｎ−キナーゼタンパク質が更にＮ−キナーゼ標的分子の下流エフェクターの活性を調節する能力の測定によっても達成できる。例えば、適当な標的に対するエフェクター分子の活性を測定しても、又は適当な標的へのエフェクターの結合を前述のように測定してもよい。
【００４７】
本発明の上記アッセイ法の一つ以上の態様において、いずれかの反応物、例えばＮ−キナーゼ又は非Ｎ−キナーゼ分子を固定して、一つ又は両方のタンパク質の非複合体から複合体の分離を容易にし、並びにアッセイの自動化に対応させるのが望ましいと思われる。試験化合物とＮ−キナーゼとの結合、又は試験化合物の存在下および非存在下におけるＮ−キナーゼと非Ｎ−キナーゼ分子との相互作用は、反応物を含有するのに適切な任意の容器中で達成できる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、及びマイクロ遠心分離管などである。一態様では、一つ又は両方のタンパク質をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を使うこともできる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｎ−キナーゼ融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ミズーリ州セントルイス）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着させることができる。次に、これを試験化合物、又は試験化合物及び吸着させてない非Ｎ−キナーゼ分子又はＮ−キナーゼのいずれかと組み合わせ、その混合物を複合体形成に導く条件下でインキュベートする（例えば塩及びｐＨについては生理的条件で）。インキュベーション後、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを洗浄し、非結合成分があればそれを除去し、ビーズの場合マトリックスを固定し、複合体を例えば前述のように直接的又は間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離し、Ｎ−キナーゼの結合又は活性のレベルを標準技術を用いて測定してもよい。
【００４８】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術も、本発明のスクリーニングアッセイに使用できる。例えば、Ｎ−キナーゼ又は非Ｎ−キナーゼ分子のいずれかを、ビオチン−ストレプトアビジン複合を利用して固定することができる。ビオチン化Ｎ−キナーゼ又は非Ｎ−キナーゼ分子は、当該技術分野で公知の技術を用いて（例えばビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州ロックフォード）、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から製造でき、それをストレプトアビジン被覆９６穴滴板（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定する。あるいは、Ｎ−キナーゼ又は非Ｎ−キナーゼ分子と反応するが、Ｎ−キナーゼのその標的非Ｎ−キナーゼ分子への結合は妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化し、結合していない非Ｎ−キナーゼ分子又はＮ−キナーゼをウェル中で抗体結合によって捕捉してもよい。そのような複合体の検出法は、ＧＳＴ−固定複合体に関して前述した方法の他に、Ｎ−キナーゼ又は非Ｎ−キナーゼ分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出法、並びにＮ−キナーゼ又は非Ｎ−キナーゼ標的分子に付随する酵素活性の検出に頼る酵素連結アッセイ法などがある。
【００４９】
別の態様では、Ｎ−キナーゼ発現モジュレーターを、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中のＮ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質発現を測定するという方法で識別する。候補化合物の存在下でのＮ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを、候補化合物の不在下でのＮ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較する。この比較を基にして、候補化合物がＮ−キナーゼ発現モジュレーターであると識別できる。例えば、Ｎ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質発現が候補化合物の不在下よりも存在下で大きい（統計的に有意に大きい）場合、該候補化合物はＮ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質発現のスティミュレーター（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）と確認される。又は、Ｎ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の不在下よりも存在下で小さい（統計的に有意に小さい）場合、該候補化合物はＮ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質発現のインヒビターと確認される。細胞中のＮ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質発現レベルは、Ｎ−キナーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質の検出に関して本明細書中に記述した方法によって測定できる。
【００５０】
本発明の更に別の側面では、Ｎ−キナーゼタンパク質をｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ又はｔｈｒｅｅ−ｈｙｂｒｉｄアッセイの“ｂａｉｔ（おとり）タンパク質”として使用することができる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；及びＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００参照）。そうすることで、Ｎ−キナーゼに結合又は相互作用するタンパク質（“Ｎ−キナーゼ結合タンパク質”又は“Ｎ−キナーゼ−ｂｐ”）であって、Ｎ−キナーゼの活性に関与する他のタンパク質を確認することができる。このようなＮ−キナーゼ結合タンパク質は、例えばＮ−キナーゼが介在するシグナリング経路の下流エレメントとして、Ｎ−キナーゼタンパク質又はＮ−キナーゼ標的によるシグナルの伝播にも関与しているようである。あるいは、このようなＮ−キナーゼ結合タンパク質は、Ｎ−キナーゼインヒビターの可能性もある。
【００５１】
ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法は、ほとんどの転写因子のモジュール（構造単位）の性質を利用したものである。転写因子は分離可能なＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインからなる。簡単に述べると、本アッセイは、二つの異なるＤＮＡ構成体を利用する。一方の構成体は、Ｎ−キナーゼタンパク質をコードする遺伝子を、既知転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合させておく。他の構成体は、未確認タンパク質（“ｐｒｅｙ（えじき）”又は“試料”）をコードするＤＮＡ配列ライブラリーから選んだＤＮＡ配列を、既知転写因子の活性化ドメインをコード化する遺伝子に融合させておく。“ｂａｉｔ”と“ｐｒｅｙ”タンパク質はインビボで相互作用できれば、Ｎ−キナーゼ依存性複合体を形成し、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインは接近する。この接近によりレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子は、転写因子に応答する転写調節部位に機能可能に連結されている。レポーター遺伝子の発現は検出できるので、機能する転写因子を含有している細胞コロニーを単離して、Ｎ−キナーゼタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得るのに使用できる。
【００５２】
別の側面において、本発明は、本明細書中に記載の二つ以上のアッセイの組合せに関する。例えば、調節化合物は、細胞ベース又は細胞を使用しないアッセイを用いて識別でき、該化合物のＮ−キナーゼタンパク質調節能力はインビボで確認できる。ここで言うインビボとは、例えば、中枢神経系の神経細胞の異常な、例えば不十分な軸索成長を特徴とする状態用の動物モデルのような動物体内である。そのような動物モデルの例は、例えば、Ｂｅｎｏｗｉｔｚら（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６（２３）：１３４８６−９０に記載されている。てんかん動物モデルも当該技術分野では知られている。
【００５３】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイで確認された新規化合物にも関する。従って、本明細書に記載のようにして確認された化合物を適当な動物モデルに使用することも本発明の範囲に含まれる。例えば、本明細書に記載のようにして確認された化合物（例えば、Ｎ−キナーゼ調節化合物、アンチセンスＮ−キナーゼ核酸分子、Ｎ−キナーゼ特異的抗体、又はＮ−キナーゼ結合パートナー ）を動物モデルに使用して、そのような化合物を用いた治療の有効性、毒性、又は副作用を調べることができる。あるいは、本明細書に記載のようにして確認された化合物を動物モデルに使用して、そのような化合物の作用機序を調べることもできる。さらに、本発明は、前述のスクリーニングアッセイによって確認された新規化合物を本明細書に記載のような治療に使用することにも関する。
【００５４】
一態様では、本発明の方法に使用するＮ−キナーゼはヒトＮ−キナーゼ、例えば組換え製造されたＮ−キナーゼである。Ｎ−キナーゼ、例えばヒトＮ−キナーゼは、標準技術を用いて組換え発現ベクターに導入し、原核細胞又は真核細胞に発現させてよい。例えば、ヒトＮ−キナーゼのようなＮ−キナーゼは、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞に発現できる。適切な宿主細胞については、さらに、ＧｏｅｄｄｅｌのＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンジエゴ（１９９０）に記載されている。あるいは、ヒトＮ−キナーゼのようなＮ−キナーゼを含有する組換え発現ベクターを、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳してもよい。
【００５５】
別の態様では、本発明の方法に使用するＮ−キナーゼはウシＮ−キナーゼ、例えば、本明細書中、例えば実施例１に記載のようなウシ新生仔脳組織などのウシ原料から精製されたＮ−キナーゼである。
【００５６】
別の態様において、本発明の方法は、さらに、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する試験化合物の能力の測定も含む。中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する試験化合物の能力の測定は、例えば、精製ラット網膜神経節細胞の解離培養物を用いて達成できる。精製ラット網膜神経節細胞の解離培養物は、例えば、Ｂａｒｒｅｓら、Ｎｅｕｒｏｎ，１：７９１−８０３，１９８８（この内容は引用によって本明細書に援用する）に記載のような免疫パンニング法によって製造できる。簡単に述べると、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの網膜はシステインで活性化されたパパインを用いて解離できる。マクロファージは、抗ラットマクロファージ抗体（Ａｃｃｕｒａｔｅ）とのインキュベーション、次いで抗ウサギＩｇＧ抗体による免疫パンニングによって除去される。神経節細胞は、抗Ｔｈｙ−１抗体による免疫パンニングによって単離し、次いで低密度培養に使用するためにトリプシンで取り除く。ラット網膜神経節細胞は、３０ｍＭの炭酸水素塩が存在する以外は前述のと同じ培地を用いて、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃に維持される。
【００５７】
試料を２４穴滴板の無作為の４ヶ所に入れ、試験化合物と接触させる。成長を盲検法で確認するためにコードは隠す。各実験は、４ウェルの陰性対照（培地とサプリメントだけ）と４ウェルの陽性対照（例えば活性が既知の標準化ＡＦ−１試料）を含みうる。各ウェルの２５の連続した領域におけるすべての神経節細胞について、成長と生存を６日後に位相差顕微鏡を用いて４００倍の倍率で評価する（１ウェルあたり約１５０個の神経節細胞を数えた）。５細胞径分の長さの突起の伸長を成長の基準として使用する。というのは、それによって、刺激された細胞が陰性対照から明らかに区別できるからである（Ｓｃｈｗａｌｂら、１９９５）。計数の完了後、コードを明らかにし、データを表にまとめて、平均と標準誤差をＣｒｉｃｋｅｔ  Ｇｒａｐｈ（ＣＡ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，ニューヨーク州アイランディア）を用いて各試料の４ヶ所のウェルについて算出する。データは、陰性対照の成長（通常４〜５％）を差し引き、陽性対照の正味成長で割って標準化する。
【００５８】
金魚網膜神経節細胞（Ｂｅｎｏｗｉｔｚら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４５）：２９６２６−３４）並びにラットと金魚の神経節細胞混合物も使用できる。
【００５９】
さらに、患者に神経有益効果をもたらす試験化合物の能力も各種の公知手順及びアッセイを用いて評価できる。例えば、ＣＮＳ損傷などの傷害後の神経細胞の接続及び／又は機能を再確立する試験化合物の能力は組織学的に判定できる（神経細胞組織をスライスして神経細胞の分枝を見る、又は染料の細胞質輸送を示す、のいずれかにより）。ＣＮＳ損傷などの傷害後の神経細胞の接続及び／又は機能を再確立する本発明の化合物の能力は、神経網膜もしくは視神経の損傷後、網膜電図を完全にもしくは部分的に回復する；又は損傷眼の光に対する瞳孔反応を完全にもしくは部分的に回復する試験化合物の能力をモニタすることによっても評価することができる。
【００６０】
患者に神経有益効果をもたらすＮ−キナーゼモジュレーターの能力を測定するのに使用できる他の試験は、脊髄損傷のヒト患者又は動物モデルにおける神経機能の標準試験（例えば、標準反射試験、泌尿器試験、尿力学試験、深部痛及び表在痛評価試験、後肢の固有受容配置、歩行、及び誘発電位試験）を含む。さらに、神経有益効果が生じた指標として、伝導活動電位の測定などによって患者の神経インパルス伝導を測定してもよい。
【００６１】
本発明のアッセイでの使用に適切な動物モデルは部分離断ラットモデル（Ｗｅｉｄｎｅｒら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３５１３−３５１８に記載）を含む。この動物モデルで、ほぼ完全に離断された索の無傷の残存フラグメントの生存と発芽を化合物がいかによく増進できるかを試験する。従って、Ｎ−キナーゼモジュレーターの投与後、これらの動物のある種の機能、例えばラットが前脚でペレット餌をいかにうまく扱えるかといった機能の回復を評価する（関係する索の９７％が切除されている）。
【００６２】
本発明のアッセイでの使用に適切な別の動物モデルは脳卒中ラットモデル（Ｋａｗａｍａｔａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１５）：８１７９−８１８４に記載）を含む。この論文に、四肢の感覚運動機能及び傷害後の前庭運動機能を評価するのに使用できる様々な試験が詳細に解説されている。これらの動物に本発明のＮ−キナーゼモジュレーターを投与すると、所定の化合物、投与経路、又は用量によって、神経有益効果がもたらされたかどうか、例えば試験動物の機能レベルが向上した、又は機能回復速度もしくは機能保持程度が増加したかどうかを評価するのに使用できる。
【００６３】
脳卒中後のヒト患者の進行を評価するのに使用される標準の神経学的評価も、患者に神経有益効果をもたらすＮ−キナーゼモジュレーターの能力を評価するのに使用できる。そのような標準の神経学的評価は、医学分野では日常的なものであり、例えばＭｏｈｒ及びＧａｕｔｉｅｒ編“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｉｎｃ．１９９５）に記載されている。
【００６４】
末梢神経系の機能評価のための標準試験は、筋電図、神経伝導速度測定、誘発電位評価及び上肢／下肢体性感覚誘発電位などである。筋電図試験は、筋肉の電気活性を記録するので、神経及び筋肉の機能の評価に使用される。電極を筋肉に挿入し、その電気活性を記録する。筋肉が静止している間及び収縮している間、挿入中の活性を記録する。神経伝導速度試験は、電気インパルスが伝わる速さを記録することによって末梢神経の健康度を評価する。末梢神経は脊髄と筋肉間の情報を伝達する。いくつかの神経系の疾患はこのインパルス速度を低下させうる。皮膚に配置した電極が、インパルスが神経に沿って動いた後の電気信号を検出し記録する。第二の刺激電極から神経に沿ってわずかな電荷を送る。刺激と応答間の時間が記録され、インパルスがいかに迅速に全面的に送られるかが調べられる。
【００６５】
脳神経機能の標準試験は、神経医学分野の専門家には公知の通り、顔面神経伝導試験；眼輪筋反射試験（まばたき反射試験）；局所顔面神経病変、ベル麻痺、三叉神経痛、及び非定型顔面痛に使用されるような三叉神経−顔面神経反射評価；誘発電位評価；視覚性、脳幹及び聴覚性誘発電位測定；熱診断細線維試験；及びコンピュータ支援による定量感覚試験などである。
患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物
別の側面において、本発明は、前述のいずれかの方法で確認された、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物にも関する。
【００６６】
一態様では、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物は、アンチセンスＮ−キナーゼ核酸分子である。“アンチセンス”核酸は、タンパク質をコードする“センス”核酸に対して相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的又はｍＲＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は、全Ｎ−キナーゼコード鎖に対して、又はその一部のみに対して相補的であり得る。一態様では、アンチセンス核酸分子は、Ｎ−キナーゼをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の“コード領域”に対してアンチセンスである。“コード領域”という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域のことである。別の態様では、アンチセンス核酸分子は、Ｎ−キナーゼをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の“非コード領域”に対してアンチセンスである。“非コード領域”という用語は、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する５’及び３’配列のことである（すなわち、５’及び３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
【００６７】
Ｎ−キナーゼをコードするコード鎖配列が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックの塩基対の規則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子は、Ｎ−キナーゼｍＲＮＡの全コード領域に対して相補的であってもよいが、Ｎ−キナーゼｍＲＮＡのコード又は非コード領域の一部にだけアンチセンスであるオリゴヌクレオチドのほうが好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ−キナーゼｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域に対して相補的でありうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成及び当該技術分野で公知の手順による酵素連結反応を用いて構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドを用いて、又は分子の生物学的安定性を増大させるように、あるいはアンチセンス及びセンス核酸間に形成された二本鎖の物理的安定性を増大させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成できる。例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる。アンチセンス核酸の作成に使用できる修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンなどである。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス指向でサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物的に製造することもできる（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、興味ある標的核酸に対してアンチセンス指向となる。以下の小節でさらに解説）。
【００６８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には患者に投与されるかまたは生体内原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で生成され、Ｎ−キナーゼタンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡとハイブリッドを形成する又は結合し、それによって、例えば転写及び／又は翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害する。ハイブリッド形成は、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるか、又は例えばＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特異的相互作用による。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、例えば脳の組織部位における直接注入を含む。あるいは、アンチセンス核酸分子を選択された細胞を標的とするように改変して全身投与することもできる。例えば、全身投与の場合、例えば、アンチセンス核酸を細胞表面の受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に連結することによって、選択された細胞表面に発現された受容体又は抗原に特異的に結合させるようにアンチセンス分子を改変できる。アンチセンス核酸分子は、本明細書中に記載のベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、ベクターの構成体は、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌ  ＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置くようなものが好ましい。
【００６９】
さらに別の態様では、アンチセンスＮ−キナーゼ核酸分子は、α−アノマー核酸分子であり得る。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、これは、通常のβ−ユニットとは反対に鎖が互いに平行に走っている（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は，２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含むこともできる。
【００７０】
さらに別の態様では、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する化合物はリボザイムである。リボザイムは、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断できるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子であり、一本鎖核酸に対する相補的領域を有している。従って、リボザイム（例えばハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載））を利用してＮ−キナーゼｍＲＮＡの転写物を触媒的に切断すれば、Ｎ−キナーゼｍＲＮＡの翻訳を阻害できる。Ｎ−キナーゼをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、Ｎ−キナーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＮ−キナーゼをコードするｍＲＮＡ中の切断されるヌクレオチド配列に対して相補的な、テトラヒメナ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築できる。例えば、Ｃｅｃｈら米国特許第４，９８７，０７１号；及びＣｅｃｈら米国特許第５，１１６，７４２号参照。あるいは、Ｎ−キナーゼｍＲＮＡは、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡをＲＮＡ分子プールから選ぶのに使用することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．及びＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８参照。
【００７１】
あるいは、Ｎ−キナーゼ遺伝子発現は、Ｎ−キナーゼの調節領域（例えばＮ−キナーゼプロモーター及び／又はエンハンサー）に対して相補的なヌクレオチドを標的にして、標的細胞内でＮ−キナーゼ遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することによって阻害することもできる。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；及びＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７−１５参照。
【００７２】
さらに別の態様では、中枢神経系の神経細胞の軸索成長を調節する化合物は、抗Ｎ−キナーゼ抗体である。全長Ｎ−キナーゼタンパク質、又はその代わりにＮ−キナーゼの抗原ペプチドフラグメントを免疫原として使用して抗Ｎ−キナーゼ抗体を作製する。Ｎ−キナーゼの抗原ペプチドは、配列番号１で示したアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、Ｎ−キナーゼのエピトープも包含する。その結果、ペプチドに対して作られた抗体は、Ｎ−キナーゼタンパク質と特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、更に好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、なお更に好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。
【００７３】
抗原ペプチドに包含される好適なエピトープは、タンパク質表面に位置するＮ−キナーゼの領域、例えば親水性領域、並びに高抗原性の領域である。
Ｎ−キナーゼ免疫原は、典型的には適切な対象（例えばウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物）を免疫原で免疫化して抗体を製造するのに使用される。適切な免疫原調製物は、例えば、組換え発現されたＮ−キナーゼタンパク質又は化学合成されたＮ−キナーゼポリペプチドを含有できる。該製剤は、さらにフロイント完全又は不完全アジュバントのようなアジュバント、又は同様の免疫刺激剤を含んでもよい。免疫原Ｎ−キナーゼ調製物による適切な対象の免疫化によって、ポリクロナール抗Ｎ−キナーゼ抗体反応が誘発される。
【００７４】
本明細書中で使用している“抗体”という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、Ｎ−キナーゼのような抗原を特異的に結合する（免疫反応をする）抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、抗体をペプシンのような酵素で処理することによって得られるＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。本発明は、Ｎ−キナーゼ分子を結合するポリクロナール及びモノクロナール抗体を提供する。本明細書中で使用している“モノクロナール抗体”又は“モノクロナール抗体組成物”という用語は、Ｎ−キナーゼの特定のエピトープと免疫反応することが可能な１種の抗原結合部位のみを含有する抗体分子集団のことである。従って、モノクロナール抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定のＮ−キナーゼタンパク質に対して単一の結合親和性を示す。
【００７５】
ポリクロナール抗Ｎ−キナーゼ抗体は、前述のように適切な対象をＮ−キナーゼ免疫原で免疫化することによって製造できる。免疫化された対象の抗Ｎ−キナーゼ抗体価は、固定したＮ−キナーゼを用いてエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような標準技術によって時間に対してモニタできる。所望であれば、Ｎ−キナーゼに対する抗体分子を哺乳動物（例えば血液）から単離し、プロテインＡクロマトグラフィーのような周知技術によってさらに精製し、ＩｇＧフラクションを得ることもできる。免疫化してから適当な時間経過後、例えば抗Ｎ−キナーゼ抗体価が最大になったら、抗体産生細胞を被験者から採取し、原著がＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７のハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；及びＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５も参照）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）又はトリオーマ技術のような標準技術によってモノクロナール抗体を製造するのに使用できる。モノクロナール抗体ハイブリドーマの製造技術はよく知られている（一般的に、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに収載されているＲ．Ｈ．ＫｅｎｎｅｔｈのＡ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ニューヨーク州ニューヨーク（１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６参照）。簡単に述べると、不死細胞系（典型的には骨髄腫）を、前述のように、Ｎ−キナーゼ免疫原で免疫化した哺乳動物のリンパ球（典型的には脾細胞）に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養物上清をスクリーニングして、Ｎ−キナーゼを結合するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマを識別する。
【００７６】
リンパ球と不死化細胞系を融合するのに使用される多くの周知プロトコルのいずれもが、抗Ｎ−キナーゼモノクロナール抗体の製造に適用できる（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．（上記）；Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（上記）；Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（上記）参照）。さらに、当業者であれば、同様に有用な、そのような方法の多くの変形があることは理解されよう。典型的には、不死細胞系（例えば骨髄腫細胞系）はリンパ球と同種の哺乳動物から誘導される。例えば、マウスのハイブリドーマは、本発明の免疫原製剤で免疫化したマウスのリンパ球をマウスの不死化細胞系と融合させることによって製造できる。好適な不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地（“ＨＡＴ培地”）に感受性のあるマウスの骨髄腫細胞系である。いくつかの骨髄腫細胞系、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞系のいずれもが、標準技術に従って融合パートナーとして使用できる。これらの骨髄腫細胞系はＡＴＣＣから入手できる。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）を用いてマウスの脾細胞に融合する。融合の結果得られたハイブリドーマ細胞は、次にＨＡＴ培地を用いて選別する。ＨＡＴ培地は、非融合細胞及び生産力のない融合骨髄腫細胞を死滅させる（非融合脾細胞は、形質転換されないために数日後に死滅する）。本発明のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養物の上清をＮ−キナーゼを結合する抗体について、例えば標準のＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングすることによって検出される。
【００７７】
モノクロナール抗体分泌ハイブリドーマを製造する代わりに、Ｎ−キナーゼを用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって、モノクロナール抗Ｎ−キナーゼ抗体を識別し単離することができる。これにより、Ｎ−キナーゼを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離できる。ファージディスプレイライブラリーを作成及びスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。また、抗体ディスプレイライブラリーの作成及びスクリーニングに使用するのに特になじみやすい方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら；ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４に見つけることができる。
【００７８】
また、標準の組換えＤＮＡ技術で作製できる、ヒト及び非ヒト部分の両方を含むキメラ及びヒト化モノクロナール抗体のような組換え抗Ｎ−キナーゼ抗体も本発明の範囲に含まれる。そのようなキメラ及びヒト化モノクロナール抗体は、当該技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて製造できる。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；及びＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載の方法を用いる。
【００７９】
一態様では、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物は、Ｎ−キナーゼに特異的な細胞内抗体である。細胞のタンパク質機能を阻害するために細胞内抗体を使用することは当該技術分野で公知である（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２６３８−２６４６；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓら（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８；Ｗｅｒｇｅ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７４：１９３−１９８；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７４２７−７４２８；Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７８８９−７８９３；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓら（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：３９６−３９９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：５９５−６０１；Ｄｕａｎ，Ｌら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５０７５−５０７９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９３２−５９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３９３１−２３９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：６６６−６７２；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−１５５１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７−３１４１；Ｍａｒａｓｃｏら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６１０；及びＤｕａｎら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０３８３２参照）。
【００８０】
細胞内抗体を用いてタンパク質活性を阻害するには、組換え発現ベクターを作製するが、これは、ベクターが細胞内に導入されると、抗体鎖が細胞の細胞内コンパートメントで機能性抗体として発現されるような形態で抗体鎖をコードしている。
【００８１】
さらに別の態様では、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物は小分子である。本明細書中で使用している“小分子”という用語は、ペプチド、擬似ペプチド、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１モルあたり約１０，０００ｇ未満の分子量を有する有機又は無機化合物（すなわちヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を含む）、１モルあたり約５，０００ｇ未満の分子量を有する有機又は無機化合物、１モルあたり約１，０００ｇ未満の分子量を有する有機又は無機化合物、１モルあたり約５００ｇ未満の分子量を有する有機又は無機化合物、並びにそのような化合物の塩、エステル、および他の医薬上許容しうる形態などであるが、これらに限定されない。
【００８２】
また更に別の態様では、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物は、Ｎ−キナーゼポリペプチド又はその部分、例えば、少なくともＮ−キナーゼポリペプチドの１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００個の隣接アミノ酸を含むフラグメントである。例えば、該化合物は、Ｎ−キナーゼの構成的に活性な触媒ドメインを含むことができる。
【００８３】
また更に別の態様では、患者に神経有益効果をもたらすことが可能な化合物は、Ｎ−キナーゼ核酸分子又はその部分である。
好適な態様では、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、細胞に進入し、細胞内で作用することが可能である。例えば、膜トランスロケーションドメインを用いて、Ｎ−キナーゼのペプチドモジュレーターを細胞内に誘導する。そのような膜トランスロケーションドメインは当該技術分野で公知で、アンテナペディアホメオドメインタンパク質の第３へリックス及びＨＩＶ−１タンパク質Ｔａｔ、並びに、例えば、Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０４４４−１０４５０；Ｌｉｎｄｇｒｅｎら（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１，９９−１０３；Ｈｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，４７４−４７７（２００１）；米国特許第５，８８８，７６２号；米国特許第６，０１５，７８７号；米国特許第５，８４６，７４３号；米国特許第５，７４７，６４１号；米国特許第５，８０４，６０４号；及び公開ＰＣＴ出願のＷＯ９８／５２６１４、ＷＯ００／２９４２７及びＷＯ９９／２９７２１に記載のものなどであるが、これらに限定されない。前記各参考文献の全内容は引用によって本明細書に援用する。
【００８４】
このほか、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物（すなわちＮ−キナーゼモジュレーター）の細胞内への移動を容易にするための当該技術分野における公知技術は、例えば、Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  Ｍら（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１（３）：９９−１０３；Ｇａｒｉｅｐｙ  Ｊら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９（１）：２１−２８；Ｖｙａｓ  ＳＰら（２００１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １８（１）：１−７６；Ｍｏｒｒｉｓ  ＭＣら（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１（５）：４６１−４６６；及びＤｅｒｏｓｓｉ  Ｄら（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８（２）８４−８７に記載のものなどを含む。これらすべての内容は引用によって本明細書に援用する。
【００８５】
治療的遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムを発現する構成体は、ウィルスベクター、並びに例えば、Ｈｏｐｅ  ＭＪら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ  １５（１）：１−１４に記載のものを含む非ウィルス性の送達システムによって細胞内に送達できる。
医薬上許容しうる製剤
本発明は、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物及び医薬上許容しうる担体を含む医薬組成物並びに包装製剤も提供する。
【００８６】
本発明の方法において、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物は、医薬上許容しうる製剤にして投与できる。そのような医薬上許容しうる製剤は、Ｎ−キナーゼモジュレーター並びに医薬上許容しうる担体及び／又は賦形剤を含むことができる。本明細書中で使用している“医薬上許容しうる担体”は、生理的に適合性のあるいずれか及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌薬及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。例えば、担体は脳脊髄液への注入に適したものであり得る。賦形剤は、医薬上許容しうる安定剤及び崩壊剤を含む。本発明は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、又はビーズの形態の合成又は天然ポリマー、並びに水中油形乳剤、ミセル、混合ミセル、合成膜小胞、及び再封入赤血球を含む脂質ベースの製剤を含むいずれかの医薬上許容しうる製剤に関する。
【００８７】
一態様では、医薬上許容しうる製剤はポリマーマトリックスを含む。“ポリマー”又は“ポリマーの”は専門用語で、神経障害などの標的とする状態の治療が行えるようにＮ−キナーゼモジュレーターを送達することが可能な、モノマー単位の反復で構成される構造枠を含む。当該用語には、合成又は天然のコポリマー又はホモポリマーも含まれる。線状ポリマー、分枝ポリマー、及び架橋ポリマーも含まれるとする。
【００８８】
例えば、本発明で使用する医薬上許容しうる製剤の形成に適切なポリマー材料は、天然誘導ポリマーの、アルブミン、アルギネート、セルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、及び多糖類など、並びに合成ポリマーの、ポリエステル（ＰＬＡ，ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール、ポロキソマー（ｐｏｌｏｘｏｍｅｒ）、ポリ無水物、及びプルロニクスなどを含む。これらのポリマーは、中枢神経系を含む神経系と生体適合性があり、何らの有毒分解副産物を生ずることなく中枢神経系内で生分解性があり、しかもポリマーの動力学特性を操作することによって活性化合物の放出様式及び期間を変更する能力を持つ。本明細書中で使用している“生分解性”という用語は、酵素の作用によって、加水分解作用によって、及び／又は他の同様の機序によって、患者の体内で時間をかけて分解するポリマーを意味する。本明細書中で使用している“生体適合性”という用語は、ポリマーが、有毒又は有害でなく、免疫拒絶も起こさないことによって、生組織又は生体と適合性があることを意味する。ポリマーは当該技術分野で公知の方法を用いて製造できる。
【００８９】
ポリマー製剤は、活性化合物の液化ポリマー内への分散（米国特許第４，８８３，６６６号に記載、該特許の教示内容は引用によって本明細書に援用する）、又はバルク重合、界面重合、溶液重合、及び環重合などの方法（Ｏｄｉａｎ  Ｇ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｉｎｇ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８１に記載、この内容は引用によって本明細書に援用する）によって作製できる。製剤の性質及び特性は、反応温度、ポリマー及び活性化合物の濃度、使用する溶媒の種類、及び反応時間などのパラメータを変化させることによって制御される。
【００９０】
治療用活性化合物は、一つ以上の医薬上許容しうるポリマーに被包して、マイクロカプセル、マイクロスフェア、又はマイクロ粒子（これらの用語は本明細書中では互換的に使用する）に形成できる。マイクロカプセル、マイクロスフェア、又はマイクロ粒子は、従来、直径２ｍｍ以下、通常直径５００μｍ以下の球状粒子からなる自由流動粉末である。１μｍ未満の粒子は、従来、ナノカプセル、ナノ粒子又はナノスフェアと呼ばれている。大部分の場合、マイクロカプセルとナノカプセル、マイクロスフェアとナノスフェア、又はマイクロ粒子とナノ粒子間の違いは大きさであり、両者の内部構造間の相違は、一般的に、あったとしてもごくわずかである。本発明の一側面において、平均直径は、約４５μｍ未満、好ましくは２０μｍ未満、さらに好ましくは約０．１〜１０μｍである。
【００９１】
別の態様では、医薬上許容しうる製剤は脂質ベースの製剤を含む。公知の脂質ベースの薬物送達システムのいずれも本発明の実施に使用できる。例えば、多胞リポソーム、多重膜リポソーム及び単膜リポソームは、被包された活性化合物の持続放出速度が確立できる限り、いずれも使用可能である。制御放出用の多胞リポソーム薬物送達システムの製造法は、ＰＣＴ出願番号ＵＳ９６／１１６４２、ＵＳ９４／１２９５７及びＵＳ９４／０４４９０に記載されており、これらの内容は引用によって本発明に含める。
【００９２】
合成膜小胞の組成物は、通常リン脂質の組合せ、通常ステロイド、特にコレステロールとの組合せである。他のリン脂質又は他の脂質も使用できる。
合成膜小胞の製造に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシド、及びガングリオシドなどで、好適な態様は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、及びジオレオイルホスファチジルグリセロールである。
【００９３】
活性化合物を含有する脂質小胞の製造に当たっては、活性化合物のカプセル化の有効性、活性化合物の不安定性、小胞の均一性及び得られた集団の大きさ、活性化合物：脂質の比率、透過性、製剤の不安定性、及び製剤の医薬的許容性といった変数を考慮しなければならない。
【００９４】
導入の前に、製剤は、γ線又は電子線滅菌のような、当該技術分野で利用できる数多くの技術のいずれかによって滅菌することができる。
医薬上許容しうる製剤の投与
本発明の医薬上許容しうる製剤は、活性化合物が患者の神経系と接触して、神経有益効果をもたらすように投与される。本発明は、製剤の局所投与及び全身投与の両方を考えている。局所投与の望ましい特徴は、活性化合物の有効な局所濃度が達成できること、並びに活性化合物の全身投与による有害な副作用が避けられることである。一態様では、活性化合物は患者の脳脊髄液への導入によって投与される。本発明のある種の側面において、活性化合物は、脳室、腰椎部、又は大槽に導入される。別の側面において、活性化合物は、神経損傷部位又は索損傷部位、疼痛部位又は神経変性部位、又は視神経網膜細胞に接触させるために眼内に、といったように局所投与される。
【００９５】
医薬上許容しうる製剤は、水性媒体中に懸濁できるので、従来の皮下針を通して、又は注入ポンプを用いて導入される。
一態様では、本明細書中に記載の活性化合物製剤は、例えば、ＣＮＳへの傷害が発生したときから傷害発生後約１００時間までの間、例えば傷害時から２４、１２、又は６時間以内に患者に投与される。
【００９６】
本発明の別の態様では、活性化合物製剤は、患者のくも膜下に投与される。本明細書中で使用している“くも膜下投与”という用語は、活性化合物製剤を、骨孔から側脳室注入又は大槽穿刺もしくは腰椎穿刺などの技術によって、患者の脳脊髄液に直接送達することを含むことを意図している（Ｌａｚｏｒｔｈｅｓら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１４３−１９２及びＯｍａｙａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１：１６９−１７９に記載、これらの内容は引用によって本明細書に援用する）。“腰椎部”という用語は、第３腰椎と第４腰椎（下背）間の領域を含むことを意図する。“大槽”という用語は、後頭部の頭蓋が終わり脊髄が始まる領域を含むことを意図する。“脳室”という用語は、脊髄中心管とつながっている脳腔を含むことを意図する。前述のいずれかの部位への活性化合物の投与は、活性化合物製剤の直接注入又は注入ポンプの使用によって達成できる。植込型又は外部式のポンプとカテーテルが使用できる。
【００９７】
注入の場合、本発明の活性化合物製剤は、液体溶液、好ましくはハンクス溶液又はリンガー溶液のような生理学的に適合性のある緩衝液の形態に製剤化される。また、活性化合物製剤は、固体の形態に製剤化し、使用直前に再溶解又は懸濁させてもよい。凍結乾燥形も含まれる。注入は、例えば、活性化合物製剤のボーラス注入又は連続注入（例えば注入ポンプを用いて）の形態で実施できる。
【００９８】
本発明の一態様では、活性化合物製剤は、患者の脳内に側脳室注入によって、好ましくは傷害（中枢神経系の神経細胞の異常、不十分又は不適切な軸索成長を特徴とする状態に至る）発生の１００時間以内（例えば傷害時の６、１２、又は２４時間以内）に投与する。注入は、例えば患者の頭蓋骨に作った骨孔を通して行うことができる。別の態様では、製剤は、外科的に挿入したシャントを通して、患者の脳室に、好ましくは傷害発生の１００時間以内（例えば傷害時の６、１２、又は２４時間以内）に投与する。例えば、注入は、小さい第３及び第４脳室にも行うことは可能であるが、より大きい側脳室に行うことができる。さらに別の態様では、活性化合物製剤は、患者の大槽又は腰椎部に、好ましくは傷害発生の１００時間以内（例えば傷害時の６、１２、又は２４時間以内）に注入によって投与する。
【００９９】
頭蓋内組織へのその他の投与手段は、本発明の化合物を嗅上皮に適用し、次に嗅球に伝達、そして脳により近い部分に移動させることを含む。そのような投与は、噴霧又はエアゾール製剤によって行うことができる。
【０１００】
本発明の別の態様では、活性化合物製剤を、患者の傷害部位に、好ましくは傷害発生の１００時間以内（例えば傷害時の６、１２、又は２４時間以内）に投与する。
投与期間及び投与レベル
本発明の方法の好適な態様では、神経有益効果、例えば有効な軸索成長の調節を生み出すために、活性化合物を患者に長期間投与する。活性化合物との持続接触は、例えば活性化合物を長期にわたって、例えば、１週間、数週間、１ヶ月又はそれより長期間反復投与することによって達成できる。更に好ましくは、活性化合物の投与に使用する医薬上許容しうる製剤は、患者に活性化合物の持続送達、例えば“緩徐放出”を提供する。例えば、医薬上許容しうる製剤を患者に投与後、少なくとも１、２、３、又は４週間の間、製剤は活性化合物を送達できる。好ましくは、本発明に従って治療されるべき患者は、少なくとも３０日間活性化合物で治療される（反復投与又は持続送達システムの使用のいずれか、又は両方によって）。
【０１０１】
本明細書中で使用している“持続送達”という用語は、投与後長期にわたって、好ましくは少なくとも数日間、１週間、数週間、１ヶ月、又はそれより長期間、インビボにおける活性化合物の連続送達を含むことを意図する。活性化合物の持続送達は、例えば活性化合物の治療効果の長期持続によって示すことができる（例えば、患者に神経有益効果が持続的にもたらされることによって、活性化合物の持続送達を示すことができる）。あるいは、活性化合物の持続送達は、インビボにおける活性化合物の長期存在を検出することによって示してもよい。
【０１０２】
持続送達のための好適な方法は、ポリマーカプセル、製剤送達のためのミニポンプ、生分解性インプラント、又は移植トランスジェニック自己細胞（米国特許第６，２１４，６２２号に記載）の使用を含む。埋込可能な注入ポンプシステム（例えばＩｎｆｕｓａｉｄ；例えばＺｉｅｒｓｋｉ，Ｊ．ら（１９８８）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．４３：９４−９９；Ｋａｎｏｆｆ，Ｒ．Ｂ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｏｓｔｅｏｐａｔｈ．Ａｓｓｏｃ．９４：４８７−４９３参照）及び浸透ポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売）は、当該技術分野で利用可能である。別の投与様式は、埋込と外部からのプログラミングが可能な注入ポンプである。適切な注入ポンプシステム及び貯蔵所システムは、Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔによる米国特許第５，３６８，５６２号及びＤｏａｎによる米国特許第４，７３１，０５８号にも記載され、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｅｌｔｅｃ  Ｉｎｃ．によって開発されている。
【０１０３】
用量値は、緩和されるべき状態の重症度によって異なることに注意する。また、特定の患者のための具体的な投与計画は、個人の必要性及び活性化合物を投与、又は投与を監督している人物の専門的判断に従って、時間をかけて調整されるべきであり、本明細書中に記載の用量範囲は単に例示的なものであって、クレームした発明の範囲又は実施を制約することを意図するものでないことも理解されるべきである。
【０１０４】
本発明は、別の態様で、本質的にＮ−キナーゼモジュレーター及び医薬上許容しうる担体からなる医薬組成物、並びに、ＣＮＳ神経細胞を該組成物と接触させることによって軸索成長を調節する該組成物の使用法を提供する。“本質的に〜からなる”という用語は、該医薬組成物が他の神経細胞成長モジュレーター、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）を含有しないことを意味する。一態様では、本発明の医薬組成物は包装製剤として提供できる。包装製剤には、容器に入れた本発明の医薬組成物、及び神経障害を有する患者に神経有益効果をもたらすための組成物の投与法に関する指示書の印刷物を含みうる。医薬製造時に神経細胞の軸索成長を調節するためのＮ−キナーゼモジュレーター誘導因子を使用することも本発明に含まれる。
ＣＮＳ神経細胞のインビトロ治療
ＣＮＳ神経細胞は、さらに、インビトロで軸索成長を調節するために、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物とインビトロで接触させることができる。従って、当該技術分野で周知の技術を用いて、患者からＣＮＳ神経細胞を摘出し、インビトロで成長させ、次いで軸索成長を調節するために本発明に従って治療する。簡単に述べると、ＣＮＳ神経細胞培養物は、適切な基質（例えば培養皿）に付着している神経細胞組織のフラグメントから神経細胞を遊離移動させることによって、又は機械的もしくは酵素的に組織を分解してＣＮＳ神経細胞の懸濁物を作製することによって得ることができる。例えば、酵素のトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ、ディスパーゼ、又はそれらの様々な組合せが使用できる。トリプシンとプロナーゼは最も完全な分解を行うが、細胞を損傷する可能性がある。コラゲナーゼとディスパーゼは、完全な分解とは言えないが、有害性も少ない。組織（例えば神経組織）の摘出法及び組織を分解して細胞（例えばＣＮＳ神経細胞）を得る方法は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、１９９４年、に記載されている。この内容は引用によって本明細書に援用する。
【０１０５】
こうして得た細胞は、次に、Ｎ−キナーゼの活性を調節する化合物に、前述の量及び期間接触させる。ＣＮＳ神経細胞の軸索成長の調節が達成されたら、これらの細胞は患者に、例えば移植によって再投与できる。患者の体内で統合が最もうまくいくのは原始細胞であるので、細胞はインビトロで広く分化させないようにするのが好ましい。
【０１０６】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これを更なる制約と解釈すべきではない。本願中に引用したすべての参考文献、特許、公開特許出願、並びに図及び配列リストは、引用によって本明細書に援用する。
【０１０７】
【実施例】
実施例Ｉ．Ｎ−キナーゼポリペプチドの単離及び特徴付け
ウシの脳の新皮質灰白質を、プロテアーゼ及びホスファターゼインヒビターを含有する緩衝液中でホモジナイズし、粒子状物質は遠心沈降させた。約１ｋｇの組織から得た可溶性画分をＮ−キナーゼ単離の出発物質として使用した。
【０１０８】
精製過程中、キナーゼ活性はインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）キナーゼ法を用いてモニタした。この方法では、ヒストンＨＦ−１基質タンパク質を１０％のポリアクリルアミドゲルに重合化した後、分析する試料を該ゲル中で電気泳動した。電気泳動の完了後、タンパク質をグアニジウムイソチオシアネートで部分再生し、６−ＴＧが存在する場合又は存在しない場合で、［３２Ｐ］−ＡＴＰとＭｎ２＋の存在下でインキュベートした。（Ｍｎ２＋で活性化されるが、Ｍｇ２＋又はＣａ２＋で活性化されないのはＮ−キナーゼの特有の性質である）。キナーゼの精製は、ゲル中でキナーゼがＨＦ−１基質をリン酸化する部位に対応する６−ＴＧで阻害可能な放射性バンドを見つけることによってモニタした。
【０１０９】
精製過程の第一段階で、出発物質を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた（ＰｈａｒｍａｃｉａのＦａｓｔ−Ｓカラム使用）。６−ＴＧで阻害可能なキナーゼ活性はこのカラムに強力に結合しているので、０．３ＭのＮａＣｌで溶離した。次に、Ｎ−キナーゼを含有する陽イオン交換カラム画分をシバクロンブルーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分離した。これにより、アデニンヌクレオチド結合タンパク質が分離される。６−ＴＧで阻害可能な４７〜５０ｋＤａのポリペプチドは強力に結合しており、溶離するのに１．５Ｍ  ＮａＣｌのＮａＣｌ濃度を要した（図１Ａ参照）。
【０１１０】
Ｎ−キナーゼポリペプチドを含有する溶離画分を、次に、Ｃ４疎水性相互作用カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて逆相クロマトグラフィーにかけた。簡単に述べると、Ｎ−キナーゼを含有するシバクロンブルーカラム画分をＣ４カラムに適用し、アセトニトリル−イソプロパノール濃度を増加させる傾斜溶離を行った。カラム画分のキナーゼ活性をインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）キナーゼアッセイで評価すると、６−ＴＧで阻害可能な、ＨＦ−１リン酸化活性が画分２４〜２６に溶離されたこと（図１Ｂ）が示された。より純度を上げるために、これらの画分をプールし、同じカラムに再適用して、アセトニトリル−イソプロパノール濃度を増加させる傾斜溶離による分離を繰り返した。Ｎ−キナーゼポリペプチドは、再度画分２４〜２６に溶離された。
【０１１１】
最高濃度のＮ−キナーゼを含有するカラム画分を凍結乾燥し、１０％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルに適用した。少量の試料を並列ゲルに流してインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）キナーゼアッセイを行った。ゲルをクーマシーブルーで染色すると、４９ｋＤａにおけるバンドがはっきりと見えた。これは、その移動の位置が６−ＴＧで阻害可能なキナーゼ活性と一致していた。このバンドを切り取って、ＨＦ−１リン酸化活性を含有していることを確認した。
【０１１２】
次に、Ｎ−キナーゼポリペプチドを含有しているゲルバンドを、部分タンパク質分解によって消化した。タンパク質分解フラグメントを質量分析で分析し、フラグメントの質量を、例えばＥｎｇ  Ｊ．Ｋ．ら（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９７６−９８９；Ｃｈｉｔｔｕｍ  Ｈ．Ｓ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１０８６６−８７０；及びＬｅＲｏｙ  Ｇ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１９００−０４に記載の方法を用いて種々の公知ペプチドの質量と比較した。前記参考文献の内容は引用によって本明細書に援用する。
【０１１３】
この分析から、Ｎ−キナーゼは、ＭＳＴ−３のアイソフォーム、すなわちＭＳＴ−３そのもの、ＭＳＴ−３ｂ、又は未定義のアイソフォームのいずれかであることが分かった。これらのタンパク質は、動物界に遍く見られるセリン−トレオニンキナーゼのＳＴＥファミリーのメンバーである。ＳＴＥファミリーメンバーは、一般的に、細胞分化の種々の側面に関与しているモジュラーシグナリングカセットの成分である。図２にＮ−キナーゼのアミノ酸配列を示す。精製タンパク質と公表配列間の直接対応は青で示す。Ｋ６５（太字）は、キナーゼドメインのＡＴＰ結合領域にある。
【０１１４】
均等物
当業者であれば、単なる日常的実験を用いて、本明細書中に記載の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、又は確認できるであろう。そのような均等物も以下のクレームに包含されるとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ〜ＣはＮ−キナーゼポリペプチドの精製を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。精製の各段階におけるＮ−キナーゼバンドを星印で示す。図１Ａは、顕著な４９ｋＤａのバンドを表しているが、これはシバクロンブルーカラムに強力に結合しており、溶離するのに１．５〜１．７５ＭのＮａＣｌを要する。図１Ｂは、Ｃ４疎水性相互作用カラムでの分離によって得られたタンパク質画分を表す。２４〜２６画分は、Ｎ−キナーゼポリペプチドを含有する。図１Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって達成された精製の最終段階を示す。星印で示したバンドは、インゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）キナーゼ法で検定した並列ゲルで視覚化した通り、その移動位置がＮ−キナーゼの活性と一致した。
【図２】ヒトＮ−キナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。精製タンパク質と公表配列間の直接対応は青で示す。Ｋ６５（太字）は、キナーゼドメインのＡＴＰ結合領域にある。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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