(57)【要約】本発明は、自動システムで使用するためのマイクロタイタープレートに関する。具体的には、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）実験に必要とされる条件下で熱的に安定であると同時にまた、自動システムにおける機械的な操作に必要な剛性および寸法を維持するマイクロタイタープレートに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のウェルを有する、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートであって、シンジオタクチックポリスチレンからなる前記プレート。
【請求項２】
前記プレートは９６ウェルプレートである、請求項１に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項３】
前記プレートは３８４ウェルプレートである、請求項１に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項４】
前記プレートは１５３６ウェルプレートである、請求項１に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項５】
複数のウェルを有する、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートであって、環状オレフィンポリマーからなる前記プレート。
【請求項６】
前記プレートは９６ウェルプレートである、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項７】
前記プレートは３８４ウェルプレートである、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項８】
前記プレートは１５３６ウェルプレートである、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項９】
前記環状オレフィンポリマーは、ノルボレンモノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、および開環メタセシス共重合からなる群から選択されるプロセスによって生産される、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項１０】
前記環状オレフィンポリマーは、シクロペンタジエンモノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、および開環メタセシス共重合からなる群から選択されるプロセスによって生産される、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項１１】
複数のウェルを有する、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートであって、本質的にシンジオタクチックポリスチレンからなる材料から構築される前記プレート。
【請求項１２】
複数のウェルを有する、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートであって、本質的に環状オレフィンポリマーからなる材料から構築される前記プレート。
【請求項１３】
請求項１、５、１１、または１２のいずれか１項に記載のプレートの使用方法であって：
前記ウェルの少なくとも１つに核酸を配置させること、そして、
前記核酸の温度の上昇および低下を含む様式で、前記核酸を増幅すること
を含む方法。
【請求項１４】
前記ウェルにおいて増幅した核酸の存在を検出することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出することは、前記増幅した核酸の量を定量化することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出が行われる自動検出システムに、前記プレートを配置することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自動システムで使用するためのマイクロタイタープレート、具体的にはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ）用途に設計されたプレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、広範に使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学プロトコルである。ＰＣＲは、遺伝学、分子生物学、細胞生物学、臨床化学、法医科学、および分析生化学を含む多くの科学分野での診断および研究用の驚くべきツールであることが証明されている。ＰＣＲ中に反応温度を慎重に制御および循環させることにより実施される反応としては、核酸配列の化学的増幅、リガーゼ連鎖反応、および核酸シーケンシングが挙げられるが、これらに限定されれない。ＰＣＲは通常、サーマルサイクラーに接触させて配置させた小さなチューブまたはマルチウェルマイクロタイタープレート中で実行される。研究者等は、比較的効率的に、かつ非常に低容積で、数多くのＰＣＲ実験を潜在的に実施するマイクロタイタープレートを使用する。非常に小さな比容積の多くのウェルからのＰＣＲ試薬および産物の添加ならびに除去は、好ましくは、具体的には自動コンピュータプログラム式ロボットにより実機械的に施される。
【０００３】
自動システムは、サンプルのハイスループットスクリーニングのために、生化学分野で使用されている。自動検出システムは、フルオルイメージャーおよび他の生化学検出システムを包含し得る。これらのシステムとしては、Applied Biosystem'sのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  ＨＴ配列検出システム、Ｎｏｒｔｈｓｔａｒ（商標）ＨＴＳワークステーション、ＣＯＢＲＡ（商標）ロボットサンプルハンドリングシステム、およびＦＭＡＴ（商標）８１００  ＨＴＳシステムが挙げられるが、これらに限定されない機械であり得る。自動システムは、例えば、各種スクリーニングプロトコルで使用されるマイクロタイタープレートのような製品を取り扱うためのロボットアームを使用し得る。これらの製品は通常、硬質ポリスチレン材料から作製され、これによりロボットアームは製品を容易につかむことが可能である。しかしながら、ポリスチレンは、熱安定性を示さないため、例えばＰＣＲ実験中に加熱しなくてはならない製品では、ポリプロピレンが使用される。しかしながら、ポリスチレンは、軟質であり、取り扱い時に変形する傾向にあるため、自動システムでの使用には適さない。
【０００４】
ＰＣＲ用途で使用するためのマイクロタイタープレートは、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリカーボネートのような熱安定性プラスチック材料から作製される。ロボットが複数のプレートをつかみ、正確な位置まで複数のプレートを移動し、または複数のプレートをともに重ね合わせるのに十分な剛性を提供する、ロボットと相性がいいポリスチレンとは異なり、熱安定性プラスチック材料は、かかる剛性および操作性に欠ける。さらに、ポリプロピレンは、部分的に不透明な材料であり、すなわち、曇って見えるか、または完全には透明ではない。したがって、いったんサンプルをウェルに入れてしまうとサンプルを見ることが困難である。また、熱安定性材料から構成されるプレートは、材料が光路の変化を引き起こすため、蛍光エンドポイント測定およびリアルタイムＰＣＲには適さない。
【０００５】
ＰＣＲは、９４〜９５℃での処理の複数回のサイクルを必要とし、そこでは、ポリプロピレン製のプレートは、例えば、収縮、ねじれ、および反りにより変形することが多い。マイクロタイタープレートのこの寸法の変化は重大な問題を引き起こす。プレートに加えられる熱の範囲は決まっていて、マイクロタイタープレートの変更した形状に順応するように設計されていないため、マイクロタイタープレートの複数のウェル間の熱伝導は、変形したプレート上では一様でない。さらに、熱的に安定ではないマイクロタイタープレートが、ＰＣＲ後に自動液体ハンドラーで操作される場合、プレートのねじれまたは反りにより引き起こされる寸法の変化が問題である。この状況では、ディスペンサーノズルは、プレートの各ウェルの底部に到達するのが困難であり得る。場合によっては、ディスペンサーノズルは、ウェルの側面に触れて、ウェルの底部に到達しない場合もある。ディスペンサーノズルがウェルの底部に接触できない場合、溶液がウェルに分取される際に気泡がウェル中に形成される場合があり、あるいは溶液をマイクロタイタープレートから取り出す際にかなりの量の溶液がウェル中に残ってしまう場合がある。これは、ＰＣＲ実験の準備と実施において自動システムを使用することを望む研究者等にとって大きな懸念である。ウェルに溶液を分取する際、およびＰＣＲ後に産物を取り出す際の不正確さは、濃度のような測定、および所定の分子の検出においてかなりの誤差をもたらし得る。
【０００６】
さらに、変形したマイクロタイタープレートのウェルにシーリングキャップを適用する場合、ウェル中の溶液は、ＰＣＲ中にシーリングキャップとプレートとの間の空間から蒸発および漏出し得る。さらに、いったんプレートの寸法がＰＣＲ後に変化すると、ロボットは、サーマルサイクラーからプレートを効率的に操作および移動することができない。自動システムは、特定パラメータにしたがって、プレートおよび個々のウェルを配置するようにコンピュータ上でプログラムされており、そこで機械は、変形が生ずると、プレートおよびウェルの寸法または位置の変化を識別することが不可能である。したがって、マイクロタイタープレートの変形により引き起こされるＰＣＲ実験の行程にわたるウェルの位置の変化のため、自動システムにおいてロボットの使用を導入できない。ＰＣＲ中のプレートの変形により引き起こされる問題は、より小さなウェルおよび液体容量を使用することから３８４ウェルおよび１５３６ウェルプレートの使用で特に重要になってくる。
【０００７】
使用するプラスチック材料の厚さを増加させることにより、ある程度まで変形を防ぎ得るが、ＰＣＲ実験における重要な要因は、熱伝導性である。ＰＣＲプレートウェルの壁を通してサーマルサイクラーから迅速な熱伝導性を維持するためには、壁の厚さは、薄くすべきであり、通常約０．３ｍである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、シンジオタクチックポリスチレンを含む組成物から作製される、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートに関する。本発明のマイクロタイタープレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートであり得る。
【０００９】
本発明は、環状オレフィンポリマーを含む組成物から作製される、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートに関する。上記環状オレフィンプレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートであり得る。
【００１０】
本発明はさらに、環状オレフィンポリマーを含む組成物からなるマイクロタイタープレートであって、上記ポリマーは、ノルボレンモノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、および開環メタセシス共重合によって生産される、マイクロタイタープレートに関する。本発明はまた、環状オレフィンポリマーを含む組成物から作製されるマイクロタイタープレートであって、上記ポリマーは、シクロペンタジエンモノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、および開環メタセシス共重合によって生産される、マイクロタイタープレートに関する。
【００１１】
本発明はまた、本質的にシンジオタクチックポリスチレンまたは環状オレフィンポリマ
ーからなる、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
自動ＰＣＲ用途で使用するための理想的なプラスチック材料は、以下の特徴を示す：
１．ポリスチレンの剛性に少なくとも類似した剛性、
２．９４〜９５℃の熱安定性、
３．湿潤条件下での９４〜９５℃の処理後の最低限の変形（収縮、ねじれ、反り等）、
４．射出成形技術による大量生産能、
５．ポリプロピレンに少なくとも類似した速い熱伝導性、
６．タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびヌクレオチドの最低限の非特異的吸収、および
７．射出成形に関する最低限のまたは少なくとも予測可能な収縮要因。
【００１３】
シンジオタクチックポリスチレンおよび環状オレフィンポリマーは、熱安定性を示し、ポリスチレンと同じ硬度を有し、ともに射出成形に適している。さらに、本発明者等は、これらの材料から作製された製品、具体的にはＰＣＲプレートで非特異的ＤＮＡまたはタンパク質の付着が観察されないことを、実験から見出した。本発明者等は、ＰＣＲおよび自動システムにおける操作に必要とされる基準を満たすのに十分な熱安定性および剛性を維持することが可能な、シンジオタクチックポリスチレンおよび環状オレフィンポリマーから主に作製されたマイクロタイタープレートを創り出した。
【００１４】
環状オレフィンポリマーは、日本ゼオン（商品名Ｚｅｏｎｅｘ（登録商標）およびＺｅｏｎｏｒ（登録商標））、三井化学（商品名Ａｐｅｌ）、およびＪＳＲ株式会社（商品名Ａｒｔｏｎ（登録商標））から入手し得る。本発明のマイクロタイタープレートは、様々な等級の環状オレフィン、例えば１４１０Ｒ等級の環状オレフィン（日本ゼオン、日本）から構築されてもよい。シクロオレフィンポリマーとも称される環状オレフィンポリマーは、ジシクロペンタジエン（ＤＣＰＤ）およびエチレンから作製される、環状ノルボレン分子に由来する人工熱可塑性プラスチックである。脂環式オレフィン樹脂は、モノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、または開環メタセシス共重合により作製され得る。上記樹脂は、熱安定性、低水分吸収、寸法安定性、および高溶融流量を示す。特に、Ｚｅｏｎｅｘ（登録商標）およびＺｅｏｎｏｒ（登録商標）はまた、化学的耐性、および極めて低い蛍光を示す。本発明の環状オレフィンマイクロタイタープレートは、最大１４０℃まで熱的に安定である。
【００１５】
シンジオタクチックポリスチレン（ＳＰＳ）はメタロセン触媒重合により作製される。Ｘａｒｅｃ（登録商標）という商品名のシンジオタクチックポリスチレンは、出光石油化学株式会社（東京、日本）から得られ得る。本発明のマイクロタイタープレートは、様々な等級のＳＰＳ、例えばＳ１００等級から構築され得る。本発明のシンジオタクチックポリスチレンマイクロタイタープレートは、最大２５０℃まで安定である。
【００１６】
本発明のマイクロタイタープレートは、好ましくは、プラスチック材料の射出成型の一般的な既知の方法により形成されるが、当業者に既知の他の手段により形成されてもよい。マイクロタイタープレートの組成物は、ポリマー、着色剤、潤滑剤、または当業者に既知の他の添加剤を含有してもよい。
【００１７】
マイクロタイタープレートのウェルは、帯状形式すなわち一列形式で配列させることができるか、あるいは行列形式で配列させることができる。マイクロタイタープレート配置の１つは、総計９６個のウェルに関して、ウェル中心間に９ｍｍ離れて空間がある８×１２個のウェルを有する。ハイスループットスクリーニングに関して、ウェルプレートの全体の大きさを同じに維持しながらウェルの総数を増加することにより他の構造、例えば、ウェル中心間に４．５ｍｍ離れて空間がある１６×２４個のウェルを有するように設計した３８４ウェルプレート、およびウェル中心間に２．２５ｍｍ離れて空間がある３２×４８個のウェルを有するように設計した１５３６ウェルプレート、を創出してもよい。これらのウェルプレートの全体の大きさは、９６ウェルプレートと同じであるため、３８４および１５３６ウェルプレート中のウェルの大きさは、必然的に９６ウェルプレート中の大きさよりも小さくなるが、ウェルの深さは依然として同じである。マイクロタイタープレートの全体の寸法は、the Society for Biomolecular Screening（ＳＢＳ）により決定される国際基準により設定される。
【００１８】
ＰＣＲ用途のために、生化学分野で現在使用中のマイクロタイタープレートと対比して、本発明のマイクロタイタープレートは、図３に示すように、かつ実施例２に記載するように、ＰＣＲ実験前、ＰＣＲ実験中、またはＰＣＲ実験後に、反りをほとんど示さないか、または反りを全く示さない。これは、マイクロタイタープレートとサーマルサイクラーとの間での一様な接触を可能にし、プレートの正確な寸法が自動システムにおいて容易な操作を可能とするように維持されるため、ＰＣＲ実験が実施され得る一貫した環境を提供する。これらの条件は、ハイスループットスクリーニング手順、特に３８４ウェルプレートのような多くのウェルを有するプレートが使用されるハイスループットスクリーニングに理想的である。
【００１９】
さらに、従来技術のマイクロタイタープレートは、プレート上のウェルの底部で形成され得る気泡の識別を妨げる曇った外観を有する。本発明で使用されるプラスチック材料の透明性により、本発明のマイクロタイタープレートのウェル中の溶液を容易に眺めることが可能である。本発明で使用される材料はまた、従来技術で使用される材料と比較して非常に低い自己蛍光を示し、図１および図２に示すように、かつ実施例１に記載するように、本発明をリアルタイムＰＣＲ用途で使用するのに適切なものとしている。
【実施例１】
【００２０】
環状オレフィン（Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）、日本ゼオン、日本）から構成される３８４ウェルマイクロタイタープレートを、リアルタイムＰＣＲを実施することで、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３８４ウェル透明光反応プレート(Applied Biosystems)、およびＡＢｇｅｎｅ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ−ｆａｓｔプレートと比較した。本発明の３８４ウェルプレートの幾つかを１１０℃で３時間アニーリングした。
【００２１】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出システム(Applied Biosystems)を用いて、−アクチンプラスミドＤＮＡの１０倍希釈物とともに、ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）−アクチンを用いてＰＣＲを実施した。ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）は、−アクチンプライマー、および１つの蛍光色素を組み込んだ二重標識蛍光発生ハイブリダイゼーションプローブを含有する。ＦＡＭがレポーターとして作用し、その発光スペクトルは、第２の色素であるＴＡＭＲＡにより消失した。−アクチン順方向プライマー２．５μｌ（３Ｍ）、−アクチン逆方向プライマー２．５μｌ（３Ｍ）、および上述のプローブ２．５μｌ（２Ｍ）を、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ’ｓ、および最適緩衝成分を含有するＡＢＩ  ２×マスターミックス１２．５μｌと混合した。
【００２２】
様々な濃度のプラスミドＤＮＡを、１０ｎｇ／サンプル〜０．１ｆｇ／サンプルの範囲で、ＤＥＰＣ処理水５μｌ中に、１０倍希釈で、各希釈について二重で調製した。次に、プラスミドＤＮＡの各段階希釈物５μｌを、上述のＴａｑ−Ｍａｎ（登録商標）−アクチンＰＣＲミックス溶液２０μｌと混合した。
【００２３】
ＰＣＲを以下の通りに実施した：５０℃で２分、９５℃で１０分、ならびに９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクル。サンプルそれぞれに関して、６０℃工程で蛍光データを収集した。このデータを図２に示す。グラフは、段階希釈物それぞれに関して各サイクルにて二重で測定した蛍光を示す。
【００２４】
ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００でＰＣＲを行った後、ＡＢＩプレートおよびＺｅｏｎｏｒのプレアニーリングしたプレート中のエンドポイントＰＣＲ産物を、励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５０５ｎｍで、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光イメージャー（日立）によりスキャンした。強度を２つの方法で算出した。第１に、ウェルおよび周辺区域２１．６８ｍｍを含む広い強度区域に基づいて強度を算出した。次に、ウェルの中心である狭い強度区域（１．０３ｍｍ）を選定することにより強度を算出した。これらの算出結果は図１で見ることができる。
【実施例２】
【００２５】
本発明の６つの環状オレフィン３８４マイクロタイタープレート（Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標））を、それぞれ以下の条件：１１０℃で０．５時間、１．０時間および１．５時間、ならびに１２５℃で０．５時間および１．０時間にさらした。次に、これらの処理プレートを、３８４ウェルそれぞれ中に水２０μｌを入れたＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００(Applied Biosystems)上で、９４℃で１５秒、および６０℃で６０秒（サーマルサイクラーのふたは、１０５℃に加熱）の５０ＰＣＲサイクルに付した。各プレートの幅、長さ、高さ、および反りを、キャリパにより、ＰＣＲ前および後に測定し、図３は、これらの寸法の変化のグラフ表示である。比較のために、ＡＢＩ  ３８４ウェル透明光反応プレートもまた、同じＰＣＲ条件下で試験した。
【実施例３】
【００２６】
ＡＢＩ  ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）光学９６ウェル反応プレート、本発明のブラックシンジオタクチックポリスチレン（ＳＰＳ）９６ウェルプレート、本発明のホワイトＳＰＳ９６ウェルプレート、および本発明の環状オレフィン（Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標））９６ウェルプレートで、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応混合物は、−アクチン特異的プライマー０．２５μｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ  ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液、およびＴａｑポリメラーゼ(Promega)１ユニットを含有していた。個々の混合物はそれぞれ、ヒトゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、または０ｎｇの入った２０μｌも含んでいた。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：ＰＴＣ−１００（商標）サーマルサイクラー(MJ Research)、またはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）２７００サーマルサイクラー(Applied Biocyctems)上で、９４℃で４５秒、６０℃で１分、および７２℃で１分を２５サイクル。ＰＣＲ産物を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分析し、結果を図４に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＡＢＩ３８４ウェルＰＣＲプレート、およびプレアリーニングした本発明の３８４ウェルプレートで実施したＰＣＲ後に測定したエンドポイント蛍光強度のグラフ表示である。強度は、−アクチンプラスミドＤＮＡ濃度に関して示してある。データは、、実施例１で詳述している。
【図２】図２は、それぞれ、本発明のアニーリングした３８４ウェルプレート、本発明の未処理３８４ウェルプレート、ＡＢＩ３８４ウェルプレート、およびＡＢｇｅｎｅ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ−ｆａｓｔ３８４ウェルプレートで実施したＰＣＲの各サイクルで測定した蛍光の変化のグラフ表示である。蛍光は、４０回のＰＣＲサイクルそれぞれで測定した。データおよびＰＣＲ条件は実施１に詳述している。
【図３】図３は、本発明のＰＣＲプレートの寸法の変化のグラフ表示である。幅、長さ、高さ、および反りの変化を、様々な条件下でプレートを処理した後に測定した。本発明のプレートに対する変化を、標準的なＡＢＩプレートで観察される変形と比較することができる。
【図４】図４は、アガロースゲル中の電気泳動によるＰＣＲ産物の分析を示す。ＰＣＲ実験は、同条件下であるが、４つの異なるＰＣＲプレート上で実施した。ＰＣＲ条件およびプレートの詳細は、実施例３に記載している。
【図１】
2004532002.tif 000002
【図２】
2004532002.tif 000003
【図３】
2004532002.tif 000004
【図４】
2004532002.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004532002.tif 000006
2004532002.tif 000007
2004532002.tif 000008
2004532002.tif 000009
2004532002.tif 000010
2004532002.tif 000011
2004532002.tif 000012
2004532002.tif 000013
2004532002.tif 000014
2004532002.tif 000015
2004532002.tif 000016
2004532002.tif 000017
【国際調査報告】
2004532002.tif 000018