(57)【要約】本発明は、対応するケト基を含有する化合物の微生物還元反応によって、(Ｓ)−１−アリールエタノールの製造のための新規な立体選択的な反応に関する。(Ｓ)−１−アリールエタノールは、アルツハイマー疾患の処置に有用なガンマ−セレクターゼインヒビターである化合物の製造における中間体として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004532017.tif 000027
［式中、
ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＲ1からなる群から選ばれて、ここで、
Ｒ1は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、または(ＣＨ2)nＣＯＲ2であって、
ｎは、１〜１０の整数であって、
Ｒ2は、ＯＨ、ＯＲ3またはＮＨ2であって、
Ｒ3は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、または置換もしくは無置換のアリールである］
の化合物の製造法であって、
式（ＩＩ）：
【化２】
2004532017.tif 000028
［式中、
ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＲ1からなる群から選ばれて、ここで、
Ｒ1は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、または(ＣＨ2)nＣＯＲ2であって
ｎは、１〜１０の整数であって、
Ｒ2は、ＯＨ、ＯＲ3またはＮＨ2であって、
Ｒ3は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、または置換もしくは無置換のアリールである］
で示されるケトンの酵素還元反応を触媒することができるオキシドレダクターゼ酵素と反応させることによる式（ＩＩ）の化合物の立体選択的な還元反応による、該製造法。
【請求項２】
式（Ｉ）：
【化３】
2004532017.tif 000029
［式中、
ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＲ1からなる群から選ばれて、ここで、
Ｒ1は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、または(ＣＨ2)nＣＯＲ2であって
ｎは、１〜１０の整数であって、
Ｒ2は、ＯＨ、ＯＲ3またはＮＨ2であって、
Ｒ3は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、または置換もしくは無置換のアリールである］
の化合物の製造法であって、
式（ＩＩ）：
【化４】
2004532017.tif 000030
［式中、
ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＲ1からなる群から選ばれて、ここで、
Ｒ1は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、または(ＣＨ2)nＣＯＲ2であって
ｎは、１〜１０の整数であって、
Ｒ2は、ＯＨ、ＯＲ3またはＮＨ2であって、
Ｒ3は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、または置換もしくは無置換のアリールである］
で示されるケトンの酵素還元反応を触媒することができるオキシドレダクターゼ酵素を供する微生物と、式（ＩＩ）の化合物とを反応させることを含む、式（ＩＩ）の化合物の立体選択的な還元反応による、該製造法。
【請求項３】
オキシドレダクターゼ酵素は大腸菌中で発現する図１のピヒア・メタノリカケトレダクターゼである、請求項１に記載の製造法。
【請求項４】
オキシドレダクターゼを供する微生物はピヒア・メタノリカATCC 56510、ピヒア・メタノリカATCC 56508およびピヒア・メタノリカATCC 58403からなる群から選ばれて、そして該オキシドレダクターゼはケトレダクターゼである、請求項２に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、対応するケト基を含有する化合物の微生物還元反応による、(Ｓ)−１−アリールエタノールの製造のための新規な立体選択的な反応に関する。本発明は、対応するケトンの微生物還元反応による、キラルなアルコールの新規な製造法に関する。
【０００２】
（背景技術）
ゾウ(Bing-nan Zhou)ら（J. Am Chem. Soc., 105巻, 5926-5928頁, 1983）は、Ｌ−カルニチン（これは、ヒト代謝および長鎖脂肪酸の運搬において重要な役割を果たしている）の化学微生物学的な製造法を記載している。特に、この刊行物は、パン酵母、すなわちサッカロミセス・セレビシエによる４−クロロアセト酢酸エチルの(Ｓ)−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルへの還元反応を教示している。
【０００３】
ウシオ(Kazutoshi Ushio)ら（Tetrahedron Letters, 27巻, No.23, 2657-2660頁, 1986）は、メタノール増殖酵母によるベータ−ケトエステルの還元反応を開示している。この刊行物は、該主題の反応が得られる生成物のエナンチオマー過剰率をＤ−異性体方向へ著しくシフトさせることを教示している。該反応をそれらの培地中で増殖する酵母に特有の酵素のためにメタノール中で増殖する酵母を用いて行なった場合に、この現象は生じた。
【０００４】
クリステン(Markus Christen)ら（J. Chem. Soc., Chem. Commun. 264-266頁, 1988）は、６−(ｐ−クロロフェニルチオ)−３,４−ジヒドロヘキサン酸メチルの４つの立体異性体の製造を開示しており、キラリティーの重要な導入は適当な酵母による還元反応によって有効である。ベータケトエステルの酵母による還元反応は非常に研究されているが、該生成物の絶対立体配置、または特に同様に達成されるエナンチオ過剰率のいずれかを予想することは未だ困難である。
【０００５】
トリンコン(Antonio Trincone)ら（Biotechnology and Bioengineering, 35巻, 559-564頁, 1990）は、スルホロブス・ソルファタリクス(Sulfolobus solfataricus)の休止細胞を用いたケトンの不斉還元反応を記載している。この生物の休止細胞の還元能力は細胞増殖の期に強く依存すると記載している。
【０００６】
パテル(Ramesh Patel)ら（Enzyme Microb. Technol., 13巻, 906-912頁, 1991）は、４,５−ジヒドロ−４−(４−メトキシフェニル)−６−(トリフルオロメチル−１Ｈ−１−)ベンズアゼピン−２−オンの立体特異的な微生物還元反応を記載している。特に、重要な中間体である(３Ｒ−シス)−１,３,４,５−テトラヒドロ−３−ヒドロキシ−４−(４−メトキシフェニル)−６−(トリフルオロメチル)−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−２−オンは、親ケトンの立体選択的な微生物還元反応によって製造されると開示している。それは、４つの公知の可能性の間から単一異性体を得るための特異的な条件の選択によって可能となったと、記載されている。
【０００７】
パテル(Ramesh Patel)ら（Enzyme Microb. Technol., 15間, 1014-1021頁, 1993）は、ジケト化合物である３,５−ジオキソ−６−(ベンジルオキシ)ヘキサン酸メチルステルの、得られるジヒドロキシ化合物の単一のエナンチオマーヘの立体選択的な還元反応を記載している。
【０００８】
パテル(Ramesh Patel)ら（Enzyme Microb. Techno. 14巻, 731-738頁, 1992）は、ベータ−ケトエステルの還元反応から得られるヒドロキシ生成物の光学純度を改善するために、ゲオトリクム・カンジダウム(Geotrichum candidum)を加熱処理する方法を記載している。
【０００９】
コメタニ(Kometani)ら（Journal of Fermentation and Bioengineering, 80巻, No.2, 208-210頁, 1995）は、エネルギー源としてエタノールを使用する酵母媒介性の生物還元反応を教示している。パン酵母の場合のエタノールの消費速度およびプロキラルなケトンの還元速度との間の関係を調べており、そしてエタノールがプロキラルなアルコールからキラルなアルコールの大量スケールの製造に利用することができると結論付けている。
【００１０】
パテル(Ramesh Patel)ら（米国特許第5,391,495号、1995年2月21日発行）は、該還元反応を触媒することができる微生物または酵素を用いた、あるケト含有スルホンアミド化合物の立体選択的な還元反応によるその対応するヒドロキシ基含有の化合物の製造を開示している。該命名された酵素はオキシドレダクターゼまたはデヒドロゲナーゼであり、そして該微生物は、ハンセヌラ種、ロードコッカス種およびノカルジア種から選ばれることが好ましい。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、対応するケト基を含有する化合物の微生物還元反応によって、(Ｓ)−１−アリールエタノールの製造のための新規な立体選択的な反応に関する。本発明は、とりわけ、アルツハイマー疾患の処置のための新規なγ−セクレクターゼインヒビターである４−[２−((１Ｒ)−１−{[(４−クロロフェニル)スルホニル]−２,５−ジフルオロアニリノ}エチル−５−フルオロフェニル]ブタン酸を製造するために、対応するケトンの微生物還元反応によるキラルなアルコールの新規な製造法に関する。
【００１２】
従って、本発明の第１の態様によれば、式（Ｉ）：
【化１】
2004532017.tif 000002
［式中、
ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＲ1からなる群から選ばれて、ここで、
Ｒ1は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、または(ＣＨ2)nＣＯＲ2であって、
ｎは、１〜１０の整数であって、
Ｒ2は、ＯＨ、ＯＲ3またはＮＨ2であって、
Ｒ3は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、または置換もしくは無置換のアリールである］
の化合物の製造法を提供し、該製造法は、
式（ＩＩ）：
【化２】
2004532017.tif 000003
［式中、
ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＲ1からなる群から選ばれて、ここで、
Ｒ1は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、または(ＣＨ2)nＣＯＲ2であって
ｎは、１〜１０の整数であって、
Ｒ2は、ＯＨ、ＯＲ3またはＮＨ2であって、
Ｒ3は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、または置換もしくは無置換のアリールである］
で示されるケトンの酵素還元反応を触媒することができるオキシドレダクターゼ酵素と反応させることによる式（ＩＩ）の化合物の立体選択的な還元反応による。
【００１３】
本発明の第２の態様によれば、式（Ｉ）：
【化３】
2004532017.tif 000004
［式中、
ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＲ1からなる群から選ばれて、ここで、
Ｒ1は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、または(ＣＨ2)nＣＯＲ2であって
ｎは、１〜１０の整数であって、
Ｒ2は、ＯＨ、ＯＲ3またはＮＨ2であって、
Ｒ3は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、または置換もしくは無置換のアリールである］
の化合物の製造法を提供し、そして該製造法は、
式（ＩＩ）：
【化４】
2004532017.tif 000005
［式中、
ＸおよびＹは各々独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＲ1からなる群から選ばれて、ここで、
Ｒ1は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、または(ＣＨ2)nＣＯＲ2であって
ｎは、１〜１０の整数であって、
Ｒ2は、ＯＨ、ＯＲ3またはＮＨ2であって、
Ｒ3は、置換もしくは無置換のアルキル、アルケニル、Ｃ3〜7シクロアルキル、または置換もしくは無置換のアリールである］
で示されるケトンの酵素還元反応を触媒することができるオキシドレダクターゼ酵素を供する微生物と反応させることによる、式（ＩＩ）の化合物の立体選択的な還元反応による。
【００１４】
本発明の他の態様および実施態様を、本明細書の以下に提示する。
【００１５】
（発明の詳細な記載）
式Ｉで示される化合物を生成するための上記の式ＩＩで示される化合物の立体選択的な還元反応は、本発明に従って、オキシドレダクターゼ酵素、または好ましくは式ＩＩで示されるケトンの酵素還元反応を触媒することができるオキシドレダクターゼ酵素を供する微生物との反応によって行なう。該微生物の細胞は、無傷の湿性細胞または乾燥細胞（例えば、凍結乾燥、スプレー乾燥、または加熱乾燥の細胞）の形態で、または処置した細胞物質（例えば、破壊細胞または細胞抽出物）の形態であり得る。多数の且つ広範囲にわたる微生物がオキシドレダクターゼのいくつかの形態を供することが知られているが、ロードコックス属(Rhodococcus)、ブレビバクレリウム属(Brevibacterium)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、カンジダ属(Candida)、ゲオトロリクム属(Geotrichum)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、ピヒア属(Pichia)、ハンセヌラ属(Hansenula)、ノカルジア属(Nocardia)、ムコール・スフィンゴモナス属(Mucor Sphingomonas)、パン酵母(Baker's yeast)の選ばれた種だけが、高い定量的なおよびエナンチオ的な収率で式Ｉの目的化合物を得るための式ＩＩで示される化合物の還元反応を触媒することを見出した。これらの種は、ロードコックス・エリトロポリス(Rhodococcus erythropolis)ATCC 4277、ロードコックス・エリトロポリスDSM 6971、ロードコックス種ATCC 21227、ロードコックス・エリトロポリスATCC 27854、カンジダ・ソノレンシス(Candida sonorensis) ATCC 56511、カンジダ・ボイジニ(Candida boidinii)ATCC 26175およびATCC 56507、カンジダ・ギリエノンジー(Candida guilliennondii)ATCC 9058、カンジダ・ウティリス(Candida utilis)ATCC 9950、カンジダ・パロポシロシス(Candida parapsilosis)ATCC 52820、ゲオトリクム・カンジダム(Geotrichum candidum)34614およびATCC 34014、ロドトルラ・グルティニス(Rhodotorula glutinis)ATCC 26207およびATCC 201718、ハンセヌラ・ファビアニ(Hansenula fabianii)ATCC 58045、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha) ATCC 58401、ATCC 34438およびATCC 26012、ハンセヌラ・サツルヌス(Hansenula saturnus)ATCC 16762、ノカルジア・サルモニコロル(Nocardia salmonicolor)ATCC 19149、ピヒア・アノマラ(Pichia anomala)ATCC 66094、ピヒア・カプスラタ(Pichia capsulata)ATCC 29204、ピヒア・メタノリカ(Pichia methanolica)ATCC 56510、ATCC 56508およびATCC 58403、ピヒア・ピヌス(Pichia pinus)ATCC 28780、ピヒア・シルビコラ(Pichia silvicola)ATCC 16764、ピヒア・スティピティス(Pichia stipitis)ATCC 59785、スフィンゴモナス・パウシモビリス(Sphingomonas paucimobilis)ATCC 202027、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ATCC 12341およびATCC 44953、ノカルジオデス・アルブス(Nocardiodes albus)ATCC 55425、ムコール・ロキシー(Mucor rouxii)ATCC 24905、ムコール・ヒエマリス(Mucor hiemalis)ATCC 16636、およびブレビバクテリム種(Brevibacterium sp.)ATCC19653である。本明細書で使用する用語「ＡＴＣＣ」は、ある微生物についての寄託機関(depository)、すなわちアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852）の受託番号を意味する。用語「ＤＳＭ」は、ジャーマン・コレクション・オブ・ミクロオルガニズム・アンド・セル・カルチャーズ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)（Branschweig, Germany）を意味する。遺伝子改変の生物の使用をまた企図する。宿主細胞は、いずれかの細胞、例えば本明細書に記載する触媒反応をすることができる酵素の１つ以上を発現する遺伝子を含むように改変した大腸菌であり得る。
【００１６】
本明細書で使用する以下の用語は、以下に示す定義を有する。用語「アルキル」とは、炭素数が１〜１０、好ましくは炭素数が１〜４である、場合により置換された直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を意味する。
【００１７】
用語「アルケニル」とは、炭素数が１〜１０、好ましくは炭素数が１〜４である、場合により置換された直鎖または分枝鎖の不飽和炭化水素基を意味する。
【００１８】
用語「置換アルキル」とは、例えば１〜４個の置換基によって置換されたアルキル基を意味し、ここで該置換基とは例えば、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、オキソ、アルカノイル、アリール、アリールオキシ、アラルキル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノおよび二置換アミノを挙げられる。
【００１９】
用語「置換アルケニル」とは、例えば１〜４個の置換基によって置換されたアルケニル基を意味し、ここで該置換基とは例えば、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、オキソ、アルカノル、アリール、アリールオキシ、アラルキル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノおよび二置換アミノを挙げられる。
【００２０】
用語「アリール」とは、環部分内の炭素数が６〜１２である単環または二環の芳香族炭化水素基を意味し、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニルおよびジフェニル基を挙げられ、その各々は置換され得る。
【００２１】
用語「置換アリール」とは、例えば１〜４個の置換基によって置換されたアリール基を意味し、ここで該置換基は例えばアルキル、置換アルキル、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、アルカノイル、アルカノルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロチオ、ウレイド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルバミル、アルコキシカルボニル、アルキルチオノ、アリールチオノ、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールオキシなどを挙げられる。該置換基は、更にハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、置換アルキル、置換アリールおよびアラルキルからなる群から選ばれる要素の１つ以上で置換され得る。
【００２２】
微生物の使用に関して、本発明の該酵素還元方法は、使用する微生物の発酵後に、すなわち発酵および還元の２段階で、またはそれらを同時に、すなわち１段階もしくはインサイチュの発酵および還元で行なうことができる。後者の場合に、該微生物を十分な増殖を実現するまで適当な培地、特に窒素および炭素源を含有する培地中で増殖して、次いで式ＩＩで示されるそれら化合物から選ばれる化合物をそれに加えることができる。その後に、該酵素還元反応を、式ＩＩで示される化合物の実質的に完全な変換を得るまで続ける。
【００２３】
２段階の方法論において、該微生物を最初にそれが予め決めたレベルの酵素活性を示すまで上記の適当な培地中で増殖させ、その後、該細胞を通常の分離方法によって収集し、そしてそれらから適当な緩衝剤などを含有する微生物細胞の懸濁液を調製する。適当な緩衝剤としては例えば、リン酸緩衝剤（特に、ナトリウム塩またはカリウム塩リン酸緩衝剤）、トリス−ＨＣｌ、酢酸ナトリウムなどを含む。水をも用いて、微生物細胞の懸濁液を調製することができる。次いで、式ＩＩで示される化合物をそれに加え、そして変換が視覚的に完結するまで該酵素還元反応を続ける。いずれかの場合に、炭素、窒素および微量元素の供給源について上記の通り、適当な増殖培地を含むであろう。誘発物質を、同様に加えることができる。当該分野の当業者が知る通り、用語「誘発物質」とは、細胞中での所望する酵素（すなわち、オキシドレダクターゼ）の活性を開始したりまたは増大して所望する生成物を与える、いずれかの化合物を意味する。式ＩＩで示される化合物は、特に微生物の増殖の間、少量で加える場合に、誘発物質と考えられる。
【００２４】
該培地のための適当な炭素源は例えば、糖（例えば、マルトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、ソルビトール、スクロース、デンプン、マンニトール、プロピレングリコールなど）、有機酸およびそれらの塩（例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど）、アミノ酸およびそれらの塩（例えば、グルタミン酸ナトリウムなど）、並びにアルコール（例えば、エタノール、プロパノール）などを含むことができる。適当な窒素源としては例えば、Ｎ−ＺアミンＡ、コーン・スティープ・リカー(corn steep liquor)、大豆食、ビーフエキス、酵母エキス、糖蜜、パン酵母(baker's yeast)、トリプトン(tryptone)、栄養大豆(nutrisoy)、ペプトン、イースタミン(yeastamin)、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどを含み得る。適当な微量元素としては例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、カルシウム塩、コバルト塩、ニッケル塩、鉄塩、ナトリウム塩およびカリウム塩を含み得る。本発明に従って使用される適当な培地としては例えば、これらの分類のいずれかから選ばれる多数の構成成分を含み得る。代表的な好ましい培地としては、以下のものを重量％で含む水性培地を含むが、これらに限定されない。
2004532017.tif 000006
【００２５】
培地番号５を加圧減菌後に、該ネオマイシン（水中）およびクロラムフェニコール（２００プルーフのエタノール中）のろ過した減菌溶液を加えて、それぞれ最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬおよび３３ｍｇ／Ｌとする。
【００２６】
減菌前に、ｐＨは、好ましくは約６〜８に、最も好ましくは約ｐＨ  ６．８に調節する。次いで、該培地を例えば約１２１℃の温度で３０分間加熱することによって減菌する。減菌後に、該培地をｐＨ  ６．５〜７．５に、最も好ましくは約７．０にまで調節する。微生物の増殖および還元反応の間、ｐＨを約４．０〜９．０の間、好ましくは約ｐＨ  ６．０〜８．０の間に保つ。上記の構成成分由来の適当な塩基の塩または酸の塩を、通常、ｐＨの調節のために使用することができる。
【００２７】
該反応混合物の温度は該還元反応に利用することができる熱エネルギーの基準であり、この理由で、適当な温度は保たれて、完結させる該方法にとって利用可能な十分なエネルギーが存在することを保証するべきである。本発明の方法にとって適当な温度範囲は、約５℃〜約６０℃の範囲であり、約２５℃〜約４０℃であることが好ましい。圧は本発明の方法の実施にとって重要であることが知られておらず、便宜のためにほぼ常圧を典型的に保つ。
【００２８】
本発明の方法は、好気性条件下で行なうことが好ましい。該反応混合物の撹拌および通気はまた、生体内変換反応にとって利用可能な酸素の量に影響を及ぼす主題の反応にとって有利である。該反応は、上記の１段階または２段階での微生物の増殖の間に、例えば振とうフラスコ（shakeflask）または発酵槽中で行なうのが有利である。約１０〜約１０００  ＲＰＭの範囲の撹拌が好ましく、約５０〜約５００ＲＰＭが最も好ましい。毎分培地の容量当たり約０．１〜１０倍容量（ｖ／Ｖｔ.）の空気の通気が好ましく、毎分培地の容量当たり約５倍容量の空気の通気が特に好ましい。
【００２９】
式ＩＩで示される化合物の完全な変換は、式ＩＩで示される化合物の該培地への添加の時間から測定して、例えば約１〜７２時間、典型的には約４〜４８時間を必要とし得る。有機液体または混和性もしくは非混和性の、すなわち二層、有機／水の液体混合物を同様に使用することができるが、該培地は水ベースであることが好ましい。
【００３０】
本発明の立体選択的な酵素還元反応は、特に該単離酵素を使用する場合には、補助因子（例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオシド（ＮＡＤＨ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ））を加えることによって行なうことができる。その後に、例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生して、再利用することができる。インサイチュでのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生する更なる酵素を使用することができ、例えばギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼが挙げられる。適当な水素供与体としては例えば、分子水素、ギ酸塩（例えば、アルカリ金属またはアンモニウムのギ酸塩）、グルコース、次亜リン酸塩、またはビオロゲン（例えば、メチルビオロゲン）の存在下での電気化学的な還元反応を含む。例えばエタノールまたはギ酸を用いて、更なる酵素なしでＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生することもできる。
【００３１】
式ＩＩの化合物を、出発化合物および培地の合わせた重量ベースで約０．２％〜約５％重量％となるように、該反応培地に加えることが更に好ましい。出発物質の量に対する微生物の接種は、上記の期間を有する式ＩＩで示される化合物の酵素還元反応において、通常約５重量％〜約３０重量％の細胞濃度を与えるのが十分である。示す微生物を用いて上記の好ましい反応パラメータを使用することにより、該反応収率を７０％よりも大きく、最適には９０％過剰で、式Ｉで示される化合物の所望のエナンチオマーのエナンチオ過剰率を９３％より大きく、最適には９９％過剰で得るであろう。本発明の還元反応の生成物、すなわち式Ｉで示される化合物は、単離および／または精製の方法論にとっていずれかの適当な方法（例えば、抽出法、樹脂の吸着／脱着、蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフィー法など）によって回収することができる。
【００３２】
本発明の実施における様々な他の態様および改変は、上記の本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当該分野における当業者によって容易に行なうことができることは、明らかであろう。従って、本明細書に添付する特許請求の範囲は、上記の正確な記載に限定されるものではなく、むしろ本発明に属する特許可能性の新規性の特徴の全て（これは関連分野の当業者によって均等なものと扱われるであろう全ての特徴および実施態様を含む）を包含するものと解釈されると意図する。本発明を、以下の実験例を引用して更に記載する。
【００３３】
実施例１
２−ブロモ−４−フルオロアセトフェノン(ＩＩＩ)の立体選択的な酵素還元反応：ホールセル−２段階反応の使用
様々な微生物培養物（１ｍＬ）を、５００ｍＬのフラスコ内の上記の培地１（１００ｍＬ）中に播種し、振とう器を用いて２８℃、２００ＲＰＭで、４８時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、そして細胞を１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）（１０ｍＬ）中に懸濁した。グルコースを２５ｍｇ／ｍＬで細胞懸濁液に加え、２−ブロモ−４−フルオロアセトフェノン（基質は、式ＩＩＩ：
【化５】
2004532017.tif 000007
を参照）（１５ｍｇ）をそれに加えた。
【００３４】
生体内変換反応（還元反応）を、振とう機を用いて２８℃、２００ＲＰＭで２４〜４８時間行なった。予め決めた時間で、該反応混合物を４倍容量のアセトニトリルを用いてクエンチし、ボルテックスミキサーを用いて混合し、０．２ミクロンのフィルターを通してろ過して集め、そして試料（１ｍＬ）をＨＰＬＣ方法１によって分析して、基質および生成物の濃度を測定した。残りの溶液を窒素の気流下で蒸発させて乾固し、そして該残渣をエタノール（１ｍＬ）を用いて溶かし、ろ過し、ＨＰＬＣ方法２によって分析して、生成物のエナンチオ過剰率を測定した。該結果を、以下の表１にまとめる。この実施例における生成物を、式ＩＶ：
【化６】
2004532017.tif 000008
に示す。
【００３５】
方法１
この方法を発展させて、式（ＩＩＩ）で示されるケトンの式（ＩＶ）で示されるアルコールへの還元反応を追跡した。
カラム：フェニルヘキシル（０．４６×１５ｃｍ、５μ）（Phenomenex製）、
移動相：アセトニトリル：水（１：１）、
流速：１ｍＬ／分、
カラム温度：５０℃、
検出器：２１０ｎｍでのＵＶ、
注入容量：５μＬ。
２−ブロモ−４−フルオロアセトフェノン（ＩＩＩ）は約６．３分で溶出し、Ｓ−１−(２'−ブロモ−４'−フルオロフェニル)エタノール(ＩＶ)またはそのエナンチマーは約５．４分で溶出する。
【００３６】
方法２
この方法を発展させて、式（ＩＶ）で示されるアルコールのエナンチオ純度を追跡した。
カラム：キラルパックＡＤ（０．４６×２５ｃｍ、１０μｍ、ダイセル化学社(Daicel Chemical Industries Ltd.)製）、
移動相：０．２４９容量％の無水エタノールのヘキサン溶液、
流速：１ｍＬ／分、
カラムの温度：周囲温度、
検出器：２１０ｎｍでのＵＶ、
注入容量：２および５μＬ。
((Ｒ／Ｓ)−１−(２−ブロモ−４−フルオロフェニル)エタノール）のエナンチオマーは、約４８分（Ｒ）および５４分（Ｓ）で溶出する。該基質である２−ブロモ−４−フルオロアセトフェノンは、約１５分で溶出する。
【表１】
2004532017.tif 000009
【００３７】
実施例２
パン酵母の使用
この実施例における基質（式ＩＩＩ）および生成物（式ＩＶ）を、実施例１において示す。
方法の詳細：
バイオリアクター（Braun Biostat B製）(３Ｌ）にｐＨ電極を備える。インペラー(impeller)のスピードを５００ＲＰＭにセットし、温度を２８℃にセットする。１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）（８００ｍＬ）を該バイオリアクターに加える。該バイオリアクターの内容物を３００〜５００ＲＰＭで撹拌し、そして該温度を実験中、２８℃に保つ。ポンプを始動させ、１０％水酸化ナトリウム溶液の自動添加を制御してｐＨ定数を６．０に保つ。活性な乾燥酵母（レッドスター(Red Star)製）（１５０ｇ）を３０分間かけてゆっくりと加える。２−ブロモ−４−フルオロアセトフェノン（５ｇ）を加える。最少量の脱イオン水（５ｍＬ）を用いて、いずれかの残留ケトンを該反応器中に洗浄する。必要ならば、ＳＡＧ消泡剤（０．５ｍＬ）を加えて、該発泡体を制御する。該発泡体を制御するために、必要に応じて、更にＳＡＧ消泡剤（０．５ｍＬ）をここでまたは後に加えることができる。毎時間８〜１０ｍＬの速度での２５％グルコース溶液の添加を開始する。全てのグルコース溶液（２００ｍＬ）を２０〜２４時間かけて加える。４、８、１２、２０、２２、２４時間で、および必要ならば更に２時間間隔で、試料（１ｍＬ）を取り出す。基質および生成物の濃度、並びに生成物のエナンチオ過剰率の測定について、実施例１に記載する通り分析する。２０〜２８時間の反応時間が通常、該反応の完結のために十分である。この方法において、生成物の反応収率は９０％であって、また所望の異性体のエナンチオ過剰率は９９．５％であった。
【００３８】
実施例３
式（ＩＶ）で示されるケトメチルエステルの式（ＩＶ）で示される対応するアルコールヘの還元反応：
様々な微生物の培養物（１ｍＬ）を、５００ｍＬフラスコ内の上記の培地１または培地３（１００ｍＬ）中に播種し、そして振とう機を用いて２８℃、２００ＲＰＭで４８時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、そして細胞を１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）（１０ｍＬ）中に懸濁した。グルコースを該細胞懸濁液に２５ｍｇ／Ｌで加え、そしてケトメチルエステル（式Ｖ：
【化７】
2004532017.tif 000010
で示される基質）（１０ｍｇ）をそれに加えた。
【００３９】
該生体内変換反応（還元反応）を、振とう機を用いて２８℃、２００ＲＰＭで２４〜４８時間行なった。該反応混合物を２倍容量の酢酸エチルを用いて抽出し、窒素の気流下で蒸発させて乾固した。酢酸エチル抽出物の一部をアセトニトリルに溶解し、ＨＰＬＣ方法３によって分析して、基質および生成物の濃度を測定した。別の一部をヘキサン：イソプロパノール（１：１）の混合物に溶解し、そしてＨＰＬＣ方法４によって分析して、生成物のエナンチオ過剰率を測定した。
【００４０】
該結果を以下の表２にまとめる。この実施例における生成物を、式ＶＩ：
【化８】
2004532017.tif 000011
に示す。
方法３：
カラム：クロマシル(Kromasil)Ｃ−８（０．４６×１５ｃｍ、５ミクロン、Waters製）、
移動相：１００％溶媒Ａ（０．２％Ｈ3ＰＯ4）と、０％溶媒Ｂ（アセトニトリル：０．２％Ｈ3ＰＯ4  ９０：１０）〜７０％溶媒Ｂの勾配溶出で２０分間、次いで１００％溶媒Ｂで２５分間、続けて１００％溶媒Ｂで３０分間続ける、
流速：１ｍＬ／分、
検出：２１０ｎｍでのＵＶ、
保持時間：ケトメチルエステル（Ｖ）は２０．３分、およびヒドロキシメチエステル（ＶＩ）は１８分。
方法４：
カラム：キラルパックＡＤ（０．４６×２５ｃｍ、１０ミクロン、ダイセル製）、
移動相：ヘキサン：エタノール：イソプロパノール（９８．３２：１．４３：０．２５）、
流速：１ｍＬ／分、
検出：２１０ｎｍでのＵＶ。
(Ｒ／Ｓ)−ヒドロキシメチルエステルのエナンチオマーは、約２３．６分（Ｒ）および３１．１分（Ｓ）で溶出する。
表２．ケトメチルエステル（式（Ｖ））の対応する(Ｓ)−ヒドロキシメチルエステル（式（ＶＩ））ヘの微生物還元反応：
2004532017.tif 000012
ＮＤは、測定していないことを示す。
【００４１】
実施例４
ケトエチルエステル（ＶＩＩ）の対応するアルコール（ＶＩＩＩ）ヘの還元反応：
様々な微生物培養物（１ｍＬ）を、５００ｍＬフラスコ内の上記の培地１または培地３（１００ｍＬ）中に播種させ、そして振とう機を用いて２８℃、２００ＲＰＭで４８時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、そして細胞を１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）（１０ｍＬ）に懸濁した。グルコースを該細胞懸濁液に２５ｍｇ／ｍＬで加え、そしてケトエチルエステル（基質は式ＶＩＩ：
【化９】
2004532017.tif 000013
を参照）（１０ｍｇ）をそれに加えた。
【００４２】
該生体内変換反応（還元反応）を、振とう機を用いて２８℃、２００ＲＰＭで行なった。該反応混合物を２倍容量の酢酸エチルを用いて抽出し、窒素気流下で蒸発させて乾固した。酢酸エチル抽出液の一部をアセトニトリルに溶解し、ＨＰＬＣ方法５によって分析して、基質および生成物の濃度を測定した。別の一部をヘキサン：イソプロパノール（１：１）混合物に溶解し、ＨＰＬＣ方法６によって分析して、生成物のエナンチオ過剰率を測定した。該結果を、以下の表３にまとめる。この例における生成物を、式ＶＩＩＩ：
【化１０】
2004532017.tif 000014
に示す。
方法５：
カラム：フェニルヘキシル（０．４６×１５ｃｍ、５ミクロン、フェノメネクス(Phenomenex)製）、
移動相：アセトニトリル：水（１：１）、
流速：１ｍＬ／分、
検出：２１０ｎｍでのＵＶ、
保持時間：ケトエチルエステル（ＶＩＩ）は１２．４分、ヒドロキシエチルエステル（ＶＩＩＩ）は８．９分。
方法６：
カラム：キラルパックＡＤ（０．４６×２５ｃｍ、１０ミクロン、ダイセル製）、
移動相：ヘキサン：エタノール：イソプロパノール（９６．９：２．８５：０．２５）、
移動相：１ｍＬ／分、
検出：２１０ｎｍでのＵＶ。
(Ｒ／Ｓ)ヒドロキシエチルエステルのエナンチマーは、約１５分（Ｒ）および１９分（Ｓ）で溶出する。
表３．ケトエチルエステルの対応する（Ｓ)−ヒドロキシエチルエステルヘの微生物還元反応：
2004532017.tif 000015
【００４３】
実施例５
ケトｔ−ブチルエステル（ＩＸ）の対応するアルコール（Ｘ）ヘの還元反応：
様々な微生物培養物（１ｍＬ）を、５００ｍＬフラスコ内の上記の培地１または培地３（１００ｍＬ）中に播種し、そして振とう機を用いて２８℃、２００ＲＰＭで４８時間イキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、そして細胞を１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）（１０ｍＬ）に懸濁した。グルコースを該細胞懸濁液に２５ｍｇ／ｍＬで加え、そしてケトｔ−ブチルエステル（基質は式ＩＸ：
【化１１】
2004532017.tif 000016
を参照）（１０ｍｇ）をそこに加えた。
【００４４】
該生体内変換反応（還元反応）を、振とう機を用いて２８℃、２００ＲＰＭで行なった。該反応混合物を２倍容量の酢酸エチルを用いて抽出し、そして窒素の気流下で蒸発させて乾固した。該酢酸エチル抽出物の一部をアセトニトリルに溶解し、上記実施例４に記載する通りＨＰＬＣ方法５によって分析して、基質および生成物の濃度を測定した。該保持時間は、ケトｔ−ブチルエステル（ＩＸ）は２８．３分であり、およびヒドロキシｔ−ブチルエステル（Ｘ）は１９．２分である。
【００４５】
別の一部を、ヘキサン：イソプロパノール（１：１）混合物中に溶解し、ＨＰＬＣ方法７によって分析して、生成物のエナンチオ過剰率を測定した。
方法７：
カラム：キラルパックＡＤ（０．４６×２５ｃｍ、１０ミクロン、ダイセル製）、
移動相：ヘキサン：イソプロパノール（９０：１０）、
流速：１ｍＬ／分、
検出：２１０ｎｍでのＵＶ。
(Ｒ／Ｓ)ヒドロキシｔ−ブチルエステルのエナンチオマーは、約２３．６分（Ｒ）および３２．８分（Ｓ）で溶出する。
【００４６】
該結果を、以下の表４にまとめる。この実施例の生成物を、式（Ｘ）：
【化１２】
2004532017.tif 000017
に示す。
表４：ケトｔ−ブチルエステルの対応する(Ｓ)−ヒドロキシｔ−ブチルエステルへの微生物還元反応：
2004532017.tif 000018
【００４７】
実施例６
精製したケトレダクターゼ酵素によるケトメチルエステルの還元反応：
ケトレダクターゼの精製
ピヒア・メタノリカATCC58403の１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）による２０％細胞懸濁液を、細胞切断前にホモジナイズした。数継代の間に、該細胞懸濁液をミクロ流動機(microfluidizer)に通すことによって、該細胞を破壊した。該破壊した細胞懸濁液を少なくとも２０分間、１８,０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞デブリを除去した。無細胞エキスをデカントし、そしてタンパク質精製に使用した。全ての精製工程を４℃で行なった。該精製は、該酵素をハイ−トラップブルーセファロース(Hi-Trap Blue-Sepharose)アフィニティーカラムから溶出させるために、３つの異なる条件を用いて行なった。該タンパク質を、緩衝液Ａ（１０％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴおよび１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ  ６．５）を用いて平衡化させたアフィニティーカラム上にロードした。該タンパク質を、以下の３つの方法によってアフィニティーカラムから溶出した：（１）ｐＨ勾配（ｐＨ  ６．５でロードして、ｐＨ  ８．５で溶出する）、（２）緩衝液Ａ中、ＮａＣｌ勾配（０〜０．８Ｍ）；および、（３）緩衝液Ａ中、ＮＡＤＰ勾配（０．１〜０．５ｍＭ）。
【数１】
2004532017.tif 000019
【００４８】
該酵素を、均一にまで精製した。該精製した酵素について、分子量を〜４０Ｋｄと測定した。該酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性タンパク質である。クローニングおよび過剰発現を促進するであろう該タンパク質のＮ−末端および内部のペプチド配列を測定した。
【数２】
2004532017.tif 000020
【数３】
2004532017.tif 000021
【００４９】
該精製した酵素を、ケトメチルエステル（基質Ｖ）の対応する(Ｓ)−ヒドロキシメチルエステル（生成物ＶＩ）ヘの還元反応について調べた。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）の該反応混合物（５ｍＬ）は、３ユニット(unit)の精製したケトレダクターゼ、基質Ｖ（５ｍｇ）、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰ、グルコース（２５ｍｇ）および１５ユニットのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨを再生するため）を含んだ。反応は、実施例３に記載するとおり実施した。基質Ｖおよび生成物ＶＩの濃度、並びに生成物のエナンチオ過剰率を、実施例３に記載するとおり測定した。９０％の反応収率および９９．９％のエナンチオ過剰率を得た。
【００５０】
実施例７
Ｐ．メタノリカ由来のケトレダクターゼをコードする遺伝子の単離
Ａ．  Ｐ．メタノリカ由来の染色体ＤＮＡの製造
Ｐ．メタノリカATCC 13825のストック培養物を、Ｆ７培地（リットル当たり、麦芽エキス（１０．０ｇ）、酵母エキス（１０．０ｇ）、ペプトン（１０．０ｇ）、デキストロース［ｐＨ  ７．０］（２０．０ｇ））中で増殖し、そしてアリコート（１ｍＬ）を液体窒素下でバイアルに保存した。バイアルを室温で解凍し、そして２５０ｍＬフラスコ内のＹＰＤ培地（２０ｍＬ）中に播種した。ＹＰＤは、リットル当たり、酵母エキス（１０．０ｇ）、ペプトン（２０．０ｇ）およびデキストロース（２０．０ｇ）からなる。該フラスコを、２５０ｒｐｍで振り混ぜながら３０℃で２０時間インキュベートした。サッカロミセス・セレビシエ染色体ＤＮＡの速い単離方法は、Ｐ．メタノリカＤＮＡの製造の記載（AusubelらによるCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1990）を使用した。該沈降したＤＮＡを、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、そして２６０nmでの分光光度的分析によって測定して、最終濃度をＴＥ緩衝液（０．０１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）中で１．０ｍｇ／ｍＬにまで再懸濁した。
【００５１】
Ｂ．Ｐ．メタノリカの部分的なＳａｕ３Ａ１ライブラリの構築
項目１．Ａに記載する通り製造したＰ．メタノリカ染色体ＤＮＡを、０．２５ｍＬの反応容量（これは、ＤＮＡ（２５μｇ）、酵素（５ユニット）（Promega, Madison, WI）、０．００６Ｍ  トリスＨＣｌ、０．００６Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．１０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．００１Ｍ  ジチオトレイトール（ｐＨ  ７．５）からなる）中、３７℃で５分間、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ１を用いて部分的に切断した。該反応混合物を、１：１の等量のフェノール：クロロホルムを用いて１回抽出した。遠心分離後に、上層の水相を保存し、このものに３Ｍ酢酸ナトリウム（０．１容量）およびイソプロパノール（０．６容量）を加えた。ＤＮＡを、微量遠心管中で１６，０００×ｇで５分間遠心分離することによってペレットし、７０％ＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）を用いて１回洗浄した。SpeedVac (Savant Instruments, Farmingdale, NY）中で５分間乾燥後に、該ペレットをＴＥ緩衝液（０．０６ｍＬ）中で再懸濁した。該ＤＮＡを、０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有するＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ  トリズマ(Trizma)塩基、０．０２Ｍ酢酸および０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．３）中の０．８％アガロースゲルを用いて１５Ｖで２０時間、電気泳動した。約５１０ｋｂのＤＮＡ断片を含有する領域を、１ｋｂのＤＮＡラダー(ladder)（Life Technologies, Gaithersburg, MD）と比較することによって同定し、そして該ゲルから切除した。推奨プロトコールに従って、ＤＮＡをQIAquick Gel Purification Kit（Qiagen Inc., Valencia, CA）を用いて抽出した。アリコートを０．８％ＴＡＥアガロースゲル上で２０時間、１５Ｖで電気泳動して、所望する断片の大きさの範囲が得られたことを確認し、そしてＤＮＡマス(mass)ラダー（Life Technologies）と比較することによって、該断片の濃度を測定した。
【００５２】
プラスミドｐＺｅｒｏＩ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、０．０５μＬの反応容量（これは、ＤＮＡ（２μｇ）、０．００６Ｍ  トリスＨＣｌ、０．００６Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．００１Ｍ  ＤＴＴ（ｐＨ  ７．５）からなる）中で、ＢａｍＨＩ（Promega）を用いて消化した。１０ユニットの制限エンドヌクレターゼを加え、そして該混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。該反応を、１：１の等容量のフェノール：クロロホルムを加えることによって終止させた。５分間遠心分離（１３，０００×ｇ）後に、該上部の（水）相を除去し、そしてこのものを新たなマイクロチューブ中に入れた。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ７．５）（５μＬ）および氷冷１００％エタノール（Shelton Scientific, Shelton, CT）（１１０μＬ）を該水相と混合し、そしてＤＮＡを１３，０００×ｇで１０分間ペレットした。いずれかの液体を吸引によって除去し、そして該ペレットを７０％氷冷エタノールを用いて１回洗浄した。該エタノールを吸引によって除去し、そして該ペレットをSpeedVac中で５分間乾燥した。該消化したプラスミドＤＮＡを減菌の蒸留水中で最終濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬまで再懸濁した。
【００５３】
濃縮したＰ．メタノリカＤＮＡ断片（５〜１０ｋｂ）を、０．０２ｍＬの反応液（これは、染色体ＤＮＡ（０．１μｇ）、プラスミドＤＮＡ（０．０３μｇ）、０．０３Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．８）、０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．０１Ｍ  ジチオトレイトールおよび０．０００５Ｍアデノシン−５'−トリリン酸およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega）（３ワイス(Weiss)ユニット）からなる）中でＢａｍＨＩ切断ｐＺｅｒｏ２にライゲートした。該反応を１６℃で１８時間行なった。ＤＮＡを濃縮し、そして塩を減菌蒸留水（１５μＬ）および１−ブタノール（２５０μＬ）を用いて抽出することによって除去した。該混合物を１３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、そして全ての液体を吸引によって除去した。該ペレットをSpeedVac中で５分間乾燥し、そして減菌蒸留水（５μＬ）中に再懸濁した。該ライゲートしたＤＮＡを、商業主の推奨にしたがって電気コンピテントなＤＨ１０Ｂ細胞（Life Technologies）中に形質転換した。形質転換後に、ＬＢ培地（０．９６ｍＬ）を加え、そして細胞を３７℃で１時間増殖させた。１３７ｍｍのＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋サークル（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）を、ＬＢ寒天（７５ｍＬ）＋カナマイシンを含有するペトリ皿（１５０ｍｍ）の上部に置いた。５，０００コロニーを形成するユニットを得るのに十分な部分的Ｓａｕ３Ａ１ライブラリのアリコートを、ＬＢ培地（１ｍＬ）中に希釈し、そして該フィルター上に均一に広げた。該プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。コロニーを、２つの新たなフィルター上に複製し、これらをＬＢ＋カナマイシン寒天培地上に置き、そして３７℃で６時間インキュベートした。細胞の溶解および放出されたＤＮＡの中和は、該フィルターについて与えた指示に従って行なった。該ＤＮＡを、「自己架橋」様式でＵＶストラタリンカー(Stratalinker)２４００ユニット（Stratagene, Inc., La Jolla, CA）を用いて該フィルターに架橋させた。該フィルターを３×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、リットル当たりＮａＣｌ（１７３．５ｇ）、クエン酸ナトリウム（８８．２ｇ）を含み、ｐＨは１０Ｎ  ＮａＯＨを用いて７．０に調節する）の溶液、０．１％  ＳＤＳを有する容器内に置き、そして該溶解したコロニーを湿ったキムワイフ(Kimwipe)を用いてふき取る(rubbing)ことによって、細胞デブリを除去した。次いで、該フィルターを少なくとも３時間、および同じ洗浄用液と一緒に６５℃で少なくとも３時間インキュベートした。
【００５４】
Ｃ．ケトレダクターゼ遺伝子を含有するクローンの選択
精製Ｐ．メタノリカケトレダクターゼの部分的なアミノ酸配列に基づく混合型オリゴヌクレオチドプライマーを、調製した（図１を参照）。センチおよびアンチセンスプライマーの全ての可能な組み合わせを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。該反応液は、総容量が０．５ｍＬで、０．０５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、２５０μｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン、２％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１ｍＭ  クレゾールレッド、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０００５Ｍの各プライマー、０．２５μＬ（０．６２５Ｕ）のタカラ(Takara)Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（PanVera, Madison, WI）および０．１μｇ  Ｐ．メタノリカ染色体ＤＮＡからなる。増幅反応は、以下の条件下でパーキンエルマー(Perkin-Elmer)モデル４８０サーマルサーキュラー中で行なった：９４℃で４分間変成し；続いて９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１．５分間および最後の伸張は７２℃で５分間を３０サイクルとした。それぞれ、６５０および８５０ｂｐの断片の強い増幅は、１．０％ＴＡＥアガロースゲル上の各反応液の試料の電気泳動後に、オリゴヌクレオチド対１８３＋１８６、および１８５＋１８８を用いて観察した。
【００５５】
断片を、該アガロースゲルから単離し、そしてQIAquick Gel Extraction Kitを用いて精製した。該ＤＮＡを、商業主のプロトコールに従ってベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen, Carlsbad, CA）にライゲートし、そしてエレクトロポレーションによって大腸菌ＤＨ１０Ｂ中に形質転換した。細胞をＬＢ寒天培地（これは、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびＢｌｕｏ−ｇａｌ（Life Technologies；ジメチルホルムアミドの２％[ｗ／ｖ］溶液（７５μＬ））を含有する）上に広げた。各ライゲーション／形質転換から無作為に選んだ５つの白色コロニーを、ＬＢ＋カナマイシン液体培地中に播種し、そして３７℃、２５０ｒｐｍで２０時間増殖した。プラスミドＤＮＡを、QIAprep Spin Miniplasmid Kit（Qiagen）を用いて各試料から調製した。予想インサートの存在を、上記の条件を用いたＰＣＲによって確認した。１つの代表的なプラスミドを、ALPexpress AutoRead kit (Amersham-Phamacia）を用いて配列決定し、そしてALFexpress automated DNA sequencing unitを用いて分析した。両方の場合において、精製した酵素から得られるがオリゴヌクレオチドを製造するのに使用しない部分的なアミノ酸配列もまた、該ＰＣＲ断片中にコードされていることが分かった。
【００５６】
これらの結果に基づいて、ジゴキシゲニン標識プローブを、商業主の指示に従って、上記の２組のプライマーおよび該PCR DIG Probe Synthesis kit（Roche Biochemicals, Indianapolis, IN）を用いて製造した。上記の該単離ＰＣＲ断片（約１０ｎｇ）を、鋳型ＤＮＡとして含んだ。増幅条件は、以下の通りとした：９４℃で４分間変成し；続いて９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間の３０サイクルとした。該反応液のアリコート（５μＬ）を、該非標識化断片と一緒に１．０％  ＴＡＥアガロースゲル上で電気泳動した。ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰヌクレオチドの取り込みは、該標識断片の分子量の有意な増加によって確かめることができた。優位な取り込みは、オリゴヌクレオチド１８３＋１８６を用いて得た。
【００５７】
Ｐ．メタノリカＳａｕ３Ａ１ライブラリ由来の溶解しおよび変性したＤＮＡを含有する二組のフィルターを、ローラーボトル(roller bottle)中で、DIG EasyHyb溶液（Roche）（１０ｍＬ）および該変性の標識ＰＣＲ断片（５μＬ）と一緒にインキュベートした。ハイブリダイゼーションは、４２℃で１８時間、進行させた。フィルターを、２×ＳＳＣ（これは、２０×溶液から調製し；２０×ＳＳＣは、リットル当たりＮａＣｌ（１７３．５ｇ）、クエン酸ナトリウム（８８．２ｇ）を含み、ｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨを用いて７．０に調節した）、０．１％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を用いて室温で５分間、２回洗浄し、次いで０．５％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６８℃で１５分間、２回洗浄した。抗−ジゴキシゲニン抗体との結合、洗浄および検出を、ＤＩＧ標識およびDetection Kit試薬およびプロトコール（Roche）を用いて行なった。該膜をワットマン(Whatman)３ＭＭペーパー上に置いて、過剰量の液体を除去し、サランラップ(Saran Wrap)で覆い、そしてオートラジオグラフィーフィルム（Kodak X-OMAT LS）に曝露させた。１個のハイリブリダイズしたコロニーを、該マスター(master)フィルターから選び(pick)、そしてＬＢ＋カナマイシン液体培地上に画線し(streak)、そして３７℃で２４時間インキュベートした。該コロニーを、QIAfilter Plasmid Midi Kit（Qiagen）を用いて、プラスミド単離のためのＬＢ＋カナマイシン液体培地上で増殖した。約５．０ｋｂのインサートを示す制限酵素切断地図が、組換えプラスミド中に存在した。単離したＤＮＡについて、そのもののオリゴ(oligos)１８３＋１８６および１８５＋１８８を用いた増幅を支持する能力を調べ、このことを確認した。単離ＰＣＲ断片のＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを、ｐＫＲ５．０中の該インサートの分析に使用した。分子量が３９，８００ダルトンを有する３５３アミノ酸のタンパク質をコードする１０５９ｂｐのオープンリーディングフレームを、見出した（図１）。このことは、単離ケトレダクターゼのサイズ（ゲルろ過によって４０，０００ダルトン）とほぼ一致する。
【００５８】
実施例８
Ｐ．メタノリカケトレダクターゼ遺伝子のサブクローニングおよび大腸菌中での発現
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、発現ベクターＰＢＭＳ２０００中にクローニングするのに適当な制限部位を含有する完全なケトレダクターゼ遺伝子を増幅した。使用したプライマーを、以下に示す：
【数４】
2004532017.tif 000022
（太文字のヌクレオチドは、制限酵素ＢｓｐＨＩについての認識配列を示し；下線のヌクレオチドは、ケトレダクターゼ遺伝子の開始Ｍｅｔコドンを示す）、
【数５】
2004532017.tif 000023
（太文字のヌクレオチドは、制限酵素ＢａｍＨＩについての認識配列を示し；下線のヌクレオチドは、ケトレダクターゼ遺伝子の３’末端での停止コドンを示す）。
【００５９】
ＰＣＲ条件は、ｐＫＲ５．０  ＤＮＡを鋳型として使用し且つ反応液のサイズを２００μＬにまで増大させる（全ての構成成分の容量は比例して増加させる）ことを除いて、１．Ｃ項で示す条件と同一とした。該反応液のアリコートを１．０％ＴＡＥアガロースゲル上で電気泳動して、予想分子量（１０７７ｂｐ）のバンドの存在を確認した。該反応混合物の残りを、１：１のフェノール：クロロホルムを用いて１回抽出し、そして５分間、遠心分離（１３，０００×ｇ）後の水相を保持した。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ７．５）（２０μＬ）および１００％氷冷エタノール（４４０μＬ）を加えることによって、ＤＮＡを沈降した。１０分間、遠心分離（１３，０００×ｇ）後に、液体を吸引によって除去し、そして該ペレットを７０％エタノールで洗浄した。該エタノールを吸引して除き、そして該ＤＮＡをSpeedVac中で５分間乾燥した。該ペレットを、減菌蒸留水（０．０４３ｍＬ）中に再懸濁し、その後に０．０５ｍＬの反応容量（これは、０．０００６Ｍ  トリス−ＨＣｌ、０．０００６Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．００１Ｍ  ＤＴＴ（ｐＨ  ７．５）からなる）中で消化した。１０ユニットの各制限エンドヌクレアーゼ（１μＬ）を加え、そして該混合物を３７℃で１．５時間インキュベートした。該反応を、１：１の等量のフェノール：クロロホルムを加えることによって終止した。５分間、遠心分離（１３，０００×ｇ）後に、上部の（水）相を取り出し、このものを新しいマイクロチューブ中に入れた。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ７．５）（５μＬ）および氷冷１００％エタノール（Shelton Scientific, Shelton, CT）（１１０μＬ）を該水相と混合し、そして該ペレットを７０％氷冷エタノールを用いて１回洗浄した。該エタノールを吸引によって除去し、そして該ペレットをSpeedVac中で５分間乾燥した。該消化したプラスミドＤＮＡを、減菌蒸留水中に最終濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬにまで再懸濁した。
【００６０】
該ＢｓｐＨＩ／ＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ断片を、０．０２ｍＬの反応液（これは、プラスミド（０．０１μｇ）、ＰＣＲ産物（０．０３μｇ）、０．０３Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．８）、０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．０１Ｍ  ジチオトレイトールおよび０．０００５Ｍ  アデノシン−５’−トリリン酸塩からなる）および３ワイスユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega）中でＢｓｐＨＩ／ＢｓｍＨＩで切断したｐＢＭＳ２０００にレイゲートした。該反応は、１６℃で１８時間行なった。ＤＮＡを濃縮し、そして塩を減菌蒸留水（１５μＬ）および１−ブタノール（２５０μＬ）を用いて抽出することによって除去した。該混合物を１０分間遠心分離（１３，０００×ｇ）し、そして全ての液体を吸引によって除去した。該ペレットをSpeedVac中で５分間乾燥し、そしてこのものを減菌蒸留水（５μＬ）中で再懸濁した。該ライゲートしたＤＮＡを、商業主の推奨に従って、電気的にコンピテントなＤＨ１０Ｂ細胞（Life Technologies, Inc.）中に形質転換した。形質転換後に、ＬＢ培地（０．９６ｍＬ）を加え、そして該細胞を３７℃で１時間増殖した。該細胞のアリコートをＬＢ寒天培地（これは、１０μｇ／ｍＬの硫酸ネオマイシン（Sigma）を含有する）上に広げ、そして該プレートを３７℃で２０時間インキュベートした。該正確なインサートの存在は、１６個の無作為に選んだコロニーの一部が鋳型ＤＮＡの供給源であることを除いて、１．Ｃ項に記載する条件を用いたＰＣＲによって確立した。該１６コロニーの内の１４個は、正確なサイズの断片を増幅した。これらの単離物のうちの１つ由来のプラスミドを、ｐＢＭＳ２０００−ＰＭＫＲ（ピヒア・メタノリカケトレダクターゼ(Pichia metanolica ketoreductase)の場合）と命名した。
【００６１】
ｐＢＭＳ２０００−ＰＭＫＲを、商業者のプロトコールに従って、コンピテントな大腸菌株ＢＬ２１−CodonPlus (DE3)-RIL（Stratagene）中に形質転換した。細胞を、ＬＢ寒天培地（これは、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）およびネオマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含有する）上に広げた。４つのコロニーを無作為に選択し、そしてこのものを項１．Ｃに記載する条件を用いたＰＣＲのための鋳型ＤＮＡの供給源として使用した。全ての４つの反応が正確なサイズのＤＮＡ断片を増幅し、このことはBL21-CodonPlus (DE3)-RILの形質転換が成功したことを示す。これらの単離物の１つを発現菌株として選択し、そしてこのものを全ての更なる実験に使用した。該発現菌株のバイアルロットは、弱いログ期（ＯＤ６００〜３．５）まで、MT3／neo／chorブロス中、１５℃で該細胞を培養し、グリセロールを１０％の最終容量に加え、そして液体窒素中で凍結することによって調製した。MT3／neo／chorブロスの構成成分は、１％  NZ−Amine A（Sheffield Products, Norwich, NY）、２％イースタミン（A. E. Staley, Decataur, IL）、２％グリセロール、０．６％  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．３％  ＫＨ2ＰＯ4、０．１２５％  (ＮＨ4)2ＳＯ4、０．０２４６％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（EM Science）、１０μｇ／ｍＬ  硫酸ナオマイシンおよび３０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール（EM Science）とした。
【００６２】
該ケトレダクターゼ遺伝子の発現は、プラスミドｐＢＭＳ２０００上で始まるｐｔａｃプロモーターのＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄガラクトシド）によって制御した。該発現菌株は、ＯＤ600nmが〜０．７に達するまで、２５０ｍＬフラスコ内のMT3/neo/chlor（２５ｍＬ）中、２２５ＲＰＭで増殖した。この後に、ＩＰＴＧ（Life Technologies）を加えて、最終濃度を０．５ｍＭとした。該培養物を終夜（〜１６時間）増殖させて、ケトレダクターゼ遺伝子の完全な誘発および該ケトレダクターゼタンパク質の産生を可能とした。
【００６３】
該終夜発現の培養物の試料（１ｍＬ）をマイクロチューブに移し、そして該細胞を１４，０００×ｇで２分間ペレットした。該上清液を真空吸引して、そして該細胞ペレットをＯＤ600が３０となるまで蒸留水に再懸濁した。該細胞懸濁液（１０μＬ）を、蒸留水（１７．５μＬ）、０．５Ｍジチオトレイトール（Sigma）（１０μＬ）および４×NuPAGE LDSタンパク質試料ロード用緩衝液(Protein Sample Loading buffer)（Invitrogen）（１２．５μＬ）に加えた。タンパク質試料を７０℃で１０分間インキュベートし、そしてアリコート（１５μＬ）をNuPAGE１０％ビス−トリスゲル（Invitrogen）上にロードした。ゲルを、IX NuPAGE MOPS SDS操作用緩衝液(Running Buffer)中で、該追跡用色素が該ゲルの下部に達するまで、１２５ｍＡで電気泳動した。タンパク質分子量標準（Mid-Range Protein Molecular Weight Markers, Promega Corp., Madison, WI）については、隣接するレーンで行なった。該操作の完結後に、該ゲルをタンパク質染色用溶液（４０％エタノール／１０％酢酸／５０％水中の０．１％クーマシーブルーR250［Sigma］）を含有するトレーに移した。該溶液をプラットホーム振り混ぜ機上に置き、そして静かに１時間撹拌した。該染色用溶液を除去し、そして脱染用溶液（１×Gel-Clear Destain, Novex）によって置き換えた。該ゲルを該プラットホーム振り混ぜ機上に戻し、そして該タンパク質のバンドがはっきりと見ることができるまで脱染した。該ケトレダクターゼ発現菌株から調製したタンパク質試料は、約４０，０００ダルトンの分子量を有する明らかに過剰発現したタンパク質を示した。コントロール培養物、非形質転換のBL21-CodonPlus (DE3)-RIL、またはpBMS2000で形質転換したBL21-CodonPlus (DE3)-RILのいずれかは、ＩＰＴＧ誘発後に比較可能なバンドを全く示さなかった。その後の実験は、該過剰発現タンパク質が可溶性のタンパク質画分中で優位に見られることを示した。
【００６４】
該異種発現タンパク質がケトレダクターゼ活性を有するかどうかを調べるために、該発現菌株を、上記のとおり（培養容量は１Ｌにまで増大させ、そして該フラスコサイズは４Ｌにまで増大させたことを除いて）増殖させ、そして誘発させた。ＩＰＴＧを用いた終夜の誘発後に、試料を上記のタンパク質ゲル上で分析した。該結果は、該培養サイズのスケールアップが該菌株の異種タンパク質を過剰発現させる能力に全く影響を及ぼさないことを示した。生体内変換プロセスにおける組換え酵素の使用例を、実施例９に示す。ケトレダクターゼタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を、図１に示す。
【００６５】
【数６】
2004532017.tif 000024
【数７】
2004532017.tif 000025
【数８】
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【００６６】
実施例９
ピヒア・メタノリカ由来のケトレダクターゼを発現する組換え大腸菌による、ケトメチルエステル（Ｖ）の還元反応：
ピヒア・メタノリカ由来のケトレダクターゼ遺伝子をクローニングし、大腸菌中で過剰発現させた。大腸菌の細胞（これは、ケトレダクターゼを発現する）を、１５−Ｌおよび２５０Ｌ発酵槽内の培地５中で増殖した。大腸菌中でのケトレダクターゼの誘発は、培地の光学細胞密度（ＯＤ）が３．０に達したときに、誘発物質として０．２５ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって、行なった。ＩＰＴＧの添加後、発酵槽中で増殖させた３０時間後に、細胞を収集した。細胞を用いて、細胞懸濁液によるケトメチルエステル（基質Ｖ）の対応する(Ｓ)−ヒドロキシメチルエステル（生成物ＶＩ）ヘの生体内変換反応を触媒した。
【００６７】
本実施例における基質および生成物は、実施例３に記載する通りであった。ケトレダクターゼ酵素を発現する大腸菌の細胞を、１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）（１Ｌ）中、１０％（Ｗ／Ｖ）細胞濃度で懸濁した。細胞懸濁液を、１００μＭ  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、１ｍＭ  フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５０ｇのグルコース、３４００ユニットのグルコースデヒドロゲナーゼおよび４．５ｇの基質（ケトメチルエステル、式Ｖ）を用いて補足した。生体内変換反応は、２８℃の温度で５００ＲＰＭで行なった。基質Ｖおよび生成物ＶＩの濃度、並びに生成物ＶＩのエナンチオ過剰率を、実施例３に記載する通りＨＰＬＣ分析法によって測定した。該反応は２０時間内で完結し、生成物（ヒドロキシメチルエスエル、式ＶＩ）の反応収率は９５％であった。生成物ＶＩについてエナンチオ過剰率９９．９％が得られた。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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