(57)【要約】ビタミンＥおよび前立腺癌に関する組成物および方法が開示される。１つの実施形態において、ビタミンＥスクシネートまたは誘導体および抗前立腺癌化合物を含む、薬学的組成物が提供される。１つの実施形態において、この抗前立腺癌化合物が抗アンドロゲンである、薬学的組成物が提供される。１つの実施形態において、この抗アンドロゲンが、Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ、Ｃａｓｏｄｅｘ、またはＮｉｌｕｔａｍｉｄｅである、薬学的組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＥスクシネートまたは誘導体および抗前立腺癌化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記抗前立腺癌化合物が抗アンドロゲンである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記抗アンドロゲンが、Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ、Ｃａｓｏｄｅｘ、またはＮｉｌｕｔａｍｉｄｅである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記抗アンドロゲンが、Ｆｌｕｔａｍｉｄｅである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記抗アンドロゲンの濃度が、２０μＭ以下である、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ビタミンＥスクシネートが、式２に示される構造を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ビタミンＥスクシネートの濃度が１００μＭ以下である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記抗前立腺癌化合物が、２０μＭ以下である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、前立腺癌を有する被験体を処置する方法。
【請求項１０】
前記組成物を投与する工程が、前記組成物を前記被験体に注入する工程を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記組成物を投与する工程が、該組成物を経口的に摂取するか、皮膚パッチにより摂取するか、または皮下注射によって接種することを包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．関連出願）
本願は、２００１年７月２７日に出願された、Ｙｅｈらによる、「Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ」に対する、米国特許仮出願番号６０／３０８，２９５号の優先権を主張する。この出願は、その全体を参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（ＩＩ．謝辞）
本研究は、国立保健衛生研究所の助成ＤＫ６０９１２によって助成された。連邦政府は、本発明の権利を有し得る。
【０００３】
（ＩＩＩ．発明の背景）
前立腺癌は、最も普通の癌であり、米国人男性の癌による死亡の第２の主要な原因である。
【背景技術】
【０００４】
アンドロゲンにより制御される注目される遺伝子は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。ＰＳＡは、前立腺癌のスクリーニングおよび評価のための高感度かつ選択的なマーカーとして実証され、従って、ＰＳＡは、疾患および前立腺癌治療に対する応答の指標として使用される。
【０００５】
ＶＥＳは、通常の血清条件下またはアンドロゲン刺激条件下のいずれかで培養された、ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞における細胞内ＰＳＡレベルおよび分泌ＰＳＡレベルを減少することが、本明細書中で示される。さらに、これらの結果は、ＰＳＡの阻害が、ＡＲタンパク質レベルのＶＥＳ媒介性ダウンレギュレーションと同時に生じることを示した。さらに、ＶＥＳによるＡＲタンパク質の阻害は、タンパク質レベルで生じ、ＡＲ  ｍＲＮＡの転写制御的レベルのレベルで主に生じるというわけではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（ＩＶ．発明の要旨）
本明細書中で開示される組成物および方法の目的に従うと、１つの局面において、これらの組成物および方法は、細胞内または被験体内でＰＳＡレベルを改変するための組成物および方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のさらなる利点は、一部は、以下の本明細書中で示され、一部は、本明細書から明らかであるか、または本発明の実施によって学習され得る。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲中に特に指摘される、要素および組み合わせによって実現かつ達成される。前述の一般的な記載および続いての詳細な説明の両方は、単に例示的かつ説明的であり、そして特許請求の範囲に記載されるように本発明を制限しないことが理解される。
【０００８】
本明細書に援用され、そしてその一部を構成する、添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を示し、本明細書と一緒になって、本発明の原理の説明を提供する。
【０００９】
（ＶＩ．詳細な説明）
本明細書中に開示される、本発明の組成物および方法は、以下の主題の好ましい実施形態の詳細な説明およびそこに含まれる実施例、ならびに図およびその前後の説明を参照することによって、より容易に理解され得る。
【００１０】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示および記載される前に、本発明は、他に詳述されない限り、特定の合成方法、特定の組換え生物工学方法に限定されず、または他に詳述されない限り、特定の試薬に限定されないことが理解されるべきである。このようなものは、もちろん、変化し得るからである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、限定を意図しないこともまた、理解されるべきである。
【００１１】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、「薬学的キャリア（ａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ）」の言及は、２種以上のこのようなキャリアの混合物を含む、などである。
【００１２】
範囲は、本明細書中において、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表現され得る。このような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または別の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」の使用によって近似として表現される場合、この特定の値は、別の実施形態を形成することが理解される。範囲の各々の終点は、他方の終点に対してと、他の終点とは無関係にとの両方で重要であることが、さらに理解される。本明細書中に開示される多数の値が存在すること、および各値はまた、本明細書中において、その値自体に加えて「約」その特定の値であると開示されることもまた、理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示される場合、その値「以下」、「その値以上」、および値の間の可能な範囲もまた、開示されることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」および「１０以上」もまた開示される。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、以下の意味を有するように定義される多数の用語が参照される：
「任意の」または「必要に応じて」とは、引き続いて記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいこと、およびこの記載は、この事象または状況が起こる例および起こらない状況を含むことを意味する。
【００１４】
略語：ＡＲ、アンドロゲンレセプター；ＰＳＡ、前立腺特異抗原；ＤＨＴ、５α−ジヒドロテストステロン；Ｓｕ、コハク酸；α−ＶＥＳ、α−ビタミンＥコハク酸、ＨＦ、ヒドロキシフルタミド；Ｖｉｔ  Ｄ３、１α，２５−ヒドロキシビタミンＤ３；ＶＤＲ、ビタミンＤレセプター；ＰＰＡＲ、ペルオキシソーム増殖剤応答性レセプター；ＲＸＲ、レチノイドＸレセプター；Ｈ−ＬＢＤ、ヒンジおよびリガンド結合ドメイン；Ｌｕｃ、ルシフェラーゼ；ＣＡＴ、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒｅｎｐｈｅｎｉｃａｌ）アセチルトランスフェラーゼ、ＦＢＳ、ウシ胎仔血清、ＬＨ−ＲＨ  −  黄体化ホルモン放出ホルモン、ＢＰＨ−良性前立腺過形成、ＤＥＳ−ジエチルスチルベストロール、およびＧｎＲＨ−性腺刺激ホルモン放出ホルモン。
【００１５】
（Ａ．組成物）
開示される組成物を調製するために使用される成分、ならびに組成物自体および本明細書中に開示される方法において使用するための組成物が、開示される。これらおよび他の材料は、本明細書中に開示されており、そしてこれらの化合物の各種々の個々の順列および集合的な順列の特定の参照が明白に開示されないかもしれないが、これらの材料の組合せ、部分集合、相互作用、群などが開示される場合、各々が、具体的に企図され、そして本明細書中に記載されることが理解される。例えば、特定のＶＥＳまたはＶＥＳ誘導体が開示および議論され、そしてＶＥＳまたはＶＥＳ誘導体を含む多数の分子に対してなされ得る多数の改変が議論される場合、具体的に逆のことが示されない限り、ＶＥＳまたはＶＥＳ誘導体および可能な改変の各々および全ての組み合わせおよび順列が、具体的に企図される。従って、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスと同程度に開示され、そして組み合わせ分子の例Ａ−Ｄが開示されている場合、各々が個々に列挙されない場合でさえも、各々が個々にかつ集合的に、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されているとみなされることを意味することが企図される。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせもまた、開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの部分集合は、開示されるとみなされる。この概念は、本願の全ての局面（開示される組成物を作製および使用する方法における工程が挙げられるが、これらに限定されない）に対して適用される。従って、実施され得る種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態と共に、または実施形態の組み合わせと共に、実施され得る。
【００１６】
ＶＥＳおよびＶＥＳ誘導体を含有する組成物が、開示される。ＶＥＳまたはＶＥＳ誘導体および抗アンドロゲンを含有する組成物もまた、開示される。ＶＥＳまたはＶＥＳ誘導体を含有する薬学的組成物、ならびにＶＥＳまたはＶＥＳ誘導体および抗アンドロゲンを含有する薬学的組成物もまた、開示される。
【００１７】
抗アンドロゲンは、代表的に、アンドロゲンレセプターの活性を阻害する組成物であり、そして例えば、ヒドロキシフルタミド（ＨＦ）が挙げられる。ＨＦのように機能する抗アンドロゲンが好ましい。ＨＦのように機能し、そしてＨＦに構造的に関連する抗アンドロゲンもまた、好ましい。
【００１８】
本明細書中に開示されるトコフェリルスクシネート（ＶＥＳ）は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（前立腺癌の進行についてのマーカー）の発現を抑制し得る。ＶＥＳはまた、転写および転写後調節によって、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）発現を抑制し得るが、リガンド結合、核転座、またはＡＲ二量化を抑制し得ない。ＡＲのこのＶＥＳ媒介阻害は、選択的である。なぜなら、ＶＥＳは、他の核レセプターの発現を抑制しないからである。細胞増殖研究は、ＶＥＳが前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞の増殖を阻害することをさらに示す。対照的に、ヒドロキシフルタミド（ＨＦ）（前立腺癌患者を処置するために現在使用されている抗アンドロゲン）は、ＬＮＣａＰ細胞増殖をわずかにのみ阻害する。興味深いことに、ＨＦおよびＶＥＳの同時の添加は、ＬＮＣａＰ細胞増殖のより有意な阻害を生じる。さらに、セレノメチオニン（ＳＭ）（前立腺癌処置アジュバント）は、ＬＮＣａＰ細胞増殖に対する阻害効果を示すが、依然として、ＡＲ／ＰＳＡ経路に対して効果を有さない。一緒になって、このデータは、ＶＥＳが、転写レベルと翻訳レベルとの両方でＡＲ発現を阻害することによって、アンドロゲン／ＡＲ媒介細胞増殖およびＰＳＡ発現を抑制し得ることを示す。
【００１９】
前立腺癌は、最も通常の非皮膚癌であり、そして米国における男性の、２番目に主要な癌による死因である（８）。アンドロゲンレセプター（ＡＲ）は、正常な前立腺と前立腺癌との両方の発達のために必要とされる。ＡＲは、前立腺および前立腺癌の発達および分化における、重要な因子である。前立腺癌の後期段階において、８０％を超える前立腺癌組織は、ＡＲ染色に対して陽性のままである（３４）。全体的に、これらの観察は、ＡＲの、前立腺癌の阻害および抑制における重要性を示す。前立腺癌の初期段階において、ほとんど全ての癌細胞は、アンドロゲン依存性であり、そして抗アンドロゲンに高度に感受性である。しかし、前立腺癌は、通常、アンドロゲン除去処置の数年後に再発し、そして大部分の癌細胞は、アンドロゲン非依存性になり、抗アンドロゲン治療を無益にする（９）。報告は、ＡＲリガンド結合ドメイン、ＡＲ同時調節因子、またはレセプターリン酸化における変異が、ＡＲを非アンドロゲンアゴニストに対して応答可能にし得ることを示唆する（１０〜１３）。さらに、アンドロゲン除去治療の間のこれらの因子によるＡＲの活性化は、アンドロゲン非依存性の前立腺癌増殖を容易にし得る。アンドロゲン非依存性の前立腺腫瘍が不治であるので、このような異常なＡＲ活性化の予防は、魅力的な治療標的である。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、主要なアンドロゲン調節遺伝子であり、そして前立腺癌のスクリーニングおよび評価のための、感受性かつ選択的なマーカーである（１４）。その結果、ＰＳＡは、疾患の進行の指標として使用され、そして前立腺癌治療に応答する。
【００２０】
本明細書中で、アンドロゲン依存性ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞株（１５）は、ＶＥＳが前立腺癌の発達および進行を防止する潜在的な機構を研究するための細胞モデルとして使用された。ＶＥＳは、ＬＮＣａＰ細胞（これは、正常な血清中またはアンドロゲンで刺激した条件のいずれかで培養された）におけるＰＳＡの細胞内レベルおよび分泌レベルを低下させる。さらに、これらの結果は、ＰＳＡの阻害が、ＡＲタンパク質レベルのＶＥＳ媒介ダウンレギュレーションと協働することを示す。ＡＲタンパク質の阻害は、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルの調節に起因するのみでなく、ＶＥＳがＡＲタンパク質翻訳の効率に影響を与えることにも起因する。
【００２１】
ＬＮＣａＰ細胞株は、リンパ節前立腺癌転移由来であり（１５）、そしてヒト前立腺癌研究のための最良のインビトロモデルの１つである。なぜなら、ホルモン難治前立腺癌腫を代表し、そしてその増殖はアンドロゲンに応答性であるからである。さらに、ＬＮＣａＰ細胞は、機能的変異体ＡＲを発現し、そしてＰＳＡ（これは、前立腺癌のスクリーニングおよび評価のための感受性かつ特異的な腫瘍マーカーである）を産生する（２２、３０〜３２）。野生型ＡＲとＬＮＣａＰ変異体との両方が、アンドロゲンに応答するが、エストロゲン性化合物およびいくつかのアンドロゲンは、ＬＮＣａＰ変異体ＡＲと高い親和性で結合し、そしてＡＲ転写活性およびＰＳＡ発現をより効率的に刺激する（１２、３３）。
【００２２】
最近、４６ｋＤａのトコフェロール結合タンパク質（ＴＡＰ）が、ウシ肝臓の細胞質ゾルから同定された（３５）。追跡研究において、ヒトＴＡＰ（ｈＴＡＰ）が単離され、そして組換えｈＴＡＰは、４６０ｎＭのＫｄでビタミンＥと結合し得た。ノーザンブロッティングアッセイは、より高レベルのｈＴＡＰ  ｍＲＮＡが、肝臓、脳、および前立腺において見出されることを示す。
【００２３】
転写レベル（４３）または核転座レベル（４４）のいずれかでＡＲ発現に阻害効果を示す他の天然産物とは異なり、本明細書中に開示されるビタミンＥは、ＡＲの翻訳を阻害する。抗増殖治療は、細胞の生存または表現型についての異なる経路または機構を標的とする試薬を提供することによって、増強され得る。従って、前立腺癌の処置または予防のための、ビタミンＥスクシネート誘導体と他の試薬との組み合わせが、開示される。
【００２４】
（１．ビタミンＥ）
ビタミンＥの構造が、式Ｉに示される。
【００２５】
【化１】
2004538304.tif 000002
ビタミンＥは、受胎能および生殖に関与することが示されている。ラットにおけるビタミンＥの欠損は、雌性における吸収および雄性における受胎能の損失を導く。ビタミンＥは、抗酸化効果を有することが示されており、これは、細胞を酸素およびフリーラジカルによる損傷から保護し得る。ビタミンＥはまた、赤血球の形成に関与することが示されている。ビタミンＥは、植物性脂質および動物の体脂肪において見出され得るが、動物は、自分でビタミンＥを産生し得ない。例えば、ビタミンＥは、植物性油、ナッツおよびナッツ油、種子、卵黄、マーガリン、パルメザン、チェダー、ヒヨコマメ、ダイズ、コムギ麦芽、オートミール、アボカド、オリーブ、ニンジン、アメリカボウフウ、トウガラシ、青菜（ｇｒｅｅｎ  ｌｅａｆｙ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ）、サツマイモ、トマト、スイートコーン、およびオランダガラシにおいて見出され得る。
【００２６】
ビタミンＥは、トコフェロールに関連する一般構造を有し、そしてビタミンＥ誘導体は、代表的に、トコールのメチル化形態である。ビタミンＥの、少なくとも４つの天然であり得る誘導体が存在する：α−トコフェロール、Ｃ２９Ｈ５０  Ｏ２は、５，７，８−トリメチルトコールであり、最も強い一般的なビタミンＥ活性で結合しており、β−トコフェロールＣ２８Ｈ４８  Ｏ２は、５，８，−トリメチルトコールであり、γ−トコフェロールＣ２８Ｈ４８  Ｏ２は、７，８，−トリメチルトコールであり、そしてδ−トコフェロールＣ２７Ｈ４６  Ｏ２は、８，−トリメチルトコールである。
【００２７】
ビタミンＥは、天然の形態および合成の形態で見出され得る。ビタミンＥの天然の形態は、ｄ立体異性体形態（ＲＲＲ−）（例えば、ｄ−トコフェロール）の代表的に全てであり、一方で合成形態は、ｄｌが変動するものである（例えば、ｄｌ−トコフェロール）。
【００２８】
さらに、ビタミンＥの種々のエステル化誘導体（例えば、スクシネート誘導体（ＶＥＳ））が存在する。ビタミンＥのエステル化誘導体は、式Ｉに示される環ヒドロキシルにおいて起こり得る。従って、例えば、スクシネートまたはアセテートは、この環ヒドロキシルをエステル化するために使用され得る。別の公知の誘導体は、ＲＲＲ−α−トコフェリルスクシネートである。ビタミンＥスクシネートの構造は、以下に示される。
【００２９】
【化２】
2004538304.tif 000003
多数の異なる型の前立腺癌治療が存在する。例えば、視床下部からのホルモン分泌は、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例えば、
【００３０】
【化３】
2004538304.tif 000004
（これらは、精巣および副腎によるＴの産生を阻害する））によって調節され得る。抗アンドロゲン治療剤（例えば、
【００３１】
【化４】
2004538304.tif 000005
（これらは、ＡＲに対するアンドロゲン結合をブロックし得る））もまた、存在する。他の治療剤としては、５−αレダクターゼインヒビター（例えば、
【００３２】
【化５】
2004538304.tif 000006
（これは、ＴのＤＨＴへの転換を阻害し得る））の投与が挙げられる。ＤＨＴは、Ｔより高い結合親和性を有する、ＡＲについての最も効果的なリガンドである。しかし、この化合物は、一般に、前立腺癌患者より、ＢＰＨ患者に適用される。
【００３３】
エストロゲン（例えば、ＤＥＳ、エストラジオール、およびＳｔｉｌｐｈｏｓｔｅｒｏｌ  Ｈｏｎｖａｎ）もまた、前立腺癌の処置において使用されている。これらの分子は、視床下部からのホルモンの量を減少させ得る。これらの分子は、下垂体からのＬＨ分泌および視床下部からのＧｎＲＨ分泌におけるネガティブなフィードバック調節を誘導することによって、精巣からのＴ合成を減少させ得る。他の治療剤としては、ケトコナゾール（Ｎｉｚｏｒａｌ）（これは、シトクロムｐ４５９酵素系を阻害して、Ｔ合成を減少させ得る）、およびステロイド（例えば、ヒドロコルチゾン、アミノグルテチミド（Ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｅｍｉｄｅ）（Ｃｙｔａｄｒｅｎ）、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ）、およびシプロテロン（Ａｎｄｒｏｃｕｒ））が挙げられる。ケトコナゾールは、通常、第ＩＶ段階の再発性前立腺癌を罹患する患者における第二系統のホルモン治療として使用される。アミノグルテチミド（Ｃｙｔａｄｒｅｎ）は、コレステロールのプレグネノロンへの酵素的転換を阻害することによって、副腎のステロイド生成をブロックする。シプロテロン（Ｃｙｐｏｔｅｒｏｎｅ）は、弱いプロゲステロン活性を有するステロイド抗アンドロゲンであり、これは、脳下垂体性腺刺激ホルモンの部分的な抑制および血清Ｔの低下を生じる。ヒドロコルチゾンおよびＤｅｃａｄｒｏｎを使用する主要な目的は、症状を軽減し、そして前立腺癌患者の生活の質を増加させることである。これらの治療剤の組み合わせが実施され、そして本明細書中に開示されることが理解される。
【００３４】
従って、抗前立腺癌化合物（例えば、フルタミド／ＨＦ、カソデックス（ｃａｓｏｄｅｘ）、ニルタミド（ｎｉｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、フィナステリド、１，２５−ジヒドロキシル、ビタミンＤ３、および天然産物（ケルセチン、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）、イソフラボノイド、エピガロカテキンガラート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）（ＥＧＣＧ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が挙げられる））が開示される。これらおよび他のものは全て、開示されるビタミンＥ誘導体（例えば、ＶＥＳ）と、集合的または個々に、任意の組み合わせで組み合わせて添加され得る。
【００３５】
代表的に、抗前立腺癌化合物は、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、０．１μＭ以下、または０．０１μＭ以下の濃度で提供され得る。代表的に、抗アンドロゲンもまた、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、０．１μＭ以下、または０．０１μＭ以下の濃度で提供され得る。代表的に、ビタミンＥ誘導体（例えば、ＶＥＳ）は、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、０．１μＭ以下、または０．０１μＭ以下の濃度で投与され得る。しかし、当業者は、任意の開示された組成物を、例えば、作用について開示された細胞モデルおよび動物モデルに依存して、ならびに種々の濃度でインビボで組成物を試験することによって、インビボで投与するための最適な濃度についてアッセイする方法を理解する。
【００３６】
（Ｂ．組成物を作成する方法）
組成物は、本明細書中に開示される方法を使用して、または当業者に公知の任意の方法によって、作製され得る。組成物はまた、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．から購入され得る。
【００３７】
（Ｃ．組成物を使用する方法）
開示される組成物を使用して、前立腺癌細胞の増殖を減少させ得る。従って、これらの組成物は、前立腺癌に指向された治療において使用され得、そしてこれらは、他の前立腺癌治療（例えば、抗アンドロゲン（例えば、ヒドロキシフルタミド（ＨＦ））の投与）と組み合わせて使用され得る。
【００３８】
（１．薬学的生成物の送達）
組成物は、薬学的組成物であり、被験体に投与され得るように適切に処方された組成物である。代表的に、このことは、この組成物が、本明細書中で議論されるような、薬学的に受容可能なキャリアと共に存在することを意味する。上記のように、この組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリア中でインビボで投与され得る。「薬学的に受容可能な」とは、生物学的にも他の様式でも望ましくなくはない材料を意味する。すなわち、この材料は、いずれの所望でない生物学的影響をも引き起こさずに、またはそれが含まれる薬学的組成物の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用せずに、核酸またはベクターと共に被験体に投与され得る。キャリアは、当然、当業者に周知であるように、活性成分の任意の分解を最小にするように、そして被験体における任意の有害な副作用を最小にするように選択される。
【００３９】
この組成物は、経口的に、非経口的（例えば、静脈内）に、筋肉内注射により、腹腔内注射により、経皮的に、体外的に、局所などにより投与され得るが、局所的な鼻腔内投与または吸入による投与が、代表的に好ましい。本明細書中で使用される場合、「局所鼻腔内投与」は、外鼻孔の一方または両方を介した、鼻および鼻孔への組成物の送達を意味し、そしてスプレー機構もしくは液滴機構による送達、または核酸もしくはベクターのエーロゾル適用を介した送達を含み得る。後者は、多数の動物（例えば、ヒト）が同時に処置される場合に、有効である。吸入薬による組成物の投与は、鼻または口を通る、スプレー機構または液滴投与による送達を介してであり得る。送達は、挿管を介して、呼吸系（例えば、肺）の任意の領域に直接送達され得る。必要とされる組成物の正確な量は、被験体間で異なり、種、年齢、体重および被験体の一般的な状態、処置されるアレルギー障害の重篤度、使用される特定の核酸またはベクター、投与形態などに依存する。従って、各組成物の正確な量を特定することは、可能ではない。しかし、適切な量は、本明細書中の教示が与えられた慣用的な実験を使用する当業者によって決定され得る。
【００４０】
組成物の非経口投与は、使用される場合、注射によって一般に特徴付けされる。注射は、従来の形態（液体溶液または懸濁液のいずれか）、注射前の液体中での懸濁溶液に適切な固体形態、またはエマルジョンで調製され得る。局所投与のために最近改良されたアプローチは、遅延放出（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ）系または持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）系の使用を含み、一定の投薬が維持される。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００４１】
この材料は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれる）中に存在する。これらは、抗体、レセプター、またはレセプターリガンドを介して特定の細胞型に標的化され得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化する技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５（１９９１））。ビヒクル（例えば、「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」）および他の抗体結合体化リポソーム（結腸癌に標的化する脂質媒介薬物を含む）は、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡのレセプター媒介ターゲッティング、リンパ球指向性癌ターゲッティング、およびインビボでマウスグリア細胞の高度に特異的な治療レトロウイルスターゲッティングである。以下の参考文献は、腫瘍組織に対して特定のタンパク質を標的化するための技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７、（１９９２））。一般に、レセプターは、エンドサイトーシスの経路に関与する（誘導される構成物またはリガンドのいずれか）。クラスリンでコーティングされたピット中のこれらのレセプタークラスターは、クラスリンでコーティングされたベシクルを介して細胞に入り、レセプターが分類される酸性化エンドソームを通過し、次いで細胞表面に再循環するか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、種々の機能（例えば、栄養の摂取、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性侵入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプターレベルの調節）に役立つ。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドの型、リガンドの原子価、およびリガンドの濃度に依存して、１以上の細胞内経路に従う。レセプター媒介エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構が、総説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６、３９９−４０９（１９９１））。
【００４２】
（ａ）薬学的に受容可能なキャリア）
この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて治療学的に使用され得る。
【００４３】
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらのほとんどは、代表的に、薬物のヒトへの投与のための標準的なキャリア（滅菌水、生理食塩水および緩衝化溶液（生理学的ｐＨ）のような溶液を含む）である。この組成物は、筋肉内または皮下に投与され得る。別の組成物を被験体に送達することを可能にする任意の化合物または組成物（この送達自体は、被験体に対して有害ではない）は、薬学的に受容可能なキャリアとしてみなされ得る。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与される。
【００４４】
薬学的組成物は、選択した分子に加えて、キャリア、濃厚剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、界面活性剤などを含み得る。薬学的組成物はまた、１以上の成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬など）を含み得る。
【００４５】
薬学的組成物は、局所的処置または全体的処置が所望されるか否かに依存して、処置される領域において多数の方法で投与され得る。投与は、局所的（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内）、経口、吸入、または非経口（例えば、点滴、皮下注射、腹腔内注射または筋肉内注射）であり得る。開示される組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内または経皮的に投与され得る。
【００４６】
非経口投与のための調製物としては、滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられ得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、アルコール／水性溶液、エマルジョンおよび懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム水溶液、リンガーデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンガーデキストロースに基づく電解質補充剤）などが挙げられる。防腐薬および他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどとして存在し得る。
【００４７】
局所投与のための処方物は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴、懸濁液、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来の薬学的キャリア、水性ベース、粉末ベースまたは油性ベース、濃厚剤などが、必要とされるか、または所望され得る。
【００４８】
経口投与のための組成物としては、粉末または顆粒、懸濁液または水中溶液もしくは非水性媒体中の溶液、カプセル、スターチ、あるいは錠剤が挙げられる。濃厚剤、矯味矯臭薬、希釈剤、乳化剤、分散性酸（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ  ａｃｉｄ）または結合剤が、所望され得る。
【００４９】
この組成物のいくらかは、薬学的に受容可能な酸付加塩または塩基付加塩として強力に投与され、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸）、ならびに有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、クエン酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応によって、または無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）および有機塩基（例えば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミンおよびアリールアミン、ならびに置換エタノールアミン）との反応によって形成され得る。
【００５０】
（ｂ）治療学的使用）
組成物の投与のための投薬範囲は、症状障害に影響を及ぼす所望の効果を提供するのに十分広い。投薬量は、有害な副作用（例えば、所望しない交差反応、アナフィラキシー反応など）を生じるほど多くなるべきではない。一般に、投薬量は、年齢、状態、性別および患者の疾患の程度により変化し、そして当業者によって決定され得る。投薬量は、任意の反対事象時に個々の外科医によって調節され得る。投薬量は、毎日、１日または数日毎に、１以上の用量投薬量で投与され得る。
【００５１】
アンドロゲン活性を阻害するＰＳＡおよびアンチアンドロゲン化合物を阻害するＶＥＳまたはＶＥＳ誘導体を含む薬学的組成物が、好ましい。好ましいアンチアンドロゲン化合物は、ＨＦである。
【００５２】
開示された組成物はまた、推定前立腺癌治療の効果を決定するためのＬＮＣａＰ細胞増殖アッセイ中の標準として使用され得る。
【００５３】
（Ｄ．実施例）
以下の実施例は、本発明において特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が、どのように生成および評価されるかの完全な開示および記載を当業者に提供するように記載されており、そして本発明の単なる例示であることが意図され、そして発明者が、どの範囲を自己の発明とみなすかを限定することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を確実にするための努力がなされたが、ある程度の誤差および変動が、考慮されるべきである。他に示さなければ、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。
【００５４】
（１．実施例１）
疫学的証拠が、毎日のビタミンＥの補充が、前立腺癌の危険性を低下させ得ることを示した。本明細書中に開示されるように、ビタミンＥスクシネート（α−ＶＥＳ）は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺癌の進行についてのマーカーの発現を抑えた。α−ＶＥＳは、翻訳後調節（タンパク質分解）を介したアンドロゲンレセプター（ＡＲ）の発現を抑制した。細胞増殖研究およびＭＴＴアッセイは、α−ＶＥＳが前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞の増殖を阻害し得ることをさらに示した。対照的に、ヒドロキシフルタミド（ＨＦ）（前立腺癌患者の処置に現在使用される抗アンドロゲン）が、ＬＮＣａＰ細胞の増殖についてのわずかな阻害のみを示した。興味深いことに、ＨＦおよびα−ＶＥＳの同時添加により、ＬＮＣａＰ細胞増殖のより有意な阻害を生じた。α−ＶｉｔＥおよびｒ−ＶｉｔＥと比較して、これらはまた、ＬＮＣａＰ細胞増殖を阻害するための最も有効な化合物であることを示唆した。併せて、このデータは、アンドロゲン／ＡＲのα−ＶＥＳとアンドロゲン／ＡＲ−媒介細胞増殖との間の関係を示した。この型の機構は、前立腺癌に対して指向性の治療のための新たな機会を提供する。
【００５５】
（ａ）材料および方法）
（１）（化学物質および試薬）
ＲＲＲ−α−トコフェリルスクシネート、（＋）−γ−トコフェロール、スクシン酸および５−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＶｉｔＤ３）を、Ｆｌｕｋａから購入し、ヒドロキシフルタミド（ＨＦ）は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇからの寄贈物であった。ＥＸＰＲＥ３５Ｓ３５Ｓタンパク質標的化混合物を、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。ＶＥＳコハク酸（Ｓｕｃ）、セレノメチオニン（ＳＭ）、および５−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を、Ｓｉｇｍａから購入した。ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に対する抗体、ペルオキソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）、およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）およびアクチンは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのものであった。ＰＳＡ（クローンＥＲ−ＰＲ８）抗体を、Ｄａｋｏから購入した。
【００５６】
（２）（細胞培地およびＶＥＳ処置）
ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。線維芽細胞を、最初に、正常な前立腺組織から培養した。８％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を充填したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中、１２ウェル、６０ｍｍまたは１００ｍｍの培養皿（所望の密度、３７℃および５％  ＣＯ２）中で、ＬＮＣａＰ細胞を、６０％〜８０％のコンフルエンスに達するまで増殖させるか、８％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含む、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地１６４０中で増殖させた。この線維芽細胞を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中に維持した。この細胞を、他の成分（ＨＦ、Ｖｉｔ  Ｄ３、ＤＨＴ、コハク酸）を含むかまたは含まない、指定された濃度のＶＥＳを用いて処置した。この細胞を、指定された濃度で、コントロール、ＶＥＳ、ＨＦ、ＳＭ、またはＤＨＴのようなＳｕｃで処置した。処置の間、この培地を４日毎に変え、そして新鮮な化合物を、２日毎に添加した。
【００５７】
（３）（細胞の計数およびチアゾリルブルー（ＭＴＴ）アッセイ）
ＭＴＴアッセイは、哺乳動物細胞の生存および増殖についての比色定量アッセイである（１３，１６）。５×１０４ＬＮＣａＰ細胞を、１２ウェルプレートに播種した。３６〜４８時間後、培地を、リガンドを用いるか、または用いない異なる化合物の処理により、８％ＦＢＳまたはＣＳ−ＦＢＳを含み、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０にさらに２日、４日および６日で換えた。各期間処理の終わりに、２００μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を、１ｍｌの培地を有する各ウェルに、３時間３７℃で添加した。インキュベーション後、０．０４ＭのＨＣｌ（イソプロプルアルコール中、２ｍｌ）を、各ウェルに添加した。室温で３０分間攪拌し、そして数回ピペッティングした後、この吸光度を、試験波長（５９８ｎｍ）で読取った。この２×１０５線維芽細胞を、６−ウェル皿の各ウェル中で播種した。この処置およびＭＴＴアッセイは、ＬＮＣａＰ細胞と類似していた。細胞の計数のために、細胞をトリプシン処理し、培地によって中和し、そして血球計により計数した。線維芽細胞を、６ウェルプレート中で２×１０５／ウェルで播種し、そして細胞増殖アッセイを、ＬＮＣａＰ細胞のために使用した同一のＭＴＴアッセイを使用することによって行った。
【００５８】
（４）（ウエスタンブロッティング）
ＬＮＣａＰ細胞由来の総タンパク質溶解物を、上記のように調製した（Ｙｅｈ，ＰＮＡＳ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって５０μｇタンパク質を分離した後、タンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレンに対して電気泳動によって移動させ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、そして０．１％のＴｗｅｅｎ−２０および１０％のＦＣＳを含むＰＢＳ中で２時間インキュベートした。ヒトＡＲ、ＰＳＡ、およびβ−アクチンに対して特異的な一次抗体を、マニュアルに記載されるように、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に希釈し、そして室温で２時間インキュベートした。メンブレンをＰＢＳＴ中で洗浄し（３回、各々の時間は１０分）、そしてマニュアルに記載されるＡＰ結合体化二次抗体をＰＳＢＴ中でインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した（３回、各々の時間は１０分）。このタンパク質を、ＡＰウェスタンブロッティング試薬によって検出した。
【００５９】
（５）（ノーザンブロット分析）
ＬＮＣａＰ細胞を、ＶＥＳまたは他の化合物の指定された濃度で処理した。１、２および３日の処理後、細胞を収集した。総ＲＮＡを、製造業者の指示書書（ＧＩＢＣＯ）に従って、Ｔｒｉｚｏｌを使用して抽出した。総ＲＮＡ（２０μｇ）を、ホルムアルデヒド−アガロースを介して電気泳動させ、そして製造業者のプロトコールに従って、ハイボンド−Ｎ＋メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に移動させた（１７）。
【００６０】
ノーザンブロットのために、ヒトＰＳＡ、ＡＲ、およびβ−アクチンｃＤＮＡのフラグメントを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．製のランダムプラスミドＤＮＡ標識キットを使用して、［３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識した。メンブレンを、製造業者の使用者マニュアルに従って、プレハイブリダイズし、ハイブリダイズし、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製のＲａｐｉｄ−ｈｙｂシステムを使用して洗浄した。このｍＲＮＡを、ホスホリメジャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）スクリーンシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して検出した。
【００６１】
（６）（ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲの［３５Ｓ］−メチオニン標識）
ＬＮＣａＰ細胞を、１００ｍｍディッシュにプレートして、そして８０％コンフルエンスに至るまで７２〜９６時間に亘って増殖させた。以下の手順において使用した、全てのパルス培地、追跡培地、および洗浄培地を使用前に３７℃まで暖めた。細胞を、無メチオニンＤＭＥＭ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび３７℃にて２時間に亘って透析した５％ウシ胎仔血清を加えた培地の交換の間に１度、プレ洗浄ＰＢＳで洗浄した。同時に、ＬＮＣａＰ細胞を、代表的には、２４時間に亘って、１０μＭ  ＶＥＳまたはエタノール（０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）によって調製した。全ての培地を、５ｍｌ／ディッシュの容積で細胞に加えた。２時間後に、以下に示すいずれかの間に亘って細胞をパルス培地でインキュベートすることによって標識した：１）１時間、その後に、タンパク質安定性アッセイのための追跡培地を用いた２時間、６時間、および１２時間のインキュベーション；または２）タンパク質翻訳アッセイのための追跡期間を持たない、０．５、２、６、および１２時間。パルス培地は、５％透析ＦＢＳを加えた無メチオニンＤＭＥＭ中の１００μＣｉ／ｍｌ［３５Ｓ］メチオニン（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）および５μＭの未標識からなった。細胞を溶解するために、予め冷却したＲＩＰＡ緩衝液（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０／０．１％  ＳＤＳ／０．５％デオキシコール酸ナトリウム／１×ＰＢＳ）＋１ｍＭ  ＰＭＳＦをディッシュの各々に添加した。回収する前に、ＬＮＣａＰ細胞を予め温めたＰＢＳで２回洗浄した。
【００６２】
（７）（［３５Ｓ］−メチオニン標識した細胞の溶解）
細胞を溶解するために、０．６ｍｌの予め冷却しておいたＲＩＰＡ緩衝液＋１ｍＭ  ＰＭＳＦをディッシュの各々に添加し、これを、氷上で２分間静置した。この溶液を、ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅチューブに移して、そして、細胞破砕物を、４℃にて５分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離することによってペレット化した。上清を、新しいｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅチューブに移して、そして免疫沈降が行われるまで−７０℃で保存した。
【００６３】
（８）（［３５Ｓ］−メチオニン標識した細胞溶解物の抗ＡＲ抗体による免疫沈降）
３００μｇの細胞のタンパク質の全体を新しい新しいｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅチューブに移し、次いで、３μｌのウサギ抗ＡＲポリクローナル抗体−ＮＨ２７（１９）および５００μｌの反応緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０））を添加（２０）して、一定の揺動のもと４℃、２時間でインキュベートした。２５μｌのプロテインＡ／Ｇビーズを、この溶液に添加して、そして、一定の揺動のもと４℃、２時間でインキュベートした。サンプルを、４℃にて３分間、２，５００×ｇで遠心分離してこのビーズを回収し、次いで、氷冷却した緩衝液を使用して３回洗浄した。５０μｌの１．５×ＳＤＳゲルローディング緩衝液を添加して、４分間煮沸した。アリコート（２５μｌ）をゲル電気泳動に供して、ＩＱＭＡＣソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｍｉｃｓ）を使用してオートラジオグラフィー信号よる定量を行った。
【００６４】
（９）（細胞トランスフェクションおよびレポーター遺伝子アッセイ）
ＰＳＡプロモータールシフェラーゼアッセイのために、ＬＮＣａＰ細胞を、６０〜７０％のコンフルエンスに至るまで６０ｍｍディッシュにおいてプレートし、次いで、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用することによって６ｋｂ  ＰＳＡプロモーター連結ルシフェラーゼレポーター（ＰＳＡ６．０−Ｌｕｃ）でトランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後、これらの細胞をさらに２４時間に亘って種々の化合物で処理した。ＡＲ  Ｎ末端／Ｃ末端（Ｎ−Ｃ）相互作用アッセイのために、ＣＯＳ−１細胞（１×１０５）を、０．５μｇのｐＧ５−Ｌｕｃレポーターおよび図の凡例において示したような他の発現ベクターでトランスフェクトする１２時間前に、１２ウェルプレート上にプレートした。２４時間のトランスフェクションの後に、１０ｎＭ  ＤＨＴおよび／または１０μＭ  ＶＥＳをさらに２４時間に亘って添加した。トランスフェクトの各々について、サルウイルス４０プロモーター駆動Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＳＶ４０ＲＬ）を内部コントロールとして使用した。
【００６５】
（１０）（インビボＡＲ放射性リガンド競合結合アッセイ）
ＬＮＣａＰ細胞を、６０ｍｍディッシュにプレートし、そして６０％のコンフルエンスに至るまで増殖した。細胞を、２４時間に亘って、１０μＭ  ＶＥＳまたはエタノール（０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌ）によって調製した。次いで、培地を８％ＣＳ−ＦＢＳを伴うＲＰＭＩへと換え、そして、１００倍の過剰な未標識Ｒ１８８１（２５０ｎＭ）を加えたかまたはそれらを加えていない２．５ｎＭ［３Ｈ］Ｒ１８８１を使用することによって競合リガンド結合を実施した（１８）。１時間のインキュベーションの後に、細胞を溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えたＰＢＳ）によって回収した。細胞抽出物のうちの等しい量のタンパク質を結合アッセイに供して、これを、ヒドロキシアパタイトを添加することによって停止させた。各サンプルを、サンプリングマニホルド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過し、そして、未結合リガンドを、洗浄することによって除去した。結合リガンドを含んだ濾紙を、５ｍｌの液体シンチレーション液を含んだカウンティングバイアルに移し、多目的シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて計数した。
【００６６】
（（ｂ）結果）
（１）（ＶＥＳはＬＮＣａＰ細胞の増殖を抑制するが、前立腺線維芽細胞の増殖を抑制しない）
多くの前立腺腫瘍は、フルタミド退薬症状を随伴するホルモン無反応性段階へと進行し（２１）、抗アンドロゲン（例えば、ＨＦ）の存在下でこの腫瘍が増殖することを可能にする。したがって、前立腺癌を管理するためのより効果的に抗増殖性試薬を探索することが必要である。ここで、ＬＮＣａＰ細胞中のＨＦを伴ったＶＥＳの阻害効果を比較した。ＭＴＴアッセイを使用したときに、５ｎＭ  ＤＨＴがＬＮＣａＰ細胞増殖を刺激し得、そして、５μＭ  ＨＦの添加によって、８％ＣＳ−ＦＢＳを伴う培地中のこのＤＨＴ誘導性細胞増殖を抑制しないことを、図１Ａは実証する。対照的に、１０μＭ  ＶＥＳの添加によって、ＤＨＴ媒介性細胞増殖を効果的にさらに抑制する。５μＭ  ＨＦと１０μＭ  ＶＥＳの両方の添加によって、ＤＨＴ媒介性細胞増殖は抑制され得る。さらに、８％ＣＳ−ＦＢＳを、ＤＨＴを伴わない８％ＦＢＳで置き換えたときに、５μＭのＨＦは、ＬＮＣａＰ細胞増殖を第２日目で誘導し、この誘導は第４日目後に徐々に消失する（図１Ｂ）。さらに、１０μＭ  ＶＥＳは、ＬＮＣａＰ細胞増殖を阻害し、そして、１０μＭ  ＶＥＳおよび５μＭ  ＨＦの両方の組合せは、第４日目後のＬＮＣａＰ細胞増殖をさらに抑制し得る。全体として、図１Ａおよび図１Ｂからの結果によって、ＦＢＳ中または５ｎＭ  ＤＨＴの存在下にあるＣＳ−ＦＢＳ中のいずれかにおいて、１０μＭ  ＶＥＳはＬＮＣａＰ細胞増殖を効果的に阻害し得ることが実証される。１０μＭ  ＶＥＳおよび５μＭのＨＦに組み合わせは、ＬＮＣａＰ細胞増殖をさらに抑制する。同時に、形態形成変化がこの処置期間においてＬＮＣａＰ細胞中で観察され、この細胞の殆どが４日間のＶＥＳ処理の後に死滅した（図１Ｃ）。
【００６７】
腫瘍細胞を正常な前立腺組織由来の一次培養線維芽細胞で置き換えたときに、１０μＭ  ＶＥＳは、細胞増殖に対する僅かな阻害効果のみを有し（図１Ｄ）、これは、ＶＥＳがアンドロゲン感受性である腫瘍細胞に対する選択的な阻害効果を有し得ることを示唆する。血球計を使用する直接的な細胞数計数によって、これらの細胞増殖の結果をさらに確認した。
【００６８】
（２）（ＶＥＳはＰＳＡの発現を阻害する）
図２Ａおよび図２Ｂにおいて示されるように、ウェスタンブロット分析およびノーザンブロット分析を使用した場合に、ＰＳＡのｍＲＮＡおよびタンパク質の両方が５ｎＭ  ＤＨＴによって誘導され得、そして、１０μＭ  ＶＥＳの添加によって、図１Ａおよび図１Ｂについて記載される同じ条件下で培養したＬＮＣａＰ細胞におけるｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＰＳＡの発現を効果的に抑制した。ＶＥＳ抑制ＰＳＡ発現が転写レベルで起こり得るか否かをさらに研究するために、６．０ｋｂ  ＰＳＡプロモーターに連結したルシフェラーゼレポーター（ＰＳＡ６．０−Ｌｕｃ）を使用してこのＶＥＳ効果を評価した。図２Ｃにおいて示されているように、５ｎＭ  ＤＨＴは、ＰＳＡ６．０−Ｌｕｃ活性を誘導し、そして、Ｓｕｃではなく１０μＭ  ＶＥＳの添加がＤＨＴ誘導性ＰＳＡ６．０−Ｌｕｃ活性を抑制した。ＰＳＡプロモーターのＶＥＳ媒介性阻害が特異的か否かを試験するために、ＳＰ１のトランス活性化に対するＶＥＳの効果を、（ＧＡＬ４結合部位連結ルシフェラーゼレポーターであるｐＧ５−Ｌｕｃに結合しそして活性化し得る）ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合ＳＰ１を試験することによって調べた。これらの結果は、１０μＭ  ＶＥＳがＧＡＬ４−ＳＰ１転写活性を有意に阻害しなかったことを示す（図２Ｄ）。これらをあわせて、発明者らのデータは、１０μＭ  ＶＥＳがＤＨＴ媒介性細胞増殖を抑制するだけではなく、ＬＮＣａＰ細胞内のＤＨＴ誘導性ＰＳＡ発現も選択的に抑制することを示す。
【００６９】
（３）（ＶＥＳは、ＡＲのｍＲＮＡ発現およびタンパク質発現に影響を与える）
図３Ａにおいて示されるように、ノーザンブロットのデータは、ＶＥＳがＡＲのｍＲＮＡ発現およびタンパク質発現を阻害するが；しかし、ＰＳＡのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルが初期の時間帯において低下し始めることを示している。次に、ＶＥＳがタンパク質レベルでのＡＲに影響を与えるか否かを決定するために、ＬＮＣａＰ細胞を、１０μＭ  ＶＥＳの非存在下またはその存在下において５ｎＭ  ＤＨＴを伴って、ＲＰＭＩ８％ＦＣＳまたはＣＳ−ＦＣＳ中に培養した。細胞抽出物全体をウェスタンブロット分析のために収集した。ＮＨ２７抗ＡＲ抗体を使用したとき、これらの結果は、１０μＭ  ＶＥＳはＡＲ発現をタンパク質レベルで抑制し得るが、１０ｎＭ  Ｖｉｔ  Ｄはタンパク質レベルでＡＲ発現のレベルを抑制し得ないことを示した。この発現は、１０μＭ  ＶＥＳがＰＰＡＲｒ発現に対して殆ど効果を示さない場合に、特異的である（図２ｅ〜２ｆ）。
【００７０】
（４）（ＶＥＳは、ＡＲの、リガンド結合、Ｎ−Ｃ二量体化または核での転座に影響を与えない）
アンドロゲンに対する結合の後に、ＡＲは、二量体（２３）を形成し、そして、細胞質から核へと輸送し（２４）、そして、アンドロゲン応答性エレメントを認識することによってこれらの標的遺伝子を活性化する（２５）。第１に、競合放射性リガンド結合アッセイを使用して、ＶＥＳがＡＲリガンド結合能に影響を与えるか否かを調べた。結果によって、未標識のＲ１８８１は、特異的な結合の９５％について競合し得、そしてＶＥＳ処理は、ＡＲリガンド結合に殆ど影響を与えないことを示す（図４Ａ）。次に、ＶＥＳがＡＲのＮ−Ｃ相互作用（これは、ＡＲトランス活性化において重要な役割を果たすことが示唆されている（２６））に影響を与えるか否かを調べた。哺乳動物のツーハイブリットシステム（これは、ＧＡＬ４−ＤＢＤと融合したＡＲのヒンジおよびリガンド結合のドメイン（ＧＡＬ−ＡＲＨＬＢＤ）、ＶＰ１６と融合したＡＲのＮ末端（ＶＰ１６−ＡＲＮ）およびｐＧ５−Ｌｕｃレポーター（２３）を含む）を使用した。これらの結果は、１０ｎＭ  ＤＨＴがＡＲのＮ−Ｃ相互作用を誘引し、そして１０μＭ  ＶＥＳの添加がＡＲ  Ｎ−Ｃ相互作用に殆ど影響を与えないことを示している（図４Ｂのレーン３および４）。ＶＥＳがＡＲの輸送（ｔｒａｎｌｏｃａｔｉｏｎ）に影響を与えるか否かを調べた。ＶＥＳは、細胞質と核との間のＡＲの分布に殆ど影響を与えないが、総ＡＲ染色強度は減少し、これは、ＶＥＳがＡＲタンパク質発現に影響を与え得ることを示唆する。これらの免疫染色の結果は、ノーザンブロットアッセイおよびウェスタンブロットアッセイを追認するだけではなく、ＶＥＳがＡＲタンパク質機能をダウンレギュレートするために転写後の経路を介して機能し得ることを示す。
【００７１】
全体として、これらのデータが、ＶＥＳは、リガンド結合、Ｎ−Ｃ二量体化、およびＡＲの核輸送に影響を与え得ないことを示す。代わりに、ＶＥＳは総ＡＲ染色強度を低下し、このことは、ＶＥＳが転写レベルまたは翻訳レベルでＡＲ発現に影響を与え得ることを示唆する。
【００７２】
（５）（ＶＥＳは、ＬＮＣａＰ細胞におけるＡＲタンパク質の転写を阻害する）
転写後レベルでのＡＲ発現の調節に関連する可能な機構を決定するために、パルス追跡標識を、ＶＥＡがＡＲ−タンパク質翻訳の効率またはその安定性に影響を与えるか否かを特徴付けるために適用した（２７）。シグナルの強度が出発点において異なるが、ＡＲの分解速度がＶＥＳの非存在または存在において類似している。これらのデータは、ＶＥＳがＡＲ−タンパク質安定性に殆ど影響を与えないことを示している（図５Ａ）。一方、ＶＥＳ処理の後では、ＡＲタンパク質合成は、コントロール群の合成と比較してずっと低い（図５Ｂ）。これらの結果は、ＶＥＳが、安定性に影響を与えるというよりもタンパク質翻訳の阻害を介してＡＲタンパク質レベルを調節し得ることを示唆する。
【００７３】
（６）（ＶＥＳは、ＡＲ、ＶＤＲ．ＰＰＡＲα、およびＲＸＲαの発現を示差的に調節する）
ＡＲ機能のＶＥＳ媒介性ダウンレギュレーションが特異的であるか否かを試験するために、同じ条件下で他の核レセプターの発現レベルを調べた。ＡＲ、ＶＤＲ、ＰＰＡＲαおよびＲＸＲαに対する抗体を使用したとき、この結果は、（１０μＭ  Ｓｕｃではなく）１０μＭ  ＶＥＳがＡＲタンパク質レベルを抑制し得ることを示した。このＶＥＳ媒介性ＡＲ抑制は、１０μＭ  ＶＥＳがＰＰＡＲα発現およびＲＸＲα発現に対して殆ど影響を示さず（図３Ｂ）、そして対照的にＶＤＲの発現を増大する（図３Ｂ）ときに、選択的である。
【００７４】
（７）（（セレニウムではなく）ＶＥＳがＡＲ発現およびＰＳＡ発現に影響を与える）
ＳＭは、食餌中におけるセレニウムの主要な供給源であることが既知である。１０μＭのＳＭ（これは、ＬＮＣａＰ細胞増殖を阻害することが報告されている（２９））を使用した。４日間の処理の後のＬＮＣａＰ細胞におけるＳＭ媒介性増殖阻害を観察したが、ウェスタンブロットデータは、ＳＭがＡＲ発現およびＰＳＡ発現に対して影響を全く与えないことを示した（図６）。まとめると、これらの結果は、（セレニウムではなく）ＶＥＳがＡＲ発現およびＰＳＡ発現をダウンレギュレートすることを示唆している。前立腺癌細胞のＶＥＳ媒介性増殖阻害は、ダウンレギュレートされたＡＲ発現に部分的に起因し得、そして、ＳＭは他の機構を介して機能し、前立腺癌細胞の増殖を阻害し得る。
【００７５】
（８）（ＬＮＣａＰ細胞中におけるＡＲの安定性を検出するためのパルス追跡標識化）
ＶＥＳはＡＲ発現のタンパク質レベルに効果的に影響を与える。パルス追跡標識化を実施して、ＶＥＳがタンパク質の翻訳効率および安定性に影響を与えるか否かを特徴付けた。図７に示されるように、これらの結果は、ＶＥＳがＡＲのタンパク質の安定性（２時間〜６時間）に影響を与え、そしてその結果としてＡＲタンパク質の蓄積を阻害することを示した。
【００７６】
（９）（ＬＮＣａＰの増殖に対する、α−Ｖｉｔ  Ｅ、γ−Ｖｉｔ  ＥおよびＶＥＳの効果）
図８に示されるように、ＶＥＳ、Ｖｉｔ  Ｄ、α−Ｖｉｔ  Ｅ、およびγ−Ｖｉｔ  Ｅは、ＲＰＭＩ  ８％ＦＢＳにおける細胞増殖を阻害し得る。しかし、ＶＥＳは、最も有効な化合物であり、これは、他の化合物と比較して、その抗酸化剤能力と関連しない。
【００７７】
ＶＥＳ媒介生物学的事象の下流標的をさらに特徴付けるために、マイクロアレイ技術が適用されている。
【００７８】
（１０）（ＶＥＳが癌細胞の増殖を差示的に阻害する）
線維芽細胞の初代細胞培養物は、ＶＥＳ媒介増殖効果の効率を示すことが確立された。これらの結果は、ＶＥＳが、差示的に、ＬＮＣａＰを阻害するが、初代培養された線維芽細胞増殖を阻害しないことを示した。
【００７９】
（１１）（ＶＥＳ、ＶＤＲ、および前立腺癌）
ＡＲ発現のウェスタンブロット分析は、１０μＭ  ＶＥＳがＶＤＲ発現を誘導し得ることを示した。
【００８０】
（１２）（スクシネート誘導体  対  アセテート誘導体）
細胞増殖、ならびにＡＲおよびＰＳＡの発現に対する、α−Ｖｉｔ  Ｅスクシネート（ＶＥＳ）、α−Ｖｉｔ  Ｅアセテート（ＶＥＡ）、α−Ｖｉｔ  Ｅ、およびγ−Ｖｉｔ  Ｅの効果を比較した。結果は、ＶＥＳが、Ｖｉｔ  Ｅの最も有効なアイソフォームであり、そしてα−Ｖｉｔ  Ｅもまた、ＰＳＡおよびＡＲの発現を阻害し得ることを示した。しかし、ＶＥＡもγ−Ｖｉｔ  Ｅも、ＡＲおよびＰＳＡの発現を効率的に阻害しない。一緒にすると、これらの結果は、試験されたｖｉｔ  Ｅアナログのうち、ＶＥＳが、前立腺癌細胞の増殖阻害について最も有効なアイソフォームであることを示す（図９および１０）。
【００８１】
（Ｅ．参考文献）
【００８２】
【数１】
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【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１は、ＶＥＳがＬＮＣａＰ細胞の細胞増殖を阻害するが、前立腺線維芽細胞の細胞増殖を阻害しないことを示す。（Ａ）ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＣＳ−ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中で培養し、ＤＨＴ（５ｎＭ）、Ｓｕｃ（１０μＭ）、ＨＦ（５μＭ）、ＶＥＳ（１μＭまたは１０μＭ）、またはＨＦ（５μＭ）と合わせたＶＥＳ（１０μＭ）で処理した。細胞を示した時間に回収した。細胞増殖をＭＴＴアッセイによって決定した。コントロール群を、０．１％（体積／体積）エタノール中で培養し、それを１００％に決定した。全ての結果を、同じ時点のコントロール群と比較した。
【図１Ｂ】図１は、ＶＥＳがＬＮＣａＰ細胞の細胞増殖を阻害するが、前立腺線維芽細胞の細胞増殖を阻害しないことを示す。（Ｂ）ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中で培養し、Ｓｕｃ（１０μＭ）、ＨＦ（５μＭ）、ＶＥＳ（１μＭまたは１０μＭ）、またはＨＦ（５μＭ）と合わせたＶＥＳ（１０μＭ）で処理した。細胞を示した時間に回収した。細胞増殖をＭＴＴアッセイによって決定した。コントロール群を、０．１％（体積／体積）エタノール中で培養し、それを１００％に決定した。全ての結果を、同じ時点のコントロール群と比較した。
【図１Ｃ】図１は、ＶＥＳがＬＮＣａＰ細胞の細胞増殖を阻害するが、前立腺線維芽細胞の細胞増殖を阻害しないことを示す。（Ｃ）位相差顕微鏡写真は、エタノール、１０μＭ  Ｓｕｃ、１０μＭ  ＶＥＳへの曝露の２日目、４日目、および６日目での、ＬＮＣａＰ細胞の代表的な形態学的応答を示す。（×１００．）
【図１Ｄ】図１は、ＶＥＳがＬＮＣａＰ細胞の細胞増殖を阻害するが、前立腺線維芽細胞の細胞増殖を阻害しないことを示す。（Ｄ）一次培養された前立腺線維芽細胞を、１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で維持し、そしてＳｕｃおよびＶＥＳで示されるように処理した。細胞増殖をＭＴＴアッセイによって決定した。コントロール群を、０．１％（体積／体積）エタノール中で培養し、それを１００％に決定した。全ての結果を、同じ時点でコントロール群と比較した。
【図２Ａ】図２は、ＶＥＳがＰＳＡの発現を阻害することを示す。（Ａ）ＶＥＳは、タンパク質のレベルでＰＳＡの発現を阻害する。ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩまたは８％  ＣＳ−ＦＢＳ  ＲＰＭＩおよび５ｎＭ  ＤＨＴ中で培養し、エタノール、１０μＭ  Ｓｕｃ、または１０μＭ  ＶＥＳ（０．１％  体積／体積）で、２日間および４日間処理した。処置しない細胞を２日目に回収し、コントロールとして使用した。ウェスタンブロッティングを、ＰＳＡタンパク質の発現を検出するために使用した。アクチンを内部コントロールとして供した。
【図２Ｂ】図２は、ＶＥＳがＰＳＡの発現を阻害することを示す。（Ｂ）ＶＥＳは、ｍＲＮＡレベルでＰＳＡ発現を阻害する。ＬＮＣａＰ細胞を、１０μＭ  ＶＥＳ、１０μＭ  Ｓｕｃ、またはエタノール（０．１％体積／体積）でそれぞれ処理した。細胞を、ノーザンブロッティング分析のために１日目、２日目、および３日目に回収した。β−アクチンを内部コントロールとして供した。
【図２Ｃ】図２は、ＶＥＳがＰＳＡの発現を阻害することを示す。（Ｃ）ＶＥＳは、転写レベルでＰＳＡ遺伝子の発現を阻害する。トランジェントトランスフェクションアッセイを、ＬＮＣａＰ細胞において、ＰＳＡ６．０−Ｌｕｃプラスミドを使用して、１０μＭ  Ｓｕｃ、１０μＭ  ＶＥＳ、またはエタノール（０．１％体積／体積）の処理を用いて、実施した。ヒストグラムは、シミアンウイルス４０活性に規格化され、ＤＨＴの存在下でのＶＥＳ処理なしでのＰＳＡプロモーター活性の倍数として示される、ルシフェラーゼ活性のレベルを示す。
【図２Ｄ】図２は、ＶＥＳがＰＳＡの発現を阻害することを示す。（Ｄ）ＶＥＳは、ＳＰ１のトランス活性化活性に対して効果を有さない。ＣＯＳ−１細胞において、１μｇのＧａｌ４−ＤＢＤ融合ＳＰ１（Ｇａｌ４−ＳＰ１）を、示されるように、１０μＭ  ＶＥＳの存在下または非存在下で１μｇのｐＧ５−Ｌｕｃおよび５ｎｇのＳＶ４０ＲＬで同時トランスフェクトした。トランスフェクションを、少なくとも３回実施し、平均±ＳＤとして示した。
【図２Ｅ】図２は、ＶＥＳがＰＳＡの発現を阻害することを示す。図２Ｅは、ＶＥＳがタンパク質レベルでＰＳＡ発現を阻害することを示す。８％  ＦＢＳ培地を有するＲＰＭＩにおいて、ＬＮＣａＰ細胞を、コハク酸（１０−５Ｍ）ＶＥＳ（１０−５Ｍ）およびビタミンＤ３（１０−８）で、２日間、４日間、および６日間処理した。いずれの処理も受けずに第１日（０日目）に回収されたＬＮＣａＰ細胞を、コントロールとして使用する。ウェスタンブロッティングを、ＰＳＡタンパク質の発現レベルの検出に適用した。８％  ＣＳ−ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地中で、ＬＮＣａＰ細胞を、コハク酸（１０−５Ｍ）、ＶＥＳ（１０−５Ｍ）およびビタミンＤ３（１０−８）で、２日間、４日間、および６日間処理した。ＤＨＴ（５×１０−９Ｍ）を、毎日補充した。いずれの処理も受けずに第１日（０日目）に回収されたＬＮＣａＰ細胞およびＤＨＴを含まずにコハク酸（１０−５Ｍ）で４日間処理されたＬＮＣａＰ細胞を、コントロールとして使用した。ウェスタンブロッティングを、ＰＳＡタンパク質の発現レベルを検出するために使用した。
【図２Ｆ】図２は、ＶＥＳがＰＳＡの発現を阻害することを示す。（Ｆ）．ＶＥＳは、ＲＮＡレベルにおいてＰＳＡ発現を阻害する。ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地中、または８％  ＣＳ−ＦＢＳおよびＤＨＴ（５×１０−９Ｍ）を有する培地中、で毎日培養し、ＶＥＳ（１０−５Ｍ）、コハク酸（１０−５Ｍ）およびＶｉｔ  Ｄ３（１０−８Ｍ）それぞれによって処理した。細胞を、ノーザンブロッティング分析のために、１日目、２日目、および３日目に回収した。
【図２Ｇ】図２は、ＶＥＳがＰＳＡの発現を阻害することを示す。（Ｇ）．ＶＥＳは、転写レベルで、ＰＳＡ遺伝子の発現を阻害する。トランジェントトランスフェクションを、ＰＳＡ（６．０）−Ｌｕｃプラスミドを使用して、ＬＮＣａＰ細胞において実施し、そしてエタノール（０．１％体積／体積）、コハク酸（１０−５Ｍ）ＶＥＳ（１０−５Ｍ）およびＶｉｔ  Ｄ３（１０−８Ｍ）それぞれによって処理した。トランスフェクションを、３回実施し、平均として示した：バーは、標準偏差を示す。
【図３Ａ】図３は、ＶＥＳがＡＲ、ＶＤＲ、ＰＰＡＲα、およびＲＸＲαのタンパク質レベルを差示的に制御することを示す。（Ａ）ＶＥＳは、ＡＲを転写レベルおよび転写後レベルでダウンレギュレートする。ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中で培養し、そして１０μＭ  ＶＥＳ、またはエタノール（０．１％体積／体積）で処理した。細胞を、種々の時点で回収した。同じ培養皿から回収された２５μｇのＲＮＡおよび５０μｇのタンパク質を、それぞれノーザンブロッティングアッセイおよびウェスタンブロッティングアッセイに適用した（４５）。アクチンの量を、コントロールとして示す。
【図３Ｂ】図３は、ＶＥＳがＡＲ、ＶＤＲ、ＰＰＡＲα、およびＲＸＲαのタンパク質レベルを差示的に制御することを示す。（Ｂ）ＬＮＣａＰ細胞を、１０μＭ  Ｓｕｃ、１０μＭ  ＶＥＳ、またはエタノール（０．１％体積／体積）で処理した。処理しないＬＮＣａＰ細胞を、２日目に回収し、コントロールとして使用した。全細胞溶解物を、ＡＲ、ＶＤＲ、ＰＰＡＲ、またはＲＸＲに対する一次抗体を使用する、ウェスタンブロッティングアッセイに供した。
【図４Ａ】図４は、ＶＥＳがリガンド結合およびＡＲのＮ−Ｃ二量化に影響し得ないことを示す。（Ａ）８％  ＣＳ−ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中で培養したＬＮＣａＰ細胞を、１００倍過剰の標識されないＲ１８８１を有して、または有さずに２．５ｎＭ  [３Ｈ]  Ｒ１８８１で処理した。細胞を回収し、そして洗浄し、そして放射能を測定した。競合なしの[３Ｈ]  Ｒ１８８１結合を、１００％に決定した。データを、少なくとも３回の独立した実験の値からの平均±ＳＤとして示した。
【図４Ｂ】図４は、ＶＥＳがリガンド結合およびＡＲのＮ−Ｃ二量化に影響し得ないことを示す。（Ｂ）ＡＲ  Ｎ−Ｃ二量体化。内因性ＡＲを有さないＣＯＳ−１細胞を、１０ｎＭ  ＤＨＴおよび／または１０μＭ  ＶＥＳの存在下または非存在下において、ＧＡＬ４−ＤＢＤ融合ＡＲ−ＨＬＢＤ（Ｇａｌ４−ＡＲ−ＨＬＢＤ）、ＶＰ１６融合ＡＲ−Ｎ（ＶＰ１６−ＡＲ−Ｎ）、またはｐＳＧ５−ＳＲＣ−１と同時トランスフェクトした。ＨＦを、ＤＨＴ媒介性ＡＲ  Ｎ−Ｃ相互作用をブロックする、コントロールとして添加した。ＳＲＣ−１（ステロイドレセプター同時活性化因子）を、Ｎ−Ｃ相互作用を増強する、ポジティブコントロールとして適用した（２６）。
【図５Ａ】図５は、ＶＥＳがＡＲタンパク質安定性に対して影響を与えないが、ＡＲの翻訳を減少することを示す。（Ａ）安定性アッセイについて、エタノールまたは１０μＭ  ＶＥＳ（０．１％体積／体積）で２４時間前処理した後、ＬＮＣａＰ細胞を、［３５Ｓ］メチオニンで標識した。２時間の標識後、細胞を、洗浄し、新鮮な培地を供給し、次いで、０時間、２時間、６時間および１２時間の時点で回収した。
【図５Ｂ】図５は、ＶＥＳがＡＲタンパク質安定性に対して影響を与えないが、ＡＲの翻訳を減少することを示す。（Ｂ）ＡＲ翻訳アッセイについて、ＬＮＣａＰ細胞を、メチオニン非含有培地中で２時間培養し、次いで、１００μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニンを添加し、０．５時間、２時間、６時間、および１２時間で回収するまで、培地中に放置した。細胞溶解後、３００μｇの全タンパク質を、抗−ＡＲ  ＮＨ２７抗体によって、免疫沈降に供し、ＳＤＳ／８％ＰＡＧＥゲル上で分析し、そしてオートラジオグラフィシグナルを、ＩＱＭＡＣソフトウェアを使用することによって定量した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）。
【図６】図６は、ＳＭがＡＲおよびＰＳＡ発現に対して効果を有さないことを示す。ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中で培養し、そして１０μＭ  ＳＭ、１０μＭ  ＶＥＳ、またはエタノール（０．１％体積／体積）で処理した。第１日（０日目）に、処理されない細胞から回収されたタンパク質を、コントロールとして使用した。５０μｇの全細胞溶解物を、ウェスタンブロッティングアッセイに供した。
【図７Ａ】図７Ａは、α−ＶＥＳがＡＲの分解速度を加速することを示す。ＬＮＣａＰ細胞を、１００−ｍｍ皿上で、４８時間培養した。［３５Ｓ］メチオニン標識の２時間前、細胞を、メチオニン非含有培地で欠乏した。次いで、１００μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニンを、培地に１時間添加した。細胞を、ＰＢＳによって洗浄し、そして８％  ＦＢＳを含有する新鮮な培地を供給し、次いで、０時間、２時間、６時間および１２時間の時点で回収した。細胞溶解後、１５０μｇの全タンパク質を、ＡＲ−ＮＨ２７抗体によって免疫沈降に供し、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、そしてオートラジオグラフィに供した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、α−ＶＥＳがＡＲタンパク質の蓄積を減速することを示す。ＬＮＣａＰ細胞を、播種し、上記のようにメチオニン欠乏した。次いで、１００μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］メチオニンを、培地に添加し、回収まで培地中に放置した。細胞を、０．５時間、２時間、６時間、および１２時間で回収した。次いで、１５０μｇの全細胞抽出物を、上記のように、免疫沈降、ゲル分析、およびオートラジオグラフィシグナルに供した。
【図８】図８は、α−Ｖｉｔ  Ｅ、γ−Ｖｉｔ  Ｅ、およびＶＥＳの、ＬＮＣａＰ細胞の増殖に対する効果を示す。ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養し、そして１０−５Ｍのα−Ｖｉｔ  Ｅ、γ−Ｖｉｔ  Ｅ、またはＶＥＳで処理した。細胞を、図に示された時間で回収した。全ての細胞増殖を、細胞計数およびＭＴＴアッセイによって決定した。コントロール群は、０．１％（体積／体積）エタノールを含み、これを１００％に決定した。全ての結果を、同じ時点のコントロール群と比較した。
【図９】図９は、ＶＥＡ、ＶＥＳ、α−Ｖｉｔ  Ｅ、およびγ−Ｖｉｔ  Ｅの、ＡＲ発現およびＰＳＡ発現に対する効果を示す。ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養し、２０−５Ｍの示された試薬で処理した。細胞を、図に示された時間に回収した。２日目に、処理されない細胞から回収されたタンパク質を、コントロールとして使用した。６０μｇの全細胞溶解物を、ウェスタンブロッティング分析に供した。
【図１０】図１０は、α−Ｖｉｔ  Ｅ、γ−Ｖｉｔ  Ｅ、ＶＥＳ、およびＶＥＡの、ＬＮＣａＰ細胞の増殖に対する効果を示す。ＬＮＣａＰ細胞を、８％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で培養し、そして１０−５Ｍの示された試薬で処理した。細胞を、図に示された時間に回収した。全ての細胞増殖を、細胞計数およびＭＴＴアッセイによって決定した。コントロール群は、０．１％（体積／体積）エタノールを含み、これを１００％に決定した。全ての結果を、同じ時点のコントロール群と比較した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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