(57)【要約】抗癌処置の前および後の非侵襲性手順によって得られたサンプルにおける、増殖因子レセプターのリン酸化レベルを検出および比較することによって、抗癌剤の有効性を決定するための方法が提供される。本発明はまた、非浸襲性手段によって得られた毛包または他の組織における、増殖因子レセプターのリン酸化を検出するための方法を提供する。癌処置の有効性を決定するための方法であって、該方法は、（ａ）癌処置を受ける患者から、非浸襲性手順によって組織サンプルを獲得する工程；および（ｂ）該癌処置の前および後に、該組織における増殖因子レセプターのリン酸化を決定する工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌処置の有効性を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）癌処置を受ける患者から、非浸襲性手順によって組織サンプルを獲得する工程；および
（ｂ）該癌処置の前および後に、該組織における増殖因子レセプターのリン酸化を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、上皮増殖因子レセプター、線維芽細胞増殖因子レセプター、酸性線維芽細胞増殖因子レセプター、塩基性線維芽細胞増殖因子レセプター、インスリン様増殖因子レセプター、神経増殖因子レセプター、トランスフォーミング増殖因子αレセプター、トランスフォーミング増殖因子βレセプター、ニューレグリンレセプター、ベータセルリンレセプター、アンフィレグリンレセプター、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子レセプターまたはサイトカイン増殖因子レセプターのリン酸化が決定される、方法。
【請求項３】
前記組織サンプルが毛包である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織サンプルが頬粘膜組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組織サンプルがパパニコラウスミアサンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組織サンプルが膀胱洗浄細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組織サンプルが皮膚の切屑を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、増殖因子レセプターのリン酸化を決定する工程が、以下：
（ａ）該増殖因子レセプターを含むサンプルを獲得する工程；
（ｂ）該サンプルを、抗リン酸化増殖因子レセプター抗体と接触させる工程；
（ｃ）結合した抗体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記抗体が検出可能な標識をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な標識を含む第二の抗体が、前記検出の前に接触される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出可能な標識が、蛍光、酵素または放射線核種を含む群から選択される、請求項９および１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出する工程が、免疫蛍光を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出する工程が、比色検出を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記患者が、乳房、前立腺、結腸、膵臓、頭部および頸部、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、食道、胃腸、脳、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、卵巣、皮膚、胃または子宮の癌を有する、方法。
【請求項１５】
毛包中の増殖因子レセプターのリン酸化を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）毛包を調製する工程；
（ｂ）該毛包を、抗リン酸化増殖因子レセプター抗体と共にインキュベートする工程；
（ｃ）工程（ｂ）の組成物を、検出可能な標識を含む第二の抗体と共にインキュベートする工程；ならびに
（ｄ）該増殖因子との、工程（ｂ）および（ｃ）の抗体の結合を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記増殖因子レセプターが、上皮増殖因子レセプター、線維芽細胞増殖因子レセプター、酸性線維芽細胞増殖因子レセプター、塩基性線維芽細胞増殖因子レセプター、インスリン様増殖因子レセプター、神経増殖因子レセプター、トランスフォーミング増殖因子αレセプター、トランスフォーミング増殖因子βレセプター、ニューレグリンレセプター、ベータセルリンレセプター、アンフィレグリンレセプター、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子レセプターまたはサイトカイン増殖因子レセプターである、方法。
【請求項１７】
前記増殖因子レセプターが上皮増殖因子レセプターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
抗癌剤を用いる癌の処置の有効性を決定するためのキットであって、該キットは、以下：
（ａ）抗癌剤の投与の前および後に、非侵襲性手段によってサンプルを抽出するための構成要素；
（ｂ）該サンプル中の増殖因子レセプターのリン酸化状態を決定するための構成要素、
を備える、キット。
【請求項１９】
癌治療の方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）請求項１に記載の方法によって、患者における癌処置の有効性を決定する工程；
（ｂ）該有効性に基づいて、異なる癌処置の必要性を決定する工程；および
（ｃ）該患者に対して該癌処置を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記癌処置が、増殖因子レセプターのリン酸化を変化させるために設計される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記変化が、前記増殖因子レセプターのリン酸化の減少である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記変化が、前記増殖因子レセプターのリン酸化の増大である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法であって、前記増殖因子レセプターが、上皮増殖因子レセプター、線維芽細胞増殖因子レセプター、酸性線維芽細胞増殖因子レセプター、塩基性線維芽細胞増殖因子レセプター、インスリン様増殖因子レセプター、神経増殖因子レセプター、トランスフォーミング増殖因子αレセプター、トランスフォーミング増殖因子βレセプター、ニューレグリンレセプター、ベータセルリンレセプター、アンフィレグリンレセプター、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子レセプターまたはサイトカイン増殖因子レセプターである、方法。
【請求項２４】
前記増殖因子レセプターが、上皮増殖因子レセプターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌処置が、化学療法処置である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学療法が、増殖因子レセプターのリン酸化を変化させる化学療法剤を用いる処置を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化学療法剤が、プロテインキナーゼインヒビターである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロテインキナーゼインヒビターが、チロシンキナーゼインヒビターである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学療法剤が、ＰＫＩ１６６である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学療法剤が、Ｃ２２５抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテインキナーゼインヒビターが、セリンスレオニンキナーゼインヒビターである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１９に記載の方法であって、前記患者が、乳房、前立腺、結腸、膵臓、頭部および頸部、腎臓、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、食道、胃腸、脳、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、卵巣、皮膚、胃または子宮の癌を有する、方法。
【請求項３３】
増殖因子レセプターのリン酸化を調節する候補薬物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
（ａ）候補薬物を非ヒト動物に投与する工程；
（ｂ）非侵襲性手段によってサンプルを獲得する工程；
（ｃ）該サンプル中の増殖因子レセプターのリン酸化状態を決定する工程、
を包含し、ここで、同種の非ヒト動物中の同じ組織に由来する増殖因子レセプターのリン酸化と比較した、該増殖因子レセプターのリン酸化の変化が、増殖因子レセプターのリン酸化のモジュレーターとして、該候補薬物を同定する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
政府は、Ｍａｒｃ  Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより、国立癌研究所、国立衛生研究所からの認証番号Ｒ３５−ＣＡ４２１０７およびＣＡ６７９５２に従う本発明における権利を所有する。この研究は、癌センター支援コア認証番号ＣＡ１６６７２、およびＭｉｎｉｓｔｅｒｉｕｍ  ｆｕｒ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ｕｎｄ  Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（Ｎｏｒｄ−Ｒｈｉｎｅ−Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の「Ｌｉｓｅ−Ｍｅｉｔｎｅｒ−Ｐｒｏｇｒａｍｍ」のＨａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎｓｓｔｉｐｅｎｄｉｕｍから一部、さらに支持されている。
【０００２】
本願は、２００１年１１月３日に出願された米国仮出願番号６０／２４５，７４５からの優先権を主張し、この開示全体は参考として援用される。
【０００３】
（１．発明の分野）
本発明は、癌治療の分野に一般的に関連する。より詳細には、これは、癌治療の有効性を決定するための非侵襲性方法に関係する。
【０００４】
（２．関連技術の説明）
癌を治療する方法として、放射線療法、手術および化学療法が挙げられる。化学療法は、広く用いられている一方で、指示された化学治療薬、またはそれらの併用が、緩解達成おいて必ずしも効を奏するとは限らない。大抵は、指示された化学療法の方針は開始され、癌の緩解達成に失敗しただけという結果となる。化学療法は、医師が、この治療は失敗であると判断を下し得る前に、数週間または数ヶ月でも継続し得、代わりの化学治療薬が正当化される。貴重な時間が、この効果のない化学療法の期間に失われる。
【０００５】
腫瘍細胞は、一般的に正常細胞より多くの増殖因子受容体を発現する。癌および転移を処置するため代表的に使用される化学療法薬は、増殖因子受容体のリン酸化を阻害するものである。いくつかの例として、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）のリン酸化を阻害するＮｏｖａｒｔｉｓ  ＰＫＩ１６６抗体またはＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃ２２５抗体のような薬剤がある。現在、これらの治療型の有効性を検査するための唯一の方法は、生体組織検査の実行によるものであり、これは、浸襲性の手順であり、麻酔からの合併症という結果になり得、すでに免疫無防備状態である患者において感染をさらに引き起こし得る。例えば、ＧｅｗｉｒｔｚおよびＣａｌａｂｒｅｔｔａ（米国特許第５，４２７，９１６号）は、治療の開始前および直後の患者から得られた腫瘍細胞における増殖−制御遺伝子の発現を比較することによって、抗腫瘍性療法の有効性を予測するための方法について考察している。このように、抗癌治療の有効性を評価するための効果的、かつ非侵襲性の方法が要求される。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、抗癌治療の有効性を決定するための非侵襲性方法を提供することにより、従来技術におけるこれらおよび他の欠点を克服する。抗癌処置の前後に、非侵襲性手順によって得られたサンプルにおける増殖因子受容体のリン酸化レベルを決定および比較することにより、抗癌剤の有効性を決定するための方法が提供される。
【０００７】
非侵襲性方法により得られ得る種々の組織サンプル型が、本明細書中に記載される。いくつかの具体例として、このサンプルは、毛包細胞、頬粘膜細胞、皮膚切屑、膀胱洗浄細胞、パパニコラウスミアサンプルなどであり得る。
【０００８】
毛包における増殖因子受容体のリン酸化を決定するための新規の方法もまた本明細書中で提供される。
【０００９】
（ａ）癌処置を受けている患者から非侵襲性方法により組織サンプルを得る工程；および（ｂ）癌処置前後の前記の組織における増殖因子受容体のリン酸化を決定する工程、を包含する癌処置の有効性を決定するための方法が供給される。本明細書中でのコントロールは、癌処置前のサンプルにおける増殖因子受容体の量である。リン酸化が決定されるためのこの増殖因子受容体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、酸性繊維芽細胞増殖因子受容体、塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）、トランスホーミング増殖因子α受容体（ＴＧＦ−αＲ）、トランスホーミング増殖因子β受容体（ＴＧＦ−βＲ）、ニューレグリン／ヒレグリン受容体、ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）受容体、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）受容体、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子受容体、またはサイトカイン増殖因子受容体であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「サイトカイン」は、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような、しかしこれらに限定されない分子を含むことを意味する。
【００１０】
非侵襲性方法により得られたこの組織サンプルは、毛包、頬粘膜細胞／組織、パパニコラウスミアサンプル、膀胱洗浄細胞、皮膚切屑および他の同様な細胞サンプルであり得る。非侵襲性方法の手順は、手術を必要としない手順として本明細書中で定義される。
【００１１】
本発明はまた、一般的工程の（ａ）増殖因子受容体を含むサンプルを得る工程（ｂ）サンプルを抗体と接触させる工程；および（ｃ）結合した抗体を検出する工程、を包含する増殖因子受容体のリン酸化を決定するための方法を供給する。
【００１２】
使用される抗体は、任意の抗リン酸化増殖因子受容体抗体でもあり得る。代替の実施形態において、抗体は、抗リン酸チロシン抗体、抗リン酸セリン抗体または抗リン酸スレオニン抗体であり得る。この抗体は、検出可能な標識をさらに含み得る。一つの実施形態において、この方法は、検出前に一次抗体と接触する検出可能な標識を含む二次抗体を有する。
【００１３】
当業者に公知のほぼ全ての任意の検出可能な標識が、使用され得る。具体的な実施形態において、検出可能な標識は、蛍光、酵素、化学発光標識、または放射性核種からなる群から選択される。蛍光の例として、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＹＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ，Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、ＨＥＸ，６−ＪＯＥ，オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー，ＲＥＧ，ローダミングリーン、ローダミンレッド、ＲＯＸ，ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッドが挙げられる。蛍光は、免疫蛍光検査法により検出され、当該分野において公知の方法により定量化される。例えば、吸光度が、決定され得、Ｏｐｔｉｍａｓ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓのようなソフトウェアが使用され得る。酵素標識の例として、いくつか挙げると、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、またはアルカリホスファターゼが挙げられ、そして分光光度法で定量され得る検出方法を提供するために、比色定量指示基質が用いられ得る。放射性核種の例として、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉが挙げられる。
【００１４】
本発明の方法は、任意の癌型に羅患した癌患者において有用であることが企図される。具体的には、患者は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、頭部の癌、首部の癌、膀胱癌、血液の癌、骨の癌、骨髄癌、脳の癌、食道癌、胃腸癌、脳の癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、皮膚癌、胃癌、または子宮癌を有し得る。
【００１５】
さらなる実施形態は、癌治療中の複数の時点で、増殖因子受容体をリン酸化について分析することを企図する。さらに、１人の患者由来の複数の組織が、同様に分析され得る。本発明者はまた、この方法を自動化することを企図する。
【００１６】
本発明はまた、毛包における増殖因子受容体のリン酸化を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）毛包を調製する工程；（ｂ）毛包を抗リン酸化増殖因子受容体抗体とインキュベートする工程；（ｃ）工程（ｂ）の組成物と検出可能な標識を含む二次抗体をインキュベートする工程；および（ｄ）増殖因子受容体に対する工程（ｂ）および工程（ｃ）の抗体の結合を検出する工程、を包含する。この増殖因子受容体は、上皮増殖因子受容体、繊維芽細胞増殖因子受容体、酸性繊維芽細胞増殖因子受容体、塩基性繊維芽細胞受容体、インスリン様増殖因子受容体、神経増殖因子受容体、トランスホーミング増殖因子α受容体、トランスホーミング増殖因子β受容体、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、ニューレグリン受容体、ベータセルリン受容体、アンフィレグリン受容体、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子受容体、またはサイトカイン増殖因子受容体であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「サイトカイン」は、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような、しかしこれらに限定されない分子を含むことを意味する。具体的な実施形態において、この増殖因子受容体は、上皮増殖因子受容体である。
【００１７】
本発明はまた、抗癌剤を用いた癌の処置の有効性を決定するためのキットを提供し、前記キットは、（ａ）抗癌剤の投与前後の非侵襲性方法によるサンプル抽出のための成分；（ｂ）サンプル中の増殖因子受容体のリン酸化状態を決定するための成分を適当な容器手段中に包含する。
【００１８】
本発明の別の局面は、（ａ）請求項１の方法により患者における癌処置の有効性を決定する工程；（ｂ）この有効性に基づいて異なる癌処置の必要性を決定する工程；（ｃ）この患者に対して異なる癌処置を施す工程、を包含する癌療法の方法を提供する。患者がうけているこの癌処置は、増殖因子受容体のリン酸化における変化を生じる処置であり得る。この変化は、この増殖因子受容体のリン酸化における減少または増加であり得る。この増殖因子受容体は、上皮増殖因子受容体、繊維芽細胞増殖因子受容体、酸性繊維芽細胞増殖因子受容体、塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子受容体、神経増殖因子受容体、トランスホーミング増殖因子α受容体、トランスホーミング増殖因子β受容体、ニューレグリン受容体、ベータセルリン受容体、アンフィレグリン受容体、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子受容体、またはサイトカイン増殖因子受容体であり得る。
【００１９】
ある実施形態において、この癌処置は、化学療法治療であり得る。ある局面において、この化学療法薬は、増殖因子受容体のリン酸化を変える。一つのこのような例において、この化学療法薬は、プロテインキナーゼ阻害因子である。一つの実施形態において、プロテインキナーゼ阻害因子は、チロシンキナーゼ阻害因子である。一つの具体的実施形態において、化学療法薬は、ＰＫＩ１６６である。別の具体的実施形態において、チロシンキナーゼ阻害因子は、Ｃ２２５抗体である。さらに他の実施形態において、プロテインキナーゼ阻害因子は、増殖阻害因子受容体のいずれかに対する抗体であり得る。別の実施形態において、プロテインキナーゼ阻害因子は、セリンキナーゼ阻害因子またはスレオニンキナーゼ阻害因子である。
【００２０】
この患者は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、頭部の癌、首部の癌、腎臓癌、膀胱癌、血液の癌、骨の癌、骨髄癌、脳の癌、食道癌、胃腸癌、脳の癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、皮膚癌、胃癌、または子宮癌を有し得る。
【００２１】
本発明はまた、（ａ）非ヒト動物に候補薬剤を投与する工程；（ｂ）非侵襲性の方法によりサンプルを得る工程；（ｃ）前記サンプルにおける増殖因子受容体のリン酸化状態を決定する工程であって、ここで、前記増殖因子受容体のリン酸化における変化（同じ種の非ヒト動物における同じ組織由来の増殖因子受容体のリン酸化を比較して）は、増殖因子受容体のリン酸化のモジュレータとして前記候補薬剤を同定する工程、を包含する、増殖因子受容体のリン酸化を調節する候補薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、一つ以上を意味し得る。特許請求の範囲で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と共に使用される時、「ａ」または「ａｎ」という単語は、一つまたは一つ以上を意味し得る。本明細書中で使用する場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも二つめ以上を意味し得る。
【００２３】
本発明の別の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な記載からら明らかとなる。しかし、本発明の精神および範囲内における種々の変更および改変は、この詳細な記載から当業者に明らかとなるため、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示の目的のみで示されることが理解されるべきである。
【００２４】
（例示的な実施形態の説明）
抗癌処置レジメンは、一般的に、処置の経過と有効性を決定するため、および処置の次の方針を決めるために侵襲性手順（例えば、患者から組織サンプルを得るための生体組織検査法）を含む。しかし、侵襲性の生体組織検査法は、すでに免疫無防備状態である患者に、麻酔および二次感染と関連するさらなる危険を被らせ、そして同様の理由のために実施され得ない。このようにして、貴重な時間が失われ、そして患者は、癌処置に無効であり得る化学療法から不必要な副作用を被り得る。本発明は、癌処置の有効性を決定するための非侵襲性方法を提供する。
【００２５】
いくつかの腫瘍細胞型は、正常細胞よりもはるかに多い増殖因子受容体を発現し、そして癌においてこれらの受容体は、リン酸化されることが見出されてきた。例えば，受容体プロテインチロシンキナーゼ（例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）（Ｋｏｒｃら、１９９３）、ｃ−ｅｒｂＢ２（Ｙａｍａｎａｋａら、１９９３）、ＩＧＦ−１（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、１９９５）、およびＦＧＦ−Ｒ（Ｗａｇｎｅｒら、１９９８））は、ヒト膵臓癌組織または膵臓癌細胞株において多く発現される。本発明者らは、ヌードマウスに対する抗癌剤ＰＫＩ１６６の経口投与が、ヒト癌細胞の転移の劇的な減少、およびリン酸化ＥＧＦＲレベルの減少を生じることを発見した（詳細は以下の考察を参照のこと）。本発明は、腫瘍および転移の処置における抗癌剤の有効性を決定するための非侵襲性方法を提供するために、この発見を利用する。
【００２６】
本発明者らは、侵襲性手順の細胞を有しない被験体から得られ得る生物学的サンプルにおいて増殖因子受容体のリン酸化を決定する、アッセイを本明細書中で提供する。いくつかの癌療法（例えば、ＰＫＩ１６６のような化学療法薬）は、増殖因子受容体のリン酸化を阻害し、それにより治療の有効性を媒介する。本発明者らは、非侵襲性方法により得られるサンプル（例えば、毛包、頬粘膜細胞、パパニコラウスミアサンプル、膀胱洗浄細胞、皮膚切屑など）において実施されるこのようなアッセイが、抗癌治療の有効性の決定を提供することを示した。
【００２７】
それゆえ、抗癌治療前後に、毛包を得る工程およびＥＧＦＲのような増殖因子受容体のリン酸化を決定する工程は、抗癌処置の有効性の分析を可能にする。このようにして、患者の頭部から数本の毛を引き抜く工程は、アッセイのためのサンプルを提供する。これは、生体組織検査に必要とされる手術手順の必要性を除き、関連する感染の危険を大幅に減少する。
【００２８】
このようにして、本発明はまた、一つの癌療法の有効性の決定に基づいて癌治療レジメンを提供する。例えば、一つの化学療法薬が無効である場合、その癌の他の局面を標的とする別の化学療法薬を、必要としている患者に投与し得る。
【００２９】
一つの実施形態において、本発明は、毛包における増殖因子受容体のリン酸化を検出するための方法を教示する。これは、毛包を調製するための方法に次いで、毛包の免疫染色を含む。実施例と題されたこの節は、使用する方法論を詳述する。
【００３０】
このようにして、本発明のある具体的な実施形態の実行に従い、ＥＧＦ−Ｒ発現細胞のサンプルは、抗癌剤（例えば、プロテインキナーゼ阻害因子）を用いた任意の処置前にＥＧＦ−Ｒを過剰発現することが公知の癌の形成に羅患している患者から収集される。このようなＥＧＦ−Ｒ発現細胞の一例としては、毛包、頬粘膜、パパニコラウスミアサンプル、膀胱洗浄細胞、皮膚切屑などが挙げられるが、これたに限定されない。このような細胞型は、非侵襲性方法を通じて容易に収集され得る。細胞におけるＥＧＦ−Ｒのリン酸化のレベルは、例えば、増殖因子受容体のリン酸化を検出する任意の公知の方法（例えば、抗体の使用）によって決定され、本明細書の他の部分において考察される。好ましい決定の方法は、免疫蛍光を使用する。抗癌療法の初回用量の投与直後、ＥＧＦ−Ｒ発現細胞の二番目のサンプルが、患者から得られ、ＥＧＦＲリン酸化レベルが、再度決定される。これらのレベルの比較は、処置後のリン酸化レベルにおける変化を提供し、次々に治療の有効性を決定する。
【００３１】
（Ｉ．増殖因子および受容体）
増殖因子は、細胞の増殖および／または分化を活性化するという主な結果を伴って、細胞表面上の特定の増殖因子受容体に結合するタンパクである。増殖因子受容体は、増殖因子の結合に関する情報を細胞の内側へ伝達するシグナル伝達タンパクであり、これは、細胞において種々のシグナル変換カスケードの活性化を引き起こす。多くの増殖因子受容体が公知である。あるものは、極めて多目的であり、多数の異なる細胞型において細胞分裂を刺激し；その一方で、他は、特定の細胞型に特異的である。
【００３２】
目的考察のために、以下の記述は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に焦点を置く。しかし、当業者に公知のように、本発明の方法は、癌細胞におけるリン酸化レベルを上昇および／または変化された全ての増殖因子受容体に適用できると企図される。他のいくつかの代表的な増殖因子受容体としては、繊維芽細胞増殖因子受容体、酸性繊維芽細胞増殖因子受容体、塩基性繊維芽細胞受容体、インスリン様増殖因子受容体、神経増殖因子受容体、トランスホーミング増殖因子α受容体、トランスホーミング増殖因子β受容体、ニューレグリン／ヒレグリン受容体、ベータセルリン受容体、アンフィレグリン受容体、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子受容体などが挙げられる。増殖因子のリン酸化状態における変化は、種々の癌（例えば、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、頭部および首部の癌、腎臓癌、膀胱癌、血液の癌、骨の癌、骨髄癌、脳の癌、食道癌、胃腸癌、脳の癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌など）において見られる。この癌は、癌前の病巣、癌、癌腫、転移性癌および転移性腫瘍であり得る。さらに、本発明はまた、毛包において発現される全ての増殖因子受容体を企図する。このようにして、以下の代表的な記述は、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００３３】
全ての増殖因子と同様に上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、応答性細胞の表面上の特異的高親和性の低容量受容体に結合する。ＥＧＦ結合に応答して活性化される、チロシンキナーゼ活性が、ＥＧＦ受容体に固有である。ＥＧＦ受容体のキナーゼドメインは、活性化後の受容体に関連するシグナル変換カスケードにおいて、ＥＧＦ受容体自体をリン酸化（自己リン酸化）し、そして他のタンパク質をリン酸化する。
【００３４】
ＥＧＦは、中胚葉起源および外胚葉起源両方の細胞、特にケラチノサイトおよび繊維芽細胞に対して増殖効果を有し、そしてある癌腫および毛包細胞に対して増殖抑制効果を示す。ＥＧＦに対する増殖−関連応答としては、核のプロトオンコジーン発現の誘導（例えば、Ｆｏｓ，ＪｕｎおよびＭｙｃ）が挙げられる。ＥＧＦはまた、胃酸分泌を減少するように作用する。
【００３５】
（ＩＩ．増殖因子受容体のリン酸化の検出）
リン酸化アッセイは、当該分野において周知である。一般的に、このアッセイは、増殖因子に結合した場合の増殖因子受容体のリン酸化に基づく。増殖因子の代表的な結合は、受容体型に依存しているチロシン残基またはセリン−スレオニン残基で、この受容体を自己リン酸化するキナーゼの宿主を活性化するシグナル変換カスケードを誘導する。
【００３６】
リン酸化アッセイは、本明細書のいくつかの部分において、抗活性化増殖因子受容体抗体とも称される、抗リン酸化増殖因子受容体抗体を含む、適切な抗体を要し、そして抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＧＦＲ抗体、抗ＦＧＦＲ抗体などによって例示される。いくつかの実施形態において、抗ホスホチロシン抗体、抗ホスホセリン抗体、または抗ホスホスレオニン抗体も同様に使用され得る。
【００３７】
リン酸化増殖因子受容体の検出は、上記のような抗増殖因子受容体抗体である、一次抗体とリン酸化増殖因子受容体を含む細胞またはサンプルとの接触工程を包含する。この後に、一次抗体と結合し得る検出可能な標識と結合した二次抗体との接触工程が続く。この二次抗体は、次いで、検出可能な標識によって検出される。
【００３８】
この検出可能な標識は、蛍光物質であり得る。以下の蛍光物質は、本発明を実施するにあたり有用であると特に企図される。Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン  ４８８、オレゴングリーン  ５００、オレゴングリーン  ５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッド。あるいは、標識は、酵素標識または放射性標識であり得る。この好ましい検出方法は、免疫蛍光法による方法である。
【００３９】
免疫蛍光顕微鏡法は、緑色、赤色、および青色の蛍光を個々に選別するためにフィルターホイール（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ＮＹ）に取り付けられた狭帯域通過励起フィルターを備えた、エピフルオレセイン顕微鏡上の適当な対物レンズを用いて、一般的に実行される。画像は、冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）およびＳｍａｒｔＣａｐｔｕｒｅソフトウェア（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いてコンピュータに取り込まれる。画像は、さらにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて処理される。免疫蛍光反応強度を決定するための一つの方法は、吸光度ＯＤに関し、光学画像分析ソフトウェアを用いて決定され得る。
【００４０】
（ＩＩＩ．毛包）
毛包の解剖学的構造および生活環が、この節で記載される。毛包細胞は、増殖している上皮細胞であり、そしてこれらの細胞は、癌細胞において見られる増殖因子受容体レベルを反映するため、毛包の断面が、本発明において増殖因子受容体のリン酸化のレベルを決定するために用いられてきた。本発明は、抗体（例えば、抗リン酸化増殖因子受容体抗体、および抗ホスホチロシン抗体、抗ホスホセリン抗体、抗ホスホスレオニン抗体）を用いた毛包の免疫染色のための方法を記載する。
【００４１】
この毛包は、上皮細胞の５つの同心円層からなる管状構造である。基部に、真皮乳頭（ＤＰ）を囲む球頭膨張物、毛球がある。これらは、毛球から皮膚表面に押されるので、内部の三つの上皮層は、美しい毛幹を形成するための角質化を受け、その一方で、外部の二つの層は、上皮鞘を形成する。毛球で、全ての層は、合併して互いに区別不可能になり；毛を形成する予定の細胞の塊は、毛母体として公知である。
【００４２】
活発な毛の成長の間、真皮乳頭を囲んでいる上皮細胞は、増殖して小胞の４つの内部層を形成し、その一方で、最も外側の層は、単に上皮表面の胚芽層の下方への延長を示す。真皮乳頭を囲んでいる上皮塊全体が、毛根を構成する。
【００４３】
小胞の最も内側の層の細胞は、毛幹の髄質または芯を形成するために穏やかな角質化を受け；この髄質層は、細い毛でほとんど区別不可能である。この髄質は、毛の大部分を形成する広範な、高度に角質化された層、皮質によって囲まれている。小胞の第三細胞層は、毛の表面上の硬くて、薄いキューティクルを形成するために角質化を受ける。このキューティクルは、毛髪のマッティングを妨ぐといわれる配置の重複ケラチン板からなる。
【００４４】
小胞の第四層は、内部毛根鞘ＩＲＳを構成し；この層の細胞は、ほんの少し角質化され、そして成熟した毛のまわりに皮脂が分泌される間隔をあけている脂腺管のレベルで分解される。この最も外側の層（外側毛根鞘  ＥＲＳ）は、毛髪の形成に関与せず；この層は、ガラス状膜ＧＭとして公知の厚い、特別な基底膜によって小胞を囲んでいる結合組織ＣＴの鞘から分離される。
【００４５】
増殖している小胞において、大きな活性メラノサイトは、毛幹の皮質に組み込まれているメラニンと増殖している細胞と共に拡散される。メラニンの黒、茶色、および黄色の形態は、最終的な毛の色を決めるために種々の組み合わせで産生される。乳児（期）、小児（期）、および女性において、体毛は、細くて柔かく、硬毛として公知の頭皮の毛髪とは反対に、うぶ毛として公知である。思春期の男性ホルモンの産生は、両性において、さらなる最終的な陰毛および腋毛の発達、および成熟した男性の体におけるうぶ毛と硬毛との置換を引き起こす。
【００４６】
毛髪の横断面の形はまた、人種間で異なる。モンゴル人種の直毛は、横断面が丸く、ヨーロッパ人のウェーブのかかった髪の特長は、楕円であり、黒人の縮毛は、より腎臓型である。
【００４７】
さらに、毛包の構造は、生成する毛の型に依存する。例えば、頭皮および他の硬毛の小胞は、長く真っ直ぐになる傾向があるのに対し、細く柔かい毛（うぶ毛）を生成する体毛の小胞は、比較的短くて豊富であり；縮毛は、湾曲した小胞または毛球が毛幹に角度をなして位置する小胞により生成され得る。
【００４８】
染色方法は、毛包の上皮成分およびコラーゲン性成分の明瞭な描写を可能にし、当該分野において周知である。この真皮乳頭ＤＰは、非常に血管性であり、小胞を外部から囲んでいるガラス状膜Ｇと連続する基底膜によって、上皮細胞から分離される。小胞の鞘はまた、血管中に豊富であり、そして毛包の分時運動に感受性がある繊細な知覚神経末端叢を含み、このようにして、高感受性の触覚受容体として働く。
【００４９】
毛髪横断面において、毛根の増殖する細胞と合併した毛包の５つの細胞層を見出し得る。大量の色素が、皮質に伸展する基底層において見出され、そして毛根の基底膜に沿って拡散されるメラノサイトによって、生成される。
【００５０】
個々の毛包は、増殖および休止の周期を受け、そしてこれは、それらの構造における変化において反映される。増殖期において、小胞は、皮下組織へ深く浸透し、そして毛球は突出し、その一方で、休止期の間、小胞はより短くなり、毛球はより小さくなり真皮乳頭を欠く；休止状態の小胞は、棍状毛として公知である。
【００５１】
この周期的な増殖パターンは、体の異なる部分の毛によって到達される長さの制限を決める因子である。例えば、毛髪の増殖期は、二年またはそれ以上のオーダーであり、およそ数ヶ月続く小胞の休止期の間に各毛は落とされてる。小胞の少しの部分のみが、任意の一時で休止期において正常であり、このようにして持続的な毛の群を維持している。反対に、体毛、眉毛、睫毛などは、比較的短い増殖期および不適切な過増殖を妨げる、より長い休止期を有する。
【００５２】
（ＩＶ．代表的な抗癌処置）
以下は、本発明者らによって以前に開発された新規な抗癌処置における考察である。本明細書中に記載されるマウスモデルおよび組み合わせ療法は、種々の癌に対する治療に関して有用であると企図される。この処置は、膵臓癌のために開発され、実施されたが、この処置はリン酸化増殖因子受容体を発現する他の癌にも同様に有効であると企図され、従って、以下は、この非制限的な例の説明である。
【００５３】
膵臓外分泌の癌は、広範な局所的侵襲、ならびに早期リンパ性転移および血行性転移によって特徴づけられる（Ｗａｒｓｈａｗら、１９９２；Ｅｖａｎｓら、１９９７）。診断の時に、８０％以上の患者が、局所的に進行する疾患または転移性疾患のいずれかを示す（Ｗａｒｓｈａｗら、１９９２；Ｅｖａｎｓら、１９９７；ＷａｎｅｂｏおよびＶｅｚｅｒｉｄｉｓ、１９９６）。初期段階で膵臓癌を検出できないこと、その病原力、および有効な全身系の療法の欠如が、この疾患による速やかな死の原因となる。実際に、膵臓の腺癌を有する全ての患者の１〜４％しか診断の５年後に生存していない（Ｌａｎｄｉｓら、１９９９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、１９９４）。進行型の膵臓癌を有する患者に対して、デオキシシチジンアナログのゲムシタビンの新しい導入さえも、生存中央値を６ヶ月以上に延長しない（Ｂｕｒｒｉｓら、１９９７）。明らかに、ヒト膵臓癌腫療法に対する新規なアプローチが必要とされる。
【００５４】
この疾患の生物学の理解における最近の進展は、その療法に対してすぐに新しいアプローチを提案し得る。保存施設のヒト膵臓腫瘍組織またはヒト膵臓癌細胞株を用いた研究努力は、多数の特徴的な生化学的異常および遺伝的異常を同定してきた。これらは、膵臓腺癌標本の７５〜９０％におけるＫ−ｒａｓオンコジーンのコドン１２での部分変異を含み（Ａｌｍｏｇｕｅｒａら、１９８８；Ｐｅｌｌｅｇａｔａら、１９９４）；サイクリン依存（ＣＤＫ）阻害ｐ１６遺伝子を含むホモ接合の欠失が、ヒト膵臓癌異種移植片の８５％において見出された（Ｃａｌｄａｓら、１９９４）。腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦ−β）の増殖抑制効果を媒介するシグナル変換分子、Ｓｍａｄ４（ＤＰＣ４）の変異またはホモ接合の欠失は、ｐ５３における変異として腫瘍（Ｈａｈｎら，１９９６；Ｇｒａｕら，１９９７）の５０％以上に見出される（Ｐｅｌｌｅｇａｔａら、１９９４、Ｓｉｎｉｃｒｏｐｅら、１９９６）。他の研究者らはまた、受容体プロテインチロシンキナーゼ（例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）（Ｋｏｒｃら、１９９３）、ｃ−ｅｒｂＢ２（Ｙａｍａｎａｋａら、１９９３）、ＩＧＦ−１（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、１９９５）、およびＦＧＦ−Ｒ（Ｗａｇｎｅｒら、１９９８））が、ヒト膵臓癌組織または膵臓癌細胞株において多く発現されることを実証した。
【００５５】
広範な先行の研究は、培養されたヒト膵臓癌細胞が、高レベルのＥＧＦ−Ｒを発現し、そしてＴＧＦ−αを産生すること、およびヒト膵臓癌が、ＥＧＦ−Ｒおよび公知のリガンド５つ全てを過剰発現することを示した（Ｋｏｒｃら、１９９３；Ｓｍｉｔｈら、１９８７；Ｅｂｅｒｔら、１９９４；Ｋｏｂｒｉｎら、１９９４）。さらに、この受容体およびそのリガンドを発現しない腫瘍と比較した場合、ヒト膵臓腫瘍におけるＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−α、およびＥＧＦの過剰発現は、速やかな進行性の疾患と相互関係がある。短縮型ＥＧＦ−Ｒの発現は、膵臓癌細胞増殖の阻害と関連し、そしてシスプラチンに対する感受性を高める。
【００５６】
膵臓癌細胞は、遺伝的変化および生化学的変化の増殖促進効果によって特徴づけられるが、正常な宿主細胞との広範な相互作用が、腫瘍の進行性の増殖および転移のために必要である。局所的な増殖および転移に必要な重要な腫瘍−宿主の相互作用は、増殖腫瘍の新生血管形成である（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５；ＨａｎａｈａｎおよびＦｏｌｋｍａｎ、１９９６）。新脈管形成の程度は、腫瘍細胞および宿主細胞によって放出された脈管形成前因子と脈管形成因子との間のバランスに依存する。
【００５７】
ヒト膵臓癌細胞は、脈管形成前分子である脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を分泌する（Ｂｒｕｎｓら、１９９９；Ｋｕｎｉｙａｓｕら、１９９９）。現在、ヒト癌の大半の型に対する主要な脈管形成前因子と見なされているＶＥＧＦは、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αによって強く誘導される。このように、ＥＧＦ−Ｒに媒介された増殖および新脈管形成の両方が、ヒト膵臓癌腫の進行性の増殖に必須であり、そして治療のための標的として各々評価されてきた。新規な経口のＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害因子（ＰＫＩ１６６）によるＥＧＦ−Ｒシグナル伝達経路の下方制御が、ヌードマウスの膵臓に移植されたヒト膵臓癌の増殖および転移を阻害するか否かの評価は、毎週のゲムシタビンの注射と組み合わせた毎日のＰＫＩ１６６の経口投与が、腫瘍に関連する内皮細胞におけるアポトーシスの誘導によって部分的に媒介された有意な治療効果をもたらすことを示した。
【００５８】
ゲムシタビンの腹腔内注射と組み合わせた新規なＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害因子ＰＫＩ１６６の経口投与によるＥＧＦ−Ｒシグナル伝達経路の遮断は、ヌードマウスの膵臓に移植されたヒト膵臓癌腫細胞の増殖、ならびにリンパ節転移、および肝臓転移を有意に阻害した。ＰＫＩ１６６単独およびゲムシタビン単独を用いた処置は、初期新生物の増殖を４５％減少させた。しかし、ＰＫＩ１６６とゲムシタビンの組み合わせは、初期の膵臓癌の増殖を有意に減少させ（８５％まで）、そしてリンパ節転移および肝臓転移の発生率（生成）を有意に減少させた。結果として、この組み合わせ療法は、有意な生存の延長をもたらし、数匹のマウスをこの疾患から開放した。この毎日のＰＫＩ１６６の経口投与（５０または１００ｍｇ／ｋｇ体重）が、十分に許容された。この膵臓癌の免疫組織化学的分析は、ＰＫＩ１６６単独を用いて処置されたマウスまたはゲムシタビンとの組み合わせにおけるマウス由来の病変における活性化ＥＧＦ−Ｒの下方制御を実証した。この効果は、脈管形成前分子ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の産生における下方制御、および微細血管密度における有意な減少を伴う。さらに、ＣＤ３１およびＴＵＮＥＬに対する抗体を用いた内皮細胞の二重染色は、微細血管密度における減少が、内皮細胞におけるアポトーシスの有意な増加に起因することを示した。
【００５９】
ヒト膵臓癌の進行性の増殖は、ＥＧＦ−Ｒの発現と関連し（Ｋｏｒｃら、１９９３；Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８４）、そしてそのリガンドの少なくとも１つとのＥＧＦ−Ｒの同時発現は、速やかな進行性の疾患と相関する。結合ＥＧＦおよびトランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）に加えて、このＥＧＦ−Ｒは、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、およびアンフィレグリンによって活性化され得る。リガンド結合後、ＥＧＦ−Ｒは、二量化し、そして細胞内ドメイン内のチロシン残基における自己リン酸化およびリン酸基転移を通じて活性化される。このＥＧＦ−Ｒおよび結合したプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）はまた、アポトーシスを調節し（Ｕｃｋｕｎら、１９９８ａ；Ｕｃｋｕｎら、１９９８ｂ）、ＥＧＦ−Ｒ  ＰＴＫの不活性化は、ＥＧＦ誘導受容体自己リン酸化、ＭＡＰＫ活性化、ＰＩ３Ｋ活性化、Ｓ期への細胞の移行、サイクリンＥが関連したキナーゼ活性、および細胞周期のＧ１期における細胞の結果的な蓄積を阻害することが示されてきた（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、１９９７）。放射線または化学療法薬との組み合わせにおける抗ＥＧＦ−Ｒ抗体（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｃ２２５抗体）によるＥＧＦ−Ｒのターゲティングは、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍の増殖を有意に阻害し得る（Ｐｅｒｒｏｔｔｅら、１９９９；Ｌｉｐｓｏｎら、１９９８；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、１９９６；Ｈｕａｎｇら、１９９９；Ｂａｓｅｌｇａら、１９９３；ｖａｎ  Ｇｏｇら、１９９８；Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋら、１９８８）。
【００６０】
ＥＧＦ−Ｒは腫瘍細胞のみでなく（Ｋｏｒｃら、１９９３；Ｓｍｉｔｈら、１９８７；Ｅｂｅｒｔら、１９９４；Ｋｏｂｒｉｎら、１９９４；Ｙａｍａｎａｋａら、１９９３；Ｗａｇｎｅｒら、１９９６；Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８４；ＭａｓｓａｇｕｅおよびＰａｎｄｉｅｌｌａ、１９９３）、分裂している内皮細胞（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９３；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９８６）でも発現される。さらに、腫瘍細胞におけるＥＧＦ−Ｒの活性化は、脈管形成前分子ＶＥＧＦの産生を誘導することが示されてきた（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９３）。ＰＫＩ１６６単独またはＰＫＩ１６６とゲムシタビンを用いて処置されたマウスにおいて、膵臓腫瘍における細胞は、ＥＧＦ−Ｒを発現したが、活性化（リン酸化）ＥＧＦ−Ｒを発現しなかった（Ｂｒｕｎｓら、２０００）。ＰＫＩ１６６単独またはゲムシタビンとの組み合わせを用いたマウスの処置は、腫瘍細胞の増殖（ＰＮＣＡ）における減少、および腫瘍細胞（ＴＵＮＥＬ）のアポトーシスにおける増加と関連していた。この組み合わせ療法と共に観察される増加したアポトーシスが、Ｇ１期のＲ点での細胞の停止に起因してもしなくても、（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、１９９６）ＥＧＦ−Ｒ遮断の結果は、証明されなかった。
【００６１】
腫瘍標本の免疫組織化学的分析は、ＰＫＩ１６６とゲムシタビンを用いたマウスの処置が、微細血管密度（ＭＶＤ）で表した腫瘍に関連した血管の数において有意な減少を生じたことを明らかにした（Ｂｒｕｎｓら、２０００）。この減少は、３つの非排他的機構に起因し得た。第一に、多くの新生物内の内皮細胞が、ＥＧＦ−Ｒを発現することが示されてきた（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９３；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９８６；Ｓｈｉｕｒｂａら、１９８８；Ｂｏｈｌｉｎｇら、１９９６；Ｒｏｃｋｗｅｌｌら、１９９７）。さらに、内皮細胞におけるＴＧＦ−αのＥＧＦ−Ｒに対する結合は、その増殖を刺激することが示されてきた（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９３；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９８６）。ＥＧＦ−Ｒの遮断は、Ｇ１期のＲ点での細胞の停止を生じる（Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８４；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、１９９６）ので、ＭＶＤにおける減少は、内皮細胞の増殖における減少に起因し得た。第二に、腫瘍標本の免疫組織化学的分析は、活性化ＥＧＦ−Ｒ（膵臓腫瘍中の）における減少が、脈管形成前分子ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の発現における減少に伴うことを明らかに示した。最近の結果は、ＶＥＧＦ（Ｂｅｎｊａｍｉｎら、１９９９；ＢｅｎｊａｍｉｎおよびＫｅｓｈｅｔ、１９９７）およびＩＬ−８（Ｋｕｍａｒら、１９９８；Ｋｉｔａｄａｉら、１９９８；Ｘｕら、１９９９）が、未熟な血管内皮細胞に対する生存因子として働き得、そしてＶＥＧＦが、ＴＮＦ−αまたは他の刺激薬によって誘導されるアポトーシスから内皮細胞を保護し得ることを示した（Ｓｙｒｉｄｏｐｏｕｌｏｓら、１９９７；Ｇｅｒｂｅｒら、１９９８；Ｎｏｒら、１９９９；ＷａｔａｎａｂｅおよびＤｖｏｒａｋ、１９９７）。
【００６２】
ＥＧＦ−Ｒシグナル伝達経路の刺激は、ｒａｓおよびｒａｆを活性化することが知られており、これは、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎのリン酸化を生じ、増加されたＡＰ−１の転写活性を導く（Ｋｅｒｂｅｌら、１９９８；Ｇｒｕｇｅｌら、１９９５；Ｒｏｚａｋｉｓ−Ａｄｃｏｃｋら、１９９３；Ｒａｋら、１９９５）。従って、ＥＧＦ−Ｒシグナル伝達経路のブロックは、減少されたＡＰ−１の活性を生じ、よって、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の転写が減少される。腫瘍細胞によるＶＥＧＦの産生の減少は、ゲムシタビン（これは、腫瘍関連内皮細胞において、明白なアポトーシスの増強を導く）により損傷を受けた、分裂する内皮細胞の回復を妨げ得る。第３に、ＰＫＩ１６６はまた、ＶＥＧＦレセプターであるＫＤＲおよびＦｌｔ−１の活性を阻害する（表２）。
【００６３】
要約すれば、Ｂｒｕｎｓら（２０００）は、ゲムシタビンと組合わせたＰＴＫインヒビターＰＫＩ１６６による、ＥＧＦ−Ｒシグナル伝達経路のブロックは、ヌードマウスにおけるヒト膵臓癌の有意な治療を実現する。原発性腫瘍増殖、ならびにリンパ節転移および肝転移の阻害は、直接的な抗腫瘍効果、および抗新脈管形成効果の両方により、媒介される。従って、この組合わせ治療は、種々の癌の処置に対する新しいアプローチを提供する。
【００６４】
（Ｖ．癌治療）
いくつかの癌治療は、当該分野において公知であり、そして公知の種々の抗癌剤の１つ以上の使用は、癌治療として本発明の文脈内に含む。「抗癌」剤は、例えば、以下によって、被験体中の癌にネガティブに影響し得る：１つ以上の癌細胞の殺傷、１つ以上の癌細胞におけるアポトーシスの誘導、１つ以上の癌細胞の増殖速度の減少、転移の発生もしくは数の減少、腫瘍のサイズの減少、腫瘍の増殖の阻害、腫瘍もしくは１つ以上の癌細胞への血液供給の減少、１つ以上の癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答の促進、癌の進行の阻止もしくは阻害、または癌を有する被験体の寿命の延長。抗癌剤としては、例えば、以下が挙げられる：化学療法剤（化学療法）、放射線療法因子（放射線療法）、外科的処置（手術）、免疫療法剤（免疫療法）、遺伝子治療因子（遺伝子治療）、ホルモン療法、他の生物学的因子（生物療法）および／または代替の治療。
【００６５】
（Ａ．化学療法剤）
用語「化学療法」は、癌を処置するための薬物の使用をいう。「化学療法剤」は、癌の処置において投与される化合物または組成物を意味するために用いられる。化学療法剤のいくつかの例は、以下を含む：抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（ムタマイシンおよび／またはマイトマイシン−Ｃとしても公知））、アクチノマイシンＤ（ダクチノマイシン）、ブレオマイシン、およびプリコマイシン）、植物のアルカロイド（例えば、タキソール、ビンクリスチン、およびビンブラスチン）、種々雑多な薬剤（例えば、シスプラチン、ＶＰ１６、腫瘍壊死因子）、アルキル化剤（例えば、カルムスチン、メルファラン（アルケラン、Ｌ−フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、Ｌ−ＰＡＭ、またはＬ−サルコリシンとしても公知であり、ナイトロジェンマスタードのフェニルアラニン誘導体である）、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン（マイラランとしても公知）、ロムスチン）、ならびに他の薬剤（例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、カンプトセシン、イホスファミド、ニトロソ尿素（Ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ファルネシル−タンパク質転移酵素インヒビター、トランスプラチナム（Ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、およびメトトレキサート、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態））、あるいは前述の任意のアナログもしくは誘導体。表１は、多数の化学療法剤および異なる癌の型におけるそれらの使用を列挙する。
【００６６】
いくつかの化学療法剤は、癌細胞における増殖因子レセプターのリン酸化状態を変化させる。例えば、タンパク質リン酸化酵素インヒビターＰＫＩ１６６は、癌細胞中のリン酸化されたＥＧＦＲの量を減少させ、癌は、腫瘍の収縮および転移の減少を示す。従って、タンパク質リン酸化インヒビター薬物は、本発明の文脈において重要な、別の主要なクラスの化学療法化合物である。
【００６７】
【表１】
2004529315.tif 000002
2004529315.tif 000003
2004529315.tif 000004
2004529315.tif 000005
（Ｂ．放射線療法剤）
放射線療法剤は、ＤＮＡ損傷を誘導する、放射線および波動を含む（例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、紫外線照射、マイクロ波、電子線放射、放射性同位体など）。治療は、上記記載の放射線の形態を用いて、局所的な腫瘍部位を照射することにより、達成され得る。これらの全ての薬剤は、おそらく、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆物質、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持に、広範囲な損傷をもたらすようである。
【００６８】
放射線療法剤、ならびに投与、投薬量などの方法は、当業者に周知であり、そして本明細書中の開示の観点から、本発明とともに組合わせ得る。例えば、Ｘ線についての投薬量範囲は、延長された期間（３〜４週間）に対して一日の線量５０〜２００レントゲンから、単回線量２０００〜６０００レントゲンまで分布する。放射性同位体についての投薬量は、広範に変化し、そしてこの同位体の半減期、照射される放射線の強度および型、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００６９】
（Ｃ．手術）
癌を有するヒトの約６０％は、例えば、予防的手術、診断的手術または段階的手術、治療的手術および待機的手術を含む、いくつかの型の手術を受ける。手術、および特に治療的手術は、他の治療（例えば、本発明および１つ以上の他の薬剤）と組合わせて使用され得る。
【００７０】
治療的手術は、全てまたは部分的な癌組織が、物理的に除去、摘出および／または破壊される切除を含む。手術は、表在性の癌、プレ癌、または正常組織に付随する量を、除去、摘出または破壊し得ることが、さらに企図される。手術による処置としては、例えば、以下が挙げられる：腫瘍切除、レーザー手術、冷凍外科、電気外科、および顕微鏡的に制御された手術（モース氏手術）。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部分の物理的な除去をいう。全ての癌細胞、組織、または腫瘍の一部を切除する際に、人体に空洞が形成され得る。
【００７１】
（Ｄ．免疫療法剤）
免疫療法剤は、一般的に、癌細胞を標的化および破壊するための、免疫効果器の細胞および分子の使用に依存する。免疫効果器は、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で治療の効果器として働き得るか、または抗体は、実際に細胞の死滅をもたらすために他の細胞を漸増し得る。抗体はまた、薬物または毒素（例えば、化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、そして単に標的因子として作用し得る。そのような抗体結合体は、免疫毒素と呼ばれ、そして当該分野において周知である（米国特許第５，６８６，０７２号、米国特許第５，５７８，７０６号、米国特許第４，７９２，４４７号、米国特許第５，０４５，４５１号、米国特許第４，６６４，９１１号、および米国特許第５，７６７，０７２号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。あるいは、効果器は、腫瘍細胞標的と直接的または間接的のいずれかで相互作用する表面分子を保有するリンパ球であり得る。種々の効果器細胞は、細胞傷害性のＴ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【００７２】
免疫治療の１つの局面において、腫瘍細胞は、標的化されやすい（すなわち、他の大部分の細胞上には存在しない）いくつかのマーカーを保有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、そしてこれらの腫瘍マーカーのいずれかは、本発明の文脈において、標的化に適切であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、以下が挙げられる：癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、尿性腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲンレセプター、ラミニンレセプター、ｅｒｂＢおよびｐ１５５。
【００７３】
（Ｅ．遺伝子治療剤）
化学療法剤および放射性療法剤のような薬剤に対して耐性である腫瘍細胞は、臨床腫瘍学における主要な問題を示す。１つ以上の抗癌剤の効力の改善は、このような薬剤を、遺伝子治療とともに組合わせることによって可能である。例えば、単純ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系により脳腫瘍へ送達された場合、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性が首尾よく誘導された（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９２）。遺伝子治療剤は、増殖因子レセプターのリン酸化を変化するタンパク質またはアンチセンス分子をコードし得る（例えば、増殖因子をコードする遺伝子）。本発明の文脈において、遺伝子治療が、単独でかまたは他の抗癌剤とあわせて、同様に使用され得ること、および本発明の方法を用いるこのような処置の効力が決定され得ることが、企図される。
【００７４】
（Ｆ．抗癌治療の組合わせ）
上記の治療のような種々の癌治療が、本発明の文脈において使用され得る。一般的に、癌治療の有効性を向上させるために、２つ以上の抗癌剤を組合わせることが、所望され得る。
【００７５】
１つの抗癌剤の投与は、数分〜数日〜数週間までわたる間隔だけ、他の抗癌剤の、前または後であり得る。両方の抗癌剤が一緒に投与される実施形態において、一般的に、一方の薬剤は、有意な期間が各送達の時間の間に失効しないことを確実にする。このような例において、互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に患者に投与されることが企図され、遅延時間が約１２時間しかないものが最も好ましい。いくつかの状況において、処置のための期間を有意に延長することが所望され得るが、ここでそれぞれの投与の間に、数日（２、３、４、５、６または７日）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）によって無効にされる。
【００７６】
いずれかの薬剤の１回より多い投与が、完全な癌の治癒を達成するために必要とされることもまた、考えられ得る。以下に例示されるように、種々の組合わせが使用され得、ここで１つの抗癌剤が「Ａ」であり、そして別の抗癌剤が「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ。
【００７７】
他の組合わせもまた企図され、本発明に記載されるような、増殖因子レセプターのリン酸化状態の改善または減少に関するアッセイは、処置の効力を決定するためおよび必要とされる薬物の投与を再調整するために、これらの組合わせ処置の間の任意の段階において実行され得る。
【００７８】
（ＶＩ．抗体）
本発明の特定の局面において、１つ以上の抗体が、細胞の表面上のリン酸化した増殖因子レセプターを検出するために、癌治療の効力を決定する手法として、そしてさらに、より良い癌治療レジメンを開発するための手法として使用される。これらの抗体は、商業的に入手されても作製されてもよく、そして本明細書に記載される種々の診断的および治療的適用における使用を見出す。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような任意の免疫学的結合因子を広く言及することが意図される。一般的に、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。なぜなら生理学的な状況において最も一般的な抗体であり、そして研究室の設定において最も容易に作製されるからである。
【００８０】
用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様の分子を言及するために使用され、そして抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）など）を含む。抗体に基づく種々の構築物およびフラグメントを調製および使用するための技術は、当該分野において周知である。抗体を調製および特徴づけするための方法もまた、当該分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００８１】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、特定の長所（例えば、再現性および大量生産）を有することが認識され、そしてこれらの使用は、一般的に好ましい。従って、本発明は、ヒト起源、マウス起源、サル起源、ラット起源、ハムスター起源、ウサギ起源およびさらにニワトリ起源のモノクローナル抗体を提供する。調製の容易さおよび試薬の入手しやすさに起因して、マウスのモノクローナル抗体は、しばしば好ましい。
【００８２】
しかし、「ヒト化」抗体はまた、ヒトの定常領域ドメインおよび／または可変領域ドメイン、二特異性抗体、組換え抗体および操作された抗体ならびにそれらのフラグメントを保有する、マウス、ラット、または他の種に由来するキメラ抗体として企図される。患者の歯の疾患に対する「特注の（ｃｕｓｔｕｍ−ｔａｉｌｏｒｅｄ）」抗体の開発のための方法は、同様に公知であり、そしてこのような特注の抗体もまた企図される。
【００８３】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するための方法は、一般的に、ポリクローナル抗体の調製のための方法と同じ方針に沿って開始される。簡潔には、ポリクローナル抗体は、本発明に従って、動物をＬＥＥ組成物またはＣＥＥ組成物を用いて免疫化し、そしてその免疫化した動物から抗血清を回収することにより、調製される。
【００８４】
広範囲の動物種が、抗血清の産生のために使用され得る。典型的に、抗血清の産生のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。当業者に公知である動物の選択は、操作の容易さ、費用または血清の所望される量に基づいて決定され得る。
【００８５】
また、当該分野において周知であるものとして、特定の免疫原組成物の免疫原性が、アジュバントとして公知であり、免疫応答の非特異的な刺激因子の使用により増強され得る。適切なアジュバントは、全て受容可能な免疫刺激性の化合物（例えば、サイトカイン、ケモカイン、補因子、毒素、形質胞体、合成組成物またはこのようなアジュバントをコードするＬＥＥｓもしくはＣＥＥｓ）を含む。
【００８６】
使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられる：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ＭＤＰ化合物（例えば、ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰ）、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）。ＲＩＢＩもまた企図され、ＲＩＢＩは、２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０乳濁液中で、細菌から抽出される３種類の成分（ＭＰＬ、トレハロースジミコナゾール（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ））を含む。ＭＨＣ抗原でさえ、使用され得る。例示的に、しばしば好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅させたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的な刺激因子）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【００８７】
アジュバントに加えて、生物学的応答修飾因子（ＢＲＭ）を同時投与することが所望され得、これは、Ｔ細胞免疫を上方制御するかまたはサプレッサー細胞活性を下方制御することが示されている。このようなＢＲＭとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ、ＰＡ）；低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ；３００ｍｇ／ｍ２）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ、ＮＪ）、サイトカイン（例えば、γ−インターフェロン、ＩＬ−２、もしくはＩＬ−１２）または免疫ヘルパー機能に関係したタンパク質（例えば、Ｂ−７）をコードする遺伝子。
【００８８】
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫化のために使用される動物と同様に免疫原の性質に基づいて変動する。種々の経路が、以下を含むが、これらに限定されない免疫原を投与するために使用され得る：皮下、筋肉内、皮内、表皮内、静脈内および腹腔内。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化に続く種々の時点における、免疫化した動物の血液をサンプリングすることによりモニターされ得る。
【００８９】
第２の、ブースター投与量（例えば、注射により投与される）がまた、与えられ得る。ブーストするプロセスおよび滴定するプロセスは、適切な力価が達成されるまで反復される。所望されるレベルの免疫原性が得られる場合、免疫化された動物は、採血され得、そして単離および貯蔵された血清、ならびに／またはその動物は、ＭＡｂを産生するために使用され得る。
【００９０】
ウサギのポリクローナル抗体の産生のために、動物は、耳静脈を通して採血され得るか、または心臓の穿刺により採血され得る。採取された血液を、凝血させて、次いで、全細胞および血餅から血清成分を分離するために遠心分離する。血清は、種々の適用のためのものとして使用され得るか、または、所望される抗体の画分は、周知の方法（例えば、別の抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに結合したペプチド）により、または例えば、プロテインＡクロマトグラフィーもしくはプロテインＧクロマトグラフィーを用いることにより精製され得る。
【００９１】
ＭＡｂは、米国特許第４，１９６，２６５号に例示される技術のような（本明細書中に参考として援用される）周知の技術の使用を介して容易に調製され得る。典型的に、この技術は、選択された免疫原組成物（例えば、精製したかまたは部分的に精製した、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはドメイン）を用いて適切な動物を免疫化する工程を包含し、この組成物は、野生型組成物または変異組成物である。免疫化組成物は、抗体産生細胞を刺激するために効果的な様式で投与される。
【００９２】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するための方法は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じ方針に沿って開始される。齧歯類（例えば、マウスおよびラット）は、好ましい動物であるが、ウサギ細胞、ヒツジ細胞またはカエル細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は、特定の利点を提供し得る（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６、ｐｐ．６０〜６１）が、マウスの使用が好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、最も慣用的に使用され、そして一般的に高いパーセントの安定な融合物を与えるために、最も好ましい。
【００９３】
動物は、一般的に上記のように、抗原を用いて注射される。抗原は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）とともに混合され得る。同一の抗原または抗原をコードするＤＮＡを用いたブースター投与は、約２週間の間隔を空ける。
【００９４】
免疫化に次いで、抗体産生のための潜在性をもつ体細胞、具体的にＢリンパ球（Ｂ細胞）は、ＭＡｂを生成するプロトコルにおける使用のために選抜される。これらの細胞は、生検をされた、脾臓、扁桃腺もしくはリンパ節からか、または末梢血サンプルから入手され得る。脾臓細胞および末梢血細胞が、好ましい。なぜなら、脾臓細胞は、分裂する形質芽球の段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であるからであり、そして末梢血は、容易に入手可能であるからである。
【００９５】
しばしば、動物のパネルは、免疫化され、そして最大の抗体力価を有する動物の脾臓は、回収され、そして脾臓のリンパ球は、注射器を用いて脾臓をホモジナイズすることによって得られる。典型的に、免疫化したマウス由来の脾臓は、約５×１０７〜２×１０８個のリンパ球を含む。
【００９６】
次いで、免疫化した動物由来の抗体産生性のＢリンパ球は、不死化骨髄腫細胞の細胞（一般的には、免疫化された動物と同一種のもの）と融合される。好ましくは、抗体産生性でないハイブリドーマを作成する融合手順における使用のために適した骨髄腫細胞株は、高い融合効率を有し、次いで、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中での増殖を無能にさせる酵素の欠損を有する。
【００９７】
当業者に公知である（Ｇｏｄｉｎｇ、ｐｐ．６５〜６６、１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ｐｐ．７５〜８３、１９８４を挙げる）多くの骨髄腫細胞のうちのいずれか１つは、使用され得る。例えば、使用し得る免疫化された動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌが使用され得；ラットについては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が使用され得；そして、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６が、ヒト細胞融合との組合わせにおいて全て有用である。
【００９８】
マウス骨髄腫細胞の１つは、ＮＳ−１骨髄腫細胞株（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１としても称される）であり、これは、細胞株受託番号ＧＭ３５７３を要求することにより、ＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから容易に入手可能である。使用され得る別のマウス骨髄腫細胞株は、８−アザグアニン−耐性マウスの、マウスの骨髄腫ＳＰ２／０非プロデューサー細胞株である。
【００９９】
抗体を産生する脾臓細胞または抗体産生のリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とのハイブリッドを生成するための方法は、体細胞を骨髄腫細胞と２：１の割合で混合する工程を包含するが、この割合は、通常、細胞膜の融合を促進する因子（化学的または電気的）の存在下で、それぞれ約２０：１から約１：１まで変化し得る。センダイウイルスを用いる融合方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）により記載され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ）を用いる融合方法は、Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）により記載される。電気的に誘導される融合方法の使用もまた適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、ｐｐ．７１〜７４、１９８６）。
【０１００】
融合手順は、通常、約１×１０−６〜１×１０−８の低頻度で生存可能なハイブリッドを産生する。しかし、この融合手順は、生存可能な融合したハイブリッドが、選択培地中で培養することにより、親の、融合していない細胞（特に、正常に、永久に分裂し続ける融合していない骨髄腫細胞）から分化される場合、問題を生じない。選択培地は、一般的に、組織培養培地中でヌクレオチドのデノボ合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成を阻害するが、アザセリンは、プリンの合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地は、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンを補充される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンを補充される。
【０１０１】
好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を作動し得る細胞のみが、ＨＡＴ培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の主要な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ））を欠損し、そして骨髄腫細胞は、生存し得ない。Ｂ細胞は、この経路を作動し得るが、Ｂ細胞は、培養における寿命が制限され、そして一般的に約２週間以内に死滅する。従って、選択培地中で生存し得る唯一の細胞は、骨髄腫細胞およびＢ細胞に由来して形成されたハイブリッド細胞である。
【０１０２】
この培養工程は、特定のハイブリドーマが選抜されるハイブリドーマの集団を提供する。典型的に、ハイブリドーマの選抜は、マイクロタイタープレート内で単一クローン希釈により細胞を培養し、次いで、所望の反応性について個々のクローンの上清（約２〜３週間後の）を試験することにより実施される。アッセイは、放射免疫測定、酵素免疫アッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノ結合アッセイなどのように、高感度、簡便かつ迅速でなければならない。
【０１０３】
次いで、選択されたハイブリドーマは、段階希釈され、そして個々の抗体産生細胞株の中へクローン化される。次いで、このクローンは、ＭＡｂを提供するために永久に増殖され得る。細胞株は、基本的な２種類の方法でＭＡｂ産生のために利用され得る。第１に、ハイブリドーマのサンプルは、体細胞および骨髄腫細胞を元々の融合のために提供するために使用された型の組織適合性の動物（例えば、同系のマウス）に（しばしば腹膜腔中へ）注射され得る。必要に応じて、動物は、注射の前に、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）のようなオイルを用いてプライムされる。注射された動物は、融合された細胞ハイブリッドにより産生された特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発現する。次いで、動物の体液（例えば、血清または腹水）は、高濃度でＭＡｂを提供するために穿刺され得る。第２に、個々の細胞株は、インビトロで培養され得、ここで、ＭＡｂは、ＭＡｂが高濃度で容易に入手され得る培養培地の中へ自然に分泌される。
【０１０４】
いずれかの方法により産生されたＭＡｂは、所望ならば、濾過、遠心分離および種々のクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）を用いてさらに精製され得る。本発明のモノクローナル抗体のフラグメントは、モノクローナル抗体から入手され得、そして酵素（例えば、ペプシンまたはパパイン）を用いる消化を含む方法により、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の開裂によって産生され得る。あるいは、本発明により包含されるモノクローナル抗体のフラグメントは、自動化ペプチド合成機を用いて合成され得る。
【０１０５】
分子クローニングアプローチがモノクローナルを生成するために使用され得ることもまた、企図される。１つの実施形態において、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーは、免疫化された動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製され、そして適切な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞およびコントロール細胞を用いるパニングにより選択される。従来のハイブリドーマ技術よりも優れるこのアプローチの利点は、一回で約１０４倍の多くの抗体が産生およびスクリーニングされ得ること、ならびに、適切な抗体の発見の機会をさらに増加させるＨ鎖およびＬ鎖の組合わせにより、新たな特異性が産生されることである。別の例において、ＬＥＥまたはＣＥＥは、無細胞系を用いてインビトロで抗原を産生するために使用され得る。これらは、単鎖抗体ライブラリーを走査するための標的として使用され得る。これは、動物の使用なしに、多くの異なる抗体が極めて迅速に同定されることを可能にする。
【０１０６】
あるいは、本発明により包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、自動化されたペプチド合成機を用いて、またはＥ．ｃｏｌｉ中にて、完全長遺伝子もしくは遺伝子フラグメントの発現により合成され得る。
【０１０７】
（Ａ．抗体結合体）
本発明は、さらに、リン酸化された増殖因子レセプターに対する抗体、および抗体結合体を形成するためにその抗体に連結され得る因子を提供する。診断用因子または治療用因子として抗体分子の効力を増加させるために、少なくとも１つの所望の分子または部分を、連結または共有結合的に結合または複合化することは、慣用的である。このような分子または部分は、少なくとも１つのエフェクター分子またはリポーター分子であり得えるが、これらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性（例えば、細胞傷害性活性）を有する分子を含む。抗体に付着されているエフェクター分子の限定されない例としては、以下が挙げられる：毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射標識したヌクレオチド、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、増殖因子、およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。対照的に、リポーター分子は、アッセイを用いて検出され得る任意の部分として規定される。抗体に結合体化されているリポーター分子の限定されない例としては、以下が挙げられる：酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、燐光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはリガンド（例えば、ビオチン）。本発明の文脈において、レセプター分子が使用されることが企図される。
【０１０８】
十分な選択性、特異性または親和性を有する任意の抗体が、抗体結合体に対する基準として使用され得る。このような特性は、当業者に公知である従来の免疫学的スクリーニング方法論を用いて評価され得る。生物学的に活性な分子への結合のための抗体分子中の部位は、標準的な抗原結合部位に加えて、病原体、Ｂ細胞超抗原、Ｔ細胞コレセプターＣＤ４およびＨＩＶ−１エンベロープを結合し得る可変ドメイン内に属する部位を含む（Ｓａｓｓｏら、１９８９；Ｓｈｏｒｋｉら、１９９１；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎｎら、１９９５；Ｃｌｅａｒｙら、１９９４；Ｌｅｎｅｒｔら、１９９０；Ｂｅｒｂｅｒｉａｎら、１９９３；Ｋｒｅｉｅｒら、１９９１）。さらに、可変ドメインは、抗体の自己結合（Ｋａｎｇら、１９８８）に関与し、そして抗抗体により認識されるエピトープ（イディオトープ）を含む（Ｋｏｈｌｅｒら、１９８９）。
【０１０９】
抗体結合体の特定の例は、抗体が検出可能な標識に連結される抗体結合体である。「検出可能な標識」は、それらの特定の機能的特性、および／または化学的特徴に起因して検出され得る、化合物および／または要素であり、検出可能な標識の使用は、抗体が検出される、および／またはさらに所望ならば抗体が定量化されることを可能にする。
【０１１０】
抗体結合体は、一般的に、診断用因子としての使用に対して好ましい。抗体診断法は、一般的に、以下の２種類のクラスに含まれる：インビトロ診断薬（例えば、種々の免疫アッセイ）において使用するための抗体診断薬、および／またはインビボ診断プロトコル（一般的に、「抗体指向性画像化」として公知である）において使用するための抗体診断薬。
【０１１１】
多くの適切な造影剤は、抗体への造影剤の結合についての方法として、当該分野において公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号；同第４，９３８，９４８号；および同第４，４７２，５０９号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。使用される画像化部分は、常磁性イオン；放射性同位元素；蛍光色素；ＮＭＲで検出可能な物質；Ｘ線画像化であり得る。
【０１１２】
常磁性イオンの場合、例示の目的で、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）および／またはエルビウム（ＩＩＩ）のようなイオンが言及され得、ガドリニウムが特に好ましい。他の文脈（例えば、Ｘ線画像化）において有用なイオンは、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、および特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
治療的適用および／または診断的適用についての放射性同位元素の場合、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２ユウロピウム、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５硫黄、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｉｃｉｕｍ）９９ｍおよび／またはイットリウム９０が言及され得る。１２５ヨウ素は、特定の実施形態における使用に対して、しばしば好ましく、そしてテクネチウム９９ｍおよび／またはインジウム１１１はまた、それらの低いエネルギーおよび広範囲の検出に対する適合性に起因してしばしば好ましい。本発明の放射能標識化モノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法に従って産生され得る。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／またはヨウ化カリウムならびに化学的酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）、あるいは酵素的酸化剤（例えば、ラクトペルオキシダーゼ）との接触によりヨウ素化され得る。本発明に従うモノクローナル抗体は、リガンド交換処理、例えば、第一スズ溶液を用いて過テクネチウム酸を還元し、還元したテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラム上でキレート化し、そして抗体をこのカラムへ適用することによりテクネチウム９９ｍで標識化され得る。あるいは、直接的な標識化技術（例えば、過テクネチウム酸、還元剤（例えば、塩化スズ（ＳＮＣｌ２））、緩衝化溶液（例えば、フタル酸ナトリウムカリウム溶液）、および抗体をインキュベートすることによる）が、使用され得る。金属イオンとして存在する放射性同位元素を抗体に結合させるためにしばしば用いられる中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０１１４】
結合体としての使用のために意図される蛍光標識の中には、Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドを含む。
【０１１５】
本発明中において意図される別の型の抗体結合体は、主に、インビトロでの使用が意図される抗体結合体であり、その抗体結合体において、その抗体は、色素生産性基質と接触すると有色生成物を生ずる、２次結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に、連結されている。適切な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼ、（ホースラディッシュ）過酸化水素ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい２次結合リガンドは、ビオチン化合物ならびに／またはアビジン化合物およびストレプトアビジン化合物である。これら標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（各々が、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【０１１６】
抗体への分子の部位特異的結合についてのなお別の公知の方法は、ハプテンに基づいた親和性標識との抗体の反応を含む。本質的に、ハプテンに基づいた親和性標識は、抗原結合部位におけるアミノ酸と反応し、それによって、この部位を破壊し、特異的抗原反応を遮断する。しかしながら、この方法は、抗体結合体による抗原結合の損失が生じるので、都合が良くないかもしれない。
【０１１７】
アジド基を含む分子もまた、低強度紫外光により生じた反応性ニトレン中間体を介して、タンパク質への共有結合を形成するために使用され得る（ＰｏｔｔｅｒおよびＨａｌｅｙ，  １９８３）。特に、プリンヌクレオチドの２−アジドアナログおよびプリンヌクレオチドの８−アジドアナログが、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質の同定のための部位特異的な光プローブとして、使用されている（ＯｗｅｎｓおよびＨａｌｅｙ，１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎら，１９８５）。２−アジドヌクレオチドおよび８−アジドヌクレオチドもまた、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインを位置付けるために、使用されている（Ｋｈａｔｏｏｎら，１９８９；Ｋｉｎｇら，１９８９；およびＤｈｏｌａｋｉａら，１９８９）。２−アジドヌクレオチドおよび８−アジドヌクレオチドは、抗体結合剤として使用され得る。
【０１１８】
いくつかの方法が、結合体部分への抗体の結合または結合体化について、当該分野において公知である。ある結合法は、例えば、抗体に結合した、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミンテトラ酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリル−３（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号（各々本明細書中に参考として援用する））のような、有機キレート剤を用いた金属キレート複合体の使用を包含する。モノクローナル抗体もまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で、酵素と反応し得る。蛍光マーカーとの結合体が、これらのカップリング剤の存在下またはイソチオシアネートとの反応によって、調製される。米国特許第４，９３８，９４８号の中で、乳癌の画像化が、モノクローナル抗体を使用し行われ、検出可能な画像部分は、メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミデートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートのような、リンカーを使用して、抗体に結合している。
【０１１９】
他の実施形態において、抗体結合部位を変化しない反応条件を使用する、免疫グロブリンのＦｃ領域におけるスルヒドリル基の選択的誘導による免疫グロブリンの誘導体化が、企図される。この方法に従って生成した抗体結合体は、改良した寿命、改良した特異性および改良した感受性を示すことが、開示される（米国特許第５，１９６，０６６号（本明細書中に参考として援用する））。レポーター分子またはエフェクター分子が、Ｆｃ領域において炭水化物残基と結合体化している、エフェクター分子およびレポーター分子の部位特異的結合もまた、この文献の中で開示されている（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら，  １９８７）。このアプローチは、現在臨床評価中である、診断上有望な抗体、および治療上有望な抗体を生成することが、報告されている。
【０１２０】
（Ｂ．免疫検出法）
なおさらなる実施形態において、本発明は、特にリン酸化した状態にある増殖因子レセプターのような生物学的成分の結合、精製、除去、定量および／または、一般的な検出のための、免疫検出法に関する。いくつかの免疫検出法としては、少し言及すると、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウェスタンブロットが挙げられる。様々な有用な免疫検出法の工程は、各々参考として援用されるＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＭＨおよびＢｅｎ−Ｚｅｅｖ  Ｏ，  １９９９；Ｇｕｌｂｉｓ  ＢおよびＧａｌａｎｄ  Ｐ，  １９９３；Ｄｅ  Ｊａｇｅｒ  Ｒら，  １９９３；およびＮａｋａｍｕｒａら，  １９８７のような、科学論文の中に記載されている。
【０１２１】
一般に、免疫結合法は、特にリン酸化状態にある増殖因子レセプターを含むと疑われるサンプルを取得する工程、ならびに、第１リン酸化増殖因子レセプター抗体および／または第２リン酸化増殖因子レセプター抗体にサンプルを場合によっては、免疫複合体の形成を有効にする条件下で接触させる工程を包含する。
【０１２２】
これらの方法は、特にリン酸化状態にある増殖因子レセプターを精製する方法を包含する。これら場合において、抗体は、サンプルから抗原性リン酸化増殖因子レセプター成分を、除去する。この抗体は、好ましくは、例えば、カラムマトリックスの形態の、固体の支持体に連結され、リン酸化した抗増殖因子レセプター抗原性成分を含んでいる疑いのあるサンプルが、その固定した抗体に適用される。不必要な成分がカラムから洗浄され、溶出されるべき固定化した抗体に免疫複合体化した抗原が残る。
【０１２３】
この免疫結合法はまた、サンプル中の抗原成分量の検出および定量のための方法、および、結合プロセス中に形成したすべての免疫複合体の検出および定量を包含する。ここで、抗原を含む疑いのあるサンプルを取得し、そしてリン酸化増殖因子レセプターが生成した抗原に対する抗体とサンプルを接触させ、その後、特定の条件下で形成した免疫複合体量を検出および定量する。
【０１２４】
抗原検出に関して、分析される生物学的サンプルは、抗原を含むと疑われる任意のサンプル（例えば、組織切片または組織標本、均質化された組織抽出物、細胞、小器官、上記の抗原含有組成物のいずれかの分離された形態および／または上記の抗原含有組成物のいずれかの精製された形態、あるいは、血液および／または血清を含む細胞または組織と接触する、任意の生物学的液体であり得るが、組織サンプルまたは組織抽出物が好ましい。
【０１２５】
免疫複合体（一次免疫複合体）の形成に有効な条件下および十分な時間、選抜した生物学的サンプルを抗体と接触させることは、一般に、単に抗体組成物をサンプルに添加すること、および、存在するすべてのリン酸化抗増殖因子レセプター抗原と複合体を形成する（すなわち、結合する）ために十分な時間、その混合物をインキュベートするだけのことである。この後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウェスタンブロットのような、サンプル−抗体組成物は、非特異的結合したすべての抗体を取り除くために洗浄され、それにより、一次免疫複合体内に特異的に結合している抗体のみを検出することが可能になる。
【０１２６】
一般に、免疫複合体形成の検出は、当該分野において周知であり、多数のアプローチの適用を介して達成され得る。これらの方法は、一般的に、放射性タグ、蛍光性タグ、生物学的タグおよび酵素的タグのうちのいずれかのような、標識またはマーカーの検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許としては、各々本明細書中で参考のために援用される、第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号が、挙げられる。もちろん、当該分野において公知であるように、第２抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配合のような、ニ次結合リガンドの使用を介して、さらなる利益を見出し得る。
【０１２７】
この検出において使用されるリン酸化抗増殖因子レセプター抗原抗体自体は、検出可能な標識に連結され得、その後、単にこの標識を検出し、それによって、組成物中の一次免疫複合体量を決定できる。あるいは、一次免疫複合体に結合している第１抗体は、その抗体に対して結合親和性を持つ第２結合リガンドを使用して、検出され得る。これらの場合において、この第２結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。この第２抗体リガンドは、頻繁にそれ自体が抗体であり、従って、その抗体を「ニ次」抗体と称し得る。この一次免疫複合体は、二次免疫複合体を形成させるために有効な条件下および十分な時間で、標識二次結合リガンドまたは標識二次抗体と接触させられる。その後、一般的に、このニ次免疫複合体は、標識ニ次抗体または標識ニ次リガンドへのいかなる非特異的結合も除去するために洗浄され、それから、ニ次免疫複合体に残存した標識が検出される。
【０１２８】
さらなる方法は、２段階のアプローチによる一次免疫複合体の検出を包含する。上記抗体に結合親和性を有する第２結合リガンド（例えば、抗体）が、上記したように、ニ次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄後、このニ次免疫複合体は、免疫複合体（三次免疫複合体）を形成させるために有効な条件下および十分な時間再び、その二次抗体に対して結合親和性を持つ第３結合リガンドまたは第３抗体と、接触させられる。この第３リガンドまたは第３抗体は、検出可能な標識に連結され、それにより、このようにして形成した三次免疫複合体を検出することが可能になる。この系は、望まれるならば、シグナル増幅を提供し得る。
【０１２９】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃａｎｔｏｒによって立案されたある免疫検出法は、２つの異なる抗体を使用する。ビオチン化モノクローナル第１段階抗体またはビオチン化ポリクローナル第１段階抗体が、標的抗原を検出するために使用され、その後、第２段階抗体が、複合体化したビオチンに結合したビオチンを検出するために、使用される。この方法において、試験するサンプルは、最初に第１段階抗体含有溶液中でインキュベートされる。標的抗原が存在する場合、その抗体のいくつかは、ビオチン化抗体／抗原複合体を形成するようにその抗原に結合する。ついで、この抗体／抗原複合体は、ストレプトアビジン（またはアビジン）溶液、ビオチン化ＤＮＡ溶液、および／または相補的ビオチン化ＤＮＡ溶液中で、連続してインキュベートし、この抗体／抗原複合体に各段階でさらなるビオチン部位を添加することによって、増幅される。増幅が適当なレベルに達するまで、この増幅段階が繰り返される。増幅が適当なレベルに達した時、そのサンプルは、ビオチンに対する第２段階抗体を含む溶液中で、インキュベートされる。この第２段階抗体は、例えば、色素生産性基質を用いる組織酵素学により抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用され得る酵素を用いて、標識される。適度な増幅を用いて、巨視的に目に見える結合体が、生成され得る。
【０１３０】
免疫検出についての別の公知の方法は、免疫ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用する。このＰＣＲ法は、ビオチン化ＤＮＡとのインキュベートまで、上記Ｃａｎｔｏｒ法と類似している。しかしながら、複数回のストレプトアビジンおよびビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションを使用する代わりに、ＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体が、その抗体を遊離する低ｐＨ緩衝液または高塩緩衝液を用いて、洗浄される。その後、この結果生じた洗浄溶液が、適切なコントロールと共に、適切なプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うために、使用される。少なくとも理論上、ＰＣＲの莫大な増幅能力および増幅特異性が、１つの抗原分子検出のために、利用され得る。
【０１３１】
本発明における免疫検出法は、膵臓癌におけるＥＧＦ−Ｒ、乳癌におけるヘレグリンなどのような、特異的リン酸化増殖因子レセプターが過剰発現される様々な癌のような、状態の診断および、そのような状態の予後において、明らかな有用性を有する。ここで、変化したリン酸化増殖因子レセプターに関連した特定の癌を含んでいると疑われる生物学的サンプルおよび／または臨床的サンプルが、使用される。しかしながら、これらの実施形態はまた、例えば、ハイブリドーマの選択におけるような、抗原サンプルまたは抗体サンプルの力価測定において、非臨床サンプルへの適用も有する。
【０１３２】
様々な形態をした患者の臨床的診断および／またはその患者のモニタリングにおいて、例えば癌のような疾患、癌特異的リン酸化増殖因子レセプターの検出、および／または、正常な被験体由来の対応する生物学的サンプル中のレベルと比較した癌特異的遺伝子産物のレベルの変化は、癌を有する患者を示す。しかしながら、当業者に公知であるように、このような臨床学的診断は、必ずしも、単離中に本方法に基づいてなされるわけではない。当業者は、陽性の同定を示すバイオマーカーの型および／または量、ならびに／あるいは低レベルのバイオマーカーおよび／またはバイオマーカーのバックグラウンド変化における、有意な差異を区別することを熟知している。実際、バックグランド発現レベルは、しばしば、「カットオフ」を形成するために使用され、この「カットオフ」を超えて増えた検出は、有意であり、そして／または陽性であると、スコア付けされる。もちろん、本発明の抗体は、当業者に公知であるいかなる免疫検出またはいかなる治療において使用される。
【０１３３】
（（ｉ）ＥＬＩＳＡ）
これまでに詳述したように、免疫アッセイは、最も単純かつ／または直接的な意味で、結合アッセイである。ある好ましい免疫アッセイは、当該分野で公知である様々な型の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を使用する免疫組織化学的検出もまた、特に有用である。しかしながら、検出は、このような技術、またはウェスタンブロット、ドットブロット、ＦＡＣＳ分析に限定されず、類似したものもまた使用され得ることが、容易に認識される。
【０１３４】
例示的なＥＬＩＳＡにおいて、本発明中で記載される抗リン酸化増殖因子レセプター抗体は、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェルのような、タンパク質親和性を示す選択された表面上に、固定される。その後、臨床的サンプルのような、抗原を含むと疑われる試験組成物が、そのウェルに添加される。結合および／または非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄の後、結合した抗原が検出され得る。検出は一般に、検出可能な標識に連結された、別の抗リン酸化増殖因子レセプターを添加することにより、達成される。この型のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出はまた、第２抗リン酸化増殖因子レセプター抗体を添加すること、続いてその第２抗体に対して結合親和性を有する第３抗体を添加することにより達成され、この第３抗体は、検出可能な標識に連結されている。
【０１３５】
別の例示的なＥＬＩＳＡにおいて、抗原を含む疑いのあるサンプルは、ウェルの表面上に固定され、そして／または、その後、抗リン酸化増殖因子レセプター抗体に接触させられる。結合および／または非特異的結合した免疫複合体を除去するための洗浄後、結合した抗リン酸化増殖因子レセプター抗体が検出される。最初の抗リン酸化増殖因子レセプター抗体が、検出可能な標識に連結されている場合、その免疫複合体は直接検出され得る。また、この免疫複合体は、第１抗リン酸化増殖因子レセプター抗体に対して結合親和性を有する第２抗体を使用して、検出され得、その第２抗体は、検出可能な標識に連結されている。
【０１３６】
抗原が固定される別のＥＬＩＳＡは、検出において、抗体競合の使用を包含する。このＥＬＩＳＡにおいて、抗原に対する標識抗体が、ウェルに添加され、結合させられ、そして／またはそれらの標識を使用して検出される。次いで、未知サンプル中の抗原量が、コートされたウェルとインキュベート中に、抗原に対する標識抗体とサンプルとを混合することによって、決定される。このサンプル中の抗原の存在が、ウェルへの結合に利用し得る抗原に対する抗体量を減少させるために作用し、従って、最終シグナルを減少させる。これはまた、非標識抗体が抗原コートしたウェルに結合する場合に、未知サンプル中の抗原に対する抗体の検出に適しており、標識抗体に結合するために利用し得る抗原の量を減少させる。
【０１３７】
使用される形式に関係無く、ＥＬＩＳＡは、共通して特定の特徴（例えば、コーティング、インキュベーションおよび結合、非特異的結合種除去のための洗浄、および結合した免疫複合体の検出）を有する。これらを以下に記載する。
【０１３８】
抗原または抗体のいずれかでプレートをコーティングする際、一般的には、一晩または特定した時間中、抗原溶液または抗体溶液とプレートのウェルをインキュベートする。それから、不完全に吸着された物質を除去するために、プレートのウェルが洗浄される。それから、ウェルの残存している利用し得るどの表面も、試験抗血清に関しては抗原的に中性である非特異的タンパク質で、「コートティング」される。これらの非特異的タンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは粉乳溶液が挙げられる。このコーティングは、固定表面上の非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、その表面上への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを減少する。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡにおいて、直接的な手順よりむしろ、二次検出法または三次検出法を使用する方が、おそらく慣習的である。このように、ウェルへのタンパク質または抗体の結合、バックグラウンドを減少するための非反応性物質を使用したコーティング、および非結合物質の除去のための洗浄の後、固定表面は、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするために有効な条件下において、試験する生物学的サンプルと接触させられる。その後、この免疫複合体の検出は、標識二次結合リガンドまたは標識二次抗体、および標識三次抗体または第３結合リガンドと組み合わせた二次結合リガンドまたは二次抗体を、必要とする。
【０１４０】
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするために有効な条件」は、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）または、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎのような溶液で、抗原および／または抗体を希釈することを好ましくは包含する、条件を意味する。これら添加した薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少を補助する傾向がある。
【０１４１】
「適切な」条件はまた、有効な結合を可能とするために十分な温度または時間での、インキュベーションを意味する。インキュベーション工程は、代表的には、約１時間〜２時間〜４時間程度であるかまたは好ましくは、２５℃〜２７℃程度の温度である。または、インキュベーション工程は、４℃程度で一晩であり得る。
【０１４２】
ＥＬＩＳＡにおける全インキュベーション工程の後、非複合体化物質を除去するために、接触表面が、洗浄される。好ましい洗浄手順としては、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸塩緩衝液のような、溶液で洗浄することが挙げられる。試験サンプルと本来の結合物質との間の特異的免疫複合体の形成およびその後の洗浄の後、さらに微量の免疫複合体の発生が、決定され得る。
【０１４３】
検出手段を供与するために、第２抗体または第３抗体は、検出を可能にするために会合した標識を、有する。好ましくは、これは、適切な色素生産性基質とインキュベートした際に、呈色する酵素である。このように、例えば、さらなる免疫複合体形成の発生を支持する一定の時間および条件下（例えば、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎのようなＰＢＳ含有溶液中で、室温で２時間のインキュベーション）において、第１免疫複合体および第２免疫複合体を、ウレア−ゼ結合体化抗体、グルコースオキシダーゼ結合体化抗体、アルカリフォスファターゼ結合体化抗体または過酸化水素ペルオキシダーゼ結合体化抗体と、接触またはインキュベートすることが求められる。
【０１４４】
標識抗体とのインキュベーション、その後の非結合物質除去のための洗浄の後、例えば、尿素もしくはブロモクレゾールパープルのような色素生産性基質、または酵素標識としてペルオキシダーゼを用いた場合、２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）もしくはＨ２Ｏ２のような色素生産性基質とインキュベートすることにより、標識量が定量される。その後、例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて、呈色の程度を測定することによって、定量が達成される。
【０１４５】
（（ｉｉ）免疫組織化学）
本発明における抗体はまた、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究のために調製された、新鮮凍結パラフィン包埋組織ブロックおよび／またはホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックの両方と組み合わせて、使用され得る。これらの粒状標本からの組織ブロックの調製法は、様々な予後因子に関する以前のＩＨＣ研究において、首尾よく使用されており、当業者に周知である（Ｂｒｏｗｎら，  １９９０；Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏら，  １９９０；Ａｌｌｒｅｄら，  １９９０）。
【０１４６】
簡単に述べると、小さなプラスチックカプセルにおいて、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に、室温で、凍結「粉砕」組織５０ｎｇを再水和すること；遠心分離によりその粒子をペレット化すること；粘着性包埋媒体（ＯＣＴ）中にそのペレットを再懸濁すること；カプセルを転倒し、そして／または遠心分離により再びペレット化すること；−７０℃のイソペンタン中で瞬間凍結すること；プラスチックカプセルを切断し、そして／または組織の凍結シリンダーを取り出すこと；低温保存装置のマイクロトームチャック上にその組織シリンダーを固定すること；ならびに／あるいは２５〜５０個の連続切片に切断することによって、凍結切片が、調製され得る。
【０１４７】
永久組織が、類似した方法によって調製され得る。プラスチック微小遠心管中でのサンプル５０ｍｇの再水和；ペレット化すること；４時間の固定のために１０％ホルマリン中に再懸濁すること；洗浄すること／ペレット化すること；温かい２．５％寒天中に再懸濁すること；ペレット化すること；その寒天を固めるために氷水中で冷却すること；この管から組織／寒天ブロックを取り出すこと；パラフィン中に、このブロックを浸透および／または包埋すること；ならびに／あるいは５０個までの連続永久切片に切断すること、を包含する。
【０１４８】
（（ｉｉｉ）キット）
さらなる実施形態において、本発明は、例えば非侵襲的方法により取得した生物学的サンプルにおける、抗癌処置の効力を検出する際に使用するための、キットを提供する。このようなキットは、一般的に、本発明において同定したリン酸化増殖因子レセプターに対する免疫特異性を有する、１つ以上の抗体を含有する。
【０１４９】
従って、このキットは、適当な容器手段の中に、（ａ）抗癌剤投与前および抗癌剤投与後に非侵襲的方法によってサンプルを抽出するための成分；（ｂ）そのサンプル中の増殖因子レセプターのリン酸化状態を決定するための成分、を含有する。
【０１５０】
抗リン酸化増殖因子抗体、抗ホスホチロシン抗体、抗ホスホセリン抗体および／または抗ホスホスレオニン抗体のような、抗体を含有するキットが、多くの場合、好ましい。より好ましい実施形態において、その抗体は、リン酸化増殖因子抗体に結合する抗体であることが、企図される。モノクローナル抗体は、容易に調製され、しばしば好ましい。癌マーカータンパク質または癌マーカーペプチドが提供される場合、モノクローナル抗体が、高度に精製されていることが、一般的に好ましい。
【０１５１】
このキットの免疫検出試薬は、所定の抗体または抗原自体に会合または連結された検出可能な標識を含む、多様な型のいずれか１つを採り得る。二次結合リガンドに会合または結合された、検出可能な標識もまた、企図される。代表的な二次リガンドは、第１抗体または第１抗原に対して結合親和性を有する、二次抗体である。
【０１５２】
（ＶＩＩ．実施例）
本発明の好ましい実施形態を立証するために、続く実施例を挙げる。続く実施例において開示された技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を示し、従って本発明の実施にとって好ましい様式を構成すると見なされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、本開示を考慮すると、開示した特定の実施形態において、多くの改変が為され得ること、そしてなお、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、類似した結果を取得し得ることを、当業者は認識するはずである。
【０１５３】
（実施例１）
（毛包細胞の分析）
抗癌剤処理前の患者および抗癌剤処理後の患者から取得した毛包細胞を、増殖因子レセプターリン酸化の決定のために、次のように処理した。毛包を、アセトン中で１０分間固定し、ＯＣＴ中に包埋し、液体窒素中で凍結した。凍結切片を、切断し、抗リン酸化ＥＧＦ−Ｒ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とともにインキュベートし、続いてＡｌｅｘａヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともにインキュベートし、蛍光顕微鏡において検査した。アセトン中に固定したサンプルおよび冷蔵庫で１週間保存したサンプルもまた、いくつかの場合で使用した。
【０１５４】
毛包を、解剖顕微鏡下で切開し、毛包の真上の毛幹を切断した。この毛包を、ＰＢＳ中に４％の魚ゼラチンを含むタンパク質ブロッキング溶液で満たした、８−チャンバースライドガラス（Ｌａｂ−Ｔｅｋ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、移した。２０分後、余分な溶液を除去し、この毛包を、タンパク質ブロッキング溶液中に希釈した抗活性化ＥＧＦ−Ｒの１：５０希釈溶液と、４℃で一晩インキュベートした。そのサンプルを、３分間３回洗浄した後、上記タンパク質ブロッキング溶液とともに１０分間インキュベートした。その後、このサンプルを、Ａｌｅｘａ  ５９４結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧと、室温で１時間インキュベートし、ウェルをすすいだ。この毛包を、前もってＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡ）で満たした懸滴スライドガラスへ、細鉗子を用いて移した。サンプルを、この毛包の破壊を防ぐために、懸滴スライドガラス内に固定し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡で検査した。図１−５は、リン酸化ＥＧＦ−Ｒで染色した、免疫蛍光毛包を示す。
【０１５５】
この染色をさらに、電子顕微鏡により確認した。凍結毛包を、上記のように抗活性化ＥＧＦ−Ｒとインキュベートし、続いて、金標識抗マウスＩｇＧ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ  Ｉｎｃ．，ＣＡ）とインキュベートした。その金粒子を、Ｇｏｌｇｅｎｈａｎｃｅ（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，ＮＹ）を用いて、増強した。この断面を、後方散乱走査電子顕微鏡のために、加工した。適切なコントロールを行った。図６は、低倍率におけるこの毛包の接線方向断面を示し、囲み中の領域を、図７において、高倍率で示す。明らかに、その金粒子は、毛包の内毛根鞘よりも外毛根鞘において、濃縮されている。
【０１５６】
本発明者らはまた、毛細胞周期の役割が、増殖因子レセプターの発現、およびサイトカインレセプターの発現において役割を果たす、ということを意図している。本発明者らは、これが、毛周期における異なる段階を決定するために、ＰＣＮＡ／ＴＵＮＥＬ比を必要とすることを、想定している。
【０１５７】
（実施例２）
（ＰＫＩ１６６処理した腫瘍細胞におけるＥＧＦ−Ｒリン酸化）
（材料および方法）
（膵臓癌細胞株および培養条件）これらの研究のために、ヌードマウスにおける連続選択サイクルの後単離した、高転移性細胞株（Ｌ３．６ｐｌ）（Ｂｒｕｎｓら  １９９９）を、使用した。十分に分化したムチン含有膵臓癌細胞の腹腔リンパ節転移から樹立された、オリジナルのＣＯＬＯ３５７ヒト膵臓癌細胞株は、Ｌ３．３株と名付けた肝転移を単離するために、Ｖｅｚｅｒｉｄｉｓらによって、ヌードマウスの脾臓に注入された（Ｖｅｚｅｒｉｄｉｓら  １９９２）。このＬ３．３細胞を、ヌードマウスの膵臓に注入され、Ｌ３．４ｐｌ（膵臓−肝臓）と名付けた肝転移を、単離した。さらなる２回の同所性注入−選択サイクルの後、オリジナルのＣＯＬＯ３７５細胞よりも有意に高い発生率で自発的肝転移を生じる、Ｌ３．６ｐｌと名付けた細胞が、単離された（Ｂｒｕｎｓら  １９９９）。この高転移性ヒト膵臓癌Ｌ３．６ｐｌ細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、２倍のビタミン溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、およびペニシリン−ストレプトマイシン混合物（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を補充した、ダルベッコ最小培地（ＤＭＥＭ）中に、維持した。付着性単層培養物を、プラスチック上に維持し、ＣＯ２  ５％および空気９５％の混合物中で、３７℃でインキュベートした。この培養物は、マイコプラズマ属および次の病原性マウスウイルスを含まなかった：レオウイルス３型、肺炎ウイルス、Ｋウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、センダイウイルス、マイニュートウイルス、マウスアデノウイルス、マウス肝炎ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、エクトロメリアウイルス、および乳酸デヒドロゲナーゼウイルス（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤによりアッセイした）。凍結ストックからの再生後、１２週間よりも短い時間、この培養物を維持した。
【０１５８】
（試薬）新規なＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤である、ＰＫＩ１６６（４−（Ｒ）−フェニチルアミノ−６−（ヒドロキシル）フェニル−７Ｈ−ピロール［２．３−ｄ］−ピリミジン）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ（Ｂａｓｌｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって、合成および提供された。インビボ投与のために、ＰＫＩ１６６を、ＤＭＳＯ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０中に溶解し、その後ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中に１：２０に希釈した（Ｔｒａｘｌｅｒら  １９９９）。全抗体を、以下に列挙したように購入した：ウサギ抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＬ−８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、ラット抗マウスＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１およびペルオキシダーゼ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、マウス抗ＰＣＮＡクローンＰＣ  １０（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ラット抗マウスマクロファージスカベンジャーレセプター（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）、マウス抗ヒトＥＧＦ−Ｒ（活性型）ＩｇＧ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ１  ＥＧＦ−Ｒクローン３０（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）、ペルオキシダーゼ結合体化Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２、ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２断片、アフィニピュア（ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ）Ｆａｂ断片ヤギ抗マウスＩｇＧ、ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ラットＩｇＧ、およびテキサスレッド結合体化ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＣＡ）、ペルオキシダーゼ結合体化ラット抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、モノクローナル抗ホスホチロシン  ＭＡｂ  ４Ｇ１０およびポリクローナルヒツジ抗ヒトＥＧＦ−Ｒ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、免疫沈降反応のためのＭＡｂ抗ＥＧＦ−Ｒ（クローンＥＧＦ−ＲＩ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）およびヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｄｙｅ  ３３４２  ＭＷ  ６１５．９（Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）、安定した３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）、およびＧｉｌｌのヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。四酸化オスミウム（４％水溶液）を、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）より購入し、ｐｒｏｌｏｎｇ溶液をＭｏ��ｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から、およびペプシンをＢｉｏｍｅｄａ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。
【０１５９】
テトラゾリウム（ＭＴＴ，Ｍ２１２８）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．より購入し、１ｍＬ  ＰＢＳ中に５ｍｇのＭＴＴを溶解し、粒子を除去するためにその溶液をろ過することによって、ストック溶液を調製した。その溶液を遮光し、４℃で保存し、そして１ヶ月以内に使用した。ＥＣＬ検出システムを、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から購入し、ＶＥＧＦキットおよびＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキットを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）より購入した。ＴＵＮＥＬを、改良した市販のアポトーシス検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＳ）を使用して、行った。［α−３２Ｐ］を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．より購入した。
【０１６０】
（酵素の調製およびキナーゼアッセイ）ＥＧＦ−Ｒタンパク質チロシンキナーゼ（ＭｃＧｌｙｎｎら  １９９２ａ）、Ａｂｌタンパク質チロシンキナーゼ（Ｇｅｉｓｓｌｅｒら  １９９２）、およびｃ−Ｓｒｃタンパク質チロシンキナーゼ（Ｇｅｉｓｓｌｅｒら  １９９０）を使用するインビトロ酵素アッセイを、フィルタ結合アッセイとして、９６ウェルプレートにおいて行った。簡単に述べると、ＥＧＦ−Ｒ細胞内キナーゼドメイン（ＥＧＦ−Ｒ−ＩＣＤ）を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μＣｉ／ａｓｓａｙ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ、０．４μＭ  ＡＴＰ、２μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ  ４：１）（Ｓｉｇｍａ  Ｐ２７５）、１％  ＤＭＳＯ、および３０ｎｇ  ＥＧＦ−Ｒ−ＩＣＤ中で、全量３０μＬにて、アッセイした。ｃ−ＡｂｌのＨｉｓタグ化キナーゼドメインを、以前記述されたように（Ｂｈａｔら  １９９７）、バキュロウイルス／Ｓｆ９系においてクローニングし、発現させ、そして、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．０６μＣｉ／ａｓｓａｙ（＝３０μＬ）［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ，５μＭ  ＡＴＰ，３０μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｔｙｒ  ６：２：５：１）（Ｓｉｇｍａ  Ｐ１１５２），１％  ＤＭＳＯ、および５０ｎｇ  ｃ−Ａｂｌ酵素中で、アッセイした。Ｓｒｃキナーゼ（６０μｇ／ｍＬ）を、室温で１０分間、５０μＭ  ＡＴＰを用いてプレアクチベートし、キナーゼ阻害を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１μＣｉ／ａｓｓａｙ（＝３０μＬ）［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ、２０μＭ  ＡＴＰ、２５μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ  ４：１）、１％ＤＭＳＯ、および１０ｎｇ  ｃ−Ｓｒｃ酵素中で、測定した。
【０１６１】
ＫｄｒのＧＳＴ融合キナーゼドメイン、Ｆｌｔ−１のＧＳＴ融合キナーゼドメイン、ＦｌｋのＧＳＴ融合キナーゼドメイン、ＴｅｋのＧＳＴ融合キナーゼドメイン、ｃ−ＭｅｔのＧＳＴ融合キナーゼドメイン、およびｃ−ＫｉｔのＧＳＴ融合キナーゼドメインを、バキュロウイスル中で発現させ、グルタチオン−セファロースを介して精製した。キナーゼ阻害を、以前ＥＧＦ−Ｒについて記載したものと本質的に同様に、ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ  ４：１）のリン酸化における減少を検出することによって、測定した。各キナーゼを、ＰＫＩ１６６の存在下またはＰＫＩ１６６の非存在下で、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ〜３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、３ｍＭ〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２μＣｉ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ、１μＭ〜８μＭ  ＡＴＰ、３μｇ／ｍＬ〜８μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ  ４：１）、１％  ＤＭＳＯ中で、全量３０μＬにて最適緩衝液条件下で、１０分間、周囲温度でインキュベートした。反応を、２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを１０μＬ添加することで終結させ、その反応混合液を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＧ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に、移した。洗浄（０．５％  Ｈ３ＰＯ４）、エタノール中での浸漬、および乾燥の後、フィルタを、液体シンチレーションカウンター中で、計数した。ＰＫＩ１６６に関するＩＣ５０値を、阻害パーセントの線形回帰分析によって、計算した。Ｃｄｃ２／サイクリンＢタンパク質キナーゼの阻害（Ａｒｉｏｎら  １９８８；Ｐａｒｔａｎｅｎら  １９９１）およびＰＫＣの阻害（ＭｃＧｌｙｎｎら  １９９２ｂ）を、以前記載されたように、アッセイした。
【０１６２】
（動物および腫瘍細胞の同所移植）国立癌研究所−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ癌研究開発センター（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）の動物生産分野から、雄性無胸腺ヌードマウス（ＮＣｒ−ｎｕ）を購入した。アメリカ実験動物保護認定協会から認可された施設において、そして、米国農務省、米国保健福祉省、および国立衛生研究所における現今の規定および基準に従って、特定の病原菌非存在条件下で、このマウスをラミナーフローキャビネットに入れ、そして維持した。このマウスが８週齢から１２週齢の時、このマウスを、制度上のガイドラインに従って、使用した。
【０１６３】
（腫瘍細胞の同所移植）腫瘍を生成するために、Ｌ３．６ｐｌ細胞を、０．２５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡに手短に曝すことによって、サブコンフルエント培養物から採取した。トリプシン処理を、１０％ＦＢＳ含有培地を使用して、停止した。その細胞を、一度、無血清培地中で洗浄し、ＨＢＳＳ中に再懸濁した。９０％を超える生存度を有する単細胞からなる懸濁液のみを、注入に使用した。細胞を、以前記載したように、膵臓に注入した。マウスが瀕死となった時（５週間〜６週間）、このマウスを屠殺した。原発性膵臓腫瘍の大きさおよび重量、局所的（腹腔および大動脈）リンパ節転移の発生、および肝転移数を、記録した。組織病理学により、その疾患の性質を確認した。免疫組織化学的染色手順および組織学的染色手順のために、腫瘍組織の一部を、ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋した。腫瘍の別の部分を、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中に包埋し、液体窒素中で瞬間凍結し、−７０℃で保存した。
【０１６４】
（無胸腺ヌードマウス膵臓における樹立したヒト膵臓癌腫瘍増殖の治療）膵臓への腫瘍細胞の移植の７日間後、５匹のマウスを屠殺し、腫瘍病巣の存在を決定した。この時、平均腫瘍体積は、１８ｍｍ３だった。組織学的検査により、その病巣が活発して増殖している膵臓癌であることを、確認した。このマウスを、次のような処理グループ（ｎ＝１０）に無作為化した：ＰＫＩ１６６（１００ｍｇ／ｋｇ）を毎日経口投与、ゲムシタビン１２５ｍｇ／ｋｇを１週間に２回腹腔内注入、ＰＫＩ１６６（５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）を１０日間毎日経口投与、およびゲムシタビン（１２５ｍｇ／ｋｇ）を１週間に２回腹腔内注入。コントロールマウスに、ＰＫＩ１６６のための経口ビヒクル溶液（ＨＢＳＳ中で１：２０に希釈したＤＭＳＯ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０）を与え、そして、ＨＢＳＳを、腹腔内投与した。
【０１６５】
この治療実験を、全生存数を決定するために、繰り返した。そのようにするために、マウスの膵臓に、Ｌ３．６ｐｌ細胞を移植し、７日目に、この４つの処理グループ（ｎ＝５）に、無作為化した。このマウスが瀕死となった時、屠殺および剖検を行った。膵臓腫瘍の体積およびリンパ節転移の発生数および肝転移の発生数を、記録した。生存数を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって、評価した。
【０１６６】
本動物モデルにおいて、ゲムシタビンの治療的効果を評価するために、用量−応答予備実験を行った。腫瘍細胞（Ｌ３．６ｐｌ）を、膵臓に注入し、７日後、マウスのグループ（ｎ＝５）に、毎週２回、５００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、６２ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、１５．５ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを、腹腔内注入した。全マウスを、３５日目で屠殺した。腫瘍体積および転移発生数を、決定した。
【０１６７】
（剖検手順および組織学的研究）マウスを安楽死させ、その体重を測定した。膵臓中の原発性腫瘍を摘出し、重量を測定した。免疫組織化学的染色手順およびＨ＆Ｅ染色手順のために、その腫瘍組織の一部分を、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、その腫瘍組織の別の部分を、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中に包埋し、直ちに液体窒素中で凍結し、そして−７０℃で保存した。目に見える肝転移を、解剖顕微鏡を用いて計算し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理した。巨視的に腫脹した局所的（腹腔および大動脈）リンパ節を収集し、組織学によって、転移性疾患の存在を確認した。
【０１６８】
（ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＰＣＮＡ、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、およびＥＧＦ−Ｒの免疫組織化学的（ＩＨＣ）決定）パラフィン包埋組織を、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＥＧＦ−Ｒ、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の同定のために、使用した。切片（４μｍ〜６μｍ厚）を、正に荷電したＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）上に、固定し、一晩乾燥した。切片を、キシレン中でパラフィンから外し、続いて、一連のアルコール勾配（１００％エタノール／ｄｄＨ２Ｏ［ｖ／ｖ］、９５％エタノール／ｄｄＨ２Ｏ［ｖ／ｖ］、８０％エタノール／ｄｄＨ２Ｏ［ｖ／ｖ］）処理を行い、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中で、再水和した。ＰＣＮＡのために分析した切片を、「抗原賦活（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）」のために、５分間マイクロ波処理した（Ｓｈｉら  １９９１）。他のパラフィン包埋組織全てを、３７℃で１５分間、ペプシン（Ｂｉｏｍｅｄａ）処理し、ＰＢＳを用いて洗浄した。ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１および活性化ＥＧＦ−Ｒの同定のために使用した凍結組織を、切断し（８μｍ〜１０μｍ）、正に荷電したＰｌｕｓスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に固定し、３０分間風乾した。凍結切片を、冷アセトン中（５分）、アセトン／クロロホルム（ｖ／ｖ）中（５分）、およびアセトン中（５分）に固定し、ＰＢＳを用いて洗浄した。免疫組織化学的手順を、以前記載されたように行った（Ｒａｋら  １９９６）。陽性反応を、安定な３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）とともにこのサンプルを１０分〜２０分間インキュベートすることによって、またはＣＤ３１染色後に、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）とサンプルをインキュベートすることによって、可視化した。この切片を蒸留水ですすぎ、Ｇｉｌｌのヘマトキシリンで１分間、対比染色し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｏｕｎｔ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に封入した。二次抗体のみに曝したコントロールサンプルは、特異的染色を示さなかった。活性化ＥＧＦ−Ｒについて分析した切片を、一次抗体とインキュベートする前に、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２断片（ＰＢＳで１：１０に希釈）を用いて、４時間〜６時間、前処理した。ＤＡＢとインキュベートした後、活性化ＥＧＦ−Ｒについて染色した後の陽性反応を、ｄｄＨ２Ｏで１：１０００に希釈した四酸化オスミウム（４％水溶液）を使用して、増強した。
【０１６９】
（ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１（内皮細胞）およびＴＵＮＥＬ（アポトーシス細胞）に対する免疫蛍光二重染色）凍結組織を切片化し（８μｍ〜１０μｍ）、正に荷電したスライドガラスに固定し、３０分間風乾し、冷アセトン中に５分間、アセトン＋クロロホルム（１：１）中に５分間、およびアセトン中に５分間、固定した。サンプルを、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中に５％正常ウマ血清および１％正常ヤギ血清を含有するタンパク質ブロッキング溶液とともに、室温で２０分間、インキュベートし、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体（ヒト交差反応性）の適切な希釈液（１：４００）と、４℃で１８時間をかけてインキュベートした。このサンプルを、ＰＢＳを用いて各３分間４回洗浄した後、スライドガラスを、テキサスレッド結合体化二次ヤギ抗ラットの適切な希釈液（１：２００）と、暗中で、室温で１時間インキュベートした。サンプルを、０．１％Ｂｒｉｊ含有ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで５分間洗浄した。
【０１７０】
ＴＵＮＥＬを、次のように改変した市販のアポトーシス検出キットを使用して、行った：サンプルを４％パラホルムアルデヒド（メタノールフリー）を使用して、室温で１０分間固定し、ＰＢＳを用いて、５分間２回洗浄し、その後、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と、室温で１５分間インキュベートした。ＰＢＳを使用した各々５分間の２回の洗浄の後、そのサンプルを、室温で１０分間、平衡緩衝液（キットから）とインキュベートした。その平衡緩衝液を排出し、平衡緩衝液と、核酸ミックスと、ＴｄＴ酵素とを含む反応緩衝液を、組織切片へ添加し、暗中で１時間、３７℃で、加湿雰囲気中でインキュベートした。その反応を、２×ＳＳＣ中でサンプルを１５分間、浸漬することによって、終結した。取り込まれていない蛍光ｄＵＴＰを除去するために、サンプルを５分間、３回洗浄した。内皮細胞の定量のために、そのサンプルを、Ｈｏｅｃｈｓｔステイン３００μｇ／ｍＬと、室温で１０分間インキュベートした。増強試薬（Ｐｒｏｌｏｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でスライドガラスを処理することによって、蛍光の退色を、最小限におさえた。免疫蛍光鏡検を、緑色、赤色、および青色の蛍光を個々に選択するために、フィルタホイール（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，ＮＹ）中に取り付けた狭帯域励起フィルタを装備した落射蛍光顕微鏡の、４０×対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ  Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ）を使用することによって、行った。画像を、冷却式ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）およびマッキントッシュコンピューターのＳｍａｒｔＣａｐｔｕｒｅソフトウェア（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、取り込んだ。画像を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、さらに加工した。内皮細胞を、赤色蛍光によって同定し、ＤＮＡ断片化を、アポトーシス細胞の細胞核内に局在する緑色蛍光および黄色蛍光によって、検出した。アポトーシスを引き起こした内皮細胞の定量を、４００倍の倍率での５〜１０個の無作為な０．０１１ｍｍ２視野における、アポトーシスを引き起こした内皮細胞と全内皮細胞数との比率の平均として、表現した。全ＴＵＮＥＬ発現の定量のために、アポトーシス発生数を、１００倍の倍率での１０個の無作為な０．１５９ｍｍ２視野において、計数した。
【０１７１】
（微小血管密度（ＭＶＤ）、ＰＣＮＡおよび光学密度（ＯＤ）の定量化）
ＭＶＤを定量するために、１０個の無作為な０．１５９ｍｍ２の視野（１００×倍率）を各腫瘍について得、そして微小血管を上記の方法に従って定量した。免疫組織化学的反応強度を定量するために、処置した腫瘍組織の１０個の無作為な０．０３９ｍｍ２の視野（２００×倍率）において１００のＶＥＧＦポジティブ細胞およびＩＬ−８ポジティブ細胞のＯＤを、Ｏｐｔｉｍａｓ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて測定した。このサンプルは対比染色しなかったので、ＯＤはＩＨＣ反応の生成物のみに起因した。ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の細胞質免疫反応性を、コンピューター補助画像分析により評価し、正常膵臓腺の発現に対する腫瘍細胞の発現に１００を乗じて表わした（Ｙｏｎｅｄａら、１９９８；Ｒａｄｉｎｓｋｙら、１９９５）。ＰＣＮＡの発現を定量するために、１０個の無作為な０．１５９ｍｍ２の視野（１００×倍率）においてポジティブ細胞数を数えた。
【０１７２】
（インビトロでの細胞傷害性分析）
全てのアッセイにおいて、７００〜１０００個の腫瘍細胞を、平底の９６ウェルプレートの３８ｍｍ２ウェル中に４連で播種し、一晩接着させた。次いでこの培養物を洗浄し、培地（ネガティブコントロール）あるいはゲムシタビンを有するかまたは有さないＰＫＩ１６６含有培地で置換（ｒｅｆ）した。６日後（コントロール培養物はコンフルエンスに達しなかった）、代謝的に活性な細胞数をＭＴＴアッセイにより決定した（Ｆａｎら、１９９２）。０．４２ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む培地での２〜４時間のインキュベーション後、この細胞をＤＭＳＯ中に溶解した。代謝的に生存する細胞によるＭＴＴのホルマザンへの転換を、ＭＲ−５０００  ９６ウェルマイクロタイタープレートリーダーで５７０ｎｍにてモニターした（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）。増殖阻害を以下の式から計算した：
細胞分裂停止（％）＝［１−（Ａ／Ｂ）］×１００、
ここで、Ａは処置した細胞の吸光度であり、そしてＢはコントロール細胞の吸光度である。
【０１７３】
（ＰＫＩ１６６を用いた処置後のＥＧＦ−Ｒ自己リン酸化のウエスタンブロット分析）
血清を飢餓させたＬ３．６ｐｌ細胞を、ＰＫＩ１６６（０．０１μＭ、０．０５μＭおよび０．５μＭ）で６０分間処置し、次いで４０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦを有するかまたは有さないで１０分間インキュベートし、洗浄し、そして５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  Ｎａ  オルトバナデート（Ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ）を含有するＰＢＳ中で粉砕し、遠心分離した。ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、２０μＭ  ロイペプチンおよび０．１５Ｕ／ｍｌ  アプロチニン）に再懸濁し、超音波処理し、そして遠心分離して不溶性タンパク質を回収した。免疫沈降を、前述のようにＭａｂ抗ＥＧＦ−Ｒ（クローンＥＧＦ−ＲＩ）を用いて実施した（Ｐｅｒｒｏｔｔｅら、１９９９；Ｐａｒｋｅｒら、１９９８）。免疫沈降物を、７．５％  ＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥで分析し、０．４５μｍのニトロセルロース膜上に転写した。このフィルターをＴＤＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中３％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、ＴＴＢＳ（ＴＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中のポリクローナルヒツジ抗ヒトＥＧＦ−Ｒ（１：１０００）またはモノクローナル抗ホスホチロシン（Ｍａｂ  ４Ｇ１０）（１：２０００）のいずれかを用いてプローブし、そしてＴＴＢＳ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ヒツジＩｇＧ（１：２０００）（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはヒツジ抗マウスＩｇＧ（１：２０００）をそれぞれ用いてインキュベートした。タンパク質のバンドをＥＣＬ検出システムにより可視化した。さらなる実験のために、血清を飢餓させたＬ３．６ｐｌ細胞を、ＰＫＩ１６６（０．０５μＭ、０．５μＭ）を有するかまたは有さずにゲムシタビン（１０ｎＭ）で１時間処置し、次いでｒｈＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）を有するかまたは有さずに１０分間インキュベートした。次いでウエスタンブロット分析を実施した。
【０１７４】
（インビトロでのＶＥＧＦおよびＩＬ−８の発現）
Ｌ３．６ｐｌ細胞（２０００細胞／３８ｍｍ２ウェル）を、５％ＦＢＳを含有する２００μｌの補充ＤＭＥＭ中で９６ウェルプレートに２４時間プレートし、次いで、０．０５μＭ、０．５μＭまたは１μＭのＰＫＩ１６６で処理した。補充ＤＭＥＭ（５％  ＦＢＳ）およびヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）は、コントロールとして作用した。７２時間後、この培養物の上清を回収し、（細胞数について補正した）ＶＥＧＦおよびＩＬ−８のタンパク質レベルをＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットによって決定した。
【０１７５】
（統計分析）
膵臓腫瘍体積、転移の発生率、ＶＥＧＦ、ＬＩ−８の発現、ＰＣＮＡ、ＴＵＮＥＬ、ＣＤ３１の定量化、および内皮細胞のアポトーシスの割合を、独立スチューデントｔ検定により比較した。生存分析を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により算出し、ロングランクテストにより比較した。
【０１７６】
（結果）
（インビトロでのタンパク質キナーゼの阻害についての選択性）
ピロロ−ピリミジンクラスの新規ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼインヒビターである、ＰＫＩ１６６（４−（Ｒ）−フェネチルアミノ−６−（４−ヒドロキシ）フェニル−７Ｈ−ピロロ［２．３−ｄ］−ピリミジン）は、０．７ｎＭのＩＣ５０値でＥＧＦ−Ｒキナーゼの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を阻害する（表２）。酵素反応速度研究は、ＰＫＩ１６６がＡＴＰ競合阻害によってＥＧＦ−Ｒキナーゼに影響を与えるという見解を支持する。ＰＫＩ１６６は、セリン／スレオニンキナーゼＰＫＣ−αおよびＣｄｃ２／サイクリンＢの阻害に関連して＞３０００の高い選択性の比を示した。他のチロシンキナーゼに関して、ＰＫＩ１６６はまた、ｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼ（ＩＣ５０＝２８ｎＭ）に対して活性であり、ｃ−Ｓｒｃ（ＩＣ５０＝１３０ｎＭ）、ＶＥＧＦレセプターファミリーチロシンキナーゼＫＤＲ（ＩＣ５０＝３２７ｎＭ）およびＦｌｔ−１（ＩＣ５０＝９６２ｎＭ）に対して幾分活性を示した。しかし、ＥＧＦ−Ｒ  ＩＣＤの阻害について＞４０の選択的因数が存在した（Ｔｒａｘｌｅｒら、１９９９）。マウスに対する１００ｍｇ／ｋｇの単回経口投与後、ＰＫＩ１６６は迅速に吸収され（ｔ  ｍａｘ＝１時間）、そして高濃度のＰＫＩ１６６は、血漿（Ｃ  ｍａｘ＝３２．８μＭ）および皮下のＡ４３１腫瘍（Ｃ  ｍａｘ＝５３．０μＭ）において検出される。無変化のＰＫＩ１６６の持続したレベルは、経口投与の８時間後までにマウスの血漿において見出される（Ｔｒａｘｌｅｒら、１９９９）。
【０１７７】
（表２）
ＰＫ１１６６ａによる酵素活性の相対的阻害
【０１７８】
【表２】
2004529315.tif 000006
ａ詳細な説明は「材料および方法」に見出される
（表５）
コントロールおよび処置したヌードマウスの膵臓におけるヒト膵臓癌腫の免疫組織化学的分析
【０１７９】
【表３】
2004529315.tif 000007
ａＬ３．６ｐｌヒト膵臓癌細胞（１×１０６）を、ヌードマウスの膵臓に注射した。７日後、マウスの群を、１週間に２回のゲムシタビン（１２５ｍｇ／ｋｇ）単独の腹腔内注射、毎日のＰＫ１１６６（１００ｍｇ／ｋｇ）単独、ゲムシタビンおよびＰＫ１１６６、または生理食塩水（コントロール）の経口摂取で処置した。全てのマウスを３５日目に屠殺した。
ｂ平均±ＳＤのポジティブ細胞／視野を、１０個の無作為な０．１５９ｍｍ２の視野（×１００）の測定から決定した。
ｃ平均±ＳＤの吸光度を、「材料および方法」に記載のように決定した。
ｄ１０個の無作為な０．００１１ｍｍ２の視野（×４００）における平均±ＳＤのＣＤ３１／ＴＵＮＥＬポジティブ細胞。蛍光二重標識を、凍結組織切片で実行した。
ｅコントロールと比較して、Ｐ＜０．００１。
【０１８０】
（表４）
（ＰＫ１１６６およびゲムシタビンを用いる治療によるヒト膵臓癌腫を有するヌードマウスの生存）
【０１８１】
【表４】
2004529315.tif 000008
ａヌードマウスは、膵臓に、１×１０６個のＬ３．６ｐｌ細胞の注射を受けた。７日後、マウスの群を、１週間に２回のゲムシタビン（１２５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射、毎日のＰＫ１１６６（５０ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビンおよびＰＫ１１６６、または生理食塩水（コントロール）の経口摂取で処置した。瀕死のマウスを屠殺し、剖検した。
ｂ腫瘍ポジティブマウス／注射を受けたマウス。
ｃ他の群のマウスと比較して、Ｐ＜０．０００１。
【０１８２】
（表３）
（ヌードマウスの膵臓におけるヒト膵臓癌腫増殖の処置）
【０１８３】
【表５】
2004529315.tif 000009
ａＬ３．６ｐｌヒト膵臓癌細胞（１×１０６）をヌードマウスの膵臓に注射した。７日後、マウスの群を、１週間に２回のゲムシタビン（１２５ｍｇ／ｋｇ）単独の腹腔内注射、毎日のＰＫ１１６６（１００ｍｇ／ｋｇ）単独、ゲムシタビンおよびＰＫ１１６６、または生理食塩水（コントロール）の経口摂取で処置した。全てのマウスを３５日目に屠殺した。
ｂポジティブマウスの数／注射を受けたマウスの数。
ｃコントロールに対して、Ｐ＜０．００１。
ｄ全ての他の群に対して、Ｐ＜０．００１。
【０１８４】
（ＰＫＩ１６６によるヒト膵臓癌細胞におけるＥＧＦ−Ｒ自己リン酸化の阻害）
第１セットの実験において、ＰＫＩ１６６を用いてＥＧＦ−ＲのＥＧＦ刺激チロシンリン酸化を阻害するＬ３．６ｐｌ細胞の処置の能力を決定した。血清を含んでいないがＥＧＦを含有する培地を用いて１５分間インキュベートしたＬ３．６ｐｌ細胞は、抗ＥＧＦ−Ｒ免疫沈降した細胞溶解物のウエスタンブロット上で抗ホスホチロシン抗血清により検出されるように、高レベルの自己リン酸化ＥＧＦ−Ｒ（１７０ｋＤａのバンド）を示した。ＰＫＩ１６６で６０分間にわたって前処置し、続いてＥＧＦで１５分間処置した細胞は、用量（０．０１〜０．５μＭ）に依存する様式で自己リン酸化を阻害した。１７０ｋＤａのバンドを、抗ＥＧＦ−Ｒ抗血清を用いるウエスタンブロット分析により、ＥＧＦ−Ｒとして確認した。ノーザンブロット分析は、Ｌ３．６ｐｌ細胞における高レベルのＥＧＦ−Ｒ特異的転写物が処置に応じて変化しなかったことを実証した。１０μＭのゲムシタビン濃度は、ＥＧＦ−Ｒの自己リン酸化に影響を与えなかった（データは示していない）。
【０１８５】
（ゲムシタビンおよびＰＫＩ１６６によって媒介されるインビトロでの細胞傷害性）
Ｌ３．６ｐｌ細胞を、ＰＫＩ１６６の非傷害性濃度（０．０３μＭ）の非存在下または存在下において、ゲムシタビンの漸増濃度（０〜１０μＭ）を含有する培地中で６日間にわたってインキュベートした。ゲムシタビンによって媒介される細胞傷害性は、ＰＫＩ１６６によって増強され、ＰＫＩ１６６の存在下でゲムシタビンについてのＩＣ５０が０．８８μＭから０．５２μＭに減少した（Ｐ＜０．０５）。
【０１８６】
（膵臓癌の増殖および転移の阻害）
胸腺欠損ヌードマウスの膵臓に、Ｌ３．６ｐｌ細胞を注射した。７日後、このマウスを４つの処置群（各１０匹のマウス）に無作為化した。第１群にゲムシタビン（１２５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を１週間に２回与え、第２群にＰＫＩ１６６（１００ｍｇ／ｋｇ）の経口投与を毎日与え、第３群に１週間に２回のゲムシタビンおよび毎日のＰＫＩ１６６を与え、そして最後の群にＨＢＳＳをコントロールとして与えた。コントロールのマウスが瀕死になったので、３５日目に全てのマウスを屠殺した。詳細な剖検は、全てのマウスが膵臓に腫瘍を有することを示した。表３にまとめられたこのデータは、毎日の経口ＰＫＩ１６６および１週間に２回のゲムシタビン腹腔内注射が、コントロールマウスと比較して腫瘍体積の中央値を優位に減少させたことを示す（それぞれ、２２０ｍｍ３、１６６ｍｍ３および３９９ｍｍ３；ｐ＜０．０１）。ゲムシタビンおよびＰＫＩ１６６の組み合わせは、膵臓における腫瘍体積の中間値をなおさらに減少させる（５９ｍｍ３；ｐ＜０．０００１）。可視の肝臓転移（解剖顕微鏡の補助で数えた）は、コントロールマウスの３０％および処置群の１０％に存在した（表３）。組織学的にポジティブな局所的リンパ節転移は、コントロール動物の９０％、ゲムシタビン処置動物の９０％およびＰＫＩ１６６処置動物の９０％において見い出された。しかし、ゲムシタビンおよびＰＫＩ１６６の両方を受けた動物の６０％のみが、組織学的にポジティブな局所的リンパ節転移を有した（表３）。ＰＫＩ１６６単独またはゲムシタビンとの組み合わせでの処置は、体重の維持によって決定されるように、十分に許容された（表３）。
【０１８７】
第２の生存研究について、この群のサイズを１５匹のマウスに増加した。マウスが瀕死になったときにマウスを屠殺し、剖検し、そして表４にデータをまとめた。コントロール群における生存時間の中央値は３７日であった。ゲムシタビン単独、ＰＫＩ１６６単独、および併用治療で処置した後、生存時間の中央値はそれぞれ５６日、７０日および７５日であった（コントロール対ゲムシタビン、ｐ＜０．００００２；コントロール対ＰＫＩ１６６、ｐ＜０．０００００１；コントロール対ＰＫＩ１６６およびゲムシタビン、ｐ＜０．００００１）。詳細な剖検は、全てのコントロールマウスまたはゲムシタビン単独もしくはＰＫＩ１６６単独で処置したマウスは膵臓癌を有するが、併用レジメンを受けたマウスは腫瘍発生率が７５％であったことを示した。コントロールマウス、ゲムシタビン単独またはＰＫＩ１６６単独で処置したマウスにおける肝臓転移の発生率は、それぞれ７／１５、１１／１５および５／１５であるが、ＰＫＩ１６６およびゲムシタビンで処置したマウスは可視の肝臓転移は有さなかった（ｐ＜０．０００１）。組織学的に確認されたリンパ節転移の発生率は、コントロールマウス、ゲムシタビン処置またはＰＫＩ１６６処置したマウスについて、それぞれ、１４／１５、１３／１５および１０／１５であったが、併用レジメンを与えたマウスでは、この発生率は４／１５（ｐ＜０．０１）であった。ゲムシタビンの２５０ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの漸増用量は、本研究において使用された１２５ｍｇ／ｋｇの用量と比較して、膵臓の腫瘍の増殖および転移をさらに減少しなかった（データーは示していない）。
【０１８８】
（組織学的分析および免疫学的分析）
異なる群から得た腫瘍を、慣用的な組織学的分析および免疫学的分析について処理した。ゲムシタビンおよびＰＫＩ１６６で処置したマウスに由来する腫瘍は、壊死領域を有し、そして多くの浸潤細胞を含んでいた。特異的な抗ＥＧＦ−Ｒ抗体およびチロシンリン酸化（活性化）ＥＧＦ−Ｒに対して特異的な抗体を用いる免疫組織化学は、全ての処置群由来の腫瘍が同レベルのＥＧＦ−Ｒを発現したが、コントロールマウスまたはゲムシタビンで処置したマウス由来の腫瘍のみが活性化ＥＧＦ−Ｒについてポジティブに染色されたことを実証した。
【０１８９】
細胞増殖およびアポトーシスを、それぞれ、抗ＰＣＮＡ抗体およびＴＵＮＥＬ法を使用して、評価した。コントロール腫瘍中のＰＣＮＡ陽性腫瘍細胞の平均数は、２３７±３９であった。ゲムシタビンまたはＰＫＩ１６６を用いた治療の後、これは、それぞれ、２３７±６６または１８５±３３であった（表５）。最低数のＰＣＮＡ陽性細胞（１３０±４５）は、ゲムシタビンおよびＰＫＩ１６６の両方を用いて処置されたマウスの腫瘍において見出された（Ｐ＜０．００１）。
【０１９０】
ＴＵＮＥＬ陽性細胞の平均数は、ＰＣＮＡ陽性と反比例の関係であった。コントロール腫瘍において、これは、６６±２１であり、ゲムシタビン処置腫瘍において、これは、２２５±９５であり、ＰＫＩ１６６処置腫瘍において、これは、２８７±８４であり、そして併用処置腫瘍においては、これは、２９８±８０であった（コントロール対ゲムシタビン、Ｐ＜０．０４；コントロール対ＰＫＩ１６６、Ｐ＜０．００３；コントロール対ＰＫＩ１６６＋ゲムシタビン、Ｐ＜０．００１）。併用療法群の腫瘍と比較して、ゲムシタビン単独またはＰＫＩ１６６単独で処置した腫瘍中のＴＵＮＥＬ陽性腫瘍細胞の数に、有意差は存在しなかった。ＴＵＮＥＬ陽性細胞に対するＰＣＮＡ陽性細胞の計算された比は、ゲムシタビン単独、ＰＫＩ１６６単独、併用療法で処置されたマウス、およびコントロールマウスにおいて、ぞれぞれ、１．１、０．６４、０．４３および３．６１であった。
【０１９１】
ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の腫瘍細胞生成は、ゲムシタビン単独またはコントロールマウスと比較して、ＰＫＩ１６６またはＰＫＩ１６６およびゲムシタビンを用いた処置の開始の３５日後に、有意に減少した（Ｐ＜０．００１）（表５）。ＰＫＩ１６６によるＥＧＦ−Ｒシグナル伝達経路の遮断が、Ｌ３．６ｐｌ細胞によるＶＥＧＦおよびＩＬ−８の発現を下方調節したか否かを決定するために、細胞をウェルにプレートし、そして、５％ＦＢＳを補充され、１μＭ  ＰＫＩ１６６または１０ｎＭ  ゲムシタビンを含むかまたは含まない培地中で、これらの細胞を７２時間インキュベートした。培養物上清を収集して、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８のタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。コントロール細胞は、１４００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび１４００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−８を生成した。ゲムシタビン処置した細胞は、１２８０ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび２０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−８を生成した。ＰＫＩ１６６処置された細胞は、１８０ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｐ＜０．００１）および６４０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−８（Ｐ＜０．０１）を生成した。従って、ＥＧＦ−Ｒシグナル伝達経路の遮断は、２つの重要なプロ脈管形成（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）分子の生成を減少させた。ｂＦＧＦタンパク質の発現については、効果は見出されなかった（データ示さず）。
【０１９２】
ＭＶＤ（ＣＤ３１に対する抗体を用いて染色することによって測定される）は、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８の発現に正比例した。すなわち、コントロール腫瘍（６０±２３）またはゲムシタビン処置した腫瘍（５２±１８）と比較して、ＰＫＩ１６６（２４±１８）または併用療法（２４±１３）での処置後の、一視野当たりの腫瘍ＭＶＤの有意な減少（コントロール対ＰＫＩ１６６、Ｐ＜０．０００５；コントロール対ＰＫＩ１６６およびゲムシタビン、Ｐ＜０．０００２）（表５）が観察された。併用療法後の腫瘍と比較して、ＰＫＩ１６６単独で処置した腫瘍のＭＶＤには、有意差は存在しなかった。
【０１９３】
最後に、ＣＤ３１／ＴＵＮＥＬ蛍光二重標識技術は、ＰＫＩ１６６または併用療法で処置した腫瘍中の多くの内皮細胞が、アポトーシスを経たことを明らかにした。総内皮細胞に対するアポトーシス内皮細胞の割合の有意な増加は、コントロール腫瘍またはゲムシタビン処置した腫瘍と比較して、ＰＫＩ１６６（２０±１５）またはＰＫＩ１６６＋ゲムシタビン（３１±２０）での処置の開始２３日後に回収した膵臓腫瘍において見出された（Ｐ＜０．００１）（表５）。
【０１９４】
（実施例３）
（新生物および毛包における、活性化ＥＧＦ−Ｒの平行発現）
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、ＵＶ−２２３７線維肉腫細胞を皮下注射した。移植の７日後、マウスに、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのＰＫＩ１６６、５０ｍｇ／ｋｇのＰＫＩ１６６および１００ｍｇ／ｋｇのＰＫＩ１６６の週に３回の経口投与を与えた。マウスを、処置の１５日後（６回の経口投与）（すなわち、最後の経口投与の１日後）に屠殺した。
【０１９５】
腫瘍を回収し、そして免疫組織化学のために処理した。対側性の背部の皮膚および毛を切り出し、そして免疫組織化学のために調製した。腫瘍および皮膚／毛サンプルを切断し、ＥＧＦ−Ｒに対する抗体およびリン酸化（活性化）ＥＧＦ−Ｒに対する抗体を用いて染色した。結果を図８に示す。
【０１９６】
治療に関わらず、全ての腫瘍サンプルおよび全ての皮膚／毛包サンプルは、ＥＧＦ−Ｒについて陽性であった。１０ｍｇ／ｋｇのＰＫＩ１６６を用いた経口治療は、腫瘍または皮膚／毛包中の活性化ＥＧＦ−Ｒの発現を減少させなかった。５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＰＫＩ１６６を用いた経口処置は、腫瘍および皮膚／毛包の両方においてＥＧＦ−Ｒのリン酸化を阻害した。
【０１９７】
従って、皮膚／毛包のリン酸化ＥＧＦ−Ｒの発現は、腫瘍のリン酸化ＥＧＦ−Ｒの発現と平行する。従って、皮膚／毛包におけるリン酸化ＥＧＦ−Ｒの決定は、腫瘍の代理として働き得る。
【０１９８】
本明細書中で開示および特許請求される組成物および／方法の全ては、本発明の開示の教示の下で、過度の実験なしになされ得、そして実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法の工程または一連の工程において、バリエーションが、この組成物および／方法に適用され得ることが、当業者に明らかである。より具体的には、化学的および物理的の両方で関連する特定の薬剤が、本明細書中に記載の薬剤を置換して、なお同じまたは類似の結果を達成し得ることが明らかである。当業者に明らかである、全てのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような、本発明の精神、範囲および概念内であると考えられる。
【０１９９】
（ＶＩＩＩ．参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中に示される詳細を補充する例示的手順の詳細または他の詳細を提供する程度まで、本明細書中で参考として具体的に援用される。
【０２００】
【表６】
2004529315.tif 000010
2004529315.tif 000011
2004529315.tif 000012
2004529315.tif 000013
2004529315.tif 000014
2004529315.tif 000015
2004529315.tif 000016
2004529315.tif 000017
【図面の簡単な説明】
次の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある局面をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書中で示される具体的な実施形態の詳細な記載と共に一つ以上のこれらの図面を参照することにより、より良く理解され得る。
【図１】
図１は、一つの毛包における核の位置を示し、ここで、毛球は完全には除去されていないが、その真上にある外側の包皮は、インタクトである。
【図２】
図２は、活性化（リン酸化）ＥＧＦ−Ｒを染色した様々な毛包を示す。
【図３】
図３は、外側の毛根包皮に侵入する一次抗体と二次抗体両方を示す。
【図４】
図４は、抗体を用いて染色された毛包の横断側面図を示す。
【図５】
図５は、抗リン酸化ＥＧＦ−Ｒ抗体およびＡｌｅｘａ５９４抗マウスＩｇを用いて染色された毛包の横断側面図を描写する。
【図６】
図６は、抗リン酸化ＥＧＦ−Ｒ、次いでＧｏｌｄｅｎｈａｎｃｅを用いて高められた金標識抗マウスＩｇＧとインキュベートされた毛包の後方散乱走査電子顕微鏡観察部分である。
【図７】
図７は、内側の毛根包皮と比較して高濃度の外側の毛根包皮における金粒子を示す、図６よりも高倍率での毛包の後方散乱走査電子顕微鏡観察部分である。
【図８】
図８は、新生物および毛包における活性化ＥＧＦ−Ｒの平行な発現レベルである。腫瘍および皮膚／毛髪サンプルは、切断され、ＥＧＦ−Ｒに対する抗体およびリン酸化（活性化）ＥＧＦ−Ｒに対する抗体を用いて染色された。
【図２】
2004529315.tif 000018
【図３】
2004529315.tif 000019
【図４】
2004529315.tif 000020
【図５】
2004529315.tif 000021
【図６】
2004529315.tif 000022
【図７】
2004529315.tif 000023
【図８】
2004529315.tif 000024
【国際公開パンフレット】
2004529315.tif 000025
2004529315.tif 000026
2004529315.tif 000027
2004529315.tif 000028
2004529315.tif 000029
2004529315.tif 000030
2004529315.tif 000031
2004529315.tif 000032
2004529315.tif 000033
2004529315.tif 000034
2004529315.tif 000035
2004529315.tif 000036
2004529315.tif 000037
2004529315.tif 000038
2004529315.tif 000039
2004529315.tif 000040
2004529315.tif 000041
2004529315.tif 000042
2004529315.tif 000043
2004529315.tif 000044
2004529315.tif 000045
2004529315.tif 000046
2004529315.tif 000047
2004529315.tif 000048
2004529315.tif 000049
2004529315.tif 000050
2004529315.tif 000051
2004529315.tif 000052
2004529315.tif 000053
2004529315.tif 000054
2004529315.tif 000055
2004529315.tif 000056
2004529315.tif 000057
2004529315.tif 000058
2004529315.tif 000059
2004529315.tif 000060
2004529315.tif 000061
2004529315.tif 000062
2004529315.tif 000063
2004529315.tif 000064
2004529315.tif 000065
2004529315.tif 000066
2004529315.tif 000067
2004529315.tif 000068
2004529315.tif 000069
2004529315.tif 000070
2004529315.tif 000071
2004529315.tif 000072
2004529315.tif 000073
2004529315.tif 000074
2004529315.tif 000075
2004529315.tif 000076
2004529315.tif 000077
2004529315.tif 000078
2004529315.tif 000079
2004529315.tif 000080
2004529315.tif 000081
2004529315.tif 000082
2004529315.tif 000083
2004529315.tif 000084
2004529315.tif 000085
2004529315.tif 000086
2004529315.tif 000087
2004529315.tif 000088
2004529315.tif 000089
2004529315.tif 000090
2004529315.tif 000091
2004529315.tif 000092
2004529315.tif 000093
2004529315.tif 000094
2004529315.tif 000095
2004529315.tif 000096
2004529315.tif 000097
2004529315.tif 000098
2004529315.tif 000099
2004529315.tif 000100
2004529315.tif 000101
2004529315.tif 000102
2004529315.tif 000103
2004529315.tif 000104
2004529315.tif 000105
2004529315.tif 000106
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529315.tif 000107
【国際調査報告】
2004529315.tif 000108
2004529315.tif 000109
2004529315.tif 000110
2004529315.tif 000111
2004529315.tif 000112