(57)【要約】本発明は、化学組成物の毒性を同定および分類するための方法およびシステム、ならびに新規な組成物を毒性についてスクリーニングするための方法およびシステムを提供する。本発明は、遺伝子発現またはタンパク質発現における変化を検出する工程を包含し、それによって、毒性が既知もしくは未知の種々の化学組成物と接触させた、単離された哺乳動物ＬＳＣにおける分子プロフィールを確立し、そして化学組成物の毒性と分子プロフィールとを相関させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学組成物の分子プロフィールを作成する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）哺乳動物肝臓幹細胞（ＬＳＣ）の単離された集団を、該化学組成物と接触させる工程；および
ｂ）該化学組成物に応答した該哺乳動物ＬＳＣにおける遺伝子発現またはタンパク質発現の変化を記録し、該化学組成物の分子プロフィールを作成する工程、を包含する方法。
【請求項２】
所定の毒性を有する化学組成物の分子プロフィールのライブラリーを編集する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）哺乳動物肝臓幹細胞（ＬＳＣ）の単離された集団を、所定の毒性を有する化学組成物と接触させる工程；
ｂ）該化学組成物に応答した該哺乳動物ＬＳＣにおける遺伝子発現またはタンパク質発現の変化を記録し、該化学組成物の分子プロフィールを作成する工程；および
ｃ）所定の毒性を有する、少なくとも２つの化学組成物を用いて、工程ａ）および工程ｂ）を繰り返すことによって、分子プロフィールのライブラリーを編集する工程、
を包含する方法。
【請求項３】
遺伝子発現またはタンパク質発現の前記変化が、標識によって検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識が、蛍光、比色、放射性、酵素、酵素基質、ヌクレオシドアナログ、磁気、ガラス、ラテックスビーズ、金コロイド、および電気的トランスポンダーからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分子プロフィールが、遺伝子発現の変化を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現の前記変化が、ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイによって検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分子プロフィールが、タンパク質発現の変化を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質発現の前記変化が、免疫活性アッセイによって検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質発現の前記変化が、質量分析アッセイに検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＳＣが、ヒトのＬＳＣである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、治療剤、神経毒、腎臓毒、肝臓毒、造血細胞の毒、および筋肉毒からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、１つ以上の生殖器官の細胞に対して毒性である薬剤、催奇性薬剤および発癌物質からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、農薬、化粧品、および環境汚染物質からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＳＣが、非ヒト哺乳動物のＬＳＣである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、動物治療剤、神経毒、腎臓毒、肝臓毒、造血細胞の毒、および筋肉毒からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、１つ以上の生殖器官の細胞に対して毒性である薬剤、催奇性薬剤および発癌物質からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、農薬、化粧品、および環境汚染物質からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
請求項２、１０〜１８のいずれか１項に記載の方法によって作製される、所定の毒性を有する化学組成物の分子プロフィールのライブラリー。
【請求項２０】
前記ライブラリーが、少なくとも２０個の化学組成物についての分子プロフィールを含む、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２１】
試験化学組成物の毒性を分類する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）請求項１に従って、該試験化学組成物の分子プロフィールを作成する工程；および
ｂ）工程ａ）における分子プロフィールを、所定の毒性を有する化学組成物の分子プロフィールと比較する工程、
を包含し、
ここで、該試験化学組成物の毒性の分類が、工程ｂ）における比較によって決定される、方法。
【請求項２２】
試験化学化学組成物の毒性を分類する体系的な方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）請求項１に従って、該試験化学組成物の分子プロフィールを作成する工程；および
ｂ）工程ａ）における分子プロフィールを、所定の毒性を有する化学組成物の分子プロフィールの複合ライブラリーと比較する工程であって、ここで、該複合ライブラリーが、少なくとも２つの化学組成物の分子プロフィールを含み、該分子プロフィールが、請求項１に従って作成される、工程、
を包含し、
ここで、該試験化学組成物の毒性の分類が、工程ｂ）における比較によって決定される、方法。
【請求項２３】
試験化学組成物の毒性を順位付けする方法であって、該方法は以下：
ａ）請求項１に従って、該試験化学組成物の分子プロフィールを作成する工程；および
ｂ）工程ａ）における分子プロフィールを、所定の毒性を有する化学組成物の分子プロフィールの複合ライブラリーと比較する工程であって、ここで、該複合ライブラリーが、少なくとも２つの化学組成物の分子プロフィールを含み、該分子プロフィールが、請求項１に従って作成される工程、
を包含し、
ここで、該試験化学組成物の毒性が、工程ｂ）における比較によって順位付けされる、方法。
【請求項２４】
前記試験化学組成物が、既知または未知である、請求項２１〜２３に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、前記ＬＳＣが、ヒトのＬＳＣである、請求項２１〜２３に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、治療剤、神経毒、腎臓毒、肝臓毒、造血細胞の毒、または筋肉毒である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、１つ以上の生殖器官の細胞に対して毒性である薬剤、催奇性薬剤および発癌物質からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、農薬、化粧品、および環境汚染物質からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＬＳＣが、非ヒト哺乳動物のＬＳＣである、請求項２１〜２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、動物治療剤、神経毒、腎臓毒、肝臓毒、造血細胞の毒、および筋肉毒からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、１つ以上の生殖器官の細胞に対して毒性である薬剤、催奇性薬剤および発癌物質からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
さらに、所定の毒性を有する前記化学組成物が、農薬、化粧品、および環境汚染物質からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
化学組成物のＬＳＣにおける分子プロフィールを、所定の毒性を有する化学組成物のＬＳＣにおける分子プロフィールのライブラリーと比較するための集積システムであって、該集積システムが、以下：アレイ上の標識のパターンを読み取るのに適し、そして所定の毒性を有する化学組成物のＬＳＣにおける複数の分子プロフィールを有するデータベースファイルを含む、デジタルコンピューターに作動可能に連結される、アレイリーダー、を備える、集積システム。
【請求項３５】
前記データファイルが、少なくとも２０個の遺伝子またはタンパク質発現プロフィールを含む、請求項３４に記載の集積システム。
【請求項３６】
１時間あたりアレイ上で５００以上の標識のハイブリダイゼーションパターンを読み取ることが可能である、請求項３４に記載の集積システム。
【請求項３７】
さらに、アレイ上の標識のパターンを読み取るための光学検出器に作動可能に連結される、請求項３４に記載の集積システム。
【請求項３８】
ＬＳＣにおける分子プロフィールと化学組成物の毒性とを相関させる集積システムであって、該集積システムが、以下：所定の毒性を有する化学組成物のＬＳＣにおける複数の分子プロフィールを有するデータベースファイル、および分子プロフィール−毒性の相関に適切なプログラムを含む、デジタルコンピューターに作動可能に連結される、アレイ上の標識のパターンを読み取るのに適したアレイリーダー、を備える、集積システム。
【請求項３９】
前記データファイルが、少なくとも２０個の遺伝子またはタンパク質発現プロフィールを含む、請求項３８に記載の集積システム。
【請求項４０】
１時間あたりアレイ上で５００以上の標識のハイブリダイゼーションパターンを読み取ることが可能である、請求項３８に記載の集積システム。
【請求項４１】
さらに、アレイ上の標識のパターンを読み取るための光学検出器に作動可能に連結される、請求項３８に記載の集積システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年６月１４日出願の米国仮特許出願番号第６０／２１１，６０６号（これは、その全体が参考として本明細書中に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、毒性化合物を同定および特徴付ける方法ならびに毒性効果について新化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０００３】
（背景技術）
コンビナトリアル化学ライブラリーの高処理能力スクリーニングアッセイを利用するような、現代の薬物探索の方法における進歩は、我々に疾患の処置のための前例のない多数の薬物候補を提供し続けている。しかし、宿主系に対する薬物毒性の問題は、健康管理の設定のために、ライブラリーからの薬物候補の解釈において、重大な評価制限段階（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｓｔｅｐ）にあり続けている。類似の毒性問題は、産業および普通の化学物質の開発も同様に妨害する。高価で、かつ時間を浪費するのに加えて、現在利用可能な毒素学的スクリーニングアッセイは、ヒトの治療に関連する全毒性を検出できない。例えば、全ての期待されるヒトの治療法の３分の１ほどは、予想外の毒性に起因して、ヒトの臨床治験の第１相で不合格になる。潜在的な毒性のための潜在的な治療法をスクリーニングする、より良好な手段は、費用および新治療法の開発の不確定性を減少させ、そして不確定性の減少によって、民間部門を助長して薬物開発のさらなる資源を与える。
【０００４】
従来の「単一レセプター」細胞株および動物毒性試験の、現在利用可能な代替物は、これらの必要性を十分に満たしていない。例えば、Ｆａｒｒ、米国特許第５，８１１，２３１号は、種々の細胞株の細胞において選択されたストレスプロモーターを選択する工程、およびこれらのプロモーターに連結した遺伝子の転写物レベルを決定する工程によって、毒性化合物を同定および特徴付ける方法を提供する。それゆえ、この方法は、プロモーターおよび細胞株の両方が示す、潜在的な毒性薬剤の目的の生物に対する影響の程度に依存する。
【０００５】
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションアレイの使用は、化学組成物の潜在的な毒性を決定するための別の経路を提供する。化学組成物に培養細胞を曝露し、次いで、その曝露された細胞の発現パターンを、他の化学薬剤に曝露された細胞の発現パターンと比較することによって、試験化学組成物の発現パターンと類似した発現パターンを検出し得、このようにして、化学組成物の毒性が類似であり得ることを予測し得る。例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２：３９６−３９９を参照のこと。これらの方法は、個々の細胞株が、完全な生物の複雑な生物学を十分に表し得ないという事実で損害を受ける。さらに、複数の細胞株での反復試験でさえ、再現されないか、または生物で生じる細胞および組織の間の複雑な相互作用を説明しない。
【０００６】
肝臓細胞に基づく毒性アッセイもまた、公知である。例えば、Ｍａｉｅｒは、単離された新鮮なラット肝細胞の培養物を用いるインビトロ毒性試験の開発を記載している。Ｍａｉｅｒ，Ｐ．、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ（１９８８）、４４（１０）：８０７−８１７。この試験は、肝臓において細胞分化を妨害する化合物の指標としての、倍数体肝細胞の薬物誘導病理学的変化に基づく。ＳａｗａｉおよびＡｗａｔａは、試験物質の毒性を試験するために使用され得る肝細胞を細胞培養するための方法を記載している。ＳａｗａｉおよびＡｗａｔａ、日本国特許第１０１７９１５０号。ＴａｋａｓｈｉｎａおよびＮａｏｋｉは、継代培養可能な肝細胞株を、毒性試験に使用され得る肝細胞と融合させることによって得られる樹立された培養可能な肝細胞を記載している。ＴａｋａｓｈｉｎａおよびＮａｏｋｉ、日本国特許第０６３１９５３５号。さらに、このような細胞株を用いる毒性アッセイは、完全な生物または組織の複雑な生物学を十分に考慮し得ず、そして毒性の影響を決定する細胞および組織の相互作用の寄与に対応できない。
【０００７】
Ｌｏｃｋｈａｒｔらは、公知の遺伝子群の発現プロフィールを用いて、細胞に対する有害な副作用に関して薬物をスクリーニングする方法を記載している。Ｌｏｃｋｈａｒｔら、米国特許第６，０３３，８６０号。この方法は、１６個の公知の遺伝子発現における変化を評価し、それゆえ、同一性が公知であり、発現レベルが詳細に測定され得る非常に少数の遺伝子の発現を変化させる薬物および毒性型だけに制限される。
【０００８】
チトクロムＰ４５０の発現に基づく薬剤の細胞毒性を同定または試験する方法もまた、公知である。Ｈａｒｒｉｓら、米国特許第５，６６０，９８６号。この方法は、内因性チトクロムＰ４５０を発現するヒト気管支および肝臓の上皮細胞株に対する薬剤の細胞毒性試験に基づいている。この方法は、複雑な細胞および組織の相互作用を考慮しない細胞株に基づくアッセイなので、特定の遺伝子の発現およびその性質に関するその狭い焦点によって制限される。
【０００９】
主に体内で有毒な物質を解毒する生体の役割を実行するという理由で、肝臓は、物質の毒性の影響が最も頻繁に、そして厳しく表される部位である。例えば、表１を参照のこと。それゆえ、肝臓に関連するか、または肝臓で発見された細胞で、潜在的に毒性の化合物の影響に主な焦点を置く毒性アッセイは、特に有益なことが予期される。
【００１０】
当該分野で必要とされることは、細胞が、他の型の細胞と相互作用し、かつ毒性の影響の共通標的に最も関連する環境において、潜在的な毒性に関して、化学組成物を体系的に試験する方法である。さらに必要とされることは、費用、時間、ならびに動物およびヒトの試験の倫理的問題を伴わずに、どれが生物全体または組織に対する組成物の影響に関連するかに取り組む手段である。本発明は、これらおよび他の必要物に取り組む。
【００１１】
（発明の開示）
本発明は、化学組成物の毒性を評価する新規の方法を提供する。実施形態の１群において、本発明は、化学組成物の分子プロフィールを作成する方法に指向され、この方法は、以下の工程を含む：ａ）哺乳動物の肝臓幹細胞（ＬＳＣ）の単離された集団と化学組成物とを接触させる工程；およびｂ）その化学組成物の分子プロフィールを作成するために、化学組成物に応答する哺乳動物ＬＳＣでの遺伝子発現またはタンパク質発現の変化を記録する工程。
【００１２】
本発明は、さらに所定の毒性を有する化学組成物の分子プロフィールのライブラリーを集計する方法を具体化し、この方法は以下の工程を含む：ａ）哺乳動物ＬＳＣの単離された集団と所定の毒性を有する化学組成物とを接触させる工程；ｂ）その化学組成物の分子プロフィールを作成するために、化学組成物に応答する哺乳動物ＬＳＣでの遺伝子発現またはタンパク質発現の変化を記録する工程；ならびにｃ）所定の毒性を有する少なくとも２つの化学組成物を用いて、工程ａ）およびｂ）を反復することにより分子プロフィールのライブラーを集計する工程。本発明の方法により集計された分子プロフィールライブラリーは、コンピューターハードドライブ、コンパクトディスク、カセット、フロッピー（登録商標）ディスクなどのような適切な記憶機器に蓄積され得る。一般的そして好ましくは、適切な記憶装置は、このようなデータを機器（コンピューターのような）で読み取り可能な形態に保存する。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、ＬＳＣ中のその分子プロフィールを、所定の毒性を有する同定された化学組成物の分子プロフィールと比較することによって、試験化学組成物の毒性を分類する方法を提供する。１つの局面において、この試験化学組成物は、所定の毒性を有する化学組成物と同じで有り得る。例えば、公知の化学組成物と同一の分子プロフィールを呈するような試験化学物質が、この試験によって同定される。
【００１４】
本発明はさらに、そのプロフィールを、所定の毒性を有する複数の化学組成物のプロフィールを含むライブラリーと比較させることによって、試験化学組成物の毒性を分類するための体系方法を含む。好ましくは、ライブラリーに含まれる化学組成物は、型および標的の組織または器官について類似の毒性を発揮する。このライブラリーは、データベースの形態をとり得る。データベースは、異なる毒性分類の化学組成物についての１つより多いライブラリーを含み得る。
【００１５】
本発明の１つの局面において、この試験化学組成物の毒性は、ＬＳＣ中のその分子プロフィールと、所定の毒性を有する化学組成物の分子プロフィールとの比較によって分類され得る。
【００１６】
本発明のＬＳＣは、ヒトまたは非ヒトの哺乳動物であり得、これらとしては、ネズミ種、ならびにイヌ種、ネコ種、ブタ種、ウシ種、ヤギ種、ウマ種およびヒツジ種が挙げられる。
【００１７】
遺伝子またはタンパク質の発現レベルにおける変化は、以下のいずれかから選択される標識の使用によって検出され得る：蛍光、比色、放射性、酵素、酵素基質、ヌクレオシドアナログ、磁気、ガラス、またはラテックスビーズ、金コロイド、および電気的トランスポンダー。変化はまた、質量分析法によって検出され得る。この化学組成物は、公知（例えば、潜在的な新規薬物）または未知（例えば、道端近くに捨てられているのが見つかった未知の化学物質のサンプル、および未知の毒性のサンプル）であり得る。
【００１８】
さらに、この化学組成物は、治療薬剤（または潜在的な治療薬剤）であり得るか、あるいは神経毒、肝臓毒、造血細胞の毒、筋肉毒（ｍｙｏｔｏｘｉｎ）、発癌物質、催奇性薬剤、または１つ以上の生殖器官に対する毒素のような公知の毒性の薬剤であり得る。この化学組成物はさらに、殺虫剤、殺真菌薬、抗線虫薬、および肥料のような農薬、いわゆる「美容食品（ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌ）」を含む化粧品、工業廃水または副産物、あるいは環境汚染物質であり得る。それらはまた、動物の治療法または潜在的な治療法であり得る。
【００１９】
本発明はまた、本発明の方法を実行するために都合よく使用され得るアレイ形式（例えば、液体アッセイ）で提供されるＬＳＣを提供する。アレイ形式で提供される細胞は、目的の化学組成物に曝露され得、そしてその細胞の分子プロフィールが決定され得る。この分子プロフィールは、例えば、（そのアレイ）自体の基材上でＬＳＣをプローブ化するか、または（そのアレイ）基材から細胞を解離し、そして本明細書中に記載の分子プロフィールの決定のためにそれらを調製することによって、決定され得る。
【００２０】
本発明はさらに、アレイ上の標識パターンを読むために適応されたアレイリーダーを備えた、化学組成物の分子プロフィールを化学組成物の分子プロフィールのライブラリーと比較するための、統合されたシステムを含み、これは、公知または未知の化学組成物と接触された哺乳動物のＬＳＣの遺伝子発現またはタンパク質発現プロフィールの多数を有するデータファイルを含むコンピューターに動作可能に連結される。
【００２１】
本発明はまた、アレイ上の標識パターンを読むために適応されたアレイリーダーを備えた、化学組成物の分子プロフィールと化学組成物の毒性とを関連付ける統合されたシステムを含み、これは、所定の毒性を有する化学組成物と接触された哺乳動物のＬＳＣの分子プロフィールの多数を有するデータベースファイル、および分子プロフィール毒性相関に適切なプログラムを含むデジタルコンピューターに動作可能に連結される。本発明のこの統合されたシステムは、１時間に５００標識より多くを読み取り得、そしてさらにアレイ上の標識パターンを読むための光学検出器に動作可能に連結され得る。
【００２２】
（発明を実施するための形態）
（Ａ．定義）
本明細書中で使用される「毒性」とは、生きている生物またはそれらの一部に対する化学物質の任意の有害な影響を意味する。この毒性は、個々の細胞、組織、器官、または器官系に対するものであり得る。それゆえ、毒性の測定は、ヒトまたは動物の健康状態に対する化学物質の潜在的な影響（環境での化学的曝露の重要性を含む）を決定することに不可欠である。あらゆる化学物質およびあらゆる薬物は、多少の濃度で有害な影響を有する；従って、この問題は、一部、薬物または化学物質が、規定された目的で市販されるために十分に低い危険性を示すかどうか、または環境汚染に関して、環境でのその存在によって示される危険性が、その放出を防ぐための特別な予防措置を必要とするか、または一旦放出されれば隔離またはレメディエーションを必要とするかどうかということである。例えば、Ｋｌａａｓｓｅｎら、編、ＣａｓａｒｅｔｔおよびＤｏｕｌｌ’ｓ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ　Ｂａｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｏｉｓｏｎｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、５ｔｈ　Ｅｄ．１９９６）を参照のこと。本明細書中に使用される、「所定の毒性」を有する化学組成物は、化学組成物の毒性型および／または特定の薬力学的特性が決定されたことを意味する。例えば、化学組成物は、肝臓毒性を誘導することが公知であり得る。さらに、化学物質によって引き起こされる肝臓毒性の重症度は、肝臓組織と接触する化学物質の量または濃度によって定量的に測定され得る。
【００２３】
本発明による「遺伝子またはタンパク質の発現における改変」は、１つ以上の遺伝子またはタンパク質の発現レベルにおける、正常な組織培養培地および正常な細胞培養条件のみに曝露されているＬＳＣの遺伝子またはタンパク質の発現レベルとの比較した変化を意味する。状況に依存して、化学薬剤に曝露されたＬＳＣが、コントロールＬＳＣでは発現されないタンパク質を発現する場合、この成句は、単一のタンパク質または遺伝子の発現における変化を意味し得るか、またはＬＳＣの遺伝子またはタンパク質の全体の発現パターンを意味し得る。この成句は、１つ以上の時点ならびに／あるいはＬＳＣの分化、増殖および／または十分に分化した肝細胞への発達の経路に沿った段階での、ＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質の発現を含み得る。この成句は、十分に分化した肝細胞での遺伝子またはタンパク質の発現を含まない。
【００２４】
本明細書中に使用される「ＬＳＣ型」または「ＬＳＣの型」は、特定の供給源（例えば、供給源の種、組織、年齢によって定義されるような）から単離されるＬＳＣおよび／または特定のＬＳＣ単離方法に従って単離されるＬＳＣをいう。
【００２５】
本明細書中に使用される「化学組成物」、「化学物質」、「組成物」、および「薬剤」は、一般的に同義語であり、そして目的の化合物をいう。例えば、この化学物質は、潜在的な治療、農薬化学、環境汚染物質、あるいは犯罪現場、廃棄物処理場で検出されたか、または道端に捨てられた未知の物質として考慮され得る。
【００２６】
本明細書中に使用される化学組成物の「分子プロフィール」または「プロフィール」は、培養培地のみに接触する類似ＬＳＣと比較して、その化学組成物によって接触されるＬＳＣでの遺伝子もしくはタンパク質の発現、またはその両方の変化パターンをいう。
【００２７】
本明細書中に使用される化学組成物の「有効プロフィール」とは、細胞、組織、器官、および／または生物における化学組成物の、予期された、特徴的なおよび／または所望の影響の存在および／または程度をいう。例えば、骨の発達を誘導することが公知であるか、または予想される薬物の有効プロフィールは、骨の発達に関連する遺伝子および／またはタンパク質のアップレギュレーションのような影響を含み得る。
【００２８】
本明細書中に使用される「データベース」とは、培養培地のみと接触させた同種のＬＳＣと比較した、化学組成物と接触させたＬＳＣでの遺伝子またはタンパク質、あるいはその両方のパターンにおける変化に対する、化学薬剤の毒性、生物学的影響、またはその両方についての情報を関連付ける情報を記録するための、法則化されたシステムをいう。
【００２９】
本明細書中に使用される「ライブラリー」とは、少なくとも２つの化学組成物の分子プロフィールの編集をいい、これは、化学組成物と接触させたＬＳＣでの遺伝子またはタンパク質、あるいはその両方の発現における変化と、他の化学組成物によって引き起こされるこのような発現のプロフィールとの比較を可能にする。
【００３０】
「アレイ」は、法則化された位置または配置を意味する。最も一般的に、本明細書中に使用される「アレイ」は、オリゴヌクレオチド（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）、チップまたは相補的オリゴヌクレオチド（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）を捕らえるために使用される他の表面上に配置されたリガンド、あるいはリガンドのための基質の法則化された配置をいう。例えば、その配置内のオリゴヌクレオチドまたはリガンドの各配置は既知であるので、この配列（核酸）または物理的性質（タンパク質）は、核酸または基質がアレイに結合する位置によって決定され得る。
【００３１】
「作動可能な連結」とは、２つ以上のエレメントが、第１のエレメント（光学的リーダーによる読み取りのような）において生じる事象が、第２のエレメントによって伝えられ、そして第２のエレメントによって作用されること（例えば、光学的リーダーからのデータに関係するコンピューターによる計算）を可能にする方法で接続されることを意味する。
（Ｂ．一般な説明）
本発明は、インビボでの複雑な生物学的相互作用および細胞相互作用を密にモデル化するインビトロ系において、ゲノムワイドな基礎に基づき、化学的組成物の毒性を評価する方法を提供する。１つの局面において、本発明は、その標的を確証する能力、および潜在的な治療剤に対する応答に関連する発現した遺伝子の全てを迅速に同定し、そしてこれらを定量化する能力の両方のために、薬物開発において特に有用である。。
【００３２】
本発明は、多能性肝臓幹細胞（ＬＳＣ）の特性を利用することによって、これらの目的を達成する。ＬＳＣは、肝臓および／または他の組織／器官（例えば、膵臓、腸）の複数の上皮細胞に分化することが可能な形成多能性前駆細胞である。一般に、これらは、肝細胞または胆管細胞のいずれかに発生し得る前駆細胞である。しかし、これらはまた、他の細胞型に分化し得ると考えられている。ＬＳＣは、前腸の肝憩室内で、一般に胚発生段階における胚前駆細胞（本発明の目的のためのＬＳＣの好ましい形態）として、見出されるかまたは単離された。それらはまた、成人の肝臓から、幹細胞特性または幹細胞様特徴を有する細胞として単離された。本発明の目的のために、成人肝臓中に見出される卵円形細胞（ｏｖａｌ　ｃｅｌｌ）もまたＬＳＣである。多数の組織型に分化におけるその多能性に起因して、ＬＳＣの単離された集団は、マウスまたはより大きい哺乳動物の使用に関連する、費用および困難性を回避しつつ、従来の単細胞アッセイまたは酵母アッセイを行うのに比べ、インビボ系の複雑性に対してずっと近いモデルを提供する。
【００３３】
本発明の目的のために、ＬＳＣは、他の型の幹細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ））を超える多くの利点を有する。ＬＳＣは、多くの供給源から比較的容易に単離、および精製される。これらはまた、培養物中で増大し、そして改変条件（例えば、薬物処理）に供することが比較的容易である。他方では、ＥＳ細胞を得ることは大変複雑であり、そして大変な労力を要する傾向があり得る。ＥＳ細胞の場合、ヒト胚または動物胚の使用はまた、倫理的な監視および規制による監視を受け得る。ＬＳＣはまた、これらが、肝細胞および胆管細胞（これらは、薬物および他の物質に起因する毒性に対して最も感受性のある器官である肝臓において優勢な細胞である）のための前駆細胞であるという点で、他の幹細胞を超える有意な利点を与える（例えば、表１を参照のこと）。従って、肝臓の細胞成分および発生に焦点をあてた毒性アッセイは、多くの試験化合物の潜在的な毒性のより直接的な評価を与えると期待される。さらに、ＬＳＣは、生きた個体から、（例えば、針または成人の肝臓の小さいくさび状生検によって）単離され得るので、本発明は、独特の薬物感受性を有する、個々の患者または患者の集団に対して毒性プロファイルの開発を可能にする手段、すなわち、ＥＳ細胞を毒性アッセイのために使用する場合には達成することがほとんど不可能であった領域を提供する。最近の技術開発によって、いくつかの場合において、死後２４時間までの死体からこれらの細胞を単離することが可能である。
【００３４】
本発明に使用されるＬＳＣは、細胞集団を含み、この集団の大多数は、適切な条件下で培養した場合、異なった細胞系統に発生し得る多能性細胞である。ＬＳＣ集団は、多能性細胞を少なくとも５１％含むことが好ましい。より好ましくは、このＬＳＣ集団は、多能性細胞を少なくとも７５％含む。そしてさらにより好ましくは、このＬＳＣ集団は、多能性細胞を少なくとも９５％含む。
【００３５】
最も単純な形態において、本発明に従った分子プロファイルを作製する方法は、ＬＳＣと目的の化学組成物とを接触させ、次いで、この薬剤に曝露していないＬＳＣ（「コントロールＬＳＣ」）と比較して、この化学組成物に曝露されたＬＳＣ（「試験ＬＳＣ」）における、遺伝子発現、タンパク質発現、またはこれらの両方の変化を決定する工程を包含する。
【００３６】
さらに、２以上の異なる化学組成物（例えば、類似の毒性を有する化学組成物）についての分子プロファイルを編纂することによって、ライブラリーが作製され得る。これらの組成物の分子プロファイルは、これらの遺伝子発現またはタンパク質発現のパターンにおける共通の変更を識別するために、定量的または定性的のいずれかで、互いに比較され得る。例えば、各化学組成物についての、遺伝子発現パターン全体またはタンパク質発現パターン全体は独特であり得るが、ある特定の遺伝子またはタンパク質の発現レベルにおける変化は、類似の毒性を有する組成物の間で類似し得る。すなわち、いくつかの遺伝子／タンパク質は、同様にアップレギュレートされており、従って、コントロールに比べてより多い量で発現され得る；一方、他の遺伝子／タンパク質は、同様にダウンレギュレートされ、従って、コントロールに比べてより少ない量で発現され得る。次いで、これらの化学組成物の共通の分子的特徴は、これらの毒性と相関付けられ、そして新規の化学組成物または以前に試験されていない化学組成物（例えば、薬物スクリーニングアッセイでの薬物リード）の毒性を評価するための代理マーカーとして役割を果たし得る。
【００３７】
多数の化合物が、前臨床研究および臨床研究を受けた。前臨床研究としては、とりわけ、少なくとも２種の哺乳動物種での毒性研究が挙げられ、この種うちの１つは、通常ネズミ科の種であり、代表的にはマウスまたはラットであり、そして臨床試験は、任意の明らかな毒性についての情報を常に含む。種々のこれらの化合物の毒性についての相当の量の情報が、利用可能である。利用可能な毒性情報に基づいて、これらの化合物は、特定の毒性のカテゴリーに分類され得る。例えば、多くの化学組成物が、これらが毒性を及ぼす組織または器官に従って表１に列挙される。
【００３８】
【表１】
2004503256.tif 000002
本発明の１つの実施形態において、肝臓毒性を有することが知られている組成物は、ＬＳＣにおけるこれらの分子プロファイルの組織分析のために使用される。別の実施形態において、心臓血管系に対する毒性を引き起こす組成物は、ＬＳＣにおけるこれらの分子プロファイルについて評価される。本発明の尚さらに別の実施形態において、神経系に対して毒性を引き起こす組成物が、ＬＳＣにおけるこれらの分子プロファイルについて評価される。あるいは、選択された疾患を処置するための既知の薬物または潜在的な薬物は、それらの毒性の組織分析において一緒に使用され得る。この点に関して、例えば、抗癌剤および抗癌剤候補は、これらの組織および器官の毒性についてスクリーニングされ得る。
【００３９】
本発明の１つの局面に従って、化学組成物の分子プロファイルは、これらの薬剤が非ヒト動物、ヒト、またはこれらの両方において示す毒性と相関し得る。次いで新規の薬剤または以前に試験されていない薬剤に曝露したＬＳＣの発現パターンを、既知の毒性の薬剤によって誘導された発現のこのようなプロファイルのライブラリーと比較することによって、この新規の薬剤の毒性における類似の型について、予測が行われ得る。さらに、この新規の薬剤の毒性は、もしあれば、既知の毒性化合物の中で階級付けされ得、薬物開発における優先順位についての情報が提供される。
【００４０】
薬物開発における有用性に加えて、本発明はまた、化学組成物の毒性に興味が持たれる他の分野における用途を有する。従って、本発明は、農薬（例えば、殺虫剤および肥料）の毒性を評価するために使用され得る。これは、さらに、化粧品において使用され得る。例えば、これは、候補化粧品を、化合物を動物実験に移す前に毒性についてスクリーニングするために使用され、これによってＤｒａｉｚｅ眼刺激性試験のような手順に供される必要ある動物の数を潜在的に減少する。同様に、本発明の方法は、「美容食品（ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ）」としての使用が意図される薬物に対して適用され得、ここで、主に化粧品である薬剤がまた、ある程度の準治療的特性を有することが示される。さらに、本発明は、環境汚染の相対的な毒性（廃棄物、石油化学製品残渣、燃焼生成物、および生産加工産物を含む）を評価するために用いられ得る。このような夾雑物の例としては，ダイオキシン、ＰＣＢ、および炭化水素が挙げられる。
【００４１】
一般に、タンパク質発現または遺伝子発現のレベルを検出するために使用される方法が、タンパク質発現量または遺伝子発現量の、少なくとも相対的な指標を提供することが好ましい。より好ましくは、この方法は、タンパク質発現または遺伝子発現の定量的指標を提供し、既知の毒性の化学組成物に曝露したＬＳＣのタンパク質発現または遺伝子発現に対する、試験化学組成物に曝露されたＬＳＣタンパク質発現または遺伝子発現の比較を容易にする。
（Ｃ．ＬＳＣの調製）
ヒトまたは他の哺乳動物種のＬＳＣの調製方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｒｅｉｄらの米国特許第５，５７６，２０７号および同第５，７８９，２４６号は、その子孫が様々な肝細胞に分化し得る未成熟細胞の単離または拡大の方法を記載する。これらの細胞は、肝臓、膵臓、胃、肺、および骨髄を含む様々な組織から単離され得る。この未成熟（前駆）細胞は、標準的な手順（例えば、酵素学的な分離、および機械的な分離）によって、組織供給源から分離され得る。分離された細胞集団は、標準的な方法（例えば、前駆細胞のエピトープ（このようなエピトープは当該分野で公知であり、以下に例が提供される）を認識する抗体の使用）により前駆細胞についてさらに濃縮される。この前駆細胞の拡大は、細胞外マトリクス、肝臓支質細胞および増殖因子の存在下で、この細胞を培養することによって、達成され得る。これらの細胞の単離および拡大に適切な他の条件はまた、開示される。これらの前駆細胞は、肝細胞、胆管細胞、肝内皮細胞、および伊東細胞に分化し得る。
【００４２】
肝前駆細胞を単離する方法は公知である。例えば、、Ｒｅｉｄら、米国特許第６，０６９，００５号は、パニング技術を使用する単離方法および蛍光発色細胞分類を記載する。これらの肝前駆細胞は、肝細胞を分離し、その後に抗体を使用して（蛍光発色細胞分類によって）パニングおよび分類を行い、夾雑細胞型の量を減じることによって単離される。
【００４３】
肝前駆細胞を、単離し、特徴付け、そして培養するための別の方法は、Ｎａｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，５５９，０２２号に記載される。肝前駆細胞は、密度勾配遠心分離によって単離され、そしてこれらの形態学、染色特徴、高増殖活性、およびインビトロでの分化能によって、他の肝臓実質細胞から識別される。
【００４４】
肝臓幹細胞を得る別の方法は、ＦａｒｉｓのＰＣＴ公開ＷＯ００／０３００１に記載される。Ｆａｒｉｓは、胎児、小児、または成人の肝臓組織から一次肝臓幹細胞を単離する方法を記載し、この方法は、肝細胞との細胞クラスターに加わる肝臓幹細胞の傾向に基づき、さらなる濃縮は、イムノサブトラクション、選択的酵素消化、および免疫親和性選択によって達成される。
【００４５】
種々の分化した細胞（肝臓直系の細胞を含む）を生じることが可能な胆管前駆細胞の単離が、Ｐａｎｇらの米国特許第５，８６１，３１３号に記載されている。哺乳動物胆管の微小構造を有する細胞の集団（例えば、胆管外植片）は、培養され、この培養集団中の前駆細胞の増殖を生じる薬剤と接触される。引き続き、この前駆細胞は、例えば、直接的な機械的分離によって、この外植片の残りから分離されるか、または外植片の全てもしくは一部分の分離によって単離される。前駆細胞の単離および培養に適切な種々の条件は、参考文献において提供される。
【００４６】
肝前駆細胞に対する表現型類似性を有する、条件的に形質転換された肝前駆細胞の単離がまた、記載される。Ｆｉｏｒｉｎｏら（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−−Ａｎｉｍａｌ（１９９８），３４：２４７−２５８）は、肝臓の種々の分化マーカーを発現されるように誘導され得る細胞の単離を記載する。
【００４７】
ＬＳＣの系特異的分化は、当該分野で周知の種々の生物学的活性因子および／または条件によって、誘導され得る。これらは、例えば、Ｂｒｉｌｌら、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅａｇｅｓ　ａｎｄ　ｈｅｐａｔｏｍａｓ　Ｉｎ　Ｌｉｖｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），ｐｐ．８６９−８９７（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；ＲｅｉｄおよびＬｕｎｔｚ，Ｅｘ　ｖｉｖｏ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　Ｉｎ　Ｂａｓｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９７），７５：３１−５７（Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）；ＲｅｉｄおよびＬｕｎｔｚ（１９９７），Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７），７５：３１−５７に記載され、一般的には、Ｒｅｉｄ，Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ／ｌｉｎｅａｇｅ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｌｉｎｅａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｋｅｙｓ　ｔｏ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｌｉｖｅｒ　Ｉｎ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９７），（Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ／Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ａｕｓｔｒｉｎ，ＴＸ）；Ｂｒｉｌｌら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（１９９５），５９：９５−１０２；Ｂｒｉｌｌら．，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ＆Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９９），４４：３６４−３７１；ならびにＦａｒｉｓ，ＰＣＴ公開ＷＯ００／０３００１を参照のこと。例えば、肝前駆細胞の分化は、細胞を未分化形態で維持することが知られている状態を取り除くことによってか、またいくつかの公知の増殖因子（例えば、ＨＧＦ、ＦＧＦ、およびＩＧＦ−ＩＩ）の１つを投与することよって達成され得る。肝幹細胞の分化はまた、肝組織（すなわち、他の肝細胞、または当該分野で公知の細胞マトリクス成分）との接触によって、誘導され得る。培養培地中のデキサメタゾンの存在が、肝細胞系および胆管細胞系の両方に沿う、胚性マウス肝細胞の分化を誘導することが示された。培養培地に、血清、インシュリン、デキサメタゾン、およびジメチルスルホキシドを補充することによって、細胞がＥ１２ラット肝臓から単離された細胞が、肝細胞マーカーを発現するように誘導し、一方、これらの細胞を酪酸ナトリウムに曝露することは、胆管細胞マーカーの発現を生じる。一般的には、ＧｒｉｓｈａｍおよびＴｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ，Ｌｉｖｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　Ｉｎ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ｐｐ．２３３−２８２（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）（１９９７）；ＳｈｉｏｊｉｒｉおよびＭｉｚｕｎｏ，Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．（１９９３），１８７：２２１−２２９；ＧａｌｌおよびＢｈａｔｈａｌ，Ｊ　Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９０），７１：４１−５０；ならびにＧｅｒｍａｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．（１９８８），４８：４９０９：４９１８を参照のこと。
【００４８】
本発明で使用するために得たＬＳＣは、当該分野で周知であるかまたは本明細書中で引用した参考文献に記載されるように、これらの別個の特性によって同定され得る。例えば、肝臓幹細胞は、これらのさらに分化した子孫より小さくなり、より高い細胞質対核の比、未分化であり薄い核およびわずかな細胞間接着を有する傾向がある。Ｒｅｉｄら、米国特許第６，０６９，００５号。Ｎａｕｇｈｔｏｎらは、低い細胞質対核の比、酸性染色液および塩基性染色液の組合わせを接触した場合の特異的な特徴を有する染色、ならびに培地内で成熟肝細胞より高い増殖速度を有する彼らの方法で単離した肝前駆細胞を記載する。Ｎａｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，５５９，０２２号。
【００４９】
あるいは、本発明で使用されるＬＳＣは、例えば、所定の段階のＬＳＣの集団に特異的な抗体の使用によるような、特異的なマーカーの検出によって同定され得る。例えば、ＧｒｉｓｈａｍおよびＴｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ（前出）は、分化を評価するために、そして肝臓上皮細胞（ＯＣ．２およびＯＣ．３を含む）の系を追跡するために、肝前駆細胞で発現されるが肝細胞で発現されないマーカーである一般に使用される抗体マーカーの実質的な表を記載する。また、サイトケラチンに対する抗体は、肝臓上皮細胞系および分化を評価する際に有用であり得る。例えば、Ｍｏｌｌら、Ｃｅｌｌ（１９８２），３１：１１−２４；ＯｓｂｏｒｎおよびＷｅｂｅｒ，Ｃｅｌｌ（１９８２），３１：３０３−３０６；Ｍａｒｃｅａｕ，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９０），６３：４−２０；Ｓｈｉｏｊｉｒｉら．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．（１９９１），５１：２６１１−２６２０；ならびに、Ｂｌｏｕｉｎら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（１９９２），５２：４５−５４は、全ての型の上皮細胞は、２〜１０個のサイトケラチン（ＣＫ）の組み合わせを発現すること、およびこの細胞により発現されるＣＫの特定の組み合わせ（例えば、ヒトの、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ７およびＣＫ１９（ならびに少ないが、ＣＫ１４）に等価なＣＫの組み合わせ）が、肝上皮細胞の分化した形態を示すことを報告した。
【００５０】
必要ならば、本発明において使用するために得、そして培養したＬＳＣを、ＬＳＣの物理的特性または化学的特性（例えば、サイズ、質量、密度、特異的な抗原、または遺伝子発現）に基づいて、当該分野で公知の方法（例えば、フローサイトメトリー、細胞分類、濾過または遠心分離）を使用して、培養物から単離し得る。
【００５１】
化学的組成物を試験するために使用されるＬＳＣは、任意の脊椎動物種のものであり得る。ＬＳＣが由来する特定の種の選択は、代表的には、いくつかの因子の釣り合いを反映する。第１に、研究の目的に基づいて、１つ以上の種が特定の目的となり得る。例えば、ヒトＬＳＣは、潜在的なヒト治療剤として試験される組成物と共に使用するための特定の目的のものであり得、その一方で、ウマＬＳＣ、ネコＬＳＣ、ウシＬＳＣ、ブタＬＳＣ、ヤギＬＳＣ、イヌＬＳＣ、またはヒツジＬＳＣは、潜在的な獣医学的治療について、より関心が持たれ得る。
【００５２】
第２に、さらにヒト治療剤の試験に関して、費用および取り扱いの考慮によって、いくつかまたは全ての試験は、非ヒトＬＳＣ、さらに非霊長類ＬＳＣを用いて、実施されることが決定づけられる。いくつかの試験について、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、および他の利用可能で、費用がかからない実験動物由来の、ＬＳＣを使用することが所望され得る。
【００５３】
第３に、多くの情報が、化学組成物の毒性に関して利用可能である種を選択することは、しばしば価値があり、その結果、観察された、遺伝子およびタンパク質の発現の変化は、毒性の種々の型に相関し得る。この理由で、マウスおよびラットは好ましい実施形態である。殆どの前臨床試験が、少なくとも１種のマウス種で実施され、それゆえ、マウスおよびラットの様々な組織に対する様々な組成物の毒性についての多くの情報が存在する。マウスまたはラット由来のＬＳＣを使用することによって、ＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質の発現の変化と、これらの種におけるこれらの薬剤によって示される毒性との相関付けが可能となる。前臨床試験において一般に使用される、他の種（例えば、モルモット、ウサギ、ブタおよびイヌ）のＬＳＣはまた、同様の理由で好ましい。代表的には、これらの種のＬＳＣは、「ファーストパス（ｆｉｒｓｔ　ｐａｓｓ）」スクリーニングのために、またはヒトにおける毒性についての詳細な情報が必要でない場合、またはマウスまたはこれらの実験用の種のうちの他の１つの結果が、ヒトにおける既知の毒性または他の効果と相関した場合で、使用される。
【００５４】
第４に、霊長類は前臨床試験において広範囲に使用されず、かつ他の実験動物に比べ、購入するにも、そして維持するのにもしばしば費用がかかり、これらの生化学および発生生物学は、より一般的な実験動物の生化学および発生生物学よりヒトの生化学および発生生物学にかなり近い。従って、霊長類に由来するＬＳＣは、毒性試験のためには好ましく、ここでこの研究は、さらなる費用および取り扱い考慮の根拠を示すために十分に重要である。最も好ましいのは、ヒトＬＳＣである。なぜならば、これらのＬＳＣにおける薬物の毒性についての結論は、ヒトに対する化学的組成物の効果に対して最も直接的に関連すると考えられ得るからである。霊長類またはヒトのＬＳＣにおける研究を実施することによって、他の種のＬＳＣについての毒性研究の結果が確証されることが期待される。
【００５５】
第５に、ヒト治療薬に関して、規制当局は、一般に、ヒトの試験を始め得る前に動物データを要求し；前臨床動物研究において使用された種のＬＳＣを使用することが所望される。次いで、ＬＳＣにおける毒性試験の結果は、動物試験の間、研究者が毒性の程度および種類について予測することを導き得る。特定の動物種が、他の型と異なる型のヒト毒性のより良好なモデルであることが、当該分野で公知であり、種はまた、薬物を代謝する能力において異なる。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．（１９７８）２２：１３３−１３８；Ｄｕｎｃａｎ，Ａｄｖ　Ｓｃｉ（１９６７）２３：５３７−５４１を参照のこと。従って、特定の前臨床毒性研究における使用に好ましい特定の種は、薬物候補の意図する使用に従って、変化し得る。例えば、生殖系に影響を与えることが意図される薬物ついて適切なモデルを提供する種は、神経系に影響を与えることを意図する薬物についてのモデルとしては適切ではないかもしれない。前臨床試験に適切な種を選択するための基準は、当該分野で公知である。
【００５６】
異なった種由来のＬＳＣが、本発明の方法において、使用され得るが、一般に哺乳動物細胞が好ましい。以下の議論にいおいて、コントロールと試験ＬＳＣとの任意の所定の比較において、コントロールとして使用されるＬＳＣおよび化学組成物の影響を試験するために使用されるＬＳＣが、同じ種に由来することが想定される。
【００５７】
（Ｄ．化学組成物とＬＳＣとの接触）
（１．概論）
一旦、ＬＳＣ培養が開始されると、これは化学組成物と接触され得る。簡便には、この化学組成物は、水溶液であり、そしてこれはこの培養培地に導入される。この導入は、任意の簡便な手段によって行い得るが、通常は、ピペット、マイクロピペッター、またはシリンジの使用による。いくつかの適用（例えば、ハイスループットスクリーニング）において、この化学組成物を、ロボットアームに基づき得る自動的手段（例えば、自動化ピペッティングシステム）によって導入する。化学組成物はまた、粉末形態または固体形態として、薬学的賦形剤、結合剤、および薬学的組成物で一般に使用される他の物質を伴うかまたはそれを伴わずに、あるいは意図する用途において使用され得る他のキャリアと共に培地に導入され得る。例えば、農薬または石油化学薬剤としての用途が意図される化学組成物を、これらの化学物質または薬剤の毒性を試験するために、単独で培地に導入し得るか、または、これらの化学物質または薬剤の組み合わせが相乗効果を有するか否かを決定するために、この環境で共に使用され得るかもしくは見出され得る、他の物質を組み合わせて導入し得る。代表的には、この培養物は、化学組成物の導入後少なくとも単時間振盪され、この組成物が培地全体に分散したことを確認する。
【００５８】
（２．接触のタイミング）
化学的組成物を培養物に添加する時間は、実施者の裁量の範囲であり、特定の研究目的に伴って変わる。好都合には、ＬＳＣを培養してすぐに化学的組成物を添加して、ＬＳＣの全ての組織の発生におけるタンパク質または遺伝子の発現においての変化の決定を可能にする。しかし、特定の肝細胞型におけるこの組成物の影響についての研究に焦点を合わせることに興味がもたれ得る。以前に記載したように、個々の分化した組織（例えば、肝細胞および胆管細胞）は、特定の誘導因子および／または条件の存在下で発生することが知られ、特定の細胞マーカーによって同定され得る。このような因子、条件およびマーカーは、当該分野において公知であり、本明細書および引用される参考文献において例が提供される。従って、化学的組成物の添加を、ＬＳＣの分化段階、増殖段階および／または発生の種々の時点および／または段階において行い得る。１つの実施形態において、この化学的組成物を、未分化形態に維持されたＬＳＣに接触させる。別の実施形態において、化学的組成物の添加を、目的の細胞型／組織が発生を開始する時点において行う。なお別の実施形態において、目的の細胞型／組織においての遺伝子またはタンパク質の発現の変化への影響を観察するために、化学的組成物の添加を、この発生開始後の選択された時点において行う。
【００５９】
（３．化学的組成物の投薬）
化学的組成物の細胞傷害性について公知の情報量、研究の目的、利用可能時間、実施者の力量に依存して、異なる量のこの組成物を用いてＬＳＣを接触させる。特に、この化学的組成物を用いた他の研究または過去の研究もしくは実地経験によって、特定の濃度が体内で最も一般に見出される濃度であることが示された場合、化学的組成物をただ１つの濃度で投与し得る。さらに一般的には、化学的組成物を異なる濃度で、並行して培養されるＬＳＣ培養物に添加して、遺伝子またはタンパク質の発現における濃度の相違の影響を評価し得、それゆえ異なる濃度でのこの組成物の毒性における相違を評価し得る。代表的には例えば、化学的組成物を規定濃度または中間濃度で添加し、所望される精度の程度に依存して、２倍または５倍の濃度の増大および減少によって限界が定められる。
【００６０】
この組成物が細胞傷害性が未知の組成物である場合、好都合にはまず予備研究を実施して、この組成物を試験する濃度範囲を決定する。投薬量濃度を決定する種々の手順は、当該分野において公知である。例えば、１つの一般的手順は、薬剤が直接的に細胞傷害性である投薬量を決定することである。次いで実施者は、用量を２分の１に減じて、典型的には、目的の薬剤を５倍希釈または２倍希釈の濃度において、目的の型の細胞の並行培養物へ投与することにより投薬研究を実施する。環境汚染物質に関して、この組成物はまた通常、環境中で見出される濃度で試験される。農薬（例えば、食品に残留物を残すような殺虫剤）に対して、この薬剤は通常、残留物が見出される濃度において試験されるが、他の濃度でも同様に試験されるようである。
【００６１】
１つの実施形態において、ＬＳＣ中の化学的組成物の毒性プロフィール（例えば、分子プロフィール）は、この化学的組成物がＬＳＣに接触する濃度に、相関する。このような相関は、受容可能な程度または受容可能でない程度の細胞傷害性を生じる化学的組成物の濃度の有用な指標を提供し得る。別の実施形態においてＬＳＣ中の化学的組成物の効力のプロフィールは、この化学的組成物がＬＳＣに接触する濃度に、相関する。このような相関は、受容可能な程度および／または所望される程度の化学的組成物の効力を生じるに十分な化学的組成物の濃度の有用な指標を提供し得る。なお別の実施形態において、毒性プロフィール−濃度相関および効力プロフィール−濃度相関は、化学的組成物の望ましさおよび／または有用性の尺度を提供する指標に用いられる。例えば、非常に望ましい化学的組成物は、受け入れられないレベルのＬＳＣ毒性を生じる高濃度、ならびに望ましいおよび／または有用なレベルの効力を得る低濃度の関数であるような指標を有する化学的組成物である。
【００６２】
（Ｅ．遺伝子発現またはタンパク質発現のレベル変化の検出）
（１．タンパク質発現の変化の検出）
タンパク質発現は、当該分野で公知の多数の方法によって検出され得る。例えば、サンプル中のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）によって分離して、クマシーブルーまたは銀染料のような染料によって可視化し得る。ゲル上にＸ線フィルムシートを置くことによって、放射性標識を検出し得る。タンパク質をまた、等電点電気泳動によって、等電点に基づいて分離し、染色によって可視化し得る。さらに、等電点電気泳動（通常、垂直方向で実施する）と組み合せてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、サンプル中のタンパク質の２次元分離を提供し得る。例えば、高圧液体クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、表面増強レーザー脱着／イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）のような技術によって、そして沈降速度が十分に異なる場合、密度勾配遠心分離によってタンパク質をさらに分離し得る。例えば、目的の効果をもつ化学的組成物（「試験サンプル」）に接触したＬＳＣ由来のサンプルおよび目的の化学的組成物の存在を除いて同一の条件下で培養したＬＳＣ由来のサンプル（「コントロールサンプル」）を並行して泳動して、検出されるタンパク質および検出されるタンパク質量の何らかの相違を記録することによって、これらの技術を用いてタンパク質発現のレベルの変化を検出することを達成し得る。
【００６３】
免疫検出は、タンパク質発現における変化を検出するための一群の有用な技術を提供する。これらの技術において、抗体は典型的に、標準的プロトコル（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）において教示されるプロトコル）に従って、マウスまたはウサギにタンパク質を注射することによって、このタンパク質に対して惹起される。次いで、このようにして惹起される抗体を用いて、当該分野で公知の種々の免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫アッセイ、ウエスタンブロット、ドットブロット、免疫沈降、および病巣（ｆｏｃａｌ）免疫アッセイ）において、タンパク質の存在を検出し、そしてこのタンパク質を定量し得る。試験サンプルおよびコントロールサンプルについて、並行して試験を行い、サンプル間の結果における何らかの相違を記録することによって、タンパク質発現における変化を決定し得る。例えば、ＥＬＩＳＡの結果は、タンパク質の存在量に直接関連し得る。
【００６４】
タグ化は、タンパク質発現における変化を検出および決定する別の方法を提供する。例えば、タンパク質をコードする遺伝子を操作して、検出可能なタグを含むハイブリッドタンパク質を産生して、その結果、そのタグの検出によってそのタンパク質を特異的に検出し得る。（例えば、そのタンパク質が分離されたゲルにおいて）放射性標識の直接の画像化および定量を可能にするシステムが利用可能である。試験サンプルおよびコントロールサンプル中に存在するタグの量の相違を観察することによって、発現の相違を決定し得る。
【００６５】
標準的なタンパク質化学技術によっても、タンパク質を分析し得る。例えば、トリプシン、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　Ｂプロテアーゼ、キモトリプシンまたは他のタンパク質分解性酵素によるタンパク質分解性消化を実施することによって、タンパク質を分析し得る。消化された産物の相対量を比較することによって、発現の相違を決定し得る。
【００６６】
タンパク質発現における相違を決定するために１つの特に好ましい方法は、質量分析法（すなわち、ＭＳ）であり、これは、少ない労力で最も広範な数のタンパク質の最も広範なプロフィールを提供する。さらに、ＭＳは、サンプル中に存在するタンパク質の正確な検出のみでなく、定量をも可能にする。この手順を単独または選択的な物理的特性に基づく前述の１つ以上の方法との組み合せのいずれかによって用いて、サンプル中に存在するタンパク質を分割し得る。分割することで、サンプル中の異なる物理的特性タンパク質の数を減じ、そしてサイズ、静電荷、金属イオンに対する同じアフィニティーなどの類似したタンパク質の比較を可能にすることによってより良好なＭＳ分析を生じる。従って、例えば、サンプル中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動に供し得、次いでゲル上の得られた目的のスポットをＭＳに供し得る。以下の実施例２において、サイジングカラムを用いて実施される最初の分割およびＳＥＬＤＩを用いて実施される第２の分割を記載する。実施例２に記載のプロトコルにおいて、分子量が３０ｋＤより小さいタンパク質の分析が例証されることに注目すべきである。もちろんあるいは、より高分子量タンパク質を本発明の方法において分析し得、そしてサンプル中の全てのタンパク質を分析する準備が実施者にできている場合、または例えば、サンプル中の異なるタンパク質の総数が、分割せずとも分析するに十分少ないことを予備分析が示す場合、タンパク質を分画する必要はない。
【００６７】
質量分析計に接続されたコンピューターをまた用いて、サンプルを分析して、タンパク質発現の変化が特定の毒性を示し得るか否かを決定することを容易にし得る。例えば、ＭＳから読み出したものは、「減算算出」に用いられ得、ここでコントロールＬＳＣ中のタンパク質発現が定量されて、次いで化学的組成物に接触したＬＳＣの定量されたタンパク質発現から差し引かれ、コントロールＬＳＣによって発現されるタンパク質より多いかまたは少ない量で発現されるタンパク質のみが示される。この方法は直ちに、コントロール集団と試験集団との間でのタンパク質発現の相違に注意を集中する。このような比較の例は、図１Ｂおよび図１Ｃにおいて示され、そして以下に詳細に議論される。
【００６８】
（２．遺伝子発現の変化の検出）
遺伝子発現のレベルを検出および比較する多くの方法は、当該分野で公知である。
【００６９】
このような比較のための１つの標準的な方法は、ノザンブロットである。この技術において、標準的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（第２版．１９８９）を参照のこと）に従って、ＲＮＡをサンプルから抽出して、ＲＮＡ分析に適切な種々のゲルのいずれかにローディングし、次いでこれを泳動して、サイズによってＲＮＡを分離する。次いでゲルをブロットして（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）に記載のように）、目的のＲＮＡについてのプローブにハイブリダイズする。実施者の検出系についての好みに依存してプローブは、放射性または非放射性であり得る。例えば、「Ｇｅｎｉｕｓ　Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を製造者の指示に従って用いて、結合プローブの化学発光を検出することによって、プローブを用いたハイブリダイゼーションを観察して、分析し得る。リボソームＲＮＡバンドのエチジウムブロマイド染色によって、レーン中の等しいＲＮＡローディングを判断し得る。あるいは、プローブを放射標識して、写真フィルムを用いてオートラジオグラフィによって検出し得る。
【００７０】
種々の方法のいずれかによって、ＲＮＡをまた増幅し得て、次いで検出し得る。
例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，米国特許第５，６８６，２７２号は、リガーゼ連鎖反応（すなわち「ＬＣＲ」）を用いたＲＮＡ配列の増幅を開示する。ＬＣＲは、以下によって、十分に記載される：Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８），２４１：１０７７−１０８０；Ｗｕら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９８９），４：５６０−５６９；Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：５−１６（１９９１）；およびＢａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１），８８：１８９−１９３。またはＲＮＡは、ＤＮＡに逆転写され、次いでＬＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）または他の方法によって増幅され得る。ＲＮＡの逆転写を行う典型的プロトコルは、米国特許第５，７０５，３６５号に教示される。適切なプライマーおよびＰＣＲプロトコルの選択は、例えば、Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．ら編，ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　１９９０（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ）（以後、「Ｉｎｎｉｓら」）において教示される。メッセンジャーＲＮＡの示差的発現をまた、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，米国特許第５，８１４，４４５号に教示されるように、ｍＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写し、次いでこのｃＤＮＡを制限酵素で切断し、そして電気泳動で分離して、ｃＤＮＡフラグメントの比較を可能にすることによって比較し得る。
【００７１】
典型的には、ビオチンまたは多くの蛍光色素のいずれかを用いて、プライマーを５’末端で標識する。通常、プローブは酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼ）を用いて標識する（Ｉｎｎｉｓら（前出）中の、ＬｅｖｅｎｓｏｎおよびＣｈａｎｇ，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ　Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｅｒｓを参照のこと）が、また例えば、ビオチン−ソラレンを用いて標識され得る。プライマー標識および酵素標識プローブ合成についての詳細な典型的プロトコルは、ＬｅｖｅｎｓｏｎおよびＣｈａｎｇ（前出）によって教示される。または、プローブをまた放射活性同位体を用いて標識し得る。放射性標識されたＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブを合成する典型的なプロトコルは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に示される。通常、３２Ｐは、ＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブを標識するために用いられる。ＰＣＲ産物検出のための多くの方法は、公知である。例えば、非同位体標識プローブを用いたＰＣＲ産物検出の詳細なプロトコルを示すＩｎｎｉｓ（前出）を参照のこと。一般に、プローブとＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーションを可能にする工程があり、それに続いて、検出を可能にする１つ以上の現像工程がある。
【００７２】
例えば、ビオチン化ソラレンプローブを用いる場合、ハイブリダイズしたプローブをストレプトアビジンＨＲＰ結合体と共にインキュベートし、次いで色素原（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））と共にインキュベートする。あるいは、実施者が放射標識プローブを用いることを選択した場合、プローブがハイブリダイズしたＰＣＲ産物をオートラジオグラフィによって検出し得る。別の例として、増幅の間にビオチン化ｄＵＴＰ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＤ）を使用し得る。次いで、標識されたＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動して、ナイロンフィルターにサザン転写し、そして例えば、ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ検出システムによって、検出し得る。取りこまれたビオチン化ｄＵＴＰを検出するプロトコルは、例えば、Ｉｎｎｉｓら（前出）中の、Ｌｏら，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｄＵＴＰに示される。最後に、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで泳動して、そして核酸を特異的に認識する色素（例えば、エチジウムブロマイド）によって核酸を検出し得る。
【００７３】
Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，米国特許第５，８０７，６８０号は、示差的に発現したｍＲＮＡを同時に同定する方法および相対的濃度を測定する方法を教示する。アンカープライマーを用いてｃＤＮＡを形成し、次いでＰＣＲを行う工程を含む技術は、組織に発現されるほぼ全てのｍＲＮＡを、ゲル上の異なるバンドとして可視化を可能にし、このバンドの強度は、ｍＲＮＡの濃度におよそ対応する。
【００７４】
別の群の技術は、相対的な転写発現レベルの分析を用いる。最近、４つのこのようなアプローチが開発され、包括的なハイスループットアッセイを可能にする。第１に、（上記の参考文献に記載されるように）サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写して、そして５’末端および３’末端のシングルパス（ｓｉｎｇｌｅ　ｐａｓｓ）配列決定に供して、試験サンプルおよびコントロールサンプル中に発現される遺伝子についての、発現配列タグを規定し得る。異なるサンプルに由来するタグの相対的な表示の列挙は、サンプルにおける遺伝子転写物のおよその相対的表示の概算を提供する。
【００７５】
第２に、ＥＳＴにおけるバリエーションが開発され、遺伝子発現の連続分析（すなわち、「ＳＡＧＥ」）として公知であり、これは、大量の転写物の定量的かつ同時の分析を可能にする。この技術は、短い診断用配列タグの単離および配列決定を使用して、標的機能に特有の遺伝子発現パターンを明らかにし、そして例えば、正常細胞および腫瘍細胞における何千もの遺伝子の発現レベルの比較に用いられる。例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）　２７０：３６８−３６９；Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）　２７６：１２６８−１２７２を参照のこと。
【００７６】
第３に、ディファレンシャルディスプレイに基づいてアプローチが開発された。これらのアプローチにおいて、発現された遺伝子中のフラグメント長についての情報と合わされる場合に、特定の配列デリミタによって規定されるフラグメントを遺伝子の特有の識別物として用い得る。次いで、細胞内で発現された遺伝子の相対的表示は、この遺伝子に関連するフラグメントの相対的表示によって評価され得る。このアイデアを利用するために開発されたいくつかのアプローチの一部の例は、Ｇｅｎｅ　Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．によって用いられる差示的に発現された配列の制限酵素分析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｎａｌｙｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；「ＲＥＡＤＳ」）およびＤｉｇｉｔａｌ　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって用いられる、総遺伝子発現分析（ｔｏｔａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ；「ＴＯＧＡ」）である。ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、例えば、差示的に発現される遺伝子のＰＣＲによる同定のためのＤｅｌｔａＴＭ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔを販売している。
【００７７】
第４に、好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション分析についての多くの技術のうち１つを用いて、検出が実施される。これらのアプローチにおいて、目的のサンプル由来のＲＮＡを通常、逆転写に供して、標識されたｃＤＮＡを得る。次いでｃＤＮＡを、典型的には、チップまたは他の表面上に既知の順序で整列させた、公知の配列のオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡにハイブリダイズする。標識されたｃＤＮＡがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの位置は、ｃＤＮＡについての配列情報を提供する一方で、ハイブリダイズした標識されたＲＮＡまたはｃＤＮＡの量は、目的のＲＮＡまたはｃＤＮＡの相対的表示の見積もりを提供する。さらに、この技術は、２つ以上の異なる検出可能標識を用いた、同時ハイブリダイゼーションを可能にする。次いでハイブリダイゼーションの結果は、サンプルの相対的発現の直接の比較を提供する。
【００７８】
ハイブリダイゼーション分析のための多くのキットが市販されている。これらのキットは、フィルター、顕微鏡スライド、マイクロチップおよび質量分析法による技術を含む、高密度フォーマットでの特定のＲＮＡまたはｃＤＮＡの同定を可能にする。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ）は、目的の遺伝子の高い精度の配列決定のためのアレイ内に、既知の配列、長さおよび位置を有する、何千もの異なるオリゴヌクレオチドプローブを備えたＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ　Ｐｒｏｂｅアレイを販売する。ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＡｔｌａｓＴＭ　ｃＤＮＡ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｒｒａｙは、５８８個の選択された遺伝子の発現パターンのモニタリングを可能にする。Ｈｙｓｅｑ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のＧｅｎｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｍｏｄｕｌｅは、事前に配列情報がなくとも細胞あたり１コピーのｍＲＮＡの分解能でＲＮＡのハイスループットスクリーニングを可能にする。Ｉｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、例えば、整理されたヒト癌遺伝子およびシグナル伝達遺伝子の規則正しいオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する。この分野において、他の会社によって使用される技術は、例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：３９６−３９９（１９９８）において議論される。
【００７９】
（３．標識）
本発明の方法において、発現レベルの変化を検出するために、タンパク質および遺伝子の両方を標識し得る。用語「標識」は、分光学的手段、光化学的手段、生物化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段によって検出可能な、組成物をいう。例えば、有用な核酸標識およびタンパク質標識は、以下を含む：３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、電子密度試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ　ｒｅａｇｅｎｔ）、酵素（例えば、通常ＥＬＩＳＡにおいて使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質。
【００８０】
広範な種々の標識および結合体化技術は、公知であり、科学的文献および特許文献の両方において広範に報告されており、一般に本発明に対して、核酸、増幅された核酸およびタンパク質の標識のために適用可能である。適切な標識としては、放射ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子などが挙げられる。標識剤は必要に応じて、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質または他のポリマー（例えば、アフィニティーマトリックス、炭水化物または脂質）を含む。標識された核酸または標識されたタンパク質の検出は、多くの方法（免疫ブロッティング、放射性マーカーまたは生物発光マーカーの追跡、サザンブロット、ノザンブロットまたはサイズ、電荷もしくはアフフィニティーに基づいて分子を追跡する他の方法を含む）のいずれかによって実施され得る。使用される特定の標識または検出可能部分および特定のアッセイは、本発明の重大な局面ではない。
【００８１】
検出可能部分は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料であり得る。このような検出可能な標識は、ゲル、カラムおよび固体基材の分野においてよく開発されており、そして一般にこのような方法において有用な標識は、本発明に適用可能であり得る。従って、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生物化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明における有用な標識としては、以下が挙げられる：蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、ｌ２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、ＬａｃＺ、ＣＡＴ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび、マーカー遺伝子産物としてもしくはＥＬＩＳＡにおいてのいずれかで検出可能な酵素として、通常使用される他の酵素）、核酸インターカレーター（例えば、エチジウムブロマイド）および比色定量標識（例えば、金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ）ならびに電子トランスポンダー（例えば、米国特許第５，７３６，３３２号）。
【００８２】
蛍光標識は、単一種有機分子に限定されず、無機分子、有機分子および／または無機分子の多分子混合物、結晶、ヘテロポリマーなどを含むことが理解される。従って、例えば、シリカシェルに閉じ込められるＣｄＳｅ−ＣｄＳコアシェルナノクリスタルは、生物学的分子に結合するために容易に誘導され得る。Ｂｒｕｃｈｅｚら、Ｓｃｅｉｎｃｅ（１９９８）２８１：２０１３−２０１６。同様に、高蛍光量子ドット（硫化亜鉛キャップカドニウムセレン化合物）は、超高感度生物学的検出における使用のための生物分子に共有結合的に結合する。ＷａｒｒｅｍおよびＮｉｅ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８１：２０１６−２０１８。
【００８３】
標識は、当該分野で周知の方法に従って所望の核酸またはタンパク質に直接的にまたは間接的に結合する。上に示されるように、広範の種々の標識は、必要とされる感度、化合物の結合の容易さ、安定性必要条件、利用可能な装置および処分可能な設備に依存して標識を選択し、使用され得る。非放射活性標識は、しばしば間接的な手段によって結合される。一般的にリガンド分子（例えば、ビオチン）は、ポリマーに共有結合的に結合される。次いで、リガンドは、本来検出可能であるか、またはシグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物）に共有結合的に結合されるかのいずれかである抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。多くのリガンドおよび抗リガンドは、使用され得る。リガンドは、天然の抗リガンド（例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾール）を有する場合、標識された抗リガンドと組み合わせて使用され得る。あるいは、任意のハプテン化合物または抗原化合物は、抗体と組み合わせて使用され得る。
【００８４】
標識は、また、例えば、酵素またはフルオロフォア（ｆｌｏｕｒｏｐｈｏｒｅ）との結合によって単一生成化合物に直接的に結合され得る。標識として目的の酵素は、主に、ハイドロラーゼ（特に、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ）またはオキシドレダクダーゼ（特にペルオキシダーゼ）である。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、アンベリフェロン、蛍光緑色タンパク質などが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタルジンジオン（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）（例えば、ルミノール）が挙げられる。
【００８５】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が、放射活性標識である場合、検出のための手段としては、シンチレーションカウンター、近接カンウンター（シンチレーションを備えるマイクロプレート）またはオートラジオグラフィーにおけるような写真用フィルムが挙げられる。標識が、蛍光標識である場合、適切な波長の光を用いて蛍光色素を励起すること、そして例えば、顕微鏡によって、目視検査によって、写真用フィルムを介して、電荷結合デバイス（ＣＣＤＳ）または光電子増倍管のような電子検出器などの使用によって、得られた蛍光を検出することによって検出され得る。同様に、酵素学的標識は、酵素のための適切な基質を提供すること、および得られた反応産物を検出することによって検出され得る。最後に、単純な比色定量の標識は、しばしば、標識と結合する色を観察することによって簡単に検出される。従って、種々のディップスティックアッセイにおいて、結合した金色は、しばしばピンク色に見えるが、種々の結合してビーズは、ビーズの色に見える。
【００８６】
（Ｆ．毒性との相関分子プロフィール）
本発明は、既定の毒性を有する化学的組成物の絶え間なく拡大する（ｅｖｅｒ−ｗｉｄｅｒｉｎｇ）群と試験ＬＳＣとを接触することによる分子プロフィールのライブリーの編集の複数の反復を考える。多くの化学的組成物の毒性および生物学的効果は、すでに、以前の動物試験または臨床試験を介して公知である。任意のこのような情報は、ＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質発現の変更と共に注意深く留意される。多数の化学的組成物または薬剤に関する試験からのデータが集められるように、データはライブラリーから集められる。別個のライブラリーは、各型の毒性について維持され得る；好ましくは、実施された全ての試験の結果およびＬＳＣが暴露された薬剤に関する任意の利用可能な毒性情報を記録する単一のデータベースが維持され得る。好ましくは、生物学的効果もまた、留意される。過去の経験によると毒性の生物学が、より理解される場合、生物学的効果は、しばしば、特定の毒性に関連するか、または特定の毒性に対するマーカーになることが示される。
【００８７】
実施形態の一群において、（これは、表１に列挙される１つ以上のＬＳＣを含み得る）既定の毒性を有する１つ以上の化学的組成物と接触する、１つ以上の型のＬＳＣの分子プロフィール（これは、表２に列挙される１つ以上のＬＳＣを含み得る）を含むライブラリーが、編集される。
【００８８】
（表２　ＬＳＣの型の例）
【００８９】
【表２】
2004503256.tif 000003
本発明は、化学的組成物と試験ＬＳＣとの接触の各反復は、化学的組成物および／またはＬＳＣ型に特徴的な、遺伝子の発現パターンまたはタンパク質の発現パターンあるいは両方を産生することが考えられる。類似の毒性の合理的な多数の化学的化合物の遺伝子またはタンパク質の発現における改変の決定は、毒性に関連する、遺伝子の発現パターンまたはタンパク質発現のパターンあるいは両方が決定され得るように所望である。類似の毒性を有する薬物のクラスに共通するＬＳＣ細胞における遺伝子またはタンパク質発現パターンの変化は、関連する生物学および毒性を有するような化合物を認識するために有用である代理の分子プロフィールとして役立つ。これは、以前に試験されていない化合物に関して予測的な力を本発明に与える遺伝子またはタンパク質の発現および毒性におけるこれらの改変の相関である。
【００９０】
毒性と遺伝子発現パターンまたはタンパク質の発現パターンとの相関は、任意の簡便な手段によって実施され得る。例えば、パターンの視覚的な比較は、異なる型の毒性に関連するパターンを決定するために実行され得る。より簡便には、相関は、以下の節に考察される統計学的なプログラムの１つを使用する、コンピューターによって行なわれ得る。好ましくは、神経ネットワークプログラムは、パターン認識のために詳細に設計されているので、相関は、非パラメーターの統計学的方法または神経ネットワークプログラムを使用するコンピューターによって実施される。一旦、特定の毒性に対するバイオマーカーである発現マーカーの相関が、作製されれば、再び、コンピューターによって簡便に、新しいまたは未知の化学的組成物によって誘導される遺伝子の発現パターンまたはタンパク質の発現パターンと既知のパターンの比較が行なわれ得、発現の最も近接した一致を提供し得る。次いで、パターンを再調査して、新しいまたは未知の化学物質のありそうな毒性を推定する。
【００９１】
（Ｇ．試験化学的組成物の毒性の分類および順位付け）
試験化学的組成物の分子プロフィールは、前節に記載されるような試験化学組成物によって接触されるＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質の発現における変更を検出することによって確立され得る。一旦、試験組成物の分子プロフィールが決定されれば、既定の毒性を有する化学的組成物の分子プロフィールと比較され得るか、または好ましくは、既定の毒性を有する化学的組成物の分子プロフィールのライブラリーと比較される。このような比較の結果は、試験組成物が、毒性であるか否か、どの型の毒性か、および他の既知の毒性組成物と比較してどのような毒性かの可能性を推定するために、情報を提供する。
【００９２】
本発明を実施する目的のために、ＬＳＣ細胞におけるその分子プロフィールに基づく試験組成物の毒性の推定は、１００％正確である必要はない。薬物開発の有効性および費用に対する主要な肯定的な影響を有するために、１つのみが、より少ない毒性の可能性を適度に増大し、従って、より首尾よい薬剤候補は、例えば、新しい薬物リードの優先順位のついたリストの上半分にある。
【００９３】
前の節に留意されるように、化学的組成物に曝露されるＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質の発現における変更は、当該分野で公知の多数の手段のいずれかによって検出され得る。ＭＳによって決定されるタンパク質発現は、出力データが、典型的に質量分析計に連結されるコンピューターに直接入力され、そして即座に種々の計算に利用可能であるので、このような比較に特に都合がよい。変更が、グラフ表示に影響されやすい場合、ＭＳが検出の手段として使用され、直接比較は、コントロールＬＳＣと比較されるタンパク質の発現に対する化学的組成物の効果から構成される。変更が、例えば、多数の読み出しを生じるＥＬＩＳＡによって検出される場合、次いで、多数の読み出しは、タンパク質の発現を定量するために使用され得る。遺伝子発現に関して、ノザンブロットは、プローブ化された各ＲＮＡについて存在するＲＮＡの量に相関し得る。遺伝子発現が、ハイブリダイゼーションアッセイによって検出される場合、試験ＬＳＣおよびコントロールＬＳＣ由来の核酸についてのハイブリダイゼーションのパターンは、比較のための基礎を提供する。
【００９４】
分子のプロフィールの比較は、当該分野で公知の多数の手段によって行なわれ得る。通常、計算から得られたグラフは、例えば、ファイルフォルダーなどに保存され得、そしてコントロールと比較される発現の通常のパターンおよび差異を識別するために視覚的に調査され得る。簡便には、しかし、このデータは、コンピューターによって保存され得、そして比較され得る。プログラムは、例えば、質量分析データと比較するために利用可能である。比較の１つの形態は、「サブトラクティブな計算」およびグラフ表示の使用に基づき、試験化学的組成物（「試験サンプル」）と接触するＬＳＣのタンパク質発現に対するコントロールＬＳＣ（「コントロールサンプル」）におけるタンパク質発現を比較する。この型の比較において、コントロールサンプルによって発現される各タンパク質の量は、試験サンプルによって発現される量から減算される。コントロールサンプル値は、横線によって示され、そして異なる量において発現される任意のタンパク質は、試験サンプルの発現が、コントロールの発現と異なる量を示す線の高さを有し、線の上または線の下（それぞれ、コントロールの発現と比較して正の量および負の量を示す）として示される。この方法は、タンパク質発現における差異に注目する。同様の様式において、プログラムはまた、発現パターンにおける任意の差異が、容易に識別され得るように２つ以上の試験サンプルの発現と比較するために使用され得る。発現のパターンがより類似すると、２つの薬剤の効果および毒性の型がより類似することが予想される。
【００９５】
比較のこの形態は、さらに図１に例示される。これは、考察の明確さのために単独で提供される。図１は、ＬＳＣによって発現される核タンパク質おける差異を例示する。上部パネル（パネル１Ａ）は、質量分析計からの読み取りのハーフトーン再生（ｈａｌｆ−ｔｏｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）である。長軸にそってシートを見ると、上のバンドは、コントロール（試験化学組成物の非存在下において増殖したＬＳＣ）に対するマススペクトルであり、中間のバンドは、添加された試験化学的化合物（試験化合物Ｉ）の存在下で増殖したＬＳＣに対するスペクトルであり、そして図１Ａの下のバンドは、第２の試験化学的化合物（試験組成物ＩＩ）に曝露されたＬＳＣによって発現される核タンパク質のマススペクトルである。
【００９６】
図１Ｂおよび図１Ｃは、試験化学的組成物（「試験ＬＳＣ」）の１つと接触したＬＳＣと、化学的組成物を添加されていない標準組織増殖培地において増殖するコントロールＬＳＣとの間のタンパク質発現レベルにおける差異を図によって例示する。これらのパネルは、それぞれの試験ＬＳＣとコントロールとの間の同一のタンパク質のコンピューターの減算を例示して、試験ＬＳＣとコントロールＬＳＣとの間の発現における有意な差異であるこれらのタンパク質のみを示す。各バーは、単一のタンパク質を示し、そしてバーの長さは、コントロールＬＳＣによって発現された量と比較される試験組成物に曝露されたＬＳＣによって発現されるタンパク質の量を示す。中央の線より上のバーは、試験ＬＳＣが、コントロールＬＳＣが発現するよりも多いタンパク質を発現することを示す；線より下のバーは、試験ＬＳＣが、コントロールのタンパク質より少ないタンパク質を発現することを示す。
【００９７】
図１Ｂは、コントロールＬＳＣと比較される試験組成物Ｉの存在下で増殖したＬＳＣによって発現される核タンパク質における差異を例示する。図１Ｃは、試験組成物ＩＩの存在下で増殖するＬＳＣによって発現される核タンパク質およびコントロールにおける差異を例示する。（試験ＬＳＣとコントロールＬＳＣの両方は、分化／発生／増殖の同じ時点にある。）これらの例示の図において、左から図１Ｂおよび図１Ｃを読むと、最初に出くわすバーは、両方の図に関して同じ位置におけるラインより上であるが、バーの高さは、図１Ｃのほうがより高い。これは、試験ＬＳＣの両方の群が、コントロールを発現するよりもこのタンパク質をより発現するが、試験組成物ＩＩと接触する細胞は、試験組成物Ｉと接触する細胞が発現するよりもかなり多く発現することを示す。
【００９８】
図１Ｃの軸のＸまたは分子量にそって続けると、出くわす次の４つのバーは、図１Ｂにおける対応物を有することを示す。さらに図のそれぞれにおいて、同じ３つのタンパク質を示すバーは、線の下にあるが、同じ４番目のタンパク質についてのバーは、線より上にある。再び、線の高さは、図１Ｃと図１Ｂの間では異なる。従って、この例示において、検出された最初の５つの核タンパク質に関して、試験化合物Ｉおよび試験化合物ＩＩと接触したＬＳＣは、異なるレベルの発現であるが、同じパターンのタンパク質発現を表示することを示す。それぞれのこれらのタンパク質のそれぞれおよび全体の発現パターンは、未知の化学組成物（例えば、新しい潜在的治療法）が、試験組成物の組織毒性を有することを示すプロフィールに含まれる候補である。逆に、図１Ｃの４０００ダルトン分子量ラインの右に例示されるような検出される第１のタンパク質は、図１Ｂにおける対応物（またはコントロール細胞のレベルとは異なるレベルで発現される点での少なくとも１つの対応物）を有さないことを示す。このタンパク質は、試験化学的組成物の組織／器官毒性の正常の経路を示したタンパク質とみなされない。同じ組織／器官に対する他の毒素の発現経路とこのタンパク質は相関するが、このタンパク質は、試験化学的化合物によって示される同じ組織／器官の対する毒性に関し得る。同様の分析が、２つのグラフにおいて例示される他のタンパク質においてなされ得る。
【００９９】
比較の別の形態は、考察の明確さのためだけに提供される、図２、３および４において例示される。これらの図は、２つの化学的組成物のうちの１つに曝露されたコントロールサンプルによって、およびコントロールサンプルによって発現された小核タンパク質、小細胞質タンパク質および大細胞質タンパク質ならびにサンプルによって発現されるタンパク質の量を図で示す。これらのグラフは、視覚的に比較され得、そして発現したタンパク質および量は、手動で記録した。図２は、上記のような３つのＬＳＣ群における小核タンパク質の発現を比較する。これらのグラフにおいて、パネルにおける各バーは、単一のタンパク質を示すが、バーの長さは、コントロールＬＳＣと比較される発現した量の比較ではなく発現したタンパク質の相対的な量を示す。図２において、上のパネル２Ａは、標準的な組織培養培地中のＬＳＣに加えて、化学的組成物に曝露されないＬＳＣにおいて、質量分析によって決定されるような、タンパク質発現レベルのグラフである。真ん中のパネル２Ｂは、試験化合物Ｉに曝露されるＬＳＣのタンパク質の発現のレベルを例示する。そして、下のパネル２Ｃは、試験組成物ＩＩと接触するＬＳＣの発現のレベルを例示する。これらのパネルにおいて、相対的な値として、タンパク質の発現レベル（Ｙ軸におけるプロットが示される）は、分子量（Ｘ軸にプロットして示される）に対してプロットされる。例示されるようなパネルの視覚的な比較は、発現のレベルは異なるが、試験された２つの化学的組成物に曝露されるＬＳＣによって発現されるタンパク質のいくつかが、同じであり、そして他のものは異なり、そして共にいずれの組成物にも曝露されないコントロールＬＳＣが示すものと異なる発現パターンを示すことを明らかにする。
【０１００】
図３は、前述の段落において考察されるのと同じＬＳＣの３つの群における小細胞質タンパク質の発現のレベルを例示する。これらのパネルは、図２のように同じ順序に整列される。もう１度、各群に対する発現レベル（Ｙ軸にプロットして示される）は、タンパク質の分子量（Ｘ軸にプロットして示される）に対してプロットされる。もう１度、例示されるようなパネルの視覚的な比較は、発現のレベルにおいて異なるが、試験された２つの化学的組成物に曝露されたＬＳＣによって発現されるタンパク質のいくつかが、同じであり、そして他のものは、異なることを明らかにする。
【０１０１】
同様に、図４は、上に考察されるＬＳＣの同じ群によって発現される大きい細胞質タンパク質のグラフ分析を例示する。もう１度、質量分析計によって決定される発現のレベルは、Ｙ軸にプロットされ、一方で分子量は、Ｘ軸にプロットされる。もう１度、明確な類似性および明確な差異が、試験化学的組成物に曝露されたＬＳＣのタンパク質発現パターン間、およびこれらのタンパク質発現パターンと試験化学的組成物のいずれかへの曝露なしに増殖されたＬＳＣのタンパク質発現パターンとの間に観察され得る。
【０１０２】
薬物が、複雑かつ固有のタンパク質発現パターンを誘導し得ることは上のような図から明らかである。いくつかのタンパク質は、コントロールＬＳＣにおけるタンパク質発現と比較してより小量で発現されるか（または「下方制御」）され、そして他は、コントロールと比較してより多量に発現されるか（または（「上方制御される」）。さらに、化学的組成物は、同じタンパク質のいくつかに影響を与え得、従って、共通のサブパターンを共有し得る。
【０１０３】
例えば、図２Ｃに例示されるように、２５００ダルトンの分子量を示す線の右に、強く発現したタンパク質を表す、Ｙ軸における１５単位を超える、高い線が存在する。パネル２Ｂおよび２Ａまでの線に続いて同じタンパク質が、試験組成物Ｉと接触するＬＳＣおよびいずれの組成物とも接触しないコントロールＬＳＣの両方における高レベルで発現されることが示される。従って、このタンパク質は、サンプルが採取される発生の時点でＬＳＣにおいて高く発現するようであるが、発現のレベルにおけるいくつかのバリエーションが存在する。しかし、パネル２Ｃの右につづき、そして同じ比較をすると、次の存在するタンパク質はまた、試験組成物Ｉに曝露されるＬＳＣにおいておよそ同じ量で存在することが示されるが、コントロールＬＳＣによって全て発現されない。従って、このタンパク質は、他の組成物および他の種類の毒性から試験化学的組成物の組織／器官毒性を有する化学的組成物を区別するための候補である。
【０１０４】
好ましくは、結果は、検索可能なデータ分野に記録される化合物の公知の毒性についての情報を有する、コンピューターデータベースに配置される。タンパク質発現または遺伝子発現における変更を検出する他の形態からのデータの入力はまた、手動またはコンピューターデータベースにおいて再検討され、そして記録される。例えば、ＥＩＬＳＡからの値またはウエスタンブロットにおいて同定されるタンパク質は、コントロールサンプルおよび試験サンプルにおいて発現されるタンパク質の型および量を同定するために記録され得る。同様に、ノザンブロットにおけるパターンまたはオリゴヌクレオチドアレイ上のハイブリダイゼーションパターンは、コントロールサンプルおよび試験サンプルの遺伝子発現を同定するために記録され得る。情報は、手動で維持され得るが、好ましくは、コンピューター検索可能な形態で維持される。
【０１０５】
標準データベースプログラム（例えば、Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ　Ｄａｔａ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（Ｓｙｂａｓｅ，Ｉｎｃ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）またはＯｒａｃｌｅ８（Ｏｒａｃｌｅ　Ｃｏｒｐ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ　Ｓｈｏｒｅｓ，ＣＡ））は、情報を保存および比較するために使用され得る。あるいは、このデータは、例えば、Ｐａｒｔｅｋ　Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）から入手可能な特別に設計されたプログラムにおいて記録または分析（あるいは両方）され得る。
【０１０６】
さらに、質量分析計のような、統合統計システムを販売する会社は、結果を記録するためのソフトウェアを内蔵した機械を提供する。このような会社としては、Ｆｉｎｎｉｇａｎ　Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ），Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｗａｌｋ　ＣＴ），Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ　ＣＡ），およびＨｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）が挙げられる。同様にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，　ＣＡ）およびＩｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ　ＣＡ）のような会社は、ハイブリダイゼーションアッセイの走査画像を記録および分析するために独自の画像認識アルゴリズムを維持するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションサービスを提供する。
【０１０７】
好ましい実施形態において、このデータは、神経ネットワーク技術によって記録および分析され得る。神経ネットワークは、データセットにおけるパターン認識のために特別に設計された複雑な非直線系式である。１つのこのようなプログラムは、Ｗａｒｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）製のＮｅｕｒｏＳｈｅｌｌ　ＣｌａｓｓｉｆｉｅｒＴＭ分類アルゴリズムである。他の神経ネットワークプログラムは、Ｐａｒｔｅｋ，Ｉｎｃ．，ＢｉｏＣｏｍｐ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＷＡ）およびＺ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＬＬＣ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から入手可能である。
【０１０８】
（Ｈ．アレイリーダーを適合させる）
１つの実施形態において、本発明は、遺伝子またはタンパク質発現における変化をそれぞれ検出するための、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのアレイまたは結合したタンパク質のアレイの形成に関する。このようなアレイは、アレイリーダーによって走査または読み取りされ得る。
【０１０９】
代表的には、このアレイリーダーは、アレイ上の標識（例えば、結合したタンパク質またはハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド）のパターンを読み取るために適合され、１以上のデータファイル（これは、既知または未知の毒性化学組成物と接触させた哺乳動物ＬＳＣの、複数の遺伝子発現プロフィールまたはタンパク質発現プロフィールを有する）を記憶し、または（例えば、外部ドライブで、またはインターネットを介して）アクセス可能なコンピューターに作動可能に連結された最適なスキャナーを有する。しかし、アレイリーダーは、光学的に検出できない標識を「読み取る」ために適切な検出デバイス（たとえば、電子中継器）に適合され得る。
【０１１０】
（Ｉ．高スループットスクリーニングにおける使用）
本発明の方法は、高スループットスクリーニングに容易に適合され得る。高スループット（「ＨＴＰ」）スクリーニングは、大きな製薬会社においてすでに開発された多数の特徴づけされていない化合物ならびにコンビナトリアルケミストリーによって現在合成されている新規化合物の氾濫に起因して、非常に望ましい。本発明を使用して、数百の化学組成物がＬＳＣで試験され得、そして遺伝子またはタンパク質の発現またはこれら両方において得られた変更を、既知の化学組成物の毒性と比較して、新規化合物が保有する毒性の型およびおそらく毒性の程度を予測し得る。次いで、受容可能な毒性プロフィールを有するこれらの組成物は、さらなるレベル試験について考慮され得る。
【０１１１】
ＨＴＰスクリーニングは、自動化されかつ統合された培養システム、サンプル調製（タンパク質またはＲＮＡ／ｃＤＮＡ）、および分析を使用することによって容易にされ得る。これらの工程は、標準的なロボットアームを使用する通常の実験器具、またはより最近開発されたマイクロチップおよび微小流動デバイス（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）によって開発されたもの、米国特許第５，８００，６９０号においてＯｒｃｈｉｄ　Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｓｔｏｎ、ＮＪ）によって記載されるもの、１９９７年１０月２５日のＮｅｗ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔに記載されるもの、および他の会社によるもの（これらは、非常に低量の試薬を使用する自動化分析の方法を提供する）において実行され得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｒ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：２６２６−２６３０（１９９７）；Ｔｕｒｇｅｏｎ，Ｍ．、Ｍｅｄ　Ｌａｂ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　Ｒｅｐｔ，Ｄｅｃ．１９９７、１頁を参照のこと。
【０１１２】
（実施例）
（実施例１．毒性スクリーニングのために化学的化合物を選択する）
特定の分類の毒性に分類される組成物を使用して、分子プロフィールを確立し、そして特定の毒性についてのライブラリーを編成する。表１は、特定の組織もしくは器官に対して、または発生段階の間に毒性であることが公知の、多くの組成物を列挙する。特に、肝臓毒性を引き起こすこれらの組成物を、各組成物を接触させたＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質の発現パターンの変更を決定することによって、その分子プロフィールについて評価する。それによって、肝臓毒性を有する組成物の分子プロフィールを含むライブラリーを、編成する。心臓血管毒性を引き起こすこれらの組成物を、同様に、その分子プロフィールについて評価し、そしてライブラリーを編成する。さらに、中枢神経系に対する毒性を有する組成物についての分子プロフィールおよびライブラリー、ならびに発生の毒性を有する組成物についての分子プロフィールおよびライブラリーを、ＬＳＣシステムを使用して同様に確立する。上記のような実験手順を、一般的に、そして以下の実施例においてより詳細に、特定の型の毒性を有する組成物についての分子プロフィールおよびライブラリーを編成するために続ける。
【０１１３】
特定の疾患に対する活性を有することが既知であるかまたは疑われる薬物を使用して、毒性評価のための分子プロフィールおよびライブラリーを確立し得る。例えば、表１に列挙される、類似の毒性を有する抗新生物薬物を使用して、これらの薬物に曝露されたＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質の発現パターンにおける変更を決定することによって分子プロフィールを編成し得る。同様に、類似の毒性を有する抗生物質をまた、ＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質の発現パターンにおける変更について評価し得る。糖尿病を制御する薬物、脂質レベルを低下させるための薬物、または抗炎症性薬物もまた使用される。一旦、類似の毒性を有する特定の型の薬物の分子プロフィールを含む混成ライブラリーが確立されると、これを使用して、潜在的な毒性についての類似の型を導く新規の薬物についてスクリーニングし得る。また、上記のような実験手順を、一般的に、そして以下の実施例においてより詳細に記載されるように、分子プロフィールおよびライブラリーのために、ならびに新規薬物が導く毒性の分類分け／順位付けのために続ける。
【０１１４】
（実施例２．組織／器官毒性に関して、化学的薬剤についてのタンパク質プロフィールを確立する）
この実施例は、肝臓幹細胞の培養、所定の組織毒性または器官毒性を有する異なる化学的薬剤に対する肝臓幹細胞の曝露、および肝臓幹細胞におけるタンパク質発現の変化の決定を実証する。
【０１１５】
（細胞の単離）
ヒト肝臓前駆細胞を、以下に記載の方法に従って単離、精製および培養増殖させる：
（方法１）
肝臓前駆細胞を、Ｒｅｉｄら、米国特許第５，５７６，２０７号および同第５，７８９，２４６号に従って、単離する。簡潔には、肝臓切片を、５００〜５０００ｍｇ／Ｌのグルコースおよび２〜１０％の抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含む氷冷ＰＢＳ溶液に配置する。この肝臓切片を、切り刻み、そして１ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む生理食塩溶液中に調製されたコラゲナーゼ、プロナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼを含む溶液で連続消化する。消化を、攪拌水浴中で３７℃で約２０分間行う。次いで、部分的に消化した組織を、重力によって組織篩を通して裏ごしし、未消化の残留物を２回再消化する。次いで、収集した細胞を、生理食塩水溶液で洗浄する。細胞を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ支持体のような基底表面を介して極性化および補給させるように、ＩＶ型コラーゲンのマトリックス上またはマトリックス中に配置する。マトリックス結合細胞に、胚性肝臓誘導ストロマ細胞補給層を供給し、そして０．４ｍＭ未満のカルシウムおよび１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０μＵ／ｍｌの成長ホルモン、２０ｍＵ／ｍｌのプロラクチン、１０μｇ／ｍｌのグルカゴン、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０−８Ｍのデキサメタゾン、１０−９ＭのＴ３、３×１０−１０Ｍの銅、および１０−１０Ｍの亜鉛を含有する基本培地（例えば、ＲＰＭＩ　１６４０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１０、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２）（これらを含む培地を、本明細書中以降、「培地Ａ」とよぶ」）中で培養する。あるいは、この培地は、０．４％のウシ血清アルブミン、１リットル当たり７６ｍＥｑの遊離脂肪酸混合物（３１％のパルミチン酸、２．８％のパルミトレイン酸、１１．６％のステアリン酸、１３．４％のオレイン酸、３５．６％のリノール酸および５．６％のリノレン酸）をさらに含む（これらを含む培地を、本明細書中以降、「培地Ｂ」と呼ぶ）。１０−６Ｍのデキサメタゾン、０．１〜１００μｇ／ｍｌのインスリン、５０ｎｇ／ｍｌの多刺激活性（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２５〜１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０−４Ｍのノルエピネフリン、２５μｌ／ｍｌの造血素および１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含む培地Ａまたは培地Ｂをまた、使用し得る。この方法によって獲得された肝臓前駆細胞を、以下に記載のように本発明に従って分析する。
【０１１６】
（方法２）
肝芽（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔ）を、Ｒｅｉｄら、米国特許第６，０６９，００５号に記載の方法に従って単離する。簡潔には、肝臓を、妊娠１４日目のラット胎仔から切り出し、そして新鮮な氷冷Ｈａｎｋ’ｓ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）中に配置する。全ての組織を収集し、そして非肝組織を除去した後、ＨＢＳＳ−５ｍＭ　ＥＧＴＡを、１ｍＭの最終ＥＧＴＡ濃度まで添加する。次いで、肝臓を、穏やかに６〜８回粉砕し、組織を部分的に分解し、次いで、４００ｇで５分間、４℃で遠心分離する。引き続く全ての遠心分離工程を、同じ設定で実施する。上清を除去し、そして細胞および組織のペレットを、１ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むＨＢＳＳ中の０．６％のコラゲナーゼＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）中に再懸濁し、穏やかに粉砕し、次いで、３７℃で１５分間攪拌する。分散した細胞をプールし、１ｍＭのＥＧＴＡを含むＨＢＳＳ中に懸濁し、そして４６μｍの組織収集器（Ｂｅｌｌｃｏ　Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）を通して濾過する。細胞懸濁物を、遠心分離し、そして細胞を、ＭＥＭアミノ酸、ＭＥＭビタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、鉄飽和トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、遊離脂肪酸（７．６ｍＥｑ／Ｌ）、微量元素、アルブミン（０．１％、フラクションＶ、脂肪酸フリー、Ｍｉｌｅｓ　Ｉｎｃ．、Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉｌｌ．）、ｍｙｏ−イノシトール（０．５ｍＭ）およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）を補充されたＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ−ＭＥＭ）中に再懸濁する。細胞数および生存率を、血球計算器およびトリパンブルー排除によって決定する。
【０１１７】
赤血球系細胞を除去するために、標準的な手順に従って、ウサギ抗ラットＲＢＣ　ＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｉｎｃ．、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、Ｐａ．）を用いて調製したパニング皿を使用する。０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）で希釈した抗体（０．５ｍｇ／皿）を、１００ｍｍ２の細菌学的ポリスチレンペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｊ．）に注ぐ。この皿を、表面を均一に被覆するために旋回させ、室温で約４０分間インキュベートする。被覆された皿をＰＢＳで４回洗浄し、そして使用の前に０．１％のＢＳＡを含むＨＢＳＳで１回洗浄する。
【０１１８】
３×１０７細胞までの細胞を含む細胞懸濁物を、被覆された皿中で、ウサギ抗ラットＲＢＣ　ＩｇＧと共に４℃で約１０分間インキュベートする。非接着細胞を、吸引によって除去し、そしてプレートをＨＢＳＳ−０．１％　ＢＳＡ−０．２ｍＭ　ＥＧＴＡで３回洗浄し、そして遠心分離する。この細胞ペレットを、ＨＢＳＳ−ＭＥＭに再懸濁し、そしてＲＢＣパニングを繰り返す。第二のＲＢＣパニングの後、細胞数および生存率を、再び決定する。
【０１１９】
次いで、ＲＢＣパニング後に回収された細胞を、マウスモノクローナル抗体ＯＸ−４３（１／２００＝１５μｇ／ｍｌ、ＭＣＡ　２７６、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）およびモノクローナル抗体３７４．３（１／５００〜１／７５０、Ｒ．ＦａｒｉｓおよびＤ．Ｈｉｘｏｎ、Ｂｒｏｗｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、Ｒ．Ｉ．から入手可能）と共に同時に４℃で４０分間インキュベートすることによって、懸濁物中で標識する。二次抗体は、ＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧ、重鎖特異的（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．、Ａｌａ．）およびＦＩＴＣ結合体化抗マウスＩｇＭ、重鎖特異的（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）である。
【０１２０】
分類前の細胞および分類後の細胞を、４℃でＨＢＳＳ−ＭＥＭ中で維持する。抗体標識後、１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを各サンプルに添加する。蛍光活性化細胞分類を、６０ｍＷの出力で４Ｗのアルゴンレーザーを使用し、そして１００μｍのノズルを使用して、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｃｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳＴＡＲ＋（Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実行する。４８８ｎｍの蛍光発光を、ＦＩＴＣについては５３０／３０ｎｍ帯通過フィルター、ＰＥについては５８５／４２ｎｍ帯通過フィルターの通過後に、収集する。蛍光測定を、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）対ＦＬ２（ＰＥ）の二パラメータープロット上の対数増幅を使用して実施する。蛍光が、陰性コントロール細胞の９５％より高い場合に、細胞は陽性であるとみなされる。
【０１２１】
細胞の物理学的特徴の測定のために、ＦＡＣＳＴＡＲ＋パラメーターは、ＦＳＣゲイン８およびＳＳＣゲイン８である。ＨＢＳＳを、閾値液体として利用する。表形式のデータを獲得し、そしてＬｙｓｉｓＩＩソフトウェアを使用して分析する。
【０１２２】
単一抗体に対する陽性度を決定するために、蛍光対側方散乱のドットブロットを使用する。密度プロットＦＬ１対ＦＬ２を使用して、両方の抗原の発現に関して集団を選択する。分類増強モジュールを、非直角ゲーティングのために使用し、そして目的の集団を選択するために多パラメーターゲーティングを使用する。
【０１２３】
全ての集団から分類された細胞を、基本培地としてのα−ＭＥＭを含む無血清のホルモン的に規定された培地に配置し、これに以下の成分を添加する：インスリン（１０μｇ／ｍｌ）；ＥＧＦ（０．０１μｇ／ｍｌ、Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ、Ｎ．Ｙ．）；成長ホルモン（１０μＵ／ｍｌ）；プロラクチン（２０ｍＵ／ｍｌ）；トリヨードサイロニン（１０−７Ｍ）；デキサメタゾン（１０−７Ｍ）；鉄飽和トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）；フォリン酸（１０−８Ｍ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）、遊離脂肪酸混合物（７．６ｍＥｑ／Ｌ；Ｎｕ−Ｃｈｅｋ−Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ、Ｍｉｎｎ．）；プトレシン（０．０２μｇ／ｍｌ）；ヒポキサンチン（０．２４μｇ／ｍｌ）；チミジン（０．０７μｇ／ｍｌ）；ウシアルブミン（０．１％、フラクションＶ、脂肪酸フリー、Ｍｉｌｅｓ　Ｉｎｃ．Ｋａｎｋａｋｅｅ、Ｉｌｌ．）；微量元素；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０００００２５ｍｇ／ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．８ｍｇ／ｌ）、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０００００２４ｍｇ／ｌ）、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ（０．００１２ｍｇ／ｌ）、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．００００１２ｍｇ／ｌ）、ＮＨ４ＶＯ３（０．００００５８ｍｇ／ｌ）、Ｈ２ＳｅＯ３（０．０００３９ｍｇ／ｌ）；Ｈｅｐｅｓ（３１ｍＭ）およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）［ＨＤＭ］。試薬は、他を特定しない限り、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．によって供給される。微量元素混合物は、Ｉ．Ｌｅｍｉｓｈｋａ博士、Ｐｒｉｎｓｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＪから入手可能である。
【０１２４】
各培養集団のアリコートおよび種々の細胞懸濁物のサイトスピンを、氷冷エタノールまたはアセトンと混合する。１％のＢＳＡを含むＰＢＳでの、室温で３０分間のブロッキング後、混合した細胞を、以下の一次抗体を使用して、間接的免疫蛍光によって研究する：ポリクローナルウサギ抗ラットアルブミン（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、ウサギ抗マウスＡＦＰ抗血清（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎ．、Ｃｏｓｔａ　Ｍｅｓａ、Ｃａｌｉｆ．）、モノクローナルマウス抗ヒトサイトケラチン１９（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＩＩ．）、ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＧＦ　ＩＩレセプター（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃｚｅｃｈ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｏｒｃｈｅｒｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ）、マウスモノクローナル抗ラット−Ｔｈｙ−１（ＯＸ−７、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）、モノクローナルマウス抗デスミン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）、および２５８．２６（出生後肝細胞およびいくつかの胎仔肝臓実質細胞を同定するモノクローナルマウス抗ラット抗体）（Ｒ．Ｆａｒｉｓ博士およびＤ．Ｈｉｘｏｎ博士、Ｂｒｏｗｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＲＩ）。二次抗体としては、一次抗体に対応する種特異的なローダミン結合体化抗体が挙げられる。陰性コントロールは、マウスＩｇＧもしくはウサギＩｇＧまたはマウスアイソタイプコントロールで染色された細胞からなる。新たに単離された成体肝細胞を、アルブミン染色についての陽性コントロールとして使用する。γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を、Ｒｕｔｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｈｉｓｔ．Ｃｙｔ．（１９６９）、第１７巻、５１７−５２６頁によって記載される方法を使用して、エタノール固定された細胞の免疫化学によってアッセイする。
【０１２５】
主に未成熟の前駆肝細胞を含む細胞集団を、アルブミン、α−フェトプロテインおよびＧＧＴを発現する集団として同定する。いくつかの例において、これらの細胞の同定を、これらの細胞のマーカーについてノーザンブロット分析および／またはウェスタンブロット分析によって確認し、これらの分析は、本明細書中に記載され、当該分野で公知である。
【０１２６】
得られる肝臓前駆細胞を、ＨＤＭ中で維持し、そして以下に記載のように本発明に従って分析する。
【０１２７】
（方法３）
肝臓を、妊娠１５日目のラット胎仔から切り出し、そして０．８ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を含む、氷冷したＣａ２＋フリーのＨＢＳＳ中に配置し、そして室温で約１分間穏やかに攪拌する。非肝組織の除去後、肝臓を、穏やかに粉砕し、次いで、１ｍＭ　ＣａＣｌ２および０．０６％のＤＮＡｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）を含むＨＢＳＳ中の０．６％のＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｌｏｔ　１１Ｈ６８３０、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）と共に３７℃で約１０〜１５分間攪拌する。５分間隔で、組織断片を、１ｇで堆積させる。上清を回収し、そして新鮮なコラゲナーゼ溶液を添加する。分散した細胞をプールし、５ｍＭ　ＥＧＴＡを含むＨＢＳＳ中に懸濁し、そして１ｇの下で４６μｍの組織収集器（Ｂｅｌｌｃｏ　Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）を通して濾過する。得られた細胞懸濁物を、４５０ｇの下で４℃で約５分間遠心分離する。細胞ペレットを、０．２ｍＭ　ＥＧＴＡおよび０．５％のＢＳＡを含むＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ−ＥＧＴＡ−０．５％　ＢＳＡ）中に再懸濁し、そして細胞数を、推定する。細胞生存率を、０．０４％のトリパンブルーの除外によって評価し、そして懸濁物のアリコートを、４５０ｇで約５分間遠心分離する。
【０１２８】
造血細胞および内皮細胞を、抗体被覆したポリスチレン皿上に免疫接着させる（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅ）ために、パニング皿を、標準的な手順に従って、ウサギ抗ラットＲＢＣ　ＩｇＧ（Ｉｎｔｅｒ−ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｅｗｅｌｌ、Ｎ．Ｊ．）およびマウスの全ＩｇＧ分子に対するヤギＩｇＧ（Ｍ−３０１４、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）を用いて調製する。０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）で希釈した抗体（０．５ｍｇ／皿）を、表面を均一に被覆するように１００ｍｍ２の細菌学的ポリスチレンペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｊ．）に注ぐ。この皿ぎ、そして室温で約４０分間インキュベートする。被覆された皿をＰＢＳで洗浄し、次いで使用の前に０．１％のＢＳＡを含むＨＢＳＳで洗浄する。
【０１２９】
３×１０７細胞までの細胞を含む細胞懸濁物を、被覆された皿中で４℃で約１０分間インキュベートする。非接着細胞を含む上清を、傾けて旋回させながら穏やかな吸引によって除去し、ＨＢＳＳ−ＥＧＴＡ−０．１％　ＢＳＡでの洗浄と組み合わせ、そして４５０ｇの下で４℃で約５分間遠心分離する。細胞をプールし、そしてウサギ抗ラットＲＢＳ　ＩｇＧで被覆した新たな皿を用いて再パニングする。次いで、非接着細胞を上記のように除去し、そして１×１０７／ｍｌの濃度でＨＢＳＳ−ＥＧＴＡ−０．５％　ＢＳＡで再懸濁する。次いで、富化された肝細胞を、マウスモノクローナル抗体ＯＸ−４３（１５μｇ／ｍｌ、ＭＣＡ　２７６、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）と共に４℃で４０分間同時にインキュベートする。洗浄後、肝細胞の富化を、ヤギ抗マウス全ＩｇＧ抗体で被覆した皿中で４℃で１０分間細胞をパニングすることによって達成する。非接着細胞を、上記のように除去する。
【０１３０】
得られる肝臓前駆細胞を、ＨＤＭ中で維持し（上記の方法３を参照のこと）、そして以下に記載のように本発明に従って分析する。
【０１３１】
（方法４）
肝臓前駆細胞を、Ｎａｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，５５９，０２２号に記載される方法に従って単離する。簡単にいうと、肝臓を、標準的な手順に従って成体ラットから取り出す。この肝臓を、改良したブフナー漏斗に置き、そしてＣａ２＋および０．０５ｇ／ｄｌ　ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，ＭＯ）を含む緩衝液を用いて、再循環系内で約１５〜２０分間、灌流する。次いでこの肝臓を、１．５％のＢＳＡを補充したコラゲナーゼ緩衝液を含むペトリ皿に移し、そして肝細胞を、グリソン鞘の穿孔の後に懸濁液中に遊離させ、１８５μｍナイロンシーブを通して濾過し、遠心分離によってペレットにし、そして完全培地（培地５００ｍｌあたり、６％ウシ胎仔血清および１０％ウマ血清を用いて馴化し、そして３５μｌのグルカゴン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ９２６１）、１０μｇのインスリン（Ｓｉｇｍａ＃１４０１１）、０．２５ｇのグルコース、および２５０μｌのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンを補充したＤＭＥＭ）中に再懸濁する。肝臓細胞を、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配遠心分離を使用して、亜集団に分離する。
【０１３２】
肝臓前駆細胞を得るために、大きな集団（直径約３０μｍ）の好酸性細胞（これは増殖し、そして培養において成熟肝細胞に類似の細胞に分化する）を、以下のように分離する：新鮮な単離された肝臓細胞の単一細胞の懸濁液を遠心分離し（５００×ｇ／５分）、そしてこのペレットを培地に再懸濁する。この細胞懸濁液を、「ニート（ｎｅａｔ）」Ｐｅｒｃｏｌｌおよび１×ＰＢＳの７０％ｖ／ｖ溶液の２５ｍｌにわたり重層し、そして８００×ｇで１０分間遠心分離する。（４つのうち）下方２つの帯域をプールし、洗浄し、そして２５％／５０％（ｖ／ｖ、ニートＰｅｒｃｏｌｌ／１×ＰＢＳ）不連続勾配に対して遠心分離し、明確な界面帯域およびペレットを得る。この界面（密度＝１．０３８１ｇ／ｍｌ）は、約９０％の大きな、軽い好酸性の、複数の隆起した（ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ）仁を有する単核細胞または二核細胞からなる。次いで、この方法によって得られる肝臓前駆細胞を、以下に記載するように、本発明に従って分析する。
【０１３３】
（方法５）
肝臓前駆細胞を、Ｆａｒｉｓ，ＰＣＴ公開ＷＯ００／０３００１に記載される方法に従って単離する。簡単にいうと、肝臓を切除し、細かく刻み、そして０．１Ｍ　Ｈｅｐｅｓを有するＨＢＳＳを含む懸濁緩衝液に入れる。この細かく刻んだ組織を、３７℃にて滅菌プレート上で約４０〜５０分間インキュベートする。この合わせた懸濁液を、２３０ミクロンのスチールメッシュフィルター、そして６０ミクロンのナイロンメッシュフィルターを通して連続して濾過する。フィルター上に残っている残留物を洗浄して流し、そして消化緩衝液中に入れる。この消化緩衝液は、０．０２ｇのウシ血清アルブミン、０．１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、ＣａＣｌ２（５００ｍＭ）、ＳＴＩ（０．０２５ｇ／１００ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ）、およびコラゲナーゼＩＶ型（６０単位／ｍｌ）、ｐＨ７．４〜７．５を含む、ＣＭＦ培地（Ｇｉｂｃｏ）溶液である。細胞を、振盪水浴中で３７℃でインキュベートする。２０分後、この細胞懸濁液をチューブに移し、そして重力下で沈降させる。
【０１３４】
次いで、この上清および残留物（沈降した物質）を分離する。この上清をデカントし、そして８０×ｇで５分間遠心分離する。新鮮な消化緩衝液を、細胞に添加し、そしてこの細胞を、振盪水浴中に戻す。遠心分離の後に残るペレットを、洗浄緩衝液（ＤＭＥＭ−Ｆ１２およびＢＳＡ（１ｇ／１００ｍｌ）ｐＨ７．２〜７．３）で再懸濁する。
【０１３５】
この細胞懸濁液を、６０ミクロンのナイロンメッシュフィルターを通して濾過し、次いで当容積の９０％Ｐｅｒｃｏｌｌおよび１０％　１０×ＤＭＥＭ−Ｆ１２と混合する。これを、３００×ｇで約５分間遠心分離する。このペレットを、（上記のように）洗浄緩衝液中に再懸濁し、そして１２０×ｇで約５分間、遠心分離する。次いでこのペレットを、洗浄緩衝液中に再懸濁する。
【０１３６】
ラット胆管および中皮細胞に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂ）に結合体化させたＤｙｎａｂｅａｄを細胞懸濁液に添加し、そしてローテーターで４℃にて、約１０分間インキュベートする。次いでこの懸濁液を、磁石に置き、抗体陽性細胞を取り出し、これを捨てる。この工程を、少なくとも３回以上繰り返す。抗体陰性細胞を、ＣＣＡＭ（例えば、抗ラット細胞−ＣＡＭ　１０５；Ｅｎｄｏｇｅｎ）に特異的な抗体に結合体化させたＤｙｎａｂｅａｄと共にさらなるインキュベートに供し、そして付着した幹細胞を有する抗体陽性細胞（例えば、ダブレットおよびトリプレットのような細胞クラスター）を、培養し、そしてサイトスピンする。
【０１３７】
単離された細胞の培養物を、トリプシン処理して細胞クラスターを解離させ、次いで、細胞マーカー（例えば、ＣＫ１９（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＣＣＡＭ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）、ジペプチジルペプチダーゼ−４（Ｅｎｄｏｇｅｎ））に特異的な抗体を磁気ビーズと組み合わせて曝露し、ＦＡＣＳ分類して幹細胞を富化する。
【０１３８】
この方法によって得られた肝臓前駆細胞を、以下に記載されるように、本発明に従って分析する。
【０１３９】
（試験化合物への細胞の曝露およびタンパク質発現の分析方法）
上記のように単離された細胞を、ラットの尾の腱から抽出されたＩ型コラーゲンでコーティングされたウェル中に、高密度（例えば、１ウェルあたり５０，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ２）でプレートして細胞を分化させる。所定の毒性を有する薬物（例えば、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））（これは、糖尿病の制御のために所望される薬物であり、まれにではあるが重篤な肝臓毒性を示し、最近市場から排除された）を、ＬＳＣを含むプレートの１つの群（「Ａ」群）に、約２０μＭの最終濃度で添加する。同じ日に、所定の毒性を有する別の薬物（例えば、エリスロマイシンエストレート（ｅｓｔｏｌａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ８６３０）（これは、公知の肝臓毒性を有するエリスロマイシンの形態である）を、最終濃度約５０μＭでプレートの第２の群（「Ｂ」群）に添加する。培養細胞を含むプレートの第３の群（「Ｃ１」群）を、コントロールとして働くように、薬物を添加しないで培養する。さらに、組織培養培地のみを含むプレート（「Ｃ２」群）を、培養培地中のタンパク質分解についてのコントロールとして、培養細胞を含むプレートと平行して培養する。薬物に対する細胞の曝露期間後（例えば、約１０、２０、３０および４０日後）に、培養物を収集し、細胞をＰＢＳのような緩衝液で洗浄し、次いで緩衝液（例えば、ＰＢＳ、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　−Ｘ１００を含む）中で、氷上で約１０分溶解させる。核をペレット化し、そして上清を除去し、そして分析まで−８０℃で貯蔵する。核を、０．２％ＳＤＳを有するＰＢＳのような緩衝液中で溶解させ、そしてＤＮＡを剪断するために、ダンスホモジナイズする。不溶性物質を、ペレット化し、そして核溶解物を分析まで−８０℃で貯蔵する。細胞質および核溶解物をまた、さらなるコントロールとして働くように、任意の試験化合物に対する曝露前の０日目に採取する。
【０１４０】
溶解物および培地のサンプルを、例えば、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および０．４Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液中で３倍に希釈する。希釈された溶解物または培地のアリコートサンプルを、サイジングスピンカラム（このカラムは、例えば３０ｋＤのサイズカットオフでサンプルを分画する）に入れ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および５０ｍＭ　ＮａＣｌ中で平衡化する。このカラムを、各画分について適切な力で適切な時間（例えば、７００ｇで３分）スピンする。約２５μＬの複数の画分を、カラム平衡化緩衝液を使用して、各カラムについて回収する。
【０１４１】
サンプルを、表面増強レーザー脱着／イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（「ＳＥＬＤＩ」）によって分配し、そしてタンパク質を、質量分析法によって検出する。ＳＥＬＤＩは、タンパク質を最適な表面上で捕捉することを可能にし、これは、次いで、選択されたストリンジェンシーで洗浄され得ることを可能にし、所望の特性（例えば、捕捉のために使用される表面の金属イオンに対する親和性）に従って分画を可能にする。
【０１４２】
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ順相チップ（ｎｏｒｍａｌ　ｐｈａｓｅ　ｃｈｉｐ）（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、スピンカラムによって生成された画分中のタンパク質を分離する。各画分の約１μｌのアリコートを、チップ上のスポットに沈着させ、そしてこのサンプルを室温で約５分間風乾する。０．５％のトリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）を有する５０％アセトニトリル中の飽和シナピン酸（「ＳＰＡ」）の約０．５μＬの混合物を、各スポットに適用する。このチップを再び室温で約５分間風乾し、そしてＳＰＡ混合物の第二のアリコートをアプライする。
【０１４３】
チップを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　１リーダーによって読み取る。例示的なリーダーの設定は、以下の通りである。自動モードを、ＳＥＬＤＩ定量設定でデータ収集に使用する。２セットのタンパク質プロフィールを、１つを低レーザー強度（フィルターアウト（ｆｉｌｔｅｒ　ｏｕｔ）１５）、そしてもう１つを高レーザー強度（フィルターアウト５０）、検出器設定を１０で収集する。同じサンプルスポット上の１つの位置当たり、平均１５ショットを行う。異なる溶解物由来のタンパク質プロフィールを、ＳＥＬＤＩソフトウェア（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して比較する。このプログラムは、互いに約１％以内の分子量を有する２つのタンパク質は、同一物であると仮定する。次いで、これは、コントロールサンプルに対して試験サンプルを比較して結果を定量し、そしてコントロール中の各タンパク質の量を水平線で示し、コントロールサンプル中のタンパク質の量と比較した試験サンプル中の各タンパク質の量の任意の減少または超過を、コントロールを示す線の下または上の線として示すグラフを印刷する。
【０１４４】
（実施例３．組織毒性および器官毒性についての抗癌薬物のスクリーニング）
この実施例は、抗癌剤をその組織毒性または器官毒性についてスクリーニングするためのＬＳＣ系の使用を例示する。
【０１４５】
ヒトおよび／または動物における既知の毒性および生物学的終点を有する化合物および薬物（抗癌薬物および治療剤の両方）を、ＬＳＣにおける遺伝子またはタンパク質の発現プロフィールを集めるために選択する。さらに、化合物を、活性の関連した既知の機構に関して、および以前の研究において使用された化合物に関してヒトを用いたインビトロ細胞培養物効果の臨床結果に相関するように選択する。表３。
【０１４６】
【表３】
2004503256.tif 000004
（ａ．遺伝子発現プロフィールを確立する）
選択された化合物の遺伝子発現パターンを、ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して測定および定量し、そして細胞分化について正規化する。化合物の遺伝子発現パターンを、化合物に曝露されていないコントロールＬＳＣ培養物、あるいは適切な場合には類似の機能または用量限定的毒性を有する関連した薬物で処置したＬＳＣ培養物と比較する。類似もしくは関連した毒性を有する多数の抗癌剤についての遺伝子発現プロフィールを集めることによって、遺伝子発現における共通の変化を、識別して毒性と相関させ、そして試験抗癌薬物候補物の毒性を評価するための代理プロフィールとして使用する。
【０１４７】
ｃＤＮＡマイクロアレイは、例えば、Ｓｈａｌｏｎら（１９９６）、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ　６：６３９−６４５に記載されるような、当該分野で公知かつ利用可能な多種のうちの任意の１つであり得る。ｃＤＮＡマイクロアレイは、コントロールと化学的に処置された細胞との直接の比較によって、数千の遺伝子の発現の同時モニタリングを可能にする。３’発現配列タグ（ＥＳＴ）を、整列し、そして高速ロボットを使用して、１スライド当たり数百〜数千の濃度で、ガラス顕微鏡スライド上にスポットする。蛍光ｃＤＮＡプローブを、２つの異なる波長で励起する蛍光（すなわち、Ｃｙ３およびＣｙ５）を使用して標識されたｄＵＴＰを使用する逆転写反応を用いて、コントロールＲＮＡおよび試験ＲＮＡから生成させる。これらのプローブは、各サンプル中の相対的な遺伝子発現の直接の比較のために、同じチップに対するコントロールＲＮＡおよび試験ＲＮＡの両方のハイブリダイゼーションを可能にする。この蛍光シグナルを、特別に操作された走査型共焦点顕微鏡を使用して検出する。検証されたヒトクローンの１５，０００個の配列および８７００個のマウスクローンの収集物を使用して、ｃＤＮＡマイクロアレイを作製するのに用い得る。これらのマイクロアレイは、種々の薬剤で処置されたＬＳＣ培養物中の遺伝子発現パターンの分析のために理想的である。
【０１４８】
マイクロアレイ分析の別の例が、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、米国特許第６，０４０，１３８号に記載される。この方法において、標的細胞由来の標識されたＲＮＡまたはｃＤＮＡは、このオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイは、ＲＮＡサンプルまたはｃＤＮＡサンプル中の標的核酸の部分配列に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブを含む場合、この高密度アレイにハイブリダイズされる。Ｌｏｃｋｈａｒｔら（前述）において記載されるように調製した、２０マーのオリゴヌクレオチドプローブは、平坦なガラススライド上に整列される。標識ＲＮＡを、当該分野で公知の方法（例えば、標識ヌクレオチドの存在下で細胞をインキュベートする）を使用して、コントロールＬＳＣおよび試験ＬＳＣから生成する。あるいは、標識ｃＤＮＡは、標識ヌクレオチド（例えば、異なる波長で励起する蛍光を使用するｄＵＴＰ）での逆転写反応を使用して、試験細胞およびコントロール細胞のＲＮＡから調製される。標識ＲＮＡまたはｃＤＮＡからのシグナルは、レーザー照射スキャニング共焦点蛍光顕微鏡によって読み取られ得る。本方法におけるマイクロアレイは、１０，０００個よりも多い異なる遺伝子を同時にモニタリングし得る。
【０１４９】
簡単に言うと、ＲＮＡは、コントロールＬＳＣおよび処理されたＬＳＣから単離される。総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮＡｅａｓｙキットを使用して調製する。続いて、ＲＮＡを、Ｃｙ３またはＣｙ５　ｄＵＴＰのいずれかを用いて、１回の逆転写で標識する。得られた標識ｃＤＮＡを、濃縮された容積中で混合し、そしてアレイにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションを、蒸発を防ぐように特注で設計したチャンバー中で６５℃で一晩、インキュベートする。ハイブリダイゼーションの後、チップを特注の共焦点レーザースキャナでスキャンし、これにより、Ｃｙ３チャネルおよびＣｙ５チャネルの両方について、アレイ上のそれぞれのスポットの強度の結果を提供する。次いで、このデータを、さらなる拡張を備えるソフトウェアパッケージを用いて分析する。これらの拡張は、それぞれのスポットにわたるシグナルの統合、指定されたハウスキーピング遺伝子のパネルに対するデータの正規化、および統計学的計算により、割合が異常値であるか、または処理によって有意に変化した遺伝子のリストを作成することを可能にする。画像分析ソフトウェアに加えて、情報科学パッケージ（例えば、Ｓｐｏｔ−ＦｉｒｅおよびＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（その両方共が市販されている））を使用して、用量および／または時間にわたる複数の実験における、遺伝子のクラスター化および分析が可能になる。一般に、ｃＤＮＡマイクロアレイ技術は、定量的データを提供するための、実行可能な技術として、今だに有効である。赤／緑の割合によって、１つの集団　対　他の集団における遺伝子の発現の相対的なレベルに対する良好な定量的データが提供されるが、このデータはその遺伝子の誘導／下方調節のレベルの絶対値ではない。アレイに対する、サンプルの各々の対を、３連でハイブリダイズする。３つのうち２つのハイブリダイゼーション実験において、一貫して誘導されるかまたは抑制される異常値は、さらに伝統的なＲＮＡ定量的方法（例えば、ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ）によって検証される。
【０１５０】
各々の薬物を、増殖、分化およびＲＮＡ発現に対するその効果について、少なくとも３回、別々のＬＳＣクラスターで試験する。細胞数（増殖）、発現した／発現していない、および／もしくは特定の分化マーカー／特徴（分化）を示す細胞の量、ならびにＲＮＡレベル／ｃＤＮＡマイクロアレイデータ（ＲＮＡ発現）を、３回以上の実験について平均を取り、そしてその平均値およびＳＥＭを決定する。全ての結果を、約１５個の「ハウスキーピング」遺伝子を使用して正規化する。これにより、ヒトまたは動物において毒性ではないコントロール化合物に対する試験薬物の効果の、定量的な比較が可能になる。統計的な比較により、所定の薬物が、コントロール薬物または未処理細胞と比較して、ＬＳＣ遺伝子発現に影響するか否かを決定するための情報、および、細胞中のＲＮＡにおける変化が関連するか否かを決定するための情報を提供する。
【０１５１】
（ｂ．タンパク質発現プロフィールの構築）
選択された抗癌剤のタンパク質発現プロフィールを、実施例２に記載されるように、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎのＳＥＬＤＩ質量分析（ＭＳ）−ＴＯＦシステムを使用して構築する。収集したＬＳＣ培養物由来の総細胞溶解物を、０．１％ＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（０．５％）のいずれかにおいて調製し、そして等しいタンパク質質量を、製造業者のプロトコールを使用して、タンパク質アレイチップに直接適用する。いくつかの状況について、チップとサンプルとの間のより定量的な比較を可能にするために、１つ以上の既知のコントロールペプチドの規定された質量を内部較正および定量的な標準として、添加することが好適であり得る。それぞれのチップは、２つの薬物を３連で分析し得る。ストリンジェントな条件および実験的な複製を行った後、１つの試験化合物あたり平均して６つのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐｓＴＭを使用する。
【０１５２】
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ技術は、サンプル中のタンパク質について捕獲、保持、およびチップ上で直接精製することを可能にする。次いで、マイクロチップ上のタンパク質を、ＳＥＬＤＩによって分析する。この分析によって、サンプル中のタンパク質の分子量を決定する。次いで、サンプル中の精製されたタンパク質の分子量を自動的に読出した値を評価し得る。代表的に、このシステムは、２０％未満のＣＶを有する。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎデータ分析システムは、このデータを、内部参照標準に対して正規化し、そして薬物処理された細胞中に見出されるタンパク質の読出し値から、コントロールサンプル中に見出されるデータの読出しを減算する。このデータ分析は、薬物によって刺激されるタンパク質発現、および発現が薬物によって阻害されるコントロール細胞中にのみ見出されるタンパク質を明らかにする。この分析は、コントロール群と処理群との間のタンパク質発現の定量的な読出し値を提供する。複数のサンプルの分析は、タンパク質発現における平均の倍数変化値および可変性の相対的な測定値を提供する。これは、タンパク質変化の統計的な尺度を提供し得る平均値±ＳＥＭとして表され得る。この分析を使用して、ヒトにおける毒性の類似の形態を誘導する薬物が、ＬＳＣ中のタンパク質発現において類様の変化を引き起こすか否かを決定する。各々の薬物を、ＬＳＣの少なくとも３つの別々の群で分析する。
【０１５３】
本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許出願は、刊行物または特許出願の各々が詳細にかつ個々に参考として援用されることを示すように、本明細書中で参考として援用される。
【０１５４】
前述の本発明は、理解を明確にする目的で図解および実施例によっていくらか詳細に記載してきたが、ある種の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対してなされ得ることが、本発明の教示を鑑みて、当業者に容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、２つの化学組成物のうちの１つに曝露されたＬＳＣとコントロールＬＳＣとの間の核タンパク質の発現における相違を例示的に示す。
図１Ａは、質量分析計から読み出しのハーフトーンでの再現を示す。最上位のバンドは、試験化学組成物のいずれかの非存在下で増殖されるコントロールＬＳＣの質量スペクトルである。中間のバンドは、試験化学組成物（試験組成物Ｉ）の存在下で増殖したＬＳＣの質量スペクトルであり、そして図１Ａの下のバンドは、第二の試験化学組成物（試験組成物ＩＩ）に曝露されたＬＳＣによって発現された核タンパク質の質量スペクトルを示す。
図１Ｂおよび図１Ｃは、試験ＬＳＣとコントロールＬＳＣとの間の発現において有意に差のあるこれらのタンパク質のみを示すために、それぞれの試験ＬＳＣおよびコントロールＬＳＣの間での同一タンパク質の減算計算を示す棒グラフである。それぞれの棒は、単一のタンパク質を示し、そしてその棒の高さは、化学組成物に曝露されないＬＳＣによる発現量と比較された、試験組成物に曝露されたＬＳＣによるタンパク質発現量を示す。図１Ｂ：コントロールのタンパク質発現と比較した、試験組成物Ｉと接触させた試験ＬＳＣのタンパク質発現。図１Ｃ：コントロールのタンパク質発現と比較した、試験組成物ＩＩと接触させた試験ＬＳＣのタンパク質発現。
【図２】
図２は、質量分析計によって検出された小さな核タンパク質の発現を示す棒グラフである。Ｘ軸：検出されたタンパク質の質量。Ｙ軸：相対単位での検出されたタンパク質量。図２Ａ：化学組成物に曝露されていないコントロールＬＳＣのタンパク質発現。図２Ｂ：試験組成物Ｉに曝露されたＬＳＣのタンパク質発現。図２Ｃ：試験化合物ＩＩに曝露されたＬＳＣのタンパク質発現。太線は、２つの試験化学組成物のそれぞれに曝露されたＬＳＣ間の異なる量で発現されたタンパク質を示す。
【図３】
図３は、質量分析計によって検出された小さな細胞質タンパク質の発現を示す棒グラフである。Ｘ軸：検出されたタンパク質の質量。Ｙ軸：相対単位での検出されたタンパク質量。図３Ａ：化学組成物に曝露されていないコントロールＬＳＣのタンパク質発現。図３Ｂ：試験組成物Ｉに曝露されたＬＳＣのタンパク質発現。図３Ｃ：試験化合物ＩＩに曝露されたＬＳＣのタンパク質発現。太線は、２つの試験化学組成物のそれぞれに曝露されたＬＳＣ間の異なる量で発現されたタンパク質を示す。
【図４】
図４は、質量分析計によって検出された大きな核タンパク質の発現を示す棒グラフである。Ｘ軸：検出されたタンパク質の質量。Ｙ軸：相対単位での検出されたタンパク質量。図４Ａ：化学組成物に曝露されていないコントロールＬＳＣのタンパク質発現。図４Ｂ：試験組成物Ｉに曝露されたＬＳＣのタンパク質発現。図４Ｃ：試験化合物ＩＩに曝露されたＬＳＣのタンパク質発現。太線は、２つの試験化学組成物のそれぞれに曝露されたＬＳＣ間の異なる量で発現されたタンパク質を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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