(57)【要約】本発明は、ATB0,+によって輸送可能な化合物を明らかにした。これらの化合物に関する情報に基づき、ATB0,+によって輸送可能な薬物を設計し、産生し、かつスクリーニングすることができる。そのような薬物は、NOS、フェニルグリシン、カルニチン、D-アミノ酸が関与しうる疾患を治療および/または予防するために役立つ可能性がある。ATB0,+遺伝子は、上記のような疾患の遺伝子治療に用いるために患者に投与されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ATB0,+による被輸送能を有する薬物またはプロドラッグのスクリーニング方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)ATB0,+による被輸送能を有する化合物を選択する段階；
(b)選択された化合物と、該化合物が治療および/または予防し得る疾患とを関連づける段階；ならびに
(c)段階(b)により疾患と関連づけされた化合物を選択する段階。
【請求項２】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンもしくはD-アミノ酸、または、それらの誘導体、およびアミノ酸に基づくプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物の設計方法であって、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸ならびにそれらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計することを提供する方法。
【請求項４】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計する段階；ならびに
(b)設計された化合物を合成する段階。
【請求項５】
合成された化合物がATB0,+による被輸送能を有するか否かを判定し、輸送される化合物を選択する段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、薬物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計する段階；
(b)設計された化合物を合成する段階；ならびに
(c)合成された化合物がATB0,+による被輸送能を有するか否かを判定し、輸送される化合物を選択する段階。
【請求項７】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、薬物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計する段階；
(b)設計された化合物を合成する段階；ならびに
(c)合成された化合物と、該化合物が治療および/または予防し得る疾患とを関連づける段階。
【請求項８】
ATB0,+を介して化合物を輸送する方法であって、該化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物である方法。
【請求項９】
ATB0,+を介して化合物を輸送する方法であって、該化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物であり、該化合物が放射性物質で標識されたまたはトキシン付加された、方法。
【請求項１０】
NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、および、オルニチンの誘導体である、請求項2から9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
ATB0,+遺伝子を有効成分として含有する、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体からなる群より選択される化合物により治療および/または予防しうる疾患の治療薬。
【請求項１２】
ATB0,+遺伝子を投与する段階を含む、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体からなる群より選択される化合物により治療および/または予防しうる疾患の遺伝子治療。
【請求項１３】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、癌治療薬。
【請求項１４】
癌がiNOS発現性癌である、請求項13記載の治療薬。
【請求項１５】
癌が乳癌または肝癌である、請求項13記載の治療薬。
【請求項１６】
化合物がNOS阻害剤である、請求項13記載の治療薬。
【請求項１７】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を投与する段階を含む、癌を治療する方法。
【請求項１８】
癌がiNOS発現性癌である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
癌が乳癌または肝癌である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
化合物がNOS阻害剤である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
癌治療薬の製造のための、ATB0,+による被輸送能を有する化合物の使用。
【請求項２２】
癌がiNOS発現性癌である、請求項21記載の使用。
【請求項２３】
癌が乳癌または肝癌である、請求項21記載の使用。
【請求項２４】
化合物がNOS阻害剤である、請求項21記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、薬物およびプロドラッグの送達系としてアミノ酸輸送体ATB0,+を利用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
一酸化窒素（NO）は、様々な生理的プロセスに関与した重要な調節分子である（Moncada,S.、J.R.Soc.Med.、92、164-169（1999)、Martin,E.ら、Sem.Perinatol.、24、2-6（2000)、Bredt,D.S.、Free Rad.Res. 31、577-596（1999))。この分子は、L-アルギニンから一酸化窒素合成酵素（NOS）により生成される。NOSについては、3種の個別のアイソフォームが同定されている:ニューロン性NOS（nNOSまたはNOS I)、誘導性NOS（iNOSまたはNOS II)、および内皮性NOS（eNOSまたはNOS III)(Knowles,R.G.およびMoncada,S.、Biochem.J.、298、249-258（1994)、Stuehr,D.J.、Biochim.Biophys.Acta、1411、217-230（1999))。NOは多くの生理的プロセスにおいて必須の役割を果たすにもかかわらず、NOの過剰生成は、炎症、肺血症性ショック、糖尿病、および神経変性を含む多数の病態に関連している（Miller,M.J.S.およびGrisham,M.B.、Mediators Inflammation、4、387-396（1995)、Symeonides,S.およびBalk,R.A.、Infect.Dis.Clin.N.Amer.、13、449-463（1999)、Mandrup-Poulsen,T.、Diabetologia、39、1005-1029（1996)、Jenner,P.およびOlanow,C.W.、Neurology、47、S161-S170（1996))。従って、NOSを阻害することによるNO生成の妨害は、これらの病態の治療につながる可能性がある。異なる病態にはNOSの異なるアイソフォームが関連しているので、特異的NOSアイソフォームの選択的阻害が、これらの疾患の様々な治療法の治療適用を強化する上で必要となると考えられる。異なるNOSアイソフォームに対し選択性のあるいくつかの阻害剤が同定されている（Southan,G.J.およびSzabo,C.、Biochem.Pharmacol.、51、383-394（1996)、Bryk,R.およびWolff,D.J.、Pharmacol.Ther.、84、157-178（1999))。これらの阻害剤の使用は、ヒトおよび実験動物におけるNOの過剰生成に関連した多様な病態の治療において有用であることが示されている（Moncada,S.およびHiggs,E.A.、FASEB J.、9、1319-1330（1995)、Hobbs,A.J.ら、Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.、39、191-220（1999))。
【０００３】
NOS阻害剤の治療的有効性は、これらの阻害剤のNOSとの相互作用のための標的細胞への取込み効率により、著しい影響を受けると予想される。さらに、小腸におけるこれらの阻害剤の輸送は、それらの経口的生体利用率（バイオアベイラビリティー）に影響を及ぼすと考えられる。従ってNOS阻害剤の細胞取込み機構に関する情報は、それらの治療的可能性を評価する上で重要である。ほとんどのNOS阻害剤は、構造上アルギニン、リジン、シトルリン、およびオルニチンと関連している（Southan,G.J.およびSzabo,C.、Biochem.Pharmacol.、51、383-394（1996)、Bryk,R.およびWolff,D.J.、Pharmacol.Ther.、84、157-178（1999))。その結果、NOS阻害剤の細胞取込みにおいて、アミノ酸輸送システムが重要な役割を果たすこととなる。哺乳動物細胞において、複数の輸送システムが、アミノ酸輸送を媒介するように機能し、かつこれらの輸送システムは、基質特異性、基質親和性、駆動力、および組織発現パターンが著しく異なっている（Christensen,H.N.、Methods Enzymol.、173、576-616（1989))。これらの輸送システムの多くが、最近クローニングされ、かつ機能的に特徴決定されている（Palacin,M.ら、Physiol.Rev.、78、969-1054（1998)、Genapathy,V.ら、Intestinal transport of peptides and amino acids. In Current Topics in Membranes.、Barrett,K.E.およびDonowitz,M.編、Vol.50、pp.379-412、Academic Press.（2001))。過去に、NOS阻害剤の取込みを媒介するアミノ酸輸送システムの同定を目的としたいくつかの研究がある（Schmidt,K.ら、Mol.Pharmacol.、44、615-621（1993)、Schmidt,K.ら、Biochem.J.、301、313-316（1994)、Baydoun,A.R.およびMann,G.E.、Biochem.Biophys.Res.Commun.、200、726-731（1994)、Schmidt,K.ら、J.Neurochem.、64、1469-1475（1995)、Raghavendra Rao,V.L.およびButterworth,R.F.、J.Neurochem.、67、1275-1281（1996))。これまでにNOS阻害剤の細胞取込みに関与しているアミノ酸輸送システムが2種類同定されている。これらは、システムy+およびシステムLである。両システム共、Na+とは無関係の輸送システムであり、したがって、細胞内のNOS阻害剤を含むそれらの基質を濃縮する能力はごく弱いものである。本発明者らの知るところでは、その他のアミノ酸輸送システムでNOS阻害剤の輸送にかかわるものは示されていない。
【０００４】
カルニチン（β-ヒドロキシ-γ-トリメチルアミノブチレート）は、長鎖の脂肪酸のβ酸化には必須である。これは、ヒトに関しては、肝および腎において内因性に合成される（Carter.A.L.ら、Journal of Child Neurology、10（別冊2)、S3-S7（1995))。食物供給源に由来するものはまた、腸管内でも吸収される（Rebouche,C.J.、FASEB Journal、6、3379-3386（1992))。この分子の生物学的重要性は、様々な遺伝性疾患や後天性疾患において発症するカルニチン欠損症の臨床的結果から明らかである（Kerner,J.およびHoppel,C.、Annual Review of Nutrition、18、179-206（1998))。カルニチン欠損症の症状は、骨格筋ミオパシー、心筋ミオパシー、脳障害、および成長障害がある（Kerner,J.およびHoppel,C.、Annual Review of Nutrition、18、179-206（1998)；Treem,W.R.ら、New England Journal of Medicine、319、1331-1336（1988))。心筋や骨格筋を含むほとんどの組織において、細胞内カルニチンレベルは、血漿レベルよりも数倍高く、その理由はNa+依存型高親和性カルニチン輸送システムが存在するからである（Bremer,J.、Physiological Reviews、63、1420-1480（1983))。同一の輸送システムはまた、尿細管上皮細胞の刷子縁膜にも存在し、ここではカルニチンの再吸収に関与している（Rebouche,C.J.およびMack,D.L.、Archives of Biochemistry and Biophysics、235、393-402（1984)；Huang,W.ら、Biochemical Pharmacology、58、1361-1370（1999))。この輸送システムの遺伝子欠損は、カルニチンの過剰な尿中排泄をもたらし、これが全身のカルニチン欠損症を起因する。この輸送システムは、心筋や骨格筋のような組織におけるカルニチンの能動蓄積にも寄与しているので、この遺伝子欠損は、これらの組織中の細胞内カルニチンレベルの劇的低下に関連している。原発性カルニチン欠損症とも称されるこの欠損症の主な臨床症状は、骨格筋および心筋のミオパシーであり、これは細胞内カルニチンレベルの低下に起因した脂肪酸酸化によるエネルギー産生が損なわれた結果もたらされる。最近、この輸送体がクローニングされた（Wu,X.ら、Biochemical and Biophysical Research Communications、246、589-595（1998)；Tamai,I.ら、Journal of Biological Chemistry、273、20378-20382（1998))。興味深いことに、この輸送体はいくつかの有機カチオンも輸送する（Wu,X.ら、Biochemical and Biophysical Research Communications、246、589-595（1998)、Wu,X.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、290、1482-1492（1999))。さらにこれは、その一次構造を基に、有機カチオン輸送体遺伝子ファミリーに属している（Wu,X.ら、Biochemical and Biophysical Research Communications、246、589-595（1998))。従って、この輸送体はOCTN2（新規有機カチオン輸送体2）と称されている。
【０００５】
D-アミノ酸は一般的に、哺乳動物における代謝経路に対して異物であると見なされる。特にD-アミノ酸オキシダーゼを除いて、ほとんど全ての哺乳動物の酵素はL-アミノ酸に対して選択的である。D-アミノ酸は血漿中に見出されるが、食物または腸内微生物叢に由来すると考えられている。ほとんどのD-アミノ酸の血清中レベルは、微生物を含まない実験動物では顕著に減少しており、これにより腸内微生物が血清中に存在するD-アミノ酸に有意に関与していることが示されている（J.J. Corrigan、Science、164、142（1969）、M. Friedman、J. Agric. Food Chem.、47、3457（1999））。食物も同様に、食品の調製および加工の際にL-エナンチオマーから生成されたD-アミノ酸を含む（E.H.ManおよびJ.L.Bada、Annu. Rev. Nutr.、7、209（1987））。
【０００６】
D-アミノ酸は哺乳動物における代謝経路に関与しないことから、これらのアミノ酸の生物学的重要性にはまだ疑問が残る。しかし、特定のD-アミノ酸が有用な作用を有する証拠がある（M.Friedman、J. Agric. Food Chem.、47、3457（1999）、E.H.ManおよびJ.L. Bada、Annu. Rev. Nutr.、7、209（1987））。D-フェニルアラニンおよびD-ロイシンは鎮痛性であることが示されており、難治性疼痛の管理において薬理学的に用いられている（R.S.S.ChengおよびB.Pomeranz、Brain Res.、177、583（1979）、K. Budd、Adv. Pain Res. Ther.、5、305（1983））。同様に、最近の研究により、D-セリンを統合失調症患者に投与すると、認識機能および動作が改善する可能性があることが示された（G. Tsaiら、Biol.Psychiatry、44、1081（1998））。また、グルタミン酸作動性神経伝達の調節にD-セリンが生理的機能を有する証拠も存在する（T. Matsuiら、J. Neurochem.、65、454（1995）、J.P.Mothetら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、97、4926（2000））。このアミノ酸はN-メチル-D-アスパラギン酸受容体上のグリシン部位に結合するが、この結合は、グルタミン酸による受容体関連Ca2+チャンネル機能の活性化にとって不可欠である。興味深いことに、このD-アミノ酸は、セリンラセマーゼによって媒介されるL-セリンのラセミ化によって脳において内因性に産生される（H. Woloskerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96、721（1999））。この酵素は、脳から最近クローニングされて、NMDA受容体と同時局在することが判明している（H. Woloskerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96、13409（1999））。
【０００７】
D-アミノ酸は、細菌中に豊富に存在し（M. Friedman、J. Agric. Food Chem.、47、3457（1999））、したがって、生理的条件下で細菌コロニー形成が多い結腸および回腸中に有意な量存在すると予想される。先に述べたように、食物も同様にD-アミノ酸を含む。いくつかのD-アミノ酸は、重要な生理的および薬理的な機能を有することが現在知られていることから、細菌由来のおよび食物性のD-アミノ酸の腸管吸収は重要な問題点となる。管腔のD-アミノ酸が血液に流入するために腸管内に有効な機構が存在すれば、外因性D-アミノ酸が生物学的作用を発揮することがおそらく可能であろう。アミノ酸の腸管吸収を媒介するいくつかの輸送体が最近クローニングされた（V. Ganapathyら、Current Topics in Membranes、50、379（2001））。今日まで、有意な程度までD-アミノ酸を輸送することが示されているアミノ酸輸送体は2個に過ぎない（Y. Kanaiら、J. Biol. Chem.、273、23629（1998）、Y. Fukasawaら、J. Biol. Chem.、275、9690（2000））。それらは、システムL1およびシステムasc1である。いずれも、細胞質膜を介したアミノ酸交換を媒介する促進性輸送体である。輸送機能が如何なる推進力にも連動していないために、それらは活性ではない。システムL1およびシステムasc1は、脳からクローニングされており、これらの輸送体の転写物は腸管において検出可能である。興味深いことにこれらの輸送体はヘテロ二量体であり、どちらも4F2細胞表面抗原の重鎖（4F2hc）を共通のサブユニットとして含む。4F2hcは、腸管粘膜細胞の側底膜のみに局在するため、システムL1およびシステムasc1は、細胞から血液へのアミノ酸の流出に関与する可能性がある。現在のところ、管腔から細胞へのD-アミノ酸の流入を媒介しうる腸上皮細胞の刷子縁膜に輸送システムが存在するか否かはわかっていない。
【０００８】
ATB0,+として知られている輸送体は、小腸、肺および乳腺において発現されるアミノ酸輸送体である。機能的には、ATB0,+は、中性および塩基性のアミノ酸のためのNa+およびCl-連動型輸送システムである。これは、腸管におけるアミノ酸の吸収において重要な役割を果たしている（Ganapathy,V.ら、Intestinal transport of peptides and amino acids. In, Current Topics in Membranes（Barrett,K.E.およびDonowitz,M.編)、Vol.50、pp.379-412、Academic Press（2001))。ヒトATB0,+のクローニングが最近報告されている（Sloan,J.L.およびMager,S.、Journal of Biological Chemistry、274、23740-23745（1999))。現時点で、ATB0,+の輸送機能は、基質としてのアミノ酸についてのみ研究されている。その輸送機能は集積力が強く、Na+およびCl-の膜内外勾配ならびに膜電位によりエネルギー供給されている。ATB0,+は、アミノ酸（例えば、グリシンおよびプロリン)、神経伝達物質（例えば、モノアミンおよびγ-アミノブチレート)、ならびに浸透圧調節物質（osmolyte)(例えば、タウリンおよびベタイン）のような様々な化合物に関する、Na+およびCl-連動型輸送体の遺伝子ファミリーに属する。構造的に、ATB0,+は、γ-アミノブチレート輸送体およびベタイン輸送体に非常に密に関連している。
【発明の開示】
【０００９】
発明の開示
本発明者らは、マウスの結腸から得たNa+およびCl-連動型のアミノ酸輸送体であるATB0,+をクローニングし、かつそのNOS阻害剤輸送能について調べた。ATB0,+が哺乳動物細胞で発現された場合、これはNa+およびCl-に運動した方法で様々な中性および塩基性のアミノ酸を輸送することができる。本発明者らは、いくつかのNOS阻害剤を、ATB0,+を介したグリシン取込みを阻害する能力について調べ、それらは全て取込み過程においてグリシンと競合することを発見した。[3H]-Nω-ニトロ-L-アルギニンを用いて、本発明者らは、このATB0,+を介したNOS阻害剤のNa+およびCl-連動型の輸送を直接明らかにした。本発明者らはその後、アフリカツメガエル（X. laevis）の卵母細胞系を用い、広範な種類のNOS阻害剤のATB0,+を介した輸送について調べた。これは、クローニングされたATB0,+を発現している卵母細胞において、電圧固定条件下で、NOS阻害剤が誘導した内向き電流を評価することにより達成された。これらの研究は、ATB0,+は、広い範囲の双性イオン性に加え陽イオン性のNOS阻害剤を輸送することができることを示した。これらのデータは、腸管内におけるNOS阻害剤に関するイオン勾配駆動性集積性輸送システム（concentrative transport system）を初めて同定したことを示している。
【００１０】
本発明者らは、輸送体によるカルニチンおよびそのアシルエステルの相互作用を調べるために、輸送体をマウス結腸からクローニングし、かつ哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞において機能的に発現させた。
【００１１】
クローニングされたATB0,+は、哺乳動物細胞において発現された場合、カルニチン、プロピオニルカルニチン、およびアセチルカルニチンを輸送することができた。この輸送プロセスは、Na+およびCl-依存性であった。カルニチンのミカエリス定数は、0.83±0.08mMであり、Na+活性化のヒル係数は1.6±0.1であった。
【００１２】
クローニングされたATB0,+は、Xenopus laevis卵母細胞で発現された場合、電圧固定条件下、カルニチンおよびプロピオニルカルニチンが存在する中で、内向き電流を誘導することができた。アセチルカルニチンの存在する中では、電流は検出されなかった。カルニチン誘導電流は、強制的にNa+およびCl-の存在に左右された。この電流は、カルニチンで可飽和であり、かつミカエリス定数は1.8±0.4mMであった。Na+およびCl-の活性化動力学の分析は、2個のNa+および1個のCl-が、この輸送体によるカルニチンの輸送に関連していることを明らかにした。
【００１３】
これらの研究により、アミノ酸輸送体ATB0,+の新規機能の同定が説明されている。この輸送体は、腸管、肺、および乳腺において発現されているので、これらの組織におけるカルニチンの活用において重要な役割を果たす可能性がある。
【００１４】
カルニチンのNa+依存型輸送システムについては既に説明されている。この輸送体は、OCTN2（新規有機カチオン輸送体2）としても知られており、これはほとんどの組織において発現され、かつ高い親和性によりカルニチンを輸送する。しかしこれは、Na+勾配と膜電位によってのみエネルギー供与される。対照的に、ATB0,+は、カルニチン低親和性輸送体であるが、そのエネルギー供与はNa+勾配、Cl-勾配、および膜電位によるので、OCTN2よりもかなり高い凝集力を示す。
【００１５】
また、本発明者らは、ATB0,+のD-アミノ酸の輸送能につき検討を行なった。現在のところ、腸内管腔側にある輸送体でD-アミノ酸を輸送するものは知られていない。本発明者らは、ATB0,+がD-アラニン、D-セリン、D-メチオニン、D-ロイシン、D-トリプトファンを輸送することを明らかにした。さらに、本発明者らは、生体内での重要性が解明されているD-セリンにつき、ATB0,+と他の輸送体の輸送能の比較を行なった。その結果、ATB0,+は他の多くの輸送体よりも高いD-セリン輸送能を有することが判明した。
【００１６】
さらに、本発明者らは、フェニルグリシニンが、その他の必須アミノ酸よりも高親和性でATB0,+により輸送されることも見出した。さらにまた、本発明者らは、(S)-(3-(2-ニトログアニジル)フェニル)グリシンのようなL-フェニルグリシン誘導体NOS阻害剤がATB0,+によって特異的に輸送されることも発見した。
【００１７】
さらに、本発明者らは、HRPE細胞に発現させたマウスATB0,+を介した輸送プロセスに関してアスパラギン酸およびグルタミン酸に基づくプロドラッグの能力を評価した。その結果、アスパラギン酸およびグルタミン酸のメチルおよびベンジルエステルは、グリシン輸送の強力な阻害剤であることが判明した。本発明者らはまた、アシクロビルのL-グルタミン酸γ-エステルがATB0,+によって輸送されることも発見した。さらに、本発明者らは、アシクロビルのL-バリンα-エステルさえもATB0,+によって輸送されることを証明した。
【００１８】
さらに、本発明者らは、炎症状態の腸管におけるATB0,+の発現を評価した。その結果、炎症状態によって、回腸および結腸におけるATB0,+発現が顕著に増加することが判明した。本発明者らはまた、乳腺腫瘍のような腫瘍、ならびに乳癌および肝臓癌のような癌細胞株においてもATB0,+の発現が上昇することを発見した。
【００１９】
ATB0,+は、他の主要アミノ酸輸送体と異なり、Na+勾配、Cl-勾配、および膜電位の3つの駆動力に依存性であり、したがってATB0,+は集積力が高いため、効果的な薬物送達系になりうる。また、その組織分布またはその発現が、消化管（回腸および結腸)、肺、乳腺に特異的に偏っており、その様な組織特異的な疾病への効果的な送達系となりうる。さらに、その発現は例えば腸炎、敗血症および乳癌などの病態により誘導されるため、そのような病巣への効果的な送達系となりうる。さらに、基質認識性が広いため、アミノ酸構造を持つプロドラッグの送達に有用な可能性がある。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、薬物およびプロドラッグの送達系としてのアミノ酸輸送体ATB0,+の使用を提供することである。本発明の好ましい態様において、ATB0,+によって輸送される薬物はNOS阻害剤、フェニルグリシン誘導体、カルニチン、D-アミノ酸もしくはその誘導体、またはアミノ酸構造を有するプロドラッグである。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、ATB0,+によって輸送されるのに適した薬物のスクリーニング法を提供すること、およびスクリーニングによって得られた薬物を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、ATB0,+によって輸送されるのに適した薬物またはプロドラッグを設計する方法を提供することである。本発明の好ましい態様において、薬物はフェニルグリシン骨格を有し、プロドラッグは一部分としてチロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、および3-カルボキシフェニルグリシンまたは4-カルボキシフェニルグリシンを有する。
【００２３】
即ち、本発明は、薬物およびプロドラッグの送達系としてのアミノ酸輸送体ATB0,+の使用に関し、より詳細には、本発明は以下を提供する：
(1)ATB0,+による被輸送能を有する薬物またはプロドラッグのスクリーニング方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)ATB0,+による被輸送能を有する化合物を選択する段階、
(b)選択された化合物と、該化合物が治療および/または予防し得る疾患とを関連づける段階、ならびに
(c)段階(b)により疾患と関連づけされた化合物を選択する段階；
(2)ATB0,+による被輸送能を有する化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンもしくはD-アミノ酸、または、それらの誘導体、およびアミノ酸に基づくプロドラッグである、(1)に記載の方法；
(3)ATB0,+による被輸送能を有する化合物の設計方法であって、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸ならびにそれらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計することを提供する方法；
(4)ATB0,+による被輸送能を有する化合物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計する段階、ならびに
(b)設計された化合物を合成する段階；
(5)合成された化合物がATB0,+による被輸送能を有するか否かを判定し、輸送される化合物を選択する段階をさらに含む、(4)に記載の方法；
(6)ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、薬物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計する段階、
(b)設計された化合物を合成する段階、ならびに
(c)合成された化合物がATB0,+による被輸送能を有するか否かを判定し、輸送される化合物を選択する段階；
(7)ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、薬物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計する段階、
(b)設計された化合物を合成する段階、ならびに
(c)合成された化合物と、該化合物が治療および/または予防し得る疾患とを関連づける段階；
(8)ATB0,+を介して化合物を輸送する方法であって、該化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物である方法；
(9)ATB0,+を介して化合物を輸送する方法であって、該化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物であり、該化合物が放射性物質で標識されたまたはトキシン付加された、方法；
(10)NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、および、オルニチンの誘導体である、(2)〜(9)のいずれかに記載の方法；
(11)ATB0,+遺伝子を有効成分として含有する、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体からなる群より選択される化合物により治療および/または予防しうる疾患の治療薬；
(12)ATB0,+遺伝子を投与する段階を含む、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体からなる群より選択される化合物により治療および/または予防しうる疾患の遺伝子治療；
(13)ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、癌治療薬；
(14)癌がiNOS発現性癌である、(13)に記載の治療薬；
(15)癌が乳癌または肝癌である、(13)に記載の治療薬；
(16)化合物がNOS阻害剤である、(13)に記載の治療薬；
(17)ATB0,+による被輸送能を有する化合物を投与する段階を含む、癌を治療する方法；
(18)癌がiNOS発現性癌である、(17)に記載の方法；
(19)癌が乳癌または肝癌である、(17)に記載の方法；
(20)化合物がNOS阻害剤である、(17)に記載の方法；
(21)癌治療薬の製造のための、ATB0,+による被輸送能を有する化合物の使用；
(22)癌がiNOS発現性癌である、(21)に記載の使用；
(23)癌が乳癌または肝癌である、(21)に記載の使用；
(24)化合物がNOS阻害剤である、(21)に記載の使用。
【００２４】
本発明は、ATB0,+による被輸送能を有する薬物またはプロドラッグのスクリーニング方法を提供する。本発明において、ATB0,+とは、中性および塩基性のアミノ酸に対するNa+およびCl-連動型輸送システムである。これは、腸管内でのアミノ酸吸収における重要な役割を果たす。
【００２５】
本発明における化合物としては、これらに制限されるわけではないが、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、ならびに、化合物ライブラリ、遺伝子ライブラリの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物由来の産物、海洋生物由来の細胞抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンもしくはD-アミノ酸、または、それらの誘導体、およびアミノ酸に基づくプロドラッグ等を挙げることができる。
【００２６】
本発明において、NOS阻害剤とは、好ましくは中性および塩基性のL-α-アミノ酸の構造に基づくNOS阻害剤であり、より好ましくはL-アルギニン、L-リジン、L-シトルリン、L-オルニチンの構造に基づくNOS阻害剤であり、さらに好ましくはGCAを除いた表2記載のNOS阻害剤である。
【００２７】
本発明において、L-フェニルグリシン誘導体とは、好ましくはフェニルグリシン構造を有する薬物およびプロドラッグであり、より好ましくは、生理学的pHにおいて遊離α-アミノ基およびα-カルボキシル基を有しかつR基に酸性基を有さないフェニルグリシン誘導性薬物、または、3-カルボキシルフェニルグリシンもしくは4-カルボキシルフェニルグリシンを有する3-カルボキシルエステルプロドラッグもしくは4-カルボキシルエステルプロドラッグである。ただし、親薬物（parent drug）は生理学的pHにおいて酸性であるべきではない。
【００２８】
本発明において、カルニチンとは、好ましくはカルニチンおよびその誘導体、ならびにカルニチンおよびそのアシルエステル、より好ましくはカルニチン、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチンである。
【００２９】
本発明において、D-アミノ酸とは、好ましくはD-アラニン、D-セリン、D-メチオニン、D-ロイシン、D-トリプトファン、D-トレオニン、D-ヒスチジン、D-フェニルアラニン、D-グルタミン、およびそれらの誘導体であり、より好ましくはD-アラニン、D-セリン、D-メチオニン、D-ロイシン、D-トリプトファンおよびそれらの誘導体であり、さらにより好ましくはD-アラニン、D-セリン、D-メチオニン、D-ロイシン、およびD-トリプトファンである。
【００３０】
本発明において、アミノ酸に基づくプロドラッグとは、好ましくは（D-アミノ酸およびL-アミノ酸を含む）アミノ酸部分を有する。アスパラギン酸およびグルタミン酸については、β-カルボキシルエステルプロドラッグおよびγ-カルボキシルエステルプロドラッグがそれぞれ好ましい。中性および塩基性のアミノ酸については、α-カルボキシルエステルプロドラッグが好ましい。
【００３１】
本発明において、上記化合物を必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識および蛍光標識等を挙げることができる。
【００３２】
本発明において、化合物がATB0,+により輸送されるか否かを判定する方法としては、これらに制限されるわけではないが、例えば、実施例に記載の方法によって行うことができる。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法においては、次いで、選沢された化合物と、本化合物が治療および/または予防し得る疾患との関係を調べる。選択された化合物との関連を検証する疾患は特に制限はされないが、例えば、選択された化合物がNOS阻害剤であれば、以下の疾患との関連を検証する。敗血症性ショック/低血圧（Titheradge MA、Biochim Biophys Acta、1999 1411(2-3):437-55)、抗炎症性、炎症性腸疾患（Kubes P、McCafferty DM.、Am J Med 2000；109(2):150-8)、リウマチ様関節炎（Salerno Lら、Curr Pharm Des 2002、8(3):177-200)、腎炎（Cattell V.、Kidney Int 2002 61(3):816-821)、アルツハイマー病および卒中（Heneka MTおよびFeinstein DL、J Neuroimmunol 2001 114:8-18)、癌（Thomsen LL、Cancer Metastasis Rev 1998 17(1):107-18)、HIVおよびHCV感染（Lake-Bakaar Gら、Dig Dis Sci 2001 46(5):1072-6)、多発性硬化症（Liu JSら、Am J Pathol 2001 158(6):2057-66)、喘息（Redington AEら、Thorax 2001 56(5):351-7)、骨関節炎（Abramson SBら、Curr Rheumatol Rep 2001 3(6):535-41)、心筋炎（Gluck Bら、Herz 2000 25(3):255-60)、緑内障（Chiou GC、J Ocul Pharnacol Ther 2001 17(2):189-98)、遅延型出血性ショック（Szabo C.、New Horiz 1995 3(1):2-32)、持続性疼痛（Meller STら、Neuropharmacology 1994、33(11):1471-8)、臓器移植術（Trajkovic V.、Curr Drug Metab 2001、2(3):315-29)、およびパーキンソン病（Knott,C.ら、Mol Cell Neurosci 2000；16(6):724-39)。選択された化合物がL-フェニルグリシン誘導体であれば、以下の疾患を試験することができる：NOS阻害剤に関して記載された疾患、抗インフルエンザウイルス（Kati,WM.ら、Antimicrob Agents Chemother 2001、45(9):2563-70)、脳疾患ならびに虚血および分裂病などの疾患（Pellicciari RおよびCostantinoG、Curr Opin Chem Biol 1999 3(4):433-40； Conway SJら、Bioorg Med Chen Lett. 2001、11(6):777-80；Roberts PJ.、Neuropharmacology 1995、34(8):813-9）ならびに心筋虚血（Blackburn KJら、Br. J. Pharmacol. 1979 66:443-444)。
【００３４】
選択された化合物がカルニチンであれば、以下の疾患を試験することができる：骨格筋ミオパシー、心筋ミオパシー、脳障害、および成長障害（Kerner,J.およびHoppel,C.、Annual Review of Nutrition、18、179-206（1998)； Treem,W.R.ら、New England Journal of Medicine、319、1331-1336（1988)）を含むカルニチン疾患。
【００３５】
選択された化合物がD-アミノ酸であれば、以下の疾患を試験することができる：D-セリンおよびその誘導体による統合失調症（Heresco-Levy,U.、Int.J.Neuropsychopharmacol. 2000 3(3):243-258.、Krystal,JH.およびD'Souza,DC.、Biol.Psychiatry.1998 44(11):1075-76)。
【００３６】
選択された化合物がアミノ酸に基づくプロドラッグであれば、プロドラッグの親薬物に関する疾患を試験することができる。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法における次の段階では、疾患と関連づけされた化合物を選択する。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法においては、選択された化合物と、薬剤学的に許容される担体とを混合してもよい。選択された化合物の誘導体を合成し、本誘導体と薬剤学的に許容される担体とを混合してもよい。
【００３９】
本発明は、ATB0,+による被輸送能を有する化合物の設計方法であって、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計することを特徴とする方法を提供する。本方法は、これら化合物の基本骨格をもとに新たな化合物を設計する方法である。化合物の設計に関しては、当業者であれば周知の方法によって実施することができる。
【００４０】
また、本発明は、ATB0,+による被輸送能を有する化合物の製造方法を提供する。本方法においては、まず、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計する。次いで、設計された化合物を合成する。本方法は、合成された化合物がATB0,+による被輸送能を有するか否かを判定し、ATB0,+により輸送される化合物を選択する段階をさらに含む。このようにして製造された化合物の中には、薬理活性を有するものがあると考えられる。
【００４１】
また、本発明は、ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、薬物の製造方法を提供する。本方法の第一段階においては、まず、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物を設計する。第二段階において、設計された化合物を合成する。第三段階において、合成された化合物と、本化合物が治療および/または予防し得る疾患とを関連づけてもよいし、まずは、合成された化合物がATB0,+により輸送されるか否かを判定し、輸送される化合物を選択し、その後、合成された化合物と本化合物が治療および/または予防し得る疾患の間の関係を決定してもよい。本方法においては、さらに、疾患と関連づけされた化合物を選択し、得られた化合物と、薬剤学的に許容される担体とを混合してもよい。また、選択された化合物の誘導体を合成し、本誘導体と薬剤学的に許容される担体とを混合してもよい。
【００４２】
また、本発明は、ATB0,+を介して化合物を輸送する方法であって、本化合物がNOS阻害剤、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物である方法を提供する。本方法においては、化合物を標識してもよい。標識は、これらに制限されるわけではないが、例えば、放射性物質およびトキシンなどが例示できる。
【００４３】
本発明はさらに、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチン、およびD-アミノ酸、ならびにその誘導体からなる群より選択される化合物によって治療および/または予防可能な疾患に関するATB0,+遺伝子の治療的使用を提供する。そのような使用には、例えば、活性成分としてATB0,+遺伝子を含む治療薬が含まれ、これはATB0,+遺伝子を投与する段階を含む上述の疾患に対する遺伝子治療を提供する。当業者は、既知の方法を用いて遺伝子治療を行うと考えられる。本発明の遺伝子治療のために用いられるベクターは、如何なる特定のベクターにも限定されない。
【００４４】
本発明はまた、癌（好ましくは、iNOS発現癌、より好ましくは乳癌および肝臓癌）の治療のためにATB0,+によって輸送されることができる化合物、例えばNOS阻害剤の使用を提供する。そのような使用には、例えば、ATB0,+によって輸送されることができる、NOS阻害剤などの化合物を活性成分として含む癌治療薬、ATB0,+によって輸送されることができる、NOS阻害剤などの化合物を投与する段階を含む癌治療、および、ATB0,+によって輸送されることができる、NOS阻害剤などの化合物を癌治療薬産生のために用いることが含まれる。
【００４５】
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００４６】
1．アミノ酸輸送体ATB0,+を介した一酸化窒素合成酵素阻害剤のNa+およびCl-連動型能動輸送
方法
材料
[3H]-グリシンは、Moravek社（Brea、CA）から購入し、[3H]-L-NNAは、Amersham Pharmacia Biotech社（Piscataway、NJ）から購入した。その他の放射標識したアミノ酸は全て、Dupont-New England Nuclear社（Boston、MA）またはAmerican Radiolabeled Chemicals社（St. Louis、MO）のいずれかから入手した。NOS阻害剤は、Sigma社またはCalbiochem社のいずれかから入手した。
【００４７】
マウスATB0,+のクローニング
以前に記載されたように、SuperScriptプラスミドシステム（Life Technologies社)を用いて、マウスの結腸から単離されたpoly(A)+RNAにより、一方向cDNAライブラリを構築した（Sugawara,Mら、J.Biol.Chem. 275、16473-16477（2000)、Fei,Y.J.ら、J.Biol.Chem.、275、23707-23717（2000)、Wang,H.ら、Am.J.Physiol.、278、C1019-C1030（2000))。ライブラリスクリーニングのためのプローブを、GenBank（アクセッション番号AF161714）に報告されたマウスのATB0,+cDNAに特異的なプライマーを用いるRT-PCRにより調製した。これらのプライマーは、5'-GTT GGC TAT GCA GTG GGA TT-3'（センス）および5'-GAG GCC AAG GAG AAA CAA AA-3'（アンチセンス）であり、これらはcDNA配列における396位〜415位および1606位〜1625位のヌクレオチドに対応している。RT-PCRは、マウスの結腸から調製したpoly(A)+RNAを用いて行った。得られた産物は、サイズが〜1.2kbpであり、その同一性の確認のためにサブクローニングおよび配列決定された。このcDNAを、ランダムプライミングにより[α-32P]dCTPで標識し、かつマウス結腸のcDNAライブラリのスクリーニングのためのプローブとして使用した。配列決定は、自動式Perkin-Elmer Applied Biosystems社の377 Prism DNAシーケンサーを用いて行った。最長の陽性クローン（〜3kbp）を機能試験に用いた。
【００４８】
ノーザンブロット
マウス腸管の長軸に沿ったATB0,+mRNAの発現パターンを、ノーザンブロット分析により調べた。小腸全体を、4個の同等のセグメントに分割し、最近位の小腸を第一のセグメント、最遠位の小腸を第四のセグメントとした。これら4種のセグメントおよび盲腸、結腸からpoly(A)+mRNAを単離し、ノーザンブロット分析に使用した。ブロットを、高ストリンジェントな条件下で、順にマウスのATB0,+、マウスPEPTlおよびマウスβ-アクチンに特異的な[32P]標識したcDNAプローブでハイブリダイズした。
【００４９】
HRPE細胞におけるATB0,+の機能発現
これは、ワクシニアウイルス発現系を用いて行った（Sugawara,Mら、J.Biol.Chem. 275、16473-16477（2000)、Fei,Y.J.ら、J.Biol.Chem.、275、23707-23717（2000)、Wang,H.ら、Am.J.Physiol.、278、C1019-C1030（2000))。輸送の測定は、基質として放射標識したアミノ酸またはNOS阻害剤を用い、37℃で15分間行った。輸送用緩衝液は、140mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaC12、0.8mM MgSO4、および5mMグルコースを含有する25mM Hepes/Tris（pH7.5）であった。ベクター単独をトランスフェクションされた細胞を用いて、常に並行して内因性輸送活性を測定した。基質として大部分の実験で使用されたグリシンにより、内因性輸送は、cDNAをトランスフェクションされた細胞内で測定された輸送の＜5％を占めた。cDNA特異的輸送は、内因性活性について補正することにより計算した。動力学的パラメータであるミカエリス定数（Kt）と最大速度（Vmax）を、cDNA特異的輸送のデータを、単一の可飽和輸送システムを説明するミカエリス-メンテンの式に当てはめることにより算出した。Na+およびCl-活性化動力学は、cDNA特異的輸送データを、ヒル式に当てはめ、ヒル係数を算出することにより分析した。
【００５０】
X. laevis卵母細胞におけるATB0,+の機能発現
クローニングされたマウスATB0,+cDNAからキャップ形成したcRNAを、mMESSAGE mMACHINE（商標）キット（Ambion社）を用いて合成した。X. laevisの成熟卵母細胞を、コラゲナーゼA処理（1.6g/ml）により単離し、手で卵胞を除去し（defolliculate)、かつゲンタマイシン10mg/mlを補充した改変Barth培地中において18℃で維持した（Sugawara,Mら、J.Biol.Chem. 275、16473-16477（2000)、Fei,Y.J.ら、J.Biol.Chem.、275、23707-23717（2000)、Wang,H.ら、Am.J.Physiol.、278、C1019-C1030（2000))。翌日、卵母細胞に50ng cRNAを注入した。未注入の卵母細胞を対照として用いた。これらの卵母細胞を用いて、cRNA注入後6日目に電気生理学的試験を行った。電気生理学的試験は、二微小電極（two-microelectrode）電圧固定法を用いて行った（Sugawara,Mら、J.Biol.Chem. 275、16473-16477（2000)、Fei,Y.J.ら、J.Biol.Chem.、275、23707-23717（2000)、Wang,H.ら、Am.J.Physiol.、278、C1019-C1030（2000))。卵母細胞を、NaCl含有緩衝液（100mM NaCl、2mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、3mM Hepes、3mM Mes、および3mM Tris、pH7.5）で灌流し、引き続き異なるNOS阻害剤またはアミノ酸を含有する同じ緩衝液で灌流した。膜電位は-50mVに固定した。増分20mVで電圧パルスを+50から-150mVへ100ms期間で印加し、かつ定常電流を測定した。基質存在下および非存在下で測定された定常電流間の差異を、基質誘導電流とみなした。基質の可飽和輸送に関する動力学的パラメータK0.5（すなわち、最大電流の半分の誘導に必要な基質濃度）を、ミカエリス-メンテンの式に基質誘導電流値を当てはめることにより算出した。これらの実験は、2個の異なるバッチから得た少なくとも3個の異なる卵母細胞について繰り返した。
【００５１】
結果
マウスATB0,+の構造的特徴
結腸mRNA由来のクローニングマウスATB0,+cDNAは、長さ3,007bpであり（GenBankアクセッション番号AF320226)、かつ638個のアミノ酸のタンパク質をコードしている。マウスATB0,+の一次構造は、最近クローニングされたヒトATB0,+（Sloan,J.L.およびMager,S.、J.Biol.Chem.、274、23740-23745（1999)）と高度に相同性を有する。これら2種のタンパク質間のアミノ酸配列の同一性は88％である。
【００５２】
マウス腸管におけるATB0,+mRNAの発現パターン
腸管の長軸に沿ったATB0,+の発現パターンを決定するために、本発明者らは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより、マウス小腸の別々の領域におけるATB0,+mRNAの定常状態レベルを分析した（図1）。ATB0,+mRNAは、小腸の最初の3個のセグメントにおいては検出されなかった。しかし小腸の第四セグメント、盲腸および結腸において、mRNAの発現は明らかであった。このmRNAレベルは、遠位小腸よりも、結腸および盲腸においてより豊富であった。対照的に、小腸ペプチドのH+連動型輸送体であるPEPTlのmRNAは、4種全ての小腸セグメントにおいて検出されたが、盲腸と結腸では検出されなかった。これらのデータは、ATB0,+mRNAの発現は、マウス小腸の遠位領域に制限されていることを示している。
【００５３】
マウスATB0,+の機能的特徴
クローニングされたマウスATB0,+cDNAの機能的同一性を、最初に、哺乳動物細胞においてクローンを異種発現し、その輸送機能を試験することにより確立した。本発明者らは、クローニングされたマウスATB0,+を発現しているHRPE細胞における数種の中性および塩基性のアミノ酸の輸送を研究した。さらに内因性輸送活性の対照として利用するためベクター単独をトランスフェクションされた細胞において、これらのアミノ酸の輸送を、同一条件下で測定した。試験した13種のアミノ酸全ての輸送活性（Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His、Gln、Asn、Leu、Ile、Phe、Trp、およびArg）は、ベクターをトランスフェクションされた細胞においてよりも、マウスのATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞において有意に高いことがわかった（データは示さず)。輸送活性におけるcDNA誘導性の増加は、グリシン以外の全てのアミノ酸について16％〜190％の間を変動した。グリシンの輸送は、cDNAをトランスフェクションされた細胞において格別に高かった。これは、ベクターをトランスフェクションされた細胞における輸送活性と比べて38倍増加していた。
【００５４】
マウスATB0,+を介したグリシンの輸送は他のアミノ酸輸送と比べて顕著に高かったので、本発明者らはクローニングした輸送体のさらなる特徴決定のための基質としてグリシンを用いた。図2に示した結果は、内因性輸送活性を補正した後の、ATB0,+特異的輸送活性のみを示している。ATB0,+を介したグリシン輸送は、Na+およびCl-の存在によって強制的に左右されている。マウスATB0,+を介したグリシン輸送は可飽和であり、ミカエリス-メンテン定数（Kt）は210±18μMであった。次に輸送プロセスに関連したNa+およびCl-イオンの量を、Na+活性化動力学およびCl-活性化動力学により分析した。マウスATB0,+の輸送活性は、Na+濃度にS字相関しており、かつNa+活性化プロセスのヒル係数は、2.0±0.1であった。対照的に、マウスATB0,+の輸送活性は、Cl-濃度と双曲的関係を示した。Cl-活性化プロセスのヒル係数は、0.7±0.1であった。これらの結果は、Na+：Cl-：グリシンの化学量比が2:1:1であることを示している。Na+およびCl-のK0.5値（すなわち、最大輸送活性の半分を誘導するのに必要なこれらのイオンの濃度）は、各々、25±1mMおよび18±8mMであった。
【００５５】
次に、クローニングされた輸送体を介した輸送プロセスに関して様々なアミノ酸が[3H]-グリシン（60nM）と競合する能力を評価することにより、マウスATB0,+のアミノ酸特異性を試験した（表1)。
【００５６】
（表１）マウスATB0,+のアミノ酸基質特異性
2004529642.tif 000002
【００５７】
[3H]-グリシン（60 nM）の輸送を、ベクターをトランスフェクションされたHRPE細胞およびmATB0,+cDNAをトランスフェクションされたHRPE細胞において、NaClの存在下（pH 7.5）で37℃で15分間測定した。非標識アミノ酸は濃度2.5 mMで用いた。cDNA特異的輸送を、mATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞における輸送からベクターをトランスフェクションされた細胞における輸送を差し引くことによって計算した。データ（4回の別々の測定の平均値±SEM）は、cDNA特異的輸送のみを表す。
【００５８】
濃度2.5mMにおいて、試験した全ての中性および塩基性のアミノ酸が、マウスATB0,+を介した[3H]-グリシンの輸送を阻害した。阻害は、70％から100％まで変動した。対照的に、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびNメチル化された中性アミノ酸MeAIBは、有意な阻害を示さなかった。これらのデータは、クローニングされたマウスATB0,+が、Na+およびCl-に連動した様式で中性および塩基性のアミノ酸の輸送を媒介できることを示している。
【００５９】
ATB0,+を介したNOS阻害剤の輸送
次に本発明者らは、HRPE細胞においてマウスATB0,+を介した輸送プロセスについて、NOS阻害剤およびそれらの親アミノ酸（アルギニン、リジン、オルニチン、およびシトルリン）が、濃度2.5mMで[3H]-グリシン（10μM）と競合する能力について評価した（表2)。
【００６０】
（表２）マウスATB0,+を介したNOS阻害剤の輸送
2004529642.tif 000003
【００６１】
[3H]-グリシン（10 μM）の輸送は、ベクターをトランスフェクションされたHRPE細胞およびmATB0,+cDNAをトランスフェクションされたHRPE細胞において、NaClの存在下（pH 7.5）で37℃で15分間測定した。非標識アミノ酸およびNOS阻害剤は濃度2.5 mMで用いた。cDNA特異的輸送は、mATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞における輸送からベクターをトランスフェクションされた細胞における輸送を差し引くことによって計算した。括弧内の数値は対照輸送に対する割合（％）である。データ（4回の別々の測定の平均値±SEM）は、cDNA特異的輸送のみを表す。mATB0,+はまた、mATB0,+cRNAを注射することによってX.laevis卵母細胞において発現させ、アミノ酸およびNOS阻害剤（1 mM）によって誘導された内向き電流を、二微小電極電圧固定法を用いて測定した。灌流液はNaCl（pH 7.5）を含んだ。データは、卵母細胞の三つの異なるロットからの平均値±SEMを表す。
【００６２】
親アミノ酸の4種全てが、マウスATB0,+を介したグリシン輸送の著しい阻害を引き起こした。この阻害は55％〜85％の間で変動した。同様に試験した全てのNOS阻害剤も、ATB0,+を介したグリシン輸送を阻害した。アルギニンに基づくNOS阻害剤であるL-NNA、L-NAME、L-NMMHA、L-NDMA、L-NMEA、L-NMMA、およびL-NABEによって引き起こされた阻害は、30％〜80％の範囲内であった。リジンに基づくNOS阻害剤であるL-NILは、35％の阻害を引き起こした。L-TCおよびL-MTCはシトルリンに基づくNOS阻害剤であるが、これらはATB0,+を介したグリシン輸送の阻害剤として非常に強力であり、その阻害は70％〜85％の範囲内であった。オルニチン誘導体であるL-NIOは40％阻害を引き起こした。L-カナバニンおよびL-GGAは両方共グアニジノ誘導体であるが、これらも効果的阻害剤であり、それぞれ75％および40％の阻害を引き起こした。
【００６３】
図3は、6種のNOS阻害剤による、ATB0,+を介したグリシン輸送阻害の用量反応相関を示している。阻害強度は下記の順であった：L-TC＞L-NNA＞L-MTC＝L-NMMA＞L-NIO＝L-NIL。IC50値（すなわち、50％阻害を引き起こすのに必要な化合物の濃度)を下記に示す：L-TC（0.21±0.03mM)、L-NNA（0.56±0.04mM)、L-MTC（0.73±0.09mM)、L-NMMA（0.77±0.12mM)、L-NIO（2.65±0.25mM)、およびL-NIL（2.60±0.29mM)。
【００６４】
これらの結果は、試験した全てのNOS阻害剤が、クローニングされたマウスATB0,+の基質結合部位と相互作用することを示している。しかし、これらのデータは、これらのNOS阻害剤が輸送体にとって輸送可能な基質であることを示唆しているが、それを証明しているわけではない。いくつかの化合物は、それ自身が膜を越えて輸送されることなく、基質結合部位への結合の際にグリシンと競合することにより、輸送を遮断している可能性がある。これらの阻害剤が実際に輸送体の輸送可能基質であるかどうかを決定するために、これらの阻害剤のATB0,+を介した輸送を直接測定しなければならなかった。この目的のためにATB0,+の基質として[3H]-L-NNAを用い、かつクローニングされた輸送体を発現しているHRPE細胞におけるその輸送を調べた（図4)。ATB0,+を発現している細胞におけるL-NNAの輸送は、ベクターをトランスフェクションされた細胞におけるものよりも4倍高く、このことは、L-NNAが実際にこの輸送体の輸送可能な基質であることを示している。この結論は、さらに、この輸送体の基質であるグリシン、セリンおよびアルギニンによるATB0,+特異的L-NNA輸送の阻害によっても裏付けられた。対照的に、この輸送体の基質でないMeAIBおよびグルタミン酸は、ATB0,+特異的L-NNA輸送を阻害しなかった。このATB0,+特異的L-NNA輸送は可飽和であり、ミカエリス定数は0.75±0.10mMであった。
【００６５】
哺乳動物発現系では、市販の放射標識型NOS阻害剤の入手に限界があるので、ATB0,+を介した広範な種類のNOS阻害剤の輸送を研究するためには理想的ではない。従って本発明者らは、ATB0,+を介した多数のNOS阻害剤の輸送を直接測定するために、別の方法を試みねばならなかった。本発明者らは、この目的のためにX. laevis卵母細胞系を用いた。cRNAを注入することにより、クローニングされたマウスATB0,+をこれらの卵母細胞において機能的に発現させ、次にこの輸送体を介したNOS阻害剤（1mM）の輸送を、二微小電極電圧固定技術を用い、これらの阻害剤により誘導された内向き電流でモニタリングした。この手法は、ATB0,+の起電性のために実行可能である。電圧固定条件下で、ATB0,+発現卵母細胞の被験化合物への曝露時の内向き電流誘導は、卵母細胞への化合物の輸送の結果生じる膜の脱分極を示すと考えられた。これらの実験において、未注入の卵母細胞を陰性対照として用いた。これらの卵母細胞の実験結果を表2に示している。試験したNOS阻害剤の中でL-NAME、L-NABEおよびL-GGA以外は全て、クローニングされたATB0,+を発現させた卵母細胞において、顕著な内向き電流を誘導した。電流は、30nA〜500nAの範囲内で変動した。これとは対照的に、L-NAME、L-NABEおよびL-GGAは、非常に小さい電流しか誘導しなかった（10nA〜15nA)。アルギニン、リジン、シトルリン、およびオルニチンのアミノ酸類は、130nA〜550nAの範囲の電流を誘導した。
【００６６】
卵母細胞発現系におけるATB0,+を介したNOS阻害剤輸送をより詳細に分析するために、本発明者らは、3種のNOS阻害剤、すなわちL-NIL、L-MTC、およびL-NIOを選択した。本発明者らは、個別のNOSアイソフォームに対する選択性を基に、これらの化合物を選んだ：NOS IIについてL-NIL、NOS IについてL-MTC、およびNOS IIIについてL-NIO。図5は、L-NILおよびL-MTCによって誘導された内向き電流のイオン依存性を示している。NaClが存在する場合、濃度1mMのL-NILは、82±18nAの内向き電流を誘導した。しかしNMDG塩化物が存在する場合、この化合物への卵母細胞の曝露時に、測定可能な内向き電流は存在せず、このことは、L-NIL誘導性電流は、Na+の存在に強制的に依存することを示している。この化合物は、グルコン酸ナトリウムの存在下において（すなわち塩素不在下)、小さいが有意な電流を（〜10nA）誘導した。しかし、この実験に使用したL-NILは塩素塩であったので、少量の塩素がこれらの実験条件下で存在していた。これにより、観察されたような電流の誘導がもたらされた。このことは、塩素非存在型で入手可能なL-MTCにより得たデータにより裏付けられた。NaClが存在する場合、L-MTCは濃度1mMで、内向き電流116±34nAを誘導した。しかし、Na+かCl-のいずれかが存在しない場合には、測定可能な電流は存在せず、このことは、L-MTC誘導性内向き電流が絶対的にNa+およびCl-の両方の存在に依存していることを示している。Na+およびCl-の存在時にL-NILおよびL-MTCにより誘導されたこれらの電流の強制的依存性は、アルギニンについて得られたデータに類似していた。アルギニンは、塩素非含有塩として使用した場合に、382±57nAの内向き電流を誘導した。Na+かCl-のいずれかが存在しない場合は、アルギニンでは、測定可能な電流は認められなかった。
【００６７】
次に本発明者らは、卵母細胞発現系におけるATB0,+を介したL-MTC、およびL-NIOの輸送の飽和動力学を、それらの輸送の測定値として対応する阻害剤により誘導された内向き電流を用いて分析した。これらの実験の結果を図6に示しているが、これは3種全ての化合物のATB0,+を介した輸送が可飽和であることを示している。膜電位-50mVで算出したK0.5値（最大電流の半分を誘導するのに必要な化合物の濃度）は、L-MTC、L-NIL、およびL-NIOについて、各々、1.36±0.08mM、2.27±0.29mM、および2.24±0.35mMであった。しかしK0.5値は、3種全ての化合物について膜電位により影響を受けた。この値は、膜の過分極に伴い低下し、かつ膜の脱分極に伴い増加していった。
【００６８】
考察
本明細書において、本発明者らは、Na+およびCl-連動型のアミノ酸輸送体ATB0,+を介したNOS阻害剤の輸送に関する証拠を示した。本発明により、これらの有効な治療的物質の、イオン勾配駆動性集積的輸送システムが初めて同定された。NOS阻害剤のATB0,+を介した輸送を裏付ける証拠は、マウス結腸からクローニングされたATB0,+により得られた。クローニングされたATB0,+の輸送機能は、哺乳動物細胞とX. laevis卵母細胞における異種発現により試験された。この手法により本発明者らは、広範なNOS阻害剤のこの輸送体を介した輸送を直接研究することが可能になった。NOS阻害剤は、本質的に陽イオン性または双性イオン性のいずれかの性質であることができる。先行する研究は、陽イオン性NOS阻害剤はシステムy+により輸送されるが、双性イオン性NOS阻害剤はシステムLにより輸送されることを示している（Schmidt,K.ら、Mol.Pharmacol.、44、615-621（1993)、Schmidt,K.ら、Biochem.J.、301、313-316（1994)、Baydoun,A.R.およびMann,G.E.、Biochem.Biophys.Res.Commun.、200、726-731（1994)、Schmidt,K.ら、J.Neurochem.、64、1469-1475（1995)、Raghavendra Rao,V.L.およびButterworth,R.F.、J.Neurochem.、67、1275-1281（1996))。システムy+は双性イオン性NOS阻害剤と相互作用せず、かつシステムLは陽イオン性NOS阻害剤と相互作用しない。本研究において本発明者らにより、ATB0,+は、陽イオン性に加え双性イオン性の両方のNOS阻害剤を輸送することができることが示された。これは、この輸送体の基質特異性によるものである。ATB0,+は、塩基性アミノ酸に加え中性アミノ酸を基質として認識する。ATB0,+のアミノ酸基質の中で、アルギニン、リジン、シトルリン、およびオルニチンのアミノ酸類がどのようにして輸送体により処理されるかということが本研究に直接関係しているが、これは、現在研究に使用されるほとんどのNOS阻害剤はこれら4種のアミノ酸に構造的に関連しているからである。アルギニン、リジン、およびオルニチンは塩基性でありかつシトルリンは中性であるが、本研究は、これら4種のアミノ酸は全て、ATB0,+にとって輸送可能な基質であることを示している。同様に、塩基性または中性であるかを問わずこれらの4種のアミノ酸に構造的に関連したほとんどのNOS阻害剤は、ATB0,+を介して輸送される。
【００６９】
これまでに基質としてNOS阻害剤を認識することがわかっている3種のアミノ酸輸送体の中で、ATB0,+が最も集積力が強い。この輸送体は、Na+およびCl-の膜内外勾配と膜電位の組合せによりエネルギー供与される。対照的に、システムy+は膜電位のみにより駆動されており、かつシステムLは駆動力のない促進核酸輸送系である可能性が高い。従って、ATB0,+を発現している細胞へのNOS阻害剤の輸送は、集積性が高い可能性がある。これらの細胞におけるNOS阻害剤の細胞内濃度は、細胞外濃度の数倍に達する可能性がある。
【００７０】
本発明者らは、哺乳動物細胞の発現系におけるATB0,+に対する6種のNOS阻害剤の親和性を、輸送プロセスにおいてアミノ酸基質と競合するそれらの能力から決定した。これらは、L-NNAおよびL-NMMA（両者共構造的にアルギニンに関連)、L-NIL（構造的にリジンに関連)、L-TCおよびL-MTC（両者共構造的にシトルリンに関連)、ならびにL-NIO（構造的にオルニチンに関連）である。これら6種の化合物のIC50値は、0.2〜2.7mMの範囲を変動した。L-NNAについてさらに本発明者らは、同じ哺乳動物細胞の発現系において、ATB0,+を介したその輸送から直接親和性を決定した。輸送の直接測定値から計算されたミカエリス定数（Kt）は、競合阻害試験から算出されたIC50値に近似していることがわかった（0.75±0.10mMに対して0.56±0.04mM)。別の3種のNOS阻害剤（L-MTC、L-NIL、およびL-NIO）についても、本発明者らは、X. laevis卵母細胞の発現系を用いて、ATB0,+を介したそれらの輸送のミカエリス定数を算出した。これらの実験から算出されたKt値は、哺乳動物細胞発現系を用いる競合阻害試験から決定された、対応するIC50値に類似していることが見出された（L-MTCについて、1.36±0.08mMに対して0.73±0.09mM、L-NILについて、2.72±0.29mMに対して2.60±0.29mM、L-NIOについて、2.24±0.35mMに対して2.65±0.25mM)。
【００７１】
ATB0,+を介したNOS阻害剤の輸送は、薬学や臨床と重要な関連性を有する。このことは、ATB0,+が、NOS阻害剤の薬物送達系として使用できる可能性があることを示唆している。本発明者らは、マウス結腸からATB0,+をクローニングした。しかし、結腸のみではなく遠位小腸においてもこの輸送システムの発現に関する十分な証拠がある（Ganapathy,V.ら、Intestinal transport of peptides and amino acids. In Current Topics in Membranes. Barrett,K.E.およびDonowitz,M.編、Vol.50、pp.379-412、Academic Press.（2001)、Munck,L.K.、Biochim.Biophys.Acta、1241、195-213（1995))。この輸送機能は、回腸粘膜細胞の刷子縁膜に存在することが示されている（Ganapathy,V.ら、Intestinal transport of peptides and amino acids. In Current Topics in Membranes. Barrett,K.E.およびDonowitz,M.編、Vol.50、pp.379-412、Academic Press.（2001)、Munck,L.K.、Biochim.Biophys.Acta、1241、195-213（1995))。ATB0,+mRNAは、本試験において、腸管の遠位領域（回腸、盲腸および結腸）においてのみ検出可能であった。腸管の長軸に沿ったATB0,+mRNA発現パターンは興味深いものであり、かつこれはこの輸送体がNOS阻害剤送達系としての用途の可能性があることに関連している。本発明者らの知る限り、遠位腸管に制限されたATB0,+の発現は、アミノ酸輸送体の中で独特なものである。食物タンパク質に由来したアミノ酸は、大部分が近位小腸において吸収されるので、腸管の遠位領域におけるアミノ酸濃度は低い。結果として、NOS阻害剤とATB0,+を介した輸送に関する内因性アミノ酸との間で、競合はほとんどないと考えられる。これにより、NOS阻害剤の小腸での吸収効率が増大すると考えられる。
【００７２】
小腸の刷子縁膜には、小腸管腔からのNOS阻害剤の取込みに寄与し得る2種の別のアミノ酸輸送システムがある。これらはシステムy+およびシステムb0,+である。システムy+の陽イオン性NOS阻害剤を輸送する能力は、十分定義されている。対照的に、システムb0,+のNOS阻害剤を輸送する能力についてはほとんど情報がない。この輸送システムは、中性アミノ酸に加え塩基性アミノ酸と相互作用することができるので、本発明者らは、このシステムは双性イオン性および陽イオン性のNOS阻害剤を活用することができると推定した。本発明者らの最近の研究により、実際に、システムb0,+が、少なくとも部分的に双性イオン性NOS阻害剤L-NNAの小腸刷子縁膜を越えた取込みに寄与していることが示されている（Hatanaka,T.ら、Pharmaceut.Res.、16、1770-1774（1990))。しかし、システムy+およびシステムb0,+の両システム共、イオン勾配によっては駆動されない。従って本発明者らは、Na+およびCl-の膜内外勾配とエネルギー的に連動しているATB0,+は、これは管腔から小腸および結腸の吸収細胞へのNOS阻害剤の取込みにおいて、おそらくシステムy+およびシステムb0,+よりもずっと効果的である可能性が高いと推測する。
【００７３】
NOS阻害剤の経口生体利用率は、これらの化合物の小腸および結腸の刷子縁膜への侵入経路の存在のみではなく、側底細胞膜の排出経路の存在によっても左右されると考えられる。腸管の側底細胞膜には、2種のアミノ酸輸送システムが存在し、これらは小腸および結腸の吸収細胞から血液へのNOS阻害剤の排出に関連している。これらは、システムLおよびシステムy+Lである（Ganapathy,V.ら、Intestinal transport of peptides and amino acids. In Current Topics in Membranes. Barrett,K.E.およびDonowitz,M.編、Vol.50、pp.379-412、Academic Press.（2001))。ATB0,+、システムy+、およびシステムb0,+を介して小腸および結腸の上皮細胞へ吸収されるNOS阻害剤は、システムLおよびシステムy+Lを介して側底細胞膜を越えてこれらの細胞から排出することができる。
【００７４】
本研究は、さらにNOS阻害剤を使った小腸および結腸の炎症の管理にも臨床的に関連している。炎症時の小腸および結腸の上皮細胞中のNOS II誘導に関する説得力のある証拠がある（Tepperman,B.L.ら、Am.J.Physiol.、265、G214-G218（1993)、Singer,I.I.ら、1996、Gastroenterology、111、871-875（1996))。一酸化窒素は、腸管の正常な生理的機能に加え、細菌性肺血症および炎症性大腸疾患のような病態においても重要な役割を果たしている（Stensen,W.F.、Gastrointestinal inflammation. In, Textbook of Gastroenterology（Yamada,T.編)、Lippincott Williams & Wilkins、Philadelphia、pp.123-140（1999))。炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病が、主に結腸および/または回腸に関連し、腸管のこれらの部位においてATB0,+が特に発現されているという指摘は興味深い。NOS阻害剤の送達系としてATB0,+を使用するという考えは、特に小腸および結腸の上皮細胞中にNOS IIの誘導がある炎症性腸疾患の臨床管理の点で、いくつかの理由により魅力的である。ATB0,+は集積性の高い輸送体であり、したがってNOS阻害剤は、小腸および結腸の上皮細胞に非常に効率的に吸収され、かつ細胞内部に高濃度で蓄積されると考えられる。このことは、これらの細胞におけるNOS II阻害の効果的手段をもたらすと考えられる。さらに、小腸管腔内のNOS阻害剤は、ATB0,+を介した細胞への輸送に関してNOS IIの基質であるアルギニンと競合し、したがってNOS II活性のためのアルギニンの利用可能性を減少させると考えられる。従ってATB0,+は、NOS阻害剤をアルギニンの代わりに細胞へ送ることを可能にすると考えられる。このことは、NOS IIの基質であるアルギニンの利用可能性の低下、および細胞内NOS阻害剤濃度の上昇の両方により、非常に効果的なNOS II活性の阻害が生じる。
【００７５】
2.アミノ酸輸送体ATB0,+によるカルニチンのNa+およびCl-連動型能動輸送
方法
哺乳動物細胞の発現系におけるマウスATB0,+を介したカルニチン輸送
本発明者らは、マウス結腸のcDNAライブラリ（GenBankアクセッション番号AF320226）から完全長の機能的ATB0,+をクローニングした。クローニングされた輸送体は、ワクシニアウイルス発現法により、ヒト網膜色素上皮（HRPE）細胞において機能的に発現された（Wu,X.ら、Biochemical and Biophysical Research Communications、246、589-595（1998)、Wu,X.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、290、1482-1492（1999))。HRPE細胞におけるマウスATB0,+とのカルニチンの相互作用についての最初の試験は、ATB0,+を介した輸送についてグリシンと競合するカルニチンの能力を評価することにより行われた。その後の試験は[3H]-カルニチンを用いて行い、ATB0,+を介したカルニチン輸送を直接評価した。輸送の測定は、ベクターをトランスフェクションされた細胞と、マウスATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞において、並行して、24ウェル培養プレートを用いて行った。細胞の放射標識基質とのインキュベーションは、37℃で15分間行った。輸送用緩衝液の組成は、140mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mM MgSO4、および5mMグルコースを含有する、25mM Hepes/Tris（pH7.5）であった。cDNA特異的輸送は、ベクターをトランスフェクションされた細胞における輸送について調節し算出した。[3H]-グリシン、[3H]-カルニチン、アセチル-[3H]-カルニチンおよびプロピオニル-[3H]-カルニチンは、Moravek Biochemicals社（Brea、CA、USA）から購入した。
【００７６】
X. laevis卵母細胞発現系におけるマウスATB0,+を介したカルニチン輸送
X. laevis由来の成熟卵母細胞を、コラゲナーゼA（1.6mg/ml）処理により単離した。卵母細胞は、手で卵胞を除去され、その後マウスATB0,+のcRNAまたは水を注入するのに用いられた（Fei,Y.J.ら、Journal of Biological Chemistry、275、23707-23717（2000))。cRNAは、mMESSAGE mMACHINE（商標）キット（Ambion、Austin、TX、USA）を用いて合成した。卵母細胞におけるマウスのATB0,+を介したカルニチン輸送を、二微小電極電圧固定法を用い電気生理学的にモニタリングした（Fei,Y.J.ら、Journal of Biological Chemistry、275、23707-23717（2000))。膜電位は-50mVに固定した。卵母細胞をカルニチンで灌流し、かつ誘導された電流をモニタリングした。誘導電流を、輸送速度（transport rate）の測定値とした。灌流用緩衝液の組成は、100mM NaCl、2mM KCl、lmM MgCl2、1mM CaC12を含有する10mM Hepes/Tris（pH7.5）であった。
【００７７】
データ分析
実験は少なくとも3回繰り返した。結果は、平均土S.E.で示した。動力学的パラメータであるミカエリス定数（Kt）および最大速度（Vmax）は、単一の可飽和輸送システムを説明しているミカエリス-メンテン式にATB0,+特異的輸送データを当てはめ算出した。Na+およびCl-活性化動力学は、Na+およびCl-のK0.5値（最大活性化の半分に必要なNa+またはCl-濃度）およびヒル係数（n11、活性化プロセスに関連したNa+またはCl-イオンの数）を決定するために、ヒル式にATB0,+特異的輸送データを当てはめ分析した。
【００７８】
結果
哺乳動物細胞の発現系におけるマウスATB0,+を介したカルニチン輸送の分析
カルニチンとγ-アミノブチレートの間、さらにはカルニチンとベタインの間には、顕著な構造的類似性がある。カルニチンは、β炭素位にヒドロキシル基が付加され、かつアミノ基がトリメチルアミノ基と置換された、γ-アミノブチレートの誘導体である。末端炭素原子位置にトリメチルアミノ基が存在するために、カルニチンは、構造的にベタインにも類似している。ATB0,+の一次構造は、γ-アミノブチレート輸送体およびベタイン輸送体の構造に似ているので、本発明者らは、ATB0,+がγ-アミノブチレートおよびベタインと相互作用することが可能であるかどうかを調べた。同じ実験において、本発明者らは、ATB0,+が、カルニチンならびにそのアセチルおよびプロピオニルエステルと相互作用する能力についても試験した。これらの研究において、ATB0,+の輸送機能は、クローニングされたマウスATB0,+を発現しているHRPE細胞におけるグリシンの輸送を測定することによりモニタリングした。これらの細胞におけるATB0,+の発現は、グリシン輸送を30倍まで増大させた（図8A)。この輸送体の被験化合物との相互作用は、ATB0,+を介したグリシン輸送を阻害する能力を評価することにより調べた（図8B)。これらの研究は、興味深いが、かなり意外な結果をもたらした。γ-アミノブチレートおよびベタインは、ATB0,+を介したグリシン輸送に対する作用を、全くまたはほとんど示さなかった。対照的に、カルニチンおよびプロピオニルカルニチンは、ATB0,+を介したグリシン輸送を顕著に阻害した。カルニチンおよびプロピオニルカルニチンのIC50値（50％阻害した化合物の濃度）は、各々、0.6±0.1mMおよび0.9±0.1mMであった。アセチルカルニチンも、ATB0,+を介したグリシン輸送を阻害することができるが、驚くべきことにこのエステルの阻害効力は、カルニチンおよびそのプロピオニルエステルの効力よりもずっと低かった（アセチルカルニチンのIC50値は15±3mM)。
【００７９】
本発明者らは、カルニチンとそのエステル類がATB0,+を輸送することができる基質であるかどうかを決定するために、ベクターをトランスフェクションされた細胞とATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞の間で、[3H]-カルニチンおよびそのエステルの輸送を比較した（図9A)。HRPE細胞におけるATB0,+発現は、ベクターをトランスフェクションされた細胞における輸送と比べて増大したカルニチン（16倍）およびプロピオニルカルニチン（6倍）の輸送を誘導した。アセチルカルニチンの輸送も、ATB0,+発現により増大されたが、これは非常に小さい程度であった（2倍)。これらのデータは、ATB0,+が、輸送可能な基質としてカルニチン、プロピオニルカルニチン、およびアセチルカルニチンを認識することを示している。ATB0,+は、Na+およびCl-連動型の輸送体遺伝子ファミリーの一員であるので、これら2種のイオン性ATB0,+を介したカルニチン輸送に対する影響について本発明者らは調べた（図2B)。この輸送は、取込み用緩衝液中のNa+がN-メチル-D-グルカミンで交換された場合に、完全に破壊された。グルコネートとの交換により取込み用緩衝液からCl-を除去すると、輸送は〜60％に低下した。これらの結果は、ATB0,+を介したカルニチン輸送は、Na+およびCl-の両方に連動していることを示している。Cl-の除去は、この輸送を完全に破壊することはなかったが、その理由は、輸送測定時に細胞からCl-が放出される可能性があるからである。輸送体はCl-と高親和性で相互作用し、したがって輸送体は、Cl-が低濃度であったとしても、有意に活性がある。
【００８０】
ATB0,+を介したカルニチンの輸送は可飽和である（図10A)。動力的パラメータKtおよびVmaxの値は、0.83±0.08mMおよび72±2nmol/106細胞/15分間であった。ATB0,+を介したカルニチン輸送とNa+濃度の関係は、S字状であった（図10B)。Na+のK0.5は、54±4mMであり、ヒル係数（nH）は1.6±0.1であった。この発現系において、実験時に細胞からのCl-の著しい量の流出があったので、Cl-活性化動力学は調べなかった。
【００８１】
X. laevis卵母細胞発現系におけるマウスATB0,+を介したカルニチン輸送の分析
ATB0,+を介したアミノ酸基質の輸送は、電気発生的である（Sloan,J.L.およびMager,S.、Journal of Biological Chemistry、274、23740-23745（1999))。ATB0,+を介したカルニチン輸送の起電性を調べるために、本発明者らは、X. laevis卵母細胞発現系を用いた。マウスATB0,+を発現している卵母細胞をカルニチンで灌流した場合、二微小電極電圧固定技術により、顕著な内向き電流が検出可能であった（10mMカルニチンで〜300nA)(データは示さず)。同様の条件下で、プロピオニルカルニチンは〜200nAの電流を誘導した。対照的に、アセチルカルニチンは、検出可能な電流を誘導することができなかった。カルニチンとプロピオニルカルニチンにより誘導された電流は、Na+に加えCl-の存在に完全に依存していた。これら2種のイオンのいずれかを取り除くと、電流は完全に遮断された。
【００８２】
本発明者らは、輸送体機能の測定値としてカルニチンが誘導した内向き電流を用いて、ATB0,+を介したカルニチン輸送の動力学的パラメータを分析した。この電流は、カルニチン濃度の上昇により可飽和である（図11A)。カルニチンのK0.5は1.8±0.4mMであった。カルニチン誘導電流のNa+活性化動力学は、S字相関を示した（図11B)。Na+のK0.5は、25±4mMであり、ヒル係数（nH）は1.9±0.5であった。Cl-の除去は、カルニチン誘導電流を完全に遮断したので、実験条件下では明らかに卵母細胞からのCl-の流出はなかった。従って、本発明者らはこの発現系を用いて、Cl-活性化動力学を分析した。カルニチン誘導電流とCl-濃度の間の関係は、双曲線状であった（図11C)。Cl-のK0.5は15±5mMであり、かつヒル係数（nH）は0.9±0.2であった。これらのデータは、ATB0,+を介した輸送プロセスに関して、Na+：Cl-：カルニチンの化学量論的比が2：1：1であることを示している。
【００８３】
考察
現時点で、OCTN2のみが、イオン勾配連動型方法におけるカルニチン輸送が示された輸送体である（Wu,X.ら、Biochemical and Biophysical Research Communications、246、589-595（1998)、Wu,X.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、290、1482-1492（1999)、Tamai,I.ら、Journal of Biological Chemistry、273、20378-20382（1998))。OCTN2の輸送機能は、Na+の存在により左右される。Cl-は、この輸送体の機能において何ら役割を持たない。しかしカルニチンが中性的性質であることおよび輸送プロセスがNa+共輸送と連動することにより、輸送体は電気発生的である可能性がある。従ってOCTN2を介したカルニチン輸送は、膜内外Na+勾配および膜電位によりエネルギー供与される。本研究では、第二のイオン勾配連動型カルニチン輸送体の同定を説明している。ATB0,+は、Na+およびCl-と連動した方法で、カルニチンを輸送する。この輸送プロセスは電気発生的である。従ってATB0,+を介したカルニチン輸送は、Na+およびCl-の膜内外勾配に加え、膜電位によりエネルギー供給される。カルニチンのためのATB0,+の集積的な能力は、OCTN2のものよりもはるかに大きい。しかしATB0,+は、カルニチンの低親和性輸送体である（Kt=1mM〜2mM)。対照的に、OCTN2は、カルニチンの高親和性輸送体である（Kt=5μM〜15μM)(Tamai,I.ら、Journal of Biological Chemistry、273、20378-20382（1998)、Wu,X.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、290、1482-1492（1999))。血液中のカルニチン濃度は30μM〜50μMの範囲内であり、従ってOCTN2は、生理的条件下でのほとんどの組織におけるカルニチンの細胞取込みにとってATB0,+よりもずっと重要である。興味深いことに、これら2種の輸送体の組織分布はかなり異なっている。OCTN2はほとんどの組織において発現されるのに対して、ATB0,+は主に乳腺、肺、および腸管において発現される。ATB0,+が発現される組織において、ATB0,+は重要な役割を果たしている可能性がある。OCTN2輸送機能を遺伝的に欠損しているJVSマウスを用いた最近の研究により、カルニチンの小腸での吸収が、欠損のためにわずかに約50％に低下していることが示された（Yokogawa,K.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 289、224-230（1999))。OCTN2機能の欠損は小腸での吸収を完全には排除しないという知見により、小腸でのカルニチン吸収に関する、これまで同定されていなかったいくつかのさらなる輸送体の関与が示唆されている。ATB0,+は腸管において発現されるので、この輸送体が、OCTN2と共に、カルニチンの小腸での吸収に参加することは可能である。さらにATB0,+は小腸においてのみではなく結腸においても発現される。本研究は、マウス結腸からクローニングしたATB0,+についても行った。微生物叢は、カルニチンを炭素供給源として利用する（Rebouche,C.J.およびSeim,H.、Annual Review of Neutrition、18、39-61（1998))。従って本発明者らは、結腸のATB0,+は、カルニチンの吸収に役割を果たしうり、その結果管腔におけるカルニチンに関する結腸の微生物と競合すると推定した。同様に、乳腺のATB0,+は、乳汁へのカルニチン分泌に関与しうる。加えてATB0,+を介したカルニチン輸送はおそらく、OCTN2が遺伝子欠損した患者におけるカルニチンの恒常性に密接に関連している可能性がある。
【００８４】
OCTN2とATB0,+は、それらの親和性および駆動力が異なるのみではなく、それらの基質特異性も異なる。OCTN2は、カルニチン、アセチルカルニチンおよびプロピオニルカルニチンを同等の親和性で輸送する（Wu,X.ら、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、290、1482-1492（1999))。対照的に、ATB0,+は、カルニチンおよびプロピオニルカルニチンのみを輸送する。この輸送体は、アセチルカルニチンに対して非常に低い親和性を示している。アセチルカルニチンが、細胞内や循環血流中では主要なアシルカルニチンエステルである。これは、代謝の同化および異化経路における重要な中間体である。OCTN2およびATB0,+のアセチルカルニチンに対する親和性の差は、生理的意味を持つ可能性がある。
【００８５】
3．アミノ酸輸送体ATB0,+によるD-アミノ酸のNa+およびCl-連動型能動輸送
方法
方法を表3および図面の簡単な説明（図11）に簡単に示す。
【００８６】
結果および考察
本発明者らは、異種発現系におけるD-セリンの輸送に関して、別々のアミノ酸輸送体クローン10個の機能を評価した（図11）。これらの輸送体は全て、腸管において発現される。被験輸送体の一覧には、三つのエネルギー非依存的ヘテロ二量体促進拡散輸送体（L1、L2、およびb0,+）、Na+連動型システムA（ATA1、ATA2、およびATA3）の三つのサブタイプ、Na+およびH+連動型システムNの二つのサブタイプ（SN1およびSN2）、Na+連動型システムATB0、ならびにNa+およびCl-連動型システムATB0,+が含まれる。促進性輸送体の中で、システムL1（LAT1/4F2hc）およびb0,+（b0,+AT/4F2hc）は、有意なD-セリン輸送能を示した。LAT2/4F2hcおよびb0,+AT/rBAT複合体は、検出可能なD-セリン輸送活性を示さなかった。システムAのサブタイプの中で、ATA1およびATA2はD-セリン輸送活性を示したが、ATA3は示さなかった。SN1およびSN2は、D-セリンを輸送しなかった。ATB0は、D-セリンを顕著な程度まで輸送することができ、その輸送活性は、システムL1、システムb0,+、システムATA1、およびシステムATA2のそれよりはるかに高い。D-セリンの輸送能は、Na+およびCl-連動型輸送体ATB0,+が最高であった。ATB0,+は、多数の推進力、すなわちNa+勾配、Cl-勾配、および膜電位によってその輸送機能がエネルギー付与される神経伝達物質輸送体の遺伝子ファミリーに属する。ATB0およびATB0,+の機能的活性は、腸上皮細胞の刷子縁膜において証明されており、したがって、これらの二つの輸送体は、管腔から粘膜細胞へのD-セリンの能動的吸収を媒介する可能性がある。これらの二つの輸送系のエネルギー論に基づいて、ATB0,+は、このプロセスにおいて主要な役割を果たすと予想される。
【００８７】
ATB0,+が他のD-アミノ酸を輸送することができるか否かを調べるために、異なる二つのアプローチを用いた（表3）。
【００８８】
（表３）ATB0,+によるD-アミノ酸に対するL-アミノ酸の輸送
2004529642.tif 000004
【００８９】
[3H]-グリシン（10 μM）の輸送を、ベクターをトランスフェクションされたHRPE細胞およびmATB0,+cDNAをトランスフェクションされたHRPE細胞において測定した。非標識アミノ酸を、濃度2.5 mMで用いた。cDNA特異的輸送を、mATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞における輸送からベクターをトランスフェクションされた細胞における輸送を差し引くことによって計算した。値は対照輸送の割合（％）である。データ（4回の別々の測定の平均値±SEM）は、cDNA特異的輸送のみを表す。また、mATB0,+cRNAを注入することによってX.laevis卵母細胞においてmATB0,+を発現させ、アミノ酸（1 mM）によって誘導された内向き電流を、二微小電極電圧固定法を用いて測定した。灌流液はNaCl（pH 7.5）を含んだ。データは、卵母細胞の三つの異なるロットからの平均値±SEMを表す。
【００９０】
第一のアプローチにおいて、ATB0,+の輸送機能を、基質としてグリシンを用いる哺乳動物細胞異種発現系において測定し、様々なアミノ酸のL-エナンチオマーおよびD-エナンチオマーがこの輸送機能を阻害する能力を比較した。試験した全ての中性アミノ酸および塩基性アミノ酸は、L-エナンチオマーとして存在する場合、ATB0,+を介したグリシン輸送の強力な阻害剤であった。D-エナンチオマーの場合、アラニン、セリン、メチオニン、ロイシンおよびトリプトファンのみが強力な阻害剤であった。阻害の程度は、これらのアミノ酸5個に関してL-エナンチオマーとD-エナンチオマーのあいだで同等であった。対照的に、トレオニン、ヒスチジン、フェニルアラニンおよびグルタミンのD-エナンチオマーは、対応するL-エナンチオマーよりも、阻害剤としての有効性がかなり低かった。アスパラギン、リジン、アルギニン、バリン、およびイソロイシンは、対応するL-エナンチオマーが強力な阻害剤であるのに対し、D-エナンチオマーとして存在する場合、阻害剤としてほぼ完全に無効であった。阻害とは、阻害剤が輸送体によって膜を介して転位することを必ずしも意味しないため、これらのアミノ酸のL-エナンチオマーおよびD-エナンチオマー型の輸送を、異種性ATB0,+を発現するXenopus laevis卵母細胞において直接評価した。これは、二微小電極電圧固定法を用いて、アミノ酸誘導型内向き電流をモニタリングすることによって行われた。全被験アミノ酸のL-エナンチオマーは内向き電流を誘導し、これによりATB0,+によってそれらが輸送されたことが示される。D-エナンチオマーの場合、アラニン、セリン、メチオニン、ロイシン、およびトリプトファンのみが電流を誘導した。トレオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、およびグルタミンは、小さいが有意な電流を生じたのに対し、残りのアミノ酸は電流を生じなかった。X.laevis卵母細胞発現系によるこれらの結果は、哺乳動物細胞発現系による結果の確証となる。これらのデータは、ATB0,+が、L-エナンチオマーとして存在する全ての中性アミノ酸および塩基性アミノ酸を輸送することができることを示している。しかし、輸送体は、輸送可能な基質としてD-エナンチオマー型のアラニン、セリン、メチオニン、ロイシン、およびトリプトファンのみを認識する。
【００９１】
4．アミノ酸輸送体ATB0,+によるフェニルグリシンおよびその誘導体のNa+およびCl-連動型能動輸送
方法
材料
[3H]-グリシンは、Moravek（Brea、CA）から購入されたものであり、[14C]-L-フェニルグリシンは、American Radiolabeled Chemicals, Inc（St.Louis、MO）から購入されたものである。[3H]-L-グルタミンおよび[3H]-L-アラニンは、Dupont-New England Nuclear（Boston、MA）およびAmersham Pharmacia Biotech（Piscataway、NJ）からそれぞれ得た。
【００９２】
HRPE細胞におけるATB0,+、ATB0、およびb0,+ATの機能的発現
これは、ワクシニアウイルス発現系を用いて行った。輸送の測定は、基質として放射標識アミノ酸を用いて37℃で15分間行った。輸送緩衝液は、140 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl2、0.8 mM MgSO4、および5 mMグルコースを含む25 mM Hepes/Tris（pH 7.5）であった。内因性の輸送活性は常に、ベクターのみをトランスフェクションされた細胞を用いて同時に測定した。cDNA特異的輸送は、内因性活性を補正することによって計算された。
【００９３】
X.laevis卵母細胞発現系におけるATB0,+の機能的発現
X.laevis由来の成熟卵母細胞を、コラゲナーゼA（1.6 mg/ml）による処置によって単離した。卵母細胞の卵胞を手で除去して（defolliculate）からマウスATB0,+cRNAまたは水の注射用に用いた（Fei, Y.J.ら、Journal of Biological Chemistry、275、23707〜23717（2000））。cRNAを、mMESSAGE mMACHINE（商標）キット（Ambion、Austin、TX、USA）を用いて合成した。卵母細胞におけるマウスATB0,+による化合物の輸送を、二微小電極電圧固定法を用いて電気生理的にモニタリングした（Fei, Y.J.ら、Journal of Biological Chemistry、275、23707〜23717（2000））。膜電位を、-50 mVで一定に維持した。卵母細胞を各化合物で灌流して、誘導電流をモニタリングした。誘導電流は輸送速度の測定値として得た。灌流緩衝液の組成は、100 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl2、および1 mM CaCl2を含む10 mM Hepes/Tris（pH 7.5）であった。
【００９４】
(S)-2-(3-ベンジルオキシカルボニルアミノフェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ酢酸tert-ブチルエステルの合成（図14実施例1）
(S)-2-(3-ベンジルオキシカルボニルアミノフェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ酢酸（1.0 g）、tert-ブチル2,2,2-トリクロロアセチミデート（1.0 g）およびBF3-Et2O（1滴）のCH2Cl2（30 ml）混合液を室温で一晩攪拌した。反応混合物を真空で濃縮して、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（3：1ヘキサン：EtOAc）によって精製すると、表題化合物（800 mg）が得られた。
2004529642.tif 000005
【００９５】
(S)-2-(3-アミノフェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ酢酸tert-ブチルエステルの合成（図14実施例2）
(S)-2-(3-ベンジルオキシカルボニルアミノフェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ酢酸tert-ブチルエステル（800 mg）および10％Pd-Cのエタノール混合液をH2下で攪拌した。混合物を濾過して触媒を除去し、濾液を真空で濃縮して表題化合物（650 mg）を得た。
2004529642.tif 000006
【００９６】
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸tert-ブチルエステルの合成（図14実施例3）
(S)-2-(3-アミノフェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ酢酸tert-ブチルエステル（2.6 g）、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（2.2 g）およびEt3N-AcOH/MeCN（1 M、8.0 ml）のMeCN（50 ml）混合液を気密容器において50℃で3日間攪拌した。反応混合液を真空で濃縮して、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（2：1ヘキサン:EtOAcおよび15：1 CHCl3：MeOH）によって精製すると、表題化合物（900 mg）が得られた。
2004529642.tif 000007
【００９７】
(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸塩酸塩の合成（図14実施例4）
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸tert-ブチルエステル（800 mg）およびH2O（1 ml）のHCl/ジオキサン（4 M、5 ml）混合液を室温で一晩攪拌した。混合物を真空で濃縮して、H2O（5 ml）に溶解して、5 ml固相抽出器（WatersODS）の中を通過させ、凍結乾燥して、表題化合物（550 mg）を得た。得られた化合物をH2O（5 ml）に溶解して、DOWEX 50W X8イオン交換樹脂（Na+型）15mlを予め充填したクロマトグラフィーカラムに適用した。カラムを水で洗浄して、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸が確実に完全に溶出するように2％アンモニア水によって濯いだ。アンモニア溶出液を凍結乾燥して、得られた残渣をH2O（10 ml）に再度溶解した。(-)-10-カンフルスルホン酸（460 mg）を溶液に加えて、50℃に加熱した。均一な混合物を4℃まで冷却して、同じ温度で一晩放置した。混合物を濾過して、沈殿した固体を除去し、DOWEX 50W X8イオン交換樹脂（Na+型）15 mlを予め充填したクロマトグラフィーカラムに濾液を適用した。カラムを水によって洗浄して、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸が確実に完全に溶出するように、2％アンモニア水によって濯いだ。アンモニア溶出液を凍結乾燥した。残渣に1 M HCl（2 ml）およびH2O（10 ml）を加えて、混合物を凍結乾燥すると、表題化合物（350 mg、98％ee）が得られた。
2004529642.tif 000008
【００９８】
結果および考察
ATB0,+のアミノ酸特異性を、クローニングされた輸送体を介した輸送のプロセスに関して、L-フェニルグリシンを含む多様なアミノ酸が[3H]-グリシン（60 nM）と競合する能力を評価することによって試験した（表4）。
【００９９】
（表４）マウスATB0,+のアミノ酸基質特異性
2004529642.tif 000009
【０１００】
[3H]-グリシン（60 nM）の輸送は、ベクターをトランスフェクションされたHRPE細胞およびmATB0,+cDNAをトランスフェクションされたHRPE細胞において、NaClの存在下（pH 7.5）で37℃で15分間測定された。非標識アミノ酸を、濃度2.5 mMで用いた。cDNA特異的輸送は、mATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞における輸送からベクターをトランスフェクションされた細胞における輸送を差し引くことによって計算された。データ（4回の別々の測定の平均値±SEM）は、cDNA特異的輸送のみを表す。
【０１０１】
2.5 mMの濃度で、試験した中性アミノ酸および塩基性アミノ酸は全て、ATB0,+を介した[3H]-グリシンの輸送を阻害した（70％〜99％）。L-フェニルグリシンは、ATB0,+を介した[3H]-グリシンの輸送を完全に（100％）阻害した。これは、ATB0,+に対するL-フェニルグリシンの親和性が全必須アミノ酸の親和性よりも高いことを示している。
【０１０２】
L-フェニルグリシンと必須アミノ酸とのあいだのATB0,+の親和性の差を定量するために、本発明者らは、ATB0,+を介した[3H]-グリシンの輸送の、L-フェニルグリシン、L-アラニン、およびL-フェニルアラニンを用いた阻害に関する用量反応相関を比較した（図12）。これらの試験から計算したIC50値（すなわち、50％阻害を引き起こすアミノ酸濃度）を表5に示す。これらの競合において用いた[3H]-グリシンの濃度が57 nMであることから、これらのIC50値は実験条件下ではKi値（すなわち阻害定数）にほぼ等しいが、この値はほとんどのアミノ酸に関してATB0,+の既知のKi値（＞6μM）よりもずっと少ない。これらの値の比較から、L-フェニルグリシンに対するATB0,+の親和性は、グリシンおよびフェニルアラニンに関して対応する親和性よりも、それぞれ19倍および13倍高いことが示される。
【０１０３】
腸内刷子縁膜（BBM）において、少なくとも三つの輸送体がL-フェニルグリシンを輸送すると考えられる；ATB0,+、ATB0およびb0,+AT。L-フェニルグリシンが腸内BBMにおいてATB0,+に対する特異的基質であることを証明するために、本発明者らは、ATB0およびb0,+ATを介した[3H]-アラニンおよび[3H]-グルタミンの輸送のL-フェニルグリシン、L-アラニン、およびL-フェニルアラニンによる阻害に関する用量反応相関を比較した。その上、本発明者らは、これらの結果からIC50値を計算した（表5）。
【０１０４】
（表５）mATB0,+、hATB0、およびmb0,+AT rBAT複合体を介した輸送の阻害に関するKi値の比較
2004529642.tif 000010
【０１０５】
取込みの測定を、非標識アミノ酸の濃度範囲にわたって阻害を評価した点を除き、表1に記載したように行った。Ki値は、mATB0,+に対して特異的な57 nM[3H]-グリシン、hATB0に対して特異的な32 nM[3H]-アラニン、およびmb0,+AT rBAT複合体に対して特異的な36 nM[3H]-アルギニンの取込みの阻害に関する用量反応相関から計算した。
【０１０６】
L-フェニルグリシンに関して、ATB0,+の親和性は、ATB0およびb0,+ATの対応する親和性よりも、それぞれ4倍および53倍高い。
【０１０７】
これらの結果は、L-フェニルグリシンが、クローニングされたマウスATB0,+の基質結合部位と高い親和性で相互作用することを示している。しかし、これらのデータは、フェニルグリシンが輸送体に関する輸送可能な基質であることを示唆しているが証明していない。いくつかの化合物は、それ自身が膜を越えて輸送されることなく、基質結合部位との結合の際にグリシンと競合することによって輸送を遮断する可能性がある。これらの阻害剤が実際に輸送体の輸送可能な基質であるか否かを決定するためには、これらの阻害剤のATB0,+を介した輸送の直接測定を行わなければならない。この目的のため、本発明者らは、[14C]-L-フェニルグリシンをATB0,+の基質として用いて、クローニングした輸送体を発現するHRPE細胞におけるその輸送を試験した（図13）。ATB0,+発現細胞内のL-フェニルグリシンの輸送は、ベクターをトランスフェクションされた細胞内よりも3倍高く、これは、L-フェニルグリシンが実際にこの輸送体に関する輸送可能な基質であることを証明している。その上、ATB0,+によるcDNA特異的L-フェニルグリシン輸送は、ATB0およびmb0,+ATによるcDNA特異的輸送より10倍高かった。
【０１０８】
併せて考慮すると、これらの結果は、L-フェニルグリシンが、試験した全てにおいてATB0,+の最も特異的な基質であることを示している。フェニルグリシン誘導体薬物は、腸管から効率的に吸収されて、結腸、肺、および乳腺など、ATB0,+を豊富に発現する組織に輸送される可能性が高い。
【０１０９】
その上、本発明者らは、L-フェニルグリシン誘導体の例として(S)-(3-(2-ニトログアニジル)フェニル)グリシンを合成した（図14）。この化合物は、強力なNOS阻害剤であるL-NNAの誘導体でもあるため、NOS阻害剤として有効であると考えられる。本発明者らは、この化合物の輸送を調べるためにX.laevis卵母細胞発現系を用いた。この化合物の輸送を、様々な濃度のこの化合物によって誘導された内向き電流によってモニタリングした（図15A）。本発明者らはまた、双方の化合物の親和性を比較するためにL-NNAの電流もモニタリングした（図15B）。(S)-(3-(2-ニトログアニジル)フェニル)グリシンおよびL-NNAのKm値はそれぞれ、106±1 μMおよび348±5 μMである。これらのデータは、L-NNA化学構造のフェニルグリシン誘導体化学構造への改変がATB0,+に対する輸送親和性を増加させることを示している。本発明者らが実施例6において示すように、ATB0,+は、iNOSと同様に、炎症状態において誘導可能である。併せて考慮すると、(S)-(3-(2-ニトログアニジル)フェニル)グリシンのようなL-フェニルグリシン誘導体NOS阻害剤は、結腸、肺、および乳腺など、ATB0,+を豊富に発現する組織の炎症に対して有効となるはずである。
【０１１０】
5．アミノ酸に基づくプロドラッグの送達系としてのATB0,+の利用可能性に関する証拠
方法
輸送試験
方法を、表6および図面の簡単な説明（図16）に簡単に示す。
【０１１１】
アシクロビルのL-グルタミン酸γ-エステルの合成
アシクロビルおよび酢酸アンモニウムはSigma（St.Louis、MO）から購入した。N-α-CBZ-L-グルタミン酸γ-ベンジルエステル（Z-Glu-OBzl）は、Nova biochem（San Diego、CA）から購入した。1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）、10重量％パラジウム/活性炭素（Pd/C）、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、ジメチルホルムアミド（DMF）、およびジクロロメタン（CH2Cl2）はAldrich（Milwaukee、WI）から購入した。メタノール（MeOH）およびHPLC等級のアセトニトリルは、EM Science（Gibbstown、NJ）から購入した。エタノール（EtOH）は、AAPER alcohol and chemical company（Shelbyville、KY）から購入した。アシクロビル（0.888 mmol）およびZ-Glu-OBzl（2.22 mmol）をDMF（6 ml）に溶解して、EDC（426 mmol）およびDMAP（2.22 mmol）を溶液に加えた。溶液を室温で18時間攪拌した。DMFを真空下で除去して、残渣をNHシリカゲル（Chromatorex DM-1020、Fuji Silysia Chemical LTD、日本）上で、溶出液として1：10〜1：5 MeOH-CH2Cl2を用いてクロマトグラフィーを行って、アシクロビルZ-Glu-OBzlγエステルを生成した。
【０１１２】
アシクロビルZ-Glu-OBzlγエステルをEtOH（1 ml）、MeOH（1 ml）、およびCH2Cl2（1 ml）に溶解して、10％Pd/C（20 mg）を加えた。混合物を水素下で3日間攪拌した。混合物を濾過して触媒を除去し、溶媒を真空下で除去した。生成物は白色の非結晶固体（120 mg）であった。全体的な収率：38％。
2004529642.tif 000011
【０１１３】
最終生成物の純度は、分析カラム（Cyclobond I 2000、4.6×100 mm、Advanced Separation Technologies Inc、Whippany、NJ）を備えたDionex分析HPLCシステム（Dionex corporation、Sannyvale、CA）を用いたRP-HPLCにより確認した。分析RP-HPLCの勾配は、以下の通りであった：（溶媒A）10％5 mM酢酸アンモニウム水溶液のアセトニトリル溶液、（溶媒B）90％5 mM酢酸アンモニウム水溶液のアセトニトリル溶液、100：0〜90：10（溶媒A：溶媒B）を1 ml/分で3分間。保持時間は1.42分間、純度は96％であった。化合物の分子量は、ESI-MSによって決定した（Finnigan Mat LC-Q、Finnigan Corporation、San Jose、CA）。値はMH+として表記する。
【０１１４】
結果および考察
アスパラギン酸およびグルタミン酸はATB0,+の基質ではないが、アスパラギンおよびおよびグルタミンは基質であるため、本発明者らは、その側鎖におけるカルボキシル基が別々の化学基で置換されているアスパラギン酸およびグルタミン酸の誘導体は、輸送体の基質となると考えられるという仮説を立てた。この仮説を調べるため、本発明者らは、そのようないくつかの誘導体が、ATB0,+による輸送に関してグリシンと競合する能力を評価した（表6）。本発明者らは、アスパラギン酸およびグルタミン酸のメチルおよびベンジルエステルが、グリシン輸送の強力な阻害剤であることを発見した。これらの誘導体は濃度1 mMにおいて80％〜100％の阻害を引き起こし、これは、これらの誘導体がATB0,+によって認識されることを示している。ヒドロキサメート（hydroxamate）、アニリド、およびナフチルアミド誘導体も同様に、ATB0,+による輸送に関して、グリシンと中等度に効率的に競合する。図16Aは、アスパラギン酸、アスパラギン、およびアスパラギン酸-β-ベンジルエステルの用量反応相関を記述し、図16Bは、グルタミン酸、グルタミン、およびグルタミン酸-γ-ベンジルエステルの用量反応相関を記述する。予想されるように、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、ATB0,+を介したグリシン輸送の有効な阻害剤ではない。しかし、アミド誘導体（アスパラギンおよびグルタミン）およびベンジルエステル誘導体は強力な阻害剤である。興味深いことに、アスパラギン酸のベンジルエステル（IC50値、70±8 μM）は、グルタミン酸のベンジルエステル（IC50値、156±12 μM）より約2倍強力であり、これは、対応するグルタミン酸誘導体よりも良好に、ATB0,+がアスパラギン酸誘導体と相互作用しうることを示唆している。したがって、本発明者らは、治療薬がβ-カルボキシル基においてアスパラギン酸に連結できれば、得られた誘導体は、ATB0,+の優れた基質となる可能性があると推測する。
【０１１５】
（表６）
【化１】
2004529642.tif 000012
*0.25 mM
【化２】
2004529642.tif 000013
*0.25 mM
【０１１６】
HRPE細胞にベクター単独またはマウスATB0,+cDNAのいずれかをトランスフェクションして、ワクシニアウイルス技術によって機能的発現を行った。[3H]グリシン（10 μM）の輸送を、アスパラギン酸およびグルタミン酸の様々な誘導体（1 mM）の存在下および非存在下で測定した。データは、cDNA特異的輸送のみを表す。結果は、阻害剤の非存在下で測定した対照輸送の％として示す。
【０１１７】
これらのプロドラッグの親薬物は真の薬物ではない。本発明者らは、ウイルス感染用の市販薬であるアシクロビルのL-グルタミン酸-γ-エステルを合成し、これらの案の実用性を試験した。この試験を評価するために、本発明者らは、X.laevis卵母細胞発現系を用いた。このプロドラッグの輸送を、このプロドラッグの様々な濃度によって誘導された内向き電流によってモニタリングした（図17）。これらのデータにより、ATB0,+によるアシクロビルのL-グルタミン酸-γ-エステルの飽和可能な輸送を直接示している。
【０１１８】
その上、本発明者らは、アミノ酸に基づくプロドラッグの基質認識の拡大の可能性を調べるために、アシクロビルのL-バリン-α-エステル（バラシクロビル）の輸送を評価した。本発明者らは、マウスATB0,+cDNAをトランスフェクションされたHRPE細胞における[8-3H]-バラシクロビル輸送を試験した（図18）。その結果、ATB0,+発現細胞における[8-3H]-バラシクロビルの輸送は、ベクターをトランスフェクションされた細胞より3倍高く、これは、バラシクロビルが実際にこの輸送体に対する輸送可能基質であることを証明している。
【０１１９】
6．炎症状態での腸管におけるATB0,+発現の上昇
方法
方法は、図面の簡単な説明（図19）に簡単に示す。
【０１２０】
結果および考察
D-セリンは、グルタミン酸神経伝達の重要な調節物質でありかつ他のD-アミノ酸も同様に有意な生物作用を有しうるため、D-アミノ酸の腸管吸収が変化する可能性がある病態が存在するか否かを知ることは臨床的に重要である。したがって本発明者らは、腸機能に影響を及ぼすことが知られている炎症状態の腸管におけるATB0,+発現を評価した。本発明者らは、この目的のために二つの異なる動物モデルを用いた。第一に、本発明者らは、細菌性リポ多糖類の注射によってマウスに敗血症を生じる敗血症の動物モデルを用いた。この動物モデルは、腸の形態および機能に及ぼす敗血症の影響を調べるために広く用いられている。第二に、本発明者らは、慢性炎症のモデルとしてインターロイキン-2ノックアウトマウスを用いた。IL-2-/-マウスは、生後5週間〜6週間以内に重度の潰瘍性大腸炎を発症する。第一のモデルにおいて、生理食塩液を注射したマウスを対照とした。第二のモデルにおいて、IL-2+/+マウスを対照とした。ATB0,+mRNAの定常状態レベルを、空腸、回腸、および結腸における半定量的RT-PCRによって試験した。グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（GAPDH）mRNAを細菌敗血症モデルの内部対照として用いた。しかし、GADPH mRNAは、IL-2+/+マウスと比較してIL-2-/-マウスでは数倍上昇しているため、このmRNAは潰瘍性大腸炎モデルに関する内部対照として好適ではなかった。したがって、本発明者らは、この動物モデルの内部対照としてシクロフィリンC mRNAを用いた。それぞれの内部対照に関して補正した後、ATB0,+mRNAが、生理食塩液処置マウスと比較してリポ多糖類処置マウスの回腸において7倍、および結腸において2倍増加していることが判明した（図19）。同様に、ATB0,+mRNAレベルは、IL-2+/+マウスと比較してIL-2-/-マウスでは回腸において12倍、および結腸において5倍増加した（図19）。これらのデータは、炎症状態によって、回腸および結腸におけるATB0,+発現の顕著な増加が起こることを示している。ATB0,+mRNAは、どのマウスの空腸においても検出されなかった。本発明者らは、細菌由来のD-セリンおよび他のD-アミノ酸の腸管吸収が、これらの炎症状態では有意に増加しうると推測する。
【０１２１】
7．腫瘍組織におけるATB0,+発現の上昇
本発明者らは、腫瘍組織におけるATB0,+発現を評価した。本発明者らは、105日齢のFvB野生型ポリオーマミドル（middle）T抗原雌性マウスの乳腺腫瘍および対照マウスの対応する乳腺腫瘍からのmRNAを用いた。腫瘍のmRNA試料はマウス2匹から採取した。対照乳腺をマウス3匹から採取してRNA調製のためにプールしたが、その理由は、乳腺組織が小さすぎて各マウスに関するmRNAを調製できなかったからである。定常状態のATB0,+mRNAを、乳腺腫瘍および対応する対照において半定量的RT-PCRによって試験した（図20）。ATB0,+は対照乳腺には検出されなかったが、一方で両腫瘍試料においてRT-PCRによってATB0,+が検出された。本発明者らは、サザンブロットによる半定量的RT-PCRによって腫瘍におけるATB0,+の誘導レベルを定量した。ATB0,+は、約58倍および88倍増加した。本発明者らはまた、iNOSの誘導レベルも定量した。iNOSはまた、両腫瘍試料において約33倍および134倍増加した。多くの腫瘍におけるiNOS発現がより高いことは周知であり、iNOSは、腫瘍発生および腫瘍の増殖において重要な役割を果たす可能性がある（Jaiswal, M.ら、Am. J. Physiol. 281、G626〜G634（2001）、Thomsen, L.L.ら、Cancer Research、57：3300〜3304、（1997））。本発明者らはまた、ヒト乳癌細胞株MCF-7およびヒト肝癌細胞株Hep-G2におけるATB0,+の発現がより高いことを発見した。
【０１２２】
産業上の利用可能性
本発明によって、ATB0,+により輸送可能な化合物が明らかにされた。この化合物情報に基づけば、ATB0,+により輸送可能な薬物の設計、製造およびスクリーニングが可能である。これら薬物は、NOS、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸等が関与する疾患の治療および/または予防に役立つ。また、ATB0,+遺伝子を患者に投与することによって、上記疾患の遺伝子治療を行うことも考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】マウス腸管の長軸に沿ったATB0,+mRNAノーザンブロット分析の結果を示す写真を示す。小腸は、小腸の最も近位領域を示す第一セグメントから最も遠位領域を示す第四セグメントまでの4個の同等のセグメントに分けた。ブロットは、順にマウスATB0,+、マウスPEPTlおよびマウスβ-アクチンに特異的な[32P]標識cDNAプローブと、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズした。
【図２】基質としてグリシンを用いた哺乳動物細胞の発現系におけるマウスATB0,+の機能的特徴を示す。結果は、ATB0,+特異的輸送活性についてのみ示し、これはcDNAをトランスフェクションされた細胞における輸送から、ベクターをトランスフェクションされた細胞における輸送を差し引いて算出した。A. ATB0,+を介したグリシン（60nM）輸送のイオン依存性。B. ATB0,+を介したグリシン輸送の飽和動力学。C. ATB0,+を介したグリシン（60nM）輸送のNa+活性化動力学。D. ATB0,+を介したグリシン（60nM）輸送のCl-活性化動力学。
【図３】クローニングされたマウスATB0,+を発現しているHRPE細胞におけるNOS阻害剤によるATB0,+特異的グリシン（10μM）輸送の阻害の用量反応相関を示す。
【図４】ATB0,+を介したL-NNA輸送の特徴を示す。クローニングされたマウスATB0,+はHRPE細胞において発現されており、[3H]-L-NNA（10μM）の輸送が試験された。結果はATB0,+特異的輸送についてのみ示した。A. ベクターをトランスフェクションされた細胞およびATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞におけるL-NNAの輸送。B. アミノ酸（5 mM）によるATB0,+特異的L-NNA輸送の阻害。C. ATB0,+を介したL-NNA輸送の飽和動力学。
【図５】クローニングされたマウスATB0,+を発現しているX. laevis卵母細胞におけるL-アルギニン、L-NIL、およびL-MTCにより誘導された内向き電流のイオン依存性を示す。卵母細胞は、NaCl、グルコン酸ナトリウム、またはNMDG塩化物を含有する緩衝液中で、1mM基質で灌流された。
【図６】X. laevis卵母細発現系におけるATB0,+を介した輸送に関するNOS阻害剤の飽和動力学を示す。クローニングされたマウスATB0,+を発現している卵母細胞を、濃度漸増するL-MTC、L-NIL、およびL-NIOで灌流し、かつ内向き電流を電圧固定条件下で測定した。上側パネルは、-50mVでの基質濃度と内向き電流の関係を示している。下側パネルは、K0.5値と膜電位の間の関係を示している。
【図７】HRPE細胞におけるカルニチンおよびそのアシルエステルによるマウスATB0,+を介したグリシン輸送の阻害を示す。A. ベクターをトランスフェクションされた細胞およびマウスATB0,+cDNA（mATB0,+）をトランスフェクションされた細胞における、グリシン（10μM）輸送。B. γ-アミノブチレート（GABA）、ベタイン、カルニチン、アセチルカルニチン、およびプロピオニルカルニチンによるATB0,+を介したグリシン（10μM）輸送の阻害。阻害剤が存在しない場合の輸送を100％とする。
【図８】HRPE細胞におけるマウスATB0,+によるカルニチンおよびそのアシルエステルの輸送、ならびにこのプロセスのイオン依存性を示す。A. ベクターをトランスフェクションされた細胞およびマウスATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞における、カルニチン（25μM)、プロピオニルカルニチン（25μM)、およびアセチルカルニチン（25μM）の輸送。B. ベクターをトランスフェクションされた細胞およびマウスATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞における、NaCl存在下、Na+存在およびCl-非存在（グルコン酸Na）下、ならびにCl-存在およびNa+非存在（NMDG-Cl）下での、カルニチン（15μM）輸送。
【図９】HRPE細胞におけるマウスATB0,+を介したカルニチン輸送の飽和動力学およびNa+活性化動力学を示す。A. カルニチン濃度0.1mM〜5mMの範囲内のマウスATB0,+を介したカルニチン輸送（挿入図、Eadie-Hofsteeプロット；V、カルニチン輸送、nmo1/106細胞/15分；S、カルニチン濃度、mM)。B. Na+濃度2.5mM〜140mMの範囲内のマウスATB0,+を介したカルニチン（15μM）輸送。
【図１０】Xenopus laevis卵母細胞におけるマウスATB0,+を介したカルニチン輸送の特徴を示す。A. マウスATB0,+を発現している卵母細胞におけるカルニチン誘導電流の飽和動力学（挿入図、Edie-Hofsteeプロット；I、カルニチン誘導電流；S、カルニチン濃度、mM)。B. マウスATB0,+を発現している卵母細胞におけるカルニチン（lmM）誘導電流のNa+依存性（挿入図、ヒルプロット；I、カルニチン誘導電流；Imax、カルニチンlmMで誘導された最大電流)。C. マウスATB0,+を発現している卵母細胞におけるカルニチン（lmM）誘導電流のCl-依存性（挿入図、ヒルプロット；I、カルニチン誘導電流；Imax、カルニチンlmMで誘導された最大電流)。
【図１１】腸管において発現される10個の異なるアミノ酸輸送体によるD-セリンの輸送を示す。それぞれの輸送体のcDNAをトランスフェクションされた細胞HRPE細胞において、D-[3H]-セリン（5 μM）の輸送を測定した。
【図１２】マウスATB0,+を介した[3H]グリシン（57 nM）取込みの阻害に関する用量反応相関を示す。
【図１３】ベクターをトランスフェクションされた細胞、ならびに、マウスATB0,+、ヒトATB0、およびマウスb0,+AT/rBAT cDNAをトランスフェクションされた細胞におけるL-フェニルグリシンの輸送を示す。クローニングした輸送体をHRPE細胞において発現させ、[14C]フェニルグリシン（10 μM）の輸送をNa+の存在下または非存在下において試験した。
【図１４】(S)-(3-(2-ニトログアニジル)フェニル)グリシン合成のプロセスを示す。
【図１５】クローニングしたマウスATB0,+を発現するX.laevis卵母細胞における(S)-(3-(2-ニトログアニジル)フェニル)グリシン（A）およびL-NNA（B）によって誘導される内向き電流の用量反応相関を示す。
【図１６】アミノ酸輸送体ATB0,+によるアスパラギン酸およびグルタミン酸骨格のプロドラッグのNa+およびCl-連動型能動輸送を示す。マウスATB0,+cDNA特異的なグリシン輸送（10 μM）を、cDNAの異種発現後にHRPE細胞において測定した。アスパラギン酸誘導体（A）およびグルタミン酸誘導体（B）の濃度を表記のように変動させた。結果を、阻害剤非存在下で測定した対照輸送に対する割合（％）として示す。
【図１７】クローニングしたマウスATB0,+を発現するアフリカツメガエル（X.laevis）卵母細胞におけるアシクロビルのL-グルタミン酸γ-エステルによって誘導された内向き電流の用量反応相関を示す。
【図１８】ベクターをトランスフェクションされた細胞およびマウスATB0,+cDNAをトランスフェクションされた細胞における[8-3H]-バラシクロビルの輸送を示す。クローニングされた輸送体をHRPE細胞において発現させ、[8-3H]-バラシクロビル（1.25 μM）の輸送を試験した。
【図１９】炎症状態の腸管におけるATB0,+発現の上昇を示す写真である。マウスに、生理食塩液（対照）、または細菌のリポ多糖類（5 mg/kg体重）のいずれかを腹腔内注射した。注射から16時間後、マウスを屠殺して、mRNAを単離するために腸の様々な部分（J、空腸；I、回腸；C、結腸）を採取した。5週齢のIL2+/+マウスおよびIL2-/-マウスを屠殺して、mRNAを単離するために腸の様々な部分を採取した。マウスATB0,+、マウスグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（GAPDH）、およびマウスシクロフィリンC（CypC）に対して特異的なプライマー対を用いて、PCRサイクル数の少ない半定量的RT-PCRを行い、RT-PCR産物をサザンハイブリダイゼーションによって検出してシグナルを定量した。
【図２０】マウス乳腺腫瘍におけるATB0,+およびiNOS発現の上昇を示す写真である。
【図１】
2004529642.tif 000014
【図２】
2004529642.tif 000015
【図３】
2004529642.tif 000016
【図４】
2004529642.tif 000017
【図５】
2004529642.tif 000018
【図６】
2004529642.tif 000019
【図７】
2004529642.tif 000020
【図８】
2004529642.tif 000021
【図９】
2004529642.tif 000022
【図１０】
2004529642.tif 000023
【図１１】
2004529642.tif 000024
【図１２】
2004529642.tif 000025
【図１３】
2004529642.tif 000026
【図１４】
2004529642.tif 000027
【図１５】
2004529642.tif 000028
【図１６】
2004529642.tif 000029
【図１７】
2004529642.tif 000030
【図１８】
2004529642.tif 000031
【図１９】
2004529642.tif 000032
【図２０】
2004529642.tif 000033
【国際公開パンフレット】
2004529642.tif 000034
2004529642.tif 000035
2004529642.tif 000036
2004529642.tif 000037
2004529642.tif 000038
2004529642.tif 000039
2004529642.tif 000040
2004529642.tif 000041
2004529642.tif 000042
2004529642.tif 000043
2004529642.tif 000044
2004529642.tif 000045
2004529642.tif 000046
2004529642.tif 000047
2004529642.tif 000048
2004529642.tif 000049
2004529642.tif 000050
2004529642.tif 000051
2004529642.tif 000052
2004529642.tif 000053
2004529642.tif 000054
2004529642.tif 000055
2004529642.tif 000056
2004529642.tif 000057
2004529642.tif 000058
2004529642.tif 000059
2004529642.tif 000060
2004529642.tif 000061
2004529642.tif 000062
2004529642.tif 000063
2004529642.tif 000064
2004529642.tif 000065
2004529642.tif 000066
2004529642.tif 000067
2004529642.tif 000068
2004529642.tif 000069
2004529642.tif 000070
2004529642.tif 000071
2004529642.tif 000072
2004529642.tif 000073
2004529642.tif 000074
2004529642.tif 000075
2004529642.tif 000076
2004529642.tif 000077
2004529642.tif 000078
2004529642.tif 000079
2004529642.tif 000080
2004529642.tif 000081
2004529642.tif 000082
2004529642.tif 000083
2004529642.tif 000084
2004529642.tif 000085
2004529642.tif 000086
2004529642.tif 000087
2004529642.tif 000088
2004529642.tif 000089
2004529642.tif 000090
2004529642.tif 000091
2004529642.tif 000092
2004529642.tif 000093
2004529642.tif 000094
2004529642.tif 000095
2004529642.tif 000096
2004529642.tif 000097
2004529642.tif 000098
2004529642.tif 000099
2004529642.tif 000100
2004529642.tif 000101
2004529642.tif 000102
2004529642.tif 000103
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529642.tif 000104
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月12日(2003.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ATB0,+による被輸送能を有する薬物またはプロドラッグのスクリーニング方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)ATB0,+による被輸送能を有する化合物を選択する段階；
(b)選択された化合物と、該化合物が治療および/または予防し得る疾患とを関連づける段階；ならびに
(c)段階(b)により疾患と関連づけされた化合物を選択する段階。
【請求項２】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンもしくはD-アミノ酸、または、それらの誘導体、およびアミノ酸に基づくプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物のデザイン方法であって、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸ならびにそれらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物をデザインすることを提供する方法。
【請求項４】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物をデザインする段階；ならびに
(b)デザインされた化合物を合成する段階。
【請求項５】
合成された化合物がATB0,+による被輸送能を有するか否かを判定し、輸送される化合物を選択する段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、薬物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物をデザインする段階；
(b)デザインされた化合物を合成する段階；ならびに
(c)合成された化合物がATB0,+による被輸送能を有するか否かを判定し、輸送される化合物を選択する段階。
【請求項７】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、薬物の製造方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物をデザインする段階；
(b)デザインされた化合物を合成する段階；ならびに
(c)合成された化合物と、該化合物が治療および/または予防し得る疾患とを関連づける段階。
【請求項８】
ATB0,+を介して化合物を輸送する方法であって、該化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物である方法。
【請求項９】
ATB0,+を介して化合物を輸送する方法であって、該化合物がNOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体、ならびにアミノ酸に基づくプロドラッグからなる群より選択される化合物であり、該化合物が放射性物質で標識されたまたはトキシン付加された、方法。
【請求項１０】
NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、および、オルニチンの誘導体である、請求項2から9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項2から9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ATB0,+遺伝子を有効成分として含有する、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体からなる群より選択される化合物により治療および/または予防しうる疾患の治療薬。
【請求項１３】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項12記載の治療薬。
【請求項１４】
ATB0,+遺伝子を投与する段階を含む、NOS阻害剤、フェニルグリシン、カルニチンおよびD-アミノ酸、ならびに、それらの誘導体からなる群より選択される化合物により治療および/または予防しうる疾患の遺伝子治療。
【請求項１５】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項14記載の遺伝子治療。
【請求項１６】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、癌治療薬。
【請求項１７】
癌がiNOS発現性癌である、請求項16記載の治療薬。
【請求項１８】
癌が乳癌または肝癌である、請求項16記載の治療薬。
【請求項１９】
化合物がNOS阻害剤である、請求項16記載の治療薬。
【請求項２０】
NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、オルニチン、およびフェニルグリシンの誘導体である、請求項19記載の治療薬。
【請求項２１】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項20記載の治療薬。
【請求項２２】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を投与する段階を含む、癌を治療する方法。
【請求項２３】
癌がiNOS発現性癌である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
癌が乳癌または肝癌である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
化合物がNOS阻害剤である、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、オルニチン、およびフェニルグリシンの誘導体である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
癌治療薬の製造のための、ATB0,+による被輸送能を有する化合物の使用。
【請求項２９】
癌がiNOS発現性癌である、請求項28記載の使用。
【請求項３０】
癌が乳癌または肝癌である、請求項28記載の使用。
【請求項３１】
化合物がNOS阻害剤である、請求項28記載の使用。
【請求項３２】
NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、オルニチン、およびフェニルグリシンの誘導体である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を有効成分として含有する、炎症治療薬。
【請求項３５】
炎症が敗血症である、請求項34記載の治療薬。
【請求項３６】
炎症が炎症性腸疾患である、請求項34記載の治療薬。
【請求項３７】
化合物がNOS阻害剤である、請求項34記載の治療薬。
【請求項３８】
NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、オルニチン、およびフェニルグリシンの誘導体である、請求項37記載の治療薬。
【請求項３９】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項38記載の治療薬。
【請求項４０】
ATB0,+による被輸送能を有する化合物を投与する段階を含む、炎症治療方法。
【請求項４１】
炎症が敗血症である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
炎症が炎症性腸疾患である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
化合物がNOS阻害剤である、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、オルニチン、およびフェニルグリシンの誘導体である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
炎症治療薬の製造のための、ATB0,+による被輸送能を有する化合物の使用。
【請求項４７】
炎症が敗血症である、請求項46記載の使用。
【請求項４８】
炎症が炎症性腸疾患である、請求項46記載の使用。
【請求項４９】
化合物がNOS阻害剤である、請求項46記載の使用。
【請求項５０】
NOS阻害剤が、アルギニン、リジン、シトルリン、オルニチン、およびフェニルグリシンの誘導体である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
フェニルグリシン誘導体が、(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸tert-ブチルエステル。
【請求項５３】
(S)-2-アミノ-2-(3-(N'-ニトログアニジノ)フェニル)酢酸。
【国際調査報告】
2004529642.tif 000105
2004529642.tif 000106
2004529642.tif 000107
2004529642.tif 000108
2004529642.tif 000109
2004529642.tif 000110
2004529642.tif 000111
2004529642.tif 000112