(57)【要約】本発明は新規の神経保護性４−ピリミジンアミン誘導体および４−ピリミジナミンを含んで成る神経保護性の製薬学的組成物を提供する。本発明はまた、虚血性細胞死、とりわけ神経細胞死を予防し、外傷事象による被験体の神経細胞死の可能性を低下させるための、これらの組成物の使用法を提供する。最後に、本発明は本製薬学的組成物を被験体に投与するための装置を提供する。
2004505952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬学的に許容されうる担体および式
【化１】
2004505952.tif 000057
を有する化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩を含んで成る製薬学的組成物であって、
式中
（ａ）　Ｒ９はＨ、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、置換フェニル、ピリジニル、置換ピリジニル、ナフチル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニル、ピリミジンおよび２，４−（ビスメトキシフェニル）−５−ピリミジニルから成る群より選択され、
前記置換フェニルは式
【化２】
2004505952.tif 000058
［ここで、（ｉ）Ｒ１２はＨ、ＯＨ、低級アルキルチオ、アルコキシ、アルキルアミン、ジアルキルアミン、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシ、シアノ、シアノアルキル、フェニル、フェニルアルコキシもしくは置換ピペラジニル、Ｎ−（ｔ−ブトキシ）カルバミルアルキルであり、（ｉｉ）Ｒ１３はそれぞれ独立にＨ、ＮＯ２、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシもしくはフェニルであり、（ｉｉｉ）Ｒ１４はそれぞれ独立に、Ｈ、アルコキシ、フェニルオキシもしくはフェニルアルコキシである］
を有し、
（ｂ）Ｒ１０はシアノアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ置換アルキルアミノおよびヒドロキシ置換ジアルキルアミノから成る群から選択され、そして
（ｃ）Ｒ１１はＨもしくは低級アルキルである。
【請求項２】
Ｒ９が置換フェニルである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項３】
Ｒ１１がＨであり、Ｒ１０がジアルキルアミノもしくはヒドロキシ置換ジアルキルアミノである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項４】
化合物がＮ１，Ｎ１−ジメチル−Ｎ４−［６−［４−（フェニルメトキシ）フェニル］−４−ピリミジニル］−１，４−ベンゼンジアミンである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項５】
化合物がＮ１−（６−［１，１’−ビフェニル］−３−イル−４−ピリミジニル）−Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−１，４−ベンゼンジアミンである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項６】
化合物がＮ１−（６−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−４−ピリミジニル）−Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−１，４−ベンゼンジアミンである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項７】
化合物が２−［［４−［（６−［１，１’−ビフェニル］−３−イル−４−ピリミジニル）アミノ］フェニル］エチルアミノ］−エタノールである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項８】
化合物が２−［［４−［（６−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル−４−ピリミジニル）アミノ］フェニル］エチルアミノ］−エタノールである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項９】
化合物が２−［エチル［４−［［６−［４−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−４−ピリミジニル］アミノ］フェニル］アミノ］−エタノールである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項１０】
化合物が式
【化３】
2004505952.tif 000059
のものである、請求項１の製薬学的組成物。
【請求項１１】
製薬学的に許容されうる担体および式
【化４】
2004505952.tif 000060
を有する化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩を含んで成る製薬学的組成物であって、
式中、
（ａ）　Ｒ９はＨ、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、置換フェニル、ピリジニル、置換ピリジニル、ナフチル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニル、ピリミジンおよび２，４−（ビスメトキシフェニル）−５−ピリミジニルから成る群から選択され、
前記置換フェニルは式
【化５】
2004505952.tif 000061
［ここで、（ｉ）Ｒ１２はＨ、ＯＨ、低級アルキルチオ、アルコキシ、アルキルアミン、ジアルキルアミン、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシ、シアノ、シアノアルキル、フェニル、フェニルアルコキシもしくは置換ピペラジニル、Ｎ−（ｔ−ブトキシ）カルバミルアルキルであり、（ｉｉ）Ｒ１３はそれぞれ独立にＨ、ＮＯ２、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシもしくはフェニルであり、（ｉｉｉ）Ｒ１４はそれぞれ独立に、Ｈ、アルコキシ、フェニルオキシもしくはフェニルアルコキシである］
を有し、
（ｂ）Ｒ１１はＨもしくは低級アルキルであり、そして
（ｃ）Ｒ１５はＨもしくはアルキルである。
【請求項１２】
細胞を予防的に有効量の請求項１の化合物と接触させることを含んで成る、細胞集団における虚血死を低下させるための方法。
【請求項１３】
細胞を請求項１１の製薬学的組成物中に含有された予防的に有効量の化合物と接触させることを含んで成る、細胞集団における虚血死を低下させるための方法。
【請求項１４】
細胞集団が神経細胞、グリア細胞、心臓細胞、リンパ球、マクロファージおよび繊維芽細胞から成る群から選択される細胞を含んで成る、請求項１２の方法。
【請求項１５】
細胞が神経細胞、グリア細胞、心臓細胞、リンパ球、マクロファージおよび繊維芽細胞から成る群から選択される、請求項１３の方法。
【請求項１６】
外傷事象の前、期間中もしくはその後の適当な期間内に、神経細胞を、請求項１の製薬学的組成物中に含有される予防的に有効量の化合物と接触させることを含んで成る、神経細胞を含んで成る細胞集団中の外傷事象に反応した死亡を低下させる方法。
【請求項１７】
外傷事象の前、期間中もしくはその後の適当な期間内に、神経細胞を、請求項１１の製薬学的組成物中に含有される予防的に有効量の化合物と接触させることを含んで成る、神経細胞を含んで成る細胞集団中の外傷事象に反応した死亡を低下させる方法。
【請求項１８】
接触がインビトロで実施される、請求項１２の方法。
【請求項１９】
接触がインビトロで実施される、請求項１４の方法。
【請求項２０】
接触がエックスビボで実施される、請求項１２の方法。
【請求項２１】
接触がエックスビボで実施される、請求項１４の方法。
【請求項２２】
接触がインビボで実施される、請求項１２の方法。
【請求項２３】
接触がインビボで実施される、請求項１４の方法。
【請求項２４】
外傷事象の前、期間中もしくはその後の適当な期間内に、予防的に有効量の請求項１の製薬学的組成物を被験体に投与することを含んで成る、被験体における外傷事象に反応する、神経細胞死を低下させる方法。
【請求項２５】
外傷事象の前、期間中もしくはその後の適当な期間内に、予防的に有効量の請求項１１の製薬学的組成物を被験体に投与することを含んで成る、被験体における外傷事象に反応する、神経細胞死を低下させる方法。
【請求項２６】
被験体がヒトである、請求項２４の方法。
【請求項２７】
外傷事象が医学的障害、物理的外傷、化学的外傷および生物学的外傷から成る群から選択される、請求項２４の方法。
【請求項２８】
製薬学的組成物が外傷事象以前に投与される、請求項２４の方法。
【請求項２９】
製薬学的組成物が外傷事象期間中に投与される、請求項２４の方法。
【請求項３０】
製薬学的組成物が外傷事象後に投与される、請求項２４の方法。
【請求項３１】
被験体がヒトである、請求項２５の方法。
【請求項３２】
外傷事象が医療上の障害、物理的外傷、化学的外傷および生物学的外傷から成る群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項３３】
製薬学的組成物が外傷事象の以前に投与される、請求項２５の方法。
【請求項３４】
製薬学的組成物が外傷事象期間中に投与される、請求項２５の方法。
【請求項３５】
製薬学的組成物が外傷事象後に投与される、請求項２５の方法。
【請求項３６】
容器およびその中の製薬学的組成物を含んで成り、そこで容器が予防的用量の製薬学的組成物を被験体に送達するための装置を有する、請求項１の製薬学的組成物を被験体に投与するための装置。
【請求項３７】
容器およびその中の製薬学的組成物を含んで成り、そこで容器が予防的用量の製薬学的組成物を被験体に配達する装置を有する、請求項１１の製薬学的組成物を被験体に投与するための装置。
【請求項３８】
製薬学的組成物を配達するための装置がシリンジである、請求項３６の装置。
【請求項３９】
製薬学的組成物を配達するための装置がシリンジである、請求項３７の装置。
【請求項４０】
式
【化６】
2004505952.tif 000062
の化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩であって、
式中、
Ｒ２０は
【化７】
2004505952.tif 000063
から成る群から選択され、
ここで、ＲＡおよびＲＢは独立に、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール−アルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキルおよびデヒドロアビエチルから選択され、ここで、あらゆる基のアリールシクロアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロシクロアルキル部分は場合によっては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロゲン化アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、アリールアミド、アラルキルアミド、アゾ、ニトロ、シアノ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルスルホニルＮ（Ｈ）、もしくはアルキルスルホニルＮ（アルキル）から独立に選択された１個以上の置換基で置換される、
あるいはまた、ＲＡおよびＲＢはそれらが結合されている窒素原子と一緒になって、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルの群から選択される化合物を形成し、そこでヘテロアリールもしくはヘテロシクロアルキルは場合によっては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン化アルキル、アルキルカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アゾ、ニトロもしくはシアノから独立に選択される１個以上の置換基で置換される、
ＲＣはアルキル、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルキルカルボニル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−アミノアルキルカルボニルもしくは［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−アルキルカルボニルから成る群から選択され、
ＲＤはアルキル、アリール、アラルキル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−アミノアルキル、［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−アルキルもしくはビフェニルから選択され、ここでアルキル、アリールもしくはアラルキル基のアルキルもしくはアリール部分は場合によっては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アゾ、ニトロ、シアノもしくはトリフルオロメチルから独立に選択された１個以上の置換基で置換される、
Ｒ２１は水素、アルキル、アリール、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニルおよびアラルキルカルボニルから成る群から選択され、ここでアリール部分は場合によっては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロゲン化アルキルもしくはニトロから独立に選択された１個以上の置換基で置換される、
ｐは０〜３から選択された整数であり、
ｑは０〜３から選択された整数であり、
Ｒ２２およびＲ２３はそれぞれ独立に、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルおよびジアルキルアミノカルボニルから成る群から選択される。
【請求項４１】
請求項４０における化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩であって、
式中、
ＲＡが水素、アルキル、アリールおよびアラルキルから成る群から選択され、ここであらゆる基のアリール部分は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン化低級アルキル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アゾ、ニトロ、シアノ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、低級アルキルチオおよびアリールチオから独立に選択された１〜３置換基で置換され、
ＲＢは水素、アルキル、ハロゲン化低級アルキル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アミノ−低級アルキル、低級アルキル−アミノ−低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ−低級アルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−低級アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール−低級アルキル、低級アルコキシ−低級アルキル、アリールオキシ、アリールオキシ−低級アルキル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキルおよびデヒドロアビエチルから成る群から選択され、ここであらゆる基のアリール、シクロアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロシクロアルキル部分は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン化低級アルキル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アゾ、ニトロ、シアノ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、低級アルキルチオおよびアリールチオから独立に選択される１〜３置換基で置換されるか、
あるいはまた、ＲＡおよびＲＢはそれらが結合されている窒素原子と一緒になって、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルから成る群から選択される環構造を形成する、ここでヘテロアリールもしくはヘテロシクロアルキル基は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、トリフルオロメチル、低級アルキルカルボニル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アリールアミノ、アゾ、ニトロもしくはシアノから独立に選択される１〜２置換基で置換される、
ＲＣは低級アルキル、アラルキル、低級アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−アミノ−低級アルキルカルボニルおよび［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−低級−アルキルカルボニルから成る群から選択され、
ＲＤはアルキル、アリール、アラルキル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−アミノ−低級アルキル、［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−低級アルキルおよびビフェニルから成る群から選択され、ここでアリールもしくはアラルキル基のアルキルもしくはアリール部分は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アゾ、ニトロ、シアノもしくはトリフルオロメチルから独立に選択された１〜２置換基で置換され、
Ｒ２１は水素、低級アルキル、アリール、アラルキル、低級アルキルカルボニル、アリールカルボニルおよびアラルキルカルボニルから成る群から選択される（ここでアリール、アラルキル、アリールカルボニルもしくはアラルキルカルボニル基のアリール部分は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシもしくはトリフルオロメチルから独立に選択された１〜２置換基で置換される）、
ｐは０〜２の整数であり、
ｑは０〜２の整数であり、
Ｒ２２およびＲ２３はそれぞれ独立に、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、フェニルオキシカルボニル、アミノカルボニル、低級アルキルアミノカルボニルおよびジ（低級アルキル）アミノカルボニルから成る群から選択される。
【請求項４２】
Ｒ２０が
【化８】
2004505952.tif 000064
であり、ｐが０であり、そしてｑが０である、
請求項４１における化合物。
【請求項４３】
ＲＡが水素、低級アルキルおよびアラルキルから成る群から選択され、
ＲＢが水素、低級アルキル、ハロゲン化低級アルキル、アラルキル、置換アラルキル（ここでアラルキル上の置換基はハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシもしくはトリフルオロメチルから独立に選択される１〜３個である）、アルコキシアルキル、シクロアルキル−アルキル、デヒドロアビエチル、ジ（低級アルキル）−アミノ−低級アルキル、ビフェニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール（ここでヘテロアリール基上の置換基はハロゲンもしくは低級アルキルから独立に選択される１〜２個である）、ヘテロアリール−低級アルキル、アリールオキシ−低級アルキルおよび低級アルコキシカルボニル−低級アルキルから成る群から選択され、そして
Ｒ２１が水素である、
請求項４２におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項４４】
ＲＡが水素、メチル、エチルおよびベンジルから成る群から選択され、そして
ＲＢが水素、メチル、プロピル、ｎ−ブチル、ベンジル、フェニルエチル、メトキシプロピル、シクロヘキシルメチル、３−クロロベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２−エトキシベンジル、２，５−ジフルオロベンジル、デヒドロアビエチル、３，４−ジメトキシベンジル、ジエチルアミノプロピル、４−ブロモ−２−ピリジル、ジメチルアミノエチル、４−ビフェニル、２−フラニルメチル、３−ヨードベンジル、２，２，２−トリフルオロエチル、３，４−ジフルオロベンジル、２−チエニルエチル、３，５−ジメチル−２−ピリジル、２−（エトキシ）アセチル、２−メトキシベンジル、４−ブロモベンジル、３，５−ジトリフルオロメチルベンジル、３−メトキシフェニルエチル、３，４，５−トリメトキシベンジル、４−メトキシフェニルエチル、４−イミダゾリルエチル、２−トリフルオロメチルベンジル、３−メトキシベンジル、３−メチルベンジル、３，５−ジメトキシベンジル、２−ブロモベンジル、４−フルオロベンジル、１−ナフチルメチル、フェノキシエチル、４−トリフルオロメチルベンジル、３−ピリジル、２−メチルベンジル、２−フルオロベンジルおよび３，４−ジメトキシフェニルエチルから成る群から選択される、
請求項４３におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項４５】
ＲＡが水素、メチルおよびベンジルから選択され、そして　ＲＢがメチル、メトキシプロピル、シクロヘキシルメチル、３−クロロベンジル、２，５−ジフルオロベンジル、フェニルエチル、４−ブロモ−２−ピリジル、
ジメチルアミノエチル、ｎ−ブチル、２−フラニルメチル、３，４−ジフルオロベンジル、２−チエニルエチル、４−ブロモベンジル、３−メトキシフェニルエチル、３，４，５−トリメトキシベンジル、ベンジル、３−メチルベンジルおよびフェノキシエチルから成る群から選択される、
請求項４４におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項４６】
ＲＡが水素およびメチルから成る群から選択され、そして
ＲＢがメチル、メトキシプロピル、２，５−ジフルオロベンジル、３，４−ジフルオロベンジル、４−ブロモベンジル、３，４，５−トリメトキシベンジル、ベンジル、３−メチルベンジルおよびｎ−ブチルから成る群から選択される、
請求項４５におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項４７】
ＲＡがメチルでありそしてＲＢがメチルである請求項４６におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項４８】
ＲＡおよびＲＢがそれらが結合されている窒素原子と一緒になってヘテロアリール、ヘテロシクロアルキルおよびｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル置換ヘテロシクロアルキルから成る群から選択された環構造を形成し、そして
Ｒ２１が水素である、
請求項４２におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項４９】
ＲＡおよびＲＢがそれらが結合されている窒素原子と一緒になってＮ−ピロリジニル、Ｎ−モルホリニル、Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニル、Ｎ−ヘキサメチレンイミおよびＮ−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジニルから成る群から選択された環構造を形成する、
請求項４８におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項５０】
ＲＡおよびＲＢがそれらが結合されている窒素原子と一緒になってＮ−モルホリニルおよびＮ−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジニルから成る群から選択される環構造を形成する、
請求項４９におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項５１】
ＲＡおよびＲＢがそれらが結合されている窒素原子と一緒になってＮ−モルホリニルを形成する、
請求項５０におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項５２】
Ｒ２０が
【化９】
2004505952.tif 000065
であり、ｐが０であり、そしてｑが０である、請求項４１におけるような化合物。
【請求項５３】
ＲＣがアリールカルボニル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−２−アミノアルキルカルボニルおよび［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−アルキルカルボニルから成る群から選択され、
Ｒ２１が水素である、
請求項５２におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項５４】
ＲＣがベンゾイル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−２−アミノプロピオノイルおよび［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−ペンタノイルから成る群から選択される、
請求項５３におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項５５】
Ｒ２０が
【化１０】
2004505952.tif 000066
であり、ｐが０であり、そしてｑが０である、
請求項４１におけるような化合物。
【請求項５６】
ＲＤが（±）−Ｎ−ベンゾイル−２−アミノアルキル、［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−アルキル、アルキル、置換アリール（ここでアリール上の置換基はアゾ、ニトロ、ハロゲン、アルコキシ、トリフルオロメチルから独立に選択される）、ビフェニル、アラルキルおよび置換アラルキル（ここでアラルキル基のアルキル部分はハロゲンから選択された置換基で置換される）から成る群から選択され、そして
Ｒ２１は水素、アルキルカルボニルおよび置換アリールカルボニル（ここでアリールカルボニル基のアリール部分上の置換基はハロゲンもしくはトリフルオロメチルから選択される）から成る群から選択される、
請求項５５におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項５７】
ＲＤが（±）−Ｎ−ベンゾイル−２−アミノエト−２−イル、［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−ブト−４−イル、１−クロロ−１−フェニル−メチル、３−アゾ−６−ニトロフェニル、ペントアセカニル、４−ビフェニル、４−ブトキシフェニル、４−トリフルオロメチルフェニル、３−フルオロフェニルおよびプロピルから成る群から選択され、そして
Ｒ２１が水素、プロピルカルボニル、３−フルオロフェニルカルボニルおよび４−トリフルオロメチルフェニルカルボニルから成る群から選択される、
請求項５６におけるような化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩。
【請求項５８】
製薬学的に許容されうる担体および請求項４０の化合物を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項５９】
請求項４０の化合物および製薬学的に許容されうる担体を混合することにより製造された製薬学的組成物。
【請求項６０】
請求項４０の化合物および製薬学的に許容されうる担体を混合することを含んで成る製薬学的組成物の製法。
【請求項６１】
細胞集団の少なくとも一部を請求項４０の製薬学的組成物中に含有された予防的に有効量の化合物と接触させることを含んで成る、細胞集団における虚血死の低下法。
【請求項６２】
細胞集団中の少なくとも１個の細胞が神経細胞、グリア細胞、心臓細胞、リンパ球、マクロファージおよび繊維芽細胞から成る群から選択される、請求項６１の方法。
【請求項６３】
外傷事象の以前、期間中もしくはその後に、神経細胞を予防的に有効量の請求項４０におけるような化合物と接触させることを含んで成る、外傷事象に反応する神経細胞を含んで成る細胞集団における死亡を低下させる方法。
【請求項６４】
外傷事象の以前、期間中もしくはその後に、予防的に有効量の請求項４０におけるような化合物を被験体に投与することを含んで成る、被験体における外傷事象に反応する神経細胞死を低下させる方法。
【請求項６５】
外傷事象が医学的障害、物理的外傷、化学的外傷および生物学的外傷から成る群から選択される、請求項６４の方法。
【請求項６６】
それを必要とする被験体における、細胞の経験している虚血死の可能性を低下するための医薬の調製のための、請求項４０におけるような化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の交差引用）
本出願は、２０００年８月８日出願の米国仮出願第６０／２２３，７９５号明細書（ここに引用することにより組み込まれる）からの優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規の神経保護性の４−ピリミジンアミン誘導体、神経保護性の４−ピリミジンアミンと２−ピリジンアミン組成物、および虚血事象後の細胞死を予防するためのそれらの使用方法に関する。本化合物および組成物は神経細胞死およびその結果として生じる障害の予防において特別の重要性を有する。
【０００３】
（発明の背景）
グルタミン酸は哺乳動物の中枢神経系における主要な迅速興奮性神経伝達物質である。それは３分類のリガンド依存性イオンチャンネル、すなわちＡＭＰＡ、カイニン酸およびＮＭＤＡ受容体を開放することによりニューロンを脱分極する。シナプスのグルタミン酸濃度の一過性の増大が、通常の興奮性伝達の間に起こる。しかしながら、シナプスのグルタミン酸濃度の過剰の増大はニューロンに対し毒性であり、そして普遍的にグルタミン酸興奮毒性と称される神経細胞死の過程を誘発する（Ｍｅｌｄｒｕｍ　ａｎｄ　Ｇａｒｔｈｗａｉｔｅ　１９９０）。グルタミン酸興奮毒性は、虚血誘発性の脳損傷、癲癇および多様な慢性神経変性性疾患に寄与する（Ｍｅｌｄｒｕｍ　ａｎｄ　Ｇａｒｔｈｗａｉｔｅ　１９９０）。
【０００４】
３分類のグルタミン酸依存性チャンネルのうち、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の特異的過剰活性化が、主として多様なニューロン型における興奮毒性のニューロン死誘導の原因である（Ｍｅｌｄｒｕｍ　ａｎｄ　Ｇａｒｔｈｗａｉｔｅ　１９９０）。動物卒中モデルにおいて、虚血誘発性の脳損傷は、特異的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１での前処理により大きく緩和することができる（Ｐａｒｋら　１９８８）。多くの型のニューロンにおいて、グルタミン酸興奮毒性は、主として、カルシウムに対するＮＭＤＡ受容体の高浸透性によるカルシウムイオンの過剰の流入に由来すると考えられている（Ｓｃｈｎｅｇｇｅｎｂｕｒｇｅｒら　１９９３）。高細胞内カルシウム濃度は、一酸化窒素合成酵素、ホスホリパーゼ、プロテアーゼおよびキナーゼのようなカルシウムに調節される酵素の過剰活性化につながるかもしれない。さらに、高細胞内カルシウム濃度は興奮毒性を媒介するかもしれない。
【０００５】
ＮＭＤＡ受容体によるグルタミン酸のシグナル伝達は、初代ニューロン培養物中の分裂促進剤に活性化されるタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化および活性化を誘導する（ＢａｄｉｎｇとＧｒｅｅｎｂｅｒｇ　１９９１；Ｘｉａら　１９９５）。虚血性脳傷害の動物モデルは、ＭＡＰＫファミリーのメンバーの増大された活性が神経損傷を媒介するかもしれないことを示唆している（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉら　１９９９；Ｙａｎｇら　１９９７）。Ｊｎｋ３（主として脳で発現される、ＭＡＰキナーゼのＪＮＫファミリーの１メンバー）の欠失は、インビボでのカイニン酸誘発性の興奮毒性から海馬ニューロンを保護するが、とは言えこの形態の毒性におけるＮＭＤＡ受容体の役割は明らかでない（Ｙａｎｇら　１９９８）。ＥＲＫ１／２［（ｐ４４／４２）ＭＡＰキナーゼ］の上流の活性化キナーゼの特異的阻害は、焦点性脳虚血による神経損傷を防ぐ（Ａｌｅｓｓａｎｄｉｒｉｎｉら　１９９９）。培養された初代海馬ニューロンにおいて、ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２　ＭＡＰＫ）のシグナル伝達経路の阻害は、広範なスペクトルのグルタミン酸受容体アンタゴニスト、キヌレン酸の除去により誘導されるニューロン死に対し保護する（Ｍｕｒｒａｙら　１９９８）。受容体に媒介されないグルタミン酸誘導性の酸化的毒性もまた、ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路の阻害により封鎖される（Ｓｔａｎｃｊｕら　２０００）。集合的に、これらの報告は、グルタミン酸誘導性の神経毒性におけるＥＲＫ１／２　ＭＡＰＫシグナル伝達のための重要な役割を明瞭に示す。しかしながら、ＥＲＫ１／２　ＭＡＰＫ経路が非常に決定的に関与している興奮毒性シグナル伝達カスケードを、どの分類のグルタミン酸受容体が引き起こす可能性があるかに関しては、不明なままである。
【０００６】
文献からの強固な証拠は、ＭＥＫ（ＭＡＰキナーゼもしくはＥＲＫキナーゼ、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のトレオニン−チロシンキナーゼ活性化物質）の阻害がインビボでの有効な神経保護戦略であることを示唆している（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉら　１９９９；Ｈｕ　ａｎｄ　Ｗｉｅｌｏｃｈ　１９９４；Ｋｉｎｄｙ　１９９３）。これらの報告は、一過性脳虚血がげっ歯類の脳中でｐ４２　ＭＡＰキナーゼのリン酸化を誘導することを示している。ＭＥＫ１／２の選択的阻害剤、ＰＤ０９８０５９は、リン酸化におけるこの誘導を封鎖することができ、また、神経損傷の程度を低下させることができる（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉら　１９９９）。初代ニューロン培養物の文献はまた、ＭＡＰキナーゼ経路がインビトロでの興奮毒性損傷に関連することも示唆している（Ｂａｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　１９９１；Ｆｉｏｒｅら　１９９３；Ｋｕｒｉｎｏら　１９９５；Ｍｕｒｒａｙら　１９９８；Ｒｏｓｅｎら　１９９４；Ｘｉａら　１９９６）。これらの報告は、その多様なイオンチャンネル共役型および／もしくは代謝共役型受容体によるグルタミン酸シグナル伝達がｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼの活性化をもたらすことを示している。増大されたｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性化は前初期遺伝子転写を誘導し（Ｘｉａら　１９９６）、また、培養された海馬ニューロンの発作活動誘発性の細胞死に関係している（Ｍｕｒｒａｙら　１９９８）。
【０００７】
ＮＭＤＡ受容体をｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性化に結びつけるシグナル伝達経路、もしくはｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼを遅延型神経毒性に結びつける下流の経路は十分に理解されていない。ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼの上流の活性化物質はＭＥＫ１およびＭＥＫ２である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら　１９９０；Ｃｒｅｗｓ，Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉ　ａｎｄ　Ｅｒｉｋｓｏｎ　１９９２；ＺｈｅｎｇとＧｕａｎ　１９９３）。ＭＥＫ１／２はＲａｆファミリーのキナーゼによりリン酸化され（Ｊａｉｓｗａｌら　１９９４；Ｍｏｏｄｉｅら　１９９３）、これはＲａｓファミリーの小型のＧＴＰ結合タンパク質により活性化される（Ｐａｐｉｎら　１９９５）。
【０００８】
ＮＭＤＡ受容体の活性化をＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ｐ４２／４４　ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードに共役させるかもしれない１個の候補の中間体分子は、カルシウム依存性チロシンキナーゼＰＹＫ２である（Ｌｅｖら　１９９５）。増大された細胞内カルシウム濃度はＰＹＫ２を活性化することができ、これは順にＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を活性化することができる。
【０００９】
ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達にイオンチャンネル活性化を結びつけるかもしれない第二の候補の中間体は、カルモジュリンキナーゼ（ＣａＭ−Ｋ）である。２つの型のＣａＭ−Ｋ、ＣａＭ−ＫＩＩおよびＣａＭ−ＫＩＶがニューロン中で高度に発現されている（Ｓａｋａｇａｍｉ　ａｎｄ　Ｋｏｎｄｏ　１９９３；Ｓｏｌａ，ＴｕｓｅｌｌとＳｅｒｒａｔｏｓａ　１９９９）。これらのタンパク質キナーゼはカルシウムおよびカルモジュリンの結合に際して活性化され、そしてそれらはｐ３８、ＪＮＫおよびｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性を調節することができる（Ｅｎｓｌｅｎら　１９９６）。
【００１０】
第三の候補の中間体分子は一酸化窒素（ＮＯ）であるかもしれない。皮質ニューロン中で、ＰＳＤ−９５によるＮＯ産生に共役するＮＭＤＡ受容体が、ＮＭＤＡ受容体誘導性の神経毒性に必要とされる（Ｓａｔｔｌｅｒら　１９９９）。増大されたＮＯ産生はｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性もまた増大させることができる（Ｌａｎｄｅｒら　１９９６）。
【００１１】
ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼの下流にある分子は、ＣＲＥＢ、Ｅｌｋ−１、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓのような転写因子を包含する（Ｖａｎｈｏｕｔｔｅら　１９９９）。ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ経路はまた、神経細糸のような細胞骨格成分のリン酸化も誘導し（Ｌｉら　１９９９ａ）、シナプシンＩとアクチンの相互作用も調節し（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃら　１９９６）、ミエリン塩基性タンパク質もリン酸化し（Ａｈｎら　１９９１）そしてアミロイド前駆体タンパク質の分泌も調節する（Ｄｅｓｄｏｕｉｔｓ−Ｍａｇｎｅｎら　１９９８）。従って、ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ活性化の下流に、神経毒性の多数の潜在的調節物質が存在する。
【００１２】
グルタミン酸受容体刺激の下流で活性化されるシグナル伝達経路の詳細な理解は、低酸素／虚血誘発性の神経損傷を予防する有効な手段を決定するために有用であるとみられる。この目的に向かって、これらの経路を研究するための多数の試みがなされている。Ｌｉｐｔｏｎ（米国特許第５，５０６，２３１号明細書）は、ＮＭＤＡ受容体に拮抗する化合物の投与によるヒト免疫不全ウイルスに感染した患者におけるＣＮＳニューロンに対する損傷の低下方法を記述する。この特許は、ＮＭＤＡ受容体の下流のシグナル伝達経路の成分を調節する化合物の投与による神経保護効果を示唆していない。Ｍａｉｅｓｅ（米国特許第５，５１９，０３５号明細書）は、一酸化窒素投与により誘発される脳虚血から神経保護性として、タンパク質キナーゼＣ阻害剤を記述する。海馬ニューロン培養物を利用するモデルが記述される。Ｍａｈａｎｔｈａｐｐａ（ＷＯ　９９／００１１７）は、神経保護剤としてのＰａｔｃｈｅｄ媒介性シグナルに対するヘッジホッグの影響を模倣するＨ８９を包含する化合物、とりわけタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害剤を記述する。Ｌｉｕ（ＷＯ　９９／５８９８２）は、神経細胞、とりわけＨＮ３３海馬神経細胞中でｃ−Ｊｕｎ　Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）もしくは混合系統キナーゼ（ＭＬＫ）に拮抗する神経保護性化合物の同定方法を記述する。最後に、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉ（ＷＯ　９９／３４７９２）は、限局性脳虚血が誘発され、そして神経保護効果をモニターするためにＭＥＫ１阻害剤が投与される、卒中のマウスモデルを記述する。
【００１３】
グルタミン酸受容体に媒介される興奮毒性について知られていることにもかかわらず、その作用機序およびそれが引き起こす神経細胞死を選択的に阻害することができる化合物について、多くが学ばなければならないままである。
【００１４】
（発明の要約）
本発明は一般式（Ｉ）
【００１５】
【化１１】
2004505952.tif 000003
【００１６】
の新規の神経保護性４−ピリミジンアミン誘導体もしくは製薬学的に許容されうるその塩に関し、
式中、
Ｒ２０は
【００１７】
【化１２】
2004505952.tif 000004
【００１８】
から成る群から選択され、
ここで、ＲＡおよびＲＢは独立に、水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール−アルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキルおよびデヒドロアビエチルから選択され、ここで、アリールのシクロアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロシクロアルキル部分は場合によっては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロゲン化アルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、アリールアミド、アラルキルアミド、アゾ、ニトロ、シアノ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルスルホニルＮ（Ｈ）、もしくはアルキルスルホニルＮ（アルキル）から独立に選択される１個以上の置換基で置換される、
あるいはまた、ＲＡおよびＲＢはそれらが結合されている窒素原子と一緒になって、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルの群から選択される化合物を形成し、そこでヘテロアリールもしくはヘテロシクロアルキルは場合によっては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン化アルキル、アルキルカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アゾ、ニトロもしくはシアノから独立に選択される１個以上の置換基で置換される、
ＲＣはアルキル、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルキルカルボニル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−アミノアルキルカルボニルもしくは［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−アルキルカルボニルから成る群から選択され、
ＲＤはアルキル、アリール、アラルキル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−アミノアルキル、［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−アルキルもしくはビフェニルから選択され、ここでアルキル、アリールもしくはアラルキル基のアルキルもしくはアリール部分は場合によっては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アゾ、ニトロ、シアノもしくはトリフルオロメチルから独立に選択された１個以上の置換基で置換される、
Ｒ２１は水素、アルキル、アリール、アラルキル、アルキルカルボニル、アリールカルボニルおよびアラルキルカルボニルから成る群から選択され、ここでアリール部分は場合によっては、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロゲン化アルキルもしくはニトロから独立に選択される１個以上の置換基で置換される、
ｐは０〜３から選択された整数であり、
ｑは０〜３から選択された整数であり、
Ｒ２２およびＲ２３はそれぞれ独立に、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルおよびジアルキルアミノカルボニルから成る群から選択される。
。
【００１９】
本発明を表わすものは製薬学的に許容されうる担体およびいずれかの前記の式（Ｉ）の化合物を含んで成る製薬学的組成物である。本発明の１例は前記の式（Ｉ）のいずれかの化合物および製薬学的に許容されうる担体を混合することにより製造された製薬学的組成物である。本発明を表わすものは、前記の式（Ｉ）のいずれかの化合物および製薬学的に許容されうる担体を混合することを含んで成る製薬学的組成物の製法である。
【００２０】
本発明のもう１つの例はそれを必要とする被験体における細胞集団の虚血死を低下させるための医薬の調製における本明細書中に記述された式（Ｉ）のいずれかの化合物の使用である。
【００２１】
本発明は更に、製薬学的に許容されうる担体および一般式（ＩＩ）
【００２２】
【化１３】
2004505952.tif 000005
【００２３】
を有する化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩を含んで成る製薬学的組成物を提供し、
式中、
（ａ）　Ｒ９はＨ、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、置換フェニル、ピリジニル、置換ピリジニル、ナフチル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニル、ピリミジンおよび２，４−（ビスメトキシフェニル）−５−ピリミジニルから成る群から選択され、
前記置換フェニルは式（ＩＩＩ）
【００２４】
【化１４】
2004505952.tif 000006
【００２５】
［ここで、（ｉ）Ｒ１２はＨ、ＯＨ、低級アルキルチオ、アルコキシ、アルキルアミン、ジアルキルアミン、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシ、シアノ、シアノアルキル、フェニル、フェニルアルコキシもしくは置換ピペラジニル、Ｎ−（ｔ−ブトキシ）カルバミルアルキルであり、（ｉｉ）Ｒ１３はそれぞれ独立にＨ、ＮＯ２、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシもしくはフェニルであり、そして（ｉｉｉ）Ｒ１４はそれぞれ独立に、Ｈ、アルコキシ、フェニルオキシもしくはフェニルアルコキシである］
を有し、
（ｂ）Ｒ１０はシアノアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ置換アルキルアミノおよびヒドロキシ置換ジアルキルアミノから成る群から選択され、そして
（ｃ）Ｒ１１はＨもしくは低級アルキルである。
【００２６】
本発明はまた、製薬学的に許容されうる担体および一般式（ＩＶ）
【００２７】
【化１５】
2004505952.tif 000007
【００２８】
を有する化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩を含んで成る製薬学的組成物を提供し、
式中、
（ａ）　Ｒ９はＨ、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、置換フェニル、ピリジニル、置換ピリジニル、ナフチル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニル、ピリミジンおよび２，４−（ビスメトキシフェニル）−５−ピリミジニルから成る群から選択され、
前記置換フェニルは一般式（Ｖ）
【００２９】
【化１６】
2004505952.tif 000008
【００３０】
［ここで、（ｉ）Ｒ１２はＨ、ＯＨ、低級アルキルチオ、アルコキシ、アルキルアミン、ジアルキルアミン、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシ、シアノ、シアノアルキル、フェニル、フェニルアルコキシもしくは置換ピペラジニル、Ｎ−（ｔ−ブトキシ）カルバミルアルキルであり、（ｉｉ）Ｒ１３はそれぞれ独立にＨ、ＮＯ２、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシもしくはフェニルであり、そして（ｉｉｉ）Ｒ１４はそれぞれ独立に、Ｈ、アルコキシ、フェニルオキシもしくはフェニルアルコキシである］
を有し、
（ｂ）Ｒ１１はＨもしくは低級アルキルであり、そして
（ｃ）Ｒ１５はＨもしくはアルキルである。
【００３１】
本発明は更に、細胞集団中の細胞を本発明の製薬学的組成物のいずれかの中に包含される予防的に有効量の化合物と接触させることを含んで成る、細胞集団中の虚血死を低下させる方法を提供する。
【００３２】
本発明は更に、外傷事象の前、期間中もしくはその後の適当な期間内に、神経細胞を本製薬学的組成物のいずれかの中に含有された予防的に有効量の化合物と接触させることを含んで成る、外傷事象に反応する、神経細胞死を低下させる方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた更に、外傷事象の前、期間中もしくはその後の適当な期間内に、予防的に有効量のいずれかの本製薬学的組成物を被験体に投与することを含んで成る、被験体における外傷事象に反応した、神経細胞死を低下させる方法を提供する。
【００３４】
最後に、本発明は容器およびその中の製薬学的組成物を含んで成り、そこで容器が予防的用量の製薬学的組成物を被験体に配達するための装置を有する、いずれかの本製薬学的組成物を被験体に投与するための装置を提供する。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞集団における虚血死を低下させるのに有用な、式中、Ｒ２０、Ｒ２１、ｐ、ｑ、Ｒ２２およびＲ２３が前記に定義されたとおりである一般式（Ｉ）
【００３６】
【化１７】
2004505952.tif 000009
【００３７】
の新規な神経保護性４−ピリミジンアミン誘導体もしくは製薬学的に許容されうるその塩を提供する。
【００３８】
本発明の１態様は式（Ｉ）の化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩であり、
式中、
Ｒ２０は
【００３９】
【化１８】
2004505952.tif 000010
【００４０】
から成る群から選択され、
ＲＡは水素、アルキル、アリールおよびアラルキルから成る群から選択され、ここであらゆる基のアリール部分は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン化低級アルキル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アゾ、ニトロ、シアノ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、低級アルキルチオおよびアリールチオから独立に選択された１〜３置換基で置換される、
ＲＢは水素、アルキル、ハロゲン化低級アルキル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アミノ−低級アルキル、低級アルキル−アミノ−低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ−低級アルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−低級アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール−低級アルキル、低級アルコキシ−低級アルキル、アリールオキシ、アリールオキシ−低級アルキルおよびデヒドロアビエチルから成る群から選択され、ここであらゆる基のアリール、シクロアルキル、ヘテロアリールもしくはヘテロシクロアルキル部分は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン化低級アルキル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アゾ、ニトロ、シアノ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、低級アルキルチオおよびアリールチオから独立に選択された１〜３置換基で置換されるか、
あるいはまた、ＲＡおよびＲＢはそれらが結合されている窒素原子と一緒になって、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルから成る群から選択される環構造を形成する、ここでヘテロアリールもしくはヘテロシクロアルキル基は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、トリフルオロメチル、低級アルキルカルボニル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アリールアミノ、アゾ、ニトロもしくはシアノから独立に選択された１〜２置換基で置換される、
ＲＣは低級アルキル、アラルキル、低級アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−アミノ−低級アルキルカルボニルおよび［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−低級−アルキルカルボニルから成る群から選択され、
ＲＤはアルキル、アリール、アラルキル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−アミノ−低級アルキル、［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−低級アルキルおよびビフェニルから成る群から選択され、ここでアリールもしくはアラルキル基のアリール部分は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アゾ、ニトロ、シアノもしくはトリフルオロメチルから独立に選択された１〜２置換基で置換され、
Ｒ２１は水素、低級アルキル、アリール、アラルキル、低級アルキルカルボニル、アリールカルボニルおよびアラルキルカルボニルから成る群から選択される（ここでアリール、アラルキル、アリールカルボニルもしくはアラルキルカルボニル基のアリール部分は場合によっては、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシもしくはトリフルオロメチルから独立に選択された１〜２置換基で置換される）、
ｐは０〜２からの整数であり、
ｑは０〜２からの整数であり、
Ｒ２２およびＲ２３はそれぞれ独立に、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、フェニルオキシカルボニル、アミノカルボニル、低級アルキルアミノカルボニルおよびジ（低級アルキル）アミノカルボニルから成る群から選択される。
【００４１】
本発明の１態様において、Ｒ２０は
【００４２】
【化１９】
2004505952.tif 000011
【００４３】
である。
【００４４】
好ましくは、ＲＡは水素、低級アルキルおよびアラルキルから成る群から選択される。より好ましくは、ＲＡは水素、メチル、エチルおよびベンジルから成る群から選択される。更により好ましくは、ＲＡは水素、メチルおよびベンジルから成る群から選択される。もっとも好ましくは、ＲＡは水素およびメチルから成る群から選択される。
【００４５】
好ましくは、ＲＢは水素、低級アルキル、ハロゲン化低級アルキル、アラルキル、置換アラルキル（ここでアラルキル上の置換基はハロゲン、アルキル、アルコキシもしくはトリフルオロメチルから独立に選択される１〜３個である）、アルコキシアルキル、シクロアルキル−アルキル、デヒドロアビエチル、ジアルキルアミノアルキル、ビフェニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール（ここでヘテロアリール基上の置換基はハロゲンもしくは低級アルキルから独立に選択される１〜２個である）、ヘテロアリール−アルキル、アリールオキシアルキルおよびアルコキシカルボニルアルキルから成る群から選択される。
【００４６】
より好ましくは、ＲＢは水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ベンジル、フェニルエチル、メトキシプロピル、シクロヘキシルメチル、３−クロロベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２−エトキシベンジル、２，５−ジフルオロベンジル、デヒドロアビエチル、３，４−ジメトキシベンジル、ジエチルアミノエチル、４−ブロモ−２−ピリジル、ジメチルアミノエチル、４−ビフェニル、２−フラニルメチル、３−ヨードベンジル、２，２，２−トリフルオロエチル、３，４−ジフルオロベンジル、２−チエニルエチル、３，５−ジメチル−２−ピリジル、２−（エトキシ）アセチル、２−メトキシベンジル、４−ブロモベンジル、３，５−ジトリフルオロメチルベンジル、３−メトキシフェニルエチル、３，４，５−トリメトキシベンジル、４−メトキシフェニルエチル、４−イミダゾリルエチル、２−トリフルオロメチルベンジル、３−メトキシベンジル、３−メトキシベンジル、３，５−ジメトキシベンジル、２−ブロモベンジル、４−フルオロベンジル、１−ナフチルメチル、フェノキシエチル、４−トリフルオロメチルベンジル、３−ピリジル、２−メチルベンジル、２−フルオロベンジルおよび３，４−ジメトキフェニルエチルから成る群から選択される。
【００４７】
更により好ましくは、ＲＡは水素、メチルおよびベンジルから選択され、かつ
ＲＢはメチル、メトキシプロピル、シクロヘキシルメチル、３−クロロベンジル、２，５−ジフルオロベンジル、フェニルエチル、４−ブロモ−２−ピリジル、
ジメチルアミノエチル、ｎ−ブチル、２−フラニルメチル、３，４−ジフルオロベンジル、２−チエニルエチル、４−ブロモベンジル、３−メトキシフェニルエチル、３，４，５−トリメトキシベンジル、ベンジル、３−メチルベンジルおよびフェノキシエチルから成る群から選択される。
【００４８】
更により好ましくは、ＲＢはメチル、メトキシプロピル、２，５−ジフルオロベンジル、３，４−ジフルオロベンジル、４−ブロモベンジル、３，４，５−トリメトキシベンジル、ベンジル、３−メチルベンジルおよびｎ−ブチルから成る群から選択される。
【００４９】
もっとも好ましくは、ＲＢはメチルである。
【００５０】
本発明の１態様において、ＲＡおよびＲＢはそれらが結合されている窒素原子と一緒になってＮ−ピロリジニル、Ｎ−モルホリニル、Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニル、Ｎ−ヘキサメチレンイミおよびＮ−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジニルから成る群から選択される環構造を形成する。
【００５１】
好ましくは、ＲＡおよびＲＢがそれらが結合されている窒素原子と一緒になってＮ−モルホリニルおよびＮ−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジニルから成る群から選択される環構造を形成する。
【００５２】
より好ましくは、ＲＡおよびＲＢがそれらが結合されている窒素原子と一緒になってＮ−モルホリニルを形成する。
【００５３】
本発明の１態様において、Ｒ２０は
【００５４】
【化２０】
2004505952.tif 000012
【００５５】
である。
【００５６】
好ましくは、ＲＣはアラルキルカルボニル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−２−アミノアルキルカルボニルおよび［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−アルキルカルボニルから成る群から選択される。より好ましくは、ＲＣはベンゾイル、（±）−Ｎ−ベンゾイル−２−アミノプロピオノイルおよび［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−ペンタノイルから成る群から選択される、
本発明の１態様において、Ｒ２０は
【００５７】
【化２１】
2004505952.tif 000013
【００５８】
である。
【００５９】
好ましくは、ＲＤは（±）−Ｎ−ベンゾイル−２−アミノアルキル、［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−アルキル、アルキル、置換アリール（ここでアリール上の置換基はアゾ、ニトロ、ハロゲン、アルコキシ、トリフルオロメチルから独立に選択される）、ビフェニル、アラルキルおよび置換アラルキル（ここでアラルキル基のアルキル部分はハロゲンから選択される置換基で置換される）から成る群から選択される。より好ましくは、ＲＤは（±）−Ｎ−ベンゾイル−２−アミノエト−２−イル、［３ａＳ−（３ａα，４β、６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−ブト−４−イル、１−クロロ−１−フェニル−メチル、３−アゾ−６−ニトロフェニル、ペンタデカニル、４−ビフェニル、４−ブトキシフェニル、４−トリフルオロメチルフェニル、３−フルオロフェニルおよびプロピルから成る群から選択される。
【００６０】
本発明の１態様において、Ｒ２１は水素、アルキル、アラルキル、アルキルカルボニルおよびアリールカルボニルから成る群から選択され、ここでアリール基は場合によっては、ハロゲンおよびトリフルオロメチル選択される１置換基で置換される。好ましくは、Ｒ２１は水素、エチル、ベンジル、プロピルカルボニル、３，４−フルオロフェニルカルボニルおよび４−トリフルオロメチルフェニルカルボニルから成る群から選択される。より好ましくは、Ｒ２１は水素である。
【００６１】
本発明の１態様において、ｐは０〜２からの整数である。好ましくは、ｐは０〜１からの整数である。本発明の１態様においてｑは０〜２からの整数である。好ましくは、ｑは０〜１からの整数である。
【００６２】
本発明の１態様において、Ｒ２２およびＲ２３はそれぞれ独立に、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、フェニルオキシカルボニル、アミノカルボニル、低級アルキルアミノカルボニルおよびジ（低級アルキル）アミノカルボニルから成る群から選択される．
Ｒ２０が
【００６３】
【化２２】
2004505952.tif 000014
【００６４】
から成る群から選択される式（Ｉ）の化合物はスキーム１および２に概説される過程に従って調製することができる。
【００６５】
【化２３】
2004505952.tif 000015
【００６６】
より具体的には、式（Ａ１）の適当に置換された化合物（ここでｎおよびｍはそれぞれ独立に、０〜７から選択される整数である）、既知の化合物もしくは既知の方法により調製された化合物（例えば、ｎおよびｍがそれぞれ１である場合は、化合物はＢｉｏＦｏｃｕｓ，ＰＣＣ（ＵＫ）から購入することができる）を、無水条件下で、ジクロロメタン、クロロホルム等のようなハロゲン化有機溶媒中で塩化チオニルと反応させて、式（Ａ２）の対応する化合物を生成する。
【００６７】
式（Ａ２）の化合物は無水条件下で、Ｎ−メチル−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等のような有機溶媒中でカリウムフタルイミドと反応させて、式（Ａ３）の対応する化合物を生成する。
【００６８】
式（Ａ３）の化合物を還流温度で、エタノール、メタノール、イソプロパノール等のような有機溶媒中で、ヒドラジン一水和物と反応させて、式（Ｉａ）の対応する化合物を生成する。
【００６９】
ＲＡおよび／もしくはＲＢが水素以外のものである式（Ｉ）の化合物はスキーム２に概説される過程に従って調製することができる。
【００７０】
【化２４】
2004505952.tif 000016
【００７１】
従って、スキーム１におけるように調製された式（Ａ２）の適当に置換された化合物は約１００〜１５０℃の範囲内の高温で、好ましくは、約１００〜１３５℃の範囲内の温度でＮ−メチル−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等のような有機溶媒中で、適当に置換された第一級、第二級もしくは環式アミン、式（Ａ４）の化合物と反応させて、式（Ｉｂ）の対応する化合物を生成する。
【００７２】
Ｒ２０が
【００７３】
【化２５】
2004505952.tif 000017
【００７４】
から成る群から選択される式（Ｉ）の化合物はスキーム３に概説される過程に従って調製することができる。
【００７５】
【化２６】
2004505952.tif 000018
【００７６】
従って、スキーム１におけるように調製された式（Ａ４）の適当に置換された化合物を適当に置換した酸、式（Ａ５）の化合物、適当に置換したアルキルエステル、式（Ａ６）の化合物もしくは適当に置換した酸塩化物、式（Ａ７）の化合物と反応させて、式（Ｉｃ）の対応する化合物を生成する。
【００７７】
式（Ａ４）の化合物を酸、式（Ａ５）の化合物と反応させる場合、反応はトリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピリジン等のような第三級アミンの存在下で、ヘキサフルオロリン酸Ｏ−ベンゾイルトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、ヘキサフルオロリン酸Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ”，Ｎ”−テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）等のようなカップリング触媒の存在下で、ＮＭＰ、ＤＭＦ等のような有機溶媒中で実施して、式（Ｉｃ）の対応する化合物を生成する。
【００７８】
式（Ａ４）の化合物をアルキルエステル、式（Ａ６）の化合物と反応させる場合は、その反応はＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ピリジン等の存在下で、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン等のような有機溶媒中で実施されて、式（Ｉｃ）の対応する化合物を生成する。
【００７９】
式（Ａ４）の化合物を酸塩化物、式（Ａ７）の化合物と反応させる場合は、その反応はＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ピリジン等のような第三級アミンの存在下で、ジオキサン、ＴＨＦ、トルエン等のような有機溶媒中で実施して、式（Ｉｃ）の対応する化合物を生成する。
【００８０】
Ｒ２１がアルキルカルボニル、アリールカルボニルもしくはアラルキルカルボニルから成る群から選択され、ＲＤがアルキル、アリールもしくはアラルキルから成る群から選択される式（Ｉ）の化合物のためには、式（Ａ４）の化合物を式（Ａ５）もしくは（Ａ７）の適当に置換された化合物と、好ましくは、２当量以上の式（Ａ５）もしくは（Ａ７）の化合物と反応させて、式（Ｉｄ）の対応する化合物を生成する。
【００８１】
【化２７】
2004505952.tif 000019
【００８２】
Ｒ２０が
【００８３】
【化２８】
2004505952.tif 000020
【００８４】
から成る群から選択される式（Ｉ）の化合物はスキーム４に概説される過程に従って調製することができる。
【００８５】
【化２９】
2004505952.tif 000021
【００８６】
従って、式（Ａ１）の適当に置換された化合物を、場合によっては約５０〜１００℃の範囲内の高温で、ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ピリジン等のような第三級アミンの存在下で、トルエン、ジオキサン、ＴＨＦ等のような有機溶媒中で、適当に置換された酸塩化物、式（Ａ８）の化合物と反応させて、式（Ｉｅ）の対応する化合物を生成する。
【００８７】
Ｒ２１が水素以外である、式（Ｉ）の化合物はスキーム５に概説された過程に従って調製することができる。
【００８８】
【化３０】
2004505952.tif 000022
【００８９】
より具体的には、式（Ａ９）の化合物、既知の化合物もしくは既知の方法により調製された化合物をクロロホルム、塩化メチレン等のような有機溶媒中で、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル・クロリド（ＢＯＣ−ＯＮ）等のような保護試薬と反応させて、ＰＴがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル等のような対応する保護基である式（Ａ１０）の対応する化合物を生成する。
【００９０】
式（Ａ１０）の化合物はＲ２１ａがアルキル、アリールもしくはアラルキルである式（Ａ１１）の適当に置換された酸塩化物と、または式（Ａ１２）の適当に置換された酸と反応させて、式（Ａ１３）の対応する化合物を生成する。
【００９１】
式（Ａ１０）の化合物を式（Ａ１１）の適当に置換された酸塩化物と反応させる場合は、その反応はＮ−メチル−モルホリン、ＤＩＰＥＡ、ＴＥＡ、ピリジン等のような有機アミンの存在下で、塩化メチレン、クロロホルム等のような有機溶媒中で実施されて、式（Ａ１３）の対応する化合物を生成する。
【００９２】
式（Ａ１０）の化合物が適当に置換された式（Ａ１２）の酸と反応させる場合は、その反応はカルボニルジイミダゾール、シクロヘキシルカルボジイミン等のような活性化剤の存在下で、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ＮＭＰ等のような有機溶媒中で実施されて、式（Ａ１３）の対応する化合物を生成する。
【００９３】
式（Ａ１３）の化合物は当業者に知られた標準脱保護条件下で脱保護されて（例えば、保護基がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである場合は、脱保護はトリフルオロ酢酸、塩化水素酸等のような酸の存在下で、塩化メチレン、クロロホルム等のような有機溶媒中で実施される）、式（Ａ１４）の対応する化合物を生成する。
【００９４】
次に式（Ａ１４）の化合物を、場合によっては還流温度で、エタノール、メタノール等のような有機溶媒中で、ハロアルコール、ＸがＢｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｆのようなハロゲンである式（Ａ１５）の化合物（例えば、２−ブロモエタノール）と、反応させて、式（Ａ１６）の対応する化合物を生成する。
【００９５】
当業者は、次に式（Ａ１６）の化合物をスキーム１もしくはスキーム４中の式（Ａ１）の化合物と置換し、スキーム１、２、３および／もしくは４に概説された過程に従って反応させて、式（Ｉ）の所望の対応する化合物を生成することを確認するであろう。
【００９６】
本発明は更に、製薬学的に許容されうる担体および式（Ｉ）の化合物を含んで成る製薬学的組成物を提供する。
【００９７】
本発明は更に、治療的もしくは予防的に有効量の１種以上の式（Ｉ）の化合物もしくは１種以上の式（Ｉ）の化合物を含有する製薬学的組成物を細胞もしくは被験体に投与することを含んで成る、それを必要とする被験体の細胞集団の虚血死を低下する方法を提供する。
【００９８】
本発明はまた、製薬学的に許容されうる担体および一般式（ＩＩ）
【００９９】
【化３１】
2004505952.tif 000023
【０１００】
を有する化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩を含んで成る製薬学的組成物を提供し、
式中
（ａ）　Ｒ９はＨ、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、置換フェニル、ピリジニル、置換ピリジニル、ナフチル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニル、ピリミジンおよび２，４−（ビスメトキシフェニル）−５−ピリミジニルから成る群から選択され、
前記置換フェニルは一般式（ＩＩＩ）
【０１０１】
【化３２】
2004505952.tif 000024
【０１０２】
［ここで、（ｉ）Ｒ１２はＨ、ＯＨ、低級アルキルチオ、アルコキシ、アルキルアミン、ジアルキルアミン、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシ、シアノ、シアノアルキル、フェニル、フェニルアルコキシもしくは置換ピペラジニル、Ｎ−（ｔ−ブトキシ）カルバミルアルキルであり、（ｉｉ）Ｒ１３はそれぞれ独立にＨ、ＮＯ２、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシもしくはフェニルであり、そして（ｉｉｉ）Ｒ１４はそれぞれ独立に、Ｈ、アルコキシ、フェニルオキシもしくはフェニルアルコキシである］
を有し、
（ｂ）Ｒ１０はシアノアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ置換アルキルアミノおよびヒドロキシ置換ジアルキルアミノから成る群から選択され、そして
（ｃ）Ｒ１１はＨもしくは低級アルキルである。
【０１０３】
本製薬学的組成物の１態様において、Ｒ９は置換フェニルである。もう１つの態様において、Ｒ１１はＨであり、Ｒ１０はジアルキルアミノもしくはヒドロキシ置換ジアルキルアミノである。
【０１０４】
本発明の製薬学的組成物の好ましい態様において、その中に含有された化合物はその構造が「実施例の詳細」に示されている以下の群から選択される。
【０１０５】
Ｎ１，Ｎ１−ジメチル−Ｎ４−［６−［４−（フェニルメトキシ）フェニル］−４−ピリミジニル］−１，４−ベンゼンジアミン、
Ｎ１−（６−［１，１’−ビフェニル］−３−イル−４−ピリミジニル）−Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−１，４−ベンゼンジアミン、
Ｎ１−（６−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−４−ピリミジニル）−Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−１，４−ベンゼンジアミン、
２−［［４−［（６−［１，１’−ビフェニル］−３−イル−４−ピリミジニル）アミノ］フェニル］エチルアミノ］−エタノール、
２−［［４−［（６−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル−４−ピリミジニル）アミノ］フェニル］エチルアミノ］−エタノール、
２−［エチル［４−［［６−［４−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−４−ピリミジニル］アミノ］フェニル］アミノ］−エタノールおよび
２−｛［４−（２’，４’−ビス−ベンジルオキシ−［４，５’］ビピリミジル−６−イルアミノ）−フェニル］−エチル−アミノ｝エタノール（本化合物は以下に示す構造を有する
【０１０６】
【化３３】
2004505952.tif 000025
【０１０７】
本発明はまた、製薬学的に許容されうる担体および一般式（ＩＶ）
【０１０８】
【化３４】
2004505952.tif 000026
【０１０９】
を有する化合物もしくは製薬学的に許容されうるその塩を含んで成る製薬学的組成物を提供し、
式中、
（ａ）　Ｒ９はＨ、チエニル、フラニル、ピロリル、フェニル、置換フェニル、ピリジニル、置換ピリジニル、ナフチル、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル、２−ベンゾフラニル、ピリミジンおよび２，４−（ビスメトキシフェニル）−５−ピリミジニルから成る群から選択され、
前記置換フェニルは一般式（Ｖ）
【０１１０】
【化３５】
2004505952.tif 000027
【０１１１】
［ここで、（ｉ）Ｒ１２はＨ、ＯＨ、低級アルキルチオ、アルコキシ、アルキルアミン、ジアルキルアミン、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシ、シアノ、シアノアルキル、フェニル、フェニルアルコキシもしくは置換ピペラジニル、Ｎ−（ｔ−ブトキシ）カルバミルアルキルであり、（ｉｉ）Ｒ１３はそれぞれ独立にＨ、ＮＯ２、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲン置換低級アルキル、ハロゲン置換低級アルコキシもしくはフェニルであり、そして（ｉｉｉ）Ｒ１４はそれぞれ独立に、Ｈ、アルコキシ、フェニルオキシもしくはフェニルアルコキシである］
を有し、
（ｂ）Ｒ１１はＨもしくは低級アルキルであり、そして
（ｃ）Ｒ１５はＨもしくはアルキルである。
【０１１２】
別記されない限り、本明細書で使用される用語「アルキル」は炭素およびＨのみから成る、飽和の直鎖、分枝もしくは環式置換基を意味する。好ましくは、アルキル鎖は１〜２０炭素原子、より好ましくは、１〜１５炭素原子、更により好ましくは、１〜８炭素原子を含んで成る。低級アルキルは１〜４炭素原子を含有するアルキルを意味する。
【０１１３】
「アルケニル」の用語は少なくとも１個の二重結合を含有する、炭素およびＨのみから成る、不飽和の直鎖、分枝もしくは環式置換基を意味する。「アルキニル」の用語は少なくとも１個の三重結合を含有する、炭素およびＨのみから成る、不飽和の直鎖、分枝もしくは環式置換基を意味する。
【０１１４】
「アルコキシ」の用語は、アルキルが定義されたようなものである、Ｏ−アルキルを意味する。「アルキルチオ」の用語は、アルキルが定義されたようなものである、Ｓ−アルキルを意味し、アルキルチオ基はＳ原子により結合される。
【０１１５】
酸性のアルキルは末端ＣＯＯＨ基をもつ炭素鎖である。本明細書で使用される「アルキルアミノ」の用語はアルキル置換アミノ基を意味することとする。同様に、「ジアルキルアミノ」の用語は２個の独立に選択されたアルキル基で置換されたアミノ基を意味することとする。「ヒドロキシ置換ジアルキルアミノ」の用語は、アルキル基のどちらかもしくは双方が、１個もしくは複数のアルキル基のいずれかの炭素原子において独立に、ヒドロキシ基で独立に置換されているジアルキルアミノ基を意味することとする。
【０１１６】
「ハロ」の用語はフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
【０１１７】
「Ｐｈ」もしくは「ＰＨ」の記号はフェニルを意味する。
【０１１８】
本明細書で使用される「アリール」は、別記されない限り、フェニル、ナフチル等のような未置換炭素環式芳香族基を表わすこととする。
【０１１９】
本明細書で使用される「アラルキル」は、別記されない限り、フェニル、ナフチル等のようなアリール基で置換されたあらゆる低級アルキル基を意味することとする。例えば、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピル、ナフチルメチル、等。
【０１２０】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」は別記されない限り、場合によってはＯ、ＮおよびＳから成る群から独立に選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有する、Ｏ、ＮおよびＳから成る群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有するあらゆる５もしくは６員の単環式芳香族環構造、または、場合によってはＯ、ＮおよびＳから成る群から独立に選択される１〜４個の更なるヘテロ原子を含有する、Ｏ、ＮおよびＳから成る群から選択された少なくとも１個のヘテロ原子を含有する９もしくは１０員の二環式芳香族環構造を意味することとする。ヘテロアリール基はその結果が安定な構造物であるように、環のいずれかのヘテロ原子もしくは炭素原子に結合されることができる。
【０１２１】
適当なヘテロアリール基の例はそれらに限定はされないが、ピロリル、フリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、プラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラニル、フラザニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリニル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、イソチアゾリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノオキサリニル、ナフチリジニル、プテリジニル等を含む。好ましいヘテロアリール基はフラニル、チエニル、イミダゾリル、ピリジルおよびイソキノロニルを含む。
【０１２２】
本明細書で使用される「ヘテロシクロアルキル」の用語は、場合によってはＯ、ＮおよびＳから成る群から独立に選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有する、Ｏ、ＮおよびＳから成る群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有するあらゆる４〜８員の、好ましくは、５〜７員の単環式の飽和もしくは一部不飽和の環構造、または、場合によってはＯ、ＮおよびＳから成る群から独立に選択された１〜４個の更なるヘテロ原子を含有する、Ｏ、ＮおよびＳから成る群から選択された少なくとも１個のヘテロ原子を含有する９〜１０員の飽和、一部不飽和もしくは一部芳香族の二環式環系を意味することとする。ヘテロシクロアルキル基はその結果が安定な構造になるように環のあらゆるヘテロ原子もしくは炭素原子に結合されることができる。
【０１２３】
適当なヘテロアリール基の例はそれらに限定はされないが、ピロリニル、ピロリジニル、ジオキサラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、トリチアニル、インドリニル、クロメニル、３，４−メチレンジオキシフェニル、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニル、ヘキサメチレンイミン、等を含む。好ましいヘテロシクロアルキル基はピロリジニル、モルホリニル、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニル、ヘキサメチレンイミンおよびピペラジニルを含む。
【０１２４】
具体的な基が「置換されて」いる時、（例えば、アリール、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール等）その基は置換基のリストから独立に選択された１個以上の置換基、好ましくは１〜５置換基、より好ましくは１〜３置換基、もっとも好ましくは１〜２置換基をもつことができる。
【０１２５】
置換基に関連して、「独立に」の用語は２個以上のこれらの置換基が可能である時は、これらの置換基は相互に同一でも異なってもよい。
【０１２６】
本明細書をとおして使用された標準命名法に従うと、指定された側鎖の末端部分が最初に記述され、次に結合地点の方向に向かって隣接官能基を続けて記述する。従って、例えば、「フェニルＣ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニルＣ１−Ｃ６アルキル」置換基は式
【０１２７】
【化３６】
2004505952.tif 000028
【０１２８】
の基を表わす。
【０１２９】
本発明の目的のためのピリミジン環系は以下の番号付けを有することとする。
【０１３０】
【化３７】
2004505952.tif 000029
【０１３１】
本発明の製薬学的組成物中に含有される化合物は以下の「実施例の詳細」の節に例示される。式（ＩＩ）および（ＩＶ）の化合物は化学図書館の一部としてＢｉｏＦｏｃｕｓ，ＰＣＣ（ＵＫ）から市販されている。あるいはまた、以下に例示された式（ＩＩ）および（ＩＶ）の化合物は既知の方法を使用して調製することができる。
【０１３２】
本明細書中で使用される「製薬学的に許容されうる塩」という句は、遊離塩基の望ましい薬理活性を有し、生物学的にも他の点でも有害でない遊離塩基の塩を意味する。これらの塩は無機もしくは有機の酸から導かれうる。無機酸の例は、塩酸、硝酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸である。有機酸の例は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メチルスルホン酸、サリチル酸などである。
【０１３３】
本発明の製薬組成物は、従来的な製薬技法に従って調製されうる。その中の製薬学的に許容されうる担体は、投与に望まれる調製物の形態に依存して、経静脈、経口、経鼻もしくは非経口を限定することなく含む全身投与などの広くさまざまな形態をとりうる。この組成物を経口投与形態で調製する際、経口液状製剤（たとえば、懸濁液、エリキシル剤および溶液）の場合には、水、グリコール、油、アルコール、香味料、防腐剤、色素、シロップなどといった通常の製薬学的な担体のいずれが使用されてもよく、もしくは経口固形製剤（たとえば、粉末、カプセルおよび錠剤）の場合には、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などといった担体のいずれが使用されてもよい。
【０１３４】
それらの投与の容易さのために、錠剤およびカプセル剤は都合のよい経口投薬単位形態を代表する（これらでは、固形の製薬学的な担体が使用される）。望まれるなら、錠剤は標準的な技法による糖コーティングもしくは腸溶コーティングがなされうる。非経口の場合、担体は通常、滅菌水を含んで成るが、可溶性もしくは防腐性目的のための他の成分もまた含められうる。また、注射可能な懸濁液も適切な液状担体、懸濁剤などを用いて調製されうる。本化合物はまた、エアロゾルの形でも投与されうる。
【０１３５】
本発明は、本製薬組成物のいずれかの中に含まれる予防的に有効な量の化合物を細胞に接触させることを含んで成る、細胞集団における虚血死を減らすための方法もまた提供する。
【０１３６】
本明細書中で用いられる「予防的に有効な量」の本製薬組成物、もしくはそれらの中の化合物とは、細胞の集団中における細胞死の発生を減少させる量を意味する。本製薬組成物は一般に、１投薬単位（たとえば、錠剤、カプセル、粉末、注射、小さじ一杯など）あたり約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇを含むであろう。一つの実施態様では、本製薬組成物は１投薬単位あたり約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇの化合物を含み、好ましくは約０．０５〜約２０ｍｇ／ｋｇを含む。本製薬組成物の予防的有効用量を決定するための方法は、当該技術分野において公知である。ヒトに本製薬組成物を投与するための有効用量は、例えば、動物試験の結果から数学的に決定されうる。
【０１３７】
本明細書中で使用される「細胞集団」とは、培養容器中におけるようなインビトロの細胞、または体液の一部、無傷の組織もしくは器官のようなインビボにある細胞を指す。細胞集団は均質（１つの細胞型を含んで成る）もしくは不均一（混合された細胞型の集団を含んで成る）でありえる。好ましい細胞集団は、本発明の化合物の存在下で虚血死から保護されると同定された、少なくとも１つの細胞型を含んで成る不均一な細胞集団である。
【０１３８】
本方法の１つの実施態様では、細胞集団を構成する細胞は、好ましくは哺乳類細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。外傷性事象に反応した虚血性傷害の減少を示す細胞集団を構成する細胞は、神経細胞、グリア細胞、心臓の細胞、リンパ球、マクロファージおよび繊維芽細胞から成る群から選択される少なくとも一つの細胞を含んで成る細胞集団を含むが、それに限定されない。好ましい実施態様では、細胞は神経細胞である。
【０１３９】
本発明は、本製薬組成物のいずれかの中に含まれる予防的に有効な量の化合物を、外傷性事象の前、その途中、もしくは後の適切な期間内に、神経細胞に接触させることを含んで成る、外傷性事象に反応した神経細胞死を減らすための方法もまた提供する。
【０１４０】
これらの本方法は共に、インビトロ、エックスビボ、もしくはインビボで実施されうる。本明細書中で用いられる、「インビトロ」で細胞に薬剤を接触させることには、例を挙げれば、単一細胞培養、混合細胞培養もしくは初代細胞組織培養中にある細胞に、そのような薬剤を接触させることを含む。「エックスビボ」で細胞に薬剤を接触させることには、例を挙げれば、それが由来する被験体の体外で維持された組織化された組織もしくは器官の一部である細胞に、そのような薬剤を接触させることを含む。「インビボ」で細胞に薬剤を接触させるとは、被験体内に存在する細胞に、そのような薬剤を接触させることを意味する。
【０１４１】
本発明はさらに、外傷性事象の前、その途中、もしくは後の適切な期間内に、予防的に有効な量の本製薬組成物のいずれかを被験体に投与することを含んで成る、被験体における外傷性事象に反応した神経細胞死を減らすための方法を提供する。用語「被験体」はあらゆる動物もしくは人工的に改変された動物を限定することなく含む。好ましい実施態様では、被験体はヒトである。
【０１４２】
本製薬組成物のいずれかを被験体に投与する経路は、好ましくは、たとえば経静脈（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）および経口投与を含む全身投与である。１つの実施態様では、本組成物は神経系に直接投与される。この投与経路は、ポンプ装置を持つ、もしくは持たないカテーテルならびに頭蓋内および椎骨内針を使用できる、大脳内、心室内、脳室内、クモ膜下腔内、大槽内、髄腔内および／もしくは脊髄周囲（ｐｅｒｉ−ｓｐｉｎａｌ）の投与経路を含むが、それに限定されない。注入量は、たとえば、数分〜数日の範囲の期間にわたり、１分間に体重１ｋｇあたり約１．０〜１．０×１０４μｇの本化合物の範囲をとりうる。局所的投与の場合、本化合物はたとえば、賦形剤に対して約０．１〜約１０％の薬剤の濃度で製薬学的な担体と混合されうる。
【０１４３】
本方法では、神経細胞死を引き起こす外傷性事象には、たとえば、医学的障害、物理的外傷、化学的外傷、もしくは生物学的外傷を含む。
【０１４４】
神経細胞死を引き起こす医学的疾患の例には、周産期低酸素性虚血性傷害、心停止、脳卒中／虚血性発作、低血糖誘導性神経障害、心臓外科手術誘導性脳虚血、心的外傷後ストレス精神障害、ストレス誘発性記憶障害、慢性癲癇、多発性硬化症、パーキンソン病、糖尿病性末梢神経障害、神経障害性疼痛、ベル麻痺、洞不全症候群、アルツハイマー病、ピック病、びまん性レビ小体病、クロイツフェルト・ヤコブ病および他のタンパク質凝集病、進行性核上性麻痺（スチール・リチャードソン症候群）、多系統変性症（シャイ・ドレ−ガ−症候群）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、退行性運動失調症、皮質基底変性症、グアム島のＡＬＳ−パーキンソン痴呆複合症、亜急性萎縮性脳炎、ハンチントン病、シヌクレイノパチー（多系統萎縮症を含む）、原発性進行性失語症、線条体黒質系変性症、マジャド・ジョセフ病、３型脊髄小脳失調、オリーブ橋小脳変性症、ジル・ド・ラ・トゥレット病、延髄・偽球麻痺、脊髄・球脊髄性筋萎縮症（ケネディー病）、原発性側索硬化症、家族性強直性対麻痺、ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルク・ウエランダー病、テイ・サックス病、サンドホフ病、家族性痙攣疾患、神経遮断薬悪性症候群、ウォルファルト・クーゲルベルク・ウェランダー病、痙攣性不全対麻痺、進行性多病巣性白質脳症、ＡＩＤＳ関連痴呆症、洞不全症候群、帯状疱疹後神経障害、ウイルス性髄膜炎、細菌性髄膜炎、プリオン病、および家族性自律神経失調症（ライリー・デイ症候群）を含むが、それに限定されない。
【０１４５】
神経細胞死を引き起こす物理的外傷には、例えば、局所性脳外傷、広汎性脳外傷、脊髄損傷、脳梗塞、塞栓性閉塞、血栓性閉塞、再潅流、頭蓋内出血、鞭打ち、揺さぶられっこ症候群、および放射線誘導性末梢神経損傷を含む。
【０１４６】
神経細胞死を引き起こす化学的外傷には、例えば、アルコール、化学療法剤、戦用ガス、鉛、シアノアクリレート、ポリアクリルアミド、および毒性吸入薬への暴露を含む。最後に、神経細胞死を引き起こす生物学的外傷には、例えば、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、ならびに髄膜炎誘導性の細菌およびウイルスへの暴露を含む。
【０１４７】
本方法の実施において、製薬組成物は外傷性事象の前、その途中、もしくはその後に被験体に投与されうる。本明細書中で使われる用語「その後」とは、外傷性事象と共に始まり、外傷性事象に起因する細胞死の可能性が減少するまで続く期間中のいずれかの時点を指す。
【０１４８】
最後に本発明は、１つの容器およびその中の本製薬組成物を含んで成り、その容器が被験体に予防的用量の製薬組成物を送達するための装置を有する、本製薬組成物のいずれかを被験体に投与するための器具を提供する。好ましい実施態様では、製薬組成物を送達するための装置は注射器である。理想的には、本器具は本組成物を含む使い捨ての、あらかじめ用量の決められた、自動注入可能な装置である。そのような装置は、例えば、移動外来ユニット（ｍｏｂｉｌｅ　ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ　ｕｎｉｔ）において、もしくは神経毒性事象の危険に曝されている人への投与のために有用であろう。機械的自動注入装置は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、アナフィラキシーショックを受けやすい個人のためのエピネフリンを含む自動注入装置であるＥｐｉＰｅｎ・装置（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）が例示される。
【０１４９】
本発明は、あとに続く実験の詳細の参照によって、より良く理解されるであろうが、当業者はこれらが、この後に続くの特許請求の範囲においてより十分に記述される本発明の例示となるものに過ぎないことを、容易に認めるであろう。さらに、この出願を通して種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、この結果、本発明が関係する技術水準をより十分に記述するために、引用することにより本出願に取り込まれる。
［実験の詳細］
【０１５０】
【表１】
2004505952.tif 000030
【０１５１】
例２
分化したＰ１９細胞の分析
Ｐ１９細胞の分化
Ｐ１９細胞は、高用量のレチノイン酸の存在下で分裂終了ニューロンへと比較的迅速に分化誘導されうる多能性胚性癌腫株である（Ｊｏｎｅｓ−Ｖｅｌｌｅｎｅｕｖｅら　１９８２；　Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅら　１９８３；　ＭｃＢｕｒｎｅｙとＲｏｇｅｒｓ　１９８２）。それらは、同じく奇形癌腫前駆細胞のレチノイン酸分化から誘導されるヒトＮＴ−２Ｎニューロンの、マウスにおける相当物である。おそらく２つの奇形癌由来神経細胞株のうち、より良く知られている分化ＮＴ−２Ｎニューロンは、種々の幅広い神経細胞マーカーを発現し、ＮＭＤＡ受容体媒介性の低酸素誘導性興奮毒性細胞死を受ける（ＰｌｅａｓｕｒｅとＬｅｅ　１９９３；　Ｐｌｅａｓｕｒｅ，ＰａｇｅおよびＬｅｅ　１９９２；　Ｒｏｏｔｗｅｌｔら　１９９８）。ＮＴ−２Ｎと同様に、分化したＰ１９ニューロンもまた、多種多様な神経細胞マーカーを発現し、アゴニストに対するＮＭＤＡ受容体媒介性細胞内カルシウム反応を示し、興奮毒性を受ける（Ｃａｎｚｏｎｉｅｒｏら　１９９６；　Ｇｒｏｂｉｎら　１９９９；　Ｍｏｒｌｅｙら　１９９５；　ＲａｙとＧｏｔｔｌｉｅｂ　１９９３；　Ｔｕｒｅｔｓｋｙら　１９９３）。
【０１５２】
Ｐ１９細胞はＡＴＣＣ（ヴァージニア州マナッサス）から購入された。それらは１５０ｃｍ２の組織培養フラスコ中で、１０％のウシ胎児血清、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（０．１５％　ｗ／ｖ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）により、５％のＣＯ２の大気中、３７℃で培養された。
【０１５３】
分化プロトコールの１日目に、コンフルエントなＰ１９細胞が培養培地中で５０〜７０％のコンフルエントに分割された。プロトコールの２日目、１０μＭのオールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ、Ｓｉｇｍａ）および１０μＭのＭＫ−８０１が培養培地に添加された。１０μＭのＭＫ−８０１は、ＮＭＤＡ受容体を発現し始める分化中のニューロンにおける細胞死を防ぐために、この段階で含められた。４日目、新鮮なＡＴＲＡおよびＭＫ−８０１と共に、新鮮な培養培地が細胞に与えられた。５日目、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸塩緩衝食塩水による４回の洗浄、および４ｍｌの非酵素的細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を加えることによって、細胞が組織培養フラスコから分離された。
【０１５４】
分離された後、細胞は４０ｍＬの分化培地中に置かれた。分化培地は、１％のＮ−２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、０．１％の微量元素Ｂ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１ｍＭの硫酸カドミウム（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのグルタミン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（０．１５％　ｗ／ｖ）および１％の抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）から成った。１０μＭのシトシン−Ｄ−アラビノフラノシドが、未分化細胞の増殖を防ぐために分化培地に添加された。この時点以後、ＭＫ−８０１は存在しなかった。細胞は２０回倍化され、それから、９６穴プレートに１：４で分配、もしくは１００ｍｍの組織培養皿に１：３で分配された。再プレーティングから４日後、細胞は化合物の添加に最適となり、２４時間後に試験された。
ＲＴ−ＰＣＲ
トータルＲＮＡは、１００ｍｍ組織培養皿の分化したＰ１９ニューロンもしくは未分化のＰ１９細胞から、ＱＩＡＧＥＮ　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉキットを用い、製造業者のプロトコールに従って単離された。げっ歯類ＮＭＤＡ受容体サブユニットのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、未分化のＰ１９細胞、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）誘導から４日後の細胞、およびＡＴＲＡ誘導から９日後の細胞から分離された２５０ｎｇのトータルＲＮＡ鋳型から得られた。ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ−ＲＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い、製造業者のプロトコールに従って準備された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ機器および２５０ｎｇの鋳型ＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭガラスキャピラリー中で実施された。逆転写酵素反応は５５℃で１０分間実施された。ＰＣＲは３０サイクル実施された：アニーリング温度は５０℃、伸長温度は７２℃および、融解温度は８０℃であった。反応は各プライマーセットについて、Ｈ２Ｏ−陰性対照と比較された。５μＬの反応産物が取り除かれ、１×ＴＢＥアガロースゲル上に流された。使用された種々のマウスＮＭＤＡ受容体サブユニットに対するプライマーセットは、ゼータ１およびイプシロン１〜４を含む。
【０１５５】
レチノイン酸処置後４日目および９日目のＲＮＡサンプル、未分化のサンプルおよび対照のサンプルが電気泳動によって分離され、ゼータ１、イプシロン１およびイプシロン２内部プライマーでプロービングされた。
【０１５６】
トータルＲＮＡサンプルからのＮＭＤＡ受容体サブユニットのＲＴ−ＰＣＲは、レチノイン酸分化誘導がゼータ１、イプシロン１、およびイプシロン２　ｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現も誘導することを明らかにした。データは３つの個別の実験を使ってまとめられた。
ウエスタンブロット
培地が１００ｍｍ組織培養皿上にプレーティングされた細胞から吸引された。細胞はＲＩＰＡ細胞溶解バッファー中に回収された（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＬ　ｐＨ　７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１０％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）。各サンプルは２０秒間超音波処理され、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＢｉｏＲａｄ）が最終的な１×濃度に加えられ、サンプルは９５℃で１０分間インキューベートされた。ＮＭＤＡ受容体抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎから取得したラットＮＲ１、ＮＲ２ＡおよびＮＲ２Ｂに対するポリクローナル抗体）でプロービングされるサンプルは、６％　Ｔｒｉｓ−グリシン成形済みゲル（ＮＯＶＥＸ）上で電気泳動にかけられた。ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ抗体（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）でプロービングされるサンプルは、１２％　Ｔｒｉｓ−グリシン成形済みゲル（ＮＯＶＥＸ）上で電気泳動にかけられた。電気泳動は２００ボルトで１．５時間、ＮＯＶＥＸの器具で実施された。タンパク質はＢｉｏＲａｄウェットトランスファー（ｗｅｔ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）装置を１００ボルトで１時間使用して、ポリビニリデンジフルオリド・メンブレン（ＰＶＤＦ、ＮＯＶＥＸ）へとトランスファーされた。トランスファーに先立ち、ＰＶＤＦメンブレンは１００％メタノールに１分間浸され、それから、トランスファーバッファーに５分間浸された。トランスファー後、メンブレンは取り除かれ、ブロッキング溶液（５％乳汁、０．０５％　ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）中で４℃で一晩ゆっくりと振盪された。メンブレンはそれからＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで１回洗浄され、５％の乳汁を含むＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで１：１０００とされた一次抗体が室温で１時間インキューベートされた。メンブレンは室温で１５分間４回洗浄された。セイヨウワサビペルオキシダーゼに連結された二次抗体が、５％の乳汁を含むＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中、室温で約４５分間インキューベートされた。メンブレンはそれから、室温で１５分間４回洗浄された。ブロットはＥＣＬ　ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使って現像され、フィルムに露光された。
【０１５７】
ウエスタンブロット解析が、レチノイン酸の暴露後４日目もしくは９日目に回収されたＰ１９細胞のライセート中のＮＭＤＡ受容体サブユニット・タンパク質について実施された。適切な大きさのバンド（ゼータ１＝約１２０ｋＤａ、イプシロン１およびイプシロン２＝約１８０ｋＤａ）が高度に分化したＰ１９ニューロンのライセートから検出されたが、未分化細胞のライセートからは検出されなかった。データは同様な結果の３つの個別の実験をあらわした。
【０１５８】
ウエスタンブロット解析は、高度に分化したＰ１９ニューロンが検出可能なレベルのゼータ１、イプシロン１、およびイプシロン２タンパク質を発現することを明らかにした。イプシロン３およびイプシロン４のｍＲＮＡもしくはタンパク質は、これらの細胞において、どの時点でも検出されなかった。
【０１５９】
これらのデータは、Ｐ１９細胞を首尾よくニューロンに分化させるそのような方法が、ｍＲＮＡ、タンパク質のレベルでのＮＭＤＡ受容体の機能的な発現、ＭＫ−８０１感受性アゴニスト誘導性細胞内カルシウム応答、およびＭＫ−８０１感受性グルタミン酸毒性をもたらすことを実証する。これらのデータは文献と非常に良く一致している。しかし、興味深いことにゼータ１およびイプシロン２の発現に加えて、Ｐ１９細胞分化の他の報告された方法（ＲａｙとＧｏｔｔｌｉｅｂ　１９９３）ではこれまで発現が成し遂げられていないＮＭＤＡ受容体のイプシロン１サブユニットの確かな発現もまた成し遂げられた。３つすべてのサブユニットの存在は、皮質および海馬を含む成体齧歯類前脳領域において観察される発現パターンにより密接に似ている（Ｉｓｈｉｉら　１９９３；　Ｌａｕｒｉｅら　１９９５；　Ｍｏｎｙｅｒら　１９９４；　Ｍｏｎｙｅｒら　１９９２；　Ｓｔａｎｄａｅｒｔら　１９９４）。
【０１６０】
例３
分化Ｐ１９の興奮毒性試験
細胞は３７℃で１時間、５μＭのＦｕｒａ−２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を加えられた。それらはハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）で１回洗浄され、ＨＢＳＳバッファー中で試験された。細胞は修正されたＡＴＴＯＦＬＵＯＲＴＭ　Ｉｍａｇｅｒ（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、メリーランド州ロックビルパイク）のステージ上に置かれた。Ｆｕｒａ−２の高速二重励起はＲＡＴＩＯＡＲＣＴＭ　Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ　Ｅｘｃｉｔｏｒ（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使って実施された。水銀灯の光は３３４ｎｍもしくは３８０ｎｍの帯域フィルター（１０ｎｍの帯域幅）を通され、それから、２．５Ｈｚのレートで２０×対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ、Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ、ＮＡ＝０．７５）を通された。放射光は４００ｎｍ二色性ミラーを透過され、ＡＴＴＯＦＬＵＯＲＴＭ増強ＣＣＤカメラに集められた。比率画像（Ｒａｔｉｏ−ｉｍａｇｅ）が取得され、３３４ｎｍおよび３８０ｎｍで励起されたときの画像の平均強度がＡＴＴＯＦＬＵＯＲ　ＲＡＴＩＯＶＩＳＩＯＮＴＭソフトウェア（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、メリーランド州ロックビル）を使用して分析された。
【０１６１】
ＡＴＲＡ後９日目のＰ１９ニューロンが１００μＭのＭＫ−８０１の存在下もしくは非存在下で３ｍＭのグルタミン酸、１ｍＭのグリシンで処置された際におけるＦｕｒａ−２の３３０ｎｍ／３８０ｎｍ強度比率の変化がプロットされた。ＭＫ−８０１は試験の２４時間前に投与された。トレースは各条件についての３つの個別の実験からの平均±標準誤差である。高度に分化したＰ１９ニューロンは、ＮＭＤＡ受容体アゴニストの添加に伴う細胞内カルシウムレベルの増加を検出するＦｕｒａ−２画像化法の使用により示されたように、機能的なＮＭＤＡ受容体を形成するＮＭＤＡ受容体サブユニットを発現した（図１Ａ）。選択的ＮＭＤＡ受容体チャネル遮断薬であるＭＫ−８０１は、この反応を有意に阻害した（図１Ａ）。さらに、Ｐ１９ニューロンはＮＭＤＡ受容体に特異的な結合部位を発現した。［３Ｈ］−ＭＫ−８０１結合のＭＫ−８０１阻害がＰ１９の膜において試験された。ＭＫ−８０１の濃度は１０−ＸＭとして表されている。データポイントは８回の実験からの平均±標準誤差をあらわす。％対照＝（（ＣＰＭ−ＣＰＭｂｏｔｔｏｍ／（ＣＰＭｔｏｐ−ＣＰＭｂｏｔｔｏｍ））×１００。（図１Ｂ）。ＭＫ−８０１阻害は濃度に依存し、１００％の阻害が達成された。
【０１６２】
対照のＰ１９ニューロンの細胞体および突起は、生細胞細胞質染料のカルボキシフルオレセイン二酢酸（ＣＦＤＡ）によって明るく染まる。ＡＴＲＡ誘導後９日目のＰ１９ニューロンがＣＦＤＡで標識され、それから、Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ　Ｉｍａｇｅｒを共焦点モードで使用して画像化された。対照の細胞は溶媒で２４時間処置され、グルタミン酸の細胞は１ｍＭのグリシンの存在下で３ｍＭのグルタミン酸を２４時間受け、グルタミン酸＋Ｕ０１２６の細胞は３ｍＭのグルタミン酸および１ｍＭのグリシンと同時に１０μＭのＵ０１２６を２４時間受けた。画像は３つの別個の実験において、フルオレセイン二酢酸で染色された対照の生細胞、グルタミン酸処置細胞、死んだ細胞、およびＵ０１２６で保護された細胞から取得された。Ｐ１９ニューロンの細胞体は特徴として、そのままの組織培養プラスチック上にプレーティングされると、密な凝集塊へと集合した。広範な突起のネットワークが神経細胞体のクラスターをつないだ。有毒濃度のグルタミン酸およびグリシンで２４時間処置されたＰ１９ニューロンは、孤立した細胞体において蛍光染色を示し、突起は検出不可能で、広範な細胞の残骸が顕性であった。細胞死の相対レベルは、生細胞蛍光染料のアラマーブルーを用いて、プレートリーダーにより迅速かつ量的に測定された（図２Ｂ）。
【０１６３】
細胞生存の指標であるアラマーブルーの蛍光が、ＮＭＤＡ誘導性細胞毒傷害後の細胞生存率を決定するために用いられた。３２個のウェルが対照の溶媒を受け、３２個のウェルが３ｍＭのグルタミン酸および１ｍＭのグリシンを２４時間を受け、そして３２個のウェルが５μＭのＡ２３１８７を２４時間受けた単一の９６穴プレートからの計数が図２Ａに示されている。ＧＲＡＰＨＰＡＤＴＭソフトウェアを使用して実施されたＴｕｋｅｙ　ｐｏｓｔ−ｈｏｃ解析による一元配置分散分析によって決定されたところでは、グルタミン酸およびＡ２３１８７の状態は、対照とは有意に異なっていた。これらのデータは、細胞がグルタミン酸およびグリシンで処置されたときの、アラマーブルーの蛍光における典型的な６０％の減少を示している。しかし、なまの蛍光カウントは実験ごとに変化するため、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは対照のパーセントとして表されている。
【０１６４】
一定の１ｍＭグリシン濃度の存在下におけるグルタミン酸毒性用量反応が、分化したＰ１９ニューロンにおいて測定された。データポイントを通して生成された曲線は、６つの別個の用量反応曲線の平均である。データポイントは対照細胞のパーセント±標準誤差としてあらわされる。％対照＝（（［グルタミン酸］ｅｘｐ−［グルタミン酸］ｍａｘ）／（対照ｖｅｈｉｃｌｅ−［グルタミン酸］ｍａｘ））×１００。グルタミン酸毒性のＥＣ５０は８．１μＭであると計算された［９５％信頼区間の下限＝３．５μＭ；　９５％信頼区間の上限＝１９μＭ］。これらのデータは、２４時間のグルタミン酸処置が一定用量のグリシンの存在下で、用量依存的にＰ１９ニューロンを殺したことを実証する（図２Ａ，２Ｂ）。グリシン単独ではＰ１９ニューロンの生存率に影響しなかった。
【０１６５】
ＮＭＤＡ受容体遮断薬であるＭＫ−８０１は、Ｐ１９ニューロンにおけるグルタミン酸毒性を用量依存的に防御した（図２Ｃ）。３ｍＭのグルタミン酸および１ｍＭのグリシンが誘導するＰ１９神経細胞死のＭＫ−８０１の用量依存的阻害。％神経保護＝（グルタミン酸ｍａｘの存在下における阻害剤−［グルタミン酸］ｍａｘ）／（対照ｖｅｈｉｃｌｅ−［グルタミン酸］ｍａｘ））×１００。データポイントは３つの別個の実験の平均±標準誤差である。達成される最大のＭＫ−８０１防護は、対照のレベルに近かった。
【０１６６】
これらのデータは、毒性が特異的なＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＭＫ−８０１の存在下で完全に妨げられることから、Ｐ１９ニューロンにおけるグルタミン酸毒性がＮＭＤＡ受容体の活性化を必要とすることを実証する。しかし、データはＡＭＰＡもしくはカイニン酸受容体もまたグルタミン酸によって活性化され、興奮毒性に寄与しうるという可能性を排除しない。この可能性は、グルタミン酸アゴニストに対する細胞内カルシウム応答が複数の成分を含むと報告している初代神経細胞培養からのデータ（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ，　Ｌａｍｂｅｒｔ，とＮｉｃｈｏｌｌｓ　１９９０）に矛盾しないであろう。そのような成分は、ＡＭＰＡ／カイニン酸受容体の活性化、膜の脱分極、電位作動型カルシウムチャンネルの活性化、ＮＭＤＡ受容体マグネシウム遮断の解放、およびＮＭＤＡ受容体の活性化を含む。しかし、そのように高いレベルの複雑性があっても、多くの主要な神経細胞モデルにおいて、グルタミン酸興奮毒性はＮＭＤＡ受容体を通してシグナルを送っており、Ｐ１９神経細胞モデル系の場合のように、神経細胞死をもたらすためにその活性化を必要とする（Ｔｙｍｉａｎｓｋｉら　１９９３）。
【０１６７】
これらの細胞は、種々の既知キナーゼ阻害剤（表１の化合物識別（ＩＤ）列）がＮＭＤＡによって誘導される細胞毒性に与える影響を測定するために用いられた。最初に、Ｐ１９細胞が例２に記述されるようにして分化させられた。それから、細胞は１ｍＭのグリシンの存在下で３ｍＭのグルタミン酸に曝された。
【０１６８】
細胞生存率が決定された。興奮毒性を防ぐ化合物が、毒性傷害を与えられない分化したＰ１９細胞と比較して生きている細胞のパーセンテージを測定することによって決定された（表Ｉ）。
【０１６９】
細胞生存率は２つの方法を使用して測定された。第一の方法は、生細胞染料のカルボキシフルオレセイン二酢酸（ＣＦＤＡ）を用いた、共焦点単一細胞蛍光画像法に基づく方法であった。ＣＦＤＡは生きている細胞の細胞体および突起を標識する。したがって、生きている細胞は広範なＣＦＤＡ標識を示す一方、死んでいる細胞ははるかに少ないＣＦＤＡ染色を示す。ＣＦＤＡ蛍光は、修正されたＡｔｔｏｆｌｕｏｒ　Ｉｍａｇｅｒ装置（Ａｌｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、メリーランド州ロックビルパイク）を用いて測定された。細胞は培地中で１μＭのＣＦＤＡにより１５分間標識され、それから、Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ顕微鏡のステージ上に置かれた。色素は、１０ｎｍの帯域幅の４８８ｎｍの帯域フィルターを通り抜け、ＣＡＲＶリアルタイム共焦点スピニングディスク・モジュール（Ａｌｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、メリーランド州ロックビル）を通り抜け、それから、４０×油浸対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ　Ｆｌｕａｒ；　ＮＡ＝１．３）通り抜けた水銀灯光源からの光によって励起された。放射光は、４９５ｎｍ二色性ミラーを透過され、Ａｔｔｏｆｌｕｏｒ増強ＣＣＤカメラに集められ、画像はＡｔｔｏｆｌｕｏｒ　ＲａｔｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ａｔｔｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、メリーランド州ロックビル）を用いて可視化された。
【０１７０】
細胞生存率を測定するための第二の方法は、プレートリーダー法であった。黒色の９６穴プレート（Ｐａｃｋａｒｄ　ｖｉｅｗｐｌａｔｅｓ）中に蒔かれた細胞は、５％のアラマーブルー色素（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を加えられた。アラマーブルーは、ミトコンドリアのレダクターゼを利用して、非蛍光性のレサズリンを蛍光性のレゾルフィン（励起５３５ｎｍ、放射５８０ｎｍ）へと変換する色素である。ベースラインの蛍光のカウントは、アラマーブルーの添加の直後に室温でＷａｌｌａｃプレートリーダーによって測定された。細胞生存率の蛍光カウントは、３７℃で１時間のインキュベーションの後、同じようにして取得された。蛍光は、バックグラウンド蛍光の減算の後、対照の未処置の細胞のパーセントとして表された。生細胞／死細胞は、光学顕微鏡で視覚的に確かめられた。
【０１７１】
下の表Ｉで用いられる化合物Ａとは、以下の式を持つ化合物を意味する
【０１７２】
【表２】
2004505952.tif 000031
【０１７３】
キナーゼ阻害活性および効力は、文献から引き出された（Ｃｈｉｊｉｗａら　１９９０；　Ｆａｖａｔａら　１９９８；　Ｈｅｎｒｙら　１９９８；　ＩｎｈｏｒｎとＭａｊｅｒｕｓ　１９８７；　Ｋｏｂａｙａｓｈｉら　１９８９；　Ｌｅｅら　１９９４；　Ｏｎｏｄａら　１９８９；　Ｔｏｋｕｍｉｔｓｕら　１９９０）。神経保護のＩＣ５０は３つの別個の曲線の平均であり、９５％信頼区間（Ｃ．Ｉ．）の上限および下限が共に示されている。ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、曲線は適合され、信頼区間が決定された。
【０１７４】
例４
分化Ｐ１９アッセイにおけるＭＥＫ１／２阻害剤の評価
Ｕ０１２６（ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ］メチレン］ブタンジニトリル）は、ＭＥＫ１／２に対して非常に選択的なことが報告されており（Ｆａｖａｔａら　１９９８）、この結果はここで確認された。Ｕ０１２６が阻害することが見出された他の唯一のキナーゼはＰＫＣ−γであるが、この酵素の阻害のＩＣ５０は、野生型ＭＥＫ１／２に対するその発表されたＩＣ５０より６０倍高かった（下の表ＩＩおよびＩＩＩ）。
【０１７５】
キナーゼ活性を分析するのに用いられた一般的な手順は、次の通りだった：キナーゼ反応混合液は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ＝８、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０μＭ　ＡＴＰ、０．２５〜１μＭビオチン化ペプチド基質、１ウェルあたり０．２〜０．８マイクロキュリーの３３Ｐ−γ−ＡＴＰ［２０００〜３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ］）中に調製された。アッセイ条件は各プロテインキナーゼについてわずかに異なり、例えば、インシュリン受容体キナーゼは活性のために１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２を要求し、カルモデュリン依存性プロティンキナーゼはカルモジュリンおよび１０ｍＭのＣａＣｌ２を必要とする。反応混合液はストレプトアビジン被覆Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅのウェル内に分配され、１００％　ＤＭＳＯ中の１μｌの薬剤ストックが１００μＬ反応体積に添加されて、反応中の最終濃度は１％　ＤＭＳＯとなった。酵素は５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ＝８．０、０．１％　ＢＳＡで希釈され、各ウェルに添加された。反応は化合物の存在下で３０℃で１時間インキューベートされた。１時間後、反応混合液はプレートから吸引され、プレートは１００ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗浄された。プレートは、固定されたペプチドに取り込まれた３３Ｐ−γ−ＡＴＰを決定するために、シンチレーションカウンターで測定された。試験化合物は、１００μＭ〜１０ｐＭの範囲の一桁ずつの間隔の８つの濃度で、２回ずつ試験された。アッセイの最高と最小のシグナルが各プレートで決定された。ＩＣ５０は、試験化合物のｌｏｇ濃度に対するパーセント阻害をグラフで表わすことによって、式［最大シグナル−バックグラウンド／試験化合物シグナル−バックグラウンド（１００）＝％阻害］に従って、アッセイにおける最大のシグナルのパーセント阻害の用量反応曲線から計算された。分析されているキナーゼにふさわしい既知の阻害剤化合物もまた、各プレート上に含められた。結果は図３に示されている。
キナーゼ酵素の定義および出所
ＶＥＧＦ−Ｒ（血管内皮増殖因子受容体２）は、Ｎ末端のポリヒスチジンタグの後ろにラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼドメインのアミノ酸７８６〜１３４３を含む融合タンパク質である。ＣＤＫ１（サイクリン依存性キナーゼ１）は、ヒトＣＤＫ１触媒サブユニットおよび、その正の制御サブユニット・サイクリンＢの両方を発現している昆虫細胞から分離される。インシュリン受容体キナーゼは、ヒト・インシュリン受容体のβ−サブユニットの細胞質ドメインの残基９４１〜１３１３から成る。プロテインキナーゼＡは、ウシの心臓から精製したｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡの触媒サブユニットである。ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）は、昆虫細胞中で合成されたヒト・タンパク質のγもしくはβアイソフォームである。カゼインキナーゼ１は、大腸菌中で合成されたラットＣＫ１デルタ・アイソフォームのＣ末端部分のアミノ酸３１８で切断されたものである。カゼインキナーゼ２は、大腸菌中で合成されたヒトＣＫ２タンパク質のαおよびβサブユニットを含む。カルモジュリンキナーゼ（カルモデュリン依存性プロティンキナーゼ２）は、昆虫細胞中で合成されたラット・タンパク質のαサブユニットの切断されたバージョンである。グリコゲン合成酵素キナーゼ３は、大腸菌中で合成されたウサギ酵素のβアイソフォームである。ＭＡＰキナーゼは、大腸菌中で合成され、精製の前にＭＥＫ１によるリン酸化によって活性化された、Ｎ末端にポリヒスチジンタグを含むラットＥＲＫ−２アイソフォームである。ＥＧＦＲ（上皮細胞成長因子受容体）は、ヒトＡ４３１細胞の膜から精製される。以下のチャートは選択されたキナーゼおよびそれらの対照用阻害剤を示す。
【０１７６】
下の表ＩＩＩで用いられる化合物Ａ（Ｃｍｐｄ　Ａ）とは、以下の式を持つ化合物を意味する
【０１７７】
【表３】
2004505952.tif 000032
【０１７８】
【表４】
2004505952.tif 000033
【０１７９】
キナーゼ阻害のＩＣ５０値は、少なくとも２つの曲線の平均であり、ＧｒａｐｈＰａｄ曲線フィッティング・ソフトウェアを使用して決定された。
【０１８０】
Ｕ０１２６がＰ１９ニューロン中のＭＥＫ１／２酵素を阻害するか否かを決定するために、ＭＥＫ１／２基質ｐ４２　ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）の、グルタミン酸誘導性リン酸化を妨げるその能力が試験された。ウエスタンブロットは最初に、処理後９日目のＡＴＲＡ　Ｐ１９ニューロンのライセートを用いて、ｐ４２／４４（ＥＲＫ１／２）のリン酸化型に特異的な抗体でプロービングされ、それから、プローブが剥がされ、全ｐ４２／４４（ＥＲＫ１／２）を認識する抗体で再プロービングされた。データは、Ｐ１９ニューロンにおいて毒性を誘導するのに用いられた濃度のグルタミン酸およびグリシンが、これらの細胞において、ｐ４２　ＭＡＰＫリン酸化にも急速かつ再現性の良い増加を誘導したことを実証する。Ｕ０１２６の存在下では、リン酸化型ｐ４２　ＭＡＰＫは減少していたものの、全ｐ４２　ＭＡＰＫ量における変化は明白でなかった。別のウエスタンブロット実験では、ＡＴＲＡ　Ｐ１９ニューロン・ライセートは、処置後９日目に、ｐ４２／４４（ＥＲＫ１／２）のリン酸化型に特異的な抗体でプロービングされた。同じブロットはプローブを剥がされ、全ｐ４２／４４（ＥＲＫ１／２）を認識する抗体で再プロービングされた。ｐ４２　ＭＡＰＫリン酸化のグルタミン酸誘導性上昇は、対照に対し２４時間の時点でまだ明らかに増加していたことから、持続性であった。これらのブロットは同様な結果の３つの個別の実験をあらわしている。Ｕ０１２６はこの時点でも同様に、リン酸化レベルの増加を妨げた。全ｐ４２　ＭＡＰＫにおける変化は明白でなかった。
【０１８１】
Ｕ０１２６が直接ＮＭＤＡ受容体をブロックしていないことを確かめるため、グルタミン酸およびグリシンに対するＰ１９ニューロン細胞内カルシウム反応が、１０μＭのＵ０１２６の存在下で試験された。ＡＴＲＡ処置から９日後のＰ１９ニューロンのＦｕｒａ−２画像トレースは、１０μＭのＵ０１２６の存在下、３ｍＭのグルタミン酸、１ｍＭのグリシンで２４時間処置された。Ｕ０１２６はグルタミン酸およびグリシンと同時に投与された。トレースは各条件についての４つの個別の実験からの平均±標準誤差である。
【０１８２】
データは、Ｕ０１２６がこの細胞内カルシウム反応を妨げないことを実証した。（図４Ａ）。Ｕ０１２６がＰ１９ニューロンにおいて［３Ｈ］−ＭＫ８０１結合を阻害しないこともまた実証された。いかなるＵ０１２６濃度でも、有意な阻害は観察されなかった。データポイントは８回の実験からの平均±標準誤差をあらわす。パーセント対照は、図１Ｂ（図４Ｂ）において述べられているように定義される。あわせて、これらのデータは、Ｕ０１２６がＮＭＤＡ受容体活性化の下流のシグナル経路に作用することをさらに示す。
ｐ４２／４４　ＭＡＰＫ阻害剤Ｕ０１２６は後発性（ｄｅｌａｙｅｄ）の神経保護を示す
治療薬は虚血性事象の数時間後から数日後に投与されても、なお効能を保持している必要があることから、効能の時間経過は、潜在的な神経保護治療薬にとって、極めて関連するパラメーターである。次のセットの実験は、ＭＥＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６が、グルタミン酸による誘発の後さまざまな時点で加えられた場合に、神経保護の効能を保持するか否かを調べた。アッセイは基本的に記述されたように実施されたが、Ｕ０１２６の投与の時間は、最初の興奮毒性と比較して遅かった。データは、グルタミン酸による誘発後６時間までＵ０１２６が最大限に神経保護的であったことを実証する（図５Ａ）。しかし、ｐ３８阻害剤は、グルタミン酸による誘導後、わずか１５分で効能を失った（図５Ｂ）。Ｕ０１２６は、グルタミン酸による誘導の開始から数時間後に加えられた場合でさえ、最大限に神経保護的であった。これは、グルタミン酸がＰ１９ニューロンにおいて、グルタミン酸の添加から２４時間後においてさえ検出可能な、ｐ４２　ＭＡＰＫリン酸化の持続性の増加を媒介するからであるかもしれない。グルタミン酸による誘導から数時間後、上流の活性化酵素ＭＥＫのＵ０１２６阻害は、ｐ４２　ＭＡＰＫのホスファターゼ脱リン酸化に有利となり、細胞死を防ぐのに十分な時間の範囲内に、ｐ４２／４４　ＭＡＰＫシグナル経路を再安定化するのかもしれない。
【０１８３】
よって、ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、分化したＰ１９ニューロンにおけるグルタミン酸誘導性毒性に必要である。グルタミン酸誘導性の細胞死は２４時間以内に生じ、用量依存的であり、ＮＭＤＡ受容体媒介性である。グルタミン酸はｐ４２　ＭＡＰキナーゼのリン酸化を誘導し、これはその上流のキナーゼＭＥＫの阻害剤Ｕ０１２６によって妨げられる。Ｕ０１２６はグルタミン酸毒性も用量依存的に妨げる。それは、グルタミン酸による誘導の開始の前、もしくは数時間後にさえ、投与されると、効果的である。
【０１８４】
虚血性事象の後に加えられた場合にさえも後発性の神経保護性を発揮できる化合物が、潜在的な脳卒中治療薬に特に求められている特質である。多種多様な機構を持つ多くの化合物が、処置後の後発性神経保護を示すことが報告されている。これらの中には、グルタミン酸受容体アンタゴニスト（Ｌｉら　１９９９ｂ；　Ｔａｋａｈａｓｈｉら　１９９８；　Ｔｕｒｓｋｉら　１９９８）、抗酸化剤（Ｃａｌｌａｗａｙら　１９９９；　Ｐａｚｏｓら　１９９９；　Ｓａｋａｋｉｂａｒａら　２０００）、抗痙攣薬（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ｂｌｏｏｍら　１９９８；　Ｗａｓｔｅｒｌａｉｎら　１９９６；　Ｙａｎｇら　１９９８）、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｈｅｎｇら　１９９８）、キナーゼ阻害剤（Ｔａｔｌｉｓｕｍａｋら　１９９８）、およびマグネシウム（ＨｅａｔｈとＶｉｎｋ　１９９９）がある。しかし、これは、ｐ４２／４４　ＭＡＰキナーゼ経路の特異的阻害剤が後発性神経保護を示し、効能の時間ウィンドウが毒性誘発の開始から十分に後まで延びている、ＮＭＤＡ受容体媒介興奮毒性の細胞培養モデルにおける最初の実証である。
Ｕ０１２６神経保護はグルタミン酸誘導毒性に選択的である。
【０１８５】
Ｕ０１２６が種々の非特異的な毒性傷害に対して保護的であるか否か、もしくは、この化合物の効能がグルタミン酸誘導性毒性に選択的か否かを決定するために、その効果がＰ１９神経細胞死の他のさまざまなインデューサーに対して試験された。
【０１８６】
図６Ａは、１０μＭのＵ０１２６の存在下もしくは非存在下における、さまざまな濃度のＡ２３１８７による２４時間のＰ１９ニューロンの処置を示す。細胞はそれから、アラマーブルーの蛍光について分析された。データポイントを通して生成された曲線は、３つの別個の用量反応曲線の平均である。データポイントは対照細胞のパーセント±標準誤差としてあらわされる。Ｕ０１２６が存在しない場合、Ａ２３１８７毒性のＥＣ５０は５２０ｎＭ［３４０ｎＭ〜７８４ｎＭ］であると計算された。１０μＭのＵ０１２６が存在する場合、Ａ２３１８７毒性のＥＣ５０は８３３ｎＭ［４４０ｎＭ〜１．６μＭ］であると計算された。
【０１８７】
図６Ｂは、１μＭのスタウロスポリンで誘導したＰ１９ニューロンの毒性は、添加から２４時間後にアラマーブルーの蛍光によって測定したところ、１０μＭのＵ０１２６によって保護できなかったことを示す。スタウロスポリンではなく溶媒を受けた細胞は、対照レベルのアラマーブルーの蛍光を示した。しかし、いかなる濃度のＵ０１２６も、スタウロスポリンで処置された細胞において対照レベルに戻った蛍光をもたらさなかった。
【０１８８】
図６Ｃは、いかなる毒性のインデューサーも存在しない条件において、溶媒もしくは１０μＭのＵ０１２６で処置されたＰ１９ニューロンで試験されたアラマーブルーの蛍光を示している。Ｕ０１２６単独では、これらの対照レベルの蛍光に影響を及ぼさなかった。データは、Ｕ０１２６がスタウロスポリンもしくはＡ２３１８７誘導性の死亡に対して保護的でなかったことを実証する（図６Ａ、６Ｂ）。さらに、Ｕ０１２６はＰ１９ニューロンの基底生存率には影響を及ぼさなかった（図６Ｃ）。
【０１８９】
例５
分化Ｐ１９細胞アッセイを用いた薬剤スクリーニング
市販の化学ライブラリー（ＢｉｏＦｏｃｕｓ　ＰＬＣ，英国）が、本明細書中に記述される方法を使用してスクリーニングされた。化合物のストック濃度は、ＤＭＳＯ中で約４００μＭであった。一次スクリーンで使用された化合物の濃度は１μＭであった。陽性の化合物は、７０％もしくはより大きな神経保護性を示すものとして割り当てられた。用量反応試験が９６穴プレートにおいて実施され、ここで、カラム１は対照の溶媒、カラム２は３ｍＭのグルタミン酸および１ｍＭのグリシンを受け、カラム３は３ｍＭのグルタミン酸、１ｍＭのグリシンおよび１０μＭのＵ０１２６を受けた。カラム４〜１１は以下の最終濃度（μＭ）で化合物を受けとった：３、１．２、０．４８、０．１９２、０．０７７、０．０３１、０．０１２および０．００５。各列は確認のために異なる化合物を含んだ。列Ｂ〜Ｇだけが化合物を受け、列ＡおよびＨは未処置のままだった。データは、％神経保護＝（（化合物−グルタミン酸平均）／（Ｕ０１２６−グルタミン酸平均）×１００）として表される。
【０１９０】
２つの属の化合物、４−ピリミジンアミンおよび２−ピリジンアミンは、ここのデータが示すように、神経保護的性質を示すことが見出された。２−ピリジンアミンについての限られたデータも同様に呈示されているが、４−ピリミジンアミンのみが本発明の対象である。この生物学的試験の結果は以下の表にまとめられる。「％阻害（Ｉｎｈ）」は、２４時間後に生き残っている対照細胞のパーセンテージを示し、１マイクロモル濃度でスクリーニングされた化合物の神経保護効果をあらわす。ＩＣ５０は用量反応実験からのデータに関係する。＞１と記載されたＩＣ５０値は、試験された最も高い用量（３μＭ）の範囲内では極大が観察されないが、それでも生物活性を示すことを示す。ＮＤは、用量反応実験で試験されていない化合物を指す。
【０１９１】
【表５】
2004505952.tif 000034
【０１９２】
【表６】
2004505952.tif 000035
【０１９３】
【表７】
2004505952.tif 000036
【０１９４】
【表８】
2004505952.tif 000037
【０１９５】
例６
２−ピリジンアミンおよび４−ピリミジンアミン誘導体はＰ１９ニューロンにお
いてＭＥＫ活性を阻害しない。
【０１９６】
ここで試験された市販の２−ピリジンアミンおよび４−ピリミジンアミン化合物は、それらがＰ１９ニューロンにおけるグルタミン酸誘導性ｐ４４／４２　ＭＡＰキナーゼリン酸化を阻害しなかったことから、これらの細胞におけるＭＥＫ１／２キナーゼ活性を阻害しなかった。しかし、Ｕ０１２６は予想通り、この活性を阻害した（図８）。Ｐ１９ニューロン中のＭＥＫ活性は、３ｍＭのグルタミン酸および１ｍＭのグリシンの添加によって誘導され、ＭＥＫの基質であるｐ４４／４２　ＭＡＰキナーゼのリン酸化についてアッセイすることにより測定された。細胞は、グルタミン酸／グリシンの存在下もしくは非存在下で、本明細書中に記述される化合物もしくはＵ０１２６で処置され、処置から５分後に、続くウエスタンブロット解析のために回収された。データは、Ｕ０１２６は予想通りにＭＥＫ基質のリン酸化を効果的に阻害したが、２−ピリジンアミンおよび４−ピリミジンアミン化合物は阻害しなかったことを実証する。したがって、２−ピリジンアミンおよび４−ピリミジンアミンはＭＥＫ阻害剤ではない。
【０１９７】
２−ピリジンアミンおよび４−ピリミジンアミンは興奮毒性の開始後、少なくとも２時間は最大限に神経保護的であった。化合物は、グルタミン酸／グリシン添加の１５分前もしくは２時間後のいずれかに、１μＭの濃度で投与された。Ｕ０１２６は陽性対照として試験された。Ｕ０１２６と同様に、２−ピリジンアミンおよび４−ピリミジンアミン化合物は、異なる標的において活性であるにもかかわらず、両方の時点で最大限の神経保護的効能を保持した。
【０１９８】
例７
神経保護のインビボモデル：
中大脳動脈閉塞プロトコール
生後約９０〜１００日の自然発症高血圧性（ＳＨＲ）のオスのラット（約２５０〜３００ｇ）が体重を計られ、それから、ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）／キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）カクテル（１．２ｍｌ／ｋｇ；　ｉ．ｐ．）で麻酔され、その後、長時間作用性の抗生物質（例えば、Ｃｏｍｂｉｏｔｉｃ）が皮下投与された。麻酔のレベルは、角膜反射（眼への空気パフ）ならびに、尾もしくは足のつまみに応じた脚反射によって評価される。ラットが麻酔された後、それは小動物用手術台上に置かれ、外科手順の間、拘束される。ラットの体温は直腸のプローブでモニターされ、恒常性の加熱パッドで３７℃に維持される。切開領域は剃られ、ベタジンを塗布される。手術領域は無菌である。すべての手術器具はオートクレーブおよび／もしくはガラスビーズ乾性機器滅菌器で殺菌され、それから、使用の前に滅菌食塩水もしくはアルコールですすがれる。
【０１９９】
（１）大腿動脈カテーテル。留置カテーテルが定期的な採血および動脈血圧の計測のために大腿動脈に据えられる。切開が大腿動脈領域で行われる。組織は動脈を分離するために鈍的剥離（ｂｌｕｎｔ　ｄｉｓｓｅｃｔ）される。動脈の遠心端が滅菌縫合で結紮され、ゆるい結紮（ｌｏｏｓｅ　ｌｉｇａｔｕｒｅ）がカテーテルを所定位置に固着するために近位端の付近に行われる。小さな切開がカテーテルの挿入のために動脈に行われる。ＰＥ５０管の斜角端（ｂｅｖｅｌ−ｔｉｐｐｅｄ　ｅｎｄ）が動脈内に５ｍｍ挿入され、それから、滅菌縫合によって所定位置に固着される。ＰＥ管は、動脈を開存性に保つために最小限に使用されるヘパリン添加生理食塩水で満たされた１ｃｃシリンジに付けられる。動脈血は３回採血される：虚血の１０分前、虚血開始の２時間後、および再潅流の１５分後。血液サンプルはすべて、ｐＨ、ＰａＯ２、ＰａＣＯ２、ヘマトクリットおよびグルコースを決定するために、１００〜３００μｌ体積が採取される。実験を通して、採取された血液の最大量は、動物１匹あたり１ｍｌを上回らない。採血が行われていないときは、平均動脈圧を測定するために、血圧トランスデューサーがカテーテルに付けられる。外科手順の終わりに、カテーテルは取り除かれ、動脈は結んでとめられ、切開領域は縫合されて閉じられる。
【０２００】
（２）限局性脳虚血のタンデムＣＣＡ−ＭＣＡ閉塞モデル。オスの自然発症高血圧ウィスターラット（ＳＨＲ）が、Ｂｒｉｎｔとその共同研究者によって記述された技法（Ｊ．　Ｃｅｒｅｂ　Ｂｌｏｏｄ　Ｆｌｏｗ　Ｍｅｔａｂ　８：４７４−４８５，　１９８８）を修正したものを用いて、総頚動脈（ＣＣＡ）および中大脳動脈（ＭＣＡ）の両方の片側性（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ）閉塞による可逆性限局性脳虚血のために準備される。左のＣＣＡが首の腹側表面の切開を通して分離される。同側のＭＣＡの分離のためには、第二の切開が左眼の外眼角と、対応する外耳道の間になされ、その下にある頭骨が露出される。ＭＣＡは、Ｚｅｉｓｓ手術用顕微鏡による直接的な可視化の下、頬骨弓と側頭鱗骨の融合部の２〜３ｍｍ頭側に開けた５ｍｍの穿頭孔を通して露出される。硬膜は滅菌した２６ｇ針で開かれ、白金線（直径０．１ｍｍ）が下皮質静脈（ｉｎｆｅｒｉｏｒ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｖｅｉｎ）のすぐ上の、ＭＣＡの下に挿入される。ＭＣＡは、Ａｒｏｎｏｗｓｋｉとその共同研究者によって述べられているようにして（Ｓｔｒｏｋｅ，　２５：２２３５−２２４０，　１９９４）、白金線を横切る血管の挙上および圧迫によって一時的にふさがれる。同時に、ＣＣＡは動脈瘤クリップによってふさがれる。ＣＣＡおよびＭＣＡの閉塞の持続期間は２時間である。この期間の終わりに、針金およびクリップは血管を再潅流させるために慎重に取り外され、切開領域は縫合されて閉じられる。ラットは、そのホームケージに戻る前に、回復のために隔離ケージに置かれる。ラットは、麻酔および外科手順からの平穏無事な回復を確実にするために、手術後２〜４時間密接にモニターされる。麻酔からの回復後、実験分析のために必要となるまで、ラットはＬＡＭガイドラインによる確立されたプロトコールに従って飼育される。
【０２０１】
（３）試験化合物は、いずれかの適切な経路によって投与される：静脈内、皮下、もしくは腹腔内。化合物投与の用量および時間は、インビトロでのアッセイ結果もしくは文献照会に基づく。
【０２０２】
（４）２つの結果の測定値が、化合物の効能を評価するために用いられる：（ａ）モリス水迷路、自発運動活性、放射状迷路といったいくつかのＣＮＳパラダイム、およびＣＮＳ一般挙動プロファイルにおける挙動成績、ならびに（ｂ）大脳皮質梗塞の大きさの組織学的検査。虚血から２４時間後、ラットは挙動パラダイムにおいて試験され、続いて、脳組織検査のために安楽死させられる。ラットはペントバルビタール・ナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）の腹腔内投与により深く麻酔される。麻酔の深さは角膜反射の欠如および尾部を抓むことによってチェックされる。ラットは約５０ｍｌのヘパリン化生理食塩水による心臓通過（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ）潅流によって安楽死させられる。潅流の後、脳は取り除かれ、ブロッキングされ、１ｍｍのスラブ（ｓｌａｂ）に切片化される。各スラブは細胞生存率を示す色素のＴＴＣ溶液中に１５分間置かれる。染色されたスラブは、Ｎｉｋｏｎ　ＳＭＺ−Ｕ解剖顕微鏡で視覚化され、影響を受けた脳領域の画像分析が、ＩｍａｇｅＰｒｏ　２．１ソフトウェアを使用して定量される。梗塞体積は対側（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）脳半球の％として表される。統計学的比較が処置群間でなされる（一元配置分散分析）。
【０２０３】
例８
インビボ試験：脳虚血の一過性モデル
体重２５０〜３００ｇのオスのウィスターラット（Ｉｆｆａ　Ｃｒｅｄｏ、フランス）が、実験前、少なくとも５日間の間、１２時間−１２時間の明暗サイクル（７：００ａ．ｍ．に点灯、７：００ｐ．ｍ．に消灯）の下、２１±２℃の室温、５０±１５％の湿度で１ケージあたり２匹で飼育された。この間、ラットは市販のラット固形飼料（Ｔｒｏｕｗ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ｆｒａｎｃｅ、フランス・ヴィニー、ｒｅｆ．８１１００２）および水道水に自由にアクセスできた。
【０２０４】
動物は誘導のために空気中の５％ハロセンで麻酔され、それから手術中は１２％ハロセンで麻酔された。ラットの体温は加熱パッドで３７℃に維持された。２ｃｍの切開が首の中心および右の総頚動脈（ＣＣＡ）、外頸動脈（ＥＣＡ）になされ、そして、内頸動脈（ＩＣＡ）が手術用顕微鏡の下で露出された。ＩＣＡはさらに、翼口蓋動脈（ＰＡ）の分枝および頭蓋内ＩＣＡの分枝を同定するために切開された。ＣＣＡは結紮された。３−０絹縫合糸がＥＣＡの始点に結ばれ、結紮された。カテーテル（直径＝０．５８ｍｍ）が小さな穿刺を通してＣＣＡ内に導入され、ＩＣＡの頭蓋内分枝に進められた。４−０外科用ナイロン縫合糸がカテーテル内に導入された。約１９ｍｍの長さのナイロン縫合糸が、縫合糸がＭＣＡの始点をブロックするまで、ＣＣＡから穏やかにＩＣＡの内腔の中を進められた。縫合糸は熱によってカテーテル内に固定され、再潅流を行わせるために縫合糸を引き出すことができるように、カテーテル突出を１ｃｍ残した。切開は皮膚クリップを使って閉じられた。麻酔はそれから終了され、動物は麻酔から回復するまで赤外線灯の下に置かれた。ラットは１０〜１５分後に目を覚ました。２時間の虚血の後、先端がＩＣＡ内腔を晴らすまで縫合糸を引き戻すことによって、再潅流が実施された。虚血開始の１時間後に、溶媒もしくは試験化合物が腹腔内（ｉ．ｐ．）もしくは静脈内（ｉ．ｖ．）に投与された。
【０２０５】
閉塞の開始から２４時間後、ラットは断頭によって殺された。脳は直ちに取り除かれ、イソペンタン中で凍結され、−２０℃で保管された。それから、脳は低温切断機（ｃｒｙｏｃｕｔ）により２０μｍ厚の切片に切断された。各２０番目の切片が梗塞領域を測定するために用いられた。切片はクレシルバイオレットで染色され、線条体および皮質における梗塞領域が、切片画像のデジタル化の後、画像分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ、ＮＩＨ）を用いた面積測定によって決定された。
【０２０６】
上述の手順に続き、ＭＫ−８０１、化合物＃４６および化合物＃２６４（本明細書の表に記載）がラットにおける神経保護効果について評価され、表ＶＩＩＩに結果が記載されている。データは１２回の測定についての平均損傷体積（ｍｍ３）をあらわす。使用された溶媒は５％デキストロース中の１５％Ｓｏｌｕｔｏｌであった。
【０２０７】
【表９】
2004505952.tif 000038
【０２０８】
合成例
例９
Ｎ−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ’−（２−クロロエチル）−Ｎ’−エチル−ベンゼン−１，４−ジアミン
【０２０９】
【化３８】
2004505952.tif 000039
【０２１０】
２−｛［４−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イルアミノ）−フェニル］−エチル−アミノ｝−エタノール（２ｇ、４．８ｍｍｏｌ）（ＢｉｏＦｏｃｕｓ　ＰＣＣ（英国）より入手可能）およびジクロロメタン（４０ｍＬ）の溶液が、塩化チオニル（１．４ｍｌ、１９．１ｍｍｏｌ）で処置され、室温で一晩撹拌された。反応はＮａＨＣＯ３（ｓ）で停止され、ジクロロメタンによって抽出された。有機層はＭｇＳＯ４で乾燥され、濾過され、蒸発させられて、結晶固体として標記産物を生じた。
【０２１１】
収量：（１．７ｇ、８２％）。
【０２１２】
例１０
Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ−エチル−ベンゼン−１，４、−ジアミン
【０２１３】
【化３９】
2004505952.tif 000040
【０２１４】
Ｎ−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ’−（２−クロロエチル）−Ｎ’−エチルベンゼン−１，４−ジアミン（０．３５ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルピロリジノン（５ｍＬ）の溶液が、フタル酸カリウム（０．２２７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）で処置され、その結果生じた混合液が１００℃で一晩撹拌された。反応は冷やされ、ジクロロメタンで希釈され、水層が中性になるまで、水で洗浄された。有機層はＫ２ＣＯ３で乾かされ、濾過され、溶媒が蒸発させられて、２−（２−｛［　４−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル−アミノ）−フェニル］−エチルアミノ）−エチル）−イソインドール−１，３−ジオンを生じた。
【０２１５】
２−（２−｛［４−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イルアミノ）−フェニル］エチルアミノ）−エチル）−イソインドール−１，３−ジオン（０．５ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）、エタノール（５０ｍｌ）およびヒドラジン一水和物（３ｍＬ）の溶液が３時間還流され、それから室温で一晩撹拌された。０℃への冷却後、濃塩酸／水（１：１、２０ｍＬ）が加えられ、反応液は２時間還流された。エタノールは蒸発され、水性混合液は濾過された。濾過液はＮａＨＣＯ３（ｓ）で塩基性にされ、ジクロロメタンで抽出された。有機層はＭｇＳＯ４で乾燥され、濾過され、溶媒が蒸発させられて、固体として標記産物を生じた。
【０２１６】
収量：（０．１７ｇ、５１％）。
【０２１７】
例１１
Ｎ−［１−（（２−｛［４−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イルアミノ）−フェニル］−エチル−アミノ）エチルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド、化合物（２０５）
【０２１８】
【化４０】
2004505952.tif 000041
【０２１９】
Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ−エチルベンゼン−１，４−ジアミン（０．１ｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ベンゾイル−アラニン（０．０３２ｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０６６ｍｌ、０．３７ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０７ｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の溶液が室温で一晩撹拌された。酢酸エチルおよびＮａＨＣＯ３（ｓ）が力強い撹拌と共に加えられた。この有機層はＮａ２ＳＯ４で乾燥され、濾過され、固体へと蒸発させられた。この物質はＨＰＬＣによって精製され、オレンジ色の固体として標記化合物を生じた。
【０２２０】
例１２
５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸（２−｛［４−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イルアミノ）−フェニル］−エチル−アミノ｝−エチル）−アミド、化合物（２０６）
【０２２１】
【化４１】
2004505952.tif 000042
【０２２２】
Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ−エチルベンゼン−１，４−ジアミン（０．１ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、ビオチン・コハク酸エステル（０．１ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２　ｍｌ）、およびジオキサンの溶液が室温で一晩撹拌された。酢酸エチルおよび水が徹底的な混合と共に加えられた。この有機層は分離され、ＭｇＳＯ４で乾燥され、濾過され、蒸発させられた。残留物は逆相クロマトグラフィーによって精製され、標記化合物を生じた。
【０２２３】
収量：（０．０３１ｇ、４１％）。
【０２２４】
化合物２０８は、上に概説されている手順に従って、適切な試薬の選択および置換により、同様にして調製された。
【０２２５】
例１３
ヘキサデカン酸（２−｛［４−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル−アミノ）−フェニル］−エチルアミノ｝−エチル）−アミド、化合物（２１０）
【０２２６】
【化４２】
2004505952.tif 000043
【０２２７】
Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ−エチルベンゼン−１，４−ジアミン（０．０２５ｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、塩化パルミトイル酸（０．０１６ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．０２４ｍＬ、０．１３２ｍｍｏｌ）、およびジオキサン（０．４ｍＬ）の溶液が室温で一晩撹拌された。酢酸エチルおよびＮａＨＣＯ３（ｓ）が徹底的な混合と共に加えられた。有機層は分離され、ＭｇＳＯ４で乾燥され、濾過され、蒸発されて油となった。この物質は逆相クロマトグラフィー（２０％　ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）を用いて精製され、固体として標記化合物を生じた。
【０２２８】
収量：（０．０１１ｇ、２８％）。
【０２２９】
化合物２０７、２１１および２１２は、上に概説されている過程に従って、適切な試薬の選択および置換により、同様にして調製された。
【０２３０】
例１４
Ｎ−（２−｛［４−［（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−ブチリル−アミノ］−フェニル］−エチルアミノ｝−エチル）−ブチルアミド（ｂｕｔｙｒａｍｉｄｅ）、化合物（２７４）
【０２３１】
【化４３】
2004505952.tif 000044
【０２３２】
Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ−エチルベンゼン−１，４−ジアミン（０．０２５ｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、プロピオン酸クロライド（０．００６ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．０２４ｍＬ、０．１３２ｍｍｏｌ）およびジオキサン（０．４ｍＬ）の溶液が、室温一晩で撹拌された。酢酸エチルおよびＮａＨＣＯ３（ｓ）が徹底的な混合と共に加えられた。有機層は分離され、ＭｇＳＯ４で乾燥され、濾過され、蒸発されて油となった。この物質は逆相クロマトグラフィー（２０％　ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）を用いて精製され、油として標記化合物が生じた。
【０２３３】
収量：（０．０１２ｇ、３７％）。
【０２３４】
化合物２７２および２７３は、上に概説されている過程に従って、適切な試薬の選択および置換により、同様にして調製された。
【０２３５】
例１５
Ｎ−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ−［２−（シクロヘキシルメチル−アミノ）エチル］−Ｎ’−エチル−ベンゼン−１，４−ジアミン、化合物（２１４）
【０２３６】
【化４４】
2004505952.tif 000045
【０２３７】
Ｎ−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル）−Ｎ’−（２−クロロエチル）−Ｎ’−エチルベンゼン−１，４−ジアミン（０．０２５ｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）、シクロヘキシルアミン（０．０２２ｍＬ、０．１７４ｍｍｏｌ）および１−メチル−２−ピロリジノン（０．６ｍＬ）の溶液がガラス製マイクロチューブ中、１３０℃で一晩加熱された。反応混合液は濾過され、産物は逆相クロマトグラフィー（２０％　ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって濾過液から分離され、油として標記産物を生じた。
【０２３８】
収量：（０．００２ｇ、７％）。
【０２３９】
化合物２０９、２１３および２１５〜２６９は、上に概説されている過程に従って、適切な試薬の選択および置換により、同様にして調製された。
【０２４０】
例１６
２−ベンゾイルアミノ−プロピオン酸２−２−｛［４−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イル−アミノ）フェニル］−エチル−アミノ−エチルエステル、化合物（２６９）
【０２４１】
【化４５】
2004505952.tif 000046
【０２４２】
２−｛［４−（６−ビフェニル−３−イル−ピリミジン−４−イルアミノ）−フェニル］−エチル−アミノ｝−エタノール（０．２ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、Ｎ−ベンゾイルアラニルクロリド（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，ら　ＪＯＣ，　６０（５），１９９５，　１２３３）（０．６ｍＬ、１．９ｍｍｏｌ）およびトルエン（０．５ｍＬ）の溶液が８０℃で一晩撹拌された。反応が冷やされたあと、ＤＭＦ（１ｍＬ）が加えられ、撹拌が１時間再開された。酢酸エチルおよびＮａＨＣＯ３（ｓ）が徹底的な混合と共に加えられた。この有機層は分離され、ＭｇＳＯ４で乾燥され、濾過され、蒸発されて油となった。この物質はフラッシュクロマトグラフィー（２０％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製され、固体として標記産物を生じた。
【０２４３】
収量：（０．０４１ｇ、１９％）。
【０２４４】
化合物２７０および２７１は、上に概説されている過程に従って、適切な試薬の選択および置換により、同様にして調製された。
【０２４５】
上述の手順に続いて、表ＩＸ、Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩに記載されているように、本発明の式（Ｉ）の代表的な化合物が調製された。
【０２４６】
【表１０】
2004505952.tif 000047
【０２４７】
【表１１】
2004505952.tif 000048
【０２４８】
【表１２】
2004505952.tif 000049
【０２４９】
【表１３】
2004505952.tif 000050
【０２５０】
【表１４】
2004505952.tif 000051
【０２５１】
表ＩＸ＜Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩに記載されている代表的な化合物は、例５に記述される手順に従って試験され、結果は表ＸＩＩＩに記載されている。特に明記しない限り、分子量はＨｅｗｌｉｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　Ｓｅｒｉｅｓ　１０５０化学イオン化質量分析計で測定された。
【０２５２】
【表１５】
2004505952.tif 000052
【０２５３】
【表１６】
2004505952.tif 000053
【０２５４】
前述の明細書は、例証の目的で提供された例によって本発明の原理を教示する一方、本発明の実施は、以降の特許請求の範囲およびそれらの均等の範囲内に属するものとして、通常の変型、適合および／もしくは修正のすべてを包含することが理解されるであろう。
【０２５５】
【表１７】
2004505952.tif 000054
【０２５６】
【表１８】
2004505952.tif 000055
【０２５７】
【表１９】
2004505952.tif 000056
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＮＭＤＡ受容体−媒介の機能的細胞内カルシウム反応。充填正方形の記号は対照を表わし、充填三角形の記号は１００μＭのＭＫ−８０−１を表わす。
【図１Ｂ】
分化されたＰ１９ニューロンにおける［３Ｈ］−ＭＫ−８０１結合
【図２Ａ】
アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ　Ｂｌｕｅ）蛍光測定を使用するＰ１９ニューロン生存率実験。
【図２Ｂ】
アラマーブルー読み取り値によるグルタミン酸用量−死亡の反応。データは対照の％として表わす。
【図２Ｃ】
ＭＫ−８０１用量−依存ブロック。
【図３Ａ】
化合物Ａ、ｐ３８阻害剤、前処理用量反応。
【図３Ｂ】
Ｕ０１２６、ＭＥＫ１／２阻害剤、前処理用量反応。
【図４Ａ】
Ｕ０１２６はグルタミン酸誘導カルシウム反応をブロックしない。
【図４Ｂ】
Ｕ０１２６はＰ１９ニューロンにおける［３Ｈ］−ＭＫ−８０１結合をブロックしない。
【図５Ａ】
Ｕ０１２６処理後の効力の時間経過。
【図５Ｂ】
化合物Ａ処理後の効力の時間経過。
【図６Ａ】
Ｕ０１２６はスタウロスポリン−誘発毒性を阻止しない。充填正方形の記号は化合物を表わさない。充填三角形の記号は１０μＭのＵ０１２６を表わす。
【図６Ｂ】
Ｕ０１２６はＡ２３１８７−誘発毒性をブロックしない。
【図６Ｃ】
Ｕ０１２６は基礎的Ｐ１９ニューロン生存率に影響しない。
【図７】
２−ピリミジナミンおよび４−ピリミジナミン化合物（化合物番号により表に示す）は処理後の遅延した神経保護を示す。グルタミン酸処理の２時間後に達成される効力はＰ１９ニューロンがこれらの化合物で前処理される時に達成されるものと同等である。この一過性プロファイルはＭＥＫ阻害剤、Ｕ０１２６のものに合致する。開放された、点をもつ棒グラフは前処理％ＮＰを表わし、充填棒グラフは処理の２時間後の％ＮＰを表わす。
【図１Ａ】
2004505952.tif 000067
【図１Ｂ】
2004505952.tif 000068
【図２Ａ】
2004505952.tif 000069
【図２Ｂ】
2004505952.tif 000070
【図２Ｃ】
2004505952.tif 000071
【図３】
2004505952.tif 000072
【図４Ａ】
2004505952.tif 000073
【図４Ｂ】
2004505952.tif 000074
【図５Ａ】
2004505952.tif 000075
【図５Ｂ】
2004505952.tif 000076
【図６Ａ】
2004505952.tif 000077
【図６Ｂ】
2004505952.tif 000078
【図６Ｃ】
2004505952.tif 000079
【図７】
2004505952.tif 000080
【国際公開パンフレット】
2004505952.tif 000081
2004505952.tif 000082
2004505952.tif 000083
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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