(57)【要約】抗癌剤封入リポソーム及び悪性腫瘍の治療におけるその使用。本発明のリポソームは、脂質フラグメント、活性オリゴペプチド、及びこれら２つのフラグメントの間に挿入されるオリゴペプチドスペーサーの３つのサブ構造からなるリポペプチドにてコーティングされる。本発明のリポソームは悪性腫瘍を治療するために静脈内投与することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤を封入したリポソームにおいて、該リポソームは、脂質フラグメント、活性オリゴペプチド、及びこれら２つのフラグメントの間に挿入されるオリゴペプチドスペーサーの３つのサブ構造（図３）からなるリポペプチドにてコーティングされていることを特徴とする抗癌剤封入リポソーム。
【請求項２】
前記コーティングリポペプチドの前記脂質フラグメントは炭素鎖の長さがＣ６〜Ｃ２０である脂肪酸であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項３】
前記コーティングリポペプチドの前記脂質フラグメントは好ましくはデカノイル、ミリストイル、またはステアロイルである請求項１及び２に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項４】
前記コーティングリポペプチドの前記活性配列フラグメントはＳＩＫＶＡＶＳであることを特徴とする請求項１乃至３に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項５】
前記コーティングリポペプチドの前記活性配列フラグメントと前記脂質フラグメントとの間に挿入される前記オリゴペプチドスペーサーはアミノ酸残基５〜１０個分の長さを有することを特徴とする請求項１乃至４に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項６】
前記コーティングリポペプチドの前記活性配列フラグメントと前記脂質フラグメントとの間に挿入される前記オリゴペプチドスペーサーは、以下の配列、ＡＡＡＡＡＣＹＥ、ＳＳＡＡＡＣＹＥ、またはＲＫＥＲＫＥＣＹＥのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至５に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項７】
薬剤に対するリポソームを形成する全脂質の比が２０：１〜２：１であり、好ましくは１０：１であることを特徴とする請求項１乃至６に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項８】
リポソームの脂質成分は天然及び合成物由来のリン脂質及びコレステロールであることを特徴とする請求項１乃至７に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項９】
前記リン脂質は好ましくは正味電荷が０であるホスファチジルコリン、及び負に帯電した別のリン脂質、好ましくはホスファチジルグリセロールであることを特徴とする請求項１乃至８に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１０】
前記負帯電リン脂質に対する前記中性リン脂質の比が１０：２〜１０：１０であり、好ましくは１０：７〜１０：１０であることを特徴とする請求項１乃至９に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１１】
全脂質量に対するコレステロールの比率が０〜５０％、好ましくは３５〜５０％であることを特徴とする請求項１乃至１０に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１２】
必要に応じて脂質過酸化阻害剤を含有することを特徴とする請求項１乃至１１に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１３】
前記脂質過酸化阻害剤は、３，４−ジヒドリド−２，２−ジメチル−６−ヒドロキシ−７−メトキシ−２Ｈ−１−ベンゾピランのような、ＢＨＴ、クロマンまたはクロメンなどの薬剤としての使用が認められた抗酸化剤であるビタミンＥまたは酢酸ビタミンＥなどのビタミン類及びその誘導体であることを特徴とする請求項１乃至１２に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１４】
全脂質量に対するコーティングリポペプチドの比率が０．１％〜３０％、好ましくは１％〜１５％であることを特徴とする請求項１乃至１３に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１５】
平均粒径が５０ｎｍ〜２５０ｎｍであることを特徴とする請求項１乃至１４に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１６】
前記封入抗癌剤は、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体；チオテパなどのエチレンイミン類；カルムスチンなどのニトロソ尿素；テモゾロミドまたはダカルバジンなどのリースト剤；メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤；チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体；フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体；ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体；エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体；ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体；ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質；シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物；リツキシマブなどのモノクローナル抗体；ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミドなどの他の抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項１乃至１５に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、施療する生物の他の細胞には影響を及ぼすことなく当該生物体内の癌細胞を選択的に破壊することが可能な抗癌療法のシステムを提供するものである。より詳細には本発明は上記の治療において有用な抗癌剤を含有したリポソームに関するものである。
【０００２】
【従来技術】
癌は先進諸国においては最も一般的な疾病であり、充実性悪性腫瘍を有する患者では腫瘍の転移が主たる死因となっている。腫瘍の転移では別の臓器や異なる組織において原発性腫瘍に由来する新たな癌中心が出現する。こうした転移過程には、腫瘍細胞が細胞の構成要素及びホスト組織と相互作用を行う一連の段階が含まれる。その段階とは、原発性腫瘍からの腫瘍細胞の分離、血管内腔への侵入、血管やリンパ系を介した他の組織への細胞の移動、血管内皮への接着、血管外遊出及び新たな組織への浸潤、及び２次腫瘍の形成である。
【０００３】
この過程を通じて悪性腫瘍細胞は細胞外基質の各要素と相互作用を行うが、特に基底膜に接着して腫瘍細胞自身及び／または腫瘍細胞に刺激された実際のホスト細胞が産生する蛋白分解酵素の作用により基底膜を傷害する。すなわち細胞接着性の変化は、原発腫瘍からの細胞の遊離、細胞の移動、及び新たな組織への細胞の着床に密接に関連した過程であり、転移が生ずるうえで不可欠な要素である。
【０００４】
この相互作用に介在する主要な接着分子がインテグリンである。インテグリンは膜貫通糖蛋白質の一ファミリーであり、非共有結合によってα鎖とβ鎖の２本の鎖が結合した構造を有する（疎水性物質）。インテグリンは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンやコラーゲンなどの特定の細胞外基質蛋白質の受容体として特に機能する（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｅ．， Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ， Ｆ．Ｇ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ（１９８９）， １， ４， １１９−１２６）。最近になって腫瘍細胞ではインテグリンの発現が変化し、こうした細胞においてインテグリンの存在量が増加することが示された（Ｄｅｄｈａｒ， Ｓ．， Ｓａｕｌｍｉｅｒ， Ｒ．， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． （１９９０）， １１， ４８１−４８９）。この発現量の増加は、腫瘍細胞の細胞外基質への接着及び転移能の獲得の要因となっている。
【０００５】
腫瘍を消失させる主な治療法として、特にアントラサイクリンファミリーを中心とした細胞分裂抑制因子を静脈内投与する方法がある（Ｙｏｕｎｇ， Ｒ．Ｃ．， Ｏｚｏｌｓ， Ｒ．Ｆ．， Ｍｙｅｒｓ， Ｃ．Ｅ．， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．（１９８１）， ３０５， １３９−１５３）。しかしながら、これらの細胞分裂抑制因子が腫瘍細胞に対する選択性を欠いていること、腫瘍細胞がこれらの薬剤に対する耐性を獲得すること、細胞分裂抑制因子の作用に対する原発腫瘍及び転移細胞の応答が異なることから、こうした治療によって通常深刻な副作用が生じ、その一部は慢性的または不可逆的である。
【０００６】
そのため今日の化学療法は、これらの薬剤の抗腫瘍効果を高めるとともにその毒性を低減させることに主眼をおいたものとなっている。その方法の一つは適当な濃度の細胞分裂抑制因子を標的細胞に送達することであり、これによって正常細胞を傷害することなく原発腫瘍や転移細胞が選択的に破壊される。こうした方法によれば薬剤の治療指数が向上し、より高い治療効果を上げることが可能である。
【０００７】
こうした系では、薬剤が親水性である場合にはこれをリポソームの水性空間中に取り入れ、薬剤が親油性を有する場合にはこれを水性空間と脂質２重層との間に分布させる。このようにリポソームに封入した薬剤を治療中の患者に投与することが可能である。
【０００８】
抗癌剤の投与にリポソームを使用することで従来の投与法の効果がしばしば向上することが多くの研究者によって示されている（例えば、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９８２） ４２， ４７３４−４７３９ ａｎｄ Ｖａｎ Ｈｏｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９８４） ４４， ３６９８−３７０５）。
【０００９】
様々な動物モデルにおいて、ドキソルビシンをリポソームに封入することにより慢性及び急性の副作用毒性が著しく低減することが示されている（例えば、Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９８０） ４０， １５３２−１５３７， Ｆｏｒｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＥ （１９８１） ７８， １８７３−１８７７， Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．： Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． （１９８２） １８ １６７−１７６， Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９８５） ４５， ７９６−８０３ ａｎｄ Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．： Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．（１９８６） ７７， ４５９−４６７）。更にリポソームに封入したドキソルビシンの投与により、脱毛、体重減少、悪心、嘔吐、及び血管外遊出による皮膚壊死などの他の毒性指標も大幅に低減される（Ｆｏｒｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．： Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ． Ｒｅｐ． （１９８３） ６７， ４８１−４８４。及びこの段落で上述した文献を参照。）。
【００１０】
同様に様々な動物モデルにおいて、毒性が大幅に低下する代わりに抗腫瘍効果が損なわれるといったことがないことも示されている（上述の文献及び、Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．： Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． （１９８６） １６， ２２−２７， Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９８３） ４３， ４７３０−４７３５ ａｎｄ Ｂｒ． Ｊ． ｃａｎｃｅｒ （１９８５） ５１， ６８１−６８９， Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．： Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． （１９８７） ７８， ７０７−７１３， Ｆｏｒｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９８３） ４３， ５４６−５５０， ａｎｄ Ｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９８７） ４７， ３３６６−３３７２）。
【００１１】
癌転移の発生率及びその特別な性質のために、抗転移療法は、従来の治療法に代わる新たな治療法の模索に多大な努力が費やされた分野の一つとなっている。アントラサイクリンはその作用機序、高い有効性、及び高い毒性ゆえにリポソームなどの徐放系への薬剤封入の分野で最も研究が進められている細胞分裂抑制因子のファミリーである。このことは増加の一途にあるリポソーム関連特許から明らかであり、これらの特許の８０％は細胞分裂抑制因子に適用されたものである。
【００１２】
アントラサイクリンを含有したリポソームの最初の世代のものは、ＰＣ、ＰＧ、及びコレステロールからなる小胞であり、その水性内空間に薬剤が封入されるものであった。こうしたリポソームでは薬剤の毒性は低下するがその抗腫瘍活性は遊離薬剤の活性を上回ることはなく、リポソームが最も送達されやすい臓器である肝臓全体に転移細胞が拡がった腫瘍モデルのみにおいて薬剤の活性の向上が見られ、腫瘍の増殖が局所的である場合には活性の改善は見られなかった（Ｍａｙｈｅｗ， Ｅ．， Ｒｕｓｔｕｍ， Ｙ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ． （１９８３）， ４７， ８１−８６）。更に、これらのリポソームは小胞体のマクロファージによって速やかに捕捉されるために静脈注射後の生物体内での効果は数時間しか持続しない。こうした理由のため、精力的な研究が行われたにも関わらず、リポソームに対する細胞分裂抑制因子の輸送体としての当初の期待を満足するような製剤は存在しなかった。８０年代に入り、血流中での循環時間を延長する目的で表面に糖脂質（Ａｌｌｅｎ， Ｔ．Ｍ．， Ｈａｎｓｅｎ， Ｃ．， Ｒｕｔｌｅｄｇｅ， Ｊ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ （１９８９）， ９８１， ２７−３５； Ｍｏｒｉ， Ａ．， Ｋｌｉｖａｎｏｖ， Ａ．Ｌ．， Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ， Ｖ．Ｐ．， Ｈｕａｎｇ， Ｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． （１９９１）， ２８４， ２６３−２６６）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの疎水性高分子（Ｂｌｕｍｅ， Ｇ．， Ｃｅｖｅ， Ｃ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ （１９９０）， １０２９， ９１−９７， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．Ｍ．， Ｈａｎｓｅｎ， Ｃ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｆ．， Ｒｅｄｅｍａｎｎ， Ｃ．， Ｙａｕ−Ｙｏｕｎｇ， Ａ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ （１９９１）， １０６６， ２９−３６）を有するリポソームが初めて報告されるに到って状況は変化した。こうしたリポソームは、所謂「第２世代リポソーム」または「ステルスリポソーム」と呼ばれるものである。ＰＥＧ及び糖脂質によるこうした安定化効果はこれらの物質の疎水性によるものと考えられる。これらの物質の疎水性は、リポソーム表面での凝集体の形成を防止し、リポソームが細胞受容体や血漿中蛋白質のリガンドとして認識されることを防ぐものである。更に、リポソーム表面にこれらの物質が存在することによって立体効果が生じ、オプソニンなどの血中蛋白質の作用が阻害されるとともにリン脂質のリン酸基に対するマクロファージ受容体の結合性が低下するために血中での循環時間が長くなる。
【００１３】
その後、酢酸ビタミンＥ、ＢＨＴまたはクロマン誘導体などの脂質の過酸化を抑制する添加物質を添加することによりこうしたリポソームの安定性及び有効性を向上させることが可能であることが何人かの研究者によって見出された（欧州特許公報第０２７４１７４号、国際公開公報第８５００９６８号、同９２０２２０８号及び米国特許第５６０５７０３号）。
【００１４】
こうしたガレヌス製剤は従来の剤形と比較して多くの利点を与えるものであるが、少ない投薬量で高い効果を上げ、副作用を抑制または低減するために標的細胞に向けて小胞を誘導するには課題が残っている。
【００１５】
基本的な考え方は、標的細胞によって選択的に認識される任意の化学物質をリポソーム表面に取り込ませるというものである。標的細胞に向けてリポソームを誘導するうえで重要となるのは適当なベクター分子を選択することである。
【００１６】
腫瘍細胞へとリポソームを誘導することが可能な任意の化学構造を選択する方法は、決して容易なものではなく、腫瘍細胞の場合では、膜内蛋白質、及び、転移能、分裂能、及び問題となる組織に応じて異なる抗原及び表面受容体のように極めて多様であり、これらは認識構造を選択するための基準として用いることが可能であるものの実際にはその選択は容易ではない。更に実際には多くの場合、分裂中の細胞及び／または腫瘍細胞はその相違する特徴として正常細胞と比較して所定の構造を過剰発現している。
【００１７】
これまでに得られた知見によれば、接着過程及びこれに関与する蛋白質は、転移過程及び細胞の増殖に必要な血管新生において重要な役割を担っていることが示されている。
【００１８】
これらの機序に関わりの深い蛋白質のうち、ラミニンは腫瘍細胞においてその受容体が過剰発現していることが示されていることからリポソーム誘導物質の有力な候補である。
【００１９】
ラミニンはコラーゲンに次ぐ細胞の基底膜の主要成分である。ラミニンは、α鎖（４４０ｋＤａ）、β鎖（２００ｋＤａ）及びγ鎖（２２０ｋＤａ）の３本のポリペプチド鎖が２本の短腕と１本の長腕を有する十字架状に配された糖蛋白質である。これらの鎖はジスルフィド結合及び非共有結合型の相互作用によって結合しており、異なる構造ドメインを有する非対称分子を構成している。
【００２０】
各細胞はラミニン分子のペプチド配列及び／または機能的ドメインを認識する異なる特異的膜受容体を有する。これらの受容体はインテグリンと非インテグリンの２つのグループに分類される。
【００２１】
インテグリンはα鎖及びβ鎖の２本の膜貫通ポリペプチド鎖が非共有結合的に会合した構造を有する。これらの分子は細胞が細胞外基質の要素に接着するための受容体となっている。インテグリンには細胞−細胞の認識に介在するものもある。各インテグリンはラミニンなどの基質中分子に存在する特定のペプチド配列を認識する。
【００２２】
非インテグリン型の受容体の中で最もよく研究されているのはラミニンに対する６７ｋＤａの受容体であり、癌を含む各種の細胞組織から単離、同定されている。更に転移性腫瘍細胞はその細胞表面に正常細胞よりも多くの受容体を発現していることが確認されていることから、こうした受容体を腫瘍の悪化を示すマーカー及び各種の腫瘍の活性の指標とすることが可能であると考えられている。
【００２３】
ラミニンは以下のような異なる転移活性を示す。すなわち、
−細胞接着、成長、及び増殖を引き起こす。
【００２４】
−上皮細胞と腫瘍細胞の区別を刺激する。
【００２５】
−細胞遊走を引き起こす。
【００２６】
−その細胞表面における存在によって腫瘍細胞の悪性度を高め、腫瘍細胞の浸潤性及び転移活性を高める。
【００２７】
信頼のおける研究により、ラミニンの異なる機能は、ラミニンα鎖のＰＡ２２−２フラグメントに存在するアミノ酸５個からなる配列ＳＩＫＶＡＶＳのようなラミニン分子中に存在する特定のペプチド配列によるものであることが示されている。詳細には、この領域で最も高い活性を示す部分がペンタペプチドであるＳＩＫＶＡＶＳである。
【発明の概要】
現在、リポソームに関する研究は、腫瘍細胞を認識し、これに特異的に結合する抗体、ペプチド、及び蛋白質などをこのリガンド小胞の表面に取り込むことによってこの種の細胞にリポソームを誘導することに向けられている（Ａｌｌｅｎ Ｔ．Ｍ．， Ａｕｓｔｉｎ， Ｇ．Ａ．， Ｃｈｏｎｎ， Ａ．， Ｌｉｎ， Ｌ．， Ｌｅｅ， Ｋ．Ｃ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ （１９９１）， １０６１， ５６−６３）。
【００２８】
しかるに本発明の目的は、リポソームに封入された抗癌剤の新たな応用である。当該リポソームはその主たる特徴として特にＳＩＫＶＡＶＳ配列などのラミニンの構造に由来するリポペプチドによって被覆されている。このようにして調製されたリポソームは腫瘍細胞に対して高い選択性を示すことから封入された抗癌剤の効果が高められる。
【００２９】
本発明において使用する略語の意味
ＤＸＲ：ドキソルビシン
ＰＣ：ホスファチジルコリン
ＰＬ：水素化した卵のリン脂質
ＰＧ：ホスファチジルグリセロール
ＣＨＯＬ：コレステロール
ＣＲＯＭ：クロマン−６
Ａ　Ａｌａ　　　アラニン
Ｃ　Ｃｙｓ　　　システイン
Ｄ　Ａｓｐ　　　アスパラギン酸
Ｅ　Ｇｌｕ　　　グルタミン酸
Ｆ　Ｐｈｅ　　　フェニルアラニン
Ｇ　Ｇｌｙ　　　グリシン
Ｈ　Ｈｉｓ　　　ヒスチジン
Ｉ　Ｉｌｅ　　　イソロイシン
Ｋ　Ｌｙｓ　　　リシン
Ｌ　Ｌｅｕ　　　ロイシン
Ｍ　Ｍｅｔ　　　メチオニン
Ｎ　Ａｓｎ　　　アスパラギン
Ｐ　Ｐｒｏ　　　プロリン
Ｑ　Ｇｌｎ　　　グルタミン
Ｒ　Ａｒｇ　　　アルギニン
Ｓ　Ｓｅｒ　　　セリン
Ｔ　Ｔｈｒ　　　スレオニン
Ｖ　Ｖａｌ　　　バリン
Ｗ　Ｔｒｐ　　　トリプトファン
Ｙ　Ｔｙｒ　　　チロシン
Ｌａｍ２Ｍ：ミリストイル−ＰＥＧＡＤ
Ｌａｍ９：ミリストイル−ＹＥＳＩＫＶＡＶＳ
Ｌａｍ９Ｃｙｓ：ミリストイル−ＣＹＥＳＩＫＶＡＶＳ
Ｌａｍ９Ｃｙｓ−ｂ−Ａｌａ：ミリストイル−ＡＡＡＡＡＣＹＥＳＩＫＶＡＶＳ
ＡＧ１０：ＧＹＳＲＡＲＫＥＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＲＫＥ
（Ｅ８）−２−４Ｇ：ＮＰＷＨＳＩＹＩＴＲＦＧ
ｍｉｒ：ミリストイル
ＤＯＸ：ドキソルビシン
（発明の詳細な説明）
本発明は抗癌剤を含有したリポソームの調整法及びその使用に関する。
【００３０】
本発明のリポソームはその主たる特徴として疎水性誘導ペプチド（被覆リポペプチド）のフラグメントで被覆されている。このようにして調製されたペプチドは腫瘍細胞に対して高い指向性を示すことから、封入された抗癌剤の効果が高められる。
【００３１】
予想し得なかったことであるが、リポソームに取り込む以前にｉｎ　ｖｉｔｒｏでは活性を示す被覆リポペプチドがリポソームに取り込まれるとその指向性が完全に失われる。このため本発明によれば、被覆リポペプチドの前記配列と親油性鎖との間に挿入されることによって何らかの機序により活性ペプチド配列の指向性を維持するペプチドスペーサーが開発された。
【００３２】
すなわち被覆リポペプチド（疎水性誘導ペプチド）の構造は次のようなものである。
【００３３】
脂質フラグメント　　　　スペーサー　　　　活性配列
したがって本発明の目的は、抗癌剤を含有したリポソームであって、その表面に、特に脂質フラグメント、活性オリゴペプチド、及びオリゴペプチドスペーサーの３つの構造ブロックからなる、ラミニンから誘導されたペプチドフラグメント（被覆リポペプチド）を有するリポソームの調製法及びその使用法を提供することにある。
【００３４】
脂質フラグメントとは、炭素鎖長がＣ６〜Ｃ２０である脂肪酸であり、より詳細にはデカノイル、ミリストイル、及びステアロイルである。
【００３５】
スペーサーフラグメントは、アミノ酸残基５〜１０個分の長さを有する、より詳細にはアミノ酸残基７〜９個分の長さを有する、更に詳細には配列ＡＡＡＡＡＣＹＥ、ＳＳＡＡＡＣＹＥ及びＲＫＥＲＫＥＣＹＥを有するラミニンに対して不活性なオリゴペプチドからなる。
【００３６】
活性配列はオリゴペプチドＳＩＫＶＡＶＳからなる。
【００３７】
リポソームを形成する脂質は広く知られている。一般的には正味電荷が０か負の値であるリン脂質やコレステロールなどのステロールが含まれる。脂質は、最終的なリポソームの粒径、封入される薬剤、及び調製時に求められる安定性に関する必要条件に基づいて選択される。通常、リポソームの最大の脂質成分はホスファチジルコリン（ＰＣ）である。各ＰＣは長さ及びアクリル鎖の飽和度が異なり、天然または合成の供給源から単離される。負に帯電したリン脂質を含有することでリポソーム溶液が安定化し、リポソームの自然な凝集を防ぐことができる。
【００３８】
最もよく用いられる負に帯電したリン脂質として、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）がある。負帯電リン脂質に対する中性リン脂質の比率は、１０：２〜１０：１０の範囲である。コレステロールを含有することにより、イオンや小さな極性分子に対する膜の透過性が失われてリポソームの安定性に寄与するだけでなく、２重層間での一連の蛋白質の貫通性が低下して蛋白質間の無秩序性が高くなる。通常用いられるコレステロールの比率は全脂質の０〜５０％である。
【００３９】
必要に応じ、安定性を向上させ、封入薬剤の毒性を低下させる添加剤を本発明のリポソームに加えることが可能である。例えば米国特許第５６０５７０３号、欧州特許公開番号第０２７４１７４号、国際公開公報第８５００９６８号及び同９２０２２０８号に述べられるような脂質酸化阻害剤が挙げられる。
【００４０】
本発明のリポソームに封入することが可能な抗癌剤としてはこれらに限られるものではないが次のようなものが挙げられる。すなわち、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体；
チオテパなどのエチレンイミン類；
カルムスチンなどのニトロソ尿素；
テモゾロミドまたはダカルバジンなどのリースト剤；
メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤；
チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体；
フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体；
ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体；
エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体；
ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体；
ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質；
シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物；
リツキシマブなどのモノクローナル抗体；
ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミドなどの他の抗腫瘍剤などである。
【００４１】
上記の記載に基づけば、本発明のリポソームは次の特徴を有するものである。すなわち、
ａ）１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度である。
【００４２】
ｂ）成分脂質は、天然もしくは合成化合物由来のリン脂質及びコレステロールである。
【００４３】
ｃ）全脂質量に対するコレステロールの比率が０〜５０％、好ましくは３５〜５０％である。
【００４４】
ｄ）存在するリン脂質は、正味電荷が０であるホスファチジルコリンと、場合により負に帯電した別のリン脂質、好ましくはホスファチジルグリセロールを含む。
【００４５】
ｅ）負に帯電したリン脂質に対する中性リン脂質の比が１０：２〜１０：１０、好ましくは１０：７〜１０：１０の範囲である。
【００４６】
ｆ）場合によりリポソームは例えば米国特許第５６０５７０３号、欧州特許公開番号第０２７４１７４号、国際公開公報第８５００９６８号及び同第９２０２２０８号に述べられるような脂質酸化阻害剤を含有する。
【００４７】
ｇ）ペプチドの濃度は０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌで変動する。
【００４８】
ｈ）リポソームは、水溶液中で形成されるものであって、生理的であろうとなかろうと、生理学的に等張な水溶液、例えば、０．９％Ｎａｃｌ水溶液中で形成される。
【００４９】
ｊ）リポソームの粒径はいずれの場合も５００ｎｍ未満、好ましくは３００ｎｍ未満、より詳細には５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲である。
リポソームの調製及び薬剤の取込み
好ましい一方法としてＢａｎｇｈａｍ等によって提案された方法があり、不均一な粒径の多重膜リポソーム（ＭＬＶ）が得られる。この方法では脂質を適当な有機溶媒に溶解した後、溶媒を真空下に回転蒸発により除去する。得られた脂質膜を薬剤を含有した適当な水性媒体により、手動もしくは機械的な撹拌によって水和する。公知の方法によってＭＬＶの不均質な懸濁液の粒径を減少させ、均一化する。好ましい方法としては例えば、チタン製プローブを用いた超音波処理によってＳＵＶリポソームを得る方法と、ＭＬＶ溶液をポリカーボネート製フィルターから押し出してＶＥＴリポソームを得る方法の２方法がある。
【００５０】
ペプチドフラグメントの調製
Ｆｍｏｃ／ｔＢｕを用いたメリフィールドの固相法（１９６２）によってペプチドの合成を行った。
【００５１】
リポペプチドの取込み
使用したリポペプチドはアシル化オリゴペプチドであり、好ましくはデカノイル、ミリストイル、またはステアロイルなどのＣ６〜Ｃ２０の直鎖飽和炭化水素鎖を有するアシル基である。このリポペプチドを、リポソームを形成するための他の残りの成分と混合するか、もしくはリポペプチドを小胞とともに６０℃でインキュベートしてリポソームに取り込む。小胞の２重層はゲル状であり、これらの誘導体の疎水性部分が小胞内部に取り込まれる。いずれの場合にも誘導体の疎水性部分は２重層を形成し、ペプチド配列は親水性の外面に残される。
【００５２】
本発明の方法を以下に幾つかの実施例に基づいて説明するが、これはあくまで説明を目的としたものであって発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００５３】
実施例１：カルボキシル末端を有する活性ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ／ｔＢｕを用いたメリフィールドの固相法（１９６２）によってラミニンから誘導されるペプチドの合成を行った。
【００５４】
カルボキシル末端を有する配列を得るため、固相合成の支持体として、下記表１に示す処理を行った官能基化度が０．７２ｍｅｑ／ｇのＷａｎｇレジンを使用した。
【００５５】
【表１】
2004510811.tif 000002
【００５６】
概略的に述べると、真空システムに接続したフィルターを有するシリンジに入れたＷａｎｇレジン１ｇを開始点とし、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を３０分間吹き込んだ。同時にフィルター重量秤にて最初のＦｍｏｃ−アミノ酸の必要量を秤量してＤＭＦに溶解し、この溶液にカップリング剤として４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）（モル比にして０．３：１）を加えた。試薬はすべて反応を行ううえで必要とされる量の５倍の過剰量を用いた。この後、この混合物を予め乾燥したレジンに加え、時折撹拌しつつ室温で２時間反応させた。反応後、レジンを異なる溶媒で洗浄して完全に乾燥させた。
【００５７】
最後にアミノ酸の全体量を求めた。反応が不完全である場合には、最初に加えた量の半分に当たる量の試薬を追加して更に２時間反応を行った。この後、同様のレジン乾燥及び導入されたアミノ酸の定量の過程を繰り返した。
【００５８】
残りのＦｍｏｃ−アミノ酸の結合は、アミノ基の脱保護及びアミド結合の形成を行う後工程において行われた。
【００５９】
ここで、Ｆｍｏｃアミノ保護基を除去するため、ペプチジルレジンを一旦ＤＭＦ／２０％ピペリジンで１分間処理し、２回目にこの処理を５分間行った。この後、ＤＭＦにて複数回洗浄してピペリジンを除去し、ニンヒドリン試験を行ってＦｍｏｃ基の脱離が完全であることを確認した（青色に呈色）。場合によりＤＭＦ／ピペリジン／ＤＢＵ（４８：２：２、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物中に試薬１．８−ジアザビシクロ［５．４．０］−ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）を用いて７分間レジンを処理することによって脱保護を行った。この処理の最後にレジンをＤＭＦにて複数回洗浄し、上記に述べたのと全く同様にニンヒドリン試験を行った。
【００６０】
ペプチジルレジンの脱保護の後、これに結合剤と所望のＦｍｏｃ−アミノ酸を加えた。配列の合成の難度に応じて結合剤の２つの組合わせを使用した。すなわち、
モル比にして１：１のＨＯＢｔとＤＩＰＣＤＩ、及びＦｍｏｃ−アミノ酸。
【００６１】
モル比にして１：２：１のＨＯＢｔ、ＤＩＥＡ、及び２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）。
【００６２】
試薬はすべて必要量に対して２．５倍の過剰量を使用した。
【００６３】
いずれの場合も反応は１時間行い、ニンヒドリン試験を行って遊離アミノ基の消失を確認して（黄色に呈色）反応終了を制御した。反応が不完全である場合には混合物を更に１時間レジンと接触状態においた後、ニンヒドリン試験を再び行った。レジン中に遊離アミノ基が残存する場合にはこれをＤＭＦで数回洗浄し、最初に用いた量の半分の試薬を再び加えた。反応を繰り返し行ったにも関わらず結合が不完全である場合があった。不規則な主鎖とならないように合成を継続するため、遊離状態で存在するアミノ基をアセチル化して不完全な鎖の合成を阻止した。そのため、ペプチジルレジン１モル当量につき２モル当量の無水酢酸及び１モル当量の４−ＤＭＰでレジンを３０分間処理した。次いでレジンをＤＭＦで洗浄し、ニンヒドリン試験を行ってアミノ基が完全に消失したことを確認した（黄色に呈色）。
【００６４】
プロリンのようなアミノ酸の２級アミノ基を検出する場合には、ニンヒドリンはこうしたアミノ基と反応しないのでニンヒドリン試験に代えてクロラニル試験を行う。
【００６５】
実施例：アミノ末端を有するペプチドの合成
カルボキシアミド末端を有するペプチドがｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）レジンから得られる。このレジンは、４０％のＤＣＭ／ＴＦＡ酸性混合物にて複数回洗浄した後、この混合物を２０分間レジンと接触させるという特殊な前処理を必要とする。この後、酸を除去するためレジンをＤＣＭで５回、毎回１分づつ洗浄し、これを中和するためにレジンのｐＨが塩基性となるまで塩基性混合物としての５％ＤＣＭ／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）にて処理した。最後にＤＩＥＡを除去するためにＤＣＭで複数回洗浄した。
【００６６】
次にＦｍｏｃ基で保護した酸性スペーサーであるｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α［１，９Ｈ−フルオレン−９−ｅ］−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシアセチック（ＡＭ）の縮合を行うことにより、アミノ末端を有する配列が得られる。そのため、必要量の１．５倍のＦｍｏｃ−ＡＭを秤量し、これをやはり過剰量のヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びＤＩＰＣＤＩ試薬（１：１、モル比）とともにレジンに加え、９０分間反応させた。Ｋａｉｓｅｒ試験すなわちニンヒドリン試験によってレジンから遊離アミノ基が消失したことを確認して反応の完了を確認した。すべてのスペーサー分子が結合していない場合、最初に使用した半分の量の試薬を用いて反応を再び繰り返した。すべてのスペーサーが結合した時点でレジンをＤＭＦにて複数回洗浄して余分な試薬を除去した。
【００６７】
残留したＦｍｏｃ−アミノ酸は、実施例１に述べたのと同様、アミノ基の脱保護とアミド結合の形成を行う後工程において導入した。
【００６８】
実施例３：ペプチドの脱保護とレジンからの分離
遊離ペプチド配列を脱保護するため、下表のプロトコールにしたがって先ずＦｍｏｃ基をアミノ末端から外す。
【００６９】
【表２】
2004510811.tif 000003
【００７０】
場合により合成の際２０％ＤＭＦ／ピペリジンをＤＭＦ／ピペリジン／ＤＢＵ（４８：２：２、ｖ／ｖ／ｖ）混合物に置換し、７分間ペプチジルレジンと接触させた。
【００７１】
次いでペプチドをレジンから分離し、１段反応でアミノ酸官能基鎖から保護基を外した。これを行うため、ペプチド鎖に存在する保護基に応じてアニソール、チオアニソール、フェノール、メルカプトエタノール、及び水などの異なるスカベンジャーを含む様々なＴＦＡ混合物を調製した。真空システムに接続したフィルターを有するシリンジに所定量のペプチジルレジンを入れ、これにスカベンジャーの酸性混合物を加えて時折撹拌しながら室温で２〜３時間レジンと接触させた。この時間の経過後、レジンを濾過してＴＦＡで３回洗浄し、濾液と洗浄物を試験管に回収した。始めにＴＦＡを窒素にて蒸発させた後、冷やしたジエチルエーテルを加えて白色の沈殿物（遊離ペプチド）を得た。沈殿物を３０００ｒｐｍで１５分遠心し上清を捨て、この工程を更に５回繰り返した。最後に窒素により固体生成物から残留エーテルを除去した。これをペプチドの溶解度に応じて水または１０％酢酸に再溶解して凍結乾燥し、完全に乾燥した原料遊離ペプチド生成物を得た。
【００７２】
実施例４：固相中でのペプチド配列の疎水性誘導
脂肪酸のカルボキシル基にアミド結合を形成することによってＦｍｏｃアミノ酸と同様に脂肪酸を前記配列に導入した。
【００７３】
真空ポンプに接続されたフィルターを有するシリンジに所定量のペプチジルレジンを入れ、ＤＭＦで膨潤させた。次いでＦｍｏｃ基を脱保護した。脱保護の完了後、対象とするペプチド配列に応じてＤＰＣＤＩ／ＨＯＢｔまたはＴＢＴＵ／ＤＩＥＡ／ＨＯＢｔ合成試薬とともに各脂肪酸を２．５倍の過剰量で加えた。合成を行った際と同様、ニンヒドリン試験によって遊離アミン基の消失を確認して反応の終了を確認した。
【００７４】
遊離疎水性誘導体を得るため、最初のペプチド配列をレジンから分離した際に用いた条件と同じ条件下でペプチジルレジンをＴＦＡとスカベンジャーの同様の酸性混合物で処理した。
【００７５】
実施例５：表面をリポペプチドでコーティングしたドキソルビシン含有リポソームの調製
すべての場合において始めにＢａｎｇｈａｍにより述べられた方法にしたがって大粒径の多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を調製した。これに超音波処理を行って小粒径の一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）を得た。
【００７６】
使用した材料及び溶液はすべて無菌状態であり、無菌状態を維持するために全過程を通じて作業は層流フードの下で行った。
【００７７】
前記２つの活性配列の疎水性誘導体を有するリポソームはその組成にホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、コレステロール、及びクロマン６を含む。これを得るため以下の方法を用いた。
【００７８】
先ずＳＵＶリポソームを調製した。ＰＣ、ＰＧ、コレステロール、及びクロマン６を秤量してクロロフォルムに溶解し、回転式エバポレータで溶媒を蒸発させて脂質膜を形成した。残留溶媒は１時間の凍結乾燥によって完全に除去した。
【００７９】
この時間の経過後、得られた膜を１ｍｌの０．９％ＮａＣｌにて水和し、得られた球状体を１時間６０℃の浴中においた。得られたＭＬＶリポソームに濃度２ｍｇ／ｍＬ（２．４ｍｇ）のドキソルビシン溶液を１．２ｍｌ加えた。調製物を６０℃の浴中に１５分静置した後、球状体を真空自由回転式エバポレータに入れ２０分間ゆっくり回転させた。
【００８０】
ＳＵＶリポソームを得るため、超音波浴中でＭＬＶに各サイクル２分ずつの超音波処理を５分の静置間隔をおいて８サイクル行なった。その間ＭＬＶは６０℃の浴中に静置した。
【００８１】
２００μＬのリポソーム、２００μＬの０．９％ＮａＣｌ、及び１２μＬのリポペプチドのＤＭＳＯ溶液（ｃ＝１０ｍｇ／ｍｌ）を混合してリポペプチドを取り込んだ。混合物は６０℃で１時間静置した後、室温で更に３０分静置した。
【００８２】
別の方法として、初めからリポペプチドを取り込んだリポソームを調製した。ＰＣ、ＰＧ、コレステロール、及びクロマン６の各脂質をクロロフォルム／メタノールに溶解したリポペプチドと上記の例と同じモル比で混合した。それ以外は前述の場合と同様の処理を行った。
【００８３】
最後に、封入されずに残ったドキソルビシンと取り込まれずに残ったリポペプチドを除去するため、試料をＰＤ−１０カラム（セファデックスＧ−２５）にかけた。このため最初に０．９％ＮａＣｌにてカラムを平衡化した。平衡化の後、試料を流してやはり０．９％ＮａＣｌでカラムから溶出した。これにより最大２ｍＬのリポソームを得た。
【００８４】
この処理の後、ドキソルビシンが導入された以下のリポソームを得た。
【００８５】
【表３】
2004510811.tif 000004
【００８６】
実施例６：表面をリポペプチドでコーティングしたパクリタキセル含有リポソームの調製
すべての場合において始めにＢａｎｇｈａｍにより述べられた方法にしたがって大粒径の多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を調製した。これに超音波処理を行って小粒径の一枚膜リポソームを得た。
【００８７】
使用した材料及び溶液はすべて無菌状態であり、無菌状態を維持するために全過程を通じて作業は層流フードの下で行った。
【００８８】
前記２つの活性配列の疎水性誘導体を有するリポソームはその組成にホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、及びコレステロールを含む。これを得るため以下の方法を用いた。
【００８９】
先ずＳＵＶリポソームを調製した。ＰＣ及びコレステロールを秤量してクロロフォルムに溶解し、回転式エバポレータで溶媒を蒸発させて脂質膜を形成した。残留溶媒は１時間の凍結乾燥によって完全に除去した。
【００９０】
この時間の経過後、得られた膜を１ｍＬの０．９％ＮａＣｌにて水和し、得られた球状体を１時間６０℃の浴中においた。得られたＭＬＶリポソームに濃度０．５ｍｇ／ｍＬ（０．６ｍｇ）のパクリタキセル溶液を１．２ｍＬ加えた。調製物を６０℃の浴中に１５分静置した後、球状体を真空自由回転式エバポレータに入れ２０分間ゆっくり回転させた。
【００９１】
ＳＵＶリポソームを得るため、超音波浴中でＭＬＶに各サイクル２分ずつの超音波処理を５分の静置間隔をおいて８サイクル行なった。その間ＭＬＶは６０℃の浴中に静置した。
【００９２】
２００μＬのリポソーム、２００μＬの０．９％ＮａＣｌ、及び１２μＬのリポペプチドのＤＭＳＯ溶液（ｃ＝１０ｍｇ／ｍｌ）を混合してリポペプチドを取り込んだ。混合物は６０℃で１時間静置した後、室温で更に３０分静置した。
【００９３】
別の方法として、初めからリポペプチドを取り込んだリポソームを調製した。ＰＣ、ＰＧ、及びコレステロールの各脂質をクロロフォルム／メタノールに溶解したリポペプチドと上記の例と同じモル比で混合した。それ以外は前述の場合と同様の処理を行った。
【００９４】
最後に、封入されずに残ったパクリタキセルと取り込まれずに残ったリポペプチドを除去するため、試料をＰＤ−１０カラム（セファデックスＧ−２５）にかけた。このため最初に０．９％ＮａＣｌにてカラムを平衡化した。平衡化の後、試料を流してやはり０．９％ＮａＣｌでカラムから溶出した。これにより最大２ｍＬのリポソームを得た。
【００９５】
この処理の後、パクリタキセルが導入された以下のリポソームを得た。
【００９６】
【表４】
2004510811.tif 000005
【００９７】
実施例７：細胞接着試験
ラミニン１と各合成ペプチド（５０ｍｇ／ウェル）の溶液をＴＰＰ（スイス）製９６穴組織培養プレートの各ウェル中に固定した。ウェルは一晩室温で乾燥させた。ウェルは使用前にカルシウム及びマグネシウムイオンを含まない生理的食塩水で洗浄した。残存するポリスチレンのフリーラジカルは１％ＢＳＡ溶液でブロックした。
【００９８】
この溶液は培養され、ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０の５１Ｃｒ細胞で標識された。標識細胞をラミニンと各合成ペプチドが入ったウェルに入れた（１ｃｐｍ／ウェル）。
【００９９】
３７℃で３０分培養した後、未接着の細胞を洗浄により除去した。接着細胞は平滑化し、放射能を測定した。具体的な接着率を添付の図１に示した。
【０１００】
実施例８：Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのラミニンペプチドによるラミニン（完全な分子）への細胞接着の阻害
実施例１で述べた処理の後、５１Ｃｒで標識したＨＴ１０８０細胞を１μｇのラミニンでコーティングしたウェル（０．３２ｃｍ２）に接着させた。接着した細胞は、異なる濃度のラミニンの合成ペプチドフラグメントとともに培養した。結果を図２に示した。
【０１０１】
実施例９：腫瘍細胞のラミニンペプチドの特異的受容体に作用するドキソルビシンリポソームの分裂抑制効果
ドキソルビシンの分裂抑制効果を以下に述べるＭＴＴ法により分析した。指数増殖期の培養から得られたＨＴ１０８０細胞を０．３６ｃｍ２のウェル（ＴＰＰ（スイス）製９６穴組織培養プレート）にウェル当たり５０００個の細胞密度で播いた。１日後に細胞を洗浄しドキソルビシン含有リポソームとともに２時間培養した。同じ薬剤濃度で異なるリポソーム製剤を使用し、（ドキソルビシン濃度を０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲で高くした）複数のウェルで試験を行った。培養後、ＰＢＳで細胞を５回洗浄し完全培地中で３日間培養した。この培養期間の後、各ウェルに１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（テトラゾリウム塩、Ｓｉｇｍａ社）を含むＰＢＳを５０μＬづつ加え、更に４時間培養した。生細胞においてのみ見られる、テトラゾリウム塩の還元によって生成するホルマザンの細胞内結晶をＤＭＳＯに溶解した。このＤＭＳＯ溶液の５４０ｎｍでの吸光度を測定することによって代謝活性を有する細胞数を推定した。
【０１０２】
細胞分裂抑制率を式（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００から計算した。ただしＡはコントロール培地中で培養した腫瘍細胞における吸光度であり、Ｂはリポソーム製剤とともに培養した腫瘍細胞における吸光度である。
【０１０３】
求めた細胞分裂抑制率の結果を図３に示した。
【０１０４】
−結果は、それぞれ３重に行った３つの独立した実験における平均±標準偏差を示す。
【０１０５】
−ＩＣ５０はコントロールロットと比較して５０％の細胞が生存する薬剤濃度として定義される。
【０１０６】
−Ｐ＞０．０５：スチューデント検定ｔ
実施例１０：腫瘍を有する動物に遊離薬剤またはリポソーム製剤（ＰＣ／ＰＧ／Ｃｈｏｌ／ミリストイル−ＡＡＡＡＡＣＹＥＳＩＫＶＡＶＳ）／ドキソルビシン）として投与したドキソルビシンの生体内分布
動物：　動物産地としてＩＦＦＡ　ＣＲＥＤＯ社（リヨン、フランス）より入手した免疫抑制ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを用いて試験を行った。動物は無病原体条件下、層流キャビン内で飼育し、８週齢に達した時点で使用した。
細胞培養条件：　１０％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、可欠アミノ酸、Ｌ−グルタミン、及びビタミン溶液（ＧＩＢＣＯ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を添加したＨａｍ’ｓＦ−１２培地（ＧＩＢＣＯ、グランドアイランド、ニューヨーク州）でＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞を培養した。
培養細胞はプラスチック容器に入れ、加湿したインキュベータで３７℃にて５％ＣＯ２／９５％空気中で培養した。細胞系はマイコプラズマ感染がないことを確認した。
【０１０７】
サブコンフルエンス（５０〜７０％のコンフルエンス）に達した培養からトリプシン（０．２５％）及びＥＤＩＴＡ（０．０２％）処理により腫瘍細胞を回収した。細胞は補足培地中で洗った後、注射用にハンクス液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した。このｉｎ　ｖｉｖｏ実験では生存率（トリパンブルー染色で判定）が９０％以上である単一細胞懸濁液のみを使用した。
生体内分布試験：　ＨＢＳＳ中で１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度としたＨＴ−１０８０細胞を同量の１０ｍｇ／ｍＬ液状マトリゲル（コラボレイティブ　バイオメディカル　プロダクト社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）と予め混合した。得られた懸濁液の０．０２ｍＬをマウスの左前肢側部に皮下接種した。腫瘍の成長を毎週２回観察した。腫瘍体積が１ｃｍ３に達した時点（細胞注入の２５日後）でマウスにドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）をリポソーム製剤または遊離薬剤の形態で単回静脈内投与した。薬剤の投与から３０分、５時間、及び２４時間後にマウスを殺して腫瘍組織及び血漿の試料を採取した。結果を図４及び図５に示した。
【図１】
2004510811.tif 000006
【図２】
2004510811.tif 000007
【図３】
2004510811.tif 000008
【図４】
2004510811.tif 000009
【図５】
2004510811.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004510811.tif 000011
2004510811.tif 000012
2004510811.tif 000013
2004510811.tif 000014
2004510811.tif 000015
2004510811.tif 000016
2004510811.tif 000017
2004510811.tif 000018
2004510811.tif 000019
2004510811.tif 000020
2004510811.tif 000021
2004510811.tif 000022
2004510811.tif 000023
2004510811.tif 000024
2004510811.tif 000025
2004510811.tif 000026
2004510811.tif 000027
2004510811.tif 000028
2004510811.tif 000029
2004510811.tif 000030
2004510811.tif 000031
2004510811.tif 000032
2004510811.tif 000033
2004510811.tif 000034
2004510811.tif 000035
2004510811.tif 000036
2004510811.tif 000037
2004510811.tif 000038
2004510811.tif 000039
2004510811.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成14年4月5日(2002.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤を封入したリポソームにおいて、該リポソームは、脂質フラグメント、活性オリゴペプチド、及びこれら２つのフラグメントの間に挿入されるオリゴペプチドスペーサーの３つのサブ構造（図３）からなるリポペプチドにてコーティングされていることを特徴とする抗癌剤封入リポソーム。
【請求項２】
前記コーティングリポペプチドの前記脂質フラグメントは炭素鎖の長さがＣ６〜Ｃ２０である脂肪酸であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項３】
前記コーティングリポペプチドの前記脂質フラグメントは好ましくはデカノイル、ミリストイル、またはステアロイルである請求項１及び２に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項４】
前記コーティングリポペプチドの前記活性配列フラグメントはＳＩＫＶＡＶＳであることを特徴とする請求項１乃至３に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項５】
前記コーティングリポペプチドの前記活性配列フラグメントと前記脂質フラグメントとの間に挿入される前記オリゴペプチドスペーサーはアミノ酸残基５〜１０個分の長さを有することを特徴とする請求項１乃至４に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項６】
前記コーティングリポペプチドの前記活性配列フラグメントと前記脂質フラグメントとの間に挿入される前記オリゴペプチドスペーサーは、以下の配列、ＡＡＡＡＡＣＹＥ、ＳＳＡＡＡＣＹＥ、またはＲＫＥＲＫＥＣＹＥのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至５に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項７】
薬剤に対するリポソームを形成する全脂質の比が２０：１〜２：１であり、好ましくは１０：１であることを特徴とする請求項１乃至６に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項８】
リポソームの脂質成分は天然及び合成物由来のリン脂質及びコレステロールであることを特徴とする請求項１乃至７に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項９】
前記リン脂質は好ましくは正味電荷が０であるホスファチジルコリン、及び負に帯電した別のリン脂質、好ましくはホスファチジルグリセロールであることを特徴とする請求項１乃至８に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１０】
前記負帯電リン脂質に対する前記中性リン脂質の比が１０：２〜１０：１０であり、好ましくは１０：７〜１０：１０であることを特徴とする請求項１乃至９に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１１】
全脂質量に対するコレステロールの比率が０〜５０％、好ましくは３５〜５０％であることを特徴とする請求項１乃至１０に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１２】
必要に応じて脂質過酸化阻害剤を含有することを特徴とする請求項１乃至１１に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１３】
前記脂質過酸化阻害剤は、３，４−ジヒドリド−２，２−ジメチル−６−ヒドロキシ−７−メトキシ−２Ｈ−１−ベンゾピランのような、ＢＨＴ、クロマンまたはクロメンなどの薬剤としての使用が認められた抗酸化剤であるビタミンＥまたは酢酸ビタミンＥなどのビタミン類及びその誘導体であることを特徴とする請求項１乃至１２に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１４】
全脂質量に対するコーティングリポペプチドの比率が０．１％〜３０％、好ましくは１％〜１５％であることを特徴とする請求項１乃至１３に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１５】
平均粒径が５０ｎｍ〜２５０ｎｍであることを特徴とする請求項１乃至１４に記載の抗癌剤封入リポソーム。
【請求項１６】
前記封入抗癌剤は、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体；チオテパなどのエチレンイミン類；カルムスチンなどのニトロソ尿素；テモゾロミドまたはダカルバジンなどのリースト剤；メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤；チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体；フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体；ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体；エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体；ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体；ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質；シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物；リツキシマブなどのモノクローナル抗体；ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミドなどの他の抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項１乃至１５に記載のリポソーム。
【請求項１７】
悪性腫瘍を治療すべくヒトまたは他の哺乳動物に静脈内投与するための請求項１乃至１６に記載のリポソーム封入抗癌剤の使用。
【国際調査報告】
2004510811.tif 000041
2004510811.tif 000042
2004510811.tif 000043
2004510811.tif 000044
2004510811.tif 000045
2004510811.tif 000046
2004510811.tif 000047
2004510811.tif 000048