(57)【要約】ＤＰＰＩＶに対し有意な配列相同性を有する新規タンパク質またはポリペプチド、それらをコードする核酸、それらのタンパク質を発現するようにそのような核酸で改変された細胞、それらのタンパク質に対する抗体、それらのタンパク質または関連タンパク質の活性の阻害剤である新たな治療薬を発見するためのスクリーニング方法、およびそのようなスクリーニング方法によって発見された治療薬、ならびに新たな治療的措置をすべて提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、３および５のうち１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、または（ｂ）それらと少なくとも約７０％類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、しかも同じ生物学的機能を示すか、
または、配列番号２、４および６のうち１つの選択的スプライスバリアントであり、または
（ａ）もしくは（ｂ）をコードする前記核酸からの少なくとも１４個の隣接ヌクレオチドを含むプローブであるか、または
前記のいずれか１つに相補的である
ことを特徴とする単離核酸。
【請求項２】
ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の単離核酸。
【請求項３】
配列番号２、４および６のいずれか１つの全長を含むＤＮＡ転写物であるか、または配列番号２、４および６のうち１つの全コード領域に相補的であることを特徴とする請求項１に記載の単離核酸。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを対象とすることを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２、４および６のいずれか１つの全長を含むＲＮＡ転写物であることを特徴とする請求項１に記載の単離核酸。
【請求項６】
配列番号２、４および６のうち１つの選択的スプライスバリアントであることを特徴とする請求項１に記載の単離核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸によってコードされることを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１、３および５のうち１つと少なくとも約９０％類似しているアミノ酸を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１に記載の単離核酸。
【請求項９】
配列番号１、３および５のうち１つと少なくとも約９５％類似しているアミノ酸を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１に記載の単離核酸。
【請求項１０】
配列番号１、３および５のうち１つと少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項１に記載の単離核酸。
【請求項１１】
配列番号２、４および６のうち１つからの少なくとも１４個の隣接ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１による核酸プローブ。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸に加えてそれらの発現を操作するために前記核酸と実施可能に連結された発現制御要素を含むことを特徴とする単離組換えポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】
動作可能にプロモーターと連結された配列番号１、３および５のいずれか１つで示される全アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項１に記載の核酸を含み、前記発現ベクターは適合する宿主細胞中に存在することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１４】
配列番号１、３または５のアミノ酸配列の少なくとも成熟タンパク質部分をコードする請求項１に記載の核酸の挿入により遺伝子組み換えされたことを特徴とする哺乳類、昆虫または細菌宿主細胞。
【請求項１５】
配列番号１、３および５のうち１つの成熟タンパク質部分を含むポリペプチドの産生方法であって、その方法は、前記ポリペプチドの産生に十分な条件下で請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドは前記細胞の表面において発現され、培養液からポリペプチドまたはその断片を回収するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
任意選択的に、グリコシル化されていてもよく、かつ
（ａ）配列番号１、３および５のいずれか１つで示される成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し；（ｂ）（ａ）の成熟タンパク質のうち１つと少なくとも約７０％の類似性を有する成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し、かつ同じ生物学的機能を示し；（ｃ）配列番号１、３および５のいずれかの成熟タンパク質と少なくとも約９０％の同一性を有する成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し；または（ｄ）（ａ）の免疫学的に反応性の断片である
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１８】
（ａ）の成熟タンパク質と少なくとも約９５％の類似性を有する成熟タンパク質であることを特徴とする請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
（ａ）の成熟タンパク質と少なくとも約９５％の類似性を有する成熟タンパク質であることを特徴とする請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号１、３および５のうち１つの成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し、またはそれぞれの成熟タンパク質と同じ生物学的機能を示すそれらの断片であることを特徴とする請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１７、１８および１９に記載の前記成熟タンパク質のうち１つの生物学的機能を阻害することを特徴とするＤＰＲＰアンタゴニスト。
【請求項２２】
請求項１７に記載のポリペプチドまたは断片を認識することを特徴とする抗体。
【請求項２３】
配列番号１または３または５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識することを特徴とする請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
請求項１７に記載の少なくとも１つの成熟タンパク質の酵素活性を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、１個または複数の試験化合物またはその塩の存在下で前記成熟タンパク質および前記成熟タンパク質に適した基質をインキュベートすること、前記成熟タンパク質の酵素活性を測定すること、前記活性を試験化合物の不存在下で測定された同様の活性と比較すること、および酵素活性を低下させる１種または複数の試験化合物を選択することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の成熟タンパク質の少なくとも１つの酵素活性を阻害せず、ＤＰＰＩＶの酵素活性を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、１個または複数のＤＰＰＩＶの阻害剤またはその塩の存在下で前記成熟タンパク質および前記成熟タンパク質に適した基質をインキュベートすること、前記成熟タンパク質の酵素活性を測定すること、前記活性をＤＰＰＩＶ阻害剤の不存在下で測定された同様の活性と比較すること、および前記成熟タンパク質の酵素活性を低下させない化合物を選択することを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）に関連する新規セリンプロテアーゼ、およびこれらのプロテアーゼをコードする単離核酸に関し、これらの単離核酸はすべて、新たな治療薬の発見、プロテアーゼ活性の測定、およびこれらのプロテアーゼに対する化合物の阻害活性の測定に有用である。
【０００２】
（発明の背景）
プロテアーゼおよびペプチダーゼは、ペプチドアミド結合の加水分解を触媒する酵素である。プロテアーゼは、細菌からウイルスから哺乳類までのほぼすべての生命体において生物学的プロセスの調節に重要な役割を果たす。プロテアーゼは、例えば、消化、血液凝固、アポトーシス、免疫応答の活性化、チモーゲン活性化、ウイルス成熟、タンパク質分泌およびタンパク質輸送において重要な機能を成す。作用部位、基質優先度、および機序などの多くの基準に従ってプロテアーゼを分類することができる。したがって、例えばアミノペプチダーゼは、ペプチドのＮ末端残基において優先的に作用するが、カルボキシペプチダーゼは、Ｃ末端において優先的に作用し、エンドペプチダーゼは、２つの末端から離れた部位において作用する。カルボキシペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼの中で、ペプチジルペプチダーゼは、基質から単一アミノ酸残基を切断し、ジペプチジルペプチダーゼは、基質からジペプチド単位（２個のアミノ酸）を切断し、トリペプチダーゼは、基質から３個のアミノ酸を切断する。基質優先度は、切断部位に直接接するＮ末端のアミノ酸残基に関して発現されることが多い。例えば、トリプシン様ペプチダーゼは、塩基性アミノ酸（アルギニンまたはリジン）の次にあるペプチドを優先的に切断し、すなわち加水分解される結合は、Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｘａａ結合である。別の例として、ペプチダーゼのキモトリプシン様ファミリーは、芳香族残基に隣接するペプチドを優先的に加水分解する。機構的に、ペプチダーゼは、セリン依存性、システイン依存性、アスパラギン酸依存性または亜鉛依存性であると分類される。
【０００３】
ペプチダーゼおよびプロテアーゼは多くの生理学的プロセスの調節に関与しているため、治療薬の開発にとって魅力的な標的である。例えば、プロテアーゼおよびペプチダーゼ阻害剤は、高血圧症、凝固障害、およびウイルス感染の治療に用いられる。
【０００４】
触媒活性にセリンを利用するタンパク質分解酵素は広範に分布しており、ウイルス、細菌および真核生物に見いだされる。セリンプロテアーゼの２０を超えるファミリー（Ｓ１〜Ｓ２７で表される）が同定されており、それらは、構造類似性およびその他の機能的証拠に基づき、６種類のクラン（ｃｌａｎ）（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦおよびＳＧ）に分類されている。４種類のクラン（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣおよびＳＥ）に関しては構造が知られているが、それらは全体として無関係のようであり、セリンペプチダーゼについて少なくとも４種類、恐らくそれ以上の進化上の起源を示唆している、ＲａｗｌｉｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔｔ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１９〜６１（１９９４）。
【０００５】
プロリルオリゴペプチダーゼファミリーは、多くの進化的に関連するペプチダーゼからなり、それらの触媒活性は、セリンプロテアーゼのトリプシンファミリーと類似した電荷リレー系によってもたらされるようであるが、独立した収束進化により進化したものである。触媒機序には保存されたセリン残基が必要であることが実験的に（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテアーゼＩＩならびにブタおよび細菌ＰＥにおいて）明らかとなっている。このセリンは、触媒三つ組残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ）の一部であり、通常はこれらの酵素（約７００から８００個のアミノ酸を含むすべてのタンパク質である）のＣ末端から約１５０残基離れて位置している。
【０００６】
最も集中して研究されているプロリルオリゴペプチダーゼの１つは、ＩＩ型糖タンパク質であるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ、ＥＣ３．４１４．５）であり、これは、原形質膜の外側にあることが知られている特徴が十分に明らかにされた唯一のジペプチジルアミノペプチダーゼである。前述のように、ジペプチジルアミノペプチダーゼの特徴は、様々な小さなペプチドからＮ末端ジペプチドを切断するそれらの能力である。ジペプチジルアミノペプチダーゼは、様々な基質特異性および細胞局在化を示し、このことはペプチドプロセシングにおける各活性の様々な機能を示唆している。ＤＰＰＩＶの特徴は、最後から２番目の残基としてプロリンまたはアラニンを含むＮ末端ジペプチドを切断する能力である。ＤＰＰＩＶ遺伝子は、約７０ｋｂの長さがあり、サイズが４５ｂｐから１．４ｋｂまでの２６個のエキソンを含む。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（３，４６５ｂｐ）は、７６６個のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。活性部位配列（Ｇ−Ｗ−Ｓ−Ｙ−Ｇ）をコードするヌクレオチドは、２個のエキソン間に分割されている。このことが、プロリルオリゴペプチダーゼファミリーのゲノム組織化を古典的セリンプロテアーゼファミリーのゲノム組織化とを明確に区別している。
【０００７】
ＤＰＰＩＶは哺乳類の組織に広く分布し、腎臓、腸管上皮および胎盤に極めて多量に見いだされる（Ｙａｒｏｎ，Ａ．およびＮａｉｄｅｒ，Ｆ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．中のＣｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９３［１］、３１）。ヒト免疫系では、この酵素は、ＣＤ４＋型の活性化Ｔリンパ球によってほぼ排他的に発現され、この酵素は細胞表面抗原ＣＤ２６と同義であることが明らかにされている。ヒト生理学におけるＤＰ−ＩＶの正確な役割はいまだ完全には理解されていないが、最近の研究から、ヒトの生理学および病態生理学において、この酵素は明らかに重要な役割を有していることが明らかとなった。
【０００８】
ヒトＴ細胞上では、ＤＰＰＩＶ発現は胸腺分化の後期に現れ、ＣＤ４＋ヘルパー／メモリー集団に優先的に限定され、ＣＤ２６は、強力な共刺激Ｔ細胞活性化シグナルを送ることができる。したがって、Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ２６としても知られるＤＰＰＩＶは、ＣＤ４５チロシンホスファターゼとの会合を介する免疫応答で重要な役割を果たし、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をＴ細胞表面に結合させる能力により、Ｔ細胞をアデノシン媒介性増殖阻害から守る。さらに、ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶによるケモキネスの機能の調節は、リンパ球輸送およびＨＩＶ株の感染力にとって不可欠のようである。ＤＰＰＩＶは、Ｔ細胞活性化、細胞接着、腎臓および腸管におけるプロリン含有ペプチドの消化、ＨＩＶ感染およびアポトーシス、ならびにある種の黒色腫細胞における腫瘍形成能の調節への関与を含む多くの機能に関係している、Ｐｅｔｈｉｙａｇｏｄａ他、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２０００；１８（５）：３９１〜４００。また、ＤＰＰＩＶは、内分泌調節および代謝生理にも関与している。より具体的には、ＤＰＰＩＶは、ＧＬＰ−１のアミノ末端Ｈｉｓ−Ａｌａジペプチドを切断し、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを生成し、それによってＧＬＰ−１に対する生理学的応答を短縮する。グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、グルコース依存性インスリン分泌を引き起こすインクレチンであり、ＤＰＰＩＶによって速やかに分解され、ＤＰＰＩＶ切断の半減期が循環からＧＬＰ−１が除去される半減期よりかなり短いために、ＤＰＰ−ＩＶ阻害によるＧＬＰ−１生物活性の著しい上昇（５から１０倍）が予想される。ＤＰＰＩＶの阻害剤は、現在、２型糖尿病および耐糖能異常のための強力な治療薬として臨床的に研究されている。
【０００９】
１９９３年にはＤＰＰＩＶの様々な異なる阻害剤が知られていた。それらのうちの１つが自殺阻害剤のＮ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏ−（ニトロベンゾイル−）ヒドロキシルアミンである。もう１つは競合的阻害剤のｅ−（４−ニトロ）ベンゾキシカルボニル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏであり、もう１つはポリクローナルウサギ抗ブタ腎臓ＤＰＰＩＶ免疫グロブリンである。それ以後も他の阻害剤が開発され、米国特許第５，９３９，５６０号、第６，１１０，９４９ｍ号、第６，０１１，１５５号および第５，４６２，９２８号に詳細に記載されている。
【００１０】
そのセリン型触媒活性に加え、しかしそれに依存せず、ＤＰＰＩＶは、可溶性細胞外酵素アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）としっかり結合し、受容体として作用し、シグナル伝達を媒介すると考えられている。ＤＰＰＩＶ構造の特徴は、２個の細胞外ドメイン、α／βフォールド加水分解酵素ドメインおよび約５０個のアミノ酸の反復ベータシートからなる７枚羽根の（７−ｂｌａｄｅ）ベータ−プロペラドメインである。最近、大きさによって基質を選択するほかに、１２個の高度に保存されたシステイン残基のうち１０個を含むベータ−プロペラドメインがペプチダーゼドメインの触媒反応に寄与していることが明らかにされた。さらに、システインが豊富なドメインは、コラーゲンＩおよび細胞外ＡＤＡに対するＤＰＰＩＶの結合を担っている。また、ＤＰＰＩＶは、細胞の細胞外マトリックスとのフィブロネクチン媒介性相互作用において役割を果たしていると報告されている。最近の研究は、ＤＰＰＩＶのプロテアーゼ活性がその抗侵襲活性に必要でないのは、細胞外セリンプロテアーゼ活性を欠くＤＰＰＩＶの変異体がそのような活性を保持しているためであることを示している。
【００１１】
ＤＰＰＩＶと類似性を共有する多くのタンパク質が文献に報告されている。ＤＰＰ−Ｉ、ＤＰＰ−ＩＩ、ＤＰＰ−ＩＩＩ、ＤＰＰ−Ｘおよび線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を含むこれらのタンパク質のいくつかがクローニングされている。それらは同定され、分子クローニングおよび発現タンパク質の機能試験により、または組織抽出物における生化学的活性として特徴付けられている。ＤＰＰＩＶとの機能的類似性を備えるＤＰＰＩＶ−ベータおよびその他の新規ペプチダーゼは未だにクローニングされていない。プロリルオリゴペプチダーゼのファミリーのさらなるメンバーの同定、特徴付けおよび／または適切な分類、それらの生理学的（および特に病態生理学的）役割の解明、ならびに新たな治療薬の開発への知識の応用は有意義な挑戦である。
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、ＤＰＰＩＶに関連するタンパク質のファミリーのうち３種類の新規メンバーを構成するプロリルオリゴペプチダーゼ（プロリン後切断）活性を持つタンパク質であって、完全長タンパク質、選択的スプライスフォーム、サブユニット、および変異体を含むタンパク質、ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、上記タンパク質の基質、相互作用タンパク質、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤をスクリーニングする方法を提供し、さらにタンパク質および／または変異体、それらの誘導体および／または類縁体および／またはそれらに対するリガンドを含む薬剤組成物を提供する。
【００１３】
ＤＰＰＩＶと有意な配列相同性を有するこれらの新規タンパク質をジペプチジルペプチダーゼＩＶ関連タンパク質１、２および３（ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２およびＤＰＲＰ−３）と呼ぶ。ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２およびＤＰＲＰ−３のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯＳ：）：１、３および５に示す。これらのタンパク質をコードする核酸配列をさらに開示する（配列番号２、４および６）。表１は、新規タンパク質ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２およびＤＰＲＰ−３およびその他の知られているセリンプロテアーゼ間の相同性（すなわち類似性）を表している。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２とＤＰＰＩＶ間の最大の相同性はＣ末端配列に見られる。ＤＰＰＩＶとの配列相同性に基づき（図１を参照）、これらのＤＰＲＰタンパク質は酵素としての役割を含むが、それらに限定されない機能を有することが予想されるであろう。クローニング、発現、生化学的および分子化学的特徴付けはこの仮説を裏付けた。
【００１６】
ＤＰＲＰの発現パターンならびに特殊化された上皮細胞および形質細胞（ライディッヒ細胞、前立腺上皮細胞、リンパ球、Ｂ細胞）への局在化は、分化、増殖および炎症における役割と一致している。ホルモン感受性癌（乳癌、前立腺癌、精巣癌）、テストステロンによって調節される組織におけるＤＰＲＰ−１遺伝子の局在化、および分化が不十分な癌における大量の発現は、ＤＰＲＰを活性化または阻害する分子が、無秩序な成長、分化およびステロイドまたはポリペプチドホルモン合成および分解を特徴とする障害の治療において多くの治療用途を有していることを示している。本明細書に開示されるデータは、ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２が、当業者によく知られている前立腺癌および精巣癌のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの増殖の調節に関与している仮説を裏付けている。
【００１７】
本明細書に記載のＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２活性ならびにそれらの発現パターンは、ペプチドおよびケモキネスのような生化学的メディエーターの酵素修飾を介し、免疫系および神経内分泌系の生理学的レギュレーターとしての機能的役割を有することと一致する。阻害剤の使用法に基づきＤＰＰＩＶについて前述した多くの機能は、その作用およびＤＰＲＰのような類似したタンパク質の作用に部分的に起因していると思われる。したがって、ＤＰＰＩＶ、ＤＰＲＰおよびＦＡＰのようなその他の関連プロテアーゼの選択的かつ強力な阻害剤を発見することは、それらの阻害剤および新たに同定されるセリンプロテアーゼ阻害剤、ならびにそのようなタンパク質の機能を改変するその他の活性化合物の有効かつ安全な薬剤使用法を実現する中核を成すと考えられる。
【００１８】
したがって、本発明は、新規タンパク質またはポリペプチド、それらをコードする核酸、これらのタンパク質を発現するようにその核酸で改変された細胞、これらのタンパク質に対する抗体、これらのタンパク質の活性の阻害剤である（またはＤＰＰＩＶの阻害剤であるがタンパク質ではない）新たな治療薬を発見するためのスクリーニング方法、およびそのようなスクリーニング方法によって発見される治療薬を提供する。新規タンパク質およびそれらをコードする核酸を用い、例えば生殖障害、炎症性障害および代謝性障害などのある種の疾患を治療するための新たな治療薬を発見することができ、治療上または診断的価値を有する抗体の調製にも使用することができる。
【００１９】
本発明の一態様によれば、主にヒト起源の新規な成熟した生物活性タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、標準的技法により適当な動物（ヒトを含む）組織または体液から少量単離してもよい。しかしながら、そのタンパク質を発現するように遺伝子が組み換えられた細胞の培養液中でより大量に調製することがより好都合である。
【００２０】
本発明のもう１つの態様によれば、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのゲノムＤＮＡを含む単離核酸分子を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、本発明の核酸配列と特異的にハイブリッド形成するのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブを提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の態様によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける科学的研究、例えばＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に有用なこのようなポリペプチドを製造するために組み換え技法を利用するプロセスを提供する。このようなポリペプチドを製造するためのプロセスには、このようなポリペプチドおよび／または成熟タンパク質をコードする核酸配列を含むＤＮＡベクターが形質移入された組み換え原核生物および／または真核生物の宿主細胞を、このようなタンパク質の発現を促進する条件下で培養することと、続く発現産物のこのようなタンパク質または断片の回収が含まれる。
【００２３】
さらにもう１つの態様によれば、本発明は、ＤＰＲＰポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法を提供し、その使用法には、細菌、真菌、原虫およびウイルス感染などの感染、特にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２による感染、疼痛、糖尿病、性早熟症、不妊症、肥満症、食欲不振、過食症、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、ホルモン感受性およびアンドロゲン非依存性癌を含む癌、片頭痛、嘔吐、不安を含む精神障害および神経障害、精神分裂病、躁鬱病、うつ病、痴呆、および重症精神遅滞、ならびに運動障害（以降はまとめて「疾患」と呼ぶ）の治療が含まれる。
【００２４】
本発明のさらにもう１つの態様によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それらの成熟タンパク質の生物活性を、例えばＮ末端ジペプチドを切断することにより阻害する化合物の発見に利用するプロセスを提供し、そのような阻害剤も提供する。
【００２５】
より具体的な態様では、本発明は、（ａ）配列番号１、３および５のうち１つのアミノ酸配列が含まれるポリペプチド、（ｂ）それらと少なくとも約７０％類似し、同一の生物学的機能を示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、または配列番号２、４および６のうち１つの選択的スプライスバリアントである、または（ａ）もしくは（ｂ）をコードする前記核酸からの少なくとも１４個の隣接ヌクレオチドを含むプローブである、または前記のいずれか１つに相補的である単離核酸を提供する。
【００２６】
もう１つの具体的な態様では、本発明は、場合によりグリコシル化されていてもよく、（ａ）配列番号１、３および５のいずれか１つで示される成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し；（ｂ）（ａ）の成熟タンパク質のうち１つと少なくとも約７０％の類似性を有する成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し、同一の生物学的機能を示し；（ｃ）配列番号１、３および５のいずれかの成熟タンパク質と少なくとも約９０％の同一性を有する成熟タンパク質のアミノ酸配列を有し；または（ｄ）（ａ）の免疫学的に反応性の断片であるポリペプチドを提供する。
【００２７】
さらにもう１つの具体的な態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの成熟タンパク質の酵素活性を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、前記成熟タンパク質および前記成熟タンパク質に適した基質を１個または複数の試験化合物またはその塩の存在下でインキュベートすること、前記成熟タンパク質の酵素活性を測定すること、試験化合物の存在下で測定された同様の活性を前記活性と比較すること、および酵素活性を低下させる１種または複数の試験化合物を選択することを含む方法を提供し、また、本発明は、１個または複数のＤＰＰＩＶの阻害剤またはその塩の存在下で少なくとも１個の成熟タンパク質および適当な基質の酵素活性を阻害しないＤＰＰＩＶの酵素活性を阻害することができる化合物をスクリーニングすること、前記成熟タンパク質の酵素活性を測定すること、ＤＰＰＩＶ阻害剤の存在下で測定された同様の活性を前記活性と比較すること、および前記成熟タンパク質の酵素活性を低下させない化合物を選択することに関する方法を提供する。
【００２８】
本発明のこれらの態様またはその他の態様は以下の詳細な説明により当業者には明らかになるはずである。
【００２９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の一態様によれば、単離核酸配列（ポリヌクレオチド）を提供し、これらは３種類のＤＰＲＰ（配列番号１、３および５）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードする。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（ＤＰＲＰ−１）、ヒト大腸ライブラリー（ＤＰＲＰ−２）およびヒト視床下部ｃＤＮＡライブラリー（ＤＰＲＰ−３）を用いて発見された。ＤＰＲＰ−１の単離核酸は、長さが約８８２個のアミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ヒトＤＰＰＩＶと構造的に関連し、ヒトＤＰＰＩＶタンパク質配列全体にわたり２６％の同一性および４１％の類似性を示す。ＤＰＲＰ−２の単離核酸は、約８６４個のアミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、全ＤＰＰＩＶアミノ酸配列と３９％類似している。疎水性プロットを用いるＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２主要アミノ酸配列の分析から、これら２種類のタンパク質は膜貫通ドメインを有していないことが予測される。この事実にもかかわらず、細胞活性化によってこれらの細胞内セリンプロテアーゼが分泌されることが可能である。休止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）細胞プロリンジペプチダーゼ（ＱＰＰ）は、リソソームとは異なる細胞内小胞を標的とするセリンプロテアーゼである（Ｃｈｉｒａｖｕｒｉ  Ｍ、他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００年１１月１５日；１６５（１０）：５６９５〜７０２）。この仮説は、ケモカイン、サイトカイン、ペプチドおよびポリペプチドの翻訳後調節に関する機序へのＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２の関与が起こりうる部位および範囲を拡大する。完全長ＤＰＲＰ−３配列は、７９６個のアミノ酸、１から４８番までのシグナルペプチド、および３４から５６番の間の膜貫通ドメインを含む。成熟タンパク質はＩＩ型膜タンパク質であると予想され、切断されて可溶体を生成することができる可能性がある。アミノ酸配列を配列番号５に示すが、これは配列番号６から推定され、ＤＰＰＩＶと５４％の類似性を有する。
【００３１】
プロリルオリゴペプチダーゼ酵素サブファミリーＳ９Ｂのメンバーとこれらのポリペプチドとのアミノ酸配列アラインメントは、３種類のＤＰＲＰタンパク質すべてが、ＤＰＰＩＶおよびＦＡＰと全体的に配列および構造的相同性を有していることを示している。ＤＰＲＰは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｈｉｓという順序の触媒残基および活性部位配列（Ｇ−Ｗ−Ｓ−Ｙ−Ｇ）を持つ酵素クランＳＣ（セリン求核性）のメンバーであることが予想される。
【００３２】
【表２】
2004528812.tif 000003
【００３３】
ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２、およびＤＰＲＰ−３は、古典的セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、キモトリプシンおよびサブチリシンのいずれとも配列類似性を示さない。触媒的三つ組残基の順序は、３種類の主な関連ＳＣクランファミリーで異なり、キモトリプシンではＨｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒであり、サブチリシンではＡｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒであり、プロリルオリゴペプチダーゼではＳｅｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓである。
【００３４】
表２に示すように、ＤＰＲＰ−３は、ＤＰＰＶＩと最も高い相同性を有する（６８％の相同性および５１％の同一性）。Ｗａｄａ他は、ＤＰＰＶＩ、ＤＰＰＩＶ関連タンパク質についてｃＤＮＡクローンをウシ、ラット（Ｗａｄａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１９７〜２０１（１９９２））およびヒト（Ｙｏｋｏｔａｎｉ他、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０３７〜１０３９（１９９３））脳ライブラリーから単離した。Ｗａｄａ他は、ＤＰＰＩＶとは違って、ＤＰＰＶＩにおける触媒三つ組残基が最初のセリン残基を有しないことを明らかにした。ＤＰＲＰ−３では、セリンプロテアーゼファミリーに特徴的な触媒三つ組残基中のアミノ酸のうち２個が保存されている。しかしながら、セリン残基自体はグリシンで置き換えられている。セリン残基がないことは、この部位におけるプロテアーゼ活性を妨げそうであるが、タンパク質の他の機能的ドメインによって媒介される複数のその他の機能は無傷のままである可能性がある。
【００３５】
前述のように、ＤＰＰＩＶは、そのペプチダーゼとしての触媒活性の他に、発現細胞および組織に応じて重要な機能を発揮する多機能分子である。また、ＤＰＲＰ−３およびＤＰＰＶＩは、完全な触媒三つ組残基がないにもかかわらず複数の機能を維持している可能性が高い。例えば、ＤＰＰＶＩは、ニューロンの可塑性の調節と関連づけられてきた。ＤＰＰＶＩは、海馬、視床、視床下部および被殻（ｓｔｉａｔｕｍ）で高度に発現される。さらに、ｒｕｍｐ  ｗｈｉｔｅ  Ｒｗ／Ｒｗ胚の発育停止および胚死亡率は、ＤＰＰＩＶ遺伝子の破壊に起因すると考えられている。Ｒｗ変異は、マウス第５染色体の近位部の３０ｃＭに及ぶ染色体反転と関係している。Ｒｗ染色体上のＤＰＰＶＩ遺伝子のゲノム解析は、Ｃ末端領域の有意な分画の喪失をもたらすコード領域における反転ブレークポイントを位置づけている、Ｈｏｕｇｈ  Ｒ．Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９５、１３８００〜１３８０５（１９９８）。
【００３６】
ヒトＤＰＲＰ−１遺伝子は、長さが３２６６８ｂｐであると予想されており、少なくとも２２個のエキソンおよび８個の転写物を有する。この遺伝子は、第１５染色体（ＮＴ＿０１０２６５）の１５ｑ２１．１〜１５ｑ２２．１位に位置づけている。予想される選択的スプライスバリアント転写物の長さは、６０２ｂｐから４５２３ｂｐ間と異なる（配列番号７〜２２を参照）。これは、ノーザンブロット分析により観察される複数の転写物と一致している（実施例２を参照）。転写物を表すＥＳＴは、老化線維芽細胞、Ｔリンパ球、胚中心Ｂ細胞、生殖細胞精上皮腫、精巣、メラニン細胞、子宮、卵巣乳房、多発性硬化症病変、膵臓および胎盤を含む多数の組織中に見いだされた。
【００３７】
ヒトＤＰＲＰ−２は、少なくとも２７個のエキソンおよび９個のスプライスバリアントを持つ遺伝子に属する（配列番号２３〜４０を参照）。１種類のＳＮＰが３’ＵＴＲで観察された。（８８％（３７）Ｃ対１２％（５）Ｔ）。ＤＰＲＰ−２遺伝子は、第１９染色体の領域１９ｐ１３．３に位置づけている。この位置は、多くの疾患マーカーに対するホストであり、低カルシウム尿性高カルシウム血症、ＩＩ型小脳性運動失調症、筋ジストロフィー、痙攣、アテローム性動脈硬化症感受性、乾癬、外胚葉性形成異常、および急性骨髄性白血病を含む様々な障害と関係している。ノーザンブロット分析により観察されるｍＲＮＡの遍在性分布に一致して（実施例２を参照）、ＤＰＲＰ−２は、ＥＳＴの範囲の調査の際、多種多様な組織中で発現された（例えば、肝臓、脾臓、筋肉、メラニン細胞、心臓、肺、胎盤、皮膚、膵臓、胃、脳副甲状腺で６４個を超えるＥＳＴが発現された）。
【００３８】
ヒトＤＰＲＰ−３は、少なくとも２３個のエキソンおよび２個のスプライスバリアントを持つ遺伝子に属する（配列番号４１〜４４を参照）。この遺伝子は、第２染色体（ＮＴ＿００５４４５）２ｑ１２．３〜２ｑ１４．１位に位置づけている。ＤＰＲＰ−３の転写物は、ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２のような広い分布は示さない。実施例２におけるノーザンブロットによって示されるように、ＤＰＲＰ−３発現は脳および膵臓に限定されている。ＤＰＲＰ−３ｍＲＮＡを表すＥＳＴは、多発性硬化症病変、視床下部、全脳および神経に由来する組織中に多くあり、少数の転写物が子宮および大腸に見いだされる。
【００３９】
ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２およびＤＰＲＰ−３を含むクランＳＣにおけるヒトプロテアーゼと齧歯類プロテアーゼとの関係を近隣結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇ）法（ＮＪ）を用いて分析した、ＳａｉｔｏｕおよびＮｅｉ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．、４、４０６〜５２５（１９８７）を参照。系統発生解析は、Ｓ９プロテアーゼの中で、ＤＰＲＰ−１とＤＰＲＰ−２は共に膜貫通ドメインを欠き、ＤＰＰＩＶおよびＦＡＰのような密接に関係のあるタンパク質とは区別されることを示している。しかしながら、ＤＰＰＩＶとＦＡＰの間およびＤＰＲＰ−３とＤＰＰＶＩの間には類似性が見られ、これらはすべてＩＩ型膜タンパク質である。
【００４０】
さらにＤＰＲＰ関連遺伝子についてデータベース検索することにより、ＤＰＲＰ−１に関連するマウス配列の存在が明らかとなった。このマウス配列と新規なヒトプロテアーゼのアラインメントは、ｍＤＰＲＰ−１がそのヒト対応物とかなりの相同性を示すことを示している（図２）。当業者が容易に認めるように、新規マウスプロテアーゼ遺伝子は、本明細書に開示されている配列情報を用いて単離でき、当技術分野でよく知られ、ルーチン的に用いられる発現構築物の１つへ容易に組み入れることができる。トランスジェニックマウスモデルを作製するための当業者によるこの開示配列の使用法は、例えば、マウス胚性幹細胞における相同的組換えをもたらす遺伝子標的ベクターの開発を用いている。ＤＰＲＰ遺伝子の機能をさらに分析する際にノックアウトマウスを用いることは、価値ある手段である。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であってもよく、ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれると理解すべきである。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってもよく、一本鎖であれば、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、それぞれ配列番号２、４および６で示されるコード配列と同一であるか、遺伝子コードの重複性もしくは同義性または一塩基多型の結果として、同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であってもよい。例えば、配列番号２、４および６のいずれか１つの全長を含むＲＮＡ転写物であってもよい。
【００４２】
配列番号１、３、５の成熟タンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドには、成熟タンパク質単独のコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列に加えてリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列などの追加のコード配列；および成熟タンパク質のコード配列（および任意選択的に追加のコード配列）に加えてイントロンもしくは成熟タンパク質のコード配列の非コード配列５’および／または３’などの非コード配列が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００４３】
したがって、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」または用語「ポリペプチドをコードする核酸」は、成熟タンパク質のコード配列のみが含まれるポリヌクレオチドまたは核酸ならびに追加のコード配列および／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドまたは核酸を包含すると理解されるべきである。用語ポリヌクレオチドおよび核酸は互換的に使用される。
【００４４】
また、本発明には、成熟タンパク質のコード配列が、同一のリーディングフレーム内で宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列と融合していてもよいポリヌクレオチドが含まれる。例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するために分泌配列として機能するリーダー配列が融合していてもよい。このようなリーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質またはプレプロタンパク質と呼ばれ、宿主細胞によって切断され成熟型のタンパク質を生成するリーダー配列を有することができる。これらのポリヌクレオチドは、プロタンパク質をコードするように５’拡張領域を有し、このプロタンパク質は、成熟タンパク質に加えてＮ末端における追加のアミノ酸残基である。このようなプロ配列を有する発現産物はプロタンパク質と呼ばれ、これは不活性型の成熟タンパク質であるが、ひとたびプロ配列が切断されると活性な成熟タンパク質が残る。したがって、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）を共に有するタンパク質をコードすることができる。
【００４５】
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列とフレーム内で融合したコード配列を有することができる。マーカー配列は、ポリヒスチジンタグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ｃ−ｍｙｃタグまたは哺乳類宿主、例えばＣＯＳ−１細胞を使用する場合のＶ５タグであってもよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当すると思われ（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．他、Ｃｅｌｌ、３７：７６７（１９８４））、およびｃ−ｍｙｃタグは、ヒトＭｙｃタンパク質に由来するエピトープであってもよい（Ｅｖａｎｓ，Ｇ．Ｉ．他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０〜３６１６（１９８５））。
【００４６】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、遺伝子にはコード領域の前および後にくる領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる。用語「有意な配列相同性」は、アミノ酸残基の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも４０％が保存され、非保存残基のうち、少なくとも４０％が保存的置換であることを示すことを意図している。
【００４７】
本発明の完全長遺伝子の断片は、完全長ｃＤＮＡを単離するため、ならびに遺伝子に対して有意な配列相同性を有し、類似の生物活性または機能を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする他のｃＤＮＡを単離するために、ｃＤＮＡライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。この用途のためには、類似の生物活性または機能とは、最後から２番目の残基としてＡｌａもしくはＰｒｏまたは他のアミノ酸を有するＮ末端ジペプチドを切断する能力を意味する。このタイプのこのようなプローブは、少なくとも１４個の塩基（配列番号２、４または６のうち１つに由来する少なくとも１４個の隣接ヌクレオチド）、好ましくは少なくとも３０個の塩基を有し、このようなプローブは、例えば５０個以上の塩基を含むことができる。また、このようなプローブを用い、完全長転写物に対応するｃＤＮＡクローンおよび／またはレギュレーターおよびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含む１個または複数のゲノムクローンを同定することができる。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、プローブがハイブリッド形成するライブラリーのメンバーの位置を確認するのに有用である。一例としては、知られているＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、次いでそのプローブをライブラリーのスクリーニングに用いて当該遺伝子のコード領域を単離することができる。
【００４８】
本発明は、配列間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性または類似性があり、類似の生物活性を有するタンパク質をコードする、前述の配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチドをさらに提供すると考えられる。さらに、当技術分野で知られているように、アミノ酸配列が配列中の各々の個別残基に対して同一または保存アミノ酸置換を含む場合には、２つのポリペプチド間には「類似性」が存在する。同一性および類似性は、配列解析ソフトウエア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７０５）を用いて測定することができる。特に、本発明は、厳密な条件の下で前述のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するようなポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用する用語「厳密な条件」は、ポリヌクレオチド配列と配列番号２、４および６のポリヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを可能にし、少なくとも約７０％の同一性のある条件を意味する。好適な厳密な条件は、例えばプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムアミドの濃度により、またはハイブリダイゼーション温度によって規定することができ、当技術分野でよく知られている。特に、厳密性は、塩の濃度を下げることにより、ホルムアミドの濃度を上げることにより、および／またはハイブリダイゼーション温度を上げることにより増すことができる。
【００４９】
例えば、高厳密性条件下のハイブリダイゼーションは、約３７℃から４２℃において約５０％のホルムアミドを用いることができ、低厳密性条件下のハイブリダイゼーションは、約３０℃から３５℃において約３５％から２５％のホルムアミドを用いる。高厳密性条件下でハイブリッド形成するための特定の条件設定の１つは、４２℃、５０％ホルムアミド、５ｘ．ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、および２００μｇ／ｍｌ剪断および変性サケ精子ＤＮＡを用いる。低厳密性下のハイブリダイゼーションについては、前述と類似の条件を３５℃の低温において３５％ホルムアミド中で用いることができる。特定レベルの厳密性に対応する温度範囲は、当該核酸のプリンとピリミジンの比を計算すること、およびそれに従って温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記範囲および条件に対する変更は当技術分野でよく知られている。ハイブリダイゼーションは、配列間に少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の同一性のある場合にのみ行うことが好ましい。好ましい実施形態において前述のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、配列番号２、４および６のｃＤＮＡのうち１つによってコードされる成熟タンパク質と実質的に同一の生物学的機能または活性を示すポリペプチドをコードする。
【００５０】
前述のように、好適なポリヌクレオチドプローブは、少なくとも１４個の塩基、好ましくは３０個の塩基、より好ましくは少なくとも５０個の塩基を有し、前述のようにそれらとの同一性を有し、活性を維持していても維持していなくともよい本発明のポリヌクレオチドとハイブリッド形成するはずである。例えば、このようなポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号２、４および６のポリヌクレオチドとハイブリッドを形成させ、例えば、このようなポリヌクレオチドを回収するためのプローブとして、または診断用プローブ、またはＰＣＲプライマーとして用いることができる。したがって、本発明には、それぞれ配列番号１、３および５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対し、好ましくは少なくとも３０個の塩基、より好ましくは少なくとも５０個の塩基を有するそれらの断片をコードするポリヌクレオチドに対し、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００５１】
当技術分野でよく知られているように、遺伝子コードは、２種類以上のヌクレオチドトリプレット（コドン）によって特定のアミノ酸がコードされているという点で重複性であり、本発明には、本明細書の配列中で具体的に例示されているコドンとは異なるコドンを用いて同一のアミノ酸をコードするこれらのポリヌクレオチド配列が含まれる。このようなポリヌクレオチド配列は、本明細書で「等価」ポリヌクレオチド配列と呼ぶ。さらに、本発明には、成熟タンパク質の一部またはすべて、それぞれ配列番号１、３および５の予想アミノ酸配列を有するポリペプチドのうち１つの類縁体および誘導体などの断片をコードする前述のポリヌクレオチドの変異体が含まれる。変異体形のポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体、または天然に存在しないポリヌクレオチドの変異体であってもよい。例えば、核酸中の変異体は、単に遺伝子コードの縮重によるアミノ酸のコドン配列の差であってもよく、または欠失変異体、置換変異体および付加または挿入変異体であってもよい。当技術分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、コードされたポリペプチドの生物学的機能を実質的には変化させない１個または複数のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有することができる代替形態のポリヌクレオチド配列である。
【００５２】
さらに、本発明には、配列番号１、３および５の予想アミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの断片、類縁体および誘導体が含まれる。配列番号１、３および５のポリペプチドに言及する場合の用語「断片」、「誘導体」および「類縁体」は、そのようなポリペプチドと同一の生物学的機能または生物活性を本質的に維持しているポリペプチドを意味する。例えば、類縁体には、プロタンパク質部分の切断によって活性化され活性な成熟タンパク質を生成することができるプロタンパク質が含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってもよいが、グリコシル化、または非グリコシル化組換えポリペプチドであることが好ましい。
【００５３】
それぞれ配列番号１、３および５のポリペプチドの断片、誘導体または類縁体は、（ｉ）１個または複数のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、このような置換アミノ酸残基が、遺伝子コードによってコードされている、またはされていない断片、誘導体または類縁体、（ｉｉ）１個または複数のアミノ酸残基に置換基が含まれる断片、誘導体または類縁体、または（ｉｉｉ）リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列などの成熟タンパク質に追加のアミノ酸が融合された断片、誘導体または類縁体であってもよい。このような断片、誘導体および類縁体は、当業者の範囲内にあり、本明細書の教示に基づいて提供されると見なされる。
【００５４】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離形態でなければならず、実質的な均質性または純度まで精製されていることが好ましい。実質的な均質性とは、少なくとも約８５％の純度を意味する。
【００５５】
用語「単離」は、物質がその元の環境（例えば、天然に存在する場合には自然環境）から取り出されたことを意味するために使用される。例えば、生きている動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されているとは見なされないが、同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然系に共存する物質のほぼすべてから分離されている場合には単離されていると見なされる。ＤＮＡの場合、この用語には、例えば、ベクター中に、自己複製プラスミドまたはウイルス中に、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み入れられる組換えＤＮＡ；または他の配列とは関係なく別の分子（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成したｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。また、この用語には、追加のポリペプチド配列、例えば融合タンパク質をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。さらに、配列番号２、４または６の１つで示され、ＤＰＲＰの選択的スプライスバリアントをコードするヌクレオチドの一部が含まれる組換えＤＮＡが含まれる。様々な選択的スプライスバリアントを、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６に例示する。
【００５６】
本発明のポリペプチドには、配列番号１、３および５のポリペプチド（特に成熟タンパク質における）、ならびに配列番号１、３および５のポリペプチドのうち１つと少なくとも７０％の類似性（例えば、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％の同一性）、より好ましくは配列番号１、３および５のポリペプチドのうち１つと少なくとも９０％の類似性（例えば、好ましくは少なくとも９０％の同一性）、最も好ましくは配列番号１、３および５のポリペプチドのうち１つと少なくとも９５％の類似性（例えば、好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドのいずれか１つが含まれる。さらに、少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸の配列を含むようなポリペプチドの正確な部分が含まれることが好ましい。
【００５７】
本発明のポリペプチドの断片または部分は、ペプチド合成によって対応する完全長ポリペプチドを産生するための中間体として用いてもよい。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分を用い、本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成することもできる。
【００５８】
また、本発明には、このようなポリヌクレオチドが含まれるベクター、そのようなベクターを用いて遺伝子組み換えされた宿主細胞、および前記を用いる組換え技法によるポリペプチドの産生が含まれる。宿主細胞は、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであってもよいこのようなベクターにより一般的に遺伝子組み換え（形質導入または形質転換または形質移入）される。このベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってもよい。組換え宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択しまたは本発明の遺伝子を増幅するため必要に応じて改良された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、当業者によく知られているように、発現のために選択された宿主細胞について一般的に用いられる条件である。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技法によりポリペプチドを産生するために用いてもよい。したがって、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含まれる。このようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡ、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどのウイルスＤＮＡの組み合わせに由来するベクターが含まれる。しかしながら、宿主中で複製可能かつ生存可能である限り、その他のベクターも使用することができる。
【００６０】
様々な手順のいずれかにより、適切なＤＮＡ配列をベクター中に挿入することができる。一般に、当技術分野でよく知られている手順によりＤＮＡ配列を適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入するが、この手順は当業者の範囲内にあると見なされる。
【００６１】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）と動作可能に連結され、ｍＲＮＡ合成を指揮する。このようなプロモーターの代表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰ．ｓｕｂ．Ｌプロモーターおよび原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られているその他のプロモーターを挙げることができる。また、発現ベクターは、翻訳開始および転写終結のためのリボソーム結合部位を含まなければならない。また、ベクターには、発現を増幅するのに適した配列も含まれる。さらに、発現ベクターは、真核生物細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性など、または大腸菌においてはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの、形質転換宿主細胞を選択するための表現型形質を提供するための１個または複数の選択可能なマーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【００６２】
前述の適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを用いて適切な宿主を形質転換し、宿主がタンパク質を発現することを可能にすることができる。適切な宿主の代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞；酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫などの動物細胞；アデノウイルス；植物細胞などを挙げることができる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると見なされる。
【００６３】
ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ９５／９６  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ、２１５〜２１６ページ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．９４３０３から明らかなように、核酸配列の合成的製造は当技術分野でよく知られている。したがって、本発明には、本発明のタンパク質を製造するのに有用な発現ベクターも含まれる。
【００６４】
さらに、本発明には、広く前述される１個または複数の配列を含む組換え構築物が含まれる。この構築物は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含むことができ、これらには本発明の配列が前方または後方に挿入されている。この実施形態の好ましい態様では、構築物は、例えば、配列に動作可能に連結されたプロモーターを含むレギュレーター配列を含む。多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、市販されている。例えば、以下のベクターを示す。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐブルースクリプトＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；および真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主中で複製可能かつ生存可能である限り、その他の好適なプラスミドまたはベクターを使用することができる。
【００６５】
プロモーター領域は、選択可能なマーカーと共にＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチル転移酵素）ベクターまたは他のベクターを用い、望ましいどの遺伝子からも選択することができる。２種類の適切なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に有名な細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ．ｓｕｂ．Ｒ、Ｐ．ｓｕｂ．Ｌおよびｔｒｐが含まれる。真核生物プロモーターには、極初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの範囲にある。
【００６６】
発現ベクターの構成要素には、一般的に１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８）、またはハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子、２）大腸菌複製起点、３）Ｔ７およびＳＰ６ファージプロモーター配列、４）ｌａｃオペレータ配列、５）ラクトースオペロン抑制遺伝子（ｌａｃＩｑ）および６）マルチプルクローニング部位リンカー領域が含まれる。このような複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）から誘導することができる。
【００６７】
適切な制限酵素認識部位を有し、ポリペプチド配列番号２、４および６のうち１つをコードするヌクレオチド配列は、例えば、以下の実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従い、ＤＰＲＰ−１の場合にはＫｐｎＩ（５’プライマーとして）およびＮｏｔＩまたはＳａｃＩ（３’プライマーとして）の制限酵素認識部位、またはＤＰＲＰ−２の場合にはＨｉｎｄＩＩＩ（５’プライマーとして）およびＮｏｔＩまたはＢａｍＨＩ（３’プライマーとして）の部位を用いるＰＣＲプライマーを用いて作製する。ＰＣＲ挿入断片をゲル精製し、適合する制限酵素で消化する。挿入断片およびベクターを標準プロトコルに従ってライゲーションする。
【００６８】
他の実施形態では、本発明は、前述の構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、哺乳類細胞などの高等な真核生物細胞、酵母細胞などの下等な真核生物細胞であってもよく、または宿主細胞は、細菌細胞などの原核生物細胞であってもよい。宿主細胞中への構築物の導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ媒介性形質移入、リポフェクションまたは電気穿孔法によって行うことができる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８６））。
【００６９】
宿主細胞中のこのような構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生するために従来の方法で用いられることが好ましい。あるいは、従来のペプチド合成装置により、またはそのようにして調製した好適な断片の化学的ライゲーションにより、本発明のポリペプチドを合成的に製造することができる。
【００７０】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御の下で哺乳類細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。また、無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を産生することができる。原核生物および真核生物宿主と共に用いるのに適したクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）によって記載されている。
【００７１】
高等な真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加する。エンハンサーには、プロモーター上で作用してその転写を増加させるＤＮＡ（通常は約１０から３００ｂｐ）のシス作用性因子が含まれる。その例には、転写起点ｂｐ１００から２７０の後側上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、転写起点の後側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
【００７２】
一般的に、組換え発現ベクターには、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を指揮するために高度に発現した遺伝子から誘導されるプロモーターが含まれる。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、アルファ−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などの解糖酵素をコードするオペロンから誘導することができる。異種構造配列は、適切な段階で、翻訳開始および終結配列、好ましくは翻訳タンパク質の細胞膜周辺腔または細胞外培地への分泌を方向付けることができるリーダー配列と一緒に組み立てる。場合により、異種配列は、望ましい特徴、例えば発現組換え産物の安定化または簡単な精製を付与するＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
【００７３】
細菌使用に有用な発現ベクターは、望ましいタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、機能性プロモーターにより動作可能なリーディング段階で好適な翻訳開始および終結シグナルと一緒に挿入することにより構築する。このベクターは、１個または複数の表現型選択可能マーカーならびにベクターの維持を保証し、望ましい場合には宿主内の複製を提供するための複製起点を含むものと思われる。形質転換に適した原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌およびシュードモナス属の様々な菌種、ストレプトマイセス属、ならびにブドウ球菌属が含まれるが、その他の宿主を選択して用いることができる。
【００７４】
代表的であるが非限定的な例として、細菌使用に有用な発現ベクターは、選択可能なマーカーおよびよく知られているクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子を含む市販のプラスミドに由来する細菌の複製起点を含むことができる。このような市販ベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）が含まれる。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」切片を、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と結合させる。
【００７５】
好適な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の培養後、適切な手段（例えば、温度変化または化学誘導）により選択プロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。通常は遠心分離により細胞を収集し、次いで物理的または化学的手段により破壊し、得られる粗製抽出物をさらに精製するために保持する。タンパク質の発現で用いられる微生物細胞は、凍結融解循環、超音波処理、機械的破壊および細胞溶解剤の使用を含む好都合ないかなる方法によっても破壊でき、このような方法は当業者によく知られている。
【００７６】
また、様々な哺乳類細胞培養系を用い、組換えタンパク質を発現させることができる。哺乳類発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ．２３：１７５（１９８１）によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系が含まれる。適合するベクターを発現することができるその他の細胞系には、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳類発現ベクターは、一般に複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、および必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含むものと思われる。ＳＶ４０スプライスに由来するＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を用い、必要な非転写遺伝因子を提供することができる。
【００７７】
組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む方法によりポリペプチドを回収しかつ精製することができる。細胞の表面でポリペプチドが発現されている場合には容易に回収することができるが、そのようなことは必要条件ではない。また、より長い形態のポリペプチドを発現させた後で切断産物を回収することも望ましい。必要に応じ、当技術分野で知られているタンパク質リフォールディングステップを用いて成熟タンパク質の立体配置を完成することができる。最終精製ステップには高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、精製天然生成物であってもよく、または原核生物または真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫または哺乳類細胞による）からの組換え技法により産生させてもよい。組換え産生手順に用いる宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されなくてもよい。また、本発明のポリペプチドには、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれる。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、他のタンパク質の混入が実質的にないように単離されかつ精製される。例えば、本発明のタンパク質は、サンプル中に存在する全タンパク質の少なくとも８０重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは全タンパク質の少なくとも９８重量％を構成していなければならない。
【００８０】
これらのタンパク質は、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはエタノールなどの他の好適な溶媒、または好適な溶媒の混合物中で溶液の形態であってもよい。溶媒の混合物の例には、１０（重量）％エタノール水溶液および水に溶けた２（重量）％ＤＭＳＯ水溶液が含まれる。さらに、溶液は、塩、緩衝剤、カオトロピック剤、界面活性剤、保存剤などを含むことができる。あるいは、タンパク質は凍結乾燥粉末または結晶性固体などの固体の形態であってもよく、これらは残留溶媒、塩などを含んでいてもよい。
【００８１】
本明細書で使用する用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ’タンパク質分解性断片などの抗原結合性断片が含まれる。キメラ抗体、Ｆｖ断片、単鎖抗体などの遺伝子組み換えされたインタクトな抗体または断片、ならびに合成抗原結合性ペプチドおよびポリペプチドも含まれる。ヒト以外の抗体は、ヒトフレームワークおよび定常領域上にヒト以外のＣＤＲを移植することにより、またはヒト以外の可変領域全体を組み入れることにより（場合により露出残基の置換によりヒト様表面で抗体を「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」（その結果、生成するものは「化粧被覆（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体である））ヒト化することができる。ある場合には、ヒト化抗体は、ヒト可変領域フレームワークドメイン内にヒト以外の残基を保有し、適切な結合特性を高めることができる。抗体をヒト化することにより、生物学的半減期を増加させ、ヒトへの投与の際の有害な免疫反応の可能性を軽減しなければならない。
【００８２】
本明細書で有用な抗体を作製または選択するための代替技法には、ヒトプロホルモンＤＰＲＰタンパク質またはそれに由来するペプチドへのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるリンパ球の曝露、およびファージまたは類似のベクターにおける抗体ディスプレイライブラリーの選択（例えば、固定化または標識ヒトＤＰＲＰタンパク質またはペプチドの使用による）が含まれる。潜在的なヒトＤＰＲＰポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージディスプレイ）上または大腸菌などの細菌上に示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。このようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野でよく知られている多くの方法で得ることができる。
【００８３】
当業者には明らかなように、ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットなどの様々な温血動物にヒトＤＰＲＰポリペプチドまたはその断片を接種することにより作製することができる。ヒトプロホルモンＤＰＲＰポリペプチドの免疫原生は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）またはフロイント完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバント、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ＫＬＨまたはジニトロフェノールなどの界面活性物質の使用により増加させることができる。ヒトで用いるアジュバントの中で、ＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびコリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。また、免疫化に有用なポリペプチドには、免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質とＤＰＲＰもしくはその一部の融合物などの融合ポリペプチドが含まれる。ポリペプチド免疫原は、完全長分子またはその一部であってもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合には、そのような部分をキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイドなどの巨大分子キャリアと免疫化のために好都合に結合または連結することができる。また、ＤＰＲＰに対する抗体は、当技術分野でよく知られている方法を用いて作製することができる。このような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、および単鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーにより製造される断片が含まれるが、これらだけに限定されるものではない。治療上の使用には中和抗体（すなわち、活性部位において相互作用を遮断または修正する抗体）が特に好ましい。
【００８４】
抗体を産生するために、結合タンパク質、またはＤＰＲＰと特異的に結合するペプチド、単鎖抗体のライブラリー、Ｆａｂ断片、その他の抗体断片、非抗体タンパク質ドメイン、またはペプチドをスクリーニングすることができる。これらのライブラリーは、ファージディスプレイ、その他の組換えＤＮＡ法、またはペプチド合成を用いて作製することができる（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９〜３１４（１９６６））。このようなライブラリーは、当技術分野でよく知られている方法を用いて普通にスクリーニングし、ＤＰＲＰに対して特異的結合を示す配列を同定することができる。
【００８５】
ＤＰＲＰに対する抗体を誘導するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。また、これらのオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と一致していることが好ましい。また、ＤＰＲＰアミノ酸の短いストレッチをＫＬＨなどの別のタンパク質の短いストレッチと融合させることができ、キメラ分子に対する抗体を産生することができる。
【００８６】
ＤＰＲＰに対するモノクローナル抗体は、培養における連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供するよく知られているどの技法を用いても調製することができる。これらの技法には、ハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法、およびＥＢＶハイブリドーマ技法が含まれ、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体が好ましい。
【００８７】
さらに、適切な抗原特異性および生物活性のある分子を得るためのヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングなどの「キメラ抗体」の産生のために開発された技法を用いることができる、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４〜６０８（１９８４）を参照。あるいは、単鎖抗体を産生するために記載された技法を当技術分野で知られている方法を用いて適合させ、ＤＰＲＰ特異的単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を持つが異なるイディオタイプの組成の抗体は、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからのチェインシャフリングによって作製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ．Ｒ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０〜１１１２３（１９９１））。
【００８８】
また、リンパ球集団においてｉｎ  ｖｉｖｏにおける産生を誘導することにより、または文献に記載の極めて特異的な結合試薬の免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることにより抗体を産生することができる。（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３〜３８３７（１９８９））。
【００８９】
また、ＤＰＲＰに対する特異的結合部位を含む抗体断片も作製することができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって作製されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる。（Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２７５〜１２８１（１９８９））。
【００９０】
様々な免疫学的検査法を用い、望ましい特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を持つポリクローナルまたはモノクローナル抗体のどちらかを用いる競合的結合アッセイまたは免疫放射線アッセイのための多くのプロトコルが当技術分野でよく知られている。このような免疫学的検査法は、通常、ＤＰＲＰとその特異的抗体の間の複合体形成を測定するものである。２つの非干渉ＤＰＲＰエピトープと反応するモノクローナル抗体を利用する２部位のモノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる。
【００９１】
前述のように、ＤＰＲＰを疾患の治療に用いることができる。本発明のこの態様で用いるのに適した薬剤組成物には、有効量の活性成分が含まれ、疾患の１つに関して意図した目的を達成する組成物が含まれる。治療上有効な投与量の決定は、当業者の能力で十分に行える範囲であり、最初は、細胞培養アッセイ、例えば新生細胞のアッセイ、または動物モデル、通常はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、もしくはブタのどちらでも推定することができる。また、動物モデルを用い、適切な濃度範囲および投与の経路を決定し、次いで一般的にその情報を用いてヒトにおける投与に有用な投与量および経路を決定することができる。
【００９２】
治療上有効な投与量は、疾患の特定の症状または状態を寛解させる活性成分、例えばＤＰＲＰもしくはその断片、ＤＰＲＰの抗体、またはＤＰＲＰのアゴニスト、アンタゴニストもしくは阻害剤の量を指す。例えば、投与される量は、望ましい標的基質を基質と接触して切断するのに有効であってもよい。同様に、治療上の有効性および毒性は、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な投与量）またはＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）統計値を計算することによるなどの細胞培養液中または実験動物を用いる標準的医薬手順により決定することができる。毒性効果と治療効果の投与量比は治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療係数を示す薬剤組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒト使用のための用量範囲を策定する際に使用される。このような組成物に含まれる用量は、ＥＤ５０が含まれ、毒性がほとんどまたはまったくない循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、用いられる剤形、患者の感受性、および投与の経路に応じてこの範囲内で変化する。
【００９３】
正確な用量は、通常治療を必要とする対象に関連する要素に鑑みて医師によって決定され、用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するため、または望ましい効果を維持するために調整される。考慮すべき要素には、疾患状態の重症度、対象の一般健康状態、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の併用、反応感受性、および治療法に対する耐性／応答が含まれる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じ、長時間作用性の薬剤組成物を３から４日ごとに、毎週、または２週ごとに１回投与することができる。
【００９４】
本発明のさらに別の態様は、ＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２およびＤＰＲＰ−３ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ転写物に対してアンチセンスである配列を有するポリヌクレオチド分子を提供する。アンチセンスポリヌクレオチド分子の投与は、ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ２またはＤＰＲＰ−３によってコードされるタンパク質の産生を遮断することができる。アンチセンスポリヌクレオチド分子を調製し、そのような分子を投与するための技法は、当技術分野で知られている。例えば、アンチセンスポリヌクレオチド分子を細胞との融合のためにリポソーム中に封入することができる。
【００９５】
特に、特殊化した上皮細胞、免疫細胞（リンパ球およびＢ細胞）、アストロサイトの腫瘍、および様々なホルモン感受性癌におけるＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２およびＤＰＲＰ−３の発現は、癌、異形成および転移の病態生理学における潜在的役割の証拠を提供している。したがって、他の態様では、本発明は、不適当なＤＰＲＰ活性または発現レベルに関係する疾患を検出するための診断アッセイに関する。ＤＰＲＰと特異的に結合する抗体を、ＤＰＲＰの発現を特徴とする障害を診断するため、またはＤＰＲＰもしくはＤＰＲＰのアゴニストもしくはアンタゴニスト（阻害剤）で治療される患者をモニターするためのアッセイで使用することができる。診断目的に有用な抗体は、治療薬について前述した方法と同様の方法で調製することができる。ＤＰＲＰの診断アッセイには、抗体およびヒト体液中または細胞もしくは組織の抽出物中のＤＰＲＰを検出するための標識を利用する方法が含まれる。抗体は改変の有無にかかわらず使用でき、リポーター分子との共有結合性または非共有結合性連結によって標識することができる。多種多様のリポーター分子が当技術分野では知られている。触媒的に不活性となるように改変された組換えＤＰＲＰタンパク質を優性ネガティブ阻害因子として用いることもできる。このような改変には、例えば活性部位の変異が含まれる。
【００９６】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを含む、ＤＰＲＰを測定するための様々なプロトコルが当技術分野で知られており、ＤＰＲＰ発現の変化レベルまたは異常レベルを診断するための基礎を提供する。ＤＰＲＰ発現の正常値または標準値は、正常な哺乳類対象、好ましくはヒトから得られる体液または細胞抽出物を、複合体形成に適した条件の下でＤＰＲＰに対する抗体と合わせることによって確立される。生物学的サンプル中のＤＰＲＰを検出する方法は、ａ）生物学的サンプルを提供するステップと、ｂ）ＤＰＲＰと抗体の間で複合体形成を起こさせるのに適した条件の下で生物学的サンプルと抗ＤＰＲＰ抗体を合わせるステップと、ｃ）ＤＰＲＰと抗体の間の複合体形成を検出することにより、生物学的サンプル中のＤＰＲＰの存在を証明するステップとを含む。次いで、複合体形成の量を様々な方法により、好ましくは測光手段により定量することができる。対象、対照、および生検組織からの疾患サンプル中で発現されたＤＰＲＰの量を標準値と比較する。標準値と対象値の間の偏差が診断している疾患のパラメータを確立する。
【００９７】
本発明の別の実施形態では、ＤＰＲＰをコードするポリヌクレオチドが診断目的に用いられ、ポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、ならびにＰＮＡが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用い、ＤＰＲＰの発現が疾患の１つと相関している可能性がある生検組織中の遺伝子発現を検出しかつ定量することができる。診断アッセイを用い、ＤＰＲＰの不存在、存在、および過剰発現を区別し、治療的介在中のＤＰＲＰレベルの調節をモニターすることができる。さらに、ＤＰＲＰ遺伝子に関する薬理ゲノム学的な一塩基多型（ＳＮＰ）の解析は、疾患になりやすい素因または薬物に対する応答変化を示す変異体をスクリーニングするための方法として用いることができる。
【００９８】
ＤＰＲＰポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、それらの断片、ＤＰＲＰの抗体、ならびにＤＰＲＰのアゴニスト、アンタゴニストもしくは阻害剤を発見ツールとして用い、分子認識事象ならびにＤＰＲＰタンパク質と相互作用するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを同定することができる。具体例はファージディスプレイペプチドライブラリーであり、１回のパンニングで１０８個を超えるペプチド配列をスクリーニングすることができる。このような方法ならびにその他の方法は、当技術分野で知られており、それらを利用してＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２またはＤＰＲＰ−３活性を阻害または高める化合物を同定することができる。カップリングした結合は、複合体または経路などの機能的相互作用を表し、ＤＰＲＰと相互作用するタンパク質は、酵母の２つのハイブリッド系、プロテオミクス（示差２Ｄゲル分析および質量分析法）およびゲノミクス（マイクロアレイによる示差的遺伝子発現または遺伝子発現ＳＡＧＥの逐次解析）により同定することができる。機能的にＤＰＲＰと連結すると同定されたタンパク質および相互作用のプロセスは、これらのＤＰＲＰ−タンパク質相互作用の阻害剤、アゴニストおよびアンタゴニストならびにモジュレーターをスクリーニングする方法の基礎を形成する。
【００９９】
本明細書で使用する用語「アンタゴニスト」は、ＤＰＲＰと結合した場合に、ＤＰＲＰの生物活性または免疫活性効果の量または期間を減少させる、例えば、Ｎ末端ジペプチドを切断するペプチダーゼの酵素活性を低下させる阻害剤分子を指す。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、ＤＰＲＰの効果を減少させるその他の分子が含まれ、例えば、競合型または非競合型機序によりＤＰＲＰと結合しかつＤＰＲＰを不活性化する小さな分子および有機化合物が含まれる。ＤＰＲＰテトラペプチドペプチド酵素活性阻害剤の具体例を実施例６および７に記載する。阻害剤は、例えばＤＰＲＰプロテアーゼ活性の阻害剤か、またはそれらが相互作用するタンパク質に対するＤＰＲＰの結合活性の阻害剤であってもよい。このような阻害剤の具体例には、例えば抗ＤＰＲＰ抗体、ペプチド、タンパク質断片、または小さなペプチジルプロテアーゼ阻害剤、または望ましい細胞タイプ中への導入を可能にする媒体中で調合された小さな非ペプチド有機分子阻害剤が含まれる。あるいは、このような阻害剤を、細胞媒介性エンドサイトーシスおよび他の受容体媒介性事象による導入のための標的リガンドに取り付けることができる。このような方法をさらに以下に説明するが、本明細書に記載のＤＰＲＰヌクレオチドおよびアミノ酸配列が与えられれば、当業者によって実施することができる。
【０１００】
ＤＰＲＰのその他の使用法は、治療薬として使用するため、例えばＤＰＲＰとの結合を阻害するための潜在的アンタゴニストのスクリーニング、ならびにアゴニストのスクリーニングのためである。ＤＰＲＰ、その免疫原生断片、またはそのオリゴペプチドは、様々な薬物スクリーニング技法のいずれかにおける予測されるアゴニストまたはアンタゴニストである化合物のライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。このようなスクリーニングに用いられる断片は、溶液中に遊離していても、固体支持体に固定されていても、細胞表面上に保持されていても、または細胞内に位置していてもよい。次いで、ＤＰＲＰと被験試剤との間の結合複合体の形成を測定する。ＤＰＲＰを阻害するアンタゴニストを発見するためのその他のアッセイは、ＤＰＰＩＶの阻害剤について記載する米国特許第６，０１１，１５５号、第６，１０７，３１７号、第６，１１０，９４９号、第６，１２４，３０５号および第６，１６６，０６３号の開示から明らかである。これらのＤＰＲＰの価値ある別の使用法は、１個または複数のＤＰＲＰを阻害することにより、望ましくない副作用を有していないことを示すためのＤＰＰＩＶの阻害剤のスクリーニングである。
【０１０１】
ＤＰＲＰと結合する分子を同定するために小さな分子のライブラリーをスクリーニングするために提供される方法は、一般にａ）小さな分子のライブラリーを提供すること、ｂ）複合体形成に適した条件の下で、小さな分子のライブラリーを、配列番号１、３もしくは５のいずれかのポリペプチドと、またはそれらの断片と合わせること、およびｃ）複合体形成を検出すること（ここで、このような複合体の存在は、ＤＰＲＰと結合する小さな分子を同定する）を含む。
【０１０２】
アンタゴニストを同定するための一方法は、通常は切断が起きると考えられる条件の下で、ＤＰＲＰを発現するベクターにより形質転換された細胞からの抽出物中に、ＤＰＲＰと結合する小さな分子を色素生産性基質（例えばＡｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣまたはＡｌａ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ）と一緒に送達し、次いで分光光度法によって蛍光、または紫外光吸収の変化をモニターすることにより酵素による切断の阻害についてアッセイし、切断を阻害する分子を同定することを含む。分子の存在下で反応速度または蛍光もしくは紫外光吸収の総量が減少することは、小さな分子がＤＰＲＰの触媒／酵素活性を減少させるアンタゴニストであることを証明している。このような分子を同定したら、それらを投与し、ＤＰＲＰによる切断を軽減または阻害することができる。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「アゴニスト」は、ＤＰＲＰと結合した場合に、ＤＰＲＰの効果の期間を増加または延長させる分子を指す。アゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、またはＤＰＲＰと結合しかつＤＰＲＰの効果を調節するその他の分子が含まれる。小さな分子が有効なＤＰＲＰアゴニストであると分かることはあまりないが、アゴニストとしてＤＰＲＰと結合するこのような小さな分子を同定する方法は、ＤＰＲＰを発現するベクターにより形質転換された細胞中に、ＤＰＲＰと結合する色素生産性形態の小さな分子を送達すること、分光光度法により蛍光、または紫外光吸収変化をアッセイすることを含む。紫外吸収または蛍光の量の増加は、小さな分子がＤＰＲＰ活性を増加させるアゴニストであることを証明するであろう。
【０１０４】
使用することができる薬物スクリーニングのための別の技法は、公開ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４に記載のように、当該タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。この方法では、プラスチックピンなどの固体基体上、または他の表面上で多数の異なる小さな試験化合物が合成される。試験化合物をＤＰＲＰ、またはその断片と反応させ、次いで洗浄する。次いで、当技術分野でよく知られている方法により、結合したＤＰＲＰを検出する。また、前述の薬物スクリーニング技法で使用するために、精製ＤＰＲＰをプレート上へ直接コーティングすることができる。あるいは、非中和抗体を用い、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化することができる。
【０１０５】
別の実施形態では、ＤＰＲＰと結合することができる中和抗体をＤＰＲＰとの結合についての試験化合物と特異的に競合させる競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体を用い、ＤＰＲＰと１個または複数の抗原決定基を共有するいずれのペプチドの存在も検出することができる。
【０１０６】
前述のように、結合部位を検討することにより、例えば、天然リガンドよりもＤＰＲＰとの相互作用の大きなリガンドを設計することができる。このようなアンタゴニストリガンドは、より大きな親和性でＤＰＲＰと結合し、その結果競合的リガンドとして機能する。あるいは、天然ＤＰＲＰのリガンド結合部位と相同または類似した合成または組換えタンパク質を、ＤＰＲＰに対して大きな親和性を有する他の分子と同様に設計することができる。また、このような分子は、ＤＰＲＰと置き換わることができ、防御効果を提供することができるべきである。
【０１０７】
前述のように、ＤＰＲＰの構造についての知識は、合成結合部位相同体および類縁体の設計を可能にする。このような分子は、潜在的治療薬を標的とするための結合特性の使用法を極めて容易にするはずであり、それらを用いて潜在的治療薬をスクリーニングすることができる。さらに、それらの分子をモノクローナル抗体の産生における免疫原として用い、抗体自体は、前述の診断および／または治療に用いることができる。
【０１０８】
プロリルオリゴペプチダーゼＳ９Ｂファミリーのいくつかのメンバーについての遍在性の発現を考えると、ＤＰＰＩＶ、ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２、ＤＰＲＰ−３、ＦＡＰおよびＤＰＰＶＩの標的遺伝子の破壊が証明されているヌル表現型の細胞系は、選択的かつ効力のある化合物のスクリーニングを支援する価値が大きいはずである。したがって、本発明は、体細胞遺伝子標的ベクターを構築するためのＬｏｘ−Ｎｅｏ  ＩＲＥＳ  ｔｋカセットおよびＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ  Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ／ｏｕｔカセットＤＮＡエレメントで組み換えられた細胞系を提供する。
【０１０９】
実施例１
哺乳類発現系を用いるＤＰＲＰ遺伝子のクローニングおよび発現
遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち配列番号４５および４６を用い、完全長ポリペプチドＤＰＲＰ−１をコードするＤＮＡ断片を増幅させた。さらに、その遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち配列番号５０および５１を用い、完全長ポリペプチドＤＰＲＰ−２をコードするＤＮＡ断片を増幅させた。さらに、その遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち配列番号５５および５６を用い、完全長ポリペプチドＤＰＲＰ−３をコードするＤＮＡ断片を増幅させた。
【０１１０】
この３つの増幅配列は、市販のキット（ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡおよびＧｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて０．７％アガロースゲルからそれぞれ単離した。次いで、断片をクローニングベクター、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、ＵＳＡ）中にライゲーションし、配列決定した。対応するクローニング構築物は、それぞれｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ１、ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ２およびｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ３と命名した。テンプレートとしてのｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ１またはｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ２またはｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ３およびＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用い、切断型ＤＰＲＰ−１またはＤＰＲＰ−２またはＤＰＲＰ−３をコードするＤＮＡ配列を増幅させた。ＤＰＲＰ−１の場合は配列番号４５および４７を用い、ＤＰＲＰ−２の場合は配列番号５０および５２を用い、ＤＰＲＰ−３の場合は配列番号５７および５８を用いた。増幅配列は、さらにまた、同じ精製キットを用いて０．７％アガロースゲルから単離し、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（−）中にサブクローニングした。得られた構築物は、ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ１ｆ、ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ２ｆおよびｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ３ｆと命名した。
【０１１１】
ＤＰＲＰ−１哺乳類発現構築物を作製するため、ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ１を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化し、完全長ＤＰＲＰ−１遺伝子を遊離させた。ＤＰＲＰ−１遺伝子を運ぶＤＮＡ断片は、上記キットを用いてゲルバンド精製し、次いで発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）中に挿入してネイティブなＤＰＲＰ−１発現構築物を作製し、これをｐｃＤＮＡ−ＤＰＲＰ１と命名した。ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ１ｆを制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、切断型ＤＰＲＰ−１ｆ遺伝子を遊離させた。ＤＰＲＰ−１ｆ遺伝子を運ぶＤＮＡ断片は、上記キットを用いてゲルバンド精製し、次いで発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）中に挿入し、タグ付きＤＰＲＰ−１発現構築物ｐｃＤＮＡ−ＭｙｃＨｉｓ−ＤＰＲＰ１を作製した。
【０１１２】
ＤＰＲＰ−２哺乳類発現構築物を作製するため、ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、完全長ＤＰＲＰ−２遺伝子を遊離させた。ＤＰＲＰ−２遺伝子を運ぶＤＮＡ断片は、上記キットを用いてゲルバンド精製し、次いで発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）中に挿入してネイティブなＤＰＲＰ−２発現構築物を作製し、これをｐｃＤＮＡ−ＤＰＲＰ２と命名した。ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ２ｆを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、切断型ＤＰＲＰ−２ｆ遺伝子を遊離させた。ＤＰＲＰ−２ｆ遺伝子を運ぶＤＮＡ断片は、上記キットを用いてゲルバンド精製し、次いで発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）中に挿入し、ｐｃＤＮＡ−ＭｙｃＨｉｓ−ＤＰＲＰ２と命名したタグ付きＤＰＲＰ−２発現構築物を作製した。
【０１１３】
ＤＰＲＰ−３哺乳類発現構築物を作製するため、ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、完全長ＤＰＲＰ−３遺伝子を遊離させた。ＤＰＲＰ−３遺伝子を運ぶＤＮＡ断片は、上記キットを用いてゲルバンド精製し、次いで発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）中に挿入し、ｐｃＤＮＡ−ＤＰＲＰ３と命名されたネイティブなＤＰＲＰ−３発現構築物を作製した。ｐＧＥＭ７−ＤＰＲＰ３ｆを制限酵素ＮｈｅＩおよびＡｐａＩで消化し、切断型ＤＰＲＰ−３ｆ遺伝子を遊離させた。ＤＰＲＰ−３ｆ遺伝子を運ぶＤＮＡ断片は、上記キットを用いてゲルバンド精製し、次いで発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）中に挿入し、タグ付きＤＰＲＰ−３発現構築物ｐｃＤＮＡ−ＭｙｃＨｉｓ−ＤＰＲＰ３を作製した。
【０１１４】
実施例２
ヒト組織におけるＤＰＲＰ遺伝子の発現パターン
定量的ＰＣＲ分析を行い、ヒト組織における本発明のポリペプチドについてのｍＲＮＡの発現レベルを調べた。前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＤＵ１４５）、ＭＬＴＣ−１系（マウス精巣）、およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（乳癌）を含む多数のヒト細胞系に対してはＲＴ  ＰＣＲも行った。ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２およびＤＰＰＩＶについての予想サイズのバンドは様々な癌細胞系ですべて発現され、ＦＡＰも極めて低レベルで発現された。
【０１１５】
ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、ＤＰＲＰプローブを用い、８種類の異なる組織から単離された２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡについて行った。具体的には、３２ＰｄＣＴＰ（Ａ．Ｐ．Ｆｅｉｎｂｅｒｇ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２、６（１９８３））の存在下で、ランダムプライミングによって放射能標識された１ｋｂのＮ末端断片についてヒトのマルチプルティッシュノーザン（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）を探索した。ハイブリダイゼーションは、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）中で６８℃において一夜行った。まず、ブロットを２倍ＳＳＣおよび０．０５％ＳＤＳ中で室温におてい洗浄し、次いで０．１倍ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で６０℃（ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２）および５０℃（ＤＰＲＰ−３）において洗浄した。
【０１１６】
ノーザン分析は、いくつかの組織におけるＤＰＲＰ−１の発現を示し、精巣、前立腺、筋肉および脳で最も大きなシグナルであった。精巣は、長さが約７．５、４．５および２．５ｋｂの３個の転写物を示した。より短いｍＲＮＡ種は精巣に極めて多かったが、試験した他の組織ではごくわずかであった。ＤＰＲＰ−２は、すべての組織で遍在的に発現され、肝臓および筋肉で最も高いレベルであり、主に５ｋｂの転写物であった。ＤＰＲＰ−３発現は脳および膵臓に限定された。具体的な脳領域（小脳、皮質、髄質、脊髄、後頭葉、前頭葉、側頭葉および被殻）では、３種類のプロテアーゼについてさらに分析を行った。ＤＰＲＰ−１はすべての領域で発現され、脊髄では低レベルであり、一方ＤＰＲＰ−２は試験したすべての脳領域で発現された。
【０１１７】
ＤＰＲＰ−１の定量的ＰＣＲにはオリゴヌクレオチドプライマー配列番号４８および４９を用い、ＤＰＲＰ−２の定量的ＰＣＲにはオリゴヌクレオチドプライマー配列番号５３および５４を用いた。ヒトマルチプルティッシュｃＤＮＡ（ＭＴＣ（商標））Ｐａｎｅｌ  ＩおよびＰａｎｅｌ  ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ、ＵＳＡ）を正規化ｃＤＮＡテンプレートとして用いた。各ｃＤＮＡ０．５ｎｇを２５μｌのＰＣＲ反応で用い、各プライマーの最終濃度は３００ｎＭとした。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００配列検出システムで検出した。製造者の推奨熱サイクルパラメータ、例えば５０℃２分間、９５℃１０分間、続いて９５℃１５秒間と６０℃１分間の４０サイクルを用いた。得られたデータは、膵臓、卵巣および精巣における比較的高率なＤＰＲＰ−１とＤＰＲＰ−２の発現、および肝臓におけるＤＰＲＰ−２の特に高率な発現を示している。
【０１１８】
実施例３−ＤＰＲＰポリクローナル抗体の産生およびウエスタンブロッティング
ＤＰＲＰ−１をコードするｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列をＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）を用いて分析して高い免疫原生の領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成して抗ＤＰＲＰ−１抗体を産生させるために用いた。ＤＰＲＰ−２およびＤＰＲＰ−３についてこの手順を繰り返した。適切なペプチド配列の選択および抗体産生の技法は、当業者によく知られている方法である。Ｃ末端近辺または親水性領域中のエピトープなどの適切なエピトープの選択は、当技術分野でよく知られている。
【０１１９】
通常は、長さが約１５から２０個の残基であるオリゴペプチド、例えばＤＰＲＰ−１の場合には配列番号５９、ＤＰＲＰ−２の場合には配列番号６０、ＤＰＲＰ−３の場合には配列番号６１を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａを用いて合成した。Ｆｍｏｃ化学反応を用い、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）との反応により、１９または１５残基のペプチドを、それぞれキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）とカップリングさせた。完全フロイントアジュバントにおいて溶かしたオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体でウサギを免疫化した。得られた抗血清は、例えばペプチドをプラスチックに結合させ、１％ＢＳＡでブロックし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、放射性ヨウ素標識ヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、抗ペプチド活性について試験した。
【０１２０】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した正常ヒトタンパク質サンプル（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｄｌｅｙ）（総タンパク質約３６μｇ）を用いてウエスタンブロッティングを行った。１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによりタンパク質を分画し、０．４５ｍｍのニトロセルロース膜に移した。Ｔｒｉｓ緩衝塩水（ＴＢＳ）中で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および１％ＢＳＡにより膜をブロックした。抗ＤＰＲＰ−１またはＤＰＲＰ−２特異抗体を一次抗体として用い、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝塩水で１：５，０００に希釈し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用前に同じ緩衝液で１：５，０００に希釈した。ＡＰ用のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で膜をインキュベートすることにより、当該バンドが望ましい強度に達するまで陽性反応を可視化した。ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２タンパク質は、脳、筋肉、腎臓、前立腺、精巣および卵巣組織で検出された。ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２をそれぞれ約１０１ｋＤａおよび１００ｋＤａ体として合成し、これらは、表３に示す一次構造から推定される分子量とよく一致している。
【０１２１】
【表３】
2004528812.tif 000004
【０１２２】
類似する分子量の追加のバンドがいくつか観察された。これらのバンドは、タンパク質の翻訳後グリコシル化の存在に起因すると考えられる。また、表３は、ＤＰＲＰタンパク質についての潜在的Ｎグリコシル化部位数を示す。タンパク質のグリコシル化および非グリコシル化体の存在は、オリゴ糖合成の阻害剤であるツニカマイシンを用いて評価した。より小さな形が非グリコシル化体であることは明らかである。ＤＰＲＰ−１についてｍＲＮＡ（ノーザン分析）とタンパク質含量（ウエスタン分析）の相関関係を表４に示す。
【０１２３】
【表４】
2004528812.tif 000005
【０１２４】
実施例４
ヒト組織におけるＤＰＲＰタンパク質の免疫組織化学的局在化
多くの様々なホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織から４ミクロンの切片を調製した。キシレン中５分間と、続く段階的なアルコール系から蒸留水への４回の浸漬により組織切片からパラフィンを除いた。２種類の異なる濃度において、酵素消化組織を含む、および含まないいくつかの異なるＳＨＩＥＲ溶液とともに蒸気熱誘導エピトープ回収（ｓｔｅａｍ  ｈｅａｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）（ＳＨＩＥＲ）を用いた（Ｌａｄｎｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．；６０、ｐ３４９３〜３５０３、２０００）。処理および用いた抗体希釈液について以下に概要を説明する。
【０１２５】
１．ブロッキング試薬１５分間（正常ヤギ血清）
２．一次抗体２５、６０分間または一夜インキュベーション
３．二次抗体２５分間（ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ）
４．内因性ペルオキシダーゼブロッキング３×１．５分間
５．ＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）／西洋ワサビペルオキシダーゼ２５分間
６．ＤＡＢ色素原３×５分間（ブラウン反応生成物）
７．Ｌｉｇｈｔヘマトキシリンカウンター染色１分
【０１２６】
検出化学反応を保証するために陽性対照を実施し、抗原前処理を適切に行った。ウサギＩｇＧを陰性対照として用いた。ＤＰＲＰ−１抗体の検出には、アビジン−ビオチンをベースとする組織染色系を用いた。色素原としてのＤＡＢと共に、西洋ワサビペルオキシドをリポーター酵素として用いた。染色後、アルコール系から無水エタノールと、続くキシレン洗浄によりスライドを脱水した。スライドをガラス製カバースリップおよびパーマウント（ｐｅｒｍｏｕｎｔ）で恒久的に覆った。陽性染色が暗褐色の色素原（ＤＡＢ−ＨＲＰ反応生成物）によって示されている代表的な染色のデジタル画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ製のビデオカメラを用いて捕えた。ヘマトキシリン対比染色により、細胞および組織形態を評価するための青い核染色が得られた。
【０１２７】
ＤＰＲＰ−１ウサギポリクローナル抗体は、正常な精巣、前立腺、子宮内膜腺、扁桃腺および膵臓を含むホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を標識する。この抗体は、正常な卵巣、膀胱および腎臓の上皮細胞にも存在した。染色は、線維芽細胞などの上皮および一部の間質細胞、内皮細胞ならびにリンパ球の細胞質に局在化した。興味深いことに、ＤＰＲＰ−１抗体について試験した正常な精巣では、ライディッヒ細胞に特有な発現があり、精細管を取り囲む空間である間質組織には多核化マクロファージが見いだされた。扁桃腺Ｂ細胞はＤＰＲＰ−１抗体で染色された。
【０１２８】
実施例５
ＤＰＲＰタンパク質の哺乳類および昆虫細胞発現および精製
製造者によって推奨されているＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ、ＵＳＡ）法を用い、ｐｃＤＮＡ−ＤＰＲＰ１、ｐｃＤＮＡ−ＭｙｃＨｉｓ−ＤＰＲＰ１、ｐｃＤＮＡ−ＤＰＲＰ−２またはｐｃＤＮＡ−ＭｙｃＨｉｓ−ＤＰＲＰ２のプラスミドＤＮＡをＰＥＡＫ（ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ、ＵＳＡ）またはＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）中に形質移入した。形質移入された細胞を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で４８時間、５％ＣＯ２と共に３７℃において維持した。次いで、細胞を集め、組換えタンパク質抽出に用いた。形質移入４８時間後に細胞を収集し、ホモジナイズし、次いで１８，０００×ｇで４０分間回転させた。上清をサイトゾル分画として集めた。この分画をＴＡＬＯＮスピンカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上にロードし、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を５０ｍＭ  ＰＢＳ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７で溶離した。次いで、組換えタンパク質を、抗ｍｙｃ抗体によるウエスタンブロッティングにより検出し、ＰｒｏｔｏＢｌｏｔ  ＩＩ  ＡＰシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて可視化した。ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２の組換え親和性精製融合物をウエスタンブロットにより検出し、ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２を、予測される１１２ｋＤａおよび１０９ｋＤａ体として合成した。
【０１２９】
天然に存在するＤＰＲＰタンパク質または組換えＤＰＲＰタンパク質は、ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２またはＤＰＲＰ−３に特異的な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーにより実質的に精製した。免疫親和性カラムは、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）などの活性化クロマトグラフィー用樹脂にＤＰＲＰ抗体を共有結合でカップリングさせることにより作成した。カップリング後、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし洗浄した。
【０１３０】
ＤＰＲＰタンパク質を含有する培地または細胞抽出物を免疫親和性カラムに通し、ＤＰＲＰの優先的吸収を可能にする条件（例えば、界面活性剤存在下における高イオン強度の緩衝液）の下でカラムを洗浄した。抗体／ＤＰＲＰ結合を破壊する条件（例えば、ｐＨ２〜３の緩衝液または尿素もしくはチオシアネートイオンなどの高濃度のカオトロープ）の下でカラムを溶離し、精製ＤＰＲＰを収集した。
【０１３１】
実施例６
ＤＰＲＰタンパク質の酵素活性および阻害剤のスクリーニング方法
組換えＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２の反応速度特性を連続蛍光定量アッセイで測定した。緩衝液、ｐＨおよび温度依存性最適化の結果、以下のアッセイ条件となった。酵素アッセイは５０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中において行い、精製酵素５０μｌ（５０μｇ／ｍｌ）を様々な濃度のＡｌａ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１μｌと混合した。次いで、プレートを３７℃において３０分間インキュベートし、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒを用いλｅｘ４０３５５およびλｅｍ５３５で蛍光を検出した。ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２のＫｍ値は類似していた（それぞれ２０８および１６１μＭ）。
【０１３２】
さらなる生化学的特徴付けは、ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２がＤＰＰＩＶに類似したプロフィールを有していることを示している。２種類の精製プロテアーゼおよびＤＰＰＩＶを室温において３０分間、阻害剤と共にプレインキュベートした。次いで、基質のＡｌａ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（１００μＭ）を加え、蛍光強度を６０分間のあいだに６０個の読み取り値として記録した。不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤のＡＥＢＳＦは、３種類すべての酵素に強い阻害を示す唯一の被験阻害剤であった（表５）。このことは、これらの酵素がセリンプロテアーゼスーパーファミリーに属するという構造的およびドメイン分析予測を支持している。
【０１３３】
【表５】
2004528812.tif 000006
【０１３４】
Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＭＣの他に、試験した別の基質もＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２がジペプチジルペプチダーゼであることを支持した。データは、各基質（１２５μＭ）を酵素と共に３０分間インキュベートした後の蛍光変化を、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＭＣで測定した蛍光のパーセンテージとして決定することにより導かれ、試験した基質の中でＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣが唯一の良好な基質であった。
【０１３５】
【表６】
2004528812.tif 000007
【０１３６】
ＤＰＰＩＶをインキュベートした場合に活性の低下を示すであろう各ＤＰＲＰタンパク質のそれぞれを試験するための最適な基質を見つけるため、さらに天然および非天然アミノ酸ジ、トリおよびテトラペプチドを試験した。
【０１３７】
本明細書に記載の酵素アッセイ法は、ＤＰＲＰ酵素のペプチド阻害剤および非ペプチド阻害剤をスクリーニングするために利用することができる多くの方法の１つである。酵素活性の阻害剤を発見するために、テトラペプチド阻害剤のライブラリーを試験した。候補阻害剤は、１０〜２０ｍＭのＤＭＳＯ原液として調製し、−２０℃で保存した。アッセイ緩衝液で希釈液を調製した。阻害された酵素の蛍光変化を対照（溶媒）酵素の蛍光変化と比較することにより阻害を測定した。１００−（サンプルのｆｌ単位／対照のｆｌ単位×１００）が阻害パーセント値を示す。阻害パーセントおよび酵素が５０％阻害される阻害剤濃度（ＩＣ５０）は、阻害パーセントを対数スケール上の阻害剤濃度に対してプロットすることによって確定された。図３に示すように、いくつかのテトラペプチドアミドが酵素活性を阻害し、データは溶媒（０．０２％ＤＭＳＯ）のみが存在する下での活性に対する％として表す。化合物は１ｍＭを加えた。最も興味深いのは、ＤＰＰＩＶに比べ、ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２に対する一部のテトラペプチドの明らな差次的活性であった。３種類すべての酵素がペプチド−１によって阻害されたが、ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２のみがペプチド−４およびペプチド−５によって有意に阻害された。このことは、精製酵素の選択的阻害が可能であることを証明している。
【０１３８】
また、本実施例に記載のアッセイを用い、ＤＰＲＰ活性を阻害または増強する薬剤として、巨大分子を含む追加の合成化合物または天然に存在する化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。このアッセイで用いられるＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２ポリペプチドは、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける翻訳、組換え発現（実施例５を参照）または生化学的手順によって入手することができる。また、本明細書に記載した以外の方法を用い、ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２またはＤＰＲＰ−３を阻害する化合物をスクリーニングしかつ同定することができ、それらの方法には、例えばＥＬＩＳＡおよびＲＩＡなどの結合アッセイが含まれる。
【０１３９】
実施例７
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト癌細胞の増殖に対するＤＰＲＰ阻害剤の効果
ＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２活性のいくつかの阻害剤がヒト癌細胞の増殖に対して有していると思われる効果を評価する試みにおいて、ＬＮＣａｐ、ＰＣ３およびＤｕ１４５、マウス精巣系ＭＬＴＣ−１およびＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞を９６ウエルの組織培養プレート中で平板培養し（ウエル当たり１０４個）、ＣＯ２インキュベータ中３７℃において２４時間培養して付着させた。次いで、２４時間から９６時間までの様々なインキュベーション時間に様々な希釈（最終希釈：０．１ｎＭ〜１０μＭ）で化合物をウエルに加え、毎日新しい化合物を置き換えた。希釈ＤＭＳＯのみの添加を対照とした。これらの化合物と３回ずつ繰り返しインキュベートした後、ＸＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｒｏｃｈｅ  １−４６５−０１５）を用いて細胞の増殖を測定した。ＸＴＴミックスを加えて５時間後に４９０および６５０ｎｍにおいてプレートを読み取った。３種類の阻害剤について０．１、１、１０および１００×ＩＣ５０に等しい濃度において細胞増殖の増加を観察したが、ＰＣ３細胞についての結果を図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに示す。
【０１４０】
全体的に見て、ｍＲＮＡ増幅、ウエスタンブロッティングおよび免疫組織化学によって明らかにされたように、ＤＰＲＰは多種多様な組織中で発現される。ノーザンブロットおよびウエスタンブロットによれば、ＤＰＲＰ−１は精巣中に最も多かった。また、ＤＰＲＰ−１と相同の精巣ｃＤＮＡ源からの多数の発現配列タグ（ＥＳＴ）も精巣における多量のＤＰＲＰ−１の発現を支持している。実施例４は、特異的ＤＰＲＰ−１抗体を用いるヒト精巣におけるＤＰＲＰ−１タンパク質の免疫組織化学的局在化について記載している。ＤＰＲＰ−１は類上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｏｉｄ）ライディッヒ細胞において強く発現され、ライディッヒ細胞は、哺乳類の雄における精巣アンドロゲン（雄のステロイドホルモン）の主要な源である。精巣の間質では、ライディッヒ細胞およびマクロファージは、マクロファージ表面上に延びるライディッヒ細胞突起の「指状組織（ｄｉｇｉｔａｔｉｏｎ）」と密接に結合している。ライディッヒ細胞に極めて近い多核細胞もＤＰＲＰ−１抗体で染色され、このプロテアーゼがマクロファージにおいても発現され、精巣中のマクロファージがライディッヒ細胞の傍分泌調節において重要な役割を果たしていることを示唆している。精巣のマクロファージによって分泌されるサイトカインは、ライディッヒ細胞に対して分裂促進的であり、間葉性前駆細胞が成熟ライディッヒ細胞に分化する際に重要な役割を果たす。精巣の成熟に関与するタンパク質および経路をより明確に理解することは、性早熟症の新たな治療の発見に重要である。さらに、ライディッヒ細胞は、性ステロイド産生（主にテストステロン）を介して性索間質腫瘍などの腫瘍を引き起こす。テストステロンは、乳癌および子宮癌、卵巣癌および男性ホルモン性脱毛症（ヘアロス）などのいくつかの腫瘍形成および疾患と関係している。テストステロンおよびその他の男性ホルモンを産生する体内のその他の腺（例えば、副腎）におけるＤＰＲＰタンパク質の局在化についてのさらなる調査を現在検討中である。ＤＰＲＰ−１とステロイドおよびポリペプチドホルモン生合成経路機能との可能な関係を検討しており、実施例７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞モデルにおける前立腺、精巣および乳房におけるＤＰＲＰタンパク質の役割を理解することと関連している。
【０１４１】
免疫組織化学的分析は、子宮内の子宮内膜腺（実施例４を参照）、膵臓腺房、腎臓の糸球体、膀胱内の形質細胞、扁桃腺内のＢ細胞の一部、前立腺の円柱上皮細胞および分化が不十分な前立腺扁平上皮化生、Ｇｌｅａｓｏｎグレード４の前立腺癌、および良性前立腺肥大における過形成腺にＤＰＲＰ−１が局在している。乳癌、ならびに精上皮腫および前立腺扁平上皮化生における陽性染色は、ホルモン感受性組織、特に分化が不十分な細胞とＤＰＲＰ−１との一般的関係を示唆している。特殊化した上皮細胞および炎症性形質細胞（リンパ球）におけるＤＰＲＰ−１の存在にも興味がある。炎症性乳癌では多数の浸潤リンパ球が見られ、全般的予後も不良である。ＤＰＲＰ−１およびその他のＤＰＲＰタンパク質は、通常、腫瘍の周辺に一定して浸潤しているリンパ形質細胞成分を有する髄様癌に出現し、このことは新生物に対する宿主組織の反応を表すと考えられている。大部分のリンパ球はＴ細胞であり、大部分の形質細胞は、ＩｇＧ産生型である。いくつかの抗原が、Ｂ細胞、乳癌細胞のサブグループ、およびその他の上皮癌細胞上に多くあり、これらの抗原は、新しい種類の治療用モノクローナル抗体にとっての標的であり、Ｂ細胞特異的抗原ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体でいくつかの注目すべき成功が実現している。したがって、ＤＰＲＰタンパク質に対するモノクローナル抗体は、癌を含む、ＤＰＲＰタンパク質が関与する疾患を診断しかつ治療するのに有用であると思われる。
【０１４２】
多くの組織の特殊化された上皮細胞におけるＤＰＲＰ−１の発現は、ＤＰＲＰ−１およびその他のＤＰＲＰタンパク質が細胞の成長およびそれらの分化に関与していることを示唆している。前立腺癌および精巣癌のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて実施例６に記載の阻害剤を用いる試験は（実施例７）、図４Ａ〜４Ｃに示すように、ＤＰＲＰ−１／ＤＰＲＰ−２阻害剤がｎＭ濃度でＰＣ３細胞の増殖に５０〜６０％の増加を引き起こしたことを示した。
【０１４３】
本発明をその好ましい実施形態にしたがって説明してきたが、これらの実施形態は発明者らが現在知りうる最良の方法を構成するもので、当業者にとって明らかなように、本明細書に添付する特許請求の範囲に示される範囲を逸脱することなく変更および修正を行えることは理解されるであろう。例えば、本開示は、ある場合にはＤＰＲＰ−１およびＤＰＲＰ−２を中心に扱っているが、ＤＰＲＰ−３およびその断片もそれらをコードする核酸であることから、同様に有用であると見なされる。本発明の具体的特徴は、特許請求の範囲で強調されている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２、ＤＰＲＰ−３およびＤＰＰＩＶを一緒に線状に配置した整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を示し、陰影は、特定の位置における同一（黒色）または類似（灰色）のアミノ酸残基を示すために付けた図である。
【図１Ｂ】
ＤＰＲＰ−１、ＤＰＲＰ−２、ＤＰＲＰ−３およびＤＰＰＩＶを一緒に線状に配置した整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を示し、陰影は、特定の位置における同一（黒色）または類似（灰色）のアミノ酸残基を示すために付けた図である。
【図２】
図１と同じようにヒトおよびマウスＤＰＲＰ−２を一緒に線状に配置した整列を示す図である。
【図３】
様々なテトラペプチドアミド阻害剤のジペプチジルペプチダーゼ酵素活性に対する効果を示すグラフである。
【図４Ａ】
３種類の阻害剤化合物の様々な用量におけるＰＣ３前立腺癌細胞系の増殖に対する効果を示すグラフである。
【図４Ｂ】
３種類の阻害剤化合物の様々な用量におけるＰＣ３前立腺癌細胞系の増殖に対する効果を示すグラフである。
【図４Ｃ】
３種類の阻害剤化合物の様々な用量におけるＰＣ３前立腺癌細胞系の増殖に対する効果を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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