(57)【要約】本発明は、ヘルペスウイルスを投与することによって血管細胞および心血管細胞において核酸を発現させる方法または核酸にコードされるタンパク質様成分を産生させる方法を提供する。本発明は、ヘルペスウイルスを投与することにより血管組織および心血管組織に治療的利益を生み出す方法を提供する。加えて、本発明はヘルペスウイルスの投与および他の追加的薬剤または外科的方法を伴う治療を含む、血管疾患および心血管疾患の併合療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管細胞内で異種核酸配列を発現させる方法であって、異種核酸を含む複製可能組換え単純ヘルペスウイルスベクターを細胞に投与することを含み、前記単純ヘルペスウイルスの中枢神経系における増殖能が減弱されている、前記方法。
【請求項２】
単純ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルスの少なくとも１つの非必須遺伝子において、ヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換または欠失によって減弱されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
単純ヘルペスウイルスが更に単純ヘルペスウイルスの少なくとも１つの必須遺伝子において、ヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換または欠失によって減弱されている、請求項３記載の方法。
【請求項４】
組換えＨＳＶベクターが少なくとも一つの発現可能γ１３４．５遺伝子を欠損している請求項１記載の方法。
【請求項５】
組換えＨＳＶベクターが２つの発現可能γ１３４．５遺伝子を欠損している請求項１記載の方法。
【請求項６】
血管細胞が内皮細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
血管細胞が平滑筋細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
血管細胞が外膜細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
異種核酸配列がポリペプチドをコードする配列である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが、抗増殖性ポリペプチド、血管拡張性ポリペプチド、および血管形成性ポリペプチドからなる群より選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
異種核酸配列がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドが抗増殖性ポリペプチド、血管拡張性ポリペプチドまたは血管形成性ポリペプチドをコードするＲＮＡに相補的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単純ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
単純ヘルペスウイルスがＨＳＶ−２である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
単純ヘルペスウイルスが抗ウイルス薬による単純ヘルペスウイルス感染の治療に必須である少なくとも一つの遺伝子を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
心血管疾患または血管細胞疾病を治療または防止する方法であって、異種核酸を含む複製可能組換え単純ヘルペスウイルスベクターを細胞に投与することを含み、前記単純ヘルペスウイルスの中枢神経系における増殖能が減弱されている、前記方法。
【請求項１７】
単純ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルスの少なくとも１つの非必須遺伝子において、ヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換または欠失によって減弱されている、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
単純ヘルペスウイルスが更に単純ヘルペスウイルスの少なくとも１つの必須遺伝子において、ヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換または欠失によって減弱されている、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
組換えＨＳＶベクターが少なくとも一つの発現可能γ１３４．５遺伝子を欠損している請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
組換えＨＳＶベクターが２つの発現可能γ１３４．５遺伝子を欠損している請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
心血管疾患が血管組織における高血圧症である請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
異種核酸配列が血管組織において、７日以上、１４日以上、２１日以上、２８日以上、３５日以上、および７０日以上からなる群より選ばれる期間発現される、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
異種核酸配列がスクリーニング可能または選択可能マーカーをコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
異種核酸配列が抗血栓性核酸、血管形成制御核酸、免疫調節因子、細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の阻害因子またはプログラム細胞死の制御因子である、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
心血管疾患または疾病が、慢性心不全、高血圧性心血管疾患、虚血性心疾患、不整脈、先天性心疾患、心弁膜疾患または狭窄欠陥、心筋症、動脈瘤、慢性静脈不全、末梢動脈疾患または再狭窄からなる群より選ばれる、請求項１６記載の方法。
【請求項２６】
血管細胞に少なくとも一つの薬物を投与することを更に含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２７】
薬物が、抗抗リポタンパク質症薬、抗動脈硬化薬、抗血栓／線維素溶解薬、血液凝固薬、抗不整脈薬薬、高血圧薬、血管収縮薬、鬱血心不全の治療薬、抗アンギナ薬、および抗感染薬からなる群より選ばれる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
単純ヘルペスウイルスがＨＳＶ−１である、請求項１６記載の方法。
【請求項２９】
単純ヘルペスウイルスがＨＳＶ−２である、請求項１６記載の方法。
【請求項３０】
単純ヘルペスウイルスが抗ウイルス薬による単純ヘルペスウイルス感染の治療に必須の少なくとも一つの遺伝子を更に含む請求項１６記載の方法。
【請求項３１】
異種核酸を含む複製可能な単純ヘルペスウイルスベクターを細胞に導入することを含む、機能的に異常な血管細胞を正常な生理状態に誘導する方法であって、前記単純ヘルペスウイルスベクターは中枢神経系における増殖が減弱されているウイルスベクターである、前記方法。
【請求項３２】
単純ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの非必須遺伝子においてヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換または欠失によって減弱されている、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
単純ヘルペスウイルスが更に単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの必須遺伝子においてヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換または欠失によって減弱されている、請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
合衆国政府は本発明について何らかの権利を有する場合がある。
２０００年１１月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／２５３，６８０号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般に遺伝子治療の分野に関する。より具体的には、本発明は単純ヘルペスウイルスベクターを投与して血管および心血管組織に治療的な利益をもたらすことに関する。更なる特徴において、本発明はヘルペス単純ウイルスベクターの投与と少なくとも一つの追加の薬物または外科的手順、および、単純ヘルペスウイルスベクターを血管細胞及び組織へ容易にデリバリーするための外科的手順及び他のターゲッティング手段を含む複合治療法に関する。
【０００３】
関連技術
血管疾患は依然として西側世界における死亡と疾病の主要な原因である［ＭｃＧｏｖｅｒｎら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３４：８８４−８９０， １９９６］。現在の治療ストラテジーは主として危険因子改変および／または重要な病巣の機械的治療に焦点が当てられている。これらのストラテジーはしばしば効果的であるが、疾病血管組織内の根本的な病理学的欠陥を遺伝的に改変できることは血管疾患の治療の新たなパラダイムを提供し、おそらく血管疾患の治療法を根本的に変えるであろう。血管遺伝子導入の可能性は１９８９年に最初に示され、レトロウイルス導入されたｌａｃＺ遺伝子を発現する内皮細胞（ＥＣ）がブタの骨動脈に付着し機能し得ることが示された［Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３２４−１３４４， １９８９］。それ以来、導入ベクターおよびデリバリー系を洗練および改良するために毎年１０億米ドル近くが使われてきた［Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃａｒｄｉｏ． １３： ３６９−３７４， １９９８］。
【０００４】
多様なベクターが血管組織へ遺伝子を導入するために使用されており、種々の結果をもたらしている。最も一般的なベクター系−裸のプラスミドＤＮＡ［Ｉｓｎｅｒら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ． ７：９８９−１０１１， １９９６； Ｂａｕｍｇａｒｔｅｒら、Ｃｉｒ． ９７： １１１４−１１２３， １９９８］、リポソーム−被包ＤＮＡ ［Ａｒｍｅａｎｕら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １：３６６−３７５， ２０００］、レトロウイルス［Ｇｅａｒｙら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５： １２１１−１２１６， １９９４］、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）［Ｌｙｎｃｈら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８０：４９７−５０５， １９９７］およびアデノウイルス［Ｋａｙ， Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ２４： １６０−１６１， １９９６； Ｙｅｈら、ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１： ６１５−６２３， １９９７］は応用例によってはある種の成功を収めている。裸のＤＮＡのみを用いる遺伝子導入はトランスフェクション効率が低いために限られた成功しか収めていない［Ｂａｕｍｇａｒｔｅｒら、Ｃｉｒ． ９７： １１１４−１１２３， １９９８；Ｒｅｉｓｓｅｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４： ４４９−４５８， １９９３； Ｔｕｒｕｎｅｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６： ６−１１， １９９９］。リポソーム内部に被包化されたＤＮＡはいくらかより効果的であるが［Ａｒｍｅａｎｕら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １： ３６６−３７５， ２０００； Ｔｕｒｕｎｅｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６： ６−１１， １９９９； Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３： ６５２−６６１， １９９４； ＬｉｍらＣｉｒ． ８３： ２００７−２０１１， １９９１； Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ２７： １３５−１４４， １９９８； Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ． ８５： ３３９−３４５， １９９９］、一般には、無傷の基底膜への完全な侵入性を欠いている。
【０００５】
初期の実験でレトロウイルスが使用され［Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １３４２−１３４４， １９８９； Ｄｕｎｎら、Ｃｒｉｃ． ９９： ３１９９−３２０５， １９９６］、より最近ではアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用されているが［Ｚｈｕら、Ｃｉｒｃ． ９６： ６２８−６３５， １９９７］、非分裂細胞における効率の低さという大きな問題がある。比較的新しいベクター系であるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は強い免疫応答を刺激することなく効率的に骨格筋へ感染することが示されており［Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８： ９７−１２９， １９９２］、予備的結果ではＡＡＶは血管ＥＣ ［Ｌｙｎｃｈら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８０： ４９７−５０５， １９９７； Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４： ７５７−７６１， １９９７； Ｋｏｔｉｎ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ． ５：７９３−８０１， １９９４； Ｘｉａｏら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ８０９８−８１０８． １９９６］、平滑筋細胞（ＳＭＣ， Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４： ７５７−７６１， １９９７）、および心臓細胞［Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、Ｃｉｒｃ． ９９： ２０１−２０５， １９９９］をトランスフェクションできることが示されている。しかしながら、最近の報告では、無傷の内皮を有する血管組織への遺伝子導入は、３０日後に陽性染色細胞が１〜１４％しかないので問題があるかも知れないことが示されている［Ｅｓｌａｍｉら、Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ３１： １１４９−１１５９， ２０００］。
【０００６】
明らかに、血管遺伝子導入のための最も広くテストされたベクターは複製欠損アデノウイルスである［Ｙｅｈら、ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１： ６１５−６２３， １９９７］。アデノウイルスベクターは非分裂細胞において高い浸透性を示し、高濃度で産生することができ、比較的大きな導入遺伝子を保持することが出来る。これらは広範な種々のマーカー及び生物学的に活性な遺伝子を血管へ導入するために実験的に使用されている。そのような遺伝子には、Ｒｂ［Ｃｈａｎｇら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５： ２２６０−２２６８， １９９５； Ｓｍｉｔｈら、Ｃｉｒｃ． ９６： １８９９−１９０５， １９９７］、ｐ２１［Ｃｈａｎｔら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５： ２２６０−２２６８， １９９５； Ｓｃｈｅｉｎｍａｎら、Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ２９： ３６０−３６９， １９９９］、シトシンデアミナーゼ［Ｈａｒｒｅｌｌら、１９９７；Ｆｏｒｔｕｎａｔｏら、２０００］、ナトリウム利尿性Ｃ型ペプチド（Ｕｅｎｏら，１９９７）、メタロプロテイナーゼ阻害因子（Ｃｈｅｎｇら、１９９８；Ｇｅｏｒｇｅら、２０００；Ｄｏｌｌｅｒｙら、１９９９）、ヒルジン（Ｂｉｓｈｏｐら、１９９９）、シクロオキシゲナーゼ（Ｚｏｌｄｈｅｌｙｉら、１９９６）、組織因子経路阻害因子（Ｚｏｌｄｈｅｌｙｉら、２０００）、トロンボモジュリン（Ｗａｕｇｈら、２０００）、ｅｃＮＯＳ（Ｖａｒｅｎｎｅら、１９９８；Ｃａｂｌｅら、１９９９）、βＡＲＫＣＴ（Ｆｕｌｔｏｎら、１９９６）およびｂＦＧＦに対するアンチセンスＲＮＡ（Ｈａｎｎａら、１９９７；Ｎｅｓｃｈｉｓら、１９９８；Ｈａｎｎａら、２０００）が含まれる。これらのプロトコルの多くの成功は、部分的には、使用したベクターが極めて高濃度であること、およびバルーンインフレーションによって損傷を生じさせるという一般的なモデル（これにより内皮を露出させベクターの侵入を増強する）を使用したことによるものである。
【０００７】
非損傷動脈または静脈移植片のような無傷の血管組織への遺伝子導入はより困難であることが分かっている（Ｅｓｌａｍｉら、２０００；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９；Ｆｕｌｔｏｎら、１９９６；Ｈａｎｎａら，２０００；Ｍａｎｎら、１９９５；Ｆｕｌｔｏｎら、１９９７；Ｆｕｌｔｏｎら、１９９８；Ｆａｉｒｅｓら、２０００）。一般に導入効率が低く、必要な用量が高く、生物学的効果はあまり明瞭でない（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９；Ｆｕｌｔｏｎｒａ、１９９６；Ｈａｎｎａら、２０００；Ｍａｎｎら、１９９５；Ｆｕｌｔｏｎら、１９９７；Ｆｕｌｔｏｎら、１９９８；Ｆａｉｒｅｓら、２０００）。さらに、そして最も重要なことに、細胞質エピソームの無効化は一般に第１週の後に終了するので無傷の免疫系は長期の導入遺伝子発現に依然として重大な障害である（Ｅｓｌａｍｉら、２０００；Ｃｈａｎｇら、１９９５）。宿主を免疫調節すれば導入遺伝子の寿命を延ばすことが出来るが［Ａｓｃｈｅｒら、Ａｎｎ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １４： ３８５−３９２， ２０００］、血管疾患をもつ年長者集団に全体的な免疫抑制をすることは明らかに実際的でない。アデノウイルスベースの血管組織における遺伝子導入に本質的な問題は、これまでにわずか１例の治療的遺伝子導入が報告されているだけという事実にもっともよく示されており［血管形成について、Ｒｏｓｅｎｇａｒｔら、１９９９］、血管過増殖以上の治療または予防のためにアデノウイルスベクターを使用する臨床試験のさらなる公表がなければならない。
【０００８】
長期の導入遺伝子発現を生じさせる可能性のあるベクターはＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）である。ＨＳＶ−１は頻発性口咽頭ヘルペスの原因となるウイルスである。ＨＳＶ−１は溶解性の非組込みＤＮＡウイルスであり、向神経性で長期感染を確立することが明らかにされている。アデノウイルスのように、ＨＳＶ−１は高力価に作製することができ、欠損させて大きな導入遺伝子と置き換えることの出来る複数の非必須遺伝子を潜在的に含んでいる。このことにより、ＨＳＶの使用は全身性疾患のための遺伝子導入法となるかもしれないという推測が導かれる（Ｃｕｌｖｅｒ、１９９６；ＬａｃｈｍａｎｎとＥｆｓｔａｔｈｉｏｕ、１９９７）。しかしながら、ＨＳＶの溶解性かつ高度に感染性という性質、潜伏期に関する長寿命能力のため、これを治療に使用する前に重要な遺伝子改変が必要となる［ＬａｃｈｍａｎｎとＥｆｓｔａｔｈｉｏｕ， １９９７； Ｈｕａｒｄら、１９９５； Ａｄｖａｎｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５： １６０−１６５， １９９８］。作製すべき最初の組換えヘルペスウイルスの組は、非分裂細胞中でウイルスの増殖を中程度に低下させる１以上の遺伝子（例えば、チミジンキナーゼまたはリボヌクレオチドレダクターゼ）を欠損している（Ｍａｒｔｕｚａら、１９９１；Ｍｉｎｅｔａら、１９９４；Ｍｉｙａｔａｋｅら、１９９９）。ＨＳＶ−１は種々の遺伝的操作を用いて、中枢神経系の悪性腫瘍の治療として詳細に研究されてきた［Ａｄｖａｎｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５： １６０−１６５， １９９８； Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９５；Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙら、Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ５７： １５０２−１５０９， １９９７］。より最近では、ウイルスを非ヴィルレントにする試みがγ１３４．５遺伝子の両方のコピーを欠失させることにより行われている（Ｃｈｏｕら、１９９０；ＣｈｏｕとＲｏｉｚｍａｎ、１９９４）。
【０００９】
しかしながら、本発明者らは、導入ベクター及びデリバリーシステムを用いたフェーズＩ臨床試験が血管形成因子の導入の可能性を扱っている例を２例しか知らない［Ｂａｕｍｇａｒｔｅｒら、Ｃｉｒｃ． １１１４−１１２３， １９９８； Ｉｓｎｅｒら、１９９５； Ｓｙｍｅｓら、１９９９；Ｒｏｓｅｎｇａｒｔら、１９９９］。従って、この技術における進展にもかかわらず、血管疾患を治療するためのより広い体細胞遺伝子治療応用ための治療方法およびより効果的なベクターに対する需要がなお存在する。
【００１０】
発明の概要
本発明は、組換え単純ヘルペスウイルスを使用して異種核酸を血管細胞中で発現させる方法を提供することにより、上述の問題に対する解決法を提供する。本発明はまた、血管疾患を治療または予防する方法、および、機能的に異常な血管に正常な生理機能を誘導する方法を提供する。
本発明の一つの側面によれば、血管細胞中で異種核酸を発現させる方法が提供される。本方法は、複製可能な組換え単純ヘルペスウイルスベクターを投与することを含み、この単純ヘルペスウイルスベクターは異種核酸を含み、かつこの単純ヘルペスウイルスは中枢神経系における増殖が弱められている。
【００１１】
この組換え単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの非必須遺伝子中のヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換、欠失によって増殖が減弱されている。関連する実施態様において、この組換え単純ヘルペスウイルスは、さらに単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの必須遺伝子中に非サイレント挿入、置換、欠失を含んでいても良い。一つの実施態様では、この単純ヘルペスウイルスは非必須遺伝子である一つの発現可能γ１３４．５遺伝子を欠損している。さらなる実施態様において、この組換え単純ヘルペスウイルスは両方の発現可能なγ１３４．５遺伝子を欠損している。
【００１２】
本発明の方法によって治療するための適切な血管細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞および／または外膜細胞が含まれる。さらなる実施態様において、異種核酸配列はポリペプチド、すなわち抗増殖性ポリペプチド、血管拡張性ポリペプチド、および血管形成性ポリペプチドをコードする。さらなる実施態様において、異種核酸配列はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドをコードする。さらなる実施態様において、このアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドは抗増殖性ポリペプチド、血管拡張性ポリペプチドまたは血管形成性ポリペプチドをコードするＲＮＡに相補的である。好ましくは、本組換え単純ヘルペスウイルスはＨＳＶ−１である。関連する実施態様において、本組換え単純ヘルペスウイルスは更に抗ウイルス薬による単純ヘルペスウイルス感染の治療に必須の少なくとも一つの遺伝子を含む。
【００１３】
本発明の他の側面により、心血管疾患又は血管細胞の異常状態の治療若しくは予防方法であって、異種核酸配列を含む増幅可能な組換え単純ヘルペスウイルスベクターを細胞に投与することを含み、その単純ヘルペスウイルスが中枢神経系における増殖について減弱されている方法が提供される。
この組換え単純ヘルペスウイルスは単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの非必須遺伝子中でヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換または欠失によって増殖が弱められている。この組換え単純ヘルペスウイルスはさらに、単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの必須遺伝子中でヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換または欠失を含んでいても良い。一つの実施態様では、この単純ヘルペスウイルスは一つの発現可能なγ１３４．５遺伝子、非必須遺伝子、を欠損している。更なる実施態様では、この組換え単純ヘルペスは両方の発現可能γ１３４．５遺伝子を欠損している。
好ましい実施態様では、心血管疾病は血管組織における緊張亢進症である。好ましくは、心血管疾病は、慢性心不全、高血圧心血管疾患、虚血性心臓疾患、不整脈、先天性心疾患、心弁膜疾患または狭窄欠損（ｓｔｅｎｏｔｉｃ ｄｅｆｅｃｔ）、心筋症、動脈瘤、慢性静脈不全、末梢動脈疾患または再狭窄からなる群より選ばれる。
【００１４】
さらなる実施態様において、異種核酸配列は７日以上、１４日以上、２１日以上、２８日以上、３５日以上、７０日以上からなる群より選ばれる期間の間血管組織内で発現される。
さらなる実施態様は異種核酸配列がスクリーニング可能または選択可能なマーカーをコードすることを要求する。好ましくは、異種核酸配列は抗血栓性核酸、血管形成制御核酸、免疫調節因子、細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の阻害因子またはプログラム細胞死の制御因子である。
関連する実施態様において、本発明の方法はさらに、血管細胞に対する少なくとも一つの治療薬又は薬物を投与することを含む。好ましい実施態様において、この薬物は、高脂肪タンパク血症薬（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗動脈硬化薬、抗血栓／線維素溶解薬、血液凝固薬、抗不整脈薬、降圧薬、血管収縮薬、うっ血性心不全治療薬、抗アンギナ薬および抗感染薬からなる群より選ばれる。好ましくは、本組換え単純ヘルペスウイルスはＨＳＶ−１である。関連する実施態様において、本組換え単純ヘルペスウイルスはさらに抗ウイルス薬による単純ヘルペスウイルス感染の治療のために必須の少なくとも一つの遺伝子を含む。
【００１５】
本発明の更なる側面により、機能的に異常な血管細胞において正常な生理機能を誘導するための方法であって、異種核酸を含む複製可能な組換え単純ヘルペスウイルスを細胞に投与することを含み、前記単純ヘルペスウイルスが中枢神経系における増殖について減弱されている前記方法が提供される。
本組換え単純ヘルペスウイルスは単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの非必須遺伝子中でヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換、欠失によって増殖が減弱されている。本組換え単純ヘルペスウイルスは、さらに、単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの必須遺伝子中でヌクレオチド配列の非サイレント挿入、置換、欠失によって増殖が減弱されていてもよい。
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記載および実施例を参照することによりよりよく理解されるであろう。
【００１６】
発明の詳細な記載
体細胞遺伝子導入は種々の虚血性、血栓性および増殖性血管異常を治療する方法として提案されてきた。しかしながら、血管遺伝子導入の分野における進歩は内皮に効率よく侵入しより深い細胞層に安定かつ長期にトランスフォーミング、トランフェクションまたは感染することのできるベクターがなかったために阻害されてきた。
近年、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）の神経病原性が遺伝的に弱毒化され、その結果毒性が顕著に低下され、一方その浸透能は維持され長期感染が確率された。γ１３４．５遺伝子の両方のコピーを欠損させると毒性が低下するが、分裂細胞における複製が可能であり、おそらく安定なエピソーム性感染が可能である。γ１３４．５遺伝子の産物はウイルスタンパク質合成に関与する翻訳開始因子ｅＩＦ−２のαサブユニットのリン酸化を阻害する。
【００１７】
先行技術の欠陥を克服するために、γ１３４．５遺伝子の両方のコピーが欠失したＨＳＶ−１の改変された組換体（Ｃｈｏｕら、１９９０；ＣｈｏｕおよびＲｏｉｚｍａｎ， １９９４）をｉｎ ｉｎｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて血管組織をトランスフェクションする信頼性および効率について評価した。ＨＳＶ−１ベクターおよびその使用は、血管細胞への遺伝子導入のために非常に効果的であることが本明細書において示され、そのトランスフェクション効率と持続性は伝統的なウイルスベクターのそれを遙かに上回ることが示される。本明細書の開示はγ１３４．５−欠損ＨＳＶ−１ベクターは、無傷の免疫系を有する動物において４週間に至るまで動脈化静脈内膜の５０％において導入遺伝子発現を維持することができたことを明らかにした。明らかにされた持続性と効率は他のベクターについて報告された結果を遙かに上回ったので（Ｅｓｌａｍｉら、２０００；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９；Ｓｃｈｅｉｎｍａｎら、１９９９；Ｇｅｏｒｇｅら、２０００；Ｄｏｌｌｅｒｙら、１９９９；Ｗａｕｇｈら、２０００；Ｈａｎｎａら、２０００；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９９）、これらの結果は驚くべきことであり予想外であった。
【００１８】
本発明のベクターのさらに驚くべきかつ予想外の特性はこれらの効果を達成するために必要な用量が低いことによって示された。１ｍｌあたりわずか１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）がこの持続性および効率を達成するために使用され、この用量はアデノウイルスを使用する伝統的なストラテジーよりも数桁低い用量である（Ｃｈａｎｇら、１９９５；Ｓｍｉｔｈら、１９９７；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９；Ｃｈａｎｇら、１９９５；Ｓｃｈｅｉｎｍａｎら、１９９９；Ｕｅｎｏら、１９９７；Ｃｈｅｎｇら、１９９８；Ｇｅｏｒｇｅら、２０００；Ｄｏｌｌｅｒｙら、１９９９；Ｂｉｓｈｏｐら、１９９９；Ｚｏｌｄｈｅｌｙｉら、２０００；Ｗａｕｇｈｒａ、２０００；Ｖａｒｅｎｎｅら、１９９８；Ｃａｂｌｅら、１９９９；Ｆｕｌｔｏｎら、１９９６；Ｈａｎｎａら、１９９７；Ｎｅｓｃｈｉｓら、１９９８；Ｈａｎｎａら、２０００；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９９）。さらに、この低い用量において明らかな毒性又は免疫刺激性は無かった。しかしながら実験系ではＨＳＶ感染が動脈血栓を生じさせること（Ｋｅｙら、１９９０）およびＨＳＶはアテローム発生に関与しているかもしれないと言う指摘［Ａｌｂｅｒら、Ｃｉｒｃ． １０２： ７７９−７８５， ２０００］を考慮すると、毒性がないことまたは低下していることも驚くべきことであり予想外であった。
【００１９】
ある実施態様において、本明細書に記載のＨＳＶ−１ベクターおよびその使用方法は低濃度（例えば、投与ベクター１ｍｌあたり約１０９ｐｆｕ以下）において高い効率（細胞の４０％より多いトランスフェクション）を有する。特に、本明細書に記載のＨＳＶ−１ベクターはウイルス負荷の低減（例えば、１ｍｌあたり約１０１０ｐｆｕ未満の総ウイルス投入）が可能である。
ある実施態様において、本明細書に記載のＨＳＶ−１ベクターおよび使用法は宿主細胞、組織または器官において導入遺伝子発現が長期持続すること（例えば、約２８日以上）を明らかにしている。特定の側面において、この導入遺伝子持続期間は宿主生物が免疫適格であるという事実にもかかわらず長期となる。
特定の実施態様において、本明細書に記載のＨＳＶ−１ベクターおよびその使用方法は高レベルの細胞浸透度（例えば約４０％以上）を示す。
ある実施態様において、本明細書に記載のＨＳＶ−１ベクターおよびその使用方法は低毒性または許容可能な細胞毒性を示す（例えば、細胞当たりの総ウイルス粒子数比として表した感染多重度（ＭＯＩ）が２において約１０％以下の細胞毒性）。
【００２０】
Ａ．  核酸
本発明のある実施態様は、ベクター、プロモーター、治療用核酸およびその他のトランスフォーメーション及び細胞内における発現に関する核酸を含む種々の核酸に関する。ある側面において、核酸は野生型核酸又は変異核酸を含む。特定の側面において、核酸はポリペプチドをコードする、または転写された核酸を含む。
用語「核酸」はこの分技術分野でよく知られている。本明細書において「核酸」とは、一般にＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導体若しくは類似体の分子（すなわち、鎖）をいい、ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドには、例えば、ＤＮＡに見いだされるプリンまたはピリミジン塩基（たとえば、アデニンＡ、グアニンＧ、チミンＴまたはシトシンＣ）、またはＲＮＡに見いだされるプリンまたはピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシルＵ、またはＣ）を含む、天然に生じるヌクレオチドが含まれる。用語「核酸」は用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、これらは用語「核酸」の亜種である。用語「オリゴヌクレオチド」とは、約３〜約１００ヌクレオチド長の分子を言う。用語「ポリヌクレオチド」は約１００ヌクレオチド長よりも大きな少なくとも一つの分子を言う。
【００２１】
これらの定義は一般に一本鎖分子について言うが、特定の実施態様においてはこの一本鎖分子に部分的、実質的または完全に相補的である追加の鎖も包含する。従って、核酸は特定の配列を含む分子に相補的な鎖または相補物を含む二本鎖分子又は三本鎖分子を包含することがある。本明細書において、一本鎖核酸は接頭語ｓｓによって記載し、二本鎖核酸は接頭語ｄｓによって、三本鎖酢酸は接頭語ｔｓによって記載することがある。
特定の側面において、核酸はＲＮＡおよび／またはタンパク質、ポリペプチドおよび／又はペプチドをコードする。ある実施態様では、本発明は少なくとも一つのタンパク質様分子を含む新規な組成物に関する。本明細書において「タンパク質様分子」、「タンパク質様組成物」、「タンパク質様化合物」、「タンパク質様鎖」または「タンパク質様物質」とは、一般に、遺伝子から翻訳される内在性の約２００アミノ酸より大きいまたは完全長のタンパク質；約１００アミノ酸より大きなポリペプチド；および／または約３〜約１００アミノ酸のペプチドをいうが、これらに限定されない。上述の全ての「タンパク質様」という語は本明細書において互換的に使用される。
【００２２】
Ａ．１．  核酸の調製
核酸は当業者に知られたどの技術によって作製してもよく、例えば、化学合成、酵素的作製または生物学的作製によって作製してもよい。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例にはＥＰ２６６，０３２（引用により本明細書に取り込まれるものとする）に記載されたようなホスホトリエステル、ホスファイト、またはホスホルアミダイト化学および固相技術、またはＦｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６および米国特許第５，７０５，６２９号（それぞれ引用により本明細書に取り込まれることとする）に記載されたデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成によって作製された核酸が含まれる。本発明の方法において、１以上のオリゴヌクレオチドを使用しても良い。オリゴヌクレオチド合成の種々の機構は、例えば、米国特許第４，６５９，７７４号、第４，８１６，５７１号、第５，１４１，８１３号、第５，２６４，５６６号、第４，９５９，４６３号、５，４２８，１４８号、第５，５５４，７４４号、第５，５７４，１４６号、第５，６０２，２４４号に開示されている（これらはそれぞれ引用により本明細書にとりこまれることとする）。
【００２３】
酵素的に作製される核酸の非限定的な例は、ＰＣＲＴＭのような増幅反応において酵素によって生成される核酸（例えば、米国特許第４，６８３，２０２および第４，６８２，１９５号を参照せよ；これらは引用により本明細書に取り込まれるものとする）または米国特許第５，６４５，８９７号（引用により本明細書に取り込まれるものとする）に記載されるオリゴヌクレオチド合成によって生成される核酸である。生物学的に作製される核酸の非限定的な例には、バクテリア中で複製される組換えＤＮＡベクター（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照せよ）のような、生細胞において生成（すなわち複製）される組換え核酸が含まれる。
【００２４】
Ａ．２．  核酸の精製
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心勾配、または当業者に知られたいかなる手段によって精製しても良い（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。好ましい側面において、核酸は生理学的に許容できる核酸である。生理学的に許容できる核酸は当業者には知られたものであり、その例は本明細書に記載されている。
ある実施態様において、本発明は単離された核酸に関する。本明細書において「単離された核酸」とは、１以上の細胞の全ゲノム核酸および転写核酸の大多数から分離された、または、それらを含まない核酸分子をいう。ある実施態様において、「単離された核酸」とは、例えば、脂質またはタンパク質、小さな生物学的分子等のような細胞成分その他の様なｉｎ ｖｉｔｒｏ反応成分、またはその大部分を含まないように分離された核酸分子をいう。
【００２５】
Ａ．３．  核酸セグメント
ある実施態様において、核酸は核酸セグメントである。本明細書において、用語「核酸セグメント」とは、例えば非限定的な例として、ペプチドまたはペプチド配列の一部のみをコードする断片のような、核酸の小さな断片をいう。従って、「核酸セグメント」は遺伝子配列のいかなる部分を含んでも良く、ペプチドまたはポリペプチドコード領域の約２ヌクレオチド、好ましくは５０ヌクレオチドから完全長を含んでも良い。
種々の核酸セグメントを特定の核酸配列に基づいて設計することができ、かつどのような長さにも設計することができる。配列に番号を割り当てることにより、例えば、最初の残基を１、２番目の残基を２等とすることにより全ての核酸セグメントを定義するアルゴリズムを作製することができる：
ｎからｎ＋ｙ
（式中、ｎは１から配列の最後の番号までの整数であり、ｙは核酸配列の長さ−１、ｎ＋ｙは配列の最後の番号を越えない）。
【００２６】
従って、１０−ｍｅｒについては、核酸セグメントは、塩基１から１０、２から１１、３から１２等、に対応する。２０−ｍｅｒについては、核酸セグメントは、塩基１から２０、２から２１、３から２２その他、に対応する。ある実施態様において、核酸セグメントはプライマーまたはプローブであってよい。本明細書において「プローブ」とは、一般に検出方法または組成に使用される核酸を言う。本明細書において「プライマー」とは、一般に伸長若しくは増幅法または組成物に使用される核酸を言う。
Ａ．４．  核酸相補物
本発明はまた核酸に相補的な核酸を包含する。ある核酸が他の核酸に標準的なワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン相補規則に従って塩基対形成可能である場合、他の核酸の「相補物」または他の核酸に「相補的」である。本明細書において、「他の核酸」とは別の分子であっても、空間的に離れた同一分子の配列であっても良い。好ましい実施態様において、相補物はｉｎ ｖｉｖｏにおいてＲＮＡ転写物の発現（例えば、翻訳）を低下させるために使用するアンチセンス核酸である。
本明細書において、用語「相補的」または「相補物」は、一部のヌクレオチドがその対応ヌクレオチドと塩基対形成しない場合であっても他の核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズすることの出来る連続したヌクレオチドまたは半連続（例えば、１以上の連続するヌクレオチドが分子中に存在しない）ヌクレオチドの配列を含む核酸をもいう。しかしながら、あるアンチセンス実施態様において、完全に相補的な核酸が好ましい。
【００２７】
Ｂ．  ベクター
用語「ベクター」は、複製が可能な細胞中への導入のために核酸配列を挿入することが出来る担体核酸分子を言う。本明細書において「ベクター」とは担体分子並びに挿入核酸（典型的には異種）および担体分子を含む組換え分子のいずれをも言う。当業者にはこの用法は文脈から明らかであろう。核酸セグメントは、「外因性」であってもよい。この語は、セグメントが導入される細胞のゲノムに期限を有しない配列であることを意味する。本明細書において「異種」核酸は他の核酸配列について外来性である核酸セグメントを意味すべく定義される。例えば、核酸セグメントは細胞のゲノムに異種であることも、別の並列する核酸セグメント（第１の核酸セグメントと一緒になって大きな核酸を構成する）に対して異種であることもある。
【００２８】
用語「発現ベクター」はＲＮＡをコードする転写可能な核酸を含む遺伝的構築物のいかなる型をもいう。ある場合には、ＲＮＡ分子は次にタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの作製の場合には、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは種々の「制御配列」を含むことができる。「制御配列」とは機能可能に結合されたコード配列を特定の宿主細胞中で転写およびおそらくは翻訳するために必要な核酸配列を言う。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは他の機能に働く核酸配列を含んでいても良く、それらは以下に記載する。
本明細書で言及するように、少なくとも異種核酸配列の発現は同起源のＲＮＡ分子（典型的にはｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ）の発現として定義される。より一般的には、異種核酸配列の発現とは、ポリペプチド遺伝子産物を生産する転写及び翻訳の細胞内過程を言う。ポリペプチド遺伝子産物は典型的にはそのポリペプチドに特徴的な少なくとも１つの機能を含むが、本明細書で言及するように、異種核酸配列の発現は非機能性ポリペプチドの産生を含むことが考慮されている。
【００２９】
Ｂ．１．  ＨＳＶ  ウイルスベクター
Ｉ型およびＩＩ型ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）は約１５０ｋｂの二本鎖の直線ＤＮＡゲノムを含み、少なくとも８４の発現可能なオープンリーディングフレームを含む［単純ヘルペス遺伝子の機能を記載した表１を参照せよ。（Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３： １１３０７−１１３１２， １９９６  １０月）］。野生型ＨＳＶは細胞に溶解性感染することができ、ある型の細胞（例えば神経）において潜伏状態を確立することができる。アデノウイルスと同様にＨＳＶも種々の型の細胞に感染することができ、それらには、筋肉（Ｙｅｕｎｇら、１９９９）、耳（Ｄｅｒｂｙら、１９９９）、ｅｙｅ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９９９）、腫瘍（Ｙｏｏｎら、１９９９；Ｈｏｗａｒｄら、１９９９）、肺（Ｋｏｈｕｔら、１９９８）、神経（Ｇａｒｒｉｄｏら、１９９９；ＬａｃｈｍａｎｎとＥｆｓｔａｔｈｉｏｕ，１９９９）、肝臓（Ｍｉｙｔａｋｅら、１９９９；Ｋｏｏｂｙら、１９９９）およびランゲルハンス島（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ）（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈら、１９９９）が含まれる。
【００３０】
ＨＳＶウイル遺伝子は細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され一時的に制御され、大きく分けて３つの識別できるフェーズまたは動力学的分類で転写物を生じさせ続いて遺伝子産物を生じさせる。これらの３つのフェーズは、前初期（ＩＥ）またはα遺伝子、初期（Ｅ）またはβ遺伝子、および後期（Ｌ）またはγ遺伝子と称される。新たに感染された細胞の核内にウイルスゲノムが到着すると直ちにＩＥ遺伝子が転写される。これらの遺伝子の効率的発現にはそれに先立つウイルスタンパク質の合成を必要としない。ＩＥ遺伝子の産物は転写の活性化および残りのウイルスゲノムを制御するために必要とされる。
【００３１】
ＨＳＶは分裂中及び非分裂宿主細胞の両方に広範囲に感染することができ、従って、異種核酸を宿主細胞にデリバリーするためのウイルスベクター作製に使用されてきた。ある実施態様において、単純ヘルペスウイルスベクターはＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２ベクターであってよい。特に好ましいベクターはγ１３４．５遺伝子の１以上のコピーまたはリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子（すなわちＩＣＰ６をコードするγ１３９遺伝子またはγ１４０遺伝子）を欠損したウイルスベクターである。γ１３４．５遺伝子の単一コピーを有するベクターは病原性と関連する逆反復配列を欠いている。ウイルスベクターに本明細書に開示する方法または当業者に知られた方法で変異を導入して、本明細書に開示する方法に使用する、少なくとも一つのγ１３４．５遺伝子および／またはリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子を欠くウイルスベクターを作製することが出来る。例えば、１以上のγ１３４．５遺伝子またはリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子を欠く単純ヘルペスウイルスを作製する方法は、米国特許第６，１２０，７７３号、第６，１０６，８２６号、第５，７９５，５７１３号、第５，５８５，０９６号及び、第５，３２８，６８８号に開示されている（それぞれ、引用により本明細書に取り込まれるものとする）。
【００３２】
実施態様には、中枢神経系における増殖が減弱されている単純ヘルペスウイルスの（本発明の方法における）使用が含まれる。本明細書において減弱されたＨＳＶは以下のように定義される。野生型株（非組換え体）は脳内接種によってマウスを殺すために１０ｐｆｕから１０００ｐｆｕを必要とする。減弱されたウイルスはマウス宿主を殺すために少なくとも１００，０００ｐｆｕを必要とする。更に、病原性ウイルスは細胞から細胞へ迅速に移り渡るが、宿主動物が感染に対して免疫的に応答出来ないのでない限り、減弱されたウイルスは極めて拘束されており細胞から細胞へあまり効率よく移らない（従って、マウスのような宿主を殺すためにはより多くのウイルス粒子が必要である）。
【００３３】
ＨＳＶは、単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの非必須遺伝子における非サイレントヌクレオチド挿入、置換または欠失によってＣＮＳにおける増殖を弱めることができ、それは本発明に有用である。非必須遺伝子の例およびそれらの機能は表３に記載した。そのような減弱したＨＳＶウイルスはまた単純ヘルペスウイルスの少なくとも一つの必須遺伝子における非サイレントヌクレオチド挿入、置換または欠失を含んでいても良い。必須遺伝子の例とそれらの機能は表２に示した。
本明細書において、必須遺伝子は、細胞中で感染性子孫を生成するために必要な遺伝子として定義される。たとえば、ＨＳＶ遺伝子、α４は必須である。すなわちこの遺伝子が存在しないとウイルスは感染性子孫を生じさせない。しかしながら、当業者は、α４遺伝子産物を産生する細胞株では欠損変異体（α４−）の複製が許されることを認識するであろう。本明細書において、非必須遺伝子は、存在しないまたは機能しない場合に、欠損遺伝子産物を供給しない細胞株におけるウイルスの複製を阻害しないおよび子孫生成を阻害しない遺伝子として定義される。例えば、ＨＳＶ遺伝子、α０は非必須遺伝子と考えられている。すなわち、α０欠失変異体（α０−）は多くの異なる細胞株で子孫を産生する（ある細胞株では力価は５０〜１００倍低いが、他の細胞株ではほぼ正常の収量が産生される）。
【００３４】
ＨＳＶの反復逆配列中に位置するγ１３４．５の様な遺伝子の安定な改変を保証するため、未改変遺伝子における再構成を防止するように反復逆配列自体が改変される。理論に拘泥することはしないが、遺伝子再構成、または遺伝子転換は反復領域にその部分または全体が見いだされる重複遺伝子の反復逆配列媒介対形成の結果として、遺伝子の一つのコピーが（例えば未改変コピーが）その遺伝子の他のコピー（例えば改変コピー）の転換のための鋳型として働いて起こると考えられている。従って、当業者は、通常の手順を用いて、逆反復配列中に含まれる遺伝子に加えてその逆反復配列を改変遺伝子が効果的に失われるのを防止するに十分に改変するであろう。例えば、当業者は、一つの逆頒布配列をその反復とそれに含まれる遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ対形成を効果的に防止するに十分に改変するであろうし、それにより反復中に見いだされる改変遺伝子の欠失が防止されることが期待され、それは遺伝子転換の防止によるものであると考えられる。
【００３５】
【表１】
表１．
2004528820.tif 000002
【表２】
表１．つづき
2004528820.tif 000003
【表３】
表１．つづき
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【表４】
表１．つづき
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【００３６】
【表５】
表１．つづき
2004528820.tif 000006
【００３７】
【表６】
表２
2004528820.tif 000007
【００３８】
【表７】
表３
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【００３９】
本明細書において、１以上の変異遺伝子が、中枢神経系（ＣＮＳ）またはニューロンにおける増殖について減弱されるために十分になほど発現が低下若しくは活性が低下、または発現しない若しくは活性がないように変異導入される場合、そのウイルスベクターはその遺伝子を「欠損」しているという。そのような変異には、例えば、１以上の遺伝子のコード配列または制御配列におけるフレームシフト変異、挿入、欠失、短縮化その他が含まれ得る。γ１３４．５遺伝子の産物は神経毒性に寄与する（Ｃｈｏｕら、１９９４）。１以上のγ１３４．５遺伝子を欠くウイルベクターは弱毒化された神経毒性を有しているが、タンパク質合成を阻害せず正常な宿主細胞の死をもたらす（勿論、γ１３４．５遺伝子の欠失は典型的にはオーバーラップする反対方向のｏｒｆｐの一部又は全部を欠失させる）。１以上のリボヌクレオチドレダクターゼを欠くＨＳＶウイルスベクターも弱毒化された神経毒性を有し（すなわち、リボヌクレオチドレダクターゼのいずれかのサブユニットを欠損すると弱毒化が生じる）、アシクロビルやガンシクロビルのような抗ウイルス薬に影響を受けやすく、宿主がベクター投与の望ましくない副作用［たとえばウイルス脳炎、米国特許第６，１０６，８２６号］を示す症例において抗ウイルス治療を可能とする。ヘルペスウイルスベクター中の１以上の他の遺伝子を変異させてヘルペスウイルスベクターの効率を改善するまたは副作用を低下させることも考慮されている。そのような遺伝子はこの技術分野で知られており、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、またはＨＳＶ複製、感染または潜伏に必要な他の遺伝子が含まれる。
【００４０】
治療遺伝子のデリバリーに使用するため、ＨＳＶは複製欠損であってよい。複製欠損ＨＳＶヘルパーウイルスフリーの細胞株を作製するプロトコルは記載されている（米国特許第５，８７９，９３４号；米国特許第５，８５１，８２６号）。一つのＩＥタンパク質、感染細胞ポリペプチド４（ＩＣＰ４）はα４遺伝子によってコードされ、ウイルス感染およびＩＥから後期転写への移行の両方に絶対に必要である。したがって、その複雑で多機能な特性およびＨＳＶ遺伝子発現の制御に中心的な役割を果たすので、ＩＣＰ４は典型的にはＨＳＶ遺伝子研究の標的となってきた。
ＩＣＰ４を欠失したＨＳＶウイルスの表現型研究によりそのようなウイルスは潜在的に遺伝子導入目的に有用であることが示される（Ｋｒｉｓｋｙら、１９９８ａ）。ＩＣＰ４を欠失したウイルスを遺伝子導入に望ましいものとする一つの特性は、それらがウイルスＤＮＡ合成を指示するタンパク質およびウイルスの構造タンパク質をコードするウイルス遺伝子発現することなく、５つの他のＩＥ遺伝子、ＵＳ１．５、ＩＣＰ０、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ２２およびＩＣＰ４７のみを発現するからである（ＤｅＬｕｃａら、１９８５）。この特性は宿主細胞の代謝又は遺伝子導入に伴う免疫応答に対する可能性のある有害な効果を最小にするために望ましい。ＩＣＰ４に加えて更なるＩＥ遺伝子ＩＣＰ２２およびＩＣＰ２７の欠失はＨＳＶ細胞毒性の低減を改善し、初期および後期ウイルス遺伝子発現を妨げる（Ｋｒｉｓｋｙら、１９９８ｂ）。
【００４１】
遺伝子導入におけるＨＳＶの治療的可能性は種々のｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系およびｉｎ ｖｉｖｏでパーキンソン病（Ｙａｍａｄａら、１９９９）、網膜芽細胞腫、脳内および皮内腫瘍（Ｍｏｒｉｕｃｈｉら、１９９８）、Ｂ細胞悪性腫瘍（Ｓｕｚｕｋｉら、１９９８）、卵巣癌（Ｗａｎｇら、１９９８）およびデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｈｕａｒｄら、１９９７）のような疾患について証明されている。
従って、ある実施態様において、ウイルスベクターは治療用核酸をコードする核酸配列を含む。好ましい側面において、核酸は血管の、心臓のおよび／または心血管疾患または異常を治療するために効果的なアンチセンス核酸またはタンパク質様構成物をコードする。当業者は標準的組換え技術によりベクターを構築する技術を有しているであろう（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９９８およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４を参照せよ。）。本発明の核酸をデリバリーするために使用できるウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
【００４２】
Ｂ．２．    治療用核酸
ある実施態様において、本発明のベクターは異種核酸を含む。好ましい側面において異種核酸はタンパク質様成分またはアンチセンス産物をコードする治療用核酸を含む。例示的な異種核酸は、抗増殖活性、血管拡張活性または血管形成活性を有するヌクレオチド（例えばアンチセンス）、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
種々の遺伝子に関するヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは従前に開示されており当業者に知られたコンピューターデータベースに見いだすことができる。そのようなデータベースの一つが全米バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。これらの遺伝子のコード領域を増幅し、本発明のベクターへ本明細書に開示される方法または当業者に知られた方法を用いて（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）クローン化し、および／またはベクター中で発現させることができる。
【００４３】
ある実施態様において、ベクターはそのような治療用核酸を２以上含んでも良い。この治療用核酸は同じ機能群（例えば、いずれも抗増殖性、血管拡張性または血管形成性である等）から選ばれてもよく、異なる機能群（例えば抗増殖性および血管形成性）から選ばれても良い。標的細胞に特定の治療用核酸の組合わせを提示することにより、いずれかの核酸若しくは両方の核酸またはそれらがコードする産物の標的細胞に対する全般的な生理学的効果を増強することができる。
例えば、細胞外基質タンパク質の沈着および血管細胞増殖はアテローム性動脈硬化症と関連している。過剰発現している（例えばブタ動脈において）酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）のような遺伝子は、平滑筋細胞増殖を生じさせ、その結果動脈壁の肥厚を生じさせ、動脈壁における内皮細胞遊走のために新たな血管形成を引き起こす。ＴＧＦ−β１および血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦＢ）の過剰発現も血管壁肥厚を生じさせる。ある側面において、アテローム性動脈硬化症に寄与するタンパク質（例えばａＦＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦＢ）をコードするＲＮＡに結合する核酸の血管細胞または心血管細胞における発現はアテローム性動脈硬化症の進行を抑えるであろうことが考慮されている。
【００４４】
他の例において、細胞増殖を阻害する産物をコードする核酸を発現させるベクターの投与は患者の再狭窄を阻害することが明らかにされている。例えば、チミジンキナーゼを発現させるアデノウイルスベクターは、細胞をガンシクロビルによる殺傷を受けやすくし、ガンシクロビル投与と併用すると、動物モデルにおいてバルーン血管形成後の平滑筋増殖および再狭窄を阻害した（Ｏｈｎｏら、１９９４）。従って、特定の側面において、このような血管肥厚化に関する治療用核酸を発現するベクターの投与は、アテローム性動脈硬化症や再狭窄の患者の治療に使用される薬物（例えば、抗リポタンパク質症薬、抗動脈硬化薬、抗血栓／線維素溶解薬、抗高血圧薬）の投与および／または手術的方法（例えば、動脈バイパス手術、バルーン血管形成術）と併用することも出来る。
好ましい実施態様において、治療用核酸は血管若しくは心血管の疾患または疾病の治療に効果的であろう。本発明のベクターの投与により利益を受けるであろう心血管疾患または疾病には、慢性心不全、高血圧心血管疾患、虚血性心疾患、不整脈、先天性心疾患、心弁膜疾患、心筋症、動脈瘤、慢性静脈不全、末梢動脈疾患またはそれらの組合せが含まれるが、これらには限定されない。
【００４５】
ある実施態様において、本発明のベクターは少なくとも一つの抗増殖性、血管拡張性または血管形成性タンパク質様成分をコードするであろう。例えば、ある側面において、本発明のベクターは抗血栓性核酸、血管形成を制御する核酸（例えば、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、免疫調節性核酸（例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−１０）、細胞増殖刺激核酸（例えば、血小板由来増殖因子、ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓ）、細胞増殖の阻害因子をコードする核酸（例えば、ｐ５３、ｐ２１、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ））またはそのような核酸のアンチセンス発現構築物を含んでよい。
【００４６】
さらなる実施態様において、本発明のベクターは１以上の酵素をコードしていて良く、それらには、アンジオジェニン、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、老化細胞由来阻害因子１（ｓｄｉ１）、細胞周期タンパク質（ｃｄｃ）、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）、Ｃ型ナトリウム利尿性ペプチド（ＣＮＰ）が含まれるがこれらに限定されず、ｇａｘ（これに限定されない）を含むホメオボックス遺伝子、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ、内皮細胞一酸化窒素合成酵素（ｅｃ−ＮＯＳ）、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、ヒルジン、ＶＣＡＭ，ＩＣＡＭ、ＰＥＣＡＭまたはＥ−セレクチンを含む（これらに限定されない）細胞接着分子、メテロプロテイナーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ）、アドレノメジュリンのようなｃＡＭＰ類似物、細胞外応答キナーゼ（ＥＲＫ）及びｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）のような有糸分裂活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびそれらの阻害物質、およびそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドが含まれる。他の実施態様において、本発明のベクターは１以上のポリヌクレオチドをコードすることがある。他の実施態様において、本発明のベクターはｃ−ｍｙｂを含む（これに限定されない）癌遺伝子を含むことがある。
【００４７】
Ｂ．２．ａ．    抗血栓性核酸
ある実施態様において、治療用核酸は抗血栓効果を生み出すことがある。そのような核酸の非限定的な例には、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ヒルジン、ｔ−ＰＡまたはｐ３００コード配列が含まれる。
Ｂ．２．ｂ．    血管形成制御核酸
他の実施態様において、本発明のベクターは血管形成を増強または阻害する核酸をコードしていて良い。血管形成を制御する核酸の非限定的な例には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、ＴＮＦαまたはそれらのレセプターが含まれる。
【００４８】
Ｂ．２．ｃ．    免疫調節因子
免疫調節因子を本ベクターに含めて細胞または患者の（例えば動物の）応答を増強させる得ることが考えられる。免疫調節因子は生成されたタンパク質、免疫調節因子をコードする核酸、および／またはワクチン組成物中で免疫調節因子を発現する細胞として含めることが出来る。以下の節に関心のある免疫調節因子の非限定的な例を列挙する。種々の免疫調節因子の組合わせ（例えば、サイトカインとケモカイン）をある実施態様で使用し得ることが考慮される。
Ｂ．２．ｃ．ｉ．    サイトカイン
インターロイキン、サイトカイン、インターロイキンまたはサイトカインをコードする核酸、および／またはそのような化合物を発現する細胞は異種核酸遺伝子産物として考えられる。インターロイキン及びサイトカインには、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、β−インターフェロン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；カケクチン）、ＴＧＦβ、ＬＴおよびこれらの組合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
Ｂ．２．ｃ．ｉｉ    ケモカイン
ケモカイン、ケモカインをコードする核酸、および／またはケモカインを発現する細胞も異種核酸として使用することが出来る。ケモカインは一般に化学誘引物質として作用し、免疫エフェクター細胞をケモカイン発現部位に集める。治療部位、例えば血管内組織、に他の免疫系構成成分をリクルートメントするために特定のケモカインコード配列をサイトカインコード配列と一緒に発現させることが有利な場合がある。そのようなケモカインには、例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ１−β、ＩＰ−１０およびそれらの組合せが含まれる。当業者はある種のサイトカインも化学誘因作用を有し、ケモカインとして分類することもできることを認識するであろう。
【００５０】
Ｂ．２．ｄ．    細胞増殖の誘導因子
一つの実施態様において、細胞増殖の特定の誘導因子に対するアンチセンスｍＲＮＡを使用してその細胞増殖誘導因子の発現を阻害することが考慮される。細胞増殖を誘導するタンパク質は更にその機能によって種々のカテゴリーに分けられる。これらの全タンパク質の共通性は細胞増殖を制御するという能力である。
例えば、ＰＤＧＦの一形態、ｓｉｓ癌遺伝子は分泌増殖因子である。タンパク質、ＦＭＳ、ＥｒｂＡ、ＥｒｂＢおよびｎｅｕも増殖因子レセプターである。これらのレセプターの変異は制御可能機能の欠損を生じさせる。例えば、点変異はＮｅｕレセプタータンパク質の膜貫通ドメインｎｅｕ癌遺伝子を生じさせる。ｅｒｂＡ癌遺伝子は甲状腺ホルモンの細胞内レセプターに由来する。修飾されたＥｒｂＡレセプターは内在性甲状腺ホルモンと競合し、制御できない増殖を引き起こすと考えられている。
【００５１】
癌遺伝子の最も大きなクラスにシグナル伝達タンパク質（例えばＳｒｃ， ＡｂｌおよびＲａｓが含まれる）。タンパク質Ｓｒｃは細胞質プロテインキナーゼであり、その前癌遺伝子から癌遺伝子へのトランスフォーメーションは、ある場合にはチロシン残基５２７における変異によって生じる。対照的に、ＧＴＰａｓｅタンパク質ｒａｓのプロト癌遺伝子から癌遺伝子へのトランスフォーメーションは配列中のアミノ酸１２のバリンからグリシンへの変異（ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ 活性を低下させる）によって生じる。
Ｊｕｎ、ＦｏｓおよびＭｙｃのような他のタンパク質は転写因子として核機能にその影響を直接的に発揮するタンパク質である。
【００５２】
Ｂ．２．ｅ．    細胞増殖の阻害因子
ある実施態様では、遺伝的構築物を通して細胞増殖阻害因子の活性を回復させることが意図されている。腫瘍抑制性癌遺伝子は過剰な細胞増殖を抑制するように機能する。これらの遺伝子の不活性化はその阻害活性を破壊し、制御されない増殖を引き起こす。腫瘍抑制因子ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１およびＣ−ＣＡＭはこのクラスのタンパク質の例である。
高レベルのｐ５３は化学発癌、紫外線照射、いくつかのウイルスによってトランスフォーメーションした多くの細胞で見いだされる。ｐ５３遺伝子はヒトの広範な種類の腫瘍において変異的不活性化の頻度の高い標的であり、一般的なヒトの癌において最も頻度の高い変異遺伝子であることが既に詳細に記載されている。５０％を超えるヒトＮＳＣＬＣで変異しており（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、１９９１）他の腫瘍の幅広い範囲で変異している。
ｐ５３遺伝子は３９３アミノ酸のリンタンパク質をコードし、ラージＴ抗原やＥ１Ｂのような宿主タンパク質と複合体を形成することができる。このタンパク質は正常な組織および細胞に見いだされるが、トランスフォームした細胞や腫瘍組織と比較して僅かである。
【００５３】
野生型ｐ５３は多くの型の細胞で重要な成長因子およびシグナル伝達タンパク質として認識されている。ミスセンス変異はｐ５３遺伝子については一般的で、癌遺伝子のトランスフォーメーション能に本質的である。点変異によって刺激された単一の遺伝的変化が発がん性ｐ５３を作り出すことができる。しかしながら、他の癌遺伝子と異なり、ｐ５３点変異は少なくとも３０の別個のコドン内で生じ、しばしばホモ接合性を低下させることなく細胞の表現形シフトを生じさせる支配的アレルを作り出すことが知られている。更に、これらのドミナントネガティブアレルは生物体内で寛容され、生殖系列を通過するようである。変異アレルは、ほとんで機能不全になっていないものから強い浸透性のドミナントネガティブアレルまで種々の範囲に現れる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１）。
細胞増殖の他の阻害因子はｐ１６である。真核細胞周期の主要な移行はサイクリン依存性キナーゼ、すなわちＣＤＫによって起動される。ＣＤＫのひとつ、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）はＧ１通過の進行を制御する。この酵素の活性はＧ１後期においてＲｂをリン酸化することである。ＣＤＫ４の活性は活性化サブユニット、Ｄ型サイクリンおよび、ＣＤＫ４に特異的に結合してこれを阻害し、その結果網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）リン酸化を制御し得るタンパク質として特徴づけられる阻害的サブユニットｐ１６ＩＮＫ４によって制御されている（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９３；Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９５）。ｐ１６ＩＮＫ４はＣＤＫ４阻害因子であるので（Ｓｅｒｒａｎｏ、１９９３）、この遺伝子の欠失はＣＤＫ４の活性を増大させ、網膜芽細胞腫の過リン酸化を生じさせるであろう。ｐ１６がＣＤＫ６の機能を制御することも知られている。
【００５４】
ｐ１６ＩＮＫ４はＣＤＫ阻害タンパク質の新たに記載されるクラスに属し、このクラスにはｐ１６Ｂ、ｐ１９、ｐ２１ＷＡＦ１、およびｐ２７ＫＩＰ１が含まれる。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子は９ｐ２１にマッピングされ、この染色体領域は多くの型の腫瘍で頻度高く欠失している。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子のホモ接合性欠失および変異はヒトの腫瘍細胞株で頻度が高い。この証拠はｐ１６ＩＮＫ４遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆する。しかしながら、この解釈はｐ１６ＩＮＫ４遺伝子変異の頻度は未培養原発腫瘍においては培養細胞株におけるよりも非常に低いという観察により疑問視されてきた（Ｃａｌｄａｓら、１９９４；Ｃｈｅｎｇら、１９９４；Ｈｕｓｓｕｓｓｉａｎら、１９９４；Ｋａｍｂら、１９９４；Ｋａｍｂら、１９９４；Ｍｏｒｉら、１９９４；Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９４；Ｎｏｂｏｒｉら、１９９５；Ｏｒｌｏｗら、１９９４；Ａｒａｐら、１９９５）。プラスミド発現ベクターでトランスフェクションしたことによる野生型ｐ１６ＩＮＫ４の回復はある種のヒト癌細胞株のコロニー形成能を低下させた（Ｏｋａｍｏｔｏ、１９９４；Ａｒａｐ、１９９５）。
本発明に従って使用できる他の遺伝子には、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合遺伝子、およびｐ２１／ｐ２７融合遺伝子が含まれる。
【００５５】
Ｂ．２．ｆ．    プログラム細胞死の制御
ある実施態様において、野生型ＨＳＶに対して増殖に関して弱められた遺伝的構築物がアポトーシスを阻害するのではなく寧ろ刺激し、従って疾患組織又は望ましくない組織の死を促進するために使用することが意図されている。アポトーシス、またはプログラム細胞死、は正常な胚発生、成体組織におけるホメオスタシス維持に本質的な過程である（Ｋｅｒｒら、１９７２）。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質およびＩＣＥ−様プロテアーゼは他の系において重要な制御因子でありエフェクターであることが明らかにされている。Ｂｃｌ−２タンパク質は濾胞リンパ腫と関連して発見されたが、このタンパク質はアポトーシスの制御および多様なアポトーシス性刺激に応答した細胞生存の増強に重要な役割を果たす（Ｂａｋｈｓｈｉら、１９８５；ＣｌｅａｒｙとＳｋｌａｒ、１９８５；Ｃｌｅａｒｙら、１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら、１９８５；ＴｓｕｊｉｍｏｔｏとＣｒｏｃｅ、１９８６）。現在、進化的に保存されたＢｃｌ−２タンパク質は、死−アゴニストまたは死−アンタゴニスト、すなわち、アポトーシス制御因子として分類可能な関連タンパク質ファミリーの一員として認識されている。
【００５６】
この発見に続いて、Ｂｃｌ−２が種々の刺激によって引き起こされる細胞死を抑制することが示された。また、共通の構造的および配列相同性を有するＢｃｌ−２細胞死制御タンパク質ファミリーが存在することは今では明らかになっている。これらのファミリーの異なるメンバーはそれぞれＢｃｌ−２に類似の機能を有するか（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）、またはＢＣｌ−２機能と反対に作用し細胞死を促進する（たとえば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）ことが示されている。野生型ＨＳＶは、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のプロアポトーシスメンバーの修飾を含む種々の機構によりアポトーシスを阻害する。
【００５７】
Ｂ．３．    プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」とは核酸配列の領域であって、転写の開始および速度が制御される制御配列である。プロモーターは、核酸の特定の転写を開始させるために、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子のような制御タンパク質および制御分子が結合する遺伝的素片を含んでよい。「機能的に配置された」、「機能的に結合された」、「制御下」、および「転写制御下」なる句は、プロモーターが、転写を制御する配列に対して正しい機能的配置および／または方向にあることを意味する。
【００５８】
プロモーターは一般にＲＮＡ合成の開始部位を位置決めする機能を有する配列を含む。最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くあるプロモーター、例えば哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターでは、開始部位自身に重なる別個のセグメントが開始場所の固定を補助する。さらなるプロモーターエレメントは転写開始の頻度を制御する。典型的にはこれらは開始部位の３０−１１０ｂｐ上流に位置するが、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能素片を含むことが示されている。コード領域をプロモーターの「制御下」に置くために、転写開始部位の５’末端を選択したプロモーターの下流（すなわち３’’側）に配置する。「上流」のプロモーターはＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。プロモーター素片間の間隔は融通性が高く、従ってプロモーター機能は、これらの素片が互いに逆位または移動されても保存される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーター素片間の間隔は活性を低下させずに５０ｂｐまで増加させることができる。プロモーターに依存して、個々の素片は転写を活性化するために協同的にも独立に機能することができる。プロモーターは「エンハンサー」と共に用いることも用いないこともできる。エンハンサーとは、核酸配列の転写活性化に関与するｃｉｓ−作用制御因子である。
【００５９】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られるような、天然の核酸配列と関連したものであって良い。そのようなプロモーターは「内在性」であると称される。同様に、エンハンサーは、天然の核酸配列の下流または上流に位置する、その配列と天然に関連したものであってよい。あるいは、コード核酸配列を組換えまたは異種プロモーター（通常、天然の環境においてその核酸配列と関連していないプロモーターをいう）の下流に配置することによってある種の利点が得られるであろう。組換えまたは異種エンハンサーは、通常、天然の環境においてその核酸配列と関連していないエンハンサーを言う。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、他のいずれかのウイルスまたは原核細胞若しくは真核細胞から単離されるプロモーターまたはエンハンサー、および「天然には生じない」プロモーター、すなわち、異なる転写制御領域の異なる素片、共通配列、および／または、発現を改変する変異を含むプロモーターまたはエンハンサーが含まれる。例えば、組換えＤＮＡ構築物中に最も一般的に使用される原核細胞プロモーターには、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。
【００６０】
好ましいプロモーターおよび、エンハンサー、転写因子結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、リボソーム結合部位その他（以下を参照）のような他の発現制御素片は血管細胞で機能する真核細胞素片である。プロモーターおよびエンハンサー核酸配列を合成的に作製することに加えて、これらの配列は組換えクローニングおよび／またはＰＣＲＴＭを含む核酸増幅技術を用いて、本明細書に開示する構成要素と関連させて、作製することができる（米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照せよ。これらは引用により本明細書に取り込まれることとする。）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストその他のような非−核細胞小器官内でこれらの配列に転写および／または発現を指令する制御配列も使用することができると考えられている。
【００６１】
もちろん、発現のために選択した細胞器官、細胞型、組織、器官、または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要であろう。分子生物学における当業者は、一般にタンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組合わせを知っているであろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照せよ。この文献は引用により本明細書に取り込まれるものとする。）。使用するプロモーターは構成的であっても、組織特異的であっても、および／または導入ＤＮＡセグメントの高レベル発現を指令する適切な条件下で有用なもの、例えば、組換えタンパク質および／またはペプチドの大量生産に有利なものであってよい。
【００６２】
ある実施態様において、プロモーターは構成的である。他の実施態様においては、プロモーターは組織特異的である。好ましい側面において、プロモーターは血管特異的又は組織特異的である。組織特異的プロモーターまたは他のエレメントの実体およびその活性を解析するための方法は当業者によく知られたものである。真核細胞で有用なそのようなエレメントの非限定的な例にはＳＭ２２遺伝子プロモーター（Ｋｕｈｂａｎｄｎｅｒら、２０００）、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏら、１９９９）、ソマトスタチンレセプター２遺伝子（Ｋｒａｕｓら、１９９８）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅら、１９９９）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔら、１９９８）、マウスアルファ２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉら、１９９８）、Ｄ１Ａドーパミンレセプター遺伝子（Ｌｅｅら、１９９７）、インスリン様成長因子ＩＩ（Ｗｕら、１９９７）、およびヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏら、１９９６）が含まれる。
【００６３】
さらに、どのプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、インターネトでアクセスできる真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢ）も発現を駆動するために使用することができる。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系は別の可能な実施態様である。真核生物細胞は、デリバリー複合体の一部として、または追加の遺伝子発現構築物としてのいずれにせよ適切なバクテリアポリメラーゼが供給されれば、ある種のバクテリアプロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
表４に本発明との関係において遺伝子の発現を制御するために使用できるエレメント／プロモーターの非限定的な例を列挙した。表５には、特定の刺激に応答して活性化され得る核酸配列の領域である、誘導可能エレメントの非限定的な例を提示してある。
【００６４】
【表８】
表４．
2004528820.tif 000009
【００６５】
【表９】
表４．つづき
2004528820.tif 000010
【００６６】
【表１０】
表４．つづき
2004528820.tif 000011
【００６７】
【表１１】
表５．
2004528820.tif 000012
【００６８】
【表１２】
表５．つづき
2004528820.tif 000013
【００６９】
Ｂ．４．    開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特異的な開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳に必要なこともある。こられのシグナルにはＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルの提供が必要な場合もある。当業者はこのことを容易に決定することができるであろうし、必要なシグナルを提供することができる。挿入物全体の翻訳を保証するために開始コドンは所望のコード配列の読み取り枠と「インフレーム」でなければならない。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然のものでも合成されたものでも良い。
【００７０】
本発明のある実施態様において、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用してマルチ遺伝子またはポリシストロン性メッセンジャーが作製される。ＩＲＥＳエレメントは５’メチル化キャップ依存性翻訳のスキャンモデルを迂回させることができ、内部部位からの翻訳を開始させる（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒとＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコナウイルス群の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）のＩＲＥＳエレメント（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒとＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）および哺乳動物メッセンジャーのＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋとＳａｒｎｏｗ）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは異種オープンリーディングフレームに結合することができる。マルチオープンリーディングフレームは一緒に転写可能であり、それぞれはＩＲＥＳによって隔てられており、ポリシストロンメッセンジャーを生成する。ＩＲＥＳエレメントがあるため、各オープンリーディングフレームは効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能となる。マルチ遺伝子は単一のメッセンジャーを転写するための単一のプロモーター／エンハンサを用いて効率的に発現させることができる（米国特許第５，９２５，５６５号および５，９３５，８１９号参照）。
【００７１】
Ｂ．５．    マルチクローニング部位
ベクターは、複数の制限酵部位を含み、それぞれが標準的な組換え技術と組み合わせてベクターを消化するために使用できる核酸領域であるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができる（例えば、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｉら、１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら，１９９８、およびＣｏｃｅａ、１９９７を参照せよ。これらは引用により本明細書に取り込まれるものとする。）。「制限酵素消化」とは、核酸分子の特定の場所でのみ機能するＩＩ型エンドヌクレアーゼによる核酸分子の触媒的切断をいう。これら制限酵素の多くは商業的に入手可能である。そのような酵素の使用は当業者には広く知られている。しばしば、ベクターは外来性配列をベクターにライゲーションできるようにＭＣＳ内部を切断する制限酵素を用いて直線化または断片化される。「ライゲーション」とは、２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成させる過程である。制限酵素およびライゲーション反応に関する技術は組換え技術の当業者によく知られている。
【００７２】
Ｂ．６．    スプライシング部位
転写された真核生物ＲＮＡ分子のほとんどはＲＮＡスプライシングを受けて一次転写物からイントロンが除去される。ＨＳＶはＲＮＡスプライシングを阻害するため、ｃＤＮＡがベクターへの真核性挿入物の好ましい形態であるが、適切に発現される（イントロン無し）ゲノム配列も考慮される。野生型ＨＳＶのＲＮＡスプライシング−阻害能を欠損するベクターはタンパク質発現のための転写物の適切なプロセッシングを保証するためにドナーおよび／又はアクセプタースプライシング部位を必要とするかもしれない（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、１９９７を参照せよ。この文献は引用により本明細書に取り込まれるものとする。）。
【００７３】
Ｂ．７．    終結シグナル
本発明のベクターまたは構築物は一般に少なくとも一つの終結シグナルを含んでいるだろう。「終結シグナル」または「ターミネーター」はＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的終結に関与するＤＮＡ配列から構成されている。従って、ある実施態様では、ＲＮＡ転写物の産生を終了させる終結シグナルが意図されている。ターミネータはｉｎ ｖｉｖｏで所望のメッセンジャーレベルを達成するために必要なことがある。
【００７４】
真核系において、ターミネーター領域は新しい転写物の特異的切断を許しその結果ポリアデニル化部位を露出させる特異的なＤＮＡ配列を含んでいても良い。この配列は、特殊な内在性ポリメラーゼに転写物の３’末端に約２００個のＡ残基（ポリＡ）の伸長物を付加するように指令する。このポリＡ尾部で修飾された分子はより安定でより効率的に翻訳されるようである。従って、真核細胞を含む他の実施態様において、ターミネーターはＲＮＡの切断シグナルを含み、より好ましくはターミネーターシグナルはメッセンジャーのポリアデニル化を促進することが意図されている。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位素片はメッセンジャーレベルを増強するように働き、異種核酸配列を含むカセットから他の配列へのリードスルーを最小限にするために作用することができる。
【００７５】
本発明において使用が考慮されているターミネーターには、本明細書において記載されるまたは当業者に知られているいっさいの既知の転写終結因子が含まれ、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーターまたはウイルスターミネーター配列、ＳＶ４０ターミネーターのような、遺伝子の終結配列が含まれるが、これらに限定されない。ある実施態様において、終結は、配列の短縮化によるような、転写可能または翻訳可能配列の欠失によることがある。
【００７６】
Ｂ．８．    ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核系発現においては、典型的には転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含ませるであろう。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の実施の成功に重要であるとは考えられず、そのようないずれの配列も使用することができる。好ましい実施態様には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれ、これらは種々の標的細胞中でよく機能することが知られおり便利である。ポリアデニル化は転写物の安定性を増し、あるいは細胞質輸送を容易にすることができる。
【００７７】
Ｂ．９．    複製起点
宿主細胞中でベクターを増殖させるため、ベクターは複製が開始する特異的な核酸配列である複製部位起点（しばしばｏｒｉと称される）を１以上を有していて良い。あるいは、宿主が酵母である場合、自己増殖複製配列（ＡＲＳ）を使用しても良い。
【００７８】
Ｂ．１０．    選択およびスクリーニング可能マーカー
本発明のある実施態様において、本発明の核酸を含む細胞は発現ベクター中にマーカーを含めることによりｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで同定することができる。そのようなマーカーは細胞に同定可能な表現形を与え、その発現ベクターを含む細胞の同定を容易にする。例えば、トランスフォーメーションした細胞を同定するためにスクリーニング可能なマーカー（例えば、βガラクトシダーゼ）を用いることができる。
一般には、選択可能マーカーは選択的生存性を可能とする特性を与えるものである。正の選択マーカーはマーカーの存在がある種の既知の条件下（例えば、抗生物質の攻撃）で生存を許すようなマーカーであり、負の選択マーカーはその存在が生存を妨げるマーカーである。正の選択マーカーの例は、薬剤（例えば抗生物質）耐性マーカーである。
通常薬剤選択マーカーを含めることはクローニング及び形質転換体の同定の助けとなる。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択可能マーカーである。実施条件に基づいて形質転換体の識別を可能とする表現型を付与するマーカーに加えて、他の型のマーカー、比色解析にその基礎を置く、ＧＦＰのようなスクリーニング可能なマーカも考慮される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のようなスクリーニング可能な酵素も使用できる。当業者はまた免疫学的マーカーを、おそらくはＦＡＣＳ解析と組み合わせて使用する方法を知っているであろう。遺伝子産物をコードする異種核酸配列と同時に発現可能でありさえすれば使用するマーカーは重要であるとは考えられない。選択可能及びスクリーニング可能マーカーは当業者にはよく知られたものである。
【００７９】
Ｃ．  ベクターデリバリーおよび細胞形質転換
本発明と共に使用される、細胞小器官、細胞、組織または生物の形質転換のための核酸デリバリーの適切な方法は、単純ヘルペスウイルスベクターを細胞小器官、細胞、組織または生物へ導入することのできるどのような方法も実質的に含むと考えられ、そのような方法は本明細書に記載され、または当業者に知られている。そのような方法には、ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションのような核酸の直接デリバリー（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９、Ｎａｂｅｌら，１９８９）、マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎとＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号、引用により本明細書に取り込まれることとする）を含むインジェクション（米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４７号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号。これらは引用により本明細書に取り込まれるものとする。）による方法；エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号、引用により本明細書に取り込まれるものとする；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）による方法；リン酸カルシウム沈殿による方法（ＧｒａｈａｍとＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎとＯｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）；ＤＥＡＥデキストランに続くポリエチレングリコールを使用する方法（Ｇｏｐａｌ，１９８５）；直接音波処理による方法（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）；リポソーム媒介トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕとＳｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７；Ｗｏｎｇら，１９８０；Ｋａｎｅｄａら、１９８９；Ｋａｔｏら、１９９１）およびレセプター媒介トランスフェクションによる方法（ＷｕとＷｕ、１９８７；ＷｕとＷｕ、１９８８）；微粒子銃による方法（ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９４／０９６９９および９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号、第５，３２２，７８３号、第５，５６３，０５５号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８７７号及び第５，５３８，８８０号、それぞれ引用により本明細書に含まれるものとする）、およびこれらの方法の組合わせが含まれるが、これらに限定されない。このような技術を適用することにより、細胞内器官、細胞、組織または生物は安定に形質転換することも一過性に形質転換することもできる。
【００８０】
Ｃ．１．    Ｅｘ  ｖｉｖｏ  形質転換
生物から取り出した血管細胞及び組織をｅｘ ｖｉｖｏ環境でトランスフェクションする方法は当業者に知られたものである。例えば、イヌの内皮細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでレトロウイルス遺伝子導入により遺伝的に改変されイヌに移植されている（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９）。他の例では、ユカタンミニブタ（Ｙｕｋａｔａｎ ｍｉｎｉｐｉｇ）内皮細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでレトロウイルスによってトランスフェクションされダブルバルーンカテーテルを用いて動脈に移植されている（Ｎａｂｅｌら、１９８９）。従って、細胞または組織を取り出し、本発明の単純ヘルペスウイルスベクターを用いてｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクションしてもよいことが考慮されている。特定の側面において、移植された細胞または組織は生物体中に置くことが出来る。好ましい一面において、治療用核酸が移植された細胞または組織中で発現される。
【００８１】
Ｃ．２．    インジェクション
ある実施態様において、核酸は細胞小器官、細胞、組織または生物体に１回以上のインジェクション（すなわち、注射）によってデリバリーすることができる。これらには、例えば、皮下注射、皮内注射、筋肉注射、静脈注射、腹腔内注射その他が含まれる。インジェクションの方法は当業者にはよく知られており（例えば、生理食塩水を含む組成物の注射）、更なる例は本明細書に記載される。
【００８２】
Ｃ．３．    リポソーム媒介トランスフェクション
本発明の更なる実施態様において、核酸は、例えばリポソームのような脂質複合体に閉じこめられていても良い。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒体によって特徴づけられる小胞構造体である。マルチラメラリポソームは水性媒体で隔てられた複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水性溶液に懸濁されると自然に形成される。脂質成分は自己再配列を受けた後、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じこめる（ＧｈｏｓｈとＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。また、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化された核酸も考慮される。
【００８３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてリポソーム媒介核酸デリバリーおよび外来ＤＮＡの発現は非常に成功してきた（ＮｉｃｏｌａｕとＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ細胞及び肝癌細胞におけるリポソーム媒介デリバリー及び外来ＤＮＡの発現の可能性も明らかにされている（Ｗｏｎｇら、１９８０）。
本発明のある実施態様において、リポソームは赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体形成させてもよい。このことにより、細胞膜との融合が容易になり、リポソーム被包化ＤＮＡの細胞内侵入を促進されることが示されている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施態様において、リポソームはＨＶＪおよびＨＭＧ−１と複合体化またはこれらと組み合わせて使用することができる。他の実施態様において、デリバリービヒクルはリガンド及びリポソームを含んでいて良い。好ましいデリバリービヒクルはリポソーム及びレセプターのような血管細胞特異的結合パートナーに選択的、好ましくは特異的なリガンドを含む。
【００８４】
Ｃ．４．    レセプター媒介トランスフェクション
更に、核酸はレセプター媒介デリバリービヒクルによって標的にデリバリーすることができる。これは標的細胞で起こるであろうレセプター媒介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布の観点から、このデリバリー法は本発明に更なる特異性を付加する。
ある種のレセプター媒介遺伝子ターゲッティングビヒクルは細胞レセプター特異的リガンドおよび核酸結合成分を含む。他はデリバリーされる核酸が機能的に結合した細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドがレセプター媒介遺伝子導入に使用されており（ＷｕとＷｕ，１９８７；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４；Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ０２７３０８５）、この技術の操作可能性が確立されている。他の哺乳動物細胞型との関連で特異的なデリバリーが記述されている（ＷｕとＷｕ，１９９３、引用により本明細書に取り込まれることとする）。本発明のある側面において、リガンドは標的細胞手段において特異的に発現しているレセプターに対応して選ばれるであろう。
【００８５】
別の実施態様において、細胞特異的核酸ターゲッティングビヒクルの核酸デリバリービヒクル成分は、上述したように特異的結合リガンドをリポソームと組み合わせて含むことができる。デリバリーすべき核酸はリポソーム中に閉じこめられており、特異的結合リガンドがリポソーム膜に機能的に取り込まれている。従って、このリポソームは特異的に標的細胞のレセプターに結合しその内容物を細胞にデリバリーする。このような系は、例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）を使用してＥＧＦレセプターの上方制御を示す細胞への核酸のレセプター媒介デリバリーを行う系を用いて機能することが示されている。
さらなる実施態様において、核酸デリバリービヒクルはリポソーム自身であり、好ましくは細胞特異的結合を指令する１以上の脂質または糖タンパク質を含むであろう。例えば、ラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドをリポソームに取り込ませ、肝細胞によるインシュリン遺伝子の取り込み増加を生じさせたことが観察されている（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。本発明の組織特異的形質転換構築物を同様な方法で標的細胞に特異的にデリバリーすることが考慮されている。
【００８６】
Ｄ．  宿主細胞
本明細書において、用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は互換的に用いることがある。これらの後は全てそれらの子孫、次世代のいずれおよび全てを含む。故意または不用意な変異のため全ての子孫が同一でないかもしれないことは理解される。異種核酸の発現との関連で、「宿主細胞」とは原核細胞または真核細胞をいい（好ましくは、血管細胞である）、ベクターを複製させることができ、および／または、ベクターによってコードされる異種核酸を発現させることのできるいかなる形質転換可能な生物も含まれる。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして用いることができ、かつ使用されてきた。宿主細胞は、「感染」、「トランスフェクション」または「形質転換（トランスフォーメーション）」されることがあり、これらは、外来性核酸が宿主細胞へ移行または導入される過程を言う。形質転換した細胞には初代処理細胞及びその子孫が含まれる。本明細書において「操作された」および「組換え」細胞または宿主細胞とは、ベクターのような外来性核酸配列が導入された細胞を指すことが意図されている。従って、組換え細胞は非天然の導入核酸を含まない天然に生じる細胞から区別できる。
【００８７】
いくつかのベクターは、原核細胞及び真核細胞のいずれか又は両方で複製および／又は発現を可能にする制御配列を採用することがある。当業者は上述した宿主細胞を維持し、ベクター（例えば、本発明のヘルペスウイルス）の複製を許すためのインキュベーション条件を理解するであろう。ベクターの大量生産を可能にする技術及び条件、およびベクターによってコードされる核酸および同起源のポリペプチド、タンパク質またはペプチドの生産を可能とする技術および条件も理解され知られている。
宿主細胞として使用するための多数の細胞株および培養物はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）を通して入手できる。適切な宿主はベクター骨格（即ち担体）および所望の結果に基づいて当業者によって決定することができる。ベクターの複製および／又は発現のための真核宿主細胞の例には、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２細胞が含まれるが、これらに限定されない。種々の細胞型および生物種からの宿主細胞が入手可能で、当業者に知られたものである。
【００８８】
ある実施態様では、ＲＮＡまたはタンパク質性配列を他の選択したＲＮＡ又はタンパク質性配列とともに同じ宿主細胞内で共発現させることが考慮されている。共発現は宿主細胞を２以上の個別の組換えベクターで共トランスフェクションすることによって達成することができる。あるいは、複数の個別のＲＮＡコード領域を含む単一の組換えベクターを作製することができ、その単一のベクターでトランスフェクションした宿主細胞中でこれらを発現させることができる。
組織は本発明のベクターで形質転換すべき宿主細胞（単数または複数）を含んでいるであろう。組織は、生物体の一部または生物体から（例えば手術により）分離されたものであって良い。ある側面において、細胞又は組織は宿主から取り出され、ベクターおよび／または試薬と接触され、次に組織又は生物体へ再移植され、それによって手術的介入のような機械的手段を通した宿主細胞のベクターターゲッティングの特異性を達成することができる。ある実施態様では、組織は、脂肪細胞、肺胞、エナメル芽細胞、軸索、基底細胞、血液（例えばリンパ細胞）、血管、骨、骨髄、脳、胸、軟骨、頸部、結腸、角膜、胚性細胞、子宮内膜、表皮、上皮、食道、顔面、繊維芽細胞、ろ胞細胞、神経節細胞、グリア細胞、杯状細胞、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、神経、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、皮膚、小腸、脾臓、幹細胞、胃、小腸細胞および、それらの全ての癌を含み得るが、それらに限定されない。
【００８９】
血管組織または心血管組織における本発明のヘルペスウイルスベクターに含まれる核酸の発現の持続期間の延長は本発明の有利な側面である。特定の実施態様において、血管組織または心血管組織は内皮細胞、平滑筋細胞または外膜細胞を含む。特定の局面において、本発明のベクターは１、２，３またはそれ以上の型の血管細胞または心血管細胞中（例えば、内皮細胞、平滑筋細胞または外膜）で発現されてもよくどんな細胞型の組み合わせ中で発現されても良い。ある実施態様において、異種核酸配列は血管組織または心血管組織または細胞型中で、約１日以上、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約３１日、約３２日、約３３日、約３４日、約３５日、約３６日、約３７日、約３８日、約３９日、約４０日、約４１日、約４２日、約４３日、約４４日、約４５日、約４６日、約４７日、約４８日、約４９日、約５０日、約５１日、約５２日、約５３日、約５４日、約５５日、約５６日、約５７日、約５８日、約５９日、約６０日、約６１日、約６２日、約６３日、約６４日、約６５日、約６６日、約６７日、約６８日、約６９日、約７０日、約７１日、約７２日、約７３日、約７４日、約７５日、約７６日、約７７日、約７８日、約７９日、約８０日、約８１日、約８２日、約８３日、約８４日、約８５日、約８６日、約８７日、約８８日、約８９日、約９０日、約９１日、約９２日、約９３日、約９４日、約９５日、約９６日、約９７日、約９８日、約９９日、約１００日、あるいはそれ以上の日数、およびここから導き出されるいかなる範囲の間でも発現させることができる。
ある実施態様において、宿主細胞または組織は、少なくとも一種の生物体に見いだすことができる。ある実施態様には、その生物は真核生物（例えば、動物、ヒト）であってよく、当業者に理解できるように、これらに限定されない。
【００９０】
Ｅ．  治療薬
本発明のヘルペスウイルスの効能を増大させるため、本発明のこれらの成分および方法を血管疾患又は心血管疾患又は異常の治療に効果的な薬と組み合わせることが望ましいことがある。ある実施態様において、薬理学的治療薬、手術又はそれらの組み合わせを含む従来の治療法又は薬物（これらに限定されない）をベクター投与と組み合わせて良いことが考慮されている。非限定的例において、治療的利益には、血管組織における緊張亢進症の低減、または、医学的又は手術的処置において起こるような血管または心血管介入に伴う再狭窄の低減が含まれる。従って、ある実施態様において、本発明の治療方法は本発明のベクターを他の治療薬と組み合わせて投与することを含む。
【００９１】
この過程は細胞を薬物およびベクターと同じ時に（例えば、実質的に同時に）または、ベクターおよび薬物の細胞、組織又は生物体への別個の投与が所望の治療利益を与える時間内に接触させることを含む。本明細書において、用語「接触」、および「露出」とは、細胞、組織または生物体について言う場合、本発明の治療構築物および／または治療薬が標的細胞、組織または生物体へデリバリーされる、または標的細胞、組織または生物体と直接接触しておかれる過程を記述するために使用される。細胞、組織または生物体を、本発明のベクターおよび１以上の薬物を含む単一の成分若しくは薬理学的製剤と（例えば、投与により）接触させ、または細胞を２以上の別個の成分（この場合、一つの成分がベクターを含み他の成分が１以上の薬物を含んでよい）または製剤と接触させることができる。
【００９２】
本ヘルペスウイルベクターは、他の薬物に先行して投与しても、同時投与しても、および／またはその後に投与してもよく、その間隔は数分から数週間にわたってよい。本ベクターおよび薬物が別個に細胞、組織または生物に与えられる実施態様において、一般には重要な期間がそれぞれのデリバリー時の間に満了しないようにし、本ベクターおよび薬物がその細胞、組織または生物に対して組み合わされた有利な効果を発揮できるようにするであろう。例えば、そのような例において、細胞、組織または生物体を２，３、４又はそれ以上の様式で実質的にベクターと同時（約１分以内）に接触させるであろうことが考慮されている。
【００９３】
別の側面では、１以上の薬物が本発明のベクターの投与と同時、またはその前および／またはその後、約１分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間、約４８時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約１月、約２月、約３月、約４月、約５月、約６月、約７月、約８月、約９月、約１０月、約１１月、約１２月、およびこれらに由来するいかなる範囲の期間においても投与することができる。
【００９４】
本発明のヘルペスウイルスベクターおよび１以上の薬物の種々の組合わせ療法を使用することができる。そのような組合わせの非限定的な例を以下に示す。以下では、ベクターを含む組成物を「Ａ」、薬物を「Ｂ」で表す：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
ベクターを含む組成物の細胞、組織または生物体への投与は、（もしあるのであれば）治療の毒性を考慮しつつ血管または心血管治療に一般的なプロトコルに従えばよい。必要であれば治療サイクルを繰り返すことが予想される。種々の追加的薬物を本発明と組み合わせて用いても良いことは予想できる。
【００９５】
Ｅ．１．    薬理学的治療薬
薬理学的治療薬及び投与方法、用量その他は当業者によく知られており（例えば、“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”， Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎの“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”および“Ｔｈｅ Ｍｅｒｋ Ｉｎｄｅｘ”を参照せよ。これらは引用により本明細書に含まれるものとする。）、本明細書の開示に照らしてこれらを本発明と組み合わせることができる。治療すべき患者の状態に依存していくらかの用量の変動は必然的に生じるであろう。いずれにしろ投与に責任のある者は個々の患者に適切な用量を決定するであろうし、そのような個別の決定は当業者の能力の範囲内である。
本発明において使用できる薬理学的治療薬の非限定的な例には、抗高リポタンパク質症薬、抗動脈硬化薬、抗血栓／線維素溶解薬、血液凝固薬、抗不整脈薬、抗高血圧薬、血管収縮薬、うっ血性心不全薬、抗アンギナ薬、抗感染薬（例えば、抗細菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬）またはこれらの組合わせが含まれる。
【００９６】
Ｅ．１．ａ．    抗高リポタンパク質症薬
ある実施態様において、心血管治療、特にアテローム性動脈硬化症および血管組織の肥厚またはブロッキングの治療のために１以上の血中脂質および／またはリポタンパク質の濃度を低下させる薬物（「抗高リポタンパク質症薬」として知られる）の投与をベクター投与と組み合わせることができる。ある側面において、抗高リポタンパク質症薬にはアリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体、樹脂酸／胆汁酸隔離薬、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモン類似体、その他の薬物（以下参照）、この技術分野で知られた他の高リポタンパク質症薬およびそれらの組合せを含み得る。
【００９７】
Ｅ．１．ａ．ｉ．    アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体
アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体の非限定的な例には、ベクロブレート、エンザフィブレート、ビニフィブレート、シプロフィブレート、クリノフィブレート、クロフィブレート（アトロミド−Ｓ）、クロフィブリン酸、エトフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル（ロビド）、ニコフィブレート、ピリフィブレート、ロニフィブレート、シムフィブレートおよびテオフィブレートが含まれる。
Ｅ．１．ａ．ｉｉ．    樹脂酸／胆汁酸隔離薬
樹脂／胆汁酸隔離薬の非限定的な例には、コレスチラミン（コリバー、クエストラン）、コレスチポール（コレスチド）およびポリデキシドが含まれる。
【００９８】
Ｅ．１．ａ．ｉｉｉ．    ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害薬
ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害薬の非限定的な例には、ロバスタチン（メバコール）、プラバスタチン（プラバコール）またはシムバスタチン（ゾコール）が含まれる。
Ｅ．１．ａ．ｉｖ．    ニコチン酸誘導体
ニコチン酸誘導体の非限定的な例には、ニコチネート、アセピモックス、ニセリトロール、ニコクロネート、ニコモールおよびオキシナイアシン酸が含まれる。
Ｅ．１．ａ．ｖ．    甲状腺ホルモン及びその類似体
甲状腺ホルモン及びその類似体の非限定的な例にはエトロキセート、チロプロピン酸（ｔｈｙｒｏｐｒｏｐｉｃ ａｃｉｄ）およびチロキシンが含まれる。
Ｅ．１．ａ．ｖｉ．    その他の抗高リポタンパク質症薬
その他の抗高リポタンパク質症薬の非限定的な例には、アシフラン、アザコステロール、ベンフルオレックス、β−ベンザルブチルアミド、カルニチン、コンドロイチン硫酸、クロメストロン、デタクストラン（ｄｅｔａｘｔｒａｎ）、デキストラン硫酸ナトリウム、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエノイン酸、エリタデニン、フラザボール、メグルトール、メリナミド、ミタトリエンジオール、オルニチン、γ−オリザノール、パンテチン、ペンタエリスリトールテトラアセテート、α−フェニルブチルアミド、ピロザジル、プロブコール（ロレルコ）、β−シトステロール、サルトシル酸−ピペラジン塩、チアデノール、トリパラノールおよびゼンブチン（ｘｅｎｂｕｃｉｎ）が含まれる。
【００９９】
Ｅ．１．ｂ．    抗動脈硬化薬
抗動脈硬化薬の非限定的な例はピリジノールカルバメートである。
Ｅ．１．ｃ．    抗血栓／線維素溶解薬
ある実施態様において、心血管治療、特にアテローム性動脈硬化および脈管（例えば動脈）ブロックの治療のために、血栓を除去又は防止することを助ける薬物の投与をベクターの投与と組み合わせることができる。抗血栓薬および／または線維素溶解薬の非限定的な例には、抗凝血薬、抗凝血アンタゴニスト、抗血小板薬、血栓溶解薬、血栓溶解因子アンタゴニストまたはそれらの組合わせが含まれる。
ある側面において、経口的に投与できる、アスピリンおよびワルファリン（クマジン）のような抗血栓薬が好ましい。
【０１００】
Ｅ．１．ｃ．ｉ．      抗凝血薬
抗凝血薬の非限定的な例には、アセノクマロール、アンクロッド、アニシンジオン、ブロミンジオン、クロリンジオン、クメタロール、シクロクマロール、デキストラン硫酸ナトリウム、ジクマロール、ジフェナジオン、エチルビスクマセテート、エチリデンジクマロール、フルインジオン、ヘパリン、ヒルジン、ナトリウムリアポレート、オキサジジオン、ペントサンポリサルフェート、フェニンジオン、フェンプロクモン、ホスビチン、ピコタミド、チオクロマロールおよびワルファリンが含まれる。
Ｅ．１．ｃ．ｉｉ．      抗血小板薬
抗血小板薬の非限定的な例には、アスピリン、デキストラン、ジピリダモール（ペルサンチン）、ヘパリン、サルフィンピラノン（アンツラン）およびチクロピジン（チクリッド）が含まれる。
Ｅ．１．ｃ．ｉｉｉ．      血栓溶解薬
血栓溶解薬の非原的的な例には、組織プラスミノーゲン活性化因子（アクチバーゼ）、プラスミン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（アボキナーゼ）、ストレプトキナーゼ（ストレプターゼ）およびアニストレプラーゼ／ＡＰＳＡＣ（エミナーゼ）が含まれる。
【０１０１】
Ｅ．１．ｄ．      血液凝固薬
患者が出血を起こしているあるいは出血が増加する可能性がある実施態様においては、血液凝固を増強する薬物を使用することができる。血液凝固促進薬の非限定的な例には、血栓溶解因子アンタゴニスト及び抗凝血因子アンタゴニストが含まれる。
Ｅ．１．ｄ．ｉ．      抗凝血因子アンタゴニスト
抗凝血因子アンタゴニストの非限定的な例には、プロタミン及びビタミンＫ１が含まれる。
Ｅ．１．ｄ．ｉｉ．      血栓溶解因子アンタゴニストおよび抗血栓薬
血栓溶解因子アンタゴニストの非限定的な例には、アミノカプロン酸（アミカール）およびトランセキサム酸（アムスタット）が含まれる。抗血栓薬の非限定的な例には、アナグレリド、アルガトロバン、シルスタゾール、ダルトロバン、デフィブロチド、エノキサパリン、フラキシパリン、インドブフェン、ラモパラン、オザグレル、ピコタミド、プラフィブリド、テデルパリン、チクロピジンおよびトリフルサルが含まれる。
【０１０２】
Ｅ．１．ｅ．      抗不整脈薬
抗不整脈薬の非限定的な例には、クラスＩ抗不整脈薬（ナトリウムチャンネル遮断薬）、クラスＩＩ抗不整脈薬（β−アドレナリン遮断薬）、クラスＩＩ抗不整脈薬（脱分極延長薬）、クラスＩＶ抗不整脈薬（カルシウムチャンネル遮断薬）およびその他の抗不整脈薬（以下を参照）が含まれる。
Ｅ．１．ｅ．ｉ．      ナトリウムチャンネル遮断薬
ナトリウムチャンネル遮断薬の非限定的な例には、クラスＩＡ、クラスＩＢ、クラスＩＣの抗不整脈薬が含まれる。クラスＩＡ抗不整脈薬の非限定的な例には、ジスピラミド（ノルペース）、プロカインアミド（プロネスチル）およびキニジン（キニデックス）が含まれる。クラスＩＢ抗不整脈薬の非限定的な例には、リドカイン（キシロカイン）、トカイニド（トノカルド）およびメキシレチン（メキシチル）が含まれる。クラスＩＣ抗不整脈薬の非限定的な例には、エンカイニド（エンカイド）およびフレカイニド（タンボコール）が含まれる。
【０１０３】
Ｅ．１．ｅ．ｉｉ．      β遮断薬
β遮断薬は、βアドレナリン遮断薬、β−アドレナリンアンタゴニストまたはクラスＩＩ抗不整脈薬としても知られており、それらの非限定的な例には、アセブトロール（セクトラル）、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、べフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブルラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、ブチドリンヒドロクロリド、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール（ブレビブロック）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ナドキソロール、ニフェナロール、ニプラジロール、オキソプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネタロール、プロパノロール（インデラル）、ソタロール（ベタパース）、スルフィナロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、トリプロロールおよびキシビノロールが含まれる。ある側面において、β遮断薬はアリールオキシプロパノールアミン誘導体を含んでいてよい。アリールオキシプロパノールアミン誘導体の非限定的な例にはアセブトロール、アルプレノロール、アロチノロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブニトロロール、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、エパノロール、インデノノール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ニプラジロール、オキソプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、タリノロール、テルタロロール、チモロールおよびトリプロロールが含まれる。
【０１０４】
Ｅ．１．ｅ．ｉｉｉ．      脱分極延長薬
脱分極を延長する薬物はクラスＩＩＩ抗不整脈薬としても知られるが、これらのの非限定的な例には、アミオダロン（コルダロン）およびソタロール（ベタパース）が含まれる。
Ｅ．１．ｅ．ｉｖ．      カルシウムチャンネル遮断薬／アンタゴニスト
カルシウムチャンネル遮断薬はクラスＩＶ抗不整脈薬としても知られているが、アリールアルキルアミン（例えば、ベプリジル、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、プレニルアミン、テロジリン、ベラパミル）、ジヒドロピリジン誘導体（フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン）、ピペラジン誘導体（例えば、シンナリジン、フルナリジン、リドフラジン）またはベンシクラン、エタフェノン、マグネシウム、ミベフラジルまたはペルヘキシリンのような他のカルシウムチャンネル遮断薬が含まれる。ある実施態様において、カルシウムチャンネル遮断薬は長期作用ジヒドロピリジン（ニフェジピン型）カルシウムアンタゴニストを含む。
【０１０５】
Ｅ．１．ｅ．ｖ．      その他の抗不整脈薬
その他の抗不整脈薬の非限定的な例には、アデノシン（アデノカルド）、ジゴキシン（ラノキシン）、アセカイニド、アジュマリン、アモプロキサン、アプリンジン、ブレチリウムトリセート、ブナフチン、ブトベンジン、カポベン酸、シフェンリン、ジソピラニド、ヒドロキニジン、インデカイニド、イパトロピウムブロミド、リドカイン、ロラジャミン、ロルカイニド、メオベンチン、モリシジン、ピルメノール、プラジュマリン、プロパフェノン、ピリノリン、キニジンポリガラクツロネート、キニジンサルフェートおよびビキジルが含まれる。
【０１０６】
Ｅ．１．ｆ．        抗高血圧薬
抗高血圧薬の非限定的な例には、交感神経遮断薬、α／β遮断薬、α遮断薬、抗アンジオテンシンＩＩ薬、β遮断薬、カルシウムチャンネル遮断薬、血管拡張薬およびその他の抗高血圧薬が含まれる。
【０１０７】
Ｅ．１．ｆ．ｉ．    α遮断薬
α遮断薬は、α−アドレナリン遮断薬またはα−アドレナリンアンタゴニストとしても知られており、その非限定的な例には、アモスラロール、アロチノロール、ダピプラゾール、ドキサゾシン、エルゴロイドメシレート、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ニセルゴリン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、トリマゾシンおよびヨヒンビンが含まれる。ある実施態様において、α遮断薬はキナゾリン誘導体を含んでよい。キナゾリン誘導体の非限定的な例には、アルフゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシンおよびトリマゾシンが含まれる。
【０１０８】
Ｅ．１．ｆ．ｉｉ．      α／β遮断薬
ある実施態様において、抗高血圧薬はαおよびβアドレナリンアンタゴニストの両方である。α／β遮断薬の非現的的な例はラベタロール（ノルモジン、トランデート）である。
Ｅ．１．ｆ．ｉｉｉ．      抗−アンジオテンシンＩＩ薬
抗−アンジオテンシンＩＩ薬の非限定的な例には、アンジオテンシン変換酵素阻害物質およびアンジオテンシンＩＩレセプターアンタゴニストが含まれる。アンジオテンシン変換酵素阻害物質（ＡＣＥ阻害物質）の非限定的な例には、アラセプリル、エナラプリル（バソテック）、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルトプリル、ペリンドプリル、キナプリルおよびラミプリルが含まれる。アンジオテンシンＩＩレセプター阻害物質は、アンジオテンシンＩＩレセプターアンタゴニスト、ＡＮＧレセプター遮断薬または１型ＡＮＧ−ＩＩレセプター遮断薬（ＡＲＢＳ）としても知られており、その非限定的な例には、アンジオカンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタンおよびバルサルタンが含まれる。
【０１０９】
Ｅ．１．ｆ．ｉｖ．      交感神経遮断薬
交感神経遮断薬の非限定的な例には、中枢作用性交感神経遮断薬または末梢作用性交感神経遮断薬が含まれる。中枢作用性交感神経遮断薬は、中枢神経（ＣＮＳ）交感神経遮断薬としてもしられ、その非限定的な例には、クロニジン（カタプレス）、グアナベンズ（ウィテンシン）、グアンファシン（テネックス）およびメチルドーパ（アルドメット）が含まれる。末梢作用性交感神経遮断薬には、ガングリオン遮断薬、アドレナリン作動性神経遮断薬、βアドレナリン遮断薬またはα１−アドレナリン遮断薬が含まれる。ガングリオン遮断薬の非限定的な例には、メカミラミン（インベルシン）およびトリメタファン（アルフォナド）が含まれる。アドレナリン作動性神経遮断薬の非限定的な例には、グアネチジン（イスメリン）およびレゼルピン（セルパシル）が含まれる。βアドレナリン遮断薬の非限定的な例には、アセニトロール（セクトラル）、アテノロール（テノルミン）、ベタキソロール（ケルロン）、カルテオロール（カルトロール）、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）、メトプロロール（ロプレッサー）、ナダノール（コルガード）、ペンブトロール（レバトール）、ピンドロール（ビスケン）、プロプラノロール（インデラル）およびチモロール（ブロカドレン）が含まれる。α−アドレナリン遮断薬の非現的的な例には、プラゾシン（ミニプレス）、ドキサゾシン（カルジュラ）およびテトラゾシン（ヒトリン）が含まれる。
【０１１０】
Ｅ．１．ｆ．ｖ．      血管拡張薬
ある実施態様において、心血管治療薬は血管拡張薬（例えば、脳血管拡張薬、冠状動脈拡張薬または末梢血管拡張薬）を含むことがある。ある好ましい実施態様において、血管拡張薬は冠状動脈拡張薬を含む。冠状動脈拡張薬の非限定的な例には、アモトリフェン、ベンダゾール、ベンフロジルヘミスクシネート、ベンジオダロン、クロラシジン、クロモナール、クロベンフロール、クロニトレート、ジラゼップ、ジピリダモール、ドロプレニラミン、エフロキセート、エリスリチルテトラニトラン、エタフェノン、フェンジリン、フロレジル、ガングレフェン、ヘレストロールビス（β−ジエディルアミノエチルエーテル）、ヘキソベンジン、イトラミントシレート、ケリン、リドフラニン、マンニトールヘキサニトラン、メジバジン、ニコルグリセリン、ペンタエリスリトールテトラニトレート、ペントリニトロール、ペルヘキシリン、ピメフィリン、トラピジル、トリクロミル、トリメタジジン、トロールニトレートホスフェートおよびビスナジンが含まれる。
【０１１１】
ある側面において、血管拡張薬は長期治療用血管拡張薬または高血圧発作用血管拡張薬を含むことがある。長期治療用血管拡張薬の非限定的な例には、ヒドララジン（アプレゾリン）およびミノキシジル（ロニテン）が含まれる。高血圧発作用血管拡張薬の非限定的な例には、ニトロプルシド（ニプライド）、ジアゾキシド（ハイパースタットＩＶ）、ヒトララジン（アプレゾリン）、ミノキシジル（ロニテン）およびベラパミルが含まれる。
【０１１２】
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．      その他の抗高血圧薬
その他の抗高血圧薬の非限定的な例には、アジュマリン、γ−アミノ酪酸、ブフェンヨード、シクレタイニン、シクロシドミン、クリプテナミンタンネート、フェノールドーパム、フロセキナン、ケタンセリン、メブタメート、メカミラミン、メチルドーパ、メチル４−ピリジルケトンチオセミカルバゾン、ムゾリミン、パルギリン、ペンピジン、ピナシジル、ピペロキサン、プリマペロン、プロトヴェラトリン、ラウバシン、レシメトール、リルメニデン、サララシン、ニトロプルシドナトリウム、チクリナフェン、トリメタファン、カムシレート、チロシナーゼおよびウラピジルが含まれる。
ある側面において、抗高血圧薬はアリールエタノールアミン誘導体（以下を参照）、ベンンゾチアジアジン誘導体、Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン／フタラジン、イミダゾール誘導体、４級アンモニウム化合物、レゼルピン誘導体またはスルホンアミド誘導体を含むことがある。
【０１１３】
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ａ．      アリールエタノールアミン誘導体
アリールエタノールアミン誘導体の非限定的な例には、アモスラロール、ブフラロール、ジレバロール、ラベタロール、プロネタロール、ゾタロールおよびスルフィナロールが含まれる。
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｂ．      ベンゾチアジアジン誘導体
ベンゾチアジアジン誘導体の非限定的な例には、アルチザイド、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロタリドン、シクロペンチアジド、シクロチアジド、ジアゾキシド、エピチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチジド、ヒドロフルメチジヂド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチジド、テトラクロルメチアジドおよびトリクロロメチアジドが含まれる。
【０１１４】
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｃ      Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体
Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体の非限定的な例には、アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルチプリル、ペリンドプリル、キナプリルおよびラミプリルが含まれる。
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｄ．       ジヒドロピリジン誘導体
ジヒドロピリジン誘導体の非限定的な例には、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニゾルジピンおよびニトレンジピンが含まれる。
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｅ．      グアニジン誘導体
グアニジン誘導体の非限定的な例には、ベタニジン、デプリソキン、グアナベンズ、グアナクリン、グアナドレル、グアナゾジン、グアネチジン、グアンファシン、グアノクロール、グアノキサベンズおよびグアノキサンが含まれる。
【０１１５】
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｆ．      ヒドラジン／フタラジン
ヒドラジン／フタラジンの非限定的な例には、ブドララジン、カルドララジン、ジヒドララジン、エンドララジン、ヒドラカルバジン、ヒドララジン、フェニプラジン、ピルドララジンおよびトドララジンが含まれる。
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｇ．      イミダゾール誘導体
イミダゾール誘導体の非限定的な例には、クロニジン、ロフェキシジン、フェントラアミン、チアメニジンおよびトロニジンが含まれる。
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｈ．      ４級アンモニウム化合物
４級アンモニウム化合物の非限定的な例には、アゼメトニウムブロミド、クロリソンダミンクロリド、ヘキサメトニウム、ペンタシニウムビス（メチルサルフェート）、ペンタメトニウムブロミド、ペントリニウムタルトレート、フェナクトロピニウムクロリドおよびトリメチジニウムメトサルフェートが含まれる。
【０１１６】
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｉ．      レゼルピン誘導体
レゼルピン誘導体の非限定的な例には、ビエタセルピン、デセルピジン、レシンナミン、レゼルピンおよびシロシンゴピンが含まれる。
Ｅ．１．ｆ．ｖｉ．ｊ．      スルホンアミド誘導体
スルホンアミド誘導体の非限定的な例には、アンブシド、クロパミド、フロセミド、インダパミド、キネタゾン、トリパミド、およびキシパミドが含まれる。
Ｅ．１．ｇ．      血管収縮薬
血管収縮薬は一般には手術の際に起こりえる急性循環不全の場合に血圧を上昇させるために使用される。血管収縮薬は抗低血圧薬としても知られており、その非限定的な例には、アメジニウムメチルサルフェート、アンジオテンシンアミド、ジメトフリン、ドーパミン、エチフェルミン、エチレフリン、ゲペフリン、メタラミノール、ミドドリン、ノルエピネフリン、フォレドリンおよびシネフリンが含まれる。
【０１１７】
Ｅ．１．ｈ．      うっ血性心不全の治療薬
うっ血性心不全の治療薬の非限定な例には、抗−アンジオテンシンＩＩ物質、後負荷−前負荷低減治療（ａｆｔｅｒｌｏａｄ−ｐｒｅｌｏａｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（以下を参照）、利尿薬および変力薬（ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）が含まれる。
Ｅ．１．ｈ．ｉ．      後負荷−前負荷低減治療
ある実施態様において、アンジオテンションアンタゴニストに耐えられない動物（患者）は組み合わせ療法によって治療することができる。そのような治療はヒドララジン（アプレソリン）およびイソソリビドジニトレート（イソルジル、ソルビトレート）投与を組み合わせるものであってよい。
【０１１８】
Ｅ．１．ｈ．ｉｉ．      利尿薬
利尿薬の非限定的な例には、チアジドまたはベンゾチアジアジン誘導体（例えば、アルチアジド、ベンドロフルメタジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロロタリドン、シクロペンチアジド、エピチアジド、エチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチジド、テトラクロロメチアジド、トリクロロメチアジド）、有機水銀化合物（例えば、クロロメロドリン、メラルリド、メルカンファミド、メルカプトメリンナトリウム、メルクマリル酸（ｍｅｒｃｕｍａｌｌｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、メルクマチリンナトリウム、塩化第１水銀、メルサリル）、プテリジン（例えば、フルテレン、トリアンテレン）、プリン（例えばアセフィリン、７−モルホリノメチルテオフィリン、パモブロン、プロテオブロミン、テオブロミン）アルドステロンアンタゴニストを含むステロイド（例えば、カンレノン、オレアンドリン、スピロノラクトン）、スルホンアミド誘導体（例えば、アセタゾールアミド、アンブシド、アゾセミド、ブメタニド、ブタゾールアミド、クロラミノフェナミド、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジフェニルメタン−４，４’−ジスルホンアミド、ジスルファミド、エトキサゾールアミド、フロセミド、インダパミド、メフルシド、メタゾールアミド、ピレタニド、キネタゾン、トラセミド、トリパミド、キシパミド）、ウラシル（例えば、アミノメトラジン、アミソメトラジン）、カリウム節約型アンタゴニスト（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｓｐａｒｉｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）（例えば、アミロリド、トリアンテレン）又は、アミノジン、アルブチン、クロラザニル、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドラカルバジン、イソソルバイド、マンニトール、メトチャルコン、ムゾリミン、ペルヘキシリン、チクルナフェンおよび尿素のようなその他の利尿薬が含まれる。
【０１１９】
Ｅ．１．ｈ．ｉｉｉ．      変力薬
正の変力薬は強心薬としても知られているが、その非限定的な例には、アセフィリン、アセチルジギトキシン、２−アミノ−４−ピコリン、アムリノン、ベンフロジルヘミスクシネート、ブクラデシン、セルベロシン、カンフォタミド、コバラトキシン、シマリン、デノパミン、デスラノシド、ジギタリン、ジギタリス、ジギトキシン、ジゴキシン、ドブタミン、ドーパミン、ドペキサミン、エノキシモン、エリスロフレイン、フェナルコミン、ギタリン、ギトキシン、グリコシアミン、ヘプタミノール、ヒドラスチニン、イボパミン、ラナトシド、メタミバム、ミルリノン、ネリフォリン、オレアンドリン、ウアアバイン、オキシフェドリン、プレナルテロール、プロシラリジン、レジブフォゲニン、シラレン、シラレニン、ストロファンチン、スルマゾール、テオブロミン及びキサモテロールが含まれる。
【０１２０】
特定の側面において、変力薬は強心配糖体、β−アドレナリンアゴニストまたはホフホジエステラーゼ阻害物質である。強心配糖体の非限定的な例には、ジゴキシン（ラノキシン）およびジギトキシン（クリストジギン）が含まれる。β−アドレナリンアゴニストの非限定的な例には、アルブテロール、バムブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキセテドリン（ｄｉｏｘｅｔｈｅｄｒｉｎｅ）、ドブタミン（ドブトレックス）、ドーパミン（イントロピン）、ドペキサミン、エフェドリン、エタフェドリン、エチルノルエピネフリン、フェノテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プロカテロール、プロトキロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロール及びキサモテロールが含まれる。ホスホジエステラーゼ阻害物質の非限定的な例はアムリノン（イノコール）である。
【０１２１】
Ｅ．１．ｉ．      抗アンギナ薬
抗アンギナ薬は有機ニトレート、カルシウムチャンネル遮断薬、β遮断薬およびそれらの組合わせを含んでよい。
有機ニトレートはニトロ血管拡張薬としても知られており、その非限定的な例には、ニトログリセリン（ニトロ−ビド、ニトロスタット）、イソソルバイドジニトレート（イソルジル、ソルビトレート）およびアミルニトレート（アスピロール、バポロール）が含まれる。
Ｅ．１．ｊ．      抗感染薬
抗感染薬（例えば、抗細菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬）は一般に感染を低減又は予防するために使用される。抗細菌薬の非限定的な例には、抗細菌性抗生物質、合成抗細菌薬、レプロ抑制性抗細菌薬、リケッチア抗細菌薬、結核菌抑制性抗細菌薬またはこれらの組合わせが含まれる。
Ｅ．１．ｊ．ｉ．      抗生物質抗細菌薬
抗生物質抗細菌薬の非限定的な例には、アミノグリコシド（例えば、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、ホルチマイシン、ゲンタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、ミクロノマイシン、ネオマイシンウンデシレネート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ストレプトニコジド、トブラマイシン）、アンフェノール（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、クラムフェニコールパルミテート、クロラムフェニコールパントテネート、フロルフェニコール、チアムフェニコール）、アンサマイシン（例えば、リファミド、リファンピン、リファマイシン、リファキシミン）、β−ラクタム（例えば、カルバペネム、セファロスポリン、セファマイシン、モノバクタム、オキサセフェム、ペニシリン）、リコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）、マクロリド（例えば、アジスロマイシン、カルボマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシンアシストレート、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシングルコヘプトネート、エリスロマイシンラクトビオネート、エリスロマイシンラクトビオネート、エリスロマイシンプロピオネート、エリスロマシンステアレート、ジョサマイシン、ロイコマイシン、ミデカマイシン、ミオカマイシン、オレアンドマイシン、プリマイシン、プリマイシン、ロキタマイシン、ロザラマイシン、ロキスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン）、ポリペプチド（例えば、アンフォマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンヅラシジン、エンビオマイシン、フザガンジン、グラミシジン、グラミシジンＳ、ミカマイシン、ポリミキシン、ポリミキシンＢ−メタンスルホン酸、プリスチナマイシン、リストセイチン、テイコプラニン、チオストレプトン、ツベルアクチノマイシン、チロシジン、チロスリシン、バンコマイシン、バイオマイシン、バイオマイシンパントテネート、ビルジニアマイシン、亜鉛バシトラシン）、テトラサイクリン（例えば、アピシクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、グアメサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ペニメピサイクリン、ピパサイクリン、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、セノサイクリン、テトラサイクリン）またはその他の抗生物質抗細菌薬（例えば、シクロセリン、ムピロシン、ツベリン）が含まれる。
【０１２２】
カルバペネムβ−ラクタムの非限定的な例はイミペネムである。セファロスポリンβ−ラクタムの非限定的な例には、セファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシムプロキセチル、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロスポリンＣ、セファロチン、セファピリンナトリウム、セフラジンおよびピブセファレキシンが含まれる。
【０１２３】
セファマイシンβ−ラクタムの非限定的な例には、セフブペラゾン、セフメタゾール、セフミノックス、セフォテタンおよびセフォキシチンが含まれる。モノバクタムβ−ラクタムの非限定的な例には、アズトレオナム、カルモナムおよびチゲモナムが含まれる。オキサセフェムβ−ラクタムの非限定的な例にはフロモキセおよびモキソラクタムが含まれる。ペニシリンβ−ラクタムの非限定的な例には、アミジノシリン、アミジノシリンピボキシル、アモキシシリン、アンピシリン、アパルシリン、アスポキシリン、アジドシリン、アズロシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、カルベニシリン、カルフェシリンナトリウム、カリンダシリン、クロメトシリン、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリンジフェニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ヘタシリン、レナンピシリン、メタンピシリン、メチシリンナトリウム、メズロシリン、ナフシリンナトリウム、メズロシリン、ナフシリンナトリウム、オキサシリン、ペナメシリン、ペネタメートヒドロド、ペニシリンＧベネチアミン、ペニシリンＧベンザチン、ペニシリンＧベンズヒドリルアミン、ペニシリンＧカルシウム、ペニシリンＧヒドラバミン、ペニシリンＧカリウム、ペニシリンＧプロカイン、ペニシリンＮ、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンザチン、ペニシリンＶヒドラバミン、ペニメピサイクリン、フェネチシリンカリウム、ピペラシリン、ピバンピシリン、プロピシリン、キナシリン、スルベニシリン、タランピシリン、テモシリンおよびチカルシリンが含まれる。
【０１２４】
Ｅ．１．ｊ．ｉｉ．      合成抗細菌薬
合成抗細菌薬の非限定的な例には、２，４−ジアミノピリミジン（例えば、ブロジモプリム、テトロキソプリム、トリメトプリム）、ニトロフラン（例えば、フラルタドン、フラゾリウムクロリド、ニフラデン、ニフラテル、ニフルフォリン、ニフルピリノール、ニフルプラジン、ニフルトイノール、ニトロフランチオン）、キノロンおよびキノン類似体（例えば、アミフォキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ロメフロキサシン、ミロキサシン、ナリジキシン酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリン酸、ペフロキサシン、ピペミド酸、ピロミド酸、ロゾキサシン、テマフロキサシン、トスルフォキサシン）、スルフォナミド（例えば、アセチルスルファメトキシプラキシン、アセチルスルフィソキサゾール、アゾスルファミド、ベンジルスルファミド、クロラミン−Ｂ、クロラミン−Ｔ、ジクロラミン Ｔ、フォルモスルファチアゾール、Ｎ２−フォルミルスルフィソミジン、Ｎ４−β−Ｄ−グルコシルスルファニルアミド、マフェニド、４’−（メチルスルファノイル）スルファニルアミド、ｐ−ニトロスルファチアゾール、フタリルスルファセタミド、フタリルスルファチアゾール、サラゾスルファジミジン、サクシニルスルファチアゾール、スルファベンザミド、スルファセタミド、スルファクロピリダジン、スルファクリソイジン、スルファシチン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファドキシン、スルファエチドール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファレン、スルファロキシ酸、スルファメラジン、スルファメーター、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトミジン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメトロール、スルファミドクリソイジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファニルアミドメタンスルホン酸トリエタノールアミン塩、４−スルファニルアミドサリチル酸、Ｎ４−スルファニルスルファニルアミド、スルファニリル尿素、Ｎ−スルファニリル−３，４−キシルアミド、スルファニトラン、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファプロキシリン、スルファピラジン、スルファピリジン、スルファソミゾール、スルファシマジン、スルファチアゾール、スルファチオウレア、スルファトラミド、スルフィソミジン、スルフィソキサゾール）、スルホン（アセダプソン、アセジアスルホン、アセトスルホンナトリウム、ダプソン、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、ソラスルホン、サクシスルホン、スルファニル酸、ｐ−スルファニリルベンジルアミン、ｐ，ｐ’−スルホニルジアニリン−Ｎ，Ｎ’ジアガラクトシド、スルホキソンナトリウム、チアゾールスルホン）および、その他の合成抗細菌薬（例えば、クロフォクトール、ヘキセジン、メテナミン、メテナミンアンヒドロメチレン−シトレート、メテナミンヒプレート、メテナミンマンデレート、メテナミンスルホサリチレート、ニトロキソリン、及びキシボルノール）が含まれる。
【０１２５】
Ｅ．１．ｊ．ｉｉｉ．      レプロ抑制性抗細菌薬
レプロ抑制性抗細菌薬の非限定的な例には、アセダプソン、アセトスルホンナトリウム、クロファジミン、ダプソン、ジアチモスルホン、グルコスルホンナトリウム、ヒドノカルプ酸、ソラスルホン、サクシスルホンおよびスルホキソンナトリウムが含まれる。
Ｅ．１．ｊ．ｉｖ．      リケッチア抗細菌薬
リケッチア抗細菌薬は抗リケッチア薬としても知られているが、その非限定的な例には、ｐ−アミノ安息香酸、クロラムフェニコール、クロラムフェニコールパルミテート、クロラムフェニコールパントテネートおよびテトラサイクリンが含まれる。
Ｅ．１．ｊ．ｖ．      結核菌抑制性抗細菌薬
結核菌抑制性抗細菌薬の非限定的な例には、ｐ−アミノサリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸ヒドラジン、ベンゾイルパス、５−ブロモサリチルヒドロキサム酸、カプレオマイシン、クロファジミン、シアデタシド、シクロセリン、ジヒドロストレプトマイシン、エンビオマイシン、エタムブトール、エチオナミド、４’−ホルミルサクシンアニル酸チオセミカルバゾン、フロナジド、グリコニアジド、イソブトール、イソニアジド、イソニアジドメタンスルホネート、モルファジナミド、オピニアジド、パルシニアジド、フェニルアミノサリチレート、プロチオナミド、ピラジナミド、リファンピン、サリナジド、ストレプトマイシン、スバチゾン、スルホニアジド、チアセタゾン、チオカルリド、ツベルアクチノマイシン、ツベルシジン、ツベリンベラジド、ビオマイシンおよびビクマイシンパントテネートが含まれる。
【０１２６】
Ｅ．１．ｊ．ｖｉ．      抗真菌薬
抗真菌薬の非限定的な例には、抗生物質抗真菌薬及び合成抗真菌薬が含まれる。抗生物質抗真菌薬の非限定的な例には、アンフォテリシンＢ、カンジシジン、デルモスタチン、フィリピン、ファンギクロミン、ハチマイシン、ハミシン、ルセンソマイシン、メパルトリシン、ナタマイシン、ニスタチン、ペチロシンおよびペリマイシンのようなポリエン、および、アザセリン、グリソフルビン、オリゴマイシン、ネオマイシンウンデシレネート、ピロールニトリン、シッカニン、ツベルシジンおよびビリジンのようなその他の抗生物質真菌薬が含まれる。
【０１２７】
合成真菌薬の例には、アリルアミン、イミダゾール、トリアゾールおよびその他の合成真菌薬が含まれる。アリルアミンの非限定的な例には、ナフチフィンおよびテルビナフィンが含まれる。イミダゾールの非限定的な例には、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン、クロルミダゾール、クロコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、エニルコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾールニトレート、スルコナゾール及びチオコナゾールが含まれる。トリアゾールの非限定的な例には、フルコナゾール、イトラコナゾールおよびテルコナゾールが含まれる。その他の抗生物質真菌薬の非限定的な例には、アクリゾルシン、アモロルフィン、ビフェナミン、ブロモサリチルクロルアニリド、ブクロサミド、カルシウムプロピオネート、クロルフェネシン、シクロピロックス、クロキシキン、コパラフィネート、ジアムタゾールジヒドロクロリド、エキサラミド、フルシトシン、ハレタゾール、ヘキセチジン、ロフルカルバン、ニフラテル、ヨウ化カリウム、プロピオン酸、ピリチオン、サリチルアニリド、ナトリウムプロピオネート、スルベンチン、テノニトロゾール、トルシクレート、トリンデート、トルナフテート、トリアセチン、ウジョチオン、ウンデシレン酸およびプロピオン酸亜鉛が含まれる。
【０１２８】
Ｅ．１．ｊ．ｖｉｉ．      抗ウイルス薬
抗ウイルス薬の非限定的な例には、アシクロビル、シタラビン、ジデオキシアデノシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシン、エドクスウリジン、フロクスウリジン、ガンシクロビル、イドクスウリジン、イノシンプラノベックス、ＭＡＤＵ、トリフルウリジン、ビダラビンおよびジドブジンのようなある種のプリンおよびピリミジノンが含まれる。その他の抗ウイルス薬には、アセチルロイシンモノエタノールアミン、アマンタジン、アミジノマイシン、クミンアルデヒド、チオセミカルバゾン、フォスカルネットナトリウム、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ケトキサール、リゾチーム、メチサゾン、モロキシジン、ポドフィロトキシン、リバビリン、リマンタジン、スタリマイシン、スタロロン、トロマンタジンおよびキセナゾ酸が含まれる。
【０１２９】
Ｅ．２．    外科的処置
ある側面において、ＨＳＶベクターの投与と共に、またはベクターを血管細胞、組織および期間へ標的化するのを容易にするために外科的処置を行うことができる。外科的処置には、例えば、予防的、診断的または進行度判断、治療、および緩和手術が含まれるであろう。手術、特に治療手術は、増殖減弱化（ＣＮＳ）ＨＳＶベクターおよび一以上の他の薬物の投与のような他の治療法と組合わせて使用さすることができる。
血管及び心血管疾患及び異常のためのそのような外科的処置は当業者にはよく知られており、器官に手術を行うこと、機械的人工心血管器官を提供すること、血管形成、冠動脈再灌流、カテーテルアブレーション、患者に移植可能な電気的除細動器を提供すること、機械的循環補助、またはこれらの組合わせが含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用できる機械的循環補助の非限定的な例には、大動脈内バルーンカウンターパルゼイション、左心補助循環装置またはこれらの組合わせが含まれる。
もしろん、少なくとも１つの追加的治療薬（例えば、本発明の方法に使用するベクター、薬理学的治療薬）による灌流、直接注入、全身注入又は局所適用により手術の領域を更に処置することができる。このことは当業者には知られており、本明細書にも記載される。
【０１３０】
Ｆ．  医薬調製物
本発明の医薬組成物は一種以上のヘルペスウイルスベクターまたは製薬的に許容できる担体に分散された若しくは溶解された追加的薬物の効果的量を含む。用語「製薬的にまたは薬理学的に許容できる」とは、動物、例えば適切にはヒトに投与した場合に有害な、アレルギー性または他のやっかいな反応を生じさせない分子および組成物をいう。少なくとも一種のヘルペスウイルスベクターまたは追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は本明細書の開示に照らして当業者には理解されるであろう（その例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、引用により本明細書に取り込まれるものとする）。更に、動物（例えばヒト）への投与用には、調製物は米国ＦＤＡ生物学的基準局（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｓ）による規制または（適用される場合は）同等の他国の政府規制によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度基準を満たさなければならないことは当然である。
【０１３１】
本明細書において、「製薬的に許容できる担体」には、当業者に知られたどのような溶媒、分散媒体、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬剤、薬剤安定化剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、芳香剤、色素、およびその他の材料およびそれらの組合わせも含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、ｐ．１２８９−１３２９、引用により本明細書に取り込まれるものとする。）。通常のいずれかの担体が活性成分と共存できない範囲を除いて、治療組成物または医薬組成物中の使用が考慮される。
【０１３２】
ヘルペスイウルスベクターおよび／または追加の薬物を含む医薬組成物は、そらが固体、液体またはエアロゾル形態で投与されるか、および注射のようにその投与経路用に無菌的である必要性に依存して、種々の型の担体を利用することができる。医薬組成物は、静脈投与、皮内投与、動脈内投与、移植片内投与、腹腔内投与、病変部内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸腔内投与、胸内投与、鼻腔内投与、ガラス体内投与、腟内投与、直腸内投与、局所投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、皮下投与、結膜下投与、小胞内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍部内投与、眼内投与、経口投与、局所投与、部分投与、吸入投与（例えばエアロゾ吸入）、注射、インフュージョン、連続インフュージョン、標的細胞を直接沐浴させる局所的灌流（例えば、自己組織移植片）、カテーテルによる投与、洗滌による投与、クリームによる投与、脂質組成物（リポソーム）中での投与、その他の方法、またはこれらのいかなる方法の組合わせによって投与することができ、そのことは当業者であれば分かるであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照せよ）。
【０１３３】
動物患者に投与する本発明の医薬組成物の実際の用量は医者によって、および体重、病状の重篤度、治療すべき疾患の型、以前のまたは現在の治療的介入、患者の特発症および計画した投与経路によって決定することができる。投与に関与する医者は、いずれにしろ、医薬組成物中の活性成分の濃度及び個々の患者に対する適切な用量を通常の手順により決定するであろう。
【０１３４】
ある実施態様において、医薬組成物は例えば、少なくとも０．１％の活性化合物（例えば、ヘルペスウイルスベクター、治療薬剤）を含むであろう。他の実施態様において、活性化合物は一単位の約２質量％〜約７５質量％、例えば、約２５％〜約６０％、およびこれから導かれるどのような範囲でも含まれ得る。他の非限定的な例では、１用量は１回の投与について約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、およびこれから導かれるどのような範囲においても含み得る。上記から導かれる範囲の非限定的な例として、開示された値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重その他、を投与することができる。
【０１３５】
どの場合も、医薬組成物は一種以上の構成成分の酸化を遅延させるため種々の抗酸化物質を含んで良い。更に、微生物作用の防止は種々の抗生物質及び抗真菌薬のような保存剤によってもたらされる。これらには、パラベン（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組合わせが含まれるが、それらに限定されない。
ヘルペスウイルスおよび／または薬物は遊離状態、中性又は塩の形態で医薬組成物に製剤化することができる。製薬的に許容できる塩には、酸付加塩、例えば、タンパク質性成分の遊離のアミノ基と形成される、または、例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸のような有機酸と形成される塩が含まれる。遊離のカルボキシル基と形成される塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄のような無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインのような有機塩基から誘導することもできる。
【０１３６】
医薬組成物が液体形態である実施態様において、担体は溶媒又は分散媒体であって良く、それらには、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、その他）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組合わせが含まれるが、これらに限定されない。例えば、レシチンのような被覆を使用することにより、例えば、液体、ポリオールまたは脂質のような担体に分散させて必要な粒子サイズを維持することにより、例えばヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤を使用することにより、またはそれらを組合わせることにより適切な流動性を維持することができる。多くの場合に、糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組合わせのような等張剤を含ませることが好ましいであろう。
【０１３７】
他の実施態様において、点眼薬、点鼻液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入薬を本発明において使用することができる。そのような組成物は一般に標的とする組織型に共存するように設計される。非限定的な例として、点鼻液は通常鼻経由で液滴またはスプレーで投与するように設計された水性溶液である。点鼻液は多くの点で鼻分泌液に類似するように調製され、それにより正常な繊毛活動が維持される。従って、好ましい実施態様において、水性点鼻液は通常等張または僅かに緩衝化されて約５．５〜６．５に維持される。加えて、眼科調製物に使用されるのと類似の抗微生物保存剤、薬剤、または適切な薬剤安定化剤が必要であればこの製剤に含めることができる。例えば、種々の商業的点鼻調製物は抗生物質または抗ヒスタミン薬のような薬物を含むことが知られている。
【０１３８】
ある実施態様において、投与し得るウイルスベクター濃度は約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０ ＰＦＵ／ｍｌであり、ここから導かれるいずれの数値、およびこれから導かれるいずれの範囲であってもよい。ある実施態様において、組織または生物に投与し得るウイルスベクターの濃度範囲には、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、から約１０１３ ＰＦＵ／ｋｇまでが含まれ、ここから導かれるいずれの数値、および個々から導かれるどの濃度範囲であってもよい。他の実施態様において、細胞に投与できるウイルスベクターの濃度範囲（ＭＯＩ）には、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９から約１００  ＰＦＵ／細胞が含まれ、これから導かれるいずれの範囲であってもよい。
【０１３９】
ある実施態様において、本医薬組成物は経口摂取のような経路で投与するために調製される。これらの実施態様では、固体組成物は、たとえば、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル（たとえば、ハード−シェルまたはソフト−シェルゼラチンカプセル）、徐放性製剤、舌下組成物、トローチ、強壮剤、懸濁液、シロップ、ウエファー、またはそれらの組み合わせを含んでも良い。経口組成物は直接食物または食餌に取り込んでも良い。経口投与のための好ましい担体は、不活性希釈剤、同化できる食べられる担体またはそれらの組み合わせを含む。本発明の他の側面において、経口組成物はシロップ又は強壮剤として調製されることがある。シロップまたは強壮剤は、例えば少なくとも一つの活性物質、および、場合により、甘味剤、保存剤、香料、色素、またはそれらの組み合わせを含んでも良い。
ある実施態様において、経口組成物は１以上のバインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、香料、およびそれらの組み合わせを含んでも良い。本組成物は以下の１以上を含んでも良い：トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチンまたはそれらの組み合わせのようなバインダー；リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはこれらの組み合わせのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸またはこれらの組み合わせのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；シュークロース、ラクトース、サッカリンまたはこれらの組み合わせのような甘味剤；ペパーミント、ウインターグリーンの油、チェリー香味料、オレンジ香味料その他のような芳香剤、またはこれらの組み合わせ。用量単位形態がカプセルの場合、上記の型の材料に加えて液体担体のような担体を含んでも良い。種々の他の材料が被覆または別の様式で用量単位の物理的形態を修飾するために存在してよい。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルはセラック、砂糖またはその両方で被覆されてもよい。
【０１４０】
他の投与態様に適切な追加の製剤には坐薬が含まれる。坐薬は種々の質量および形態の固体用量形態であり、通常薬剤が入っており、直腸、膣または尿道に挿入するためのものである。挿入後、坐薬は軟化し、融解または空洞体液に溶解する。一般には、坐薬について、伝統的な担体には、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせが含まれる。ある実施態様において、坐薬は、例えば、約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含む混合物から作ることができる。
【０１４１】
滅菌した注射可能な溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に必要に応じて上述の種々の他の成分と共に取り込み、続いてフィルター滅菌することによって調製される。一般に分散物は種々の滅菌活性成分を基本分散媒体および／または他の成分を含む滅菌したビヒクルに取り込むことによって調製される。滅菌した注射可能溶液、懸濁液またはエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥または凍結乾燥技術であり、活性成分の粉末を、場合により固体または液体形の追加の所望の成分と共に生ずる。注射が投与の形態である場合、必要に応じて液体媒体は適切に緩衝化され、液体組成物は十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされる。直接注入のために高度に濃縮された組成物の調製も考慮され、その場合、極めて迅速な浸透を起こさせ、高濃度の活性成分を狭い領域にデリバリーするためにＤＭＳＯの溶媒としての使用が考慮される。
【０１４２】
本組成物は好ましくは製造および保存の条件下で安定であり、細菌や真菌のような微生物のコンタミネーションに対して保護されている。エンドトキシンコンタミネーションは安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持されるのが望ましいことが理解されるであろう。
特定の実施態様において、注射可能な組成物の長期吸収はその組成物中に吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組み合わせを用いることによってもたらされる。
【０１４３】
Ｇ．  キット
本明細書に記載した組成物のいずれもキットとして調製することができる。非限定的な例において、ベクター（例えば血管または心血管の疾患または異常の治療用核酸を含むヘルペスウイルスベクター）および場合により追加の物質をキットに調製することができる。このキットは適切な容器にベクターおよび、場合により、追加の物質を含む。
本キットは適切に小分けしたベクター及び場合により追加の標識若しくは未標識薬物組成物を含み、これは例えば検出アッセイ用の標準曲線を用意するために使用することができる。本キットの構成物は水性媒体または固体形態、例えば凍結乾燥形態のいずれの形態でも梱包することができる。本キットの容器手段は一般には少なくとも１本のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジを含み、または、構成物、好ましくは小分けした構成物を置くこのとのできる他の容器手段を含む。キット中に１以上の構成物がある場合、このキットは一般に追加の構成物を別個に設置するための第２、第３または他の追加の容器を含むであろう。しかしながら、構成物の種々の組合わせが１つのバイアル中に含まれていても良い。本発明のキットはまた典型的にはベクターおよび場合により追加の物質を収納するための手段、および他の試薬容器を含み、市販のために密閉される。そのような容器は所望のバイアルが保持される射出成形または吹込成形プラスチック容器を含んでいて良い。
【０１４４】
本キットの構成物が１以上の液体溶液として提供される場合、この液体溶液は水性溶液であって、更に、滅菌水性溶液であることが特に好ましい。ベクターおよび場合により追加的の物質は注射可能組成物として配合することもできる。注射可能組成物の場合、容器手段自体がシリンジ、ピペットおよび／または他の類似の器具であって、そこから配合物を動物の身体の領域に適用、注射可能、および／またはキットの他の構成物と混合可能であってよい。
本キットの構成物はまた乾燥粉末として提供することもできる。試薬および／または構成物が乾燥粉末として提供される場合、この粉末は適切な溶媒または混合物の場合は液体担体を添加することにより再構成することができる。この溶媒は他の容器手段によって提供されても良いことは当然である。
【０１４５】
容器の数および型に関係なく、本発明のキットは本発明の医薬組成物を動物の組織、器官または身体に注射／投与することを補助する器具を含んでよく、そのような器具と共に梱包することができる。そのような器具はシリンジ、ピペット、鉗子、およびいずれかの医学的に適用されるデリバリー装置であってよい。
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を示すために記載される。しかしながら、当業者は本明細書の開示に照らして、ここに開示される具体的な実施態様を本発明の精神及び範囲を逸脱することなく改変することができることを理解するであろう。
【０１４６】
実施例１    ベクター調製
Ｒ３６１６およびＲ８４９
γ１３４．５プロモーターの制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を含む、複製能のある、神経毒性−弱毒化（中枢神経系内の増殖が減弱されている）組換えγ１３４．５−欠損ＨＳＶ−１ウイルス（ＨＡＶｌａｃＺまたはＲ８４９）を記載する。以下の方法およびベクターは米国特許第５，２３８，６８８号および第６，１２０，７７３号に記載されている。これらの文献は引用により本明細書に取り込まれるものとする。
ＨＳＶベクターＲ３６１６は非必須遺伝子（単数又は複数）の破壊による増殖−減弱ＨＳＶの例であるが、当業者は他の非必須ＨＳＶ遺伝子を破壊（例えば、挿入、置換又は欠失）して類似の増殖−減弱ＨＳＶ（表１および３を参照せよ）を得ることがことを認識するであろう。さらに、当業者はそのような破壊遺伝子が必須遺伝子（表１および３を参照せよ）であっても良いことを認識するであろう。
【０１４７】
組換えウイルスＲ３６１７はγ１３４．５遺伝子の各コピー中の１ｋｂｐのＤＮＡを欠失しており、インタクトなＲ４００２ ＤＮＡとプラスミドｐＲＢ３６１６ ＤＮＡをウサギ皮膚細胞に共導入することによって作製した。プラスミドｐＲＢ３６１６中、γ１３４．５遺伝子の大部分を含む配列、即ち、ＨＳＶ−１ Ｆ株のＢａｍＨＩ Ｓ断片中のＢｓｔＥＩＩとＳｔｕＩ部位の間に位置する配列が欠失している。ｐＲＢ３６１６を作製するため、プラスミドｐＲＢ１４３［Ｐｏｓｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ７．， ７， ４２０１ （１９８０）］をＢｓｔＥＩＩおよびＳｔｕＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化し、再結合した。形質転換の子孫を、ＢＵｄＲ（ブロモデオキシウリジン）を含む培地を上層した１４３ ｔｋ−（チミジンキナーゼ−）細胞上にプレーティングして、ｔｋ−ウイルスを選抜した。ｔｋ遺伝子はＲ４００２のγ１３４．５遺伝子の両方のコピーに存在するため、選抜された子孫は両方のコピーに欠失を含む。選抜したｔｋ−ウイルスをＲ３６１７と命名し、γ１３４．５遺伝子の両方のコピーにおける欠失の存在を調べた。インタクトなγ１３４．５遺伝子は存在しなかった。
【０１４８】
神経毒性のアッセイのために、Ｒ３６１７の本来のｔｋ−遺伝子における欠失（ＨＳＶ−１（Ｆ）Δ３０５にその起源がある）を修復しなければならなかった。これはインタクトなＲ３６１７ ＤＮＡとｔｋ遺伝子を含むＢａｍＨＩ Ｑ断片とをウサギ皮膚細胞に共導入することによって達成された（ＣｈｏｕとＲｏｉｚｍａｎ、１９９４）。１４３ｔｋ−細胞中でｔｋ＋表現型について選抜したウイルスをＲ３６１６と命名した（Ｃｈｏｕら、１９９０）。γ１３４．５遺伝子の代わりにβガラクトシダーゼレポーターカセットを保持する組換えウイルスＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）は以下のように作製した。インタクトなＲ４００２ ＤＮＡおよびγ１３４．５遺伝子のＢｓｔＥＩＩ−ＳｔｕＩ ＤＮＡ断片をβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のコード領域のＢｓｔＥＩＩ−ＳｔｕＩ ＤＮＡ断片で置換したプラスミドでウサギ皮膚細胞をトランスフェクションした。組換えが側方領域を通じて起こった。トランスフェクションの子孫を１４３ｔｋ−細胞中、ＢＵｄＲの存在下で選抜した。クローンを精製し、β−ガラクトシダーゼのオープンリーディングフレームの存在についてテストし、チミジンキナーゼ遺伝子をレスキューするためにＢａｍＨＩ Ｑ ＤＮＡで共トランスフェクションした。Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）組換えウイルスにおいて、β−ガラクトシダーゼコード配列は遺伝子産物の最初の２８アミノ酸をコードするγ１３４．５遺伝子と融合している。キメラ遺伝子はγ１３４．５プロモーターから発現される。ウイルス力価はＶｅｒｏ細胞で測定した。Ｒ３６１６はアクセッション番号ＡＴＣＣ ＶＲ２２８０の下にアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｍｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａに１９９０年８月１４日に寄託されている。
【０１４９】
アデノ関連ウイルスベクター
比較実験における対照として、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを従前に記載されているように（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、１９９９）作製し精製した。簡単に言えば、ＡＡＶヘルパープラスミド、ｐＡｄ１４はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＸｂａＩ部位にクローン化されたＡＡＶ ｒｅｐおよびａｐ遺伝子並びにＢａｍＨＩ部位にクローン化されたＳＶ４０複製起点を含んでいる。ウイルスをＣｓＣｌ勾配遠心により精製し、ＰＢＳに対して透析し、小分けして−８０℃に保存した。ウイルス力価はドットブロットハイブリダイゼーションアッセイを用いてウイルスゲノム／ｍｌ数を測定することによって決定した。ＨｅＬａ細胞をこのウイルスで感染させ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）で染色して３−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）活性を感染２４時間後に明らかにすることにより検出した。
【０１５０】
実施例２    細胞培養およびＭＴＴアッセイ
血管遺伝子導入のための適切な用量を決定するため、ヒトの臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を段階付けした濃度のＨＳＶ−１と１２０分間接触させ、以下に記載するように生存率を標準的な７２時間ＭＴＴアッセイを用いて評価した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）をＥＢＭ−２完全培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ ＃ＣＣ３１５６）および単一小分け量のＥＧＭ−２（＃ＣＣ４１７６）に懸濁し、３７℃、加湿５％ＣＯ２インキュベータ内でＰ７５フラスコ中１００％コンフルエントまで増殖させた。細胞の継代には、全試薬パック内容物（ＨＢＳＳ、トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴＮＳ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ ＣＣ−５０３４）を３７℃水槽で溶解し、使用済み培地を取り出して捨てた。ＨＵＶＥＣはそれを覆う充分なＨＢＢＳで洗滌し、トリプシン／ＥＤＴＡを添加し、倒立顕微鏡下でフラスコを緩やかに振盪した。細胞の接着性が無くなったならば、トリプシンを当量のＴＮＳで不活性化させた。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを完全ＥＢＭ−２培地および単一用量のＥＧＭ−２中に再懸濁した。
【０１５１】
生細胞がＭＴＴ黄色塩（３−［４，５−ジメチルチオゾール−２−イル］−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）をフォルマザンに還元することができるという選択性に基づく改変比色アッセイを用いて、ウイルス曝露に伴うＨＵＶＥＣ生存率を定量した。ＨＵＶＥＣを培地中に懸濁し、９６穴平底マイクロタイタープレートに体積０．１ｍｌ、密度１ｍｌあたり５ｘ１０３でプレーティングした。細胞を一晩インキュベーションし、次にＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）に懸濁したＨＳＶ Ｒ３６１６に３７℃にて２時間、加湿５％ＣＯ２下で曝露した。上清を吸引し、０．１ｍｌの完全ＥＢＭ−２を各ウェルに加えた。ゼロプレートは６０分間インキュベーションした。上清を再び吸引し、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）をゼロプレートの各ウェルに３７℃にて４時間加えた。フォルマザン結晶の形成後、上清を下の細胞層をかく乱しないように注意深く吸引した。フォルマザン結晶は０．１ｍｌ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に溶解し、吸光度をパーソナルコンピューター（Ａｐｌｌｅ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）に接続したミクロプレート分光計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ ００４）を用いて５１５ｎｍにて測定した。この工程を７２時間後に繰り返し、相対細胞生存率を計算した。この実験を全部で３回繰り返した。
ＭＯＩ＝１でＲ３６１６に感染させたＨＵＶＥＣは７２時間にわたって９２±１９％生存した。予想されたように、ウイルス濃度の上昇に伴って生存する細胞の割合は減少し、ＭＯＩ＝５０では僅かに４±２％細胞が生存するのみであった。以後のウイルス用量は全組織体積中の細胞数を概算した後ＭＯＩが１〜２の範囲になるように選択した。
【０１５２】
実施例３  全器官培養におけるヒト伏在静脈の感染
静止血管組織におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入をテストするため、手術の際に破棄されたヒト伏在静脈を１２０ｍｍＨｇにて１０分間ビヒクル、ＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９）またはｌａｃＺ遺伝子を含む対照アデノ関連ウイルス（ＡＡＶｌａｃＺ）に感染させた。
伏在静脈分節（ｓｅｇｍｅｎｔ）を認可された手続きに従って冠動脈又は末梢バイパス手術の際に患者から採取した。どの患者も静脈疾患の経歴はなかった。ヒト伏在静脈分節は手術した外科医により良好な状態にあると判断され、直径は３．５〜５．５ｍｍの範囲であった。ヒト伏在静脈を感染させ、全体を培養した。
これらの分節を生理食塩水で緩やかに洗滌して残存残渣を取り除き、過剰な外膜を鋭利にトリミングした。静脈分節を輪状に切断しＲＰＭＩ−１６４０培地／１５％ＦＢＳの入った別々の培養ウェルに入れ、３７℃にて培養した。この静脈を隣接する対照分節および実験分節に分け、ベクターインフュージョンおよび圧力監視（Ｈｅｗｌｅｔｔ―Ｐａｃｋａｒｄ ７７８５３４Ｂ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のため別々に２２ゲージカテーテルで両端にて二重カニュレーションした。静脈をビヒクル（ｎ＝４）、ＡＡＶｌａｃＺ ４ｘ１０１１ ｐｆｕ／ｍｌ（ｎ＝２）、またはＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９） ６．５ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌで１２０ｍｍＨｇにて１０分間、流出を抑え低剪断力下で膨張させた。静脈の主経路を次に生理食塩水でリンスし、静脈を長さ０．５ｃｍのリングに切断した。
【０１５３】
第１のリングは直ちに１．２５％グルタルアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＳで洗滌し、発色アッセイのため３７℃にてＸ−ｇａｌと暗黒条件下でインキュベーションした。残りのリングは（４−７、入手できる静脈の量に依存）それぞれ別個に６ｍｌの培地（１５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）を含む培養ウェルに入れ、３７℃にてインキュベーションした。培地は２日おきに交換した。３、５、１０、１４、２０、２８、３２、３４、４０、４８および５５日後に静脈分節を培地から取り出し、Ｘ−ｇａｌで上述のように染色した。
【０１５４】
ＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９）に曝露した全ての分節はβ−ガラクトシダーゼを発現していた。発現はどの静脈においても曝露直後には存在しなかったが、２０日以後（例えば、３４日）には全ての静脈は内膜および外膜にて顕著な発現を示し、より程度は低いが中膜にも発現を示した。これらの分節をエオジンで対比染色した。ＨＳＶ−媒介導入遺伝子発現はＥＣ層に限定されず、全ての細胞層に存在し、内側板に顕著な量の発現があり、アデノウイルス媒介感染で見られる発現を上回るようであった。また、ＨＳＶがＥＣ細胞層に効率的に侵入でき、静脈壁内深く細胞を感染させることができることは以前には明らかにされておらず、驚くべき事である。発現はこの研究の最終時点である５５日間持続した。これは、一般に７日後には消失するというアデノウイルス−媒介遺伝子導入に対して極めて対照的である。
【０１５５】
ＡＡＶｌａｃＺ曝露後の発現は非常に少なく、ＡＡＶｌａｃＺに曝露した伏在静脈は内膜及び外膜において首尾一貫しない染色を示し、ＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９）よりもずっと低かった。ビヒクルのみに曝露したどの静脈分節でも発現は明瞭でなかった。
これらの分節をフォン・ウイルブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｏｔｒ）（ｖＷＦ）に対するウサギ抗−ヒト抗体でも染色して免疫組織化学によって内皮の存在と完全性を調べた。パラフィン埋包組織の４μｍ切片をポリ−Ｌ−リジン被覆スライドにマウントし、キシレンおよび連続的に濃度低下させたエタノールおよびｄＨ２Ｏで連続的に５分間脱パラフィンした。
【０１５６】
次に切片を予備加温した１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ ６．０）中で７０℃にて６０分間インキュベーションし、ｄＨ２Ｏで３回洗滌し、予備加温したプロテイナーゼＫ（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌ）中で３７℃にて２０分間インキュベーションした。０．５％カゼイン（Ｓｉｇｍａ）およびＰＢＳ中の正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）の１０％溶液でブロッキングした後、内在性アビジン及びビオチンをブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて抑制した。スライドを０．５％カゼイン／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で３回洗滌し、０．５％カゼイン中０．８μｇ／ｍｌに力価調整したウサギ抗−ヒトｖＷＦ（ＤＡＫＯ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と４℃にて一晩インキュベーションした。適当な陰性対照（ウサギＩｇＧイソ型、ＤＡＫＯ）も用いた。
【０１５７】
スライドを３回洗滌し、ヤギ−抗−ウサギＩｇＧビオチン化二次抗体（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ、０．５％カゼインおよび１０％正常ヒト血清）と３７℃にて２５分間インキュベーションした。内在性ペルオキシダーゼは３％Ｈ２Ｏ２で抑制し（室温（ＲＴ）にて２０分間）、スライドを洗滌し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｌｉｔｅ（ＡＢＣ）とＲＴにて２５分間インキュベーションした。組織をＶｅｃｔｏｒ ＤＡＢキットで現像し、ライトグリーンＳＦイエロウィッシュ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈａｎｏｖｅｒ Ｐａｒｋ、ＩＬ）の０．０３％溶液で対比染色した。切片をアルコール、キシレン中で脱水し、パーマウンド（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）およびカバーグラスでマウントし、光学顕微鏡で調べた。
ＨＳＶｌａｃＺによる処理は、ビヒクルまたはＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９）への曝露の３４日後にて培養ヒト静脈においてｖＷＦ染色によって定量評価したところ、ＥＣ層の完全性にはっきり分かるほどの影響を与えなかった。
【０１５８】
実施例４    ウサギ外頸静脈パッチの感染
増殖中の血管組織における ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子導入を証明するため、オスのニュージランドホワイトウサギ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔ）の外頸静脈をビヒクル、ＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９）またはＡＡＶｌａｃＺに曝露した。
オスＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギ（３．５〜４ｋｇ）をケタミンヒドロクロリド（４０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射（１ｍｌ）、および気管内挿管によるハロタン増強によって麻酔した。抗生物質予防処置は毎日エンロフロキサシン１０ｍｇ／ｋｇ ＩＭで行った。滅菌技術を用い、外頸静脈を露出させ、二つの枝管を２４ゲージカテーテルでカニュレーションした。１本のカニューレは灌流および感染に使用し、もう一本は管内圧力の監視に使用した。主経路をビヒクル（ｎ＝６）、ＡＡＶｌａｃＺ ４ｘ１０１１ ｐｆｕ／ｍｌ（ｎ＝２）、またはＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９） ４ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌ（ｎ＝４）で１００ｍｍＨｇにて１０分間感染させた。
【０１５９】
感染後、静脈を生理食塩水で灌流し、切り出し、二弁化した。同側性総頸動脈（ＣＣＡ）を同じ切り口を通じて露出させ、動物を静脈内ヘパリン投与（２００Ｕ／ｋｇ）で全身的に抗凝血処置した。ＣＣＡを二重クランプし、１．５ｃｍ縦方向動脈切開を頭部甲状腺枝部に近い方で行った。４．５倍ルーペで拡大しながら、８−０ポリプロピレン縫合糸（Ｄａｖｉｓ−Ｇｅｃｋ ＴＥ−１４５；Ｍａｎａｔｅｅ、ＰＲ）を用いて動脈切開を外頸静脈パッチ血管形成で再構成した。移植片を通る超音波走行時間を測定し（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｓ Ｉｎｃ．  ＨＴ２０７；Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）、デジタルデータ取り込みシステム（Ｌａｂ Ｍａｓｔｅｒ Ｄ．Ｍ．Ａ．；Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．， Ｓｏｌｏｎ， ＯＨ）を用いて記録した。ウサギへの外頸静脈片の埋め込みのための全操作は問題なく終了した。ビヒクル処置パッチ対ウイルス感染パッチの平均血流の有意な差は移植時にはなかった（ビヒクル１５．０±１．２対ウイルス感染１８±１．０ｍｌ／分；ｐ＝ＮＳ）。切り口を閉じ、動物を回復させた。抗凝血は止めなかった。
【０１６０】
４週間後、静脈パッチを集め開存性（ｐａｔｅｎｔ）およびＸ−ｇａｌを用いたβ−ガラクトシダーゼ発現について評価した。動物を再麻酔し、静脈パッチを再露出させた。動脈内圧およびパッチ部を通る血流を再び測定及び記録した。全ての静脈パッチは４週にて採取した時点で開存していた（ｎ＝１２）。
この静脈パッチを、パッチ部の１ｍｍ遠位から始まり、末端から１ｍｍで終わる３つの細片に分けた。採取した血管を１．２５％グルタルアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗滌し、３７℃にてＸ−ｇａｌで一晩インキュベーションした。５μｍ切片をパッチの各部分から切り出しエオジン、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ ＆ Ｅ）およびＷｅｉｇｅｒｔ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎを用いて染色した。各組織切片の高倍率視野像（４０Ｘ）をデジタルカメラ（Ｓｏｎｙ ＰｏｗｅｒＨＡＤ  ３ＣＣＤ）を備えた顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔｏ−ＦＸ）を用いて調べた。染色された細胞／核を標準的画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓ ３．０．１）を用いて計測した。管腔を円周上に取り巻いて位置する新生内膜、中膜および外膜におけるβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の総数を計測した。新生内膜、中膜および外膜における総細胞数をＨ ＆ Ｅ切片にて計測した。陽性細胞数の平均を総細胞数に対するパーセンテージとして表した。これは感染効率を反映する。
【０１６１】
ＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９；ｎ＝４）に曝露した静脈パッチの全ては、曝露（すなわち感染）後４週間にて、静脈壁の全ての層、特に新生内膜を含む平滑筋細胞（ＳＭＣ）にて顕著なβ−ガラクトシダーゼ発現を示した（感染効率４８±２％）。全てのスライドをエオジンで対比染色した。外膜、中膜および新生内膜における計算された感染効率はそれぞれ４２±１％、５８±３％、および４８±２％であった。興味深いことに、動脈片（再構築物の後壁）、特に縫合人工物を囲む縁近くにも中程度の発現が見られた。対照的に、ＡＡＶｌａｃＺで感染させたパッチは首尾一貫しない導入遺伝子発現を示し、大部分は外膜に制限されていた。ビヒクル−曝露パッチまたはＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９）感染静脈パッチまたはＡＡＶ感染静脈パッチの反対側から採取した外頸静脈またはＣＣＡにおいては発現が明らかではなかった。
【０１６２】
実施例５            培養ヒト細胞に対するＲ８４９の効果
培養ヒト細胞におけるＨＳＶ Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）の効果を示すため、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＃ＣＣ２５１７）および臍帯動脈平滑筋細胞（＃ＣＣ２５７９）を別個にＥＧＭ完全培地カプセルキット（＃ＣＣ３１８２）中に懸濁し、Ｐ７５フラスコ内で、３７℃にて５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で１００％コンフルエントまで増殖させた。生細胞がＭＴＴ黄色塩（３−［４，５−ジメチルチオゾール−２−イル］−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）をフォルマザンに還元できるという選択的能力に基づいた改変比色アッセイを用いてウイルス曝露後およびアシクロビル（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によるレスキュー後のＨＵＶＥＣおよびＵＡＳＭＣ生存率を定量した。
【０１６３】
ＭＯＩ＝１にてＲ８４９に感染させたＨＵＶＥＣの相対細胞生存率は４８時間後および７２時間後にそれぞれ１０２±１０％および８１±４％であった。同様に、感染ＵＡＳＭＣの相対細胞生存率はそれぞれ９２±１０％、７３±６％であった。予想されたように、ウイルス濃度が高くなるにつれ生存細胞の割合は減少し、ＭＯＩ＝２５で感染させると、わずかにＨＵＶＥＣの１２±３％、ＵＡＳＭＣの５±１０％しか生存せず（アシクロビル０．２５μｇ／ｍｌにて７２時間相対細胞生存率は４５±５％、アシクロビル０．５μｇ／ｍｌでは８５±９％であった）、一方、同様に感染させたＵＡＳＭＣは、１０μｇ／ｍｌアシクロビルによってもレスキューできなかった。このことにより、（１）Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）は低用量では相対的に非毒性である、（２）Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）は高用量では内皮細胞（ＥＣ）よりもＳＭＣに対してより毒性である、（３）ＭＯＩ＝２５で曝露されたＥＣの大部分はアシクロビルの治療適用量でレスキューできるが、ＳＭＣではできないことが明らかにされた。従って、Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）はこの治療トラテジーにおける標的細胞集団であるＳＭＣに対して選択性を示す。
【０１６４】
実施例６    ヒト静脈全体に対するＲ８４９の効果
Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）のヒト静脈全体に対する効果を再度（上述の実施例３に記載したように）調べた。冠動脈また周辺バイパスの時に採取した未使用伏在静脈を２２ゲージのカテーテルで両端にてカニュレーションし、ビヒクルまたは１ｘ１００ ＰＦＵ／ｍｌ Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ；ｎ＝８）のいずれかで１２０ｍｍＨｇにて１０分間膨張させた。
第１のリングは直ちに１．２５％グルタルアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＳで洗滌し、発色アッセイのため３７℃にてＸ−ｇａｌと暗黒条件下でインキュベーションした。残りのリングはそれぞれ別個に６ｍｌの培地（３０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）培養ウェルに入れ、３７℃にてインキュベーションした。２〜５５日後に静脈分節を培地から取り出し、Ｘ−ｇａｌで染色した。
【０１６５】
結果はＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）−感染分節は感染後５５日にいたるまでβ−ガラクトシダーセ発現を示した。興味深いことに、導入遺伝子発現はＥＣ細胞に限定されず、全ての細胞層に存在し、内膜において顕著な発現があり、これはアデノウイルス−媒介感染において観察される発現を上回るようであった。
明らかに、再狭窄を抑えるために設計したどんなストラテジーも抗血栓内皮細胞層を乱してはならない。内皮に対するＨＳＶの潜在的な負の効果をテストするため、培養したヒト伏在静脈をＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）に曝露し、次に、内皮マーカ、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｃＷＦ）について、免疫染色を用いて調べた。静脈をビヒクルまたはＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ；６．５ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌ）で、上述したように１２０ｍｍＨｇにて１０分間膨張させた。静脈分節を培地から取り出し、固定し、染色した。４μｍ切片をポリ−Ｌ−リジン被覆スライドにマウントし、キシレンおよび連続的に濃度低下させたエタノールおよびｄＨ２Ｏで連続的に５分間脱パラフィンした。スライドを０．５％カゼイン／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で３回洗滌し、０．５％カゼイン中０．８μｇ／ｍｌに力価調整したウサギ抗−ヒトｖＷＦ（ＤＡＫＯ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と４℃にて一晩インキュベーションした。適当な陰性対照（ウサギＩｇＧイソ型、ＤＡＫＯ）も用いた。スライドを３回洗滌し、ヤギ−抗−ウサギＩｇＧビオチン化二次抗体（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ、０．５％カゼインおよび１０％正常ヒト血清）と３７℃にて２５分間インキュベーションした。組織をＶｅｃｔｏｒ ＤＡＢキットで現像し、ライトグリーンＳＦイエロウィッシュ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈａｎｏｖｅｒ Ｐａｒｋ、ＩＬ）の０．０３％溶液で対比染色した。遺伝子導入は一貫して血管壁全体に示され、ｖＷＦの存在で判断すると内皮はほとんど無傷で残っていた。
【０１６６】
実施例７      免疫適格動物における静脈移植片へのＲ８４９感染
Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）−媒介感染の時間経過を調べるため、長期計画実験の可能性を考慮し、ウサギ血管パッチモデルにおける（実施例４に記載したような）実験を再度行った。オスＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギ（３．５〜４ｋｇ）を麻酔し外頸静脈を外科的に露出させた。主経路をビヒクル（ｎ＝６）、ＨＳＶｌａｃＺ（Ｒ８４９） ４ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌ（ｎ＝８）またはＲ３６１６ ３ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌ（対照ウイルス、ｎ＝２）に１２０ｍｍＨｇにて１０分間感染させた。感染後、静脈を切り出し、８−０ポリプロピレン縫合糸を用いて総頸動脈血管形成として適合させた。この静脈パッチ技術は最少の外科的損傷で動脈化静脈素片を形成できる利点がある。４種間後、動物を再麻酔し、静脈パッチを再露出させた。対照（３１±２ｍｌ／分）対ウイルス感染パッチ（３４±３ｍｌ／分）において平均血流の有意な差は移植時にはなかった。全ての静脈パッチは４週にて採取した時点で開存していた。
【０１６７】
Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）４ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌに曝露したパッチは、顕著なβ−ガラクトシダーゼ染色を血管壁の全ての部分で示し、内側層で最も顕著であった。計算した感染効率（感染細胞のパーセンテージ）は外膜で４２±２％、中膜で４４±９％、新生内膜で４５±６％であった。中程度のβ−ガラクトシダーゼ染色は静脈パッチに隣接する未処置動脈部分でも検出され、無傷の頸動脈のより遠位の部分にも検出された。一定した感染率は安定かつ持続的な遺伝子発現と共役しており他のベクターによる結果を遙かに上回っていた［Ｍｏａｗａｄら、Ａｎｎ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １５： ３６７−７３， ２００１； Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ２９： ８７４−８３， １９９９； Ｈａｎｎａら、Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ３１： ７７０−８０， ２０００； Ｇｅｏｒｇｅら、Ｃｉｒｃ． １０１： ２９６−３０４， ２０００； Ｅｓｌａｉｍら、Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ３１： １１４９−５９， ２０００； Ｄｏｌｌｅｒｙら、Ｃｉｒｃ． ９９： ３１９９−２０５， １９９９； Ｓｃｈｅｉｎｍａｎら、Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ２９： ３６０−９， １９９９； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ２９： ５４３−５０， １９９９およびＷａｕｇｈら、Ｃｉｒｃ． １０２：３３２−７， ２０００］。さらに、これらの結果を達成するために必要なＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）の用量は１０８ ｐｆｕ／ｍｌ以下であり、これは従来のアデノウイルスを用いたストラテジーよりも数桁低い。
【０１６８】
実施例８      免疫適格動物における新生内膜過形成に対するＲ８４９の効果
血行力学的に損傷させた静脈パッチ血管形成を使用してＳＭＣ増殖および新生内膜過形成に対するＲ８４９（ｌａｃＺ）の効果をテストした。血液流が損なわれることは付随する剪断ストレスの低下と共にＳＭＣ増殖のよく知られた刺激因子であり［Ｒｅｃｔｅｎｗａｌｄら、Ｃｉｒｃ． １０２， ２０００およびＫｕｍａｒら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １７： ２２３８−４４， １９９７］、静脈移植が失敗する重要な素因である［Ｍｅｙｅｒｓｏｎら、Ｊ． Ｖａｓｃ． ｕｒｇ． ３４：９０−７， ２００１］。従って、バイパス移植失敗をシミュレートするために著しく血流が低下した条件下における静脈移植のモデルを開発した。
一般に、上述した実施例のように、ウサギに外科的な静脈露出を行い、Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）感染、および静脈パッチ形成を行った。傷口を閉じる前に、血管形成再構成部の主枝（総頸動脈）を縛り、頭部甲状腺小動脈（ｓｍａｌｌ ｃｒａｎｉａｌ ｔｈｙｒｏｉｄ ａｒｔｅｒｙ）による血流のみを残した。これにより血流を基準のおよそ５％まで低下させる効果が再現性を持って生じ、この状態は犠牲にするまで維持された。
【０１６９】
得られた静脈パッチは著しく肥厚し萎縮しており、静脈移植の動物モデルについて報告された厚さで最も厚かった。組織学的特徴は層状血栓及び血流抑制性管腔狭窄を含み、失敗したヒトのバイパス移植片の特徴と類似していた。
具体的には、このモデルを用いてＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）のＳＭＣ増殖に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果をテストした。ウサギ外頚静脈をＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ；ｎ＝８）またはビヒクル（ＰＢＳＳ；ｎ＝６）で１０分間感染させ、次に流出を制限して頸動脈静脈パッチ形成を行った。移植時の平均血流及び剪断ストレスはＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）−感染群（２．８±０．３ｍｌ／分、０．１７±０．０３ダイン／ｃｍ２）、およびビヒクル群（２．６±１．７ｍｌ／分、０．３２±０．１ダイン／ｃｍ２）において類似していた。４週間後、静脈パッチを再露出させ、最終記録血圧にて灌流−固定し、新生内膜過形成について形態計量的に調べた。５μｍ切片を切り、ワイゲルト・ファン・ギーソン（Ｗｅｉｇｅｒｔ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ）技法を用いて染色し内弾性膜を明瞭にし、デジタル平面面積測定を用いて解析した（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ； Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ，； Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）。Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）−感染パッチは広く開存しており、ビヒクル処理対象よりも顕著に新生内膜過形成が少なかった（Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）２８０±２８、対、ビヒクル４１０±３８μｍ、ｐ＝０．００３）。Ｒ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）処理は本質的に「低−血流」パッチ形態を「高−血流」生理機能に戻した。
【０１７０】
実施例９  確立したＲ８４９感染のアシクロビルによる根絶およびＲ８４９感染におけるＲ８４９の全身毒性
ベクターの所望の生物学的効果が完了した後、感染を弱める又は除去することは遺伝子治療ストラテジーに対する重要な強化となり、毒性および長期後遺症に対する可能性を限定するために役立つであろう。アシクロビルナトリウム（１２−アミノ−１，９−ジヒドロ−９−［（２−ヒドロキシ−エトキシ）メチル］−６Ｈ−プリン−６−オン；商品名ゾヴィラックス（Ｚｏｖｉｒａｘ）；Ａｌｐｈａｐａｒｍ ＵＳＰＤ， Ｉｎｃ，．）は単純ヘルペスウイルス、帯状ヘルペス（帯状疱疹）ウイルス、水痘（水疱瘡）ウイルス、エプスタイン−バールウイルスを含むヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスに限定された抗ウイルススペクトラムを有する合成プリンヌクレオシド類似体である。臨床的には、この使用は単純ヘルペスウイルス、陰部ヘルペスウイルス、帯状ヘルペスの治療に限定されている。
【０１７１】
その作用機序は、細胞内侵入、最初にウイルスチミジンキナーゼによるモノホスフェートへの変換、次に細胞性グアニレートキナーゼによるジホスフェートへの変換、最後に、他の種々の細胞性酵素によるトリホスフェートへの変換が含まれると考えられている。完全に活性なアシクロビルトリホスフェートはヘルペスウイルスのＤＮＡ鎖中の位置について天然の基質、デオキシグアノシントリホフフェートと競合する。一度取り込まれると、（１）ウイルスＤＮＡポリメラーゼに対する競合阻害、（２）ウイルスＤＮＡ鎖への取り込みおよびその生長の停止、（３）ウイルスＤＮＡポリメラーゼの不活性化によってＤＮＡ合成を停止させる。未感染細胞は僅かのアシクロビル取り込みおよびリン酸化しか示さない。本実施例で使用したＨＳＶ株はｔｋ活性を保持しており、従って、シクロビルによる中和に高度に感受性である。確立したＨＳＶ−１感染が所望の（組換えＨＳＶの）ｉｎ ｖｉｖｏ治療効果が完了した後に根絶できるか否かをテストするため、ウサギモデルを使用した。
【０１７２】
外科的露出の後、外頸静脈を４ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌのＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）に（ｎ＝８；０．２〜４．０ｍｌ）１２０ｍｍＨｇにて１０分間感染させ、前述したように静脈パッチとして総頸動脈の上に形成させた（静脈パッチ血管形成）。１週間の回復後、ウサギの半分（ｎ＝４）にアシクロビル（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）７５ｍｇ／ｋｇ体重を計５日間静脈内投与した。同じ術後日から初めて、ウサギを同時に経口アシクロビル（Ａｌｐｈａｐａｒｍ  ＵＳＰＤ Ｉｎｃ．；３ｍｇ／ｍｌ Ｈ２Ｏ）処置し、犠牲にするまで維持した。基準血清アシクロビル濃度、電解質濃度、血中尿素態窒素濃度、およびクレアチニン濃度を、アシクロビル処置前、処置開始の２日、５日、および１０日後、および犠牲時に測定した。アシクロビル治療中、アシクロビルの血清濃度は治療範囲内（９±４μｇ／ｍｌ）に維持した。血清電解質濃度、血中尿素態窒素、およびクレアチニンを測定したところ、この研究を通して有意な全身毒性はなかった。
【０１７３】
４週間後、動物を再麻酔し、静脈パッチを再露出させ採取した。血管を１．２５％グルタルアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗滌し、３７℃にてＸ−ｇａｌとともに一晩インキュベーションした。切片を調べることにより、アシクロビル処置は完全にレポーター遺伝子（ｌａｃＺ）発現を除去し、β−ガラクトシダーゼ活性は１％未満の細胞にしか見られなかった（ｐ＜０．５５）。処置した静脈パッチはＲ８４９（ＨＳＶｌａｃＺ）感染が全くなくなった後も広く開存したままであったことから治療的抗増殖効果は保持されるようである。
ＨＳＶ感染による血球数算定、血小板機能、凝結、肝臓または腎臓の機能に有意な異常は無かった（表６参照）。感染は二重クランプした静脈に局在しており、従って、全身曝露はごく僅かであった。
【０１７４】
本発明を好ましい実施態様として記載してきたが、本発明は本開示、特に、請求項の最も広い適切な解釈の範囲内にあるこれらの実施態様およびそれらの必要条件を考慮して当業者が考える全ての改変および変形を包含することが意図されている。本明細書に引用した全ての文献（科学論文、米国特許、外国特許、および公開特許出願）は本明細書に引用により取り込まれるものとする。
【０１７５】
【表１３】
表６
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【０１７６】
【表１４】
表６つづき
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【０１７７】
参考文献
以下の参考文献は本明細書に記載した事項の例示的、手順的または他の詳細な補足を提供するという程度において、本明細書に取り込まれるものとする。
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１９９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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