(57)【要約】本発明は、Ａ．フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）プロフィリンの単離された核酸配列およびアミノ酸配列、生体活性のあるＡ．フミガーツスプロフィリンを用いるＡ．フミガーツスプロフィリン修飾物質をスクリーニングする方法、ならびにＡ．フミガーツスプロフィリン修飾物質に関するスクリーニングのためのキットを提供する。
2004535763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性を有するタンパク質であるＡ．フミガーツスプロフィリンタンパク質をコードする、単離された核酸配列：
（ｉ）タンパク質の活性がアクチンとの結合を含む；および（ｉｉ）配列比較アルゴリズムを用いて測定された配列番号：２に対するアミノ酸配列同一性が９０％を上回る配列を、タンパク質が有する。
【請求項２】
タンパク質が、配列番号：２を含むタンパク質に対するポリクローナル抗体と特異的に結合する、請求項１記載の単離された核酸配列。
【請求項３】
核酸が配列番号：２をコードする、請求項１記載の単離された核酸配列。
【請求項４】
核酸が配列番号：１のヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離された核酸配列。
【請求項５】
核酸が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１と選択的にハイブリダイズする、請求項１記載の単離された核酸配列。
【請求項６】
以下の特性を有するタンパク質であるアスペルギルス・フミガーツスプロフィリンタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター：
（ｉ）タンパク質の活性がアクチンとの結合を含む；および（ｉｉ）配列比較アルゴリズムを用いて測定された配列番号：２に対するアミノ酸配列同一性が９０％を上回る配列を、タンパク質が有する。
【請求項７】
請求項６記載のベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項８】
配列比較アルゴリズムを用いて測定された配列番号：２に対するアミノ酸配列同一性が９０％を上回る、単離されたアスペルギルス・フミガーツスプロフィリンタンパク質。
【請求項９】
Ａ．フミガーツスプロフィリンに対するポリクローナル抗体と特異的に結合する、請求項８記載の単離されたタンパク質。
【請求項１０】
Ａ．フミガーツスプロフィリンである、請求項８記載の単離されたタンパク質。
【請求項１１】
配列番号：２のアミノ酸配列を有する、請求項８記載の単離されたタンパク質。
【請求項１２】
配列番号：１のヌクレオチドに対する配列同一性が８０％を上回る配列を含む、単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年１１月２７日に出願された米国特許出願第０９／７２２，９４６号の一部継続出願であり、その全開示内容は、全文が全目的に関して、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、酵母アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）におけるアクチン動態およびリン脂質の加水分解に関与する遺伝子に関し、より詳細には、この遺伝子の同定、単離およびクローニングに関する。本発明はまた、抗真菌活性を備えた化合物に関するスクリーニングのためにこの遺伝子を用いる方法にも関する。
【０００３】
発明の背景
プロフィリンは１２ｋＤａ〜１５ｋＤａの遍在性真核生物アクチンであり、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）結合タンパク質でもある。マシェスキー（Ｍａｃｈｅｓｋｙ）およびポラード（Ｐｏｌｌａｒｄ）（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：３８１〜５。このタンパク質は、哺乳動物細胞において、休止細胞におけるホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）によるリン脂質加水分解を阻害するＰＩＰ２と結合することによって作用する。ゴールドシュミット−クレルモン（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１５７５〜８。細胞分裂時にはチロシンキナーゼ受容体の活性化に続いてＰＬＣがリン酸化されてそのために活性化され、プロフィリンの存在下でもＰＩＰ２を加水分解する。ゴールドシュミット−クレルモン（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１２３１〜３。この加水分解により、既知の伝達物質であるイノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）ならびにプロフィリンが遊離する。プロフィリンは原形質膜からサイトゾルに移動し、そこでアクチンと結合して細胞骨格の再構成を触媒する。ゴールドシュミット−クレルモン（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ）およびジャメイ（Ｊａｍｅｙ）（１９９１）Ｃｅｌｌ ６６：４１９〜２１。
【０００４】
プロフィリンは、単量体または球状（Ｇ−）アクチンからのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の遊離を触媒する。モックリン（Ｍｏｃｋｒｉｎ）ら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９：５３５９〜６２；ゴールドシュミット−クレルモン（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ）ら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１３：１０８１〜９。この活性はＧ−アクチン上でのＡＤＰからＡＴＰへの交換を劇的に増大させ、これによってアクチンのミクロフィラメントへの重合は不活性化され、細胞骨格の再構築が促進される。カルリエ（Ｃａｒｌｉｅｒ）（１９８９）Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５：１３９〜７０。このため、プロフィリンは真核細胞の分裂周期の重要な構成要素である上、アクチン細胞骨格との相互作用により、細胞の総合的な完全性、小胞輸送および細胞極性の重要な構成要素ともなっている。
【０００５】
プロフィリンが酵母の発育サイクルに重要であることを示唆する証拠が得られている。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロフィリン遺伝子におけるヌル変異は多くの出芽酵母株で致死的である。マグドレン（Ｍａｇｄｏｌｅｎ）ら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：５１０８〜１５。他の出芽酵母株ではヌル変異によって極めて異常な形態を有し、増殖速度が著しく低下した株が生じる。ハーラー（Ｈａａｒｅｒ）ら（１９９０）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１０：１０５〜１４。リン脂質の加水分解におけるプロフィリンの役割は示されていないが、プロフィリンの原形質膜から細胞質中へのＰＩＰ２依存的な移動は示されている。オストランダー（Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ）ら（１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ４６：２７０４５〜５０。出芽酵母のプロフィリンがＲＡＳ／アデニル酸シクラーゼ経路と相互作用することも示されている。ヴォイチェク（Ｖｏｊｔｅｋ）ら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６６：４９７〜５０５。
【０００６】
全身性真菌感染症の多くは治療されないと致死的であり、その予防および治療には切実な需要がある。事実、カンジダ感染症およびアスペルギルス感染症は１９８０年代および１９９０年代に急増している（Ｍｕｓｉａｌ， ＣＥ、Ｃｏｃｋｅｒｉｌｌ ＩＩＩ， ＦＲ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＧＤ．（１９８８）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂ Ｒｅｖ １（４）：３４９〜３６４；Ｓａｒａｌ Ｒ．（１９９１）Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ １３：４８７〜４９２）。接合菌症、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症およびフザリウム感染症の増加も認められている。真菌感染症の増加の理由はいくつかあるが、重要な要因の一つは免疫不全個体の数が増加していることである。この群には、ＨＩＶ症（ＡＩＤＳ）の患者、高齢患者、侵襲的な外科手術を受けた患者、移植患者および熱傷患者が含まれる。
【０００７】
免疫抑制個体の数の増加に伴って、これらの患者に認められる真菌感染症の数および種類も増加する。カンジダ症は免疫抑制患者に最も多い真菌感染症であり続けているが、アスペルギルス症、接合菌症および糸状菌による他の感染症の患者数も増加しており、大きな問題となっている（Ｇｅｏｒｇｉｅｖ， Ｖ． Ｓｔ．（１９９８）「免疫不全宿主における感染症（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ Ｈｏｓｔｓ）」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；およびＦａｕｃｉ， ＡＳ．（１９９８）Ｅｍｅｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｃｉｄｏｄ／ｅｉｄ／ｖｏｌ４ｎｏ３／ｆａｕｃｉ．ｈｔｍｌ）。地方病性の真菌症、特にヒストプラスマ症およびコクシジウム症も患者に対するリスクとなる。このような感染症のリスクが特に高いのは、ＡＩＤＳ患者、骨髄移植または臓器移植を受けた者、化学療法を受けている者、および消耗性疾患、重症外傷、長期入院の患者または抗菌薬の長期投与を受けた者である（ＮＩＡＩＤ ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ、１９９６）。
【０００８】
ＣＤＣの全米病院サーベイランスシステム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ）によれば、病院と関係のある真菌感染症の頻度は１９８０年と１９９０年との間にほぼ２倍近くになった。１９９７年に地方病性真菌症の臨床症状を示した個体は２４０，０００例と推定されている。現在の治療アプローチでは（主にアンホテリシンＢおよびアゾール類）、全身性真菌感染症の患者の死亡率は、病原体によるが３０％〜１００％の範囲である。
【０００９】
真菌感染症の重症度は免疫系の機能が低下するほど高くなる。真菌はＡＩＤＳ患者に最も多くみられる病原体の一つであり、主な真菌病原体の事実上すべてがＨＩＶ陽性患者における感染症の原因となる。未治療のＨＩＶ陽性患者の大半が真菌感染症の発生を少なくとも１回経験し、多くの真菌感染症はＨＩＶ感染個体におけるＡＩＤＳ指標疾患となっている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｐ．（１９９９）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｃｕｒｅ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ＿ｍｅｔｈｏｄｓ／ａｓｐｅｒ−ａｉｄｓ．ｈｔｍｌ）。
【００１０】
このため、新たな抗真菌剤に対しては切実な需要が存在する。このような作用物質（ａｇｅｎｔ）の単離を目的とする高スループットスクリーニング法が最近開発されたことにより、この需要が満たされる機会が訪れている。プロフィリンはこのようなスクリーニング手法の対象として適しており、このため、抗真菌剤の新たな重要な標的である。
【００１１】
発明の概要
本発明は、Ａ．フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）プロフィリンをコードする単離された核酸分子に関する。Ａ．フミガーツスプロフィリンは、配列比較アルゴリズムを用いて測定された配列番号：２（図２参照）に対するアミノ酸配列同一性が７０％、８０％または９０％を上回る配列を有することが好ましい。
【００１２】
１つの局面において、本発明は、Ａ．フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）プロフィリンをコードする単離された核酸配列を提供し、ここで、プロフィリンは、配列比較アルゴリズムを用いて測定された、配列番号：２に対して７０％、８０％、または９０％を上回るアミノ酸配列同一性を有する配列を有する。１つの態様において、本タンパク質はさらに、配列番号：２に対して産生されたポリクローナル抗体と特異的に結合する。
【００１３】
１つの態様において、本核酸はＡ．フミガーツスプロフィリンまたはその断片をコードする。もう１つの態様において、本核酸は配列番号：２をコードする。もう１つの態様において、本核酸は配列番号：１のヌクレオチド配列を有する（図１を参照されたい）。
【００１４】
１つの局面において、本核酸は、配列番号：２に対する配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回るアミノ酸配列をコードする配列を含み、または、もう１つの態様において、配列番号：２に対する配列同一性が９８％〜１００％であるアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【００１５】
１つの態様において、本核酸は、配列番号：１に対する配列同一性が５５％もしくは６０％を上回る、好ましくは７０％を上回る、より好ましくは８０％を上回る、より好ましくは９０％もしくは９５％を上回る配列を含み、または、もう１つの態様において、配列番号：１に対する配列同一性が９８％〜１００％である配列を含む。本明細書で提供されるもう１つの態様において、本核酸は、配列番号：１の配列またはその相補配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００１６】
もう１つの局面において、本発明は、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする核酸を含む発現ベクターを提供し、ここでタンパク質は、配列比較アルゴリズムを用いて測定された、配列番号：２に対して７０％、８０％、または９０％を上回るアミノ酸配列同一性を有する配列を有する。本発明はさらに、本ベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１７】
もう１つの態様において、本タンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列を有する。１つの局面において、本明細書に提供するタンパク質は、配列番号：２に対する配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回るアミノ酸配列を含み、または、もう１つの態様において、配列番号：２に対する配列同一性が９８％〜１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列またはその断片、より詳細には配列番号：２のアミノ酸配列またはその断片のＡＴＰ加水分解ポケットまたはＰ−ループを含む、実質的に精製されたポリペプチドを特徴とする。
【００１９】
真菌性疾患の治療のための作用物質を含む、標的タンパク質の修飾物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）もまた提供される。本明細書に提供する作用物質およびおよび組成物を、噴霧剤、粉末および他の組成物の処方物を含む、さまざまな用途に用いることができる。真菌性疾患の治療方法も本明細書に提供する。
【００２０】
発明の詳細な説明
Ｉ． 定義
「Ａ．フミガーツスプロフィリン」とは、アクチンおよびＰＩＰ２と結合可能であって、後述の配列を有する、Ａ．フミガーツスに存在するタンパク質またはポリペプチドを指す。
【００２１】
「抗Ａ．フミガーツスプロフィリン」抗体とは、Ａ．フミガーツスプロフィリンの遺伝子、ｃＤＮＡまたはそれらの部分配列によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体断片を指す。
【００２２】
「生体活性のある」標的タンパク質とは、アクチンおよびＰＩＰ２との結合能ならびにＡＴＰの加水分解能を非制限的に含む、標的タンパク質の生体活性の１つまたは複数を有する標的タンパク質を指す。
【００２３】
本明細書で用いる「生物試料」とは、標的タンパク質もしくはその断片または核酸標的タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を含む、生物組織または体液である。生物試料は少なくとも１つの細胞または細胞抽出物を含む。
【００２４】
「制御領域」とは、核酸またはその任意のサブユニットの発現を調節するヌクレオチド配列を指し、これには任意のプロモーター、サイレンサー、エンハンサー、スプライス部位、転写開始因子、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、翻訳制御因子、翻訳開始部位、翻訳終結部位およびメッセージ安定性因子が非制限的に含まれる。このような調節領域はコード領域の５’側または３’側にあってもよく、コード領域内に介在するイントロンにあってもよい。
【００２５】
「比較域（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」には、２つの配列の最適整列化を行った後に、ある配列を同じ数の連続した位置を持つ参照配列と比較しうるような２５個〜６００個、通常は約５０個〜約２００個、より一般的には約１００個〜約１５０個からなる群から選択される数の連続した位置のいずれか１つの区域に対する言及が含まれる。比較のための配列整列化の方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性整列化アルゴリズムにより、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）ならびにアルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）により、または手作業による整列化および肉眼的検査によって行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前記を参照）。
【００２６】
このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化した場合にある正値の閾値スコアＴと一致する、またはそれを満たす、長さＷの短いワードを検索配列中に同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定する。Ｔは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前記）。これらの初期の近隣ワードでのヒットは、それらを含む長いＨＳＰを見いだすための検索を開始する源となる。ワードの検索は、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列の両方向に対して延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（一致する残基対に関する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合には、累積スコアの算出にスコア行列を用いる。各方向へのワード検索の延長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値に比べて量Ｘより低くなった場合：１つもしくは複数の負スコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ未満になった場合；または配列のいずれかの端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、ＴおよびＸは整列化の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォールトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォールトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対するタンパク質配列を用いる）はデフォールトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【００２７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列一致率の算出に加えて、２つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の指標の１つは最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、ある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００２８】
有用なアルゴリズムインプリメンテーション（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）のもう１つの例がＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは漸進的な対形式の整列化を用いて、一群の関連配列から多数の配列アラインメントを作成する。これはアラインメントを作成するために用いたクラスター化の関係を示すデンドログラムのプロットも行う。ＰＩＬＥＵＰはフェング（Ｆｅｎｇ）およびドリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１〜３６０（１９８７）の漸進的整列化法を単純化したものを用いている。用いる方法はヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３（１９８９）と類似している。原則的に、ＰｉｌｅＵｐは最大５００個の配列を整列化することができ、この際、最終的なアラインメントにおける個々の配列はいずれも最大長が７，０００文字に限定される。
【００２９】
多重アラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の手順は最も類似した２つの配列のペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）から始め、整列化された２つの配列のクラスターを作成する。続いてこのクラスターを、次に最も関連性の高い配列、または整列化された配列のクラスターに対して整列化する。２つの配列クラスターは、個々の２つの配列のペアワイズアラインメントを単純に拡張することによって整列化することができる。一連のこのようなペアワイズアラインメントは徐々に類似性が低くなる配列を含み、各反復時の配列クラスターから保存部位の最終的なアラインメントおよびコンセンサス配列が得られる。
【００３０】
本明細書で用いる「診断法（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）」とは、健康状態または疾病状態の同定または特徴分析を支援する化合物、方法、システムまたは装置のことである。診断法を、当技術分野で公知の標準的なアッセイに用いることができる。
【００３１】
「発現ベクター」とは、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能とする一連の特殊な核酸要素を備えた、組換え的または合成的に作製された核酸構築物のことである。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸断片の一部でありうる。典型的な場合、発現ベクターは、転写させようとする核酸がプロモーターと機能的に結合したものを含む。
【００３２】
「高ストリンジェンシー条件」とは、以下のものによって特定されうる：（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃〜６８℃を用いる；（２）ハイブリダイゼーション時にホルムアミドなどの変性剤、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）＋７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃を用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸、４２℃を用い、４２℃の０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃の５０％ホルムアミド中で洗浄し、その後、ＥＤＴＡを含む５５℃の０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う。
【００３３】
本明細書で用いる「高スループットスクリーニング」とは、多数の候補作用物質または試料のスクリーニングを同時に行えるアッセイを指す。以下にさらに説明するように、このようなアッセイの例にはマイクロタイタープレートの使用が含まれ、これは少量の試薬および試料を用いて多数のアッセイを同時に行うことができることから特に好都合である。
【００３４】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、発現ベクター内に含まれる遺伝子の複製または発現を補助する細胞を指す。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞でもよく、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａその他の哺乳動物細胞、または植物細胞などの真核細胞でもよい。この定義には初代細胞および培養細胞系の両方が含まれる。
【００３５】
「特異的にハイブリダイズする」という用語は、配列が複合混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合の、ストリンジェントな条件における特定のヌクレオチド配列のみとの結合、二本鎖形成またはハイブリッド形成を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が異なれば異なると考えられる。配列が長いほど高い温度で特異的にハイブリダイズすると考えられる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度および強度での特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下で）である。一般に、ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオン濃度で約１．０Ｍ未満、一般的にはナトリウムイオン（または他の塩の）濃度で約０．０５Ｍ〜１．０Ｍ、ｐＨ７．０〜８．３であり、温度は短いプローブ（例えば、１０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃であって、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを上回るもの）に関しては少なくとも約６０℃であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの二本鎖ＤＮＡ脱安定剤の添加によっても得られる。
【００３６】
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一である」または「一致」率という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いた評価により、一定の比較域にわたって最大の対応関係が得られるように比較および整列化を行った場合、または手作業による整列化および肉眼検査を行った場合に、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが指定された比率である、２つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。好ましくは、一致率は、少なくとも約２５アミノ酸長の配列の領域にわたり、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸長または１００アミノ酸長の領域にわたって存在する。この定義は、被験配列が参照配列に対して指定されたまたは実質的な同一性を有するという条件の下で、被験配列の相補物も指す。好ましくは、一致率は、少なくとも約２５ヌクレオチド長の配列の領域にわたり、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長または１００ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００３７】
配列一致率をタンパク質またはペプチドに言及して用いる場合には、同一でない残基の位置はしばしば、アミノ酸残基が類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有し、このため分子の機能的特性を変化させない他のアミノ酸残基によって置換されている保存的アミノ酸置換として異なることが認識されている。配列が保存的置換として異なる場合には、置換の保存的性質を補正するために配列一致率を上方調整してもよい。または、比較の際にこのような保存的置換が含まれる場合には、「一致」率（％）に対して「類似」率（％）を記載することができる。この調整を行うための手段は当業者に周知である。保存的置換のスコアは、例えばＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にインプリメントされているような、例えば、マイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラーズ（Ｍｉｌｌｅｒｓ）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ４：１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムによって算出することができる。
【００３８】
「同質遺伝子の」とは、同一のゲノムを有するが単一の遺伝子は異なる、染色体またはプラスミド上に存在する系を指す。
【００３９】
「単離された」「精製された」または「生物的に純粋である」という用語は、その天然の状態に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学の技法を用いて決定される。ある調製物に存在する主な分子種であるタンパク質は、実質的に精製されている。単離された遺伝子において、関心対象の核酸は、関心対象の遺伝子と隣接し、関心対象のタンパク質以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを表す。特に、これは核酸またはタンパク質の純度が少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％であることを意味する。
【００４０】
「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段によって検出可能な組成物のことである。例えば、有用な標識には、緑色、黄色、赤色もしくは青色の蛍光性タンパク質、３２Ｐなどの放射性同位体、蛍光性色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに一般に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質（例えば、配列番号：２のポリペプチドは、例えば、放射性標識をペプチドに組み入れることによって標識可能であり、そのペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用することができる）。
【００４１】
「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、プローブと結合した標識の存在を検出することによってプローブの存在が検出されるように、リンカーを介して共有的に、またはイオン結合、ファンデルワールス結合もしくは水素結合によって、標識と結合したもののことである。
【００４２】
「中程度にストリンジェントな条件」とは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「」分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９に記載された通りに特定することができ、これには、上記のものよりもストリンジェンシーの程度が低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用が含まれる。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む３７℃の溶液中での一晩のインキュベーションに続いて、フィルターを約３７℃〜５０℃の１×ＳＳＣ中で洗浄することである。プローブ長などの要因に合わせることが必要な場合に、温度、イオン強度などをいかにして調整するかを当業者は認識していると考えられる。
【００４３】
「修飾物質」「阻害物質」および「標的タンパク質の活性化物質」とは、標的タンパク質の活性に関するインビトロおよびインビボでのアッセイを用いて同定される修飾性分子を指す。このようなアッセイには、アクチン結合活性またはＰＩＰ２への結合などの結合活性が含まれる。試料またはアッセイを被験濃度および対照濃度の候補作用物質で処理する。対照濃度はゼロでもよい。２つの濃度間で標的タンパク質の活性に変化があれば、この変化は修飾物質が同定されたことを示す。活性の変化は上昇でも低下でもよく、好ましくは対照と比較して少なくとも２０％〜５０％、より好ましくは少なくとも５０％〜７５％、より好ましくは少なくとも７５％〜１００％、より好ましくは１５０％〜２００％の変化であり、最も好ましくは少なくとも２倍〜１０倍の変化である。さらに、変化によって結合特異性または基質の変化を示すこともできる。
【００４４】
「多コピープラスミド」とは、細胞内に１０コピーから３０コピーが存在するプラスミドを指す。
【００４５】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖型または二本鎖型のそれらの重合体を指す。特に限定する場合を除き、この用語は、参照核酸と同様の結合活性を有し、天然のヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸も含む。別に指示する場合を除き、個々の核酸配列には、保存的に改変されたその変種（例えば、縮重コドン置換物）および相補配列、ならびに明示的に示された配列も黙示的に含まれる。例えば、縮重コドン置換物は、１つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの３番目の位置が、混成塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を作製することによって得ることができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０）２６０５〜２６０８（１９８５）；Ｃａｓｓｏｌら、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に用いられる。
【００４６】
「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、１つまたは複数のタイプの化学結合、通常は水素結合形成によって通常起こる相補的塩基対合によって、相補配列を有する標的核酸と結合しうる核酸と定義される。本明細書で用いるプローブには、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）または修飾塩基が含まれうる。さらに、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、プローブ中の塩基をホスホジエステル結合以外の結合によって連結させてもよい。このため、プローブは例えば、構成要素の塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結されたペプチド核酸でもよい。ハイブリダイゼーション条件の厳密性に応じて、プローブが、プローブ配列と完全に相補的ではない標的配列とも結合しうることを当業者は理解すると考えられる。プローブは好ましくは同位体、発色団、発光団（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）、色素原によって直接的に標識する、または後にストレプトアビジン複合体が結合するビオチンなどによって間接的に標識する。プローブの有無をアッセイすることにより、選択した配列または部分配列の有無を検出することができる。
【００４７】
「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指して互換的に用いられる。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然のアミノ酸に対応する人工的な模倣化学物質であるアミノ酸重合体、さらには天然のアミノ酸重合体および非天然型のアミノ酸重合体に対して適用される。本明細書において、周知の三文字記号または命名委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によってアミノ酸を言及してもよい。同様にヌクレオチドも、一般的に認められた一文字コード、すなわち、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによって推奨されている一文字記号によって言及しうる。
【００４８】
「プロモーター」とは、核酸の転写を指令する一並びの核酸制御配列と定義される。本明細書で用いるプロモーターには、転写開始部位の付近にある必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にはＴＡＴＡボックス要素が含まれる。プロモーターは選択的には、転写開始部位から数千塩基対もの間を隔てて位置しうる遠位エンハンサーまたはレプレッサー要素も含む。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性をもつプロモーターのことである。「誘導性」プロモーターとは、環境または発生段階による調節を受けるプロモーターのことである。「機能的に結合した」という用語は、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指令するような、核酸発現制御配列（プロモーター、または一連の転写因子結合部位など）と第２の核酸配列との間の機能的つながりを指す。
【００４９】
抗体と「特異的（または選択的）に結合する」、または「特異的（または選択的）な免疫反応性がある」という用語は、タンパク質またはペプチドに言及する場合、タンパク質または他の生体物質の不均一集団内にそのタンパク質が存在することの決定因子となる結合反応を指す。すなわち、指定のイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は特定のタンパク質とバックグラウンドの少なくとも２倍で結合し、試料中に存在する他のタンパク質とは意味のある量としては実質的に結合しない。特異的結合部分は一般に、互いに少なくとも１０６Ｍ−１の親和性を有する。診断薬または治療薬に用いるのに好ましい抗体はしばしば、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１などの高い親和性を有する。このような条件下での抗体に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性の点から選択された抗体が必要と思われる。例えば、Ａ．フミガーツスプロフィリンに対する特異的な免疫反応性はあるが、Ａ．フミガーツスプロフィリンの多型変種、オルソログ、対立遺伝子および密接な関連性のある相同体を除く他のタンパク質に対する免疫反応性はない抗体のみを入手するために、配列番号：２にコードされたアミノ酸配列を有するＡ．フミガーツスプロフィリンに対して産生された抗体を選択することができる。この選択は、アフィニティークロマトグラフィーにより例えば線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）ｕｎｃ−１０４およびヒトＫｉｆ１Ａなどの分子と交差反応する抗体を取り除くことによって達成されうる。特定の抗体に対して特異的に免疫反応性である抗体の選択には、種々の形式のイムノアッセイを用いうる。例えば、あるタンパク質に対して免疫反応性である抗体の選択には、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に用いられる（特異的な免疫反応性の決定に用いうるイムノアッセイの形式および条件に関する説明については、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）を参照）。一般に、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルもしくはノイズの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０倍〜１００倍と考えられる。
【００５０】
「選択的に会合する」という用語は、核酸が上記に定義した別のものと「選択的にハイブリダイズする」能力、または抗体が上記に定義したタンパク質と「選択的に（または特異的に）結合する」能力を指す。
【００５１】
「被験組成物」（本明細書では「候補作用物質」および「被験化合物」および「被験作用物質」と互換的に用いられる）とは、１つまたは複数の細胞骨格成分の間の相互作用に対する影響をアッセイすることが求められる分子または組成物を指す。「被験組成物」とは、選択的には担体中にある、任意の分子または分子の混合物でありうる。
【００５２】
本明細書で用いる「治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」とは、ヒトおよび動物の疾患の両方に適用可能な、標的タンパク質をインビボで修飾しうると考えられる化合物を指す。細胞骨格系の修飾は、抗真菌剤および抗炎症剤を非制限的に含む、さまざまな状態において望ましいと考えられる。
【００５３】
「変種（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。個々の核酸配列に関して、保存的に改変された変種とは、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一な配列を指す。遺伝暗号の縮重性のために、任意のタンパク質は多数の機能的に同一な核酸によってコードされうる。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアラニンというアミノ酸をコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。このような核酸異形は「サイレント異形（ｓｉｌｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」であり、保存的に改変された異形の一種である。何らかのポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント異形についても述べている。当業者は、核酸内の各コドンを改変して機能的に同一な分子を作製しうることを認識していると考えられる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント異形は、記載する各配列に黙示的に含まれる。
【００５４】
本発明の標的タンパク質の定義には、野生型標的タンパク質のアミノ酸配列変種も含まれる。これらの変種は、置換変種、挿入変種または欠失変種という３つのクラスの１つまたは複数に分類される。これらの変種は通常、カセット式変異誘発もしくはＰＣＲ変異誘発、または変種をコードするＤＮＡを作製するための当技術分野で周知の他の技法を用いて、標的タンパク質をコードするＤＮＡ中でヌクレオチドの部位特異的変異誘発を行い、その後にＤＮＡを組換え細胞培養物において発現させることによって調製する。変種標的タンパク質の最大約１００アミノ酸残基〜１５０アミノ酸残基の断片を、確立された技法を用いるインビトロ合成によって調製してもよい。アミノ酸配列変種は、それらを標的タンパク質のアミノ酸配列の天然の対立遺伝子変異または種間変異とは隔てる特徴である、異形の所定の性質によって特徴づけられる。変種は一般に天然の類似体と同じ質の生体活性を示すが、特徴の変化した変種を選択することもできる。
【００５５】
アミノ酸置換は一般に単一残基のものであり、挿入は通常、約１アミノ酸〜約２０アミノ酸の程度のものと考えられるが、これよりかなり長い挿入も許容されうる。欠失は約１残基〜約２０残基の範囲であるが、場合によっては欠失がはるかに長くてもよい。
【００５６】
最終的な誘導体に到達するために、置換、欠失および挿入またはそれらの任意の組み合わせを用いてよい。一般に、分子の変質を最小限に抑えるために、これらの変化は少数のアミノ酸に対して行われる。しかし、ある種の状況では、より大規模な特徴も許容されると思われる。
【００５７】
以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換物であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、「タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」（１９８４）を参照のこと）。
【００５８】
ＩＩ． 標的タンパク質
本発明は、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする核酸を初めて提供する。本タンパク質はプロフィリンスーパーファミリーに属する。より詳細には、図２のＡ．フミガーツスプロフィリン配列は、分裂酵母（Ｓ． ｐｏｍｂｅ）プロフィリン；カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）プロフィリン；および出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロフィリンに対して、１２６アミノ酸にわたり、約３０％〜４０％の同一性を有する。
【００５９】
１つの局面において、Ａ．フミガーツスプロフィリンは、以下の機能的および構造的な特徴のうち少なくとも１つ、または好ましくは複数を有することによって定義される。機能的には、Ａ．フミガーツスプロフィリンはアクチンおよびＰＩＰ２との結合能を有すると考えられる。
【００６０】
本明細書で提供される新規ヌクレオチド配列は、Ａ．フミガーツスプロフィリンまたはその断片をコードする。このため、１つの局面において、本明細書で提供される核酸は、本明細書で提供される新規タンパク質によって定義される。本明細書で提供されるタンパク質は、以下の特徴のうち１つまたは複数を有するアミノ酸配列を含む：配列番号：２に対する配列同一性が７０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、より好ましくは９０％を上回る、より好ましくは９５％を上回る、または、もう１つの態様において、配列番号：２に対する配列同一性が９８％〜１００％である。上記のように、ヌクレオチドを配列番号：１という形で記載する場合には、配列同一性は同じ比率の可能性もあり、または遺伝暗号の縮重性のために幾分低い可能性もある。本発明には、配列番号：１またはその縮重形態からの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、２００個または３００個の連続したヌクレオチドを有する、図１に示したヌクレオチド配列（配列番号：１）の断片も含まれる。このような断片のいくつかは、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして用いることができる。文脈から異なることが明らかな場合を除き、図または配列中に示したヌクレオチド配列に対する言及は、示した配列、その完全な相補物または二重鎖となった２本の鎖も指す。野生型標的タンパク質のアミノ酸配列変種も標的タンパク質の定義の範囲に含まれる。
【００６１】
Ａ．フミガーツスプロフィリンヌクレオチド配列の一部は、Ａ．フミガーツスプロフィリンの多型変種、オルソログ、対立遺伝子および相同体を同定するために用いられうる。この同定は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下およびシークエンシングによってインビトロで行うことができ、または他のヌクレオチド配列との比較用のコンピュータシステムにて配列情報を用いることによって行うこともできる。配列比較は、以下に考察する配列比較アルゴリズムのいずれかを、好ましいアルゴリズムとしてＰＩＬＥＵＰを用いて行うことができる。
【００６２】
当業者には理解されると思われるが、標的タンパク質は、デノボ合成およびタンパク質をコードする核酸の発現の両方を含む、さまざまな方法で生産することができる。
【００６３】
本発明の標的タンパク質を、標的タンパク質と、抗タグ抗体が選択的に結合しうるエピトープを付与するタグポリペプチドとの融合物を含むキメラ分子が形成されるような方法で修飾してもよい。エピトープタグは一般に、標的タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に配置する。エピトープタグを付与することにより、標的タンパク質の容易な検出が可能になるほか、親和性精製による容易な精製も可能になる。さまざまなタグエピトープが当技術分野では周知である。その例には、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体である１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：２１５９を参照）；ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎｓら（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０を参照）；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３：５４７を参照）。その他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４を参照）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎｅら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２を参照）；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒ（１９９１）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１５１７３を参照）；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３９３を参照）。
【００６４】
本明細書で提供されるペプチドのいずれかの生体活性は、当技術分野で公知のアッセイによって日常的に確認されうる。１つの態様において、Ａ．フミガーツスプロフィリンの多型変種、対立遺伝子およびオルソログ、相同体を、当技術分野で公知のアクチンアッセイまたはＰＩＰ２アッセイを用いて確認する。
【００６５】
生体活性をもつＡ．フミガーツスプロフィリンが初めて単離されたことにより、このタンパク質の修飾物質をアッセイするための手段が提供される。生体活性をもつＡ．フミガーツスプロフィリンは、Ａ．フミガーツスプロフィリンまたはその断片に対する修飾物質を同定するために有用である。インビボアッセイおよびその使用も本明細書で提供される。Ａ．フミガーツスプロフィリンおよびその部分と結合する候補作用物質を同定する方法も本明細書で提供される。
【００６６】
Ａ．フミガーツスプロフィリンの部分または断片のいくつかは、図２に示した配列（配列番号：２）からの少なくとも７個、１０個、１５個、２０個、３５個、５０個、７５個、１００個、または１２５個の連続したアミノ酸を含む。いくつかの断片は、配列番号：２由来の１２５個、１００個、７５個、５０個または３５個未満の連続したアミノ酸を含む。例えば、例示的な断片には、１５個〜２０個のアミノ酸または３５個〜５０個のアミノ酸を有する断片が含まれる。このような断片をコードする核酸も本発明に含まれる。
【００６７】
本明細書でさらに説明するように、本明細書には、本明細書に記載の新規化合物を用いる非常にさまざまなアッセイ、治療法および診断法を提供する。本明細書で提供される使用および方法には、以下にさらに説明するように、インビトロ、インサイチューおよびインビトロの用途があり、医学、獣医学、農業および研究を基盤とする用途に用いることができる。
【００６８】
ＩＩＩ． Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする遺伝子の単離
Ａ． 一般的な組換えＤＮＡ法
本発明は、組換え遺伝学の分野の日常的な技法に依拠している。本発明における一般的な使用方法を開示している基本的な出典には、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版、１９８９）；クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）、「遺伝子の導入および発現：実験マニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９９０）；および「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が含まれる。
【００６９】
核酸の場合、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ＢＰ）のいずれかによってサイズを表す。これらは、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルでの電気泳動、配列が決定された核酸、または公表されたＤＮＡ配列から得られる推定値である。タンパク質の場合、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数によってサイズを表す。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列が決定されたタンパク質、導き出されたアミノ酸配列、または公表されたタンパク質配列から推定される。
【００７０】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルーセル（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ． ２２：１８５９〜１８６２（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホロアミダイドトリエステル法に従って、ファンデバンター（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：６１５９〜６１６８（１９８４）に記載された自動合成装置を用いて化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリーニア（Ｒｅａｎｉｅｒ）、Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． ２５５：１３７〜１４９（１９８３）に記載された未変性アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣによって行う。
【００７１】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、ウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、Ｇｅｎｅ １６：２１〜２６（１９８１）による二本鎖鋳型のシークエンシング用の連鎖停止法などを用いたクローニングの後に確認することができる。
【００７２】
Ｂ． Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードするヌクレオチド配列の単離のためのクローニング方法
一般的には、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする核酸配列および関連した核酸配列相同体は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングするか、またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅法を用いて単離する。または、Ａ．フミガーツスプロフィリン相同体を同じく認識して選択的に結合する、Ａ．フミガーツスプロフィリンに対して産生された抗血清または精製抗体を用いて、発現された相同体を免疫学的に検出することによって、Ａ．フミガーツスプロフィリンおよびＡ．フミガーツスプロフィリン相同体をクローニングするために、発現ライブラリーを用いることもできる。さらに、プライマーを用いる増幅法を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡからＡ．フミガーツスプロフィリンを増幅および単離することもできる。Ａ．フミガーツスプロフィリン相同体の増幅および単離のために、縮重プライマーを用いる増幅法を用いることもできる。プライマーを用いる増幅法を、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする核酸の単離のために用いることもできる。これらのプライマーを用いて、例えば数百ヌクレオチドのプローブを増幅することができ、続いてこれをライブラリーを完全長のＡ．フミガーツスプロフィリンに関してスクリーニングするために用いる。
【００７３】
他の種におけるＡ．フミガーツスプロフィリンの相同体をコードする遺伝子を同定するのに適したプライマーおよびプローブは、本明細書で提供される配列の比較によって作製する。上述のように、抗体を用いてＡ．フミガーツスプロフィリン相同体を同定することができる。例えば、Ａ．フミガーツスプロフィリンの保存性アクチン結合ドメインまたはタンパク質全体に対して作製した抗体は、Ａ．フミガーツスプロフィリン相同体の同定に有用である。
【００７４】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、選択したｍＲＮＡを、例えば、Ａ．フミガーツスプロフィリンのｍＲＮＡを豊富に含む供給源を選択する必要がある。ゲノムライブラリーは通常、例えば、改変λバクテリオファージまたは大腸菌プラスミド中に含められる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記）。ｃＤＮＡライブラリーをこのようなベクター中にλｇｔ１０、λｇｔ１１またはλＺＡＰとして含めてもよい。ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換し、二本鎖にした上で組換えベクター中に連結した上で、増殖、スクリーニングおよびクローニングの目的で組換え宿主に導入する。ｃＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニングのための方法は周知である（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ ２５：２６３〜２６９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記；Ａｕｓｕｂｅｌら、前記を参照）。
【００７５】
Ａ．フミガーツスプロフィリン核酸およびその相同体を単離する別の方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型の増幅とを組み合わせる（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；「ＰＣＲのプロトコール：方法および応用の手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照）。ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応などの方法を用いて、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、Ａ．フミガーツスプロフィリンの核酸配列を直接増幅することができる。縮重オリゴヌクレオチドは、本明細書で提供される配列を用いてＡ．フミガーツスプロフィリン相同体が増幅されるように設計可能である。制限酵素部位をプライマーに組み入れることができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法は、例えば、発現させようとするタンパク質をコードする核酸配列のクローニングのため、生理的試料中のＡ．フミガーツスプロフィリンをコードするｍＲＮＡの存在の検出用のプローブとして用いるための核酸を作製するため、核酸配列の決定のため、または他の目的のためにも有用と思われる。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子をアガロースゲルから精製し、適したベクター中にクローニングしうる。
【００７６】
Ａ．フミガーツスプロフィリンの遺伝子発現を、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロット法、ドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、定量的ＰＣＲなどの当技術分野で公知の技法によって分析することもできる。
【００７７】
合成オリゴヌクレオチドは、プローブとしての使用またはタンパク質の発現を目的として組換えＡ．フミガーツスプロフィリン遺伝子を構築するために用いることができる。この方法は、遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の双方を表す、通常長さ４０ｂｐ〜１２０ｂｐの一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて行われる。続いて、これらのＤＮＡ断片のアニーリング、連結およびクローニングを行う。または、Ａ．フミガーツスプロフィリン遺伝子の特定の部分配列を増幅するための正確なプライマーを用いて増幅法を行うこともできる。続いて、その特定の部分配列を発現ベクター中に連結する。
【００７８】
Ａ．フミガーツスプロフィリンの遺伝子は一般に、複製および／または発現のために原核細胞または真核細胞への形質転換導入を行う前に、中間ベクター中にクローニングする。これらの中間ベクターは原核生物ベクターまたはシャトルベクターであることが一般的である。
【００７９】
Ｃ． 原核生物および真核生物における発現
Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードするｃＤＮＡなどの、クローニングした遺伝子の高レベルの発現を得るためには、転写を指令する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーターを含み、さらにタンパク質をコードする核酸の場合には翻訳開始のためのリボソーム結合部位も含む発現ベクターを構築することが重要である。適した細菌プロモーターは当技術分野で周知であり、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らおよびアウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らに記載されている。Ａ．フミガーツスプロフィリンタンパク質の発現のための細菌発現系としては、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌を用いうる（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ ２２：２２９〜２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３〜５４５（１９８３）。このような発現系のためのキットが市販されている。真核生物発現系は当技術分野で周知であり、市販もされている。
【００８０】
異種核酸の発現を指令するために用いるプロモーターは、個々の用途に応じて異なる。プロモーターは好ましくは、異種転写開始部位に対して、自然下の状況における転写開始部位との距離とほぼ同じ距離を隔てて位置する。しかし、当技術分野で知られている通り、この距離はプロモーター機能を損なわずにある程度変えることが可能である。
【００８１】
発現ベクターは、プロモーターに加えて、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする核酸の宿主細胞における発現のために必要なすべての追加的な要素を含む転写単位または発現カセットを含むことが一般的である。このため、典型的な発現カセットは、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする核酸配列と機能的に結合したプロモーター、および、転写物の効率的なポリアデニル化のために必要なシグナル、リボソーム結合部位ならびに翻訳終結部位を含む。一般的には、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする核酸配列を、コードされるタンパク質のトランスフェクト細胞による分泌を促進するための切断性シグナルペプチド配列と結合させてもよい。このようなシグナルペプチドには特に、組織プラスミノーゲン活性化物質、インスリンおよび神経成長因子、ならびにオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼若ホルモンエステラーゼに由来するシグナルペプチドが含まれる。カセットのその他の要素としては、エンハンサーのほか、ゲノムＤＮＡを構造遺伝子として用いる場合には機能的なスプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロンが含まれうる。
【００８２】
発現カセットは、プロモーター配列に加えて、効率的な終結がなされるように、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含む必要がある。終結領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から入手してもよく、異なる遺伝子から入手してもよい。
【００８３】
遺伝情報を細胞内に運ぶためにどのような発現ベクターを用いるかは特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に用いられる任意の従来のベクターを用いてよい。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２をベースとするプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系が含まれる。好都合な分離方法が得られるように、ｃ−ｍｙｃまたはヒスチジンタグなどのエピトープタグを組換えタンパク質に付加することもできる。
【００８４】
真核生物発現ベクターには、ＳＶ４０ベクター、サイトメガロウイルスベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン−バーウイルス由来のベクターなどの、真核生物ウイルス由来の調節配列を含む発現ベクターが一般に用いられる。真核生物ベクターのその他の例には、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効なことが示されている他のプロモーターの指令下でタンパク質の発現が可能となる任意の他のベクターが含まれる。
【００８５】
発現系の中には、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、遺伝子増幅をもたらすマーカーを備えたものもある。または、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指令下にあるＡ．フミガーツスプロフィリンをコードする配列を有する、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターなどを用いる、遺伝子増幅を用いない高収率発現系も適している。
【００８６】
発現ベクターに一般に含まれる要素には、大腸菌内で作用するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能とする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能とするプラスミドの非必須領域における一意的な制限部位も含まれる。どの抗生物質耐性遺伝子を選択するかは特に重要ではなく、当技術分野で公知の多くの耐性遺伝子のうちの任意のものが適する。選択的には、真核細胞におけるＤＮＡの複製と干渉しないように、必要に応じて原核生物配列を選択する。
【００８７】
標準的なトランスフェクション法を用いて、大量のＡ．フミガーツスプロフィリンタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞系を作製し、続いて標準的な技法を用いて精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１７６１９〜１７６２２（１９８９）；「タンパク質精製の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照）。
【００８８】
真核細胞および原核細胞の形質転換は標準的な技法に従って行う（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ． Ｂａｃｔ． １３２：３４９〜３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７〜３６２（Ｗｕら編、１９８３）を参照）。外来性ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手法のうち任意のものを用いうる。これらには、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム、微量注入、プラズマベクター（ｐｌａｓｍａ ｖｅｃｔｏｒ）、ウイルスベクターの使用、および、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための周知の他の方法のうち任意のものを用いることが含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）。唯一必要なのは、用いる具体的な遺伝子工学手順が、Ａ．フミガーツスプロフィリンを発現しうる宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を首尾良く導入できるという点のみである。
【００８９】
発現ベクターを細胞に導入した後に、Ａ．フミガーツスプロフィリンの発現を促す条件下でトランスフェクト細胞を培養し、以下に明記する標準的な技法を用いて培養物からＡ．フミガーツスプロフィリンを収集する。
【００９０】
ＩＶ． Ａ．フミガーツスプロフィリンポリペプチドの精製
天然型および組換え型のＡ．フミガーツスプロフィリンポリペプチドはいずれも、機能アッセイに用いるために精製することができる。１つの好ましい態様において、アッセイに用いるための標的タンパク質を精製して、実質的に純粋な試料を得ることができる。
【００９１】
標的タンパク質は、どのような他の成分が試料中に存在するかに応じて、当業者に公知のさまざまな方法によって単離または精製しうる。標準的な精製法には、電気泳動法、分子的手法、免疫学的方法、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング、硫酸アンモニウムなどの物質による選択的沈殿などが含まれる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、「タンパク質精製：原理および実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前記；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照）。例えば、標的タンパク質を標準的な抗標的抗体カラムを用いて精製することができる。限外濾過およびダイアフィルトレーション法を、タンパク質濃縮と組み合わせることも有用である。好ましい精製方法は、ポリヒスチジンタグタンパク質と組み合わせたＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）の使用である。
【００９２】
発現されたタンパク質は、精製された生化学的活性をもつタンパク質を得るための標準的なクロマトグラフィー手順によって精製することができる。本明細書で提供されるペプチドのいずれかの活性は、当技術分野で公知のアッセイによって日常的に確認されうる。
【００９３】
Ａ． 組換え細菌からのＡ．フミガーツスプロフィリンの精製
形質転換を施した大量の細菌細胞により、一般的にはプロモーター誘導後に組換えタンパク質を発現させる；ただし、発現は構成的でもよい。ＩＰＴＧによるプロモーター誘導は、好ましい発現方法である。細菌は当技術分野における標準的な手順に従って増殖させる。タンパク質の単離には新鮮細胞または凍結細胞を用いる。
【００９４】
または、Ａ．フミガーツスプロフィリンを細菌の周辺質から精製することも可能である。細菌の可溶化を行った後に、Ａ．フミガーツスプロフィリンが細菌の周辺質に輸出された時点で、細菌の周辺質画分を低温浸透圧ショック、さらに当技術分野で公知の他の方法によって単離することができる。周辺質から組換えタンパク質を単離するためには、細菌細胞に遠心分離処理を行ってペレット化する。このペレットを２０％ショ糖を含む緩衝液中に再懸濁する。細胞を可溶化するためには、細菌を遠心分離し、氷冷した５ｍＭ ＭｇＳＯ４中にペレットを再懸濁して、氷浴中に約１０分間おく。この細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントして回収する。上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に公知の標準的な分離法によって宿主タンパク質から分離することができる。
【００９５】
Ａ．フミガーツスプロフィリンに好適なその他の精製方式は、その全体がすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられている、１９９９年４月２０日に出願された米国特許出願第０９／２９５，６１２号に概要が示されている方法に基づきうる。
【００９６】
Ｂ． Ａ．フミガーツスプロフィリンポリペプチドを精製するための標準的なタンパク質分離法
溶解性分画
特にタンパク質混合物が複合体である場合には、しばしば最初の段階として、最初に塩分画を行うことにより、不要な宿主細胞タンパク質（または細胞培養液に由来するタンパク質）の多くを関心対象の組換えタンパク質から分離しうる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減らすことによってタンパク質を沈殿させる。そこでタンパク質は溶解性の点から沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。一般的なプロトコールでは、タンパク質溶液に硫酸アンモニウム飽和溶液を添加し、その結果、硫酸アンモニウム濃度が２０％〜３０％となるようにする。この濃度で最も疎水性の高いタンパク質が沈殿すると考えられる。次に沈殿物を廃棄し（関心対象のタンパク質が疎水性でない場合）、硫酸アンモニウムを上清に添加し、関心対象のタンパク質が沈殿することが公知である濃度にする。続いて、沈殿物を緩衝液に溶解し、必要であれば過剰な塩を透析または透析濾過によって除去する。低温エタノール沈殿法などの、タンパク質の溶解性に依拠するその他の方法も当業者に知られており、複合タンパク質混合物の分画に用いることができる。
【００９７】
サイズの差に基づく濾過（Ｓｉｚｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
Ａ．フミガーツスプロフィリンの分子量を利用し、種々の孔径の膜（例えば、Ａｍｉｃｏｎ社またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の膜）を通過させる限外濾過を用いて、それよりもサイズが大きいまたは小さいタンパク質からそれを単離することができる。第１の段階として、分子量カットオフ値が関心対象のタンパク質の分子量よりも低い孔径の膜を通してタンパク質混合物の限外濾過を行う。続いて、限外濾過後の保持物質に、分子量カットオフ値が関心対象のタンパク質の分子量よりも高い膜に対する限外濾過を行う。組換えタンパク質はこの膜を通過して濾液に入ると考えられる。続いて、濾液に以下に述べる通りのクロマトグラフィーを行うことができる。
【００９８】
カラムクロマトグラフィー
Ａ．フミガーツスプロフィリンを、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性および異種分子に対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体をカラム基質に結合させて、タンパク質の免疫精製を行うこともできる。これらの方法はすべて当技術分野で周知である。クロマトグラフィー法を任意の規模で、しかもさまざまな製造者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）による装置を用いて行えることは、当業者には明らかであると考えられる。
【００９９】
Ｖ． Ａ．フミガーツスプロフィリンの免疫学的検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いたＡ．フミガーツスプロフィリン遺伝子および遺伝子発現の検出のほかに、イムノアッセイを用いてＡ．フミガーツスプロフィリンを検出することも可能である。イムノアッセイを用いて、Ａ．フミガーツスプロフィリンを定性的または定量的に分析することができる。適用可能な技術に関する一般的な概要は、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８８）に記載されている。
【０１００】
Ａ． Ａ．フミガーツスプロフィリンに対する抗体
Ａ．フミガーツスプロフィリンと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製方法は当業者に知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、「免疫学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記；Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理および実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（第２版、１９８６）；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５）を参照）。このような技法には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製、さらにはウサギまたはマウスの免疫処置によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６（１９８９）を参照）。
【０１０１】
ヒト化型のマウス抗体は、組換えＤＮＡ技術により、非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト定常領域と結合させることによって作製しうる。クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６、１００２９〜１００３３（１９８９）および国際公開公報第９０／０７８６１号（すべての目的に関して、参照として組み入れられる）を参照されたい。ヒト抗体はファージディスプレイ法を用いて入手することができる。例えば、ダワー（Ｄｏｗｅｒ）ら、国際公開公報第９１／１７２７１号；マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、国際公開公報第９２／０１０４７号を参照されたい。これらの方法では、その構成要素が外面に異なる抗体を提示する、ファージのライブラリーを作製する。抗体は通常、Ｆｖ断片またはＦａｂ断片として提示される。望ましい特異性を備えた抗体を提示しているファージを、Ａ．フミガーツスプロフィリンまたはその断片に対する親和性の高さによって選択する。Ａ．フミガーツスプロフィリンに対するヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの区域をコードする導入遺伝子および不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から産生させることもできる。例えば、ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら、国際公開公報第９３／１２２２７号（１９９３）；クチャラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）、国際公開公報第９１／１０７４１号（１９９１）（それぞれその全体がすべての目的に関して参照として組み入れられる）。ヒト抗体は、競合的結合実験または他の方法により、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように選択することができる。このような抗体は、マウス抗体と同じ有用な機能的特性を有している可能性が特に高い。ヒトポリクローナル抗体を、免疫原物質による免疫処置を受けたヒトから採取した血清の形態として供給することもできる。選択的には、Ａ．フミガーツスプロフィリンを親和性試薬として用いる親和性精製により、このようなポリクローナル抗体を濃縮することができる。
【０１０２】
Ａ．フミガーツスプロフィリンを含むさまざまな免疫原を、Ａ．フミガーツスプロフィリンと特異的に反応する抗体の作製に用いうる。例えば、組換えＡ．フミガーツスプロフィリンまたはその抗原性断片を、本明細書に記載した通りに単離する。組換えタンパク質を上記の通りに真核細胞または原核細胞で発現させ、上に一般的に述べた通りに精製することができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作製のために好ましい免疫原である。または、本明細書に開示した配列に由来し、担体タンパク質と結合させた合成ペプチドを免疫原として用いることもできる。天然のタンパク質を純粋または不純な状態で用いてもよい。続いて、抗体を産生しうる動物の体内にその生成物を注入する。タンパク質を測定するためのイムノアッセイに後で用いるためには、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれを作製してもよい。
【０１０３】
ポリクローナル抗体の作製方法は当業者に知られている。フロイントアジュバントなどの標準的なアジュバント、および標準的な免疫処置プロトコールを用いて、近交系マウス（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギにタンパク質による免疫処置を行う。検査採血を行い、Ａ．フミガーツスプロフィリンに対する反応性の力価を測定することにより、免疫原調製物に対する動物の免疫応答を観測する。免疫原に対して適切な高い力価を持つ抗体が得られた時点で、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。望ましいならば、タンパク質に反応する抗体を濃縮するために抗血清をさらに分画することもできる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記を参照）。
【０１０４】
モノクローナル抗体は、当業者に周知の種々の技法によって入手しうる。簡潔に述べると、望ましい抗原による免疫処置を受けた動物から得た脾細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化させる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１〜５１９（１９７６）を参照）。代替的な不死化の方法には、エプスタイン−バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じたクローンを抗原に対する望ましい特異性および親和性に関してスクリーニングし、このような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内に注射することを含む種々の技法によって高めることもできる。または、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）に概要が示された一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合性断片をコードするＤＮＡ配列を単離することもできる。
【０１０５】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ、例えば、固体支持体上に固定した免疫原を用いる固相イムノアッセイにおいて免疫原に対する滴定を行う。一般には、力価が１０４またはそれ以上であるポリクローナル抗血清を選択し、競合結合イムノアッセイを用いて、非Ａ．フミガーツスプロフィリンタンパク質または他の生物由来の他の相同タンパク質（例えば、真菌性または脊椎動物性のプロフィリン）との交差反応性を調べる。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は通常、少なくとも約０．１ｍＭ、より一般的には少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約０．１μＭまたはそれ未満（ｏｒ ｂｅｔｔｅｒ）、最も好ましくは０．０１μＭまたはそれ未満（ｏｒ ｂｅｔｔｅｒ）のＫｄで結合すると考えられる。
【０１０６】
Ａ．フミガーツスプロフィリン特異的抗体が得られれば、種々のイムノアッセイ法によってＡ．フミガーツスプロフィリンを検出することができる。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の概説については、「基礎免疫学および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイは、「酵素イムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；ならびにハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）前記において、詳細に概説された複数の方式のうち任意の形式で行いうる。
【０１０７】
Ｂ． 結合アッセイ
抗体は、治療のために、または上記の配列同一性の特徴を有するＡ．フミガーツスプロフィリンの存在を同定するために用いることができる。さらに、以下にさらに述べるように、抗体とＡ．フミガーツスプロフィリンとの相互作用に対する修飾物質を同定するために抗体を用いることもできる。以下の考察は結合アッセイの用途における抗体の使用を対象としているが、「非競合」または「競合」アッセイに関して記載したものと同じ一般的なアッセイ形式を、微小管などのＡ．フミガーツスプロフィリンと結合する任意の化合物、または米国特許出願第６０／０７０，７７２号に記載された化合物とともに用いうることは理解されている。
【０１０８】
１つの好ましい態様において、周知のさまざまな免疫学的結合アッセイのうち任意のものを用いてＡ．フミガーツスプロフィリンの検出および／または定量化を行う（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号参照）。一般的なイムノアッセイの概説については、「細胞生物学における方法 第３７巻：細胞生物学における抗体（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ａｓａｉ編、１９９３）；「基礎免疫学および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照されたい。免疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）には一般に、選択したタンパク質または抗原（この場合にはＡ．フミガーツスプロフィリンまたはその抗原性部分配列）と特異的に結合する抗体を用いる。抗体（例えば、抗Ａ．フミガーツスプロフィリン）を、当業者に周知の数多くの手段および上記の手段のうち任意のものを用いて作製してもよい。
【０１０９】
イムノアッセイには、抗体および抗原によって形成された複合体と特異的に結合し、それを標識する標識剤もしばしば用いられる。標識剤はそれ自体が抗体／抗原複合体を含む部分の１つであってもよい。したがって、標識剤は、標識されたＡ．フミガーツスプロフィリンポリペプチドまたは標識された抗Ａ．フミガーツスプロフィリン抗体であってもよい。または、標識剤が、抗体／Ａ．フミガーツスプロフィリンの複合体と特異的に結合する二次抗体などの第３の部分であってもよい（二次抗体は、第１の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的なことが一般的である）。免疫グロブリンの定常領域と特異的に結合しうる、プロテインＡまたはプロテインＧなどの他のタンパク質を標識剤としても用いてもよい。これらのタンパク質は、さまざまな種に由来する免疫グロブリン定常領域に対して強い非免疫原性反応性を示す（概論については、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１１：１４０１〜１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：２５８９〜２５４２（１９８５）を参照）。ストレプトアビジンなどの別の分子が特異的に結合しうるビオチンなどの検出可能な部分によって標識剤を修飾することができる。当業者にはさまざまな検出可能部分が周知である。
【０１１０】
アッセイ全体を通じて、試薬の各々の組み合わせを用いた後には、インキュベーションおよび／または洗浄の段階が必要と思われる。インキュベーションの段階は、約５秒間〜数時間、選択的には約５分間から約２４時間の範囲でありうる。しかし、インキュベーション時間はアッセイ形式、抗原、溶液の容積、濃度などに依存すると考えられる。通常、アッセイは室温で行うが、４℃〜４０℃などの一定範囲の温度で行うこともできる。
【０１１１】
非競合アッセイ形式
試料中のＡ．フミガーツスプロフィリンを検出するためのイムノアッセイは競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイは、抗原の量を直接測定するアッセイである。例えば、１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、抗Ａ．フミガーツスプロフィリン抗体を、それを固定化するための固体基質に対して直接結合させることができる。これらの固定化された抗体は被験試料中に存在するＡ．フミガーツスプロフィリンを捕捉する。このようにして固定化したＡ．フミガーツスプロフィリンに対して、次に、標識を有する第２のＡ．フミガーツスプロフィリン抗体などの標識剤を結合させる。または、第２の抗体には標識がなく、その代わりに、第２の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な第３の抗体をそれと結合させてもよい。第２または第３の抗体には一般に、検出可能な部分が得られるように、ストレプトアビジンなどの別の分子と特異的に結合するビオチンなどの検出可能な部分による修飾を行う。
【０１１２】
競合アッセイ形式
競合アッセイでは、試料中に存在する未知Ａ．フミガーツスプロフィリンによって抗Ａ．フミガーツスプロフィリン抗体から解離した（競合により離れた）、添加した（外因性の）既知のＡ．フミガーツスプロフィリンの量を測定することにより、試料中に存在するＡ．フミガーツスプロフィリンの量を間接的に測定する。１つの競合アッセイでは、既知の量のＡ．フミガーツスプロフィリンを試料に添加し、続いて試料を、Ａ．フミガーツスプロフィリンと特異的に結合する抗体と接触させる。抗体と結合した外因性Ａ．フミガーツスプロフィリンの量は、試料中に存在するＡ．フミガーツスプロフィリンの濃度と反比例する。１つの特に好ましい態様において、抗体を固体基質上に固定化する。抗体と結合したＡ．フミガーツスプロフィリンの量は、Ａ．フミガーツスプロフィリン／抗体の複合体中に存在するＡ．フミガーツスプロフィリンの量を測定することにより、または、複合体を形成していない残ったタンパク質の量を測定することによって決定しうる。標識したＡ．フミガーツスプロフィリン分子を用いることによってＡ．フミガーツスプロフィリンの量を検出してもよい。
【０１１３】
交差反応性の決定
競合結合形式のイムノアッセイを、交差反応性の評価に用いることもできる。例えば、配列番号：２によって少なくとも一部がコードされるタンパク質を固体支持体に対して固定化することができる。固定化された抗原に対する抗血清の結合と競合するタンパク質（例えば、その他の真菌性および脊椎動物性のプロフィリン）をアッセイに添加する。添加したタンパク質が、抗血清の固定されたタンパク質との結合と競合する能力を、配列番号：２によってコードされるＡ．フミガーツスプロフィリンがそれ自体と競合する能力と比較する。上記のタンパク質に関する交差反応性の比率を、標準的な計算を用いて算出する。上に挙げた添加したタンパク質のそれぞれとの交差反応性が１０％未満であるような抗血清を選択してプールする。交差反応性のある抗体は、選択的には、添加した検討対象のタンパク質、例えば近縁性の低い相同体などによる免疫吸着により、プールした抗血清から除去される。
【０１１４】
免疫吸着がなされてプールされた抗血清は次に、本発明のタンパク質と思われる第２のタンパク質を、免疫原タンパク質（すなわち、配列番号：２のＡ．フミガーツスプロフィリン）と比較するために、上記の競合結合イムノアッセイに用いられる。この比較を行うためには、２つのタンパク質を広範囲の濃度にわたって互いにアッセイし、抗血清と固定されたタンパク質との結合の５０％を阻害するのに必要な各タンパク質の量を決定する。結合の５０％を阻害するために必要な第２のタンパク質の量が、結合の５０％を阻害するために必要な配列番号：２によってコードされるタンパク質の量の１０倍未満であれば、第２のタンパク質はＡ．フミガーツスプロフィリン免疫原に対して産生されたポリクローナル抗体と特異的に結合するという。
【０１１５】
その他のアッセイ形式
ウエスタンブロット（イムノブロット）分析は、試料中のＡ．フミガーツスプロフィリンの存在を検出および定量化するために用いられる。この技法は一般に、試料のタンパク質を分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離し、分離されたタンパク質を適した固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化ナイロンフィルター）に移行させた上で、Ａ．フミガーツスプロフィリンと特異的に結合する抗体とともに試料をインキュベートする段階を含む。抗Ａ．フミガーツスプロフィリン抗体は、固体支持体上のＡ．フミガーツスプロフィリンと特異的に結合する。これらの抗体を直接標識してもよく、または、抗Ａ．フミガーツスプロフィリン抗体と特異的に結合する標識抗体（例えば、標識したヒツジ抗マウス抗体）を用いて後に検出してもよい。
【０１１６】
その他のアッセイ形式には、特定の分子（例えば、抗体）と結合し、封入された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いるリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が含まれる。続いて、放出された化学物質を標準的な技法に従って検出する（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒｏｄ． Ｒｅｖ． ５：３４〜４１（１９８６）を参照）。
【０１１７】
非特異的結合の減少
当業者は、イムノアッセイにおける非特異的結合をできるだけ減らすことが往々にして望ましいことを理解すると考えられる。特に、固体基質上に固定された抗原または抗体をアッセイに用いる場合には、基質に対する非特異的結合の量をできるだけ減らすことが望ましい。このような非特異的結合を減らす手段は当業者には周知である。この技法には一般に、基質をタンパク質性組成物でコーティングすることが含まれる。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳およびゼラチンなどのタンパク質組成物が広く用いられるが、脱脂粉乳が最も好ましい。
【０１１８】
標識
アッセイに用いる個々の標識または検出可能基は、アッセイに用いる抗体の特異的結合にそれが大きな妨げとならない限り、本発明の特に重要な面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質でありうる。このような検出可能な標識はイムノアッセイの分野では十分に開発されており、通常、このような方法に有用なほとんどすべての標識を本発明に適用することができる。すなわち、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電子的、工学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡに一般に用いられる他のもの）、およびコロイド金もしくは着色ガラスもしくはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色定量用標識、または質量分析法、ＮＭＲ分光法もしくは当技術分野で公知の他の分析手段によって検出可能な他の標識が含まれる。標識を、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイの望ましい構成要素に直接的または間接的に結合させてもよい。以上に示した通り、非常にさまざまな標識を用いることができ、標識の選択は必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要条件、用いうる装置、および廃棄への対応に依存する。
【０１１９】
非放射性標識は間接的な手段によって結合されることが多い。一般的には、リガンド分子（例えば、ビオチン）を分子と共有結合させる。続いてリガンドを、内在的に検出可能であるか、検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物などのシグナル系と共有結合した別の分子（例えば、ストレプトアビジン）と結合させる。リガンドおよびその標的は、Ａ．フミガーツスプロフィリンを認識する抗体、または抗Ａ．フミガーツスプロフィリンを認識する二次抗体との任意の適した組み合わせで用いることができる。
【０１２０】
酵素または蛍光団との結合などにより、分子をシグナル生成化合物と直接結合させることもできる。標識として関心がもたれる酵素は主として加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼであると考えられる。蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが含まれる。用いうるさまざまな標識系またはシグナル生成系の概説については、例えば、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【０１２１】
標識の検出手段は当業者に周知である。すなわち、例えば、標識が放射性標識であれば、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーの場合の写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識であれば、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、その結果生じた蛍光を検出することによってそれを検出しうる。蛍光は、肉眼的に、写真フィルムにより、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出装置の使用によって検出しうる。同様に、酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供し、その結果得られた反応生成物を検出することにより検出することができる。さらに、単純な比色定量標識は、標識に伴う色を単に観察することによって検出しうる。すなわち、種々の試験紙アッセイにおいて、結合した金はしばしば薄赤色を呈し、一方、種々の結合ビーズはビーズの色調を呈する。
【０１２２】
いくつかのアッセイ形式には、標識成分を用いる必要がない。例えば、凝集アッセイを用いて標識抗体の存在を検出することができる。この場合には、標的抗体を含む試料により、抗原をコーティングした粒子を凝集させる。この形式では、どの成分も標識する必要はなく、単純な肉眼検査によって標的抗体の存在を検出する。
【０１２３】
ＶＩ． 標的タンパク質の修飾物質に関するアッセイ
本発明は、標的タンパク質と結合する、または標的タンパク質の結合特性もしくは生体活性の修飾物質として作用する、候補作用物質を同定するための方法を提供する。１つの態様において、本方法は同時に複数回行われる。例えば、本方法を、マルチウェルスクリーニングプレート内の複数のアッセイ混合物に対して同時に行うことができる。したがって、１つの局面において、本発明は、高スループットスクリーニングシステムを提供する。
【０１２４】
より詳細には、本発明の方法は、抗真菌活性を有し、そのため臨床開発向けに候補化合物を完成させる出発点となる、プロフィリンの阻害物質を同定するために用いることができる。これらの方法は、インビトロで細菌に発現させたアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）のプロフィリンに対する生化学的阻害を示し、ヒトプロフィリンに対するカウンタースクリーニングがなされた阻害物質を同定するために用いることができる。１つの特に好ましい態様において、本方法はさらに、哺乳動物細胞に対する関心対象の化合物の毒性を評価する段階も含む。
【０１２５】
アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のＥＳＴの断片を増幅した後にアスペルギルス・フミガーツスのｃＤＮＡライブラリーを低ストリンジェンシーでスクリーニングすることにより、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする遺伝子をクローニングした。このタンパク質を大腸菌で発現させ、均質になるまで精製した。この方法を用いて、培養液１リットル当たり数十ミリグラム〜数百ミリグラムの精製タンパク質を得ることができる。このタンパク質は、他の生物から単離された相同体で以前に認められた生化学活性を示した。カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）のタンパク質は、公開されている配列情報を用いて各々の遺伝子をクローニングし、適切なプライマーを設計してＰＣＲを行い、クローニングしたこれらの遺伝子を上記の通りに発現させることによって入手した。カンジダ・アルビカンスのプロフィリンを、Ａ．フミガーツスプロフィリンに関して述べたように均質になるまで精製する。例えば、すべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第９７／３１１０４号を参照されたい。
【０１２６】
Ａ．フミガーツスプロフィリンおよび他のプロフィリンとアクチンとの相互作用に関する、蛍光を検出手段として用いる３８４穴プレートでのアッセイが開発されている。このアッセイにはピレン標識アクチンを用いる（Ｐｏｌｌａｒｄ（１９８４）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９９：７６９〜７７７）。ピレン−アクチンが集合すると蛍光の量子収量が２５倍に増加する（図３）。この極めて強いシグナルを、プロフィリンの修飾物質に関するアッセイに利用することができる。高スループットスクリーニングに必要な量を精製できることからニワトリ骨格アクチンを用いたが、これは真菌アクチンとのアミノ酸配列同一性が９０％であり、真菌アクチンと集合して共重合体を生じうる。ピレン標識した骨格アクチンを調製し、重合特性ならびに真菌プロフィリンとの相互作用に関して調べた。
【０１２７】
アクチンの集合動態をプロフィリンの存在下および非存在下でモニタリングすることができる。アクチンの集合は３つの相として進行する。誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）にはアクチン単量体３個から種子（ｓｅｅｄ）が形成される。これに続く伸長期にはフィラメントが種子から伸長する。最後の定常状態では重合体濃度は一定であるが、フィラメントはトレッドミル現象を示す。プロフィリンと結合したアクチンは既存のアクチンフィラメントの反矢じり端を伸長させるが、プロフィリンはフィラメントの新たな核形成を極めて強く阻害する（Ｐｏｌｌａｒｄら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３：６６３１〜６６４１）。図３は、３８４穴プレートアッセイにおけるＡ．フミガーツスプロフィリンによるピレン−アクチン核形成の阻害を示す。プロフィリンのアクチンとの相互作用に対する阻害物質は、アクチン核形成のこの阻害を抑制し、理想的にはプロフィリンの非存在下で認められるレベルに近いレベルまでピレン蛍光を著しく増加させるはずと考えられる。
【０１２８】
したがって、本発明は、プロフィリンのアクチンとの相互作用を阻害または修飾する低分子の同定を目的とする高スループット法を提供する。プロフィリンに関する生化学アッセイはいくつか存在する（その多くはこのタンパク質の重要なインビボ機能を評価するものである）（Ｋｒｅｉｓ， ＴおよびＶａｌｅ， Ｒ（編）（１９９９）「細胞骨格タンパク質およびモータータンパク質に関する手引き（Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。例えば、エテノ−ＡＴＰの蛍光を用いて、プロフィリンによるアクチンのヌクレオチド交換の増強を阻害する化合物をスクリーニングすることができるが、遺伝学的な証拠から、この活性はインビボで極めて重要である可能性が示唆されている（Ｗｏｌｖｅｎら、２０００）。
【０１２９】
Ｃ． 候補作用物質
候補作用物質にはさまざまな化学的物質群（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌａｓｓｅｓ）が含まれるが、これは典型的には有機分子であり、好ましくは分子量が１００ダルトンを上回り、約２，５００ダルトン未満である有機低分子化合物である。候補作用物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含むことが一般的であり、好ましくは少なくとも２つの化学的官能基を含む。候補作用物質はしばしば、上記の官能基の１つまたは複数が置換された環状炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。候補作用物質は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体またはそれらの組み合わせを含む生体分子の中にも見いだされる。特に好ましいものはペプチドである。
【０１３０】
候補作用物質は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、非常にさまざまな源から得られる。１つの好ましい態様において、候補作用物質は有機化学部分であり、その多岐にわたるものが文献中に記載されている。段階的な様式で合成可能な多くのタイプの化合物に関してコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。このような化合物には、ポリペプチド、タンパク質、核酸、βターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマー性Ｎ置換型グリシンおよびオリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅ）が含まれる。化合物の大規模なコンビナトリアルライブラリーは、アフィマックス社（Ａｆｆｙｍａｘ）による国際公開公報第９５／１２６０８号、アフィマックス社（Ａｆｆｙｍａｘ）による国際公開公報第９３／０６１２１号、コロンビア大学（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）による国際公開公報第９４／０８０５１、ファーマコペイア社（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）による国際公開公報第９５／３５５０３号、およびスクリップス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）による国際公開公報第９５／３０６４２号（それぞれその全体がすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる）に記載された、コード化合成ライブラリー（ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（ＥＳＬ）法によって構築することができる。ペプチドライブラリーをファージディスプレイ法によって作製することもできる。例えば、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）、国際公開公報第９１／１８９８０号を参照されたい。スクリーニングを行う化合物を、例えば、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＣＩ）の天然物貯蔵所（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＮＣＩの公開合成化合物コレクション（Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＮＣＩの治療薬開発プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）などを含む、国営または民間の供給元から入手することもできる。スクリーニングを行う化合物を、例えば、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＣＩ）の天然物貯蔵所（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＮＣＩの公開合成化合物コレクション（Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＮＣＩの治療薬開発プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）などを含む、国営または民間の供給元から入手することもできる。
【０１３１】
ＶＩＩ． 用途
本明細書に提供する組成物による抑制または治療が可能な真菌感染症には、以下のものが非制限的に含まれる：例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ（トルロプシス）グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ルシタネ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｅａｅ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）およびカンジダ・プソイドトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を非制限的に含むカンジダ属によって生じる、爪真菌症、慢性粘膜皮膚カンジダ症、口腔カンジダ症、喉頭蓋炎、食道炎、胃腸感染症、泌尿生殖器感染症を非制限的に含むカンジダ症；例えば、Ａ．フミガーツス、黄色コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）およびアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）を非制限的に含むアスペルギルス属によって生じる、顆粒球減少症を非制限的に含むアスペルギルス症；例えば、ムコールクモノスカビ属（Ｍｕｃｏｒ． Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．）アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、カニンガメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇａｍｅｌｌａ）、ザクセンネ（Ｓａｋｓｅｎａｅａ）、バシドボルス（Ｂａｓｉｄｏｂｏｌｕｓ）およびコニドボルス（Ｃｏｎｉｄｏｂｏｌｕｓ）などの接合菌によって生じる、肺感染症、副鼻腔感染症および鼻脳感染症を非制限的に含む接合菌症；例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）によって生じる、中枢神経系の感染症、髄膜炎および気道の感染症を非制限的に含むクリプトコッカス症；例えば、トリコスポロン・バイゲル（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ）によって生じる、トリコスポロン症；例えば、シュードアレシェリア・ボイディ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ）によって生じる、シュードアレシェリア症；例えば、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）およびフザリウム・プロリフェラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）などのフザリウム菌によって生じる、フザリウム感染症；ならびに、例えば、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）（全身性皮下膿瘍）ドレックスラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、バイポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、エキセロヒーラム属（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ ｓｐｐ．）、ペシロミセス・リラシナム（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｍ）、エキソフィラ・ジャーンセルメイ（Ｅｘｏｐｈｉｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ）（皮膚結節）、癜風菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｌｆｕｒ）（毛包炎）、アルテルナリア（皮膚結節性病変）、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）（脾臓感染および播種性感染症）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒ���ｌａ ｓｐｐ．）（播種性感染症）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｐ．）（蓄膿症）、トルロプシス・カンジダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｃａｎｄｉｄａ）（真菌血症）、カーバラリア属（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ．）（鼻咽頭感染症）、カニンガメラ属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｐ．）（肺炎）、Ｈ．カプスラーツム（Ｈ． Ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、Ｂ．デルマチチジス（Ｂ． ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、スポロトリックス・シェンキー （Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）およびブラジル・パラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ゲオトリクム・カンジダ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）（播種性感染症）によって生じる、その他の感染症。
【０１３２】
本明細書で用いる「真菌感染症」の治療とは、真菌感染症に起因する状態の治療を指す。このため、例えば、肺炎、鼻咽頭感染症、播種性感染症、ならびに上に列挙したものおよび当技術分野で知られた他の状態を、本明細書に提供する組成物を用いて治療してもよい。好ましい態様においては、本明細書に提供する組成物により、免疫不全状態の罹患生物またはこのような罹患生物がいる場所に対して治療および衛生化を行う。感染症をもたらした具体的な真菌を同定することが望ましい場合には、当技術分野で知られた技法を用いてもよく、例えば、ミュジアル（Ｍｕｓｉａｌ）ら、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３４９〜６４（１９９８）を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１３３】
したがって、本発明の組成物は細胞に対して投与される。「投与される」とは、本明細書において、細胞培養物または患者内の細胞に対する、本発明の候補物質の治療的有効量の投与を意味する。「治療的有効量」とは、本明細書において、投与した対象に効果を及ぼす投与量のことを意味する。厳密な用量は治療の目的に依存すると考えられ、当業者は既知の技法を用いてこれを確認しうると思われる。当技術分野で知られているように、全身性送達または局所性送達のいずれであるか、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事内容、投与時期、薬剤相互作用および疾患の重症度に応じた調整が必要と思われ、当業者はこれを日常的な実験によって確認しうると考えられる。「細胞」とは、本明細書において、有糸分裂または減数分裂を変更することが可能な、または細胞の形態（例えば繊維状菌糸の成長など）を変更することが可能な、ほぼあらゆる細胞を意味する。
【０１３４】
本発明の目的に関する「患者」には、ヒトおよび他の動物、特に哺乳動物ならびに他の生物が含まれる。このため、本方法はヒトの治療法および獣医学的な用途の両方に適用可能である。好ましい態様において、患者は哺乳動物であり、最も好ましい態様において、患者はヒトである。
【０１３５】
本明細書に記載された、望ましい薬理活性を有する候補作用物質を、生理的に許容される担体中にある状態で患者に投与してもよい。導入様式に応じて、化合物は以下に考察するさまざまな方式で製剤化しうる。製剤中の治療的活性化合物の濃度は、約０．１重量％〜１００重量％の範囲でさまざまであってよい。作用物質を単独で投与してもよく、他の治療法、すなわち放射線照射または他の化学療法薬と併用してもよい。
【０１３６】
１つの好ましい態様において、薬学的組成物は薬学的に許容される塩などの水溶性形態にあり、これには酸付加塩および塩基付加塩の両方が含まれるものとする。
【０１３７】
薬学的組成物は、顆粒剤、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル剤、懸濁剤、軟膏、ローション剤などのさまざまな形態として製剤化することができる。治療的活性をもつ化合物を含む組成物を構成するために、経口的または局所的使用に適した薬学的等級（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｇｒａｄｅ）の有機または無機担体および／または希釈液を用いることができる。当技術分野で公知の希釈剤には、水性媒体、植物性および動物性の油ならびに脂肪が含まれる。補助的薬剤として、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なｐＨ値を確保するための緩衝液、ならびに皮膚浸透促進剤を用いることができる。薬学的組成物が以下のうち１つまたは複数を含んでもよい：血清アルブミンなどの担体タンパク質；緩衝液；微結晶性セルロース、ラクトース、トウモコロシデンプンおよび他のデンプンなどの充填剤；結合剤；甘味料および他の風味物質；着色剤；ならびにポリエチレングリコール。添加物は当技術分野で周知であり、さまざまな製剤に用いられている。
【０１３８】
本発明の候補作用物質の投与は、経口的、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、腟内、直腸内または眼内を非制限的に含む、以上に考察したさまざまな方法で行うことができる。場合によっては、例えば創傷および炎症の治療には、候補作用物質を溶液または噴霧剤として直接適用してもよい。
【０１３９】
当業者は、本明細書に記載の方法を診断用途にも用いうることを容易に理解すると考えられる。本明細書で用いる診断法（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）とは、ヒトまたは他の動物における健康状態または疾病状態の同定または特徴分析を支援する化合物または方法である。より詳細には、Ａ．フミガーツスプロフィリンと特異的に結合する抗体を、Ａ．フミガーツスプロフィリンの発現を特徴とする疾患の診断に、またはＡ．フミガーツスプロフィリンまたはＡ．フミガーツスプロフィリンのアゴニスト、アンタゴニストもしくは阻害物質による治療を受けている罹患生物のモニタリングのためのアッセイに用いてもよい。診断アッセイには、ヒトの体液中または細胞もしくは組織の抽出物中のＡ．フミガーツスプロフィリンを検出するために抗体および標識を用いる方法が含まれる。抗体を、改変して用いても改変せずに用いてもよく、レポーター分子を共有的または非共有的に結合させてもよい。非常に多様なレポーター分子が当技術分野で知られており、これらを用いることができる。
【０１４０】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを含む、Ａ．フミガーツスプロフィリンを測定するための種々のプロトコールが当技術分野で知られており、Ａ．フミガーツスプロフィリンの発現レベルの変化または異常を診断する基盤となる。Ａ．フミガーツスプロフィリンの発現値が正常または標準的であることは、正常な哺乳動物対象、好ましくはヒトから採取した体液または細胞抽出物を、Ａ．フミガーツスプロフィリンに対する抗体と、複合体の形成に適した条件下で混ぜ合わせることによって確認される。複合体の標準的な形成量は、さまざまな方法、好ましくは光度測定手段によって定量化しうる。生検組織由来の対象、対照および疾患試料において発現されたＡ．フミガーツスプロフィリンの量を標準値と比較することができる。標準値と対象の値との偏差から、疾患を診断するためのパラメーターを設定する。
【０１４１】
本発明のもう１つの態様では、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いてもよい。用いうるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、ならびにＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、Ａ．フミガーツスプロフィリンが疾患と相関すると思われる生検組織における遺伝子発現の検出および定量化に用いうる。診断アッセイを用いて、Ａ．フミガーツスプロフィリンの有無および過剰発現の判定、ならびに治療的介入時のＡ．フミガーツスプロフィリンのレベルのモニタリングを行ってもよい。
【０１４２】
１つの局面においては、Ａ．フミガーツスプロフィリンまたは密接に関連した分子をコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出しうるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを用いてもよい。プローブの特異性、それが特異性の高い領域または特異性の低い領域のいずれから作製されたか、およびハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシー（最高、高い、中程度または低い）により、プローブによってＡ．フミガーツスプロフィリンをコードする天然の配列のみ、対立遺伝子変種または関連配列のいずれが同定されるかが決まると考えられる。
【０１４３】
また、関連配列の検出にプローブを用いてもよく、これらは好ましくは、任意のＡ．フミガーツスプロフィリンコード配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、配列番号：１の配列に、またはＡ．フミガーツスプロフィリン遺伝子のプロモーター、エンハンサーおよびイントロンを含むゲノム配列に由来するものでよい。
【０１４４】
Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードするＤＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションプローブを作製するための手段には、Ａ．フミガーツスプロフィリンまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、ｍＲＮＡプローブの作製のためのベクター中にクローニングすることが含まれる。このようなベクターは当技術分野で知られておりかつ市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼおよび適切な標識ヌクレオチドを付加することによってＲＮＡプローブをインビトロで合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブを、さまざまなレポーター基によって、例えば、３２Ｐもしくは３５Ｓなどの放射性核種によって、またはアビジン／ビオチン結合系などを介してプローブと結合させたアルカリホスファターゼなどの酵素標識によって標識してもよい。
【０１４５】
１つの特定の局面において、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードするヌクレオチド配列は、関連した疾患の存在を検出するアッセイのために有用と思われる。Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法によって標識し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で、罹患生物由来の液体または組織試料に加えてもよい。適切なインキュベーション期間の後に試料を洗浄してシグナルを定量し、標準値と比較する。シグナルの量が対照試料と比較して有意に変化しているならば、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードするヌクレオチド配列の試料中の量の変化により、関連する疾患の存在が示される。このようなアッセイは、動物試験、臨床試験における特定の治療計画の有効性を評価するため、または個々の罹患生物の治療のモニタリングのために用いられうる。
【０１４６】
Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードする配列から設計したオリゴヌクレオチドのさらなる診断用途には、ＰＣＲの使用が含まれうる。これらのオリゴマーを、化学合成してもよく、酵素的に生成させてもよく、配列番号：１に基づいてインビトロで作製してもよい。オリゴマーは、Ａ．フミガーツスプロフィリンをコードするポリヌクレオチドの断片、またはＡ．フミガーツスプロフィリンをコードするポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドの断片を含むことが好ましいと考えられ、特定の遺伝子または状態の同定のために最適化された条件下で用いられると考えられる。密接な関連のあるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出または定量化のために、オリゴマーを比較的低いストリンジェンシー条件下で用いてもよい。当業者が実施している定量的ＰＣＲを用いて、被験試料中のＡ．フミガーツスｍＲＮＡの相対レベルを検出することもできる。
【０１４７】
Ａ．フミガーツスプロフィリンの発現を定量化するために用いうる方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の同時増幅、および標準曲線からの結果の外挿が含まれる。多数の試料を定量化する速度は、関心対象のオリゴマーを種々の希釈度で用意するＥＬＩＳＡ形式でアッセイを行うことによって高めることができ、分光光度計または比色反応によって迅速な定量化が得られる。
【０１４８】
当業者は、本明細書に記載の方法が診断用途にも用いられうることを容易に理解すると考えられる。本明細書で用いる診断法とは、ヒトまたは他の動物における健康状態または疾病状態の同定または特徴分析を支援する化合物または方法である。
【０１４９】
本発明は、標的タンパク質の修飾物質のスクリーニングのためのキットも提供する。このようなキットは、容易に入手しうる材料および試薬から調製可能である。例えば、このようなキットは、以下の材料のうち１つまたは複数を含みうる：生体活性をもつ標的タンパク質、反応チューブ、および標的タンパク質の活性の検査のための指示。本キットは生体活性をもつ標的タンパク質を含むことが好ましい。キットの想定ユーザーおよびユーザーの個々の需要に応じて、さまざまなキットおよび成分を本発明に従って調製することができる。例えば、キットをアクチン結合アッセイ用に適合化することができる。
【０１５０】
理解を容易にする目的で、上記の本発明を例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、本発明の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、ある種の変更または修正を加えうることは当業者には容易に明らかになると考えられる。
【０１５１】
実施例
以下の実施例は例示のみを目的として提供するものであり、制限を意図したものではない。当業者は、決定的に重要ではない種々のパラメーターを変更または改変しても本質的に類似した結果が得られることを容易に理解すると考えられる。
【０１５２】
１． ニワトリ筋肉からのアクチンアセトン粉末の調製
骨および皮を除いた新鮮なニワトリ胸肉２ｋｇを、前もって冷却しておいた肉挽き器（粗粉砕機）でミンチ化する。穏やかに攪拌しながら４Ｌの０．１Ｍ ＫＣＬ、０．１５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ． ６．５中で１０分間、４℃で抽出する。５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理を４℃で行う。ペレットを４Ｌの０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ３中で攪拌しながら４℃で正確に５分間抽出する。これを繰り返す。ペレットを４Ｍの１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．０中で攪拌しながら４℃で１回抽出する。ペレットを４Ｌのナノ純度ｄＨ２Ｏ中で攪拌しながら１０分間、４℃で一回抽出する。
【０１５３】
ペレット（一部が固体で一部がゼラチン状）を慎重に採取して８Ｌビーカーに入れる。室温のドラフト（ｆｕｍｅ ｈｏｏｄ）内で、前もって冷却しておいたアセトン４Ｌ中で１０分間攪拌しながら５回抽出する。抽出のたびにアセトンの最上層をデカントし、残ったタンパク質沈殿物をチーズクロス１枚で濾過する。残りのアセトンは過剰な圧力を加えずにそっと圧搾する。チーズクロスを敷いたパイレックスガラス皿の上にタンパク質粉末（残留物）の層を重ねる。その上をもう１枚のチーズクロスで覆い、ドラフト内で一晩乾燥させる。残留物をプラスチック製広口瓶に入れて−２０℃で一晩保存する。ニワトリ胸肉４ｋｇから全量４５０ｇのアクチンアセトン粉末が得られた。
【０１５４】
２． 「清浄な」ニワトリ胸肉アクチン
ニワトリ胸肉アセトン粉末（上記の通りに調製）を緩衝液Ａで抽出する：粉末１０ｇ当たり２００ｍｌの冷却した緩衝液Ａを用いる。滅菌しておいたチーズクロス数枚に混合液を通過させて圧搾することによって抽出物を収集する。残留物を同容積の緩衝液Ａで再び抽出する。抽出物をまとめる。抽出後の粉末は廃棄する。ＪＬＡ１０ローターにて１０Ｋｒｐｍで１時間、４℃で遠心処理を行う。上清を滅菌しておいたチーズクロス２枚に通して収集する。Ｎａ２ＡＴＰを０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２に添加して５０ｍＭとする。攪拌プレート上で４℃にて６０分間攪拌し、アクチンを重合させて偽結晶を形成させる。注：Ｎａ２ＡＴＰは１００ｍＭ原液（ｐＨ ８．０）とし、ＭｇＣｌ２は１Ｍ（ｐＨ ８．０）とする。固体ＫＣＬをゆっくり添加して０．６Ｍとし（緩衝液１Ｌ当たり４５ｇ）、４℃で３０分間攪拌する。ＪＬＡ１０ローターにて１０Ｋｒｐｍで１時間、４℃で遠心処理を行う。上清を廃棄し、冷却した緩衝液Ａでペレットの表面を直ちにすすぎ洗いする。洗浄液は廃棄する。少量の冷却緩衝液Ａ（約２５ｍｌ〜３０ｍｌ）を各々の瓶に添加してペレットを軟化させる。蓋をした瓶を手で激しく振盪することによって再懸濁させる。清浄な瓶にペレットをまとめ、最初の粉末１ｇに対して３ｍｌの緩衝液Ａを用いるように緩衝液Ａで容積を調節する。氷上で大型ダウンスホモジナイザー（内筒Ｂ）を用いてホモジネート化する。緩衝液Ａに対する透析を４８時間で４回交換しながら４℃での攪拌下にて行う。透析されたアクチンを収集し、４５Ｔｉローターを用いて４０Ｋｒｐｍで１時間、４℃で遠心分離する。上清を収集する（Ｇ−アクチン）。保存用にＧ−アクチンを重合させるため、ＫＣＬが（３Ｍ原液から）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２が１ｍＭ、ＮａＮ３が（１０％原液から）０．０２％となるように添加する。
緩衝液Ａ
２ｍＭ Ｔｒｉｓ
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．００５％ＮａＮ３
０．５ｍＭ Ｂ−メルカプトエタノール（１リットル当たり３６ｕｌ）
０．２ｍＭ Ｎａ２ＡＴＰ
ｐＨ ８．０、１倍溶液を作る場合
【０１５５】
３． ピレン−アクチン
上記の通りに調製した「清浄な」アクチンを出発材料とする。清浄なアクチンの濃度をＧ−緩衝液で４０ｕＭ〜４５ｕＭに調節する。ＤＴＴも２−メルカプトエタノールも含まないＧ−緩衝液に対する透析を、一晩またはそれ以上にわたって数回行う。透析後にアクチンを、アルミホイルで包んだチューブまたは瓶に移す。続いて直ちに以下のものを瓶に加える：
１． ＭｇＣｌ２、２ｍＭまで（１Ｍ原液を用いる）
２． ＊ピレン、ゆっくりと混合しながら４５ｕＭまで（６０倍原液を用いる、下記参照）；および
３． ＫＣＬ、０．１Ｍまで（３Ｍ原液を用いる）。
【０１５６】
暗所でゆっくりと振盪または攪拌を行いながら２０℃で９０分間インキュベートする。Ｆアクチン（重合体）をＴＬＡ１００．３ローターにより９０Ｋｒｐｍで１５分間遠心してペレット化する。ペレットをまとめ、Ｇ−緩衝液中に再懸濁させて最終濃度を約６０ｕＭとする。ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールを加えた数リットルのＧ−緩衝液に対して、４℃で暗所にて一晩または数日にわたって透析する。沈殿したピレンおよび変性アクチンを除去するために９０Ｋで１５分間または４５Ｋで１時間、除去遠心を行う。氷上および暗所にてＧ−アクチンを滅菌した瓶に移す。液体窒素中で液滴凍結法を行い、ペレットを遮光（アルミホイルで包んだ）瓶に入れて−８０℃で保存する。
【０１５７】
３３９ｎＭ（Ｅ＝２８，１００／ｃｍ／Ｍ）でピレン濃度を測定し、アクチン濃度をピレン標識後に測定する（ＯＤ２９０−０．３３×ＯＤ３３９）／２４．９。
【０１５８】
＊ピレンヨードアセトアミド：ピレンを無水ＤＭＳＯ中に溶解して１ｍｇ／ｍｌ（２．６ｍＭ）とする。これは６０倍希釈液となり、段階５ではこれを用いて最終濃度４５ｕＭとする（分子プローブＰ−２９、Ｎ−１（ピレン）ヨードアセトアミド）。
【０１５９】
４． 最適化されたプロフィリンアッセイ：アクチン集合の阻害
アッセイ条件（プレート読み取り機実験の場合、１ウェル当たり５０ｕｌ）：
アクチン、ピレン−アクチンおよびプロフィリンペレットを氷上または室温で解凍し（試料当たり５００ｕｌ）、その後は常に氷上に置く。アクチンおよびピレン−アクチンを１００，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間〜１時間超遠心分離する（Ｂｅｃｋｍａｎ）。上層の７５％を採取して滅菌チューブに移す。ＯＤ２９０を読み取る。ＯＤ２９０が０．６ならば２５ｕＭ（または１ｍｇ／ｍｌ）である、ということを用いて、濃度をｕＭ単位で算出する。アクチン濃度は６ｕＭ、ピレン−アクチンは２ｕＭに一定に保つ。２５ｕｌの塩を最後に添加する。プロフィリンの濃度は０ｕＭ〜５．０ｕＭまたは７．５ｕＭの範囲とする。
【０１６０】
試料２５ｕｌを各ウェルに添加する。２５ｕｌの２×開始塩（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓａｌｔ）を各ウェルに添加する。ピレン動態の読み取り（Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ環境）を１５０サイクルで、３６０ｎＭ〜４０７ｎＭにて行う。
Ｇ緩衝液
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．０
０．２ｍＭ ＡＴＰ
０．１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．５ｍＭ ＤＴＴ
１０×開始塩
５００ｍＭ ＫＣＬ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ Ｋ−ＥＧＴＡ、ｐＨ ８．０
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．０
【０１６１】
本明細書で説明した態様は例示のみを目的としており、当業者にはそれに鑑みてさまざまな修正または変更が想起されると考えられるが、これらは本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解されねばならない。本明細書に引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、その全体がすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ．フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）プロフィリンをコードする核酸配列の態様の１つを示す（配列番号：１）。
【図２】Ａ．フミガーツスプロフィリンのアミノ酸配列を示す（配列番号：２）。
【図３】Ａ．フミガーツスプロフィリンに関する代表的なピレン−アクチンアッセイの結果を示す。プロフィリンの非存在下では、蛍光の経時的増加によって示されるように、ピレン−アクチンは集合してフィラメントとなる。５．０ｕＭプロフィリンを添加すると自発的集合は阻害され、蛍光の任意の増加が減衰して、Ｇ−アクチン対照（塩非含有）と区別できない程度の微量となる。プロフィリンの阻害物質は相対蛍光強度を上昇させると考えられる。ｘ軸はサイクル数（１サイクル／３０秒）を示し、ｙ軸は任意の蛍光強度を反映する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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2004535763.tif 000059
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535763.tif 000060
2004535763.tif 000061
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004535763.tif 000062
2004535763.tif 000063
【国際調査報告】
2004535763.tif 000064
2004535763.tif 000065