(57)【要約】【課題】ステロールをアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン／アンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンに転換する能力を有する微生物及び調製方法及びその使用の提供。【解決手段】開示されるのは、ステロールをアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン（ＡＤ）及びアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン（ＡＤＤ）へ転換するのに優れた能力を有する微生物、該微生物の調製方法及びその使用であり、及びさらに特には、ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＡＴＣＣ  ２９４７２の突然変異菌株である、ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９、該突然変異菌株の調製方法及びＡＤ及びＡＤＤを調製する上でのその使用である。本発明の変異株は、既知の微生物と比較して、ステロイドホルモン前駆体であるＡＤ及びＡＤＤへステロールを転換するのに優れた能力を有し、そしてしたがって、ステロイドホルモンの大量生産に非常に有益である
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミコバクテリウム  ホルツィツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２９４７２）由来の、ステロールをアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン及びアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンに転換し得る、ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９（ＫＣＣＭ−１０２５９）。
【請求項２】
前記ステロールは、シトステロール、コレステロール、スチグマステロール及びカンペステロールからなる群より選択される請求項１記載のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９。
【請求項３】
以下の段階：
（ａ）ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＡＴＣＣ  ２９４７２菌株をステロール含有培養培地にて培養する段階；
（ｂ）前記培養されたミコバクテリウム  ホルツィツムをニトロソグアニジンにて処理する段階；及び
（ｃ）ステロール又はアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン及びアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンを０．１ないし２．０ｇ／Ｌの濃度に補った培地において前記ニトロソグアニジン処理されたバクテリアを生育させ、それにより、ステロール添加培地にて早く生育する突然変異菌株及びアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン及びアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン添加培地にて遅く生育する突然変異菌株を選択し得る段階
からなる、寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５９として大韓民国種菌協会附設韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＫＣＣＭ）に２００１年４月１４日に寄託された、ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９を調製する方法。
【請求項４】
前記ステロールは、シトステロール、コレステロール、スチグマステロール及びカンペステロールからなる群より選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
ステロール含有液体培地においてミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９を培養する段階及び該培養培地からアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン及びアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンを回収する段階からなる、アンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン及びアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンを調製する方法。
【請求項６】
前記ステロールは、シトステロール、コレステロール、スチグマステロール及びカンペステロールからなる群より選択される請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ステロールをアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン及びアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンに転換する優れた能力を有する微生物である、ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９、該微生物の調製方法及びその使用、並びにさらに特には、従来既知の微生物の転換速度よりも４倍又はそれ以上高い転換速度を有する微生物、該微生物の調製方法及びアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン及びアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンを調製することにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
副腎皮質、精巣、卵巣又は胎盤、黄体から放出される分泌ホルモンであるステロイドは、コレステロールから合成される。それらはその生理的作用にしたがって以下のように約５種類に区分される：男性及び女性に対してそれぞれ第二次性徴の発達に重大な役割を果たすアンドロゲン（アンドロステロン、テストステロン等）及びエストロゲン（エストラジオール等）の性ホルモン、妊娠を刺激しそして維持するゲストゲン（プロゲステロン等）、タンパク質の異化により糖新生を刺激しそして肝臓グリコーゲン量を増加させる糖質コルチコイド（コルチゾン、ヒドロコルチゾン等）、及び体内の電解質と水分の平衡を維持するのに重要な役割を果たす鉱質コルチコイド（デオキシコルチコステロン、アルドステロン等）。
【０００３】
上述のホルモン量は、文明の発達に従い増加したストレス及び環境ホルモンへの曝露の為に体内で不均衡となり、多くの病気を生じさせ、そして病気の治療の為にステロイドホルモンが幅広く使用されている。特に、合成エストロゲンは人工授精、不妊患者の治療において本質的に使用され、そして糖質コルチコイドは虹彩炎、関節炎等の種々の炎症により引き起こさせる痛みを和らげる役割を果たしている。さらに、致命的であるアジソン病は、デオキシコルチコステロン及びヒドロコルチゾンの投与により治療され得る。
【０００４】
上述したように増加した需要に応える為にステロイドホルモンの生体外合成に対する種々の研究が為されており、そしてその一つは、微生物を使用したステロイドホルモン前駆体の生成に関する。マモリ及びベルセロン（Ｂｅｒ．７０４７０及びＢｅｒ．７０２０７９，１９３７）は、酵母発酵により１７−β−ヒドロキシステロイドへの１７−ケトステロイドの還元を報告した。また、ピータースン及びマレーは、米国特許第２，６０２，７６９号公報において、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の菌体を使用してプロゲステロンの１１α−ヒドロキシル化を生成する方法を開示しており、そしてクレーチィは、米国特許第３，６８４，６５７号公報において、ミコバクテリウム種を使用した、１７−アルキル基を含むステロイドからの、アンドロステ−４−エン−ジエン−３，１７−ジオン、アンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン、及び２０α−ヒドロキシメチルプレグナ−１，４−ジエノ−３−オンの為の方法を開示している。
【０００５】
ステロイドホルモンの大量生産を達成する為に、唯一の炭素源としてステロールを使用して微生物を単離しそして発酵の為の基質として使用されるステロールの構造を変性する試みが為され、そしてまた、金属、金属吸着剤及び金属還元剤のようなステロールの核の分解を防止し得る化学添加剤の使用によりステロイドの獲得速度を高める試みが為され、これらの試みは大きく進歩している（Ｍａｒｓｈｅｃｋ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３（１），７２ないし７７、１９７２）。さらに、土壌から単離された微生物に対する物理的及び化学的処理により突然変異誘発を為すステロイド前駆体の生産性を改善する研究が為され、そして特に、アップジョンは、米国特許第４，２９３，６４４号公報において、ミコバクテリウム（ＡＴＣＣ  ２９４７２）由来の突然変異菌株により種々のステロールからアンドロステ−４−エン−３，１７−ジオン（以下、ＡＤとして言及する。）を主に収率向上させ、また少量のアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン（以下、ＡＤＤとして言及する。）を得る方法を記載している。
【特許文献１】
米国特許第２，６０２，７６９号公報
【特許文献２】
米国特許第３，６８４，６５７号公報
【非特許文献１】
Ｍａｒｓｈｅｃｋ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３（１），７２ないし７７、１９７２
【特許文献３】
米国特許第４，２９３，６４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ステロイドホルモン医薬品の増加した需要にしたがって、上述のホルモン前駆体、とりわけ、ステロイドの生体外合成の為の重要な前駆体化合物であるＡＤ及びＡＤＤの大量生産の必要がある。しかしながら、従来既知の微生物は、ＡＤ及びＡＤＤの合成に低い生産性を有している。この点に関し、ＡＤ及びＡＤＤへのステロールの高い転換速度を有する微生物を開発することが早急に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の開示
本発明の発明者らによる多くの試みの結果として、ミコバクテリウム  ホルツィツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２９４７２）のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９突然変異菌株が、ＡＤ及びＡＤＤへのステロールの優れた転換効率を有することが発見され、そして本発明はその結果に基づいて完成された。
【０００８】
したがって、ＡＤ及びＡＤＤへのステロールの優れた転換効率を有する突然変異微生物を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
ＡＤ及びＡＤＤへのステロールの優れた転換効率を有する突然変異微生物を調製する方法を提供することが本発明のもう一つの目的である。
【００１０】
ＡＤ及びＡＤＤへのステロールの優れた転換効率を有する突然変異微生物を使用してＡＤ及びＡＤＤを調製する方法を提供することが本発明のさらにもう一つの目的である。
【００１１】
上記目的を達成する為に、本発明は、（ａ）ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＡＴＣＣ  ２９４７２菌株をステロール含有培養培地にて培養する段階；（ｂ）前記培養されたミコバクテリウム  ホルツィツムをニトロソグアニジン（ＮＴＧ）にて処理する段階；及び（ｃ）ステロール又はＡＤ及びＡＤＤを０．１ないし２．０ｇ／Ｌの濃度に補った培地において前記ニトロソグアニジン処理されたバクテリアを生育させ、それにより、ステロール添加培地にて早く生育する突然変異菌株及びＡＤ及びＡＤＤ添加培地にて遅く生育する突然変異菌株を選択し得る段階からなる、寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５９として大韓民国種菌協会附設韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＫＣＣＭ）に寄託された、ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９を調製する方法を提供する。
【００１２】
本発明のＡＤ及びＡＤＤを調製する方法は、ステロール含有液体培地にて突然変異微生物であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９を培養し及び該培養培地からＡＤ及びＡＤＤを回収する段階を含む。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１は、ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９の培養培地におけるＡＤ及びＡＤＤのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明を実施するための最良の形態
本発明にしたがって、発酵によってコレステロールからステロイドへ転換し得るミコバクテリウム  ホルツィツム（ＡＴＣＣ  ２９４７２）が使用された。
【００１５】
本発明のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９を調製する為に、最初に、ミコバクテリウム  ホルツィツム菌株（ＡＴＣＣ  ２９４７２）をＯ．Ｄ０．６ないし０．８まで成長させ、そしてその後、微生物の死滅率９９．９％の量のニトロソグアニジン（ＮＴＧ）にて処理した。微生物の突然変異菌株を生成するのに一般に使用される化合物であるＮＴＧは、グアニジンの第６炭素原子のメチル化によりＤＮＡ複製の間にＧＣ塩基対をＡＴ塩基対に置換することによる突然変異を誘発する。ＮＴＧの量は、培地５ｍｌあたり３００ないし４００μｇであり、そして好ましい量は５ｍｌあたり３３０μｇである。さらに、突然変異は、ＵＶ照射、ＩＮＨ（イソニアジド）及び他の突然変異誘発物質により為され得る。
【００１６】
ＮＴＧ処理された菌株から、ステロール添加固形培地にて高い生育速度及びＡＤ及びＡＤＤ添加固形培地中にて低い生育速度の両方を有する突然変異菌株を選択し、そして最終的に、フラスコ培養により最も高い転換速度を有する突然変異菌株ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９が得られた。
【００１７】
好ましくは、菌株の選択において使用されるステロール又はＡＤ及びＡＤＤは、０．１ないし２．０ｇ／Ｌの量で培地に添加され、そして好ましくは０．４ないし０．６ｇ／Ｌである。ステロールは、シトステロール、コレステロール、スチグマステロール及びカンペステロールからなる群より選択され得、そしてステロールはコレステロールであることが好ましい。
【００１８】
上述したとおりの方法により調製されたミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、寄託番号ＫＣＣＭ−１０２５９として大韓民国種菌協会附設韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に２００１年４月１４日に寄託された。
【００１９】
最終的に選択された突然変異菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９が培養され、そしてそのＡＤ及びＡＤＤへのコレステロールの転換速度が分析された本発明の一態様においては、突然変異菌株は、野生型菌株よりも、小規模培養においてはおよそ２．３倍高い転換速度を、そして大規模培養においてはおよそ４．２倍高いことを示した。突然変異菌株培養培地２Ｌから、ＡＤ及びＡＤＤが一般の分離及び精製方法によりおよそ８０％の精製収率にて回収された。培養の２日後から、突然変異菌株は野生型菌株よりも高い濃度のＡＤ及びＡＤＤを生成したことが分かった。
【００２０】
したがって、本発明のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、ＡＤ及びＡＤＤの大量生産の為に使用され得る。そのような方法は、ステロール含有液体培地にてミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９を培養する段階及び該培養培地からＡ
Ｄ及びＡＤＤを回収する段階を含む。【００２１】
本発明のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９がステロイドホルモン合成の前駆体として使用されるＡＤ及びＡＤＤを調製するのに使用される場合、ＡＤ及びＡＤＤは高い収率で得られ得る。
【００２２】
本発明を、以下の実施例を添付された図面と共に参照してより詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を説明する為のみに提供され、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例１  突然変異菌株の調製
突然変異を誘発させる為に、ＹＮＧ培地中にミコバクテリウム  ホルツィツム菌株（ＡＴＣＣ  ２９４７２）を接種し、そしてＯ．Ｄ．０．６ないし０．８に到達するまで培養し、培養培地５ｍｌを遠心分離してセルペレットを得た。得られたペレットを０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０を含む滅菌された０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）にて２回洗浄し、そして緩衝液５ｍｌ中に再懸濁し、そしてＮＴＧを３３０μｇ／ｍｌの濃度にてセル懸濁液に添加した。ＮＴＧ処理されたセル懸濁液を３７℃において９０分間振とうしながら培養し、そしてその後遠心分離してセルペレットを得、そして得られたセルペレットを滅菌された０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて３回洗浄しそして緩衝液中に再懸濁した。最終的なセル懸濁液をＳＭ１固形培地に塗抹し、そしてコロニーを形成させる為に３７℃にて３ないし４日間培養した。
【００２４】
実施例２  突然変異菌株の選択
実施例１から得られたコロニーを、ＭＳ１、ＭＳ１＋コレステロール、ＭＳ１＋ＡＤＤ（又はＡＤ）及びＹＮＧ固形培地に接種し、そしてコレステロール含有培地（ＭＳ１＋コレステロール培地）において高い生育速度及びＡＤＤ（又はＡＤ）含有培地において低い生育速度の両方を有する菌株を選択する為に３０℃にて３日間培養し、そして選択した菌株をミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９と命名した。最少無機物培地であるＭＳ１培地を対照として用い、そして培地の組成を表１に示した。
【表１】
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【００２５】
実施例３  ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９菌株におけるＡＤ及びＡＤＤへのコレステロールの転換速度の調査
実施例２から選択された突然変異菌株ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９をＹＮＧ培地５ｍｌに前培養し、そしてその後、ブドウ糖１ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０  ０．０１ｇ及び種々の無機塩を含むＳＭ４発酵培地１００ｍｌ（表１を参照。）中において、３０℃にて１２０時間の間２００ｒｐｍで培養した。コレステロールは培養培地にあまり良好には溶解しない為、コレステロールをアセトンにて溶解し、そしてアセトン中のコレステロール懸濁液を１００ｍｌあたりコレステロール０．１ｇの量で培地に添加した。培養後、培養培地をエチルエーテル及び石油エーテルにて抽出し、そしてその後、２−プロパノールにて溶解し、そして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実施した、コレステロールからのミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９菌株により生成されたＡＤ及びＡＤＤ量の解析に使用した。ＡＤ及びＡＤＤへのコレステロールの転換速度は、ＡＤ及びＡＤＤのモル濃度と添加したコレステロールのモル濃度の比により計算した収率として表した。また、野生型であるミコバクテリウム  ホルツィツム（ＡＴＣＣ  ２９４７２）のＡＤ及びＡＤＤの生成量及び転換速度を調査した。結果を表２に示す。
【表２】
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表２に示されるように、突然変異菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、ＡＤ及びＡＤＤへのコレステロールの転換速度が、野生型菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＡＴＣＣ  ２９４７２よりもおよそ２．３倍高いことを示した。
【００２６】
実施例４
実施例３と同様の方法により調製した、１００ｍｌ培地に前培養した突然変異菌株を、滅菌した２．５Ｌ培地（ｐＨ８．０）を含んだ５Ｌ発酵器内に接種し、そして６００ｒｐｍにて振とうしながら、１ｖｖｍ（通気速度）において３０℃にて１２０時間培養した。アセトン中に溶解したコレステロールを５ｇ／Ｌの量で添加した。ＡＤ及びＡＤＤの生成量及びＡＤ及びＡＤＤへのコレステロールの転換速度を実施例３と同様の方法により解析し、そして結果を表３に示す。
【表３】
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表３に示されるように、突然変異菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、野生型菌株よりもおよそ４．２倍高い転換速度を示した。
【００２７】
実施例５
ＡＤ及びＡＤＤを、実施例４において調製した培養液から精製した。培養液２．５ＬをｐＨ３．０に調整し、そして５０００ｒｐｍで４℃にて１分間遠心分離した。得られたバイオマスのペレットを７０％アセトン中に懸濁することにより抽出して濾過し、そしてアセトンの蒸発後に５ないし１０℃に保持してホルモンを沈殿させた。得られた沈殿物を濾過し、及び５５℃にて乾燥し、そして残存したコレステロールを除去する為に乾燥した沈殿物にヘキサンを添加し、そしてその後に濾過し及び再乾燥し、そして得られた粗ホルモン中間体を回収した。ホルモン中間体の回収率を表４に示す。
【表４】
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表４に示されるように、ホルモン中間体の精製収率は、突然変異菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９の２．５Ｌ培養培地からおよそ８０％であった。
【００２８】
実施例６
ミコバクテリウム  ホルツィツムの野生型及び突然変異菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９により生成されたホルモン中間体の濃度を、ＨＰＬＣを用いて測定した。ミコバクテリウム  ホルツィツムの野生型又は突然変異型を含む培養液培地を、ジエチルエーテルと石油エーテルの１：１混合物４倍容積を用いて２回抽出し、そして溶媒をその後に蒸発させた。抽出されたホルモンを、１．０ｍｌ／分の流量、２７００ｐｓｉ及び２５０ｎｍの条件下において、カラムとしてペガシル（Ｐｅｇａｓｉｌ）  ＯＤＳ（４．６×２５０、５μｍ、１２０オングストローム、センシュー  パック（Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ），日本）を利用したＨＰＬＣを用いて、定量分析の為にイソプロピルアルコール中に懸濁し、そして移動相を５０％ＴＨＦを用いて解析した（図１を参照。）。
結果として、培養後２日目から、突然変異菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム
ＥＵＧ−１１９は、野生型菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＡＴＣＣ  ２９４７２よりもより高いレベルでＡＤ及びＡＤＤを生成したことが分った。
【００２９】
実施例７
突然変異菌株であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９の微生物学的性質を既知の方法を用いて調査し、そしてそれは以下のとおりである。ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、炭素源としてブドウ糖、多糖類、グリセロール、脂肪酸、ステロール等を含む糖類を利用して、３０ないし３５℃にて生育し得る。また、グラム陽性菌であるミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、その細胞壁中に多量の脂肪を含んでおり、そして黄色コロニーを形成して生育する。
全体として、本発明のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、既知のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＡＴＣＣ  ２９４７２菌株と類似の形態学的及び物理的性質を示すが、その発酵作用により、ＡＤ及びＡＤＤへのステロールの転換に優れた能力を有している。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
産業上の利用可能性
上述したように、本発明のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、従来既知の微生物、とりわけミコバクテリウム  ホルツィツム  ＡＴＣＣ  ２９４７２と比較して、ホルモン前駆体として使用され得るＡＤ及びＡＤＤへのステロールの優れた転換効率を有している。したがって、本発明のミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９は、ステロイドホルモンの大量生産に非常に有益である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ミコバクテリウム  ホルツィツム  ＥＵＧ−１１９の培養培地におけるＡＤ及びＡＤＤのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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