(57)【要約】【課題】内皮細胞に選択的に結合し標識できる新規な核酸分子を提供する。【解決手段】配列番号１〜２９に示される内皮細胞を選択的に標識する核酸分子、ならびにそれを用いて腫瘍疾患を検出する方法。本特異的核酸分子（アプタマー）は、種々の「ヘアピンループ」または「ふくらみ」中に位置する活性結合部位を有する図１の仮設構造モデルで示され、リンカー部分（ｎ）を介して５’末端がビオチン標識（ＢＢＢ）され、黒丸は塩基対を表す。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
添付の配列表の配列番号１から配列番号２１のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む核酸分子。
【請求項２】
添付の配列表の配列番号１から配列番号２１のヌクレオチド配列の１つを有する核酸分子。
【請求項３】
上記非機能性部分の少なくとも１つのヌクレオチドが置換または欠失している、請求項１または請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
治療および／または診断薬と連結される、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
組織切片の組織検査のための、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項６】
腫瘍疾患の検出のための、添付の配列表のヌクレオチド配列番号９を含む核酸分子の使用。
【請求項７】
上記検出をネズミ／ウシタンパク質「ｐｉｇｐｅｎ」に対するヒト相同体を介して行う、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
核酸分子を内皮細胞に選択的に結合する、または内皮細胞を選択的に標識する方法であって、その核酸分子が添付の配列表の配列番号１から配列番号２１のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
核酸分子が添付の配列表の配列番号１から配列番号２１のヌクレオチド配列の１つを有する核酸分子であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）生物材料を準備し、
（ｂ）腫瘍マーカーを検出する
工程を含んでなる、腫瘍疾患の検出方法であって、その検出を添付の配列表の配列番号９のヌクレオチド配列を含む核酸分子を用いて行うことを特徴とする腫瘍疾患の検出方法。
【請求項１１】
検出をネズミ／ウシ「ｐｉｇｐｅｎ」に対するヒト相同体を介して行うことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記核酸分子の非機能性部分の少なくとも１つのヌクレオチドが置換または欠失していることを特徴とする請求項８ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
上記核酸分子が治療薬と連結されていることを特徴とする請求項８ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上記核酸分子が診断薬と連結されていることを特徴とする請求項８ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記診断薬がＦＩＴＣ、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびそれらの誘導体、ならびにさらなる蛍光物質、酵素マーカー、赤外線マーカーおよびキレート剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子が天然複合生物材料に選択的に結合することを特徴とする、請求項８ないし１５のいずれか一項に記載の方法における、添付の配列表の配列番号１から配列番号２１のヌクレオチド配列の１つを含む核酸分子の使用。
【請求項１７】
（ａ）生物材料を準備し、
（ｂ）腫瘍マーカーを検出する
工程を含んでなる、腫瘍疾患の検出方法であって、
その検出をネズミ／ウシタンパク質「ｐｉｇｐｅｎ」に対するヒト相同体を介して行うことを特徴とする腫瘍疾患の検出方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は内皮細胞に選択的に結合する、または内皮細胞を選択的に標識する核酸分子、腫瘍疾患を同定する方法、かかる方法で使用される核酸分子ならびにかかる核酸分子の使用法に関する。
【０００１】
この種の方法およびそこで使用される核酸分子は公知のものであって、アプタマーとも呼ばれる。関連する総説はＯｓｂｏｒｎｅら、”Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ： ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １９９７， １： ５−９．に見出せる。
アプタマーは高親和性のＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり、それらの特異的な空間的構造により標的分子に高い親和性を有する。かかるアプタマーを見出すためには、全く異なる配列および二次構造を有する多数のオリゴヌクレオチドを無作為かつ酵素的に生成し、これから標的分子に高い親和性を示すオリゴヌクレオチドを選択、濃縮するといったコンビナトリアルアプローチがしばしば用いられる。この技術はまたＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）とも呼ばれる。
【０００２】
一次構造が公知の場合、かかるオリゴ−ポリヌクレオチド（アプタマー）は例えばＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使って合成してもよい。
アプタマーに対する標的構造は、レセプターまたは他のタンパク質、脂質構造もしくは炭水化物構造であってよい。テオフィリン（Ｊｅｎｉｓｏｎら、”Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４； ２６３ （５１５２）： １４２５−９を参照）、ＡＴＰ（Ｔａｎｇら、”Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ”， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．１９９７； ４ （６）： ４５３−９を参照）、アルギニン（Ｇｅｉｇｅｒら、”ＲＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｗｉｔｈ ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｅｎａｎｃｉｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９６； ２４ （６）： １０２９−３６を参照）のような小分子に対して高い親和性を示すアプタマーがすでに発見されている。同様に、自然環境では通常いずれの核酸にも結合しないタンパク質結合アプタマーも見出されている。Ｍｏｒｒｉｓら、”Ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ： Ｃｏｍｐｌｅｘ ｔａｒｇｅｔｓ”； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９８； ９５： ２９０２−２９０７は、細胞膜に対して向けられるアプタマーの開発に成功した。
【０００３】
当技術分野の現状は、引用した文献の著者らは複合生体材料に結合するまたはそれを標識する核酸分子の完全な配列を示していないという欠点をもつ。比較的高分子量の構造の標識について研究しているＭｏｒｒｉｓらは、単に配列モチーフを示しているに過ぎない。この刊行物によれば、かかる配列モチーフを含む核酸分子は赤血球細胞膜から人工的に生成した小胞（赤血球ゴースト）に結合する。
上記の点から、本発明の１つの目的は最初に記載したタイプとはまた別の核酸分子、特に内皮細胞に選択的に結合し標識できる核酸分子を提供することである。
【０００４】
本発明によれば、この目的は添付の配列表の配列番号１から配列番号２１のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む核酸分子により達成される。
その結果、本発明の基礎をなす目的は完全に達成される。それは発明者らが、上記ヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む核酸分子は、天然の生物材料のみならず技術的方法により生成したその一部分までも認識および結合し、かつ内皮細胞に特異的であるということを認識しているからである。発明者らの発見によれば表中の配列の少なくとも１つを含む核酸分子は使用される生物材料に対する高い特異性により識別される。
【０００５】
しかし、添付した配列表の配列番号１から配列番号２１のヌクレオチド配列の１つを有する核酸分子が好ましい。
発明者らのデータから、クレームのヌクレオチド配列の１つを有する核酸分子を最初に記載した方法で使用する場合に本発明の根拠であるかかる目的が完全に達成されることが明らかになった。驚くべきことにヌクレオチド配列によりあらかじめ決定されている核酸分子の二次構造は生物材料に特異性の高い結合を付与するに十分な状態である。
【０００６】
さらに核酸分子内の非機能性部分の少なくとも１つのヌクレオチドが置換または欠失している場合が好ましい。
これは、発明者らが特定の核酸分子の配列中の特定の機能性領域が生物組織との選択的結合を司っていることを見出したことによる。これらの領域は「ヘアピンループ」または「ふくらみ」の二次構造中に折りたたまれた配列とともに位置する。これらの機能性領域の塩基配列がマッチする場合、非機能性部分の配列が互いに異なる２つの核酸分子またはアプタマーは、同じ構造に結合できる。かかる相違には単一または複数のヌクレオチドのヌクレオチド交換および欠失の双方、ならびに鎖の末端切断または末端修飾が含まれる。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、配列番号１から配列番号２１のヌクレオチド配列の１つを含む核酸分子を使用して内皮細胞に選択的に結合するまたは内皮細胞を選択的に標識する方法であり、またこれらの配列に関しては核酸分子の非機能性部分の少なくとも１つのヌクレオチドが置換または欠失している配列変異が包含される。
配列番号１から配列番号２１の配列は内皮細胞に特異的に結合する。血管の管腔側を裏打ちするこれらの細胞はとりわけ脈管形成、血管形成および血液−組織関門を経た物質のトランスサイトーシスにおいて重要な役割を担う。これに関連して、かかる方法は内皮細胞の分化および腫瘍供給血管または炎症性内皮細胞の特異的病変の標識を研究するために特に好適である。
【０００８】
この核酸分子が治療薬と連結されている場合もまた好ましい。
クレームの核酸分子は治療薬をその標的位置に輸送するための標的特異的担体として機能する可能性を有する。この「薬剤標的化」により非病原性組織との望ましくない相互作用の大部分は避けられるため、発明者らは治療薬を標的特異的に使用することにより、特に用量の低減または望ましくない副作用の徹底的な逓減を期待している。
【０００９】
比較的最近の癌研究試験では腫瘍の血液供給の遮断が治療のための有望なアプローチであることが示されたため、好適な標的組織は特に腫瘍組織である（総説文献Ｃｅｒｅｓｈ， Ｄ．Ａ．，”Ｄｅａｔｈ ｔｏ ａ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ， ｄｅａｔｈ ｔｏ ａ ｔｕｍｏｒ”， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １９９８， ４（４）： ３９５−６； Ｍｏｌｅｍａ ら， ”Ｒｏｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ａｔｔａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ’ｓ ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ”， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １９９８， １９（９）： ３９２−４を参照）。かかる方法はまた、新規の核酸配列を用いて有利に行うことができる。
【００１０】
本発明に至る実験中、発明者らは添付の配列表中の配列番号９のヌクレオチド配列を含む核酸分子により腫瘍特異的組織が選択的に同定できることを見出した。これにより、これらの核酸分子を使用すれば変性した腫瘍組織と健康な組織との特異性の高い識別が可能である。このように発明者らはそれぞれの標的に向けられた治療のための確実な基礎を提供する使用法を提供する。
これに関連する本発明のさらなる目的は、添付の配列表の配列番号１のヌクレオチド配列を含むまたは含んでなる核酸分子の腫瘍疾患検出への使用ならびに腫瘍疾患検出のためのそれぞれの方法であり、
ａ）生物材料を準備し、
ｂ）腫瘍マーカーを検出する、
工程を含む。ただしこの検出は添付の配列表の配列番号１のヌクレオチド配列を含むまたは含んでなる核酸分子を用いて行う。
【００１１】
発明者らのさらなる研究から、添付の配列表の配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子によりネズミ／ウシタンパク質「ｐｉｇｐｅｎ」に対する相同体を介して腫瘍組織と健常組織との識別が起こることを見出した。このタンパク質は現在に至るまで比較的知られていない内皮タンパク質であり、分子量は６７ｋＤａである。さらに、その腫瘍組織との関連は現在知られていない。このように、このタンパク質はＲＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを有する炭水化物結合タンパク質としてこれまでに記載されているが、それが核膜と結合する可能性がある；例えばＡｌｌｉｅｇｒｏら、”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｉｌｅｄ ｂｏｄｙ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ”， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３９， ６０−６８ （１９９８）を参照。
【００１２】
上記の点から、本発明の目的の１つは添付の配列表の配列番号９のヌクレオチド配列を含む核酸分子の腫瘍疾患検出のための使用であり、その検出はネズミ／ウシタンパク質「ｐｉｇｐｅｎ」に対するヒト相同体を介して起こる。もう１つの目的はネズミ／ウシタンパク質「ｐｉｇｐｅｎ」に対するヒト相同体を介する腫瘍疾患の検出方法である。
クレームの核酸分子のさらなる適用は、炎症性内皮病変への治療薬の輸送である。可能性のある治療薬は、例えば抗脈管形成または抗炎症物質である。
【００１３】
機能担持ＤＮＡセグメントを用いてクレームの特異的核酸分子を伸張することにより、限局的に活性な免疫治療薬の調製も可能である。本明細書で意図するのは多大な免疫刺激活性を有する「ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｓ」の使用である。
本願の発明者らは、クレームの核酸分子を上記の病状の治療に使用しうることを初めて認識した。
かかる核酸分子はまた診断薬と連結するのが特に好ましい。
【００１４】
診断および上記の薬剤ターゲッティングにおいても通常使用されるモノクローナル抗体に比べ、かかる修飾核酸分子またはアプタマーは多数の利点を有する。配列に基づく二次構造の形成のために、可能性のある結合リガンドのレパートリーはモノクローナル抗体の調製に利用可能な免疫レパートリーより実質的に広い。
さらに、アプタマーは実質的により迅速に得られ、コスト効果も高い。可能性のある何百万ものリガンドを３〜４週間のうちに試験できる。これに対し抗体産生ハイブリドーマ細胞の調製は実験動物のワクチン注射から始めなければならない。このワクチン注射は数週間続く。これに加え、２００から３００のハイブリドーマ細胞系を試験するには何ヶ月も要する。
【００１５】
生物においてそれらの構造が原因で機能を遂行する細胞外オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドの存在は知られていないので、これらの核酸分子またはアプタマーはまた、抗体による認識を逃れた「通常の」免疫システムの「異常な」エピトープを認識する可能性も有する。
クレームの核酸分子の特に有利な点は、役に立つモノクローナル抗体に対し結合特異性および親和性を示すことである。このためそれらは診断法または薬剤ターゲッティング法で使用されるのに特に好適である。診断法に関しては、意図される方法は特に診断薬がヒトの体の外部で使用されるものである。
【００１６】
診断法の枠組み内で特に好適な診断薬は、例えばフルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光化合物をはじめとするビオチン、ジゴキシゲニンおよびその誘導体、酵素マーカー、赤外線マーカー、ならびにキレート剤が挙げられる。従って、核酸分子に連結された診断薬が上記物質を含んでなる群から選択される方法が特に好ましい。
さらに、組織切片の組織検査における上記の核酸分子の使用法も本発明の一部をなす。
【００１７】
発明者らはクレームの核酸分子を組織学的薬剤として直接使用することができ、これにより組織中の生物標的構造のｉｎ ｓｉｔｕでの局在化が可能となることを認識している。かかる使用法の特定の利点はクレームの核酸分子の複合生物材料、好ましくは内皮細胞に対する最初に言及した特異性である。これにより、バックグラウンドシグナルまたは非特異的交差反応の妨害なしにこれらの組織の特異的染色が可能となる。
【００１８】
該核酸分子が天然複合生物材料に選択的に結合する場合、記載したいずれの方法においても上記の核酸分子の使用が特に好ましい。
発明者らは複雑な天然の生物組織および内皮細胞それぞれに結合する核酸分子を初めて提供する。これに対し、Ｍｏｒｒｉｓらにより提供された配列モチーフはそこで使用された核酸分子またはアプタマーの一部であるが、赤血球細胞膜から人工的に生成された小胞に結合する。この方法で生成された膜の完全性は生理的赤血球細胞膜に必ずしも一致する必要はない。複雑な生物組織のモデルとして赤血球成分を選択することもまた、ここでは適当ではない。赤血球は高度に分化しているという特色を有する。赤血球は生物の他の典型的な細胞とは多数の特性が異なる：タンパク合成をせず、細胞の集合体に統合されず、酸素運搬に関して高度に専門化しているなど。
【００１９】
発明者らは特異的核酸分子を選択するために内皮細胞系の天然細胞を生物材料として使用した。このことは、これらの核酸分子はまたｉｎ ｖｉｖｏでも確実に使用できるという利点を有する。
機能性核酸分子を濃縮するため、発明者らは以下の工程からなる方法を用いた：
ａ）異なる核酸分子ライブラリーを標的構造とともにインキュベートし；
ｂ）機能性核酸分子を選択および濃縮し；
ｃ）選択された核酸分子を単離する。この時、濃縮を調節するために選択された核酸分子の蛍光標識を用いる。
【００２０】
発明者らは特異的核酸分子またはアプタマーを見出すために選択された核酸分子は通常放射性標識によって濃縮する必要はないが、ここでは好適な検出法を組み合わせて蛍光標識を使用できるものと考えている。機能性核酸分子の特異的結合の特性が、かかる蛍光標識により保持できるとは予期されていなかったが、それは好ましくも配列の５’または３’末端で保持されていた。それまで行われていた公知の方法では、連続的な選択ラウンドのプール中の機能性核酸分子はもっぱら濃縮中に取り込まれた放射性ｄＮＴＰのシンチレーション測定により制御されていた。
【００２１】
放射性物質を取り扱う研究と結びついた帰結は、特定の同位元素研究所の建設、廃棄物処理の問題、放射性物質の輸送および保管に関する厳しい規制、健康が損なわれる危険性、高いコストなど、一般に公知である。これらの問題は、蛍光標識のような別の検出技術を用いることにより避けることができる。
新規の濃縮法は極めて経済的であることが証明された。ＦＡＣＳ測定の繰り返しサイクルにより、完全な内皮細胞のそれら本来の環境に埋め込まれている多様な標的に対して同時選択が可能となるのみならず、蛍光標識を用いるＦＡＣＳによりｉｎ ｓｉｔｕにおいて個々の特異的結合アプタマーの評価が可能となる。
【００２２】
上記し、さらに以下にも説明されるかかる特徴は、本発明の範囲内であればそれぞれの場合に示された組合せのみならず他の組合せあるいは単独でも使用できる。
以下、さらなる特徴おより利点を示す実施例を挙げて、本発明を説明する。
実施例１　生物標的構造としての内皮細胞
特異的アプタマー選択のために使用された標的構造は、ラット由来の内皮前立腺細胞系である、細胞系ＹＰＥＮ−１（ＣＲＬ−２２２２， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＵＳＡ）である。この細胞は密集前の内皮細胞層を掻き取ることにより採取する。トリパンブルーで染色後、Ｎｅｕｂａｕｅｒ計数チャンバー中で完全な細胞の数を計数して細胞濃度を見積もる。
実施例２　開始ライブラリー（ｓｓＤＮＡライブラリー）およびプライマー
特異的核酸分子またはアプタマーが選択される合成開始ライブラリー（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ， Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）は、およそ９６ｍｅｒのポリヌクレオチドからなり、プライマーハイブリダイゼーション部位である配列が明らかな１８個のヌクレオチドによって約６０の無作為に連鎖された塩基（６０Ｎ）の両側が挟まれている（５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ−［６０Ｎ］−ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ＴＣＴ−３’）。特異的核酸分子は固相合成（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ａｌａｍｅｎｄａ ＵＳＡ）により合成されるＦＴＩＣ標識およびビオチン標識ＨＰＬＣ精製プライマー（５’−ＦＩＴＣ−１８Ｃ−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ−３’および５’−ＢＢＢ−ＡＧＡ ＴＴＧＣＡＣ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＣＴ−３’、ただし１８Ｃは１８−炭素エチレングリコールスペーサー、「ＦＩＴＣ」および「Ｂ」はそれぞれＦＴＩＣ分子およびビオチン分子）を用いる以下に説明するＰＣＲ法により増幅する。
実施例３　内皮細胞に特異的な核酸分子またはアプタマーの取得
特異的核酸分子を得るには数回の繰り返し選択が必要である。
【００２３】
光保護条件下で以下の工程を実施した。
第１ラウンド
実施例２の開始ライブラリー（１×１０１５配列）の約１．７ｍｏｌのＤＮＡを選択バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）， ５ｍＭ ＫＣｌ， １００ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ＮａＮ３）（第１ラウンドでは１ｍｌ、その後のラウンドでは２００ｍｌ）に溶解する。該ＤＮＡを変性させ（８０℃、１０分）、０℃、１０分間で再生させる。細胞表面および反応血管壁へのポリヌクレオチドの非特異的結合を減少させるため、５モル過剰のｔＲＮＡ（Ｇｉｂｃｏ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をそれぞれの場合に加える。無関係の表面タンパク質に高い親和性を示すＤＮＡ分子を除去するために、該ＤＮＡ溶液を３×１０７ 個のＮ９小グリア細胞とともに３７℃／５％ ＣＯ２で３０分間プレインキュベートする。
【００２４】
この小グリア細胞を遠心分離で除去し、その上清を１０６個のＹＰＥＮ内皮細胞と３７℃／５％ ＣＯ２でインキュベートする。各回１ｍｌの選択バッファー（０．２％ ＢＳＡ添加）で遠心分離して３回洗浄した後、ＰＣＲ法でアプタマーを増幅するため、鋳型として内皮細胞に結合した核酸分子を使用する（タグポリメラーゼおよびｄＮＴＰはＰｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙから入手）。
ＰＣＲ法はＣｒａｅｍｒｉ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ， ”１０（２０）−ｆｏｌｄ ａｐｔａｍｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９３； ２１（１８）： ４４１０の条件に従って行う。使用するプライマーは上記のＦＩＴＣおよびビオチン標識プライマーである。
ＦＩＴＣ標識した一本鎖の取得
蛍光細胞計算法による分析のために、ＦＩＴＣ標識ｓｓＤＮＡを以下のように調製する：磁石スタンド中で適当量の磁気ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ； Ｄｙｎａｌ Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて磁気を帯びた鎖中のｄｓＤＮＡ ＰＣＲ生成物を単離することによりビオチン化した鎖からＦＩＴＣ複合ｓｓＤＮＡを精製し、次いで製造業者の指示に従いアルカリ変性させ、最終容量２００ｍｌの選択バッファー中に採取する。続いてそれぞれの場合に得られたｓｓＤＮＡ溶液を選択ラウンドのためのプールとして供する。
第２および第３選択ラウンド
ポリスチレン製の反応管中で小グリア細胞に対して新規のＦＩＴＣｓｓＤＮＡプールを再びプレインキュベートする。この選択は（同様にポリスチレン製反応管中で）１．５×１０５個の内皮細胞に対して行う。３７℃で３０分間インキュベートした後、０．２％ＢＳＡ添加選択バッファー１ｍｌを用いる３回の洗浄により、特異性の低いＤＮＡ結合およびその５’修飾が結合の欠如を引き起こす配列から該細胞を分離する。内皮細胞−核酸分子複合体の蛍光はフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）で測定する。ｓｓＤＮＡは前ラウンドと同様に増幅する。
第４から第８選択ラウンド
小グリア細胞の再プレインキュベーション（上記）後、１×１０５個の内皮細胞に対してかかる選択を行う。
【００２５】
ポリスチレン製反応管をポリプロピレン製反応管に変えることにより分離マトリックス結合配列を確実に除去する。３０分間のインキュベーションおよび細胞の洗浄（前ラウンドに従う）後、フローサイトメーター（選択ラウンドあたり５０００細胞を計数）で蛍光強度を測定する。上記に従い細胞結合核酸分子をＰＣＲ増幅する。
第８ラウンドのプールからのそれぞれのクローンの取得
第７回目の選択ラウンド（第８ラウンドプール）からの特異的核酸分子を、非修飾プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にクローン化する（ＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。アルカリ溶解によりそれぞれのクローンのプラスミドを単離し、該挿入体（ＰＣＲ生成物）を選択ラウンドと同様に修飾プライマーを用いてＰＣＲ増幅する。上記のように一本鎖が得られる。
【００２６】
このＦＩＴＣアプタマー溶液を用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）および組織結合検査を行い個々の配列の結合特異性を同定する。
ＦＡＣＳ測定
連続的な選択ラウンドにおけるアプタマーの特異的結合および個々のクローンの特異的結合はＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：蛍光活性化細胞選別）により測定する。
【００２７】
細胞は（シグナル産生結果として）、それらの蛍光標識の強度に比例して電磁放射線を放出する。この放射線を検出し、定量する。このように、該放射線により細胞に結合した蛍光標識リガンド量の結果が得られる。蛍光強度をシグナル産生結果の関数としてヒストグラムにプロットする。蛍光増加の方向への強い偏りが、本明細書で用いられた生物標的材料および内皮細胞に対する特異的核酸分子またはアプタマーの高い親和性の尺度となる。
（ａ）連続的選択ラウンドにおけるＦＩＴＣ連結アプタマーのＦＡＣＳ分析
ＦＩＴＣ連結アプタマーの特異的結合を第２回およびそれ以降の選択ラウンドにおいて測定する。核酸分子またはアプタマーを内皮細胞と（上記に従い）インキュベートした後、内皮細胞を選択バッファー（０．２％ＢＳＡ添加）で２回洗浄し、細胞蛍光をＦＡＣＳで測定する。
（ｂ）個々のＦＩＴＣ連結クローンの特異的結合のＦＡＣＳ分析
この目的のために５×１０４のＹＰＥＮ内皮細胞を選択バッファー（１ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ添加；２０分、０℃）とプレインキュベートし、上記のＦＩＴＣ−ｓｓＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ添加；３７℃／５％ ＣＯ２／３０分）とインキュベートする。該細胞を選択バッファー（０．２％ＢＳＡ添加）で２回洗浄し、細胞蛍光をＦＡＣＳで測定する。
組織切片の組織結合検査
得られた個々のＦＩＴＣ修飾核酸分子またはアプタマーの結合を、ラットグリア芽腫の凍結組織切片の組織結合検査により試験する。組織切片を１ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを含む選択バッファーとプレインキュベートする（２０分、４０℃）。プレインキュベートした組織切片を上記のＦＩＴＣ−アプタマー溶液（１ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ添加）で被覆し、室温で４０分間インキュベートする。この組織切片を選択バッファーで２回洗浄し、蛍光顕微鏡検査法により免疫蛍光を定量する。
【００２８】
特異性の高い核酸分子またはアプタマーは、グリア芽腫組織の新しく形成された微小管の選択的染色によりそれら自身を識別し、かつ他の非内皮細胞組織とは最小の交差反応を示すことが分かった。このように該核酸分子は内皮細胞染色のための組織プローブとして特に好適である。
実施例４　（内皮細胞）−特異的抗原に特異的な核酸分子またはアプタマー
以下に示すヌクレオチド配列は上記方法により得られ、本発明の一部をなす。プライマーハイブリダイゼーション部位は実際のアプタマー配列の５’および３’に位置する（太字）。
核酸分子１（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＴＡ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＧＣ ＧＴＴ ＣＧＴ
ＡＡＴ ＣＡＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＧＴ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＴＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子２（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＣＴＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＴＧＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＣＣ ＴＧＣ ＧＣＣ
ＧＴＴ ＧＴＧ ＧＴＣ ＴＧＴ ＴＣＧ ＴＴＧ ＴＴＣ ＴＡＧ ＴＴＧ ＴＴＴ ＴＣ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子３（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＴＧ ＧＧＴ ＴＴＴ
ＴＴＧ ＧＴＧ ＴＡＣ ＧＴＣ ＣＣＴ ＧＴＡ ＡＡＴ ＨＡＧ ＴＴＴ ＣＡＧ ＴＣＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子４（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＡＧ ＴＧＣ ＴＧＡ ＴＴＣ ＣＣＧ ＴＴＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＧＧＴ
ＡＴＣ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＧＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＡＧ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子５（一次構造）
ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＣＡ ＴＡＡ ＣＣＴ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＣＴＧ
ＡＣＴ ＴＴＡ ＧＣＣ ＧＴＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＡＴ ＣＣＣ ＣＴＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子６（一次構造）
５’−−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＧＧ ＴＧＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＧ ＧＴＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＡＴＡ
ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＣＣ ＣＣＧ ＡＴＴ ＴＧＧ ＡＴＧ ＴＡＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＣＧＣ ＧＴＧ ＴＡＴ
ＴＴＴ ＴＧＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＡＡＡ ＧＴＧ ＴＴＧ ＣＴＡ ＣＡ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ＴＣＴ−３’
核酸分子７（一次構造）
５’−−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＡＧＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＧＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＣＴ
ＡＴＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＣＣＡ ＴＴＴ ＡＧＧ ＡＴＴ ＴＴＡ ＴＧＧ ＴＴＧ ＧＧＣ ＧＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ
ＣＡＡ ＴＣＴ−３’
核酸分子８（一次構造）
５’−−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＣＣＣ ＧＣＣ ＴＴＴ ＡＣＴ ＴＧＧ ＧＡＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＡＣＣ
ＧＣＧ ＧＴＡ ＴＡＴ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＧＴ ＴＣＧ ＧＡＧ ＴＴＣ ＴＧＴ ＧＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子９（一次構造）
５’−−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＡＧＧ ＣＧＧ ＴＧＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＧＴ ＡＴＡ
ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＴＴ ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＣＴＡ ＧＴＣ ＧＣＡ ＡＧＡ ＴＡＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−−３’
核酸分子１０（一次構造）
５’−−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＣＴＧ ＴＴＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＣＡＡ ＡＡＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＴＣＡ
ＣＧＴ ＣＣＧ ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＴＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＴＧＣ Ｔ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ
ＣＡＡ ＴＣＴ−３’
核酸分子１１（一次構造）
５’−−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＣ ＴＣＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣ ＴＴＡ
ＴＧＧ ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＣＣＧ ＴＧＣ ＴＴＧ ＴＴＣ ＧＴＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子１２（一次構造）
５’−−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＣ ＣＧＣ ＡＴＡ ＡＴＡ ＡＧＧ ＧＴＡ
ＴＧＴ ＡＴＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＴＧＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＧＡ ＴＧＣ ＣＡＴ Ａ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ
ＣＡＡ ＴＣＴ−３’
核酸分子１３（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＡＣ ＣＴＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＣＣＴ ＴＴＴ
ＴＡＡ ＣＧＴ ＧＧＧ ＧＴＴ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＴＴ Ｇ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子１４（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＣＣ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＧＡＣ ＧＡＴ
ＡＴＧ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＧＡ ＧＧＴ ＧＴＴ ＧＡＧ ＴＴＴ ＡＧＴ ＧＴＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子１５（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＣＧ ＡＴＡ ＡＡＴ ＴＴＴ ＧＣＴ ＡＡＧ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＡＡ
ＧＡＣ ＴＧＴ ＧＴＴ ＣＧＴ ＧＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ＴＣＴ−３’
核酸分子１６（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＴＡ ＣＣＧ ＴＡＧ ＴＴＡ ＧＣＡ ＴＡＴ ＧＴＡ ＧＴＧ
ＴＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ＴＣＴ−３’
核酸分子１７（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＣＧ ＣＣＴ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＡ ＡＣＣ ＣＧＡ ＧＴＧ ＣＴＴ
ＴＧＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子１８（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＣＴ ＴＧＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＴＴ
ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＴＴ ＴＧＣ ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＣＧ ＣＴＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子１９（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＧＧ ＡＣＣ ＣＧＴ ＧＴＴ
ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＴＴＴ ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子２０（一次構造）
５’ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＧＧＴ ＴＧＧ ＡＧＡ ＣＣＴ ＴＡＴ ＴＧＧ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＣＡ
ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＡＡ ＣＣＣ ＣＧＧ ＴＴＴ ＣＣＧ ＴＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ−３’
核酸分子２１（一次構造）
５’−ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＣＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＧＣＣ ＴＴＡ ＧＴＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＧＧＴ
ＴＧＴ ＴＧ ＡＧＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ＴＣＴ−３’
実施例５　特異的核酸分子またはアプタマーの構造モデル
図１は特異的ヌクレオチド配列またはアプタマー配列の仮説の二次構造を示している。種々の「ヘアピンループ」または「ふくらみ」中に位置する活性結合部位が示されている。図に示された核酸分子はリンカー部分（ｎ）を介して５’末端がビオチン標識（ＢＢＢ）されている。黒丸は塩基対を表す。位置情報は、分子中のヌクレオチドの位置を示す。
実施例６　クレームの核酸分子のヒストグラム
図２および図３は見出された核酸分子のＦＡＣＳヒストグラムを表す。蛍光強度（Ｆ）を横軸に任意対数単位でプロットし、縦軸は任意線形単位でプロットされたシグナル産生結果（Ｅ）の数を示す。このヒストグラムは核酸分子配列番号１から２１の標的組織への結合特異性を示す。ヒストグラム中の核酸分子のプロットされた線（配列番号１から２１、太字）の蛍光の強さが増加する方向への移動は、対照と比較してこれらの分子の標的組織に対する親和性が高いことを表している。示された対照は、それぞれの場合においてＦＩＴＣに同様に連結された非特異的１本鎖ＤＮＡを用いた場合の蛍光である（非特異的ｓｓＤＮＡ，灰色）。このように２１個の核酸分子すべてが、使用した内皮細胞に高い親和性を有するという特徴があった。
実施例７　選択ラウンドの複合プール中の核酸分子のヒストグラム
図４において第２（−−−−）、第４（・・・・）および第７（−・−・−・−・−）選択ラウンド由来のアプタマーのプールのＦＡＣＳヒストグラムが重ねてある。プロットされた選択ラウンドのヒストグラムの線のますます強い蛍光方向への移動は、連続的な選択ラウンドのプール中の、結合核酸分子（アプタマー）の特異性が高まっていることを示す。使用した対照はＦＩＴＣに同様に連結された非特異的１本鎖ＤＮＡを用いた場合の蛍光シグナルである（非特異的ｓｓＤＮＡ，灰色）。
実施例８　配列番号９のヌクレオチド配列を含む核酸分子の腫瘍−および「ｐｉｇｐｅｎ」−特異的アプタマーとしての同定
発明者らが行った組織分析から、また実施例３の最後の部分の記載から、ラット脳のグリア芽腫の組織切片中で、すべての新規核酸分子のうち配列番号９のヌクレオチド配列を含む核酸分子が最も強い蛍光シグナルを示し、かつそれは固形腫瘍が成長している領域に特異的であることが分かった。これは図５に示されている。図５の写真Ａでは複雑なグリア芽腫中に埋め込まれている微小管の選択的染色が示されている。ＢにはＤＡＰＩを用いる細胞核の対比染色が示されており、細胞に富む腫瘍領域では上記のアプタマーにより微小管が選択的に標識されるが（写真の右側の明るい糸状構造が染色された微小管を表す）、腫瘍周囲領域の脈管組織は標識されないことを示している（写真の左側）。Ｃでは、ＤＡＫＯ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙで市販されている内皮ＣＤ−３１ ｍＡｂによる二重染色が示されており、両方の蛍光シグナルが重なり、またアプタマー陽性細胞を内皮細胞として決定している。Ｄでは、モノクローナル抗体ＣＤ−３１および非特異的配列−ランダムアプタマーによる染色を行ったが、内皮細胞または脈管付随組織の二重染色とはならず、シグナルの重なりもなかった、Ｅにおいてはピペットチップを用いて合わさった細胞層を傷つけて採取した内皮細胞培養物の染色が示されている。ここでアプタマーは密集前の創傷循環領域において、内皮細胞への結合を有意に増加させた。目盛り線は５０μｍを表す。
【００２９】
本試験は配列番号９のヌクレオチド配列を含むアプタマーが病的な微小管の複雑な構築体を特異的に染色することを示す。ＤＡＰＩを用いる細胞の核の対比染色は細胞に富む腫瘍領域中の微小管を選択的に標的化するが腫瘍周囲領域の脈管組織は標的化しないことを示す。発明者らはさらなる実験で（本明細書には示していない）それぞれのアプタマーでラットの正常脳を染色したところ、内皮細胞または脈管付随組織のいずれもが染色されず、蛍光顕微鏡検査法で検出できなかった。腫瘍組織切片を内皮細胞に向けられたマウスＩｇＧ、例えば上記のＣＤ−３１抗体で染色し、次いでそれぞれのアプタマーで標識することにより、アプタマーの標的が内皮細胞であることが確認された。創傷内皮細胞組織を染色すると、この病変領域においてアプタマーの分子標的の著しいアップレギュレーションが示され、すなわちこれは単一層が合わさった領域に比べて増殖が高まっているとことを特徴とする領域を表す。
【００３０】
配列番号９のヌクレオチド配列を含むアプタマーにより認識された標的を同定するために以下の工程を用いた：１ｍｇ（１００μｌ）の磁気ストレプトアビジンビーズを１ｍｌの選択バッファー中でインキュベート（３０分、室温）（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ， Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）して２００ｐｍｏｌのトリプルビオチン化（ｔｒＢ）アプタマーによりコーティングした。対照として１００μｌの磁気ビーズを２００ｐｍｏｌの非選択ＦＩＴＣ−ｓｓＤＮＡ（ｔｒＢ−９６−ｎｔ）でコーティングした。Ｋｌｏｃｋｅｒ ら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９， ８５１７−８５２７ （１９９９）の記載に従って１．５×１０９個のＹｐｅｎ−１内皮細胞をプロテアーゼ阻害剤存在下で溶解させた。遠心分離後、タンパク質のペレットを４００μｌの選択バッファーに再懸濁し超音波処理（０℃、２０秒）し、非特異的競合剤として１００倍過剰のｔＲＮＡ（２０ｎｍｏｌ）を添加し、アプタマーで被覆した磁気ビーズとともに選択バッファー中でインキュベートした（総容量１．５ｍｌ、０℃、１５分）。このタンパク質−アプタマー−磁気ビーズ複合体を磁石スタンド中で除去し、５回洗浄した（１回目の洗浄：１５０ｍＭのＮａＣｌを含む選択バッファー１ｍｌ；２−５回目の洗浄：１００ｍＭのＮａＣｌおよび２ｎｍｏｌのｔＲＮＡを含む選択バッファー２００μｌ）。３０μｌの１Ｍ ＮａＣｌ中でインキュベート（０℃、３０分）することによりアプタマーでコーティングしたビーズからタンパク質を除去し、クーマシーブルーで染色後ＰＡＧＥにより分析した。
【００３１】
図６は本実験の結果を示す。レーンＡには分子マーカー、Ｂレーンには配列番号９のヌクレオチド配列を含むアプタマーを用いて単離した標的、Ｃレーンには対照として非選択ｓｓＤＮＡ（９６−ｎｔ）を用いて精製した単離物質、Ｄレーンには処理していない内皮細胞が表されている。それぞれのアプタマーを含む反応により単離された標的バンドはアスタリスクにより示され、それは６７ｋＤａのタンパク質であることが同定された。
【００３２】
この標的タンパク質は以下のように同定された：
それぞれのゲル片をゲルから切り取り、例えばＳｈｅｖｃｈｅｎｋｏら， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６８， ８５０−８５８ （１９９６）の記載に従ってトリプシン消化を行った。改変した点を以下に示す：切り取ったバンドを完全に脱染して、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ ８．１）中６７ｎｇ／μｌの濃度のブタトリプシン（配列決定グレード、修飾、Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３７℃で３時間消化した。ペプチドマッピングおよびタンデム質量分析によるトリプシン断片の配列決定に先立って、５０％トリフルオロ酢酸／５０％水溶液、次いで５０％トリフルオロ酢酸／５０％アセトニトリル溶液を用いて該ペプチド混合物をゲルから抽出する。該抽出物を真空乾燥させる。乾燥させたペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸に再溶解させ、Ｃ１８球形シリカ逆相物質（ＺｉｐＴｉｐＣ１８ＴＭ，　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填した既製のピペットチップを用いて精製する。５０％メタノール／１％ギ酸１０μｌを用いて該ペプチドを溶出させ、ナノエレクトロスプレータンデム質量分析（Ｑ−Ｔｏｆ， Ｍｉｄｒｏｍａｓｓ， Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ， Ｅｎｇｌａｎｄ）により配列決定する。
【００３３】
発明者らは配列番号９のヌクレオチド配列を含むアプタマーにより認識される標的に対し論じられた分析を行った。そうすることにより、質量分析またはタンデム質量分析それぞれにより該タンパク質の３つのトリプシンペプチド断片が分析、配列決定された。その結果、かかるアプタマーにより検出された標的はマウス「ｐｉｇｐｅｎ」タンパク質に対する相同体であることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
それぞれ特異的核酸分子またはアプタマーの二次構造の模式図である。
【図２】
クレームの核酸分子のフローサイトメトリーによる核酸分子の特徴を示す。
【図３】
クレームの核酸分子のフローサイトメトリーによる核酸分子の特徴を示す。
【図４】
連続的な選択実験のプール中の該特異的核酸分子またはアプタマーの濃縮を示す。
【図５】
配列番号９のヌクレオチド配列を有する該核酸分子の、ラットグリア芽腫の凍結組織切片の染色を示す。
【図６】
配列番号９のヌクレオチドを有する該核酸分子により認識された標的を分析するためのクーマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルを示す。
【配列表】2004503214.tif 000002
2004503214.tif 000003
2004503214.tif 000004
2004503214.tif 000005
2004503214.tif 000006
2004503214.tif 000007
2004503214.tif 000008
2004503214.tif 000009
2004503214.tif 000010
2004503214.tif 000011
【図１】
2004503214.tif 000012
【図２】
2004503214.tif 000013
【図３】
2004503214.tif 000014
【図４】
2004503214.tif 000015
【図５】
2004503214.tif 000016
【図６】
2004503214.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004503214.tif 000018
2004503214.tif 000019
2004503214.tif 000020
2004503214.tif 000021
2004503214.tif 000022
2004503214.tif 000023
2004503214.tif 000024
2004503214.tif 000025
2004503214.tif 000026
2004503214.tif 000027
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2004503214.tif 000029
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2004503214.tif 000065
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004503214.tif 000066
【国際調査報告】
2004503214.tif 000067
2004503214.tif 000068
2004503214.tif 000069
2004503214.tif 000070
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2004503214.tif 000073
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