(57)【要約】カルシニューリンの触媒サブユニットのスプライスバリアントに基づくカルシニューリンのレギュレーターが提供される。好ましくは、触媒サブユニットは、このサブユニットのβ型、γ型、および／または、α型である、本発明は、レギュレーター、および、好ましくは、カルシニューリン活性の障害に関連する病気の治療のための活性剤として、レギュレーターの刺激活性に影響を及ぼす物質、を含む。
2004535830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシニューリンの触媒サブユニットのスプライスバリアントに基づくことを特徴とする、カルシニューリンのレギュレーター。
【請求項２】
触媒サブユニットが、前記サブユニットのβ型、γ型、および／またはα型であることを特徴とする、請求項１に記載のカルシニューリンのレギュレーター。
【請求項３】
図４（配列番号７、８）、図５（配列番号９、１０）、および／または図６（配列番号１１、１２）に記載のアミノ酸配列と、少なくとも７０％一致するアミノ酸配列を特徴とする、請求項１または２に記載のカルシニューリンのレギュレーター。
【請求項４】
図１（配列番号１、２）、図２（配列番号３、４）、および／または図３(配列番号５、６)に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％一致するヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項１〜３の１項に記載のカルシニューリンのレギュレーター。
【請求項５】
図１（配列番号１、２）および／または図２（配列番号３、４）に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％一致することを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項６】
カルシニューリンのレギュレーターをコードすることを特徴とする、請求項５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
図４（配列番号７、８）および／または図５（配列番号９、１０）に記載のアミノ酸配列と、少なくとも７０％一致することを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項８】
カルシニューリンのためのレギュレーターを形成することを特徴とする、請求項７に記載のアミノ酸配列。
【請求項９】
請求項１〜４の１項に記載のレギュレーターであることを特徴とする、特に病気の治療のための、活性剤。
【請求項１０】
請求項１〜４の１項に記載のレギュレーターに影響を及ぼすことを特徴とする、特に病気の治療のための、活性剤。
【請求項１１】
前記レギュレーターの活性を高めることを特徴とする、請求項１０に記載の活性剤。
【請求項１２】
前記レギュレーターの活性を低下させることを特徴とする、請求項１０に記載の活性剤。
【請求項１３】
前記病気は、カルシニューリン活性の障害に関連することを特徴とする、請求項９〜１２の１項に記載の活性剤であって、好ましくは、前記病気は、神経変性病、心疾患、免疫学的疾患、炎症性疾患、および／または癌である、前記活性剤。
【請求項１４】
病気の治療のための請求項９〜１３の１項に記載の活性剤の使用。
【請求項１５】
請求項９〜１３の１項に記載の少なくとも１つの活性剤を投与することを特徴とする、病気の治療方法。
【請求項１６】
請求項９〜１３の１項に記載の少なくとも１つの活性剤を効果的な量で含み、かつ、少なくとも１つの薬学的キャリアーを含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項１７】
病気の診断のためのカルシニューリンのレギュレーターの使用であって、前記レギュレーターの周波数を分析することを特徴とし、好ましくは、レギュレーターと相互作用する少なくとも１つの物質を使用する、前記使用。
【請求項１８】
前記レギュレーターは、請求項１〜４の１項に記載のレギュレーターであることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記相互作用物質は、レギュレーターに対する抗体であることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記相互作用物質は、レギュレーターをコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブリダイズする、核酸分子であることを特徴とする、請求項１７〜１９の１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記病気は、カルシニューリン活性の障害に関連することを特徴とする、請求項１７〜２０の１項に記載の使用であって、好ましくは、前記病気は、神経変性病、心疾患、免疫学的疾患、炎症性疾患、および／または癌である、前記使用。
【請求項２２】
請求項１〜４の１項に記載のレギュレーターと相互作用する、少なくとも１つの物質を含む、病気の診断用キット。
【請求項２３】
カルシニューリンの活性に影響を及ぼす物質の探索方法であって、カルシニューリンの触媒サブユニットのスプライスバリアントを使用し、スプライスバリアントおよび／またはカルシニューリンと相互作用する物質を同定し、および／または、単離することを特徴とする、前記方法。
【請求項２４】
スプライスバリアントは、請求項１〜４の１項に記載のレギュレーターであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の方法によって同定され、および／または、単離されることを特徴とする、病気の治療のための活性剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシニューリン(Calcineurin)のレギュレーター(regulator)、および、このレギュレーターの使用に関する。
【０００２】
カルシニューリンは、セリン／スレオニン蛋白質ホスファターゼであり、触媒サブユニット（カルシニューリンＡ）と制御サブユニット（カルシニューリンＢ）とからなるヘテロダイマーである。触媒サブユニットは、約６０、制御サブユニットは、約１８ｋＤａである。この蛋白質ホスファターゼは、カルシウムおよびカルモデュリンの制御下にあり、酵素活性のためには、カルシウムとカルモデュリンとの結合が必要である。
【０００３】
両サブユニット、触媒サブユニットおよび制御サブユニットは、異なる遺伝子によってコードされる、異なるイソ型において生じる。哺乳動物では、触媒サブユニットに対する３つの異なる遺伝子（Ａ−α、Ａ−β、Ａ−γ）が特徴付けられている。一般に、このサブユニットは、５つの異なるドメインを有する：現段階では機能が知られていないＮ−末端ドメイン、触媒ドメイン、Ｂ−サブユニット結合ドメイン、カルモデュリン結合ドメイン、および自己抑制ドメイン。
【０００４】
カルシニューリンは、細胞応答に対するカルシウムシグナルの結合(coupling)において、重要な役割を果たす。それは偏在的に発現されるが、各サブユニットの様々なイソ型について、異なる組織発現パターンが説明されている。現在、カルシニューリンは、様々な場面で議論されている。例えば、カルシニューリンは、神経シグナル経路と関連付けられているが、神経機能はほとんど理解されていない。更に、カルシニューリンは、免疫抑制との関連で議論されており、そこでは、カルシニューリンは、Ｔ細胞応答において、転写因子ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子；Nuclear Factor Of Activated T-Cells）を介して作用する。
【０００５】
カルシニューリン活性の制御に関して、この酵素が、カルシウムおよびカルモデュリンによって制御されることが知られている(ルスナク(Rusnak), F. および メルツ(Mertz), P. (2000), Physiol. Rev. 80, 1483-1521)。それは、サイトソルカルシウム発生時のカルシウムとカルモデュリンとの結合によって活性になり、そして、それらの各細胞レセプターとの複合体において、免疫抑制剤サイクロスポリンＡおよびＦＫ ５０６の結合において阻害される。更に、いわゆるカルシプレシン(calcipressin)群のカルシニューリンレギュレーターが説明されている（キングスバリー(Kingsbury), T.J. および クニンハム(Cunningham), K.W. (2000), Genes and Dev. 14, 1595-1604）。また、細胞のレドックス状態は、カルシニューリンの制御と関連付けられている（ワン(Wang)ら (1996) ネイチャー(Nature) 383, 434-437）。
【０００６】
虚血／再潅流傷害から心臓肥大、心不全、卒中、筋萎縮性側索硬化症、変性運動ニューロン疾患(degenerative motor neuron disease)、骨格筋疾病およびてんかんまでの範囲の様々な機能障害における、カルシニューリン発現、活性、および組織分布の変化が説明されている。
【０００７】
カルシニューリンは、心不全および卒中のような広範な疾患において、きわめて重要な役割を果たすので、カルシニューリンの活性に関する制御機構は、特に興味深い。制御機構の詳細な知見は、特に、病気の状態において、カルシニューリンの活性に影響を及ぼす可能性を示し得る(would provide a possibility)。よって、本発明は、このきわめて重要な酵素の活性に影響を及ぼすための適当なターゲットを提供すること、および、カルシニューリン活性の障害に関連する病気の治療のための活性剤を提供することを目的とする。
【０００８】
この目的は、請求項１に記載のカルシニューリンのレギュレーターによって解決される。このレギュレーターの好ましい態様を、従属項である請求項２〜４に記載する。対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、請求項５〜８に記載する。請求項９〜１３に、病気の治療のための活性剤を記載する。請求項１４〜１６は、前記活性剤の使用、病気の治療方法、および、薬学的組成物に関する。請求項１７〜２２は、病気の診断のためのレギュレーターの使用、および、対応するキットに関する。請求項２３〜２５は、物質の探索方法、および、それにより得られる(resulting)活性剤を記載する。これにより、すべての請求項の文言は、本明細書に参照として含まれる(The wording of all claims is hereby made to the content of the specification by reference)。
【０００９】
本発明は、カルシニューリンの触媒ユニットのスプライスバリアント(splice variant)に基づく、カルシニューリンのレギュレーターを含む。完全サブユニットと比べて、このレギュレーターは、完全サブユニット、触媒ドメインおよびカルシニューリンＢ結合ドメイン（the catalytic and the Calcineurin B binding domain）を欠いているので、それ自体は、ホスファターゼ活性を持たない。それは、Ｎ末端ドメインの一部、および、完全カルモデュリン結合ドメイン、ならびに、自己抑制ドメインを保持している。本発明のレギュレーターは、特に、低カルシウム濃度において、カルシニューリンのホスファターゼ活性を刺激し得る。スプライスバリアント自体は、カルシウムに結合する。従って、スプライスバリアントの刺激活性は、特に驚くべきものである。なぜなら、スプライスバリアントとカルシニューリンとは、カルシウムのために競争すると考えられていたからである。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、スプライスバリアントは、カルシニューリンと、特に、触媒性カルシニューリンホロ酵素と、蛋白質複合体を形成する。カルシニューリンとスーパーオキシド・ジスムターゼ(superoxide dismutase)との蛋白質複合体が特に好ましい。
【００１１】
一般に、スプライスバリアントの刺激効果は、低カルシウム濃度に依存する。好ましくは、これらのカルシウム濃度は、１ｍＭ以下(below 1mM)である。天然条件下でのスプライスバリアントの推定される機能は、カルシニューリンを、カルシウムに対してより感受性の高い酵素にすることであり、これにより、低カルシウム濃度であっても、カルシニューリン関連シグナル経路がもたらされる(triggering)。本発明のスプライスバリアントは、低カルシウム濃度においてもカルシニューリン活性を保証する、更なる制御メカニズムをもたらす。
【００１２】
先に略述したように、カルシニューリンの触媒サブユニットのイソ型は３つある。本発明の好ましい態様において、カルシニューリンのレギュレーターは、触媒サブユニットのβ型、γ型、および／またはα型に基づいている。異なるイソ型のスプライスバリアントは、２つの形、（ａ）および（ｂ）、においてそれぞれ生じ、図１〜６に示すように、一方の形の（ｂ）は、１０アミノ酸残基に対する３０ヌクレオチドが欠けている。特に好ましい態様において、レギュレーターは、β型（配列番号７、８）、γ型（配列番号９、１０）、および／またはα型（配列番号１１、１２）のスプライスバリアントのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、特に、少なくとも９０％一致したアミノ酸配列を特徴とする。好ましくは、本発明のレギュレーターは、β型（配列番号１、２）、γ型（配列番号３、４）、および／またはα型（配列番号５、６）のスプライスバリアントをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、特に、少なくとも９０％一致したヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１３】
更に、本発明は、スプライスバリアントのβ型のアミノ酸配列を表し、および／または、スプライスバリアントのγ型のアミノ酸配列を表す、図２に記載のヌクレオチド配列（配列番号３、４）と、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、特に、少なくとも９０％一致する、図１に記載のヌクレオチド配列（配列番号１、２）と、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、特に、少なくとも９０％一致したヌクレオチド配列を含む。好ましくは、これらのヌクレオチド配列は、カルシニューリンのレギュレーターをコードする。
【００１４】
また、本発明は、スプライスバリアントのβ型のアミノ酸配列を表し、および／または、スプライスバリアントのγ型のアミノ酸配列を表す、図５に記載されている（配列番号９、１０）、図４に記載のアミノ酸配列（配列番号７、８）と、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、特に、少なくとも９０％一致したアミノ酸配列を含む。
【００１５】
更に、本発明は、特に、病気の治療のための活性剤を含む。ここで、活性剤は、前記のカルシニューリンのレギュレーターである。本発明のレギュレーターは、カルシニューリンのホスファターゼ活性を刺激し得るので、その活性剤は、カルシニューリン活性の低下を伴う病気、例えば、アルツハイマー病または筋萎縮性側索硬化症、の治療のために特に有用である。
【００１６】
本発明の別の態様において、先に記載したようなカルシニューリンのレギュレーターに影響を及ぼす、病気の治療のための活性剤が提供される。ある態様において、前記活性剤は、カルシニューリンのレギュレーターの活性を高める。そのような活性剤は、低カルシニューリン活性を伴う病気の治療に、特に有用である。別の態様において、活性剤は、カルシニューリンのレギュレーターの活性を低下させる。そのような活性剤は、カルシニューリン活性の増加を伴う病気の治療に、特に有用である。
【００１７】
好ましくは、活性剤は、レギュレーターと相互作用することにより、その刺激活性を阻害する物質である。別の態様において、活性剤は、機能レギュレーターと基質のために競争し、および／または、機能蛋白質複合体の形成に影響を及ぼす、レギュレーターの不活性変異体である。そのような機能蛋白質複合体は、カルシニューリンおよびレギュレーター、および／または、スーパーオキシド・ジスムターゼ、および／または、他の成分から構成され得る。
【００１８】
カルシニューリンのレギュレーターの活性を低下させる活性剤によって効果的に治療され得る病気の一例は、心疾患である。例えば、カルシニューリンが、心不全の器官の組織において、正常な組織中の約４倍多いことが記載されている。刺激剤の活性を低下させる活性剤、即ち、前述のカルシニューリンのレギュレーター、の投与によって、病的状態が和らげられる(counteracted)。
【００１９】
本発明の別の態様において、カルシニューリンのレギュレーターの役割(part)は、カルシニューリンの刺激であり、それにより、フィードバックメカニズムにおけるカルシウムチャンネルが閉じられ、必要とされるカルシウム流入が止められるため、カルシニューリンの活性はなくなる。レギュレーターの活性を低下させる、本発明の剤、即ち、カルシニューリンの刺激剤、を添加することにより、フィードバックメカニズムは停止する。従って、カルシウムチャンネルは開いたままであり、カルシウム流入が続き、カルシニューリン活性が維持される。従って、カルシニューリンのレギュレーターの活性を高める活性剤が選択されるか、または、前記活性を低下させる活性剤が選択されるならば、それは、治療されるべき病気の所定の状態(circumstances)に依存する。一般に、例えば、心疾患、ならびに／または、てんかんのような神経変性病、または、筋萎縮性側索硬化症、ならびに、骨格筋疾患、免疫学的疾患、炎症性疾患、および／もしくは、癌のような他の疾患は、本発明による活性剤による治療のための好ましい候補(candidates)である。
【００２０】
一般に、すべてのＣＮＡ類（α、βおよび／またはγのいずれか）、更に、ＣＮＡ類の活性に影響を及ぼす活性剤も同様に、アポトーシスに影響を及ぼすために使用され得る。例えば、ＣＮＡ類の活性化剤（およびＤＮＡ類自体）は、アポトーシスの強力な刺激剤であるのに対し、ＣＮＡ類の阻害剤（および変性ＣＮＡ類自体）は、アポトーシスの強力な阻害剤として使用され得る。
【００２１】
本発明によれば、ＣＮＡ類の活性化剤は、例えば、問題のある細胞においてアポトーシスを引き起こすことによって、例えば、癌、免疫疾患、神経系疾患、心臓病および心疾患、ならびに／または、炎症性疾患を治療するための治療剤として（例えば、治療用蛋白質として）使用され得る。既に記載した本発明の活性化剤に加えて、例えば、遺伝子操作したＣＮＡ類および／またはＣＮＡ類自体（ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列）も、アポトーシスの活性化剤として使用され得る。
【００２２】
一方、ＣＮＡ類（α、βおよび／またはγのいずれか）の阻害剤は、問題のある細胞においてアポトーシスを防ぐことによって、例えば、癌、免疫疾患、神経系疾患、心臓病および心疾患、ならびに／または、炎症性疾患を治療するための治療剤として使用され得る。本発明のそのような阻害剤は、既に記載したものに加えて、例えば、ＣＮＡ類のアンチセンス配列（類）および／またはＣＮＡ類に対する抗体であり得る。
【００２３】
更に、本発明は、病気の治療のための前述の活性剤の使用、および、前述の本発明の活性剤を少なくとも１つ投与する、病気の治療方法、を含む。前記使用および前記方法の更なる詳細については、前述の説明を参照のこと。
【００２４】
また、本発明は、前述の活性剤の少なくとも１つを効果的な量で含み、かつ、少なくとも１つの薬学的キャリアーを含む、薬学的組成物を含む。治療されるべき病気の状態に応じて、薬学的組成物は、例えば、局所または全身投与される。
【００２５】
更に、本発明は、生体内での前記レギュレーターの周波数(frequency)を分析する、病気の診断のためのカルシニューリンのレギュレーターの使用を含む。先に略述したように、いくつかの病気は、病気でない状態と比べた場合、カルシニューリンの活性の増加または減少を伴う。多くの場合には、このカルシニューリン活性の変化は、前述のスプライスバリアントに基づく、カルシニューリンのレギュレーターの活性および／または周波数の変化によって引き起こされる。例えば、後述の実施例で詳述するように、筋萎縮性側索硬化症のための動物モデルにおいて、カルシニューリンＡのβ型の本発明のスプライスバリアントは、正常な動物におけるよりもはるかに強く発現される。従って、本発明は、それぞれの病気の診断のための、特に、病気の初期診断における、レギュレーターの使用を含む。本発明の使用の好ましい態様において、カルシニューリンのレギュレーターと相互作用する、少なくとも１つの物質が使用される。カルシニューリンのレギュレーターは、前述のレギュレーターであることが好ましい。
【００２６】
本発明の使用の好ましい態様において、前記相互作用物質は、好ましくは、蛋白質−蛋白質または蛋白質−ペプチド相互作用のレベルで、レギュレーターと相互作用する抗体である。一般に、当業者に明らかなように、レギュレーターに特異的な抗体、例えば、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体が、本発明の方法に適している。本発明の使用の好ましい態様において、特異的な抗体は、診断試験の迅速かつ容易な実施を可能にするアレイ上に置かれる。例えば、抗体は、免疫診断の分野において知られている、ディップスティック(dip stick)上に置かれる。
【００２７】
本発明の使用の別の好ましい態様において、相互作用物質は、レギュレーターをコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子である。そのようなハイブリダイゼーションプローブは安価で入手容易であり、かつ、診断試験は一般的な方法によって行われ得るので、この態様は、特に好ましい。例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、即ち、レギュレーターをコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子、を、ＤＮＡチップ上に載せ、そして、完全な診断反応を、自動化された方法で行うことが好ましい。この態様において、本発明の使用は、異なる病気の迅速な診断に特に有用である。
【００２８】
前記病気の好ましい例は、カルシニューリン活性の障害に関連する。例えば、前記病気は、筋萎縮性側索硬化症のような神経変性病であり、および／または、前記病気は、心不全のような心疾患である。また、免疫学的疾患、炎症性疾患、および／または癌も、カルシニューリン活性の障害に関連する病気の例である。
【００２９】
更に、本発明は、カルシニューリンのレギュレーターと相互作用し得る物質を少なくとも１つ含むキットを含む。このキットは、前述の診断のために特に有用である。前記キットの好ましい態様において、キットは、レギュレーターに対して特異的な抗体を少なくとも１つ含む。キットの別の態様において、キットは、レギュレーターをコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブリダイズし得る、少なくとも１つの核酸分子を含む。
【００３０】
更に、本発明は、カルシニューリンの活性に影響を及ぼす物質の探索方法を含む。この方法は、カルシニューリンの触媒サブユニットのスプライスバリアントを、スプライスバリアント自体および／もしくはカルシニューリンと相互作用し得る物質を同定し、ならびに／または、単離するために使用することを特徴とする。この方法の好ましい態様において、カルシニューリンの活性はインビトロで測定され、それにより、おそらく、レギュレーターを介してカルシニューリンの活性に影響を及ぼす、（対照としての）更なる物質を用いて、または用いずに、レギュレーターの影響が分析される。この方法の別の好ましい態様において、少なくとも、カルシニューリン、レギュレーター、およびおそらくカルシニューリンの活性に影響を及ぼす物質との間の複合体形成が、読み出し(read-out)システムとして使用される。この方法において使用されるレギュレーターの更なる詳細については、前述の記載を参照のこと。
【００３１】
最後に、本発明は、前記方法によって同定され、および／または、単離される、病気の治療のための活性剤を含む。
【００３２】
本発明の記載した特徴および更なる特徴は、実施例および従属項と併せて、以下の図面の説明から、より詳細に理解され、それにより、個々の特徴のそれぞれが、単独で、またはお互いに組み合わせて理解されるであろう。
【００３３】
図面において、以下のことが示される：
図１：カルシニューリンＡのβ型の本発明のスプライスバリアントのヌクレオチド配列、このスプライスバリアントの更なる変異体は、ヌクレオチド２６８から２９７が欠けている。
【００３４】
図２：カルシニューリンＡのγ型の本発明のスプライスバリアントのヌクレオチド配列、このスプライスバリアントの更なる変異体は、ヌクレオチド２３２から２６１が欠けている。
【００３５】
図３：カルシニューリンＡのα型の本発明のスプライスバリアントのヌクレオチド配列、このスプライスバリアントの更なる変異体は、ヌクレオチド２４４から２７３が欠けている。
【００３６】
図４：カルシニューリンＡのβ型の本発明のスプライスバリアントのアミノ酸配列、このスプライスバリアントの更なる変異体は、アミノ酸残基９０から９９が欠けている。
【００３７】
図５：カルシニューリンＡのγ型の本発明のスプライスバリアントのアミノ酸配列、このスプライスバリアントの更なる変異体は、アミノ酸残基７８から８７が欠けている。
【００３８】
図６：カルシニューリンＡのα型の本発明のスプライスバリアントのアミノ酸配列、このスプライスバリアントの更なる変異体は、アミノ酸残基８２から９１が欠けている。
【００３９】
図７：カルシニューリンＡ−αのＰＣＲ増幅。カルシニューリンｃＤＮＡ類を、ネステッド(nested)ＰＣＲによって増幅し、アンプリコンを０．８％アガロースゲル上で分離した。１．６ｋｂの既知の転写物のほかに、約４５０ｂｐの更なるスプライスバリアントが検出された。
【００４０】
図８：カルシニューリン（ＣＮ）Ａα１６Ｋのドメインおよびエキソン構造。配列は、エキソン１、１１、１２、１３および１４からなり、かつ、Ｎ−末端ドメインの一部、カルモデュリン結合ドメイン、および自己抑制ドメインを含む。触媒ドメイン（エキソン２−８）およびカルシニューリンＢ結合ドメイン（９＋１０）は欠けている。ＣＮ Ｂ：カルシニューリンＢ結合ドメイン；ＣａＭ：カルモデュリン結合ドメイン；ＡＩ：自己抑制ドメイン、
【００４１】
図９：カルシニューリンの免疫ブロット。１：ウシ脳カルシニューリン（シグマ(Sigma)）、２：Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシド・ジスムターゼによってプルダウンした(pulled down)ウシ脳カルシニューリン（ウシ脳ＣＮＡ、シグマ(Sigma)、とのインキュベーション前に、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤを、ＮｉＮＴＡ−磁気ビーズと結合させた。）、３：ヒト組換え型ＳＯＤ、４−９：ネズミ脊髄蛋白質抽出物、４、５、および８番目のレーン：サイトソル画分、５、７、および９番目のレーン：ペレット画分、４−７番目のレーン：野生型、８および９番目のレーン：ヒト突然変異Ｃｕ／ＺｎＳＯＤのために組み換えられたマウス。１から３は、モノクローナルマウス抗カルシニューリンＡ抗体によって目に見えるようになり、４および５は、ウサギ抗カルシニューリンＡαによって、６から９は、ウサギ抗カルシニューリンＡβ抗体（ケミコン(Chemicon)、テメキュラ(Temecula)、USA）によって目に見えるようになった。
【００４２】
図１０：ＣＮＡα１６Ｋによるホスファターゼ活性の活性化は、カルシウム(Ca)依存性である。カルシニューリンアッセイを、以下に記載するように行った。ＥＤＴＡの添加によって、フリーのＣａの異なる濃度を達成した。値を、平均＋／−標準偏差として示す。Ｎ＝７。**ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定(Student's t test)による対照ＣＮ活性とは大幅に異なる。
【００４３】
図１１：プレインキュベーションは、ＣＮＡα１６Ｋの有効性を高める。カルシニューリン活性アッセイを、以下に記載するように行った。プレインキュベーションは、基質添加前に、標準的なＣＮおよびＣＮＡα１６Ｋが添加され、３０分間インキュベートされたことを示すのに対し、プレインキュベーションなしに、両蛋白質は、基質添加直前に添加された。値を、平均＋／−標準偏差として示す。Ｎ＝７。**ｐ＜０．０２、スチューデントｔ検定による対照ＣＮ活性とは大幅に異なる；**ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定による対照ＣＮ活性とは大幅に異なる。
【００４４】
図１２：カルシニューリンＡα１６Ｋと標準的なカルシニューリンとの直接相互作用。１：カルシニューリンポジティブコントロール。２：バクテリアコントロール溶出物を、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズと結合させ、ウシ脳ＣＮ（シグマ(Sigma)）をプルダウンするために使用した。３：ＣＮＡα１６Ｋによるカルシニューリンのプルダウン(pull-down)（ＣＮＡα１６Ｋを、ウシ脳ＣＮ、シグマ(Sigma)、によるインキュベーション前に、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズと結合させた）。４:ＣＮＡα１６Ｋによる脊髄ホモジェネート(homogenate)のプルダウン（ネズミ脳ホモジェネートとのインキュベーション前に、ＣＮＡα１６Ｋを、ＮｉＮＴＡ磁気ビーズと結合させた）、５：バクテリアコントロール溶出物を、Ｎｉ−ＮＴＡ磁気ビーズと結合させ、脊髄ホモジェネートをプルダウンするために使用した。
【００４５】
実施例：
以下の実施例の説明において、カルシニューリンＡのα型の本発明のスプライスバリアントのクローニングおよび生化学的特徴付けを示す。この新規な短いスプライスバリアントは、触媒ドメインおよびカルシニューリンＢ結合ドメインを欠いている。エキソン１１−１４を含む、この短いｃＤＮＡの翻訳産物は、スーパーオキシド・ジスムターゼによってプルダウンしたカルシニューリンのウエスタンブロットにおけるカルシニューリンＡポジティブ免疫反応性によって判断される(aspected)サイズ範囲において、および、ネズミ脊髄抽出物において、検出された。カルシニューリンＡの他のイソ型のＮ末端領域においてエピトープを認識する異なる抗体を使用して、野生型マウスの脊髄において、対応する短いカルシニューリン変異体を検出した。特に、本発明のスプライスバリアントは、メンブレン画分において、特に、核のメンブレン画分において検出された。
【００４６】
しかし、それ自体はホスファターゼ活性が欠けているにもかかわらず、標準的なカルシニューリンへこれらのスプライスバリアントを添加すると、カルシニューリンのホスファターゼ活性は増加する。この刺激効果は、Ｃａ−依存性であり、低カルシウム濃度においてのみ見られる。従って、スプライスバリアントの考えられ得る(possible)機能は、カルシニューリンを、よりカルシウム感受性が高い酵素にすることにより、低カルシウム濃度であっても、カルシニューリン関連シグナル経路、例えば、ＮＦ−ＡＴを介した転写活性化、をもたらすことである。その結果、脱リン酸化のようなカルシニューリンによって制御されるフィードバックメカニズム、およびそれによるグルタメートレセプターの閉鎖(closing)は、有毒なカルシウム流入を低減させるようである。例えば、筋萎縮性側索硬化症について、本発明のスプライスバリアントは、カルシウム流入に対する細胞の感受性(susceptibility）を高めることができ、そのため、例えば、筋萎縮性側索硬化症、ならびに、ニューロンのアポトーシス、卒中、および心不全におけるカルシウム関連シグナルへの影響の、少なくとも部分的な原因となる。
【００４７】
後に示すように、本発明のスプライスバリアントの刺激効果は、スプライスバリアントがカルシニューリンとプレインキュベートされる場合に高まる。これは、スプライスバリアントと標準的なカルシニューリンとの間の直接的な物理的相互作用の検出によっても強化される、時間依存性メカニズムを示す。おそらく、本発明のスプライスバリアントの効果は、カルモデュリンを介して働き、例えば、カルシニューリン−カルモデュリン複合体を安定化することによりカルモデュリンの活性化効果を高める。
【００４８】
１．材料および方法
１．１  カルシニューリンＡαクローニング
クロンテック(Clontech)、パロ・アルト(Palo Alto)、カリフォルニア、からのヒト脊髄ポリ−Ａ+−ＲＮＡから、ネステッドＰＣＲによって、カルシニューリンＡαを増幅した。ＰＣＲは、２５μｌ容量において行った。それらは、２．５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（ストラタジーン(Stratagene)）、０．２５μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ−ミックス、０．２５μｌのＣＮＡ−ｓ１プライマー（１０μＭ）、０．２５μｌのＣＮＡ−ａｓ１プライマー（１０μＭ）、２．５μｌのｃＤＮＡ、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ(Promega)）、０．２５μｌのＰｆｕポリメラーゼ、および更に(ad)２５μｌの蒸留水を含んでいた。９５℃での３分間の第一加熱段階によって、ＰＣＲを開始した。増幅条件は、９５℃での４０秒の変性、５５℃での４０秒のアニーリング、および７２℃での３分の伸長の３５サイクルであった。７２℃での１０分間の延長(extension)段階によって、ＰＣＲを終了させた。
【００４９】
上記のように、プライマーＣＮＡ−ｓ２およびＣＮＡ−ａｓ４を含む２．５μｌの第一増幅反応物(amplification reaction)によって、ネステッドＰＣＲを行った。増幅条件は、９５℃での４０秒の変性、５５℃での４０秒のアニーリング、および７２℃での３分間の伸長の２５サイクルであった。７２℃での１０分間の延長段階によって、ＰＣＲを終了させた。
【００５０】
プライマー配列は
【化１】
2004535830.tif 000003
【００５１】
得られたアンプリコンを、Bam HIおよびXma Iによって消化し、電気泳動し、製造者の勧めに従い、Qiaquickゲル抽出キット（キアゲン(Qiagen)、ヒルデン(Hilden)、ドイツ）によるゲル電気泳動後に精製した。消化したアンプリコンを、Bam HIおよびXma Iによって消化したｐＱＥ３０ベクター（キアゲン(Qiagen)、ヒルデン(Hilden)、ドイツ）にライゲートした。得られたクローンを、完全に配列決定した。
【００５２】
１．２  ＣＮＡα１６Ｋクローンの発現および精製
得られたプラスミドｐＱＥ３０Ｋ１６を、Ｍ１５バクテリアに形質転換し、ポジティブクローンを、強く振とうしながら、３７℃で一晩、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種させた。翌朝、０．５ｍｌのバクテリアを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１リットルに接種させ、バクテリアが０．５〜０．７のＯＤ600に達した後、最終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるように、ＩＰＴＧを培養物に添加した。４時間後、５，０００ｇ、２０分間の遠心分離によって、バクテリアをペレット化し、そのペレットを、−８０℃で一晩凍結させた。
【００５３】
凍結させたペレットを、氷中で１５−３０分間解凍し、湿潤重量１グラム当たり２．５ｍｌで、溶解バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））中に、細胞を再懸濁させた。最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチームを添加し、氷上で３０分間、細胞をインキュベートし、次いで、１０秒間、氷上で６回、細胞を超音波処理した。４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心分離することによって、細胞デブリをペレット化し、上清を、Ｎｉ−ＮＴＡの５０％スラリー１ｍｌと混合した。
【００５４】
６０分間、４℃で、穏やかに撹拌しながら、混合物をインキュベートし、カラムに導入した。
【００５５】
４ｍｌの洗浄バッファー（５０ｍＭのNaH2PO4、300mM NaCl、50mM イミダゾール (pH8.0))によって３回、カラムを洗浄した後、１．６ｍｌの溶出バッファー(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、500mM イミダゾール(pH8.0))によって、蛋白質を溶出した。溶出後、限外濾過(セントレックス(centrex) UF-2、シュライシャー・アンド・シュエル(Schleicher & Schuell)、ダッセル(Dassel))によって、バッファーを交換した。
【００５６】
１．３  ウエスタンブロッティング
１２％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、標準的なプロトコルに従い、ニトロセルロースメンブレンへ、蛋白質を移した。製造者の勧めに従い、シグマ(Sigma)からのモノクローナルマウス抗カルシニューリンＡ抗体（希釈率１：４０００）、ケミコン(Chemicon)からのポリクローナルウサギ抗カルシニューリンＡベータおよびアルファ抗体（希釈率１：１０００）、ならびに、アマシャム・ファルマシア(Amersham Pharmacia)からの二次ＨＲＰ結合(conjugated)ヒツジ抗マウスおよびロバ抗ウサギ抗体（希釈率１：１０００）を用いて、免疫検出を行った。アマシャム・ファルマシア(Amersham Pharmacia)からのＥＣＬプラスキットを用いて検出を行った。
【００５７】
１．４  カルシニューリン活性アッセイ
カルシニューリン活性アッセイキット（カルバイオケム(Calbiochem)、パロ・アルト(Palo Alto)、USA）を用いて、カルシニューリン活性をアッセイした。簡単に言えば、脱塩カラムによってカルシニューリンを脱塩した後、５μｌの精製したカルシニューリン（シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)、ダイセンホフェン(Deisenhofen)、ドイツ）を、２５μｌの２×アッセイバッファー（100mM NaCl, 50mM Tris, 6mM MgCl2, 0.5mM CaCl2, 0.5mM DTT, 0.25% NP-40, 0.25μM カルモデュリン）、５μｌのＣＮＡα１６Ｋ溶液（１．５μｇ／μｌ）を含むか、または含まない、１０μｌの基質溶液（150μM RII ホスホペプチド）に添加した。３０分後、１００μｌのグリーン(Green)試薬を添加することによって、反応を停止し、更に１５分経過後、２６０ｎｍでの吸収を測定した。ホスファターゼ標準曲線を用いて、放出されたホスファターゼを算出した。活性のカルシウム感受性の検出のために、最終濃度が５ｍＭ（フリーのカルシウム：５μＭ）および１．５ｍＭ（フリーのカルシウム：６５μＭ）となるように、２×アッセイバッファーへ、ＥＤＴＡを添加した。WEBMAXC v. 2.1 (スタンフォード(Stanford)、USA)によって、フリーのカルシウムを算出した。
【００５８】
１．５  プルダウンアッセイ
ＣＮＡα１６Ｋの精製後、限外濾過によってバッファーを交換し、イミダゾールを除去した。アッセイのために、４℃で１６時間、５０μｇのＣＮＡα１６Ｋを含むバッファーＡ(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH8.0)を、５０μｌのＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（キアゲン(Qiagen)、ヒルデン(Hilden)、ドイツ）、および、１０μｇの精製したウシ脳カルシニューリン（シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)、ダイセンホフェン(Deisenhofen)、ドイツ）または１００μｌのネズミ脳ホモジェネートを添加したか、または添加していない、３００μｌのバッファーＡとともにインキュベートした。バクテリアからの対応する溶出画分を、ｐＱＥ３０のみによって形質転換し、ＣＮＡα１６Ｋと完全に同様に処理し、ＣＮＡα１６Ｋのための対照として使用した。
【００５９】
結合後、一定に振とうしながら（１０００ｒｐｍ、４℃）、５００μｌのバッファーＡによって、３０分間、２回、ビーズを洗浄し、１００μｌのバッファーＣバッファー（50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 500mM イミダゾール, pH8.0）によって溶出を行った。ウエスタンブロッティングによってカルシニューリンを検出した。
【００６０】
１．６  カルシニューリンＡβクローニング
真核生物発現ベクターへのカルシニューリンスプライスバリアントＣＮＡβＫ１６（配列番号７、図１、図４）のクローニング：
以下のプライマーを使用して、原核生物発現ベクターｐＱＥ３０Ｋ１６から、カルシニューリンスプライスバリアントを増幅した：
【化２】
2004535830.tif 000004
または、
【化３】
2004535830.tif 000005
および、両方のケースにおいて、
【化４】
2004535830.tif 000006
【００６１】
製造者の勧めに従って、組み換えによって、アンプリコンを、真核生物発現ベクターｐＤＥＳＴ １２．２に挿入した。得られたクローンを配列決定し、Ｈｉｓ−タグ型については、pEXP12-K101と、非タグ型については、pEXP12-K105と命名した。
【００６２】
１．７  アポプトース(Apoptose)アッセイ
Ｈｅｌａ細胞（セルビックス・カルシノーマ(Cervix Carcinoma)）におけるＴＮＦによって誘発されたアポトーシスを、癌細胞におけるアポトーシスのモデルとして使用したが、それは、原則として、神経細胞、免疫細胞、心筋細胞、および他の組織においても重要である[セル(Cell) 1996 Nov. 1； 87 (3): 565-76, ＴＮＦレセプター１エフェクター機能の詳細な分析(Dissection of TNF receptor 1 effector functions)：ＪＮＫ活性化は、アポトーシスとは関係ないが、ＮＦ−カッパＢ活性化は、細胞死を防ぐ(JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death)。 リウ(Liu) ZG、ハシュ(Hsu) H、ゲデル(Goeddel) DV、カリン(Karin) M.]。プラスミド(pEXP12-K101もしくはpEXP12-K105)を含むいずれかのＣＮＡβ１６Ｋによって、または、空の(empty)ｐＣＤＮＡ３ベクターを含むか、もしくはプラスミドをまったく含まない対照として、Ｈｅｌａ細胞をトランスフェクトした。ＴＮＦによって、細胞アポトーシスを誘発した(10 ng/ml、トランスフェクションの４８時間後)。各ケースにおいて、細胞を、ＬａｃＺを発現するＣＭＶ−β−プラスミド(CMV-β-plasmid expressing LacZ)とともにトランスフェクトした。よって、ＬａｃＺポジティブ（青）細胞を数えることによって、細胞生存率を試験することができる。トランスフェクションの２４時間後に、Ｘ−Gal染色によって試験された、ＬａｃＺポジティブ細胞の減少は、アポトーシスによる細胞死を示す。
【００６３】
１．８  蛋白質抽出
２×均質化バッファー（500 mM スクロース、4mM EDTA、0.02 % β-メルカプトエタノール；500 μl/100 mg 組織）へ、凍結した脊髄組織を移した。プロテアーゼに対する保護のために、1/10 volのＰＭＳＦ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびロイペプチン（１ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれ添加した、最後に、蒸留水によって、組織１００ｍｇ当たり１０００μｌに容量を平衡化した。この溶液中で、ガラス製ホモジェナイザーによって、組織を均質化し、次いで、カップに移した。これらのカップを、４℃、１４，０００ｇで３時間遠心分離し、粒子（不溶物）を含む画分から、可溶物を分離した。遠心分離後、可溶性画分を新たなカップに満たした。十分な量の２×均質化バッファーによって、粒子を含むカップを満たした。標準としてウシ血清アルブミンを用いて、バイオラド(BioRad)蛋白質アッセイ試薬によって、両画分の蛋白質含有量を決定した。
【００６４】
２．結果
２．１  新規カルシニューリンＡαスプライスバリアントのためのｃＤＮＡの特徴付けおよび構造
ヒト脊髄ポリ−Ａ+−ＲＮＡ（クロンテック(Clontech)、パロ・アルト(Palo Alto)、USA）から、ネステッドＰＣＲによって、カルシニューリンＡαスプライスバリアントを増幅した。１．６ｋｂの強いバンドは、カルシニューリンＡαスプライスバリアントに対する転写物を示していた。実際に、クローニングおよび配列決定から、１．６ｋｂのバンドは、エキソン１３の選択的スプライシングによって３０塩基対異なる２つのスプライスバリアントからなることが示された。また、約４５０ｂｐに、より小さなバンドが得られ、次いで、それを単離してクローニングした（図７）。配列決定により、このアンプリコンが、カルシニューリンＡαのコーディング塩基対１−５７および１１５８−１５３３と１００％の同一性を示す、４３８塩基対のオープンリーディングフレームを取り囲んでおり、それにより、カルシニューリンＡα遺伝子のエキソン１、１１、１２、１３、および１４を表す(representing)ことが示された（図３）。ＣＮＡα１６Ｋと命名されたｃＤＮＡは、１５，５２２ダルトンの算出分子量を有する、Ｎ末端ドメインの一部およびカルモデュリン結合ドメイン、ならびに、自己抑制ドメインを含む、１４５アミノ酸の蛋白質をコードする。標準的なカルシニューリンＡαからの触媒ドメインおよびカルシニューリンＢ結合ドメインは、完全に欠けていた（図８）。また、バイオインフォマティック分析は、システインプロテアーゼとのわずかな類似性を示す。
【００６５】
このｃＤＮＡがクローニング人工産物(artefact)を表すか、または、それが、蛋白質に翻訳される新規カルシニューリンＡαスプライスバリアントであるかを決定するために、精製された、市販のウシカルシニューリン（シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)、ダイセンホフェン(Deisenhofen)、ドイツ）において、ウエスタンブロット分析を行った。抗カルシニューリンＡ抗体により、より小さな免疫反応性バンドが、３５ｋＤの範囲で目に見えるようになったが、１６ｋＤの範囲の免疫反応性は検出できなかった。カルシニューリン活性が、スーパーオキシド・ジスムターゼによって保護され、この酵素を一緒に精製する(copulifies)という事実を考慮して、精製されたカルシニューリンおよび結合パートナーとしてのヒト組み換え型スーパーオキシド・ジスムターゼ（SOD）を用いるプルダウンアッセイを行い、ウエスタンブロッティングによって、相互作用蛋白質を分析した。図９からわかるように、結合パートナーとしてのＳＯＤなしで、標準的なカルシニューリンおよび既に見られていた３５ｋＤのバンドだけが検出できた（レーン１）のに対し、結合パートナーとしてのＳＯＤを用いるアッセイにおいて、約１６ｋＤの更なるバンドが検出できた（図９、レーン２）。ヒト組み換え型ＳＯＤのみでは、カルシニューリン免疫反応性は見られなかった（レーン３）。明らかに、ヒト組み換え型ＳＯＤとのアフィニティーによって、ＣＮＡα１６Ｋが豊富になった。
【００６６】
しかし、カルシニューリンＡαのＮ末端部に対する抗体を用いると、５９ｋＤの標準的な変異体のほかに、マウスの脊髄抽出物のサイトソル画分において、約１６ｋＤのより小さなバンドを直接検出することができた（図９、レーン４）のに対し、ペレット画分では、１６ｋＤのバンドは観察できなかった（図９、レーン５）。
【００６７】
また、カルシニューリンＡβのＮ末端部に対する抗体を使用する場合、マウスの脊髄からの蛋白質抽出物のサイトソル画分およびペレット画分の両方において、１６ｋＤの範囲の免疫反応性が容易に検出できた（図９、レーン６−９）。興味深いことに、ヒト筋萎縮性側索硬化症と非常に似ている表現型を発達させる変異したヒトスーパーオキシド・ジスムターゼのために組み換えられたマウスにおいて、この短いスプライスバリアントの発現は、はるかに強く（図９、レーン８および９）、運動ニューロン疾患におけるスプライスバリアントの役割が示唆された。
【００６８】
２．２  カルシニューリンＡα１６Ｋの組み換え型発現、精製、および生化学的分析
新たなカルシニューリンスプライスバリアントを生化学的に分析するために、ｃＤＮＡをｐＱＥ３０発現ベクターにクローニングした結果、バクテリア溶菌液からの迅速な精製のためのＮ末端ＨＩＳタグを有する、１５８アミノ酸および算出分子量１６，９２１．１３Ｄａの仮想(hypothetical)蛋白質が得られた。ＩＰＴＧによる誘導(induction)およびＮｉ−ＮＴＡアガロースによる精製により、実際に、１７ｋＤａの蛋白質が得られた。発現効率は低く、５００ｍｌの培養液から、約６００μｇのカルシニューリンＡα１６Ｋ蛋白質が得られた。アフィニティーカラム溶出液のウエスタンブロッティングにより、抗カルシニューリンＡ抗体を用いてポジティブな免疫反応性が示された。
【００６９】
触媒ドメインの欠如により予想されるように、基質としてホスホ-RIIペプチドを用いるカルシニューリン活性アッセイにおいて、ＣＮＡα１６Ｋはホスファターゼ活性を示さなかった。第二に、精製したウシカルシニューリン（シグマ(Sigma)、ダイセンホフェン(Deisenhofen)）を、ＣＮＡα１６Ｋとともに、および、ＣＮＡα１６Ｋなしでインキュベートすることにより、ＣＮ Ａ活性へのＣＮＡα１６Ｋの影響を調べた。対照として、バクテリアをｐＱＥ３０によって形質転換し、誘発し、採取し、そして、カルシニューリンＡα１６Ｋの場合と正確に同様に、精製工程を繰り返した。匹敵する(comparable)溶出画分を、ＣＮＡα１６Ｋに対する対照として用いた。図１０において見られるように、対照溶出液の添加と比較した場合、精製したカルシニューリンホロ酵素への精製したＣＮＡα１６Ｋの添加は、RIIペプチドの脱リン酸化を刺激した。対照溶出液の添加と比べて（１００％）、カルシニューリンのホスファターゼ活性は、１１８．５％（６５μＭのフリーＣａ）、および１１９．６％（５μＭのフリーＣａ）に増加した。興味深いことに、この効果は、低カルシウム濃度においてのみ見ることができた（図１０）。標準的なアッセイ条件下でのカルシウム濃度において、通常、１ｍＭの範囲において、顕著な効果は検出できなかった。このことは、ＣＮＡα１６Ｋによるホスファターゼ活性の活性化は、低いが生理学的に関連するカルシウム濃度に、本質的に制限されることを示す。
【００７０】
基質添加前に、３０分間、ＣＮＡα１６Ｋとカルシニューリンをプレインキュベーションすることにより、測定直前にカルシニューリンへＣＮＡα１６Ｋを直接添加する場合（対照活性と比べて１０６％、図１１）と比べて、ＣＮＡα１６Ｋの活性化効果は増加した（対照活性の１２６％）。
【００７１】
結合蛋白質としてＣＮＡα１６Ｋを用いるプルダウンアッセイを行い、ＣＮＡα１６Ｋと精製したカルシニューリンとの間にインビトロで直接相互作用があるかを確認した。このアッセイにおいて、ＣＮＡα１６Ｋを、磁気Ｎｉ−ＮＴＡビーズに結合させ、精製したウシカルシニューリンならびにネズミ脊髄溶出液とともにインキュベートした。再び、ｐＱＥ３０によって形質転換され、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースによって精製されたバクテリアからの対応する溶出液を、対照として用いた。図１２において見られるように、精製されたウシ脳カルシニューリンまたはネズミ脊髄ホモジェネートのいずれかを使用すると、固定化されたヒスチジンによってタグされたＣＮＡα１６Ｋへのカルシニューリンの強固な結合が見られた（図１２、レーン３および４）。それに対して、対照溶出液を使用した場合には、検出可能な結合は見られなかった（図１２、レーン２および５）。
【００７２】
２．３  カルシニューリンＡβ１６Ｋの発現および機能的特徴付け
カルシニューリンＡα１６Ｋについて得られた結果に加え、カルシニューリンＡβ１６ＫのＣＮＡスプライスバリアントを発現させ、特徴付けした。最初に、そのスプライスバリアントのｃＤＮＡを、材料および方法のポイント１．７に記載のようにクローニングした。
【００７３】
ＣＮＡβ１６Ｋのクローニング後、材料および方法のポイント１．８に記載のように、アポプトースアッセイを行った。前記アッセイの結果を、表１および添付のダイヤグラム１に示す。
【００７４】
【表１】
2004535830.tif 000007
【００７５】
まとめ：ニューロン特異的ＣＮＡβＫ１６をトランスフェクトされたすべての細胞は、ＴＮＦによって誘発されたアポトーシスに対する感受性がより高い。その結果、ＣＡＮβ１６Ｋは、ニューロンアポトーシスの重要なレギュレーターである。なぜなら、それはニューロン特異的だからである。一般に、ＣＮＡ１６Ｋ類（β、γ、αのいずれか）は、アポトーシスにおいて、特に、癌、脳、心臓、免疫系において重要である。そのようなＴＮＦへの影響は、カルシニューリン調節なしでも得られ、即ち、おそらく、その触媒活性に依存しない。
【００７６】
上記表１によって示され得るように、ニューロン特異的ＣＮＡβ１６Ｋをトランスフェクトされたすべての細胞は、ＴＮＦによって誘発されたアポトーシスに対する感受性がより高い、その結果、ＣＮＡβ１６Ｋは、ニューロンアポトーシスの重要なレギュレーターである。なぜなら、それはニューロン特異的だからである。一般に、カルシニューリン、および、そのため、レギュレーターは、細胞サイクルおよび免疫系の制御[ルスナク(Rusnak) F (2000), フィジオロジカル・レビュー(Physiological reviews) 80, 1483-1521]、ならびに、Ｈｅｌａ癌細胞による結果によって示されるように、癌に関連するので、ＣＮＡ類（α、β、またはγのいずれか）は、アポトーシスにおいて、特に、癌、脳、心臓、免疫系において重要である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】カルシニューリンＡのβ型の本発明のスプライスバリアントのヌクレオチド配列。
【図２】カルシニューリンＡのγ型の本発明のスプライスバリアントのヌクレオチド配列。
【図３】カルシニューリンＡのα型の本発明のスプライスバリアントのヌクレオチド配列。
【図４】カルシニューリンＡのβ型の本発明のスプライスバリアントのアミノ酸配列。
【図５】カルシニューリンＡのγ型の本発明のスプライスバリアントのアミノ酸配列。
【図６】カルシニューリンＡのα型の本発明のスプライスバリアントのアミノ酸配列。
【図７】カルシニューリンＡ−αのＰＣＲ増幅。
【図８】カルシニューリン（ＣＮ）Ａα１６Ｋのドメインおよびエキソン構造。
【図９】カルシニューリンの免疫ブロット。
【図１０】ＣＮＡα１６Ｋによるホスファターゼ活性の活性化は、カルシウム(Ca)依存性であることを示す。
【図１１】プレインキュベーションは、ＣＮＡα１６Ｋの有効性を高めることを示す。
【図１２】カルシニューリンＡα１６Ｋと標準的なカルシニューリンとの直接相互作用。
【図１】
2004535830.tif 000008
【図２】
2004535830.tif 000009
【図３】
2004535830.tif 000010
【図４】
2004535830.tif 000011
【図５】
2004535830.tif 000012
【図６】
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【図７】
2004535830.tif 000014
【図８】
2004535830.tif 000015
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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