(57)【要約】本発明は、癌の予防と治療用及び炎症治療用の薬剤組成物に関するものであり、キサントリゾール（Xanthorrhizol）を有効成分として含有することを特徴とする。キサントリゾールは、突然変異の発生及び腫瘍の形成を抑え、発癌物質の解毒化酵素の活性を増進させ、癌細胞のアポトーシスを誘導し、さらに、炎症反応に関与するＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ酵素の活性を効果的に抑える。したがって、キサントリゾールを含有する薬剤組成物は、癌の予防と治療または炎症の治療に非常に有効である。
2004523595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサントリゾール（Xanthorrhizol）を有効成分として含有する、癌の予防と治療用及び炎症治療用の薬剤組成物。
【請求項２】
薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項１記載の癌の予防と治療用及び炎症治療用の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予防と治療用及び炎症治療用の薬剤組成物に関するものであり、詳しくは、突然変異の発生及び腫瘍の形成を抑え、発癌物質の解毒化酵素の活性を高め、癌細胞のアポトーシスを誘導し、さらに、炎症反応に関与するＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ酵素の活性を抑制する、癌の予防と治療及び炎症治療に効果的な薬剤組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌（cancer）は、世界的に年間約７００万人の死亡原因になる疾病であり、 米国だけで１９９７年１年間約１５０万人以上の新しい癌患者が発生したという報告もある。このような趨勢を考慮すれば癌はまもなく世界第１の死亡原因になると推定される。
【０００３】
癌は、様々な要因によって発症することが知られている。発癌物質（carcinogens）は、遺伝子と付加体を形成したり、遺伝子に損傷を与えたりして突然変異を誘発することが知られており、このような突然変異の発生が主たる発癌要因であることもよく知られている。発癌物質は、生体内に直接入ることもあるが、体内代謝によって最終的に発癌物質に転換されることもある。
【０００４】
発癌の過程は、開始段階（initiation）、進行段階（promotion）、及び進展段階（progression）の３つの段階に区分することができる。開始段階では、外因性または内因性の発癌物質によってある細胞または一群の細胞のＤＮＡが損傷を受け、この損傷が修復されないと遺伝子に変異が生ずることになる。遺伝子に変異が生じた細胞では周囲環境に対する応答も変化し、正常細胞に比べて増殖能力が高くなることがある。進行段階では、このような細胞が選択的に増殖し、その遺伝子発現が変化する結果、高増殖、形態異常及び炎症に関与する物質が生成される。そして、進展段階では、遺伝子が益々不安定となり遺伝子発現が変化することで細胞増殖が助長され、この過程を経て早期癌（良性癌）が悪性癌へと転化する。良性癌から悪性癌へ進行すると治療が難しいため、最近は癌の生成自体を抑え悪性癌への進行を遮ることに研究の焦点が向けられている。
【０００５】
このような癌の初期段階の治療方法としては、化学療法、放射線療法、外科療法、遺伝子治療法など様々な方法が開発されているが、この中では薬物による化学療法が最も多く使用されている。従来は、副作用が少ない合成抗癌剤を開発しようとする研究が主に進んだが、最近は、癌の予防及び治療に有効な天然物質を開発することにもっと大きな関心が集められている。
【０００６】
天然物質から癌生成抑制剤（抗癌剤）を開発するための研究の一環として、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）は、１９９４年と１９９６年に癌生成抑制剤の候補物質中、１６種の臨床試験用の癌生成抑制剤を選定して発表したことがあった（表１参照）。
【０００７】
【表１】
2004523595.tif 000003
【０００８】
表１に示した物質のうち、クルクミン（curcumin）は、インドの伝統の生薬であるショウガ科（Zingiberaceae）植物であるウコン（Curcuma longa Linn）から分離された色素成分で、抗酸化効果と抗炎症効果に優れ（Elizabath K. and Rao M.N.A.、Int. J. Pharm.、５８:２３７−２４０、１９９０；Tonnesan H.H.、Int. J. Pharm.、５１:１７９-１８１、１９８９）、抗突然変異効果、抗癌効果及び細胞増殖抑制効果にも優れたものであることが知られている（Nagabhushan M. and Bhide S.V.、J. Nutr. Growth Cancer、４:８３-８９、１９８７；Huang M.T., et al.、Cancer Res.、４８:５９４１-５９４６、１９８８；Soudamini K.K. and Kuttan R.、J． Ethnopharmacol.、２７:２２７-２３３、１９８９；Jee S.H., et al、J. Invest. Dermatol.、１１１:６５６-６６１、１９９８）。また、クルクミンは、フォボルエステル（phobol ester）により誘導される癌の進行を抑えて、ヒト白血病、結腸癌、ＣＮＳ、メラノーマ、腎臓癌及び乳房癌の細胞株に対して細胞毒性を示すことが報告されている（Ramsewak R.S., et al.、Phytomedicine、７:３０３-３０８、２０００）。米国国立癌研究所（ＮＣＩ）は、クルクミンを癌予防剤として開発するために臨床試験を図ってきた（Kelloff G.J., et al.、Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.、３:８５-９８、１９９４）。
【０００９】
このように、副作用がなく、突然変異の発生などの癌生成の可能性を抑え悪性癌への進行を阻害し、さらに腫瘍の形成と密接に関連する炎症まで治療できる天然物質の開発が続いている。
【発明の開示】
【００１０】
したがって、本発明が達成しようとする技術的な課題は、突然変異の発生及び腫瘍の形成を抑え、発癌物質の解毒化酵素の活性を増進させ、癌細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導し、さらに、炎症反応に関与するＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ酵素の活性を抑えて癌予防と治療及び炎症の治療に効果的な薬剤組成物を提供することである。
【００１１】
前記の技術的な課題を達成するため、本発明は、キサントリゾール（Xanthorrhizol）を有効成分として含有することを特徴とする癌予防と治療用及び炎症治療用の薬剤組成物を提供する。
【００１２】
キサントリゾールは、１９７０年ドイツのリムプラ（Rimpler）などによってクルクマキサントリザー（Curcuma xanthorrhiza）から最初に分離されたセスキテルペン（sesquiterpene）系の化合物で、下記〔化１〕に示される化学構造を有する。
【００１３】
【化１】
2004523595.tif 000004
【００１４】
キサントリゾールは、ラットの子宮の強直性収縮を濃度依存的に抑え（Ponce-Monter H., et al.、Phytother. Res.、１３:２０２-２０５、１９９９）、ストレプトコッカスミュータンス（Streptococcus mutans）のような口腔病菌に対して抗菌活性を示すことが報告されている（Hwang J.K.、Fitoterapia、７１:３２１-３２３、２０００；Hwang J.K.、Planta Med.、６６:１９６-１９７、２０００）。このようなキサントリゾールは、インドネシアの伝統薬剤であるショウガ科植物であるクルクマキサントリザー（Curcuma xanthorrhiza Roxb.）から抽出できるが、抽出方法としては、韓国公開特許公報第２０００-７３２９５号及びＷＯ８８/０５３０４号に開示されるように、有機溶媒抽出法、超臨界流体抽出法、マイクロウェーブ抽出法及び超音波抽出法などが使用されうる。
【００１５】
本発明者らは、キサントリゾールの癌生成抑制及び癌と炎症に対する治療効果を研究した結果、キサントリゾールが突然変異発生と腫瘍生成を抑え、発癌物質の解毒化酵素の活性を増進させ、癌細胞のアポトーシスを誘導し、さらに、炎症反応に関与するＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ酵素の活性を抑えて癌予防と治療及び炎症の治療に非常に効果的に使用されうることを見出した。以下、キサントリゾールの癌予防と治療及び炎症の治療効果について詳しく説明する。
【００１６】
発癌物質の多くは突然変異源である。t-ブチルハイドロぺルオキシド（tert-butylhydroperoxide）または過酸化水素（hydrogen peroxide）は、酸素ラジカルを生成するため、遺伝子を損傷し突然変異を起こさせる酸化性の変異誘導剤であることが知られており（Taffe B.G., et al.、J. Biol. Chem.、２６２:１２１４３-１２１４９、１９８７；Kappus H.、Arch. Toxicol.、６０:１４４-１４９、１９８７）、特に、t-ブチルハイドロぺルオキシドは、生理条件下で活性酸素種を生成して、マウスの皮膚に腫瘍促進剤として作用する（Epe B., et al.、Environ. Health Perspect.、８８:１１１-１１５、１９９０）。本発明者らの実験によると、キサントリゾールは、t-ブチルハイドロペルオキシドまたは過酸化水素により誘導される突然変異の発生率を公知の抗癌物質であるクルクミンよりもより効果的に低下させる。
【００１７】
また、癌生成抑制物質（抗癌物質）をスクリーニングするときによく使用されるマウス皮膚癌モデル（DiGiovanni J.、Pharmacol. Ther.、５４:６３-１２８、１９９２）を用いて実験した結果によると、キサントリゾールは腫瘍の生成を効果的に抑えることが明らかになった。これは、キサントリゾールが有効な抗癌物質であることを示すものである。
【００１８】
また、キサントリゾールは、発癌物質の体内の解毒化に関与して癌生成を抑えるフェイズＩＩ解毒化酵素（Phase II detoxicification enzyme）の活性を誘導する。 即ち、キサントリゾールは、フェイズＩＩ解毒化酵素の一種（Talalay P., et al.、In: Cancer Biology and Therapeutics. eds. J.G. Cory and A. Szentivanyi. Plenum Press、New York、ＮＹ、ｐｐ.１９７-２１６、１９８１）である ＱＲ〔ＮＡＤＰ（Ｈ）:キノンオキシドレダクターゼ（quinone oxidoreductase）〕の活性を誘導して人体の発癌物質の解毒能力を向上させることによって癌発生を初期に制御し、また癌の進行を抑制できる。
【００１９】
一方、腫瘍の発生過程では、ＮＦ-ｋＢの活性が増える（参照:Cogswell P.C., et al.、Oncogene、１９:１１２３-１１３１、２０００）。ＮＦ-ｋＢが活性化されるためには、ＩｋＢαがリン酸化されてＮＦ-ｋＢから分離されなければならない。ＩｋＢαがリン酸化されてＮＦ-ｋＢから分離されると、ＮＦ-ｋＢが活性化され、ＩｋＢが２０ｓプロテアソーム（proteasome）によって分解される。キサントリゾールは、ＮＦ-ｋＢの活性化を効果的に抑える。このような結果からキサントリゾールは、有効な抗腫瘍活性をもつ物質ということがわかる。
【００２０】
また、キサントリゾールは、癌細胞のアポトーシスを誘導する。アポトーシスの過程には、インターロイキン-１β転換酵素（ＩＣＥ:interleukin-1β converting enzyme）であるカスパーゼ（caspase）が重要な役割を担うことが知られている（Martin S.J. and Green D.R.、Cell、８２:３４９-３５２、１９９５）。カスパーゼのグループは、少なくとも１０個以上のカスパーゼ酵素からなっており、ＩＣＥ（caspase-１、４、５）、Ｉｃｈ-１（caspase-２、９）、ＣＰＰ３２（caspase-３、６、７、８、１０）のサブグループを持っている。プロカスパーゼ（procaspase）がカスパーゼに活性化されると、次の段階にある他のカスパーゼを活性化させるが、カスパーゼ-３によってＤＮＡ修復酵素であるポリ（ＡＤＰ-リボース）ポリメラーゼ（Poly(ADP-ribose)polymerase（ＰＡＲＰ））が分解されて、ＤＮＡ断片化促進因子（DNA fragmentation-promoting factor:ＤＦＦ）などを活性化させて、アポトーシスを誘導する（Liu X.S., et al.、Cell、８９:１７５-１８４、１９９７）。アポトーシスのとき、一般的に観察されるＤＮＡの断片化及び核凝縮（nuclear condensation）などの形態学的な特徴が伴うが、癌細胞をキサントリゾールで処理すると、このような特徴が観察される。
【００２１】
一方、キサントリゾールは、炎症反応に関与するＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ酵素の発現を阻害するため、炎症治療に効果的に利用されうる。腫瘍の発生過程の各段階が進行されるほど、炎症反応に関与する酵素であるＣＯＸ-２（cyclooxygenase-２：シクロオキシゲナーゼ-２）とｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase：誘導性一酸化窒素合成酵素）の発現が増加することが知られている（Kitayama W., etal.、Carcinogenesis、２０:２３０５-２３１０、１９９９；Takahashi M., et al.、Cancer Res.、５７:１２３３-１２３７、１９９７）。従って、癌発生と炎症反応は、密接な関係があることがわかる。
【００２２】
ＣＯＸは、プロスタグランジン（prostaglandin）の生合成に関わる主酵素で、生体内では二種類のアイソフォームが存在する。ＣＯＸ-１は、通常の生理条件下で発現して胃腸管の保護や腎臓機能の調節などに関与する。ＣＯＸ-２は、通常の組織では発現が見られず、炎症又はその他の免疫反応時、細胞分裂因子（mitogen）やサイトカイン（cytokines）類などによって細胞内で一時的にかつ迅速に発現される。多数の研究者らがＣＯＸ-１を阻害する非ステロイド系の消炎剤（nonsteroidal anti-inflammatory drugs：ＮＳＡＩＤｓ）の副作用を減らしながらも、選択的にＣＯＸ-２を抑える物質を探そうと努力している。
ＮＯＳ酵素も持続的に発現される形態（constitutive form）と誘導性形態（inducible form）が存在するが、ｉＮＯＳによる一酸化窒素（ＮＯ：nitric oxide）の過剰生成は、病理的な血管拡張、細胞毒性、組織の損傷などと関連している。最近の研究結果によると、ＮＯＳが血管透過性を増し、浮腫などの炎症反応をもたらしたり、ＣＯＸの活性を促進させてプロスタグランジンなどの炎症媒介体の生合成を促進して炎症反応を深化させると言われる。各種の癌組織では、ｉＮＯＳ活性が大きく増加される。従って、ＣＯＸ-２の活性及びｉＮＯＳの活性を効果的に抑えるキサントリゾールは、癌予防と治療用のみならず、炎症治療用としても有効に使用されうる。
【００２３】
キサントリゾールを含有する本発明の癌予防と治療用及び炎症治療用の薬剤組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含むことができる。担体としては、製薬分野で通常的に使用される溶媒、分散媒質、吸収遅延剤などが使用されうる。
【００２４】
本発明の癌予防と治療用及び炎症治療用の薬剤組成物は、標的組織に至ることができる限り、如何なる一般的な経路を通じても投与されうる。従って、本発明の組成物は、局部、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮などから投与でき、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放剤などとして製剤化が可能である。望ましい剤形は注射剤であり、組成物の投与量は、病人の疾病の種類及び程度、年齢、性別などに応じて諸般の技術常識を考慮して決定すればよい。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を具体的に説明するために望ましい実施例を挙げて詳しく説明する。しかし、本発明に係る実施例は様々な形態に変更可能であり、本発明の範囲は決して以下に詳述する実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。下記の実施例の実験結果は、平均値±ＳＥとＩＣ５０で示し、ＩＣ５０は反応の５０％を抑える濃度である。統計分析は、Student t-testを用いた。Ｐ値が０.０５未満なら、有意性があると評価した。
【００２６】
キサントリゾールの分離及び精製例
乾燥されたクルクマキサントリザー（Curcuma xanthorrhiza）の根茎をインドネシアのヤクジャカルタ（Yakjakarta）の市場から購入した（Voucher specimen No.YS98015）。７５％（ｖ/ｖ）メタノールにて根茎を抽出した後、エチルアセテート、ブタノール、水で分画した。その後、エチルアセテートの分画をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりへキサン／エチルアセテート（１０:１、ｖ/ｖ）で溶出し所定の単一物質に精製した。精製した物質に対してＥＩ-ＭＳにて分子量を測定し、1Ｈ-ＮＭＲ、13Ｃ-ＮＭＲ及びＩＲスペクトルを分析した結果、精製された物質がキサントリゾールであることを確認した。
【００２７】
IR（CDCl3, Vmax) 3402, 2915, 1708, 1620, 1599 cm-1;
EI-MS（m/z）218, 148, 136, 135, 121; 1H-NMR（CDCl3, 400 MHz）1.18（3H, d, J=7.1 Hz), 1.52（3H, s), 1.57(2H, dt, J=7.1, 7.2 Hz), 1.67(3H, s), 1.85（2H, dt, J=7.0, 7.2 Hz), 2.20(3H, s), 2.59(1H, qt), 5.08(1H, t, J=7.0, 7.2 Hz), 6.59(1H, br s), 6.66(1H, br d), 7.01(1H, d, J=7.6 Hz）;
13C-NMR(CDCl3, 400 MHz）147.16, 113.50, 153.51, 120.86, 130.74, 119.42, 38.98, 38.32, 26.10, 124.48, 131.39, 15.31, 25.67, 17.64, 22.3
【００２８】
実施例１
活性酸素種により誘発される突然変異に対する抗突然変異効果
サルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）ＴＡ１０２菌株に、活性酸素種にて突然変異を誘発させてキサントリゾールの抗突然変異効果（抗変異作用）を測定した（Levin D. E.、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、７９：７４４５-７４４９、１９８２）。
【００２９】
サルモネラティフィムリウムＴＡ１０２菌株をＯｘｏｉｄ社の栄養液体培地で１１時間培養した。活性酸素種を生成するt-ブチルハイドロぺルオキシド（１００μg/プレート）または過酸化水素（５０μg/プレート）とキサントリゾールが含まれた反応混合物（６００μL）に前記菌株培養液１００μLを加えた後、３７℃で３０分間反応させた。ポジティブコントロールとしては、キサントリゾールの代わりにクルクミンを用いた。本実験に用いたキサントリゾールまたはクルクミンの濃度は、t-ブチルハイドロぺルオキシドを用いた抗突然変異調査では各々０、１０、２０、４０、６０nmol/プレートであり、過酸化水素を用いた抗突然変異調査では各々２、４、８、１０、２０、５０nmol/プレートであった。０.５ｍＭヒスチジンとビオチンが含まれた寒天溶液２mlに反応混合物を移しよく混ぜた後、最少グルコース培地（minimal glucose plate）に注いで固化させた。３７℃で４８時間培養した後、Ｈｉｓ+の復帰突然変異（revertant）のコロニー数を数えて抗突然変異効果を測定した。
【００３０】
t-ブチルハイドロぺルオキシドと過酸化水素にて突然変異を誘発させた場合の抗突然変異効果を各々図１のグラフ（Ａ）とグラフ（Ｂ）で示し、過酸化水素にて誘導した突然変異に対するキサントリゾールの抗突然変異効果を示す寒天プレートの写真を図２に示した。これらの図に示すように、キサントリゾールは、酸素ラジカルを生成して遺伝子を傷つける酸化性突然変異剤として知られているt-ブチルハイドロぺルオキシドおよび過酸化水素によって誘導された突然変異に対して、ポジティブコントロール（対照群）に用いたクルクミンより優れた抗突然変異効果（抗変異作用）を示した。
【００３１】
実施例２
マウス皮膚癌モデルでの腫瘍形成抑制効果
腫瘍開始剤（ＤＭＢＡ）と腫瘍促進剤（ＴＰＡ）を用いた多段階のマウス皮膚癌モデルで、キサントリゾールとクルクマキサントリザーロックスブ（Curcuma xanthorrhiza Roxb.）メタノール抽出物の腫瘍形成抑制効果（抗腫瘍効果）を調べた。
【００３２】
クルクマキサントリザーロックスブのメタノール抽出物は、次の方法で製造した。乾燥させたクルクマキサントリザーを細断した後、試料１００ｇ当り７５％メタノール４００mlを加えて常温で二日間反復抽出した。抽出した試料をワットマン（Whatman）濾紙で濾過し、濾液を減圧蒸留したのち凍結乾燥してメタノール抽出物を得た。
【００３３】
マウス皮膚癌モデルでのキサントリゾールとクルクマキサントリザーロックスブのメタノール抽出物の抗腫瘍効果を調べるため、実験群当たり３０匹のＩＣＲマウス（６週齢、雌）を用いた。動物用クリッパーで実験群に使用されるマウスの背毛を除去し、一週間後、マウスの背中にアセトン（０.２ml）に溶かしたＤＭＢＡ（０.２mol）を１回局所塗布し、ネガティブコントロールとしては、同じボリュームのアセトンのみを塗布した。その後、毎週３回ずつ１９週間０.２mlのアセトンに溶かしたＴＰＡ（１０nmol）を同所に局所塗布し、メタノール抽出物とキサントリゾールは、ＴＰＡを局所塗布する３０分前にそれをマウスの背中に局所塗布した。
腫瘍を持っている動物の割合を示す“腫瘍発生率”と、実験動物１匹当り持っている腫瘍の平均数を示す“腫瘍生成率”を２週間隔で調べた。その結果が図３及び図４に示される。図３のグラフ（Ａ）は実験群各々に対する腫瘍生成率を、同図グラフ（Ｂ）は実験群各々に対する腫瘍発生率を示したものであり、図４はキサントリゾールを処理して１９週経過後のマウスの腫瘍発生抑制程度を示す写真である。
【００３４】
これらの図面を参照すると、濃度２μmolと６μmolの結果を比べるとき、キサントリゾールが濃度依存的に腫瘍形成を抑制したことがわかる。キサントリゾールを塗布しなかった場合（ＤＭＢＡ＋ＴＰＡ）の実験群の全てのマウスから腫瘍が生成され、マウス当り平均１５.５個の腫瘍が観察された。対照的に、６μmolのキサントリゾールを一週間に３回ずつ局所塗布した実験群からは、５７％の腫瘍発生率と４.０個の腫瘍生成率を示した。これらの実験結果は、キサントリゾールが腫瘍生成率と腫瘍発生率とをいずれも顕著に抑える優秀な腫瘍形成抑制剤であることを示すものである。
【００３５】
実施例３
キノンレダクターゼの活性誘導効果の測定
ラットの肝臓癌細胞であるHepa 1c1c7細胞（２.５×１０4/ml）を９６ウエルプレートに入れ、５％ＣＯ2、３７℃で１０％ＦＢＳ-α-ＭＥＭ（Gibco BRL）の培地下で２４時間培養した。次に、前記培養物に、１９０μLの新しい培地と１０％ＤＭＳＯに溶かした１０μLのキサントリゾールを加えた後、５％ＣＯ2、３７℃で４８時間培養した。次に、培地を捨て、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）バッファーで洗浄後、各ウエルに０.８％ジギトニン（digitonin）と２mMのＥＤＴＡを含有する反応溶液５０μLを加え、１０分間培養して細胞を破壊した。次に、オービタルシェーカー（１００ｒｐｍ）でプレートを１０分間振った後、メナジオン（menadione）とＭＴＴ（3-［4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide）を含有する反応液（最終反応溶液５０ml：０.５Ｍ-Tris ２.５ml、１.５％Tween-20 ０.３４ml、７.５ｍＭ ＦＡＤ ０.０３４ml、１５０ｍＭ Ｇ-６-Ｐ ０.３３４ml、５０ｍＭ ＮＡＤＰ ３０μL、Glucose 6-phosphate dehydrogenase １００μL、ＢＳＡ ３３.４mg、ＭＴＴ １５mg、５０ｍＭ menadione  ５０μL）２００μLを加えて、１０分間反応させた。その後、０.３mMジクマロール（dicoumarol）を含有している５mMリン酸カリウム（pH7.4）溶液５０μLを加えて反応を中断させ、５９５nmでの吸光度を測定した。
【００３６】
キサントリゾールが細胞成長に与える影響を評価するため、第２のプレートセットを上記と同様に培養してタンパク質の測定を行った。培地を除去した後、０.２％のクリスタルバイオレット（crystal violet）にて細胞を１０分間染め、水洗して乾燥させた。０.５％のＳＤＳ  ２００μLを加えて混ぜた後、５９５nmでの吸光度を測定した。
【００３７】
実験結果を評価するため、まず次の数学式１からキサントリゾール処理群と対照群の各々のキノンレダクターゼ（ＱＲ）の比活性（QR specific activity）を算出した。また、キサントリゾールにより誘導されるキノンレダクターゼ活性の相対レベル、即ち、ＱＲ誘導比（QR induction  ratio[Treated/Control]）は、ＱＲ比活性を求めてから次の数学式２のように対照群と試験物質処理群のＱＲ比活性の比として計った。試験物質処理に用いたキサントリゾールの濃度は、各々５０、１０、２、０.４μMであった。
【００３８】
〔数学式１〕
ＱＲ非活性  ＝（ＭＴＴの吸光度変化/分）／（クリスタルバイオレットの吸光度変化）×３２４７nmol/mg
〔数学式２〕
ＱＲ誘導比  ＝（キサントリゾール処理群のＱＲ比活性）／（対照群のＱＲ比活性）
【００３９】
前記数学式１及び２を用いて算出したＱＲ誘導比の計算結果を図５に示す。同図に示すように、対照群と比べてキサントリゾール濃度０.４μM及び５０μMで各々約１２５％及び１３０％のＱＲ誘導活性を示した。この結果は、キサントリゾールが、キノンレダクターゼ（ＱＲ）のような発癌物質解毒化酵素の活性を高めることにより、生体内での発癌物質の除去に寄与しうることを示すものである。
【００４０】
実施例４
ＴＰＡによるＣＯＸ-２誘導の阻害
マウスの皮膚にＴＰＡを局所処理すると、ＣＯＸ-２の発現が増加されるということが知られている。従って、その事実に基づいて、キサントリゾールがＣＯＸ-２の発現に及ぼす影響を以下のように測定した。
【００４１】
約５週の雌マウスを大韓実験動物センター（ソウル、韓国）で購入して１２時間周期で光と暗い環境に適応させた。次に、マウスの背毛を先ず除去した後、二日後、キサントリゾールをアセトン（２００μL）に溶かしてマウスの皮膚に局所塗布した。次に、３０分後にＴＰＡ（１０nmol/２００μL）をアセトンに溶かしてまた局所塗布し、４時間後に皮膚を切り取って脂肪組織を除き液体窒素に入れたのち粉末につぶした。
【００４２】
粉末にタンパク質溶解バッファー[１５０mM ＮａＣｌ、０.５％Triton X-100、５０mM Tris-HCl(pH7.4)、２０mM ＥＧＴＡ、１mM ＤＴＴ、１mM Ｎａ3ＶＯ4、プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット]４００μLを入れて、氷で３０分間反応させたのち遠心分離して上層液を得た後、タンパク質検出試薬（Bio-Rad protein assay）を用いてタンパク質を定量した。３０μgのタンパク質を含有する溶液を５分間SDS sample loading bufferで煮沸後ＳＤＳ-ＰＡＧＥを行った。その後、電気泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜へ移し、０.１％Tween 20を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）に溶かした５％の脱脂粉乳液に、前記ＰＶＤＦ膜を常温で２時間浸した後、ＰＢＳＴで洗った。次に、抗ＣＯＸ-２ヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz社製品、Santa Cruz、CA、USA）を加えて１時間反応させたのちＰＢＳＴで洗って、抗ヤギホースラディッシュペルオキシダーゼ共役（anti-goat horseradish peroxidase conjugated）二次抗体（Zymed Laboratories Inc.、San Francisco、CA、USA）を加えて反応させ、ＰＢＳＴで３回洗った。その後、ＥＣＬ（Enhanced chemiluminescence）検出キットにてＣＯＸ-２を可視化した。そのウェスタンブロット写真を図６に示す。同図に示すように、キサントリゾールにて前処理した場合、濃度依存的にＣＯＸ-２の蛋白発現が減少した。
【００４３】
実施例５
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって誘導されたＣＯＸ-２活性の阻害
細胞にＬＰＳ処理をすると、ＣＯＸ-２の活性が誘導される。このような事実に基づいて、ＣＯＸ-２活性の誘導に対するキサントリゾールの影響を調べるために遊離されたプロスタグランジンＰＧＥ2の量を以下のように定量した。
【００４４】
マウスマクロファージ系細胞株であるＲＡＷ２６４.７細胞を１０％のＦＢＳ-ＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ2下に１週間に二回継代培養した。細胞を１０％のＦＢＳ-ＤＭＥＭ培地に懸濁し、細胞濃度は、１０×１０5/ml、最終濃度は５００μMになるようにアスピリンを添加して、細胞に残存するＣＯＸ酵素の活性を非可逆的に抑制させた。その後、前記細胞懸濁液を９６-ウエルプレートに各ウエル当り２００μLずつ加え、４時間培養して細胞を付着させたのちＰＢＳにて２回洗った。
【００４５】
次に、各ウエルに１μg/mlのＬＰＳを含有した１０％のＦＢＳ-ＤＭＥＭ培地を２００μLずつ入れた（対照群にはＬＰＳがない培地を加える）。その後、ＬＰＳが含有されている新鮮な培地に交換すると同時に、キサントリゾールで処理して１６時間培養した後、その上層液を取って遊離されたプロスタグランジン（prostaglandin）量を酵素免疫分析法で定量した。回収された上層液をＰＧＥ2-アセチルコリンエステラーゼトレーサ（ＰＥＧ2-acetylcholineesterase tracer）とともに抗-ＰＧＥ2抗体（Amersham Life Sciences、Arlington Heights、IL）が付着されているプレートの各ウエルに入れ、常温で１８時間培養した。その後、ウエルに残っている溶液を洗い捨て、０.０５％のTween 20-リン酸バッファー溶液にて各ウエルを５回洗った。その後、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試液２００μLを各ウエルに加えた後、７時間培養して４０５ｎｍでの吸光度を測定し、ＰＧＥ2標準品にて検量線を作成してキサントリゾールで処理した培養液中のＰＧＥ2生成量を測った。ＬＰＳを処理した群と処理しなかった群から生成されたＰＧＥ2の差を基準にして、各試料の抑制率を測って、その結果を図７に示した。
【００４６】
図７に示すように、キサントリゾールは、濃度依存的にＣＯＸ-２の活性を抑えることがわかり、特に１μｇ/ml以上の濃度では９８％以上の抑制効果を示した（ＩＣ５０=０.０７μｇ/ml=０.３２μM）。この結果は、キサントリゾールがＣＯＸ-２活性を阻害することにより、細胞内で過剰生成されたプロスタグランジン類による炎症発現や癌化過程としての細胞増殖促進を抑える物質であることを示すものである。
【００４７】
実施例６
ｉＮＯＳ活性の抑制
キサントリゾールが、ＬＰＳ処理によって誘導されるｉＮＯＳ（inducible Nitric Oxide Synthase）の活性に与える影響を測定した。ＲＡＷ２６４.７細胞（８×１０5/ml）を１０％のＦＢＳ-ＤＭＥＭ培地にて懸濁して、２４-ウエルプレートの各ウエル当り１mlずつ４時間付着させた。その後、新しい培地に交換し、ＬＰＳを１μｇ/mlになるように加えた後、キサントリゾールをＤＭＳＯに溶かしてＬＰＳと同時に培養液に加えた後、３７℃、５％ＣＯ2細胞培養器で２０時間培養した。
【００４８】
各培養液中に遊離されたＮＯの生成程度をグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬を用いて測定した。９６-ウエルプレートに培養液を１００μLずつ入れ、グリース試薬１５０μLを加えて１０分間反応させた後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定した。検量線作成のための標準品としては、ＮａＮＯ2を用い、その結果を図８に示した。
【００４９】
図８に示すように、キサントリゾールは、濃度依存的にｉＮＯＳの活性を抑え、特に１０μg/mlの濃度では９９％以上の抑制効果を示した（ＩＣ５０=１.０１μg/ml=４.６３μM）。この結果は、キサントリゾールが一酸化窒素種の生成を遮るため、炎症や癌化過程での細胞増殖を阻害しうる物質であることを示すものである。
【００５０】
実施例７
マウス皮膚でのＩｋＢの変化測定
ＮＦ-ｋＢが活性化されるためには、ＩｋＢがリン酸化されてＮＦ-ｋＢから分離されなければならない。マウス皮膚でのＩｋＢの変化を測定するため、細胞抽出液（cytoplasmic extract）を次のように作製した。実施例４と同様にして得たマウスの皮膚組織を溶解バッファー[１０mM ＨＥＰＥＳ(pH7.8)、１０mM ＫＣｌ、２mM ＭｇＣｌ2、１mM ＤＴＴ、０.１mM ＥＤＴＡ、０.１mM phenylmethylsulfonyl fluoride（ＰＭＳＦ）]に入れ均一化したのち、遠心分離して細胞抽出液を得た。その後、細胞質タンパク質を１２％アクリルアミドゲル上で電気泳動したのちＰＶＤＦ膜に移し、０.１％Tween 20を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）に溶かした５％の脱脂粉乳液に、このＰＶＤＦ膜を常温で２時間浸した後、ＰＢＳＴで洗った。その後、タンパク質に抗ＩｋＢウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz社製品、Santa Cruz、CA、USA）を加え、常温で２時間間反応させたのちＰＢＳＴで洗って、次に抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ共役二次抗体（Zymed Laboratories Inc.、San Francisco、CA、USA）を加えて反応させ、ＰＢＳＴで３回洗った。その後、ＥＣＬ溶液で反応させた後、ＩｋＢのマウス皮膚での発現変化を可視化した。そのウェスタンブロット写真を図９に示す。
【００５１】
図９に示すように、ＴＰＡで処理した場合観察されるＩｋＢαの分解は、キサントリゾールで前処理したとき濃度依存的に抑制されることがわかった。
【００５２】
実施例８
キサントリゾールによるアポトーシスの誘導
クルクマキサントリザーのメタノール抽出物またはキサントリゾールをＨＬ-６０細胞に各々処理した後、位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察した。ヒト急性白血病細胞株であるＨＬ-６０（Human promyelocytic leukemia）細胞を３７℃、５％ＣＯ2の恒温細胞培養器に１０％のＦＢＳ（fetal bovine serum）が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を用いて三日周期で継代培養した。その後、ＨＬ-６０細胞を、６-ウエルプレートに移して培養した後、実施例２の方法によって製造したクルクマキサントリザーのメタノール抽出物（１５μg/ml）または上述した分離精製方法で製造したキサントリゾール（４０μM）で処理し、２４時間後、４％の中性緩衝されたホルマリンを用いて細胞を固定させた。その後、細胞をスライドに載せ空気中に乾燥させ、ＤＮＡに反応するＨｏｅｃｈｅｓｔ  ３３２５８染色試薬を用いて細胞の核を観察したが、クルクマキサントリザーのメタノール抽出物とキサントリゾールで処理した場合、共に核が凝縮されて、キサントリゾールがアポトーシスを誘導することを示唆した。
【００５３】
１０％のＦＢＳ-ＲＰＭＩ  １６４０培地で成長する細胞を１００mm培養皿で２日間培養した後、０、１０、４０、８０μMのキサントリゾールにて処理してＤＮＡ断片化効果を測定した。２４時間反応をさせたのち遠心分離して細胞を集めて、５００μLの溶解バッファー（１％Triton-X 100、５０mM Tris−HCl(pH7.4)、２０mM ＥＤＴＡ）を添加して、氷の上で１時間反応させたのち遠心分離して細胞を破砕した後、上層液を集めた。この上層液に１％ＳＤＳ １００μL、ＴＥ/ＲＮａｓｅ（１０mg/ml）１０μL、プロテナーゼＫ（１mg/ml）５０μLを添加し、３７℃で４時間以上反応させた後、同量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（２５:２４:１）を加え、懸濁液になるまで混ぜた。この混濁液を遠心分離して上層液を集め、冷たいエタノールを２.５倍入れて-７０℃で１時間以上放置して、ＤＮＡを沈澱させた。その後、遠心分離して上層液を除去し室温で乾燥した後、１.５％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。このアガロースゲルの写真結果を図１０に示す。
【００５４】
図１０に示すように、キサントリゾール１０μMと４０μMでは、アポトーシスの代表的な標識であるＤＮＡ断片化が形成されなかったが、８０μMではＤＮＡ断片化が形成された。
【００５５】
次に、キサントリゾールが細胞周期のＤＮＡに及ぼす影響をフローサイトメーターを用いて確認した。ＦＢＳを除去したＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を４８時間放置して細胞周期をＧ０状態に停止させたのち培地を除去し、１０％のＦＢＳが入っている培地で各々０、２０、６０μMのキサントリゾールとともに反応させた。２４時間後、遠心分離して細胞を集め冷たい７０％のエタノールで細胞を固定させ、細胞を-２０℃に保管した。細胞を測定する前、プロポディウムイオジド（propodium iodide）で染色して細胞のＤＮＡ量をフローサイトメトリーで分析した。その結果を図１１に示す。
【００５６】
図１１に示すように、ネガティブコントロールの場合は、サブ-Ｇ１期（アポトーシスピーク、Ｍ１分画、サブディプロイドＤＮＡ量）の細胞が２０％ほど占めるが、キサントリゾールの濃度が高まるほどこのサブ-Ｇ１期の細胞が増え、各々２０μMでは３６％、６０μMでは７６％を占めることが観察された。この結果は、キサントリゾールが濃度依存的にアポトーシスを誘導することを示すものである。
【００５７】
実施例９
キサントリゾールによるプロカスパーゼ-３の活性化
０、１０、４０、８０μMのキサントリゾールでＨＬ-６０細胞を２４時間処理した後、細胞を集めて実施例４のタンパク質溶解バッファー４００μLを加えた。その後、４℃で４０分間反応させ反応液を遠心分離して、その上層液を得た。これとは別に、８０μMのキサントリゾールでＨＬ-６０細胞を処理して０、２、４、６、９、１２時間経過後、細胞を集めて溶解させたのち同じ方法で上層液を得た。その後、タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分離した後、それをＰＶＤＦ膜に移したのちプロカスパーゼ-３に対する一次抗体であるマウスモノクロナール抗体（Transduction Laboratories、Lexington、KY、USA）と、抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ共役二次抗体を用いて順次に標識し、ＥＣＬ溶液と反応させた。その後、プロカスパーゼ-３をＥＣＬ検出キットにて可視化した。そのウェスタンブロット写真が図１２に示される。
【００５８】
図１２に示すように、キサントリゾール４０μMで処理した場合、プロカスパーゼ-３がカスパーゼ-３に活性化されることが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
上記のように、キサントリゾールは、突然変異の発生及び腫瘍の形成を抑え、発癌物質の解毒化酵素の活性を増進させ、癌細胞のアポトーシスを誘導する。また、炎症反応に関与するＣＯＸ-２及びｉＮＯＳ酵素の活性を効果的に抑えるため、キサントリゾールを含有する薬剤組成物は、癌の予防と治療または炎症の治療に非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】t-ブチルハイドロぺルオキシド（Ａ）及び過酸化水素（Ｂ）にて誘導した突然変異に対するキサントリゾールの抗突然変異効果を測定したグラフである。
【図２】過酸化水素にて誘導した突然変異に対するキサントリゾールの抗突然変異効果を示す寒天プレートの写真である。
【図３】（Ａ）（Ｂ）は、マウス皮膚癌モデルにおいてＤＭＢＡとＴＰＡにて誘発した腫瘍生成に対するクルクマキサントリザーロックスブのメタノール抽出物とキサントリゾールの腫瘍生成の抑制効果を測定したグラフである。
【図４】（Ａ）〜（Ｄ）は、マウス皮膚癌モデルにおいてＤＭＢＡとＴＰＡにて誘発した腫瘍生成に対するキサントリゾールの腫瘍生成の抑制効果を示すマウスの腫瘍部位の写真である。
【図５】キサントリゾールのキノンレダクターゼ（ＱＲ）の活性誘導効果を示すグラフである。
【図６】キサントリゾールがＴＰＡによって誘導されたＣＯＸ-２タンパク質の発現を抑制することを示すウェスタンブロット解析結果である。
【図７】リポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって誘導されたＣＯＸ-２活性のキサントリゾールによる抑制効果を測定したグラフである。
【図８】キサントリゾールのｉＮＯＳの活性抑制効果を測定したグラフである。
【図９】キサントリゾールのＩｋＢの分解抑制効果を測定したウェスタンブロット解析結果である。
【図１０】キサントリゾールのＤＮＡ断片化効果を測定したアガロースゲル電気泳動結果である。
【図１１】キサントリゾールのアポトーシス誘導効果を示すフローサイトメトリーによる分析結果である。
【図１２】キサントリゾールがプロカスパーゼ-３を活性化することを示すウェスタンブロット解析結果である。
【図１】
2004523595.tif 000005
【図３】
2004523595.tif 000006
【図５】
2004523595.tif 000007
【図７】
2004523595.tif 000008
【図８】
2004523595.tif 000009
【図１１】
2004523595.tif 000010
【図２】
2004523595.tif 000011
【図４】
2004523595.tif 000012
【図６】
2004523595.tif 000013
【図９】
2004523595.tif 000014
【図１０】
2004523595.tif 000015
【図１２】
2004523595.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004523595.tif 000017
2004523595.tif 000018
2004523595.tif 000019
2004523595.tif 000020
2004523595.tif 000021
2004523595.tif 000022
2004523595.tif 000023
2004523595.tif 000024
2004523595.tif 000025
2004523595.tif 000026
2004523595.tif 000027
2004523595.tif 000028
2004523595.tif 000029
2004523595.tif 000030
2004523595.tif 000031
2004523595.tif 000032
2004523595.tif 000033
2004523595.tif 000034
2004523595.tif 000035
2004523595.tif 000036
2004523595.tif 000037
2004523595.tif 000038
2004523595.tif 000039
2004523595.tif 000040
2004523595.tif 000041
2004523595.tif 000042
2004523595.tif 000043
2004523595.tif 000044
2004523595.tif 000045
2004523595.tif 000046
2004523595.tif 000047
2004523595.tif 000048
2004523595.tif 000049
【国際調査報告】
2004523595.tif 000050
2004523595.tif 000051