(57)【要約】異なるｐＫｓ値を有する酸及び塩基を含有する分析用及び分取用の電気泳動のための媒体であって、少なくとも２つの酸であって、隣接する酸のｐＫｓ値（ΔｐＫｓ）が１より大きくなく、好ましくは０．８〜０．５である少なくとも２つの酸と、ｐＫｓ値が約１．５〜１１の間にある少なくとも２つの塩基であって、隣接する塩基のｐＫｓ値の差分（ΔｐＫｓ）が１より大きくなく、好ましくは０．８〜０．５である少なくとも２つの塩基とを含有する媒体。
2004509354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なるｐＫｓ値を有する酸及び塩基を含有する分析用及び分取用の電気泳動のための媒体であって、ｐＫｓ値が約３．０〜１２の間にある少なくとも２つの酸であって、隣接する酸のｐＫｓ値の差分（ΔｐＫｓ）が１より大きくなく、好ましくは０．８〜０．５である少なくとも２つの酸と、ｐＫｓ値が約１．５〜１１の間にある少なくとも２つの塩基であって、隣接する塩基のｐＫｓ値の差分（ΔｐＫｓ）が１より大きくなく、好ましくは０．８〜０．５である少なくとも２つの塩基とを含有することを特徴とする媒体。
【請求項２】
少なくとも３つの酸及び３つの塩基を含有することを特徴とする、請求項１記載の媒体。
【請求項３】
酸の相対的及び絶対的濃度が増大するｐＫｓ値と共に連続的に増加し、かつ塩基の相対的及び絶対的濃度が増大するｐＫｓ値と共に減少し、いつも最も強い酸及び塩基の濃度と比較して、より弱い酸及び／又はより弱い塩基の濃度が、１〜３の範囲のｐＫｓ値間の僅かな差分の場合には係数１．５〜３だけ増加され、他方、３〜８の範囲のｐＫｓ値間の大きい差分の場合には、より弱い酸及び塩基の相対的濃度が係数４〜８まで増加されることを特徴とする、請求項１又は２記載の媒体。
【請求項４】
電気泳動移動完了後に隣接したｐＨ値単位あたり、酸／塩基対が形成され、前記対がそれぞれの酸及びそれぞれの塩基のｐＫｓ値の算術平均値に相当するｐＨ値を発生することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の媒体。
【請求項５】
個々の酸及び塩基の濃度が、充分な緩衝液容量の調整及び維持のために電気泳動移動完了後の平衡状態で選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の媒体。
【請求項６】
より狭いｐＨ間隔の調整のために、酸及び塩基の絶対濃度が増加され、必要な場合は、酸及び塩基のΔｐＫｓ値が酸及び塩基の適切な選択によって縮小されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の媒体。
【請求項７】
それぞれ使用した酸及び／又は塩基の分子量が３００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）より小さいことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、分析用及び分取用の電気泳動のための媒体に関する。
高圧電気泳動に際してｐＨ勾配を形成するような水溶液は、大規模にタンパク質及びペプチドの分析に使用される。前記のような公知の溶液は、両性の性質を有する多価電解質を含有し、常法の合成で不飽和カルボン酸類とポリアミン類の縮合及び／又は重合によって製造される。この合成の結果、異なる分子量とさまざまな数の酸性基（カルボキシル基）及び塩基性基（アミノ基及び／又はイミノ基）の多数の化合物が生成する。高圧電気泳動の条件下に、これらの多価電解質は、酸性及び塩基性の基の異なる比率に基づいて、特に酸性の性質を有する前記多価電解質が陽極の近傍領域に濃縮され、全ての他の多価電解質が酸性もしくは塩基性の性質の「序列」に従って電極の間に配列され且つその際にも濃縮されるように、配列される。個々の種の酸性及び／又は塩基性の性質に従って多価電解質の選択的富化によって、ｐＨ勾配が全水溶液の内部で発生される。
【０００２】
前記ｐＨ勾配を利用して、タンパク質及びペプチドのような両性化合物を異なる酸性及び／又は塩基性の性質に従って分離することができる。この分析分離方法は文献において「等電点電気泳動」（“Ｉｓｏｅｌｅｋｔｒｉｓｃｈｅ Ｆｏｋｕｓｓｉｅｒｕｎｇ”）と呼ばれる。この方法が特異的ゲル（ポリアクリルアミド）で実施される場合、この方法はＰＡＧＩＥＦ（ポリアクリルアミドゲル上の等電点電気泳動）と呼ばれ、標準方法と考えられる。
【０００３】
商慣習上の両性電解質の合成時に使用された不飽和酸、たとえば置換されたアクリル酸は高毒性であり、その残留含有分が非常に問題があると考えられる。
【０００４】
この理由から商業上の両性電解質の使用は、後にヒトに投与されるべきタンパク質類の洗浄に対して禁止されている。
【０００５】
両性電解質の合成時に、未知の構造の多数の化学種が形成され、それらの相対的濃度はそれぞれのバッチに応じて強く変化しうる。しかしそれによって、分析結果の再現性が負の影響を受ける。
【０００６】
特別の応用において、両性電解質と分析電解質との望ましくない錯体形成の結果として「人口バンド」（“ａｒｔｉｆｉｚｉｅｌｌｅ Ｂａｎｄｅｎ”）が報告されている。
【０００７】
より高い分子量を有する両性電解質によるタンパク質類の分析染色反応の部分的妨害も同様に報告されている。特定の製造者の製品中の、ＭＧ＞１０ＫＤを有する両性電解質の異常に高い割合については幾度も報告された。
【０００８】
タンパク質類の分取洗浄の場合において、両性電解質の連続分離は困難であり、時々不完全である；疑われる原因として、錯体形成が推測されている。
【０００９】
商業上の両性電解質は、生物粒子がこれら媒体において凝集するので、生物粒子用の分離媒体として適していないことが証明された。
【００１０】
本発明の目的は、上記欠点を有さず、かつその適用範囲がそれによって著しく拡大される、異なるｐＫｓ値の酸及び塩基を含有する等電点電気泳動（ＩＦ）用の水溶液を提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、請求項１記載の水溶液によって達成される。その他の有利な形態は、続く請求項２ないし７に記載される。
【００１２】
本発明による水溶液は、段階付きの「酸性度」及び／又は「塩基性度」を有する酸及び塩基の混合物を含有する。個々の酸のｐＫｓ値は、ｐＫｓ３．５〜ｐＫｓ１２の範囲内で変化し、「隣接する（ｂｅｎａｃｈｂａｒｔｅｎ）」酸のｐＫｓ値の差分（ΔｐＫｓ）は、ΔｐＫｓ＝１より大きくてはならない。ΔｐＫｓ＜０．８の値が理想的と考えれる。
【００１３】
使用される塩基のｐＫｓ値は、ｐＫｓ＝１．５〜ｐＫｓ＝１１の範囲内で変化する。個々の塩基の値の差分は、ΔｐＫｓ＜０．８が満たされたとき、理想的である。
【００１４】
使用される酸及び／又は塩基の数とそれらの相対的濃度が、ｐＨ勾配の範囲（Ｓｐａｎｎｅ）とプロフィル（Ｐｒｏｆｉｌ）を決定する。最小数はそれぞれ２つの酸及び／又は２つの塩基であり、好ましくは３つの酸及び／又は３つの塩基になる。広いｐＨ範囲（ｐＨ２．５〜１０）の場合に、段階付きのｐＫｓ値を有する１１の酸及び１３の塩基が使用される。
【００１５】
添付の図１〜３にそれぞれ３つの典型的な酸及び塩基のモデル例を用い電気泳動移動後のそこから生じるｐＨ勾配の形成が描かれる。次の酸：ヒドロキシ酪酸（ＨＩＢＡ：ｐＫｓ＝３．８）、ＨＥＰＥＳ（ｐＫｓ＝７．５）及び２−ヒドロキシピリジン（ｐＫｓ＝１１．６）、及び次の塩基：タウリン（ｐＫｓ＝１．５）、メラミン（ｐＫｓ＝５）及びアメジオール（Ａｍｍｅｄｉｏｌ）（ｐＫｓ＝９）は、異なる濃度で出発溶液中に存在する（図１参照）。一般的規則として、非常に弱い酸及び非常に弱い塩基の相対的濃度が、相対的に強い酸及び塩基の濃度に比べて明らかに高い（係数約５）。「適度な強さ」の酸及び塩基の濃度は、係数約１．５ないし最大３だけ増加されている。
【００１６】
図２及び３に、電気泳動移動後の上記酸及び塩基の相対的濃度を表す。表示した「平衡状態」で酸及び塩基の「対」が形成され、前記対が相互に非常に少ない程度でイオン化することができ（強い酸：ＨＩＢＡ＋非常に弱い塩基：タウリン、弱い酸：ＨＥＰＥＳ＋弱い塩基：メラミン、及び強い塩基：アメジオール＋非常に弱い酸：２−ＯＨ−ピリジン）、かつそれによって媒体固有の物質の電気泳動移動が停止する。この対の範囲内で、それぞれ酸及び塩基のｐＫｓ値の算術平均値に相当するｐＨ値が作られる。それにより、これらの対のｐＨ値は次のようになる：ＨＩＢＡ／タウリン溶液　ｐＨ＝２．６、ＨＥＰＥＳ／メラミン　ｐＨ＝６．２５、２−ＯＨ−ピリジン／アメジオール　ｐＨ＝１０．３。一つの対が安定したｐＨ値を保証できるｐＨ範囲は、約１ｐＨ単位である。種々のｐＫｓ値を有する全ての他の酸及び塩基は、個々の酸及び塩基の絶対濃度が平衡状態で充分な緩衝液容量を保証する限りにおいて、同様に１ｐＨ単位の内部で安定したｐＨ値を保証する対を形成する。
【００１７】
本発明による溶液は、性質が詳細に知られている定義の明確な化学物質からなる。全混合物の再現性は、製造に使用される秤の精密度及び／又は正確度によって保証されている。使用される物質類は毒性がない。使用した物質類の各々は「単官能性」であり、すなわち錯体形成及び／又はバイオポリマーの凝集のような作用は全く起こらないか、又は複数の官能基群を有する多価電解質と比較して少なくとも明らかに低減されている。この混合物の全ての個々の種の分子量は＜３００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）になる。
【００１８】
本発明による水溶液は、すでに成功裡にバイオポリマー及び生物粒子用の分離媒体としてテストされ、生物両立性があることが明らかとなった。大抵の個々の種は類似のｐＫｓ値を有する化学物質と置換してよいので、生物粒子の分離媒体に対する特異的要求事項は混合物の組成の変化によって考慮することができる。この理由から、後のヒト投与のための生物粒子及びバイオポリマー（ペプチド類及びタンパク質類）の洗浄用の前記溶液の官庁の許可が可能であると思われる。
【００１９】
以下、種々のｐＨ間隔を有する本発明による水溶液のいくつかの例を示す。この場合、より狭いｐＨ間隔用の媒体の製造に際して、酸及び塩基の絶対濃度が増加されることに注意すべきである；通常、ｐＫｓ値の差分は新規の成分の使用によって縮小される。
【００２０】
【表１】
2004509354.tif 000003
【００２１】
【表２】
2004509354.tif 000004
【００２２】
【表３】
2004509354.tif 000005
【００２３】
【表４】
2004509354.tif 000006
【００２４】
【表５】
2004509354.tif 000007
【００２５】
上記媒体において、広範囲に線形のｐＨ勾配が発生される。ｐＨプロフィルは、酸及び塩基の相対的濃度が変化されることによって、一定のｐＨ範囲内で平坦化することができる。本発明による溶液の製造において、通常の場合、個々の化合物の添加の順序は重要ではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１〜３は、３つの典型的な酸及び塩基のモデル例を用いた場合の電気泳動移動後に生じるｐＨ勾配の形成を示す図であり、図１は、酸としてのヒドロキシ酪酸（ＨＩＢＡ）、ＨＥＰＥＳ及び２−ヒドロキシピリジン、及び塩基としてのタウリン、メラミン及びアメジオールが、異なる濃度で出発溶液中に存在することを示す図である。
【図２】電気泳動移動後の上記酸の相対的濃度を示す図である。
【図３】電気泳動移動後の上記塩基の相対的濃度を示す図である。
【図１】
2004509354.tif 000008
【図２】
2004509354.tif 000009
【図３】
2004509354.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004509354.tif 000011
2004509354.tif 000012
2004509354.tif 000013
2004509354.tif 000014
2004509354.tif 000015
2004509354.tif 000016
2004509354.tif 000017
2004509354.tif 000018
2004509354.tif 000019
2004509354.tif 000020
2004509354.tif 000021
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509354.tif 000022
2004509354.tif 000023
【国際調査報告】
2004509354.tif 000024
2004509354.tif 000025
2004509354.tif 000026
2004509354.tif 000027
2004509354.tif 000028
2004509354.tif 000029