(57)【要約】物質ライブラリーを用いて標的分子の適切なエフェクターを製造し決定する方法。本発明は、特徴づけされた物質ライブラリーを用いて標的物質を現象学的に描写する方法、および活性化合物をスクリーニングするための、コンビナトリアル合成の物質ライブラリーの成分を選択する方法、および特徴づけされたコンビナトリアル合成の物質ライブラリーそのものに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の手順を含む、標的分子を現象学的に記述する方法：
ａ）調査する標的物質を、結合活性を持ち得る物質から成る特徴づけされた物質ライブラリーと接触させること、
ｂ）調査する標的物質が結合活性を持つ物質に結合するパターンの決定、
ｃ）調査する標的物質の結合特性と可能な限り類似する結合特性を持つ公知の試験物質の同定、およびこれらの試験物質の公知のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの決定。
【請求項２】
ライブラリーが試験物質としてタンパク質、ペプチドまたは核酸を用いて特徴づけられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
結合パターンを質量分析により決定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的物質および試験物質の結合特性を、パターン認識およびクラスター分析による数学的評価により比較することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
物質ライブラリーが試験化合物を用いて特徴づけられることを特徴とする、結合活性を持ち得る物質を含む、上記物質ライブラリー。
【請求項６】
物質ライブラリーが公知の治療標的と結合する物質を含むことを特徴とする、結合活性を持ち得る物質を含む、上記物質ライブラリー。
【請求項７】
結合活性を持ち得る物質が、カルボン酸、アミン、エステル、アルデヒド、ケトン、アセタールおよびヘテロ環、例えばアルカロイド、ならびに脂質、糖類、ステロイドおよび他の天然生成物、そしてまたペプチドおよびタンパク質、例えば抗体またはペプトイドそしてまたそれらのホモダイマーもしくはヘテロダイマーもしくはホモマルチマーもしくはヘテロマルチマー、またはそれらのアゴニストおよびアンタゴニストであることを特徴とする、請求項５または６に記載の物質ライブラリー。
【請求項８】
結合活性を持ち得る物質が予め決定された物理化学的特性を広範な特性範囲にわたりカバーすることを特徴とする、請求項５から７のいずれか１項に記載の物質ライブラリー。
【請求項９】
潜在的なエフェクターから成るライブラリーを構築する基準としての記述子を予め選択するための、請求項５から８のいずれか１項に記載の特徴づけされた物質ライブラリーの使用。
【請求項１０】
潜在的なエフェクターから成るライブラリーを構築する基準としての記述子を予め選択するための、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法により決定された記述子から、コンビナトリアル合成により得られる物質ライブラリー。
【請求項１２】
コンビナトリアル合成で生成される化合物を、記述子により多様にすることを特徴とする、請求項１１に記載の物質ライブラリー。
【請求項１３】
以下の手順を含む、調査する標的物質の適切なエフェクターを発見する方法：
ａ）請求項１から４のいずれか１項に記載された方法に従って決定されたアゴニストおよび／またはアンタゴニストの構造的特徴を含む、潜在的なエフェクターから成る、請求項１０から１２に記載のライブラリーの生成、
ｂ）調査する標的物質を当該ライブラリーと接触させること、および
ｃ）調査する標的物質の結合相手物質の同定。
【請求項１４】
結合相手物質を、続けてそのエフェクター特性について試験することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は特徴づけされた物質ライブラリーを用いて標的物質を現象学的に記述する方法、および活性化合物をスクリーニングするための、コンビナトリアル物質ライブラリーの成分を選択する方法、および特徴づけされたコンビナトリアル的に作成した物質ライブラリーそのものに関する。
【０００２】
一般に治療的または診断的に活性な活性化合物の検索は、適切な標的物質の同定および実証から始まる。薬理学的に活性となり得る物質に関するこのような生物学的標的の調査は、非常に困難であるとの結論に至ることがよくある。
【０００３】
適切な標的の同定にしばしば続いて、先行技術の公知の方法に従って、個々の化合物または化合物ライブラリーの選択的合成、適切ならばコンビナトリアル合成を行い［Ｌ． Ｖａｎ Ｈｉｊｆｔｅ， Ｇ． Ｍａｒｃｉｎｉａｋ， Ｎ． Ｆｒｏｌｏｆｆ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ １９９９， ７２５， ３−１５］、ｉｎ ｖｉｔｒｏ または ｉｎ ｖｉｖｏ アッセイにて標的に対するこれら化合物の生物学的活性を分析する。
【０００４】
合成した試験物質は、それらの物理化学的特性、例えば親油性パラメータｌｏｇＰ、電離定数（ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔａｎｔ）ｐＫａまたは溶解度Ｌが、可能な限り広範な特性範囲を均一にカバーするように選択する［Ｈ． Ｍａｔｔｅｒ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９７， ４０， １２１９−１２２９］。可能な限り多様な、そして結果的に不完全または非常に広範かのいずれかとなるこの化合物ライブラリーから、潜在的な活性物質の相対的に小さな群を生物学的スクリーニングにより、しばしば簡単な結合アッセイにより選択する。
【０００５】
これらの潜在的な活性物質の特定の物理化学的特性を起点として、今度は多様性を制限して定義された化合物ライブラリーを合成し、標的に対するそれら化合物の生物学的活性を調べる。次にこの結果から、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ または ｉｎ ｖｉｖｏ アッセイで評価された、１つまたはそれ以上のモデル構造を得るに至る。
【０００６】
最後にこれらの活性物質を臨床試験段階に通す前に、そのＡＤＭＥＴ特性（ＡＤＭＥＴは吸収される能力（Ａ）、分散される能力（Ｄ）、代謝される能力（Ｍ）、排泄される能力（Ｅ）、および器官または細胞形成への毒性（Ｔ）に基づく）について検査する。
【０００７】
このような方法の実践手段はトライアンドエラーの原則に基づき、相応に手間とコストがかかる。特に標的の適切な結合相手物質を同定するために膨大な個別実験を行う必要がある。生物学的活性物質のさらなる最適化を図ることができるのは、進んだ段階のまさに最終ステップに限られ、しかもその最適化の成功が、例えば薬理学的活性化合物としての当該物質の有用性を決定づけるのに極めて重要であることがしばしばある。
【０００８】
ハイスループットスクリーニングは、比較的多数の試験する物質を扱い評価することができる。固相でのコンビナトリアル合成の化合物ライブラリー、例えばスプリット−カップル−リコンバイン法で製造された場合の生物学的ハイスループットスクリーニングでは、固定された物質を直接分析するか、または合成中に固相ビーズをコードし活性ビーズのコードを読みとるかのいずれかにより、活性物質を同定することができる。しかし溶液でのコンビナトリアル化合物ライブラリーの生物学的ハイスループットスクリーニングは、常に設定される何段階もの解析および手間のかかるサブライブラリーの合成が必要となる。個々の化合物はまた活性物質を直接同定できるように、高度にパラレルな、および自動化された様式で製造し、各化合物にハイスループットスクリーニングを続けて行うこともしばしばある［Ｄ． Ｌ． Ｖｅｎｔｏｎ， Ｃ． Ｐ． Ｗｏｏｄｂｕｒｙ， Ｃｈｅｍｏｍ． Ｉｎｔｅｌｌ． Ｌａｂ． Ｓｙｓｔ． １９９９， ４８， １３１−１５０］。
【０００９】
この場合、試験化合物中の、さらなるプロセッシングに進める潜在的な活性成分と、非活性成分とを個人の判断で識別しなければならないことが多い［Ｇ． Ｗ． Ｃａｌｄｗｅｌｌ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｄｅｖ． ２０００， ３０−４１］。化合物ライブラリーの成分の最も生物学的に活性な３０％、または分子バックボーン鎖および有効な側鎖に関して主観的に活性化合物様である成分が、しばしば選択される［Ｂ． Ｌａｄｄ， Ｍｏｄ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０００， １， ４６−５２］。
【００１０】
これらの理由のため、トライアンドエラーの方法を用いることは別として、活性化合物のラショナル （ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ）デザイン法を開発する試みがなされている。本明細書に特に記載すべき方法は、分子モデリングおよびＳＡＲ分析である［Ａ． Ａｊａｙ， Ｗ． Ｐ． Ｗａｌｔｅｒｓ， Ｍ． Ａ． Ｍｕｒｃｋｏ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ４１， ３３１４−３３２４； Ｅ． Ｈｏｄｇｋｉｎ， Ｋ． Ａｎｄｒｅｗｓ−Ｃｒａｍｅｒ， Ｍｏｄ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０００， ３， ５５−６０］。今日ではこの目的のための多数のコンピュータープログラムを得ることができる［Ｗ． Ａ． Ｗａｒｒ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｓｃｉ． １９９７， ３７， １３４−１４０］。しかしこれまでのところ特に生物学的活性物質をデザインする純粋なラショナル法によっては数種の活性化合物が開発することができたに過ぎない；実際これまでにこれらの方法が成功であるとの証明はなされていない。さらに活性化合物をラショナルデザインするためには、標的は十分に特徴づけをされていなければならない；標的の３次元構造を知ることが必要になることさえしばしばある。
【００１１】
本発明はラショナル分子デザインに頼らなければならないことなく、生物学的および／または化学的活性物質を開発する選択の方法を利用できるようにするという目的に基づいている。
【００１２】
本発明により特徴づけされた、結合活性を持ち得る多数の物質を含むライブラリーをこの目的に使用する。本発明の意味する範囲内において結合活性を持ち得る物質は、他の化合物、特に核酸、タンパク質またはペプチドと相互作用することのできる分子であると解釈する。これらの分子は例えば低分子量物質、例えばカルボン酸、アミン、エステル、アルデヒド、ケトン、アセタールおよびヘテロ環、例えばアルカロイド、ならびに脂質、糖類、ステロイドおよび他の天然生成物を含む；しかしペプチドおよびタンパク質、例えば抗体またはペプトイド、そしてまたそれらのホモダイマーもしくはヘテロダイマーもしくはホモマルチマーもしくはヘテロマルチマー、またはタンパク質の公知のアゴニストおよびアンタゴニストを使用することもできる。
【００１３】
このライブラリーはさらに、結合活性を持ち得る、および広範な特性の範囲にわたり予め決定された物理化学的特性、例えばサイズ、親油性または極性を可能な限り均質にカバーする物質の選択によって補足する。適切な選択は例えば以下の助けを借りて行うことができる（Ｊ． Ｍ． Ｂｌａｎｅｙ， Ｅ． Ｊ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９７， １， ５４−５９； Ｈ． Ｍａｔｔｅｒ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９７， ４０， １２１９−１２２９）。
【００１４】
結合活性を持ち得る物質からなるこのライブラリーは、試験物質を用いて特徴づけを行い、それにより特徴づけされる。適切な試験物質は、その少なくとも１つのアゴニストまたはアンタゴニストの構造が分かっている、すべての公知のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。好ましい試験物質は既に十分に特徴が明らかにされている核酸、タンパク質およびペプチド、例えばレセプター、抗体、酵素、転写因子、イオンチャンネルもしくはコード鎖またはＤＮＡ配列の調節遺伝子、例えばプロモーターもしくはオペレーターである。特に好ましい試験物質は、治療の標的として当業者に知られているあらゆる化合物である。
【００１５】
このライブラリーを、ライブラリー中の結合活性をもつ物質に試験物質が結合するパターンを決定することにより、特徴づけを行う。両者の接触は溶液中で均質に、または固相に固定された試験化合物を用いて不均質に、のいずれかで行うことができる。
【００１６】
均質なアッセイにおいては、試験物質と特徴づけを行うライブラリーとを各例毎に適切な溶媒に溶かして相互作用させる。この実施法では設定された条件下、例えば試験物質および結合活性を持ち得る物質を正確な設定濃度で、または例えば生理学的溶液の条件という再現性のある使用下で行える点で有利である。次にサンプルを溶液から取り出し、ライブラリーに由来する結合活性を有する物質の濃度の減少から、試験物質の静的結合パターンを決定する。測定は、例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、ナノスプレーＥＳＩ−ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）または飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）で行う。質量分析計で結合パターンを決定する前に、クロマトグラフィーで分別してサンプルを分離することができるが、サンプルを直接質量分析計で測定することもできる。
【００１７】
好ましくは均質な溶液中での接触は透析ユニットで行う。初めに、特徴づけを行うライブラリー中の結合活性を持ち得るすべての物質を、好ましくは試験物質の濃度よりはるかに高い出発濃度に設定する。その結果、主にライブラリーの最も高い結合活性を持つ物質しか結合できず、一方、より弱い活性成分はこの競合的状況のいかなる結合にも関与できない。透析過程の間、設定された時間をおいてサンプルを取り出し、ライブラリーの各成分の質量シグナル強度を時間分解で、ＥＳＩ−ＭＳ、ナノスプレーＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩまたはＴＯＦ−ＳＩＭＳにて決定することができる。これらのサンプルはこのまま精製せずに、あるいは精製後、好ましくはクロマトグラフィーによる精製後のいずれかで分析することができる。
【００１８】
特徴づけを行うライブラリーの結合活性を持つ成分および試験物質は、質量分析計または好ましくはオンラインのクロマトグラフィーのいずれかで分離することができる。透析が進むにつれてライブラリーの濃度が特定の値以下に低下すると、より弱い活性物質さえもが結合できる非競合的状況がその時起こる。この時間経過を追う動的実施法は、測定の時間経過の過程の間に発生する結合活性を持ち得る物質の、濃度勾配による付加的な情報を提供する。
【００１９】
不均質なアッセイにおいては、試験物質は固相、例えば磁気ポリマービーズに結合させる。非競合的および競合的システム双方が起こるように、特徴づけを行うライブラリーを様々な設定濃度で、固定された試験物質に加える。固相をライブラリー由来の結合した活性成分と共に分離した後、質量分析法を用いて溶液中に残存するＭＳＬ成分を決定する、または結合成分を固相から溶出した後でその結合成分を決定するかのいずれかを行う。
【００２０】
このライブラリーを、結合活性を持つライブラリー由来の物質についての、静的結合パターンを様々な試験物質を用いて繰り返し決定することにより、または時間経過を追う動的結合パターンにより特徴づけを行う、すなわち本発明で意味する範囲内において特徴づけを行うことができる。ライブラリーの結合特性が特徴づけされる度合いは、ライブラリーと作用させる試験物質の使用数に直接比例する。
【００２１】
試験物質は注目する部分に応じて選択する；したがってこのライブラリーをタンパク質性の標的物質の調査に使う場合、好ましい試験物質は十分に特徴を明らかにされた天然または合成タンパク質である。
【００２２】
パターン認識、特にクラスター分析をこれらのデータを分析する数学的手段として利用する（Ｋ． Ｂａｃｋｈａｕｓ， Ｂ． Ｅｒｉｃｈｓｏｎ， Ｗ． Ｐｌｉｎｋｅ， Ｒ． Ｗｉｅｂｅｒ， Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｅｍｅｔｈｏｄｅｎ ［Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ］， ９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０００， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ； Ｄ．Ｔ． Ｓｔａｎｔｏｎ， Ｔ．Ｗ． Ｍｏｒｒｉｓ， Ｓ． Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ， Ｃ． Ｎ． Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｓｃｉ． １９９９， ３９， ２１−２７； Ｐ． Ｃ． Ｊｕｒｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８６， ２３２， １２１９−１２２４）。結合活性を持ち得るｎ個の成分からなる特徴づけされたライブラリーを、ｍ個の試験物質により特徴づけを行う場合、ｎ個の成分をスパンさせたｎ次元空間内の設定されたポイントを、この時各試験物質に割り当てることができる。
【００２３】
理想的なケースにおいては選択される試験化合物群が、特徴づけされたライブラリーの成分をポイントで表す、スパンさせたｎ次元空間全体をカバーする。
標的物質を本発明により特徴づけされたライブラリーに暴露する場合、標的物質の結合パターンは試験物質について述べた方法と同様に決定することができる。この点において、決定される結合パターンは標的物質を現象学的に記述すると言える。例えば親油性領域が標的物質にあれば、特徴づけされたライブラリーから結合活性をもつ相応の物質がその時結合する；極性領域に接近できる場合は、ライブラリーから極性物質がその時結合する。決定される結合パターンに基づいて、個々の成分をスパンさせたｎ次元空間の特異的なポイントをその時標的物質に割り当てることができる。
【００２４】
ライブラリーに特有のｎ次元空間に近接して存在するポイントは、類似する結合特性を示す化学的標的物質または試験物質に割り当てられることになる。
本発明はさらに、結合活性を持ち得る物質から成る、本発明により特徴づけされたライブラリーを用いて、標的物質を現象学的に記述する方法に関する。当方法において、調査する標的化合物を特徴づけされたライブラリーと相互作用させ、その特異的相互作用により作成される標的物質の結合パターンを続いて決定する。決定された結合パターンに基づいて、特徴づけされたライブラリーのｎ次元空間内の、標的物質の結合特性を表現するポイントを、上述の方法により標的物質に割り当てる。特徴づけされたライブラリーのｎ次元空間内の隣接する複数のポイントで表わされる、そしてそれ故に類似の結合特性を示すそれらの試験物質を、今や決定することができる。次に、これらの試験物質の公知のアゴニストまたはアンタゴニストから、調査中の標的物質との特異的結合を促進する物理化学的記述子を同定することが可能になる。
【００２５】
本発明の大きな利点は、そのアゴニスト、アンタゴニストまたはその他の結合相手物質も明らかである必要のない、新たに同定した標的の構造を、類似の構造的特徴および／または類似の生理学的特性をもつ試験化合物群と相関させることができることである。このことは逆に、類似する試験物質の公知のアゴニスト、アンタゴニストおよび非結合物質の構造的特徴および物理化学的特性を起点として、調査中の標的の構造への潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストの、物理化学的および構造的な要件に関する結論を導くことができることを意味する。得られた情報に基づいて、調査する標的物質との特異的相互作用を持つかどうかを調査できる化合物を選択することができる。その結果トライアンドエラーの原則とは反対に、本発明による方法は、未知の標的物質に対して活性な物質（エフェクター）の検索に利用できる物理化学的記述子を、ラショナル分子デザインに頼らなければならないことなく選択することを可能にする。
【００２６】
興味深い標的物質は、特に特定の発症に関与し得るタンパク質である；この場合、その３次元構造が分かっているかどうか、またはそれらの生化学的特性が解明されているかどうかは重要ではない。
【００２７】
興味深いその他の標的構造は、遺伝子制御に活性のあるＤＮＡ配列、例えばプロモーターまたはオペレーターである。
上述の方法により同定された記述子は、例えばコンビナトリアル合成的に生成され（Ｊ． Ｍ． Ｂｌａｎｅｙ， Ｅ． Ｊ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９７， １， ５４−５９）、そしてエフェクターとなり得る物質から成るライブラリーの作成に用いることができる。このようなライブラリーを生成する際、公知の物理化学的特性、例えば活性化合物の膜通過能力を促進する構造要素、または分解もしくは排泄される生物学的もしくは生理学的能力を改善する構造要素、を有する他の記述子を考慮することができる（Ｐ． Ｊ． Ｓｉｎｋｏ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９９， ２， ４２−４８）。
【００２８】
本発明の意味する範囲内において、エフェクターは調査する標的物質と特異的に相互作用し、その機能に影響を与える生物学的または化学的に活性な物質である。エフェクターの例として酵素の阻害剤、活性化剤もしくは誘導剤、または補酵素、転写因子またはレセプターがある。
【００２９】
したがって本発明はさらに、本発明により特徴づけされたライブラリーを用いて決定された記述子を、エフェクターとなり得る物質から成るライブラリーの作成に使用すること、および調査する標的物質の適切なエフェクターを同定するため選択的に構築されるライブラリーに関する。
【００３０】
適切なエフェクターは今や、当該分野の技術者の公知の方法により同定することができる。
【国際公開パンフレット】
2004510134.tif 000002
2004510134.tif 000003
2004510134.tif 000004
2004510134.tif 000005
2004510134.tif 000006
2004510134.tif 000007
2004510134.tif 000008
2004510134.tif 000009
2004510134.tif 000010
2004510134.tif 000011
2004510134.tif 000012
2004510134.tif 000013
2004510134.tif 000014
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004510134.tif 000015
【国際調査報告】
2004510134.tif 000016
2004510134.tif 000017
2004510134.tif 000018
2004510134.tif 000019
2004510134.tif 000020
2004510134.tif 000021
2004510134.tif 000022
2004510134.tif 000023
2004510134.tif 000024
2004510134.tif 000025