(57)【要約】本発明は検査すべき化合物の哺乳動物および／またはヒトの新生脂質生成を抑制する能力を測定することにより、肥満症の治療および／または予防に好適である化合物を見いだすための方法を記載している。更に、哺乳動物中の新生脂質生成を抑制する能力を有する化合物の肥満症の治療および／または予防のための薬剤を製造するための使用が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満症の治療および／または予防に好適である化合物を発見するための方法において、哺乳動物、特にヒトの新生脂質生成を抑制する能力を有する化合物を選択することを特徴とする、肥満症の治療および／または予防に好適である化合物の発見方法。
【請求項２】
哺乳動物中に存在するカルボアンヒドラーゼの少なくとも１つの活性を抑制する能力を有する化合物を好適なものとして選択する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの化合物を少なくとも１つのカルボアンヒドラーゼと接触させ、引き続き少なくとも１つのカルボアンヒドラーゼの活性を抑制する化合物を同定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
齧歯類動物またはヒト中に存在するカルボアンヒドラーゼを使用する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
ヒト中に存在するカルボアンヒドラーゼを使用する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物、特にヒト中に存在するサブタイプＩＩおよび／またはＶのカルボアンヒドラーゼを使用する、請求項２記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物、特にヒト中に存在するサブタイプＶのカルボアンヒドラーゼを使用する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
カルボアンヒドラーゼが化学的方法または生物工学的方法により得られ単離された酵素として存在し、かつ該化合物の影響下でのカルボアンヒドラーゼの活性の変化をインビトロ酵素活性テスト中で測定する、請求項３記載の方法。
【請求項９】
単離した、生存する哺乳動物細胞のクエン酸サイクル中で形成される代謝生成物の量の減少をもたらす能力を有する化合物を好適なものとして選択する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
細胞のクエン酸サイクル中で形成されたシトレート、マレエート、フマレート、α−ケトグルタレートの量の減少および／またはクエン酸サイクルの脂質後続生成物の形成の減少を化合物の影響下に測定する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
齧歯類動物またはヒトからの単離した生存細胞を使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
脂肪細胞または肝細胞を使用する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
肥満症の治療および／または予防に好適である化合物を発見するための方法において、請求項８記載の方法および付加的に請求項９記載の方法においてそれぞれ好適な化合物として同定された化合物を選択することを特徴とする、肥満症の治療および／または予防に好適である化合物の発見方法。
【請求項１４】
肥満症の治療および／または予防に好適である化合物を発見するための方法において、請求項１記載の方法において好適な化合物として同定され、かつ付加的に抗痙攣特性の測定のための標準テストにおいて実質的に作用を有さないものとして同定された化合物を選択する、肥満症の治療および／または予防に好適である化合物の発見方法。
【請求項１５】
哺乳動物中の新生脂質生成を抑制する能力を有する化合物の、肥満症の治療および／または予防のための薬剤を製造するための使用。
【請求項１６】
哺乳動物中に存在する少なくとも１種のカルボアンヒドラーゼを抑制する能力を有する化合物の請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
哺乳動物中に存在するサブタイプＩＩおよび／またはＶのカルボアンヒドラーゼを抑制する能力を有する化合物の請求項１５または１６記載の使用。
【請求項１８】
抗痙攣特性を実質的に有さない化合物の請求項１５記載の使用。
【請求項１９】
請求項１による方法により初めて肥満症の治療および／または予防に好適であると同定された化合物の、肥満症の治療および／または予防のための薬剤を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は肥満症の治療および／または予防に好適な化合物を発見するための方法に関する。更に本発明は哺乳動物中の新生脂質生成（ｄｅ−ｎｏｖｏ−Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｅ）を抑制する能力を有し、かつ中枢神経系（＝ＺＮＳ）への作用を実質的に有さない化合物の肥満症の、治療および／または予防のための薬剤を製造するための使用に関する。
【０００２】
肥満症（脂肪過多症）は今日、特に開発された産業国において、大部分は調和のとれていない、脂肪過多の食料に起因する、国民の健康のためにますます深刻さを増している問題である。体重超過の人の人口比率が上昇すると共に、個人的な不満〜心臓−循環器疾患または一定の型の糖尿病にまで達する、肥満症の後遺症も上昇する。従って、すでに肥満症の治療または予防を目指すいくつかの治療の試みがなされている。例としては、腸管中での脂肪分解を減少し、このようにして摂取した栄養からのエネルギー収率を低下させる、リパーゼ抑制化合物を挙げることができる。食物脂肪はこの治療の試みにおいては少なくとも部分的に再び分解されずに排泄される。しかしながら、公知治療形を補足することのできる、肥満症の治療および／または予防のためのその他の新規な治療の試みは望まれている。
【０００３】
意外にも、哺乳動物、特にヒトの新生脂質生成を抑制することのできる化合物は有利な方法で著しく有効な肥満症の治療および／または予防に好適であるということが見いだされた。特に良好な結果は前記化合物を長期間にわたって、例えば数週間の期間にわたって投与する場合に達せられる。
【０００４】
本発明の対象は哺乳動物、特にヒトの新生脂質生成を抑制する能力を有する化合物を選択することにより、肥満症の治療および／または予防に好適である化合物を発見するための方法である。更に本発明の対象は哺乳動物中の新生脂質生成を抑制し、かつＺＮＳへの作用、例えば抗痙攣作用を実質的に有さない化合物の、肥満症の治療および／または予防のための薬剤を製造するための使用に関する。
【０００５】
新生脂質生成（以降ＤＮＬと短縮する）とは、哺乳動物の有機体中での炭水化物から身体独自の脂肪酸の構成であると理解される。この構成反応は体細胞のサイトゾル中で行われ、いわゆるクエン酸サイクルまたはクレブス・マルチウスサイクルに基づく。身体独自の生化学的反応において、このサイクルにおいて両方の構成成分、すなわち炭水化物から由来するピルベートと炭酸水素塩とから種々の中間工程を介して（マレエート、フマレートおよびα−ケトグルタレートを介して）最終的にシトレートが構成される。シトレートが過剰に構成されると、これらは中間工程のアセチル−コエンザイムＡを介して遊離脂肪酸（＝脂質後続生成物（ｌｉｐｉｄｉｓｃｈｅ Ｆｏｌｇｅｐｒｏｄｕｋｔｅ））に変換する、これは脂肪を形成し、次いで脂肪細胞（＝Ａｄｉｐｏｚｙｔｅｎ）に貯蔵される。脂肪酸から形成された脂肪の体細胞中への過剰の貯蔵は一般的に肥満症に導くことがある。クエン酸サイクルには種々の酵素が関与している。クエン酸サイクルの物質変換は主に提供される炭酸水素塩の量に依存する。提供される炭酸水素塩の量はその際この炭酸水素塩が二酸化炭素から構成される速度に依存している。この炭酸水素塩を提供する平衡反応はいわゆるカルボアンヒドラーゼ（Ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅｎ）により触媒される。従来公知のカルボアンヒドラーゼおよびそのアイソザイムのうちで、哺乳動物中では主にサブタイプＩＩ（＝ＣＡ ＩＩ）並びにＶ（＝ＣＡ Ｖ）のカルボアンヒドラーゼアイソザイムが反応の触媒に関与し、これは炭酸水素塩をクエン酸サイクルに提供する。特にサブタイプＶのカルボアンヒドラーゼはミトコンドリア中に存在するので、このカルボアンヒドラーゼは重要である。クエン酸サイクルはミトコンドリア中でも行われる。
【０００６】
クエン酸サイクル中で生じる物質変換を低下させることを目指して、哺乳動物細胞中のＤＮＬを抑制する種々の可能性が考えられる。これにより、脂肪酸の構成のために提供される、過剰に生産されるシトレートの濃度を減少させることができる。本発明に相応して、クエン酸サイクルのための炭酸水素塩を供給する反応を触媒するカルボアンヒドラーゼを抑制することにより、ＤＮＬを有利に抑制することができる。本発明の目的のためにサブタイプＩＩおよび／またはＶのカルボアンヒドラーゼ、有利にはＣＡ Ｖを抑制することができる。
【０００７】
非特異的なカルボアンヒドラーゼを抑制することのできる化合物（＝非特異的またはクラシックなＣＡ−インヒビター）は公知であり、すでに長い間種々の治療分野に、主には利尿剤としてまたは眼科薬として使用された。そのようなクラシックなＣＡ−インヒビターの使用分野に関する概観は、例えばＣ． Ｔ． Ｓｕｐｕｒａｎ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ， １０ （５） （２０００） ５７５−６００に記載されている。これに対して、“特異的なＣＡ−インヒビター”とはほぼ１つのＣＡ−サブタイプ（例えばＣＡ Ｖ）またはＣＡ−サブタイプの限定された１つの群のみを抑制する化合物であると理解するべきである。肥満症の治療および／または予防に照準を合わせたクラシックなＣＡ−インヒビターの使用は従来公知ではなかった。
【０００８】
一般的に、肥満症の圧倒的に多数の公知の例は摂取した栄養中の外来脂肪の過剰な割合に起因すると思われる。高度に発展した国、例えばＵＳＡにおいては脂肪過多の人はその栄養の３０％までを脂肪の形で摂取する。従って、今日の認識によれば肥満症に導く脂肪貯蔵は主に過剰に摂取する食物脂肪に由来し、これは炭水化物−代謝を目指すＤＮＬの抑制により影響を受けない。
【０００９】
ＤＮＬの抑制により脂肪細胞中への脂肪酸の貯蔵の減少が達せられたにもかかわらず、ＤＮＬの抑制は体細胞中への脂肪酸の貯蔵への僅かな寄与により、従来人における肥満症の治療および／または予防のために好適でない手がかりであるとして見なされてきた。この方向への専門分野で発表された意見の総括は、例えばＭ． Ｋ． Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ５３ （１） （１９９９） ５３−６５に記載されている。専門分野において支配的なこの考えは、ＤＮＬ−抑制の原理に基づく、肥満の治療および／または予防のための薬剤に照準を合わせた検索またはその開発をも妨害した。
【００１０】
本発明の範囲においては意外にも、哺乳動物、特にヒト中のＤＮＬを抑制する能力を有する化合物が肥満症の治療および／または予防のために有効に使用することができ、特にこの化合物を例えば６週間にわたる、長期間にわたって、該当する患者に投与する場合に、好適に使用することができることが見いだされた。これによれば、ＤＮＬが脂肪細胞中に貯蔵された体脂肪に対して比較的僅かに寄与するにすぎないにもかかわらず、ＤＮＬの抑制により脂肪過多の人の体重の明らかな減少が長期間にわたって達成することができる。長期間にわたってのＤＮＬの抑制により、この僅かな効果も、全体的には体重の減少のために著しい寄与が達せられるように蓄積することができる。
【００１１】
化合物のトピラマート（Ｔｏｐｉｒａｍａｔ）の例は、本発明による方法が実際に肥満症の治療および／または予防に好適な化合物を的確に目指して見いだすために好適であることを示す。トピラマートはＥＰ０１３８４４１Ａ２から公知の抗てんかん薬である。更に、トピラマートは多要素の薬理学的作用スペクトルを有しているということでも公知である。こうしてトピラマートは緊張依存のナトリウムチャネルを遮断し、こうして細胞の膜電位を安定化し、ＧＡＢＡ−レセプターを活性化し、こうしてＧＡＢＡを介しての抑制を強化して、カルボアンヒドラーゼ−インヒビターとして作用し、最終的にはカイニン酸／ＡＭＰＡ−レセプター（グルタメートレセプターのサブ型）を抑制することができ、これによりＡＭＰＡ−誘導電流が生じることを抑制する。トピラマートはこれによりＺＮＳに著しい作用を示す。トピラマートの抗てんかん特性が前記薬理学的関連ファクターに起因するのかどうかは公知ではない。
【００１２】
ＷＯ９８／００１３０はトピラマートが肥満症の治療のために好適であると思わせる薬理学的特性も有していることを記載している。この特性はてんかん患者の長期間の研究において随伴作用として偶然に発見された。てんかん患者で観察された重量減少がトピラマートのどの薬理学的特性によるものであるのか、従来公知ではなかった。トピラマートはＷＯ９８／００１３０中に一般式Ｉの抗痙攣作用を有する化合物の肥満症の治療のために好適な群の範囲にある。
【００１３】
本発明による方法により、トピラマートは強力なＣＡ−インヒビター、特に哺乳動物中に存在するサブタイプＩＩおよびＶのカルボアンヒドラーゼの強力なインヒビターであるということ、およびトピラマートは哺乳動物細胞中のＤＮＬを有効に抑制することができるということを示すことができた。こうして、従来説明することのできなかったてんかん患者の体重減少に導くトピラマートの薬理学的随伴作用が、哺乳動物中のＤＮＬを効果的に抑制する能力に実質的に起因するということが、本発明による方法を用いて初めて証明された。本発明による方法を用いて肥満症の治療および／または予防に好適である未来の化合物を見いだすことができるということがこれにより期待される。本発明による方法を用いて初めて、この原理により薬理学的能力を有するＤＮＬ−抑制に作用する化合物を迅速にかつ簡単に見いだすことの可能性が開けた。本発明により前記の原理により作用する肥満症の治療および／または予防に好適である化合物を少なくとも最初の情報を提供する選択法を長時間かかる高いインビボテスト、例えば実験動物への飼料付与実験なしに選択することができる。
【００１４】
トピラマートの薬理学的特性の従来の実験においてはそのＣＡ−抑制作用は常に目立たないかまたは非常に僅かで医療上意味を有さないとして記載されていたので（例えば、Ｂ． Ｅ． Ｍａｒｙａｎｏｆｆ 等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０ （１９８７） ８８０−８８７； Ｂ． Ｅ． Ｍａｒｙａｎｏｆｆ 等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１ （１９９８） １３１５−１３４３； Ｓ． Ｊ． Ｄｏｄｇｓｏｎ 等，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ４１（１） （２０００） ｐ ３５−３９を参照）、この結果は意外であった。前記の従来の研究においては、トピラマートのＣＡ−抑制活性の測定のために、その都度種々異なる哺乳動物のＣＡを含有するテスト溶液、これは更に種々異なる身体の部位、例えば血液または器官組織含有する、を使用した。
【００１５】
本発明による第１の実施形においては、哺乳動物中に存在する少なくとも１つのカルボアンヒドラーゼの活性を抑制する能力を有する化合物を好適なものとして選択することにより、肥満症の治療および／または予防に好適な化合物を見いだすことができる。例えば、少なくとも１つの検査すべき化合物を少なくとも１つのカルボアンヒドラーゼと接触させ、引き続き少なくとも１つのカルボアンヒドラーゼの活性を抑制する化合物を公知法で同定することができる。有利には、この実施形においてはヒトまたは齧歯類動物のような哺乳動物、例えば家ネズミ、マウスまたはモルモット、中に存在するカルボアンヒドラーゼ、特にサブタイプＩＩおよび／またはＶのカルボアンヒドラーゼを使用する。特に有利であるのは、ヒト中に存在するカルボアンヒドラーゼの使用である。好適なカルボアンヒドラーゼは、例えば前記の哺乳動物から単離し、所望の場合は精製することができ、または有利に公知の化学的方法または生物工学的方法により製造することができる。
【００１６】
この第１の実施形の有利な変法においては、検査すべき化合物の影響下でのカルボアンヒドラーゼの活性の変化を公知のインビトロ酵素活性テスト中で測定することができ、その際カルボアンヒドラーゼは単離しかつ付随化合物を少なくとも十分に含有しない酵素として存在する。化学的方法または生物工学的方法により製造されたカルボアンヒドラーゼは特に純粋な形で使用することができるので、有利にはこれを使用する。カルボアンヒドラーゼの活性の測定のためのインビトロ活性テストは公知である。本発明の範囲においてカルボアンヒドラーゼの活性の変化を測定するために好適なインビトロ酵素活性テストには、例えばカルボアンヒドラーゼの影響下でのｐＨ値の変化の測定（Ｋ． Ｈ． Ｗｉｌｂｕｒ， Ｎ． Ｇ． Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７６ （１９４８） １４７−１５４； Ｇ． Ｓａｎｙａｌ， Ｔ． Ｈ． Ｍａｒｅｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５６ （１９８１） ６０８−６１２を参照）、ストップ・フロー測定法（Ｒ． Ｇ． Ｋｈａｌｉｆａｈ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４６ （１９７１） ２５６１−２５７３を参照）または４−ニトロフェニルアセテート・エステラーゼ法（Ｙ． Ｐｏｃｋｅｒ， Ｊ． Ｔ． Ｓｔｏｎｅ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ８７ （１９６５） ５４９７−５４９８）を挙げることができる。最後に挙げたテストは検査すべきカルボアンヒドラーゼの影響下に４−ニトロフェニルアセテートの加水分解速度を測定する、その際エステラーゼとしても作用する、カルボアンヒドラーゼの特性を利用している。
【００１７】
この関連において本発明においては、Ｃ． Ｔ． Ｓｕｐｕｒａｎ等、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ （１９９８） ５７７−５９４（特に第５９２頁参照；以降には“Ｓｕｐｕｒａｎ等”として記載する）またはＡ． Ｓｃｏｚｚａｆａｖａ等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２ （１９９９） ３６９０−３７００（特に第３６９７頁参照；以降には“Ｓｃｏｚｚａｆａｖａ等”として記載する）に記載されている化合物のＣＡ−抑制特性の測定のためのテスト法が有利である。こうして前記のＳｕｐｕｒａｎ等によりおよびＳｃｏｚｚａｆａｖａ等により記載されたテスト法は本発明の開示の範囲に明記されたものとする。前記Ｓｕｐｕｒａｎ等によるおよびＳｃｏｚｚａｆａｖａ等によるインビトロ−標準活性テストの１つにおいてＩＣ５０−濃度値が少なくとも１０μｍｏｌ／ｌまたはそれ以下（＝より高い活性）を示す化合物を好適なＣＡ抑制作用化合物（＝ＣＡ−インヒビター）として、本発明の範囲において選択することができる。ヒトＣＡ−サブタイプの活性を測定すべきである場合、４−ニトロフェニルアセテート・エステラーゼ法とは異なる方法が好適である。特に、比較的迅速な反応経過を追跡可能である方法が好適である。
【００１８】
Ｓｃｏｚｚａｆａｖａ等（前記）において記載されている４−ニトロフェニルアセテート・エステラーゼ法により実施する酵素活性テスト（最初はＹ． ＰｏｃｋｅｒおよびＪ． Ｔ． Ｓｔｏｎｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６ （１９６７） ６６８−６７８に記載）においては、本発明の範囲においてトピラマートは生物工学的方法により得られたサブタイプＩＩ（のヒトカルボアンヒドラーゼに対して著しい抑制作用を示しＩＣ５０＝５ｎｍｏｌ／ｌ）、この抑制作用は比較物質として測定したクラシックなＣＡ−抑制剤アセタゾールアミドまたはメタゾールアミドに起因する抑制作用より明らかに強いということが証明された。サブタイプＩＩのヒトカルボアンヒドラーゼはＳｃｏｚｚａｆａｖａ等において記載された方法により得られた。
【００１９】
同じテストにおいて、トピラマートが生物工学的方法により得られたマウスのサブタイプＶａ（＝ｍＣＡ Ｖａ）のカルボアンヒドラーゼに対して著しい抑制作用を同様に有すること（ＩＣ５０＝７４ｎｍｏｌ／ｌ）が証明された。Ｓｃｏｚｚａｆａｖａ等により記載された実験報告書とは異なり、この場合には酵素ｍＣＡ Ｖａを１２０ｎＭの濃度で使用した。ｍＣＡ ＶａはＨ． Ｒ． Ｈｅｃｋ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９ （１９９４） ２４７４２−２４７４６に記載された公知の方法により得られた。このためには、ｍＣＡ Ｖａをコードする配列をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘発可能なＴ７−プロモータの制御下に有するプラスミドベクターを有するバクテリア株Ｅ． コリ ＢＬ ２１（ＤＥ３）を使用した。バクテリア培地を３７℃で撹拌下に、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）液状培地中に接種し、その成長を６００ｎｍ分光光度測定により追跡した。バクテリア培養物が指数増殖期に入った時に、ＩＰＴＧ１ｍｍｏｌ／ｌの最終濃度でＩＰＴＧを添加した。３時間のインキュベーション時間（３７℃で、撹拌下）の後、バクテリア培地を７０００×ｇで１５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。生じたペレットを二回蒸留水０．１体積（Ｖｏｌ）中に取り込み、リゾチーム（１０００μｇ／ｍｌ）を加えた。細胞溶解は超音波処理で行った。このためには、得られたバクテリア懸濁液の分割量１０ｍｌを上部の開口したガラス容器中に入れ、この試料のそれぞれを３分間４回超音波で処理した。それぞれの音波パルスの後、試料の６００ｎｍにおける吸光を測定した、そのためには試料のそれぞれ１００μｌを二回蒸留水９００μｌで希釈した。終点は試料の６００ｎｍ−吸収が出発値の約１／１０にある値として達せられる。細胞溶解が達せられた後、ＣａＣｌ２−結合緩衝液（ＣａＣｌ２−Ｂｉｎｄｕｎｇｓｐｕｆｆｅｒ； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を添加し、かつ得られた細胞溶解物を精製のために、カルモジュリン−親和性樹脂カラムに供給した。この精製は樹脂に結合するカルモジュリンドメインのカルモジュリン−結合ペプチド・タグ（これは発現したｍＣＡ Ｖａ−プロテインのＮ−末端に存在する）への高い親和性に基づく。この精製は公知法で行われた（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の教書“Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＬＩＣ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ”）。
【００２０】
本発明による方法の第２の実施形において、クエン酸サイクル中で単離した、生存哺乳動物細胞が形成する代謝生成物の量の減少をもたらすか、またはクエン酸サイクルの脂質後続生成物の形成の減少をもたらす能力を有する化合物を選択することにより、肥満症の治療および／または予防のために好適な化合物を見いだすことができる。検査すべき化合物の影響下にその量が測定可能に減少する、クエン酸サイクルの代謝生成物としては酸に可溶の代謝生成物、例えばシトレート、マレエート、フマレートおよび／またはα−ケトグルタレートが好適である。シトレートが有利である。更に、代謝生成物としてクエン酸サイクルの脂質後続生成物、例えば遊離脂肪酸が好適である。この第２の実施形においても、最終的に検査すべき化合物の、哺乳動物中に存在する少なくとも１つのカルボアンヒドラーゼの活性を抑制する能力を測定するが、使用したテストモデルは第１に挙げた実施形においてとは異なる。第２の実施形の方法はクエン酸サイクルの１４Ｃ−アイソトープで標識した基質からの放射能の単離した生存する哺乳動物細胞のクエン酸サイクルの代謝中間生成物または後続生成物中への取り込みを測定し、かつ見いだされた結果を、同じ条件であるが、相違としてはＣＡ−抑制作用を有する化合物の影響下で達せられた結果と比較する、という原理に基づく。この変法において有利には齧歯類動物、例えば家ネズミ、マウスまたはモルモットの、またはヒトの単離された生存細胞を使用する。ヒトの細胞が有利である。齧歯類動物の細胞を使用する限りにおいては、脂肪細胞または肝細胞を使用する。齧歯類動物の脂肪細胞が有利である。ヒトの細胞を使用する限りにおいては、脂肪細胞または肝細胞を使用することができる。ヒトの肝細胞が有利である。この変法において使用する哺乳動物の細胞は通常の培養および／またはクローニング法により獲得することができる。天然または生物工学的に変性された哺乳動物細胞を使用することができる。クエン酸サイクルの酸溶解性の中間生成物中への放射能の取り込みを測定する限りにおいては、１４Ｃ−標識基質、有利に１４Ｃ−炭酸水素塩（＝ＮａＨ［１４Ｃ］Ｏ３）を使用する。クエン酸サイクルの脂質後続生成物中への放射能の取り込みを測定するべき限りにおいては、１４Ｃ−標識基質としては有利に［Ｕ−１４Ｃ］グルコースを使用する。
【００２１】
哺乳動物中のＤＮＬを抑制する化合物の能力を測定するこの第２の実施形の有利な変法は Ｓ． Ａ． Ｈａｚｅｎ 等により、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １０ （４） （１９９６） ４８１−４９０（以降“Ｈａｚｅｎ 等”と記載する）中に記載されている。前記のＨａｚｅｎ 等により記載されたテスト法に関しては、こうして本発明の開示の範囲に明記されている。クエン酸サイクル中の前工程物として使用することのできる１４Ｃ−標識物質からの放射能の組込、例えば１４Ｃ−炭酸水素塩のシトレート、マレエート、フマレートおよび／またはα−ケトグルタレート中への組込を少なくとも１０μｍｏｌ／ｌまたはそれ以下（より高い効果）のＩＣ５０−値で明らかに抑制する化合物を本発明において好適なものとして選択することができる。
【００２２】
Ｈａｚｅｎ 等により記載されたテストモデルに相当する、本発明の範囲において実施したテストモデルにおいて、トピラマートは生物工学的方法により得られたセルライン３Ｔ３−Ｆ４４２Ａの家ネズミ−脂肪細胞のクエン酸サイクルの酸溶解性物質代謝生成物の形成に著しい抑制作用を示した。このトピラマートの抑制作用（ＩＣ５０＝３４８ｎｍｏｌ／ｌ）は比較物質として測定したクラシックなＣＡ−インヒビターであるエトクスゾールアミド（Ｅｔｈｏｘｚｏｌａｍｉｄ）より明らかに著しい。
【００２３】
肥満症の治療および／または予防のために好適である化合物を見いだすための本発明による方法の特に有利な変法においては、前記の方法の第１の実施形、特に前記インビトロ−酵素活性テストにおいて哺乳動物中に存在するカルボアンヒドラーゼの少なくとも１つを抑制するために好適であるとして選択され、かつ更に前記の方法の第２の実施形においてクエン酸サイクル中で単離される生存哺乳動物細胞中で形成された物質代謝生成物の量の減少に作用するために好適なものとして選択される化合物を選択する。方法の第１の実施形においては迅速かつ効果的に哺乳動物中に存在するカルボアンヒドラーゼを抑制する化合物の能力を試験することができる。方法の第２の実施形においては、特に検査する化合物がＣＡ Ｖが局在する生存哺乳動物細胞のミトコンドリア中に侵入する能力も有しているかどうかの根拠をもたらす。好適な化合物の選択のためには第１および第２に挙げた実施形を平行してまたは任意の順序で順次実施することができる。
【００２４】
本発明により哺乳動物中のＤＮＬを抑制する能力を有する化合物は肥満症の治療および／または予防のための薬剤の製造のために好適である。その際哺乳動物中に存在する少なくとも１つのカルボアンヒドラーゼを抑制する能力を有する化合物を選択する。選択された化合物はもちろん生理学的に認容性でなければならず、かつ一般的な医薬作用物質に対する要求、例えば安全性および認容性に関する要求を満たさなければならない。哺乳動物中に存在するサブタイプＩＩおよび／またはＶのカルボアンヒドラーゼを抑制することのできる化合物の使用は有利である。特異的にＣＡ ＩＩおよび／またはＣＡ Ｖ、特にＣＡ Ｖを抑制することの可能な化合物が有利である。
【００２５】
ＣＡ−抑制作用を有し、長期間の投与において結果として患者の体重の減少をもたらす公知化合物、例えばトピラマートは著しいＺＮＳに対する作用、例えば抗痙攣作用をも有する。肥満症の治療および／または予防の目的で長期間にわたって投与する予定の化合物にとって、ＺＮＳに対する付随効果はしばしば不所望である。前記の本発明の方法により肥満症の治療および／または予防に好適であるとして選択された化合物を、従ってＺＮＳに向けられている効果に関しても更に検査することができる。例えば場合により存在する抗痙攣作用に関して化合物を検査することができる。抗痙攣作用に関する化合物の検査のために、例えばＧ．Ｃｈｅｎ 等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ８７ （１９５４） ３３４−３３９（以降“Ｇ．Ｃｈｅｎ 等”と記載する）およびＪ． Ｅ． Ｐ． Ｔｏｍａｎ 等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９ （１９４６） ２３１ （以降“Ｔｏｍａｎ 等”と記載する）による、いわゆる“超最大電気ショックテスト”（＝ＳＥＳ−テスト、場合によっては“最大電気ショックテスト（ＭＥＳ−テスト）”とも呼ばれる）が好適である。前記Ｇ．Ｃｈｅｎ 等およびＴｏｍａｎ 等により記載されたテスト法はこうして本発明の開示の範囲に明記されている。こうして肥満症の治療および／または予防の目的で患者に長期間にわたって投与すべき化合物は前記Ｇ．Ｃｈｅｎ 等によるおよびＴｏｍａｎ 等によるＳＥＳ−テストにおいて実質的に作用を有さず、有利には少なくとも経口投与１００ｍｇ／ｋｇの高い投与においても、このテストに常用の基準により有意と見なされる効果を示すべきではない（すなわち、Ｇ．Ｃｈｅｎ 等による“保護投与量（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖ Ｄｏｓｅ）”ＰＤ５０≧１００ｍｇ／ｋｇ（経口投与）；この際、Ｇ．Ｃｈｅｎ 等により記載されたＰＤ５０値は“最少有効投与量”ＭＥＤとして汎用される投与記載に実質的に相当する）。化合物を見いだすための前記方法において好適なものとして選択され、かつ前記Ｇ．Ｃｈｅｎ 等によるＭＥＳ−テストにおいて実質的に効果を有さない化合物が肥満症の治療および／または予防のための薬剤を製造するために特に好適である。前記ＳＥＳ−（もしくはＭＥＳ−）テストは薬理学的な標準テストであり、相応するサービス提供者（例えば“Ｐａｎｌａｂｓ”）において慣用法として実施することができる。
【００２６】
本発明により、肥満症の治療および／または予防のために好適であるとして見いだされた化合物は通常薬剤として薬学的助剤と共に薬学的剤形、例えば錠剤、カプセル剤、座薬または液剤中に含有されていてよい。これらの製剤は常用の固体または液体担体物質、例えば乳糖、デンプンまたはタルクまたは液体パラフィンの使用下に、かつ／または常用の薬学的助剤、例えば崩壊剤、溶解助剤または保存剤の使用下に公知の方法により製造することができる。本発明による医薬組成物は例えばＥＰ０１３８４４１Ａ２から、並びにＷＯ９８００１３０からも公知である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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