(57)【要約】同化可能な炭素源及び窒素源、無機質塩類を含み、かつ、最適な範囲で供給することにより同化可能な炭素源を及び窒素源を制御した培地中、約37〜41℃内の温度での液内培養において、別のストレプトマイセス・テネブラリウス株の適用によってカルバモイル・トブラマイシン製造のために代謝制御された発酵工程を開発した。本願発明の結果として、高い純度をもつカルバモイル・トブラマイシンの多収量製造を達成することができた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
6'-O-カルバモイル・トブラマイシン産生微生物由来の6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの製法であって、以下のステップ：
a)6'-O-カルバモイル・トブラマイシン産生微生物を含む発酵ブロスを調製し；
b)同化可能な炭素源及び同化可能な窒素源を一定レベルに調節し；
c)6'-O-カルバモイル・トブラマイシンを回収する、
を含む上記製法。
【請求項２】
前記6'-O-カルバモイル・トブラマイシン産生微生物が、ストレプトマイセス・テネブラリウスである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記の同化可能な炭素源がグルコースである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記グルコースを、約0.001〜約0.5%の範囲内で一定レベルに調節する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記グルコースを、約0.001〜約0.4%の範囲内で一定レベルに調節する、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前記グルコースを、約0.001〜約0.05%の範囲内で一定レベルに調節する、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
前記の同化可能な炭素源がグルタミン酸である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記同化可能な炭素源がグルタミン酸ナトリウムである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記の同化可能な炭素源を、約0.005〜約0.1%の範囲内で一定レベルに調節する、請求項7又は8に記載の方法。
【請求項１０】
前記の同化可能な炭素源を、約0.001〜約0.1%の範囲内で一定レベルに調節する、請求項7又は8に記載の方法。
【請求項１１】
前記の同化可能な窒素源がアンモニア態窒素である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンモニア態窒素が、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びその混合物から選ばれる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンモニア態窒素が硫酸アンモニウムである、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンモニア態窒素を、約0.03〜約0.2%の範囲内で一定レベルに調節する、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンモニア態窒素を、約0.02〜約0.2%の範囲内で一定レベルに調節する、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
前記発酵ブロス中の一定レベルの同化可能な炭素源及び同化可能な窒素源を、グルコース、グルタミン酸ナトリウム、及び硫酸アンモニウムの連続的な供給により調節する、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記グルコース、グルタミン酸ナトリウム、及び硫酸アンモニウムの連続的な供給が、互いに独立に生じる、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
無機塩類の連続的な供給をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記無機塩類が、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、リン酸塩、マンガン、ナトリウム、カリウム、及びコバルトから成る群から選ばれる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記グルコース溶液が、約4.0〜約5.0のpHに調整される、請求項4、5又は6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記グルコース溶液のpHが、無機リン酸塩を使って調整される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記無機塩類がリン酸である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記無機塩類を、1日あたり約0.001〜約0.002％の量で発酵中に供給する、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記ストレプトマイセス・テネブラリウス株がNCAIM B(P) 000169である、請求項2に記載の方法。
【請求項２５】
前記ストレプトマイセス・テネブラリウス株がNCAIM B(P) 000204である、請求項2に記載の方法。
【請求項２６】
前記発酵が液内培養である、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
前記発酵を、約37℃〜約41℃の温度範囲で維持する、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
請求項1に記載の方法により製造される6'-O-カルバモイル・トブラマイシン。
【請求項２９】
請求項1に記載の方法により製造される6'-O-カルバモイル・トブラマイシンを含む、ヒトの感染症の治療に有用な製剤。
【請求項３０】
請求項1に記載の方法により製造される6'-O-カルバモイル・トブラマイシンを含む、ヒトの眼及び耳の感染疾の治療に有用な製剤。
【請求項３１】
前記の請求項1に記載の方法により製造される6'-O-カルバモイル・トブラマイシンが、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーザ、エッシェリキア・コリ、エンテロバクター・アエロゲネス、プロテウス・ミラビリス、クレブシエラ・ニューモニエ、モルガネラ・モルガニイ、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・エジプチウス、モラクセレア・ラクナータ、及びアシネトバクター・カルコアセチカスから成る群から選ばれる細菌を死滅させる、請求項29又は30に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許
当該出願は、Estavan BAKONDI-KOVACS、Ilona Csutoros NOVOTNY、Janos ERDEI、Gabor BALOGHによる、「カルバモイル・トブラマイシン製造のための代謝制御された発酵工程」と題する、2001年1月9日に出願された米国仮出願特許番号第60/260,542号、及び2001年12月4日に出願された同第60/337,127号の35 U.S.C. 119(e)項下の利益を主張する；ここで、上記仮出願の内容を本明細書中に援用する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、6'-O-カルバモイル・トブラマイシン製造のための代謝制御された発酵工程の開発に関する。
【０００３】
より特に、本発明は、グルコース、グルタミン酸、及びアンモニア態窒素のレベルを調節することを通して発酵工程を制御することによって6'-O-カルバモイル・トブラマイシンを製造するためのストレプトマイセス・テネブラリウス(Streptomyces tenebrarius)の培養を開示する。
【背景技術】
【０００４】
本発明の背景
トブラマイシンは、O-3-アミノ-3-デオキシ-α-D-グルコピラノシル-(1-6)-O-[2,6-ジアミノ-2,3,6-トリデオキシ-α-D-リボ-ヘキソ-ピラノシル-(1-4)]-2-デオキシ-D-ストレプトアミン[a/k/s「4-[2,6-ジアミノ-2,-3,6-トリデオキシ-α-D-グリコピラノシル]-6-[3-アミノ-3-デオキシ-α-D-グリコピラノシル]-2-デオキシストレプトアミン」、ネブラマイシン因子6;NF6；ゲメブシン；トブラシン；トブラジスチン；トブラレックス；トブラマキシン；トブレックスの化学名をもつ。トブラマイシンは、以下の：
【化１】
2004524018.tif 000002
で表される化学式をもつ。
【０００５】
トブラマイシンは、グラム陽性及びグラム陰性バクテリアの両方に対する活性の広い範囲をもつ抗生物質である。感受性の細菌は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcs epidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、シュードモナス・アエルギノーザ(Psudomonas aeruginosa)、エッシェリキア・コリ(Escherichia coli)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabelis)、クレブシエラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、モルガネラ・モルガニイ(Morganella morganii)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・エジプチウス(Haemophilus aegyptius)、モラクセレア・ラクナータ(Moraxlea lacumata)、及びアシネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)を含んでいる。トブラマイシンは、目及び耳の感染症における優れた抗細菌特性をもつことが知られている。
【０００６】
トブラマイシンは、現在ストレプトマイセス・テネブラリウスの培養によって製造されている。カルバモイル・トブラマイシンの製造において、流加技術がしばしば使われる。バッチ発酵において、炭素と窒素の代謝は、直接的に制御されない。培養期間中に生じる栄養素の枯渇によって、カルバモイル・トブラマイシンの収量は、実質的に減少する。カルバモイル・トブラマイシン発酵は、とりわけ酸素供給に敏感でもある。その上、培養中の蒸発に起因する容量の損失も収量に影響し、かつ、培養中の容量の補正は汚染の危険をもたらす。
【０００７】
実質的に高い収量と純度をもつカルバモイル・トブラマイシンのための発酵製造を改善するために、発酵工程における供給特性を細かい制御技術によって調節することができる技術を開発することが望ましい。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的
従って、カルバモイル・トブラマイシンを製造するための経済的な、かつ、高効率の工程を提供することが本発明の目的である。開示した工程は、6'-O-カルバモイル・トブラマイシン産生微生物の培養を伴い、そして実質的に高められた純度を生むための、そのような微生物による6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの発酵工程の代謝制御に関する。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、6'-O-カルバモイル・トブラマイシン産生微生物の培養中の一定レベルの栄養を選択的に調節することである。
【００１０】
グルコース、グルタミン酸、及びアンモニア態窒素のレベルを独立に維持することによって6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの発酵工程の代謝制御を提供することが本発明のよりさらなる目的である。
【００１１】
本発明の概要
本発明は、同化可能な炭素及び窒素源、並びに無機塩類を含む培地中、約37℃〜約41℃の範囲の温度での、液内培養による6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの製造のための高収量発酵工程を提供する。
【００１２】
好ましくは、前記工程は、二次代謝中の菌株の炭素及び窒素代謝を、連続的にグルコース、グルタミン酸ナトリウム、及びアンモニウム溶液を供給することによって約0.001〜約0.5%のグルコース・レベル、約0.005〜約0.1のグルタミン酸レベル、及び約0.03〜約0.2%のアンモニア態窒素レベルで制御することにより、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの産生のために安定した発酵ブロス中での微生物の6'-O-トブラマイシン産生株を培養するステップを含んでいる。本発明による方法において、栄養の調節は、好ましくは互いに独立して行われる。
【００１３】
1の態様によると、無機リン酸塩は、発酵中、1日あたり約0.001〜約0.002%の分量で供給される。
【００１４】
本発明は、以下のステップ：
a)6'-O-カルバモイル・トブラマイシン産生微生物を含む発酵ブロスを調製し；
b)一定レベルの同化可能な炭素源及び同化可能な窒素源を調節し；そして
c)6'-O-カルバモイル・トブラマイシンを回収する、
を含む、ストレプトマイセス・テネブラリウスから6'-O-カルバモイル・トブラマイシンを製造し、その上6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの産生を代謝的に制御する工程を提供する。
【００１５】
本発明は、約37℃〜約41℃の温度幅をもつ発酵培地を提供する。
本発明は、液内培養用である発酵培地を提供する。
本発明は、異なるストレプトマイセス・テネブラリウスを使用する、同化可能な炭素、同化可能な窒素源、無機塩類を含む発酵ブロスを提供する。
【００１６】
本発明は、約0.001〜約0.5%のグルコース・レベルで制御される同化可能な炭素及び窒素源を提供する。本発明は、約0.005〜約0.1%のグルタミン酸レベルで制御される同化可能な炭素源及び窒素源をさらに提供する。本発明は、約0.03〜約0.2%のアンモニア態窒素レベルで制御される同化可能な炭素源及び窒素源をさらに提供する。
【００１７】
本発明は、互いに独立に、グルコース、グルタミン酸ナトリウム、及びアンモニウム(NH4+)溶液を連続的に供給することによって制御される同化可能な炭素源及び窒素源を提供する。
【００１８】
本発明を、リン酸によりグルコースのpHを調整するためにさらに提供する。好ましくは、グルコース溶液のpH範囲は、約4〜約5である。本発明は、1日につき約0.001〜約0.002%の分量で存在するグルコースと一緒に発酵培地に供給される無機リン酸塩をも提供する。
【００１９】
本発明の詳細な説明
本明細書中に使用されるとき、「ppm」は、百万分の1を表し、「rpm」は1分間あたりの回転数を表し、「vvm」は、1分間あたりの容量あたりの容量を表す。
【００２０】
本明細書中に使用されるとき、用語「NH3-N」はアンモニア態窒素を表す。
別段の指定がない限り、用語「%」は、重量対重量の%を表す。例えば0.001%グルコースは。0.001 gのグルコース対100 gの発酵ブロスを意味する。
【００２１】
本明細書中に使用されるとき、用語「6'-O-カルバモイル-トブラマイシン」は、トブラマイシンのカルバモイル化された形態を表す。トブラマイシンの合成中、トブラマイシンは、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンであるところのカルバモイル化された形態で生合成される。それはカルバモイル・トブラマイシンとしても知られている。
【００２２】
本明細書中に使用されるとき、用語「流加技術」は、1以上の栄養成分が発酵工程中にバッチに加えられる発酵を表す。1又は2の栄養素の増分が発酵中に加えられるとき(約1〜約2%)、それはバング−バング発酵(bang-bang fermentation)と呼ばれる。多数のほんの一部の栄養素が発酵の間中加えられる(約0.02〜約0.05%)又はまさしく(途切れない)連続的に供給されるとき、それは連続流加発酵と呼ばれる。本明細書中に使用されるとき、用語「連続的な供給」は、栄養素と酸素のほんの一部の供給(約0.02%〜約0.05%)又は本当に連続的な供給を表す。
【００２３】
本明細書中に使用されるとき、用語「同化可能であること」は、栄養素の吸収及び微生物の複雑な成分の生合成で使用するためのそのような栄養素を消費、使用、又は分解するための酵素系をもつ所定の微生物を表す。
【００２４】
本明細書中に使用されるとき、用語「無機塩類」は、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、リン酸塩、マンガン、ナトリウム、カリウム、及びコバルトを含む生物学的に重要な元素の塩及び微量元素を表す。
【００２５】
本明細書中に使用されるとき、用語「主発酵槽」は、ストレプトマイセス・テネブラリウスの増殖及び6'-O-カルバモイル・トブラマイシン製造のために使われる発酵工程で使用される容器を表す。
【００２６】
それ故に、本発明は、発酵工程を個別に制御することによって；好ましくは、グルコース、グルタミン酸、及びアンモニア態窒素のレベルを連続的に調節することによって；最も好ましくは、各々他から独立した、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンを製造するための工程を提供する。
【００２７】
本発明によると、トブラマイシンは、カルバモイル化された形態で生合成され、それは、6'-O-カルバモイル-トブラマイシンである。炭素と窒素代謝の種類、速度、及び比率は、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの形成に重要である。バッチ発酵において、この代謝は直接的に制御されない。本発明は、発酵ブロス中のグルコース及びグルタミン酸レベルを最適化し、そしてカルバモイル・トブラマイシンの形成のために炭素又は窒素代謝の比を最適化するために提供される。この情報に基づいて、本発明は、6'-O-カルバモイル・トブラマイシン製造のための新しい発酵技術をさらに提供する(すなわち、制御された流加技術)。他の発酵製品のための流加技術が一般に周知であり、そして使用されているのに対して；本発明は、同化可能な炭素と窒素の代謝を制御することによる6'-O-カルバモイル・トブラマイシンのための制御された、つまり6'-O-カルバモイル・トブラマイシンに独特の流加技術を提供する。
【００２８】
本願発明の発酵工程において、異なる同化可能な炭素源及び窒素源を使用することができる。本発明の好ましい態様は、同化可能な炭素源としてグルコースかグルタミン酸(又はその塩)を使うことを伴う。本発明の他の好ましい態様は、同化可能な窒素源としてアンモニア態窒素を使うことを伴う。
【００２９】
本発明によると、同化可能な窒素源は、代謝しうる有機及び無機化合物の群から選ばれる。そのような化合物は、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなど、及びそれらの混合物を含む。好ましくは、アンモニア態窒素は硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4]である。
【００３０】
本発明によると、グルコース、グルタミン酸、及び「アンモニア態窒素」のレベルを調節することは、カルバモイル・トブラマイシンの生合成に重要である。本発明は、「グルコース、グルタミン酸、又はアンモニア態窒素の少なくとも1つのレベル」が一定のレベルで制御又は調節され、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンのより良い産生量と純度をもたらす、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの発酵工程を提供する。
【００３１】
本発明の発酵工程を実行するために好ましい6'-O-カルバモイル・トブラマイシン産生微生物は、ストレプトマイセス・テネブラリウスである。好ましくは、ストレプトマイセス・テネブラリウスは、NCAIM B(P)000169として寄託されたストレプトマイセス・テネブラリウス株である。好ましくは、ストレプトマイセス・テネブラリウスは、NCAIM B(P)000204として寄託されたストレプトマイセス・テネブラリウス株である。
【００３２】
本発明の1の態様において、グルコース・レベルは、約0.001〜約0.5%に調節される。好ましくは、グルコース・レベルは、約0.001〜約0.4%に調節される。最も好ましくは、グルコース・レベルは、約0.001〜約0.05%に調節される。
【００３３】
本発明の他の態様において、グルタミン酸レベルは、約0.005〜約0.1%に調節される。より好ましくは、グルタミン酸レベルは、約0.001に約0.1%に調節される。
【００３４】
本発明の他の好ましい態様において、塩の形態でのグルタミン酸(例えば、グルタミン酸ナトリウム)は、約0.005〜約0.1%に調節される。より好ましくは、グルタミン酸塩レベルは、約0.001〜約0.1%に調節される。
【００３５】
本発明の他の態様において、アンモニア態窒素レベルは、約0.03〜約0.2%に調節される。より好ましくは、アンモニア態窒素レベルは、約0.02〜0.2%に調節される。
【００３６】
好ましくは、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの代謝制御された発酵は、互いに独立に、グルコース、グルタミン酸ナトリウム及びアンモニア態窒素溶液を連続的に供給することによって行われる。
【００３７】
トブラマイシンは、アミノグリコシド型の抗生物質である。6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの生合成中、グルコース異化作用の2つの方法：エムデン-マイヤーホフ-パルナス・サイクル及び異化の産物が6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの生合成を抑制するヘキソース-リン酸経路が存在する。代謝制御された発酵は、発酵ブロス中のグルコースのレベルを維持することによって調節される。好ましくは、グルコース異化生成物(又はグルコース異化生成物中間体)抑制の不存在を確実にするために、グルコースは低レベル、例えば約0.001〜約0.5%で維持される。
【００３８】
同じように、代謝制御された発酵は、発酵ブロス中のグルタミン酸レベルを維持することによって調節される。好ましくは、グルタミン酸塩の異化生成物抑制の不存在を確実にするために、グルタミン酸(又はその塩)を、低いレベル、例えば約0.005〜約0.1%で維持する。
【００３９】
同じように、代謝制御された発酵は、発酵ブロス中のアンモニア態窒素レベルを維持することによって調節される。好ましくは、アンモニア態窒素は、低いレベル(例えば、約0.03〜約0.2%)で維持される。低レベルでアンモニア態窒素レベルを調節することは、異化生成物に関係した問題のないアミノ基転移工程のための基質の十分な供給を保証する。
【００４０】
本発明は、グルコース、グルタミン酸、及びアンモニア態窒素の少なくとも1つのレベルを維持することによる代謝制御された発酵を提供する。
【００４１】
本発明の他の態様において、無機リン酸塩は、発酵培地に供給される。但し、その全体量は、発酵工程の効率的な進行を可能にするのに十分である。好ましくは、無機リン酸塩の量は、1日につき約0.001〜約0.002%の量の範囲中にある。
【００４２】
本発明は、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの代謝制御された発酵を提供する。ここで、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの改善された収量は、一般に約30%より大きい。
【００４３】
本発明を、本発明の範囲を制限することのない、以下の実施例でさらに説明する。
【実施例】
【００４４】
実施例1
【００４５】
【表１】
2004524018.tif 000003
【００４６】
接種培地によるストレプトマイセス・テネブラリウスの培養
(グルコースを含まない)接種培地を、60 Lの容器中に準備した。この接種培地を約121℃で約60分間滅菌した。
【００４７】
グルコース溶液を、別個に準備した。グルコース溶液のpHを、塩酸により約4.0〜約5.0の値に調整した。グルコース溶液の滅菌を、約121℃、約30分間で行った。滅菌したグルコース溶液を、滅菌した接種培地に加えた。
【００４８】
ストレプトマイセス・テネブラリウス株(NCAIM B(P)000169)を、約500 mLの分量の無菌(グルコースを伴う)接種培地中に接種した。ストレプトマイセス・テネブラリウス株の栄養細胞培養を、対数期まで成長させた。培養を、温度：約37℃、上部圧力：約0.4 bar、混合速度：約2.6 m/秒、及び曝気配給量：約0.4 ppmのパラメーターで実行した。
【００４９】
発酵培地によるストレプトマイセス・テネブラリウスの培養
(グルコースを含まない)主発酵培地を、300 Lの容器中に準備した。この主発酵培地を約121℃で約60分間滅菌した。
【００５０】
グルコース溶液を、別個に準備した。グルコース溶液を、塩酸を用いて約4.0〜約5.0のpHに調整した。グルコース溶液を、約121℃で約30分間滅菌した。滅菌したグルコース溶液を、滅菌後の主発酵培地に加えた。
【００５１】
接種(seed)段階の主発酵槽への移行は、培養の24時間後であった。接種段階対主発酵の比率は、10%だった。主発酵槽に関する培養パラメーターは以下のとおりであった。0〜70時間の間の温度：約37℃、そして70時間〜発酵工程の終わりの温度：約39℃；曝気率：約O.1 ppm；撹拌速度：約250 rpm；内圧：約0.2 bar。
【００５２】
8 g/L培地の分量のグルタミン酸ナトリウム溶液を準備した。10 g/L培地の硫酸マグネシウム溶液も準備した。グルタミン酸ナトリウムと硫酸マグネシウムの両方の溶液を、約121℃で約60分間滅菌した。次に、両溶液を、24時間経ったときに主発酵培養物中に20 Lの分量で加えた。培養を、144時間の行った。
【００５３】
培地の最初のグルコース含量は、発酵の80時間目までに尽きた。培地の最初のグルタミン酸塩含量は、発酵の60時間目まで完全に消費された。培地の(「正式の」滴定によって計測された)最初の120 mg/100 mLのNH3-Nは、発酵の50時間目までに60 mg/100 mL未満まで減少し、発酵の終わりまでに完全に消費された。
【００５４】
HPLCによって計測された得られた収量は、1,856 μg/gのアプラマイシン、678 μg/gのカルバモイル・カナマイシン、及び1,968 μg/gの6'-O-カルバモイル・トブラマイシンであった。
【００５５】
実施例2
【００５６】
【表２】
2004524018.tif 000004
【００５７】
接種培地によるストレプトマイセス・テネブラリウスの培養
接種培地を、60 Lの容器中に準備した。この接種培地を約121℃で約60分間滅菌した。
グルコース溶液を、別個に準備した。グルコース溶液を、塩酸を用いて約4.0〜約5.0のpHに調整した。グルコース培地を、約121℃で約30分間滅菌した。滅菌したグルコース培地を、滅菌後の接種培地に加えた。
【００５８】
ストレプトマイセス・テネブラリウス株(NCAIM B(P)000169)を、約500 mLの分量の滅菌した接種培地中に接種した。ストレプトマイセス・テネブラリウス株の栄養細胞培養を、対数期まで成長させた。培養を、温度：約37℃、上部圧力：約0.4 bar、混合速度：約2.6 m/秒、及び曝気配給量：約0.4 ppmのパラメーターで実行した。
【００５９】
主発酵培地によるストレプトマイセス・テネブラリウスの培養
主発酵培地を、300 Lの容器中に準備した。この主発酵培地を約121℃で約60分間滅菌した。
【００６０】
グルコース溶液を、別個に準備した。グルコース溶液を、塩酸を用いて約4.0〜約5.0のpHに調整した。グルコース培地を、約121℃で約30分間滅菌した。滅菌したグルコース培地を、滅菌後の接種培地に加えた。
【００６１】
接種段階の主発酵槽への移行の条件は、実施例1の記載と同様であった。培養時間は約20時間だった。24時間目に行った栄養供給を伴う培養パラメーターは、実施例1の記載と同様であった。
【００６２】
培地中のグルコース、グルタミン酸塩及びアンモニア態窒素含量の消耗(すなわち、消費)も、実施例1の記載と同様であった。
【００６３】
HPLCによって計測した得られた収量は、2,150 μg/ gの6'-O-カルバモイル・トブラマイシンであった。
【００６４】
実施例3
接種培地を、実施例2の記載と同様に準備した。500 mLのストレプトマイセス・テネブラリウス株(NCAIM B(P)000204)の栄養細胞培養により接種を行った。培養パラメーターは、実施例1の記載と同様であった。
【００６５】
主発酵培地を、実施例2の記載と同様に準備した。接種段階の移行の条件は、実施例1の記載と同様であり、そして培養時間は約18時間だった。24時間目に行った栄養供給を伴う培養パラメーターは、実施例1の記載と同様であった。
【００６６】
培地のグルコース、グルタミン酸塩及びアンモニア態窒素含量の消耗も、実施例1の記載と同様であった。
HPLCによって計測した得られた収量は、2,210 μg/gの6'-O-カルバモイル・トブラマイシンであった。
【００６７】
実施例4
接種培地を、実施例2の記載と同様に準備した。500 mLのストレプトマイセス・テネブラリウス株(NCAIM B(P)000169)の栄養細胞培養により接種を行った。培養パラメーターは、実施例2の記載と同様であった。
【００６８】
主発酵培地を、実施例2の記載と同様に準備したが、グルコース溶液のpHをリン酸により調整した。接種段階の移行の条件は、実施例1の記載と同様であり、そして培養時間は約18時間だった。24時間目に行った栄養供給を伴う培養パラメーターは、実施例1の記載と同様であった。
【００６９】
その上、50%のグルタミン酸ナトリウム溶液を調製し、そして121℃で60分間滅菌し、次に50%のグルコース溶液を調製し、リン酸により約4,0〜約5.0にpHを調整後、それを約121℃で約30分間滅菌した。前記グルコース溶液中のリン酸塩含量は、約0.05〜約0.2%の範囲内にあった。これらの溶液の供給を、産生期におけるグルコース及びグルタミン酸塩の含量をそれぞれ約0.001〜約0.05%及び約0.001〜0,1%の範囲内に制御することにより発酵24時間目〜終わりまで実行した。前記濃度に加え、約30〜約200 mg/100 mL(すなわち、約0.03〜約0.2%)の範囲内にアンモニア態窒素含量を制御するために、アンモニア水も供給した。
HPLCによって計測した得られた収量は、3,150 μg/gの6'-O-カルバモイル・トブラマイシンであった。
【００７０】
実施例5
接種培地を、実施例2の記載と同様に準備した。500 mLのストレプトマイセス・テネブラリウス株(NCAIM B(P)000204)の栄養細胞培養により接種を行った。培養パラメーターは、実施例2の記載と同様であった。
接種段階の移行条件は、実施例1の記載と同様であり、そして培養時間は約16時間だった。
【００７１】
主発酵培地を、実施例4の記載と同様に準備した。実施例4と同様に、50%のグルタミン酸ナトリウム溶液を調製し、そして121℃で60分間滅菌した。50%のグルコース溶液を調製し、リン酸により約4,0〜約5.0にpHを調整後、次に約121℃で約30分間滅菌した。
【００７２】
代謝制御された供給を伴う発酵条件は、実施例4の記載と同様であった。これらの溶液の供給を、産生期におけるグルコース及びグルタミン酸塩の含量をそれぞれ約0.001〜約0.5%及び約0.001〜0,1%の範囲内に制御することにより発酵24時間目〜終わりまで実行した。前記濃度に加え、約20〜約200 mg/100 mL(すなわち、約0.02〜約0.2%)の範囲内に発酵培地のアンモニア態窒素含量を制御するために、アンモニア水も供給した。
【００７３】
HPLCによって計測した得られた収量は、4,030 μg/gの6'-O-カルバモイル・トブラマイシンであった。
流加技術の適用は、発酵ブロス(fermentation broth)中のより高い6'-O-のカルバモイル・トブラマイシン活性を提供する。
【００７４】
供給の結果として、蒸発による容量の損失だけが埋め合わせられるだけでなく、その上、発酵槽容量の能率的な利用及びより大量の収穫される有効成分をももたらす、バッチの発酵作用容量の増加を得ることができる。
【００７５】
発酵中の供給特性の微調整の可能性により、洗練された、ハイレベルな制御された技術を得ることができる。本発明は、グルコース、グルタミン酸塩、及びアンモニア態窒素のレベルを調節するという理由で、供給特性の微調整を確実にすることにより、発酵工程を提供する。
【００７６】
カルバモイル・トブラマイシン発酵は、酸素供給に非常に敏感である。流加技術の場合において、内圧及び曝気率を最適に要求値に調整することによってより容易にこのパラメーターを制御することができる。例えば、0.1 vvmより高い曝気率又は0.2 barより高いバック・プレッシャーを用いることにより、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンの力価は減少し始め、そしてカナマイシンB(夾雑物)のレベルが増す(例えば、6'-O-カルバモイル・トブラマイシン/カナマイシンBの比が悪化する)。たとえ0.2〜0.4 vvmの曝気率であっても、力価は、25〜50%まで減少し、カナマイシンBのレベルは倍になる。本発明によると、代謝制御された発酵技術を用いた流加技術をしようして、夾雑物形成を容易に制御することができる。従って、発酵の内圧及び曝気率を調節することに加えて、6'-O-カルバモイル・トブラマイシンのより良好な求められる最善の値は、同化可能な炭素源及び炭素源、そして無機リン酸塩の連続的な供給により達成される。
【００７７】
それ故に、バッチ用の供給(BG50996特許を参照のこと)に関連する連続的な供給を使って、前記の利点をより容易に達成することができる。
【００７８】
流加工程の適用により、より単純な最初の培地の組成物が準備され、動物に由来する成分(例えば、カゼイン加水分解物など)を除き、及びウシ海綿状脳症(BSE)汚染の潜在的な危険を回避することによってそれを向上させる可能性を提供する。
【００７９】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施例により範囲を制限されることはない。実際に、本明細書中に記載のものに加えて、本発明の様々な修飾が、先の記述及び添付の図面から当業者にとって明らかになる。そのような修飾は、当該請求の範囲内にある。様々な刊行物が本明細書中に引用されおり、この開示をそれらの全体で本明細書中に援用する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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