(57)【要約】本発明は、空中窒素を固定する能力、リンミネラルおよび化合物を分解する能力、カリウムミネラルおよび化合物を分解する能力、複合炭素化合物を分解する能力、成長因子を過剰生産する能力、およびＡＴＰを過剰生産する能力が増強している酵母細胞を含む生物学的肥料組成物を提供する。本発明の生物学的肥料組成物は、作物植物への窒素、リンおよびカリウムの供給において無機肥料にとってかわることができる。該生物学的肥料組成物の製造方法および使用方法も包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵母細胞要素の少なくとも１つを含む生物学的肥料組成物：
（ａ）窒素を固定する第一の複数の酵母細胞を含む第一酵母細胞要素；
（ｂ）リン化合物を分解する第二の複数の酵母細胞を含む第二酵母細胞要素；または、
（ｃ）カリウム化合物を分解する第三の複数の酵母細胞を含む第三酵母細胞要素。
【請求項２】
さらに、以下を含む請求項１に記載の生物学的組成物：
（ｄ）複合炭素化合物を単純炭水化物に変換する第四の複数の酵母細胞を含む第四酵母細胞要素；
（ｅ）成長因子を過剰生産する第五の複数の酵母細胞を含む第五酵母細胞要素；および、
（ｆ）アデノシン三リン酸を過剰生産する第六の複数の酵母細胞を含む第六酵母細胞要素。
【請求項３】
以下の酵母細胞要素の少なくとも１つを含む生物学的肥料組成物：
（ａ）第一の複数の酵母細胞を、８６０から８７０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第一の電磁場において、前記第一の複数の酵母細胞の窒素固定を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第一酵母細胞要素；
（ｂ）第二の複数の酵母細胞を、３６０から３７０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第二の電磁場において、前記第二の複数の酵母細胞のリン化合物分解を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第二酵母細胞要素；または、
（ｃ）第三の複数の酵母細胞を、２５０から２６０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第三の電磁場において、前記第三の複数の酵母細胞のカリウム化合物分解を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第三酵母細胞要素。
【請求項４】
さらに以下を含む請求項３に記載の生物学的組成物：
（ｄ）第四の複数の酵母細胞を、１０８７から１０９７ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第四の電磁場において、前記第四の複数の酵母細胞の複合炭素分子から単純炭水化物への変換を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第四酵母細胞要素；
（ｅ）第五の複数の酵母細胞を、１３８２から１３９２ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第五の電磁場において、前記第五の複数の酵母細胞の成長因子の過剰生産を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第五酵母細胞要素；および、
（ｆ）第六の複数の酵母細胞を、１６９０から１７００ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第六の電磁場において、前記複数の酵母細胞のアデノシン三リン酸の過剰生産を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第六酵母細胞要素。
【請求項５】
さらに有機基材要素、無機基材要素、または有機および無機基材要素の両方を含む、請求項２または４に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項６】
各酵母細胞要素が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｅｂｒｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ； Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍおよび Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる群から選択される属に属する酵母細胞を別々に含む、請求項２または４に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項７】
各酵母細胞要素が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｏｇｏｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｅｌｌｉｓ、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｉ、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓａｋｅ、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ Ｂｅｉｊｅｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｉｎｅｎｓｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｕｓ、 Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｃａｎｄｉｄａ、 Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｆａｍｔａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌｏｂｏｓａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｈｒｅｎｄｏｏ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃａｐｉｔａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｓ、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｒｂｏｒｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ Ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｍｂｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｏｂｕｓｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｕｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ、Ｃｒｅｂｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｋｌｏｅｃｋｅｒｉ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ 、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｒｏｂｕｓｔｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｒａｂｉｔｏｌｇｅｎｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｊａｄｉｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｃｈｎｅｇｇｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ 、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂａｒおよびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｉｎｅｓｉｓからなる群から選択される酵母の種の細胞を含む、請求項２または４に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項８】
各酵母細胞要素がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞を含む、請求項２または４に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項９】
各酵母細胞要素の酵母細胞が、別々に、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒに寄託されていて、ＡＳ２．５０１、ＡＳ２．５３５、ＡＳ２．４４１、ＡＳ２．４０６、ＡＳ２．３８２および ＡＳ２．１６からなる群から選択される受託番号を有する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎの細胞である請求項２または４に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の酵母細胞要素（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む請求項２に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項１１】
請求項３に記載の酵母細胞要素（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む請求項４に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項１２】
さらに有機基材要素、無機基材要素、または有機および無機基材要素の両方を含む、請求項１０または１１に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項１３】
酵母細胞要素（ａ）を約０．１から０．２重量％、酵母細胞要素（ｂ）を約０．１から０．２重量％、酵母細胞要素（ｃ）を約０．１から０．２重量％、酵母細胞要素（ｄ）を約０．１から０．２重量％、酵母細胞要素（ｅ）を約１重量％、酵母細胞要素（ｆ）を約重量３％、有機基材要素を約６５重量％、無機基材要素を約１９重量％、およびデンプンを約１４重量％含む、請求項１２に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項１４】
複数の酵母細胞を含む組成物であって、前記複数の酵母細胞が、８５０から８６０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞の窒素固定を引き起こすのに十分な時間培養された、組成物。
【請求項１５】
複数の酵母細胞を含む組成物であって、前記複数の酵母細胞が、３６０から３７０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞のリン化合物分解を引き起こすのに十分な時間培養された、組成物。
【請求項１６】
複数の酵母細胞を含む組成物であって、前記複数の酵母細胞が、２５０から２６０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞のカリウム化合物分解を引き起こすのに十分な時間培養された、組成物。
【請求項１７】
複数の酵母細胞を含む組成物であって、前記複数の酵母細胞が、１０８７から１０９７ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞の複合炭素分子の単純炭水化物への変換を引き起こすのに十分な時間培養された、組成物。
【請求項１８】
複数の酵母細胞を含む組成物であって、前記複数の酵母細胞が、１３８２から１３９２ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から２０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞の成長因子の過剰生産を引き起こすのに十分な時間培養された、組成物。
【請求項１９】
複数の酵母細胞を含む組成物であって、前記複数の酵母細胞が、１６９０から１７００ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞のアデノシン三リン酸の過剰生産を引き起こすのに十分な時間培養された、組成物。
【請求項２０】
酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞である、請求項１４、１５、１６、１７、１８または１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
（ｉ）以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）の酵母細胞要素の少なくとも１つ；
（ａ）第一の複数の酵母細胞が窒素を固定することができるように、第一の複数の酵母細胞を、約８６５．５２２ＭＨｚの振動数と約１２５０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場において２４時間培養し、そして前記第一の複数の酵母細胞を、約８６５．５２２ＭＨｚの振動数と約４６５６ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下において２４時間培養することによって調製された、第一酵母細胞要素；
（ｂ）第二の複数の酵母細胞がリン化合物を分解することができるように、第二の複数の酵母細胞を、約３６６．２４３ＭＨｚの振動数と約１２３０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場において２４時間培養し、そして前記第二の複数の酵母細胞を、約３６６．２４３ＭＨｚの振動数と約４５７０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下において２４時間培養することによって調製された、第二酵母細胞要素；または、
（ｃ）複数の酵母細胞がカリウム化合物を分解することができるように、第三の複数の酵母細胞を、約２５５．４２５ＭＨｚの振動数と約１３４０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場において２４時間培養し、そして前記第三の複数の酵母細胞を、約２５５．４２５ＭＨｚの振動数と約４８５０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下において２４時間培養することによって調製された、第三酵母細胞要素；
を含み、
（ｉｉ）第四の複数の酵母細胞が複合炭素分子を単純炭水化物へと変換することができるように、第四の複数の酵母細胞を、約１０９２．３８７ＭＨｚの振動数と約１５３０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場において２４時間培養し、そして前記第四の複数の酵母細胞を、約１０９２．３８７ＭＨｚの振動数と約４７２０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下において２４時間培養することによって調製された、第四酵母細胞要素；
（ｉｉｉ）第五の複数の酵母細胞が成長因子を過剰生産することができるように、第五の複数の酵母細胞を、約１３８７．５５６ＭＨｚの振動数と約１６２０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場において２４時間培養し、そして前記第五の複数の酵母細胞を、約１３８７．５５６ＭＨｚの振動数と約４８３０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下において２４時間培養することによって調製された、第五酵母細胞要素；および、
（ｉｖ）複数の酵母細胞がアデノシン三リン酸を過剰生産することができるように、第六の複数の酵母細胞を、約１６９４．３６５ＭＨｚの振動数と約１４７０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場において２４時間培養し、そして前記第六の複数の酵母細胞を、約１６９４．３６５ＭＨｚの振動数と約４７８０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下において２４時間培養することによって調製された、第六酵母細胞要素
を含み、ここで前記酵母細胞要素がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞を含む、生物学的肥料組成物。
【請求項２２】
第一酵母細胞要素が酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ ＡＳ２．５０１の細胞を含み、第二酵母細胞要素が酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ ＡＳ２．５３５の細胞を含み、第三酵母細胞要素が酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ ＡＳ２．４４１の細胞を含み、第四酵母細胞要素が酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ ＡＳ２．４０６，の細胞を含み、第五酵母細胞要素が酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ ＡＳ２．３８２の細胞を含み、そして、第六酵母細胞要素が酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ ＡＳ２．１６の細胞を含む、請求項２１に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項２３】
複数の酵母細胞が乾燥している、請求項２１に記載の生物学的肥料組成物。
【請求項２４】
複数の酵母細胞の大気中窒素を固定する能力を活性化または増強する方法であって、前記複数の酵母細胞を、８５０から８６０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞の窒素固定を引き起こすのに十分な時間培養する工程を含む方法。
【請求項２５】
複数の酵母細胞が窒素を固定することができるように、前記複数の酵母細胞を、約８６５．５２２ＭＨｚの振動数と約１２５０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場の存在下で２４時間培養する工程、および前記第一の複数の酵母細胞を、約８６５．５２２ＭＨｚの振動数と約４６５６ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下で２４時間培養する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
複数の酵母細胞がリン含有ミネラルまたは化合物を分解する能力を活性化または増強する方法であって、前記複数の酵母細胞を、３６０から３７０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞のリン化合物分解を引き起こすのに十分な時間培養する工程を含む方法。
【請求項２７】
第二の複数の酵母細胞がリン化合物を分解することができるように、前記複数の酵母細胞を、約３６６．２４３ＭＨｚの振動数と約１２３０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場の存在下で２４時間培養する工程、および前記第二の複数の酵母細胞を、約３６６．２４３ＭＨｚの振動数と約４５７０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下で２４時間培養する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
複数の酵母細胞がカリウム含有ミネラルまたは化合物を分解する能力を活性化または増強する方法であって、前記複数の酵母細胞を、２５０から２６０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞のカリウム化合物分解を引き起こすのに十分な時間培養する工程を含む方法。
【請求項２９】
複数の酵母細胞がカリウム化合物を分解することができるように、前記複数の酵母細胞を、約２５５．４２５ＭＨｚの振動数と約１３４０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場の存在下で２４時間培養する工程、および前記第三の複数の酵母細胞を、約２５５．４２５ＭＨｚの振動数と約４８５０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下で２４時間培養する工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
複数の酵母細胞が高分子量炭素物質を分解する能力を活性化または増強する方法であって、前記複数の酵母細胞を、１０８７から１０９７ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞の複合炭素分子から単純炭水化物への変換を引き起こすのに十分な時間培養する工程を含む方法。
【請求項３１】
第四の複数の酵母細胞が複合炭素分子を単純炭水化物へ変換することができるように、前記複数の酵母細胞を、約１０９２．３８７ＭＨｚの振動数と約１５３０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場の存在下で２４時間培養する工程、および前記第四の複数の酵母細胞を、約１０９２．３８７ＭＨｚの振動数と約４７２０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下で２４時間培養する工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
複数の酵母細胞が成長因子を過剰生産する能力を活性化または増強する方法であって、前記複数の酵母細胞を、１３８２から１３９２ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞の成長因子の過剰生産を引き起こすのに十分な時間培養する工程を含む方法。
【請求項３３】
第五の複数の酵母細胞が成長因子を過剰生産することができるように、前記複数の酵母細胞を、約１３８７．５５６ＭＨｚの振動数と約１６２０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場の存在下で２４時間培養する工程、および前記第五の複数の酵母細胞を、約１３８７．５５６ＭＨｚの振動数と約４８３０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下で２４時間培養する工程を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、約４００ｇ／ｌの濃度のデンプン溶液を含む発酵培地に前記酵母細胞を播種する工程、および２０から３０℃の間の温度で少なくとも９０％の発酵基材が発酵するまで発酵を進行させる工程を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
複数の酵母細胞がＡＴＰを過剰生産する能力を活性化する方法であって、前記複数の酵母細胞を、１６９０から１７００ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場の存在下において、前記複数の酵母細胞のアデノシン三リン酸の過剰生産を引き起こすのに十分な時間培養する工程を含む方法。
【請求項３６】
複数の酵母細胞がアデノシン三リン酸を過剰生産することができるように、前記複数の酵母細胞を、約１６９４．３６５ＭＨｚの振動数と約１４７０ｍＶの振幅を有する第一の電磁場の存在下で２４時間培養する工程、および前記第六の複数の酵母細胞を、約１６９４．３６５ＭＨｚの振動数と約４７８０ｍＶの振幅を有する第二の電磁場の存在下で２４時間培養する工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
さらに、約４００ｇ／ｌの濃度のデンプン溶液を含む発酵培地に前記酵母細胞を播種する工程、および２０から３０℃の間の温度で少なくとも９０％の発酵基材が発酵するまで発酵を進行させる工程を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
生物学的肥料の酵母細胞要素間で共生様関係を形成させる方法であって、
（ａ）第一の複数の酵母細胞を、８６０から８７０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第一の電磁場において、前記第一の複数の酵母細胞の窒素固定を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第一酵母細胞要素；
（ｂ）第二の複数の酵母細胞を、３６０から３７０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第二の電磁場において、前記第二の複数の酵母細胞のリン化合物分解を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第二酵母細胞要素；
（ｃ）第三の複数の酵母細胞を、２５０から２６０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第三の電磁場において、前記第三の複数の酵母細胞のカリウム化合物分解を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第三酵母細胞要素；および、
（ｄ）第四の複数の酵母細胞を、１０８７から１０９７ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する第四の電磁場において、前記第四の複数の酵母細胞の複合炭素分子から単純炭水化物への変換を引き起こすのに十分な時間培養することによって調製された第四酵母細胞要素；
を含む混合物を調製する工程、
混合物を、８６０から８７０ＭＨｚ、３６０から３７０ＭＨｚ、２５０から２６０ＭＨｚおよび１０８７から１０９７ＭＨｚの複数の振動数を有し、各振動数が０から３０００ｍＶの振幅を有する電磁場の存在下で、前記酵母細胞要素の共生様関係形成を引き起こすのに十分な時間培養する工程であって、ここで前記電磁場における各振動数に対する振幅が０から３０００ｍＶの間を循環する工程、
を含む方法。
【請求項３９】
さらに、複数の酵母細胞および土壌を含む混合物を調製する工程、８５０から８６０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場において、前記混合物を前記複数の酵母細胞の土壌への適応を引き起こすのに十分な時間培養する工程、を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
さらに、前記複数の酵母細胞および土壌を含む混合物を調製する工程、３６０から３７０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場において、前記混合物を前記複数の酵母細胞の土壌への適応を引き起こすのに十分な時間培養する工程、を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
さらに、前記複数の酵母細胞および土壌を含む混合物を調製する工程、２５０から２６０ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場において、前記混合物を前記複数の酵母細胞の土壌への適応を引き起こすのに十分な時間培養する工程、を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
さらに、前記複数の酵母細胞および土壌を含む混合物を調製する工程、１０８７から１０９７ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場において、前記混合物を前記複数の酵母細胞の土壌への適応を引き起こすのに十分な時間培養する工程、を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
さらに、前記複数の酵母細胞および土壌を含む混合物を調製する工程、１３８２から１３９２ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場において、前記混合物を前記複数の酵母細胞の土壌への適応を引き起こすのに十分な時間培養する工程、を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、前記複数の酵母細胞および土壌を含む混合物を調製する工程、１６９０から１７００ＭＨｚの範囲の振動数と１０００から５０００ｍＶの範囲の振幅を有する電磁場において、前記混合物を前記複数の酵母細胞の土壌への適応を引き起こすのに十分な時間培養する工程、を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１２に記載の生物学的肥料組成物の生産方法であって、
（ｉ）酵母細胞要素（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を混合することによって混合物を調製する工程；および、
（ｉｉ）前記混合物に前記有機基材要素および無機基材要素を添加して生物学的肥料を形成させる工程を、示したその順序で含む、方法。
【請求項４６】
さらに前記生物学的肥料を乾燥させる工程を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
乾燥工程が以下の工程、
（ｉｉｉ）酵母細胞が休眠になるように一定期間６５℃以下の温度で前記生物学的肥料組成物を乾燥させる工程；
（ｉｖ）水分含量が５％未満であるように一定期間７０℃以下の温度で前記生物学的肥料組成物を乾燥させる工程；
（ｖ）前記生物学的肥料組成物を外界温度まで冷却する工程；および、
（ｖｉ）適当な大きさの前記生物学的肥料組成物の顆粒を形成する工程、
を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
さらに酵母細胞要素間で共生様関係を形成させる工程を含む方法であって、工程（ｉ）の後で、工程（ｉｉ）の前に、酵母細胞の混合物を８６０から８７０ＭＨｚ、３６０から３７０ＭＨｚ、２５０から２６０ＭＨｚ、１０８７から１０９７ＭＨｚ、１３８２から１３９２ＭＨｚおよび１６９０から１７００ＭＨｚの複数の振動数を有し、各振動数が０から３０００ｍＶの振幅を有する電磁場の存在下で、前記酵母細胞要素の共生様関係形成を引き起こすのに十分な時間培養する工程であって、ここで前記電磁場における各振動数に対する振幅が０から３０００ｍＶの間を循環する工程、
を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ｉ）の後、工程（ｉｉ）の前に、さらに以下の工程：
（ｉｉｉ）工程（ｉ）の酵母細胞の混合物に土壌のサンプルを添加する工程、
（ｉｖ）８６０から８７０ＭＨｚ、３６０から３７０ＭＨｚ、２５０から２６０ＭＨｚ、および１０８７から１０９７ＭＨｚの複数の振動数を有し、各振動数が０から３０００ｍＶの振幅を有する電磁場の存在下で、酵母細胞要素が土壌へ適応するのに十分な時間培養する工程であって、前記電磁場における各振動数に対する振幅が０から３０００ｍＶの間を循環する工程；および、
（ｖ）酵母細胞を土壌から分離する工程、
を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
さらに、工程（ｉ）の後、工程（ｉｉ）の前に以下の工程：
（ｉｉｉ）工程（ｉ）の酵母細胞の混合物を８６０から８７０ＭＨｚ、３６０から３７０ＭＨｚ、２５０から２６０ＭＨｚ、１０８７から１０９７ＭＨｚ、１３８２から１３９２ＭＨｚおよび１６９０から１７００ＭＨｚの複数の振動数を有し、各振動数が０から３０００ｍＶの振幅を有する電磁場の存在下で、前記酵母細胞要素の共生様関係形成を引き起こすのに十分な時間培養する工程であって、ここで前記電磁場における各振動数に対する振幅が０から３０００ｍＶの間を循環する工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の酵母細胞の混合物に土壌のサンプルを添加する工程、（ｖ）前記酵母細胞と土壌との混合物を、８６０から８７０ＭＨｚ、３６０から３７０ＭＨｚ、２５０から２６０ＭＨｚ、１０８７から１０９７ＭＨｚ、１３８２から１３９２ＭＨｚおよび１６９０から１７００ＭＨｚの複数の振動数を有し、各振動数が０から３０００ｍＶの振幅を有する電磁場の存在下で、酵母細胞要素の土壌への適応を引き起こすのに十分な時間培養する工程であって、ここで前記電磁場における各振動数に対する振幅が０から３０００ｍＶの間を循環する工程；および、
（ｖｉ）酵母細胞を土壌から分離する工程、
を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１−１３および２１−２３のいずれかに記載の生物学的肥料組成物の存在下で植物を成長させる工程を含む、植物成長を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、空中窒素を固定し、リン、カリウムおよび／または炭素を含む不溶性化合物を分解する、酵母を含む生物学的肥料に関する。本発明はまた、該生物学的肥料の製造方法および作物収量を増加させるための該生物学的肥料の使用方法にも関する。
【０００２】
２．発明の背景
肥料の使用は、高収量の作物の成長を支持するにおいて不可欠である。植物が健康な成長のために必要とする基本的な栄養素のなかで、大量の窒素（ＮＯ３−またはＮＨ４＋として取り込まれる）、リン（Ｈ２ＰＯ４−として取り込まれる）、およびカリウム（Ｋ＋として取り込まれる）栄養素は、ほとんどの土壌の多数の作物に要求される（Ｗｉｃｈｍａｎｎ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， ＩＦＡ Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ Ｕｓｅ Ｍａｎｕａｌ）。そのような大量の窒素、リンおよびカリウム栄養素は、天然のミネラルを加工処理するか、または化合物を生産するかのいずれかの、無機肥料の形態で主に供給される（Ｋ． Ｆ． Ｉｓｈｅｒｗｏｏｄ， １９９８， Ｍｉｎｅｒａｌ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ Ｕｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ． ２６）。１９４０年代からの無機肥料の開発と使用により、同じないしわずかに少ない耕作地で作物収量が有意に増加し、今日の莫大な人口を養っている。農業のそのような進歩がなければ、多くの牧草地および森林が耕作地へと変わっていたであろう（Ｋ． Ｆ． Ｉｓｈｅｒｗｏｏｄ， １９９８， Ｍｉｎｅｒａｌ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ Ｕｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ． ２６）。
【０００３】
人類に豊かな農産物を供給するには無機肥料が重要であるにもかかわらず、近年、環境に与えられる害が認識されるようになった。無機肥料は土壌に害を与える可能性がある。例えば、多くの窒素肥料は土壌を酸性化し、それによって植物およびその他の土壌生物の成長に有害な影響を与える可能性がある。化学窒素肥料の大規模な使用はまた、天然の窒素固定微生物の活性を阻害し、それによって土壌の天然の肥料分が減少する可能性がある。無機肥料はまた、土壌および生産物に有害物質を導入する可能性もある。例えば、岩石リンから加工されたリン肥料にはカドミウムなどの有害要素が少量含まれていることがよくあり、有害要素は土壌中に蓄積し、植物に取り込まれる可能性がある。無機肥料の長期間の使用は、深刻な環境汚染を引き起こす可能性もある。例えば、浸出および土壌風食による窒素およびリン肥料の流出は、土壌および地下水の汚染、そして、地表水の富栄養化を引き起こしてきた。汚染された土壌および水の浄化は、複雑で困難な仕事である。そのような仕事のための費用も膨大である。
【０００４】
この問題の解決への探索において、有機肥料に回帰する者もある。周知のように、有機肥料は様々な供給源に由来する。有機肥料のタイプには、作物の残余物および動物の厩肥などの農場廃物；木材のような植物および動物産物からの残余物；および下水のような都市廃棄物が含まれる（Ｗｉｃｈｍａｎｎ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， ＩＦＡ Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ Ｕｓｅ Ｍａｎｕａｌ）。有機肥料は通常栄養分が少なく植物成長の支持における有効性が低い。例えば、家畜厩肥中の全栄養分は２％以下であり、その中の窒素栄養分は環境中に流出するために効率的に利用するのがより困難である（Ｋ． Ｆ． Ｉｓｈｅｒｗｏｏｄ， １９９８， Ｍｉｎｅｒａｌ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ Ｕｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ． ２６）。通常、有機肥料は土壌に非常に大量に用いなければならない。高い作物収量を達成するためには、有機肥料は無機肥料を補うために用いられるにすぎない。したがって、無機肥料に関する問題は、無機肥料の代わりに有機肥料を用いることによっては、十分に解決することができない。さらに、有機肥料によっても環境問題が生じている。例えば、有機肥料の中には、未処理の場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびカイガラムシ科（Ｃｏｃｃｉｄａｅ）などの、病原性微生物を含むものがある。有機肥料も有毒化学物質を含むことがあり、また、望ましくない臭気を生じることもある。有機肥料を用いても自然の水系の汚染および富栄養化に寄与する。したがって、米国を含む世界中の多くの場所で、有機肥料の組成および用法にかなりの制限を課する法律および規制が確立してきた。
【０００５】
微生物を利用した生物学的肥料が、無機肥料に代わるものとして提案されてきた。根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｏｒ）、およびアゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）などの細菌（例えば、米国特許第５０７１４６２号を参照されたい）および、黄色コウジ菌−オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ−ｏｒｙｚａｅ）などの真菌類（例えば、米国特許第４６７００３７号を参照されたい）を含む天然の窒素固定微生物が、生物学的肥料中に用いられてきた。岩石リン鉱石（ｒｏｃｋ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｒｅ）またはその他の不溶性のリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）を可溶性のリンへと可溶化することのできる天然の微生物も、生物学的肥料中に、別々に（例えば、米国特許第５９１２３９８号）または窒素固定微生物と組み合わせて（例えば米国特許第５４８４４６４号）利用されてきた。遺伝的に改変された細菌株も生物学的肥料において開発および利用されてきた。組換えＤＮＡ技術に基づくアプローチが、生物学的肥料における使用のためにより有効な窒素固定、リン分解、およびカリウム分解細菌株を作出するために開発されてきた。例えば、米国特許第５５７８４８６号；ＰＣＴ公報ＷＯ９５／０９８１４号；中国特許公報：ＣＮ１０８１６６２Ａ号；ＣＮ１０８２０１６Ａ号；ＣＮ１０８２０１７Ａ号；ＣＮ１１０３０６０Ａ号；およびＣＮ１１０９５９５Ａ号を参照されたい。
【０００６】
しかし、天然の微生物に基づく生物学的肥料は、一般的に無機肥料に効果的に取って代わるほどには十分に有効ではない。それゆえ窒素、リンおよびカリウムの作物への供給において無機肥料に取って代わることのできる生物学的肥料を開発して、無機肥料にともなう問題を回避しつつ高品質の農産物を生産することが重要なのである。本発明は、無機肥料に取って代わることのできる、酵母に基づく生物学的肥料を供給するものである。
【０００７】
本明細書における刊行物の引用は、本明細書に引用された刊行物が関連する先行文献であることを許容する意図でなされたものではなく、引用された刊行物が本願発明の特許性に対する材料とみなされることを許容する意図でなされたものでもない。これら刊行物の全ての日付に関する記載または内容に関する表示は本出願人が知り得る情報に基づくものであり、これらの刊行物の日付または内容の正確性を許容するものではない。
【０００８】
３．発明の概要
本発明は、生物学的肥料に関する。本発明の生物学的肥料組成物は、６種類に及ぶ酵母細胞要素、有機基材要素、および／または無機基材要素を含むものであってよい。特に、組成物の中の酵母細胞要素はそれぞれ、空中窒素の固定、不溶性ミネラルまたは化合物の分解、複合炭素材料または化合物の分解、成長因子の過剰生産、またはＡＴＰの過剰生産、の能力を有するものである。
【０００９】
本発明では、市販および／または公的に入手可能な、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母を用いるが、それに限定されるものではない。本発明の酵母細胞要素は、細胞の空中窒素固定能、不溶性リンミネラルまたは化合物分解能、不溶性カリウムミネラルまたは化合物分解能、および複合炭素材料または化合物分解能が、活性化または増強されるような、活性化条件下で酵母細胞を培養することによって生産される。酵母細胞はまた、過剰の成長因子またはＡＴＰの生産能が活性化または増強されるような条件下で培養することもできる。そのような活性を示す酵母細胞は、大気からの窒素を栄養分として植物によって利用可能な窒素化合物に変換し、それらがなければ不溶性である、リン、カリウムおよび炭素を、ミネラルおよび複雑な分子から放出させて、これらの要素が植物が成長のために利用できるような形態中で有効なものとするという点において有用である。当該肥料中には、他の植物栄養分−供給酵母細胞に成長因子およびＡＴＰを供給することによって、支持するために用いられる酵母細胞もある。
【００１０】
本発明はまた、多種の有機および無機材料を本発明の酵母株の成長を支持するために肥料中に用いることを含む。１つの態様において、当該肥料は、炭鉱廃棄物および岩石リンと、酵母株とを混合することによって生産される。別の態様において、当該肥料は、動物厩肥、そして任意に生物学的殺菌剤と、酵母株とを混合することによって生産される。さらに別の態様において、当該肥料は、下水処理場からの汚泥および生物学的殺菌剤と、酵母株とを混合することによって生産される。
【００１１】
本発明はまた、本発明の酵母株と、有機および／または無機材料とを、混合、乾燥、そして梱包する工程を含む、肥料の製造方法にも関する。
【００１２】
本発明はさらに、本発明の肥料の使用方法にも関する。本発明の生物学的肥料は、多種の植物の成長および成熟を支持および促進するために用いられる。
【００１３】
４．図面の簡単な記載
図１．酵母細胞の活性化。１．酵母培養物；２．容器；３．電磁場源
図２．酵母株間の共生様関係の形成。４．窒素固定酵母のための電磁場源；５．Ｐ−分解酵母のための電磁場源；６．Ｋ−分解酵母のための電磁場源；７．Ｃ−分解酵母のための電磁場源；８．酵母培養物；９．容器
図３．土壌タイプへの酵母細胞の適応。１０．電極；１１．容器；１２．電極；１３．酵母培養物；１４．電磁場源；１５．温度制御装置
図４．有機材料案内工程。１６．有機原料；１７．破砕機；１８．粉砕機；１９．粉末形態の有機材料
図５．無機材料案内工程。２０．無機原料；２１．破砕機；２２．粉砕機；２３．粉末形態の無機材料
図６．酵母発酵工程。２４．活性化酵母細胞；２５．酵母細胞培養用タンク、デンプン：水（３５℃）＝１：２．５、２８−３０℃での４８−７２時間の半好気性発酵；２６．収集培養物
図７．有機および無機原料の混合。２７．無機材料；２８．デンプン；２９．有機材料；３０．混合機；３１．混合物；３２．肥料生産段階へと運ばれる混合物
図８．酵母細胞の混合。３３．窒素固定、Ｐ−分解、Ｋ−分解、およびＣ−分解酵母の入口；３４．混合タンク；３５．ＡＴＰ−生産酵母；３６．ＧＰ−生産酵母；３７．酵母混合物；３８．肥料生産段階へと運ばれる混合物
図９．肥料生産工程。３９．酵母混合物；４０．有機および無機材料の混合物；４１．顆粒作成機；４２．肥料顆粒
図１０．乾燥工程。４３．肥料顆粒；４４．第一乾燥機；４５．第二乾燥機；４６．乾燥肥料
図１１．冷却および梱包工程。４７．乾燥肥料；４８．冷却機；４９．分離機；５０．大用量袋充填機；５１．最終産物
【００１４】
５．発明の詳細な記載
１つの態様において、本発明は、酵母細胞を含む生物学的肥料組成物を提供する。本発明はまた、種々の態様において、生物学的肥料組成物の製造方法および生物学的肥料組成物の使用方法も提供する。
【００１５】
本発明の生物学的肥料組成物は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）、およびカリウム（Ｋ）の植物、特に作物植物への供給において、化学／無機肥料に取って代わることのできるものである。本発明の生物学的肥料組成物は、作物収量を１０−６０％増加させることができる。本発明の生物学的肥料は、空中窒素およびリンおよびカリウムミネラルなどの原料を植物の栄養分に変換させるために生存酵母の代謝活性を利用するために、酵母細胞によるそのような栄養分の変換および放出は、土壌の栄養分含量によって部分的に調節される。そして土壌の栄養分含量は、環境および植物の変化する要求の両方に部分的に依存する。したがって、生物学的肥料組成物による植物栄養分の放出は、土壌状態に適合させることができ、一定期間にわたって継続させることができる。
【００１６】
１つの態様において、本発明の生物学的肥料組成物は１または複数の酵母細胞要素を含む。生物学的肥料組成物の酵母細胞要素は、以下の機能の１つを発揮することができる複数の酵母細胞を含み、それらは各々、結果として１つのタイプの栄養分を植物に提供する：（１）空中窒素の固定；（２）リンミネラルまたは化合物の分解；（３）カリウムミネラルまたは化合物の分解；（４）複合または高分子量の炭素材料または化合物の分解。さらに別の酵母細胞要素を、肥料組成物中の他の酵母を支持するための成長因子およびＡＴＰを生産するために含ませることができる。
【００１７】
本発明の生物学的肥料組成物はさらに、有機基材要素および／または無機基材要素を含んでいてもよい。肥料組成物の有機基材要素は、肥料中の酵母細胞のための一次炭素源である。無機基材要素は、肥料組成物中の酵母細胞に、リンおよび／またはカリウムを含む、ミネラル、材料および化合物を提供する。有機および無機基材要素はまた、植物にその他のミネラルおよび微量元素を提供しうる。その他のミネラルにはカルシウム、マグネシウムおよびイオウなどがあり、微量元素にはホウ素、銅、鉄、マンガン、モリブデンおよび亜鉛などがあるが、それらに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書において用いられる「窒素固定」または「空中窒素の固定」という語は、分子窒素または大気中の窒素を１または複数の窒素（Ｎ）化合物に変換する生物学的工程を含む。窒素（Ｎ）化合物にはアンモニア、アンモニウム塩、尿素および硝酸塩が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【００１９】
本明細書において用いられる「リンミネラルまたは化合物の分解」という句は、岩石リンに存在する水不溶性リン化合物などを含むがそれに限定されるものではないリン（Ｐ）化合物を、植物およびその他の酵母によって生存および／または成長のためにより簡単に利用され得る別の１または複数のリン化合物へと変換する生物学的工程のことをいう。例えば結果的に得られるリン化合物はより水に可溶性であって、したがって植物の根によって取り込まれ得る。
【００２０】
本明細書において用いられる「カリウムミネラルまたは化合物の分解」という句は、カリウム雲母に存在する水不溶性カリウム化合物などを含むがそれに限定されるものではないカリウム（Ｋ）化合物を、植物およびその他の酵母によって生存および／または成長のためにより簡単に利用され得る１または複数の別のカリウム化合物へと変換する生物学的工程のことをいう。例えば結果的に得られるカリウム化合物はより水に可溶性であって、したがって植物の根によって取り込まれ得る。
【００２１】
本明細書において用いられる「複合または高分子量の炭素ミネラル、材料または化合物の分解」という句は、複合有機または無機炭素分子の、通常より低分子であって、植物およびその他の酵母を含む他の生物によって生存および／または成長のためにより簡単に利用され得る１または複数の炭素分子への生物学的変換をいう。例えば、それには風化した石炭中の高分子量炭素化合物を、ペントースおよびヘキソースのような単純炭化水素に変換することが含まれる。この工程にはポリマー炭素化合物における炭素原子の長鎖を切断する反応が含まれる。
【００２２】
本明細書において用いられる「成長因子」という語は、一般に酵母の成長に要求される分子のことをいい、それにはビタミン、特に例えばビタミンＢ−１、リボフラビン（ビタミンＢ−２）、ビタミンＢ−１２、ナイアシン（Ｂ−３）、ピリドキシン（Ｂ−６）、パントテン酸（Ｂ−５）などのビタミンＢ複合体、葉酸、ビオチン、パラ−アミノ安息香酸、コリンおよびイノシトールが含まれるがそれらに限定されるものではない。
【００２３】
多くの有機および無機材料を用いて、酵母細胞によって変換されて酵母および植物によって利用される栄養分になる、リン、カリウムおよび複雑な高分子量の炭素ミネラル、材料および化合物を供給することができる。本発明において用いられる有機および無機材料には以下ものが含まれるがそれらに限定されるものではない。燐灰岩または岩石リン、燐灰石、燐灰土、シルビナイト、岩塩、カーナライト、カリウム雲母、褐炭などがあるがそれらに限定されるものではないミネラル；炭鉱廃棄物、風化した石炭、石炭紛、および炭化水素廃棄物などがあるがそれらに限定されるものではない工業材料または廃棄物；下水処理場からの汚泥、埋め立てごみ、泥炭、川および湖の底からの泥などの泥があるがそれらに限定されるものではない環境物質および廃棄物；都市部および家禽厩肥、牛厩肥、豚厩肥、羊厩肥および糞化石などの動物厩肥からの廃棄物および厩肥、植物からの廃棄物質、魚粉、骨粉、ヒト廃棄物、乾燥血液などを含む動物からの廃棄物質、およびセルロース、デンプンおよび／またはその他の炭水化物を含む植物材料の発酵産物または副産物などがあるがそれらに限定されるものではない有機廃棄物。
【００２４】
さらに、必要に応じて生物学的肥料組成物は殺菌剤を含むものであってもよい。環境面から安全な殺菌剤が好ましい。例えば、生物学的殺菌剤、スーパーＣＭ６１を、都市部および動物厩肥からの廃棄物および厩肥などの環境廃棄物および有機廃棄物とともに使用することができる。
【００２５】
様々な態様において、本発明の生物学的肥料組成物は、少なくとも１つの酵母細胞要素、好ましくは６つの酵母細胞要素を含む。本発明者は一定の培養条件下において様々な酵母株に以下の６つの活性を示させることができることを見出した：（１）空中窒素の固定；（２）リンミネラルまたは化合物の分解；（３）カリウムミネラルまたは化合物の分解；（４）複合または高分子量の炭素材料または化合物の分解；（５）肥料組成物中の他の酵母株の要求を支持するのに十分な量の過剰の成長因子の生産；および（６）肥料組成物中の他の酵母株の要求を支持するのに十分な量の過剰のＡＴＰの生産。培養される酵母において活性化または増強される活性は、培養条件によって決まる。６つの活性のそれぞれに特有の培養条件は、節５．１−５．６にそれぞれ詳細に記載する。
【００２６】
本発明によると、生物学的肥料の酵母細胞要素は、複数の酵母細胞を電磁場の存在下で適当な培地中で培養することによって生産される。電磁場は当該技術分野に周知の様々な手段によって作ることができる。例示的な構成の概略図を図１に示す。所望の振動数と振幅を有する電磁場は、電磁波、好ましくはシヌソイド波を１００ＭＨｚ−２０００ＭＨｚの振動数範囲で発生させることができる１または複数のシグナル発電機を含む電磁場源（３）によって作られる。所望であればシグナル増幅器を用いて出力を増大させてもよい。電磁場は、シグナルエミッターのきわめて近くに培養物を置くことを含む様々な手段によって培養物に適用することができる。１つの態様において、電磁場は培養物（１）中に沈めた電極によって適用される。好ましい態様において、一方の電極は金属板であり、他方の電極は容器（２）の内側に形成された複数の電線からなり、そうすることによって電磁場のエネルギーが培養物中に均等に分配され得る。用いられる電極電線の数は、培養物の体積と電線の直径との両方に依存する。好適な態様において、５０００ｍｌまでの体積を有する培養物であれば、培養物１００ｍｌ毎に直径０．１−１．２ｍｍの間の電極電線を１本用いればよく、１０００ｌをこえる体積を有する培養物であれば、培養物１０００ｌ毎に直径３−３０ｍｍの間の電極電線を１本用いればよい。
【００２７】
本発明の使用に考えられる酵母の種類には以下の属の酵母が含まれるがこれらに限定されるものではない：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ， Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ， Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ， Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ， Ａｓｈｂｙａ， Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ， Ｃａｎｄｉｄａ， Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ， Ｃｒｅｂｒｏｔｈｅｃｉｕｍ， Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ， Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ； Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ， Ｈａｎｓｅｎｕｌａ， Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ， Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ， Ｐｉｃｈｉａ， Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ，および Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ。酵母株の例には以下のものが含まれるがこれらに限定されるものではない： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ， ＡＣＣＣ２０３４， ＡＣＣＣ２０３５， ＡＣＣＣ２０３６， ＡＣＣＣ２０３７， ＡＣＣＣ２０３８， ＡＣＣＣ２０３９， ＡＣＣＣ２０４０， ＡＣＣＣ２０４１， ＡＣＣＣ２０４２， ＡＳ２．１， ＡＳ２．４， ＡＳ２．１１， ＡＳ２．１４， ＡＳ２．１６， ＡＳ２．５６， ＡＳ２．６９， ＡＳ２．７０， ＡＳ２．９３， ＡＳ２．９８， ＡＳ２．１０１， ＡＳ２．１０９， ＡＳ２．１１０， ＡＳ２．１１２， ＡＳ２．１３９， ＡＳ２．１７３， ＡＳ２．１７４， ＡＳ２．１８２， ＡＳ２．１９６， ＡＳ２．２４２， ＡＳ２．３３６， ＡＳ２．３４６， ＡＳ２．３６９， ＡＳ２．３７４， ＡＳ２．３７５， ＡＳ２．３７９， ＡＳ２．３８０， ＡＳ２．３８２， ＡＳ２．３９０， ＡＳ２．３９３， ＡＳ２．３９５， ＡＳ２．３９６， ＡＳ２．３９７， ＡＳ２．３９８， ＡＳ２．３９９， ＡＳ２．４００， ＡＳ２．４０６， ＡＳ２．４０８， ＡＳ２．４０９， ＡＳ２．４１３， ＡＳ２．４１４， ＡＳ２．４１５， ＡＳ２．４１６， ＡＳ２．４２２， ＡＳ２．４２３， ＡＳ２．４３０， ＡＳ２．４３１， ＡＳ２．４３２， ＡＳ２．４５１， ＡＳ２．４５２， ＡＳ２．４５３， ＡＳ２．４５８， ＡＳ２．４６０， ＡＳ２．４６３， ＡＳ２．４６７， ＡＳ２．４８６， ＡＳ２．５０１， ＡＳ２．５０２， ＡＳ２．５０３， ＡＳ２．５０４， ＡＳ２．５１６， ＡＳ２．５３５， ＡＳ２．５３６， ＡＳ２．５５８， ＡＳ２．５６０， ＡＳ２．５６１， ＡＳ２．５６２， ＡＳ２．５７６， ＡＳ２．５９３， ＡＳ２．５９４， ＡＳ２．６１４， ＡＳ２．６２０， ＡＳ２．６２８， ＡＳ２．６３１， ＡＳ２．６６６， ＡＳ２．９８２， ＡＳ２．１１９０， ＡＳ２．１３６４， ＡＳ２．１３９６， ＩＦＦＩ １００１， ＩＦＦＩ １００２， ＩＦＦＩ １００５， ＩＦＦＩ １００６， ＩＦＦＩ １００８， ＩＦＦＩ １００９， ＩＦＦＩ １０１０， ＩＦＦＩ １０１２， ＩＦＦＩ １０２１， ＩＦＦＩ １０２７， ＩＦＦＩ １０３７， ＩＦＦＩ １０４２， ＩＦＦＩ １０４３， ＩＦＦＩ １０４５１， ＩＦＦＩ １０４８， ＩＦＦＩ １０４９， ＩＦＦＩ １０５０， ＩＦＦＩ １０５２， ＩＦＦＩ １０５９， ＩＦＦＩ １０６０， ＩＦＦＩ １０６３， ＩＦＦＩ １２０２， ＩＦＦＩ １２０３， ＩＦＦＩ １２０６， ＩＦＦＩ １２０９， ＩＦＦＩ １２１０， ＩＦＦＩ １２１１， ＩＦＦＩ １２１２， ＩＦＦＩ １２１３， ＩＦＦＩ １２１５， ＩＦＦＩ １２２０， ＩＦＦＩ １２２１， ＩＦＦＩ １２２４， ＩＦＦＩ １２４７， ＩＦＦＩ １２５１， ＩＦＦＩ １２７０， ＩＦＦＩ １２７７， ＩＦＦＩ １２８７， ＩＦＦＩ １２８９， ＩＦＦＩ １２９０， ＩＦＦＩ １２９１， ＩＦＦＩ １２９１， ＩＦＦＩ １２９２， ＩＦＦＩ １２９３， ＩＦＦＩ １２９７， ＩＦＦＩ １３００， ＩＦＦＩ １３０１， ＩＦＦＩ １３０２， ＩＦＦＩ １３０７， ＩＦＦＩ １３０８， ＩＦＦＩ １３０９， ＩＦＦＩ １３１０， ＩＦＦＩ １３１１， ＩＦＦＩ １３３１， ＩＦＦＩ １３３５， ＩＦＦＩ １３３６， ＩＦＦＩ １３３７， ＩＦＦＩ １３３８， ＩＦＦＩ １３３９， ＩＦＦＩ １３４０， ＩＦＦＩ １３４５， ＩＦＦＩ １３４８， ＩＦＦＩ １３９６， ＩＦＦＩ １３９７， ＩＦＦＩ １３９９， ＩＦＦＩ １４１１， ＩＦＦＩ １４１３， ＡＣＣＣ２０４３， ＡＳ２．２， ＡＳ２．３， ＡＳ２．８， ＡＳ２．５３， ＡＳ２．１６３， ＡＳ２．１６８， ＡＳ２．４８３， ＡＳ２．５４１， ＡＳ２．５５９， ＡＳ２．６０６， ＡＳ２．６０７， ＡＳ２．６１１， ＡＳ２．６１２； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄ， ＡＳ２．１３１， ＡＳ２．２１３； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ Ｌｉｎｄｎｅｒ， ＡＳ２．２８５； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ Ｌｉｎｄｎｅｒ ｖｅｒ． ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ Ｌｏｄｄｅｒ， ＡＳ２．２０９， ＡＳ２．１１５７； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ Ｈａｎｓｅｎ， ＡＳ２．３４９， ＡＳ２．１１５８； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ （Ｓａｉｔｏ） Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＳ２．２８６， ＡＳ２．３４３； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｏｇｏｓ ｖａｎ ｌａｅｒ ｅｔ Ｄｅｎａｍｕｒ ｅｘ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ， ＡＳ２．１５６， ＡＳ２．３２７， ＡＳ２．３３５； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｅｌｌｉｓ Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ Ｋｒｅｇｅｒ Ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＳ２．１９５； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ， ＡＳ２．６９９； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ， ＡＳ２．１００； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｉ Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ ｋｒｅｇｅｒ ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＳ２．２８７； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ Ｂｏｕｔｒｏｕｘ， ＡＳ２．１７８， ＡＳ２．１８０， ＡＳ２．３７０， ＡＳ２．３７１； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓａｋｅ Ｙａｂｅ， ＡＣＣＣ２０４５； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ Ｂｅｉｊｅｒ， ＩＦＦＩ １０２３， ＩＦＦＩ １０３２， ＩＦＦＩ １０３６， ＩＦＦＩ １０４４， ＩＦＦＩ １０７２， ＩＦＦＩ １２０５， ＩＦＦＩ １２０７； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｉｌｌｉａｎｕｓ Ｓａｃｃａｒｄｏ， ＡＳ２．５， ＡＳ２．７， ＡＳ２．１１９， ＡＳ２．１５２， ＡＳ２．２９３， ＡＳ２．３８１， ＡＳ２．３９２， ＡＳ２．４３４， ＡＳ２．６１４， ＡＳ２．１１８９； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．， ＡＳ２．３１１； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ Ｈａｎｓｅｎ， ＡＣＣＣ２０４４， ＡＳ２．２４３， ＡＳ２．５０８； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｉｎｅｎｓｅｓ Ｙｕｅ， ＡＳ２．１３９５； Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ， ＡＣＣＣ ２０４６， ＡＳ２．１１４８； Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ Ｌｉｎｄｅｒ， ＡＣＣＣ２０４７， ＡＣＣＣ２０４８， ＡＳ２．２４８， ＡＳ２．２４９， ＡＳ２．２５５， ＡＳ２．２５７， ＡＳ２．２５９， ＡＳ２．２６０， ＡＳ２．２７４， ＡＳ２．９９４， ＡＳ２．１０４３， ＡＳ２．１１４９， ＡＳ２．１１７８， ＩＦＦＩ．１０５６； Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｕｓ Ｋｌｙｖｅｒ ｅｔ ｖａｎ Ｎｉｅｌ， ＡＣＣＣ ２０４９， ＡＣＣＣ ２０５０， ＡＳ２．６１９， ＡＳ２．９６２， ＡＳ２．１０３６； Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ （Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ Ｂｒｅｂｅｃｋ） Ｋｌｕｙｖｅｒ ｅｔ ｖａｎ Ｎｉｅｌ， ＡＣＣＣ２０５１， ＡＳ２．２６１， ＡＳ２．２６２； Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｃａｎｄｉｄａ（Ｓａｉｔｏ）Ｌｏｄｄｅｒ， ＡＣＣＣ２０５２， ＡＳ２．２７０； Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｆａｍｔａ （Ｈａｒｒｉｓｏｎ）Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＣＣＣ２０５３， ＡＳ２．６８５； Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌｏｂｏｓａ （Ｏｌｓｏｎ ｅｔ Ｈａｍｍｅｒ）Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＣＣＣ２０５４， ＡＳ２．２０２； Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＳ２．７５； Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｈｒｅｎｄｏｏ Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ Ｋｒｅｇｅｒ ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＣＣＣ２０５５， ＡＳ２．１１９３； Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃａｐｉｔａｔｕｍ Ｄｉｄｄｅｎｓ ｅｔ Ｌｏｄｄｅｒ， ＡＣＣＣ２０５６， ＡＳ２．１３８５； Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ（ｄｅ Ｂｅｕｒｍ ｅｔ ａｌ．）Ｏｔａ， ＡＣＣＣ２０５７， ＡＳ２．２５， ＡＳ２．５７０， ＡＳ２．５７１， ＡＳ２．１３７４； Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｓ （Ｓｏｎｅｄａ） Ｓｏｎｅｄａ， ＡＣＣＣ２０５８， ＡＳ２．１３８８； Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ （Ａｓｈｂｙ ｅｔ Ｎｏｗｅｌｌ） Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄ， ＡＣＣＣ２００１， ＡＳ２．４７５， ＡＳ２．１１７６； Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ Ｇｉｌｅｈｒｉｓｔ ｅｔ Ｓｔｉｋｅｓ， ＩＤ（Ｄ １０）２３； Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ （Ｒｏｂｉｎ） Ｂｅｒｋｈｏｕｔ， ＡＣＣＣ２００２， ＡＳ２．５３８， ＩＤ １６ｕ（Ｃ１）ｕ， ＩＤ ６１ｖ（Ｃ１）ｖ； Ｃａｎｄｉｄａ ａｒｂｏｒｅａ， ＡＳ２．５６６； Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ） Ｌａｎｇｅｒｏｎ ｅｔ ｇｕｅｒｒａ， ＡＳ２．６３， ＩＤ ２１ ａ（Ｃ５）ａ， ＩＤ ２１ ｂ（Ｃ５）ｂ； Ｃａｎｄｉｄａ Ｋｒｕｓｅｉ （Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ） Ｂｅｒｋｈｏｕｔ， ＡＳ２．１０４５； Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｍｂｉｃａ（Ｌｉｎｄｎｅｒ ｅｔ Ｇｅｎｏｕｄ） ｖａｎ．Ｕｄｅｎ ｅｔ Ｂｕｃｋｌｅ��， ＡＳ２．１１８２； Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ （Ｈａｒｒｉｓｏｎ） Ｄｉｄｄｅｎｓ ｅｔ Ｌｏｄｄｅｒ， ＡＳ２．１２０７， ＡＳ２．１２１６， ＡＳ２．１２２０， ＡＳ２．１３７９， ＡＳ２．１３９８， ＡＳ２．１３９９， ＡＳ２．１４００； Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｒｕｓｅｉ （Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ｅｔ Ｃｈａｌｍｅｒ） Ｌａｎｇｅｒｏｎ ｅｔ Ｇｕｅｒｒａ， ＩＤ １９ ａ（Ｃ４）ａ， ＩＤ １９ ｂ（Ｃ４）ｂ， ＩＤ １９ ｃ（Ｃ４）ｃ， ＩＤ １９ ｄ（Ｃ４）ｄ； Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ （Ａｓｈｆｏｒｄ） Ｌａｎｇｅｒｏｎ ｅｔ Ｔａｌｉｃｅ， ＡＳ２．５９０； Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ （Ａｓｈｆｏｒｄ） ｅｔ Ｔａｌｉｃｅ Ｖａｒ．ｉｍｔｅｒｍｅｄｉａ Ｖａｎ Ｒｉｊ ｅｔ Ｖｅｒｏｎａ， ＡＳ２．４９１； Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ （Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ） Ｂａｓｇａｌ， ＡＳ２．６８， ＩＤ６４（Ｃ３）； Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ （Ｌｉｎｄｎｅｒ） Ｗｉｎｄｉｓｃｈ， ＡＳ２．４９２； Ｃａｎｄｉｄａ ｒｏｂｕｓｔａ Ｄｉｄｄｅｎｓ ｅｔ Ｌｏｄｄｅｒ， ＡＳ２．１１９５； Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｕｓａ （Ａｎｄｅｒｓｏｎ） Ｄｉｄｄｅｎｓ ｅｔ Ｌｏｄｄｅｅｒ， ＡＳ２．５１１， ＡＳ２．１３６７， ＡＳ２．１３６９， ＡＳ２．１３７２， ＡＳ２．１３７３， ＡＳ２．１３７７， ＡＳ２．１３７８， ＡＳ２．１３８４； Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ （Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ） Ｂｅｒｋｏｕｔ， ＡＣＣＣ２００４， ＡＣＣＣ２００５， ＡＣＣＣ２００６， ＡＳ２．１６４， ＡＳ２．４０２， ＡＳ２．５６４， ＡＳ２．５６５， ＡＳ２．５６７， ＡＳ２．５６８， ＡＳ２．６１７， ＡＳ２．６３７， ＡＳ２．１３８７， ＡＳ２．１３９７， ＩＤ １７ ａ（Ｃ２）ａ， ＩＤ １７ ｂ（Ｃ２）ｂ， ＩＤ １７ ｄ（Ｃ２）ｄ； Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ Ｈｅｎｎｅｂｅｒｇ Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ Ｋｒｅｇｅｒ Ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＳ２．１２０， ＡＳ２．２８１， ＡＳ２．１１８０； Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ （Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ） Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ， ＡＳ２．１４０１； Ｃｒｅｂｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ （Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄ） Ｒｏｕｔｅｉｎ， ＡＣＣＣ２０１３， ＡＣＣＣ２０１４， ＡＳ２．４８１， ＡＳ２．４８２， ＡＳ２．１１９７； Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ （Ｋｕｆｆｅｒａｔｈ） Ｓｋｉｎｎｅｒ， ＡＣＣＣ２００７， ＡＳ２．１１４， ＩＤ ９５ （ｙ２）； Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ （Ｓａｎｆｅｌｉｃｅ） Ｖｕｉｌｌｅｍｉｎ， ＩＤ ２５ ｕ（Ｄ２）ｕ， ＩＤ ２５ ｖ（Ｄ２）ｖ， ＩＤ ２５ ｗ（Ｄ２）ｗ； Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ （Ｚｏｐｆ） Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＣＣＣ２０１０， ＡＳ２．４５； Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｋｌｏｅｃｋｅｒｉ Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄ ｅｔ Ｐｅｊｕ， ＡＣＣＣ２００８， ＡＣＣＣ２００９， ＡＳ２．３３， ＡＳ２．３４， ＡＳ２．４９４； Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．， ＡＣＣＣ２０１１， ＡＣＣＣ２０１２； Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ （Ｌｉｎｄｎｅｒ） Ｄｅｋｋｅｒ， ＡＣＣＣ２０１５， ＡＳ２．１１４５； Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄ； Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ Ｌｉｎｋ， ＡＣＣＣ２０１６， ＡＳ２．３６１， ＡＳ２．４９８， ＡＳ２．６１６， ＡＳ２．１０３５， ＡＳ２．１０６２， ＡＳ２．１０８０， ＡＳ２．１１３２， ＡＳ２．１１７５， ＡＳ２．１１８３； Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｕｄｗｉｇｉｉ （Ｈａｎｓｅｎ） Ｆａｎｆ ｅｔ ａｌ．， ＡＳ２．３６３； Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｒｏｂｕｓｔｕｍ Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＣＣ２０１７， ＡＳ２．６２１； Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ （Ｋｒｚｅｍｅｃｋｉ） Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＡＳ２．３６４； Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ （Ｈａｎｓｅｎ） Ｈ ｅｔ Ｐ ｓｙｄｏｗ， ＡＣＣＣ２０１８， ＡＳ２．２９４， ＡＳ２．２９５， ＡＳ２．２９６， ＡＳ２．２９７， ＡＳ２．２９８， ＡＳ２．２９９， ＡＳ２．３００， ＡＳ２．３０２， ＡＳ２．３３８， ＡＳ２．３３９， ＡＳ２．３４０， ＡＳ２．３４１， ＡＳ２．４７０， ＡＳ２．５９２， ＡＳ２．６４１， ＡＳ２．６４２， ＡＳ２．７３５， ＡＳ２．７８２， ＡＳ２．７９４； Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｒａｂｉｔｏｌｇｅｎｓ Ｆａｎｇ， ＡＳ２．８８７； Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｊａｄｉｎｉｉ Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ， ＡＣＣＣ２０１９； Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓａｔｕｒｎｕｓ （Ｋｌｏｃｋｅｒ） Ｈ ｅｔ Ｐ ｓｙｄｏｗ， ＡＣＣＣ２０２０， ＡＳ２．３０３； Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｃｈｎｅｇｇｉｉ （Ｗｅｂｅｒ） Ｄｅｋｋｅｒ， ＡＳ２．３０４； Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＡＳ２．７４０， ＡＳ２．７６０， ＡＳ２．７６１， ＡＳ２．７７０， ＡＳ２．７８３， ＡＳ２．７９０， ＡＳ２．７９８， ＡＳ２．８６６； Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ （Ｒｅｅｓｓ ｅｍｅｎｄ． Ｋｌｏｃｋｅｒ） Ｊａｎｋｅ， ＡＣＣＣ２０２１， ＡＣＣＣ２０２２， ＡＣＣＣ２０２３， ＡＳ２．１９７， ＡＳ２．４９６， ＡＳ２．７１１， ＡＳ２．７１４； Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＣＣＣ２０２４， ＡＳ２．１３９０； Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ （Ｌｉｎｄｎｅｒ） Ｈａｎｓｅｎ， ＡＣＣＣ２０２５， ＡＣＣＣ２０２６， ＡＳ２．８６， ＡＳ２．８７， ＡＳ２．７０５， ＡＳ２．８０３； Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ Ｈａｎｓｅｎ， ＡＣＣＣ２０２７， ＡＳ２．８９， ＡＳ２．６６１， ＡＳ２．１０３９； Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ Ｂａｎｎｏ， ＡＣＣＣ２０２８， ＡＳ２．１３８９； Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ （Ｓａｉｔｏ） Ｌｏｄｄｅｒ， ＡＣＣＣ２０２９， ＡＳ２．２８０； Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ （Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ） Ｈａｒｒｉｓｏｎ， ＡＣＣＣ２０３０， ＡＳ２．１０２， ＡＳ２．１０７， ＡＳ２．２７８， ＡＳ２．４９９， ＡＳ２．６９４， ＡＳ２．７０３， ＡＳ２．７０４， ＡＳ２．１１４６； Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｍｉｎｕｔａ （Ｓａ���ｔｏ） Ｈａｒｒｉｓｏｎ， ＡＳ２．２７７； Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂａｒ （Ｄｅｍｍｅ） Ｌｏｄｄｅｒ， ＡＣＣＣ２０３１， ＡＳ２．２１， ＡＳ２．２２， ＡＳ２．１０３， ＡＳ２．１０５， ＡＳ２．１０８， ＡＳ２．１４０， ＡＳ２．１６６， ＡＳ２．２７２， ＡＳ２．２７９， ＡＳ２．２８２； Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｉｎｅｓｉｓ Ｌｅｅ， ＡＳ２．１３９１； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ Ｌｉｎｄｎｅｒ， ＡＳ２．３１２； および Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ Ｈａｎｓｅｎ， ＡＣＣＣ２０３２， ＡＣＣＣ２０３３， ＡＳ２．１１３， ＡＳ２．１１６， ＡＳ２．１１８， ＡＳ２．１２１， ＡＳ２．１３２， ＡＳ２．１６２， ＡＳ２．１８９， ＡＳ２．２００， ＡＳ２．２１６， ＡＳ２．２６５， ＡＳ２．３７７， ＡＳ２．４１７， ＡＳ２．４２０， ＡＳ２．４４０， ＡＳ２．４４１， ＡＳ２．４４３， ＡＳ２．４４４， ＡＳ２．４５９， ＡＳ２．５９５， ＡＳ２．６０５， ＡＳ２．６３８， ＡＳ２．７４２， ＡＳ２．７４５， ＡＳ２．７４８， ＡＳ２．１０４２。
【００２８】
本発明によって活性化可能であり、本発明に含まれる酵母種の中にはヒトおよび／または他の生物に対して病原性であることが知られているものもある。例えば以下のものである；Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ （Ａｓｈｂｙ ｅｔ Ｎｏｗｅｌｌ） Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄ， ＡＣＣＣ２００１， ＡＳ２．４７５， ＡＳ２．１１７６； Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ Ｇｉｌｅｈｒｉｓｔ ｅｔ Ｓｔｉｋｅｓ， ＩＤ（Ｄ １０）２３； Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ （Ｒｏｂｉｎ） Ｂｅｒｋｈｏｕｔ， ＡＣＣＣ２００２， ＡＳ２．５３８， ＩＤ １６ｕ（Ｃ１）ｕ， ＩＤ ６１ｖ（Ｃ１）ｖ； Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｒｕｓｅｉ （Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ｅｔ Ｃｈａｌｍｅｒ） Ｌａｎｇｅｒｏｎ ｅｔ Ｇｕｅｒｒａ， ＩＤ １９ ａ（Ｃ４）ａ， ＩＤ １９ ｂ（Ｃ４）ｂ， ＩＤ １９ ｃ（Ｃ４）ｃ， ＩＤ １９ ｄ（Ｃ４）ｄ； Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ （Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ） Ｂｅｒｋｏｕｔ， ＩＤ １７ ａ（Ｃ２）ａ， ＩＤ １７ ｂ（Ｃ２）ｂ， ＩＤ １７ ｄ（Ｃ２）ｄ； Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ （Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ） Ｓａｎｔａ Ｍａｒｉａ， ＡＳ２．１４０１； Ｃｒｅｂｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ （Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄ） Ｒｏｕｔｅｉｎ， ＡＣＣＣ２０１３， ＡＣＣＣ２０１４； Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ （Ｋｕｆｆｅｒａｔｈ） Ｓｋｉｎｎｅｒ， ＡＣＣＣ２００７， ＡＳ２．１１４， ＩＤ ９５ （ｙ２）； Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ （Ｓａｎｆｅｌｉｃｅ） Ｖｕｉｌｌｅｍｉｎ， ＩＤ ２５ ｕ（Ｄ２）ｕ， ＩＤ ２５ ｖ（Ｄ２）ｖ， ＩＤ ２５ ｗ（Ｄ２）ｗ； Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ （Ｚｏｐｆ） Ｌｏｄｄｅｒ ｅｔ Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ Ｒｉｊ， ＡＣＣＣ２０１０； Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ Ｋｌｏｅｃｋｅｒｉ Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄ ｅｔ Ｐｅｊｕ， ＡＣＣＣ２００８， ＡＣＣＣ２００９； Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．， ＡＣＣＣ２０１１， ＡＣＣＣ２０１２； Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ （Ｌｉｎｄｎｅｒ） Ｄｅｋｋｅｒ， ＡＣＣＣ２０１５， ＡＳ２．１１４５。一定の環境下、例えば開放耕地でのそれらの使用がヒトおよび／または他の生物の健康に危害を与える可能性のある場合などには、本発明の生物学的肥料においてそのような病原性酵母を使用するのはあまり好ましくない。
【００２９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ） 属の酵母が一般的に好ましい。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株のなかでは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎが好適な株である。最も好ましい酵母の株は、ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ （ＣＧＭＣＣ）に寄託されており、受託番号がＡＳ２．５０１， ＡＳ２．５３５， ＡＳ２．４４１， ＡＳ２．４０６， ＡＳ２．３８２， およびＡＳ２．１６であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ株である。一般的に酵母株は私立または公立の研究室の培養物あるいは、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０２２０９　および ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ （ＣＧＭＣＣ）， Ｃｈｉｎａ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｉｄｉａｎ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ ２７１４， Ｂｅｉｊｉｎｇ， １０００８０， Ｃｈｉｎａなどの公的に利用可能な培養物寄託施設から得ることができる。
【００３０】
本発明の酵母細胞要素の調製は酵母の純粋な株から開始するのが好ましいが、それに限定されるものではない。それぞれの酵母細胞要素は異なる種または株の酵母細胞の混合物を培養することによって作成してもよい。酵母細胞要素の組成は、当該技術分野に周知の標準的な酵母同定技術によって決定することができる。
【００３１】
酵母の中には他の酵母よりも所望の機能の１つをより効率的に果たすことができるものがある。本発明の条件下での培養前または培養後の６つの所望の機能の１つを果たす酵母の種または株の能力は、当該技術分野において公知の方法によって簡単に試験することができる。例えば、固定された窒素量は、引用により本出願にその内容全体が含まれる米国特許第５５７８４８６号に記載の改変アセチレン還元法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｃｅｔｙｌｅｎｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することができる。改変アセチレン還元法は固定された窒素の量を空気中の体積における分子窒素の減少を測定することによって決定する。固定された窒素量は酵母細胞によって生産されたアンモニアおよび硝酸塩の測定によっても決定することができる（例えば、Ｇｒｅｗｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９６５， Ｃｏｒｎｅｌｌ Ａｇｒ Ｅｘｐ Ｓｔａ Ｂｕｌｌ ９６０：２２２５を参照されたい）。その他の機能について、不溶性または生物学的に利用不可能なリン化合物からの変換の結果として植物に利用可能になったリンの量は、モリブデンブルー法（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， １９６２， Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２７：３１−３６を参照されたい）またはＵＶ吸収法によって決定することができる；一方、不溶性または生物学的に利用不可能なカリウム化合物から変換された利用可能なカリウムの量は、例えば、炎色原子吸収分光測定法（ｆｌａｍｅ ａｔｏｍｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（例えば、Ｐｕｃｈｙｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ａｓｓｏｃ． Ｏｆｆ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６９：８６８−８７０を参照されたい）によって決定することができる。生物学的肥料組成物が土壌に添加された後の、植物が利用可能なＮ、ＰおよびＫを酵母が供給する能力は、当該技術分野に公知の多くの技術によって試験することができる。例えば、土壌中の酵母細胞によって生産される、植物に利用可能なアンモニア、硝酸塩、ＰおよびＫは、モルガン土壌試験系（ｔｈｅ Ｍｏｒｇａｎ ｓｏｉｌ ｔｅｓｔ ｓｙｓｔｅｍ）によって抽出および定量分析することができる（例えば、Ｌｕｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９５０， Ｃｏｎｎ Ａｇｒ Ｅｘｐ Ｓｔａ Ｂｕｌｌ ５４１を参照されたい）。
【００３２】
いかなる理論または機構にも束縛されることなく、本発明者は、それぞれの機能を果たすことにおいて酵母細胞が活性にまたはより効率的になるように、酵母の遺伝子または遺伝子セットの発現が、培養条件によって活性化および／または促進されるということを信じている。
【００３３】
本発明によると、生物学的肥料組成物は以下の生物学的機能の１つを果たすことができる少なくとも１つの酵母細胞要素を含む：（１）空中窒素の固定；（２）肥料組成物または土壌中に存在する、不溶性または生物学的に利用不可能なリンミネラルまたは化合物の分解；（３）肥料組成物または土壌中に存在する、不溶性または生物学的に利用不可能なカリウムミネラルまたは化合物の分解；（４）肥料組成物または土壌中に存在する、複合または高分子量の炭素材料または化合物の分解；（５）肥料組成物中の他の酵母株の要求を支持するのに十分な量の過剰な成長因子の生産；および（６）肥料組成物中の他の酵母株の要求を支持するのに十分な量の過剰なＡＴＰの生産。好適な態様において、生物学的肥料組成物は１つの酵母株から６つの異なる酵母種または株を含んでいてもよく、それらはそれぞれの機能を果たす能力を増強または最大化するような特有の条件下で培養される。代替調製も考えられることを理解すべきである。したがって、所望であれば生物学的肥料組成物は１または複数の上記の酵母細胞要素を含まないものであってもよい。例えば、生物学的に利用可能なリンが豊富な土壌においては、肥料組成物を、リン化合物分解酵母からなる要素を含まないように調剤してもよい。本発明の最も好適な態様において、すべての６つの酵母細胞要素および有機および／または無機基材を含む生物学的肥料組成物が考えられる。
【００３４】
本発明の別の態様において、様々な酵母細胞要素の酵母細胞が混合物中で存在している場合、異なる機能を有する酵母細胞が栄養分および成長因子を互いに供給および／または依存することができるような一定の条件下で酵母細胞を培養すればよい。その結果、本発明の肥料組成物の様々な酵母細胞要素間に、共生様の関係が確立される。この培養工程は任意であるが、生物学的肥料の安定性および効果を改良して、肥料を自然の土壌環境における長期間の使用のためにより好適なものとすることができる。この任意の工程の培養条件については節５．７において記載する。
【００３５】
本発明のさらに別の態様において、酵母細胞を特定のタイプの土壌に適応させるために、酵母細胞を一定の条件下で培養してもよい。この培養工程は任意であり、各酵母細胞要素に別々に適用してもよいし、酵母細胞要素の混合物に適用してもよい。その結果、特定の土壌環境における酵母の成長と生存がよりよくなる。この任意の工程の培養条件については節５．８において記載する。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、生物学的肥料組成物が植物の成長を支持または促進するとは、生物学的肥料が土壌中に存在する場合または植物の根、茎、葉またはその他の部分に適用された場合、植物または植物の一部が生存能力、大きさ、重量、発芽率、成長速度、または成熟速度を獲得することをいう。したがって、生物学的肥料組成物は、あらゆる種類の農業、園芸および林業の実施において有用性がある。生物学的肥料組成物は、開放耕地または温室における大規模の商業的農業のため、または室内における観賞用植物のためにも利用可能である。好ましくは、生物学的肥料は作物植物の成長を促進するために用いられ、作物植物には穀類作物、野菜作物、果物作物、花卉作物、および牧草作物などが挙げられるがそれらに限定されるものではない。例えば、生物学的肥料は小麦、大麦、トウモロコシ、大豆、米、カラスムギ、ジャガイモ、リンゴ、オレンジ、トマト、メロン、サクランボ、レモン、レタス、ニンジン、サトウキビ、タバコ、綿花などに使用できる。
【００３７】
生物学的肥料組成物は従来の肥料と同様に適用することができる。関連技術分野における当業者に知られているように、多くの方法および器具が使用できる。１つの態様において、本発明の酵母株の培養液を直接土壌または植物に適用する。別の態様において、本発明の酵母株の乾燥紛を土壌または植物に適用する。さらに別の態様において、本発明の酵母細胞要素と有機および無機基材要素との混合物を土壌または植物に適用する。生物学的肥料組成物を、散布器、噴霧器およびその他の自動化されていてもよい機械的手段によって土壌に適用してもよい。生物学的肥料組成物を、例えば、種および／または根を浸すことや葉に噴霧することによって直接植物に適用してもよい。そのような適用は、１年に１回、成長期に１回、または所望によりさらに頻繁に定期的に行えばよい。本発明の生物学的肥料組成物はその他のタイプの肥料と同時にまたは交替で使用することもできる。
【００３８】
節５．１−５．６において、窒素固定、リン化合物分解、カリウム化合物分解、複合炭素化合物分解、成長因子生産、およびＡＴＰ生産に用いられる酵母細胞要素がそれぞれ記載される。それぞれの酵母細胞要素の調製方法が記載される。節５．７には本発明の肥料組成物における酵母株の間の共生様関係の確立方法が記載される。節５．８には特定のタイプの土壌に本発明の酵母細胞を適応させる方法が記載される。節５．９には生物学的肥料組成物の製造が記載される。有機および無機原料の調製方法および、混合、乾燥、冷却、および梱包を含む生物学的肥料の製造方法も記載される。本発明の様々な態様において、微生物の取り扱い、移動および貯蔵の標準的な技術が用いられる。必須ではないが、本発明の工程を行う際、無菌条件または清潔な環境が望ましい。
【００３９】
５．１．窒素固定酵母細胞要素
窒素固定は、空中窒素がアンモニアおよび硝酸塩に変換される工程である。７０以上の属の、多くは細菌およびラン藻である、８００種近くの天然の微生物が窒素を固定することができると判明している。窒素固定微生物の中には、リゾボウム（Ｒｈｉｚｏｂｏｕｍ） のように、特にマメ科の根において、植物と共生関係を形成するものもある。アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）のように自由生活性であって土壌中の窒素を固定することができるものもある。
【００４０】
本発明において、酵母の窒素を固定する能力が活性化または増強され、その結果得られる窒素固定酵母細胞は本発明の生物学的肥料組成物の要素として利用可能である。
【００４１】
本発明によると、窒素固定能力が増強した酵母細胞は、適当な培地中で電磁場の存在下で細胞を培養することによって調製される。酵母における窒素固定を活性化または増強するための電磁場の振動数は、通常８００ＭＨｚ−１０００ＭＨｚの範囲に見出される。十分な期間酵母細胞が培養された後、細胞はその窒素固定能力について当該技術分野に周知の方法によって試験すればよい。
【００４２】
窒素固定酵母細胞を作る本発明の方法は、液体培地中で行われる。培地は酵母細胞によって同化できる栄養源を含む。一般に、例えば、シュークロース、グルコース、フルクトース、デキストロース、マルトース、キシロース、その他の糖、およびデンプンなどの、炭水化物を単独で、あるいは組み合わせて、培地中の同化可能な炭素源として利用可能である。培地中に利用される１または複数の炭水化物源の正確な量は部分的に培地のその他の成分に依存するが、一般的に炭水化物の量は普通、培地の重量で約０．１％から５％の範囲、好ましくは約０．５％から２％の範囲、そして最も好ましくは約１％である。これらの炭素源は個別に利用できるし、いくつかの炭素源を培地中で組み合わせてもよい。
【００４３】
培地に混合できる無機塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン酸、硫酸、炭酸などのイオンを生成し得る通常の塩である。栄養無機塩には、ＣａＣＯ３， ＫＨ２ＰＯ４， ＭｇＳＯ４， ＮａＣｌ， およびＣａＳＯ４が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００４４】
【表１】
表Ｉ：窒素固定酵母のための培地の組成
2004510667.tif 000002
【００４５】
表Ｉに示される培地の組成はこれに限定する意図のものではないことに注意されたい。培養規模や培地要素の供給場所などを、経験的および経済的に考慮して、当業者によって培地を様々に改変することができる。
【００４６】
該工程は、選抜された１または複数の酵母株の１つの種菌１ｍｌを各１００ｍｌの培地に、細胞密度１０２−１０５細胞／ｍｌ、好ましくは３ｘ１０２−１０４細胞／ｍｌで播種することによって開始する。必要に応じて該工程をスケールアップまたはダウンすることができる。酵母培養物は、約１２−２４時間、好ましくは約２４時間、電磁場の存在下で培養する。電磁場は、当該技術分野で知られているあらゆる手段によって適用することができるが、８６０−８７０ＭＨｚの範囲、好ましくは約８６５ＭＨｚ、より好ましくは８６５．５２２−８６５．６２２ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは８６５．５７２ＭＨｚの振動数を有するのがよい。電磁場の振幅は１０００−２０００ｍＶの範囲、好ましくは約１２５０ｍＶがよい。この培養の最初の期間の後、酵母細胞を、振幅を４０００−５０００ｍＶの範囲、好ましくは約４６５６ｍＶのより高いレベルに上げることを除いては実質的に同じ条件下でさらにおよそ２４時間インキュベートする。この培養工程の例示的な構成を図１に示す。本発明のこの工程は約２５−３０℃の範囲の温度で行うが、２８℃で該工程を行うのが好ましい。培養工程は好ましくは、溶存酸素濃度が０．０２５−０．８ｍｏｌ／ｍ３の間、好ましくは０．４ｍｏｌ／ｍ３の条件下で行うのがよい。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない、当業者に公知のあらゆる従来の手段によって制御することができる。
【００４７】
培養工程の最後に、窒素固定酵母細胞を当該技術分野で知られている様々な方法によって培養物から回収し、約０℃−４℃以下の温度で保存すればよい。窒素固定酵母細胞は乾燥させて粉状形態で保存してもよい。
【００４８】
培養された酵母細胞が窒素を固定する能力を試験するために当該技術分野で知られているいかなる方法を用いてもよい。例えば、調製された酵母の窒素固定能力を評価するために、微生物によって固定された窒素を測定するための改変アセチレン還元法を用いることが挙げられる。改変アセチレン還元法は、引用により本出願にその内容全体が含まれる、米国特許第５５７８４８６号に記載されている。例えば、１ｍｌの調製された酵母培養物を、２５０ｍｌのスケールのフラスコ中の３０ｍｌの表１による培地中に播種する。培養物を、約２０％体積の酸素および８０％体積の窒素を含む空気の存在下で２０−２８℃の温度範囲で２４−５６時間インキュベートする。固定された窒素量を次に、例えばガスクロマトグラフィーが挙げられるがそれに限定されるものではない当該技術分野で知られているあらゆる手段によって、空気から減少した窒素を測定することによって決定することができる。本発明の酵母細胞によって固定された窒素量は、酵母乾燥重量１ｍｇにつき少なくとも約１０ｍｇである。例えば、活性化の後、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈａｎｓｅｎ株 ＡＳ２．５０１によって固定される窒素量は、約１１２００ｍｇ／ｇに達し得る。
【００４９】
５．２．リン分解酵母細胞要素
本発明のリン化合物分解（Ｐ−分解）酵母は、岩石リンなどの不溶性または生物学的に利用不可能なリン含有物質を、植物に利用可能にするために可溶性リン化合物へと変換する。
【００５０】
本発明において、酵母の不溶性リン含有物質を分解する能力が活性化または増強され、その結果得られるＰ−分解酵母細胞は本発明の生物学的肥料組成物の要素として利用可能である。
【００５１】
本発明によると、Ｐ−分解可能な酵母細胞は、適当な培地中で電磁場の存在下で細胞を培養することによって調製される。酵母におけるＰ−分解を活性化または増強するための電磁場の振動数は、通常３００ＭＨｚ−５００ＭＨｚの範囲に見出される。十分な期間細胞が培養された後、細胞はそのリン含有物質分解能力について当該技術分野に周知の方法によって試験すればよい。
【００５２】
Ｐ−分解酵母細胞を作る本発明の方法は、液体培地中で行われる。培地は酵母細胞によって同化できる栄養源を含む。一般に、例えば、シュークロース、グルコース、フルクトース、デキストロース、マルトース、キシロース、その他の糖、およびデンプンなどの、炭水化物を単独で、あるいは組み合わせて、培地中の同化可能な炭素源として利用可能である。培地中に利用される１または複数の炭水化物源の正確な量は部分的に培地のその他の成分に依存するが、一般的に炭水化物の量は普通、培地の重量で約０．１％から５％の範囲、好ましくは約０．５％から２％の範囲、そして最も好ましくは約１．５％である。これらの炭素源は個別に利用できるし、いくつかの炭素源を培地中で組み合わせてもよい。
【００５３】
培地に混合できる無機塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、硫酸、炭酸などのイオンを生成し得る通常の塩である。栄養無機塩には、ＣａＣＯ３， ＭｇＳＯ４， ＮａＣｌ， およびＣａＳＯ４が挙げられるがこれらに限定されるものではない。好適な形態における不溶性リン含有物質も培地中に含まれる。例えば、２００メッシュ以上の岩石リンの粉が含まれるがそれに限定されるものではない。その他の不溶性リン含有物質を別々にまたは組み合わせて使用することができる。
【００５４】
【表２】
表ＩＩ：Ｐ−分解酵母のための培地組成
2004510667.tif 000003
【００５５】
表ＩＩに示される培地の組成はこれに限定する意図のものではないことに注意されたい。培養規模や培地要素の供給場所などを、経験的および経済的に考慮して、当業者によって培地を様々に改変することができる。
【００５６】
該工程は、選抜された１または複数の酵母株の１つの種菌１ｍｌを各１００ｍｌの培地に、細胞密度１０２−１０５細胞／ｍｌ、好ましくは３ｘ１０２−１０４細胞／ｍｌで播種することによって開始する。必要に応じて該工程をスケールアップまたはダウンすることができる。酵母培養物は、約１２−２４時間、好ましくは約２４時間、電磁場の存在下で培養する。電磁場は、当該技術分野で知られているあらゆる手段によって適用することができるが、３６０−３７０ＭＨｚの範囲、好ましくは約３６６ＭＨｚ、より好ましくは３６６．１９９−３６６．２８７ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは３６６．２４３ＭＨｚの振動数を有するのがよい。電磁場の振幅は１０００−２０００ｍＶの範囲、好ましくは約１２３０ｍＶがよい。この培養の最初の期間の後、酵母細胞を、振幅を４０００−５０００ｍＶの範囲、好ましくは約４５７０ｍＶのより高いレベルに上げることを除いては実質的に同じ条件下でさらにおよそ２４時間インキュベートする。この培養工程の例示的な構成を図１に示す。本発明のこの工程は約２５−３０℃の範囲の温度で行うが、２８℃で該工程を行うのが好ましい。培養工程は好ましくは、溶存酸素濃度が０．０２５−０．８ｍｏｌ／ｍ３の間、好ましくは０．４ｍｏｌ／ｍ３の条件下で行うのがよい。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない、当業者に公知のあらゆる従来の手段によって制御することができる。
【００５７】
培養工程の最後に、Ｐ−分解酵母細胞を当該技術分野で知られている様々な方法によって培養物から回収し、約０℃−４℃以下の温度で保存すればよい。Ｐ−分解酵母細胞は乾燥させて粉状形態で保存してもよい。
【００５８】
培養された酵母細胞が不溶性リン含有物質を分解する能力を試験するために当該技術分野で知られているいかなる方法を用いてもよい。１つの態様において、１ｍｌの調製された酵母培養物を、３０ｍｌの表２による培地中に播種する。培養物を、２０−２８℃の温度範囲で２４−５６時間インキュベートする。培養物中のＰＯ４３−の形態の生物学的に利用可能なリンの量を次に、ＵＶ吸収分光測定法が含まれるがそれに限定されるものではない当該技術分野で知られているあらゆる方法によって、測定することができる。培養物中のＰＯ４３−の量は酵母乾燥重量１ｇにつき少なくとも１０ｍｇ上昇する。例えば、活性化の後、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｈａｎｓｅｎ株 ＡＳ２．５３５の培養物におけるＰＯ４３−の量は、約４４６０ｍｇ／ｇに上昇する。
【００５９】
５．３．カリウム分解酵母細胞要素
本発明のカリウム化合物分解（Ｋ−分解）酵母は、カリウム雲母などの不溶性カリウム含有物質を、植物に利用可能にするために可溶性カリウムへと変換する。
【００６０】
本発明において、複数の酵母細胞の不溶性カリウム含有物質を分解する能力が活性化または増強され、その結果得られるＫ−分解酵母細胞は本発明の生物学的肥料組成物の要素として利用可能である。
【００６１】
本発明によると、Ｋ−分解可能な酵母細胞は、適当な培地中で電磁場の存在下で細胞を培養することによって調製される。酵母におけるＫ−分解を活性化または増強するための電磁場の振動数は、通常１００ＭＨｚ−３００ＭＨｚの範囲に見出される。十分な期間酵母細胞が培養された後、細胞はそのカリウム含有物質分解能力について当該技術分野に周知の方法によって試験すればよい。
【００６２】
Ｋ−分解酵母細胞を作る本発明の方法は、液体培地中で行われる。培地は酵母細胞によって同化できる栄養源を含む。一般に、例えば、シュークロース、グルコース、フルクトース、デキストロース、マルトース、キシロース、その他の糖、およびデンプンなどの、炭水化物を単独で、あるいは組み合わせて、培地中の同化可能な炭素源として利用可能である。培地中に利用される１または複数の炭水化物源の正確な量は部分的に培地のその他の成分に依存するが、一般的に炭水化物の量は普通、培地の重量で約０．１％から５％の範囲、好ましくは約０．５％から２％の範囲、そして最も好ましくは約１．５％である。これらの炭素源は個別に利用できるし、いくつかの炭素源を培地中で組み合わせてもよい。
【００６３】
培地に混合できる無機塩は、ナトリウム、カルシウム、リン酸、硫酸、炭酸などのイオンを生成し得る通常の塩である。栄養無機塩には、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４， ＣａＣＯ３， ＭｇＳＯ４， ＮａＣｌ， およびＣａＳＯ４が挙げられるがこれらに限定されるものではない。好適な形態における不溶性カリウム含有物質も培地中に含まれる。例えば、２００メッシュ以上のカリウム雲母の粉が含まれるがそれに限定されるものではない。その他の不溶性カリウム含有物質を別々にまたは組み合わせて使用することができる。
【００６４】
【表３】
表ＩＩＩ：Ｋ−分解酵母のための培地組成
2004510667.tif 000004
【００６５】
表ＩＩＩに示される培地の組成はこれに限定する意図のものではないことに注意されたい。培養規模や培地要素の供給場所などを、経験的および経済的に考慮して、当業者によって培地を様々に改変することができる。
【００６６】
該工程は、選抜された１または複数の酵母株の１つの種菌１ｍｌを各１００ｍｌの培地に、細胞密度１０２−１０５細胞／ｍｌ、好ましくは３ｘ１０２−１０４細胞／ｍｌで播種することによって開始する。必要に応じて該工程をスケールアップまたはダウンすることができる。酵母培養物は、約１２−２４時間、好ましくは約２４時間、電磁場の存在下で培養する。電磁場は、当該技術分野で知られているあらゆる手段によって適用することができるが、２５０−２６０ＭＨｚの範囲、好ましくは約２５５ＭＨｚ、より好ましくは２５５．３８８−２５５．４６２ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは２５５．４２５ＭＨｚの振動数を有するのがよい。電磁場の振幅は１０００−２０００ｍＶの範囲、好ましくは約１３４０ｍＶがよい。この培養の最初の期間の後、酵母細胞を、振幅を４０００−５０００ｍＶの範囲、好ましくは約４８５０ｍＶのより高いレベルに上げることを除いては実質的に同じ条件下でさらにおよそ２４時間インキュベートする。この培養工程の例示的な構成を図１に示す。本発明のこの工程は約２５−３０℃の範囲の温度で行うが、２８℃で該工程を行うのが好ましい。培養工程は好ましくは、溶存酸素濃度が０．０２５−０．８ｍｏｌ／ｍ３の間、好ましくは０．４ｍｏｌ／ｍ３の条件下で行うのがよい。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない、当業者に公知のあらゆる従来の手段によって制御することができる。
【００６７】
培養工程の最後に、Ｋ−分解酵母細胞を当該技術分野で知られている様々な方法によって培養物から回収し、約０℃−４℃以下の温度で保存すればよい。Ｋ−分解酵母細胞は乾燥させて粉状形態で保存してもよい。
【００６８】
培養された酵母細胞が不溶性カリウム含有物質を分解する能力を試験するために当該技術分野で知られているいかなる方法を用いてもよい。１つの態様において、１ｍｌの調製された酵母培養物を、３０ｍｌの表３による培地中に播種する。培養物を、２０−２８℃の温度範囲で２４−５６時間インキュベートする。培養物中のＫ＋の形態の生物学的に利用可能なカリウムの量を次に、原子吸収分光測定法が含まれるがそれに限定されるものではない当該技術分野で知られているあらゆる方法によって、測定することができる。培養物中のＫ＋の量は酵母乾燥重量１ｇにつき少なくとも１０ｍｇ上昇する。例えば、活性化の後、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｈａｎｓｅｎ株 ＡＳ２．４４１の培養物におけるＫ＋の量は、約４０５０ｍｇ／ｇに達する。
【００６９】
５．４．複合炭素分解酵母細胞要素
本発明の炭素分解（Ｃ−分解）酵母は、セルロースなどの、複雑な、通常高分子量の炭素化合物および材料を、ペントースおよびヘキソースのような単純な炭水化物へと変換する。そのような単純炭化水素はその他の酵母細胞に利用され、それらの成長および活性化を支持する。
【００７０】
本発明において、酵母の複合炭素化合物を分解する能力が非常に効率的に活性化または増強され、その結果得られるＣ−分解酵母細胞は本発明の生物学的肥料組成物の要素として利用可能である。
【００７１】
本発明によると、Ｃ−分解可能な酵母細胞は、適当な培地中で電磁場の存在下で細胞を培養することによって調製される。酵母におけるＣ−分解のための電磁場の振動数は、通常１０００ＭＨｚ−１２００ＭＨｚの範囲に見出される。十分な期間酵母細胞が培養された後、細胞はその複合炭素化合物を分解する能力について当該技術分野に周知の方法によって試験すればよい。
【００７２】
Ｃ−分解酵母細胞を作る本発明の方法は、液体培地中で行われる。培地は酵母細胞によって同化できる栄養源を含む。好適な形態における、セルロース、石炭などの複合炭素含有物質が培地中の炭素源として利用可能である。培地中に利用される１または複数の炭素源の正確な量は部分的に培地のその他の成分に依存するが、一般的に炭水化物の量は普通、培地の重量で約０．１％から５％の範囲、好ましくは約０．１％から１％の範囲、そして最も好ましくは約０．５％である。これらの炭素源は個別に利用できるし、いくつかの炭素源を培地中で組み合わせてもよい。
【００７３】
培地に混合できる無機塩は、ナトリウム、カルシウム、リン酸、硫酸、炭酸などのイオンを生成し得る通常の塩である。栄養無機塩には、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４， ＣａＣＯ３， ＭｇＳＯ４， ＮａＣｌ， およびＣａＳＯ４が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００７４】
【表４】
表ＩＶ：ＳＣ−分解酵母のための培地組成
2004510667.tif 000005
【００７５】
表ＩＶに示される培地の組成はこれに限定する意図のものではないことに注意されたい。培養規模や培地要素の供給場所などを、経験的および経済的に考慮して、当業者によって培地を様々に改変することができる。
【００７６】
該工程は、選抜された１または複数の酵母株の１つの種菌１ｍｌを各１００ｍｌの培地に、細胞密度１０２−１０５細胞／ｍｌ、好ましくは３ｘ１０２−１０４細胞／ｍｌで播種することによって開始する。必要に応じて該工程をスケールアップまたはダウンすることができる。酵母培養物は、約１２−２４時間、好ましくは約２４時間、電磁場の存在下で培養する。電磁場は、当該技術分野で知られているあらゆる手段によって適用することができるが、１０８７−１０９７ＭＨｚの範囲、好ましくは約１０９２ＭＨｚ、より好ましくは１０９２．３４６−１０９２．４２８ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは１０９２．３８７ＭＨｚの振動数を有するのがよい。用いられる振幅は１０００−２０００ｍＶの範囲、好ましくは約１５３０ｍＶがよい。この培養の最初の期間の後、酵母細胞を、振幅を４０００−５０００ｍＶの範囲、好ましくは約４７２０ｍＶのより高いレベルに上げることを除いては実質的に同じ条件下でさらにおよそ２４時間インキュベートする。この培養工程の例示的な構成を図１に示す。本発明のこの工程は約２５−３０℃の範囲の温度で行うが、２８℃で該工程を行うのが好ましい。培養工程は好ましくは、溶存酸素濃度が０．０２５−０．８ｍｏｌ／ｍ３の間、好ましくは０．４ｍｏｌ／ｍ３の条件下で行うのがよい。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない、当業者に公知のあらゆる従来の手段によって制御することができる。
【００７７】
培養工程の最後に、Ｃ−分解酵母細胞を当該技術分野で知られている様々な方法によって培養物から回収し、約０℃−４℃以下の温度で保存すればよい。Ｃ−分解酵母細胞は乾燥させて粉状形態で保存してもよい。
【００７８】
培養された酵母細胞が複合炭素含有物質を分解する能力を試験するために当該技術分野で知られているいかなる方法を用いてもよい。１つの態様において、１ｍｌの調製された酵母培養物を、３０ｍｌの表ＩＶによる培地中に播種する。培養物を、２０−２８℃の温度範囲で２４−５６時間インキュベートする。培養物中の単純炭化水素の量を次に、クロマトグラフィーおよび分子蛍光分光測定法が含まれるがそれらに限定されるものではない当該技術分野で知られているあらゆる方法によって、測定することができる。好ましくは、培養物中の単純な炭水化物の量は酵母乾燥重量１ｇにつき少なくとも１０ｍｇ上昇する。例えば、活性化の後、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｈａｎｓｅｎ ＡＳ２．４０６の培養物における単純炭化水素の量は、２７２００ｍｇ／ｇに達し得る。
【００７９】
５．５．成長因子生産酵母細胞要素
本発明の成長因子生産（ＧＰ−生産）酵母は、ビタミンＢ−１、リボフラビン（ビタミンＢ−２）、ビタミンＢ−１２、ナイアシン（Ｂ−３）、ピリドキシン（Ｂ−６）、パントテン酸（Ｂ−５）、葉酸、ビオチン、パラ−アミノ安息香酸、コリン、イノシトールなどが挙げられるがそれらに限定されるものではないビタミンおよびその他の栄養素を、その他の酵母株の成長を支持することができる量、生産する。そのような成長因子は発酵工程の間に酵母によって生産される。
【００８０】
本発明において、酵母の成長因子を過剰生産する能力が活性化または増強され、その結果得られるＧＰ−生産酵母細胞は本発明の生物学的肥料組成物の要素として利用可能である。
【００８１】
本発明によると、ＧＰ−生産可能な酵母細胞は、適当な培地中で電磁場の存在下で細胞を培養することによって調製される。酵母におけるＧＰ−生産を活性化または増強するための電磁場の振動数は、通常１３００ＭＨｚ−１５００ＭＨｚの範囲に見出される。十分な期間酵母細胞が培養された後、細胞はその成長因子を生産する能力について当該技術分野に周知の方法によって試験すればよい。
【００８２】
ＧＰ−生産酵母細胞を作る本発明の方法は、液体培地中で行われる。培地は酵母細胞によって同化できる栄養源を含む。一般的に、例えば、シュークロース、グルコース、フルクトース、デキストロース、マルトース、キシロースなどの糖およびデンプンなどの炭水化物を、単独でまたは組み合わせて培地中の同化可能な炭素源として利用可能である。培地中に利用される１または複数の炭水化物源の正確な量は部分的に培地のその他の成分に依存するが、一般的に炭水化物の量は普通、培地の重量で約０．１％から５％の範囲、好ましくは約０．５％から２％の範囲、そして最も好ましくは約０．８％である。これらの炭素源は個別に利用できるし、いくつかの炭素源を培地中で組み合わせてもよい。
【００８３】
培地に混合できる無機塩は、ナトリウム、カルシウム、リン酸、硫酸、炭酸などのイオンを生成し得る通常の塩である。栄養無機塩には、ＮＨ４ＮＯ３， Ｋ２ＨＰＯ４，ＣａＣＯ３， ＭｇＳＯ４， ＮａＣｌ， およびＣａＳＯ４が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００８４】
【表５】
表Ｖ：ＳＧＰ−生産酵母のための培地組成
2004510667.tif 000006
【００８５】
表Ｖに示される培地の組成はこれに限定する意図のものではないことに注意されたい。培養規模や培地要素の供給場所などを、経験的および経済的に考慮して、当業者によって培地を様々に改変することができる。
【００８６】
該工程は、選抜された１または複数の酵母株の１つの種菌１ｍｌを各１００ｍｌの培地に、細胞密度１０２−１０５細胞／ｍｌ、好ましくは３ｘ１０２−１０４細胞／ｍｌで播種することによって開始する。必要に応じて該工程をスケールアップまたはダウンすることができる。酵母培養物は、約１２−２４時間、好ましくは約２４時間、電磁場の存在下で培養する。電磁場は、当該技術分野で知られているあらゆる手段によって適用することができるが、１３８２−１３９２ＭＨｚの範囲、好ましくは約１３８７ＭＨｚ、より好ましくは１３８７．５１７−１３８７．５９５ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは１３８７．５５６ＭＨｚの振動数を有するのがよい。用いられる振幅は１０００−２０００ｍＶの範囲、好ましくは約１６２０ｍＶがよい。この培養の最初の期間の後、酵母細胞を、振幅を４０００−５０００ｍＶの範囲、好ましくは約４８３０ｍＶのより高いレベルに上げることを除いては実質的に同じ条件下でさらにおよそ２４時間インキュベートする。この培養工程の例示的な構成を図１に示す。本発明のこの工程は約２５−３０℃の範囲の温度で行うが、２８℃で該工程を行うのが好ましい。培養工程は好ましくは、溶存酸素濃度が０．０２５−０．８ｍｏｌ／ｍ３の間、好ましくは０．４ｍｏｌ／ｍ３の条件下で行うのがよい。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない、当業者に公知のあらゆる従来の手段によって制御することができる。
【００８７】
培養工程の最後に、ＧＰ−生産酵母細胞を当該技術分野で知られている様々な方法によって培養物から回収し、約０℃−４℃以下の温度で保存すればよい。ＧＰ−生産酵母細胞は乾燥させて粉状形態で保存してもよい。
【００８８】
培養された酵母細胞が成長因子を過剰生産する能力を試験するために当該技術分野で知られているいかなる方法を用いてもよい。１つの態様において、１ｍｌの調製された酵母培養物を、３０ｍｌの表Ｖによる培地中に播種する。培養物を、２０−２８℃の温度範囲で３２−４８時間インキュベートする。培養物中のビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６およびＢ１２の総量によって表される成長因子の量を次に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれるがそれに限定されるものではない当該技術分野で知られているあらゆる方法によって、測定することができる。培養物中の成長因子の量は酵母乾燥重量１ｇにつき少なくとも１０ｍｇ上昇する。例えば、活性化の後、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｈａｎｓｅｎ ＡＳ２．３８２の培養物におけるビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６およびＢ１２の量は、総計６１２０ｍｇ／ｇに達し得る。
【００８９】
５．６．ＡＴＰ生産酵母細胞要素
本発明のＡＴＰ生産酵母は、ＡＴＰを、生物学的肥料組成物中のその他の酵母株の成長を支持することができる量、過剰生産することができる。
【００９０】
本発明において、酵母のＡＴＰを過剰生産する能力が活性化または増強され、その結果得られるＡＴＰ−生産酵母細胞は本発明の生物学的肥料組成物の要素として利用可能である。
【００９１】
本発明によると、ＡＴＰ−生産能力が増強した酵母細胞は、適当な培地中で電磁場の存在下で細胞を培養することによって調製される。酵母におけるＡＴＰ−生産を活性化または増強するための電磁場の振動数は、通常１６００ＭＨｚ−１８００ＭＨｚの範囲に見出される。十分な期間細胞が培養された後、細胞はそのＡＴＰを生産する増強した能力について当該技術分野に周知の方法によって試験すればよい。
【００９２】
ＡＴＰ−生産酵母細胞を作る本発明の方法は、液体培地中で行われる。培地は酵母細胞によって同化できる栄養源を含む。一般的に、例えば、シュークロース、グルコース、フルクトース、デキストロース、マルトース、キシロースなどの糖およびデンプンなどの炭水化物を、単独でまたは組み合わせて培地中の同化可能な炭素源として利用可能である。培地中に利用される１または複数の炭水化物源の正確な量は部分的に培地のその他の成分に依存するが、一般的に炭水化物の量は普通、培地の重量で約０．１％から５％の範囲、好ましくは約０．５％から２％の範囲、そして最も好ましくは約０．８％である。これらの炭素源は個別に利用できるし、いくつかの炭素源を培地中で組み合わせてもよい。
【００９３】
培地に混合できる無機塩は、ナトリウム、カルシウム、リン酸、硫酸、炭酸などのイオンを生成し得る通常の塩である。栄養無機塩には、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４，ＣａＣＯ３， ＭｇＳＯ４， ＮａＣｌ， およびＣａＳＯ４が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００９４】
【表６】
表ＶＩ：ＡＴＰ生産酵母のための培地組成
2004510667.tif 000007
【００９５】
表ＶＩに示される培地の組成はこれに限定する意図のものではないことに注意されたい。培養規模や培地要素の供給場所などを、経験的および経済的に考慮して、当業者によって培地を様々に改変することができる。
【００９６】
該工程は、選抜された１または複数の酵母株の１つの種菌１ｍｌを各１００ｍｌの培地に、細胞密度１０２−１０５細胞／ｍｌ、好ましくは３ｘ１０２−１０４細胞／ｍｌで播種することによって開始する。必要に応じて該工程をスケールアップまたはダウンすることができる。酵母培養物は、約１２−２４時間、好ましくは約２４時間、電磁場の存在下で培養する。電磁場は、当該技術分野で知られているあらゆる手段によって適用することができるが、１６９０−１７００ＭＨｚの範囲、好ましくは約１６９４ＭＨｚ、より好ましくは１６９４．３２８−１６９４．４０８ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは１６９４．３６５ＭＨｚの振動数を有するのがよい。電磁場の振幅は１０００−２０００ｍＶの範囲、好ましくは約１４７０ｍＶがよい。この培養の最初の期間の後、酵母細胞を、振幅を４０００−５０００ｍＶの範囲、好ましくは約４７８０ｍＶのより高いレベルに上げることを除いては実質的に同じ条件下でさらにおよそ２４時間インキュベートする。この培養工程の例示的な構成を図１に示す。本発明のこの工程は約２５−３０℃の範囲の温度で行うが、２８℃で該工程を行うのが好ましい。培養工程は好ましくは、溶存酸素濃度が０．０２５−０．８ｍｏｌ／ｍ３の間、好ましくは０．４ｍｏｌ／ｍ３の条件下で行うのがよい。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない、当業者に公知のあらゆる従来の手段によって制御することができる。
【００９７】
培養工程の最後に、ＡＴＰ−生産酵母細胞を当該技術分野で知られている様々な方法によって培養物から回収し、約０℃−４℃以下の温度で保存すればよい。ＡＴＰ−生産酵母細胞は乾燥させて粉状形態で保存してもよい。
【００９８】
培養された酵母細胞がＡＴＰを過剰生産する能力を試験するために当該技術分野で知られているいかなる方法を用いてもよい。１つの態様において、１ｍｌの調製された酵母培養物を、３０ｍｌの表ＶＩによる培地中に播種する。培養物を、２０−２８℃の温度範囲で３６−５６時間インキュベートする。培養物中のＡＴＰの量を次に、ＨＰＬＣが含まれるがそれに限定されるものではない当該技術分野で知られているあらゆる方法によって、測定することができる。生産されたＡＴＰの量は酵母乾燥重量１ｇにつき少なくとも約１０ｍｇ上昇する。例えば、活性化の後、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｈａｎｓｅｎ株ＡＳ２．１６の培養物において生産されたＡＴＰの量は約３３２０ｍｇ／ｇに達し得る。
【００９９】
５．７．共生様関係の形成
本発明の別の態様において、節５．１−５．４に記載されているように窒素固定、リン含有ミネラルまたは化合物の分解、不溶性カリウム含有ミネラルまたは化合物の分解、および複合炭素材料の分解の能力が新たに活性化または増強された酵母株を、組み合わせて共生様関係を形成するように培養することにより、それらは生物学的に利用可能な窒素、リン、カリウム、および炭素栄養分の外界からの供給に実質的に頼ることなく、共に成長することができる。成長に必要な栄養分は肥料組成物中のそれぞれの栄養分生産酵母株が、様々な源からの生物学的に利用不可能な栄養分を、利用可能な栄養分へと変換することによって供給される。それぞれのタイプの栄養分を生産する各酵母株の活性は、部分的にはその他の酵母細胞および植物の要求に関係している。その結果、可溶性の、生物学的に利用可能な栄養分へは必要な場合に変換され、したがって、例えば溶脱による過剰の損失を避けることができる。
【０１００】
生物学的肥料の性能を改善するために利用可能な任意の工程を以下に記載する。節５．１−５．４にしたがって調製した４つの酵母株を、適当な液体培地中で電磁場の存在下で混合し、培養する。培地は生物学的に利用不可能な形態の、窒素、リン、カリウムおよび炭素栄養素を含む。例えば、これらに限定されるものではない例において、空中窒素が窒素栄養源として使用され、燐灰岩の粉がリン栄養源として使用され、カリウム雲母の粉がカリウム栄養源として使用され、粉状セルロースが複合炭素栄養源として使用される。その他の形態の不溶性のリン−およびカリウム−含有物質および複合炭素化合物を、上記のミネラルのいずれかの代わりにまたはそれと組み合わせて、リン、カリウムおよび炭素栄養源として使用してもよい。培地に混合できる無機塩は、ナトリウム、カルシウム、硫酸、炭酸などのイオンを生成し得る通常の塩である。栄養無機塩には、ＣａＣＯ３， ＭｇＳＯ４， ＮａＣｌ， およびＣａＳＯ４が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【０１０１】
【表７】
表ＶＩＩ：共生様関係の形成のための培地組成
2004510667.tif 000008
【０１０２】
表ＶＩＩに示される培地の組成はこれに限定する意図のものではないことに注意されたい。培養規模や培地要素の供給場所などを、経験的および経済的に考慮して、当業者によって培地を様々に改変することができる。
【０１０３】
培養工程は好ましくは、溶存酸素濃度が０．０２５−０．８ｍｏｌ／ｍ３の間、好ましくは０．４ｍｏｌ／ｍ３の条件下で行うのがよい。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない、当業者に公知のあらゆる従来の手段によって制御することができる。本発明のこの工程は約２５−３０℃の範囲の温度で行うが、２８℃で該工程を行うのが好ましい。該工程は４つの酵母細胞株の各種菌を通常約２０ｍｌ、それぞれ細胞密度約１０８細胞／ｍｌで滅菌培地に播種することによって開始する。必要に応じて該任意工程をスケールアップまたはダウンすることができる。
【０１０４】
酵母培養物は、１２−７２時間、好ましくは約４８時間、４つの別々の電磁場の存在下で培養する。電磁場は、様々な手段によって適用することができるが、それぞれ以下の振動数を有する：（１）窒素固定については、８６０−８７０ＭＨｚの範囲、好ましくは約８６５ＭＨｚ、より好ましくは８６５．５２２−８６５．６２２ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは８６５．５７２ＭＨｚ；（２）リン分解については、３６０−３７０ＭＨｚの範囲、好ましくは約３６６ＭＨｚ、より好ましくは３６６．１９９−３６６．２８７ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは３６６．２４３ＭＨｚ；（３）カリウム分解については、２５０−２６０ＭＨｚの範囲、好ましくは約２５５ＭＨｚ、より好ましくは２５５．３８８−２５５．４６２ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは２５５．４２５ＭＨｚ；そして（４）複合炭素分解については、１０８７−１０９７ＭＨｚの範囲、好ましくは約１０９２ＭＨｚ、より好ましくは１０９２．３４６−１０９２．４２８ＭＨｚの範囲、そして最も好ましくは１０９２．３８７ＭＨｚ。各電磁場の振幅は０−３０００ｍＶの間、好ましくは２０−１８００ｍＶの間で１ｍＶずつ完全な周期当たり１８−２３分の速度で繰り返し周期的に循環する。この培養工程の例示的な構成を図２に示す。
【０１０５】
５．８．土壌適応
本発明の酵母株は様々なタイプの土壌中で成長し、それぞれの機能を果たすことができなけらばならない。酵母株の生存および成長の能力は本発明の酵母株を特定の土壌条件に適応させることによって増強され得る。
【０１０６】
本発明の別の態様において、節５．１−５．６のいずれかによって調製された酵母細胞は、別々にまたは混合物中で、１または複数の土壌ソースからの土壌を含有する固体または半固体培地で培養することができる。生物学的肥料の性能を改良するために利用できるこの任意の工程は、以下の実施例によって記載する。
【０１０７】
１０６細胞／ｍｌの密度の１０ｍｌの酵母を含有する懸濁液を１０００ｃｍ３の土壌培地と混合する。必要に応じて該工程をスケールアップまたはダウンすることができる。酵母および土壌の混合物は、約４８−９６時間、好ましくは約４８時間、電磁場の存在下で培養する。電磁場は、様々な手段によって適用することができるが、酵母の株に応じて、節５．１−５．６に記載した振動数のいずれかに対応する振動数を有するのがよい。電磁場の振幅は１００−３０００ｍＶの範囲、好ましくは２１００ｍＶ、を利用するのがよい。培養物を約３℃から約４８℃の間で循環する温度でインキュベートする。例えば、典型的なサイクルにおいて、培養物の温度は、３５−４８℃で開始し、この温度に約１−２時間保ち、次に４２−４５℃に調節し、この温度で１−２時間保ち、そして２６−３０℃に調節し、この温度で約２−４時間保ち、そして次に５−１０℃に下げ、この温度で約１−２時間保ち、そして次のサイクルに向けて温度を再び３５−４５℃に上げるのがよい。このサイクルを該工程が完了するまで繰り返す。最後の温度サイクルが完了した後、培養物の温度を３−４℃に下げ、この温度で約５−６時間保つ。この適応の後、酵母細胞をろ過などの従来の方法によって培地から単離および回収すればよい。適応した酵母細胞は４℃以下で保存することができる。培養工程の例示的な構成を図３に示す。
【０１０８】
５．９．酵母細胞の分離または濃縮
節５．７にしたがって共生様関係を形成するように適応した酵母細胞を、それぞれの酵母細胞株がそれらが獲得した機能または増強された機能を保ちつつ、分離または濃縮することができる。酵母細胞の分離は、引用によりその内容全体が本出願に包含される、米国特許第５５７８４８６号および中国特許公報ＣＮ１１１０３１７Ａ号に記載された方法によって行うことができる。酵母細胞の活性化のために用いた振動数を分離工程の間に用いればよい。分離した酵母細胞は乾燥させて保存することができる。
【０１０９】
５．１０．生物学的肥料の製造
酵母細胞要素のほかに、様々な有機および無機原料を本発明の生物学的肥料組成物に含ませることができる。そのような材料の調製および生物学的肥料の製造に関する工程を以下に記載する。
【０１１０】
５．１０．１．有機および無機物質要素の調製
広範な有機および無機材料を、本発明の生物学的肥料組成物において使用することができる。炭鉱廃棄物および風化した石炭が挙げられるがそれらに限定されるものではない有機材料、あるいは有機物質を２０％以上含有するあらゆる材料が、植物および酵母の成長を支持するための炭素源として利用できる。そのような有機材料の組み合わせや混合物も利用できる。そのような材料に存在する有機化合物は、複合または高分子量の炭素鎖分子を簡単な炭素化合物へとくずして、それらが植物および肥料中のその他の酵母細胞によって利用できるようにすることができる酵母によって分解される。
【０１１１】
燐灰石やカリウム雲母が挙げられるがそれらに限定されるものではない無機材料が、それぞれリンおよびカリウムのソースに含まれる。その他のリン−またはカリウム−含有材料およびミネラルも利用できる。これらの無機化合物はＫ−分解およびＰ−分解酵母細胞によって分解されて、植物および肥料中の酵母細胞の成長によって利用され得る、生物学的に利用可能なカリウムおよび生物学的に利用可能なリンになる。あらゆる有機または無機材料を単独で、または本発明のその他の材料と組み合わせたり他の材料の代わりに使用できる。また、１または複数の有機または無機成分を、特定の適用によって望ましいと考えられる場合には、省いたり、あるいは他の成分と替えたりしてもよい。例えば、土壌が十分なカリウムミネラルを含んでいる場合には、カリウム雲母は省くことができる。
【０１１２】
本発明に用いられる有機および無機材料は酵母細胞または植物の成長を阻害し得る量の有毒物質または有毒微生物を含むべきではない。
【０１１３】
本発明の有機および無機要素は肥料に組み入れられる前に適当な形態および大きさになるよう砕かれる。典型的には、有機または無機材料は破砕機に運ばれて、破砕機中で直径が５ｃｍ以下の破片へと破砕される。従来からの破砕機または同等の機械をこの目的のために使用することができる。この破片は次に運搬手段によって粉砕機へと運ばれ、そして１５０以上のメッシュの粉へと粉砕される。細かく粉砕することができるあらゆる粉砕機がこの目的のために使用することができる。この粉は次に適切な貯蔵タンクへと運ばれて肥料のその他の要素と共に用いられるまで貯蔵される。粉砕工程の概略図を図４および図５に示す。
【０１１４】
５．１０．２．成長因子−生産酵母を用いた発酵工程
本発明において、節５．５に記載された活性化酵母株を種として用いて発酵工程においてＧＰ−生産酵母の調製を行う。発酵工程の概略を図６に示す。
【０１１５】
発酵培地は１キログラムのデンプンあたり、２．５ｌの水の比によって調製する。純水、好ましくはいかなる微生物も含まない水を用いて発酵培地を調製する。発酵は２０−３０℃の間の温度、好ましくは２５−２８℃の間の温度で、送電線や発電機などの強い電磁場源のない、清潔な環境および空間で行う。反応器、輸送管、および撹拌機を含む、発酵液に接触するあらゆる装置はそれぞれ使用前に完全に清潔にしておかなければならない。発酵工程は、発酵温度に応じて通常約６０−７２時間続く。発酵基材の少なくとも９０％が発酵する。発酵は好ましくは、酸素レベルが最大可溶性酸素濃度の約２０−６０％である、１または複数の半好気条件下で行う。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない当業者に公知のあらゆる従来からの手段によって制御することができる。発酵後の細胞数は約２ｘ１０１０細胞／ｍｌに至る。発酵液は、１５−２８℃の温度範囲に保ち、２４時間以内に使用しなければならない。そうでない場合は、ＧＰ−生産酵母は、脱水、乾燥して粉形態で保存することができる。
【０１１６】
５．１０．３．ＡＴＰ−生産酵母を用いた発酵工程
本発明において、節５．６に記載された適応酵母株を種として用いた発酵工程によってＡＴＰ−生産酵母の調製を行う。発酵工程の概略を図６に示す。
【０１１７】
発酵培地は１キログラムのデンプンあたり、２．５ｌの水の比によって調製する。純水、好ましくはいかなる微生物も含まない水、最も好ましくはオートクレーブ処理水を用いて発酵培地を調製する。発酵は２０−３０℃の間の温度、好ましくは２５−２８℃の間の温度で、送電線や発電機などの強い電磁場源のない、清潔な環境および空間で行う。反応器、輸送管、および撹拌機を含む、発酵液に接触するあらゆる装置はそれぞれ使用前に完全に清潔にしておかなければならない。発酵工程は、発酵温度に応じて通常約６０−７２時間続く。発酵基材の少なくとも９０％が発酵する。発酵は好ましくは、酸素レベルが最大可溶性酸素濃度の約２０−６０％である、１または複数の半好気条件下で行う。酸素レベルは攪拌および／または泡立てを含むがそれらに限定されるものではない当業者に公知のあらゆる従来からの手段によって制御することができる。発酵後の細胞数は約２ｘ１０１０細胞／ｍｌに至る。発酵液は、１５−２８℃の温度範囲に保ち、２４時間以内に使用しなければならない。そうでない場合は、ＡＴＰ−生産酵母は、脱水、乾燥して粉形態で保存することができる。
【０１１８】
５．１０．４．原料混合物の調製
有機および無機原料を、表ＶＩＩＩに示す例示的な割合で混合する。節５．１０．１にしたがって調製された適当な量の有機および無機材料およびデンプンを混合機へと運ぶ。回転ドラム混合機などが挙げられるがそれに限定されるものではない、あらゆる従来からの混合機を使用できる。混合タンクは絶え間なく回転して無機材料、有機材料、およびデンプンの粉を均一に混合する。混合物を次に貯蔵タンクへと運ぶ。有機および無機基材材料の混合手順を図７に示す。
【０１１９】
【表８】
表ＶＩＩＩ：原料の比
2004510667.tif 000009
【０１２０】
５．１０．５．酵母混合物の調製
酵母混合物を、表ＩＸに示す例示的な割合で調製する。節５．１−５．６にしたがって調製された適当な量の乾燥粉形態の６つの酵母株を混合タンクへと運ぶ。約１０−２０分間酵母を混合する。混合物を貯蔵タンクへと運ぶ。混合タンクおよび貯蔵タンクを含む酵母の混合に用いられるあらゆる装置はそれぞれ使用前に完全に清潔にしておかなければならず、好ましくは滅菌しておく。酵母混合物は２０℃以下の温度で保存し、２４時間以内に使用しなければならない。酵母の混合手順を図８に示す。２４時間以内に使用しない場合は、６種の酵母の混合物を粉形態で乾燥および保存することができる。
【０１２１】
【表９】
表ＩＸ：微生物の比
2004510667.tif 000010
【０１２２】
５．１０．６．生物学的肥料の製造
本発明の生物学的肥料は、節５．１０．５の酵母混合物と、節５．１０．１の有機および無機材料の混合物とを、表Ｘによる比で混合することによって生産する。例えば、酵母と有機および無機材料を顆粒作成機に運んで顆粒を形成する。肥料の顆粒を次に２段階乾燥工程において乾燥する。第一乾燥段階では、肥料を６５℃以下の温度で１０分以下の時間第一乾燥機中で乾燥させると、酵母細胞はすぐに休眠状態になる。次に肥料を第二乾燥機へ運んで７０℃以下の温度で３０分以下の時間乾燥させてさらに水分を除去する。この２段階の後、水分含量は５％以下となっている。両方の乾燥段階において、酵母細胞がその活力および機能を失わないように、温度と乾燥時間を厳守するのが好ましい。肥料を次に室温まで冷却する。肥料をまた、分離機でふるいにかけるのがよく、そうすると好適な大きさの肥料の顆粒が選択される。速度とふるい大きさを調節可能なターボ分離機が挙げられるがそれに限定されるものではない、あらゆる分離機を使用することができる。選択された大きさの肥料を次に大用量袋充填機へと送って梱包する。
【０１２３】
生産工程を図９−１１に示す。図９は、肥料をその要素から生産する手順の概略図である。図１０は、乾燥工程の概略図である。図１１は冷却および梱包工程の概略図である。
【０１２４】
【表１０】
表Ｘ：生物学的肥料の組成（肥料１メートルトン用）
2004510667.tif 000011
【０１２５】
６．実施例
以下の実施例は、本発明の生物学的肥料組成物の製造を例示するものである。この実施例は、本発明の好適な態様である。
【０１２６】
それぞれがＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ （ＣＧＭＣＣ）， Ｃｈｉｎａ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されており、受託番号ＡＳ２．５０１， ＡＳ２．５３５， ＡＳ２．４４１， ＡＳ２．４０６， ＡＳ２．３８２， およびＡＳ２．１６であるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｈａｎｓｅｎ株を用いて生物学的肥料の酵母細胞要素を調製した。酵母株 ＡＳ２．５０１を窒素固定用に、節５．１に記載されている方法にしたがって培養した。酵母株 ＡＳ２．５３５をＰ−分解用に、節５．２に記載されている方法にしたがって培養した。酵母株 ＡＳ２．４４１をＫ−分解用に節５．３に記載されている方法にしたがって培養した。酵母株 ＡＳ２．４０６をＣ−分解用に節５．４に記載されている方法にしたがって培養した。酵母株ＡＳ２．３８２を成長因子生産用に節５．５に記載されている方法にしたがって培養した。酵母株 ＡＳ２．１６ をＡＴＰ生産用に節５．６に記載されている方法にしたがって培養した。
【０１２７】
炭鉱廃棄物と燐灰石をそれぞれ有機および無機材料として用いた。この実施例において用いた炭鉱廃棄物は、少なくとも３０％の有機物質を含有していた。この実施例において用いた燐灰石は、少なくとも２５％のＰ２Ｏ５を含有していた。炭鉱廃棄物と燐灰石とを節５．１０．１にしたがって調製した。
【０１２８】
成長因子生産酵母は、節５．５に記載されているように、活性化酵母株ＡＳ２．３８２を種菌として用いて発酵工程にて生産した。発酵工程の概略を図６に示す。発酵培地はデンプン１ｋｇ当たり純水２．５ｌの比によって調製した。発酵培地は培地１ｌ当たり種菌溶液１０ｍｌの比によって播種した。発酵は電磁場源のない、清潔な環境中で温度２８±１℃、酸素濃度０．４ｍｏｌ／ｍ３で、約４８時間行った。発酵後の細胞数は約２ｘ１０１０細胞／ｍｌに達した。
【０１２９】
ＡＴＰ生産酵母は、節５．６に記載されているように、活性化酵母株ＡＳ２．１６を種菌として用いて発酵工程にて生産した。発酵工程の概略を図６に示す。発酵培地はデンプン１ｋｇ当たり純水２．５ｌの比によって調製した。発酵培地は培地１ｌ当たり種菌溶液１０ｍｌの比によって播種した。発酵は電磁場源のない、清潔な環境中で温度２８±１℃、酸素濃度０．４ｍｏｌ／ｍ３で、約５６時間行った。発酵後の細胞数は約２ｘ１０１０細胞／ｍｌに達した。
【０１３０】
原料混合物は表ＸＩおよび節５．１０．４の手順にしたがって調製した。
【０１３１】
【表１１】
表ＸＩ：原料の比
2004510667.tif 000012
【０１３２】
酵母混合物は表ＸＩＩおよび節５．１０．５に記載の手順にしたがって調製した。
【０１３３】
【表１２】
表ＸＩＩ：酵母の比（肥料１メートルトン用）
2004510667.tif 000013
【０１３４】
生物学的肥料を、酵母混合物と、有機および無機材料を、表ＸＩＩＩによる比で混合することによって生産した。混合した酵母と有機および無機材料を顆粒作成機に運んで顆粒を形成した。肥料の顆粒を次に２段階乾燥工程において乾燥させた。第一乾燥段階では、酵母細胞がすぐに休眠状態になるように、肥料を６０±２℃以下の温度で５分間第一乾燥機中で乾燥させた。次に肥料を第二乾燥機へ運んで６５±２℃以下の温度で８分間乾燥させてさらに水分を除去した。肥料を次に室温まで冷却した。肥料を次に大用量袋充填機へと送って梱包した。
【０１３５】
【表１３】
表ＸＩＩＩ：肥料組成物 （肥料１メートルトン用）
2004510667.tif 000014
【０１３６】
本発明は、本発明の個々の態様の１つの例示と意図して記載した特定の態様によってその範囲が限定されるものではなく、機能的に均等な方法および要素が本発明の枠内に含まれる。実際、本明細書に図示および記載したものに加えて本発明の様々な改変が、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような改変は特許請求の範囲に記載の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵母細胞の活性化を示す。
【図２】酵母株間の共生様関係の形成を示す。
【図３】土壌タイプへの酵母細胞の適応を示す。
【図４】有機材料案内工程を示す。
【図５】無機材料案内工程を示す。
【図６】酵母発酵工程を示す。
【図７】有機および無機原料の混合を示す。
【図８】酵母細胞の混合を示す。
【図９】肥料生産工程を示す。
【図１０】乾燥工程を示す。
【図１１】冷却および梱包工程を示す。
【符号の説明】
１．酵母培養物
２．容器
３．電磁場源
４．窒素固定酵母のための電磁場源
５．Ｐ−分解酵母のための電磁場源
６．Ｋ−分解酵母のための電磁場源
７．Ｃ−分解酵母のための電磁場源
８．酵母培養物
９．容器
１０．電極
１１．容器
１２．電極
１３．酵母培養物
１４．電磁場源
１５．温度制御装置
１６．有機原料
１７．破砕機
１８．粉砕機
１９．粉末形態の有機材料
２０．無機原料
２１．破砕機
２２．粉砕機
２３．粉末形態の無機材料
２４．活性化酵母細胞
２５．酵母細胞培養用タンク、デンプン：水（３５℃）＝１：２．５、２８−３０℃での４８−７２時間の半好気性発酵
２６．収集培養物
２７．無機材料
２８．デンプン
２９．有機材料
３０．混合機
３１．混合物
３２．肥料生産段階へと運ばれる混合物
３３．窒素固定、Ｐ−分解、Ｋ−分解、およびＣ−分解酵母の入口
３４．混合タンク
３５．ＡＴＰ−生産酵母
３６．ＧＰ−生産酵母
３７．酵母混合物
３８．肥料生産段階へと運ばれる混合物
３９．酵母混合物
４０．有機および無機材料の混合物
４１．顆粒作成機
４２．肥料顆粒
４３．肥料顆粒
４４．第一乾燥機
４５．第二乾燥機
４６．乾燥肥料
４７．乾燥肥料
４８．冷却機
４９．分離機
５０．大用量袋充填機
５１．最終産物
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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