(57)【要約】本発明は気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現及び／又は病原性細菌の産物の毒素により誘発される杯細胞の過形成により生じる疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製のためのＬＴＢ４アンタゴニスト又はその医薬上許される塩の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現により生じる疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製のための式（Ｉ）
【化１】
2004523512.tif 000004
のＬＴＢ４アンタゴニスト、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩の使用。
【請求項２】
病原性細菌の産物により誘発される杯細胞過形成の予防のための薬物の調製のための請求項１記載の式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩の使用。
【請求項３】
ムチン遺伝子の増大された発現又は杯細胞過形成がシュードモナス・アエルギノーサ及び／又はそれに由来する産物によりもたらされる請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
シュードモナス・アエルギノーサ毒素への暴露後の気管上皮中の杯細胞の数の増加を抑制するための薬物の調製のための請求項１〜３のいずれか記載の式（Ｉ）のＬＴＢ４アンタゴニストの使用。
【請求項５】
疾患が膵のう胞性繊維炎（ＣＦ）である請求項１〜４のいずれか記載の使用。
【請求項６】
前記薬物が経口投与される請求項１〜５のいずれか記載の使用。
【請求項７】
前記薬物が式Ｉの化合物又はその医薬上許される塩５ｍｇ〜２００ｍｇを含む請求項１〜６のいずれか記載の使用。
【請求項８】
気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現により生じた疾患を患っている患者の治療方法であって、治療を要する患者に有効量の式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩を投与することを特徴とする治療方法。
【請求項９】
病原性細菌の産物により誘発される杯細胞の過形成により生じた疾患を患っている患者の治療方法であって、治療を要する患者に有効量の式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩を投与することを特徴とする治療方法。
【請求項１０】
治療を要する患者に
（Ａ）  有効量の式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩、及び
（Ｂ）  抗生物質、ＬＴＡ４ヒドロラーゼインヒビター、５−リポキシゲナーゼインヒビター及び粘液クレアランスを増進する薬剤からなる群から選ばれた一種以上の付加的な有効成分
を投与することを含む請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
前記付加的な有効成分（Ｂ）がアミノグルコシド抗生物質、デフェンシンの構造に由来又は関連する抗菌ペプチド、好中球エラスターゼの生成又は作用を抑制する薬剤からなる群から選ばれる請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記付加的な有効成分（Ｂ）がアトレロイトン、ジロイトン、ＦＫ−７０６、ＣＥ １０３７、ＥＰＩ−ＨＮＥ−４、α１−抗トリプシン、アンブロキソール、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ネチミシン、コリスチン、イセガナン及びトブラマイシンからなる群から選ばれる請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現により生じた疾患の治療における同時、連続又は別々の投与のための、
（Ａ）式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩、
（Ｂ）抗生物質、ＬＴＡ４ヒドロラーゼインヒビター、５−リポキシゲナーゼインヒビター及び粘液クレアランスを増進する薬剤からなる群から選ばれた一種以上の付加的な有効成分、及び
（Ｃ）必要により医薬上許される担体
を別々に又は一緒に含むことを特徴とする薬物。
【請求項１４】
有効成分（Ｂ）が吸入可能な形態である請求項１３記載の薬物。
【請求項１５】
（Ａ）対（Ｂ）の重量比が１００：１から１：２００までである請求項１３又は１４記載の薬物。
【請求項１６】
少なくとも２種の別々の単位投薬形態（Ａ）及び（Ｂ）を含む医薬キットであって、
（Ａ）その一種が式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩、及び必要により医薬上許される担体を含む組成物を含み、
（Ｂ）その一種が抗生物質、ＬＴＡ４ヒドロラーゼインヒビター、５−リポキシゲナーゼインヒビター及び粘液クレアランスを増進する薬剤からなる群から選ばれた一種以上の付加的な有効成分、及び必要により医薬上許される担体を含む組成物を含むことを特徴とする医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現により生じる疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製のためのＬＴＢ４アンタゴニスト又はその医薬上許される塩の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
膵のう胞性繊維炎（ＣＦ）は主として膵のう胞性繊維炎膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）中の欠陥による遺伝疾患である。これは上皮膜を横切る異常な塩化物転移をもたらす。症候が幾つかの器官系中に現れるが、殆どの患者について、ＣＦＴＲ欠陥と関連する最も重大な病変は肺中の病変である。膵のう胞性繊維炎を患う患者は容易に感染されるようになる過剰の量の粘稠な粘液を生じる。再発感染症は患者の症状の悪化及び死亡の増大された高リスクと関連している。ＣＦＴＲ欠陥が増大された粘液生産を生じる方法は正確には知られていない。一つの仮説はＣＦＴＲ突然変異が、特にシュードモナス・アエルギノーサによる、慢性細菌感染を生じる気管上皮中の変化を生じることである。これらの細菌はムチン遺伝子、例えば、ＭＵＣ−２及びＭＵＣ−５の発現を刺激する。基礎にある塩化物チャンネル欠陥と関係する粘液脱水と組み合わされた、粘液の過剰生産は、粘液栓の形成そして最終的に肺不全をもたらす（Ｌｉ ＪＤ， Ｄｏｈｒｍａｎ ＡＦ， Ｇａｌｌｕｐ Ｍら，“膵のう胞性繊維炎肺疾患の病原におけるシュードモナス・アエルギノーサリポ多糖によるムチンの転写活性化”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９７， ９４：９６７−９７２； Ｄｏｈｒｍａｎ Ａ， Ｍｉｙａｔａ Ｓ， Ｇａｌｌｕｐ Ｍら，“グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌によるムチン遺伝子（ＭＵＣ２及びＭＵＣ ５ＡＣ）アップレギュレーション”， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９９８； １４０６：２５１−２５９）。
【０００３】
膵のう胞性繊維炎は肺の上皮内張液中のロイコトリエンＢ４の著しく上昇したレベルと関連し（Ｋｏｎｓｔａｎ ＭＷ， Ｗａｌｅｎｇａ ＲＷ， Ｈｉｌｌｉａｒｄ ＫＡ， Ｈｉｌｌｉａｒｄ ＪＢ，“ロイコトリエンＢ４が膵のう胞性繊維炎の患者の上皮内張液中で著しく上昇した”， Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １９９３； １４８：８９６−９０１）、この上昇がまた痰中に検出し得る（Ｚａｋｒｚｅｗｓｋｉ ＪＴ， Ｂａｒｎｅｓ ＮＣ， Ｐｉｐｅｒ ＰＪ， Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ＪＦ，“バイオアッセイ及びラジオイムノアッセイによる膵のう胞性繊維炎及び正常な唾液中の痰エイコサノイドの検出”， Ｂｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９８７； ２３：１９−２７）。このＬＴＢ４の源は明らかではない。何とならば、ＣＦ肺だけでなく上皮細胞中で極めて多量である好中球の如き両方の炎症細胞がこのロイコトリエンを合成するのに必要な酵素機構を有するからである。
【０００４】
同様に、シュードモナス・アエルギノーサが気管支上皮中でムチン遺伝子の増大された発現を刺激する正確なメカニズムがまた明らかではない。確かに、臨床上及び実験上の両方で、シュードモナス・アエルギノーサによる感染が肺への好中球浸潤と関連し、活性化された好中球の産物、例えば、エラスターゼ、ＴＧＦβ及びＴＮＦαが遺伝子の転写を刺激することにより、又はＲＮＡ分解を阻害することにより気管上皮中のムチン特異性ＲＮＡの量を増加することができることが知られている（Ｔａｋｅｙａｍａ Ｋ， Ａｇｕｓｔｉ Ｃ， Ｕｅｋｉ Ｉ， Ｌａｕｓｉｅｒ Ｊ， Ｃａｒｄｅｌｌ ＬＯ， Ｎａｄｅｌ ＪＡ，“好中球依存性杯細胞脱顆粒：膜結合エラスターゼ及び付着分子の役割”， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９９８； ２７５：Ｌ２９４−Ｌ３０２；Ｔａｋｅｙａｍａ Ｋ， Ｄａｂｂａｇｈ Ｋ， Ｌｅｅ ＨＭら，“上皮成長因子系が気道中のムチン生成を調節する”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９９； ９６：３０８１−３０８６）。しかしながら、細菌リポ多糖（Ｌｉ ＪＤ， Ｄｏｈｒｍａｎ ＡＦ， Ｇａｌｌｕｐ Ｍらの１９９７年の上記引用文献）、細菌プロテアーゼ（Ｋｌｉｎｇｅｒ ＪＤ， Ｔａｎｄｌｅｒ Ｂ， Ｌｉｅｄｔｋｅ ＣＭ， Ｂｏａｔ ＴＦ，“シュードモナス・アエルギノーサのプロテイナーゼが気管上皮によるムチン放出を誘発する”， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １９８４； ７４：１６６９−１６７８）、又は細菌アドヘジン（Ｉｃｈｉｋａｗａ ＪＫ， Ｎｏｒｒｉｓ Ａ， Ｂａｎｇｅｒａ ＭＧら，“上皮細胞とのシュードモナス・エルギノーサの相互作用：ヒトｃＤＮＡの発現ミクロアレイ分析による差別調節された遺伝子の同定”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２０００； ９７：９６５９−９６６４）による、肺上皮細胞に関するシュードモナス・アエルギノーサの直接の効果がまたある。肺上皮に関するシュードモナス・アエルギノーサの好中球媒介効果及び直接の効果の両方におけるＬＴＢ４の役割は知られていない。
【０００５】
（発明の開示）
本発明は気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現により生じる疾患、特にシュードモナス・アエルギノーサにより生じる疾患、例えば、膵のう胞性繊維炎の治療及び／又は予防のための薬物の調製のための式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
2004523512.tif 000002
【０００７】
のＬＴＢ４アンタゴニスト、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩の使用に関する。
本発明の別の局面は気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現により生じた疾患を患っている患者の治療方法であって、その方法が治療を要する患者に有効量の式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩を投与することを特徴とする治療方法である。
【０００８】
更に、本発明は気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現により生じた疾患の治療における同時、連続又は別々の投与のための、
（Ａ）式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩、
（Ｂ）抗生物質、ＬＴＡ４ヒドロラーゼインヒビター、５−リポキシゲナーゼインヒビター及び粘液クレアランスを増進する薬剤からなる群から選ばれた一種以上の付加的な有効成分、及び
（Ｃ）必要により医薬上許される担体
を別々に又は一緒に含むことを特徴とする薬物を提供する。
更に、本発明は少なくとも２種の別々の単位投薬形態（Ａ）及び（Ｂ）を含む医薬キットであって、
（Ａ）その一種が式（Ｉ）の化合物、その互変異性体又はこれらの医薬上許される塩及び必要により医薬上許される担体を含む組成物を含み、
（Ｂ）その一種が抗生物質、ＬＴＡ４ヒドロラーゼインヒビター、５−リポキシゲナーゼインヒビター及び粘液クレアランスを増進する薬剤からなる群から選ばれた一種以上の付加的な有効成分及び必要により医薬上許される担体を含む組成物を含むことを特徴とする医薬キットに関する。
【０００９】
（発明を実施するための最良の形態）
式（Ｉ）の化合物の医薬上許される塩として、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸の如き無機酸、及びフマル酸、マレイン酸、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、グルタル酸、グルコン酸、トリカルボアリル酸、オレイン酸、安息香酸、ｐ−メトキシ安息香酸、サリチル酸、ｏ−又はｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸及び３−ヒドロキシ−２−ナフタレンカルボン酸の如き有機酸の塩が挙げられる。式（Ｉ）の化合物そのもの、即ち、遊離塩基の形態の化合物が最も好ましい。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様において、式Ｉの化合物が病原性細菌の産物、特にシュードモナス・アエルギノーサ由来の産物により誘発される杯細胞過形成の予防のための薬物の調製に使用される。
膵のう胞性繊維炎の患者におけるシュードモナス・アエルギノーサ誘発粘液生成を抑制するのに有益であることに加えて、式（Ｉ）の化合物はまた、単独で、又は抗生物質の如きその他の治療薬と組み合わせて、ＣＦＴＲ遺伝子の欠陥のない患者のシュードモナス・アエルギノーサ感染と関連する粘液過剰分泌の治療に有益であろう。
更に、式（Ｉ）の化合物はシュードモナス・アエルギノーサによる感染と関連するようなムコイド全腸炎だけでなく、シゲラの如きその他の病原体と関連するムコイド全腸炎の治療に有益であろう。抗菌療法と組み合わせての式（Ｉ）の化合物の適用が特に有益であろう。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物は単独で又はその他の治療薬（Ｂ）と組み合わせて膵のう胞性繊維炎の治療に使用し得る。今、驚くことに、気管支又は胃腸の上皮中のムチン遺伝子の増大された発現により生じた疾患の治療における有意な予期しない治療上の利益、特に相乗の治療上の利益が、式（Ｉ）の化合物及び有効成分（Ｂ）を使用する組み合わせ療法により得られることがわかった。
例えば、この組み合わせ療法を使用して（Ｂ）単独による治療を使用して必要とされる用量と較べて所定の治療効果に必要とされる用量をかなり減少することが可能であり、それによりおそらく望ましくない副作用を最小にする。
更に、この組み合わせ療法は作用の迅速な開始及び作用の長い期間の両方を示し、その結果、患者はかれらの症状の迅速な改善及び短期作用救済薬物に対する低減された要求を感じる。
【００１２】
細菌気道重複感染についての抗生物質又は抗菌治療薬（Ｂ１）との式（Ｉ）の化合物の組み合わせが特に有益であるかもしれない。これらの治療薬として、Ｇ． Ｄｏｒｉｎｇら（２０００）“膵のう胞性繊維炎におけるシュードモナス・アエルギノーサに対する抗生物質療法：ヨーロッパのコンセンサス”Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． １６：７４９−７６７の公表されたコンセンサス記述の表１中に適切な用量とともにリストされた抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。
また、抗生物質アジスロマイシン及び抗生物質デュラマイシンが式（Ｉ）の化合物との組み合わせに適している。
式（Ｉ）の化合物はまたデフェンシンの構造に由来又は関連する抗菌性ペプチドと組み合わされてもよい。分泌された粘液は吸入された抗生物質又は抗菌性ペプチドが有効な抗菌作用に充分な濃度で気道中の標的細菌に達することを妨げ得るバリヤーに相当するので、式（Ｉ）の化合物によるムチン生成の防止はデフェンシン、又は抗生物質、例えば、コリスチン、イセガナンもしくはトブラマイシン（これらは吸入経路により投与されることが好ましい）の有効性を高める手段として特に有益である。
【００１３】
シュードモナス・アエルギノーサ誘発粘液生成を阻止する式（Ｉ）の化合物の能力に鑑みて、更なる特に有益な組み合わせは粘液クレアランスを増進する薬剤（Ｂ２）、例えば、アンブロキソールとの式（Ｉ）の化合物の組み合わせであろう。粘液クレアランスを増進する薬物の詳細なリストがＨｏｕｔｍｅｙｅｒｓ Ｅら（１９９９）“粘液クレアランスに関する薬物の効果”， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． １４：４５２−４６７により示されている。
別の特に有益な組み合わせはＬＴＢ４抑制とは別のメカニズムにより粘液生成を低減する薬物（Ｂ３）との式（Ｉ）の化合物の組み合わせである。このような薬物として、好中球エラスターゼの生成又は作用を抑制する薬物、例えば、ＦＫ−７０６、ＣＥ１０３７、ＥＰＩ−ＨＮＥ−４及びα１−抗トリプシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
生成されるＬＴＢ４の量を減少する薬物は治療効果を生じるのに必要とされるＬＴＢ４アンタゴニストの量を減少するであろう。このような薬物として、ＬＴＡ４ヒドロラーゼインヒビター、例えば、米国特許第５，７２３，４９２号に記載されたインヒビター並びに５−リポキシゲナーゼインヒビター、例えば、アトレロイトン及びジロイトンが挙げられるが、これらに限定されない。式（Ｉ）の化合物と米国特許第５，７２３，４９２号からの化合物の組み合わせ、又は式（Ｉ）の化合物と５−リポキシゲナーゼインヒビターの組み合わせが膵のう胞性繊維炎の治療に特に有益である。
式（Ｉ）の化合物又はその塩（Ａ）対（Ｂ）の重量比は、一般に、１００：１〜１：２００、例えば、７５：１〜１：１９０、７５：１〜１：１５０、６０：１〜１：１２０、５０：１〜１：１００、５０：１〜１：５０、３０：１〜１：４０、２０：１〜１：２０、１０：１〜１：１５、８：１〜１：１０、４：１〜１：１０、１：１〜１：５であってもよい。２種の薬物（Ａ）及び（Ｂ）は同じ比で別々に投与されてもよい。
【００１５】
式（Ｉ）の化合物は経口投与、経皮投与、吸入による投与又は非経口投与されてもよい。式（Ｉ）の化合物は通常の製剤、例えば、実質的に不活性医薬担体及び有効用量の活性物質からなる組成物、例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、座薬、経皮系等中で有効成分として存在する。本発明の化合物の有効用量は静脈内投与又は筋肉内投与について０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ、最も好ましくは５−３０ｍｇ／用量である。吸入について、本発明によれば、０．０１〜１．０％、好ましくは０．１〜０．５％の活性物質を含む溶液が好適である。吸入による投与について、粉末の使用が好ましい。また、本発明の化合物を、好ましくは生理食塩水又は栄養食塩液中の、注入用の溶液として使用することが可能である。
少なくとも５日間にわたって１日１回又は２回の式（Ｉ）の化合物の投与が好ましい。
【００１６】
式（Ｉ）の化合物はそれら自体で、又は本発明のその他の活性物質と一緒に、また必要によりその他の薬理学上活性な物質と一緒に使用し得る。好適な製剤として、例えば、錠剤、カプセル、座薬、溶液、エリキシル剤、エマルション又は分散性粉末が挙げられる。
好適な錠剤は、例えば、一種以上の活性物質を既知の賦形剤、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はラクトース、崩壊剤、例えば、トウモロコシ澱粉又はアルギン酸、バインダー、例えば、澱粉又はゼラチン、湿潤剤、滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルク及び／又は放出を遅延するための薬剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルピロリドンもしくはポリ酢酸ビニルと混合することにより得られてもよい。錠剤はまた幾つかの層を含んでもよい。
被覆錠剤は錠剤と同様にして得られたコアーを錠剤被覆に通常使用される物質、例えば、コリドン又はセラック、アラビアゴム、タルク、二酸化チタン又は糖で被覆することにより調製し得る。除放を得、又は不適合性を防止するために、コアーはまた幾つかの層からなってもよい。同様に、錠剤被覆物は、おそらく錠剤について記載された賦形剤を使用して、除放を得るために幾つかの層からなってもよい。
【００１７】
本発明の活性物質又はこれらの組み合わせを含むシロップ又はエリキシル剤は更に甘味料、例えば、サッカリン、シクラメート、グリセロール又は糖及び風味増進剤、例えば、矯味矯臭剤、例えば、バニリン又はオレンジエキスを含んでもよい。それらはまた懸濁アジュバント又は増粘剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、湿潤剤、例えば、脂肪アルコールとエチレンオキサイドの縮合生成物、又は防腐剤、例えば、ｐ−ヒドロキシベンゾエートを含んでもよい。
注射用の溶液は通常の方法、例えば、防腐剤、例えば、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、又は安定剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸のアルカリ金属塩の添加により調製され、注射バイアル又はアンプルに移される。
【００１８】
一種以上の活性物質又は活性物質の組み合わせを含むカプセルは、例えば、活性物質を不活性担体、例えば、ラクトース又はソルビトールと混合し、それらをゼラチンカプセルに詰めることにより調製し得る。
好適な座薬は、例えば、この目的に用意した担体、例えば、中性脂肪もしくはポリエチレングリコール又はこれらの誘導体と混合することによりつくられてもよい。
治療上有効な毎日の用量は成人当り０．１−８００ｍｇ、好ましくは１０−５００ｍｇ、特に１００−３００ｍｇである。
今、驚くことに、式（Ｉ）の強力な、長く作用するＬＴＢ４アンタゴニストはムチン遺伝子のシュードモナス・アエルギノーサ誘発転写に影響することができることがわかった。ここで測定された特別なムチン遺伝子はｍｕｃ−５ＡＣ ＲＮＡである。これは炎症刺激によりラット上皮中で誘発される主要なムチンである。ヒトでは、気管支外殖体だけでなく単離された気管支上皮細胞を用いる研究はこの遺伝子のヒト類似体、ＭＵＣ−５ＡＣの転写がシュードモナス・アエルギノーサによりアップレギュレートされることを示していた（Ｄｏｈｒｍａｎ Ａ， Ｍｉｙａｔａ Ｓ， Ｇａｌｌｕｐ Ｍらの１９９８年の上記文献）。
【００１９】
式（Ｉ）のＬＴＢ４アンタゴニストはまた驚くことにシュードモナス・アエルギノーサ毒素への暴露後に気管上皮中の杯細胞の数の増加を抑制することができることがわかった。杯細胞はムチンの重要な源である。杯細胞過形成は膵のう胞性繊維炎の特徴であり（Ｂｅｄｒｏｓｓｉａｎ ＣＷ， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＳＤ， Ｓｉｎｇｅｒ ＤＢ， Ｈａｎｓｅｎ ＪＪ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＨＳ，“膵のう胞性繊維炎の肺：異なる年齢グループからの病因知見の流行を含む定量的研究”Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ １９７６； ７：１９５−２０４）、またシュードモナス・アエルギノーサへの暴露によりサルで実験上誘発し得る（Ｃｈｅｕｎｇ ＡＴ， Ｍｏｓｓ ＲＢ， Ｋｕｒｌａｎｄ Ｇ， Ｌｅｏｎｇ ＡＢ， Ｎｏｖｉｃｋ ＷＪ Ｊｒ．，“アカゲザルの慢性シュードモナス・アエルギノーサ気管支上皮炎：ＩＩ．組織病理学分析”Ｊ． Ｍｅｄ． Ｐｒｉｍａｔｏｌ． １９９３； ２２：２５７−２６２）。
【００２０】
（実施例）
ムチンＲＮＡ生成に関するＬＴＢ４アンタゴニスト（１）の効果の生化学研究
２種の異なるラット系、ＢＤＥ及びＦ３４４／ＮＨｓｄを試験した。何とならば、従来の研究はリポ多糖に対する反応性の系関連相違を示していたからである。
物質及び方法
頭字語及び略号
ＣＦ       膵のう胞性繊維炎
ＦＡＭ     ６−カルボキシフルオレセイン
ＬＰＳ     リポ多糖
ＬＴＢ４    ロイコトリエンＢ４、（５Ｓ，１２Ｒ）−ジヒドロキシ−６，１４−シス−８，１０−トランス−エイコサテトラエン酸
ＰＣＲ     ポリメラーゼ連鎖反応
ＴＡＭＲＡ  ６−カルボキシテトラメチルローダミン
【００２１】
使用した動物  成体雄ラット、系ＢＤＥ／Ｈａｎ、平均体重約３３０ｇ（範囲３４０−４５０ｇ）、及び成体雄Ｆ３４４／ＮＨｓｄラット、平均体重約２５０ｇ（範囲２４０−２６０ｇ）
動物管理  ラットを空調室中で、２１−２５℃で、相対湿度５０％〜６５％、昼夜サイクル１２時間で収容した。それらに実験の開始前に給餌し、随時水道水を受けさせた。薬物投与の１８時間前に、食物を断ったが、飲料水を利用できるままにした。
式（Ｉ）の化合物、即ち、カルバミン酸、〔〔４−〔〔３−〔〔４−〔１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メチル−エチル〕フェノキシ〕メチル〕フェニル〕メトキシ〕−フェニル〕イミノメチル〕エチルエステルを国際特許出願ＷＯ９６／０２４９７に記載されたようにして合成し、ジェットミルにかけた。動物への投与のために、式（Ｉ）の化合物を最初にラブラソール（登録商標）に溶解し、次いで７％エマルションを蒸留水中でこのラブラソール（登録商標）溶液から調製した（均一化した）。ラブラソール（登録商標）はポリエチレングリコールのモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド並びにモノ脂肪酸エステル及びジ脂肪酸エステルの特定混合物を含む。出所：Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ， ６９８０４ Ｓａｉｎｔ−Ｐｒｉｅｓｔ， Ｆｒａｎｃｅ。
ゲル濾過により精製された、シュードモナス・アエルギノーサ血清型１０からのリポ多糖、ロット５０Ｋ４１５１。シグマから購入、カタログ番号Ｌ−８６４３。
麻酔薬：イソフルラン（フォレン（登録商標）、アボット）。
【００２２】
研究デザイン
シュードモナスＬＰＳへの暴露：  研究の初日に、ラットを１０μｇ／ｋｇ／ｍｌのシュードモナス・アエルギノーサリポ多糖ｉ．ｐ．又は食塩水ビヒクルの注射により感作した。次いで食物を断った。翌日に、動物が７％ラブラソール（登録商標）中の式（Ｉ）の化合物又は７％ラブラソール（登録商標）単独を受け、食事をケージに戻した。６時間後に、ラットを３０分間にわたって６匹のグループでシュードモナス・アエルギノーサリポ多糖のエアゾールに暴露した。１．４バールの圧縮空気により運転されたデビルビス型６４６ジェットネブライザーを使用してエアゾールを等張食塩水中のシュードモナス・アエルギノーサＬＰＳの１００μｇ／ｍｌ溶液から発生させた。空気に５％二酸化炭素を補給してラットによる呼吸保持挙動を防止した。暴露の２０時間後に、ラットをフォレン（登録商標）の過剰用量により殺した。最初の分岐からの約１ｃｍの気管の切片を除去し、液体窒素中でショック凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【００２３】
ＲＮＡの抽出及び定量  全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ系（キアゲン、ドイツ）で単離した。そのキット方法をＲＮＡａｓｅを含まないＤＮＡａｓｅ（キアゲン、カタログ番号７９２５４、室温で３０分間のインキュベーション）による特別の消化工程の包含によりわずかに変更した。抽出されたＲＮＡの性質をアガロースゲル電気泳動によりチェックした。ｍｕｃ−５ＡＣ ＲＮＡの定量をＡＢＩプリズム７７００検出器（パーキン・エルマー社、カリフォルニア、米国）を使用するタクマン（登録商標）実時間ＰＣＲ系により行なった。プローブをジーンバンク配列ＧＩ“２３１５９８４”に基づいて設計した。フォワードプローブは５’−ＴＧＧ ＧＡＡ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＣＴ ＡＣＡ ＡＣＣ Ａ−３’であり、リバースプローブは５’−ＴＣＣ ＴＧＡ ＣＴＡ ＡＣＣ ＣＣＴ ＴＴＧ ＡＣＣ Ａ−３’であり、蛍光原プローブは５’末端でフルオーＦＡＭで標識され、３’末端でクエンチャーＴＡＭＲＡで標識された、５’−ＣＣＴ ＴＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＣＴＧ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＧＣ ＧＡＴ ＧＴ−３’であった。
【００２４】
リボソームＲＮＡをハウスキーピング遺伝子として使用し、これに対し全てのｍｕｃ−５ＡＣ ＲＮＡ測定を比較した（タクマンリボソームＲＮＡ対照試薬（ＶＩＣＴＭプローブ）、アプライド・バイオシステムズ）。そのマスター混合物はアプライド・バイオシステムズにより販売された標準タクマン（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲコアー混合物（カタログ番号Ｎ８０８−０２３６）であった。ｍｕｃ−５ＡＣアッセイのために、それに２ ｍＭマンガンを補給し、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方を濃度３００ｎＭで使用した。温度順序（自動傾斜）は以下のとおりであった：５０℃１０分（逆転写）、６０℃３０分（ＤＮＡポリメラーゼ）、５分９５℃（二つの一本鎖への二本鎖の分離）、９４℃で２０秒及び５９℃で１分の４０サイクル（ポリメラーゼ連鎖反応）。リボソームＲＮＡアッセイのために、アニール温度は５９℃に代えて６０℃であった。夫々のプレート上で、夫々のサンプルを２回反復で測定し、最初にリボソームＲＮＡ次いでｍｕｃ−５ＡＣ ＲＮＡで測定した。夫々のサンプル及びプレートの対について、ｍｕｃ−５ＡＣ ＲＮＡ対リボソームＲＮＡの比を計算した。次いでプレートを全てのサンプルについて反復し、平均のｍｕｃ−５ＡＣ ＲＮＡ対リボソームＲＮＡをプレートの二つの組についての測定から計算した。標準化目的のために、一つのサンプル（Ｅ． Ｃｏｌｉ Ｏ５５．Ｂ５リポ多糖に暴露されたラット気管に由来するＲＮＡプールから）を二重プレートの両方について測定した。
【００２５】
統計分析
夫々のラット系について、陽性対照を一面ウィルコキソン試験により陰性対照及び式（Ｉ）の化合物で治療されたグループと比較した。多試験状況のために、ｐ値を夫々の実験についてボンフェロニ−ホルムに従って調節して有意のレベルを制御した（α＝０．０５）（９）。更に、２種のラット系を夫々のグループについて二面ウィルコキソン試験で比較した（α＝０．０５）。統計分析をプログラムＳＡＳ（ＳＡＳインスティチュート社、キャリィ、ノースカロライナ）、バージョン６．１２で行なった。
結果
シュードモナス・アエルギノーサエアゾールへのＢＤＥ系又はＦ３４４系のラットの暴露はｍｕｃ−５ＡＣ遺伝子の気管上皮発現の著しい増大を生じた（１８ＳリボソームＲＮＡハウスキーピング遺伝子に対し）（ｐ＝０．００４）。ＢＤＥラットでは、シュードモナス暴露後のｍｕｃ−５ＡＣ発現の増大は２７倍より大きく、Ｆ３４４ラットでは（主として未治療動物中のｍｕｃ−５ＡＣ発現についての高い対照値のために）１０倍より大きかった。３ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．の式（Ｉ）のＬＴＢ４アンタゴニストによる前治療はこの増大をビヒクルのみの前処理による値の半分未満に減少した。ＢＤＥ系を研究しても（ｐ＝０．００３の場合）またＦ３４４系を研究しても（ｐ＝０．０１０）いずれにしても、式（Ｉ）の化合物のこの効果は統計上有意であった。
【００２６】
ムチンを含む杯細胞に関するＬＴＢ４アンタゴニスト（Ｉ）の効果の組織学的研究
この研究をＢＤＥ系ラットのみで行ない、これらは先の生化学的研究で良好な結果を示した。
物質及び方法
使用した動物  生化学的研究（上記された）とほぼ同じ平均体重を有する、成体雄ラット、系ＢＤＥ／Ｈａｎ。
動物管理  ラットを先の研究のように収容した。組織学的研究の期間は生化学的研究の期間よりもかなり長いので、ラットを断食しなかった。
式（Ｉ）の化合物を先の研究のように合成し、ラットへの投与のために製剤化した。
先の研究のように、シュードモナス・アエルギノーサ血清型１０からのリポ多糖。
麻酔薬：イソフルラン
【００２７】
研究デザイン
シュードモナスＬＰＳへの暴露及び切片調製：ラットを感作し、シュードモナス・アエルギノーサリポ多糖にエアゾール暴露するための技術は先に記載されたとおりであった。しかしながら、組織学的研究では、ラットをシュードモナス・アエルギノーサリポ多糖エアゾールへの暴露の９６時間後に殺した。マウスをシュードモナスエアゾールに暴露することとそれらを殺すことの間の一層長い期間が必要であった。何とならば、組織変化はｍＲＮＡ発現の変化よりも遅く起こるからである。動物にシュードモナス・アエルギノーサエアゾールの５時間前及び２１時間後、４５時間後、６９時間後及び９３時間後に７％ラブロソール中の化合物（Ｉ）を経口投与した。化合物（Ｉ）による最後の治療の３時間後の、犠牲時に、完全な肺を除去し、７％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに埋め込んだ。左主幹気管支を免疫組織化学染色のために使用した。肺切片を主肺内気道の全長を含むように切断し、ヘマトキシリン及びエオシン又はアルシアンブルー（ＡＢ）−過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で連続して染色して全上皮領域及び細胞内粘液糖コンジュゲートについて染色された領域を夫々評価した。画像分析システム（ソフト・イメージング・システム、ミュンスター、ドイツ）を使用して、杯細胞生産を上皮粘液表面上のＡＢ−ＰＡＳ染色粘液糖コンジュゲートの体積密度により測定した。ＡＢ−ＰＡＳ染色杯細胞の数及び全上皮領域を基底板の２ｍｍの長さにわたって測定した。
【００２８】
結果
シュードモナス・アエルギノーサリポ多糖へのラットの暴露は上皮１平方ミリメートル当りの杯細胞の数の著しい増加を生じた。３ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．の化合物（Ｉ）による治療はシュードモナスエアゾール処理の効果を低減した（下記の表を参照のこと）。１平方ミリメートル当りの杯細胞の平均数は陰性対照で５０７、シュードモナス・アエルギノーサ処理陽性対照で１６６９、シュードモナス・アエルギノーサエアゾール及び３ｍｇ／ｋｇ（経口）の化合物（Ｉ）の両方で処理されたグループで４０８であった。
【００２９】
【表１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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