(57)【要約】植物体の細胞における内在性アデニル酸キナーゼ（ADK）活性の低下によるデンプンの蓄積の増加、および／または、デンプン貯蔵部分、器官、または組織における収量の増加を示すトランスジェニック植物について記載する。したがって、そのような低下は、例えば適切なアンチセンスRNAをコードする核酸分子のような核酸分子を植物のゲノムに導入することによって、達成されることが可能である。さらに、組換え核酸分子およびそのような植物体を作製するための方法について記載する。
2004526462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性アデニル酸キナーゼ（ADK）活性が低下されていることを特徴とする、トランスジェニック植物。
【請求項２】
ADKがプラスチド局在性を有する、請求項1記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
ADKが以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1または2記載のトランスジェニック植物：
（a）配列番号：2において示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）配列番号：1において示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）（a）または（b）のポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（d）遺伝暗号の縮重によって、そのヌクレオチド配列が（c）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド。
【請求項４】
植物のゲノムにおける外来の核酸分子の存在によって内在性ADK活性が低下されている、請求項1〜3のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
アンチセンス、コサプレッション、リボザイム、もしくはRNA干渉効果によって、インビボにおける突然変異誘発、抗体の発現によって、または、ドミナントネガティブ突然変異体の発現によって、内在性ADK活性の低下が達成される、請求項4記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
外来の核酸分子がADKをコードする遺伝子の転写産物に相補的であり、植物における発現を可能にするプロモーターに機能的に連結される、請求項5記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
プロモーターが植物細胞における構成的な発現を可能にする、請求項6記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
デンプン貯蔵植物である、請求項1〜7のいずれか一項記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
ジャガイモの植物体である、請求項8記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
内在性ADK活性が低下されている、トランスジェニック植物細胞。
【請求項１１】
請求項10記載のトランスジェニック植物細胞を含む請求項1〜9のいずれか一項記載のトランスジェニック植物の、繁殖材料または収穫可能な部分。
【請求項１２】
以下を含む組換え核酸分子：
（a）植物細胞における転写を確実にするプロモーター；およびそれに機能的に連結された分子；
（b）植物細胞において転写された場合に、該植物細胞における内在性ADK活性の低下を導くようなヌクレオチド配列；および選択的に
（c）転写終結シグナル。
【請求項１３】
（b）において定義付けられる核酸配列が、請求項1〜7のいずれか一項において定義付けられるような核酸分子のものである、請求項12記載の組換え核酸分子。
【請求項１４】
以下の段階を含む、デンプンの蓄積の増加、および／または、デンプン貯蔵部分、器官、もしくは組織の収量の増加を示すトランスジェニック植物を作製するための工程：
（a）該植物のゲノムにおけるその存在が、植物細胞における内在性ADK活性の低下を導くような核酸分子を、植物細胞に導入する段階；
（b）段階（a）において作製された形質転換細胞から植物体を再生する段階；および選択的に
（c）段階（b）において作製されたトランスジェニック植物から後代を作製する段階。
【請求項１５】
デンプンの蓄積の増加、および／または、デンプン貯蔵部分、器官、もしくは組織の収量の増加を示すトランスジェニック植物を生産するための、請求項12または13記載の組換え核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内在性アデニル酸キナーゼ（ADK）活性の低下による、デンプンの蓄積の増加、および／または、デンプン貯蔵部分、器官、または組織における収量の増加を示すトランスジェニック植物に関連する。本発明に従い、そのような低下は、例えば、適切なアンチセンスRNAをコードする核酸分子のような外来の核酸分子を植物のゲノムに導入することによって、達成することが可能である。さらに、本発明は、組換え核酸分子、および、開示される植物を生産するための方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
従来的な植物育種戦略または遺伝子操作戦略のいずれかによって、例えばジャガイモの塊茎のような、植物のデンプン貯蔵組織内におけるデンプンの蓄積を増加することについてはかなりの興味がもたれてきた（Schafer-Preglら, Genetics 97(1998), 834〜846；Starkら, Science 258(1991), 287〜292；Tretheweyら, Plant J. 15(1998), 109〜118）。トランスジェニックアプローチでは、スクロースの異化作用（Sonnewaldら, Nature Biotech. 15(1997), 794〜797；Tretheweyら, 上記引用文中）またはプラスチドのデンプン合成経路（Starkら, 上記引用文中；Taubergerら, Plant J. 23(2000), 43〜53）のいずれかを調節することに主に焦点が当てられてきた。今日までのところ、細菌のAGPアーゼ（Starkら, 上記引用文中）またはシロイヌナズナのアミロプラスチドの ATP/ADP輸送体（Tjadenら, Plant J. 16(1998), 531〜540）のいずれかの過剰発現からのみ、トランスジェニックアプローチが成功している。以前には、酵母のインベルターゼおよび細菌のグルコキナーゼからなる、スクロース分解のより効率のよい経路の発現によって、ジャガイモの塊茎のデンプン収量を改善する試みが行われた（Tretheweyら, 上記引用文中）。しかし、トランスジェニック塊茎が、野生型の塊茎と比較して、スクロースレベルの減少、ならびに、ヘキソースリン酸、ATP、および3-PGAのレベルの増加を示した事実にも関わらず、この試みは失敗した。ヘキソースリン酸、ATP、および3-PGAは各々、AGPアーゼの直接の前駆体および活性化物質の双方を表すため、これは興味深い（概観については、Preiss：「The Biochemistry of Plants」, 第14巻, Academic Press, San Diego, California(1988), 181〜254を参照のこと）。さらに、これらのヘキソースリン酸は、デンプン合成を犠牲にして解糖系に分配され、その結果、これらの系統内におけるデンプンの蓄積が減少することが認められた（Tretheweyら, 上記引用文中）。これらの研究全てを併せると、例えばジャガイモの塊茎におけるデンプン合成の調節が、当初予測されたよりも複雑であること、および、前駆体の濃度の単なる増加だけでは、デンプン合成を促進するには十分ではない可能性があることは明らかである。
【０００３】
したがって、植物のデンプン貯蔵組織におけるデンプンの蓄積を効果的に増加させるようなアプローチがなおも必要とされている。
【発明の開示】
【０００４】
したがって、本発明の基礎にある技術的な課題は、デンプンの蓄積の増加を示す植物の提供、ならびに、それらを作製するための手段および方法の提供である。
【０００５】
この技術的な課題は、請求項において特徴付けられるような態様の提供によって解決される。
【０００６】
したがって、本発明は、その内在性アデニル酸キナーゼ（ADK）活性を低下されたトランスジェニック植物に関連する。
【０００７】
意外にも、ジャガイモ塊茎におけるプラスチド局在性アデニル酸キナーゼの抑制が、塊茎におけるデンプンの蓄積を著しく増加させることが見出された。このADK抑制からもたらされるさらなる改善は、（184％までの）塊茎収量、塊茎の比重、アデニル酸含量、およびアミノ酸含量、特に必須アミノ酸の増加を含む。Tjaden（Plant J. 16(1998), 531〜540）から、プラスチドにおけるATP含量の増加が、デンプンの蓄積の増加を導くことが知られている。これは、プラスチドのATP/ADP輸送体を過剰発現することによって達成された。しかし、プラスチドのADKの抑制が、これらの細胞小器官におけるアデニル酸含量に対して同様の効果をもたらすことは予測されていなかった。酵素アデニル酸キナーゼ（EC 2.7.4.3）は、以下の反応の触媒作用をする：
ATP+AMP ⇔ 2 ADP。
【０００８】
本発明の提供に従ってその活性が低下させられるADKは、細胞内に任意に局在し得る。細胞質のADKアイソザイムは例えば、Moore（Plant Science Letters 35(1984), 127〜138）によって説明されている。イネからの、2つの細胞質のADKアイソザイムのヌクレオチド配列は、Kawai（Plant J. 2(1992）, 845〜854およびPlant Mol.Biol. 27(1995), 943〜951）によって説明された。ミトコンドリアに局在するADKアイソザイムは同様に、本発明の態様において使用することができる。しかし、プラスチド、特にアミロプラストは、植物細胞におけるデンプン生合成部位であるため、好ましいのは、プラスチド局在性ADKである。適切なプラスチドのADKについては、例えばトウモロコシのもの（Schiltz, Eur.J.Biochem. 222(1994), 949〜954）のように、文献において説明されている。さらに発表されているのは、上記のADKをコードするヌクレオチド配列に対して明らかな相同性を示す、発現配列タグ（EST）、即ち、ダイズからの1つ（GenBank EMBLデータベースアクセッション番号：BE022879）、シロイヌナズナからの2つ（アクセッション番号：N37538）、およびジャガイモの膨脹した走根からの1つ（アクセッション番号：AW905934）である。好ましい態様においては、活性を低下させる、上記に言及されるADKは、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされる：
（a）配列番号：2において表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）配列番号：1において表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（c）（a）または（b）のポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（d）遺伝暗号の縮重によって、そのヌクレオチド配列が（c）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列から逸脱しているようなポリヌクレオチド。
【０００９】
トランスジェニックアンチセンスジャガイモ植物体の調製に使用するために、配列番号：1において示されるようなヌクレオチド配列を有するジャガイモのプラスチドのADK（StpADK）をコードするcDNAを、添付の実施例において説明されるようにクローニングした。本文脈においては、「ハイブリダイズする」という用語は、例えばSambrookら, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」, 第2版(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYにおいて説明されるような、従来的なハイブリダイゼーション条件下、好ましくは、ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションを指す。特に好ましい態様においては、「ハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションが以下の条件下において起こることを意味する：
ハイブリダイゼーション緩衝液：2×SSC；10×デンハルト溶液（Fikoll400 + PEG + BSA；比率1：1：1）；0.1％SDS；5 mM EDTA；50 mM Na2HPO4；
250μg/ml ニシン精子DNA；50μg/ml tRNA；または
0.25 M リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2；
1 mM EDTA
7％SDS
ハイブリダイゼーション温度T = 60℃
洗浄緩衝液：2×SSC；0.1％SDS
洗浄温度T = 60℃。
【００１０】
都合の良いことに、ADKをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：1のヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも98％、および最も好ましくは少なくとも99％同一なヌクレオチド配列を有する。同様に、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号：2のアミノ酸配列に対して、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、なおもより好ましくは少なくとも98％、および最も好ましくは少なくとも99％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００１１】
「内在性アデニル酸キナーゼ（ADK）活性」という用語は、上記に示される反応の触媒作用をする、植物細胞における任意の酵素活性を指す。好ましくは該活性は、例えば、葉緑体、および特に、アミロプラストのようなプラスチドに局在し、したがって、好ましくは、単離プラスチドを用いることによって測定することが可能である（例えば、プラスチドの単離のための適切な方法については、Haake(Plant J. 14(1998), 147〜157)を参照のこと）。ADK活性は、例えばKleczkowski（Plant Physiol. 81(1986), 1110〜1114）のような文献において説明される方法によって決定することができる。「内在性」という用語は、本明細書において説明される態様を適用するための開始点として取られる元の植物、都合良くは野生型植物に存在するADK活性を指す。上記にて言及されるような「ADK活性の低下」によっては、元の植物における対応する内在性ADK活性と比較して、少なくとも20％、好ましくは25％、および最も好ましくは30％の低下が意味される。同様に、内在性ADK活性の低下は、植物細胞における、対応するADK転写産物またはタンパク質の量を測定することによって決定することができる。したがって、元の植物における対応する転写産物量と比較して、少なくとも30％、好ましくは少なくとも50〜70％、および最も好ましくは少なくとも70〜90％のADK転写産物の減少は、本発明に従ったトランスジェニック植物を示すものである。タンパク質レベルでは、対応する元の植物と比較して、ADKポリペプチドの少なくとも30％、好ましくは少なくとも50〜70％、および最も好ましくは少なくとも70〜90％の減少によって、本発明のトランスジェニック植物におけるデンプンの蓄積の効率よい増加が与えられる。
【００１２】
本文脈における「増加した蓄積」という用語は、対応する非形質転換野生型植物と比較した場合に、本発明に従ったトランスジェニック植物が、増加したデンプン含量を有することを意味する。好ましくは、植物のデンプン貯蔵部分、器官、または組織におけるデンプン含量が増加する。本文脈においては、「増加した」という用語は、対応する元の植物、好ましくは非形質転換野生型植物と比較した場合に、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも40％、さらにより好ましくは少なくとも60％、および特に好ましくは少なくとも80％の、デンプン含量における増加を意味する。特に好ましい態様においては、蓄積が2倍に増加する。
【００１３】
植物の部分、器官、または組織のデンプン含量は、例えば添付の実施例において説明される方法またはMorrell（Phytochemistry 25(1986), 1579〜1585）の方法のような、当業者によく知られた方法に従って決定することができる。
【００１４】
上記にて示されるように、本発明のトランスジェニック植物は、対応する元の植物と比較して、好ましくはデンプン含量の増加に加えてアミノ酸含量の増加、および、植物の個々のデンプン貯蔵器官または他の部分、好ましくは塊茎の比重の増加を示すことも可能である。アミノ酸含量におけるそのような増加は、植物組織に存在する、全アミノ酸含量即ち個々のアミノ酸、好ましくは通常のタンパク質性アミノ酸の総量を見た場合に、少なくとも5％、都合良くは少なくとも10％、および最も好ましくは少なくとも20％の範囲内にあることが可能である。さらに、1つのアミノ酸、特に必須アミノ酸は、相当する増加、または、より著しい増加でさえも示すことが可能である。これに関しては、本発明のトランスジェニック植物において、対応する元の植物と比較した場合に、ロイシン、メチオニン、および／またはトリプトファンの含量、都合良くはこれら3つのアミノ酸全ての含量が増加することが特に好ましい。デンプン貯蔵器官の比重の増加は、対応する元の植物における個々の器官の比重の少なくとも0.5％、好ましくは少なくとも1％の値にあることが可能である。
【００１５】
アミノ酸含量および植物組織の比重を決定するための方法は、当技術分野においてはよく知られており、例えば、添付の実施例において例証されるように実行することができる。
【００１６】
本発明のトランスジェニック植物における内在性ADK活性の低下は、植物体当たりの全生重量によって定義付けられるような、植物のデンプン貯蔵部分、器官、または組織における収量の有意な増加をもたらし得る。好ましくは、この増加は、対応する野生型植物から得られる植物体当たりの生重量の少なくとも110％、より好ましくは少なくとも120％、なおより好ましくは少なくとも180％までのものである。特に、本発明のトランスジェニック植物は、それが塊茎を有する植物、好ましくはジャガイモの植物体である場合には、塊茎収量における増加、即ち、植物体当たりに生産される塊茎の全重量の増加を示す。増加は、好ましくは、同じ環境条件下において生長させた、対応する野生型植物の塊茎収量の少なくとも110％、より好ましくは少なくとも130％、さらにより好ましくは少なくとも150％、特に好ましくは少なくとも160％、および最も好ましくは少なくとも180％までのものである。加えて、本発明のトランスジェニック植物は、好ましくは、対応する野生型植物から得られる数の少なくとも110％までの、植物体当たりの塊茎のようなデンプン貯蔵器官の数における増加をも示し得る。収量における増加のその他の重要な局面は、植物体当たりに得られる重量としてのデンプン量の増加である。この収量パラメータは、好ましくは、本発明のトランスジェニック植物において、対応する野生型植物から得られる植物体当たりのデンプン量の少なくとも110％、より好ましくは少なくとも120％、なおより好ましくは少なくとも140％、および最も好ましくは少なくとも180％まで増加する。さらなる局面においては、収穫可能なデンプン貯蔵器官、例えば塊茎当たりの生重量は、対応する野生型植物と比較して、対応する野生型植物に由来するデンプン貯蔵器官の生重量の、好ましくは少なくとも120％、およびより好ましくは少なくとも140％まで著しく増加することが可能である。
【００１７】
本発明の文脈においては、「トランスジェニック」という用語は、植物が、上記に説明されるようなADK活性が低下させられるような様式で、ゲノムが対応する元の植物のものから構造的に逸脱しているような細胞を含むことを意味する。そのような構造的差異は、優先的に、例えば欠失によって不活性化されうるADKをコードする遺伝子を指す。先行技術では、特定の酵素の活性が低下されているトランスジェニック植物を作製するための手段および方法が提供されている。好ましい態様として、本発明のトランスジェニック植物は、外来の核酸分子の存在によって特徴付けられる。したがって、本明細書において使用されるような「外来の核酸分子の存在」という用語は、本発明のトランスジェニック植物の細胞には存在するが、対応する元の植物の細胞には存在しないような任意の核酸分子を指す。それにより、少なくとも1つの突然変異（少なくとも1つのヌクレオチドの置換、挿入、欠失等）であり、影響を受けた遺伝子の発現を阻害する、または、遺伝子産物の活性を低下させるような突然変異によって、元の植物細胞における対応する核酸分子とは異なる、例えば遺伝子配列のような核酸分子が包含される。「外来の」という用語には、元の植物細胞に関して相同であるが、異なる染色体位置に位置するような、または、例として、例えばプロモーターに対する逆の方向によって異なるような核酸分子がさらに包含される。
【００１８】
原則として、外来の核酸分子は、例えば真核生物または原核生物のような、考えられる任意の起源のものであることが可能である。それは、そのような分子を含む、任意の生物体のものであることが可能である。さらにそれは、合成のもの、または、例えば、その配列の修飾により、天然に生じる分子から誘導されたものが可能である、即ち、天然に生じる分子の変種または誘導体であることが可能である。そのような変種または誘導体は、限定はしないが、1つもしくは複数のヌクレオチドの付加、欠失、突然変異によって、または組換えによって、天然に生じる分子から誘導された分子を含む。例えば、天然に生じる分子の配列を、植物、特にその核酸分子が発現される植物の好ましいコドン使用法に適合するように変化させることが可能である。
【００１９】
外来の核酸分子を導入することによる、標的植物における内在性ADK活性の低下は、先行技術において既知の適切な方法によって達成することができ、とりわけ、アンチセンス、コサプレッション、リボザイム、またはRNA干渉効果を適用することが好ましい、または、インビボの突然変異誘発、抗体の発現によって、またはドミナントネガティブ突然変異体の発現によって達成することができる。これらの方法は、以下においてさらに説明される。
【００２０】
したがって、ある植物のADKの転写産物に相補的なアンチセンスRNAをコードする核酸分子を使用することは、本発明の好ましい態様である。該アンチセンスRNAを発現させるために、核酸分子は植物における発現を可能にするようなプロモーターに機能的に連結される。本説明を通して使用されるように、「機能的に連結される」という用語は、プロモーターと、プロモーターと適合性の条件下において発現が達成されるような様式で発現される核酸分子との間の連結を指す。相補性とは、それにより、コードされるRNAが100％相補的でなければならないことを意味しない。該RNAの植物細胞における発現の際に、ADKの発現を阻害するのに十分高ければ、低い程度の相補性で十分である。転写されたRNAは、好ましくは、ADKをコードする核酸分子の転写産物に対して少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも95％相補的である。植物細胞における転写中にアンチセンス効果を引き起こすために、そのようなRNA分子は少なくとも15 bpの長さ、好ましくは100 bpより長い、および最も好ましくは500 bpより長い長さであるが、通常5,000 bp未満、好ましくは2,500 bpより短い長さを有する。植物におけるアンチセンス効果を達成するための典型的な方法は、例えば、Haake（Plant J. 14(1998), 147〜157）、Tauberger（Plant J. 23(2000), 43〜53）、およびTjaden（Plant J. 16(1998), 531〜540）によって説明されており、これにより本発明の説明に組み入れられる。同様に、アンチセンス効果は、例えばLee（Nucl.Acids Res. 6(1979), 3073）；Cooney（Science 241(1998), 456）、またはDervan（Science 251(1991), 1360）において規定された原理に従って設計された、ADK遺伝子のある領域に相補的な核酸分子がその転写を阻害し得るような、三重らせんアプローチを適用することによって達成することもできる。
【００２１】
アンチセンス技術と同様の効果は、RNA干渉（RNAi）効果を仲介するために適切な構築物を発現するようなトランスジェニック植物を作製することによって達成することができる。それにより、二重鎖RNAの形成によって、配列特異的な様式で遺伝子発現の阻害が導かれる。より特定的には、RNAi構築物においては、不活性化される遺伝子（または、非翻訳領域を含む、もしくは含まないその一部分）のコード領域を含むセンス部分の次に、相当するアンチセンス配列部分が続く。双方の部分の間には、必ずしも同じ遺伝子に由来しないイントロンを挿入することができる。転写後に、RNAi構築物は、典型的なヘアピン構造を形成する。本発明の開示に従い、RNAi技術は、Smith（Nature 407(2000), 319〜320）またはMarx（Science 288(2000), 1370〜1372）によって説明されるように実行することができる。
【００２２】
植物細胞における発現中に、コサプレッション効果によって植物細胞におけるADKをコードする核酸分子の発現を減少させるようなRNAの合成を導くDNA分子を使用することもできる。コサプレッション、および、対応するDNA配列の作製の原則については、例えば、国際公開公報第90/12084号において的確に説明されている。そのようなDNA分子は、好ましくは、ADKをコードする遺伝子の転写産物に対して高度の相同性を有するRNAをコードする。しかし、コードされるRNAがタンパク質に翻訳可能であることは、絶対的に必要ではない。コサプレッション効果の原理は、当業者には既知であり、例えば、Jorgensen, Trends Biotechnol. 8(1990), 340〜344；Niebel, Curr.Top.Microbiol.Immunol. 197(1995), 91〜103；Flavell, Curr.Top.Microbiol.Immunol. 197(1995), 43〜36；PalaquiおよびVaucheret, Plant.Mol.Biol. 29(1995), 149〜159；Vaucheret, Mol.Gen.Genet. 248(1995), 311〜317；de Borne, Mol.Gen.Genet. 243(1994), 613〜621ならびに他の情報源において説明されている。
【００２３】
同様に、ADKをコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有するRNA分子をコードするDNA分子を使用することができる。リボザイムは、RNA分子および特異的な標的配列を切断することができる、触媒として活性なRNA分子である。組換えDNA技術によって、リボザイムの特異性を変化させることが可能である。リボザイムには様々なクラスがある。ある遺伝子の転写産物の特異的な切断を目指す実用的な適用のためには、好ましくは、グループIイントロンリボザイムタイプに属するリボザイム群、または、特有の特徴としていわゆる「ハンマーヘッド」モチーフを示すリボザイムの典型的なものが使用される。標的RNA分子の特異的認識は、このモチーフに隣接する配列を変化させることによって改変することができる。これらの配列は、標的分子における配列との塩基対合によって、触媒反応、およびしたがって、標的分子の切断が行われる位置を決定する。効率のよい切断のための配列の要求性は低いため、原則として、実際的に望ましい各RNA分子について特異的なリボザイムを開発することが可能である。ADKをコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイムをコードするDNA分子を作製するために、例えばリボザイムの触媒ドメインをコードするDNA配列を、標的タンパク質ADKをコードする配列に対して相補的であるDNA配列と両側で連結する。触媒ドメインをコードする配列は、例えばSCMoウイルスのサテライトDNAの触媒ドメインであることが可能である（Davies, Virology 177(1990), 216〜224およびSteinecke, EMBO J. 11(1992), 1525〜1530）、または、TobRウイルスのサテライトDNAの触媒ドメインであることが可能である（HaseloffおよびGerlach, Nature 334(1988), 585〜591）。細胞におけるあるタンパク質の活性を低下させるためのリボザイムの発現は、当業者には知られており、例えば、EP-B1 0 321 201号において説明されている。植物細胞におけるリボザイムの発現については、例えば、Feyter（Mol.Gen.Genet. 250(1996), 329〜338）において説明されている。
【００２４】
さらに、本発明の植物細胞におけるアデニル酸キナーゼ活性は、いわゆる「インビボの突然変異誘発」によって、即ち、ADKをコードする遺伝子の配列がその天然の染色体位置において、例えば相同組換えを適用する技術によるように修飾される方法によって、低下させることもできる。これは、形質転換によって細胞に導入されるハイブリッドRNA-DNAオリゴヌクレオチド（「キメロプラスト(chimeroplast)」）を用いることによって達成することができる（TIBTECH 15(1997), 441〜447；国際公開公報第95/15972号；Kren, Hepatology 25(1997), 1462〜1468；Cole-Strauss, Science 273(1996), 1386〜1389）。RNA-DNAオリゴヌクレオチドのDNA成分の部分は、標的ADK遺伝子配列に対して相同であるが、この配列と比較して、相同領域に囲まれた、突然変異または非相同領域を示す。相同領域の標的配列との塩基対合、およびそれに続く相同組換えによって、RNA-DNAオリゴヌクレオチドのDNA成分に含まれる突然変異または非相同領域を、植物細胞の相当する遺伝子に移行させることができる。インビボの突然変異誘発によって、それが内在性ADK活性の低下をもたらす限り、ADKをコードする遺伝子の任意の部分を不活性化することができる。したがって、これは、例として、例えばRNAポリメラーゼ結合部位のようなプロモーター、およびコード領域、特に触媒活性中心またはタンパク質を、適切な細胞画分に指向させる、シグナル配列をコードする部分に関与することが可能である。個々の内在性ADKコード遺伝子が不活性化されたトランスジェニック植物を得るためのさらなる方法は、例えばT-DNAまたはトランスポゾンタギングによって導入されるような無作為ノックアウト突然変異を含む、トランスジェニック植物系統のライブラリのスクリーニング法を含む。優先的に、そのようなスクリーニングは、遺伝子型に基づくものである、即ち、ADKコード遺伝子の構造が野生型の遺伝子座から逸脱している系統を同定することによるものである。適切な方法については、Kumar（Meth. Enzymology 328(2000), 550〜574）のような文献において説明されている。
【００２５】
さらに、植物におけるADK、即ちそのようなタンパク質の特異的断片またはエピトープを特異的に認識する抗体をコードする核酸分子を、このタンパク質の活性を阻害するために使用することができる。これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または合成抗体、および、Fab、Fv、またはscFv断片等のような抗体の断片であることが可能である。モノクローナル抗体は、例えば、免疫化哺乳動物個体に由来する脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞の融合を含む、KohlerおよびMilstein（Nature 256(1975), 495）、ならびに、Galfre（Meth. Enzymol. 73(1981) 3）において最初に説明されたような技術によって、調製することができる。さらに、前述されたペプチドに対する抗体またはその断片は、例えばHarlowおよびLane「Antibodies, A Laboratory Manual」, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988において説明される方法を用いることによって得ることができる。植物における抗体または抗体様分子の発現は、当技術分野において既知の方法によって達成することが可能であり、例えば、完全なサイズの抗体（During, Plant.Mol.Biol. 15(1990), 281〜293；Hiatt, Nature 342(1989), 469〜470；Voss, Mol.Breeding 1(1995), 39〜50）、Fab断片（De Neve, Transgenic Res. 2(1993), 227〜237）、scFv（Owen, Bio/Technology 10(1992), 790〜794；Zimmermann, Mol.Breeding 4(1998), 369〜379；Tavladoraki, Nature 366(1993), 469〜472）、およびdAb（Benvenuto, Plant Mol.Biol. 17(1991), 865〜874）が、タバコ、ジャガイモにおいて（Schouten, FEBS Lett. 415(1997), 235〜241）、またはシロイヌナズナにおいて、総タンパク質の6.8％もの高い発現レベルに到達するまで（Fiedler, Immunotechnology 3(1997), 205〜216）、有効に発現されている。
【００２６】
加えて、ADKの突然変異形態をコードする核酸分子を、野生型タンパク質の活性を阻害するために使用することができる。そのような突然変異形態は、好ましくは、例えばキナーゼ活性のようなその生物学的活性を失っており、タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換、および／または付加によって、対応する野生型タンパク質から誘導されることが可能である。そのようなタンパク質の突然変異形態は、キナーゼ活性の損失に加えて、例えば、細胞の環境においてタンパク質を安定化させるアミノ酸の取り込みによって、細胞における基質親和性の増加および／または安定性の上昇を示すことが可能である。これらの突然変異形態は、天然に生じる突然変異体、または好ましくは、遺伝子操作された突然変異体であることが可能である。
【００２７】
さらに、上記に説明されるアンチセンス、リボザイム、RNA干渉、コサプレッション、インビボの突然変異誘発、抗体発現、および優性突然変異効果を、ADKの発現、または例えばADKが活性となるために必要なタンパク質の発現を制御する転写因子のような調節タンパク質をコードする遺伝子の発現を減少させるために使用することもできることは、当業者には直ちに明らかとなる。
【００２８】
本発明の開示から、それらの細胞における、上記に説明される外来の核酸分子の1つまたは複数によって、対応する元の植物と比較してADK活性の低下を示すトランスジェニック植物を作製するために、上記にて明らかにされた戦略の任意の組み合わせを使用することができることもまた明らかである。そのような組み合わせは、例えば、対応する核酸分子による植物細胞、植物組織、もしくは植物体の（共）形質転換によって、または、本発明の上記にて説明される方法の異なる態様によって生み出されたトランスジェニック植物の交配によって行うことができる。同様に、本発明の方法によって得られる植物は、デンプンの蓄積の増加と、例えばストレス耐性または改変されたデンプン生合成のような、遺伝子操作された別の形質との組み合わせを成すことができるように、他のトランスジェニック植物と交配することができる。
【００２９】
上記に説明される態様の幾つかについては、外来の核酸分子は、本発明のトランスジェニック植物において発現され、それにより「発現される」という用語は、植物の細胞の少なくとも幾つかにおいて、その核酸分子が少なくとも転写されることを意味し、またある態様については、タンパク質への翻訳も行われることを意味する。原則としては、植物の全てまたは実質的に全ての細胞において、外来の核酸分子が発現されることが可能である。しかし、ある部分、器官、細胞タイプ、組織等においてのみ発現されることもまた可能である。さらに、外来の核酸分子の発現が、誘導の際にのみ、または、ある発生段階においてのみ行われることが可能である。好ましい態様においては、核酸は、デンプン貯蔵器官または組織、例えばジャガイモの塊茎において発現される。
【００３０】
発現されるためには、本発明に従ったトランスジェニック植物に含まれる外来の核酸分子は、好ましくは、植物細胞における発現を可能にするプロモーターに連結される。
【００３１】
プロモーターは、植物に対して相同または非相同であることが可能である。適切なプロモーターは、例えば、構成的な発現に役立つ、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAのプロモーター（例えばUS-A-5,352,605を参照のこと）およびユビキチンプロモーター（例えばUS-A-5,614,399を参照のこと）、ジャガイモにおける塊茎特異的な発現に役立つ、パタチン遺伝子プロモーターB33（Rocha-Sosaら, EMBO J. 8(1989), 23〜29）、または、例えばST-LS1プロモーター（Stockhausら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84(1987), 7943〜7947；Stockhausら, EMBO, J. 8(1989) 2445〜2451）のような、光合成活性組織のみにおける確実な発現を行わせるプロモーター、Ca/bプロモーター（例えばUS-A-5,656,496、同5,639,952、Bansalら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89 (1992), 3654〜3658を参照のこと）、およびRubisco SSUプロモーター（例えばUS-A-5,034,322；同4,962,028を参照のこと）、または、胚乳特異的な発現に役立つコムギからのグルテリンプロモーター（HMWプロモーター）（Anderson, Theoretical and Applied Genetics 96, (1998), 568〜576、Thomas, Plant Cell 2(12), (1990), 1171〜1180）、イネからのグルテリンプロモーター（Takaiwa, Plant Mol.Biol. 30(6) (1996), 1207〜1221、Yoshihara, FEBS Lett. 383(1996), 213〜218、Yoshihara, Plant and Cell Physiology 37(1996), 107〜111）、トウモロコシからのshrunkenプロモーター（Maas, EMBO J. 8(11)(1990), 3447〜3452、Werr, Mol.Gen.Genet. 202(3)(1986), 471〜475、Werr, Mol.Gen.Genet. 212(2)(1988), 342〜350）、USPプロモーター、ファゼオリンプロモーター（Sengupta-Gopalan, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985), 3320〜3324、Bustos, Plant Cell 1(9)(1989), 839〜853）、または、トウモロコシからのゼイン遺伝子のプロモーター（Pedersenら, Cell 29(1982), 1015〜1026；Quatroccioら, Plant Mol.Biol. 15(1990), 81〜93）である。しかし、外部の影響によって決定される時点でのみ活性化されるようなプロモーターを使用することもできる（例えば国際公開公報第93/07279号を参照のこと）。これに関連しては、単純な誘導を可能にする熱ショックタンパク質のプロモーターが特に重要となり得る。さらに、ソラマメおよび他の植物における種子特異的な発現を確実にする、ソラマメに由来するUSPプロモーターのような種子特異的なプロモーターを使用することができる（Fiedlerら, Plant Mol.Biol. 22(1993), 669〜679；Baumleinら, Mol.Gen.Genet. 225(1991), 459〜467）。さらに、国際公開公報第91/01373号において説明されるような、果実特異的なプロモーターを使用することもできる。好ましいのは、構成的な発現を確実にするようなプロモーターである。
【００３２】
さらに、外来の核酸分子は、転写を正しく終結させる役割を果たす、および、転写産物の安定化においてある機能を有すると考えられるポリA尾部を転写産物に付加する役割を果たす、終結配列に連結することができる。そのような因子については、文献において説明されており（例えばGielenら, EMBO J. 8(1989), 23〜29を参照のこと）、自由に置き換えることができる。
【００３３】
ポリペプチドを作製するために、本発明に従ったトランスジェニック植物において外来の核酸分子が発現される場合、原則として、合成されたタンパク質を植物細胞の任意の画分に（例えば、細胞質ゾル、プラスチド、液胞、ミトコンドリアに）、または、植物の任意の画分に（例えば、アポプラストに）局在化させることができる可能性がある。特定の画分における局在化を達成するため、必要な場合、コード領域は、対応する画分における局在化を確実にするDNA配列に連結されなければならない。使用されるシグナル配列は各々、酵素をコードするDNA配列と同じ読み枠内に配置されなければならない。プラスチドにおける局在化が好ましい。
【００３４】
プラスチドにおける局在を確実にするために、以下の転移ペプチドの1つを使用することが考えられる：プラスチドのフェレドキシンの転移ペプチド：Jansenら（Current Genetics 13(1988), 517〜522）に含まれる、ホウレンソウのNADP+酸化還元酵素（FNR）の転移ペプチド。特に、5’非翻訳領域および転移ペプチドをコードする配列を含む、そこに開示されるcDNA配列のヌクレオチド171位〜165位に渡る配列を使用することができる。その他の例は、成熟waxyタンパク質の第１の34アミノ酸残基を含む、トウモロコシのwaxyタンパク質の転移ペプチドである（Klosgenら, Mol.Gen.Genet. 217(1989), 155〜161）。成熟タンパク質の第１の34アミノ酸を含まない、この転移ペプチドを使用することもまた可能である。さらに、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（Wolterら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988), 846〜850；Nawrathら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994), 12760〜12764）、NADPリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Gallardoら, Planta 197(1995), 324〜332）、グルタチオンレダクターゼ（Creissenら, Plant J. 8(1995), 167〜175）、またはR1タンパク質（Lorberthら, Nature Biotechnology 16, (1998), 473〜477）のシグナルペプチドを使用することができる。プラスチド指向性の移行のためのその他の適切なシグナルペプチドは、配列番号：2の1位〜78位のアミノ酸配列を含むStpADKのものである。
【００３５】
液胞における局在を確実にするために、以下の転移ペプチドの1つを使用することが考えられる：パタチンタンパク質のN末端配列（146アミノ酸）（Sonnewaldら, Plant J. 1(1991), 95〜106）、または、MatsuokaおよびNeuhaus（Journal of Experimental Botany 50(1999), 165〜174）；ChrispeelsおよびRaikhel（Cell 68(1992), 613〜616）；MatsuokaおよびNakamura（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991), 834〜838）；BednarekおよびRaikhel（Plant Cell 3(1991), 1195〜1206）；ならびにNakamuraおよびMatsuoka（Plant Phys. 101(1993), 1〜5）によって説明されるシグナル配列。
【００３６】
ミトコンドリアにおける局在を確実にするために、例えば、Braun（EMBO J. 11,(1992), 3219〜3227）によって説明される転移ペプチドを使用することが考えられる。
【００３７】
アポプラストにおける局在を確実にするために、以下の転移ペプチドの1つを使用することが考えられる：プロテアーゼインヒビターII遺伝子のシグナル配列（Keilら, Nucleic Acid Res. 14(1986), 5641〜5650；von Schaewenら, EMBO J. 9(1990), 30〜33）、Erwinia amylovoraに由来するレバンスクラーゼ遺伝子のシグナル配列（GeierおよびGeider, Phys.Mol.Plant Pathol. 42(1993), 387〜404）、最初の33アミノ酸をコードする、ジャガイモに由来するパタチン遺伝子B33の断片のシグナル配列（Rosahlら, Mol.Gen.Genet. 203(1986), 214〜220）または、Oshimaら（Nucleic Acid Res. 18(1990), 181）によって説明されるもののシグナル配列。
【００３８】
本発明に従ったトランスジェニック植物は、原則として、任意の植物種の植物であることが可能である、即ち、それらは単子葉植物および双子葉植物であることが可能である。好ましくは、植物は、栄養的な目的、または技術的な、特に産業上の目的のために人間によって栽培される有用な植物である。それらは、好ましくは、例えば穀物種（ライムギ、オオムギ、オートムギ、コムギ、キビ、サゴ等）、イネ、エンドウ、インゲンマメ、キャッサバ、およびジャガイモのような、デンプン貯蔵植物；トマト、ナタネ、ダイズ、アサ、アマ、ヒマワリ、ササゲ、またはクズウコン、繊維形成植物（例えば、アマ、アサ、ワタ）、油貯蔵植物（例えば、ナタネ、ヒマワリ、ダイズ）、ならびにタンパク質貯蔵植物（例えば豆類、穀物、ダイズ）である。本発明は、果樹およびヤシにも関連する。さらに、本発明は、飼料植物（例えば、アルファルファ、クローバー、ライグラスのような飼料および牧草）、および蔬菜植物（例えば、トマト、レタス、チコリー）、および観賞植物（例えば、チューリップ、ヒヤシンス）に関連する。糖貯蔵および／またはデンプン貯蔵植物が好ましい。サトウキビおよびテンサイ、トウモロコシ、イネ、コムギ、ならびにトマトの植物体は特に好ましく、ジャガイモの植物体は最も好ましい。
【００３９】
本発明に従ったトランスジェニック植物は、当業者によく知られた方法によって、植物細胞に外来の核酸分子を導入し、形質転換細胞から植物体を再生することによって調製することができる。
【００４０】
植物の宿主細胞にDNAを挿入することができる、多数の技術が利用可能である。これらの技術は、根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）または毛根病菌（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換作用物質として用いた、T-DNAによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、DNAの注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃を用いたアプローチによるDNAの挿入、および他の可能なものを含む。
【００４１】
植物細胞のアグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介の形質転換の使用については広範に渡って研究され、欧州特許第120 516号；Hoekema：「The Binary Plant Vector System」, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam(1985), 第V章；Fraleyら, Crit.Rev.Plant Sci. 4(1993), 1〜46、およびAnら, EMBO J. 4(1985), 277〜287において十分に説明されている。ジャガイモの形質転換に関しては、例えば、Rocha-Sosaら（EMBO J. 8(1989), 29〜33）を参照のこと。
【００４２】
アグロバクテリウムに基づくベクターによる単子葉植物の形質転換についても説明されている（Chanら, Plant Mol.Biol. 22(1993), 491〜506；Hieiら, Plant J. 6(1994) 271〜282；Dengら, Science in China 33(1990), 28〜34；Wilminkら, Plant Cell Reports 11(1992), 76〜80；Mayら, Bio/Technology 13(1995), 486〜492；ConnerおよびDormisse, Int.J.Plant Sci. 153(1992), 550〜555；Ritchieら, Transgenic Res. 2 (1993), 252〜265）。単子葉植物を形質転換するための代替の系は、遺伝子銃を用いたアプローチによる形質転換（WanおよびLemaux, Plant Physiol. 104(1994), 37〜48；Vasilら, Bio/Technology 11(1993), 1553〜1558；Ritalaら, Plant Mol.Biol. 24(1994) 317〜325；Spencerら, Theor.Appl.Genet. 79(1990), 625〜631）、プロトプラスト形質転換、部分的に透過処理された細胞のエレクトロポレーション、グラスファイバーを介したDNAの挿入である。特に、トウモロコシの形質転換は、文献において繰り返し説明されている（例えば、国際公開公報第95/06128号、欧州特許第0 513 849号、同第0 465 875号、同第29 24 35号；Frommら, Biotechnology 8, (1990), 833〜844；Gordon-Kammら, Plant Cell 2, (1990), 603〜618；Kozielら, Biotechnology 11(1993), 194〜200；Morocら, Theor.Appl.Genet. 80, (1990), 721〜726を参照のこと）。他のタイプの穀物での有効な形質転換も、例えば、オオムギ（WanおよびLemaux, 前記；Ritalaら, 前記；Krensら, Nature 296(1982), 72〜74）およびコムギ（Nehraら, Plant J. 5(1994), 285〜297）について説明されている。
【００４３】
本発明は、好ましくは本発明に従ったトランスジェニック植物に含まれる、トランスジェニック植物細胞であり、低下した内在性ADK活性によって特徴付けられるような細胞にも関連する。そのようなトランスジェニック細胞を作製することについての特徴および方法に関しては、本明細書の上記におけるトランスジェニック植物について特定化されるものと同じ説明および態様が適用される。
【００４４】
本発明はまた、本発明に従った植物細胞を含む本発明の植物の繁殖材料にも関連する。「繁殖材料」という用語は、栄養繁殖的にまたは生殖によって子孫を生産するのに適した、植物の成分または部分を含む。栄養繁殖に適切な方法は、例えば、切穂、カルス培養、根茎、または塊茎である。他の繁殖材料には、例えば、果実、種子、実生、プロトプラスト、細胞培養等が含まれる。好ましい繁殖材料は、塊茎、および種子である。本発明はまた、例えば果実、種子、塊茎、または根茎のような、本発明の植物の収穫可能な部分にも関連する。
【００４５】
本発明はまた、以下を含む組換え核酸分子にも関連する：
（a）植物細胞における転写を確実にするプロモーター；および、それに機能的に連結された分子；
（b）植物細胞において転写された場合、該植物細胞における内在性ADK活性の低下を導くような核酸配列；および選択的に、
（c）転写終結シグナル。
【００４６】
プロモーター、転写終結シグナル、（b）以下にて言及される核酸配列、および、該核酸分子によってコードされるタンパク質の細胞内ターゲティングに関与する好ましい態様に関しては、本発明に従ったトランスジェニック植物に関連して上記にて既に言及されたものと同じことが適用される。
【００４７】
本発明はまた、本発明の組換え核酸分子を含むベクターにも関連する。好ましいのは、植物細胞の形質転換を可能にするようなベクターであり、最も好ましいのは、例えばバイナリーベクターのような、核酸分子の植物ゲノムへの安定した組込みを可能にするベクターである。そのようなベクターは、文献において広範に説明されており、商業的に入手可能でもある。
【００４８】
さらに、本発明は、植物細胞において転写された場合、該植物細胞における内在性ADK mRNAレベルの低下を導くような外来の核酸分子を含む、および、発現する、トランスジェニック植物の調製のために、本発明に従った組換え核酸分子を使用することに関連する。
【００４９】
本発明は、以下の段階を含む、デンプンの蓄積の増加、および／または、デンプン貯蔵部分、器官、もしくは組織の収量の増加を示すトランスジェニック植物を作製するための工程にさらに関連する：
（a）該植物のゲノムにおけるその存在によって、植物細胞における内在性ADK活性の低下を導くような核酸分子を植物細胞に導入する段階；
（b）段階（a）において作製される形質転換細胞から植物体を再生する段階；および選択的に
（c）段階（b）において作製されるトランスジェニック植物から後代を作製する段階。
【００５０】
「デンプン貯蔵部分、器官、または組織の収量の増加」という用語は、本発明の提供に従って達成することができる、前述の収量に関連する改善の任意のものを指し、特に、植物体当たりの生重量により定義されるような、デンプン貯蔵部分、器官、または組織、特に塊茎または穀粒の収量の増加、デンプン貯蔵器官の数の増加、植物体当たりの重量としてのデンプン量の増加、または収穫可能な各デンプン貯蔵器官の生重量の増加、またはこれらの局面の任意のものの任意の組み合わせにおける増加を指す。
【００５１】
段階（a）に関して、導入される核酸分子は、本明細書の上記において説明されるように、本発明に従った組換え核酸分子またはベクターであることが可能である。
【００５２】
段階（b）は、当業者によく知られた方法に従って実行することができる。
【００５３】
本工程の段階（c）に従った後代の作製は、栄養繁殖および有性生殖を含む。
【００５４】
本発明は、本発明に従った工程によって得られる、または得ることが可能なトランスジェニック植物にも関連する。
【００５５】
さらに、本発明は、デンプンの蓄積の増加、および／または、デンプン貯蔵部分、器官、もしくは組織の収量の増加を示すトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞の生産について上記にて説明されるような、組換え核酸分子またはベクターの使用に関係する。
【００５６】
これらの態様および他の態様は開示され、当業者には明らかであり、本発明の説明および実施例によって包含される。本発明の意味内にて使用することができる、上記に言及される方法、手段、および適用の1つに関する付加的な文献は、最先端の技術から、例として公共のライブラリから、例えば電子的手段の使用によって、得ることが可能である。この目的は、とりわけ、例えばアドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.にてインターネットを通してアクセス可能な「medline」のような、公共のデータベースによって達成されることが可能である。当業者には、他のデータベースおよびアドレスが知られており、例えばアドレスhttp://www.lycos.com.にて、インターネットから得られることが可能である。バイオテクノロジーにおける特許および特許出願に関する情報源および情報の概観は、Berks, TIBTECH 12(1994), 352〜364に含まれる。
【００５７】
さらに、「および／または」という用語は、本明細書において現れる際は常に、「および」、「または」、および、「該用語によって連結される要素の全てまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【００５８】
上記に言及された特許、刊行物、およびデータベース入口の開示の全ては、各々のそのような特許、刊行物、またはデータベース入口が特定的におよび個々に参照として組み入れられると示されたように、その全体を、同じ程度まで参照として本明細書において特定的に組み入れられる。
【００５９】
以下の実施例は、本発明をさらに例証するために役立つ。
【００６０】
実施例においては、以下の材料および方法が使用された。
【００６１】
1．分子生物学的技術
実施例において他に明言されない限り、全ての組換えDNA技術は、Sambrookら（1989）, 「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、または、Ausubelら（1994）, 「Current Protocols in Molecular Biology」, Current Protocols, 第1巻および第2巻において説明されるようなプロトコールに従って行われる。植物の分子研究のための標準の材料および方法については、BIOS Scientific Publications Ltd.(UK)とBlackwell Scientific Publications(UK)によって共同出版された、R.D.D. Croyによる「Plant Molecular Biology Labfase」 (1993)において説明されている。
【００６２】
2．植物材料
ジャガイモの植物体（Saatzucht Lange AG, Bad Schwartau, Germanyから入手したジャガイモ(Solanum tuberosum L.cv.Desiree)）を、2％スクロースを含むMS培地（MurashigeおよびSkoog, Physiologia Plantarum 15(1962), 473〜497）上における、16時間明条件、8時間暗条件下に置いた組織培養において維持した。温室内で、22℃にて最低250μmol/m2sの光量子を伴う同じ光条件下において植物を生長させた。本発明に関連して、「発達している塊茎」という用語は、健康な10週齢の植物体から収穫された（生重量10 gを越える）塊茎について使用される；「成熟塊茎」は、老化した植物体から収穫された塊茎を指すために使用される。
【００６３】
3．トランスジェニックアンチセンス系統の調製
ジャガイモのプラスチドのアデニル酸キナーゼをコードするcDNAを手に入れるために、Kossmann（Mol.Gen.Genet. 230(1992), 39〜44）において説明されるように調製されたジャガイモの塊茎のcDNAライブラリを、対応するトウモロコシ遺伝子（Shen, Plant Mol.Biol. 26(1994), 1085〜1101）に由来するプローブを用いてスクリーニングした。プローブは、アニーリング温度40℃およびプライマーM-AdK5’（配列番号：3）およびM-AdK3’（配列番号：4）を用いた40サイクルプログラムを使用した、トウモロコシのゲノムDNAからのPCR増幅によって調製され、その結果、対応するトウモロコシcDNA 配列（Genbank/EMBLデータベース登録T25266）から予測されたように、400 bpの断片が生じた。cDNAライブラリのスクリーニングは、65℃において3時間、デンハルト緩衝液を用いて実行し、洗浄し、陽性のファージについて画線培養し、クローンをインビボにて切り出した。真の陽性クローンを同定するために、これらはその後、EcoRIによって分解した。スクリーニングによって得られた陽性cDNAクローンは、トウモロコシ遺伝子との相同性によってプラスチドのアデニル酸キナーゼをコードするものとして同定された、pBluescriptSKのEcoRI/Xhol部位にクローニングされた約900 bpの断片（配列番号：1）を含む。
【００６４】
このcDNA断片は、Asp 718/Xbal部位において切り出し、図1において示されるように、CaMV 35Sプロモーターとocsターミネーターの間において、ベクターpBinAR-Kan（Liuら, Molecular and General Genetics 223(1990), 401〜406）の対応する制限部位に連結した。アグロバクテリウム仲介の形質転換プロトコール（Rocha-Sosaら, EMBO J. 8(1989), 23〜29）を適用することによって、この構築物をジャガイモ植物体に導入した。カナマイシン含有培地上にてトランスジェニック植物を選択した（Dietzら, 1995：「Gene transfer to plants XXII」, Potrykus, I.およびSpangenberg, G.編, Berlin, Springer-Verlag, pp.24〜29）。温室条件下にて3.5リットルのポットにおいて生長させた植物体から収穫された塊茎の個別の比重および収量を決定することにより、約80系統の最初のスクリーニングを行った。その後、温室において、最初に選択された9つの系統について、系統当たり6つの植物体からの塊茎および葉を用い、転写産物および酵素活性のレベルにつき第二のスクリーニングを行った。Schenborn（Nucl.Acids Res. 13(1985), 6223）、Krieg（Meth.Enzymol.155(1987), 397）およびプロメガ技術マニュアル（Promega technical manual ）#016において説明されるように、リボプローブ法を用いて、転写産物の決定（図2）を行った。
【００６５】
4．生化学的解析
Geigenbergerら（Planta 205(1999), 428〜437）において詳細を述べられるように、HPLCシステムを用いてヌクレオチドを解析した一方、Tretheweyら（Plant Cell and Environment 22(1999), 71〜79）において説明されるように、デンプン、糖類、アミノ酸、および解糖系代謝物を正確に決定した。
【００６６】
反復解析（実施例2）において、Geigenbergerら（Planta 205(1998), 428〜437）において説明されるように、デンプン、糖類、解糖系代謝物、およびヌクレオチドを正確に決定し、Geigenbergerら（Plant Cell and Environment 19(1996), 43〜55）において説明されるようにアミノ酸を決定した。KleczkowskiおよびRandall（Plant Physiol. 81(1986), 1110〜1114）のプロトコールによって、葉および塊茎の試料における、および、Taubergerら（Plant J. 23(2000), 43〜53）によって詳細を述べられるように単離された葉の葉緑体調製物における、アデニル酸キナーゼ活性を測定した。細胞質ゾルマーカー酵素によるこれらの調製物への混入は、野生型組織またはトランスジェニック組織のいずれにおいても10％を越えなかった。デンプン合成の他の酵素は、Fernieら（Planta 213(2001), 418〜426）において詳細を述べられるように測定された。
【００６７】
実施例1
トランスジェニックADKアンチセンスジャガイモ植物の形態学的解析および生化学的解析
本研究の目的は、ジャガイモの塊茎のアミロプラスト内における生合成経路に対するプラスチドのアデニル酸キナーゼの重要性を確立することであった。このために、ジャガイモのアデニル酸キナーゼ（StpADK）のプラスチドのアイソフォームをコードするcDNAがクローニングされた（配列番号：2において示される、推定されたアミノ酸配列を有する配列番号：1）。それは、機能的なプラスチドターゲティング配列（配列番号：2の1位〜78位）を有する。アンチセンスアプローチを用いて、上記にて説明されるように、StpADK遺伝子の発現の減少を示すトランスジェニック植物を作製した。したがって、これらの系統は、総アデニル酸キナーゼ活性の有意な低下（野生型の活性の75％まで低下）を示した。さらに、活性の損失がプラスチドに局在していたことが示され得た。プラスチドのADK活性が低下されている形質転換体系統は、一般に、形態学的には大きな変化を示さなかった。しかし、トランスジェニック植物の塊茎の形態は、野生型植物のものから逸脱している。特に、塊茎の比重は、野生型植物のものを超えて有意に増加している（表1を参照のこと）。
【００６８】
トランスジェニック塊茎に存在する代謝物を解析した場合、デンプン含量の著しい増加が明らかである（表2）。調べられたトランスジェニックアンチセンス系統の全ては、野生型塊茎のものを超えて162％までの範囲に渡る、生重量（FW）に関してグルコース（μmol）として測定されたデンプンの蓄積の増加を有意に示している。さらに、炭水化物合成経路の中間代謝物であるUDP-グルコース、グルコース-6-リン酸、3-ホスホグリセリン酸、トリオースリン酸、およびADP-グルコースの含量、およびアデニル酸の含量を決定した（表3）。
【００６９】
最も著しいのは、総アデニル酸（ANT）含量がかなり増加していることであり、これは、ADKによって触媒される反応から考えて、予測され得なかった結果である。同様に、トランスジェニック塊茎において認められたATP/ADP比率の減少は予測可能ではなかった。ADK活性の低下の結果としてさらに、トランスジェニック塊茎において、アミノ酸含量も明らかに上昇する（表4）。調べられたトランスジェニック植物の全ては、総アミノ酸含量の有意な増加を示した。ロイシン、メチオニン、およびトリプトファンのような必須アミノ酸の中でもとりわけ、あるアミノ酸は特に増加する一方、他のアミノ酸は野生型の塊茎と比較して、同等の濃度の範囲に留まったままである。結果として、プラスチドのADKの活性が抑制された植物において、デンプンおよびアミノ酸の含量が著しく増加することが認められた。デンプンおよびアミノ酸の双方の生合成は、プラスチドへのATPの供給に強く依存しており、それゆえに、これらの結果は、アデニル酸キナーゼが、インビボにおいて、ATPを消費する方向において作用することをも示唆している。したがって、プラスチドのアデニル酸キナーゼがプラスチドの生合成におけるエネルギー制約を表すに違いないと結論付けることが可能である。
【００７０】
【表１】
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上記表1はアンチセンスStpAdKトランスジェニック系統の収量、比重、平均塊茎サイズ、および数を示す。ジャガイモの植物体を温室内にて3.5リットルのポットにおいて生長させた。春に収穫された系統当たり10〜15個の植物体を用いて、完全に老化した植物体からの成熟した塊茎についての、トランスジェニック塊茎収量（総塊茎生重量）、塊茎数、および比重の決定を行った。値は、平均±SEである。¶は、本試験において、系統AdK-14についてはただ1つの植物体のみを解析したことを示す。
【００７１】
【表２】
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上記表2はアンチセンスStpADKトランスジェニック塊茎の炭水化物含量を示す。温室内にて2.5リットルのポットにおいてジャガイモの植物体を生長させた。生長10週後、秋に、発達している塊茎を収穫し、スクロース、グルコース、およびデンプンの含量を決定した。データはμmol/FW（g）として示され、系統当たり6つの個々の植物体についての測定の平均±SEを示す。
【００７２】
【表３】
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上記表3はアンチセンスStpADKトランスジェニック塊茎の代謝物含量を示す。ジャガイモの植物体は、温室内にて2.5リットルのポットにおいて生長させた。発達している塊茎を生長の10週後、秋に収穫し、代謝物含量を決定した。データは、nmol/g(FW)として示され、系統当たり6つの個々の植物体についての測定の平均±SEを示す。
【００７３】
【表４】
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上記表4はアンチセンスStpADKトランスジェニック塊茎のアミノ酸含量を示す。ジャガイモの植物体を温室内にて2.5リットルのポットにおいて生長させた。発達している塊茎を生長の10週後、春に収穫し、アミノ酸含量を決定した。データはμmol/g(FW)として示され、系統当たり6つの個々の植物体についての測定の平均±SEを示す。
【００７４】
実施例2
温室条件下および圃場試験におけるトランスジェニックADKアンチセンスジャガイモ植物体の反復解析
トランスジェニック系統AdK-20、AdK -4、AdK -2、およびAdK -24を再度、温室条件下および圃場試験において生長させ、調査し、形態学的パラメータおよび生化学的パラメータについて解析した。
【００７５】
トランスジェニック植物体を温室内において野生型対照植物体と共に生長させた場合、系統AdK-20またはAdK-4においては、植物の地上部または塊茎のサイズ、数、または形態のいずれかに関わる表現型の変化は認められなかったが、系統AdK-2における総塊茎収量、および、系統AdK-24における塊茎数および塊茎収量の双方においては、有意な増加が認められた（表5）。さらに、系統AdK-20、AdK-2、およびAdK-24においては、塊茎の個別の比重が増加しており、これらの系統が、より高いデンプン含量によって特徴付けられる可能性が最も高いことを示唆する。
【００７６】
【表５】
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上記表5はアンチセンスStpAdK植物の植物体当たりの収量、塊茎数、比重、およびデンプン収量を示す。ジャガイモの植物体は、温室内で2リットルのポットにおいて、または圃場条件下のいずれかにおいて生長させた。双方の場合において、完全に老化した植物体について測定を行った。データは、系統当たり6つの個々の植物体（温室試験）、または系統当たり8つの植物体（圃場試験）についての測定の平均±SEを示す；太字および下線を施された値は、t検定によって、野生型から有意に異なる（P ＜ 0.05）ことが決定された。n.m. = 未測定。
【００７７】
総アデニル酸キナーゼ活性は、葉において、野生型植物において認められる活性の67％まで、および、塊茎において同様の程度にまで低下することが認められた（表6）。
【００７８】
【表６】
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上記表6はアンチセンスStpAdKトランスジェニック系統における酵素活性を示す。活性は、6週齢の葉、または10週齢の塊茎において決定された。示されるデータは、系統当たり6つの個々の植物体についての測定の平均±SEである（葉緑体は、系統当たり4つの植物体からのみ単離された）。太字および下線を施した値は、t検定によって、野生型から有意に異なる（P ＜ 0.05）ことが決定された。n.m. = 未測定、Sol. = 可溶性、および、GB = 顆粒結合。Φ分枝酵素の活性は、グリコーゲンホスホリラーゼの倍化刺激として表される。
【００７９】
さらに、野生型植物およびトランスジェニック植物の双方の葉から単離された葉緑体をアデニル酸キナーゼについて解析することによって、この活性の損失がプラスチドに局在し、配列に基づいて推定される細胞内局在化と一致することが示された。系統AdK-24のAGPアーゼ活性が野生型に認められるものより有意に異なる（高い）ことを唯一例外として、デンプンの生合成経路の他の酵素の活性にはほとんど変化はなかった。
【００８０】
StpAdK活性の低下は、アデニル酸プールにおける一般的な増加をもたらす。上記に説明されるように、アデニル酸キナーゼは、ATP、ADP、およびAMPの相互転換の触媒作用をする。アデニル酸キナーゼ活性の低下の、アデニル酸プールに対する影響を解析するために、反応に直接関与する3つの代謝物の全て、および、ADP-グルコースの定常状態のレベルを決定した。プラスチドのアデニル酸キナーゼ活性の低下は、様々なアデニル酸プールのレベルにおける明らかな変化を導いた（図3）。より大きな変動によってその増加は統計的には有意ではなかったが、個々のアミノ酸の増加したプールサイズに基づいて予測されるように、最も強く阻害された系統の1つにおいてのみ、塊茎の総アミノ酸含量がある傾向に従った増加を同様に示した。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】構成的なCaMV 355プロモーター（Franck, Cell 21(1980), 285〜294）と根頭癌腫病菌オクトピン合成酵素遺伝子ターミネーター（ocs）との間にアンチセンスの方向にクローニングされた、ジャガイモのプラスチドのアデニル酸キナーゼ（StpADK）のcDNA配列を含むベクターpBinAR-Kanのマップを示す。
【図２】野生型系統およびトランスジェニック系統からの葉におけるStpADKの転写産物レベルのノーザンブロットを示す。プローブは、リボプローブ法によってStpADKをコードする全長cDNAから作製された。
【図３】トランスジェニック系統のアデニル酸含量を示す。データは、系統当たり6つの個々の植物体の平均±SEとして示される。
【図４】トランスジェニック系統のデンプン含量を示す。デンプンは、図3において示されるアデニル酸の解析に使用された、発達している塊茎からの同じ試料において決定された。データは、系統当たり6つの個々の植物体の平均±SEとして示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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