(57)【要約】本発明は、非アミノ酸型または非ペプチド型基質模倣物と結合したペプチダーゼの助力をともなってプローブおよびレポーター分子を用いた、ペプチドおよびタンパク質の領域特異的修飾方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アミノ酸様基質模倣物または非ペプチド様基質模倣物と組み合わされたペプチダーゼが生体触媒として使用されることを特徴とするペプチドおよびタンパク質の生体触媒的修飾方法。
【請求項２】
カルボン酸エステルがアシル化成分として使用され、該カルボン酸エステルのアシル部分が修飾基に対応し、該カルボン酸エステルの脱離基が触媒のために使用されるペプチダーゼの特異性決定基を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
反応が、室温で水性媒体内で行われるか、または凍結水性系すなわち、−５〜−２０℃の低温で行われることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
とりわけ、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｇｌｕ−特異的エンドペプチダーゼ、サブチリシンもしくはこれらの酵素の変異体または類似した特異性決定基を有する酵素がペプチダーゼとして使用されることを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
ペプチダーゼがマーカー基およびレポーター基をペプチドおよびタンパク質に生体触媒的に導入するために使用されることを特徴とする、ペプチダーゼの使用。
【請求項６】
ペプチダーゼが、ペプチドおよびタンパク質へのマーカー基およびレポーター基の生体触媒的導入のために使用され、かつ導入されるマーカー基またはレポーター基が、使用される酵素の天然の特異性をブロックする、脱離基としてのエステル誘導体を保持するという事実により、前記基の可逆的な酵素的切断が回避されることを特徴とする、請求項５記載のペプチダーゼの使用。
【請求項７】
トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｇｌｕ−特異的エンドペプチダーゼ、サブチリシンもしくはこれらの酵素の変異体または類似した特異性決定基を有する酵素がペプチダーゼとして使用されることを特徴とする、請求項５または６記載のペプチダーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生体触媒を用いたプローブおよびレポーター分子によるペプチドおよびタンパク質の位置特異的修飾のための方法に関する。
【０００２】
ヒトおよび他の生物のゲノムの配列決定は、多くの場合、生化学的機能が適切に解明されていないかまたは全く不明である非常に大量のタンパク質配列を生じている。タンパク質は、機能的遺伝子産物であり、従って生物界の全ての活性を担う。この理由のために、タンパク質構造および機能の理解は、現代の生物学的研究に絶対的に必須である（Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３参照）。分子を損傷しない特別なプローブおよびレポーター基をによる標的化標識は、インビトロおよびインビボで分子プロセスをモニターするためにかかる調査に必須である。主要な方法は、とりわけ、蛍光標識（Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．， １９９６参照）、スピン標識の導入（Ｗ．Ｌ． Ｈｕｂｂｅｌ， Ｃ． Ａｌｌｅｎｂａｃｈ， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆＳｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｕｓｉｎｇ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｓｐｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ４（１９９４） ５６６−５７３）、光親和性標識（Ｄ．Ｉ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｗ．Ｃ． Ｐｒｏｂｓｔ， Ｇ．Ｋ．Ｅｈｒｌｉｎｇ， Ｇ． Ｓｉｎｇｈ， Ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ４９（１９８８） ７８５−８０４）および「ビオチン技術」（Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ， Ｅ．Ａ． Ｂａｙｅｒ， Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖ．１８４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９０）である。
【０００３】
ペプチドおよびタンパク質を修飾する化学的方法はタンパク質研究において重要な役割を果たしてきたし、なおも重要な役割を果たしている（Ｔ．Ｉｍｏｔｏ， Ｈ． Ｙａｍａｄａ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，編）． ｐ．２４７−２７７， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８９； Ｇ．Ｅ． Ｍｅａｎｓ，Ｒ．Ｅ． Ｆｅｅｎｅｙ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ， １９７１参照）。それゆえ、過去１０年で完全なシグナル割当が可能になり、従って１５０〜２００アミノ酸までの構築ブロックを含むタンパク質の３Ｄ構造の解明が可能になったＮＭＲ技術における急速な発達にも関わらず、大きなタンパク質の構造が、非常に多くの場合に得られ得ないタンパク質の結晶を必要とするＮＭＲおよびＸ線構造解析により解析され得ないので、化学修飾が溶液中の空間的構造を決定するためのツールとして依然として使用されている。
【０００４】
Ｎ末端のα−アミノ基が選択的修飾の好ましい標的であるので、タンパク質およびペプチドにおける遍在性リジン残基のεアミノ基は、マーカー基およびレポーター基または他の誘導体化、例えば、Ｎ末端でのペジル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）の標的導入を許容しない。化学的アシル化反応は、無水物を用いて、または好ましくは、タンパク質を生成する（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸残基の他の側鎖基とも反応し、従って選択的なＮα修飾を可能にしないＮ−ヒドロキシスクシニミドまたは４−ニトロ−フェニルエステル等の活性エステルを用いて行われる。フェニルアセチル残基のみが、その天然の作用を逆転させることによる特異性決定様式でペニシリンアシラーゼによりペプチド合成においてアミノ酸のための保護基として酵素的に挿入されており（Ｒ．Ｄｉｄｚｉａｐｅｔｒｉｓ， Ｂ．Ｄｒａｂｎｉｇ， Ｖ．Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｈ．−Ｄ． Ｊａｋｕｂｋｅ， Ｖ． Ｓｖｅｄａｓ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８７ （１９９１） ３１−３３）、同酵素により切断されている（Ｒｅｖｉｅｗ： Ａ．Ｒｅｉｄｅｌ， Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ， Ｊ．ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍ． ３３５（１９９３） １０９−１２７参照）。保護基のこの直接導入以外は、ペプチダーゼ触媒により既にＮ末端を標識された、必然的に不可逆的でないペプチダーゼ特異的アミノ酸残基とのＰ１位におけるアミノ酸またはペプチド誘導体の転移に基づく方法しか記載されていない。対照的に、ペプチドおよびタンパク質セグメントのＣＮ連結のために開発された基質模倣概念（Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａ，Ｄ．Ｕｌｌｍａｎｎ， Ｃ．Ｅｌｓｎｅｒ Ｈ．−Ｄ． Ｊａｋｕｂｋｅ， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． １０９ （１９９７） ２５８３−２５８５；Ｒｅｖｉｅｗ：Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａ， Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ． ７２ （２０００） ４６９−４８５）は不可逆性の利点を有する。
【０００５】
本発明の目的は、可能な限り二次反応を排除した、Ｎ末端でのペプチドおよびタンパク質の位置特異的な生体触媒的修飾である。
【０００６】
本目的は、非アミノ酸様または非ペプチド様基質模倣物と組み合わせて生体触媒としてペプチダーゼを使用する、ペプチドおよび／またはタンパク質の選択的な生体触媒的修飾のための方法により達成される。用語「基質模倣物（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、Ｂｏｒｄｕｓａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ． １０９ （１９９７）， ２５８３−２５８５およびＢｏｒｄｕｓａら、ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｃｈ， ３６ （１９９７）， ２４７３−２４７５により造られた。用語、脱離基は、当業者に公知であり、Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（上記を参照）により説明される（特に図１）。
【０００７】
本発明により、ペプチドまたはタンパク質のＮ−末端の生体触媒修飾は、当業者間で一般的な意見とは対照的にペプチダーゼを用いることにより達成され、このプロセスにおいて導入対象の非アミノ酸様基または非ペプチド様基は、酵素の天然の特異性をブロックするエステル誘導体の形態の脱離基を保有するように特異的に操作され、従って、不可逆的なＮα−アシル化の触媒を可能にする。理論的な基礎、仮定される反応機構および種々のプロテアーゼおよびペプチダーゼの基質模倣物の調製は、Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａ，Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３ （２０００）， ４６９−４８５による総説論文に記載されている。化学的アシル化反応とは対照的に、ペプチダーゼの位置特異性は、対応するペプチドまたはタンパク質のＮαアミノ基上のマーカー基およびレポーター基の絶対的な選択的導入を保証する修飾対象のペプチドおよびタンパク質における三官能性アミノ酸構築ブロックの反応性側鎖機能がアシル化されないという結果を有する。さらに、修飾対象である基は、文献において公知の方法のために必須であり、可逆的な切断を受けやすい酵素的な連結対象のアミノ酸またはペプチド残基に結合する必要はもうない。
【０００８】
本発明の結果は非常に驚くべきことである。なぜなら、本発明によるマーカー基またはレポーター基の生体触媒的導入の後、そのために使用されたペプチダーゼは、もはやかかる置換アミド結合を基質として認識せず、従って可逆的酵素切断を防止する。全ての考えられるマーカー基またはレポーター基が、アミノベンジル基、フロレチル（ｐｈｌｏｒｅｔｈｙｌ）基およびビオチニル基等のマーカー基またはレポーター基として使用されうる。特に、ハプテン等のペプチドまたはタンパク質の診断的使用に必要とされるマーカー基（ビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ジギトキシン等）または標識（色素、放射性標識化合物、蛍光基、電気化学発光標識（Ｅｌｅｃｓｙｓ）、発光団等）を使用することができる。物質はまた、溶解性等のタンパク質の特性を変化または改善するマーカー基またはレポーター基として選択されうる。特に、エリスロポエチン、インスリン、モノクローナル抗体または他の治療的に有効なタンパク質およびペプチド等のタンパク質またはペプチドの特性を至適化するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体等の物質を使用することが可能である。かかる治療用タンパク質およびペプチドならびに治療効力を至適化するための物質の例は、当業者に公知である。
【０００９】
そのアシル残基が、導入対象であるマーカー基またはレポーター基に対応し、かつその脱離基が選択されたセリンまたはシステインペプチダーゼの特異性決定基を保有する有機化学エステル誘導体は、本発明の生体触媒的Ｎα−アシル化のために好適に使用される。用語、脱離基および特異性決定基は、当業者に公知である（例えば、Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａ， Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．参照（上記参照））。Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａにより記載されたように、脱離基は、通常の基質の特異性媒介アミノ酸側鎖の代わりに基質模倣物に結合する（Ｔｈｏｒｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８ （１９９９）， ６０５６−６０６２）。従って、基質模倣物の重要な特性は、それぞれの酵素の一次基質特異性についての（例えば、触媒中心のＳ１部位でのＶ８プロテアーゼの強いＧｌｕ優先性についての）脱離基の高親和性である。基質模倣物に関するかかる脱離基の発見、試験および最適化は、Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．に記載されている（上記参照）。
【００１０】
実際的な手順、すなわち、カルボン酸エステルの形態での酵素的なＮα−アシル化のために使用される基質の選択および合成、緩衝液系の選択、反応時間等は、比較的重要ではなく、酵素的変換の当業者によって容易に決定されうる。
【００１１】
本発明によれば、ペプチドおよびタンパク質のＮα−選択的修飾は、適切なペプチダーゼの存在下、室温の溶液中または凍結状態すなわち低温で、その反応性カルボキシル官能基が、使用されるペプチダーゼに対応する脱離基における特異性決定基を含むエステルとして存在するカルボン酸誘導体、ならびに反応性α−アミノ官能基がブロックされていない標識対象のペプチドまたはタンパク質を用いて達成される。適切なペプチダーゼは、例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＧｌｕ−特異的エンドペプチダーゼ、サブチリシン、トリプシン変異体トリプシンＤ１８９Ｋ＋Ｋ６０Ｅ（調製については実施例９参照）等のこれらの酵素の変異体または類似した特異性決定基（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）を有する酵素である。本記載において、用語ペプチダーゼは、プロテアーゼの代わりに命名法に従って使用される。
【００１２】
ペプチド結合が、導入のために使用されるセリンペプチダーゼまたはシステインペプチダーゼの特異性に対応する修飾対象のペプチドまたはタンパク質中に存在する場合、標的配列中のいずれの感受性ペプチド結合をも切断し得ない非ペプチド性アシルドナーの脱離基中の対応する特異性決定基を有する別のペプチダーゼが使用されるか、または所望されないタンパク質分解性切断および高反応速度を妨げる凍結状態で生体触媒的修飾が行われる（総説については、Ｍ．Ｈａｅｎｓｌｅｒ，Ｊ．−Ｄ． Ｊａｋｕｂｋｅ， Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．２ （１９９６） ２７９−２８９）。
【００１３】
修飾されたペプチドおよびタンパク質は、タンパク質化学の従来の方法により分離および精製されうる。
【００１４】
本発明は、実施例を基礎として以下にさらに説明される。
【００１５】
実施例１−ペプチドへの２−アミノ安息香酸のＶ８プロテアーゼ触媒Ｎ−末端導入
モデル反応のために、２−アミノ安息香酸カルボキシメチルチオエステル（以下では２−ＡＢｚ−ＳＣｍと呼ぶ）を、カルボキシ成分として使用し、デカペプチド、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙをアミノ成分として使用した。２−ＡＢｚ−ＳＣｍおよびアミノ成分を４ｍＭおよび２ｍＭのそれぞれの濃度で２：１の比で使用した。少量の有機溶媒を含む水性緩衝液系を溶媒として使用した。反応を、酵素を添加することにより開始し、２−ＡＢｚ−ＳＣｍのほぼ完全な変換の後に酵素を不活化することにより終結させた。反応をクロマトグラフィー法により解析し、定量化した。酵素的触媒は、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの対応するＮ−末端２−ＡＢｚ−修飾アナログへのほぼ９９％の変換を導いた。合成産物の同定を有機化学の従来の方法により調べた。
【００１６】
実施例２−ペプチドへのフロレチル基のＶ８プロテアーゼ触媒Ｎ−末端導入
モデル反応のために、フロレチル−カルボキシメチルチオエステル（以下ではフロレチル−ＳＣｍと呼ぶ）をカルボキシ成分として使用し、デカペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙをアミノ成分として使用した。フロレチル−ＳＣｍおよびアミノ成分を４ｍＭおよび２ｍＭのそれぞれの濃度で２：１の比で使用した。少量の有機溶媒を含む水性緩衝液系を溶媒として使用した。反応を、酵素を添加することにより開始し、フロレチル−ＳＣｍのほぼ完全な変換の後に酵素を不活化することにより終結させた。反応を、クロマトグラフィー法により解析し、定量化した。酵素的触媒は、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの対応するＮ−末端フロレチル−修飾アナログへのほぼ９９．７％の変換を導いた。合成産物の同定は、有機化学の従来法により調べた。反応は、アミノ成分に位置するリジンのＮε−修飾もアスパラギン酸の後の検出可能なタンパク質分解性切断も生じなかった。
【００１７】
実施例３−２−アミノ安息香酸のペプチドへのα−キモトリプシン−触媒Ｎ−末端導入
モデル反応のために、２−アミノ安息香酸−４−グアニジノフェニルエステル（以下では２−ＡＢｚ−ＯＧｐと呼ぶ）をカルボキシ成分として使用し、オリゴペプチドＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒをアミノ成分として使用した。２−ＡＢｚ−ＯＧｐおよびアミノ成分を４ｍＭおよび２ｍＭのそれぞれの濃度で２：１の比で使用した。少量の有機溶媒を含む水性緩衝液系を溶媒として使用した。反応を、酵素を添加することにより開始し、２−ＡＢｚ−ＯＧｐのほぼ完全な変換の後に酵素を不活化することにより終結させた。反応を、クロマトグラフィー法により解析し、定量化した。酵素的触媒は、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒの対応するＮ−末端２−ＡＢｚ−修飾アナログへのほぼ９８．８％の変換を導いた。合成産物の同定は、有機化学の従来法により調べた。反応は、三官能性側鎖修飾も検出可能なタンパク質分解性切断も生じなかった。
【００１８】
実施例４−ペプチドへのフロレチル基のα−キモトリプシン−触媒−Ｎ−末端導入
モデル反応のために、フロレチル−４−グアニジノフェニルエステル（以下ではフロレチル−ＯＧｐと呼ぶ）をカルボキシ成分として使用し、オリゴペプチドＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒをアミノ成分として使用した。フロレチル−ＯＧｐおよびアミノ成分を４ｍＭおよび２ｍＭのそれぞれの濃度で２：１の比で使用した。少量の有機溶媒を含む水性緩衝液系を溶媒として使用した。反応を、酵素を添加することにより開始し、フロレチル−ＯＧｐのほぼ完全な変換の後に酵素を不活化することにより終結させた。反応を、クロマトグラフィー法により解析し、定量化した。酵素的触媒は、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの対応するＮ−末端フロレチル−修飾アナログへのほぼ９９．３％の変換を導いた。合成産物の同定は、有機化学の従来法により調べた。反応は、三官能性側鎖の修飾も検出可能なタンパク質分解性切断も生じなかった。
【００１９】
実施例５−ペプチドへの２−アミノ安息香酸のトリプシン−触媒Ｎ−末端導入
モデル反応のために、２−アミノ安息香酸−４−グアニジノフェニルエステル（以下では２−ＡＢｚ−ＯＧｐと呼ぶ）をカルボキシ成分として使用し、デカペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙをアミノ成分として使用した。２−ＡＢｚ−ＯＧｐおよびアミノ成分を４ｍＭおよび２ｍＭのそれぞれの濃度で２：１の比で使用した。少量の有機溶媒を含む水性緩衝液系を溶媒として使用した。反応を、酵素を添加することにより開始し、２−ＡＢｚ−ＯＧｐのほぼ完全な変換の後に酵素を不活化することにより終結させた。反応を、クロマトグラフィー法により解析し、定量化した。酵素的触媒は、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの対応するＮ−末端２−ＡＢｚ−修飾アナログへのほぼ９４．４％の変換を導いた。合成産物の同定は、有機化学の従来法により調べた。
【００２０】
実施例６−ペプチドへのフロレチル基のトリプシン触媒Ｎ−末端導入
モデル反応のために、フロレチル−４−グアニジノフェニルエステル（以下ではフロレチル−ＯＧｐと呼ぶ）をカルボキシ成分として使用し、デカペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙをアミノ成分として使用した。フロレチル−ＯＧｐおよびアミノ成分を４ｍＭおよび２ｍＭのそれぞれの濃度で２：１の比で使用した。少量の有機溶媒を含む水性緩衝液系を溶媒として使用した。反応を、酵素を添加することにより開始し、フロレチル−ＯＧｐのほぼ完全な変換の後に酵素を不活化することにより終結させた。反応をクロマトグラフィー法により解析し、定量化した。酵素的触媒は、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙの対応するＮ−末端フロレチル修飾アナログへの定量的な変換を導いた。合成産物の同定は、有機化学の従来法により調べた。
【００２１】
実施例７−大腸菌パルブリン１０のビオチン化
モデル反応のために、ビオチニル−４−グアニジノフェニルエステル（以下ではビオチニル−ＯＧｐと呼ぶ）をカルボキシ成分として使用し、タンパク質大腸菌パルブリン１０をアミノ成分として使用した。ビオチニル−ＯＧｐおよびパルブリンを２ｍＭおよび８ｍＭのそれぞれの濃度で１：４の比で使用した。少量の有機溶媒を含む水性緩衝液系を溶媒として使用した。詳細には、０．１ＭＨＥＰＥＳ（Ｎ２−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）緩衝液ｐＨ８．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１ＭＣａＣｌ２および８％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）を使用した。反応を、酵素トリプシンＤ１８９Ｋ＋Ｋ６０Ｅ（１８９位のアミノ酸ＤがＫに置換されているか、６０位のアミノ酸ＫがＥに置換されているトリプシン変異体；調製については実施例９を参照）を添加することにより開始し、２時間の反応時間の後に終結させた。酵素を６．５ｘ１０−６Ｍの濃度で使用した。反応をＭＡＬＤＩ−ＭＳ分光法により解析し、定量した（図１）。酵素的触媒は、大腸菌パルブリン１０のＮ−末端ビオチン化ビオチニル−（大腸菌パルブリン１０）への変換を導いた。
【００２２】
大腸菌パルブリン１０の一次配列は公知であり、以下のアミノ酸配列に相当する。
【００２３】
2004509973.tif 000002
【００２４】
実施例８−ＲＮａｓｅＴ１のビオチン化
モデル反応のために、ビオチニル−ＯＧｐをカルボキシ成分として使用し、タンパク質ＲＮａｓｅＴ１をアミノ成分として使用した。ＲＮａｓｅＴ１のバリアントを、タンパク質のＮ−末端のさらなるＡｒｇ（Ｒ）−Ｇｌｙ（Ｇ）でのビオチン化のために使用した。しかし、前駆体タンパク質のインビボプロセシングにおける差異により、所望のＲＮａｓｅＴ１バリアント（ＲＧ−ＲＮａｓｅＴ１）に加えて１アミノ酸短くなった種（Ｇ−ＲＮａｓｅＴ１）ならびに野生型（ＲＮａｓｅＴ１）を得た。この混合物を、酵素−触媒ビオチン化のために個々のバリアントにさらに分離することなく使用した。ビオチニル−ＯＧｐおよびＲＮａｓｅＴ１混合物を２ｍＭおよび８ｍＭのそれぞれの濃度で１：４の比で使用した。実施例７に記載されるように水性緩衝液系を溶媒として使用した。反応を、酵素トリプシンＤ１８９＋Ｋ６０Ｅ（６．５ｘ１０−６Ｍ）を添加することにより開始した。反応時間は２時間であった。反応をクロマトグラフィー法により解析し、定量化した。キャピラリー電気泳動の電気泳動図を図２に示す。ＲＧ−ＲＮａｓｅＴ１がほぼ定量的にビオチン化−ＲＧ−ＲＮａｓｅＴ１に変換されたことが明かに理解されうる。
【００２５】
実施例９−トリプシン変異体Ｄ１８９Ｋ＋Ｋ６０Ｅの調製
プラスミド
大腸菌ベクターｐＳＴを部位特異的変異誘発のために使用した。これは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの一部、ならびにα因子リーダーおよびＡＤＨ／ＧＡＰＤＨプロモーターと融合させた陰イオン性ラットトリプシンをコードする遺伝子を含む。
【００２６】
前記タンパク質は、ｐＹＴプラスミド、ウラシル−およびロイシン欠乏培地のための選択マーカーを有するｐＢＳ２４誘導体の助力により発現された。
【００２７】
ｐＳＴおよびｐＹＴプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を有する。対応する切断部位を伴った両方のベクター、すなわち、プラスミドｐＳＴ（５．４ｋｂ）およびｐＹＴ（１４ｋｂ）の地図は、図３に示される。
【００２８】
変異誘発
部位特異的変異誘発を、大腸菌プラスミドｐＳＴにおいてＱｕｉｋ ｃｈａｎｇｅ（登録商標）キット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いて行った。
【００２９】
手順は、ｐＳＴベクターの両方のプラスミド鎖が、所望の変異を含む２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて開始してＰＦＵポリメラーゼにより複製されるＰＣＲの手順の通りであった。野生型ｐＳＴは、個々の変異を生じるテンプレートとして働いた。これらの単一変異体は、次いで二重変異体を構築するための開始点であった。
【００３０】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ここで太字の文字は変異を示す：
2004509973.tif 000003
【００３１】
得られるＰＣＲ産物で、超形質転換受容性（ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＸＬＩＩブルー細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を形質転換した。引き続く選択を、アンピシリン含有栄養アガープレート（ＬＢ−ａｍｐ）において行った。選択したコロニーをアンピシリンを含む液体培地（ＬＢ−ａｍｐ）に移し、プラスミドを培養の１日後ＳＮＡＰ−キット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＥ）を用いて単離した。単離したＤＮＡを１％アガロースゲルを用いて電気泳動により調べた。完全な遺伝子を配列決定することにより、所望の変異のみが得られることを保証することができた。
【００３２】
サブクローニング
ｐＹＴ発現ベクターにおけるサブクローニングは、ｐＳＴプラスミドにおいて生じた全ての変異体のために必要であった。これは、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩでの制限消化および対応するｐＹＴベクター断片への連結により行った。適切な制限混合物中の全てのベクター断片を低融点アガロースゲル（０．８％）に適用し、適切な分離の後に切断した。ゲル切片を５５℃で融解させ、所望の組み合わせに従ってプールし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一晩連結した。再び必要であった形質転換およびプラスミド単離を上記のように行った。
【００３３】
首尾良いサブクローニングを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでの二重消化の後に特徴的な制限パターンによってアガロースゲル中でテストした。
【００３４】
完全なトリプシノーゲン遺伝子を配列決定することにより、所望の変異のみが得られることを保証することができた。
【００３５】
酵母形質転換および選択
使用した酵母細胞株を、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＤＬＭ １０１α ［Ｍａｔ ａ， ｌｅｕ２−３， −１１２ ｈｉｓ ２， ３−１１，−１５ ｃａｎ １， ｕｒａ ３Δ， ｐｅｐ４Δ， ［ｃｉｒ０］， ＤＭ２３］。ＥＺ酵母形質転換キット（ＺＹＭＯ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、形質転換受容性酵母細胞を調製し、ｐＹＴプラスミドを形質転換した。選択を、３０℃で３〜４日間のインキュベーションによりウラシル−欠乏ＳＣプレートにおいて行った。ロイシン−欠乏ＳＣプレートに、個々のコロニーを播種し、また３０℃で３〜４日間インキュベートすることで細胞内のプラスミドのコピー数の増大を導いた。これらのプレートの個々のコロニーを用いて、８％グルコースを含むロイシン欠失ＳＣ液体培地のプレ培養物に播種した。それらを、３０℃で１２０ｒｐｍで３日間振盪することによりインキュベートした。２０ｍｌのプレ培養物を種菌として使用し、ＹＰＤ培地を含む１リットルのメイン培養物（１％グルコース、１％バクトペプトン、０．５％酵母抽出物）に播種した。インキュベーションパラメータはプレ培養のものに一致し、それらを４日後に収穫した。
【００３６】
トリプシンバリアントの単離および精製
細胞を４０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により最初に分離し、上清をｐＨ４．０に調整し、１２０００ｒｐｍで再び遠心分離した。トリプシノーゲンを含むほぼ粒子を含まない上清を、２ｍＭ酢酸ナトリウム／１００ｍＭ酢酸（ｐＨ４．５）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ（ＳＵＰＥＬＣＯ）カチオン交換カラムに適用した。２ｍＭ酢酸ナトリウム／１００ｍＭ酢酸（ｐＨ４．５）から開始して２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）までの線状ｐＨグラジエントによって溶出した。
【００３７】
トリプシノーゲンを含む画分を決定し、１５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりプールした。タンパク質溶液の容積を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器（ＡＭＩＣＯＮ）によって約１０〜１５ｍｌに濃縮した。
【００３８】
トリプシノーゲンバリアントの対応するトリプシンＤ１８９Ｋ＋Ｋ６０Ｅへの活性化を、ｐＨ６．５で高度に精製されたエンテロキナーゼ（ＢＩＯＺＹＭＥ）を用いて行い、ＳＤＳゲル電気泳動によりモニターした。
【００３９】
活性化酵素をＢｉｏｃａｄＳｐｒｉｎｔパーフュージョンクロマトグラフィーシステム（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて精製した。タンパク質サンプルを、５％Ｂｉｓ／ＴｒｉｓプロパンｐＨ６．０で平衡化したＰＯＲＯＳ２０ＨＱ−アニオン交換カラム（４ｘ１００ｍｍ、ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）および引き続く９５％までの３Ｍ ＮａＣｌ溶液グラジエント溶出により分離した。トリプシンを含む画分をＳＤＳゲルを用いて調べ、プールした。それらを、その後１ｍＭＨＣｌに対して４℃で透析し、サンプルをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器で２〜４ｍｌに濃縮した。
【００４０】
最終収率は、１リットルの培養培地当たり約２〜５ｍｇタンパク質であった。
【００４１】
濃度の測定
調製物のタンパク質濃度を、５９５ｎｍの波長で分光光度計においてＢｒａｄｆｏｒｄの方法に従って測定した。検量線を、５０μｍ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのウシトリプシンの系列希釈に基づいてプロットした。
【図面の簡単な説明】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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