(57)【要約】ＢｉＡｂと活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）との接合化によって、養子性免疫療法を成功させるための主要な障害が克服された。ＢｉＡｂを用いた方法は、モノクローナル抗体の標的特異性および腫瘍を溶解させるＴ細胞の細胞傷害性能力を利用している。ＢｉＡｂとＡＴＣとの接合化は、Ｔ細胞の全てを抗原特異性ＣＴＬとし、このような細胞の注入は、がん患者のＣＴＬの実効先駆体周波数を著しく増加させる。さらに、このような接合化ＡＴＣの腫瘍排除能力は、ＢｉＡｂと再び接合していないＡＴＣよりも数倍高く、この接合化ＡＴＣは、殺腫瘍性サイトカイン、そしてモカインを分泌し、最後の注入から８日間患者の体内に、または処置を停止してから１０週間以上ベージュ／ＳＣＩＤマウスの内に生存する。注入後、ベージュ／ＳＣＩＤ内の細胞の残留性は、宿主中で長期生存能力を示した。腫瘍細胞に対する細胞傷害の３サイクルの後に接合化ＡＴＣを再び刺激すると、接合化ＡＴＣはインターフェロンγを分泌した。これは、複数回にわたって抗原に暴露した細胞組成物の腫瘍特異的免疫応答が発達したことを示している。つまり、接合化ＡＴＣは、細胞傷害性「薬剤」として作用し、複数回にわたり腫瘍を排除し（直接排除）、排除後分裂し（生体内のエフェクター：標的比を増加させる）、そして、殺腫瘍性サイトカインを分泌して（間接排除）、腫瘍部位にてケモカインを分泌し（腫瘍溶解物に対して患者を免疫化するためにナイーブＴ細胞および抗原提示細胞を補充する）、数週間から数ヶ月にわたり患者および動物モデルに残留する（長期生存）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者から抹消血単核細胞を単離する工程と、
溶解性抗ＣＤ３モノクローナル抗体での生体外刺激によってＴ細胞を活性化し、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で上記活性化Ｔ細胞を成長させる工程と、
腫瘍細胞の腫瘍関連抗原およびＴ細胞のＴ細胞受容体複合体と結合することのできる二重特異性抗体と活性化Ｔ細胞とを接合する工程であって、ここで、二重特異性抗体は上記Ｔ細胞および上記腫瘍細胞、および／またはＦｃ受容体陽性細胞および腫瘍細胞と結合しており、腫瘍標的と上記抗体との結合によって上記Ｔ細胞が活性化して、上記Ｔ細胞およびＦｃ受容体陽性細胞が上記腫瘍に再方向化し、上記活性化接合化Ｔ細胞によって上記腫瘍細胞が排除される工程と、
二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を含む自家細胞の組成物を患者に再注入する工程と、
を含む、癌患者を処置する方法。
【請求項２】
上記方法はさらに、少なくとも約７日間ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと共に培養して、少なくとも追加の約２日間はＴＮＦαと共に、またはなしで培養した自家樹状細胞の組成物、および二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を、腫瘍動脈内または腫瘍部位に皮下同時注入または同時注射する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記樹状細胞および二重特異性抗体と接合した活性化Ｔ細胞は異質遺伝子型ドナーに由来している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を含む自家細胞の組成物を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦまたは他の免疫増大サイトカインと共に、またはなしで、このような治療を必要とする患者に再注入する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を含む異質遺伝子型細胞の組成物を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦまたは他の免疫増大サイトカインと共に、またはなしで、このような治療を必要とする患者に再注入する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
上記二重特異性抗体は２つのモノクローナル抗体からなる、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
上記二重特異性抗体のそれぞれの特異性は、腫瘍抗原およびＴ細胞受容体複合体に方向性を持っている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記モノクローナル抗体は化学的にヘテロ共役し、二重特異性抗体を形成している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記二重特異性抗体は、任意の腫瘍関連抗原に方向性を持つモノクローナル抗体からなる、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項１０】
上記二重特異性抗体の抗Ｔ細胞受容体モノクローナル抗体成分は、Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３に対して方向性を持っている、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍のＴ細胞媒介細胞傷害性は免疫抑制患者に生じる、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞媒介細胞傷害性は、異常細胞増殖または成長に関連した疾患に感受性の患者または該疾患を患っている患者に生じる、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項１３】
このような治療を必要とする患者に使用するために、上記接合化Ｔ細胞を凍結し、解凍する、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項１４】
上記Ｔ細胞は、Ｔ細胞１００万個当たり約０．５ｎｇ〜約５００ｎｇの用量の二重特異性抗体と接合する、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項１５】
約２５：１のエフェクター：標的比において、腫瘍標的に対して少なくとも約３０％の特異的細胞傷害性レベルの％を達成するように、解凍した分割量の患者活性化Ｔ細胞を滴定することによって、接合化用量を各個人の患者に最適化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
注入用量は少なくとも約２０億個の接合化Ｔ細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記患者は少なくとも約４回の注入を受ける、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記Ｔ細胞はＣＤ３／ＣＤ８陽性である、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記Ｔ細胞はＣＤ３／ＣＤ４陽性細胞である、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項２０】
患者からの上記接合化Ｔ細胞を、他の形態の治療および／または免疫担当ナイーブＴ細胞、および免疫担当ナイーブＢ細胞と共に同時投与する、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項２１】
自家細胞または異質遺伝子型細胞、二重特異性抗体と接合した活性化Ｔ細胞を、このような治療を必要とする患者に投与することを含む、
異常細胞成長および増殖によって特徴付けられる疾患を患っている哺乳類または、疾患に感受性の哺乳類を処置するための組成物。
【請求項２２】
上記組成物はさらに、同時注入前にケモカインおよびサイトカインと共に少なくとも約７日間培養した樹状細胞、および／または免疫担当ナイーブＴ細胞、および免疫担当ナイーブＢ細胞を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
上記樹状細胞を培養するために使用された上記ケモカインおよびサイトカインは、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−αからなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
上記樹状細胞を培養するために使用された上記ケモカインおよびサイトカインは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦからなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
上記組成物は、二重特異性抗体と接合した自家活性化Ｔ細胞、自家免疫担当ナイーブＴ細胞、および自家免疫担当ナイーブＢ細胞と共にこのような治療を必要とする患者に同時注入した自家樹状細胞を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
上記組成物は異質遺伝子型細胞である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
上記組成物は、二重特異性抗体と接合した活性化Ｔ細胞と共に同時注入した樹状細胞を含む、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
同時注入の前に少なくとも約７日間、ケモカインおよびサイトカインと共に樹状細胞を培養する、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２９】
上記樹状細胞を培養するために使用された上記ケモカインおよびサイトカインは、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αからなる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
上記樹状細胞を培養するために使用された上記ケモカインおよびサイトカインは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦからなる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
癌患者から抹消血単核細胞を単離する工程と、
溶解性または固体支持体に固定された抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ８モノクローナル抗体での生体外刺激によってＴ細胞を活性化させ、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で上記活性化Ｔ細胞を成長させる工程と、
抗体のＦｃ部分を介して、Ｔ細胞のＴ細胞受容体複合体および腫瘍細胞の腫瘍関連抗原と結合することのできる二重特異性抗体と同時活性化Ｔ細胞とを接合する工程であって、ここで、上記二重特異性抗体は、上記接合化Ｔ細胞に標的とされた部位に補充された上記Ｔ細胞、上記腫瘍細胞、および上記Ｆｃ受容体細胞と結合しており、上記抗体の結合によって上記Ｔ細胞が同時活性化して、上記Ｆｃ受容体陽性細胞が上記二重特異性抗体のＦｃ領域と結合する工程と、
二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞、免疫担当ナイーブＴ細胞、および免疫担当ナイーブＢ細胞を含む自家細胞の組成物を患者に再注入する工程と、
を含む癌患者を治療するための方法。
【請求項３２】
上記方法はさらに、少なくとも約７日間ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと共に培養し、少なくとも追加の約２日間はＴＮＦαと共に、またはなしで培養した自家樹状細胞の組成物、および二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を、腫瘍動脈内または腫瘍部位に皮下同時注入または同時注射する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記樹状細胞および二重特異性抗体と接合した活性化Ｔ細胞は異質遺伝子型ドナーに由来している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を含む自家細胞の組成物を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦまたは他の免疫増大サイトカインおよびケモカインと共に、またはなしで、このような治療を必要とする患者に再注入する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を含む異質遺伝子型細胞の組成物を、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦまたは他の免疫増大サイトカインと共に、またはなしで、このような治療を必要とする患者に再注入する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ビーズまたは任意の固体支持体に固定されたＣＤ３およびＣＤ２８に対して方向性を持つモノクローナル抗体によってＴ細胞を同時活性化する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍抗原に特異的な二重特異性抗体と同時活性化Ｔ細胞とを接合する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
自家供給源または異質遺伝子型ドナーから上記同時活性化Ｔ細胞を単離する、請求項３６および３７に記載の方法。
【請求項３９】
患者に再注入された上記細胞組成物は溶解性二重特異性抗体を含まない、請求項１〜５、または３２に記載の方法。
【請求項４０】
上記同時活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞１００万個当たり少なくとも約０．５ｎｇ〜少なくとも約５００ｎｇの用量の二重特異性抗体と接合する、請求項３２または３８に記載の方法。
【請求項４１】
約２５：１のエフェクター：標的比において、腫瘍標的に対して少なくとも約３０％の特異的細胞傷害性レベルの％を達成するように、患者活性化Ｔ細胞の解凍した分割量を滴定することによって、接合化用量を各個人の患者に最適化する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
注入用量は少なくとも約２０億個の接合化Ｔ細胞である、請求項３２または３８に記載の方法。
【請求項４３】
上記患者は少なくとも約４回の注入を受ける、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
上記Ｔ細胞はＣＤ３／ＣＤ８陽性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
上記Ｔ細胞はＣＤ３／ＣＤ４陽性細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
患者からの上記接合化Ｔ細胞を、他の形態の治療共に同時投与する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
上記腫瘍は、前立腺癌、乳癌、白血病、大腸癌、脳腫瘍、肺癌、頚部癌などのような任意の腫瘍である、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項４８】
Ｔ細胞の活性化は免疫応答を促進するサイトカインを産生する、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項４９】
上記活性化Ｔ細胞によって産生されたサイトカインは、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン２、他のインターロイキン、ＴＮＦα、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αなどである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
上記活性化Ｔ細胞によって産生されたサイトカインは、上記活性化Ｔ細胞が標的とする部位にナイーブＴ細胞およびナイーブＢ細胞、ＮＫ細胞、単球などを補充する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
上記接合化活性化Ｔ細胞は、二重特異性抗体の腫瘍特異性抗原部分の腫瘍への再標的化を介して、主要な組織適合性制限を回避する、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項５３】
患者に再注入された細胞の上記組成物は、ナイーブ免疫細胞からの抗原特異性メモリーＴヘルパー細胞の成長を刺激または誘導する、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項５４】
上記抗原特異性メモリーＴヘルパー細胞はＴｈ１またはＴｈ２である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
上記抗原特異性メモリーＴヘルパー細胞は、異常抗原または腫瘍抗原に方向性を持っている、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
上記異常抗原または腫瘍抗原はＨＥＲ２／ｎｅｕである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
患者に再注入された細胞の上記組成物は、ナイーブ免疫細胞からの抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の成長を刺激または誘導する、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項５８】
上記抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔｃ１、およびＴｃ２は、異常抗原または腫瘍抗原に特異的である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
上記異常抗原または腫瘍抗原はＨＥＲ２／ｎｅｕである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
上記再注入は、二重特異性抗体に標的とされる抗原以外の抗原に方向性を持った抗原特異性Ｔ細胞の成長を誘導または刺激する、請求項５３または５７に記載の方法。
【請求項６１】
患者に再注入された細胞の上記組成物は、ナイーブ免疫細胞からの抗原特異性メモリーＢ細胞の成長を刺激または誘導する、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項６２】
上記Ｂ細胞は異常抗原または腫瘍抗原に特異的な抗体を産生する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
上記抗原はＨＥＲ２／ｎｅｕである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
上記再注入は、患者の腫瘍細胞または異常細胞に発現された抗原に方向性を持つ抗原特異性Ｂ細胞の成長を誘導または刺激する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
患者に再注入された細胞の上記組成物は、抗原特異性Ｔ細胞の先駆体の周波数を増加させる、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項６６】
上記Ｔ細胞はＴヘルパー細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
上記Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
上記Ｔ細胞はＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に特異的である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
上記Ｔ細胞は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原以外の異常抗原または腫瘍抗原に特異的である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
上記二重特異性抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトファージ提示ライブラリ誘導ヒト抗体、または遺伝子組み換え抗体である、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項７１】
上記患者は免疫応答が抑制されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項７２】
自家Ｔ細胞または異質遺伝子型Ｔ細胞には、ケモカインまたはサイトカインをコードするベクターが形質導入されている、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項７３】
上記抗体は、請求項５３〜６９に記載の上記免疫応答を誘導することができる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
上記抗原特異性接合化Ｔ細胞は、異常抗原または腫瘍抗原と接触した後、生存し、増殖してメモリーＴ細胞を産生する、請求項１〜５、２１、または３１に記載の方法。
【請求項７５】
上記Ｔ細胞はＴヘルパー細胞である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
上記Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
異質遺伝子型Ｔ細胞は、ＨＬＡ同一ドナー、ＨＬＡ一部不適合ドナー、またはＨＬＡ非血縁不適合ドナーに由来する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
上記患者は哺乳類または齧歯類である、請求項１〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７９】
上記患者は、異常細胞正常および異常細胞増殖によって特徴付けられる疾患を患っているか、該疾患に感受性である、請求項１〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８０】
上記組成物はバイスタンダー免疫応答を誘導する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項８１】
上記バイスタンダー免疫応答はナイーブ免疫細胞からなる、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
上記免疫細胞はＴ細胞またはＢ細胞である、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８３】
上記バイスタンダー免疫応答は、ナチュラルキラー細胞、ＬＡＫ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞からなる、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８４】
上記免疫細胞は、免疫活性化サイトカインおよびケモカインを分泌する、請求項８２または８３に記載の組成物。
【請求項８５】
二重特異性抗体と接合した自家活性化Ｔ細胞、二重特異性抗体と接合した異質遺伝子型活性化Ｔ細胞、または二重特異性抗体と接合した一部ＨＬＡ不適合活性化Ｔ細胞、免疫担当ナイーブＴ細胞、免疫担当ナイーブＢ細胞、他の免疫細胞および幹細胞を含む組成物。
【請求項８６】
上記組成物は、白血病または腫瘍の成長を患っている患者に、幹細胞移植と組み合わせて投与される、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
上記接合化Ｔ細胞は異質遺伝子型である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８８】
上記接合化Ｔ細胞は細胞分裂する、請求項１または２１に記載の方法。
【請求項８９】
上記接合化細胞は何サイクルもの抗原特異性腫瘍細胞排除を行う、請求項１または２１に記載の方法。
【請求項９０】
癌患者から抹消血単核細胞を単離する工程と、
溶解性抗ＣＤ３モノクローナル抗体での生体外刺激によってＴ細胞を活性化し、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で上記活性化Ｔ細胞を成長させる工程と、
Ｔ細胞のＴ細胞受容体複合体および腫瘍細胞の腫瘍関連抗原と結合する能力のある二重特異性抗体と活性化Ｔ細胞とを接合する工程であって、ここで、上記二重特異性抗体は上記Ｔ細胞、上記腫瘍細胞、およびＦｃ受容体陽性細胞と結合しており、腫瘍標的と上記抗体との結合によって上記Ｔ細胞が同時活性化し、上記Ｔ細胞およびＦｃ受容体陽性細胞が上記腫瘍細胞へ再方向化して、上記活性化接合化Ｔ細胞により上記腫瘍細胞が破壊される工程と、
二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を含む自家細胞の組成物を患者に再注入する工程と、
を含む癌患者を治療するための方法。
【請求項９１】
二重特異性抗体と接合した上記活性化Ｔ細胞を含む自家細胞の組成物を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦまたは他の免疫増大サイトカインと共に、またはなしで、このような治療を必要とする患者に再注入する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
上記二重特異性抗体は２つのモノクローナル抗体からなる、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
上記二重特異性抗体のそれぞれの特異性は、腫瘍抗原およびＴ細胞受容体複合体に方向性を持っている、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
上記自家細胞は、腫瘍細胞の様々なエピトープに特異的なＴ細胞の増殖を誘導する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
接合化Ｔ細胞と結合したままである上記二重特異性抗体により、接合化Ｔ細胞は、接合化Ｔ細胞が標的細胞の所望の抗原であると認識した多数の標的細胞を標的とし排除する、請求項１、３１および９０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９６】
接合化Ｔ細胞と結合したままである上記二重特異性抗体により、接合化Ｔ細胞は、接合化Ｔ細胞が標的細胞の所望の抗原であると認識した多数の標的細胞を標的とし排除する、請求項２１または８５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９７】
Ｔ細胞抗原に対する結合特異性と癌細胞の表面に存在する抗原に対する結合特異性とを有する抗体と結合しているＴ細胞、および薬学的に容認可能な賦形剤を含む組成物をヒト癌患者に注入する工程を含む処置方法。
【請求項９８】
上記抗体は、約１０−８モル／Ｌ以上の結合特異性で、ＣＤ２８およびＣＤ３から選択された抗体ならびにＨＥＲ２と結合している、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
上記抗体は患者の抗原または癌細胞と結合しており、上記Ｔ細胞は患者の癌細胞を溶解させることができる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
Ｔ細胞が次々に患者の癌細胞を溶解させるように、患者のＴ細胞にＴ細胞メモリーを作成する工程をさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびＧＭ−ＣＳＦから選択されるサイトカインを患者に注入する工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
注入に適切な薬学的に容認可能な賦形剤、および１０−８モル／Ｌ以上の結合特異性でＴ細胞上で抗原と結合した抗体と、１０−８モル／Ｌ以上の結合親和性で癌細胞の抗原と結合した抗体とに結合している薬学的に有効な量のＴ細胞を含む組成物。
【請求項１０３】
サイトカインおよび公知のヒトハプロタイプのＴ細胞をさらに含む、請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０４】
Ｔ細胞は２つの抗体のヘテロ共役体と結合している、請求項９７に記載の組成物。
【請求項１０５】
ヘテロ共役体の１つの抗体はＣＤ２８およびＣＤ３から選択された抗原と結合し、ヘテロ結合体のもう１つの抗体はＨＥＲ２と結合する、請求項１０４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２００１年８月１７日に出願した米国仮出願番号第６０／３１３，１６４号の優先権を主張したものであり、その全体が本明細書に参照として援用されている。
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、異常細胞増幅によって特徴付けられる悪性腫瘍または他の疾患のためのＴ細胞に基づく治療における組成物および方法を提供する。特に、本発明は、腫瘍抗原に対抗して作成された化学的にヘテロ共役（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）した二重特異性モノクローナル抗体と接合（ａｒｍ）した生体内活性化Ｔ細胞に関するものである。本発明は、乳癌、前立腺癌、腎臓癌のような悪性腫瘍、または他の悪性腫瘍と診断された患者からの自家Ｔ細胞、血縁ＨＬＡ同一Ｔ細胞、一部血縁ＨＬＡ不適合Ｔ細胞、または異質遺伝子型Ｔ細胞を用いた処置、および抗原特異性長期記憶Ｔ細胞の生成を提供する。本発明の利点については、特定の腫瘍特異性抗原に対抗する抗体を作成することであり、方法は、腫瘍を攻撃する標的特異性の二重特異性抗体と接合した患者の自家活性化Ｔ細胞を用いる。
【０００２】
（２．背景）
早期発見のほとんどの悪性腫瘍は、従来の手術、化学療法または放射線治療によって処置される。対照的に、免疫系が大きい（ｂｕｌｋｙ）かまたは移転性の疾患を拒絶することはほとんどない。進行した癌および血液学的悪性腫瘍を処置する際に臨床応答を向上させる抗原特異性システムまたは抗原非特異性システムを同定することを試みる。
【０００３】
免疫治療において鍵となる難関は、癌患者の免疫系に、自家腫瘍に対して特異的な免疫応答をさせることである。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、悪性黒色腫、およびｐ５３のような少数の腫瘍特異性抗原は十分特徴付けられており、生体外および生体内特異性免疫応答を誘導することが知られている。養子性移植されたＴ細胞は、動物の致命的腫瘍組織量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）を取り除くか、収縮するが、この原理をヒトに適合させるには問題がある。さらに、腫瘍浸潤リンパ球による処置を受けた腎細胞癌および悪性黒色腫を有する何人かの患者に、劇的な臨床応答が見うけられたが、ネズミモデルでの成功は、腎細胞癌および悪性黒色腫の患者への試みにおいて高い治癒速度を導かなかった。
【０００４】
従来のアプローチは、ＩＬ−２を用いた自家腫瘍抗原に方向性を持った細胞傷害性活性を示す腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の膨張、ならびに腎癌（ＲＣＣ）および転移性悪性黒色腫（ＭＭ）の患者へのＴＩＬの再注入を含む。ＴＩＬは、活性化ナチュラルキラー細胞（ＡＮＫ）活性を示すＣＤ３＋細胞であるが、１つの細胞当たりＡＮＫよりも効果的なキラー（ｋｉｌｌｅｒ）である（文献１９）。ＴＩＬは、転移性悪性黒色腫損傷を往来する（ｔｒａｆｆｉｃ  ｔｏ）ことが報告されている（文献２０）。進行したＲＣＣ、ＭＭおよび他の進行した腫瘍の患者にＴＩＬおよび高用量のＩＬ−２を用いた実験において、１３〜６０％の臨床応答が得られ、１５〜２０％の臨床応答が最もよく報告されている（文献２２〜２５）。高い臨床応答は、選択した患者の差異および実験処理過程の差異に起因する。
【０００５】
しかし、この治療的アプローチには重大な欠点がある。ＴＩＬ治療の１つの欠点は高用量のＩＬ−２の注入に関する毒性であり、この毒性のために、低い（ｐｏｏｒ）一般状態の患者へのＩＬ−２の使用が制限されている（文献２６〜２８）。ＩＬ−２の主要な毒性は、呼吸困難および低血圧を導く体液増大（ｆｌｕｉｄ  ｇａｉｎ）および毛細血管の漏れであり、しばしば血管収縮支持体（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｏｒ  ｓｕｐｐｏｒｔ）およびＩＣＵモニタリングを必要とする（文献２６）。他の副作用として、熱、寒気、倦怠感、下痢、増加したクレアチニン、精神状態の変化、心不整脈、および発疹が挙げられる（文献２７、２８）。高用量のＴＩＬ自体は、毒性なしで注入されるが（文献２９）、ＴＩＬの効き目は、高用量のＩＬ−２の同時投与と関連していると考えられている。後の研究によって、高用量のＩＬ−２のみは、ＴＩＬ治療と組み合わせた高用量のＩＬ−２に等しいことが示された。
【０００６】
このアプローチの別の欠点は、ＴＩＬと高用量のＩＬ−２との組み合わせによる陽性臨床応答の割合が容認できない程低いことである。不都合なことに、ＴＩＬによって示される抗腫瘍活性は、大きな一連の臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｒｉｅｓ）に一貫して見うけらなかった。従って、臨床応答を改善するために、腫瘍特異性ＣＴＬを生成するための新規のアプローチおよび腫瘍を特異的に標的化する方法が必要とされる。
【０００７】
上記の問題および他の問題に取り組む戦略を含む免疫療法のアプローチを提供することが、当業者に必要とされている。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、腫瘍細胞を溶解させるＴ細胞の細胞傷害性受容能力を増大させるために、Ｔ細胞の細胞傷害性受容能力と抗体の特異性とを組み合わせる。本発明はさらに、特定の腫瘍抗原に特異的な二重特異性抗体と活性化自家Ｔ細胞とを接合することによって、患者個人に対して腫瘍を治療するための組成物および方法を提供する。腫瘍抗原が患者によって異なる場合、活性化Ｔ細胞と接合する二重特異性抗体は、新しい抗原に特異的な二重特異性抗体に置き換えられる。さらに、長期抗原特異性Ｔ細胞は、本発明に開示された方法および組成物によって生成される。
【０００９】
本発明は、二重特異性抗体とＴ細胞との接合が、例えば腫瘍逸脱（ｔｕｍｏｒ  ｅｓｃａｐｅ）のような養子免疫療法を成功するためのいくつかの重要な問題点を著しく克服するという利点がある。このアプローチは、特定の腫瘍に方向性を持ったＣＴＬの先駆体の周波数（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を増加し、腫瘍部位のエフェクター細胞の特異的結合および増殖を向上し、そして、殺腫瘍性活性を増加させる。
【００１０】
一般的に、本発明は、腫瘍抗原を標的とする二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）と活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）との接合を提供する。このアプローチは、例えばＨｅｒ２＋前立腺腫瘍を溶解させるＴ細胞の毒性受容能力を増大させるため、ＣＤ３（Ｔ細胞受容体、ＴＣＲ）および腫瘍抗原に方向性を持った抗体の特異性と組み合わせる。この例証的な実施例において、ＡＴＣとＨｅｒ２＋標的との間のＢｉＡｂブリッジは、主要な組織適合性制限を回避して、Ｔ細胞の細胞傷害性をＨｅｒ２＋標的にする。低用量のＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）の中で正常被験体および癌患者からのＡＴＣを最初に成長し、次いで例えば抗ＣＤ３×抗Ｈｅｒ２（Ｈｅｒ２Ｂｉ）のようなＢｉＡｂと該ＡＴＣとを接合するため、本発明は、同時投与したＩＬ−２のようなケモカインの毒性副作用を回避する。これらのＡＴＣ標的は、Ｈｅｒ２＋乳癌細胞系、前立腺癌細胞系、および膵癌細胞系を標的とし排除する。本発明はまた、二重特異性抗体接合化ＡＴＣ、ＩＬ−２、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の複数回の注入を含む免疫療法（ＩＴ）を提供する。
【００１１】
本発明の別の主要な利点は、細胞傷害性は、腫瘍に対して非常に特異的に方向性を持ち局在性であるため、細胞傷害性効果を産出するためにｎｇ量の二重特異性抗体しか必要としないことである。本発明の別の利点は、自家患者細胞の使用であり、このことにより、移植片対宿主反応の複雑性を回避し、再注入された細胞は洗浄されて、抗体またはサイトカインの持ち越しがなく、そして、二重特異性抗体は疾患の進行中に出現した新規の腫瘍抗原に対抗して作成される。
【００１２】
好ましい実施形態において、患者の末梢血単核細胞を取り出す工程を含む本発明の方法に従って癌患者を処置する。固体支持体に付着した溶解性の抗ＣＤ３モノクローナル抗体、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体のいずれかによる生体外刺激によって、患者のＴ細胞を活性化する。約１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で活性化Ｔ細胞を拡張する。一旦適切な数の活性化Ｔ細胞、例えば約１０億〜１００億個の活性化Ｔ細胞が得られると、Ｔ細胞は、二重特異性抗体を備える。二重特異性抗体は、抗体のＦｃ部分を介して、Ｔ細胞のＴ細胞受容体複合体、腫瘍細胞の腫瘍関連抗原、およびアクセサリー細胞のＦｃ受容体と結合する能力がある。腫瘍細胞を攻撃する細胞傷害性を生体外で検査し、細胞毒性活性に基づいて、二重特異性抗体の適切な接合化用量（ａｒｍｉｎｇ  ｄｏｓｅ）を決定する。次いで、二重特異性抗体と接合した活性化Ｔ細胞、免疫担当ナイーブＴ細胞または免疫担当成熟Ｔ細胞、免疫担当ナイーブＢ細胞または免疫担当成熟Ｂ細胞、および樹状細胞を含む自家細胞の組成物を患者に再注入する。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、二重特異性抗体を形成するために化学的にヘテロ共役した２つのモノクローナル抗体（好ましくは１：１の比で）から構成される。二重特異性抗体の好ましい特異性は、腫瘍抗原に対するものであり、例えばＨｅｒ２＋とＴ細胞受容体との複合体である。最も好ましいＴ細胞受容体の抗原は、ＣＤ３およびＣＤ２８である。本発明の１つの特徴において、二重特異性抗体を形成するモノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり、当業者に周知の方法を用いて遺伝子組み換えされている。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、自家活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞１００万個当たり少なくとも約０．５ｎｇの抗体、より好ましくはＴ細胞１００万個当たり約１０ｎｇの抗体、最も好ましくはＴ細胞１００万個当たり少なくとも約１００ｎｇの抗体と接合する。しかし、２５：１のエフェクター：標的比において、腫瘍標的に対して少なくとも約３０％の特異的細胞傷害性レベルの％に達するように、凍結した分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）の患者活性化Ｔ細胞を滴定することによって、接合化用量を各個人の患者に最適化する。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、接合化Ｔ細胞（ａｒｍｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の注入用量は、好ましくは約２０億個、より好ましくは約１０億個、最も好ましくは少なくとも約４０億個の接合化Ｔ細胞である。本発明の１つの特徴において、患者は、少なくとも約４回の注入、より好ましくは約６回の注入、最も好ましくは少なくとも約１０回の注入を受ける。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ８陽性細胞および／またはＣＤ３／ＣＤ４陽性細胞のいずれかである。本発明の１つの特徴において、他の形態の治療と共に患者からの接合化Ｔ細胞を同時投与する。自家Ｔ細胞には、ケモカインをコードするベクターが形質導入されており、高濃度の局部性ケモカインを産生する。従って、本発明はまた、免疫抑制患者を処置するのに適している。
【００１７】
別の好ましい実施形態において、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴで処置された患者は、注入されたＴ細胞によって認識された特定の抗原に対して免疫記憶を誘導する。記憶Ｔ細胞は好ましくは成熟免疫応答または二次免疫応答を示すため、免疫応答は、ナイーブ免疫応答または一次免疫応答と比較して、より迅速で特異的である。記憶細胞は、例えばフローサイトメトリー分析によって容易に同定される。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴは、何サイクルもの腫瘍細胞の排除を行うことができる。つまり、当該細胞は、患者への注入後、１回以上、腫瘍細胞を標的とし排除することができる。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、抗ＣＤ３活性化ポリクローナルＴ細胞集合の複数回にわたる暴露は、抗原特異性Ｔ細胞クローン（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ）の成長（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔ）を誘導する。好ましくは、特定の腫瘍抗原に方向性を持った抗原特異性クローンの誘導は、まだ定義されず未知である腫瘍の抗原を認識するＴ細胞の生成を誘導するために、細胞応答を成熟させる。
【００２０】
別の好ましい実施形態において、抗原提示細胞、例えば樹状細胞と共に、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴを患者に注入する。
【００２１】
本発明の他の特徴を、以下に開示する。
【００２２】
（図面の簡単な説明）
図１は、抗腫瘍関連抗原ＭＡｂ（抗ＴＡＡ）（９１８４）とＯＫＴ３とをヘテロ共役させる工程を示す図である。
【００２３】
図２は、２〜１５％の勾配を用いた非還元ＳＤＳゲル電気泳動によるヘテロ共役生成物の分析を示す。
【００２４】
図３は一晩の培養を示しており、ここでＭＣＦ−７細胞またはＰＣ−３細胞を用いたＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣのロゼッティング（ｒｅｓｅｔｔｉｎｇ）を表示する。
【００２５】
図４のＡ〜Ｅは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞およびＭＣＦ−７細胞とのＩｇＧＩ（Ｈｅｒ２Ｂｉの９１８４部分）の結合を示すヒストグラムを示す。
【００２６】
図５は、正常な被験体からの接合化ＡＴＣ、新鮮な（ｆｒｅｓｈ）ＰＢＭＣまたはＡＴＣによる、ＭＣＦ−７に方向性を持つ特異的細胞傷害性の発達を示すグラフである。
【００２７】
図６は、５〜２５のＥ／Ｔにおける、非接合化ＡＣＴ、ならびに０．５ｎｇ、５．０ｎｇおよび５０．０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣについて組成物の滴定曲線を示す。各曲線は、ＭＣＦ−７標的に関する３つの実験の特異的細胞傷害性％の補間平均値（±ＳＥＭ）を表す。
【００２８】
図７は、Ｔ細胞の部分集合を特異的細胞傷害性について測定するための、濃縮されたＴ細胞の部分集合の細胞傷害性活性を例証する細胞傷害性アッセイの結果を示す。
【００２９】
図８は、どのくらい長くＡＴＣは接合したままであり、腫瘍細胞を排除し続けるのかを示す棒グラフである。
【００３０】
図９は、ＣＥＡと結合し、該ＣＥＡを標的化させる役割を果たす画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）の細胞傷害性アッセイの結果を示す。セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）３００カラムを用いて、二量体および多量体を含む画分を単量体の画分から単離し、全てのタンパク質濃度を同一に調整した後、ＬＳ１７４Ｔに方向性を持った特異的細胞傷害性％についてそれぞれの画分を試験した。
【００３１】
図１０は、ＡＴＣ１０６当たり５０ｎｇのＯＫＴ３×９１８４と接合した１０個の正常被験体からのデータを要約したグラフである。
【００３２】
図１１は、生体内ＡＴＣ媒介細胞傷害性を示すグラフである。各パネルに示された培養の日に制御速度凍結（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒａｔｅ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ）を用いて凍結保存した癌患者からのＡＴＣを、解凍して、Ｈｅｒ２Ｂｉと接合した。そして、ＭＣＦ−７に方向性を持つ細胞傷害性についてＡＴＣを検査した。
【００３３】
図１２は、ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍細胞とのＡＴＣの結合によって誘導されたサイトカイン分泌を例証する棒グラフを示す。
【００３４】
図１３は、様々な腫瘍ＨＥＲ２＋腫瘍標的に対抗したＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳによって媒介された生体内細胞傷害性を例証するグラフを示す。
【００３５】
図１４は、接合化ＡＴＣにおいてＯＫＴ３×９１８４との接合化用量の増加はＰＣ−３に方向性を持つ特異的細胞傷害性％を増大させることを示すグラフである。
【００３６】
図１５は、ＰＣ−３細胞、ＭＣＦ−７細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞と結合したＨｅｒ２ＢｉＡｂから得られたフローサイトメトリーの結果を示す。
【００３７】
図１６は、図１のスキームに基づくＯＫＴ３×Ｈｅｒｃの化学的共役の結果を示すゲルである。２〜１５％勾配ゲルを用いた非還元ＳＤＳゲル電気泳動によって、ＢＣＡタンパク質を定量および分析し、ゲル中のタンパク質を可視化するためにクーマシーブルー染色を用いる。
【００３８】
図１７は、２つの正常被験体からのＡＴＣにおける、ＳＫ−ＢＲ−３標的を溶解させる能力を示すグラフである。
【００３９】
図１８は、ＯＫＴ３×９１８４とＯＫＴ３×Ｈｅｒｃとの比較的な接合化用量を示すグラフである。
【００４０】
図１９は、標的細胞との培養後２４時間の接合化ＡＴＣによるインターフェロンγ分泌を示す棒グラフである。
【００４１】
図２０は、ＰＣ−３標的を用いた、Ｈｅｒ２ＢｉまたはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ接合化正常ＡＴＣの細胞溶解受容能力を示すグラフである。
【００４２】
図２１は、接合化Ｔ細胞が冷凍／解凍後もＰＣ−３に対する細胞傷害性を維持していることを示すグラフである。
【００４３】
図２２は、ＰＣ−３細胞との結合によってＯＫＴ３×９１８４と接合した正常ＡＴＣによって作成されたＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳを示す棒グラフである。図２２は、接合化ＡＴＣ１００万個当たりの斑点数としてのデータを要約したものである。
【００４４】
図２３は、ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣによって媒介された細胞傷害性が、溶解性ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標）によって阻害されないことを例証するグラフである。
【００４５】
図２４は、古いロット（ｌｏｔ）および新しいロットのＯＫＴ３×９１８４と接合したＡＴＣが少なくとも１１ヶ月間安定していることを示すグラフである。
【００４６】
図２５は、接合化ＡＴＣ（２０×１０６）とＣＥＡ＋ＬＳ１７４（１×１０６）クローン癌細胞系との皮下同時注射（ウィン（Ｗｉｎｎ）アッセイ）が、接合化ＡＴＣを受けたマウスの４０％において腫瘍の進行および死亡を妨げ、一方、ＡＴＣのみを受けたマウスのうち１０％しか１００日より長く生存しなかったことを例証しているグラフである。
【００４７】
図２６は、ＰＣ−３と結合することによって誘導されたＨｅｒ２ＢｉまたはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合した正常ＡＴＣよるサイトカイン分泌を例証している棒グラフである。
【００４８】
図２７は、何サイクルもの化学療法を受けた患者からの接合化Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を例証している棒グラフである。
【００４９】
図２８および２９は、特異的細胞傷害性に必要とされる接合化用量の臨床的結果を例証しているグラフである。図２８は、健常者（ＮＬ）のデータを示し、図２９は患者（ＰＴ）のデータを示す。
【００５０】
図３０は、細胞標本化が、Ｈｅｒ２＋ＭＣＦ−７標的に方向性を持つＡＴＣ特異的細胞傷害性にほとんど影響を与えないことを示すグラフである。
【００５１】
図３１は、Ｈｅｒ２Ｂｉ（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ）と抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８同時活性化Ｔ細胞（ＣＯＡＣＴＳ）との接合によるＴ細胞の細胞傷害性能力を例証するグラフである。
【００５２】
図３２は、ＯＫＴ３×９１８４と接合した癌患者のＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣを用いた臨床的データを例証するグラフである。ＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣは、ＭＣＦ−７標的に対抗する同等の特異的細胞傷害性活性を有する。パネルＰ１、Ｐ２およびＰ３は、非接合化および接合化のＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣにおける特異的細胞傷害性を媒介する能力を示す。
【００５３】
図３３は、３．１３〜２５．００の比率を標的とするエフェクターにおける、１つの正常被験体および前立腺癌を有する２人の患者についての特異的細胞傷害性を示すグラフである。
【００５４】
図３４は、接合化ＡＴＣがＭＩＡ標的（膵臓細胞系）を排除したことを示すグラフである。
【００５５】
図３５は、時間０で検査した接合化Ｔ細胞の分割量および非接合化Ｔ細胞の分割量によって媒介された一次細胞傷害性アッセイを示すグラフである。第一組の標的とのインキュベーションから４８時間後に、非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣを回収し、４５時間後の二次培養および二次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第二組の標的に再び塗布した。４８時間後〜９６時間後に、再び塗布した非接合化（ＡＴＣ）または接合化ＡＴＣ（ａＡＴＣ）をＳＫ−ＢＲ−３と共に同時培養した後、非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣを回収し、９６時間後の三次培養および三次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第三組の標的上に再び塗布した。最後に、９６時間後〜２１５時間後に、非接合化および接合化ＡＴＣをＳＫ−ＢＲ−３と共に同時培養し、２１５時間後の四次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第四組の標的上に再び塗布した。
【００５６】
図３６は、非接合化、またはＯＫＴ３×ハーセプチン、ＯＫＴ３×リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）と接合したＣＤ４部分集合またはＣＤ８部分集合の多数のＣＦＤＡ−ＳＥ＋細胞を示すフローサイトメトリーアッセイの結果である。ＣＤ４＋集合は、分裂して低減した強度を示した非常に明確な細胞組成物によって細胞分裂の証拠を示したが、ＯＫＴ３×リツキサンと接合したＣＤ４＋細胞および非接合化ＡＴＣは、あまり多くの分裂細胞を示さず、半分の染色強度を示した。
【００５７】
図３７は、ＩｇＧ２ａ保持接合化ＡＴＣを検出することによって患者内での生存または輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を表すフローサイトメトリーのデータのグラフである。
【００５８】
図３８は、ＰＣ−３腫瘍標的に対する特異的細胞傷害性％が、ＢｉＡｂと活性化Ｔ細胞との接合を通して上昇することを示すグラフである。６：２５、１２：５、および２５．１の３つのＥ／Ｔ比で細胞傷害性を測定した。平均値の標準偏差（ＳＥＭ）のパーセントを、各Ｅ／Ｔ比の偏差棒で表現した。非接合化のＡＴＣ（黒丸）は、最も大きいＥ／Ｔにおいて全ての腫瘍標的の半分以下を排除し、５ｎｇ（□）、５０ｎｇ（黒三角）、および５００ｎｇ（黒四角）と接合したＡＴＣは、２５：１のＥ／Ｔ比において、ほぼ１００％の腫瘍細胞を溶解させた。
【００５９】
図３９は、非接合化ＡＴＣ（）と、接合化ＡＴＣ（黒四角）と、無関係のＢｉＡｂ付きＡＴＣとの比較を示すグラフであり、接合化ＡＴＣが、コントロールを上回るサイトカインおよびケモカインの分泌濃度の増加を示すことを明らかにしている。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの非接合化ＡＴＣサイトカイン分泌は、このチャートにおいて非常に小さい。Ｔ細胞およびＰＣ−３標的を１０：１のＥ／Ｔ比でプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。
【００６０】
図４０は、カプランマイヤープロットであり（オレンジ線）、腫瘍がないための生存率は、最も高用量（２×１０７）の接合化ＡＴＣを与えたマウス内で最も高いことを示している。次いで少ない用量（１０７）の接合化ＡＴＣ（黒三角）を受けたマウス、続いて同じ用量（１０７）の非接合化ＡＴＣ（黒四角）を受けたマウスにおいて、生存率がコントロール（○）を越えて向上した。
【００６１】
図４１は、腫瘍成長遅延曲線を示すグラフであり、ＰＣ−３腫瘍を予防する非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣの効果を表している。最も高用量の接合化ＡＴＣ（２×１０７）は、１０５日目まで腫瘍成長の遅延に非常に効果的であったが、１０７の接合化ＡＴＣでの処置は、腫瘍成長を阻止しないが遅延することはできた（△）。１０７の非接合化ＡＴＣ（◆）は、腫瘍成長の遅延において等しい用量の接合化ＡＴＣほど効果的ではないが、コントロール（黒四角）を越えて腫瘍の成長を遅延することができた。
【００６２】
図４２は、腫瘍成長遅延を示すグラフである。最も高用量（５×１０７）の接合化ＡＴＣ＋ＩＬ−２（黒三角）は、ＩＬ−２コントロール群（黒四角）と比較して、９０日目まで腫瘍成長を遅延させた（ｐ＝０．０６３６）。低用量の１０７のａＡＴＣ（△）は、コントロールマウスと比較して、腫瘍成長を遅延させるのに効果的ではない。
【００６３】
図４３は、カプランマイヤープロットであり、十分な数の接合化ＡＴＣが確立された腫瘍を有するマウスに長期間の緩和を引き起こすことを示す。５×１０７の接合化ＡＴＣ＋ＩＬ−２を週に二回与えたマウス５匹のうち２匹（４０％）において、６週間の処置後腫瘍は消えた（△）。１０７の接合化ＡＴＣ＋ＩＬ−２による６週間の処置後、６匹のマウスのうち１匹（１７％）において腫瘍が消滅した（□）。また、全てのコントロールマウス（ＩＬ−２のみを与えた）は、腫瘍標的の第一次注射から６週間以内に腫瘍組織量のために犠牲となった（○）。確立された腫瘍が直径５×５ｍｍに達してから、接合化ＡＴＣ＋ＩＬ−２またはＩＬ−２のみを用いた処置を開始した。
【００６４】
図４３は、ＡＴＣ（ＳＫ−ＢＲ−３に３回暴露した非接合化活性化Ｔ細胞）、ヒトＥＢＶ誘導（ｄｒｉｖｅｎ）Ｂ細胞系に暴露した非接合化ＡＴＣ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現しないＢ細胞系；最終回のみ）、およびａＡＴＣ（３回ＳＫ−ＢＲ−３に暴露し、４回目にこのアッセイに暴露した接合化ＡＴＣ）からのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳの数を示す棒グラフである。接合化後２０日目にアッセイを行った。Ｔ細胞１００万個当たり約５０ｎｇの抗体での最初の接合化から、さらなる接合化を行わなかった。
【００６５】
（好ましい実施形態を含む発明の詳細な説明）
本発明は、腫瘍を処置するための新規の組成物および方法を提供する。組成物は、腫瘍抗原と特異的に結合して最終的に腫瘍を破壊する能力のある二重特異性抗体と接合した活性化Ｔ細胞を含有する。本発明は、患者自身のＴ細胞を使用し、患者の生体外Ｔ細胞を活性化して、患者の腫瘍に特異的な抗体とＴ細胞とを接合する利点がある。ナイーブＴ細胞およびナイーブＢ細胞、ならびに樹状細胞のような強力な抗原提示細胞を含む組成物と共に、患者自身の活性化接合化Ｔ細胞を再注入することによって、患者自身の先駆細胞傷害性細胞プールを増加させ、長期記憶Ｔ細胞を誘導する。
【００６６】
処置するための本発明の改変Ｔ細胞、組成物および方法を説明する前に、本発明は、記載の特定の細胞系、賦形剤、または方法工程に限定されないことが理解されるべきで、当然変化され得る。また、本明細書に使用した専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であって、限定することを意図せず、添付の請求項の範囲によってのみ本発明の範囲を限定する。
【００６７】
値の範囲が与えられている場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値（文脈が明らかに規定しない限り下限の単位の１０倍）がまた明確に開示される。任意の記載の値または記載の範囲における介在値と、任意の別の記載の値または記載の範囲における介在値との間の各小さな範囲は、本発明に含まれる。上記小さな範囲の上限および下限は、独立してこの範囲に含まれるか、あるいは除外されてもよく、記載の範囲において明確に除外された限界に対して、限界の一方または両方が上記小さな範囲に含まれる範囲、または限界の両方とも上記小さな範囲に含まれない範囲がそれぞれまた、本発明に含まれる。記載の範囲が片方または両方の限界を含む場合、これらの含まれた限界の片方または両方を除外する範囲がまた本発明に含まれる。
【００６８】
定義されない限り、本明細書に使用された全ての技術および科学的用語は、本発明が属する当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施および試験において使用され、好ましい方法および材料が記載される。本明細書に記載の全ての印刷物は、引用された印刷物と関連した方法および／または材料を開示および説明するために、参照として本明細書に援用される。
【００６９】
尚、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されているように、対象物名は、文脈が明確に記述しない限り、単数または複数を問わずに使用される。従って、例えば「Ｔ細胞」は複数のＴ細胞を含み、「抗体」は１つ以上の抗体および当業者に公知であるその等価物を含む。
【００７０】
本明細書中で議論した刊行物は、本願の出願日前に開示されている。本発明は、先願発明の効力によって、上記刊行物の日付よりも前であるという権利を有しないと解釈されるものは本明細書中には何もない。
【００７１】
一般的に、本発明は、化学的にヘテロ共役した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）×抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（９１８４）二重特異性モノクローナル抗体（ＢｉＡｂ）または抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）×抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ハーセプチン）二重特異性モノクローナル抗体（ＢｉＡｂ）と接合した活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時活性化Ｔ細胞（ＣＯＡＣＴＳ）からなる「薬物」を提供する。溶解性ＯＫＴ３（約１０−２０ｎｇ／ｍｌ）での生体外刺激によってＡＴＣを生成し、少なくとも約１００〜約６００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２中で該ＡＴＣを培養する。また、ビーズに同時に固定した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）／抗ＣＤ２８（９．３）モノクローナル抗体での同時活性化によってＣＯＡＣＴＳを生成するる。Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞に方向性を持った機能的細胞傷害性に基づいて、予め滴定した用量の二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）とＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳとを接合させる。非結合のモノクローナル抗体またはヘテロ共役体を、接合化ＡＴＣまたは接合化ＣＯＡＣＴＳから洗浄する。
【００７２】
ＢｉＡｂと接合したＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳは、交換可能に本開示の目的の「薬物」を指す。当該薬物は、胸部腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、および他のＨＥＲ２腫瘍のようなＨｅｒ２／ｎｅｕ＋腫瘍を有する患者に特異的な抗腫瘍効果を提供する。しかし、この抗原は実例に過ぎず、決して限定として解釈されるべきではない。個人の患者の腫瘍に対抗して作成された任意の抗体が使用されてもよい。この抗体の使用は、腫瘍における任意の抗原の変化を監視できる利点があり、個人または疾患進行段階への処置を調整することができる。本発明の他の主要な利点は、ＡＴＣおよびＣＯＡＣＴＳの両方が用量制限的な細胞に基づく毒性を引き起こさないことである。さらに、従ってモノクローナル抗体が患者に注入されず、毒性のある副作用の危険性を取り除く。
【００７３】
好ましい実施形態において、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴは、何サイクルもの腫瘍抗原認識および腫瘍細胞排除を行う。これらＡＴＣまたはＣＯＡＣＴにおける多数の細胞を排除する能力を、以下の実施例で示す。ＡＴＣおよび／またはＣＯＡＣＴを同定し、腫瘍細胞を排除するその能力を測定するために使用するアッセイを、以下の詳細および以下の実施例で議論する。例えば、例えばＨｅｒ２＋腫瘍のような腫瘍抗原を標的とした接合化Ｔ細胞を、同業者に周知のフローサイロメトリーまたは他の方法によって検出され得る二次抗体または蛍光マーカーを用いてＴ細胞を標識化することによって同定する。接合化Ｔ細胞検出用の標識の例として、緑色蛍光タンパク質およびアビジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。実例として、腫瘍部位での接合化Ｔ細胞の存在を確認するために、腫瘍特異性Ｔ細胞を二重特異性抗体と接合し、検出可能なマーカーで標識する、腫瘍の生体組織検査（ｂｉｏｐｓｙ）を行った。本技術に周知の方法によって生体組織検査される組織を処理し、細胞検出アッセイ用に調製した。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、抗ＣＤ３活性化ポリクローナルＴ細胞集合の複数回にわたる暴露は、抗原特異性Ｔ細胞クローン、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕのような抗原特異性Ｔ細胞クローンの成長を引き起こす。決して限定として解釈されるべきではない実例として、図４４に示されたデータは、ＡＴＣ（ＳＫ−ＢＲ−３に３回暴露した非接合化活性化Ｔ細胞）、ヒトＥＢＶ誘導Ｂ細胞系に暴露した非接合化ＡＴＣ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現しないＢ細胞系；最終回のみ）、およびａＡＴＣ（３回ＳＫ−ＢＲ−３に暴露し、４回目にこのアッセイに暴露した接合化ＡＴＣ）からのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳの数を示す棒グラフである。接合化後２０日目にアッセイを行った。Ｔ細胞１００万個当たり約５０ｎｇの抗体での最初の接合化から、さらなる接合化を行わなかった。明らかに、接合化ＡＴＣの部分集合は、ＨＥＳＲ２／ｎｅｕの初回刺激を受け、ＳＫ−ＢＲ−３細胞のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に再び対抗するために激しく応答し得る記憶細胞となる。さらに、結果は、抗ＣＤ３活性化ポリクローナルＴ細胞集合の複数回にわたる暴露が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異性Ｔ細胞クローンの成長を選択および誘導することを示唆している。
【００７５】
好ましくは、特定の腫瘍抗原に方向性を持った抗原特異性クローンの誘導は、まだ定義されず未知である腫瘍の抗原を認識するＴ細胞の生成を誘発させるための細胞応答を成熟させる。
【００７６】
好ましい実施形態において、樹状細胞のような任意の抗原提示細胞なしで患者にＡＴＣまたはＣＯＡＣＴを注入する。下の実施例で考察するように、培養システムにおいて任意の樹状細胞なしで患者に接合化Ｔ細胞を投与する。明らかに、活性化Ｔ細胞は、活性化のクラスＩＩを上方制御して専門の（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）抗原提示細胞のように振る舞い、再活性化工程によって産生されたサイトカインおよびケモカインの存在下で架橋腫瘍抗原と共に作用して抗原特異性ＣＴＬを誘導する。クラスＩＩの上方制御は、ポリクローナル混合物のＣＤ４ヘルパー細胞からの必要な助力を提供し、抗原特異性ＣＴＬを誘導するために必要な信号を与える。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、特異的に１つの特定の刺激性抗原だけでなく、「バイスタンダー（ｂｙ−ｓｔａｎｄｅｒ）」Ｔ細胞をも活性化するという利点がある。従って、より大きな免疫応答が産出され、Ｂ細胞によって、より多くのリンホカインの産生、それに続くより多くの免疫グロブリンの産生を導く。
【００７８】
記憶Ｔ細胞が特定の抗原の刺激なしで拡張（増殖）してクローンの大きさを維持するため、本発明の別の利点は、記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）の抹消プール（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｐｏｏｌ）を維持することである。本発明はナイーブＴ細胞および／または先駆細胞の増殖を可能にするため、ナイーブＴ細胞のレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）（ＣＤ４５ＲＡ＋）もまた維持される。例えば、サイトカインによって刺激されて成長する記憶表現型の静止Ｔ細胞の周波数を評価するために、限界希釈実験を行った。自己反応性応答を防ぐために、自家照射マクロファージおよび抗ＤＲ抗体の存在下で、ＩＬ−２のみと共に、またはＴＮＦ−αおよびＩＬ−６と組み合わせて、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋静止Ｔ細胞を培養した。
【００７９】
「先駆細胞」は、より成熟した細胞へ分化する能力のある細胞分化経路の任意の細胞である。このように、用語「先駆細胞集合」は、より成熟した細胞へ成長することが可能な細胞の郡を指す。先駆細胞集合は、全能性細胞、多能性細胞、および幹細胞系譜制限された細胞（例えば、全ての造血系譜に成長することができない細胞、または例えば赤血球系譜の細胞のみに成長することのできる細胞）を含む。本明細書に使用される用語「全能性細胞」は、全ての細胞系譜に成長することが可能な細胞を指す。同様に、用語「全能性細胞集合」は、全ての細胞系譜に成長することが可能な細胞の組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を指す。また本明細書に使用される用語「多能性細胞」は、様々な（全てではない）系譜に成長することが可能な細胞を指し、少なくとも全ての造血系譜（例えば、リンパ球系譜、赤血球系譜、および血小板系譜）に成長することができる。例えば、多能性細胞は、樹状細胞以外の全ての細胞系譜に成長する能力を持つ点で全能性細胞とは異なる。「多能性細胞集合」は、全ての細胞系譜に成長することはできないが、少なくとも全ての造血系譜に成長することが可能な細胞の組成物を指す。このように、全能性細胞または該細胞の組成物は、多能性細胞または該細胞の組成物に比べあまり成長しない。本明細書中の用語「成長」、「分化」、および「成熟」全て、少なくとも２つの異なる細胞系譜に分化して特殊化細胞になることが可能な段階の細胞の発達を指す。本願の目的のために、これらの用語を交換可能に使用する。
【００８０】
本明細書中の用語「集合」は、同じか異なる同定特性を有する細胞を指す。用語「系譜」は、初期の先駆細胞から完全な成熟細胞（すなわち、特殊化細胞）までの、細胞型の全ての成長段階を意味する。
【００８１】
全身性記憶Ｔ細胞は、特定の機知の抗原の細胞表面発現によって特徴付けられる。代表的に、これらの細胞は、ＣＤ４に対して陽性であり、ＣＤ４５ＲＡおよびインテグリンα４β７の発現を欠く。これらの細胞はさらに、ＣＣＲ４の発現によって特徴付けられる。当該細胞の一部は、共通白血球抗原陽性（ＣＬＡ＋）である。蛍光検出またはＥＬＩＳＡなどによる抗体染色および分析、逆転写酵素のＰＣＲ、転写増幅および核酸マイクロアレイへのハイブリダイゼーションなどの任意の従来の方法によって当該細胞の同定を確認する。
【００８２】
皮膚と関連したいくつかの記憶Ｔ細胞は、ＣＬＡを発現することが知られており、このような細胞は、例えば黒色腫を処置するために、これらの細胞の皮膚組織への輸送またはホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）を調節する本方法を用いた処置ために特に興味のあるものである。
【００８３】
他の全身性記憶細胞は、ＬＦＡ−１結合により内皮ＩＣＡＭ−１に付着して誘導される。これらの付着分子は、拒絶反応、乾癬、関節炎に直接関与する。ＬＦＡ−１媒介付着の誘導を妨げるＣＣＲ４阻止剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、移植部位での記憶Ｔ細胞の蓄積を妨げ；Ｔ細胞による膵島内（ｉｎｔｒａ−ｉｓｌｅｔ）浸潤を予防してインスリン依存性真性糖尿病の悪化を抑制し；中枢神経系譜へのＴ細胞の浸潤を阻止して多発性硬化症および他の脱髄疾患を処置し；リウマチ様関節炎を患っている患者の滑膜性連結におけるＴ細胞の蓄積を防ぎ；記憶Ｔ細胞を蓄積させて免疫応答性に影響を与えることなどによって拒絶反応を抑制することに有用である。従って、二重特異性抗体が任意の所望のエピトープに特異的であるため、本発明の薬物（ＡＴＣ、ＣＯＡＣＴ）は、腫瘍以外の疾患を処置することが可能である。
【００８４】
本発明において、患者からのＴ細胞は、好ましくは溶解性抗ＣＤ３抗体によって生体外活性化されるか、あるいは溶解性であるか固体支持体に固定化された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を用いて同時活性化される。好ましい固体支持体は、プラスチック、または抗体が固定化され得る任意の面、あるいはダイナル（Ｄｙｎａｌ）ビーズのようなビーズである。一旦Ｔ細胞が活性化すると、Ｔ細胞は二重特異性抗体と接合する。活性化Ｔ細胞表面上の所望の分子と結合した標識化抗体、またはＦｃ領域のような二重特異性抗体の一部分に方向性を持った標識化抗体を用いることによって、患者の身体を通る上記活性化Ｔ細胞の場所および動きを監視することができる。本発明のフローサイトメトリー法を用いて細胞の監視を行う。また、本技術に公知の任意の画像技術によって検出可能な薬剤によってＴ細胞を標識化する。
【００８５】
本明細書中の「患者」は、処置される哺乳類被験体、好ましくは人間の患者を指す。いくつかの事例において、本発明の方法は、マウス、ラット、およびハムスターなどの齧歯類、ならびに霊長類を含む、実験動物、獣医用、疾患用動物モデルの開発に使用され得る。
【００８６】
本明細書中の用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、一般的に所望の薬学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患またはその症状を完全にか部分的に予防する点で予防的であるか、および／または疾患および／または疾患に起因する悪影響を部分的に、または完全に治療する点で治療的であるかも知れない。一般的に、本発明の方法は、一般的に癌と称す疾患の処置に関するものであり、処置される癌のタイプの癌細胞表面に存在することが知られている抗原と特異的に結合する抗体を利用することによって、様々なタイプの癌に適用され得る。本明細書中の「処置」は、哺乳類、特にヒトにおけるこのような疾患の任意の処置を含み、
（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるがまだ疾患と診断されていない被験体における疾患を予防および／または診断する工程と、
（ｂ）疾患を抑制する、すなわち疾患の悪化を阻止する工程と、
（ｃ）疾患を緩和する、すなわち疾患の後退を促す工程と、を含む。
【００８７】
本発明は、癌患者の処置に関するものであり、特に正常な外科的方法論によって一般的に処置できないタイプの癌を処置することを目的としている。より詳細には、「処置」は、治療的に検出可能で有益な効果を癌患者に与えることを意味する。上記効果は、患者自身の免疫系を刺激し癌の処置を促進させることを含む。
【００８８】
様々なタイプの癌が処置されているが、Ｔ細胞と結合した抗体は一般的に処置され得る癌のタイプを決定する。上記抗体は、標的とされる癌細胞の抗原に対して十分高いレベルの結合親和性を有する。本明細書において、抗体が「特異的」であるか、または十分高い結合親和性を有することを考慮するために、例えば、抗体は、標的とされる癌の細胞表面に好ましく特異的である目的のエピトープに対して約１０−７モル／ｌ、または約１０−８〜約１０−９モル／ｌ、および１０−１１モル／ｌ以上の結合親和性を有する。結合親和性に関して使用された用語「特異性」は、非常に高い親和性の結合を意味し、他の分子と同様に結合しない結合親和性を意味しないことが、当業者によって理解される。例えば構造における抗原の配列または抗体結合穴（ｐｏｃｋｅｔ）自体の構造と関連した様々なエピトープとの交差反応が見出される。このような交差反応を明らかにする抗体は、さらに本発明の目的に特異的であると考えられる。
【００８９】
本明細書中の「免疫細胞」は、アッセイされ得る免疫系の任意の細胞を含むことを意味し、Ｂリンパ球（Ｂ細胞とも呼ぶ）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞とも呼ぶ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、肥満細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤（ＴＩＬ）細胞、ハイブリドーマなどの遺伝子組み換え免疫細胞、薬物改変免疫細胞、および上記細胞型の誘導体、先駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、または先駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）が挙げられる。
【００９０】
「活性」、「活性化」、または「増大」は、応答して測定可能なレベルの免疫機能を示す免疫細胞の能力である。活性化度の測定は、前の活性化の結果としてさらに刺激された場合の増大した活性を発現する免疫細胞の能力の定量的評価を意味する。能力の増大は、免疫細胞が低用量の刺激剤に応答する活性化に刺激される活性化プロセスの間に生じる生化学的変化に起因し得る。
【００９１】
測定され得る免疫細胞活性として、（１）細胞またはＤＮＡ複製を測定することによる細胞増殖、（２）サイトカイン産生の増加（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＴＮＦ−αのようなサイトカインについての具体的な測定値を含む）、（３）細胞媒介標的排除または溶解、（４）細胞分化、（５）免疫グロブリンの産生、（６）表現型変化、（７）ケモタキシンの走化性（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｎ）に応答する能力を測定することよる走化性因子またはケモタキシンの産生、（８）いくつかの他の免疫細胞型の活性阻害による免疫抑制、（９）異常活性の示唆として、特定の条件下での活性化免疫細胞の分裂を意味するアポトーシス、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
本明細書中の用語「癌」、「新生物」および「腫瘍」は、複数または単数を問わず交換可能に使用され、細胞を宿主生物体に対して病的にする悪性転換を引き起こす細胞を意味する。原発性癌細胞（つまり、悪性転換部位の近辺から得られた細胞）は、十分確立された技術、特に組織学的検査によって非癌細胞から容易に識別される。本明細書中の癌細胞の定義は、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞先祖由来の任意の細胞をも含む。上記癌細胞先祖由来の細胞として、転移した癌細胞、ならびに癌細胞由来の生体外培養物および細胞系を含む。「臨床的に検出可能な」腫瘍は、固形腫瘍として一般的に現われるタイプの癌を意味する場合、ＣＡＴスキャン、ＭＲ画像処理、Ｘ線、超音波、または触診のような手段によって腫瘍の質量を基に検出される腫瘍であり、患者から得られるサンプルの１つ以上の癌特異性抗原の発現によって検出可能である。
【００９３】
成熟および細胞分化を評価するためのいくつかの異なる方法が利用可能である。例えば、このような方法の１つとして、細胞表現型を測定するものがある。免疫細胞の表現型および任意の表現型の変化については、様々な免疫細胞型の特徴を示す膜タンパク質と結合するモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色法の後にフローサイトメトリーによって評価する。
【００９４】
細胞分化を評価するための第二の方法は、細胞機能を測定することによる。この方法は、細胞内または細胞から分泌される酵素、細胞内におけるｍＲＮＡ、遺伝子、タンパク質、または他の代謝物質の発現を測定することによって、生化学的に行われる。生物検定はまた、機能細胞の分化、または患者の腫瘍、腫瘍細胞系、新鮮な腫瘍からの細胞に方向性を持つ特定の抗体の産生を測定するために使用される。
【００９５】
本明細書の「新鮮な腫瘍」は、外科的または他の方法によって宿主から取り出された腫瘍を指す。
【００９６】
上記の患者からのＴ細胞は、好ましくは溶解性抗ＣＤ３抗体によって生体外活性化されるか、あるいは溶解性であるか固体支持体に固定された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を用いて同時活性化される。好ましい固体支持体は、プラスチック、または抗体が固定化され得る任意の面、あるいはダイナルビーズのようなビーズである。一旦Ｔ細胞が活性化すると、Ｔ細胞は二重特異性抗体と接合する。
【００９７】
二重特異性抗体は、１つの結合腕（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｒｍ）を備えるＴ細胞のＴ細胞受容体複合体と、第二結合腕を備える腫瘍細胞の腫瘍関連抗原とに結合することができる。従って、上記二重特異性抗体は、サイトカインを放出することによって腫瘍細胞を排除するＴ細胞を活性化する。さらに、Ｔ細胞は、二重特異性抗体による活性化の間にその受容体を介して腫瘍特異性抗体を認識し、長期にわたる免疫が開始する可能性がある。この点について特に重要なことは、二重特異性抗体の無傷Ｆｃ部分が単球／マクロファージ／樹状細胞のような補助細胞との結合を媒介することであり、当該無傷Ｆｃ部分によって、これらの細胞自体が細胞傷害性となり、および／または同時に重要な同時刺激の信号がＴ細胞に伝達される。
【００９８】
二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）は、薬物、プロドラッグ（ｐｒｏ−ｄｒｕｇ）の活性化、および免疫補充（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）戦略を標的とするために使用されてきた（文献９６）。Ｔ細胞が腫瘍を特異的に標的とすることによって、上記二重特異性抗体は腫瘍に対する細胞傷害性を直接媒介することができる。ＢｉＡｂは、循環している不活性なプロドラッグを腫瘍部位にて活性薬物に変換する酵素を産生するように改変されてきた。注入されたＢｉＡｂは、生体内の腫瘍細胞を標的とする免疫エフェクター細胞を補充および再標的とするために使用されるか、および／または免疫療法のための生体外拡張後にエフェクターＴ細胞と接合するために使用される。
【００９９】
無傷二重特異性抗体は、２つの抗体の半分子（ｓｅｍｉ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（１つのＨ免疫グロブリン鎖および１つのＬ免疫グロブリン鎖）から構成され、各分子はさらに、詳細には、正常抗体と同様に周知の効果機能を示すＦｃ部分を有する。本発明の、二重特異性抗体を調製するための特に好ましい方法は、下の実施例に記載する化学的ヘテロ共役による。他の調整方法はまた、本発明の上記の定義に従う無傷二重特異性抗体を導く場合、有用であることが理解されるべきである。
【０１００】
免疫グロブリンは、２組の短鎖／長鎖複合体を有し、一般的に少なくとも１つの鎖は、ヒトフレームワーク領域部分（ｈｕｍａｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ  ｓｅｇｍｅｎｔ）と機能的に結合したマウス相補性決定領域を含む。例えば、マウス相補性決定領域は、さらなる天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）マウスアミノ酸残基の有無を問わず、Ｈｅｒ２＋型腫瘍と結合する能力のあるヒト様（ｈｕｍａｎ−ｌｉｋｅ）抗体を産生するために使用される。
【０１０１】
機能的Ｆｃ部分を含まない二重特異性Ｆ（ａｂ）２断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）とは対照的に、本発明に用いた無傷二重特異性抗体は機能的Ｆｃ部分を保持する。本発明の無傷二重特異性抗体は、Ｔ細胞とだけでなく、Ｆｃ受容体陽性細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞）としてもまた知られる補助細胞とも結合することができる。細胞の結合は、Ｋａｎｅｋｏ，Ｔら、Ｂｌｏｏｄ（１９９３年３月１日）８１（５）：１３３３−１３４１；およびＫａｎｅｋｏ，Ｔら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ（１９９４）１４：２１９−２２９；Ｋａｎｅｋｏ，Ｔら、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９４）１４：２１３−２１７によって使用された方法の効率と比較して１０〜１０００倍高い、効果的で直接的な腫瘍の破壊を提供する際に重要な役割を果たす。本発明の無傷二重特異性抗体は、Ｔ細胞の最適な同時刺激を可能にする。最適な同時刺激において特に好ましい表面抗原は、ＣＤ３および／またはＣＤ２８ならびに特定の選択されたサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α）である。
【０１０２】
本発明の無傷二重特異性抗体と活性化Ｔ細胞との接合は、Ｔ細胞による腫瘍細胞の破壊を効果的に指示する。樹状細胞のような補助細胞はまた、接合化プロセスの間に本発明の二重特異性抗体によってもまた結合され得る。従って、癌患者からの樹状細胞は、刺激されて腫瘍の一部分を取り込み、処理し、提示する。
【０１０３】
標的腫瘍細胞の破壊を導く免疫機構は、少なくとも部分的に理解されている。表面にＣＤ８＋抗原決定基を保持する細胞傷害性Ｔ細胞の集合が同定された。これらの細胞は、活性化の際にＣＤ４＋ヘルパーリンパ球を必要とし、この活性化は、主要な組織適合性複合体に関連した抗原処理および提示によって媒介される複雑な事象である。抗原処理において、腫瘍抗原を標的とする細胞のみが活性化されることが保証されている。
【０１０４】
Ｔリンパ球の部分集合における様々なマーカーに方向性を持つモノクローナル抗体は、免疫エフェクター細胞を活性化するために使用されてきた。注射によって投与されたＯＫＴ３抗体は、例えばＣＤ３と結合し、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＲＡＮＴＥＳ、および／またはＩＬ−６の放出、組織損傷、ならびにＴ細胞活性の活性化または抑制のいずれかを含む一連の免疫効果を引き起こす。近年、ＯＫＴ３特異性は、二重特異性抗体の抗腫瘍特異性と組み合わされた。Ｌｉｎｋら、Ｂｌｏｏｄ、８１：３３４３（１９９３）によって、１つのＯＫＴ３の腕とＢ細胞悪性抗原に方向性を持つ別の腕とを有する二重特異性抗体が、標的腫瘍細胞の細胞傷害性を誘導することが示された。興味深いことに、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞本来の特異性には関係なく、腫瘍細胞の存在を必要とする。従って、同じ抗体による腫瘍細胞およびエフェクター細胞の同時結合において、Ｔ細胞は、一般Ｔ細胞集合から効果的に補充され、再び腫瘍細胞を破壊することを標的とする。
【０１０５】
Ｗｅｉｎｅｒ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、別冊７、６３（１９９２）によって、二重特異性抗体の作用がＩＬ−２の同時投与によって増強され、組み合わせの治療は、抗腫瘍モノクローナル抗体のみを用いた場合よりも１００〜１０００倍大きい腫瘍荷重（ｔｕｍｏｒ  ｌｏａｄ）を処理することが示された。あるいは、二重特異性抗体を使用する際に観察される同時刺激が、Ｆｃ単球受容体との抗体のＦｃドメインの結合を通して提供され、次いでＣＤ２８との膜タンパク質のＢ７族の結合を介した同時刺激が提供される可能性がある。二重特異性Ｆ（ａｂ’）の同時投与による細胞傷害性Ｔ細胞の生体外事前活性（ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）がまた報告された（Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５１：５７１６（１９９１））。
【０１０６】
しかし、本発明において、Ｔ細胞は、活性化し、患者に再注入される前に腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ２＋腫瘍）に対抗する特異性を有する二重特異性抗体と接合するという点で、先行技術とは異なる。
【０１０７】
好ましい実施形態において、再注入される細胞内組成物は、ナイーブＴ細胞、およびナイーブＢ細胞、ならびに樹状細胞のような補助細胞から構成される。樹状細胞は、強力な抗原提示細胞である。明らかに、樹状細胞（例えば、約５×１０５〜約２×１０６個の樹状細胞）を含む細胞の組成物は、強力な抗原提示細胞を提供し、それによって接合化Ｔ細胞および／またはナイーブ免疫応答性Ｔ細胞の用量が、患者の予後によって低減される。従って、これらの樹状細胞は、ナイーブＴ細胞のプールからの腫瘍特異性Ｔ細胞応答を刺激する。
【０１０８】
二重特異性抗体の産生に使用されるモノクローナル抗体は市販されている。例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫ−Ｔ３）は、オルトバイオテック（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）から入手可能である。Ｈｅｒ２＋（ハーセプチン（登録商標））のような腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体は、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＳＦ、ＣＡにより購入可能である。
【０１０９】
モノクローナル抗体はまた実験室で製造され得る。従って、所定の細胞型の癌細胞表面に表示された共通抗体決定基に特異的な抗体を選択する際に、細胞の混合物を調製する。上記混合物は所定の組織型の多数の癌細胞由来の各細胞系からの細胞を含んでいる。次いで、異種ヒト腫瘍細胞を用いて動物を免疫化する従来の免疫化プロトコルに従って、マウスのような実験動物に全ての細胞の上記混合物を注射する。続いて、動物、好ましくは切断された脾臓から反応性Ｂ細胞を回収し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成する。統計的分布関数に基づき１ウェル当たり１〜２のハイブリドーマが予測される限界レベル以下に細胞密度を維持することによって、単離された単一ハイブリドーマを得る可能性が上がる。
【０１１０】
クローンを作成し、成長させた後、分泌されたモノクローナル抗体を含む上清培地を取り除く。次いで、標的抗原決定基を表示する細胞と抗体との結合を導く条件下で、所定の組織の癌細胞の混合物と、異なる細胞型の癌細胞の混合物とを、モノクローナル抗体に接触させることによって、まずスクリーニングを行う。続いて抗体を認識する蛍光染料を加えて、どの細胞が検出可能な染料を有し、どの細胞が有しないかを測定するために、フローサイトメーターで細胞を評価する。発光強度の対数で細胞型を識別する。従って、細胞を、表面に標識化抗体が結合している第一級と、非標識化抗体が結合している第二級とに分類し、フローサイトメトリーにおいて細胞の二峰性分布を示す。
【０１１１】
第二スクリーニングは、前立腺癌の各細胞および癌の他の細胞がモノクローナル抗体で標識されている、二峰性分布を示す細胞に対してさらにスクリーニング試験を行う。従って、標識化抗体を用いて各癌細胞型をそれぞれ試験し、目的の細胞由来の癌細胞に対する結合特異性によって抗体を同定する。例えば前立腺癌由来の細胞と明白な反応性を示す抗体、および非前立腺癌由来の細胞と反応性を示さない抗体をさらに試験する。この方法によって治療される癌細胞型は、卵巣、胸、特定の内分泌腺（甲状腺）、精巣、および前立腺のような生存能力に本質的でない身体の器官に由来する癌細胞型、またはそれらの器官から生じた全ての癌細胞型を含む。
【０１１２】
第三スクリーニング試験は、第一および第二スクリーニングの両方を通過したモノクローナル抗体に対して行い、非相同組織由来の正常組織部分を制御しながら、所定の細胞型の多数の癌からの組織部分に対する標識化抗体の結合特異性を測定する。
【０１１３】
本明細書中の用語「由来」は、患者から取り出された腫瘍の二次培養によって細胞を得ることを意味する。上記用語は、リンパ系の非固形腫瘍から確立された細胞系にもまた適用される。腫瘍細胞の慣例的二次培養技術は、当技術に周知であり、増殖因子、栄養素、支持マトリックス、および特定の組織型にとって必要な場合ホルモンの使用を含む。実験動物の免疫化、その後の脾臓Ｂ細胞の細胞融合によるハイブリドーマの生成、およびそれに続く培養の技術は従来通りである。本発明の実施に使用する基本的なプロトコルは、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版、１９９１年の「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に詳細が述べられおり、参照として本明細書に援用されている。
【０１１４】
これらのプロトコルを本発明のハイブリドーマの単離に適用して、融合細胞の適切な希釈を行うことが重要であり、これにより９６ウェルトレイの多数のウェルが約１〜２クローンを含み、好ましくはそれ以上含まない。この目的を達成する十分好ましい希釈において、約６〜１２％のウェルは全くクローンを含まない。
【０１１５】
フローサイトメトリーには、いくつかの鍵となる利点がある。最初に、安定な細胞表面の抗体が同定されることが重要である。細胞全体と結合した抗体のみを選択することによって、安定な表面構成要素の抗原を選択する可能性が上昇する。抗体／細胞の相互作用に関する用語「安定」は、標的分子が好ましくは構造および膜の一体性に不可欠な構成細胞膜の糖タンパク質であり、細胞周期中に、排除（ｓｈｅｄ）されたか、置換、または抗原性に改変された細胞の一過性の滞留ではない。
【０１１６】
フローサイトメトリーによるスクリーニングの第二の利点は、二峰性プロフィールによって、ある細胞が蛍光団で標識化された抗体と結合し、他の細胞が結合していないことが示されることである。従って上記プロフィールは、特異性の限界（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の示唆である。単一の蛍光ピークが観察された場合、これは腫瘍細胞と非前立腺細胞との両方に共通したある抗原が抗体によって同定されたことを意味する。２つのピークは、腫瘍細胞の１つ以上の部分集合が特有の抗原を有し、腫瘍細胞の１つ以上の部分集合（全ての回集合ではない）が非腫瘍細胞と抗原を共有しているか、あるいは腫瘍細胞が正常細胞と共有しない抗原を有しているかのどちらかを意味している。予選択の方法の別の利点は、細胞を標識し、該細胞をフローサイトメトリーのために調製する技術が公知であるため、慣例的に行うことが可能なことである。
【０１１７】
二重特異性抗体は、様々な医療的適用に利用されてきた。米国特許第５，６０１，８１９号（Ｗｏｎｇ）は、特定のＴ細胞部分集合の増殖および破壊を選択的に引き起こす組み合わせのＣＤ３とＣＤ２８またはインターロイキン２との受容体二重特異性抗体の使用を開示している。Ｂｅｌａｎｉらは、低用量でＴ細胞の特異性を標的とし、高用量で全身性サイトカイン産生による非特異性Ｔ細胞活性化を引き起こすＢ細胞リンパ種モデルの二重特異性ＩｇＧ機能を示した。この研究により、ｂｓＦ（ａｂ’）２は、活性化Ｔ細胞によってＴ細胞媒介溶解を標的とする能力を有することが見出された。従って、多くの適用において、酵素によって消化された断片などの抗体の一部分は、無傷の抗体に見られる効果を媒介する。これらの断片は、可変短鎖抗体ドメインおよび可変長鎖抗体ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）を必ず含み、他のタンパク質断片と一体化して二重特異性抗原結合タンパク質構造を形成する。この構造は、分散した定常フレームワークβシート部分を含むＣＤＲを最小限備える。これらの領域は、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号で開示されるように、慣例的なクローニングおよび配列決定手順によって容易に同定され、該特許は本明細書中に参照として援用されている。クローニングは、機能的可変領域の側面にある保存配列に相補的なＰＣＲプライマーによって促進され得る。
【０１１８】
エフェクター細胞に特異的なＣＤＲと組織特異性抗原に対するＣＤＲとを結合する有用な二重特異性抗体はまた、マウス抗体の短鎖および長鎖定常領域をそのヒトの対応する部分と置換することによってか、あるいはヒト抗体にＣＤＲを融合させることによって、ヒト化され得る。これらの手順を実施する方法は、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号に記載されている。本発明の免疫構造はまた、二重特異性単一鎖抗体であってもよく、当該抗体は一般的に、可変短鎖部分から構成される組み換えポリペプチドであり、該短鎖部分はリンカー分子を介して対応する可変長鎖部分と共有結合している。上記二重特異性単一鎖抗体については、米国特許第５，４５５，０３０号、同第５，２６０，２０３号、および同第４，４９６，７７８号で開示され、本明細書中に参照として援用されている。Ｆｃ部分をまた備える単一鎖の二重特異性抗体におけるより複雑な構造は、米国特許第５，６３７，４８１号で詳細に提供されている。このタイプの構造の主な利点は、さらなる精製を必要とする融合細胞の混成型（ｈｙｂｒｉｄ）ハイブリドーマの３つの別々の抗体型ではなく、１種の抗体しか産生されないことである。
【０１１９】
二重特異性抗体を作成する際に他の方法を使用することができる。本発明の特に好ましい方法は、２つのモノクローナル抗体の化学的ヘテロ共役によるものである。記載の作成方法に加えて、市販のモノクローナル抗体を購入してもよい。異なる特異性を有する無傷の抗体あるいは抗体断片のどちらかの化学的結鎖によって、化学的ヘテロ共役を作成することができる。化学的ヘテロ共役の好ましい方法を下の実施例に記載し、その方法を図１に概略的に示す。
【０１２０】
二重特異性抗体はまた、抗体断片の酵素および再結合を含む開裂ジスルフィド交換によって作成され得る（Ｇｌｅｎｎｉｅら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆ（ａｂ’）２  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｆａｂ’Ｆｒａｇｍａｎｔｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５（１９８７））。別の方法は、短縮Ｆｃを介して転写因子ＦｏｓおよびＪｕｎのロイシンジッパー領域と結合したＦ（ａｂ’）２を作成することである（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３（１９９２））。
【０１２１】
二重特異性抗体はまた、混成型ハイブリドーマによって作成される。混成型ハイブリドーマは、２つのハイブリドーマ細胞系を融合することによって作成され、従って、得られた混成型ハイブリドーマは、２つの生産的な短鎖対立遺伝子を備えている。混成型ハイブリドーマは、親ハイブリドーマにより作成された抗体によって認識される２つの異なる抗原のそれぞれに対して一価である個々の二重特異性ＩｇＧ分子を分泌する。しかし、混成型ハイブリドーマは、親ハイブリドーマによって認識される２つの抗原のそれぞれに対する二重特異性抗体および単一特異性抗体の両方を作成する。さらに、常に短鎖／長鎖の正確性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）が生じるというわけではない。つまり、混成型ハイブリドーマ細胞系によって作成される可能性のある長鎖と短鎖の組み合わせが１０通りある。これらの組み合わせのうち１つは、所望の二重特異性抗体である。従って、二重特異性構成要素のある程度の精製が、上記二重特異性抗体の使用前に必要とされる。精製の好ましい方法は、タンパク質Ａ免疫親和性クロマトグラフィーとその後のＨＰＬＣ精製である。
【０１２２】
本発明をより完全に理解するために、いくつかの定義を述べる。本明細書中の用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされた１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子として、κ、λ、α、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。完全長の免疫グロブリンの「短鎖」（約２５Ｋｄまたは約２１４個のアミノ酸）は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子（約１１０個のアミノ酸）およびＣＯＯＨ末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。完全長の免疫グロブリンの「長鎖」（約５０Ｋｄまたは約４４６個のアミノ酸）も、可変領域遺伝子（約１１６個のアミノ酸）および他の上記の定常領域遺伝子、例えばγ（約３３０個のアミノ酸）によって同様にコードされる。
【０１２３】
免疫グロブリンの１つの形態は、抗体の基本構造単位から構成される。この形態は四量体であり、２組の等しい免疫グロブリン鎖からなり、各組は１本の短鎖と１本の長鎖を有する。各組において、短鎖可変領域および長鎖可変領域は共に抗原と結合する役目をし、定常領域は抗体エフェクター機能を示す。抗体に加えて、免疫グロブリンは、Ｆｖ，Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、および二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を含む様々な他の形態、ならびに単一鎖状（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５、５８７９−５８８３（１９８８）、およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３−４２６（１９８８）；本明細書中に参照として援用されている）で存在している。
【０１２４】
免疫グロブリンの短鎖または長鎖可変領域は、３つの超可変領域（ＣＤＲ’）が介在する「フレームワーク」領域から構成される。フレームワーク領域およびＣＤＲ’の伸張は以前に定義されている（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｅ．Ｋａｂａｔら、米国厚生省（Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、（１９８３）参照；本明細書中に参照として援用されている）。異なる短鎖または長鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。本明細書中の「ヒトフレームワーク領域」は、天然のヒト免疫グロブリンフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％以上、一般的に９０〜９５％またはそれ以上）であるフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、つまり構成要素の短鎖と長鎖とを組み合わせたフレームワーク領域は、ＣＤＲ’を配置して配列する役目を果たす。ＣＤＲ’は主に、抗原のエピトープと結合する際に重要な働きをする。
【０１２５】
キメラ抗体は、一般的に遺伝子組み換えによって、異なる種に属する免疫グロブリンの可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から作成されてきた。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変断片は、γ１およびγ３のようなヒト定常断片と結合している。従って、代表的な治療的キメラ抗体は、マウス抗体からの可変ドメインまたは抗原結合ドメインと、ヒト抗体からの定常ドメインまたはエフェクタードメインとからなるハイブリッドタンパク質である。他の哺乳類の抗体が使用されてもよい。
【０１２６】
本明細書中の用語「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（通常マウスまたはラット）免疫グロブリンからの１つ以上のＣＤＲ’を含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲ’を提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域が存在しなくてもよいが、存在する場合は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一（つまり、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上の同一性）でなければならない。従って、ＣＤＲ’を出来る限り除いたヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化短鎖免疫グロブリンとヒト化長鎖免疫グロブリンとを含む抗体である。例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒト型（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ）であるため、ヒト化抗体は、上で定義した代表的なキメラ抗体を含まない。また、ドナー抗体（ｄｏｎｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」の処理によって「ヒト化される（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」と言われている。なぜなら、得られたヒト化抗体は、ＣＤＲ’を提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予測されるからである。
【０１２７】
尚、ヒト化抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を与えないさらなる保存アミノ酸置換基を有する。保存置換基によって、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンのような組み合わせが意図される。
【０１２８】
ヒト化抗体を含むヒト化免疫グロブリンは、遺伝子組み換えによって作成される。上記のヒト化免疫グロブリンのほとんどは、特定のヒト免疫グロブリン鎖のフレームワーク（アクセプター）と同一のフレームワーク、および非ヒトドナー免疫グロブリン鎖からの３つのＣＤＲ’を含む。
【０１２９】
重要なことは、アクセプターとして、ヒト化され得るドナー免疫グロブリンと非常に相同性のある特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワーク、または、多くのヒト抗体からの共通（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）フレームワークが使用されることである。例えば、データーバンク（例えば、国立生物医学研究財団法人タンパク質同定情報源（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ））における、ヒト長鎖（または短鎖）可変領域とのマウス長鎖（または短鎖）可変領域の配列の比較によって、様々なヒト領域との相同性の程度が、一般的に約４０％から約６０−７０％と大きく異なることが示された。ドナー免疫グロブリンの長鎖（または短鎖）可変領域に対し最も相同性を有するヒト長鎖（または短鎖）可変領域の１つを、アクセプター免疫グロブリンとして選択することによって、少数のアミノ酸が、ドナー免疫グロブリンからヒト化免疫グロブリンへ移動する際に変化する。従って、ＣＤＲ’付近のアミノ酸が変化して高次構造が歪む小さな変化が生じることは明らかである。さらに、ヒト化免疫グロブリン鎖を含むヒト化抗体の正確な全体の形状は、ドナー抗体の形状に非常に類似しており、この形状によってＣＤＲ’が歪む機会が低減する。
【０１３０】
一般的に、少なくとも１０〜２０本の異なるヒト長鎖の代表的な集合体において、３〜５本の最も相同性の長鎖可変領域配列のうち１本を、長鎖フレームワークと提供するアクセプターとして選択し、短鎖対しても同様に選択する。好ましくは、１〜３本の最も相同性の長鎖可変領域のうち１本を使用する。選択したアクセプター免疫グロブリン鎖は、最も好ましくは、フレームワークにおいて、ドナー免疫グロブリンに対して少なくとも６５％の相同性を有する。
【０１３１】
多くの場合において、ヒト化短鎖および長鎖が互いに好適に結合することを保証するために、同じヒト抗体からの短鎖と長鎖とをアクセプター配列として使用することが好ましい。アクセプター免疫グロブリンの選択方法に関係なく、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワークにおける少数のアミノ酸を、アクセプターよりむしろドナーに位置するアミノ酸と等しくなるように選択することによって、高い親和性を達成することが可能である。
【０１３２】
ヒト化抗体は一般的に、マウス抗体よりも、いくつかの場合においては、人間治療用のキメラ抗体よりも、少なくとも３つの潜在的な利点を有する：
１）エフェクター部分がヒト型であるため、ヒト免疫系の他の部分との相互作用を好む（例えば、補体依存性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効果的に破壊する）、
２）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を外来性として認識せず、その結果このような抗体に対する抗体応答が、完全な外来性マウス抗体、または部分的な外来性キメラ抗体に対する抗体応答よりも小さい。
【０１３３】
抗体はまた、遺伝子組み換えされてもよい。特に好ましくは、アクセプターヒトフレームワーク領域をコードするＤＮＡ断片と結合した所望の抗原（例えば、ヒトＴ細胞ＣＤ３複合体）と結合し得るドナー免疫グロブリンから長鎖および短鎖ＣＤＲをコードする組み換えＤＮＡ断片を発現することによって産生されるヒト化免疫グロブリンである。
【０１３４】
ＤＮＡ断片は一般的に、天然の、または異種プロモーター領域を含むヒト化免疫グロブリンのコード配列と操作可能に連結した発現制御ＤＮＡ配列をさらに備える。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換するか、あるいは形質移入し得るベクターの真核生物プロモーターシステムであるが、原核生物宿主の制御配列もまた使用される。一旦ベクターが適切な宿主に組み込まれると、ヌクレオチド配列の高いレベルの発現に適した条件下で、宿主を保存し、所望であるように、ヒト化短鎖、長鎖、短／長鎖の二量体または無傷抗体、結合フラグメント、あるいは他の免疫グロブリン形態の収集および精製を続いて行う（Ｓ．Ｂｅｙｃｈｏｋ、Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）参照；本明細書中に参照として援用されている）。
【０１３５】
周知の工程に従って、様々なヒト細胞、好ましくは免疫化Ｂ細胞からヒト定常領域ＤＮＡ配列を単離することができる（Ｋａｂａｔ  ｏｐ．ｃｉｔ．およびＷＰ８７／０２６７１参照）。本発明の好ましい免疫グロブリンを産生するためのＣＤＲは、ヒトＴ細胞受容体ＣＤ３複合体のように、所定の抗原と結合し得るモノクローナル抗体から同様に誘導され、抗体を産生することのできる任意の便利な哺乳類源（例えばマウス、ラット、ウサギ、または他の脊椎動物）を用いた周知の方法によって作成される。定常領域およびフレームワークＤＮＡ配列のために適切な源の細胞、ならびに免疫グロブリンの発現および分泌のための宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、第６版（１９８８）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．；本明細書中に参照として援用されている）のような多数の供給源から入手可能である。
【０１３６】
天然配列と「実質的に相同性」である他の改変免疫グロブリンは、当業者に周知の様々な組み換えＤＮＡ技術を用いて容易に設計され製造される。例えば、フレームワーク領域は、いくつかのアミノ酸の置換、末端および中間の付加および削除などによって一次構造レベルが異なる。さらに、本発明のヒト化免疫グロブリンにおいて、様々な異なるヒトフレームワーク領域が、単独で、または組み合わせて使用される。一般的に、遺伝子組み換えは、部位特異的突然変異誘発（ＧｉｌｌｍａｎおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ、８、８１−９７（１９７９）、ならびにＳ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２８、７３１−７３４（１９８７）；共に本明細書中にて参照として援用されている）のような様々な周知の技術によって容易に達成される。
【０１３７】
実質的に相同性免疫グロブリン配列は、比較免疫グロブリンタンパク質に対して少なくとも約８５％の相同性、一般的には少なくとも約９０％、そして好ましくは９５％の相同性を示す配列である。
【０１３８】
あるいは、一次抗体構造の一部分しか含まないポリペプチド断片が作成され、当該断片は１つ以上の免疫グロブリン活性（例えば、補体結合活性）を保持する。これらのポリペプチド断片は、当技術に周知の方法による無傷抗体のタンパク分解開裂によってか、あるいは部位特異的突然変異誘発を用いて当業者に公知のベクターの所望の位置に終結コドンを挿入することによって作成される。
【０１３９】
上記のように、ＤＮＡ配列が発現制御配列と操作可能に（すなわち発現制御配列の機能を確実にする位置に）連結した後に、該ＤＮＡ配列が宿主に発現される。これらの発現ベクターは、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして、宿主生物体中で般的に複製し得る。一般的に、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシン耐性）を含み、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号参照；本明細書中に参照として援用されている）。
【０１４０】
大腸菌は、本発明のＤＮＡ配列を複製するために特に有用な原核生物宿主である。使用に適した別の微生物宿主として、バシラスサブチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）のようなバシラス菌、サルモネラ菌、セラチア菌、および様々なシュードモナス属のような他の腸内細菌が挙げられる。これらの原核生物宿主において、宿主細胞に適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を一般的に含む発現ベクターがまた産生される。さらに、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、βラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージラムダからのプロモーターシステム任意の数の様々な周知のプロモーターが存在する。プロモーターは一般的に発現を制御する。プロモーターは、必要に応じてオペレーター配列によって発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了させるためのリボソーム結合部位配列などを備える。
【０１４１】
酵母などの他の微生物はまた発現のために使用され得る。サッカロミケスは、プロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、または他の糖分解酵素）および複製起点のような発現制御配列、ならびに所望の終結配列などを有する適切なベクターを備える好ましい宿主である。
【０１４２】
微生物に加えて、哺乳類組織細胞の培養がまた、本発明のポリペプチドを発現および作成するために使用される（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、「Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ」、ＶＣＨ出版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８７）；本明細書中に参照として援用されている）。真核細胞が実際には好ましい。なぜなら無傷免疫グロブリンを分泌し得る多数の適切な宿主細胞系が当技術で開発されているからである。上記真核細胞としては、ＣＨＯ細胞系、様々なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞系など、および形質転換Ｂ細胞またはハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列（例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー）（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、８９、４９−６８（１９８６）；本明細書中に参照として援用されている）と、必須処理情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位）と、転写終結部位とを備える。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ウシ乳頭種ウイルスなどに由来するプロモーターである。
【０１４３】
目的のＤＮＡ断片を含むベクター（例えば、長鎖および短鎖のコード配列および発現制御配列）を、周知の方法によって宿主細胞に移す。上記周知の方法は宿主細胞の型によって異なる。例えば、塩化カルシウムのトランスフェクションは一般的に原核細胞に使用されるが、リン酸カルシウムの処理またはエレクトロポレーションは、他の宿主細胞に使用される（一般的に、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）参照；本明細書中に参照として援用されている）。
【０１４４】
本発明の抗体全体、個々の短鎖および短鎖、または他の免疫グロブリン形態は、一旦発現されると、当技術の標準の手順（例えば、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動など）に従って生成される（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）参照）。薬学的使用（体外使用を含む）において、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色法などを開発および実施する際に、少なくとも約９０〜９５％の相同性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％以上の相同性が最も好ましい（一般的に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９７９および１９８１）参照）。
【０１４５】
他の適切な技術は、抗原ポリペプチドへの、あるいはファージまたは同様のベクターにおける抗体のライブラリの選択への、リンパ球の生体外暴露を含む（Ｈｕｓｅら（１９８９）、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６参照；本明細書中に参照として援用されている）。本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変の有無を問わずに使用され、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能な信号を供給する基質との供給結合あるいは非共有結合のいずれかによって標識化される。様々な標識および共役技術が知られており、化学的文献および特許文献の両方において広範囲に報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、組み換え免疫グロブリンが作成される（Ｃａｂｉｌｌｙの米国特許第４，８１６，５６７号参照）。これらの特許は本明細書中に参照として援用されている。
【０１４６】
本発明の抗体はまた、タンパク質または抗原標的を単離するアフィニティークロマトグラフィー使用される。抗体が固体支持体（例えば、アガロースまたはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）などのような粒子）に結合しているカラムを用意し、細胞可溶化物を該カラムに通過させる。続いて中性洗剤の濃度を増加させることによってカラムを洗浄し、精製された抗原を放出する。
【０１４７】
抗体はまた、特定の発現生成物（例えば、抗ＣＤ３、またはＴ細胞を活性化させる任意の他の分子）に対して発現ライブラリをスクリーニングするために、そしてＡＴＣと接合する際に使用される。一般的に、このような手順に使用される抗体は、抗体の結合によって抗原の存在を容易に検出し得る部分で標識化される。
【０１４８】
例えば、ＣＤ３複合体に対して生じる抗体はまた、抗ディオタイプの抗体を産生するのに有用である。
【０１４９】
好ましいファージ提示ランダムペプチドライブラリの調製および特性が他で記載されてきた。ＴＳＡＲ−９として知られているファージ提示ランダムペプチドライブラリの調製の記載については、Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９２）１２８：５９−６５を参照し、以下にさらに記載する。特に、固定長の退化オリゴヌクレオチドをバクテリオファージベクターへ組み込んでクローニングすることによって、ランダムペプチドの組み換えライブラリが作成され、Ｍ１３ウイルス粒子の表面におけるｐＩＩＩタンパク質のアミノ末端で発現される（各粒子の表面に、ｐＩＩＩ融合の３〜５個のコピーが存在する）。続いて、標的と結合したウイルス粒子を単離することによって、これらのライブラリをスクリーニングすることができる。単離物を一晩かけて増殖し、ＤＮＡ配列決定によって、結合の役目をする提示ペプチド配列を演繹する。
【０１５０】
これらのライブラリには、約＞１０８の異なる組み換え体が存在し、挿入物のヌクレオチド配列決定は、発現されたペプチドにおいてアミノ酸の配列が実にランダムであることを示している。これらのライブラリは、本明細書中にてＴＳＡＲライブラリと称され、ＴＳＡＲは、合成親和性試薬全集（Ｔｏｔａｌｌｙ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を表す。ＴＳＡＲライブラリの調製は、米国特許第６，４３２，９２０号にさらに記載される。
【０１５１】
本発明の好ましい薬学的組成物は、上記の方法によって作製されたか、市販のいずれかのモノクローナル抗体の使用を含む。モノクローナル抗体は、目的の二重特異性抗体を作製するために好ましくは化学的にヘテロ共役している。次いで、これらの二重特異性抗体は、活性化Ｔ細胞を「接合化」するために使用される。
【０１５２】
１つの実施形態において、二重特異性抗体は、接合化細胞が腫瘍標的を排除した後もＴ細胞と結合したままであり、従って、接合化Ｔ細胞は複数の標的腫瘍を排除することができる。すなわち、接合化Ｔ細胞が腫瘍標的と接触し、当該標的を排除しても、二重特異性抗体は、接合化Ｔ細胞から解放されない。一旦接合化Ｔ細胞が１つの腫瘍標的を排除すると、該接合化Ｔ細胞は、接合化Ｔ細胞が特異性を示す別の腫瘍標的と係合し、第二腫瘍標的を排除し、別の腫瘍標的などに係合する。好ましくは、接合化Ｔ細胞は、何サイクルもの標的細胞の排除を行う。詳細については下の実施例にて考察する。
【０１５３】
本明細書中の「標的細胞」は、接合化Ｔ細胞が結合する抗原を備える任意の細胞である。標的細胞は、腫瘍抗原に限定されないが、例えば、ウイルス抗原、伝染病生物体抗原などを含む。
【０１５４】
本明細書中の「接合」は、目的のＴ細胞抗原に対して特異的な二重特異性抗体部分の結合である。目的のＴ細胞抗原とは、ＣＤ３および／またはＣＤ３およびＣＤ２８のようなＴ細胞受容体複合体抗原である。二重特異性抗体の第二部分は、特定の腫瘍抗原に特異的な抗体であり、当該第二部分によって、活性化Ｔ細胞は特定の腫瘍抗原に対して標的となる。
【０１５５】
抗体を使用した様々な手順が腫瘍の処置に適用されているが、記録されている細胞傷害性Ｔ細胞を使用した成功の試みはあるとしてもごくわずかである。理論的に、細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍を処置する好ましい手段である。しかし、細胞傷害性Ｔ細胞を特異的に活性化する手段は存在しない。抗体とは対照的に、ＣＤ８細胞の表面におけるＴ細胞受容体は、外来性抗原を直接認識することができない。まず初めに、抗原はＴ細胞受容体に対して提示されなければならない。
【０１５６】
本発明は、下の実施例に記載されるようにＴ細胞の活性化についての詳細な説明を提供する。
【０１５７】
ＣＤ８Ｔ細胞への抗原の提示は、クラスＩの主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって達成される。主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、免疫応答に重要な役割を果たす糖タンパク質の広義の系統（ｆａｍｉｌｙ）をコードする大きな遺伝子座を指す。ＭＨＣ遺伝子はＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体とも称され、ヒトの第六染色体に位置している。ＭＨＣ遺伝子によってコードされた分子は、細胞表面に存在し、「非自己」として組織移植物の認識に大きな役割を果たしている。従って、膜結合ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞による抗原の認識に深く関与している。
【０１５８】
ＭＨＣ生成物は、３つの主要なクラス（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）に分類される。ヘルパー細胞として主に働くＴ細胞はＣＤ４を発現し、主にクラスＩＩ分子と相互作用するが、傷害性エフェクター細胞を代表するＣＤ８発現分子はクラスＩ分子と相互作用する。
【０１５９】
クラスＩ分子は、主に内因性タンパク質の細胞内分解から誘導されたペプチドと結合する能力を有する膜糖タンパク質である。ウイルス、細菌、および他の異種タンパク質から誘導されたペプチドとＭＨＣ分子との複合体は、Ｔ細胞の抗原応答性を誘因するリガンドを含む。一方、正常細胞の生成物から誘導されたペプチドとのＭＨＣ分子の生成物は、胸腺においてＴ細胞に自己ペプチドに耐性を示すことを「教示（ｔｅａｃｈｉｎｇ）」する重要な役割を果たす。クラスＩ分子は、無傷の抗原全体を提示せず、むしろ「ペプチド結合溝」に付加した（ｌｏａｄｅｄ）抗原のペプチド断片を提示する。
【０１６０】
本明細書中の「異質遺伝子型」は、非自己の主要な組織適合性複合体ドナーに由来する免疫細胞を意味するために使用さている。ＨＬＡハプロタイプ／アロタイプは個人によって異なり、しばしば個人のＨＬＡタイプを決定するのに有用である。ＨＬＡタイプは、標準分類手順およびフィコール勾配（Ｆｉｃｏｌｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）により精製された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を介して決定される。
【０１６１】
当業者によって理解されるように、用語「宿主適合性」または「自家」細胞は、細胞が供給される対象物または「宿主」の細胞と同じか類似したハプロタイプの細胞を意味する。
【０１６２】
本明細書中の「一部不適合ＨＬＡ」は、宿主ＨＬＡタイプに対して約２０〜９０％の適合性を示すＨＬＡタイプを意味する。
【０１６３】
長年、免疫学者は、ウイルス、レトロウイルス、および癌細胞を標的とする特異的細胞傷害性細胞を生み出すことを切望してきた。一般的にウイルス性疾患に対抗したターゲティングは、生ワクチンまたは弱毒化ワクチンによって生体内で達成されるが、レトロウイルスまたは癌細胞において達成された同様の成功はない。さらに、ワクチンを用いたアプローチは、免疫抑制患者に所望の有効性を与えない。少なくとも１人の研究者は、ＣＤ８細胞を生体外でＩＬ−２（Ｔ細胞の増殖因子）と共に培養することによって、「急速（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」出現（ｅｘｉｓｔｉｎｇ）ＣＤ３細胞の比較的非特定的なアプローチを取った。しかし、このプロトコル（ＬＡＫ細胞治療として知られる）は、すでに活性化されたＣＤ８細胞の拡張のみを可能とする。どういうわけか免疫系が常に活性しているため、ＩＬ−２模造細胞のほとんどは、疾患に対抗する目的とは無関係である。実際、このタイプの治療が、所望の特異性を有する任意の細胞を活性化することは証明されていない。従って、ＬＡＫ細胞治療の利点は、よくても議論の余地があり、一般的に副作用は非常に深刻で多くの研究は中断された。
【０１６４】
ペプチドのみと結合したクラスＩＭＨＣ分子の提示は、一般的に、ＣＤ８細胞の活性化に効果的ではない。実際、ＣＤ８細胞は、ペプチド結合クラスＩＭＨＣ分子だけでなく、同時刺激分子もまた提示する抗原提示細胞（例えば樹状細胞）によって活性化される。このような同時刺激分子はＢ７を含み、当該Ｂ７は、ここでＢ７．１およびＢ７．２として設定された２つの亜群として認識される。インテグリンのような細胞接着分子がこの目的を支援することがまた見出されている。
【０１６５】
樹状細胞は、血液を含む全ての組織および器官に存在する抗原提示細胞である。より詳細には、樹状細胞は、Ｔリンパ球に対して抗原を提示する。すなわち、上記樹状細胞は、抗原を処理して提示し、ナイーブＴ細胞および記憶Ｔ細胞からの応答を刺激する。抗原提示の役割に加え、樹状細胞は、非リンパ組織と直接連絡し、傷害（ｉｎｊｕｒｙ）シグナル（虚血、感染、または炎症）または腫瘍成長について非リンパ組織を調査する。一旦樹状細胞が信号を送ると、リンパ球および単球を誘因するＩＬ−１を解放することによって免疫応答を開始する。
【０１６６】
ＣＤ８Ｔ細胞が、クラスＩＭＨＣおよび同時刺激分子と結合したペプチドを備える抗原提示細胞（例えば樹状細胞）と相互作用すると、ＣＤ８Ｔ細胞は、活性化して増殖し、エフェクターＴ細胞となる（一般的に、ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ出版、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９４）参照；本明細書中に参照として援用されている）。
【０１６７】
従って、必要とされるもの、および本発明が提供するものは、Ｔ細胞を活性化する方法であり、従ってＴ細胞は増殖し、細胞傷害性となる。Ｔ細胞を生体外で活性化し、活性化細胞傷害性Ｔ細胞を患者に再導入することができるため、本発明はまた有用である。活性化の効果を増大させるＴ細胞受容体複合体（抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）の架橋結合によって活性化を達成する。
【０１６８】
再注入される細胞の組成物は、接合化活性化Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、ナイーブＢ細胞、および樹状細胞から構成されるため、本発明はまたは、抗原提示細胞に関するものである。強力な抗原提示細胞である能力に加えて、樹状細胞はまた、二重特異性抗体のＦｃ部分と結合し、腫瘍に結合した接合化Ｔ細胞と、二重特異性抗体のＦｃ部分に結合した樹状細胞との複合体を形成する。従って、理論的には、非常に強力で局部的な免疫応答が、腫瘍部位の樹状細胞のような抗原提示細胞の係合によって産出される。
【０１６９】
ケモカインおよびサイトカインはまた、免疫応答の発達に重要な役割を果たす。白血球の輸送におけるケモカインの役割はＢａｇｇｉｏｌｉｎｉ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９２：５６５−８によって評論されており、異なるタイプおよび程度の活性化のリンパ球の複雑な輸送における輸送応答がケモカインによって媒介されることを提案している。ケモカインを阻害するための低分子の使用は、ＢａｇｇｉｏｌｉｎｉおよびＭｏｓｅｒ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１８９−１１９１によって評論されている。
【０１７０】
リンパ球ホーミングにおける様々な特定のケモカインの役割は、以前に記載されている。例えばＣａｍｐｂｅｌｌら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅによって、ＳＤＦ−１（ＰＢＳＦとも呼ばれる）、６−Ｃ−ｋｉｎｅ（Ｅｘｏｄｕｓ−２とも呼ばれる）、およびＭＩＰ−３β（ＥＬＣまたはＥｘｏｄｕｓ−３とも呼ばれる）がほとんどの循環リンパ球（ほとんどのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む）の接着を誘導し、ＭＩＰ−３α（ＬＡＲＣまたはＥｘｏｄｕｓ−１とも呼ばれる）がナイーブではなく記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の接着を誘導することが示された。また、Ｔａｎｇｅｍａｎｎら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６３３０−７は、二次リンパ器官のホーミングにおける二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）、高内皮小静脈（ＨＥＶ）関連ケモカインの役割を開示している。Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４１（４）：１０５３−９は、ＣＣＲ７としてのＳＬＣに対する受容体を記述し、そしてそのリガンド（ＳＬＣ）が、生理的ひずみ（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｈｅａｒ）によって回転しているリンパ球の迅速なインテグリン依存性静止（ａｒｒｅｓｔ）を引き起こすことを開示している。
【０１７１】
好ましくは、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴは、ナイーブ幹細胞または多能性幹細胞から記憶Ｔ細胞を誘導させる。未成熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞は、マーカーによって容易に同定され、フローサイトメトリー分析によって検出される。記憶Ｔ細胞の生物学は、Ｄｕｔｔｏｎら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６：２０１−２３で評論されている。記憶細胞は、異なるパターンの細胞表面マーカーを発現し、ナイーブ細胞のマーカーとは機能的に異なるいくつかの方法で応答する。ヒト記憶細胞はＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋である。ナイーブ細胞とは対照的に、記憶細胞は、全種類のＴ細胞サイトカインを分泌する。
【０１７２】
成熟Ｂ細胞は、例えば、蛍光色素で標識化されたモノクローナル抗体を備えるＣＤ１９およびＣＤ２０を含む細胞表面抗原によるイムノアッセイによって測定されるか、あるいは、酵素がこれらの抗原に対して使用される。プラズマ細胞に分化するＢ細胞は、培養された細胞の固定化塗抹標本（ｓｍｅａｒ）の直接免疫蛍光法によって細胞内免疫グロブリンを染色することにより数えられる。
【０１７３】
成熟および細胞分化を評価するいくつかの異なる方法が利用可能である。例えば、上記方法の１つは、細胞表現型を測定することによる。免疫細胞の表現型および表現型の変化は、様々な免疫細胞型の膜タンパク質特性と結合したモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色法の後にフローサイトメトリーによって評価される。
【０１７４】
細胞分化を評価するための第二の方法は、細胞機能を測定ことによる。この方法は、細胞内または細胞から分泌される酵素、細胞内におけるｍＲＮＡ、遺伝子、タンパク質、または他の代謝物質の発現を測定することによって、生化学的に行われる。生物検定はまた、機能細胞の分化、または患者の腫瘍、腫瘍細胞系、または新鮮な腫瘍からの細胞に関する特定の抗体産生を測定するために使用される。
【０１７５】
本明細書の「新鮮な腫瘍」は、外科的または他の方法によって宿主から取り出された腫瘍を指す。
【０１７６】
免疫細胞は、モノクローナル抗体または多クローン性抗血清のいずれかによって検出可能である様々な細胞表面分子を発現する。分化または活性化を引き起こす免疫細胞はまた、培養された細胞の固定化塗抹標本の直接免疫蛍光法によって特徴的な表面タンパク質の存在を染色することにより数えられる。
【０１７７】
生体外Ｔ細胞傷害性アッセイは当業者に周知である。一般的に細胞傷害性は、５時間の５１クロム酸ナトリウム（５１Ｃｒ）解放アッセイによって測定される。特に、２０時間の５１Ｃｒ解放アッセイが好ましい。本明細書中にて「標的細胞」とも呼ばれる腫瘍細胞を、平底マイクロタイタープレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。標的を洗浄し、翌日３７℃で５１Ｃｒを用いて標識化した。５１Ｃｒは、エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスのいずれかによって標的細胞に取り込まれ、細胞質に保持されている。腫瘍細胞を含むウェルを洗浄し、接合化ＡＴＣまたは非接合化ＡＴＣ（「エフェクター細胞」と呼ばれる）を異なるＥ：Ｔ比でプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。細胞の溶解は、エフェクター細胞による標的細胞の破壊に起因した、標的細胞から上清への５１Ｃｒの解放の測定値である。１０分間１０００ｒｐｍでマイクロタイタープレートを遠心分離し、約５０μｌ〜約１００μｌの分割量を取り出す。そして、翌日γ線計数器を用いて放射能のレベルを測定し、特異的溶解％を計算する。
【０１７８】
以下の式用いて特異的溶解％を測定する：
（標的細胞から解放された５１Ｃｒ）−（標的細胞から解放された自発性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）５１Ｃｒ）／（標的細胞から解放された最大５１Ｃｒ）−（標的細胞から解放された自発性５１Ｃｒ）×１００。
【０１７９】
標的細胞から解放された自発性５１Ｃｒは、エフェクター細胞が添加されていない腫瘍細胞を用いて測定される。標的細胞から解放された最大５１Ｃｒは、例えば１Ｍ  ＨＣｌを添加することによって入手され、標的細胞の細胞質に存在する５１Ｃｒの合計量を表す。
【０１８０】
本願で示す細胞傷害性アッセイのすべては、１８〜２０時間にわたりＩＬ−２を添加せず行われる。接合化ＡＴＣまたは接合化ＣＯＡＣＴＳによって媒介された再方向化（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）細胞傷害性は、血清および補体が存在しＩＬ−２が存在しない条件下で生じる。従って、注入された接合化Ｔ細胞は、ＩＬ−２の非存在下では、少なくとも１８〜２０時間にわたって腫瘍を排除する。
【０１８１】
血清および補体は、接合化ＡＴＣにより媒介された細胞傷害性に影響を与えない。接合化ＡＴＣは、新鮮なＰＢＭＣおよびウサギの補体または高濃度の新鮮なヒト血清の存在下では溶解されない。この結果は、接合化ＡＴＣが、補体の固定化および、Ｆｃ受容体媒介抗体依存性細胞傷害性を介した溶解によって、生体内で溶解されないことを示している。
【０１８２】
トリチウム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を用いた標的細胞の標識のような他の細胞傷害性アッセイもまた使用される。３Ｈ−ＴｄＲは、標的細胞によって細胞の核に取り込まれる。３Ｈ−ＴｄＲの解放は、ＤＮＡ断片化による細胞死の測定である。培養時間が少なくとも約４８時間であり、少なくとも約１ｍｌのシンチレーション流体の存在下でβ線計数器を用いて５０μｌ〜約１００μｌの上清を測定することを除き、上記のようにアッセイを行う。上の式を用いて特異的溶解％の計算を行う。
【０１８３】
本申請書全体において、以下の定義を使用する。
【０１８４】
用語「蛍光成分」または「蛍光標識」あるいは「標識化」は、光を吸収し、時間をかけて少なくともいくらかのエネルギーを光として再放射し得る成分を指す。該用語は、分散した化合物、分子、天然蛍光タンパク質、蛍光および非蛍光の化合物または分子の高分子複合体または混合物を含む。用語「蛍光成分」または「蛍光標識」はまた、有機リガンド感応性を有するランタニドイオンおよびランタニド錯体のような長時間の蛍光減衰を示し、光を吸収し、数ミリ秒にわたってエネルギーを再放射する成分を含む。他の標識は、様々な蛍光色素および蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質）を含む。多色分析に使用され得る蛍光色素は、フィコビリンタンパク質（例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン）、フルオレセイン、およびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）を含む。
【０１８５】
活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）は、ＣＤ８表現型のＴリンパ球が優位を占めるヒトリンパ球の異種集合であり、該ＣＤ８表現型は、ＯＫＴ３による刺激、および低用量のＩＬ−２での成長の後に増殖する。３００，０００ＩＵ／ｍ２／日の低用量のＩＬ−２および、多くとも２５０μｇ／ｍ２／日または少なくとも１２５μｇ／ｍ２／週に二回の用量のＧＭ−ＣＳＦの皮下注入または連続注入と組み合わせて、ＡＴＣは安全に供給される。ＡＴＣはまた、他の免疫増大サイトカインまたはケモカイン（例えばＩＬ−１２）と共に投与される。
【０１８６】
好ましくは、再注入されたＡＴＣまたはＣＯＡＣＴは、約４週間にわたり、週に二回、患者に投与される。当業者は、患者の年齢、性別、体重および体調によって、正しい回数および用量を決定することができる。
【０１８７】
マーモナブ（Ｍｕｒｍｏｎａｂ）ＯＫＴ３：ＯＫＴ３（オルトクローン（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｏｎｅ）ＯＫＴ３）は、前臨床試験および臨床試験の両方において広範囲に特徴付けられている。ＯＫＴ３は、ヒトＣＤ３に方向性を持つマウスＩｇＧ２ａ  ＭＡｂであり、オルトバイオテック、ラリタン、ＮＪから市販されている。５ｍｌの静菌水を含む５ｍｇのバイアルで購入することができる。そして、ＯＫＴ３は、ＡＴＣを作成するため、ＣＯＡＣＴＳを作成するためにダイナルビーズをコーティングするため、そして９１８４またはハーセプチン（登録商標）との化学的ヘテロ共役を生成するために使用される。
【０１８８】
ＩＬ−２プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）：プロロイキン（組み換えＩＬ−２）は、カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）、エメリービル、ＣＡより購入可能である。このプロロイキンは、腎細胞癌の処置に認証されている。臨床級薬剤は培養によってＴ細胞を拡張させるために使用されている。現在、本研究室において、ＡＴＣおよびＣＯＡＣＴＳを拡張させるために上記薬剤を使用している。
【０１８９】
ＣＯＡＣＴＳは、約５０％のＣＤ４＋表現型を含むヒトＴ細胞異種集合であり、同時固定化ＯＫＴ３および９．３Ｍａｂによって当該ＣＤ４＋表現型を増殖および分化させる。そして、低用量のＩＬ−２の存在下および非存在下で１４日間ＣＯＡＣＴＳを成長させる。ＣＯＡＣＴＳのみを患者に注入する。ＩＬ−２、ＯＫＴ３、９．３、およびビーズは、最終生成物には含まれない。ＯＫＴ３を９．３（抗ＣＤ２８モノクローナル抗体）で同時固定化し、Ｔ細胞を同時刺激する。
【０１９０】
マーム（Ｍｕｒｍ）９．３は、ヒトＴ細胞のＣＤ２８受容体に方向性を持つＩｇＧ２ａアイソタイプのマウスＭａｂである。９．３Ｍａｂは、Ａｂｂｏｔｔ−Ｂｉｏｔｅｃｈによって、臨床級条件下で製造された。ダイナルビーズ上でＯＫＴ３と共に上記抗体を同時固定化し、培養中にＴ細胞を活性化する。上記抗体を患者に注入しない。ビーズを取り出してから、モノクローナル抗体を取り出す。
【０１９１】
ＢｉＡｂ：ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ［いずれかをＨｅｒ２Ｂｉと命名する］は、ＡＴＣと接合するために使用され、従って、ＡＴＣによって示される非ＭＨＣ限定細胞傷害性は、二重特異性抗体によって再び方向性を持ち、特定の標的抗原を発現する標的を溶解させる。Ｈｅｒ２ｂｉと接合したＡＴＣは、Ｈｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣと呼ばれる。
【０１９２】
臨床級９１８４Ｍａｂ：臨床の材料であるＧＭＰ９１８４（抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）は、ネクセルコーポレイション（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アービング（Ｉｒｖｉｎｇ）、ＣＡによって、１ｍｇを含むバイアルで供給される。９１８４は、ネクセルによって広範囲に特徴付けられ、欧州市場の幹細胞製品の一掃に使用されている。
【０１９３】
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕモノクローナル抗体（９１８４、ネクセルコーポレイション）。ネクセルコーポレイションによって治験薬として提供された抗Ｈｅｒ２（９１８４）モノクローナルは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに方向性を持ったマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＣＦ−７、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＰＣ−３に対する結合の特性および再方向化細胞傷害性を媒介する能力は、前臨床試験で十分に実証されてきた。
【０１９４】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、前立腺癌の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ｈｅｒ２）は、チロシンキナーゼの上皮成長因子受容体族に属する。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発癌遺伝子は、著しい配列相同性を有する１８５ｋＤａの膜貫通受容体をクラスＩの受容体チロシンキナーゼ族にコードする（文献１４５）。Ｈｅｒ２は、乳癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、口腔癌（文献１４６）、および前立腺癌（文献１４２〜１４４）で過剰に発現される。Ｈｅｒ２の過剰発現によって、Ｈｅｒ２は理想的な標的となる。しかし、前立腺癌でのＨｅｒ２／ｎｅｕの発現は、賛否両論である。前立腺癌でのＨｅｒ２／ｎｅｕの発現が小さいか、またはないことを提案している報告もあれば（文献１４２、１４７、１４８）、大きいことを提案している報告もある（文献１４４）。
【０１９５】
ハーセプチン（登録商標）：ハーセプチン（登録商標）（ジェネンテック、ＳＦ、ＣＡ）は、前臨床試験および臨床試験で広範囲に特徴付けられている。Ｍａｂは、Ｔａｘｏｌと組み合わせてＩＶ段階の乳癌を処置する生体内使用のために市販されている（文献１６１）。
【０１９６】
ＯＫＴ３：市販用の臨床級ＯＫＴ３は、９１８４またはハーセプチン（登録商標）とヘテロ共役ており、それぞれＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃを生成する。
【０１９７】
接合化Ｔ細胞（「薬物」）：
接合化ＡＴＣは、６〜１４日間成長したＡＴＣであり、Ｈｅｒ２Ｂｉ（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ）と接合している。
【０１９８】
接合化ＣＯＡＣＴＳは、６〜１４日間で成長したＣＯＡＣＴであり、Ｈｅｒ２Ｂｉ（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ）と接合している。
【０１９９】
特定の治療用において、所望のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ケモカイン、または本発明の任意の他の免疫増大分子）をコードするＤＮＡ発現ベクターが、本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入される。
【０２００】
本明細書中の用語「ベクター」（「発現ベクター」を含む）は、宿主細胞に取り込まれて、目的の核酸を発現し得る任意の目的の核酸配列である。ベクターは、例えば直線（ｌｉｎｅａｒ）核酸配列、プラズミド、コスミド、ファージミド、および染色体外ＤＮＡを含む。より詳細には、ベクターは、組み換えＤＮＡであってもよい。本明細書中の用語「発現」または「遺伝子発現」は、ＤＮＡの転写およびＲＮＡ転写の翻訳を含む目的の核酸配列のタンパク質生成物の生成を意味する。
【０２０１】
上記ベクターは、ベクター、リポソーム、無防備のＤＮＡ、アジュバント補助（ａｄｊｕｖａｎｔ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどを含む。ベクターは、標的部分（例えば、細胞表面受容体へのリガンド）と核酸結合部分（例えば、ポリリシン）とを備えるＷＯ９３／０４７０１に記載の化学共役、ウイルスベクター（たとえば、ＤＮＡウイルスベクター、またはＲＮＡウイルスベクター）、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）と核酸結合部分（例えば、プロタミン）を備える融合タンパク質であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載の融合タンパク質、プラズミド、ファージなどを含む。上記ベクターは、染色体性、非染色体性、または合成的である。
【０２０２】
好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学的結合を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。ウイルスベクターは、サイトカインまたはケモカインを特定の細胞に導入するために選択される。このようなベクターは、オルソポックスベクターまたはアビポックスベクターのようなポックスベクター、単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクター（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．ら、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１１４９（１９９０））のようなヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５））、およびアデノ関連ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４））を含む。
【０２０３】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞質に導入する。ポックスウイルスベクターは、核酸の短期発現のみを生じる。アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、および単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクターが、核酸を神経細胞へ導入するのに好ましい。アデノシンウイルスベクターは、アデノシン関連ウイルス（約４ヶ月）よりも短期の発現（約２ヶ月）を生じる。また、アデノシン関連ウイルスの発現はＨＳＶベクターよりも短い。上記ベクターは、一般的な技術（例えば、感染、形質移入、形質導入、または形質転換）によって導入される。遺伝子導入の方法の例として、無防備ＤＮＡリン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、原形質融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが挙げられる。
【０２０４】
好ましい実施形態において、接合化ＡＴＣは、ホルモン抵抗性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）前立腺癌およびＨｅｒ２＋腫瘍を有する他の患者の処置に使用される。しかし、二重特異性抗体は、個々の患者に存在する腫瘍に特異的に産生されるため、本発明は、全ての型の腫瘍を処置することができる。本発明は、自家Ｔ細胞の使用、および個々の患者に存在する特定の腫瘍に対するモノクローナル抗体の産生が可能であるという利点がある。従って、それぞれの患者に対して処置を調整することができ、新しい腫瘍抗原に対抗する新しいモノクローナル抗体の産生によって腫瘍抗原が変化した場合、処置を変更することが可能である。次いで、新しい腫瘍に特異的な抗体は、Ｔ細胞を活性化する抗体とヘテロ共役し、新規の二重特異性抗体を形成する。この新規の二重特異性抗体は、新しい腫瘍抗原に対して特異的であり、自家ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴと接合するために使用され、患者に注入される。
【０２０５】
特に、本発明は、個々の患者における接合化ＡＴＣの最大耐量（ＭＴＤ）を論証し、ＨＲＰＣを有する患者に関与して、個々の患者を基準に接合化戦略の有効性を決定する。
【０２０６】
好ましくは、患者を処置するためのプロトコルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離を必要とする。フィコール−ヒパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配でＰＢＭＣを単離する。下の実施例に記載のように、各患者からのＰＢＭＣを活性化し、次いで低温保存する。週に２回、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳを解凍し、洗浄して、Ｈｅｒ２ｂｉと接合し、患者に注入する。好ましくは、接合化ＡＴＣの用量増加計画（ｄｏｓｅ  ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ）において４つの用量レベルがある。用量レベルは、一回の注入当たり少なくとも約２０億、３０億、５０億、および８０億個の接合化ＡＴＣ（一回の注入当たり約２００億〜８００億個の接合化ＡＴＣの総用量範囲）である。患者への注入は非常に低用量から開始される（下の実施例に用量の決定を記載する）。細胞に基づく毒性が生じた場合、用量レベルを下げる。
【０２０７】
本発明において、１回の注入当たりの接合化ＡＴＣの適切な用量範囲は、約２５億〜約４００億個の接合化ＡＴＣである。少なくとも約週に二回、少なくとも約４週間にわたり本発明の注入を投与する。好ましい接合化ＡＴＣ／注入用量は、１回の注入当たり少なくとも約２５億個、より好ましくは約１００億個、最も好ましくは約４００億個の接合化ＡＴＣである。
【０２０８】
毒性について下で考察する。患者において細胞に基づく毒性の兆候が見られなかった場合、用量レベルを次の用量レベルに進める。好ましくは、各患者に少なくとも約１０回の注入を施す。週に約２用量を２週間にわたり、そして週に約１回分の用量を約６週間にわたり注入する。接合化ＡＴＣまたは接合化ＣＯＡＣＴＳの最初の注入の約３日前から始めて最後の注入の約１週間後まで毎日の割合で、少なくとも約３００，０００ＩＵ／ｍ２／日のＩＬ−２または他の免疫増大サイトカイン（例えばＩＬ−１２）を患者に皮下投与する。
【０２０９】
ＩＬ−２の好ましい用量範囲は少なくとも約５０，０００ＩＵ／ｍ２／日、より好ましくは約１５０，０００ＩＵ／ｍ２／日、最も好ましくは約３００，０００ＩＵ／ｍ２／日である。
【０２１０】
ＩＬ−１２、または他の免疫増大サイトカインまたはケモカインの好ましい用量範囲は、少なくとも約５，０００ＩＵ／ｍ２／日、より好ましくは約１５０，０００ＩＵ／ｍ２／日、最も好ましくは約３００，０００ＩＵ／ｍ２／日である。これらの用量は、患者の年齢、性別、体調、大きさ、体重などによって変化し、当業者により決定される。
【０２１１】
また、接合化ＡＴＣまたは接合化ＣＯＡＣＴＳの最初の注入の約３日前から始めて最後の注入の約１週間後まで少なくとも約週に２回、約１２５μｇ／ｍ２の用量で、ＧＭ−ＣＳＦを投与する。ＧＭ−ＣＳＦの好ましい用量範囲は、少なくとも約５０μｇ／ｍ２、より好ましくは約２００μｇ／ｍ２、および最も好ましくは約１２５μｇ／ｍ２である。腫瘍および免疫の評価を、約０ヶ月目、３ヶ月目、６ヶ月目、９ヶ月目、および１２ヶ月目に行う。臨床応答が生じた場合、次の用量レベルで患者を再び処置する。接合化および非接合化のＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの１１１インジウム標識化を、接合化および非接合化のＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの輸送を測定するために使用する。一般的に、ＭＴＤを測定した後に、輸送手順を行う。
【０２１２】
上記手順は、処置プロトコルがホルモン抵抗性前立腺癌の患者に使用される方法の例であるが、処置される腫瘍の型によって変更され得る。また、患者に投与された接合化ＡＴＣまたは接合化ＣＯＡＣＴＳの量は患者の体調によって変化し、当業者が適切な要因全てを考慮した上で決定される。しかし、好ましくは約１×１０６〜約１×１０１２、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０１１、そしてさらにより好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０の接合化ＡＴＣ細胞または接合化ＣＯＡＣＴＳ細胞を成人に使用する。これらの量は、患者の年齢、体重、大きさ、体調、性別、処置されるべき腫瘍の型、投与の経路、処置が局部的であるか、または全身的であるか、および他の要因によって変化する。当業者は、患者の特定の状況および要求に適した適切な用量および投与計画を容易に導くことができる。
【０２１３】
細胞成分を再び導入する方法が当技術に公知であり、Ｈｏｎｓｉｋらの米国特許第４，８４４，８９３号およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇの同第４，６９０，９１５号に例示された手順を含む。例えば、静脈内注入を介した活性化ＣＤ８細胞の投与が適切である。
【０２１４】
本明細書において、接合化ＡＴＣまたは接合化ＣＯＡＣＴＳを用いた免疫療法が臨床的寛解期（ＣＲ）を誘導するかどうかは、適切な腫瘍抗原の５０％減少によって決定される。例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌の患者における臨床的寛解期は、従来のＥＬＩＳＡによって測定される血中ＰＳＡ濃度（ｓｅｒｕｍ  ＰＳＡ  ｌｅｖｅｌ）の５０％減少によって定義されている。
【０２１５】
本明細書において、接合化ＡＴＣまたは接合化ＣＯＡＣＴＳを用いた免疫療法が全生存率（ＯＳ）を向上させるかどうかの決定は、免疫療法処置の初日から死亡までの時間長として定義される。
【０２１６】
本明細書において、接合化ＡＴＣまたは接合化ＣＯＡＣＴＳを用いた免疫療法が無進生存率（ＰＦＳ）を向上させるかどうかの決定は、免疫療法処置の初日から疾患の進行までの時間長として定義される。
【０２１７】
本発明について、ＩＩＩｂ／ＩＶ段階の乳癌のめにＰＢＳＣＴの後に複数回投与のＡＴＣと組み合わせて投与した３００，０００ＩＵ／ｍ２／日の用量のＩＬ−２（連続注入または皮下投与）および１２５μｇ／ｋｇ／日のＧＭ−ＣＳＦ（皮下投与）において、用量制限毒性はない。ハーセプチンのみ、または化学療法と組み合わせたハーセプチンを使用した臨床において、毒性が見られる（文献１５９）。数ｎｇのＢｉＡｂと接合したＡＴＣは、用量制限の細胞に基づく毒性を生成しない。モノクローナル抗体の注入によって熱、悪寒、低血圧、喘鳴、息切れなどの副作用が予測され、これらの副作用は、用量および注入間隔を低減することによって、あるいは抗ヒスタミン剤（例えば、ベネドリル（Ｂｅｎｅｄｙｌ）ＴＭ）を投与することによって処置される。
【０２１８】
好ましい実施形態において、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳを活性化するために、好ましくは抗Ｔ細胞受容体モノクローナル抗体を使用する。Ｔ細胞を活性化させるために使用される好ましい抗体として、ＡＴＣの作成に対してはＯＫＴ３であり、ＣＯＡＣＴＳの作成に対してはダイナルビーズのような固体支持体にコーティングされたＯＫＴ３／９．３である。収集の手順においてＡＴＣおよびＣＯＡＣＴＳの両方を全体的に洗浄して、任意の培養成分（ｍｅｄｉｕｍ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を取り除く。
【０２１９】
ＡＴＣの作成は、下の実施例で考察するように、好ましくは単一パルスの抗体に関与しており、続いて細胞注入の前に細胞生成物を含まない任意の残存抗体を洗浄する。
【０２２０】
ＣＯＡＣＴＳの好ましい作成は、同時固定化抗体ＯＫＴ３および９．３を保持するダイナルビーズに関するものであり、生体外培養の約４日目に当該抗体を取り出す。ＣＯＡＣＴＳの最小解放基準は、好ましくは少なくとも約２５ビーズ／３×１０６細胞未満、より好ましくは少なくとも約５０ビーズ／３×１０６細胞未満、そして最も好ましくは少なくとも約１００ビーズ／３×１０６細胞未満である。
【０２２１】
本明細書に記載の活性化方法において、本発明は、モノクローナル抗体をＴ細胞受容体と直接架橋結合させ、下の実施例に記載の低用量のＩＬ−２で活性化Ｔ細胞を拡張するという点で従来技術とは異なる。例えば、自己リンパ球療法（ＡＬＴ）は、自家腫瘍の摘出物およびＯＫＴ３で刺激されたＰＢＭＣ由来の培養上清（ＣＭ）を含む培養によって産生された自家ＰＢＭＣの注入を含む（文献５０）。ルイス肺癌およびＢ１６黒色腫からの腫瘍摘出物を用いたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける前臨床試験によって、脾細胞は刺激されてＣＤ４４＋記憶ＣＴＬを拡張し、腫瘍の抗原投与に応答することが示された（文献５１、５２）。ＡＬＴ産出細胞傷害性エフェクター細胞を用いた続きの試験は、自家腫瘍の代わりにＯＫＴ３刺激化ＰＢＭＣによって生成されたＣＭで成長したＰＢＭＣから入手される。この手順は、活性化方法における差異に基づいてＡＬＴと抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）とを識別するという点で本発明とは異なる。また、ＯＫＴ３刺激化ＰＢＭＣからの上清を介して間接的にＡＬＴを活性化する。一方、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をＯＫＴ３と直接架橋結合し、低用量のＩＬ−２でＴ細胞を拡張することによって、ＡＴＣを調整する。
【０２２２】
抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）：抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＭＡｂ）とのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の架橋結合は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン合成、および免疫応答を導く（文献５４〜５７）。低用量のＩＬ−２（少なくとも約５〜１００ＩＵ／ｍｌ）の存在下でＰＢＭＣをＯＫＴ３で刺激することによってＡＴＣを作成する。ＡＴＣには様々な臨床応用がある。ＡＴＣは、活性化ＮＫ細胞傷害性特性および活性化ＮＫ様細胞傷害性特性を有し、殺腫瘍性サイトカインを産生し、標的抗体または遺伝子生成物を送達し得る媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）として働くことができる。前臨床試験によって、ＡＴＣは、健常者および悪性腫瘍を持つ患者からのＰＢＭＣまたは骨髄から拡張され、非ＭＨＣ制限細胞傷害性を媒介することが示された（文献６２〜７２）。また、生体外試験によって、ヒトＡＴＣが、ダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞（ＡＮＫ感応性標的）、Ｋ５６２細胞（ＮＫ感応性標的）、白血病性芽細胞（文献７３、７４）、神経芽細胞腫（文献６３）、および多発性骨髄腫の自家形質細胞（文献７５）に対して非ＭＨＣ制限細胞傷害性を提示することが示された。さらに、ＡＴＣは、免疫学的に活性であるか、あるいは殺腫瘍性であるサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはＧＭ−ＣＳＦ）を産生する。
【０２２３】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８同時活性化Ｔ細胞（ＣＯＡＣＴＳ）：ＴＣＲと抗ＣＤ３との架橋結合は、情報伝達増幅経路を引き起こし、Ｔ細胞増殖、サイトカイン合成、および免疫応答を導く（文献５４〜５７）。しかし、最適の活性化および増殖は、抗ＣＤ２８分子またはＢ７分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）を用いたＴ細胞のＣＤ２８受容体の同時刺激を必要とする（文献７９〜８３）。これらの相互作用は、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）におけるｍＲＮＡの増殖および安定化を増大させる（文献８４）。ＣＤ２８受容体の同時刺激はまた、βケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、およびＭＩＰ１−βの産生を増加させる（文献８５）。腫瘍部位でのケモカイン分泌の増加は、エフェクター細胞の補充を増大させる。
【０２２４】
１つの好ましい実施形態において、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳには、ケモカインをコードするベクターが形質導入されており、高濃度のサイトカインを局部的に送達する。このサイトカインは、他のエフェクター細胞を補充して、Ｔ細胞の増殖を引き起こし、局部的免疫応答を増大させる。形質導入の方法は当業者に周知である。
【０２２５】
「ベクター」は、細胞を形質導入、形質移入、形質転換、または感染させる組成物である。従って、上記ベクターは、細胞に天然ではない核酸および／またはタンパク質を細胞に発現させるか、細胞に天然でない様式で核酸および／またはタンパク質を細胞に発現させる。核酸が細胞外環境から細胞内に転位されると、細胞に核酸が「形質導入」される。核酸を細胞に移すための任意の方法が使用される：当該用語は、表示しない限り、核酸を細胞に移す特定の方法を意味しない。細胞に核酸が形質導入され、安定して複製されると、細胞が核酸によって「形質転換」される。ベクターは、細胞によって発現され得る核酸（一般的にＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む。ベクターは選択に応じて、核酸の細胞への完全な導入を助ける物質（例えば、ウイルス粒子、リポソーム、蛋白質外被など）を含む。一旦核酸が細胞内へ形質導入されると、「細胞形質導入ベクター」は、細胞内での安定な複製および発現の能力のある核酸をコードするベクターである。
【０２２６】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８同時活性化Ｔ細胞（ＣＯＡＣＴＳ）は、生体外で、様々な腫瘍細胞系に方向性を持つ抗腫瘍活性を提示する（文献８６）。ＣＯＡＣＴＳは、Ｔｈ１−型サイトカインプロフィールを産生し（文献７９、８７）、アポトーシスに抵抗性を示す細胞生存遺伝子Ｂｃｌ−Ｘ１の誘導に起因して生体内で長く生存する（文献８８、８９）。
【０２２７】
本発明の作成方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために、下の実施例を記載する。これらの実施例は、発明者が発明として考慮されるものの範囲を限定したり、また、下の実験が、実施された実験の全てであるか、あるいは実施された実験でしか過ぎないことを意図したりしない。使用した数字（例えば、量、温度など）の正確性を保証するために努力したが、いくらかの実験誤差および偏差は考慮されるべきである。表示しない限り、部品は重量で、分子量は平均分子量で、温度は摂氏で、圧力は気圧か、または気圧付近で表示される。
【０２２８】
（実施例）
（材料および方法）
（ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳのために使用された成分）
オルトクローンＯＫＴ３（ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３）。オルトバイオテック（ラリタン、ＮＪ）からＯＫＴ３を購入した。ＯＫＴ３は、５ｍｇのムロモナブ−ＣＤ３を含むアンプル５個のパッケージで無菌溶液として供給された。プロロイキン（登録商標）（アルデスロイキン（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、ＩＬ−２）。カイロン（エメリービル、ＣＡ）からプロロイキン（登録商標）（組み換えＩＬ−２）を購入した。２〜５％のヒト血清（バイオ  ホイッタカー（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ））を補充したＲＰＭＩ１６４０（バイオ  ホイッタカー）中の低用量のＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）でＡＴＣを拡張させた。ＲＰＭＩ１６４０（バイオ  ホイッタカー）に２ｍＭのＬ−グルタミン（バイオ  ホイッタカー）と５０μｇ／ｍｌゲンチマイシン（ｇｅｎｔｉｍｉｃｉｎ）（バイオ  ホイッタカー）とを補充した。
【０２２９】
「接合化ＡＴＣ」または「接合化ＣＯＡＣＴ」は、接合化Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に対する最良の記述的名称である。化学的ヘテロ共役抗ＣＤ３×抗Ｈｅｒ２（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×ハーセプチン（登録商標）のいずれか）を、Ｈｅｒ２ｂｉと呼ぶ。従って、抗ＣＤ３×抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＢｉＡｂと接合したＡＴＣを、Ｈｅｒ２ｂｉ接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳと名付ける。また、ＯＫＴ３×ハーセプチン（登録商標）をＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと略す。
【０２３０】
（抗ＣＤ３×抗Ｈｅｒ２二重特異性抗体の調製）
等モル濃度のＯＫＴ３と抗Ｈｅｒ２（９１８４またはハーセプチン）を共役させる。室温で１時間、ＯＫＴ３をトラウト（Ｔｒａｕｔ‘ｓ）試薬と反応させ、室温で、９１８４、ハーセプチンまたはコントロールの無関係な抗体をスルホサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートと反応させた。ＰＢＳの１０ＤＧカラム（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ））で両方のＭａｂを精製し、非結合性架橋剤を取り除いた。架橋結合化Ｍａｂを等モル比で混合し、４℃で一晩、共役させた。これらの濃度において、二量体形成は最適であり、多量体形成が最小限に抑えられる。ヘテロ共役反応の反応物、生成物、精製画分を、ＳＤＳ非還元ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色を用いて可視化する。細菌および真菌の培養（マイコプラズマ用ＰＣＲ（ＡＴＣＣ、カタログ番号９０−１００１Ｋ））の７日後のみに、最終的使用のために最終生成物ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃを取り除いた。内毒素についてのアッセイ（バイオ  ホイッタカー、カタログ番号５０−６４７０）は、全て陰性であった。
【０２３１】
各二重特異性抗体ヘテロ共役ロット（以前の試験で細菌、真菌、マイコプラズマ、および内毒素に対して陰性である）を、解放前のＰＣ−３、ＭＣＦ−７、および／またはＳＫ−ＢＲ−３標的細胞に対抗する正常細胞標本化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの用量滴定接合化によって検査した。多数のバイアルの予備試験した正常ドナーを１４日間拡張し、ロット試験用に分割量で細胞標本化し、防護化患者ＡＴＣを評価するために正常コントロールを提供した。Ｈｅｒ２Ｂｉの接合化用量が増加するにつれて、各ロットは、同じＥ／Ｔ比において特異的細胞傷害性が増加する用量滴定効果を示すはずである。このような滴定によって各ロットの接合化用量範囲を決定した。２５：１のＥ／Ｔにおいて少なくとも約５０％のＰＣ−３、ＭＣＦ−７、またはＳＫ−ＢＲ−３の特異的細胞傷害性％が、５０個のＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの接合化用量を用いた細胞傷害性アッセイの２０時間後に達成されない場合、ロットは拒絶される。
【０２３２】
（ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの調製、培養、接合化、および細胞標本化）
正常な被験体および癌患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール−ヒパーク（ニコメドファーマ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）、オスロ、ノルウェーのリンパプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｒｐ））によって単離した。２０μｇ／ｍｌの固定化ＯＫＴ３または２０ｎｇ／ｍｌの溶解性ＯＫＴ３（オルトバイオテック株式会社、ラリタン、ＮＪ）をコーティングしたプレート上でＰＢＭＣを活性化した（文献６７、６８）。ＯＫＴ３および９．３Ｍａｂを同時にコーティングしたビーズを用いてＰＢＭＣを４日間同時刺激することによって、ＰＢＭＣまたは白血球交換療法生成物からＣＯＡＣＴＳを産生した。培養の４日後に、ビーズを取り出し、さらに４日間培養を続けた。表示しない限り、抗生物質、Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（カイロン株式会社、エメリービル、ＣＡ）、および１００％ウシ胎仔血清ＦＣＳ（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ローガン、ＵＴ）または表示のヒト血清（バイオ  ホイッタカー）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（バイオ  ホイッタカー、ウォーカースビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）、ＭＤ）で１４日間、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳを成長させた。細胞を数え、１０６／ｍｌで保存した。トリパンブルー排除法（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）により生存度を測定した。正常被験体または癌患者からのＴ細胞を成長させた。そして、Ｔ細胞を洗浄して、数え、表示の用量（１時間４℃で１２５μｌの培地に１０６個のＴ細胞）でＢｉＡｂと共にインキュベート（「接合」）した。試験前にＴ細胞を完全培地で二回洗浄した。
【０２３３】
（ＡＴＣの活性化、培養、細胞標本化、解凍、および洗浄）
簡単に言うと、白血球交換療法によってリンパ球を入手し、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、および２％のプールヒト血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地で、１−３×１０６細胞／ｍｌの密度で該リンパ球を培養した。細胞を最大１４日間培養した。細胞濃度に基づき、完全培地において、３〜４日ごとにＡＴＣを数え、分断し、および／または栄養を補充した。さらなるＯＫＴ３を添加しなかった。培養後、フェンウォル（Ｆｅｎｗａｌｌ）細胞収集器を用いて、ＡＴＣを収集して、洗浄した。そして、制御速度凍結を用いて１０％ＤＭＳＯおよび２０％タンパク質（アルブミンまたは自家原形質）で上記ＡＴＣを細胞標本化し、液体窒素中に保存した。最終細胞標本化生成物に、外因性ＩＬ−２、ＯＫＴ３、または他の培養試薬（例えば培養成分）は含まれていない。
【０２３４】
（ＣＯＡＣＴＳの添加、培養、ビーズ取り出し、細胞標本化、解凍、および洗浄）
簡単に言うと、白血球交換療法によってリンパ球を入手し、２ｍＭのＬ−グルタミン、および２％のプールヒト血清を補充したＥｘ  ｖｉｖｏ１５培地において、１−３×１０６細胞／ｍｌの密度で該リンパ球を培養した。Ｔ細胞を同時活性化するために、同時固定化ＧＭＰ級ＯＫＴ３および９．３を備えるダイナルビーズと共に、白血球交換療法生成物からのＰＢＭＣを同時培養した。培養の４日後、ＭａｇＳｅｐ装置を用いてビーズを取り出し、ＣＯＡＣＴＳを培養に戻した。最終的に１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む完全培地において、３〜４日ごとにＣＯＡＣＴＳを数え、分断し、および／または栄養を補充した。培養後、フェンウォル細胞収集器を用いて、ＣＯＡＣＴＳを収集して、洗浄した。そして、制御速度凍結を用いて１０％ＤＭＳＯおよび２０％タンパク質（アルブミンまたは自家原形質）で上記ＡＴＣを細胞標本化し、液体窒素中に保存した。最終細胞標本化生成物に、外因性ＩＬ−２、ＯＫＴ３、または培養試薬（例えばビーズや培養成分）は含まれていない。
【０２３５】
（ＡＴＣ培養の開始、分断、および収集）
ステリセル複数容器セット（Ｓｔｅｒｉｃｅｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  Ｓｅｔｓ）のＬ−グルタミン、ゲンチミシン、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、および２％のヒト血清を補充したＲＰＭＩ１６４０中の２０ｎｇ／ｍｌの溶解性ＯＫＴ３で、１×１０６単核球／ｍｌの濃度のＰＢＭＣを活性化した。活性化Ｔ細胞を数え、分断し、その拡張速度を基づいて栄養を補充した。培養の６〜１４日後、ＡＴＣを収集した。収集したＡＴＣの量が１〜１０Ｌの場合、当業者に周知の手順を、少量のＴ細胞の収集および細胞標本化に使用した。１０Ｌを越える用量については、フェンウォル細胞収集システムを用いてＡＴＣを収集した。また、市販のヒト血清を用いて、非接合化ＡＴＣまたは接合化ＡＴＣの細胞標本化を行った。
【０２３６】
細胞受容体を架橋結合するために、ビーズに固定された抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（９．３）モノクローナル抗体を使用した。オルトバイオッテク（ラリタン、ＮＪ）からＯＫＴを購入した。９．３抗体（ロット番号３−３０９−９００４１１）は、アボットバイオテック（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によりＤｒ．Ｃａｒｌ  Ｊｕｎｅのために作成された。製造者のプロトコルに従って、ＯＫＴ３および９．３は、１：１の化学量論のトシル化学を介して、常磁性ポリスチレンダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）と連結している。磁気ビーズおよび当該ビーズに連結したモノクローナル抗体は全て、臨床的使用のためのＧＭＰ条件下で作成される。
【０２３７】
２〜５％のヒト血清を補充したＲＰＭＩ１６４０またはＸ  ＶＩＶＯ１５において、ＣＯＡＣＴＳを拡張した。
【０２３８】
（３ＬバッグのＯＫＴ３／９．３コーティング化ビーズを用いた培養の開始）
１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で、溶解性ＯＫＴ３（２０ｎｇ／ｍｌ）をＰＢＭＣに接種し、該ＰＢＭＣを刺激してＡＴＣを産生する手順は、ＯＫＴ３／９．３のコーティングを導入して修正された。ＰＢＭＣを数え、３：１（ビーズ／細胞）の比でビーズを添加し、ネクセルセラピューティック株式会社（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｎｃ）（アービング、ＣＡ）より提供された３Ｌのガス透過性バッグにこれらの混合物を接種した。
【０２３９】
マックスセップ（Ｍａｘ  Ｓｅｐ）を用いた培養の４日目にビーズを取り出した後、培養上清にＣＯＡＣＴＳを戻した。フェンウォル細胞収集器（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ））を用いて、ＣＯＡＣＴＳを収集し、洗浄して、濃縮した。
【０２４０】
（持ち越しサイトカインを含まない注入生成物）
注入された細胞性生物は、外因性サイトカインを含まない。データは、培養に使用されたＩＬ−２が、５０ｍｌ管のＡＴＣを１回洗浄した後、ＥＬＩＳＡによって検出不可能であることを示している。培養されたＡＴＣを洗浄する前には、３．５ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２が検出された。第二実験において、１２００ＩＵ、６００ＩＵ、および３００ＩＵのＩＬ−２／ｍｌを添加した二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の５０ｍｌ管は、１回の洗浄後、検出可能なＩＬ−２を含まなかった。ＥＬＩＳＡは、５０ｐｇ／ｍｌ（＜１ＩＵ／ｍｌ）に感応性である。ＡＴＣおよびＣＯＡＣＴＳの両方を等しく洗浄したため、ＣＯＡＣＴＳは、収集および洗浄の後、生物学的に有意なサイトカインを含まなかった。
【０２４１】
（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×ハーセプチン（登録商標）を生成するための成分）
本願は、２つのＢｉＡｂを使用した。両方のＢｉＡｂ標的Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、化学的ヘテロ共役プロセスを用いて、抗ＣＤ３×抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕの混合物を生成する。
【０２４２】
ＯＫＴ３×９１８４は、臨床級９１８４（Ｈｅｒ２／ｎｅｕに方向性を持ったＩｇＧ１マウスＭａｂは、ネクセル株式会社、アービング、ＣＡから提供された）と化学的にヘテロ共役した臨床級オルトクローンＯＫＴ３（ムロモナブ、ＣＤ３に方向性を持ったＩｇＧ２ａマウスＭａｂをオルトバイオテック、ラリタン、ＮＪから購入した）から構成される。
【０２４３】
ＯＫＴ３×ハーセプチン（登録商標）（ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ）は、臨床級ハーセプチン（登録商標）（トラストズマブ（ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに方向性を持つヒト化ＩｇＧ１Ｍａｂをジェネンテック、サンフランシスコ、ＣＡ）から購入した）と化学的にヘテロ共役した臨床級ＯＫＴ３（ＣＤ３に方向性を持つＩｇＧ２ａマウスモノクローナル抗体）から構成される。
【０２４４】
トラウト緩衝液：トラウト緩衝液（ｐＨ８）は、トリエタノールアミン（シグマウルトラ（Ｓｉｇｍａ  Ｕｌｔｒａ）番号Ｔ９５３４）、１．５Ｍ  ＭａＣｌ（シグマ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（二水酸化二ナトリウム（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  Ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）（シグマ）から構成される。
【０２４５】
スルホサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート：スルホＳＭＣＣ（ＳＭＣＣ緩衝液、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）番号２２３２２）をピアス、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、ＩＬから購入した。
【０２４６】
ヘテロ共役生成物：当モル量の、トラウト緩衝液と架橋結合したＯＫＴ３と、スルホＳＭＣＣと架橋結合した９１８４、ハーセプチン、またはリツキサンとを、４℃で一晩培養した。単量体、二量体、または多量体の存在を同定するために、非還元ＳＤＳゲルを行った。材料を無菌濾過し、無菌、内毒素、およびマイコプラズマの試験による品質管理は、標準的手順および公開基準を用いた（カブトガニ変形細胞溶解物（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）、バイオ  ホイッタカー  カタログ番号５０−６４７０；マイコプラズマ検出キット、ＡＴＣＣ、カタログ番号９０−１００１Ｋ）。
【０２４７】
（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｓと接合したＡＴＣ）
ＡＴＣを、細胞標本化後に解凍し、ＡＴＣ１００万個当たり５〜１００ｎｇの未精製化学的ヘテロ共役Ｈｅｒ２Ｂｉの滴定用量と接合し、非結合抗体がなくなるまで洗浄して、患者に注入した。
【０２４８】
（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｓと接合したＣＯＡＣＴＳ）
ＣＯＡＣＴを、細胞標本化後に解凍し、ＣＯＡＣＴ１００万個当たり５〜１００ｎｇの未精製化学的ヘテロ共役Ｈｅｒ２Ｂｉの滴定用量と接合し、非結合抗体がなくなるまで洗浄した。そして接合化ＣＯＡＣＴＳを患者に注入した。最大６０×１０９ＣＯＡＣＴＳが投与された患者において、抗体またはビーズの持ち越しに起因した毒性または副作用は見られなかった。
【０２４９】
（各患者に対して特定の接合化用量）
患者のＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳ細胞生成物の凍結した分割量の滴定に基づいて、各患者に対する最適の接合化用量を決定した。ＰＣ−３細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、またはＭＣＦ−７細胞において、２５：１のＥ／Ｔの特異性細胞傷害性レベルの％が少なくとも３０％に達するように、接合化用量を調整した。各患者の接合化用量を、各患者の接合化ワークシートに記録した。下の表１は、処置計画の実証例の１つであり、決して本発明を限定することを意図しない。
【０２５０】
【表１】
2004538331.tif 000002
【０２５１】
上記処置は、ＩＬ−２の皮下注射を含む。当該皮下注射は、接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳを最初に注入する３日前から３×１０５ＩＵ／ｍ２／日の用量で開始され、接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの最後の用量を注入してから７日後まで、ＩＬ−２を投与する。
【０２５２】
上記処置は、週に２回８週間にわたる１２５μｇ／ｍ２のＧＭ−ＣＳＦの皮下注射を含み、この皮下注射は、接合化ＡＴＣを最初に注入する３日前から開始し、最後の用量の接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの注入から７日目で終了する。
【０２５３】
難治性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）癌（ＳＬＭＣ  ＢＲＭ  ９４−０１、ＢＲＭ  ９５−０２）に対する低用量のＩＬ−２の存在下でのＡＴＣ注入、ならびに転移性乳癌（ＢＲＭ  ９５−０３）のためのＰＢＳＣＴの組み合わせとその後のＡＴＣ注入、連続ＩＬ−２注入（約３×１０５ＩＵ／ｍ２／日を約６５日）およびＧＭ−ＣＳＦ注入（ＰＢＳＣＴの後約５日〜約２１日）は、致命的な自家移植片対宿主疾患または自己免疫症候群を誘導しない。ＡＴＣと、ＩＬ−２と、ＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせによって誘導された第３級皮膚発疹は、自家移植片対宿主疾患または自己免疫症候群（ＧＶＨＤ）であるかも知れないし、そうでないかも知れない。患者は、無調節または過敏性Ｔ細胞に起因して「自家または同系」ＧＶＨＤ皮膚発疹を発症し得る。ＰＢＳＣＴとＡＴＣとを受けた２３人の患者のうちの２人は皮膚発疹を発症したが、この皮膚発疹は、自家ＧＶＨＤに関連していると思われているが、タキソール（Ｔａｘｏｌ）のような化学療法の薬剤に関連しているかも知れない。処置は必要とされずに、皮膚発疹は自然に治まった。発疹は、ステロイドで処置されなかった。症候群に起因した不可逆的毒性を患っている患者はいなかった。
【０２５４】
（臨床生成物の接合化）
３０億〜１００億個の細胞標本化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴを、解凍して、洗浄し、２％のアルブミンを含むプラスマネート（ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）に再懸濁し、４℃で１時間培養することによって遠心分離管で接合化した。２％のアルブミンを含むプラスマネートでＨｅｒ２Ｂｉを２回洗浄し、患者へ注入するための輸送バッグ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂａｇ）へ移した。生存度試験、無菌試験、および細胞傷害性試験のために、１つの分割量を取り出した。
【０２５５】
（腫瘍細胞系およびモノクローナル抗体）
ＡＴＣＣロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランドから、乳癌細胞系ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＢＲ−３を購入した。ＯＫＴ３をオルトバイオテックから購入した。９１８４は、ネクセルによって供給された抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＩｇＧ１である。ハーセプチン（登録商標）およびリツキサン（抗ＣＤ２０）をジェネンテック、ＳＦ、ＣＡから購入した。Ｔ８４．５５ハイブリドーマ（抗癌胎児性抗原）をＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤから購入した。ノースウェストバイオセラピューティックス（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、シアトル、ＷＡのアルトンボイントン（Ａｌｔｏｎ  Ｂｏｙｎｔｏｎ）からＩＧ３（抗前立腺特異膜抗原）が供給された。
【０２５６】
表２は、ロゼッティング、フローサイトメトリー、および細胞傷害性について、２つの二重特異性抗体（ＯＫＴ３×９１８４およびＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ）の結合および機能の特徴をまとめたものである。
【０２５７】
【表２】
2004538331.tif 000003
【０２５８】
（前立腺癌、乳癌、および他のＨｅｒ２／ｎｅｕ＋腫瘍）
患者はＡＴＣを産生するためのリンパ球の白血球交換療法を受けた。注入の指定時間において、ＡＴＣを解凍し、洗浄して、Ｈｅｒ２ｂｉで接合化し、注入した。接合化ＡＴＣの用量増加計画において４つの用量レベルが存在する。各用量レベルは３人の患者からなり、用量レベルは、２０億、３０億、５０億、および８０億個／注入（用量の合計が２００億〜８００億個）である。細胞に基づく毒性が生じた場合、次の用量レベルに進む前に、さらに３人の患者を同じ用量レベルに追加する。各患者に対し１０回の注入を与えた。週に２回分の用量を２週間にわたって注入し、週に１回分の用量を次の６週間にわたり注入した。患者は、接合化ＡＴＣの最初の注入の３日前から最後の注入の１週間後まで、毎日皮下にＩＬ−２（３００，０００ＩＵ／ｍ２／日）を受けた。接合化ＡＴＣの最初の注入の３日前から最後の注入の１週間後まで、週に２回１２５μｇ／ｍ２の用量でＧＭ−ＣＳＦを投与した。最初に接合化ＡＴＣを注入してから０ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、および１２ヶ月後に、腫瘍および免疫の評価を行った。ＡＴＣの接合化が腫瘍部位への輸送を促進するのかどうかを測定するために、接合化ＡＴＣおよび非接合化ＡＴＣの１１１インジウム標識化を、測定可能な疾患を有する選択された患者に対して行った。
【０２５９】
ＮＣＩ免疫療法毒性評価（ｓｃｏｒｉｎｇ）システムを用いて有害事象を評価した。ＰＳＡ濃度における５０％の減少が目的の応答であるとした。ＰＳＡ濃度、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体濃度、注入前および注入後のＰＢＭＣによるＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳ、自家腫瘍に対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳ（もしあれば）、サイトカイン分泌、ＰＢＭＣの表現パターンの検査Ｔ細胞増殖、およびＨＡＭＡ応答を、指定の時間点で評価した。
【０２６０】
９０日間にわたるＩＬ−２の低用量皮下（ＳＱ）投与（２×１０５ＩＵ／ｍ２／日）は、第３級毒性を導かなかった。いずれの患者も、肺毛細血管漏れ症候群、重症高血圧、乏尿、高窒素血症、または高ビリルビン血症を体験しなかった（文献１６２）。最も一般的な毒性として、疲労、熱、および嘔気が挙げられる。いずれの患者も、副作用のためにＳＱ治療を停止する必要がなかった。従って、高用量のＩＬ−２に起因した死亡が公知の毒性であるが、低用量ＳＱＩＬに関連した主要毒性は生じないと考えられる。
【０２６１】
ＧＭ−ＣＳＦはコロニー刺激因子である。公知の副作用および毒性：ＧＭ−ＣＳＦ（ロイキン−サグラ−モスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ−Ｓａｇｒａ−ｍｏｓｔｉｍ））を受けた患者は、投与（１〜４時間）後６０〜９０分で熱；悪寒；嘔気；嘔吐；下痢；疲労；衰弱；頭痛；食欲不振；血栓症；頻拍または不整脈あるいは他の心臓障害；めまい；顔面紅潮；骨、筋肉、腰、腹部、または関節の痛み；注射部位の局部的反応；湿疹；ならびに腎臓および肝臓の機能障害を経験した。好酸球増加症または他の血液成分の異常が生じるかも知れない。呼吸障害または心不全を引き起こす可能性のある、心臓の周辺、ならびに末端および肺における液体貯留または既存の液体貯留の悪化は、あまり報告されていない。まれに、患者は急性アレルギー反応を発症する。サグラモスチム（Ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）のさらなる注射後の、低血圧、低酸素症、一時的な意識消失、および呼吸困難もまた報告されている。これらの兆候は、サグラモスチムのさらなる注射によって生じるかも知れないし、生じないかも知れない。重大な心臓、肺、腎臓、または肝臓の障害を有する患者において、サグラモスチムの投与後にこれらの兆候が悪化するかも知れない。他の副作用が生じる可能性もある。
【０２６２】
（Ｈｅｒ２ｂｉ接合化ＡＴＣの注入）
ＢＭＴ単位に基づき外来患者に対してＡＴＣの注入を行った。生成物、患者、無菌などの同定についての全ての適切な保証を再注入前に行った。凍結ＡＴＣを解凍し、洗浄して、事前滴定用量のＨｅｒ２ｂｉと接合した。接合化ＡＴＣを３回洗浄し、融合培地で再懸濁させた。Ｈｅｒ２ｂｉ接合化ＡＴＣの注入時間は患者によって異なるが、接合化ＡＴＣの用量（最大８０億個）を３０分かけて投与した。注入後少なくとも１時間、全ての患者を観察した。観察時間の初めから終わりまで１５分おきにバイタルサイン（Ｖｉｔａｌ  Ｓｉｇｎｓ）（Ｔ、Ｐ、Ｒ、およびＢＰ）を得た。フローチャートを評価して患者の免疫療法毒性について全てのバイタルを記録した。安定な場合、患者は退院することができる。
【０２６３】
（最大耐量（ＭＴＤ）の決定）
第１相試験の終点は、１）接合化ＡＴＣの最大耐量に達すること、または２）細胞生成物拡張の技術的限界に到達することとして定義されている。３つの患者は各用量レベルに所属する。各患者は、１つの治療クール当たりに１０回の注入を受けた。用量レベルは、１回の注入当たり２０億、３０億、５０億、および８０億個である。最初の３人の患者に対して、２×１０９の接合化ＡＴＣを１０回注入し（合計用量；２×１０１０）（第一用量レベル）、第２の３人の患者に対して、３×１０９の接合化ＡＴＣを１０回注入し（合計用量；３×１０１０）（第二用量レベル）、第３の３人の患者に対し５×１０９の接合化ＡＴＣを１０回注入し（合計用量；５×１０１０）、第４の３人の患者に対して８×１０９の接合化ＡＴＣを１０回注入した（合計用量；８×１０１０）。ＭＴＤに達するまで細胞用量を増加させた。最初の２週間は週に２回分の用量を注入し、後の６週間は週に２回分の用量を注入した。
【０２６４】
（Ｈｅｒ２ｂｉ接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの用量調節）
常に第３級以上の深刻な毒性が継続した場合、毒性が第０級または第１級に改善されるまで処置を行った。接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの用量を低減しても毒性が継続した場合、ＩＬ−２を停止し、低減した用量の接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴを続けた。第３級以上の深刻な毒性が再び生じた場合、接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳ注入を停止した。未解決の毒性について、それぞれの再注入後２日間は毎日毒性を評価し、処置クールの間は毎週、毒性を評価した。非血液学的第４級毒性を発症する患者は、処置の中断を必要とした。
【０２６５】
接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴの毒性は、接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの注入から注入の１２時間後まで続く毒性である。皮膚、肝臓、腸のＧＶＨＤ、または他の自己免疫疾患のような遅延型臨床兆候（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）は、用量増加を目的とした注入の遅延型毒性と見なされる。しかし、汚染細胞性生物の注入に起因した全身感染は、ＭＴＤの決定における生成物関連毒性と見なされない。
【０２６６】
（毒性の分類−ＮＣＩ一般毒性階級）
第Ｉ級〜第ＩＩ級の毒性が生じた場合、患者は注入計画を続けた。第ＩＩ級の毒性が生じた場合、毒性が第Ｉ級または第ＩＩ級に減少するまで「薬剤」を差し控え（ｈｏｌｄ）、次いで注入を再び開始した。再開後に第ＩＩＩ級または第ＩＶ級の毒性が生じた場合、「薬剤」注入を停止した。第ＩＶ級の毒性が生じた場合、患者は第ＩＶ級の毒性を保持すると評価し、次の注入を前の用量に低減した。前の用量が第ＩＶ級の毒性を引き起こした場合、「薬剤」を停止した。特定の用量レベルにおいて第ＩＶ級の毒性が３人中１人の患者の割合で生じた場合、さらに３人の患者を細胞用量レベルに加え、その用量レベルの患者を合計６人とした。細胞用量レベルの６人の患者のうち２人が第ＩＶ級の毒性を発症する場合、この用量をＭＴＤと定義した。次の３人の患者に対して、前の細胞用量レベルの６６％（２／３）を投与した。用量増加の評価を目的として、同じ用量レベルの各患者に対して、６回の注入のうち少なくとも４回の注入を行った。
【０２６７】
（放射性のインジウム標識された接合化Ｔ細胞）
接合化Ｔ細胞に施した放射能の量は、骨のスキャンに使用した量に類似している。
【０２６８】
ＭＴＤの決定後、測定可能な疾患を有する約６人の患者を輸送研究に加えた。各患者に１１１インジウム標識化ＡＴＣを投与し、少なくとも約７２時間、２４時間ごとに腫瘍局在化について当該患者をスキャンした。スキャンでの標識の消滅後、同じ量の１１１インジウム標識化Ｈｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣを患者に投与し、腫瘍部位での標識化の量に有意な差異が存在するかどうかを測定した。非接合化ＡＴＣおよびＨｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣを１１１インジウムで標識した。Ｈｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣのＭＴＤを決定した後、１１１インジウム標識化非接合化ＡＴＣの注入によって特定の患者を研究した。ＡＴＣを解凍し、凍結培地なしで洗浄し、４℃で１時間、最適の濃度のＨｅｒ２ｂｉと接合するか、非接合化のまま放置した。そして、過剰な接合抗体なしで上記ＡＴＣを洗浄し、標準核医学標識化手順を用いて１１１インジウムで標識した。汎用性中エネルギーコリメーターを備えたγカメラ（ピッカプリズム（Ｐｉｃｋｅｒ  Ｐｒｉｓｍ）２０００、ピッカインターナショナル（Ｐｉｃｋｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、クリーブランド、ＯＨ）を用いて、４時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に平面全身画像処理を行った。そして、標識が検出されなくなるまで続けた。４時間で得られるはずの５００ｋカウントの標的において、画像処理時間は約３０分であった。
【０２６９】
（第ＩＶ段階乳癌処置）
増加する量の二重特異性抗体ＯＫＴ３×ハーセプチン（ＨＥＲ２Ｂｉ）接合化活性化Ｔ細胞（接合化Ｔ細胞）からなる第Ｉ相用量増加試験に、第ＩＶ段階乳癌の患者を加える。１４日間にわたり白血球交換療法生成物からＡＴＣを拡張させ、該ＡＴＣをＨＥＲ２Ｂｉと接合し、細胞標本化して、８つの分割用量で注入した。最大耐量を測定し、最大の技術的に到達可能な用量に達するまで、接合化ＡＴＣの増加する用量を投与した。２５億、５０億、１００億、２００億、および４００億個の接合化ＡＴＣを週に二回４週間にわたり、各用量レベルの３人の患者に投与した。任意の用量レベルにおいて１人の患者に第３級の非血液学的毒性が見られた場合、その用量レベルの集団を６人の患者に拡大した。拡大した集団において、第３級非血液学的毒性を発症せずに、治療に耐性を示した患者がこれ以上増えなかった場合のみ、用量を次のレベルに増加させた。低用量のＩＬ−２（約３００，０００ＩＵ／ｍ２／日）およびＧＭ−ＣＳＦ（約１５０μｇ／ｍ２を週に２回）を、接合化ＡＴＣの最初の注入の１日前から開始し、接合化ＡＴＣの最後の用量を注入してから７日目に終了した。
【０２７０】
第Ｉ相の設定において最大耐量（ＭＴＤ）を決定した後、２＋または３＋ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳癌腫瘍を有する患者に対して、ＭＴＤを用いた第ＩＩ相の臨床試験を行った。この臨床試験は、毒性プロフィールの定義、臨床応答の測定、全生存率および無進生存率の評価、臨床パラメータおよび免疫パラメータの順次評価（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を可能にした。臨床試験の第Ｉ相部分および第ＩＩ相部分において、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍を有する特定の患者に、１１１インジウムで標識した非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣを投与し、転移した腫瘍部位に対する接合化ＡＴＣの生存率および接合化ＡＴＣの局在化を測定した。
【０２７１】
（サイトカインについてのＥＬＩＳＡアッセイ）
接合化または非接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳを、必要に応じてＰＣ−３、ＭＣＦ−７、またはＳＫ−ＢＲ−３と共に培養した。臨床的接合化プロセスに使用した濃度と等しい濃度のＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒおよび無関係なコントロール（ＯＫＴ３、９１８４、Ｈｅｒｃ、および／またはＯＫＴ３×リツキサン）と、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳとを接合した。接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳを、２４時間、１０：１または５：１のＥ／Ｔで同時培養した。Ｔ細胞のプレートへの塗布濃度が１×１０６となるように標的細胞およびエフェクター細胞を調整した。ＥＬＩＳＡを用いて上清を検査し、産生されたサイトカインの量をｐｇ／１００万個のＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳ／２４時間で表した。
【０２７２】
（単一細胞分泌ＩＦＮγについてのＥＬＩＳＰＯＴＳ）
接合化または非接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳを、必要に応じてＰＣ−３、ＭＣＦ−７、またはＳＫ−ＢＲ−３と共に培養した。臨床的接合化プロセスに使用した濃度と等しい濃度のＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒおよび無関係なコントロール（ＯＫＴ３、９１８４、Ｈｅｒｃ、および／またはＯＫＴ３×リツキサン）と、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳとを接合した。接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳを、２４時間、１０：１または５：１のＥ／Ｔで同時培養した。Ｔ細胞のプレートへの塗布濃度が１×１０６となるように標的細胞およびエフェクター細胞を調整した。このように培養したＴ細胞を、平底ウェルに標的細胞を残したまま回収した。Ｔ細胞を数え、ＥＬＩＳＰＯＴウェル（ミリポア株式会社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．））のプレートに塗布した。そして、２４時間後に解剖顕微鏡を用いて斑点の数を数えた。ＩＦＮγの斑点の数を、ＩＦＮγ分泌細胞／１００万個のＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳとして表した。
【０２７３】
（Ｈｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣまたは非接合化ＡＴＣの１１１インジウムオキシン標識化）
改変した標準方法を用いて、１１１インジウムオキシン（アマシャムヘルスケア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、アーリントンハイツ、ＩＬ）でＡＴＣまたはＨｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣのサンプルを標識した（文献１６３、１６４）。約２×１０５のＣＯＡＴＳを洗浄し、緩衝化したグルコール含有培地で再懸濁し、その後７００μＣｉの１１１インジウムオキシンと上記サンプルとを混合した。次いで、残りのＡＴＣ用量と標識化細胞とを混合し、患者に再び注入した。
【０２７４】
（細胞傷害性アッセイ）
２０時間の５１Ｃｒ解放アッセイを用いて細胞傷害性を測定した。平底マイクロタイタープレートに腫瘍細胞を塗布し、一晩３７℃で培養した。標的を洗浄し、次の日に３７℃で５１Ｃｒを用いて標識した。腫瘍細胞を含むウェルを洗浄し、異なるＥ：Ｔ比で接合化ＡＴＣまたは非接合化ＡＴＣを塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、γ線計数器でプレートを数え、特異的溶解％を計算した。
【０２７５】
本願に示した全ての細胞傷害性アッセイを、１８〜２０時間、ＩＬ−２を添加せずに行った。接合化ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳにより媒介された再方向化細胞傷害性が、血清および補体が存在しＩＬ−２が存在しない条件下で生じた。従って、注入した接合化Ｔ細胞は、ＩＬ−２の非存在下で少なくとも１８〜２０時間腫瘍を排除すると思われる。
【０２７６】
血清および補体は、接合化ＡＴＣにより媒介された細胞傷害性に影響を与えなかった。接合化ＡＴＣは、新鮮なＰＢＭＣおよびウサギ補体、または高濃度の新鮮なヒト血清の存在下で溶解されなかった。この結果は、接合化ＡＴＣが補体固定化によって生体内で溶解されず、Ｆｃ受容体を介した溶解が抗体依存性細胞傷害性を媒介することを提案している。
【０２７７】
（施設内審査委員会）
「抗ＣＤ３×抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ二重特異性抗体と接合した活性化Ｔ細胞を用いたホルモン抵抗性前立腺癌患者におけるＨｅｒ２／ｎｅｕ前立腺癌の標的化」という題のプロトコルおよびその同意書は、ロジャーウイリアムズ病院施設内審査委員会によって承認された。ＩＲＢは研究を監視し、プロトコルの変更が開始される前にＩＲＢの承認が得られる。被験体への危険性または他の問題に関する予期しない問題の全てがＩＲＢに報告される。
【０２７８】
処置計画はプロトコルに従っており、特定のプロトコルに関する治療および治療の代替の形態は、研究者および被指名人によって患者に提示される。手順の危険性および有害性は、十分に患者に説明される。また、プロトコルは特定の詳細および同意書を含む。
【０２７９】
（臨床前研究の概要）
ＡＴＣを接合化する最適の時間間隔は、ＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの活性化後約４日目から１４日目までであることが、前臨床試験によって示された。最適の細胞傷害性に必要とされるＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃの飽和接合化用量は、約５０ｎｇ／１０６のＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳであった。二重特異性抗体媒介細胞傷害性は、ＯＫＴ３×Ｔ８４．６６（抗ＣＥＡ）を用いた比較研究に基づいて二量体画分に多く含まれた。正常ＡＴＣおよび患者ＡＴＣによる殺腫瘍性サイトカイン分泌は、腫瘍抗原との特異的結合によって誘導された；５）正常ＡＴＣまたは患者ＡＴＣが接合する前の細胞標本化。ＯＫＴ３×９１８４接合化正常ＡＴＣは、ＰＣ−３腫瘍標的、ＭＣＦ−７腫瘍標的、およびＳＫ−ＢＲ−３腫瘍標的を溶解した。ＯＫＴ３×９１８４の接合化用量の増加は、ＭＣＦ−７標的、ＳＫ−ＢＲ−３標的、およびＰＣ−３標的に方向性を持った特異的細胞傷害性％を増加させた。フローサイトメトリーは、ＯＫＴ３×９１８４がＭＣＦ−７細胞、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、およびＰＣ−３細胞と結合することを示した。ＯＫＴ３×ＨｅｒｃとＡＴＣとの接合化はＭＣＦ−７標的、ＳＫ−ＢＲ−３標的、およびＰＣ−３標的の標的化を著しく促進した。ＡＴＣと接合するＯＫＴ３×ＨｅｒｃおよびＯＫＴ３×９１８４の用量は、ＭＣＦ−７標的およびＰＣ−３標的を標的化する用量と類似している。ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣとＳＫ−ＢＲ−３との結合は、ＩＦＮγ分泌を誘導した。ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合した正常ＡＴＣは、ＰＣ−３を排除する点で共通している。接合化患者Ｔ細胞は、凍結／解凍の後もＰＣ−３に対する細胞傷害性のままである。ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣによって媒介される細胞傷害性は、溶解性ハーセプチン（登録商標）によって阻害されなかった。臨床毒性および有効性をＳＣＩＤマウスモデルで評価した。当該マウスモデルは、ウィンアッセイで注射したＳＣＩＤマウスの１０％においてＯＫＴ３×抗ＣＥＡ接合化ＡＴＣが、皮下投与の場合いかなる臨床毒性もなくＬＳ１７４Ｔ大腸癌細胞の成長を妨げることを示した。臨床的利点はないが、接合化ＡＴＣのＩ．Ｖ．尾静脈注射および腹腔内注射は、ＳＣＯＤマウスにおける罹患（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）または死亡を引き起こさなかった。ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合した正常ＡＴＣによるサイトカイン分泌は、ＰＣ−３との結合によって誘導された。導入遺伝子サイトカインおよび内因性サイトカインは、ＩＬ−２遺伝子が形質導入されたＡＴＣの標的化によって再び誘導される。接合プロセスの臨床的スケールアップは、正常ＡＴＣおよび患者ＡＴＣの両方において特異的細胞傷害性に必要とされる接合化用量に差異がないことを示した。健常者からの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８同時活性化Ｔ細胞は、ＯＫＴ３×９１８４と接合することができ、ＭＣＦ−７に方向性を持つ特異的細胞傷害性を示す。細胞標本化は、ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃの両方を用いたＨｅｒ２＋ＭＣＦ−７標的またはＰＣ−３標的に方向性を持つ特異的細胞傷害性にほとんど影響を与えなかった。ＯＫＴ３×９１８４と接合した癌患者のＣＯＡＣＴＳ���よびＡＴＣは、ＭＣＦ−７標的に対抗する共通の特異的細胞傷害性を有する。
【０２８０】
（実施例１）
（ＯＫＴ３×９１８４の化学的結合）
図１は、抗腫瘍関連抗原ＭＡｂ（抗ＴＡＡ）（９１８４）とＯＫＴ３とをヘテロ共役させる工程を示す。５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中のＯＫＴ３（１〜５ｍｇ）を、室温で一時間、５倍モル過剰のトラウト試薬（２−イミノチオレン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）ＨＣｌ）（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）と反応させる（工程、図１）。別の反応で、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中の９１８４（１〜５ｍｇ）を、室温で一時間、４倍モル過剰のスルホサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホＳＭＣＣ、ピアス製、ロックフォード、ＩＬ）と反応させる（工程２）。ＰＢＳのＰＤ−１０カラム（ファーマシア、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン）で両方のＭａｂを精製し、非結合性架橋剤を取り除いた。直ちに、架橋結合化Ｍａｂを等モル比で混合し、４℃で一晩共役させた（工程３）。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を用いてタンパク質の定量を行った。２〜１５％の勾配ゲル（ＯＷＬサイエンティフィック（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォバーン、ＭＡ）を用いた非還元ＳＤＳゲル電気泳動によって、ヘテロ共役生成物を分析した。ゲル中のタンパク質を可視化するために、クーマシーブルー染色を用いた。ゲルドック（Ｇｅｌ  Ｄｏｃ）１０００システム（バイオラド、ハーキユリーズ、ＣＡ）を用いて、濃度測定分析を行った。ゲルの第５レーンの濃度測定は、約６７％の単量体、約２３％の二量体、および約１０％の多量体の分割量を示した（図２）。第１レーン、高分子量のマーカー；第２レーン、１０μｇのＯＫＴ３を充填した；第３レーン、１０μｇの９１８４を充填した；第４レーン、ブランク；第５レーン、３０μｇのＨｅｒ２Ｂｉを充填した。非共役ＯＫＴ３および９１８４（単量体）、ＯＫＴ３×９１８４の二量体、およびＯＫＴ３×９１８４の多量体を、第５レーンに示した。
【０２８１】
無関係な抗前立腺特異性膜抗原（抗ＣＤ３×ＩＧ３）、ハーセプチン（登録商標）（抗ＣＤ３×Ｈｅｒｃ）、リツキサン（抗ＣＤ３×Ｒｉｔ）、Ｔ８４．６６（抗ＣＤ３×Ｔ８４．６６）を用いて、他の抗ＣＤ３ヘテロ共役体を同じ手順で作成した。
【０２８２】
（実施例２）
（ＭＣＦ−７細胞またはＰＣ−３細胞のＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣのロゼッティング）
表示しない限り、全てのヘテロ結合を用いた全ての接合化をｎｇ／１００万個のＡＴＣとして表す。非接合化ＡＴＣ（左下、図３）、５０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣ（左上）、５０ｎｇの無関係ＯＫＴ３／ＩＧ３と接合したＡＴＣ（右上）、または２５０ｎｇの非共役ＯＫＴと２５０ｎｇの非共役９１８４との混合物で処置したＡＴＣ（右下）を、３７℃で一晩ＭＣＦ−７細胞と共に培養した。９０：１から３：１のエフェクター：標的（Ｅ／Ｔ）比での一晩培養によって、一貫してＭＣＦ−７細胞またはＰＣ−３細胞にロゼットが形成（ｒｏｓｅｔｔｅ）した。
【０２８３】
（実施例３）
（ＡＴＣとＨｅｒ２Ｂｉとの結合）
フィコエリトリン（ＰＥ）共役ヤギ抗マウスＩｇＧ２およびＩｇＧ、またはイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）共役ヤギ抗マウスＩｇＧ２（カルタグラボラトリ株式会社（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、バーリンゲーム、ＣＡ）を、Ｈｅｒ２Ｂｉの結合を検出するために使用した。記載の濃度のＨｅｒ２Ｂｉのサンプルと共に１０６のＡＴＣを１時間４℃でインキュベートし、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄して、ＰＥまたはＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスと共に３０分間暗闇でインキュベートし、ＡＴＣの表面のＯＫＴ３（ＩｇＧ２ａ）または９１８４（ＩｇＧ１）の量を測定することによって、結合を決定した。そして、１０６のＭＣＦ−７またはＳＫ−ＢＲ−３を１μｇのＢｉＡｂと共に１時間４℃でインキュベートすることによって、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７、およびＳＫ−ＢＲ−３とＨｅｒ２Ｂｉとの結合を測定した。細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。
【０２８４】
結合を定量するために、ＡＴＣと接合するＨｅｒ２Ｂｉの増加用量に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した（図４、Ａパネル）。１００万個のＡＴＣを０ｎｇ、０．５ｎｇ、５ｎｇ、５０ｎｇ、および５００ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合した。Ａパネルは、ヤギ抗マウスＩｇＧアロタイプ特異性抗体と直接共役したＡＴＣ表面上のＨｅｒ２Ｂｉの９１８４（ＩｇＧ１）部分の量が増加して検出されたことを示している。さらに、０．５ｎｇの接合化用量が、アイソタイプのコントロールにおけるバックグラウンド染色として検出された。
【０２８５】
Ｈｅｒ２Ｂｉの特異的結合を表示する抗ＩｇＧ１および抗ＩｇＧ２ａ特異的試薬を用いて、二重染色を行った。Ｈｅｒ２ＢｉのＩｇＧ１部分（９１８４）を特異的に検出するために、５０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣを、９１８４についてはヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣで染色した。５ｎｇの接合化用量のＭＦＩは８２であり、ＡＴＣの３８％は陽性であった。５０ｎｇの用量において、ＭＦＩは２２３であり、ＡＴＣの９３％は陽性であった。接合化用量をさらに５００ｎｇまで増加したとき、結合は増加しなかった。これらのデータに基づいて、５０ｎｇを飽和接合化用量として選択した。９１８４およびＯＫＴ３についてのＭＦＩは、それぞれ６８および１０５０であった。ＩｇＧ１−ＦＩＴＣおよびＩｇＧ２ａ−ＰＥで染色したＡＴＣのうち９５％以上が明らかにＨｅｒ２Ｂｉとの結合を示した。
【０２８６】
（実施例４）
（ＭＣＦ−７細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞上のＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体の検出）
ＭＣＦ−７またはＳＫ−ＢＲ−３を、１μｇのＨｅｒ２Ｂｉまたは９１８４と共にインキュベートし、洗浄して、ＩｇＧ１−ＧＩＴＣで染色した。ヒストグラムは、ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７とＩｇＧ１（Ｈｅｒ２Ｂｉの９１８４部分）との結合をそれぞれ示す。多数のＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞の９７％において、１１３３のＭＦＩで、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＰＥによって９１８４およびＨｅｒ２Ｂｉの両方を検出した（Ｄパネル、図４）。無関係なＯＫＴ３／ＩＧ３はＳＫ−ＢＲ−３と結合しなかった（図示せず）。ＭＣＦ−７細胞（１０６）を、１μｇのＨｅｒ２Ｂｉまたは１μｇの９１８４と共にインキュベートした。腫瘍細胞を洗浄し、ＩｇＧ１−ＦＩＴＣで染色した。ヒストグラムはＭＣＦ−７とＩｇＧ１−ＦＩＴＣとの結合を示している。９１８４は、２８のＭＦＩでたった６４％のＭＣＦ−７細胞にしか検出されず、Ｈｅｒ２Ｂｉは、３５のＭＦＩでたった４８％のＭＣＦ−７細胞にしか検出されなかった（Ｅパネル）。この結果は、ＭＣＦ−７細胞のＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体のほとんど検出不可能な発現を確証している（文献１５８）。
【０２８７】
（実施例５）
（ＭＣＦ−７に方向性を持った特異的細胞傷害性の発達）
５１Ｃｒ解放アッセイを用いて細胞傷害性を測定した。４×１０４／ウェルの細胞濃度で、平底マイクロタイタープレートに腫瘍細胞を塗布した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、一回洗浄し、３７℃で４時間５１Ｃｒ（２μＣｉ／ウェル）（アマシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ）で標識し、３回洗浄した。そして、４のエフェクター：標的比（Ｅ／Ｔ）で、ＡＴＣを３通りプレートに塗布した。一晩の培養後、ＣＯＢＲＡ−ＩＩγ線計数器（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）、ダウナーズグローブ、ＩＬ）でγ線を数えるために、１００μｌ分割量の培養上清を取り出した。特異的溶解％＝（試験カウント／分−自発性カウント／分）／（最大カウント／分−自発性カウント／分）×１００。培地のみで標的をインキュベートすることによって自発性解放を測定し、１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００（シグマケミカル会社、セントルイス、ＭＯ）で標的を溶解させることによって最大解放を測定した。接合化ＡＴＣにより媒介された再方向化細胞傷害性の発達を定義するために、３つの正常被験体からの新鮮なＰＢＭＣまたはＡＴＣと５０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉとを接合し、図５に記載の日にＭＣＦ−７細胞に対する細胞傷害性を試験した。水平なパネルの各セットは、３つの別々の正常被験体についてのデータを示している。０日目（Ｄ０）にＰＢＭＣを試験し、４日目（Ｄ４）、６日目（Ｄ６）、８日目（Ｄ８）、１３日目または１４日目（Ｄ１３またはＤ１４）に、非接合化ＡＴＣ（黒丸、抗体なし）、５０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣ（黒四角）、５０ｎｇのＯＫＴ３×ＩＧ３と接合したＡＴＣ（黒三角）を試験した。
【０２８８】
培養前の接合化した新鮮な（不活性化）ＰＢＭＣによるＭＣＦ−７細胞の溶解は、全てのＥ／Ｔ比において一貫して１０％未満であり、５０ｎｇのトラウト架橋結合化ＯＫＴ３、または無関係なＯＫＴ３×ＩＧ３と接合したＡＴＣは、試験した全ての時点およびＥ／Ｔ比で３０％の特異的溶解を示した。培養６日後の接合は、一貫して特異的細胞傷害性を増強した。
【０２８９】
Ｈｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣは非常に効力があるため、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体をほとんど発現しないＭＣＦ−７、乳癌細胞系と結合し、排除する。本発明のデータは、本発明の新規の結合および細胞傷害性のアッセイが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのための従来の免疫組織化学染色に比べより感応性であることを示している。フローサイトメトリーは、ＭＣＦ−７の表面上のＨｅｒ２／ｎｅｕの存在をほとんど検出することができないが（図４、Ｅパネル）、ＭＣＦ−７細胞は常にＨｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣによって排除されている。本発明のデータは、前立腺癌細胞のＨｅｒ２／ｎｅｕの極めて小さな発現も標的化され、生体内で溶解されていることを示している。
【０２９０】
（実施例６）
（ＭＣＦ−７に方向性を持った特異的細胞傷害性は、接合化用量およびＥ／Ｔと共に増大する）
Ｈｅｒ２Ｂｉのための最適接合化用量範囲を決定するために、５：１〜２５：１のＥ／Ｔで用量滴定の研究を行った。図６は、５〜２５のＥ／Ｔ比における、非接合化ＡＴＣ、ならびに０．５ｎｇ、５．０ｎｇ、および５０．０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣの混合物の滴定曲線を示している。各曲線は、ＭＣＦ−７標的に方向性を持った３つの実験の特異的細胞傷害性％の補間化平均値（±ＳＥＭ）を表す。各用量滴定曲線は、表示のＥ／Ｔにおける３つの被験体からのＡＴＣを用いたデータの補間化平均値を示している。非接合化ＡＴＣ（黒逆三角）または０．５（黒丸）、５．０（黒四角）、および５０（◆）と接合したＡＴＣ。Ｈｅｒ２Ｂｉの接合化用量の増加は、特異的細胞傷害性％の平均値を増大させる。２５〜５００ｎｇの無関係なＯＫＴ３×ＩＧ３またはＯＫＴ３と接合したＡＴＣは、非接合化ＡＴＣと類似した特異的細胞傷害性％を示した（図示せず）。
【０２９１】
（実施例７）
（特異的細胞傷害性についてＴ細胞部分集合を測定するために、高濃度のＴ細胞部分集合を検査した）
ダイナビーズ−４５０ＣＤ４（ダイナル、レークサクセス、ＮＹ）を、ＣＤ４細胞の陽性選択およびＣＤ８細胞の陰性選択（ＣＤ４減少（ｄｅｐｌｅｔｅｄ））に対するＤＥＴＡＣＨａＢｅａｄ法において使用した。単離後ＡＴＣおよびＡＴＣ部分集合の表現型をＦＡＣＳ分析によって測定した。ＣＤ４選択（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）細胞は９９％のＣＤ４＋であり、ＣＤ４減少細胞は９４％のＣＤ８＋であった。非画分化ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、およびＣＤ８＋細胞と５０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉとを接合し、ＭＣＦ−７細胞に対する再方向化細胞傷害性を媒介する能力について検査した（図７）。全てのＥ／Ｔにおいて、接合化ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、およびＣＤ８＋細胞の特異的細胞傷害性％は、一貫して非接合化ＣＤ３集合、ＣＤ４集合、ＣＤ８集合よりも高く、細胞傷害性の階層は、ＣＤ８＋細胞＞ＣＤ３＋細胞＞ＣＤ４＋細胞である。
【０２９２】
（実施例８）
（接合化ＡＴＣは２日間以上結合したままであり、細胞傷害性を示す）
どのくらい長くＡＴＣは接合したままであり、腫瘍細胞を排除し続けるのかを測定するために、接合後２４時間間隔で、フローサイトメトリーおよび細胞傷害性アッセイを行った。正常被験体からのＡＴＣを、０ｎｇ、５０ｎｇ、および５００ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥを用いてＨｅｒ２Ｂｉを検出した（図８、Ａパネル）。結果は、２４時間後結合が著しく減少したが、残りのＨｅｒ２Ｂｉは安定しており、７２時間後も検出可能であることを示している。Ｈｅｒ２Ｂｉ結合は、ＯＫＴ３結合に匹敵していた。これらの研究は、ヘテロ共役がＨｅｒ２Ｂｉの抗ＣＤ３のパートナーの結合を妨げなかったこと示している。５ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣは、接合化後２４時間でＭＣＦ細胞の３３±１％の溶解を示した。Ｈｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣは、５４時間後までＭＣＦ−７標的を排除し続け、２４：１のＥ／Ｔ比において、３５±４％の特異的溶解％が観察された。５４時間後、５０ｎｇおよび５００ｎｇの高い接合化用量において、特異的溶解％は４８％未満であり、細胞傷害性は低下しなかった。５００ｎｇの親ＯＫＴ３または９１８４と接合したＡＴＣは、バックグラウンドを上回る細胞傷害性を示さなかった。これらの結果は、Ｈｅｒ２Ｂｉ再方向化細胞傷害性が５４時間継続していることを示している。
【０２９３】
（実施例９）
（高濃度二量体の分画におけるＢｉＡｂ活性の増大）
ＯＫＴ３×Ｔ９４．６６（抗ＣＥＡ）ヘテロ共役体とＡＴＣとを接合して、ＣＥＡ＋ＬＳ１７４Ｔ大腸癌細胞を排除するために作成した。ＣＥＡと結合し、ＣＥＡを標的化する画分を確認するため、セファクリル３００カラムを用いて、二量体および多量体を含む画分を単量体の画分から単離し、全てのタンパク質濃度を同一に調整した後、ＬＳ１７４Ｔに方向性を持つ特異的細胞傷害性％についてそれぞれの画分を試験した（図９）。□は二量体の画分を、○は非画分化材料を、△は単量体の画分を、▽は非接合化ＡＴＣをそれぞれ表している。ＡＴＣは、各画分の５０ｎｇのヘテロ共役体と接合している。高濃度二量体の画分は、非画分化へテロ共役体を上回る細胞傷害性を示したが、単量体の画分は比較的低い細胞傷害性を示した。
【０２９４】
（実施例１０）
（１０人の正常なコントロール被験体からのＨｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣ）
図１０は、１０６のＡＴＣ当たり５０ｎｇのＯＫＴ３×９１８４と接合した１０人の正常被験体からのデータをまとめたものである。２０：１のＥ／Ｔにおいて、１０人の正常被験体および６人の患者からの接合化ＡＴＣによるＭＣＦ−７細胞の特異的溶解％における平均値の増加は、それぞれ５９±１１％および３２±９％であった。これらの平均値は、２０：１のＥ／Ｔにおける非接合化ＡＴＣよりも極めて高かった（正常被験体においてｐ＜０．００１、対応のあるスチューデントのｔ検定）。ＡＴＣが５０ｎｇの非共役ＯＫＴ３、５０ｎｇの非共役９１８４、または５０ｎｇのＯＫＴ３×ＩＧ３と接合している場合、特異的細胞傷害性はＡＴＣと同じであった（図示せず）。
【０２９５】
（実施例１１）
（生体内ＡＴＣ媒介細胞傷害性）
各パネル（図１１）に表示した培養の日に制御速度凍結を用いて細胞標本化した癌患者からのＡＴＣを解凍し、Ｈｅｒ２Ｂｉと接合した。ＭＣＦ−７に方向性を持った細胞傷害性についてＡＴＣを試験した。腎細胞癌（３）の患者は事前化学療法を受けなかったが、乳癌（２）およびリンパ腫（１）の患者は事前化学療法を受けた。６人の患者について特異的細胞傷害性％が３２±９％増加した。Ｈｅｒ２Ｂｉとの接合化は患者ＡＴＣによって媒介された特異的細胞傷害性％を著しく増加させた（Ｐ＜０．０００４、対応のあるスチューデントのｔ検定）。この結果は、化学療法を受けた者と受けなかった者との間に差異がなかったことを示している。
【０２９６】
（実施例１２）
（ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍細胞との結合によって誘導されたサイトカイン分泌）
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、およびＧＭ−ＣＳＦは抗腫瘍作用を与えると仮定し、ＳＫ−ＢＲ−３との接合化ＡＴＣの結合はＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＧＭ−ＣＤＦ分泌を誘導するかどうかを試験するための実験を行った（図１２）。２４ウェルプレートに２×１０５／ウェルの濃度で腫瘍細胞を塗布し、３７℃で一晩培養した。次の日、非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣ（２×１０６／ウェル）を、腫瘍細胞（Ｔ）と共に同時培養した（総用量２ｍｌ）。各サンプルの培養上清をプール（ｐｏｏｌ）し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム、ミネアポリス、ＭＮ）によってＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＧＭ−ＣＳＦについて検査した。全ての値を、μｇ／ｍｌ／１０６ＡＴＣ／２４時間で報告した。非接合化ＡＴＣ、あるいは腫瘍の存在下または非存在下で最大５００ｎｇの無関係なＯＫＴ３×ＩＧ３または９１８４と接合したＡＴＣは、いかなるＩＦＮγまたはＴＮＦαも誘導しなかった（図示せず）。バックグラウンドは５ｐｇ未満であった。Ｈｅｒ２Ｂｉ（５０ｎｇおよび１００ｎｇの両方の用量で）と接合したＡＴＣをＳＫ−ＢＲ−３と同時培養させた場合、培養によって、バックグラウンドを超えてＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＧＭ−ＣＳＦの産生が著しく増加した。トラウト架橋結合化ＯＫＴ３コントロールでのＡＴＣの刺激は、腫瘍の非存在下または存在下で１１０ｎｇのＩＦＮγ、ＳＫ−ＢＲ−３の非存在下または存在下で５０ｐｇ未満のＴＮＦαを産生した。ＭＣＦ−７およびＰＣ−３を用いて同様の結果を得た。
【０２９７】
（実施例１３）
（様々な腫瘍細胞系に対抗して媒介された生体外細胞傷害性）
Ｈｅｒ２ＢｉとのＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳの接合は、ＨＥＲ２＋腫瘍標的ＭＣＦ−７、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＰＣ−３の溶解を著しく促進した。この臨床試験において、少数のＨＥＲ２受容体（ＨＥＲ２ｒ）を発現するモデル標的としてのＭＣＦ−７乳癌系、多数のＨＥＲ２ｒを発現するモデル標的としてのＳＫ−ＢＲ−３乳癌系、および器官特異的標的としてのＰＣ−３前立腺癌細胞系（中程度の数のＨＥＲ２ｒ）を調査した。ＭＣＦモデルを使用した結果は、Ｈｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣを用いて陽性腫瘍を標的化（たとえ弱くても）する明確な理論的根拠を与えた。結合研究は、ＰＣ−３が、ＭＣＦ−７よりも表面に多くのＨＥＲ２受容体を備えていることを示している（図１５）。Ｈｅｒ２Ｂｉは、７２時間以上も接合化ＡＴＣ上に存在したままであり、５４時間より長く再方向化細胞傷害性を媒介し続けることが見出された。
【０２９８】
Ｈｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣと、ＰＣ−３（左パネル）およびＭＣＦ−７（右パネル）に対して検査した（図１３）。ＡＴＣを非接合のままにするか（黒丸）、あるいは５０ｎｇのＯＫＴ３／ＩＧ３（黒逆三角）またはＨｅｒ２Ｂｉ（黒四角）と接合した。Ｅ／Ｔ滴定は、接合化ＡＴＣがＰＣ−３およびＭＣＦ−７癌細胞系に対して細胞傷害性であることを示している。小さいＥ／Ｔ比において、特異的細胞傷害性％はＭＣＦ−７細胞よりもＰＣ−３細胞のほうが高いと思われる。これらの結果は、ＰＣ−３癌細胞がＭＣＦ−７細胞よりも表面に多くのＨｅｒ２受容体を備えていることを示すフローサイトメトリーの結果と一貫している。
【０２９９】
図１４は、ＯＫＴ３×９１８４の接合化用量の増加は、ＰＣ−３に方向性を持った特異的細胞傷害性％を上昇させることを示している。図１４に表示したＡＴＣのみ、または０．１ｎｇ、０．５ｎｇ、１．０ｎｇ、５ｎｇ、５０ｎｇ、および５００ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣをＰＣ−３に対して試験した。無関係なＢｉＡｂはＯＫＴ３×Ｒｉｔ．であった。ＰＣ−３に方向性を持った細胞傷害性は、５０ｎｇの用量でほぼ最適となった。同様の滴定曲線において、３人の正常被験体からのＡＴＣについて同様の結果を得た。
【０３００】
図１５は、フローサイトメトリーを用いて得た結果を表している。このデータは、Ｈｅｒ２ＢｉがＰＣ−３細胞と結合していることを示している。ＰＣ−３、ＭＣＦ−７、およびＳＫ−ＢＲ−３を、１μｇのＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３を用いて処置し、続いてＰＥ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色して、ＭＣＦ−７（低い発現）およびＳＫ−ＢＲ−３（高い発現）と比較したＰＣ−３のＨｅｒ２受容体の発現レベルを測定した。図１５は、ＰＣ−３細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞とのＯＫＴ３×９１８４の明確な結合、極めて低いと予測されるＭＣＦ−７細胞との結合を示している。
【０３０１】
（実施例１４）
（ＳＫ−ＢＲ−３標的に方向性を持ったＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ細胞傷害性）
図１で述べたものと同一の様式で、ＯＫＴ３とハーセプチン（登録商標）とのヘテロ共役を行った。５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中のＯＫＴ３（２ｍｇ）と５倍モル過剰のトラウト試薬とを反応させた。０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中のハーセプチン（２ｍｇ）と、４倍モル過剰のスルホＳＭＣＣとを、室温で１時間反応させた（工程２）。ＰＢＳのＰＤ−１０カラムで両方のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を精製し、非結合性架橋剤を取り除いた。直ちに、架橋結合化Ｍａｂを等モル比で混合し、４℃で一晩共役させた（工程３）。２〜１５％の勾配ゲルを用いた非還元ＳＤＳゲル電気泳動によって、ＢＣＡタンパク質を定量および分析した（図１６）。ゲル上のタンパク質を可視化するために、クーマシーブルー染色を用いた。第一レーン、高分子量のマーカー；第二レーン、ＯＫＴ３（４μｇ）；第三レーン、９１８４（４μｇ）；第四レーン、ＯＫＴ３×９１８４（４μｇ）；第五レーン、ＯＫＴ３×９１８４（８μｇ）；第六レーン、Ｈｅｒｃ（４μｇ）；第七レーン、ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ（４μｇ）；第八レーン、ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ（８μｇ）。濃度測定による第三レーン、第四レーン、第六レーンおよび第七レーンの二量体の割合は、それぞれ２７％、２７％、２１％および２１％であった。
【０３０２】
図１７は、ＳＫ−ＢＲ−３標的を溶解させる２つの正常被験体からのＡＴＣの能力を示している。正常被験体（Ａ）からの、非接合化ＡＴＣ、５０ｎｇのＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣ、無関係なＯＫＴ３×４Ｄ４（前立腺特異的膜抗原に対して生じたモノクローナル抗体（アルトンボイントンからの供給品））と接合したＡＴＣ、または５０ｎｇの非共役ＯＫＴ３と５０ｎｇの非共役Ｈｅｒｃとの混合物を試験した。同様に正常被験体（Ｂ）を試験した。非結合化ＡＴＣおよび５０ｎｇのＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣのみを示す。
【０３０３】
（実施例１５）
（比較接合化用量）
ＯＫＴ３×９１８４とＯＫＴ３×Ｈｅｒｃとの間の接合化用量の差異を測定するために、増加する用量のＯＫＴ３×ＨｅｒｃおよびＯＫＴ３×９１８４とＡＴＣとを接合した。両方のＢｉＡｂは、ＳＫ−ＢＲ−３標的を排除するためのＡＴＣとの接合化に効果的であった（図１８参照）。図１８は、小さいＥ：Ｔ比のＳＫ−ＢＲ−３標的に方向性を持つ特異的細胞傷害性について、５ｎｇおよび５０ｎｇの接合化用量では、ＯＫＴ３×ＨｅｒｃはＯＫＴ３×９１８４よりわずかに効果が低いことを示している。これらの差異はこれらのアッセイの実験的偏差に起因し得る。重要なことは、５０〜５００ｎｇ／１０６のＡＴＣの接合化は、ＳＫ−ＢＲ−３標的を溶解させるＡＴＣの能力を著しく向上させることである。
【０３０４】
（実施例１６）
（接合化ＡＴＣによるＩＦＮ分泌）
５０ｎｇのＯＫＴ３×９１８４または１００ｎｇのＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと正常ＡＴＣとを接合し、１０：１のＥ：ＴでＳＫ−ＢＲ−３標的と共に同時培養した。そして、培養の２４時間後にＩＦＮγ分泌について培養上清を検査した（図１９）。コントロールとしての、無関係なＯＫＴ３×ＩＧ３、あるいはＯＫＴ３＋９１８４またはＯＫＴ３＋Ｈｅｒｃの混合物との接合化は、２００ｇ未満のＩＦＮγ／ｍｌ／１０６のＡＴＣを誘導した。両方のＢｉＡＢについて１００ｎｇの接合化用量では、ＩＦＮγ分泌の同様の誘導は生じなかった。５０ｎｇの接合化用量において、ＯＫＴ３×ＨｅｒｃとのＡＴＣの接合化は、ＯＫＴ３×９１８４とのＡＴＣの接合化よりも少ないＩＦＮγを誘導した。しかし、これは実験的誤差に起因し得る。
【０３０５】
５０ｎｇのＯＫＴ３×ＨｅｒｃとＡＴＣとを接合する際に、どのくらい低いＥ：ＴがＩＦＮγを刺激するのに効果的であるかを決定するために、５：１、１．５：１、１．２５：１、および０．６２５：１のＥ：Ｔ比でＳＫ−ＢＲ−３標的と共に同時培養した、接合化ＡＴＣ由来の２４時間の培養上清を検査した。２．５：１のＥ：Ｔ比において、抗体なし（ＡＴＣのみ）、溶解性ＯＫＴ３とＨｅｒｃとの混合物、または無関係なＯＫＴ３×ＩＧ３ＢｉＡｂとの接合体に、バックグラウンドのレベルを超えた増加が見られた。これらの滴定実験に基づいて、５：１〜１０：１のＥ／Ｔ比で全てのサイトカイン分泌研究を行った。
【０３０６】
（実施例１７）
（ＰＣ−３標的を用いた、Ｈｅｒ２ＢｉまたはＯＫＴ×Ｈｅｒｃ接合化正常ＡＴＣの比較）
図２０は、５ｎｇ、５０ｎｇ、および５００ｎｇの接合化用量におけるＯＫＴ３×９１８４とＯＫＴ３×Ｈｅｒｃとの直接比較を示している。５００ｎｇの無関係なＯＫＴ３×Ｒｉｔと接合したＡＴＣは、最も大きいＥ／Ｔ比のコントロールとして示す。これらのデータは、ＯＫＴ３×９１８４およびＯＫＴ３×Ｈｅｒｃの両方が、ＰＣ−３細胞に対する滴定に同様の傾向を示すことを表している。この実験では、ＯＫＴ３×９１８４用量滴定についての細胞傷害性曲線は、同等の用量のＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣよりも高かった。
【０３０７】
接合化患者Ｔ細胞は、凍結／解凍後もＰＣ−３に対して細胞傷害性を維持する。患者からのＯＫＴ３×９１８４接合化ＡＴＣを、抗ＣＤ３活性化後１４日間拡張させ、細胞標本化して解凍して、５０ｎｇ／１０６のＡＴＣと接合し、そして特異的細胞傷害性について検査した（図２１）。５０ｎｇのＯＫＴ３×９１８４（○）、ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ（）、またはＯＫＴ３×Ｒｉｔ（▽）とＡＴＣとを接合した。溶解性ＯＫＴ３＋９１８４（黒四角）の混合物をまたコントロールとして使用した。これらのデータは、凍結および解凍されたＡＴＣが接合化して、ＰＣ−３に方向性を持った細胞傷害性を媒介することを示している。
【０３０８】
（実施例１８）
（ＰＣ−３細胞との結合の際にＯＫＴ３×９１８４と接合した正常ＡＴＣにより産生されたＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳ）
Ｈｅｒ２／ｎｅｕを保持するＰＣ−３細胞に暴露されたときにＩＦＮγを産出する接合化ＡＴＣの数の周波数を測定するために、１０：１のエフェクター：標的比で４時間、１つの平底マイクロウェル当たり４０，０００個のＰＣ−３細胞を含むように、５０ｎｇ／１００万個のＯＫＴ３×９１８４と接合したＡＴＣをプレートに塗布した。４時間後、エフェクターを取り出し、モノクローナル７−Ｂ６−１抗ヒトＩＦＮγ抗体で予めコーティングされたミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）マルチスクリーンニトロセルロースＨＡプレートに該エフェクターを塗布した。プレートを成長させ、解剖顕微鏡を用いてＥＬＩＳＰＯＴＳの数を数えた。図２２は、ＡＴＣのみ（○）、ＰＣ−３と混合したＡＴＣ（ＰＣ−３）、５０ｎｇの溶解性ＯＫＴ３で再び刺激したＡＴＣ（ＯＫＴ３）、５０ｎｇのＯＫＴ３およびＰＣ−３で刺激したＡＴＣ（ＯＫＴ３＋ＰＣ−３）、腫瘍なしでＯＫＴ３×９１８４と接合したＡＴＣ（Ｈｅｒ２Ｂｉ）、およびＰＣ−３と混合したＯＫＴ３×９１８４と接合したＡＴＣ（Ｈｅｒ２Ｂｉ＋ＰＣ−３）について、斑点数／１００万個の接合化ＡＴＣをまとめたものである。尚、誤差バーは、三重の計数の±ＳＤを示す。Ｈｅｒ２Ｂｉブリッジを介したＰＣ−３細胞との係合に対する接合化ＡＴＣの明確で活発な応答が存在した。
【０３０９】
古いロットおよび新しいロットのＯＫＴ３×９１８４は、少なくとも１１ヶ月間安定であった。１９９７年１２月９日（古い）および１９９８年１１月５日（新しい）に作成したＯＫＴ３×９１８４の２つのバッチにより媒介された接合化および特異的細胞傷害性において差異はなかった。図２４は、１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、および５０ｎｇの古い、または新しいＯＫＴ３×９１８４と接合したＡＴＣを表す。各用量の用量滴定曲線は重なっている。
【０３１０】
図２３は、ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣにより媒介された細胞傷害性が溶解性ハーセプチン（登録商標）によって阻害されなかったことを示している。増加する濃度の抗Ｈｅｒ２抗体（０．５ｎｇ、５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、５００ｎｇ、１０００ｎｇ、５０００ｎｇのハーセプチン（登録商標））は、１０００ｎｇ／ｍｌに達するまで、Ｈｅｒ２ｉ接合化ＡＴＣにより媒介される細胞傷害性を阻害しなかった。従って、循環するハーセプチン（登録商標）は、Ｈｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣによる標的排除を阻害しない。一方、非接合化ＡＴＣの添加前のＨｅｒ２Ｂｉと細胞標的との事前結合は、ロゼットを形成したり、特異的細胞傷害性を高めたりしなかった（データを図示せず）。つまり、Ｈｅｒ２Ｂｉを用いた患者の処置は、ＣＤ３を介した非接合化ＡＴＣと腫瘍との十分な結合を提供しなかった。誤差バーは±１のＳＤを示している。
【０３１１】
（実施例１９）
（生体内有効性および細胞傷害性）
５０ｎｇのＯＫＴ３×抗ＣＥＡと接合した２０×１０６〜５０×１０６のＡＴＣの複数回の皮下注射および腹腔内注射は、ＳＣＩＤマウスに有毒ではなかった。接合化ＡＴＣ（２０×１０６）とＣＥＡ＋ＬＳ１７４（１×１０６）大腸癌細胞系との皮下同時注射（ウィンアッセイ）は、接合化ＡＴＣを受けたマウスの４０％において腫瘍の進行および死亡を妨げたが、一方、ＡＴＣのみを受けたマウスのうち１０％しか１００日より長く生存しなかった（図２５）。腫瘍細胞（１×１０６のＬＳ１７４Ｔ）の移植を保証するために、ＳＣＩＤマウスにＮＫ細胞を排除する３Ｇｙの全身照射を与えた。全てのコントロールＳＣＩＤマウス（ＡＴＣなしの腫瘍）は、２２日目までに腫瘍の進行のために死亡した（腫瘍サイズ＞２２ｍｍ）。
【０３１２】
（実施例２０）
（ＰＣ−３との結合により誘導されたＨｅｒ２ＢｉまたはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合した正常ＡＴＣによるサイトカイン分泌）
上記のように腫瘍細胞（２００，０００個）をプレートに塗布し、一晩インキュベートした。次の日、非接合化ＡＴＣまたは接合化ＡＴＣ（２×１０６／ウェル）を、腫瘍細胞（Ｔ）と共に２４時間同時培養した。培養上清をプールし、上記のようにＩＦＮγ、ＴＮＦγ、およびＧＭ−ＣＳＦ（Ｇ）について検査した。この結果は、腫瘍、ＡＴＣ、またはＯＫＴ３またはＯＫＴ３／Ｒｉｔと接合したＡＴＣの存在下で、低い濃度のＩＦＮγが産出されたことを示唆している。５０ｎｇのＨｅｒ２ＢｉまたはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合した正常ＡＴＣを、ＰＣ−３と共に同時培養した場合（図２６）、ＡＴＣは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＧＭ−ＣＳＦの産出を著しく増加させた（誤差バーは±のＳＤを示す）。
【０３１３】
図２７は、Ｈｅｒ２ＢｉまたはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合した患者からのＴ細胞についての結果を示す。ユーイング肉腫（Ｅｗｉｎｇ’ｓ  Ｓａｒｃｏｍａ）の患者がすでに５サイクルのイホスファミドとエトポシドとの化学療法を受けた後に、血液サンプルからＡＴＣを成長させた。Ｈｅｒ２Ｂｉ接合化ＡＴＣのＰＣ−３との結合は、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成において５倍もの顕著な増加を誘導した。ＰＣ−３を欠くＧＭ−ＣＳＦ合成は高かったが、患者ＡＴＣによるＧＭ−ＣＳＦ産生は２倍増加した。これらのデータは、何サイクルもの化学療法を受けた患者からのＡＴＣは、Ｈｅｒ２Ｂｉとの接合化後もなおサイトカインを産生することができることを示している。
【０３１４】
ＡＴＣのレトロウイルス遺伝子導入（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）において、ＩＬ−２導入遺伝子および内因性サイトカインＩＦＮγの両方の濃度が、レトロウイスルベクターを含むＩＬ−２の形質導入の１週間以上後に静止状態となったことが、結果によって示されている。しかし、ＯＫＴ３×抗ＣＥＡ（Ｔ８４．６６）接合化ＡＴＣのＣＥＡ＋ＬＳ１７４Ｔへの暴露は、ＩＬ−２およびＩＦＮγの分泌を誘導した（文献１５７）。同時に、Ｈｅｒ２受容体を保持する異なる腫瘍によって、ならびに異なるＢｉＡｂおよび大腸癌細胞標的を用いた異なるモデルによって、サイトカイン分泌が誘発されることが、これらのデータによって示された。
【０３１５】
（実施例２１）
（特異的細胞傷害性に必要とされる接合化用量の臨床的スケールアップ）
１０億個のＡＴＣと０ｎｇの用量を接合化させた。０．１〜５００ｎｇにわたる一連の用量滴定曲線に対してＭＣＦ−７に方向性を持った細胞傷害性を比較した。図２８は、健常者（ＮＬ）のデータを示し、図２９は患者（ＰＴ）のデータを示す。
【０３１６】
１０億個のＡＴＣを含むプラスマネートのエトクス（Ｅｔｈｏｘ）製３Ｌバッグに５０μｇのＢｓＡｂを添加することによって、ＡＴＣ１００万個当たり５０ｎｇのＢｓＡｂと１０億個のＡＴＣとを接合した。管内のＡＴＣと接合するために使用した用量を、図の凡例に示す。
【０３１７】
細胞標本化は、Ｈｅｒ２＋ＭＣＦ−７標的に方向性を持った特異的細胞傷害性にほとんど影響を与えなかった。図３０は、２つの分割量が機能的細胞傷害性活性について類似していることを示している。再方向化細胞傷害性への凍結／解凍の影響を検査するために、細胞標本化し、解凍して、１５ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合した正常ＡＴＣの分割量と、３０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合した同一のＡＴＣの分割量とを比較した。図３０の右パネルは、凍結し、解凍して、その後ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣにおける特異的溶解を示している。
【０３１８】
（実施例２２）
（Ｈｅｒ２Ｂｉ（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ）での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８同時活性化Ｔ細胞（ＣＯＡＣＴＳ）の接合化）
非接合化ＣＯＡＣＴＳ、あるいは５０ｎｇのＯＫＴ３×９１８４、５０ｎｇの９１８４のみ、または５０ｎｇのＯＫＴ３×ＩＧ３と接合したＣＯＡＣＴＳを、表示のＥ／Ｔ比でＭＣＦ−７に方向性を持つ細胞傷害性について検査した。図３１は、ＣＯＡＣＴＳが接合し、ＭＣＦ−７標的を溶解させることを示している。
【０３１９】
ＯＫＴ３×９１８４と接合した癌患者ＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣは、ＭＣＦ−７標的に方向性を持つ同等な特異的細胞傷害活性を有する。３人の癌患者の同じ血液サンプルから、１４日間の培養期間にわたりＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣを作成した。各患者からの接合化ＣＯＡＣＴＳまたはＡＴＣをＭＣＦ−７標的に対して検査した。パネルＰ１、Ｐ２およびＰ３は、特異的細胞傷害性を媒介する、非接合化および接合化のＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣの能力を示す。
【０３２０】
抵抗性癌患者を処置するために、自家生体外拡張化ＣＯＡＣＴＳの注入を用いて、第Ｉ相用量増加試験を完了した（文献９５）。生体外ＣＯＡＣＴＳ拡張の技術的限界、ＣＯＡＣＴＳの生体内局在化および輸送、患者へのＣＯＡＣＴＳ注入により誘導される免疫効果について評価した。ＣＯＡＣＴＳの注入は安全であり、検出可能な血中濃度のＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦαを誘導し、新鮮に単離されたＰＢＭＣが生体外抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８同時刺激の際にＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを分泌する能力を著しく高めた。これらのデータは、これらの患者の免疫系がＣＯＡＣＴＳ注入によって変更されたことを提案している。化学療法と生物反応修飾物質とを組み合わせたＣＯＡＣＴＳを評価する続きの研究が進行中である。
【０３２１】
（実施例２３）
（遺伝子導入Ｔ細胞のＢｉＡｂ標的再活性化は、内因性サイトカイン産生および導入遺伝子サイトカイン生成物発現の分泌の両方を促進する）
導入遺伝子下方制御を回避するために、ＯＫＴ３×Ｔ８４．６６（抗ＣＤ３×抗癌胎児性抗原）を、ＩＬ−１α遺伝子導入ＡＴＣと結合させ、該ＡＴＣを新しい標的に向けるために使用した（文献１５７）。ＡＴＣをＩＬ−１αレトロウイルスベクターで修飾し、抗ＣＤ３×Ｔ８４．６６と接合し、ＬＳ１７４Ｔ（ＣＥＡ＋大腸癌系）と混合した。ＬＳ１７４Ｔ細胞との接合化ＡＴＣの結合は、内因性ＩＦＮγ分泌およびＩＬ−１α分泌の両方を誘導した。これらのデータはさらに接合化ＡＴＣの使用を支持している。
【０３２２】
（実施例２４）
（膵癌に特異的な接合化ＡＴＣを用いたヒト患者の処置）
膵癌の患者（ＡＲ）において、５８％のＣＤ３＋細胞、４３％のＣＤ４＋細胞、および１４％のＣＤ８＋細胞からなる９．８×１０９の単核球の開始集合に白血球交換療法を施した。ＡＴＣを回収し、１０日後に、９４％のＣＤ３＋細胞、８３％のＣＤ４＋細胞、および１２％のＣＤ８＋細胞からなる総回収量６１．８×１０９のＡＴＣと接合した。用量５０ｎｇのＯＫＴ３×ハーセプチン二重特異性抗体と接合したＡＴＣ（２．５×１０９）の複数回分用量を２週間にわたり患者に投与した。任意の用量制限毒性はなかった。
【０３２３】
下の表３は、接合化ＡＴＣで処置したホルモン抵抗性前立腺癌（ＨＲＰＣ）の男性患者およびＯＫＴ３×９１８４を用いたそれら臨床毒性をまとめたものである。二重特異性抗体は別の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモノクローナル抗体を含んでいるにも関わらず、毒性はほぼ同じである。
【０３２４】
【表３】
2004538331.tif 000004
【０３２５】
前立腺癌の４人の患者（表Ｉ）、１人の第ＩＩ段階乳癌の患者、および膵癌の最初の患者に投与した用量において、用量制限毒性はないことが明らかである。全ての注入は外来患者を基に行った。
【０３２６】
表４は、接合化前のＡＴＣの拡張、およびホルモン抵抗性前立腺癌の男性患者に注入した生成物の表現パターンの検査のデータをまとめたものである。
【０３２７】
【表４】
2004538331.tif 000005
【０３２８】
（実施例２５）
（さらなる正常被験体および２人の癌患者からのＡＴＣにより媒介されたＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性前立腺細胞系に方向性を持つ特異的細胞傷害性の確認）
１００万個のＡＴＣ当たり５０ｎｇのＯＫＴ３×ハーセプチンと接合したＡＴＣを用いて、さらなるデータを得た。前日の夜にＦＧ膵臓細胞系をプレートに塗布し、５１Ｃｒで放射標識した。そして、非接合化ＡＴＣ、ＯＫＴ３×ハーセプチンと接合したＡＴＣ、無関係なＢｉＡｂ（ＯＫＴ３×リツキサン）と接合したＡＴＣをプレートに塗布し、同時培養の１８時間後に５１Ｃｒ解放を評価した。３．１３〜２５．００のエフェクター：標的における１人の正常被験体および２人の前立腺癌の患者についての特異的細胞傷害性を図３３に示す。２人の患者および健常者からのＡＴＣの接合化は、全てのエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）における特異的細胞傷害性を増加させた。
【０３２９】
第二膵臓細胞系の細胞傷害性を確認するために、さらなる細胞系（ＭＩＡ）をＡＴＣＣから購入し、同一のアッセイで検査した。図３４は、接合化ＡＴＣがＭＩＡ標的を排除したことを示している。ＭＩＡ細胞系のウェスタンブロット法は、細胞系のＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の発現を証明した。
【０３３０】
（実施例２６）
（ＯＫＴ３×ハーセプチンと接合したＡＴＣは複数回排除することができる）
接合化ＡＴＣが腫瘍細胞を複数回排除することができるかどうかを決定するために、非接合化ＡＴＣ、ＨＥＲ２Ｂｉと接合したＡＴＣ、およびＯＫＴ３×リツキサンと接合したＡＴＣを含む一連の並列培養（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を組み立てた。それぞれの細胞傷害性アッセイの前に、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌標的細胞をプレートに塗布し一晩放置した。ＡＴＣと接合する前に、５（６）カルボキシフルオレセインジアセテートＮ−スクシニミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）色素でＡＴＣを標識した。従って、フローサイトメトリーを用いた緑色蛍光に対するゲートの開閉（ｇａｔｉｎｇ）よって色素を検出し、生じた細胞分裂の数を評価することができる。それぞれの放射標識の後に、塗布された標的細胞の低温計数（ｃｏｌｄ  ｃｏｕｎｔ）を行うことによって、細胞傷害性アッセイの日に２．５〜１０：１のエフェクター：標的比を設定した。この巧みな操作（ｍａｎｅｕｖｅｒ）は、エフェクターＴ細胞の添加前に各ウェルにおける細胞の損失を明らかにし、標的の実数値を与えた。図３５のＡパネルは、時間０で検査した接合化Ｔ細胞の分割量および非接合Ｔ細胞の分割量によって媒介された一次細胞傷害性アッセイを示す。第一組の標的とのインキュベーションから２４時間後に、非接合化ＡＴＣおよび接合ＡＴＣを回収し、４５時間後の二次培養および二次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第二組の標的に再び塗布した。４８時間後〜９６時間後に、再び塗布した非接合化（ＡＴＣ）または接合化ＡＴＣ（ａＡＴＣ）をＳＫ−ＢＲ−３と共に同時培養した後、非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣを回収し、９６時間後の三次培養および三次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第三組の標的上に再び塗布した。最後に、９６時間後〜２１５時間後に、非接合化および接合化ＡＴＣをＳＫ−ＢＲ−３と共に同時培養し、２１５時間後の四次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第四組の標的上に再び塗布した。反復の細胞傷害性が観察されたため、データは、ＡＴＣはまだＯＫＴ３×ハーセプチンと「接合」していたこを示している。２１３時間後の接合化ＡＴＣのフローサイトメトリーは、ＡＴＣ表面のＯＫＴ３（マウスＩｇＧ２ａ）の存続を明確に示している。生存度はヨウ化プロピジウムおよびトリパンブルー排除法より一貫して８０％高かった。
【０３３１】
（実施例２７）
（細胞分裂は、細胞傷害性を媒介するＡＴＣ集合で生じる）
細胞が、ＳＫ−ＢＲ−３標的細胞の表面のＨＥＲ２／ｎｅｕと結合した後に分裂するかどうかを測定するために、図３５に示した実験を行った。図３６のフローサイトメトリーのデータは、減少したＣＦＤＡ−ＳＥ蛍光を示す細胞の検出によって、数ラウンドの腫瘍抗原暴露の間にいくらかの細胞分裂が生じたことを証明している。ＡおよびＢパネルは、接合化ＡＴＣとＳＫ−ＢＲ−３標的とを混合してから３時間後と４８時間後の接合化ＡＴＣを示しており、ＣおよびＤパネルは、ＳＫ−ＢＲ−３標的と混合してから３時間後と４８時間後の非接合化ＡＴＣを示している。また、ＥおよびＦパネルは、標的へ暴露しなかった接合化ＡＴＣのみを示す。Ｂパネルでの３０、約２０、約１０および約５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）のピークと比較すると、Ｂパネルでは、ほぼ全ての集合がＡパネルにおける元のピークのＭＦＩ（３０および１８）から下方にシフトしたことが示された。標的と混合した非接合化ＡＴＣ（Ｄパネル）は、ポイント２でほぼ全ての細胞と共に同調培養したＡＴＣに見られるおおよその倍増時間で分裂した。Ｆパネルの接合化ＡＴＣはすでに分裂し始めており、分裂した大きな細胞集合（約２０のＭＦＩ）および二倍に分裂した小さい細胞集合（約９のＭＦＩ）が存在する。対照的に、ＳＫ−ＢＲ−３の存在下の非接合化ＡＴＣは増殖せず、標的なしの接合化ＡＴＣは、分裂しない細胞を代表する小さな集合（約３５のＭＦＩ）を用いた接合化プロセスによって誘導された「低」レベルの活性化という結果として、いくつかの増殖シフトを示した。接合化はＡＴＣに低レベルの再刺激を与えると予測される。つまり、接合化ＡＴＣおよび標的化ＡＴＣのＢパネルは、Ａパネルの集合番号１および集合番号２からの矢印によって同定された４つの細胞集合を示す。
【０３３２】
（実施例２８）
（ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の部分集合は、優先的に増殖する）
ＨＥＲ２Ｂｉまたは無関係な（コントロール）ＯＫＴ３×リツキサンと接合する前に、全てのＡＴＣをＣＦＤＡ−ＳＥで標識し、ＣＦＤＡ−ＳＥ陽性ＡＴＣの集合全体に生じたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の割合を測定するために、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋に方向性を持ったフィコエリトリン標識化モノクローナル抗体を使用した。
【０３３３】
図３６は、ＯＫＴ３×ハーセプチンまたはＯＫＴ３×リツキサンと接合しているか、非接合化のままである、ＣＤ４＋部分集合またはＣＤ８＋部分集合のＣＦＤＡ−ＳＥ＋細胞の数を示す別の実験と重ね合わせた結果である。重要なポイントは、ＣＤ４＋細胞集合は、分裂することで強度が減少した非常に明瞭な細胞集合によって細胞分裂の証拠を示し、一方、ＯＫＴ３×リツキサンと接合したＣＤ４＋の細胞および非接合化ＡＴＣは、分裂した細胞ほど多くの細胞を示さず、半分の染色強度しか示さなかったことである。
【０３３４】
（実施例２９）
【０３３５】
【表５】
2004538331.tif 000006
【０３３６】
（注入後の循環接合化ＡＴＣの輸送および検出）
注入後の循環接合化ＡＴＣの生存または輸送について、ＩｇＧ２ａ保持接合化ＡＴＣを検出するための新しく開発されたフローサイトメトリーアッセイを用いて患者を観察した。膜に結合したＩｇＧ２ａ（ＢｉＡｂのＯＫＴ３部分またはＯＫＴ３のみ）を保持するＴ細胞を検出するフローサイトメトリーの感度を測定するために、５０ｎｇ／１００万個のＡＴＣと接合したＡＴＣの既知量を増加させながら、新鮮なヘパリン添加血液へ添加し、ＰＥ共役ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ２ａを用いてマウスＩｇＧ２を保持する細胞について全血検査した。
【０３３７】
図３７の６つのパネルは、この方法を用いてフローサイトメトリーによって、ゲートで５５８万個の正常白血球（ＣＢＣから合計５．５８×１０３／ｍｍ３のＷＢＣ）と混合した接合化ＡＴＣを１２，５００個／ｍｌまで検出することができることを示している。
【０３３８】
図３７のＦパネルは、ＯＫＴ３×ハーセプチン／１００万個と接合した０．４％のＡＴＣが全血で検出されたことを示している。これらの感度の研究に基づいて、いくつかの無作為の血液サンプルを検査し、マウスＩｇＧ２ａ保持Ｔ細胞について血液の表現パターンを検査した。接合化ＡＴＣの第６回目の注入後８日目までに、患者ＭＲＵ番号５２３９０２の末梢血において、ＷＢＣゲートで最大１．５％の陽性細胞（アイソタイプのコントロールに修正）が検出された。
【０３３９】
（実施例３０）
（接合化ＡＴＣの第１回目注入後の接合化ＡＴＣの生体内生存）
存続ＩｇＧ２ａ保持細胞の検出に基づいて、接合化ＡＴＣの第１回目注入後の接合化ＡＴＣの生存を測定する動力学的研究を行った。抹消血についての表現パターンを、２．０×１０９のＯＫＴ３×９１８４（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ネクセルからの供給品）接合化ＡＴＣの注入前、注入後１０分、３０分、１時間、１０時間、そして４８時間に得た。動力学的研究は、注入後３０分でＷＢＣ全体の約１％で接合化ＡＴＣが検出されることを示した。接合化ＡＴＣは約４時間後には検出されなかったが、患者の循環系で、注入してから１０時間後から２４時間後に検出され、存続していた。
【０３４０】
（実施例３１）
（ベージュ（Ｂｅｉｇｅ）／ＳＣＩＤマウスにおける移植ヒトＴ細胞の長期生存）
続きの研究は、１１回または１２回の腫瘍への５０×１０６の接合化ＡＴＣの注入後小康状態に入ったヒトＴ細胞を移植したマウスに対して行った。脾臓および骨髄の表現パターンの検査は、５．５％のＣＤ３＋細胞を明らかにした。コントロールマウスは、検出不可能なヒトＣＤ３＋細胞を保持した。データによって、直接注射した接合化ＡＴＣが腫瘍細胞を排除し、直接注射した接合化ＡＴＣの総数（６０億個）を上回ったことを示している。生体内接合化ＡＴＣの数の増加は、接合化ＡＴＣが生体内で腫瘍と係合した後少なくとも１回以上分裂することに原因がある。尚、腫瘍の退化後はマウスにＩＬ−２を投与しなかった。
【０３４１】
（実施例３２）
（ＡＴＣの生体内輸送および腫瘍部位での蓄積）
血液の表現パターンの検査および接触可能転移性傷害の生体組織検査を行った。ＯＫＴ３×ハーセプチン（登録商標）のＯＫＴ成分を検出する抗ＩｇＧ２ａ抗体を用いる間接免疫蛍光アッセイで、生体検査された組織を用いた。臨床試験のプロトコルは、可能な場合生体組織検査を組み入れる。例えば、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常者から入手し、密度勾配遠心沈殿法（例えばフィコール／ヒパーク）を用いて単離した。標準方法を用いて特定の細胞集合を減少させるか、または濃縮した。例えば、単球／マクロファージをプラスチックに付着させることによって単離した。例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞表面マーカーに対する抗体を用いて陽性および／または陰性選択によって、例えば、特定の一次モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共に細胞をインキュベートし、次いで一次ｍＡｂと結合した二次抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いてｍＡｂと結合している細胞を単離することによって、Ｔ細胞またはＢ細胞を濃縮したり、減少させたりした。造血幹細胞由来の抹消血または骨髄を、幹細胞特異的ｍＡｂ（例えば、抗ＣＤ３４ｍＡｂ）を用いた同様の技術によって単離することができる。特定の細胞集合は、標準的な方法に従って、蛍光活性化セルソーティングによって単離できる。同業者に公知の細胞特異的表面マーカーに対するモノクローナル抗体は市販されている。
【０３４２】
（実施例３３）
（腫瘍再成長の予防）
腫瘍の成長を回避するために、１０６のＰＣ−３腫瘍細胞と、ＩＬ−２のみ、１０７の非接合化ＡＴＣおよびＩＬ−２、１０７の接合化ＡＴＣおよびＩＬ−２、または２×１０７の接合化ＡＴＣおよびＩＬ−２のいずれかとを、照射を受けたベージュ／ＳＣＩＤ雌マウス（レイフラケルトン博士からの提供品）の臀部に同時皮下注射した。１０ＩＵ／体重ｇの用量でＩＬ−２を投与した。５０ｎｇのＯＫＴ３×ハーセプチンＢｉＡｂを、ＡＴＣと接合するために使用した。一旦注射すると、マウスにさらなる処置を与えないが、２〜４日ごとに、重量および長さ×幅の腫瘍寸法について観察した。標準半楕円方程式：（長さ×幅２）／２を用いて腫瘍の体積を計算する際に、長さ×幅の腫瘍寸法を用いた。８６４ｍｍ３（１２×１２ｍｍ）の腫瘍を有する動物を安楽死させた。腫瘍成長の最初の兆候から最初の同時注射後１０５日目まで、マウスを連続的に観察した。
【０３４３】
ベージュ／ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍の確立を妨げるために、照射を受けた雌マウスおよび未照射雌マウスの臀部に１０６の腫瘍細胞を皮下注射し、６２．５ｍｍ３（５×５ｍｍ）の腫瘍を成長させた。ＩＬ−２のみ、１０７の接合化ＡＴＣおよびＩＬ−２、または５×１０７の接合化ＡＴＣおよびＩＬ−２のいずれかを、週に２回、マウスの腫瘍内に直接注射した。１０ＩＵ／体重ｇの用量のＩＬ−２を維持した。５０ｎｇのＯＫＴ３×ハーセプチンＢｉＡｂをＡＴＣと接合するために使用した。上記のウィン（または同時注射）アッセイに従い、長さ×幅の腫瘍寸法および動物重量について、２〜４日ごとにマウスを個々に観察した。８６４ｍｍ３（１２×１２ｍｍ）の腫瘍を有するマウスを安楽死させた。腫瘍が鎮静化するまでマウスを連続的に観察し、その後定期的に再発を追跡した。
【０３４４】
（統計分析）
エクセル（マイクロソフトオフィス）を用いて、特異的細胞傷害性を三重のウェルの平均値±標準偏差として計算した。エクセルを用いて、サイトカインおよびケモカインの分泌についてのＥＬＩＳＡ値を二重のウェルの平均値として計算した。生体外データの全てのグラフ表示は、シグマプロット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）（ジャンデル株式会社（Ｊａｎｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、サンラファエル、ＣＡ）を用いて作成した。
【０３４５】
全ての動物実験に対して、カプランマイヤー曲線を作成した。腫瘍成長遅延モデルをまた作成し、ノンパラメトリックなクラスカルワリス検定およびその後のダン（Ｄｕｎｎ）の多重比較検定を用いて、各グループの成長曲線の統計的差異を検査した。プリズム（Ｐｒｉｓｍ）統計プログラム（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて、全ての統計分析を行った。
【０３４６】
（フローサイトメトリー）
腫瘍再発の後に、小康状態に入った２匹の動物および２匹の未処置無腫瘍コントロールマウスの骨髄、脾臓、および末梢血のサンプルを回収した。ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ８、ヒトＣＤ１６、ヒトＣＤ４５ＲＯ、ヒトＣＤ４５ＲＡ、およびヒトＣＤ５６の発現を、ＦＡＣＳカリバーシステム（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンノゼ、ＣＡ）のフローサイトメトリーによって評価した。
【０３４７】
（結果）
（接合化活性化Ｔ細胞は、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞と結合し溶解させる）
ＯＫＴ３×ハーセプチンＢｉＡｂ接合化ＡＴＣは、非接合化ＡＴＣまたは無関係な（ＯＫＴ３×リツキサン）ＢｉＡｂ接合化ＡＴＣを上回る特異性を示し、ＰＣ−３前立腺癌細胞の高レベルの溶解を引き起した。腫瘍抗原と係合せずにＡＴＣのＣＤ３タンパク質と架橋結合する無関係なＢｉＡｂの使用は、腫瘍標的の存在下で非接合化ＡＴＣのレベルを上回る細胞傷害性を誘導しなかった。
【０３４８】
１０６のＡＴＣ当たり５〜５００ｎｇのＢｉＡｂ用量は、非接合化Ｔ細胞に観察される特異的細胞傷害性％を二倍から三倍にした（図３８）。５〜５００ｎｇのＢｉＡｂ用量は、全てのＡＴＣの細胞傷害性を再方向化するのに最適である。なぜなら、低用量のＢｉＡｂは排除レベルを減少させ、高用量のＢｉＡｂは腫瘍細胞の溶解を増加させなかったからである。ＢｉＡｂとの接合化は、活性化Ｔ細胞によるサイトカインおよびケモカインの分泌を促進させた。
【０３４９】
ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γは、抗腫瘍効果を生じることが知られているため（ＥＬＩＳＡアッセイ小冊子、他の文献）、細胞培養の上清を、１０：１のＥ／Ｔ比で３７℃の一晩のインキュベーション後に測定した。接合化ＡＴＣは、無関係な接合化Ｔ細胞または活性化Ｔ細胞と比較した場合、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γに顕著な増加を示した（図３９）。ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳケモカインは、腫瘍部位への接合化ＡＴＣの輸送を向上させる。この理由のために、ケモカイン分泌を定量するＥＬＩＳＡによって細胞培養の上清を検査した。ＰＣ−３腫瘍標的に暴露した接合化ＡＴＣにおいて、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳケモカインの分泌濃度の増加が観察された。サイトカイン分泌と同様に、無関係な接合化ＡＴＣまたはＡＴＣのみは、低濃度のケモカイン分泌を示した。
【０３５０】
（実施例３４）
（接合化活性化Ｔ細胞と前立腺癌細胞との同時注射はマウスの腫瘍を回避した）
ＰＣ−３腫瘍細胞と１０ＩＵ／ｇのＩＬ−２のみを受けたコントロールマウスは、７０日目までに腫瘍組織量のために全て犠牲となった。ＰＣ−３腫瘍標的ごとに１０のＡＴＣ（１０７の用量のＡＴＣ＋ＩＬ−２）のみを受けたマウス（ｎ＝１３）うち３匹は全く腫瘍を成長させなかったが、１／４のマウスは１０５日目までに１０８ｍｍ３（６×６ｍｍ）の低い腫瘍組織量を持ちながらまだ生存していた。ＰＣ−３標的と同時注射した最も高用量の接合化ＡＴＣ（２×１０７のＡＴＣ＋ＩＬ−２）は、グループ全体（ｎ＝７）の腫瘍成長を完全に回避するのに十分であった（ｐ＝０．００００５）。図４０のカプランマイヤー生存曲線は、同時注射後、皮下腫瘍組織を有しないマウスの割合を表す。
【０３５１】
図４１は、マウスのグループ内の腫瘍成長を遅延させる際の非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣの相対的有効性を表す。高用量の２×１０７の接合化ＡＴＣは、１０５日目までにマウス全部の腫瘍成長を完全に回避することができ、コントロールと比較すると統計学的に十分である（ｐ＜０．００１）。５０％未満の接合ＡＴＣまたは非接合化ＡＴＣ（１０７）のみがコントロールの比率を上回って腫瘍成長を遅延させた（ｐ＜０．０１）。
【０３５２】
（実施例３５）
接合化活性化Ｔ細胞を用いた確立された腫瘍の処置はマウスの腫瘍を排除する）
皮下臀部の腫瘍が６２．５ｍｍ３（５×５ｍｍ）に到達してから、直接腫瘍注射を開始した。注射計画（小康状態になるまで週に２回）全体を通して、両方の処置グループ（１０７および２×１０７のａＡＴＣ＋１０ＩＵ／ｇのＩＬ−２）およびコントロールマウス（１０ＩＵ／ｇのＩＬ−２のみ）において確立された腫瘍が成長し続けるのが観察された。全てのコントロールマウスは、腫瘍細胞注入後６週間以内に８６４ｍｍ３以上の腫瘍体積に起因して犠牲となったが、両方の処置グループで小康状態が観察された。低用量の１０７のＡＴＣを受けたマウスの腫瘍成長については、１匹のマウスの腫瘍体積が６６６ｍｍ３に達し、その後２２４ｍｍ３に縮小して４日後には消滅したことを除いて、コントロールマウスと同様の結果を与えた（図４２）。この例外的なマウスに６週間の処置のみを与え、その後さらなる処置やＩＬ−２を与えずに７週間腫瘍の小康状態を維持した。この際に、腫瘍再発が生じ、マウスは死亡した。５×１０７のＡＴＣを用いたマウスの処置は、低用量のＡＴＣまたはＩＬ−２での処置と比べて、処置後最初の６週間以内の生存率を向上させたと思われる。さらに、同様の小康状態の結果が、高用量のａＡＴＣを与えた２匹のマウスにおいて、処置の６週間後に観察された。約８６４ｍｍ３の腫瘍体積を持つ２匹のマウスについて、２〜４日以内にその腫瘍は単純に消滅し、さらなる処置またはＩＬ−２を施さずに１２週間腫瘍の小康状態は維持された。これら２匹のマウスは１２週間後に再発し、生存曲線は統計学的に有意ではなかったが（ｐ＝０．１９５）、動物は、フローサイトメトリーによる移植分析のために犠牲となった。
【０３５３】
腫瘍成長遅延分析は、データが統計学的に有意ではなかったが（Ｐ＝０．０６３６）、コントロールと比較して高用量の接合化ＡＴＣのみが効果的であることを明らかにした。
【０３５４】
（実施例３６）
（長期ヒトＴ細胞移植は、腫瘍小康状態によって示される）
腫瘍の注射を受けなかったか、あるいはＡＴＣ処置またはＩＬ−２を受けた、２匹のベージュ／ＡＣＩＤ雌マウスを、処置ベージュ／ＡＣＩＤ雌マウスのヒトＴ細胞再発を評価するためのネガティブコントロールとして使用した。両方のコントロールマウスの骨髄、脾臓、および抹消血において、検出不可能（１％未満）のヒトリンパ球が観察された。
【０３５５】
第一処置マウス（５×１０７のＡＴＣ）のフローサイトメトリーは、骨髄に約３％のＣＤ４５ＲＡ＋ヒト細胞および１％のＣＤ４５ＲＯ＋ヒト細胞、抹消血に約５％のＣＤおよびおそらく５％のＣＤ３＋集合、ＣＤ４５ＲＡ集合およびＲＯ＋集合、脾臓に検出不可能なヒト細胞を明らかにした。第二処置マウス（同じ用量）からの結果は、骨髄に約２．５％のＣＤ４＋、２％のＣＤ８＋、および最大２．５％のＣＤ４５ＲＡ集合およびＲＯ＋集合、脾臓にそれぞれ約４％のＣＤ４５ＲＡおよびＲＯ＋、最大３％のＣＤ８＋、および５．５％のＣＤ３＋集合、抹消血に検出不可能なヒト細胞を明らかにした。
【０３５６】
（実施例３７）
（生存および輸送を測定するための接合化ＡＴＣの表現パターンの検査）
注入後の接合化ＡＴＣの動力学を測定するために、第一回目の注入前、３０分後、１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後（丁度２回目の注入前）に、血液の表現パターンについて検査した。観察された動力学に基づいて、複数回の注入の間の接合化ＡＴＣの崩壊定数および蓄積を定義するために、さらなる研究を行った。第一回目の注入について、注入直前および注入の１時間後にサンプルを検査した。ＡＴＣの表面上のＯＫＴ３単量体またはＯＫＴ３二量体または多量体を検出するために、ＰＥ共役ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ２ａを使用した。１１１インジウム標識輸送研究と組み合わせてこれらの研究を行った。
【０３５７】
（臨床的相関性（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ）／分析）
様々な時点での接合化ＡＴＣの注入前および注入後におけるヒトからの新鮮な未刺激ＰＢＭＣのＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴＳの数を比較した。先駆体の周波数の差異を検索するために、各時点のＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴＳの数と、ＥＬＩＳＰＯＴＳの事前処置数とを比較した。使用した検査は、１）ＨＲＰＣを有する患者のベースラインＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳ応答が同じ年齢の健常者と異なるかどうか、２）ＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴＳ応答の誘導が、同じ人において接合化ＡＴＣの注入前と注入後とで異なるかどうか、そしてどのくらい長くその応答が上昇したままであるのか、３）応答はＨＥＲ２受容体に特異的であるか、それとも非特異的であるか、４）臨床応答の結果としてＨＥＲ２受容体の循環量が減少するのかどうか、５）免疫学的アッセイまたは血清アッセイのそれぞれを実験データーベースと照合し、生体内／生体外相互関係を検索するために該アッセイは臨床応答データーベースと相互関係を示すのかどうか、を測定する。
【０３５８】
（実施例３８）
（接合化ＡＴＣ処置を受けた後の各所定の時点とベースラインとの間の免疫学的変化の比較）
増殖、ＥＬＩＳＰＯＴＳ、または各時点での接合化ＡＴＣ処置後とベースラインとの間に産生されたサイトカインの量について、約０．５３の標準偏差の差異を検出するために、合計２８人の患者を使用した。合計２８人の患者は、この集合の真の変化が１０％である場合±１１％以内で、特定の表現型の比率変化（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅ）の推定において両側９５％の信頼区間を与えた。増殖、ＥＬＩＳＰＯＴＳ、および産生されたサイトカインの量について、ベースラインと接合化ＡＴＣ処置の後との間の差異を比較するために、対応のあるｔ検定またはウイルコクソンの符号付き検定を使用し、変化が有意となる時点を同定した。これらの免疫応答への時間の影響を調査するために、反復測定データのための混合モデルを用いて、異なる時点（ベースラインを含む）からのデータを分析した。
【０３５９】
様々な時点での接合化ＡＴＣの注入前および注入後におけるヒトからの新鮮な未刺激ＰＢＭＣのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳの数を比較し、先駆体の周波数の差異を検索するために、接合化ＡＴＣによる腫瘍の生体内溶解は、生体外で腫瘍に暴露されるとＰＣ−３に応答（回収応答）するメモリー細胞を誘導するかどうかを検査した。これらの比較に、対応のあるｔ検定またはウイルコクソンの符号付き検定を使用した。同様に、免疫療法の前および後に抗ＣＤ３刺激細胞を比較した。ＨＥＲ２＋細胞系およびＨＥＲ２−細胞系での刺激の後に、さらなる比較を行った。これらの刺激による結果を、コントロールとしての同じ年齢の人によるＰＢＭＣの応答に標準化した。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳの数について、平均値、中央値、標準偏差を計算した。そして、刺激無しのＨＲＰＣの患者のベースラインでＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳの数が同じ年齢の健常者と異なるかどうかを調査するために、スチューデントｔ検定を行った。免疫療法前と後のＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳの誘導における平均値の変化を、時間に対してプロットし、どのくらい長くその応答が上昇したままであるのかを検査した。この研究集合において、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳの誘導への時間の影響を調査するために、反復測定データのための混合モデルを用いた。ＨＥＲ２受容体の循環量への時間の影響を検査するために、反復測定データのための混合モデルを使用した。臨床応答（完全応答／部分応答）および無進生存率の推定装置として、生体内または生体外の免疫学的アッセイまたは血清アッセイ（例えばＨＡＭＡ）それぞれを評価するために、ロジスティック回帰モデルおよびコックス比例危険回帰モデルをそれぞれ使用した。
【０３６０】
（実施例３９）
（抗ＣＤ３活性化ポリクローナルＴ細胞の複数回の暴露は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的Ｔ細胞クローンの成長を誘導する）
図４４に示したデータは、ＡＴＣ（ＳＫ−ＢＲ−３へ３回暴露した非接合化Ｔ細胞）、ヒトＥＢＶ誘導Ｂ細胞系へ暴露した非接合化ＡＴＣ（Ｂ細胞はＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現しない；最終回のみ）、およびａＡＴＣ（ＳＫ−ＢＲ−３へ３回暴露し、第４回目にこのアッセイに暴露した接合化ＡＴＣ）からのＩＦＮγＦＬＩＳＰＯＴＳの数を示す。接合化後２０日目にこのアッセイを行った。５０ｎｇ／１００万個での最初の接合化から、さらなる接合化を行わなかった。明らかに、接合化ＡＴＣの部分集合は、ＨＥＳＲ２／ｎｅｕの初回刺激を受け、ＳＫ−ＢＲ−３細胞のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に再び対抗するために激しく応答し得る記憶細胞となる。明らかに、部分集合の接合化ＡＴＣは、ＨＥＳＲ２／ｎｅｕの初回刺激を受け、ＳＫ−ＢＲ−３細胞のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に再び対抗するために激しく応答する能力によって測定されるように、記憶細胞となる。さらに、結果は、抗ＣＤ３活性化ポリクローナルＴ細胞集合の複数回にわたる暴露が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的Ｔ細胞クローンの成長を選択または誘導することを示唆している。
【０３６１】
これは、特定の腫瘍抗原および、まだ未定義および未知の腫瘍の抗原に方向性を持った抗原特異性クローンを作成する新規の方法である。このタイプの免疫化の利点の１つは、真の定義のない独自の抗原を持つ患者に免疫性を与えることである。これは、生体内モデルおよび生体外モデルで起こる。
【０３６２】
新しい概念：培養システムには樹状細胞が存在しないため、活性化Ｔ細胞は、活性化の際にクラスＩＩを上方制御して専門の抗原提示細胞のように振る舞い、再活性化工程によって産生されたサイトカインおよびケモカインの存在下で架橋腫瘍抗原と共に作用して抗原特異性ＣＴＬを誘導する、という可能性が非常に高い。クラスＩＩ上方制御は、抗原特異性ＣＴＬを誘導するために必要な信号を提供するために混合したポリクローナルのＣＤ４ヘルパー細胞による必要な助力を提供する。次の実験では、樹状細胞および精製された活性化Ｔ細胞部分集合を使用して、この疑問に取り組んだ。
【０３６３】
詳細な実施形態を基に本発明を説明してきたが、本発明の真の精神と範囲から逸脱せずに様々な変更が加えられ、等価物で置換されることが当業者に理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスの工程を本発明の目的、精神および範囲に適合させるために、多くの修正が加えられる。このような修正の全ては、本明細書中に添付の特許請求の範囲内であることを意図する。
【０３６４】
次の文献はその全体が本明細書に援用されている。
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【図面の簡単な説明】
【０３６５】
【図１】抗腫瘍関連抗原ＭＡｂ（抗ＴＡＡ）（９１８４）とＯＫＴ３とをヘテロ共役させる工程を示す図である。
【図２】２〜１５％の勾配を用いた非還元ＳＤＳゲル電気泳動によるヘテロ共役生成物の分析を示す。
【図３】一晩の培養を示しており、ＭＣＦ−７細胞またはＰＣ−３細胞を用いたＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣのロゼッティングを表示する。
【図４】Ａ〜Ｅは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞およびＭＣＦ−７細胞とのＩｇＧＩ（Ｈｅｒ２Ｂｉの９１８４部分）の結合を示すヒストグラムを示す。
【図５】正常な被験体からの接合化ＡＴＣ、新鮮なＰＢＭＣまたはＡＴＣによる、ＭＣＦ−７に方向性を持つ特異的細胞傷害性の発達を示すグラフである。
【図６】５〜２５のＥ／Ｔにおける、非接合化ＡＣＴ、ならびに０．５ｎｇ、５．０ｎｇおよび５０．０ｎｇのＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣについて組成物の滴定曲線を示す。各曲線は、ＭＣＦ−７標的に関する３つの実験の特異的細胞傷害性％の補間平均値（±ＳＥＭ）を表す。
【図７】Ｔ細胞の部分集合を特異的細胞傷害性について測定するための、濃縮されたＴ細胞の部分集合の細胞傷害性活性を例証する細胞傷害性アッセイの結果を示す。
【図８】どのくらい長くＡＴＣは接合したままであり、腫瘍細胞を排除し続けるのかを示す棒グラフである。
【図９】ＣＥＡと結合し、該ＣＥＡを標的化させる役割を果たす画分の細胞傷害性アッセイの結果を示す。セファクリル３００カラムを用いて、二量体および多量体を含む画分を単量体の画分から単離し、全てのタンパク質濃度を同一に調整した後、ＬＳ１７４Ｔに方向性を持った特異的細胞傷害性％についてそれぞれの画分を試験した。
【図１０】ＡＴＣ１０６当たり５０ｎｇのＯＫＴ３×９１８４と接合した１０個の正常被験体からのデータを要約したグラフである。
【図１１】生体内ＡＴＣ媒介細胞傷害性を示すグラフである。各パネルに示された培養の日に制御速度凍結を用いて凍結保存した癌患者からのＡＴＣを、解凍して、Ｈｅｒ２Ｂｉと接合した。そして、ＭＣＦ−７に方向性を持つ細胞傷害性についてＡＴＣを検査した。
【図１２】ＳＫ−ＢＲ−３腫瘍細胞とのＡＴＣの結合によって誘導されたサイトカイン分泌を例証する棒グラフを示す。
【図１３】様々な腫瘍ＨＥＲ２＋腫瘍標的に対抗したＨｅｒ２Ｂｉと接合したＡＴＣまたはＣＯＡＣＴＳによって媒介された生体内細胞傷害性を例証するグラフを示す。
【図１４】接合化ＡＴＣにおいてＯＫＴ３×９１８４との接合化用量の増加はＰＣ−３に方向性を持つ特異的細胞傷害性％を増大させることを示すグラフである。
【図１５】ＰＣ−３細胞、ＭＣＦ−７細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞と結合したＨｅｒ２ＢｉＡｂから得られたフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１６】図１のスキームに基づくＯＫＴ３×Ｈｅｒｃの化学的共役の結果を示すゲルである。２〜１５％勾配ゲルを用いた非還元ＳＤＳゲル電気泳動によって、ＢＣＡタンパク質を定量および分析し、ゲル中のタンパク質を可視化するためにクーマシーブルー染色を用いる。
【図１７】２つの正常被験体からのＡＴＣにおける、ＳＫ−ＢＲ−３標的を溶解させる能力を示すグラフである。
【図１８】ＯＫＴ３×９１８４とＯＫＴ３×Ｈｅｒｃとの比較的な接合化用量を示すグラフである。
【図１９】標的細胞との培養後２４時間の接合化ＡＴＣによるインターフェロンγ分泌を示す棒グラフである。
【図２０】ＰＣ−３標的を用いた、Ｈｅｒ２ＢｉまたはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ接合化正常ＡＴＣの細胞溶解受容能力を示すグラフである。
【図２１】接合化Ｔ細胞が冷凍／解凍後もＰＣ−３に対する細胞傷害性を維持していることを示すグラフである。
【図２２】ＰＣ−３細胞との結合によってＯＫＴ３×９１８４と接合した正常ＡＴＣによって作成されたＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳを示す棒グラフである。図２２は、接合化ＡＴＣ１００万個当たりの斑点数としてのデータを要約したものである。
【図２３】ＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合したＡＴＣによって媒介された細胞傷害性が、溶解性ハーセプチン（登録商標）によって阻害されないことを例証するグラフである。
【図２４】古いロットおよび新しいロットのＯＫＴ３×９１８４と接合したＡＴＣが少なくとも１１ヶ月間安定していることを示すグラフである。
【図２５】接合化ＡＴＣ（２０×１０６）とＣＥＡ＋ＬＳ１７４（１×１０６）クローン癌細胞系との皮下同時注射（ウィンアッセイ）が、接合化ＡＴＣを受けたマウスの４０％において腫瘍の進行および死亡を妨げ、一方、ＡＴＣのみを受けたマウスのうち１０％しか１００日より長く生存しなかったことを例証しているグラフである。
【図２６】ＰＣ−３と結合することによって誘導されたＨｅｒ２ＢｉまたはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃと接合した正常ＡＴＣよるサイトカイン分泌を例証している棒グラフである。
【図２７】何サイクルもの化学療法を受けた患者からの接合化Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を例証している棒グラフである。
【図２８】特異的細胞傷害性に必要とされる接合化用量の臨床的結果を例証しているグラフである。健常者（ＮＬ）のデータを示している。
【図２９】特異的細胞傷害性に必要とされる接合化用量の臨床的結果を例証しているグラフである。患者（ＰＴ）のデータを示している。
【図３０】細胞標本化が、Ｈｅｒ２＋ＭＣＦ−７標的に方向性を持つＡＴＣ特異的細胞傷害性にほとんど影響を与えないことを示すグラフである。
【図３１】Ｈｅｒ２Ｂｉ（ＯＫＴ３×９１８４またはＯＫＴ３×Ｈｅｒｃ）と抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８同時活性化Ｔ細胞（ＣＯＡＣＴＳ）との接合によるＴ細胞の細胞傷害性能力を例証するグラフである。
【図３２】ＯＫＴ３×９１８４と接合した癌患者のＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣを用いた臨床的データを例証するグラフである。ＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣは、ＭＣＦ−７標的に対抗する同等の特異的細胞傷害性活性を有する。パネルＰ１、Ｐ２およびＰ３は、非接合化および接合化のＣＯＡＣＴＳおよびＡＴＣにおける特異的細胞傷害性を媒介する能力を示す。
【図３３】３．１３〜２５．００の比率を標的とするエフェクターにおける、１つの正常被験体および前立腺癌を有する２人の患者についての特異的細胞傷害性を示すグラフである。
【図３４】接合化ＡＴＣがＭＩＡ標的（膵臓細胞系）を排除することができたことを示すグラフである。
【図３５】時間０で検査した接合化Ｔ細胞の分割量および非接合化Ｔ細胞の分割量によって媒介された一次細胞傷害性アッセイを示すグラフである。第一組の標的とのインキュベーションから４８時間後に、非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣを回収し、４５時間後の二次培養および二次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第二組の標的に再び塗布した。４８時間後〜９６時間後に、再び塗布した非接合化（ＡＴＣ）または接合化ＡＴＣ（ａＡＴＣ）をＳＫ−ＢＲ−３と共に同時培養した後、非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣを回収し、９６時間後の三次培養および三次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第三組の標的上に再び塗布した。最後に、９６時間後〜２１５時間後に、非接合化および接合化ＡＴＣをＳＫ−ＢＲ−３と共に同時培養し、２１５時間後の四次細胞傷害性アッセイにおいてそれぞれの分割量を第四組の標的上に再び塗布した。
【図３６】非接合化、またはＯＫＴ３×ハーセプチン、ＯＫＴ３×リツキサンと接合したＣＤ４部分集合またはＣＤ８部分集合の多数のＣＦＤＡ−ＳＥ＋細胞を示すフローサイトメトリーアッセイの結果である。ＣＤ４＋集合は、分裂して低減した強度を示した非常に明確な細胞組成物によって細胞分裂の証拠を示したが、ＯＫＴ３×リツキサンと接合したＣＤ４＋細胞および非接合化ＡＴＣは、あまり多くの分裂細胞を示さず、半分の染色強度を示した。
【図３７】ＩｇＧ２ａ保持接合化ＡＴＣを検出することによって患者内での生存または輸送を表すフローサイトメトリーのデータのグラフである。
【図３８】ＰＣ−３腫瘍標的に対する特異的細胞傷害性％が、ＢｉＡｂと活性化Ｔ細胞との接合を通して上昇することを示すグラフである。６：２５、１２：５、および２５．１の３つのＥ／Ｔ比で細胞傷害性を測定した。平均値の標準偏差（ＳＥＭ）のパーセントを、各Ｅ／Ｔ比の偏差棒で表現した。非接合化のＡＴＣ（黒丸）は、最も大きいＥ／Ｔにおいて全ての腫瘍標的の半分以下を排除し、５ｎｇ（□）、５０ｎｇ（黒三角）、および５００ｎｇ（黒四角）と接合したＡＴＣは、２５：１のＥ／Ｔ比において、ほぼ１００％の腫瘍細胞を溶解させた。
【図３９】非接合化ＡＴＣ（）、接合化ＡＴＣ（黒四角）、および無関係のＢｉＡｂ付きＡＴＣの比較を示すグラフであり、接合化ＡＴＣが、コントロールを上回るサイトカインおよびケモカインの分泌濃度の増加を示すことを明らかにしている。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの非接合化ＡＴＣサイトカイン分泌は、このチャートにおいて非常に小さい。Ｔ細胞およびＰＣ−３標的を１０：１のＥ／Ｔ比でプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。
【図４０】カプランマイヤープロットであり（オレンジ線）、腫瘍がないための生存率が、最も高用量（２×１０７）の接合化ＡＴＣを与えたマウス内で最も高いことを示している。次いで少ない用量（１０７）の接合化ＡＴＣ（黒三角）を受けたマウス、続いて同じ用量（１０７）の非接合化ＡＴＣ（黒四角）を受けたマウスにおいて、生存率がコントロール（○）を越えて向上した。
【図４１】腫瘍成長遅延曲線を示すグラフであり、ＰＣ−３腫瘍を予防する非接合化ＡＴＣおよび接合化ＡＴＣの効果を表している。最も高用量の接合化ＡＴＣ（２×１０７）は、１０５日目まで腫瘍成長の遅延に非常に効果的であったが、１０７の接合化ＡＴＣでの処置は、腫瘍成長を阻止しないが遅延することはできた（△）。１０７の非接合化ＡＴＣ（◆）は、腫瘍成長の遅延において等しい用量の接合化ＡＴＣほど効果的ではないが、コントロール（黒四角）を越えて腫瘍の成長を遅延することができた。
【図４２】腫瘍成長遅延を示すグラフである。最も高用量（５×１０７）の接合化ＡＴＣ＋ＩＬ−２（黒三角）は、ＩＬ−２コントロール群（黒四角）と比較して、９０日目まで腫瘍成長を遅延させた（ｐ＝０．０６３６）。低用量の１０７のａＡＴＣ（△）は、コントロールマウスと比較して、腫瘍成長を遅延させるのに効果的ではない。
【図４３】カプランマイヤープロットであり、十分な数の接合化ＡＴＣが確立された腫瘍を有するマウスに長期間の緩和を引き起こすことを示す。５×１０７の接合化ＡＴＣ＋ＩＬ−２を週に二回与えたマウス５匹のうち２匹（４０％）において、６週間の処置後腫瘍は消えた（△）。１０７の接合化ＡＴＣ＋ＩＬ−２による６週間の処置後、６匹のマウスのうち１匹（１７％）において腫瘍が消滅した（□）。また、全てのコントロールマウス（ＩＬ−２のみを与えた）は、腫瘍標的の第一次注射から６週間以内に腫瘍組織量のために犠牲となった（○）。確立された腫瘍が直径５×５ｍｍに達してから、接合化ＡＴＣ＋ＩＬ−２またはＩＬ−２のみを用いた処置を開始した。
【図４３】ＡＴＣ（ＳＫ−ＢＲ−３に３回暴露した非接合化活性化Ｔ細胞）、ヒトＥＢＶ誘導Ｂ細胞系に暴露した非接合化ＡＴＣ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を発現しないＢ細胞系；最終回のみ）、およびａＡＴＣ（３回ＳＫ−ＢＲ−３に暴露し、４回目にこのアッセイに暴露した接合化ＡＴＣ）からのＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴＳの数を示す棒グラフである。接合化後２０日目にアッセイを行った。Ｔ細胞１００万個当たり約５０ｎｇの抗体での最初の接合化から、さらなる接合化を行わなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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