(57)【要約】本発明は、三次元顕微鏡検査法により、試料、特に厚い生物学的試料およびこの試料が放射する蛍光のフィールドを入手するための方法に関する。本発明は、一方ではデジタル・ホログラフィにより入手した干渉計信号、他方では、前記試料からの蛍光信号を順次別々に測定し、記録する測定および記録ステップと、デジタル・ホログラフィにより入手した前記干渉計信号、およびこのように記録した前記蛍光信号を、所与の時間の試料自体のおよび前記試料が放射した蛍光フィールドの鮮明な三次元画像を再構成するために結合する処理ステップとを含むことを特徴とする。
2004538451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡検査法により、試料、特に厚い生物学的試料の三次元画像、およびこの試料から放射された蛍光フィールドの三次元画像を得るための方法であって、
一方でデジタル・ホログラフィによって得た干渉信号と、他方で前記試料から放射される蛍光信号とを順次別々に測定かつ記録する測定・記録ステップと、
所与の瞬間における試料自体と前記試料から放射された蛍光フィールドとを鮮明な三次元画像として再構成するために、デジタル・ホログラフィによって得た前記干渉信号と記録した前記蛍光信号とを結合する処理ステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試料と前記試料の蛍光フィールドとにおける三次元画像の変化を監視するために、前記測定・記録ステップと前記処理ステップとを時間の経過中に反復して行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検査中の前記試料自体と前記試料の蛍光フィールドとの鮮明な三次元画像を再構成するために、デジタル・ホログラフィによって得た干渉信号と前記蛍光信号との前記結合を数値解析によって行うことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光励起光源と結合されたデジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の前記方法を実行するための計器。
【請求項５】
前記蛍光励起光源が反射モードまたは透過モードで動作することを特徴とする請求項４に記載の計器。
【請求項６】
デジタル・ホログラフィで動作する前記顕微鏡が、部分的にコヒーレントまたは選択的にコヒーレントであって透過的に作用する光源光ビームを発生することが可能な光源を含むことを特徴とする請求項４または５に記載の計器。
【請求項７】
前記顕微鏡の部分的にコヒーレント光源が、下記の素子、すなわち、狭いスペクトル幅の光を放射する光源（Ｓ）と、第１のレンズ（Ｌ１）と、第１のアパーチャ（Ａ１）と、第２のレンズ（Ｌ２）と、第２のアパーチャ（Ａ２）と、第３のレンズ（Ｌ３）とを含み、
前記光放射源から放射される光が前記第１のレンズ（Ｌ１）、前記第１のアパーチャ（Ａ１）、前記第２のレンズ（Ｌ２）、前記第２のアパーチャ（Ａ２）および前記第３のレンズ（Ｌ３）の順に一連に通過するように、前記光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置がなされ、前記第３のレンズから出た光が、視準された光（平行光線束）であることを特徴とする請求項４または５に記載の計器。
【請求項８】
前記顕微鏡の部分的にコヒーレント光源が、下記の素子、すなわち、狭いスペクトル幅の光を放射する光源（Ｓ）と、光ファイバと、第１のレンズ（Ｌ１）と、第２のレンズ（Ｌ２）と、第３のレンズ（Ｌ３）と、調整可能なアパーチャ（Ａ１）とを含み、
前記アパーチャ（Ａ１）において視準された光（平行光線束）を得るために、前記光放射源から放射される光が均一な光視域を有する前記光ファイバを最初に通過し、次に前記第１のレンズ（Ｌ１）を通過し、次に前記第２のレンズ（Ｌ２）および前記第３のレンズ（Ｌ３）を通過するように、前記光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置がなされていることを特徴とする請求項６に記載の計器。
【請求項９】
前記顕微鏡の部分的にコヒーレント光源が、下記の素子、すなわち、レーザ源（Ｓ）と、第１のレンズ（Ｌ１）と、回転拡散装置（Ｄ）と、第２のレンズ（Ｌ２）と、アパーチャ（Ａ）とを含み、
前記レーザ源から放射されるレーザ・ビームが最初に前記第１のレンズ（Ｌ１）を通過し、次に前記第１のレンズ（Ｌ１）の焦点の後に設置された前記回転拡散装置（Ｄ）を通過し、次に前記回転拡散装置（Ｄ）の面に対してその焦点距離のところに設置された前記第２のレンズ（Ｌ２）を通過し、次に前記アパーチャ（Ａ）を通過するように、前記光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置がなされていることを特徴とする請求項６に記載の計器。
【請求項１０】
前記顕微鏡の部分的にコヒーレント光源が、下記の素子、すなわち、レーザ源（Ｓ）と、第１のレンズ（Ｌ１）と、すりガラス板のような回転拡散装置（Ｄ）と、第２のレンズ（Ｌ２）とを含み、
前記レーザ源から放射される前記レーザ・ビームが最初に前記第１のレンズ（Ｌ１）を通過し、次に前記回転拡散装置（Ｄ）を通過し、次に前記第２のレンズ（Ｌ２）を通過するように、前記光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置がなされ、
前記第１のレンズ（Ｌ１）から出た前記レーザ・ビームが、前記回転拡散装置（Ｄ）から調整可能な距離（ｄ）であって前記拡散装置の上流に位置する焦点ポイントにおいて焦点を結ぶことを特徴とする請求項６に記載の計器。
【請求項１１】
デジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡が、
前記光源光ビームから２つの平行なビーム、すなわち、物体ビーム（Ｏ）および参照ビーム（Ｒ）を形成するためのビーム・スプリッタ（ＢＳ１）およびミラー（Ｍ１）を有する可動の第１サブ組立体（ＳＥ１）と、
前記光源光ビームを前記第１サブ組立体（ＳＥ１）の上方の前記ビーム・スプリッタ（ＢＳ１）に指向させるための、ミラーであることが好ましい手段（Ｍ）と、
前記物体ビーム（Ｏ）と前記参照ビーム（Ｒ）とを再結合した光ビームとして結合するためのビーム・スプリッタ（ＢＳ２）およびミラー（Ｍ２）を有する固定または可動の第２サブ組立体（ＳＥ２）と、
検査対象の試料を備え、前記第１サブ組立体（ＳＥ１）と前記第２サブ組立体（ＳＥ２）との間の前記物体ビーム（Ｏ）の光学通路に配置された対物セル（Ｓｏ）と、
前記対物セル（Ｓｏ）の下流に位置し、前記第１サブ組立体（ＳＥ１）と前記第２サブ組立体（ＳＥ２）との間の前記物体ビーム（Ｏ）の光学通路に配置された第１顕微鏡対物レンズ（ＭＬ１）と、
前記第１サブ組立体（ＳＥ１）と前記第２サブ組立体（ＳＥ２）との間の前記参照ビーム（Ｒ）の光学通路に配置された光学通路補正手段と、
前記光学通路補正手段の下流に位置し、前記第１サブ組立体（ＳＥ１）と前記第２サブ組立体（ＳＥ２）との間の前記参照ビーム（Ｒ）の光学通路に配置された第２顕微鏡対物レンズ（ＭＬ２）と、
前記対物セル（Ｓｏ）上に前記物体ビーム（Ｏ）の焦点を結ばせることが可能な第１焦点調整手段（Ｌ４）と、
前記光学通路補正手段上に前記参照ビーム（Ｒ）の焦点を結ばせることが可能な第２焦点調整手段（Ｌ５）と、
を含む請求項４〜１０のいずれか１項に記載の計器。
【請求項１２】
前記光学通路補正手段が、前記対物セル（Ｓｏ）に類似しているが、検査対象の前記試料を含んでいない参照セル（Ｓｒ）を備えることを特徴とする請求項１１に記載の計器。
【請求項１３】
前記光学通路補正手段が、適当な厚さおよび適当な組成の透明な材料を備えることを特徴とする請求項１１に記載の計器。
【請求項１４】
前記計器が、前記干渉信号および前記蛍光信号を記録かつ処理するために、コンピュータ処理および画像分析手段に接続されたＣＣＤカメラのような記録・処理手段を含み、前記再結合した光ビームの焦点を前記記録手段（Ｃ）上に結ばせるための追加の焦点調整手段（Ｌ６）を含むことを特徴とする請求項４〜１３のいずれか１項に記載の計器。
【請求項１５】
デジタル・ホログラフィで動作可能な顕微鏡であって、
光源光ビームを発生することが可能な部分的にコヒーレント光源と、
前記光源光ビームから２つの平行なビーム、すなわち、物体ビーム（Ｏ）と参照ビーム（Ｒ）とを形成するためのビーム・スプリッタ（ＢＳ１）およびミラー（Ｍ１）を有する可動の第１サブ組立体と（ＳＥ１）と、
前記光源光ビームを前記第１サブ組立体（ＳＥ１）の上方の前記ビーム・スプリッタ（ＢＳ１）に指向させるための、ミラーであることが好ましい手段（Ｍ）と、
前記物体ビーム（Ｏ）と前記参照ビーム（Ｒ）とを再結合した光ビームとして結合するためのビーム・スプリッタ（ＢＳ２）およびミラー（Ｍ２）を有する固定または可動の第２サブ組立体（ＳＥ２）と、
検査対象の試料を備え、前記第１サブ組立体（ＳＥ１）と前記第２サブ組立体（ＳＥ２）との間の前記物体ビーム（Ｏ）の光学通路に配置された対物セル（Ｓｏ）と、
前記対物セル（Ｓｏ）の下流に位置し、前記第１サブ組立体（ＳＥ１）と前記第２サブ組立体（ＳＥ２）との間の前記物体ビーム（Ｏ）の光学通路に配置された第１顕微鏡対物レンズ（ＭＬ１）と、
前記第１サブ組立体（ＳＥ１）と前記第２サブ組立体（ＳＥ２）との間の前記参照ビーム（Ｒ）の前記光学通路に配置された光学通路補正手段と、
前記光学通路補正手段の下流に位置し、第１サブ組立体（ＳＥ１）と第２サブ組立体（ＳＥ２）との間の前記参照ビーム（Ｒ）の前記光学通路に配置された第２顕微鏡対物レンズ（ＭＬ２）と、
前記対物セル（Ｓｏ）上に前記物体ビーム（Ｏ）の焦点を結ばせることが可能な第１焦点調整手段と（Ｌ４）と、
前記光学通路補正手段上に前記参照ビーム（Ｒ）の焦点を結ばせることが可能な第２焦点調整手段（Ｌ５）と、
を含むことを特徴とする顕微鏡。
【請求項１６】
前記部分的にコヒーレント光源が、下記の素子、すなわち、狭いスペクトル幅の光を放射する光源（Ｓ）と、第１のレンズ（Ｌ１）と、第１のアパーチャ（Ａ１）と、第２のレンズ（Ｌ２）と、第２のアパーチャ（Ａ２）と、第３のレンズ（Ｌ３）とを含み、
前記光放射源から放射される光が前記第１のレンズ（Ｌ１）、前記第１のアパーチャ（Ａ１）、前記第２のレンズ（Ｌ２）、前記第２のアパーチャ（Ａ２）および前記第３のレンズ（Ｌ３）の順に一連に通過するように、前記光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置がなされ、前記第３のレンズから出た光が、視準された光（平行光線束）であることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
【請求項１７】
部分的にコヒーレント光源が、下記の素子、すなわち、狭いスペクトル幅の光を放射する光源（Ｓ）と、光ファイバと、第１のレンズ（Ｌ１）と、第２のレンズ（Ｌ２）と、第３のレンズ（Ｌ３）と、調整可能なアパーチャ（Ａ１）とを含み、
前記アパーチャ（Ａ１）において視準された光（平行光線束）を得るために、前記光放射源から放射される光が均一な光視域を有する前記光ファイバを最初に通過し、次に前記第１のレンズ（Ｌ１）を通過し、次に前記第２のレンズ（Ｌ２）および前記第３のレンズ（Ｌ３）を通過すように、前記光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置がなされていることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
【請求項１８】
前記顕微鏡の部分的にコヒーレント光源が、下記の素子、すなわち、レーザ源（Ｓ）と、第１のレンズ（Ｌ１）と、回転拡散装置（Ｄ）と、第２のレンズ（Ｌ２）と、アパーチャ（Ａ）とを含み、
前記レーザ源から放射されるレーザ・ビームが最初に前記第１のレンズ（Ｌ１）を通過し、次に前記第１レンズ（Ｌ１）の焦点の後に設置された前記回転拡散装置（Ｄ）を通過し、次に前記回転拡散装置（Ｄ）の面に対してその焦点距離のところに設置された前記第２のレンズ（Ｌ２）を通過し、次に前記アパーチャ（Ａ）を通過するように、前記光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置がなされていることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
【請求項１９】
部分的にコヒーレント光源が、下記の素子、すなわち、レーザ源（Ｓ）と、第１のレンズ（Ｌ１）と、すりガラス板のような回転拡散装置（Ｄ）と、前記第２のレンズ（Ｌ２）とを含み、
前記レーザ源から放射される前記レーザ・ビームが最初に第１のレンズ（Ｌ１）を通過し、次に前記回転拡散装置（Ｄ）を通過し、次に前記第２のレンズ（Ｌ２）を通過するように、前記光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置がなされ、
前記第１のレンズ（Ｌ１）から出たレーザ・ビームが、前記回転拡散装置（Ｄ）から調整可能な距離（ｄ）であって前記拡散装置の上流に位置する焦点ポイントにおいて焦点を結ぶことを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
【請求項２０】
前記光学通路補正手段が、前記対物セル（Ｓｏ）に類似しているが、検査対象の前記試料または適当な厚さおよび適当な組成の透明な材料を含んでいない参照セル（Ｓｒ）を備えることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡検査法によって試料の三次元画像を得るための方法および計器と、三次元でこの試料から放射された蛍光フィールドを得るための方法および計器とに関する。前記試料は、蛍光発光する試料、または、１つまたはそれ以上の蛍光色素により予め標識付けされている試料とのいずれかである。
【０００２】
特に、前記方法および前記計器の態様の１つは、時間経過中におけるその動的挙動およびその変化を観察するには厚すぎる場合がある生物学的試料から放射された蛍光の三次元画像の取得に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来の蛍光顕微鏡検査法は、生物学の分野において実質的な進歩を遂げてきた。特に、免疫蛍光検査の技術により、組織内の分子やそれらの位置に特定の標識を付けることができるようになった。さらに、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）の発見により、生体細胞内の蛋白質の位置を決定する研究や前記蛋白質のダイナミクスおよび相互作用を決定する研究は革命的な進歩を遂げた。
【０００４】
しかし、従来の蛍光顕微鏡検査法に関する問題の中の１つとしては、鮮明な面の外側に位置する元素から放射された蛍光についての問題である。この寄生的な光はかなりの背景ノイズを生じるので、画像を鮮明に捕らえることができない。胎児のような厚い生物学的試料を観察する場合には、画像の解釈が非常に難しくなる。
【０００５】
共焦点顕微鏡検査法は、試料を走査する非常に小さい領域上の試料の蛍光を励起することにより、また小さなアパーチャ手段によって照明された領域の外側において放射される蛍光を遮断することにより、この問題を克服することができる。
【０００６】
しかし、共焦点顕微鏡検査法も、それ自体の欠点を持っている。
【０００７】
共焦点顕微鏡検査法の欠点の１つとして、この技術はオプトメカニカル・デバイスによって試料を完全に走査しなければならないことである。この操作は、表示するための画像を得る前に、容積分析のための比較的長い時間（通常、数秒程度）を必要とする。
【０００８】
さらに、共焦点顕微鏡検査法で使用する励起光源は、一般に、生物学的試料に損傷を与える恐れがあるアルゴン・レーザまたはアルゴン−クリプトン・レーザである。
【０００９】
他の１つの欠点は、上記励起光源を使用した場合、蛍光発光内で観察するために必要な全波長を容易にカバーできないことである。
【００１０】
最後に、共焦点顕微鏡検査法は、きわめて高度な技術であって、その操作に高い精度を必要とするとともに高価である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、顕微鏡検査法により、試料、特に厚い生物学的試料の三次元画像の取得を可能にするとともに、三次元で前記試料が放射する蛍光発光の測定を可能にし、共焦点顕微鏡検査法を含む従来の顕微鏡検査法技術の欠点がない方法および計器を提供することにある。
【００１２】
特に、本発明の目的は、試料とこの試料の蛍光フィールドの三次元画像を取得することができ、すなわち、試料の全容積上の蛍光分布についての情報を取得することができ、その一態様として時間経過中のその変化を監視することができるとともに、各画像を取得するまでの時間的遅延が最小である方法および計器を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、過度に複雑な操作を必要とせず、特に共焦点顕微鏡検査法と比較した場合にコストが安い方法およびデバイスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、試料、好ましくは厚い生物学的試料の三次元画像を取得するための方法および計器に関し、デジタル・ホログラフィによって取得した干渉信号を蛍光信号と結合することにより、前記試料から放射された蛍光フィールドを取得する。
【００１５】
「厚い試料」という用語は、従来の光学的顕微鏡検査法では試料の全部の深さにわたって鮮明な画像を同時に入手することができないような寸法の試料を意味する。
【００１６】
実際の本発明の第１目的は、顕微鏡検査法により、試料、特に厚い生物学的試料の三次元画像、およびこの試料から放射された蛍光フィールドの三次元画像を取得するための方法を提案することである。前記方法としては、
一方でデジタル・ホログラフィによって得た干渉信号と、他方で試料から放射される蛍光信号とを順次別々に測定かつ記録する測定・記録ステップと、
所与の瞬間における試料自体と前記試料から放射された蛍光フィールドとを鮮明な三次元画像として再構成するために、デジタル・ホログラフィによって得た前記干渉信号と記録した前記蛍光信号とを結合する処理ステップとを有することを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、試料と前記試料の蛍光フィールドとにおける三次元画像の変化を監視するために、前記測定・記録ステップと前記処理ステップとを時間の経過中に反復して行う。
【００１８】
より好ましくは、検査中の前記試料自体と前記試料の蛍光フィールドとの鮮明な三次元画像を再構成するために、デジタル・ホログラフィによって得た干渉信号と前記蛍光信号との前記結合を数値解析によって行う。
【００１９】
本発明の第２目的は、前記方法を実施するための計器を提供することにある。前記計器は、蛍光励起光源と結合されたデジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡から形成されている。
【００２０】
好ましくは、蛍光励起光源が反射モードまたは透過モードで動作する。
【００２１】
より好ましくは、デジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡は、部分的にコヒーレントまたは選択的にコヒーレントであって透過的に作用する光源光ビームを発生することが可能な光源を備えている。
【００２２】
本発明の第１の好ましい実施形態として、前記顕微鏡の部分的にコヒーレント光源は、下記の素子、すなわち、狭いスペクトル幅の光を放射する光源と、第１のレンズと、第１のアパーチャと、第２のレンズと、第２のアパーチャと、第３のレンズとを備えている。光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置は、光放射源から放射される光が第１のレンズ、第１のアパーチャ、第２のレンズ、第２のアパーチャ、第３のレンズの順に一連に通過するようになされている。第３のレンズから出た光は、視準された光（平行光線束）である。
【００２３】
本発明の他の好ましい実施形態として、前記顕微鏡の部分的にコヒーレント光源は、下記の素子、すなわち、狭いスペクトル幅の光を放射する光源と、光ファイバと、第１のレンズと、第２のレンズと、第３のレンズと、調整可能なアパーチャとを備えている。アパーチャにおいて視準された光（平行光線束）を得るために、光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置は、光放射源から放射される光が均一な光視域を有する光ファイバを最初に通過し、次に第１のレンズを通過し、次に第２のレンズおよび第３のレンズを通過するようになされている。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施形態として、顕微鏡の部分的にコヒーレント光源は、下記の素子、すなわち、レーザ源と、第１のレンズと、回転拡散装置と、第２のレンズと、アパーチャとを備えている。光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置は、レーザ源から放射されるレーザ・ビームが最初に第１のレンズを通過し、次に第１のレンズの焦点の後に設置された回転拡散装置を通過し、次に回転拡散装置の面に対してその焦点距離のところに設置された第２のレンズを通過し、次にアパーチャを通過するようになされている。
【００２５】
本発明の他の好ましい実施形態として、顕微鏡の部分的にコヒーレント光源は、下記の素子、すなわち、レーザ源と、第１のレンズと、すりガラス板のような回転拡散装置と、第２のレンズとを備えている。光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的配置は、レーザ源から放射されるレーザ・ビームが最初に第１のレンズを通過し、次に回転拡散装置を通過し、次に第２のレンズを通過するようになされている。第１のレンズから出たレーザ・ビームは、回転拡散装置から調整可能な距離であって拡散装置の上流に位置する焦点ポイントにおいて焦点を結ぶ。このようなレーザ源は、前記顕微鏡のレンズがない状態で本発明のホログラフィ顕微鏡と一緒に使用される。
【００２６】
デジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡は、さらに、下記の素子を備えることが好ましい。すなわち、顕微鏡は、光源光ビームから２つの平行なビーム、すなわち、物体ビームおよび参照ビームを形成するためのビーム・スプリッタおよびミラーを有する可動の第１サブ組立体と、
光源光ビームを第１サブ組立体の上方のビーム・スプリッタに指向させるための、ミラーであることが好ましい手段と、
前記物体ビームと前記参照ビームとを再結合した光ビームとして結合するためのビーム・スプリッタおよびミラーを有する固定または可動の第２サブ組立体と、
検査対象の試料を有し、第１サブ組立体と第２サブ組立体との間の物体ビームの光学通路に配置された対物セルと、
物体セルの下流に位置し、第１サブ組立体と第２サブ組立体との間の物体ビームの光学通路に配置された第１顕微鏡対物レンズと、
第１サブ組立体と第２サブ組立体との間の参照ビームの光学通路に配置された光学通路補正手段と、
前記光学通路補正手段の下流に位置し、第１サブ組立体と第２サブ組立体との間の参照ビームの光学通路に配置された第２顕微鏡対物レンズと、
前記物体セル上に前記物体ビームの焦点を結ばせることが可能な第１焦点調整手段と、
前記光学通路補正手段上に前記参照ビームの焦点を結ばせることが可能な第２焦点調整手段とを備えている。
【００２７】
前記光学通路補正手段は、対物セルに類似しているが、検査対象の試料を含んでいない参照セルを備えていることが好ましい。
【００２８】
前記光学通路補正手段は、適当な厚さおよび適当な組成の透明な材料を備えていることが好ましい。
【００２９】
前記干渉信号および前記蛍光信号を記録かつ処理するために、コンピュータ処理および画像分析手段に接続されたＣＣＤカメラのような記録・処理手段を設置することができ、また、再結合した光ビームの焦点を前記記録手段上に結ばせるための追加の焦点調整手段を設置することもできる。
【００３０】
本発明の第３の目的は、本発明の方法で使用することができ、デジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡に関する。前記顕微鏡は、光源光ビームを発生することが可能な部分的にコヒーレント光源と、
光源光ビームから２つの平行なビーム、すなわち、物体ビームと参照ビームとを形成するためのビーム・スプリッタとミラーを有する可動の第１サブ組立体と、
光源光ビームを第１サブ組立体の上方のビーム・スプリッタに指向させるための、ミラーであることが好ましい手段と、
前記物体ビームと前記参照ビームとを再結合した光ビームとして結合するためのビーム・スプリッタおよびミラーを有する固定または可動の第２サブ組立体と、
検査対象の試料を有し、第１サブ組立体と第２サブ組立体との間の物体ビームの光学通路に配置された対物セルと、
物体セルの下流に位置し、第１サブ組立体と第２サブ組立体との間の物体ビームの光学通路に配置された第１顕微鏡対物レンズと、
第１サブ組立体と第２サブ組立体との間の参照ビームの光学通路に配置された光学通路補正手段と、
前記光学通路補正手段の下流に位置し、第１サブ組立体と第２サブ組立体との間の参照ビームの光学通路に配置された第２顕微鏡対物レンズと、
前記物体セル上に前記ビームの焦点を結ばせることが可能な第１焦点調整手段と、
前記光学通路補正手段上に参照ビームの焦点を結ばせることが可能な第２焦点調整手段とを備えている。
【００３１】
第１の好ましい実施形態として、部分的にコヒーレント光源は、下記の素子、すなわち、狭いスペクトル幅の光を放射する光源と、第１のレンズと、第１のアパーチャと、第２のレンズと、第２のアパーチャと、第３のレンズとを備えている。光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置は、光放射源から放射される光が第１のレンズ、第１のアパーチャ、第２のレンズ、第２のアパーチャおよび第３のレンズの順に一連に通過するようになされている。第３のレンズから出た光は、視準された光（平行光線束）である。
【００３２】
本発明の他の好ましい実施形態として、部分的にコヒーレント光源は、下記の素子、すなわち、狭いスペクトル幅の光を放射する光源と、光ファイバと、第１のレンズと、第２のレンズと、第３のレンズと、調整可能なアパーチャとを備えている。アパーチャにおいて視準された光（平行光線束）を得るために、光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的な配置は、光放射源から放射される光が均一な光視域を有する光ファイバを最初に通過し、次に第１のレンズを通過し、次に第２のレンズおよび第３のレンズを通過するようになされている。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施形態として、前記顕微鏡の部分的にコヒーレント光源は、下記の素子、すなわち、レーザ源と、第１のレンズと、回転拡散装置と、第２のレンズと、アパーチャとを備えている。光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的配置は、レーザ源から放射されるレーザ・ビームが最初に第１のレンズを通過し、次に第１のレンズの焦点の後に配置された回転拡散装置を通過し、次に回転拡散装置の面に対してその焦点距離のところに配置された第２のレンズを通過し、次にアパーチャを通過するようになされている。
【００３４】
本発明の他の好ましい実施形態として、部分的にコヒーレント光源は、下記の素子、すなわち、レーザ源と、第１のレンズと、すりガラス板のような回転拡散装置と、第２のレンズとを備えている。光源が動作している場合におけるこれら種々の素子の相対的配置は、レーザ源から放射されるレーザ・ビームが最初に第１のレンズを通過し、次に回転拡散装置を通過し、次に第２のレンズを通過するようになされている。第１のレンズから出たレーザ・ビームは、回転拡散装置から調整可能な距離であって拡散装置の上流に位置する焦点ポイントにおいて焦点を結ぶ。このようなレーザ源は、前記顕微鏡のレンズがない状態で本発明のホログラフィ顕微鏡と一緒に使用される。
【００３５】
さらに、前記光学通路補正手段は、対物セルに類似しているが、検査対象の試料または適当な厚さおよび適当な組成の透明な材料を含んでいない参照セルを備えている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
デジタル・ホログラフィ用に使用される光源
本発明による計器で使用することができる光源の第１のタイプは、図１の部分的にコヒーレント光源に対応する。色消しレンズＬ１は、例えば、ＬＥＤ（発光ダイオード）のような拡張した空間的にコヒーレントでない波長ろ過光源が放射した光線を調整可能なアパーチャの第１のアイリス絞りＡ１に対して視準する。アパーチャＡ１は、光の空間的なコヒーレンスを増大するために光源の角度スペクトルを制限する。第２の色消しレンズＬ２は、第２のアイリス絞りＡ２が光源のサイズを制限する焦点面で、第２の光源を生成する。第３のレンズＬ３は、視準したビームを生成する。デジタル・ホログラフィの場合、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３の焦点距離は、例えば、１００ｍｍである。
【００３７】
本発明による計器で使用することができる光源の第２のタイプは、図２の部分的にコヒーレント光源に対応する。レンズＬ１は、例えば、ＬＥＤ（発光ダイオード）のような拡張した空間的にコヒーレントでない波長ろ過光源が放射した光線を視準する。均一な光フィールドを得るために、この光源からの光線をそのコアが液体である光ファイバを通してＬＥＤからレンズＬ１に運ぶことができる。この一組のレンズＬ２およびＬ３は、視準したビームを形成する。空間フィルタＡ１は、光の空間的なコヒーレンスを増大するために光源の角度スペクトルを制限する。
【００３８】
本発明による計器では、部分的にコヒーレントでないように作られたレーザ源を使用することもできる。図３は、光学系で従来使用されてきたこのような光源の動作原理を示す。平行な光線レーザ・ビームは、レンズＬ１により焦点を結ぶ。回転拡散装置Ｄは、その直径が顕微鏡の視野範囲を照明するのに十分な直径の光のスポットを形成するため、焦点ポイントの後に置かれる。拡散装置は、拡散装置が回転することにともなって変化するスペックル・フィールドを生成する。レンズＬ２は、その焦点ポイントが回転拡散装置の面に位置するように設置される。
【００３９】
次に、アパーチャＡは、スペックル点のサイズを増大することができるように、レンズの後に置かれる。画像記録システムの露出時間と比較した場合、十分高速で回転するモータを使用することにより、このような光源が上記の空間的、部分的にコヒーレント光源と同じものであることを実際に証明することができる。空間的なコヒーレンスの幅は、アパーチャの直径により調整されるスペックル点のサイズに直接関係する。
【００４０】
図４は、本発明による計器で使用することができるコヒーレント光源をベースとする視準された部分的にコヒーレント光源の他のタイプを示す。レーザ・ビームは、レンズ（Ｌ１）によってすりガラス板（Ｄ）の近くに焦点を結ぶ。すりガラス板は、光を散乱する。すりガラス板の後に置かれたレンズ（Ｌ２）は、前記板が散乱した光を視準する。焦点ポイントとすりガラス板との間の距離（ｄ）を調整することにより、視準したビーム・スペックル点のサイズが調整される。
【００４１】
デジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡
図５は、本発明による計器で使用する顕微鏡の平面を示す。デジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡の干渉計は、マッハ・ツェンダータイプのもので、２つのサブ組立体ＳＥ１およびＳＥ２を備える。これらの各サブ組立体は、それぞれビーム・スプリッタＢＳ１およびＢＳ２とミラーＭ１およびＭ２とを有する。デジタル・ホログラフィ用の光源Ｓは、上述した光源のような部分的にコヒーレント光源である。前記光源Ｓは、ビーム・スプリッタＢＳ１を照明する。ビームのある一部はＢＳ１を透過し、他の一部はミラーＭ１の方に反射する。
【００４２】
第１サブ組立体ＳＥ１は、２つの平行な光ビーム、すなわち、物体ビームＯと参照ビームＲとを形成するために使用される。第１サブ組立体ＳＥ１は回転テーブル上に装着されている一方、第２サブ組立体ＳＥ２は固定または可動可能になっている。それにより、干渉計の２つのビーム、すなわち、物体ビームＯと参照ビームＲとの光学通路における等質化を調整することができる。
【００４３】
物体ビームについては、レンズＬ４が光ビームの焦点をその観察セルＳｏ内に位置する対象物または試料上に結ぶ。対象物は、蛍光の観察に適している顕微鏡の対物レンズＭＬ１により観察される（従来の顕微鏡においては、種々の可能な倍率を使用することができる）。この一組のレンズＬ４−ＭＬ１は、無限焦点システムを形成する。対物レンズＭＬ１は、レンズＬ６とともに試料を貫通する面の画像を生成する。
【００４４】
同様に、参照ビームＲについては、レンズＬ５が試料を含んでいるが後者を含んでいない観察セルと同一観察セルＳｒ上に光ビームの焦点を結ぶ。または、レンズＬ５が光ビームの焦点を標本ガラスのような適当な組成および厚さを有する透明な材料上に結ぶ。この配置によって干渉計の２つのビームの光学通路における等質化を最適にすることができる。
【００４５】
ＭＬ１と同じ顕微鏡の対物レンズＭＬ２は、参照ビーム内に置かれる。この一組のレンズＬ５−ＭＬ２も無限焦点システムを構成する。光学通路ＭＬ１−Ｌ６とＭＬ２−Ｌ６とは、同じになるように調整される。
【００４６】
ミラーＭ２およびビーム・スプリッタＢＳ２を有する第２サブ組立体ＳＥ２は、物体ビームＯを参照ビームＲと結合するために使用される。結合した物体ビームＯと参照ビームＲとは、カメラ（図５に参照記号Ｃで示す）の感光面内で干渉する。
【００４７】
以下に説明するように、デジタル・ホログラフィを実施するには、試料を遮断する鮮明な面内で測定した光学振幅についての知識を必要とする。光学振幅は、下記の２つの方法によって干渉パターンから決定することができる。
（ｉ）キャリヤまたはフーリエ変換法：この方法を使用した場合、試料の分析を行わないときには、干渉縞の線形配列を取得するために、対物ビームと基準ビームとがＣＣＤカメラに小さな角度で入射する。次に、試料による光学位相の変化が干渉縞の形の変化で明らかになる。振幅はフーリエ変換分析により決定される。
（ｉｉ）サブ組立体ＳＥ２のミラーＭ２は、基準光学通路を波長の正確な分数だけ変化させることができる、その光軸に沿ったピエゾ圧電変位用のシステムを含む。そのため、波長の一定の分数により位相シフトしたいくつかの画像の記録からなる、いわゆる、「位相ステッピング」を実施することができる。これらの干渉図を組み合わせれば、コンピュータ処理により、試料からでた光の振幅を計算することができる。
【００４８】
顕微鏡は、要件により直接顕微鏡検査法モードまたは逆顕微鏡検査法モードで動作することができる。
【００４９】
蛍光用計器
図５の場合、蛍光励起光源Ｓ’は反射モードで設置されている。すでに説明したように、この励起光源は透過モードで動作するように設置することができる。
【００５０】
反射光内の蛍光
図５に示す構成の場合、光源Ｓ’は、水銀灯または石英−ハロゲン・ランプ、またそうでない場合には、蛍光励起のために必要な短い波長領域内の光を放射する光源である。適当と思われる場合には、光源としてレーザを使用することができる。レンズにより視準された光線は、使用した蛍光色素によって選択した励起フィルタＦ１に入り、適当なダイクロイック・ミラーＭＤにより対物レンズを通して試料上に反射する。
【００５１】
試料内に含まれる蛍光色素から放射された蛍光は、これらの長い光波長が透明なダイクロイック・ミラーＭＤを通り、短い波長を阻止するために設置された阻止フィルタＦ２を通ってカメラを介して記録される。
【００５２】
例えば、２つの干渉計ビームの光学通路の等質化を最適にするために、ガラスのような適当な組成および厚さの材料を基準ビーム内に追加することができる。
【００５３】
透過光内の蛍光
この構成の場合には、２つの構造を使用することができる。
（ｉ）単一光源構造：使用する単一光源は、デジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡用のものである。しかし、この光源は、短い波長の範囲で放射を行うので、同時に、蛍光励起光源としても使用される。これにより、対象物のホログラムを生成することもできるし、試料の蛍光色素を励起することもできる。
（ｉｉ）２光源構造：特に、デジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡用の光源は、下記の２つの方法で、蛍光色素を励起するために必要な光を放射する光源と組み合わされる。蛍光に必要な光源は、ビーム・スプリッタＢＳ１の直前に設置されるか、試料上に光線の焦点を結ぶレンズＬ４の直前に設置される。
【００５４】
蛍光信号の三次元再構成のためのデジタル・ホログラフィと蛍光信号との結合
すでに説明したように、本発明の計器は、下記の目的のために２つの結合した光学的サブシステムを備える。
（ｉ）試料の透過内の干渉画像記録
（ｉｉ）蛍光励起光源により活性化された試料の蛍光画像記録
【００５５】
これらの画像は、カメラＣの感光面上に、試料の光軸に垂直な面の鮮明な画像を形成する一組のレンズＭＬ１−Ｌ６からなる無限焦点システムにより形成される。干渉画像および蛍光画像は、順次記録される。
（ｉ）蛍光光源は、シャッターによりマスクされ、１つまたは複数の干渉画像が記録される。
（ｉｉ）干渉記録用の光源は、マスクされるかまたはオフにされ、１つまたは複数の蛍光画像が記録される。
【００５６】
試料の厚さが画像形成デバイスの被写体深度より薄い場合には、試料の画像はどの場所でも鮮明である。しかし、本発明が関連するのはこの場合であるが、試料の厚さが被写体深度を超える場合には、画像内における被写体深度領域を超える試料のこれらの部分は不鮮明になる。
【００５７】
干渉信号および蛍光信号は、試料が無限焦点レンズシステムを使用してカメラＣにより観察されるので、センサのところで完全に重畳し、鮮明な面は、色消しの光学構成部材ＭＬ１−Ｌ６を使用しているために、両方のタイプの照明に対して共通になる。
【００５８】
干渉記録またはホログラフィ記録の役割
干渉記録により、試料の鮮明な面内の複雑な光学振幅を正確に測定することができる。コヒーレントまたは部分的にコヒーレントな干渉光源Ｓが作動し、視準されたビームとしてビーム・スプリッタＢＳ１を照明する。
【００５９】
物体ビームと呼ばれるこのビームの一部は、経路ＢＳ１−Ｍ１−Ｌ４−Ｓｏ−ＭＬ１−ＢＳ２−Ｌ６−Ｃを通る。このビームの位相および振幅は、対物セルＳｏ内に含まれた試料により変調される。
【００６０】
参照ビームと呼ばれるビームの他の部分は、経路ＢＳ１−Ｌ５−Ｓｒ−ＭＬ２−Ｍ２−ＢＳ２−Ｌ６−Ｃを通る。このビームの位相および振幅は、参照セルＳｒにより変調される。
【００６１】
物体ビームと参照ビームとは、カメラＣの感光面上で干渉する。干渉パターンの形は、試料ＳｏおよびＳｒによる相対的な光学位相の変化により影響を受ける。参照セルＳｒは、対物セルＳｏ類似の実験セルであるが、検査中の試料を含んでいないため、干渉パターンの形は、検査中の試料による光学位相の変化だけにより有意な影響を受ける。
【００６２】
第１の対物レンズは、干渉パターンまたはカメラが測定したパターンをベースとして、試料から出てくる複素光学振幅を測定するためのものである。この測定を行うために、干渉法で従来の２つの方法を使用することができる。
（ｉ）フーリエ変換法［１］
（ｉｉ）位相シフト法
【００６３】
試料の鮮明面内における複素光学振幅が分かっている場合には、平行な面内の複素振幅を計算するために、デジタル・ホログラフィ方法が使用される［２〜６］。これらの方法は、数字による方法により、フーリエ光学系伝搬法則（キルヒホッフ・フレネル式）を使用して光学フィールドを計算する。ゆえに、画像形成システムの最初の被写体深度領域から遠ざかる面内の複素光学振幅を計算することができる。不鮮明に記録されたこれらの画像領域は、これらの方法により鮮明にすることができる。
【００６４】
（ｘ，ｙ）面内の複素光学振幅ｕ（ｘ，ｙ）は下式により計算することができる。
【００６５】
【数１】
2004538451.tif 000003
ここで、
Ｉ（ｘ，ｙ）は、点（ｘ，ｙ）のところの光度であり、
α（ｘ，ｙ）は、点（ｘ，ｙ）のところの光学位相であり、
ｉは、ｉ２＝−１のような虚数である。
【００６６】
それ故、干渉計法は、デジタル・ホログラフィにより距離ｄだけ離れている平行な面内の光学振幅ｕｄ’（ｘ’，ｙ’）を計算することができるように、画像が形成される面内で、数量Ｉ（ｘ，ｙ）およびα（ｘ，ｙ）を決定する方法である。この計算は、正式には下式のように表される。
【００６７】
【数２】
2004538451.tif 000004
ここで、Ｒ［ｄ］は、キルヒホッフ−フレネル演算子である。
文献［２］にこの式のいくつかの数字による評価が記載されている。
【００６８】
蛍光信号の記録
蛍光励起光源が作動した場合、試料内に分布している蛍光物質は、等方向に光を放射し、ＣＣＤビデオ・カメラが検出した信号を発生する。面から距離ｄだけ離れている位置に位置する試料の点（ｘ０，ｙ０）による放射について考えてみる。顕微鏡の対物レンズが有限のアパーチャを有し、蛍光放射点がその画像が形成される対象物の面内に、ビデオ・カメラにより観察することができる光のディスクを生成するので、その画像は一組のレンズＭＬ１−Ｌ６により形成される。
【００６９】
光度のこの分布は、Ｉｐ（ｘ−ｘ０，ｙ−ｙ０）で示される。ここで、サブスクリプトｐは、考慮の対象になる蛍光信号であることを示す。
【００７０】
第１の近似値に対する発光ディスクの直径Ｄは、下式により表される。
【００７１】
【数３】
2004538451.tif 000005
ここで、ｆｎｕｍｂｅｒＭＬ１は、そのアパーチャの直径に対するＭＬ１の焦点距離の比率である。
【００７２】
コヒーレントでない照明の回折効果を考慮に入れなければならない場合、非常に短い距離ｄに対して式（３）を修正しなければならないことに留意されたい。しかし、これらの距離ｄの場合には、点光源の画像が被写体深度領域内に位置しているので、鮮明さについてはこの後何の操作も必要としない。
【００７３】
鮮明な面から異なる距離ｄのところに位置するかもしれないいくつかの放射領域を有するもっと複雑な試料の場合には、光度の分布を基本的な分布、Ｉｐ（ｘ−ｘ０，ｙ−ｙ０）の合計として表すことができる。
【００７４】
デジタル・ホログラフィ信号と蛍光信号の複素振幅間の結合
本発明の用途の主題であるコンセプトは、デジタル・ホログラフィの数字による処理によって蛍光信号を操作することができるようにし、不鮮明に記録された蛍光信号を鮮明にすることができるようにするために、デジタル・ホログラフィ信号と蛍光信号を結合することである。
【００７５】
この結合ができるようにするために、蛍光を放射する生物学的試料内の領域に、それを囲む非蛍光領域とは異なる光学的特性（光学的吸収および／または屈折率）を持たせなければならない。細胞生物学の多くの用途において、この条件が満たされることを指摘しておかなければならない。何故なら、蛍光は、位相差光学的顕微鏡でも見ることができる、細胞小器官に標識を付けるために使用されるからである。位相差によるこの証明により、小器官の屈折率および／または吸収の局所的変化が分かる。
【００７６】
一定の背景に対して局所的な屈折率および／または吸収が変化している領域である生物学的試料内の蛍光の狭い領域を考慮する場合、およびこの領域が試料の鮮明な面から距離ｄのところに位置すると仮定した場合には、すでに説明したように、蛍光領域は光度Ｉｐ（ｘ−ｘ０，ｙ−ｙ０）の光点を生じる。干渉法により測定した光学振幅は、式（１）により表される。
【００７７】
【数４】
2004538451.tif 000006
第一に、等しい蛍光振幅は下式により表される。
【００７８】
【数５】
2004538451.tif 000007
ここで、Ａは、本発明で重要な役割を演じない乗算定数である。
式（４）は、蛍光に影響を与えた領域を増幅するために、蛍光の光度によって干渉の振幅を加重する。
【００７９】
次に、蛍光の鮮明な画像を再構成するために、デジタル・ホログラフィ再構成が適用される。
【００８０】
【数６】
2004538451.tif 000008
【００８１】
次に、蛍光点の光度の鮮明な画像を入手するために、光度Ｕｐ’＊（ｘ’，ｙ’）Ｕｐ’(ｘ’，ｙ’)の計算が行われる。
【００８２】
実際には、干渉の光学的振幅と蛍光点とは、距離ｄが分からない状態で測定される。デジタル・ホログラフィ再構成技術は、蛍光点の最も鮮明な画像を得るために適用された技術である。
【００８３】
試料内に屈折率および／または吸収が変化しているいくつかの狭い領域を有し、これら領域の中のいくつかだけが蛍光を放射する場合を考慮すると、２つの場合が生じる。
（ｉ）第１の場合：干渉信号および蛍光信号が試料の鮮明な面内で別々になっている場合。この場合には、上記方法を直接使用することができる。
（ｉｉ）第２の場合：試料の鮮明な面において干渉信号および蛍光信号が少なくとも部分的に重なっている場合。
【００８４】
この第２の場合には、上記の方法を使用すると、実際にはそうでない蛍光領域の偽の再構成が行われる恐れがある。それは、一方で重畳している屈折率および／または吸収が変化している２つの領域による干渉信号、他方でこれら２つの領域の中の一方だけが蛍光を放射する場合を考慮するからである。何故なら、蛍光スポットは、少なくとも部分的に２つの領域からの干渉信号と重なっているので、上記方法を使用すると、２つの領域に対する蛍光に有意な影響を与える。この場合、関連する領域だけを再構成するために、多くの修正方法を実施することができる。例示としての方法には、反復修正手順がある。鮮明な面内の最初の蛍光分布はＤ０と呼ばれる。１回目の反復の際に、両方の領域に対して蛍光を与える上記のホログラフィ再構成方法が使用される。この再構成の結果は構成Ｃ１と呼ばれる。次に、コヒーレントでない光学系の伝搬法則を使用し、Ｃ１に対応する試料の鮮明な面内のＤ１と呼ぶ蛍光の分布が計算される。Ｃ１に修正を行って第２の構成Ｃ２を入手するために、Ｄ１およびＤ０が比較される。この比較のために、コヒーレントでない光学系の法則により新しい蛍光の分布Ｄ２が計算され、反復修正プロセスがコヒーレントでない光学系の法則により計算した蛍光の分布ＤＮ（Ｎ番目の反復）と蛍光の分布Ｄ０との間に有意の小さな差異が得られるまで反復して行われる。このような最適化手順を実施するために、多くの数字による最適化方法を使用することができる。例としては、この場合には、（ＤＮ−Ｄ０）２であってもよい、コスト関数の最小化のためのランダム探索をベースとするシミュレートしたアニーリング方法がある［７］。
【００８５】
要するに、本発明は、三次元でマイクロ試料の蛍光領域を測定するために、蛍光計器をデジタル・ホログラフィで動作する顕微鏡と結合する技術であり、現在の周知の技術と比較すると多くの利点を有する。
【００８６】
第１の利点は、従来の蛍光顕微鏡検査法と比較した場合、本発明を使用すれば、システムの光軸に沿って試料を移動しなくても、蛍光の三次元画像を得ることができる。
【００８７】
さらに、本発明の場合は、デジタル・ホログラフィが供給する位相情報および振幅情報を、各点でデジタル処理による寄生蛍光を除去するために使用することができる。
【００８８】
共焦顕微鏡検査法タイプと比較した場合、本発明は、また、特定のいくつかの利点を有する。
【００８９】
これら利点のうちの１つは、共焦点顕微鏡検査法タイプと比較すると、本発明は遥かに簡単に実施することができることである。
【００９０】
他の１つの利点は、本発明を使用すれば、蛍光信号を発生するために光源のもっと広い範囲を使用することができ、それ故、種々の用途をカバーするため使用することができる波長範囲を広げることができることである。また、これにより、生物学的試料にもっと悪影響が少ない光源を使用することもできる。
【００９１】
また、共焦点顕微鏡検査法と比較すると、本発明を使用すれば、共焦点顕微鏡検査法内の走査による一時的な歪みが除去されるような方法で蛍光を記録するため、全試料についての情報を容積について同時に、または、各入手間に非常に短い遅延時間（通常は、１／２５秒）で記録することができる。
【００９２】
要するに、干渉信号を蛍光信号と結合する本発明で提案した方法を使用すれば、試料内の蛍光を発する領域を三次元で鮮明な画像で位置付けることができる。この方法は、生物学者達が光学的顕微鏡の被写体深度を超える厚さを非常に迅速に示す生きた胎児のダイナミクスの変化をチェックしたい胎生学の分野に有利に適用することができる。ゆえに、本発明を使用すれば、例えば、蛍光色素で標識が付けられた細胞の動きの後の三次元分析を行うことができる。
【００９３】
さらに、本発明によるホログラフィ顕微鏡は、また、従来技術による計器と比較すると、特に、（１９９９年発行の）Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．３８号７０８５〜７０９４ページ掲載のＦ．Ｄｕｂｏｉｓ他の「部分的空間的コヒーレント光源を使用するデジタル・ホログラフィ顕微鏡による改良形三次元画像形成」（Improved  three-dimensional  imaging  with  digital  holography  microscope  using  a  partial  spatial  coherent  source）という名称の論文に記載のホログラフィ顕微鏡と比較すると多数の利点を有する。
【００９４】
何故なら、上記文献に記載のホログラフィ顕微鏡と比較した場合、本発明によるホログラフィ顕微鏡では、それぞれ対物セルおよび参照セル内に光の焦点を結ぶために使用するレンズＬ４およびレンズＬ５、（または他の光学通路補正手段）は、干渉計自身の中、より詳細に説明すると、それぞれ対物レンズＭＬ１およびＭＬ２の前面に位置し、干渉計の外に位置していないからである。それ故、ビーム・スプリッタＢＳ１に達した光線は、ミラーＭ（図５）により視準されるが、光軸に対する入射光線の位置が変化する場合には、焦点の位置は修正されない。この機能により、回転テーブルをはるかに有効に使用することができ、物体ビームおよび参照ビームの光学通路の等質化をより容易に行うことができる。この調整ができるということが、部分的にコヒーレント光源を有するホログラフィ顕微鏡にとっては必要不可欠なことである。
【００９５】
さらに、本発明によるホログラフィ顕微鏡の場合には、試料を含むセルＳｏ類似の参照観察セルＳｒ、または、適当な組成および厚さの透明な材料を対物Ｏおよび基準Ｒの光学通路の等質化を改善するために使用することができる。
【００９６】
最後に、上記文献と比較した場合、本発明による顕微鏡は、上記文献で使用しているものより優れていることが分かっている３つの他のタイプの部分的にコヒーレント光源を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】空間的にコヒーレントでない光源から作られた本発明の空間的、部分的にコヒーレント光源の第１実施形態を示す図。
【図２】空間的にコヒーレントでない光源から作られた本発明の空間的、部分的にコヒーレント光源の第２実施形態を示す図。
【図３】空間的にコヒーレント光源から作られた本発明の空間的、部分的にコヒーレント光源の第３実施形態を示す図。
【図４】空間的にコヒーレント光源から作られた本発明の空間的、部分的にコヒーレント光源の第４実施形態を示す図。
【図５】図２の空間的、部分的にコヒーレント光源を使用する本発明の計器の好ましい実施形態を示す図。
【参照文献】
【００９８】
１．（１９７２年発行の）Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．７２号１５６〜１６０ページ掲載の、Ｍ．Ｔａｋｅｄａ、Ｈ．ＩｎａおよびＳ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉの「コンピュータをベースとするトポグラフィおよび干渉法用の干渉縞パターン分析のフーリエ変換方法」
（Fourier transform method of fringe pattern analysis for computer based topography and interferometry）
２．（１９９９年発行の）Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．３８号、７０８５〜７０９４ページ掲載の、Ｆ．Ｄｕｂｏｉｓ、Ｌ．ＪｏａｎｎｅｓおよびＪ．−Ｃ．Ｌａｇｒｏｓの「部分的空間的コヒーレント光源を使用するデジタル・ホログラフィ顕微鏡による改良形三次元画像形成」（Improved three-dimensional imaging with digital holography microscope using a partial spatial coherent source）
３．（１９９９年発行の）Ｏｐｔ．Ｌｅｔ．２４号２９１〜２９３ページ掲載の、Ｅ．Ｃｕｃｈｅ、Ｆ．ＢｅｖｉｌａｃｑｕａおよびＣ．Ｄｅｐｅｕｓｉｎｇｅの「定量位相対照画像形成のためのデジタル・ホログラフィ」（Digital holography for quantitative phase contrast imaging）
４．（１９９８年発行の）Ｏｐｔ．Ｌｅｔ．２３号１２２１〜１２２３ページ掲載の、Ｔ．ＺｈａｎｇおよびＩ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉの「位相シフト・デジタル・ホログラフィによる三次元顕微鏡検査法」（Three-dimensional microscopy with phase-shifting digital holography）
５．（１９９６年発行の）Ｆｌｏｗ  Ｍｅａｓ．Ｉｎｓｔｒ．７巻１号１〜６ページ掲載の、Ｓｋａｒｍａｎ、ＷｏｚｎｉａｃおよびＢｅｃｋｅｒの「新規ＣＣＤをベースとするホログラフィ干渉計を使用する同時三次元ＰＩＶおよび温度測定」（Simultaneous 3D-PIV and temperature measurement using a New CCD based holographic interferometer）
６．（２０００年発行の）Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．３９号５３０２〜５３０８ページ掲載の、Ｙ．ＴａｋａｋｉおよびＨ．Ｏｈｚｕの「ハイブリッド・ホログラフィ顕微鏡：視角を使用する三次元対物情報の視覚化」（Hybrid holographic microscopy Visualization of three-dimensional
object information by use of viewing angles）
７．（１９８３年発行の）Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２０号６７１〜６７９ページ掲載の、Ｓ．Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、Ｃ．Ｄ．Ｇｅｌａｔｔ，Ｊｒ．およびＭ．Ｐ．Ｖｅｃｃｈｉの「シミュレートしたアニーリングによる最適化」（Optimization by Simulated Annealing）
８．（１９９７年発行の）Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２巻、１９号１５０６〜１５０８ページ掲載の、Ｂ．Ｗ．Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ、Ｔ．−Ｃ．Ｐｏｏｎ、Ｇ．Ｉｎｄｅｂｅｔｏｕｗ、Ｂ．Ｓｔｏｒｒｉｅ、Ｋ．Ｓｈｉｎｏｄａ、Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ、およびＭ．Ｈ．Ｗｕの「三次元ホログラフィ蛍光顕微鏡検査法」（Three-dimensional holographic fluorescence microscopy）
【図１】
2004538451.tif 000009
【図２】
2004538451.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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