(57)【要約】本発明は、第２群アレルゲンに特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび完全なＩｇＧ分子、ならびにそれらの使用に関する。より正確には、本発明は、イネ科植物の花粉に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂ（Ｐｈｌ  ｐ２）および試薬、ならびにこれらを含むキットおよびワクチンに関する。本発明はまた、特にＩ型アレルギーの診断および治療および防止のための、第２群特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび完全なＩｇＧ分子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２Ａから２Ｂに示すアミノ酸配列またはその本質的に相同な変異体を有する、第２群アレルゲンに特異的なヒトＩｇＥのＦａｂ。
【請求項２】
配列番号１Ａから１Ｂに示す核酸配列またはその本質的に相同な変異体によってコードされている、第２群アレルゲンに特異的なヒトＩｇＥのＦａｂ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＩｇＥのＦａｂの可変領域を含む第２群アレルゲンに特異的なヒトＩｇＧ。
【請求項４】
Ｐｈｌ  ｐ２に対する、請求項１もしくは２に記載のＩｇＥ−Ｆａｂまたは請求項３に記載のＩｇＧ。
【請求項５】
組換え製造される、請求項１から２もしくは４のいずれかに記載のＩｇＥ−Ｆａｂまたは請求項３もしくは４に記載のＩｇＧ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のＩｇＥ−Ｆａｂならびに／またはＩｇＧ、ならびに／または対応する完全な抗体、ならびに／または前記のＦａｂおよび／もしくは抗体の修飾体を含む、診断試薬。
【請求項７】
請求項６に記載の試薬を含む診断キット。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載のＩｇＥ−Ｆａｂならびに／またはＩｇＧ、ならびに／または対応する完全な抗体、ならびに／または前記のＦａｂおよび／もしくは抗体の修飾体を含むＩ型アレルギーに対するワクチン。
【請求項９】
Ｉ型アレルギーの受動的免疫療法のための、請求項１から５のいずれかに記載のＰｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび／またはＩｇＧまたは請求項８に記載のワクチンの使用。
【請求項１０】
Ｉ型アレルギーを診断するための、請求項１から５のいずれか一項に記載のＰｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび／またはＩｇＧまたは請求項６に記載の試薬の使用。
【請求項１１】
環境アレルゲンを検出するための、請求項１から５のいずれか一項に記載のＰｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび／またはＩｇＧの使用。
【請求項１２】
アレルゲン抽出物を標準化するための、請求項１から５のいずれか一項に記載のＰｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび／またはＩｇＧの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第２群アレルゲンに特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよびその使用に関する。より詳しくは、本発明は、イネ科植物の花粉に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂ（Ｐｈｌ  ｐ２）および試薬、ならびにこれらを含むキットおよびワクチンに関する。本発明はまた、特にＩ型アレルギーの診断および治療および防止のための第２群特異的ＩｇＥ−Ｆａｂの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
約５億人が、それ自体は無害な抗原（すなわち、アレルゲン）に対するＩｇＥ抗体が形成されることに基づく遺伝的に決定された過敏性疾患であるＩ型アレルギーに罹っている（１）。Ｉ型アレルギーの様々な症状（アレルギー性鼻炎、結膜炎およびアレルギー性喘息）は、主として、エフェクター細胞に結合した特異的なＩｇＥ抗体が架橋すること、そして続いて生物学的媒介因子（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン類）が放出されることによって引き起こされる（２）。
【０００３】
イネ科植物およびトウモロコシは世界中に分布して、容易に空気中に漂う多量の花粉をもたらしており、従って最も重要なアレルゲン源に属する。４０％を越えるアレルギー患者がイネ科植物の花粉アレルゲンに対して敏感になっており、その第２群アレルゲンが、最も頻繁に認識されるアレルゲンの１つである（３、４）。第２群アレルゲンは、約１０ｋＤａから１１ｋＤａの分子量を有する高度に相同なタンパク質として多くのイネ科植物種の花粉に存在する。イネ科植物花粉アレルギー者の約７０％は、種々のイネ科植物種およびトウモロコシ種に由来する第２群アレルゲンの配列的および構造的および免疫学的な類似性のために、様々な第２群アレルギーに対して敏感になっている（５〜７）。オオアワガエリに由来する組換えＰｈｌ  ｐ２が、天然アレルゲンの性質と同等である免疫学的に活性な組換えタンパク質として製造されている（６）。さらに、ｒＰｈｌ  ｐ２の三次元構造が、最近、ＮＭＲ分析によって決定されており、免疫グロブリン様ドメインの構造的特徴に類似していることが見出された（８）。
【０００４】
Ｉ型アレルギーに特異的な治療は、基本的には、能動的な予防接種および受動的な予防接種により行うことができる。特異的な免疫療法が、能動的なワクチン接種により行われ、アレルゲンに対する非応答性が誘導される。特異的免疫療法の免疫学的機構は、１９１１年から成功的に実施されているが、完全には理解されていない（９、１０）。考えられる機構として、ＩｇＥアレルゲンの相互作用を妨げるＩｇＧクラスの阻止抗体の誘導、Ｔ細胞およびエフェクター細胞の応答の調節、ならびに寛容性の生成が議論されている（１１）。能動的なワクチン接種とは対照的に、受動的なワクチン接種は、保護的な免疫グロブリンの移入に基づいており、多くの感染性疾患（例えば、肝炎）に対する日常的な処置である。Ｉ型アレルギーの処置に対する「受動的な予防接種」の治療効率は、６０年以上前の古典的な実験によって明らかにされている。１９３５年に、Ｃｏｏｋｅおよび共同研究者らは、特異的免疫療法による処置に成功した患者から得られた血液を輸血することによる花粉症患者の治療を報告した（１２）。その数年後、Ｌｏｖｅｌｅｓｓは、Ｃｏｏｋｅにより報告された保護的な効果は、阻止抗体によることを明らかにした（１３）。なぜ阻止抗体がＩ型アレルギーの受動的治療に有用であり得るかについてはいくつか議論されている。第１に、ＩｇＥは、容易に競合し得る免疫グロブリンの最も重要性のない豊富なクラスである。第２に、アレルギー反応は、阻止抗体またはＩｇＥアレルゲン相互作用の他の競合因子を容易に適用することができ、全身適用の必要性がない標的器官（鼻、眼、肺、皮膚）において生じている。しかしながら、Ｉ型アレルギーの処置のために「受動的な予防接種の概念」を適用するためには、アレルゲンの特徴づけおよび抗体技術の分野での進歩が必要である。
【発明の開示】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、Ｉ型アレルギーの診断および免疫療法に好適なヒトＩｇＥ−Ｆａｂを提供する。
【０００６】
第１の態様において、本発明は、配列番号２Ａから２Ｂに示すアミノ酸配列またはその本質的に相同な変異体を有する、第２群アレルゲン（すなわち、種々のイネ科植物種およびトウモロコシ種に由来する花粉アレルゲン）に特異的なヒトＩｇＥのＦａｂを提供する。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、配列番号１Ａから１Ｂに示す核酸配列またはその本質的に相同な変異体によってコードされる、第２群アレルゲンに特異的なヒトＩｇＥのＦａｂを提供する。例えば、遺伝コードの縮重によって生じた変異体。本発明はまた、上記ＩｇＥ  Ｆａｂの可変領域を含む、第２群アレルゲンに特異的なヒトＩｇＧを提供する。好ましくは、本発明の完全なＩｇ分子はＩｇＧ１サブタイプである。本発明者らは、知られているベクターシステムを使用して、本発明のＩｇＥ  Ｆａｂの可変領域をヒトＩｇＧ１につないだ。驚くべきことに、これらの完全なＩｇＧ１抗体は、Ｐｈｌ  ｐ２により誘導される患者好塩基球の脱顆粒を強く抑制する。このことは、臨床適用に対するそれらの可能性を示している。
【０００８】
本発明によるＩｇＥ−Ｆａｂおよび／または完全なＩｇは、Ｐｈｌ  ｐ２（すなわち、オオアワガエリ由来の花粉）に対するものであるが、いくつかの他の花粉アレルゲンと交差反応する。本発明によるＩｇＥ−Ｆａｂおよび／または完全なＩｇは組換え製造することができる。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、本発明によるＩｇＥ−Ｆａｂおよび／または完全なＩｇを含む診断試薬に関する。あるいは、試薬は、対応する完全な抗体、および／または前記のＦａｂおよび／または抗体の修飾体を含む。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、上記に示された試薬を含む診断キットに関する。キットは、免疫アッセイを行うための任意の従来のキットであり得る。
【００１１】
第５の態様において、本発明は、本発明によるＩｇＥ−Ｆａｂおよび／または完全なＩｇを含む、Ｉ型アレルギーに対するワクチンに関する。
【００１２】
本発明によるＰｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび／または完全なＩｇならびにワクチンの好ましい使用は、Ｉ型アレルギーの受動的免疫療法のためである。この使用は予防目的または治療目的であり得る。
【００１３】
本発明によるＰｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび／または完全なＩｇの別の使用は、Ｉ型アレルギーを診断するためである。
【００１４】
本発明によるＰｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび／または完全なＩｇのさらなる使用は、環境アレルゲンを検出するためである。
【００１５】
さらに、本発明によるＰｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ−Ｆａｂおよび／または完全なＩｇのさらなる使用は、アレルゲン抽出物を標準化するためである。
【００１６】
ＩｇＥアレルゲンとの相互作用を妨げるヒト起源の特異的な競合因子を得るために、本発明者らはコンビナトリアルライブラリー技術（１４）を使用した。ＩｇＥコンビナトリアルライブラリーをイネ科植物花粉アレルギー患者のリンパ球から構築した（１５）。本発明は、第２群イネ科植物花粉アレルゲンに対して特異性を有するヒトＩｇＥ  Ｆａｂを提供する。本発明のヒトＩｇＥ  Ｆａｂは、その定常領域を有しておらず、従って、エフェクター細胞を活性化して、生物学的に活性な媒介因子を放出させることができない。第２群アレルゲンにおけるＩｇＥ  Ｆａｂの結合部位が、主要なオオアワガエリ花粉アレルゲン（Ｐｈｌ  ｐ２）の組換えフラグメントを使用してマッピングされ、そしてＩｇＥ  Ｆａｂと、種々のイネ科植物種およびトウモロコシ種に由来する第２群アレルゲンとの交差反応性が調べられた。さらに、Ｐｈｌ  ｐ２に特異的なＩｇＥ  Ｆａｂは、第２群アレルゲンを含有する花粉を粒子ブロッティングによって確認するために有用である。ＥＬＩＳＡ競合実験によって、イネ科植物花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体のＰｈｌ  ｐ２に対する結合をＩｇＥ  Ｆａｂが阻止する能力が分析された。環境アレルゲン負荷の検出、診断用および治療用のアレルゲン抽出物の標準化、ならびにイネ科植物花粉アレルギーの受動的治療のために組換え第２群特異的ＩｇＥ  Ｆａｂが有用であることが議論される。
（発明の詳細な説明）
【００１７】
材料および方法
生物学的材料、患者血清および抗体
ハルガヤ、オートムギ、ギョウギシバ、ライグラス、ヨシ、ハナガグサ、ライムギ、コムギおよびトウモロコシの花粉は、Ａｌｌｅｒｇｏｎ（Ｖａｌｉｎｇｅ、スウェーデン）から購入した。血清は、病歴、皮膚針試験、ＲＡＳＴによって、そして記載（１６）されるような組換えイネ科植物花粉アレルゲンとの試験によって特徴づけられたイネ科植物花粉アレルギー患者から集めた。非アレルギー者の血清が陰性コントロールとして含められた。１２５Ｉで標識された抗ヒトＩｇＥ抗体（ＲＡＳＴ）をＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）から得た。
【００１８】
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から入手し、プラスミドｐＣｏｍｂ３（１７）の改変体であるプラスミドｐＣｏｍｂ３ＨをＣａｒｌｏｓ  Ｆ．Ｂａｒｂａｓ（Ｓｃｒｉｐｐｓ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から譲り受けた。アルカリホスファターゼ結合のヤギ抗ヒトＦａｂ抗血清およびヤギ抗マウスＦａｂ抗血清は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。
【００１９】
ＩｇＥ  Ｆａｂおよび軽鎖をコードするｃＤＮＡの配列分析
Ｐｈｌ  ｐ２に対して特異性を有する抗体フラグメントを発現する３つのファージクローンを、記載（１５）されているようにｒＰｈｌ  ｐ２に対するパンニングによって単離した。３つのクローンはすべて、ＥＬＩＳＡによってＰｈｌ  ｐ２特異的Ｆａｂの産生について、そして制限分析によって重鎖フラグメントおよび軽鎖をコードする正しいｃＤＮＡの挿入について調べられ、その後、配列決定された。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎチップ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して組換え大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅから調製された。両方のＤＮＡ鎖を、プライマーウォーキング（１８）によって、３５Ｓ−ｄＣＴＰ（ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮ、Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ、英国）およびＴ７ポリメラーゼ配列決定キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して配列決定した。配列決定用プライマーはＭＷＧ（ＭＷＧ  ＡＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）から得た。重鎖フラグメントおよび軽鎖のＰｈｌ  ｐ２特異的なＤＮＡ配列は、Ｖ  Ｂａｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）に寄託されている生殖系列配列と比較された。
【００２０】
大腸菌におけるｒＰｈｌ  ｐ２特異的Ｆａｂの発現
ｒＰｈｌ  ｐ２特異的Ｆａｂを発現するｐＣｏｍｂ３Ｈプラスミドを含有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＳＢ培地で、０．６〜１のＯ．Ｄ．６００ｎｍまで３７℃で増殖させた。１．５ｍＭのＩＰＴＧによる誘導の後、細胞を３２℃で４時間インキュベーションした。誘導後の大腸菌を４℃で２０分間の５０００ｒｐｍでの遠心分離によって集め、上清をＥＬＩＳＡ分析のために−２０℃で保存した。細胞を、１ｍＭのＰＭＳＦを含有するＰＢＳに再懸濁し、ウルトラツラックス（Ｉｋａ、Ｓｔａｕｆｆｅｎ、ドイツ）を用いてホモジネーションして、４℃で２０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離した（抽出物）。抽出物を、記載（１５）されるように、ｒＰｈｌ  ｐ２の結合能力についてＥＬＩＳＡアッセイで試験した。
【００２１】
ヒトＩｇＥ  Ｆａｂの結合部位をマッピングするためのＰｈｌ  ｐ２アレルゲンの組換えフラグメントの発現
β−ガラクトシダーゼ融合の完全なＰｈｌ  ｐ２および様々なＰｈｌ  ｐ２フラグメントを発現するラムダｇｔ１１ファージクローンを記載（８）されるように作製した。大腸菌Ｙ１０９０を、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有するＬＢ平板にコンフルエンスな生育層として平板培養した（１９）。１０６プラーク形成単位を越える各ファージクローンを含有するファージ溶解物の２μｌ量を規定された順序で大腸菌生育層にドットして、プラークが見えるまで平板を４３℃でインキュベーションした。組換えタンパク質の合成を、１０ｍＭのＩＰＴＧに浸したニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）をさらに４時間重ねることによって誘導した。ＩｇＥ  Ｆａｂと反応するクローンを免疫スクリーニングによって同定した。この目的のために、フィルターを、室温において、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＴＢＳＴで、５分間にわたり２回、そして３０分間にわたり１回洗浄し、その後、抗Ｐｈｌ  ｐ２のＦａｂを含有する大腸菌抽出物とのプロービングを、そしてコントロール目的については空のｐＣｏｍｂ３Ｈプラスミドで形質転換された大腸菌から得られた抽出物とのプロービンングを４℃で一晩行った。洗浄後、Ｆａｂを、ＴＢＳＴ／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１：５０００希釈されたアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＦａｂ抗血清を用いて検出した。
【００２２】
天然花粉抽出物の調製；免疫ブロッティングによる第２群アレルゲンの同定
それぞれのイネ科植物種およびトウモロコシ種の１００ｍｇの花粉を５ｍｌのＳＤＳサンプル緩衝液に別々に再懸濁して、ウルトラツラックス（ＩＫＡ、Ｓｔａｕｆｆｅｎ、ドイツ）を用いて１分間ホモジネーションし、９５℃で５分間煮沸し、そして１４５００ｒｐｍで５分間遠心分離して不溶物を除いた。その後、同じ量のタンパク質抽出物（１００μｇ／スロット）を還元条件下での１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）にブロットした（２０〜２２）。
【００２３】
種々のイネ科植物種およびトウモロコシ種に由来するブロットされた花粉抽出物を含有するニトロセルロースメンブランを、室温において、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＴＢＳＴで、５分間にわたり２回、そして３０分間にわたり１回ブロッキングし、その後、Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂを含有する細菌抽出物に４℃で一晩さらした。洗浄後、メンブランを、それぞれ、ＴＢＳＴ／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１：５０００希釈されたアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＦａｂ抗血清とインキュベーションして、結合したＦａｂを検出した。
【００２４】
粒子ブロッティング
ハルガヤ、オートムギ、ギョウギシバ、ライグラス、オオアワガエリ、ヨシ、ハナガグサ、ライムギ、コムギ、トウモロコシおよびカバノキ（コントロール）の花粉粒子を、爪楊枝を使用して、規定された順序でニトロセルロースメンブランに付けた。メンブランを、水に浸けたＷｈａｔｍａｎ紙の上に半時間置き、アレルゲンを放出させた。放出されたタンパク質が、記載（１９）されるようにポンソーＳ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）により検出された。第２群アレルゲンが、免疫ブロッティングについて記載されているように、Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂにより検出された。主要なカバノキ花粉アレルゲン（Ｂｅｔ  ｖ１）を放出する花粉粒子を同定するために、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＦａｂ抗血清（Ｐｉｅｒｃｅ）により検出される組換えマウス抗Ｂｅｔ  ｖ１  Ｆａｂが使用された。
【００２５】
ＩｇＥ競合実験
イネ科植物花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体がＰｈｌ  ｐ２に結合することを阻害するＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂの能力を、免疫ブロット競合実験によって調べた。等量のブロットされたｒＰｈｌ  ｐ２（１μｇ／ｃｍ）を含有するニトロセルロースのストリップを、室温において、緩衝液Ａ（０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０および０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）で、５分間にわたり２回、そして３０分間にわたり１回ブロッキングし、その後、Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂを含有する細菌抽出物とのプレインキュベーションを、そしてコントロール目的については抗Ｐｈｌ  ｐ５のＩｇＥ  Ｆａｂを含有する細菌抽出物とのプレインキュベーションを、（両方とも５μｇ／ｍｌの濃度で）４℃で一晩行った。洗浄後、ストリップを、緩衝液Ａで１：５希釈されたイネ科植物花粉アレルギー患者血清と４℃で一晩インキュベーションした。結合したＩｇＥ抗体を、１２５Ｉで標識された抗ヒトＩｇＥ抗体（ＲＡＳＴ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検出し、結合したＩｇＥ抗体の量をガンマカウンター（１２７７Ｇａｍｍａｍａｓｔｅｒ、ＬＫＢ、Ｗａｌｌａｃ）でのガンマ計数によって定量した。すべての実験は二連として行われ、偏差は１０％未満であり、結果は平均値を表す。ＩｇＥ結合の阻害率が、競合するＦａｂの存在下または非存在下で測定された平均ｃｐｍ値から計算された。阻害率＝１００−ｃｐｍＦａｂ×１００／ｃｐｍコントロール。
【００２６】
結果
結果が、添付された配列表および図面とともに下記において議論される。
【００２７】
配列番号１。ＩｇＥ  ＦａｂのＤＮＡ配列比較。配列番号１Ａは、クローン９４の重鎖ＤＮＡ配列と、クローン６０およびクローン１００の重鎖ＤＮＡ配列とのアラインメントを示す。配列番号１Ｂは、３つの軽鎖ｃＤＮＡの配列アラインメントを示す。ＸｈｏＩ部位およびＳｃａＩ部位が斜体字で印刷される。骨格領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）および超可変領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）には印が付けられている。同一アミノ酸はダッシュにより示される。
【００２８】
配列番号２。アミノ酸配列アラインメント。配列番号２Ａは、３つのＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂ（クローン６０、クローン９４、クローン１００）に由来する重鎖アミノ酸配列と、相同的なヒトＩｇＭリウマトイド因子の重鎖のアミノ酸配列（アクセション番号：Ｙ１４９３６）とのアラインメントを示す。配列番号２Ｂは、ＩｇＥ  Ｆａｂ由来の軽鎖と、抗Ｒｈ（Ｄ）抗体（ＡＦ０４４４６２）および２つのリウマトイド因子（Ｓ５６１９９、Ｓ６７０５９）に由来する３つの相同的軽鎖とのアミノ酸配列アラインメントを示す。骨格領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）および超可変領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）には印が付けられ、同一アミノ酸はダッシュにより示される。
【００２９】
３つのＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂは、種々の軽鎖で組み換えられている非常に関連する重鎖フラグメントを含有する：自己抗体との配列相同性
３つの重鎖フラグメント（クローン９４、６０、１００）の骨格領域ならびに相補性決定領域は同じサイズであった。（配列番号１Ａ）およびそれらのＶＨ領域はＶＨ４ファミリーのメンバー（例えば、アクセション番号：Ｕ７１１０６；２３）と最大の類似性を示した。これらの３クローンの重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのアラインメントは、これらのクローンが数ヌクレオチドでのみ異なることを示している（クローン９４対クローン６０については３４２ｂｐのうち２７ｂｐ、８％；クローン９４対クローン１００については３４２ｂｐのうち１８ｂｐ、５％；クローン６０対クローン１００については３４２ｂｐのうち９ｂｐ、３％）。ヌクレオチド交換は、骨格およびＣＤＲを含む完全な可変領域全体に等しく分布していた（配列番号１Ａ）。
【００３０】
軽鎖ｃＤＮＡの配列分析により、それらがカッパファミリーに属することが明らかにされた。３つの軽鎖の配列比較により、重鎖間で認められるよりもはるかに大きい変化が示された（配列番号１Ｂ）。ヌクレオチド変化のほんどがＣＤＲ１（９％から３３％）およびＣＤＲ３（２５％から３３％）において認められた。
【００３１】
３つのｒＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂクローンの重鎖フラグメントの可変領域の推定アミノ酸配列の比較が配列番号２Ａに示す。クローン６０およびクローン１００は非常に類似している（９５％の配列同一性）が、８６％および８８％のよりゆるやかな配列同一性が、それぞれ、クローン６０とクローン９４との間およびクローン９４とクローン１００との間で認められた。少数のアミノ酸交換は、ときには保存的な交換ではなく、３つのクローンの骨格領域および相補性決定領域の全体に等しく分布していた（図２Ａ）。知られているヒト可変領域と比較し、驚くほどの配列類似性が、ヒトＩｇＭリウマトイド因子（アクセション番号：Ｙ１４９３６；２４）に対して見出された（図２Ａ）。ＩｇＥ  Ｆａｂおよびリウマトイド因子の重鎖フラグメント間で配列および長さが完全に異なるＣＤＲ３領域を除いて、比較するに値する配列同一性が、ＩｇＥ  Ｆａｂおよびリウマトイド因子の４つの骨格領域のすべてについて、およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２について見出された（配列番号２Ａ）。
【００３２】
配列番号２Ｂは、３つのクローンの軽鎖の推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの軽鎖のアミノ酸配列は、かなりの配列変化を、特にＣＤＲ１（２７％から４６％）およびＣＤＲ３（５６％）において示した。ＣＤＲ２領域は１つまたは２つのアミノ酸交換において異なるだけであり、そして骨格領域でもまた、少数のアミノ酸交換が認められるだけであった（ＦＲＷ１では１０％未満、ＦＲＷ２では１４％未満、ＦＲＷ３では１０％未満）（配列番号２Ｂ）。
【００３３】
３つのＩｇＥ  Ｆａｂに由来する軽鎖は、ヒト自己抗体、すなわち、ヒト抗Ｒｈ（Ｄ）抗体由来の自己抗体（アクセション番号：ＡＦ０４４４６２；２５）および２つのヒトリウマトイド因子（アクセション番号Ｓ５６１９９、同Ｓ６７０５９；２６、２７）に由来する軽鎖との興味深いアミノ酸配列類似性を示した。
【００３４】
ＩｇＥ  Ｆａｂの可変領域における体細胞変異は抗原により駆動される選択プロセスを示す
図１Ａには、クローン９４の重鎖フラグメントの可変領域のＤＮＡ配列と、非常に関連する生殖系列配列（アクセション番号：Ｚ１２３６５；Ｖ遺伝子、ＦＲ１〜ＦＲ３；Ｘ９７０５１；Ｄ遺伝子、ＣＤＲ３；Ｘ８６３５５；Ｊ遺伝子、ＣＤＲ３＋  ＦＲ４）（２２〜２４）との比較が示される。合計で、本発明者らは２６個のヌクレオチド交換を見出し、そのうちの１１％（１０／９３）がＣＤＲにおいて見出され、７％（１６／２４３）が骨格領域において認められた。これらの変異のうち５つはサイレントであったが、１８個の変異はアミノ酸交換をもたらしていた。
【００３５】
クローン９４の軽鎖の可変領域ＤＮＡ配列と、密接に関連する生殖系列配列（アクセション番号：Ｘ９３６２７；Ｖ遺伝子、ＦＲ１〜ＣＤＲ３；Ｊ００２４２；ＣＤＲ３＋  ＦＲ４；２５、２６）との比較を図１Ｂに示す。本発明者らは１８個のヌクレオチド交換を見出し、そのうちの１１％（９／８１）がＣＤＲに存在し、４％（９／２２８）が骨格領域に存在した。ほとんどの変異がＣＤＲ３おいて見出された。
【００３６】
Ｐｈｌ  ｐ２のＮ末端の６４アミノ酸を含む組換えフラグメントはＩｇＥ  Ｆａｂに対する結合部位を含有する
ｒＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂに対する結合部位を決定するために、ニトロセルロースにドットされた完全なβ−ｇａｌ融合ｒＰｈｌ  ｐ２アレルゲン（９６アミノ酸）、最初の６４アミノ酸部分（１〜６４）を含むＮ末端のｒＰｈｌ  ｐ２フラグメント、および６９アミノ酸長のＣ末端ｒＰｈｌ  ｐ２フラグメント（２８〜９６アミノ酸）をＦａｂにさらした（図２Ａ）。図２Ｂに、免疫グロブリンドメインに類似し、主にβシート構造からなる完全なＰｈｌ  ｐ２アレルゲンのリボン表示を示す。Ｎ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントがモデルに示されている（図２Ｂ）。これらの２つのフラグメントはＩｇＥ反応性ドメインとしてすでに同定されていたが、それよりも小さいフラグメントはＩｇＥ結合能を示さなかった（８）。クローン９４について例示されるように、３つのＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂはすべて、完全なｒＰｈｌ  ｐ２（１）およびＮ末端のｒＰｈｌ  ｐ２フラグメント（２）を認識したが、Ｃ末端フラグメント（３）またはλｇｔ１１ファージのコントロールタンパク質（４）には結合しなかった（図２Ｃ）。空のｐＣｏｍｂ３Ｈプラスミドで形質転換された細菌から得られた細菌抽出物は、ドットされたタンパク質のいずれとも反応しなかった（図２Ｃ）。Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂと、以前に記載されたより小さいＰｈｌ  ｐ２フラグメントとの非反応性（８）が認められた（データ示さず）。
【００３７】
抗Ｐｈｌ  ｐ２のＩｇＥ  Ｆａｂは、イネ科植物およびトウモロコシの７つの種に由来する天然の第２群アレルゲンと交差反応し、粒子ブロッティングによって第２群アレルゲン含有花粉を同定する
組換えヒトＩｇＥ  Ｆａｂが種々のイネ科植物種およびトウモロコシ種に由来する天然の第２群アレルゲンと交差反応するかどうかを調べるために、ニトロセルロースにブロットされた、いくつかのイネ科植物種およびトウモロコシ種に由来する天然花粉抽出物を試験した（図３）。ＩｇＥ  Ｆａｂは、ハルガヤ、ライグラス、ハナガグサ、ライムギおよびコムギにおいて第２群アレルゲンと強く反応した。弱い反応性がオートムギおよびヨシに関して認められただけであった。第２群アレルゲンを有しないこと、または低レベルの第２群アレルゲンを含有することが報告されている単子葉植物から得られた花粉抽出物との反応性は認められなかった（ギョウギシバ、トウモロコシ）（１６）。
【００３８】
花粉アレルゲン負荷の環境測定が、現在、空気サンプリングおよび花粉形態学の分析によって行われている。本発明者らは、Ｐｈｌ  ｐ２特異的Ｆａｂが、第２群アレルゲンを含有する花粉粒子を粒子ブロッティングによって免疫学的に同定するために使用できることを明らかにしている（図４）。１０個の異なるイネ科植物種およびカバノキに由来する、メンブランに結合させた花粉粒子を、水和後、タンパク質を放出し、これらのタンパク質をポンソーＳにより染色した（図４Ａ）。Ｐｈｌ  ｐ２特異的Ｆａｂにより、第２群アレルゲンを含有するイネ科植物花粉粒子だけが同定された（ハルガヤ、ライグラス、ハナガグサ、ライムギ、コムギおよびオートムギ）（図４Ｂ）。主要なカバノキ花粉アレルゲン（Ｂｅｔ  ｖ１）に対する特異性を有するマウスＦａｂはカバノキ花粉のみと反応した。これにより、このアッセイの特異性が確認された（図４Ｃ）。
【００３９】
Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂはイネ科植物花粉アレルギー患者のＩｇＥ抗体のＰｈｌ  ｐ２に対する結合を阻害する
表１には、Ｐｈｌ  ｐ５特異的ＩｇＥ  Ｆａｂ（コントロール）とのプレインキュベーションに対して、Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  ＦａｂとプレインキュベーションされたニトロセルロースブロットのｒＰｈｌ  ｐ２に対する、２７名のイネ科植物花粉アレルギー患者から得られた血清のＩｇＥ結合の定量が示されている（表１）。１４名の血清（５２％）では、Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂとのプレインキュベーションにより、血清ＩｇＥの結合が５０％未満に低下した（表１）。１０名の血清（３８％）では、ＩｇＥ結合の減少が３０％から５０％であり、残る３名の血清（１０％）では、２２％から２９％のＩｇＥ結合の減少を達成することができた（表１）。５２％の範囲におけるＰｈｌ  ｐ２に対するＩｇＥ結合の平均阻害が、Ｐｈｌ  ｐ２をＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂとプレインキュベーションしたときに達成された（表１）。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
考察
本発明者らにより、非常に重要な環境アレルゲンの１つである主要オオアワガエリ花粉アレルゲン（Ｐｈｌ  ｐ２）に対して特異性を有する３つのヒトＩｇＥ抗体フラグメントの分子的および免疫学的な特徴づけが報告される。これらのＩｇＥ  Ｆａｂは、イネ科植物花粉アレルギー患者のリンパ球から構築されたＩｇＥコンビナトリアルライブラリーから、組換えＰｈｌ  ｐ２に対するパンニングによって単離された。配列分析により、３つの重鎖フラグメントはすべてがＶＨ４ファミリーに属し、互いに密接に関連することが明らかにされた（２３）。重鎖の可変領域は、少数のアミノ酸配列変化が骨格領域および相補性決定領域の全体に等しく分布しているが、カッパ軽鎖は、関連性があまりなく、著しい配列変化をＣＤＲ１ドメインおよびＣＤＲ３ドメインにおいて示した。本発明者らは、主要なオオアワガエリ花粉アレルゲンに対して特異性を有するＩｇＥ  Ｆａｂは、種々の軽鎖と組み換えられている同一の重鎖フラグメントからなることを既に以前に見出していた（１５）。さらに、Ｐｈｌ  ｐ５特異的ＩｇＥの重鎖フラグメントは、異なる特異性を有する抗体に由来する軽鎖と組み換えることができるが、抗原特異性は保持されることが明らかにされている（１５、ＬａｆｆｅｒおよびＶａｌｅｎｔａ、未発表データ）。また、本発明者らの研究によれば、類似した重鎖フラグメントは、種々の軽鎖と組み換えることができるが、元のアレルゲンに対する特異性は保持されることが示される。本発明者らは、詳細には、本発明者らがコンビナトリアルライブラリー法によって単離したそのような重鎖および軽鎖の組合せが、ライブラリーの構築のために使用されたアレルギー患者において存在するという証拠を有していないが、後者の発見により、ある種のＩｇＥ抗体の特異性が重鎖によって決定され、そして軽鎖の無差別的な使用が、アレルゲン特異性を失うことなく可能であるという推測が裏づけられる。これに関連して、３つのＩｇＥ  Ｆａｂのすべてが、Ｐｈｌ  ｐ２のＮ末端の６４アミノ酸を含む同じ組換えフラグメントに結合したことは注目される。
【００４２】
Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂの重鎖フラグメントならびに軽鎖と、ヒト自己抗体（リウマトイド因子、抗Ｒｈ（Ｄ）抗体）との密接な配列類似性は、Ｐｈｌ  ｐ２の最近決定された三次元構造が、ヒトに存在する免疫グロブリン様ドメインとの予想外の類似性を示したという事実（８）の観点から、注目される。これまでのところ、本発明者らは、ＩｇＥ  Ｆａｂがヒトタンパク質と反応し得るという証拠を有していないが、様々なイネ科植物種およびトウモロコシ種から得られた花粉抽出物を用いて試験したとき、本発明者らは、第２群アレルゲンとの広範囲の交差反応性を見出した。従って、組換えＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂは、環境中の第２群アレルゲンの負荷量を測定するために使用することができ、従って、予防的処置のために有用であると考えられる。さらに、組換えＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂは、イネ科植物アレルギーの診断および処置のために現在使用されている天然アレルゲン抽出物における第２群アレルギーの測定および標準化のために使用することができる。Ｐｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  ＦａｂがＰｈｌ  ｐ２の主要なエピトープ含有ドメインと反応して、イネ科植物花粉アレルギー患者（ｎ＝２７）の完全なＩｇＥ抗体のＰｈｌ  ｐ２に対する結合を強く阻害した（５２％の平均阻害）という本発明者らの発見は、これらのＦａｂの治療的可能性を示している。これらのＦａｂがアトピーの標的器官における上皮細胞または抗原提示細胞に結合し得る場合、侵入するアレルゲンに対する安定した防御線を築くこと、そしておそらくはエフェクター細胞を活性化することなく、抗原提示細胞のタンパク質分解性区画内に直接Ｆａｂを差し向けることさえ可能になり得る。後者の方法は、タンパク質分解を介してアレルゲンを不活性化し得るだけでなく、予防的な粘膜免疫性の誘導のためにも有用であり得る。
【００４３】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】クローン９４の、密接に関連する生殖系列配列（アクセション番号が左端に印刷されている）との可変重鎖ＤＮＡ配列の比較である。ＣＤＲおよびＦＲの位置が示されている。ヌクレオチドはアミノ酸コードのトリプレットでグループ化されており、同一ヌクレオチドはダッシュによって示されている。
【図１Ｂ】クローン９４の、密接に関連する生殖系列配列（アクセション番号が左端に印刷されている）との可変軽鎖ＤＮＡ配列の比較である。ＣＤＲおよびＦＲの位置が示されている。ヌクレオチドはアミノ酸コードのトリプレットでグループ化されており、同一ヌクレオチドはダッシュによって示されている。
【図２Ａ】図２は、Ｐｈｌ  ｐ２アレルゲンにおけるＰｈｌ  ｐ２特異的ヒトＩｇＥ  Ｆａｂの結合部位のマッピングを示す。Ｎ末端の６４アミノ酸およびＣ末端の６９アミノ酸を含む組換えＰｈｌ  ｐ２フラグメントの概略（図２Ａ）。
【図２Ｂ】図２は、Ｐｈｌ  ｐ２アレルゲンにおけるＰｈｌ  ｐ２特異的ヒトＩｇＥ  Ｆａｂの結合部位のマッピングを示す。図２Ｂは、Ｎ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントが示されるＰｈｌ  ｐ２アレルゲンの三次元構造のリボン表示を示す。
【図２Ｃ】図２は、Ｐｈｌ  ｐ２アレルゲンにおけるＰｈｌ  ｐ２特異的ヒトＩｇＥ  Ｆａｂの結合部位のマッピングを示す。図２Ｃは、完全なｒＰｈｌ  ｐ２（１）、Ｎ末端のＰｈｌ  ｐ２由来フラグメント（２）、Ｃ末端のＰｈｌ  ｐ２由来フラグメント（３）およびβ−ｇａｌ単独（４）を含有するニトロセルロースフィルターに対するクローン９４由来のＩｇＥ  Ｆａｂの結合を示す。コントロール目的のために、フィルターに結合したクローンは、空のプラスミド（ｐＣｏｍｂ３Ｈ）で形質転換された細菌の抽出物にさらされた。
【図３】図３は、ｒＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂが、種々のイネ科植物に由来する天然の第２群アレルゲンと交差反応することを示す。ｒＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂが、ニトロセルロースにブロットされたイネ科植物花粉抽出物との反応性について試験された（Ａｎｔ  ｏ：ハルガヤ；Ａｖｅ  ｓ：オートムギ；Ｃｙｎ  ｄ：ギョウギシバ；Ｌｏｌ  ｐ：ライグラス；Ｐｈｒ  ｃ：ヨシ；Ｐｏａ  ｐ：ハナガグサ；Ｓｅｃ  ｃ：ライムギ；Ｔｒｉ  ｓ：コムギ；Ｚｅａ  ｍ：トウモロコシ；Ｐｈｌ  ｐ：オオアワガエリ）。１４．３ｋＤａマーカーの位置が右端に矢印によって示される。
【図４】図４は、第２群アレルゲンを含有する花粉粒子の粒子ブロッティングによる検出を示す。１０個の異なる単子葉植物（Ａｎｔ  ｏ：ハルガヤ；Ａｖｅ  ｓ：オートムギ；Ｃｙｎ  ｄ：ギョウギシバ；Ｌｏｌ  ｐ：ライグラス；Ｐｈｌ  ｐ：オオアワガエリ；Ｐｈｒ  ｃ：ヨシ；Ｐｏａ  ｐ：ハナガグサ；Ｓｅｃ  ｃ：ライムギ；Ｔｒｉ  ｓ：コムギ；Ｚｅａ  ｍ：トウモロコシ）の花粉粒子およびカバノキ（Ｂｅｔ  ｖ）の花粉粒子がニトロセルロースにドットされた。放出されたタンパク質がポンソーＳによって染色された（Ａ）。第２群アレルゲンがＰｈｌ  ｐ２特異的ＩｇＥ  Ｆａｂによって検出され（Ｂ）、主要なカバノキ花粉アレルゲン（Ｂｅｔ  ｖ１）が特異的なＦａｂによって検出された（Ｃ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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