(57)【要約】本発明は、ここではｈＳＰＰ１と称する、ヒトスフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼのポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。該ポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用して、発現ベクター、該ベクターを含有する宿主細胞、プローブとプライマー、ｈＳＰＰ１タンパク質及びそのポリペプチドに対する抗体、ｈＳＰＰ１の存在又は発現に関するアッセイ、及びｈＳＰＰ１と相互作用する化合物の同定のためのアッセイをさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド、及び
（ｄ）ストリンジェント条件下で（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド
から成る群より選択される組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、天然、非天然及び修飾ヌクレオチドから成る群より選択されるヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヌクレオチド間の結合が天然及び非天然結合から成る群より選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）適当な宿主細胞を請求項４に記載の発現ベクターで形質転換すること、及び
（ｂ）該発現ベクターからの該ｈＳＰＰ１タンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含む、組換え宿主細胞からｈＳＰＰ１タンパク質を発現するための方法。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する組換えポリペプチド。
【請求項８】
（ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）配列番号１からのコード配列を有するポリヌクレオチド
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有する少なくとも１つの宿主細胞を提供すること、
（ｂ）候補化合物とｈＳＰＰ１ポリペプチドの相互作用が起こりうるように該細胞の少なくとも１つを候補化合物に接触させること、及び
（ｃ）候補化合物の存在下でのポリペプチドの相対活性を調べることによって候補化合物がｈＳＰＰ１ポリペプチドのインヒビターであるかどうかを判定すること
を含む、候補化合物がｈＳＰＰ１ポリペプチドのインヒビターであるかどうかを判定する方法。
【請求項９】
段階（ｃ）において、段階（ｂ）以前の少なくとも１つの細胞のｈＳＰＰ１ポリペプチド活性の測定を、段階（ｂ）以後の少なくとも１つの細胞のｈＳＰＰ１ポリペプチド活性の測定と比較することによって相対活性を判定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するｈＳＰＰ１ポリペプチドを含む試料を提供すること、
（ｂ）候補化合物とｈＳＰＰ１ポリペプチドの相互作用が起こりうるように該試料を候補化合物に接触させること、及び
（ｃ）候補化合物の存在下でのｈＳＰＰ１ポリペプチドの相対活性を調べることによって候補化合物がｈＳＰＰ１ポリペプチドのインヒビターであるかどうかを判定すること
を含む、候補化合物がｈＳＰＰ１ポリペプチドのインヒビターであるかどうかを判定する方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ｃ）において、段階（ｂ）以前の試料のｈＳＰＰ１ポリペプチド活性の測定を、段階（ｂ）以後の試料のｈＳＰＰ１ポリペプチド活性の測定と比較することによって相対活性を判定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ｈＳＰＰ１遺伝子を含むトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトスフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼ、該酵素をコードするポリヌクレオチド及びヒトスフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼによるスフィンゴシン−１−リン酸の異化作用を測定するアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴシン−１−リン酸（ＳＰＰ）は、様々な生物学的プロセスを調節する生物活性スフィンゴ脂質代謝産物である（Ｇｏｅｔｚｌら（１９９８）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２、１５８９−１５９８及びＳｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．（１９９９）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６５、３４１−３４４において総説されている）。その作用の多くは、ＥＤＧ（内皮細胞分化遺伝子）受容体として知られている、特異的細胞表面Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のファミリーによって仲介されると報告されている。報告によれば、内皮細胞上に発現されたＥＤＧ−１へのＳＰＰの結合は、生存率（Ｈｉｓａｎｏら（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９３、４２９３−４２９９）、化学走性とインビトロでの血管新生（Ｗａｎｇら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３５３４３−３５３５０）及び形態形成分化を導く接着接合構築（Ｌｅｅら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９、３０１−３１２）を増強するのに対し、ＥＤＧ−５及びＥＤＧ−３へのＳＰＰの結合は神経突起退縮とソーマラウンディング（ｓｏｍａ  ｒｏｕｎｄｉｎｇ）を誘導することが報告されている（Ｐｏｓｔｍａら（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５、２３８８−２３９３及びＶａｎ  Ｂｒｏｃｋｌｙｎら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、４６２６−４６３２）。さらなる研究では、ＳＰＰが心房筋細胞においてＧｉ依存性内向き整流性Ｋ＋チャネルの活性化を誘導し（ｖａｎ  Ｋｏｐｐｅｎら（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、２０８２−２０８７）、まだ特性付けられていないＧＰＣＲを通して黒色腫細胞の運動性を阻害する（Ｙａｍａｍｕｒａら（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６、１０７５１−１０７５９）ことが示唆されている。
【０００３】
ＳＰＰはまた、細胞の内部で重要な役割を果たすと記述されている。様々な外部刺激に応答して、スフィンゴシンからＳＰＰへのリン酸化を触媒する酵素、スフィンゴシンキナーゼが活性化される（Ｏｌｉｖｅｒａら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５、５５７−５６０；Ｃｈｏｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０、６３４−６３６；Ｍｅｌｅｎｄｅｚら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，９３９３−９４０２；Ｘｉａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５、１４１９６−１４２０１；Ｋｌｅｕｓｅｒら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８、１８１７−１８２４及びＭｅｙｅｒ  ｚｕ  Ｈｅｒｉｎｇｄｏｒｆら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７、２８３０−２８３７）。次に細胞内ＳＰＰがＩｎｓＰ３非依存的に内部貯蔵からカルシウムを動員し（Ｍｅｙｅｒ  ｚｕ  Ｈｅｒｉｎｇｄｏｒｆら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７、２８３０−２８３７及びＭａｔｔｉｅら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１８１−３１８８）、同時に増殖（Ｒａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１０７７７−１０７８３及びＶａｎ  Ｂｒｏｃｋｌｙｎら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４２、２２９−２４０）とアポトーシスの抑制（Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８１、８００−８０３；Ｐｅｒｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３、１２２８−１２３２；Ｅｄｓａｌｌら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、６９５２−６９６０；Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２９１０−２９１６）を導く様々なシグナル伝達経路を誘導する。
【０００４】
リガンド及び第二メッセンジャーとしてのその二元機能及び細胞の増殖と生存におけるその枢要な役割の故に、ＳＰＰの合成と分解は空間的−時間的に厳密に調節されていると予想される。しかしながら、最近まで、ＳＰＰの代謝に関わる酵素についてはほとんど知られていなかった。以前の報告は、スフィンゴシンキナーゼをラット腎から見かけ上の均質性まで精製することを述べている（Ｏｌｉｖｅｒａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１２５７６−１２５８３）。その後最初の哺乳類スフィンゴシンキナーゼがラットからクローン化され、特性付けられた（Ｋｏｈａｍａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２３７２２−２３７２８）。該キナーゼは、新規の、高度に保存された遺伝子ファミリーに属すると述べられている（Ｋｏｈａｍａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２３７２２−２３７２８及びＮａｇｉｅｃら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１９４３７−１９４４２）。スフィンゴシンキナーゼの強制発現は細胞の増殖と生存を著じるしく増強し、細胞内で産生されたＳＰＰの細胞運命決定における重要性を裏付けた（Ｏｌｉｖｅｒａら（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４７、５４５−５４８）。
【０００５】
ＳＰＰは２つの異なる経路によって代謝されうる。１つの経路では、ＳＰＰはミクロソームピリドキサールリン酸依存性リアーゼによってパルミトアルデヒドとホスホエタノールアミンへと異化され、その後これらはグリセロ脂質の生合成のために利用されうる。第二の経路では、ＳＰＰは特異的ホスファターゼによってスフィンゴシンへと脱リン酸化される（Ｓｐｉｅｇｅｌら（１９９６）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０、１３８８−１３９７）。
【０００６】
酵母での遺伝子操作試験は、哺乳類細胞へのそれらの作用を想起させるように、養分遮断と熱ストレス後の酵母の増殖と生存における長鎖リン酸化スフィンゴイド塩基の重要な役割を明らかにした（Ｍａｎｄａｌａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５、１５０−１５５；Ｇｏｔｔｌｉｅｂら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１、６６−７１；Ｍａｏら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４２、６６７−６７５及びＳｋｒｚｙｐｅｋら（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１、１１３４−１１４０）。最近になって、これら２つの異化経路のリアーゼ及びホスファターゼ酵素をコードする酵母遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて同定された（Ｓａｂａら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２６０８７−２６０９０；Ｍａｎａｄａｌａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５、１５０−１５５及びＭａｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２８６９０−２８６９４）。
【０００７】
ＬＢＰ１及びＬＢＰ２によってコードされる酵母ＳＰＰホスファターゼは、リン酸部分の配位と加水分解に関与すると予測される３つのドメイン内の配列保存を共有する、マグネシウム非依存性膜結合酵素のファミリーである、２型脂質リン酸ホスホヒドララーゼの成員である（Ｓｔｕｒｋｅｙら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６、４６９−４７２）。３つの保存ドメインを含む酵素についての酵母ゲノムの検索は、推定上の２型脂質ホスファターゼをコードする４個の遺伝子の存在を明らかにした。これらのうちの２個、ＤＰＰ１及びＬＰＰ１は、ホスファチジン酸（ＰＡ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、及びジアシルグリセロールピロリン酸（ＤＧＰＰ）に対して活性を有するホスファターゼをコードすることが示された（Ｔｏｋｅら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１４３３１−１４３３８及びＴｏｋｅら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２７８−３２８４）。これに対し、ＬＢＰ１（ＹＳＲ２又はＬＣＢ３としても知られる）及びＬＢＰ２（ＹＳＲ３）は、リン酸化スフィンゴイド塩基について顕著な特異性を備え、グリセロ脂質基質に対しては活性を持たないホスファターゼをコードする（Ｍａｎｄａｌａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５、１５０−１５５；Ｍａｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２８６９０−２８６９４及びＳｋｒｚｙｐｅｋら（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１、１１３４−１１４０）。
【０００８】
酵母ＳＰＰホスファターゼに類似した酵素特性を有する高アフィニティーＳＰＰホスファターゼ活性の存在が、粗ラット肝及び小脳抽出物において記述されている（Ｄｅ  Ｃｅｕｓｔｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１１、１３９−１４６）。ＬＰＰ１／ＰＡＰ２ａ、ＬＰＰ３／ＰＡＰ２ｂ、及びＬＰＰ２／ＰＡＰ２ｃとして知られる、２型脂質リン酸ホスホヒドロラーゼの３つのアイソフォームが哺乳類細胞からクローン化されたが（Ｂｒｉｎｄｌｅｙら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２４２８１−２４２８４において総説されている）、これらの遺伝子産物は、脂質／界面活性剤ミセルにおいてインビトロで検定したとき、ＰＡ、ＬＰＡ、ＳＰＰ、セラミド−１−Ｐ、及びＤＧＰＰに対して同様の効率で広い基質特異性を有すると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヒトスフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼ（ｈＳＰＰ１）をコードするポリヌクレオチド、ｈＳＰＰ１ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞、ｈＳＰＰ１ポリペプチド、及びスフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼ活性のアッセイを実施するために該ポリヌクレオチド、ポリペプチド及び宿主細胞を使用する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
スフィンゴシン−１−リン酸（ＳＰＰ）の異化作用に関与する酵素、ヒトＳＰＰ１のポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。組換えｈＳＰＰ１酵素はＳＰＰの脱リン酸化において触媒的に活性である。該酵素は、インビトロで、及び該タンパク質の活性を変化させる又はｈＳＰＰ１と相互作用して、潜在的に、ｈＳＰＰ１の発現を変化させる化合物をスクリーニングするための及び全細胞アッセイにおいて使用される。本発明は、該ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、組換え酵素を発現する宿主細胞及び組換え酵素を発現する宿主細胞から調製される抽出物、プローブ及びプライマー、ならびにアッセイにおけるこれらの分子の使用を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の１つの局面は、ｈＳＰＰ１タンパク質をコードする配列を有するポリヌクレオチドである。特定実施態様では、コードされたタンパク質は配列番号２に対応する配列を持つ。他の実施態様では、コードされたタンパク質は天然に生じる突然変異体又は多型形態のタンパク質でありうる。好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ又は両者の混合物であり、一本鎖又は二本鎖でありうる。特定実施態様では、ポリヌクレオチドは天然、非天然又は修飾ヌクレオチドで構成される。ある実施態様では、ヌクレオチド間結合は天然に生じる結合である。他の実施態様では、ヌクレオチド間結合は非天然結合であるか又は天然と非天然結合の混合物でありうる。最も好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号１の配列に含まれる配列を持つ。
【００１２】
本発明の１つの局面は、ｈＳＰＰ１タンパク質をコードする、天然に生じるポリヌクレオチドに特異的な少なくとも約２５個の隣接ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオチドである。特定の好ましい実施態様では、この局面のポリヌクレオチドは、ｈＳＰＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を特異的に検出するためのプローブとして有用である。他の特定実施態様では、この局面のポリヌクレオチドは、ｈＳＰＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を特異的に検出するための、核酸増幅に基づくアッセイにおける使用のためのプライマーとして有用である。好ましい実施態様では、この局面のポリヌクレオチドは、プローブ又はプライマーの検出のための化合物、同位体、タンパク質又は配列を含むがこれらに限定されない、付加的な成分を含みうる。
【００１３】
本発明の１つの局面は、ｈＳＰＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は相補的配列、及び調節領域を含む発現ベクターである。特定実施態様では、コードされたタンパク質は配列番号２に対応する配列を持つ。特定実施態様では、ベクターは、その内部でベクターを使用することができる宿主細胞の種類に応じて適宜に、当該技術において既知であり、使用される様々な調節領域のいずれかを有しうる。最も好ましい実施態様では、ベクターは、哺乳類宿主細胞におけるコードタンパク質の発現に適した調節領域を持つ。他の実施態様では、ベクターは、他の真核生物、細菌、酵母、昆虫細胞、藍細菌又は放線菌におけるコードタンパク質の発現に適した調節領域を持つ。一部の好ましい実施態様では、調節領域は誘導的発現を提供し、また別の好ましい実施態様では、調節領域は構成的発現を提供する。最後に、この局面に従って、プラスミド、ファージ、ウイルス又はそれらの組合せから発現ベクターを誘導することができる。
【００１４】
本発明の１つの局面は、ｈＳＰＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は相補的配列、及び調節領域を含む発現ベクターを含有する宿主細胞である。特定実施態様では、コードされたタンパク質は配列番号２に対応する配列を持つ。好ましい実施態様では、宿主細胞は真核生物、酵母、昆虫細胞、グラム陽性菌、藍細菌又は放線菌である。最も好ましい実施態様では、宿主細胞は哺乳類細胞である。
【００１５】
本発明の１つの局面は、宿主細胞においてｈＳＰＰ１タンパク質を発現するための工程である。この局面では、ｈＳＰＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は相補的配列を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする。この局面に従って、コードされたｈＳＰＰ１タンパク質の発現を誘導する条件下で宿主細胞を培養する。特定実施態様では、発現は誘導的又は構成的である。特定実施態様では、コードされるタンパク質は配列番号２に対応する配列を持つ。
【００１６】
本発明の１つの局面は、配列番号２のアミノ酸配列を有する精製ｈＳＰＰ１ポリペプチドあるいは天然に生じる突然変異体又は多型形態の該タンパク質の配列を有する精製ｈＳＰＰ１ポリペプチドである。
【００１７】
本発明の１つの局面は、候補化合物がｈＳＰＰ１ポリペプチドの活性を変化させうるかどうかを判定する方法である。この局面に従って、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、特定宿主細胞に適した発現ベクターを構築する。宿主細胞を発現ベクターで形質転換するか又はトランスフェクトして、ｈＳＰＰ１ポリペプチドの発現を誘導する条件下で培養する。細胞を候補化合物と接触させる。最後に、候補化合物の存在下でｈＳＰＰ１ポリペプチドの活性を測定する。その活性が候補化合物の不在下でのタンパク質の活性に比べて低ければ、候補化合物はｈＳＰＰ１ポリペプチドのインヒビターである。好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を持つタンパク質あるいはその天然に生じる突然変異体又は多型形態をコードする。他の好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号１の配列を持つ。特定実施態様では、宿主細胞におけるｈＳＰＰ１の活性を比較することによってｈＳＰＰ１の相対活性を判定する。一部の実施態様では、宿主細胞を破壊して、放出された膜抽出物に候補物質を接触させる。他の実施態様では、細胞を候補物質に接触させながら破壊し、その後ｈＳＰＰ１タンパク質の活性を測定することができる。最後に、この局面に従えば、同じ条件下での宿主細胞におけるｈＳＰＰ１活性に関して以前に測定された又は予想される活性値との比較によって相対活性を判定することができる。しかし、好ましい実施態様では、候補化合物に接触させなかった対照細胞におけるｈＳＰＰ１の活性を測定することによって相対活性を決定する。特定実施態様では、宿主細胞は哺乳類細胞であり、阻害されるタンパク質は哺乳類細胞によって産生されるｈＳＰＰ１である。
【００１８】
「約」とは、特定して言及されるよりも上下１０％から２０％の範囲内を意味する。
【００１９】
ここで使用するとき「アゴニスト」は、ｈＳＰＰ１と相互作用して、ｈＳＰＰ１の活性を刺激する化合物又は分子である。
【００２０】
ここで使用するとき「アンタゴニスト」は、ｈＳＰＰ１と相互作用して、ｈＳＰＰ１とＳＰＰの相互作用を妨げる化合物である。
【００２１】
ここで使用するとき「インヒビター」は、ｈＳＰＰ１と相互作用して、ｈＳＰＰ１を阻害するか又はｈＳＰＰ１がＳＰＰの脱リン酸化を触媒するのを妨げる化合物である。
【００２２】
ここで使用するとき「モジュレーター」は、細胞生化学の局面と相互作用して、細胞内、細胞の表面又は細胞のペリプラズム内に存在する、あるいは周囲の血清又は媒質中に存在するｈＳＰＰ１のポリペプチドの量の増加又は減少を生じさせる化合物である。ｈＳＰＰ１ポリペプチドの量の変化は、タンパク質の発現へのモジュレーターの作用、例えば転写、翻訳、翻訳後プロセシング、転座又はタンパク質の折りたたみによって、あるいはタンパク質の発現に直接又は間接的に関与する細胞生化学の成分に影響を及ぼすことによって調節されうる。あるいは、モジュレーターは、タンパク質との直接相互作用によって又は直接又は間接的に変化を生じさせる細胞生化学のもう１つ別の成分と相互作用することによって、タンパク質の代謝回転を加速する又は減速することを通して働くことができる。
【００２３】
本発明の１つの局面は、ヒト以外の動物においてｈＳＰＰ１遺伝子の組織特異的及び時間特異的発現又は活性を研究するために有用なトランスジェニック動物である。該動物はまた、様々な化合物がインビボでｈＳＰＰ１の活性又は発現のアゴニスト、アンタゴニスト又はインヒビターとして働く能力を研究するために、あるいはインビトロで培養又はアッセイのための細胞を提供することにより、有用である。本発明のこの局面の１つの実施態様では、該動物を、機能的内在性ｈＳＰＰ１遺伝子を欠く、さらなる動物を作製するための方法において使用する。もう１つの実施態様では、この局面の動物を、内在性遺伝子の発現の不在下でｈＳＰＰ１遺伝子を発現する動物を作製するための方法において使用する。特定実施態様では、非ヒト動物はマウスである。さらなる実施態様では、ｈＳＰＰ１遺伝子は野生型ｈＳＰＰ１遺伝子又は突然変異体ｈＳＰＰ１遺伝子である。
【００２４】
ここで引用する参考文献はすべて、背景資料としてその全体が参照してここに組み込まれる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ここではｈＳＰＰ１と称する、ヒトスフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼのポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。該ポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用して、発現ベクター、該ベクターを含む宿主細胞、プローブ及びプライマー、ｈＳＰＰ１タンパク質及びそのポリペプチドに対する抗体、ｈＳＰＰ１の存在又は発現に関するアッセイ、及びｈＳＰＰ１と相互作用する化合物の同定のためのアッセイをさらに提供する。
【００２６】
ポリヌクレオチド
本発明において有用なポリヌクレオチドは、ここで述べるもの及び当業者がこの明細書の教示に従ってそれらから誘導することができるものを包含する。本発明の好ましい局面は、ヒトＳＰＰ１タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドである。１つの好ましい実施態様は、図１、配列番号１に示されている、下記のように開示される配列を持つ核酸である。
【００２７】
【化１】
2004524840.tif 000002
翻訳の開始及び終止コドンに下線を付している。特に好ましい実施態様は、配列番号１のｈＳＰＰ１のコード配列を含むポリヌクレオチドである。
【００２８】
本発明の単離核酸分子は、一本鎖（コード鎖又は非コード鎖）又は二本鎖のいずれでもよい、リボ核酸又はデオキシリボ核酸分子、ならびに合成一本鎖ポリヌクレオチドのような合成核酸を包含しうる。
【００２９】
本発明はまた、この明細書全体を通して開示する実質的に精製された核酸分子を含有する、原核及び真核生物の、組換えベクター及び組換え宿主細胞に関する。
【００３０】
ここで使用するとき「ポリヌクレオチド」は２個以上のヌクレオチドの核酸である。ポリヌクレオチドは、単位の記述によって言及される、多数のポリヌクレオチド単位で構成されうる。例えば、ポリヌクレオチドは、その領域内に、コード配列を有するポリヌクレオチド、調節領域であるポリヌクレオチド及び／又は当該技術において一般的に使用される他のポリヌクレオチド単位を含みうる。
【００３１】
「発現ベクター」は、宿主細胞中に存在するとき、調節領域がコード配列の発現を指令することができるように、コード領域に作動可能に連結された調節領域を有するポリヌクレオチドである。発現ベクターの使用は当該技術において周知である。発現ベクターは様々な宿主細胞において使用することができ、それ故、調節領域は好ましくは個々の宿主細胞に適するように選択される。
【００３２】
「調節領域」は、コード配列の転写又は翻訳の開始又は終結を促進する又は増強することができるポリヌクレオチドである。調節領域は、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、又は宿主細胞の関連する転写又は翻訳開始又は終結因子によって認識される配列を含む。転写又は翻訳の開始を指令する調節領域は、コード配列の構成的又は誘導的発現を指令することができる。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、ここで開示するｈＳＰＰ１遺伝子配列の完全長又は部分長配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖でありうる。一本鎖の場合には、ポリヌクレオチドはコード「センス」鎖又は相補的「アンチセンス」鎖でありうる。アンチセンス鎖は、ｈＳＰＰ１タンパク質をコードするＲＮＡと相互作用することにより、遺伝子のモジュレーターとして有用でありうる。アンチセンス鎖は、好ましくはｈＳＰＰ１タンパク質をコードするＲＮＡにユニークな又は特異的な配列を持つ完全長鎖よりも短い。
【００３４】
ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又は両者の混合物を包含しうる。ポリヌクレオチドは、細胞によって、無細胞生化学反応において又は化学合成を通して産生されうる。イノシン、メチル−シトシン、デアザ−グアノシン、等々を含む、非天然又は修飾ヌクレオチドが存在しうる。天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合が適切でありうる。しかし、ポリヌクレオチドはヌクレオチド間の非天然結合を有しうる。非天然結合は当該技術において周知であり、限定を伴わずに、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオネート、ホスホロアミダイト及びリン酸エステル結合を包含する。デホスホ結合もヌクレオチド間の架橋として知られている。これらの例は、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、及びチオエーテル架橋を包含する。例えばＮ−ビニル、メタクリルオキシエチル、メタクリルアミド又はエチレンイミンヌクレオチド間結合を有する「可塑性（ｐｌａｓｔｉｃ）ＤＮＡ」が使用できる。「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）も有用であり、ヌクレアーゼによる分解に抗する。これらの結合がポリヌクレオチド内で混合されうる。
【００３５】
ここで使用するとき、「精製」及び「単離」は、対象とするポリヌクレオチド、タンパク質及びポリペプチド、又はそれらのそれぞれのフラグメントが、インビボ環境から取り出されて、天然では認められない形態又は純度で存在することを表わすために交換可能に用いられる。精製又は単離核酸分子は、塩基配列決定、制限消化、部位指定突然変異誘発、及び核酸フラグメントのための発現ベクターへのサブクローニング、ならびにポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を産生する機会を与えるためあるいはアミノ酸配列分析又はペプチド消化を実施するために完全に又は部分的に精製されたタンパク質又はタンパク質フラグメントを入手することのように、但しこれらに限定されることなく、当業者によって操作されうる。それ故、ここで特許請求する核酸は、全細胞中又は細胞溶解産物中あるいは部分的又は実質的に精製された形態中に存在しうる。該分子は、天然で認められるよりも少なくとも約５倍から１０倍高い濃度で存在することが好ましい。ポリヌクレオチドは、天然で認められるよりも少なくとも約１００倍高い濃度で標準的な方法によって細胞成分から入手され、精製される場合、実質的に純粋とみなされる。ポリヌクレオチドは、天然で認められるよりも少なくとも約１０００倍高い濃度で入手される場合、本質的に純粋とみなされる。均一に精製された、すなわち少なくとも１０，０００−１００，０００倍に精製されたポリヌクレオチドが最も好ましい。化学合成された核酸配列は、その化学的前駆物質から精製されるとき、上述した基準によって実質的に精製されているとみなされる。
【００３６】
「組換え」の語は、人の手によって作製されたポリヌクレオチド製剤、構築物、発現系及びそれらを含有する細胞系統を表わすために使用される。
【００３７】
ストリンジェント条件下でｈＳＰＰ１配列にハイブリダイズするさらなる新規ポリヌクレオチドを用いたアッセイは本発明に包含される。限定ではなく例として、高ストリンジェンシーの条件を用いる手順は次の通りである：ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る緩衝液中、６５℃で２時間から一晩実施する。１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ及び５−２０Ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、６５℃で１２時間から４８時間フィルターをハイブリダイズさせる。２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターの洗浄を行う。これに続いて０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーを実施する。
【００３８】
高ストリンジェンシーの条件を用いる他の手順は、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド中４２℃で１２時間から４８時間実施するハイブリダイゼーション段階又は０．２ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中６５℃で３０分間から６０分間実施する洗浄段階のいずれかを含む。
【００３９】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを実施するための上記手順において言及する試薬は当該技術において周知である。これらの試薬の組成物の詳細は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに認められる。上記に加えて、使用しうる高ストリンジェンシーの他の条件は当該技術において周知である。
【００４０】
「同一性」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の測定である。一般に、配列は最も高いレベルの対合が得られるように整列される。「同一性」自体は当該技術で認識されている意味を持ち、公表されている手法を用いて算定することができる。例えば：（ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＲＯＪＥＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＰＲＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）参照。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の同一性を測定するいくつかの方法があるが、「同一性」の語は当業者には周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ（１９８８）４８：１０７３）。２個の配列間の同一性又は類似性を決定するために一般的に用いられる方法は、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４，及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ（１９８８）４８：１０７３に開示されているものを含むが、これらに限定されない。同一性及び類似性を決定するための方法はコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２個の配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴ？、ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３）を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
例示として、配列番号１の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が配列番号１の参照ヌクレオチド配列の各々１００個のヌクレオチドにつき５個までの相違を含みうることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列内のヌクレオチドの５％までが欠失しているか又はもう１つ別のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは参照配列内の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、あるいはそれらの末端位置の間のどこかで、参照配列内のヌクレオチドにおいて個々に又は参照配列内の１又はそれ以上の隣接グループにおいて、散在して起こりうる。
【００４２】
同様に、配列番号２の参照アミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、ポリペプチド配列が配列番号２の参照アミノ酸配列の各々１００個のアミノ酸につき５個までのアミノ酸変化を含みうることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意味する。言い換えると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列内のアミノ酸残基の５％までが欠失しているか又はもう１つ別のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは参照配列内の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ又はカルボキシ末端の位置で、あるいはそれらの末端位置の間のどこかで、参照配列内の残基において個々に又は参照配列内の１又はそれ以上の隣接グループにおいて散在して起こりうる。
【００４３】
ポリペプチド
本発明の１つの好ましい局面は、実質的に精製された形態のヒトＳＰＰ１タンパク質である。好ましい実施態様は、図２、配列番号２に示されており、下記のように１文字コードで開示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である：
【００４４】
【化２】
2004524840.tif 000003
【００４５】
本発明はまた、当該突然変異が診断、治療又は予防用途のタンパク質又はタンパク質フラグメントを提供し、ｈＳＰＰ１機能のモジュレーター及び／又はインヒビターをスクリーニングするために有用であるように、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端トランケーション及びカルボキシ末端トランケーションを含むがこれらに限定されない、配列番号２として示すｈＳＰＰ１ポリペプチド配列の生物学的に活性なフラグメント及び突然変異体又は多型形態に関する。
【００４６】
ここで提供するポリヌクレオチド及びポリペプチドの開示を使用して天然に生じる形態のｈＳＰＰ１をコードするポリヌクレオチドを単離して、当業者は、配列比較によってそのような天然に生じる形態がｈＳＰＰ１の突然変異体又は多型形態であるかどうかを判定することができる。さらに、ｈＳＰＰ１タンパク質の生物活性についてのインビトロ又はインビボアッセイにおける該タンパク質又はフラグメントの常套的試験により、コードされたタンパク質、又は何らかのｈＳＰＰ１タンパク質のフラグメントが生物学的に活性であるかどうかを判定することができる。例えば、宿主細胞においてＮ末端又はＣ末端トランケーション、あるいは内部付加又は欠失を発現し、スフィンゴシン−１−リン酸の脱リン酸化を触媒するそれらの能力を試験することができる。
【００４７】
特定アミノ酸をコードする様々なコドンにはかなりの量の重複が存在することが知られている。それ故、本発明はまた、場合によって起こりうる同一アミノ酸の翻訳をコードする代替的コドンを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を対象とする。
【００４８】
それ故、本発明は、同一タンパク質をコードする異なるＤＮＡ分子を生じうるコドンの重複を開示する。本明細書に関して、１又はそれ以上の置換されたコドンを担う配列を縮重変異と定義する。発現されるタンパク質の最終的な物理的性質を実質的に変化させない、ＤＮＡ配列又は翻訳されたタンパク質のいずれかにおける突然変異も、本発明の範囲内に包含される。例えば、バリンによるロイシンの置換、アルギニンによるリシンの置換、又はアスパラギンによるグルタミンの置換はポリペプチドの機能性に変化を生じさせないと考えられる。しかし、単に、変化していないｈＳＰＰ１タンパク質と比較してスフィンゴシン−１−リン酸の異化作用を触媒する能力を検定することによって、所与の変化を生物学的機能への影響に関して検査することができる。
【００４９】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然に生じるペプチドのものとは異なる性質を持つペプチドをコードするように変化させうることが知られている。ＤＮＡ配列を変化させる方法は、部位指定突然変異誘発を含むがこれに限定されない。変化した性質の例は、基質に対する酵素の親和性の変化を含むがこれに限定されない。
【００５０】
ここで使用するとき、野生型ｍＳＰＰ１の「生物学的に活性な等価物」又は「機能的誘導体」は、野生型ｍＳＰＰ１の生物活性と実質的に同様の生物活性を有する。「機能的誘導体」の語は、スフィンゴシン−１−リン酸の異化作用を触媒することができる野生型ｍＳＰＰ１タンパク質の「フラグメント」、「突然変異体」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」、「オーソローグ」及び「相同体」及び「化学的誘導体」を包含することが意図されている。
【００５１】
「フラグメント」の語は、野生型ｈＳＰＰ１の何らかのポリペプチドサブセットを指す。「突然変異体」の語は、野生型形態と実質的に同様でありうるが、異なる生物学的形質を有する分子を指すことが意図されている。そのような変化した形質は、変化した基質結合、変化した基質親和性及びｈＳＰＰ１の生物活性に影響を及ぼす化合物に対する変化した感受性を包含するが、いかなる意味においてもこれらに限定されない。「変異体」の語は、野生型タンパク質全体又はそのフラグメントのいずれかと構造及び機能において実質的に同様の分子を指す。両方の分子が実質的に同様の構造を持つか、又は両方の分子が同様の生物活性を有する場合、分子は野生型ｈＳＰＰ１様タンパク質と「実質的に同様」である。それ故、２個の分子が実質的に同様の活性を有していれば、一方の分子のその構造が他方では認められない場合又は２個のアミノ酸配列が同一でない場合でも、それらは変異体であるとみなされる。「類似体」の語は、完全長ｈＳＰＰ１タンパク質又は生物学的に活性なそのフラグメントのいずれかと機能において実質的に同様の分子を指す。
【００５２】
ｈＳＰＰ１遺伝子又はコードされるタンパク質に関してここで使用するとき、「多型」ｈＳＰＰ１は、広く動物の個体群において天然に認められるｈＳＰＰ１である。典型的には、ｈＳＰＰ１の多型についての遺伝子は、ｈＳＰＰ１遺伝子をプローブとして使用する高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによって検出することができる。ｈＳＰＰ１の多型形態は、配列番号１としてここで開示する特定ｈＳＰＰ１遺伝子とは異なるヌクレオチド配列によってコードされうる。しかし、サイレント突然変異の故に、多型ｈＳＰＰ１遺伝子はここで開示するものと同じか又は異なるアミノ酸配列をコードしうる。さらに、一部の多型形態のｈＳＰＰ１はその形態を野生型ｈＳＰＰ１活性と識別する生物学的形質を示し、その場合、その多型形態は同時に突然変異体でもある。
【００５３】
タンパク質又はそのフラグメントは、組成物中で又は天然では認められない純度で、その天然環境から少なくとも部分的に遊離して得られるとき、精製又は単離されているとみなされる。該分子は、天然で認められるよりも少なくとも約５倍から１０倍高い濃度で存在することが好ましい。タンパク質又はそのフラグメントは、天然で認められるよりも少なくとも約１００倍高い濃度で得られる場合、実質的に純粋とみなされる。タンパク質又はそのフラグメントは、天然で認められるよりも少なくとも約１０００倍高い濃度で得られる場合、本質的に純粋とみなされる。均一に精製された、すなわち少なくとも１０，０００倍から１００，０００倍に精製されたタンパク質が最も好ましい。
【００５４】
本発明のポリペプチドに関して「組換え」の語は、上述したように組換え工程によって作製される、組換え細胞によって発現される又は天然細胞から精製されるポリペプチドだけを指す。部分精製されたｈＳＰＰ１ポリペプチドを含有する製剤は、「組換え」の語の範囲内であることが意図されている。
【００５５】
ｈＳＰＰ１の発現
宿主細胞において組換えｈＳＰＰ１ポリペプチドを発現するために様々な発現ベクターが使用できる。発現ベクターは、ここでは、適切な宿主におけるクローン化したＤＮＡの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳のための調節配列を含む核酸配列と定義される。そのようなベクターは、酵母、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような様々な宿主において遺伝子を発現するために使用できる。特別に設計されたベクターは、細菌−酵母又は細菌−動物細胞のような宿主間での遺伝子の往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは次のものを含むべきである：宿主細胞における自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高いコピー数のための潜在能、及び調節配列。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡへの結合とＲＮＡ合成の開始に関与する調節配列と定義される。強力なプロモーターは、高い頻度でｍＲＮＡを開始させるものである。発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド又はウイルスを包含しうるが、これらに限定されない。
【００５６】
特に、様々な細菌発現ベクターが細菌細胞において組換えｈＳＰＰ１を発現するために使用できる。組換えｈＳＰＰ１の発現に適した市販の細菌発現ベクターは、ｐＱＥ（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＥＴ１１ａ又はｐＥＴ１５ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ）、λｇｔ１１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、及びｐＫＫ２２３−３（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を含むが、これらに限定されない。
【００５７】
代替的に、無細胞転写−翻訳系においてｈＳＰＰ１  ＤＮＡを、又は無細胞翻訳系においてｈＳＰＰ１  ＲＮＡを発現することができる。ｈＳＰＰ１ポリペプチドの無細胞合成は、バッチ又は当該技術において既知の連続様式でありうる。
【００５８】
ｈＳＰＰ１を化学的に合成することもできるが、この方法は好ましくない。
【００５９】
ｈＳＰＰ１タンパク質を合成するために発現ベクターと共に様々な宿主細胞が使用できる。これらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を包含しうる。昆虫及び酵母細胞も適切でありうる。しかし、最も好ましい宿主細胞は哺乳類宿主細胞である。
【００６０】
宿主細胞におけるｈＳＰＰ１の発現後、ｈＳＰＰ１ポリペプチドを回収することができる。いくつかのタンパク質精製手順が使用可能であり、使用に適する。ｈＳＰＰ１タンパク質及びポリペプチドは、界面活性剤による可溶化、限外ろ過、酸抽出、アルコール抽出、アルコール沈殿、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、レシチンクロマトグラフィー、アフィニティー（例えば抗体又はＨｉｓ−Ｎｉ）クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性又は親水性相互作用に基づくクロマトグラフィーを含む方法の様々な組合せ又は個別適用によって、細胞溶解産物及び抽出物から、又は培地から精製することができる。一部の場合には、タンパク質の変性とリフォールディング段階が使用できる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び逆相ＨＰＬＣも有用でありうる。最終的な緩衝組成物を調整するためには透析が使用できる。
【００６１】
ｈＳＰＰ１タンパク質自体は、タンパク質の活性を阻害する又は刺激する化合物を含めて、タンパク質の活性を変化させる化合物を同定するためのアッセイにおいて有用である。ｈＳＰＰ１タンパク質はまた、タンパク質に対する抗体の作製、タンパク質の構造試験、及びタンパク質の構造／機能の関係のために有用である。
【００６２】
ｈＳＰＰ１のモジュレーター、アゴニスト、アンタゴニスト及びインヒビター
本発明はまた、ｈＳＰＰ１タンパク質の発現を調節する、ｈＳＰＰ１タンパク質の活性を刺激する又は阻害する化合物についてのスクリーニングのための方法を対象とする。ｈＳＰＰ１を調節する又は阻害する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、又は非タンパク様有機又は無機化合物又は他の種類の分子でありうる。ｈＳＰＰ１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現を調節するか、あるいはｈＳＰＰ１の生物学的機能のアゴニスト、アンタゴニスト又はインヒビターである化合物は、様々なアッセイによって検出することができる。アッセイは、発現又は活性に変化があるかどうかを判定する単純な「イエス／ノー」アッセイでありうる。アッセイは、被験試料の発現又は活性を標準試料、すなわち対照における発現又は活性のレベル又は度合と比較することによって定量的にすることができる。モジュレーターである化合物は、化合物の存在下で産生されるｍＲＮＡ及び／又はｈＳＰＰ１の量を測定することによって検出できる。アゴニスト、アンタゴニスト又はインヒビターである化合物は、化合物の存在下と不在下でｈＳＰＰ１タンパク質の特異的活性を測定することによって検出できる。
【００６３】
タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、ｈＳＰＰ１の検出と分析に適したキットの作製に役立つ。そのようなキットは、少なくとも１つの容器を厳密に閉鎖された状態に保持するのに適した区画化された担体を含む。担体は、ｈＳＰＰ１を検出するのに適した組換えｈＳＰＰ１又は抗ｈＳＰＰ１抗体のような試薬をさらに含む。担体はまた、標識抗原又は酵素基質等のような検出のための手段を含みうる。
【００６４】
アッセイ
本発明のアッセイは、生物活性に関して又は酵素への結合に関して化合物をスクリーニングする技術において一般的に知られる多くの様式で設計されうる。本発明のアッセイは、ＳＰＰをスフィンゴシンに変換する又はジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（ＤＨＳＰ）をジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳ）に変換するｈＳＰＰ１の活性を好都合に利用することができる。便宜上、下記の説明は主としてＳＰＰのスフィンゴシンへの変換を対象とするが、アッセイではどちらの変換も追跡することができる。
【００６５】
本発明は、ｈＳＰＰ１ポリペプチドと特異的に相互作用する化合物を同定する方法を包含する。該酵素と相互作用する化合物は、ｈＳＰＰ１の活性を刺激する又は阻害することができる。ｈＳＰＰ１に親和性を有する化合物の結合の特異性は、ｈＳＰＰ１ポリペプチドを発現する組換え細胞からの膜に対する化合物の親和性を測定することによって示すことができる。ｈＳＰＰ１ポリペプチドの発現、及びｈＳＰＰ１に結合する又はＳＰＰからスフィンゴシンへの変換を阻害する化合物についてのスクリーニングは、ｈＳＰＰ１に親和性を持つ化合物を迅速に選択するための有効な方法を提供する。ＳＰＰは放射能標識することができるが、当該技術において既知の他の手段によっても標識することができ、その後、ｈＳＰＰ１活性のアッセイにおいて標識ＳＰＰのスフィンゴシンへの変換を追跡するために使用することができる。
【００６６】
ｈＳＰＰ１のフラグメント又は突然変異体、ｈＳＰＰ１の多型又は対立遺伝子変異体を生成することを所望する場合には、下記で述べるアッセイにおいてそれらの生成物を試験し、その結果を配列番号２の活性ｈＳＰＰ１ポリペプチドを用いて得られた結果と比較することができる。このようにして、フラグメント、突然変異体、多型又は対立遺伝子変異体の、化合物に結合する、ｈＳＰＰ１のアゴニストによって活性化される、あるいはｈＳＰＰ１のアンタゴニストによって不活性化又は阻害される能力を容易に評価することができる。
【００６７】
それ故、本発明は、ｈＳＰＰ１のアゴニスト、アンタゴニスト、及びインヒビターである化合物を同定しうるアッセイを包含する。本発明のアッセイ方法は、ＳＰＰとｈＳＰＰ１ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドの相互作用をアッセイに組み込む少なくとも１つの段階を含むことから、当該技術において述べられているものとは異なる。
【００６８】
リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストを同定するための一般的方法は当該技術において周知であり、ｈＳＰＰ１のアゴニスト及びアンタゴニストを同定することに適合させうる。所与の方法における段階の順序は、アッセイの当業者によって認識されるであろうように、変化させる又は同時に実施することができる。下記は、本発明のアッセイを実施するために使用できる様々な様式のサンプリングである。
【００６９】
従って、本発明は、候補化合物がｈＳＰＰ１のアゴニスト又はインヒビターであるかどうかを判定するための方法であって：
（ａ）ｈＳＰＰ１ポリペプチドをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクトすること、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、細胞内でｈＳＰＰ１が発現されるのに十分な時間増殖させること、
（ｃ）化合物の存在下と不在下で細胞の部分を標識ＳＰＰに接触させること、
（ｄ）細胞の部分における標識ＳＰＰのスフィンゴシンへの変換を測定すること、及び
（ｅ）化合物の存在下と不在下でＳＰＰのスフィンゴシンへの変換の量を比較して、化合物の存在下でのＳＰＰのスフィンゴシンへの変換の量の減少は化合物がｈＳＰＰ１のインヒビターであることを示唆し、一方ＳＰＰのスフィンゴシンへの変換の増加は化合物がｈＳＰＰ１のアゴニストであることを示唆すること
を含む方法を包含する。
【００７０】
該方法の段階（ｃ）を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用の検討のために当該技術で典型的に使用される条件である：例えば、生理的ｐＨ；ＰＢＳのような一般的に使用される緩衝液又は組織培地中で示されるもののような塩条件；約４℃から約５５℃の温度。この段階では、ＳＰＰと候補化合物を連続的に又は同時に細胞に適用することができる。化合物を最初に適用するか又は化合物とＳＰＰを同時に適用することが好ましい。
【００７１】
上記の全細胞法は、化合物が細胞膜を横切ってｈＳＰＰ１と相互作用することができるかどうかを評価することを所望する場合のアッセイにおいて使用できる。しかし、上記の方法は、被験細胞を候補化合物に接触させるのではなく、細胞から膜を調製して、それらの膜を化合物に接触させるように改変することができる。細胞ではなく膜を用いるそのような改変は当該技術において周知であり、例えばＨｅｓｓら、１９９２に述べられている。膜を検定する特定方法を下記の実施例において説明する。
【００７２】
従って、本発明は、候補化合物が膜内のｈＳＰＰ１ポリペプチドのアゴニスト又はインヒビターであるかどうかを判定するためにＳＰＰとｈＳＰＰ１の相互作用を利用する方法であって：
（ａ）細胞においてｈＳＰＰ１の発現を指令する発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることによって被験細胞を提供すること、
（ｂ）被験細胞からｈＳＰＰ１を含有する膜を調製すること、
（ｃ）リガンドが膜内のポリペプチドに結合するような条件下で膜をＳＰＰに接触させること、
（ｄ）同様の条件下で膜を候補化合物にさらに接触させること、
（ｅ）化合物の存在下と不在下で膜におけるＳＰＰのスフィンゴシンへの変換の量を測定すること、
（ｆ）化合物の存在下と不在下でＳＰＰのスフィンゴシンへの変換の量を比較して、化合物の存在下でのＳＰＰのスフィンゴシンへの変換の量の減少は化合物がｈＳＰＰ１のインヒビターであることを示唆し、一方ＳＰＰのスフィンゴシンへの変換の増加は化合物がｈＳＰＰ１のアゴニストであることを示唆すること
を含む方法を提供する。
【００７３】
上述した方法のさらなる改変として、例えばバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下でｈＳＰＰ１を含有するプラスミドを用いたインビトロ転写によって、ｈＳＰＰ１をコードするＲＮＡを調製し、卵母細胞におけるｈＳＰＰ１の発現を生じさせるためにＲＮＡをツメガエル卵母細胞に微量注入することができる。その後、卵母細胞において発現されたｈＳＰＰ１への結合又はｈＳＰＰ１の活性の阻害に関して化合物を試験する。本発明のすべてのアッセイにおけると同様に、ＳＰＰとｈＳＰＰ１の相互作用を用いる段階がアッセイに組み込まれている。
【００７４】
トランスジェニック動物
本発明のトランスジェニック動物に言及するとき、我々は導入遺伝子及び遺伝子を対象とする。ここで使用するとき、「導入遺伝子」は、遺伝子を含む遺伝的構築物である。導入遺伝子は、典型的には当該技術において既知の方法によって動物又はその祖先の細胞中の１又はそれ以上の染色体に組み込まれる。ひとたび組み込まれれば、導入遺伝子はトランスジェニック動物の染色体内の少なくとも１つの位置に担われる。遺伝子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子及び／又は導入遺伝子はまた、当該技術において既知の遺伝的調節エレメント及び／又は構造エレメントを含みうる。
【００７５】
「動物」の語は、ここではヒトを除くすべての哺乳類を包含するために使用される。また、胚及び胎児段階を含めて、発生のすべての段階の個々の動物を包含する。好ましくは動物はげっ歯類であり、最も好ましくはマウス又はラットである。「トランスジェニック動物」は、マイクロインジェクション又は組換えウイルスによる感染のような、細胞以下のレベルでの計画的な遺伝的操作によって直接又は間接的に受け取られた遺伝情報を担う１又はそれ以上の細胞を含有する動物である。この導入されるＤＮＡ分子は、染色体内に組み込まれるか、又は染色体外で複製するＤＮＡでありうる。動物の記述に関連して特に異なる注釈又は理解が為されない限り、ここで使用するとき「トランスジェニック動物」の語は、遺伝情報が生殖細胞系に導入されており、それによって情報を伝達する能力を子孫に付与するトランスジェニック動物を指す。実際に子孫が遺伝情報の一部又は全部を有している場合には、それらもトランスジェニック動物である。遺伝情報は、典型的にはトランスジェニック動物が担う導入遺伝子の形態で提供される。
【００７６】
非ヒト動物によって受け取られる遺伝情報は、レシピエントが属する動物種にとって外来性であるか、又は特定個体レシピエントにとってのみ外来性でありうる。後者の場合、情報が変化するか、あるいは動物の天然遺伝子とは異なって発現されることがありうる。代替的に、変化した又は導入された遺伝子が天然遺伝子を非機能性にすることがありうる。
【００７７】
ここで使用するとき、「ターゲット遺伝子」又は「ノックアウト」（ＫＯ）導入遺伝子は、ここで述べる方法を含むがそれらに限定されない、ヒトの介入によって非ヒト動物の生殖細胞系に導入されたＤＮＡ配列である。本発明のターゲット遺伝子は、非ヒト動物のコグネイト内在性対立遺伝子を特異的に変化させるように設計された核酸配列を包含する。
【００７８】
変化したｈＳＰＰ１遺伝子は宿主細胞にとって内在性の同じタンパク質を完全にはコードしないはずであり、その発現産物は大なり小なり変化しているか又は全く存在しないことがありうる。内在性ｈＳＰＰ１タンパク質の不在下でトランスジェニック動物において非天然ｈＳＰＰ１タンパク質を発現することが有用である場合、変化したｈＳＰＰ１遺伝子が該動物の天然遺伝子にとって無効の「ノックアウト」表現型を誘導することが好ましい。しかし、より控えめに改変されたｈＳＰＰ１遺伝子も有用である場合があり、本発明の範囲内である。
【００７９】
導入遺伝子の導入のための標的細胞の１つの種類は胚幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、インビボで培養した着床前の胚から入手して、胚と融合することができる（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６（１９８１）；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８（１９８４）；Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５−９０６９（１９８６）；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８（１９８６））。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクションのような様々な標準手法によって、又はレトロウイルスを介した形質導入によってＥＳ細胞に効率的に導入することができる。生じた形質転換ＥＳ細胞を、その後、非ヒト動物からの胚盤胞と組み合わせることができる。導入されたＥＳ細胞はその後胚にコロニー形成して、生じるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４（１９８８））。生殖細胞系の形質転換体を生じるものに関して動物をスクリーニングする。これらを交配して、導入遺伝子に関してホモ接合の動物を産生する。
【００８０】
ターゲット組換え事象ならびに生じるノックアウトマウスを評価するための方法は容易に使用可能であり、当該技術において既知である。そのような方法は、標的対立遺伝子を検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を検出するためのウエスタンブロット法を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
これは治療を目的としうる。生物の細胞内に突然変異体、対立遺伝子又は変異体配列が存在すること、特に相同な内在性配列の代わりにそれらが存在することは、該生物を、ｈＳＰＰ１遺伝子あるいはコードされるポリペプチド及び／又はプロモーターの活性をインビボで調節する又はさもなければ治療上の潜在的可能性を持つことが示唆される物質の役割を試験する及び／又は検討するモデルとして使用することを可能にする。
【実施例１】
【００８２】
マウススフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼのヒト相同体の同定
ｍＳＰＰ１によってコードされるマウススフィンゴシン−１−リン酸（ＳＰＰ）ホスファターゼのヒト相同体を同定するために、ＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いてＥＳＴデータベースを検索した。ｇｂ：ＡＡ３７６２２９、ｇｂ：ＡＡ３３１５６３、ｇｂ：ＡＡ３７１４６１、ｇｂ：ＡＡ３７５３４９、ｇｂ：ＡＡ１３３９０９、ｇｂ：ＡＡ８０５３２８、及びｇｓｃ：００００５１９０を含めて、ｍＳＰＰ１と高い相同性を有するいくつかのヒト配列がＥＳＴデータベースにおいて同定された。
【００８３】
これらのＥＳＴクローンで形質転換した細菌培養をＡＴＣＣ又はＭｅｒｃｋ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒから入手し、ＷＩＺＡＲＤ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７装置でＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、ＤＮＡ製剤を自動配列分析に供した。ベクターに相補的なＴ７シークエンシングプライマーを配列分析反応において使用した。データベースの検索（ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴＥＩＮ、ＰＩＲ、ｄＥＳＴ）、配列の整列化、ならびにヌクレオチド及びタンパク質配列の分析を、ＴＢＬＡＳＴ、ＧＣＧ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  Ｃｏｎｔｉｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて実施した。配列の整列化はｍＳＰＰ１に対する相同性を確認した。
【実施例２】
【００８４】
ｈＳＰＰ１３’末端のＰＣＲ増幅
最初に、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法を用いてｃＤＮＡライブラリーからヒトＳＰＰホスファターゼ遺伝子をクローン化した。ヒトＥＳＴ  ＡＡ３７６２２９、ＡＡ３３１５６３、ＡＡ３７１４６１、ＡＡ３７５３４９、ＡＡ１３３９０９及びＡＡ８０５３２８に基づいて遺伝子特異的プライマーを設計した。遺伝子特異的プライマーは５０％から７０％のＧＣ含量を有し、Ｔｍ≧７０℃であった。プライマーをアダプタープライマーと対合させ、アダプターにライゲートした二本鎖ｃＤＮＡ及びＣＬＯＮＴＥＣＨより購入したＰＣＲキット（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙヒト胎盤ｃＤＮＡ、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、及びＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲポリメラーゼ）を用いて、５’及び３’末端を増幅するために使用した。ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ  ＧＥＮＥＡＭＰ  ＰＣＲ  ９７００装置を次のサイクリング条件で使用した：９４℃、１分間；９４℃、３０秒間と７２℃、４分間の５サイクル；９４℃、３０秒間と７０℃、４分間の５サイクル；９４℃、３０秒間と６８℃、４分間の３０サイクル；７０℃、７分間；その後４℃に保持した。
【００８５】
プライマー５’−ＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧ（配列番号３）
及び５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＧ（配列番号４）
を使用して、ヒト胎児脳ｃＤＮＡから４４３ｂｐのフラグメントを増幅した。ＰＣＲ産物をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（ＢＩＯ１０１）によって単離し、ＴＡクローニングキット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いてｐＣＲ２．１にライゲートして、プラスミドＳＰＰ（Ａ）−ｐＣＲ２．１を作製した。
【００８６】
プライマー５’−ＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＧＣＡＴＧ（配列番号５）
及び５’−ＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧ（配列番号６）
を使用して、ヒト胎盤ｃＤＮＡから９３０塩基対のフラグメントを増幅した。ＰＣＲ産物をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（ＢＩＯ１０１）によって単離し、ｐＣＲ２．１にライゲートして、プラスミドＳＰＰ（Ｂ）−ｐＣＲ２．１を作製した。ライゲーション反応物をＤＨ５αコンピテント細胞（ＢＲＬ）に形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢ寒天に塗布して、３７℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地４ｍｌに接種して、３７℃で一晩インキュベートし、ＷＩＺＡＲＤ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した。ＳＰＰ（Ａ）−ｐＣＲ２．１及びＳＰＰ（Ｂ）−ｐＣＲ２．１内のＰＣＲフラグメントの配列は、ＥＳＴ  ＡＡ３７５３４９、ＡＡ３７６２２９及びＡＡ１３３９０９と同一の配列を含み、ＳＰＰホスファターゼについての推定上の停止コドンを含有した。
【実施例３】
【００８７】
発現のためのｈＳＰＰ１クローンの構築
推定ＳＰＰホスファターゼの３’末端をコードする８３０塩基対のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＳＰＰ（Ｂ）−ｐＣＲ２．１から単離した。ＳＰＰホスファターゼの５’末端をコードする１２２２塩基対のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｇｓｃ：００００５１９０ＤＮＡ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−におけるａｍｙｇ２＿ｐ０ｂ０９）から直接単離した。２つの制限フラグメントをＧＥＮＥＣＬＥＡＮで精製し、大腸菌クローニングベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）にそのＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ部位でライゲートして、完全なＳＰＰホスファターゼコード配列（ＳＰＰ−ｐＧＥＭ３）を得た。完全なコード領域を含む２．３ＫｂのＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＳＰＰ−ｐＧＥＭ３から単離し、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１ゼオ（−）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）にそのＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩ部位でクローン化して、プラスミドｈＳＰＰ１−ｐｃＤＮＡ３．１を作製した。ライゲーション反応物をＤＨ５αコンピテント細胞（ＢＲＬ）に形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢ寒天に塗布して、３７℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地４ｍｌに接種して、３７℃で一晩インキュベートし、ＷＩＺＡＲＤ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した。無傷ｈＳＰＰ１のヌクレオチド配列を自動シークエンシングによって決定した。
【実施例４】
【００８８】
哺乳類細胞におけるホスファターゼ活性の発現
内毒素不含ＱＩＡＧＥＮ  Ｍａｘｉプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いてプラスミドｈＳＰＰ１−ｐｃＤＮＡ３．１についてトランスフェクション品質のＤＮＡを調製した。ヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補足した、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有する高グルコースダルベッコ変法イーグル培地中に保持した。ＳＰＥＣＩＡＬＴＹ  ＭＥＤＩＡ（Ｌａｖａｌｅｔｔｅ，ＮＪ）からのキットを使用してＣａＣｌ２法によって細胞（１×１０６）をプラスミドＤＮＡ２０μｇでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に無酵素解離溶液（ＳＰＥＣＩＡＬＴＹ  ＭＥＤＩＡ，Ｌａｖａｌｅｔｔｅ，ＮＪ）で細胞を採集した。低温ＰＢＳ中で細胞を３回洗い、次に１ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．２とプロテアーゼインヒビター反応混液から成る低張緩衝液に４℃で１０分間溶解した。１，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して細胞デブリを除去し、上清液を４０，０００×ｇで３０分間再び遠心分離した。４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ  ｐＨ７．５、プロテアーゼインヒビター反応混液、及び２０％グリセロール中、約２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でペレットを懸濁した。ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸ホスホヒドロラーゼ活性を、５０ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ７．２、０．０２％テルジトール（ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（ＮＰ−４０）、０．０７６％ＢＳＡ、２μＭ［３Ｈ］ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（４０，０００ｃｐｍ）、２ｍＭセミカルバジド、及び膜タンパク質０．３μｇから０．５μｇを含有する２００μｌ中で測定した。３７℃で４０分間インキュベートした後、７Ｍ  ＮＨ４ＯＨ  ２００μｌでアッセイを終了させた。クロロホルム：メタノール（３：２）１ｍｌを加え、クロロホルム層５０μｌを液体シンチレーションによって計数した。
【００８９】
ＨＥＫ２９３におけるｈＳＰＰ１の発現は、ベクターでトランスフェクトした細胞と比較してジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸ホスホヒドロラーゼ活性の３倍から５倍の上昇をもたらした。
【実施例５】
【００９０】
哺乳類組織におけるｍＳＰＰ１のｍＲＮＡ発現
レーン当り２μｇのＲＮＡを含有するヒト脳、癌及び多数の組織のポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、ゲル精製し、ランダムプライミングによって３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したＳＰＰ（Ａ）−ｐＣＲ２．１からの５５０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントでプローブした。ブロットをＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ溶液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中６８℃で１時間ハイブリダイズし、製造者のプロトコールに従って洗浄した。ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＹＮＡＭＩＣＳ  ＳＴＯＲＭ  ８６０を用いてバンドを数量化し、存在するアクチンメッセージの量に基準化した。
【００９１】
検査した２３のヒト組織のうち２２において１個の３．８ｋｂ転写産物が検出され、この遺伝子がヒトにおいて遍在的に発現されることを示唆した。
【実施例６】
【００９２】
ＳＰＰホスファターゼ活性のインヒビターとアクチベーター
ｈＳＰＰ１のインヒビターとアクチベーターを３Ｈ−ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼアッセイにおいて同定することができる。ＤＭＳＯ、メタノール、又は他の溶媒に希釈した化合物を、ｈＳＰＰ１を発現する細胞から調製した膜によるアッセイに加え、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸ホスファターゼ活性を実施例４におけるように測定する。クロロホルム層で回収される３Ｈ−ジヒドロスフィンゴシンを低下させる化合物はホスファターゼ活性のインヒビターであり、３Ｈ−ジヒドロスフィンゴシンを上昇させる化合物はアクチベーターである。半高流量ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸ホスホヒドロラーゼアッセイを、チューブストリップにおいて５０ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ７．２、０．０２％テルジトール（ＮＰ−４０）、２μＭ［３Ｈ］ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（４０，０００ｃｐｍ）、２ｍＭセミカルバジド、及びｈＳＰＰ１発現細胞から調製した膜タンパク質を含有する１００μｌのアッセイ容量に関して実施することができる。３７℃で４５分間インキュベートした後、７Ｍ  ＮＨ４ＯＨ  １００μｌ及びクロロホルム：メタノール（３：２）０．５ｍｌでアッセイを終了させることができる。自動操作ピペッティングステーションを使用して、クロロホルム層５０μｌを９６穴Ｔトレー（ＷＡＬＬＡＣ）に分配することができる。Ｔトレーを空気乾燥し、シンチラントを加えて、その後Ｂｅｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンター（ＷＡＬＬＡＣ）において計数することができる。
【実施例７】
【００９３】
ＳＰＰホスファターゼのインヒビターに関する酵母ベースのスクリーニング
酵母スフィンゴイド塩基リン酸ホスファターゼ活性は、スフィンゴ脂質代謝における他の突然変異との組合せを除いて必須ではない。そのような致死的組合せの１つはｌｂｐ１□ｄｐｌ１□ｓｕｒ２□であり、これは増殖と生存のためのｈＳＰＰ１の機能的発現に依存する。３つの酵母遺伝子の必須の組合せの分断を担い、増殖のためにｈＳＰＰ１を発現する菌株を構築するために、ｈＳＰＰ１を酵母発現ベクター（ｐＲＳ４１４−ＡＤＨ／ＴＲＰ）にサブクローニングし、次に二倍体株ｌｂｐ１□：：ＬＥＵ２／ＬＢＰ１、ｄｐｌ１□：：ＨＩＳ３／ｄｐｌ１□：：ＨＩＳ３、ｓｕｒ２□：：ＵＲＡ３／ｓｕｒ２□：：ＵＲＡ３に形質転換して、胞子形成し、Ｔｒｐ＋、Ｌｅｕ＋、Ｈｉｓ＋、Ｕｒａ＋分離株を単離することができる。ｈＳＰＰ１ホスファターゼ活性のインヒビターは菌株の増殖を阻害すると予想され、それを９６穴又は３８４穴分光光度アッセイにおいて測定することができる。
【００９４】
ＤＭＳＯ、メタノール、又は他の溶媒に希釈した化合物を穴に加え、ＳＣ−ＴＲＰ培地中でインキュベートした対数増殖期細胞を接種する。３０℃で２４時間インキュベートした後、マイクロプレート分光光度計でＯＤ６００を測定することができる。溶媒処理した細胞に比べてＯＤ６００を低下させる化合物は潜在的インヒビターである。他の機序を通して酵母増殖を阻害する化合物から特異的ｈＳＰＰ１ホスファターゼインヒビターを識別するため、増殖のためにＳＰＰホスファターゼ活性を必要としない野生型菌株に対する増殖阻害に関して化合物を試験することができ、また上述したようなインビトロｈＳＰＰ１ホスファターゼアッセイにおいて化合物をスクリーニングすることもできる。
【００９５】
実施例は本発明を実施する際の指針として提供するものであり、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、配列番号１のポリヌクレオチド配列である。
【図２】図２は、配列番号２のポリペプチド配列である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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