(57)【要約】本発明は、被験者の疾患を診断する方法に関し、この診断方法は、前記疾患の診断用の尿サンプル中の一以上の分析対象物の濃度を測定するステップと、前記尿サンプルの電気伝導度を測定するステップと、前記分析対象物の濃度を尿サンプルの電気伝導度で割ることにより分析対象物濃度の標準化値を得るステップと、この標準化値を所定の参照値と比較することにより前記被験者が前記疾患を有するかどうかを判定するステップとを含む。診断対象となる疾患は、例えば、尿中対象分析物が一以上のトロンボキサンである急性心疾患である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の疾患を診断する方法であって、
ａ）前記被験者から尿サンプルを採取するステップと、
ｂ）前記疾患の診断用の前記尿サンプル中の一以上の分析対象物の濃度を測定するステップと、
ｃ）前記尿サンプルの電気伝導度を測定するステップと、
ｄ）ステップｂ）で得た前記分析対象物の濃度をステップｃ）で得た尿サンプルの電気伝導度で割ることにより分析対象物濃度の標準化値（ＮＴＶ）を得るステップと、
ｅ）ステップｄ）で得たＮＴＶを所定の参照値と比較することにより前記被験者が前記疾患を有するかどうかを判定するステップとを含む方法。
【請求項２】
診断の対象となる疾患が急性心疾患であり、尿中分析対象物が、トロンボキサンＢ２、１１−デヒドロトロンボキサンＢ２、２，３−ジ−ノルトロンボキサンＢ２及びこれらの混合物から成る群から選択される一以上のトロンボキサンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定対象のトロンボキサンがトロンボキサンＢ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
トロンボキサン濃度と電気伝導度の両方を電流測定アッセイによって測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
トロンボキサン濃度と電気伝導度の両方を半導体系デバイスを用いて測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
電気伝導度を伝導度計を用いて測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
トロンボキサン濃度をイムノアッセイによって測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
イムノアッセイがエンザイムイムノアッセイである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾病の診断における尿の電気伝導度測定値の使用並びに尿中分析対象物（ａｎａｌｙｔｅ）の濃度の使用に関する。より詳細には、本発明は、急性心疾患の診断における尿中トロンボキサン濃度の電気伝導度標準化測定値の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種疾患を効果的に処置する上で重要な一要件として、正確で簡便且つ迅速な診断方法が利用可能であることが挙げられる。この要件は全ての病態にあてはまるが、最も重要となるのはおそらく急性心疾患等の生命を脅かす可能性のある疾患の場合であろう。
【０００３】
心臓や血管に影響を及ぼす疾病は、罹患及び死亡の主因の一つとなっている。特に西欧では、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）が主な死因となっている。心血管疾病全体は多数の様々な疾患群から成っており、各疾患はそれぞれ固有の病因論的因子を有するが、最も一般的な心血管疾病の多くに共通する要因は、多様な生化学的、病態生理学的結果を伴うアテローム硬化型プラークの形成である。
【０００４】
世界的規模でみると、毎年、７０００万を超える人々が胸の痛みを訴えて病院やプライマリ・ヘルスケア施設を訪れている。合衆国だけをみても、毎年６００万を超える人々が胸の痛みにより病院を訪れており、この統計値は、合衆国における現在の年間医療支出の１／４が優に心血管疾患によって占められているという事実に反映されている。
【０００５】
治療の有効性は心筋イベント（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｅｖｅｎｔ）が起こった時点から急激に低下するため、心血管症状を迅速に且つ正確に診断し、かなり早い段階で適切な治療を開始できるかどうかが、心疾患による死者の数を減らす上で重要となる。
【０００６】
改良された診断技法によるスクリーニングがもたらす付加的な医療上の利点は、アテローム硬化性障害やそれに続く心血管（及び脳血管）症状を発症する危険性のある患者を検出できることである。これは、重篤な心血管疾患を予防するための信頼しうる戦略を開発するうえで明らかに利点となる。最後に、早期の正確な診断検査方法を開発することによって、医療施設は不要な入院や費用のかかる検査を減らすことができ、その結果大幅なコスト削減が可能となる。現在、ＡＣＳ患者の検査にかかる年間総費用は、アメリカ心臓病大学（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）によると約６０億ドルと見積もられている。
【０００７】
トロンボキサン類は、血小板凝集や動脈収縮その他の多くの生物学的作用を引き起こすプロスタグランジン・エンドペルオキシド由来の化合物である。これらトロンボキサン類の一種であるトロンボキサンＡ２は、非常に不安定で生物活性を有する二環式オキシタン−オキサン（ｏｘｉｔａｎｅ−ｏｘａｎｅ）化合物であり、非常に強い血管収縮及び血小板凝集特性を示す。トロンボキサンＡ２はアテローム血栓性障害において重要な役割を果たすことが見出されており、不安定狭心症や急性心筋梗塞等のイベントの直後に多量のトロンボキサンＡ２が合成されることがわかっている［フィッツジェラルド、Ｄ．Ｊ．ら、（１９８６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１５：９８３−９８９］。上述のように、トロンボキサンＡ２は非常に不安定であり、１１−デヒドロトロンボキサンＢ２や２，３，ジ−ノルトロンボキサンＢ２（以下これらを総称して「トロンボキサンＢ２」という）等の安定な代謝物へと急速に転化する。これら代謝物は尿中に排出される。
【０００８】
イオン含有溶液の各種電気特性は、幾つかの異なる方法で表現することができる。これら電気特性の一つとして、電流に対する抵抗が挙げられる。電気抵抗（Ｒ）は次式によって定義することができる。
Ｒ＝ρ×（Ｌ／Ａ）
式中、Ｌ及びＡはそれぞれ、抵抗測定対象試料（ｍｅｄｉｕｍ）の長さ及び断面積を示し、ρは測定試料の抵抗率として知られる比例定数を示す。電解液の電気特性の評価基準（ｍｅａｓｕｒｅ）として、一般に電気伝導度が用いられるが、これは抵抗率の逆数で定義され、通常センチメートル当りのジーメンス（Ｓ／ｃｍ）単位で測定される。
【０００９】
尿の電気伝導度は、とりわけ尿希釈力の指標であって、様々な病態の病因論的研究に用いられてきた。一例として、尿希釈度とシュウ酸カルシウム結晶化のリスクとの関係についての研究が挙げられる。ある研究においては、尿の電気伝導度を測定して尿希釈度を評価している［ティセリウス、Ｈ．Ｇ．（１９９２）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４８：９９０〜９９４］。この研究の結果から、伝導度計を用いた尿希釈のモニタリングが、カルシウム結石疾患予防のための有用なモニタリングツールとなり得ることが示唆された。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、各種内科的及び外科的疾患の信頼しうる診断のための尿分析方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、技術的に容易に実施でき、迅速に結果が得られ、その結果、長い待ち時間を必要とせずに適切な治療計画を開始できる方法を提供することである。
【００１２】
特に、本発明の目的は、急性心疾患の診断に用いることのできる方法を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる目的は、心疾患の発症のごく初期に用いることができ、また、早い段階での警告と応急的観察の技法（ｆｉｒｓｔ−ｗｉｎｄｏｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）として用いて信頼しうる予測データを得ることのできる診断アッセイを提供することである。
【００１４】
本発明の更なる目的は、従来の方法における問題を克服する、急性心疾患のためのアッセイを提供することである。
【００１５】
本発明の他の諸目的と利点は、以下の記述により明確になるであろう。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、本発明において、尿サンプル中の分析対象物の電気伝導度と濃度両方の測定値を、信頼しうる診断用、予測用ツールとして用いることができることが見出された。また、予期されなかったことだが、電気伝導度測定値を尿中の分析対象物濃度の標準化手段として用いることによって、診断上の信頼性及び精度が大幅に高まることが判明した。
【００１７】
本発明は主に被験者の疾患の診断方法に関する。この診断方法は、
ａ）前記被験者から尿サンプルを採取するステップと、
ｂ）前記疾患の診断用の前記尿サンプル中の一以上の分析対象物の濃度を測定するステップと、
ｃ）前記尿サンプルの電気伝導度を測定するステップと、
ｄ）ステップｂ）で得た分析対象物濃度をステップｃ）で得た尿サンプルの電気伝導度で割ることにより分析対象物濃度の標準化値（ＮＴＶ）を得るステップと、
ｅ）ステップｄ）で得たＮＴＶを所定の参照値と比較することにより前記被験者が前記疾患に罹患しているかどうかを判断するステップとを含む。
【００１８】
上記ステップｂ）及びｃ）はいかなる順序で行ってもよく、また、交互に行っても同時に行ってもよい。
【００１９】
本明細書において「心疾患」とは、アテローム硬化性疾患や病理学的血栓形成性疾患を含む、心臓や血管の疾患を意味する。
【００２０】
本発明の方法の好ましい一実施形態においては、診断の対象となる疾患は急性心疾患であり、尿中分析対象物は、トロンボキサンＢ２、１１−デヒドロトロンボキサンＢ２、２，３−ジ−ノルトロンボキサンＢ２及びこれらの混合物から成る群から選択される一以上のトロンボキサンを含む。
【００２１】
本発明の方法の好ましい一実施形態においては、測定対象のトロンボキサンはトロンボキサンＢ２である。
【００２２】
多くの様々なアッセイ技法を用いて、本発明の方法に必要な測定を行うことができる。本発明の好ましい一実施形態においては、分析対象物（例えば、トロンボキサン）濃度と電気伝導度の両方を電流測定アッセイ（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）によって測定する。本発明の方法において好適に用いられる電流測定アッセイは、同時係属中のイスラエル特許出願第１３２４１０号に開示されている。
【００２３】
本発明の他の好ましい実施形態においては、分析対象物（例えば、トロンボキサン）濃度と電気伝導度の両方を半導体系デバイスを用いて測定する。
【００２４】
本発明の更に他の好ましい実施形態においては、尿サンプルの電気伝導度を伝導度計を用いて測定する。
【００２５】
本発明の方法の更に好ましい実施形態においては、分析対象物（例えば、トロンボキサン）濃度をイムノアッセイを用いて測定する。より好ましい実施形態において、前記イムノアッセイは酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）である。
【００２６】
本発明の上記全ての特徴、他の特徴及び利点は、以下に記載の本発明の例示的、非制限的な好ましい実施形態によってより良く理解されるであろう。
【００２７】
【発明の実施の形態】
尿中の分析対象物（例えば、トロンボキサンＢ２化合物）の濃度は、適切な定量的又は半定量的技法を用いて測定することができる。適切な定量的技法の例としては、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫比濁法、電流測定アッセイ、ディップスティック型アッセイ及び半導体系デバイスを用いた測定等が挙げられるが、これらに限定されない。上記技法は全て当該技術分野において広く知られており、当業者にはよく知られているものである。
【００２８】
尿の電気伝導度は、当該技術分野で知られた標準技法（例えば、電流測定技法や専用伝導度計の使用）のいずれを用いても測定することができる。固体半導体デバイスを用いることもできる。より簡便には、尿中トロンボキサン濃度と電気伝導度の両方を、半導体デバイスの別々のチャンネルを用いて同時に測定する。こうして得られた二種類の電流値を別々に解析し、以下の実施例に記載したデータ解析技法に従って診断結果を得ることができる。
【００２９】
【実施例】
トロンボキサン濃度測定値／電気伝導度測定値と臨床診断との関連付け
方法
被験者及びサンプル
ある地区の大病院の緊急治療室に収容された８９名の患者から成るグループ（年齢：４０〜７０歳）をこの研究のために無作為に選んだ。これら患者に対し診断及び治療を施す前に各患者から尿サンプルを採取した。採取した尿サンプルを直ちに凍結し、−２０℃で１ヶ月未満保存し、その後生化学的分析に付した。
【００３０】
また、これら患者に対しアスピリン等のシクロオキシゲナーゼ阻害剤を現在服用しているか、又は最近まで服用していたかどうか尋ねた。
【００３１】
尿サンプルを採取後３０日間、各患者の病状を次の２つの基準に従って評価した。
１．心イベントの有無
２．胸痛の無いこと
上記臨床評価を行うにあたり、患者グループを入院時（即ち、尿サンプルを採取した日）の結果に従って次のサブグループに分けた。
ｉ．心臓ケアユニット／循環器科に紹介
ｉｉ．病院内の内科に紹介
ｉｉｉ．退院患者
ｉｖ．全患者
【００３２】
臨床結果と生化学的／電気伝導度分析（後述する「データ解析方法」を参照）による結果とを比較し、該分析の診断ツールとしての感度と特異性を判断した。
【００３３】
分析方法
１．トロンボキサンＢ２分析
尿サンプル中のトロンボキサンＢ２の濃度は、ＢｉｏｔｒａｋＴＭシステム（英国バッキンガムシャー、リトル・シャルフォント、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ；ｃｏｄｅ　ＲＰＮ　２２０）に一部手を加えたものを用いて測定した。凍結した尿サンプルを解凍し、なんらの前処理を行うことなく直接トロンボキサンアッセイに用いた。
【００３４】
即ち、各サンプル又はトロンボキサンＢ２標準品（５０μＬ）を、ロバ抗ウサギＩｇＧで予めコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルに二連で（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）添加した。標準溶液の希釈は全て、０．９％塩化ナトリウム及び０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）から成るアッセイ用バッファーを用いて行った。このアッセイ用バッファーは、ゼロ標準（即ち、トロンボキサンＢ２が０ｐｇの）ウェル及び非特異的結合（即ち、バッファーのみを含む）ウェルの調製にも用いた。標準ウェルに添加したトロンボキサンＢ２の量は、ウェル当り０．５〜６４ｐｇの範囲であった。次に、ウサギ抗トロンボキサンＢ２抗血清（５０μＬ）を各ウェル（分光測光のためのブランクウェルを除く）に添加した。次いで、トロンボキサンＢ２−西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート溶液（５０μＬ）を各ウェル（前記ブランクウェルを除く）に添加し、プレートを室温で１時間振盪させながらインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、各ウェルの内容物を吸引し、各ウェルを４００μＬの洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５））にて４回洗浄した。最終洗浄ステップの直後、酵素基質（１５０μＬ；３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン及び過酸化水素から成る）を各ウェルに添加した。その後、プレートを室温で正確に１５分間振盪させながらインキュベートし、着色反応物を生成させた。１Ｍ硫酸（１００μＬ）を各ウェルに添加することによって反応を停止させた。十分に混合し、硫酸添加後３０分以内に、各ウェルの４５０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）をプレートリーダーを用いて読み取った。
【００３５】
結合抗体の割合（％Ｂ／Ｂ０）に対して既知のトロンボキサンＢ量（ｘ軸）をプロットすることによって、トロンボキサンＢ２標準品の検量線を作成した。結合抗体の割合（％Ｂ／Ｂ０）は次の関係式に従って算出した。
％Ｂ／Ｂ０＝［（トロンボキサン標準品ＯＤ−非特異的結合ＯＤ）／（Ｂ０ＯＤ−非特異的結合ＯＤ）］×１００
（式中、各ＯＤ値は二連ウェルでの平均値である）
【００３６】
各サンプル中のトロンボキサンＢ２量は、上記検量線から直接読み取ることによって得た。
【００３７】
２．電気伝導度分析
各尿サンプルの電気伝導度は、ＣｙｂｅｒＳｃａｎＣＯＮ１００伝導度計（Ｅｕｔｅｃｈ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｐｔｅ　Ｌｔｄ．、シンガポール）を用いて測定した。
【００３８】
３．結果の標準化
試験対象各サンプルの標準化トロンボキサンＢ２濃度値は、簡単な除法を用いるか又はより高度な統計モデルを用い、前記トロンボキサン濃度（ｐｇ／ｍｌ単位で測定）を電気伝導度値（ｍＳ／ｃｍ単位で測定）で割ることによって求めた。分析をより簡単にするため、全ての値を自然対数に変換した。トロンボキサン濃度の標準化は、トロンボキサン濃度の自然対数から電気伝導度値の自然対数を差し引くことによって行った。
【００３９】
データ解析方法
カットオフ値は、患者が疾患を伴っているか正常であるかを示す値である。カットオフ値は、レシーバオペレーティング特性曲線（ＲＯＣ）（偽陽性値ｖｓ．感度（又は真の陽性値）のプロット）に従って求めた。この解析によって試験結果と臨床結果との相関関係が最適化される。
【００４０】
上記各種分析の結果を集め、以下に記載した２つのルールに従って分析結果の解析を行った。
【００４１】
ルール１−トロンボキサンＢ２濃度測定値のみに基づく解析
ルール１においては、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、アスピリン）を服用していない患者については、トロンボキサン濃度の自然対数変換値がカットオフ値５．１より大きい場合に結果が陽性（即ち、心疾患を有する）であるとし、一方、該阻害剤を現在服用しているか又は最近まで服用していた患者については、該自然対数変換値がカットオフ値４．９より大きい場合に結果が陽性であるとする。
【００４２】
ルール２−（ｌｎトロンボキサンＢ２濃度−ｌｎ電気伝導度値）（即ち、電気伝導度値に対するトロンボキサンＢ２濃度の比の対数変換）による計算値に基づく解析
ルール２においては、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、アスピリン）を服用していない患者については、上記計算値がカットオフ値３．２より大きい場合に結果が陽性（即ち、心疾患を有する）であるとし、一方、該阻害剤を現在服用しているか又は最近まで服用していた患者については、該計算値がカットオフ値２．７より大きい場合に結果が陽性であるとする。
【００４３】
カットオフ値は、本発明の方法においては参照値として用いられる。この参照値は、多数の患者グループの診断結果に基づいて得るのが好ましい。
【００４４】
上記ルールに従ってデータを解析してまとめた後、各ルールにおける感度と特異性を次の定義に従って求めた。
感度（％）＝真陽性／（偽陰性＋真陽性）×１００
特異性（％）＝真陰性／（偽陽性＋真陰性）×１００
【００４５】
結果
臨床結果（何らかの心イベントがみられる患者／胸痛の無い患者）と上記２つのルールに基づくラボ結果とを比較した結果を表１（ルール１：電気伝導度標準化無し）及び表２（ルール２：電気伝導度標準化有り）に示す。患者の内１名については、電気伝導度の測定を行うことができなかった。
【００４６】
【表１】
2004504605.tif 000002
【００４７】
【表２】
2004504605.tif 000003
【００４８】
各患者グループにおける、上記２つのルール（即ち、非標準化トロンボキサン測定値及び電気伝導度によって標準化したトロンボキサン測定値）に基づいて得た感度及び特異性を表３（非標準化データ）及び表４（電気伝導度標準化データ）に示す。
【００４９】
【表３】
2004504605.tif 000004
【００５０】
【表４】
2004504605.tif 000005
【００５１】
表３及び４に示すように、感度については上記各ルールによりほぼ同等な値が得られたが、特異性についてはルール２（電気伝導度標準化トロンボキサン濃度の使用）の場合に大幅な改善がみられた。電気伝導度標準化法によって得られた高い特異性については有意性があるので、この方法を用いることによって、急性心エピソードのない患者（即ち、退院し得る患者）を高い信頼性で判定することができる。このように、電気伝導度で標準化されたトロンボキサンＢ２濃度データが、急性冠疾患の診断における信頼性の高い予測ツールとして用いられることが結論づけられた。
【００５２】
以上本発明の具体的な実施形態を説明したが、本発明の精神あるいは特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者は本発明に多くの修正、変更、適合化を行うことができることは理解されるであろう。
【国際公開パンフレット】
2004504605.tif 000006
2004504605.tif 000007
2004504605.tif 000008
2004504605.tif 000009
2004504605.tif 000010
2004504605.tif 000011
2004504605.tif 000012
2004504605.tif 000013
2004504605.tif 000014
2004504605.tif 000015
2004504605.tif 000016
2004504605.tif 000017
2004504605.tif 000018
2004504605.tif 000019
2004504605.tif 000020
2004504605.tif 000021
2004504605.tif 000022
2004504605.tif 000023
2004504605.tif 000024
2004504605.tif 000025
2004504605.tif 000026
【国際調査報告】
2004504605.tif 000027
2004504605.tif 000028