(57)【要約】本発明は、ゼブラフィッシュ転写伸長因子foggyに対して相同性を有するヌクレオチド及びアミノ酸配列、ニューロン形成、ドーパミン作動性又はセロトニン作動性ニューロンへの前駆細胞の分化に関する方法、並びにドーパミン作動性及びセロトニン作動性ニューロンの異常及び活性によって特徴付けられる疾患を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで神経前駆細胞を有効量のfoggyポリペプチドに接触させることにより、ドーパミン作動性ニューロンを形成する方法。
【請求項２】
接触がインビトロでなされる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
foggyポリペプチドが活性であり、図１１（配列番号：１）のアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
foggyポリペプチドが、図１１（配列番号：１）の配列を少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性で有する活性foggyアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
foggyポリペプチドが配列番号：１である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
インビトロで神経前駆細胞を有効量のfoggyポリペプチドアンタゴニストに接触させることによりセロトニン作動性ニューロンを形成する方法。
【請求項７】
接触がインビトロでなされる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
foggyポリペプチドアンタゴニストが活性であり、配列番号：３のアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
foggyポリペプチドアンタゴニストが、配列番号：３の配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性foggyアンタゴニストであるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
foggyポリペプチドが配列番号：３である請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物の疾患を治療する方法であって、前記疾患がドーパミン作動性ニューロンの退化によって特徴付けられ、有効量のfoggyポリペプチドで前もって処理した治療的に有効な量の神経前駆細胞を上記哺乳動物に移植することを含む方法。
【請求項１２】
哺乳動物の疾患を治療する方法であって、前記疾患がセロトニン作動性ニューロンの退化によって特徴付けられ、有効量のfoggyポリペプチドアンタゴニストで前もって処理した治療的に有効な量の神経前駆細胞を上記哺乳動物に移植することを含む方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのニューロン生存因子を治療的に有効な量で投与することをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ニューロン生存因子が：神経成長因子（ＮＧＦ）；毛様体神経細胞栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３（ＮＴ-３）；ニューロトロフィン-４（ＮＴ-４）；ａＦＧＦ；ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β、ＴＧＦ-β１）及び骨格筋抽出物からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾患が、姿勢反射、運動及び報酬関連行動の調節の異常によって特徴付けられるものである、請求項１１の方法。
【請求項１６】
疾患が：パーキンソン病、統合失調症、麻薬の常用及び安静時振戦、固縮、運動不能症及び姿勢異常を生じる外傷又は病気によって引き起こされる症状からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
疾患が無飲症、無食症又は感覚無視からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
治療的有効量のニューロン生存因子の投与を更に含む請求項１２の方法。
【請求項１９】
疾患が、食糧摂取、ホルモン分泌、ストレス応答、痛み及び免疫機能、性活動、心臓血管機能及び体温調節の異常な調節によって特徴付けられるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
疾患が：抑鬱；自殺感情；暴力的攻撃的な行動；強迫神経行動；拒食症／過食症及び統合失調症からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
神経前駆細胞と有効量のfoggyポリペプチドアンタゴニストを含有する物質の組成物。
【請求項２２】
神経前駆細胞と有効量のfoggyポリペプチドアンタゴニストを含有する医療用具。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ゼブラフィッシュ転写伸長因子foggyに対して相同性を有するヌクレオチド及びアミノ酸配列と、ニューロン形成と、ドーパミン作動性（DA）及びセロトニン作動性（5HT）ニューロンの異常及びその活性によって特徴付けられる疾患を治療する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
動物の神経系の発生中、細胞質成分の分布、発生日又は位置に僅かな変動性を持つ前駆細胞が、局在化した外来のシグナルに差次的に応答して、何百もの別のクラスのニューロン及び非ニューロン細胞を生じる。前駆細胞の間の最初の差異とその最終の表現型の双方が、独特の時間的又は細胞学的変化によって部分的に影響を受けるようである。例えば、Hox遺伝子の巣状の発現は脊椎動物の後脳の前後軸に沿った分節化を予期させる。Lumsden及びKrumlauf, 1996, Science 274: 1109-1114。一方、Lim、Islet及びLim-HD転写因子の独特の組み合わせが先行し、脊椎動物の運動ニューロンのサブタイプとその将来の軸索軌道を予測する。Tsuchida等, 1994, Cell 79: 957-70；Sharma等, 1998, Cell 95: 817-28。細胞外因子への差次的な応答はまた遺伝子発現の履歴によって特定され、つづいて発現遺伝子の独特のパターンに形を変える。よって、神経板中のhedgehog（Hh）への応答は転写因子のGliファミリーの存在を必要とし（Ruiz i Altaba, 1997, Cell 90: 193-6）及び異なった濃度のHhが表現型的に均一な群の細胞において別個の転写応答を導く。Tanabe及びJessell, 1996, Science 274: 1115-1123。同様に、ハエにおけるNotchリガンドDeltaに対する感覚器官前駆細胞（ＳＯＰ）系統の応答はタンパク質Numb及びProsperoの非対称的分布によって影響を受け、別個の娘細胞運命に翻訳される。Artavanis-Tsakonas等, 1999, Science 284: 770-776；Jan及びJan, 1998, Nature 392: 775-78。希な場合には遺伝子発現のパターンは遺伝子の再配列又はｍＲＮＡの母からの遺伝によって影響を受けるが、殆どの遺伝子の発現は転写レベルで調節されるようである。
【０００３】
現在まで、遺伝子の発現においてキーとなる調節段階は転写開始段階であると考えられている。よって、ショウジョウバエ胚での研究により、段階的な細胞内シグナルが転写開始因子によって運ばれること、またそのプロモーターが異なったタイプ、それらが有する結合部位の親和性の数で変わるので遺伝子はその応答が異なっていることが証明された。Burz等, 1998, EMBO J 17; 5998-6009; Jiang及びLevine, 1993, Cell 72: 741-52。同様に、外来のシグナルHh、Wnt（Eastman及びGrosschedl, 1999, Curr. Opin. Cell Biol. 11: 233-40）、BMP（Massague, 1998, Ann. Rev. Biochemistry 67: 753-91）、Delta/Serrate（上掲のArtavanis-Tsakonas等）及びレチノイン酸に対する独特の転写応答は、プロモーター結合部位の異なった分布を持つ別個の転写開始因子の使用の結果であると考えられる。しかし、翻訳可能なｍＲＮＡの生産は多段階の調節に従う複合プロセスである。例えば、脊椎動物での発生における空間的及び時間的な遺伝子発現の制御に関して比較的軽視されている領域はｍＲＮＡ伸長段階である。Greenblatt, 1997, Curr. Opin. Cell Biol. 9:310-9; Shilatifard, 1998, FASEB J. 12: 1437-46; Uptain等, 1997, Ann. Rev. Biochem. 66: 117-72。アデノウイルス、ワクシニア及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む幾つかの真核生物ウイルスは転写伸長を用いて、初期及び後期遺伝子の発現を調整し、その宿主の生理的状態に複製を適合させることが知られている。Garber及びJones, 1999, Curr. Opin. Immunol. 11: 460-65; Kim等, 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 5960-68; Wu-Baer等, 1998, J. Mol. Biol. 277: 179-97。また、細胞培養において、ガン原遺伝子c-fms、c-fos、c-myb及びc-mycを含む幾つかの脊椎動物遺伝子の発現は転写伸長段階で部分的に調節されるという指摘がある。上掲のUptain等。転写伸長の調節のありうる重要性の更なる裏付けは、Hipple-Lindau腫瘍抑制遺伝子産物が転写伸長因子に結合し（Duan等, 1995, Science 269: 1402-6）、骨髄-リンパ性白血病遺伝子がしばしば他の伸長因子と融合するという知見から生じる。上掲のShilatifard。同様に、成長遅延、ガンの高い発生及び／又は早期老化は、ブルーム及びワーナー症候群の典型であるが、ＲＮＡポリメラーゼ(Pol)Iによる伸長にも不可欠であると思われるＤＮＡヘリカーゼの突然変異によって引き起こされる。Gray等, 1997, Nature Genetics 17: 100-3。
【０００４】
インビトロ系を用いた生化学的研究により、転写伸長に刺激的又は抑制的影響を及ぼす一ダースを越える異なったタンパク複合体の存在が更に明らかにされた。上掲のGreenblatt。これらには、Pol IIに転写伸長インヒビター５,６-ジクロロ-１-β-Ｄ-リボフラノシルベンゾイミダゾール（DRB）及びH8での一時的休止又は永久的拘束を無視又は回避させる刺激因子が含まれる。Wada等, 1998, Genes & Devel. 12: 343-56。続いて、この複合体は１４Ｋｄ及び１６０Ｋｄの核タンパク質からなることが示され（上掲のWada等）、それはサッカロマイセス・セレヴィシエの転写伸長因子Spt4及び5（SuPressors ofTy insertion mutation）に構造的に相同的である。Hartzog等, 1998, Genes & Devel. 12: 357-69; Swanson等, 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 3009-19; Swanson及びWinston, 1992, Genetics 132: 325-36。インビトロにおいて、DSIFは、部分的には、負の伸長因子（NELF）複合体（Yamaguchi等, 1998, Genes Cells 3:9-15）及びPol IIの大きなサブユニットとの物理的相互作用によって、３０−６０のヌクレオチドの合成の後に、次亜リン酸化Pol IIの伸長活性を阻害する。Yamaguchi等, 1999, J. Biol. Chem. 274: 8085-92。Spt5/DSIFの阻害作用は構成的ではなく、翻訳後修飾によって調節されるように思われる。例えば、CDK9とサイクリンTからなるDRB及びH8-感受性P-TEFbキナーゼによるPol II CTDのリン酸化は、伸長複合体からのDSIF及びNELFの放出を容易にすることが示された。Wada等, 1998, EMBO J. 17: 7395-403; 上掲のYamaguchi等, 1998。また、低濃度のリボヌクレオチドの下では、DSIF複合体はインビトロでの伸長のインヒビターというよりむしろ刺激剤として作用する。上掲のWada等, 1998。それはまたＨＩＶ転写物のための正の伸長因子として作用し（上掲のKim等; 上掲のWu-Baer等）、それが多用途の伸長調節因子であるという考えを支持している。併せて考えると、これらの研究は、脊椎動物は調節された転写伸長に対する機構を保有しているが、インビボでのそのような調節の生理学的機能、普及性及び重要性は尚も解明されなければならないことの証拠を提供した。
【０００５】
セロトニン作動性ニューロンは食糧摂取、ホルモン分泌、ストレスに対する反応、痛みと免疫機能の調節において重要である。セロトニン作動性ニューロンは、大脳皮質、辺縁系及び脊髄を含む中枢神経系の殆ど全ての領域を刺激し、行動、食欲、痛み、性活動、心臓血管機能、ホルモン分泌、及び体温調節のような脳の複数の機能に影響を及ぼし得る。セロトニン作動性機能障害は様々な精神科、神経及びニューロン関連の他の疾病の病理生理学において所定の役割を担っていると思われる。例えば、精神の抑鬱、Asberg等, J. Clin. Psychiatry 47(4): 23-35 (1986); 自殺, 上掲のAsberg等, Lester, D. Pharmacopsychiatry 28 (2); 45-50 (1995)、統合失調症及び暴力での攻撃的な行動、Brown等, J. Clin. Psychiatry 54(4): 31-41 (1990), Eichelman, B.S., Annu. Rev. Med. 41: 149-158 (1990), Jacobs及びGelperin (1981) Seretonin Neurotransmission and Behavior, The MIT Press, Cambridge, MA。セロトニン摂取インヒビターは精神の抑鬱、強迫神経症及び過食症の治療に使用されている。Fuller, R.W., "Serotonin uptake inhibtors: Uses in clinical therapy and in laboratory research, "Progress in Drug Research 45: 167-204, Birkhaeuser-Varlag, Basel (1995)。セロトニン作動性ニューロンは脳血流を刺激するので、セロトニン受容体アゴニスト、例えばスマトリプタンは、片頭痛の発病を停止させるのに用いられている。Plosker G.L.等, Drugs 94(4); 622-651 (1994)。既知のクローン化セロトニン受容体の殆どは７つの膜貫通ドメインを持つＧタンパク質結合受容体スーパーファミリーに属する。Hoyer等, Pharmacol. Rev. 46(2): 157-203 (1994)。あるセロトニン受容体サブタイプはアデニル酸シクラーゼに負に連結するが、他のものは正に連結し、また他のものはホスホリパーゼＣ又はリガンド制御型イオンチャンネルの活性化に連動する。Fuller, R.W., Ann. N.Y. Acad. Sci. 780: 176-184 (1996)。
【０００６】
ドーパミン作動性ニューロンは運動及び報酬関連行動を制御する。これらのニューロンは前脳の複数の構造を刺激し、その退化又は異常な機能はパーキンソン病、統合失調症及び麻薬の常用に付随している。Hynes等, Cell 80: 95-101 (1995)。黒質に位置するドーパミン作動性ニューロンは、黒質線条体経路の両側の病巣がパーキンソン病において観察される観察運動機能障害：安静時振戦、固縮(rigidity)、運動不能症及び姿勢異常とかなり類似した症候を実験動物においてつくり出すので、線条体の活性に大きな影響を持つ。６-ヒドロキシドーパミン（OHDA）によって引き起こされる黒質線条体経路の両側病巣は齧歯類において深刻な運動不能症、無飲症、無食症及び感覚無視(sensory neglect)を引き起こした、Ungerstedt, U., Acta Physiol. Scand. 1971 (Suppl. 367): 95-121; Yirek及びSladek, 1990, Annu. Rev. Neurosci. 13: 415-440。
線条体ＤＡの喪失は線条体細胞上に位置する標的受容体の数の変更と関連している。パーキンソニズムにおいて、ＤＡ受容体の状態の変化は疾患の進行段階に依存している可能性がある。パーキンソニズムの顕著な特徴は基底核の全成分中におけるドーパミンの深刻な減少である。Hornykiewicz, O., 1988, Mt. Sinai J. Med. 55: 11-20。ドーパミンとその代謝産物は尾状核、被殻、淡蒼球及び黒質の緻密部において枯渇する。ＤＡの中程度の喪失は中坐核、視床下部外側、内側嗅部、及び扁桃体側位に見出されている。非ドーパミン作動性ニューロン系の変化には、殆どの基底核構造、小脳皮質、及び脊髄におけるノルエピネフリン、セロトニン、サブスタンスＰ、ニューロテンション及び幾つかの神経ペプチドの組織濃度の減少が含まれる。
【０００７】
統合失調症はしばしば特異な思考障害、環境に対する感情又は情動応答の乱れ及び自閉症−他の人々との相互作用からの離脱によって特徴付けられる。幻覚はまた統合失調症の徴候として結びつけられている。フェノチアジン薬が一般に統合失調症の徴候を軽減するのに効果的であると認識されている。他の医薬は神経伝達物質を含む。Snyder等, Science 184: 1243-1253 (1974)。アンフェタミンの長期の使用と中毒量はまた統合失調症様徴候を誘発する。
パーキンソン病に罹った患者における神経移植にかなりの注意が払われている。これらの臨床実験は、脳損傷領域への胎児胚神経細胞又はパラニューロン組織移植のレシピエントとしてパーキンソニズムの様々な動物モデルを用いる基礎科学的な研究から本質的に展開されてきた。神経移植の概念はかなり古いが、僅か最近の２０年においてのみ主要な進歩が見られ、様々な疾患の動物モデルにおいて正常化された機能を回復し維持するための神経移植の潜在的な長期の効果のような多くの問題が残されている。胎児ＤＡ神経細胞移植での動物実験は、そのような移植がＤＡ欠損を逆にし、黒質線条体ＤＡ系の実験的病巣を持つ動物において運動機能を回復させるという有望な結果を提供した。しかし、数多くの倫理的、法律的及び安全性の問題が、既に限られた供給を増幅させただけの要因である、臨床試験における胎児組織の使用と同時に生じており、その全てがドーパミン作動性ニューロンの代替供給源を切に必要としている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は一般に適切なニューロンの発生に不可欠な転写伸長因子であるfoggyのヌクレオチド、アミノ酸配列及び生化学的特徴付けを提供する。欠陥のあるfoggyポリペプチドを作り出す突然変異生物は、一見して形態的に正常に見えるが、よく検査すると、視床下部及び網膜ドーパミン作動性（DA）ニューロン、後脳ノルアドレナリン作動性（ＮＡ）ニューロン及び神経堤由来交感（NA）ニューロンに欠損を示している。興味深いことに、foggy突然変異体は、foggy突然変異体では視床下部ＤＡニューロンが欠損しているが、また驚いたことに隣接するセロトニン作動性（5HT）ニューロンの数の増加によって特徴付けられていた。これらのfoggy突然変異体はまた発生中の網膜においてニューロン発生に欠陥をまた示し、無軸索及び光受容体ニューロンの欠損が観察された。これに対して、網膜の神経節ニューロンには欠損がなく、数の少しの増加さえ示した。
一実施態様では、本発明は神経前駆細胞を有効量のfoggyポリペプチドに接触させることを含むドーパミン作動性ニューロンの形成方法を提供する。一側面では、foggyポリペプチドは図１１の配列番号：１を含む。特定の側面では、上記接触はインビトロでなされる。
他の実施態様では、本発明は神経前駆細胞を有効量のfoggyポリペプチドアンタゴニストに接触させることを含むセロトニン作動性ニューロンの形成方法を提供する。一側面では、foggyポリペプチドアンタゴニストは配列番号：３を含む。特定の側面では、上記接触はインビトロでなされる。
【０００９】
他の実施態様では、本発明は、疾患がドーパミン作動性ニューロンの退化によって特徴付けられる哺乳動物の疾患を治療する方法であって、有効量のfoggyポリペプチドで前もって処理した治療的に有効な量の神経前駆細胞を上記哺乳動物に移植することを含む方法を提供する。他の実施態様では、本発明は、疾患がセロトニン作動性ニューロンの退化によって特徴付けられる哺乳動物の疾患を治療する方法であって、有効量のfoggyポリペプチドアンタゴニストで前もって処理した治療的に有効な量の神経前駆細胞を上記哺乳動物に移植することを含む方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、食糧摂取、ホルモン分泌、ストレス応答、痛み及び免疫機能、性活動、心臓血管機能及び／又は体温調節の異常な調節によって特徴付けられる疾患の治療のために神経前駆細胞へのfoggyポリペプチドの適用から生じるセロトニン作動性ニューロンを用いる方法を提供する。特定の側面では、かかる疾患には、様々な精神、神経及び他の疾病、例えば精神の抑鬱、自殺感情、暴力的攻撃的な行動、強迫神経行動、拒食症／過食症及び統合失調症が含まれる。
他の実施態様では、本発明は、姿勢反射、運動及び／又は報酬関連行動の調節の異常によって特徴付けられる疾患の治療のために、神経前駆細胞へのfoggyポリペプチドアンタゴニストの適用から生じるドーパミン作動性ニューロンを用いる方法を提供する。特定の側面では、かかる疾患には、パーキンソン病、統合失調症及び麻薬の常用が含まれる。あるいは、かかる疾患は、パーキンソン様状態、例えば安静時振戦、固縮、運動不能症及び姿勢異常で、運動不能症、無飲症、無食症及び感覚無視を含むものを生じる外傷又は他の病気による障害から生じうる。
【００１０】
他の実施態様では、本発明は、神経疾患の治療のためにfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストと組み合わせて一又は複数のニューロン生存因子を哺乳動物に同時投与する方法を提供する。特定の側面では、ニューロン生存因子の同時投与は、foggyポリペプチド又はアンタゴニストの投与の前、後又は同時になされる。他の側面では、ニューロン生存因子はまた神経前駆細胞の移植と共に投与されうる。他の特定の側面では、ニューロン生存因子は神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経細胞栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３（ＮＴ-３）、ニューロトロフィン-４（ＮＴ-４）、ＦＧＦ-ｘ、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β、ＴＧＦ-β１）又は骨格筋抽出物でありうる。
更に他の実施態様では、本発明は神経前駆細胞と有効量のfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストを含有する物質の組成物を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は神経前駆細胞と、神経前駆細胞のそれぞれセロトニン作動性ニューロン又はドーパミン作動性ニューロンへの分化を刺激するための有効量のfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストを放出するための手段とを含む医療用具を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は医薬的に許容可能な担体と神経前駆細胞のそれぞれセロトニン作動性ニューロン又はドーパミン作動性ニューロンへの分化を刺激するための有効量のfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストを含有する組成物を提供する。
更に他の実施態様では、本発明はfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストをコードする単離核酸分子を提供する。
【００１１】
一側面では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長アミノ酸配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
一側面では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長foggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストｃＤＮＡ、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片のコード配列を含むＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１３】
他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストを提供する。
或る側面では、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の任意の他の特に定義された断片を有するfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストに対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストを提供する。
【００１４】
更に他の実施態様では、本発明は、ここで定義された天然foggyポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗foggy抗体又は小分子である。
更なる実施態様では、本発明は、foggyポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法であって、foggyポリペプチドを候補分子と接触させ、前記foggyポリペプチドによって媒介される生物学的活性（例えば、転写伸長）をモニターすることを含む方法を提供する。好ましくは、foggyポリペプチドは天然foggyポリペプチドである。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載の任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
別の実施態様では、本発明は、上述のあるいは下記のポリペプチドの任意のものに、好ましくは特異的に、結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
更に他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列を単離し、関連遺伝子の、又はアンチセンスプローブとして、発現を測定又は検出するのに有用でありうるオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
更に他の実施態様では、本発明は、下記の実施例に示される機能的生物学的アッセイデータに基づく種々の用途に対して本発明のfoggyポリペプチドを使用する方法を提供する。
【００１５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
I．定義
ここで使用される際の「foggyポリペプチド」及び「foggy」という用語は、ここで説明される様々なポリペプチドを意図する。これらの用語は、天然配列ポリペプチド並びにその変異体（ここで更に詳細に定義する）及びそのアンタゴニストの両方を包含する。foggyポリペプチド及びfoggyポリペプチド変異体は、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え及び／又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列foggyポリペプチド」は、天然由来のfoggyポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列foggyポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列foggyポリペプチド」という用語は、特に、ポリペプチドの自然に生じる切断、天然に生じる変異体型(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。本発明の種々の実施態様では、天然配列foggyポリペプチドは、添付された図に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは図中で太字、及び下線で示される。
【００１６】
「foggyポリペプチド変異体」又は「foggyポリペプチドアンタゴニスト変異体」とは、それぞれ、ここで開示される全長天然配列foggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニスト、又はここで開示される全長天然配列foggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストの断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するここで定義されるような活性foggyポリペプチドを意味する。このようなfoggyポリペプチド変異体は、多様な形態であり得る。例えば、「置換」変異体は、未変性配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、同じ部位に異なるアミノ酸が代わって挿入されたものである。置換には、分子内の１つのアミノ酸のみが置換された単一置換のものと、あるいは同じ分子において２又はそれ以上のアミノ酸が置換された多置換がある。「挿入」変異体は、未変性配列の特定の位置のアミノ酸に直ぐに隣接して一又は複数のアミノ酸が挿入されたものである。アミノ酸に直ぐに隣接してとは、アミノ酸のα-カルボキシル又はα-アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。「欠失」変異体は、未変性配列の一又は複数のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異体は、分子の特定領域において１又は２のアミノ酸が欠失される。また、ポリペプチド変異体はエピトープタグヘテロfoggyポリペプチド及びアンタゴニストに加えて残基に共有結合性の修飾を含む。
【００１７】
あるいは、foggyポリペプチド変異体又はfoggyポリペプチドアンタゴニスト変異体は、ここに開示されている全長天然配列foggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニスト配列、又はここに開示されている全長foggyポリペプチド配列の任意の他の特別に定義される断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そしてあるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、foggy突然変異体ポリペプチド又はfoggy突然変異体ポリペプチドアンタゴニストは、少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、あるいは少なくとも約４００アミノ酸長、あるいは少なくとも約５００アミノ酸長、あるいは少なくとも約６００アミノ酸長、あるいは少なくとも約７００アミノ酸長、あるいは少なくとも約８００アミノ酸長、あるいは少なくとも約８５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９００アミノ酸長、あるいは少なくとも約９５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９７５アミノ酸長、あるいは少なくとも約１０００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１０２５アミノ酸長、あるいは少なくとも約１０５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１０７５アミノ酸長、あるいは少なくとも約１１００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００１８】
ここで同定されるfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストに対して「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のfoggyポリペプチド/foggyポリペプチドアンタゴニスト配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら, ここでの目的ためには、％アミノ酸配列同一性値は下記の表１に記載のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られ、このALIGN-2プログラムの完全なソースコードは以下の表１に提供される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社により作成され、以下の表１に示されたソースコードは、米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９にユーザー資料と共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社（サウス  サンフランシスコ，カリフォルニア）を通じて公的に利用できるし、あるいは以下の表１に提供されるソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムはUNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムにより設定され、変動しない。
【００１９】
アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる上で、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ここでＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＰＲＯ」は関心ある仮定ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は関心ある「ＰＲＯ」ポリペプチドと比較され、これに対するポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は、それぞれ異なる仮定アミノ酸残基を表す。
【００２０】
特に断らない限り、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して上記に記載したようにして得られる。しかし、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムWU-BLAST2コンピュータプログラム（Altschulら, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を用いて下記のようにして得てもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータはデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値(Ｔ)＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST-2を使用する場合、％アミノ酸配列同一性値は、(ａ)天然foggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストから誘導された配列を有する関心あるfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストのアミノ酸配列と、関心ある比較アミノ酸配列(即ち、関心あるfoggyポリペプチドが比較されるfoggy突然変異体ポリペプチド/そのアンタゴニストであってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、(ｂ)関心あるfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチド変異体の残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが関心ある比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが関心あるfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストのアミノ酸配列である。
【００２１】
また、パーセントアミノ酸配列同一性は配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードするか、又は国立衛生研究所, Bethesda, MD.から得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全てはデフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。
【００２２】
「foggy突然変異体ポリヌクレオチド」又は「foggy突然変異体核酸配列」は、以下に定義するような活性なfoggyポリペプチドをコードする核酸分子を意味し、ここに開示する全長天然配列foggyポリペプチド配列又はそのアンタゴニスト、あるいはここに開示する全長foggyポリペプチド又はそのアンタゴニスト配列の任意の他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する。通常は、foggy突然変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列foggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニスト配列、あるいはここに開示する全長foggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニスト配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然のヌクレオチド配列を含まない。
【００２３】
ここに同定されるfoggy又はfoggyアンタゴニストコーディング核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、関心あるfoggy又はfoggyアンタゴニスト核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２４】
核酸配列比較にALIGN-2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４及び５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示しており、ここで「ＰＲＯ-ＤＮＡ」は関心ある仮定ＰＲＯコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は関心ある「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子と比較され、これに対する核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は、それぞれ異なる仮定ヌクレオチドを表す。
【００２５】
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、また、パーセント核酸配列同一性を配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードするか、又は国立衛生研究所, Bethesda, MD.から得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全てはデフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性(与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。
他の実施態様では、foggy突然変異体又はfoggy突然変異体アンタゴニストポリヌクレオチドは、活性foggyポリペプチド又はfoggy突然変異体アンタゴニストをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長foggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。foggy突然変異体ポリペプチド又はそのアンタゴニストは、それぞれfiggy変異体ポリヌクレオチド又はアンタゴニストにコードされるものであってもよい。
【００２６】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、foggyポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」foggyポリペプチドコーディング核酸又はfoggyポリペプチドアンタゴニストコーディング核酸は、ポリペプチドコーディング核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され、分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドコーディング核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたポリペプチドコーディング核酸分子は、天然の細胞中に存在する特定のポリペプチドコーディング核酸分子とは区別される。しかし、単離されたポリペプチドコーディング核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるポリペプチドコーディング核酸分子を含む。
【００２７】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗foggyモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗foggy抗体組成物、単鎖抗foggy抗体、及び抗foggy抗体の断片を包含する（下記を参照のこと）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。
【００２８】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００２９】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したfoggyポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３０】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、転写伸長を促進する、引き起こす又は生じさせる能力を保持するfoggyポリペプチドの形態を意味する。特定の態様では、転写伸長はドーパミン作動性ニューロンの形成を生じる。同様の文脈で、foggyポリペプチドアンタゴニストの「活性」は転写伸長、特にセロトニン作動性ニューロンの形成を生じる転写伸長を減弱、崩壊又は終結させる能力を意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然foggyポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然foggyポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然foggyポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。foggyポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、foggyポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、foggyポリペプチドに通常付随する１つ又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【００３１】
「治療」とは、治癒的処置及び予防的療法又は防止的療法の両方を意味し、その目的は標的とする病理的状態又は疾患を防止し又は遅く（減少）させることにある。従って、「治療」は治癒的治療と予防的又は防止的手段の双方を意味する。従って、「治療」は、治癒的処置及び再発防止の予防的方法の両方を意味する。治療を必要とするものには、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されるべきものが含まれる。ドーパミン作動性又はセロトニン作動性ニューロンの退化によって特徴付けられる疾患の治療では、治療薬は疾患の病理的要因（例えば、減少したニューロン機能）の応答の大きさを直接増加させるか減少させ、あるいは疾患を他の治療薬による治療に対してより感受性であるようにしうる。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ネコなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
１つ又は複数の更なる治療薬剤との「組み合わせに」よる投与には、順序を問わない同時（共同の）及び連続投与が含まれる。
【００３２】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）を含む。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 ）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ’)２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００３３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定する。集合的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ(ａｂ’)２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
【００３４】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法(Lowry method)で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３５】
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」又はそれに対して「特異的である」抗体は、任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合しないでその特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合するものである。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ、その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（例えばfoggyポリペプチド又はそれに対する抗体）の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」は約５００ダルトン以下の分子量を有するものとここでは定義される。
【００３６】
「疾患」はドーパミン作動性又はセロトニン作動性ニューロンの形成を生じる分子での治療又は該分子の適用から恩恵を受けるであろうあらゆる症状である。ドーパミン作動性ニューロンの移植又はその形成から恩恵を受けるであろう疾患の例は、パーキンソン病、統合失調症及び麻薬の常用を含む、不適切な姿勢反射、運動及び／又は報酬関連行動の調節に関連するものである。セロトニン作動性ニューロンの移植又はその形成から恩恵を受けるであろう疾患の例は、意識、覚醒、動作、及び食糧摂取で、攻撃、鬱病（自殺行為を含む）、統合失調症及び拒食症／過食症を含むものの異常により特徴付けられるものである。
foggyポリペプチドの「有効量」は、例えば神経前駆細胞からセロトニン作動性ニューロンの形成を生じるもののような、転写伸長を促進し、引き起こし又は生じるのに十分な少なくとも最小量である。同様に、foggyポリペプチドアンタゴニストの「有効量」は、例えば神経前駆細胞からドーパミン作動性ニューロンの形成を生じるもののような、転写伸長を減じ、乱し又は終了させるのに十分な少なくとも最小量である。ニューロン生存因子の「有効量」は生存因子がない場合にさもなくば存在するであろうニューロン細胞のより大なる集団の生存を促進させるような量である。
「ニューロン生存因子」は、その因子が接触させられるニューロンを、そうでない場合よりも長い期間の間、生存させる任意の物質である。例えば、米国特許第５７３３８７５号はグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を用いて癲癇性発作から保護し又はそれを防止する方法を記述している。ＧＤＮＦはインビトロでの胚性中脳腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンに対して栄養活性を持つ既知の薬剤である。Lin等, 1993, Science 260: 1130-1132; Lin等, 1994, J. Neurochem. 63: 758-768。組換えヒトＧＤＮＦは、また、インビボでドーパミン作動性線維の萌芽を誘発し（Hudson等, 1993, Soc. Neurosci. Abstr. 19: 652）、ラットの黒質におけるドーパミン生産を増大させ（上掲のHudson等, Miller等, 1994, Soc. Neurosci. Abstr. 20: 535-7）、６-ＯＨＤＡ障害からニューロンを保護し、インオキュロでの黒組織(nigral tissue)のラット胎仔移植の成長及び線維形成を増大させることが証明されている。Stromberg等, 1993, Exp. Neurol. 124: 401-412。
【００３７】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は末梢感覚ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン及び網膜神経節のための栄養因子である。Henderson等, 1993, Restor. Neurol. Neurosci. 5: 15-28。ＢＤＮＦはまたインビトロとインビボの双方での自然に生じる細胞死を防止することが示されている。Hofer及びBarde, 1988, Nature 331: 161-262。ニューロトロフィン-３は中枢及び末梢神経系の双方において見いだされており、後根神経節（ＤＲＧ）外植片を含む、感覚及び交感ニューロンの生存を促進することができる。毛様体神経細胞栄養因子（ＣＴＮＦ）はインビトロでのニワトリの胎仔毛様体神経節の生存を促進し、また培養された交感、感覚及び脊髄運動ニューロンの生存を支援することが見いだされた。Ip等, 1991, J. Physiol. 85: 123-130。生まれたばかりのラットの病変部位へのこのタンパク質の局所投与は対応する運動ニューロンの退化を防止することが示された。ＣＮＴＦはまた発達細胞死から運動ニューロンを救済した。Henderson等, 1993, Restor. Neurol. Neurosci. 5: 15-28。
更なるニューロン生存因子には、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン-３（ＮＴ-３）、ニューロトロフィン-４（ＮＴ-４）、ａＦＧＦ、ＩＬ-１ｂ、ＴＮＦａ-、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β、ＴＧＦ-β１）が含まれる。
前駆細胞の「治療的に有効な量」は、ドーパミン作動性又はセロトニン作動性ニューロンの喪失又はそれへの損傷によって引き起こされる生理的効果を制止し又は改善するような量である。細胞の好適な範囲は約１００から約５０００００の活性なニューロンの範囲とできる。好ましくは、範囲は約５００から約５０００００、最も好ましくは約１０００から約５０００００である。foggyポリペプチドの「治療的に有効な量」は、少なくともセロトニン作動性ニューロンの欠損によって特徴付けられる疾患に罹った患者の状態を軽減し、緩和し又は改善等するのに十分な最小量である。foggyポリペプチドの「治療的に有効な量」は、少なくともドーパミン作動性ニューロンの欠損によって特徴付けられる疾患に罹った患者の状態を軽減し、緩和し又は改善等するのに十分な最小量である。
【００３８】
「ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン」は神経伝達物質ドーパミンを分泌するニューロンを意味する。それらは線条体、辺縁系、及びネオコルテックスを神経支配し、運動ニューロンを含む幾つかの他のクラスのニューロンと共に腹側中脳に存在する。ＤＡニューロンは、姿勢反射、運動及び／又は報酬関連行動を調節する。ＤＡニューロンの喪失はパーキンソン病を生じ、その異常な機能が統合失調症及び麻薬の常用に付随している。
「セロトニン作動性（５ＨＴ）ニューロン」は神経伝達物質セロトニン（５-ヒドロキシトリプタミン）を分泌するニューロンを意味する。５ＨＴニューロンは典型的にはゆっくりとしたリズミカルなファイアリングパターンを持ち、後脳の腹側及び腹側両面の側面に集中しており、大脳皮質、辺縁系及び脊髄を含む中枢神経系のほとんどの部分を神経支配する。５ＨＴニューロンは意識、覚醒、動作、及び食糧摂取のレベルを調節する。セロトニン作動性ニューロンの異常な機能は攻撃、鬱病（自殺行為を含む）及び統合失調症に関連している。
「神経前駆細胞」はニューロンを生じるかニューロンに分化する細胞である。それらは、前方−後方及び背側−腹側軸に沿ったその相対的な位置に依存して様々なニューロンクラスに分化することが観察されている。更に、本発明において使用される神経前駆細胞は、有効量のfoggyポリペプチドに接触するとセロトニン作動性ニューロンに分化し、有効量のfoggyポリペプチドアンタゴニストに接触するとドーパミン作動性ニューロンに分化する。
【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．foggyはニューロン発生の主要な分化のマーカーである
本発明は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現に影響する突然変異の遺伝的スクリーニングで最初に同定された表現型をもつゼブラフィッシュ突然変異に相当するポリペプチドであるfoggyのヌクレオチド及びアミノ酸配列を説明し、特徴とする。現在、foggyはドーパミン作動性（ＤＡ）及びノルアドレナリン作動性（ＮＡ）ニューロンの主要な分化のマーカーとして認識されている。Guo等, 1999, Devel. Biol. 208:473-87。foggy突然変異胚は形態学的に正常であるが、視床下部及び網膜のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン、後脳ノルアドレナリン作動性（ＮＡ）ニューロン及び神経堤由来交感神経ＮＡニューロンに欠陥が見られる。驚くべきことに、視床下部のＤＡニューロンの欠陥は近くのセロトニン作動性（５ＨＴ）ニューロン数の増加を伴っていた。また、神経発生は、無軸索及び光受容ニューロンの欠陥が観察された発達した網膜にも影響していた。対照的に、網膜神経節ニューロンは欠陥がなく、さらに、少ない増加を示した。５ＨＴを含むニューロン及び後脳のマウスナーニューロン、脊髄のＧＡＢＡ作動性介在及び運動ニューロン、神経堤由来後根神経節及びＮＡアーチ関連ＣＡ（ＡＡＣ）細胞の多くの他の場合には、foggy突然変異体において正常に発生した。位置クローニングは、突然変異表現型の分子的な原因が酵母及びヒトＳｐｔ５に構造的に関連する核タンパク質の部位突然変異であることを示した。foggyの生化学分析は、それがｍＲＮＡ転写伸長及の二重調節であること、及び突然変異はその抑制性活性を崩壊させるが刺激性活性は崩壊しないことを明らかにした。まとめると、これらの発見は、実際に転写伸長が脊椎動物の遺伝子発現の主要な調節意義を有すること、及び転写伸長の的確な制御は、転写開始の調節と共に適切な神経発生に不可欠であることの分子的、遺伝的及び生化学的証拠を提供する。出願人はここで、中枢（ＣＮＳ）及び末梢（ＰＮＳ）神経系における多数のニューロンタイプの発達及び識別に選択的に影響するゼブラフィッシュ突然変異を説明する。更なる分子的、遺伝的及び生化学的分析は、突然変異の表現型が転写伸長におけるｚＳｐｔ５の抑制性機能を崩壊させるが刺激性機能は崩壊させない突然変異によって引き起こされることを示す。これらの発見は、転写伸長の調節が神経発生の間における遺伝子発現の必須の生理的制御段階を構成することを示す。
【００４２】
１．調節された過程としての転写伸長
突然変異foggy表現型は、インビボでの調節された過程としての転写伸長の意義を明らかにする。このタイプの調節は、転写開始の機構に利用できないレベルの制御を提供する。まず、それは環境の変化に対する又は細胞外刺激に対する非常に素速い反応を可能にする。例えば、ショウジョウバエは、その熱ショックタンパク質ｈｐｓ７０転写が、熱さの刺激をなくす抗終結機構により調節されるので熱さに耐えることができ；従って、転写は素速く完了し、タンパク質合成に利用できる。また、転写伸長の調節は、遺伝子転写の進行中の制御を可能にする。例えば、ヒトジストロフィン遺伝子は2000kb以上にわたり、完全に転写するのに５０時間以上かかるだろう。Uptain等, 上掲。転写伸長の段階での干渉なしに、いったん開始され、このような遺伝子の転写は２日以上の間調節されないであろう。逆に、制止されたＲＡＮ Ｐｏｌ ＩＩを有するほとんど完成したｍＲＮＡのプール保持又はジストロフィン転写の終わり近くでの停止は、抗終結シグナルに対する応答において、このタンパク質の素速い生成を可能にするだろう。最後に、転写開始及び伸長因子の組み合わせた使用は、比較的少数の因子での空間的及び時間的遺伝子発現の制御を可能にするであろう。遺伝子発現の柔軟性、素速い反応及び精巧な制御は、神経系の発生の間に特に重要である。結果として、先駆細胞は、細胞外環境の変化を絶えず監視して応答し、数時間の間隔で多大な細胞多様化を達成しなければならない。Anderson及びJan, 1997; Ericson等, 1996, Cell 87: 661-73。
【００４３】
２．foggy突然変異表現型の特異性
出願人は、転写伸長においてＳｐｔ５の阻害性の活性を崩壊するが刺激性の活性を崩壊せず、その結果それらの発生を完成させる特定サブクラスのニューロン及び細胞の不全を生じる部位突然変異をここで説明する。突然変異表現型は、ＣＮＳ及びＰＮＳの両方にわたり、複数のクラスのニューロンに影響する著しく空間的な特異性を与える。例えば、神経堤由来細胞系の中で虹色素胞、メラノサイト、及び交感神経で見ることができるが、後根神経節ニューロンでは見られない。細胞ＣＮＳの場合、ＤＡ及びＮＡにおいて欠陥があるが、５ＨＴ又はマウスナーニューロンでは見られない。欠陥は、ドーパミン、ノルアドレナリン及びアセチルコリン生成ニューロンが全て影響するので、単に一つのタイプの神経伝達物質生成には影響しない。また、所定の神経伝達物質における影響は、ＮＡ産生細胞が後脳（ＬＣニューロン）にないが心臓（ＡＡＣ細胞）近くに通常あるのに対して、５ＨＴ＋ニューロンは視床下部で増加するが後脳では増加しないという事実によって示されるように、特定の領域にあるようにみえる。
【００４４】
時間的に、突然変異は、分化の後ステージ及びおそらくはニューロン識別のサブプログラムに影響するように見える。この結論は幾つかの発見によって支持される。まず、Ｐａｎニューロンマーカー、チューブリンの発現は、４８ｈｐｆ胚で正常にみえる。Guo等, 上掲。第２に、ＬＣ及び交感神経でのＮＡ識別を制御する遺伝子phox2a（Guo等, 1999, Neuron 24: 555-66; Morin等, 1997, Neuron 18: 411-423）を含むホメオボックスは、これらの細胞の前駆体ので正常に発現されるが、その後これらの細胞が任意の神経伝達物質合成酵素を発現する前に消失する。最後に、視床下部において、余分な５ＨＴニューロンが観察されるのは、ＤＡニューロンの犠牲にして得られるようだ。foggyが最終的な神経伝達物質の識別に影響するという考えは、foggyのままであるニューロンはそれらの分化を完了できないという事実によって更に支持される。例えば、foggy視床下部にあるいくつかのＤＡニューロンは低レベルのＴＨを発現する（図１Ｂ及びＣ）が、使い残した無軸索ニューロンは低レベルのＧＡＢＡ合成酵素ＧＡＤを発現するようである（図２Ｅ及びＦ）。
網膜において、複数のニューロンの欠陥が観察され、神経節ニューロンの顕著に低い増加であった。網膜において、神経節ニューロンは最初に、foggyがない場合に神経前駆体が未熟な分化を受け、もはや後者の細胞運命を呈するのに利用できないという可能性を上昇させるようである。視床下部において、欠陥を被ったＤＡニューロン及び過剰に存在する５ＨＴニューロンは、同時に発生するようにみえる（データは示さない）。しかしながら、ニワトリの中脳／後脳領域において、５ＨＴニューロンの発生は、ＤＮＡと５ＨＴの間の発生時期の小さな時間的な違いが魚類にも存在しうることを示唆するＤＮＡ対のもの（未公開データ）に先行する。
【００４５】
３．foggyによる転写伸長の空間的及び時間的調節
foggyは、発生の間に広く発現され、生体では偏在して発現されるようである。Yamaguchi等, 上掲。さらに、ＤＳＩＰに依存する活性を有する薬剤ＤＲＢは、９５％以上の細胞性Ｐｏｌ ＩＩ転写のｍＲＮＡ合成を阻害し（Sehgal等, 1976, Cell 9:473-80）、Ｓｐｔ４及びＳｐｔ５は、クラスＩＩ遺伝子の全部ではないがそのほとんどの転写調節に関与することを示唆する。にもかかわらず、foggy突然変異は、選択的な発生の変化を生じ、遺伝子のあるサブセットにのみ影響するようである。細胞型に特異的な細胞運命変化を引き起こす、広く発現されるタンパク質における突然変異現象がしばしば見られるが、これについてはよく分かっていない。例えば、ＣＮＳで広く発現されるオルファンステロイドレセプターＮｕｒｒＩの崩壊は、マウスの中脳ＤＡニューロンの欠損を制限させる。Saucedo-Cardenas等, 1998, Proc. Natl. Sci. USA 95: 4013-4018; Zetterstrom等, 1997, Science 276: 248-250。同様に、広範囲に分布するＥＧＦ関連分子、on-eyed pinheadは、これらの組織でともに発現されるのう胚形成の間でさえも、脊索前板において欠陥を引き起こすが、脊索では引き起こされない。Zhang等, 1998, Cell 92:241-51。
【００４６】
foggyの細胞特異的表現型について少なくとも３つの可能性のある解釈がある。まず、foggy突然変異は、推定上のfoggy/zSpt5ファミリーメンバーによって、又はfoggy ｍＲＮＡの母性寄与によって補われる。あるいは、広く発現されるが、foggy/zSpt5は遺伝子のあるサブセットのみに生理的に影響することができ、それについて伸長は律速段階となる。この可能性との一致するのは、伸長率を低下させるＰｏｌ ＩＩの突然変異はショウジョウバエのホメオティック形質転換を引き起こすという発見である。Chen等, 1993; Mol.Cell. Biol. 13:4214-22; Coulter及びGreenleaf, 1985, J. Biol. Chem. 260: 13190-8。最後に、fogg/zSpt5の発現よりもむしろ活性又は核局在化が、組織又は時間的に特有の様式で、又は細胞外シグナルに応答して他の因子に依って調節されうる可能性がある。突然変異は、foggy/zSpt5の阻害的機能に影響するので、観察された表現型は、遺伝子の異常な発現に依って引き起こされ、その転写は早すぎる終結によって正常に制限又は封じられるようである。ふさわしくない細胞型での、又は不適切な発生段階の間のこのような遺伝子の過剰発現は、ニューロンの欠損を生じうる。foggy表現型の特異性は、影響する遺伝子がハウスキーピングタンパク質よりもむしろ調節性のタンパク質をコードするらしいということを説明する。発生異常が観察されるものを統一する背景にあるメカニズムのより深い理解は、foggy/zSpt5標的遺伝子の同定を必要とするだろう。
【００４７】
foggyは全てのＰｏｌ ＩＩ遺伝子の転写に影響する能力を有するけれども、幾つかの筋の証拠は、それは遺伝子発現における調節性の役割を正常に果たすことを示唆する。第１に、foggy/zSpt5並びにその哺乳動物相同体は、インビトロで転写伸長に必要とされない（図８）。第２に、foggy/zSpt5は、転写伸長で二重の影響を有するようであり、異なる環境条件でネガティブな又はポジティブな調節物質として働くことができる（それぞれ、ＤＲＢ又は低濃度のヌクレオチドの存在、図８）。第３に、foggy/zSpt5突然変異がその阻害性の活性を失うという事実は、表現型がＲＮＡ転写を広げるＰｏｌ ＩＩの根本的な不能の結果ではないことを説明する。
Ｓｐｔ５は、Ｓｐｔ４、Ｐｏｌ ＩＩの大サブユニット及びＮＥＬＦタンパク質複合体に結合し、この相互作用によってＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩによる転写伸長を阻害することが示された。Ｓｐｔ５はＰｏｌ ＩＩのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）に結合しないが、その阻害活性は、ＤＲＢ感受性キナーゼＰ-ＴＥＦｂによるＣＴＤのリン酸化によって相殺される。
【００４８】
ｈＳｐｔ５の構造機能分析（Yamaguchi等, 上掲）は、アミノ酸１７６−２７０がＳｐｔ４への結合をもたらすが、アミノ酸３１３−４３０はＰｏｌ ＩＩへの結合に必要であることを示した。Ｓｐｔ５のＣ末端ドメインの機能は、これまで分かっていなかった。本出願は、１０１２位のｚＳｐｔ５の１つのアミノ酸（ｈＳｐｔ５のアミノ酸１０１４に相当する）置換は、ＤＳＩＦのネガティブな機能を不活性化することを実証する。Ｓｐｔ５のＣ末端ドメインの可能性のある機能は、Ｓｐｔ５の阻害性の活性に重大に要求されるＮＥＬＦ複合体の結合ドメインとしてのものである。Yamaguchi等, 上掲。あるいは、Ｃ末端ドメインは転写伸長の未確認の調節物質に結合されうる。１つの可能性としては、ＤＳＩＦ/ＮＥＬＦ複合体は、細菌のＮｕｓＡ/Ｎｕｍ複合体のように機能しうる。細菌において、ＮｕｓＡタンパク質は、大腸菌ファージＨＫ０２２伸長阻害Ｎｕｍによって転写の終結が活性化されることを示し、それは、ＮｕｓｅＡの存在下においてＤＮＡ及びＲＮＡの両方に結合し、その二重鎖ＤＮＡ鋳型に対する発生期の転写を停止する。Watnick及びGottesman, 1999, Science 286:2337-2339。４つのＮｕｓ相同性ドメイン及びＮＥＬＦを含み−その後者はＲＮＡ結合成分を含むＳｐｔ５は、それぞれ同様のメカニズムによって作用しうる。Yamaguchi等, 上掲。あるいは、Ｓｐｔ４と結合したＳｐｔ５、ＮＥＬＦ、、転写伸長及びタンパク質Ｓｐｔ６に結合するクロマチン及びＳｐｔタンパク質の更なるメンバーは、ヒストンのコンパクト化及び構造化に影響し、ヌクレオソームによってＰｏｌ ＩＩの移動を抑制する。Bortvin及びWinston, 1996, Science 272: 1473-6; Compagnone-Post及びOsley, 1996, Genetics 143: 1543-54; Swanson及びWinston, 上掲。その阻害性の活性に加えて、Ｓｐｔ５は、低いヌクレオチド濃度で転写伸長の刺激物質として働く。驚くべきことに、このＳｐｔ５の刺激性の活性は、突然変異に保持される。これらの発見は、Ｓｐｔ５の阻害性及び刺激性の活性が別個のドメインにある、又はＳｐｔ５の刺激性の機能がＮＥＦＬと無関係であるという見解を支持する。
【００４９】
４．外因性シグナルによるfoggyの調節
多くのシグナル伝達経路及び細胞外刺激による転写開始の制御の十分な証拠があるが、これまで、唯一報告された多細胞生物の転写伸長と外来因子の間のつながりは線虫のNotchシグナルの研究に由来する。Notchシグナル伝達システムは、ニューロンになるか表皮細胞になるか、神経節細胞、円錐又は棒状光受容体として発達するか、及び定められた神経堤由来細胞運命をとるかの決定を含む細胞運命の選択を複合的に、時には二つに関与する。Notchによるシグナル伝達の一般的なモデルは、次のリガンド結合を切断するその細胞質ドメイン、及び無毛の転写開始因子（Ｓｕ(Ｈ)）の相同体の間の直接的な相互作用に関与する。しかしながら、Ｓｕ(Ｈ)に加えて、NotchはＮＦ-κＢ、Groucho、及びMastermind等の転写開始の他の活性化物質又はサプレッサーによって（Artavanis-Tsakonas等, 上掲; Lewis, 1998, Sem. Cell Devel. Biol. 9:583-9; Milner及びBigas, 1999, Blood 93: 2431-2448）並びに未だ同定されていない因子によってシグナル伝達に媒介する用である。Shawber等, 1996, De el. 122:3765-3773; Wang等, 1997, Devel. 124: 4435-46。
【００５０】
興味深いことに、線虫のNotchの下流に作用する酵母の２ハイブリッドスクリーニング同定成分はNotchがＥＭＢ-５、Ｓｐｔ６の虫相同体と物理的に相互作用することを示す。更に、遺伝的研究は、ＥＭＢ/Ｓｐｔ６の突然変異が細胞運命の決定での構成的活性又は突然変異したNotchの浸透度に影響することを立証した。Hubbard等, 1996, Science 273: 112-5。Ｓｐｔ６及びＳｐｔ５は遺伝的及び物理的に相互作用するという報告（Swanson及びWinston, 1992, 上掲）と一緒に考えると、これらの発見は、Ｓｐｔ５活性はNotchの経路の下流媒介物質でありうるという可能性を上昇させる。あるいは、ＦＧＦタンパク質ファミリーの哺乳動物のメンバーは、中脳のＤＡニューロンの代償として５ＨＴニューロンを誘導することが示された（Ye等, 1998, Cell 93:755-66）ので、foggy/zSpt5はＦＧＦシグナル伝達システムに関連する可能性がある。
【００５１】
Ｂ．foggy変異体
ここに記載した全長天然配列foggyポリペプチドに加えて、foggy変異体も調製できると考えられる。foggy変異体は、foggy ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のfoggyポリペプチドを合成することにより、調製できる。当業者であれば、グリコシル化部位の数又は位置を変えたりあるいは膜固着特性を変えるように、アミノ酸変化がfoggyの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列foggy又はここに記載したfoggyの様々なドメインにおける変異は、例えば米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の何れかを用いてなすことができる。変異は、天然配列foggyと比較してfoggyのアミノ酸配列が変化することになるfoggyをコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも一つのアミノ酸のfoggyの１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。アミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されうるかの指針は、foggyの配列を、相同な既知のタンパク質分子のものと比較し、相同性の高い領域になされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出されうる。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学的性質を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、得られた変異体について全長又は成熟天然配列が示す活性を試験することにより決定されうる。
【００５２】
foggyポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ末端又はＣ末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、foggyポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
foggy断片は、多くの一般的な技術の任意のものによって調製されうる。所望のペプチド断片は化学合成されてもよい。代替方法は、酵素での消化、例えば特定のアミノ酸残基によって定まる部位でタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによりfoggy断片を産生することを含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーに用いられる。好ましくは、foggyポリペプチド断片は、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示した天然foggyポリペプチドと少なくとも一つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特定の実施態様では、関心ある保存的置換を、好ましい置換との表題で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に置換例と標記され、又は以下にアミノ酸分類に関してさらに記載されるような、より実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。
【００５３】
表６
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【００５４】
foggyポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(２)中性の親水性：cys, ser, thr;
(３)酸性：asp, glu;
(４)塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
(５)鎖配向に影響を及ぼす残基：gly, pro; 及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
【００５５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野において公知の技術を使用して行わせることができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34:315 (1985)］、制限選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］又は他の周知の技術が、foggy変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析法を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。典型的には、アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085 (1989)］。アラニンもまた最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた位置と露出した位置の両方に見いだされることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００５６】
Ｃ．foggyの修飾
foggyの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つのタイプは、foggyポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、foggyの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性剤での誘導体化は、例えば、抗foggy抗体の精製方法及びその逆で用いるためにfoggyを水不溶性支持体マトリクスあるいは表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸エステル、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)ジチオ］プロピオイミデート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., サン フランシスコ, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００５７】
本発明の範囲に含まれるfoggyポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」は、この目的に対しては、天然配列foggyに見いだされる１つ又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び／又は天然配列foggyに存在していない１つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味することが意図されている。さらに、この語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
foggyポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１つ又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列foggy(Ｏ-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。foggyアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、foggyポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
foggyポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に公開された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306 (1981)に記載されている。
【００５８】
foggyポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
foggyの共有結合的修飾の他の型は、foggyポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
また、本発明のfoggyは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したfoggyを含むキメラ分子を生成するように修飾されてもよい。
【００５９】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとfoggyとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはfoggyのアミノ末端又はカルボキシル末端に位置する。このようなfoggyのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってfoggyを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は当該分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン(poly-his)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(gD)タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
別の実施態様では、キメラ分子はfoggyの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも一つの可変領域に代えてfoggyポリペプチドの可溶性(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００６０】
Ｄ．foggyの調製
以下の説明は、主として、foggy核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりfoggyを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてfoggyを調製することもできると考えられる。例えば、foggy配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成法によって生産してもよい［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動の技術又は自動によるインビトロタンパク質合成法を実施してもよい。自動合成法は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスターシティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示により実施することができる。foggyの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長foggyを生産してもよい。
【００６１】
１．foggyをコードするＤＮＡの単離
foggyをコードするＤＮＡは、foggy ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトfoggy ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またfoggy-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリーは、関心ある遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(foggyに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。foggyをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００６２】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
【００６３】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したfoggy生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００６４】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１，４４６)；大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１，５３７)；大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７，３２５)及びＫ５７７２(ＡＴＣＣ５３，６３５)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55,244)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６５】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、foggyコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス  セレビシエは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス ポンベ (Schizosaccharomyces pombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981];１９８５年５月２日公開のＥＰ １３９，３８３)；クルベロミセス ホスツ(Kluyveromyces hosts)(米国特許第４，９４３，５２９号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばケー・ラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol. 154(2): 737-742 [1983])、ケー・フラギリス(K. fragilis)(ＡＴＣＣ １２，４２４)、ケー・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ＡＴＣＣ １６，０４５)、ケー・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ＡＴＣＣ ２４，１７８)、ケー・ワルチイ(K. waltii)(ＡＴＣＣ５６，５００)、ケー・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ＡＴＣＣ ３６，９０６; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、ケー・テモトレランス(K. thermotolerans)及びケー・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(ＥＰ ４０２，２２６)；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(ＥＰ １８３，０７０; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(ＥＰ ２４４，２３４)；アカパンカビ(Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979])；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)(１９９０年１０月３１日公開のＥＰ ３９４，５３８)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(１９９１年１月１０日公開のＷＯ ９１／００３５７)；及びコウジ菌、例えばアスペルギルス ニダランス(Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００６６】
グリコシル化foggyの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)及びＣＯＳ細胞を含む。多くの特異的な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ ８０６５); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＴＣ  ＣＣＬ５１)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００６７】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
foggyをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
foggyは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるfoggy-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日公開のＥＰ ３６２１７９)、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６８】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択性マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞の適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、foggy-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub らにより, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００６９】
発現及びクローニングベクターは、通常、foggy-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Changら, Nature, 275:615 (1978)；Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で用いるプロモーターもまたfoggyをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hessら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００７０】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターはＥＰ ７３，６５７に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのfoggy転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ  ２，２１１，５０４)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００７１】
より高等の真核生物による所望のfoggyをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作用要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、foggyコード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、foggyをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのfoggyの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); ＥＰ １１７，０６０; 及びＥＰ １１７，０５８に記載されている。
【００７２】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列foggyポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はfoggy ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００７３】
５．ポリペプチドの精製
foggyの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。foggyの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
foggyを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びfoggyのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のfoggyの性質に依存する。
【００７４】
Ｅ．foggyの一般的な用途
foggyをコードするヌクレオチド配列(又はそれらの補体)は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、foggy核酸も、ここに記載される組換え技術によるfoggyポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列foggy遺伝子（配列番号：１）又はその一部は、全長foggyｃＤＮＡの単離又はＦｉｇ．１（配列番号：１）に示したfoggy配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子(例えば、foggyの天然に生じる変異体又は他の種からのfoggyをコードするもの)の単離のためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に配列番号：１のヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列foggyのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、foggy遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のfoggy遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００７５】
本出願で開示する任意のＥＳＴ配列はプローブとして、ここに記載した方法で用いることができる。
foggy核酸の他の有用な断片は、標的foggyｍＲＮＡ(センス)又はfoggy ＤＮＡ(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、foggy ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krolら(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、foggyタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖-ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、ＷＯ ９１／０６６２９に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【００７６】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ ９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２(Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス)、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター(ＷＯ ９０／１３６４１参照)を含む。
【００７７】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は一般に、少なくとも約５塩基の長さ、約１０塩基の長さ、約１５塩基の長さ、約２０塩基の長さ、約２５塩基の長さ、約３０塩基の長さ、約３５塩基の長さ、約４０塩基の長さ、約４５塩基の長さ、約５０塩基の長さ約５５塩基の長さ、約６０塩基の長さ、約６５塩基の長さ、約７０塩基の長さ、約７５塩基の長さ、約８０塩基の長さ、約８５塩基の長さ、約９０塩基の長さ、約９５塩基の長さ、約１００塩基の長さである。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したfoggyコード配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、foggyをコードするヌクレオチド配列は、そのfoggyをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【００７８】
foggyのコード配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合(例えば、foggyがレセプターである場合)、foggyは、結合性相互作用に係る他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用のインヒビターを同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターfoggyは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然foggy又はfoggyのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施することができる。
【００７９】
また、foggy又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施態様では、foggyをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりfoggyをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、foggyをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのfoggy導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたfoggyコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はfoggyをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【００８０】
あるいは、foggyの非ヒト相同体は、動物の胚性幹細胞に導入されたfoggyをコードする変更ゲノムＤＮＡと、foggyをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、foggyをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するfoggy「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、foggyをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、foggyをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。foggyをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【００８１】
また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【００８２】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である(Dzauら, Trends, in Biotechnology 11, 205-210[1993])。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【００８３】
ここに記載したfoggyポリペプチドはまた、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したfoggyポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各foggy核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のfoggyポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のfoggyポリペプチドは一方の組織で、好ましくは同組織型の正常組織に比べて病的な組織で他方に比較して異なる発現をする。foggy核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここに記載したfoggyポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のfoggyポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このfoggy生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A. Ed., (1980))、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８４】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【００８５】
foggyポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(ｒｈＧＨ)、インターフェロン(ｒｈＩＦＮ-)、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; ＷＯ ９７／０３６９２，ＷＯ ９６／４００７２，ＷＯ ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【００８６】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
本発明は、foggyポリペプチドを模倣又は増大させる(アゴニスト)、又はfoggyポリペプチドの効果を予防又は阻害する(アンタゴニスト)を同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるfoggyポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
【００８７】
このアッセイは、この分野で知られた技術である、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるfoggyポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるfoggyポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるfoggyポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００８８】
候補化合物が相互作用するここに同定した遺伝子にコードされる特定のfoggyポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者ら（Fields及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)）に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER（商品名）)は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【００８９】
ここで同定されたfoggyポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【００９０】
アンタゴニストをアッセイするために、foggyポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、foggyポリペプチド存在下での関心ある活性を阻害する化合物の能力が化合物がfoggyポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、foggyポリペプチド及び膜結合foggyポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。foggyポリペプチドは、放射性等で標識でき、レセプターに結合したfoggyポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがfoggyポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリーがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はfoggyポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したfoggyポリペプチドに暴露する。foggyポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【００９１】
レセプター同定の代替的方法として、標識foggyポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識foggyポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとfoggyポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってfoggyポリペプチドの作用を競合的に阻害するfoggyポリペプチドの変異形態であってもよい。
【００９２】
他の潜在的なfoggyポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟foggyポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 ; Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりfoggyポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: ボーカラトーン, フロリダ, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、foggyポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００９３】
潜在的アンタゴニストは、foggyポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりfoggyポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
また、ここで開示した分子の診断的及び治療的使用は、以下に開示及び説明される潜在的な機能的アッセイのヒットに基づきうる。
Ｆ．抗foggy抗体
本発明は抗foggy抗体を更に提供する。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【００９４】
１．ポリクローナル抗体
抗foggy抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、foggyポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００９５】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗foggy抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはfoggyポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する１つ又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００９６】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、foggyに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００９７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００９８】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；上掲のMorrisonら］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【００９９】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗foggy抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１００】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる(Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学刊行物：Marksら, 1992, Bio/Technology 10, 779-783; Lonbergら, 1994, Nature 368 856-859; Morrison, 1994, Nature 368, 812-13); Fishwildら, 1996, Nature Biotechnology 14, 845-51; Neuberger,1996, Nature Biotechnology 14, 826 ; Lonberg及びHuszar,1995, Intern.Rev. Immunol. 13 65-93 に記載されている。
抗体はまた、上記されているような既知の選択及び／又は突然変異誘発の方法を用いて親和性成熟されうる。好ましく親和性成熟された抗体は、成熟抗体が調製される最初の抗体（一般にマウス、ヒト化又はヒト）よりも５倍、より好ましくは１０倍、更に好ましくは２０又は３０倍高い親和性を有する。
【０１０１】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はfoggyに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１０２】
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81(1985) は無傷の抗体をタンパク分解的に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１０３】
大腸菌からＦａｂ'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１０４】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたfoggyポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗foggyポリペプチドのアームは、特定のfoggyポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のfoggyポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はfoggy結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はfoggyポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(ＴＦ)に結合する。
【０１０５】
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１０６】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolffら, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照。
【０１０７】
７．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)にコンジュゲートされた抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性コンジュゲート抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲートのためのキレート剤の例である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)にコンジュゲートされてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートされた「リガンド」(アビジン等)を投与する。
【０１０８】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされ得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０１０９】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるfoggyポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
foggyポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つを越える活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、例えば、細胞毒性薬、サイトカイン、化学治療薬又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１１０】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Scienceに開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出性製剤を調製してもよい。持続放出性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第３，７７３，９１９号)、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商品名）(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１１１】
Ｇ．抗foggy抗体の用途
本発明の抗foggy抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗foggy抗体は、foggyの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現（場合によっては、異なる発現）の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位をコンジュゲートさせるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature, 144:945 (1962)；Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗foggy抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのfoggyのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、foggyに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するfoggyを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したfoggy以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、foggyを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示目的でのみ提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１１２】
実施例
実施例において言及されている市販の試薬は、特段の指示がない限り製造者の説明に従って使用された。以下の実施例及び本明細書全体を通じてＡＴＣＣ登録番号により同定される細胞出所は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）, マナサス, バージニアである。
【実施例１】
【０１１３】
Ｉ．例示的な方法：
魚の保存と維持
魚の飼育及び維持は、Guo等, 上掲に記載されるようにして実施した。胚は、２８．５℃ｈで飼育し、Kimmel等, 1995, Dev. Dynam. 203:253-310に従って保存した。
インサイツハイブリダイゼーション及び免疫染色
ＲＮＡプローブをＲＮＡ標識試薬（Boehringer社）を用いて直線上の鋳型から合成した。ＴＨ及び５ＨＴ抗体をChemicon社から購入した。ＦＬＡＧ抗体をKodak社から購入した。Ｚｎ-８（Trevarrow等, 1990, Neuron 4: 669-79）及び抗Ｈｕ抗体（Marusich等, 1994, J. Neurobiol. 25:143-55）をオレゴン大学から入手した。Thomas Jessellにより開発された３Ａ１０モノクローナル抗体を発生研究ハイブリドーマバンク(Developmental Studies Hybridoma Bank)から入手した。インサイツハイブリダイゼーション及び抗体染色を前記のようにして実施した。
【０１１４】
ＡＦＬＰによる非常に関連したＤＮＡ多形の単離
foggy突然変異を有するヘテロ接合のメスの魚（ＡＢ/ＥＫ）を様々な遺伝子的バックグラウンドからのＷＴオスの魚と交雑し（Ｔｕ）、Ｆ１の子孫を成体まで育てた。ヘテロ接合Ｆ１の魚を、姉妹細胞対交配によって同定した。Ｆ２の子孫をヘテロ接合交配から回収し、表現型に基づいて２つのプール（それぞれ４０個体を収容）に分けた：野生型＋ヘテロ接合（ＷＴ＋Ｈｅｔ）及び突然変異（ｍｔ）のプール。遺伝子ＤＮＡをプールの魚から抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩで消化し、合成したＤＮＡアダプターに結合させ、ＰＣＲ分析に使用した。ＰＣＲプライマー（アダプター＋ＥｃｏＲＩ＋ＮＮＮ、アダプター＋ＭｓｅＩ＋ＮＮＮ）を合成し、ジェネンテックオリゴ合成装置によって染色標識し、ＰＣＲ条件は前記のようにした。Vos等, 上掲。ＰＣＲ試料をＡＢＩ自動シーケンサー３１０にかけ、データの結果をＡＢＩ遺伝子スキャン(Genescan)ソフトウェアを用いて分析した。プールの大きさ４０はfoggy遺伝子座まで約２．５ｃＭｓ以内にある多形マーカーの同定を可能にした。
【０１１５】
遺伝子マッピングと位置クローニング
同定したＡＦＬＰマーカーをfoggy突然変異個体での試験に使用して、より正確な遺伝子の距離を定めた：第１に、結合したＡＦＬＰ断片をゲル精製し、クローン化して配列決定した。第２に、配列決定の情報に基づいて、特異的なＰＣＲプライマーを設計し、ほとんどのＡＦＬＰマーカーをＰＣＲ断片長の多形又は一本鎖高次構造多形に変換した。ＡＦＬＰマーカーをマイクロサテライト遺伝子マップ上に位置づけした。次いで２つの最も近接して結合したＡＦＬＰマーカーに相当するＰＣＲプライマーを、標準的なＰＣＲ条件を用いて、マイクロアレイしたＢＡＣライブラリ（Genome Systems社）及びＹＡＣライブラリ（Research Genetics社）に使用した。ＹＡＣ及びＢＡＣ ＤＮＡを製造業者の使用説明書に従って単離し、自動サイクルシーケンサー（ＡＢＩ社）で末端を配列決定した。特定のＰＣＲプライマーを末端の配列に従って設計し、放射線ハイブリッドパネルを用いて試験し（Geisler等, 1999, Nature Genetics 23: 86-9; Hukriede等, 1999, Proc. Natl. Acad. Scil USA 96: 9745-50）、全てのfoggy領域が遺伝子ＤＮＡクローンに覆われるまでＢＡＣライブラリをスクリーニングし続けるように使用した。
【０１１６】
ＢＡＣｓ及びｃＤＮＡｓでの形質転換レスキュー
個々のＢＡＣのＤＮＡをfoggyヘテロ接合交配から誘導した１〜４の細胞ステージのゼブラフィッシュ胚に40-60ng/μlの濃度で注入した。注入した胚を４８時間まで発生させ、解剖顕微鏡下で調べ、ＴＨ抗体を用いて免疫組織化学を実施した。染色パターンの調査及び写真撮影の後に、遺伝子ＤＮＡを個々の胚から抽出し、foggy遺伝子座に強く結合したＰＣＲプライマーを用いて遺伝子型の決定に使用した。foggy突然変異表現型をレスキューしたＢＡＣ Ｂ１０８Ｊ１１をＥｃｏＲＩで消化し、ｐ３２でランダムプライマー化して３３時間胚のゼブラフィッシュｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。全長ｃＤＮＡをβアクチンプロモーターを含むベクターにクローン化し、15-30ng/μlの濃度で胚に注入し、上記のようなレスキューについて分析した。
【０１１７】
配列分析及び突然変異の検出
配列分析をUnixシステム及びジェネンテックバイオインフォマティクスグループによって開発されたソフトウェアで実施した。突然変異の検出、遺伝子特異的プライマーを約５つのfoggy突然変異及びＷＴ姉妹胚のプールから遺伝子ＤＮＡを増幅するのに使用した。突然変異及びＷＴ姉妹胚からのＰＣＲ産物（３つの別々のセット）を自動サイクルシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて直接配列決定した。突然変異及びＷＴ姉妹胚からのｃＤＮＡをＲＴ-ＰＣＲによって合成し、配列決定した。部位特異的突然変異をStratagene社の試薬を用いて実施し、１つのヌクレオチドの変化Ｔ→Ａを導入した。誘導した突然変異を含むｃＤＮＡをアクチンプロモーターの後にクローン化し、前記したようにして形態形質転換レスキューをアッセイした。
ＣＯＳ-７細胞のタンパク質発現
ＣＯＳ-７細胞を1mlのマイクロタイター皿に約６０％コンフルエンスで蒔き、ＦＬＡＧをタグしたＷＴfoggyｃＤＮＡ又は突然変異foggyｃＤＮＡを含む1μgのプラスミドをＧＩＢＣＯ-ＢＲＬ試薬を用いてトランスフェクトした。２４時間後、細胞を固定し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫染色した。
【０１１８】
転写アッセイのための組換えタンパク質
ＮｄｅＩ部位をＰＣＲ突然変異によってzfSpt5 ORFの５'末端で切断した。ＮｄｅＩ(一部)-全長を含むＮｏｔＩ断片、野生型又は突然変異ＯＲＦをｐＥＴ-１４ｂ（Novagen社）のＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ部位に挿入し、pET-agSpt5 ＷＴ及びpET-zfSpt5 mtを生産した。ヒスチジンをタグしたzfSpt5タンパク質の発現及び精製を上記のようにして実施した。Yamaguchi等, 1999, Cell 97:41-51。簡略すると、ライセートをそれぞれpET-zfSpt5 mtで形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から調製した。His-zfSpt5タンパク質をＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、全長ポリペプチドをゲル薄片から回収した。
転写アッセイ
欠乏/添加(add-back)アッセイを上記のようにして実施した。Wada等, 上掲。表示された量のhSpt4及びhSpt5、又はＷＴ又は突然変異sfSpt5の何れかを、抗DSIF p160/hSpt5モノクローナル抗体を用いて免疫枯渇したＨｅＬａ核抽出物（2μl）に戻し添加した。ＰＴＦ３-６Ｃ２ＡＴ（25ng）又はｐＳＬＧ４０２（125ng、Lee及びGreenleaf, 上掲）を鋳型に使用した。４５分のインキュベーション後、転写を50μMのＤＲＢと共に又はそれなしにＮＴＰｓの添加によって表示された時間で開始を行った。ｐＳＬＧ４０２については、低いＮＴＰの濃度（30mMのＡＴＰ、30mMのＧＴＰ、300mMのＣＴＰ、2.5mMのＵＴＰ）を使用した。Ｇなしの転写を精製し、８％の尿素ＰＡＧＥによって分析した。
【０１１９】
ＩＩ．結果：
顕著なニューロン集合の欠損又は過剰に対するfoggy突然変異の誘導
神経発生に影響するゼブラフィッシュ突然変異を、ＤＡ及びＮＡニューロンの複合グループの分子マーカーとして神経伝達物質合成酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を使用する遺伝子スクリーニングで事前に単離した。Guo等, 上掲。foggyを表す突然変異の一つは形態学的に正常に現れる（図１Ａ及びＢ）が、このようなニューロンが最初に典型的に現れるような場合に視床下部のＤＡニューロンにおいて２８ｈｐｆ（受精を達成する時間）の早期に回復不能な欠陥を被る。欠陥は、ＴＨ及びＤＡニューロンの数の減少及び幾つかの残ったＤＡ細胞体におけるＴＨレベルの低下に示されるように（図１Ｃ及びＤ）、４８ｈｐｆまでにさらに顕著となる。ゼブラフィッシュの胚において、５ＨＴニューロンのグループは視床下部ＤＡニューロンに極めて近くに発生する（図１Ｅと図１Ｃの比較）。これは、foggy突然変異の５ＨＴニューロンの運命に関心をよせた。ＷＴの魚において、５ＨＴ＋ニューロンはまず２２−２８ｈｐｆの間に現れる。続いて、４８ｈｐｆまでにそれらは５−７のニューロンの２つの別々のクラスターを構成し、それはＤＡニューロンの内側の背側視床下部/後結節となる（図１Ｅ、１Ｇ）。驚くべきことに、ＴＨ＋ＤＡニューロンの数はfoggy視床下部の何れかの側で約17+/-3から約8+/-2に減少するが、５ＨＴ＋ニューロンの数はこの位置で約6+/-1から約15+/-2までおよそ２倍となった（図１Ｆ、１Ｈ）。驚くべきことに、foggy突然変異でのＴＨ及び５ＨＴの免疫蛍光二重標識は、幾つかのニューロンが両方のマーカーにポジティブであることを示した（図１Ｈ）。ＴＨ及び５ＨＴの両方を発現するニューロンはＷＴ胚では見られなかった（図１Ｇ）。foggyはＤＡ及び５ＨＴニューロンに別々に影響する可能性を形式的に排除することができなかったが、これらの発見は、視床下部ＤＡ及び５ＨＴニューロンが通常の前駆体から誘導され、foggy突然変異がこの系において細胞運命の決定を有しうることを示唆する。視床下部とは対照的に、foggy後脳の５ＨＴ＋ニューロンは正常に発生した（図１Ｉ-Ｊ）
【０１２０】
欠損がＴＨ＋ＤＡニューロンにおいて観察された他の脳の領域は網膜であった（図２Ａ-Ｂ）。網膜は、外因性の合図に応答して共通の前駆体から順次特定化される、主に６つに分類されるニューロンを含む。Cepko,1999, Curr. Opin. Neurobiol. 9: 37-46。網膜神経節ニューロンがまず現れ、続いて錐体光受容体、水平細胞無軸索介在ニューロン、杆体光受容体及び双極ニューロンが現れる。ＴＨ＋ＤＡ無軸作介在ニューロンは更なる試験又はfoggy突然変異網膜の他のニューロンを保証した。分析は、foggyがレドプシン＋錐体（図２Ｃ-Ｄ）及びロドプシン＋杆体光受容体並びにＧＡＢＡ＋無軸索介在ニューロン（図２Ｅ-Ｆ）に欠陥を与えることを明らかにした。興味深いことに、網膜で発達する最初の細胞タイプである神経節の数は正常に現れ、更に増加するものもありうる（図２Ｇ-Ｈ）。網膜とは対照的に、レンズ及び視神経の分化は、組織学的に（示さない）及びγ-クリスタリンの発現（図２Ｉ-Ｊ）によって判断されるように、foggy突然変異胚において正常に現れた。foggy網膜の組織学的分析は４８ｈｐｆ（示さない）で層状組織は全体的に正常であり、７２ｈｐｆ（図２Ｋ-Ｌ）で光受容体及び無軸索細胞はともに正常であったことを明らかにした。
【０１２１】
さらに、foggyは後脳の青斑核（ＬＣ）でＴＨ＋ＤＢＨ＋ＮＡニューロンを発生しなかったが、後脳マウスナーニューロン（図３Ｉ-Ｊ）、脊髄ＧＡＢＡ＋介在ニューロン（図３Ｍ-Ｎ）及び脊髄運動ニューロン（データは示さない）の正常補体を有していた。神経堤由来交換ＮＡニューロン（図３Ｃ-Ｄ）もないが、神経堤由来後根神経節感覚ニューロンは正常に現れる（図３Ｋ-Ｌ）。心臓の近くにあるＮＡ細胞の一つのグループであるＴＨ＋、ＤＢＨ＋アーチ関連細胞（ＡＡＣ）は、foggy突然変異において正常なままであった。Guo等, 上掲。ＮＡニューロンの同定の獲得に必要である転写因子Phox2a（Guo等, 1999, Neuron 24: 555-66; Morin等, 1997, Neuron 18:411-423）は、ＬＣ初期前駆体で正常に発現した（図３Ｅ-Ｆ）。しかしながら、成熟ＬＣ及び交感ニューロンは存在すべきである領域にほとんどなかった（図３Ｇ-Ｈ及びデータは示さない）。しかしながら、２４、４８、６０及び７２ｈｐｆで全ての胚のトンネル染色により、異常な細胞死は検出されなかった（データは示さない）。神経系の外側で、foggy胚は２８ｈｐｆでの外観検査により野生型（ＷＴ）姉妹細胞から識別できなかった。この発生段階で、それらはまた、局所的なマーカーソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、線維芽成長因子-８（Ｆｇｆ８）、Ｏｔｘ１、Ｏｔｘ２及びＫｒｏｘ-２０の正常な発現パターンを示した（データは示さず）。４８ｈｐｆfoggy胚はまた、組織学的に正常な脊索、脊髄、体節(somits)、耳胞、目、口陥入、肝臓の内胚葉原基、前腎、卵黄嚢、心臓、血液細胞、咽頭弓、脳及び脳室を有していた（データは示さない）。７２ｈｐｆまで、ほとんどの組織及び器官が正常なままであるが、胚は神経堤由来メラノサイトの減少、循環の阻害により拡大した心膜、薄い心筋壁、小さい目及び小さい体格を示した（図１Ａ及びＢ、２Ｍ及びＮ及びデータは示さない）。まとめると、foggyは、それらが神経伝達物質の合成酵素を発現する前の段階で中枢及び末梢神経系の多種類のニューロンの正常な発生に不可欠であるという考えが、突然変異表現型によって構成される。
【０１２２】
foggy遺伝子の単離
foggy遺伝子は、foggy遺伝子座に接近して結合した多形ＤＮＡマーカーのゲノムワイドサーチを可能にする、ＡＦＬＰ（増幅断片長多形、Vos等, Nucl.Acids Res. 23: 4407-14）と呼ばれるＤＮＡフィンガープリンティング技術によって単離した（図４Ａ）。２つのＡＦＬＰマーカー、ETACMTCT155及びETACMGAT270が単離され、foggy遺伝子座に強く結合されたことが分かった（試験された２００の別々の突然変異から０の組換え）。約５０００の別々の突然変異の更なる系列は、各ＡＦＬＰマーカーがfoggy遺伝子座の何れかの側で0.06+/-0.02cM離れていることを明らかにした。ＡＦＬＰ分析の過程の間に、２０００マイクロサテライトマーカーからなる遺伝子マップが発表された。Shimoda等, 1999, Genomics 58:219-32。ＡＦＬＰマーカーは、このマップ上に位置し、染色体１５にfoggy遺伝子座を配置させる。残念ながら、この領域の染色体１５にある利用可能な全てのマイクロサテライトマーカーは、foggy遺伝子座から1cM離れてマッピングされた（図４Ｂ）。よって、ＡＦＬＰにより、我々が多形ＤＮＡマーカーETACMTCT155及びETACMGAT270の間にあるとしてfoggy遺伝子座の間隔を同定していた遺伝子マッピング及び結合分析は、それが0.12+/-0.04cMの遺伝子距離を有することが決定された。
【０１２３】
酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、ＢＡＣｓ及びＰＡＣｓからなる遺伝子クローンを２つのＡＦＬＰマーカーを用いて単離した。これらの大きなＤＮＡクローンの端を配列決定し、完全長foggy遺伝子座にかかる更なるクローンを単離するために使用した（図４Ｂ）。精密な細胞系譜解析を、ＢＡＣ/ＰＡＣ末端配列決定により同定されたＰＣＲ断片長多形（ＰＦＬＰ）又は一本鎖染色体多形（ＳＳＣＰ）を用いて実施した。この分析によって、４つのＢＡＣｓにわたる間隔にfoggy遺伝子座を位置づけすることができた。Ｂａｃがfoggy遺伝子を含むことを決定するために、レスキュー実験をYan等, 1998, Genomics 50:287-9に記載されているようにして実施した。ＢＡＣクローン（表１）をfoggyヘテロ接合交配から誘導された１又は２細胞段階のゼブラフィッシュ胚に注入し、胚を約４８ｈｐｆでＴＨ＋ＤＡ及びＮＡニューロンの出現をＴＨ抗体で免疫組織化学により分析した。ＢＡＣ Ｂ１０８Ｊ１１及びＢＡＣ Ｂ３５Ｉ１１は、ホモ接合foggy突然変異にメラノサイト並びにＴＨ＋ＤＡ及びＮＡニューロンの正常な発生の修復を可能にし（図５Ｂ、表１及びデータなし）、それらがＷＴfoggy遺伝子を含むことを示唆した。完全長ＢＡＣ Ｂ１０８Ｊ１１のショットガン配列決定はfoggy遺伝子であったようである（表１）。この可能性を更に試験するために、この転写単位に相当する全長ｃＤＮＡを単離し、ゼブラフィッシュβアクチンプロモーターを含むベクターでｃＤＮＡをクローン化させ（Higashijima等, 1997, Devel.Biol. 192: 289-99）、ゼブラフィッシュ胚内の構築物を単離した。ｃＤＮＡはfoggy突然変異胚を正常な発生に修復することができ（表１）、この転写単位がfoggy遺伝子に相当することを強力に立証した。このｃＤＮＡの異所性発現は、ＷＴ胚の発生を妨げなかった（データは示さない）。
【０１２４】
foggyは転写伸長の調節物質Ｓｐｔ５に相同な広発現核タンパク質をコードする
ｃＤＮＡレスキューのＤＮＡ配列決定分析及びデータベース検索は、推定上のfoggyタンパク質が１０８４アミノ酸残基を含み（図６Ａ）、酵母Ｓｐｔ５と相同性を有する進化的に保存されるファミリーのタンパク質に属する（図６Ｂ）ことを明らかにした。Swanson等, 上掲。インビトロ研究は、このタンパク質ファミリーが転写伸長のポジティブとネガティブ両方の調節物質として機能することを示唆したが、脊椎動物で使えるこの役割についての証拠はなかった。foggyは１０５のアミノ酸のＮ末端酸性領域を含み、その５３がＡｓｐ又はＧｌｕの何れかであり（図６Ａ）及びその中心のドメインは未知の機能を有するＮｕｓＢ/ＫＯＷからなる。同様のＮｕｓＧ/ＫＯＷドメインが、転写伸長を調節する原核生物ＮｕｓＧ（Sullivan及びGottesman, 1992, Cell 68:989-94Sullivan等, 1992, J.Bact.174:1339-44）及び翻訳に関与するタンパク質のクラスで見つかっている。Kyrpides等, 1996, Trends Biochem. Sci. 21:425-6。foggyのカルボキシル末端は、アミノ酸セリン、トレオニン、及びチロシンが多く、潜在的なリン酸化部位を形成し、３つの型のヘキサペプチド反復：4xXTPXYG、2xQTPLHD及び2xNPQTPGを示す。Ｃ末端（から＝１００アミノ酸）は全ての多細胞生物で保存されているが、酵母Ｓｐｔ５にはない（図６Ｃ）。foggy突然変異及びそれらのＷＴ姉妹から作成されたゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの配列決定分析は、ＴからＡへの１つのヌクレオチドの変化を同定し、バリン１０１２からアスパラギン酸へのコードアミノ酸を変化させた（図６Ｄ）。バリン１０１２はこのタンパク質ファミリーの様々な異種間メンバーに完全に保存されたアミノ酸であり、保存されたＣ末端ドメインに位置する（図６Ｃ）。バリン１０１２のアスパラギン酸への突然変異が実際に機能的な因果関係を有しているか、不活性な多形を示さないかどうかを更に認識するために、突然変異を担持する構築物をゼブラフィッシュ胚に注入し、突然変異多形をレスキューする可能性を評価した。ＷＴfoggyｃＤＮＡを突然変異多形を容易にレスキューしたが、１つのヌクレオチド変化を有する構築物は同じ条件で効果がなかった（図１）。まとめると、これらの発見は、単離されたｃＤＮＡが実際にfoggyをコードし、１つのヌクレオチド変化がfoggy突然変異多形をもたらすことを示す。
【０１２５】
foggyを特徴付けするために、発生の間の空間的及び時間的発現パターンを試験した。ホールマウント原位置ハイブリダイゼーションによって、母性foggyｍＲＮＡは初期胚の全ての割球で検出された（図７Ａ）。尾芽期胚（１０ｈｐｆ）において、foggy発現は腹部表皮に低レベルな発現を有して背側神経板に集中している（図７Ｂ）。約２８ｈｐｆで、foggyｍＲＮＡは、他に低レベルの発現で主に発達脳に検出され（図７Ｃ）、その発現パターンはfoggy突然変異胚でも変わりはない（図７Ｄ）。４８ｈｐｆまでに、胚全体にfoggy翻訳の顕著な下方制御がある（図７Ｃと７Ｅの比較）。foggyタンパク質が核に入ることができるか、foggy突然変異が入核を妨害するかどうかを決定するために、哺乳動物Ｃｏｓ７細胞でエピトープタグＷＴ及び突然変異タンパク質を発現させ、免疫蛍光標識によってそれらの細胞下分布を試験した。図７Ｇ-Ｊに示されるように、foggyのＷＴ及びＶａｌ１０１２のＡｓｐ突然変異形態の両方が検出され、foggyが核タンパク質であり、突然変異は核へのタンパク質進入を妨害しないことを示唆した。
【０１２６】
foggyはインビトロの転写伸長を調節し、突然変異形態は抑制物質として選択的に不活性である
また、ＷＴfoggyが実際にＳｐｔ５の機能的相同体であるか、もしそうであればｖａｌ１０１２のＡｓｐ突然変異がその転写活性を妨害するかどうかを分析した。使用したアッセイは、粗製のＨｅｌａ核抽出物における転写阻害化合物ＤＲＢによる転写伸長のＳｐｔ４/Ｓｐｔ５依存性阻害であった。Wada等, 1998, 上掲。大腸菌で発現させて精製したＷＴ及び突然変異foggyは、ヒトの対応物及び互いに対して大きさ及び移動性において同一であるように見えた（図８Ａ）。さらに、ＷＴfoggyは薬剤ＤＲＢに対する応答の修復においてｈＳｐｔ５と同程度の効果があり（図８Ｄ、レーン５及び６）、これら２つのタンパク質は実際に機能的な相同体であるという考えを示唆した。対照的に、９倍高い濃度で添加されても、突然変異foggyは伸長阻害薬剤ＤＲＢ感受性を与えなかった（図８Ｂ、レーン７-１２）。これらのデータは、foggyが転写伸長の抑制物質として生化学的に作用し、１０１２ＶａｌのＡｓｐ突然変異はこの活性を消失させることを示唆する。
【０１２７】
上記されるように、低濃度のＳｐｔ４/Ｓｐｔ５（ＤＳＩＦ）複合体は、転写伸長を抑制するよりもむしろ促進する。Wada等, 上掲。ＤＮＡ鋳型は、ＷＴ及び突然変異ｚＳｐｔ５の可能性のある促進活性を定量するのに使用され（Lee及びGreenleaf, 1997, J. Biol. Chem. 272:10990-10993）、２つのＧなしのカセット、位置＋４０から＋１２４のプロモーター近位８５-ｎｔカセット、及び位置＋１５１２から＋１８８８のプロモーター遠位３７７ｎｔカセットを含む。これら２つのカセットはＲＮａｓｅＴ１消化に耐性があり、Ｇの多い、ＲＮａｓｅＴ１感受性領域で隔てられる。ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ及びＲＮａｓｅＴ１消化に続く転写は、２つのカセットが転写物から離れ、ゲル電気泳動により分離することができる。それらの関係は転写の伸長影響に量的に反映される。正常な核抽出物が使用される場合には、転写物の遠位から近位の領域の間のモル比は時間と共に増加し、０．５の値に近づく（図９、レーン１-４；Lee及びGreenleaf, 上掲）。抽出物でのＤＳＩＦの欠乏は伸長能力の有意な減少を生じる。図９Ｃ-Ｄ、レーン５-８。ヒト又はゼブラフィッシュＳｐｔ５を用いたｒＤＳＩＦでの欠乏した抽出物の再構成は、１５分で４．６倍及び２０分で３．８倍まで転写伸長を増大させ、欠乏していない抽出物のレベルまで回復した（図９Ｃ-Ｄ、及びデータは示さない）。驚いたことに、突然変異ｚＳｐｔ５は、このアッセイにおいて伸長促進においてＷＴｚＳｐｔ５と同程度の効果を有し、１５分で４．３倍及び２０分で３．６倍まで伸長能力を増大させた（図９Ｃ-Ｄ、レーン９-１６）。まとめると、これらの結果は、これらの条件下で突然変異foggy/zSpt5が転写伸長のポジティブ制御因子としてではなくネガティブとして作用するその能力を失っていることを示す。
【実施例２】
【０１２８】
大腸菌中でのfoggyの発現
本実施例は、大腸菌での組換え発現によるfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストポリペプチド（「foggy」）の非グリコシル化形態の調製を示す。
foggyをコードするＤＮＡ配列は、まず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅される。プライマーには、選択される発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位が含まれるべきである。種々の発現ベクターが用いられる。適当なベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Bolivarら,Gene, 2:95 (1977)参照のこと）などである。ベクターは制限酵素で切断し、脱リン酸化する。次いで、このＰＣＲで増幅された配列を、ベクターへライゲーションする。好ましくは、ベクターには、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯコード化領域、ラムダ転写停止部位、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列が含まれる。
その後、ライゲーション混合物は、Sambrookら,上掲中に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換させるのに使用される。形質転換体は、ＬＢプレート上での生育能により同定され、抗生物質耐性コロニーが選択される。プラスミドＤＮＡは単離され、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定により配列確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢ培地のような液体培養液中で一晩増殖させることが可能である。この一晩かけて培養した産物は、引き続き、大規模培養に植菌するために使用されてもよい。その後、細胞は所望の吸光度になるまで増殖させ、その間に発現プロモーターが始動される。
さらに数時間細胞を培養した後、細胞は遠心により回収することができる。遠心により得られた細胞ペレットは、当該技術分野において既知の種々の試薬を用いて可溶化することができ、その後、可溶化されたfoggyタンパク質は、当該タンパク質との強固な結合を可能にする条件下にて金属キレートカラムを用い、精製することができる。
【０１２９】
foggyは、以下の方法に従い、ポリｈｉｓタグ形態で、大腸菌中で発現される。foggyをコードするＤＮＡは、まず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅される。プライマーには選択される発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び有効かつ信頼性のある翻訳開始部位、金属キレートカラムによる迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク切断的除去を提供する他の有用な配列が含まれている。その後、ＰＣＲで増幅され、ポリｈｉｓでタグ化された配列は、発現ベクターに連結され株５２（W3110fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq)）由来の大腸菌宿主を形質転換するのに使用される。形質転換体は、最初に、５０ｍｇ/ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ中で、Ｏ．Ｄ．６００に到達するまで３０℃で３−５時間振盪しながら増殖させる。培養物は５０−１００倍にＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ，１．０７ｇのＫＣｌ，５．３６ｇのディフコ  イーストエキストラクト，５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ  ｈｙｃａｓｅ  ＳＦを５００ｍＬの水に溶解し、さらに、１１０ｍＭ  ＭＰＯＳ，ｐＨ７．３，０．５５％（Ｗ/Ｖ）グルコース及び７ｍＭ  ＭｇＳＯ４になるように添加する）中にて希釈し、おおよそ、２０−３０時間、３０℃にて振盪させながら増殖させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により発現を検証するために試験サンプルをとり、全培養物は細胞を沈降させるために遠心する。細胞ペレットは、精製及び巻き戻しまで凍結させる。
【０１３０】
０．５から１Ｌの発酵槽からの大腸菌のペースト（６−１０ｇペレット）を１０倍量（Ｗ/Ｖ）の７Ｍ  グアニジン，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８のバッファーに再懸濁させる。固体の亜硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムを、各々、最終濃度０．１Ｍ及び０．０２Ｍになるように添加し、溶液は一晩、４℃にて撹拌される。このステップの結果、全てのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質が得られる。溶液は、ベックマンの超遠心機にて４０，０００ｒｐｍ、３０分間遠心される。上清は３−５倍容量の金属キレートカラムバッファー（６Ｍ  グアニジン，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）で希釈され、夾雑物を除くため、０．２２μフィルターを通してろ過される。浄化された抽出液を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍＬのキアゲンＮｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムにかける。カラムは、５０ｍＭ  イミダゾール（Calbiochem, Utrol grade），ｐＨ７．４を含む別途のバッファーにより洗浄される。タンパク質は２５０ｍＭ  イミダゾールを含むバッファーにて溶出される。所望のタンパク質を含む画分がプールされ４℃にて保存される。タンパク質濃度は、タンパクのアミノ酸配列に基づく計算上の吸光係数を用いて吸光度２８０ｎｍにより見積もられる。
【０１３１】
タンパク質は、次のような構成物で構成される新しく調製された巻戻しバッファー中で、サンプルをゆっくりと希釈することにより巻き戻される；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．６，０．３Ｍ  ＮａＣｌ，２．５Ｍ  尿素，５ｍＭ  システイン，２０ｍＭ  グリシン，及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ。巻戻し容積は、最終的なタンパク質濃度が５０から１００ｍｇ/ｍｌの間になるように選択される。巻戻し溶液は、４℃にて１２−３６時間穏やかに撹拌される。巻戻し反応は、ＴＦＡを最終濃度０．４％（ｐＨおよそ３）になるように添加することにより停止される。タンパク質の更なる精製の前に、容積は０．２２μフィルターを通してろ過され、アセトニトリルが最終濃度２−１０％になるように添加される。巻き戻されたタンパク質は、アセトニトリル濃度勾配が１０から８０％である、０．１％  ＴＦＡの移動抽出バッファーを用いて、ＰｏｒｏｓＲ１/Ｈ逆相カラムにてクロマトされる。Ａ２８０の吸収をもつ画分のアリコットがＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析され、均一な巻戻しタンパク質を含む画分がプールされる。通常、適切にも巻き戻されたほとんどのタンパク質は、逆相レジンとの相互作用から遮蔽される疎水性内部を有する最もコンパクトなもののため、これらの種のタンパク質は最も低いアセトニトリル濃度にて溶出される。凝縮体は、通常、高いアセトニトリル濃度にて溶出される。望ましい形態から誤って巻き戻されたタンパク質の形態を分離することに加え、逆相のステップは、サンプルからエンドトキシンをも除去する。
所望の巻戻されたfoggyを含む画分はプールされ、アセトニトリルはタンパク質溶液に直接、窒素を穏やかに吹き付けることにより除去される。タンパク質は、透析又は製剤化バッファーで平衡化されたＧ２５ Superfine(Pharmacia)レジンを用いたゲルろ過、及び滅菌的にろ過されることにより、０．１４Ｍ  塩化ナトリウム，及び４％  マンニトールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ６．８中に製剤化される。
【実施例３】
【０１３２】
哺乳類細胞におけるＰＲＯの発現
本実施例は、哺乳類細胞における組換え発現によりfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストの潜在的にグリコシル化された形態の調製を示す。
ベクター、ｐＲＫ５（欧州特許第３０７，２４７号、１９８９年３月１５日発行を参照のこと）は、発現ベクターとして用いた。 随意に、foggyＤＮＡは、foggyＤＮＡの挿入を可能にするように選択された制限酵素により、Sambrookら,上掲中で記載されているような連結方法を用いて、ｐＲＫ５に連結される。その結果得られるベクターはｐＲＫ５−foggyと呼ばれる。
一の実施態様において、選択された宿主細胞は２９３細胞であってもよい。ヒト２３９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５７３）は、ウシ胎児血清及び、任意に栄養素構成成分及び/又は抗生物質を添加されたＤＭＥＭなどの培養液中、組織培養プレート中でコンフルエントになるまで生育させる。約１０μｇのｐＲＫ５−foggyＤＮＡは、ＶＡ  ＲＮＡ遺伝子（Thimmappayaら,Cell, 31:543 (1982)）をコードする約１μｇのＤＮＡと混合され、５００μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２２７Ｍ  ＣａＣｌ２， に溶解させる。この混合物に対し、５００μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５），２８０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  ＮａＰＯ４を一滴ずつ添加し、２５℃で１０分間、沈殿を形成させる。沈殿物は懸濁して２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間おいた。培養液は、アスピレーターで除去し、２０％グリセロールを含む２ｍｌのＰＢＳを３０秒間添加する。２９３細胞は、無血清培地で洗浄し、新しい培地を添加し、細胞を約５日間培養する。
【０１３３】
おおよそ、形質移入２４時間後、培養液を除去し、培養液（のみ）、又は２００μＣｉ/ｍｌ３５Ｓ-システイン及び２００μＣｉ/ｍｌ３５Ｓ-メチオニンを含む培養液で置換する。培養１２時間後、条件培地を回収し、スピンフィルターにて濃縮し、１５％ＳＤＳゲルで泳動する。泳動後ゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を示すように選択された時間、フィルムを露光させる。軽質移入された細胞を含む培地は、さらに培養され（無血清培地中）、培養液は選択されたバイオアッセイで試験される。
それに代わる技術により、foggyはSomparyracら, Proc.Natl.Acad.Sci., 12：7575(1981)により記述された硫酸デキストラン法を用い、２９３細胞へ一過的に導入されてもよい。２９３細胞はスピナーフラスコ中で最大密度になるように生育させ、７００μｇのｐＲＫ５−foggyＤＮＡが添加される。まず、細胞は遠心によりスピナーフラスコから濃縮され、ＰＢＳにて洗浄される。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物は、４時間、細胞ペレット上でインキュベートされる。細胞は、９０秒間２０％グリセロールで処理し、組織培養液で洗浄し、組織培養液、５μｇ/ｍｌのウシインスリン及び０．１μｇ/ｍｌのウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコへ再び移される。約５日後、条件培地は、遠心され細胞及び細胞片を除去するためにろ過される。その後、発現されたfoggyを含むサンプルは、濃縮され、透析及び/又はカラムクロマトグラフィーのような選択されたいずれかの方法により精製され得る。
【０１３４】
他の実施態様において、foggyはＣＨＯ細胞中にて発現され得る。ｐＲＫ５−foggyは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥデキストランなどの既知の試薬を用いてＣＨＯ細胞へ形質移入され得る。上述したように、細胞培養物はインキュベートされ、培地は、培養液（のみ）又は３５Ｓ−メチオニンのような放射標識物を含む培養液に置換される。foggyポリペプチドの存在を定量後、培養液は無血清培地で置換される。好ましくは、培養は約６日間行われ、その後条件培地を回収する。発現されたfoggyを含む培養液は、いずれか選択された方法により濃縮され、精製される。
また、エピトープタグ化されたfoggyは、宿主ＣＨＯ細胞中でも発現される。foggyは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングされる。サブクローン化されたインサートは、ポリｈｉｓタグのような選択されたエピトープタグと共にフレームが合うように、バキュロウイルスの発現ベクターへ融合されるようにＰＣＲを行うことも可能である。ポリｈｉｓタグfoggyインサートは、安定クローンの選択のためにＤＨＦＲのような選択マーカーを含むＳＶ４０作動性ベクターへサブクローニングすることができる。最終的に、ＣＨＯ細胞は、ＳＶ４０作動性ベクターで形質移入されること（上述のように）が可能である。上述のように、発現を確認するために標識化することを行ってもよい。その後、発現されたポリＨｉｓタグ化foggyを含む培養液は、濃縮することも可能であり、Ｎｉ２＋キレートアフィニティークロマトグラフィーのような、いずれか選択された方法で精製される。
【０１３５】
また、foggyはＣＨＯ及び/又はＣＯＳ細胞中で一過的発現方法により発現してもよく、ＣＨＯ細胞中で、他の安定発現法によってもよい。
ＣＨＯ細胞中での安定発現は、以下の方法を用いて実施される。タンパク質は、ＩｇＧ構築物（イムノアドヘシン）として発現され、この場合、各タンパク質の可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン）に対するコード化配列は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合され、及び／又は、ポリ−Ｈｉｓタグ化形態である。
ＰＣＲ増幅の後、各ＤＮＡは、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)中に記載の標準的な技術を用いてＣＨＯ発現ベクターへサブクローン化される。ＣＨＯ発現ベクターは、ｃＤＮＡの簡便なシャトリング（入替え）を可能にするために、目的のＤＮＡの５’及び３’と適合する制限酵素部位をもつように構築される。ＣＨＯ細胞で発現に用いられるベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996))中に記載されているように使用され、目的のｃＤＮＡ及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現を誘起するために、ＳＶ４０初期プロモーター/エンハンサーを使用する。ＤＨＦＲ発現はトランスフェクションに続いてプラスミドの安定した維持の選択を可能にする。
【０１３６】
所望のプラスミドＤＮＡ１２μｇを、市販の形質移入試薬、Superfect（登録商標）(Quiagen)、Dosper（登録商標）又はFugene（登録商標）(Boehringer Mannheim)を使用して、およそ１０，０００，０００のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、Lucasら, 上掲中で記載されているように生育される。およそ３ｘ１０-７細胞が、その後の増殖及び後述の産生に使用するため、アンプル中に凍結される。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルは、水浴中に静置し、ボルテックスを行うことにより解凍される。内容物は、ピペッティングにより１０ｍｌの培養液を含む遠心用チューブに移され、５分間、１０００ｒｐｍで遠心される。上清はアスピレーターで除去され、細胞は１０ｍｌの選択培地（０．２μｍでフィルターろ過された５％ウシ胎児血清を含み、０．２μｍフィルターでろ過されたＰＳ２０）に再懸濁される。その後、細胞は、９０ｍｌの選択培地を含む１００ｍＬのスピナーへ分取される。１−２日後、細胞は、１５０ｍＬの選択増殖培地で満たされた２５０ｍＬのスピナーへ移され、３７℃で培養される。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、及び２０００ｍＬのスピナーに３ｘ１０５細胞/ｍｌになるように播種される。細胞培養液は、遠心により新しい培地と交換し産生培地へ再懸濁させる。適切ないずれかのＣＨＯ培地が用いられ、１９９２年６月１６日発行の米国特許第５，１２２，４６９号中に記載の産生培地が実際には使用された。３Ｌの産生スピナーに１．２ｘ１０６細胞/ｍＬで播種される。０日目、細胞数、ｐＨが決定される。１日目、スピナーからサンプリングされ、ろ過された空気の散布が開始される。２日目、スピナーからサンプリングされ、温度が３３℃へ変更され、５００ｇ/Ｌのグルコース３０ｍＬ及び１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサン  エマルジョン、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）、０，６ｍｌが加えられる。生産の過程を通じて、ｐＨは必ず７．２付近を保つように調整される。１０日後、又は生存率が７０％以下に落ち込むまで、細胞培養物は、遠心及び０．２２μｍのフィルターを通してろ過することにより回収される。ろ過産物は、４℃で保存されるか、即時に精製用のカラムに通されるかのいずれかとなる。
【０１３７】
ポリ−Ｈｉｓタグ化構築物に関しては、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を使用してタンパク質の精製が行われる。精製の前に、イミダゾールが５ｍＭの濃度になるように条件培地に添加される。条件培地は、０．３Ｍ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  イミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４バッファーで平衡化された６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ/ｍｉｎの流速で４℃で送り込まれる。カラムに添加後、カラムはさらに平衡化バッファーで洗浄され、タンパク質は０．２５Ｍ  イミダゾールを含む平衡化バッファーで溶出される。続いて、高度に精製されたタンパク質は、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ及び４％  マンニトール，ｐＨ６．８を含む保存用バッファーへ、２５ｍｌＧ２５Superfine(Pharmacia)カラムで脱塩され、−８０℃で保存される。
イムノアドヘシン（Ｆｃ−包含）構築物は、以下のように条件培地から精製される。条件培地は２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化された５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）へ送り込まれる。カラムに添加後、カラムは１００ｍＭ  クエン酸，ｐＨ３．５で溶出される前に平衡化バッファーで大規模に洗浄される。溶出されたタンパク質は、２７５μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ９を含むチューブへ１ｍｌ画分を回収することにより、即座に中和される。高度に精製されたタンパク質は、次いで、ポリ−Ｈｉｓタグ化タンパク質に関して上述されているように保存用バッファー中で脱塩される。均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン分解法によるＮ末端アミノ酸配列決定により評価される。
ここで開示された多くのＰＲＯポリペプチドが上記されるように成功裏に発現した。
【実施例４】
【０１３８】
酵母におけるfoggyの発現
以下に示す方法は、酵母におけるfoggy及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）の組換え発現について記述したものである。
まず最初に、酵母の発現ベクターが、ＡＤＨ２/ＧＡＰＤＨプロモーターからのfoggyの細胞内生産又は分泌のために構築される。foggyの細胞内発現をさせるために、foggyをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適した制限酵素部位に挿入する。分泌のために、foggyをコードするＤＮＡは、ＡＤＨ２/ＧＡＰＤＨプロモーター、天然のfoggyシグナルペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチド、又は、例えば、foggyの発現のために（必要ならば）酵母α−因子若しくはインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、及びリンカー配列をコードするＤＮＡと共に選択されたプラスミド中へクローン化することができる。
その後、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞は上述の発現プラスミドで形質転換することができ、選択された発酵培地で培養できる。形質転換された酵母の上清は、１０％のトリクロロ酢酸で沈殿化することにより分析することが可能で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマーシブルーによるゲルの染色が行われる。
次いで、組換体foggyを単離し、発酵培地から遠心にて酵母細胞を除くことにより精製することができ、その後、選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮する。foggyを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィーレジンを用いて、さらに精製される。
ここで開示された多くのＰＲＯポリペプチドが上記されるように成功裏に発現した。
【実施例５】
【０１３９】
バキュロウィルス感染昆虫細胞におけるfoggyの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるfoggyポリペプチド及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）の組換え発現について記述したものである。
foggyをコードする配列は、バキュロウィルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流と融合される。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及びイムノグロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域に類似の）を含む。種々のプラスミドが用いられるが、市販のｐＶＬ１３９３（Novagen）のようなプラスミド由来のプラスミドが含まれる。大まかには、foggyをコードする配列、又は膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列のようなfoggyのコード配列のうち所望の部分、又はタンパク質が細胞外タンパクの場合は成熟タンパク質をコードする配列が、５’及び３’領域に相補的なプライマーによりＰＣＲ法で増幅される。５’プライマーは隣接する制限酵素部位（選択された）を含んでいてもよい。その後、増幅産物は、選択された制限酵素により切断され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換体バキュロウィルスは、上記のプラスミド及びBaculo Gold(商品名)ウィルスＤＮＡ（Pharmingen）をSpodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販されている）を用いて共形質転換により産生される。２８℃にて４−５日培養後、放出されたウィルスは回収され、さらに増幅させるため利用される。ウィルス感染及びタンパク質発現は、上述のようにO'Reilleyら, Baculovirus expression vectors:A Laboratory Manual, Oxford:Oxford University Press(1994)の方法により行われる。
【０１４０】
発現されたポリ−ｈｉｓタグ化ＰＲＯは、例えば、以下のようにＮｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。抽出物は、Rupertら,Nature, 362:175-179 (1993)において記載されているように、組換体ウィルスを感染させたＳｆ９細胞から調製される。大まかには、Ｓｆ９細胞は洗浄され、超音波処理バッファー（２５ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％  グリセロール；０．１％  ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）中に再懸濁され、氷上にて２０秒間２度超音波処理される。超音波処理された産物は、遠心にて夾雑物が除かれ、その上清はローディングバッファー（５０ｍＭ  リン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％  グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈され、０．４５μｍのフィルターでろ過される。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販されている）は、総容積５ｍＬで調製され、２５ｍＬの水で洗浄され、２５ｍＬのローディングバッファーで平衡化される。ろ過された細胞抽出物液は、１分間に０．５ｍＬの流速でカラムに添加される。カラムは、ベースラインのＡ２８０になるまでローディングバッファーで洗浄され、その時点で分取が開始される。次に、カラムは第二の洗浄バッファー（５０ｍＭ  リン酸；３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％  グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄され、非特異的に結合したタンパク質を溶出させる。Ａ２８０がベースラインにまで再度到達した後に、カラムは、第二の洗浄バッファー中０から５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配により展開される。１ｍＬずつ分取され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はＮｉ２＋−ＮＴＡ結合アルカリホスファターゼ（Qiagen）によるウェスタンブロットにより解析される。溶出されたＨｉｓ１０タグ化ＰＲＯを含む画分がプールされローディングバッファーに対して透析される。
あるいは、ＩｇＧタグ化（又はＦｃタグ化）ＰＲＯの精製は、既知のクロマトグラフィー技術、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを用いることにより行うことができる。
【実施例６】
【０１４１】
foggyと結合する抗体の調製
本実施例は、foggyポリペプチド及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）と特異的に結合するモノクローナル抗体の調製について示すものである。
モノクローナル抗体を産生するための技術は、当該技術の分野において周知であり、例えば、Goding、上掲中に記載されている。用いられる免疫原には、精製されたfoggy、foggyを含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換体foggyを発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、過度の実験を行うことなく、当業者により行われ得るものである。
Ｂａｌｂ/ｃなどのマウスが、完全フロイントアジュバント中でエマルジョン化されたfoggy免疫原で免疫され、１−１００μｇの量で皮下又は腹腔内に注射される。あるいは、免疫源はＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ）中でエマルジョン化され、動物の後足のパッド部分に注射される。その後、免疫されたマウスは、１０から１２日後に選択したアジュバント中でエマルジョン化された追加の免疫原により追加免疫される。その後、数週間の後、マウスはさらに免疫注射により追加免疫される。血清サンプルは、抗foggy抗体を検出するためにエライザアッセイによりテストのために定期的にマウスから眼窩球出血により採取される。
【０１４２】
適当な抗体価が検出された後、抗体に対し「陽性」の動物は最終的にfoggyの静脈注射によりインジェクトされる。３から４日後、マウスは処理され、脾臓細胞が回収される。脾臓細胞は、ＡＴＣＣ，Ｎｏ．ＣＲＬ１５９７より入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選択されたマウスミエローマ細胞株と融合される（３５％ポリエチレングリコールを使用）。融合細胞は、その後、非融合細胞、ミエローマ同士のハイブリッド、脾臓細胞同士のハイブリッドの生育を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレート中にプレーティングされ得るようなハイブリドーマを産生する。
ハイブリドーマ細胞は、foggyに対する反応性に関し、エライザによりスクリーニングされることになる。foggyに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」のハイブリドーマ細胞の同定は、当該技術の範囲内のことである。
陽性ハイブリドーマ細胞は、抗foggyモノクローナル抗体を含む腹水を産生するために、同系のＢａｌｂ/ｃマウスへ腹腔内にインジェクトされる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコ又はローラーボトル中で生育させることが可能である。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫安沈殿を用いたのち、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行うことができる。あるいは、プロテインＡ又はプロテインＧに対する抗体の結合性に基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【実施例７】
【０１４３】
特異的な抗体を用いたfoggyポリペプチドの精製
天然又は組換体foggyポリペプチド及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）は、タンパク質精製の分野において様々な標準的な技術により精製される。例えばfoggyは、目的のfoggyポリペプチドに対して特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。通常、イムノアフィニティーカラムは活性化されたクロマトグラフィー用の樹脂に抗foggyポリペプチド抗体を共有結合的にカップリングさせることにより構築される。
ポリクローナルイムノグロブリンは、免疫された血清から硫安沈殿法、又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, ニュージャージー）による精製のいずれかの方法により調整される。同様に、モノクローナル抗体はマウス腹水液から硫安沈殿又は固定化プロテインＡによるクロマトグラフィーにより精製される。部分精製されたイムノグロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商品名）（Pharmacia LKB Biotechnology）のようなクロマトグラフィー用樹脂に共有結合的に結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂はブロッキングされ、生じた樹脂は製造者の指示に従い洗浄される。
【０１４４】
このようなイムノアフィニティーカラムは、可溶性形態のfoggyポリペプチドを含む細胞から画分を調製することによりfoggyポリペプチドの精製に用いられる。本精製法は、細胞全体の可溶化又は界面活性剤の添加による分画遠心法により得られる細胞成分分画の可溶化、又は当該技術分野において周知のその他の方法により得られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶性foggyポリペプチドは、細胞が生育する培地中に有効量分泌される。
可溶性foggyポリペプチドを含む調製物は、イムノアフィニティーカラムに通され、カラムはfoggyポリペプチドの優先的な吸収を可能にする条件下にて洗浄される（例えば、界面活性剤の存在下、高イオン強度のバッファー中）。その後、カラムは抗体/foggyポリペプチドの結合を壊すような条件下にて溶出され（例えば、およそｐＨ２−３の低ｐＨバッファー、又は尿素又はチオシアン酸イオンのようなカオトロピック因子の高濃度下）、foggyポリペプチドが回収される。
【実施例８】
【０１４５】
薬物スクリーニング
本発明は、特に、foggyポリペプチド及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）又はその結合フラグメントを用い、様々な薬物スクリーニングのいずれかの技術において有用である。そのような試験において用いたfoggyは、液体に可溶状態であるか、固体状の支持体に添付されているか、細胞表面上に出現されているか、細胞内に局在している。ある薬物スクリーニング方法においては、foggyを発現する組換体核酸で、安定に形質転換された真核又は原核宿主細胞が利用される。薬物は、そのような形質転換された細胞に対し、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。このような細胞は、生きた状態又は固定化形態であり、標準的な結合アッセイに対し使用され得る。例えば、foggyと、試験される薬物との間の複合体形成を測定する。あるいは、試験される薬物によって引き起こされるfoggyポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの複合体形成の減少を調べることができる。
従って、本発明は、foggyポリペプチド関連疾病又は疾患に影響を及ぼし得る薬剤又は他のいずれかの薬物についてのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、そのような薬物をfoggyに接触させることを含み、（ｉ）薬物とfoggy間の複合体の存在、又は（ｉｉ）foggyと細胞との複合体の存在を、当該技術分野において周知な方法によりアッセイすることを含む。このような競合結合アッセイにおいて、典型的には、foggyは標識される。適当なインキュベーションの後、遊離型のfoggyは結合型で存在するものと分離され、遊離型又は非複合体型の標識の量は、特定の薬物がfoggyに結合し、foggy/細胞の複合体を阻害する特定の薬物の能力の測定値である。
【０１４６】
薬物スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドと適切な結合親和性を持つ化合物に対するハイスループットのスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に発行の国際公開第８４/０３５６４号において詳細に記載されている。簡単に述べると、大量の異なる小ペプチド試験化合物は、プラスチックピン、又は何らかの表面のような固体基質上で合成される。foggyポリペプチドに適用されるとき、ペプチド試験化合物はfoggyと反応し、洗浄される。結合されたfoggyポリペプチドは、当該分野において周知の方法により検出される。また、精製されたfoggyは、上述の薬物スクリーニング技術において使用するためにプレート上に直接コートされ得る。さらに、非中和抗体はペプチドを捕獲し、固体支持体上に固定化するために用いられる。
また、本発明は、foggyと結合し得る中和抗体が、試験化合物とfoggyポリペプチド又はそのフラグメントとの結合に対し競合するような、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用においても考慮される。このように、抗体は、foggyポリペプチドと１つ又は複数の抗原決定基を共有するいずれかのペプチドの存在を検出するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１Ａ−ＪはＤＡニューロンが欠損したfoggy突然変異体と視床下部の対応する過剰な5HTニューロンを示す。左側のパネルはＷＴを示し、右側のパネルはfoggy胚を示す。（Ａ−Ｂ）側面から見たもので、２０日齢のfoggy胚を示しており、極めて正常な形態を持ち、神経冠由来メラノサイトが減少し、循環のブロックのために心臓近傍に血液の蓄積がある。図１Ｃ−Ｈは、TH抗体（１Ｃ−Ｄ）、5HT抗体（１Ｅ−Ｆ）及びTH（緑）及び5HT（赤）二重染色（１Ｇ−Ｈ）で標識された２日齢の胚を腹側から見たもので、TH＋DAニューロンの減少と視床下部中の5HTirニューロンの対応する増加を示している。THと5HT（黄色）の双方を発現する細胞は矢じるしで示している（図１Ｈ）。図１Ｉ−Ｊは5HT抗体で標識された胚を背側から見たものであり、後脳5HT＋ニューロンはfoggy胚において正常であるように見えることを示している。増加した視床下部5HT＋ニューロンは焦点面から外れている。
【図２】図２Ａ−Ｌはfoggy網膜におけるニューロン表現型を示している。ＷＴは左側でfoggy胚は右側である。図２Ａ−ＢはTH抗体で標識された３日齢の網膜であり、TH＋DA無軸索ニューロンがfoggy突然変異体では失われることを示している。図２Ｃ−Ｆは、赤オプシン（Ｃ−Ｄ）及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD-67）での２日齢の網膜のホールマウントインサイツハイブリダイゼーションであり、（Ｅ−Ｆ）はfoggy突然変異体中のGAD67＋GABA作動性無軸索ニューロンと赤オプシン＋錐体光受容体の欠損を示している。図２Ｇ−Ｈは神経節ニューロンを認識するZn-8抗体で標識された２日齢の網膜であり、foggy突然変異体では神経節ニューロンは減少せず、おそらく僅かに増加していることを示している。図Ｉ−Ｊはγ-クリスタリンでの２日齢の網膜のホールマウントインサイツハイブリダイゼーションであり、foggy突然変異体ではその発現が正常であることを示している。図２Ｋ−Ｌは７２hpfＷＴ（図２Ｋ）及び突然変異体ゼブラフィッシュ（図２Ｌ）胚からの眼の組織学的分析である。突然変異体胚の眼はＷＴに対しておよそ５０μｍ直径が小さい。全ての網膜の突然変異胚が存在し、gcl（神経節細胞層(ganglion cell layer)）、ipl（内網状層(inner plexiform layer)）、inl（内核層(inner nuclear layer)）、opl（外網状層(outer plexiform layer)）、及びpcl光受容体層と示される。軽く好塩基性の細胞（無軸索細胞）は突然変異体の内核層内には欠けている。
【図３】図３Ａ−Ｌは後脳のノルアドレナリン作動性のLCニューロンを示しており、ＰＮＳ中の神経冠由来交感ニューロンはfoggy突然変異胚では欠損している。左側はＷＴであり、右側は突然変異foggy胚を示している。図３Ａ−Ｂは３６hpf胚を背側から見たもので、DBH＋LCニューロンがfoggy突然変異体において欠損していることを示している。図３Ｃ−ＤはTH抗体で標識された２日齢の胚を腹側から見たもので、交感ニューロンがfoggy突然変異体において欠損していることを示している。図３Ｅ−Ｆは１２の体節ＷＴ及び突然変異胚を側面から見たもので、LC前駆体中でのzphox2aｍＲＮＡの正常な発現を示している。図３Ｇ−Ｈは２日齢の胚を腹側から見たもので、交感ニューロンからのzphox2aＲＮＡがないことを示している。図３Ｉ−Ｊは3A10抗体で標識された３６hpf胚を背側から見たもので、foggy突然変異体における後脳マウスナーニューロンの正常な補充を示している。図３Ｋ−ＬはHu抗体で標識された２日齢の胚を側方から見たもので、foggy突然変異体における神経冠由来後根神経節（DRG）ニューロンの正常な補充を示している。
【図４】図４Ａ−Ｂはfoggy領域における物理的地図の作製とＡＦＬＰにより密接に関連したＤＮＡ多形性マーカーを同定する。図４Ａは自動シークエンサーＡＢＩ３１０で実施されたＰＣＲ断片分析のGenescanソフトウェア出力を示す例である。各ピークはＰＣＲ断片を示し、赤の矢によって示された独特のピークはＰＣＲ断片を表し、赤の矢で示された独特のピークはfoggy遺伝子座に結合したＤＮＡマーカーを表す。図４Ｂは二つの密接に関連したAFLPマーカーであるETACMTCT155とETACMGAT270を示し、これらは全体のfoggy領域にわたる大きなゲノムＤＮＡクローン（YACs、BACs及びPACs）を単離する出発点として使用した。全てのYAC、BAC及びPACクローンのサイズはパルスフィールド電気泳動及び制限酵素切断によって決定した。全てのクローンの末端を配列決定し、その配列決定情報を用いて、次のウォークのため、ＳＳＣＰ及びＰＦＬＰによる遺伝連鎖分析のため、また放射線ハイブリッドパネル解析のために使用される特異的ＰＣＲプライマーを設計した。B108J11は形質転換レスキューアッセイ（図５を参照）によるfoggy遺伝子を含むことが見出され、つづいてその全体が配列決定された。それはまた単離foggyｃＤＮＡに対してｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのプローブとして使用された。
【図５】図５Ａ−ＣはBACクローンの注入によるfoggy突然変異表現型のレスキューを示す。図５Ａは、コントロールＤＮＡ又はP21917の注入がfoggy突然変異表現型をレスキューしなかったことを示している。例えば、突然変異胚は減少したメラノサイト、ブロックされた血液循環及びDA及びLCニューロンの欠損を示した。図５Ｂは、B109J11の注入がfoggy突然変異表現型をレスキューしたことを示している：メラノサイト、血液循環及びDA及びLCニューロンの回復によって判断して、２２の注入突然変異動物に対して、１０が完全にレスキューされ（Ｂ、左側パネル）、１２が部分的にレスキューされた（Ｂ、右側パネル）。図５Ｃは、foggy遺伝子座：B172K17ｐ（foggyから0.04+/-0.02ｃM）及びETACMGAT270（foggyから0.06+/-ｃM）の側方の堅く連結した多形性マーカーでの注入胚のＰＣＲ遺伝子型特定を示す。これは、レスキューされた胚が確かにfoggyの遺伝子型の突然変異体であったことを特定した。
【図６】図６Ａ−Ｄはfoggyポリペプチドのコード化アミノ酸配列、タンパク質のSpt5/foggyファミリーの比較、及びfoggy中の変異の検出を示している。図６Ａはゼブラフィッシュfoggyの推定アミノ酸配列を示しており、Ｎ末端の酸性領域に下線が付されている。中央とＣ末端の保存領域は括弧で印が付けられている。４つのKOWモチーフに下線が付され、kow1-４と標識されている。２つの推定核局在化シグナルはボックスで印が付けられている。ヘキサペプチド反復には二重下線が付されている。図６Ｂはfoggyと他の種からのその相同体の間の相同性を示す棒を示しており、酸性、Ｎ末端保存中央領域、ヘキサペプチド反復及び保存Ｃ末端ドメインを含む。図６Ｃは、四角で囲った保存された残基と星印をつけたインバリアントアミノ酸を有するＣ末端ドメインのアミノ酸配列の並びを示す。foggyｍ８０６変異は不変のアミノ酸１０１２−バリンをアスパラギン酸に変化させる。図６ＤはAbi-自動化シークエンサーでつくり出したクロマトグラフであり、T→Aの単一のヌクレオチド変化はfoggyｍ８０６におけるＷＴ１０１２-Valから変異Aspへのアミノ酸変化を導く。
【図７】図７Ａ−Ｊはfoggyの発現を示している。foggyＲＮＡプローブ（A-F）を用いたホールマウントインサイツハイブリダイゼーションは、母性foggyｍＲＮＡが球段階胚の全ての芽細胞腫中に存在している（Ａ）ことを示している。尾芽期の胚（図７Ｂに示される）において、foggyｍＲＮＡは神経板に高く濃縮されているが、低レベルの発現も他で検出される。体節形成の間、２８hpfの胚において、foggyｍＲＮＡが脳に多く発現されている（図７Ｃ）。２日齢の胚では、foggyｍＲＮＡは他の場所よりも脳においてより多く検出されるが、初期段階と比較して若干ダウンレギュレートされていた（図７Ｅ）。foggyｍＲＮＡの発現パターンはＷＴ（図Ｃ、Ｅ）とfoggy変異胚（図Ｄ、Ｆ）の間に差異がなかった。FLAGタグＷＴfoggyコンストラクトでトランスフェクションし、DAPI（図７Ｇ）及びFLAG抗体染色（図７Ｈ）によって可視化された哺乳動物のCos-７細胞は、ＷＴfoggyタンパク質が細胞核内に入ることを示している。FLAGタグ変異foggyコンストラクトでトランスフェクションしたCos-７細胞（図７Ｈ及び７Ｊ）は、変異foggyタンパク質が尚も細胞核に入ることができることを示している。
【図８】図８Ａ−Ｃは、foggy変異がインビトロでfoggy/zSpt5の負の機能を消失させるが正の機能は消失させないことを示している。図８Ａは次のアッセイで使用されるfoggy/zSpt5タンパク質が７．５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離され、クーマシーブリリアントブルーで染色されたことを示している。図８Ｂは、天然のＨｅＬａ核抽出物を用いた欠損／加減アッセイを示す。ヒトSpt4（5ng）と、hSpt5（50ng）か、又は野生型もしくは突然変異foggy/zSpt5（50,150,450ng）の何れかをDSIF欠損抽出物に加減し、転写応答をＤＲＢの存在下又は不存在下で１０分間、開始させた。プラスミドTF3-6C2Atは、アデノウイルスE4プロモーターの下流に３８０-ntのＧフリーカセットを含むが、鋳型として用いた。図８Ｃは、制限ＮＴＰ濃度下で鋳型としてpSLG402を用いて実施した欠損／加減アッセイを示しており、このアッセイはfoggy/zSpt5の刺激活性を測定することを可能にする。上部に概略的に図示しているように、pSLG402はアデノウイルス主要後期プロモーターの下流に２つのＧフリーカセットを含んでいる。２つのＲＮＡバンドの量はＦＬＡ２０００画像アナライザー（Fuji）を使用して定量し、近接比に対して遠位のプロモーターを計算した。
【図９】図９Ａ−Ｃはfoggy/zSpt5の陽性の機能に対するfoggy変異の効果を示している。欠損／加減アッセイを、制限されたＮＴＰ濃度下で鋳型としてpSLG402を使用して実施し、それにより、foggy/zSpt5の刺激活性の測定が可能になった。図９Ａに概略的に示されているように、pSLG402はアデノウイルス主要後期プロモーターの下流に２つのＧフリーのカセットを含む。実際のゲル像は図９Ｂに示す。２つのＲＮＡバンドの量はＦＬＡ２０００画像アナライザー（Fuji）を用いて定量した。図９Ｃはプロモーターの遠位対近位比の計算を示す。
【図１０】図１０は図１１（配列番号：１）の天然配列foggyポリペプチドをコードしている天然配列の核酸配列（配列番号：２）を示す。３文字の開始及び停止コドンは太字フォント及び下線で示されている。T→A変異の位置がまた太字及び下線で特定されている。
【図１１】図１１は天然のfoggyアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。１０１２番の位置におけるVal→Asp変異の位置がまた太字及び下線で特定されている。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004528817.tif 000139
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