(57)【要約】本発明の複合体は、１．０６３ｇ／ｍｌ未満の密度を有するヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる。それは、ＨＣＶで感染した患者から得られた血漿または血清サンプルを入手し、ＬＶＰをその密度に従って遠心分離により前記サンプルから分離し、ヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰを、プロテインＡ、抗ヒトイムノグロブリン、またはヒトイムノグロブリンを結合可能ないずれかの他の分子を使用して分離することによる方法によって得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．０６３ｇ／ｍｌ未満の密度を有する、ヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体。
【請求項２】
１．００６３から１．０６３ｇ／ｍｌの間の密度を有する請求項１記載の複合体。
【請求項３】
ヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなり、１．０６３ｇ／ｍｌ未満、好ましくは１．００６３から１．０６３ｇ／ｍｌの間の密度を有する複合体の調製方法であって、
ＨＣＶに感染した患者から血漿または血清サンプルを入手する工程；
密度に従った遠心分離によって前記サンプルからＬＶＰを分離する工程；及び
ヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰを、プロテインＡ、抗ヒトイムノグロブリン、またはヒトイムノグロブリンを結合可能ないずれかの他の分子を使用して分離する工程；
を含む方法。
【請求項４】
プロテインＡ、抗ヒトイムノグロブリン、またはヒトイムノグロブリンを結合可能な他の分子が、ビーズまたはセファロースのような支持体に接合されている請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＨＣＶウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法であって、任意に請求項３または４記載の方法によって調製された、請求項１または２記載のヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体と、イムノグロブリンのＦｃ断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプターをその表面で含む許容性細胞、またはイムノグロブリンを結合する能力を有する分子に対する少なくとも一つのレセプターを発現する許容性細胞を、培養培地中で適切な条件下で接触させ、前記許容性細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＶウイルスの増殖と複製を許容することが可能である方法。
【請求項６】
前記許容性細胞が、骨髄から由来する幹細胞、単芽球、前単球、単球、及びマクロファージのような単核細胞、マクロファージ前駆細胞、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、ヒトまたは動物の始原肝細胞、ヒトまたは動物の肝癌腫細胞系の群の細胞、クップファー細胞、樹状細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、マスト細胞、ランゲルハンス細胞；合胞体層、好酸性、好塩基性、好中球性多核細胞、血小板、赤血球及びその前駆体からなる群から選択される請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記マクロファージが、組織球、肺胞マクロファージ、脾臓及びリンパ組織のマクロファージ、クップファー細胞、破骨細胞、Ａ型滑膜細胞、組織マクロファージ及びこれらの細胞が由来する前駆細胞からなる群から好ましくは選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記許容性細胞が、イムノグロブリンのＦｃ断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプター、及び／またはＬＤＬ−レセプター及びＬＳＲ−レセプターのようなリポタンパク質に対する少なくとも一つのレセプターを有する、始原または動物肝細胞、ヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞、またはクップファー細胞である請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地が、１％のペニシリン１％、１％のストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、１０％のＦＣＳを補い、さらに任意に５０μＭのベータ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地である、請求項５から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記許容性細胞中でのＨＣＶウイルスの存在が、ＲＴ−ＰＣＲ、及び／または特に前記ウイルスに特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光によるような免疫学的方法、及び／またはフローサイトメトリーによって検出される、請求項６から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
請求項５から１０のいずれか一項記載の培養方法から得られたＨＣＶウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的または完全な精製を含む、ＨＣＶウイルスに対して向けられた抗体の、サンプル中での検出のための組成物の調製方法。
【請求項１２】
前記ウイルス粒子または前記ポリペプチドが、固相の支持体に結合されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＨＣＶウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法であって、任意に請求項３または４記載の方法によって調製された、請求項１または２記載の複合体、あるいは前記複合体の少なくとも一つの分画で、動物を免疫化する方法。
【請求項１４】
ＨＣＶウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏｍ培養方法であって、請求項１または２記載のヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体（ＬＶＰ／Ｉｇ）が入手され、前記複合体が、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体の生産のためにプロテインＡと接触され、前記ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体が、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／抗体複合体の生産のため、少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触され、前記ＬＶＰ／ＩｇプロテインＡ／抗体複合体、及び抗体を結合する能力を有する少なくとも一つの細胞レセプターを含むまたは表面で発現する許容性細胞が、培養培地中で適切な条件の下で接触され；前記許容性細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＣＶウイルスの増殖と複製を許容することができる方法。
【請求項１５】
前記プロテインＡが、ビーズまたはセファロースのような支持体に結合されている請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ＬＤＬに対する少なくとも一つのレセプターに特異的な抗体であり、前記許容性細胞が、ＬＤＬに対する少なくとも一つのレセプターを含むまたはその表面で発現している請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
前記許容性細胞が、ヒトまたは動物始原肝細胞、及びヒト肝癌腫系ＨｅｐＧ２の細胞のようなヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記培養培地が、１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ培地である請求項１４から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記許容性細胞中のＨＣＶウイルスの存在が、ＲＴ−ＰＣＲによって、及び／または特に前記ウイルスに対して特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光のような免疫学的方法によって、及び／またはフローサイトメトリーによって検出される請求項１４から１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
請求項１４から１９のいずれか一項記載の培養方法から得られたＨＣＶウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的なまたは完全な精製を含む、ＨＣＶウイルスに対して向けられた抗体の、サンプル中での検出のための組成物の調製方法。
【請求項２１】
前記ウイルス粒子または前記ポリペプチドが、固相の支持体に結合されている、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激する方法であって、請求項１または２に定義されるヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体（ＬＶＰ／Ｉｇ）を入手し、前記複合体を、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体の生産のためにプロテインＡと接触させ、前記ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体を、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／抗体複合体を生産するために、ヒトまたは動物から回収された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触させ、前記ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／特異的抗体複合体を、前記抗原提示細胞と接触させる方法。
【請求項２３】
前記抗原提示細胞が樹状細胞であり、前記抗体が、「スカベンジャー」レセプターＡ及びＢ、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」（ＴＬＲ）から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２または２３記載の方法によって得ることができる抗原提示細胞。
【請求項２５】
請求項２４記載の刺激された抗原提示細胞からなる治療剤を含む、ヒトまたは動物における体液性及び細胞性応答を誘導することを企図した治療用組成物。
【請求項２６】
ＨＣＶウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法であって、請求項１または２記載のヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体（ＬＶＰ／Ｉｇ）を入手し、前記複合体を、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体を生産するためにプロテインＡと接触させ、前記ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体を、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／抗体複合体を生産するために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の少なくとも一つの細胞レセプターに対して特異的な少なくとも一つの抗体と接触させる方法によって得ることができる、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／抗体複合体で動物を免疫化する方法。
【請求項２７】
前記抗原提示細胞が樹状細胞であり、前記抗体が、「スカベンジャー」レセプターＡまたはＢ、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」（ＴＬＲ）から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
Ｃ型肝炎は、輸血によって獲得される肝炎の主要な原因である。Ｃ型肝炎はまた、例えば静脈内薬剤注射によるような他の経皮的経路によって伝播するであろう。保健の専門家の汚染の危険は、無視できないものではない。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎は、Ａ、ＢまたはＤ型肝炎のようなウイルスと関連する他の形態の肝臓疾患とは区別されている。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、多くの場合で慢性的であり、その結果肝炎、硬変、及び癌腫のような肝臓疾患を併発する。
【０００３】
輸血を通じたウイルスの伝播の危険は、血液ドナーの選択のため減少してはいるが、Ｃ型肝炎の頻度は高いままである。現在世界中で約１億７千万の患者が、ＨＣＶで慢性的に感染されている。高度に危険な集団は、血液輸血の受容者及び静脈内薬剤ユーザーで主に見出されるが、これらの高度に危険な群に属さず、循環している抗ＨＣＶ抗体が見出されている無症候性の血液ドナーが存在する。後者の場合、感染の経路はまだ同定されていない。
【０００４】
ＨＣＶは、分子生物学的手段によって単離された最初の肝臓栄養性ウイルスであった。ウイルスゲノムの配列は、ウイルス粒子が顕在化される前にクローン化された。
【０００５】
ＨＣＶは、９．５ｋｂのポジティブ一本鎖ＲＮＡウイルスであり、相補的ＲＮＡコピーを介して複製し、その翻訳産物は、約３０００アミノ酸の単一のポリタンパク質の前駆体である。ＨＣＶゲノムの５’末端は、遺伝子に隣接した非翻訳領域に対応し、遺伝子は、構造的タンパク質、ヌクレオキャプシドのコアタンパク質、及びＥ１とＥ２／ＮＳ１という二つのエンベロープ糖タンパク質をコードする。非翻訳５’領域及びコア遺伝子は、各種の遺伝子型で比較的良く保存されているが、Ｅ２エンベロープタンパク質は、一種の単離物と他種では異なる超可変領域によってコードされる。ＨＣＶゲノムの３’末端は、非構造的（ＮＳ）タンパク質をコードする遺伝子、及び良く保存された非コード３’領域を含む。
【０００６】
そのゲノムの構成と複製の仮定的態様のため、ＨＣＶはＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科の新たな属、Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓｅｓに分類されている。
【０００７】
ＨＣＶ感染の診断のための数多くの方法が開発されている。例えば、診断的免疫学的アッセイが、患者の血清中のＨＣＶタンパク質に対して向けられた抗体を検出するために実施されている。ウイルスＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの合成とＰＣＲ増幅もまた、慢性的に感染したヒトの血清、または実験的に感染されたチンパンジーの血清中の潜在的感染性ウイルスの間接的な測定として、ＨＣＶゲノムを検出するために使用されている。さらに、遺伝子クローニングに基づいて、ＤＮＡプローブでのハイブリダイゼーション法もまた開発されている。
【０００８】
しかしながら、存在している診断法は、感度及び／または特異性を欠き、及び／または実施の困難性に苦しんでいることが認識されている。例えば、プローブのハイブリダイゼーションの方法では、低感染性のウイルスと高感染性のウイルスの間を区別することが不可能である。それ故、チンパンジーで試験されなければならないウイルスの接種と、動物で生成した感染を試験することが必要であるが、実施は困難である。
【０００９】
それ故、公衆衛生の観点から、ＨＣＶキャリアーを同定してスクリーニングするための特異的で、高感度で、実践的な方法を開発できることが一次的な重要性を有する。解決方法の一つは、特に複製のメカニズムを研究するため、中和抗体または抗ウイルス剤を試験するため、並びに生物学的物質、診断試験、及びワクチン調製物を開発するために、ウイルスの増殖を得ることを可能にするＨＣＶの培養のための非常に有効なｉｎ ｖｉｔｒｏシステムを生産することであろう。実際に、完全なＨＣＶ配列が１９８９年以降入手可能であるが（Ｑ． Ｌ Ｃｈｏｏ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４， ３５９ （１９８９））、ＨＣＶのライフサイクルと複製の態様の理解は、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養システムの欠如により妨げられている。Ｉｔｏ等（Ｊ． Ｇｅｎ， Ｖｉｒｏｌ． ７７： １０４３−１０５４ （１９９６））は、ＨＣＶを有し、疾患が慢性的に確立された患者から得たヒト肝細胞の継代培養におけるＨＣＶの複製の維持を実際に確認しており、感染の経路を示唆しているが、ウイルスの増殖に関連する問題は残っており（長期的な培養の不可能なこと）、開発されたシステムは、ヒト肝臓の供給の必要性と方法の扱いにくさによって制限されている。さらに今日まで、ＨＣＶの嗜好性に対する一般的なコンセンサスが得られておらず、ウイルスに対する全ての細胞レセプターがまだ同定されているわけではない。
【００１０】
密度の点で非常に不均一であるウイルスのＲＮＡ含有粒子は、ＨＣＶで感染された患者の血漿に存在する。ウイルスＲＮＡを含む粒子の密度のこの不均一性は、リポタンパク質の可変的な割合との関連が寄与するものである（Ｔｈｏｍｓｅｎ等， １９９３， Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８２： ６３９）。本特許明細書の記載において、発明者はこれらのハイブリッド粒子をＬＶＰ（リポ−ウイロ−粒子）と称している。密度勾配に沿ったこれらの形態のそれぞれの分布は、患者ごとに可変的である。低密度の粒子の現存する分析は、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）及びＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）の密度をカバーする密度を示す。記載されたサイズ（５０ｎｍ）は、ＶＬＤＬに近い値をもたらす。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ウイルスＲＮＡを含む前述のＬＶＰの性質は、今日まで正確には知られていないが、本発明者は、ＬＶＰがヒトイムノグロブリンと会合すること、及び既知のデータ（Ｈｉｊｉｋａｔａ等， Ｊ Ｖｉｒｏｌ． （１９９３）， １９５３−１９５８）とは対照的に、ＨＣＶウイルスＲＮＡが主に存在するのは、ヒトイムノグロブリンと会合した、１．０６３ｇ／ｍｌ以下の密度を有するＬＶＰのこれらの分画中であることを初めて示した。実際に、Ｈｉｊｉｋａｔａ等は、１．０６ｇ／ｍｌ未満の密度を有する粒子中にはヒトイムノグロブリンは存在せず、チンパンジーにおいて高感染性が見出されるものでは、この密度の粒子であることを示している。これらの実験データは、今日まで解明されていない疾患の慢性性の説明の少なくとも一つの基礎を構成し、さらにＨＣＶウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の新規な方法に対する展望を開くであろう。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の主題は、ヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体であって、前記複合体は、例えば臭化ナトリウム勾配での遠心分離によって表すと、１．０６３ｇ／ｍｌ未満、好ましくは１．００６３から１．０６３ｇ／ｍｌの間の密度を有する。
【００１３】
本発明はまた、ヒトイムノグロブリンと会合した前記ＬＶＰ複合体（ＬＶＰ／Ｉｇ）の調製方法に関し、その方法は、１．０６３ｇ／ｍｌ未満、好ましくは１．００６３から１．０６３ｇ／ｍｌの間の密度を有するＬＶＰ／Ｉｇ複合体の分画を生産するために、患者から得た結晶または血清サンプルから勾配遠心分離によって分離を実施し、次いでプロテインＡまたはヒト抗イムノグロブリンによって、あるいはヒトイムノグロブリンを結合可能ないずれかの他の分子（ビーズまたはセファロースのような支持体に結合した）によって、前記複合体の分画の精製を実施することからなる。この方法は、ＬＶＰ／Ｉｇ複合体を有する初期サンプルを「富化」可能である一方で、ＬＶＰ／Ｉｇ複合体に属さないリポタンパク質を除去することができる。
【００１４】
好ましくは本発明の調製の態様に従って精製された、得られたＬＶＰ／Ｉｇ複合体は、ＨＣＶウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の方法を実施するために使用できる。実際、数多くの細胞が、その表面で、イムノグロブリンのＦｃ断片に対するレセプターを有し、かくして、イムノグロブリンのＦｃ断片とその膜レセプターの一つとの間での相互作用を介して、イムノグロブリンと会合したウイルスＲＮＡが、これらの許容性細胞内へ浸透することを引き起こし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＶウイルスの増殖と複製をもたらすことが可能である。
【００１５】
従って、本発明の主題はまた、ＨＣＶウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法であって、ＬＶＰ／Ｉｇ複合体（好ましくは本発明の方法によって精製される）、及びイムノグロブリンのＦｃ断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプターを表面で含む許容性細胞、またはイムノグロブリンを結合する能力を有する分子に対する少なくとも一つのレセプターを発現する許容性細胞を、所定の培地で適切な条件の下で接触させ、前記許容性細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＶウイルスの増殖と複製を許容することを特徴とする。もちろん、このまたはこれらのレセプターの発現は、自発性でも誘導性でも良く、特にトランスフェクションによっても良い。
【００１６】
【発明の実施の形態】
イムノグロブリンのＦｃ断片に対する少なくとも一つのタイプのレセプターを発現する許容性細胞の中では、非制限的な例として、単核細胞（骨髄から由来する幹細胞、単芽球、前単球、単球、及びマクロファージ）、マクロファージ前駆細胞、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、肝細胞、樹状細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、マスト細胞、ランゲルハンス細胞；合胞体層、好酸性、好塩基性、好中球性多核細胞、血小板が挙げられる。
【００１７】
イムノグロブリンを結合する能力を有する分子に対する少なくとも一つのレセプターを発現する許容性細胞の中では、赤血球及びその前駆体、マクロファージ、単球、多核性白血球（好酸性、好塩基性、好中球性多核細胞）、Ｂリンパ球、及び樹状細胞が挙げられる。
【００１８】
マクロファージは、組織球、肺胞マクロファージ、脾臓及びリンパ組織のマクロファージ、クップファー細胞、破骨細胞、Ａ型滑膜細胞、組織マクロファージ及びこれらの細胞が由来する前駆細胞からなる群から好ましくは選択される。ＨＣＶウイルスは肝臓栄養性であるため、ヒトまたは動物始原肝細胞の細胞、ヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞、及びクップファー細胞は有利に好ましい。しかしながら、ＨＣＶはリンパ球中で増殖して複製することが可能であることが示されているため、Ｂリンパ球もまた好ましい許容性細胞である。
【００１９】
許容性細胞が、ヒトまたは動物始原肝細胞、ヒトまたは動物肝癌腫細胞系の細胞、またはクップファー細胞である場合、ＨＣＶウイルスによる前記細胞の感染は、ヒトイムノグロブリンのＦｃ断片と、前記許容性細胞の表面に存在するＦｃ断片に対する少なくとも一つのレセプターの間での相互作用を介して実施されるが、これらの同じ許容性細胞の表面に存在するＬＤＬ−レセプター及びＬＳＲ−レセプターのようなリポタンパク質に対するレセプターと関連するエンドサイトーシスの経路についてのリガンドであるＬＶＰの相互作用を介して実施されることもある。
【００２０】
用語、ＨＣＶウイルスはいずれのウイルス種をも指し、その中では、ヒトに対して病原性である株、減弱された株、前記株から由来する欠損株が含まれる。実際に、ＲＮＡウイルスは、高い割合の自発的なミューテーションを示すことが知られている。それ故、より高いまたはより低い度合いで有毒であろう複数の株が存在しても良い。例えば参照株に対する核酸及び／またはペプチド配列ホモロジーによって、及び／または形態学的及び／または免疫学的指標に関する株または単離物の同定によって、そのような株を同定することは当業者の能力の範囲内である。
【００２１】
用語、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」細胞システムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複製している細胞を指し、それ故初代細胞、初代細胞から由来する培養物、初代系列、及び前記初代系列から由来する系列を含む。誘導性または自発性の改変が、貯蔵または輸送の間で核型で生じるであろうことが知られているため、参照細胞系から由来する細胞は、起源となる細胞または培養物と厳密で同一でなくても良く、本発明はそのような変異体を含む。
【００２２】
用語、細胞系は、確立された、不朽化した、または自然発生的な系列を指す。実際には、興味あるウイルス培養を実施するため、細胞を永久に操作でき、ウイルスの増殖を許容する培養物で、ウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖できることが必要である。それ故細胞系は好ましくは、確立された細胞系、または各種の方法による不朽化から生ずる細胞系である。これは、（ｉ）安定な、確立された、または継続的な細胞系の確立によって、あるいは無期限に操作でき、培養物内でのウイルスの増殖を許容し、ウイルスの接種が培養物内で生じる、同じ性質の腫瘍化許容性細胞で許容性細胞を共培養することによって、（ｉｉ）かくして確立された細胞系の培養物内で、ウイルスの増殖を許容する許容性腫瘍化細胞と共培養されるウイルスで感染された一次細胞を使用して、あるいは（ｉｉｉ）例えばエプスタインバールウイルスによって、例えばＢリンパ球の不朽化系列である細胞系のウイルス感染によって実施されても良い。
【００２３】
ＨＣＶ培養のために選択される適切な培地は、ＲＰＭＩ培地またはＲＰＭＩ培地から由来する培地である。好ましくはそれは以下のものを補ったＲＰＭＩ１６４０培地である：
ペニシリン１％
ストレプトマイシン１％
グルタミン２ｍＭ
不完全化ＦＣＳ（胎児ウシ血清）１０％
【００２４】
任意に、特定の許容性細胞の培養のため、前述の培地はさらに５０μＭベータ−メルカプトエタノールを含む。
【００２５】
かくして感染された許容性細胞のいくつかの通過が実施され、前記ウイルスの存在が、感染された許容性細胞中で、及び培養上清中で、ＲＴ−ＰＣＲ、及び／または前記ウイルスに特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光によるような免疫学的方法、及び／またはフローサイトメトリーによって検出される。
【００２６】
ＨＣＶウイルスの増殖を得ることを可能にする本発明の方法は、その複製メカニズムを研究するために、中和抗体及び抗ウイルス剤を試験するために、及び診断と治療のための生物学的物質を開発するために、特に有用である。さらに本発明の方法は、感染細胞系と抗ウイルス分子を接触させることによって、少なくとも一つの抗ウイルス分子をスクリーニング及び／または選択するために有用な感染細胞系を得ることを可能にする。
【００２７】
本発明はまた、本発明の方法から得られた前記ウイルスのウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的または完全な精製を含む、ＨＣＶに対して向けられた抗体の、サンプル中での検出のための組成物の調製方法に関する。用語、部分的または完全な精製は、例えばスクロース勾配での超遠心分離による、硫酸アンモニウムでの視差沈降、ゲルクロマトグラフィー、または当業者に周知のいずれかの他の方法による精製を意味するように解される。特に、前記ウイルス粒子または前記ポリペプチドは、固相の支持体に吸着される。
【００２８】
さらに本発明は、ＨＣＶウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法に関し、この方法によれば、１．０６３ｇ／ｍｌ未満、好ましくは１．００６３から１．０６３ｇ／ｍｌの間の密度を有するヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体、または前記複合体の分画で、動物が免疫化される；前記複合体は、任意に前述の方法に従って調製されても良い。かくして前記複合体は、ウイルスタンパク質、脂質、及びリン脂質からなる分画の生産のために、例えば界面活性剤またはカオトロピズム剤で処理することによって、免疫化の前に処理工程にかけられる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体または抗体の断片の生産は、当業者の一般的知見の一部を形成する。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ． （１９７５） Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５−４９７、及びポリクローナル抗体の生産のためにはＧａｌｆｒｅ Ｇ．等， （１９７７） Ｎａｔｕｒｅ， ２６６： ５２２−５５０、及びポリクローナル抗体の生産のためにはＲｏｄａ Ａ．， Ｂｏｌｅｌｌｉ Ｇ．Ｆ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ， Ｊｏｕｎａｌ ｏｓ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． １３， ｐｐ ４４９−４５４ （１９８０）が挙げられる。抗体は、ＬＶＰ／Ｉｇ＋複合体で、またはウイルスタンパク質、脂質、及びリン脂質を含む前記複合体の分画で、マウスまたはウサギを免疫化することによって生産される。完全フロイントアジュバントを使用する免疫原の注射を動物に与える。免疫化された動物から得られた血清及びハイブリドーマ培養上清を、例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット試験のような従来法を使用して、それらの特異性及び選択性について分析する。最も特異性で最も感受性である抗体を生産するハイブリドーマを選択する。モノクローナル抗体も、生産されたハイブリドーマの細胞培養によって、またはマウスへのハイブリドーマの腹膜内注射の後、腹水液を回収することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生産されて良い。上清としてまたは腹水としての生産の態様に関わらず、次いで抗体が精製される。使用される精製の方法は、イオン交換ゲル及び排除クロマトグラフィーでの濾過、または免疫沈降を必須に含む。十分量の抗体が、もっとも有効な抗体を同定するために機能試験でスクリーニングされる。抗体、抗体の断片、または遺伝子操作によって生産されるキメラ抗体のような抗体の誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生産は、当業者に周知である。
【００２９】
とりわけ、用語、抗体の断片は、天然の抗体の断片であるＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓＦｖ（Ｂｌａｚａｒ等， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５９： ５８２１−５８３３及びＢｉｒｄ等， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３−４２６）を意味するように解され、用語、誘導体は、とりわけ天然の抗体のキメラ誘導体を意味するように解される（例えばＡｒａｋａｗａ等， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ １２０： ６５７−６６２及びＣｈａｕｄｒａｙ等， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３９： ３９４−３９７参照）。
【００３０】
本発明はまた、ＨＣＶウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養方法に関し、この方法によれば、前述のヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体（ＬＶＰ／Ｉｇ）が入手され、前記複合体が、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体の生産のためにプロテインＡと接触され、前記ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体が、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／抗体複合体の生産のため、少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触され、前記ＬＶＰ／ＩｇプロテインＡ／抗体複合体、及び抗体を結合する能力を有する少なくとも一つのレセプターを含むまたは表面で発現する許容性細胞が、培養培地中で適切な条件の下で接触される；前記許容性細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＣＶウイルスの増殖と複製を許容することができる。この方法によって好ましくは以下のことが所望される：
−　プロテインＡは、ビーズまたはセファロースのような支持体に結合される；
−　抗体は、ＬＤＬに対する少なくとも一つのレセプターに特異的な抗体であり、許容性細胞は、ＬＤＬに対する少なくとも一つのレセプターを含むまたはその表面で発現する；
−　許容性細胞は、ヒトまたは動物始原肝細胞、及びヒト肝癌腫系ＨｅｐＧ２の細胞のようなヒトまたは動物肝癌腫細胞系の群の細胞から選択される；
−　培養培地は、１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ培地である；
−　許容性細胞中のＨＣＶウイルスの存在は、ＲＴ−ＰＣＲによって、及び／または特に前記ウイルスに対して特異的な抗体を使用する間接的免疫蛍光のような免疫学的方法によって、及び／またはフローサイトメトリーによって検出される。
【００３１】
本発明の方法では、プロテインＡは過剰に添加され、そのことは、ＬＶＰ／Ｉｇのヒトイムノグロブリンに結合しないプロテインＡがまだ利用可能であり、ＬＶＰの表面に吸着し、所定の細胞レセプターに対して特異的な抗体に結合することを意味する。もちろん抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であって良いが、好ましくはより優れた特異性を確保するためにモノクローナル抗体であろう。
【００３２】
本発明はまた、ＨＣＶウイルスに対して向けられた抗体のサンプル中での検出のための組成物の調製方法に関し、その方法は、前述の培養方法から得られたＨＣＶウイルス粒子またはポリペプチドの少なくとも部分的なまたは完全な精製を含む。好ましくは前記組成物の調製のために、ウイルス粒子またはポリペプチドは固相の支持体に結合される。
【００３３】
本発明の主題はまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激する方法であって、この方法によれば、請求項１または２に定義されるヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体（ＬＶＰ／Ｉｇ）を入手し、前記複合体を、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体の生産のためにプロテインＡと接触させ、前記ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体を、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／抗体複合体を生産するために、ヒトまたは動物から回収された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な少なくとも一つの抗体と接触させ、前記ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／特異的抗体複合体を、前記抗原提示細胞と接触させる。ＡＰＣは、リンパ球の刺激を可能にする主要組織適合遺伝子複合体クラスＩまたはＩＩの分子に結合する免疫原性ペプチドを生産するために、外因性抗原を調製する工程に関与する。用語、ＡＰＣは一般的に、マクロファージ、Ｂ細胞、及び樹状細胞を包含する。本発明では、特に樹状細胞に焦点が当てられるが、これは全く制限的なものではなく、この方法は、ＡＰＣの少なくとも一つのレセプターに結合することが可能であるいずれかの抗体を包含する。抗原提示細胞が樹状細胞である場合、抗体は、「スカベンジャー」レセプターＡ及びＢ、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」（ＴＬＲ）から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である。本発明の刺激方法では、ＡＰＣは自己的であり、そのことはそれらがヒトまたは動物から回収され、本発明の方法に従ったｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激の後、それらが体液性及び細胞性応答を誘導するために、同じヒトまたは動物内に再導入されることを意味する。
【００３４】
本発明はまた、前述の方法に従って得ることができる刺激化ＡＰＣに関し、及び本発明の方法に従って刺激された抗原提示細胞からなる治療剤を含む、ヒトまたは動物における体液性及び細胞性応答を誘導することを企図した治療用組成物に関する。さらに本発明はまた、ＡＰＣから得ることが可能である抗原提示粒子または「エクソゾーム」を包含する。前記組成物は、製薬学的に許容可能であることを条件に、免疫性疾患または感染の治療または予防のための治療用または予防用組成物の調製のための、通常のアジュバント及び／または希釈液及び／または賦形剤を含む。
【００３５】
製薬学的に許容可能な賦形剤、希釈液、及びアジュバントの定義は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ 第１６版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏに示されている。
【００３６】
かくして本発明によれば、ＨＣＶウイルス感染の治療または予防のための方法は、前述の治療用組成物を所定の投与量でヒトまたは動物に投与することを含む。
【００３７】
本発明はまた、ＨＣＶウイルスに対して向けられた抗体または抗体の断片の生産方法に関し、この方法によれば、前述のヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰからなる複合体（ＬＶＰ／Ｉｇ）を入手し、前記複合体を、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体を生産するためにプロテインＡと接触させ、前記ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ複合体を、ＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／抗体複合体を生産するために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の少なくとも一つの細胞レセプターに対して特異的な少なくとも一つの抗体と接触させる方法によって得ることができるＬＶＰ／Ｉｇ／プロテインＡ／抗体複合体で動物を免疫化する。好ましくは抗原提示細胞は樹状細胞であり、抗体は、「スカベンジャー」レセプターＡまたはＢ、マンノースレセプター、及び「トール様レセプター」（ＴＬＲ）から選択される樹状細胞の少なくとも一つの細胞レセプターに特異的な抗体である。
【００３８】
【実施例】
実施例１：生物学的物質の調製
リポタンパク質の分離は、１２時間絶食し、Ｃ型肝炎ウイルスに対してポジティブと検出された患者から得た血漿または血清について実施される。
【００３９】
１％のＥＤＴＡ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ−０．１Ｍ ＥＤＴＡ）を、患者から回収された血液に添加する。混合物を４℃の温度で３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。次いで血漿を回収し、使用まで４℃で貯蔵する。
【００４０】
患者から得た血液をドライチューブで回収し、凝固した後、４℃の温度で３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。血清を回収し、使用まで４℃で貯蔵する。
【００４１】
（ｉ）１．００６３ｇ／ｍｌ未満の密度を有するＬＶＰを含む分画、１．００６３ｇ／ｍｌから１．０６３ｇ／ｍｌの間の密度を有するＬＶＰを含む分画、及び１．０６３ｇ／ｍｌより大きいＬＶＰを含む分画の生産
血漿及び血清を、Ｂｅｃｋｍａｎ社によって販売され、ＴＬ１００．４ローターを備えたＴＬ１００装置で４℃で１００，０００ｒｐｍで４時間それぞれ遠心分離する。１．００６３ｇ／ｍｌの密度を有するＬＶＰを含む上部分画を回収し、４℃で貯蔵する。下部分画を、その分画の１００ｍｌ当たり７．２１ｇのＮａＢｒの添加によって、１．０６３ｇ／ｍｌの密度に調製する。次いで下部分画を、ＴＬ１００．４ローターを備えたＴＬ１００装置で４℃で１００，０００ｒｐｍで４時間超遠心分離する。１．００６３ｇ／ｍｌから１．０６３ｇ／ｍｌの間の密度を有する分画を含む生成した上部分画を回収し、４℃で貯蔵する。
【００４２】
（ｉｉ）１．０２５ｇ／ｍｌ未満の密度を有するＬＶＰを含む分画、１．０２５ｇ／ｍｌから１．０６３ｇ／ｍｌの間の密度を有するＬＶＰを含む分画、及び１．０６３ｇ／ｍｌより大きい密度を有するＬＶＰを含む分画の生産
血漿及び血清を、１００ｍｌ当たり２．５１８ｇのＮａＢｒの添加によって、１．０２５ｇ／ｍｌの最終密度にそれぞれ調節する。ＴＬ１００．４ローターを備えたＴＬ１００装置で４℃で１００，０００ｒｐｍで４時間の遠心分離を実施する。
【００４３】
１．０２５ｇ／ｍｌ未満の密度を有する分画を含む上部分画を回収し、４℃で貯蔵する。下部分画を、１００ｍｌ当たり４．８４ｇのＮａＢｒの添加によって１．０６３ｇ／ｍｌの密度に調節する。次いで下部分画を、Ｔｌ１００．４ローターを備えたＴＬ１００装置で４℃で１００，０００ｒｐｍで４時間超遠心分離する。ＬＤＬを含む生成した上部分画を回収し、４℃で貯蔵する。
【００４４】
次いで回収された各種の分画を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．２４ｍＭ ＥＤＴＡバッファーに対して４℃で１８時間透析する。次いで分画を回収し、０．４５μの膜で濾過する。タンパク質をローリー法（Ｓｉｇｍａ）によってアッセイする。
【００４５】
実施例２：ヒトイムノグロブリンとのＬＶＰの会合の測定
ＨＣＶで感染した３人の患者から得た血漿から回収され、実施例１のプロトコールに従って調製されたＬＶＰを含む各種の分画を、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ （１９７０）， ２２７： ６８０−６８５）。これらの分画中のイムノグロブリン（Ｉｇ）の存在を、ペルオキシダーゼに接合したヤギ血清抗ヒトイムノグロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、ウエスタンブロット法によって測定した（Ｔｏｗｂｉｎ等， ＰＮＡＳ， （１９７９） ７６： ４３５０−４３５４）。その結果は、ヒトイムノグロブリンが、患者によって異なる量で、ＬＶＰを含む分画で未だ検出されることを示す。
【００４６】
ＬＶＰを含むこれらの分画中のＨＣＶゲノムの量を、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ＝逆転写；ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応）及びリアルタイムでの蛍光の検出（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲＴＭ、ＲＯＣＨＥ）によって、ＨＣＶ ＲＮＡの定量によって測定した（Ｗｉｔｔｗｅｒ等， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１９９７）， ２２： １７６−１８１）。その結果は、ＨＣＶ ＲＮＡが、患者によって異なる量で、ＬＶＰを含む分画と常に関連することを示す。
【００４７】
Ｉｇと会合したＬＶＰ（ＬＶＰ／Ｉｇ）を、ＭＳ＋分離カラムを通過させた後にＭＡＧｍｏｌプロテインＡミクロビーズタイプ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｆｒａｎｃｅ）のビーズに接合したプロテインＡを使用して、またはプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、さらに精製した。この場合では、以下の表に説明されるように、全てまたはほとんどのＨＣＶ ＲＮＡがＩｇと共精製される。従って、ＬＶＰの豊富な分画から、感染のために使用されるサンプルが、好ましくはＬＶＰ／Ｉｇ＋／ＲＮＡ＋を使用するために、そのＩｇを介して精製される。
【００４８】
【表１】
2004504836.tif 000002
【００４９】
【表２】
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【００５０】
【表３】
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【００５１】
これらの結果は、イムノグロブリンがＬＶＰを含む分画中に存在する場合、ウイルスＲＮＡはヒトイムノグロブリンと会合したＬＶＰの分画中で主に見出されることを示す。
【００５２】
実施例３：細胞標的化によるＬＶＰの内在化
実施例２によって精製されたＨＣＶウイルスでのｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス感染の初期の工程の間、細胞レセプターに対して向けられた抗体の使用は、所定の細胞系中へのＬＶＰの標的化と内在化の効率を増大可能である。
【００５３】
Ｉｇと会合したＬＶＰ（ＬＶＰ／Ｉｇ）を、実施例２に記載されるように、ＭＡＧｍｏｌプロテインＡミクロビーズタイプのビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｆｒａｎｃｅ）に接合したプロテインＡを使用して、１．０２５から１．０５５ｇ／ｍｌの間の密度を有する分画から精製した。
【００５４】
ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ培地中で培養されたヒト肝癌腫系ＨｅｐＧ２を、抗ＬＤＬレセプター抗体の存在下で精製されたＬＶＰ／Ｉｇ＋の内在化の研究のため使用した。結果は以下のプロトコールによって得られた：
【００５５】
３７℃−５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーションの後に、約７０％の集合体を得るように、９６穴プレートに４５，０００細胞／ウェルでＨｅｐＧ細胞をイノキュレートした。
【００５６】
１×ＰＢＳバッファーでの３回の洗浄を実施し、次いでＬＶＰ／Ｉｇ＋分画（０．２５×１０６コピーのＨＣＶ ＲＮＡである）を、抗ＬＤＬレセプター抗体の増大する量：つまり０、１、５、１０及び２０μｇ／ｍｌの存在下で各ウェルに添加した。アッセイ当たり４のウェルを準備した。インキュベーションを＋３７℃で３時間実施した。
【００５７】
細胞を、冷たい１×ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡを使用して３回洗浄し、次いでアイスバスで１時間１０ｍＭスラミンで処理した。１×ＰＢＳで３回新たに洗浄した後、細胞をＲｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）から得た３５０μｌの溶解バッファーで溶解した。次いでこの同じキットを使用してＲＮＡを精製し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ）。
【００５８】
得られた結果が図１に示されている。この結果は、抗ＬＤＬレセプター抗体の量が高い程、内在化するＬＶＰ／Ｉｇ＋の量も高いことを示す（ウイルスＲＮＡの定量によって測定された）。これは、マグネティックビーズ上のＬＶＰに接合されていない遊離プロテインＡの存在によって生産される、ＬＶＰ／Ｉｇ＋−プロテインＡ／マグネティックビーズ−抗ＬＤＬレセプター抗体の形成によって説明できる。この仮説は、以下の記載される実験で確認される。
【００５９】
Ｉｇと会合したＬＶＰ（ＬＶＰ／Ｉｇ＋）を、実施例２に記載されるように、ＭＡＧｍｏｌプロテインＡミクロビーズタイプ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｆｒａｎｃｅ）のビーズに接合したプロテインＡを使用して、１．００６ｇ／ｍｌ未満の密度を有する分画から精製した。
【００６０】
３７℃−５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーションの後に、約８０％の集合体を得るように、９６穴プレートに５０，０００細胞／ウェルでＨｅｐＧ２細胞をイノキュレートした。その結果は、ＬＶＰ／Ｉｇ＋分画（０．４×１０６コピーのＨＣＶ ＲＮＡである）を、各種の条件で各アッセイに添加することを除いて、前述のプロトコールで得られた：
−　５０μｇのヒトイムノグロブリンの存在下；
−　５０μｇのヒトイムノグロブリンと１０μｇ／ｍｌの抗ＬＤＬレセプター抗体の存在下；
−　１０μｇ／ｍｌの抗ＬＤＬレセプター抗体の存在下；
ここでヒトイムノグロブリンを有するＬＶＰ／Ｉｇ＋の事前インキュベーションは、室温で１時間実施された。
【００６１】
得られた結果が図２に示されている。これらの結果は、レセプターに対して特異的でないイムノグロブリンを有するＬＶＰのインキュベーションが、抗ＬＤＬレセプター抗体による内在化の容易性をブロックするという意味で、細胞標的化の特異性を確認する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ウイルスＲＮＡの定量によって測定された、内在化したＬＶＰ／Ｉｇ＋の量を表す図である。ｘ軸では、抗ＬＤＬレセプター抗体のμｇ／ｍｌ単位での量が表され、ｙ軸では、プロテインＡのμｇ当たりのＲＮＡのコピー数が表されている。
【図２】図２は、ヒトイムノグロブリン、ヒトイムノグロブリンと抗ＬＤＬレセプター抗体、抗ＬＤＬレセプター抗体の存在下、及びコントロールでのウェル当たりで得られたウイルスＲＮＡのコピー数を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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