(57)【要約】その他の細胞に有利な形で標的細胞に選択的に及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｅ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント、又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、結合選択性又は特異性が主として第１の超可変領域により決定され、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有する、ペプチド又はポリペプチドに向けられている。増強された結合は、その上又は中で結合部位が実質的に利用可能でないかつ／又は発現されていないその他の細胞に有利な形で１つの細胞を含む標的の上又は中で実質的に露呈されたかつ／又は過剰発現された結合部位に向けられる。本発明はさらに、ファージ表示ライブラリからかかるペプチド及びポリペプチドを単離するための方法、及びそれらをコードする核酸分子にも向けられている。本発明は、該ペプチド又はポリペプチドを含む薬学組成物及び疾病、特定的には癌、最も特定的には急性骨髄性白血病の診断及び治療のためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞以外の細胞に有利な形でその標的細胞に選択的に及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｅ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント、又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、結合選択性又は特異性が主として第１の超可変領域により決定され、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有する、ペプチド又はポリペプチド。
【請求項２】
第１の超可変領域が、配列番号８−２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域である、請求項１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項３】
第１の超可変領域が配列番号８−２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域であり、結合選択性又は特異性が二次的に、第２の超可変領域、第３の超可変領域及び／又は第１、第２及び第３の超可変領域をフランキングする上流側又は下流側領域のうちの単数又は複数のものによって影響される、請求項１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４】
第１の超可変領域が配列番号８と同一のＣＤＲ３領域である配列番号２５をもつｓｃＦｖである、請求項２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項５】
ｓｃＦｖ分子が２０以下のアミノ酸残基の直鎖又は分岐鎖スペーサを含む、請求項１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項６】
スペーサが配列番号１２３又は配列番号１２４である、請求項５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項７】
標的細胞が活性化、励起、修飾、変更、妨害を受けた、異常な又は病的な細胞である請求項１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項８】
病的細胞が癌細胞である請求項７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項９】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１０】
細胞が白血病又は骨髄腫細胞である請求項９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１１】
白血病又は骨髄腫細胞がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１２】
白血病細胞が急性骨髄性白血病である、請求項１０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号３０−１１３から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつか又はそれと少なくとも９０％のアミノ酸類似性をもつ連続的アミノ酸のカセットをさらに含んで成り、該カセット又はフラグメントが、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域が中に構築、挿入、付着、結合、組合せ又は融合される１つの枠組を提供する、請求項２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４】
カセットが配列番号：３０−３２、３３、３７−３９、４１、４３、４５、４６、４８、５１、５４、５７、５９−６８、７０、７１、７６−８５、８７、８９−９２、９４、９７、９９、１０３、１０６、１１２及び１１３から選択されるか又はそれらと少なくとも９０％のアミノ酸類似性をもつアミノ酸配列を有する請求項１３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５】
カセットが配列番号６１のアミノ酸配列を有するかそれと少なくとも９０％のアミノ酸類似性をもつ請求項１３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６】
カセットが配列番号６１のアミノ酸配列を有するか又はそれと少なくとも９０％のアミノ酸類似性を有する、請求項１５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号６１の７つのカルボキシ末端アミノ酸残基が配列番号１２２の７つのアミノ酸残基により置換されている、請求項１５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１８】
第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域である、請求項３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１９】
ＣＤＲ３領域が配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２０】
ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号１１５及び配列番号１１４のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２１】
第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域であり、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号８、１１５及び１１４のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２２】
ＣＤＲ３領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１６のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２３】
第２の超可変領域がＣＤＲ２超可変領域であり、ＣＤＲ２領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１８のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２４】
第３の超可変領域がＣＤＲ１超可変領域であり、ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ１領域をフランキングする下流側領域が配列番号１２０のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号３０−１１３又はそれらのフラグメントから成るグループの中から選択された連続したアミノ酸のカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号１１５及び１１４で置換されている、請求項１８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号３０−３２、３５、３７−３９、４１、４３、４５、４６、４８、５１、５４、５７、５９−６８、７０、７１、７６−８５、８７、８９−９２、９４、９７、９９、１０３、１０６、１１２及び１１３又はそれらのフラグメントから成るグループの中から選択された連続するアミノ酸のカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号１１５及び１１４によって置換されている、請求項１８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２７】
（ａ）第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域であり、
（ｂ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号８であり、
（ｃ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１１５であり、
（ｄ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１１４であり、
（ｅ）ＣＤＲ３領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を有し、
（ｆ）ＣＤＲ３領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１６のアミノ酸配列を有し、
（ｇ）ＣＤＲ２領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１９のアミノ酸配列を有し、
（ｈ）ＣＤＲ２領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１８のアミノ酸配列を有し、
（ｉ）ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２１のアミノ酸配列を有し、
（ｊ）ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２０のアミノ酸配列を有する、
請求項３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２８】
Ｆｖがファージ表示ライブラリから得ることのできるｓｃＦｖである、請求項１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２９】
ファージ表示ライブラリが、免疫化されていないヒトの末梢血リンパ球から構築されており、ｓｃＦｖペプチドが、標的細胞の表面上の以前に特徴づけされていない未精製抗原に対して選択されている、請求項２８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項３０】
バイオパンニングが、標的に対しファージを結合させる段階、未結合ファージを除去する段階、結合したファージを溶出する段階及び溶出したファージを伝播及び増幅する段階を含んで成る、請求項２８に記載のペプチド又はポリペプチドを選択又は同定するための方法。
【請求項３１】
標的細胞上又はその中の実質的に露呈されかつ／又は過剰発現された結合部位に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、標的細胞に対する結合が、その上又は中で結合部位が実質的に利用可能でないかつ／又は発現されていないその他の細胞に有利なように発生し、結合選択性又は特異性が、主として第１の超可変領域によって決定され、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｆｖが任意には単数又は複数のタグを有するペプチド又はポリペプチド。
【請求項３２】
第１の超可変領域が、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域である、請求項３１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項３３】
第１の超可変領域が、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域であり、結合選択性又は特異性が二次的に、第２の超可変領域、第３の超可変領域及び／又は第１、第２及び第３の超可変領域をフランキングする単数又は複数の上流側領域又は下流側領域によって影響され、第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域である、請求項３１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項３４】
その他の細胞に有利なように標的細胞に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、Ｆｖ分子が、第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第１の鎖及び第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第２の鎖を含んで成り、第１鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択された１つの配列をもち、第２鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択された１つの配列を有し、第１、第２及び第３の超可変領域は、それぞれＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域であり、ＦｖはｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｆｖが任意には単数又は複数のタグを有する、ペプチド又はポリペプチド。
【請求項３５】
（ａ）第１鎖及び第２鎖が各々、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択された第１の超可変領域を含んで成るか；又は
（ｂ）第１鎖の第１の超可変領域及び第２鎖の第１の超可変領域が同一であり、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されているか；又は
（ｃ）第１鎖の第１の超可変領域が配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されており、かつ第２鎖の第１の超可変領域が配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択されているか；又は、
（ｄ）第１鎖の第１の超可変領域が、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択され、第２鎖の第１の超可変領域が配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されている、
請求項３４に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項３６】
第１鎖の第２及び第３の超可変領域がそれぞれ配列番号１１４及び１１５である、請求項３４に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項３７】
（ａ）第１及び第２の状態をもつ第１の細胞上で未知のリガンドに結合し、該結合が第２の状態で有効であるものの第１の状態では実質的に有効でなく、かつ
（ｂ）免疫交差反応性により、第２の細胞上のリガンドに対し特異的又は選択的に結合し、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｆｖが任意には単数又は複数のタグを有している、
Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチド。
【請求項３８】
第１の細胞が正常な細胞である、請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項３９】
第１の状態が活性化されていない状態であり、第２の状態が活性化、励起、修飾、変更又は妨害を受けた状態である、請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４０】
第２の細胞が病的細胞である、請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４１】
病的細胞が癌細胞である、請求項４０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４２】
病的細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項４０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４３】
病的細胞が、白血病細胞である、請求項４２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４４】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項４３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４５】
第２の細胞のリガンドに対するペプチド又はポリペプチドの選択的及び／又は特異的結合が第１の超可変領域により主として決定される、請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４６】
第１の超可変領域が、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域である、請求項４５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４７】
第１の超可変領域が、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域であり、結合選択性又は特異性が二次的に、第２の超可変領域、第３の超可変領域及び／又は第１、第２及び第３の超可変領域をフランキングする、上流側領域又は下流側領域のうちの単数又は複数のものによってそれぞれ影響される請求項４６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４８】
第２の細胞により発現され請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチドによって結合される能力をもつリガンド。
【請求項４９】
請求項４８に記載のリガンドを認識し結合する分子。
【請求項５０】
請求項１、３１、３４又は３７のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項５１】
核酸がＤＮＡである、請求項５０に記載の核酸分子。
【請求項５２】
第１の細胞の第１及び第２の状態が同じであり、第１の細胞が１つの細胞系統から誘導されている、請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項５３】
細胞系統が、ジャーカット、Molt-４、ＨＳ−６０２、Ｕ９３７、ＴＦ−１、ＴＨＰ−１、ＫＧ−１、ＭＬ−２及びＨＵＴ−７８から成るグループの中から選択されている、請求項５２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項５４】
第１及び第２の細胞上の未知の免疫交差反応性結合部位に結合するターゲティング分子を同定するための方法において、
（ａ）第１の状態ではなく第２の状態において、少なくとも１つの未知のリガンドを含む結合部位を実質的に露呈又は表示する第１の標的細胞に対し単数又は複数回のバイオパンニングを行ない、かくして認識分子の第１の集団を生成する段階；
（ｂ）第２の認識分子集団を生成するべく第１の細胞の未知のリガンドに対する免疫交差反応性をもつ少なくとも１つの未知のリガンドを含む結合部位を表示する第２の細胞に対して実施される、段階（ａ）の認識分子の第１の集団から開始した後続するバイオパンニング及び／又は選択段階を実施する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の認識分子の第２の集団の増幅及び精製段階；及び
（ｄ）第２の細胞上の未知のリガンドについて選択的かつ／又は特異的であるターゲティング分子を含んで成るペプチド又はポリペプチドを段階（ｃ）の精製済み認識分子の認識部位から構築する段階、
を含んで成る、ターゲティング分子の同定方法。
【請求項５５】
第１の細胞が正常な細胞であり、第１の状態が活性化されていない状態であり、第２の状態が、活性化、励起、修飾、変更又は妨害を受けた状態である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
第２の細胞が病的細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
病的細胞が癌細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
細胞が白血病細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
医薬品の製造における、任意には薬学的作用物質と会合された、又はそれに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された状態にある、請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項６２】
医薬品が、病的細胞に対抗する活性をもつ、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
病的細胞が癌細胞である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項６２に記載の使用。
【請求項６５】
細胞が白血病細胞である、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
医薬品として使用するための、任意には薬学的作用物質と会合された、又はそれに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された状態にある、請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項６８】
医薬品が、病的細胞に対抗する活性をもつ、請求項６７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項６９】
病的細胞が癌細胞である、請求項６８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項７０】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項６８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項７１】
細胞が白血病細胞である、請求項７０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項７２】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項７１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項７３】
病的又は癌細胞の成長を阻害する上で使用するための組成物を調製する目的での、請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項７４】
細胞が白血病細胞である、請求項７３に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項７５】
白血病細胞が、急性骨髄性白血病細胞である、請求項７４に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項７６】
癌細胞の成長を阻害する上で使用するための組成物を調製することを目的とし、該組成物が癌細胞について選択的かつ／又は特異的な薬学的リガンドをもつ少なくとも１つの化合物を含んで成る、請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項７７】
薬学的に有効な量の薬学的作用物質、任意には薬学的に有効な担体と会合された又はそれに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合させられた状態にある、請求項１又は請求項３７に記載の少なくとも１つのペプチドを含んで成る組成物。
【請求項７８】
ペプチド又はポリペプチド及び薬学的作用物質がリンカー化合物を介してリンクされている、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
リンカー化合物が、ジカルボン酸、マレイミドヒドラジド、ＰＤＰＨ、カルボン酸ヒドラジド及び小型ペプチドから成るグループの中から選択されている、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
小型ペプチドが、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ及びＫＡＫ−Ｔａｇから成るグループの中から選択されている、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
タグが、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、及びＫＡＫ−Ｔａｇから成るグループの中から選択されている、請求項１、３１、３４及び３７のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項８２】
薬学的作用物質が、放射性同位元素、毒素、オリゴヌクレオチド、組換え型タンパク質、抗体フラグメント、及び抗癌剤から成るグループの中から選択されている、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８３】
放射性同位元素が、インジウム、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルリウム、122mテルリウム、125mテルリウム、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123イオジン、126イオジン、131イオジン、133イオジン、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77ブロミン、18フルオリン、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムから成るグループの中から選択されている、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
毒素が、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン及びそれらの修飾及び誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８５】
抗癌剤が、ドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン（ＭＤＯＸ）、アドリアマイシン、ｃｉｓ−プラチナ、トキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８６】
一定量の請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチドと細胞を接触させる段階を含んで成る、細胞の成長を阻害する方法。
【請求項８７】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
細胞が白血病細胞である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
腫瘍の診断的位置特定及び画像化において使用するための、画像化剤に対し付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された請求項１又は請求項３７に記載の少なくとも１つのペプチドを含んで成る薬学組成物。
【請求項９１】
疾病又は癌を治療するのに有効な量の請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチドを患者に投与する段階を含んで成る、疾病又は癌を患う患者の治療方法。
【請求項９２】
疾病又は癌が癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫から成るグループの中から選択されている、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
疾病が白血病である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
白血病が、急性骨髄性白血病である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
Ｆｖが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞に特異的又は選択的に結合する、請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項９６】
請求項９５に記載のペプチド又はポリペプチドにより結合されたＡＭＬ細胞上に提示されたリガンド。
【請求項９７】
請求項９６に記載のリガンドに結合するペプチド又はポリペプチド。
【請求項９８】
標示マーカーに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された請求項１又は請求項３７のペプチド又はポリペプチドを含んで成る、治療前、治療中又は治療後の治療の効力のin vitro分析のための診断用キット。
【請求項９９】
標示マーカー分子が螢光マーカーである請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
螢光マーカーが、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、及びそれらの修飾及び接合体から成るグループの中から選択されている、請求項９９に記載のキット。
【請求項１０１】
疾病又は癌の診断のために使用される、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０２】
構成体がＩｇポリペプチドである、請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１０３】
Ｉｇポリペプチドが組換え型ポリペプチドとして発現され、真核細胞系内で産生される、請求項１０２に記載のペプチド又はポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１０４】
真核系が哺乳動物細胞系である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
ＩｇポリペプチドがＩｇＧ ポリペプチドである、請求項１０２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１０６】
ＩｇＧ ポリペプチドがそれぞれ配列番号８、１１５及び１１４をもつＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域を含んで成る、請求項１０５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１０７】
ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域が重鎖領域である、請求項１０６に記載のＩｇＧ ポリペプチド。
【請求項１０８】
ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域が軽鎖領域である請求項１０６に記載のＩｇＧ ポリペプチド。
【請求項１０９】
ＩｇＧが配列番号２６を含む重鎖及び配列番号２７を含む軽鎖又はそれと少なくとも９０％のアミノ酸類似性をもつ鎖を有する、請求項１０２に記載のＩｇＧ ポリペプチド。
【請求項１１０】
ペプチド又はポリペプチドが原核細胞系内又は真核細胞系内で産生される、請求項１又は請求項３７のペプチド又はポリペプチドの産生方法。
【請求項１１１】
原核系が発現ベクターを含むE. coliを含んで成り、真核系が哺乳動物細胞系である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
原核系の発現ベクターが、osmＢ、deo、β−lac−Ｕ５、λＰL、ＳＲα５、及びＣＭＶから成るグループの中から選択されたプロモータを含んで成る、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
Ｒ1及びＲ2の各々が０〜１５個のアミノ酸残基を含みＸがＡrg、Ｇly又はＬysのいずれかであるＲ1−Ｘ Ｐhe Ｐro−Ｒ2のアミノ酸配列を含んで成る、結合モチーフを含んで成るペプチド又はポリペプチド。
【請求項１１４】
ＣＤＲ３がＲ1−ＸＰhe Ｐro−Ｒ2のアミノ酸配列を含み、ここでＲ1及びＲ2が各々０〜１５個のアミノ酸残基を含み、ＸがＡrg、Ｇly、又はＬysのいずれかである、請求項２、３４又は４６のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１１５】
前記ペプチド又はポリペプチドが、天然に発生しない少なくとも１つの修飾を内含する、請求項１又は請求項３７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１１６】
前記天然に発生しない修飾がペプチド又はポリペプチドをより免疫原性又はより安定なものにする、請求項１１５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１１７】
前記少なくとも１つの修飾が、ペプチド修飾、セミペプトイド修飾、環状ペプチド修飾、Ｎ−末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、バックボーン修飾、及び残基修飾から成るグループの中から選択されている、請求項１１６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１１８】
異常細胞を除去するための自己由来の骨髄のex vivoパージングのための請求項１、３１、３４、３７又は６７のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１１９】
ａ）標的細胞上で直接的にバイオパンニング手順によってか又は第１の状態ではなく第２の状態の第１の標的細胞上で間接的にバイオパンニング手順により又その後第２の標的細胞上で直接的にバイオパンニング手順によって一次認識部位を含む単数又は複数のターゲティング分子を単離し選択して、単数又は複数の前記ターゲティング分子を産生する段階；
ｂ）単数又は複数のターゲティング分子の増幅、精製及び同定段階；及び
ｃ）単数又は複数のターゲティング分子からターゲティング作用物質を構築する段階、
を含んで成り、そうでなければ該ターゲティング作用物質がペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント又はその多量体であり得る、ターゲティング作用物質の産生方法。
【請求項１２０】
ターゲティング作用物質が薬学的作用物質にカップリング、付着、組合せ、リンク、融合されているか又はこの薬学的作用物質と会合されている請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ターゲティング作用物質が抗疾病又は抗癌剤である、請求項１１９及び１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
薬学的作用物質が、放射性同位元素、毒素、オリゴヌクレオチド、組換え型タンパク質、抗体フラグメント、及び抗癌剤から成るグループの中から選択されている、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
放射性同位元素が、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルリウム、122mテルリウム、125mテルリウム、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123イオジン、126イオジン、131イオジン、133イオジン、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77ブロミン、18フルオリン、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムから成るグループの中から選択されている、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
毒素が、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア、リシン及びそれらの修飾及び誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
抗癌剤が、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
Ａ−Ｘ−Ｂ
という構造式又は構造をもつペプチド又はポリペプチドであって、式中Ｘが３〜３０個のアミノ酸の超可変ＣＤＲ３領域であり；  Ａ及びＢが各々長さ１〜１０００アミノ酸のアミノ酸鎖であり得、ここでＡがアミノ末端、Ｂがカルボキシ末端である、ペプチド又はポリペプチド。
【請求項１２７】
Ａが１５０〜２５０個のアミノ酸残基であり、Ｂが３５０〜５００個のアミノ酸残基である、請求項１２６に記載のペプチド。
【請求項１２８】
ＣＤＲ３領域が５〜１３個のアミノ酸残基である請求項１２６に記載のペプチド。
【請求項１２９】
Ｘが配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列である、請求項１２６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１３０】
より大きい又は完全な抗体又は多量体の一部分である、請求項１２７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１３１】
うち１つが請求項１２６に記載のペプチド又はポリペプチドである２つのペプチド又はポリペプチドを含んで成る二量体分子。
【請求項１３２】
同一である請求項１２６に記載の２つのペプチド又はポリペプチドを含んで成る二量体分子。
【請求項１３３】
Ｘが配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列である請求項１３１又は請求項１３２に記載の二量体分子。
【請求項１３４】
請求項１２６に記載のペプチド又はポリペプチド又は請求項１３０に記載の二量体分子をコードする核酸分子。
【請求項１３５】
哺乳動物細胞系がＳＲα５プロモータを含んで成る、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１３６】
哺乳動物細胞系がＣＭＶプロモータを含んで成る、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１３７】
実質的に本書に記述されている通りのペプチド又はポリペプチド。
【請求項１３８】
その他の細胞に有利な形で標的細胞に選択的に及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｅ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント、又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、結合選択性又は特異性が主として第１の超可変領域により決定され、第１の超可変領域が、配列番号８又は２０から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域であり、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有する、ペプチド又はポリペプチド。
【請求項１３９】
結合選択性又は特異性が二次的に、第２の超可変領域、第３の超可変領域及び／又は第１、第２及び第３の超可変領域をフランキングする上流側又は下流側領域のうちの単数又は複数のものによって影響される、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４０】
第１の超可変領域が配列番号８と同一のＣＤＲ３領域である配列番号２５をもつｓｃＦｖである、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４１】
第１の超可変領域が配列番号２０と同一のＣＤＲ３領域である配列番号２０３をもつｓｃＦｖである、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４２】
ｓｃＦｖ分子が２０以下のアミノ酸残基の直鎖又は分岐鎖スペーサを含む、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４３】
スペーサが配列番号１２３又は配列番号１２４である、請求項１４２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４４】
標的細胞が活性化、励起、修飾、変更、妨害を受けた、異常な又は病的な細胞である請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４５】
病的細胞が癌細胞である請求項１４４に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４６】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項１４４に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４７】
細胞が白血病又は骨髄腫細胞である請求項１４６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４８】
白血病又は骨髄腫細胞がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項１４６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４９】
白血病細胞が急性骨髄性白血病である、請求項１４７に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５０】
配列番号３０−１１３から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつか又はそれと少なくとも９０％のアミノ酸類似性をもつ連続的アミノ酸のカセットをさらに含んで成り、該カセット又はフラグメントが、配列番号８〜２０から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域が中に構築、挿入、付着、結合、組合せ又は融合される１つの枠組を提供する、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５１】
カセットが配列番号：３０−３２、３３、３７−３９、４１、４３、４５、４６、４８、５１、５４、５７、５９−６８、７０、７１、７６−８５、８７、８９−９２、９４、９７、９９、１０３、１０６、１１２及び１１３から選択されるか又はそれらと少なくとも９０％のアミノ酸類似性をもつアミノ酸配列を有する請求項１５０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５２】
カセットが配列番号６１のアミノ酸配列を有するかそれと少なくとも９０％のアミノ酸類似性をもつ請求項１５０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５３】
カセットが配列番号６１のアミノ酸配列を有するか又はそれと少なくとも９０％のアミノ酸類似性を有する、請求項１５２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５４】
配列６１の７つのカルボキシ末端アミノ酸残基が配列番号１２２の７つのアミノ酸残基により置換されている、請求項１５２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５５】
第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域である、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５６】
ＣＤＲ３領域が配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５７】
ＣＤＲ３領域が配列番号２０のアミノ酸配列を有する、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５８】
ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号１１５及び配列番号１１４のアミノ酸配列を有する、請求項１５５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５９】
第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域であり、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号８、１１５及び１１４のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６０】
第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域であり、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号２０、１１５及び１１４のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６１】
ＣＤＲ３領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１６のアミノ酸配列を有する、請求項１３９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６２】
第２の超可変領域がＣＤＲ２超可変領域であり、ＣＤＲ２領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１８のアミノ酸配列を有する、請求項１３９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６３】
第３の超可変領域がＣＤＲ１超可変領域であり、ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ１領域をフランキングする下流側領域が配列番号１２０のアミノ酸配列を有する、請求項１３９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６４】
配列番号３０−１１３又はそれらのフラグメントから成るグループの中から選択された連続したアミノ酸のカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号１１５及び１１４で置換されている、請求項１５５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６５】
配列番号３０−３２、３５、３７−３９、４１、４３、４５、４６、４８、５１、５４、５７、５９−６８、７０、７１、７６−８５、８７、８９−９２、９４、９７、９９、１０３、１０６、１１２及び１１３又はそれらのフラグメントから成るグループの中から選択された連続するアミノ酸のカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号１１５及び１１４によって置換されている、請求項１５５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６６】
（ａ）第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域であり、
（ｂ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号８であり、
（ｃ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１１５であり、
（ｄ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１１４であり、
（ｅ）ＣＤＲ３領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を有し、
（ｆ）ＣＤＲ３領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１６のアミノ酸配列を有し、
（ｇ）ＣＤＲ２領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１９のアミノ酸配列を有し、
（ｈ）ＣＤＲ２領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１８のアミノ酸配列を有し、
（ｉ）ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２１のアミノ酸配列を有し、
（ｊ）ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２０のアミノ酸配列を有する、
請求項１３９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６７】
（ａ）第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域であり、
（ｂ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２０であり、
（ｃ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１１５であり、
（ｄ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１１４であり、
（ｅ）ＣＤＲ３領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を有し、
（ｆ）ＣＤＲ３領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１６のアミノ酸配列を有し、
（ｇ）ＣＤＲ２領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１９のアミノ酸配列を有し、
（ｈ）ＣＤＲ２領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１８のアミノ酸配列を有し、
（ｉ）ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２１のアミノ酸配列を有し、
（ｊ）ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２０のアミノ酸配列を有する、
請求項１３９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６８】
Ｆｖがファージ表示ライブラリから得ることのできるｓｃＦｖである
、請求項１３８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１６９】
ファージ表示ライブラリが、免疫化されていないヒトの末梢血リンパ球から構築されており、ｓｃＦｖペプチドが、標的細胞の表面上の以前に特徴づけされていない未精製抗原に対して選択されている、請求項１６５に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７０】
バイオパンニングが、標的に対しファージを結合させる段階、未結合ファージを除去する段階、結合したファージを溶出する段階及び溶出したファージを伝播及び増幅する段階を含んで成る、請求項１６５に記載のペプチド又はポリペプチドを選択又は同定するための方法。
【請求項１７１】
標的細胞上又はその中の実質的に露呈されかつ／又は過剰発現された結合部位に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、標的細胞に対する結合が、その上又は中で結合部位が実質的に利用可能でないかつ／又は発現されていないその他の細胞に有利なように発生し、結合選択性又は特異性が、主として第１の超可変領域によって決定され、第１の超可変領域が、配列番号８又は２０から成るＣＤＲ３領域であり、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｆｖが任意には単数又は複数のタグを有するペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７２】
結合選択性又は特異性が二次的に、第２の超可変領域、第３の超可変領域及び／又は第１、第２及び第３の超可変領域をフランキングする単数又は複数の上流側領域又は下流側領域によって影響され、第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域である、請求項１７１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７３】
その他の細胞に有利なように標的細胞に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、Ｆｖ分子が、第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第１の鎖及び第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第２の鎖を含んで成り、第１鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号８又は２０の配列を含み、第２鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択された１つの配列を有し、第１、第２及び第３の超可変領域は、それぞれＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域であり、ＦｖはｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｆｖが任意には単数又は複数のタグを有する、ペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７４】
（ａ）  第１鎖の第１の超可変領域及び第２鎖の第１の超可変領域が同一であり、配列番号８又は２０から成るグループの中から選択されているか；又は
（ｂ）  第１鎖の第１の超可変領域が配列番号８又は２０から成るグループの中から選択されており、かつ第２鎖の第１の超可変領域が配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択されているか；又は、
（ｄ）  第１鎖の第１の超可変領域が、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択され、第２鎖の第１の超可変領域が配列番号８又は２０から成るグループの中から選択されている、
請求項１７３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７５】
第１鎖の第２及び第３の超可変領域がそれぞれ配列番号１１４及び１１５である、請求項１７３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７６】
（ａ）第１及び第２の状態をもつ第１の細胞上で未知のリガンドに結合し、該結合が第２の状態で有効であるものの第１の状態では実質的に有効でなく、かつ
（ｂ）免疫交差反応性により、第２の細胞上のリガンドに対し特異的又は選択的に結合し、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｆｖが任意には単数又は複数のタグを有しており、かつ第１の超可変領域が配列番号８又は２０から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を持つＣＤＲ３領域である、
Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７７】
第１の細胞が正常な細胞である、請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７８】
第１の状態が活性化されていない状態であり、第２の状態が活性化、励起、修飾、変更又は妨害を受けた状態である、請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１７９】
第２の細胞が病的細胞である、請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１８０】
病的細胞が癌細胞である、請求項１７９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１８１】
病的細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項１７９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１８２】
病的細胞が、白血病細胞である、請求項１８１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１８３】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項１８２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１８４】
第２の細胞のリガンドに対するペプチド又はポリペプチドの選択的及び／又は特異的結合が第１の超可変領域により主として決定される、請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１８５】
結合選択性又は特異性が二次的に、第２の超可変領域、第３の超可変領域及び／又は第１、第２及び第３の超可変領域をフランキングする、上流側領域又は下流側領域のうちの単数又は複数のものによってそれぞれ影響される請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１８６】
第２の細胞により発現され請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチドによって結合される能力をもつリガンド。
【請求項１８７】
請求項１８６に記載のリガンドを認識し結合する分子。
【請求項１８８】
請求項１３８、１７１、１７３又は１７６のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１８９】
核酸がＤＮＡである、請求項１８８に記載の核酸分子。
【請求項１９０】
第１の細胞の第１及び第２の状態が同じであり、第１の細胞が１つの細胞系統から誘導されている、請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１９１】
細胞系統が、ジャーカット、Molt-４、ＨＳ−６０２、Ｕ９３７、ＴＦ−１、ＴＨＰ−１、ＫＧ−１及びＨＵＴ−７８から成るグループの中から選択されている、請求項１９０に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１９２】
医薬品の製造における、任意には薬学的作用物質と会合された、又はそれに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された状態にある、請求項１３８又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項１９３】
医薬品が、病的細胞に対抗する活性をもつ、請求項１９２に記載の使用。
【請求項１９４】
病的細胞が癌細胞である、請求項１９３に記載の使用。
【請求項１９５】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項１９３に記載の使用。
【請求項１９６】
細胞が白血病細胞である、請求項１９５に記載の使用。
【請求項１９７】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項１９６に記載の使用。
【請求項１９８】
医薬品として使用するための、任意には薬学的作用物質と会合された、又はそれに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された状態にある、請求項１３８又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１９９】
医薬品が、病的細胞に対抗する活性をもつ、請求項１９８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２００】
病的細胞が癌細胞である、請求項１９９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２０１】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項１９９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２０２】
細胞が白血病細胞である、請求項２０１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２０３】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である、請求項２０２に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２０４】
病的又は癌細胞の成長を阻害する上で使用するための組成物を調製する目的での、請求項１３８又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項２０５】
細胞が白血病細胞である、請求項２０４に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項２０６】
白血病細胞が、急性骨髄性白血病細胞である、請求項２０５に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項２０７】
癌細胞の成長を阻害する上で使用するための組成物を調製することを目的とし、該組成物が癌細胞について選択的かつ／又は特異的な薬学的リガンドをもつ少なくとも１つの化合物を含んで成る、請求項１３８又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項２０８】
薬学的に有効な量の薬学的作用物質、任意には薬学的に有効な担体と会合された又はそれに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合させられた状態にある、請求項１３８又は請求項１７６に記載の少なくとも１つのペプチドを含んで成る組成物。
【請求項２０９】
ペプチド又はポリペプチド及び薬学的作用物質がリンカー化合物を介してリンクされている、請求項２０８に記載の組成物。
【請求項２１０】
リンカー化合物が、ジカルボン酸、マレイミドヒドラジド、ＰＤＰＨ、カルボン酸ヒドラジド及び小型ペプチドから成るグループの中から選択されている、請求項２０９に記載の組成物。
【請求項２１１】
小型ペプチドが、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７、Ｖ５及びＶＳＶ−Ｇから成るグループの中から選択されている、請求項２１０に記載の組成物。
【請求項２１２】
タグが、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７、Ｖ５及びＶＳＶ−Ｇから成るグループの中から選択されている、請求項１３８、１７１、１７３及び１７６のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２１３】
薬学的作用物質が、放射性同位元素、毒素、オリゴヌクレオチド、組換え型タンパク質、抗体フラグメント、及び抗癌剤から成るグループの中から選択されている、請求項２０８に記載の組成物。
【請求項２１４】
放射性同位元素が、インジウム、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルリウム、122mテルリウム、125mテルリウム、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123イオジン、126イオジン、131イオジン、133イオジン、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77ブロミン、18フルオリン、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムから成るグループの中から選択されている、請求項２１３に記載の組成物。
【請求項２１５】
毒素が、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、リシン及びそれらの修飾及び誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項２１３に記載の組成物。
【請求項２１６】
抗癌剤が、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ｃｉｓ−プラチナ、トキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体から成るグループの中から選択されている、請求項２１３に記載の組成物。
【請求項２１７】
一定量の請求項１３８又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチドと細胞を接触させる段階を含んで成る、細胞の成長を阻害する方法。
【請求項２１８】
細胞が、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択されている、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
細胞が白血病細胞である、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
白血病細胞が急性骨髄性白血病細胞である請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
腫瘍の診断的位置特定及び画像化において使用するための、画像化剤に対し付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された請求項１３８又は請求項１７６に記載の少なくとも１つのペプチドを含んで成る薬学組成物。
【請求項２２２】
疾病を治療するのに有効な量の請求項１３８又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチドを患者に投与する段階を含んで成る、疾病を患う患者の治療方法。
【請求項２２３】
疾病が癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫から成るグループの中から選択されている、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
疾病が白血病である、請求項２２３に記載の方法。
【請求項２２５】
白血病が、急性骨髄性白血病である、請求項２２４に記載の方法。
【請求項２２６】
Ｆｖが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞に特異的又は選択的に結合する、請求項１３８又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２２７】
請求項２２６に記載のペプチド又はポリペプチドにより結合されたＡＭＬ細胞上に提示されたリガンド。
【請求項２２８】
請求項２２７に記載のリガンドに結合するペプチド又はポリペプチド。
【請求項２２９】
標示マーカーに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された請求項１３８又は請求項１７６のペプチド又はポリペプチドを含んで成る、治療前、治療中又は治療後の治療の効力のin vitro分析のための診断用キット。
【請求項２３０】
標示マーカー分子が螢光マーカーである請求項２２９に記載のキット。
【請求項２３１】
螢光マーカーが、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、及びそれらの修飾及び接合体から成るグループの中から選択されている、請求項２３０に記載のキット。
【請求項２３２】
疾病又は癌の診断のために使用される、請求項２２９に記載のキット。
【請求項２３３】
構成体がＩｇポリペプチドである、請求項１３９又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２３４】
Ｉｇポリペプチドが組換え型ポリペプチドとして発現され、真核細胞系内で産生される、請求項２３３に記載のペプチド又はポリペプチドを産生するための方法。
【請求項２３５】
真核系が哺乳動物細胞系である、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
ＩｇポリペプチドがＩｇＧ ポリペプチドである、請求項２３３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２３７】
ＩｇＧ ポリペプチドがそれぞれ配列番号８、１１５及び１１４をもつＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域を含んで成る、請求項２３６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２３８】
ＩｇＧ ポリペプチドがそれぞれ配列番号２０、１１５及び１１４をもつＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域を含んで成る、請求項２３６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２３９】
ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域が重鎖領域である、請求項２３７に記載のＩｇＧ ポリペプチド。
【請求項２４０】
ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域が重鎖領域である、請求項２３８に記載のＩｇＧ ポリペプチド。
【請求項２４１】
ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域が軽鎖領域である請求項２３７に記載のＩｇＧ ポリペプチド。
【請求項２４２】
ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域が軽鎖領域である請求項２３８に記載のＩｇＧ ポリペプチド。
【請求項２４３】
ＩｇＧが配列番号２６を含む重鎖及び配列番号２７を含む軽鎖又はそれと少なくとも９０％のアミノ酸類似性をもつ鎖を有する、請求項２３３に記載のＩｇＧ ポリペプチド。
【請求項２４４】
ペプチド又はポリペプチドが原核細胞系内又は真核細胞系内で産生される、請求項１３９又は請求項１７６のペプチド又はポリペプチドの産生方法。
【請求項２４５】
原核系が発現ベクターを含むE. coliを含んで成り、真核系が哺乳動物細胞系である、請求項２４４に記載の方法。
【請求項２４６】
原核系の発現ベクターが、osm Ｂ、deo、β−lac−Ｕ５、λＰL及びＣＭＶから成るグループの中から選択されたプロモータを含んで成る、請求項２４５に記載の方法。
【請求項２４７】
ＣＤＲ３がＲ1−ＸＰhe Ｐro−Ｒ2のアミノ酸配列を含み、ここでＲ1及びＲ2が各々０〜１５個のアミノ酸残基を含み、ＸがＡrg、Ｇly、又はＬysのいずれかである、請求項１３８又は１７６のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２４８】
前記ペプチド又はポリペプチドが、天然に発生しない少なくとも１つの修飾を内含する、請求項１３８又は請求項１７６に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２４９】
前記天然に発生しない修飾がペプチド又はポリペプチドをより免疫原性又はより安定なものにする、請求項２４８に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２５０】
前記少なくとも１つの修飾が、ペプチド修飾、セミペプトイド修飾、環状ペプチド修飾、Ｎ−末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、バックボーン修飾、及び残基修飾から成るグループの中から選択されている、請求項２４９に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２５１】
異常細胞を除去するための自己由来の骨髄のex vivoパージングのための請求項１３８、１７１、１７３、１７６又は１９８のいずれか１項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２５２】
Ａ−Ｘ−Ｂ
という構造式又は構造をもつペプチド又はポリペプチドであって、式中Ｘが配列番号３又は２０を含む超可変ＣＤＲ３領域であり；  Ａ及びＢが各々長さ１〜１０００アミノ酸のアミノ酸鎖であり得、ここでＡがアミノ末端、Ｂがカルボキシ末端である、ペプチド又はポリペプチド。
【請求項２５３】
Ａが１５０〜２５０個のアミノ酸残基であり、Ｂが３５０〜５００個のアミノ酸残基である、請求項２５２に記載のペプチド。
【請求項２５４】
より大きい又は完全な抗体又は多量体の一部分である、請求項２５３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項２５５】
うち１つが請求項２５２に記載のペプチド又はポリペプチドである２つのペプチド又はポリペプチドを含んで成る二量体分子。
【請求項２５６】
同一である請求項２５２に記載の２つのペプチド又はポリペプチドを含んで成る二量体分子。
【請求項２５７】
請求項２５２に記載のペプチド又はポリペプチド又は請求項２５４に記載の二量体分子をコードする核酸分子。
【請求項２５８】
哺乳動物細胞系がＳＲα５プロモータを含んで成る、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２５９】
哺乳動物細胞系がＣＭＶプロモータを含んで成る、請求項２３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
［１.］  本発明は、標的細胞に特異的に結合するペプチド及びポリペプチドのファージ表示技術を用いた組織のターゲティング及び同定の分野に関する。かかるペプチド及びポリペプチドは、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント、又はフラグメントの構成体にある。より特定的には、ペプチド及びポリペプチドは、抗癌活性をもち得、かつ／又は特に血液に関連する癌に対する抗癌剤と会合されるか又はこれに接合される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
［２.］  治療用作用物質の組織選択的ターゲティングは、薬品業界において出現しつつある分野である。ターゲティングに基づく新しい癌治療は、毒性を低減させひいては全体的効力を増強させながら、治療の特異性及び潜在能を増大させるように設計されてきた。毒素、放射性ヌクレオチド及び化学療法接合体を腫瘍にターゲティングする試みにおいて、腫瘍関連抗原に対しマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ’s）が利用されてきた。さらに、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ２５といったような分化抗原が、造血悪性腫瘍を治療するにあたっての癌特異性標的として開発利用されてきた。広範に研究されてきたものの、このアプローチにはいくつかの制限条件がある。１つの制限条件は、選択的結合を表示する適切なモノクローナル抗体を単離することのむずかしさにある。第２の制限条件は、抗体単離に成功するための先行条件としての高い抗体免疫原性の必要性にある。第３の制限条件は、往々にしてより短かい血清半減期を結果としてもたらし反復的治療を防止しかくして抗体の治療上の価値を低減させることになる、マウス抗体に対する免疫応答（ヒト抗マウス抗体−ＨＡＭＡ応答）の患者体内での惹起にある。この最後の制限条件は、マウス由来のキメラ又はヒト化モノクローナル抗体を工学処理することと同時にヒト抗体を発見することについての関心を刺激した。
【０００３】
［３.］  癌を治療するためのモノクローナル抗体（Mabs）の治療的効力に影響を及ぼす要因は、数多く存在する。これらの要因としては、腫瘍細胞上の抗原の発現の特異性、発現レベル、抗原異質性及び腫瘍塊へのアクセス可能性が含まれる。白血病及びリンパ腫は一般に、癌腫といったような中実腫瘍に比べて抗体での治療に対しより高い応答性をもつ。ＭＡbsは、血流中の白血病及びリンパ腫細胞に急速に結合し、リンパ組織内の悪性細胞に容易に浸透し、かくしてリンパ球形腫瘍をＭＡｂベースの療法に対する優れた候補にしている。理想的な系は、悪性後代細胞を産生する基幹細胞の細胞表面上のマーカーを認識するＭＡｂを同定することを必要とすることになる。
【０００４】
［４.］  Ｍabsの発現／産生の一助となるように、抗体、ホルモン及びレセプタといったような単離された予め定められた標的タンパク質に結合するランダム１本鎖Ｆvs（ｓｃＦｖｓ）を選択するためにファージライブラリが使用されてきた。さらに、抗体表示ライブラリー全般そして特にファージｓｃＦｖライブラリの使用は、特異的でありながら未認識で未決定の細胞表面部分をターゲティングするための唯一の分子を発見する代替的手段を容易にする。
【０００５】
［５.］  白血病、リンパ腫及び骨髄腫は、骨髄及びリンパ組織由来の癌であり、細胞の無制御な成長に関与している。急性リンパ芽球性白血病（「ＡＬＬ」）は、特異的な臨床及び免疫学的特性によって定義される異種起源の疾病である。その他の形態のＡＬＬと同様、Ｂ細胞ＡＬＬ（「Ｂ−ＡＬＬ」）の大部分の症例の決定的な原因はわかっていないが、多くのケースにおいて、この疾病は、単細胞を異常にし連続的に増殖させるこの細胞中のＤＮＡ中の後天的遺伝的改変の結果である。
【０００６】
［６.］  ＡＭＬは、通常の条件下で骨髄性系列の末端分化した細胞（赤血球、顆粒球、単球及び血小板）を発生させる始原細胞を伴う新生物の異種起原のグループである。その他の形態の新形成の場合と同様、ＡＭＬは、単数又は複数のタイプの早期骨髄様分化を示す。比較的未分化の芽細胞での正常に分化した骨髄様細胞の置換を結果としてもたらす後天的遺伝的改変と結びつけられる。ＡＭＬは一般に、骨髄中で進行し、それより低い程度であるが、二次的造血器官の中で進行する。ＡＭＬは、主として成人が罹患し、１５〜４０才で出現率がピークに達するが、小児と同時により高齢の成人も罹患することもわかっている。ＡＭＬ患者のほぼ全てが、未分化芽細胞の異常な循環レベルの証拠が全く無い臨床的緩解に達するために、診断の直後の治療を必要とする。
【０００７】
［７.］  これまでに、腫瘍細胞に対し細胞溶解活性を誘発するさまざまなモノクローナル抗体が開発されてきた。Ｐ１８５の細胞外ドメイン（成長因子レセプタ（ＨＥＲ２））に向けられたモノクローナル抗体ＭｕＭＡｂ４Ｄ５のヒト化されたバージョンがＦＤＡにより承認されており、これがヒト乳癌の治療に使用されつつある（米国特許第５，８２１，３３７号及び５，７２０，９５４号）。結合の後、抗体は、ＨＥＲ２成長因子レセプタに依存する腫瘍細胞成長を阻害する能力をもつ。さらに、リンパ腫に関連するものを含めた末梢Ｂ細胞の急速な枯渇をひき起こすＣＤ２０に対するキメラ抗体が最近になってＦＤＡにより承認された（米国特許第５，８４３，４３９号）。この抗体の標的細胞に対する結合は、補体依存性溶解を結果としてもたらす。この産物は、最近になって承認され、現在低グレードのＢ細胞の非ホジキンリンパ腫を治療するために使用されている。
【０００８】
［８.］  いくつかのその他のヒト化及びキメラ抗体が開発中であるか又は臨床試験中である。さらに、正常な骨髄様細胞ならびに大部分のタイプの骨髄性白血病細胞の両方の上で発現されたＣＤ３３抗原と特異的に反応するヒト化Ｉｇが、抗癌薬カリケマイシン、ＣＭＡ−６７６（Sievers et al., Blood, ９０（１０Suppl.１ Part１）、５０４Ａ（１９９７））に接合された。薬物Mylotargとして知られているこの接合体は、最近承認された（Caron et al., Cancer Supplement, ７３、１０４９−１０５６（１９９４））。その細胞溶解活性を考慮して、現在臨床試験中の付加的な抗−ＣＤ３３抗体（ＨｕＭ１９５）が、ゲロニン毒素（McGraw et al., Cancer Immunol, Immunother, ３９、３６７−３７４（１９９４））及び放射性同位元素131Ｉ（Caron et al., Blood８３、１７６０−１７６８（１９９４））、90Ｙ（Jurci et al., Blood, ９２、（１０ Suppl, Part１〜２）、６１３Ａ（１９９８））及び213Ｂｉ（Sgouras et al., J. Nucl, Med., ３８（５Suppl.）２３１Ｐ（１９９７）を含めた複数の細胞毒性作用物質に接合された。
【０００９】
［９.］  白血病抗原ＣＤ−４５（ｃＨｕＬｙｍ３）に対するキメラ抗体は、骨髄移植用条件づけとしてのヒト白血病及びリンパ腫の治療のための臨床前段階にある（Sun et al, Cancer［immunol.immunother.,］４８、５９５−６０２（２００２））。in vitro検定では、特異的細胞分解がＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞毒性）検定において観察された。（Henkart, Immunity, １、３４３・３４６（１９９４）；Squier及びCohen, Current Opin. Immunol., ６、４４７−４５２（１９９４））。
【００１０】
［１０.］  これらの予備的な結果は見込みあるものに思われるが、これらには以下のような制限条件がある。最終的産物は、非ヒト配列を含み、ＨＡＭＡといったような非ヒト材料に対する厄介な免疫応答を結果としてもたらす。このＨＡＭＡ応答は、反復的治療を妨げ、産物についてより短かい血清半減期を結果としてもたらす。さらに、上述の方法は、単一の抗体種の単離しか可能にせず、又、既知の精製済みの抗原に対する抗体の単離しか可能にしない。その上、これらの方法は、正常な細胞ならびに悪性細胞上に存在する細胞表面マーカーに対する抗体の単離を可能にするかぎりにおいて、選択的ではない。
【００１１】
［１１.］  従って、上述の制限条件を克服する方法が望まれる。さらにかかる方法は、理想的には、例えば癌細胞の転移を媒介することに関与する単数又は複数の癌細胞上の標的リガンド又はマーカーの同定を可能にする。さらに、かかる方法は同様に、かかる標的に対する抗体の産生をも可能にすることになる。ファージ・ディスプレイ技術が、かかる能力を提供すると思われる。
【００１２】
［１２.］  ファージ・ディスプレイ技術の使用は、完全にヒトの配列を含むｓｃＦｖｓの単離を可能にしてきた。例えば、最近になって、ファージ・ディスプレイ技術から誘導されたｓｃＦｖクローンに基づくヒトＴＧＦｂ２レセプタに対する完全にヒトの抗体が開発された。ＴＧＦｂ２の結合と競合する能力をもつ完全にヒトのＩｇＧ４へと変換されたこのｓｃＦｖ（Thompson et al., J. Immunol Methods, ２２７、１７−２９（１９９９））は、強い抗増殖活性をもつ。当業者にとって既知のこの技術は、以下の刊行物の中でより特定的に記述されている：Smith, Science, ２２８、１３１５（１９８５）；Scott et al, Science, ２４９、３８６-３９０（１９９０）；Cwirla et al, PNAS, ８７、６３７８-６３８２（１９９０）；Devlin et al, Science, ２４９、４０４-４０６（１９９０）；Griffiths et al., EMBO J.,１３（１４）、３２４５-３２６０（１９９４）；Bass et al., Proteins, ８、３０９−３１４（１９９０）；McCafferty et al., Nature, ３４８、５５２-５５４（１９９０）；Nissim et al., EMBO J., １３、６９２-６９８（１９９４）；米国特許第５，４２７，９０８、５，４３２，０１８、５，２２３，４０９及び５，４０３，４８４号、ｌｉｂ．
【００１３】
［１３.］  このファージ・ディスプレイ表示技術を用いて、本発明の発明人らは、病的又は悪性状態にある細胞上に存在する細胞マーカーを同定した。従って、本発明の目標は、特に病的な又は悪性の状態にある細胞上又は内で実質的に露呈された又は過剰発現された細胞マーカーを認識するペプチド及びポリペプチドを同定することにある。
【００１４】
［１４.］  本発明のさらなる目標は、かかるペプチド及びポリペプチドを同定する一助として、ファージ表示技術を使用し拡大することにある。
【００１５】
［１５.］  本発明のさらなる目標はかかるペプチド及びポリペプチドを免疫交差反応性により同定することにある。
【００１６】
［１６.］  本発明のさらにもう１つの目標は、かかるペプチド及びポリペプチドが完全にヒト由来であることにある。
【００１７】
［１７.］  本発明のさらにもう１つの目標は、かかるペプチド及びポリペプチドが、必ずしも免疫原性でない可能性のある抗原に対して単離されることにある。
【００１８】
［１８.］  本発明のさらにもう１つの目標は、白血病又はリンパ腫を内含する特に血液関連癌といった癌を予防、遅延又は治療するペプチド又はポリペプチドを提供することにある。
【００１９】
［１９.］  本発明のさらにもう１つの目標は、抗癌剤及び／又は診断ラベル又はマーカーと会合させられた又はカップリングされた、又は単独のこのようなペプチド及びポリペプチドを用いて、癌性細胞を局所的にターゲティングできるようにすることにある。
【００２０】
［２０.］  本発明のさらにもう１つの目標は、所望のリガンドに対するターゲティングの作用物質を産生するための方法を提供することにある。
【００２１】
［２１.］  本発明のさらにもう１つの目標は、悪性状態で過剰に発現され抗癌剤のためのターゲティング又は診断用標識又はマーカーの構築において使用可能である細胞マーカーの認識を提供する特異的モチーフを同定することにある。
【００２２】
［２２.］  本発明のさらにもう１つの目標は、抗癌剤又は診断用標識又はマーカーと会合させられた又はこれらにカップリングされたかかるペプチド、ポリペプチド又はモチーフを有効量含む組成物を提供することにある。
【００２３】
［２３.］  ｓｃＦｖが組織内に浸透し、サイズが比較的小さいためにフルサイズの抗体に比べてさらに急速に血液から一掃されるということが立証されてきた。Adams, G.P., et al., Br. J. Cancer７７，１４０５-１４１２（１９８８）；Hudson, P.J., Curr. Opin. Immunol. １１（５），５４８-５５７（１９９９）；Wu, A.M., et al. Tumor Targeting,４，４７（１９９９）．かくして、ｓｃＦｖは往々にして、体から放射性標識をより迅速に一掃できるようにするべく腫瘍画像化といったような放射性標識が関与する診断において利用される。最近になって数多くの癌をターゲティングするscＦc多量体が、in vivoでの安定性及び効力について予備臨床評価を受けた。Adams, G. P., et al., Br. J. Cancer ７７，１４０５-１４１２（１９８８）；Wu, A. M., et al., Tumor Targeting ４，４７（１９９９）。
【００２４】
［２４.］  １本鎖Ｆv（ｓｃＦｖ）フラグメントは、ポリペプチドリンカーにより係留された抗体の重鎖（ＶH）及び軽鎖（ＶL）の可変的ドメインで構成されている。リンカーは、親抗体の類似の又は増大した親和性でｓｃＦｖがその標的を認識し結合できるようにする機能的Ｆvドメインへと（ＶH）及び（ＶL）ドメインが折畳むことができるよう充分な長さをもつ。一般的に用いられるリンカーは、柔軟性及びプロテアーゼ耐性を提供するべくグリシン及びセリン残基を含んでいる。
【００２５】
［２５.］  標準的には、ｓｃＦｖ単量体は、そのＶHドメインのＣ末端がＶLのＮ末端残基にポリペプチドリンカーにより係留されている状態で設計されている。任意には、逆の配向が用いられる：すなわち、ＶLドメインのＣ末端は、ポリペプチドリンカーを通してＶHのＮ末端残基に係留されている。Power, B, et al., J. Immun. Meth. ２４２，１９３-２０４（２０００）。ポリペプチドリンカーは、標準的に、長さがアミノ酸１２個前後である。リンカーがアミノ酸約３〜１２個にまで低減された時点で、ｓｃＦｖｓは機能的Ｆvドメイン内に折畳むことができず、代りに第２のｓｃＦｖｓと会合してdiabodyを形成する。さらに、リンカーの長さをアミノ酸３個未満まで低減させると、リンカーの長さ、組成及びＦvドメインの配向に応じて、三量体又は四量体へのｓｃＦｖ会合が強制される。B.E. Powers, P. J. Hudson, J. Immun. Meth. ２４２（２０００）１９３−１９４。
【００２６】
［２６.］  最近になって、ｓｃＦｖ 二量体、三量体及び四量体といったような多価の抗体フラグメントが往々にして、標的に対する親抗体の結合に比べて高い見かけの親和性を提供する、ということが発見されてきた。このさらに高い親和性は、腫瘍ターゲティングの利用分野のための理想的な薬物動態を含めた数多くの利点を提供する。
【００２７】
［２７.］  従って、診断及び治療の処方計画においては、これらの多価の形態のより大きな結合親和性が望ましい。例えば、標的レセプタを結合しかくして「天然」のリガンドの結合を遮断するための遮断剤として、ｓｃＦｖを利用することができる。このようなケースでは、標的に対する天然リガンドの望ましくない結合を可能にし得る解離の確率を低下させるため、ｓｃＦｖ及びレセプタの間に高親和性会合を得ることが望ましい。さらに、この高い親和性は、標的レセプタが癒着性及びローリングに関与する場合、又は、標的レセプタが、血小板といったような高純度流の部域内に存在する細胞上にある場合に特にきわめて重要である。
【００２８】
［２８.］  従って、本発明の目的は、Ｙ１及びＹ１７ｓｃＦｖの多価形態にある。これらの多価形態には、時として本書でそれぞれdiabodies, triabodies及びtetrabodiesと呼んでいる二量体、三量体及び四量体が内含されるが、これらに制限されるわけではない。
【発明の開示】
【００２９】
発明の要約
［２９.］  本発明は、特に血液関連癌細胞に対抗する標的細胞に対し選択的にかつ／又は特異的に結合するペプチド及びポリペプチドの同定、それらの構築、それらの単独での、又は単数又は複数の薬学的作用物質と会合した形又はそれらに組合された、接合された又は融合した形での使用を提供する。
【００３０】
［３０.］  本発明の１つの実施形態は、その他の細胞に有利な形で標的細胞に選択的に及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｅ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント、又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、結合選択性又は特異性が主として第１の超可変領域により決定され、Ｆｖが1本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）又はジスルフィドＦｖ（「ｄｓＦｖ」）であり、任意には単数又は複数のタグを有する、ペプチド又はポリペプチドを提供している。
【００３１】
［３１.］  本発明のもう１つの実施形態においては、その上又は中で結合部位が実質的に利用可能でないかつ／又は発現されていないその他の細胞に有利な形の１つの細胞を含む標的の上又はその中の実質的に露呈されかつ／又は過剰発現された結合部位に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、結合選択性又は特異性が、主として第１の超可変領域によって決定され、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有するペプチド又はポリペプチドが提供されている。
【００３２】
［３２.］  本発明のさらなる実施形態においては、その他の細胞に有利なように標的細胞に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、Ｆｖ分子が、第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第１の鎖及び第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第２の鎖を含んで成り、第１鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択された１つの配列をもち、第２鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択された１つの配列を有し、第１、第２及び第３の超可変領域は、それぞれＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域であり、ＦｖはｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有する、ペプチド又はポリペプチドが提供されている。
【００３３】
［３３.］  本発明のさらなる実施形態においては、
（ａ）第１鎖及び第２鎖は、各々、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択された第１の超可変領域を含んで成るか；又は
（ｂ）第１鎖及び第２鎖の第１の超可変領域は、同一であり、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されているか又は、
（ｃ）第１鎖の第１の超可変領域は、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されており、かつ第２鎖の第１の超可変領域が配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択されているか又は、
（ｄ）第１鎖の第１の超可変領域は、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択され、第２鎖の第１の超可変領域が配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されている。
【００３４】
［３４.］  本発明のさらなる実施形態においては、第１及び第２の状態をもつ第１の細胞上で未知のリガンドに結合し、該結合が第２の状態で有効であるものの第１の状態では実質的に有効でなく、かつ免疫交差反応性により、第２の細胞上のリガンドに対し特異的又は選択的に結合し、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有している、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドが提供されている。
【００３５】
［３５.］  本発明のさらなる実施形態においては、第１及び第２の細胞上の未知の免疫交差反応性結合部位に結合するターゲティング分子を同定するための方法において、
（ａ）認識分子の第１の集団を生成するべく、第１の状態ではなく第２の状態において、１つの未知のリガンドを含む結合部位を実質的に露呈又は表示する第１の標的細胞に対し実施される単数又は複数回のバイオパンニング；
（ｂ）第２の認識分子集団を生成するべく第１の細胞の未知のリガンドに対する免疫交差反応性をもつ１つの未知のリガンドを含む結合部位を表示する第２の細胞に対して実施される、段階（ａ）の認識分子の結果として得られたストックから開始した後続するバイオパンニング及び／又は選択段階；
（ｃ）段階（ｂ）の認識分子の第２の集団の増幅及び精製段階；及び
（ｄ）第２の細胞上の未知のリガンドについて選択的かつ／又は特異的であるターゲティング分子を含んで成るペプチド又はポリペプチドを段階（ｃ）の精製済み認識分子の認識部位から構築する段階、
を含んで成る、ターゲティング分子の同定方法が提供されている。
【００３６】
［３６.］  本発明のさらにもう１つの実施形態においては、Ｒ1−ＸＰhe Ｐro−Ｒ2のアミノ酸配列を含み、ここでＲ1及びＲ2が各々０〜１５個のアミノ酸残基を含み、ＸがＡrg、Ｇly、又はＬysのいずれかである結合モチーフが提供されている。
【００３７】
［３７.］  本発明のさらにもう１つの実施形態においては、
ａ）標的細胞上で直接的にバイオパンニング手順によってか又は第１の状態ではなく第２の状態の第１の標的細胞上で間接的にバイオパンニング手順により又その後第２の標的細胞上で直接的にバイオパンニング手順によって一次認識部位を含む単数又は複数のターゲティング分子を単離し選択して、単数又は複数の前記ターゲティング分子を産生する段階；
ｂ）単数又は複数のターゲティング分子の増幅、精製及び同定段階；及び
ｃ）単数又は複数のターゲティング分子からターゲティング作用物質を構築する段階、
を含んで成り、該ターゲティング作用物質がペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント又はその多量体であり得る、ターゲティング作用物質の産生方法が提供されている。
【００３８】
［３８.］  本発明のもう１つの実施形態においては、Ａ−Ｘ−Ｂという構造式又は構造をもつペプチド又はポリペプチドであって、式中Ｘが３〜３０個のアミノ酸の超可変ＣＤＲ３領域であり；  Ａ及びＢが各々長さ１〜１０００アミノ酸のアミノ酸鎖であり得、ここでＡがアミノ末端、Ｂがカルボキシ末端である、ペプチド又はポリペプチドが提供されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
［５４.］  本書では、特異性という語は、本発明のペプチド又はポリペプチド内の単数又は複数のドメインによる、標的リガンドの認識及びそれに対するその後の結合として定義される。
【００４０】
［５５.］  選択性というのは、本書では、その全ての細胞型又は細胞状態がターゲティング分子に特異的でありうる、細胞型又は細胞状態の混合から１つの細胞型又は細胞状態を選択し結合するターゲティング分子の能力として定義づけされる。
【００４１】
［５６.］  保存的アミノ酸置換というのは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質又はそのフラグメントの１つ又は２個のアミノ酸を変更することによるアミノ酸組成物内の変化として定義づけされる。置換は、置換が主要な形でペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の特徴（例えば電荷、ＩＥＦ、親和性、結合力、立体配座、可溶性）又は活性を実質的に改変しないように一般に類似の特性（例えば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負の帯電、非極性）をもつアミノ酸に関するものである。かかる保存的アミノ酸置換のために実施可能な標準的置換は、以下のようなアミノ酸の基の間でのものでありうる：
（ｉ）  グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）、
（ｉｉ）  アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）
（ｉｉｉ）  アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）
（ｉｖ）  ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）、
（ｖ）  アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）
（ｖｉ）  フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）。
【００４２】
［５７.］  保存的アミノ酸置換は、分子の選択的及び／又は特異的結合特性の主たる原因となる超可変領域ならびに可変重鎖カセットといったような分子のその他の部分の中でならびにそれにフランキングして行なうことができる。付加的に又は代替的には、修飾は、分子を再構築してフルサイズの抗体、diabodies（二量体）、triabodies（三量体）及び／又はtetrabodies（四量体）を形成するか又はminibodies又はmicrobodiesを形成することによって達成可能である。
【００４３】
［５８.］  本書の明細書及びクレーム内で使用されているように、Ｆｖは、同じであっても異なるものであってもよくかつ中で重鎖の可変領域が軽鎖の可変領域に結合、リンク、融合又は共有結合付着されるか又はそれと会合させられている、ヒト抗体の重鎖の可変領域及びヒト抗体の軽鎖の可変領域で構成されている分子として定義づけされる。
【００４４】
［５９.］  Ｆｖ分子のフラグメントは、もとのＦｖの選択的及び／又は特異的結合特性をなお保持しているもとのＦｖより小さいあらゆる分子として定義づけされる。かかるフラグメントの例としては、（１）Ｆｖの重鎖のみのフラグメントを含むminibody, （２）抗体重鎖可変領域の小さい分画単位を含むmicrobody（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＬ９９／００５８１号）、（３）軽鎖のフラグメントを含む類似のbody及び（４）軽鎖可変領域の機能的単位を含む類似のbodyが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００４５】
［６０.］  抗癌剤は、抗癌活性すなわち、癌性又は未熟な前癌細胞の成長又は分化を阻害するあらゆる活性、又は癌性細胞の転移を阻害するあらゆる活性をもつ作用物質である。本発明においては、抗癌剤は、腫瘍組織の血管形成を予防、阻害、遅延又は中断させる抗血管形成活性をもつ作用物質でもあり、又、癌性及び前癌性細胞の癒着を阻害、遅延又は中断させる抗癒着活性をもつ作用物質でもある。
【００４６】
［６１.］  癌細胞の成長の阻害というのは、本書では、（ｉ）癌性又は転移性成長の予防、（ｉｉ）癌性又は転移性成長の減速、（ｉｉｉ）細胞を無傷でかつ生きた状態に残しながらの癌細胞成長プロセス又は転移プロセスの完全な防止又は（ｉｖ）癌細胞の死滅として定義づけされる。より特定的には、癌性成長の阻害は、特に血液関連癌例えばＡＭＬ、多発性黒色腫又は慢性リンパ性白血病に対して応用可能である。
【００４７】
［６２.］  ファージミドは、プラスミドＤＮＡを運ぶファージ粒子として定義づけされる。それはプラスミドＤＮＡを運ぶことからファージミド粒子は、ファージミドゲノムの完全補体を収納するための充分な空間を有していない。ファージゲノムに欠如している構成要素は、ファージ粒子をパッケージングするために不可欠の情報である。従ってファージを伝播させるためには、欠如したパッケージング情報を補完するヘルパーファージ菌株と合わせて所望のファージ粒子を培養することが必要である。
【００４８】
［６３.］  ポリペプチドに適用された本発明で定義されている通りのカセットは、枠組として役立ち、単一の単位としてみなされ、そのように操作される連続したアミノ酸の一定の与えられた配列を意味する。アミノ酸は、片端又は両端で置換、挿入、除去又は付着され得る。同様にして、一続きのアミノ酸を、片端又は両端で置換、挿入、除去又は付着することができる。
【００４９】
［６４.］  本書で使用する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、５つのクラスすなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭのいずれか１つとして定義される。ＩｇＧクラスは、制限的な意味なくＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を内含する複数のサブクラスを包含する。
【００５０】
［６５.］  薬学組成物というのは、本発明のペプチド又はポリペプチド及びその薬学的に受容可能な担体、賦形剤又は希釈剤を含む製剤を意味する。
【００５１】
［６６.］  薬学的作用物質というのは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ又はその他のあらゆる温血動物を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）哺乳動物の予防的治療又は診断において有用である作用物質を意味する。薬学的作用物質は、放射性同位元素、毒素、オリゴヌクレオチド、組換え型タンパク質、抗体フラグメント及び抗癌剤を含むグループの中から選択される。かかる薬学的作用物質の例としては、アシクロビル、ガンシクロビル及びジドブジンを含む抗ウイルス剤；シロスタゾール、ダルテパリンナトリム、レビパリンナトリム及びアスピリンを含む血栓症／再狭窄剤；ザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸１７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダック、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ及びニメスリドを含む抗炎症剤；レフルノマイド、デニリューキン、ジフチトックス、スブリューム、ＷｉｎＲｈｏ  ＳＤＦ、デフィブロチド及びシクロホスファミドを含む抗自己免疫剤；及びリマプロスト、クロルクロメン及びヒアルロン酸を含む癒着防止／抗凝集剤が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００５２】
［６７.］  抗白血病作用物質は、抗白血病活性をもつ作用物質である。例えば、抗−白血病作用物質には、白血病又は未熟前白血病細胞の成長を阻害又は中断する作用物質、白血病又は前白血病（細胞）を死滅させる作用物質、その他の抗白血病作用物質に対する白血病又は前白血病細胞の感受性を増大させる作用物質及び白血病細胞の転移を阻害する作用物質が含まれる。本発明では、抗白血病作用物質は同様に、腫瘍の血管新生を予防、阻害、遅延又は中断させる抗血管形成活性をもつ作用物質でもありうる。
【００５３】
［６８.］  本書で使用される「親和性」という語は、レセプタ（例えば抗体上の１つの結合部位）とリガンド（例えば抗原決定群）の間の結合強度（会合定数）の尺度である。１つの抗体上の単一の抗原−結合部位と単一のエピトープの間の非共有結合的相互作用の合計の強度が、そのエピトープについての抗体の親和性である。低親和性抗体は、抗原と弱く結合し、容易に解離する傾向をもち、一方高親和性抗体は抗原とより密に結合し、結合した状態により長くとどまる。「結合力」という語は、抗原−抗体相互作用の価数を反映することから、親和性とは異なっている。
【００５４】
［６９.］  抗体−抗原相互作用の特異性：抗原−抗体反応は特異的であるものの、一部のケースでは、１つの抗原により惹起された抗体はもう１つの無関係の抗原と交差反応することができる。かかる交差反応は、２つの異なる抗原が、相同な又は類似のエピトープ又はそのアンカー領域を共有している場合又は１つのエピトープに特異的な抗体が、類似の化学的特性を有する無関係のエピトープに結合する場合に起こる。
【００５５】
［７０.］  芽細胞は、休止細胞よりも高い細胞質対核の比によって区別される細胞発達の未熟な段階にある細胞である。
【００５６】
［７１.］  血小板は、骨髄洞の中に落とされその後末梢血流内を循環する巨核球の円板様の細胞質フラグメントである。血小板は、凝固における主要な役割を含めた複数の生理学的機能をもつ。血小板は、中央部分内に顆粒を有し、周囲には明るい原形質を有するが、明確な核は全くない。
【００５７】
［７２.］  「エピトープ」という語は、本書では、抗体、抗体フラグメント、抗体複合体又はその結合フラグメント又はＴ細胞レセプタを含む複合体と相互作用する抗原決定因子又は抗原部位を意味するように使用されている。エピトープという語は、本書ではリガンド、ドメイン及び結合領域という用語と互換的に用いられている。
【００５８】
［７３.］  一つの与えられた細胞は、その表面上で、一定の与えられた抗体のための結合部位（又はエピトープ）をもつタンパク質を発現することができるが、その結合部位は、第１期（第Ｉ期）と呼ぶことのできる状態にある細胞内で隠ぺい形態で存在し得る（例えば、立体障害又は遮断を受けているか又は抗体による結合のために必要とされる特長が欠けている）。第Ｉ期は、例えば正常、健康、非病的状態でありうる。エピトープが隠ぺい形態で存在する場合、それは、一定の与えられた抗体により認識されない。すなわち、このエピトープ又は第Ｉ期にある一定の与えられた細胞に対する抗体の結合は全く存在しない。しかしながら、エピトープは、例えば、下に存在する修飾自体によって、又は、近くの又は会合した分子が修飾されたか又は領域が立体配座の変更を受けたことを理由として遮断されていないことによって、露呈され得る。修飾の例としては、折畳みの変化、翻訳後の修飾の変化、リン脂質化の変化、硫酸化の変化、グリコシル化の変化、などが含まれる。かかる修飾は、細胞が第２期（第ＩＩ期）と呼ぶことのできる異なる状態に入ったとき発生しうる。第２状態（単複）の例としては、活性化、増殖、形質転換、悪性状態、が含まれる。修飾された時点で、エピトープは次に露呈され得、抗体は結合し得る。
【００５９】
［７４.］  本書で使用されている「Ｆａｂ  フラグメント」という語は、免疫グロブリンの１価の抗原結合フラグメントである。Ｆａｂ フラグメントは、軽鎖及び重鎖の一部分で構成される。
【００６０】
［７５.］  ポリクローナル抗体は、免疫応答の産物であり、一定数の異なるＢ−リンパ球によって形成される。モノクローナル抗体は、単細胞から誘導される。
【００６１】
［７６.］  本書で使用する凝着作用というのは、懸濁した細菌、細胞、盤又はその他の類似のサイズの粒子を癒着させ塊を形成させるプロセスを意味する。このプロセスは、沈殿と類似しているが、粒子はより大きく、溶解状態ではなくむしろ懸濁状態にある。
【００６２】
［７７.］  凝集という語は、血栓又は止血栓の形成を導く逐次的メカニズムの一部としてのin vitroで誘発された血小板、及びトロンビン及びコラーゲンの集塊を意味する。
【００６３】
［７８.］  遺伝子の発現パターンは、例えばさまざまな組織内で特定の時間に、さまざまな条件下で産生された遺伝子産物の量を分析することによって研究できる。遺伝子は、遺伝子産物の量が正常な対照例えば非病的対照において見られる量よりも高い場合に、「過剰発現」されているものとみなされる。
【００６４】
［７９.］  プロモータというのは、ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始するＤＮＡ上の領域である。
【００６５】
［８０.］  抗体又は免疫グロブリンは、抗原に結合するタンパク質分子である。これらは、ジスルフィド結合によって合わせてリンクされている４つのポリペプチド鎖（２つの重鎖と２つの軽鎖）の単位で構成されている。各々の鎖は、定常領域及ぶ可変領域をもつ。これらは、その重鎖成分に基づいて、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという５つのクラスに分割することができる。これらは、Ｂリンパ球により産生され、特定の外来性抗原決定因子を認識し、その抗原の一掃を容易にする。
【００６６】
［８１.］  抗体は、抗体複合体を含めた数多くの形態で産生及び使用可能である。本書で用いられる「抗体複合体（単複）」という語は、単数又は複数の抗体ともう１つの抗体又は単数又は複数の抗体フラグメントとの複合体、又は２つ以上の抗体フラグメントの複合体を意味するように使用されている。
【００６７】
［８２.］  Ｆ（ａｂ′）２ フラグメントは、ペプシン消化により得られる免疫グロブリンの２価の抗原結合フラグメントである。それは、両方の軽鎖と両方の重鎖の一部分を含有する。
【００６８】
［８３.］  Ｆｃ フラグメントは、免疫グロブリンの非抗原結合部分である。それは、重鎖のカルボキシ末端部分及びＦｃレセプタのための結合部位を含んでいる。
【００６９】
［８４.］  Ｆｄ フラグメントは、免疫グロブリンの重鎖の可変領域及び第１の定常領域である。
【００７０】
［８５.］  汚染性タンパク質というのは、標本のために特異的に選択されておらず標本中に存在し得るようなタンパク質である。
【００７１】
［８６.］  ペプチドミメティックというのは、抗体といったようなもう１つの実体と同じ機能的効果又は活性をもつ小さい分子、ペプチド、ポリペプチド、脂質、多糖類又は接合体である。
【００７２】
［８７.］  ｆｄのｍ１３といったような繊維状ファージからの複製起点を含むように設計されたプラスミドベクターである。
【００７３】
［８８.］  その表面上の細胞特異的及び／又は疾病特異的リガンドを発現する病的、改変又はその他の形での修飾を受けた細胞が関与する広範な一連の疾病が存在する。これらのリガンドは、各々個別の細胞の認識、選択、診断及び処理を通して特定の疾病の認識、選択、診断及び処理をもたらすために利用することができる。本発明は、全て増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのフラグメント、そのフラグメントの構成体又は構成体のフラグメントを含んで成るペプチド又はポリペプチドを提供する。これらの結合特性によりペプチド又はポリペプチド分子は、その他の細胞に有利な形で標的細胞に選択的及び／又は特異的に結合することができるようになり、結合特異性及び／又は選択性は主として第１の超可変領域により決定されている。ＦｖはｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり得る。
【００７４】
［８９.］  上述のＦｖ分子は、病的細胞をターゲティングするように使用可能である。病的細胞は、例えば、癌細胞でありうる。特異的ターゲティングにより診断及び／又は治療の対象となりうる癌タイプの例としては、制限的な意味なく癌腫、肉腫、白血病、腫腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫が含まれる。白血病、リンパ腫及び骨髄腫は、骨髄及びリンパ組織に由来する癌であり、細胞の無制御成長に関与している。
【００７５】
［９０.］  疾病特に癌を診断し治療するための新しいアプローチが近年開発されてきた。その中には、さまざまなやり方で選択及び産生可能なターゲティング分子を用いた腫瘍ターゲティングアプローチがある。可能性あるターゲティング分子を同定するための１つのアプローチは、ファージ表示である。ファージ表示は、表示されたタンパク質をコードするＤＮＡがファージビリオン内部に常在する状態で、ペプチド、ポリペプチド、抗体又はタンパク質が、ファージ外皮タンパク質に対する融合による繊維状バクテリオファージの表面上のその発現及び表示により生成され選択される技術である。ファージ表示技術によって産生されるｓｃＦｖは、柔軟なアミノ酸ポリペプチドスペーサによりリンクされた抗体重鎖及び軽鎖の各々のＶＤから成る（Nissim et al.,ＥＭＢＯＪ.,１３、６９２−６９８（１９９４））。
【００７６】
［９１.］  ファージ表示ライブラリ（ファージペプチド／抗体ライブラリ、ファージライブラリ又はペプチド／抗体ライブラリとも呼ばれる）には、大きなファージ集団（一般には１０8−１０9）が含まれ、各々のファージ粒子は、異なるペプチド又はポリペプチド配列を表示する。これらのペプチド又はポリペプチドは、可変長をもつように構成されうる。表示されたペプチド又はポリペプチドは、ヒト抗体重鎖又は軽鎖から誘導され得るが、これに制限される必要はない。
【００７７】
［９２.］  本発明においては、ターゲティング分子を獲得し産生するために、ファージ表示技術により産生されたｓｃＦｖ抗体ライブラリが利用された。そのペプチド又はポリペプチドが標的細胞を認識する特定のファージクローンを同定及び単離するために、フローサイトメトリ、特に螢光活性化細胞選別装置（「ＦＡＣＳ」）が使用された。ファージ発現されたｓｃＦｖ抗体フラグメントは、高親和性クローンのin vitroスクリーニング、冨化及び選択の対象となりうる（米国特許第５，８２１，３３７号；米国特許第５，７２０，９５４号）。かくして、このタイプのライブラリは、研究及び臨床的利用分野のための新しいツールを生成するための強力な手段を提供し、従来のアプローチに比べ数多くの利点をもつ（Caron et al., Cancer Supplement, ７３，１０４９−１０５６（１９９４））。ライブラリは、抗体分子の高い多様性の可能性を含んでいる（Nissim et al., EMBO J., ６９２−６９８（１９９４））。当該ケースでは、抗体産生のための連続的材料供給源として安定したヒトｃＤＮＡを使用することができる（米国特許第５，８４３，４３９号）。分子認識及び選択は、標的タンパク質候補のin vivo 免疫原性によって影響されない。
【００７８】
［９３.］  ファージ表示抗体の親和性選択は大きなライブラリからの抗原反応性ｓｃＦｖを冨化するための有用な方法を提供するものの、それには単一のクローンを単離し可溶性ｓｃＦｖを特徴づけするための多数の段階が必要とされる。ｓｃＦｖ自体は、保存的アミノ酸置換を実施するか又はｓｃＦｖのフラグメント又はこのフラグメントの構成体を産生することによって、その親和性及び／又は結合力を改善するように修飾可能である。
【００７９】
［９４.］  異なるヒト細胞及び組織に特異的な本発明のｓｃＦｖｓは、抗疾病及び／又は抗癌活性をもつ薬物ペプチド組成物、融合又は接合体を形成するため及び／又はその診断を目的として、任意には薬学的に有効な担体と共に薬学的に有効な量でさまざまな薬学的作用物質及び／又は放射性同位元素と会合、組合せ、融合又はリンクさせることができる。
【００８０】
［９５.］  ファージクローンは、バイオパンニングとして知られている多重段階手順によって選択され、これを通して同定される。バイオパンニングは、標的と共にファージ表示タンパク質リガンド変異体（ファージ表示ライブラリ）をインキュベートし、洗浄技術により未結合ファージを除去し、結合したファージを特異的に溶出することにより実施される。溶出されたファージは、任意には、標的に対する最高の結合を表示する抗体フラグメントを担持するようなファージクローンに有利な形で特異的配列のプールを冨化する結合及び任意の増幅のさらなるサイクルを通して取り上げられる前に増幅される。複数ラウンドの後、個々のファージクローンが特徴づけされ、クローンにより表示されたペプチドの配列が、ファージビリオンの対応するＤＮＡを配列決定することによって決定される。
【００８１】
［９６.］  この要領で得られたｓｃＦｖは、リード化合物とも呼ばれる。リード化合物は、その最終フォーマットがコアペプチド又はポリペプチドを含む化合物として定義づけされる。リード化合物は、修飾及び／又は拡張され得るが、コアペプチド又はポリペプチド又はそのいくつかの保存的に修飾された形態を保持しなければならない。アミノ酸置換による修飾は、例えばＦｖのＮ末端、カルボキシ末端において又はＣＤＲ領域のいずれかの中又はその上流側又は下流側領域において行なうことができる。修飾には同様に、融合タンパク質、薬物又は毒素へのカップリング、多量体の構築、及び完全抗体分子までの拡張も含まれるが、これらに制限されるわけではない。本特許において提供されるようなリード化合物の１つの好ましいカテゴリは、バイオパンニング手順の最終産物として得られたｓｃＦｖである。
【００８２】
［９７.］  本発明の実施形態は、本発明のペプチド又はポリペプチドの少なくとも１つの非天然修飾を提供している。非天然修飾は、該ペプチド又はポリペプチドをより免疫原性又は安定性の高いものにすることができる。非天然修飾には、ペプトイド修飾、セミペプトイド修飾、環状ペプチド修飾、Ｎ−末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、バックボーン修飾及び残基修飾が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００８３】
［９８.］  抗原特異的ファージ抗体の選択は、固定化された単一の抗原に対するバイオパンニングに大幅に依存していた。標的として全細胞を用いた場合、選択には制限があった。本発明では、白血病細胞表面決定因子を認識する特異的抗体を選択するために、全細胞が使用され、ここで、特異的レセプタは以前に知られておらず特徴づけもされていなかった。この方法は、抗原濃縮の容易な調整も、望ましくない優性抗体反応性の除去も可能にするものではない。さらに、より高い親和性のクローンを伴うものとは異なり、ファージは、ｓｃＦｖの多数のコピーを表示するものについて冨化することができる。それでも、このアプローチは、その利点のため、新規のヒト抗体分子を単離するための測り知れないほど貴重なツールとなっている。
【００８４】
［９９.］  本発明の１実施形態は、第１及び第２の状態をもつ第１の細胞上で未知のリガンドに結合し、該結合が第２の状態で有効であるものの第１の状態では実質的に有効でなく、かつ免疫交差反応性により、第２の細胞上のリガンドに対し特異的又は選択的に結合し、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有している、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドを提供している。
【００８５】
［１００.］  さらなる実施形態は、第２の細胞のリガンドに対するペプチド又はポリペプチドの選択的及び／又は特異的結合が第１の超可変領域により主として決定される、本発明のペプチド又はポリペプチドを提供している。
【００８６】
［１０１.］  さらにもう１つの実施形態は、第１の超可変領域が、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域である、本発明のペプチド又はポリペプチドを提供している。
【００８７】
［１０２.］  さらにもう１つの実施形態は、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域であり、結合選択性又は特異性が二次的に、第２の超可変領域及び／又は第３の超可変領域及び／又は第１、第２及び第３の超可変領域をフランキングする、上流側領域及び／又は下流側領域のうちの単数又は複数のものによってそれぞれ影響される本発明のペプチド又はポリペプチドを提供している。
【００８８】
［１０３.］  さらなる実施形態は、本発明のペプチド又はポリペプチドにより結合された第２の細胞のリガンドを提供する。かかる２細胞選択プロトコルは、以下のことに基づいていた：すなわち、巨核球は、骨髄中の造血基幹細胞から誘導された大型多核細胞である。血小板は、巨核球細胞質から裂け離れ、末梢血中に入る。in vitroで、広範囲のサイトカインが直接基幹細胞に影響を及ぼす。例えば、基幹細胞の巨核球への分化を直接増大させることによりトロンボポエチンが血小板計数を増大させる。かくして、これらの細胞が、成熟前細胞の中でも発見される複数の細胞表面マーカーを発現する。
【００８９】
［１０４.］  悪性血球（白血病及びリンパ腫）は、部分的に分化された造血始原細胞の中で通常発見された細胞表面のタンパク質を発現する未熟な細胞として特徴づけされる。かくして、血小板は、病的又は悪性血球の上で発現された成熟前細胞表面マーカーの同定のための魅力的な供給源である。以下で論述する１つのプロトコルでは、制限的な意味なく、未知のリガンドを運んでいるような特異的細胞を、初期バイオパンニング段階のために使用した。その後に続くクローン選択は、制限的な意味なくＡＭＬ細胞といった、そのターゲティングされた細胞表面マーカーが未知である所望の標的細胞を用いて実施された。この方法では、血小板上のバイオパンニングにより得られたファージクローンは、問題の病的又は悪性血球上のリガンドを認識しそれに結合するためのツールを提供することができる。
【００９０】
［１０５.］  上述の通りの標的は、単離された組織から誘導された細胞を内含する。単離された組織は、病的組織、より特定的には癌組織でありうる。癌組織は、制限的な意味なく、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫を含むあらゆる形態の悪性腫瘍に由来するものであり得る。
【００９１】
［１０６.］  上述のバイオパンニング方法に加えて、もう１つのアプローチは、そのリガンド上の直接的パンニングにより決定されるような細胞上のリガンドを結合させるペプチド又はポリペプチドの単離に基づくものである。
【００９２】
［１０７.］  本発明は、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含むペプチド又はポリペプチドを提供している。構成体は多量体（例えばdiabody, triabody, tetrabody）又はフルサイズのＩｇ分子であり得、フラグメントはminibody又はmicrobodyでありうる。全ての誘導された構成体及びフラグメントは、その他の細胞に有利なように標的細胞に対しＳ/Ｃに結合するべく、増強した結合特性を保持している。結合選択性及び／又は特異性は、主として、第１の超可変領域によって決定され、ここでＦｖはｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有する。
【００９３】
［１０８.］
本発明の１実施形態においては、タグは、Ｆｖペプチド又はポリペプチドに挿入又は付着されており、その調製及び同定及び診断の一助となる。タグはその後分子から除去できる。タグは、以下のタグであり得るがこれらに制限されるわけではない：ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Gｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ（Jarvik and Telmer, Ann. Rev.Gen., ３２，６０１−６１８（１９９８））及びＫＡＫ（リジン−アラニン−リジン）。タグは好ましくはｃ−ｍｙｃ又はＫＡＫである。
【００９４】
［１０９.］  本発明のＦｖ分子の２つの可変鎖は、長さがアミノ酸残基０〜２０個であるスペーサにより互いに連結又はリンクされていてよい。スペーサは有枝又は無枝であってよい。好ましくは、リンカーは、０〜１５個のアミノ酸残基であり、最も好ましくは、リンカーは、１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を生み出すべく（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である。ｓｃＦｖは、ファージ表示ライブラリから得ることができる。
【００９５】
［１１０.］  Ｆｖ分子自体は、第１鎖及び第２鎖から成り、各鎖は、第１、第２及び第３の超可変領域を含む。軽鎖及び重鎖のＶＤ内の超可変ループは、相補的決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。重鎖及び軽鎖の各々の中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域が存在する。これらの領域は、抗原結合部位を形成するものと考えられており、増強した結合活性を生み出すように特異的に修飾され得る。本質的にこれらの領域のうち最も可変的であるのは、重鎖のＣＤＲ３領域である。ＣＤＲ３領域は、Ｉｇ分子のうちの最も露呈された領域であると理解されており、本書で示され提供されているように、観察された選択的及び／又は特異的結合特性を主として担っているものである。
【００９６】
［１１１.］  本発明の１実施形態は、その上又は中で結合部位が実質的に利用可能でないかつ／又は発現されていないその他の細胞に有利な形で１つの細胞を含む、標的の上又はその中の実質的に露呈されかつ／又は過剰発現された結合部位に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性をもつ、Ｆｖ分子、その構成体、そのいずれかのフラグメント又はフラグメントの構成体を含んで成るペプチド又はポリペプチドにおいて、結合選択性又は特異性が、主として第１の超可変領域によって決定され、ＦｖがｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有するペプチド又はポリペプチドを提供している。
【００９７】
［１１２.］  本発明のさらなる実施形態は、第１の超可変領域が、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域である、ペプチド又はポリペプチドを提供している。
【００９８】
［１１３.］  さらにもう１つの実施形態は、第１の超可変領域が、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域であり、結合選択性又は特異性が二次的に、第２の超可変領域及び／又は第３の超可変領域及び／又は第１、第２及び第３の超可変領域をフランキングする下流側領域のうちの単数又は複数のもの及び／又は上流側領域のうちの単数又は複数のものによって影響され、第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域である、本発明のペプチド又はポリペプチドを提供している。
【００９９】
［１１４.］  本発明の１実施形態は、活性化、励起、修飾、変更、妨害を受けた、又は病的な細胞である標的細胞に結合するペプチド又はポリペプチドを提供する。本発明のさらなる実施形態では、標的細胞は癌細胞である。標的細胞は、制限的な意味なく、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫細胞から成るグループの中から選択され得る。好ましい実施形態においては、癌細胞は、白血病細胞である。最も好ましい実施形態においては、白血病細胞はＡＭＬ細胞である。
【０１００】
［１１５.］  本発明のペプチド又はポリペプチドは同様に、重鎖及び／又は軽鎖の超可変領域のうちの単数又は複数のものを保持し選択的及び／又は特異的結合特性を有するＦｖのあらゆる構成体又は修飾された構成体でもある。構成体又は修飾された構成体には、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、（diabody, triabody, tetrabodyとも呼ばれる）二量体、三量体、四量体といったｓｃＦｖの多量体、及び完全抗体、及びそれらから構成され得かつ抗体の超可変ドメインの単数又は複数を包含するその他のあらゆる多量体が含まれる。本発明のペプチド又はポリペプチドは同様に、もとの構成体の結合特性の一部又は全てを有するあらゆる構成体又は修飾された構成体のフラグメントでもある。
【０１０１】
［１１６.］  本発明のペプチド又はポリペプチドは又、もとの構成体の選択的及び／又は特異的結合特性の一部又は全てをもちフラグメントの構成体でもある。本書で記述されているＦｖｓは、選択的及び／又は特異的に標的細胞に結合し、抗癌剤又は抗疾病作用物質と会合又は接合され得る。
【０１０２】
［１１７.］  本発明のＦｖ分子のペプチド、ポリペプチド、そのフラグメント、その構成体及びその構成体のフラグメントは、原核性又は真核性のいずれかの発現系の中で調製可能である。本発明の１実施形態においては、真核性発現系は、哺乳動物系であり、精製の後、哺乳動物の発現系内で産生されるペプチド又はポリペプチドは、実質的に哺乳動物汚染物質を含まない。本発明で定義されるような真核細胞系というのは、宿主細胞が真核細胞である、遺伝子工学処理方法によりペプチド又はポリペプチドを産生するための発現系を意味する。本発明のもう１つの実施形態においては、発明のペプチド又はポリペプチドの産生のための原核細胞系は、発現ベクターのための宿主としてE.coliを使用する。精製の後、E.coli系内で産生されたペプチド又はポリペプチドは、実質的に、E.coli汚染性タンパク質を含まない。原核細胞発現系の使用は、結果として、本発明において提供される配列の一部分又は全てのＮ末端に対するメチオニン残基の付加をもたらし得る。ペプチド又はポリペプチドの完全な発現を可能にするためのペプチド又はポリペプチド産生の後のＮ末端メチオニン残基の除去は、制限的な意味なく、適切な条件下でのアエロモナスアミノペプチターゼの使用といったような、当該技術分野で一般に既知の方法によって実施可能である（米国特許第５，７６３，２１５号）。
【０１０３】
［１１８.］  本発明は、本発明のＦｖペプチドに基づいたｓｃＦｖの産生を提供する。原核細胞内のｓｃＦｖのクローニング及び増幅のために使用されるベクター内に取込まれるプロモータは、広い選択肢の中から選択可能である。プロモータは、構造遺伝子の上流側にあり遺伝子発現を制御する能力をもつＤＮＡ配列である。プロモータは、生体の染色体（単複）の中に天然の状態で発見され、原核又は真核発現ベクター内に工学処理することもできる。所望のＤＮＡ フラグメント上の特定の遺伝子座の中に工学処理されたプロモータは、問題の遺伝子の微調整され精密に制御された発現を提供する。本発明においては、選択されたＦｖについてコードする遺伝子を内含する構成体の中で、複数のプロモータが使用された。プロモータには、制限的な意味なく、次のものが含まれる；deo, Ｐ１−Ｐ２、ｏｓｍＢ、λＰL、β−ｌａｃ−Ｕ５、ＳＲα５及びＣＭＶ早期プロモータ。Dｅｏは、適切なE.coli宿主内への導入時点で宿主に対し、構成性E.coli由来のデオキシリボヌクレオチドプロモータdeoＰ１−Ｐ２の制御下で所望の天然に発生するポリペプチド又はそのポリペプチド類似体をコードするＤＮＡの発現をもたらす能力を付与する２本鎖ＤＮＡプラスミドである。より詳細な説明は、米国特許第５，７９５，７７６号（Fisher, １９９８年８月１８日）、米国特許第５，９４５，３０４号（Fisher, １９９９年８月３１日）の中で提供されている。
【０１０４】
［１１９.］  E.col  ｏｓｍＢプロモータの発現は、浸透圧により調節される。このプロモータを運ぶベクターは、E.coli宿主内のｏｓｍＢプロモータの制御下で広範な組合せ型真核性及び原核性ポリペプチドを高レベルで産生するために使用可能である。より詳細な説明は、米国特許第５，７９５，７７６（Fisher, １９９８年８月１８日）、米国特許第５，９４５，３０４号（Fisher, １９９９年８月３１日）の中で提供されている。
【０１０５】
［１２０.］  λＰLは、易熱性抑制因子ｃＩ857により調節される熱誘発性λバクテリオファージプロモータである。さらに詳しい記述については、Hendrix et al. ランダムＩＩ，Cold Spring Harbor Laboratory（１９８３）を参照のこと。
【０１０６】
［１２１.］  β−ｌａｃ−Ｕ５は、ｌａｃＺプロモータである（Gilbert and Muller-Hill, ＰＮＡＳ（ＵＳ），５８，２４１５（１９６７）である。
【０１０７】
［１２２.］  ＳＲα５は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモータ及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型長末端反復のＲ−Ｕ５セグメントから成る哺乳動物のｃＤＮＡ発現系である。この発現系は、広範な細胞型内のＳＶ４０早期プロモータよりもさらに１又は２ケタ、活性が高い（Takebe et al., 分子及び細胞生物学、８，４６６−４７２（１９９８））。
【０１０８】
［１２３.］  ＣＭＶ中間／早期エンハンサ／プロモータとして知られているヒトサイトメガロウイルスプロモータは、最も好ましくは、本発明において、哺乳動物細胞内のクローンＤＮＡインサートの構成体発現を促進するために使用される。ＣＭＶプロモータは、Schmidt, E.V. et al.,（１９９０）Mol Cell Biol., １０，４４０６、の中で記述されており、米国特許第５，１６８，０６２号及び５，３８５，８３９号である。
【０１０９】
［１２４.］  本発明の好ましい実施形態においては、原核細胞のファージミド系の誘発のためのプロモータは、deo, ｏｓｍＢ、λＰL、β−ｌａｃ−Ｕ５及びＣＭＶプロモータを含むグループの中から選択される。本発明のより好ましい実施形態においては、、E.coli内のファージミド系の誘発のためにβ−ｌａｃ−Ｕ５プロモータを使用した。最も好ましい実施形態におては、ＣＭＶプロモータが使用される。
【０１１０】
［１２５.］  本発明の１実施形態においては、対象の発明のペプチド又はポリペプチドは以下のものを含んで成る：（ａ）コードされた配列内のみに存在し、成熟タンパク質内では欠如しているリーダー配列；（ｂ）修飾を受ける４〜１２個のアミノ酸の第１の超可変領域を内含する、およそ１３５〜１３５個のアミノ酸の重鎖の可変領域；（ｃ）短縮又は削除され得る２０個の以下のアミノ酸のスペーサ領域；（ｄ）本書に記述された特異的修飾を同様に受ける軽鎖の可変領域とそれに続く；（ｅ）任意には最後の注射可能な製品の中に存在しないフォローアップ用のタグ配列。一般にｓｃＦｖ内で長さが約アミノ酸１５個であるスペーサは、２つの可変鎖（重及び軽）が機能的Ｆｖドメイン内に折り畳むことができるようにする。機能的Ｆｖドメインは、選択的及び／又は特異的な増強した結合活性を保持する。
【０１１１】
［１２６.］  もう１つの実施形態においては、上述の（ｄ）の後に、接合、診断及び／又は同定の目的で使用可能なタグ配列又は標識が続く。この実施形態では、タグは、本発明のペプチド又はポリペプチドと標的細胞の治療又は診断用の作用物質の間を連結するように設計されている。
【０１１２】
［１２７.］  ｓｃＦｖのスペーサ領域は、線形でも分枝でもよく、一般に、構造式（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）nの倍数でグリシン及びセリン残基から成り、一般に長さが合計でアミノ酸０〜２０個であり、好ましくは長さがアミノ酸０〜１５個で、線形である。適宜スペーサ長を変更することにより、さまざまな多量体を得ることができる。本発明の実施形態においては、スペーサの長さはアミノ酸０〜５個である。もう１つの実施形態では、スペーサの長さは（以下で詳述するように、アミノ酸３個未満である）。
【０１１３】
［１２８.］  以下で本発明のｓｃＦｖ分子のアミノ酸配列の例を示す。
【０１１４】
【化１】
2004524023.tif 000002
【０１１５】
［１２９.］  リーダー配列は、破線で下線が入れられている。ＶH  領域は太字のアミノ酸配列によってコードされる。この特異的クローンは、生殖細胞系列ＶH３−ＤＰ３２から誘導されている。しかしながら各クローンの生殖細胞系統は、その特定の由来により左右される（以下参照）。囲み内のアミノ酸配列は、このライブラリに由来する全てのクローンの中の超可変領域であるＶH−ＣＤＲ３配列についてコードする。ＶH及びＶL 領域と合流するスペーサ領域は、イタリック体で示されたアミノ酸によってコードされた柔軟なポリペプチドである。最後にＶL 領域が提示されている。全てのクローン内の融合ＶL フラグメントは、生殖細胞系統ＩＧＬＶ３ＳＩの単一の突然変異を受けていないＶ遺伝子から誘導され、ここでは、波線により下線が付されたｃ−ｍｙｃタグが後に続いている。
【０１１６】
［１３０.］  ＶHフクグメントのレパートリ（４９の生殖細胞系統からの）がまず第１に、ライブラリ供給業者により免疫化されていないヒトの末梢血リンパ球の再配置されたＶ−遺伝子からＲＣＲによって生成された（「実験未使用レパートリ」と呼ぶ）。ＶH−配列の起源（生殖細胞系統）を、以下のウェブサイトの１つを用いて相同性試験（Blast探索）によって同定することができる。
【０１１７】
［１３１.］  複数の方法のうちの１つにおいて、抗体の結合特性を最適化することができる。もとのリード化合物に関するより高い結合親和性を得るために抗体を最適化する１つの方法は、リード化合物内のアミノ酸残基を置換してより高い可変性を導入するか又は配列を拡大することに基づいている。例えば、もとのＶL領域全体を、異なる抗体亜型からのＶL領域で置換することができる。
【０１１８】
［１３２.］  結合親和性を最適化する付加的な方法は、ファージミド表示突然変異誘発ライブラリを構築することにある。ファージミド表示突然変異誘発ライブラリにおいては、ＶH及びＶLＣＤＲ３内のコア配列の各アミノ酸が好ましくは当該技術分野において既知の保存的要領でその他のあらゆるアミノ酸により独立して置換されるような形で、オリゴヌクレオチドが合成される。本発明は、表示された抗体フラグメント及びファージビリオンから抽出可能な可溶性抗体フラグメントが同じ生物活性をもつ、ファージ上で表示された一組の特異的抗体ｓｃＦｖを提供している。
【０１１９】
［１３３.］  本書で用いられるファージ表示ライブラリは、免疫化されていないヒトの末梢血リンパ球から構築されたものであり、Ｆｖペプチドは、標的細胞の表面上の以前に特徴づけされていない未精製抗原に対して選択された。本書で使用する以前に特徴づけされていない未精製の抗原という語は、現行の作業に先立つ生化学的又は分子手段によって、同定、特徴づけ、単離又は精製されておらず、かつ観察された単離された抗体フラグメントに対する選択的及び／又は特異的結合によって当該作業の中で観察されている又は予測されている細胞の表面上で提示されたリガンドを意味する。
【０１２０】
［１３４.］  本発明のｓｃＦｖは、標的細胞に対する増強された結合を表示する。増強された結合は、特異的表面マーカーに向けられている。特異的表面マーカーというのは、細胞膜内で隔絶され循環する認識分子にアクセス可能な分子である。表面マーカーの存在は、本書に記述されているバイオパンニング技術を介したファージ表示技術の開発を可能にした。本発明においては、さまざまな細胞型を特徴づけしかつ区別するためならびにそのさまざまな形態でのＦｖｓのための結合部位として役立つために、特異的表面マーカーが利用される。その特徴的表面マーカーに従って、さまざまな造血細胞型を区別することができ、類似の形で、病的又は癌細胞は、それらの型及び期に独特である表面マーカーを表示する。
【０１２１】
［１３５.］  ｓｃＦｖクローンの選択は、２つの異なるバイオパンニング戦略により達成可能である：すなわち、
１．標的細胞として病的又は癌細胞を使用することによる直接的選択、及び
【０１２２】
２．第２状態にある第１の細胞の結合部位が、実質的に露呈又は表示されている未知のリガンドを含むことになる、第２の例えば活性化、励起、修飾、変更又は妨害を受けた状態にある第１の例えば正常な細胞を使用することになる、段階的選択。免疫交差反応性により、結果として得られたクローンは、その後のバイオパンニング又は選択段階の後に第２の細胞上に新規の及び未知のリガンドに対し選択的及び／又は特異的に結合することができる。さらなる任意の増幅及びその後の精製に続いて、ターゲティング分子を第２の細胞上の未知のリガンドに選択的及び／又は特異的な精製済み認識分子の認識部位から構築することができる。
【０１２３】
［１３６.］  本発明の１実施形態においては、第１の細胞は正常細胞であり得、第１の状態は未活性化状態であり、第２の状態は、活性化、励起、修飾、変更又は妨害を受けた状態であり得る。段階的選択における第２の細胞は、ヒト細胞であり得る。本発明のもう１つの実施形態では、段階的選択における第２の細胞は、病的細胞である。より好ましい実施形態においては、段階的選択における第２の細胞は、制限的な意味なく癌腫、肉腫、白血病、線腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫といった癌腫である。より好ましい実施形態においては、第２の細胞は白血病細胞である。最も好ましい実施形態においては、第２の細胞は、ＡＭＬ細胞である。
【０１２４】
［１３７.］  本発明のより好ましい実施形態は、第２の細胞のリガンドに対するその選択的及び／又は特異的結合が主として第１の超可変領域により決定されているペプチド又はポリペプチドを提供する。さらに一層好ましい実施形態においては、第１の超可変領域は、配列番号８−２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域である。
【０１２５】
［１３８.］  本発明のもう１つの実施形態は、本発明のペプチド又はポリペプチドにより結合された第２の細胞のリガンドを提供している。さらなる実施形態は、本発明のペプチド又はポリペプチドにより結合されたリガンドを認識し結合するあらゆる分子を提供している。
【０１２６】
［１３９.］  癌細胞に対する結合の増強は、正常細胞内での発現に比べた癌細胞内でのリガンドの過剰発現及び／又は結合部位の露呈に起因する可能性が最も高い。本書で使用されているように、リガンドの過剰発現という語は、特定の細胞型及び／又は特定の細胞サイクル期において通常サイレント化している遺伝子又はその産物の発現、又はこの特定の細胞型についての正常な非悪性条件下で基底レベルで発現される遺伝子の増大した発現として定義づけされる。
【０１２７】
［１４０.］  本発明のさらに好ましい実施形態においては、バイオパンニング手順の標的細胞は、細胞懸濁液の中に含有されている。造血細胞は懸濁状態で得られ、血球懸濁液とファージライブラリを混合しその後いくつかの緩衝液で洗浄することによってバイオパンニングを実施することができる。ファージは、ヒト細胞から抽出され、増幅され、表示された抗体フラグメント配列が決定される。
【０１２８】
［１４１.］  本発明のさらに一層好ましい実施形態においては、血球懸濁液は白血病細胞を含む。最も好ましい実施形態においては、血球懸濁液は、ＡＭＬ細胞を含む。対象の発明のもう１つの実施形態では、標的細胞は、単離された器官又はその一部から誘導される。
【０１２９】
［１４２.］  対象の発明のもう１つの実施形態においては、標的細胞又は第２の細胞は、１つの細胞系統から誘導されている。細胞系統は、Ｆｖクローンの結合特性を容易に決定できるように培養され操作され得る。さらに、細胞系統は、診断キットの開発においても有用であり得る。
【０１３０】
［１４３.］  好ましい実施形態においては、細胞系統は、制限的意味なく、ジャーカット、Molt-４、ＨＳ−６０２、Ｕ９３７、ＴＦ−１、ＴＨＰ−１、ＫＧ−１、ＭＬ−２及びＨＵＴ−７８細胞系統といったような造血細胞系統である。
【０１３１】
［１４４.］  本発明の好ましい実施形態では、ＣＤＲ３領域は、８４のカセット（配列番号３０−１１３）のうちのいずれか１つの中に又はその上に構築、挿入、カップリング又は融合される。より好ましい実施形態では、ＣＤＲ３領域は、４９のカセット（配列番号：３０−３２、３５、３７−３９、４１、４３、４５、４６、４８、５１、５４、５７、５９−６８、７０、７１、７６−８５、８７、８９−９２、９４、９７、９９、１０３、１０６、１１２及び１１３のうちの１つの中又は上に構築、挿入、カップリング、又は融合される。最も好ましい実施形態においては、ＣＤＲ３は、配列番号６１のカセット又はそれと少なくとも９０％の配列類似性をもつ上述の配列のいずれかのＣ末端に構築、挿入、カップリング又は融合されている。
【０１３２】
［１４５.］  １つの実施形態においては、カセットのアミノ酸配列は明示的に固定されており、一方、置換、挿入又は付着された配列は高度に可変的であり得る。カセットは、各々が最終構成体にとって重大な機能を包含する複数のドメインで構成され得る。本発明の特定の実施形態のカセットは、Ｎ末端から枠組領域１、（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、枠組領域２（ＦＲ２）、ＣＤＲ２及び枠組領域３（ＦＲ３）を含んで成る。
【０１３３】
［１４６.］  本発明の１実施形態においては、カセット内で全く異なる領域を置換することが可能である。例えば、カセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域は、非保存的又は好ましくは保存的アミノ酸置換によって置換又は修飾可能である。より特定的には、配列番号３０〜１１３又はそのフラグメントから成るグループの中から選択された連続するアミノ酸のカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域は、それぞれ配列番号１１５及び１１４によって置換され得る。さらに一層特定的には、配列番号３０−３２、３５、３７−３９、４１、４３、４５、４６、４８、５１、５４、５７、５９−６８、７０、７１、７６−８５、８７、８９−９２、９４、９７、９９、１０３、１０６、１１２及び１１３又はそれらのフラグメントから成るグループの中から選択された連続するアミノ酸のカセットのＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域がそれぞれ配列番号１１５及び１１４によって置換され得る。
【０１３４】
［１４７.］  発明の好ましい実施形態においては、ペプチド又はポリペプチドは、重鎖及び軽鎖を含み、各鎖は、それぞれＣＤＲ３、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ１領域である第１、第２及び第３の超可変領域を含む。結合の選択性及び特異性は、特に１つの鎖のＣＤＲ３領域によって、可能な場合には軽鎖のＣＤＲ３領域によって又好ましくは重鎖のＣＤＲ３領域によって決定され、二次的には、軽鎖好ましくは重鎖のＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域によって決定される。結合選択性及び特異性は同様に、第１、第２及び／又は第３の超可変領域をフランキングする上流側又は下流側領域によっても二次的に影響され得る。
【０１３５】
［１４８.］  好ましい実施形態においては、ペプチド又はポリペプチドのＣＤＲ３領域は、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を有する。
【０１３６】
［１４９.］  より好ましくは、重鎖のＣＤＲ３領域は、配列番号８〜２４を含むグループの中から選択された１つのアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号１１５と同一のアミノ酸配列をもち、ＣＤＲ１領域は配列番号１１４と同一のアミノ酸配列を有する。
【０１３７】
［１５０.］  本発明の最も好ましい実施形態においては、ＣＤＲ３領域は、配列番号８と同一のアミノ酸配列を有する。
【０１３８】
［１５１.］  重鎖及び軽鎖に加えて、Ｆｖは、０〜２０個のアミノ酸残基の柔軟なスペーサを含む。スペーサは、分枝鎖又は重鎖であり得る。スペーサの２つの可能な配列は、配列番号１２３及び１２４と同一である。
【０１３９】
［１５２.］  本発明の好ましい実施形態は、配列番号８と同一のＣＤＲ３配列及び配列番号２５と同一の完全ｓｃＦｅ 配列を伴うｓｃＦｖである。
【０１４０】
［１５３.］  本発明のもう１つの好ましい実施形態は、配列番号２０と同一のＣＤＲ３配列及び配列番号２０３と同一の完全ｓｃＦｖ 配列を伴うｓｃＦｖである。
【０１４１】
［１５４.］  本発明の最も好ましい実施形態においては、ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域はそれぞれ配列番号８、１１５及び１１４のアミノ酸を有する。
【０１４２】
［１５５.］  本発明の１実施形態においては、Ｆｖペプチドは、それ自体、配列番号３０−１１３を含むグループの中から選択されたアミノ酸配列を伴うカセットを含む可変重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域；配列番号８−２４を含むグループの中から選択されたアミノ酸配列をもつ好ましくは可変重鎖のＣＤＲ３領域；配列番号１１７のアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域をフランキングする上流側領域；配列番号１１６のアミノ酸配列をもつＣＤＲ３領域をフランキングする下流側領域；配列番号１２３又は１２４の０〜２０個のアミノ酸残基のスペーサ；配列番号７という配列をもつ可変軽鎖を含んで成る。
【０１４３】
［１５６.］  同様にして、もう１つの実施形態においては、ＣＤＲ２領域にフランキングする上流側領域は、配列番号１１９というアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域にフランキングする下流側領域は配列番号１１８というアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域は配列番号１２１というアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ１領域をフランキングする下流側領域は、配列番号１２０というアミノ酸配列を有する。
【０１４４】
［１５７.］  本発明の好ましい実施形態は、第２及び第３の超可変領域がそれぞれＣＤＲ２及びＣＤＲ１の超可変領域であり、ＣＤＲ３アミノ酸配列が配列番号８であり、ＣＤＲ２アミノ酸配列が配列番号１１５であり、ＣＤＲ１アミノ酸配列が配列番号１１４であり、ＣＤＲ３領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域をフランキングする上流側領域が配列番号１１９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２領域をフランキングする下流側領域が配列番号１１８のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ１領域をフランキングする上流側領域が配列番号１２１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ１  領域をフランキングする下流側領域が配列番号１２０のアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドを提供している。
【０１４５】
［１５８.］  本発明のもう１つの実施形態は、第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第１の鎖及び第１、第２及び第３の超可変領域をもつ第２の鎖を含んで成るＦｖ分子において、第１鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択された１つの配列をもち、第２鎖の超可変領域のうちの１つが、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択された１つの配列を有し、第１、第２及び第３の超可変領域は、それぞれＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域であり、ＦｖはｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、任意には単数又は複数のタグを有するＦｖ分子を提供している。
【０１４６】
［１５９.］  本名発明のもう１つの実施形態は、（ｉ）第１鎖及び第２鎖が各々、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択された第１の超可変領域を含んで成るか；又は（ｉｉ）第１鎖の第１の超可変領域及び第２鎖の第１の超可変領域が同一であり、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されているか；又は（ｉｉｉ）第１鎖の第１の超可変領域が配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されており、かつ第２鎖の第１の超可変領域が配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択されているか；又は（ｉｖ）第１鎖の第１の超可変領域が、配列番号１〜６及び１２５〜２０２から成るグループの中から選択され、第２鎖の第１の超可変領域が配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されている、ペプチド又はポリペプチドを提供している。
【０１４７】
［１６０.］  もう１つの実施形態は、第１鎖の第２及び第３の超可変領域がそれぞれ配列番号１１４及び１１５である、本発明のペプチド又はポリペプチドを提供する。
【０１４８】
［１６１.］  本書に記述され詳細に説明されているアミノ酸残基２５個以下の全てのアミノ酸配列について、これらのアミノ酸配列がその範囲内で１個又は２個のアミノ酸置換を内含することそして好ましくは置換が保存的アミノ酸置換であることが、該発明のさらなる実施形態として理解され考慮されるものとする。本書に記述され詳細に説明されているアミノ酸残基が２５個より多い全てのアミノ酸配列について、これらのアミノ酸配列がもとの配列に対し９０％以上の配列類似性をもつアミノ酸配列をその範囲内に内含することが該発明のさらなる実施形態として理解され考慮されるものとする（Altschul et al., Nucleic Acids Res., ２５、３３８９−３４０２（１９９７））。類似の又は相同なアミノ酸というのは、例えば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正又は負に帯電した、極性、非極性といった類似の特性を示す同一でないアミノ酸として定義づけされる。
【０１４９】
［１６２.］  アミノ酸の類似性又は相同性又は配列の類似性の百分率は、２つの異なるペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって決定される。２つの配列は、通常専用に設計されたさまざまなコンピュータプログラムの１つを使用することによって整列させられ、各位置におけるアミノ酸残基が比較される。次に、アミノ酸の同一性又は相同性が決定される。その後、アミノ酸類似性百分率を決定するためにアルゴリズムが適用される。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子の間の微妙な関係の検出に対する感度が大幅に増大したことから、一般にアミノ酸配列を比較することが好ましい。タンパク質比較には、保存的アミノ酸置換の存在を考慮に入れることができ、こうして、同一でないアミノ酸が類似の物理的及び／又は化学的特性を有する場合、１つの不整合がなお正の評点を生み出す可能性がある（Altschul et al., Nucleic Acids Rs., ２５，３３８９−３４０２（１９９７））。
【０１５０】
［１６３.］  該発明の１実施形態においては、軽鎖及び重鎖の各々の３つの超可変領域は２つの鎖の間及び鎖内部及び／又は鎖間の３つの超可変部位の間で相互交換され得る。
【０１５１】
［１６４.］  当業者であれば、本発明のペプチド又はポリペプチドの特異的及び／又は選択的な結合の実証には、適切な負の対照の使用が必要である、ということに気づくことだろう。１つの適切な負の対照は、本発明のペプチド又はポリペプチドとほぼ同一であるが超可変ＣＤＲ３領域内に唯一の差異があるアミノ酸配列をもつペプチド又はポリペプチドでありうる。もう１つの適切な負の対照は、本発明のペプチド又はポリペプチドと同じサイズ及び／又は全体的３次元構造をもつものの完全に無関係のアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドでありうる。もう１つの適切な負の対照は、本発明のペプチド又はポリペプチドと比べた場合に全く異なる物理的及び化学的特性をもつペプチド又はポリペプチドであり得る。本発明の展開において使用される負の対照は、配列番号２８と同一のＣＤＲ３配列をもつＮ１４、及び配列番号２９と同一のＣＤＲ３配列をもつＣ１８１と呼称される。しかしながら、その他の負の対照も同様に適切であり得る。
【０１５２】
［１６５.］  もう１つの実施形態は、本発明のＦｖペプチド又はポリペプチドをコードする核酸分子好ましくはＤＮＡ分子を提供する。
【０１５３】
［１６６.］  本発明の好ましい実施形態においては、Ｆｖの選択的結合を最適化するため、Ｆｖに対する主要な結合選択性及び／又は特異性を付与するＣＤＲ３配列を、任意のその他の重鎖生殖細胞系列まで移動させることができる。より特定的には、これらを８４の可能な重鎖生殖細胞系列のうちの１つまで移動させることができる。これらの８４の生殖細胞系列（配列番号：３０−１１３）には、（ａ）請求対象のファージクローンが当初単離された生殖細胞系列、（ｂ）ファージ表示ライブラリ内で利用可能な４８の付加的な生殖細胞系列及び（ｃ）本書で請求されている３５個の代替的生殖細胞系列が含まれる（Tomlinson et al., J. Mol.Biol., ２２７（３）：７７６−７９８（１９９２））。ＣＤＲ３領域自体に合わせて、ＣＤＲ３領域の局所的線形又は３次元環境は、適正なＣＤＲ３結合を誘導又は推進する上で潜在的に１つの役割を果たす可能性がある。例えば本書で配列番号８〜２４、１２５として記され４９の生殖細胞系列配列（配列番号：３０〜３２、３５、３７−３９、４１、４３、４５、４６、４８、５１、５７、５９−６８、７０、７１、７６−８５、８７、８９−９２、９４、９７、９９、１０３、１０６、１１２及び１１３）のいずれかから誘導されたＣＤＲ３配列のいずれかをもつペプチドも同様に、対象の発明により包含されている。
【０１５４】
［１６７.］  生殖細胞系列ＤＰ−３２は、本発明の複数のクローンのためのカセットである。この生殖細胞系列のＣ末端は、ファージ表示ライブラリの調製を助けるためコンセンサス配列で置換された。配列番号６１の７個のカルボキシ末端アミノ酸は、配列番号１２２の７個のアミノ酸配列により置換された。
【０１５５】
［１６８.］  本発明のＦｖｓのＣＤＲ３領域は、ＡＭＬ細胞に特異的に結合するコア配列Ａｒｇ／Ｇｌｙ／Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏを含有し得る。かかるＣＤＲ３領域の８つの例が表２に提示されている。モチーフは、各ケースにおいてＣＤＲ３領域の３つのＮ末端アミノ酸残基と一致するが、これをＣＤＲ３領域内の他の場所に位置設定することも可能である。代替的には、モチーフは、より大きな結合又はターゲティング又は認識分子の一部分のアンカー又は結合領域を構築する又は構成するために用いられるか又は単独で標的ビヒクルとして使用される結合モチーフである。
【０１５６】
［１６９.］  本発明のさらなる実施形態においては、Ｒ1及びＲ2の各々が０〜１５個、好ましくは１〜９個のアミノ酸残基を含みＸがＡrg、Ｇly又はＬysのいずれかであるＲ1−Ｘ Ｐhe Ｐro−Ｒ2のアミノ酸配列を含んで成る、結合モチーフが提供されている。最も好ましくは、ＣＤＲ３は、Ｒ1−ＸＰhe Ｐro−Ｒ2のアミノ酸配列を含み、ここでＲ1及びＲ2が各々０〜１５個のアミノ酸残基を含み、ＸがＡrg、Ｇly、又はＬysのいずれかである。
【０１５７】
［１７０.］  対象の発明のペプチド又はポリペプチドのもう１つの好ましい実施形態においては、ペプチドがその生物活性を維持する一方で、ペプチドのＣ末端又はＮ末端のいずれかに対して１〜１０００個のアミノ酸を付加することができる。本発明の好ましい実施形態においては、ペプチドがその生物活性を維持する一方で、ペプチド又はポリペプチドのＣ末端又はＮ末端のいずれかに対し１５０〜５００個のアミノ酸を付加することができる。本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、ペプチド又はポリペプチドがその生物活性を維持する一方で、ペプチド又はポリペプチドのＣ末端又はＮ末端のいずれかに対し８００〜１０００個のアミノ酸を付加することができる。
【０１５８】
［１７１.］  コアアミノ酸配列を拡張するための例としては、Ｉｇのコアとしてリード化合物を用いて、フルサイズの免疫グロブリンＩｇを構築することによるものがある。フルサイズのＩｇは、細胞の細胞分解活性の活性化又は補体を介して内因性細胞分解活性を誘発することのできる免疫グロブリンクラスに属する可能性がある（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３）。フルサイズのＩｇは、強く結合する抗体の免疫グロブリンクラスに属する可能性もある（例えばＩｇＧ４）。結合時点で、フルサイズのＩｇは、例えば免疫応答を開始するべく体の防御メカニズムのためのフラグとして作用することによって、細胞内細胞シグナリングを形質導入することによって又は標的細胞に対する損傷をひき起こすことによってといった数多くのやり方のうちの単数又は複数のやり方で作用し得る。
【０１５９】
［１７２.］  本発明の１つの好ましい実施形態は、組換え型ポリペプチドとして発現され真核細胞系統内で産生されたＩｇ分子を提供している。本発明の好ましい１実施形態においては、ＩｇポリペプチドはＩｇＧポリペプチドであり、これは哺乳動物細胞系統内で産生される。より好ましい実施形態においては、哺乳動物細胞系統は、ＣＭＶプロモータを含んで成る。
【０１６０】
［１７３.］  本発明の好ましい実施形態においては、ＩｇＧ分子は、軽鎖及び重鎖の両方において、ＣＤＲ３、ＣＤＲ３及びＣＤＲ１の超可変領域を含む。本発明のより好ましい実施形態においては、Ｆｖ分子は、それぞれ配列番号８、１１５及び１１４をもつＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域を含む。ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１領域は、重鎖及び軽鎖のものであり得る。
【０１６１】
［１７４.］  本発明のさらに好ましい実施形態は、配列番号２７と同一の配列を伴う軽鎖、配列番号２６と同一の配列を伴う重鎖又はそれらと少なくとも９０％の配列類似性をもつ重鎖及び軽鎖を有するＩｇＧ分子を提供している。本発明の最も好ましい実施形態においては、ＩｇＧの２つの重鎖は同一であり、ＩｇＧの２つの軽鎖は同一である。
【０１６２】
［１７５.］  もう１つの実施形態においては、対象の発明のペプチドは、多価のＦｖ形態へと折畳むように構築される。
【０１６３】
［１７６.］  本発明は、ｓｃＦｖ分子を含むＹ１又はＹ１７のペプチド又はポリペプチドを提供する。本書で使用されているｓｃＦｖというのは、同じものであっても、異なるものであってもよいヒト抗体の重鎖の可変領域及びヒト抗体の軽鎖の可変領域で構成され、かつその中で重鎖の可変領域が軽鎖の可変領域に対し連結、リンク、融合又は共有結合により付着されているか又はそれと会合されている、分子として定義づけされる。
【０１６４】
［１７７.］  Ｙ１及びＹ１７ｓｃＦｖ構成体は、Ｙ１又はＹ１７の抗体の超可変ドメインの単数又は複数を包含するｓｃＦｖ分子の多量体（例えば二量体、三量体、四量体など）であり得る。全てのｓｃＦｖ由来の構成体及びフラグメントは、その他の細胞に有利な形で標的細胞に対し選択的及び／又は特異的に結合するべく増強された結合特性を保持している。結合選択性及び／又は特異性は、超可変領域により主として決定される。
【０１６５】
［１７８.］  軽鎖及び重鎖の可変ドメイン内の超可変ループは、相補的決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。重鎖及び軽鎖の各々の中にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域が存在する。これらの領域のうちの最も可変的なものは、重鎖のＣＤＲ３領域である。ＣＤＲ３領域は、Ｉｇ分子の最も露呈された領域であるものと理解され、本書で規定されている通り、観察された選択的及び／又は特異的結合を主として担っている部位である。
【０１６６】
［１７９.］  対象の発明のＹ１及びＹ１７ペプチドは、多価のＦｖ形態へと折畳むように構築され得る。Ｙ１及びＹ１７多量体形態が、結合親和性及び特異性及び血中半減期の増大を改善するように構築された。
【０１６７】
［１８０.］  その他の研究者により、ｓｃＦｖの多価形態が産生されてきた。１つのアプローチは２つのｓｃＦｖをリンカーとリンクさせることであった。もう１つのアプローチには、リンケージのために２つのｓｃＦｖｓ間のジスルフィド結合を使用することが関与している。二量体又は三量体Ｆｖの産生に対する最も単純なアプローチは、Holliger et al., ＰＮＡＳ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）及びA.Kortt, et al., Protein Eng., １０，４２３−４３３（１９９７）により報告された。かかる方法の１つは、ＦＯＳ及びＪＵＮタンパク質領域の配列を付加してｓｃＦｖのＣ末端でその間にロイシンジッパーを形成することによりｓｃＦｖｓの二量体を作るように設計された。Kostelny SA et al., J Immunol. １９９２ Mar １；１４８（５）：１５４７−５３；De Kruif J et al., J Biol Chem. １９９６ Mar２９；２７１（１３）：７６３０−４。もう１つの方法は、ｓｃＦｖのＣ末端でストレプトアビジンコーディング配列を付加することによって四量体を作るように設計された。ストレプトアビジンは、４つのサブユニットで構成されており、従ってｓｃＦｖストレプトアビジンが折畳まれた時点で、４つのサブユニットが自らを収容して四量体を形成する。Kipriyanov SM et al., Hum  Antibodies Hybridomas, １９９５；６（３）；９３−１０１。さらにもう１つの方法においては、二量体、三量体及び四量体を作るため、問題のタンパク質の中に遊離システインが導入される。問題のタンパク質を遊離システインに架橋するため、可変的数（２〜４）のマレイミド基を伴うペプチドベースの架橋剤が使用された。Cochran JR et al., Immunity, ２０００Mar；１２（３）：２４１−５０。
【０１６８】
［１８１.］  この系ではファージライブラリ（本書で以上に記述されている通りのもの）は、１つの抗体のＦｖ領域の１価形態へと折畳むことのできるｓｃＦｖｓを表示するように設計された。さらに、同じく本書に以上で論述されている構成体は、細菌発現のために適している。遺伝子工学処理されたｓｃＦｖｓは、隣接してコードされた１５個のアミノ酸の柔軟なペプチドスペーサによって結合された重鎖及び軽鎖の可変領域を含む。好ましいスペーサは（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である。このスペーサの長さは、そのアミノ酸構成体要素と共に、嵩高でないスペーサを提供し、これによりＶＨ及びＶＬ領域は、その標的に対する有効な結合を提供する機能的Ｆｖドメインへと折畳むことができる。
【０１６９】
［１８２.］  本発明は、当該技術分野における既知のあらゆる方法によって調製されたＹ１及びＹ１７の多量体に向けられている。多量体特に二量体を形成する好ましい方法は、２つの単量体の間にジスルフィド結合を形成するべくシステイン残基を利用する。この実施形態においては、二量体は、二量体形成を容易にするべく（Ｙ１−ｃｙｓ  ｓｃＦｃ又はＹ１二量体と呼ばれる）ｓｃＦｖｓのカルボン末端上にシステインを付加することによって形成される。ＤＮＡ構成体が作られ（例２Ｄ及び６Ｄ参照）トランスフェクションのために使用された後、Ｙ１二量体が産生ベクター内で発現され、in vitroで再度折畳まれた。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ及びＦＡＣＳによって分析された。抗体の２リットル発酵バッチが行なわれた。E. coli菌株Ｂ２１内でＹ１〜ｃｙｓを発現させた後、再折畳みがアルギニン内で行なわれた。再折畳みの後、タンパク質は、透析され、Ｑ−セファロース及びゲルろ過（sephadex７５）により精製された。２つのピークがＳＤＳ−ＰＡＧＥ（未還元）及びゲルろ過によって検出された。ピークは別々に収集され、ＦＡＣＳにより分析された。ジャーカット細胞に対する単量体及び二量体の結合がＦＡＣＳによって検査された。二量体による結合には、同じ染色レベルについて単量体抗体の量が１００分の１しか必要とされず、これは、二量体がより大きな結合力を有することを表わしていた。二量体再折畳みのための条件が決定され、９０％を上回る二量体（mg数量）を含む材料が、その後の透析、クロマトグラフィ及びゲルろ過段階の後に産生された。精製済み二量体は、酸化条件下でゲルろ過及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特徴づけされた。ラジオレセプタアッセイ、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析により、二量体の結合能力が確認された。
【０１７０】
［１８３.］  ＣＯＮＹ１ ｓｃＦ抗体フラグメントがＹ１ｓｃＦｖから誘導される。Ｙ１ｓｃＦｖのｍｙｃタグをコードするＤＮＡ 配列は除去され、アミノ酸リジン、アラニン、リジン（ＫＡＫ）をコードする合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ配列により置換された。
【０１７１】
［１８４.］  Ｙ１二量体と（ＣＯＮＹ１とも呼ばれる）ｓｃＦｖ単量体の結合を比較するため、ＫＧ−１細胞についてin vitroで結合競合実験が行なわれた。さらに、これらの実験は、全ＹＩＩｇＧのｓｃＦｖＹ１単量体に対する結合を比較した。この研究を実施するために、Ｙ１ ＩｇＧ Ｙ１ ＩｇＧはビオチンで標識づけされた。この研究は、Ｙ１ＩｇＧがＩＧＹコービオチンと競合したことを明らかにした。関連性のないヒトＩｇＧは、標識づけされたＹ１ ＩｇＧと競合しなかった。Ｙ１ｓｃＦｖｓ（５μｇ及び１０μｇ）は、Ｙ１ ＩｇＧ−Biotin（５０ng）と部分的に競合した。研究は同様に、１ｎｇのＩｇＧ Ｙ１−ＦＩＴＣが、１μｇのｓｃＦｖ ＦＩＴＣと同じ程度までＫＧ−１細胞に（血清無しで）結合したが、血清が存在する場合、大部分のＹ１ ＩｇＧ結合は「遮断される」ということをも示した。これらの研究は同様に、ラジオレセプタアッセイ、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって分析されるように、Ｙ１二量体の結合が少なくともｓｃＦｖ単量体のものより少なくとも２０倍高いことも示した。
［１８５.］  さらにもう１つの実施形態においては、（ＹＩ−ｃｙｓ−ｋａｋ ｓｃＦｖと呼ばれる）カルボキシ末端におけるシステインに加えて、リジン−アラニン−リジンが加えられた。このｓｃＦｖ構成体のアミノ酸配列は以下に再現されている。
【０１７２】
【化２】
2004524023.tif 000003
【０１７３】
［１８６.］  ＹＩ−ｃｙｓ−ｋａｋは、細菌中のλ−ｐＬベクター内で産生された。４２℃まで温度を上昇させることよってλ−ｐＬベクター内の発現が誘発された。誘発された培養から封入体が得られ、望まれない可溶性タンパク質を除去するべく水溶液により半精製された。この封入体はグアニジンの中で可溶化され、ＤＴＴにより還元され、アルギニン／ｏｘ−グルタチオンに基づく溶液中でin vitroで再度折畳まれた。再折畳み後、タンパク質は透析され、尿素／リン酸緩衝液を含む緩衝液に対して接線方向流でのろ過により濃縮された。タンパク質は、ＳＰ−カラム中のイオンクロマトグラフィにより再精製され濃縮された。
【０１７４】
［１８７.］  ＣＯＮＹ１ ｓｃＦｖ中ならびにＹ１−ｃｙｓ−ｋａｋ ｓｃＦｖ中でより高レベルの発現を得るために、我々は、ｓｃＦｖ構成体のＮ末端配列の位置２に、アラニン残基についてコードするアミノ酸を導入した。この新たに修飾された構成体で、４倍の発現レベルが得られた。
【０１７５】
［１８８.］  血小板から誘導された抗原ＧＰＩｂ（グリコカリシン）について、単量体（ＣＯＮＹｓｃＦｖ−ＹＩ−ｋａｋとしても知られている）と二量体ＹＩ−ｃｙｓ ｋａｋ（システイン二量体）の間の結合の差を確認するべく、ＥＬＩＳＡ検定が実施された。ＧＰＩｂに対する結合を検出するために、ポリクローナル抗１本鎖抗体及び／又は新規のポリクローナル抗−ＶL（ウサギ由来）及び抗ウサギＨＲＰが使用された。二量体は、単量体より２〜１００倍高い活性を示した。例えば、０．８ ＯＤ単位を達成するために、わずか０．１mg／mlの二量体に比べて、１２．８mg／mlの単量体が使用された。図１２を参照のこと。
【０１７６】
［１８９.］  二量体は、ＳＤＳ−ｐａｇｅ電気泳動、ゲルろ過クロマトグラフィ、ＥＬＩＳＡ、ラジオレセプタ結合及びＦＡＣＳにより特徴づけされた。二量体の見かけの親和性は、結合活性力に起因して、単量体よりも高いものであった。この効果は、グリコカリシンに対するＥＬＩＳＡ、ＫＧ−１細胞に対するＦＡＣＳ及びラジオレセプタアッセイ内での競合により確認された。
【０１７７】
［１９０.］  Superdex７５ゲルろ過カラムからの再折畳み及び精製後の二量体のプロファイルを描くため、ＨＰＬＣが実施された。図１０では、Ｙ１−ｃｙｓ−ｋａｋ（二量体）は、左側で最初のピーク（〜１０．８分）であり、その後のピークは単量体（〜１２分）である。同じカラム上でランさせたタンパク質サイズマーカーに従うと、二量体は約５２ｋＤａで、単量体は２６ｋＤａである。二量体と単量体の間のバランスは、再折畳み条件（酸化された作用物質の濃度及び再折畳み緩衝液中のタンパク質の濃度）を変動させることによって変更できる。二量体及び単量体は、super-dex７５カラム内のクロマトグラフィにより分離された。
【０１７８】
［１９１.］  図１１では、二量体及び単量体の混合集団を伴うゲルが示されている。還元された形態では、２つの単量体間の還元に起因して、単量体が見られ、未還元形態では（ゲルろ過実験の場合のように）２つの集団、すなわち約３０ｋＤａの単量体画分と約６０ｋＤａの二量体が見られる。
【０１７９】
［１９２.］  さらに、ＫＧ−１細胞に対するＦＡＣＳ結合分析は、２又は３段階結合検定が実施された時点で、二量体が単量体よりもさらに感応性が高いということを示した。ＦＩＴＣによって直接標識づけされた二量体は、単量体よりもわずかに利点を示した（材料使用量が約１０分の１少ない）。二量体を競合物質として用いたＫＧ−１細胞上のラジオレセプタアッセイは、二量体が単量体よりも３０倍高い効率をもつことを示した。
【０１８０】
［１９３.］  スペーサの長さを変動させることは、二量体、三量体及び四量体を形成するさらにもう１つの好ましい方法である（当該技術分野において往々にしてそれぞれ、diabodies, triabodies及びtetrabodiesと呼ばれる）。ｓｃＦｖの２つの可変鎖をつなぐスペーサが一般的に＜？＞まで短縮される条件の下で、二量体が形成される。この短縮されたスペーサは、同じ分子からの２つの可変鎖が１つの機能的Ｆｖドメイン内に折畳むのを防ぐ。その代り、該ドメインはもう１つの分子の相補的ドメインと強制的に対合されて２つの結合ドメインを作り出す。好ましい方法では、diabody構築のために、わずか５個のアミノ酸（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）のスペーサが使用された。この二量体は、２つの同一のｓｃＦｖｓからか又は２つの異なるｓｃＦｖｓ集団から形成され得、親ｓｃＦｖ(ｓ)の選択的及び／又は特異的な増強された結合活性を保持しかつ／又は増大した結合強度又は親和性を示すことができる。
【０１８１】
［１９４.］  類似の要領で、ｓｃＦｖの２つの可変鎖をつなぐスペーサが一般的に５個未満のアミノ酸残基まで短縮され、同じ分子からの２つの可変鎖が１つの機能的Ｆｖドメインへと折畳むのを防ぐ条件下で、triabodiesが形成される。その代り、３つの分離したｓｃＦｖ分子が会合して三量体を形成する。好ましい方法においては、この柔軟なスペーサを完全に除去することによって、triabodies が得られた。triabodyは３つの同一のｓｃＦｖｓからか又は２つ又は３つの異なるｓｃＦｖｓ集団から形成され得、親ｓｃＦｖ(ｓ)の選択的及び／又は特異的な増強された結合活性を保持しかつ／又は増大した結合強度又は親和性を示すことができる。
【０１８２】
［１９５.］  類似の要領で、ｓｃＦｖの２つの可変鎖をつなぐスペーサが一般的に５個未満のアミノ酸残基まで短縮され、同じ分子からの２つの可変鎖が１つの機能的Ｆｖドメインへと折畳むのを防ぐ条件下で、tetrabodiesが形成される。その代り、４つの分離したｓｃＦｖ分子が会合して四量体を形成する。tetrabodyは４つの同一のｓｃＦｖｓからか又は異なるｓｃＦｖｓ集団からの１〜４個の個々の単位から形成され得、親ｓｃＦｖ(ｓ)の選択的及び／又は特異的な増強された結合活性を保持しかつ／又は増大した結合強度又は親和性を示すはずである。
【０１８３】
［１９６.］  スペーサの長さが一般にアミノ酸残基５個未満である条件下でtriabodies又はtetrabodiesのいずれが形成されるかは、混合物内の特定のｓｃＦｖ(ｓ)のアミノ酸配列及び反応条件により左右される。
【０１８４】
［１９７.］  好ましい方法においては、ビオチン／ストレプトアビジン会合を介して四量体が形成される。（本書でＹ１−biotag又はＹ１−Ｂと呼ばれている）ビオチンで酵素的に標識づけされる能力をもつ新規の発酵構成体が作り出された。ＢirＡ酵素のための基質である配列が、Ｙ１Ｃ−末端で付加された。ＢirＡ酵素は、この配列内でリジン残基に対しビオチンを付加する。Ｙ１−biotagはE.coli中でクローニングされ、発現された。封入体材料は単離され、再度折畳まれた。折畳まれたタンパク質の純度は９５％を上回り、１−Ｌ培養（小規模で最適化されていない条件）から１００mgを上回る純度が得られた。この形態の分子量は、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分光法に従って、ｓｃＦｖのものと類似していることがわかった。Ｙ１−biotagは、ＦＡＣＳ分析のために最も一貫性ある試薬であることが発見された。しかしながら、ＫＧ−１細胞に結合するＹ１−biotagが血清の存在下で検査された場合、血清不在下での匹敵する結合のために高い濃度（１０倍以上）が必要とされる。それでも、この構成体は、分子の結合部位が無傷の状態にとどまっている特異的ビオチニル化という利点を提供した。さらに、各々の分子は、１つのビオチンのみで標識づけされ、各分子はカルボキシ末端上で１つのビオチンを受け取る。
【０１８５】
［１９８.］  標識づけを所望の場所で１つのビオチン／分子に制限することで、ストレプトアビジンでの四量体の産生が可能となった。四量体は、ストレプトアビジン−ＰＥでＹ１−Ｂをインキュベートすることによって形成された。
【０１８６】
［１９９.］  ＦＡＣＳ分析では、Ｙ１−biotag及びストレプトアビジン−ＰＥにより作られた四量体が、血清不在下でＹ１ｓｃＦｖ 単量体より１００〜１０００倍高い感応性をもつことを示した。ストレプトアビジン−ＰＥでのＹ１−biotag四量体は、Ｙ１−反応性細胞系統（ＫＧ−１）の１つに特異的に結合すると思われる。バックグラウンド結合からのこの反応の格差は非常に高く、低量のレセプタを検出するための高い感応性を提供した。Ｙ１−ＳＡＶ四量体での正常な全血のＦＡＣＳ評価は、反応性の高い集団が全く存在しないことを示した。単球及び顆粒球は、低い程度で陽性であった。例えばＫＧ−１細胞の場合のような陽性結果が存在した細胞系統では、四量体は少なくとも１００倍反応性が高かった。
【０１８７】
［２００.］  次に、四量体は、細胞標本と共にインキュベートされた。低用量のＹ１四量体（５ng）が、細胞系統（ＫＧ−１）に良く結合し、その他のＹ１抗体形態で以前に観察されたものよりも１０〜２０倍高い応答を提供する。様々な用量の四量体で陰性の細胞系統を検査した場合、わずかな反応が見られた。
【０１８８】
［２０１.］  本発明の１実施形態は、
第１及び第２の細胞上の未知の免疫交差反応性結合部位に結合するターゲティング分子を同定するための方法において、（ａ）第１の状態ではなく第２の状態において、１つの未知のリガンドを含む結合部位を実質的に露呈又は表示する第１の標的細胞に対して行われ、かくして認識分子の第１の集団を生成する単数又は複数回のバイオパンニング段階；（ｂ）第２の認識分子集団を生成するべく第１の細胞の未知のリガンドに対する免疫交差反応性をもつ１つの未知のリガンドを含む結合部位を表示する第２の細胞に対して実施される、段階（ａ）の認識分子の結果として得られたストックから開始した後続するバイオパンニング及び／又は選択段階を実施する段階；（ｃ）段階（ｂ）の認識分子の第２の集団の増幅及び精製段階；及び（ｄ）第２の細胞上の未知のリガンドについて選択的かつ／又は特異的であるターゲティング分子を含んで成るペプチド又はポリペプチドを段階（ｃ）の精製済み認識分子の認識部位から構築する段階、を含んで成る、ターゲティング分子の同定方法を提供する。
【０１８９】
［２０２.］  １つの好ましい実施形態は、第１の細胞が正常な細胞であり、第１の状態が活性化されていない状態であり、第２の状態が、活性化、励起、修飾、変更又は妨害を受けた状態であるようになっている。より好ましい実施形態では、第２の細胞は病的細胞である。さらにより好ましい実施形態では、病的細胞は癌細胞である。この癌細胞は、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫であり得るがこれらに制限されるわけではない。さらに一層好ましい実施形態では、細胞は白血病細胞である。最も好ましい実施形態では、白血病細胞は、ＡＭＬ細胞である。
【０１９０】
［２０３.］  医薬品の製造における、任意には薬学的作用物質と会合された、又はそれに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された状態にある、ペプチド又はポリペプチドの使用を提供している。好ましい１実施形態では、医薬品は、病的細胞に対抗する活性をもつ。より好ましい実施形態においては、活性は、癌細胞に対するものである。癌細胞は、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫であり得るが、これらに制限されるわけではない。さらに一層好ましい実施形態においては、癌細胞は白血病細胞である。最も好ましい実施形態においては、白血病細胞はＡＭＬ細胞である。
【０１９１】
［２０４.］  本発明の１実施形態は、異なる単量体ｓｃＦｖｓの混合物及び／又は、異なるｓｃＦｖｓから構築されたdiabodies又はtriabodies又はtetrabodiesの混合物を含んで成る薬学組成物を提供している。
【０１９２】
［２０５.］  さらにもう１つの実施形態は、医薬品の製造における、任意には薬学的作用物質と会合された、又はそれに付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合させられた状態にある、本発明のペプチド又はポリペプチドの使用を提供している。該医薬品は、病的細胞に対抗する活性、より特定的には癌細胞に対抗する活性を有することができる。癌細胞は、癌腫、肉腫、白血病、線腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫であり得るが、これらに制限されるわけではない。より好ましい実施形態においては、医薬品は白血病細胞に対し活性をもつ。最も好ましい実施形態においては、医薬品は、ＡＭＬ細胞に対して活性をもつ。前記細胞に対する該医薬品の活性は、癌様成長の遅延、あらゆる成長の完全な予防又は癌様細胞の死滅をひき起こす可能性がある。
【０１９３】
［２０６.］  本発明の１実施形態においては、医薬品又は薬学組成物の活性は、細胞成長を阻害することによる。
【０１９４】
［２０７.］  本発明のペプチド又はポリペプチドは、癌細胞好ましくは白血病細胞そして最も好ましくはＡＭＬ細胞の成長を阻害する上で使用するための組成物、好ましくは薬学組成物を調製する目的で使用することができる。本発明の１実施形態においては、ペプチド又はポリペプチドは、癌細胞の成長の阻害において使用するための組成物を調製する目的で使用でき、この組成物は、癌細胞に選択的及び／又は特異的な薬学的リガンドをもつ少なくとも１つの化合物を含んで成る。
【０１９５】
［２０８.］  対象の発明のペプチド又はポリペプチドは、単独で患者に対して投与することができ、そうでなければ、薬学的有効量の薬学的作用物質、薬学的に有効な担体そして任意にはアジュバントと会合された、又はこれに接合、リンク又は融合された状態で医薬品又は薬学組成物を含むものとして投与可能である。かかる薬学組成物は、タンパク質、希釈剤及び酸化防止剤を内含していてよい（Osol et al. (eds.), Remington’s Pharmaceutical Sciences（第１６版）、Mack Publishing Company（１９８０）参照）。
【０１９６】
［２０９.］  もう１つの実施形態においては、薬学的作用物質は、ペプチド結合によって本発明のペプチド又はポリペプチドにリンクされている抗体又はそのフラグメントである。
【０１９７】
［２１０.］  好ましい１実施形態においては、毒素は、例えば、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン又はそれらの修飾又は誘導体である。
【０１９８】
［２１１.］  好ましい実施形態においては、使用される放射性同位元素は、位置特定及び／又は療法用に用いることのできるガンマ放出源、陽電子放出源及びＸ線放出源及び療法用に用いることのできるベータ放出源及びアルファ放出源を内含する。
【０１９９】
［２１２.］  対象の発明の特定の実施形態においては、治療用放射性同位元素は、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルリウム、122mテルリウム、125mテルリウム、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123イオジン、126イオジン、131イオジン、133イオジン、81mクリプトン、33キセノン、99イットリウム、213ビスマス、77ブロミン、18フルオリン、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムを含むグループの中から選択される。
【０２００】
［２１３.］  対象の発明のもう１つの特定の実施形態においては、抗癌剤は、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ｃｉｓ−プラチナ、トキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体を含むグループの中から選択される。
【０２０１】
［２１４.］  本発明の１実施形態は、一定量の本発明のペプチド又はポリペプチドと癌細胞を接触させる段階を含む癌細胞の成長の阻害方法を提供している。好ましい実施形態においては、癌細胞は、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫であり得るが、これらに制限されるわけではない。より好ましい実施形態においては、癌細胞は白血病細胞である。最も好ましい実施形態では、白血病細胞は、ＡＭＬ細胞である。本発明の１実施形態は、患者のin vivo及びex vivo処理を可能にする。本発明のより特定的な実施形態は、異常な基幹細胞を除去するべく自己由来骨髄のex vivoパージングを可能にする。
【０２０２】
［２１５.］  本発明のさらに特定的な実施形態においては、白血病患者の血液を、抗癌剤に接合された本発明のペプチド又はポリペプチドを含む系を通してex vivoで循環させることができる。結合した細胞及び未結合の抗癌剤の除去後、血球を患者の体内に再度導入させることができる。代替的には、白血病患者の血液を、固相に付着させられた本発明のペプチド又はポリペプチドを含む系を通してex vivoで循環させることが可能である。系内を通過し固相に付着した本発明のペプチド又はポリペプチドに結合しなかった細胞は、患者の体内に再導入させることができる。
【０２０３】
［２１６.］  本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、ペプチド又はポリペプチドは、移植に先立ち異常な基幹細胞を除去するべく懸濁状態のex vivo自己由来骨髄用に利用される。異常基幹細胞のパージングは、本発明のペプチド又はポリペプチド（すなわちターゲティング分子）、その構成体、フラグメント、構成体のフラグメント又はそのフラグメントの構成体が結合されている固体支持体（例えば磁気ビーズ及び親和性カラム、ただしこれらに制限されるわけではない）上に懸濁液を走行させることによって実施可能である。かくしてex vivoでパージされた骨髄はこのとき、自己由来の骨髄移植のために使用できる。この好ましい実施形態は、白血病患者の骨髄から放出された基幹細胞に結合するものの健康なドナーの骨髄から放出された基幹細胞には結合しないファージミドクローン（Ｙ１）の本発明における同定に基づいている。類似の要領で、Ｙ１ファージミドクローンは、ＦＡＣＳ分析により異常であることが見極められた芽細胞ならびに白血病細胞に結合する。
【０２０４】
［２１７.］  本書では、芽細胞は、哺乳動物生体内の全ての循環細胞にとっての前駆体である一次細胞として定義づけされる。それらの始原特性のため、芽細胞は、成人生体の体内には有意な量で循環しているところが発見されていない。外因性刺激無しでの循環する芽細胞の存在は、例えば造血系の悪性腫瘍を表わすものであり、その後のその消滅は、悪性疾患の緩解を表わしている可能性がある。
【０２０５】
［２１８.］  本発明のもう１つの実施形態においては、薬学組成物は予防のために用いられる。
【０２０６】
［２１９.］  好ましい実施形態においては、本発明の２つ以上のペプチド又はポリペプチドが組合わされて１つの混合物を形成する。
【０２０７】
［２２０.］  本書で使用されている混合物は、単一の調製物の中に含まれる異なる種の２つ以上の分子又は粒子として定義づけされる。分子の異なる種は、共有化学結合も非共有化学結合も形成しない。
【０２０８】
［２２１.］  対象の発明の１実施形態においては、対象の発明のペプチド又はポリペプチドは、薬学的作用物質にリンク、融合又は接合されている。
【０２０９】
［２２２.］  対象の発明のもう１つの実施形態においては、ペプチドと薬学的作用物質の間のリンクは、直接的リンクである。本書で使用されているように、２つ以上の隣接する分子の間の直接的リンクが、分子内の元素又は元素群の間の化学的結合を介して得られる。化学的結合は、例えばイオン結合、共有結合、疎水性結合、親水性結合、静電結合又は水素結合であり得る。結合は、アミン、カルボキシ、アミド、ヒドロキシル、ペプチド及びジスルフィドを含むグループの中から選択され得るが、これらに制限されるわけではない。直接的リンクは好ましくはプロテアーゼ耐性結合でありうる。
【０２１０】
［２２３.］  さらにもう１つの実施形態においては、ペプチドと薬学的作用物質の間のリンクは、リンカー化合物により作用される。本明細書及びクレーム中で使用されているリンカー化合物は、２つ以上の部分を互いにつなぐ化合物として定義づけされる。リンカーは、直鎖又は有枝鎖リンカーでありうる。有枝鎖リンカーは、２重分岐、３重分岐又は４重以上の有枝化合物から成り得る。リンカー化合物は、ジカルボン酸、マレミドヒドラジド、ＰＤＰＨ、カルボン酸ヒドラジド、及び小型ペプチドであり得るが、これらに制限されるわけではない。その他のリンカー化合物の例としては、コハク酸、グルタル酸、及びアジピン酸といったジカルボン酸；Ｎ−〔ε−マレイミドカプロン酸〕ヒドラジド、４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕ジクロヘキサン−１−カルボキシヒドラジド及びＮ−〔Ｋ−マレイミドウンデカン酸〕ヒドラジド〕といったようなマレイミドヒドラジド；サルファヒドリル反応性タンパク質に接合された（３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオニルヒドラジド）といったＰＤＰＨリンカー；２〜５個の炭素から選択されたカルボン酸ヒドラジド；及び例えば抗癌医薬品ドクソルビシンの遊離糖とｓｃＦｖの間の小型ペプチドリンカを用いた直接的カップリングが含まれる。小型ペプチドには、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Gｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、及びＫＡＫ Ｔａｇが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０２１１】
［２２４.］  対象の発明のペプチド又はポリペプチドの既知のあらゆる投与方法、例えば、静脈内、筋内、皮下、局所的、気管内、鞘内、腹腔内、リンパ内、鼻腔内、舌下、経口、直腸内、膣内、吸入式、口腔内、皮内、経皮又は胸腔内投与を利用することができる。
【０２１２】
［２２５.］  静脈内投与のためには、製剤は好ましくは、患者に投与される量が所望の組成物の約０．１mg〜約１０００mgという有効量となるような形で調製されることになる。より好ましくは、投与される量は所望の組成物約１mg〜約５００mgの範囲内にあるものとする。本発明の組成物は、広い服用量範囲全体にわたり有効であり、治療すべき疾病についての詳細、患者の体内でのペプチド又はポリペプチドベースの薬学組成物の半減期、薬学的作用物質及び薬学組成物の物理的及び化学的特性、薬学組成物の投与様式、治療又は診断を受けるべき患者についての詳細ならびに治療にあたる医師が重要とみなしたその他のパラメータといった要因により左右される。
【０２１３】
［２２６.］  経口投与用の薬学組成物は、錠剤、液体、エマルジョン、懸濁液、シロップ、丸薬、キャプレット又はカプセルの形をしていてよい。薬学組成物は同様に、装置に入れて投与することもできる。
【０２１４】
［２２７.］  局所施用のための薬学組成物は、クリーム、軟こう、ローション、貼付剤、溶液、懸濁液又はゲルの形をとることができる。
【０２１５】
［２２８.］  さらに、薬学組成物は、固体、液体又は持続放出性製剤用に調製可能である。
【０２１６】
［２２９.］  本発明に従って生成される抗体フラグメントを含む組成物は、従来の薬学的に受容可能な希釈剤又は担体を含んでいてよい。錠剤、丸薬、キャプレット及びカプセルは、ラクトース、デンプン及びステアリン酸マグネシウムといったような従来の賦形剤を内含し得る。座薬は、ろう及びグリセロールといった賦形剤を内含することができる。注射可能な溶液は、食塩水といったような無菌の発熱物質無しの媒質を含み、緩衝剤、安定剤又は防腐剤を内含する。従来の腸溶性コーティングも使用することができる。
【０２１７】
［２３０.］  対象の発明は同様に、当該技術分野において既知の合成手段により抗体フラグメントを産生する方法も包含する。
【０２１８】
［２３１.］  本発明の１実施形態は、腫瘍の診断用位置特定及び／又は画像化において使用するための画像化剤に付着、カップリング、組合せ、リンク又は融合された本発明の少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドを含んで成る薬学組成物を含む。
【０２１９】
［２３２.］  本発明のさらにもう１つの実施形態は、標示用マーカー分子に結合された本発明のペプチドを含む画像化剤を含んで成る、治療の前、途中又は後の治療の有効性をin vitroで分析するための診断用キットを提供している。本発明はさらに、癌、より特定的には腫瘍の診断用位置特定及び／又は画像化のために画像化剤を使用する方法において、
ａ）細胞を組成物と接触させる段階；
ｂ）細胞に結合した放射能を測定する段階；
ｃ）腫瘍を視覚化する段階、
を含んで成る方法を提供している。
【０２２０】
［２３３.］  本発明の好ましい実施形態においては、キットの画像化剤は、螢光染料であり、このキットは、癌、より特定的には血液関連の癌、例えば白血病、リンパ腫及び骨髄腫の治療の有効性の分析を提供する。例えば診断時点、治療中、緩解中及び再発中といった疾病の各期における染色強度及び画像化剤により染色された細胞の百分率を決定するために、ＦＡＣＳ分析が用いられる。
【０２２１】
［２３４.］  本発明はさらに、有効量の画像化剤、本発明のペプチド及び生理学的に受容可能な担体を含む組成物を提供する。
【０２２２】
［２３５.］  好ましい実施形態においては、標示マーカー分子は、放射性同位元素、Ｘ線に対し不透明な元素、常磁性イオン又は螢光分子などを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）、当該技術分野において既知の任意のマーカーである。
【０２２３】
［２３６.］  対象の発明の特定的実施形態においては、標示用放射性同位元素は、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルリウム、122mテルリウム、125mテルリウム、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123イオジン、126イオジン、131イオジン、133イオジン、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77ブロミン、18フルオリン、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムであり得るが、これらに制限されるわけではない。
【０２２４】
［２３７.］  もう１つの好ましい実施形態に従うと、標示用マーカー分子は、螢光マーカー分子である。より好ましい実施形態に従うと、螢光マーカー分子は、フルオレセイン、フィコエリスリン又はローダミン又はその修飾又は接合体である。
【０２２５】
［２３８.］  対象の発明は同様に、有効量の本発明の画像化剤、それにリンクされた薬学的作用物質及び生理学的に受容可能な担体を含む組成物をも考慮している。
【０２２６】
［２３９.］  本発明は同様に、画像化剤が器官及び細胞に結合するような条件下で本発明の画像化剤と画像化すべき器官又は細胞を接触させ、結合した画像化剤を画像化させかくして該器官又は細胞を画像化させることが関与する、器官又は細胞を画像化させる方法をも提供する。
【０２２７】
［２４０.］  対象の発明は、さらに、組成物が器官に結合するような条件下で本発明の組成物と治療すべき器官を接触させかくして該器官を治療することが関与する、in vivoで１つの器官を治療する方法を提供している。
【０２２８】
［２４１.］  本発明の好ましい実施形態においては、例えばＦＡＣＳ分析によって細胞を監視し画像化することにより、全血中の悪性細胞、より特定的には白血病細胞を、ターゲティングするために、ペプチド又はポリペプチドを利用してもよい。正常な細胞との関係における腫瘍細胞についてより高い評点（例えば４倍高い）を受けた標本は、治療の対象となる。
【０２２９】
［２４２.］  本発明は、癌を治療するのに有効な量の本発明のペプチド又はポリペプチドを患者に投与することを含む、癌を患う患者の治療を提供する。好ましい実施形態においては、癌は、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫から成るグループの中から選択されている。より好ましい実施形態においては、癌は白血病であり、最も好ましい実施形態においては、白血病はＡＭＬである。
【０２３０】
［２４３.］  最も好ましい実施形態では、本発明のペプチド又はポリペプチドは、特異的又は選択的にＡＭＬ細胞に結合する。本発明は、本発明のペプチド又はポリペプチドに結合されたＡＭＬ細胞上に提示されたリガンド、さらには、このリガンドに結合するペプチド又はポリペプチドを提供する。
【０２３１】
［２４４.］  対象の発明の新規の抗体フラグメント又はその対応するペプチドミメティックは、さまざまな疾病及び身体条件を治療するための組成物又は医薬品の製造において使用される。
【０２３２】
［２４５.］  対象の本発明は、ａ）標的細胞上で直接的にバイオパンニング手順によってか又は第１の状態ではなく第２の状態の第１の標的細胞上で間接的にバイオパンニング手順により又その後第２の標的細胞上で直接的にバイオパンニング手順によって一次認識部位を含む単数又は複数のターゲティング分子を単離し選択して、単数又は複数の前記ターゲティング分子を産生する段階；
ｂ）単数又は複数のターゲティング分子の増幅、精製及び同定段階；及び
ｃ）単数又は複数のターゲティング分子又はその認識部位からターゲティング作用物質を構築する段階、
を含んで成り、該ターゲティング作用物質がペプチド、ポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント又はその多量体であり得る、ターゲティング作用物質の産生方法を提供する。
【０２３３】
［２４６.］  ターゲティング作用物質はさらに、薬学的作用物質にカップリング、付着、組合せ、リンク、融合されているか又はこの薬学的作用物質と会合された状態となるように構築され得る。
【０２３４】
［２４７.］  本発明の好ましい実施形態においては、ターゲティング作用物質は、抗疾病又は抗癌剤である。
【０２３５】
［２４８.］  本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、薬学的作用物質は、放射性同位元素、毒素、オリゴヌクレオチド、組換え型タンパク質、抗体フラグメント、及び抗癌剤を含むグループの中から選択されている。該放射性同位元素は、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルリウム、122mテルリウム、125mテルリウム、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123イオジン、126イオジン、131イオジン、133イオジン、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77ブロミン、18フルオリン、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム及び68ガリウムを含むグループの中から選択されていてよい。
【０２３６】
［２４９.］  さらにもう１つの実施形態では、毒素は、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア、リシン及びそれらの修飾及び誘導体を含むグループの中から選択されている。
【０２３７】
［２５０.］  本発明のさらにもう１つの実施形態においては、抗癌剤は、ドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン（ＭＤＯＸ）、アドリアマイシン、ｃｉｓ−プラチナ、トキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンアルファ、ヒドロキシウレア、テモゾロマイド、サリドマイド、ブレオマイシン及びそれらの誘導体から成るグループの中から選択されている。
【０２３８】
［２５１.］  対象の発明は、（ａ）血液から誘導された細胞と共に、ファージ表示ライブラリをインキュベートすることが関与するバイオパンニング；（ｂ）未結合ファージを除去するための洗浄；（ｃ）血球からの結合したファージの溶出；（ｄ）結果として得られたファージの増幅；及び（ｅ）ペプチドを同定するための、結合したファージの表示されたペプチド配列の決定、により抗体フラグメントを同定するための方法を提供している。
【０２３９】
［２５２.］  対象の発明は、
Ａ−Ｘ−Ｂ
という構造式又は構造をもつペプチド又はポリペプチドであって、式中Ｘが３〜３０個のアミノ酸の超可変ＣＤＲ３領域であり；  Ａ及びＢが各々長さ１〜１０００アミノ酸のアミノ酸鎖であり得、ここでＡがアミノ末端、Ｂがカルボキシ末端である、ペプチド又はポリペプチドを提供している。
【０２４０】
［２５３.］  本発明の好ましい実施形態においては、Ａは、１５０〜２５０個のアミノ酸残基であり、Ｂは、３５０〜５００個のアミノ酸残基である。
【０２４１】
［２５４.］  もう１つの好ましい実施形態においては、ペプチドのＣＤＲ３領域は、５〜１３個のアミノ酸残基である。
【０２４２】
［２５５.］  もう１つの好ましい実施形態においては、上述の構造式内のＸは、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列である。
【０２４３】
［２５６.］  本発明のもう１つの実施形態においては、ペプチド又はポリペプチドは、より大きい又は完全な抗体又は多量体の一部分である。
【０２４４】
［２５７.］  さらにもう１つの実施形態においては、二量体分子は２つのペプチド又はポリペプチドを含み、うち１つは本発明のペプチド又はポリペプチドである。該二量体分子は、本発明の同一の２つのペプチド又はポリペプチドを含んでいてよい。
【０２４５】
［２５８.］  本発明の好ましい実施形態においては、Ｘは前記二量体分子内で、配列番号８〜２４から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列である。
【０２４６】
［２５９.］  もう１つの実施形態は、本発明のペプチド又はポリペプチド又は二量体分子をコードする核酸分子を提供する。
【０２４７】
［２６０.］  本発明は、医薬品の製造における、任意には薬学的作用物質と会合された又はそれに付着、組合せ、リンク又は融合された状態のペプチド又はポリペプチドの使用を提供する。
【０２４８】
［２６１.］  本発明はさらに、病的細胞、より特定的には癌細胞に対抗する活性を持つ医薬品の製造におけるペプチド又はポリペプチドの使用を提供する。癌細胞は、癌腫、肉腫、白血病、腺腫、リンパ腫、骨髄腫、芽球腫、精上皮腫及び黒色腫を含むグループの中から選択され得る。より特定的には、癌細胞は、白血病細胞であり得、最も特定的には、白血病細胞は、ＡＭＬ細胞であり得る。
【０２４９】
［２６２.］  本発明で定義づけされ以下の例中で論述されているような交換可能な系は、分子をさらに操作又は再構築する必要なく構成体の内部での再度画定された可変領域の交換又は置換を可能にするように設計された核酸構成体である。かかる系は、所望の核酸分子の急速かつ便利な調製を可能にする。
【実施例】
【０２５０】
実施例
［２６３.］  以下の例は、本発明を理解する上で一助となるように記されているが、いかなる形であれその範囲を制限するようには意図されておらず、又そのようにみなされるべきものではない。特定の試薬及び反応条件が記述されているが、本発明の範囲により包含されるべく意図された修正を加えることが可能である。従って以下の例は、本発明をさらに例示する目的で提供されている。
【０２５１】
例１：
［２６４.］  １．細胞、細菌菌株、ｓｃＦｖファージ表示ライブラリ、細胞膜の調製及びバイオパンニング手順のためのタンパク質精製。
【０２５２】
［２６５.］  １．１  白血病細胞の調製。血液標本を白血病患者から得た。フィコールクッション上でその他の細胞から単核細胞（一次細胞）を分離した（Iso-prep, Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA, USA）。２５分間、１１０×ｇで遠心分離を実施した。界面にある細胞を収集し、ＰＢＳ中で２度洗浄した。その後、ＲＰＭＩ＋１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の中で細胞を懸濁させ、計数した。長時間の貯蔵のためには、１０％のＦＣＳと１０％のＤＭＳＯをリンパ球に添加し、それを次に、−７０℃で凍結した。
【０２５３】
［２６６.］  １．２  定着した血小板の調製。血液バンクから入手した血小板濃縮物を３７℃で１時間インキュベートした。等体積の２．０％のパラホルムアルデヒドを添加し、血小板を４０℃で１８時間定着させた。低温食塩水で血小板を２回洗浄し（２５００×ｇで１０分間遠心分離）、食塩水中で０．０１％のＨＥＰＥＳ中で再懸濁させ、顕微鏡を用いて計数した。
【０２５４】
［２６７.］  血漿フォン・ウィルブランド因子及びリストセチンに対する血小板の感応性を確認した。血漿フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；１８μｇ／ml）及びリストセチン（０．６mg／ＭＩ）を定着した血小板に添加し、血小板凝集を誘発し、クロノログ・ルミ・血小板凝集計により監視した。
【０２５５】
［２６８.］  １．３  細菌菌株−ＴＧ−１及びＨＢ２１５１：０．５〜０．９のＡ600まで細胞を成長させることにより（対数増殖細胞）、感染のために新鮮な細菌培養を調製した。ファージ伝播のためにE. coli ＴＧ−１細胞を用い、ｓｃＦｖタンパク質の産生のためには、E.coli ＨＢ２１５１細胞を使用した。
【０２５６】
［２６９.］  １．４  ｓｃＦｖ表示ファージライブラリ供給源。ｓｃＦｖライブラリ（Nissim et al., ＥＭＢＯ J., １３，６９２−６９８（１９９４））は、ＭＲＣの合意を得て A. Nissim博士により提供された。ライブラリは当初、中で柔軟なポリペプチドによってＶH及びＶLのドメインがリンクされたｓＦｖ フラグメントを表示するファージミドライブラリとして構築された。ファージミドライブラリ内で表示されたｓｃＦｖｓは、ファージの微量外皮タンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に融合され、これはその後ｐＨＥＮ１ベクターへとサブクローニングされた（Nissim et al., ＥＭＢＯ J., １３，６９２−６９８（１９９４））。抗体フラグメントのレパートリがまず第１に、免疫化されていないヒトの末梢血リンパ球の再配列されたＶ−遺伝子からＲＣＲにより生成された（実験未使用のレパートリと呼ばれる）。レパートリを多様化するため、４９のクローニングされた一連のヒトＶH遺伝子セグメント内に、残基４〜１２個の重鎖ＣＤＲ３長をコードする無作為ヌクレオチド配列を導入した。全てのクローン内の融合されたＶL フラグメントは、生殖細胞系列  ＩＧＬＶ３Ｓ１の突然変異を受けていない単一のＶ遺伝子から誘導され、約１０8クローンの単一ポットライブラリを作り出す。
【０２５７】
［２７０.］  １．５  ＡＭＬ細胞からの膜調製。１０8個の洗浄された細胞を含有するペレットに対し１mlの低温溶解溶液（０．３Ｍのスクロース、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）を添加し、その後４℃で１１０００×ｇで２０分間スピンさせた。上清流体を廃棄し、ペレットをＴＥ（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ中で再懸濁させ、上述のとおりスピンさせた。最終的ペレットを０．４のＡ280で６mlのＰＢＳ中で再懸濁させ、２時間３７℃で、３本のMaxisorbimmuno-管（ＮＵＮＣ）をコーティングするために使用した。コーティングの後、管をＰＢＳで３回洗い流し、次に２時間ＲＴでＭＰＢＳ（ＰＢＳ中の２％の脱脂粉乳）で遮断させた。バイオパンニングの前に、管をさらに３回ＰＢＳで洗い流した。
【０２５８】
例２：
［２７１.］  ２．ファージミド粒子の操作  re：バイオパンニング手順。
【０２５９】
［２７２.］  ２．１  ファージミドの選択及び増幅：特定の関心の的であるエピトープを発現したファージミドを、次の４段階のバイオパンニング手順によりライブラリから選択した：
ａ）  標的に対するファージミド粒子の結合、
より特定的には、洗浄した標的細胞又は細胞膜に対するファージミド粒子の結合、
ｂ）  未結合ファージミド粒子の除去、より特定的には、大規模洗浄による除去、
ｃ）  結合したファージミド粒子の溶出、
ｄ）  溶出したファージミド粒子の伝播及び増幅、より特定的には、E.coli内で伝播及び増幅。
【０２６０】
［２７３.］  ２．２  クローンの同定：  ４段階のバイオパンニング手順を一般的に３〜５回反復した。選択されたファージミドクローンを個々に伝播させ、さらに次の作業により特徴づけした：
ａ）  ＤＮＡ配列決定、
ｂ）  複数の細胞型に対するファージの結合のex-vivoでの比較、
ｃ）  可溶性ｓｃＦｖを産生するためのE. coli HB２１５１の感染。
【０２６１】
［２７４.］  ２．３  配列分析：ファージミド粒子内の〜８００ｂｐのコードされたｓｃＦｖ ＤＮＡを、上流側プライマ＃２０３７４３（５′−ＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴ標的細胞ＣＴＡＣＧＧ）及び下流側プライマ＃１８１３９０（５′−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧ）を用いたＰＣＲにより増幅した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭBig Dye終結サイクル配列決定キット及び上述のプライマを用いて自動ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＤＮＡシーケンサ（３１０ Genetic Analyzer, Perkin Elmer）により両端部からＤＮＡフラグメントを完全に配列決定した。重鎖と軽鎖の間の柔軟なポリペプチド接合部領域にある２つの付加的なプライマ＃１９１１８１（５％−ＣＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ）及びその相補的プライマ＃１９１３４４（５′−ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧ）を配列決定のために使用した。
【０２６２】
例３：
［２７５.］  ３．バイオパンニングプロトコル
【０２６３】
［２７６.］  ３．１  基本的バイオパンニングプロトコル：バイオパンニング手順は、上述のファージ表示技術の一部分である。当該研究作業では、３つのバイオパンニングプロトコルが開発され使用された。
ａ）プロトコルＡＭ（ＡＭＬ細胞膜パンニング／細菌溶出及びそれに続く全ＡＭＬ細胞パンニング／トリプシン溶出）
ｂ）プロトコルＹＰＲ（定着したヒト血小板パンニング／酸溶出）。
ｃ）プロトコルＹＰＮＲ（定着したヒト血小板パンニング／酸溶出）。
【０２６４】
［２７７.］  これらのプロトコルは、以下で詳述されている：
【０２６５】
［２７８.］  ３．１．１  プロトコルＡＭ
【０２６６】
［２７９.］  ３．１．１．１  予備洗浄：−７０℃で貯蔵された患者由来の２×１０7個の凍結したＡＭＬ細胞を含有する１mlのアリコートを３７℃で急速解凍し、１０mlの低温２％ＰＢＳ−ミルク（ＭＰＢＳ）の中に直ちに希釈させた。細胞を室温（ＲＴ）で１２０×ｇでスピンさせ、２回洗浄し、ＭＰＢＳ内で再懸濁させ、血球計で計数した。細胞膜を、第１．５で記述されている通りに調製した。
【０２６７】
［２８０.］  ３．１．１．２  選択は、もとのNissimライブラリからの１０12個のファージミドを含有する２mlのＭＰＢＳの添加により、固定化したＡＭＬ細胞膜上で実施された。３０分間管をゆっくりと撹拌し、次に撹拌することなくさらに９０分間インキュベートし、両方の段階共室温（ＲＴ）で行なった。ＡＭＬ細胞膜上での３ラウンドのパンニングの後、１ラウンドのパンニングを全ＡＭＬ細胞上で実施した。
【０２６８】
［２８１.］  ３．１．１．３  洗浄：余剰の未結合ファージミドを除去するため、管の中味を傾瀉させ、管を１０回ＰＢＳ、０．１％ Tweenで洗浄し、ＰＢＳのみで１０回洗浄した。
【０２６９】
［２８２.］  ３．１．１．４  溶出：管に直接、対数増殖するE.coli ＴＧ−１細胞（２ml）を添加し、３０分間３７℃でゆっくり撹拌しながらインキュベートした。上述のように、滴定のためアリコートを平板固定し、残りの体積を増幅のために平板固定した。
【０２７０】
［２８３.］  ３．１．１．５  増幅：大きな平板からのコロニーをかき取り、プールした。〜０．５のＡ600まで液体培養中でアンピシリン耐性 E.coli ＴＧ−１細胞のアリコート（〜１０7）を成長させ、次にヘルパーファージ（ＶＳＣ−Ｍ１３、Stratagene）で感染させて、大きな増幅されたファージミドストックを生成した。ファージミドを、ＰＥＧ沈殿手順（１８ａ）によりレスキューした。上述の増幅したＴ１６ＭＩストックを後続するパンニングラウンドのために使用した。以前に増幅したストックの１０11個のファージミドを用いて、さらに２ラウンド、選択手順をくり返した。固定化した膜上の３回目のパンニング手順の増幅ストックをＴ１６Ｍ３と呼称した。
【０２７１】
［２８４.］  ３．１．１．６  全細胞に対する再パンニング：３回目の膜パンニングの増幅ストック、Ｔ１６Ｍ３を用いて、無傷のＡＭＬ細胞をパンニングした。２×１０7個の細胞及び１０10個のファージミドコロニー形成単位（ＣＦＵ）（Nissimライブラリ）及び１０13個の野生型バクテリオファージＭ１３を含有する０．５mlのＭＰＢＳ最終体積の中で、４℃で２時間ゆっくりと撹拌しながら選択を実施した。結合したファージミドを、５０μｌのトリプシン：ＥＤＴＡ（０．２５％：０．２５％）を用いて洗浄済み細胞ペレットから溶出し、次に、５０μｌのＦＣＳを添加することにより中和した。滴定及び増幅のため、１mlのE.coli ＴＧ−Ｉ培養（Ａ600＝０．５）を使用した。増幅した最終ストックをＴ１６Ｍ３．１と呼称した。
【０２７２】
［２８５.］  ３．１．２  プロトコルＹＰＲ
【０２７３】
［２８６.］  ３．１．２．１  選択：１mlのＰＢＳ／ＨＥＰＥＳ／１％ＢＳＡ緩衝液中で１０11のファージミド（Nissimライブラリ）で１０8個の定着したヒト血小板をパンニングすることよりクローン選択を達成した。回転により標本を混合しながらＲＴで１時間、結合を行なわせた。
【０２７４】
［２８７.］  ３．１．２．２  細胞洗浄：低速遠心分離（３５００×ｇ）により５回血小板を洗浄し、上述のように再懸濁させた。
【０２７５】
［２８８.］  ３．１．２．３  溶出：酸溶出技術により、定着した血小板から第１ラウンドの結合したファージミドを溶出させた。
【０２７６】
［２８９.］  ２００μｌの０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．２）を用いてＲＴで１０分間血小板をインキュベートした。０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０での中和及び遠心分離の後、２００μｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％／０．０５）を添加し、５０μｌのＦＣＳの添加により中和することによって、残りの血小板結合ファージを溶出した。細胞を遠心分離によって除去し、酸及びトリプシンの両方の溶出プロトコルからの溶出済みファージを含有する上清流体を収集し、それぞれＹＰＲ（ａ）−１及びＹＰＲ（ｔ）−１ストックと呼称した。これらのストックを次に、３７℃で３０分間１mlの対数増殖中のＴＧ−１細胞を添加することで増幅させた。滴定のためアリコートを平板固定し、残った感染したE.coli 細胞を２ｘＴＶ／ＡＭＰ１５cm平板上で固定させた。平板を３０℃で一晩インキュベートした。各々のパンニングラウンド後の排出量を、滴定プレート上のコロニーの計数により決定した。
【０２７７】
［２９０.］  ３．１．２．４  増殖：  クローンを第３．１．１．５節で記述した通りに増幅させた。酸及びトリプシン溶出プロトコルからの、Ｒ１（ａ）及びＲ１（ｔ）ストックと呼ばれる〜１０12ファージミド／mlの増幅されたストックをそれぞれに組合わせ、その後のパンニングのラウンドで使用した。
【０２７８】
［２９１.］  ３．１．２．５  第２及び第３のパンニングラウンドを、以下の修正を加えたＹＰＲ手順の第１のパンニングラウンドについて記述した通りに実施した。すなわち（ｉ）第２のパンニングについては、１０12のＲ１（ｔ）と組合わせて１０12のＲ１（ａ）を使用し、（ｉｉ）グリシン（ｐＨ２．２）のみで溶出を実施した。第２ラウンドの増幅した溶出液をＲ２と呼称した。（ｉｉｉ）第３のバイオパンニングラウンドについては、１０12のＲ２を使用し、第２ラウンドにおいて溶出を行なった。第３ラウンドの増幅ストックはＲ３と呼称された。
【０２７９】
［２９２.］  ３．１．３  ＹＰＮＲプロトコル
【０２８０】
［２９３.］  ３．１．３．１  バイオパンニングと洗浄を、基本的にＹＰＲプロトコルに記述されている通りに実施した。ただし、このプロトコルにおいては、（ｉ）溶出は、グリシン（ｐＨ２．２）での３回のパンニングラウンドの各々の後に実施し、第１回のパンニングと増幅の後には、増幅無しの２回の後続パンニングラウンドが続いた。第１、第２及び第３ラウンドは、それぞれＹＰＮＲ１、ＹＰＮＲ２、及びＹＰＮＲ３と呼称した。
【０２８１】
［２９４.］  ３．２  負の対照ｓｃＦｖクローンの選択
【０２８２】
［２９５.］  ３．２．１  Ｎ１４ＣＤＲ３配列：全ての結合実験について、実験未使用のライブラリ（選択前）から単一のクローンを抜き取った。このクローンから、Ｎ１４と呼ばれる可溶性ｓｃＦｖとファージストックを調製した。配列分析から、それがＶH４−ＤＰ６５遺伝子系統群に属することがわかる。Ｎ１４ ＣＤＲ３と呼称された、このクローンによりコードされたｌｌ−merＶH−ＣＤＲ３の配列は、以下の通りである（配列番号２８）。
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
【０２８３】
［２９６.］  ３．２．２  Ｃ１８１ＣＤＲ３配列：結合分析実験の中で、付加的な負のクローンＣ１８１を使用した。（組換え型Ｂ型肝炎ウイルス［ＨＢＶ］粒子に対する反応性をもつ）クローンＣ１８１は、ＶH３−ＤＰ３５系統群に属し、Ｃ１８１ ＣＤＲ３と呼称されたこのクローンによりコードされた９−merＶH−ＣＤＲ３の配列は、以下の通りである（配列番号２９）：
【０２８４】
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ
【０２８５】
例４：
［２９７.］  ４．ｓｃＦｖクローンの産生、精製、標識付け及び特徴づけ
【０２８６】
［２９８.］  ４．１  可溶性ｓｃＦｖの産生：  もとのファージミドライブラリを構築するために使用されるベクターであるｐＨＥＮ１を、ｓｃＦｖ遺伝子及びｐＩＩ１遺伝子の接合部においてコードされたアンバー停止コドンを用いて設計した。従って、選択されたクローンのベクターが、ファージミド感染によって、非サプレッサ菌株であるE.coli ＨＢ２１５１内に導入された時点で、この系は、細菌周辺質内への可溶性ｓｃＦｖの産生及び分泌を可能にする（Harrison et al., Methods in Enzymology, ２６７，８３−１０９（１９９６））。このときｓｃＦｖは、培養液から容易に回収可能である。可溶性ｓｃＦｖｓは、ＩＰＴＧで誘発されるｌａｃＺプロモータの制御下で産生される（Gilbert and Muller-Hill, ＰＮＡＳ（ＵＳ），５８，２４１５（１９６７））。
【０２８７】
［２９９.］  アンバー突然変異の上流側でベクターの中に、ｃ−ｍｙｃタグをコードする配列（アミノ酸１０個−Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ；配列番号１２３）が含まれている。発現されたｓｃＦｖのＣ末端は、（欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣペプチド又はポリペプチド）９Ｅ１０−ハイブリドーマから誘導された）マウス抗−mycタグ抗体を用いて検出可能であるｃ−mycタグを担持しているはずである。
【０２８８】
［３００.］  ４．２  プロテインＡビーズアフィニティカラム上でのｓｃＦｖの精製；  選択されたクローン及び対照クローンＣ１８１のｓｃＦｖｓは全てＶH３系統群に属し、プロテインＡアフィニティカラム上での精製を可能にする。各クローンの誘発された培養からの周辺質画分（１００−２５０ml）を調製し、プロテインＡセファロースビーズと共にインキュベートした。結合したｓｃＦｖｓを酸性溶液（０．１Ｍのグリシン、ｐＨ３．０）によってカラムから回収し、その後トリスｐＨ８．０で溶出液を中和した。回収したタンパク質の濃度をＡ280測定により決定し、その後、透析によってか又はＧ−２５セファロースカラム上でＰＢＳ緩衝液の交換を行なった。
【０２８９】
［３０１.］  ４．３  セファクリルＳ−２００カラム上でのＮ１４−ｓｃＦｖの精製：負のクローンＮ１４のｓｃＦｖは、ＶH４ 遺伝子系統群に属し、従って、プロテイン−Ａのアフィニティカラム上で精製不可能である。ｓｃＦｖ−Ｎ１４の精製のためには、６０％の硫酸アンモニウムにより、２００mlの誘発培養の周辺質画分を沈殿させた。２mlの０．１×ＰＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＰＭＳＦ中でペレットを再懸濁させ、現行の緩衝液（０．１×ＰＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ）で予め平衡化させたセファエリルＳ−２００カラム（１．５×９０cm）上に投入した。タンパク質を分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン分析によって検出されるようなＮ１４−ｓｃＦｖを含有する画分をプールし、凍結乾燥させ１／１０体積のＨ2Ｏ中で懸濁させた。このときＦＡＣＳ分析実験中で負の対照としてＮ１４−ｓｃＦｖ（標識づけされていないもの及びＦＩＴＣで標識づけされたもの）を用いた。
【０２９０】
［３０２.］  ４．４  ＦＩＴＣでの精製済みｓｃＦｖｓの標識づけ：各々の調製物からの精製されたｓｃＦｖ約１ミリグラムをＰＢＳ中で再懸濁させ、メーカーの指示事項に従って、フルオロ−タグＦＩＴＣ接合市販キット（Sigma カタログ番号ＦＩＦＣ−１）を用いて、ＦＩＦＣにカップリングさせた。
【０２９１】
［３０３.］  ４．５  精製され標識づけされたｓｃＦｖの品質分析
【０２９２】
［３０４.］  ４．５．１  精製及びＦＩＦＣ標識づけの後、各調製物（標識づけされたものとされないもの）のプロファイルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法、Superdex-７５カラム（Ａ２８０及びＡ４９５）を用いたＨＰＬＣ及び螢光光度法によって分析した。該分析は、各ｓｃＦｖ分子に対し約２個のＦＩＴＣ分子が接合されている状態でＮ１４ｓｃＦｖについて８０％の純度及びＶH３クローンについて９０％の純度を示した（２：１のＦ／Ｐ比）。
【０２９３】
［３０５.］  ４．５．２  ｓｃＦｖ特異性の保持を確認するため、ＦＩＴＣ標識づけの後の結合活性を査定した。
【０２９４】
［３０６.］  ４．６  ファージミドクローンの生化学的特徴づけ：構造を評価しさまざまなｓｃＦｖ調製物（例えば例８参照）の純度を査定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析法（Ｙ１及びＹ１７ｓｃＦｖｓのみについて）及びＨＰＬＣを含む複数のタイプの分析を使用した。ｓｃＦｖを同定するためにはウェスタン分析及びＥＩＡを使用し、ｓｃＦｖ結合を特徴づけするためにＦＡＣＳを使用した。
【０２９５】
例５：
［３０７.］  ５．結合検定
【０２９６】
［３０８.］  細胞に対する選択されたクローンの結合は、ファージミドレベルと可溶性ｓｃＦｖレベルの２つのレベルで評価された。
【０２９７】
［３０９.］  ５．１  ファージミドレベルでの結合
【０２９８】
［３１０.］  この目的で、選択されたクローンの各々から個別にファージミドストックを調製した。
【０２９９】
［３１１.］  ５．１．１  コロニー試験：１組の実験で、感染したE.coliにアンピシリン耐性を付与するバイオパンニングプロトコルから誘導された１０9の特異的ファージミドと、アンピシリン耐性をもたず「ブロッカ」として役立つ１０11の野生型Ｍ１３ファージの混合物を、細胞型パネルから選択した１０5個の細胞と共にインキュベートした。インキュベーションと洗浄の後、結合したファージをトリプシンで溶出し、アリコートを用いてE.coliＴＧ−１を感染させた。E.coliを次に２×ＴＹ／ＡＭＰ平板上に固定し、３０℃で一晩インキュベートした。各クローンについて得たコロニーの数を計算し比較した。結果は、ファージミドの結合親和性及び特異性の１つの尺度を提供している。
【０３００】
［３１２.］  ５．１．２  白色／青色コロニー試験：各実験が内部対照を内含しているこの試験においては、特定のファージミドを、ｐＧＥＭ７と呼ばれるもう１つの対象ファージミド（Promega Corp., Madison, Wisconsin,ＵＳＡ）と、上記第５．１．１節と同じ比率すなわち１／１００の比で混合した。このｐＧＥＭ７ファージミドは、アンピシリン耐性を有する；  ただし、これは、そのＰＩＩＩ遺伝子のＮ末端でいかなる組換え型ポリペプチドも発現しない。ＩｍＭ Ｘ−galを含有するアンピシリン平板上でのＴＧ−１感染及びインキュベーションの後、コロニーを計数した。ｐＧＥＭ７を含有する得られたコロニーは青色であるが、一方特異的ファージミドから得られたコロニーは、白色である。各々の試験官について（同じ平板上で成長させられた）白色／青色コロニーの入出力比から誘導された冨化係数を次に計算した。
【０３０１】
［３１３.］  ５．１．３  ファージミドのＥＩＡ
【０３０２】
［３１４.］  ５．１．３．１  選択された細胞に対するファージミドの結合：２４ウェル平板の表面上にアセトン：メタノール（１：１）を用いて約５×１０5の選択された細胞を定着させた。結合試験は１０9のファージミドを必要とした。１時間３７℃で結合を実施し、その後ＰＢＳ／Tween（０．０５％）で大規模に洗浄を行なった。ＰＢＳでの大規模な洗浄の後、平板をウサギ抗−Ｍ１３、抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ及び基質と共にインキュベートした。生成された色の強度は、Ａ４０５でＥＬＩＳＡ平板読取り装置により読取られ、結合されたファージミドのレベルに正比例していた。
【０３０３】
［３１５.］  定着した血小板に対するファージミドの結合：  ポリスチレンマイクロタイター−平板に１０8個の定着した血小板をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。結合を評価するために、約１０10のファージミドを使用した。平板の洗浄及びインキュベーション及び結合レベルの決定は、上記５．１．３．１で記述された通りに行なわれた。
【０３０４】
［３１６.］  ５．１．４  ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＢＳＡ、ＳＭ（脱脂粉乳）及びグリコカリシン（ＧＰＩｂのタンパク質分解フラグメント）から成るグループの中から選択された特異的タンパク質に対する結合検定を実施した。以下の要領で結合を検定した。２μｇ／ウェルで、試験対象のタンパク質の１つでポリスチレンマイクロタイター平板ウェルをコーティングした。４℃で一晩のインキュベーションの間、コーティングを進めさせた。結合をテストするため、約１０10個のファージミドを添加した。ＰＢＳでの大規模な洗浄の後、平板をウサギ抗Ｍ１３、抗−ウサギＢＲＰ、及び基質と共にインキュベートした。生成された色の強度により結合レベルを測定した。Ａ４０５で光学密度を測定した。各標本を全く同一の条件で検定し、平均を計算した。
【０３０５】
［３１７.］  ５．２  ｓｃＦｖレベルでの結合試験：ＨＢ２１５１の周辺質内で生成されたｓｃＦｖｓの結合を、ＥＩＡ及びＦＡＣＳ分析という２つの異なる検定によって複数の細胞型において比較した。
【０３０６】
［３１８.］  ５．２．１  可溶性ｓｃＦｖのＥＩＡ：５〜１０μｇの合計タンパク質と共に約５×１０5のＡＭＬ細胞をインキュベートした。結合を１時間４℃で行ない、その後マウス抗−ｍｙｃ抗体、抗マウスＨＲＰ、及び基質を用いてＥＩＡを行なった。各段階の後、余剰の未結合抗体を、ＰＢＳでの３回の細胞洗浄によって除去した。生成された色の強度をＥＬＩＳＡ平板読取り装置（Ｏ.Ｄ.405）により読みとる。上述の通り、色の強度は、結合レベルに正比例している。
【０３０７】
［３１９.］  ５．２．２  細胞のＦＡＣＳ分析
【０３０８】
［３２０.］  「３段階染色」手順により染色させる細胞の分析：  選択されたクローンの特異性をテストし確認するためにＦＡＣＳ分析を実施した。最初に、まずは粗製抽出物又は精製された標識づけされていないｓｃＦｖ、次にマウス抗ｍｙｃ抗体、そして最後にＦＩＴＣ又はＰＥで接合された抗マウス抗体を用いて、「３段階染色」手順を確立した。
【０３０９】
［３２１.］  ＦＡＣＳ分析には、フィコールで精製されＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中で再懸濁された５〜８×１０5個の細胞が必要である。４℃で１時間結合を行なった。各段階の後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ中で再懸濁させた。最終染色段階の後、ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、２％のホルムアルデヒド中での再懸濁により、細胞を定着させ、次にＦＡＣＳ（Becton. Dickinson）により読取った。
【０３１０】
［３２２.］  ５．２．２．２  一回の染色段階での、ＦＩＴＣで標識づけされたｓｃＦｖでの細胞の染色：  ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ中で５〜８×１０5個のフィコール精製された細胞と共にＦＩＴＣで標識づけされたｓｃＦｖをインキュベートした。結合を４℃で一時間実施した。その後、細胞を、上述の第５．２．２．１節と同じように洗浄し固定し、ＦＡＣＳにより読取った。
【０３１１】
例６：  パンニング及び配列決定の結果
［３２３.］  ６．１  ＡＭプロトコルの結果
【０３１２】
［３２４.］  ６．１．１  ＡＭプロトコルについてのパンニング結果：パンニングのために用いられた推定上のプラスミド数（入力）及びＡＭプロトコルにおいて溶出された推定上の結合したファージミド数（出力）は、下表（表１）中に要約されている：
【０３１３】
【表１】
2004524023.tif 000004
【０３１４】
［３２５.］  各々の連続するパンニングで得られた収量（出力）の冨化に留意されたい。さらに、ＡＭＬ全細胞をパンニングするのにＴ１６Ｍ３が使用された場合いかなる出力低下もなく、このことは結合したファージミドが外部細胞表面上の構成要素に特異的である可能性があること又は、この特異的系が比較的多くの非特異的結合ファージミドを含有し得ることを示唆している。
【０３１５】
［３２６.］  ６．１．２  ＡＭプロトコルについてのクローン配列結果：  クローンはＴ１６Ｍ１、Ｔ１６Ｍ２及びＴ１６Ｍ３出力ストックから取り上げられ配列決定されたものの、以下に示す結果は、主としてＴ１６Ｍ３．１出力ストックから誘導されたクローンのものである（ＡＭＬ無傷細胞パンニング）。クローンＡＭ１０、ＡＭ１１及びＡＭ１２は、Ｔ１６Ｍ３ストック内で同定されたが、その後の出力においては同定されなかった。
【０３１６】
［３２７.］  ＶH−ＣＤＲ３内で表示されたアミノ酸配列及びテスト対象クローンの出力におけるその頻度は、表２にまとめられている。
【０３１７】
表２．Ｔ１６Ｍ３及びＴ１６Ｍ３．１出力からの、ＡＭバイオパンニングプロトコルの後の選択されたクローン。
【０３１８】
【表２】
2004524023.tif 000005
【０３１９】
［３２８.］  Ａrg/Ｇly Ｐhe Ｐroのアミノ酸配列は、表２中に提示された１０個の単離済みクローンのうちの７個に存在し、その中の１つのモチーフを表わしている。さらに、同定されたモチーフが、各ケースにおいてＣＤＲ３領域のＮ末端の３つのアミノ酸を表わすという点に留意されたい。従ってこのモチーフは、さらに大きいペプチド又はポリペプチド又はＦｖ分子の一部分としての又はＣＤＲ３領域の１つ又は両方の端部のいずれかを超えて延びるその他のアミノ酸残基と組合わせた形の又は単独の有効なアンカー又は結合部位である。
【０３２０】
［３２９.］  コア配列 Ａrg/Ｇly Ｐhe Ｐro に基づいて、ＡＭＬ細胞に結合するための高い親和性をもつその他のＣＤＲ３領域を構築することができる。これらは、Ａrg/Ｇly Ｐhe Ｐroコア配列を維持する一方で、添加、欠失又は突然変異により上述の５−１２−mersのいずれかを変動させることによって構築することができる。
【０３２１】
［３３０.］  本発明のＣＤＲ３領域は、アミノ酸配列 Ｒ１−Ａrg/Ｇly Ｐhe Ｐro−Ｒ２を有し、ここでＲ１は０〜１５個のアミノ酸、好ましくは０〜９個、最も好ましくは０〜１個のアミノ酸を含み、Ｒ２は、１〜１５個、最も好ましくは１〜９個のアミノ酸を含む。Ｒ１及びＲ２は、ＡＭＬ細胞に対するＡrg/Ｇly Ｐhe Ｐro 配列の特異的結合に不利な影響を及ぼさないアミノ酸配列である。
【０３２２】
［３３１.］  上述のクローンの軽鎖のＣＤＲ３領域は同一であり、配列番号１２５の中で列挙されている。
【０３２３】
［３３２.］  ６．２  ＹＰＲ及びＹＰＮＲプロトコルの結果
【０３２４】
［３３３.］  ６．２．１  ＹＰＲ及びＹＰＮＲプロトコルについてのパンニング結果：
パンニングのために用いられた推定上のプラスミド数（入力）及び溶出された推定上の結合したファージミド数（出力）は、下表（表３、４）中に要約されている：
【０３２５】
【表３】
2004524023.tif 000006
【０３２６】
［３３４.］  表３は、トリプシン溶出が、第１ラウンドにおける酸溶出と比べて、４倍大きい出力を生み出すことを実証している。
【０３２７】
［３３５.］  増幅段階無しのＹＰＮＲプロトコルに従った再パンニングは、ファージミド感染及び細菌感染を優先的に増幅させる可能性を最小限にした。結果として得られる出力は、表４に描かれている。
【０３２８】
【表４】
2004524023.tif 000007
【０３２９】
［３３６.］  予想通り、表４に示された結果は、各々のパンニングラウンド後のファージ収量の減少を示している。このプロトコルは、非特異的ファージの増幅に起因する偏向を防ぐために使用された。
【０３３０】
［３３７.］  ６．２．２  ＹＰＲ及びＹＰＮＲプロトコルについてのクローン配列結果：  両方のプロトコルからの第３のパンニングからの複数のクローンを、配列決定のために選択した。表５に提示したアミノ酸配列は、重鎖（ＶH−ＣＤＲ３）のＣＤＲ３領域のものである。生殖細胞系列及びＲ３出力に配列が現われた頻度も同じくこの表に示されている。
【０３３１】
表５：Ｒ３出力での、ＹＰＲバイオパンニングプロトコルの後の選択されたＹ系列クローン
【０３３２】
【表５】
2004524023.tif 000008
【０３３３】
［３３８.］  ＹＰＮＲプロトコルからの単離されたクローンの大部分がＹ１でもあった。
【０３３４】
［３３９.］  以上のクローンの軽鎖のＣＤＲ３領域は同一であり、配列番号１２５中に列挙されている。
【０３３５】
例７：
［３４０.］  ７．結合評価結果
【０３３６】
［３４１.］  ７．１  ＡＭＬ細胞（ＡＭクローン系列）に対する選択されたファージミドクローンの結合：  クローンＡＭ７を除いて、テスト対象細胞に対するいかなる優先的な結合も検出されなかった。ファージミドとしてか又は精製されたｓｃＦｖとしての、全ての標的細胞に対するクローンＡＭ７の有意な、ただし非選択的な結合が観察された。結果は、ＡＭクローン系列についてのいかなる冨化も立証していない。
【０３３７】
［３４２.］  ７．２  Ｙクローン系列の結合
【０３３８】
［３４３.］  ７．２．１  ファージミド結合−定着された血小板を用いたＥＩＡ：２つの異なるプロトコルを用いた３回のパンニングラウンドの後、定着した血小板に対する結合についてＥＩＡによりファージクローンをテストした。選択されたクローンの各々からファージミドストックを調製し、これらのクローンを２セットのＥＩＡにおいてテストした。各標本を全く同一の条件で検定し、平均を計算した。結果は、図１にまとめられており、９個のＹ系列クローンのうちの６個が陽性ＥＩＡ反応を示すということを表わしている。最高の結合度は、クローンＹ１、Ｙ１６、Ｙ１７及びＹ−２７と結びつけられた。負の対照としてファージストックＭ１３（野生型バクテリオファージ）及びＥ６（ＣＬＬ白血病細胞について選択されたもの）を使用した。優性クローン、ファージＹ１は、定着した血小板に対する最高の結合を示し、Ｙ１７と共に、Ｍ１３又はＥ６ファージクローンよりもはるかに高い結合を示した。
【０３３９】
例８：
［３４４.］  ８．ｓｃＦｖｓの詳細な特徴づけ及びクローン結合
【０３４０】
［３４５.］８．１  ｓｃＦｖの構造と同定：Ｙ−Ｉの未変性構造を、Superdex７５カラムを用いたＨＰＬＣ分析によって及び質量分析法によって査定した。前者の方法の結果は、調製中の単量体、二量体及び四量体の存在を表わしている。質量分析法は、２６．５ｋＤの予想上の分子量を同定するのに充分な感度をもち、ｃ−mycタグが分割された場合、２４ｋＤの分子量が得られた。
【０３４１】
［３４６.］  しかしながら、上述の核酸配列及び質量分析法の結果に従うと予想分子量が２６．５ｋＤであるにもかかわらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、無傷で未分割の分子が３０ｋＤというみかけの分子量を有するということを表わしている。ｃ−myc−特異的抗体を用いたウェスタン分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの３ｋＤの結果を確認し、ｃ−mycタグが無傷の分子の端部に存在するという言外の意味を裏づけた。２つの手順の結果の間の不一致は、方法の精度レベルならびに、テスト対象タンパク質の見かけの分子量を改変し得るＳＤＳ−ＰＡＧＥの現行の条件に起因している。
【０３４２】
［３４７.］  ８．２  白血病細胞に対する血小板選択されたクローンの結合： 序の部分で記した通り、未成熟の造血細胞上で血小板細胞表面マーカーを発現することが可能である。血小板選択されたクローンの結合をＦＡＣＳ分析によってテストした。全血を染色しその後ＲＢＣ溶解を行なった後、又はIso-prep-（フィコールクッション）で精製された単核細胞について、ＦＡＣＳ分析を実施した。各クローンからｓｃＦｖｓを調製し、プロテインＡ上で精製し、ＦＩＴＣで標識づけした（第４．１節〜４．４節に記述されている通り）。非サプレッサE.coli菌株ＨＢ２１５）内での無傷のｓｃＦｖの産生を可能にするため、グルタミン酸（ＧＡＧ）についてコードするようＤＮＡ部位特異的突然変異誘発によりＹ−２７クローンのＶH−ＣＤＲ３内に発見されたアンバーコドン（ＴＡＧ）を突然変異させた。かかる研究のための標的細胞は、さまざまな白血病患者の新鮮な血液標本から単離された細胞である。標本は、イスラエルにある３つの医療センタから入手した。
【０３４３】
［３４８.］  クローンＹ１及びＹ１７は、テスト対象の白血病細胞に対する優先的な結合を示したが、一方その他の全てのＹ系列クローンは、バックグラウンドレベルでの結合しか示さなかった。表６は、さまざまな白血病細胞に対するＦＩＴＣで標識づけされたＹ−Ｉ及びＹ−１７の結合を示している。
【０３４４】
【表６】
2004524023.tif 000009
【０３４５】
［３４９.］  表６に分数の形で提示されている結果は、その細胞が各々のテスト対象抗体と陽性反応するものとしてＦＡＣＳ分析によって同定された患者の部分を表わしている。分子は、陽性患者の数を表わし、分母密度は、一定の与えられたｓｃＦｖ／細胞型組合せについてテストされた合計患者数を表わす。Ｙ−１７は全てのテスト対象細胞に対し強く結合した。この結合はかくして、細胞選択的でないものとみなされた。しかしながら、Ｙ１結合は、白血病細胞特に急性期にある白血病細胞の複数の試料についてきわめて選択的であることが発見された。Ｙ１−ｓｃＦｖ結合を、以下で記述するようにさらに分析した。
【０３４６】
［３５０.］  ３つのＡＭＬ標本に対するＹＩ結合の代表的結果は、図３に示されている。各々のケースにおいて、細胞集団の大部分が負の対照ｓｃＦｖでの染色により得られたバックグラウンド螢光のものよりもはるかに高い強度で螢光を発する。これらの結果は、各々の患者についてＹ１が合計細胞集団の異なる画分に結合するということを表わしている。各グラフ中の右側Ｙ−Ｉピークは、集団内の最少数のＹ１結合細胞を表わすものと考えられ、このピークより下の合計細胞の割合は、各標本中のＹＩ結合細胞の最小の割合を表わしている確率が最も高い。
【０３４７】
［３５１.］  ８．３  正常な血球に対するＹ−Ｉの結合：  異なる血球型に応じて、フィコール精製された正常な血球に対するＹ１結合を分析した。正常なリンパ球に対する結合は全く検出されなかったが、Ｙ１は、被験者２８名のうち９名からのフィコール精製された単球、被験者８名のうち５名からの血小板、そして被験者４名のうち１名からの赤血球（ＲＢＣ）に対し結合した。ただし、単球調製物の全て及び好中球調製物の多くにおいてＣＤ１４−特異的抗体が細胞に結合した。この分析の要約が表７に示されている。
【０３４８】
【表７】
2004524023.tif 000010
【０３４９】
［３５２.］  これらの結合結果は、各々のテスト対象抗体と陽性反応するものとしてＦＡＣＳ分析によって同定された正常な血液標本の部分を表わす。定着した血小板上で選択されたものの、ＦＩＴＣ−Ｙ１ ｓｃＦｖが血小板に対し相対的に低い結合親和性を示す、という点に留意されたい。
【０３５０】
［３５３.］  図４は、フィコール精製された血小板（４ａ）及び単球ゲートがけされた細胞（４ｂ）に対するＹＩの結合を実証している。単球細胞集団上のシフトは、血小板上で観察されたものよりも大きく、計算上の平均螢光は、負の対照よりもそれぞれ３０倍及び５０倍大きい。この観察事実は、フィコール精製された単球に対し数多く接着する血小板の特性に起因する確率が最も高い。その後の実験により、全血標本で検定された場合、テスト対象の正常な単球、顆粒球、血小板又はＲＢＣのいずれにおいてもいかなるＹ１結合も観察されないということが示された。同様にして、血小板富有血漿（ＰＲＰ）から誘導された場合、血小板に対するＹ１結合が全く見られなかった。同じ結合条件下で（全血中で、ＦＡＣＳ溶解溶液でのＲＢＣ溶解［Becton Dickenson］を伴う）、Ｙ１は、Ficoll精製の後に得られるものと類似の形で白血病細胞に結合した。従って我々は、天然の条件下では、血小板又は単球上のＹ−Ｉエピトープが隠されていると結論づけることができる。フィコール精製手順の間、エピトープは露呈されて、Ｙ１により認識されるべくアクセス可能となっており、一方白血球細胞については、エピトープは、精製条件及び非精製条件の両方の下で露呈されている。
【０３５１】
［３５４.］  リンパ系列及び骨髄系列の正常な造血始原細胞に加えて、臍帯血中の造血基幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）に対するＹ１結合をテストした。図５は、臍帯血ＣＤ３４＋基幹細胞に対するＦＩＴＣ−標識づけされたｓｃＦｖクローンの結合結果を示している。図５ａは、ＦＩＴＣ標識づけされた負の対照ｓｃＦｖに対するＣＤ３４＋ゲート済み細胞の結合の結果を示し、図５ｂは、ＦＩＴＣ標識づけされたｓｃＦｖクローンＹ１に対するＣＤ３４＋ゲート済み細胞の結合についての同じ分析を示している。図５ｃは、５ｂの場合と同じくＦＩＴＣ標識づけされたｓｃＦｖクローンＹ−Ｉ標本のＦＳＣ及びＳＳＣドットプロット分析を示している。この分析の結果は、前方散乱の差を（ＦＳＣ）を細胞サイズの標示として、臍帯血から誘導された２つのＣＤ３４＋基幹細胞亜集団の存在を表わしていた。Ｙ１は、２つの集団の小さい方のサイズの細胞に結合する。図５ｂ及び図５ｃ内の囲まれた部域は、クローンＹ１ｓｃＦｖを結合させるＣＤ３４＋細胞の亜集団の輪郭を描いている。さらなる分析により、小さい方のサイズの細胞が、細胞集団内に存在する死滅した細胞であり、Ｙ１結合が、Ｙ１により認識された細胞内リガンドの存在を表わしている可能性がある、ということがわかった。
【０３５２】
［３５５.］  ＧＭ−ＣＳＦで前処理された健康なドナーの末梢血球についても実験を行なった（ＧＭ−ＣＳＦ処理は、血流内への基幹細胞放出を動員する）。図５に示されたものと類似の結果が得られた。
【０３５３】
［３５６.］  ８．４  ＡＭＬ細胞上のさまざまな細胞マーカーに比べたＹ１ｓｃＦｖの結合特異性：  ＡＭＬ患者からのフィコール精製された末梢細胞及び骨髄細胞のＹ１染色を、その他の一連の抗体によるこれらの細胞の染色と比較した。１４名の患者から得た標本についてのかかるＦＡＣＳ分析の結果が、表８にまとめられている。Ｙ１を内含するテスト対象マーカーの全てについて、さまざまな個体からの調製物内で、染色された細胞の頻度に有意な可変性が存在する、という点に留意されたい。さまざまなマーカーの結合とＹ１の結合の間の相関関係の欠如は、Ｙ１がその他のテスト対象マーカーにより結合されるリガンドのいずれにも結合せず、Ｙ−Ｉリガンドがテスト対象細胞表面マーカーのいずれをも構成しないということを示唆している。
【０３５４】
【表８】
2004524023.tif 000011
【０３５５】
［３５７.］  結果は、各々の個別の抗体と反応する可能性があるものとしてＦＡＣＳ分析によって同定された。一定の与えられた患者のフィコール精製された標本中の細胞の百分率として表現されている。
【０３５６】
［３５８.］  結合検出のために必要とされるＹ１の濃度（〜１μｇ／５×１０5）に照らして、結果は、Ｙ１ｓｃＦｖがＡＭＬ細胞上の特異的リガンドに対して比較的高い結合親和性を有することを表わしている。
【０３５７】
［３５９.］  ＡＭＬ細胞に対するＹ１の結合を示す表８に提示された結果に加えて、我々は以上で（表６）、Ｙ１が、Ｂ−ＡＬＬ細胞を含めたテスト対象のその他の大部分のタイプの白血病細胞にも結合できるものの、これらのその他の白血病細胞試料についての標本サイズには制限があったということを示した。図６は、２人の患者から得た前Ｂ−ＡＬＬ細胞に対するＹ１ｓｃＦｖ結合のＦＡＣＳ分析を提示している。市販のＰＥ標識づけされたＣＤ１９（正常な末梢Ｂ細胞についてのマーカー：図６ａ、図６ｃ）又はＰＥ標識づけされたＣＤ３４（基幹細胞についてのマーカー：図６ｄ）のいずれかを用いた２重染色手順を、ＦＩＴＣ標識づけされた負の対照ｓｃＦｖ又はＦＩＴＣ標識づけされたＹ１ｓｃＦｖと共に利用した。図６ｂは、２重の負の対照である。負の対照染色パターンとの関係における、ＦＩＴＣ標識づけされた標本（ｓｃＦｖクローンＹ１）により結合された細胞の螢光強度（Ｘ軸）が提示されている（６ｅ及び６ｆ）。図６の結果は、テスト対象の２つの標本の各々の内部の白血病前Ｂ−ＡＬＬ細胞の大部分が、Ｙ−Ｉ結合に起因してＹ１ 細胞染色について陽性であることを実証している。
【０３５８】
［３６０.］  ８．５  細胞系統に対するＹ１−ｓｃＦｖの結合：  悪性造血系列から誘導された複数の細胞系統を、Ｙ１により認識されるその能力についてスクリーニングした。ＦＡＣＳ分析は、Ｙ１がテスト対象細胞の多くに結合することを示している（表９）。１つのヒトＢ細胞系統と１つのマウス骨髄細胞系統のみがテストされたという点に留意されたい。重要なことに、この結合は、対数増殖中の細胞に限られていた。静止期にある細胞は一般にＹ１に結合せず、このことはすなわち、Ｙ１リガンド発現が細胞のライフサイクル中規制されているということを表わしていた。さらに、結合強度は、反応する細胞の間で異なっている。この観察事実は、異なる細胞において、リガンドの親和性又は発現レベルに差があるということを暗に意味している。
【０３５９】
【表９】
2004524023.tif 000012
【０３６０】
［３６１.］  ８６  ＤＴＴの存在下で精製されたＹ１の結合：Ｙ１クローンがひとたび選択された時点で、ｓｃＦｖを産生するためのプロセスがさらに開発された。Ｙ１バッチのＦＩＬＣ分析の結果は、タンパク質が多量体化でき、主として単量体及び四量体を形成し、これら２つの形態の間の比率が調製物毎に異なるということを示した。均質な材料を得るためには、プロテインＡセファロースカラム上での親和性精製中に５ｍＭのＤＴＴを添加し、その後ＰＢＳ緩衝液の交換によりこれを除去した。実際、ＤＴＴ処理後、大部分（＞９０％）の材料が単量体画分内で発見された。（ＤＴＴの存在下で精製されＨＰＬＣ上で分析された）Ｙ１の単量体形態の結合とＹ１形態の混合物の結合の間には、有意な差が全く見い出されなかった。
【０３６１】
［３６２.］  ８．７  Ｙ１は白血病細胞に対する特異的クローンである：  Ｙ１カセットは、ＹH−ＤＰ３２生殖細胞系列に属する。同じ生殖細胞系列に由来する複数のその他のクローンを単離し、これについては例６で詳述されている。これらのクローンにはＹ１７、Ｙ−２７及びＹ−４４が含まれている。これらのクローン全ての一次配列（すなわち生殖細胞系列カセット）は、そのＣＤＲ３領域のみにおいて異なっている。しかしながら、Ｙ１のみが白血病細胞に対する選択性を示す。これらのクローンのＣＤ３配列は、表１０に要約されており、クローンの結合プロファイルは表１１に要約されている。
【０３６２】
【表１０】
2004524023.tif 000013
【０３６３】
【表１１】
2004524023.tif 000014
【０３６４】
［３６３.］  表１０及び１１は、一次配列が、ＶH−ＣＤＲ３領域を除いて４つのクローン間で同一であるものの、結合プロファイルはクローン毎に著しく異なっている、ということを示している。この観察事実は、ＶH−ＣＤＲ３領域の配列が、抗原に対する結合部位の特異性において重要な役割を果たすという概念を強化している。ここで、ＣＤＲ３配列の長さも、それが置かれている特異的生殖細胞系列カセットも、結合特異性の主要な決定因子であると思われない、という点に留意されたい。Ｙ１７及びＹ−２７は各々、Ｙ１と同様６−merＣＤＲ３を含み、３つのクローン全ての重鎖が同一の生殖細胞系列から誘導されている。Ｙ１７及びＹ−２７の場合、造血細胞に対する選択的結合は、実証されなかった。
【０３６５】
例９
［３６４.］  ９．１  triabodiesの構築：  もとのＹ１をコードするベクターｐＨＥＮ−Ｙ１を、ＶL及びＶH領域の両方についてＲＣＲを用いて個別に増幅させた。ＶLＰＣＲ反応のためには、センスオリゴヌクレオチド５′−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＣＴ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド５′−ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣを用いた。〜３５０ｂｐの予想されたサイズのｃＤＮＡ産物を精製し、配列決定し、ＸhoＩ及びＮotＩ制限酸素で消化させた。
【０３６６】
［３６５.］  （センスオリゴヌクレオチド５′−ＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド５′−ＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣを用いて）ＶH領域を増幅するために、同じ手順を利用した。ＶHＰＣＲ産物をＮcoＩ及びＸhoＩ制限酸素で消化させた。ＮcoＩ−ＮotＩで予め消化されたｐＨＥＮベクター内への３重連結手順利用した。最終ベクターをｐＴria−Ｙ１と呼称した。
【０３６７】
［３６６.］  E.coli形質転換の後、ＤＮＡ配列決定、タンパク質発現、及び細菌の周辺質空間からの抽出を含めたさらなる分析のため、複数のクローンを取上げた。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を実施して、Ｙ１ triabodiesのサイズを確認した。
【０３６８】
［３６７.］  ９．２  diabodiesの構築
【０３６９】
［３６８.］  以上のものからのpTria−Ｙ１ベクターをＸhoＩ制限酵素で線形化し、合成の相補的２本鎖オリゴヌクレオチド（５′−ＴＣＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴ及び５′ＴＣＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣを予めアニールし、Ｙ１−重鎖とＹ１−軽鎖間でＸhoＩ部位内に連結させた。この新しいベクターを、ｐＤia−Ｙ１と呼称した。Triabodiesについて記述した通りに、ＤＮＡ配列及びタンパク質発現を確認した。
【０３７０】
［３６９.］  ９．３  diabodies及びtriabodiesの発現及び精製
【０３７１】
［３７０.］  E.coli中の発現は、基本的に、ｓｃＦｖ−Ｙ１について上述した通りであった。ただし、形質転換されたE.coli細胞の周辺質からのＹ１ diabodies及びtriabodiesの精製は異なっていた。ｓｃＦｖ Ｙ１単量体形態を、プロテインＡセファロースビーズの親和性カラム上で精製することができた。しかしながらＹ１の単量体形態をこの手順により精製しても、効果は無かった。従って、細菌から抽出された周辺質タンパク質を６０％の硫酸アンモニウムで一晩沈殿させ、Ｈ2Ｏ中に再懸濁させ、０．１×ＰＢＳで予め平衡化したセファクリル−２００（Pharmacia）サイズ排除カラム上に装入した。画分を収集し、ＨＰＬＣで分析し、二量体又は三量体のいずれかの形態を含む別々の画分を、ＦＩＴＣ標識づけ及びＦＡＣＳ分析のために収集した。
【０３７２】
［３７１.］  ９．４  細胞に対するＹ１ diabodies及び triabodiesの結合
【０３７３】
［３７２.］  「３段階染色手順」を用いてジャーカット細胞に対しＦＡＣＳ分析を実施した。最初に、粗製抽出物又は精製済みの標識づけされていないｓｃＦｖが染色され、次にマウス抗−ｍｙｓ抗体、そして最後にＦＩＴＣ−又はＰＥ−接合された抗マウス抗体が染色される。ＦＡＣＳ分析は、フィコール精製されＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中で再懸濁された５〜８×１０5細胞を必要とする。結合は、４℃で１時間実施された。各段階の後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ中で再懸濁させた。最終的染色段階の後、ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、２％のホルムアルデヒド中で再懸濁させることにより細胞を定着させ、その後ＦＡＣＳにより読取った（Becton-Dickinson）。
【０３７４】
［３７３.］  Ｙ１−ｓｃＦｖの結合を、diabodies及び triabodiesのものと比較した。この分析（図７）中、３つの形態全ての結合プロファイルは非常に類似しており、これは、分子中の上述の修飾が、リガンドに対するＹ１の見かけの結合親和性を改変、隠匿又は破壊しなかったことを表している。
【０３７５】
［３７４.］  ９．５  Ｙ１−ｃｙｓ−ｋａｋ（システイン二量体）の産生
【０３７６】
［３７５.］  λｐＬ−ｙｌ−ｃｙｓ−ｋａｋ細菌培養１リットルを２〜３時間４２℃で誘発させた。この培養を３０分間５０００ＲＰＭで遠心分離した。１８０mlのＴＥ中でペレットを再懸濁させた（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＥＤＴＡ）。８mlのリゾチーム（５mg／mlのストックからのもの）を添加し、１時間インキュベートした。５ＭのＮａＣｌ及び２５mlの２５％トリトンを添加し、さらに１時間インキュベートした。この混合物を４℃で６０分間１３０００ＲＰＭで遠心分離に付した。上清を廃棄した。テッシュマイザ（又はホモジナイザ）を用いてＴＥ中にペレットを再懸濁させた。このプロセスを、封入体（ペレット）の色が灰色／明褐色となるまで、３〜４回くり返した。封入体を、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、０．１ＭのトリスｐＨ７．４、２ｍＭのＥＤＴＡ中で可溶化させた（１０mlの可溶化緩衝液中の１．５グラムの封入体は〜１０mg／mlの可溶性タンパク質を提供した）。これを少なくとも４時間インキュベートした。タンパク質濃度を測定し、１０mg／mlの濃度にした。ＤＴＥを６５ｍＭの最終濃度まで添加し、室温で一晩インキュベートした。０．５Ｍのアルギニン、０．１ＭのトリスｐＨ８、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．９ｍＭのＧＳＳＧを含有する溶液に対し１０mlのタンパク質を希釈させる（滴下による）ことにより再折畳みを開始した。再折畳み用溶液を４８時間〜１０℃でインキュベートした。タンパク質を含有する再折畳み用溶液を、２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６、１００ｍＭの尿素を含む緩衝液中で透析し、５００mlsに濃縮した。濃縮／透析済み溶液をＳＰ−セファロースカラムに結合させ、ＮａＣｌ勾配により（最高１Ｍまで）溶出した。
【０３７７】
［３７６.］  ９．６  ＫＧ−１細胞でのラジオレセプタ結合検定（ＲＲＡ）を用いた、ＣＯＮＹ１及びＹ１−ＩｇＧとの比較におけるＳ−ＳＹ１−二量体の親和性研究
【０３７８】
［３７７.］  検定系には、ＹＩ−ＩｇＧ構成体上のクロラミンＴ又はＣＯＮＹ１（Ｙ１ｓｃＦｖ）構成体上のBolton-Hunter試薬を用いた125Ｉでのヨウ化によって調製された放射性リガンドの使用が関与していた。検定用管には、０．２mlあたり５×１０6個のＫＧ−１細胞及びＰＢＳｔ ０．１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４中の変動する量の標識づけされていない競合物質を伴う標識づけされたトレーサが入っていた。４℃で撹拌しながら１時間インキュベートした後、細胞を低温緩衝液で徹底的に洗浄し、放射性計数のため取り上げた。
【０３７９】
［３７８.］  標識づけされたＹ１−ＩｇＧを用いたＲＲＡ研究では、管１本あたり２ngの125Ｉ−Ｙ１−ＩｇＧを使用し、３つの分子の各々で競合を実施した。結果は図８中に記述されている。この図に提示された結果は、Ｓ−ＳＹ１二量体の親和性がＣＯＮＹ１の親和性より３０倍高かったということを実証している。この実験におけるＹ１−ＩｇＧの親和性のおおまかな見積りは２×１０-8Ｍである。従って、二量体の対応する親和性は４×１０-8Ｍである。
【０３８０】
［３７９.］  標識づけされたＣＯＮＹ１を用いた第２のＲＲＡでは、１００ng／本の125Ｉ−Ｙ１−ＩｇＧを使用し、３つの分子の各々で競合を実施した。結果は図９中に記されている。この図は、Ｓ−Ｓ二量体の親和性がＣＯＮＹ１の親和性より２０倍高かったということを実証している。この実験におけるＣＯＮＹ１の親和性のおおまかな見積りは１０-6Ｍである。従って、二量体の対応する親和性は５×１０-8Ｍである。
【０３８１】
［３８０.］  ９．７  ＧＣ（グリコカリシン）に対するＥＬＩＳＡ
【０３８２】
［３８１.］  １００μｌの精製されたグリコカリシンを４℃で一晩、９６フラットウェル付MaxiSorp平板内でインキュベートした。平板をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のTween）で３回、次に２００mlのＰＢＳＴ−ミルク（ＰＢＳＴ＋２％の脱脂乳）で、室温で１時間洗浄した。平板をＰＢＳＴで洗浄し、室温で１時間異なる濃度でＰＢＳＴ−ミルク中に単量体又は二量体（１００μｌ）を添加した。その後、平板を洗浄し、抗−ＶLポリクローナル（Ｙ１から誘導されたＶLを伴う免疫化されたウサギから誘導されたもの）（ＰＢＳＴ−ミルク中で１：１００に希釈）を１時間添加した。平板を洗浄し、さらに１時間抗ウサギＨＲＰを添加した。平板を５回洗浄し、さらに１時間抗ウサギＨＲＰを添加した。平板を５回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質を約１５分間添加し、次に１００μｌの０．５Ｈ2ＳＯ4を添加して反応を停止した。ＥＬＩＳＡ読取り装置内で４５０ｎｍで平板の光学密度を測定した。
【０３８３】
［３８２.］  ９．８  原核生物（E.coli）系内で発現された組換え型グリコカリシン（ＧＣ）とのＹ１の反応性。
【０３８４】
［３８３.］  ヒト血小板ＧＰ１ｂ−グリコカルシン（ＧＣ、アミノ酸１〜アミノ酸４９３）のＮ末端可溶性部分をコードするＤＮＡフラグメントを、ＩＰＴＧ誘発可能な原核生物ベクターカセットへとクローニングした。新しく構築したプラスミドを包含するE.coli（ＢＬ２１、ＤＥ３）細胞を３７℃でO.D. ０．７〜０．８まで成長させ、次に、誘発のためのＩＰＴＧの存在について３時間３７℃で成長させた。天然の半精製されたヒト血小板由来のＧＣか又は、誘発された及び誘発されていない細胞から誘導されたE.coli 細胞リゼイト（合計タンパク質含有量）のいずれかが装入されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを分析した。ｓｃＦｖ Ｙ１−ビオチニル化されたポリクローナルウサギ抗ヒトＧＣ抗体、市販のマウス抗ヒトＣＤ４２モノクローナル抗体（ＳＺ２  Immunotech, ＰＭ６４０ Serotee, ＨＩＰ１ Pharmigen, ＡＮ５１  ＤＡＫＯ）及び、ｇｐＩｂａのＮ末端に対するポリクローナル抗体（Ｓｃ−７０７１、Santa Cruz）を用いて、ウェスタンブロット分析を実施した。２つのポリクローナル抗体は、組換え型細菌由来ＧＣならびに天然のヒト血小板由来ＧＣの両方を認識した。ｓｃＦｖＹ１及び市販の抗体は、天然のヒト由来ＧＣのみを認識し、細菌由来の組換え型血小板ＧＣを認識しなかった。
【０３８５】
［３８４.］  グリコシル化及び硫酸化といったような翻訳後修飾は、ＧＣに対するｓｃＦｖ及び市販の抗体の結合にとって不可欠である。原核生物（E.coli）系には、グリコシル化及び硫酸化といったような翻訳後修飾メカニズムが欠如している。
【０３８６】
［３８５.］  ９．９  Ｙ１の四量体の作製
【０３８７】
［３８６.］  以下の配列、ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥを、ＰＣＲ及びＩＰＴＧ誘発可能発現系へのクローニングによりＹ１のＣ末端で添加した。クローンをＹ１−biotagと命名した。この配列は、遊離ビオチンの不在下で、酵素がビオチンをリシン（Ｋ）残基に共有結合により連結させることのできる、酵素BirＡのための基質である（抗原特異的Ｔリンパ球の表現型分析。Science, １９９６．１０月４；２７４（５２８４）：９４−６，Altman JD et al）。この構成体は、ＢＬ２１細菌細胞中で封入体として産生された。前述の通りに再折畳みを行なった。封入体をグアニジン−ＤＴＥ内で可溶化させた。再折畳みは、アルギニン−トリス−ＥＤＴＡを含有する緩衝液中での希釈によって行なった。透析及び濃縮を実施し、その後HiTrapＱイオン交換精製を行なった。
【０３８８】
［３８７.］  BirＡ酵素（Avidityより購入）及びビオチンと共に、プロバイダによる推奨通りに、精製済みＹ１−biotag ｓｃＦｖをインキュベートした。ＨＡＢＡ試験（分子１個あたりのビオチンの量を推定するもの）により、ビオチニル化されたＹ１−biotagを分析し、１分子あたり約０．８を上回るビオチン分子が存在することが実証された。
【０３８９】
［３８８.］  ビオチニル化したＹ１−biotagをストレプトアビジン−ＰＥ（Phycoerytrin）と共にインキュベートして複合体を形成させ、これを、ＫＧ−１細胞（Ｙ１について陽性）を用いてＦＡＣＳ実験中で使用した。ストレプトアビジンは、最高４つのビオチニル化されたＹ−１−biotag分子を結合させることができる。結合の感応性は、結合力の増加に起因して、少なくとも１０倍増大した。
【０３９０】
［３８９.］  Ｙ１−biotagの配列は、以下の通りである：
【０３９１】
【化３】
2004524023.tif 000015
【０３９２】
［３９０.］  例１０：  フルサイズのＹ１−ＩｇＧ１の構築
【０３９３】
［３９１.］  全ＩｇＧ分子は、in vivoでのより長い半減期及びＡＤＣＣ又はＣＤＣ（補体依存性細胞毒性：Tomlinson, Current Opinions of Immunology, ５，８３−８９（１９９３））により媒介されるものといったようなin vivoでの細胞応答を誘発する潜在性を含め、Ｆｖ形態に比べていくつかの利点を有している。以下で記述する分子クローニングアプローチにより、我々は、Ｙ１Ｆｖ領域をフルサイズのＩｇＧＩ分子へと変換した。以下の順序でｃＤＮＡのフラグメントをつなぐことによってＹ１ＩｇＧＩ構築を達成した。
【０３９４】
［３９２.］  １０．１  哺乳動物の発現系のための相容性あるリーダー配列：  完全ＩｇＧ分子に必要とされる要素の適切な挿入を可能にするように、交換可能な系を設計した。推定上のリーダー配列をコードする以下の相補的２本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、アニールし、哺乳動物発現ベクターのＸhoＩ部位内に連結した（ＳＲα５プロモータの下で）。
【０３９５】
【化４】
2004524023.tif 000016
【０３９６】
開始ＡＴＧコドンの上流側に、２つのKozak要素を含み入れた。さらに、可変的領域のサブクローニングを可能にするためＸhoＩ部位とリーダー配列の推定上の分割部位の間に内部ＥcoＲＶ部位を導入した。この修飾済みベクターをｐＢＪ−３と命名した。
【０３９７】
［３９３.］  １０．２  リーダー及び定常軽量領域コーディング配列の間にＶ１ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ配列から誘導されたＶLコーディング配列を挿入した。同様にして、リーダー及び定常重量領域コーディング配列の間にはＹ１ ｓｃＦｖ ｃＤＮＡ配列を挿入した。これは、個別にＹL及びＶH領域を得るため、もとのＹ１についてコードするベクターｐＨＥＮ−Ｙ１のＰＣＲ増幅により達成された。
【０３９８】
［３９４.］  １０．３  オリゴヌクレオチド
ＶLＰＣＲ反応のためには、５′−ＴＴＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡ（センス）及び５′−ＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧＴ（アンチセンス）を使用した。〜３５０ｂｐの予想サイズのｃＤＮＡ産物を精製し、配列決定し、ＥcoＲＶ及びＡrtＩＩ制限酵素で消化した。それぞれセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド  ５′−ＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）ＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣ及び５′−ＧＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧを用いて、同じ手順を利用してＶHｃＤＮＡ領域を増幅し精製した。
【０３９９】
［３９５.］  １０．４  定常領域：  ＩｇＧ１ｃＤＮＡについて誘導された定常λ３（ＣＬ−λ３）領域及び定常重量領域  ＣＨ１〜ＣＨ３を、以下のとおりに個々に合成した：
【０４００】
［３９６.］  １０．４．１  定常ＣＬ−λ３領域については、センス５′−ＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣ及びアンチセンス５′−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴオリゴヌクレオチドと組合わせて通常の末梢Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）のプールから抽出したｍＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施した。予想されたサイズ（〜４００ｂｐ）のＰＣＲ産物を精製し、配列決定し、ＡvrＩＩ及びＮotＩ制限酵素で消化させた。
【０４０１】
［３９７.］  １０．４．２  定常ＩｇＧＩ領域（γ鎖）については、ＢＴＧで不死化させたヒトＢ細胞クローン（ＣＭＶ―クローン＃４０）を、ＰＣＲ増幅のために選択した。このクローンは、ヒトＣＭＶに対するＩｇＧＩを分泌することが示され、同様に、in vitro検定においてＡＤＣＣ応答を誘発することも示された。ＣＨ１〜ＣＨ３ ｃＤＮＡについては、オリゴヌクレオチド５′−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＴＣＴＴＣ（センス）及び５′−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣ（Ａ／Ｇ）ＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴ（アンチセンス）を合成し、ＰＣＲ増幅のために使用した。ＣＬ ｃＤＮＡコーディング配列について記述したとおりに、予想されたサイズ（〜１５００ｂｐ）のＰＣＲ産物を精製し、配列決定し、ＡvrＩＩ及びＮotＩ制限酵素で消化させた。
【０４０２】
［３９８.］  １０．５  最終発現ベクターについては、ＥcoＲＶ−ＮotＩ予備消化済みベクター、ＥcoＲＶ−ＡvrＩＩ可変ｃＤＮＡ及びＡvrＩＩ−ＮotＩ定常領域を用いて３重連結手順を実施した。重鎖及び軽鎖発現のための最終ベクターをそれぞれＹ−Ｉ−ＨＣ及びＹ１−ＬＣと呼称した。
【０４０３】
［３９９.］  １０．６  ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＡＣ）に基づく２重選択を可能にするべくＹ１−ＬＣに基づいて付加的ベクター、ｐＢＪ−Ｙ１−ＬＰを構築した。このベクター内で、Ｙ１−ＬＣプラスミドのネオマイシン耐性遺伝子は、（ｐＭＣＣ−ＺＰベクターからの）ＰＡＣ遺伝子についてコードする〜１６００ｂｐのフラグメントで置き換えられた。
【０４０４】
［４００.］  １０．７  Ｙ−１−ＩｇＧ−ＨＣ及びＹ１−ＩｇＧ−ＬＣの両方の読取り枠（ＯＲＦ）とそれらのコードされたアミノ酸配列が、以下で提示されている：
【０４０５】
［４０１.］  １０．７．１  Ｙ１−ＩｇＧ−ＨＣ（ＶH ＣH１ ＣH２ ＣH３）のＯＲＦ
【０４０６】
【化５】
2004524023.tif 000017
【０４０７】
［４０２.］  １０．７．２  Ｙ１−ＩｇＧ−ＬＣ（ＶLＣL）のＯＲＦ
【０４０８】
【化６】
2004524023.tif 000018
【０４０９】
［４０３.］  リーダー配列には下線が施されている。ＶH及びＶL領域は各々、太字で示したアミノ酸配列によりコードされ、その後にはＩｇＧ１（重鎖について）、又はλ３（軽鎖について）定常領域配列が続いている。
【０４１０】
［４０４.］  １０．８  ＣＨＯ細胞中のＹ１重鎖及び軽鎖の発現。
重鎖又は軽鎖を発現する安定した細胞のトランスフェクション及び選択のために、個別にベクターＶ１−ＨＣ及びＹ１−ＬＣを使用した。Ｇ４１８についての選択及び細胞成長の後、上清中の分泌されたタンパク質を以下に記述する通りに捕捉ＥＩＡ検定及びウェスタンブロット分析によりＩｇＧＩ発現について分析した。
【０４１１】
［４０５.］  １０．８．１  捕捉ＥＩＡ検定：  ９６ウェル付き平板のウェルにマウス抗ヒトＩｇＧＩＦｃ（Sigma）を予めコーティングした。上述のものからの上清をウェルに添加し、ビオチニル化されたヤギ抗γ鎖特異的抗体（Sigma），ストレプトアビジン−ＨＲＰ及び基質について重鎖ＩｇＧ１の存在を検出した。ＥＬＩＳＡ平板読取り装置が、Ａ405での顕色を監視した。
【０４１２】
［４０６.］  １０．８．２  ウェスタンブロット分析：  上述の細胞についての上清を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で走らせた。各鎖の発現を、（ａ）重鎖検出のためにはヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ；Sigma Cat ＃８６６７）で、又（ｂ）軽鎖検出のためにはビオチニル化されたヤギ−抗ヒトλ３鎖（Southern Biotechnology Association, （at＃２０７０−０８）で検出した。
両方の鎖の発現を、上述の検定によって確認し、フルサイズのＹ１−ＩｇＧ１を得るために同時トランスフェクションを実施した。
【０４１３】
［４０７.］  １０．９  Ｙ１−ＩｇＧの発現及び精製
【０４１４】
［４０８.］  １０．９．１  細胞培養及びトランスフェクション：  ５％ＣＯ2の雰囲気中で３７℃で１０％のウシ胎児血清及び４０μｇ／mlのゲンタマイシンを伴うＦ−１２培地中でＣＨＯ細胞を培養した。トランスフェクションの一日前に、０．８×１０6個の細胞を９０mmの皿上に播種した。Fu Gene（Roche）トランスフェクション試薬技術により、１０μｇの軽鎖及び重鎖ＤＮＡで培養を同時トランスフェクションした。非選択培地中で２日間成長させた後、細胞を、５５０μｇ／mlのネオマイシン及び３μｇ／mlのピューロマイシンを含有するＦ−１２培地中で１０〜１２日間培養した。細胞をトリプシン処理し、Costarの９６ウェル平板内で１ウェルにつき０．５個の細胞の限界希釈によりクローニングした。個々のコロニーを採取し、６ウェル皿の中で成長させ、フラスコに移した。
【０４１５】
［４０９.］  １０．９．２  重鎖及び軽鎖分泌の決定：  トランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞の上清の中に分泌された抗体の濃度を決定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡ検定を使用した。抗体の濃度を決定するためには、以下の試薬を用いた：  コーティングされた抗体としてのモノクローナル抗ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ）（Sigma）、検出要素としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ−鎖特異的）ビオチン接合体（Sigma）及び、標準としての純粋ヒトＩｇＧ１ラムダ（Sigma）。このＥＬＩＳＡ検定に基づくと産生速度は３〜４μｇ／mlの間で変動した。
【０４１６】
［４１０.］  １０．９．３  細胞からのＭＡｂ産生及び精製：  ネオマイシン及びピューロマイシンで捕捉した１０％のウシ胎児血清を伴うＦ−１２培地の中で１びんにつき１〜２×１０8個の細胞という最終濃度まで、ローラーボトル内で細胞を生成させた。産生のためには、細胞を同じ培地内で、ただし２％のウシ胎児血清を伴って、さらに２日間培養した。分泌された抗体をプロテインＧ−セファロースカラム（Pharmacia）上で精製した。結合は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で行なわれ、溶出は０．１Ｍのグリシン緩衝液ｐＨ２．５〜３．０で実施された。精製された抗体の数量は、ＵＶ吸光度により決定された。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。非変性条件下で、完全ＩｇＧ抗体は、１６０ｋＤというその予想上の分子量を有している。変性ゲル内では、重鎖及び軽鎖の両方共、それぞれ５５及び２８ｋＤという予想上の分子サイズを有する。
【０４１７】
［４１１.］  フルサイズＹ１−ＩｇＧ分子の結合：ｓｃＦｖ−Ｙ１分子の結合レベルに比べたＹ１−ＩｇＧの結合レベルを決定するために、結合実験を実施した。５nｇのＹ１−ＩｇＧをＲＡＪＩ細胞（負の対照、図７ａ）及びジャーカット細胞（Ｙ１陽性細胞、図７ｂ）の両方と反応させる２段階染色手順を利用した。検出のためには、ＰＥ標識づけしたヤギ抗−ヒトＩｇＧを使用した。同様にして、ジャーカット細胞（図７ｃ）と１μｇのｓｃＦｖ−Ｙ１を反応させ、検出のためにＰＥ標識づけされたウサギ抗−ｓｃＦｖを使用した。結果は、Ｙ１−ＩｇＧ及びｓｃＦｖ−Ｙ１の両方がジャーカット細胞に結合し、Ｙ１−ＩｇＧのものに類似した検出レベルを得るために約１０3倍多いｓｃＦｖ−Ｙ１分子が必要とされるということを示している。
【０４１８】
表の詳細な説明
［４１２.］  表１：  プロトコルＡＭから誘導されたパンニングの結果。パンニングに用いられたファージミドの推定上の数（入力）及び溶出された結合済みファージミドの推定上の数（出力）がＡＭ バイオパンニングプロトコルの４つの連続的段階についてまとめられている。各々の出力結果についての細胞供給源及び溶出培地が、各々の別々のストックを区別するのに用いた用語と共に列挙されている。
【０４１９】
［４１３.］  表２：  ＡＭバイオパンニングプロトコルの後の選択されたクローン。ＣＤＲ３領域（ＶH−ＣＤＲ３サイズ）内のアミノ酸残基の数及び単離された異なるクローンタイプについてのＣＤＲ３アミノ酸配列が要約されている。さらに、２つのＡＭバイオパンニング出力つまりＴ１６Ｍ３及びＴ１６Ｍ３．１出力における各々のクローンタイプの頻度が提示されている。
【０４２０】
［４１４.］  表３：  ＹＰＲプロトコルから誘導されたパンニングの結果：  パンニングに用いられたファージミドの推定上の数（入力）及び溶出された結合済みファージミドの推定上の数（出力）がまとめられている。各々の出力結果についての溶出培地が、各々個別のストックを区別するのに用いた用語と共に列挙されている。
【０４２１】
［４１５.］  表４：  ＹＰＮＲプロトコルから誘導されたパンニングの結果。パンニングに用いられたファージミドの推定上の数（入力）及び溶出された結合済みファージミドの推定上の数（出力）がＹＰＮＲバイオパンニングプロトコルの３つの連続的段階についてまとめられている。各々の出力結果についての溶出培地が、各々個別のストックを区別するのに用いた用語と共に列挙されている。
【０４２２】
［４１６.］  表５：  Ｒ３出力での、ＹＰＲバイオパンニングプロトコルの後の選択されたＹ系列クローン。Ｒ３出力ストックの中で複数の異なるクローンを同定した。同定されたクローンのＶH−ＣＤＲ３領域を含むアミノ酸残基の数及びアミノ酸配列、ならびに生殖細胞系列が詳述されている。
【０４２３】
［４１７.］  表６：  白血病細胞についてのＹ１結合特異性。ＦＡＣＳ分析によって決定されるような７つの異なる白血病細胞型の各々を主として含有する細胞混合物と各々反応させられた３つの異なるｓｃＦｖクローンの結合実験の結果が提示されている。結果は、各々のテスト対象抗体とその細胞が陽性反応するものとしてＦＡＣＳ分析によって同定された患者の部分を表わす。分子は、陽性患者の数を表わし、分母は一定の与えられたｓｃＦｖ／白血病細胞型組合せについてテストされた患者の合計数を表わす。
【０４２４】
［４１８.］  表７：  フィコール精製された正常な血球に対するｓｃＦｖ結合のＦＡＣＳ分析。３つのｓｃＦｖクローンが、フィコール精製された５つの異なる正常な血球型に対する結合について各々分析される。これらの結合結果は、ＦＡＣＳ分析により同定された正常血液標本の部分を、各々のテスト対象抗体と陽性反応するものとして表わしている。
【０４２５】
［４１９.］  表８：  さまざまな細胞マーカーに対する抗体の結合とＹ１ｓｃＦｖ結合の比較。Ｙ１及びその他の一連の抗体による染色のＦＡＣＳ分析結果が表わされている。ＡＮＥ患者からのフィコール精製された末梢及び骨髄細胞を調製し、ＡＭＬ細胞上のさまざまな細胞マーカーに比べたＹ１ｓｃＦｖの結合特異性が研究された。結果は、ＦＡＣＳ分析により各Ｆｖと陽性反応するものとして同定された、一定の与えられた患者のフィコール精製された標本中の細胞の百分率として表現されている。比較のため次の４つのその他の抗体が走らせた：  （１）ＣＤ１３−顆粒球及び単球についてのマーカー；（２）ＣＤ１４−単球及び好中球についてのマーカー；（３）ＣＤ３３−正常な骨髄性細胞及び白血病骨髄性細胞についてのマーカー及び（４）ＣＤ３４−基幹細胞についてのマーカー。
【０４２６】
［４２０.］  表９：  造血細胞系統に対するＹ１の結合。ヒト白血病細胞系統の３つの異なるカテゴリ及び１つのマウス細胞系統に対するＹ１ｓｃＦｖの結合を決定するために、ＦＡＣＳ分析が実施された。Ｙ１が陽性結合した（反応性）又はしなかった（非反応性）細胞系統が列挙されている。
【０４２７】
［４２１.］  表１０：  ＶH３−ＤＰ３２で単離されたクローンのＣＤＲ３配列。異なるバイオパンニング及び選択手順に従って、ＤＰ３２ 生殖細胞系列に基づく複数のクローンが単離された。クローンＹ１、Ｙ１７、Ｙ−２７及びＹ−４４が血小板上のバイオパンニング選択（ＹＰＲ及びＹＰＮＲプロトコル）の間に同定された。これらのクローンの各々のＶH−ＣＤＲ３領域の配列が提示されている。
【０４２８】
［４２２.］  表１１：  ＶH３−ＤＰ３２で単離されたクローンの結合プロファイル。複数の造血細胞に対するＤＰ３２由来のクローンの結合特異性は、ＦＡＣＳ分析によりテストされた。
【０４２９】
［４２３.］  本発明について、特定の例、材料及びデータを基準にして記述してきた。当業者であればわかるように、本発明のさまざまな態様を使用又は調製するための代替的手段が利用可能である。かかる代替的手段は、以下のクレームによって定義される通りの本発明の意図及び本質の範囲内に内含されるものとすべきである。
【０４３０】
［３９.］  本発明についてここで、制限的な意味のない単なる例として、以下で記述する添付図面を参考にしながらさらに詳しく説明する。なお図面中、
【図面の簡単な説明】
【０４３１】
【図１】［４０.］  図１は、ＥＩＡ検定により決定される通り、定着された血小板に結合するファージクローンを提示している。データは４０５ｎｍでの吸光度の一関数として提示されている。
【図２】［４１.］  図２ａ、２ｂ及び２ｃは、ＦＡＣＳ分析によって決定されるような、３人の個別のＡＭＬ患者から得た単核細胞標本の結合を提示する。２つのＦＩＴＣ標識付けされた試験対象の標本（対照ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖクローンＹ１）によって結合された細胞の螢光強度が提示されている。
【図３】［４２.］  図３は、ＦＡＣＳ分析により決定される通りのフィコール精製された単球（３ｂ）及び血小板（３ａ）に対するＹ−Ｉの結合を提示している。２つのＦＩＴＣ標識付けされた試験対象標本（対照ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖクローンＹ１）によって結合された細胞の螢光強度が提示されている。
【図４】［４３.］  図４は、臍帯血ＣＤ３４＋基幹細胞に対するＦＩＴＣ標識づけされたｓｃＦｖクローンＹ１の結合を提示する。ＦＬ３−Ｈチャンネル内のＣＤ３４＋ゲートをかけた細胞を、ＦＬＩ−Ｈ内で、ＦＩＴＣ標識づけされた負の対照ｓｃＦｖ（図４ａ）又は、ＦＩＴＩ標識づけされたｓｃＦｖクローンＹ１（図４ｂ）に対するその結合について分析した。図４ｃは、４ｂと同じＦＩＴＩ標識づけされたｓｃＦｖクローンＹ１標本のＦＳＣ及びＳＳＣドットプロット分析を提示している。図４ｂ及び４ｃ内の円で囲まれた部域は、ｓｃＦｖクローンＹ１を結合させるＣＤ３４＋細胞の亜集団の輪郭を描いている。
【図５】［４４.］  図５：  前−Ｂ−ＡＬＬ細胞を有する２人の患者から得た標本のＦＡＣＳ分析が提示されている： うち１つの標本は子供からのもの（５ａ、５ｃ、５ｅ）であり、もう１つは大人からのものである（５ｂ、５ｄ、５ｆ）。ＦＩＴＩ標識づけされた負の対照ｓｃＦｖ（５ａ、５ｂ）又はＦＩＴＩ標識づけされたＹ−ＩｓｃＦｖ（５ｃ、５ｄ）と合わせて、市販のＰＥ標識づけされたＣＤ１９（正常な末梢Ｂ細胞についてのマーカー；図５ａ、５ｃ）又はＰＥ標識づけされたＣＤ３４（基幹細胞のためのマーカー；図５ｄ）を利用した。図５ｂは、２重の負の対照である。負の対照染色パターンとの関係におけるＦＩＴＩ標識づけされた標本（ｓｃＦｖクローンＹ１）により結合された細胞の螢光強度（ｘ軸）が提示されている（５ｅ及び５ｆ）。
【図６】［４５.］  図６：この図は、ジャーカット細胞を用いて実施された結合比較研究の結果を提供している。負の対照と合わせて、ＦＩＴＩ標識づけされたＹ−ＩｓｃＦｖ単量体、diabodies及びtriabodiesのジャーカット細胞に対する結合のＦＡＣＳ分析が提示されている。
【図７】［４６.］  図７：この図は、ＩｇＧ−Ｙ−Ｉ及びｓｃＦｖ−Ｙ１の結合を比較する研究の結果を提供している。フルサイズのＩｇＧ−Ｙ１の結合とｓｃＦｖ−ＹＩ形態の結合を比較するために、２重染色手順を利用した。ＲＡＪＩ細胞（ＹＩ負細胞；図７ａ）及びジャーカット細胞（Ｙ１正細胞；図７ｂ）に対するＦＡＣＳ分析のために、５ナノグラムのＩｇＧ−ＹＩを使用した。検出のためには、ＰＥ標識づけしたヤギ抗ヒトＩｇＧを使用した。ｓｃＦｖ−ＹＩ−Ｉの結合のためには、〜１μｇ（２００倍）を使用し、その後続いて、ＰＥ標識づけされたウサギ抗−ｓｃＦｖ抗体での染色及びＦＡＣＳ分析を行なった（図７ｃ）。
【図８】［４７.］  図８：  この図は、ＹＩ 二量体、ＹＩｓｃＦｖ（ＣＯＮＹ１）及びＹＩＩｇＧの間の結合比較を示す。
【図９】［４８.］  図９：  この図は、Ｙ１スルフィド架橋二量体とＹ１ｓｃＦｖ（ＣＯＮＹ１）の間の結合比較を示す。
【図１０】［４９.］  図１０：  この図は、Ｙ１−ｃｙｓ−ｋａｋのSuperdex７５プロファイルのグラフである。
【図１１】［５０.］  図１１：  この図は、還元及び非還元性条件下での単量体に比較した二量体のサイズを明示している。
【図１２】［５１.］  図１２：  この図は、ＥＬＩＳＡ検定の結果を提供している。
【図１３】［５２.］  図１３：  この図は、抗−ＧＰＩｂα抗体のエピトープのチャートである。
【図１４】［５３.］  図１４：  この図は、アミノ酸の配列番号である。
【図１】
2004524023.tif 000019
【図２】
2004524023.tif 000020
【図３】
2004524023.tif 000021
【図５】
2004524023.tif 000022
【図６】
2004524023.tif 000023
【図７】
2004524023.tif 000024
【図８】
2004524023.tif 000025
【図９】
2004524023.tif 000026
【図１０】
2004524023.tif 000027
【図１１】
2004524023.tif 000028
【図１２】
2004524023.tif 000029
【図１３】
2004524023.tif 000030
【国際公開パンフレット】
2004524023.tif 000031
2004524023.tif 000032
2004524023.tif 000033
2004524023.tif 000034
2004524023.tif 000035
2004524023.tif 000036
2004524023.tif 000037
2004524023.tif 000038
2004524023.tif 000039
2004524023.tif 000040
2004524023.tif 000041
2004524023.tif 000042
2004524023.tif 000043
2004524023.tif 000044
2004524023.tif 000045
2004524023.tif 000046
2004524023.tif 000047
2004524023.tif 000048
2004524023.tif 000049
2004524023.tif 000050
2004524023.tif 000051
2004524023.tif 000052
2004524023.tif 000053
2004524023.tif 000054
2004524023.tif 000055
2004524023.tif 000056
2004524023.tif 000057
2004524023.tif 000058
2004524023.tif 000059
2004524023.tif 000060
2004524023.tif 000061
2004524023.tif 000062
2004524023.tif 000063
2004524023.tif 000064
2004524023.tif 000065
2004524023.tif 000066
2004524023.tif 000067
2004524023.tif 000068
2004524023.tif 000069
2004524023.tif 000070
2004524023.tif 000071
2004524023.tif 000072
2004524023.tif 000073
2004524023.tif 000074
2004524023.tif 000075
2004524023.tif 000076
2004524023.tif 000077
2004524023.tif 000078
2004524023.tif 000079
2004524023.tif 000080
2004524023.tif 000081
2004524023.tif 000082
2004524023.tif 000083
2004524023.tif 000084
2004524023.tif 000085
2004524023.tif 000086
2004524023.tif 000087
2004524023.tif 000088
2004524023.tif 000089
2004524023.tif 000090
2004524023.tif 000091
2004524023.tif 000092
2004524023.tif 000093
2004524023.tif 000094
2004524023.tif 000095
2004524023.tif 000096
2004524023.tif 000097
2004524023.tif 000098
2004524023.tif 000099
2004524023.tif 000100
2004524023.tif 000101
2004524023.tif 000102
2004524023.tif 000103
2004524023.tif 000104
2004524023.tif 000105
2004524023.tif 000106
2004524023.tif 000107
2004524023.tif 000108
2004524023.tif 000109
2004524023.tif 000110
2004524023.tif 000111
2004524023.tif 000112
2004524023.tif 000113
2004524023.tif 000114
2004524023.tif 000115
2004524023.tif 000116
2004524023.tif 000117
2004524023.tif 000118
2004524023.tif 000119
2004524023.tif 000120
2004524023.tif 000121
2004524023.tif 000122
2004524023.tif 000123
2004524023.tif 000124
2004524023.tif 000125
2004524023.tif 000126
2004524023.tif 000127
2004524023.tif 000128
2004524023.tif 000129
2004524023.tif 000130
2004524023.tif 000131
2004524023.tif 000132
2004524023.tif 000133
2004524023.tif 000134
2004524023.tif 000135
2004524023.tif 000136
2004524023.tif 000137
2004524023.tif 000138
2004524023.tif 000139
2004524023.tif 000140
2004524023.tif 000141
2004524023.tif 000142
2004524023.tif 000143
2004524023.tif 000144
2004524023.tif 000145
2004524023.tif 000146
2004524023.tif 000147
2004524023.tif 000148
2004524023.tif 000149
2004524023.tif 000150
2004524023.tif 000151
2004524023.tif 000152
2004524023.tif 000153
2004524023.tif 000154
2004524023.tif 000155
2004524023.tif 000156
2004524023.tif 000157
2004524023.tif 000158
2004524023.tif 000159
2004524023.tif 000160
2004524023.tif 000161
2004524023.tif 000162
2004524023.tif 000163
2004524023.tif 000164
2004524023.tif 000165
2004524023.tif 000166
2004524023.tif 000167
2004524023.tif 000168
2004524023.tif 000169
2004524023.tif 000170
2004524023.tif 000171
2004524023.tif 000172
2004524023.tif 000173
2004524023.tif 000174
2004524023.tif 000175
2004524023.tif 000176
2004524023.tif 000177
2004524023.tif 000178
2004524023.tif 000179
2004524023.tif 000180
2004524023.tif 000181
2004524023.tif 000182
2004524023.tif 000183
2004524023.tif 000184
2004524023.tif 000185
2004524023.tif 000186
2004524023.tif 000187
2004524023.tif 000188
2004524023.tif 000189
2004524023.tif 000190
2004524023.tif 000191
2004524023.tif 000192
2004524023.tif 000193
2004524023.tif 000194
2004524023.tif 000195
2004524023.tif 000196
2004524023.tif 000197
2004524023.tif 000198
2004524023.tif 000199
2004524023.tif 000200
2004524023.tif 000201
2004524023.tif 000202
2004524023.tif 000203
2004524023.tif 000204
2004524023.tif 000205
2004524023.tif 000206
2004524023.tif 000207
2004524023.tif 000208
2004524023.tif 000209
2004524023.tif 000210
2004524023.tif 000211
2004524023.tif 000212
2004524023.tif 000213
2004524023.tif 000214
2004524023.tif 000215
2004524023.tif 000216
2004524023.tif 000217
2004524023.tif 000218
2004524023.tif 000219
2004524023.tif 000220
2004524023.tif 000221
2004524023.tif 000222
2004524023.tif 000223
2004524023.tif 000224
2004524023.tif 000225
2004524023.tif 000226
2004524023.tif 000227
2004524023.tif 000228
2004524023.tif 000229
2004524023.tif 000230
2004524023.tif 000231
2004524023.tif 000232
2004524023.tif 000233
2004524023.tif 000234
2004524023.tif 000235
2004524023.tif 000236
2004524023.tif 000237
2004524023.tif 000238
2004524023.tif 000239
2004524023.tif 000240
2004524023.tif 000241
2004524023.tif 000242
2004524023.tif 000243
2004524023.tif 000244
2004524023.tif 000245
2004524023.tif 000246
2004524023.tif 000247
2004524023.tif 000248
2004524023.tif 000249
2004524023.tif 000250
2004524023.tif 000251
2004524023.tif 000252
2004524023.tif 000253
2004524023.tif 000254
2004524023.tif 000255
2004524023.tif 000256
2004524023.tif 000257
2004524023.tif 000258
2004524023.tif 000259
2004524023.tif 000260
2004524023.tif 000261
2004524023.tif 000262
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524023.tif 000263
【国際調査報告】
2004524023.tif 000264
2004524023.tif 000265
2004524023.tif 000266