(57)【要約】本発明はインターフェロン−α投与により上方調節され、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１で記述されるｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子の同定に関係するものである。この遺伝子の発現生成物の測定は１型インターフェロン受容体に作用するインターフェロン−α及びその他のインターフェロンによる治療に対する反応性を予測するのに有用であると提案されている。同遺伝子によりコードされているタンパクを治療に使用することも意図されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用から選択された実質的に同じ機能を持つその変異体；
（ｉｉｉ）免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用から選択された実質的に同じ機能を保持している（ｉ）または（ｉｉ）のフラグメント、
を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
該ポリペプチド及び／または天然に存在するその変異体に対する特異的抗体を作るために適したＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２に記述されるアミノ酸配列によって規定されるポリペプチドの変異体またはフラグメント。
【請求項３】
請求項１または２に記載されたポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
ｃＤＮＡである請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１の核酸配列またはそのコード配列及び／またはそれに相補的配列；
（ｂ）（ａ）に規定した配列にハイブリッド形成する配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定した配列に対する遺伝子コードの結果として縮重している配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定した配列に対して少なくとも６０％相同性を有する配列、
を含む請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１または２に記載のポリペプチドを発現することができる請求項３から５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドのインビボにおける発現を指令する単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ヒトまたは非ヒト動物の治療処置に使用するための請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチド及び医薬として許容し得る担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
抗ウイルス、抗腫瘍または免疫調節薬として治療に使用する薬剤の調製に請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチドの有効量を該患者に投与することからなる１型インターフェロンで治療し得る疾患を持つ患者の治療方法。
【請求項１４】
ポリペプチドの発現に適した条件下に請求項７に記載の宿主細胞を培養しそして該ポリペプチドを単離することからなる請求項１または２に記載のポリペプチド製造方法。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のポリペプチドまたはその天然に存在する変異体を発現することができる細胞を用意し、該細胞を被検化合物とインキュベートしそして該ポリペプチドまたは変異体をコードする遺伝子の上方調節を監視することからなる免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用を有する化合物の同定方法。
【請求項１６】
ヒトまたは非ヒト動物の治療処置に使用するための該コード配列のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のポリペプチドまたはその天然に存在する変異体のコード配列に対してアンチセンス配列をインビボにおいて発現することができるポリヌクレオチド。
【請求項１７】
治療的処置に使用するための請求項８に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項４に記載のｃＤＮＡ内の配列を標的とする核酸増幅のためのプライマーのセット。
【請求項１９】
請求項３から５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドから誘導した核酸プローブ。
【請求項２０】
固体支持体に接着した請求項１９に記載のプローブ。
【請求項２１】
該検体を１型インターフェロンの投与後に該患者から得るかまたは該測定の前に１型インターフェロンでインビトロ処理して、該患者の細胞検体におけるＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２に記述されているアミノ酸配列により規定されるタンパクまたはその天然に存在する変異体、または対応するｍＲＮＡのレベルを測定することからなる１型インターフェロンによる治療に対する患者の反応性を予測する方法。
【請求項２２】
該検体を得る前に投与するかまたは該検体をインビトロで処理するために使用するインターフェロンが該患者の治療に提案しているインターフェロンである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
患者の血液検体から単離した末梢血単核細胞を含む検体を１型インターフェロンでインビトロ処理する請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該測定がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２に記述されているアミノ酸配列により規定されるタンパクまたは該タンパクの天然に存在する変異体をコードするｍＲＮＡのレベルを測定することからなる請求項２１から２３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドを発現することができる非ヒト遺伝子導入動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はそのコード配列が以前は不明と考えられていた、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）投与により上方調節されるヒト遺伝子の同定に関するものである。この遺伝子の発現生成物の検出は、ＩＦＮ−α及び１型インターフェロン受容体に作用するその他のインターフェロンに対する反応性を予測するために使用することができる。この遺伝子によりコードされる新規の単離タンパクを治療に使用することも意図されている。
【０００２】
（発明の背景）
ＩＦＮ−αは多くの病気の治療に広く使用されている。ＩＦＮ−αを使用して治療し得る病気には、白血病、リンパ腫、及び固形腫瘍、ＡＩＤＳ−随伴カポジ肉腫のような新生物疾患及び慢性肝炎のようなウイルス感染が含まれる。またＩＦＮ−αは、自己免疫、マイコバクテリア、神経変性、寄生虫及びウイルスなどによる疾患の治療に経口腔粘膜投与が提案されてきた。特に、ＩＦＮ−αは、例えば、多発性硬化症、癩、結核、脳炎、マラリア、頚癌、性器ヘルペス、Ｂ型及びＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ及びＨＳＶ−１及び２の治療に推奨されてきた。また関節炎、狼瘡及び糖尿病の治療に対しても示唆されている。新生物疾患、例えば多発性骨髄腫、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低度リンパ腫、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、類癌腫瘍、頚癌、カポジ肉腫を含む肉腫、腎腫瘍、腎細胞癌、肝細胞癌、鼻咽頭癌を含む癌腫、血液癌、結腸・直腸癌、グリオブラストーマ、喉頭乳頭腫、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫及び脳腫瘍もまた経口腔粘膜、すなわち経口または経鼻によるＩＦＮ−αの投与により治療し得ることが示されている。
【０００３】
ＩＦＮ−αは１型インターフェロンファミリーの１員であり、１型インターフェロン受容体と相互作用することによりその特異的生物学的活性を発現する。その他の１型インターフェロンとしてはＩＦＮ−β，ＩＦＮ−ω及びＩＮＦ−τがある。
【０００４】
残念ながら、インターフェロン−αのような１型インターフェロンの潜在的治療対照である患者、例えば、慢性ウイルス性肝炎、新生物疾患及び再発多発性硬化症に罹患した患者が全て１型インターフェロンの治療に良好に反応するとは限らず、反応しても長期の有用性を示すのは一部に過ぎない。医師が１型インターフェロンによる治療結果を確信を持って予測できないために、高価な生物製剤の浪費及び治療時間の喪失という点のみならず、深刻な副作用に患者を曝すという点においても、この治療の費用‐効用比に関して重大な問題が生じる。さらに、ＩＦＮ−αの異常生産は多数の自己免疫疾患に関連することが示されている。このような理由から、１型インターフェロンは多数の遺伝子の発現を調節することによりその治療作用を発生しているので、１型インターフェロンが応答する遺伝子を同定することに非常に関心が有る。事実、患者が治療に良好に反応するか否かを決定するのは、１型インターフェロン治療に誘導される遺伝子発現の特別なパターンである。
【０００５】
（発明の要約）
経口腔粘膜または静脈内投与したＩＦＮ−αにより上方調節されたマウス遺伝子に対応するヒト遺伝子ｃＤＮＡが今同定され、そして新規ＤＮＡであると考えられる。またこの対応ヒト遺伝子を今ＩＦＮ−α上方調節遺伝子と命名する。
【０００６】
ＨｕＩＦＲＧ  ７０遺伝子は６１８アミノ酸のタンパクをコードしており、このタンパクを以下ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクと呼ぶ。このタンパクは４７０アミノ酸タンパク（ＡＢ０３３０９４）、４１９アミノ酸タンパク（ＡＫ０２２５４２）及び３７３アミノ酸タンパク（ＡＫ００１７７０）、全て機能未知、と相同性を示す。ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパク及びその機能性変異体は治療薬として、特に抗ウイルス薬、抗癌剤または免疫調節剤としての使用が考慮されている。例えば、自己免疫、マイコバクテリア、神経変性、寄生虫またはウイルス性疾患、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、癩、結核、脳炎、マラリア、頚癌、性器ヘルペス、Ｂ型またはＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ及びＨＳＶ−１または２、または新生物疾患、例えば多発性骨髄腫、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低度リンパ腫、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、類癌腫瘍、頚癌、カポジ肉腫を含む肉腫、腎腫瘍、腎細胞癌、肝細胞癌、鼻咽頭癌を含む癌腫、血液癌、結腸・直腸癌、グリオブラストーマ、喉頭乳頭腫、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫及び脳腫瘍の治療に使用することができる。言い換えると、そのタンパクは１型インターフェロンで治療し得る疾患の治療に使用することができる。
【０００７】
１型インターフェロンで治療された患者、例えばＩＦＮ−αを、例えば経口粘膜または静脈内投与により投与された患者の細胞検体中のＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体、または対応するｍＲＮＡのレベルを測定することはその治療に対する反応性を予測するのにも使用できるであろう。さらに、それとは別に、より望ましくは、例えばヒト末梢血単核細胞の検体を１型インターフェロンでインビトロ処理し、そしてＨｕＩＦＲＧ  ７０遺伝子に対応する発現生成物（望ましくはＭｒｎａ）の上方調節または下方調節を調べることによりその反応性を判断できることが判明した。
【０００８】
本発明の第一の態様によると、以下を含む単離ポリペプチドが提供される；
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）  本質的に同じ機能、例えば、免疫調節活性及び／または抗ウイルス活性及び／または抗腫瘍活性を有するその変異体；または
（ｉｉｉ）  本質的に同じ機能、例えば、免疫調節活性及び／または抗ウイルス活性及び／または抗腫瘍活性を保持する（ｉ）または（ｉｉ）のフラグメント。
【０００９】
本発明はまた、ヒトまたはヒト以外の動物の治療処置に使用する、より特異的には抗ウイルス、抗腫瘍または免疫調節剤として使用するタンパクを供給する。上記に示したように、その使用は１型インターフェロンで治療し得るあらゆる疾患に拡張することができる。
【００１０】
本発明のその他の態様により、上記に定義した本発明のポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチドまたはその補体が供給される。そのポリヌクレオチドは典型的に下記からなる配列を含んでいる；
（ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の核酸またはそのコード配列及び／またはその相補的配列；
（ｂ）  （ａ）に定義した配列の相補的配列に、例えば厳密な条件の下に、ハイブリッド形成する配列；
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）に定義した配列に対する遺伝子コードの結果として縮重している配列；
（ｄ）  （ａ），（ｂ）または（ｃ）に定義した配列と少なくとも６０％の相同性を持つ配列。
【００１１】
本発明はまた以下を供給する；
−  本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリペプチドを発現することができる発現ベクター；
−  本発明の発現ベクターを含む宿主細胞；
−  本発明のポリペプチドに特異的な抗体；
−  ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたはその機能的変異体の有効量を該患者に投与することを含む、１型インターフェロンで治療し得る疾患の患者を治療する方法；
−  抗ウイルスまたは抗腫瘍または免疫調節剤として治療に使用する、より特異的にはＩ型インターフェロンで治療し得る疾患の治療に使用する医薬品の製造におけるそのペプチドの使用；
−  本発明のポリペプチド及び医薬として受容し得る担体または希釈剤からなる医薬組成物；
−  ポリペプチドを発現させそして該ポリペプチドを単離するのに適した条件下に本発明の宿主細胞を維持することからなる、本発明のポリペプチドを製造する方法；
−  例えば、発現ベクターの形で、ヒトまたは非ヒト動物の治療処置に使用する、より特異的には抗ウイルス薬抗腫瘍剤または免疫調節剤として使用するために上記のポリペプチドのインビボにおける発現を指令する本発明のポリヌクレオチド；
−  そのポリヌクレオチド及び医薬として受容し得る担体または希釈剤からなる医薬組成物；
−  そのポリヌクレオチドの有効量を該患者に投与することからなる、Ｉ型インターフェロンで治療し得る病気の患者の治療方法；
−  抗ウイルスまたは抗腫瘍または免疫調節剤として治療に使用する、より特異的には１型インターフェロンで治療し得る病気の治療に使用する医薬品（例えばベクター製剤）の製造におけるそのポリヌクレオチドの使用；及び
−  ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体を発現し得る細胞を供給し、該細胞を被検化合物とインキュベートし、ＨｕＩＦＲＧ  ７０遺伝子発現の上方調節を監視することからなる、免疫調節活性及び／または抗ウイルス活性及び／または抗腫瘍活性を有する化合物の同定方法。
【００１２】
さらにその他の態様において、本発明は、１型インターフェロン（例えばＩＦＮ−α）を経口腔粘膜または静脈内投与した該患者から得たかまたは該測定の前にＩＦＮ−αのような１型インターフェロンでインビトロ処理した患者からの細胞検体（例えば血液検体）中の、ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体（例えば対立変異体）、または対応するｍＲＮＡの濃度を測定することからなる、１型インターフェロンによる治療、例えばＩＦＮ−α治療（例えば経口腔粘膜または非経口、例えば静脈内、皮下、または筋肉内投与によるＩＦＮ−α治療）に対する患者の反応性を予測する方法を提供する。本発明はその試験を行なうためのキットにも及ぶ。
【００１３】
（配列の簡単な説明）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１はヒトタンパクＨｕＩＦＲＧ  ７０のアミノ酸配列及びそれをコードするｃＤＮＡである。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクのアミノ酸配列のみである。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
上記に示したように、ヒトタンパクＨｕＩＦＲＧ  ７０及びその機能的変異体は治療上有用な薬物、より特異的には抗ウイルス薬、抗腫瘍薬または免疫調節薬として使用することが今意図されている。
【００１５】
この目的のヒトタンパクＨｕＩＦＲＧ  ７０の変異体は天然に存在する変異体（対立変異体または種変異体）であり、これらはＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクと本質的に同じ機能活性を有しており、またＩＦＮ−αの投与に反応して上方調節される。その他に、治療用のＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクの変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２とは異なるが、非天然突然変異体の配列を持つことがある。
【００１６】
用語「機能的変異体」とは、ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクと同じ本質的性質または基本的機能を有するポリペプチドのことである。ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクの本質的性質は免疫調節ペプチドと見なすことができる。機能的変異体ポリペプチドはさらにまたはその他に抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用を示すことがある。
【００１７】
望ましい抗ウイルス作用は、例えば、次のように試験することができる。抗ウイルス作用は次のように監視することができる。試験する変異体をコードする配列を、ウイルスパッケージシグナルΨ及び薬剤耐性マーカーを含むモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）に由来するレトロウイルスベクターのようなレトロウイルスベクター中にクローニングする。そして、ウイルスｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含む汎親和性パッケージ細胞系を、組換えレトロウイルスベクター及び高力価感染性複製が不可能なウイルスを作るために水疱性口内炎ウイルスのエンベロープグリコタンパクを含むプラスミド、ｐＶＳＶＧと共に遺伝子導入する（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，５２３２−５２３６）。感染性組換えウイルスを次いでインターフェロン感受性繊維芽細胞またはリンパ芽球細胞に遺伝子導入するために使用し、そして変異タンパクを安定して発現する細胞系を選別して、そして標準的インターフェロン生物検定（Ｔｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７１，６２２−６２５，１９７８）においてウイルス感染抵抗性を試験する。標準的増殖検定（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３，１９８３）を使用した増殖抑制及び標準的技術を使用したＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原の発現を測定することもできる。
【００１８】
ＨｕＩＦＲＧ  ７０の望ましい機能的変異体は本質的にはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２の配列から構成される。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２の機能的変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２の少なくとも２０、望ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも１００連続アミノ酸または全長に亘って、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２のアミノ酸配列と少なくとも６０％から７０％相同、望ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％そして特に望ましいのは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％相同であるポリペプチドである。タンパク相同性の測定方法は既知技術である。
【００１９】
アミノ酸置換は、例えば、１、２、または３から１０、２０または３０置換を行なうことができる。保存的置換も、例えば次ぎの表に従って行なうことができる。第２欄の同じブロックにあるアミノ酸及び望ましくは第３欄の同じ行にあるアミノ酸は互いに置換することができる。
2004515244.tif 000002
【００２０】
本発明による治療用変異ポリペプチド配列はより短いポリペプチド配列であり、例えば、少なくとも２０アミノ酸または５０，６０，７０，８０，１００，１５０または２００アミノ酸の長さまでのペプチドは、ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクの適切な生物学的作用を保持している限り本発明の範囲内に入ると考えられる。特に（限定はしないが）、本発明のこの態様は変異体が完全な天然に存在するタンパク配列のフラグメントである場合を包含している。
【００２１】
また抗−ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパク抗体を作製するために使用することができるＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクの修飾型及びそのフラグメントは本発明に包含される。そのような変異体はＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクの抗原決定基を含んでいるであろう。
【００２２】
本発明のポリペプチドは化学的に修飾することができる（例えば、翻訳後修飾）。例えば、それらをグリコシル化することができ及び／または修飾したアミノ酸残基を含むこともできる。またＮ−末端及び／またはＣ−末端に配列を加えることによる修飾をすることもできる（例えば、精製を容易にするヒスチジン残基またはＴ７タグの追加または細胞膜への侵入を促進するシグナル配列の追加）。そのような修飾ポリペプチドは本発明の用語「ポリペプチド」の範囲内に入る。
【００２３】
本発明のポリペプチドは表示ラベルで標識することができる。表示ラベルはポリペプチドを検出できるようにする適切なラベルであれば何でも良い。適当なラベルには１２５Ｉ、３５Ｓのような放射性同位元素または酵素、抗体、ポリヌクレオチド及びビオチンのようなリンカーが含まれる。本発明の標識ポリペプチドは検定に使用することができる。その検定において、固体支持体に接着したポリペプチドを用意することが望ましい。本発明はまた容器中にキットの形で収めたその標識及び／または固定化ポリペプチドにも関係している。キットは任意に他の適当な試薬、対照または説明書などを含んでいる。
【００２４】
本発明のポリペプチドは合成的にまたは組換え法により作ることができる。本発明のそのポリペプチドは修飾により天然に存在しないアミノ酸、例えば、Ｄアミノ酸を含むことができる。本発明の変異ポリペプチドは修飾によりインビトロ及び／またはインビボにおける安定性を増加させることができる。ポリペプチドが合成的手段により作られる場合には、その修飾は製造中に導入される。ポリペプチドは合成または組換えによる製造の後に修飾することもできる。
【００２５】
多数の側鎖修飾がタンパク修飾技術では知られており、本発明のポリペプチドにも存在する。その修飾には、例えば、アルデヒドと反応させ次いでＮａＢＨ４で還元する還元的アルキル化、メチルアセチミデートによるアミジン化または無水酢酸によるアシル化によるアミノ酸の修飾が含まれる。
【００２６】
本発明のポリペプチドは実質的に単離された形であろう。ポリぺプチドはそのポリペプチドの使用目的を妨害しない担体または希釈剤と混合することができるがそれでも実質的には単離されていると見なされることは理解されるであろう。本発明のポリペプチドは実質的に精製された形であり、その場合に一般的に標品中に本発明のポリペプチドを重量で９０％以上、例えば、９５％、９８％または９９％を含んでいる。
【００２７】
ポリヌクレオチド
本発明はまたＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたはその変異体をコードする単離ヌクレオチド配列並びにそれらに相補的な単離ヌクレオチド配列を含んでいる。ヌクレオチド配列はＤＮＡまたはＲＮＡ、１本鎖または２本鎖で、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むことがあり得る。望ましいヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であり、最も望ましいのはｃＤＮＡ配列である。
【００２８】
上記に示したように、そのポリヌクレオチドは典型的に下記の配列を含んでいる：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１の核酸またはそのコード配列及び／またはそれに相補的な配列；
（ｂ）例えば、厳密な条件で、（ａ）に規定した配列に相補的な配列にハイブリッド形成する配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定した配列を遺伝的にコードした結果として縮重している配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に規定した配列に少なくとも６０％相同性を持つ配列。
【００２９】
適当なコード配列を含むポリペプチドは既知技術の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている方法に従ってヒト細胞から単離するかまたは合成することができる。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドはその中に合成または修飾ヌクレオチドを含むことができる。多くの種々の形のポリヌクレオチドの修飾は既知技術である。これにはメチルホスフォネート及びホスフォチオエート骨格、分子の３’及び／または５’末端へのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。そのような修飾は本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性の増強または寿命の延長のために行われることがある。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは典型的に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のコード配列またはそれの相補体に選択的な条件下にハイブリッド形成することができるヌクレオチドの連続配列であることが望ましいヌクレオチド配列を含むであろう。そのハイブリッド形成はバックグランドより有意に高いレベルで生じるであろう。バックグランドハイブリッド形成は、例えば、ｃＤＮＡライブラリー中に存在する他のｃＤＮＡのために生じ得る。本発明のポリヌクレオチドとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のコード配列またはそれの相補体の間の相互作用により発生するシグナルレベルは典型的に、他のポリヌクレオチドとＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のコード配列の間の相互作用の強度の少なくとも１０倍、望ましくは少なくとも１００倍であろう。その相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば、３２Ｐで放射性同位元素標識することにより測定することができる。選択的なハイブリッド形成は典型的に、低ストリンジェンシー（０．３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、４０℃）、中間ストリンジェンシー（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、５０℃）または高ストリンジェンシー（例えば、０．０３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、６０℃）で行なうことができる。
【００３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のコード配列はヌクレオチド置換、例えば１、２または３から１０、２５、５０または１００置換により修飾することができる。縮重置換が行われることもありそして／または修飾された配列が翻訳される場合（例えば上記表に示したように）、保存的アミノ酸置換を生じる置換が行われることもある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のコード配列はその他にまたはさらに複数の挿入及び／または欠失及び／または１端または両端への延長による修飾をすることもできる。
【００３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１のコード配列から選択したＤＮＡ配列に選択的にハイブリッド形成できる本発明のポリヌクレオチド、そのコード配列及びそれらに相補的なＤＮＡ配列は一般的に標的配列に対して少なくとも７０％、望ましくは少なくとも８０または９０％そしてより望ましくは少なくとも９５％または９７％相同である。この相同性は典型的に少なくとも２０、望ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０または１００またはそれ以上の連続ヌクレオチドに亘っている。
【００３４】
上記の相同性の程度及び最小サイズのいずれの組合せも本発明のポリヌクレオチドを規定するために使用することができ、より厳密な組合せ（すなわち、より長い長さに亘るより高い相同性）が望ましい。例えば２５、望ましくは３０ヌクレオチドに亘って少なくとも８０％相同であるポリヌクレオチドは、４０ヌクレオチドに亘って少なくとも９０％相同であるポリヌクレオチドと同様に適当であることが判明するであろう。
【００３５】
ここに記述したようなポリヌクレオチドまたはタンパク配列の同族体は既知の相同性計算方法に従って測定することができる。例えば、タンパク相同性はアミノ酸同一性（時には「ハードホモロジー」と言われることもある）に基づいて計算することができる。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、例えばデフォルトセッティングで使用される相同性計算のために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７−３９５）。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６，２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−１０に記述されているように、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリスムを典型的にはデフォルトセッティングで相同性を計算したり、配列を整列したり、または同一または対応配列を同定したりするために使用することができる。
【００３６】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのプログラムはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を経由して誰でも入手できる。このアルゴリスムは最初、データベースの配列中の同じ長さの文字列と整列した時にマッチするかまたはある正の閾値スコアーＴを満足する問題の配列中の短い長さＷの文字列を同定することにより高スコアー配列対（ＨＳＰ）を同定することが必要である。Ｔを近隣文字列スコア閾値という（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）。このような最初の近隣文字列発見がそれを含むＨＳＰを発見するための調査を開始する種として作用する。この文字列発見は各配列に沿って両方向に、累積整列スコアが増加する限り、拡張される。各方向における文字列発見の拡張は次の場合に中止される：累積整列スコアが最大に達した値から数値Ｘ低下する；１以上の負スコア残基の整列の累積のために累積スコアが零かそれ以下になる；または配列の端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ，Ｔ及びＸは整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして文字列長（Ｗ）を１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，１０９１５−１０９１９を参照）整列（Ｂ）を５０、期待値（Ｅ）を１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。
【００３７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは二つの配列間の類似性について統計解析を行なう：例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、もし第一の配列を第二の配列と比較した際の最小合計確率が約１未満、望ましくは約０．１未満、より望ましくは約０．０１未満、そして最も望ましいのは０．００１未満であるならば、その配列はもう一つの配列と類似していると考えられる。
【００３８】
本発明によるポリヌクレオチドは、インビトロ、インビボまたはエクスビボにおいて行われる本発明によるタンパクの生成に有用である。そのポリヌクレオチド中において、本発明の求めるタンパクのためのコード配列は、選ばれた宿主細胞中において求めるタンパクの発現を指令することができるプロモーター配列に作動的に結合しているであろう。そのようなポリヌクレオチドは一般的に発現ベクターの形になっているであろう。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用を有する本発明のポリペプチドのインビボ発現を指令する発現ベクターの形で、治療用薬剤として使用することができる。
【００３９】
その目的の発現ベクターは組換えＤＮＡ技術の通常の作業により構築することができる。それらは、例えば、プラスミドＤＮＡの使用を必要とする。それらには複製の起点が準備されている。そのベクターは１以上の選別を容易にするマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子を含むことができる。本発明のベクターのその他の特徴は適当なイニシエーター、エンハンサー及びその他の要素、例えばタンパク発現のために望ましくそして正しい方向に位置しているポリアデニル化シグナルを含んでいる。その他の適当な非プラスミドベクターは当業者には明白であろう。これに関するその他の例は再度Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（上記）を参照。そのベクターはさらに、例えば、ウイルスベクターを含む。適当なウイルスベクターの例としては、単純疱疹ウイルスベクター、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＨＰＶウイルス（ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８のような）を含む複製不能レトロウイルス、及び弱毒インフルエンザウイルスがある。
【００４０】
プロモーター及びその他の発現調節シグナルは発現が計画されている宿主細胞に適合するように選択することができる。例えば、イーストプロモーターにはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ４及びＡＤＨプロモーター、Ｓ．ｐｏｍｂｅ  ｎｍｔｌ及びａｄｈプロモーターがある。哺乳動物プロモーターにはカドミウムのような重金属に反応して誘導することができるメタロチオネインプロモーター及びβ−アクチンプロモーターがある。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターのようなウイルスプロモーターも使用することができる。使用し得るウイルスプロモーターのその他の例としてはモロニーネズミ白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、及びＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）がある。その他の適当なプロモーターは組換えＤＮＡ技術において同業者にはよく知られているであろう。
【００４１】
本発明の発現ベクターはさらに本発明の求めるポリペプチドに対するコード配列に隣接し真核ゲノム配列（望ましくは哺乳動物ゲノム配列またはウイルスゲノム配列）に相同な配列、を提供する配列を含むことができる。これにより本発明のそのポリヌクレオチドを真核細胞またはウイルスのゲノム中へ相同組換えにより導入することができる。特に、ウイルス配列に隣接した発現カセットを含むプラスミドベクターは本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するのに適したウイルスベクターを調製するために使用することができる。
【００４２】
本発明は、ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたはその変異体を発現するように修飾されたインビトロの細胞、例えば原核細胞または真核細胞も含んでいる。その細胞は、例えば、ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたはその変異体をコードしたポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に取込んで安定した真核細胞系を含んでいる。本発明の宿主細胞は哺乳動物細胞または昆虫細胞、イーストのような下等真核細胞または細菌細胞のような原核細胞であり得る。本発明のポリペプチドをコードするベクターの挿入により修飾することができる細胞の個別例としては哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ，ＣＨＯ，ＨｅＬａ及びＣＯＳ細胞がある。望ましくは細胞系は安定であるだけでなく、ポリペプチドの充分なグリコシル化もできるものが選択される。発現は、例えば、形質転換卵母細胞において行なうことができる。
【００４３】
本発明のポリペプチドは遺伝子導入非ヒト動物、望ましくはマウスの細胞においても発現することができる。本発明のポリペプチドを発現することができる遺伝子導入非ヒト動物は本発明の範囲内に含まれる。
【００４４】
本発明によるポリヌクレオチドは、アンチセンス配列の生産に提供するためにアンチセンスの方向に上記のようにベクター中に挿入することもできる。アンチセンスＲＮＡまたはその他のアンチセンスポリヌクレオチドは合成的方法によっても生産できる。
【００４５】
例えば、発現ベクターの形で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または天然に存在するその変異体により定義されるアミノ酸配列のコード配列に対するアンチセンス配列をインビボで発現することができ、ヒトまたは非ヒト動物の治療に使用するためのポリヌクレオチドも本発明の追加の態様を構成すると考えられる。そのポリヌクレオチドはＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクの上方調節が原因の疾患の治療に使用できるであろう。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに対するｃＤＮＡ内の配列を標的とする核酸増幅用のプライマーの組合せ、例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマー対に拡張する。本発明はまた、明示標識、例えば、放射性標識または酵素またはビオチンのような非放射性標識で標識することができる本発明のポリペプチドに対するｃＤＮＡまたはＲＮＡ内の配列を標的とするに適したプローブを提供する。そのプローブは固相に接着することができる。その固相は、その他の核酸、例えば、他の１型インターフェロン上方調節遺伝子、例えば、ＩＦＮ−αの経口腔粘膜または静脈内投与に反応して上方調節されることが同定されているような遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはその増幅生産物に対するプローブを含むマイクロアレイ（一般的には核酸に関しては、プローブまたはＤＮＡチップとも呼ばれている）であり得る。そのようなマイクロアレイの構築方法はよく知られている（例えば、ＥＰ−Ｂ ０４７６０１４ ａｎｄ ０６１９３２１ ｏｆ Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ．Ｖ．ａｎｄ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｊａｎｕａｒｙ １９９９ ｅｎｔｉｔｌｅｄ ”Ｔｈｅ Ｃｈｉｐｐｉｎｇ Ｆｏｒｅｃａｓｔ”を参照）。
【００４７】
そのプライマーまたはプローブの核酸配列は望ましくは少なくとも１０、望ましくは少なくとも１５または少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０のヌクレオチドの長さであろう。しかし、４０，５０，６０，７０，１００または１５０ヌクレオチドの長さまたはそれ以上長くてもよい。
【００４８】
本発明のその他の態様は、ＨｕＩＦＲＧ  ７０遺伝子における突然変異、例えば一塩基多形（ＳＮＰ）の同定に本発明のプローブまたはプライマーを使用することである。
【００４９】
上記に示したように、その他の態様において本発明は、ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体を発現することができる細胞を準備し、被検化合物と共に該細胞を培養し、ＨｕＩＦＲＧ  ７０遺伝子発現の上方調節を監視することからなる、免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用を有する化合物を同定する方法を提供する。その監視はＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体をコードするｍＲＮＡに対するプローブにより行われる。その他にはＨｕＩＦＲＧ  ７０及び天然に存在するその変異体の１つ以上と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを使用することができる。
【００５０】
抗体
その他の態様によると、本発明はまた、通常の技術により得られ、そして本発明のポリぺプチドに対して特異的である抗体（例えばポリクローナルまたは望ましくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び抗原結合能力を保持するそのフラグメント）にも関係している。その抗体は、例えば、精製、単離または免疫沈降を含むスクリーニング法に使用することができ、またＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたはその変異体の機能を更に解明するための道具として使用できる。それら自身が治療薬になり得る資格を有している。その抗体は本発明によるタンパクの抗原決定基に対して作ることができる。抗体は、それが特異的であるタンパクとは高親和性でそのタンパクに結合するが他のタンパクには結合しないかまたは低親和性で結合する場合に、特異的にタンパクに結合する。抗体の特異的結合能力を測定するための競合結合または免疫放射検定のための種々のプロトコールはよく知られている。
【００５１】
医薬組成物
本発明のポリペプチドは典型的に医薬として受容し得る担体または希釈剤と共に投与するために製剤化される。医薬用担体または希釈剤は、例えば、等張溶液であり得る。例えば、固体の経口用形態は活性化合物と共に、下記を含むことができる。希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ、またはジャガイモデンプン；潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、及び／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えば、デンプン類、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニールピロリドン；分離防止剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはデンプングリコール酸ナトリウム；発泡混合物；色素；甘味剤；レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸のような湿潤剤；及び、一般的には、医薬製剤に使用される毒性のない薬理的に不活性の物質。そのような医薬製剤は既知方法、例えば、混合、顆粒化、錠剤化、糖−コーティング、またはフィルムコーティングの操作により製造することができる。
【００５２】
経口投与用の液体分散体はシロップ、乳剤及び懸濁剤のことがある。シロップは担体として、例えば、サッカロースまたはサッカロースとグリセリン及び／またはマンニトール及び／またはソルビトールを含むこともある。
【００５３】
懸濁剤及び乳剤は担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含むことがある。筋肉内注射用の懸濁剤または溶液は、活性化合物と共に、医薬品として受容し得る担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール類、例えば、プロピレングリコール、及びもし必要であれば、適当な量の塩酸リドカインを含むことができる。
【００５４】
静脈内投与または点滴用の溶液は担体として、例えば、滅菌水を含むか、または望ましくは滅菌等張食塩水溶液の形態になっている。
【００５５】
本発明に従って使用するためのＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたはその機能的同族体の適切な用量は、種々のパラメータ、特に使用される物質；年齢、体重及び治療する患者の状態；投与経路；及び必要な治療法によって決定することができる。さらに、医師は個別の患者に必要な投与経路及び投与量を決めることができるであろう。典型的な１日用量は、特異的阻害剤の活性、年齢、体重及び治療する患者の状態、及び投与の回数及び経路により、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ、望ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。望ましくは、１日用量レベルは５ｍｇから２ｇであろう。
【００５６】
治療用に適した本発明のポリヌクレオチドはまた典型的に医薬として受容し得る担体または希釈剤と共に投与するために製剤化されるであろう。そのようなポリヌクレオチドは、求めるポリペプチドの発現をインビボで達成することができる既知の技術のいずれかにより投与することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、望ましくは皮内、皮下または筋肉内注射により導入することができる。その他には、核酸は粒子介在投与器を使用して皮膚を通して直接投与することができる。治療用核酸に適した本発明のポリヌクレオチドはその他に、例えば鼻腔内または口腔内投与より口腔粘膜表面に投与することもできる。
【００５７】
治療用に適した本発明の非ウイルスベクターは、例えば、リポソーム中にまたは界面活性剤含有ベクター供給粒子に詰め込むこともできる。本発明の核酸構築の取り込みは、例えば導入試薬の使用を含む既知の導入技術により促進される。これらの試薬の例としては、カチオン性試薬、例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン及びリポフェクタント、例えばリポフェクタム及びトランスフェクタムがある。投与すべき核酸の投与量は変動し得る。典型的に、核酸は粒子介在遺伝子投与では１ｐｇから１ｍｇ、望ましくは１ｐｇから１０μｇ、そしてその他の経路では１０μｇから１ｍｇの範囲で投与されるであろう。
【００５８】
１型インターフェロン反応性の予測
上記に示したように、その他の態様において本発明は、１型インターフェロンの投与後該患者から採取したかまたは該測定前に１型インターフェロンでインビトロ処理された該患者の細胞検体中のＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体、または対応するｍＲＮＡのレベルを測定することからなる、１型インターフェロンによる治療、例えば、経口腔粘膜または静脈内によるＩＦＮ−α治療のようなＩＦＮ−α治療に対する患者の反応性を予測する方法を提供する。
【００５９】
望ましくは、反応性試験に使用する１型インターフェロンは治療のために選択された１型インターフェロンであろう。それは推奨投与経路及び推奨治療用量で投与することができる。望ましくは、その後の分析検体は、例えば、血液検体または血液検体から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の検体であろう。
【００６０】
より便利で望ましいのは、患者から採取し、血液から単離したＰＢＭＣを含む検体を１型インターフェロンで、例えば、約１から１０，０００  ＩＵ／ｍｌの用量範囲において、インビトロで処理することであろう。その処理は数時間、例えば、約７から８時間であろう。そのインビトロ試験の望ましい処理条件は正常提供者から採取したＰＢＭＣを同じ１型インターフェロンで試験しそして適当な発現生成物の上方調節を調べることにより決定することができる。繰り返しになるが、使用する１型インターフェロンは患者の治療に提案されている１型インターフェロン、例えば、組換えＩＦＮ−αであることが望ましい。その試験に使用するＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配を使用して血液検体から通常の方法で単離することができる。１型インターフェロン反応性のそのようなインビトロ試験に適したプロトコールの例は下記例３に示されている。
【００６１】
１型インターフェロンでのインビトロ処理後もし適するならば、検体をＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体のレベルについて分析する。これはＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体、例えば、その対立変異体の１以上と特異的に結合することができる抗体を使用して行われる。しかし、ＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクまたは天然に存在するその変異体をコードするｍＲＮＡについて検体を分析することも望ましいであろう。そのｍＲＮＡ分析にはｍＲＮＡを検出する既知技術のいずれか、例えば、ノーザンブロット検出またはｍＲＮＡディフェレンシャルディスプレーを使用することができる。種々の既知核酸増幅プロトコールを、検出に先立って、検体中に存在する関心のｍＲＮＡ、またはその部分の増幅に使用することができる。関心のｍＲＮＡ、または対応する増幅核酸は固相に接着した核酸プローブを使用して調べることができる。その固相支持体は上記に既に記述したような、１型インターフェロン上方調節遺伝子、例えば、ＩＦＮ−αの経口腔粘膜または静脈内投与に反応して上方調節することが同定されている遺伝子に対応するその他のｍＲＮＡまたはその増幅生成物のレベルを測定するためのプローブを有するマイクロアレイであり得る。
【００６２】
以下の例により本発明を説明する：
例
【００６３】
例１
以前の実験において正常成獣マウスの各鼻腔へ５μｌのクリスタルバイオレットをＰ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用して適用したところ、直ちに口腔喉頭腔の全表面へ色素が分布することが認められた。口腔咽頭腔の染色は色素適用後３０約分でも明らかであった。この結果は１２５Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して同様に適用することにより確認された。同じ投与方法は下記試験における口腔粘膜投与を行なうために使用された。
【００６４】
６週齢雄ＤＢＡ／２マウスをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃから購入した組換えネズミインターフェロンα（ＩＦＮα）１００，０００  ＩＵの入ったリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で、またはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃから購入した組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）の１０μｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１００μｇ／ｍｌを含むＰＢＳのいずれかで処置するか、または無処置とした。８時間後マウスを頚椎脱臼により屠殺し、口腔咽頭腔からリンパ組織を外科的に採取し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保存した。ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ １９８７（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９）の方法によりリンパ組織から抽出し、ｍＲＮＡディフェレンシャルディスプレー分析（Ｌａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，９６７−９７１）を行なった。
【００６５】
ディフェレンシャルディスプレー分析
ディフェレンシャルディスプレー分析はＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの“Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｃｌｅａｎ”及び“ＲＮＡ  ｉｍａｇｅ”キットを本質的にメーカーの説明に従って使用して行なった。簡単に言うと、ＲＮＡはＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素で処理し、そして１μｇを１００μｌの反応バッファー中で、３種の１塩基固定オリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ，Ｃ，またはＧの１つまたはその他を使用して、逆転写した。ＲＮＡはまた９種の２塩基固定オリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ，ＣＣ，ＧＧ，ＡＣ，ＣＡ，ＧＡ，ＡＧ，ＣＧ，ＧＣの１つまたはその他を使用して逆転写した。比較すべき全検体を同一実験において逆転写し、分割して凍結した。増幅はわずか１μｌの逆転写検体とＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びα−３３ＰｄＡＴＰ（３，０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を含む１０μｌの増幅混合液中において実施した。８０種の５’末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを（ＨＴ１１）Ａ，Ｃ，Ｇ，ＡＡ，ＣＣ，ＧＧ，ＡＣ，ＣＡ，ＧＡ，ＡＧ，ＣＧまたはＧＣプライマーのそれぞれと組合わせて使用した。次いで検体を７％変性ポリアクリルアミドゲルに展開し、オートラジオグラフィーを行なった。ディフェレンシャル発現と推定されるバンドを切り出し、メーカー説明に従って再増幅を行ない、そしてＩＦＮを投与した口腔咽頭腔、ＩＬ−１５処理及び賦形剤処理動物から抽出したＲＮＡのノーザンブロットをハイブリッド形成するためのプローブとして使用した。
【００６６】
クローニング及び配列分析
再度増幅したディフェレンシャルディスプレースクリーニングのバンドをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｆｒ  １部位にクローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅により増幅したｃＤＮＡをｐＣＲ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＴＡクローニングにより単離した。ＤＮＡは自動ジデオキシシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７）を使用して配列を分析した。
【００６７】
ヒトｃＤＮＡの単離
ディフェレンシャルディスプレースクリーニングにより同定されたディフェレンシャル発現したネズミ３’配列を、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋＴＭのｄｂＥＳＴデータベース中に存在するランダムヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較した。ディフェレンシャルディスプレースクリーニングから単離したネズミＥＳＴに関係しそうな配列をコンティグと組合せ、理論的ｃＤＮＡに対応するヒト共通配列を構築するために使用した。そのｃＤＮＡの一つは４１３５ヌクレオチドの長さであることが判明した。これは、組み換えネズミＩＦＮ−αを経口腔粘膜投与したマウスの口腔内リンパ組織中にその発現が約５倍増強されることが判明しているマウスの遺伝子に相当するものであった。
【００６８】
この理論的ｃＤＮＡが真正のヒト遺伝子に対応することを確認するために、共通配列の５’及び３’末端から誘導したプライマーを使用してヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）から抽出したｍＲＮＡから特異的逆転写及びＰＣＲ増幅によりｃＤＮＡを合成した。予想したサイズの単一ｃＤＮＡフラグメントが得られ、クローニングしそして配列分析した（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）。このヒトｃＤＮＡは６１８アミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）のタンパクをコードする１８５７ｂｐ長のオープンリードフレーム（ＯＲＦ）を３６−１８９２の位置に含んでいる。
【００６９】
例２
ＩＦＮ−αの静脈内投与
雄ＤＢＡ／２マウスにＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から購入した組換えネズミＩＦＮ−αの１００，０００  ＩＵを２００μｌのＰＢＳに溶解して静脈内投与するか、または同量のＰＢＳのみを投与した。８時間後、動物を頚椎脱臼により殺処理し、脾臓を常法により採取した。総ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｉ（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７） １６２， １５６−１５９）の方法により抽出し、検体当たり総ＲＮＡの１０．０μｇをグリオキサールの存在下にノーザンブロット処理し、Ｄａｎｄｏｙ−Ｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９８） ２７３， ７６９１−７６９７）により記述されているようにＨｕＩＦＲＧ  ７０  ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡプローブでハイブリッド形成した。ブロットは最初オートラジオグラフィを行ない、次いでメーカー説明書に従いＰｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒを使用して定量化した。賦形剤のみで処置した動物に比較してＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクに対するｍＲＮＡレベルの増加（約１０倍）がＩＦＮ−α処置動物の脾臓から抽出したＲＮＡ検体に検出された。
【００７０】
例３
インビトロにおける１型インターフェロン反応性の検査
正常提供者のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配により単離し、ＰＢＳに溶解した１０，０００ＩＵの組換えヒトＩＦＮ−α２（シェリング−プラウのイントロンＡ）あるいは同容量のＰＢＳのみでインビトロ処理した。８時間後遠心分離（８００ｘｇ１０分間）し、細胞ペレットを得た。総ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉの方法により細胞ペレットから抽出し、そして検体当たり総ＲＮＡの１０．０μｇをグリオキサールの存在下にノーザンブロット処理し、上記例２に既に記述したようにＨｕＩＦＲＧ  ７０  ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡプローブでハイブリッド形成した。ＰＢＳのみで処置した検体に比較してＨｕＩＦＲＧ  ７０タンパクに対するｍＲＮＡレベルの増加（約２倍）がＩＦＮ−α処置ＰＢＭＣから抽出したＲＮＡ検体に検出された。
【００７１】
同じ方法を１型インターフェロンによる治療を勧めている患者から得たＰＢＭＣを使用して１型インターフェロン反応性を予測するために使用することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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