(57)【要約】本発明は、ヒトクローディンポリペプチドファミリーの新規なメンバー、それらのポリペプチドの製造方法、ならびにそれらを用いてクローディン関連症状を処置する方法、およびクローディンポリペプチド活性を変化させる化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜１３よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１〜１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１〜３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１〜３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１２〜２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸２５〜２２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸３４〜８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸８２〜１０１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸８２〜１０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１０３〜１１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１７〜１４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１８〜１３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１４６〜１６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１６２〜１８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１６２〜１９１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１９２〜２２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む、およびクローディンポリペプチド活性を有する、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）細胞外ループドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）細胞質テイルドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）クローディンポリペプチド活性を有し、そして、少なくとも３０個のアミノ酸を含み、かつ（ａ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；その際、アミノ酸同一性％は９０％より大、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％よりなる群から選択される；ならびに
（ｈ）（ｇ）のアミノ酸配列であって、（ｇ）の該アミノ酸配列を含むポリペプチドが、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドにも結合する抗体に結合するもの。
【請求項２】
下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１９〜３３よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸５〜２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２８〜７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸７７〜９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１００〜１１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１１９〜１４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１４２〜１６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１６１〜１８３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１８４〜２１１よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む、およびクローディンポリペプチド活性を有する、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）細胞外ループドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）細胞質テイルドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）クローディンポリペプチド活性を有し、そして、少なくとも３０個のアミノ酸を含み、かつ（ａ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；その際、アミノ酸同一性％は９０％より大、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％よりなる群から選択される；ならびに
（ｈ）（ｇ）のアミノ酸配列であって、（ｇ）の該アミノ酸配列を含むポリペプチドが、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドにも結合する抗体に結合するもの。
【請求項３】
下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１１〜３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸７７〜９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１１９〜１４１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１６７〜１８９よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸３４〜７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１００〜１１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１４２〜１６６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１９０〜２２９よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む、およびクローディンポリペプチド活性を有する、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）細胞外ループドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）細胞質テイルドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）クローディンポリペプチド活性を有し、そして、少なくとも３０個のアミノ酸を含み、かつ（ａ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；その際、アミノ酸同一性％は９０％より大、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％よりなる群から選択される；ならびに
（ｈ）（ｇ）のアミノ酸配列であって、（ｇ）の該アミノ酸配列を含むポリペプチドが、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドにも結合する抗体に結合するもの。
【請求項４】
本質的に、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、単離核酸。
【請求項５】
本質的に、少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド配列を有し、高度にストリンジェントな条件下で請求項４に記載の核酸にハイブリダイズする、単離核酸。
【請求項６】
さらに、クローディンポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸のヌクレオチド配列とのヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、その際、ヌクレオチド配列同一性％は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％よりなる群から選択される、単離核酸。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項１０】
核酸が宿主細胞ゲノムに組み込まれた、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸によりコードされるポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドの発現を促進する条件下で組換え宿主細胞を培養することを含み、その際、組換え宿主細胞が請求項４〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の核酸を含むものである方法。
【請求項１２】
さらに、ポリペプチドを精製することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法により製造されたポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体がヒト抗体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
抗体がヒト化抗体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体が、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドの活性を阻害する、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドの阻害剤を設計する方法であって、該ポリペプチドの三次元構造を決定し、基質結合可能性のある部位について該三次元構造を分析し、推定反応性部位を含む分子を合成し、そして該分子のポリペプチド阻害活性を測定する工程を含む方法。
【請求項２０】
クローディンポリペプチド活性を変化させる化合物を同定するための、下記を含む方法：
（ａ）被験化合物と、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドを混合し；そして
（ｂ）被験化合物が該ポリペプチドのクローディンポリペプチド活性を変化させるか判定する。
【請求項２１】
クローディンポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定するための、下記を含む方法：
（ａ）被験化合物と、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドおよび該ポリペプチドの結合パートナーとを混合し；そして
（ｂ）被験化合物が該ポリペプチドの結合活性を阻害するか判定する。
【請求項２２】
密着結合形成活性または上皮もしくは内皮バリヤー機能活性を高める方法であって、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載の少なくとも１種類のポリペプチドを付与することを含む方法。
【請求項２３】
請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載の少なくとも１種類のポリペプチドを患者に投与することにより、患者において密着結合形成活性または上皮もしくは内皮バリヤー機能活性を高めることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
密着結合形成活性または上皮もしくは内皮バリヤー機能活性を低下させる方法であって、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドの少なくとも１種類のアンタゴニストを付与することを含む方法。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドの少なくとも１種類のアンタゴニストを患者に投与することにより、患者において密着結合形成活性または上皮もしくは内皮バリヤー機能活性を低下させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アンタゴニストが該ポリペプチドの活性を阻害する抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
上皮または内皮バリヤー機能症状を処置する方法であって、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項２８】
上皮または内皮バリヤー機能症状が、炎症、喘息、アレルギー、癌細胞の転移、腎臓におけるマグネシウム輸送欠陥などのイオン輸送障害、および炎症性腸疾患よりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
エンテロトキシン被曝による症状を処置する方法であって、請求項１〜３のいずれか１項または請求項１３に記載のポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項３０】
エンテロトキシン被曝による症状が、クロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシン（ＣＰＥ）被曝および乳児突然死症候群（ＳＩＤＳ）よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）のもとに米国仮特許出願Ｎｏ．６０／２２５，５１３（２０００年８月１５日出願）およびＮｏ．６０／２２５，７９４（２０００年８月１５日出願）の優先権を主張する。これらのすべてを本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）ポリペプチドファミリーの新規なヒトおよびネズミポリペプチド、ならびにそれらの製造方法および使用方法に関する。
【０００３】
発明の背景
クローディンポリペプチドは、細胞密着結合に関連する”４回膜貫通（ｔｅｔｒａｓｐａｎ）”ポリペプチド、すなわち４つの膜貫通（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメインをもつポリペプチドの関連グループである。密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ、”閉鎖帯（ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）”とも呼ばれる）は、上皮細胞または内皮細胞シート内の細胞間隙に、調節された半透性バリヤーを形成する。上皮または内皮バリヤー機能調節の不適切または不適正は、腸、肺などの組織における炎症の開始、維持および増悪に関与する。密着結合はこれらの細胞の膜の頂端側領域と側底側領域を分離する”フェンス”にもなり、これにより細胞シートの反対側で異なる生理的環境、たとえば腸上皮を通って物質を輸送するのに必要な異なる生理的環境を確立することができる。密着結合が水性細孔を含み、これらの細孔を通して上皮または内皮シートの細胞間で経細胞輸送が起きることも提唱された。クローディンファミリーのポリペプチドは上皮細胞および／または内皮細胞に発生全体を通じて発現し、クローディンポリペプチドファミリーの個々のメンバーは異なる組織に発現する。個々のクローディンポリペプチドに伴う生理学的機能は、それが発現する組織（１以上）により行われる機能に関連する。
【０００４】
クローディンファミリーのポリペプチドに共通の構造特色は、４つの膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインが形成する２つの細胞外ループ、および細胞質テイルドメインである。細胞質テイルドメインは、他の密着結合関連タンパク質、たとえばＺＯ（閉鎖帯）ファミリーのタンパク質との相互作用に関与すると考えられる。クローディンポリペプチドのこれらの相互作用活性はＰＤＺドメイン含有ポリペプチドを伴い、ＰＤＺドメインがクローディンポリペプチドの細胞質テイルドメインのＣ末端残基に結合すると考えられる；ＰＤＺ含有ポリペプチドが結合すると、次いでクローディンポリペプチドがオリゴマー化すると思われる。クローディンポリペプチドの細胞外ループドメインは密着結合の形成に関与すると思われ、これはクローディンポリペプチドのバリヤー機能とイオン輸送機能の両方について重要な観点である；および／またはこのドメインはウイルスタンパク質、エンテロトキシンもしくはアレルゲンに対する受容体として作用すると思われる。クローディンポリペプチドファミリーの密着結合形成活性は、隣接する上皮細胞または内皮細胞に発現する同じクローディンポリペプチドの細胞外ループとのホモタイプ相互作用により、あるいはクローディンファミリーの他のメンバーまたは他の非クローディンポリペプチドの細胞外ループとのヘテロタイプ相互作用により起きると考えられる。さらに、クローディンポリペプチドの生物学的作用は、マトリックスメタロプロテイナーゼをそれらの活性形にプロセシングする際にクローディンポリペプチド、特にそれらの最もＮ末端にある細胞外ドメインを必要とするという証拠がある（Ｍｉｙａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２８０４−２８２１１）。クローディンポリペプチドは、密着結合形成、上皮および内皮バリヤー機能、イオン輸送、ならびにウイルスタンパク質、エンテロトキシンまたはアレルゲンの結合において役割をもつので、上皮または内皮を通る輸送の無調節または不適正調節に伴う症状、たとえば炎症、喘息、アレルギー、癌細胞の転移、および腎臓におけるマグネシウム輸送欠陥などのイオン輸送障害に関連する。さらに、神経細胞に発現するクローディンポリペプチドは乏突起膠細胞のミエリン鞘形成に必要であることが示されたので、クローディンポリペプチドは脱髄症状、たとえば多発硬化症（ＭＳ）、自己免疫性脳脊髄炎、視神経炎、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）などに関連する。
【０００５】
クローディンポリペプチドファミリーの特性および活性は、さらに下記の文献に記載されている：Ｆｕｊｉｔａａｂ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，クロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシンは、密着結合統合型膜タンパク質であるクローディン−３の細胞外第２ループに結合する，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４７６：２５８−２６１；Ｋｉｎｕｇａｓａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，クローディンは免疫メディエーターに応答して腸バリヤーを調節する，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１８：１００１−１０１１；Ｔｓｕｋｉｔａ  Ｓ．ａｎｄ  Ｆｕｒｕｓｅ  Ｍ，２０００，壁の細孔：クローディンは水性細孔を含む密着結合鎖を構成する，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４９：１３−１６；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，乏突起膠細胞膜相互作用におけるＯＳＰ／クローディン−１１の関与：生態および疾患における役割，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，５９：７０６−７１１；Ｉｔｏｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，３種類の密着結合関連ＭＡＧＵＫ類、ＺＯ−１、ＺＯ−２およびＺＯ−３とクローディンＣＯＯＨ末端の直接結合，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４７：１３５１−１３６３；Ｆｕｒｕｓｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，密着結合鎖内および鎖間での異なるクローディン種の相互作用様式，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４７：８９１−９０３；Ｍｏｒｉｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，内皮クローディン：クローディン−５／ＴＭＶＣＦは内皮細胞の密着結合鎖を構成する，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４７：１８５−１９４；Ｋｕｂｏｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，密着結合に局在する膜統合型タンパク質ファミリーであるクローディンのＣａ（２＋）−非依存性細胞接着活性，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，９：１０３５−１０３８；Ｗａｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｄｅｒ  ｐ１は密着結合撹乱により経上皮アレルゲン運搬を促進する，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４：１２３−１３３；Ｓｉｍｏｎ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，経細胞Ｍｇ２＋吸収に必要な腎密着結合タンパク質パラセリン−１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１０３−１０６；Ｍｏｒｉｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，密着結合鎖の４回膜貫通ドメインタンパク質成分をコードするクローディン多遺伝子ファミリー，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：５１１−５１６；Ｆｕｒｕｓｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，単一遺伝子生成物クローディン−１または−２は線維芽細胞において密着結合鎖を再構成し、オクルディンを動員する，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４３：３９１−４０１；Ｆｕｒｕｓｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，クローディン−１および−２：オクルディンとの配列類似性をもたない、密着結合に局在する新規な膜統合型タンパク質，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４１：１５３９−１５５０；これらをすべて本明細書に援用する。
【０００６】
上皮もしくは内皮バリヤー機能の撹乱または上皮もしくは内皮を通る輸送の無調節を伴う症状、たとえば炎症性腸疾患、あるいは脱髄を伴う症状、たとえば多発硬化症に対する、より有効な処置方法を開発するためには、クローディンポリペプチドファミリーのうちこれまで同定されていないメンバーについて、それらの新規なクローディンファミリーメンバーの特性および活性を確認できる情報が必要である。特に、これまで同定されていないヒトクローディンポリペプチドの特性解明が求められている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ヒトクローディンポリペプチドファミリーの新規なメンバーであるヒトクローディン−２１を見いだしたことに基づく。
【０００８】
本発明は、下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜１３よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１〜１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１〜３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１〜３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１２〜２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸２５〜２２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸３４〜８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸８２〜１０１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸８２〜１０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１０３〜１１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１７〜１４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１８〜１３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１４６〜１６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１６２〜１８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１６２〜１９１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１９２〜２２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）少なくとも３０個の連続アミノ酸を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）クローディンポリペプチド活性を有する、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）細胞外ループドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｈ）細胞質テイルドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｉ）少なくとも２０個のアミノ酸を含み、かつ（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；その際、アミノ酸同一性％は少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、および少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％よりなる群から選択される；
（ｊ）（ｉ）のアミノ酸配列であって、（ｉ）の該アミノ酸配列を含むポリペプチドが、（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドにも結合する抗体に結合するもの；ならびに
（ｋ）クローディンポリペプチド活性を有する、（ｉ）または（ｊ）のアミノ酸配列。
【０００９】
本発明はさらに、下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１９〜３３よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸５〜２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２８〜７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸７７〜９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１００〜１１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１１９〜１４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１４２〜１６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１６１〜１８３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１８４〜２１１よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）少なくとも３０個の連続アミノ酸を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）クローディンポリペプチド活性を有する、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）細胞外ループドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｈ）細胞質テイルドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｉ）少なくとも２０個のアミノ酸を含み、かつ（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；その際、アミノ酸同一性％は少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、および少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％よりなる群から選択される；
（ｊ）（ｉ）のアミノ酸配列であって、（ｉ）の該アミノ酸配列を含むポリペプチドが、（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドにも結合する抗体に結合するもの；ならびに
（ｋ）クローディンポリペプチド活性を有する、（ｉ）または（ｊ）のアミノ酸配列。
【００１０】
本発明は、下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドをも提供する：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１１〜３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸７７〜９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１１９〜１４１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１６７〜１８９よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸３４〜７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１００〜１１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１４２〜１６６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１９０〜２２９よりなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも２０個の連続アミノ酸を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）少なくとも３０個の連続アミノ酸を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）クローディンポリペプチド活性を有する、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）細胞外ループドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｈ）細胞質テイルドメインのアミノ酸配列を含む、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｉ）少なくとも２０個のアミノ酸を含み、かつ（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列とのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；その際、アミノ酸同一性％は少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、および少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％よりなる群から選択される；
（ｊ）（ｉ）のアミノ酸配列であって、（ｉ）の該アミノ酸配列を含むポリペプチドが、（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドにも結合する抗体に結合するもの；ならびに
（ｋ）クローディンポリペプチド活性を有する、（ｉ）または（ｊ）のアミノ酸配列。
【００１１】
本発明の他の態様は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸、および好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有し、本発明のポリペプチドをコードする核酸に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸である。本発明の好ましい態様において、それらの核酸はクローディンポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードするか、あるいは本発明の核酸のヌクレオチド配列とのヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、その際、ヌクレオチド配列同一性％は少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、および少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％よりなる群から選択される。
【００１２】
それぞれ本明細書に開示するアミノ酸配列およびヌクレオチド配列からなる単離されたポリペプチドおよび核酸も本発明に含まれる。
本発明はさらに、少なくとも１種類の本発明核酸を含む発現ベクターおよび組換え宿主細胞、ならびに本発明の核酸が宿主細胞ゲノムに組み込まれた好ましい組換え宿主細胞を提供する。
【００１３】
本発明の核酸によりコードされるポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドの発現を促進する条件下で組換え宿主細胞を培養することを含み、その際、組換え宿主細胞が少なくとも１種類の本発明核酸を含むものである方法も提供される。本発明により提供される好ましい方法は、さらにポリペプチドを精製することを含む。本発明の他の態様においては、本発明方法により製造されるポリペプチドが提供される。
【００１４】
本発明の他の態様は、本発明のポリペプチドに結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体、同様に好ましくはヒト化抗体またはヒト化抗体であり、好ましくはこの抗体は本発明ポリペプチドの活性を阻害する。
【００１５】
本発明はさらに、本発明ポリペプチドの阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を設計する方法であって、本発明ポリペプチドの三次元構造を決定し、基質結合可能性のある部位について該三次元構造を分析し、推定反応性部位を含む分子を合成し、そして該分子のポリペプチド阻害活性を測定する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の態様においては、クローディンポリペプチド活性を変化させる化合物を同定するための、下記を含む方法が提供される：
（ａ）被験化合物と本発明のポリペプチドを混合し；そして
（ｂ）被験化合物が該ポリペプチドのクローディンポリペプチド活性を変化させるか判定する。
【００１７】
本発明の他の態様においては、クローディンポリペプチド型ポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定するための、下記を含む方法が提供される：
（ａ）被験化合物と、本発明のポリペプチドおよび該ポリペプチドの結合パートナーとを混合し；そして
（ｂ）被験化合物が該ポリペプチドの結合活性を阻害するか判定する。
【００１８】
本発明は、密着結合形成活性を高め、または上皮もしくは内皮バリヤー機能活性を高める方法であって、少なくとも１種類の本発明ポリペプチドを付与することを含む方法をも提供する；この方法の好ましい態様はさらに、少なくとも１種類の本発明ポリペプチドを投与することにより患者においてそれらの活性を高めることを含む。
【００１９】
さらに本発明によれば、密着結合形成活性または上皮もしくは内皮バリヤー機能活性を低下させる方法であって、本発明ポリペプチドの少なくとも１種類のアンタゴニストを付与することを含む方法が提供される；この方法の好ましい態様はさらに本発明ポリペプチドの少なくとも１種類のアンタゴニストを投与することにより患者においてそれらの活性を低下させることを含み、さらに好ましい態様においてアンタゴニストは本発明ポリペプチドの活性を阻害する抗体である。
【００２０】
本発明はさらに、上皮または内皮バリヤー機能症状を処置する方法であって、本発明のポリペプチドを投与することを含む方法を提供する；好ましい態様において、上皮または内皮バリヤー機能症状は炎症性腸疾患、喘息、アレルギー、およびイオン輸送障害よりなる群から選択される。
【００２１】
本発明はさらに、脱髄状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を処置する方法であって、本発明のポリペプチドを投与することを含む方法を提供する；好ましい態様において、脱髄状態は多発硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、視神経炎、および進行性多病巣性白質脳症よりなる群から選択される。
【００２２】
本発明の他の態様においては、ウイルス症状またはエンテロトキシン状態を処置する方法であって、本発明ポリペプチドのアンタゴニストを投与することを含む方法が提供される；好ましい態様においてウイルス症状またはエンテロトキシン症状はクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）エンテロトキシン被曝であり、他の好ましい態様においてアンタゴニストはクロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシンが本発明のクローディンポリペプチドの細胞外ループに結合するのを遮断する。
【００２３】
発明の詳細な記述
ヒトクローディンポリペプチドの構造
本発明者らは、クローディンポリペプチドファミリーの新規なメンバー、ヒトクローディン−２１、ヒトクローディン−１９およびヒトクローディン−２２を同定した。クローディンポリペプチドファミリーのメンバーに共通の典型的構造要素には、非開裂型シグナルペプチド配列、４つの膜貫通ドメイン、膜貫通ドメインが形成する２つの細胞外ループ、およびポリペプチドのＣ末端にある細胞質テイルが含まれる。これらのポリペプチドのＮ末端およびＣ末端は両方とも細胞内にある。クローディンポリペプチドの２つの細胞外ループドメインは、それぞれポリペプチドの第１と第２の膜貫通ドメイン間、および第３と第４の膜貫通ドメイン間に位置する。ポリペプチドの第２と第３の膜貫通ドメイン間の短い領域は細胞内にある。クローディンポリペプチドの細胞質テイルドメインは、ポリペプチドの第４の膜貫通ドメインからＣ末端までの範囲である。
【００２４】
ヒトクローディン−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ヒトクローディン−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびヒトクローディン−２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）のアミノ酸配列は、クローディンポリペプチドの構造特色を含む。ヒトクローディン−２１はシグナル配列ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１２〜２６）を含む；これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸２４と２５の間で全長ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６アミノ酸配列を開裂するよう指令し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸２５をＮ末端アミノ酸とする成熟型の、すなわちプロセシングされたクローディン−２１ポリペプチドを形成する。ただし、このシグナル配列ドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１〜３０を含む第１の膜貫通（ＴＭ）ドメイン内にもあるとも推定される；これは、シグナル配列が開裂せずにクローディンポリペプチドのＮ末端にきわめて近い端（この場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１〜１０）を細胞の内側に配置した状態で細胞膜に挿入されている他のクローディンファミリーメンバーと一致する。ヒトクローディン−２１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸８２〜１０１を含む第２ＴＭドメイン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１８〜１３７を含む第３ＴＭドメイン、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１６２〜１８１を含む第４ＴＭドメインをもつことも推定される。隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）分析では、同一の非開裂型シグナルドメインおよび類似の膜貫通ドメインが推定される：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１２〜３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸８２〜１０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１８〜１４０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１６６〜１８８。ヒトクローディン−２１のＴＭドメインについてのこれらの推定位置は、Ｍｏｒｉｔａらがクローディンポリペプチドファミリーの他のメンバーについて同定したもの（１９９９，密着結合鎖の４回膜貫通ドメインタンパク質成分をコードするクローディン多遺伝子ファミリー，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：５１１−５１６）ともよく一致する。他のファミリーメンバーとのアラインメントに基づき、かつＭｏｒｉｔａらの図１を参照すると、４つの膜貫通ドメインはそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１〜３３、８２〜１０２、１１７〜１４５、および１６２〜１９１の範囲であると推定される。ヒトクローディン−２１の４つのＴＭドメインについてのこれらの推定位置によれば、ヒトクローディン−２１の第１の細胞外ループは、ほぼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸３１ないしアミノ酸３４付近に始まってほぼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸８１までの範囲となり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸３４からアミノ酸８１までである；ヒトクローディン−２１の第２の細胞外ループは、ほぼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１３８ないしアミノ酸１４６付近に始まってほぼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１６１までの範囲となり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１４６からアミノ酸１６１までである。第２と第３のＴＭドメイン間にある細胞内配列は、ほぼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１０２または１０３からほぼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１１６ないし１１７までの範囲であり、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１０３からアミノ酸１１６までである。ヒトクローディン−２１の細胞質テイルドメインは、ほぼＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１８２ないしアミノ酸１９２付近に始まってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸２２０の推定Ｃ末端までの範囲である；好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の細胞質テイルドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸１９２からアミノ酸２２０までである。ヒトクローディン−１９は非開裂型シグナル配列ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸８〜２５）を含む；これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２４と２５の間で全長ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８アミノ酸配列を開裂するよう指令する。隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）分析では、ヒトクローディン−１９について下記の膜貫通ドメインが推定される：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸５〜２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸７７〜９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１１９〜１４１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１６１〜１８３。ヒトクローディン−２２は非開裂型シグナル配列ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１１〜２７）を含む；これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸２４と２５の間で全長ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１アミノ酸配列を開裂するよう指令する。隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）分析では、ヒトクローディン−２２について下記の膜貫通ドメインが推定される：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１１〜３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸７７〜９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１１９〜１４１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸１６７〜１８９。これらのポリペプチドのこれらの領域の境界はおおよそのものであり、そのようなドメインの正確な境界、たとえば膜貫通ドメインの境界はヒトクローディン−１９、−２１および−２２について本明細書中で推定したものと異なる可能性があることは当業者には自明であろう。
【００２５】
クローディンポリペプチドの細胞質テイルドメインの最もＣ末端にある残基はＰＤＺドメイン含有タンパク質との相互作用に関与すると考えられ、したがってこれらの残基を置換することは、そのポリペプチドのＰＤＺドメイン認識パターンもしくは結合機能の変化またはその機能の欠如に関連する可能性がある。クローディンポリペプチドファミリーの大部分のメンバー、たとえば本明細書に記載するヒトクローディン−１９は、それらのＣ末端に−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨアミノ酸配列をもつ。ヒトクローディン−２１は、それらのＣ末端に−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨアミノ酸配列をもつと推定される。これはクローディンファミリーの他のポリペプチドのＣ末端アミノ酸配列と厳密には一致しないが、ＰＤＺドメインと相互作用する”グループ１”ポリペプチドに対するコンセンサス要求と大部分の点で一致する（Ｃｏｗｂｕｒｎ  Ｄ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７：８３５−８３８；本明細書に援用する）：Ｃ末端残基としてのＶａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｍｅｔ、２位のＴｈｒ／Ｓｅｒ／Ｔｙｒおよび３位のＧｌｕの優位性。ヒトクローディン−２１はＣ末端残基としてＶａｌをもち、かつ３位にＡｓｐ（Ｇｌｕと同様に酸性側鎖をもつ）をもつ。ヒトクローディン−２２はＣ末端残基としてＩｌｅをもつ。したがってヒトクローディン−２１および−２２はＰＤＺドメイン含有ポリペプチドと相互作用すると推定される。ただし、それらはクローディンファミリーの他のメンバーとは異なるサブセットのＰＤＺドメインと相互作用するか、あるいはＰＤＺドメイン含有ポリペプチドとの相互作用において異なる動態または親和性を示すと思われる。
【００２６】
本発明のクローディンポリペプチドの生物活性および機能
本明細書中で用いる”本発明のクローディンポリペプチド”には、ヒトクローディン−１９、ヒトクローディン−２１、ヒトクローディン−２２、ならびに適用可能なものとして種相同体、たとえばネズミクローディン−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびネズミクローディン−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ならびにこれらのヒトクローディンポリペプチドおよびそれらの種相同体のバリアントおよび断片が含まれる。本発明のクローディンポリペプチドは、クローディンファミリーの他のポリペプチドと一致する生物活性および機能をもつ。クローディンファミリーのポリペプチドは、上皮細胞および内皮細胞を含めた細胞タイプに発生全体を通じて発現する。このファミリーのポリペプチドに伴う代表的な生物活性および機能は、密着結合形成、上皮または内皮バリヤー機能、イオン輸送、ウイルスタンパク質結合、ホモタイプまたはヘテロタイプ結合、および結合性ＰＤＺドメイン結合である。密着結合形成活性をもつポリペプチドは他の密着結合関連分子に結合して密着結合構造を形成し、これが上皮または内皮バリヤー機能および経細胞輸送を調節する。密着結合形成活性はクローディンポリペプチドの細胞外ループに関連し、おそらく細胞質テイルドメインとも関連するであろう。したがって、密着結合形成活性が要求される用途に好ましいヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドには、細胞外ループドメインをもち、かつ密着結合形成活性、たとえば上皮もしくは内皮バリヤー機能、経細胞イオン輸送、またはウイルスタンパク質結合を示すものが含まれる。本発明の好ましいクローディンポリペプチドにはさらに、１以上の本発明クローディンポリペプチドの少なくとも１つの細胞外ループドメインまたは細胞質テイルドメインを含むオリゴマーまたは融合ポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドのいずれかの断片であって密着結合形成活性をもつものが含まれる。ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ならびにクローディンファミリーの他のポリペプチドの密着結合形成活性は、たとえば普通は密着結合を形成しない細胞（たとえばＬ線維芽細胞）にオクルディンと一緒に、またはクローディンポリペプチドが密着結合形成に際して相互作用する必要のある他のいずれかのポリペプチドと一緒に、クローディンポリペプチドを導入し、次いで生成した密着結合構造を電子顕微鏡検査または免疫蛍光法で視覚化することにより判定できる（たとえばＦｕｒｕｓｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，単一遺伝子生成物クローディン−１または−２は線維芽細胞において密着結合鎖を再構成し、オクルディンを動員する，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４３：３９１−４０１参照）。あるいはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ならびにクローディンファミリーの他のポリペプチドの経細胞イオン輸送活性は、電気生理学方法で、または発光性イオン指示分子、たとえばエクオリンを用いて、好ましくはクローディンポリペプチド発現細胞からのミセル調製物においてアッセイできる。
【００２７】
クローディンポリペプチド、たとえばヒトクローディン−１９、−２１および−２２は、ホモタイプ結合、ヘテロタイプ結合、ウイルスタンパク質結合、および／またはエンテロトキシン結合活性をもつ；これらの結合活性はそれぞれクローディンポリペプチドの細胞外ループドメインに関連する。したがって、ホモタイプ結合、ヘテロタイプ結合、ウイルスタンパク質結合、および／またはエンテロトキシン結合活性が要求される用途に好ましい本発明のクローディンポリペプチドには、少なくとも１つの細胞外ループドメインをもち、かつそのような結合活性のうち少なくとも１つを示すものが含まれる。クローディンポリペプチドは、クローディンポリペプチドの細胞質テイルドメインに関連するＰＤＺドメイン結合活性も備えている。したがって、ＰＤＺドメイン結合活性が要求される用途に好ましい本発明のクローディンポリペプチドには、細胞質テイルドメインをもち、かつＰＤＺドメイン結合活性を示すものが含まれる。本発明の好ましいクローディンポリペプチドにはさらに、１以上の本発明クローディンポリペプチドの少なくとも１つの細胞外ループドメインおよび／または細胞質テイルドメインを含むオリゴマーまたは融合ポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドのいずれかの断片であって、ホモタイプ結合、ヘテロタイプ結合、ウイルスタンパク質結合、エンテロトキシン結合および／またはＰＤＺドメイン結合活性をもつものが含まれる。ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ならびにクローディンファミリーの他のポリペプチドの結合活性は、たとえばクローディンポリペプチドとそれのホモタイプ、ヘテロタイプ、ウイルスタンパク質、エンテロトキシンおよび／またはＰＤＺドメイン含有−結合パートナーとの結合を測定する酵母２ハイブリッドアッセイ法またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法により判定できる；その際、その結合を検出できるように、クローディンポリペプチドまたはそれの結合パートナーのいずれかを放射性、蛍光性または生物発光性タンパク質で標識しておく。
【００２８】
本明細書中で用いる”ヒトクローディンポリペプチド活性”という用語には、下記のうちのいずれか１以上が含まれる：本発明クローディンポリペプチドの密着結合形成、上皮または内皮バリヤー機能、およびイオン輸送活性；ホモタイプ結合、ヘテロタイプ結合、ウイルスタンパク質結合、エンテロトキシン結合、およびＰＤＺドメイン結合活性；ならびにｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ活性。本発明のクローディンポリペプチドならびにこれらのポリペプチドの断片および他の誘導体がこれらの活性を示す程度は、標準アッセイ法により測定できる。アッセイ法の例を本明細書に開示する；他の同様なタイプのアッセイ法を用いて本発明のクローディンポリペプチドおよびクローディンファミリーの他のポリペプチドの生物活性を測定できることは当業者に自明であろう。
【００２９】
ヒトクローディン−１９、−２１および−２２を含めたクローディンポリペプチドの生物活性の態様のひとつは、このポリペプチドファミリーのメンバーが特定の結合パートナー、たとえばホモタイプおよびヘテロタイプポリペプチド、ウイルスタンパク質、エンテロトキシン、ならびにＰＤＺドメイン含有ポリペプチドに結合する能力である；たとえば細胞外ループドメインはホモタイプポリペプチドに結合し、細胞質テイルドメインはＰＤＺドメイン含有ポリペプチドに結合する。本明細書中で用いる”結合パートナー”という用語には、結合パートナーとヒトクローディン−１９、−２１または−２２ポリペプチドの特定部分間の接触または接近によりヒトクローディン−１９、−２１または−２２ポリペプチドと相互作用するリガンド、受容体、基質、抗体、他のクローディンポリペプチド、同じヒトクローディン−１９、−２１または−２２ポリペプチド（ホモタイプ相互作用の場合）、および他のいずれかの分子が含まれる。上皮細胞に発現したクローディンポリペプチドは隣接する上皮細胞上の分子に結合して密着結合を形成し、内皮細胞に発現したクローディンポリペプチドは隣接する内皮細胞上の分子に結合するので、本発明のクローディンポリペプチドに対する結合パートナーも上皮細胞および内皮細胞により発現する。したがって、本発明のクローディンポリペプチドとそれらの結合パートナーとの相互作用は、隣接する上皮細胞間の相互作用および隣接する内皮細胞間の相互作用の仲介に関与すると思われる。本発明クローディンポリペプチドの細胞外ループドメインはホモタイプまたはヘテロタイプポリペプチドに結合するので、１以上の細胞外ループドメインを含む誘導体ポリペプチドがヒトクローディン−１９、−２１もしくは−２２ポリペプチドの残部とは別個の断片として、またはたとえば免疫グロブリンＦｃドメインに融合した可溶性ポリペプチドとして発現した場合、これらは本発明のクローディンポリペプチドがそれの結合パートナーに結合するのを撹乱すると予想される。この別個の細胞外ループドメインポリペプチドは、１以上の結合パートナーに結合することにより天然のヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドによる結合を阻止し、したがって優性ネガティブ様式で作用して、本発明のクローディンポリペプチドがホモタイプまたはヘテロタイプポリペプチドに結合することにより仲介する生物活性を阻害すると思われる。ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ならびにクローディンファミリーの他のポリペプチドがもつ生物活性およびパートナー結合特性は、標準法および本明細書に記載するアッセイ法によりアッセイできる。
【００３０】
クローディンファミリーのポリペプチド、たとえばヒトクローディン−１９、−２１および−２２は、上皮または内皮バリヤー機能に関与し、病因における共通の特色として異常な密着結合形成または不適正な密着結合機能調節（すなわち異常な上皮または内皮バリヤー機能）を示す疾患または状態を伝達する。より具体的には、上皮もしくは内皮バリヤー機能および／またはクローディンポリペプチドへの結合に関連する下記の状態は、クローディンポリペプチドの生物活性に関連することが知られているか、またはその可能性があるものである：炎症、喘息、アレルギー、癌細胞の転移、腎臓におけるマグネシウム輸送欠陥などのイオン輸送障害、炎症性腸疾患、およびクロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシン（ＣＰＥ）被曝。さらに、神経細胞に発現するクローディンポリペプチドは乏突起膠細胞のミエリン鞘形成に必要であることが示されたので、クローディンポリペプチドは脱髄状態、たとえば多発硬化症（ＭＳ）、自己免疫性脳脊髄炎、視神経炎、および進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）などに関連する。１以上の上記症状により促進される疾患も、直接または間接的にクローディンポリペプチドに関連する可能性がある。たとえば乳児突然死症候群（ＳＩＤＳ）の罹患性はＣＰＥ被曝と関連があるとされている。本発明のクローディンポリペプチドとそれらの基質、リガンド、受容体、結合パートナーおよび／または他の相互作用性ポリペプチドとの相互作用を遮断または阻害することが本発明の態様のひとつであり、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２活性の阻害剤を用いることによりこれらの疾患および状態を処置または改善する方法が提供される。そのような阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）またはアンタゴニストの例を後記に詳述する。低すぎるヒトクローディン−１９、−２１および−２２活性に関連する上皮もしくは内皮バリヤー機能またはイオン輸送の欠陥を伴うある状態については、これらの疾患および症状を治療または改善する方法は、単離した本発明クローディンポリペプチドまたはその活性断片もしくは融合ポリペプチドを付与することにより、あるいは内因性または外因性の本発明クローディンポリペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）を付与することにより、本発明クローディンポリペプチドの量または活性を高めることを含む。本発明のクローディンポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストの他の用途には、上皮または内皮輸送系疾患の診断薬；オクルディンまたはＺＯファミリーポリペプチドおよび密着結合形成を調べるための研究用試薬；オクルディンもしくはＺＯポリペプチドまたは上皮もしくは内皮細胞の精製、加工および保存；あるいは療法剤運搬のためのキャリヤーまたはターゲティング分子としての用途、特に血液−脳関門の密着結合におけるクローディンの役割を考慮したものが含まれる（Ｋｎｉｅｓｅｌ  Ｕ  ａｎｄ  Ｗｏｌｂｕｒｇ  Ｈ，２０００，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２０：５７−７６；本明細書に援用する）。
【００３１】
本発明のクローディンポリペプチド
ヒトクローディン−１９、−２１または−２２ポリペプチドは、下記に十分な程度に、表１に示すヒトクローディン−１９、−２１または−２２ポリペプチドアミノ酸配列とのアミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチドである：（Ａ）当業者が特定の構造ドメインを有すると思われるポリペプチドと同定できる、および／または（Ｂ）ヒトクローディンポリペプチドと共通の生物活性をもつ、および／または（Ｃ）他のヒトクローディンポリペプチドにも特異的に結合する抗体に結合する。本発明のクローディンポリペプチドは天然源から単離でき、あるいは天然クローディンポリペプチドと同じ構造をもち、あるいは天然クローディンポリペプチドと異なる構造をもつように製造できる。ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドのいずれかから何らかのタイプの変更（たとえばアミノ酸の挿入、欠失または置換；ポリペプチドのグリコシル化状態の変更；リフォールディングまたは異性化による三次元構造または自己会合状態の変更；および他のポリペプチドまたは分子との会合の変更；これらに限定されない）により誘導されたポリペプチドも、本発明のクローディンポリペプチドである。したがって、本発明により提供されるポリペプチドには、本明細書に記載する本発明クローディンポリペプチドのものと類似するアミノ酸配列を特徴とし、ただし自然または人為的に修飾がなされたポリペプチドも含まれる。本発明のクローディンポリペプチドと共通の生物活性を有するポリペプチドは、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２活性をもつポリペプチドである。クローディンポリペプチドファミリーのメンバーが示す生物活性の例には、密着結合形成、上皮または内皮バリヤー機能、イオン輸送、ホモタイプまたはヘテロタイプ結合、ウイルスタンパク質結合、およびエンテロトキシン結合が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明は、全長および成熟形の両方の本発明クローディンポリペプチドを提供する。全長ポリペプチドは、最初に翻訳されたポリペプチドの完全一次アミノ酸配列をもつものである。全長ポリペプチドのアミノ酸配列は、たとえば完全オープンリーディングフレーム（”ＯＲＦ”）のｃＤＮＡ分子の翻訳により得ることができる。１つの遺伝子座からのオルタナティブスプライシングにより、または複数の翻訳開始部位の使用により複数のｍＲＮＡ形が生成する場合、１つの遺伝子座が数種類の全長ポリペプチドをコードする可能性がある。”成熟形”のポリペプチドとは、翻訳後プロセシング工程、たとえばシグナル配列の開裂またはタンパク質分解開裂を経て、プロドメインが除去されたポリペプチドを表わす。たとえばシグナル配列が複数の部位で開裂することにより、あるいはポリペプチドを開裂するプロテアーゼ調節の相異により、その全長ポリペプチドの複数の成熟形が生成する可能性がある。成熟形のそのようなポリペプチドは、全長ポリペプチドをコードする核酸分子を適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞において発現させることにより得ることができる。成熟形ポリペプチドの配列は、全長形のアミノ酸配列からシグナル配列またはプロテアーゼ開裂部位を同定することによっても決定できる。本発明のクローディンポリペプチドには、転写後または翻訳後プロセシング事象、たとえばオルタネートｍＲＮＡプロセシングにより生じるものも含まれる；これによりたとえばトランケートされてはいるが生物活性であるポリペプチド、たとえば天然の可溶形ポリペプチドが生成する可能性がある。本発明には、タンパク質分解による変異体、たとえば異なるタイプの宿主細胞において発現する際にタンパク質分解により１以上の末端アミノ酸がポリペプチドから除去される（一般に１〜５個の末端アミノ酸）ことによるＮ末端またはＣ末端の相異も含まれる。
【００３３】
本発明にはさらに、天然様式のグリコシル化を伴う、または伴わない、本発明のクローディンポリペプチドが含まれる。酵母または哺乳動物発現系（たとえばＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞）で発現するポリペプチドは、発現系の選択に応じて分子量およびグリコシル化様式が天然ポリペプチドと類似するか、または有意に異なる可能性がある。本発明のポリペプチドを細菌発現系、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させると、グリコシル化されていない分子が得られる。さらに、ある調製物が複数の異なるグリコシル化種のポリペプチドを含有する場合もある。グリコシル基は常法により、特にグリコペプチダーゼを用いる方法で除去できる。一般に、本発明のグリコシル化ポリペプチドを過剰モルのグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共にインキュベートすることができる。
【００３４】
本発明のクローディンポリペプチドおよびそれらをコードする核酸の種相同体も本発明により提供される。本明細書中で用いる”種相同体（ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）”は、あるポリペプチドまたは核酸とは異なる種に由来するが、当業者の判定によればそのポリペプチドまたは核酸と有意の配列類似性をもつポリペプチドまたは核酸である。種相同体は、本明細書に提示するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして目的種から適切な核酸源をスクリーニングすることにより単離および同定できる。本発明には、本発明クローディンポリペプチドおよびそれらをコードする核酸の対立遺伝子バリアント（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｔ）、すなわちアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の相異が遺伝子多型性（集団内の個体間の対立遺伝子変異）によるものである天然のオルタナティブ形のそのようなポリペプチドおよび核酸も含まれる。
【００３５】
本発明クローディンポリペプチドの断片は本発明に含まれる。これらは線状であってもよく、あるいはたとえば下記に記載される既知方法で環化されてもよい：Ｈ．Ｕ．Ｓａｒａｇｏｖｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７３−７７８（１９９２）およびＲ．Ｓ．ＭｃＤｏｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，９２４５−９２５２（１９９２）（両者を本明細書に援用する）。本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片ならびにそれらをコードする核酸には、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％）のアミノ酸または核酸配列長さをもち、かつヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドまたはコード核酸との少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性をもつポリペプチドおよび核酸が含まれる；配列同一性は、オーバーラップおよび同一性が最大になり、一方では配列ギャップが最小になるようにアラインした状態で、ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより判定される。本発明には、好ましくは少なくとも８個、または少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個、さらに好ましくは少なくとも３０個、最も好ましくは少なくとも４０個の連続アミノ酸を含むセグメントを含有するかまたはコードする、ポリペプチドおよびポリペプチド断片ならびにそれらをコードする核酸も含まれる。そのようなポリペプチドおよびポリペプチド断片は、本発明クローディンポリペプチドのいずれかのセグメントとの少なくとも７０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性をもつセグメントを含有してもよい；配列同一性は、オーバーラップおよび同一性が最大になり、一方では配列ギャップが最小になるようにアラインした状態で、ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより判定される。同一性％は、視覚検査および数学的計算により判定できる。あるいは２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性％は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７，１９８４）が記述した、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することにより判定できる。ＧＡＰプログラムに好ましいデフォルトパラメーターには下記のものが含まれる：（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリックス（ｕｎａｒｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）（同一性については１、非同一性については０の数値を含む）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅ���ｓ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；ＳｃｈｗａｒｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９に記載；（２）各ギャップにつき３．０のペナルティ、および各ギャップの各記号につきさらに０．１０のペナルティ；ならびに（３）末端ギャップについてはペナルティなし。配列比較の専門家が用いる他のプログラムも使用できる：たとえばＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．０．９（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉから入手使用できる）またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズム。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ  ２．０の標準デフォルトパラメーター設定は下記のインターネットウェブページに記載されている：ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ。さらにＢＬＡＳＴアルゴリズムはＢＬＯＳＵＭ６４アミノ酸得点マトリックスを用いる；使用できる任意パラメーターは下記のものである：（Ａ）組成複雑性の低いクエリー配列のｆｉｌｔｅｒ  ｔｏ  ｍａｓｋセグメントの導入（Ｗｏｏｔｔｏｎ  ＆  ＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラムにより判定（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）；Ｗｏｏｔｔｏｎ  ＪＣ  ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ  Ｓ，１９９６，配列データベースにおける組成バイアス領域の分析，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：５５４−７１も参照）、または短周期型内部反復配列からなるセグメントの導入（Ｃｌａｖｅｒｉｅ  ＆  ＳｔａｔｅｓのＸＮＵプログラムにより判定（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３））；および（Ｂ）データベース配列との一致、すなわちＥ−得点を報告するための統計的有意性閾値（偶然見いだされるにすぎない一致の予想確率：Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率モデルに従う；一致と認められる統計的有意性がこのＥ−得点閾値より大きい場合、その一致は報告されない）；好ましいＥ−得点閾値は０．５であり、下記の順に優位性が高くなる：０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、ｌｅ−５、ｌｅ−１０、ｌｅ−１５、ｌｅ−２０、ｌｅ−２５、ｌｅ−３０、ｌｅ−４０、ｌｅ−５０、ｌｅ−７５、またはｌｅ−１００。
【００３６】
本発明は、本発明クローディンポリペプチドの特定の断片またはドメインを含む可溶形クローディンポリペプチド、特に細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの１以上の断片を含むものをも提供する。可溶性ポリペプチドは、それらが発現した細胞から分泌可能なポリペプチドである。そのような形ではポリペプチドの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインの一部または全部が欠失しており、このためポリペプチドはそれらが発現した細胞から十分に分泌される。本発明ポリペプチドの細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインは、そのようなドメインを配列情報から決定するための既知の方法により同定できる。可溶性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドが細胞から分泌可能である限り、かつ好ましくはヒトクローディン−１９、−２１および−２２の活性が保持される限り、本発明の可溶性クローディンポリペプチドには膜貫通領域の一部を含むポリペプチドも含まれる。本発明の可溶性クローディンポリペプチドにはさらに、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの少なくとも１つの細胞外部分を含むオリゴマーまたは融合ポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドのいずれかの、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２活性をもつ断片も含まれる。分泌された可溶性ポリペプチドは、目的ポリペプチドを発現する無傷の細胞をたとえば遠心により培地から分離し、そして培地（上清）を目的ポリペプチドの存在についてアッセイすることにより同定できる（かつそれの不溶性膜結合カウンターパートと識別できる）。培地中に目的ポリペプチドが存在すると、そのポリペプチドは細胞から分泌されたこと、したがって可溶形ポリペプチドであることが示される。本発明の可溶形クローディンポリペプチドの使用は多くの用途にとって有利である。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるので、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易になる。さらに、可溶性ポリペプチドは一般に経口投与および多くの酵素処理に膜結合形より適している。
【００３７】
本発明の他の態様において、好ましいポリペプチドはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドドメイン、たとえば細胞質テイルドメインおよび細胞外ループドメインの多様な組合わせを含む。したがって、本発明のポリペプチドおよびそれらをコードする核酸には、細胞質テイルドメインなど２コピー以上のドメイン、細胞外ループドメインなど２コピー以上のドメイン、または少なくとも１コピーの各ドメインを含むかまたはコードするものが含まれ、これらのドメインは任意の順序でそれらのポリペプチド内に存在しうる。
【００３８】
当業者は既知の方法でペプチドまたはＤＮＡ配列にさらに修飾を行うことができる。ポリペプチド配列における重要な修飾には、選択したアミノ酸の変更（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、交換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、挿入または欠失が含まれる。たとえば１以上のシステイン残基を欠失させ、または他のアミノ酸と交換して、分子のコンホメーションを変更することができる；これは、フォールディングまたは再生に際して不適正な分子内ジスルフィド橋の形成を阻止するための変更である。このような変更、置換、交換、挿入または欠失のための方法は当業者に周知である（たとえばＵＳＰ４，５１８，５８４参照）。他の例として、ポリペプチドの細胞外ドメインにあるＮ−グリコシル化部位をグリコシル化できないように修飾し、哺乳動物および酵母発現系において炭水化物類似体の発現を減らすことができる。真核細胞ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙを特色とする；ここでＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適宜な置換、付加または欠失により、Ａｓｎ側鎖に炭水化物残基が結合するのが阻止されるであろう。たとえば、Ａｓｎを異なるアミノ酸で交換するように選択した単一ヌクレオチド変更で、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを他のアミノ酸、たとえばＡｌａと交換してもよい。ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、ＵＳＰ５，０７１，９７２およびＥＰ２７６，８４６に記載のものが含まれ、これらを本発明に援用する。本発明の範囲内の他のバリアントには、他の化合物部分（たとえばグリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基など）との共有結合体または凝集結合体の形成により修飾してその誘導体を作製できるポリペプチドが含まれる。共有結合誘導体は、その化合物部分をアミノ酸側鎖上またはポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にある官能基に結合させることにより調製できる。結合した診断剤（検出可能）または療法剤を含む結合体も本発明において考慮される。好ましくは、このような変更、置換、交換、挿入または欠失によって、本発明ポリペプチドまたはそれと実質的に同等なものの目的活性は保持される。一例は、天然形と本質的に同じ結合親和性で結合するバリアントである。結合親和性は常法により、たとえばＵＳＰ５，５１２，４５７の記載および本明細書の記載に従って測定できる。
【００３９】
他の誘導体には、本発明のポリペプチドと他のポリペプチドまたはポリペプチド類との共有結合体または凝集結合体、たとえば組換え培養においてＮ末端またはＣ末端融合体として合成されるものが含まれる。融合ポリペプチドの例については後記にオリゴマーに関連して述べる。さらに融合ポリペプチドは、精製および同定を容易にするために付加されたペプチドを含むことができる。そのようなペプチドには、たとえばポリ−Ｈｉｓまたは抗原性同定ペプチドが含まれる；ＵＳＰ５，０１１，９１２およびＨｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載。そのようなペプチドのひとつはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドである；これは抗原性が高く、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、このため発現した組換えポリペプチドの迅速アッセイおよび円滑な精製が可能になる。４Ｅ１１と表示されるネズミハイブリドーマは、特定の二価金属カチオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを結合するモノクローナル抗体を産生する；ＵＳＰ５，０１１，９１２に記載：本明細書に援用する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託番号ＨＢ９２５９で寄託された。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（コネチカット州ニュー・ヘブン）から入手できる。
【００４０】
本発明には、本明細書に開示するヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド、本発明クローディンポリペプチドの１以上の断片、または誘導体もしくはバリアント形の本発明クローディンポリペプチドを含有する、オリゴマーまたは融合ポリペプチドが含まれる。具体的態様において、オリゴマーは可溶性の本発明クローディンポリペプチドを含む。オリゴマーは共有結合型または非共有結合型多量体の形であってもよく、これには二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーが含まれる。本発明の態様のひとつにおいて、オリゴマーはポリペプチド成分の結合能を保持し、そのため二価、三価などの結合部位をもつ。別態様において本発明は、ポリペプチドに融合したペプチド部分間で共有結合または非共有結合相互作用により結合した複数の本発明クローディンポリペプチドを含むオリゴマーに関する；これらのペプチドはオリゴマー化を促進する特性をもつものである。ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドは、それらに結合したポリペプチドのオリゴマー化を促進することができるペプチドに含まれる；これについては後記に詳述する。
【００４１】
本発明クローディンポリペプチドのバリアントが膜貫通ドメインを含むように構築する態様においては、それらはタイプＩ膜ポリペプチドを形成する。本発明の膜貫通クローディンポリペプチドを、リガンドが分かっている受容体ポリペプチドの細胞外ドメインと融合させることができる。次いで、そのような融合ポリペプチドが膜貫通ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドにより開始する細胞内信号伝達経路を制御するように操作することができる。細胞膜を貫通する本発明クローディンポリペプチドを細胞表面受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストまたは細胞接着分子と融合させて、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２の細胞内作用をさらに調節することもできる。本発明の他の態様においては、好ましいヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド断片と他の融合ポリペプチドドメインの間にインターロイキンを配置することができる。
【００４２】
免疫グロブリンベースのオリゴマー．ポリペプチド結合部位の価数増加など多数の目的で、本発明のポリペプチドまたはその断片を免疫グロブリンなどの分子に融合させることができる。たとえばヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの断片を直接に、またはリンカー配列により、免疫グロブリンのＦｃ部に融合させることができる。二価形のポリペプチドについては、そのような融合をＩｇＧ分子のＦｃ部に対して行うことができる。他のイソ型免疫グロブリンを用いてそのような融合体を形成することもできる。たとえばポリペプチド−ＩｇＭ融合により、十価形の本発明ポリペプチドが形成される。本明細書中で用いる”Ｆｃポリペプチド”という用語には、抗体のＦｃ部のＣＨドメインの一部または全部を含むＦｃ部から構成される天然形および変異形のポリペプチドが含まれる。二量体化を促進するヒンジ部を含むトランケート形のそのようなポリペプチドも含まれる。好ましいＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するＦｃポリペプチドを含む。別態様のひとつとして、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いてオリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の種々の部分に融合した特定の異種（ｈｅｔｅｌｏｒｏｇｏｕｓ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの調製は、たとえば下記により報告されている：Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８８：１０５３５，１９９１）；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３４４：６７７，１９９０）；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ（”免疫グロブリン融合ポリペプチドの構築”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１，１９９２）。免疫グロブリンベースのオリゴマーを製造および使用する方法は当技術分野で周知である。本発明の態様のひとつは、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合させることにより形成した、２つの融合ポリペプチドを含む二量体に関する。このポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合体を適宜な発現ベクターに挿入する。この組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞においてポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドを発現させ、抗体分子と同様に組み立てさせると、Ｆｃ部間に鎖間ジスルフィド結合が形成されて二価分子が得られる。ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（本明細書に援用する）に記載されている適切なＦｃポリペプチドのひとつは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部のＮ末端ヒンジ部から天然Ｃ末端までの範囲の一本鎖ポリペプチドである。他の有用なＦｃポリペプチドは、ＵＳＰ５，４５７，０３５およびＢａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：３９９２−４００１，１９９４）（本明細書に援用する）に記載されるＦｃ変異タンパク質である。この変異タンパク質のアミノ酸配列はＷＯ９３／１０１５１に提示される天然Ｆｃ配列のものと同じであるが、ただしアミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化している。この変異タンパク質はＦｃ受容体に対する親和性の低下を示す。Ｆｃ部を含���上記の融合ポリペプチド（およびそれらから形成されるオリゴマー）は、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易であるという利点をもつ。他の態様においては、本発明のポリペプチドを抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変部の代わりに用いることができる。融合ポリペプチドを抗体のＨ鎖およびＬ鎖の両方で作製すると、４つものヒトクローディン−１９、−２１および−２２細胞外領域を含むオリゴマーを形成することができる。
【００４３】
ペプチドリンカーベースのオリゴマー．あるいは、複数の本発明クローディンポリペプチドを含み、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）をもつ、またはもたないオリゴマーは、融合ポリペプチドである。適切なペプチドリンカーには、ＵＳＰ４，７５１，１８０および４，９３５，２３３（本明細書に援用する）に記載のものが含まれる。目的ペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を、いずれか適切な常法により本発明のＤＮＡ配列間にそれらと同じ読み枠内で挿入することができる。たとえば、リンカーをコードする化学合成オリゴヌクレオチドを配列間にライゲートすることができる。具体的態様において融合ポリペプチドは、本発明の可溶性クローディンポリペプチド２〜４つがペプチドリンカーで分離されたものからなる。適切なペプチドリンカー、それらと他のポリペプチドの組合わせ、およびそれらの使用は当業者に周知である。
【００４４】
ロイシンジッパー．本発明のオリゴマーを製造するための他の方法は、ロイシンジッパーを用いるものである。ロイシンジッパードメインは、それらを含むポリペプチドのオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは最初は数種類のＤＮＡ結合性ポリペプチド中に同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１７５９，１９８８）、それ以来多様なポリペプチド中に見いだされた。既知のロイシンジッパーは、二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびそれらの誘導体にある。このジッパードメイン（本明細書においてはオリゴマー化ドメインまたはオリゴマー形成ドメインとも呼ぶ）は、しばしば４または５個のロイシン残基間に他のアミノ酸が点在する反復性のヘプタッド反復配列を含む。ロイシンジッパーの使用およびロイシンジッパーを用いたオリゴマーの製造は当技術分野で周知である。
【００４５】
ポリペプチド活性を全部または一部保持すると予想され、したがってスクリーニングまたは他の免疫学的方法に有用と思われる他のポリペプチド配列断片および誘導体も、本明細書の開示内容を考慮して当業者が製造できる。そのような修飾も本発明に含まれると考えられる。
【００４６】
本発明のクローディンポリペプチドをコードする核酸
本発明には本発明のクローディンポリペプチドをコードする核酸も含まれる。これらの核酸は、ゲノム分子またはｃＤＮＡ分子を適切な供給源から単離することを含めた幾つかの方法で同定できる。核酸単離のためのプローブもしくはプライマーとして、またはデータベース検索のためのクエリー配列として用いるための、本明細書に記載するアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、それらのアミノ酸配列からの”戻し翻訳”により、またはコードＤＮＡ配列が同定されているポリペプチドとのアミノ酸同一領域の同定により得ることができる。周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドまたは目的とするヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド断片の組合わせをコードするＤＮＡ配列を単離および増幅することができる。目的とする組合わせＤＮＡ断片末端を規定するオリゴヌクレオチドを５’および３’プライマーとして用いる。これらのオリゴヌクレオチドは、増幅した組合わせＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入するのを容易にするために、制限エンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含むことができる。ＰＣＲ法はＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，サンディエゴ（１９８９），ｐｐ．１８９−１９６；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社（１９９０）に記載されている。
【００４７】
本発明の核酸分子には、一本鎖および二本鎖両方の形のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに対応する相補配列が含まれる。ＤＮＡには、たとえばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ、およびそれらの組合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、全長の遺伝子またはｃＤＮＡ分子、およびそれらの断片の組合わせが含まれる。本発明の核酸分子はヒト源に由来するものが好ましいが、本発明にはヒト以外の種に由来するものも含まれる。
【００４８】
”本質的にヌクレオチド配列からなる単離核酸”とは、その核酸がそのヌクレオチド配列のほかに、核酸分子のいずれかの末端または両端に共有結合した追加物質を含みうることを意味する。これらの追加物質は、好ましくは核酸分子のいずれかの末端、各末端または両端に共有結合した１〜１００，０００個の追加ヌクレオチド、より好ましくは核酸分子のいずれかの末端、各末端または両端に共有結合した１〜１０，０００個の追加ヌクレオチド、最も好ましくは核酸分子のいずれかの末端、各末端または両端に共有結合した１０〜１，０００個の追加ヌクレオチドである。本質的にヌクレオチド配列からなる単離核酸は、上記ヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは他の構築体であってもよい。
【００４９】
”単離核酸”は、核酸が天然源から単離されたものである場合、その核酸を単離した生物のゲノム中に存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。核酸が鋳型から酵素により、または化学的に合成されたもの、たとえばＰＣＲ生成物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドである場合、そのような方法で得られた核酸は単離核酸であると解釈される。単離核酸分子とは、分離された断片の形、またはより大きな核酸構築体の成分としての核酸を表わす。好ましい態様のひとつにおいて、本発明は実質的に内因性汚染物質を含まない特定の単離核酸に関する。核酸分子は、少なくとも１回は実質的に純粋な形で、かつその成分ヌクレオチド配列を生化学的標準法（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８９））により同定、操作および回収することができる量または濃度で単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来するものが好ましい。そのような配列は、一般に真核細胞遺伝子中に存在する内部非翻訳配列（すなわちイントロン）で中断されないオープンリーディングフレームの形で供給および／または構築されることが好ましい。非翻訳ＤＮＡの配列がオープンリーディングフレームの５’または３’側に存在してもよい。ここではこれらがコード領域の操作または発現を妨害することはない。
【００５０】
本発明には、本明細書に記載するクローディンポリペプチドをコードする核酸に中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択および適切な条件を設定するための指針に影響を及ぼす基本的パラメーターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，９および１１章；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，セクション２．１０および６．３−６．４（本明細書に援用する）に述べられており、たとえばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて当業者が容易に決定できる。中程度にストリンジェントな条件を達成する方法のひとつは、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または他の同様なハイブリダイゼーション溶液、たとえば約５０％のホルムアミドを含有するものと、約４２℃のハイブリダイゼーション温度）、ならびに０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、約６０℃の洗浄条件を用いるものである。一般に高度にストリンジェントな条件は、上記のハイブリダイゼーション条件であるが、約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄するものと定義される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ．ｓｕｂ．２  ＰＯ．ｓｕｂ．４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄用緩衝液中にＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりに使用できる；洗浄はハイブリダイゼーション終了後、１５分間行われる。ハイブリダイゼーション反応および二重らせん安定性を支配する基本原理の適用により目的とするストリンジェンシーの程度を達成するために、洗浄温度および洗浄塩類濃度を必要に応じて調節できることを理解すべきである；これは当業者に既知であり、後記に詳述する（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９参照）。核酸を配列の分からない標的核酸にハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはこのハイブリダイズさせる核酸の長さであると仮定する。配列が分かっている核酸にハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはそれらの核酸配列をアラインし、最適な配列相補領域（１以上）を同定することにより判定できる。長さ５０塩基対未満と予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）より５〜１０℃低くすべきである。ここでＴｍは下記の方程式に従って決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔの塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃの塩基数��。長さ１８塩基対を超えるハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）−（６００／Ｎ）；式中のＮはハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、そのようなハイブリダイズする核酸はそれぞれ少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、４０、より好ましくは５０ヌクレオチドの長さ、またはそれがハイブリダイズする本発明核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％）の長さをもち、かつそれがハイブリダイズする本発明核酸との少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性をもつ；配列同一性は、前記に詳述したように、オーバーラップおよび同一性が最大になり、一方では配列ギャップが最小になるようにアラインした状態で、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することにより判定される。
【００５１】
本発明は、本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子をも提供する。”対応する遺伝子”は、転写されてｍＲＮＡを生成し、これからｃＤＮＡ核酸配列が誘導されるゲノム領域であり、それらの遺伝子の調節発現に必要なゲノムの連続領域を含むことができる。したがって、対応する遺伝子はコード配列、５’側および３’側非翻訳領域、選択的スプライシングされるエキソン、イントロン、プロモーター、エンハンサー、ならびにサイレンサーまたはサプレッサーエレメントを含むことができるが、これらに限定されない。対応する遺伝子は、本明細書に開示した情報を利用して既知の方法により単離できる。そのような方法には、開示した配列情報から、適切なゲノムライブラリーまたは他のゲノム材料源中の遺伝子の同定および／または増幅に用いるプローブまたはプライマーを調製することが含まれる。”単離遺伝子”は、その遺伝子を単離した生物のゲノム中に隣接コード配列がある場合、それらから分離された遺伝子である。
【００５２】
本発明のクローディンポリペプチドを製造および精製する方法
本発明のクローディンポリペプチドの製造方法を以下に記載する。本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製はいずれか適切な方法で達成でき、これには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明のポリペプチドを組換え法で製造するために、本発明の単離核酸を機能可能な状態で発現制御配列、たとえば下記に示されるｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターに結合させることができる：Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，４４８５−４４９０（１９９１）；およびＰｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク（１９８５）。多数の適切な発現制御配列が当技術分野で知られている。組換えポリペプチドを発現させる一般法も知られており、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，５３７−５６６（１９９０）に例示されている。本明細書中で用いる”機能可能な状態で結合している（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”とは、適切な分子（たとえばポリメラーゼ）が存在する場合に本発明核酸および発現制御配列がその核酸によりコードされるポリペプチドを発現するような様式で構築体、ベクターまたは細胞内に配置されていることを意味する。本発明の態様のひとつとして、たとえば形質転換もしくはトランスフェクションまたは他のいずれか適切な方法で宿主細胞に核酸および／または発現制御配列を導入した組換え宿主細胞またはその子孫においては、少なくとも１つの発現制御配列が本発明の核酸に機能可能な状態で結合している。本発明の他の態様として、少なくとも１つの発現制御配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能な状態で結合して組換え宿主細胞のゲノムに組み込まれている。本発明の他の態様として、少なくとも１つの発現制御配列がｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または組換え宿主細胞において、トランス作用因子（たとえば転写因子）の作用により本発明の核酸に機能可能な状態で結合している。
【００５４】
さらに、適宜なシグナルペプチド（天然または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ））をコードする配列を発現ベクターに導入することができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドを産生させる宿主細胞のタイプなどの要因に依存する。具体的には、宿主哺乳動物細胞において機能可能なヘテロロガスシグナルペプチドの例には下記のものが含まれる：インターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列：ＵＳＰ４，９６５，１９５に記載；インターロイキン−２受容体のシグナル配列：Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７６８（１９８４）に記載；インターロイキン−４受容体シグナルペプチド：ＥＰ３６７，５６６に記載；タイプＩインターロイキン−１受容体シグナルペプチド：ＵＳＰ４，９６８，６０７に記載；およびタイプＩＩインターロイキン−１受容体シグナルペプチド：ＥＰ４６０，８４６に記載。シグナルペプチド（分泌リーダー）に対するＤＮＡ配列を、そのＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合ポリペプチドに翻訳されるように、読み枠を一致させて本発明の核酸配列に融合させることができる。目的とする宿主細胞において機能可能なシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、ポリペプチドが細胞から分泌される際にポリペプチドから開裂する。シグナルペプチドの開裂位置（１以上）がコンピュータープログラムにより推定したものと異なる可能性があること、および組換えポリペプチドの発現に用いる宿主のタイプなどの要因に応じて変化する可能性があることも当業者は認識するであろう。シグナルペプチドが１より多い部位で開裂することにより、ポリペプチド調製物がＮ末端アミノ酸の異なるポリペプチド分子の混合物を含有する可能性がある。
【００５５】
ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための確立した方法が報告されている（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９）。市販の試薬、たとえばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いる他のプロトコルも細胞のトランスフェクションに使用できる（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７，１９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用いて常法により哺乳動物細胞をトランスフェクションすることもできる；たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。安定な形質転換体の選択は、当技術分野で既知の方法、たとえば細胞毒性薬物に対する耐性を利用して行うことができる。Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，４８７−５１１，１９９０に、幾つかの選択方式、たとえばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性が記載されている。ＤＨＦＲ選択に適した株はＤＨＦＲを欠如するＣＨＯ  ＤＸ−Ｂ１１株である（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６−４２２０，１９８０）。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを発現するプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入すると、そのプラスミドを含む細胞のみが適宜な選択培地で増殖できる。発現ベクターに導入できる選択マーカーの他の例には、抗生物質、たとえばＧ４１８およびハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するｃＤＮＡが含まれる。このベクターを宿した細胞は、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択できる。
【００５６】
あるいは、相同組換え法、または”遺伝子標的化（ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）”法により遺伝子生成物を得ることができる。そのような技術では、外因性転写制御エレメント（たとえばＣＭＶプロモーターなど）をゲノム上の予め定めた特定部位に導入して目的とする内因性核酸配列の発現を誘導する方法を採用する。宿主染色体またはゲノムに組み込む位置は、その遺伝子の位置および配列が分かっていれば当業者が容易に決定できる。好ましい態様において、本発明は外因性転写制御エレメントを増殖可能な遺伝子と共に導入して遺伝子生成物の産生量を増加させることも考慮する；この場合も遺伝子配列自体を宿主細胞から単離する必要はない。相同組換えまたは遺伝子標的化の実施については、Ｓｃｈｉｍｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，”哺乳動物の体細胞における遺伝子増幅”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５１：８５−１０４（１９８７）、およびＣａｐｅｃｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，”新たなマウス遺伝学：遺伝子標的化によるゲノムの変更”，ＴＩＧ，５：７０−７６（１９８９）に例示されている。
【００５７】
多数のタイプの細胞を本発明ポリペプチドの発現に適した宿主細胞として使用できる。宿主哺乳動物細胞には、たとえば下記の細胞が含まれる：サル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞系、アフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）：ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：２８２１，１９９１）に記載、ヒト腎２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他のトランスフォームした霊長類細胞系、正常二倍体細胞、一次組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に由来する細胞系、一次組織片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット細胞。あるいは酵母などの下等真核生物または細菌などの原核生物においてポリペプチドを産生させることもできる。適切と思われる酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、またはヘテロロガスポリペプチドを発現しうるあらゆる酵母株が含まれる。適切と思われる細菌株には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、またはヘテロロガスポリペプチドを発現しうるあらゆる細菌株が含まれる。ポリペプチドを酵母または細菌において産生させる場合、機能性ポリペプチドを得るためには、そこで産生されたポリペプチドをたとえば適宜な部位のリン酸化またはグリコシル化により修飾することが必要であろう。そのような共有結合は、既知の化学的または酵素的方法で行うことができる。本発明の単離核酸を１以上の昆虫発現ベクター中において適切な制御配列に機能可能な状態で結合させ、そして昆虫発現系を用いてポリペプチドを調製することもできる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に関する材料および方法は、キットの形でたとえば米国カリフォルニア州サンディエゴのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されており（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）、そのような方法は当技術分野で周知である；Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）およびＬｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７（１９８８）に記載；本明細書に援用する。本明細書中で用いる、本発明の核酸を発現しうる昆虫細胞は”形質転換されている（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）”。無細胞翻訳系も、本明細書に開示する核酸構築体に由来するＲＮＡを用いてポリペプチドを調製するために使用できる。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列に機能可能な状態で結合した本発明の単離核酸を含む宿主細胞は、”組換え宿主細胞”である。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、形質転換した宿主細胞を組換えポリペプチドの発現に適した培養条件下で培養することにより産生させることができる。生成した発現ポリペプチドを次いでその培養物から（たとえば培地または細胞抽出物から）既知の精製法、たとえばゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製することができる。ポリペプチドの精製には、ポリペプチドに結合する物質を含有するアフィニティーカラムも含まれる；コンカナバリン−Ａ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）もしくはＣｉｂａｃｒｏｍ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）などのアフィニティー樹脂上での１回以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルなどの樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う１回以上の工程；または免疫アフィニティークロマトグラフィー。あるいは、精製を容易にする形で本発明のポリペプチドを発現させることもできる。たとえばマルトース結合性ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）の融合ポリペプチドとして本発明のポリペプチドを発現させてもよい。そのような融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットが、それぞれＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ（マサチュセッツ州ビバリー）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカッタウェイ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。ポリペプチドにエピトープのタグを付けた後、そのエピトープに対する特異的抗体を用いて精製することもできる。そのようなエピトープのひとつ（”Ｆｌａｇ”）がＫｏｄａｋ（コネチカット州ニューヘブン）から市販されている。最後に、疎水性の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、たとえばペンダントメチルその他の脂肪族基をもつシリカゲルを用いる１回以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を採用して、ポリペプチドをさらに精製することができる。上記の精製工程の一部または全部を多様に組み合わせて、実質的に均質な単離された組換えポリペプチドを得ることもできる。こうして精製したポリペプチドは実質的に他の哺乳動物ポリペプチドを含有せず、本発明によれば”単離ポリペプチド”と定義される。そのような本発明の単離ポリペプチドには、本発明のクローディンポリペプチド、断片、バリアント、結合パートナーなどに結合する単離抗体が含まれる。本発明のポリペプチドは、このポリペプチドをコードする核酸配列を含有する体細胞または生殖細胞を特色とするトランスジェニック動物の産物として、たとえばトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳汁の成分として発現させることもできる。
【００５９】
本発明のポリペプチド結合性ポリペプチド、たとえば本発明のポリペプチドに対して形成されたモノクローナル抗体を含むアフィニティーカラムを用いて、発現したポリペプチドを精製することもできる。これらのポリペプチドは、アフィニティーカラムから常法により分離できる；たとえば溶離用の高塩類緩衝液中に溶離し、次いでより低塩類の緩衝液を用いてこの中へ透析することにより、または用いるアフィニティーマトリックスに応じてｐＨその他の要素を変化させることにより、またはアフィニティー部分の天然基質（たとえば本発明により得られたポリペプチド）を用いて競合分離することにより分離できる。本発明のこの態様においては、ポリペプチド結合性ポリペプチド、たとえば本発明のポリペプチドの抗ポリペプチド抗体または本発明のポリペプチドと相互作用しうる他のポリペプチドを、固相支持体、たとえば本発明のポリペプチドを表面に発現する細胞の同定、分離または精製に適した、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたはこれに類する支持体に結合させることができる。固相接触表面への本発明のポリペプチド結合性ポリペプチドの結合付着は、任意の手段で達成できる。たとえば磁性マイクロスフェアをこれらのポリペプチド結合性ポリペプチドで被覆し、磁界によりインキュベーション容器内に保持することができる。そのようなポリペプチド結合性ポリペプチドを表面に保有する固相と細胞混合物の懸濁液を接触させる。本発明のポリペプチドを表面に保有する細胞は固定したポリペプチド結合性ポリペプチドに結合する。次いで、結合していない細胞を洗浄除去する。このアフィニティー結合法は、それらのポリペプチド発現細胞を溶液から精製、スクリーニングまたは分離するのに有用である。ポジティブ選択された細胞を固相から離脱させる方法は当技術分野で既知であり、たとえば酵素の使用がこれに含まれる。そのような酵素は好ましくはその細胞にとって無毒性かつ無傷害性であり、かつ好ましくは細胞表面結合パートナーの開裂を指令する。あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含有すると思われる細胞混合物を、まずビオチニル化された本発明のポリペプチド結合性ポリペプチドと共にインキュベートしてもよい。本発明のポリペプチドに確実に十分に結合させるためには、インキュベーション期間は一般に少なくとも１時間である。次いでアビジン被覆ビーズを充填したカラムに得られた混合物を通すと、アビジンに対するビオチンの高親和性によりポリペプチド結合性細胞はビーズに結合する。アビジン被覆ビーズの使用は当技術分野で既知である。Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９（１９８６）参照。結合していない物質の洗浄除去および結合した細胞の離脱は、常法により行われる。
【００６０】
本発明のポリペプチドは既知の一般的化学合成によっても製造できる。合成法による本発明ポリペプチドの構築法は当業者に既知である。合成により構築したポリペプチド配列は、ポリペプチドと共通の一次、二次または三次構造および／またはコンホメーション特性をもつことにより、それらと共通の生物学的特性、たとえばペプチド活性をもちうる。したがってそれらは、天然の精製ポリペプチドに代わる生物活性または免疫作用をもつ物質として、療法化合物のスクリーニングおよび抗体開発のための免疫学的方法に使用できる。
【００６１】
望ましい純度はそのポリペプチドの目的用途による。たとえばポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏ投与する場合、かなり高い純度が望ましい。そのような場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した際に他のポリペプチドに対応するポリペプチドバンドが検出されないほどポリペプチドを精製する。ポリペプチドに対応する多数のバンドをグリコシル化の相異、翻訳後プロセシングの相異などによってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化できることは当業者に認識されるであろう。最も好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した際に単一のポリペプチドバンドが示すように実質的に均質になるまで本発明のポリペプチドを精製する。ポリペプチドバンドを銀染色、クーマシーブルー染色、または（ポリペプチドが放射性標識されている場合）オートラジオグラフィーにより視覚化できる。
【００６２】
本発明のクローディンポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニスト
本発明のクローディンポリペプチドを中和するか、またはヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子の発現（転写または翻訳）を阻害するいかなる方法も、本発明クローディンポリペプチドの生物活性を低下させるために使用できる。具体的態様において、アンタゴニストは細胞に発現している結合パートナーにヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドのうち少なくとも１つが結合するのを阻害し、これによりこれらの本発明クローディンポリペプチドが細胞に結合することにより誘導される生物活性を阻害する。本発明の他の特定の態様においては、内因性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子発現レベルを低下させるアンタゴニストを、たとえば下記の方法で設計できる：周知のアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２  ｍＲＮＡ転写体の翻訳を阻害または阻止する；三重らせん法を用いて、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子の転写を阻害する；あるいは標的化相同組換え法を用いて、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子またはそれらの内因性プロモーターもしくはエンハンサーエレメントを不活性化または”ノックアウト”する。このようなアンチセンス、リボザイムおよび三重らせんアンタゴニストは、損傷を受けていない、または適切ならば変異したヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子活性を低下または阻害するように設計できる。そのような分子の調製および使用は当業者に周知である。
【００６３】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしてポリペプチド翻訳を阻止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接遮断する作用をもつ。アンチセンス法は、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２  ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写体に結合して翻訳を阻止する。絶対相補性が好ましいが、必須ではない。本明細書中で述べる、核酸の一部に”相補的な”配列とは、その核酸とハイブリダイズして安定な二重らせん（または適宜、三重らせん）を形成しうるのに十分な相補性をもつ配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合、この二重らせんＤＮＡの一本鎖についてこのような試験を行ってもよく、あるいは三重らせん形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補度とアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。メッセージの５’末端、たとえばＡＵＧ開始コドンまでの（これを含む）５’側非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドが翻訳阻害に最も効果的に作動するであろう。しかし、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子転写体の５’側または３’側いずれの非翻訳、非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドも、内因性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンス法に使用できる。ｍＲＮＡの５’側非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチドである。具体的態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾変異体であってよく、一本鎖または二本鎖である。たとえば分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、オリゴヌクレオチドを塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖において修飾されてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは他の付属基を含有してもよい；たとえばペプチド（たとえばｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞受容体を標的化するためのもの）、または細胞膜を通る輸送を容易にするための剤（たとえばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０９８１０，１９８８年１２月１５日公開、参照）、あるいはハイブリダイゼーションが引き金となる開裂剤、またはインターカレーション剤（たとえばＺｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，５：５３９−５４９参照）。ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトクローディン−１９、−２１および−２２転写体を発現する細胞へこれらのアンチセンス分子を運搬すべきである。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞へ運搬するための多数の方法が開発されている；たとえばアンチセンス��子を組織または細胞の誘導部位に直接注入するか、あるいは目的細胞を標的化するように設計した修飾アンチセンス分子（たとえば標的細胞表面に発現する受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合したアンチセンス）を全身投与することができる。しかし、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分な細胞内アンチセンス濃度を達成するのは困難な場合が多い。したがって好ましい方法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下に置かれた組換えＤＮＡ構築体を用いる。患者において標的細胞をトランスフェクションするためにそのような構築体を用いると、内因性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子転写体と相補的塩基対を形成することによりヒトクローディン−１９、−２１および−２２  ｍＲＮＡの転写を阻止するのに十分な量の一本鎖ＲＮＡが転写される。たとえばベクターをｉｎ  ｖｉｖｏ導入し、これを細胞に取り込ませてアンチセンスＲＮＡの転写を指令することができる。そのようなベクターは、転写されて目的とするアンチセンスＲＮＡを産生することが可能であれば、エピソームとして留まってもよく、あるいは染色体に組み込まれてもよい。そのようなベクターは、当技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術による方法で構築できる。ベクターは、哺乳動物細胞における複製および発現に用いられるプラスミド、ウイルス性、または当技術分野で既知の他のものであってよい。
【００６４】
ヒトクローディン−１９、−２１および−２２  ｍＲＮＡの転写体を接触開裂するように設計されたリボザイム分子も、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２  ｍＲＮＡの翻訳および本発明クローディンポリペプチドの発現を阻止するために使用できる（たとえばＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日公開；ＵＳＰ５，８２４，５１９参照）。本発明に使用できるリボザイムには下記のものが含まれる：ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１）、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、”Ｃｅｃｈ型リボザイム”）、たとえば天然にテトラヒメナ・テルモフィラ（Ｔｅｒａｈｙｍｅｎａ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）中にみられるもの（ＩＶＳ、またはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られる）；これについてはＴｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈらが詳細に報告している（ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０４３００；Ｂｅｅｎ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，１９８６，Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６）。アンチセンス法の場合と同様に、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチドからなっていてもよく（たとえば安定性改善、標的化などのため）、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドを発現する細胞へ運搬されなければならない。好ましい運搬方法には、強力な構成性ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下でそのリボザイムを”コードする”ＤＮＡ構築体の使用が含まれる；これにより、トランスフェクションされた細胞は、内因性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２メッセージを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生する。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、有効性に必要な細胞内濃度はより低い。
【００６５】
あるいは、標的遺伝子の調節領域（すなわち標的遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して標的であるヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造体を形成することにより、内因性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子発現を低下させることができる（一般にＨｅｌｅｎｅ，１９９１，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，６（６），５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０，２７−３６；およびＭａｈｅｒ，１９９２，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，１４（１２），８０７−８１５参照）。
【００６６】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、ならびに三重らせん分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関して当技術分野で既知のいずれかの方法により調製できる。これらには、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成するための当技術分野で周知の方法、たとえば固相ホスホロアミダイト化学合成法が含まれる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準法により、たとえば自動ＤＮＡ合成装置（たとえばＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を用いて合成できる。たとえばホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３２０９の方法で合成できる。メチルホスホナートオリゴヌクレオチドは、制御ポアガラスポリマー支持体を用いて製造できる（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：７４４８−７４５１）。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ転写によりＲＮＡ分子を産生することができる。適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、たとえばＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターを組み込んだそのようなＤＮＡ配列を多様なベクターに取り込ませることができる。あるいは、用いるプロモーターに応じてアンチセンスＲＮＡを構成性または誘導性合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築体を、細胞系に安定に導入することができる。
【００６７】
標的化相同組換え法を用いて標的遺伝子またはそれのプロモーターを不活性化または”ノックアウト”することにより、内因性標的遺伝子発現を低下させることもできる（たとえばＳｍｉｔｈｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１７，２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ，５１，５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ，５，３１３−３２１参照；これらの全体をそれぞれ本明細書に援用する）。たとえば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域または調節領域）に相同的なＤＮＡで隣接された変異型の非機能性標的遺伝子（または全く無関係なＤＮＡ配列）を選択性マーカーおよび／またはネガティブ選択性マーカーと共に、あるいはこれらのマーカーなしに用いて、標的遺伝子を発現する細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションすることができる。標的化相同組換え法によるＤＮＡ構築体の挿入により、標的遺伝子が不活性化される。そのような方法は特に農業分野に好適であり、この場合はＥＳ細胞（胚性幹細胞）に対する修飾を利用して不活性な標的遺伝子をもつ動物子孫を形成できる（たとえば前掲のＴｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９８９参照）。あるいは線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｃｅ）などのモデル生物に好適であり、この場合は”ＲＮＡ干渉”（”ＲＮＡｉ”）法（Ｇｒｉｓｈｏｋ  Ａ，Ｔａｂａｒａ  Ｈ，ａｎｄ  Ｍｅｌｌｏ  ＣＣ，２０００，シーエレガンスにおけるＲＮＡｉの遺伝に対する遺伝子要求，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７（５４６２）：２４９４−２４９７）またはトランスジーンの導入（Ｄｅｒｎｂｕｒｇ  ＡＦ，Ｚａｌｅｖｓｋｙ  Ｊ，Ｃｏｌａｉａｃｏｖｏ  ＭＰ，ａｎｄ  Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ  ＡＭ，２０００，シーエレガンス生殖細胞系列におけるトランスジーン仲介によるコサプレッション，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１４（１３）：１５７８−１５８３）を利用して、特定の標的遺伝子の発現を阻害できる。ただしこの方法は、目的部位に組換えＤＮＡ構築体を直接投与するか、または適宜なウイルスベクターを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで標的化すると、ヒトにおける使用にも適用できる。
【００６８】
本明細書に開示する核酸に対応する遺伝子（１以上）の発現を増大、低下または修飾した生物が提供される。目的とする遺伝子発現の変更は、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡを結合および／または開裂するアンチセンス核酸またはリボザイムを用いて達成できる（Ａｌｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１５（７）：２５０−２５４；Ｌａｖａｒｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６２（１）：１１−２２；およびＨａｍｐｅｌ，１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５８：１−３９；これらをすべて本明細書に援用する）。本明細書に開示する核酸配列に対応する多数コピーの遺伝子（１以上）をもつトランスジェニック動物、好ましくは細胞を遺伝子構築体で形質転換してそれらを形質転換細胞内に安定に保持させることにより作製された動物、およびその子孫が提供される。遺伝子発現レベルを増大もしくは低下させる修飾または遺伝子発現の時間的もしくは空間的パターンを変化させる修飾がなされた遺伝子制御領域をもつ、トランスジェニック動物も提供される（ＥＰ０  ６４９  ４６４Ｂ１参照；本明細書に援用する）。さらに、外因性配列を対応する遺伝子（１以上）に挿入することにより、または対応する遺伝子（１以上）の一部もしくは全部を欠失させることにより、本明細書に開示する核酸配列に対応する遺伝子（１以上）が部分的または完全に不活性化された生物が提供される。部分的または完全な遺伝子不活性化は下記により達成できる：転位性遺伝因子の挿入、好ましくは続いて不正確な切除（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，１９９２，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，１４（９）：６２９−６３３；Ｚｗａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１６）：７４３１−７４３５；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（２）：７１９−７２２；これらをすべて本明細書に援用する）、または好ましくはポジティブ／ネガティブ遺伝子選択方式で検出される相同組換え（Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２；ＵＳＰ５，４６４，７６４；５，４８７，９９２；５，６２７，０５９：５，６３１，１５３；５，６１４，３９６；５，６１６，４９１；および５，６７９，５２３；これらをすべて本明細書に援用する）。遺伝子発現が変化したこれらの生物は、好ましくは真核生物、より好ましくは哺乳動物である。そのような生物は、対応する遺伝子（１以上）に関連する障害の研究に用いるヒト以外のモデルを開発するために、また対応する遺伝子（１以上）のポリペプチド生成物（１以上）と相互作用する分子の同定に用いるアッセイ系を開発するために有用である。
【００６９】
本発明のクローディンポリペプチド自体も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法でヒトクローディン−１９、−２１および−２２の生物活性を阻害するのに使用できる。本発明クローディンポリペプチドの細胞外ループドメインが断片として、または融合ポリペプチドの成分として発現する場合、天然ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド機能の”優性ネガティブ”阻害物質として作用するこれらのドメインは本発明に含まれる。たとえば、本発明の精製ポリペプチドドメインを用いて本発明のクローディンポリペプチドが内因性結合パートナーに結合するのを阻害することができる。このような使用により、効果的にヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの相互作用が遮断され、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド活性が阻害される。本発明のさらに他の態様においては、上皮細胞および／または内皮細胞に発現する可溶形ヒトクローディン−１９、−２１および−２２結合パートナーを用いて内因性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドに結合させ、活性化を競合阻害する。さらに、本発明のクローディンポリペプチドに結合する抗体はしばしばヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド活性を阻害し、アンタゴニストとして作用する。たとえば、本発明クローディンポリペプチドの１以上のエピトープ、または本発明クローディンポリペプチドの保存バリアントの１以上のエピトープ、またはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの１以上のペプチド断片を特異的に認識する抗体を本発明に用いて、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２活性を阻害することができる。そのような抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、精製した、および修飾した本発明クローディンポリペプチドを投与して、本発明クローディンポリペプチドと膜結合していないヒトクローディン−１９、−２１および−２２結合パートナーとの相互作用を調節することができる。このような方法で、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２により影響された生物活性を修正するための別法を得ることができる。
【００７０】
他の側面において本発明にはさらに、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２活性を増大させることが有益な疾患の症状を処置または改善するための、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２活性のアゴニストの使用が含まれる。そのような疾患には、炎症、喘息、アレルギー、癌細胞の転移、腎臓におけるマグネシウム輸送欠陥などのイオン輸送障害、炎症性腸疾患、クロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシン（ＣＰＥ）被曝、乳児突然死症候群（ＳＩＤＳ）、多発硬化症（ＭＳ）、自己免疫性脳脊髄炎、視神経炎、および進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において本発明は、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２核酸またはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドを含む組成物を、細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで、および／または多細胞生物に投与するものである。ヒトクローディン−１９、−２１および−２２の好ましい療法用形態は、前記のように可溶性形態である。本発明のさらに他の態様において組成物は、疾患の処置のために宿主生物においてヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドを発現させるためのヒトクローディン−１９、−２１および−２２コード核酸を含む。これに関して特に好ましいのは、ヒト患者において異常な（たとえば低下した）内因性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド活性に関連する機能障害を処置するための発現である。さらに本発明には、内因性の本発明クローディンポリペプチドの活性を高めることが認められた化合物を細胞および／または生物に投与することが含まれる。ヒトクローディン−１９、−２１および−２２活性を高める化合物の一例は、本発明クローディンポリペプチドまたは結合パートナーに結合するアゴニスト抗体、好ましくはモノクローナル抗体である；これらは、構成性の細胞内信号伝達を生じること（または”リガンド模倣”）により、またはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド活性の天然阻害物質の結合を阻止することにより、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド活性を高めるであろう。
【００７１】
本発明のクローディンポリペプチドに対する抗体
本発明のポリペプチドと免疫反応性である抗体が本発明により提供される。そのような抗体は、抗体の抗原結合部位により本発明のポリペプチドに特異的に結合する（非特異的結合ではない）。本発明において特異的に結合する抗体は、本発明のクローディンポリペプチド、相同体およびバリアントを特異的に認識して結合するが、他の分子とは結合しない抗体である。好ましい態様のひとつにおいて、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、他のポリペプチドと交差反応しない。こうして前記の本発明クローディンポリペプチド、断片、バリアント、融合ポリペプチドなどを、それらと反応性である抗体の産生に際して”免疫原”として使用できる。
【００７２】
より具体的には、本発明のポリペプチド、断片、バリアント、融合ポリペプチドなどは、抗体形成を誘発する抗原決定因子またはエピトープを含む。これらの抗原決定因子またはエピトープは線状または高次構造（不連続）のいずれであってもよい。線状エピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一セクションからなり、一方、高次構造または不連続エピトープはポリペプチド鎖の異なる領域からの複数のアミノ酸セクションがポリペプチドフォールディングに際して近接したものからなる（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：９（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，第２版，１９９６））。フォールディングしたポリペプチドは複雑な表面をもつので、生じるエピトープはかなり多数ある；しかしポリペプチドのコンホメーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は生じるエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，第２版，１９９６））。エピトープは当技術分野で既知のいずれかの方法で同定できる。したがって本発明の態様のひとつは、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。そのようなエピトープは後記に詳述するように、抗体、特にモノクローナル抗体の形成に有用である。さらに本発明のポリペプチドに由来するエピトープは、研究試薬として、アッセイに、またポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ上清などの材料から特異的結合性抗体を精製するのに利用できる。そのようなエピトープまたはそれらのバリアントは、当技術分野で周知の技術、たとえば固相合成、化学的もしくは酵素によるポリペプチド開裂を用いて、または組換えＤＮＡ技術を用いて調製できる。
【００７３】
本発明ポリペプチドのエピトープによって誘発される抗体については、エピトープが単離されたものであっても、ポリペプチドの一部のままであっても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方とも常法により調製できる。たとえば下記を参照：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｄ（編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８８）；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（ＵＳＰ４，３７６，１１０）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０）；ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ社，ｐ．７７−９６）。本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も本発明において企図する。そのようなハイブリドーマは常法により作製および同定できる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養できる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの高力価モノクローナル抗体の産生が現在好ましい調製方法である。そのようなハイブリドーマ細胞系を作製するための方法のひとつは、動物をポリペプチドで免疫化し；免疫化動物から脾臓細胞を採取し；脾臓細胞を骨髄腫細胞系に融合させることによりハイブリドーマ細胞を作製し；そしてそのポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定することを含む。抗体産生のためには下記のうち１以上を注射することにより多様な宿主動物を免疫化できる：ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの断片、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの機能均等物、またはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドからの変異形。そのような宿主動物にはウサギ、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されない。免疫応答を高めるために宿主の種に応じて多様なアジュバントを使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：フロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウム、界面活性剤、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホール・リンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）。モノクローナル抗体は常法により回収できる。そのようなモノクローナル抗体は、いずれかの免疫グロブリンクラス、たとえばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそれらのいずれかのサブクラスであってよい。
【００７４】
さらに、”キメラ抗体”（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４）産生のために開発された、適宜な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの遺伝子を適宜な生物活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングする方法を採用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、たとえばブタモノクローナル抗体由来の可変部とヒト免疫グロブリン定常部をもつ分子である。本発明のモノクローナル抗体には、ヒト化型ネズミモノクローナル抗体も含まれる。そのようなヒト化抗体は既知の方法で調製でき、それらの抗体をヒトに投与した場合に免疫原性が低いという利点をもつ。１態様において、ヒト化モノクローナル抗体はネズミ抗体の可変部（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片はネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変部断片（抗原結合部位を欠如するもの）を含むことができる。キメラ抗体および他の工学的に作製したモノクローナル抗体の調製方法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３，１９８８）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，８４：３４３９，１９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：９３４，１９８９）、およびＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ，１４：１３９，Ｃａｎ，１９９３）に記載のものが含まれる。抗体をトランスジェニック産生するための方法は、ＧＢ２，２７２，４４０、ＵＳＰ５，５６９，８２５および５，５４５，８０６、ならびにそれらに基づく優先権を主張する関連特許にみられる；それらをすべて本明細書に援用する。ヒトに用いるためには抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であることが好ましい；そのようなヒト抗体またはヒト化抗体の調製方法も周知であり、たとえばＭｅｄａｒｅｘ社（ニュージャージー州プリンストン）およびＡｂｇｅｎｎｉｘ社（カリフォルニア州フレモント）から市販されている。
【００７５】
特異的エピトープを認識する抗原結合性抗体断片を既知の方法で調製できる。たとえば、そのような断片には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により調製できるＦ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド橋を還元することにより調製できるＦａｂ断片。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、目的とする特異性をもつモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定することができる。一本鎖抗体の調製のための文献記載の方法（ＵＳＰ４，９４６，７７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５４４−５４６）を、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２遺伝子生成物に対する一本鎖抗体の調製にも適用できる。一本鎖抗体は、Ｆｖ部のＨ鎖断片とＬ鎖断片をアミノ酸橋で連結して一本鎖ポリペプチドにすることにより形成される。さらに、当業者に周知の方法で、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドに対する抗体を用いてヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドを”模倣した”、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドに結合しうる抗イディオタイプ抗体を形成できる（たとえばＧｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，７（５）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（８）：２４２９−２４３８参照）。
【００７６】
そのような抗体を同定できるスクリーニング法は周知であり、たとえば免疫アフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。抗体をアゴニスト（すなわちリガンド模倣）特性についてスクリーニングすることができる。そのような抗体が細胞表面ヒトクローディン−１９、−２１および−２２に結合すると、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２結合パートナーが細胞表面ヒトクローディン−１９、−２１および−２２に結合した際に誘導する生物学的作用と類似の生物学的作用（たとえば生物信号の伝達）を誘導する。アゴニスト性抗体を用いて、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２仲介による刺激経路または細胞間連絡を誘導することができる。
【００７７】
本発明のクローディンポリペプチドがヒトクローディン−１９、−２１および−２２に対する結合パートナーに結合するのを遮断できる抗体を用いて、この結合により生じるヒトクローディン−１９、−２１および−２２仲介による細胞間連絡または共刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を阻害できる。そのような阻止抗体は、いずれか適切なアッセイ法により、たとえばヒトクローディン−１９、−２１および−２２結合パートナーを発現する特定の細胞へのヒトクローディン−１９、−２１および−２２の結合を抗体が阻害する能力を試験することにより同定できる。あるいは阻止抗体は、標的細胞へのヒトクローディン−１９、−２１および−２２の結合により生じる生物学的作用を阻害する能力のアッセイにより同定できる。たとえば、抗体がヒトクローディン−１９、−２１および−２２結合パートナー仲介による刺激経路を阻害する能力をアッセイできる。そのような抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に用いて、またはｉｎ  ｖｉｖｏ投与して、抗体を産生したことにより仲介される生物活性を阻害することができる。ヒトクローディン−１９、−２１および−２２と細胞表面にある結合パートナー受容体との相互作用により発症または増悪する（直接または間接的に）障害をこうして処置できる。療法は、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２結合パートナー仲介による生物活性の阻害に有効な量の阻止抗体を哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与するものである。そのような療法に用いるにはモノクローナル抗体が一般に好ましい。１態様においては、抗原結合性をもつ抗体断片を用いる。本発明においては、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２に対する抗体、ならびに生理学的に許容できる希釈剤、賦形剤またはキャリヤーを含む組成物を提供する。本発明のクローディンポリペプチドを含有するそのような組成物の適切な成分を後記に述べる。
【００７８】
本発明によれば、抗体に結合した検出可能な（たとえば診断用）または療法用の薬剤を含むコンジュゲートも提供される。そのような薬剤の例を前記に示した。これらのコンジュゲートはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法に使用できる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドまたは断片の存在をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで検出するアッセイにも使用できる。これらの抗体は、本発明のポリペプチドまたは断片を免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製するのにも使用できる。
【００７９】
本発明のクローディンポリペプチドと相互作用する化合物の合理的な設計
合理的な薬物設計の目標は、目的とする生物活性ポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子の構造類似体、たとえば阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストなどを製造することである。これらのいずれかの例を用いて、より活性もしくは安定な形のポリペプチドである薬物、またはポリペプチドの機能をｉｎ  ｖｉｖｏで増強もしくは妨害する薬物を作製できる（Ｈｏｄｇｓｏｎ  Ｊ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１９−２１、本明細書に援用する）。１方法では、目的ポリペプチドまたはポリペプチド−阻害剤複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、もしくはコンピューターホモロジーモデリング、または最も一般的にはこれらの方法の組合わせにより決定する。構造を解明して分子の活性部位（１以上）を決定するためには、ポリペプチドの形状と変化を共に確認しなければならない。頻度は低いが、相同ポリペプチドの構造に基づくモデリングによりポリペプチドの構造に関する有用な情報を得ることができる。いずれの場合も、関連構造情報を用いて類似のセルピン様分子を設計し、有効な阻害剤を同定し、またはセルピンと結合しうる小分子を同定する。合理的な薬物設計の有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎ  Ｓ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：７７９６−７８０１）が示すように改善された活性もしくは安定性をもつ分子、またはＡｔｈａｕｄａ  ＳＢ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３：７４２−７４６）が示すように天然ペプチドの阻害剤、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する分子が含まれる：これらを本明細書に援用する。阻害剤の設計を補助するための分子モデリングソフトウェアシステムならびに阻害剤−ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド相互作用におけるヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド構造情報の使用も、本発明に含まれる。本発明の具体的方法は、本発明クローディンポリペプチドの三次元構造を基質結合可能性のある部位について分析し、推定反応部位を含む新規分子を合成し、そしてこの新規分子を本明細書に詳述するようにアッセイすることを含む。
【００８０】
本明細書に詳述するように機能アッセイにより選択した標的特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解明することもできる。この方法で、原理的にはその後の薬物設計の基礎となりうるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）が得られる。機能性薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗−ｉｄ）を形成すれば、ポリペプチド結晶解析を回避することが可能である。鏡像に対する鏡像のように、抗−ｉｄの結合部位は元の受容体の類似体であると期待できる。次いでこの抗−ｉｄを用いて、化学的または生物学的に調製したペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができる。次いで単離ペプチドをファーマコアとして使用できる。
【００８１】
本発明クローディンポリペプチドの活性アッセイ
本発明の精製クローディンポリペプチド（ポリペプチド（類）、ポリペプチドの断片、バリアント、オリゴマー、および他の形を含む）は多様なアッセイに有用である。たとえば、本発明のヒトクローディン−１９、−２１および−２２分子を用いて本発明クローディンポリペプチドの結合パートナーを同定し、それらを用いて細胞間連絡または細胞活性を調節することもできる。あるいはそれらを用いて、結合パートナーではなく、細胞間連絡もしくは細胞活性を調節する部分または物質を同定できる。
【００８２】
結合パートナーを同定するためのアッセイ法．ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドならびにそれらの断片を用いて、結合パートナーを同定できる。たとえばそれらが結合パートナー候補を結合する能力を、いずれか適切なアッセイ法、たとえば一般的な結合アッセイ法で試験することができる。具体的には、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドを検出可能な試薬（たとえば放射性核種、発色団、比色反応または蛍光反応を触媒する酵素など）で標識することができる。この標識ポリペプチドと結合パートナー候補を発現している細胞とを接触させる。次いで細胞を洗浄して結合していない標識ポリペプチドを除去し、細胞結合標識の存在を標識の性質に応じて選択した適切な方法で測定する。
【００８３】
結合アッセイ法の一例は下記のものである。結合パートナー候補ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターを構築する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を１０ｃｍ２の皿内でこの組換え発現ベクターによりトランスフェクションする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）は、ＣＭＶ極初期エンハンサー／プロモーターにより誘導されてＥＢＶ核抗原−１を構成性発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１はアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）に由来する；ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：２８２１，１９９１）に記載。トランスフェクションした細胞を２４時間培養し、次いで各皿の細胞を２４ウェルプレートに分配する。さらに４８時間培養した後、トランスフェクションした細胞（約４×１０４個／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。これは結合媒質（ＲＰＭＩ  １６４０；２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌのナトリウムアジド、２０ｍＭのヘペスを含有、ｐＨ７．２）に５０ｍｇ／ｍｌの脱脂粉乳を添加したものである。次いで細胞を３７℃で１時間、たとえば前記に従って調製した種々の濃度の可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドと共にインキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、結合媒質中一定の飽和濃度１２５Ｉ−マウス抗ヒトＩｇＧと共に穏やかに撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートする。十分に洗浄した後、細胞をトリプシン処理により離脱させる。上記で用いたマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ部に対して形成されたものであり、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ペンシルベニア州ウェスト・グローブ）から入手できる。この抗体を標準クロマチン−Ｔ法により放射性ヨウ素化する。この抗体は、細胞に結合させたポリペプチド／ＦｃポリペプチドのＦｃ部に結合するであろう。すべてのアッセイにおいて、Ｆｃ融合ポリペプチド／Ｆｃの不存在下、ならびにＦｃ融合ポリペプチドおよび２００倍モル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下で、１２５Ｉ−抗体の非特異的結合をアッセイする。細胞結合１２５Ｉ−抗体をＰａｃｋａｒｄ  Ａｕｔｏｇａｍｍａ計数計で定量する。アフィニティー計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０，１９４９）を、Ｍｉｃｒｏｖａｘコンピューターで実行するＲＳ／１（ＢＢＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチュセッツ州ボストン）により行う。ハイスループットスクリーニング操作に好適な方法、たとえば下記の方法で結合を検出することもできる：シンチレーション近接アッセイ法（Ｕｄｅｎｆｉｅｌｄ  Ｓ，Ｇｅｒｂｅｒ  ＬＤ，Ｂｒｉｎｋ  Ｌ，Ｓｐｅｃｔｏｒ  Ｓ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８６７２−８６７６）、均一時間分解蛍光法（Ｐａｒｋ  ＹＷ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＴ，Ｗｕ  Ｌ，Ｚｈｅｎｇ  Ｓ，Ｃａｍｅｒｏｎ  ＰＭ，Ｗｏｏｄｓ  Ａ，Ｚａｌｌｅｒ  ＤＭ，Ｍａｒｃｙ  ＡＩ，Ｈｅｒｍｅｓ  ＪＤ，１９９９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６９：９４−１０４）、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）法（Ｃｌｅｇｇ  ＲＭ，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１０３−１１０）、または結合ポリペプチドが潜在結合パートナーに曝露される場合は表面プラズモン共鳴の変化を測定する方法、たとえばＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（スウェーデン国ウプサラ）が供給するバイオセンサーを用いる方法。
【００８４】
酵母２ハイブリッドアッセイ法または”相互作用トラップ”アッセイ法．
ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドが結合するか、または結合する可能性がある場合（たとえば受容体−リガンド相互作用）、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドをコードする核酸を相互作用トラップアッセイ（たとえばＧｙｕｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７５：７９１−８０３（１９９３）に記載）に用いて、結合が起きる他方のポリペプチドをコードする核酸を同定すること、あるいは結合相互作用の阻害剤を同定することもできる。これらの結合相互作用に関与するポリペプチドを用いて、結合相互作用のペプチド型または小分子型阻害剤もしくはアゴニストをスクリーニングすることもできる。
【００８５】
競合結合アッセイ法．他のタイプの適切な結合アッセイ法は、競合結合アッセイ法である。具体的には、バリアントが結合パートナー候補との結合に対して天然ポリペプチドと競合する能力をアッセイすることにより、そのバリアントの生物活性を測定できる。競合結合アッセイは常法により実施できる。競合結合アッセイ法に使用できる試薬には、放射性標識したヒトクローディン−１９、−２１および−２２、ならびに細胞表面にヒトクローディン−１９、−２１および−２２（内因性または組換え）を発現する無傷細胞が含まれる。たとえば放射性標識した可溶性ヒトクローディン−１９、−２１および−２２断片を用いて、細胞表面受容体への結合に対してヒトクローディン−１９、−２１および−２２バリアントと競合させることができる。無傷細胞の代わりに、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ（固相上）とＦｃ部分との相互作用により固相に結合した可溶性結合パートナー／Ｆｃ融合ポリペプチドを用いてもよい。ポリペプチドＡおよびポリペプチドＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ニュージャージー州ピスカッタウェイ）から入手できるものが含まれる。
【００８６】
細胞間連絡または細胞活性の調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を同定するためのアッセイ法．本発明のクローディンポリペプチドが細胞間連絡または細胞活性に及ぼす影響を操作して、標的細胞におけるこれらの活性を制御することができる。たとえば、開示した本発明クローディンポリペプチド、開示した本発明クローディンポリペプチドをコードする核酸、またはそれらのポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを細胞または細胞群に投与して、標的細胞における細胞間連絡または細胞活性を誘導、増強、抑制または停止することができる。この方法で使用できる本発明クローディンポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストの同定は、当業者に既知の多様なアッセイ法により実施できる。このようなアッセイ法には、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドが細胞間連絡または細胞活性に影響を及ぼす能力を評価する方法が含まれる。そのようなアッセイ法は、たとえばヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの存在下で細胞相互作用を分析するものである。そのようなアッセイ法では、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの存在下で連絡または細胞刺激の速度を測定し、次いでそのような連絡または細胞刺激がアゴニストもしくはアンタゴニスト候補または他のヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの存在下で変化するか判定する。本発明のこの態様のアッセイ法の例には、サイトカイン分泌アッセイ、Ｔ細胞共刺激アッセイ、および抗原提示細胞とＴ細胞を用いる混合リンパ球反応が含まれる。これらのアッセイ法は当業者に周知である。
【００８７】
他の態様において本発明は、被験化合物が細胞間連絡または細胞の共刺激活性に影響を及ぼす能力を検出する方法を提供する。この態様において本発明方法は下記を含む：（１）第１群の標的細胞と被験化合物（ヒトクローディン−１９、−２１および−２２受容体ポリペプチドまたはそれらの断片を含む）を、採用するそのアッセイ法に適した条件下で接触させる；（２）標的細胞における細胞間連絡または共刺激の正味速度を測定する；ならびに（３）被験化合物の不存在下で、他の点では第１群の細胞と同一の条件下に、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２受容体ポリペプチドまたはそれらの断片を含有する対照細胞における細胞間連絡または共刺激の正味速度を観察する。この態様では、対照細胞における細胞間連絡または共刺激の正味速度を、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２分子ならびに被験化合物の両方で処理した細胞のものと比較する。この比較により細胞間連絡または共刺激の正味速度の差が得られ、これにより細胞間連絡または共刺激のエフェクターを同定できるであろう。被験化合物は、細胞間連絡または共刺激を活性化もしくはアップレギュレーションまたは阻害もしくはダウンレギュレーションすることによりエフェクターとして機能する可能性があり、この方法で検出できる。
【００８８】
細胞増殖、細胞死、細胞分化、および細胞接着アッセイ法．本発明のポリペプチドはサイトカイン活性、細胞増殖（誘導または阻害）活性または細胞分化（誘導または阻害）活性を示すか、あるいは特定の細胞集団において他のサイトカインの産生を誘導することができる。すべての既知サイトカインを含めて現在までに見いだされた多数のポリペプチド因子は、１以上の因子依存性細胞増殖アッセイ法において活性を示した。したがってこれらのアッセイ法を簡便なサイトカイン活性確認法として使用できる。本発明ポリペプチドの活性は、下記を含めた細胞系について（これらに限定されない）多数のルーティンな因子依存性細胞増殖アッセイ法のいずれかにより証明される：３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢＭ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫ。本発明のヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの活性は特に下記の方法で測定できる。
【００８９】
細胞運動および接着のアッセイ法には下記に記載のものが含まれるが、これらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，編者Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ，Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，出版社Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（６．１２章：アルファおよびベータケモカインの測定、６．１２．１−６．１２．２８）；Ｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５：１３７０−１３７６，１９６５；Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＰＭＩＳ，１０３：１４０−１４６，１９９５；Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：１７４４−１７４８；Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５８６０−５８６７，１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：１７６２−１７６８，１９９４。
【００９０】
カドヘリン接着および侵入性サプレッサー活性のアッセイ法には下記に記載のものが含まれるが、これらに限定されない：Ｈｏｒｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（３２）：１８８０９−１８８１７，１９９５；Ｍｉｙａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１１：２５４７−２５５２，１９９５；Ｏｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６３：１０３３−１０３８，１９９０。
【００９１】
本発明のクローディンポリペプチドおよび核酸の診断用その他の用途
本発明により提供される本発明クローディンポリペプチドをコードする核酸は、多数の診断用その他の有用な目的に使用できる。本発明の核酸は下記に使用できる：分析、特性解明または療法に用いる組換えポリペプチドの発現；対応するポリペプチドが優先的に発現する（構成性発現、あるいは組織分化もしくは発達の特定の段階または疾病状態での発現）組織のマーカーとして；サザンゲル上での分子量マーカーとして；染色体同定または関連遺伝子位置マッピングのための染色体マーカーまたはタグとして（標識する場合）；患者において潜在的遺伝子障害を同定するための内因性ＤＮＡ配列との対比；ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて新規な関連ＤＮＡを見いだすためのプローブとして；遺伝子フィンガープリンティングに用いるＰＣＲプライマーを導き出すための情報源として；他の新規核酸を見いだすプロセスにおいて既知配列を”除外”するためのプローブとして；”遺伝子チップ”その他の支持体に結合させるオリゴマーの選択および作製（発現パターンの検査を含む）；ＤＮＡ免疫化法を用いた抗ポリペプチド抗体の産生；抗ＤＮＡ抗体産生または他の免疫応答開始のための抗原として；ならびに遺伝子療法。本発明クローディンポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの用途には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ポリペプチドの精製およびそれらの活性の測定；運搬剤；療法用および研究用の剤；分子量マーカーおよび等電点電気泳動マーカー；ペプチド断片化の対照；未知ポリペプチドの同定；ならびに抗体産生。これらの用途に適したいずれかまたはすべての核酸を、製品として販売するための試薬用として、またはキット形式で開発することができる。上記の使用を実施するための方法は当業者に周知である。そのような方法を示した参考文献には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編，１９８９、および”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ編，１９８７。
【００９２】
プローブおよびプライマー．開示したヒトクローディン−１９、−２１および−２２核酸ならびにそれらの断片の組合わせの用途には、プローブまたはプライマーとしての断片の使用が含まれる。そのような断片は一般に少なくとも約１７連続ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。他の態様において、ＤＮＡ断片は少なくとも３０、または少なくとも６０連続ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。ハイブリダイゼーション条件および適切な条件を考案するための指針に影響を及ぼす基本的パラメーターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に述べられており、前記に詳述した。遺伝子コードについての知見を前記のアミノ酸配列と合わせて用いると、一組の縮重オリゴヌクレオチドを調製できる。そのようなオリゴヌクレオチドは、たとえばＤＮＡ断片を単離および増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして有用である。特定の態様においては、縮重プライマーをヒト以外の遺伝子ライブラリーのプローブとして使用できる。そのようなライブラリーにはｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、さらにエレクトロニクスＥＳＴ（発現配列タグ）またはＤＮＡライブラリーが含まれるが、これらに限定されない。この方法で同定した相同配列を、次いでヒト以外のヒトクローディン−１９、−２１および−２２相同体を同定するためのプローブとして使用できる。
【００９３】
染色体マッピング．本発明のクローディンポリペプチドをコードする核酸ならびにこれらの核酸の開示された断片および組合わせを当業者が周知の方法で用いて、これらの核酸が位置するヒト染色体を同定することができる。有用な方法には、多様な周知の方法、たとえば放射線ハイブリッドマッピング（高分解能）、染色体スプレッドに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の分解能）、および個々のヒト染色体を含有するハイブリッド細胞系へのサザンブロットハイブリダイゼーション（低分解能）に、本発明配列または部分（オリゴヌクレオチドを含む）をプローブとして用いることが含まれるが、これらに限定されない。たとえば染色体を放射線ハイブリダイゼーションによりマッピングできる。まず、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４の９３の放射線ハイブリッドのパネルを用いてＰＣＲを実施する：ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ ＳＴＳ ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４．ｈｔｍｌ。目的遺伝子の推定エキソン内にあって、ヒトゲノムＤＮＡから生成物を増幅するがハムスターゲノムＤＮＡは増幅しないプライマーを用いる。ＰＣＲの結果を、インターネット上のＷｈｉｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｍａｐｐｉｎｇサイト（ｗｗｗ−ｓｅｑ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に提供されたデータベクトルに換算する。このデータを採点すると、放射線ハイブリッドマップ上の既知Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ  Ｓｉｔｅ（ＳＴＳ）マーカーと対比した染色体アサインメントおよび位置決定がなされる。下記のウェブサイトで放射線ハイブリッドマッピングについての追加情報が得られる：ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ ＳＴＳ ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ。
【００９４】
診断および遺伝子療法．本発明のクローディンポリペプチドをコードする核酸ならびにこれらの核酸の開示された断片および組合わせを当業者が周知の方法で用いて、これらのポリペプチドに対応する遺伝子に関連する異常を分析することができる。これにより、このマーカーが再配列または欠失した状態を判別できる。さらに、本発明の核酸またはそれらの断片をポジショナルマーカーとして用いて、位置が分かっていない他の遺伝子をマッピングすることができる。このＤＮＡは、本発明の核酸に対応する遺伝子の欠陥または量の不十分さにより仲介される（直接または間接的に）障害の処置法を開発するのに利用できる。本明細書に開示した天然ヌクレオチド配列から欠陥遺伝子を検出し、それを正常な遺伝子で交換することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイを行い、本明細書に開示した天然ヌクレオチド配列とこの遺伝子の欠陥をもつ疑いのある者から得た遺伝子の配列とを比較することにより、欠陥遺伝子を検出することができる。
【００９５】
結合パートナーのスクリーニング方法．本発明のクローディンポリペプチドそれぞれを、結合パートナーのスクリーニングまたは同定のための方法の試薬として使用できる。たとえばアフィニティークロマトグラフィーと同様に本発明のクローディンポリペプチドを固体支持体材料に結合させ、そしてそれらの結合パートナーに結合させることができる。具体的態様においては、ポリペプチドを常法により固体支持体に結合させる。一例として、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基と反応する官能基を含むクロマトグラフィーカラムを利用できる（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）。別法では、ポリペプチド／Ｆｃポリペプチド（前記）をＦｃ部分との相互作用によりポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ含有クロマトグラフィーカラムに結合させる。本発明のクローディンポリペプチドは、細胞表面に結合パートナーを発現する細胞の同定にも利用できる。ポリペプチドを固相、たとえばカラムクロマトグラフィーマトリックスまたはこれに類する適切な支持体に結合させる。たとえば磁性マイクロスフェアを本発明のポリペプチドで被覆し、磁界によりインキュベーション容器内に保持することができる。結合パートナー発現細胞を含有する可能性のある細胞混合物の懸濁液を、表面にポリペプチドをもつ固相と接触させる。細胞表面に結合パートナーを発現している細胞は固定ポリペプチドに結合する。結合していない細胞を洗浄除去する。あるいは、本発明のクローディンポリペプチドを検出可能な部分に結合させ、次いで結合パートナー発現を検査すべき細胞と共にインキュベートしてもよい。インキュベーション後、結合していない標識物質を除去し、細胞上に検出可能な部分があるか否かを判定する。他の別法では、結合パートナーを発現すると思われる細胞の混合物をビオチニル化ポリペプチドと共にインキュベートする。確実に十分に結合させるためには、インキュベーション期間は一般に少なくとも１時間である。次いで、アビジン被覆ビーズを充填したカラムに得られた混合物を通すと、アビジンに対するビオチンの高親和性により目的細胞がビーズに結合する。アビジン被覆ビーズの使用方法は既知である（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０Ｄ：２３９，１９８６参照）。結合していない物質の洗浄除去および結合細胞の離脱を常法により行う。場合により、結合パートナーをスクリーニングまたは同定するための上記方法を利用または改変して、そのような結合パートナー分子またはそれらを発現する細胞を単離または精製することもできる。
【００９６】
生物活性の測定．ポリペプチドを用いて、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２結合性ポリペプチドの生物活性をそれらの結合親和性により測定できる。したがって”品質確認”試験の実施者が本発明のポリペプチドを用いて、たとえば異なる条件下でのポリペプチドの保存寿命および安定性を監視することができる。たとえばこれらのポリペプチドを結合親和性試験に用いて、異なる温度で保存した、または異なる細胞タイプにおいて産生された結合パートナーポリペプチドの生物活性を測定することができる。これらのポリペプチドを用いて、結合パートナーポリペプチドの修飾（たとえば化学的修飾、トランケーション、変異など）後も生物活性が保持されているか判定することもできる。修飾ポリペプチドの結合親和性を、修飾していない結合性ポリペプチドの結合親和性と比較して、その修飾が結合性ポリペプチドの生物活性に及ぼす有害な影響を検出する。こうして結合性ポリペプチドをたとえば研究に用いる前に、その生物活性を確認できる。
【００９７】
キャリヤーおよび運搬剤．本発明のポリペプチドは、それらに結合した剤を、同定された結合パートナーをもつ細胞へ運搬するためのキャリヤーとしても利用できる。したがって、これらのポリペプチドを用いて診断用剤または療法用剤をそのような細胞（または細胞表面に結合パートナーを発現することが認められた他の細胞タイプ）へｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法で運搬できる。ポリペプチドに結合しうる検出可能な（診断用の）剤および療法用剤には、毒素、他の細胞毒性薬剤、薬物、放射性核種、発色団、比色反応または蛍光反応を触媒する酵素などが含まれるが、これらに限定されない。意図する用途に応じて個々の薬剤を選択する。毒素には、リシン（ｒｉｃｉｎ）、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化ポリペプチド、マイコトキシン、たとえばトリコテセン類、ならびにそれらの誘導体および断片（たとえば一本鎖）が含まれる。診断用として適する放射性核種には１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および７６Ｂｒが含まれるが、これらに限定されない。療法用として適する放射性核種の例は１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、および６７Ｃｕである。そのような剤をいずれか適切な常法によりポリペプチドに結合させることができる。ポリペプチドは、目的薬剤上の官能基と反応してたとえば共有結合を形成しうる官能基をアミノ酸側鎖上に含む。あるいは、ポリペプチドまたは薬剤を誘導体化して、目的とする反応性官能基を形成または結合させることができる。誘導体化には、種々の分子をポリペプチドに結合させるのに利用できる二官能性結合剤（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）のひとつを結合させることが含まれる。ポリペプチドを放射性標識するための多数の方法が知られている。たとえば適切な二官能性キレート化剤を用いて放射性金属核種をポリペプチドに結合させることができる。こうしてポリペプチドおよび適切な診断用剤または療法剤を含むコンジュゲート（好ましくは共有結合したもの）が調製される。これらのコンジュゲートをその用途に適切な量で投与し、あるいは他の方法で使用する。
【００９８】
本発明のクローディンポリペプチドおよびそれらのアンタゴニストによる疾病処置
本発明のクローディンポリペプチド、本発明の断片、バリアント、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体および結合パートナーは、本明細書に詳述する上皮もしくは内皮バリヤー機能またはイオン輸送に関連する状態を含めた（これらに限定されない）病的状態および疾病の処置に有用であると考えられる。用いられる療法用分子は処置する症状の病因および関与する生物学的経路に依存し、本発明のクローディンポリペプチドのバリアント、断片および結合パートナーは本発明のクローディンポリペプチドと類似または異なる作用をもつ。たとえば密着結合形成に関連する症状の処置には本発明クローディンポリペプチドの密着結合形成活性のアンタゴニストを選択できるが、そのヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの特定の断片もその活性をもつ有効な優性ネガティブアンタゴニストとして作用できる。したがって、以下の各節において”本発明クローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト”は、すべての本発明クローディンポリペプチド、本発明の断片、バリアント、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体および結合パートナーなどを表わす。本明細書に記載した生物学的考察および療法上の考察に従って、本発明の態様として提供されたものから当業者が特定の分子（１以上）を選択できると解釈される。
【００９９】
本明細書に開示する本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法は、細菌性、ウイルス性または原虫性感染症およびそれらにより起きる合併症を処置するための医療に有用である。そのような疾患のひとつはマイコプラスマ肺炎（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）である。さらに本発明によれば、エイズおよび関連症状、たとえばエイズ痴呆コンプレックス、エイズ関連衰弱、抗レトロウイルス療法によるリピジストロフィー（ｌｉｐｉｄｉｓｔｒｏｐｈｙ）、ならびにカポジ肉腫の処置のための、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストの使用が提供される。本発明によれば、マラリアおよび住血吸虫症を含めた原虫疾患の処置のための、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストの使用が提供される。さらに、らい性結節性紅斑；細菌性またはウイルス性髄膜炎；肺結核を含めた結核；および細菌性またはウイルス性感染症に付随する間質性肺炎の処置のための、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストの使用が提供される。本発明によれば、たとえばボレリア・レカレンチス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）により起きるシラミ媒介型回帰熱の処置に用いる医薬の製造のための、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストの使用も提供される。本発明のクローディンポリペプチドまたは本発明のアンタゴニストは、ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ）ウイルスにより起きる状態、たとえばヘルペス性間質性角膜炎、角膜病変、およびウイルス誘発性角膜障害の処置のための医薬の製造にも使用できる。さらに、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストは、ヒトパピローマウイルス感染症の処置にも使用できる。本発明のクローディンポリペプチドまたは本発明のアンタゴニストは、インフルエンザの処置のための医薬の製造にも使用できる。
【０１００】
本明細書に開示する本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、医薬組成物または併用療法を用いて、下記を含めた心臓血管障害を処置することができる；大動脈瘤；動脈炎；血管閉塞（大脳動脈閉塞を含む）；冠動脈バイパス術の合併症；；虚血／再潅流傷害；心臓疾患（アテローム硬化性心臓疾患を含む）；心筋炎（慢性自己免疫性心筋炎およびウイルス性心筋炎を含む）；心不全（慢性心不全（ＣＨＦ）、心不全カヘキシーを含む）；心筋梗塞；心臓手術後再狭窄；無症状心筋虚血；左心室補助装置移植後合併症；レイノー現象；血栓性静脈炎；血管炎（川崎血管炎を含む）；巨細胞性動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症；およびシェーン−ラインヘノホ紫斑病。
【０１０１】
少なくとも１種類のヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドまたはアンタゴニストと１種類以上の他の抗血管形成因子を併用して充実性腫瘍を処置することにより、腫瘍組織に栄養供給する血管形成を減らすことができる。このような併用療法に適した抗血管形成因子には、ＩＬ−８阻害剤、アンギオスタチン、エンドスタチン、クリングル５（ｋｒｉｎｇｌｅ  ５）、血管内皮増殖因子阻害剤（たとえば血管内皮増殖因子に対する抗体）、アンギオポエチン−２または他のアンギオポエチン−１アンタゴニスト、血小板活性化因子のアンタゴニスト、および塩基性線維芽細胞のアンタゴニストが含まれる。
【０１０２】
さらに、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法は、慢性疼痛症状、たとえば慢性骨盤痛（慢性前立腺炎／骨盤痛症候群を含む）の処置に用いられる。他の例として、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストならびに組成物および併用療法は、ヘルペス後疼痛の処置に用いられる。
【０１０３】
種々の内分泌系障害を処置するために本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法を用いる方法も提供される。たとえば本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストは、若年型糖尿病（自己免疫型およびインスリン依存型糖尿病を含む）の処置、および成人発症型糖尿病（インスリン非依存型および肥満症誘発型糖尿病を含む）の処置に用いられる。さらに、本発明の化合物、組成物および併用療法は、糖尿病関連の続発性症状、たとえば糖尿病性網膜障害、糖尿病患者の腎臓移植拒絶、肥満症関連インスリン耐性、および腎不全（それ自身がたんぱく尿症および高血圧症に関連する可能性がある）の処置に用いられる。他の内分泌障害もこれらの化合物、組成物または併用療法を用いて処置でき、これには多嚢胞性卵巣、Ｘ染色体性副腎性白質ジストロフィー、甲状腺機能不全症および甲状腺炎（橋本甲状腺炎、すなわち自己免疫性甲状腺炎を含む）が含まれる。
【０１０４】
消化器系の症状も本発明のクローディンポリペプチもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法を用いて処置でき、これには小児脂肪便症が含まれる。さらに、本発明の化合物、組成物および併用療法は、クローン病；潰瘍性結腸炎；特発性胃不全麻痺；膵炎（慢性膵炎、および急性膵炎関連肺傷害を含む）；ならびに潰瘍（胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含む）の処置に用いられる。
【０１０５】
尿生殖器系障害の処置のために本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法を用いる方法も含まれる；たとえば腎炎：自己免疫性腎炎、毒素被曝による腎炎、または溶血性連鎖球菌その他の感染性生物による感染症に関連する腎炎を含む。同様に本発明の化合物、組成物および併用療法により処置できるものは、尿毒症症候群およびその臨床合併症（たとえば腎不全、貧血症、および肥大性心筋症）であり、これには環境毒素、薬物または他の原因への被曝に関連する尿毒症症候群が含まれる。本発明の化合物、組成物および併用療法により処置できる他の症状は、血液透析の合併症；前立腺症状（良性前立腺肥大、非細菌性前立腺炎および慢性前立腺炎を含む）；および血液透析の合併症である。
【０１０６】
本発明は、種々の血液障害および腫瘍性障害を処置するために本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法を用いる方法をも提供する。本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストは、たとえば下記を含めた種々の形の癌の処置に用いられる；急性骨髄性白血病、エプスタイン−バーウイルス陽性上咽頭癌、神経膠腫、結腸癌、胃癌、前立腺癌、腎細胞癌、子宮頚癌および卵巣癌、肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）：癌関連カヘキシー、疲労、衰弱、カヘキシーのパラネオプラスチック症候群、および高カルシウム血症を含む。本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法により処置できる他の疾患は充実性腫瘍であり、これには肉腫、骨肉腫、ならびに癌、たとえば腺癌（たとえば乳癌）および扁平上皮癌が含まれる。さらに、本発明の化合物、組成物または併用療法は白血病の処置に有用であり、これには急性骨髄性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病、および有毛状細胞性白血病が含まれる。浸潤性転移の可能性がある他の悪性疾患を本発明の化合物、組成物および併用療法により処置することができ、これには多発性骨髄腫が含まれる。さらに、開示した本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法を用いて貧血および血液障害を処置することができ、これには慢性疾患の貧血、再生不良性貧血（ファンコーニ再生不良性貧血を含む）；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；脊髄形成異常症候群（不応性貧血、環状鉄赤芽球性不応性貧血、芽細胞過剰性不応性貧血、トランスフォーメーション状態の芽細胞過剰性不応性貧血）；骨髄線維症／骨髄様異形成；および鎌状赤血球血管閉塞性クリーゼが含まれる。
【０１０７】
開示した本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法で処置できる他の症状には、頭部または脊髄の傷害により起きるものが含まれ、これには頭部外傷による硬膜下血腫が含まれる。
【０１０８】
開示した本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法は、さらに肝臓の症状を処置するのに用いられる；たとえば肝炎：急性アルコール性肝炎、急性薬物誘発性またはウイルス性肝炎、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎、硬化性胆管炎、ならびに原因不明の肝炎を含む。
【０１０９】
多数の肺障害も、開示した本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法で処置できる。そのような症状のひとつは成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）であり、これは有毒化学物質、膵炎、外傷または他の原因への被曝を含めた多様な原因で起きる可能性がある。開示した本発明の化合物、組成物および併用療法は、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）；リンパ管平滑筋腫症；および早期産児の慢性肺線維症の処置にも有用である。さらに、本発明の化合物、組成物および併用療法は職業性肺疾患の処置に用いられる；これには石綿肺症、炭坑夫塵肺症、珪肺症、またはこれらに類する長期微粒子被曝に関連する症状が含まれる。本発明の他の態様において、開示した本発明の化合物、組成物および併用療法は下記を含めた肺障害の処置に用いられる：慢性気管支炎または肺気腫に関連する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；線維性肺疾患、たとえば嚢胞性線維症、特発性肺線維症および放射線誘発性肺線維症；肺サルコイド症；ならびにアレルギー：アレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎および喘息を含む。
【０１１０】
本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを所望によりサイトカインＩＦＮγ−１ｂ（たとえばＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（登録商標）；ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）と併用して、嚢胞性線維症または線維性肺疾患、たとえば特発性肺線維症、放射線誘発性肺線維症およびブレオマイシン誘発性肺線維症を処置できる。さらにこの併用は臓器線維化を特色とする他の疾患の処置に有用であり、しばしば肝臓の線維化を伴う全身性硬化症（”強皮症”とも呼ばれる）がこれに含まれる。嚢胞性線維症の処置には、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストおよびＩＦＮγ−１ｂを、ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）もしくはＴＯＢＩ（登録商標）または他の嚢胞性線維症処置と併用できる。
【０１１１】
本発明のクローディンポリペプチドまたは本発明のアンタゴニストを単独で、またはＩＦＮγ−１ｂと共に、線維性肺疾患の処置のために現在用いられている他の処置と一緒に投与できる。そのような他の処置には、グルココルチコイド類、アザチオプリン、シクロホスファミド、ペニシラミン、コルヒシシン（ｃｏｌｃｈｉｓｉｃｉｎｅ）、酸素補給などが含まれる。線維性肺疾患、たとえばＩＰＦの患者は、しばしば空咳（ｎｏｎｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｏｕｇｈ）、進行性呼吸困難を呈し、肺機能検査で拘束性換気パターンを示す。胸部Ｘ線写真により患者の肺に線維の蓄積がみられる。線維性肺疾患を本発明方法で処置する場合に処置が十分であるかは、患者の咳の減少（咳がある場合）を観察し、または肺の全容量、肺活量、残留肺容量の改善を調べる標準的な肺機能検査を行い、または運動状態での脱飽和を測定する動脈血ガス測定を実施し、これらの手段のいずれかで患者の肺機能改善を証明することにより検知できる。さらに、患者の改善は患者の肺線維症の進行が停止または低下したことを示す胸部Ｘ線撮影結果によっても判定できる。
【０１１２】
さらに、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト（可溶性の本発明クローディンポリペプチド、または本発明のクローディンポリペプチドに対する抗体を含む）は、コラーゲン産生をダウンレギュレーションし、したがって線維症を阻害するホルモンであるリラキシンと併用した場合、またはＴＧＦ−βの線維形成活性を遮断する薬剤と併用した場合、臓器線維症の処置に有用である。本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストと組換えヒトリラキシンを用いる併用療法は、たとえば全身性硬化症、または嚢胞性線維症、特発性肺線維症、放射線誘発性肺線維症およびブレオマイシン誘発性肺線維症を含めた線維性肺疾患の処置に有用である。
【０１１３】
他の態様では、開示した本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法を用いて多様なリウマチ性障害を処置する方法が提供される。これには下記のものが含まれる：成人および若年性慢性関節リウマチ；全身性紅斑性狼瘡；痛風；骨関節炎；リウマチ性多発筋痛；血清陰性脊椎関節症（強直性脊椎炎を含む）；およびライター病。本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法は、乾癬性関節炎および慢性ライム関節炎の処置にも用いられる。これらの化合物、組成物および併用療法を用いて、スティル病および慢性関節リウマチ関連ブドウ膜炎を処置することもできる。さらに、本発明の化合物、組成物および併用療法は随意筋の炎症による障害の処置に用いられ、これには皮膚筋炎および多発性筋炎が含まれる。さらに本明細書に開示した化合物、組成物および併用療法は、多中心性網組織球症、すなわち多核巨細胞による前炎症性サイトカインの過剰産生に伴って関節破壊および顔面や手の丘疹状結節が生じる疾患の処置に用いられる。
【０１１４】
本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、本発明の組成物および併用療法は、原発性アミロイド沈着症（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）の処置に有用である。さらに、多様な症状を特色とする続発性（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）アミロイド沈着症も、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、たとえば本明細書に開示した本発明クローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、ならびに組成物および併用療法により処置できる。そのような状態にはアルツハイマー病、続発性反応性アミロイド沈着症；ダウン症候群；および透析関連アミロイド沈着症が含まれる。同様に本発明の化合物、組成物および併用療法により処置できるものは、遺伝性周期性発熱症候群であり、これには家族性地中海熱、過免疫グロブリンＤおよび周期性発熱症候群ならびにＴＮＦ−受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）が含まれる。
【０１１５】
移植関連障害も、開示した本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法により処置できる；たとえば移植片対宿主疾患、および実質性臓器移植、たとえば心臓、肝臓、肺、皮膚、腎臓その他の臓器の移植により起きる合併症。本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストは、たとえば肺移植後の閉塞性細気管支炎の発症を予防または阻止するために投与できる。
【０１１６】
眼障害も、開示した本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法により処置できる；これには裂孔原性網膜剥離、ならびに炎症性眼疾患および喫煙関連の炎症性眼疾患、ならびに黄斑変性が含まれる。
【０１１７】
本発明のクローディンポリペプチドまたは本発明のアンタゴニストならびに開示した組成物および併用療法は、女性生殖器系に影響を及ぼす障害の処置にも有用である。たとえば多発性卵子着床不全／不妊症；胎児喪失症候群または第ＩＶ期胚喪失（自然流産）；子癇前症妊娠または子癇；および子宮内膜症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
開示した本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法はさらに、急性多発性神経障害；神経性食欲不振症；ベル麻痺；慢性疲労症候群；伝染性痴呆（クロイツフェルト−ヤコブ病を含む）；脱髄性神経障害；ギラン−バレー症候群；椎骨円板疾患；湾岸戦争症候群；重症筋無力症；無症状性脳虚血；睡眠障害（ナルコレプシーおよび睡眠無呼吸を含む）；慢性神経変性；および卒中（脳虚血性疾患を含む）の処置に有用である。
【０１１９】
皮膚または粘膜に関連する障害も、開示した本発明のクローディンポリペプチドもしくはアンタゴニスト、組成物または併用療法により処置できる。そのような障害には、棘融解疾患、たとえばダリエー病、毛包性角化症および尋常性天疱瘡が含まれる。同様に本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト、組成物および併用療法により処置できるものは、座瘡；酒土性座瘡；円形脱毛症；アフタ性口内炎；水疱性類天疱瘡；火傷；湿疹；紅斑（多形性紅斑および多形性大水疱性紅斑（スティーヴェンズ−ジョンソン症候群）を含む）；炎症性皮膚疾患；扁平苔癬；線状ＩｇＡ水疱性疾患（小児慢性水疱性皮膚病）；皮膚柔軟性喪失；粘膜表面潰瘍；好中球性皮膚炎（スイート症候群）；毛孔性紅色粃糠疹；乾癬；壊疽性膿皮症；および中毒性上皮壊死症である。
【０１２０】
本発明のクローディンポリペプチドおよびそれらのアンタゴニストの投与
本発明は、医学的障害、特にヒトクローディン−１９、−２１および−２２仲介障害に罹患している患者、好ましくは哺乳動物患者、最も好ましくはヒト患者を処置するための化合物、組成物および方法を提供する。そのようなヒトクローディン−１９、−２１および−２２仲介障害には、ヒトクローディン−１９、−２１および−２２と結合パートナーの結合により発症（直接または間接的に）または増悪する症状が含まれる。本発明の目的に関して、”疾病（ｉｌｌｎｅｓｓ）”、”疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）”、”病的状態（ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）”、”異常な状態（ａｂｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）”などの用語は、”医学的障害（ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｉｏｒｄｅｒ）”と互換性をもって用いられる。本明細書中で用いる”処置する（ｔｒｅａｔ）”および”処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”という用語には、治癒、阻止（たとえば予防）および一時的緩和または改善が含まれる。このような療法用途について、本発明のクローディンポリペプチドおよび断片、本発明のクローディンポリペプチドをコードするヒトクローディン−１９、−２１および−２２核酸、ならびに／あるいはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、たとえば抗体を、必要とする患者に周知の方法で投与することができる。本発明の組成物は、本明細書に記載したいずれかの形のポリペプチド、たとえば天然ポリペプチド、バリアント、誘導体、オリゴマーおよび生物活性断片を含有できる。具体的態様において組成物は、可溶性ポリペプチドまたはオリゴマーを含み、これには本発明の可溶性ポリペプチドが含まれる。
【０１２１】
療法有効量．本発明の処置方法または使用方法を実施するに際しては、処置すべき疾病を伴う患者に療法有効量の本発明の療法剤を投与して、好ましくはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの活性に関連する疾患を処置または改善する。”療法（用）剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）”には、本発明のクローディンポリペプチド、断片およびバリアント；本発明のクローディンポリペプチド、断片およびバリアントをコードする核酸；本発明のクローディンポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、たとえば抗体；ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド結合パートナー；本発明のクローディンポリペプチド、断片、バリアントおよび結合パートナーから形成した複合体などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で用いる”療法有効量”という用語は、有意義な患者の利益、すなわちその病的状態の治療、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の治療、治癒、予防もしくは改善の速度増大を示すのに十分な、医薬組成物または方法の各療法剤または他の有効成分の全量を意味する。単独投与する個々の療法剤または有効成分について用いる場合、この用語はその単独成分に関する。併用について用いる場合、組合わせ、逐次または同時のいずれであっても、この用語は療法効果をもたらす成分の合計量を表わす。本明細書中で用いる”療法有効量の療法剤を投与する”という句は、その障害の程度を反映する少なくとも１つの指標において改善（好ましくは持続的改善）を誘発するのに十分な量の療法剤で、それに十分な期間、患者を処置することを意味する。患者が１週間以上離れた少なくとも２回で改善を示す場合、改善は”持続的”であるとみなす。徴候または症状に基づいて改善度を判定する。その判定には患者に配布したアンケート用紙、たとえば生活の質に関するアンケート用紙を利用してもよい。処置の量および時間が十分であるかを判定するためには、患者の疾病の程度を反映する多様な指標を評価することができる。１回目の療法剤投与の前に患者を検査することにより、選択した指標のベースライン値を求める。好ましくは１回目の投薬の約６０日以内にベースライン検査を実施する。急性症状の処置のために療法剤を投与する場合、傷害が起きた後、実際上可能な限り速やかに１回目の用量を投与する。選択した１以上の指標について患者がベースラインを超える改善を示すまで療法剤、たとえば本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを投与することにより、改善を誘発する。慢性症状を処置する場合、この改善度はこの医薬を少なくとも１カ月以上の期間、たとえば１、２もしくは３カ月またはそれ以上にわたって反復投与または不定期投与することにより得られる。急性症状の処置には１〜６週間の期間、さらには１回投与で十分なことがしばしばある。傷害または急性症状には１回投与で十分な可能性がある。１以上の指標からみて処置後の患者の疾病の程度が改善されたようにみえても、同じレベルか、または投与量もしくは頻度を減らして、不定期に処置を続けることができる。処置を低減または中止した場合、のちに症状が再発したとき元のレベルに回復させてもよい。
【０１２２】
投与量．適切な投与量が処置すべき障害の性質および程度、患者の体重、年齢、全般的状態、ならびに過去の疾病および／または処置、ならびに投与経路などの要因に応じて変動することは当業者に自明であろう。予備投与量を動物試験により決定することができ、ヒトへの投与のための投与量の判定は技術分野で受け入れられている方法、たとえば標準投与治験により実施できる。たとえば療法有効量をまず細胞培養アッセイから推定できる。投与量はその化合物の比活性に依存し、ルーティン実験で容易に判定できる。細胞培養で判定したＩＣ５０（すなわち最大の半分の症状阻害を達成する被験化合物濃度）を含み、一方では毒性を最小限に抑える循環血漿濃度範囲を達成するような用量を、動物モデルに処方する。そのような情報を用いて、ヒトに有用な投与量をより厳密に判定する。最終的には担当医が、個々の患者の処置に用いる本発明ポリペプチドの量を決定する。まず担当医は低用量の本発明ポリペプチドを投与して患者の反応を観察する。その患者について最適療法効果が得られるまで本発明ポリペプチドの投与量を増加することができ、その時点でそれ以上は投与量を増加しない。本発明を実施するために用いる種々の医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｎｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約０．１ｎｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１μｇ〜約１ｍｇ）の本発明ポリペプチドを含有するものとする。本発明の態様のひとつにおいては本明細書に開示した種々の医学的障害を処置するために本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを週１回投与し、他の態様においては少なくとも週３回投与する。注射する場合、成人当たりの本発明クローディンポリペプチドまたはアンタゴニストの有効量は１〜２０ｍｇ／ｍ２、好ましくは約５〜１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは均一量を投与してもよく、その量は５〜１００ｍｇ／回であってよい。皮下注射により投与する均一量の例は、５〜２５ｍｇ／回、２５〜５０ｍｇ／回、および５０〜１００ｍｇ／回である。本発明の態様のひとつにおいては、２５ｍｇ／回または５０ｍｇ／回の本発明クローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを含有する注射用製剤を投与することにより、後記の多様な適応症を処置する。特に慢性症状には２５ｍｇまたは５０ｍｇ量を反復投与できる。注射以外の投与経路を用いる場合、医薬標準法に従って投与量を適宜調整する。多くの場合、約２５ｍｇ量の本発明クローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを週１〜３回、少なくとも３週間にわたって、あるいは５０ｍｇ量の本発明クローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを週１または２回、少なくとも３週間にわたって注射することにより、患者の症状の改善が得られるであろう。ただし、目的とする改善度を導き出すのに、これより長い期間の処置が必要な場合もある。治癒可能な慢性症状については、患者の医師が必要と考えれば投与量および頻度を調整しながらこの方式を不定期に継続することができる。上記の用量は、１８歳以上の成人患者についての例である。小児科患者（４〜１７歳）に適切な投与方式は０．４ｍｇ／ｋｇで最大用量２５ｍｇの本発明クローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを皮下注射するもの���あり、週１回以上の皮下注射により投与する。ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドに対する抗体をヒトクローディン−１９、−２１および−２２アンタゴニストとして用いる場合、好ましい投与範囲は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド抗体の他の好ましい投与範囲は０．７５〜７．５ｍｇ／ｋｇ（体重）である。ヒト化抗体、すなわち抗体分子の抗原結合部分のみがヒト以外の供給源に由来する抗体が好ましい。そのような抗体を注射するか、または静脈内投与することができる。
【０１２３】
処方．有効量の本発明のヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド（いかなる供給源に由来するものであってもよく、組換えおよび組換え以外の供給源を含むが、これらに限定されない）を他の成分、たとえば生理学的に許容できる希釈剤、キャリヤーまたは賦形剤と共に含む組成物が、本発明により提供される。”医薬的に許容できる”という用語は、有効成分の生物活性の有効性を妨害しない無毒性物質を意味する。投与に適した処方には下記のものが含まれる：水性および非水性無菌注射液剤、これらは酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい；水性および非水性無菌懸濁液剤、これらは沈殿防止剤または増粘剤を含有してもよい。前記ポリペプチドを、医薬として使用できる組成物の調製に用いられる既知の方法で配合できる。それらを唯一の有効物質として、またはその適応症に適した他の既知の有効物質と共に、医薬的に許容できる希釈剤（たとえば生理食塩水、トリス−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝液）、保存薬（たとえばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、佐剤および／またはキャリヤーとの混合物にすることができる。医薬組成物として適切な処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８９，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ペンシルベニア州イーストン）に記載のものが含まれる。さらに、そのような組成物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンとの複合体にし、またはポリマー化合物、たとえばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなどに取り込ませ、あるいはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単膜もしくは多重膜ベシクル、赤血球ゴーストまたはスフェロプラストに取り込ませることができる。リポソーム形成に適した脂質にはモノグリセリド、ジグリセリド、スルアァチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれるが、これらに限定されない。そのようなリポソーム処方の調製は当業者が容易に実施でき、たとえばＵＳＰ４，２３５，８７１；ＵＳＰ４，５０１，７２８；ＵＳＰ４，８３７，０２８；およびＵＳＰ４，７３７，３２３に開示されている；これらをすべて本明細書に援用する。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすので、意図する用途に応じて選択される。したがってキャリヤーの特性は選択した投与経路に依存する。本発明の好ましい態様のひとつにおいては、徐放形態の本発明クローディンポリペプチドを用いる。本発明方法に適した徐放形態には、本発明のクローディンポリペプチドを、徐々に溶解する生物適合性ポリマー（たとえばＵＳＰ６，０３６，９７８に記載のアルギナート微粒子）に封入しもの、そのようなポリマーと混合したもの（局所用ヒドロゲルを含む）、および／または生物適合性半透性埋込み剤に挿入したものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
療法用化合物の併用．本発明のヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドはそれ自体のまたは他のポリペプチドとの多量体（たとえばヘテロ二量体またはホモ二量体）または複合体の形でも有効である。したがって、本発明の医薬組成物は本発明のポリペプチドをそのような多量体または複合体の形で含むことができる。本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチド（１以上）とポリペプチド抗原またはペプチド抗原との複合体の形であってもよい。本発明はさらに、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを、同一患者に本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストと併用投与する１種類以上の他の薬物と共に投与することを含む。各薬物はその医薬に適した方式で投与される。”共に投与する”とは、その組合わせの各成分による同時もしくは逐次処置、および薬物を交互に投与する方式、または１成分を長期投与し、他（１以上）を断続的に投与する方式を含む。成分を同一または別個の組成物中で、同一または異なる投与経路で投与できる。本発明の医薬組成物に含有させることができる成分の例には下記のものが含まれる：サイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子、たとえばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチン。医薬組成物はさらに、本発明ポリペプチドの活性を高めるかまたはその活性もしくは処置における用途を補足する他の薬剤を含有してもよい。そのような追加因子および／または薬剤は、本発明のポリペプチドとの相乗効果を生じるために、または副作用を最小限に抑えるために、医薬組成物中に含有させてもよい。逆に、本発明のヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドまたはアンタゴニストがサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓形成因子、または抗炎症薬の処方中に、これらのサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓形成因子、または抗炎症薬の副作用を最小限に抑えるために含有されてもよい。共に投与される薬物の他の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、非ステロイド系抗炎症薬、ペントキシフィリン、サリドマイド、および疾病修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、たとえばアザチオプリン、シクロホスファミド、サイクロスポリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、メトトレキセート、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）、ならびに金化合物、たとえば経口用金、金チオリンゴ酸ナトリウムおよび金チオグルコース。さらに、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを第２のヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド／アンタゴニストと併用でき、これにはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドに対する抗体、またはヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド由来のペプチドであって天然ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチドの競合阻害剤として作用するものが含まれる。
【０１２５】
投与経路．本発明のクローディンポリペプチドまたはそれらのアンタゴニスト、および核酸を含む組成物を療法投与するためには、いずれかの効果的な投与経路を使用できる。非経口投与には、たとえば関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内もしくは皮下経路でのボーラス注射または連続注入による注射が含まれ、たとえば疾患または傷害の部位への局所投与も含まれる。他の適切な投与手段には、埋込み剤からの徐放；エアゾル剤の吸入および／または吹入れ；点眼剤；膣または直腸坐剤；バッカル剤；経口製剤、たとえば丸剤、シロップ剤、トローチ剤またはチューインガム；ならびに局所製剤、たとえばローション剤、ゲル剤、噴霧剤、軟膏剤、あるいは他の適切な手法が含まれる。あるいはポリペプチド型の本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストは、ポリペプチドを発現する培養細胞の移植により、たとえば本発明のポリペプチドまたはアンタゴニストを発現する細胞の移植により投与できる。細胞を増殖させ、または細胞において目的効果もしくは活性を生じさせるために、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで本発明ポリペプチドの存在下に培養することもできる。次いで処理した細胞を療法のためにｉｎ  ｖｉｖｏ導入することができる。他の態様においては、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストをコードするＤＮＡを用いて患者自身の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションすることにより、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを産生するように誘導する。たとえば本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストをコードする裸のＤＮＡもしくはリポソーム封入ＤＮＡの注入により、または他のトランスフェクション手段により、このＤＮＡを患者の細胞に導入できる。本発明の核酸を、細胞または生物に核酸を導入するための他の既知の手段で患者に投与することもできる（ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形が含まれるが、これに限定されない）。本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニストを１種類以上の他の生物活性化合物と共に投与する場合、これらを同一または異なる経路で投与でき、同時、別個または逐次投与できる。
【０１２６】
経口投与．療法有効量の本発明ポリペプチドを経口投与する場合、本発明のポリペプチドは錠剤、カプセル剤、散剤、液剤またはエリキシル剤の形である。錠剤の形で投与する場合、本発明の医薬組成物はさらに固体キャリヤー、たとえばゼラチンまたは佐剤を含有してもよい。錠剤、カプセル剤および散剤は、本発明のポリペプチド約５〜９５％、好ましくは本発明のポリペプチド約２５〜９０％を含有する。液状で投与する場合、液体キャリヤー、たとえば水、ワセリン、動物性もしくは植物性の油、たとえばラッカセイ油、鉱油、大豆油もしくはゴマ油、または合成油を添加できる。液状の医薬組成物はさらに、生理食塩水、ブドウ糖もしくは他の糖類溶液、またはグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含有してもよい。液状で投与する場合、医薬組成物は本発明のポリペプチド約０．５〜９０重量％、好ましくは本発明のポリペプチド約１〜５０％を含有する。
【０１２７】
静脈内投与．療法有効量の本発明ポリペプチドを静脈内、経皮または皮下注射により投与する場合、本発明のポリペプチドは発熱物質を含有しない、非経口用として許容できる水性液剤の形である。ｐＨ、等張性、安定性などに関して非経口用として許容できるそのようなポリペプチド液剤の調製は、当業者が容易に実施できる。静脈内、経皮または皮下注射用として好ましい医薬組成物は、本発明のポリペプチドのほかに、等張ビヒクル、たとえば注射用塩化ナトリウム、注射用リンゲル液、注射用ブドウ糖、注射用ブドウ糖および塩化ナトリウム、注射用乳酸加リンゲル液、または当技術分野で既知の他のビヒクルを含有する。本発明の医薬組成物は、安定剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤、または当技術分野で既知の他の添加剤を含有してもよい。本発明の医薬組成物による静脈内療法の期間は、処置する疾患の程度ならびに各患者の状態および潜在的特異体質反応に応じて異なるであろう。本発明ポリペプチドの各投与期間は連続静脈内投与１２〜２４時間であると考えられる。最終的には担当医が、本発明の医薬組成物による適切な静脈内療法期間を決定するであろう。
【０１２８】
骨および組織への投与．骨、軟骨、腱または靭帯の再生に有用な本発明組成物について、本発明の療法には局所的、全身的、または移植片もしくは医療用具として限局的に組成物を投与することが含まれる。本発明に用いる療法組成物を投与する場合、これはもちろん発熱物質を含有せず、生理学的に許容できる形のものである。さらに、骨、軟骨、または組織の損傷部位へ運搬するために、本発明組成物をカプセル封入するか、あるいは粘稠な形態で注入することが望ましい。創傷治癒および組織修復のためには場合により局所投与が適切である。あるいは、またはさらに、本発明方法においては前記のように本発明組成物に含有されてもよい本発明ポリペプチド以外の療法有用薬剤を、本発明組成物と同時または逐次投与できる。骨および／または軟骨の形成のためには、ポリペプチド含有組成物を骨および／または軟骨の損傷部位へ運搬し、骨および軟骨の発達のための構造を提供し、所望により体内へ吸収されうるマトリックスが、組成物に含有されることが好ましい。そのようなマトリックスは、現在他の移植医療に用いられている材料で形成できる。マトリックス材料の選択は、生体適合性、生物分解性、機械的特性、美的外観および界面特性に基づいてなされる。組成物の具体的用途から適切な処方が決定されるであろう。使用できるマトリックスは、生物分解性でありかつ化学的に解明された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリアンヒドリドである。使用できる他の材料は、生物分解性でありかつ生物学的に十分に解明されたもの、たとえば骨または皮膚のコラーゲンである。他のマトリックスは純粋なポリペプチドまたは細胞外マトリックス成分からなる。使用できる他の材料は、生物分解性ではないが化学的に解明されたもの、たとえば焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミナート、または他のセラミックスである。マトリックスは上記のいずれかのタイプの材料の組合わせ、たとえばポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウムからなっていてもよい。バイオセラミックスの組成を変更し（たとえばカルシウム−アルミナート−ホスフェート）、ポアサイズ、粒径、粒子形状および生物分解性を変更する処理を施してもよい。現在好ましいものは、１５０〜８００ミクロンの直径をもつ多孔質粒子の形の、乳酸とグリコール酸の５０：５０（モル重量）コポリマーである。ある用途においては、金属イオン封鎖剤、たとえばカルボキシメチルセルロース、または自家血餅を用いて、ポリペプチド組成物がマトリックスから離脱するのを防ぐことが有用であろう。好ましい金属イオン封鎖剤ファミリーはセルロース系材料、たとえばアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）であり、これにはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが含まれ、最も好ましいものはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のカチオン塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤には、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）が含まれる。本発明に有用な金属イオン封鎖剤の量は、全処方重量の０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％である。この量は、ポリペプチドがポリマーマトリックスから脱着するのを防ぎかつ組成物を取扱いやすくするのに必要であり、なおかつ前駆細胞がマトリックスに浸潤するのを阻止するほど多くない量であり、これによりポリペプチドは前駆細胞の骨形成活性を助成することができる。他の組成物において本発明のポリペプチドは、骨および／または軟骨の欠陥、創傷あるいは問題の組織を処置するのに有益な他の薬剤と併用できる。これらの薬剤には種々の増殖因子、たとえば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）が含まれる。本発明の組成物は、必然的に動物用としても有用である。ヒトのほか、特に家畜およびサラブレッドウマが本発明のポリペプチドを用いる処置に望ましい患者である。組織再生に用いるポリペプチド含有組成物の投与方式は、ポリペプチドの作用に影響を及ぼす多様な要因、たとえば形成したい組織重量、損傷部位、損傷部位の状態、創傷の大きさ、損傷組織のタイプ（たとえば骨）、患者の年齢、性別および食事、感染症があればその程度、投与時間その他の臨床要因を考慮して、担当医が決定するであろう。投与量は、再生に用いるマトリックスのタイプおよび医薬組成物中の他のポリペプチドの含有に応じて異なるであろう。たとえば他の既知の増殖因子、たとえばＩＧＦ  Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）を最終組成物に添加することも、投与量に影響を及ぼす可能性がある。たとえばＸ線、組織形態測定学的測定およびテトラサイクリン標識により組織／骨の増殖および／または修復を定期的に評価することによって、経過をモニターできる。
【０１２９】
動物用途．本発明のクローディンポリペプチドおよびアンタゴニストは、ヒト患者のほかヒト以外の動物、たとえばペット（イヌ、ネコ、鳥、霊長類など）、農場家畜（ウマ、ウシ、ヒツジ、鳥など）、またはＴＮＦ−α仲介炎症もしくは関節炎症状に罹患するいずれかの動物の疾病状態を処置するのに有用である。そのような場合、動物の体重に従って適切な投与量を決定できる。たとえば０．２〜１ｍｇ／ｋｇの投与量を使用できる。あるいは動物の体表面積に従って投与量を決定する；投与量はたとえば０．１〜２０ｍｇ／ｍ２、好ましくは５〜１２ｍｇ／ｍ２である。小型動物、たとえばイヌまたはネコについては、適量は０．４ｍｇ／ｋｇである。好ましい態様においては、本発明のクローディンポリペプチドまたはアンタゴニスト（好ましくは患者と同一種に由来する遺伝子から構築したもの）を注射または他の適切な投与経路により、週１回以上、動物の症状が改善するまで投与する。あるいは不定期に投与してもよい。
【０１３０】
医薬の製造．本発明は、本明細書に開示する医学的障害それぞれを予防または治療するための医薬の製造における、本発明のクローディンポリペプチド、断片およびバリアント；本発明のクローディンポリペプチド、断片およびバリアントをコードする核酸；本発明クローディンポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、たとえば抗体；ヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド結合パートナー；本発明のクローディンポリペプチド、断片、バリアントと結合パートナーから形成された複合体などの使用にも関する。
【０１３１】
実施例
以下の実施例は本発明の具体的態様を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１３２】
実施例１
ヒトクローディンポリペプチドの同定
ヒトゲノムがコードすると推定されるアミノ酸配列リストを含むデータセットをＣｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（メリーランド州ロックビル）から受け取った。このデータセットをＢＬＡＳＴアルゴリズムにより検索して、クローディンファミリーのポリペプチドを同定した。２つのオーバーラップアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）が新規なヒトクローディンポリペプチドであるクローディン−２１の部分アミノ酸配列であると同定された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１をヒトゲノムＤＮＡ配列のＴＢＬＡＳＴＮ検索に用いて、２つのオーバーラップゲノムＤＮＡ断片を同定した；これらの２断片から形成されたコンティグをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド２〜５９２はアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４をコードする；これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とオーバーラップし、それの両端が延長している。しかし、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のＮ末端アミノ酸配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびクローディンファミリーの他のポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を比較すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列にフレームシフトのあることが示唆される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド４０〜４２の’ａ’残基の１つを欠失すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５になる；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のヌクレオチド１〜４０５はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２４〜１５８をコードする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のヌクレオチド４０６〜５９１がコードするアミノ酸を用いてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を延長すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６が得られる；これは全長クローディン−２１ポリペプチドの推定アミノ酸配列である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のヌクレオチド１〜５９１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸２４〜２２０をコードする）。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のＮ末端領域の相異は、これらのアミノ酸配列をコードする核酸間の対立遺伝子変異によるものであると思われる。ヒトクローディン−２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）ポリペプチドおよびヒトクローディン−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）ポリペプチドの両方に対し高度の配列類似性を示すマウスアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）が同定されている；このマウスポリペプチドはヒトクローディン−２２よりヒトクローディン−２１に対する類似性の方が若干大きいので、これを本明細書においては’ネズミクローディン−２１’と呼ぶ。
【０１３３】
本発明者らは、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ’ｓ  Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）が遺伝子ＥＮＳＧ００００００６６０１８として自動作製したデータ内にヒトクローディン−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を同定した；このポリペプチドがクローディンポリペプチド活性をもち、部分ネズミクローディン−１９配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のヒト相同体であるヒトクローディンポリペプチドであると同定したのは本発明者らが最初であると思われる。さらに、ヒトクローディン−１９ポリペプチド配列のバリアント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）が同定された；このバリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸１９〜３８の代わりにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１９〜３３の配列をもつ；これは対立遺伝子変異またはスプライス変異の結果であろう。本発明者らは、Ｃｅｌｅｒａが自動作製したデータ内にヒトクローディン−２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）からなるアミノ酸配列を同定した；これらのポリペプチド配列をクローディンポリペプチド活性をもつヒトクローディンポリペプチドであると同定したのは本発明者らが最初であると思われる。
【０１３４】
ヒトクローディン−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ネズミクローディン−１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ヒトクローディン−１９のバリアント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ヒトクローディン−２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ヒトクローディン−２１のバリアント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ネズミ”クローディン−２１”（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、およびヒトクローディン−２２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）のアミノ酸配列を、クローディンファミリーの他のメンバー、たとえばクローディン−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）およびクローディン−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）のアミノ酸配列と比較した：下記の表１に示す。この比較にはＧＣＧ”ｐｒｅｔｔｙ”多重配列アラインメントプログラムを、アミノ酸類似性得点マトリックス＝ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ形成ペナルティ＝８、およびギャップ延長ペナルティ＝２で用いた。表１に示すこれらの配列のアラインメントは、このアラインメントにおいて少なくとも５つのアミノ酸配列間で同一である大文字のコンセンサス残基を示す。ヒトクローディン−２１は、クローディンポリペプチドファミリーの他のメンバーに対し約３６〜４０％のアミノ酸同一性、および約５４〜５７％のアミノ酸類似性を示す（ｂｌｏｓｕｍ６２比較マトリックスに基づく）。
【０１３５】
本発明のクローディンポリペプチドに対するアミノ酸置換その他の変更（欠失、挿入など）は、それによって表１に示す大文字の残基が変化した場合、特にそれらの変化が他のクローディンポリペプチド中に存在するその保存された位置の残基を代替しない場合、クローディンポリペプチド活性を変更または撹乱する可能性がより高いと推定される。逆に、表１のコンセンサス配列残基のうち１以上をその保存された位置のクローディンポリペプチド残基で置換する変化がクローディンポリペプチドになされた場合、そのような変更がクローディンポリペプチド機能に影響を及ぼす可能性はより低い。たとえば表１の位置５０のコンセンサス残基はトリプシンであり、あるクローディンポリペプチドはその位置にトレオニンまたはイソロイシンをもつ。その位置をトレオニンもしくはイソロイシン、または化学的に類似の残基、たとえばセリンもしくは脂肪族アミノ酸のひとつで置換することは、荷電残基、たとえばリシンまたはアルギニンなどによる置換よりポリペプチドの機能を変更する可能性が低いと思われる。
【０１３６】
本発明の態様には、変更されたアミノ酸配列を含むクローディンポリペプチドおよびクローディンポリペプチド断片が含まれる。変更されたヒトクローディン−１９、−２１および−２２ポリペプチド配列は、表１に示すクローディンアミノ酸配列との少なくとも３０％、またはより好ましくは少なくとも４０％、またはより好ましくは少なくとも５０％、またはより好ましくは少なくとも５５％、またはより好ましくは少なくとも６０％、またはより好ましくは少なくとも６５％、またはより好ましくは少なくとも７０％、またはより好ましくは少なくとも７５％、またはより好ましくは少なくとも８０％、またはより好ましくは少なくとも８５％、またはより好ましくは少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％、またはより好ましくは少なくとも９７．５％、またはより好ましくは少なくとも９９％、または最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性をもつ。
【０１３７】
【表１】
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【０１３８】
【表２】
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【０１３９】
ｃｌｄｎ＝クローディン
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ＝コンセンサス
ヒトクローディン−１９をコードする核酸はヒト染色体１ｐ３２．３にマッピングされる。ヒトクローディン−２１をコードする核酸はヒト染色体４ｑ３５．１にマッピングされる。ヒトクローディン−２２をコードする核酸はヒト染色体１１ｐ２３．２にマッピングされる。本発明のクローディンポリペプチドをコードする核酸を用いて、これらの染色体領域に関連する遺伝子異常を分析できる。たとえば、当業者はクローディンコード配列を含む染色体領域が再配列または欠失した患者を同定できる。これは、遺伝子疾患を呈する家系に関する遺伝因子としての特定の遺伝子座を確認または除外するために使用できる核酸にも実質的に適用される。
【０１４０】
実施例２
ヒトクローディン−２１転写体およびタンパク質の発現
種々の組織におけるヒトクローディン−２１の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出した。クローディン−２１転写体を下記のヒト組織において検出した：心臓、腎臓、肺、胃、胎盤、胸腺、肝臓および骨髄。腎臓、胎盤、胃および心臓に他の組織より有意に高いレベルの発現がみられた。
【０１４１】
ヒトクローディン−２１ポリペプチドとＦＬＡＧエピトープの融合タンパク質をＣＯＳ細胞において発現させ、これをＮＰ−４０で抽出して、ＮＰ−４０可溶性画分と不溶性画分を調製した。可溶性画分および不溶性画分をダブルで電気泳動し、ウェスタンブロットによりＦＬＡＧエピトープまたはクローディン−２１ポリペプチドのいずれかに特異的な抗体を用いて検出した。両抗体とも、可溶性画分および不溶性画分の両方において類似サイズのバンドを検出した。ＮＰ−４０可溶性画分の方に多量のタンパク質が検出されたが、不溶性画分にも実質量のタンパク質が検出された。ＮＰ−４０不溶性は、密着結合など細胞骨格構造に関連するタンパク質に特徴的である。ＣＯＳ細胞は密着結合を形成しないが、ヒトクローディン−２１の一部はＮＰ−４０不溶性画分中に存在する。
【０１４２】
ヒトクローディン−２１−ＦＬＡＧエピトープ融合タンパク質をＣＶ−１細胞においても発現させた。ヒトクローディン−２１−ＦＬＡＧエピトープ融合タンパク質を発現するＣＯＳ細胞およびＣＶ１細胞を標識抗−ＦＬＡＧ抗体で処理すと、ＣＯＳ細胞培養物およびＣＶ１細胞培養物の両方において細胞−細胞接触領域に染色が検出された。
【０１４３】
ヒトＴ８４腸上皮細胞におけるヒトクローディン−２１の発現を、免疫蛍光により共焦点顕微鏡検査を用いて検出した。Ｔ８４細胞を、クローディン−２１に特異的な赤色蛍光抗体およびＺＯ−１に特異的な緑色蛍光抗体で処理した；この方法では、クローディン−２１とＺＯ−１の同時局在が黄色に見える。細胞内にはクローディン−２１の存在を指示する種々の量の赤色蛍光が存在したが、細胞表面画像は細胞の端に強い黄色の染色を示し、Ｔ８４細胞単層の縦断面からは密着結合部にクローディン−２１とＺＯ−１の同時局在（黄色の点として見える）が明かになった。
【０１４４】
本明細書中に引用した刊行物および特許出願のすべてを本明細書に援用する。これにより、個々の刊行物および特許出願それぞれを個々に本明細書に援用したものとする。以上に述べた本発明は理解しやすくするために具体例および実施例により詳述されているが、本発明の教示を考慮すれば本発明の精神または範囲から逸脱することなくこれらをある程度変更および修正できることは当業者に自明であろう。
【０１４５】
【表３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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