(57)【要約】【課題】前立腺腫瘍鑑別のための方法および核酸を提供する。それは前立腺癌腫と良性前立腺過形成を区別する手段を記載する。これは前立腺癌の早期検出および治療のための手段を提供する。【解決手段】本発明は化学的修飾ゲノム配列、ゲノムＤＮＡのシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー、ならびに前立腺障害の特性化、分類、鑑別、診断および治療に使用する遺伝子の遺伝的および／または後成的パラメーターを確証するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトシンのメチル化を分析して前立腺腫瘍あるいは前立腺癌への素因の分類、鑑別および／または診断のための遺伝的および／または後成的パラメーターを測定する方法であって、下記工程を実施することを特徴とする方法；
ａ）ゲノムＤＮＡを含む生物学的試料を得て、
ｂ）ゲノムＤＮＡを抽出し、
ｃ）ゲノムＤＮＡ試料中で、５位でメチル化されていないシトシン塩基を化学的処理によってウラシル、またはハイブリダイゼーション挙動からみてシトシンと相違する他の塩基に変換し、そして
ｄ）プライマーオリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼのセットを使用して、化学的前処理されたＤＮＡの少なくとも１つの断片を増幅し、
その際、ゲノムＣｐＧ配列は配列番号１〜配列番号１１２に記載される化学的前処理されたゲノム配列、およびその相補的な配列の少なくとも１つの中に位置する。
【請求項２】
次の工程：
ｅ）１つまたはそれ以上のシトシン位置のメチル化状態の確認；および
ｆ）１つまたはそれ以上のデータセットを参照して、シトシン位置のメチル化状態の分析をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
プライマーオリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼのセットを使用する化学的前処理されたゲノムＤＮＡ断片の増幅は、増幅産物が検出可能な標識を担持するように行われる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
増幅産物を少なくとも１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡプローブ、またはアレイにハイブリダイズさせる工程をさらに含み、オリゴマーの塩基配列が少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
増幅工程は、バックグランドＤＮＡに対抗して、前立腺細胞の特定ゲノムメチル化状態に基づき、前立腺細胞中の特に関心あるＤＮＡを優先的に増幅することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
化学的処理は重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩または二亜硫酸塩の溶液によって実施されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１に記載の方法。
【請求項７】
長さ１００〜２０００塩基対を有する１０種以上の異なった断片が増幅されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１に記載の方法。
【請求項８】
数種のＤＮＡセグメントの増幅は１つの反応容器中で実施されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１に記載の方法。
【請求項９】
ポリメラーゼは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１に記載の方法。
【請求項１０】
増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
増幅産物の標識は蛍光標識、放射性核酸、および／または質量分析計で検出される特有の質量を有する検出可能な分子断片であることを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか１に記載の方法。
【請求項１２】
増幅産物または増幅産物の断片は質量分析計で検出される、請求項１〜１１のいずれか１に記載の方法。
【請求項１３】
産生された断片は、質量分析計で良好に検出するために１価の正または負の正味荷電を有することを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか１に記載の方法。
【請求項１４】
検出は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）によるか、あるいは電子スプレー質量分析法（ＥＳＩ）を使用して実施され、そして可視化されることを特徴とする、請求項３〜１３のいずれか１に記載の方法。
【請求項１５】
ゲノムＤＮＡは、細胞またはＤＮＡを含む細胞性成分から得られ、ＤＮＡ起源は、例えば、細胞株、組織学的スライド、生検、血液、リンパ液、パラフィン包埋組織；例えば前立腺またはリンパ組織およびその全ての可能性ある組合せを含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーであって、配列番号１〜１１２のいずれか１つに記載の化学的前処理されたゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、あるいは同一である長さが少なくとも９個のヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を各ケースで含むオリゴマー。
【請求項１７】
塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１６に記載のオリゴマー。
【請求項１８】
ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは、オリゴマーの中１／３に位置することを特徴とする、請求項１７に記載のオリゴマー。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１に記載の少なくとも２つのオリゴマーを含むオリゴマーのセット。
【請求項２０】
配列番号１〜１１２に記載の配列の１つおよびその相補的配列内の全てのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を検出するためのオリゴマーを含む、請求項１９に記載のオリゴマーのセット。
【請求項２１】
配列番号１〜配列番号１１２の１つのＤＮＡ配列およびその相補的な配列およびそのセグメントの増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチドとして使用され得る、請求項１９に記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２２】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは固相に結合されることを特徴とする、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２３】
配列番号１〜配列番号１１２に記載の化学的前処理されたゲノムＤＮＡおよびその相補的配列中のシトシンメチル化状態および／または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するための請求項１９〜２２のいずれか１に記載の少なくとも１０個のオリゴマーを含むオリゴマープローブのセットの使用。
【請求項２４】
配列番号１〜配列番号１１２の１つのＣｐＧジヌクレオチドおよびその相補的配列のメチル化状態に関連する疾患を分析するための担体物質に固定化された異なったオリゴマー（アレイ）の配列を作成する方法であって、請求項１６〜１８のいずれか１に記載の少なくとも１つのオリゴマーが固相に結合されている方法。
【請求項２５】
請求項２４にて得られうる異なったオリゴマー（アレイ）の配置。
【請求項２６】
四角形または六角形格子の形態で平面固相上に配列されることを特徴とする、請求項２５に記載の異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー配列のアレイ。
【請求項２７】
固相表面はシリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、または金から構成されることを特徴とする、請求項２５または２６記載のアレイ。
【請求項２８】
配列番号１〜配列番号１１２の群から得られる配列およびその相補的配列の１つに記載の化学的前処理されたゲノムＤＮＡの断片のうち、長さが少なくとも１８個の塩基配列を含む核酸。
【請求項２９】
重亜硫酸塩（二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）試薬ならびに請求項１６〜２２の１つに記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーを含むキット。
【請求項３０】
付加的標準メチル化分析試薬は、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＣＯＢＲＡ、およびこれらの組合せからなる群から得られるメチル化分析を行うための標準試薬である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
先の請求項の１つに記載の少なくとも１つの核酸を含む、前立腺細胞増殖性障害を分析するためのＤＮＡ−および／またはＰＮＡアレイ。
【請求項３２】
前立腺障害または前立腺癌腫への素因の分類、鑑別および／または診断および／または前立腺癌腫の治療のための、請求項１９〜２２の１つに記載のオリゴヌクレオチドのセットの使用、請求項２５〜２７の１つに記載のアレイの使用、請求項２９〜３０に記載のキットの使用、請求項１６〜１８の１つに記載のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーの使用、請求項２８記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分子生物学において近年の方法論の発展により研究されている観察のレベルは、遺伝子自体、これらの遺伝子のＲＮＡへの翻訳およびそれらに由来するタンパクである。個体の発達過程のどの時点で、どの遺伝子がスイッチされるか、および特定の細胞および組織中で特定の遺伝子の活性化および阻害化がどのように制御されるかの問題は、遺伝子またはゲノムのメチル化の程度および特性に関連している。この点に関して、病原性状態は個々の遺伝子またはゲノムの変化されたメチルパターンにそれら自身を表すようである。
【０００２】
本発明は核酸、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ−オリゴマー、およびゲノムＤＮＡの遺伝的(genetic)および／または後成的(epigenetic)パラメーターの分析、および特にそのシトシンメチル化状態を用いる前立腺障害あるいは前立腺癌への素因の特性化、分類、鑑別および／または診断のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌は、１９９９年に米国において１００，０００人当たり１８０人の発生率を示す西洋諸国での重大な健康管理の問題である（Cancer J. Clin.1999;49:8）。前立腺特異的抗原の濃度測定およびデジタル直腸試験を含む早期検出を改良するために、様々なスクリーニング戦略が使用されている。もしも前立腺癌種が患者に疑われるなら、癌の診断は悪性形質転換に関連した態様における生検試料の組織学的および細胞学的分析によって確認あるいは排除される。特に、前立腺癌種の初期段階は、たとえ適当な生検試料が得られても、通常の組織学的試験によって前立腺の良性過形成と区別するにはしばしば困難である（McNealJE ら、Hum. Pathol. 2001, 32:441-6）。さらに、小さなあるいは不十分な生検試料は、しばしば通常の分析を妨げる。
【０００４】
分子マーカーは、非常に小さなサイズの試料およびその組織構造が維持されていない試料ですら、完全に効果的に分析できるとの利点を示す。ここ十年間に、多くの遺伝子が良性過形成前立腺腫瘍および様々な程度の前立腺癌との間で差動的に発現されることが示されている。しかしながら、１つのマーカーではこれまで２つの障害を区別するには不十分であると示されている。高次元ｍＲＮＡ系アプローチは、近年、様々な腫瘍タイプおよび良性と悪性障害を区別するよりよい手段を提供することができると示されている。しかしながら、臨床環境において通常の診断道具として応用することは、ｍＲＮＡの極度の不安定性、ある誘因（例えば試料採取）に続き、急速に生じる発現の変化、および最も重要なことには、分析のために必要とする多量のｍＲＮＡにより妨害される(Lipshutz,R. Lら、Nature Genetics 21:20-24, 1999; Bowtell, D.D.L. Nature genetics suppl.21:25-32. 1999)。これらは通常の生検から得ることはできない。
【０００５】
ＣｐＧアイランド内の異常型ＤＮＡメチル化は、広範囲の遺伝子の抑止または過剰発現を引き起こすヒトの悪性腫瘍において一般的である(Jones, P. A.Cancer Res. 65:2463-2467, 1996)。異常なメチル化はまた、ある種の腫瘍において遺伝子のイントロンおよびコード部分のＣｐＧリッチ制御要素に生じることが示されている(Chan,M.F.ら、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 249:75-86, 2000)。高度の特徴的なＤＮＡメチル化パターンはまた、肺癌セルラインにおいても示された(Huang,T.H.-M.ら、Hum. Mol. Genet 8:459-470, 1999)。
【０００６】
５−メチルシトシンは、真核生物細胞のＤＮＡ中でもっとも頻繁に生じる共有結合修飾塩基である。これは例えば転写制御、遺伝的インプリントおよび腫瘍形成中で、その役割を果たす。したがって、遺伝子情報の１つの構成成分として、５−メチルシトシンの同定は、かなり興味深いものである。しかしながら、５−メチルシトシンの位置は、５−メチルシトシンがシトシンとして同じ塩基対形成挙動を有するから、配列決定によって同定され得ない。さらに、５−メチルシトシンによってもたらされる後成的情報は、ＰＣＲ増幅中に完全に失われる。
【０００７】
５−メチルシトシンについてＤＮＡを分析する比較的新しく、一般にもっとも頻繁に使用される方法は、シトシンと重亜硫酸塩との特別な反応に基づく。これは、その後のアルカリ加水分解時に、その塩基対形成挙動においてチミジンに対応するウラシルへ変換される。しかしながら、５−メチルシトシンはこれらの状態で未変性のままである。その結果、もとのＤＮＡがそのハイブリダイゼーション挙動によってシトシンと区別され得ないメチルシトシンが、「普通の」分子生物学的技術を使用して、例えば、増幅およびハイブリダイゼーションまたは配列決定により、唯一残るシトシンとして検出され得る。これらの技術の全ては今や十分に開発され得た塩基対形成に基づく。感度の面から、先行技術はアガロースマトリックス中に分析されるべきＤＮＡを封入して、ＤＮＡの拡散および再生を阻止する方法（重亜硫酸塩のみが１本鎖ＤＮＡに作用する）であって、これは全ての沈殿および精製工程を高速透析に代替する（OlekA, Oswasld J, Walter J. 「重亜硫酸塩によるシトシンメチル化分析の変更および改良方法」、Nucleic Acids Res. 1996Dec. 15;24(24):5064-6）。この方法を使用して個々の細胞を分析することが可能である。これはこの方法の潜在性を証明する。しかしながら、目下、約３０００塩基対以下の長さを有する個々の領域のみが分析されているが、数千の可能性あるメチル化事象における細胞の全体的分析は不可能である。この方法は小さな試料量から得た非常に小さな断片を確実に分析することができない。これらは拡散保護にもかかわらず、マトリックス中で失われる。
【０００８】
５−メチルシトシンを検出する別な公知方法の概要は、以下の総説文献から集めてもよい：Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas,H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
【０００９】
現在まで、いくつかの例外（例えば、Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B.「ＳＮＲＰＮ座位での対立遺伝子メチル化の相違点に基づく、アンゲルマンおよびプラダー・ウィリー(Angelmanand Prader-Willi)症候群の診断のためのシングル−チューブＰＣＲ試験」、Eur. J. Hum. Genet. 1997Mar-Apr;5(2):94-8）を除いて、重亜硫酸塩技術が唯一研究に使用されている。しかしながら、いつも公知遺伝子の短い特定断片が重亜硫酸塩技術に続いて増幅され、いずれかが完全に配列検定されるか（OlekA, Walter J.「Ｈ１９メチル化インプリントの移植前個体発生」、Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6）あるいは個々のシトシンの位置が、プライマー伸長反応（GonzalgoML, Jones PA.「メチル化感受性１本鎖ヌクレオチドプライマー伸長法（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）を使用する特定部位のメチル化相違点の急速定量」、NucleicAcids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31、ＷＯ特許９５００６６９）または酵素的消化（Xiong Z, Laird PW.COBRA：「高感度および定量的ＤＮＡメチル化分析」、Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4）によって検出される。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出もまた記載されている(Olekら、WO９９／２８４９８)。
【００１０】
個々の遺伝子のメチル化検出において重亜硫酸塩技術を使用することを扱うさらなる刊行物は、次の通りである：（Grigg G,Clark S.「ゲノムＤＮＡの５−メチルシトシン残基の配列決定」、Bioessays.1994 Jun;16(6):431-6, 431； Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K,  HorsthemkeB, Doerfler W.「ヒトゲノムのインプリントされた断片：ゲノム配列決定法によって決定されたプラダー・ウィリー／アンゲルマン(Prader-Willi/Angelman)症候群領域の異なったＤＮＡメチル化パターン」、Hum.Mol. Genet. 1997 Mar;6(3):387-95；Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W.「個々の染色体のメチル化分析：重亜硫酸塩ゲノム配列決定のための改良プロトコール」、NucleicAcids Res. 1994 Feb 25;22(4) 695-6；Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC,Dante R.「ゲノム配列決定は、ｐＳ２遺伝子の５'領域のＤＮＡ低メチル化とヒト肺癌細胞株中での発現との関係を示す」、Gene. 1995 May19;157(1-2): 261-4; ＷＯ９７／４６７０５、ＷＯ９５／１５３７３およびＷＯ９７／４５５６０。
【００１１】
オリゴマーアレイ製造における先行技術の概要は、１９９９年1月に発行されたNature Geneticsの特別版 (Nature GeneticsSulpplement, Vol. 21, January 1999)およびそこに引用される文献から収集することができる。
【００１２】
蛍光標識プローブは固定化ＤＮＡアレイのスキャンにしばしば使用される。Ｃｙ３およびＣｙ５色素が特定プローブの５'−ＯＨへ簡単に付着することは、特に蛍光標識に適している。ハイブリダイズされたプローブの蛍光検出は、例えば共焦点顕微鏡を用いて実施してもよい。Ｃｙ３およびＣｙ５色素、さらに多くの他のものが市販されている。
【００１３】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子の分析において非常に有効な開発である(Karas M, HillenkampF.「１０，０００ダルトンを超える分子量を有するタンパクのレーザー脱離イオン化」、Anal. Chem. 1988 Oct 15;2299-301)。検体は光吸収性マトリックス中に包埋される。マトリックスは短いレーザーパルスにより蒸発させられ、未断片化方法で気相中に検体分子を輸送する。検体はマトリックス分子との衝突によってイオン化される。適用された電位は、無電場飛行型分析管中へイオンを加速する。その異なる質量によって、イオンは異なった速度で加速される。より小さなイオンは、より大きなものと比して検出器により早く到達する。
【００１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法はペプチドおよびタンパクの分析に極めて適している。核酸の分析にはいくぶんより困難である(Gut I G, Beck D.「ＤＮＡおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析」、CurrentInnovations and Future Trends. 1995, 1;147-57)。核酸の感度はペプチドよりも約１００倍悪く、断片の大きさの増加に伴い不均衡に減少する。多重陰性電荷中心を有する核酸では、マトリックスによるイオン化方法は、かなり効率的でない。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法では、マトリックスの選択は著しく重要な役割を果たす。ペプチドの脱離では、非常に微細な結晶化を生じるいくつかの非常に効率的なマトリックスが見出されている。現在ＤＮＡではいくつかの反応性マトリックスが存在する。しかしながら、感度の相違は減少されていない。感度の相違はペプチドにより類似した方法でＤＮＡを化学的に修飾することによって減少され得る。通常の中心のリン酸塩がチオリン酸塩で置換されたホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学を使用して電荷中性ＤＮＡへ置換され得る(GutIG, Beck S.「選択的ＤＮＡアルキル化および質量分析による検出のための手段」、Nucleic Acids Res. 1995 Apr25;23(8):1367-73)。この修飾ＤＮＡへ電荷タグを連結すると、ペプチドにおいて見られるものと同程度の感度増加となる。電荷タグ化のさらなる利点は、未修飾基質の検出を相当により困難とする不純物に対する分析の安定性の増加にある。
【００１５】
ゲノムＤＮＡは標準的方法を使用して細胞、組織または他のテスト試料のＤＮＡから得られる。この標準的方法論は、Fritsch およびManiatis編集、MolecularCloning: A Laboratory Mannual, 1989)などの参考文献中に見出される。
【特許文献１】
ＷＯ特許９５００６６９
【特許文献２】
ＷＯ９９／２８４９８
【特許文献３】
ＷＯ９７／４６７０５
【特許文献４】
ＷＯ９５／１５３７３
【特許文献５】
ＷＯ９７／４５５６０
【非特許文献１】
Cancer J. Clin. 1999;49:8
【非特許文献２】
Hum. Pathol. 2001, 32:441-6
【非特許文献３】
Nature Genetics 21:20-24, 1999
【非特許文献４】
Nature genetics suppl. 21:25-32. 1999
【非特許文献５】
Cancer Res. 65:2463-2467, 1996
【非特許文献６】
Curr. Top. Microbiol. Immunol. 249:75-86, 2000
【非特許文献７】
Hum. Mol. Genet 8:459-470, 1999
【非特許文献８】
Nucleic Acids Res. 1996 Dec. 15;24(24):5064-6
【非特許文献９】
Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
【非特許文献１０】
Eur. J. Hum. Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8）
【非特許文献１１】
Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6
【非特許文献１２】
Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31
【非特許文献１３】
Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431
【非特許文献１４】
Hum. Mol. Genet. 1997 Mar;6(3):387-95
【非特許文献１５】
Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4) 695-6
【非特許文献１６】
Gene. 1995 May 19;157(1-2): 261-4
【非特許文献１７】
Nature Genetics Sulpplement, Vol. 21, January 1999
【非特許文献１８】
Anal. Chem. 1988 Oct 15;2299-301
【非特許文献１９】
Current Innovations and Future Trends. 1995, 1;147-57
【非特許文献２０】
Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73
【非特許文献２１】
Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 1989
【非特許文献２２】
Prostate 39:166-174, 1999
【非特許文献２３】
Cancer 80:1312-1321, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
記載される本発明は、前立腺腫瘍鑑別のための方法および核酸を提供する。それは前立腺癌腫と良性前立腺過形成を区別する手段を記載する。これは前立腺癌の早期検出および治療のための手段を提供する。さらに、記載される本発明は、前立腺障害鑑別診断に関する現在の方法が、組織学的および細胞学的試験において十分な大きさを有する試料の提供を必要とする先行技術を超えた改良を示す。本発明の方法は微小な試料を分類するために使用され得る。
【００１７】
本発明は化学的修飾ゲノムＤＮＡ、ならびにシトシンメチル化を検出するオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー、ならびに前立腺腫瘍あるいは前立腺癌への素因の分類、鑑別および／または診断に特に適している方法を提供する。本発明は遺伝的および後成的パラメーターおよび、特にゲノムＤＮＡのシトシンメチル化パターンが、特に前立腺腫瘍の分類、鑑別および／または診断、特に前立腺癌の鑑別診断への使用に適しているとの発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の目的は、配列番号１〜配列番号１１２のいずれか１つに記載される化学的前処理されたゲノムＤＮＡのうち、長さが少なくとも１８個の塩基配列を含む核酸を使用する本発明によって達成される。
【００１９】
化学的修飾核酸は、これまで疾病関連遺伝的および後成的パラメーターの確認に関連していなかった。
【００２０】
本発明の目的は、さらに、配列番号１〜配列番号１１２に記載される化学的前処理されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズする、長さが少なくとも１３個のヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を含む、化学的前処理されたＤＮＡにおけるシトシンメチル化状態を検出するオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーによって達成される。本発明のオリゴマープローブは、腫瘍の特定遺伝的および後成的パラメーターを初めて確認することを可能とし、特に前立腺腫瘍の鑑別診断での使用、および前立腺癌腫への素因の診断において重要で、かつ効率的な道具となる。オリゴマーの塩基配列は好ましくは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。このプローブはまた、特に好ましい対形成特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在してもよい。特に好ましいものはＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが１３-merの５'末端から５番目〜９番目のヌクレオチドである本発明のオリゴヌクレオチドであり、ＰＮＡオリゴマーの場合、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが９-merの５'末端から４番目〜６番目のヌクレオチドであることが好ましい。
【００２１】
本発明のオリゴマーは、配列番号１〜配列番号１１２の配列のＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれに関する少なくとも１つのオリゴマーを含む、いわゆる「セット」に通常は使用される。好ましいものは、配列番号１〜配列番号１１２のうちの１つに由来するＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれに関する少なくとも１つのオリゴマーを含むセットである。
【００２２】
さらに、本発明は配列番号１〜配列番号１１２のうちの１つのＤＮＡ配列またはその断片を増幅する、いわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用され得る少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットを入手可能とする。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドのセットでは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固相に結合されていることが望ましい。さらに、１つのセットの全てのオリゴヌクレオチドが固相に結合されていることが望ましい。
【００２４】
本発明はさらに、化学的前処理されたゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号１１２）のシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも１０ｎ（オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー）のセットに関する。これらのプローブは腫瘍の遺伝的および後成的パラメーターの分類、鑑別および／または診断を可能とし、特に前立腺癌の鑑別診断に有用である。さらに、プローブは前立腺癌への素因の診断を可能とする。オリゴマーのセットはまた、配列番号１〜配列番号１１２のうちの１つに記載される化学的前処理されたゲノムＤＮＡの単一ヌクレオチド多型性（SNPs）を検出するために使用してもよい。
【００２５】
本発明では、本発明によって入手可能となった様々なオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー（いわゆる「アレイ」）の配置は、固相に同様に結合されているように存在することが望ましい。異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー配列のアレイは、四角形または六角形格子の形で固相上に配置されていることに特徴がある。固相表面は好ましくはシリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、または金から構成される。しかしながら、ペレットあるいは樹脂マトリックスの形態で存在し得るニトロセルロースならびにナイロンなどのプラスチックも同様に可能である。
【００２６】
したがって、本発明のさらなる主題は前立腺腫瘍の分類、鑑別および／または診断、特に前立腺癌の鑑別診断のための担体物質に固定されたアレイを製造する方法である。この方法で、本発明の少なくとも１つのオリゴマーは固相に結合される。このようなアレイの製造法は、例えば固相化学および感光性保護基を用いる米国特許第５，７４４，３０５号から公知である。
【００２７】
本発明のさらなる主題は、前立腺腫瘍の分類、鑑別および／または診断、特に前立腺癌の鑑別診断のためのＤＮＡチップに関する。さらに、ＤＮＡチップは前立腺癌腫への素因の診断を可能とする。ＤＮＡチップは本発明の少なくとも１つの核酸を含む。ＤＮＡチップは例えば米国特許第５，８３７，８３２号から公知である。
【００２８】
さらに、本発明の主題は、例えば重亜硫酸塩含有試薬、その配列が各ケースで付表（配列番号１〜配列番号１１２）に特定される塩基配列の１８塩基長断片に対応するか、あるいは相補的である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む１セットのプライマーオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー、ならびに記載される方法を実施し、かつ評価するための指示書から構成されるキットである。しかしながら、本発明に従ってキットはまた、前記した成分の部分のみを含むことができる。
【００２９】
本発明はまた、ゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターを確かめる方法も提供する。この方法は前立腺腫瘍の分類、鑑別および／または診断、特に前立腺癌の鑑別診断及び前立腺癌への素因の診断に使用するものである。この方法は次の工程を含むシトシンメチル化および単一ヌクレオチド多型の分析を可能とする。
【００３０】
この方法の第１工程では、ゲノムＤＮＡ試料は組織または細胞起源から単離されていなければならない。このような起源は細胞株、組織学的スライド、体液、例えば血液、痰、大便、尿、脳脊髄液、パラフィンに包埋されたリンパ液組織；例えば前立腺またはリンパ性組織を含んでいてもよい。抽出は当業者にとって標準的である手段により行ってもよい。これらは界面活性剤可溶化液、超音波およびガラスビーズを使用するボルテックスを使用することを含む。一度、核酸が抽出されると、ゲノム二本鎖ＤＮＡが分析に使用される。
【００３１】
好ましい実施態様では、ＤＮＡは化学的前処理に先たって、切断されていてもよい。これは当該技術分野で標準的な手段、特に制限エンドヌクレアーゼを使用するものであってもよい。
【００３２】
この方法の第２工程では、ゲノムＤＮＡ試料は５'位でメチル化されていないシトシン塩基がウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動においてシトシンと異なる他の塩基に変換される方法で化学的に処理される。これは以下に「化学的前処理」として理解されるであろう。
【００３３】
ゲノムＤＮＡの上記処理は、好ましくは、塩基対形成挙動において非メチル化シトシン核酸塩基をウラシルまたはシトシンに似ていない他の塩基に変換することとなる重亜硫酸塩（亜硫酸塩、二亜硫酸塩）及びそれに続くアルカリ加水分解を使用して実施する。
【００３４】
化学的前処理されたＤＮＡ断片は、本発明のプライマーオリゴヌクレオチドのセット、および好ましくは熱安定性ポリメラーゼを使用して増幅される。統計的および実際的な考慮から、好ましくは長さ１００〜２０００塩基対を有する１０種以上の異なった断片が増幅される。数種のＤＮＡ断片の増幅は１つの同じ容器中で同時に実施され得る。通常、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。
【００３５】
本方法の好ましい実施態様では、プライマーオリゴヌクレオチドのセットは、配列が付表に特定される塩基配列（配列番号１〜配列番号１１２）の長さが少なくとも１８塩基対の断片とそれぞれ逆相補的であるか、あるいは同一である少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む。プライマーオリゴヌクレオチドは、好ましくはＣｐＧジヌクレオチドを含まないことを特徴とする。本方法の特に好ましい実施態様では、該プライマーオリゴヌクレオチドの配列は、目的の前立腺特異的ＤＮＡにのみ選択的にアニールし、増幅するように設計され、それによって、バックグランドまたは非関連ＤＮＡの増幅を最小限とする。本発明では、バックグランドＤＮＡとは関連組織特異的メチル化パターンを有していないゲノムＤＮＡを意味すると解釈され、この場合、関連組織は前立腺および前立腺癌組織である。実施例２において使用されたこのようなプライマーの例は、表１に含まれる。
【００３６】
本発明では、少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドが増幅中、固相に結合されていることが好ましい。異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー配列は四角形または六角形格子の形態で平面固相上に配置され、固相表面は好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、または金から構成される。これはニトロセルロースあるいは同様に使用されるプラスチックなどの他の材料においても可能である。
【００３７】
増幅によって得られた断片は、直接または間接に検出可能な標識を担持することができる。蛍光標識、放射性核種、または質量分析計で検出され得る特有な質量を有する検出可能な分子断片の形態の標識が好ましい。産生された断片は質量分析計においてよりよく検出するために１価の正または負の正味荷電を有することが好ましい。検出は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を用いて、あるいは電子スプレー質量分析法（ＥＳＩ）を使用して実施され、かつ可視化されてもよい。
【００３８】
本方法の第２工程で得られた増幅産物は、続いてアレイまたはオリゴヌクレオチドのセットおよび／またはＰＮＡプローブにハイブリダイズされる。ここで、ハイブリダイゼーションは以下に記載される方法で行われる。ハイブリダイゼーション中に使用されるプローブのセットは、好ましくは少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーから構成される。この方法では、増幅産物は前もって固相に結合されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして作用する。非ハイブリダイズ断片は続いて除去される。該オリゴヌクレオチドは付表に特定される塩基配列の断片に逆相補的であるかあるいは同一である長さが１３個のヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を含み、この断片は少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは１３-merの５'−末端から５番目〜９番目のヌクレオチドである。１つのオリゴヌクレオチドが各ＣｐＧジヌクレオチドにおいて存在する。該ＰＮＡオリゴマーは付表に特定される塩基配列の断片に逆相補的であるかまたは同一である長さが９個のヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を含み、断片は少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは９-merの５'−末端から４番目〜６番目のヌクレオチドである。好ましくは、１つのオリゴヌクレオチドが各ＣｐＧジヌクレオチドにおいて存在する。
【００３９】
本方法の第５工程で、非ハイブリダイズ増幅産物は除去される。
【００４０】
本方法の最終工程で、ハイブリダイズした増幅産物が検出される。ここで、増幅産物に付着した標識はオリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位置で確認できることが好ましい。
【００４１】
本発明では、増幅産物の標識は蛍光標識、放射性核種、または質量分析計で検出され得る特有の質量を有する検出可能な分子断片であることが好ましい。質量分析計は増幅産物、増幅産物の断片または増幅産物と相補的であるプローブの検出において好ましく、これはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）または電子スプレー質量分析法（ＥＳＩ）により実施され、かつ可視化され得る。産生した断片は質量分析計でよりよく検出するために、１価の正または負の正味荷電を有していてもよい。
【００４２】
前記方法は、好ましくはゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターを確認するために使用される。
【００４３】
本発明のオリゴマーまたはそのアレイならびに本発明のキットは、前立腺腫瘍の分類、鑑別および／または診断のために、さらに好ましくは、前立腺腫瘍の鑑別診断または前立腺癌への素因の診断に使用されることが意図される。本発明では、この方法は好ましくはゲノムＤＮＡ内の重要な遺伝的および／または後成的パラメーターの分類、鑑別および／または診断、特に前立腺腫瘍および前立腺癌への素因の鑑別診断に使用される。
【００４４】
本発明の方法は、例えば前立腺腫瘍の分類、鑑別および／または診断のために使用される。
配列番号１〜配列番号１１２に記載される本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターの分類、鑑別および／または診断、特に前立腺腫瘍の鑑別診断のために使用される。
【００４５】
本発明はさらに、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンを分析して、前立腺腫瘍および癌の分類、鑑別および／または診断、より好ましくは前立腺腫瘍の鑑別診断のための診断試薬および／または治療薬剤を製造する方法に関する。診断試薬および／または治療薬剤は、本発明の少なくとも１つの核酸（配列番号１〜１１２）が好ましくは好適な添加剤および補助剤とともに、これを製造するために使用されることを特徴とする。
【００４６】
本発明のさらなる主題は、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンを分析することによる前立腺癌の診断試薬および／または治療薬剤、特に前立腺腫瘍の鑑別診断、または前立腺癌への素因の診断に使用するものに関し、診断試薬および／または治療薬剤は、好ましくは好適な添加剤および補助剤とともに、本発明の少なくとも１つの核酸（配列番号１〜１１２）を含む。
【００４７】
本発明はさらに、ゲノムＤＮＡ内の重要な遺伝的および／または後成的パラメーター、すなわち本発明によって得られたパラメーターが、遺伝的および／または後成的パラメーターの他のセットと比較されてもよい患者または個体にとって不利である事象の診断および／または予測に関する。その差異は、患者または個体にとって不利である事象の診断および／または予想のための基礎となる。
【００４８】
本発明では、「ハイブリダイゼーション」との用語は試料ＤＮＡのワトソン・クリック塩基対形成に従って、オリゴヌクレオチドが完全に相補的な配列に結合して、二重鎖構造を形成することとして理解されるべきである。
【００４９】
「機能的変異体」との用語は、あるＤＮＡ配列に相補的であり、厳密な条件下に指示配列にハイブリダイズする全てのＤＮＡ配列を意味する。
【００５０】
本発明では、「遺伝的パラメーター」との用語はゲノムＤＮＡおよびその制御に必要とされる配列の変異および多型性である。特に、挿入、欠失、点変異、反転および多型、特に好ましくはＳＮＰ（一塩基多型）が変異として命名される。
【００５１】
本発明では、「後成的パラメーター」との用語は、特にシトシンメチル化およびさらにゲノムＤＮＡのＤＮＡ塩基の化学的修飾およびその制御に必要とされる配列である。別な後成的パラメーターとしては、例えば記載される方法を使用して直接に分析され得ないが、代わって、ＤＮＡメチル化に関連するヒストンのアセチル化が挙げられる。
【００５２】
以下に、本発明は添付図面について配列および実施例をもとにより詳細に説明されるが、これらに限定されない。
【実施例１】
【００５３】
遺伝子ＴＧＦ−アルファのメチル化分析
次の実施例は、特定ＣＧ位がそのメチル化について分析される遺伝子、ＴＧＦ−アルファの断片に関する。
【００５４】
第１工程でゲノム配列は、重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）を使用して、塩基の５位でメチル化されていない全てのシトシンが修飾されるように処理され、異なった塩基が塩基対形成挙動にしたがって置換されるが、５位でメチル化されたシトシンは未変化のままである。
【００５５】
もしも重亜硫酸塩溶液がこの反応に使用されるなら、次いで非メチル化シトシン塩基に付加が行われる。さらに、変性剤または溶剤ならびにラジカル妨害剤が存在しなければならない。これに続くアルカリ加水分解は、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの変換を生じる。化学変換ＤＮＡは、次いでメチル化シトシンの検出に使用される。第２工程では、処理されたＤＮＡ試料は水または水溶液で希釈される。好ましくは、ＤＮＡは続いて脱スルホン化される。この方法の第３工程では、ＤＮＡ試料は好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用するポリメラーゼ連鎖反応で増幅される。この場合、遺伝子ＴＧＦ−アルファのシトシンが分析される。この目的には長さ５３１ｂｐを有する規定断片が特定プライマーオリゴヌクレオチドＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＧＧＴＡＡＧ（配列番号１１３）およびＣＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡ（配列番号１１４）を使用して増幅される。この増幅産物は固相に前もって結合されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする試料となり、二本鎖構造、例えばＧＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧ（配列番号１１５）を形成する。検出されるべきシトシンは増幅産物の１８８位に位置する。ハイブリダイゼーション産物の検出は、増幅のために使用されているＣｙ３およびＣｙ５蛍光標識プライマーオリゴヌクレオチドに基づく。メチル化シトシンが重亜硫酸塩処理ＤＮＡ中のこの位置に存在しさえすれば、オリゴヌクレオチドを使用する増幅ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応が行われる。したがって、分析されるべき特定シトシンのメチル化状態は、ハイブリダイゼーション産物から推定される。
【００５６】
この位置のメチル化状態を確認するために、増幅産物試料はさらに、固相に前もって結合された他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。このオリゴヌクレオチドは問題である位置を除いて、試料のメチル化状態を分析するために前もって使用されたオリゴヌクレオチドと同一である。分析されるべき位置で、このオリゴヌクレオチドはシトシン塩基と対立するチミン塩基を含み、すなわち、ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧ（配列番号１１６）である。したがって、もしも非メチル化シトシンが分析されるべき位置に存在するならば、ハイブリダイゼーション反応のみが生じる。
【実施例２】
【００５７】
前立腺腫瘍の鑑別
特定腫瘍型にメチル化パターンを関連つけるために、まず、二者択一の腫瘍形態を有する２つのグループ、この場合、良性前立腺過形成の１つのグループと前立腺癌腫の他のグループの患者のＤＮＡメチル化パターンを分析することを必要とする。これらの分析は実施例１と同様にして実施される。この方法で得られた結果はデータベースに蓄えられ、２つのグループ間で異なってメチル化されるＣｐＧジヌクレオチドが同定される。これは例えば、配列決定によって行われうる個々のＣｐＧメチル化程度を測定して実施され得る。これは特定ＣｐＧでメチル化を定量する比較的不正確な方法であるか、そうでなければ、メチル化感受性「プライマー伸長反応」による非常に正確な方法である。特に好ましい変異体では、数百または数千のＣｐＧのメチル化状態をオリゴマーアレイ上で分析してもよい。パターンは例えば、コンピューターによって行うことができる分析を集めることによっても比較され得る。
【００５８】
全ての臨床標本は外科手術のとき、すなわち通常の臨床の場で得られた(Santourlidis, S., Prostate 39:166-174, 1999,Florl, A. R., Br. J. Cancer 80:1312-1321, 1999)。５６種の異なった遺伝子（表１に記載）から得たゲノム断片のパネルは、実施例１に従って重亜硫酸塩で処理され、ＰＣＲで増幅された。ゲノムＤＮＡは表１に記載されるプライマー対を使用して増幅された。しかしながら、当業者には自明であるように、適切な方法でゲノムを増幅する他のプライマーを使用することも可能である。このようなプライマーの設計は当業者には自明であろう。しかしながら、表１に記載されるプライマー対は特に好ましいものである。少なくとも８つのＣｐＧジヌクレオチドを含むことによって最適な結果が得られた。この識別においてもっとも有益なＣｐＧの位置は、ＴＧＦ−アルファとＰＯＭＣ遺伝子内に位置する。パネルの他のほとんどのＣｐＧは２つの表現型間で相違するメチル化パターンを示した。その結果は、メチル化フィンガープリントが固形悪性腫瘍の鑑別診断をもたらすことができ、したがって多数の臨床の場で適用され得たことを証明する。図１は前立腺癌腫と良性前立腺過形成を区別する方法の応用を示す。
【００５９】
実施例２の遺伝子及びプライマーオリゴヌクレオチドのリスト
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は良性前立腺過形成（１）および前立腺癌腫（２）の分離を示す。メチル化の高い可能性は赤色、不確定なものは黒色および低い可能性は緑色に対応する。プロットの左側のラベルは遺伝子とＣｐＧ識別名である。右側のラベルは２つのグループの平均値間の相違の有意差（ｐ−値）を示す。各列は１つのＣｐＧに相当し、各カラムは１つの試料のメチル化度に対応する。ＣｐＧは２つの障害の鑑別診断の区別への寄与にしたがって順序つけられる。寄与は上部から下部へ大きくなる。
【００６１】
配列番号１〜配列番号１１２
奇数配列番号（例えば、配列番号１、３、５、・・・）を有する配列は、それぞれのケースで化学的前処理されたゲノムＤＮＡの配列を示す。偶数配列番号（例えば、配列番号２、４、６、・・・）を有する配列は、それぞれのケースで前記配列に相補的である化学的前処理されたゲノムＤＮＡである（例えば、配列番号１に相補的な配列は配列番号２であり、配列番号３に相補的な配列は配列番号４であるなど）。
【００６２】
配列番号１１３〜配列番号１１６
配列番号１１３〜配列番号１１６は実施例１に使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
次の実施例は特定ＣＧ−位がそのメチル化状態について分析される遺伝子、この場合、ＴＧＦ−アルファの断片に関する。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529661.tif 000384
【国際調査報告】
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