(57)【要約】ウイルス、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはこれらの誘導体のようなポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのアルキルエーテルのブロックコポリマーを含む組成物は、樹状細胞の活性化を誘導する。本発明はさらに、該ブロックコポリマーがプルロニックＦ１２７およびＬ６１である、樹状細胞の活性化誘導のための組成物にも関する。より詳細には、該組成物はブロックコポリマープルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１を含む。本発明はさらに、本発明の組成物を投与することを含む、動物における樹状細胞の活性化の誘導方法にも関する。加えて本発明は、本発明の組成物を投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド、ウイルスベクターまたはそのポリヌクレオチド誘導体、および少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
【請求項２】
さらにポリカチオンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該ポリカチオンはポリアミンポリマーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
該ポリカチオンはオリゴアミンまたはオリゴアミン結合体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ブロックコポリマーの混合物が存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
該ブロックコポリマーは、少なくとも一つのオキシエチレン含有量が５０％以下のブロックコポリマーおよび、少なくとも一つのオキシエチレン含有量が５０％以上のブロックコポリマーの混合物を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
該ブロックコポリマーは、オキシエチレン含有量が５０％以下の第一のブロックコポリマー成分および、オキシエチレン含有量が５０％以上の第二のブロックコポリマー成分の混合物を含み、該第一ブロックコポリマーに対する該第二ブロックコポリマーの質量比が少なくとも２：１である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
該ブロックコポリマーは、オキシエチレン含有量が５０％以下の第一のブロックコポリマー成分および、オキシエチレン含有量が５０％以上の第二のブロックコポリマー成分の混合物を含み、該第一ブロックコポリマーに対する該第二ブロックコポリマーの質量比が少なくとも５：１である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
該コポリマーは、少なくとも一つのブロックコポリマーが７０％以上のオキシエチレン含有量を有し、少なくとも一つのブロックコポリマーが５０％以下のオキシエチレン含有量を有する混合物を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
式：
【数１】
2004509838.tif 000077
式中、Ｈ１およびＨ２はそれぞれ、第一および第二のブロックコポリマーにおけるオキシプロピレン単位の数であり；Ｌ１は、該第一のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり；Ｌ２は、該第二のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり；ｍ１は、該第一のブロックコポリマーの質量比であり；および、ｍ２は該第二のブロックコポリマーの質量比である、
で表されるＮが、約０．２ないし約９．０、好ましくは約０．２５ないし約１．５である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
該混合物は、ブロックコポリマーのプルロニック（登録商標）Ｆ１２７を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
該ブロックコポリマーの少なくとも一つは、式：
【化１】
2004509838.tif 000078
式中、ｘ、ｙ、ｚ、ｉ、およびｊは、約２〜約４００の値であり、Ｒ１、Ｒ２の対のそれぞれについては、一方が水素原子でありかつ他方がメチル基である、
を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
該ブロックコポリマーの少なくとも一つは、式：
【化２】
2004509838.tif 000079
式中、ｘ、ｙ、ｚ、ｉ、およびｊは、約２〜約４００の値であり、Ｒ１、Ｒ２の対のそれぞれについては、一方が水素原子でありかつ他方がメチル基である、
を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックＦ１２７およびＬ６１を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
プルロニックＦ１２７：Ｌ６１の比が８：１である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
プルロニックＦ１２７の量が約２％（ｗ／ｖ）であり、プルロニックＬ６１の量が約０．０２５％（ｗ／ｖ）である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
ブロックコポリマーは約１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）未満の濃度で存在する、ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
【請求項１９】
該ブロックコポリマーの濃度は約１０％未満である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
該ブロックコポリマーの濃度は約５％未満である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成する、ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
【請求項２２】
該コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
該コロイド分散は約３００ｎｍ未満の分子種を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
該コロイド分散は約１００ｎｍ未満の分子種を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
該コロイド分散は約５０ｎｍ未満の分子種を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、またはウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
該ポリヌクレオチドは、分泌性もしくは非分泌性のタンパク質、ワクチン、または抗原をコードする、請求項１に記載の組成物
【請求項２８】
分泌性もしくは非分泌性のタンパク質、ワクチン、または抗原を発現する遺伝子および、抗原提示細胞を活性化し、抗原提示活性化に対する免疫応答を誘起するのに使用可能なアジュバント分子を発現する少なくとも一つの遺伝子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む、樹状細胞の活性化を誘導する方法。
【請求項３０】
該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックＦ１２７およびＬ６１を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３１】
該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとを含み、分子溶液またはコロイド分散を形成する組成物を投与することを有する、樹状細胞の活性化を誘導する方法。
【請求項３３】
該ブロックコポリマーは、プルロニックＦ１２７およびＬ６１を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の組成物を投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
【請求項３５】
該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックＦ１２７およびＬ６１を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該組成物は、経口で、局所的で、経直腸で、経膣で、非経口的に、筋肉内に、皮内に、皮下に、腹腔内にまたは静脈内に投与されるものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の組成物を筋肉内に投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
【請求項３８】
該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックＦ１２７およびＬ６１を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該組成物は、平滑筋、骨格筋および心筋の少なくとも一つに投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１に記載の組成物を皮内に投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
【請求項４１】
少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
【請求項４２】
さらにポリカチオンを含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
該ポリカチオンはポリアミンポリマーである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
該ポリカチオンはオリゴアミンまたはオリゴアミン結合体である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
ブロックコポリマーの混合物が存在する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４６】
該ブロックコポリマーは、少なくとも一つのオキシエチレン含有量が５０％以下のブロックコポリマーおよび、少なくとも一つのオキシエチレン含有量が５０％以上のブロックコポリマーとの混合物を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
オキシエチレン含有量が５０％以上の該ブロックコポリマーに対するオキシエチレン含有量が５０％以下の該ブロックコポリマーの質量比が、１：２である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
オキシエチレン含有量が５０％以上の該ブロックコポリマーに対するオキシエチレン含有量が５０％以下の該ブロックコポリマーの質量比が、１：５である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
該コポリマーは、少なくとも一つの、オキシエチレン含有量が７０％以上であるブロックコポリマーおよび、少なくとも一つの、オキシエチレン含有量が５０％以下であるブロックコポリマーとの混合物を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５０】
式：
【数２】
2004509838.tif 000080
式中、Ｈ１およびＨ２はそれぞれ、第一および第二のブロックコポリマーにおけるオキシプロピレン単位の数であり；Ｌ１は、該第一ブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり；Ｌ２は、該第二のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり；ｍ１は、該第一のブロックコポリマーの質量比であり；および、ｍ２は該第二のブロックコポリマーの質量比である。
で表されるＮが、約０．２ないし約９．０、好ましくは約０．２５ないし約１．５である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５１】
該混合物は、ブロックコポリマーのプルロニック（登録商標）Ｆ１２７を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５２】
該ブロックコポリマーの少なくとも一つは、式：
【化３】
2004509838.tif 000081
式中、ｘ、ｙ、ｚ、ｉ、およびｊは、約２〜約４００の値であり、Ｒ１、Ｒ２の対のそれぞれについては、一方が水素原子でありかつ他方がメチル基である、
を有する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５３】
該ブロックコポリマーの少なくとも一つは、式：
【化４】
2004509838.tif 000082
式中、ｘ、ｙ、ｚ、ｉ、およびｊは、約２〜約４００の値であり、Ｒ１、Ｒ２の対のそれぞれについては、一方が水素原子でありかつ他方がメチル基である、
を有する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５４】
該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックＦ１２７およびＬ６１を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５５】
該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項５６】
組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成する、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
【請求項５７】
該コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体である、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
該コロイド分散は約３００ｎｍ未満の分子種を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
該コロイド分散は約１００ｎｍ未満の分子種を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６０】
該コロイド分散は約５０ｎｍ未満の分子種を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６１】
ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、カチオン性反復単位を複数有する少なくとも一つのポリカチオン性ポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物。
【請求項６２】
該ポリカチオン性ポリマーが、下記のフラグメントの１以上を含むカチオン性ホモポリマー、コポリマー、またはブロックコポリマーである、請求項６１に記載のポリヌクレオチド組成物：
（ａ）少なくとも一つの、以下の群から選ばれるアミノアルキレンモノマー：
（ｉ）式（Ａ）で示される第３級アミンモノマー
【化５】
2004509838.tif 000083
および、
（ｉｉ）式（Ｂ）で示される第２級アミンモノマー
【化６】
2004509838.tif 000084
式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ８のそれぞれは相互に独立して、水素、炭素原子数２〜８のアルキル基、別のＡモノマーもしくは別のＢモノマーであり；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ７のそれぞれは相互に独立して、式−（ＣＺＨ２Ｚ）−を有する直鎖もしくは分枝状のアルカンジイルであり、この際、Ｚは２〜８の値である、
（ｂ）カチオン性アミノ酸；
（ｃ）（−ＯＰＯ（ＮＨ−Ｒ９−ＮＲ１０Ｒ１１Ｒ１２）Ｏ−Ｒ８−）
ここでＲ９は炭素原子数１〜１２の直鎖脂肪族基であり、Ｒ８はｎが０〜５の整数である−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ（Ｒ１３）−であり、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２のそれぞれは相互に独立して、水素または炭素原子数１〜４のアルキル基であり、Ｒ１３は水素、炭素原子数３〜８のシクロアルキル基または炭素原子数１〜２のアルキル基である。；および
（ｄ）ビニルピリジンまたはその誘導体。
【請求項６３】
ポリヌクレオチドおよび複数のセグメントを有するポリマーを含み、該ポリマーは、カチオン性ホモポリマー、コポリマーもしくはブロックコポリマーである少なくとも一つのポリカチオン性セグメント、またはこれらの第４級塩；および
（ａ）ポリエーテル性セグメントが以下のものである、５〜約４００のモノマー単位を有する少なくとも一つの直鎖もしくは分枝状のポリエーテルセグメント：
（ｉ）少なくとも一つのアルキレンオキシモノマー−ＯＣｎＨ２ｎ−のホモポリマー、この際、ｎが２〜３である；もしくは
（ｉｉ）該第一アルキレンオキシモノマーおよび、第二の異なる、アルキレンオキシモノマー−ＯＣｍＨ２ｍ−のコポリマーまたはブロックコポリマー、この際、ｎが２〜３であり、ｍが２〜４であるまたは
（ｂ）アクリルアミド、グリセロール、ビニルアルコール、ビニルピロリジン、ビニルピリジン−Ｎ−オキサイド、オキサゾリン、モルフォリンアクリルアミドおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる、少なくとも一つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマー
のいずれかを含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
該第一アルキレンオキシモノマーがエチレンオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）であり、該第二アルキレンオキシモノマーがプロピレンオキシ（−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−）である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
生理的ｐＨにおいて、該ポリカチオン性ポリマーが少なくとも６つのカチオン性基を含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６６】
生理的ｐＨにおいて、該ポリカチオン性ポリマーが約３Å〜約１２Åで区切られるカチオン性基を複数含む、請求項６３に記載のポリヌクレオチド組成物。
【請求項６７】
該ポリエーテル性セグメントがそれぞれ約５〜約８０のモノマー単位を有し、該ポリカチオン性セグメントは、２〜約１８０の同じもしくは異なる、式−ＮＨ−Ｒ０−を有するモノマー単位のホモポリマー、コポリマーもしくはブロックコポリマーであり、この際、Ｒ０は必要であれば置換されてもよい炭素原子数２〜６の直鎖脂肪族基である、請求項６３に記載のポリヌクレオチド組成物。
【請求項６８】
該ポリカチオン性ポリマーが、少なくとも一つの非イオン性ポリマーセグメントと共有結合している、請求項６９に記載の組成物。
【請求項６９】
ポリヌクレオチドまたはその誘導体および、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む、樹状細胞の活性化を誘導する方法。
【請求項７０】
ブロックコポリマーがゲルを形成するには不十分な量で存在する、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを有する、樹状細胞の活性化を誘導する方法。
【請求項７１】
該ブロックコポリマーは、少なくともプルロニックＦ１２７およびＬ６１を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
組成物が分子溶液またはコロイド分散を形成する、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む樹状細胞の活性化を誘導する方法。
【請求項７３】
該ブロックコポリマーはプルロニックＦ１２７およびＬ６１である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
請求項７２に記載の組成物を投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
【請求項７５】
該組成物は、経口で、局所的で、経直腸で、経膣で、非経口的に、筋肉内に、皮内に、皮下に、腹腔内にまたは静脈内に投与されるものである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
該組成物は、平滑筋、骨格筋および心筋の少なくとも一つに投与される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
請求項３４に記載の組成物を皮内に投与することを含む、動物の免疫応答を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルス、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはこれらの誘導体のようなポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのアルキルエーテルのブロックコポリマーを含む組成物および、該組成物を投与することによる樹状細胞の活性化方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ワクチン投与は、感染症による死あるいは障害を予防するのに有効な方法である。感染症分野におけるこの方法の成功によって、腫瘍性疾患の治療あるいは予防におけるワクチン投与の利用に対する関心もまた刺激されている。しかしながら、これらの成功はワクチンの利用によって達成されたにもかかわらず、ワクチン開発の分野においてはいまだ多くの問題がある。非経口投与経路、必要とされる種々のワクチン投与の数、および追加免疫の必要性とその頻度、これらが全て努力あるいは疾患の撲滅の障害となっている。
【０００３】
このような問題の一つは免疫抗原性の欠如である。すなわち抗原が、病原体に対する効果的な免疫応答を促進することができないのである。加えて、ある種の抗原は、特定のタイプの免疫応答、例えば、細胞が仲介するあるいは体液性の応答しか誘発しない。アジュバントは、免疫応答を高め、促進し、増強する物質であり、そしてある場合には、一種の免疫応答を別の応答よりも促進させるのに用いられうる。多くのワクチンアジュバントが知られているが、アルミニウム塩が、安全性の心配なくヒトに広く使用されている唯一のアジュバントである。
【０００４】
今では、免疫系が悪性細胞や感染性因子を認識し、ある場合には破壊することができるという確証がある。さらに、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）が、抗腫瘍および抗感染症免疫の主要な作用因子であるらしい。Ｔ細胞の活性化は、樹状細胞によるものであることが知られている。樹状細胞（ＤＣ）は、免疫学的に未熟なＴ細胞に対する強い活性化能により、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の中でも独特である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ， １９９１）。ＤＣは、応答しているＴ細胞との生体相互作用を媒介し、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する種々の分子を恒常的、あるいは成熟後に発現している。これらはクラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子を含む。ＣＤＳＯ（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）；ＣＤ４０；ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）；およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）（Ｓｔｅｉｎｍａｎ， １９９１； Ｓｔｅｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９５）。抗原を提示し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の未熟および記憶Ｔ細胞を活性化するという樹状細胞の独特な能力によれば、これらのＴ細胞を用いて特定の抗腫瘍免疫を引き起こせる可能性が提供される。したがって、樹状細胞を選択的に誘導し、免疫応答を刺激する能力を増強させることができる物質は大いに重要である。多くの研究によって、動物モデルにおいては、樹状細胞に基づいたワクチンの腫瘍免疫療法に対する高い有効性が証明され、ヒトの腫瘍に対しても、臨床試験において実施されているものもある。ヒトの腫瘍は、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）によって認識されうる多くのタンパク質抗原を発現しており、これにより癌の免疫療法の潜在的な標的が提供されている。
【０００５】
樹状細胞（ＤＣｓ）は、Ｔ細胞に対して抗原を提示する能力が特に高い、稀な白血球であり、この特性により、近年、治療用癌ワクチンへの適用が促進されつつある。マクロファージやＢ細胞のような他の細胞もまた、抗原を提示できることが知られている。しかしながら、マクロファージは可溶性抗原を効率よく取り込めず、一方、未熟な樹状細胞は、マクロピノサイトーシスにより細胞外液から大量の抗原を取り込むことができる。
【０００６】
これに対し、Ｂ細胞は、細胞表面の免疫グロブリンを通じて、特定の可溶性分子に結合するのに特に適している。Ｂ細胞は、自身の免疫グロブリン受容体に結合した可溶性抗原を吸収し、そしてこれら抗原のペプチド断片をペプチド：ＭＨＣクラスＩＩ複合体として提示する。Ｂ細胞の問題は、同時刺激活性を恒常的に発現しているわけではないということである。Ｂ細胞は可溶性タンパク質を効率よく提示するけれども、同時刺激活性がないと強力なＣＴＬ応答を開始しないと考えられる。結果として、その抗原は未熟なＴ細胞を活性化できないだけでなく、それらのＴ細胞をアネルギー性、つまり非応答性にしてしまう。
【０００７】
生体外で腫瘍抗原と混合され、細胞ワクチンとして投与される単離ＤＣは、実験動物において保護的および治療的な抗腫瘍免疫を誘導しているということが知られている。非ホジキン性白血病および黒色腫の患者に対するＤＣワクチン投与の予備臨床試験において、抗腫瘍免疫応答の誘導および腫瘍の退縮が観察された。Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌ， Ｒｅｖ Ｍｅｄ １９９９， ５０：５０７−２９； Ｔａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， １３：６５３−６６３ （１９９９）。種々のヒト癌に対するＤＣワクチン投与の更なる試験が進行中であり、生体内におけるＤＣの腫瘍抗原への指向化方法もまた模索されている。ＤＣの抗原提示能の利用により、有効な癌の免疫療法の開発の新たな可能性が提供されている。したがって、ＤＣは細胞ワクチンとして利用可能であるが、ＤＮＡワクチンと組み合わせることにより、免疫調節因子としてもまた用いられうる。ＤＮＡワクチン投与後に、ＤＣはワクチンによりコードされる抗原を効率よく提示する。Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．，　１８６（９）：１４８１−６ （１９９７）。プラスミドＤＮＡは、ＤＣの成熟およびリンパ組織への移行を促進するアジュバント作用を有している。しかしながら、プラスミドＤＮＡの直接注入では、たいていごく少数のＤＣしかトランスフェクトされず、ごく少数のＤＣしか注入部位へ移行しない。Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １１：３０８−３１３ （１９９９）。直接トランスフェクトされたＤＣによる抗原の発現は２週間で検出されなくなる。しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞の記憶の維持における、持続性抗原の役割は疑わしいものの、記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答は４０週以上維持される。細菌性ＤＮＡ（ＣｐＧモチーフ）は、ランゲルハンス細胞および、骨髄由来の未熟なＤＣの成熟を誘導する。細菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）は、ＤＣの活性化剤として長い間知られている。Ｔｈ１型応答が起こると、炎症性Ｔ細胞は、マクロファージを活性化するために感染部位に集合するだけでなく、ケモカインを分泌することによって好中球を感染部位へと誘引する。
【０００８】
プラスミドＤＮＡワクチンを裸のＤＮＡとともに投与した際、ＧＭ−ＣＳＦアジュバントおよび糖タンパク質Ｄ抗原を一緒にデリバリーすることによって、免疫応答が増強される。Ｆｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， １８（２８）： ３２４２−５３ （２０００）。ポリ（α−４−アミノブチルグリコール酸）複合体とともに、サイトカインをコードするプラスミドＤＮＡを用いることにより、サイトカイン（インターロイキン−１２）を発現させるために遺伝子のデリバリーが利用されている。Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ２（２）： １２１−１３０． （２０００）。腫瘍のサプレッサー（抗原）ｐ５３およびインターロイキン−１２（さらにはＴＮＦ−αおよびＩＦＮγ）は、サイトカイン応答を開始し、腫瘍の成長を阻害するために、“ＬＰＤ”と名づけられた遺伝子デリバリーシステムにおける遺伝子のデリバリーによって投与される。Ｗｈｉｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ６（１１） １８６７−７５ （１９９９）。ヒトＦＬＴ−３リガンドをコードするプラスミドを静脈内注射することで、機能性およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の数を増加させる。Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １１（４）： ５４７−５４ （２０００）。レトロウイルス媒介遺伝子療法の際、多くの研究者が遺伝子発現を増強させるためにＦＬＴ−３を用いている。Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０（１１）： １７４３−５２ （１９９９） ａｎｄ Ｇｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ９４（７）： ２２８７−９２ （１９９９）。レトロウイルス媒介遺伝子ワクチン療法の際に、樹状細胞の発達を誘導し、遺伝子発現を増強させるために、ＦＬＴ−３、さらにはＧＭ−ＣＳＦが用いられている。Ｍａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６０（１２）： ３２３９−４６ （２０００）。ＣＤ４ＯおよびＦＬＴ−３リガンドは、レトロウイルス媒介遺伝子ワクチン療法の際に、樹状細胞を誘導し、遺伝子発現を増強する。Ｂｏｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３（３） １２８９−９７ （１９９９）。
【０００９】
本発明は、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスもしくはベクターのようなポリヌクレオチドおよび、上記ＤＮＡ、特にプラスミドＤＮＡによってコードされる遺伝子産物の発現に応答して、ＤＣの高レベルの産生および浸潤を誘導する、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む組成物に関する。このことによって、コードされた外来抗原（導入遺伝子）に対する、より高い免疫応答が得られ、よりよい体液性および細胞性免疫応答が達成される。本発明の組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、大量の樹状細胞を産生させることにもまた用いることができる。従来のＤＣの産生、刺激および成熟方法は、極めて困難で時間がかかるが、一方、本発明はその過程を著しく容易にした。
【００１０】
筋肉内あるいは皮内への、裸のプラスミドＤＮＡの直接注入では、ＤＮＡワクチンによってコードされる抗原に対する、強力な、長期にわたる免疫応答が誘導される。両経路の免疫処置によって、特定の抗体が産生され、ＭＨＣクラスＩにより制御される抗原特異的ＣＴＬおよび、Ｔｈ１型サイトカインを分泌するＭＨＣクラスＩＩにより制御されるＴｈ細胞の両方が活性化される。（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒ．， Ｊｕｌｙ １９９９， ｐｐ． ５０−５７）。プラスミドＤＮＡワクチンはこれらの特性から、タンパク質、生弱毒化ウイルスもしくは死滅全生物体を用いる公知の免疫処置の魅力的な代替手段となっている。結果として、ＤＮＡワクチンは、感染症、アレルギーおよび癌など多様な分野における治療法もしくは予防手段として活発に研究がなされている。この免疫処置方法に対する熱烈な関心にもかかわらず、ＤＮＡワクチンはタンパク質を発現する能力が限られている。有効な免疫処置は遺伝子発現に依存しており、このことは、ＤＮＡワクチンがタンパク質を発現しなければならないことを意味する。
【００１１】
平滑筋、骨格筋および心筋の特性により、筋肉内投与に有効なポリヌクレオチド組成物の開発およびその投与に対して多くの問題が提起されている。等張生理食塩水中の精製プラスミド（“裸のＤＮＡ”）の筋肉への直接注入により、様々な種の平滑筋、骨格筋および心筋において、ＤＮＡの取り込みおよび遺伝子の発現が起こることが発見された。Ｒｏｌｌａｎｄ Ａ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｅｇｅｌｌ Ｈｏｕｓｅ， １４３ （１９９８）。筋組織の独特な細胞構造特性が、ポリヌクレオチドを取り込む原因となっていると信じられている。なぜなら、骨格筋および心筋細胞は、ほかのタイプの組織よりも、注入された外来ＤＮＡベクターを取り込み、発現させるのにより適していると思われるためである。Ｄｏｗｔｙ ＆ Ｗｏｌｆｆ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎ， ｐ．１８２ （１９９４）。しかしながら、この方法により得られる比較的低い発現レベルにより、その用途が制限されている。Ａｉｈａｒａ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６：８６７ （１９９８）を参照。さらに、ほかの組織における遺伝子発現を増強させるために一般に提唱されている、ポリカチオン、カチオン性リポソームおよび脂質のような伝統的な遺伝子デリバリーシステムでは、たいてい、骨格筋および心筋において遺伝子の発現が阻害されてしまう。Ｄｏｗｔｙ ＆ Ｗｏｌｆｆ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．， ｐ． ８２ （１９９４）。
【００１２】
たとえ筋肉が、ウイルスベクター非存在下でプラスミドＤＮＡを効果的に取り込み発現する唯一の組織であると知られているとしても、筋肉が抗原提示部位であると考えられてはいない。なぜなら筋肉は樹状細胞、マクロファージおよびリンパ球を、たとえあったとしてもほとんど有していないからである。皮膚および粘膜は、ほとんどの外来抗原が普通に出会う解剖学上の部位である。皮膚に関連したリンパ組織は、免疫応答を高める分化細胞を含有している。Ｒａｚ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ９１： ９５１９−９５２３ （１９９４）。
【００１３】
硫酸デキストリンやサケＤＮＡのようなアニオン性ポリマーは、筋肉において遺伝子の発現を減少させることができる。Ｒｏｌｌａｎｄ Ａ．， Ｌｏｃ． ｃｉｔ．。種々の非縮合性相互作用ポリマーが使用され、横紋筋における遺伝子発現を修飾することに部分的には成功している。ポリ（ビニルピロリドン）ポリ（ビニルアルコール）のような非イオン性ポリマーは、水素結合を通して、プラスミドと相互作用する。Ｉｄ．。これらのポリマーは、筋細胞においてポリヌクレオチドの取り込みを容易にし、１０倍もの遺伝子発現の上昇を引き起こす。しかしながら、遺伝子発現の著しい増加を達成するためには、高濃度のポリマー（約５％かそれ以上）を投与する必要がある。Ｍｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ．， １３， ７０１−７０９ （１９９６）； Ｍａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ６（１）， ４１−５３ （１９９５）。遺伝子発現を改善するために必要とされるこの高濃度のポリ（ビニルピロリドン）ポリ（ビニルアルコール）は、筋組織における毒性、炎症および他の副作用に関連している可能性がある。筋肉において遺伝子発現を改善するため、あるいは、その後の治療用途のために筋肉の生理機能を修飾するために、ブロックコポリマーが用いられている。米国特許第５，５５２，３０９号；第５，４７０，５６８号；第５，６０５，６８７号；および第５，８２４，３２２号を参照。例えば、脈管系において遺伝子の導入をおこなうために用いられるウイルス粒子を調剤する目的で、ブロックコポリマーをゲル様の形状（１％を超えるブロックコポリマー）で使用することができる。同様の範囲のブロックコポリマー濃度（１〜１０％）で、ブロックコポリマーを用いて、損傷を受けた筋組織（放射線および電気的損傷、および凍傷）の透過性を修飾することができる。さらに、ブロックコポリマーを用いて膜を易透過化した後、ＤＮＡ分子を細胞に組み込むことができる。これらの適用では、ブロックコポリマーは、ゲル様構造および粘性デリバリーシステムを提供できるような濃度で使用されていた。しかしながら、これらのシステムでは筋肉に注入されたＤＮＡは拡散できるようにならず、したがって筋原繊維へのＤＮＡの注入は制限されていた。
【００１４】
こうして、患者、特に筋肉や皮膚へ投与した際の、ポリヌクレオチドの発現効率を増加させる組成物および方法が必要とされている。また、ポリヌクレオチドの細胞へのデリバリー効率を増加させる方法も必要とされている。
【００１５】
筋肉及び皮膚においては遺伝子の発現を改善させる必要があるのに対し、遺伝的障害がある、および／または遺伝子の異常な過発現がある、および／または正常な遺伝子が欠如している状況では体内の他の組織は遺伝子の移入により恩恵を被る。
【００１６】
ＲＮＡ、ＤＮＡ、ウイルスおよびリボザイムのような種々のポリヌクレオチドは、遺伝子治療の目的で用いることができる。しかしながら、遺伝子治療の成功は、下記のような多くの問題と出くわしている。
【００１７】
遺伝的疾患、細胞変異（変異を生じさせるまたは増加させる癌を含む）およびウイルス感染を治療するためのアンチセンスポリヌクレオチドの利用が広く注目を集めている。この治療手段は、一面では、治療すべき病変部位の発生に関与していると考えられているタンパク質をコードしているｍＲＮＡの“センス”鎖に結合し、その結果、ｍＲＮＡが不要なタンパク質へ翻訳されるのを停止あるいは阻害することによって機能すると考えられている。また別の一面では、例えば転写を阻害するために、ゲノムＤＮＡがアンチセンスポリヌクレオチド結合（三重らせんを形成）の標的とされる。Ｈｅｌｅｎｅ， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， ６：５６９ （１９９１）。ひとたび結合すべきｍＲＮＡの配列がわかれば、ワトソン−クリック塩基結合則によってセンス鎖に結合し、ＤＮＡ二重らせんに類似した二量体構造を形成するようなアンチセンス分子をデザインすることができる。Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ： Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ， Ｅｒｉｋｓｏｎ ａｎｄ ｌｘｚａｎｔ， ｅｄｓ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１； Ｈｅｌｅｎｅ， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， ６：５６９ （１９９１）； Ｃｒｏｏｋｅ， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， ６：６０９ （１９９１）。この技術を十分に利用することに対する深刻な障壁としては、標的のｍＲＮＡの翻訳もしくはＤＮＡの機能を効率よく妨げるために、十分な数のアンチセンス分子を細胞に効率よく導入するという問題がある。
【００１８】
発明の要約
本発明は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのアルキルエーテルのブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化誘導のための組成物に関する。さらに、本発明は、ウイルス、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはこれらの誘導体のようなポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを投与、特に筋肉内および皮内投与することを含む、樹状細胞の活性化のための方法に関する。特定の実施形態において、該ブロックコポリマーは、ゲル形成には不十分な量で存在する。本発明はまた、ブロックコポリマーが約１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）未満の濃度で存在する、少なくとも一つのポリヌクレオチドもしくはその誘導体および、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む使用方法および組成物にも関する。さらに特定の実施形態においては、該組成物はさらにポリカチオンを含む。該組成物はまたブロックコポリマーの混合物をも含む。本発明はまた、該組成物が、以下に制限されないが、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体などの、分子溶液またはコロイド分散を形成する組成物にも関する。これらの組成物は、該組成物中に存在するポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現に応答して、ＤＣの産生および浸潤レベルを上昇させるのに有用である。該組成物はまた、免疫応答を増強し、大量の樹状細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて産生させるのにも有用である。本発明はさらに、上記組成物を細胞に投与することを含む、ポリヌクレオチドの細胞へのデリバリー方法にも関する。
【００１９】
本発明は一部分、多くの予想外の驚くべき発見に基づいている。一つは、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む組成物に細胞を前もって暴露しておくことで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける樹状細胞の浸潤および活性化が著しく増強されるということである。もう一つは、ポリヌクレオチド分子（例えばプラスミドＤＮＡおよびウイルス）を単独もしくは組み合わせたブロックコポリマーと配合すると、免疫が増強されるということである。また一つは、ブロックコポリマー、“ポロキサマー”とも呼ばれるが、が用いられると、免疫応答を得るために必要とされるポリヌクレオチド分子がより少なくなり、応答を生じさせるための時間が短縮され、追加注入の必要がなくなるということである。結果として、より少ないポリヌクレオチド分子を使用することによって、ポリヌクレオチドが宿主生物の染色体に組み込まれる可能性が減少するであろう。さらに、より少ないポリヌクレオチド分子を使用することによって、全身性エリテマトーデスのような、しかしこれに限定されない疾患に関連している抗ポリヌクレオチド（もしくは抗ＤＮＡ）抗体が発現する可能性が減少するであろう。
【００２０】
発明の詳細な説明
定義
ここで用いられているように、下記の語句は以下の意味を有する：
主鎖：　グラフトコポリマー命名の際に用いられ、その上にグラフトが形成される鎖を表す。
ブロックコポリマー：　構造的もしくは配座的に異なる性質の二以上の鎖の組み合わせ。
分枝状ポリマー：　お互いに連結された二以上の鎖の組み合わせであり、少なくとも一つの鎖の末端が、別の鎖のある点に結合している。
鎖：　モノマー単位の共有結合により形成されるポリマー分子。
立体配置：　ポリマー鎖に沿った原子構成であり、主化学結合を破壊し、再構成することによってのみ、相互転換可能である。
配座：　単結合の回転によって生じる、ポリマー鎖の原子および置換基の配置。
コポリマー：　２種以上のモノマーからなるポリマー。
架橋：　２以上の鎖にともに結合している構造。
デンドリマー：　分枝が一つ以上の中心から開始する、規則正しい分枝状ポリマー。
分散：　分散媒中に分布している微粒子状物質。
グラフトコポリマー：　構造的もしくは配座的に異なる性質の２つ以上の鎖の組み合わせであり、一つの鎖が主鎖をなし、少なくとも一つの鎖が主鎖に沿った幾つかの点で結合し、側鎖を形成している。
ホモポリマー：　一種のモノマーからなるポリマー。
連結：　二つの原子間の共有化学結合であり、二つのモノマー単位間もしくは二つのポリマー鎖間の結合を含む。
ポリマーブレンド：　構造的もしくは配座的に異なる性質の２つ以上のポリマー鎖の均質な組み合わせであり、お互いに結合はしていない。
ポリマーフラグメント（もしくはポリマーセグメント）：　モノマー単位が、隣接部分が有していない構造的もしくは配座的な性質を少なくとも一つ有している、ポリマー分子の一部分。
ポリヌクレオチド：　天然もしくは人工の核酸配列。
反復単位：　ポリマー鎖に連結するモノマー単位。
側鎖：　グラフトコポリマーにおける、グラフト鎖。
スターブロックコポリマー：　中心部分の一端で一緒に連結する、構造的もしくは配座的に異なる性質を有する三以上の鎖。
スターポリマー：　中心部分の一端で一緒に連結する、三以上の鎖。
サーファクタント：　界面で吸着している界面活性物質。
ウイルスベクター：　ウイルス由来の、遺伝子移入に用いられる構築物。
【００２１】
組成物
本発明は、少なくとも一つのブロックコポリマーを含む、樹状細胞の活性化のための組成物ならびに少なくとも一つのポリヌクレオチドまたはその誘導体および少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物に関する。本発明はまた、該組成物を投与することによって、樹状細胞の活性化を誘導するおよび動物の免疫応答を増強する方法にも関する。
【００２２】
好ましい実施形態には、ポリヌクレオチドおよびカチオン性セグメントを有するブロックコポリマーを含む組成物ならびにポリヌクレオチドおよび非イオン性ポリエーテルブロックコポリマーを含む組成物とが含まれる。特に筋肉内および皮内投与に有用な一つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリ（オキシエチレン）およびポリ（オキシプロピレン）のブロックコポリマーと配合される。本発明の好ましい組成物は、さらにポリカチオンを含む。
【００２３】
本発明の組成物は、ポリヌクレオチドの細胞への導入、ポリヌクレオチドの体液中における分解からの保護、生体膜および生物学的関門（例えば血液脳関門、血管脳脊髄液関門、および腸関門）を通過するポリヌクレオチドの輸送、ポリヌクレオチドの体内における生体内分布の改変ならびにヒトまたは動物の体内の様々な組織および臓器における選択的な遺伝子発現を含む遺伝子発現の増強、に効率のよい媒体を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、本発明の組成物を利用してポリヌクレオチドを細胞に挿入またはデリバリーする方法、および、ヒトおよび動物にこれらの組成物を投与することを含む治療方法に関する。
【００２５】
好ましい実施形態において、ブロックコポリマーは、以下の式：
【００２６】
【化７】
2004509838.tif 000002
【００２７】
式中、ＡおよびＡ’はＡ型直鎖状ポリマーセグメントであり、ＢおよびＢ’はＢ型直鎖状ポリマーセグメントであり、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞれ式（Ｉ）、（ＩＩ）もしくは（ＩＩＩ）のブロックコポリマーまたは水素原子であり、Ｌは連結基であり、ただしＲ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４のうち水素原子は２つ以下である、
の一つに従っている。
【００２８】
他の実施形態において、ブロックコポリマーはポリ（オキシエチレン）およびポリ（オキシプロピレン）鎖セグメントである。さらに他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド組成物は、カチオン性反復単位を複数有するポリカチオン性ポリマーを含有する。この場合、該ポリヌクレオチドはポリカチオンと複合体化され、複合体中で安定化されてもよい。これらの組成物は、細胞膜を通過する透過性の増加を示し、細胞に核酸をデリバリーするための媒体としての使用によく適している。
【００２９】
他の実施形態において、本発明は：
（ａ）ポリヌクレオチドまたはその誘導体；
（ｂ）ポリエーテルセグメントおよびポリカチオンセグメントを有し、該ポリエーテルセグメントは少なくともＡ型ブロックを含み、該ポリカチオンセグメントはカチオン性反復単位を複数有するブロックコポリマー
を有するポリヌクレオチド組成物に関する。
【００３０】
第二の好ましい実施形態において、コポリマーは、式：
【００３１】
【化８】
2004509838.tif 000003
【００３２】
で示されるポリマーに関し、式中、Ａ、Ａ’およびＢは上記と同様であり、ＲおよびＲ’はカチオン性反復単位を複数含むポリマーセグメントであり、セグメント中の各カチオン性反復単位は該セグメント中の他の単位と同一または異なっている。この実施形態のポリマーは、“ポリ非イオン性／ポリカチオン性”ポリマーと称してもよい。好ましいポリ非イオン性／ポリカチオン性ポリマーは、非イオン性ポリマーセグメントに共有結合しているポリカチオンを含み、該非イオン性ポリマーセグメントは、アクリルアミド、グリセロール、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、ビニルピリジン、ビニルピリジンＮ−オキサイド、オキサゾリンもしくはアクロイルモルフォリン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つのモノマーのホモポリマーもしくはコポリマーである。これは例えば、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンＮ−オキサイド、ビニルピリジンＮ−オキサイドとビニルピリジンのコポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクロイルモルフォリン、またはこれらの誘導体を含む。ビニルモノマーの重合産物を含む非イオン性セグメントもまた好ましい。ＲおよびＲ’ブロックは、「Ｒ型」ポリマーセグメントまたはブロックと称してもよい。この実施形態のポリヌクレオチド組成物は、細胞にポリヌクレオチドを導入するのに効率のよい媒体を提供する。
【００３３】
したがって、本発明はさらに、本発明の組成物を利用してポリヌクレオチドを細胞に挿入する方法に関する。
【００３４】
さらに他の実施形態において、本発明は、ポリエーテルはＡ型ポリエーテルセグメントを含む、ポリヌクレオチドセグメントを含むポリヌクレオチド誘導体およびポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のうち一つまたは両方に付着したポリエーテルセグメントを含むポリヌクレオチド組成物に関する。
【００３５】
第三の好ましい実施形態において、誘導体は、式：
【００３６】
【表１】
2004509838.tif 000004
【００３７】
を有するブロックコポリマーを含み：式中、ｐＮは、５’から３’への方向を有するポリヌクレオチドを表し、ならびにＡ、Ａ’およびＢは上記のポリエーテルセグメントである。他の第三の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド複合体はポリカチオン性ポリマーを含む。式（ＩＸ）〜（ＸＩＩＩ）のポリヌクレオチド成分（ｐＮ）は、好ましくは約５〜約１，０００，０００塩基、より好ましくは約５〜約１００，０００塩基、さらにより好ましくは約１０〜約１０，０００塩基を有する。
【００３８】
ポリヌクレオチド組成物は、ポリヌクレオチドを細胞に導入するのに効率のよい媒体を提供する。したがって、本発明はまた、本発明の組成物を用いてポリヌクレオチドを細胞に挿入する方法に関する。他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドはポリ（オキシエチレン）およびポリ（オキシプロピレン）のブロックコポリマーに共有結合している。
【００３９】
本発明の他の実施形態は、ポリマー、ポリエーテルセグメント、および式−ＮＨ−Ｒ０を有するカチオン性反復単位を複数含むポリカチオン性セグメントを含むポリエーテルポリカチオンコポリマーに関し、ここでＲ０は炭素原子数２〜６の、置換されていてもよい直鎖脂肪族基であり、該ポリエーテルセグメントは少なくとも一つのＢ型セグメントのＡ型を含む。他の好ましい実施形態において、ポリカチオンポリマーは、以下の式：
【００４０】
【化９】
2004509838.tif 000005
【００４１】
で示されるポリマーを含む。式中、Ａ、Ａ’およびＢは上記と同様であり、ＲおよびＲ’は、式−ＮＨ−Ｒ０−を有するカチオン性反復単位を複数含むポリマーセグメントであり、ここでＲ０は炭素原子数２〜６の、置換されていてもよい直鎖脂肪族基である。Ｒ型セグメント中の各−ＮＨ−Ｒ０−反復単位は、該セグメント中の他の−ＮＨ−Ｒ０−反復単位と同一または異なっていてもよい。
【００４２】
さらに他の実施形態において、本発明は、式：
【００４３】
【化１０】
2004509838.tif 000006
【００４４】
を有する反復単位を複数含むポリカチオン性ポリマーを提供する。
【００４５】
式中、Ｒ８は：
（１）−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ（Ｒ１３）−であり、ここでｎは０〜約５の整数であり、Ｒ１３は水素、炭素原子３〜８のシクロアルキル、炭素原子１〜６のアルキル、または、（ＣＨ２）ｍＲ１４であり、ここでｍは０〜約１２の整数であり、Ｒ１４は炭素原子６〜２０の親油性の置換基である；
（２）環の炭素原子が３〜８の炭素環式化合物基であり、ここで該基は例えばシクロアルキルまたは芳香族基であり、これらは、炭素原子１〜６のアルキル、炭素原子１〜６のアルコキシ、炭素原子１〜６のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子１〜６を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロ、またはクロロ置換基を含んでいてもよい；または（３）環の原子が３〜８の複素環式化合物基であり、これとしては酸素原子、窒素原子、硫黄原子およびこれらの混合物からなる群より選択されるヘテロ原子１〜４を含むヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基が挙げられ、これらは、さらに炭素原子１〜６のアルキル、炭素原子１〜６のアルコキシ、炭素原子１〜６のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子１〜６を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロまたはクロロ置換基を含んでいてもよい、である。
【００４６】
Ｒ９は炭素原子１〜１２の直鎖脂肪族基であり、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は独立して水素、炭素原子１〜４のアルキル基である。Ｒ９は好ましくは炭素原子２〜１０，より好ましくは炭素原子３〜８である。Ｒ１４は好ましくは、挿入基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）を含み，これは好ましくはアクリジンまたはエチジウムブロミド基である。該ポリマー中の反復単位数は、好ましくは約３〜５０、より好ましくは約５〜２０の範囲である。このポリマーの構造は、Ｒ型セグメントまたはポリカチオン性ポリマーとして、本発明の他の実施形態に組み込むこともできる。このポリマーの末端は脂質の置換基でさらに改変されていてもよい。
【００４７】
この実施形態のポリマーを合成するために用いるモノマーは、下記のような、ＤＮＡシンセサイザーへ供給されるモノマーとして用いるのに適している。したがって、ポリマーは非常に特異的に合成されうる。加えて、ポリヌクレオチド配列、ポリエーテルブロックおよび親油性置換基をさらに組み込むことは、ポリヌクレオチド合成のために開発された最先端の自動化装置を用いてなされうる。この実施形態はまた、ポリカチオン性ポリマーの合成方法も含んでいる。
【００４８】
さらに他の実施形態において、本発明は、共有結合したポリマーセグメントを複数含むポリマーに関し、ここで該セグメントは、以下の（ａ）および（ｂ）を有する：
（ａ）少なくとも一つのポリカチオンセグメント、ここで該セグメントは、少なくとも三つのアミノアルキレンモノマーを含むカチオン性ホモポリマー、コポリマーまたはブロックコポリマーであり、該モノマーは以下の（ｉ）および（ｉｉ）からなる群より選択される；
（ｉ）式：
【００４９】
【化１１】
2004509838.tif 000007
【００５０】
を有する少なくとも一つの第３級アミノモノマー、および該第３級アミノモノマーの第４級塩、ならびに
（ｉｉ）式：
【００５１】
【化１２】
2004509838.tif 000008
【００５２】
で示される少なくとも一つの第２級アミノモノマー、および該第２級アミノモノマーの酸付加第４級塩であり、式中、
Ｒ１は水素、炭素原子２〜８のアルキル、ＡモノマーまたはＢモノマーであり、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ互いに独立して、下記式を有する同一もしくは異なる直鎖もしくは分岐状鎖のアルカンジイル基であり：
【００５３】
【化１３】
2004509838.tif 000009
【００５４】
式中、ｚは２〜８の値であり；Ｒ４は対になるように結合しているように描かれた炭素原子の一つの結合を満たす水素原子であり；Ｒ５は水素原子、炭素原子２〜８のアルキル、Ａモノマー、またはＢモノマーであり；Ｒ６は水素、炭素原子２〜８のアルキル、Ａモノマー、またはＢモノマーであり；Ｒ７は下記式を有する直鎖または分岐状鎖のアルカンジイル基であり：
【００５５】
【化１４】
2004509838.tif 000010
【００５６】
式中、ｚは２〜８の値であり；Ｒ８は水素、炭素原子２〜８のアルキル、Ａモノマー、またはＢモノマーである；ならびに
（ｂ）少なくとも一つの、約５〜約４００のモノマー単位を含む直鎖または分岐状鎖のポリエーテルセグメント、これは
（ｉ）第１のアルキレンオキシモノマー−ＯＣｎＨ２ｎ−のホモポリマー、または
（ｉｉ）該第一アルキレンオキシモノマーおよび、異なる第二のアルキレンオキシモノマー−ＯＣｍＨ２ｍ−とのコポリマーもしくはブロックコポリマー
であり、式中、ｎは２または３の値であり、ｍは２〜４の値である。
【００５７】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で示されるポリマーはまた、細胞の内部にポリヌクレオチドをデリバリーするのに効率のよい媒体を提供するために、互いに混合されてもよく、または、式（Ｖ−ａまたはｂ）、（ＶＩ−ａまたはｂ）、（ＶＩＩ−ａまたはｂ）および（ＶＩＩＩ−ａまたはｂ）で示される一以上のポリマー、および／または、式（ＩＸ−ａ，ｂ，ｃまたはｄ）、（Ｘ−ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅまたはｆ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）または（ＸＩＩＩ）で示されるポリヌクレオチド誘導体と追加してもしくは代わりに混合されることもできる。
【００５８】
式（Ｉ）〜（ＸＩＩＩ）の親水性（Ａ型）ブロックまたは疎水性（Ｂ型）ブロックの重合度は、好ましくは約５〜約４００であり得る。該重合度はより好ましくは約５〜約２００、さらにより好ましくは約５〜約８０であり得る。Ｒ型ポリカチオンブロックの重合度は、好ましくは約２〜約３００であり得る。該重合度はより好ましくは約５〜約１８０であり、さらにより好ましくは約５〜約６０であり得る。ポリカチオン性ポリマーの重合度は、好ましくは約１０〜約１０，０００であり得る。該重合度はより好ましくは約１０〜約１，０００であり、さらにより好ましくは約１０〜約１００であり得る。
【００５９】
Ａ型、Ｂ型およびＲ型ブロックを含む反復単位は、一般的に、約３０〜約５００、好ましくは約３０〜約１００、より好ましくは約３０〜約６０の分子量を有するであろう。一般的には、Ａ型またはＢ型ブロックのそれぞれにおいて、反復単位間の結合の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％がエーテル結合であろう。本願の目的のためには、エーテル結合はグリコシド結合（すなわち糖結合）を含む。しかしながら一面においては、単純なエーテル結合が好ましい。
【００６０】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明の組成物は遺伝子治療の目的に有用であり、これらは、遺伝子置換または除去治療、および遺伝子付加治療、ワクチン投与、ならびに、体内またはｉｎ ｖｉｔｒｏでポリペプチドが発現またはダウンレギュレートされるべき任意の治療条件を含む。本発明の一つの観点において、ポリヌクレオチド組成物は、ヒトまたは動物の平滑筋、骨格筋および心筋を含むがこれらに限定されない筋組織における遺伝子治療に用いられる。筋肉内投与用の組成物は、ポリ（オキシエチレン）およびポリ（オキシプロピレン）のブロックコポリマーを含むことが好ましい。
【００６１】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明は、オキシエチレン含有量が５０％以下の、少なくとも一つのポリ（オキシエチレン）およびポリ（オキシプロピレン）のブロックコポリマー、およびオキシエチレン含有量が５０％以上の、少なくとも一つのポリ（オキシエチレン）およびポリ（オキシプロピレン）のブロックコポリマー、およびポリヌクレオチドを含む組成物に関する。オキシエチレン含有量が５０％以下のブロックコポリマーの、オキシエチレン含有量が５０％以上のブロックコポリマーに対する質量比は、好ましくは１：２、より好ましくは１：５である。
【００６２】
本発明の組成物はゲルを形成しないことが好ましい。該組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成することが好ましい。サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体または他のタイプの分子凝集体を含むコロイド分散が特に好ましい。一つの観点において、ポリヌクレオチド組成物におけるポリマーおよびブロックコポリマーの濃度は、１０％未満、好ましくは１％未満、より好ましくは０．５％未満、さらにより好ましくは０．１％未満である。
【００６３】
ブロックコポリマーは、最も簡単には少なくとも二つの異なるポリマーセグメントの結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）として定義される（Ｔｉｒｒｅｌ， Ｍ．， Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｇｏｄｄａｒｄ Ｅ．Ｄ． ａｎｄ Ａｎａｎｔｈａｐａｄｍａｎａｂｈａｎ， Ｋ．Ｐ． （ｅｄｓ．）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， Ｌｏｎｄｏｎ， ｐｐ． ５９−１２２， （１９９２））。最も簡単なブロックコポリマーの構造は、二つのセグメントがそれらの末端で結合したものを含み、Ａ−Ｂ型ジブロックを形成する。二つ超のセグメントがそれらの末端で連続して結合することにより、Ａ−Ｂ−Ａ型トリブロック、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ型マルチブロックを得ることができ、さらにはマルチセグメントＡ−Ｂ−Ｃ構造も得られる。ブロックコポリマーにおいて、一種または数種の反復単位が異なるポリマーセグメントに結合すると主鎖が定義されうる場合、コポリマーは例えばＡ（Ｂ）ｎ型のグラフト構造を有する。より複雑な構造は、単一の中心に２つ超のポリマーセグメントが連結してなる（ＡＢ）ｎまたはＡｎＢｍスターブロックを含む。本発明の式ＸＶＩＩＩ〜ＸＸＩＩＩは、ジブロックおよびトリブロックである。同時に、式ＸＶＩＩのポリエーテル末端へのポリカチオンセグメントの結合により、スターブロック（例えば、（ＡＢＣ）４型）が得られる。加えて、実施例１３〜１５（下記）のポリスペルミンは分岐状である。ポリ（エチレンオキサイド）を有するこのようなポリカチオンの改変により、グラフト化ブロックコポリマーおよびスターブロックの混合物を得ることができる。本発明によれば、これらの構造すべてはポリヌクレオチドのデリバリーに有用である。
【００６４】
米国特許第５，７８３，１７８号の全開示が、ここに参照することにより引用される。
【００６５】
他の観点において、本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリエーテルブロックコポリマーのポリヌクレオチド複合体を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチド複合体はさらにポリカチオン性ポリマーを含む。組成物はさらに、適切な標的分子およびサーファクタントを含む。他の観点において、本発明は、ポリヌクレオチドならびにポリエーテルブロックおよびポリカチオンブロックを含むブロックコポリマーのポリヌクレオチド複合体を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、ポリエーテルポリマーセグメントを付着させるために５’または３’末端で共有結合的に改変されたポリヌクレオチドを提供する。
【００６６】
ポリカチオン　好ましいポリカチオンポリマー、およびコポリマーのポリカチオンセグメントとは、ポリアミン（例えばスペルミン、ポリスペルミン、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミン、ポリペンチレンイミン、ポリヘキシレンイミンおよびそれらのコポリマー）、第３級アミンおよび第２級アミンのコポリマー、部分的なまたは完全な第４級アミン、ポリビニルピリジン、ならびに、これらポリカチオンセグメントの第４級アンモニウム塩を含むがこれらに限定されない。これら好ましいポリカチオンフラグメントはまた、脂肪族、ヘテロ環、または芳香族イオネン（ｉｏｎｅｎｅｓ）を含む。Ｒｅｍｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ６：１５９ （１９６８）； Ｔｓｕｔｓｕｉ， Ｔ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｉｏｎｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ−２， Ｗｉｌｓｏｎ Ａ．Ｄ． ａｎｄ Ｐｒｏｓｓｅｒ， Ｈ．Ｊ． （Ｅｄｓ．） Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｖｏｌ． ２， ｐｐ． １６７−１８７， （１９８６）。
【００６７】
ポリカチオン性ポリマーおよびＲ型ブロックは、陽性にイオン化し得る数種の基および、生理学的なｐＨで正味の正電荷を有する。式（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）のポリエーテル／ポリカチオンポリマーはまた、ポリカチオン性ポリマーとして機能し得る。好ましくは、ポリカチオンセグメントは生理学的なｐＨで少なくとも約３個、より好ましくは少なくとも約６個、さらにより好ましくは少なくとも約１２個の正電荷を有する。生理学的なｐＨで、電荷間の距離が約２Å〜約１０Åである正電荷を供与できるポリマーまたはセグメントもまた好ましい。エチレンイミン、アミノプロピレン、アミノブチレン、アミノペンチレンおよびアミノヘキシレンの反復単位、またはこれらの基の少なくとも二つの混合物によって確立される距離が最も好ましい。（ＮＣＨ２ＣＨ２）、（ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、（ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、（ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）および（ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）の反復単位、またはこれらの混合物を利用したポリカチオン性セグメントが好ましい。
【００６８】
本発明の好ましい組成物において、ポリカチオンポリマーおよびポリエーテル／ポリカチオンコポリマーは、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーと混合される。オリゴアミン、および、オリゴアミンのポリエーテルとの結合体は、オリゴアミンのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとの結合体を含み、本発明においてポリカチオン性分子として、特にポリオキシエチレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーとの混合物において用いられ得る。本発明において有用なオリゴアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、および他のＤＮＡ縮合剤を含むがこれらに限定されない。ジエチレントリアミンおよびペンタエチレンヘキサミンのようなエチレンイミンオリゴアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパン−ジアミンおよびＮ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンのようなプロピレンイミンオリゴアミン、ブチレンイミンオリゴアミン、ペンチレンイミンオリゴアミン、ヘキシレンイミンオリゴアミン、ヘプチレンイミンオリゴアミン、およびその誘導体が、本発明において特に有用である。
【００６９】
−Ｎ−Ｒ０−反復単位を有するポリカチオンセグメントもまた好ましい。Ｒ０は、好ましくはエチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレンまたはヘキシレン鎖であり、これらは改変されてもよい。好ましい実施形態において、反復単位の少なくとも一つにおいては、Ｒ０は、エチジウムブロミド基のようなＤＮＡ挿入基を含む。このような挿入基は、核酸に対するポリマーの親和性を増すことができる。Ｒ０上の好ましい置換基は、炭素原子１〜６のアルキル、ヒドロキシ、アルキルが炭素原子１〜６であるヒドロキシアルキル、炭素原子１〜６のアルコキシ、炭素原子２〜７のアルキルカルボニル基、アルコキシが炭素原子１〜６を有するアルコキシカルボニル、アルコキシおよびアルキルがそれぞれ独立して炭素原子１〜６を有するアルコキシカルボニルアルキル、各アルキル基がそれぞれ炭素原子１〜６を有するアルキルカルボキシアルキル、アルキル基が炭素原子１〜６を有するアミノアルキル、各アルキル基が独立して炭素原子１〜６を有するアルキルアミノまたはジアルキルアミノ、各アルキルが独立して炭素原子１〜６を有するモノ−またはジ−アルキルアミノアルキル、クロロ、またはアルキルが炭素原子１〜６を有するクロロアルキル、フルオロ、またはアルキルが炭素原子１〜６を有するフルオロアルキル、シアノ、またはアルキルが炭素原子１〜６であるシアノアルキル、または、カルボキシル基である。より好ましくは、Ｒ０はエチレン、プロピレンまたはブチレンである。
【００７０】
本発明のコポリマー中のポリカチオンポリマーおよびポリカチオンセグメントは分岐状であってもよい。例えば、ポリスペルミンに基づくコポリマーは分岐状である。これらコポリマーのカチオン性セグメントは、１，４−ジブロモブタンおよびＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンの縮合によって合成された。この反応により、第１級、第２級および第３級アミンを含む高度分岐状ポリマー産物が得られる。
【００７１】
分岐状ポリカチオンの例としては、少なくとも２個の窒素原子を含むポリアミンおよび、少なくとも２個のハロゲン原子（臭素または塩素を含む）を含むハロゲン化アルキルの縮合反応の産物がある。特に、分岐状ポリカチオンは、重縮合の結果製造される。この反応の例としては、ポリスペルミンを製造する、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンおよび１，４−ジブロモブタンの反応がある。この型の分岐状ポリカチオンポリマーは、式：
【００７２】
【化１５】
2004509838.tif 000011
【００７３】
で示すことができる。
【００７４】
分岐状ポリカチオンの他の例は、式：
【００７５】
【化１６】
2004509838.tif 000012
【００７６】
で示されるポリエチレンイミンである。
【００７７】
加えて、カチオン性デンドリマー、例えばポリアミドアミンもまた、遺伝子移入用ブロックコポリマーのポリカチオンセグメントとして用いられ得る。Ｔｏｍａｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ２９， １３８（１９９０）。
【００７８】
好ましい実施形態において、ポリカチオンは、非イオン性ポリマーセグメントに共有結合している。非イオン性ポリマーセグメントは、非毒性および非免疫原性の水溶性ポリマーを含むことが好ましい。このようなポリマーの好ましい一つの例は、ポリ（オキシエチレン）、ポリ（オキシプロピレン）、ポリ（オキシエチレン）／ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーおよびポリ（オキシエチレン）／ポリ（オキシプロピレン）ランダムコポリマーを含む、エチレンオキシモノマー（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）およびプロピレンオキシモノマー（−ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−）のホモポリマーおよびコポリマーであるポリエーテルポリマーである。本発明において用いられる非イオン性ポリマーセグメントの別の好ましい例は、アクリルアミド、グリセロール、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、ビニルピリジン、ビニルピリジンＮ−オキサイド、オキサゾリンもしくはアクロイルモルフォリン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つのモノマーのホモポリマーもしくはコポリマーである。これは例えば、ポリアクリルアミド、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンＮ−オキサイド、ビニルピリジンＮ−オキサイドおよびビニルピリジンのコポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクロイルモルフォリン、もしくはこれらの誘導体を含む。ビニルモノマーの重合産物を含む非イオン性セグメントもまた好ましく、下記の非イオン性セグメントおよびその誘導体も含むが、これに限定されない：
【００７９】
【化１７】
2004509838.tif 000013
【００８０】
式中、ｍは約３〜約１０，０００の値である。
【００８１】
式（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）で示される有用なポリマーの例は、以下の式：
【００８２】
【化１８】
2004509838.tif 000014
【００８３】
のポリ（オキシエチレン）−ポリ−Ｌ−リジン）ジブロックコポリマーを含む。式中、ｉは約５〜約１００の整数であり、ｊは約４〜約１００の整数である。
【００８４】
第二の例は、以下の式：
【００８５】
【化１９】
2004509838.tif 000015
【００８６】
のポリ（オキシエチレン）−ポリ−（Ｌ−アラニン−Ｌ−リジン）ジブロックコポリマーである。式中、ｉは約５〜約１００の整数であり、ｊは約４〜約１００の整数である。
【００８７】
第三の例は、以下の式：
【００８８】
【化２０】
2004509838.tif 000016
【００８９】
のポリ（オキシエチレン）−ポリ（プロピレンイミン／ブチレンイミン）ジブロックコポリマーである。式中、ｉは約５〜約２００の整数であり、ｊは１〜約１０の整数である。
【００９０】
第四の例は、式：
【００９１】
【化２１】
2004509838.tif 000017
【００９２】
のポリ（オキシエチレン）−ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド）（「ｐＯＥ−ｐＥＶＰ−Ｂｒ」）である。式中、ｉは約５〜約１００の整数であり、ｊは約１０〜約５００の整数である。さらに他の例は、式：
【００９３】
【化２２】
2004509838.tif 000018
【００９４】
のポリマーである。式中、ｉは約１０〜約２００の整数であり、ｊは約１〜約８の整数であり、ｋは約１０〜約２００の整数である。さらに他の例は、式：
【００９５】
【化２３】
2004509838.tif 000019
【００９６】
のポリマーである。式中、「Ｇ」は−（ＮＨ（ＣＨ２）３）３−ＣＨ２ＮＨ２−を含み、ｉおよびｊは式（ＸＶＩＩＩ）で定義されたとおりであり、ｍは約１〜約８の整数である。
【００９７】
非イオン性ポリエーテルブロックコポリマーおよびポリエーテルセグメントは、式：
【００９８】
【化２４】
2004509838.tif 000020
【００９９】
を有するブロックコポリマーによって例示される。式中、ｘ、ｙ、ｚ、ｉおよびｊは約２〜約８００、好ましくは約５〜約２００、より好ましくは約５〜約８０の値であり、Ｒ１、Ｒ２の対のそれぞれについては、一方が水素原子でありかつ他方がメチル基である。式（ＸＸＩＶ）〜（ＸＸＶＩ）は過剰に簡略化されており、実際にはＢブロック内のイソプロピレンラジカルの配向はランダムであろう。このランダムな配向は、式（ＸＸＶＩＩ）および（ＸＸＶＩＩＩ）で示されており、これらはより完全である。このようなポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーは、Ｓａｎｔｏｎ， Ａｍ． Ｐｅｒｆｕｍｅｒ Ｃｏｓｍｅｔ．， ７２（４）：５４−５８ （１９５８）； Ｓｃｈｍｏｌｋａ， Ｌｏｃ． ｃｉｔ． ８２（７）：２５−３０ （１９６７）； Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ， Ｓｃｈｉｃｋ， ｅｄ． （Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９６７）， ｐｐ． ３００−３７１．によって説明されている。多くのこのような化合物は、「リポロキサマー（ｌｉｐｏｌｏｘａｍｅｒ）」、「ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）」、「プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））」および「シンペロニクス（ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ）」という一般的な商品名で市販されている。Ｂ−Ａ−Ｂ型のポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ポリマーは、しばしば「リバースド（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）」プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、「プルロニック−Ｒ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｒ（登録商標））」または「メロキサポール（ｍｅｒｏｘａｐｏｌ）」と称される。
【０１００】
式（ＸＸＶＩＩ）の「ポロキサミン」ポリマーは、テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））という商品名でＢＡＳＦ社（Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ， ＭＩ）から市販されている。式（ＸＸＶＩＩ）で示されるポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンブロックの順序は逆でもよく、この場合には式（ＸＸＶＩＩＩ）のテトロニック−Ｒ（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ−Ｒ（登録商標））となり、これもまたＢＡＳＦ社から市販されている。Ｓｃｈｍｏｌｋａ， Ｊ． Ａｍ． Ｏｉｌ． Ｓｏｃ．， ５９：１１０ （１９７９）を参照。ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーはまた、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド反復単位のランダムな混合を含む親水性ブロックを用いて設計され得る。ブロックの親水特性を維持するためには、エチレンオキサイドを多く含ませるであろう。同様に、疎水性ブロックは、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド反復単位の混合物であり得る。このようなブロックコポリマーは、プルラドットＴＭ（ＰｌｕｒａｄｏｔＴＭ）という商品名でＢＡＳＦ社より市販されている。
【０１０１】
プルロニックの多くは、以下の式：
【０１０２】
【化２５】
2004509838.tif 000021
【０１０３】
に適合するように設計されている。
【０１０４】
ｍおよびｎの値は通常、統計的な平均で表され、与えられた分子の第一ブロックの反復単位数は通常、第三ブロックの反復単位数に正確に一致するわけではない。多くのブロックコポリマーの特徴は、式（ＸＸＩＸ）を引用して説明すれば、以下のようである。
【０１０５】
【表２】
2004509838.tif 000022
【０１０６】
オキシエチレンおよびオキシプロピレン単位の平均数は、業者より提供された平均分子量（ＭＷ）を用いて計算された。コポリマーの親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）は、業者（ＢＡＳＦ社）により決定された。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８： ２３０３−２３１４ （１９９５）記載の表面張力法により決定された。
【０１０７】
本発明に関する他の特異的なポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーには以下を含むものもある。
【０１０８】
【表３】
2004509838.tif 000023
【０１０９】
2004509838.tif 000024
【０１１０】
好ましい実施形態において、組成物は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体、および、少なくともひとつのブロックコポリマーを含み、該ブロックコポリマーはプルロニック（登録商標）Ｆ１２７およびＬ６１である。他の実施形態において組成物は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのブロックコポリマーを含み、該ブロックコポリマーはプルロニック（登録商標）Ｐ８５である。
【０１１１】
式（ＸＸＶＩＩ）で示されるジアミン結合ブロックコポリマーもまた、以下の式：
【０１１２】
【化２６】
2004509838.tif 000025
【０１１３】
で示されるジアミン結合ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマーファミリーの一つであり得る。式中、破線は第二の窒素に続いているポリエーテルの対称的なコピーを表しており、Ｒ＊は炭素原子が約２〜約６のアルキレン、炭素原子が約５〜約８のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、Ｒ１およびＲ２は（ａ）両方とも水素原子、または（ｂ）一方は水素原子であり他方はメチル、のいずれかであり、Ｒ３およびＲ４は（ａ）両方とも水素原子、または（ｂ）一方は水素原子であり他方はメチルのいずれかである。ここでＲ３およびＲ４の両方が水素原子の場合、Ｒ５およびＲ６の一つは水素原子であり他方はメチルであり、Ｒ３およびＲ４の一つがメチルの場合、Ｒ５およびＲ６の両方が水素原子である。
【０１１４】
あるブロックコポリマーの疎水性／親水性特性は、オキシプロピレン基の数に対するオキシプロピレン基の数の比に依存する。例えば、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）の単一のブロックコポリマーを含む組成物において、この関係は、中心の疎水性ブロックおよび末端の親水性ブロックの分子量を考慮すれば、以下のように表される。
【０１１５】
【数３】
2004509838.tif 000026
【０１１６】
式中、Ｈはオキシプロピレン単位の数であり、Ｌはオキシエチレン単位の数である。疎水性のＢ型セグメントおよび親水性のＡ型セグメントを含むブロックコポリマーのような一般的な場合において、疎水性−親水性特性およびミセル形成特性は、以下のように定義されるｎ値に関連する。
【０１１７】
【数４】
2004509838.tif 000027
【０１１８】
適切なｎ値を有するブロックコポリマーの選択は、特異的な物質の疎水性／親水性特性または、配合される物質の混合物の混合疎水性／親水性特性に依存する。典型的には、ｎは約０．２〜約９．０、より好ましくは約０．２５〜約１．５の範囲の値をとりうる。この範囲は、数値的な臨界としてではなく、主に親水性であるポリ（オキシエチレン）ブロックおよび主に疎水性であるポリ（オキシプロピレン）ブロック間の最適な疎水性／親水性バランスを表しているとしてみなされるべきである。
【０１１９】
本発明の重要な観点は、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）の異なるブロックコポリマーの混合物を用い、適切な粒子径を保持しつつ、あるサイトカインまたはいくつかのサイトカインの混合物に適当な、より特異的な疎水性−親水性バランスを得ることである。例えば、第一のブロックコポリマーにおいてｎは１．０であり、一方第二のブロックコポリマーにおいてｎは１．５である。ここでｎが１．３である材料を所望する場合、１質量部の第一のブロックコポリマーおよび１．５質量部の第二のブロックコポリマーを用いればよい。
【０１２０】
従って、このような混合物のより一般的な関係は以下のように示される。
【０１２１】
【数５】
2004509838.tif 000028
【０１２２】
式中、Ｈ１およびＨ２はそれぞれ第一および第二のブロックコポリマーにおけるオキシプロピレン単位の数であり、Ｌ１は第一のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり；Ｌ２は第二のブロックコポリマーにおけるオキシエチレン単位の数であり；ｍ１は第一のブロックコポリマーの質量比であり；およびｍ２は第二ブロックコポリマーの質量比である。一般的に、Ｎは約０．２〜約９．０、より好ましくは約０．２５〜約１．５の範囲の値をとるであろう。
【０１２３】
疎水性Ｂ型ブロックコポリマーおよび親水性Ａ型ブロックコポリマーを含むＫ個のブロックコポリマーの混合物という、さらにより一般的な場合の場合、Ｎ値は以下のように表される。
【０１２４】
【数６】
2004509838.tif 000029
【０１２５】
一種のポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーのみが用いられている場合、Ｎはｎに等しいであろう。類似した関係が、二つ以上のポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーを用いている組成物に適用される。
【０１２６】
ブロックコポリマーの混合物が使用されている場合、Ｎ値が用いられ、この値は、構成するコポリマーの質量比に基づいて平均された、関与している各コポリマーそれぞれについてのｎの加重平均であろう。Ｎ値は、コポリマー混合物のミセル形成特性を概算するのに用いられる。ブロックコポリマー混合物を使用すると溶解度が増し、血清タンパク質存在下でより疎水性のブロックコポリマーが凝集することを妨げる。特に、エチレンオキサイド含有量が５０％を超過するポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーは、エチレンオキサイド含有量が５０％以下である疎水性ブロックコポリマーを可溶化する。好ましくは、ブロックコポリマーの混合物は、７０％以上のオキシエチレン含有量を有するブロックコポリマーおよび、オキシエチレン含有量が５０％以下である少なくとも一つのブロックコポリマーを含む。より特異的には、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７が好ましい。このような混合物において、疎水性および親水性コポリマーの好ましい比は少なくとも２：１（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも５：１（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは少なくとも８：１（ｗ／ｗ）である。ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー以外のコポリマーが用いられる場合、あるポリマークラスの一つのポリマーの疎水性／親水性特性を、他のクラスのものの特性に関連させることに同様のアプローチが応用されうる。
【０１２７】
上記パラメータを用いて、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）の一つ以上のブロックコポリマーを、Ｎ値が約０．１〜約９、より好ましくは約０．２５〜約１．５になるように結合させる。結合したコポリマーはミセルを形成し、Ｎ値はこのようにして形成されたミセルのサイズにある程度影響を及ぼす。この範囲は広く変化し得るが、典型的には、ミセルは約１０〜約２５ｎｍの平均直径を持つ。得られた調製物の平均直径のほとんどは、準弾性光散乱技術によって簡単に測定できる。
【０１２８】
本発明の一実施形態によれば、組成物は、ポリヌクレオチドまたはその誘導体、および、ブロックコポリマーが分子溶液またはコロイド分散（コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体または他のタイプの分子凝集体または分子種を含むがこれらに限定されない）である少なくとも一つのポリエチレン−ポリプロピレンブロックコポリマーを含む。分子溶液またはコロイド分散において、ブロックコポリマーにより形成された分子種のサイズは、本発明の組成物の有用性を決定する一つの主要なパラメータである。体内へ投与した後、大きい粒子は網内皮系組織で除去され、容易に病変部位に輸送され得ない（例えばＫａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒ． Ｒｅｌｅａｓｅ， ２２， １４１ （１９９２）； Ｖｏｌｋｈｅｉｍｅｒ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｅ １４：２４７ （１９９３）； Ｋｗｏｎ ａｎｄ Ｋａｔａｏｋａ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． １６：２９５ （１９９５）を参照）。また、大きい粒子の細胞中の輸送および細胞内の運搬は、制限されるかまたはわずかである。例えばＬａｂｈａｓｅｔｗａｒ ｅｔ ａｌ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｓ． ２４：６３ （１９９７）を参照。３００ｎｍ〜１μｍ超のサイズを有する凝集したカチオン性分子種は、細胞のトランスフェクションに有効ではない。Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ， Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ （１９９８）および引用文献を参照。大きい粒子、特に正に荷電しているものは、一部肝臓や塞栓症への悪影響のため体内で高い毒性を示す。例えばＶｏｌｋｈｅｉｍｅｒ， Ｐａｔｈｏｌｏｇｅ １４：２４７ （１９９３）； Ｋｈｏｐａｄｅ ｅｔ ａｌ Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ５１：５５８ （１９９６）； Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｔ． Ｈｕｍ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ３９：７１ （１９９７）を参照。小さいポリマー分子種は非毒性であり、体内の細い毛細血管に入り、体内で病変部位に輸送され、生物学的関門（血液脳関門、腸上皮を含むがこれらに限定されない）を通過して、細胞内小胞に吸収されて細胞膜を通過し、細胞内の標的部位へ輸送される。このサイズ範囲の粒子は、より大きいサイズの微粒子に比べてより効果的に動脈壁を通過すると考えられている。Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｓ． ２４：６３ （１９９７）を参照。特定の理論に制限されることを望むわけではないが、体積に対する高い表面積比により、標的分子を用いたこのような粒子の良好な標的化には、小さなサイズは必須であるとも考えられる。本発明の組成物中で形成される分子種の好ましい範囲は、約３００ｎｍ未満、より好ましくは約１００ｎｍ未満、さらにより好ましくは約５０ｎｍ未満である。
【０１２９】
他の観点において本発明は、式（Ｉ）〜（ＸＩＩＩ）で示される少なくとも一つのブロックコポリマーを含むポリヌクレオチド複合体に関し、ここでＡ型およびＢ型ブロックは大体は式−０−Ｒ９の反復単位で構成され、式中、Ｒ９は：
（１）−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ（Ｒ６）であり、ここでｎは０〜約５の整数であり、Ｒ６は水素、炭素原子３〜８のシクロアルキル、炭素原子１〜６のアルキル、フェニル、アルキルが炭素原子１〜６を有するアルキルフェニル、ヒドロキシ、アルキルが炭素原子１〜６を有するヒドロキシアルキル、炭素原子１〜６のアルコキシ、炭素原子２〜７のアルキルカルボニル基、アルコキシが炭素原子１〜６を有するアルコキシカルボニル、アルコキシおよびアルキルがそれぞれ独立して炭素原子１〜６を有するアルコキシカルボニルアルキル、各アルキルが炭素原子１〜６を有するアルキルカルボキシアルキル、アルキル基が炭素原子１〜６を有するアミノアルキル、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子１〜６を有するアルキルアミンまたはジアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子１〜６を有するモノ−またはジ−アルキルアミノアルキル、クロロ、またはアルキルが炭素原子１〜６を有するクロロアルキル、フルオロ、アルキルが炭素原子１〜６を有するフルオロアルキル、シアノ、またはアルキルが炭素原子１〜６を有するシアノアルキル、またはカルボキシル；（２）環炭素原子３〜８の炭素環式化合物基であり、ここで該基は例えばシクロアルキルまたは芳香族基であり、これは炭素原子１〜６のアルキル、炭素原子１〜６のアルコキシ、炭素原子１〜６のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子１〜６を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロ、または、クロロ置換基を含んでいてもよい；または（３）環原子３〜８の複素環式化合物基であり、これはヘテロシクロアルキルまたはヘテロ芳香族基を含んでいてもよく、これらは酸素原子、窒素原子、硫黄原子およびこれらの混合物からなる群より選択されるヘテロ原子を１〜４含んでいてもよく、これらは、炭素原子１〜６のアルキル、炭素原子１〜６のアルコキシ、炭素原子１〜６のアルキルアミノ、各アルキルがそれぞれ独立して炭素原子１〜６を有するジアルキルアミノ、アミノ、スルホニル、ヒドロキシ、カルボキシ、フルオロまたはクロロ置換基を含んでいてもよい、である。
【０１３０】
好ましくは、ｎは１〜３の整数である。Ｒ５を含む炭素環式化合物基または複素環式化合物基は、好ましくは環原子が４〜７、より好ましくは環原子が５〜６である。ヘテロ環は好ましくは１〜２のヘテロ原子を含み、より好ましくは該ヘテロ環は一つのヘテロ原子を有する。好ましくは、該ヘテロ環は炭化水素または炭化水素類似体である。これらのポリヌクレオチドを生成するのに必要なモノマーは合成によって得られることは、当業者であれば理解するであろう。本技術の当業者であればわかるように、いくつかの場合において、モノマーの重合は適切な保護基の使用が必要であろう。一般的に、Ａ型およびＢ型ブロックは、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％が−ＯＲ５−で示される反復単位である。
【０１３１】
他の観点において、本発明は、式（Ｉ）〜（ＸＩＩＩ）のうち一つのブロックコポリマーを含むポリヌクレオチド複合体に関し、ここで、Ａ型およびＢ型ブロックは−Ｏ−Ｒ５で示される反復単位を必須として有し、式中、Ｒ７は炭素−炭素のアルキル基（Ｃ ｔｏ Ｃ ａｌｋｙｌ ｇｒｏｕｐ）である。
【０１３２】
本発明で用いられるブロックコポリマーは一般的に、特定の環境下で直径約１０ｎｍ〜約１００ｎｍのミセルを形成する。ミセルは、水溶液中において両親媒性物質の非極性部分のミクロ相分離によって形成される、特定の両親媒性分子の超分子複合体である。ミセルは、特定の温度で、両親媒性物質の濃度が該両親媒性物質固有の臨界ミセル濃度（「ＣＭＣ」）に達した場合に形成される。このようなミセルは一般的に、約１０〜約３００のブロックコポリマーを含む。ブロックコポリマーの親水性および疎水性部分の大きさを変えることにより、生理学的な状況でのコポリマーのミセル形成傾向を変えることができる。ミセルは、Ｂブロックの水不溶性反復単位で形成された高密度コア（ｄｅｎｓｅ ｃｏｒｅ）、荷電が中和された核酸（ｃｈａｒｇｅ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、および、Ａブロックで形成された親水性殻を有する。ミセルは、溶液中において並進および回転の自由を有しており、ミセルを含む溶液は水同様の低い粘度を有する。ミセル形成は、一般的に約０．００１〜５％（ｗ／ｖ）のコポリマー濃度で起こる。一般的に、ポリカチオン性ポリマーおよびポリ核酸の濃度は、ポリヌクレオチド組成物中のコポリマーの濃度より低く、好ましくは少なくとも約１０倍未満、より好ましくは少なくとも約５０倍未満である。
【０１３３】
本発明で用いられるブロックコポリマーのいくつかは、高濃度でゲルを形成するであろう。これらのゲルは、コポリマー分子の並進および回転の自由がコポリマー分子間の相互作用の連続したネットワークにより顕著に強制される粘性系である。ゲル中においてＢブロック反復単位のミクロ分離は、生じるかもしれないし、生じないかもしれない。ゲルの形成を防ぐために、ポリマー濃度（ブロックコポリマーおよびポリエーテル／ポリカチオンポリマーの両方に関する）は好ましくは約１５％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは約１０％未満、さらにより好ましくは約５％未満であろう。本発明の第一の実施形態において、ゲルは回避されることがより好ましい。
【０１３４】
ポリヌクレオチド組成物がカチオン性成分を含む場合、該カチオンはポリヌクレオチドのリン酸基と会合し、リン酸基の荷電を中和し、ポリヌクレオチド成分をより疎水性化させる。この中和は、好ましくはＲ型ポリマーセグメントまたはポリカチオン性ポリマー上のカチオンによってなされる。しかしながら、リン酸の電荷は、化学的な改変によって、または、Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウムクロライド］のような疎水性カチオンとの会合によっても中和され得る。水溶液中において、電荷が中和されたポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド複合体」と称される超分子ミセル様粒子を形成して沈殿する。疎水性核または複合体は、電荷が中和されたポリヌクレオチドおよびＢ型コポリマーブロックを含む。親水性殻は、Ａ型コポリマーブロックを含む。複合体の大きさは、一般的に直径が約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲で変化する。ある環境においては、組み込まれなかった成分から複合体を分離することが実用的である。これは例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分離され得る。
【０１３５】
ポリヌクレオチド組成物の成分比は、組成物中のポリヌクレオチドの効果的な膜間透過性を最適化するのに重要な要素である。この比は比φとみなすことができ、これは、生理学的なｐＨで、組成物中の正に荷電した基の、負に荷電した基に対する比である。φ＜１の場合、複合体は、ポリヌクレオチドにより中和されていないリン酸塩を含む。中和されていない電荷に隣接したポリヌクレオチド部分は、ポリヌクレオチド複合体のシェルの一部になると考えられる。同様に、φ＞１の場合、ポリカチオン性ポリマーまたはＲ型セグメントは中和されていない電荷を有し、中和されていない部分は複合体のシェルの一部を形成するために折り畳まれるであろう。一般的に、φは約０（この場合、カチオン性の基は存在しない）〜約１００の範囲で変化し、好ましくはφは約０．０１〜約５０、より好ましくは約０．１〜約２０の範囲で変化するであろう。φは、膜間輸送の効率を上げるために変えてもよいし、組成物がポリヌクレオチド複合体を含む場合には、複合体の安定性を上げるために変えてもよい。φの多様性はまた、動物に投与された後の複合体の生体内分布に影響を与え得る。最適なφは、特に（１）ポリヌクレオチド複合体が用いられている環境、（２）用いられている特異的なポリマーおよびオリゴヌクレオチド、（３）標的化された細胞または組織、および（４）投与方法、に依存するであろう。
【０１３６】
界面活性剤を含むポリヌクレオチド組成物　本発明はまた、ポリヌクレオチド、カチオン性コポリマーおよび適切な界面活性剤の組成物も含む。界面活性剤は、（ｉ）カチオン性（様々なトランスフェクションカクテルにおいて用いられるものを含む）、（ｉｉ）非イオン性（例えばプルロニックまたはテトロニック）、または（ｉｉｉ）両性イオン（ベタインおよびリン脂質を含む）である。これらの界面活性剤は複合体の溶解度を増し、組成物の生物学的活性を増す。
【０１３７】
適切なカチオン性界面活性剤としては、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン（例えばＮ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１，３−ジアミノプロパン）、第４級アミンの塩（例えばドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合されたアルキルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、メチルベンゼトニウムクロライド、デカメトニウムクロライド、メチルが混合されたトリアルキルアンモニウムクロライド、メチルトリオクチルアンモニウムクロライド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２−（２−メチル−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノキシエトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロライド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−［２−（２−ｍｅｔｈｙｌ−４−（１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｂｕｔｙｌ）−ｐｈｅｎｏｘｙ）−ｅｔｈｏｘｙ］ｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｍｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウムクロライド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３−（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｙｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｙｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート）、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（例えば、セチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロライド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラフォーム電解質（ｄｉｃａｔｉｏｎｉｃ ｂｏｌａｆｏｒｍ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ）（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセリルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン（例えば、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（またはＤ）−リジン（ＬＰＬＬ，ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンに結合したポリ（Ｌ（またはＤ）−リジン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタメートエステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタメートエステル（Ｃ１４ＧｌｕＣｎＮ＋）、コレステロールのカチオン性誘導体（例えば、コレステリル−���β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシルアミドエチレンジメチルアミン、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン−カルボモイル）コレステロール］）を含む。
【０１３８】
適切な非イオン性界面活性剤としては、ｎ−アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ｎ−アルキルポリオキシエチレンエーテル（例えばトリトンＴＭ）、ソルビタンエステル（例えば、スパンＴＭ）、ポリグリコールエーテル界面活性剤（テルギトールＴＭ）、ポリオキシエチレンソルビタン（例えばトゥイーンＴＭ）、ポリソルベート、ポリオキシエチル化グリコールモノエーテル（例えばＢｒｉｊＴＭ、ポリオキシエチレン９ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン１０エーテル、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル）、ルブロール、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイドのコポリマー（例えばプルロニックＴＭ、プルロニックＲＴＭ、テロニックＴＭ、プルラドットＴＭ）、アルキルアリールポリエーテルアルコール（チロキサポールＴＭ）、パーフルオロアルキルポリオキシ化アミド、Ｎ，Ｎ−ビス［３−Ｄ−グルコンアミドプロピル］コラミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノジド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノジド、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−ノナノイル−β−Ｄ−グルコピラノジド１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス［３−グルコンアミドプロピル］デオキシコラミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ジギトニン、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオガラクトピラノジド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノジド、を含む。
【０１３９】
適切な両性イオン性界面活性剤としては、ベタイン（Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｎ＋Ｒ’ＣＯ２−、式中、Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ’は炭化水素鎖であり、Ｒ１が最も長い）、スルホベタイン（Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｎ＋Ｒ’ＳＯ３−）、リン脂質（例えば、ジアルキルホスファチジルコリン）、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、およびジアルキルホスファチジルエタノールアミンを含む。
【０１４０】
ポリヌクレオチド／核酸　広範多種のポリヌクレオチドまたは核酸分子が組成物のポリヌクレオチド成分になり得る。これらは、ウイルス、天然および合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、それらの類似体、またはこれらの誘導体、ならびに、（親油性基、光誘導性架橋基、アルキル化基、有機金属化合物基、挿入基、親油性基、ビオチン、蛍光性、および放射性基、ならびに、リン酸主鎖を改変する基、を含む基を組み込むために）共有結合で改変されている核酸分子、を含む。このような核酸分子は、アンチセンス核酸分子、ウイルス、ウイルスベクター、遺伝子をコードしたＤＮＡ（通常、適切なプロモータ配列を含む）、リボザイム、アプタマー、抗原核酸、オリゴヌクレオチドα−アノマー、エチルホスホトリエステル類似体、アルキルホスホメート、ホスホロチオネートおよびホスホロジチオネートオリゴヌクレオチドおよびこれら様のものを含むがこれらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、分泌性もしくは非分泌性タンパク質またはペプチド、ワクチンまたは抗原をコードする核酸分子であり得る。実際には、核酸成分は、動物に投与した後、より高効率で細胞に輸送されるのに有利であり、分解過程に対して安定であり、または、その生体内分布が改善されるような任意の核酸であり得る。
【０１４１】
標的分子　場合によっては、非共有結合的な会合により標的分子を組み込むことが望ましい。例えば、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２２：１４１ （１９９２）を参照、この内容はここに参照されることにより組み込まれる。組成物に会合され得る標的分子は、一般的に細胞の部位および疎水性基に対して親和性がある標的基を有する。標的分子は、自発的にポリヌクレオチド複合体と会合し、疎水性基を介してそこで「アンカー」になるであろう。組成物中においてこれらの標的付加体は、一般的に約１０％以下のコポリマーを含むであろう。
【０１４２】
標的分子において、疎水性基は、特に脂肪族アシル基のような脂質基であり得る。あるいは、それはブロックコポリマーまたは他の天然合成ポリマーであり得る。標的分子の標的基はしばしば、一般的にはある細胞表面の抗原に対して特異性を有する抗体を含む。それはまた、例えば細胞表面受容体との特異的な相互作用を有するホルモン、または細胞表面受容体を有する薬剤であり得る。例えば、糖脂質は、多糖の受容体を標的化するのに機能する。標的分子は、Ｒ型ポリマーブロックを含むここで挙げられた任意のポリマーブロックおよびポリカチオン性ポリマーに結合され得る。例えば、標的分子は、本発明のブロックコポリマーのポリエーテルセグメントの、自由末端基に共有結合され得る。このような標的分子は、式ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸ、ＸＸおよびＸＸＩで示されるポリマーの−ＯＨ末端基、および、式ＸＶＩＩＩ（好ましくは末端のリジン残基のε−アミノ基）、ＸＸまたはＸＸＩＩＩで示されるポリマーの−ＮＨ２末端基、または、式ＸＶＩＩＩおよびＸＩＸで示されるポリマーの−ＣＯＯＨ末端基に共有結合し得る。標的分子は、例えばＳｏｕｋｃｈａｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ６：４３ （１９９５）， ｏｒ Ａｒａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ６：４３ （１９９５）に記載されているように紡錘菌由来のペプチド（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を、核型ペプチド（ｃａｒｙｏｔｙｐｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を、または細胞への部位指向的輸送（特に、エンドソーム性の小胞から細胞質への移動、または、核への運搬）を提供する生物学的に特異的な他の基を標的分子として用いて、ポリヌクレオチド組成物の細胞内輸送、例えば核への輸送、を促進するために用いられ得る。
【０１４３】
組成物のポリヌクレオチド成分は、任意のポリヌクレオチドであり得るが、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも５個の塩基を有するポリヌクレオチドである。さらにより好ましくは少なくとも１０個の塩基である。ウイルスのゲノムおよびウイルス（脂質またはタンパク質のウイルス外殻を含む）も適切なポリヌクレオチドに含まれる。これは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス−ウイルス、またはポックスウイルスを含むがこれらに限定されないウイルスベクターを含む。本発明に用いられる他の適切なウイルスベクターは、当業者には明白であろう。「ポリ（核酸）」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ここでは同じ意味で使用されている。オリゴヌクレオチドとは、ＤＮＡおよびＲＮＡのようなポリヌクレオチドである。
【０１４４】
ポリヌクレオチド誘導体は、一以上の部分を有するポリヌクレオチドであり、（ｉ）該部分は、結果生じる物質がポリヌクレオチドとして機能できるように、開裂され、不活性化され、そうでなければ改変される、または（ｉｉ）該部分は、誘導体がポリヌクレオチドとして機能することを妨害しない。
【０１４５】
治療用途　本発明の組成物は、様々な治療に用いられ得る。好ましい実施形態において、該組成物は樹状細胞の活性化もしくは増殖を誘導するため、および、上記記載の組成物を投与することにより、動物における免疫応答を増強させるために用いられる。好ましくは、樹状細胞活性化誘導のための該組成物は、ポリヌクレオチドおよび、少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む。より好ましくは、該ブロックコポリマーは、プルロニックＦ１２７およびＬ６１である。さらにより好ましい実施形態においては、該ブロックコポリマーは約２％（ｗ／ｖ）のＦ１２７および約０．０２５％のＬ６１の混合物である。他の特異的な実施形態においては、該ブロックコポリマーはプルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１の１０倍希釈物であり、他の実施形態においては、該ブロックコポリマーはプルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１の１００倍希釈物である。別の特異的な実施形態においては、該ブロックコポリマーは、プルロニックＦ１２７およびＬ６１の８：１の混合物である。
【０１４６】
例えば、組成物は、遺伝子置換または除去治療、および遺伝子付加治療を含む遺伝子治療に用いられ得る（Ｂ． Ｈｕｂｅｒ， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ； Ｂ．Ｅ． Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｊ．Ｓ． Ｌａｚｏ Ｅｄｓ．， Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｎ．Ｙ．， １９９４， ｐｐ． ６−１１）。また、アンチセンス治療は、細胞の核および／または細胞質中の遺伝子を標的とする結果、それらを阻害する（Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００４ （１９９３）； Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， ２８：３６６ （１９９５））。アプタマー核酸薬剤は、細胞内および細胞外両方のタンパク質、ペプチドおよび小分子を標的にする。Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）， ３４６：８１８ （１９９０）を参照。抗原核酸化合物は、核中の二重鎖ＤＮＡを標的とするのに用いられ得る。Ｈｅｌｅｎｅ ａｎｄ Ｔｏｌｕｍｅ， Ｂｉｏｃｈｉｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．， Ａｃｔａ １０４９：９９ （１９９０）を参照。触媒性ポリヌクレオチドは、核および／または細胞質中のｍＲＮＡを標的とする。Ｃｅｃｈ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：６０５ （１９９２）。
【０１４７】
置換、阻害および／または付加された遺伝子の例としては、治療用分泌タンパク質、非分泌タンパク質、ワクチンおよび抗原、アデノシンデアミナーゼ、腫瘍壊死因子、細胞成長因子、ＩＸ因子、インターフェロン（例えばα−、β−およびγ−インターフェロン）、インターロイキン（例えばインターロイキン２，４，６および１２）、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＳＶ−ＴＫ、ＣＦＴＲ、ＨＩＶ−１、β−２、ミクログロブリン、レトロウイルス遺伝子（例えばｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘおよびｒｅｘ）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス遺伝子（例えば単純疱疹ウイルスタイプＩおよびＩＩ遺伝子ＩＣＰ２７／ＵＬ５４、ＩＣＰ２２／ＵＳ１、ＩＣＰ／ＩＥ１７５、プロテインキナーゼおよびエキソヌクレアーゼ／ＵＬ１３、プロテインキナーゼ／ＵＳ３、リボヌクレアーゼレダクターゼＩＣＰ６／ＵＬ３９、かなり初期の（ＩＥ）ｍＲＮＡ　ＩＥ３／ＩＥ１７５／ＩＣＰ４，１Ｅ４／ＩＣＰ２２／ＵＳ１，ＩＥ５／ＩＣＰ４７，ＩＥ１１０、ＤＮＡポリメラーゼ／ＵＬ３０、ＵＬ１３）、ヒト多剤耐性遺伝子（例えばｍｄｒｌ）、腫瘍遺伝子（例えばＨ−ｃ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｂ、ｂｃｌ−２、ｂｃｒ／ａｂｌ）、ガン抑制遺伝子ｐ５３、ヒトＭＨＣ遺伝子（例えばクラス１ＭＨＣ）、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）、ヘモグロビンαおよびβ鎖、酵素（例えば炭酸脱水素酵素、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ、フェニルアラニンヒドロラーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グルコセロブロシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ダイソトロピン、フィブロネクチン、アポリタンパク質Ｅ、嚢胞性繊維症の膜間コンダクタンスタンパク質、ｃ−ｓｒｃタンパク質、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え活性化タンパク質、免疫遺伝子、ペプチドおよびタンパク質抗原（「ＤＮＡワクチン」）、およびこれら様のものを含む。
【０１４８】
本発明によれば、二以上のプラスミドもしくは遺伝子が発現しうる。これは、抗原を発現する少なくとも一つの遺伝子、および、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞を活性化し、それによって抗原提示の増強および免疫応答の誘導のためのアジュバントとして機能できる分子；例えばサイトカイン、を発現する少なくとも一つの遺伝子を含んでもよい。このようなアジュバントの例としては、インターロイキン−１２、Ｆｌｔ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４Ｏリガンドのようなインターロイキンを含むがこれらに限定されない。抗原には、免疫応答が生じるどのような産物でもなりうる。加えて、抗原もしくはアジュバントタンパク質を遺伝子治療と併用してもよい。例えば、ＦＬＴ−３リガンドを、抗原をコードするプラスミドもしくはレトロウイルスとともに体内に注入することができる。
【０１４９】
プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１混合物は、樹状細胞の浸潤を誘導するサイトカインおよびケモカイン様と知られている、ＮＦ−κＢ誘導性遺伝子を誘導することができる。下記に示すように、ＳＰ１Ｏ１７はプロモーター依存性を有し、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を助けるようである。ＣＭＶプロモーターもしくはＮＦ−κＢ感受性エレメントカセットにより誘導されるＤＮＡ構築物は、ＳＶ−４０プロモーターもしくはＡＰ−１感受性カセットによる構築物と比較して、プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１のキャリア作用に対してかなり応答性であることが研究により証明されており、プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１は、デリバリー作用に加えて、導入遺伝子発現の転写調節を妨げることにより生物学的応答調節剤として機能しているということが示唆されている。
【０１５０】
ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニット（ＲｅｌＡ、ＮＦκＢ３、およびＮＦ−κＢ　ｐ６５サブユニットとしても知られている）は、ｐ５０、ｃＲｅｌ、ｐ５２およびＲｅｌＢを含む、Ｒｅｌ／ＮＦ−κＢ転写因子ファミリーの一員である。ＮＦ−κＢ　ｐ６５サブユニットははじめ、保存ドメインを癌原遺伝子ｃＲｅｌに渡すためのプローブとして用いたＪｕｒｋａｔＴ細胞から単離され（Ｒｕｂｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５１， １４９０−１４９３）、それ以来、自然発生的な転換によるタンパク質の変異体が存在することが示されている（Ｎａｒａｙａｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９２， ２５６， ３６７−３７０）。加えて、ＮＦ−κＢ結合ＤＮＡ配列が多くの遺伝子において発見され、それが遺伝子の機能の発現に、実際に重要であることが示されている。ＮＦ−κＢ結合配列（κＢモチーフ）は、Ｇ（グアニン）クラスターで始まり、Ｃ（シトシン）クラスターで終わる共通配列を有する約１０塩基からなる。（コンセンサス配列　５’−ＧＧＧＲＮＮＹＣＣＣ−３’）。しかしながら、炎症性タンパク質として知られているインターロイキン−１（以下、ＩＬ−１と称することもある）および腫瘍壊死因子（以下、ＴＮＦと称することもある）の遺伝子上に、ＤＮＡ結合タンパク質が結合しうる多くの配列が存在しており、ＮＦ−κＢ結合配列はここにも存在していることが知られている（Ｃｌａｒｋ， Ｂ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｉ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４， ７８９８， １９８４； Ｎｅｄｏｓｐａｓｏｖ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， ５１， ６１１， １９８６）。ＮＦ−κＢの結合により、ｍＲＮＡへの転写が阻害されることが報告されている（Ｈｉｓｃｏｔｔ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １３， ６２３１， １９９３； Ｃｏｌｌａｒｔ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０， １４９８， １９９０）。
【０１５１】
遺伝病もまた、該組成物により治療することができる。このような疾患は、リウマチ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、α−サラセミア、β−サラセミア、カルボニックアンヒドラーゼＩＩ欠損症、トリオースリン酸イソメラーゼ欠損症、テトラヒドロビオプテリン欠損性高フェニルアラニン血症、古典的フェニルケトン尿症、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィーのような筋ジストロフィー、高サルコシン血症、腺腫性腸ポリポーシス、アデノシンデアミナーゼ欠損症、悪性黒色腫、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、動脈硬化症および高コレステロール血症、Ｇａｕｃｈｅｒ病、嚢胞性線維症、大理石骨病、自然発生腫瘍の増加、ＴおよびＢ細胞免疫不全、高コレステロール、慢性関節リウマチを含む関節炎、緑内障、アルコール中毒症およびこれらに類似した症状、を含む。
【０１５２】
該組成物は、乳癌（例えば、胸部、膵臓、胃、前立腺、結腸直腸、肺、卵巣）、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、黒色腫及び悪性黒色腫、進行癌血友病Ｂ、腎細胞癌、膠芽腫、星状細胞腫、神経膠腫、ＡＭＬおよびＣＭＬなどの症状を含むがこれらに限定されない腫瘍性疾患の治療にも用いることができる。
【０１５３】
さらに該組成物は、（ｉ）脳卒中、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ筋ジストロフィーに関連した心筋症、心筋虚血、再狭窄およびこれらに類似した症状を含むがこれらに限定されない心血管性疾患、（ｉｉ）肝炎、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ、ヘルペス、ＣＭＶおよびＣＭＶｒｅｎｉｔｉｓのような関連疾患、のような感染性疾患、（ｉｉｉ）腎移植の拒絶反応およびこれに類似した症状のような移植関連障害、の治療に用いることができ、（ｉｖ）黒色腫ワクチン、ＨＩＶワクチン、マラリア、結核およびこれらに類似したワクチンを含むがこれらに限定されないワクチン療法および免疫処置療法において有用である。ポリヌクレオチドおよびウイルスがワクチンおよび免疫処置に用いられる全ての適用において、該組成物は有用である。
【０１５４】
標的細胞　本発明はまた、本発明の組成物を投与することからなる、ポリヌクレオチドを細胞にデリバリーする方法にも関する。一つの実施形態において、細胞にポリヌクレオチドをデリバリーする方法は、ブロックコポリマーはゲルを形成するには不十分な量で存在する、ポリヌクレオチドまたはその誘導体および少なくとも一つのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む組成物を投与することを含む。他の実施形態において、該ブロックコポリマーは約１５％（ｗ／ｖ）未満の濃度で存在し、より好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）未満の濃度で存在し、最も好ましくは約５％（ｗ／ｖ）未満の濃度で存在する。更なる実施形態は、該組成物は分子溶液またはコロイド分散を形成し、より好ましくは、該コロイド分散は、サスペンジョン、エマルション、ミクロエマルション、ミセル、ポリマー複合体、または他のタイプの分子凝集体である
ポリヌクレオチド組成物のデリバリーのための標的細胞は、樹状細胞、原核もしくは真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞であるが、これに限定されない。細胞標的は生体外および／または生体内であり、ＴおよびＢ細胞、原発性慢性骨髄性白血病、腫瘍浸潤リンパ球、腫瘍細胞、白血病細胞（ＨＬ−６０、ＭＬ−３、ＫＧ−１およびこれらの類似体など）、皮膚線維芽細胞、筋芽細胞、一次ニューロンを含む中枢神経系の細胞、肝細胞、癌腫（Ｂｌａｄｄｅｒ癌腫Ｔ２４、ヒト結腸癌腫Ｃａｃｏ−２など）、黒色腫、ＣＤ３４＋リンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、造血細胞、神経芽腫（ＬＡＮ−５およびこの類似体など）、神経膠腫、リンパ腫（バーキットリンパ腫ＳＴ４８６など）、ＪＤ３８）、Ｔ細胞ハイブリドーマ、一次平滑筋のような筋細胞、およびこれらの類似体を含む。
【０１５５】
使用方法　本発明のポリヌクレオチド組成物は例えば、ニワトリ、ブタ、雌ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、魚、小エビ、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを含むがこれらに限定されない、動物の治療に用いることができる。本発明のポリヌクレオチド組成物は、経口で、局所的で、経直腸で、経膣で、エアロゾルを用いて経肺的に、もしくは非経口的に、すなわち、筋肉内に、皮内に、皮下に、腹腔内にまたは静脈内に投与することができる。樹状細胞の活性化を誘導し、動物における免疫応答を増強するために、好ましい投与経路は、静脈内、経口、皮内、筋肉内、皮下もしくは腹腔内を含むがこれに限定されない。好ましくは、該投与経路は腫瘍への直接注入である。該ポリヌクレオチド組成物は単独で、もしくは、標準的な調剤実務にしたがって、調剤的に許容できるキャリアーもしくは賦形剤と組み合わせて投与することができる。経口投与のために、該ポリヌクレオチド組成物は、錠剤、カプセル、舐剤、トローチ、散剤、シロップ、エリキシル、水溶液、およびサスペンジョン、およびこれらの類似体として用いられることができる。錠剤の場合には、使用されるキャリアーは乳糖、クエン酸ナトリウムおよびリン酸塩を含む。デンプンのような様々な崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤が、錠剤において通常用いられる。カプセルの形状で経口投与するために、有用な希釈剤は、乳糖および高分子量のポリエチレングリコールである。経口使用のため水性懸濁液が必要な際には、ポリヌクレオチド組成物を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせることができる。必要とあらば、甘味剤および／または矯味剤を加えることができる。非経口使用のためには、結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の滅菌液が通常調製され、該溶液のｐＨは適当に調節され緩衝化される。静脈内使用のためには、調製液を等張化するために、溶質の総濃度を調節すべきである。目に投与するためには、綿棒や点眼器のような技術として知られている眼のデリバリーシステム（ｏｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ）により、軟膏や滴下可能な液体を導入してもよい。このような組成物はヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはポリ（ビニルアルコール）のような粘膜模擬剤（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、ソルビン酸、ＥＤＴＡもしくは塩化ベンジルクロニウムのような防腐剤、および通常量の希釈剤および／またはキャリアーを含むことができる。経肺的投与のためには、エアロゾルが形成できるよう適当に希釈剤および／またはキャリアーを選択する。
【０１５６】
筋肉内投与のためには、裸のポリヌクレオチド自体は、ポリカチオンを含まないデリバリーシステムによって筋肉内に移行し発現できるため、ポリヌクレオチドの配合物にポリカチオン性成分があってはならない。筋肉は以下の特徴を有する：独特な細胞構造、筋管あたり複数の核、特異的ポリヌクレオチド結合タンパク質（トリアジン）および独特の核−細胞質輸送。上記のどの特徴が筋肉において裸のポリヌクレオチドの取り込みおよび発現に関与しているのかについては、現在において、まだ明らかではない。ポリヌクレオチドのカチオン性複合体が、ほとんど全ての型の組織において取り込みおよび遺伝子発現を増強することが示されているが、驚くべきことに、同じ複合体が、筋肉においてはよりよい取り込みおよび遺伝子発現に貢献しないのである。実際、ポリヌクレオチドのカチオン性複合体形成は筋肉において取り込みおよび遺伝子発現を阻害し、いくつかの研究所により報告がされている。したがって、ポリヌクレオチドを筋肉内注入するためには、ポリヌクレオチドの複合体化は避けるべきである。本発明は、ポリヌクレオチドの筋肉内導入には非イオン性ブロックコポリマーを用いる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、遺伝物質を細胞内に移行させるのにブロックコポリマー単独では全く不十分である（実施例４２参照）。さらに、ポリカチオン含有ブロックコポリマーとは異なり上述の非イオン性ブロックコポリマーは、肺、肝、腎のような末梢器官における遺伝子発現を増加させない。
【０１５７】
以下の例は、本発明の特徴をより代表して表すのに有用であろうが、それらの範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【０１５８】
実施例１
形質移入効率
この実験においては、プラスミドｐβ−Ｇａｌを、マウス乳腺癌系のＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入した。プラスミドｐβ−Ｇａｌは、真核生物の転写単位および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼのハイブリッドが組み込まれているプラスミドｐＵＣ１９（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｒｕｓｓｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより入手）を含む。このプラスミドを用いて、処置された細胞から得られるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、細胞の取り込み効率を測定することができる。用いられたコポリマーは、ｘとｚとの和は５１であり、ｙは３９である式（ＸＩＶ）のトリブロックコポリマー（以下、「プルロニックＡ」）であった。用いられたポリカチオンは、ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド）（「ｐＥＶＰ−Ｂｒ」）であった。１０μｇ／ｍｌのｐβ−Ｇａｌ（大多数がスーパーコイル）溶液は、１０ｍｇ／ｍｌのプルロニックＡおよび４５μｇ／ｍｌのｐＥＶＰ−Ｂｒを含むＰＢＳ溶液中で調製された。これらの量は、ポリカチオン塩基のプラスミドリン酸基に対する比が約１０になるように計算された。プルロニックＡのＤＮＡに対する比は約１０４であった。このストック調製物はろ過滅菌され、その一部分が無血清ダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）で１０倍に希釈され、ｐβ−Ｇａｌの濃度を１μｇ／ｍｌとした。この溶液を、「プルロニックＡ形質移入培地」とした。
【０１５９】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のもとで、２ｍＭグルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（「ＦＣＳ」）を含むＤＭＥＭ培地を用いて単層培養で成長させた。単層培養で成長させた細胞は回収され、新鮮な培地で３回洗浄することにより処理プロセス用（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）に調製された。
【０１６０】
本発明の方法により形質転換される、洗浄された細胞の一部は、プルロニックＡ形質移入培地に１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁された。懸濁された細胞は、３７℃、５％ＣＯ２のもとで２時間インキュベートされた。次に細胞は新鮮な培地で洗浄され、再び平板培養された。
【０１６１】
リン酸カルシウム沈殿により形質移入される細胞の一部は、Ｐｒｏｍｅｇａ ｏｆ Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ， １９９０によって推奨される方法によって形質移入された。詳細には、ｐβ−Ｇａｌは、０．２５ＭのＣａＣｌ２と混合された。その混合物は、等量の２×ＨＢＳ（ハンクスバッファーソルト（Ｈａｎｋｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｔ）、ＧＩＢＣＯ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹより入手）と混合され、１μｇ／ｍＬのｐβ−Ｇａｌを含む混合物を作製した。不透明な混合物は室温で１０分間インキュベートされ、その後細胞に添加された。懸濁された細胞は３７℃、５％ＣＯ２のもとで２時間でインキュベートされた。その細胞は新鮮な培地で洗浄され、再び平板培養された。
【０１６２】
継代した細胞（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で４８時間インキュベートされた。インキュベート中、１６時間で培地は新鮮な培地と交換された。４８時間インキュベートした後、各インキュベートした細胞は掻きとって回収され、ＰＢＳで洗浄され、０．２Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）１００μｌに再懸濁された。その細胞は、数回の凍結／融解サイクルにより溶解され、６，０００×／ｇ超で遠心分離された。上清５０μｌが各溶解産物チューブから分取され、０．１ｍＭの４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラニシド（基質）と０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の溶液５０μｌと混合された。各混合物は３７℃で２０分インキュベートされ、存在するすべてのβ−ガラクトシダーゼを基質に作用させた。β−ガラクトシダーゼ反応を終結させるためにｐＨ１０．５の０．４Ｍグリシン５０μｌが加えられた。β−ガラクトシダーゼ活性はメチルベリフェロン（ｍｅｔｈｙｌｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎ）の存在により表され、蛍光分光器（λｅｘ＝３６５ｎｍ，λ＝４５０ｎｍ）によって測定できる。結果を以下に示す。
【０１６３】
【表４】
2004509838.tif 000030
【０１６４】
実施例２
形質移入効率
これらの実験において、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来）を用いた形質移入効率が試験された。上記のように、ｐβ−Ｇａｌが標識ポリヌクレオチドとされた。ポリヌクレオチドのポリカチオン成分は、Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミドおよびＮ−セチル−４−ビニルピリジニウムブロミドがそれぞれ９７：３のモル比で結合しているコポリマー（以下、「ｐＥＶＰ−ｃｏ−ｐＣＶＰ−Ｂｒ」）を含んでいた。ブロックコポリマーは、ｘ＋ｚが１８であり、ｙが２３である式（ＸＩＶ）のトリブロックコポリマー（以下、「プルロニックＢ」）を含んでいた。１μｇ／ｍｌのｐβ−Ｇａｌ、３μｇ／ｍｌのＰＥＶＰ−ｃｏ−ｐＣＶＰ−Ｂｒおよび１％（ｗ／ｖ）のプルロニックＢのプルロニックＢ形質移入溶液は、実施例１で調製されたものであった。ポリカチオン塩基のヌクレオチドリン酸に対する比は約７であった。プルロニックＢのｐβ−Ｇａｌに対する質量比は、約５×１０３であった。
【０１６５】
ＭＤＣＫ細胞が、９０ｍｍプレート上でプレート当り８−１０５細胞で平板培養され、血清含有成長培地で一晩インキュベートされた。次いで血清含有培地は無血清培地と交換され、細胞は３７℃、５％ＣＯ２のもとで２４時間インキュベートされた。次いで、細胞をポリヌクレオチド複合体で処置するために、培地が５ｍｌプルロニックＢ形質移入溶液で交換された。細胞は、穏やかな振盪で、３７℃、５％ＣＯ２のもとでインキュベートされた。対照実験において、細胞はポリヌクレオチド複合体で形質移入され、培地はプルロニックＢ形質移入溶液５ｍｌで交換された。細胞は、穏やかな振盪で、３７℃、５％ＣＯ２のもとで２時間インキュベートされた。対照実験において、細胞は、（懸濁された細胞でなく、平板培養された細胞が形質移入されたことを除いて）上記したのと同様のリン酸カルシウム法を用いて形質移入された。
【０１６６】
プルロニックＢ形質移入溶液またはリン酸カルシウムで処置した後、細胞は５〜６回新鮮な培地で洗浄された。次いでそれらは、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２のもとで４８時間インキュベートされた。インキュベートして初めの１６時間後に培地は交換された。インキュベート後、細胞はＰＢＳで洗浄され、トリプシン処理によってそれらのプレートから分離され、再びＰＢＳで洗浄された。β−ガラクトシダーゼが実施例１と同様に測定された。結果を以下に示す。
【０１６７】
【表５】
2004509838.tif 000031
【０１６８】
実施例３
形質移入実験
これらの実験においては、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いた形質移入効率が試験された。ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチド成分はｐβ−Ｇａｌであった。ポリカチオン成分はｐＥＶＰ−Ｂｒを含んでいた。ブロックコポリマーは、ｉが１０であり、ｊが１２である式（ＸＶＩＩ）のオクタブロックコポリマー（以下、「プルロニックＣ」、ＢＡＳＦより入手）を含んでいた。１μｇ／ｍｌのｐβ−Ｇａｌ、４μｇ／ｍｌのｐＥＶＰ−Ｂｒおよび１％（ｗ／ｖ）のプルロニックＣのプルロニックＣ形質移入溶液は、実施例１と同様に調製された。塩基性基のヌクレオチドリン酸に対する比は１０であった。プルロニックＣのｐβ−Ｇａｌに対する質量比は１０３であった。形質移入手順は実施例２で用いられたのと同様であった。結果を以下に示す。
【０１６９】
【表６】
2004509838.tif 000032
【０１７０】
実施例４
細菌の形質転換
これらの実験において、バシラス　サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＭＣ５株を用いた形質転換効率が試験された。ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチド成分は、テトラサイクリン耐性をコードしたプラスミドであるプラスミドｐＢＣ１６であった。式（ＶＩ）で示されるブロックコポリマーが用いられた。特に、該ブロックコポリマーは、ｉは４４、ｊは２０である式（ＸＸＩ）で表されるポリ（オキシエチレン）−ポリ（（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド）であった。第二の実施形態のポリヌクレオチド複合体のストック溶液は、上記の形質移入溶液と同様に調製された。溶液中のコポリマー塩基性基のＤＮＡリン酸に対する比は０．２であった。細菌は、形質転換培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ， Ｆ．Ｎ．Ａ．Ｓ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． ４４：１０７２ （１９５８）を参照）であるスピジゼン１１（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ １１）中に懸濁され、細胞の一部は、ポリヌクレオチド複合体または単独のｐＢＣ１６いずれかの様々な濃度中でインキュベートされた。細胞は複合体または単独のＤＮＡとともに、３７℃で１時間インキュベートされた。インキュベートの後、細胞は１０ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む寒天培地で平板培養された。各実験条件下で生産されたテトラサイクリン耐性コロニーの数により測定された結果を以下に示す。
【０１７１】
【表７】
2004509838.tif 000033
【０１７２】
実施例５
ヌクレアーゼからの保護
この実施例においては、プラスミドｐＴＺ１９および、ｉが４４であり、ｊが２０である式（ＸＸＩ）で示されるジブロックコポリマー（ポリ（オキシエチレン）−ポリ（（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド）の複合体が形成された。ＰＢＳに溶解されたポリヌクレオチド複合体の溶液は、約４μｇ／ｍｌのプラスミドおよび２０μｇ／ｍｌのジブロックコポリマーを含んでいた。これらの量により、ポリカチオンブロックにおける塩基性基の、ＤＮＡリン酸基に対する比が５であった。対照のインキュベーションとして、等量の単独プラスミドが緩衝液に溶解された。単独ＤＮＡまたはポリヌクレオチド複合体を含む溶液サンプルにＰＶＵＩＩヌクレアーゼが加えられ、様々な消化時間の後に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、未消化の環状プラスミドＤＮＡの量が測定された。Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ３１：１４３７−１４４３ （１９９１）を参照。結果を以下に示す。
【０１７３】
【表８】
2004509838.tif 000034
【０１７４】
実施例６
オリゴヌクレオチドの安定化
この実施例においては、ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子の転写開始部位と相補的なオリゴヌクレオチド（ＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣを含む「アンチ−ｔａｔ」）を含む複合体が、式（ＸＩＸ）で表されるジブロックコポリマー（ｉが４４であり、ｊが８であるポリオキシエチレン−ポリ（Ｌ−アラニン−Ｌ−リジン））を用いて調製された。オリゴヌクレオチド複合体は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、オリゴヌクレオチド濃度が０．７５ＯＤ２６０／μｌになるように調製された。ポリカチオンのイミノおよびアミノ基の、ポリヌクレオチドリン酸基に対する比は約５０であった。その混合物は室温で１時間インキュベートされ、複合体を形成させた。次いでその複合体は、溶出液として０．０５ＭのＮａＣｌを用いたセファデックスＧ−２５のゲルろ過クロマトグラフィーにより精製された。得られた複合体溶液は、０．１１ＯＤ２６０／μｌのオリゴヌクレオチドの濃度を示した。非複合体オリゴヌクレオチドの比較溶液が調製された。マウス血漿の一部（１０μｌ）が、等量のオリゴヌクレオチド複合体溶液または単独オリゴヌクレオチド溶液と混合された。サンプルは３７℃で、様々な時間インキュベートされた。血漿中の酵素とオリゴヌクレオチドとの反応を止めるために、サンプルが水で希釈され、フェノール：クロロホルム（１：１）の水飽和混合物で抽出された。抽出物の水相が分離され、３％過塩素酸リチウムを用いてその中のオリゴヌクレオチドを沈殿させた。その沈殿はアセトンで洗浄され、次いで水１００μｌに溶解された。未分解のオリゴヌクレオチドの存在は、Ｃ１８−シラソーブカラム（４×９０ｍｍ、Ｇｉｌｓｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を用い、溶出液として０．０５Ｍトリエチル−アンモニウムアセテート（ｐＨ７．０）中のアセトニトリル勾配を用いて、高速液体クロマトグラフィーにより測定された。結果を以下に示す。
【０１７５】
【表９】
2004509838.tif 000035
【０１７６】
実施例７
オリゴヌクレオチドの安定化
この実験においては、式（ＸＸ）のジブロックコポリマー（ポリオキシエチレン−ポリ−プロピレンイミン／ブチレンイミン、ここでｉは４４であり、ｊは４〜８である）と複合体化された際の、実施例６に記載のオリゴヌクレオチドの安定性が試験された。オリゴヌクレオチド濃度が約０．１３ＯＤ２６０／μｌであったこと以外は、実施例６で適用されたのと同じ方法がこの実施例でも適用された。結果を以下に示す。
【０１７７】
【表１０】
2004509838.tif 000036
【０１７８】
実施例８
アンチセンスの細胞取り込み効率
この実験においては、ＳＫＶＬＢ細胞において多剤耐性を逆転する際の、「アンチ−ＭＤＲ」、すなわち、ＭＤＲ１遺伝子産物をコードしたｍＲＮＡの４２２〜４３８位に相補的な配列ＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＡＴＣＣＣの１７鎖のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子、の効率を試験した。ＳＫＶＬＢ細胞は、卵巣ガン細胞系由来の多剤耐性細胞である。ＭＤＲ１遺伝子は、ＳＫＶＬＢ細胞における多剤耐性に関与することがわかっている。Ｅｎｄｉｃｏｔｔ ａｎｄ Ｌｉｎｇ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５８：１３７ （１９８９）参照。特に、単独状態の場合と、本発明のポリヌクレオチド複合体中のアンチ−ＭＤＲオリゴヌクレオチドとの効率が比較された。対照として、上記の単独かつ完全な形態のアンチ−ｔａｔオリゴヌクレオチドもまた用いられた。ポリヌクレオチド複合体は、式（ＸＸ）で表されるジブロックコポリマー（ポリオキシエチレンポリプロピレンイミン／ブチレンイミン、ここでｉは４４であり、ｊは９〜１０である）を用いて形成された。複合体は、実施例６に記載の方法によって調製された。複合体中のまたは単独状態のオリゴヌクレオチド濃度は０．１７ＯＤ２６０／μｌであった。コポリマーは、ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基のオリゴヌクレオチドリン酸基に対する比を１０にするのに十分な濃度で存在していた。
【０１７９】
ＳＫＶＬＢ細胞は、３７℃、５％ＣＯ２のもとで３日間、単独または完全なオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド含有量に基づき２０μＭの濃度で）の存在下でインキュベートされた。単独または完全なオリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地が１２時間毎に添加された。
【０１８０】
上記のように処置された細胞に関するダウノマイシン細胞毒性（ＩＣ５０）が、Ａｌｌｅｙ ｅｔ． ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４８：５８９−６０１の方法を用いて測定された。結果を以下に示す。
【０１８１】
【表１１】
2004509838.tif 000037
【０１８２】
実施例９
ヘルペスウイルスを阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
この実験では１２鎖のオリゴヌクレオチドを用い、それらはその５’末端をウンデシルリン酸置換基で、３’末端をアクリジン基で共有結合的に改変されていた。このオリゴヌクレオチド改変は、Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎｔ．， ２５：７６７−７７３ （１９９１）に記載されている。用いられたオリゴヌクレオチド配列、ＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＵは、単純性疱瘡ウイルス１（「ＨＳＶ−１」）の９８３〜９９４位のスプライシング部位に相補的であった。対照として、インフルエンザウイルスによって生産されたＲＮＡに相補的な、同様に改変された配列（ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ）が用いられた。オリゴヌクレオチドは、複合体化した、または単独のいずれかの状態で、ＨＳＶ−１感染細胞に添加された。複合体が用いられた場合、複合体は式（ＸＩＸ）で表されるジブロックコポリマー（ポリオキシエチレン−ポリ（Ｌ−アラニン−Ｌ−リジン）、ここでｉは４４であり、ｊは８である）で形成された。オリゴヌクレオチド複合体は、実施例６に記載のように形成された。
【０１８３】
アフリカンマーモセットの腎臓細胞（「ベロ」細胞）を、Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＲＣ ， ２０３：９５９ （１９９４）に記載のように、ＨＳＶ−１ウイルス（Ｌ２株、Ｍｕｓｅｕｍ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒａｉｎｓ， Ｄ．Ｉ． ｌｖａｎｏｖｓｋｉｉ， Ｉｎｓｔ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．， Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎより入手）に感染させた。感染細胞はＰＢＳで洗浄された。洗浄後、１０％のウシ胎児血清および単独または複合体オリゴヌクレオチドを含む新鮮なＲＰＭＩ−Ｌ６４０培地が細胞に添加された。次いでその細胞は、３７℃、５％ＣＯ２のもとで２４時間インキュベートされた。その後細胞培地のＨＳＶ−１感染性が、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍａｈｙ， Ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９８５に記載されたパッチプロダクション法を用いて測定された。オリゴヌクレオチドの様々な濃度を用いた結果を以下に示す。
【０１８４】
【表１２】
2004509838.tif 000038
【０１８５】
実施例１０
ヘルペスウイルスを阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
特記されない限り、この実施例は実施例９で用いられたのと同じ方法を用いた。用いられた細胞はチャイニーズハムスター腎臓細胞系であるＢＨＫ細胞であった。オリゴヌクレオチドの複合体型が用いられた場合、その複合体は、式（ＸＶＩＩ）で表されるジブロックコポリマー（ポリオキシエチレン−ポリ−Ｌ−リジン、ここでｉは４４であり、ｊは３０である）で、実施例６に記載された方法を用いた。複合体のストック溶液の濃度は０．０９ＯＤ２６０／μｌであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は１０であった。複合体または単独型のオリゴヌクレオチドは、３．０μＭの濃度で細胞に添加された。結果を以下に示す。
【０１８６】
【表１３】
2004509838.tif 000039
【０１８７】
実施例１１
Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＳＶの阻害
式（ＸＶＩＩ）で表されるブロックコポリマー（ポリオキシエチレン−ポリ−Ｌ−リジン、ここでｉは４４でありｊは３０である）並びに、アンチ−ＨＳＶおよびアンチ−インフルエンザオリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド複合体が、実施例９に記載された方法を用いて形成された。複合体のストック溶液の濃度は、０．９ＯＤ２６０／μｌであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は１０であった。
【０１８８】
近交系の白色マウス（体重６〜７ｇ）に、ウイルス懸濁液３０μｌ（力価：１０−７ＬＤ５０／ｍｌ）を腹腔内注射することによりＨＳＶ−１（Ｃｌ株、Ｂｅｌｏｒｕｓｓｉａｎ Ｒｅｓ． Ｉｎｓｔ． ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． ＆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｍｉｎｓｋより得た）を感染させた。
【０１８９】
アンチ−ＨＳＶ複合体、アンチ−インフルエンザ複合体、単独アンチ−ＨＳＶまたは単独アンチ−インフルエンザのいずれかを、感染後２、１２、２４、４８、または７２時間のいずれかで、所定のマウスの尾静脈に注射した（１０μｌ）。結果を以下に示す。
【０１９０】
【表１４】
2004509838.tif 000040
【０１９１】
実施例１２
ポリヌクレオチド複合体の血漿中寿命
ＨＩＶ−１　ｔａｔ遺伝子の転写開始部位に相補的な、３２Ｐで標識した１７−ｍｅｒ（ＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣ）が本実施例で用いられた。オリゴヌクレオチドは、Ｂｏｕｔｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２： ３５０−３５６ （１９９０）に記載されているように、その５’末端をコレステロールで改変された。オリゴヌクレオチドのポリヌクレオチド結合体は、式（ＸＸ）で表されるブロックコポリマー、ポリオキシエチレン−ポリ（プロピレンイミン／ブチレンイミン）、ここでｉは４４であり、ｊは９〜１０である）で形成された。複合体のストック溶液（ＰＢＳに溶解されたもの）の濃度は、０．１８ＯＤ２６０／μｌであった。ポリカチオンブロックのイミノおよびアミノ基の、オリゴヌクレオチドリン酸に対する比は５０であった。
【０１９２】
雄のＣ５７／Ｂｌ／６マウス（体重：２０〜２４ｇ；ｔｈｅ Ｒｕｓｓｉａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｏｓｃｏｗより得た）は、ＰＢＳに溶解された０．１８ＯＤ２６０／μｌのアンチ−ＨＩＶ結合体または単独アンチ−ＨＩＶ５０μｌの静脈注射を受けた。注射後の決められた時間に、血液サンプルが尾静脈から分取され、動物は殺された。血液または組織サンプル中の放射性物質の量は、（適切な可溶化後に）液体シンチレーション計数によって測定された。結果を以下に示す。
【０１９３】
【表１５】
2004509838.tif 000041
【０１９４】
実施例１３
カチオン性ブロックコポリマーの合成
１，４−ジブロモブタン（５．４ｇ，２５ミリモル， Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩより得た）は、１，４−ジオキサン１００ｍｌに溶解されたＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン（６．５５ｇ，５０ミリモル， Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．より得た）の溶液に加えられた。この反応混合物は、２０℃で１６時間攪拌された。この反応産物は、臭化水素塩として溶液から自然に沈殿する。この沈殿した第一中間体が回収され、１０％トリエチルアミンのメタノール溶液から、回転エバポレーションにより２回乾燥された。このエバポレーション方法は、臭化物塩を十分量除去するのに有効であった。第一中間体は５０ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解され、２．７ｇ（１２．５ミリモル）の１，４−ジブロモブタンと反応させた。再び１６時間、２０℃で反応を進め、生じた第二中間体が回収され上記のように乾燥された。
【０１９５】
第二中間体は酢酸でｐＨ７〜８に中和され、溶出液として水を用いたセファデックスＧ−２５によるゲルろ過で精製された。３種の主要なポリミンのフラクションが得られ、それぞれ１０６０、７００および５００の見かけ分子量を有していた。
【０１９６】
ポリ（オキシエチレングリコール）（１．５ｇ，分子量１５００、Ｆｌｕｋａより得た）は、１，４−ジオキサン８ｍｌに溶解され、０．１７ｇ（１ミリモル）のＮ，Ｎ’−カルボニルイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）と、２０℃で３時間反応させた。この反応混合物は２分割された。それぞれの部分が、分子量１０６０または７００のポリイミンフラクションのいずれかの１０％（ｗ／ｖ）溶液、この溶液はさらに０．０１Ｎ　ＮａＯＨを含んでいたが、４ｍｌと混合された。この混合物は１６時間、２０℃で攪拌された。この混合物より、式（ＸＸ）で表されかつ様々な分子量範囲のブロックコポリマーがゲルろ過により分離された。
【０１９７】
実施例１４
カチオン性ブロックコポリマーの合成
メトキシ−ＰＥＧのスクシンイミジルカーボネート（分子量５０００， Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）０．５ｇが、１，４−ジオキサンに溶解された。このジオキサン溶液は、上記の分子量１０６０のポリイミンポリマー０．２ｇを含む水溶液、この水溶液はさらに０．０１Ｎ　ＮａＯＨを含んでいたが、に加えられた。この反応混合物は２０℃で１６時間攪拌された。式（ＸＸＩＩ）で表されるポリマーがゲルろ過により反応物より分離された。
【０１９８】
実施例１５
カチオン性ブロックコポリマーの合成
１．５ｇのポリ（オキシエチレングリコール）（分子量８０００，Ｆｌｕｋａ）が、８ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解された。０．３４ｇ（２ミリモル）のＮ，Ｎ’−カルボニルイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）が溶液に加えられ、２０℃で３時間反応させた。０．０１Ｎ　ＮａＯＨおよび１５％（ｗ／ｖ）の、実施例１３に記載された分子量５００のポリイミンポリマーを含む水溶液８ｍｌが、第一の反応混合物に加えられた。生じた混合物を２０℃で１６時間、攪拌しながら反応させた。式（ＸＸＩＩＩ）で表されるポリマーがゲルろ過により第二の反応混合物から分離された。
【０１９９】
実施例１６
オリゴヌクレオチドとの結合体の合成
タイプ１の単純疱疹ウイルス（「ＨＳＶ−１」）の初期のｍＲＮＡのスプライシング部位（ウイルスゲノムの９８３〜９９４位）に相補的な１２−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、５’−ＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＵ（「オリゴＡ」）が、３８０Ｂ−０２ＤＮＡ−シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）を用いて合成された。該シンセサイザーでは、ホスホアミダイトケミストリーおよび８分の合成サイクルを用いた。サイクル条件および粗産物の調製は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって推奨されるようになされた。この合成により得られた粗オリゴＡを、アセトン（２ｍｌ）を含む１Ｍ　ＬｉＣｌ溶液（０．５ｍｌ）より沈殿させた。沈殿物はトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液に溶解され、２０ｍＭ　ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ８．５）中のアセトニトリル勾配により展開されたシラソーブＣ１８カラム（９×２５０ｍｍ、Ｇｉｌｓｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーで精製された。
【０２００】
精製されたオリゴＡの３’−末端は過ヨウ素酸塩で酸化されてアルデヒドを生成し、還元的アルキル化によってヘキサメチレン−ジアミンリンカーと結合され、アミン誘導体を生成した。Ｃｈｅ−Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｌｎｔｅｍａｔ． ， ２５：７６７ （１９９１）； Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＲＣ、２０３：９５９ （１９９４）を参照。式（ＸＩＶ）（ｘ＝２５、ｙ＝３８、ｚ＝２５）で表されるブロックコポリマー「プルロニックＡ」が同様に酸化され末端アルデヒドを生成した。このアミン誘導体（１ｍｇ）は１００μｌの０．１Ｍ　ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解され、２ｍｇのプルロニックＡ誘導体と混合された。１．５ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）がその混合物に加えられ、アミン基およびアルデヒド基の間で形成されたシッフ塩基が還元された。この反応を４℃で１２時間進行させた。この反応のポリマー産物は、イソプロパノールの９０％水溶液を溶出液として用いたセファデックスＬＨ−２０によるゲルろ過クロマトグラフィーで分離された。このようにして得られた結合体は、以降「オリゴＡ結合体」と称する。
【０２０１】
実施例１７
ウイルス生産に対するオリゴＡ結合体の効果
オリゴＡおよびオリゴＡ結合体が、ＲＰＭＩ　１６４０培地（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）に最終濃度０．２ｍＭ（オリゴヌクレオチド吸光度に基づく）で別々に溶解された。次いでこれらのストック溶液が０．２２μｍフィルターを通してろ過され、可能な限りのすべての細菌またはカビの混入を排除した。
【０２０２】
ベロ細胞の単層が、様々な濃度のオリゴＡまたはオリゴＡ結合体をともに含む無血清ＲＰＭＩ１６４０中で３７℃で１時間インキュベートされた。次いで、ＨＳＶ−１、Ｌ２株の培養細胞（ｔｈｅ Ｍｕｓｅｕｍ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄ．Ｉ． Ｉｖａｎｏｖｓｋｉｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｒｕｓｓｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎより得た）あたり１プラーク形成単位を、まだオリゴヌクレオチドに曝露されている間にその単層に感染させた。この感染方法はＶｉｎｏｇｒａｄｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＢＢＲＣ、２０３：９５９ （１９９４）に記載されている。ウイルスおよびオリゴヌクレオチドに曝露して８時間後、細胞上の培地は１０％ＦＣＳを含む新鮮な培地と交換された。細胞からの培地は、無効インキュベーション後２２時間および３９時間で回収され、回収された培地中のウイルス力価がＶｉｒｏｌｏｇｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍａｈｙ， Ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９８５）に記載の方法により測定された。結果を以下に示す。
【０２０３】
【表１６】
2004509838.tif 000042
【０２０４】
実施例１８
ホスホネートモノマーの合成
５０ｍｌの無水ピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解された４０ミリモルのブタンジオール−１，３（Ｍｅｒｃｋ）を、２０ミリモルの４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（Ｓｉｇｍａ）と２０℃で１．５時間反応させた。その反応は、シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ）上、クロロホルム：メタノール（９５：５）で展開される薄層クロマトグラフィーを用いてモニターされた。生産物のＲｆ値は０．６であった。その反応混合物は、２００ｍｌの８％炭酸水素ナトリウム水溶液に加えられ、生産物はクロロホルムで抽出された。クロロホルム抽出物は減圧で蒸発され、得られた油状の第一中間体が次の合成段階に用いられた。
【０２０５】
１２ミリモルの第１の中間体が、３．１４ｍｌ（１８ミリモル）のジイソプロピルエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む３０ｍｌの無水１，４−ジオキサンに溶解された。１０ｍｌの無水１，４−ジオキサンに溶解された１８ミリモルのサリチルクロロホスファイト（Ｓｉｇｍａ）が不活性アルゴン雰囲気下で少量ずつジイソプロピルエチルアミン溶液に加えられた。その反応混合物は２０℃で１時間インキュベートされた。その反応物は、上記の液層クロマトグラフィーによりモニターされた。生産物のＲｆ値は０．０５であった。１０ｍｌの水が反応混合物に加えられた。３０分後、溶媒は蒸発された。その生産物は１００ｍｌのクロロホルムに溶解され、得られた溶液は（１）１００ｍｌの８％炭酸水素ナトリウム水溶液、（２）１００ｍｌの０．２Ｍトリエチルアンモニウムアセテート溶液（ｐＨ７．２）、および（３）１００ｍｌの水を用いて段階的に洗浄された。有機溶媒は蒸発され、ホスホネートモノマーを含む油状の残渣が、（１）クロロホルム、（２）クロロホルム中の３％メタノール、および（３）クロロホルム中の６％メタノールの段階的な勾配を用いて、シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーにより精製された。モノマーの収率は４．１ｇ（＝７．３ミリモル，６３％）であった。その生産物は以下の構造：
【０２０６】
【化２７】
2004509838.tif 000043
【０２０７】
式中、ＤＭＴはジメトキシトリチル基を表す、を有し、「ホスホネートモノマーＡ」と称することができる。
【０２０８】
実施例１９
ポリカチオンＢＤＰの合成
無水ピリジン：アセトニトリル混合物（１：１）中のホスホネートモノマーＡの０．０５Ｍ溶液が、ＤＮＡシンセサイザー（型番３８０−Ｂ０２、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）の６位に置かれた。アセトニトリル：ピリジン（９５：５）混合物中のアダマントイルクロライド（Ｓｉｇｍａ）の２％溶液が、縮合剤として用いられた。その合成は、Ｈ−ホスホネートサイクル用に改変されたプログラム（Ｓｉｎｈａ ａｎｄ Ｓｔｒｉｅｐｅｋｅ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｅｄ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐ．１８５ （１９９１））を用いて行われ、ＤＭＴ基は合成終了後保存されていた。標準ＣＰＧ−５００固形担体に固定化されたアデノシン（４μモル）が、ポリマー合成中の第一単位として用いられた（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ ｅｔ ａｌ． ＢＢＲＣ， ２０３， ９５９ （１９９４））。シンセサイザーは、ホスホネートモノマーＡ反復単位をアデノシンモノマーに添加するようにプログラムされた。すべての合成段階に従って、無水ピリジン：ＣＣｌ４（５：１）混合物０．６ｍｌ中のヘキサメチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）１０４ｍｇの溶液を２０℃で１５分添加することにより、固定された基質上のＨ−ホスホネート基は酸化され、次いで担体はピリジン：アセトニトリル混合物（１：１）で洗浄された。
【０２０９】
非ブロック化およびキャップ除去は、アンモニア分解によって達成された（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｅｄ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９９１）。その生産物は、アセトニトリル勾配（０〜８０％）中のシラソーブＣカラム（９×２５０ｍｍ、Ｇｉｌｓｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いたＨＰＬＣによって精製された。ジメトキシトリチル化産物を含むピークが回収され、溶媒は蒸発され、残渣は８０％酢酸（２０分）で処理された。その酢酸は蒸発され、ポリカチオンは再びＨＰＬＣで精製された。１５−ｍｅｒの収率（ホスホネートモノマーＡに関して計算された）は、５０％（２．２μモル）であった。これにより式Ａによるポリマーが生成した。該ポリマーは、以降「ＢＤＰ」と称する。
【０２１０】
実施例２０
ジブロックコポリマーポリオキシエチレン−ＢＤＰの固相合成
ジメトキシトリチル−ポリエチレンオキサイド−Ｈ−ホスホネートが、ブタンジオール−１，３の代わりにポリエチレングリコール（１５００分子量、Ｆｌｕｋａより得た）を用いた以外は、実施例１８に記載されたように合成された。ＢＤＰポリカチオンは、鎖伸長の最終段階でジメトキシトリチル−ポリエチレンオキサイド−Ｈ−ホスホネートを最終構築ブロックとして導入した以外は、実施例１９に記載されたように合成された。ブロックコポリマーのＨ−ホスホネート基は、ヘキサメチレンジアミンの代わりにテトラメチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、実施例１９に記載されたように酸化され、その結果ジアミンおよびリン酸主鎖の間にホスホンアミド結合が形成された。
【０２１１】
実施例２１
オリゴヌクレオチド−ＢＤＰジブロックコポリマーの固相合成
１２−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、すなわち５’−ＧＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＵ（タイプ１の単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）の初期のｍＲＮＡのスプライシング領域に相補的なオリゴＡ（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ ｅｔ ａｌ．、ＢＢＲＣ、２０３：９５９ （１９９４））および、ＢＤＰポリマーを含むジブロックコポリマーが、ＤＮＡシンセセイターにより合成された。まずＢＤＰポリマーが、担体から除去されなかったこと以外は実施例１９に記載されたように合成された。次いでオリゴヌクレオチド鎖が、Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ ｅｔ ａｌ， ＢＢＲＣ， ２０３， ９５９ （１９９４）に記載された標準的なホスホロアミダイトケミストリーを用いて、固相状態の担体に結合したＢＤＰポリカチオン性ポリマー上に段階的に合成された。ジブロックコポリマーのＨ−ホスホネート基は、ヘキサメチレンジアミンの代わりにテトラメチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、実施例１９に記載されたように酸化された。
【０２１２】
実施例２２
ウイルス成長に対するオリゴヌクレオチド−ＢＤＰジブロックコポリマーの効果
本実験は、（１）実施例２１のオリゴヌクレオチド−ＢＤＰコポリマーが用いられ、（２）単一の濃度（４．４Ｍ）のオリゴヌクレオチド−ＢＤＰコポリマーが用いられたこと以外は、実施例１７に記載されたように行われた。
【０２１３】
【表１７】
2004509838.tif 000044
【０２１４】
実施例２３
分岐状ポリイミンポリカチオンの合成
Ａ．ポリイミンポリカチオン（「ポリスペルミン」）が、実施例１３に記載されるのと同様にしてＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンおよび１，４−ジブロモブタンの段階的な重縮合によって得られ、ポリ（エチレングリコール）へ結合させることなく用いられた。
【０２１５】
Ｂ．Ａで合成されたポリイミンポリカチオンが、蛍光ダンシル標識基質を得るためにダンシルクロライドによって改変され、薄層クロマトグラフィーで精製され、混合物の主成分（多くのバッチで７５％超）が、正荷電モードのエレクトロスプレーマススペクトロメトリーによって分析された。その結果が、塩化ダンシルを用いて改変されたＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンについて得られたマススペクトルと比較された。ダンシル標識Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンは、Ｍ＋１、Ｍ＋２、Ｍ＋３、およびＭ＋４（６６７．６、６６８．５、６６９．６、および６７０．５）の４形態のピークを与えた。重縮合産物のスペクトルにおいて、２つのタイプの多重モードピーク、ＭおよびＭ＋５４が観察された。Ｍ−ピークについては、Ｍ／２Ｈ＋およびＭ／Ｈ＋を有し、それぞれ５９８．５および１１９５．６に等しい二つの異なる基が観察された。この分子質量は１２個の窒素原子を有する直鎖ポリカチオンに非常に近いものであった（１２２１）。１２４９．８および６５２．５におけるＭ＋５４ピークは、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２架橋を有するポリカチオンに対応する。
【０２１６】
Ｃ．Ａで合成され、ＤＭＳＯに溶解されたポリイミンポリカチオンのサンプルについての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られた。三種のシグナルが、１．４０〜１．８０ｐｐｍ（Ｈａ）、１．８０〜２．２０ｐｐｍ（Ｈｂ）、および２．３５〜２．８０ｐｐｍ（Ｈｃ）において観察された。ＨａはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２プロトンに関し、ＨｂはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２プロトンに関し、Ｈｃは−ＮＨＣＨ２およびプロトンに関していた。これら３種についての共鳴シグナルの積分により、Ｈａ：Ｈｂ：Ｈｃ＝１．００：０．７５：１．２０という比が得られた。１２個の窒素原子を有する直鎖ポリカチオンの理論的な比は１．００：１．３３：３．６７である。Ｈｂ：ＨａおよびＨｃ：Ｈａ比の増加により、第１級、第２級および第３級アミンの混合物を有する分岐状構造の存在が示唆された。
【０２１７】
Ｄ．Ａで合成されたポリイミンポリカチオン中の第１級アミノ基の濃度は、Ｗｅｉｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ９４：５９２７ （１９７２）に記載されたフルオレスカミン方法によって測定された。重縮合産物中の第１級、第２級、および第３級アミノ基の総量は、電位差滴定を用いて測定された。第１級、第２級、および第３級アミノ基の総量の、第１級アミノ基の量に対する比は２．７であった。マススペクトロメトリーを用いて測定された縮合産物の分子質量により、顕著な分岐、すなわち第３級アミンの存在がこの実験結果から示唆された。
【０２１８】
実施例２４
直鎖ポリイミンポリカチオンの合成
ポリイミン型の直鎖ポリカチオンは、Ａｚｉｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃ． Ｅｘｐｅｒ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ２７４：１８１ （１９９５）に記載された改変還元型アミノ化法を用いて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でジアミノアルキルおよびビス−アルデヒドの縮合により合成される。０．３３ｇのマロンアルデヒドビス（ジメチルアセタール）が１０ｍｌの０．５Ｎ　ＨＣｌに加えられ、２０℃で１時間攪拌されて遊離のビス−アルデヒドを得た。１．２７ｇのＮ，Ｎ’−ビス［３−アミノプロピル］−１，４−ブタンジアミンがこの溶液に加えられ、ｐＨが５．０に調節された。この混合物は３７℃で１時間放置され、次いで１．２７ｇのＮ，Ｎ’−ビス［３−アミノプロピル］−１，４−ブタンジアミンがそれに加えられ、ｐＨは炭酸ナトリウム溶液を用いて７．０に調節された。その反応混合物は０．２６ｇの水素化シアノホウ素ナトリウムで処理され、さらに３７℃で１時間放置された。最終的なわずかに黄色い溶液は、セファデックスＧ−２５カラムを用いたゲル透過クロマトグラフィーにより１０％メタノールで脱塩され、ニンヒドリン試験により第１級アミノ基と判明した第１の高分子量のフラクションが凍結乾燥された。以下のポリイミンポリカチオンの収率は、０．４３ｇであった。
【０２１９】
【化２８】
2004509838.tif 000045
【０２２０】
実施例２５
カチオン性ブロックコポリマーの合成
１．５ｇのポリ（エチレングリコール）、メチルエステル、分子量５０００（Ｓｉｇｍａ）が、無水アセトニトリル１０ｍｌ中の１，１’−カルボニルジイミダゾール０．２５ｇによって室温で３時間活性化された。真空中で溶媒は蒸発され、その残渣が水に再溶解され、３５００Ｄａのカットオフを有するメンブラ−セル（Ｍｅｍｂｒａ−Ｃｅｌ）ＭＤ−２５−０３．５メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は、真空中で濃縮され、メタノール−水溶液中で、２倍超の分子量４０００のポリ−Ｌ−リジンとの、室温での１６〜２４時間の反応に用いられた。得られた結合体は、水中でのセファデックス−５０（微細）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィー、次いでアセトニトリル濃度勾配中での半調製カラム（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ５ｕ， １０ｍｍ×２５ｃｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーによって、精製された。収率は７０％であった。アミノ基の含有量はフルオレスカミン法によって測定され、総窒素含有量は元素分析によって測定され、結合体の純度が評価された。通常、重量に基づいて約７５〜９０％であった。
【０２２１】
実施例２６
カチオン性ブロックコポリマーの合成
２倍超のポリ−Ｌ−リジンを同じく過量のポリエチレンイミン、すなわち分子量２０００の
【０２２２】
【化２９】
2004509838.tif 000046
【０２２３】
で置き換える以外は実施例２５の方法に従って、０．４ｇのカチオン性ジブロックコポリマー：
【０２２４】
【化３０】
2004509838.tif 000047
【０２２５】
が得られた。
【０２２６】
実施例２７
グラフトコポリマーの合成
Ａ．分子量８０００のポリ（エチレングリコール）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）２４ｇ（３ミリモル）が、減圧下での無水ピリジンとの共沸により乾燥され、５０ｍｌの無水アセトニトリル中に溶解された。次いで、無水ピリジン３０ｍｌ中の４，４’−ジメトキシトリチルクロライド０．５１ｇ（１．５ミリモル）が、３０分間連続攪拌のもとこの溶液に滴下して加えられた。その混合物はさらに室温で２時間放置され、次いで、溶媒が真空中で蒸発された。残渣はジクロロメタン５０ｍｌに溶解され、５％炭酸水素ナトリウム（２×３０ｍｌ）で抽出され、シリカゲルカラム（３×４５ｃｍ、４０〜６０μｍ）に添加された。ジクロロメタン−メタノール溶液を用いた段階的な溶出によって、わずかに黄色のポリ（エチレングリコール）のモノ−４，４’−ジメトキシトリチル誘導体が収率約７５〜８５％で分離された。この反応の副産物（収率１０〜１５％）は、ポリ（エチレングリコール）のビス−４，４’−ジメトキシトリチル誘導体であった。
【０２２７】
Ｂ．Ａで得られたポリ（エチレングリコール）のモノ−４，４’−ジメトキシトリチル誘導体１．５ｇが、無水アセトニトリル１０ｍｌ中の１，１’−カルボニルジイミダゾール０．２５ｇによって、室温で３時間活性化された。減圧下で溶媒は蒸発され、残渣を水に再溶解され、３５００Ｄａのカットオフを有するメンブラ−セルＭＤ−２５−０３．５メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は真空中で濃縮され、次いでメタノール−水の溶液中で分子量１９０００のポリ−Ｌ−リジンと、室温で２４時間、ポリ（エチレングリコール）の、ポリ−Ｌ−リジンの遊離アミノ基に対するモル比が０．７：１．０で反応させた。得られた結合体は、水中でセファデックス−５０（微細）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィーによって、次いでアセトニトリル濃度勾配中で半調製カラム（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ５ｕ， １０ｍｍ×２５ｃｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製された。これにより、グラフト化ポリリジンコポリマーは収率３５％で得られ、それにおいてフルオレスカミン法によって測定されたところ、遊離アミノ基の５０％がポリ（エチレングリコール）で置換されていた。
【０２２８】
実施例２８
グラフトコポリマーの合成
Ａ．分子量８０００のポリ（エチレングリコール）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）２４ｇ（３ミリモル）が、真空中で、無水ピリジンとの共沸によって乾燥され、無水アセトニトリル５０ｍｌ中に溶解された。次いで無水ピリジン３０ｍｌ中の４，４’−ジメトキシトリチルクロライド０．５１ｇ（１．５ミリモル）が３０分間攪拌しながらこの溶液に滴下して加えられた。その混合物はさらに室温で２時間静置され、次いで溶媒が真空中で蒸発された。その残渣はジクロロメタン５０ｍｌに溶解され、５％炭酸水素ナトリウム（２×３０ｍｌ）で抽出され、シリカゲルカラム（３×４５ｃｍ、４０〜６０μｍ）に添加された。ジクロロメタン−メタノール溶液を用いた段階的な溶出により、わずかに黄色の、ポリ（エチレングリコール）のモノ−４，４’−ジメトキシトリチル誘導体が、約７５〜８５％の収率で分離された。この反応の副産物（収率１０〜１５％）は、ポリ（エチレングリコール）のビス−４，４’−ジメトキシトリチル誘導体であった。
【０２２９】
Ｂ．Ａで得られたポリ（エチレングリコール）のモノ−４，４’−ジメトキシトリチル誘導体１．５ｇが、無水アセトニトリル１０ｍｌ中の１，１’−カルボニルジイミダゾール０．２５ｇによって、室温で３時間活性化された。真空中で溶媒は蒸発され、残渣を水に再溶解され、３５００Ｄａのカットオフを有するメンブラ−セルＭＤ−２５−０３．５メンブレンで水に対して透析された。脱塩された溶液は真空中で濃縮され、次いでメタノール−水の溶液中の分子量２５０００のポリエチレンイミンと、室温で２４時間、ポリ（エチレングリコール）の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が０．７：１．０で反応させた。得られた結合体は、水中でセファデックス−５０（微細）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたゲル透過カラムクロマトグラフィーによって、次いでアセトニトリル濃度勾配中で半調製カラム（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ５ｕ， １０ｍｍ×２５ｃｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製された。これにより、グラフト化ポリエチレンイミンブロックコポリマーは収率８５％で得られ、それにおいてＷｅｉｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９７２， ９４：５９２７）に記載されたフルオレスカミン法によって測定されたところ、遊離アミノ基の４５％がポリ（エチレングリコール）で置換されていた。
【０２３０】
実施例２９
グラフトコポリマーの合成
活性化されたポリ（エチレングリコール）のポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が０．３：１．０であること以外は実施例２８の方法に従って、８０％の収率でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーを得、それにおいて遊離アミノ基の２４％がポリ（エチレングリコール）で置換されていた。
【０２３１】
実施例３０
カチオン性ブロックコポリマーの合成
分子量２０，０００のポリエチレングリコール６．０ｇの代わりに、過量の分子量５，０００のポリエチレングリコールを用いた以外は実施例２６の方法に従って、カチオン性ブロックコポリマー：
【０２３２】
【化３１】
2004509838.tif 000048
【０２３３】
を６．０ｇ得た。
【０２３４】
実施例３１
カチオン性ブロックコポリマーの合成
Ａ．分子量５，０００のポリエチレングリコール１．５ｇの代わりに、分子量５，０００のポリエチレングリコール（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）２．４ｇを用いた以外は、実施例２６の方法に従って、ポリエチレンイミンおよびポリエチレングリコール鎖セグメントを含むカチオン性ブロックコポリマー１．２ｇを得た。
【０２３５】
Ｂ．このブロックコポリマーの分子質量は、１５アングルで作動し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を備えたＤＡＷＮマルチアングルレーザーフォトメーター（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を用いた静電気光散乱法（ｓｔａｔｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）によって測定された。ブロックコポリマーのサンプルは、３５００Ｄａのカットオフを有する膜で４．５×１０−３ｇ／ｍｌ　ＮａＣｌに対して透析され、次いで、光散乱実験で用いられたフローセルに直接ろ過された。重量平均分子質量は、４回の測定に基づき計算された。セル定数（Ｃｅｌｌ ｃｏｎｓｔａｎｔ）は、異なる濃度のＮａＣｌを用いた校正によって決定された。特異的な屈折率の増加（ｄｎ／ｄｃ）は、Ｗｙａｔｔ／Ｏｐｔｉｌａｂ ９０３ 干渉分析屈折率測定器を用い、６３２．８ｎｍで測定された。得られたサンプルの分子質量は１６，０００であり、このポリマーはおおよそ一つのポリエチレンイミンセグメントおよび、二つのポリエチレングリコールセグメントを含むということが示唆された。
【０２３６】
Ｃ．合成されたコポリマーサンプル中の第１級アミノ基の数は、Ｗｅｉｇｅｌｅ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９７２， ９４：５９２７）に記載されている改変方法を用いて測定された。ｐＨ９．５の２０ｍＭホウ酸ナトリウム中のサンプル１．５ｍｌ（アミノ基の濃度は１００μＭまで）に、アセトン中のフルオレスカミン溶液（０．０２４％、Ｓｉｇｍａ）０．２５ｍｌが加えられ、５分間ボルテックスされた。島津の分光蛍光計を用い、励起波長３８４ｎｍおよび発光波長４３０〜５１０ｎｍの範囲においてこの測定はなされた。発光４７５ｎｍにおける減衰係数は１．５８×１０６Ｍ−１と測定された。第１級アミノ基の特異的な量は０．６９ミリモル／ｇであった。
【０２３７】
実施例３２
グラフトコポリマーの合成
ポリ（エチレングリコール）２４ｇの代わりに、同量のプルロニックＬ６１（ＢＡＳＦ Ｃｏ．）を用い、活性化されたプルロニックＬ６１の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が０．３：１．０であること以外は実施例２８の方法に従って、収率２２％でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいて、遊離のアミノ基のうち８％がプルロニックＬ６１で置換されていた。
【０２３８】
実施例３３
グラフトコポリマーの合成
ポリ（エチレングリコール）２４ｇの代わりに、同量のプルロニックＰ８５を用い、活性化されたプルロニックＰ８５の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が０．３：１．０であること以外は、実施例２８の方法に従って、収率７０％のグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいてポリエチレンイミンの遊離アミノ基のうち１１％がプルロニックＰ８５で置換されていた。
【０２３９】
実施例３４
グラフトコポリマーの合成
ポリ（エチレングリコール）２４ｇの代わりに、同量のプルロニックＰ１２３（ＢＡＳＦ Ｃｏ．）を用い、活性化されたプルロニックＰ１２３の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が０．３：１．０であること以外は実施例２８の方法に従って、収率３０％でグラフト化ポリリジンコポリマーが得られ、それにおいて、遊離アミノ基の９％がプルロニックＰ１２３で置換されていた。
【０２４０】
実施例３５
グラフトコポリマーの合成
ポリ（エチレングリコール）２４ｇの代わりに、同量のプルロニックＦ３８（ＢＡＳＦ Ｃｏ．）用い、活性化されたプルロニックＦ３８の、ポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が０．３：１．０であること以外は、実施例２８の方法に従って、グラフト化ポリリジンコポリマーを収率４０％が得られ、それにおいて、遊離のアミノ基の９％がプルロニックＦ３８で置換されていた。
【０２４１】
実施例３６
マルチグラフトコポリマーの合成
ポリエチレンイミンの代わりに、実施例３５で得られたプルロニックＬ１２３（ＢＡＳＦ Ｃｏ．）で改変されたポリエチレンイミンを用い、活性化されたポリ（エチレングリコール）の、改変されたポリエチレンイミンの遊離アミノ基に対するモル比が０．４：１．０であること以外は、実施例２８の方法に従って、収率２０％でグラフト化ポリエチレンイミンコポリマーが得られ、それにおいて、９％の遊離アミノ基がプルロニックＬ１２３で置換され、および３０％の基がポリ（エチレングリコール）で置換されていた。
【０２４２】
実施例３７
オリゴヌクレオチドを有する複合体
Ａ．モデルのホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドＰＳ−ｄＴ２０が、ＡＢＩ２９１ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を標準的な方法に従って合成された。アンモニア脱保護後、オリゴヌクレオチドはエタノールで２回沈殿させ、精製しないで次に用いられた。
【０２４３】
Ｂ．ＰＳ−ｄＴ２０および実施例２８で得られたポリエチレンイミン−ポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマーの間で形成された複合体が、該ブロックコポリマーの第１級アミノ基の、ＰＳ−ｄＴ２０のリン酸電荷に対する比が１．０になるように、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液中のこれらのポリマーの水溶液を混合することによって得られた。すべての溶液は二重蒸留水を用いて調製され、孔サイズ０．２２μＭのミリポアメンブレンを通して繰り返しろ過された。
【０２４４】
Ｃ．Ｂで合成された複合体の電気泳動移動度（ＥＰＭ）および粒子径が測定された。ＥＰＭの測定は、２５℃で、１５〜１８Ｖ／ｃｍの電場強度（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）で、６３５ｎｍのレーザー波長で稼動させた１５ｍＶ固体レーザーを有する「ゼータプラス」ゼータポテンシャルアナライザー（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）を用いて測定された。粒子のゼータ電位は、スモルコウスキ方程式（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用いてＥＰＭ値から計算された。有効な流体力学的径は、マルチアングルオプション（Ｍｕｌｔｉ Ａｎｇｌｅ Ｏｐｔｉｏｎ）を備えた同器具を用いて光子相関分光分析法（ｐｈｏｔｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によって測定された。粒子径測定は、２５℃、角度９０°でなされた。このサンプルのゼータ電位はゼロに近く、これは粒子が電気的に中性であることを示唆している。粒子の平均直径は３５ｎｍであった。
【０２４５】
実施例３８
ヌクレアーゼ消化に対する安定性
ＰＳ−ｄＴ２０および、実施例３９で得られたポリエチレンイミン−ポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマーとの間で形成された複合体１００μｇが、ヘビ毒であるホスホジエステラーゼ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓからのホスホジエステラーゼＩ、０．０２４ユニット／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）１ｍｇで２および１８時間、３７℃で処理された。反応混合物は、消化されたＰＳ−ｄＴ２０についてゲル透過ＨＰＬＣで分析された。該複合体中のＰＳ−ｄＴ２０の消化は５％未満であった。それに対し、同じ酵素濃度で、同じ時間間隔処置された単独ＰＳ−ｄＴ２０は完全に消化されていた。
【０２４６】
実施例３９
Ｃａｃｏ−２単層におけるオリゴヌクレオチドの蓄積
Ａ．５’−アミノヘキシルＰＳ−ｄＴ２０オリゴヌクレオチドが、ＡＢＩ２９１ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、標準的な方法に従って合成された。アンモニア脱保護後、オリゴヌクレオチドはエタノールにより２回沈殿され、精製しないで次に用いられた。５’−アミノヘキシルＰＳ−ｄＴ２０は、業者の方法に従って、フルオレセインイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ）との反応により標識された。フルオレセインラベルされたＰＳ−ＯＤＮは、ファルマシアＰＤ−１０サイズエクスクルージョンを用いて、未反応の蛍光体から分離された。
【０２４７】
Ｂ．フルオレセインラベルされたＰＳ−ｄＴ２０および、ポリエチレンイミン−ポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマーの間で形成された複合体は、ＰＳ−ｄＴ２０の代わりにフルオレセインラベルされたＰＳ−ｄＴ２０を用いた以外は、実施例３７に記載のように合成された。
【０２４８】
Ｃ．ヒト結腸直腸の癌腫由来のＣａｃｏ−２細胞（Ｆｏｇｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ５９：２２１−２２６， １９７７）は、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ Ｒ．Ｔ．（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ， Ｌａｗｒｅｎｃｅ， Ｋａｎｓａｓ）により親切にも提供されたものである。その細胞は、Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ （Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ７９：４７６−４８２， １９９０）に記載された通り、１０％の熱で不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％の非必須アミノ酸、ベンジルペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ）（ＤＭＥＭ）中、９０％空気および１０％ＣＯ２の雰囲気下で維持された。すべての組織培養培地は、Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）より得た。細胞は、コラーゲン被覆ポリカーボネートフィルターチャンバーインサート （Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、Ｃｏｓｔａｒ Ｂｒａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｏｎｔｄ．； 孔サイズ０．４μｍ；直径２４．５ｍｍ）上で育てられた。２５０，０００個の細胞が各インサートに添加され、継代数が３２〜４５回の細胞が用いられた。その細胞は２日ごとに供給され、単層が以下の吸収実験に用いられるまでの１４日間、単層を成長および分化させた。
【０２４９】
Ｄ．Ｃａｃｏ−２細胞単層は、３７℃で、塩化ナトリウム（１２２ｍＭ）、炭酸水素ナトリウム（２５ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、塩化カリウム（３ｍＭ）、硫酸マグネシウム（１．２ｍＭ）、塩化カルシウム（１．４ｍＭ）およびリン酸水素二カリウム（０．４ｍＭ）を含む分析用緩衝液を用いて３０分プレインキュベートされた。この後、この緩衝液は除去され、細胞は、分析用緩衝液中の５０μＭのフルオレセインラベルされたＰＳ−ＯＤＮまたはその複合体に９０分、３７℃で曝露された。その後、染色液が除去され、細胞の単層は氷冷したＰＢＳで３回洗浄された。次に細胞は１．０％トリトンＸ−１００中に溶解され、その一部（２５μｌ）が分取され、島津ＲＦ５０００分光蛍光計をλｅｘ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍで用いて細胞の蛍光が定量された。サンプルはまた、ピアスＢＣＡ法を用いたタンパク質定量のためにも分取された。
【０２５０】
細胞によって吸収された、フルオレセインラベルされたＰＳ−ｄＴ２０の量を以下に示す。
【０２５１】
【表１８】
2004509838.tif 000049
【０２５２】
これにより、ブロックコポリマーを有する複合体中へのポリヌクレオチドの取り込みは、細胞のポリヌクレオチドの蓄積を３倍超に増加させることが示された。
【０２５３】
実施例４０
Ｃａｃｏ−２単層を通過するオリゴヌクレオチドの輸送
Ａ．フィルターで成長したＣａｃｏ−２単層は、完全成熟した後、すなわち、塗布後１４日から、オリゴヌクレオチド透過性研究のために用いられた。フィルターは穏やかにウェルから引き離され、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）の並列拡散セル（Ｓｉｄｅ−Ｂｉ−Ｓｉｄｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｅｌｌ）に置かれ、３７℃±０．１℃で維持された。このシステムは、薬剤の経口バイオアベイラビリティーを評価するためのヒト腸上皮のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして用いられる（Ｐａｕｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ， Ｒｅｓ．， １４：１１−１７ （１９７７）。細胞単層は、３７℃で、１０％の、熱で不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、ベンジルペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含む分析用緩衝液を用いて３０分プレインキュベートされ、ドナーおよびレセプター両方のチャンバー（３ｍｌ）に加えられた。プレインキュベート後、レセプター容器中の分析用緩衝液は新鮮なものと交換され、一方、ドナー容器中の分析用緩衝液は、分析用緩衝液の、フルオレセインラベルされたＰＳ−ＯＤＮまたはその複合体５０μＭ溶液と交換された。単層の完全性を説明するために、ドナー容器中のＲ１２３溶液はまた、Ｈ３−ラベルされたマニトール、パラセルラーマーカー（Ｄａｗｓｏｎ， Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．， ７７：２１３−２３３ （１９７７） ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏｒｐ．（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）より得られる）を含んでいた。１２０分のとき、島津ＲＦ５０００蛍光分光光度計（λｅｘ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）を用いた、フルオレセインラベルされたＰＳ−ＯＤＮの定量、および、液体シンチレーションカウンター（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いたＨ３−マニトール定量のためにレセプターチャンバー中の溶液が除去された。レセプターチャンバー中の溶液を回収した後すぐに、３ｍｌの新鮮な分析用緩衝液がこのチャンバーに加えられた。フルオレセインラベルされたＰＳ−ＯＤＮ（またはマニトール）のＣａｃｏ−２細胞単層を通過した輸送が、レセプターチャンバー中に蓄積されたフルオレセインラベルされたＰＳ−ＯＤＮ（またはマニトール）の総量の、ドナーチャンバー中のフルオレセインラベルされたＰＳ−ＯＤＮ（またはマニトール）の初期量に対する百分率として示されている。それぞれの膜の複数の時点における各薬剤組成物について、三つの異なる膜の最小値が解析された。結果を以下に示す。
【０２５４】
【表１９】
2004509838.tif 000050
【０２５５】
これにより、ブロックコポリマーを有する複合体中へのポリヌクレオチドの組み込みは、Ｃａｃｏ−２単層を通過するこのポリヌクレオチドの輸送を７倍超に増加させ、その一方でパラセルラーマーカーの輸送が影響を受けないことが示された。
【０２５６】
実施例４１
様々なブロックコポリマーに基づく配合物によるプラスミドＤＮＡの
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質移入
これらの実験はＣｏｓ−７細胞で実施され、以下のように行われる；Ｃｏｓ−７細胞が用いられ、１２−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、ウェルあたり７×１０５個播種され、形質移入前に２４時間静置される（７０％の濃度）。３μｇのｐＧＬ３−ＬｕｃＳＶ４０が、様々なＮ／Ｐ比で異なるポリヌクレオチドと配合される。形質移入混合物を以下のように調製する。１％Ｈｅｐｅｓが添加された１００μｌのＤＭＥＭを含むエッペンドルフチューブに、以下のものが加えられる；０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ３０μｌ、様々なＮ／Ｐ比を得るための様々な濃度の試験用ポリマー３５μｌ。形質移入混合物は５分間インキュベートされ、完全ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｈｅｐｅｓ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を用いて１ｍｌにされる。ウェルあたり５００□ｌの形質移入混合物が添加される。３７℃および５％ＣＯ２の雰囲気下での４時間の形質移入の後、細胞はＰＢＳでリンスされ、１ｍｌの完全ＤＭＥＭ中で一晩静置され、ルシフェラーゼ分析を行うために、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの推奨に従って回収される。簡潔に言うと、細胞は氷上で３０分溶解され、次いで１３０００ｇで２分間遠心分離される。上清は保存されルシフェラーゼ活性を分析される。分析は以下のように行われた。２０□ｌの上清が、１００□ｌのルシフェラーゼ基質を含む光測定用チューブに加えられる。発光はルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で５秒間測定される。データは秒あたりの相対的な光単位で報告され、ＢｉＣｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ Ａｃｉｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （Ｓｉｇｍａ）を用いてタンパク質に対して標準化される。結果は、ＰＥＩに結合したプルロニックＰ１２３は、ＰＥＩ単独に比べて、ＣＭＶ−Ｌｕｃの形質移入を改善することを示し、これにより、ブロックコポリマー部分がより優れた形質移入に有利であることを示唆している。Ｐ１２３単独では細胞を形質移入せず、ＣＭＶ−Ｌｕｃ単独のように全く役に立たない、ということに留意すること。この観察は、Ｐ１２３が筋肉内での遺伝子発現を促進させるために用いられている、実施例４４に示されたデータと対照的である。
【０２５７】
【表２０】
2004509838.tif 000051
【０２５８】
実施例４２
ＤＮＡの生体内分布の生物学的調節剤としてのブロックコポリマー
ＣＭＶ−Ｌｕｃ（５０μｇ）またはオリゴヌクレオチド（１００μｇ）が、様々なブロックコポリマーに基づいた配合物を含むように２００ｕｌに再懸濁され、Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウス（６〜８週齢）に静脈内注射される。注射の２４時間後、マウスは剖検され、ルシフェラーゼ活性が測定され、またはオリゴヌクレオチド蓄積が定量されるための様々な臓器が採取される。プラスミドＤＮＡについては、すべての主要な臓器が、タンパク質分解酵素阻害剤を添加された細胞溶解用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で組織粉砕機（Ｋｏｎｔｅｓ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ．）を用いて迅速にホモジナイズされる。その抽出混合物は、氷上で３０分静置され、最高速度で２分間遠心分離される。その上清は保存され、ルシフェラーゼ活性を分析される。分析は以下のように行われる：２０μｌの上清が、ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１００μｌを含む光測定用チューブに加えられる。発光は、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で５秒間測定される。そのデータは、タンパク質１ｍｇあたりのルシフェラーゼのｐｇとして報告される。オリゴヌクレオチドについては、主要な臓器がフェノール：クロロホルムで２回抽出され、エタノールで沈殿された後、定量される。この結果は、従来のリポソーム性配合物およびＰＥＩを用いると遺伝子発現は肺に集中することを示し、このことは肺動脈塞栓症の危険を増加させると知られている因子の一つである。しかしながら、Ｐ１２３のような疎水性ブロックコポリマーに結合されたＰＥＩと配合されると、遺伝子発現は肝臓の方へ転換される。加えて、Ｐ１２３が単独で用いられる場合、様々な臓器における遺伝子発現は、筋肉組織を除いて非常に低い。オリゴヌクレオチドについて、その蓄積は、疎水性キャリアー（ＰＥＧに結合されたＰＥＩ）が用いられる場合腎臓で観察され、疎水性キャリアー（Ｐ８５−ＰＥＩ／Ｐ８５）が用いられる場合は肝臓の方へ転換される。体の様々な領域における遺伝子発現およびオリゴヌクレオチドの蓄積を転換し得る広範囲の疎水性および親水性バランスを付与するために、多種多様のブロックコポリマー混合物が調製され得る。
【０２５９】
【表２１】
2004509838.tif 000052
【０２６０】
実施例４３
ブロックコポリマーを用いた筋肉内での形質移入
この実験においては、４匹のグループで飼育され自由にえさを与えられたＣ５７Ｂｌ／６雌マウス（６〜７週齢）の筋肉（前脛骨筋）において遺伝子発現を促進するために、ブロックコポリマーが用いられる。ルシフェラーゼをコードするＣＭＶ誘導性プラスミドＤＮＡ５μｇがブロックコポリマーと配合され、前脛骨筋に筋肉注射された。各筋肉注射の前に、マウスはケタミンおよびキシラジンの混合溶液を用いて麻酔される。筋肉注射５日後にマウスは殺され、注射された各筋肉は切除され、タンパク質分解酵素阻害剤を添加された細胞溶解用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で組織グラインダー（Ｋｏｎｔｅｓ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ．）を用いて迅速にホモジナイズされる。抽出混合物は氷上で３０分間静置され、次いで最高速度で２分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。分析は以下のようになされる。２０μｌの上清が、１００μｌのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む光測定用のチューブに加えられる。発光はルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で５秒間測定される。そのデータは、前脛骨筋あたりの相対的な光単位として報告される。下記の表に示すように、ブロックコポリマーは、注射して５日後に測定される遺伝子発現を促進する。カチオン性試薬の使用は遺伝子発現を改善せず阻害した。この改善の理由は、筋肉細胞の表面張力を変え、それによって筋管におけるプラスミドＤＮＡの取り込みを増加させる、というブロックコポリマーの特性にあるのかもしれない。
【０２６１】
【表２２】
2004509838.tif 000053
【０２６２】
実施例４４
筋肉中での遺伝子発現を改善するブロックコポリマーの濃度
これらの実験は、筋肉注射に用いられるブロックコポリマーの濃度が滴定されたこと以外は実施例４３と同様に行われる。プラスミドＤＮＡの筋肉内へ移入するために用いられるブロックコポリマーの濃度は低い。筋肉内注射のために用いられたブロックコポリマーの濃度はゲルを形成しない。ブロックコポリマーの溶液は、ブロックポリマーのミセルおよびユニマー中に存在する。筋肉内の遺伝子発現を改善する濃度は、以下に矢印で示されるように０．１％より低い。この濃度は、同じブロックコポリマーが静脈内注射された場合の最大許容量より約１００倍低い。また、ブロックコポリマーの組み合わせには、さらに遺伝子発現を改善できるものもある。
【０２６３】
【表２３】
2004509838.tif 000054
【０２６４】
【表２４】
2004509838.tif 000055
【０２６５】
実施例４５
ブロックコポリマーを用いた遺伝子発現の延長
この実験においては、筋肉が４８時間および２週間後に採取された以外は実施例４３と同様に、ルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡがブロックコポリマーと配合された。以下の表に示すように、遺伝子発現はブロックコポリマーによって延長された。
【０２６６】
【表２５】
2004509838.tif 000056
【０２６７】
実施例４６
ブロックコポリマーを用いた筋肉における遺伝子発現の速度論
動態実験は、筋肉が１、２、３、４、および７日目に採取された以外は実施例４３に記載されたような条件でなされた。以下の表に示すように、遺伝子発現は、ブロックコポリマーを有するものでより早く始まっており、７日を越えて同じレベルで持続した。
【０２６８】
【表２６】
2004509838.tif 000057
【０２６９】
実施例４７
筋肉内での遺伝子発現の種間比較
２つの異なる種、すなわちマウスとラットとに注射される以外は実施例４３におけるように、ブロックコポリマーはプラスミドＤＮＡを配合するために用いられた。６〜８週齢のマウスおよび３月齢のラットの前脛骨筋が、筋肉注射４８時間後に採取された。以下に示される表より、二つの仮説が立てられる；（１）ブロックコポリマーは２以上の種に適用されることができ、ヒトのような異なる種に適用され得る、および（２）ブロックコポリマーは成長した動物において遺伝子発現を促進し、これは、ブロックコポリマーが成熟した筋原繊維の形質移入を容易にしていることを示唆している。
【０２７０】
【表２７】
2004509838.tif 000058
【０２７１】
実施例４７Ａ
プルロニック（登録商標）Ｆ１２７およびスペルミンの結合体
ポリ（エチレングリコール）２４ｇの代わりに同量のプルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ＢＡＳＦ Ｃｏ．）を用い、分子量．２５，０００のポリエチレンイミンの代わりにスペルミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ）を用い、さらに１，１’−カルボニルジイミダゾールによって活性化されたポリ（エチレングリコール）１０ｇあたり、スペルミン１０ｇを超過するモル量を用いたこと以外は実施例２８の方法に従って、スペルミンに結合されたプルロニック（登録商標）Ｆ１２７が得られた。スペルミンが結合したプルロニック（登録商標）Ｆ１２７が１５ｇ、この方法により生成された。
【０２７２】
実施例４７Ｂ
スペルミンに結合されたブロックコポリマーを用いた筋肉内形質移入
この実施例においては、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７が実施例４７Ａに記載されたようにスペルミンに結合され、６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスの前脛骨筋にプラスミドＤＮＡを形質移入するのに用いられた。マウスは５匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられた。ルシフェラーゼをコードするＣＭＶ誘導性プラスミドＤＮＡ５μｇがスペルミンに結合されたＦ１２７と配合され、前脛骨筋に注射された。その他の方法は実施例４３と同様である。データを下記の表に示す。このデータは、Ｆ１２７と結合され、ＤＮＡと配合されたスペルミンが、裸のＤＮＡと比較して導入遺伝子の発現を増加させることを示している。
【０２７３】
【表２８】
2004509838.tif 000059
【０２７４】
実施例４７Ｃ
スペルミンと混合されたブロックコポリマーを用いた筋肉内形質移入
この実施例においては、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７はスペルミンと混合され、プラスミドＤＮＡを６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスの前脛骨筋に形質移入するために用いられた。マウスは５匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられた。ルシフェラーゼをコードするＣＭＶ誘導性プラスミドＤＮＡ５μｇが、スペルミンと混合されたＦ１２７と配合され、前脛骨筋に注射された。その他の方法は実施例４３と同様である。データを下記の表に示す。このデータは、プルロニックブロックコポリマーと混合されたスペルミンは形質移入率を増加させることを示している。
【０２７５】
【表２９】
2004509838.tif 000060
【０２７６】
実施例４８
ブロックコポリマーを用いた虚血性組織の治療
ウサギの片方の後肢で虚血が誘導されてから１０日後に、５００□ｇのｐｈＶＥＧＦ１６５（または、塩基性ＦＧＦのような、副行血管の形成を促進することが知られている成長因子をコードする、他のいずれかのＤＮＡプラスミド）が０．１％ｗ／ｖのブロックコポリマーと配合され、虚血の後肢筋肉に筋肉注射された（Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９４：１２， ３２８１−９０ （１９９６））。３０日後、副行血管を確認するために血管造影が行われ、毛細血管を確認するために組織学的分析が行われた。虚血性の骨格筋は、ブロックコポリマーと配合された裸のプラスミドＤＮＡを用いた遺伝子治療のための有望な標的を象徴している。血管形成サイトカインをコードする遺伝子、特に損傷のない細胞により本来分泌される遺伝子の筋肉注射による形質移入は、広範な末梢血管疾患を有する患者のための代替治療方法となるかもしれない。
【０２７７】
実施例４９
遺伝子に基づくワクチン投与に用いられるブロックコポリマー
ブロックコポリマーは、疾患（ガン、ウイルス感染、など）に関連する様々な抗原に対するすべての体液性および細胞性免疫応答を引き起こすために用いられ得る。以下の実施例は、ＨＩＶに焦点をあてているが、これに限定されない。ＨＩＶのｇｐ１２０遺伝子にありサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって誘導されるプラスミドＤＮＡ構造を含むブロックコポリマー配合物が調製された。５μｇのｇｐ１２０プラスミドＤＮＡおよび０．０１％のブロックコポリマーを含む、５０μｌのブロックコポリマー配合物が調製され、前脛骨筋に注射された。注射より約２週間後、筋肉が注射した部位から切除され、実施例４１の方法に従って細胞溶解物として調製され、ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｂｏｔ Ｌａｂｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いてｇｐ１２０の存在を検出する。プラスミドＤＮＡをワクチン接種したマウス血清中に存在するｇｐ１２０抗体のＨＩＶ感染防御能力は、ＨＴ４−６Ｃプラーク還元分析により以下のように測定される。ＨＴ４−６Ｃ細胞（ＣＤ４＋ＨｅＬａ細胞）がＲＰＭＩ培地（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）中で培養される。次いで細胞群がバッチに分割される。いくつかのバッチは、約１０５〜１０６感染単位のＨＩＶを、約１０７個のＨＴ４−６Ｃ細胞に加えることによりＨＩＶ感染させる。その他のバッチは、ＨＩＶおよび、ｇｐ１２０プラスミドＤＮＡをワクチン投与されたマウスの血清約５０μｌの両方を添加することにより、ＨＩＶ感染に対するｇｐ１２０免疫血清の防御効果を試験される。インキュベーション３日後、すべてのバッチの細胞は洗浄され、固定され、クリスタルバイオレットを用いて染色され、プラークの数が計測された。ｇｐ１２０プラスミドＤＮＡ−ワクチン投与されたマウスの血清およびＨＩＶの両方で処置される細胞のバッチにおけるプラーク数の減少を、ＨＩＶ単独で処置されたバッチの数と比較して、ｇｐ１２０免疫血清の防御効果が測定される。
【０２７８】
実施例５０
ジストロフィーのマウス筋肉におけるＩｎ ｖｉｖｏでのジストロフィンの機能発現
完全なジストロフィンコード領域およびＳＶ４０ポリを含むＸｐ２１プラスミドから、ラウス肉腫ウイルスプロモーター制御下のジストロフィン遺伝子を含むプラスミドが調製される。ジストロフィン異常性デュシェンヌ／ベッヘ筋肉（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ／Ｂｅｃｈｅｒ Ｍｕｓｃｕｌａｒ）０．１％ブロックコポリマー溶液１００μｌ中の２００μｇのこのプラスミドが、ジストロフィン遺伝子産物を欠損した変異マウス系（ＭＤＸマウス；Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）の四頭筋（ｑｕａｄｒｉｃｅｐｓ）に注射される。Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．に記載された方法に従った、および同じ抗ジストロフィン抗体（蛍光性二次抗体を有する抗６０ｋｄの抗体）を用いた免疫組織化学によって機能性ジストロフィンの発現が注射後７日間モニターされる。ジストロフィーマウスにおけるジストロフィン遺伝子産物の機能発現は、注射された動物の四頭筋の断面図において観察される蛍光のパターンを正常な動物において観察される蛍光パターンと比較することによって検出される。Ｗａｔｋｉｎｓ Ｓ． Ｃ．， Ｈｏｆｆｍａｎ Ｅ． Ｐ．， Ｓｌａｙｔｅｒ Ｈ． Ｓ．， Ｋｉｎｋｅｌ Ｌ． Ｍ．， Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｍｙｏｆｉｂｒｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ， Ｊｕｎｅ ３０， １９８８； ３３３ （６１７６：８６３−６）。正常なジストロフィン発現は、筋線維の原形質膜の下に局在化しているため、四頭筋の断面図においては細胞を取り囲む蛍光パターンを示す。さらに、ジストロフィン発現は、精製された抗６０ｋｄ抗体の親和性を用いたウエスタンブロット分析によって定量される。
【０２７９】
実施例５１
ブロックコポリマーの組み合わせが、皮内投与に続く遺伝子発現を改善する
この実験においては、５匹のグループで飼育され自由にえさを与えられたＣ５７Ｂ１／６雌マウス（６〜７週齢）の皮膚において遺伝子発現を促進するために、ブロックコポリマーが用いられる。５ｕｇのプラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃが、ブロックコポリマープルロニック（登録商標）Ｆ１２７／Ｌ６１の組み合わせを含む溶液５０ｕｌと配合された。プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃは、ケベック大学、ＩＮＲＳ−ＩＡＦのアルバート　デスコトウ博士（Ｄｒ． Ａｌｂｅｒｔ Ｄｅｓｃｏｔｅａｕｘ）からの寄贈であった。ブロックコポリマーは、最終濃度０．０１％ｗ：ｖで、ｗ：ｗ比が８：１（Ｆ１２７：Ｌ６１）であった。この配合物は、少なくとも５匹のＣ５７Ｂｌ／５７マウスの尾の付け根に注射された。７日後、実施例４２のように、注射した部位の周囲の皮膚および組織が回収され、抽出されて、ルシフェラーゼ活性をモニターした。ルシフェラーゼ活性は実施例４２に記載されたように測定された。以下のデータが得られ、活性レベルは、生理的食塩水中の裸のＤＮＡのみが与えられた対照マウスのレベルと比較された。
【０２８０】
この結果は、ブロックコポリマーを組み合わされて配合されたプラスミドＤＮＡは、ブロックコポリマーなしで投与されたＤＮＡと比べて２０倍高いレベルのルシフェラーゼ遺伝子発現を示すということを示している。
【０２８１】
実施例５２
ブロックコポリマーの組み合わせは、皮内注射されたＤＮＡ組成物に対する
体液性免疫応答を改善する
この実験において、ブロックコポリマーは、５匹のグループで飼育され、自由にえさを与えられたＣ５７Ｂｌ／５７雌マウス（６〜７週齢）に皮内注射されたＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質に対する液性免疫応答を改善するために用いられる。Ｃ５７Ｂ１／５７マウスは、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７／Ｌ６１のブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないｐＣＭＶ−Ｂｇａｌ（β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードしている）の５ｕｇを皮内注射された。その配合物は、実施例５１に記載されたように調製された。血液サンプルは、注射から２および４週後に回収され、β−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、ＥＬＩＳＡによって測定された。
【０２８２】
ＥＬＩＳＡは、９６−ウェルプレート中で一晩、β−ガラクトシダーゼを吸着させることによって行われた。一連の希釈された血清を加える前に、プレートはＰＢＳ−ＢＳＡ１％で２時間ブロックされた。１時間のインキュベーションの後、血清は除去され、プレートはＰＢＳ−トゥイーン０．０１％で２回リンスされ、二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇＧ）がプレートに加えられた。ＡＢＴＳ基質の添加の前に、プレートはＰＢＳ−トゥイーン（登録商標）０．０１％で２回リンスされた。
【０２８３】
データは、抗原に応答したマウスの百分率および応答したマウスの平均力価で表されている。すべての非配合ｐＣＭＶ−Ｂｇａｌを注射されたマウスは抗原に応答しなかった。しかしながら、接種から２および４週間後、ブロックコポリマーと組み合わされて配合されたｐＣＭＶ−Ｂｇａｌを注射されたマウスのそれぞれ３３％および６６％が応答した。この実施例は、ブロックコポリマーはプラスミドによってコードされるタンパク質に対する免疫応答を増強させるということを示している。
【０２８４】
【表３０】
2004509838.tif 000061
【０２８５】
実施例５３
ブロックコポリマーの組み合わせは、ブタ生殖および呼吸器症候群ウイルス
（ＰＲＲＳＶ）の防御性表面抗原（ＯＲＦ５）に対する体液性免疫反応を改善した
この実験において、ブロックコポリマーと組み合わされて配合され、皮内に注射されたプラスミドｐＣＭＶ−ＯＲＦ５は、コードされたタンパク質に対する免疫応答を改善した。４匹のグループで飼育されたＢａｌｂ／Ｃマウス（６〜７週齢）は、ブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないプラスミドｐＣＭＶ−ＯＲＦ５（ＧＰ５タンパク質をコードしている）の５ｕｇを皮内に注射された。その配合物は実施例５１に記載されたように調製された。血液サンプルは接種から３および５週間後に回収され、ＧＰ５に特異的な液性免疫応答をモニターした。血液採取後のはじめの３週後に追加免疫がなされた。
【０２８６】
この結果は、抗−ＧＰ５抗体の平均力価が増加していることによって示されるように、ブロックコポリマーの組み合わせと配合されたｐＣＭＶ−ＯＲＦ５を注射されたマウスは、プラスミドＤＮＡ単独を投与されたマウスに比べてより強い液性免疫応答を引き起こすということを証明している。
【０２８７】
【表３１】
2004509838.tif 000062
【０２８８】
実施例５４
単一のブロックコポリマーは、皮内投与されたＤＮＡ組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験においては、Ｃ５７Ｂｌ／５７マウス（６〜８週齢および、サンプルセットあたりマウス６匹）が、プルロニック（登録商標）８５を最終濃度０．１％または０．０１で含むまたは含まないｐＣＭＶ−Ｂｇａｌの５または５０ｕｇを皮内注射された。接種後２および４週間後に血液サンプルは回収され、β−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、実施例５２のようにＥＬＩＳＡによって測定された。
【０２８９】
データは、β−ガラクトシダーゼに応答したマウスの百分率、および応答したマウスの抗β−ガラクトシダーゼ抗体の平均力価として表される。この結果は、非配合のｐＣＭＶ−Ｂｇａｌを注射されたマウスのβ−ガラクトシダーゼに応答した数は、プルロニック（登録商標）Ｐ８５と配合されたｐＣＭＶ−Ｂｇａｌを注射されたマウスに比べて少なかったということを示している。どちらの濃度のプラスミドＤＮＡを投与されたマウスにおいてもこのような差が生じた。また、プルロニック（登録商標）Ｐ８５と配合されたｐＣＭＶ−Ｂｇａｌを注射されたマウスにおける力価は、非配合のｐＣＭＶ−Ｂｇａｌを投与されたマウスよりも高かった。０．１％の濃度でプルロニックＰ８５を用いた応答がより弱いのは、より低い遺伝子発現に起因するものであろう。０．０１％のＰ８５は、よりよい免疫応答を引き起こすより高い遺伝子発現をもたらすのに、より適切な濃度である。
【０２９０】
【表３２】
2004509838.tif 000063
【０２９１】
【表３３】
2004509838.tif 000064
【０２９２】
実施例５５
単一のブロックコポリマーは、筋肉内投与されたＤＮＡ組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験において、Ｃ５７Ｂ１／マウスは、ＤＮＡ組成物を筋肉内注射したあとの免疫応答の改善を示した。Ｃ５７Ｂｌ／５７（６〜７週齢）雌マウスは、プルロニック（登録商標）８５を含むまたは含まないｐＣＭＶ−Ｂｇａｌの５および５０ｕｇを筋肉内注射された。６匹のマウスが各サンプル配合物を注射された。この配合物は実施例５１に記載されたように調製された。血液サンプルは接種後２および４週間後に回収され、□ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫反応をモニターした。特異的な抗β−ガラクトシダーゼ抗体の検出は、実施例５２に記載されたようにＥＬＩＳＡにより測定された。
【０２９３】
データは、抗原に応答したマウスの百分率、および応答したマウスの平均力価として表される。このデータは、２週間後、５ｕｇのｐＣＭＶ−Ｂｇａｌ単独を注射されたマウスのすべてが免疫応答を示さなかったということを示している。しかしながら、プルロニック（登録商標）８５と配合されたｐＣＭＶ−Ｂｇａｌを注射されたマウスはすべて免疫反応を示した。プルロニック（登録商標）８５と配合されたｐＣＭＶ−Ｂｇａｌを注射されたマウスの抗β−ガラクトシダーゼ抗体の力価は、ｐＣＭＶ−Ｂｇａｌ単独を注射されたマウスよりも常に高かった。
【０２９４】
【表３４】
2004509838.tif 000065
【０２９５】
【表３５】
2004509838.tif 000066
【０２９６】
実施例５６
ブロックコポリマーの組み合わせは、筋肉内投与されたＤＮＡ組成物に対する
体液性免疫反応を改善する
この実験において、ブロックコポリマーは、７匹のグループで飼育されたＣ５７Ｂ１／５７（６〜７週齢）雌マウスの筋肉（前脛骨筋）における液性免疫応答を改善するために用いられる。Ｃ５７Ｂｌ／５７マウスは、ブロックコポリマーの組み合わせを含むまたは含まないｐＣＭＶ−Ｂｇａｌの５または５０ｕｇを筋肉内注射された。この配合物は実施例５１に記載されたように調製された。２および４週間後に血液サンプルは回収され、□−ガラクトシダーゼに特異的な液性免疫応答をモニターした。特異的な抗体の検出は、実施例５２に記載されたようにＥＬＩＳＡによって測定された。
【０２９７】
データは、抗原に応答したマウスの百分率、および応答したマウスの平均力価として表される。このデータは、マウスがブロックコポリマーと配合されたＤＮＡを投与された場合：（１）追加の注射または追加免疫が必要ない、（２）マウスを免疫化するのにより少量のＤＮＡしか必要としない、および（３）免疫反応が始まる時間がより短い、ということを示している。
【０２９８】
【表３６】
2004509838.tif 000067
【０２９９】
【表３７】
2004509838.tif 000068
【０３００】
実施例５７
ブロックコポリマーの組み合わせはブタおよびマウスにおいて
ＰＲＲＳＶウイルスの防御性表面抗原に対する体液性免疫反応を改善する
ブタおよびＢａｌｂ／Ｃ、ＣＤ１マウス（少なくとも５匹の動物、すべて雌）は、ブロックコポリマーの組み合わせ（プルロニック（登録商標）Ｆ１２７／Ｌ６１）を含むまたは含まない、ＰＲＲＳＶウイルスのＯＲＦ５遺伝子（ＧＰ５タンパク質をコードする）を含むアデノウイルスを、０および２１日に皮内注射された。この配合物は実施例５１に記載されたように調製された。５０日後、これらの動物はＰＲＲＳＶウイルスで刺激された。刺激してから７日後に血液サンプルが回収され、ＧＰ５に特異的な体液性免疫応答をモニターした。
【０３０１】
この結果は、ＧＰ５に対するウエスタンブロットによって示されたように、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７／Ｌ６１を配合されたアデノウイルスを投与された動物のみが、免疫記憶を引き起こした。
【０３０２】
実施例５８
ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーの
溶液挙動
ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーが、１０μＭ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の２．５％ＰＢＳ溶液中に、以下に示す濃度で溶解され、その混合物は、少なくとも１時間、２２．５℃または３７℃でインキュベートされた。次いで、これらの系において形成された凝集体の有効径が、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８：２３０３−２３１４ （１９９５）に記載された準弾性光散乱法により測定された。結果を以下に示す。
【０３０３】
【表３８】
2004509838.tif 000069
【０３０４】
2004509838.tif 000070
【０３０５】
「ＮＤ」：検出不可
「ＬＰＳ」：液相分離
（＊）　光散乱測定には濁度が高すぎる
これらの結果は、（１）プロピレンオキサイド含有量が５０％（ｗ／ｖ）以上である疎水性ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）ブロックコポリマーが、生理的温度で、水溶液中で凝集する傾向を明らかに示す、（２）これらのコポリマーの凝集および相分離は、血清タンパク質の存在下で顕著に増強される、ということを示している。
【０３０６】
実施例５９
疎水性プルロニックコポリマーの溶液挙動に対する
親水性プルロニックコポリマーの効果
二つの異なるポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）ブロックコポリマーの混合物の代わりに単一のコポリマーを用いたこと以外は、実施例５８と同じ方法。結果を以下に示す。
【０３０７】
【表３９】
2004509838.tif 000071
【０３０８】
2004509838.tif 000072
【０３０９】
「ＮＤ」：検出不可
（＊）　光散乱測定には濁度が高すぎる
これらの結果は、（１）エチレンオキサイド含有量が５０％（ｗ／ｖ）超の親水性ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーは、生理的温度において、プロピレンオキサイド含有量が５０％（ｗ／ｖ）以上の疎水性親水性ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーの凝集を妨げる、（２）エチレンオキサイド含有量が５０％（ｗ／ｖ）超の親水性ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーは、血清タンパク質の存在下で、プロピレンオキサイド含有量が５０％以上の疎水性親水性ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマーの凝集を妨げる、ことを示している。これらのデータはまた、ブロックコポリマーの混合物が用いられた場合、エチレンオキサイド含有量が７０％以上の親水性ブロックコポリマーが好ましく、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７が特に好ましいということを示している。
【０３１０】
実施例６０
ｐＣＭＶ−βｇａｌ／プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１を注射した
筋肉からの浸潤細胞の単離
Ｃ５７／Ｂｌ／６マウスが、５０μＬ食塩水中の５０μｇのｐＣＭＶ−βｇａｌ、またはプルロニックＦ１２７およびプルロニックＬ６１の混合物を含む溶液５０μＬ中の５０μｇのｐＣＭＶ−βｇａｌを筋肉内に投与された。プルロニックＦ１２７およびプルロニックＬ６１の混合物は実施例５１に記載されたように、ブロックコポリマー質量比が８：１（Ｆ１２７：Ｌ６１）となるように調製された。注入５日後、筋肉は、スライスして免疫組織化学分析を行うために凍結、あるいは、浸潤細胞を機械的に単離するために回収された。次いで筋肉断片は、遺伝子発現および浸潤細胞の位置を特定し、その量を測定するために、ｘ−ｇａｌおよびヘマトキシリン−エオジンで染色された。その結果、ｐＣＭＶ−βｇａｌ／プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１を注入された筋肉は１０倍高いｘ−ｇａｌ染色を示し、配合されたＤＮＡの場合、裸のｐＣＭＶ−βｇａｌと比較して、組織の導入遺伝子発現部位において、それに比例したより多くの浸潤白血球が確認された。次いで筋肉断片は、注射後の筋肉における浸潤白血球の細胞タイプを決定する目的で、免疫組織化学分析を行うために用いられた。さらに、浸潤細胞は筋肉から抽出され、フローサイトメトリー分析を行った。単離された細胞がＴ細胞かどうか決定するためにＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１１ａ分子マーカーに対する抗体が選択され、該細胞がＢ細胞かどうか決定するためにＢ２２０分子に対する抗体が選択され、該細胞がナチュラルキラー細胞かどうか決定するためにＮＫ１．１分子に対する抗体が用いられ、該細胞が浸潤好中球かどうか決定するためにＧｒ−１マーカーに対する抗体が用いられ、該細胞がマクロファージかどうか決定するためにＭａｃ−１分子に対する抗体が用いられた。これらの研究の結果、単離された細胞の大部分が、分析されたマーカー抗原をどれも発現していないということが判明した。上記の表面マーカーを発現していない（下記の結果参照）ことが知られている唯一の浸潤細胞は、未熟な樹状細胞である。
【０３１１】
【表４０】
2004509838.tif 000073
【０３１２】
ｐＣＭＶ−βｇａｌ／プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１を注射された筋肉中の浸潤細胞のフェノタイピング
実施例６１
浸潤細胞のフェノタイプの同定
プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１単独、ｐＣＭＶβｇａｌ、ｐＣＭＶβｇａｌ／プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１、ｐＣＭＶ（空ベクター）および空ベクター／プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１を注射されたマウスの筋肉の細胞が単離され、樹状細胞の増殖に有利な条件で培養された。さらに明確には、上記の群の細胞が、等量、９６−ウェルプレートにおいて平板培養された。ＧＭ−ＣＳＦ（ＤＣの分化を活性化すると知られている増殖因子）、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４、およびＬＰＳ（同様にＤＣの刺激剤として知られている）を用いた恒常的な刺激のもとで７日後、ｐＣＭＶβｇａｌ／プルロニックＦ１２７／プルロニックＬ６１を注射された筋肉から単離された細胞のみが増殖し、樹状突起（スパイクおよびベール）を示していた（下記の結果参照）。
【０３１３】
【表４１】
2004509838.tif 000074
【０３１４】
実施例６２
プルロニックＦ１２７／プルロニック６１のプロモーター依存性効果
この実験において、プルロニックＦ１２７／プルロニック６１は、４匹のグループで飼育され、自由に飼料を与えられた、Ｃ５７Ｂ１／６（６〜７週齢）雌マウスの筋肉（前脛骨筋）における遺伝子発現（転写）に対するその効果を測定するために用いられた。５μｇの、ルシフェラーゼをコードするＣＭＶ−、５Ｖ４０−、ＡＰ−１、ＮＦ−κＢ−誘導性プラスミドＤＮＡがプルロニックＦ１２７／プルロニック６１と配合され、または配合されず、前脛骨筋に筋肉内注射される。各注射前に、ケタミンおよびキシラジンの混合液を用いてマウスは麻酔される。注入５日後にマウスは殺され、注射された各筋肉は切除され、タンパク質分解酵素阻害剤が添加された細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中のポリトロンを用いて迅速にホモジナイズされる。抽出物は氷上で３０分間保存され、次いで、最大速度で２分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。測定は以下のように行われる：１００μＬのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む光測定用チューブに、２０μＬの上清が加えられる。発光はルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて５秒間測定される。データはまずは１秒あたり、前脛骨筋あたりの相対的な光単位であるが、次いで、裸のＤＮＡに比較しての増加の百分率として報告される。下記の表に示されるように、プルロニックＦ１２７／プルロニック６１はプロモーター依存性を有し、特異な転写を誘導する。
【０３１５】
【表４２】
2004509838.tif 000075
【０３１６】
実施例６３
プルロニックＦ１２７／プルロニック６１は浸潤細胞（樹状細胞）において
抗原の取り込みを増加させる
前脛骨筋は、注入５日後に回収され（５０μｇ／筋）、切除され、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ中で機械的な力によって切り刻まれた。筋の小片の懸濁液は、磁石棒を用いて１０分間かき混ぜられ、浸潤細胞が抽出された。抽出された細胞は、無菌のガラスウール栓を有する漏斗を通してろ過することで回収された。残った筋肉片は、２ｍＬの完全培地を加え、上記の操作を繰り返すことによってもう２回抽出された。細胞懸濁液はプールされ、４℃、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。細胞のペレットは、エッペンドルフチューブあたり１×１０６細胞の細胞密度を得るように再懸濁された。細胞は次いで溶解緩衝液中で３０分間抽出され、その後最大速度で２分間遠心分離される。上清は保存され、ルシフェラーゼ活性が測定される。測定は以下のように行われる：１００μＬのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む光測定用チューブに、２０μＬの上清が加えられる。発光はルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて５秒間測定される。データは１秒あたり、前脛骨筋あたりの相対的な光単位として報告される。
【０３１７】
【表４３】
2004509838.tif 000076
【０３１８】
当業者にとって明白である開示された本発明の様々な改変、改良および用途が存在するであろうし、本出願はこれらの実施形態を包含することを意図している。本発明は特定の好ましい実施形態において説明されたが、これらの全範囲は以下の特許請求の範囲を参照することによって判断されることを意図している。
【０３１９】
ここで引用された様々な刊行物、特許および特許出願は、それら全体を参照することによって組み込まれる。
【国際公開パンフレット】
2004509838.tif 000085
2004509838.tif 000086
2004509838.tif 000087
2004509838.tif 000088
2004509838.tif 000089
2004509838.tif 000090
2004509838.tif 000091
2004509838.tif 000092
2004509838.tif 000093
2004509838.tif 000094
2004509838.tif 000095
2004509838.tif 000096
2004509838.tif 000097
2004509838.tif 000098
2004509838.tif 000099
2004509838.tif 000100
2004509838.tif 000101
2004509838.tif 000102
2004509838.tif 000103
2004509838.tif 000104
2004509838.tif 000105
2004509838.tif 000106
2004509838.tif 000107
2004509838.tif 000108
2004509838.tif 000109
2004509838.tif 000110
2004509838.tif 000111
2004509838.tif 000112
2004509838.tif 000113
2004509838.tif 000114
2004509838.tif 000115
2004509838.tif 000116
2004509838.tif 000117
2004509838.tif 000118
2004509838.tif 000119
2004509838.tif 000120
2004509838.tif 000121
2004509838.tif 000122
2004509838.tif 000123
2004509838.tif 000124
2004509838.tif 000125
2004509838.tif 000126
2004509838.tif 000127
2004509838.tif 000128
2004509838.tif 000129
2004509838.tif 000130
2004509838.tif 000131
2004509838.tif 000132
2004509838.tif 000133
2004509838.tif 000134
2004509838.tif 000135
2004509838.tif 000136
2004509838.tif 000137
2004509838.tif 000138
2004509838.tif 000139
2004509838.tif 000140
2004509838.tif 000141
2004509838.tif 000142
2004509838.tif 000143
2004509838.tif 000144
2004509838.tif 000145
2004509838.tif 000146
2004509838.tif 000147
2004509838.tif 000148
2004509838.tif 000149
2004509838.tif 000150
2004509838.tif 000151
2004509838.tif 000152
2004509838.tif 000153
2004509838.tif 000154
2004509838.tif 000155
2004509838.tif 000156
2004509838.tif 000157
2004509838.tif 000158
2004509838.tif 000159
2004509838.tif 000160
2004509838.tif 000161
2004509838.tif 000162
2004509838.tif 000163
2004509838.tif 000164
2004509838.tif 000165
2004509838.tif 000166
2004509838.tif 000167
2004509838.tif 000168
2004509838.tif 000169
2004509838.tif 000170
2004509838.tif 000171
2004509838.tif 000172
2004509838.tif 000173
2004509838.tif 000174
2004509838.tif 000175
2004509838.tif 000176
2004509838.tif 000177
2004509838.tif 000178
2004509838.tif 000179
2004509838.tif 000180
2004509838.tif 000181
2004509838.tif 000182
2004509838.tif 000183
2004509838.tif 000184
2004509838.tif 000185
2004509838.tif 000186
2004509838.tif 000187
2004509838.tif 000188
2004509838.tif 000189
2004509838.tif 000190
2004509838.tif 000191
2004509838.tif 000192
2004509838.tif 000193
2004509838.tif 000194
2004509838.tif 000195
2004509838.tif 000196
2004509838.tif 000197
2004509838.tif 000198
2004509838.tif 000199
2004509838.tif 000200
2004509838.tif 000201
2004509838.tif 000202
2004509838.tif 000203
2004509838.tif 000204
2004509838.tif 000205
2004509838.tif 000206
2004509838.tif 000207
2004509838.tif 000208
2004509838.tif 000209
2004509838.tif 000210
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004509838.tif 000211
【国際調査報告】
2004509838.tif 000212