(57)【要約】本発明は、本発明において「ＭＡｂ５０−４」及び「ＭＡｂ１８４−１０」と呼ばれる抗体、並びにＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０と競合するポリペプチドを特徴とする。ＭＡｂ５０−４はＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３４８９により、ＭＡｂ１８４−１０はＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９９９により産生されうる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡｂ５０−４、ＭＡｂ１８４−１０であるか、又はヒト・シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するポリペプチドを含む、実質的又は部分的に純粋なポリペプチド調製物。
【請求項２】
ＭＡｂ５０−４である、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
ＭＡｂ１８４−１０である、請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
ＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかであるか、又はヒト・シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＩｇＧ２ｂサブタイプもしくはＩｇＧ２ａサブタイプのいずれかであるか、又はＩｇＧ２ｂサブタイプもしくはＩｇＧ２ａサブタイプのいずれかに由来する断片である、請求項４のモノクローナル抗体。
【請求項６】
ＩｇＧ２ｂサブタイプ又はＩｇＧ２ａサブタイプである、請求項４のモノクローナル抗体。
【請求項７】
ヒトのＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、及びＣＹＰ３Ａ７のうちのいずれかと有意に交差反応しない、請求項６のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ヒト・シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６により触媒されるブフラロールの代謝を少なくとも７５％特異的に阻害する、請求項７のモノクローナル抗体。
【請求項９】
ＭＡｂ５０−４である、請求項４のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ＭＡｂ１８４−１０である、請求項４のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
ＭＡｂ５０−４、ＭＡｂ１８４−１０であるか、又はヒト・シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するポリペプチドを産生する細胞系。
【請求項１２】
ポリペプチドが、ＩｇＧ２ｂサブタイプもしくはＩｇＧ２ａサブタイプの抗体であるか、又はＩｇＧ２ｂサブタイプもしくはＩｇＧ２ａサブタイプいずれかに由来する断片である、請求項１１の細胞系。
【請求項１３】
ポリペプチドが、ＩｇＧ２ｂサブタイプ又はＩｇＧ２ａサブタイプの抗体である、請求項１１の細胞系。
【請求項１４】
抗体が、ヒトのＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、及びＣＹＰ３Ａ７のうちのいずれかと有意に交差反応しないものである、請求項１３の細胞系。
【請求項１５】
抗体が、ヒト・シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６により触媒されるブフラロールの代謝を少なくとも７５％特異的に阻害するものである、請求項１４の細胞系。
【請求項１６】
抗体がＭＡｂ５０−４である、請求項１１の細胞系。
【請求項１７】
抗体がＭＡｂ１８４−１０である、請求項１１の細胞系。
【請求項１８】
不死化されている、請求項１１〜１７のいずれかの細胞系。
【請求項１９】
ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３４８９である、請求項１１の細胞系。
【請求項２０】
ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９９９である、請求項１１の細胞系。
【請求項２１】
試料中のシトクロムＰ４５０  ２Ｄ６に関してアッセイする方法であって、
ａ）該試料を請求項１から３のいずれかのポリペプチドと接触させる工程、及び
ｂ）該ポリペプチドの、該試料中に存在する物質と結合する能力を測定する工程を含む、方法。
【請求項２２】
試料中のシトクロムＰ４５０  ２Ｄ６に関してアッセイする方法であって、
ａ）該試料を請求項４から１０のいずれかの抗体と接触させる工程、及び
ｂ）該抗体の、該試料中に存在する物質と結合する能力を測定する工程を含む、方法。
【請求項２３】
シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６が化合物を代謝するか否かを決定する方法であって、
ａ）シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６と、該化合物と、ＭＡｂ５０−４、ＭＡｂ１８４−１０であるか、又はヒト・シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合し、かつヒト・シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６により触媒されるブフラロールの代謝を少なくとも７５％特異的に阻害するモノクローナル抗体とを合わせる工程、及び
ｂ）シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の、該化合物を代謝する能力を測定する工程を含む、方法。
【請求項２４】
抗体がＭＡｂ５０−４である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
抗体がＭＡｂ１８４−１０である、請求項２３の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本願は、参照により本明細書に組み込まれる２０００年９月２９日出願の米国仮出願第６０／２３６，６６５号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本明細書において引用される参照は、特許請求の範囲に記載された発明に対する先行技術であるとは認められない。
【０００３】
シトクロムＰ−４５０酵素は、薬物、環境化学物質、及び生体分子（ｅｎｄｏｂｉｏｔｉｃｓ）の代謝を担う重要な酵素系である。ヒト・シトクロムＰ−４５０酵素は、個体及び組織に不均一に分布している複数の型で存在している。Ｐ−４５０酵素の複数の型は、オーバーラップする場合もあるが、異なる基質特異性及び生成物特異性を有している（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．４０：２４３−２８８，１９８８；Ｇｕｅｎｇｅｒｉｓｈら．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２８３：１−１１，１９９１；Ｇｕｅｎｇｅｒｉｓｈら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５４：１７−６１，１９９２，Ｃｏｏｎら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．６：６６９−６７３，１９９２；及びＮｅｌｓｏｎら，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１−４２，１９９６）。
【０００４】
Ｐ４５０酵素の１つの型は、Ｐ４５０  ２Ｄ６である（「ＣＹＰ２Ｄ６」とも呼ばれる）。ＣＹＰ２Ｄ６は、多数の薬物の代謝において機能するデブリソキンヒドロキシラーゼであり、多形的に発現している（Ｇｅｌｂｏｉｎら，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：４６９−４７７，１９７７）。
【０００５】
ヒト集団におけるＣＹＰ２Ｄ６多形の大部分が、最初、デブリソキン／スパルテインの酸化におけるＣＹＰ２Ｄ６の役割によって同定された。その後の研究によって、カフカス地方集団の５〜１０％及びアジア集団の１％が、低代謝群のための常染色体劣性形質を保有していることが示された（Ｃｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．（１９９６）Ｔｈｅ  ＣＹＰ２Ｄ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ．Ｉｎ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  Ｐ４５０：Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ｃ．Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｖ．Ｐａｒｋｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【０００６】
阻害性モノクローナル抗体は、基質代謝における異なるＰ４５０酵素の量的役割を評価するための単純かつ正確な方法を提供する。ＣＹＰ２Ｄ６を阻害するとして記載されたモノクローナル抗体については、Ｇｅｌｂｏｉｎら，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：４６９−４７７，１９９７、Ｋｒａｕｓｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５４：１５−１７，１９９７、及び米国特許第６，０６０，３５３号を参照のこと。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、本明細書において「ＭＡｂ５０−４」及び「ＭＡｂ１８４−１０」と呼ばれる抗体、並びにＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０と競合するポリペプチドを特徴とする。ＭＡｂ５０−４はＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３４８９により、ＭＡｂ１８４−１０はＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９９９により産生されうる。
【０００８】
従って、本発明の第一の態様は、ＭＡｂ５０−４、ＭＡｂ１８４−１０であるか、又はヒトＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するポリペプチドを含む、実質的又は部分的に純粋なポリペプチド調製物を記載する。「ポリペプチド」という発現には、単鎖ポリペプチド、及び免疫グロブリンのような多鎖ポリペプチドが含まれる。ヒトＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０と競合するポリペプチドは、好ましくは、抗体である。
【０００９】
「実質的又は部分的に純粋なポリペプチド調製物」という発現は、存在する全タンパク質の少なくとも１０％を構成するポリペプチドを示す。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、試料又は調製物の中の全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％に相当する。「実質的又は部分的に純粋なポリペプチド調製物」という発現は、精製を必要とはせず、例えば、精製されていない化学合成されたポリペプチドを含みうる。
【００１０】
ヒトＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するポリペプチドとは、過剰及び同等の量の競合ポリペプチドとＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０とが利用された場合、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％、ＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０の結合を減少させるものである。結合競合アッセイは、ＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０がヒトＣＹＰ２Ｄ６と結合する条件を使用して実施されうる。
【００１１】
本発明のもう一つの態様は、ＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかであるか、又はヒトＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するモノクローナル抗体であるモノクローナル抗体を記載する。「モノクローナル」抗体とは、均一な抗体集団である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、又は抗体をコードする外因性核酸を含有している組換え細胞の使用を含む技術のような、種々の技術を使用して作製されうる。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３４８９（ＭＡｂ５０−４を産生）又はＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９９９（抗体ＭＡｂ１８４−１０を産生）から産生されるモノクローナル抗体を記載する。ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３４８９及びＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９９９は、ブダペスト条約に基づき、それぞれ２００１年６月２９日及び２０００年６月７日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）に寄託された。
【００１３】
本発明のもう一つの態様は、ＭＡｂ５０−４、ＭＡｂ１８４−１０であるか、又はヒトＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するポリペプチドを産生する細胞系を記載する。好ましい細胞系は、ハイブリドーマ、及びポリペプチドをコードする組換え核酸を含有している組換え細胞系である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、試料中のＣＹＰ２Ｄ６に関するアッセイの方法を記載する。その方法は、（ａ）試料を、本明細書に記載のポリペプチド、好ましくは抗体と接触させる工程；及び（ｂ）ポリペプチドの、試料中に存在する物質と結合する能力を測定する工程を含む。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、ＣＹＰ２Ｄ６が化合物を代謝するか否かを決定する方法を記載する。その方法は、（ａ）ＣＹＰ２Ｄ６と、化合物と、ＣＹＰ２Ｄ６により触媒されるブフラロールの代謝を少なくとも約７５％特異的に阻害する本明細書に記載のポリペプチド、好ましくはＭＡｂ５０−４、ＭＡｂ１８４−１０であるか、又はヒトＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するモノクローナル抗体であるポリペプチドとを合わせる工程；及び（ｂ）ＣＹＰ２Ｄ６の、化合物を代謝する能力を測定する工程を含む。
【００１６】
本発明のその他の特徴及び利点は、種々の例を含む、本明細書に提供されたさらなる説明より明らかとなる。提供された例は、本発明の実施において有用な種々の成分及び方法論を例示するものである。例は、特許請求の範囲に記載された発明を制限しない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用なその他の成分及び方法論を利用することが可能である。
【００１７】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＣＹＰ２Ｄ６によるブフラロール１’−水酸化のＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０による阻害を示す図である。モノクローナル抗体腹水及びＣＹＰ２Ｄ６（１５ｐｍｏｌ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液９７０μｌを、室温で５分間プレインキュベートした。２５μＭブフラロール及び１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを１ｍＬ添加することにより、反応を開始させ、３７℃で１０分間インキュベートした。モノクローナル抗体の存在下及び非存在下で形成された１’−ＯＨ−ブフラロールを内部標準と比較することにより、対照に対する割合（％）を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で決定した。データは、デュプリケート決定の平均値である。
【００１８】
図２は、１２個の組換えヒトＰ４５０によるマーカー基質の代謝のＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０による阻害の特異性を示す図である。個々のＰ４５０に関する特異的アッセイは、下記表１に示されている。ＭＡｂは、１０〜３０ｐｍｏｌの組換えＰ４５０を含有しているインキュベーション混合物１ｍＬ当たり１μｌのマウス腹水として使用された。全ての試料が、ＨＰＬＣによって分析された。データは、トリプリケート決定の平均値（標準誤差付き）である。
【００１９】
図３は、１２個の組換えヒトＰ４５０によるマーカー基質代謝のＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０による阻害の特異性を示す図である。個々のＰ４５０に関する特異的アッセイは、表１に示されている。ＭＡｂは、１０〜３０ｐｍｏｌの組換えＰ４５０を含有しているインキュベーション混合物１ｍＬ当たり５μｌのマウス腹水として使用された。全ての試料が、ＨＰＬＣによって分析された。データは、トリプリケート決定の平均値（標準誤差付き）である。
【００２０】
図４は、ＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０を使用した、７個のヒト肝ミクロソーム（ＨＬ）のパネルにおけるブフラロール１’−水酸化へのヒトＣＹＰ２Ｄ６の寄与の評価を示す図である。ＭＡｂ（５μｌ腹水）及びＨＬ（３０ｐｍｏｌ）を含む、補因子を含有しているインキュベーション混合物１ｍＬを、５分間のプレインキュベーションの後、３７℃で１０分間インキュベートした。ＰＨＬ＝プールされたヒト肝ミクロソーム。ヒト肝ミクロソームにおけるブフラロール１’−ヒドロキシラーゼの対照比活性（ｎｍｏｌ／分，ｎｍｏｌ）は、それぞれ、２．５（ＨＬ１４）、１．４（ＨＬ１５）、０．８（ＨＬ１６）、５．８（ＨＬ１７）、３．７（ＨＬ１８）、２．５（ＨＬ１９）、及び１．５（ＰＨＬ）であった。
【００２１】
図５は、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、及びＣＹＰ２Ｃ８／９に特異的な阻害性ＭＡｂの組み合わせ使用による、ＨＬ１６におけるブフラロール１’−水酸化への単一及び複数のＰ４５０の寄与の評価を示す図である。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
モノクローナル抗体ＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０は、ヒトＣＹＰ２Ｄ６と結合し、ＣＹＰ２Ｄ６活性を選択的に阻害する。ＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０が結合するＣＹＰ２Ｄ６の領域は、ポリペプチド結合のための、好ましくはＣＹＰ２Ｄ６活性の選択的阻害のための標的部位を提供する。
【００２３】
ＣＹＰ２Ｄ６と結合するポリペプチドは、ＣＹＰ２Ｄ６が試料中に存在するか否かの決定のような、多様な用途を有する。好ましいポリペプチドは、ＣＹＰ２Ｄ６と選択的に結合するものである。
【００２４】
ＣＹＰ２Ｄ６との選択的結合は、少なくとも以下の非標的Ｐ４５０酵素：ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、及びＣＹＰ３Ａ７に関して決定される。ＣＹＰ２Ｄ６と選択的に結合するポリペプチドは、（１）１個以上、好ましくは全ての非標的Ｐ４５０酵素と結合するよりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍強く、ＣＹＰ２Ｄ６と結合する、及び（２）１個以上、好ましくは全ての非標的Ｐ４５０酵素と検出可能に結合しない条件の下で、ＣＹＰ２Ｄ６と検出可能に結合する、という特徴の一方又は両方を有している。ポリペプチドのＰ４５０非標的酵素及びＣＹＰ２Ｄ６との結合能は、後述の実施例に記載されたもののような条件を使用して測定されうる。
【００２５】
より好ましいポリペプチドは、ＣＹＰ２Ｄ６活性を選択的に阻害するものである。ＣＹＰ２Ｄ６活性を選択的に阻害するポリペプチドは、個々のＰ４５０の相互作用、並びに薬物及び薬物候補の代謝への寄与に関する情報を提供するために使用されうる。そのような情報は、薬物の効力、薬物の相互作用、及び薬物の毒性の予測に有用であり得る。
【００２６】
ＣＹＰ２Ｄ６活性の選択的阻害は、少なくとも以下の非標的Ｐ４５０酵素：ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、及びＣＹＰ３Ａ７に関して決定される。ブフラロール代謝を有意に阻害し、１個以上、好ましくは全てのＰ４５０非標的酵素を、約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満阻害する場合、そのポリペプチドはＣＹＰ２Ｄ６を選択的に阻害する。ブフラロール代謝の有意な阻害は、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも約９０％のブフラロールの阻害によって達成される。阻害率（％）は、後述の実施例に記載されたもののような種々の条件を使用して測定されうる。
【００２７】
ＣＹＰ２Ｄ６との結合能を有するポリペプチドには、抗体、抗体断片、及びそれらの誘導体が含まれる。抗体の基本構造単位は、ヒンジ領域を介して２個のＦａｂ領域と連結されたＦｃ領域を提供する４本のポリペプチド鎖を含有している（例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；及びＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照のこと）。
【００２８】
天然に存在する抗体において、４本のポリペプチド鎖は、２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を含有している。重鎖及び軽鎖は、各々、定常領域及び可変領域を含有している。可変領域には、抗原特異性を担う超可変領域が含まれている。
【００２９】
２本の重鎖ポリペプチドのカルボキシ末端領域は、ジスルフィド結合により連結されＦｃ領域を作製している定常領域である。Ｆｃ領域は、補体及びマクロファージの活性化のような生物学的活性の提供にとって重要である。Ｆｃ領域を構成する２本の重鎖ポリペプチドは、各々、ヒンジ領域を介して異なるＦａｂ領域へと延びている。
【００３０】
Ｆａｂ領域は、各々、可変領域と定常領域とから構成された軽鎖、及び可変領域と定常領域とを含有している重鎖領域を含有している。軽鎖は定常領域を介してジスルフィド結合によって重鎖と連結されている。
【００３１】
Ｆａｂ領域の軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に参加するＦｖ領域を提供する。Ｆｖ領域の特異性は、比較的よく保存されている領域（フレームワーク領域とも呼ばれる）に挟まれている３つの超可変領域（相補性決定領域とも呼ばれる）によって決定される。フレームワーク領域及び相補性決定領域に関連しているアミノ酸は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１によって記載されているようにして、番号付けされ、整列化されうる。
【００３２】
高等脊椎動物においては、軽鎖の２つのクラス及び重鎖の５つのクラスが存在する。軽鎖はκ又はλのいずれかである。重鎖は抗体クラスを定義し、α、β、ε、γ、又はμのいずれかである。例えば、ＩｇＧは、γ重鎖を有している。種々の重鎖については、γ１、γ２、γ３、及びγ４のようなサブクラスも存在する。重鎖は、ヒンジ領域及びテール領域に独特のコンフォメーションを与える（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。
【００３３】
サブクラスはさらに細分される場合がある。例えば、ＩｇＧ２サブタイプは、さらにＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂに分類されうる（Ｈａｈｎ  Ｇ．Ｓ．（１９８２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｔｅｓ．Ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｓ．Ｅ．Ｒｉｔｚｍａｎｎ（編）Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及びＴｕｒｎｅｒ  Ｍ．Ｗ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．第２版  Ｅ．Ｊ．Ｈｏｌｂｏｒｏｗ＆Ｗ．Ｇ．Ｒｅｅｖｅｓ（編）Ｇｒｕｎｅ＆Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００３４】
ＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するポリペプチド
ヒトＣＹＰ２Ｄ６との結合に関してＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合するポリペプチドは、種々の技術を使用して入手されうる。適切な技術には、ＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０を含む競合アッセイを使用した競合性抗体の選択、ＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０のいずれかからのＦｖ断片を含むポリペプチドの導出、及びＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０のいずれかと競合することが同定された抗体からのＦｖ断片を含むポリペプチドの導出が含まれる。
【００３５】
Ｆｖ断片中に提供される情報に基づき、抗原と結合する多数の異なるポリペプチド誘導体が作製されうる。好ましい誘導体は、抗体標的との結合能を維持しているポリペプチドを得るため、ＭＡｂ５０−４もしくはＭＡｂ１８４−１０又はそれらの断片の定常領域又は可変領域に施された修飾を含有している。種々の型の修飾の例には、１個以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、及び改変が含まれる。特定のポリペプチドのＭＡｂ５０−４又はＭＡｂ１８４−１０との競合能は、競合実験を使用して決定されうる。
【００３６】
適切なポリペプチドは、種々の抗体領域を修飾することにより抗体から導出されうる。修飾は、Ｆｃ領域又はＦａｂ定常領域のような種々の領域に施すことができる。Ｆａｂ定常領域が除去される場合、Ｆｖを構成する重鎖及び軽鎖の可変領域は、ポリペプチド・リンカーによって連結されうる。
【００３７】
適切なポリペプチドは、Ｆｖ領域、特にフレームワーク領域内を修飾することによっても導出されうる。そのような修飾を施す能力は、抗体のヒト化に関する種々の参照に例示されている（例えば、米国特許第５，６９３，７６２号、第６，０５４，２９７号、及び第６，０５６，９５７号を参照のこと）。
【００３８】
好ましいポリペプチドは、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、個々のＰ４５０の量を定量的に測定することができる、正確で、安定な、かつ高度に特異的な試薬である。それらは、一般的に、ポリクローナル抗体又は化学的阻害剤のいずれかより大きな特異性を有している。さらに、モノクローナル抗体は、強い非競合的阻害動力学を示すことができるため、特定の薬物の代謝へのＰ４５０の寄与が、［Ｓ］、Ｋｍ、並びに基質及び触媒反応の型に関わらず、正確に決定されうる。従って、単一のＰ４５０と特異的に結合し、かつ／又はそれを阻害するモノクローナル抗体は、複数の型Ｐ４５０を含有している組織における、基質代謝におけるそのＰ４５０の役割を同定し定量するために使用されうる。モノクローナルにより達成される阻害の程度は、代謝反応への標的Ｐ４５０の寄与の尺度となる。
【００３９】
ポリペプチドの作製
ポリペプチドは、化学合成、組換え核酸技術、及びハイブリドーマの使用を含む技術を含む、標準的な技術を使用して作製されうる。ポリペプチドの化学合成技術は、当分野において周知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０参照）。
【００４０】
組換え核酸技術は、ポリペプチド合成のために核酸テンプレートを利用する。インビトロ翻訳の技術、並びに核酸を細胞へと導入し、核酸を発現させてタンパク質を製作するための技術の例は、当分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、及びＳａｍｂｒｏｏｋら，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照）。
【００４１】
原核生物（例えば、大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））由来のもの、並びに真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、及び哺乳類）由来のものを含む、種々の起源の多様な細胞系が、組換え抗体発現のために使用されうる（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９９）。抗体をコードする核酸は、宿主染色体とは別に自律的に存在しうる発現ベクターを使用して、宿主へ導入されうる。又は、抗体をコードする核酸は、宿主染色体へと組み込まれてもよい（例えば、国際特許出願第ＷＯ９５／１７５１６号参照）。
【００４２】
ハイブリドーマとは、不死化された抗体産生細胞系である。ハイブリドーマを製作し使用するための技術の例は、後述の実施例、並びにＡｕｓｕｂｅｌ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８、及びＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５のような参照に記載されている。
【００４３】
ＣＹＰ２Ｄ６発現レベルの決定
ＣＹＰ２Ｄ６と特異的に結合するポリペプチドは、ＣＹＰ２Ｄ６の発現レベルを決定するために利用されうる。酵素レベルを検出するためにポリペプチドを使用するための種々の形式が、当分野において周知である。
【００４４】
一般に、ＣＹＰ２Ｄ６発現レベルを決定するアッセイは、試料をＣＹＰ２Ｄ６に特異的なポリペプチドと接触させること、及び試料中に存在する物質とのポリペプチド結合を測定することを含む。ポリペプチド結合は、検出可能標識を含有しているポリペプチドを利用した技術、及びＣＹＰ２Ｄ６特異的ポリペプチドを認識する抗体を使用した技術のような、種々の技術を使用して測定されうる。検出可能標識には、蛍光標識、放射標識、及び基質を定量可能な生成物へと代謝する酵素（例えば、酵素がアルカリホスファターゼであり、基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムであるような場合）を含む。
【００４５】
本発明の一実施形態において、ＣＹＰ２Ｄ６発現は、以下の工程を使用することにより決定される。試料の成分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのようなゲル上で分離し、分離された試料を吸着することができる物質（例えば、ニトロセルロース紙）へと転写し、ＣＹＰ２Ｄ６に特異的な一次抗体と接触させ、一次抗体に特異的であり、かつ検出可能標識を含んでいる二次抗体と接触させる。次いで、ＣＹＰ２Ｄ６の量を、検出可能標識のアッセイにより定量する。
【００４６】
ＣＹＰ２Ｄ６活性及び化合物代謝の決定
ＣＹＰ２Ｄ６活性及び化合物代謝の程度は、当分野において周知の技術を使用してブフラロール代謝をアッセイすることにより測定されうる。代謝の程度を測定することができる１つの手段は、反応を停止させた後、基質及び生成物のレベルを測定し、その活性レベルを阻害性ポリペプチドを添加しなかった対照試料と比較することによる。例えば、ジクロロメタンを添加することにより反応を停止させ、次いで、代謝物を水相から有機相へと抽出し、有機相を乾燥させ、試料残さを代謝物の分離及び定量のために直ちにＨＰＬＣに供することができる。代謝レベルを決定するためのその他の方法も許容され、本発明に含まれる。
【００４７】
本発明の一実施形態において、基質に対するＣＹＰ２Ｄ６の活性は、（１）基質を含有している試料をＣＹＰ２Ｄ６活性を特異的に阻害する抗体と接触させること；（２）基質及び生成物のレベルを測定すること；並びに（３）その基質及び生成物のレベルを、ＣＹＰ２Ｄ６及び基質を含有しているが抗体は含有していない対照試料から得られたレベルと比較することを含む方法において測定される。変動の程度が、基質代謝へのＣＹＰ２Ｄ６の寄与を示す。
【００４８】
実施例
本発明の種々の特徴をさらに例示するために以下に実施例を示す。実施例も、本発明の実施のために有用な方法論を例示する。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載された発明を制限しない。
【００４９】
実施例１：実験法
抗体の入手及び特徴決定に利用した種々の実験プロトコルを、以下に示す。
【００５０】
ヒトＰ４５０の調製
Ｐ４５０  ３Ａ４、３Ａ７、１Ａ１、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、及び２Ｅ１、並びにＯＲ（Ｐ４５０オキシドレダクターゼ）のヒトｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現ベクターに個々に挿入した。スポドプテラ・フルギペドラ（Ｓｐｏｒａｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｄｒａ）（Ｓｆ２１）昆虫細胞に、組換えウィルスを別々に感染させ、Ｐ４５０タンパク質を発現させた。Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅ  ＣＹＰ３Ａ５＋ＯＲは、Ｇｅｎｔｅｓｔ  Ｉｎｃ．より購入した。個々のＰ４５０を発現しているＳｆ２１細胞よりミクロソームを調製し、使用時まで−８０℃で保存した。Ｐ４５０含有量及びタンパク質濃度を決定した。代謝研究の場合には、Ｐ４５０タンパク質をＯＲと共発現させ、マーカー基質を用いてそれらの比活性を測定した（表１）。
【００５１】
【表１】
2004524007.tif 000003
【００５２】
モノクローナル抗体のＩＣ５０の決定
ＩＣ５０値は、Ｇｒａｆｉｔバージョン３．０９（Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｉｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｅｒｉｔｈａｎｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．，Ｓｔａｉｎｅｓ，ＵＫ）を使用して、以下のようにして計算した。
【００５３】
【数１】
2004524007.tif 000004
［式中、Ｖ０は非阻害速度であり、ｖは観察速度であり、ｓは勾配係数であり、Ｉは阻害剤濃度である］
【００５４】
マウスの免疫感作及びハイブリドーマ作製
バキュロウイルス発現ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質を含有しているＳｆ２１細胞ミクロソーム５０μｇを完全フロイントアジュバント０．２ｍＬに乳化させたもので、３匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、４から６週間に３回ｉ．ｐ．注射により免疫感作し（一次免疫感作）、続いて不完全フロイントアジュバントを用いて２回の免疫感作を行った。３回目の免疫感作の３日後、１匹のマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。骨髄腫細胞の、解離させた感作脾細胞との融合は、ＰＥＧ５０００処理によって実施した。ＨＡＴ培地で希釈された細胞を、１０，０００個／ウェル（０．２ｍＬ／ウェル）の密度で１０枚の９６穴組織培養プレートへと分配した。ハイブリドーマを選出し、選択ＨＡＴ培地中で増殖させた。
【００５５】
抗体産生に関するスクリーニング
モノクローナル抗体スクリーニングは、マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）及びマウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）に対するアルカリホスファターゼ結合ヤギＦ（ａｂ’）２断片を使用したＥＬＩＳＡによって実施した。イムノアッセイ・プレートを、１ｐｍｏｌ／ウェル（１００μＬ）のバキュロウイルス発現ＣＹＰ２Ｄ６を含有しているＳｆ２１ミクロソーム、又は野生型バキュロウイルス感染Ｓｆ２１細胞ミクロソームを、１×コーティング溶液を使用してコーティングした。ハイブリドーマが増殖し始めた時点で、各ウェルからの消費済み培地を、ＥＬＩＳＡによってＣＹＰ２Ｄ６に対する抗体の存在に関してスクリーニングした。各陽性ウェルを再スクリーニングし、次いで１０％ＦＢＳを含む完全培地を使用してサブクローニングした。目的のハイブリドーマを、モノクローナルであることを確実にするため、少なくとも２から３回再サブクローニングした。
【００５６】
イムノブロット分析
Ｓｆ２１細胞から発現されたＰ４５０、及び肝ミクロソーム・タンパク質（１ｐｍｏｌ／ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースへと転写し、培養液又は腹水に由来するモノクローナル抗体を用いて探索した。モノクローナル抗体結合は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体を使用して検出した。
【００５７】
抗体の特徴決定
アイソタイプ決定は、マウス・モノクローナル抗体タイピング・キット（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．）によって提供されるオクタロニー免疫拡散技術を使用して実施した。
【００５８】
モノクローナル抗体を含有している腹水の調製
プリスタンによる初回刺激の後、腹水の調製のため、ハイブリドーマ細胞を、１０６個／匹の密度で各マウスの腹腔に注射した。高度に濃縮されたモノクローナル抗体を含有している腹水を、２から３週後に各マウスから回収した（３〜５ｍＬ／匹）。
【００５９】
ＣＹＰ２Ｄ６のモノクローナル抗体による阻害
典型的な１ｍＬのインキュベーションは、モノクローナル抗体（必要に応じて０．００３９から４０μＬの腹水）、及び１０から３０ｐｍｏｌのＣＹＰ２Ｄ６又はその他のＰ４５０、又は３０ｐｍｏｌのヒト肝ミクロソーム（全Ｐ４５０）を含有している０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．４）９７０μＬを含有していた。混合物を、室温で５分間プレインキュベートし、最終容量１ｍＬのＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）及び基質（メタノールに溶解）の添加によって反応を開始させ、３７℃で１０から３０分間インキュベートした。抗ＭＫ−０６７７モノクローナル抗体を、非特異的結合の対照として使用した。（１個以上の）代謝物の定量のための内部標準の添加の後に、代謝物を８倍容量のジクロロメタンで抽出し、窒素ガス流の下で乾燥させた。残さを、５０から８０％のメタノール又はアセトニトリルの水溶液１００μＬに溶解させ、ＨＰＬＣ又はＬＣ−ＭＳによって直ちに分析した。モノクローナル抗体のＣＹＰ２Ｄ６以外のＰ４５０との交差反応性を決定するためのマーカー・アッセイは、表１に列挙されている。
【００６０】
実施例２：結果
ヒトＣＹＰ  ２Ｄ６に対する抗体の生成及び特徴決定に関する結果を、以下に示す。
【００６１】
ヒトＣＹＰ２Ｄ６に特異的なモノクローナル抗体の調製
ＣＹＰ２Ｄ６  ｃＤＮＡをコードしている組換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ２１細胞のＣＹＰ２Ｄ６に富むミクロソームで、マウス免疫感作した。免疫感作の３週間後、免疫感作されたマウスに由来する分散させた脾細胞を骨髄腫細胞と融合させたところ、３，０００個超のハイブリドーマ・クローンを含むＨＡＴ選択培養物が形成された。ＥＬＩＳＡによって、ＣＹＰ２Ｄ６との結合活性が陽性の抗体産生ハイブリドーマ・クローン１９１個が同定された。インビトロ・アッセイを使用すると、１９１個のハイブリドーマのうち２個のクローン（ＭＡｂ１８４−１０及びＭＡｂ５０−４として定義した）が、ＣＹＰ２Ｄ６酵素活性を強く阻害するモノクローナル抗体を産生した（図１）。しかしながら、２個のモノクローナル抗体は、いずれも、ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質を含むイムノブロットを与えず、そのことからＣＹＰ２Ｄ６上の（１個以上の）エピトープが高度に高次構造性であることが示唆された。モノクローナル抗体の免疫グロブリンのアイソタイプは、オクタロニー免疫拡散技術によって、ＭＡｂ５０−４についてはＩｇＧ２ｂ、ＭＡｂ１８４−１０についてはＩｇＧ２ａと同定された。
【００６２】
ＣＹＰ２Ｄ６に対するモノクローナル抗体の阻害効果
ＭＡｂ１８４−１０又はＭＡｂ５０−４を含有しているマウス腹水を、ＣＹＰ２Ｄ６活性の指標として一般に使用されているＣＹＰ２Ｄ６により触媒されるブフラロール１’−水酸化に対する阻害効果に関して調査した。図１は、腹水の容量に対する阻害の滴定曲線を示している。１０〜１５ｐｍｏｌのＣＹＰ２Ｄ６を含有している１ｍＬインキュベーションへの１μＬの腹水の添加により、ＣＹＰ２Ｄ６により触媒されるブフラロール代謝は９８％超阻害された。ＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０のＩＣ５０値は、それぞれ０．１０１±０．００５、０．０５±０．００２μＬ腹水／ｍＬインキュベーションであることが決定され、このことから、モノクローナル抗体の活性が極めて高いことが示唆された。
【００６３】
モノクローナル抗体のその他のＰ４５０との阻害的交差反応性
モノクローナル抗体の特異性を決定するため、１１個の他のヒトｃＤＮＡ発現Ｐ４５０についてのマーカー・アッセイを調査した（表１）。１μＬ腹水／ｍＬインキュベーションのモノクローナル抗体は、ＣＹＰ２Ｄ６により触媒されるブフラロール代謝を９９％阻害することが見出されたが、他の１１個のヒトｃＤＮＡ発現ヒトＣＹＰ１Ａ１（フェナントレン９−水酸化）、ＣＹＰ１Ａ２（フェナセチンＯ−脱エチル化）、ＣＹＰ２Ａ６（クマリン７−水酸化）、ＣＹＰ２Ｂ６（ジアゼパムＮ−脱メチル化）、ＣＹＰ２Ｃ８（タキソール６α−水酸化）、ＣＹＰ２Ｃ９（フルビプロフェン４’−水酸化）、ＣＹＰ２Ｃ１９（メフェニトイン４’−水酸化）、ＣＹＰ２Ｅ１（クロロゾキサゾン６−水酸化）、ＣＹＰ３Ａ４（テストステロン６β−水酸化）、ＣＹＰ３Ａ５（テストステロン６β−水酸化）、及びＣＹＰ３Ａ７（テストステロン６β−水酸化）に対する有意な阻害的交差反応性は示さなかった（図２）。モノクローナル抗体腹水の容量を、５μＬ／ｍＬインキュベーションに増加させても、交差反応は観察されなかった（図３）。従って、２個のモノクローナル抗体の阻害効果は、高度にＣＹＰ２Ｄ６特異的である。
【００６４】
ヒト肝ミクロソームにおけるブフラロール代謝へのＣＹＰ２Ｄ６の寄与
阻害性のＭＡｂ１８４−１０及びＭＡｂ５０−４を、ヒト肝調製物におけるブフラロール１’−水酸化へのＣＹＰ２Ｄ６の寄与を決定するために使用した。７個体を調査したところ、ヒト肝ミクロソームのブフラロール代謝基底活性は、０．９から５．９ｎｍｏｌ／分，ｎｍｏｌの範囲であった。モノクローナル抗体の添加により、ＣＹＰ２Ｄ６依存性の活性は、肝ドナーに依って、最低で４７％、最高で９３％阻害された（図４）。これらの結果は、ＣＹＰ２Ｄ６に加え、他のＰ４５０もブフラロール代謝において役割を果たしていることを示唆している。図４は、各試料中のＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０の両方の阻害効果が極めて一致していたことを示している。
【００６５】
興味深いことに、７個のヒト肝ミクロソームのうちの１つ（ＨＬ１６）においては、ＣＹＰ２Ｄ６が、全ブフラロール１’−ヒドロキシラーゼ活性のわずか４７％にしか寄与しなかった。他のＰ４５０の寄与を決定するために、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ８／９、及びＣＹＰ３Ａ４に特異的な３個の阻害性モノクローナル抗体を、単独で又は組み合わせて使用して、ＨＬ１６のさらなる分析を実施した。これらのＰ４５０の単独でのＨＬ１６におけるブフラロール代謝への量的寄与は、ＣＹＰ２Ｄ６が４３％、ＣＹＰ２Ｃ８／９が１７％、ＣＹＰ３Ａ４が無視しうる程度と決定された（図５）。３個のモノクローナル抗体を同時にＨＬ１６ミクロソームに添加した場合には、阻害性モノクローナル抗体の相加的な効果が観察され、ＨＬ１６の全ブフラロール１’−ヒドロキシラーゼは６３％超阻害された。従って、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ８／９は、それぞれおよそ４４％及び１７％、ブフラロール代謝に寄与した。ＨＬ１６における残りの酵素活性（３７％）についての他のＰ４５０の役割は、不明なままである。これらの結果は、ヒト組織における特定の薬物の代謝への個々のＰ４５０の寄与の決定において、阻害性モノクローナル抗体が有益であることを証明している。
【００６６】
その他の実施形態も、以下の特許請求の範囲に含まれる。いくつかの実施形態を示し説明したが、本発明の本旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修飾を行うことは可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＣＹＰ２Ｄ６によるブフラロール１’−水酸化のＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０による阻害を示す図である。
【図２】
１２個の組換えヒトＰ４５０によるマーカー基質の代謝のＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０による阻害の特異性を示す図である。
【図３】
１２個の組換えヒトＰ４５０によるマーカー基質代謝のＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０による阻害の特異性を示す図である。
【図４】
ＭＡｂ５０−４及びＭＡｂ１８４−１０を使用した、７個のヒト肝ミクロソーム（ＨＬ）のパネルにおけるブフラロール１’−水酸化へのヒトＣＹＰ２Ｄ６の寄与の評価を示す図である。
【図５】
ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、及びＣＹＰ２Ｃ８／９に特異的な阻害性ＭＡｂの組み合わせ使用による、ＨＬ１６におけるブフラロール１’−水酸化への単一及び複数のＰ４５０の寄与の評価を示す図である。
【図１】
2004524007.tif 000005
【図２】
2004524007.tif 000006
【図３】
2004524007.tif 000007
【図４】
2004524007.tif 000008
【図５】
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【国際公開パンフレット】
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2004524007.tif 000031
2004524007.tif 000032
2004524007.tif 000033
【国際調査報告】
2004524007.tif 000034
2004524007.tif 000035