(57)【要約】本発明は、トランスジェニック動物ならびに遺伝子機能の特徴付けに関する方組成物および法に関する。具体的には、本発明は、標的遺伝子における破壊を含むトランスジェニック細胞を提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞を含む。好ましくは、本発明の細胞は、幹細胞であり、そしてより好ましくは、胚性幹（ＥＳ）細胞、そして最も好ましくは、マウスＥＳ細胞である。１つの実施形態に従って、トランスジェニック細胞は、幹細胞中に標的化構築物を導入し、標的遺伝子の突然変異をもたらす相同組換え体を生成することにより産生される。別の実施形態では、トランスジェニック細胞は、以下に記載するトランスジェニック動物由来である。トランスジェニック動物由来の細胞は、組織または器官、および任意の細胞系列またはその任意の子孫から単離されるか、あるいはそれらに存在する細胞を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化構築物であって、以下：
（ａ）標的遺伝子に相同な第１のポリヌクレオチド配列；
（ｂ）該標的遺伝子に相同な第２のポリヌクレオチド配列；および
（ｃ）選択可能なマーカー
を含む、標的化構築物。
【請求項２】
前記標的化構築物が、スクリーニングマーカーをさらに含む、請求項１に記載の標的化構築物。
【請求項３】
標的遺伝子に対する標的化構築物を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子に相同な第１のポリヌクレオチド配列を得る工程；
（ｂ）該標的遺伝子に相同な第２のポリヌクレオチド配列を得る工程；
（ｃ）選択可能なマーカーを含むベクターを提供する工程；および
（ｄ）該ベクターに該第１の配列および該第２の配列を挿入して、該標的化構築物を産生する工程
を包含する、方法。
【請求項４】
標的遺伝子に対する標的化構築物を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子の第１の領域に相同な第１の配列および標的遺伝子の第２の領域に相同な第２の配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程；ならびに
（ｂ）該第１の配列と該第２の配列との間に陽性選択マーカーを挿入して、標的化構築物を形成する工程
を包含する、方法。
【請求項５】
標的遺伝子中に破壊を含む、細胞。
【請求項６】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記マウス細胞が、胚性幹細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
標的遺伝子中に破壊を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物由来の、細胞。
【請求項１０】
標的遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１に記載の標的化構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）前記細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）前記得られた胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを繁殖させて、トランスジェニックマウスを産生する工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
標的遺伝子の発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該標的遺伝子中に破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）薬剤を、該非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；および
（ｃ）該非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された標的遺伝子の発現が調節されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
標的遺伝子の機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該標的遺伝子中に破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）薬剤を、非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程；および
（ｃ）非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された標的遺伝子の機能が調節されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
標的遺伝子の発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を薬剤と接触させる工程；および
（ｃ）該標的遺伝子の発現が調節されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
標的遺伝子の機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を薬剤と接触させる工程；および
（ｃ）該標的遺伝子の機能が調節されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記細胞が、請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物由来である、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１、請求項１２、請求項１３または請求項１４に記載の方法によって同定される、薬剤。
【請求項１７】
標的遺伝子の活性を調節する、薬剤。
【請求項１８】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで該トランスジェニックマウスは、胸腺の異常を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項１９】
前記胸腺の異常が、野生型マウスと比較した胸腺の重量の減少である、請求項１８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
前記胸腺の異常が、野生型マウスと比較した胸腺対体重比の減少である、請求項１８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが、発作に対する増大した感受性を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項２２】
前記マウスが、野生型マウスと比較したより低い用量のメトラゾールで発作様応答を示す、請求項２１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２３】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが、野生型マウスと比較した刺激プロセシング欠損を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項２４】
前記刺激プロセシング欠損が、精神分裂病に観察される刺激プロセシング欠損と類似する、請求項２３に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２５】
前記マウスが、野生型マウスと比較した減少したプレパルス阻害を示す、請求項２３に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２６】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを産生する方法であって、ここで、該トランスジェニックマウスが、以下の表現型：胸腺の異常、発作に対する増大した感受性または刺激プロセシング欠損の少なくとも１つを示し、ここで、該方法は、以下：
（ａ）アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子標的化構築物を、細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）該得られた胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを繁殖させて、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを産生する工程
を包含する、方法。
【請求項２７】
請求項１８または請求項２６に記載のトランスジェニックマウス由来の、細胞。
【請求項２８】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を改善する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤をアナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、以下の表現型：胸腺の異常、発作に対する増大した感受性または刺激プロセシング欠損の少なくとも１つを改善するか否かを決定する工程：を包含する、方法。
【請求項２９】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤をアナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、該トランスジェニックマウスにおけるアナフィラトキシンＣ３ａレセプター発現を調節しているか否かを決定する工程であって、ここで該薬剤が、以下の挙動：発作に対する感受性および刺激プロセシングの少なくとも１つに対する効果を有する、工程
を包含する、方法。
【請求項３０】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中の破壊に関連する挙動を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤をアナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、以下の挙動：発作に対する感受性および刺激プロセシングの少なくとも１つを調節するか否かを決定する工程：
を包含する、方法。
【請求項３１】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を薬剤と接触させる工程；および
（ｃ）該薬剤が、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子機能を調節する否かを決定する工程であって、ここで該薬剤が、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を調節する、工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記表現型が、胸腺の異常、発作に対する増大した感受性および刺激プロセシング欠損の少なくとも１つを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２８、請求項２９、請求項３０または請求項３１に記載される方法によって同定される、薬剤。
【請求項３４】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子の活性を調節する、薬剤。
【請求項３５】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子の変異に関連する疾患を改善する方法であって、該方法は、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子の活性を調節する薬剤の治療的有効量を、必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
コルディン遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスは、以下の表現型：侵害受容障害および不安障害の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス。
【請求項３７】
コルディン遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを産生する方法であって、ここで該トランスジェニックマウスは、以下の表現型：侵害受容障害および不安障害の少なくとも１つを示し、該方法は、以下：
（ａ）コルディン遺伝子標的化構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）該得られた胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを繁殖させて、コルディン遺伝子中に破壊を含む該トランスジェニックマウスを産生する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項３６または請求項３７に記載のトランスジェニックマウス由来の、細胞。
【請求項３９】
コルディン遺伝子中の破壊に関連する表現型を改善する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤をコルディン遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、以下の表現型：侵害受容障害および不安障害の少なくとも１つを改善するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項４０】
コルディン発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤を、コルディン遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、トランスジェニックマウスにおけるコルディン発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで該薬剤が、以下の挙動：疼痛および不安への応答の少なくとも１つに対する効果を有する、工程
を包含する、方法。
【請求項４１】
コルディン遺伝子中の破壊に関連する挙動を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤を、コルディン遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、トランスジェニックマウスの共調および平衡を調節するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項４２】
コルディン遺伝子機能を調節する薬剤を同定する方法でああって、該方法は、以下：
（ａ）コルディン遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を薬剤と接触させる工程；および
（ｃ）該薬剤が、コルディン遺伝子機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで該薬剤が、コルディン遺伝子中の破壊に関連する表現型を調節する、工程
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記表現型が、侵害受容障害および不安障害の少なくとも１つを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３９、請求項４０、請求項４１または請求項４２に記載の方法によって同定される、薬剤。
【請求項４５】
コルディン遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで該トランスジェニックマウスが、疼痛に対する応答の減少を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項４６】
コルディン遺伝子の活性を調節する、薬剤。
【請求項４７】
コルディン遺伝子の変異に関連する疾患を改善する方法であって、該方法が、コルディン遺伝子の活性を調節する薬剤の治療的有効量を、必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４８】
ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスは、以下の表現型：脾臓異常、腎臓異常、脾臓異常、肝臓異常、胸腺の異常、リンパ節における異常、リンパ球における異常、骨髄における異常または骨における異常の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス。
【請求項４９】
前記脾臓異常が、野生型マウスと比較した脾臓の重量の増大である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５０】
前記脾臓異常が、野生型マウスと比較した脾臓のサイズの増大である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５１】
前記脾臓異常が、野生型マウスと比較した脾臓対体重比の増大である、請求項４８に記載されるトランスジェニックマウス。
【請求項５２】
前記腎臓異常が、野生型マウスと比較した腎臓の重量の増大である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５３】
前記腎臓異常が、野生型マウスと比較した腎臓のサイズの増大である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５４】
前記腎臓異常が、野生型マウスと比較した腎臓対体重比の増大である、請求項４８に記載されるトランスジェニックマウス。
【請求項５５】
前記肝臓異常が、野生型マウスと比較した肝臓の重量の増大である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５６】
前記肝臓異常が、野生型マウスと比較した肝臓のサイズの増大である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５７】
前記肝臓異常が、野生型マウスと比較した肝臓対体重比の増大である、請求項４８に記載されるトランスジェニックマウス。
【請求項５８】
前記胸腺異常が、野生型マウスと比較した胸腺の重量の増大である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５９】
前記胸腺異常が、野生型マウスと比較した胸腺のサイズの増大である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６０】
前記胸腺異常が、野生型マウスと比較した胸腺対体重比の増大である、請求項４８に記載されるトランスジェニックマウス。
【請求項６１】
前記胸腺の異常が、野生型マウスと比較した胸腺の皮質の拡大および髄質の減少である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６２】
前記リンパ節の異常が、野生型マウスと比較したリンパ節の欠乏である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６３】
前記リンパ節の異常が、リンパ節の非存在である、請求項４８に記載されるトランスジェニックマウス。
【請求項６４】
前記リンパ節の異常が、野生型マウスと比較した消化管関連リンパ組織の欠乏である。請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６５】
前記リンパ球の異常が、リンパ浸潤を含む、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６６】
前記リンパ球の異常が、リンパ腫と一致する、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６７】
以下の疾患の症状：不健康な身なり、機能低下、増大した胸囲および増大した腹囲、肝脾腫大症、拡大した胸腺、腹水、衰弱、斜視、猫背、悪液性、嗜眠および呼吸障害の少なくとも１つをさらに含む、請求項６６に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６８】
前記骨髄が、蒼白である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６９】
前記骨の異常が、脆性である、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７０】
前記骨の異常が、白い塊の結合する、請求項４８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７１】
ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを産生する方法であって、ここで、該トランスジェニックマウスが、以下の表現型：脾臓異常、腎臓異常、脾臓異常、肝臓異常、胸腺の異常、リンパ節における異常、リンパ球における異常、骨髄における異常または骨における異常の少なくとも１つを示し、該方法は、以下：
（ａ）ＲＯＲγ遺伝子標的化構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）該得られた胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）キメラマウスを繁殖させて、ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを産生する工程
を包含する、方法。
【請求項７２】
請求項４８または請求項７１に記載されるトランスジェニックマウス由来の、細胞。
【請求項７３】
ＲＯＲγ遺伝子中の破壊に関連する表現型を改善する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤を、ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を有するトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、以下の表現型：脾臓異常、腎臓異常、脾臓異常、肝臓異常、胸腺の異常、リンパ節における異常、リンパ球における異常、骨髄における異常または骨における異常の少なくとも１つを改善するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項７４】
ＲＯＲγ遺伝子中の破壊に関連する表現型を改善する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤を、ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、以下の表現型：上昇した血清アラニンアミノトランスフェラーゼ、上昇した血清アルカリホスファターゼ、上昇した血清アスパラギン酸トランスフェラーゼ、上昇した血中尿素窒素および上昇した血中リンの少なくとも１つを改善するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項７５】
ＲＯＲγ遺伝子中の破壊に関連する表現型を改善する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤を、ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、該トランスジェニックマウスにおけるＲＯＲγ発現を調節しているか否かを決定する工程であって、ここで該薬剤は、以下の疾患の症状：不健康な身なり、機能低下、増大した胸囲および増大した腹囲、肝脾腫大症、拡大した胸腺、腹水、衰弱、斜視、猫背、悪液性、嗜眠および呼吸障害の少なくとも１つに対して効果を有する、工程
を包含する、方法。
【請求項７６】
ＲＯＲγ遺伝子機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を薬剤と接触させる工程；および
（ｃ）該薬剤が、ＲＯＲγ遺伝子機能を調節するか否かを決定する工程
を包含し、ここで該薬剤は、ＲＯＲγ遺伝子中の破壊に関連する表現型を調節する、方法。
【請求項７７】
前記表現型が、脾臓異常、腎臓異常、脾臓異常、肝臓異常、胸腺の異常、リンパ節における異常、リンパ球における異常、骨髄における異常または骨における異常を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項７８】
前記表現型が、リンパ腫を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項７９】
請求項４２、請求項４３、請求項４４および請求項４５に記載される方法によって同定される、薬剤。
【請求項８０】
ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで該トランスジェニックマウスは、リンパ腫を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項８１】
ＲＯＲγ遺伝子の活性を調節する、薬剤。
【請求項８２】
ＲＯＲγ遺伝子中の変異に関連する疾患を改善する方法であって、該方法が、ＲＯＲγ遺伝子の活性を調節する薬剤の治療学的有効量を、必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項８３】
ＢＭＰ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが、以下の表現型：異常尾、低い体重または短い体長の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス。
【請求項８４】
ＢＭＰ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを産生する方法であって、ここで該トランスジェニックマウスが、以下の表現型：異常尾、低い体重または短い体長の少なくとも１つを示し、該方法は、以下：
（ａ）ＢＭＰ遺伝子標的化構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）該得られた胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程、ここで該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）キメラマウスを繁殖させて、ＢＭＰ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを産生する工程
を包含する、方法。
【請求項８５】
請求項８３または請求項８４に記載のトランスジェニックマウス由来の、細胞。
【請求項８６】
ＢＭＰ遺伝子中の破壊に関連する表現型を改善する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）薬剤を、ＢＭＰ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、以下の表現型：異常尾、低い体重または短い体長の少なくとも１つを改善するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項８７】
ＢＭＰ遺伝子機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＢＭＰ遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を薬剤と接触させる工程；および
（ｃ）該薬剤が、ＢＭＰ遺伝子機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで該薬剤が、ＢＭＰ遺伝子中の破壊に関連する表現型を調節する、工程
を包含する、方法。
【請求項８８】
前記表現型が、異常尾、低い体重または短い体長の少なくとも１つを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項８９】
請求項８６または請求項８７に記載の方法によって同定される、薬剤。
【請求項９０】
ＢＭＰ遺伝子の活性を調節する、薬剤。
【請求項９１】
ＢＭＰ遺伝子の変異に関連する疾患を改善する方法であって、該方法が、ＢＭＰ遺伝子の活性を調節する量薬剤の治療学的有効を、必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子機能の特徴付けに関連するトランスジェニック動物、組成物、および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
実験動物モデルは、遺伝子の役割を理解するための重要な手段である。より詳細には、変更または不活性化された特定遺伝子を有する動物を開発する能力は、遺伝子機能の研究にとって計り知れないほど貴重であり、そしてヒトにおける同様な発現を有する疾患の原因となる遺伝子および／または機構の予期せぬ発見につながっている。これらの遺伝的に操作された動物はまた、種々の疾患および障害のための治療的処置を同定および試験するためにも有用である。
【０００３】
多くの遺伝子の機能を同定することは、疾患におけるこれらの遺伝子の役割を確認することおいて有用である。ヒトとマウスとの間の高レベルな相同性のため、例えば、動物の選択された遺伝子の標的生殖系列変異を行うことによって、個々のヒト遺伝子の機能を明確にすることが可能である。結果として得られる変異動物の表現型は、ヒトにおける表現型を定義するのに役立てるために用いられ得る。
【０００４】
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）、コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、核ホルモンレセプター、骨形態形成タンパク質およびアクアポリン（ａｑｕａｐｏｒｉｎ）タンパク質をコードする種々のファミリーに属する、いくつかの興味ある遺伝子が最近、発見されている。これらの遺伝子およびその発現産物の役割を確認することは、疾患経路の決定ならびに診断上および治療上で有用な標的の同定を可能とし得る。
【０００５】
ＧＰＣＲは、７種の推定膜貫通ドメイン（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と称する）を有するとして特性化されている。これらは、細胞外または細胞質ループによって連結された膜貫通α−へリックスを表すと考えられている。ほとんどのＧ−タンパク質共役レセプターは、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ループのそれぞれに１つの保存システイン残基を有する。Ｇ−タンパク質共役レセプターは、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質によって細胞内で種々の細胞内酵素、イオンチャネルおよび輸送体に結合され得る。異なったＧ−タンパク質α−サブユニットは、優先的に特定のエフェクターを刺激して、細胞内で種々の生物学的機能を調節する。
【０００６】
アナフィラトキシン、特に、Ｃ３ａおよびＣ５ａは、炎症反応の媒介因子としての役割を示唆する種々の生物学的活性を有する：これらは、平滑筋の収縮、ヒスタミン放出、毛細血管透過性の増大、血管内皮に対する白血球の接着、白血球の走化性ならびに血小板および白血球の凝集を引き起こす（Ｖｏｇｔ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ３：１７７−８８（１９８６）を参照のこと）。これらの効果のほとんどは、アナフィラトキシン刺激細胞（例えば、白血球および内皮）によって産生され得る他の媒介因子、特にアラキドン酸誘導体の協力によって支持される。補体ペプチドのインビボの効果は、これらの産生部位に大いに依存する：体循環における血管内放出は、主に白血球の活性化、凝集および肺血管中のそれらの蓄積に起因する、成体の呼吸窮迫症候群およびショック肺のような有害な症状を引き起こす。血管内放出は、特定の薬物によって、およびバイパス装置または透析装置の表面との血液の接触によって、誘導され得る。補体系の活性化は、種々の炎症性障害およびＣＮＳの神経変性プロセスにおいて報告されている。最近の証拠は、補体タンパク質およびレセプターが、グリア細胞および驚くべきことにニューロン上で、またはこれらによって合成されることを示す。これらのタンパク質の中で、補体の炎症機能の最も可能性のある媒介因子であるものは、走化性ペプチドおよびアナフィラキシーペプチドである、Ｃ３ａおよびＣ５ａに対するレセプターである。グリア細胞のＣ３ａレセプターおよびＣ５ａレセプター（Ｃ３ａＲおよびＣ５ａＲ）の機能は、免疫細胞のＣ３ａＲおよびＣ５ａＲに類似のようである。しかし、これらのレセプターがニューロン上で有する役割については、ほとんど知られていない（Ｎａｔａｆら、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：３９７−４０２（１９９９）を参照のこと）。
【０００７】
最近、ｃＤＮＡ（クローンＡＺ３Ｂ）が、Ｎ−ホルミルペプチドレセプター遺伝子に由来するプローブを用いて、分化したＨＬ−６０細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離された（Ｒｏｇｌｉｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３０５（１−２）：３９−４３（１９９６）；登録番号Ｕ２８４８８；ＧＩ：１１９９５７７）。１．９７ｋｂのｃＤＮＡは、４８２アミノ酸を有する推定Ｇタンパク質共役レセプターをコードした。全てのＧＰＣＲに共通する推定７回膜貫通ドメインに加えて、このタンパク質は、４番目の膜貫通ドメインと５番目の膜貫通ドメインとの間に、約１７２アミノ酸の大きい細胞外ループ（これは、今日までに同定された数百のＧＰＣＲの中で、独自の特徴である）を含んだ。高い配列相同性は、アミノ末端の１７０残基およびカルボキシル末端の１５０残基においてこのタンパク質と多くの化学誘引物質レセプター（例えば、ヒトＣ３ａアナフィラトキシンレセプター（Ｃ３ＡＲ）（Ｃｒａｓｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（８）：１９４４−５０（１９９６））およびマウス補体Ｃ３ＡＲ遺伝子（登録番号ＡＦ０５３７５７；ＧＩ：３１７０５１３））との間に存在した。ノーザン分析およびフローサイトメトリー分析は、メッセージおよびタンパク質が、いくつかの分化した造血細胞株において、肺、胎盤、心臓および内皮細胞において広く発現されることを示唆した。Ｒｏｇｌｉｃらは、このタンパク質が、ＧＰＣＲスーパーファミリー内の別個のグループのレセプターを規定すると仮定した。Ｔｏｒｎｅｔｔａらは、４７７アミノ酸のオープンリーディングフレームをコードする３．３ｋｂの全長Ｃ３ａ  ｃＤＮＡを報告した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５２７７−８２（１９９７）；登録番号Ｕ７７４６１；ＧＩ：２１３０５３４）。推定アミノ酸は、４つの推定Ｎ結合グリコシル化部位を含み、そしてヒトＣ３ａレセプターのコード領域を含む４８２アミノ酸に対して６５％同一であった。
【０００８】
ＧＰＣＲの１つの重要なサブファミリーは、セロトニン神経伝達物質レセプターＧＰＣＲである。セロトニン（ａｋａ  ５−ＨＴ）は、重要な神経調節物質かつＣＮＳおよび腸の局所ホルモンであり、複数のレセプターを活性化することによって、広範な生理学的機能および病態生理学的経路を媒介する。体内の約９０％のセロトニンは、腸壁中のクロム親和細胞に存在し、少量が筋層間神経叢に存在する。セロトニンはまた、血小板が高濃度で存在する血液においても見出される。ＣＮＳにおいて、セロトニンニューロンは、脳幹の縫線核に主に起源し、そして脳のほとんどの領域に突き出す。セロトニンは、５−ヒドロキシトリプトファンを介して、アミノ酸トリプトファンから合成される。末梢において、５−ＨＴは、大きい血管、腸および子宮を含む多くの平滑筋に接触し、そしてまた、ＮＯの形成を介した内皮依存性の血管拡張を誘導する。セロトニンは、感覚神経の末端を刺激し、かつ蠕動の媒介因子であり、そして血小板凝集および止血に関与し得る。これはまた、炎症媒介因子および微小血管制御への関与を有し得る。ＣＮＳにおいて、セロトニンは、広範な機能（食欲、気分、不安、幻覚、睡眠、嘔吐および疼痛認知の制御を含む）に関与すると考えられる。セロトニンレセプターリガンドは、うつ病、片頭痛および手術後の嘔吐の処置における臨床的用途を見出し、そして他の状態におけるその使用についての強力な可能性が存在する。
【０００９】
分子生物学的研究および薬理学的研究は、５−ＨＴレセプターの多数のサブタイプの存在を明らかにした。１つのセロトニンレセプターは、５−ＨＴ−５レセプターである。ＣＮＳにおいて、この５−ＨＴ−５レセプターｍＲＮＡは、小脳皮質、海馬、小帯、嗅球および小脳顆粒層において見出される。５−ＨＴ５（Ａサブタイプ）レセプターをコードするｃＤＮＡ（１６８６ｂｐ）は、マウス脳ライブラリーから単離された（ＥＭＢＯ  Ｊ．１１（１３）、４７７９−８６（１９９２））。この配列は、ＧｅｎＢａｎｋに提出されている（ＧＩまたはＮＩＤ番号：４９７５８；登録番号：Ｚ１８２７８）。アミノ酸配列の比較は、５−ＨＴ５Ａレセプターが、以前に同定された全ての５−ＨＴレセプターの遠い類縁であることを明らかにした。その薬理学的プロフィールは、５−ＨＴ−１Ｄレセプターの薬理学的プロフィールに類似し、５−ＨＴ−１Ｄは、アデニル化シクラーゼを阻害することが示され、そして脳幹神経節において優勢に発現される、５−ＨＴレセプターのサブタイプである。しかし、５−ＨＴ−１Ｄレセプターとは異なり、この５−ＨＴ５Ａレセプターは、アデニル化シクラーゼを阻害せず、そしてそのｍＲＮＡは、脳幹神経節において見出されなかった。５−ＨＴ５Ａ遺伝子のコード配列は、塩基５０９〜１５８２を含むと考えられる。
【００１０】
過去１５年にわたり、７回膜貫通レセプターを標的化するほぼ３５０種の治療的薬剤が、市場に首尾よく導入されてきた。これらのレセプターは、治療的標的としての、確立された、証明された来歴を有するが、機能不全または疾患を予防、回復または矯正する際に役割を果たし得るＧＰＣＲの同定および特徴づけに対する、明らかな必要性が存在する。
【００１１】
一般に、増殖因子は、細胞表面上のレセプターに結合し、細胞の増殖および／または分化を活性化する主な結果を有するタンパク質である。多くの増殖因子は、非常に用途が広く、多くの異なる細胞型で細胞分裂を刺激する；一方、その他は、特定の細胞型に特異的である。より詳細には、増殖因子は、ポリペプチドホルモンのような物質であり、インビボまたはインビトロで規定された動物細胞集団の増殖に影響するが、栄養物質ではない。組織の増殖および分化に関与するタンパク質は、増殖を促進または阻害し得、そして分化を促進または阻害し得、従って、一般的な用語「増殖因子」は、サイトカイン、栄養因子およびこれらのインヒビターを含む。増殖因子または栄養因子のうち、現在公知であるものは、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−γ）である。トランスフォーミング増殖因子−βは、多くの異なる細胞型で種々の応答を引き起こすようである。
【００１２】
ＴＧＦ−βのメンバーの中には、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）がある。ＢＭＰは、創傷治癒、組織修復において有用であり、そして軟骨および／または骨の増殖を誘導することが示されている。ＢＭＰは、胚発生の間に強力な効果を有する。１つの特定のメンバーであるＢＭＰ−４は、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚において強力な腹側化効果を有することが示されており、血液および間葉の分化を生じ、脊索、筋肉および神経系のような背側組織の形成を阻害する。（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：６３９−６４７（１９９１）を参照のこと）。ＢＭＰ−４は、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚において腹側で発現される。ＢＭＰ−４の発現は、紫外線光による照射のような腹側化処理によって、増大される。腹側化ＢＭＰのインヒビターは、組織分化に対して背側化効果を有すると考えられる。１つのこのような増殖因子インヒビターは、コルディンである。
【００１３】
コルディン（ＣＨＲＤ）は、腹側化ＴＧＦ−β様ＢＭＰに結合し、そしてそれらを潜伏性の複合体に抑えることによって、初期脊椎動物胚組織を背側化する、重要な発生の増殖因子インヒビターである。具体的には、ＣＨＤＲは、分泌型のＢＭＰアンタゴニストである。哺乳動物コルディン配列の配列データベースが検索され、ヒトＣＨＲＤおよびマウスＣＨＲＤのＣ末端領域をコードするＥＳＴが同定された。マウスＣＨＲＤの全長ｃＤＮＡ配列が、４つの内部システインリッチリピートおよび４つの潜在的なＮグリコシル化部位を含む、９４８アミノ酸のタンパク質を予測することが決定された。（例えば、Ｐａｐｐａｎｏら、（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５２：２３６−２３９（１９９８）を参照のこと）。ノーザンブロット分析は、交尾後７日のマウス胚における、高レベルの３．７ｋｂのＣＨＲＤ転写物を検出した。ＣＨＤＲ転写物のレベルは、後期発生段階および成体組織において減少し、このことは、哺乳動物胚における原腸形成期の間のコルディンの主要な役割を示す。さらに、マウスコルディン遺伝子およびヒトコルディン遺伝子の両方が、いくつかの胎仔および成体の組織、特に肝臓および小脳において容易に検出可能なレベルで発現されることが示され、このことは、組織形成および恒常性におけるさらなる役割を示唆する。ヒト成体組織およびヒト胎仔組織におけるｍＲＮＡ発現のドットブロット分析は、ＣＨＲＤが肝臓で高レベルで発現されることを示した。部分的ヒトＣＨＲＤ  ｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された（ＧＩまたはＮＩＤ番号：３８２２２１７；登録番号ＡＦ０７６６１２）。
【００１４】
マウスタンパク質と８６％の配列同一性を有する９５４アミノ酸のタンパク質をコードするヒトＣＨＲＤ  ｃＤＮＡは、クローニングされ、そして配列決定された。（Ｓｍｉｔｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０５：１０４−１１１（１９９９））。このＣＨＲＤ遺伝子が、１１．５ｋｂにわたって２３個のエキソンを有することもまた、決定された。このヒトＣＨＲＤ遺伝子は、放射線ハイブリッドマッピングによって３ｑ２７に局在し、そしてマウスＣＨＲＤ遺伝子は、種間バッククロスを使用して、第１６染色体の近傍に局在した。（Ｐａｐｐａｎｏら、前出を参照のこと）。ヒトコルディン遺伝子の遺伝子編成は、決定され、そしてＴＨＰＯ（トロンボポエチン）、ＣＬＣＮ２（電圧ゲートの（ｖｏｌｔａｇｅ＾ｇａｔｅｄ）塩素イオンチャネル遺伝子）およびＥＩＦ４Ｇ１（真核生物翻訳開始因子γ遺伝子）を含む３ｑ２７の遺伝子クラスター内にマップされることが示された。（Ｓｍｉｔｈら、前出を参照のこと）。ＣＨＲＤ遺伝子およびＴＨＰＯ遺伝子は、非常に密に隣接する（単一のコスミドクローン内）。これら２つの遺伝子は、合計２２ｋｂを占め、そして２ｋｂ未満離れたプロモーターを使用して、反対の鎖から転写される。このＣＨＲＤ遺伝子およびコルディン調節ＧＳＣ（グースコイド（ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ）遺伝子は、３ｑにマップされる発生奇形症候群であるコルネリア・ド・ランゲ症候群（ＣＤＬＳ）の潜在的な候補遺伝子であることが見出された。この症候群は、精神的なハンディキャップ、成長遅滞、独特の顔面特徴および四肢の縮小欠損（ｌｉｍｂ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔ）によって主に特徴付けられる。ＣＤＬＳ患者は、代表的には、散発性の症例として生じるが、いくつかの報告は、優性遺伝であることを示唆している。ＣＨＲＤ遺伝子およびＧＳＣ遺伝子の候補は、以下を含むいくつかの系列の証拠によって支持される：３ｑ２６．３〜ｑ２７でのＣＤＬＳ遺伝子についての以前の証拠；ＣＤＬＳと血小板減少症との間の有意な関連を示唆する報告；ＣＤＬＳにおける疑わしい遺伝的異質性；新規の平衡転座を有するＣＤＬＳ患者において検出される、１４ｑ３２切断点に密に近接するＧＳＣ遺伝子の位置；グースコイドによる、コルディン発現の公知の調節；およびマウスＧＳＣ遺伝子の胚性発現パターン。しかし、変異スクリーニングは、ＣＨＲＤまたはＧＳＣにおける、ＣＤＬＳ患者特有の変異を同定できなかった。
【００１５】
マウスＣＨＲＤ  ｍＲＮＡは、最初に、原始線条前方で発現され、次いで、これに由来する節および軸の中内胚葉において発現され、このことは、ＣＨＲＤが、初期胚のパターン形成において役割を果たし得ることを示唆する。ＣＨＲＤの標的化された不活化は、正常な初期発生および神経誘導を有するが、内耳および外耳の発生における後期の欠損ならびに咽頭および心臓血管の組織化における異常を示す死産動物を生じた。
【００１６】
原腸中期において、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）の発現が、ＣＨＲＤの発現と重なることが実証された。（例えば、Ｂａｃｈｉｌｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：６５８−６６１（２０００）を参照のこと）。ノギン変異体は、正常な原腸形成および前方中枢神経系のパターン形成を経るが、後期段階においては、多くの異常が後方脊髄および体節において観察された。ノギンおよびコルディンの変異についてヘテロ接合体であるマウス間の交雑は、新生仔において二重ホモ接合体の変異体を生成しなかった。２つのノギン／コルディン二重ヌル胚は、出産間近に解剖された動物において見出された。両方とも、再吸収を受けていたが、明らかに全前脳症、単一の鼻窩、単眼および無顎症を有した。いずれかそれ自体の変異においては観察されないこれらの奇形は、ソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（ｓｈｈ）を欠く胚に類似した。１２．５日の胚において、二重変異胚は、アプロセンセファリー（ａｐｒｏｓｅｎｃｅｐｈａｌｙ）に類似したより重篤な表現型を有して回収された。８．５日胚で解剖された二重変異胚において、前脳の縮小が明らかに明白であった。このデータは、コルディンおよびノギンが、前方内臓内胚葉の確立には必要でないが、前方パターンのその後の仕上げには必要であることを実証した。中胚葉発生もまた影響され、ｓｈｈの欠如によって示された。これは、ＢＭＰアンタゴニストのコルディンおよびノギンが、初期マウス発生の間において互いに補い合うことを示唆した。両方の遺伝子産物が除去された場合、前方−後方、背側−腹側、および左−右のパターン形成が、全て影響された。
【００１７】
最近、マウスＣＨＲＤ  ｃＤＮＡの３２５４ｂｐの配列が報告された（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０９６２７６；ＧＩ  ４４０６１８５）。このコード領域は、ヌクレオチド１〜２８４７にわたり、９４８アミノ酸のポリペプチドをコードすると考えられた。増殖因子インヒビターの重要性に鑑み、機能不全または疾患を予防、回復または矯正する際に役割を果たし得る増殖因子インヒビターの同定および特徴づけに対する、明らかな必要性が存在する。
【００１８】
核レセプタースーパーファミリーは、共通のモジュール構造を共有するリガンド活性化転写因子の多様なグループを構成する。このスーパーファミリーとしては、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤのレセプター、ならびにリガンドが同定されていない嗅覚レセプターのような、多くのレセプターが挙げられる。このスーパーファミリーは、各々がいくつかの密接に関連した遺伝子を含む、多くのサブファミリーに分けられ得る。ＲＯＲαおよびＲＯＲβに加えて、ＲＯＲサブファミリーの第三のメンバーであるＲＯＲγが、クローニングされた（Ｈｉｒｏｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０５：１９７６−１９８３（１９９４）；Ｍｅｄｖｅｄｅｖら、Ｇｅｎｅ  １８１：１９９−２０６（１９９６）；Ｍｅｄｖｅｄｅｖら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４６：９３−１０２（１９９７））。ＲＯＲγのアミノ酸配列は、種間で高度に保存されている；マウスＲＯＲγとヒトＲＯＲγとの間のアミノ酸配列は、８８％の同一性を示す（Ｈｉｒｏｓｅら、（１９９４）；Ｍｅｄｖｅｄｅｖら、（１９９６）；Ｍｅｄｖｅｄｅｖら、（１９９７））。
【００１９】
ほとんどの核レセプターは、５つの主なドメインを含む：アミノ末端のＡ／Ｂドメイン、２つのジンクフィンガードメインを含む高度に保存されたＤＮＡ結合（Ｃ）ドメイン、ヒンジ領域（Ｄ）、リガンド結合ドメイン（Ｅ）、およびカルボキシル末端のＦドメイン。この核レセプターは、１以上のヌクレオチドによって分離されるコアモチーフのコンセンサス配列ＰｕＧＧＴＣＡまたは直列反復、パリンドローム反復もしくは逆方向反復を含む、単一のコアモチーフから構成される応答エレメントに対して、単量体またはホモ二量体もしくはヘテロ二量体として結合する。核レセプターの役割は、胚発生、細胞増殖および分化の制御において実証されている。さらに、これらのレセプターの発現および構造における遺伝的変更は、種々の疾患プロセスに関連している（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１７０２−１７０５（１９８８）；ＤｅＬｕｃａｓ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．５：２９２４−２９３３（１９９１）；Ｃｈｏｍｉｅｎｎｅら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ４：８０２−８０７（１９９１））。
【００２０】
最近、ｃＤＮＡ（ｍＲＯＲγオーファン核レセプター）ｍＲＮＡが、マウス筋肉ｃＤＮＡライブラリーから単離された（Ｍｅｄｖｅｄｅｖら、Ｇｅｎｅ  １８１  １９９−２０６（１９９６）；登録番号Ｕ４３５０；ＧＩ：１１５５３４０）。２０６６ｂｐのｃＤＮＡは、ヒトの５６０アミノ酸のＲＯＲに類似した、５１６アミノ酸残基のタンパク質をコードした（Ｈｉｒｏｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０５：１９７６−８３（１９９４）を参照のこと）。さらに、このタンパク質とヒトＲＯＲγの間に、８８％の全体的同一性で、高い配列相同性が存在した。インビトロで合成されたＲＯＲγを使用するＲＯＲγ応答エレメントの分析は、これが、６ｂｐのＡＴリッチ配列が先行する単一のコアモチーフＧＧＴＣＡから構成される応答エレメントに対して、単量体として結合することを明らかにした。異なる組織由来のＲＮＡを使用したノーザンブロット分析は、ｍＲＯＲγが、骨格筋、肝臓および腎臓において高度に発現されることが見出されたことを示した。
【００２１】
従って、重要な調節機能が、ＲＯＲサブファミリーのメンバーについて一般的に示唆されてきた（Ａｕｓｔｉｎら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、９：２６７−２７６（１９９８））が、発生および分化においてＲＯＲγによって果たされる特定の役割は、いまだ解明されなければならない。
【００２２】
ＴＧＦ−βのメンバーの中には、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）がある。ＢＭＰは、創傷治癒、組織修復において有用であり、そして軟骨および／または骨の増殖を誘導することが示されている。ＢＭＰは、胚発生の間に強力な効果を有する。１つの特定のメンバーであるＢＭＰ−４は、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚において強力な腹側化効果を有することが示されており、血液および間葉の分化を生じ、脊索、筋肉および神経系のような背側組織の形成を阻害する（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：６３９−６４７（１９９１）を参照のこと）。ＢＭＰ−４は、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚において腹側で発現される。ＢＭＰ−４の発現は、紫外線光による照射のような腹側化処理によって、増大される。
【００２３】
動物の発生の間、細胞は、それらの隣の細胞とシグナルを交換し、このシグナルは、細胞の特定の群に、組織化された分化した構造（例えば、四肢、節または他の体の部分）を生成させる。これらのプロセスを理解することは、損傷を受けた体の部分を再生し、または出生異常を診断するために細胞を操作することを可能にし得る。ねじれた原腸形成タンパク質（ｔｗｉｓｔｅｄ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＴＳＧ）は、初期Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚の背側部分のパターン形成に必要な５つの公知な分泌タンパク質の１つである。胚の背側半分全体のパターン形成に必要なデカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ＤＰＰ）タンパク質とは異なり、ＴＳＧは、背側正中線の細胞の発生運命決定にのみ必要である。腹側の縞の細胞で発現される場合、ＴＳＧタンパク質は、背側のほとんどの細胞に拡散し得、そしてｔｓｇ変異胚において背側正中線細胞をレスキューし得る。ＤＰＰ活性のピークレベル後に背側正中線に沿って細胞の発生運命を決定する、支持的であるよりむしろ許容的な役割におけるＴＳＧの機能は、ＴＳＧに応答するように細胞を「準備（ｐｒｉｍｅ）」させる。
【００２４】
セリンプロテアーゼは、小胞体を通過する未成熟タンパク質を輸送するために働き、次いで切断されるＮ末端のシグナルペプチドを含む、分泌タンパク質である（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、Ｎｕｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５６８３−９０（１９８６））。これらのシグナル配列における差異は、個々の酵素を識別する１つの手段を提供する。いくつかのセリンプロテアーゼ、特に消化酵素は、不活性な前駆体またはプレプロ酵素として存在し、そしてシグナルペプチドの３’側に、リーダーペプチド配列または活性化ペプチド配列を含む。種々のセリンプロテアーゼを識別する他の特徴は、膜アンカーを提供するＮ結合グリコシル化部位の存在または非存在、セリンプロテアーゼの二次構造を決定するシステイン残基の数および分布、ならびにＳ’のような基質結合部位の配列である。このＳ’基質結合領域は、Ｎ末端Ｉ（＋１）に対して、およそ＋１７〜＋２９にわたる残基によって規定される。分子のこの領域における差異は、酵素の基質特異性を決定すると考えられる。
【００２５】
プロテアーゼは、種々の発生プロセスおよび代謝プロセスに関与する（Ｓｔｒｏｕｄ、Ｓｃｉ．Ａｍ．２３１：７４−８８（１９７４）；Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：３５０−３５７（１９８４））。酵素機能を変更する分子欠損は、しばしば、重篤なヒト疾患（例えば、出血、血栓症およびアテローム硬化症）を生じる。ヘプシン（ｈｅｐｓｉｎ）は、トリプシンファミリーの新規のセリンプロテアーゼであり、アミノ末端近傍に１つの膜貫通ドメインを含む（Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２４４：１００−１１４（１９９４））。この構造的特徴は、ほとんどの他のセリンプロテアーゼからヘプシンを区別する。血液凝集に加えて、ヘプシンは、細胞増殖に重要であることが報告される。破壊されたヘプシン遺伝子を有するトランスジェニックマウスは、上昇した血清アルカリホスファターゼレベルを示す（米国特許第５，９８１，８３０号；Ｗｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：３２１−３２６（１９９８））。組織学的試験において、ヘパシン−／−マウスの主要な器官中に、明らかな異常は見出されなかった。この結果は、ヘプシンが、胚発生および正常な止血に必須ではないことを示した。
【００２６】
ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｒａｎｏｇａｓｔｅｒにおいて、別の膜貫通セリンプロテアーゼ、Ｓｔｕｂｂｌｅ−ｓｔｕｂｂｌｏｉｄは、ヘプシンの構造的特徴と類似の構造的特徴を有することが報告されている。Ｓｔｕｂｂｌｅ−ｓｔｕｂｂｌｏｉｄタンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける上皮形態形成および発生において、重要な役割を果たす。Ｓｔｕｂｂｌｅ−ｓｔｕｂｂｌｏｉｄ遺伝子における欠損は、脚、羽および剛毛の奇形を生じる（Ａｐｐｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：４９３７−４９４１（１９９３））。
【００２７】
気道トリプシン様プロテアーゼは、慢性気道疾患を有する患者の痰から単離された酵素である（Ｙａｍａｏｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１９）：１１８９５−９０１（１９９８）；登録番号ＮＰ  ００４２５３；ＧＩ：４７５８５０８）。４１８アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する、完全な１５１７塩基対のｃＤＮＡ配列を得た。このポリペプチドは、ＨＮ２末端の近傍に疎水性の推定膜貫通ドメインを有し、２３２残基の触媒領域および１８６残基の比触媒領域からなる。このポリペプチドは、ＣＯＯＨ末端の触媒領域が細胞外にある、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であることが示唆される。このタンパク質は、膜結合型前駆体として合成され、そして限定されたタンパク質分解によって、可溶性かつ活性なプロテアーゼに成熟すると考えられた。これは、ヒトヘプシン、エンテロペプチダーゼ、アクロシンおよび肥満細胞トリプターゼ（ｔｒｙｐｔａｓｅ）に対して、触媒領域の配列における２９〜３８％の同一性を示した。非触媒領域は、他の既知のタンパク質にほとんど類似性を有さなかった。ノーザンブロット分析において、１．９キロベースの転写物は、試験された１７種のヒト組織の中で、気管において最も突出して検出可能であった。最近、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼおよびヒトヘプシンに対する配列類似性を有するマウスＥＳＴが、Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒ胚ｃＤＮＡライブラリーから同定された（登録番号ＡＡ４１５６５８；ＧＩ：２０７５９２３）。
【００２８】
アクアポリンファミリーは、選択的水チャネルのグループであり、主要内因性膜タンパク質（ＭＩＰ）のより大きいファミリーの一部である。今日まで、８つの異なるアクアポリンが、クローニングされている。アクアポリン−１〜アクアポリン−４は、腎臓内で同定され、そしてネフロンに沿った糸球体濾過の水再吸収において役割を果たす。アクアポリン０は、眼の水晶体繊維細胞の、主要な（６０％）内因性タンパク質である。この遺伝子における変異は、マウスの白内障形成に関連する。アクアポリン１は、ＣＨＩＰ−２８とも呼ばれ、ホモ四量体として膜に存在し、そして赤血球、脈絡叢、腎臓のヘンレわなの近位細管および下行性の肢、ならびに多くの他の部位に存在する（Ｈｅｙｍａｎｎら、ＪＳＢ  １２１（２）、１９１−２０６（１９９８））。驚くべきことに、機能的なＡＱＰ４遺伝子を欠く患者において、いかなる病理学的結果も知られていない。アクアポリン２は、ＷＣＨ−ＣＤとも呼ばれ、皮質および髄質の集合管（ｃｏｌｌｅｎｃｔｉｎｇ  ｄｕｃｔ）の主要な細胞の水チャネルであり、シナプトブレビンまたは小胞結合膜タンパク質２（ＶＡＭＰ２）によって膜の先端に転位された場合にアルギニンバソプレシンが作用しない限り、細胞質小胞に局在する。機能的ＡＱＰ２タンパク質の欠如は、腎原性尿崩症の稀な形成を生じる。ＡＱＰ３およびＡＱＰ４は、集合管の主要な細胞の基底外側膜に局在し、ＡＱＰ３は、皮質または髄質外側に優勢に局在し、一方、ＡＱＰ４は、内部髄質集合管において優勢である。腎水保存における、これら２つの水チャネルの臨床的重要性は、いまだ決定されていない。最近、ＡＱＰ４を欠損したトランスジェニックマウスが、作製された（Ｍａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：９５７−９６２（１９９７））。興味深いことに、表現型の異常は非常に微妙で、最大の尿濃縮における小さい欠損を有し、ＩＭＣＤの低い部分におけるＡＱＰ４の優勢な局在に一致する。アクアポリン−５は、明らかに、外分泌組織における液体分泌に関連する。アクアポリン−６の正確な機能は、その不確かな局在に起因して知られていないが、腎臓における限定された存在は、水輸送における潜在的な役割を示唆し得る。アクアポリン−７は、精子の冷凍保存において役割を果たすようであるが、アクアポリン−８は、膵液の分泌を担うと考えられる（Ｄｉｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１９：１８３−９９（１９９８）において再検討される）。一般に、ラットを除くと、これらのタンパク質の個体発生を試験した研究はほとんどなく、妊娠、または母体もしくは胎仔における液体バランスの任意の障害におけるこれらの遺伝子の発現については、実質的に何も知られていない。
【００２９】
最近、マウスアクアポリン−８水チャネルｃＤＮＡが単離された（登録番号ＡＦ０１８９５２；ＧＩ：２３５３７９６）。１４４７ｂｐのｃＤＮＡ（ＡＱＰ８と称される）は、７８３ｂｐのオープンリーディングフレームを有することが見出された。コードされた２６１アミノ酸の疎水性タンパク質は、ＭＩＰファミリーメンバーに見出される保存されたＮＰＡモチーフを含む（Ｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４０：３２４−８（１９９７））。
【００３０】
（発明の要旨）
本発明は、一般的にトランスジェニック動物、ならびに遺伝子機能の特徴づけに関する組成物および方法に関する。
【００３１】
本発明は、標的遺伝子における破壊を含むトランスジェニック細胞を提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞を含む。好ましくは、本発明の細胞は、幹細胞であり、そしてより好ましくは、胚性幹（ＥＳ）細胞、そして最も好ましくは、マウスＥＳ細胞である。１つの実施形態に従って、トランスジェニック細胞は、幹細胞中に標的化構築物を導入し、標的遺伝子の突然変異をもたらす相同組換え体を生成することにより産生される。別の実施形態では、トランスジェニック細胞は、以下に記載するトランスジェニック動物由来である。トランスジェニック動物由来の細胞は、組織または器官、および任意の細胞系列またはその任意の子孫から単離されるか、あるいはそれらに存在する細胞を含む。
【００３２】
本発明はまた、標的化構築物、および幹細胞中に導入される場合、相同組換え体を産生する標的化構築物を産生する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明の標的化構築物は、標的遺伝子に相同である第１および第２のポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、構築物中で２つの異なった相同ポリヌクレオチド配列間に位置することが好ましい選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチド配列も含む。標的化構築物は、相同組換えを強化し得る他の調節エレメントをも含み得る。
【００３３】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック動物、および標的遺伝子に破壊を含むこのような非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子中の変異に対してヘテロ接合性およびホモ接合性であるトランスジェニック動物を含む。１つの局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子の機能を欠損している。別の局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子に変異を有することに関連した表現型を含む。
【００３４】
本発明はまた、トランスジェニック動物中の標的遺伝子の破壊と関連する表現型に影響を及ぼし得る薬剤を同定する方法も提供する。例えば、推定薬剤がトランスジェニック動物へ投与され、そして推定薬剤に対するトランスジェニック動物の応答が測定され、そして「正常」または野生型マウスの応答と比較されるか、あるいはトランスジェニック動物コントロール（薬剤投与されない）と比較される。本発明は、このような方法に従って同定された薬剤をさらに提供する。本発明はまた、標的遺伝子の破壊に関連した状態を処置するための治療薬剤として有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【００３５】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現または機能に対して効果を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、トランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与する工程を包含する。この方法は、例えば薬剤に対するトランスジェニック動物の応答を測定する工程、およびコントロール動物（これは、例えば野生型動物あるいはトランスジェニック動物コントロールであり得る）とトランスジェニック動物の反応を比較する工程を包含する。標的遺伝子の発現または機能に対してある効果を有し得る化合物はまた、例えば、このような化合物を同定するために、細胞ベースアッセイで細胞に対してスクリーニングされ得る。
【００３６】
本発明はまた、標的遺伝子の核酸配列を含む細胞系列を提供する。このような細胞系列は、細胞系中で機能するプロモーターへの作動可能な連結によって、このような配列を発現することが可能であり得る。好ましくは、標的遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。標的遺伝子または標的タンパク質を薬剤と接触させる工程および薬剤／標的遺伝子複合体または薬剤／標的タンパク質複合体を検出する工程を包含する、標的遺伝子に相互作用する薬剤を同定する方法も提供される。このような複合体は、例えば、作動可能に連結された検出可能なマーカーの発現を測定して検出され得る。
【００３７】
本発明はさらに、標的遺伝子における破壊、より詳細には標的遺伝子または標的遺伝子によってコードされる標的タンパク質の発現または機能における破壊に関連した疾患または状態を処置する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、必要とする患者へ標的遺伝子または標的タンパク質の発現または機能をもたらす治療薬剤を投与する工程を包含する、標的遺伝子の発現または機能中の破壊に関連した疾患または状態を処置する工程を包含する。この実施形態に従って、この方法は、治療上、有効な量の天然、合成、半合成、または組換え標的遺伝子、標的遺伝子産物またはそのフラグメント、ならびに天然、合成、半合成または組換え類似体の投与を含む。
【００３８】
本発明はさらに、破壊された標的遺伝子の発現または機能に関連した疾患または状態を処置する方法を提供し、この方法は、変異された標的遺伝子を検出し、かつ遺伝子治療によってこれを置換する工程を包含する。
【００３９】
（定義）
用語「遺伝子」とは、（ａ）本明細書に開示されるＤＮＡ配列の少なくとも１つを含む遺伝子；（ｂ）本明細書中に開示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列、および／または；（ｃ）本明細書中に開示されるコード配列の相補鎖にハイブリダイズする任意のＤＮＡ配列をいう。好ましくは、この用語は、コード領域ならびに非コード領域を含み、そして好ましくはプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列を含む正常な遺伝子発現に必要である全ての配列を含む。
【００４０】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、任意の長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を呼ぶために互換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそのアナログを含み得る。ヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、そして既知または未知である任意の機能を発揮し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、１本鎖、２本鎖および３重ヘリックス分子を含む。
【００４１】
「オリゴヌクレオチド」とは、５〜約１００ヌクレオチドの１本鎖または２本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして公知であり、そして遺伝子から単離され得るか、あるいは当該技術分野で公知である方法によって化学的に合成され得る。「プライマー」とは、酵素媒介核酸合成の開始に３’−ヒドロキシ末端を提供する、通常、１本鎖であるオリゴヌクレオチドをいう。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的実施形態である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。核酸分子はまた、メチル化核酸分子および核酸分子アナログのような改変核酸分子を含み得る。プリンおよびピリミジンのアナログは、当該技術分野で公知であり、アジリジニルシトシン（ａｚｉｒｉｄｉｎｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、プソイドウラシル、５−ペンチルニルウラシルおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。デオキシリボ核酸におけるチミンの代替としてのウラシルの使用はまた、ピリミジンのアナログ形態と考えられる。
【００４２】
ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、コード配列または非コード配列の少なくとも９個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも４５個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
【００４３】
用語「遺伝子標的化」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントが哺乳動物細胞に導入される場合に生じ、そしてそのフラグメントが内因性相同配列に位置し、組換えを起こす１つの型の相同的組換えをいう。
【００４４】
用語「相同組換え」とは、相同ヌクレオチド配列の部位での２つのＤＮＡ分子間または染色分体間のＤＮＡフラグメントの交換をいう。本明細書中で使用される場合、用語「相同」は、参照配列と比べて、少なくとも約７０％の配列同一性、典型的には、少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、そしてより好ましくは約９８％の配列同一性、そして最も好ましくは参照配列に比べて約１００％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の特性を示す。相同性は、「ＢＬＡＳＴＮ」アルゴリズムを使用して決定され得る。相同配列は、ヌクレオチド配列中に挿入、欠失および置換を有し得ることが理解される。したがって、ヌクレオチドの直線的な配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確に対応しないか、または整列しなくても、本質的に同一であり得る。参照配列とは、遺伝子または隣接配列の一部、または染色体の反復部分のようなより大きな配列のサブセットであり得る。
【００４５】
用語「標的遺伝子」（あるいは、「標的遺伝子配列」または「標的ＤＮＡ配列」あるいは「標的配列」と称される）とは、相同組換えによって改変される任意の核酸分子、または任意の遺伝子のポリヌクレオチドをいう。この標的配列としては、インタクトな遺伝子、エキソンもしくはイントロン、調節配列または遺伝子間の任意の領域が挙げられる。この標的遺伝子は、個々のゲノムＤＮＡ中の特定の遺伝子または遺伝子座の一部分を含む。本明細書中で提供される場合、本発明の標的遺伝子は、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子、５−ＨＴ５Ａ遺伝子、ＲＯＲγ遺伝子、ＢＭＰ遺伝子、気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子、またはアクアポリン８遺伝子である。
【００４６】
「アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子」は、配列番号１を含む配列またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号Ｕ７７４６１；ＧＩ２１３０５３４で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子のコード配列は、配列番号１またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号Ｕ７７４６１；ＧＩ２１３０５３４で同定される遺伝子を含む。
【００４７】
「５−ＨＴ５Ａ遺伝子」は、配列番号５を含む配列またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号Ｚ１８２７８；ＧＩＮＯ：４９７５８で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、５−ＨＴ５Ａ遺伝子のコード配列は、配列番号５またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号Ｚ１８２７８；ＧＩＮＯ：４９７５８で同定される遺伝子を含む。
【００４８】
「コルディン遺伝子」は、配列番号９を含む配列またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＦ０９６２７６；ＧＩ４４０６１８５で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、コルディン遺伝子のコード配列は、配列番号９またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＦ０９６２７６；ＧＩ４４０６１８５で同定される遺伝子を含む。
【００４９】
「ＲＯＲγ遺伝子」は、配列番号１３を含む配列またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号Ｕ４３５０；ＧＩＮＯ：１１５５３４０で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、ＲＯＲγ遺伝子のコード配列は、配列番号１３またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号Ｕ４３５０；ＧＩＮＯ：１１５５３４０で同定される遺伝子を含む。
【００５０】
「ＢＭＰ遺伝子」は、配列番号１７を含む配列またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＦ２９２０３３；ＧＩＮＯ：９８３７５６９で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、ＢＭＰ遺伝子のコード配列は、配列番号１７またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＦ２９２０３３；ＧＩＮＯ：９８３７５６９で同定される遺伝子を含む。
【００５１】
「気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子」は、配列番号２１を含む配列またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＡ４１５６５８；ＧＩＮＯ：２０７５９２３で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子のコード配列は、配列番号２１またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＡ４１５６５８；ＧＩＮＯ：２０７５９２３で同定される気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子を含む。
【００５２】
「アクアポリン８遺伝子」は、配列番号２５を含む配列またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＦ０１８９５２；ＧＩＮＯ：２３５３７９６で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、アクアポリン８遺伝子のコード配列は、配列番号２５またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＦ０１８９５２；ＧＩＮＯ：２３５３７９６で同定されるアクアポリン８遺伝子を含む。
【００５３】
標的遺伝子の「破壊」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントが内因性相同配列の位置に位置し、組換えが起こる場合に生じる。これらの配列の破壊または改変としては、ＤＮＡ配列の、挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）もしくは置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。挿入としては、動物起源、植物起源、原核生物起源、またはウイルス起源の遺伝子であり得る遺伝子全体の挿入が挙げられる。破壊は、例えば、標的遺伝子の、プロモーター、エンハンサー、またはスプライス部位を変更し得るか、または置換し得、そして、正常遺伝子産物の産生を部分的にもしくは完全に阻害することによってか、または正常遺伝子産物の活性を増強することによって、正常遺伝子産物を変更し得る。
【００５４】
用語「トランスジェニック細胞」とは、遺伝子標的化の方法によって完全または部分的に、破壊されたか、改変されたか、変更されたか、または置換された、標的遺伝子を、そのゲノムの中に含む細胞をいう。
【００５５】
用語「トランスジェニック動物」とは、遺伝子標的化の方法によって破壊された特定の遺伝子を、そのゲノムの中に含む動物をいう。このトランスジェニック動物は、ヘテロ接合動物（すなわち、１つの欠損対立遺伝子および１つの野生型対立遺伝子）およびホモ接合動物（すなわち、２つの欠損対立遺伝子）の両方を含む。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー」または「正選択マーカー」とは、特定の条件下で、この遺伝子を保有する細胞のみが生存および／または増殖することを可能にする産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する、植物細胞および動物細胞は、化合物Ｇ４１８に対して耐性である。このＮｅｏｒ遺伝子マーカーを保有しない細胞は、Ｇ４１８によって殺傷される。他の正選択マーカーは、当業者に公知である。
【００５７】
「宿主細胞」は、ベクターについて、または核酸分子および／もしくはタンパク質の取り込みについて、レシピエントであり得るかまたはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然の変異、偶然の変異、または意図的な変異に起因して（形態または全ＤＮＡ相補体において）本来の親に必ずしも完全に同一である必要はない。宿主細胞は、本発明の構築物でトランスフェクトされた細胞を含む。
【００５８】
用語「調節する」とは、本明細書中で使用される場合、標的遺伝子または標的タンパク質の、機能、発現、活性、あるいは標的遺伝子中の破壊に関連する表現型の、阻害、低減、増加、または増強をいう。
【００５９】
用語「改善する」とは、標的遺伝子中の破壊に関連する異常または症状を含む、状態、疾患、障害または表現型の、減少（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）、低減（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）または除去をいう。
【００６０】
用語「異常」とは、標的遺伝子の破壊が関係する任意の疾患、障害、状態または表現型（病理学的状態を含む）をいう。
【００６１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、遺伝子および遺伝子発現産物、主に、標的遺伝子に関連する遺伝子および遺伝子発現産物の、発現および機能の評価に部分的に基づく。特に、本発明は、疾患経路の規定ならびに診断的および治療的に有用な標的の同定を可能にする。例えば、疾患状態で変異しているかまたはダウンレギュレートされている遺伝子は、疾患状態を引き起こすことまたはこれを悪化させることに関連し得る。このような遺伝子の活性をアップレギュレートさせることに関する処置、または代替的な経路に関連する処置は、この疾患状態を改善し得る。
【００６２】
（標的化構築物の生成）
本発明の標的化構築物は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて生成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｅ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。例えば、標的化構築物は、従来の方法に従って調製され得、ここで、配列は、合成されてもよく、天然供給源から単離されてもよく、操作されてもよく、クローン化されてもよく、連結されてもよく、インビトロ変異誘発、プライマー修復などに供されてもよい。種々の段階において、この連結された配列は、クローン化され得、そして制限分析、配列決定などによって分析され得る。
【００６３】
標的化ＤＮＡは、当該分野で周知の技術を使用して構築され得る。例えば、標的化ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドの化学合成、二本鎖ＤＮＡテンプレートのニックトランスレーション、配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅（またはリガーゼ連鎖反応増幅）、目的配列（例えば、クローン化されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または上述したものの任意の組み合わせ）を保有する、原核生物ベクターまたは標的クローニングベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、ＹＡＣ、コスミド、バクテリオファージＤＮＡ、他のウイルスＤＮＡもしくは複製中間体、またはそれらの精製された制限フラグメント）の精製、ならびに所望のヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドの他の供給源によって生成され得る。さらに、相同性の長さは、当該分野で公知の方法を使用して選択され得る。例えば、選択は、予め決定した内因性標的ＤＮＡ配列の配列組成および配列の複雑性に依存し得る。
【００６４】
本発明の標的化構築物は、代表的に、標的遺伝子の部分または領域に相同な第１の配列、およびこの標的遺伝子の第２の部分または領域に相同な第２の配列を含む。標的化構築物は、正選択マーカーをさらに含み、この選択マーカーは、好ましくは、この標的ＤＮＡ配列の一部分または領域に対して相同な、第１のＤＮＡ配列と第２のＤＮＡ配列との間に配置される。この正選択マーカーは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る。
【００６５】
当該分野で公知の他の調節配列も、標的化構築物中に組み込まれ得、特定の細胞型の特定遺伝子の発現を破壊し得るかまたは制御し得る。さらに、この標的化構築物はまた、スクリーニングマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または別の改変された蛍光タンパク質）をコードする配列を含み得る。
【００６６】
相同配列のサイズは重要ではなく、わずか５０塩基対から１００ｋｂ程度の多さの範囲にあり得るが、好ましくは、各フラグメントは、約１ｋｂ長より長く、より好ましくは、約１ｋｂと約１０ｋｂとの間であり、そしてさらにより好ましくは、約１ｋｂと約５ｋｂとの間である。当業者は、より長いフラグメントは、ＥＳ細胞中での相同組換え事象の数を増加させ得るが、より長いフラグメントはまたクローン化がより困難であることを認識する。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態において、標的化構築物は、係属中の米国特許出願第０８／９７１，３１０号（１９９７年１１月１７日出願）（この開示は本明細書中で全体が参考として援用される）に記載された方法を用いて、プラスミドゲノムライブラリーから直接調製される。一般に、目的の配列は、例えば、ロングレンジＰＣＲを使用して１工程で、プラスミドライブラリーから同定および単離される。この配列の単離後、標的配列を破壊する第２のポリヌクレオチドが、目的の配列をコードする２つの領域の間に容易に挿入され得る。この局面に従って、この構築物は、以下の２工程で生成される：（１）標的配列に相同な配列を、（例えば、ロングレンジＰＣＲを使用して）増幅する工程、および（２）別のポリヌクレオチドがこの上記の相同配列に隣接されるように、この別のポリヌクレオチド（例えば、選択マーカー）を、このＰＣＲ産物に挿入する工程。代表的には、このベクターは、プラスミドゲノムライブラリー由来のプラスミドである。完成した構築物はまた、代表的には環状プラスミドである。
【００６８】
別の実施形態において、この標的化構築物は、米国出願番号６０／２３２，９５７号（２０００年９月１５日出願）（この開示は、本明細書中でその全体が援用される）に記載された、調節された正選択法に従って設計される。この標的構築物は、２つのｌａｃＯ部位を有し、ＰＧＫプロモーター下に位置する、ＰＧＫ−ｎｅｏ融合遺伝子、およびＳＶ４０  Ｔ抗原由来のＮＬＳをコードする配列に融合されたｌａｃリプレッサーを含むＮＬＳ−ｌａｃＩ遺伝子を含むように設計される。
【００６９】
別の実施形態において、この標的化構築物は、１より多くの選択マーカー遺伝子（負選択マーカー（例えば、単純疱疹ウイルスｔｋ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子）を含む）を含み得る。この負選択マーカーは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る（例えば、米国特許第５，４６４，７６４号；米国特許第５，４８７，９９２号；米国特許第５，６２７，０５９号；および米国特許第５，６３１，１５３号を参照のこと）。
【００７０】
（細胞の生成および相同組換え事象の確認）
一旦、適切な標的化構築物が調製されると、この標的化構築物は、当該分野で公知である任意の方法を使用して、適切な宿主細胞に導入され得る。種々の技術が本発明において使用され得、この技術としては、例えば、前核マイクロインジェクション；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化；胚のエレクトロポレーション；精子媒介遺伝子移入；およびリン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿、核へのＤＮＡのマイクロインジェクション、インタクトな細胞との細菌性プロトプラスト融合、トランスフェクション、ポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど）などが挙げられる（例えば、米国特許第４，８７３，１９１号；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１；Ｌｏ，１９８３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４；Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、１９８９，Ｃｅｌｌ，５７：７１７−７２３を参照のこと）。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術が、当該分野で公知である（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ，１９８９，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１１５：１７１−２２９；Ｋｅｏｗｎら，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ｋｅｏｗｎら，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，５２７−５３７頁；Ｍａｎｓｏｕｒら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２を参照のこと）。
【００７１】
本発明の好ましい局面において、この標的化構築物は、エレクトロポレーションによって、宿主細胞に導入される。このプロセスにおいて、高電場強度（ｈｉｇｈ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の電気衝撃は、生体膜を可逆的に透過性にし、この構築物の導入を可能にする。エレクトロポレーションの間に生成される細孔は、高分子（例えば、ＤＮＡ）の取り込みを可能にする（例えば、Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：７１６１−７１６５を参照のこと）。
【００７２】
相同組換えが可能な任意の細胞型が、本発明の実施において使用され得る。このような標的細胞の例としては、ヒト、ウシ種、ヒツジ種、マウス種、サル種、のような哺乳動物を含む脊椎動物、ならびに糸状菌および高等多細胞生物（例えば、植物）のような他の真核生物（ｅｔｈｅｒ  ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に由来する細胞が挙げられる。
【００７３】
好ましい細胞型としては、胚性幹（ＥＳ）細胞が挙げられ、これは代表的には、インビトロで培養される着床前の胚から得られる（例えば、Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら、１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．Ｏ．ら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５−９０６９；ならびにＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８を参照のこと）。ＥＳ細胞は、当業者に周知の方法を使用して、標的化構築物の導入のために、培養および調製される（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９８７；Ｂｒａｄｌｅｙら，１９８６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３５７−３７１；Ｈｏｇａｎらによる「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ」：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，１９８６；Ｔｈｏｍａｓら，１９８７，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３；Ｋｏｌｌｅｒら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０７３０；Ｄｏｒｉｎら，１９９２，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１：１０１；ならびにＶｅｉｓら，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７５：２２９を参照のこと）。標的化構築物が挿入されるＥＳ細胞は、標的化構築物が導入される発生胚（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏ）と同種の胚または胚盤胞に由来する。ＥＳ細胞は、代表的には、発生の胚盤胞段階の胚である哺乳動物に導入される際の内細胞塊に一体化しそして個体の生殖系列に寄与する、これらの能力について選択される。従って、この能力を有する任意のＥＳ細胞系は、本発明の実施における用途に適切である。
【００７４】
本発明はまた、他の細胞型（例えば、幹細胞）の遺伝子をノックアウトするために使用され得る。例としては、幹細胞は、骨髄、リンパまたは神経前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）および前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）であり得る。遺伝子の破壊またはノックアウトを含むこれらの細胞は、個体発生経路における標的遺伝子機能の研究において特に有用であり得る。幹細胞は、任意の脊椎動物種（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類など）に由来し得る。
【００７５】
標的化構築物が細胞に導入された後に、首尾良く遺伝子標的化が生じた細胞が同定される。標的化された遺伝子に対する標的化構築物の挿入は、代表的には、マーカー遺伝子の発現について細胞を同定することによって検出される。好ましい実施形態において、本発明の標的化構築物で形質転換される細胞は、選択マーカーを発現しない細胞を選択する適切な薬剤を用いる処置に供される。選択マーカー遺伝子を発現する細胞のみが、特定の条件下で生存および／または増殖する。例えば、導入されたネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞は、化合物Ｇ４１８に対して耐性であるが、このｎｅｏ遺伝子マーカーを発現しない細胞は、Ｇ４１８で殺傷される。この標的化構築物はまた、スクリーニングマーカー（例えば、ＧＦＰ）を含む場合、相同組換えは、蛍光灯の下での細胞コロニーのスクリーニングを通して同定され得る。相同組換えを受けた細胞は、ＧＦＰ遺伝子を欠失しており、そして蛍光を発しない。
【００７６】
調節された正の選択方法が相同組換え事象の同定において使用される場合、無作為な取り込み後では選択マーカー遺伝子の発現が阻害されるが、その相同組換え後ではその発現が許容（脱抑制）されるような様式で、選択マーカー遺伝子の発現が調節されるように、この標的化構築物が設計される。より具体的には、トランスフェクトされた細胞が、ｎｅｏ遺伝子の発現についてスクリーニングされ、これは、（１）この細胞が首尾良くエレクトロポレートされ、そして、（２）ｎｅｏの転写のｌａｃリプレッサー阻害が相同組換えによって取り除かれることを必要とする。この方法は、トランスフェクトされた細胞および相同組換え体の同定が、単一の薬物を添加することによる１工程でおこなわれることを可能にする。
【００７７】
あるいは、正負の選択技術が、相同組換え体を選択するために使用され得る。この技術は、トランスフェクトされた細胞の増殖について選択する（すなわち、正選択）ために第１の薬物（例えば、ネオマイシン様薬物）が細胞集団に添加されるプロセスを含む。第２の薬物（例えば、ＦＩＡＵ）が、その後、負選択マーカーを発現する細胞を殺傷する（すなわち、負選択）ために添加される。負選択マーカーを含み、そしてそれを発現する細胞は、選択薬剤によって殺傷されるが、負選択マーカーを含まない細胞およびそれを発現しない細胞は、生き残る。例えば、この構築物が非相同的に挿入された細胞は、ＨＳＶチミジンキナーゼを発現し、それゆえ、疱疹薬物（例えば、ガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）（ＧＡＮＣ）またはＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル；１−（２−ｄｅｏｘｙ  ２−ｆｌｕｏｒｏ−Ｂ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｌｕｒａｎｏｓｙｌ）−５−ｉｏｄｏｕｒａｃｉｌ）に対して感受性である（例えば、Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２：（１９８８）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２，（１９８９）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ５：７０−７６（１９８９）を参照のこと）。
【００７８】
成功した組換えは、選択される細胞のＤＮＡを分析することによって同定されて、相同組換えを確認し得る。当該分野で公知の種々の技術（例えば、ＰＣＲおよび／またはサザン分析）を使用して、相同組換え事象を確認し得る。
【００７９】
相同組換えはまた、幹細胞、および全能性胚性幹細胞ではない他の細胞型の中の、遺伝子を破壊するために使用され得る。例としては、幹細胞は、骨髄、リンパまたは神経前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）および前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）であり得る。このようなトランスジェニック細胞は、個体発生経路における遺伝子機能の研究において特に有用である。幹細胞は、任意の脊椎動物種（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類など）に由来し得る。
【００８０】
全能性ではない細胞において、当該分野で公知の方法を使用して、標的の両方のコピーをノックアウトすることが所望され得る。例えば、標的遺伝子座で相同組換えを含む細胞（正選択マーカー（例えば、Ｎｅｏｒ）の発現について選択され、非無作為組み込みについてスクリーニングされた）は、さらに、上昇したレベルの選択薬剤（例えば、Ｇ４１８）に対する曝露によって複数のコピーの選択マーカー遺伝子について選択され得る。次いで、この細胞は、標的遺伝子座におけるホモ接合性について分析される。あるいは、第２の構築物は、２つの相同配列の間に挿入された異なる正選択マーカーを用いて生成され得る。この２つの構築物は、連続または同時のいずれかで、この細胞に導入され得、その後、各々の正マーカー遺伝子について、適切な選択が行われ得る。この最終的な細胞は、標的の両方の対立遺伝子の相同組換えについてスクリーニングされる。
【００８１】
（トランスジェニック動物の作製）
次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞（または、生存可能な動物を生成する目的について適切な他の発生段階（例えば、桑実胚））に注入され、キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１１３−１５２頁（１９８７）を参照のこと）。あるいは、選択されたＥＳ細胞を、解離されたマウス胚細胞と凝集されて、凝集キメラを形成し得る。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植され得、そしてこの胚を出産させ得る。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有するキメラである子孫は、この動物の全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させるために使用され得る。１つの実施形態において、キメラである子孫マウスを使用して、遺伝子の中でヘテロ接合性破壊を有するマウスを生成する。次いで、ヘテロ接合トランスジェニックマウスを、交尾させ得る。代表的にこのような交尾による子孫の１／４が、この標的遺伝子の中にホモ接合性破壊を有することは当該分野で周知である。
【００８２】
次いで、ヘテロ接合およびホモ接合のトランスジェニックマウスは、標的遺伝子の破壊が表現型の変化、特に病理学的変化を引き起こすかどうかを決定するために、正常な野生型マウスと比較され得る。例えば、ヘテロ接合およびホモ接合マウスは、理学的検査、剖検、組織像、臨床化学、全血球算定、体重、器官重量、および骨髄の細胞学的評価によって表現型変化について評価され得る。
【００８３】
１つの実施形態において、標的遺伝子の破壊に関連する表現型（または表現型の変化）は、データベースに入力されるか、または保存される。好ましくは、このデータベースは、（ｉ）遺伝子型データ（例えば、破壊された遺伝子の同定）および（ｉｉ）遺伝子型データに関連する表現型データ（例えば、遺伝子破壊から生じる表現型）を含む。このデータベースは好ましくは、電子データベースである。さらに、このデータベースは好ましくは、このデータベースが検索可能であるように探索ツールと組み合わされる。
【００８４】
（条件的トランスジェニック動物）
本発明はさらに、組換え方法を用いて産生された条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物などの条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物を意図する。酵母プラスミドに由来するバクテリオファージＰ１  Ｃｒｅリコンビナーゼおよびｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的なＤＮＡリコンビナーゼ酵素の２つの非制限的な例であり、これらの酵素は、特異的標的部位（ｃｒｅリコンビナーゼではｌｏｘ  Ｐ部位、そしてｆｌｐリコンビナーゼではｆｒｔ部位）でＤＮＡを切断し、そして第二の切断部位へのこのＤＮＡの連結を触媒する。多数の適切な別の部位特異的リコンビナーゼが記載されており、それらの遺伝子は、本発明の方法に従って使用され得る。このようなリコンビナーゼとしては、バクテリオファージλのＩｎｔリコンビナーゼ（Ｘｉｓを有するかまたは有さない）（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ、Ｒ．ら、Ｌａｍｂｄａ  ＩＩ、（Ｈｅｎｄｒｉｘ、Ｒ．ら、編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２１１−５０頁（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））；ＴｐｎＩおよびβ−ラクタマーゼトランスポゾン（Ｍｅｒｃｉｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２：３７４５−５７（１９９０））；Ｔｎ３レソルバーゼ（Ｆｌａｎａｇａｎ  ＆  Ｆｅｎｎｅｗａｌｄ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２０６：２９５−３０４（１９８９）；Ｓｔａｒｋら、Ｃｅｌｌ、５８：７７９−９０（１９８９））；酵母リコンビナーゼ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２：６１０−１８（１９９０））；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳｐｏＩＶＣリコンビナーゼ（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１０９２−９８（１９９０））；Ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＆  Ｓａｄｏｗｓｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２０５：６４７−６５８（１９８９）；Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：４５２７−３３（１９９０）；Ｇｏｌｉｃ  ＆  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ、Ｃｅｌｌ、５９：４９９−５０９（１９８９）；Ａｍｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１４：５５−７２（１９９０））；Ｈｉｎリコンビナーゼ（Ｇｌａｓｇｏｗら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１００７２−８２（１９８９））；免疫グロブリンリコンビナーゼ（Ｍａｌｙｎｎら、Ｃｅｌｌ、５４：４５３−４６０（１９８８））；およびＣｉｎリコンビナーゼ（Ｈａｆｆｔｅｒ  ＆  Ｂｉｃｋｌｅ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、７：３９９１−３９９６（１９８８）；Ｈｕｂｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２０５：４９３−５００（１９８９））（全ては参考として本明細書中に援用される）が挙げられる。このようなシステムは、：Ｅｃｈｏｌｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４６９７−１４７００（１９９０））；ｄｅ  Ｖｉｌｌａｒｔａｙ（Ｎａｔｕｒｅ、３３５：１７０−７４（１９８８））；Ｃｒａｉｇ、（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：７７−１０５（１９８８））；Ｐｏｙａｒｔ−Ｓａｌｍｅｒｏｎら、（ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２４２５−３３（１９８９））；Ｈｕｎｇｅｒ−Ｂｅｒｔｌｉｎｇら、（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９２：１０��−１６（１９９０））；およびＣｒｅｇｇ  ＆  Ｍａｄｄｅｎ（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１９：３２０−２３（１９８９））（全ては参考として本明細書中に援用される）によって議論されている。
【００８５】
Ｃｒｅは、均質になるまで精製され、そしてｌｏｘＰ部位との反応は、広く特徴付けられている（Ａｂｒｅｍｓｋｉ  ＆  Ｈｅｓｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：１５０９−１４（１９８４）、参考として本明細書中に援用される）。Ｃｒｅタンパク質は、３５，０００の分子量を有し、そしてＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ／ＤｕＰｏｎｔから商業的に入手可能である。このｃｒｅ遺伝子（Ｃｒｅタンパク質をコードする）はクローン化され、そして発現されている（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ３２：１３０１−１１（１９８３）、参考として本明細書中に援用される）。このＣｒｅタンパク質は、同じＤＮＡ分子または異なるＤＮＡ分子に存在し得る２つのｌｏｘＰ配列間の組換えを仲介する（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４５：２９７−３０９（１９８１））。ｌｏｘＰ部位の内部スペーサー配列は非対称性であるので、２つのｌｏｘＰ部位は互いに対して方向性を呈し得る（Ｈｏｅｓｓ  ＆  Ａｂｒｅｍｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：１０２６−２９（１９８４））。従って、同じＤＮＡ分子上の２つの部位が、直接的に繰り返された方向にある場合、Ｃｒｅはその部位間のＤＮＡを切り出す（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ３２：１３０１−１１（１９８３））。しかしながら、この部位が互いに関して反転している場合、それらの間のＤＮＡは組換え後に切り出されるのではなく、単に反転される。したがって、直接方向に２つのｌｏｘＰ部位を有する環状ＤＮＡ分子が組換えられて、２つのより小さな環を生産する。これに対して、反転した方向に２つのｌｏｘＰ部位を有する環状分子は、ｌｏｘＰ部位が隣接するＤＮＡ配列を単に反転する。さらに、リコンビナーゼ作用は、標的が別個のＤＮＡ分子上に存在する場合、標的部位の遠位にある領域の相互交換を生じ得る。
【００８６】
リコンビナーゼは、ノックアウトモデルにおいて遺伝子機能を特徴付けるために重要な適用を有する。本明細書中に記載される構築物が標的遺伝子を破壊するために使用される場合、正の選択マーカーの挿入が標的遺伝子の翻訳開始部位の下流（３’）に生じるとき融合転写物が生産され得る。融合転写物は未知の結果を伴うあるレベルのタンパク質発現を生じ得る。正の選択マーカー遺伝子の挿入がすぐ近くの遺伝子の発現に影響を与え得ることが示唆されている。所与の表現型が遺伝子の不活性化に関連しているか、またはすぐ近くの遺伝子の転写に関連しているかを識別し得ないので、これらの効果はノックアウト事象後に遺伝子機能を決定することを難しくする場合がある。両方の潜在的問題は、リコンビナーゼ活性を利用することによって解決される。正の選択マーカーに同じ方向のリコンビナーゼ部位が隣接する場合、対応するリコンビナーゼを加えると、正の選択マーカーが除去される。このようにして、正の選択マーカーまたは融合転写物の発現により生じる影響は避けられる。
【００８７】
１つの実施形態では、精製されたリコンビナーゼ酵素は、直接マイクロインジェクションによって細胞へもたらされる。別の実施形態では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターに作動可能に連結される同時トランスフェクトされた構築物またはベクターから発現される。この実施形態のさらなる局面は、いつおよびどこで組換えが生じるかを選択することが可能である組織特異的または誘導性リコンビナーゼ構築物の使用である。誘導性形態のリコンビナーゼ媒介組換えを実行するための１つの方法は、誘導性または組織特異的なプロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントを使用して所望のリコンビナーゼ活性を発現するベクターの使用を含む。誘導性発現エレメントは好ましくは、所望のリコンビナーゼ活性の発現の誘導性制御または誘導性活性化を可能とするように作動的に配置される。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、および他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−５１（１９９６）；Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９３０２−６（１９９４））。使用することができるさらなる制御エレメントとしては、ウイルス性プロモーターなどの特異的転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターを組み込んだベクターは、必要な転写因子を発現する細胞中でリコンビナーゼ活性のみを発現する。
【００８８】
（疾患のモデル）
本明細書中に記載される細胞および動物に基づいた系は、疾患のモデルとして使用され得る。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギおよび非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されないあらゆる種の動物が、疾患動物モデルを生み出すために使用され得る。さらに、ヒトから得た細胞が使用され得る。これらの系は種々の用途において使用され得る。このようなアッセイは、薬剤（例えば、疾患症状を回復させることが可能である化合物）を同定するように設計されたスクリーニング戦略の一部として使用され得る。したがって、動物系および細胞に基づく系モデルは、疾患治療に有効であり得る薬物、医薬、治療および介入を同定するために使用され得る。
細胞に基づいた系は、疾患症状を回復させるように作用し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、このような細胞系は、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物に曝露され得る。これは、曝露された細胞中で疾患症状のこのような回復を誘導するに充分な濃度で、かつ充分な時間で行う。曝露された後、細胞は１つ以上の疾患細胞性表現型が、より正常な、あるいはより野生型の非疾患表現型に似ているように変化されているか否かを決定するために試験される。
さらに、本明細書中に記載されるものなどの動物に基づいた疾患系は、疾患症状を回復させることができる化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、疾患または動物の他の表現型特徴を処置することにおいて有効であり得る薬物、医薬、治療および介入を同定するための試験基質として使用され得る。例えば、動物モデルは、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物または薬剤に曝露され得る。これは、曝露された動物の疾患症状のこのような回復を誘導するのに充分な濃度および充分な時間で行う。曝露に対する動物の反応は、疾患に関連する障害の逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を評価してモニターされ得る。曝露は、本明細書中に記載されるモデル動物の妊娠中に母動物を処置し、それによって疾患または表現型を阻止または回復させ得る化合物または薬剤に胚または胎児を曝露することを含み得る。新生児、若年および成体の動物もまた曝露され得る。
【００８９】
より具体的には、本発明の動物モデル（具体的には、トランスジェニックマウス）を使用して、薬剤（化合物を含む）を同定する方法が、好ましくは、標的遺伝子中の破壊に関連する少なくとも１つの表現型に影響を与える能力に基づいて提供される。１つの実施形態では、本発明は、標的遺伝子または代替的に標的タンパク質の発現または機能に影響を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、例えば、薬剤に対する動物の生理学的応答を測定する工程、およびコントロール動物に対してそのような動物の生理学的応答を比較する工程を包含し、ここで、コントロール動物と比較した、標的遺伝子中に破壊を含む動物の生理学的応答が、この薬剤の特異性を示す。「生理学的応答」とは、測定され得る動物のあらゆる生物学的または物理的パラメーターである。生理学的応答を評価するために、分子アッセイ（例えば、遺伝子転写、タンパク質産生および分解速度）、物理的パラメーター（例えば、運動生理学的試験、呼吸の種々のパラメーターの測定、心拍数または血圧の測定、出血時間の測定、ＰＴＴ．Ｔ、またはＴＴ）および細胞アッセイ（例えば、細胞表面マーカーの免疫組織化学アッセイ、または凝集または増殖する細胞の能力）が使用され得る。本発明のトランスジェニック動物および細胞は、標的遺伝子の破壊に関係する表現型に関連する疾患、障害または状態のためのモデルとして使用され得る。
【００９０】
本発明は、行動表現型に関係する新規な処置を試験および開発するための特殊な動物モデルを提供する。行動表現型の分析は、例えば、神経学的、神経心理学的、または精神病性疾病などのヒトの遺伝性疾患のために提案される遺伝的および薬理学的治療の有効性を試験するために有用な動物モデルの開発を可能とする。
【００９１】
測定された種々の挙動の統計的分析は、当業者にとって慣用的に使用される任意の従来の統計プログラム（例えば、「分散分析」またはＡＮＯＶＡなど）を使用して実施され得る。約０．０５以下の「ｐ」値が一般的に統計的に有意であると考えられるが、わずかに高いｐ値は統計的に有意な差をなおも示し得る。異常な挙動を統計的に分析するために、トランスジェニック動物（またはその群）の挙動と野生型マウス（またはその群）の挙動との間での比較を、典型的にはある定められた条件下にて行う。本明細書中に使用されるように、「異常な挙動」とは、標的遺伝子に破壊を有しない動物（例えば野生型マウス）と異なる、標的遺伝子に破壊を有する動物（例えばトランスジェニック動物）によって示される挙動を指す。異常な挙動は、客観的に測定（または観察）および比較され得る任意数の標準的挙動からなる。比較する場合、ノックアウト動物と野生型コントロール動物との間に意義ある挙動の差が本当に存在することを確認するためには、その変化が統計的に有意であることが好ましい。測定または観察され得る挙動の例としては、運動失調、急速四肢運動、眼球運動、呼吸、運動活動性、認識、情緒的挙動、社会的挙動、機能亢進、過敏症、不安、学習障害、異常報酬挙動および攻撃性などの異常社会的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
一連の試験は、異常な挙動を同定するための神経学的および神経心理学的試験を含む、本発明の動物モデルの挙動的表現型を測定するために使用され得る。これらの試験は例えば、学習および記憶、食事、疼痛、攻撃性、有性生殖、不安、抑うつ、精神分裂病、および薬物乱用に関する異常な挙動を測定するために使用され得る（例えば、ＣｒａｗｌｅｙおよびＰａｙｌｏｒ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ３１：１９７−２１１（１９９７）を参照のこと）。
【００９３】
社会的相互作用試験は種々の設定において他の動物へマウスを曝露することを含む。動物の社会的挙動（例えば、接触、登上、匂いかぎおよび交尾）が続いて評価される。次いで、挙動における差異は統計的に解析され、比較され得る（例えば、Ｓ．Ｅ．Ｆｉｌｅら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．２２：９４１−９４４（１９８５）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎ，Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２３９−２４７（１９８６）参照）。挙動試験の例としては下記のものが挙げられる。
【００９４】
マウス驚愕反応試験は、代表的には、動物を感覚（代表的には、聴覚性）刺激に曝露し、動物の驚愕反応を測定することを含む（例えば、Ｍ．Ａ．Ｇｅｙｅｒら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．２５：４８５−４９８（１９９０）；ＰａｙｌｏｒおよびＣｒａｗｌｅｙ，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １３２：１６９−１８０（１９９７）参照）。（正常な驚愕反応からの）抑制パーセントが、驚愕パルスに先立つ短い低度の前パルスを使用して、まず動物に「合図を与える（ｃｕｅｉｎｇ）」ことによって測定される前パルス抑制試験もまた、使用され得る。
【００９５】
電気ショック試験は、通常、電気を流した表面への曝露および例えば、運動活性、学習、社会的挙動など、その後の挙動の測定を含む。挙動は測定され、標準的な統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｇ．Ｊ．Ｋａｎｔら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．２０：７９３−７９７（１９８４）；Ｎ．Ｊ．Ｌｅｉｄｅｎｈｅｉｍｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．３０：３５１−３５５（１９８８）参照）。
【００９６】
テイルピンチまたは固定化試験は、動物の尾部に圧力を加え、かつ／または動物の運動を制限することを含む。運動活動性、社会的挙動および認識挙動が、測定される領域の例である（例えば、Ｍ．Ｂｅｒｔｏｌｕｃｃｉ  Ｄ’Ａｎｇｉｃら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５５：１２０８−１２１４（１９９０）参照）。
【００９７】
新規の試験は、通常、新規な環境および／または新規な対象への曝露を含む。新規な環境中および／または新規な対象の周囲での動物の運動挙動が測定され、統計的に解析される（例えば、Ｄ．Ｋ．Ｒｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．１７：１９３−２０２（１９８２）；Ｂ．Ｐｏｕｃｅｔ，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０３：１００９−１００１６（１９８９）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎら、Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２３１−２３８（１９８６）を参照のこと）。この試験は、視覚処理の欠乏または欠損を検出するために使用され得る。
【００９８】
学習された無力（ｈｅｌｐｌｅｓｓｎｅｓｓ）試験は、動物の挙動によって影響をされ得ないストレス、例えば有害刺激への曝露を含む。動物の挙動は、種々の標準的統計試験を使用して統計的に解析され得る（例えば、Ａ．Ｌｅｓｈｎｅｒら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．２６：４９７−５０１（１９７９）参照）。
【００９９】
あるいは、テイルによって「逆さまに」宙吊りされたときに、マウスの「不動」時間を測定するテイル宙吊り試験が使用され得る。これは、動物がもがくか否かの目安、すなわち抑うつの指標である。ヒトでは、抑うつはその生活または状況の制御欠如の感情から生じると考えられている。抑うつ状態は、動物が制御できない逆況に繰り返し付されることによって、動物に誘発され得ると考えられている。遂には「学習された無力」の状況が達成され、そこでは動物が、その環境を変えようとすることをやめ、そして単にその宿命を受け入れる。より早くもがきをやめる動物は、より抑うつ傾向にあると考えられる。試験に先だってある種の抗うつ剤を投与すると動物があきらめる前にもがく時間を増加させることが、研究によって示されている。
【０１００】
モーリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓ  ｗａｔｅｒ−ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ）は、水中での空間方向性を学習し、続いて、例えば、不正確な選択の数を計算することなどによって動物の挙動を測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｅ．Ｍ．Ｓｐｒｕｉｊｔら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５２７：１９２−１９７（１９９０）を参照のこと）。
【０１０１】
あるいは、Ｙ字型迷路が使用され得る（例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ３２：７２３−７２６（１９８９）；Ｄｅｌｌｕ，Ｆ．ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  ７３：３１−４８（２０００）を参照のこと）。Ｙ迷路は、一般的に認識能力の試験であると考えられている。Ｙ迷路の各アームの大きさは、他の大きさも使用され得るけれども、例えば、約４０ｃｍ×８ｃｍ×２０ｃｍであり得る。各アームはまた、例えばアーム内の運動を自動的に検出するために、等しく間隔をあけた１６のフォトビームを有することができる。少なくとも２種の異なった試験がこのようなＹ迷路を使用して実施され得る。連続Ｙ迷路パラダイムでは、マウスに例えば約１０分間、Ｙ迷路の３つのアーム全てを探索させる。動物は、フォトビーム検出グリッドを使用して連続的に追跡され、そのデータは自発的交替およびポジティブな偏り挙動を測定するために使用され得る。自発的交替とは、迷路の最も馴染みのないアームを訪れる「正常な」動物の自然な傾向を呼ぶ。交替は、動物が２回、連続して同じ方向に回転を行うときに記録され、したがって、最低頻度で入った迷路のアームへの連続した訪問を表す。位置の偏りは、一方の方向での回転を他方の方向よりも好む動物の傾向を測定して、自己中心的（ｅｇｏｃｅｎｔｒｉｃａｌｌｙ）に定義された反応を決定する。したがって、この試験は他人中心性または自己中心性機構に基づいて進む動物の能力の差異を検出し得る。２つの試験的Ｙ迷路記憶試験は、自由選択探索パラダイムに基づく新規性および空間記憶に対する反応を測定する。第１の試験（取得）中、動物は、例えば約１５分間、自由にＹ迷路の２つのアームを訪問し得る。第３のアームはこの試験中、遮蔽されている。第２の試験（回復）は例えば約２時間の試験間間隔をおいてから実施される。回復試験中、遮蔽されたアームは開放され、動物は例えば、約５分間、３つのアーム全てに近づき得る。データは回復試験中に集められ、各アームへの訪問回数および時間について解析される。迷路の３つのアームはほとんど同一であるから、新規性と精通さとの間の区別は各アームの位置に関連する部屋周囲の「環境的」空間的手掛かり（ｃｕｅ）に依存している。トランスジェニック動物モデルのアームへの入場および新規のアームで過ごす持続時間における変化は、新規性および認識過程を媒介することにおけるその遺伝子の役割を示し得る。
【０１０２】
消極的回避またはシャトルボックス試験は、一般的には、２つ以上の環境への曝露を含み、そのうちの１つは有害であって、動物により学習される選択をもたらす。行動測定は、例えば、反応の潜伏時間、正確な反応の回数および反応一貫性を含む（例えば、Ｒ．Ａｄｅｒら、Ｐｓｙｃｈｏｎ．Ｓｃｉ．２６：１２５−１２８（１９７２）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎ，Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２２１−２３０（１９８６）を参照のこと）。あるいは、ゼロ迷路が使用され得る。ゼロ迷路では、動物を、例えば、２つの開放四分円および２つの閉塞四分円を有する高架環状プラットホームのうちの閉鎖四分円中に置き、約５分間、探索させる。このパラダイムは、げっ歯類の正常な探索活動と解放空間への嫌悪との間の接近−回避葛藤を利用する。この試験は不安のレベルを測定し、抗不安剤の有効性を評価するために使用され得る。閉鎖四分円に対して開放四分円で過ごす時間は、例えば、各移行場所にフォトビームを配置して、自動的に記録され得る。
【０１０３】
食物回避試験は、新しい食物への曝露、および、例えば、食物摂取および摂取の潜伏時間を客観的に測定することを含む。測定された行動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｂ．Ａ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．６７：１５−２２（１９６９）を参照のこと）。
【０１０４】
高架式プラス迷路試験は、プラットホーム上で側部のない迷路に曝露することを含み、動物の行動は、迷路侵入および迷路学習の回数をカウントして客観的に測定される。この行動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｈ．Ａ．Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ，２０：６０３−６０６（１９８８）を参照のこと）。
【０１０５】
刺激誘導機能亢進試験は、刺激薬物（例えば、アンフェタミン、コカイン、ＰＣＰなど）の注射、および、例えば、運動活動、社会的相互作用、認識行動を客観的に測定することを含む。動物の行動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｐ．Ｂ．Ｓ．Ｃｌａｒｋｅら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ９６：５１１−５２０（１９８８）；Ｐ．Ｋｕｃｚｅｎｓｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１：２７０３−２７１２（１９９１）を参照のこと）。
【０１０６】
自己刺激試験は、一般的には、マウス自体の脳への電気的刺激および／または化学的刺激を調節する機会をマウスに与えることを含む。行動は、自己刺激の頻度およびパターンによって測定される。このような行動は、標準的統計試験によって統計的に解析される（例えば、Ｓ．Ｎａｓｓｉｆら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，３３２：２４７−２５７（１９８５）；Ｗ．Ｌ．Ｉｓａａｃら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０３：３４５−３５５（１９８９）を参照のこと）。
【０１０７】
報酬試験は、種々の行動（例えば、運動行動、認識行動および社会的行動）を具体化し、例えば、行動変化の速度および信頼度を測定し、そして測定された行動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｌ．Ｅ．Ｊａｒｒａｒｄら、Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６１：５１９−５３０（１９８６）を参照のこと）。
【０１０８】
ＤＲＬ（低反応率差次的強化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ｌｏｗ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ））実施試験は、間欠的報酬パラダイムに曝露し、適切な反応（例えば、レバー押し）の回数を測定することを含む。このような行動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｊ．Ｄ．Ｓｉｎｄｅｎら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１００：３２０−３２９（１９８６）；Ｖ．Ｎａｌｗａら、Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１７：７３−７６（１９８５）；およびＡ．Ｊ．Ｎｏｎｎｅｍａｎら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．９５：５８８−６０２（１９８１）を参照のこと）。
【０１０９】
空間学習試験は、複雑で新規の環境に曝露し、空間学習の速度および範囲を測定し、そして測定された行動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｎ．Ｐｉｔｓｉｋａｓら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．３８：９３１−９３４（１９９１）；Ｂ．Ｐｏｕｃｅｔら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３７：２６９−２８０（１９９０）；Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３７：２６３−２６８（１９９０）；およびＦ．Ｖａｎ  Ｈａａｒｅｎら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０２：４８１−４８８（１９８８）を参照のこと）。あるいは、所与の時間に動く、より大きな距離が、動物の活動レベルおよび不安の目安であるオープンフィールド（ｏｆ）試験が使用され得る。オープンフィールドが新規な環境である場合、このオープンフィールドは、動物が探索する欲動と自身を守る欲動との間で「板ばさみ」となる接近−回避状況を作り出すと考えられる。部屋が明るくされ、隅以外に隠れる場所がないために、「正常な」マウスは、隠れる場所のない中心よりも隅および周辺でより長い時間を費やすであろうと予測される。しかしながら、「正常な」マウスは、部屋をますます探索するにつれて中心領域へ出て行く。次いで、特に心配性のマウスは、中心領域の探索を比較的わずかにしかしないか、または全くせずに、隅でその時間のほとんどを費やす一方、大胆な（すなわち心配性でない）マウスは、大きな距離を動き、中心領域に対して周辺をそれほど好まないことを示すことが推定され得る。
【０１１０】
視覚、体性感覚および聴覚失認試験は、一般的には感覚的刺激に曝露し、例えば環境に適応する（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｎｇ）反応を客観的に測定し、そして測定された行動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｖａｒｇｏら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０２：１９９−２０９（１９８８）を参照のこと）。
【０１１１】
完了行動試験は、一般的には、餌と飲み物を与えること、および消費量を客観的に測定することを含む。測定された行動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０２：３０１−３０８（１９９０）；Ｍ．Ｇ．Ｃｏｒｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０７２−２０７６（１９８３）を参照のこと）。
【０１１２】
視覚識別試験もまた、動物の視覚処理を評価するために使用され得る。１つまたは２つの類似の対象物がオープンフィールドに置かれ、動物は約５〜１０分間、探索させられる。各対象物を探索するために費やされた時間（対象物への接近、すなわち、例えば約３〜５ｃｍ以内での動きが対象物の探索とみなされる）が記録される。次いで、動物はオープンフィールドから取り出され、そして対象物が類似の対象物および新奇な対象物に取り替えられる。動物はオープンフィールドへ戻され、古い対象物に対して新奇な対象物を探索することに費やす時間の割合が、（再び、約５〜１０分間の時間をかけて）測定される。「正常な」動物は、代表的には、古い対象物よりもむしろ新奇な対象物を探索することにより高い割合の時間を費やす。サンプリングと試験との間に遅れが課せられる場合、記憶作業は、より海馬依存性になる。遅れが課せられない場合、作業は単純な視覚識別により大きく基づく。この試験はまた、対象物（好ましくは単純なブロック）がスプレーされ得るか、さもなければ匂いを保持するために処理される、嗅覚識別のためにも使用され得る。この試験はまた、動物が味覚識別できるか否かを決定するためにも使用され得、新奇な食物ではなく先に食べた食物にもどる動物は、味覚新奇恐怖症（ｎｅｏｐｈｏｂｉａ）を示す。
【０１１３】
ホットプレート痛覚脱失試験（ｈｏｔ  ｐｌａｔｅ  ａｎａｌｇｅｓｉａ  ｔｅｓｔ）は、熱または痛みによる刺激に対する動物の感受性を評価するために使用され得る。例えば、マウスは約５５℃のホットプレート上に置かれ得、そしてマウスの応答潜伏時間（例えば、後足を持ち上げて後足をなめるまでの時間）が記録され得る。これらの反応は反射的でなく、むしろ皮質の関与を必要とする「高等な」応答である。この試験は、侵害受容障害を評価するために使用され得る。
【０１１４】
加速ロータロッド試験は、マウスの協調および平衡を測定するために使用され得る。動物は、例えば、回転トレッドミル（または回転丸太）のように作動するロッド上に置かれ得る。ロータロッドは、最初はゆっくりと回転し、次いで、例えば、約６０ｒｐｍの速度に達するまで次第に速く回転するようにすることができる。マウスは、落下を避けるために連続して自分自身の位置を変えなければない。動物は、好ましくは、最低２０分間あけて少なくとも３回、試験される。最も長くロッド上に留まることができるマウスは、より良好な協調および平衡を有すると考えられる。
【０１１５】
メトラゾール投与試験は、発作または類似の事象に対する感受性を変化させるための動物のスクリーニングのために使用され得る。例えば、メタゾール５ｍｇ／ｍｌ溶液は、例えば、約０．３７５ｍｌ／分の速度でマウスの尾静脈から注入され得る。この注入は、マウス全てに発作を経験させ、続いて致死を引き起こす。最も早く発作段階に入ったマウスは、発作をおこす傾向がより高いと考えられる。４つの異なる生理学的段階が記録され得る：注入開始後、速やかに、マウスは著しい「痙攣」、続いて一連の発作を示し、「強直性伸展（ｔｏｎｉｃ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」として公知である体の最終緊張となり、続いて死に至る。
【０１１６】
（標的遺伝子産物）
本発明はさらに、標的遺伝子産物を生産するための標的遺伝子配列の使用を意図する。標的遺伝子産物は、機能的に等価な遺伝子産物を示すタンパク質を含み得る。このような等価遺伝子産物は、本明細書中に記載される遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含み得るが、これはサイレント変化を生じ、従って、機能的に等価な標的遺伝子産物を生産する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいてなされ得る。
【０１１７】
例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本明細書中に使用される場合、「機能的に等価である」とは、標的遺伝子配列によってコードされる内因性遺伝子産物と実質的に類似のインビボ活性を示すことができるタンパク質をいう。あるいは、アッセイの一部として使用される場合、「機能的に等価である」とは、内因性遺伝子産物の対応する部分が行う様式と実質的に類似の様式で他の細胞内分子または細胞外分子と相互作用することができるペプチドをいう。
【０１１８】
本発明の方法に従って有用である他のタンパク質産物は、組換え手段または合成手段により生産された標的遺伝子由来であるか、あるいはこれに基づくペプチド（誘導ペプチド）である。
【０１１９】
標的遺伝子産物は、当該技術分野で周知である技術を使用した、組換えＤＮＡ技術によって生産され得る。従って、遺伝子配列をコードする核酸を発現することによって本発明の遺伝子ポリペプチドおよびペプチドを調製するための方法が、本明細書中に記載される。当業者に周知である方法は、タンパク質コード遺伝子配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（上述）およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９（上述）を参照のこと）。あるいは、タンパク質の遺伝子配列をコードすることができるＲＮＡは、例えば、自動合成器（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）を参照のこと）を使用して化学的に合成され得る。
【０１２０】
種々の宿主発現ベクター系が、本発明の遺伝子コード配列を発現するために使用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列を生産し、続いて精製し得るビヒクルを示すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、インサイチュで本発明の遺伝子のタンパク質を示し得る細胞も示す。これらとしては、タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；タンパク質コード遺伝子配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されたか、またはタンパク質コード遺伝子配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
細菌系において、多くの発現ベクターは、発現される遺伝子のタンパク質について意図される用途に依存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が生産されるべき場合には、抗体の生成またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望ましくあり得る。このようなベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（このベクターにおいて、タンパク質コード遺伝子配列は、融合タンパク質が生産されるように、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター中に個々に連結され得る）（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，２：１７９１−９４（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：３１０１−０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５５０３−９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターはまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて外来ポリペプチドを融合タンパク質として発現するために使用され得る。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着と、これに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出とによって溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、結果として、クローン化された標的遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１２２】
好ましい実施形態において、全長ｃＤＮＡ配列が、標準的ＰＣＲ方法論（Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０））を使用して、アミノ末端でインフレームＢａｍＨＩ部位に、そしてカルボキシル末端でインフレームＥｃｏ  ＲＩ部位に付加され、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中に連結される。得られたｃＤＮＡ構築物は、放射性標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識部位を、そして親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列を含む（Ｎｉｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：１０７５−８０（１９８５）；Ｚａｂｅａｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：１２１７−２４（１９８２））。
【０１２３】
昆虫系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。遺伝子コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。遺伝子コード配列の首尾のよい挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉鎖性組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク性被覆を欠くウイルス）の産生を生じる。次いで、これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染するために使用される（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４−９３（１９８３）；米国特許第４，７４５，０５１号を参照のこと）。
【０１２４】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスに基づく発現系が、使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、目的の配列をコードする遺伝子は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列）に連結し得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロ組換えまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１または領域Ｅ３）における挿入は、組換えウイルスを生じ、この組換えウイルスは、感染した宿主において生存し得、かつ遺伝子タンパク質を発現し得る（例えば、Ｌｏｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３６５５〜５９（１９８４）を参照のこと）。特定の開始シグナルはまた、挿入された遺伝子のコード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。全遺伝子（それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む）が、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる翻訳制御シグナルが必要とされなくてもよい。しかし、遺伝子コード配列の一部のみが挿入される場合、外因性の翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）が、提供されなければならない。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために所望されるコード配列のリーディングフレームと、同じ位相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの封入によって増大され得る（Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜４４（１９８７））。
【０１２５】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または特定の所望される様式の遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞種が、選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変について、特徴的な機構および特定の機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、発現される外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために、選択され得る。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
長期にわたって高収率な組換えタンパク質の生成、安定な発現が好ましい。例えば、遺伝子タンパク質を安定に発現する細胞株が、操作され得る。宿主細胞は、ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されたＤＮＡ、および選択マーカーを用いて形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞を、富化培地中で１〜２日間増殖させ得、次いで富化培地を選択培地に入れ替える。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がその染色体にプラスミドを安定に組み込み、そして増殖し、病巣を形成することを可能にする。次いでこの病巣は、クローニングされ、そして細胞株に拡大され得る。この方法は、遺伝子タンパク質を発現する細胞を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、遺伝子タンパク質の内因性の活性を生じる化合物をスクリーニングおよび評価するために特に有用であり得る。
【０１２７】
好ましい実施形態において、組換えタンパク質の発現のタイミングおよび／または量の制御は、誘導発現構築物を使用して制御され得る。組換えタンパク質の誘導的発現のための、誘導構築物および誘導的な系は、当業者に周知である。このような誘導プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、および他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなど、が挙げられるが、これらに限定されない（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜５１（１９９６）；Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９３０２〜６（１９９４））。使用され得るさらなる制御エレメントとしては、ウイルスプロモーター、特定のＨＩＶプロモーターなどの特定の転写因子に必要なプロモーターが挙げられる。１つの実施形態において、Ｔｅｔ誘導遺伝子発現系が使用される（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６〜６９（１９９５））。Ｔｅｔ発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｎ１０トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロン由来の２つの調節エレメント（テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、およびＴｅｔＲに結合するテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ））に基づいている。このような系を使用して、組換えタンパク質の発現がｔｅｔＯオペレーター配列の制御下に置かれ、そして宿主細胞にトランスフェクトされるか、または形質転換される。ＴｅｔＲ（これは、宿主細胞中に同時にトランスフェクトされる）の存在下、ＴｅｔＲタンパク質のｔｅｔＯ調節エレメントへの結合に起因して、組換えタンパク質の発現が抑制される。次に、調節された遺伝子の高レベルの発現が、ＴｅｔＲへの結合についてｔｅｔＯエレメントと競合する、テトラサイクリン（Ｔｃ）またはＴｃ誘導体（例えば、デオキシサイクリン（Ｄｏｘ））の濃度変化に応答して誘導され得る。ｔｅｔ誘導遺伝子の発現のための構築物および材料は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから市販されている。
【０１２８】
アッセイ系の成分として使用される場合、遺伝子タンパク質は、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで標識され、遺伝子タンパク質と試験物質との間に形成される複合体の検出を容易にし得る。任意の種々の適切な標識系が使用され得、これらとしては、１２５Ｉなどのラジオアイソトープ；物質に曝露されたときに検出可能な熱量測定シグナルまたは光を発生する酵素標識系；ならびに蛍光標識、が挙げられるが、これらに限定されない。組換えＤＮＡ技術を使用して、このようなアッセイ系のための遺伝子タンパク質を生成する場合、標識化、固定化、および／または検出を容易にし得る融合たんぱく質を操作することが有利であり得る。
【０１２９】
間接的な標識は、遺伝子産物に特異的に結合するタンパク質（例えば、標識された抗体）の使用を含む。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
（抗体の生成）
１以上のエピトープを特異的に認識し得る抗体の生成のための方法が、本明細書中に記載される。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記いずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば、生物学的サンプル中の標的遺伝子の検出において、または異常な標的遺伝子活性を阻害するための方法として、使用され得る。従って、このような抗体は、疾患の処置方法の一部として使用され得、そして／または診断的技術の一部として使用されることによって、患者は、標的遺伝子タンパク質の異常なレベル、もしくはこのようなタンパク質の異常な形態の存在について試験され得る。
【０１３１】
抗体の生成のために、種々の宿主動物は、標的遺伝子、その発現産物、またはその一部を注入することによって免疫され得る。このような宿主動物としては、２、３の例を挙げると、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられ得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントを使用して、宿主の種に依存する免疫学的応答を増大させ得る。このようなアジュバントとして、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｇｅｌ）、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
ポリクローナル抗体は、抗原（例えば、標的遺伝子産物またはその抗原性官能基の誘導体抗原）で免疫された動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、上記のような宿主動物は、アジュバンド（これも上記）を補充された遺伝子産物を注入することによって免疫され得る。
【０１３３】
モノクローナル抗体（これは、特定の抗原に対する抗体の均一な集団である）は、連続的な培養細胞株による抗体分子の生成を提供する任意の技術によって獲得され得る。これらの技術としては、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜７（１９７５）；および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２０２６〜３０（１９８３））、ならびにＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７７〜９６頁（１９８５））が挙げられるがこれらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンのクラス、およびその任意のサブクラスであり得る。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボにおいて培養され得る。インビボにおいて高力価なｍＡｂの生成が、現在のところ好ましい生成方法である。
【０１３４】
さらに、「キメラ抗体」の生成（適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる）のために開発された方法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２〜５４（１９８５））が、使用され得る。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種由来である（例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する）分子である。
【０１３５】
あるいは、単鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５４４〜４６（１９８９）は、遺伝子−単鎖抗体を生成するために適用され得る。単鎖抗体は、アミノ酸の架橋を介してＦｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。
【０１３６】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じ得るＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜８１（１９８９））、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にし得る。
【０１３７】
（スクリーニング方法）
本発明は、アゴニスト（すなわち、標的遺伝子ポリペプチドに結合して、活性化する因子）またはアンタゴニスト（すなわち、標的遺伝子ポリペプチドの活性または標的遺伝子ポリペプチドのリガンドとの相互作用を阻害する）のような因子をスクリーニングするためのプロセスにおいて使用され得る。従って、本発明のポリペプチドはまた、低分子の物質および、例えば、細胞、無細胞調製物、キメラライブラリー、および当該分野で公知の天然の産物の混合物中のリガンドの結合を評価するために使用され得る。レセプターを調節し得る因子を同定およびスクリーニングするために慣用的に使用される任意の方法が、本発明によって使用され得る。
【０１３８】
本発明は、標的遺伝子の発現または機能を調節する因子を同定およびスクリーニングするための方法を提供する。より詳細には、標的遺伝子配列を含有かつ発現する細胞を使用して、治療的因子をスクリーニングし得る。このような細胞としては、非組換え単球細胞株（例えば、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６３））；内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ’ｓおよびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ’ｓ））；ならびに一般的な哺乳動物細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６５１）））が挙げられ得る。さらに、このような細胞として、組換え細胞株、トランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、本発明のトランスジェニックマウスを使用して、疾患に関連する１以上の細胞型を含む細胞株を生成し得、この細胞株は、この障害のための細胞培養モデルとして使用され得る。本発明の疾患トランスジェニック動物由来の細胞、組織、および初代培養物が使用され得るが、連続細胞株の生成が好ましい。トランスジェニック動物由来の連続細胞株の誘導に使用され得る技術の例については、Ｓｍａｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：６４２〜４８（１９８５）を参照のこと。
【０１３９】
標的遺伝子配列は、目的の細胞のゲノムに導入され得、そのゲノム中で過剰発現され得る。標的遺伝子配列を過剰発現するために、標的遺伝子配列のコード部分は、目的の細胞型において遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は、当業者に周知であり、そして過度の実験なしに使用され得る。標的遺伝子配列はまた、破壊されても、過少発現されてもよい。標的遺伝子の破壊または過少発現された標的遺伝子配列を有する細胞を使用して、例えば、この破壊または過少発現に起因する任意の機能欠損を補う代替的な経路を生じ得る因子をスクリーニングし得る。
【０１４０】
インビトロ系は、標的遺伝子産物に結合し得る化合物を同定するために設計され得る。このような化合物としては、Ｄ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸からなるペプチド（例えば、ランダムペプチドライブラリーの形態で（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２〜４（１９９１）を参照のこと））、リンペプチド（例えば、ランダムまたは部分縮重特異的リンペプチドライブラリー；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ、７２：７６７〜７８（１９９３）を参照のこと）、抗体、ならびに有機低分子または無機低分子が挙げられるが、これらに限定されない。同定された化合物は、例えば、標的遺伝子タンパク質（好ましくは標的遺伝子タンパク質変異体）の活性の調節；標的遺伝子タンパク質の生物学的機能の生成；または正常な標的遺伝子の相互作用を破壊するか、もしくはこのような相互作用を破壊する化合物のスクリーニングにおいて有用であり得る。
【０１４１】
標的遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、標的遺伝子タンパク質および試験化合物の反応混合物を、条件下で調製し、十分な時間この２つの化合物を相互作用させて結合し、これによって反応混合物中で除去および／または検出され得る複合体を形成することを含む。これらのアッセイは、種々の方法で実施され得る。例えば、このようなアッセイを実施するための１つの方法は、標的遺伝子タンパク質または試験物質を固相にアンカーする工程、および反応の最後に固相にアンカーされた標的タンパク質／試験物質複合体を検出する工程を包含する。このような方法の１つの実施形態において、標的遺伝子タンパク質は、固体表面にアンカーされ得、アンカーされていない試験化合物は、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、標識され得る。
【０１４２】
実際には、マイクロタイタープレートが簡便に使用される。アンカーされた成分は、非共有結合または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は、タンパク質の溶液で固体表面をコーティングし、乾燥することによって簡単に達成され得る。あるいは、このタンパク質に特異的な固定化された抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を使用して、このタンパク質を固体表面にアンカーし得る。この表面は、前もって調製され得、そして保存され得る。
【０１４３】
アッセイを実施するために、固定化されていない成分が、付着された成分を含む被覆表面に添加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成された全ての複合体が固体表面上に固定化されたまま残るような条件下に除去（例えば、洗浄）される。固体表面上に付着された複合体の検出は多くの方法で達成され得る。以前の固定化されていない成分が前もって標識されている場合には、表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。以前の固体化されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的標識が、表面上に付着された複合体を検出するために使用され得る；例えば、以前の固定化されていない成分に特異的な標識抗体（次ぎにこのような抗体が、標識された抗Ｉｇ抗体で直接的に標識されるか、または間接的に標識され得る）を使用する。
【０１４４】
あるいは、反応は液相中で実施され得、反応生成物は未反応成分から分離され、複合体は、例えば、標的遺伝子産物または試験化合物に特異的な、溶液中に形成された任意の複合体を付着するための、固定化抗体、および付着された複合体を検出するための可能性ある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して検出される。
【０１４５】
上記された方法の１つによって特定の標識遺伝子産物に結合することが示される化合物は、さらに標的遺伝子タンパク質から生化学的応答を惹起するその能力について試験され得る。発現産物のアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターは、当該分野で周知であるアッセイを使用して同定され得る。
【０１４６】
（アンチセンス、リボザイム、および抗体）
治療剤として使用され得る他の薬剤としては、標的遺伝子、その発現産物およびその機能的フラグメントが挙げられる。さらに、変異標的遺伝子活性を低下または阻害する薬剤は、疾患症状を回復させるために使用され得る。このような薬剤としては、アンチセンス、リボザイムおよび三重螺旋分子が挙げられる。このような分子の生成および使用のための技術は当業者には周知である。
【０１４７】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、かつタンパク質翻訳を阻害することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンスＤＮＡに関して、翻訳開始部位、例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０領域と＋１０領域との間に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１４８】
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレオチド切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む。リボザイム分子の組成は、標的遺伝子ｍＲＮＡに対して相補的な１以上の配列を含まなければならず、そしてｍＲＮＡ切断の原因である周知の触媒配列を含まなければならない。この配列としては、米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと（その全体が本明細書中に参考として援用される）。標的遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列のエンドヌクレオチド切断を特異的かつ有効に触媒する操作されたハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子はそれ自体で本発明の範囲内である。
【０１４９】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は最初、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位について目的の分子をスキャニングすることにより同定される。一旦、同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配列を適切なものでなくし得る、二次構造などの予想される構造的特徴について評価され得る。候補配列の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためのそれらの接触可能性を試験することにより評価され得る。
【０１５０】
転写の阻害のための三重螺旋形成に使用される核酸分子は１本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対の法則によって三重螺旋形成を促進するように設計されなければならない。これは、一般的には二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）を必要とする。ヌクレオチド配列は、得られた三重螺旋の３本の関連した鎖にわたってＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットを生じるピリミジンベースであり得る。ピリミジンに富む分子は、その鎖に平行に配向した二重鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域に相補的である塩基を提供する。さらに、例えばＧ残基の伸長を含む、プリンに富む核酸分子が選択され得る。これらの分子は、ＧＣ対に富むＤＮＡ二重鎖とともに三重螺旋を形成する。そこでは、大多数のプリン残基は、標的二重鎖のうちの一本鎖上に配置され、三重鎖の３本鎖にわたりＧＧＣトリプレットを生じる。
【０１５１】
あるいは、三重螺旋形成のために標的化することができる潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、二重鎖のうち、最初に一方の鎖、次いで他方の鎖と塩基対を形成し、二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長の必要性を排除するように、交互５’−３’、３’−５’様式で合成される。
【０１５２】
本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイムおよび／または三重螺旋分子は、正常および変異標的遺伝子対立遺伝子の両者によって生産されるｍＲＮＡの転写（三重螺旋）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を低減あるいは阻止し得ることが可能である。標的遺伝子活性の十分に正常な程度が維持されることを確証するために、正常な活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、使用されるいなかなるアンチセンス、リボザイム、または三重螺旋処理にも感受性を有する配列を含まない細胞中へ導入され得る。また、細胞または組織の標的遺伝子活性の必須の程度を維持するために、細胞または組織中に正常な標的遺伝子タンパク質を共投与することが好ましい場合もある。
【０１５３】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および三重螺旋分子はＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関する当該分野で公知である任意の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学合成法など、当該技術分野で周知であるオリゴデオシキリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する技術を含む。あるいは、ＲＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成され得る。このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む広範囲に多様なベクター中に導入され得る。また、使用されるプロモーターに応じて、構成的にまたは誘導可能にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物が、細胞株中に安定して導入され得る。
【０１５４】
ＤＮＡ分子の種々の周知である修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入され得る。可能性ある修飾としては、分子の５’および／または３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列を付加すること、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの主鎖内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
標的遺伝子タンパク質、および特に変異遺伝子タンパク質の両方に特異的であり、かつその活性を妨害する抗体は、変異標的遺伝子機能を阻止するために使用され得る。このような抗体は、当該技術分野で公知であり、また本明細書中に記載されるような標準的技術を使用して、タンパク質自身に対して、またはタンパク質の一部分に対応するペプチドに対して生成され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
標的遺伝子タンパク質が細胞内にありかつ抗体全体が使用される例では、抗体を内在化させることが好ましい場合がある。しかしながら、リポフェクチンリポソームは、細胞中へ標的遺伝子エピトープに結合する抗体またはＦａｂ領域のフラグメントを送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的または広がった標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは当該技術分野で周知である方法を使用して、化学的に合成され得るか、あるいは組換えＤＮＡ技術により生産され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（１９８４）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３、前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出を参照のこと）。また、細胞内標的遺伝子エピトープに結合する単鎖中和抗体も投与され得る。このような単鎖抗体は、例えばＭａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７８８９−９３（１９９３）に記載される技術などを使用することにより、例えば、標的細胞集団内の単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することで投与され得る。
【０１５７】
標的遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列は、疾患症状が改善されるような、ある程度の標的遺伝子タンパク質の生産に十分である濃度で、疾患症状を示す患者に直接に投与され得る。患者は遺伝子置換治療法で治療されてもよい。正常な標的遺伝子の１以上の複製物、または標的遺伝子機能を有する正常な標的遺伝子タンパク質の生産を指向する遺伝子の一部分は、ベクターを使用して細胞内へ挿入され得る。ベクターとしては、リポソームなどの細胞中にＤＮＡを導入する他の粒子のほかに、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記したような技術が、ヒト細胞中へ正常な標的遺伝子配列を導入するために使用され得る。
【０１５８】
次いで、正常な標的遺伝子を発現する遺伝子配列を含む細胞、好ましくは自己細胞は、疾患症状の改善を可能とする位置で、患者の中に導入されるかあるいは再導入され得る。
【０１５９】
（薬学的組成物、有効投薬量、および投与経路）
標的変異体遺伝子の発現、合成および／または活性を阻害する同定された化合物は、疾患を処置または改善するために治療的に有効な用量で患者に投与され得る。治療的に有効な用量とは、疾患の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【０１６０】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療的有効量）を測定するための、細胞培養物または実験動物の標準的な薬学的方法により決定され得る。毒性と治療的効果との用量割合は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得る間は、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、病気に冒された組織の部位をこのような化合物の標的とする送達系を設計するように注意すべきである。
【０１６１】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方することに使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかあるいは全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。この投薬量は使用される投薬形態および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用されるいかなる化合物についても、治療的に有効な用量が細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は細胞培養で決定されたようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。このような情報を使用して、より正確にヒトにおいて有用な用量を決定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１６２】
本発明により使用するための薬学的組成物は、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して従来の方法で処方され得る。したがって、この化合物およびその生理学的に受容可能な塩および溶媒和物は、吸入または通気（口または鼻のいずれかから）、または経口、頬側、非経口、局所、皮下、腹膜内、静脈内、胸膜内、眼球内、動脈内、または直腸投与による投与のために処方され得る。また、薬学的組成物が化合物の活性を増強する他の生成物とともに投与され得、必要に応じて他の治療成分を含み得ることも考えられる。
【０１６３】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、前糊化（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｓｅｄ）トウモロコシデンブン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムスターチ（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ））；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に受容可能な賦形剤を使用する従来の手段によって調製される形態（例えば錠剤またはカプセル）をとり得る。錠剤は当該技術分野で周知である方法で被覆され得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとり得るか、あるいは使用前に水または他の適したビヒクルを用いて構成する乾燥製品として存在してもよい。このような液体調製物は懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食性脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に受容可能な添加剤を使用する従来の手段によって調製され得る。この調製物はまた、適切に緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含み得る。
【０１６４】
経口投与の場合の調製物は、活性化合物を制御して放出させるように適切に処方され得る。
【０１６５】
頬側投与の場合には、この組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１６６】
吸入による投与の場合には、本発明による使用のための化合物は、適した噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスを使用する加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー形態で便宜的に送達される。加圧エアゾールの場合には、投薬量単位は、一定量を送達するバルブを備えることによって決定され得る。吸入器または通気器に使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルまたはカートリッジが、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基材との粉末状混合物を含むように処方され得る。
【０１６７】
この化合物は注射、例えば、ボーラス量注入（ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または連続注入による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方剤は、単位投薬形態、例えば添加された保存剤とともにアンプルまたは多用量容器に入れられ得る。この組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳化液のような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含んでいてもよい。また、活性成分は使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない無菌水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【０１６８】
この化合物はまた、例えば、ココア脂または他のグリセリドなどのような従来の座薬基剤を含む座薬または保持性浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａｓ）などの直腸用組成物として処方され得る。経口摂取はおそらく、いなかる投薬の中でも最も容易な方法である。このような投与経路は一般的に単純で簡単であり、しばしば、患者の視点からみて不便さまたは不快さが最も少ない投与経路である。しかしながら、これはタンパク質および他の生物学的活性組成物を含む多くの物質には好ましくない環境である胃に物質を通すことを伴う。胃の酸性、加水分解性およびタンパク質分解性である環境が、続く同化作用のためにタンパク性物質をアミノ酸およびオリゴペプチドへ消化することを効率的に進めるので、単に経口的に摂取した場合、広範囲に多様な生物学的活性タンパク性物質のうち、ほんのわずかのものが胃を通過して生き残り、小腸で体内に吸収されることは驚くべきことではない。その結果、多くのタンパク性薬剤はしばしば皮下、筋肉内または静脈内注射による非経口などの他の方法で摂取されなければならない。
【０１６９】
薬学的組成物はまた、薬剤活性を安定化するために、種々の緩衝剤（例えば、トリス、酢酸塩、リン酸塩）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ポリソルベート）、ヒト血清アルブミンなどのキャリア、保存剤（チメロサール、ベンジルアルコール）およびアスコルビン酸などの抗酸化剤を含み得る。安定化剤はＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤であり得る。ＥＢＰはまた、長期間にわたり、制御された送達を患者に行うための高分子化合物の微粒子調製物中に導入され得る。薬学的組成物中の成分のより大規模な検索は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ（版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９０）に見られる。
【０１７０】
先に記載した処方物に加えて、化合物はまたデポー調製物として処方され得る。このような長期作用処方剤は移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与されてもよい。したがって、例えば、化合物は適切な高分子または疎水性物質（例えば、受容可能な油中の乳化剤として）またはイオン交換樹脂とともに処方され得るか、または難溶解性誘導体として（例えば、難溶解性塩として）処方され得る。
【０１７１】
組成物は、所望であれば、活性成分を含む１つ以上の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスに入れられていてもよい。このパックは、例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチックの箔を含んでもよい。このパックまたはディスペンサーデバイスに投与のための指示書が添付されていてもよい。
【０１７２】
（診断薬）
標的遺伝子に関連した疾患症状を診断するために、種々の方法が使用され得る。具体的に、試薬が、例えば標的遺伝子変異の存在を検出するために、あるいは標的遺伝子ｍＲＮＡの過剰発現（ｏｖｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または過少な発現（ｕｎｄｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のいずれかを検出するために使用され得る。
【０１７３】
本発明の診断および予後判定の方法によれば、野生型標的遺伝子座の変化が検出される。さらに、この方法は、野生型標的遺伝子座を検出し、疾病素因または新形成の欠如を確認することによって実施され得る。「野生型遺伝子の変化」はコードおよび非コード領域における欠失、挿入および点変異を含む変異のすべての形態を包含する。欠失は全遺伝子または遺伝子の一部だけであってもよい。点変異は停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞性変異はある組織（例えば腫瘍組織）にだけ生じるものであり、生殖系列に遺伝されない。生殖系列変異は、体組織のいずれにも見出され、遺伝され得る。ただ１つの対立遺伝子が体細胞で変異されると、初期新形成状態が示される。しかし、両方の対立遺伝子が変異される場合、後期新形成状態が示され得る。したがって、遺伝子変異の発見は診断および予後の両方の情報を提供する。欠失されない標的遺伝子対立遺伝子（例えば、標的遺伝子欠失を有する染色体に対する姉妹染色体に見られる）は、挿入、小欠失および点変異などの他の変異のためにスクリーニングされ得る。腫瘍組織に見られる変異は、標的遺伝子産物の減少した発現に関連し得る。しかしながら、非機能的遺伝子産物をもたらす変異はまた、癌状態にも関連し得る。点変異事象は、ｍＲＮＡの発現の損失または減少をもたらす遺伝子のプロモーター中などの調節領域中で生じ得る。点変異はまた、標的遺伝子産物の発現の損失をもたらすか、あるいはｍＲＮＡの安定性または翻訳効率の減少をもたらす適切なＲＮＡプロセッシングを無効とし得る。
【０１７４】
候補遺伝子座中の変異を検出するために使用可能な１つの試験は、癌患者から得たゲノム標的配列をコントロール集団から得たものと直接に比較することである。また、例えばＰＣＲによっての増幅後、メッセンジャーＲＮＡを配列決定し、それによって候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要性を排除することができる。標的遺伝子のコード領域の外側に起こる（ｆａｌｌ）癌患者の変異は、標的遺伝子の近くまたはその中のイントロンおよび調節配列などの非コード領域を試験することにより検出され得る。非コード領域中の変異が重要であるとの初期指標は、コントロール個体と比較して癌患者での異常な大きさのまたは多量のメッセンジャーＲＮＡ分子を明らかにするノーザンブロット実験から判明し得る。
【０１７５】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの特異的遺伝子核酸または抗遺伝子抗体試薬を含むプレパッケージングされた診断キットを使用して実施され得る。これは、例えば、疾患症状を示すか、あるいは疾患が進展する危険性のある患者を診断する臨床設定において便宜的に使用され得る。
【０１７６】
遺伝子が発現されるいかなる細胞型または組織、好ましくは単球、内皮細胞または平滑筋細胞も、以下に記載される診断において使用され得る。
【０１７７】
分析される細胞型または組織から得たＤＮＡまたはＲＮＡは、当該技術分野で周知である方法を使用して容易に単離され得る。診断手法はまた、核酸精製が必要でないように、生検または切除から得た患者組織の組織切片（固定および／または凍結されている）上で、直接にインサイチュにて実施され得る。核酸試薬は、このようなインサイチュ手法のためのプローブおよび／またはプライマーとして使用され得る（例えば、Ｎｕｏｖｏ、ＰＣＲ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９２）を参照のこと）。
【０１７８】
遺伝子ヌクレオチド配列、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかは、例えば、疾患関連遺伝子構造および発現を検出するために生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用され得る。このようなアッセイとしては、サザンまたはノーザン分析、制限フラグメント長多型アッセイ、１本鎖コンホメーション多型分析、インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析が挙げられ得るが、これらに限定されない。このような分析は、遺伝子の発現パターンの定量的局面、ならびに遺伝子発現および／または遺伝子組成の定性的局面の両方を明らかにし得る。すなわち、このような局面としては、例えば、点変異、挿入、欠失、染色体再配置、および／または遺伝子発現の活性化または不活性化が挙げられ得る。
【０１７９】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、１つ以上の標識核酸試薬と、分析される細胞型または組織から獲得された核酸を、目的の核酸分子内の相補的配列への、これらの試薬の特異的なアニーリングに好ましい条件下で、接触およびインキュベートする工程を含み得る。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少なくとも９〜３０ヌクレオチドである。インキュベーション後、全てのアニールしない核酸は、核酸：フィンガープリント分子のハイブリッドから除去される。次いで、このような分子が存在する場合に、ハイブリダイズしたフィンガープリント組織由来の核酸の存在が検出される。このような検出スキームを使用して、目的の組織または細胞型由来の核酸は、例えば、固相支持体（例えば、膜）、またはプラスチック表面（例えば、マイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズ上の表面）に固定化され得る。この場合、インキュベーション後、アニールしない標識核酸試薬は容易に除去される。残りのアニールした標識核酸試薬の検出は、当業者に周知である標準的技術を使用して達成される。
【０１８０】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための代替の診断方法は、例えばＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）に記載の実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−９３（１９９１））、自己配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４−７８（１９９０））、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３−７７（１９８９））、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７（１９８８））、または任意の他の核酸増幅方法によるそれらの増幅、続く、当業者に周知の技術を使用する増幅された分子の検出を含み得る。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在する場合の、核酸分子の検出のために特に有用である。
【０１８１】
このような検出スキームの１つの実施形態において、ｃＤＮＡ分子が目的のＲＮＡ分子から（例えば、ｃＤＮＡへのＲＮＡ分子の逆転写によって）得られる。このようなＲＮＡが単離され得る細胞型または組織は、野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが公知であるいかなる組織も含み、単球、内皮細胞、および／または平滑筋が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、ｃＤＮＡ内の配列が、ＰＣＲ増幅反応などのような核酸増幅反応のための鋳型として使用される。この方法の逆転写および核酸増幅工程で合成開始試薬（例えば、プライマー）として使用される核酸試薬は、本明細書中に記載される遺伝子核酸試薬の中から選択され得る。このような核酸試薬の好ましい長さは少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。増幅産物の検出のために、核酸増幅は、放射標識または非放射標識したヌクレオチドを使用して実施され得る。あるいは、充分に増幅された産物が生成され得、その結果、この産物は、標準的エチジウムブロマイド染色によって、または任意の他の適した核酸染色方法を使用することにより可視化され得る。
【０１８２】
野生型または変異遺伝子ペプチドに対する抗体がまた、疾患診断薬および予後判定薬としても使用され得る。このような診断方法は、遺伝子タンパク質発現のレベルにおける異常、またはフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造および／または組織、細胞内、もしくは細胞下の位置における異常を検出するために使用され得る。構造的差異としては、例えば、正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質に対する変異体フィンガープリント遺伝子タンパク質の大きさ、電気陰性度、または抗原性の差異が挙げられ得る。
【０１８３】
分析される組織または細胞型から得たタンパク質は、当業者に周知の技術（ウエスタンブロット分析を含むがこれに限定されない）を使用して容易に検出または単離され得る。ウエスタンブロット分析を実施するための方法の詳細な説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前出、１８章を参照のこと。本明細書で使用されるタンパク質の検出および単離方法はまた、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））に記載されるような方法であり得る。
【０１８４】
野生型または変異体遺伝子ペプチド分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、フィンガープリント遺伝子ペプチドが抗フィンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体との相互作用によって検出されるイムノアッセイを含み得る。
【０１８５】
例えば、本発明において有用な抗体、または抗体のフラグメントは、野生型または変異体遺伝子ペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために使用され得る。これは、例えば光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、または蛍光検出と組み合わせて蛍光標識抗体（以下を参照）を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。このような技術は、フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面上で発現される場合に、特に好ましい。
【０１８６】
本発明において有用な抗体（またはそのフラグメント）はさらに、フィンガープリント遺伝子ペプチドのインサイチュ検出のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法におけるように、組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的検体を取り出し、そしてその検体に本発明の標識抗体を適用することによって達成され得る。抗体（またはフラグメント）は、好ましくは生物学的サンプルの上に標識抗体（またはフラグメント）を重ねることにより適用される。このような手順の使用を通じて、フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在だけでなく、試験された組織における分布をも決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、広範囲の組織学的方法（例えば、染色手順）のいずれかが、このようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることを容易に理解する。
【０１８７】
野生型、変異体または伸長したフィンガープリント遺伝子ペプチドのためのイムノアッセイは、代表的に、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、生物学的流体、組織抽出物、新たに収集した細胞、または組織培養物中でインキュベートされた細胞のような生物学的サンプルをインキュベートする工程、および当該技術分野で周知の多くの技術のいずれかによって、結合した抗体を検出する工程を含む。
【０１８８】
生物学的サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体もしくはキャリア、または細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定し得る他の固相支持体と接触され、そしてその上に固定化され得る。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で洗浄され、続いて、検出可能に標識された遺伝子特異的抗体を使用して処理され得る。次いで、固相支持体は、緩衝液で２回目の洗浄をされ、未結合抗体を除去し得る。次いで、固相支持体上の結合標識の量が、従来の手段により検出され得る。
【０１８９】
用語「固相支持体またはキャリア」は、抗原または抗体に結合し得る任意の支持体を含むことを意図する。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であるか不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合した分子が抗原または抗体に結合し得る限り、実質的に任意の可能性のある構造的配置を有し得る。したがって、支持体の配置は、ビーズのような球状、または試験管の内側表面または棒状体の外表面のような円筒状であり得る。あるいは、表面は、シート、試験片などのように平らであり得る。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適切なキャリアを知っているか、または、慣用的な実験を使用することにより適切なキャリアを確証し得る。
【０１９０】
所定の組の（ａ  ｇｉｖｅｎ  ｌｏｔ  ｏｆ）抗野生型または抗変異体のフィンガープリント遺伝子ペプチド抗体の結合活性は、周知の方法に従って決定され得る。当業者は、慣用的な実験を使用することにより、各々の決定のための操作的および最適なアッセイ条件を決定し得る。
【０１９１】
遺伝子ペプチド特異的抗体が検出可能に標識され得る方法の１つは、酵素に当該抗体を連結し、そして酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）にこれを使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ｒｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ，８：２８９−９８（１９７８）［“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７，１９７８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．］；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１：５０７−２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ（編），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａら（編），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｉｇａｋｕ−Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度定量法、蛍光定量法によるか、あるいは可視的手段によって検出され得る化学部分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは、発色基質）と反応する。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出は酵素の発色基質を使用する比色方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準に対する基質の酵素反応の程度を可視的に比較することにより達成され得る。
【０１９２】
検出はまた、任意の種々の他のイムノアッセイを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通して、フィンガープリント遺伝子の野生型、変異体、または伸長したペプチドを検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照のこと）。放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【０１９３】
蛍光化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体は、適切な波長の光に暴露される場合、その存在が、蛍光によって検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
【０１９４】
抗体はまた、１５２Ｅｕのような蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して抗体に結合され得る。
【０１９５】
抗体はまた、化学発光化合物に結合することにより検出可能に標識され得る。次いで、化学発光でタグ化された抗体の存在が、化学反応の過程の間に発生する発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルである。
【０１９６】
同様に、生物発光化合物が、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学系において見出された化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識目的のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１９７】
本願中、種々の刊行物、特許および公開特許出願は、確認のための引例として参照される。本願で参照されるこれらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、ここで、本発明が関連する分野の状況をより完全に記載するために、本開示中に参考として援用される。
【０１９８】
以下の実施例は、本発明を説明することのみを意図され、本発明を限定するように解釈されるべきでない。
【０１９９】
（実施例）
（実施例１：アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
アナフィラトキシンＣ３ａレセプターの役割を調査するために、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中の破壊を、相同組換えにより作製した。詳細には、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より詳細には、図２Ａ〜図２Ｂに示されるように、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子（詳細には、配列番号１を含む）を破壊または改変する能力を有するアナフィラトキシンＣ３ａレセプター特異的標的化構築物を、本明細書中で配列番号３または配列番号４と同定されるオリゴヌクレオチド配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０２００】
この標的化構築物を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系に由来するＥＳ細胞に導入し、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製し、そしてＦ２ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。
【０２０１】
アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化および発現パターンについて分析した。核レセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を決定した。ホモ接合マウスは、以下の表現型の少なくとも１つを示した：
胸腺。野生型マウスと比較して減少したサイズおよび減少した重量の胸腺を含む、変異マウスの胸腺における異常。詳細には、ホモ接合マウスは、図３および以下の表１に示されるように、野生型マウスと比較して、剖検における小さい胸腺、ならびに減少した胸腺重量および減少した胸腺対体重比を有することが報告された：
【０２０２】
【表１】
2004524002.tif 000002
発現。総ＲＮＡを、成体Ｃ５７Ｂ１／６野生型マウス由来の器官または組織から単離した。ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ処理し、そしてランダムプライマーを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、転写されないゲノムマウスＤＮＡに特異的なプライマーを使用して、ゲノムの混入の非存在について調べた。ｃＤＮＡを、ＨＰＲＴプライマーを使用して濃度について平均化した。ＲＮＡ転写物は、大脳、皮質、皮質下領域、小脳、脳幹、嗅球、脊髄、眼、ハルダー腺、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、皮膚、膀胱、下垂体、副腎、唾液腺、骨格筋、舌、胃、小腸、大腸、盲腸、精巣、精巣上体、精嚢、凝固腺（ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ  ｇｌａｎｄ）、前立腺、卵巣、子宮および脂肪組織（ｗｈｉｔｅ  ｆａｔ）において検出可能であった。ＲＮＡ転写物は、胆嚢において検出可能ではなかった。
【０２０３】
（挙動）
挙動研究について、ホモ接合マウスを以下の通りに作製した：
上記の標的化構築物を、１２９／ＳｖＥｖマウス亜系由来のＥＳ細胞に導入して、キメラマウスを作製する。Ｆ１Ｎ０マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製した。Ｆ２Ｎ０ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。Ｆ１Ｎ０ヘテロ接合体を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配して、Ｆ１Ｎ１ヘテロ接合体を作製した。Ｆ２Ｎ１ホモ接合マウスを、Ｆ１Ｎ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。
【０２０４】
ホモ接合マウスは、以下の挙動表現型を示した：
ホモ接合マウスは、特徴的な発作様応答（発作に対して増加した感受性を示す）を誘発するために、有意により少ない用量のメトラゾール（ｍｅｔｒａｚｏｌ）を必要とした。ホモ接合変異体はまた、９０ｄＢの前パルスを有する有意に減少したＰＰＩ（分裂病患者において観察されるのと同様な刺激処理欠損を示す）を示した。
【０２０５】
（実施例２：５−ＨＴ５Ａ遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
５−ＨＴ５Ａ遺伝子の役割を調査するために、５−ＨＴ５Ａ遺伝子中の破壊を、相同組換えによって生成した。詳細には、５−ＨＴ５Ａ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より詳細には、図５Ａ〜図５Ｂに示されるように、５−ＨＴ５Ａ遺伝子（詳細には、配列番号５を含む）を破壊または改変する能力を有する５−ＨＴ５Ａ特異的標的化構築物を、本明細書中で配列番号７または配列番号８と同定されるオリゴヌクレオチド配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０２０６】
この標的化構築物を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系に由来するＥＳ細胞に導入し、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製し、そしてＦ２ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。
【０２０７】
５−ＨＴ５Ａ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型変化および発現パターンについて分析した。
【０２０８】
発現。ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）発現は、脳および食道において検出可能であった。脳において、染色は、プルキンエ細胞を有する小脳および発現を示す顆粒層の核に限定された。ホールマウント（ｗｈｏｌｅｍｏｕｎｔ）染色において、ｌａｃＺ発現は、小脳のみで検出可能であった。小脳の冠状切片は、Ｘ−Ｇａｌシグナルが、プルキンエ細胞層に限定されたことを明らかにした。さらに、プルキンエ細胞に隣接した別の核は、染色を示した。強いＸ−ｇａｌシグナルがまた、扁平上皮細胞に存在した。
【０２０９】
（実施例３：コーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
コーディンの役割を調査するために、コーディン遺伝子中の破壊を、相同組換えにより作製した。詳細には、コーディン遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より詳細には、図５Ａ〜図５Ｂに示されるように、コーディン遺伝子（詳細には、配列番号９を含む）を破壊または改変する能力を有するコーディン特異的標的化構築物を、本明細書中で配列番号１１または配列番号１２と同定されるオリゴヌクレオチド配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０２１０】
この標的化構築物を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系に由来するＥＳ細胞に導入し、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製し、そしてＦ２ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。
【０２１１】
コーディン遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化および発現パターンについて分析した。コーディン遺伝子中の破壊に関連する表現型を決定した。ホモ接合マウスは、以下の表現型の少なくとも１つを示した：異常な痛覚、疼痛および不安に対する減少した応答。
【０２１２】
発現。総ＲＮＡを、成体Ｃ５７Ｂ１／６野生型マウス由来の器官または組織から単離した。ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ処理し、そしてランダムプライマーを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、転写されないゲノムマウスＤＮＡに特異的なプライマーを使用して、ゲノムの混入の非存在について調べた。ｃＤＮＡを、ＨＰＲＴプライマーを使用して濃度について平均化した。ＲＮＡ転写物は、大脳、皮質、皮質下領域、小脳、脳幹、眼、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、皮膚、胆嚢、膀胱、下垂体、副腎、唾液腺、舌、胃、大腸、盲腸、精巣、精巣上体、精嚢、凝固腺、前立腺、卵巣、および子宮において検出可能であった。
【０２１３】
（挙動）
挙動研究について、ホモ接合マウスを以下の通りに作製した：
上記の標的化構築物を、１２９／ＳｖＥｖマウス亜系由来のＥＳ細胞に導入して、キメラマウスを作製した。Ｆ１Ｎ０マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製した。Ｆ２Ｎ０ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。Ｆ１Ｎ０ヘテロ接合体を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配して、Ｆ１Ｎ１ヘテロ接合体を作製した。Ｆ２Ｎ１ホモ接合マウスを、Ｆ１Ｎ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。
【０２１４】
ホモ接合マウスは、以下の挙動表現型を示した：
Ｆ２Ｎ０ホモ接合変異マウスは、ホットプレート試験に対するそれらの応答潜伏時間において、野生型動物と比較して、統計的に有意な増加を示した。ホモ接合マウスは、Ｆ２Ｎ０野生型マウスと比較して、５５℃のホットプレート上に配置される場合に、その後足をなめるまでの時間量において、統計学的に有意な増加を示した。しかし、Ｎ１世代の動物は、いずれの差異も示さなかった。この試験を使用して、侵害障害（すなわち、減少した疼痛応答）を示した。
【０２１５】
Ｎ０およびＮ１世代の両方由来のホモ接合変異動物は、オープンフィールド試験チャンバーの中央領域においてより多くの時間を過ごす傾向を示した。この試験は、不安障害を示し得る。
【０２１６】
（実施例４：ＲＯＲγ遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
ＲＯＲγの役割を調査するために、ＲＯＲγ遺伝子中の破壊を、相同組換えにより作製した。詳細には、ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より詳細には、図９Ａ〜図９Ｂに示されるように、ＲＯＲγ遺伝子（詳細には、配列番号１３を含む）を破壊または改変する能力を有するＲＯＲγ特異的標的化構築物を、本明細書中で配列番号１５または配列番号１６と同定されるオリゴヌクレオチド配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０２１７】
この標的化構築物を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系に由来するＥＳ細胞に導入し、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製し、そしてＦ２ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。
【０２１８】
ＲＯＲγ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化および発現パターンについて分析した。核レセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を決定した。ホモ接合マウスは、以下の表現型の少なくとも１つを示した：
リンパ節。リンパ節は、全ての雌のホモ接合マウスにおいて存在しなかった。さらに、消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）は、全てのホモ接合変異体由来の腸の慣用的な切片において存在しなかった。
【０２１９】
リンパ球。野生型マウスと比較して、最小から中程度のリンパ球の蓄積が、変異マウスにおける種々の組織（肝臓、肺、膵臓、唾液腺および甲状腺）において存在した。ホモ接合変異マウスは、リンパ腫と一致したリンパ様浸潤を有する多数の器官を有した。この浸潤は、中程度から重篤まで変化し、そして任意の器官系を含み得る。これらの細胞は、増加した有糸分裂速度および頻繁なアポトーシスを有した。併発は、脾臓および胸腺において最も重篤である傾向がある。関与する他の器官としては、以下が挙げられる：肝臓、胆嚢、肺、腎臓、膀胱、心臓、大動脈、骨、骨髄、下垂体、副腎、胸腺、脳および脊髄（髄膜）、膵臓、胃、小腸および大腸、喉頭、気管、食道、舌、骨格筋、精巣、精巣上体、膀胱、精嚢、眼およびハルダー腺。
【０２２０】
２匹の臨床的に病気のホモ接合体の雌（２０７７４および２０２９９）ならびに２匹の臨床的に病気のホモ接合体の雄（１９９２２および２０２９４）は、リンパ球が優勢である非常に上昇した総白血球数を有した。１つの白血病の雌２０７７４において、リンパ球は、未成熟であった（芽細胞性）。これは、リンパ腫の白血病期と一致する。罹患したマウスホモ接合体は、乏しい毛づくろいおよび機能低下を含む病気の徴候を示した。このマウスは、増大した胸部および腹部の寸法、肝脾腫大、拡大した胸腺、および腹水を有した；これらは、弱く、斜視のようであり、背が丸く、悪液性、嗜眠性であり、そして呼吸に障害があった。
【０２２１】
脾臓。以下の表２および図１０において示されるように、全てのホモ接合変異体において、野生型マウスと比較して増加した体重および増加した脾臓：体重の比を含む脾臓における異常が検出された。これらは、平均して、ホモ接合体の雌の０．６１パーセントに対して野生型コントロールの雌の０．４パーセント、およびホモ接合変異体の雄の０．５２パーセントに対して野生型コントロールの雄の０．２６パーセントであった。６８〜１８９日における脾臓重量および脾臓：体重比は、野生型マウスにおけるよりも約５倍大きかった。
【０２２２】
脾臓リンパ様小胞は、胚中心の増加した数のリンパ球（過形成）によって拡大され、そしておよびホモ接合マウス中の小胞の縁領域で拡大された。
【０２２３】
【表２】
2004524002.tif 000003
肝臓。変異体マウスにおいて、野生型マウスと比較して増加したサイズ、体重、および変色を含む肝臓における異常が検出された。肝臓重量および肝臓：体重比は、野生型コントロールマウスにおけるよりも約２倍大きかった（表２および図１１）。
【０２２４】
腎臓。変異体マウスにおいて、野生型マウスと比較して増加したサイズ、体重、および変色を含む腎臓における異常が検出された。腎臓：体重比は、野生型コントロールマウスにおけるよりも約１．５倍大きかった（表２および図１２）。
【０２２５】
胸腺。胸腺における異常が検出された。胸腺重量および胸腺：体重比は、野生型コントロールマウスにおけるよりも約１０〜３０倍大きかった（表１および図１３）。皮質内側の特徴の減少を有する中程度の胸腺萎縮症が存在した。さらに、胸腺皮質拡大（過形成）および関連した延髄減少（萎縮症）が、全てのホモ接合マウスにおいて観察された。胸腺皮質リンパ球は、増加した有糸分裂活性およびアポトーシスを有する過形成性であった。
【０２２６】
骨および骨髄。骨および骨髄における異常が、６８〜１８９日において検出された。骨髄は、蒼白であり、そして骨は、白い塊が付着し脆性であった。
【０２２７】
体重。雄のホモ接合マウスの体重は、野生型コントロールマウスの体重の約６０％であった。野生型コントロールマウス対雌のホモ接合変異マウスの体重における差異は、存在しなかった。全体の観察は、いくつかのマウスについて不完全であった。
【０２２８】
血清化学。臨床的に病気のホモ接合マウスは、野生型マウスと比較した場合、種々の分析物の上昇を有した。以下を含む複数の肝臓関連分析物を評価した：全４匹の雄および３匹の雌のうちの２匹におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＰ）；２匹の雄におけるビリルビン；ならびに１匹の雄におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、別の肝臓関連分析物は、４匹の雄および２匹の雌において上昇した。これらの種々の上昇は、肝臓の腫瘍細胞浸潤と一致している。心臓の腫瘍細胞浸潤もまた、ＡＬＴ上昇に寄与し得た。腎臓関連分析物もまた、上昇した。３匹の雄が、上昇した血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびリン酸レベルを有した。これは、おそらく、腎臓および／または腎盤の腫瘍細胞浸潤に関係している。
【０２２９】
発現。総ＲＮＡを、成体Ｃ５７Ｂ１／６野生型マウス由来の器官または組織から単離した。ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ処理し、そしてランダムプライマーを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、転写されないゲノムマウスＤＮＡに特異的なプライマーを使用して、ゲノムの混入の非存在について調べた。ｃＤＮＡを、ＨＰＲＴプライマーを使用して濃度について平均化した。ＲＮＡ転写物は、小脳、嗅球、眼、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、胸腺、リンパ節、皮膚、胆嚢、膀胱、下垂体、副腎、唾液腺、骨格筋、舌、胃、小腸、大腸、盲腸、精巣、精巣上体、精嚢、凝固腺、前立腺、卵巣、および子宮において検出可能であった。
【０２３０】
（実施例５：ＢＭＰ遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
ＢＭＰの役割を調査するために、ＢＭＰ遺伝子中の破壊を、相同組換えにより作製した。詳細には、ＢＭＰ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より詳細には、図１５Ａ〜図１５Ｂに示されるように、ＢＭＰ遺伝子（詳細には、配列番号１７を含む）を破壊または改変する能力を有するＢＭＰ特異的標的化構築物を、本明細書中で配列番号１９または配列番号２０と同定されるオリゴヌクレオチド配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０２３１】
この標的化構築物を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系に由来するＥＳ細胞に導入し、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製し、そしてＦ２ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。
【０２３２】
ＢＭＰ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化について分析した。核レセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を決定した。ホモ接合マウスは、以下の表現型の少なくとも１つを示した：
１）異常な尾：
４９日目に、年齢および性が一致した野生型コントロールマウスと比較した場合、調査した９匹のホモ接合マウスのうち５匹（２匹の雌（１０７９６、１０７９９）および３匹の雄（１０８２９、１９４７８、１９４７９））が異常な尾を有した。
【０２３３】
３００日目（実際３０３〜４５０日齢）に、年齢および性が一致した野生型コントロールマウスと比較した場合、９匹のホモ接合変異マウスのうち１匹の雄（１０８２７）が異常な尾を有した。
【０２３４】
２）体重：
４９、９０、１８０、および３００日齢で、低い体重の傾向のホモ接合変異体の雄および雌。
【０２３５】
４９、９０、１８０、および３００日齢で、低い体重／体長比の傾向のホモ接合変異体の雄および雌。
【０２３６】
３）短い体長：
４９、９０、１８０、および３００日齢のホモ接合変異体の雄および雌。
【０２３７】
より詳細には、年齢（４９、９０、１８０、および３００日齢）および性の一致した野生型コントロールマウスと比較した場合、ホモ接合変異マウスは、全ての時点において、３つ全てのパラメーター（体重、体長、および体重／体長比）について低い値を有した。一般的に、ホモ接合変異体と一致した野生型コントロールマウスとの間の差異は、雌についてよりも雄について大きかった。体重および体重／体長比は、１８０日齢後のホモ接合変異体の雄について減少した。各々の３つのパラメーターについて、野生型コントロールの雄とホモ接合変異体の雄との間の差異の大きさは、３００日齢で最大であった。
【０２３８】
（実施例６：気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
気道トリプシン様プロテアーゼの役割を調査するために、気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子中の破壊を、相同組換えにより作製した。詳細には、気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より詳細には、図１７Ａ〜図１７Ｂに示されるように、気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子（詳細には、配列番号２１を含む）を破壊または改変する能力を有する気道トリプシン様プロテアーゼ特異的標的化構築物を、本明細書中で配列番号２２または配列番号２４と同定されるオリゴヌクレオチド配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０２３９】
この標的化構築物を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系に由来するＥＳ細胞に導入し、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製し、そしてＦ２ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化について分析した。
【０２４０】
（実施例７：アクアポリン−８遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
アクアポリン−８遺伝子の役割を調査するために、アクアポリン−８遺伝子中の破壊を、相同組換えにより作製した。詳細には、アクアポリン−８遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より詳細には、図１９Ａ〜図１９Ｂに示されるように、アクアポリン−８遺伝子（詳細には、配列番号２５を含む）を破壊または改変する能力を有するアクアポリン−８特異的標的化構築物を、本明細書中で配列番号２７または配列番号２８と同定されるオリゴヌクレオチド配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０２４１】
この標的化構築物を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系に由来するＥＳ細胞に導入し、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と交配することによって作製し、そしてＦ２ホモ接合変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することによって作製した。
【０２４２】
アクアポリン−８遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化および発現パターンについて分析した。核レセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を決定した。ホモ接合マウスは、以下の表現型の少なくとも１つを示した：
体重。ホモ接合変異体の雄は、９０日齢後の野生型コントロールマウスよりもより体重が重い傾向を有する。
【０２４３】
発現。総ＲＮＡを、成体Ｃ５７Ｂ１／６野生型マウス由来の器官または組織から単離した。ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ処理し、そしてランダムプライマーを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、転写されないゲノムマウスＤＮＡに特異的なプライマーを使用して、ゲノムの混入の非存在について調べた。ｃＤＮＡを、ＨＰＲＴプライマーを使用して濃度について平均化した。ＲＮＡ転写物は、眼、肝臓、膵臓、胸腺、胆嚢、胃、大腸、盲腸、精巣、精嚢、卵巣、および子宮において検出可能であった。
【０２４４】
当業者に明らかなように、上の実施形態の種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行なわれ得る。これらの改変およびバリエーションは、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、オーファンアナフィラトキシンＣ３ａレセプターのポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。図１はまた、アナフィラトキシンＣ３ａレセプターのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。図２Ｂはまた、アナフィラトキシンＣ３ａレセプター標的化構築物において標的化アーム（相同配列）として用いられた、配列番号３および配列番号４として同定される配列を示す。
【図３】
図３は、野生型マウスならびにアナフィラトキシンＣ３ａレセプター遺伝子における破壊を有するヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスの胸腺重量および体重の比に関するグラフを示す。
【図４】
図４は、５−ＨＴ５Ａ遺伝子のポリヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。図４はまた、５−ＨＴ５Ａ遺伝子についてのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図５Ａ】
図５Ａは、５−ＨＴ５Ａ遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、５−ＨＴ５Ａ遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。図５Ｂはまた、５−ＨＴ５Ａ標的化構築物において標的化アーム（相同配列）として用いられた、配列番号７および配列番号８として同定される配列を示す。
【図６】
図６は、オーファンコルディンのポリヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。図６はまた、コルディンポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図７Ａ】
図７Ａは、コルディン遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、コルディン遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。図７Ｂはまた、コルディン標的化構築物において標的化アーム（相同配列）として用いられた、配列番号１１および配列番号１２として同定される配列を示す。
【図８】
図８は、オーファンＲＯＲγのポリヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。図８はまた、ＲＯＲγのアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図９Ａ】
図９Ａは、ＲＯＲγ遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、ＲＯＲγ遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。図９Ｂはまた、ＲＯＲγ標的化構築物において標的化アーム（相同配列）として用いられた、配列番号１５および配列番号１６として同定される配列を示す。
【図１０】
図１０は、野生型マウスならびにＲＯＲγ遺伝子における破壊を有するヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスの脾臓重量および体重の比に関するグラフを示す。
【図１１】
図１１は、野生型マウスならびに破壊を有するヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスの肝臓重量および体重の比に関するグラフを示す。
【図１２】
図１２は、野生型マウスならびにＲＯＲγ遺伝子における破壊を有するヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスの腎臓重量および体重の比に関するグラフを示す。
【図１３】
図１３は、野生型マウスならびにＲＯＲγ遺伝子における破壊を有するヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスの胸腺重量および体重の比に関するグラフを示す。
【図１４】
図１４は、ＢＭＰ遺伝子のポリヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。図１４はまた、ＢＭＰポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図１５Ａ】
図１５Ａは、ＢＭＰ遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。
【図１５Ｂ】
図１５Ｂは、ＢＭＰ遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。図１５Ｂはまた、ＢＭＰ標的化構築物において標的化アーム（相同配列）として用いられた、配列番号１９および配列番号２０として同定される配列を示す。
【図１６】
図１６は、オーファン気道トリプシン様プロテアーゼのポリヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。図１６はまた、この気道トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。
【図１７Ａ】
図１７Ａは、気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。
【図１７Ｂ】
図１７Ｂは、気道トリプシン様プロテアーゼ遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。図１７Ｂはまた、気道トリプシン様プロテアーゼ標的化構築物において標的化アーム（相同配列）として用いられた、配列番号２３および配列番号２４として同定される配列を示す。
【図１８】
図１８は、アクアポリン８のポリヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。図１８はまた、アクアポリン８のアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。
【図１９Ａ】
図１９Ａは、アクアポリン８遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。
【図１９Ｂ】
図１９Ｂは、アクアポリン８遺伝子を破壊するために用いられる標的化構築物の設計を示す。図１９Ｂはまた、アクアポリン８標的化構築物において標的化アーム（相同配列）として用いられた、配列番号２７および配列番号２８として同定される配列を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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