(57)【要約】【課題】本発明の目的は、標的蛋白質に選択的に結合して切断出来る合成触媒を提供することにある。また、本発明の他の目的は、該合成触媒を用いて標的蛋白質を選択的に切断する方法を提供することにある。【解決手段】標的蛋白質を選択的に切断する能力を有する、下記一般式（Ａ）(Ｒ)(Ｚ)ｎ                            （Ａ）（式中、ｎは１以上の整数を示し、Ｒは標的蛋白質を選択的に認識して結合出来る物質、例えば、酵素の阻害剤や受容体の拮抗剤を示し、Ｚは金属イオン−リガンド錯体を示す。）で表される合成触媒、及び該合成触媒を用いることを特徴とする、標的蛋白質を選択的に切断する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的蛋白質を選択的に切断する能力を有する、下記一般式（Ａ）
(Ｒ)(Ｚ)ｎ                            （Ａ）
（式中、ｎは１以上の整数を示し、Ｒは標的蛋白質を選択的に認識して結合出来る物質を示し、Ｚは金属イオン−リガンド錯体を示す。）
で表される合成触媒。
【請求項２】
リガンドが環状又は非環状であり、リガンド内に含まれる金属配位原子中の１〜４個が窒素原子である請求項１に記載の合成触媒。
【請求項３】
リガンドの骨格が下記からなる群より選ばれた１種以上である請求項１又は２に記載の合成触媒。
【化１】
2004529763.tif 000023
【請求項４】
金属イオンがＮｉ（II）、Ｃｕ（II）、Ｚｎ（II）、Ｐｄ（II）、Ｃｒ（III）、Ｆｅ（III）、Ｃｏ（III）、Ｒｈ（III）、Ｉｒ（III）、Ｒｕ（III）、Ｐt（IV）、Ｚｒ（IV）、及びＨｆ（IV）からなる群より選ばれた１種以上である請求項１に記載の合成触媒。
【請求項５】
ＲとＺが互いにリンカーによって連結されている、請求項１に記載の合成触媒。
【請求項６】
リンカーがアルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル,スルフヒドリル及び／又はチオエーテル基といった官能基や、アミド、イミド、エステル及び／又はチオエステルといった誘導体に属する、１〜３０個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び／又は硫黄原子からなる骨格を有する主鎖を含むものである、請求項５に記載の合成触媒。
【請求項７】
リンカーがそれぞれアルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル、スルフヒドリル及び／又はチオエーテルといった官能基や、酸、アミド、イミド、エステル及び／又はチオエステルといった誘導体に属する、１〜３０個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び／又は硫黄原子からなる骨格を有する側鎖を含むものである、請求項５に記載の合成触媒。
【請求項８】
請求項１に記載の合成触媒を用いることを特徴とする、標的蛋白質を選択的に切断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白質の混合物中から特定蛋白質のみを選択的に認識して切断出来る合成触媒及びこれを利用して特定蛋白質を選択的に切断する方法に関するものである。特定蛋白質を選択的に切断することによって蛋白質の生理活性を選択的に抑制することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質は生体内で様々な生理的な機能を担っている。特に、酵素と受容体は疾患に係わる機能を担当する場合が多いため、酵素と受容体の機能を抑制する分子は医薬品として使われることがある。酵素の場合には、阻害剤が酵素の活性部位を可逆的に封鎖して酵素機能を抑制し、受容体の場合は、拮抗剤が可逆的に結合することにより受容体の機能を低下させる（非特許文献１）。自殺阻害剤は、酵素の活性部位に共有結合により結合して酵素の活性を阻害する。狂牛病に対するプリオンやアルツハイマー病に対するアミロイドで例示されるように、多くの毒性蛋白質は深刻な健康上の問題を誘発させる。毒性蛋白質に対し、その蛋白質の骨格を特異的に切断出来る合成分子は効果的な医薬として使われ得るが、このような分子については未だ報告された例がない。
【０００３】
このような阻害剤又は拮抗剤を酵素又は受容体に加える時、活性を持った蛋白質の濃度が減少する程度を簡単な数式で表すと以下の通りである。
【０００４】
【化２】
2004529763.tif 000002
【０００５】
（式中、Ｐは活性を持った蛋白質を示し、Ｌは阻害剤又は拮抗剤を示す。）
前記式（１）は単純な阻害剤又は拮抗剤に関するものであり、式（２）は自殺阻害剤に関するものである。
【０００６】
活性を持った蛋白質の濃度（［Ｐ］）が全体蛋白質の濃度（［Ｐ］ｏ）の半分になるＬの全体濃度（［Ｌ］＋［ＰＬ］＋［ＰＬ’］）をＬ５０と表現すれば、Ｌ５０は式（１）の場合には（ＫＬ＋０．５［Ｐ］ｏ）となる。即ち、一般的な阻害剤や拮抗剤の場合には、ＫＬが小さいほどＬ５０は小さくなるものの、０．５［Ｐ］ｏより小さくはならない。式（２）の場合には、Ｌ５０は０．５［Ｐ］ｏであるが、ＫＬが小さいほど、又はＫｓｉが大きいほどＬの濃度を半分の水準に減少させるのにかかる時間が短くなる。Ｌ５０が小さいほど阻害剤や拮抗剤を医薬品として使用するには効果的である。しかしながら、いくら優れた阻害剤や拮抗剤であっても、当量より多い量の蛋白質の生理活性を阻害することは出来ない。
【０００７】
ある種の金属錯体は蛋白質を切断する能力を有していることが知られている。例えば、Ｃｕ（II）とシクレン（ｃｙｃｌｅｎ）、Ｃｕ（II）と１，４，７−トリアザノナン、Ｃｕ（II）とトレン（ｔｒｅｎ）、Ｐｄ（II）とエチレンジアミン、Ｆｅ（III）又はＣｏ（III）と配位高分子二重膜（coordinatively polymerized  bilayer membranes）間に形成された錯体が蛋白質のペプチド結合を加水分解する能力を有していると報告されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７）。また、コバルト（III）に配位されたアミドがコバルト（III）イオンによって加水分解されることも知られている（非特許文献８）。しかしながら、金属の錯体が特定蛋白質を選択的に攻撃して切断した例は今まで報告された例がない。
【０００８】
【非特許文献１】
Medicinal Chemistry, 2nd Ed., Ganellin, C. R.; Roberts, S. M. Ed.; Academic Press: London, 1993
【非特許文献２】
Zhu, L.; Qin, L.; Parac, T. N.; Ｋｏstic, N. M. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 5218
【非特許文献３】
Hegg, E. L.; Burstyn, J. N. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 7015
【非特許文献４】
Suh, J.; Oh, S. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 1067
【非特許文献５】
Jang, B.-B.; Lee, K. P.; Min, D. H.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12008
【非特許文献６】
Moon, S.-J.; Jeon, J. W.; Kim, H.; Suh, M. P.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 7742
【非特許文献７】
Suh, J.; Moon, S.-J. Inorg. Chem. 2001, 40, 4890
【非特許文献８】
Sutton, D. A.; Buckingham, D. A. Acc. Chem. Res. 1987, 20, 357
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、標的蛋白質に選択的に結合して切断出来る合成触媒を提供することにある。また、本発明の他の目的は、該合成触媒を用いて標的蛋白質を選択的に切断する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前述のように、阻害剤や拮抗剤はどんなに性能が素晴らしくても当量より多い量の標的蛋白質の生理活性を阻害することは出来ない。また、毒性蛋白質を特異的に切断する合成触媒は知られていない。従って、本発明者らは阻害剤又は拮抗剤として作用する医薬品が有する、このような基本的な限界を克服し、毒性蛋白質を特異的に切断する合成触媒を創出するために鋭意研究を行った結果、下記一般式（Ａ）
(Ｒ)(Ｚ)ｎ                              （Ａ）
（式中、ｎは１以上の整数を示し、Ｒは標的蛋白質を選択的に認識して結合出来る物質、例えば、酵素の阻害剤や受容体の拮抗剤を示し、Ｚは金属イオン−リガンド錯体を示す。）
で表される合成触媒を創出することに成功した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に係る一般式（Ａ）で表される合成触媒について、以下に詳細に説明する。
本発明の合成触媒は標的蛋白質を認識する部位である、基Ｒを持っており、この部位は標的蛋白質と選択的に結合して錯体を形成することが出来る。このように認識部位と標的蛋白質との間に結合が形成された後、金属イオン−リガンド錯体で構成された反応部位（Ｚ）が標的蛋白質のペプチド結合を切断することになる。切断された蛋白質は新しい高次構造に迅速に変わり、触媒を結合する能力が低くなり、これに伴って触媒は切断された蛋白質から分離され再生されることによって、他の標的蛋白質の切断に再び使用することが出来る。従って、標的蛋白質と合成触媒が結合する能力が強くなくても、時間を充分にかければ相当量の標的蛋白質が切断され、蛋白質の活性を充分に抑制することが出来る。
【００１２】
本発明に係る合成触媒が蛋白質の活性を阻害する機序はミカエリス・メンテンの式に類似の下記式（４）により簡単に表すことが出来る。
【００１３】
【化３】
2004529763.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｐは前記と同義であり、Ｃは本発明に係る一般式（Ａ）の合成触媒を示し、Ｐ’は切断された新しい蛋白質を示し、Ｋｃはミカエリス定数に対応する定数である。）
【００１５】
前記式（４）から分かるように、合成触媒（Ｃ）は活性蛋白質（Ｐ）と結合して錯体（ＰＣ）を形成した後、蛋白質を切断して新しい蛋白質（Ｐ’）を生成すると同時に自らを再生させる。この場合、標的蛋白質（Ｐ）の半分を切断し、その生理活性を抑制するのに必要な触媒の量に何らの制限はない。標的蛋白質の活性を一定水準まで阻害するのに必要とする時間を長くするほど少量の触媒を使用することが出来る。合成触媒が標的蛋白質と錯体（ＰＣ）を強く形成するほどＫｃは小さくなり、Ｋｃが小さくなるかｋｐｃが大きくなるほど蛋白質切断速度は速くなる。
【００１６】
本発明に係る合成触媒の認識部位Ｒとしては、使用する標的蛋白質を選択的に認識し、結合出来る全ての物質が使用可能である。標的蛋白質についての過去に蓄積されたデータから既存の構造を選択しても良いし、新しい構造をデザインすることも出来る。
【００１７】
例えば、蛋白質が酵素である場合、その酵素の活性を阻害する公知の阻害剤を使用することが出来、蛋白質が受容体である場合、その受容体に結合する公知の拮抗剤を使用することが出来る。即ち、阻害剤或いは拮抗剤に対する情報が知られている標的蛋白質の場合、既存の阻害剤或いは拮抗剤を認識部位として活用して蛋白質切断合成触媒をオーダーメードで合成することが出来る。しかしながら、本発明に係る合成触媒が結合する標的蛋白質上の位置は公知の阻害剤や拮抗剤が結合する標的蛋白質上の位置と異なっても構わない。阻害剤や拮抗剤は標的蛋白質の活性に必須な部位に結合するのに対し、本発明に係る合成触媒は活性部位以外の位置であっても標的蛋白質を特異的に認識して結合した後、結合部位周辺に位置したペプチド結合を切断しさえすれば、所期の目的を達成出来るからである。従って、公知の阻害剤や拮抗剤と関連のない新しい構造を認識部位として使用することも出来る。また、拮抗剤や阻害剤が知られていない標的蛋白質の場合には本発明に係る合成触媒を使用してスクリーニングすることによって新しい認識部位を探索することが出来る。
【００１８】
どの蛋白質が標的蛋白質になるかによって、またその標的蛋白質に対して公知の多くの阻害剤又は拮抗剤中からどれを選択するかによって、又は認識部位を新たに設計するかしないかによって、本発明に係る合成触媒の認識部位Ｒは限りなく変化させることが出来る。かくして、この認識部位を構造的に特定することは不可能である。
【００１９】
前記一般式（Ａ）の構造で反応部位Ｚに該当する触媒中心はＣｕ（II）のシクレン（ｃｙｃｌｅｎ）錯体のような金属錯体である。使用可能な金属錯体は、認識部位に結合しない状態では蛋白質を切断出来ないか、切断効果が僅かに確認できる程度である。この金属錯体を蛋白質認識部位に結合させて合成した分子、即ち、合成触媒は標的蛋白質と複合体を形成する。標的蛋白質と合成触媒の複合体における、金属錯体と標的蛋白質の切断部位との間の有効濃度が十分に高くなることにより、標的蛋白質のペプチド結合の效果的な切断が可能となる。
【００２０】
本発明者らはこのような合成触媒を使用して標的蛋白質を選択的に切断することによって、生理活性を抑制しようとする目的を達成するに当たって、金属イオン−リガンド錯体を構成する金属イオン及びリガンドの種類が特定のものに限定されることが非常に重要であることを見出した。
【００２１】
蛋白質を切断する能力を持った多数の金属錯体が知られている。この中で、本発明に係る金属イオン-リガンド錯体の構成要素に適した金属イオンとしては、Ｎｉ（II）、Ｃｕ（II）、Ｚｎ（II）、Ｐｄ（II）、Ｃｒ（III）、Ｆｅ（III）、Ｃｏ（III）、Ｒｈ（III）、Ｉｒ（III）、Ｒｕ（III）、Ｐt（IV）、Ｚｒ（IV）、及びＨｆ（IV）からなる群より選ばれた１種以上、好ましくはＣｕ（II）、Ｃｒ（III）、Ｆｅ（III）、Ｃｏ（III）、Ｒｈ（III）、Ｉｒ（III）、及びＲｕ（III）からなる群より選ばれた１種以上が挙げられ、キレート形成リガンドの骨格としては下記分子構造の群から選ばれた１種以上が挙げられる。
【００２２】
【化４】
2004529763.tif 000004
【００２３】
前記構造式から分かるように、本発明に係るキレート形成リガンドは環状又は非環状であり、リガンド内に含まれる金属配位原子中１〜４個は、窒素原子であるという特徴を持っている。これらの窒素原子は芳香族の窒素原子であっても非芳香族の窒素原子であってもどちらでも良い。
【００２４】
本発明に係る一般式（Ａ）の構造において、Ｒ及びＺは、ＲとＺとの間を直接連結する主鎖及び主鎖に任意に結合した側鎖を含むリンカーにより連結されている。認識部位Ｒが標的蛋白質に結合すれば、反応部位Ｚは標的蛋白質内のペプチド結合中の一つ以上を切断することになる。蛋白質上の切断部位と反応部位Ｚとの間の有効濃度を増加させれば、反応部位Ｚの反応性を向上させることが出来る。この有効濃度を調節する効果的な方法は合成触媒中に含まれる認識部位（Ｒ）と反応部位（Ｚ）との間の相対的な位置を調節することである。相対的な位置調節のために利用されるものが、リンカーの長さと形状である。
【００２５】
リンカーは主鎖を含むべきである。主鎖の骨格は１〜３０個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び／又は硫黄原子から構成され、これらの原子はアルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル、スルフヒドリル及び／又はチオエーテル基のような官能基や、アミド、イミド、エステル及び／又はチオエステルのような誘導体に属する。リンカーは側鎖を含むことが出来、これらはそれぞれ、アルキル、アリール、カルボニル、アミン、エーテル、ヒドロキシ、シリル、スルフヒドリル及び／又はチオエーテル基のような官能基や、酸、アミド、イミド、エステル及び／又はチオエステルのような誘導体に属する１〜３０個のホウ素、炭素、窒素、酸素、ケイ素、リン及び／又は硫黄原子から構成される骨格を有する。
上記で説明したような定義に基づいて、様々な標的蛋白質及び合成触媒に対する切断部位及び反応部位間の有効濃度を調節するのに好適なリンカーの構造を設計することが出来る。
【００２６】
本発明に係る合成触媒で反応部位（Ｚ）は認識部位（Ｒ）１個当り１個以上の割合で結合出来る。反応部位は相互に同じであるか、或いは互いに異なる。認識部位１個当り１〜３個の反応部位を結合させる場合、典型的な結合形態を例示すると、以下の通りである。別のやり方で認識部位内部に反応部位を挿入することも可能である。
【００２７】
【化５】
2004529763.tif 000005
【００２８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、これらによって本発明の範囲が何ら制限されるものではない。実施例ではミオグロビン（Ｍｂ）とアビジンが標的蛋白質として用いられている。Ｍｂの場合、触媒は新しく用意した組合せライブラリーを用いて見出された認識部位を備えたものである。他方、アビジンの場合は、ビオチンがアビジンに強く結合することが知られているので、ビオチンを触媒の認識部位として使用した。実施例では反応性金属中心のキレート形成リガンドとして種々の有機化合物らが試みられた。実施例では合成触媒を標的蛋白質のそれよりも多いモル量、又は少ないモル量で添加した。
【実施例１】
【００２９】
蛋白質−切断触媒の結合部位を調べるために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）類縁体を含むシクレン（Ｃｙｃ）誘導体の組合せライブラリー（ＣｙｃＡｃ（Ｑ）ｎＬｙｓＮＨ２：ＱはＰＮＡモノマーＡ'、 Ｇ、 Ｔ'、 又はＣを示す）を作製した。ＰＮＡ類縁体はＤＮＡの核酸塩基と塩基対をなすために使用し得る核酸塩基類縁体（ＮＢ（Ａ'）、ＮＢ（Ｇ）、ＮＢ（Ｔ'）、ＮＢ（Ｃ））を含んでいる。ＮＢ（Ａ'）及びＮＢ（Ｔ'）はそれぞれＮＢ（Ｔ）及びＮＢ（Ａ）を認識するが、相互間での認識は出来ない（Lohse, J.; Dahl, O.; Nielson, P. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999,96, 10804）。それ故、ライブラリーに存在するＰＮＡ混合物間の塩基対の結合はＰＮＡｓの成分としてＡ及びＴの代りにＡ'及びＴ'を使用することによって抑制され得る。
【００３０】
【化６】
2004529763.tif 000006
【００３１】
Ａ'のＦｍｏｃ誘導体（Ｎ−［（２−アミノ−６−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−９Ｈ-プリン−９−イル）アセチル］−Ｎ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）グリシン（１））を下記スキーム１に従って合成した。
【００３２】
【化７】
2004529763.tif 000007
【００３３】
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に（２−アミノ−６−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−９Ｈ−プリン−９−イル）酢酸（１ａ）（２．０ｇ，５．８ｍｍｏｌ）（Haaima, G.; Hansen, H.; Christensen, L.; Dahl, O.; Nielsen, P. Nucleic Acid Res. 1997,25, 4639）を加えて攪拌し、これにtert−ブチル  Ｎ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）グリシネイト（１ｂ）のＨＣｌ塩（２．８ｇ，６．４ｍｍｏｌ） (Thomson, S.; Josey, J.; Cadilla, R.; Gaul, M.; Hassman, C.; Luzzio, M.; Pipe, A.; Reed, K.; Ricca, D.; Wiethe, R.; Noble, S.; Tetrahedron 1995,51, 6179）とトリエチルアミン（ＴＥＡ）（１．６ｍＬ，１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物にＯ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＢＴＵ）（２．４ｇ，６．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を塩化メチレン（ＭＣ）（１００ｍＬ）に溶解した。ＭＣ溶液を５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ×２）、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍＬ×２）、及び食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−［（２−アミノ−６−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−９Ｈ−プリン−9−イル）アセチル］−Ｎ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）グリシネイト（１ｃ）を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:20);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01 (s, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.37-7.25 (m, 9H), 6.33 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.05 及び 4.90 (s, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (m, 2H), 4.00及び3.94 (s, 2H), 3.50 (s, 1H), 3.37(m, 2H), 3.15(s, 1H), 1.38(m, 9H).
１ｃ（１．５ｇ，２．１ｍｍｏｌ）のＭＣ（２５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２５ｍＬ）を加えて、反応混合物を５時間攪拌した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状の１を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.1 (s, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.72 (s, 1H), 7.67 (m, 2H), 7.45-7.29 (m, 9H), 6.33 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.05及び4.90 (s, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (m, 2H) 4.00及び3.94 (s, 2H), 3.50 (s, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.15 (s, 1H); HRMS実測値（exact mass）665.6874 (M+H)+, C34H33N8O7としての計算値（calcd）665.6854.
【００３４】
Ｔ'（Ｎ−｛［２−（ベンジルチオ）−４−オキソピリミジン−１（４Ｈ）−イル］アセチル｝−Ｎ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）グリシン（２））のＦｍｏｃ誘導体を下記スキーム２に従って合成した。
【００３５】
【化８】
2004529763.tif 000008
【００３６】
［２−（ベンジルチオ）−４−オキソピリミジン−１（４Ｈ）−イル］酢酸（２ａ）を、メトキシベンジル基の代りにベンジル基をＳ−保護基として使用したことを除いては文献（Lohse, J.; Dahl, O.; Nilesen, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 11804）に記載された方法に従って合成した。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 13.54 (br s 1H), 7.69 (d, 1H), 7.42 (d, 2H), 7.38-7.25 (m, 3H), 5.91 (d, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.56 (s, 2H).
２ａ（３．６ｇ，５．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液に攪拌下、１ｂ（６．２ｇ，６．４ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（３．６ｍＬ，１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物にＨＢＴＵ（５．４ｇ，６．４ｍｍｏｌ）を加えて混合物を３時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣をＭＣ（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ×２）、５％  Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍＬ×２）、及び食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−｛［２−（ベンジルチオ）−４−オキソピリミジン−１（４Ｈ）−イル］アセチル｝−Ｎ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）グリシネイト（２ｂ）を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:20);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.87 (d, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.47-7.20 (m, 10H), 5.90 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.35 (d, 2H), 4.27 (d, 2H), 4.18-4.16 (m, 2H), 4.14 (s, 1H), 3.36 (m, 2H), 3.30 (m, 1H), 3.28 (m, 1H), 1.38 (m, 9H).
２ｂ（３．０ｇ，４．６ｍｍｏｌ）のＭＣ（２５ｍＬ）溶液にＴＦＡ（２５ｍＬ）を加えて、反応混合物を５時間攪拌した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状の２を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.87 (d, 2H), 7.64 (m, 2H), 7.39-7.20 (m, 10H), 5.90 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.23-4.16 (m, 3H), 4.14 (s, 1H), 3.39-3.35 (m, 2H), 3.32 (m, 1H), 3.15 (m, 1H); HRMS実測値599.6873 (M+H)+, C32H32N4O6Sとしての計算値599.6875.
［４，７，１０−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル］酢酸（３）を下記スキーム３に従って合成した。
【００３７】
【化９】
2004529763.tif 000009
【００３８】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル  １，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリカルボキシルレート（３ａ）（１０ｇ，２１ｍｍｏｌ）(Kimura, E.; Aoki, S.; Koike, T.; Shiro, M. J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 3068）、Ｎａ２ＣＯ３（２．５ｇ，２３ｍｍｏｌ）、及びＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）の混合物にエチルブロモアセテート（３．２ｍＬ，２３ｍｍｏｌ）を加えた。不均一な混合物を一晩還流させた。濾過後、溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル  １０−（２−エトキシ−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリカルボキシルレート（３ｂ）を得た。
Rf:0.5（酢酸エチル(EtOAc)/ヘキサン1:1）;1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.16 (q, 2H), 3.55-3.32 (br, 14H), 2.94 (br s, 4H), 1.45 (m, 27H), 1.32 (t, 3H).
３ｂ（１０ｇ，１８ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）溶液にＮａＯＨ水溶液（１Ｎ，１００ｍＬ）を加え、反応混合物を２時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を１０％クエン酸水溶液に溶解させた後、ｐＨを５に調整した。溶液をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×２）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、蒸発させて無定形固体状の３を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 3.53-3.30 (br, 14H), 2.96 (br s, 4H), 1.43 (m, 27H); MS (MALDI-TOF) m/z 531.75 (M+H)+（C25H47N4O8としての計算値531.67）．
【００３９】
ｆｍｏｃ基で保護されたＰＮＡモノマーＧ及びＣをApplied Biosystems社から購入し、ｆｍｏｃ基で保護されたＬ−リジンをNova Biochem社から購入した。
組合せライブラリー用のＰＮＡ（ＣｙｃＡｃ（Ｑ）ｎＬｙｓＮＨ２）を、Ａ'、Ｔ'、Ｇ、Ｃ、及びＬ−リジンのｆｍｏｃ誘導体とカルボン酸３から、Expedite Model 8909 Nucleic Acid Synthesis Systemを用いた自動合成装置により合成した。ライブラリーの合成において、Ａ'、Ｔ'、Ｇ、及びＣのｆｍｏｃ誘導体は重合体支持体に結合して長さが増加しているＰＮＡ鎖に対して同等の反応性を有してカップリングするものと推定された。ＰＮＡの純度をＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥＴＭ  STR Biospectrometry Workstation modelを使用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により確認した。ＣｙｃＡｃ（Ｑ）ｎＬｙｓＮＨ２ライブラリー（全体濃度：約７×1０−５Ｍ）をＣｕＣｌ２水溶液（３．５×１０−４Ｍ）と混合すると、Ｃｕ（II）がＣｙｃ部位に結合したＣｕ（II）ＣｙｃＡｃ（Ｑ）ｎＬｙｓＮＨ２ライブラリーを生成した。蛋白質（約１×1０−５Ｍ）溶液をこの混合物に加えて蛋白質の切断を試験した。３７℃、ｐＨ７．０（５０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ））の条件で各分子当たり最大８個のＰＮＡモノマーを含有するＣｕ（II）Ｃｙｃライブラリーで試験したところ、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した結果では、牛血清アルブミン、γ−グロブリン、延長因子Ｐ、ゼラチンＡ、ゼラチンＢ、及びウマ心臓Ｍｂのような蛋白質が切断されていることを示す証拠は確認出来なかった。分子当たり９個のＰＮＡモノマーを含有するＣｕ（II）Ｃｙｃライブラリーは、Ｍｂの切断に対する明白な活性を示した。本発明者らはＣｕ（II）Ｃｙｃの側に位置した既知のＰＮＡモノマーを使用して４グループのライブラリーを合成しており、Ｍｂ切断に対する活性を試験して最上のターミナルモノマーを見出した。残りのモノマーに対しても検索を繰り返した結果、下記構造式（Ｉ）のＣｕ（II）錯体(MS (MALDI-TOF) m/z 2851.49 (M+H)+(C111H153N64O25S2としての計算値2850.58）が最良の触媒として選択された。
【００４０】
【化１０】
2004529763.tif 000010
【００４１】
緩衝液（１ｍＭ ２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６．０）に（Ｉ）（１．２当量）を溶解し、これにＣｕＣｌ２の水溶液を加えて（Ｉ）のＣｕ（II）錯体のストック溶液を調製した。［Ｃｕ（II）（Ｉ）］でＭｂを分解した後、電気泳動（ＳＤＡ−ＰＡＧＥ）を行った。その結果を図１に示した。ここで、反応は、ｐＨ７．５（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）、［Ｍｂ］ｏ（Ｍｂの初期濃度）が７．９μＭ、［Ｃｕ（II）（Ｉ）］ｏ（［Ｃｕ（II）（Ｉ）］の初期濃度）が２．０μＭの条件で行われた。１７０時間の間に［Ｃｕ（II）（Ｉ）］１分子当たりＭｂ２．５分子が切断された。［Ｍｂ］の時間−依存的な減少を擬一次動力学的方程式に適用した結果、擬一次反応速度定数（ｋｏ）が５．７×１０−３ｈ−１であることが示された。図１の曲線はそのデータを擬一次動力学的方程式に適用して得られたものである。反応混合物から酸素を除去することはｋｏに特別な影響を与えなかった。前記実験と同じ条件で［Ｃｕ（II）（Ｉ）］の代りに［Ｃｕ（II）Ｃｙｃ］でＭｂを処理すると、Ｍｂが切断されないことが観察された。
【００４２】
文献（Castillo-Blum, S. E.; Sosa-Torres, M. E. Polyhedron, 1995,14, 223）に報告された一般的な方法によって、Ｃｏ（III）イオンを（Ｉ）のＣｙｃ部位に導入して、（Ｉ）のＣｏ（III）錯体を製造した。［Ｃｏ（III）（Ｉ）］として：MS (MALDI-TOF) m/z 2908.44 (M+H)+(C111H153N64O25S2Coとしての計算値2908.51).
【００４３】
また、［Ｃｏ（III）（Ｉ）］によってＭｂを分解した後、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。その結果が図１に示されている。ここで、反応はｐＨ７．５（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）、［Ｍｂ］ｏが４．７μＭ、［Ｃｏ（III）（Ｉ）］ｏが０．４７μＭの条件で行った。１００時間の間に［Ｃｏ（III）（Ｉ）］１分子当たりＭｂ６．０分子が切断された。［Ｍｂ］の時間−依存的な減少を擬一次動力学的方程式に適用した結果、ｋｏは９．４×１０−３ｈ−１であった。反応混合物から酸素を除去することはｋｏ値に特別な影響を与えなかった。前記実験と同じ条件で［Ｃｏ（III）（Ｉ）］の代りに［Ｃｏ（III）Ｃｙｃ］でＭｂを処理すると、Ｍｂが切断されないことが観察された。
【００４４】
前記（Ｉ）の構造はＣｕ（II）錯体を使用して検索したが、詳細な動力学的分析はより高い触媒活性を有する［Ｃｏ（III）］錯体を使用して行った。ｐＨ７．５でＣｏ（触媒の初期濃度）に対するｋｏの依存性を図２に示した。ここで、［Ｍｂ］ｏは４．７μＭに固定させた。図２に示された２つの直線はＣｏ＝［Ｍｂ］ｏで交差している。図２の動力学的データはＣｏ≧［Ｍｂ］ｏであり、従ってＫｃ＜＜５μＭの時、Ｍｂが［Ｃｏ（III）（Ｉ）］と完全に結合していることを示している。また、［Ｍｂ］ｏより大きいＣｏを使用して測定したｋｏはｋｐｃに該当する。ここでＫｃとｋｐｃは式（４）に定義されている。このようにして測定した種々のｐＨでのｋｐｃ値を図３に示す。式（５）のスキームによるベルシェープ型のｐＨ分布を分析した結果、ｐＫａ１＝５．５０±０．４２及びｐＫａ２＝８．６８±０．４６の値を得た。図３の曲線はこれらのｐＫ値に基づいて図示されたのである。もしも、Ｍｂ又は（Ｉ）のイオン化が無視出来るならば、これらのｐＫａ値はＭｂと錯体を形成した［Ｃｏ（III）（Ｉ）］におけるＣｏ（III）イオンのアコリガンドのイオン化と考えられる。
【００４５】
【化１１】
2004529763.tif 000011
【００４６】
Ｍｂ（１２μＭ）と［Ｃｏ（III）（Ｉ）］（３．５μＭ）とをｐＨ６．０で、３７℃で、８５時間インキュベートして得られた反応混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによれば、図４に示すように、Ｍｂは２対の蛋白質（一方の対の分子量：７０７４及び９８９２、他方の対の分子量：８０４５及び８９０９）に分けられる。図４で、ｍ／ｚ値１６９５３及び１６９５３／２のピークは、Ｍｂ（分子量：１６９５３）に起因するものである。［Ｃｏ（III）（Ｉ）］による蛋白質切断の可能な部位はそれぞれの２対に対して、Ｌｅｕ８９−Ａｌａ９０（分子量：７０７７及び９８９４の断片を生成）及びＬｅｕ７２−Ｇｌｙ７３（分子量：８０５７及び８９１４の断片を生成）である。現時点では２個の切断部位が触媒の異なる結合様式を含んでいるか否かは明白ではない。２個の切断部位がＭｂと触媒との間に形成された同じ錯体に起因する可能性もある。
【００４７】
牛血清アルブミン、γ−グロブリン、延長因子Ｐ、ゼラチンＡ、及びゼラチンＢのような他の蛋白質を［Ｃｕ（II）（Ｉ）］又は［Ｃｏ（III）（Ｉ）］とインキュベーションした場合には、蛋白質切断は観察されなかった。このことは［Ｃｕ（II）（Ｉ）］又は［Ｃｏ（III）（Ｉ）］がＭｂに対して特異的であることを示している。
【００４８】
構造式（Ｉａ）で示される如く、ＣｙｃＡｃユニットに隣接したＰＮＡ残基がＡ'の代りにＣである［Ｃｏ（III）（Ｉ）］の類縁体を合成した。［Ｃｏ（III）（Ｉａ）］はＭｂの切断に対する触媒活性を示さなかったが、これはＭｂが［Ｃｏ（III）（Ｉ）］だけを特異的に認識していることを示している。
【００４９】
【化１２】
2004529763.tif 000012
【００５０】
図１のデータにおいては、［Ｃｕ（II）（Ｉ）］又は［Ｃｏ（III）（Ｉ）］の各分子によりそれぞれ最大２．５又は６個のＭｂ分子が切断されたが、これは［Ｃｕ（II）（Ｉ）］又は［Ｃｏ（III）（Ｉ）］の作用が触媒的性質を持っていることを示している。反応速度は反応混合物からＯ２を除去することにより影響を受けなかった。これらの結果をテトラアザリガンドのＣｕ（II）錯体及びＣｏ（III）錯体によるペプチド結合の水解切断についての先の知見（Moon, S.-J.; Jeon, J. W.; Kim, H.; Suh, M. P.; Suh, J. J. Am. Chem. Soc. 2000,122, 7742: Suh, J.; Moon, S. J. Inorg. Chem. 2001,40, 4890: Sutton, D. A.; Buckingham, D. A. Acc. Chem. Res. 1987,20, 357）と結びつけて考えると、［Ｃｕ（II）（Ｉ）］及び［Ｃｏ（III）（Ｉ）］によるＭｂ切断が加水分解的性質を有していることが支持される。
【実施例２】
【００５１】
実施例１に記載の方法に準じて化合物（II）を合成した。
【００５２】
【化１３】
2004529763.tif 000013
【００５３】
（II）のＣｏ（III）錯体を実施例１と同じ方法により得た。Ｍｂ（１２μＭ）と［Ｃｏ（III）（II）］（１２μＭ）とをｐＨ７．０又はｐＨ８．０（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で、３７℃でインキュベートしたところ、Ｍｂはそれぞれｋｏ値１．４×１０−２ｈ−１又は６．９×１０−３ｈ−１で分解された。実施例２の結果は、（Ｉ）のＬｙｓは触媒活性を必要としないことを示している。
【実施例３】
【００５４】
スキーム４に従って、Ｎ２，Ｎ６−ビス｛［４，７，１０−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル］アセチル｝リジン（４）を合成した。
【００５５】
【化１４】
2004529763.tif 000014
【００５６】
ブロモ酢酸（３．５ｇ，２６ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１００ｍＬ）溶液にＮ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５．３ｇ，２６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。４ａ（２ｇ，８．５８ｍｍｏｌ）のＨＣｌ塩をジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（３．０ｍＬ，１７ｍｍｏｌ）を加えてクロロホルム（５０ｍＬ）に完全に溶解し、この溶液をブロモ酢酸溶液にゆっくり加えた。室温で８時間攪拌した後、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を濾去し、濾液を濃縮した。残渣をＣＨ３ＣＮ（１００ｍＬ）に再溶解し、溶けないＤＣＵを濾去した。濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して白色固体状のメチル  Ｎ２，Ｎ６−ビス（ブロモアセチル）リシネート（４ｂ）を得た。Rf:0.7 (EtOAc);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.30 (br s, 1H), 6.71 (br s, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.05 (d, 0.7H), 3.90 (m, 3.4H), 3.86 (s, 3H), 3.30 (m, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.57 (m, 2H), 1.37 (m, 2H).
３ａ（３．１ｇ，６．５ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２．２ｇ，１９ｍｍｏｌ）、及びＣＨ３ＣＮ（１００ｍＬ）の混合物に４ｂ（１．３ｇ，３．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を攪拌し、２日間還流させた。濾過後、溶媒を留去してフラッシュクロマトグラフィーで精製し、無定形固体状のメチル Ｎ２，Ｎ６−ビス｛［４，７，１０−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル］アセチル｝リシネート（４ｃ）を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:40);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.06 (br s, 1H), 6.92 (br s, 1H), 4.50 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.13-3.53 (br m, 30H), 2.79-2.63 (br m, 8H), 1.84-1.65 (m, 4H), 1.44-1.47 (m, 54H), 1.36 (m, 2H).
４ｃ（１．７ｇ，１．４ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ（５０ｍＬ）溶液にＮａＯＨ水溶液（１Ｎ，５０ｍＬ）を加え、反応混合物を１時間攪拌した。溶媒を留去し、得られた残渣を１０％クエン酸水溶液に溶解した後、ｐＨを４に調整した。溶液をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×２）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して無定形固体状の４を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 4.14 (m, 1H), 3.17-3.46 (br m, 28H), 3.14 (t, 2H), 2.79-2.70 (br m, 8H), 1.73 (m, 1H), 1.55 (m, 1H), 1.36 (m, 54H), 1.33-1.20 (m, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 1172.48 (M+H)+(C56H103N10O16としての計算値1172.49).
【００５７】
４を使用して実施例１に記載の方法に従って下記化合物（III）を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 3191.87 (M+H)+(C127H185N70O28S2としての計算値3190.23).
【００５８】
【化１５】
2004529763.tif 000015
【００５９】
Ｃｕ（II）イオンと（III）との錯体形成、及びＭｂの分解についての動力学的測定を実施例１と同様にして行った。Ｍｂ（７．９μＭ）と［Ｃｕ（II）（III）］（６．４μＭ）とをｐＨ８．０（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で、３７℃でインキュベーションしたところ、Ｍｂはｋｏ値：３．３×１０−３ｈ−１で分解された。
【００６０】
（III）のＣｏ（III）錯体を実施例１と同様にして得た。Ｍｂ（７．９μＭ）を［Ｃｏ（III）（III）］（４．８μＭ）とｐＨ８．０（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で、３７℃でインキュベーションしたところ、Ｍｂはｋｏ値：３．２×１０−３ｈ−１で分解された。
【実施例４】
【００６１】
スキーム５に従って、Ｎ−（｛４，７，１０−トリス［（ベンジルオキシ）カルボニル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル｝アセチル）グリシル−Ｎ−（２−｛［（９Ｈ-フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）グリシン（５）を合成した。
【００６２】
【化１６】
2004529763.tif 000016
【００６３】
Ｎ−保護基として、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカボネートの代りにベンジルクロロホルメートを使用したことを除いては、３の合成に用いた方法に従って、化合物５ａ（｛４，７，１０−トリス［（ベンジルオキシ）カルボニル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン-1−イル｝酢酸）を合成した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34 (m, 15H), 5.15 (m, 6H) 3.53-3.30 (br, 14H), 2.96 (br s, 4H).  ５ａ（２ｇ，３．２ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（１００ｍＬ）溶液に、撹拌下、グリシンエチルエステル塩酸塩（０．５３ｇ，３．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．４ｍＬ，７．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物にＨＢＴＵ（１．３ｇ，３．５ｍｍｏｌ）を加えて２時間攪拌した。溶液を濃縮し、得られた残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ×２）、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍＬ×２）、及び食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過後、溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して、無定形固体状のエチル Ｎ−（｛４，７，１０−トリス［（ベンジルオキシ）カルボニル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル｝アセチル）グリシネート（５ｂ）を得た。
Rf:0.5 (CH3OH/MC 1:19);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.29 (m, 15H), 7.00 (s, 1H), 5.28 (s, 6H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.90 (br s, 2H), 3.40-3.15 (br m, 14H), 2.80 (br s, 4H), 1.26-1.22 (m,3H).    ５ｂ（２．０ｇ，２．８ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ（５０ｍＬ）溶液にＮａＯＨ水溶液（１Ｎ，５０ｍＬ）を加え、反応混合物を１時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を１０％クエン酸水溶液に溶解した後、ｐＨを４に調整した。溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後、濃縮して無定形固体状のＮ−（｛４，７，１０−トリス［（ベンジルオキシ）カルボニル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル｝アセチル）グリシン（５ｃ）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.29 (m, 15H), 7.00 (s, 1H), 5.28 (s, 6H), 3.90 (br s, 2H),3.40-3.15 (br m, 14H), 2.80 (br s, 4H)．
５ｃ（１．５ｇ，２．２ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（１００ｍＬ）溶液に、撹拌下、１ｂ（１．５ｇ，２．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．１ｍＬ，４．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物にＨＢＴＵ（０．９０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加えて混合物を２時間攪拌した。溶液を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ×２）、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍＬ×２）、及び食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−（｛４，７，１０−トリス［（ベンジルオキシ）カルボニル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル｝アセチル）グリシル−Ｎ−２−｛［（９Ｈ-フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）グリシネイト（５ｄ）を得た。
Rf:0.3 (CH3OH/MC 1:19);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.75 (m, 2H), 7.59 (m, 2H), 7.40-7.16 (m, 19H), 5.05-4.85 (br s, 6H), 4.37 (m, 2H), 4.22-4.16 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.70-3.32 (br m, 18H), 3.04 (br s, 4H), 1.47 (m, 9H).
５ｄ（１．５ｇ，１．５ｍｍｏｌ）のＭＣ（２５ｍＬ）溶液にＴＦＡ（２５ｍＬ）を加えた。反応混合物を５時間攪拌し、溶媒を留去した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状の５を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.72 (m, 2H), 7.57(m,2H),7.40-7.16 (m, 19H), 5.05-4.85 (br s, 6H), 4.37 (m, 1H), 4.20-4.18 (m, 2H), 4.06-3.95 (br s, 4H), 3.70 (br s, 2H), 3.40-3.10 (br m, 18H), 2.83-2.78 (br s, 4H); HRMS実測値1013.1403 (M+H)+, C55H62N7O12としての計算値1013.1370.
【００６４】
実施例１に記載の方法に従って、５を使用して化合物（IV）を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2879.63 (M+H)+(C117H165N68O26S2としての計算値2877.75）  実施例２の結果から（Ｉ）のＬｙｓ残基は、Ｍｂの認識に必須でないことが確認された。従って、（Ｉ）のＰＮＡ ９−ｍｅｒ部分が認識部位である。アミノ末端の代りにカルボキシル末端に結合したＣｙｃとＰＮＡ ９−ｍｅｒも同様にＭｂ−切断触媒として有用であるか否かをテストするために化合物（IV）を合成した。
【００６５】
【化１７】
2004529763.tif 000017
【００６６】
Ｃｕ（II）イオンと（IV）との錯体形成、及びＭｂの分解についての動力学的測定を実施例１と同様にして行った。Ｍｂ（７．９μＭ）と［Ｃｕ（II）（IV）］（６．４μＭ）とをｐＨ８．０（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で、３７℃でインキュベーションしたところ、Ｍｂはｋｏ値：２．２×１０−３ｈ−１で分解された。
【実施例５】
【００６７】
スキーム６に従って｛４，１０−ビス［（ベンジルオキシ）カルボニル］-1-オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−７−イル｝酢酸（６）を合成した。
【００６８】
【化１８】
2004529763.tif 000018
【００６９】
文献（Sasugue, J. M.; Segat-Dioury, F.; Sylvestre, I.; Favre- Reguillon, A.; Foos, J.; Madic, C.; Guy, A. Tetrahedron, 2001,57, 4713）に従って、ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ，Ｎ−ビス（２−｛［（２−ニトロフェニル）スルホニル］アミノ｝エチル）グリシネイト（６ａ）を合成した。６ａ及び無水Ｎａ２ＣＯ３（３．０ｇ，２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に懸濁させ、撹拌下、これにブロモエチルエーテル（１ｍＬ，７．９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液を１００℃で滴下した。反応混合物を一晩加熱した後、濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に加えた。有機層を食塩水（１００ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形固体状のｔｅｒｔ−ブチル｛４，１０−ビス［（２−ニトロフェニル）スルホニル］−１−オキソ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−７−イル｝アセテート（６ｂ）を得た。
Rf:0.3 (EtOAc/ヘキサン 2:1);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01-7.98 (m, 2H), 7.69 (m, 4H), 7.60 (m, 2H), 3.68 (m, 4H), 3.55 (m, 4H), 3.72-3.38 (m, 4H), 3.33 (s, 2H), 3.05 (m, 4H), 1.45 (s, 9H).
６ｂ（１．８ｇ，２．７ｍｍｏｌ）及びチオフェノール（０．７０ｍＬ，６．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液にＮａ２ＣＯ３（２．３ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩攪拌した後、濃縮した。残渣を１０％クエン酸水溶液に溶解してｐＨを３に調整した。水層をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えて水層のｐＨを約１３に上げた後、水層をＭＣ（１００ｍＬ×３）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後、濃縮した。得られた粗生成物（ｔｅｒｔ−ブチル  １−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−７−イルアセテート（６ｃ））を精製せずに、そのまま次の反応に使用した。６ｃ（０．５０ｇ，１．７ｍｍｏｌ）のクロロホルム（７０ｍＬ）溶液にＴＥＡ（０．６１ｍＬ，４．３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を攪拌した後、ここにベンジルクロロホルメート（０．４３ｍＬ，３．９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。反応混合物を３時間攪拌し、５％クエン酸水溶液（５０ｍＬ×３）で洗浄し、濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィーで精製してオイル状のジベンジル  ７−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−オキソ−エチル）−１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−４，１０−ジカボネート（６ｄ）を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:15);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.32-7.27 (m, 10H), 5.12 (s, 4H), 3.59-3.33 (br m, 14H), 2.99-2.93 (br m, 4H), 1.45 (s, 9H).
６ｄ（０．５０ｇ，１．０ｍｍｏｌ）のＭＣ（１５ｍＬ）溶液にＴＦＡ（１０ｍＬ）を加えた。反応混合物を５時間攪拌した。溶媒を留去した後、残渣を１０％クエン酸水溶液に溶解してＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を食塩水（５０ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮してオイル状の６を得た。
Rf:0.2 (CH3OH/MC 1:10);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34-7.25 (m, 10H), 5.11 (m, 4H), 4.23-4.08 (br m, 4H), 3.84-3.50 (br m, 10H), 3.25-3.15 (br m, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 500.50 (M+H)+(C26H34N3O7に対する計算値500.58).
【００７０】
実施例１に記載の方法に従って、６を使用して化合物（Ｖ）を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2851.49 (M+H)+(C111H152N63O26S2に対する計算値2850.75).
【００７１】
【化１９】
2004529763.tif 000019
【００７２】
実施例１に記載の方法に従って、（Ｖ）のＣｏ（III）錯体を製造した。
ｐＨ８．０（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）又は９．０（５０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、温度３７℃でＭｂ（７．９μＭ）を［Ｃｏ（III）（Ｖ）］（４．８μＭ）とインキュベートしたところ、Ｍｂはそれぞれｋｏ値：１．５×１０−３ｈ−１又は５．３×１０−３ｈ−１で分解された。
【実施例６】
【００７３】
スキーム７に従って、｛４，７−ビス［（ベンジルオキシ）カルボニル］−１，４，７−トリアザノナン−１−イル｝酢酸（７）を合成した。
【００７４】
【化２０】
2004529763.tif 000020
【００７５】
文献（Schulz, D.; Weyhermueller, T.; Wieghardt, K.; Nuber, B. Inorg. Chim. Acta 1995,240, 217）に従って、１，４，７−トリアザノナン−１−イル酢酸（７ａ）を合成した。７ａ（３．０ｇ，７．４ｍｍｏｌ）をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ，５０ｍＬ）と１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）の混合液に溶解し、この溶液にベンジルクロロホルメート（３．０ｍＬ，２２ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、その溶液を３時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を１Ｎ ＨＣｌに溶解した後、ｐＨを３に調整した。その溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーで精製して無定形の固体状の７を得た。
Rf:0.4 (CH3OH/MC 1:9);1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.34 (m, 10H), 5.15 (d, 4H), 3.38 (m, 10H), 2.74 (br s, 4H); MS (MALDI-TOF) m/z 456.06 (M+H)+(C24H30N3O6に対する計算値456.52).
【００７６】
実施例１に記載された方法に従って、７を使用して化合物（VI）を合成した。
MS (MALDI-TOF) m/z 2807.51 (M+H)+(C109H148N63O25S2に対する計算値2806.69).
【００７７】
【化２１】
2004529763.tif 000021
【００７８】
実施例１の記載に準じて、Ｃｕ（II）イオンと（VI）の錯体を製造し、Ｍｂの分解に対する動力学的測定を行った。ｐＨ８．０（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）、温度３７℃でＭｂ（７．９μＭ）を［Ｃｕ（II）（VI）］（６．４μＭ）とインキュベートしたところ、Ｍｂはｋｏ値：３．６×１０−３ｈ−１で分解された。
【実施例７】
【００７９】
スキーム８に従って、シクレンを含むｄ−ビオチン誘導体の５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［３−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル）プロピル］ペンタンアミド（VII）を合成した。
【００８０】
【化２２】
2004529763.tif 000022
【００８１】
−６０℃に冷却したＭＣ（３０ｍＬ）にオキサリルクロリド（１．４ｍＬ，１６ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（０．８９ｍＬ，１３ｍｍｏｌ）、８ａ（２．２ｇ，１０ｍｍｏｌ）のＭＣ（２０ｍＬ）溶液、及びＴＥＡ（８．７ｍＬ，６３ｍｍｏｌ）を順次滴下した。１時間後、反応混合物を５０ｍＭクエン酸で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１／１）で精製して無色オイル状のベンジル ３−オキソプロピルカルバメート（８ｂ）を得た。３ａ（２．３ｇ，４．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に８ｂ（１．０ｇ，４．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液及びＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１．３ｇ，６．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌した。ＴＨＦを留去し、反応混合物を０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍＬ）と混合してＥｔｏＡｃ（５０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１／１）で精製してトリ−ｔｅｒｔ−ブチル  １０−（３−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝プロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリカルボキシルレート（８ｃ）を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.32 (m, 5H), 5.09 (s, 2H), 3.56-3.16 (br, 14H), 2.58 (br, 6H), 1.66 (m, 6H), 1.44 (m, 27H).
８ｃ（１．０ｇ，１．５ｍｍｏｌ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ）のＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）懸濁液を１気圧水素下に２４時間攪拌した。触媒をセライト濾過により除き、溶媒を留去して無色オイル状のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル  １０−（３−アミノプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリカルボキシルレート（８ｄ）を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 3.56-3.30 (br, 12H), 2.72-2.58 (br, 8H), 1.59 (m, 2H), 1.43 (m, 27H).
ｄ−ビオチン（０．２２ｇ，０．８９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を０℃に冷却し、ここにＨＢＴＵ（０．４４ｇ，１．２ｍｍｏｌ）、８ｄ（０．４７ｇ，０．８９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液、及びＤＩＥＡ（２００μＬ，１．２ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を室温で６時間攪拌した。反応混合物をＭＣ（３０ｍＬ）と混合し、その混合物を５０ｍＭクエン酸（３０ｍＬ×２）及び食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ／ＭＣ＝１／９）で精製してトリ−ｔｅｒｔ−ブチル  １０−［３−（｛５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタノイル｝アミノ）プロピル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリカルボキシルレート（８ｅ）を得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 6.52 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 4.50 (q, 1H), 4.31 (t, 1H), 3.53-3.33 (br, 12H), 3.19 (m, 3H), 2.90 (m, 2H), 2.60 (br, 6H), 2.25 (t, 2H), 1.70 (m, 6H), 1.44 (d, 27H).
ＴＦＡの１０％ＭＣ溶液に８ｅ（０．５１ｇ，０．６７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３時間攪拌した。反応混合物にエチルエーテルを注入した。白色沈澱物を集めてＣＨ３ＯＨ−ジエチルエーテル混合液に溶解した。ＨＣｌ溶液を滴下すると（VII）のＨＣｌ塩が生成した。この塩をＣＨ３ＯＨ−ジエチルエーテルで再結晶した。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 4.57 (t, 1H), 3.85 (q, 1H), 3.30-2.94 (br, 20H), 2.74 (br, 3H), 2.23 (t, 2H), 1.76-1.55 (m, 6H), 1.38 (m, 2H); MS (MALDI-TOF) m/z 456.56 (M+H)+(C21H42N7O2Sに対する計算値456.68).
【００８２】
Ｃｕ（II）をＣｙｃ部位に結合させると、（VII）のＣｕ（II）錯体である［Ｃｕ（II）（VII）］が形成されることは、Ｃｕ（II）イオンを（VII）に添加するに伴って生じるＵＶスペクトルの変化を測定することにより確認した。アビジンに対するビオチンの強い親和力を考え、［Ｃｕ（II）（VII）］をアビジンに対する蛋白質−切断剤としてテストした。アビジンと［Ｃｕ（II）（VII）］との錯体形成をアビジンの存在下又は不在下における［Ｃｕ（II）（VII）］のゲル濾過クロマトグラフィーで分析して確認した。ｐＨ６（５０ｍＭ ＭＥＳ）、温度５０℃で７日間アルゴン雰囲気中でアビジン（２．５×1０−５Ｍ）を［Ｃｕ（II）（VII）］（２．５×1０−５Ｍ）とインキュベートして得られた反応混合物を尿素−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析した結果、約５０％のアビジンが分解され、より小さなフラグメントを造ることが確認された。同生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した結果、アビジン（Ｍ．Ｗ．１５６３０）は、分子量１０７５９及び４９２２の２つの蛋白質に切断されることが確認された。アビジンのアミノ酸配列とアビジン−ビオチン錯体の３次元Ｘ線結晶構造を調べたところ、切断部位はＴｈｒ３５−Ａｌａ３６で、分子量１０７２６及び４９２２のフラグメントが生成することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
以上の説明のように、本発明者らによって創出された合成触媒は標的蛋白質に対する親和力を持つ認識部位とペプチド結合切断活性を持つ反応部位とから構成され、標的蛋白質を選択的に認識する能力とペプチド結合を速かに切断する能力とを同時に保有することが出来る。従って、このような合成触媒を使用すれば種々の蛋白質が混合されている状況でも標的蛋白質だけを選択的に切断することによってその蛋白質の生理活性を抑制することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】［Ｃｕ（II）（Ｉ）］（ａ）又は［Ｃｏ（III）（Ｉ）］（ｂ）によるＭｂの時間−依存的な分解を示すグラフである。（実施例１）
【図２】Ｍｂ［Ｃｏ（III）（Ｉ）］の分解における、Ｃｏに対するｋｏの依存性を示すグラフである。（実施例１）
【図３】Ｍｂ［Ｃｏ（III）（Ｉ）］の分解における、ｋｐｃのｐＨ分布を示す。（実施例１）
【図４】Ｍｂを［Ｃｏ（III）（Ｉ）］とインキュベーションすることによって得られる反応生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルである。（実施例１）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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