(57)【要約】本発明は、ヒト酵素分子（ＨＥＭ）と、ＨＥＭを同定及びコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、およびアンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ＨＥＭの異常発現に関連する疾患の診断・治療・予防方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６）からなる群から選択されたアミノ酸配列と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる群から選択された請求項１の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる群から選択された請求項４の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項８】
請求項６の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、
（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収するステップとを含むことを特徴とする請求項１のポリペプチドの生産方法。
【請求項１０】
請求項１のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１１】
単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、
（ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、
（ｄ）前記（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、
（ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のＲＮＡ等価物とで構成される群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１のポリヌクレオチドの少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
サンプルにおいて、請求項１１に記載のポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルをプローブでハイブリダイズするステップであって、前記プローブが、前記サンプル内の前記標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を含む少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含み、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、該ステップと、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体が存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする標的ポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項１４】
前記プローブが少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルにおいて、請求項１１のポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するステップと、
（ｂ）増幅された前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする標的ポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項１６】
有効量の請求項１のポリペプチド及び医薬的に容認できる賦形剤を含む組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１６の組成物。
【請求項１８】
機能的なＨＥＭ（新規のヒト酵素分子）の発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１６の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項１９】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１９のスクリーニング方法によって同定されたアゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む組成物。
【請求項２１】
機能的なＨＥＭの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２０の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２２】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項２２のスクリーニング方法によって同定されたアンタゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む組成物。
【請求項２４】
機能的なＨＥＭの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２３の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２５】
請求項１のポリペプチドに特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの試験化合物と結合させるステップと、
（ｂ）請求項１のポリペプチドと前記試験化合物との結合を検出して、請求項１のポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドの活性を変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも１つの試験化合物と結合させるステップと、
（ｂ）前記試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を評価するステップと、
（ｃ）前記試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性と、前記試験化合物の不在下での請求項１のポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、
前記試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性を変化させる化合物の存在を示唆すること特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップと、
（ｃ）様々な量の前記化合物の存在下での前記標的ポリヌクレオチドの発現と、前記化合物の不在下での前記標的ポリヌクレオチドの発現とを比較するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２８】
試験化合物の毒性を評価する方法であって、
（ａ）核酸を含む生体サンプルを前記試験化合物で処理するステップと、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸と、請求項１１のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイズさせるステップであって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１１のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドである、前記ステップと、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量するステップと、
（ｄ）前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量を、未処理の生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量と比較するステップとを含み、
前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量の差が試験化合物の毒性を示唆することを特徴とする試験化合物の毒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ヒト酵素分子の核酸配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、自己免疫／炎症性の疾患、遺伝性疾患、神経疾患、及び癌を含む細胞増殖異常の診断・治療・予防におけるこれらの配列の利用に関する。本発明はさらに、ヒト酵素分子の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響についての評価にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
生合成及び生分解の細胞プロセスには、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、及び補助因子生合成酵素を含む幾つかの主な酵素群が関与する。これらの酵素群はそれぞれ、よく制御された精密な機能を有する多数の基質特異性酵素からなる。これらの酵素は、解糖、クエン酸回路、及び脂肪酸代謝などの代謝プロセスや、アミノ酸、ステロイド、リン脂質、及びアルコール等の生合成及び生分解や、シグナル伝達、細胞増殖、炎症、及びアポトーシス等の調節を促進し、ＤＮＡの複製や修復、及び翻訳プロセスにおける重要な触媒ステップにおいて機能する。
【０００３】
酸化還元酵素
生合成および生分解の多くの経路は、供与体または受容体補助因子の酸化または還元を伴う酸化還元酵素（脱水素酵素または還元酵素）の活性を必要とする。潜在的な補助因子には、チトクローム、酸素、ジスルフィド、鉄‐硫黄タンパク質、フラビンアデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドＮＡＤおよびＮＡＤＰがある（Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ， Ｅ． Ａ． および Ｌｅｅｃｈ， Ａ． Ｒ． （１９８３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｕ． Ｋ． ｐｐ． ７７９−７９３）。還元酵素活性が、補助因子の酸化と同時に起こる基質と補助因子との間の電子の移動を触媒する。脱水素酵素の逆反応は、補助因子の還元およびそれに続く基質の酸化を触媒する。酸化還元酵素は、タンパク質の幅広いスーパーファミリーであって、細菌から植物およびヒトに至る生物の全ての細胞における様々な反応を触媒する。これらの反応には、糖の代謝、肝臓における或る種の解毒反応や、脂肪酸、アミノ酸、糖質コルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、およびロスタグランジンの生合成および生分解が含まれる。異なったファミリーメンバーは、反応が通常に触媒される方向に従って命名されるため、酸化還元酵素、酸化酵素、還元酵素、または脱水素酵素と呼ばれ得る。更に、ファミリーメンバーは、細胞質、細胞膜、ミトコンドリア内膜および外膜、およびペルオキシソームを含むその酵素固有の細胞内部位に局在化する場合が多い。
【０００４】
短鎖アルコール脱水素酵素（ＳＣＡＤ）は、わずか１５％〜３０％の配列同一性を共有する脱水素酵素のファミリーであって、その類似性が主に補酵素結合ドメインおよび基質結合部位に存在する。よく知られているエタノール分解の役割に加えて、ＳＣＡＤは脂肪酸、ステロイド、および或る種のプロスタグランジンの生合成および生分解にも関与することから、脂質貯蔵病、筋障害、ＳＣＡＤ欠乏症、および或る種の遺伝病などの様々な疾患に関与する。例えば、レチノール脱水素酵素は、レチノールをレチノイン酸の前駆体であるレチナールに変換するＳＣＡＤファミリーのメンバーである（Ｓｉｍｏｎ， Ａ． ら （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０ ： １１０７−１１１２）。分化およびアポトーシスのレギュレーターであるレチノイン酸は、細胞増殖および炎症に関与する遺伝子をダウンレギュレートすることが分かっている（Ｃｈａｉ， Ｘ． ら （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０ ： ３９００−３９０４）。更に、レチノール脱水素酵素は、小児期発生常染色体劣性重症網膜ジストロフィーなどの先天性の眼の疾患に関与する（Ｓｉｍｏｎ， Ａ． ら （１９９６） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３６ ： ４２４−４３０）。
【０００５】
神経インパルスの伝達、細胞増殖および分化の調節、免疫反応の誘導、および組織恒常性には、神経伝達物質の代謝が伴う（Ｗｅｉｓｓ， Ｂ． （１９９１） Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １２ ： ３７９−３８６ ； Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｓ． Ｍ． ら （１９９２） Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６４ ： ４１５−４２４ ； Ｂｒｏｗｎ， Ｊ． Ｋ． および Ｉｍａｍ， Ｈ． （１９９１） Ｊ． Ｉｎｈｅｒｉｔ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓ． １４ ： ４３６−４５８）。神経伝達物質の代謝の多くの経路には、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨなどの補助因子の酸化または還元を伴う酸化還元酵素の活性が必要である（Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ， Ｅ． Ａ． および Ｌｅｅｃｈ， Ａ． Ｒ． （１９８３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｕ． Ｋ． ｐｐ． ７７９−７９３）。カテコールアミン（エピネフリンまたはノルエピネフリン）の分解には、脳におけるアルコール脱水素酵素または末梢組織におけるアルデヒド脱水素酵素が必要である。ＮＡＤ＋依存性アルデヒド脱水素酵素は、脳、血小板、肺、および肺内皮における５−ヒドロキシ‐インドール−３−酢酸（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）の代謝産物）を酸化する（Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ， Ｅ． Ａ． および Ｌｅｅｃｈ， Ａ． Ｒ． 前出 ｐ． ７８６）。ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ依存性酸化還元酵素活性を利用する他の神経伝達物質の分解経路には、Ｌ−ＤＯＰＡ（ドーパミンの前駆体、神経興奮化合物（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｕｎｄ））、グリシン（脳および脊髄における抑制性伝達物質）、ヒスタミン（炎症反応の際に肥満細胞から遊離）、およびタウリン（脳幹、脊髄、および網膜の抑制性伝達物質）の分解経路がある（Ｎｅｗｓｈｏｌｍｅ， Ｅ． Ａ． および Ｌｅｅｃｈ， Ａ． Ｒ． ｓｕｐｒａ， ｐｐ． ７９０， ７９２）。神経伝達物質の代謝経路における後成的または遺伝的な障害は、パーキンソン病や遺伝性ミオクローヌスを含む様々な組織における或る範囲の病態につながり得る（ＭｃＣａｎｃｅ， Ｋ． Ｌ． および Ｈｕｅｔｈｅｒ， Ｓ． Ｅ． （１９９４） Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ ｐｐ． ４０２−４０４ ； Ｇｕｎｄｌａｃｈ， Ａ． Ｌ． （１９９０） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ４ ： ２７６１−２７６６）。
【０００６】
テトラヒドロ葉酸は担体として作用するグルタミン酸分子の誘導体であって、活性化した１炭素単位をプリン、ピリミジン、およびアミノ酸メチオニンの生合成を含む様々な生合成反応に提供する。テトラヒドロ葉酸は、テトラヒドロ葉酸脱水素酵素、テトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ、およびテトラヒドロ葉酸合成酵素の３つの酵素活性を含むテトラヒドロ葉酸合成酵素と呼ばれるホロ酵素複合体の活性によって生成される。従って、テトラヒドロ葉酸脱水素酵素は、細胞増殖に必須である核酸およびアミノ酸のブロック形成において重要な役割を果たしている。
【０００７】
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（３ＨＡＣＤ）は脂肪酸の代謝に関与する。３ＨＡＣＤは、真核生物細胞のミトコンドリアおよびペルオキシソームにおいて、ＮＡＤのＮＡＤＨへの酸化が同時に生じる３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの３−オキソアシル− ＣｏＡへの還元を触媒する。ペルオキシソームでは、３ＨＡＣＤおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼが２機能酵素（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ）と呼ばれる酵素複合体を形成し、この複合体の欠損がペルオキシソーム２機能酵素の欠損症に関連する。この脂肪酸代謝の中断によって、脳、骨、および副腎の発達を阻害する超長鎖脂肪酸が生成される。この欠損症の症状をもって生まれる乳児は、通常６ヶ月以内に死亡する（Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｐ． ら （１９８９） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８３ ： ７７１−７７７ ； Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ）， ＃２６１５１５）。アルツハイマー病の特徴である神経変性は、脳の或る領域における細胞外プラークを伴う。これらのプラークの主なタンパク質成分は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の幾つかの分解産物の１つであるβアミロイドペプチド（Ａβ）である。Ａβと結合することが実証されている３ＨＡＣＤが、アルツハイマー病に感染したニューロンで過剰に発現されている。更に、抗３ＨＡＣＤ抗体はアルツハイマー病の培養細胞モデルにおけるＡβの毒作用を遮断し得る（Ｙａｎ， Ｓ． ら （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９ ： ６８９−６９５ ； ＯＭＩＭ， ＃６０２０５７）。
【０００８】
エストロゲン、テストステロン、およびコルチコステロンなどのステロイドは、共通の前駆体であるコレステロールから生成され、互いに相互変換される。幾つかの脱水素酵素を含む様々な酵素がコレステロールに作用する。ヒドロキシステロイド脱水素酵素などのステロイド脱水素酵素は、高血圧症、肥満、癌に関与する（Ｄｕａｘ， Ｗ． Ｌ． ａｎｄ Ｇｈｏｓｈ， Ｄ． （１９９７） Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ６２ ： ９５−１００）。このような脱水素酵素の例には、前立腺およびほかのアンドロゲン応答性組織に高発現するミイクロソーム膜タンパク質である３−オキソ−５−α−ステロイド脱水素酵素（ＯＳＡＤ）がある。ＯＳＡＤは、テストステロンのジヒドロテストステロンへの変換を触媒する。ジヒドロテストステロンは、最も強力なアンドロゲンである。ジヒドロテストステロンは、胚発生時の男性表現型の形成、並びに適切なアンドロゲン仲介性の組織（前立腺や男性生殖器など）の成長に必須である。テストステロンのジヒドロテストステロンへの変換を阻害するＯＳＡＤの欠損は、外性器の不完全形成によって特徴付けられる稀に見られる男性偽雌雄同体型を引き起こす（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｓ．， ら （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４ ： １５９−１６１ ； Ｌａｂｒｉｅ， Ｆ．， ら （１９９２） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３１ ： １５７１−１５７３ ； ＯＭＩＭ ＃２６４６００）。従って、ＯＳＡＤは性分化およびアンドロゲンの生理機能に中心的な役割を果たす。
【０００９】
１７β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（１７βＨＳＤ６）は、男性ホルモンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴＴ）の調節に重要な役割を果たしている。１７βＨＳＤ６は、ＤＨＴＴの前駆体である３α−ジオールを容易にグルクロン酸化して組織から除去されるアンドロステロンに酸化してＤＨＴＴのレベルを低下させるように作用する。１７βＨＳＤ６はまた、胚腎２９３細胞で発現されるとアンドロゲン基質およびエストロゲン基質の両方で活性である。異なったステロイド基質に特異的であって、様々な組織における酸化反応および／または還元反応を触媒する１７βＨＳＤの少なくとも５つの他のイソ酵素が同定された（Ｂｉｓｗａｓ， Ｍ． Ｇ． および Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｗ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２ ： １５９５９−１５９６６）。例えば１７βＨＳＤ１はエストラジオールを選択的に還元し、卵巣および胎盤に豊富である。１７βＨＳＤ２はアンドロゲンの酸化を触媒し、子宮内膜および胎盤に存在する。１７βＨＳＤ３は、精巣のみに存在する還元酵素である（Ｇｅｉｓｓｌｅｒ， Ｗ． Ｍ． ら （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７ ： ３４−３９）。ＤＨＴＴなどのアンドロゲンの過剰な存在は、良性前立腺肥大および前立腺癌などの或る種の病態を引き起こし得る。
【００１０】
酸化還元酵素は、ミトコンドリアおよびペルオキシソームにおける脂肪酸代謝経路の構成要素である。主β酸化経路は飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の両方を分解し、一方、補助経路は不飽和脂肪酸の分解に必要な更なるステップを行う。補助β酸化酵素である２，４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ還元酵素が、主β酸化経路に入る前に不飽和脂肪酸からの偶数個の二重結合の除去の触媒をする。この酵素はまた、不飽和脂肪酸からの奇数個の二重結合の除去もし得る（Ｋｏｉｖｕｒａｎｔａ， Ｋ． Ｔ． ら （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０４ ： ７８７−７９２ ； Ｓｍｅｌａｎｄ， Ｔ． Ｅ． ら （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ： ６６７３−６６７７）。２，４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ還元酵素は、ミトコンドリアおよびペルオキシソームの両方に存在する。ミトコンドリアおよびペルオキシソームにおけるβ酸化酵素の遺伝性の欠損は重症疾患に関連し、そのような重症疾患の中には、生後すぐに症状が現われて、数週間以内に死亡に至るものもある。β酸化酵素の欠損は、ライ症候群、ツェルヴェーガー症候群、新生児副腎性白質ジストロフィー、乳児レフサム病、アシルＣｏＡ酸化酵素欠損症、および二機能タンパク質（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）欠損症に関連する（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ． ら （１９９４） Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ５４ ： ３６−４３ ； Ｈｏｅｆｌｅｒ， 前出 ； Ｃｏｔｒａｎ， Ｒ． Ｓ． ら （１９９４） Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｗ． Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， ｐ． ８６６）。ペルオキシソームβ酸化酵素は、癌性組織においてその機能が損なわれる。腫瘍性ヒト乳房上皮細胞は、正常な細胞と同数のペルオキシソームを有するが、脂肪酸アシルＣｏＡ酸化酵素活性はコントロール組織よりも低い（ｅｌ Ｂｏｕｈｔｏｕｒｙ， Ｆ．， ら （１９９２） Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６６ ： ２７−３５）。ヒト結腸癌は、正常な結腸組織よりもペルオキシソームが少なく、脂肪酸アシルＣｏＡ酸化酵素活性および二機能酵素（エノイル−ＣｏＡヒドラターゼを含む）活性が正常な組織よりも低い（Ｃａｂｌｅ， Ｓ．， ら （１９９２） Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ． Ｂ Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ． Ｉｎｃｌ． Ｍｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． ６２ ： ２２１−２２６）。クエン酸回路の基質であるケトグルタル酸へのイソクエン酸の変換を触媒するイソクエン酸脱水素酵素が、もう１つの重要な酸化還元酵素である。イソクエン酸脱水素酵素は、ＮＡＤ依存性若しくはＮＡＤＰ依存性の何れかであって、サイトゾル、ミトコンドリア、およびペルオキシソームに見られる。イソクエン酸脱水素酵素の活性は、ホルモン、神経伝達物質、および成長因子によって発生的に調節される。
【００１１】
グリコール酸経路におけるペルオキシソームの２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（２−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）であるヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＨＰＲ）が、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの両方の酸化を伴うヒドロキシピルビン酸のグリセリン酸への変換を触媒する。逆脱水素酵素反応により、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋が減少する。ＨＰＲは、ヌクレオチドおよび塩基をＡＴＰおよびＧＴＰが合成される経路に戻して再利用する。ＡＴＰおよびＧＴＰは、ＤＮＡおよびＲＮＡを生成するため、並びにシグナル伝達およびエネルギー代謝を様々な点を調節するために用いられる。プリンヌクレオチド生合成の阻害剤が、癌およびウイルス疾患の治療に抗増殖性薬剤として以前から使用されている。ＨＰＰはまた、セリンの生合成を調節して、タンパク質の合成に利用可能な細胞内のセリンのレベルを調節する。
【００１２】
ミトコンドリアの電子伝達鎖（呼吸鎖）は、ミトコンドリア膜における一連の酸化還元酵素型酵素複合体であって、電子をＮＡＤＨからこれら複合体内の一連のレドックスコアを介して酸素に伝達し、この酸化がＡＴＰの合成につながる（酸化的リン酸化）。次に、ＡＴＰが、エネルギーが必要な多くの細胞の反応が行われるようにするための主なエネルギー源となる。呼吸鎖における主な複合体には、ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）、コハク酸：ユビキノン酸化還元酵素（複合体ＩＩ）、チトクロームｃ１−ｂ酸化還元酵素（複合体ＩＩＩ）、チトクロームｃ酸化酵素（複合体ＩＶ）、およびＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）が含まれる（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ． ら （１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｐ． ６７７−６７８）。複合体ＩＩはサイトゾル側に存在するが、それ以外の複合体は全て、ミトコンドリア膜の内側のマトリックス側に存在する。複合体ＩＩは、クエン酸回路で生成された電子を呼吸鎖に伝達する。クエン酸回路においてコハク酸のフマル酸への酸化により生じた電子が、複合体ＩＩの電子伝達体を介して膜結合ユビキノン（Ｑ）に伝達される。これら核コード遺伝子の転写調節が、呼吸酵素の生合成を調節するための主な手段であると思われる。呼吸鎖における酵素発現の欠損および変化が、様々な疾患に関連する。
【００１３】
補助因子としてＮＡＤを用いる他の脱水素酵素活性も、ミトコンドリアの機能に重要である。バリンの異化反応に重要な３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素（３ＨＢＤ：３−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）が、ミトコンドリア内における３−ヒドロキシイソ酪酸のメチルマロン酸セミアルデヒドへのＮＡＤ依存性の酸化を触媒する。３−ヒドロキシイソ酪酸のレベルの上昇が、ケトアシドーシス、メチルマロン酸血症、およびメチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素に関連した他の疾患を含む様々な病態で報告された（Ｒｏｕｇｒａｆｆ， Ｐ． Ｍ． ら （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４ ： ５８９９−５９０３）。
【００１４】
アミノ酸代謝に重要な別のミトコンドリア脱水素酵素として、イソヴァレリル−ＣｏＡ脱水素酵素（ＩＶＤ）がある。ＩＶＤはロイシン代謝に関与し、イソヴァレリル−ＣｏＡの３−ｍｅｔｈｙｌｃｒｏｔｏｎｙｌ−ＣｏＡへの酸化を触媒する。ヒトＩＶＤは四量体フラボタンパク質であって、核でコードされ、ミトコンドリア移入シグナル配列を有する４５ｋＤａの前駆体としてサイトゾルで合成される。ＩＶＤをコードする遺伝子の変異から生じる遺伝性疾患により、イソ吉草酸血症として知られる症状が引き起こされる。この変異により、ＩＶＤ前駆体のミトコンドリアへの移入およびプロセシングが行われなくなる（Ｖｏｃｋｌｅｙ， Ｊ． ら （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７ ： ２４９４−２５０１）。
【００１５】
トランスフェラーゼ
トランスフェラーゼは、分子群の転移を触媒する酵素である。反応は、酸化、還元、または共有結合の開裂を伴い、基質または或る種の基質上の特定部位に特異的である場合が多い。トランスフェラーゼは、細胞成分の合成及び分解などの機能、および細胞機能の調節に必須な反応に関与する。細胞機能とは、細胞シグナル伝達、細胞増殖、炎症、アポトーシス、分泌、および排泄が含まれる。トランスフェラーゼは、転移される群の型によって分類される場合が多い。例えば、メチルトランスフェラーゼは一炭素メチル基を転移し、アミノトランスフェラーゼは窒素アミノ基を転移し、同様に命名された酵素は、補酵素Ａなどの小さな酵素群は勿論、アルデヒド基、若しくはケトン基、アシル基、グリコシル基、アルキル基又はアリル基、イソプレニル基、ｓａｃｃｈａｒｙｌ基、リン含有基、硫黄含有基、若しくはセレニウム含有基を転移する。
【００１６】
アシルトランスフェラーゼは、脂肪酸β酸化経路に関与するペルオキシソームカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ、および脂肪酸の代謝及び輸送に関与するミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼを含む。コリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、神経伝達物質であるアセチルコリンの生合成を触媒する。
【００１７】
アミノトランスフェラーゼは、タンパク質の合成及び分解において重要な役割を果たし、さらに別のプロセスにも貢献する。例えば、アミノトランスフェラーゼ５−アミノレブリン酸シンターゼは、ヘム生合成の第一ステップであるグリシンに対するスクシニルＣｏＡの付加を触媒する。別のアミノトランスフェラーゼは、神経の機能及び代謝に重要な経路に関与する。例えば、グルタミントランスアミナーゼＫ（ＧＴＫ）としても知られるグルタミンフェニルピルビン酸アミノトランスフェラーゼは、ピリドキサールリン酸補助因子と共に複数の反応を触媒する。ＧＴＫは、Ｌ−グルタミンとフェニルピルビン酸を２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｍａｔｅ及びＬ−フェニルアラニンへの可逆的な変換を触媒する。ＧＴＫのその他のアミノ酸基質には、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ヒスチジン、及びＬ−チロシンが含まれる。ＧＴＫはまた、キヌレニンのキヌレン酸への変換を触媒する。このキヌレン酸はトリプトファン代謝産物であり、脳におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体のアンタゴニストであって神経調節機能として作用しうる。キヌレニン代謝経路の変化は、複数の神経疾患に関連しうる。ＧＴＫはまた、グルタチオンに結合したハロゲン化生体異物の代謝において役割を果たし、ラットでは腎毒性を、ヒトでは神経毒性を引き起こす。ＧＴＫは、腎臓、肝臓、及び脳内で発現する。ヒトＧＴＫ及びラットＧＴＫの双方は、推定ピリドキサールリン酸結合部位を含む（ＥｘＰＡＳｙ ＥＮＺＹＭＥ： ＥＣ ２．６．１．６４； Ｐｅｒｒｙ， Ｓ． Ｊ． ら （１９９３） Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４３： ６６０−６６５、 Ｐｅｒｒｙ， Ｓ． ら （１９９５） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３６０： ２７７−２８０、及びＡｌｂｅｒａｔｉＧｉａｎｉ， Ｄ． ら （１９９５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６４： １４４８−１４５５）。この経路に関連する第二のアミノトランスフェラーゼは、キヌレニン／α−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡａｄＡＴ）である。ＡａｄＡＴは、リジンの代謝の際、α−アミノアジピン酸及びα−ケトグルタル酸塩のα−ケトアジペート及びＬ−グルタメートへの可逆的な変換を触媒する。ＡａｄＡＴはまた、キヌレニンからキヌレン酸へのアミノ基の転移も触媒する。サイトゾルＡａｄＡＴは、ラット腎臓、肝臓、及び脳内で発現する（Ｎａｋａｔａｎｉ， Ｙ． ら （１９７０） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９８： ２１９−２２８、 Ｂｕｃｈｌｉ， Ｒ． ら （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２９３３０−２９３３５）。
【００１８】
グリコシルトランスフェラーゼは、膜結合ミクロソーム酵素のファミリーである哺乳動物ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｏｓｙｌトランスフェラーゼを含む。この膜結合ミクロソーム酵素は、薬剤、発癌物質、およびその他の外来物質の解毒および排泄において重要な役割を果たす反応において、ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄの親油性基質への転移を触媒する。もう１つの哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼである哺乳動物ＵＤＰ−ガラクトースセラミドトランスフェラーゼは、神経系のミエリン膜におけるガラクトセレブロシドの合成においてガラクトースのセラミドへの転移を触媒する。ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、約５０のアミノ酸残基の保存されたシグネチャドメインを共有する（ＰＲＯＳＩＴＥ： ＰＤＯＣ００３５９， ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ． ｈｃｕｇｅ． ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｐｒｏｓｉｔｅ． ｈｔｍｌ）。
【００１９】
メチルトランスフェラーゼは、様々な薬理学的に重要なプロセスに関与する。ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼは、ニコチンアミド及び他のピリジンのＮ−メチル化を触媒する。これは、薬剤及び他の外来化合物の細胞内処理における重要なステップである。フェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼは、ノルアドレナリンのアドレナリンへの変換を触媒する。６−Ｏ−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼはＤＮＡのメチル化を逆転する。これは、発癌に於ける重要なステップである。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからウロポルフィリノーゲンＩＩＩへの２つのメチル基の転移を触媒するウロポルフィリン−ＩＩＩ Ｃメチルトランスフェラーゼは、コバラミンの生合成における第１の特異的酵素である。このコバラミンは、悪性貧血において取り込みが減少する食物酵素である。タンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼは、タンパク質におけるアルギニン残基の翻訳後メチル化を触媒し、それによってグアニジノ基におけるアルギニンのモノメチル化またはジメチル化が生じる。基質には、ヒストンやミエリン塩基性タンパク質、更にｍＲＮＡのプロセシング、スプライシング、および輸送に関与するヘテロ核リボ核タンパク質が含まれる。タンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼは、マイトジェンによってアップレギュレートされるタンパク質、慢性リンパ性白血病に関与するタンパク質、およびインターフェロンと相互作用することから、サイトカイン受容体シグナル伝達におけるメチル化に重要な役割を果たしていると考えられる（Ｌｉｎ， Ｗ．−Ｊ． ら （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １５０３４−１５０４４； Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈ， Ｃ． ら （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６： ２６０−２６６； および Ｓｃｏｔｔ， Ｈ． Ｓ． ら （１９９８） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４８： ３３０３４０）。
【００２０】
ホスホトランスフェラーゼは高エネルギーのリン酸基の転移を触媒する。このため、エネルギーを必要とする反応やエネルギー放出反応に重要である。代謝酵素であるクレアチンキナーゼは、クレアチン／クレアチンリン酸とＡＴＰ／ＡＤＰとの間の可逆的なリン酸の転移を触媒する。グリコシアミンキナーゼはＡＴＰからｇｕａｎｉｄｏａｃｅｔａｔｅへのリン酸の転移を触媒し、アルギニンキナーゼはＡＴＰからアルギニンへのリン酸の転移を触媒する。システイン含有活性部位がこのファミリーに保存されている（ＰＲＯＳＩＴＥ： ＰＤＯＣ００１０３）。
【００２１】
プレニルトランスフェラーゼは、イソプレニル基の転移を触媒する、αサブユニットおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体である。プレニルトランスフェラーゼの例には、哺乳動物タンパク質であるファルネシルトランスフェラーゼがある。ファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニットは、それぞれがインバリアントなトリプトファンを備えた３４個のアミノ酸からなる５つの反復から構成されている（ＰＲＯＳＩＴＥ ： ＰＤＯＣ００７０３）。
【００２２】
ｓａｃｃｈａｒｙｌトランスフェラーゼは、様々な代謝プロセスに関与する糖化酵素である。例えば、ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈｒｙｌトランスフェラーゼ−４８は糖化後期の最終産物の受容体である。これらの最終産物の蓄積が、糖尿病性血管合併症、大血管障害、腎不全、およびアルツハイマー病で観察される（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ， Ｐ． Ｊ． （１９９８） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （Ｎｏｉｓｙ Ｌｅ−Ｇｒａｎｄ） ４４： １０１３−１０２３）。
【００２３】
補酵素Ａ（ＣｏＡ）トランスフェラーゼは、２つのカルボン酸間のＣｏＡの転移を触媒する。スクシニルＣｏＡ：３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（３−ｏｘｏａｃｉｄ ＣｏＡ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、例えば、ＣｏＡをスクシニルＣｏＡからアセト酢酸などのレシピエントに転移する。アセト酢酸は、ケトン体の代謝に必須であり、糖尿病などの代謝障害によって影響を受けた組織に蓄積される（ＰＲＯＳＩＴＥ ： ＰＤＯＣ００９８０）。
【００２４】
加水分解酵素
加水分解とは、水の分子を導入することによって基質内の共有結合を破壊することである。この反応は、基質の標的結合における水分子の酸素原子による求核攻撃を含む。水分子は、標的結合全域で分離され、結合が破壊されて２つの分子が生成される。加水分解酵素は、細胞シグナル伝達、細胞増殖、炎症、アポトーシス、分化、排泄等の作用に不可欠な反応に必要である。加水分解酵素は、これらの作用を含む疾患プロセスにおいて鍵となるステップに関与している。加水分解酵素即ちヒドロラーゼは、基質特性によって、ａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、ホスホリパーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ホスホジエステラーゼ、リゾチーム、グリコシダーゼ、ｇｌｙｏｘｙｌａｓｅ、スルファターゼ、ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、及びｓｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅを含む群に分類することができる。
【００２５】
ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステル化合物の２つのエステル結合の内の一方のエステル結合の加水分解を触媒する。従って、ホスホジエステラーゼは、様々な細胞のプロセスに極めて重要である。ホスホジエステラーゼは、蛋白合成及び細胞の成長及び複製に不可欠であるようなＤＮＡ及びＲＮＡのエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含む。
【００２６】
膵リパーゼ及びコリパーゼは、複合体を形成する。この複合体は、不溶性の長鎖トリアシルグリセロールを腸管細胞の刷子縁を越えることができる極性の高い分子へ変換することによって食事脂肪の分解において重要な役割を演じる。コリパーゼは、リパーゼのＣ末端ドメインに結合する。
【００２７】
カルボキシルエステラーゼは、カルボン酸エステルを加水分解するタンパク質であって、Ａ、Ｂ、Ｃの３つのカテゴリーに分けられる。殆どのＢ型カルボキシルエステラーゼは、進化論的に関連し、タンパク質ファミリーを構成するものと考えられる。タンパク質のＢ型カルボキシルエステラーゼファミリーには、脊椎動物アセチルコリンエステラーゼ、哺乳類肝ミクロソームカルボキシルエステラーゼ、哺乳類胆汁酸塩活性化リパーゼ、アヒル脂肪アシル−ＣｏＡ ヒドロラーゼが含まれる。このタンパク質ファミリーのメンバーには、触媒的に活性でないがサイログロブリンやショウジョウバエタンパク質ｎｅｕｒａｃｔｉｎなどのその他のＢ型カルボキシルエステラーゼに進化論的に関連するドメインを含むものもある。
【００２８】
アシル−ＣｏＡ チオエステラーゼは、カルボキシルエステラーゼファミリーの別のメンバーである（Ａｌｅｘｓｏｎ， Ｓ．Ｅ． ら （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１４：７１９−７２７）。アシル−ＣｏＡ チオエステラーゼがステロイド産生組織において調節的役割を有していることを示唆している証拠がある（Ｆｉｎｋｉｅｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． ら （１９９８） Ｅｕｒ． ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５６：６０−６６）。
【００２９】
ホスホリパーゼＡ２ 阻害剤は、ヒトのロイシンリッチα２ 糖タンパク質と３３％の配列相同性を有していることが分かった（Ｏｋｕｍｕｒａ， Ｋ． ら （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１９４６９−１９４７５）。ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）コンセンサス配列はまた、ホルモン受容体、酵素、酵素阻害剤、細胞癒着のためのタンパク質、およびリボソーム結合タンパク質等の生物学的に重要なプロセスに関係するタンパク質を含む多数のタンパク質の１次構造においても見られる。ＬＲＲドメインを含有する全てのタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与していると考えられる。
【００３０】
リゾチームｃスーパーファミリーは、通常のリゾチームｃ、カルシウム結合リゾチームｃ、及びαラクトアルブミンからなる（Ｐｒａｇｅｒ， Ｅ．Ｍ． 及び Ｐ． Ｊｏｌｌｅｓ （１９９６） ＥＸＳ ７５：９−３１）。リゾチームｃスーパーファミリーのタンパク質は、３５〜４０％の配列相同性及び共通の３次元フォールドを有するが、異なる機能を有することがある。リゾチームは、糖におけるグリコシド結合の形成および切断を行う（Ｉｙｅｒ， Ｌ． Ｋ． ａｎｄ Ｑａｓｂａ， Ｐ． Ｋ． （１９９９） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １２ （２） ： １２９−１３９）。リゾチームｃは、様々な組織及び分泌物に遍在し、或る種の細菌の細胞壁を溶解させることができる（ＭｃＫｅｎｚｉｅ， Ｈ．Ａ． （１９９６） ＥＸＳ ７５：３６５−４０９）。
【００３１】
ｇｌｙｏｘｙｌａｓｅシステムは、ｍｅｔｈｙｇｌｙｏｘａｌからのＳ−Ｄｌａｃｔｏｙｌｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅの生成を触媒するｇｌｙｏｘｙｌａｓｅ Ｉと、トリオースリン酸エネルギー代謝の副次生成物と、Ｓ−ＤｌａｃｔｏｙｌｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅをＤ−乳酸と還元グルタチオンに加水分解するｇｌｙｏｘｙｌａｓｅ ＩＩとからなる。ｍｅｔｈｙｇｌｙｏｘａｌのレベルは高血糖時に上昇するが、これはトリオースリン酸エネルギー代謝の上昇による可能性が高い。ｇｌｙｏｘｙｌａｓｅＩＩ活性の上昇が、ヒトの非インスリン依存型糖尿病及びラット同疾患モデルにおいて見られる。ｇｌｙｏｘｙｌａｓｅシステムは、細菌毒の解毒と、細胞増殖及び微小管構造の調節に関与している。ｇｌｙｏｘｙｌａｓｅＩＩの基質であるＳ−Ｄｌａｃｔｏｙｌｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅのレベルの上昇により、ＨＬ６０細胞の成長停止及び毒性を誘導した。従って、ｇｌｙｏｘｙｌａｓｅシステム、特にｇｌｙｏｘｙｌａｓｅＩＩは、細胞増殖や、糖尿病等の自己免疫疾患に関連するであろう。
【００３２】
α／β加水分解酵素フォールド（立体構造）は、多様な系統発生的起源や触媒機能を有する幾つかの加水分解酵素に共通のタンパク質の折りたたみである。α／β加水分解酵素フォールドを有する酵素は、αヘリックスで連結された８枚のβシートからなる共通の核構造を有する。このフォールドの最も保存された構造的特徴は、求核−ヒスチジン−酸触媒３つ組（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ａｃｉｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）のループである。求核性ループ及び酸ループは２つ以上のアミノ酸の型を含むが、触媒３つ組におけるヒスチジンは完全に保存されている（Ｏｌｌｉｓ， Ｄ．Ｌ． ら （１９９２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ５：１９７−２１１）。
【００３３】
スルファターゼは、広範囲にわたる配列相同性及び高い構造的類似性を共有するような高度に保存された遺伝子ファミリーのメンバーである。スルファターゼは、硫酸エステルの切断を触媒する。この機能を発揮するため、スルファターゼは小胞体において、保存されたシステイン残基の酸化を伴うユニークな翻訳後修飾を受ける。多発性スルファターゼ欠損症と称されるヒトの疾患は、スルファターゼを不活性にするようなこの翻訳後修飾段階における障害に起因する（Ｒｅｃｋｓｉｅｋ， Ｍ． ら （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：６０９６−６１０３）。
【００３４】
ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅは、リン酸エステルを加水分解する酵素である。ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅの中には、ｍｕｔＴ ドメインシグネチャ配列を含むものもある。ｍｕｔＴは、ＤＮＡから酸化的障害を受けたグアニンを取り除くＧＯシステムに関与するタンパク質である。
【００３５】
グリコシダーゼは、１個以上の糖を含む化合物であるグリコシドのｈｅｍｉａｃｅｔｙｌ結合の切断を触媒する。哺乳類βガラクトシダーゼは、ガングリオシド、糖タンパク質、及びグリコサミノグリカンから末端ガラクトースを取り除く。βガラクトシダーゼは、ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅに分類されるファミリー３５に属する。
【００３６】
ｓｅｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅは、その活性部位にセリン残基を含む加水分解酵素の機能的クラスである。この酵素クラスは、多様な基質を加水分解するプロテイナーゼ、エステラーゼ、及びリパーゼを含むことから、様々な生物学的役割を有する。このスーパーファミリーのタンパク質は、基質特異性またはアミノ酸類似性に基づいて更にサブファミリーに分類することができる（Ｐｕｅｎｔｅ， Ｘ．Ｓ． 及び Ｃ． Ｌｏｐｅｚ−Ｏｎｔ （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１２９２６−１２９３２）。
【００３７】
リアーゼ
リアーゼは、非加水分解的または非酸化的にＣ−Ｃ、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｓ、Ｃ−（ハロゲン化物）、Ｐ−Ｏまたはその他の結合を切断し、少なくとも一方が二重結合を有する２つの分子を生成する反応を触媒する酵素のクラスである（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｉｙ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐ．６２０）。リアーゼは、脂肪酸代謝及び他の多様な酵素的プロセスを含む代謝エネルギー生産において作用する細胞生化学の重要な成分である。
【００３８】
Ｃ−Ｃリアーゼ群には、ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｌｙａｓｅ（デカルボキシラーゼ）、アルデヒドリアーゼ（アルドラーゼ）、オキソ酸リアーゼ（ｏｘｏ−ａｃｉｄ−ｌｙａｓｅ）及びその他のリアーゼが含まれる。Ｃ−Ｏリアーゼ群には、多糖類に作用するリアーゼであるヒドロリアーゼ及びその他のリアーゼが含まれる。Ｃ−Ｎリアーゼ群には、アンモニアリアーゼ、アミジンリアーゼ、ａｍｉｎｅ−ｌｙａｓｅ（デアミナーゼ）及びその他のリアーゼが含まれる。
【００３９】
リアーゼの適切な調節は通常の生理機能に必須である。例えば、変異誘導性のウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ欠損が、遺伝性疾患である家族性晩発性皮膚ポルフィリン症の感光性皮膚障害を引き起こし得る（Ｍｅｎｄｅｚ， Ｍ． ら （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｇｅｎｅｔ． ６３ ： １３６３−１３７５）。ＡＤＡ遺伝子の遺伝子変異に起因するアデノシン‐デアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を引き起こすことが示された（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ， Ｍ． Ｓ． （１９９８） Ｓｅｍｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ３５ ： ２９１−２９８）。
【００４０】
イソメラーゼ
イソメラーゼは酵素の１つのクラスであって、分子内の形状または構造の変化を触媒して単一の生成物を形成する。このクラスには、エピメラーゼ、シス−トランス−イソメラーゼ、細胞内酸化還元酵素、細胞内転移酵素（ムターゼ）、および細胞内リアーゼが含まれる。イソメラーゼは細胞内生化学の重要な成分であって、タンパク質の折りたたみ、光伝達、解糖やその他の多様な酵素プロセスを含む代謝エネルギー生成において作用する（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ｐｐ．４８３−５０７）。
【００４１】
ラセマーゼは、非対称の１つの中心を有する基質における非対称の炭素原子の周りの分子構造の反転を触媒し、それによって２つのラセマーゼを相互変換するイソメラーゼのサブセットである。エピメラーゼは、２つ以上の非対称の中心を有する基質における非対称の炭素原子の周りの構造の反転を触媒し、それによって２つのエピマーが相互変換するイソメラーゼの別のサブセットである。ラセマ−ゼ及びエピメラーゼは、アミノ酸及び誘導体、ヒドロキシ酸及び誘導体、炭水化物及びその誘導体に作用し得る。ＵＤＰ−ガラクトースとＵＤＰ−グルコースの相互変換は、ＵＤＰ−ガラクトース−４’−エピメラーゼによって触媒される。このエピメラーゼの適正な調節及び機能は、糖タンパク質及び糖脂質の合成に必須である。血中のガラクトースのレベルの上昇は、胎児のスクリーニングプログラムにおけるＵＤＰ−ガラクトース−４’−エピメラーゼの欠損に相関性があった（Ｇｉｔｚｅｌｍａｎｎ， Ｒ． （１９７２） Ｈｅｌｖ． Ｐａｅｄｉａｔ． Ａｃｔａ ２７：１２５−１３０）。
【００４２】
フォールディング酵素（ｆｏｌｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）の１クラスであるペプチジルプロリル・シス−トランス・イソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）は、タンパク質の成熟及び輸送における律速段階であると考えられるある種のプロリンイミド結合を異性化する。ＰＰＩａｓｅは、タンパク質におけるある種のプロリンイミド結合のシス−トランス異性化を触媒する。ＰＰＩａｓｅには、サイクロフィリンファミリー、ＦＫ５０６結合タンパク質ファミリー、及び新規に特徴づけられたｐａｒｖｕｌｉｎファミリーの進化的に関連性のない３つのファミリーがある（Ｒａｈｆｅｌｄ， Ｊ．Ｕ．他 （１９９４） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３５２： １８０−１８４）。
【００４３】
サイクロフィリン（ＣｙＰ）は、初めはＴ細胞活性化のインヒビターである免疫抑制剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の主受容体として同定された（Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ， Ｒ．Ｅ．他 （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６： ５４４−５４７； Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｍ．Ｗ．他 （１９８６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１： ８５４７−８５５５）。従って、ＣｙＰのペプチジルプロリルイソメラーゼ活性は、Ｔ細胞を活性化させるシグナル伝達経路の一部であると考えられる。その後の研究で、ＣｙＰのイソメラーゼ活性が、正確なタンパク質の折りたたみ及び／またはタンパク質の輸送に必須であり、タンパク質複合体の構築／分解並びにタンパク質の活性の調節に関与し得ることが分かった。例えば、ショウジョウバエにおいて、ＣｙＰ ＮｉｎａＡはロドプシンの正しい局在化に必要であり、哺乳動物ＣｙＰ（Ｃｙｐ４０）は、ステロイド受容体を結合するＨｓｐ９０／Ｈｓｐ７０複合体の一部である。哺乳動物ＣｙＰ（ＣｙｐＡ）は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）からのｇａｇタンパク質と結合することが分かった。この相互作用は、シクロスポリンによって抑制され得る。シクロスポリンは強力な抗ＨＩＶ−１活性を有するため、ＣｙｐＡは、ＨＩＶ−１の複製において必須の機能を果たしていると考えることができる。Ｃｙｐ４０は、転写因子ｃ−Ｍｙｂに結合してそれを活性化させることが分かった。この作用は、シクロスポリンによって逆にされる。この作用は、転写、形質転換、及び分化の調節にＣｙＰが関与することを示唆するものである（Ｂｅｒｇｓｍａ， Ｄ．Ｊ．他 （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２３２０４−２３２１４； Ｈｕｎｔｅｒ， Ｔ． （１９９８） Ｃｅｌｌ ９２： １４１−１４３； ａｎｄ Ｌｅｖｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｄ． ａｎｄ Ｎｅｓｓ， Ｓ．Ａ． （１９９８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． １：２０３−２１１）。
【００４４】
フォールディング酵素の別のクラスには、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼがある。タンパク質の折りたたみにおける主な律速段階の１つが、タンパク質の適正な構築に必須のチオール−ジスルフィド交換である。所定の比率の酸化チオールと還元チオールとを含む緩衝液で、還元された折りたたまれていないタンパク質をインキュベートすると天然の高次構造となるが、折りたたみの速度が遅いため、自然の高次構造への到達度がその大きさ及びそのタンパク質におけるシステインの数に比例して低下する。真核生物の小胞体及び原核生物の細胞膜周辺腔などのある種の細胞区画が、周りのサイトゾルより酸化した状態に維持される。これらの区画でジスルフィドが正しく生成される。しかしながら、その速度は通常の細胞プロセスには十分であるが、分泌タンパク質の合成には不十分である。プロテインジスルフィドイソメラーゼであるチオレドキシン及びグルタレドキシンは、ジスルフィド結合の形成を触媒することが可能であり、細胞における酸化還元環境を調節し、必要なチオール−ジスルフィド交換を可能とする（Ｌｏｆｅｒｅｒ， Ｈ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０：２６１７８−２６１８３）。
【００４５】
これらのタンパク質のそれぞれの機能はやや異なっているが、それら全てがジスルフィド含有酸化還元タンパク質の群に属する。これらの酸化還元タンパク質は、真核生物及び原核生物において広く見られ、保存された活性部位配列を含む。プロテインジスルフィドイソメラーゼは、真核生物の小胞体及び原核生物の細胞周辺腔に見られる。プロテインジスルフィドイソメラーゼは、折りたたまれているペプチド鎖においてそれ自体のジスルフィドをチオールと交換して機能する。これとは対照的に、還元されたチオレドキシン及びグルタレドキシンは、通常は細胞質で見られ、基質タンパク質のジスルフィドを直接還元して機能する。
【００４６】
これらの触媒分子は、ジスルフィド形成を促進するだけではなく様々な生理学的プロセスに関与する。チオレドキシン系は、例えばリボヌクレオチドレダクターゼの水素供与体として、及び酸化還元制御によって酵素の制御因子として働く。また、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、およびステロイド受容体などの転写因子の活性を調節する。近年、成人Ｔ細胞白血病由来因子、３Ｂ６−インターロイキン１、Ｔ細胞ハイブリドーマ由来（ＭＰ−６）Ｂ細胞刺激因子、及び初期妊娠因子などのいくつかのサイトカインや分泌サイトカイン様因子がチオレドキシンと同一であることが報告された（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ａ． （１９８５） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５４：２３７−２７１， Ａｂａｔｅ， Ｃ．他、 （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１１５７−１１６１， Ｔａｇａｙａ， Ｙ．他（１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８：７５７−７６４， Ｗａｋａｓｕｇｉ， Ｈ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：８０４−８０８， Ｒｏｓｅｎ， Ａ．他 （１９９５） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７−６２５−６３３）。チオレドキシンはまた、細胞成長の制御因子として及び免疫系のメディエーターとしての役割を含む様々な細胞外活性を有することが分かった（Ｍｉｒａｎｄａ−Ｖｉｚｕｅｔｅ， Ａ．他 （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１９０９９−１９１０３， Ｙａｍａｕｃｈｉ， Ａ．他 （１９９２） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：２６３−２７０）。
【００４７】
酸化還元酵素はイソメラーゼでもあり得る。酸化還元酵素は、酸化される基質から還元される基質への可逆的な電子の逆移送を触媒する。酵素のこのクラスには、脱水素酵素、水酸化酵素、酸化酵素、酸素転化酵素、過酸化酵素、及び還元酵素が含まれる。酸化還元酵素のレベルを適正に維持することは生理学的に重要である。ペントースリン酸経路は、例えば、還元剤ＮＡＤＰＨの生成に関与し、それと同時にグルコース−６−ホスファターゼをリボース−５−リン酸に酸化させる酵素を利用する。ＮＡＤＰＨは、還元的生合成が起こる反応のためのエネルギーとなる。リボース−５−リン酸及びその誘導体は、ＡＴＰ、補酵素Ａ、ＮＡＤ＋、ＦＡＤ、ＲＮＡ，及びＤＮＡなどの重大な意味をもつ生物分子の一部となる。ペントースリン酸経路は、酸化的枝分かれ経路及び非酸化的枝分かれ経路の双方を有する。グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ラクトナーゼ、及び６−リングルコン酸脱水素酵素などの酵素によって触媒される酸化的枝分かれ経路で、グルコース−６−リン酸とＮＡＤＰ＋がリブロース−６−リン酸とＮＡＤＰＨに変換される。ホスホメントースイソメラーゼ、ホスホメントースイエピメラーゼ、トランスケトラーゼ、及びトランスアルドラーゼなどの酵素によって触媒される非酸化的枝分かれ経路において、炭素数が３個、４個、５個、６個、及び７個の糖の間での相互転換が起こりうる。
【００４８】
イソメラーゼの別のサブグループにはトランスフェラーゼ（またはムターゼ）がある。トランスフェラーゼは、化学基を１つの化合物（供与体）から別の化合物（受容体）に転移する。これらの酵素によって転移される基の中には、アシル基、アミノ基、リン酸基（ホスホトランスフェラーゼまたはホスホムターゼ）及びその他の基が含まれる。トランスフェラーゼであるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼは、脂肪酸代謝の重要な成分である。このトランスフェラーゼの遺伝的欠損は、筋障害を引き起こし得る（Ｓｃｒｉｖｅｒ Ｃ．Ｒ．他 （１９９５） Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ ｐｐ．１５０１−１５３３）。
【００４９】
イソメラーゼの別のサブグループには、ポイソメラーゼがある。ポイソメラーゼは、ＤＮＡの形態状態に影響を及ぼす酵素である。例えば、トポイソメラーゼまたはそれらの調節における障害は、通常の生理に影響を及ぼし得る。トポイソメラーゼＩＩのレベルの低下は、毛細血管拡張性運動失調に関連する或る種のＤＮＡプロセスの障害に相関する（Ｓｉｎｇｈ， Ｓ． Ｐ． ら （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６ ： ３９１９−３９２９）。
【００５０】
リガーゼ
リガーゼは、２つの基質分子間の結合の形成を触媒する。このプロセスには、ＡＴＰまたは類似のエネルギー供与体におけるピロリン酸結合の加水分解が伴う。リガーゼは、炭素−酸素、炭素−硫黄、炭素−窒素、炭素−炭素、及びリン酸エステル結合を含み得る形成する結合の種類に基づいて分類される。
【００５１】
炭素−酸素結合を形成するリガーゼには、翻訳に役割を果たす重要なＲＮＡ関連酵素であるアミノアシル運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）合成酵素が含まれる。タンパク質の生合成は、適当なｔＲＮＡと結合を形成する各アミノ酸に依存する。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、アミノ酸の活性化及びそのアミノ酸に対応するｔＲＮＡの接着に作用する。２０のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が構造から２つのクラスに分類することができ、それぞれのクラスは触媒ドメインの固有の形状によって特徴づけられている。クラスＩ酵素は、ヌクレオチド結合ロスマンフォールドに基づいた触媒ドメインを含む。クラスＩＩ酵素は、７本鎖逆平行βシートモチーフ、Ｎ末端調節ドメイン、及びＣ末端調節ドメインからなる中央の触媒ドメインを含む。クラスＩＩ酵素は、酵素の構造に基づいてヘテロ二量体およびホモ二量体の２つのグループに分類され、ホモ二量体のグループは、Ｎ末端調節ドメインの構造及びＣ末端調節ドメインの構造によって更に分類される（Ｈａｒｔｌｅｉｎ， Ｍ．およびＣｕｓａｃｋ， Ｓ． （１９９５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４０：５１９−５３０）。抗アミノアシルｔＲＮＡ自己抗体が、皮膚筋炎及び多発性筋炎の患者によって産生され、合併症を伴う間質性肺疾患（ＩＬＤ）に強い相関性がある。これらの抗体は、ウイルス感染に応答して産生されると思われ、コクサッキーウィルスを用いて動物においてウイルス筋炎を実験的に引き起こした。
【００５２】
炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ（酸−チオールリガーゼ）は、炭素原子含有基質（炭素基質）の分子間輸送を伴う多数の細胞内生合成中間代謝プロセスを仲介する。このような反応の例には、クエン酸回路、脂肪酸および長鎖リン脂質の合成、アルコールおよびアルデヒドの合成、中間代謝物の合成、およびアミノ酸分解経路に関与する反応がある。これらの反応の中には、ＡＤＰ若しくはＡＮＰとピロリン酸へのＡＴＰの変換の形であるエネルギーが必要な反応もある。
【００５３】
多くの場合、炭素基質は、少なくとも２つの炭素原子を含む小分子に由来する。炭素基質は、細胞内で炭素基質キャリア分子として働く大きな分子に共有結合している場合が多い。上記した生合成機構では、キャリア分子は補酵素Ａである。補酵素Ａ（ＣｏＡ）は、ヌクレオチドＡＤＰの誘導体に構造的に関連し、ホスホジエステル結合によりアデノシン３’，５’−ニリン酸のαリン酸基に結合した４’−ホスホパンテテインからなる。４’−ホスホパンテテインの末端チオール基は、炭素基質の結合を形成するのための部位として作用する。細胞における生合成および中間代謝の際にキャリア分子としてＣｏＡを用いる主な炭素基質には、アセチル成分、サクシニル成分、およびプロピオニル成分が含まれ、総称してアシル基と呼ばれる。他の炭素基質には、脂肪酸酸化中間体として働くエノイル脂質（ｅｎｏｙｌ ｌｉｐｉｄ）、並びにアセチルＣｏＡ流入調節因子／ミトコンドリアアシル基輸送タンパク質として働くカルニチンが含まれる。アシルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡはそれぞれ、アシルＣｏＡ合成酵素およびアセチルＣｏＡ合成酵素によって細胞内で生合成される。
【００５４】
脂肪酸の活性化は、少なくとも３つの型のアシルＣｏＡ合成酵素、すなわち（１）アセチルＣｏＡ合成酵素、（２）中鎖アシルＣｏＡ合成酵素、および（３）アシルＣｏＡ合成酵素の活性によって仲介される。アセチルＣｏＡ合成酵素は、アセテートおよび幾つかの他の低分子量カルボン酸を活性化させ、筋ミトコンドリアおよびその他の組織のサイトゾルに見られる。中鎖アシルＣｏＡ合成酵素は、主に食事に由来する４個から７個の炭素原子を含む脂肪酸を活性化させ、肝ミトコンドリアのみに存在する。アシルＣｏＡ合成酵素は、６個から２０個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸に特異的であって、ミクロソームおよびミトコンドリアに見られる。アシルＣｏＡ合成酵素活性に関連するタンパク質が、細菌、酵母、植物、マウス、およびヒトを含む様々なソースで確認された。アシルＣｏＡ合成酵素の活性は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによる酵素のリン酸化によって調節され得る。
【００５５】
炭素−窒素結合を形成するリガーゼには、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いるアンモニアによるグルタミン酸のグルタミンへのアミノ化を触媒するグルタミン合成酵素（グルタミン酸アンモニアリガーゼ）などのアミド合成酵素が含まれる。グルタミンは、新規のピリミジンヌクレオチド合成、並びにプリンおよびピリミジンリボヌクレオチド相互変換に関与する様々なアミド転移反応におけるアミノ基の主な供給源である。グルタミン合成酵素の過剰な発現が、原発性肝癌で観察された（Ｃｈｒｉｓｔａ， Ｌ．他 （１９９４） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ． １０６：１３１２−１３２０）。
【００５６】
酸−アミノ−酸リガーゼ（ペプチド合成酵素）は、真核細胞およびある種の細菌における細胞内タンパク質の分解の主経路であるユビキチン結合系（ＵＣＳ：ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）に関連するユビキチンプロテアーゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）によって代表される。ＵＣＳは、異常なタンパク質の除去を仲介し、遺伝子転写および細胞周期の進行などの細胞内のプロセスを制御する重要な調節タンパク質の半減期を調節する。ＵＣＳ経路では、分解の標的となったタンパク質に小さな耐熱性タンパク質であるユビキチン（Ｕｂ）が結合する。Ｕｂは、まずユビキチン活性化酵素（Ｅ１）によって活性化され、次に幾つかのＵｂ結合酵素（Ｅ２）の内の１つに輸送される。次にＥ２が、Ｕｂ分子をそのＣ末端グリシンを介して標的タンパク質の内部のリシン（受容体リシン）に結合する。次に、ユビキチン化されたタンパク質が、大きなマルチサブユニット蛋白分解酵素複合体であるプロテアソームによって認識されて分解される。ユビキチンは、ユビキチンプロテアーゼによる再利用のために放出される。ＵＣＳは、有糸分裂サイクルキナーゼ（ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｋｉｎａｓｅｓ）、オンコプロテイン、ｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、ウイルス蛋白、シグナル伝達に関連する細胞表面受容体、転写調節因子、および変異した或いは損傷したタンパク質の分解に関与する（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ， Ａ． （１９９４） Ｃｅｌｌ ７９：１３−２１）。マウスプロトオンコジーンであるＵｎｐは、核ユビキチンプロテアーゼをコードする。この核ユビキチンプロテアーゼが過剰に発現すると、ＮＩＨ３Ｔ３細胞が癌化する。この遺伝子のヒト相同体のレベルは、小細胞癌および肺の腺癌において一貫して上昇している（Ｇｒａｙ， Ｄ． Ａ． （１９９５） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：２１７９−２１８３）。
【００５７】
シクロリガーゼおよび他の炭素−窒素リガーゼは、プリンおよびピリミジンの生合成の新規の経路に関与する様々な酵素および酵素複合体を含む。これらの経路がＲＮＡおよびＤＮＡの双方の複製のためのヌクレオチドの合成に極めて重要であるため、これらの酵素の多くは、癌および感染症などの細胞増殖異常の治療のための臨床薬の標的である。
【００５８】
プリンの生合成は、アミノ酸であるグリシンおよびグルタミン、並びに他の小分子から新たに起こる。このプロセスにおける３つの重要な反応は、グリシンアミド−リボヌクレオチドシンテターゼ（ＧＡＲＳ）、アミノイミダゾールリボヌクレオチドシンテターゼ（ＡＩＲＳ）、およびグリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＲＴ）からなる３機能酵素によって触媒される。これら３つの酵素が共同で、ｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅにグリシンを結合することにより、アデニル酸ヌクレオチドおよびグアニル酸ヌクレオチド双方の前駆体であるホスホリボシルアミノイミダゾールが生成される。この３機能タンパク質は、ダウン症候群の病理学に関係する（Ａｉｍｉ， Ｊ．他 （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８：６６６５−６６７２）。アデニロコハク酸シンテターゼは、ＡＴＰ合成経路の重要なステップであるイノシン酸をアデニロコハク酸に変換するプリン生合成の後半のステップを触媒する。この酵素はまた、尿素回路に類似の反応を触媒する別の炭素−窒素リガーゼ、すなわちアルギニノコハク酸シンテターゼに類似している（Ｐｏｗｅｌｌ， Ｓ． Ｍ．他 （１９９２） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０３：４−１０）。
【００５９】
新規のプリンの合成と同様に、ピリミジンヌクレオチドであるｕｒｉｄｙｌａｔｅおよびｃｙｔｉｄｙｌａｔｅの新規の合成も、この場合オロト酸およびホスホリボシルピロリン酸（ＰＰＲＰ）に由来するオロチジル酸（ｏｒｏｔｉｄｙｌａｔｅ）ヌクレオチドである共通の前駆体から起こる。３つの炭素−窒素リガーゼを含む３機能酵素は、このプロセスにおいて重要な役割を演じる。この場合、酵素であるアスパラギン酸トランスカルバミラーゼ（ＡＴＣａｓｅ）、カルバミルリン酸シンテターゼＩＩ、およびジヒドロオロターゼ（ＤＨＯａｓｅ）が、ＣＡＤと呼ばれる１つの遺伝子によってコードされる。これら３つの酵素が共同で、ピリミジン生合成の開始反応物であるグルタミン、ＣＯ２、およびＡＴＰを結合することにより、オロト酸およびｏｒｏｔｉｄｙｌａｔｅの前駆体であるｄｉｈｙｄｒｏｏｒｏｔａｔｅが生成される（Ｉｗａｈａｎａ， Ｈ．他 （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１９：２４９−２５５）。更なるステップにより、ウリジンヌクレオチドがｏｒｏｔｉｄｙｌａｔｅから合成される。シチジンヌクレオチドは、アミノ供与体としてのグルタミンおよび酵素ＣＴＰシンテターゼを用いるＵＴＰのアミド化により、ウリジン−５’−三リン酸（ＵＴＰ）から得られる。ヒトＣＴＰシンセターゼにおける調節性変異により、癌の治療に広く用いられている薬剤に対する多薬剤耐性が付与されると考えられている（Ｙａｍａｕｃｈｉ， Ｍ．他 （１９９０） ＥＭＢＯ Ｊ． ９：２０９５−２０９９）。
【００６０】
炭素−炭素結合を形成するリガーゼには、カルボキシラーゼであるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼが含まれる。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを利用したＣＯ２とＨ２ＯによるアセチルＣｏＡのカルボキシル化を触媒する。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、長鎖脂肪酸の生合成における律速段階である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの２つのアイソフォームであるＩ型およびＩＩ型は、組織特異的にヒトで発現される（Ｈａ， Ｊ．他 （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１９：２９７−３０６）。ピルビン酸カルボキシラーゼは核でコードされるミトコンドリア酵素であって、ピルビン酸のオキサロ酢酸への変換を触媒する。オキサロ酢酸は、クエン酸回路の重要な中間体である。
【００６１】
リン酸エステル結合を形成するリガーゼには、ＤＮＡの複製および修復に関与するＤＮＡリガーゼが含まれる。ＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰ加水分解によるエネルギーを用いて、あるヌクレオチドの遊離５’−リン酸をまず活性化させ、次にそれを隣接するヌクレオチドの３’−ＯＨ基と反応させて、ＤＮＡ鎖における隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を形成する。この再接合反応は、新しくＤＮＡを複製するプロセスにおいて一過的に形成される岡崎フラグメントと呼ばれる小さなＤＮＡ断片を連結するＤＮＡ複製、並びにＤＮＡ修復の両方で起こっている。ＤＮＡ修復とは、ＤＮＡの複製または転写が起こる前に、酸化的な障害、加水分解攻撃、またはＤＮＡの制御のきかないメチル化によって生成される偶然の塩基の変化を修正するプロセスのことである。ブルーム症候群は遺伝性のヒト疾患であって、ＤＮＡ結合の部分的な欠損が起こり、それによって癌が発生し易くなる（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．他 （１９９４） Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｐ．２４７）。
【００６２】
補助因子生合成酵素
補酵素および補欠分子族を含む補助因子は、酵素の反応に必要な低分子量の無機または有機化合物である。ある特定の補助因子、すなわちモリブデン含有補助因子であるｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎは、硝酸還元酵素、亜硫酸酸化酵素、キサンチン脱水素酵素、およびアルデヒド酸化酵素を含む様々な酵素の活性に必要である遍在性の分子である。
【００６３】
ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎの合成は、２つのステップの反応経路を介して行われる。第１に、グアノシン誘導体が前駆体Ｚと呼ばれる中間体に変換される。次にこの前駆体Ｚが、ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎに変換される。ヒトでは、ＭＯＣＳ１転写物が、第１のステップに関与するＭＯＣＳ１ ＡおよびＭＯＣＳ１ Ｂの２つの酵素をコードする。ＭＯＣＳ２も１つの転写物であって、２つの重複する読み枠で第２のステップを触媒する酵素であるｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎシンターゼの２つのサブユニットをコードする（Ｒｅｉｓｓ， Ｊ．他 （１９９９） Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ６４：７０６−１１）。アスペルギルス−ニデュランスでは、ＣｎｘＡＢＣがｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎ合成経路における第１のステップを触媒する。ヒトにおける場合と同様にアスペルギルス−ニデュランスの場合も、第２のステップはｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎシンターゼによって触媒される。加えて、変換因子であるＣｎｘＦも、アスペルギルス−ニデュランスにおいて見出された（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ， Ｍ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１４８６９−１４８７６）。ＣｎｘＦは、このシンターゼに硫黄原子を輸送してこのシンターゼが前駆体Ｚにｄｉｔｈｉｏｌｅｎｅ基を付加することができるようにする酵素である大腸菌ＭｏｅＢに類似している。ＣｎｘＦも、アスペルギルス−ニデュランスにおいて同様の反応を仲介すると考えられている。ＣｎｘＦはまた、チアミン生合成に必要な酵素であるＴｈｉＦ、異質細胞（ｈｅｔｅｒｃｙｓｔ）形成に関与するＨｅｓＡ、および真核生物ユビキチン活性化タンパク質Ｅ１に類似している。しかしながら、ＣｎｘＦとこれらのタンパク質との間には明確な生理学的な関連性が存在しない。
【００６４】
ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎの生合成障害により、ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎ依存性酵素活性が消失する。ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎ依存性酵素の欠損により、新生児発作、精神薄弱、および水晶体転移が引き起こされる。補助因子代謝物の欠損により生じるその他の疾患には、悪性貧血およびメチルマロン酸性尿症が含まれる。
【００６５】
新規のヒト酵素分子、およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。この新規の組成物は、自己免疫／炎症性の疾患、遺伝性疾患、神経疾患、及び癌を含む細胞増殖異常の診断・治療・予防において有用であり、また、ヒト酵素分子の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響についての評価にも有用である。
【００６６】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＨＥＭ」、個別にはそれぞれ「ＨＥＭ−１」、「ＨＥＭ−２」、「ＨＥＭ−３」、「ＨＥＭ−４」、「ＨＥＭ−５」、「ＨＥＭ−６」、「ＨＥＭ−７」、「ＨＥＭ−８」、「ＨＥＭ−９」、「ＨＥＭ−１０」、「ＨＥＭ−１１」、「ＨＥＭ−１２」、「ＨＥＭ−１３」、「ＨＥＭ−１４」、「ＨＥＭ−１５」、「ＨＥＭ−１６」、「ＨＥＭ−１７」、「ＨＥＭ−１８」、「ＨＥＭ−１９」、「ＨＥＭ−２０」、「ＨＥＭ−２１」、「ＨＥＭ−２２」、「ＨＥＭ−２３」、「ＨＥＭ−２４」、「ＨＥＭ−２５」、および「ＨＥＭ−２６」と呼ぶヒト酵素分子である精製されたポリペプチドを提供する。本発明の一実施態様では、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。別法では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００６７】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたポリペプチドをコードする。別法では、このポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択される。
【００６８】
更に、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。別法では、本発明は、この組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。更なる別法では、本発明は、この組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物を提供する。
【００６９】
また、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの生産方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドの発現に好適な条件下で、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、（ｂ）このように発現したポリペプチドを回収するステップとを含む。
【００７０】
更に、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００７１】
更に、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、（ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｄ）前記（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のＲＮＡ等化物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００７２】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、（ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｄ）前記（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のＲＮＡ等化物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプルにおいて検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）前記サンプル内の標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を構成する少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むプローブと前記サンプルをハイブリダイズさせるステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片とでハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、該ステップと、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含む。別法では、前記プローブは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００７３】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、（ｃ）前記（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｄ）前記（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のＲＮＡ等化物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプルにおいて検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するステップと、（ｂ）増幅された前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含む。
【００７４】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含む効果的な量のポリペプチド及び好適な医薬用賦形剤を含む組成物を提供する。一実施例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的ＨＥＭの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００７５】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドのアゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）このサンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＨＥＭの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００７６】
更に、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドのアンタゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）このサンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアンタゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＨＥＭの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００７７】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの化合物と結合させるステップと、（ｂ）このポリペプチドとこの試験化合物との結合を検出して、このポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップとを含む。
【００７８】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法は、（ａ）このポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも１つの化合物と結合させるステップと、（ｂ）この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性を評価するステップと、（ｃ）この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性と、この試験化合物の不在下でのこのポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性の変化が、このポリペプチドの活性を調節する化合物の存在を示唆するという特徴を有する。
【００７９】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択された配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【００８０】
本発明はさらに、試験化合物の毒性を評価する方法を提供する。この方法は、（ａ）核酸を含む生体サンプルを前記試験化合物で処理するステップと、（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸をプローブとハイブリダイズするステップと、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を測定するステップと、（ｄ）前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量を、未処理の生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量とを比較するステップとを含み、前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量の差異が試験化合物の毒性を示唆する。この方法における前記プローブは、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、（３）前記（１）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（４）前記（２）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（５）前記（１）乃至（４）のＲＮＡ等価物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの連続する少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。また、前記ハイブリダイゼーションは、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行わる。また、前記標的ポリヌクレオチドが、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、（３）前記（１）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（４）前記（２）に相補的なポリヌクレオチド配列と、（５）前記（１）乃至（５）のＲＮＡ等価物とを含む。代替的に前記標的ポリヌクレオチドは前記ポリヌクレオチド配列の断片である。
【００８１】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。
【００８２】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００８３】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【００８４】
（定義）
用語「ＨＥＭ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＨＥＭのアミノ酸配列を指す。
【００８５】
用語「アゴニスト」は、ＨＥＭの生物学的活性を強める、或いは模倣する分子を指す。このアゴニストは、ＨＥＭに直接相互作用するか、或いはＨＥＭが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＨＥＭの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００８６】
用語「アレル変異配列」は、ＨＥＭをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。ある遺伝子は、天然型のアレル変異配列が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。
【００８７】
ＨＥＭをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＨＥＭと同じポリペプチド或いはＨＥＭの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＨＥＭと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＨＥＭの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれ得る。
【００８８】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００８９】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって行われる。
【００９０】
用語「アンタゴニスト」は、ＨＥＭの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、ＨＥＭに直接相互作用するか、或いはＨＥＭが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＨＥＭの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００９１】
用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２、及びそれらの断片、Ｆｖ断片などの無傷の分子を指す。ＨＥＭポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から、或いは化学的に合成可能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００９２】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００９３】
本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、ＤＮＡと、ＲＮＡと、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と、ホスホロチオネートやメチルホスホネート、ベンジルホスホネート（ｂｅｎｚｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）などの修飾された骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を有するオリゴヌクレオチドと、２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖などの修飾された糖を有するオリゴヌクレオチドと、５−メチルシトシンまたは２’−ｄｅｏｘｙｕｒａｃｉｌ、７−ｄｅａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅなどの修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。アンチセンス分子は、化学合成や転写を含む任意の方法で作り出すことができる。相補的アンチセンス分子は、一度細胞に導入されると、細胞によって作られた天然の核酸配列と塩基対となって二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「負」または「マイナス」という表現はアンチセンス鎖であり、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である。
【００９４】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のＨＥＭ、合成のＨＥＭまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００９５】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「５’ＡＧＴ３’」が相補的な配列「３’ＴＣＡ５’」と対をなす。
【００９６】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。ＨＥＭ若しくはＨＥＭの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡなど）を含む水溶液に展開され得る。
【００９７】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにＤＮＡ配列の解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’及び／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配列もある。
【００９８】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。
元の残基　　　　　　　保存的な置換
Ａｌａ　　　　　　　　　Ｇｌｙ， Ｓｅｔ
Ａｒｇ　　　　　　　　　Ｈｉｓ， Ｌｙｓ
Ａｓｎ　　　　　　　　　Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ
Ａｓｐ　　　　　　　　　Ａｓｎ， Ｇｌｕ
Ｃｙｓ　　　　　　　　　Ａｌａ， Ｓｅｒ
Ｇｌｎ　　　　　　　　　Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ
Ｇｌｕ　　　　　　　　　Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ
Ｇｌｙ　　　　　　　　　Ａｌａ
Ｈｉｓ　　　　　　　　　Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ
Ｉｌｅ　　　　　　　　　Ｌｅｕ， Ｖａｌ
Ｌｅｕ　　　　　　　　　Ｉｌｅ， Ｖａｌ
Ｌｙｓ　　　　　　　　　Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ
Ｍｅｔ　　　　　　　　　Ｌｅｕ， Ｉｌｅ
Ｐｈｅ　　　　　　　　　Ｈｉｓ， Ｍｅｔ， Ｌｅｕ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ
Ｓｅｒ　　　　　　　　　Ｃｙｓ， Ｔｈｒ
Ｔｈｒ　　　　　　　　　Ｓｅｒ， Ｖａｌ
Ｔｒｐ　　　　　　　　　Ｐｈｅ， Ｔｙｒ
Ｔｙｒ　　　　　　　　　Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ
Ｖａｌ　　　　　　　　　Ｉｌｅ． Ｌｅｕ， Ｔｈｒ
一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、ａ）置換された領域のポリペプチドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、ｂ）置換された部位の分子の電荷または疎水性、及び／または、ｃ）側鎖の大半が維持される。
【００９９】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【０１００】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって修飾されたポリペプチドのことである。
【０１０１】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１０２】
用語「断片」は、ＨＥＭまたはＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或いは、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【０１０３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【０１０４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２のある断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる。
【０１０５】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、それに続くオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１０６】
「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間または２つ以上のポリペプチド配列間の配列類似性である。この配列類似性は配列同一性と言い換えることができる。
【０１０７】
ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」または「％の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比較を行うことができる。
【０１０８】
ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。このプログラムはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１０９】
別法では、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ） （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）が提供する、広く用いられている無料の配列比較アルゴリズム一式が、ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含む幾つかのソース及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメータと共に用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒｉｌ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｎを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【０１１０】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【０１１１】
高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードの縮重によって類似のアミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に同じタンパク質をコードする様々な核酸配列を作製できることを理解されたい。
【０１１２】
ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」または「％の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）が保存される。
【０１１３】
ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ バージョン３．１２ｅ配列アラインメントプログラム（上記）に組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いる対方式のポリぺプチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、及び「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１１４】
別法では、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【０１１５】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペプチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【０１１６】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ（キロベース）〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【０１１７】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１１８】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配列が高い相同性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件下で、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性即ちストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の決定において特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過程は、目的のストリンジェンシーにするためにその最中に条件の変更が可能であり、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【０１１９】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄過程を行う際の温度によっても左右される。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低く選択される。このＴｍは、（所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーションの条件は、周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他による， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版の１−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ； 特に２巻の９章に記載されている。
【０１２０】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２ｘ ＳＳＣ及び約１％のＳＤＳの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。ＳＳＣの濃度は、約０．１％のＳＤＳが存在の下、約０．１〜２ｘ ＳＳＣの範囲である。通常は、ブロッキング試薬を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの切断され変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。
【０１２１】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。
【０１２２】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１２３】
「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴をもつ。
【０１２４】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすＧＶＲＥＤのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＨＥＭのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１２５】
用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１２６】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１２７】
用語「調節」は、ＨＥＭの活性の変化を指す。例えば、調節によって、ＨＥＭのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１２８】
用語「核酸」及び「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指し、一本鎖若しくは二本鎖であって、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、任意のＤＮＡ様物質、及びＲＮＡ様物質である。
【０１２９】
「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般に、機能的に結合したＤＮＡ配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードする領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【０１３０】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組成物が溶解性となる。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る。
【０１３１】
ＨＥＭの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＨＥＭの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１３２】
「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＨＥＭやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレオチドにアニーリングした後、あるＤＮＡポリメラーゼ酵素によって、標的のＤＮＡ一本鎖に沿って伸長される。プライマーの組は、例えば、ＰＣＲ法における核酸配列の増幅（及び同定）に用いることができる。
【０１３３】
本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及びプライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【０１３４】
プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．他による、１９８９年、名称「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版の１−３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）、またはＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他による、１９８７年、名称「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）、並びに Ｉｎｎｉｓ他による、１９９０年、名称「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ．）を参照されたい。ＰＣＲ用のプライマーの組は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ （Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用いて、ある既知の配列から引き出すことができる。
【０１３５】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのＰＣＲ用のプライマーの対の選択、及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌクレオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用である。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈ Ｗｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ ＴＸより入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｏｐｅ）におけるプライマーの設計に有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ１より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂａｒａｙ）」を入力できる。また、Ｐｒｉｍｅｒ３は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように変更することもできる）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（ＵＫ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ より入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片は、例えば、ＰＣＲ法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイエレメント、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。
【０１３６】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化学合成によって作られる場合も多いが、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ に記載されたような遺伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【０１３７】
別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワクチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニアウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【０１３８】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写や翻訳、またはＲＮＡの安定性を調節する宿主またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１３９】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分が含まれる。
【０１４０】
本明細書において、ＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」とは、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１４１】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＨＥＭ、ＨＥＭをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１４２】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１４３】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１４４】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１４５】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板には、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこにポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１４６】
「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１４７】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条件下で起こり、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、バクテリオファージまたはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１４８】
本明細書における「遺伝子組換え生物」とは、当分野で周知の遺伝子組換え技術などを用いて、人間が生物の１つ以上の細胞に異種の核酸を導入した任意の生物であり、動物及び植物を含むが、それらに限定されるものではない。微量注入や組換えウイルスに感染させるなどの慎重な遺伝子操作によって、細胞の前駆体に直接或いは間接的に異種核酸を細胞に導入する。「遺伝子操作」とは、典型的な交雑育種やｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精ではなく、組換えＤＮＡ分子を導入することである。本発明に従った遺伝子組換え生物には、細菌及びラン藻類、菌類、植物、動物が含まれる。本発明の単離されたＤＮＡは、当分野で周知の、例えば、感染、形質移入、形質転換、トランス接合（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）などの方法によって、宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをそのような生物に導入する技術は周知であり、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）に記載されている。
【０１４９】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメータ設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｎによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一性が極めて高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの択一的スプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば、或る集団、病態、病態の性向を示唆し得る。
【０１５０】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメータ設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｐによって、あるポリペプチド配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なくとも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプチドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、或いはそれ以上の同一性を示し得る。
【０１５１】
（発明）
本発明は、新規のヒト酵素分子（ＨＥＭ）及びＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した自己免疫／炎症性の疾患、遺伝性疾患、神経疾患、及び癌を含む細胞増殖異常の診断、治療、及び予防に関する。
【０１５２】
表１は、本発明のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の識別番号を示す。各ポリヌクレオチドおよびそれに対応するポリペプチドは、１つのインサイトプロジェクト識別番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ ＩＤ）に相関する。各ポリペプチド配列は、記載されているようにポリペプチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）の両方によって示されている。各ポリヌクレオチド配列は、記載されているようにポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびインサイトポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）の両方によって示されている。
【０１５３】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｅｐｔ）データベースにおいてＢＬＡＳＴ解析により同定された本発明のポリペプチドに相同性を有する配列を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、ＧｗｎＢａｎｋ相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１５４】
表３は、本発明の各ポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、潜在的なリン酸化部位および潜在的なグリコシル化部位を示す。列６は、シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１５５】
表２および表３は共に、本発明の各ポリペプチドの特性を一覧にしたものであって、これらの特性は請求するポリペプチドが酵素分子であることを立証するものである。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、そのＭ１残基からＥ３８４残基において、ドブネズミβアラニンシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２０３１０６）と８４％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２を参照）。ＢＬＡＳＴの確率スコアは０．０であり、これは探しているポリペプチド配列アラインメントが偶然の一致により得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５はまた、炭素−窒素加水分解酵素ドメインを有する。これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３を参照）。ＢＬＩＭＰＳ解析、更にＢＬＡＳＴ解析から得られたデータによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５が加水分解酵素であることが裏付けられた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６は同様の方法で解析してアノテーションを付けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２６の解析のためのアルゴリズムおよびパラメータを表７に記載する。
【０１５６】
表４に示されているように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列、またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列、或いはこれらの２種類の配列のあらゆる組み合わせを用いて組み立てた。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するインサイトポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さを示す。列４は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５は、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡから推定されるコード配列（エキソン）、および／またはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方からなる群に対応する識別番号を示す。これらの配列を用いて本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を組み立てた。表４の列６および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するｃＤＮＡ配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１５７】
表４の列５に示されている識別番号は、具体的には、例えばインサイトｃＤＮＡおよびそれらに対応するｃＤＮＡライブラリの識別番号を示す。例えば、３５４００８４Ｈ１はインサイトｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＳＥＭＶＮＯＴ０４はそれが由来するｃＤＮＡライブラリである。ｃＤＮＡライブラリが示されていないインサイトｃＤＮＡは、プールされているｃＤＮＡライブラリ（例えば、ＳＸＡＤ９００８３Ｖ１）に由来する。または、列５の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡすなわちＥＳＴ（例えば、ｇ２７９５８８８）の識別番号の場合もある。または、列５の識別番号は、Ｇｅｎｓｃａｎ分析によって推定されるゲノムＤＮＡのコード領域の場合もある。このＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列は、配列を組み立てる前に編集する場合がある（実施例４を参照）。または、列５の識別番号は、“ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ”アルゴリズムによってｃＤＮＡおよびＧｅｎｓｃａｎ推定エキソンの両方からなる群の場合もある（実施例５を参照）。または、列５の識別番号は、“ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ”アルゴリズムによってｃＤＮＡおよびＧｅｎｓｃａｎ推定エキソンの両方からなる群の場合もある（実施例５を参照）。場合によっては、列５に示されている配列の範囲と重複するインサイトｃＤＮＡの範囲が得られ、最終的なコンセンサス配列が決定されるが、それに相当するインサイトｃＤＮＡの識別番号は示されていない。
【０１５８】
表５は、インサイトｃＤＮＡ配列を用いて組み立てられたこれらの完全長ポリヌクレオチド配列が由来する代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。代表的なｃＤＮＡライブラリとは、上記ポリヌクレオチド配列の組み立ておよび決定に用いられたインサイトｃＤＮＡ配列を最も多く含むインサイトｃＤＮＡライブラリのことである。表５に示されているｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織およびベクターが表６に示されている。
【０１５９】
本発明はまた、ＨＥＭの変異体も含む。好適なＨＥＭの変異体は、ＨＥＭの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつＨＥＭアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１６０】
本発明はまた、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、ＨＥＭをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１６１】
本発明はまた、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、ＨＥＭの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１６２】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＨＥＭをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み合わせは、天然のＨＥＭのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【０１６３】
ＨＥＭをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のＨＥＭのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するＨＥＭ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞または原核宿主に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＨＥＭ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【０１６４】
本発明はまた、ＨＥＭ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＨＥＭまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【０１６５】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７； ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１．を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１６６】
当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。好ましくは、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３或いは３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７； Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３．を参照）。
【０１６７】
当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＨＥＭをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの方法では、一般的なプライマー及び入れ子プライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ ２：３１８−３２２を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．ら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：８１８６を参照）。キャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む（例えば、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。（例えば、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ． 他 （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０を参照）。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、ＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含量が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計される。
【０１６８】
完全長のｃＤＮＡをスクリーニングする場合は、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５’領域を有する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１６９】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能である。出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ及びＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。
【０１７０】
本発明の別の実施例では、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＨＥＭ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＨＥＭのクローン化及び発現に利用可能である。
【０１７１】
種々の目的でＨＥＭをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化パターンの変更、コドン選択の変更、スプライスバリアントの作製等が可能である。
【０１７２】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャフリング技術を用いてシャフリングして、ＨＥＭの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＨＥＭの生物学的特性を変更或いは改良することができる。ＤＮＡシャフリングは、ＰＣＲ法による遺伝子断片の組換えで遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。次に、このライブラリを、目的の特性を有する遺伝子変異体を同定するために選択或いはスクリーニングする。これらの好ましい変異体をプールし、ＤＮＡシャフリング及び選択／スクリーニングを繰り返す。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムな位置に変異がある１つの遺伝子の断片を、目的の特性が最適化するまで、組換え及びスクリーニング、シャフリングを実施することもできる。別法では、所定の遺伝子の断片を、同じ或いは異なった種の同じ遺伝子ファミリーの相同な遺伝子の断片で組換え、それによってプロトコルに従った調節可能な方法で、多数の天然遺伝子の遺伝子多様性を最大にすることができる。
【０１７３】
別の実施例によれば、ＨＥＭをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＨＥＭ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実行可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ５５−６０； Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．ら（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４を参照）。また、合成の自動化は例えばＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＨＥＭのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１７４】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ． 及び Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１を参照）を用いて実質的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシークエンシングにより確認することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前出、ｐｐ２８−５３を参照）。
【０１７５】
生物学的に活性なＨＥＭを発現させるために、ＨＥＭをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメントは、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＨＥＭをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＨＥＭをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０１−１８−１６２．を参照）。
【０１７６】
当業者に周知の方法を用いて、ＨＥＭをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる。（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章及び１３章１−４章を参照）。
【０１７７】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＨＥＭをコードする配列の保持及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． 他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１； Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． １９１−１９６、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他 （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． 他（１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１７８】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＨＥＭをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９．を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＨＥＭが必要な場合は、ＨＥＭの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【０１７９】
ＨＥＭの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． ら （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、及びＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． ら （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１−１８１−１８４．を参照）。
【０１８０】
植物系もＨＥＭの発現に使用可能である。ＨＥＭをコードする配列の転写は、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或いはＴＭＶ（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． ら． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３ ： １６７１−１６８０ ； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． ら （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ： ８３８−８４３ ； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． ら （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５を参照）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。（例えば、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ ＮＹ， ｐｐ．１９１−１９６を参照）。
【０１８１】
哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＨＥＭをコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞にＨＥＭを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用いることが可能である。
【０１８２】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているものより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０１８３】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＨＥＭの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＨＥＭをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１８４】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能である。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれｔｋ−またはａｐｒ−細胞において使用される。（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対する耐性を与える（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−３５７０； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。さらに選択に利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤが文献に記載されている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．他（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−１３１を参照）。
【０１８５】
マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＨＥＭをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＨＥＭをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＨＥＭをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１８６】
一般に、ＨＥＭをコードする核酸配列を含み、ＨＥＭを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８７】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＨＥＭの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ＨＥＭ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。（例えば、 Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他．（１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ； Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ＮＹ； 及びＰｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９０） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【０１８８】
種々の標識技術及び結合技術が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＨＥＭをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。
【０１８９】
ＨＥＭをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換された細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用されるその配列及び／またはそのベクターによる。ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＨＥＭの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１９０】
更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０１９１】
本発明の別の実施例では、ＨＥＭをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＨＥＭタンパク質が、ＨＥＭの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、ＨＥＭをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＨＥＭが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ． （１９９５、前出 ｃｈ １０）．に記載されている。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【０１９２】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＨＥＭの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、３５Ｓメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１９３】
本発明のＨＥＭまたはその断片を用いて、ＨＥＭに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＨＥＭへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１９４】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＨＥＭの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、化合物は、ＨＥＭが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＨＥＭを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。ＨＥＭを発現する細胞またはＨＥＭを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＨＥＭまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１９５】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＨＥＭと結合させるステップと、ＨＥＭとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、細胞遊離剤、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１９６】
本発明のＨＥＭまたはその断片を用いて、ＨＥＭの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、ＨＥＭが少なくとも１つの試験化合物と結合する、ＨＥＭの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＨＥＭの活性が試験化合物不在下でのＨＥＭの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＨＥＭの活性の変化は、ＨＥＭの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をＨＥＭの活性に適した条件下でＨＥＭを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは細胞遊離系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、ＨＥＭの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１９７】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＨＥＭまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３ ３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１９８】
ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１ １４７）。
【０１９９】
ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品で処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＨＥＭを乳汁内に分泌するなどＨＥＭを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０２００】
（治療）
ＨＥＭのある領域とヒト酵素分子のある領域との間に、例えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、ＨＥＭの発現は、膵臓、尿性器および癌性の組織に密接に関連する。従って、ＨＥＭは、自己免疫／炎症性の疾患、遺伝性疾患、神経疾患、及び癌を含む細胞増殖異常においてある役割を果たすと考えられる。ＨＥＭの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＨＥＭの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＨＥＭの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＨＥＭの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２０１】
従って、一実施例において、ＨＥＭの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＨＥＭまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には自己免疫／炎症性の疾患、遺伝性疾患、神経疾患、及び癌を含む細胞増殖異常が含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、日光性角化症、副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷、並びにリンパ腫、白血病、および骨髄腫を含む造血性の癌が含まれ、遺伝性疾患の中には、副腎白質ジストロフィー、アルポート症候群、コロイデレミア、デュシェンヌ−ベッカー型筋ジストロフィー、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン病、マルファン症候群、筋ジストロフィー、筋緊張性異栄養、頻繁骨形成不全（ｐｙｃｎｏｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ）、レフサム症候群、網膜芽腫、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ウェルナー症候群、フォン‐ウィルブランド病、ウィルムス腫瘍、ツェルヴェーガー症候群、ペルオキシソームアシル−ＣｏＡ酸化酵素欠損症（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｏｘｉｄａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ペルオキシソームチオラーゼ欠損症、ペルオキシソーム２官能タンパク質欠損症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ及びカルニチン欠損症、ミトコンドリ超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリ短鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリ電子伝達フラボタンパク質及び電子伝達フラボタンパク質：ユビキノンオキシドレダクターゼ欠損症、ミトコンドリ３官能タンパク質欠損症、ミトコンドリ短鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症が含まれ、また、神経疾患の中には、新生児発作、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む精神薄弱および中枢神経系の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、季節性の感情の障害（ＳＡＤ）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上性麻痺、皮質基底変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、及び家族性前頭側頭痴呆が含まれ、また、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれる。
【０２０２】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＥＭの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＥＭまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０２０３】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＥＭの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＨＥＭを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０２０４】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＥＭの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＥＭの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０２０５】
更なる実施例では、ＨＥＭの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＨＥＭのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した自己免疫／炎症性の疾患、遺伝性疾患、神経疾患、及び癌を含む細胞増殖異常が含まれる。一実施態様では、ＨＥＭと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＨＥＭを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０２０６】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＥＭの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２０７】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０２０８】
ＨＥＭのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたＨＥＭを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＨＥＭと特異的に結合するものを同定が可能である。ＨＥＭの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０２０９】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＨＥＭまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【０２１０】
ＨＥＭに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＨＥＭアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２１１】
ＨＥＭに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ら． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． ら． （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１−８−４２； Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． ら． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． ら． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０を参照）。
【０２１２】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１−４８５１−４８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．ら． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＨＥＭ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混合によって生成することもできる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１１１２０−３を参照）。
【０２１３】
抗体は、リンパ球集団の中のｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘発することによって、または免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、得ることもできる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ３８３３−３８３７； Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０２１４】
ＨＥＭに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）に断片と、Ｆ（ａｂ’）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． ら． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２７５−１２８１を参照）。
【０２１５】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＨＥＭとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性ＨＥＭエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２１６】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＨＥＭに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＨＥＭ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のＨＥＭエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体医薬のＫａは、ＨＥＭに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＨＥＭエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体医薬は、ＨＥＭ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、ＨＥＭが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２１７】
ある下流での適用におけるこのような医薬品の品質及び適性を調べるために、ポリクローナル抗体医薬の抗体価及び結合活性を更に評価する。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＨＥＭ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。（例えば、Ｃａｔｔｙ， 前出， 及びＣｏｌｉｇａｎ 他、前出を参照）。
【０２１８】
本発明の別の実施例では、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＨＥＭをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＨＥＭをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０２１９】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に送達することができる（例えば、Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５； ａｎｄ Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他 （１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６．を参照 ）。また、アンチセンス配列は、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１； Ａｕｓｕｂｅｌ， 前出； Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ． ａｎｄ Ｗ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ、及び当分野で周知のその他の系が含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ， Ｒ．Ｊ．他 （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５； ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６．を参照）。
【０２２０】
本発明の別の実施例では、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療は、（ｉ）遺伝子欠損症（例えば、Ｘ染色体連鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ． 他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）によって特徴づけられる重度の複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ１）、遺伝性アデノシン−デアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０； Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）に関連する重度の複合型免疫欠損、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ． 他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． 他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６； Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． 他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損による血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５　Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０； Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療したり、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物（例えば、細胞増殖の制御不能による癌の場合）を発現させたり、及び（ｉｉｉ）細胞内の寄生虫（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６； Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）や、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ等の原虫寄生体）に対する防御機能を有するタンパク質を発現させて行うことができる。ＨＥＭの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＨＥＭを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２２１】
本発明の更なる実施例では、ＨＥＭの欠損による疾患や異常症は、ＨＥＭをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＨＥＭ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的な導入技術には、（ｉ）個々の細胞内へのＤＮＡのマイクロインジェクション、（ｉｉ）金粒子の打ち込み、（ｉｉｉ）リポソーム仲介性トランスフェクション、（ｉｖ）受容体仲介性遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソン（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． ａｎｄ Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７； Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． ａｎｄ Ｈ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）の使用が含まれる。
【０２２２】
ＨＥＭの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＨＥＭを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＨＥＭをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２２３】
市販のリポソーム形質転換キット（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが販売しているＰＥＲＦＥＣＴ ＬＩＰＩＤ及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ ＫＩＴ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能である。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． ａｎｄ Ａ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法 （Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他 （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代細胞にＤＮＡを導入するためには、これらの標準的な哺乳動物トランスフェクションプロトコルを変更する必要がある。
【０２２４】
本発明の別の実施例では、ＨＥＭの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でＨＥＭをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えば、ＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能であり、公表データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。このベクターは、ＶＳＶｇ（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０； Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６； Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６； Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１； Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）等の乱交雑エンベロープタンパク質若しくは標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子を発現する好適なベクター産生細胞系（ＶＰＣＬ）において増殖される。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、ある細胞集団（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）の形質導入、並びに形質導入した細胞を患者に戻す方法は、遺伝子治療の分野では周知であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９； Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７； Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６； Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６： Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２２５】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＨＥＭの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野では周知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島の中に導入するために可変性であることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他． （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターが、米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについてはまた、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４； ａｎｄ Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２を参照し、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２２６】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＨＥＭの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＨＥＭを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野では周知である。複製適格性の単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、霊長類の眼にレポーター遺伝子を送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製は、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために、好適なプロモーターのコントロールの下で、細胞に導入される少なくとも１つの内在性遺伝子を含むゲノムからなる組換えＨＳＶ ｄ９２についての記載がある。また上記特許には、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ株の作製及び使用方法が開示されている。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ ａｎｄ Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１を参照し、引用することをもって本明細書の一部とする。クローニングされたヘルペスウイルス配列の操作や、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドをトランスフェクトした後の組換えウイルスの継代、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は当分野で周知の技術である。
【０２２７】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ， ＳＦＶ）の生物学的な研究が広範に行われ、遺伝子伝達ベクター（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）がＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． ａｎｄ Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスカプシドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡが完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルで複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に対してカプシドタンパク質が過剰に産生される。同様に、ＨＥＭをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＨＥＭをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＨＥＭが合成される。通常はαウイルス感染は２〜３日以内の細胞溶解に関係するが、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスターの正常な腎細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解性の複製が遺伝子治療に適用できるように好適に変更することが可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他． （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＨＥＭを導入することできる。ある集団における細胞のサブセットの特定の形質導入には、形質導入する前に細胞のソーティングを必要とする場合がある。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの操作、αウイルスｃＤＮＡ及びＲＮＡのトランスフェクション、並びにαウイルスの感染方法は当分野で周知である。
【０２２８】
例えば開始部位から約−１０から約＋１０までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を阻害することが可能である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害することができる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重鎖ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． ら． （１９９４） Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ． 及び Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計できる。
【０２２９】
酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。例えば、ＨＥＭをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０２３０】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテストすることによって評価することが可能である。
【０２３１】
本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用いて、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホスホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＨＥＭをコードするＤＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０２３２】
ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くすることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキング配列の追加、または分子のバックボーン内のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネートまたは２’Ｏメチルを用いる修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく、イノシン、キュエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、及びワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）などの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大することができる。
【０２３３】
本発明の更なる実施例は、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。特定のポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物には、限定するものではないが、特定のポリヌクレオチド配列と相互作用可能な非高分子化学物質、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子やその他のポリペプチド転写調節因子が含まれる。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビター或いはエンハンサーとして作用し、ポリヌクレオチドの発現を変化させ得る。従って、ＨＥＭの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＨＥＭの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２３４】
特定のポリヌクレオチドの発現の変化の有効性を調べるために、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングすることができる。試験化合物は、有効な化合物の化学修飾を含む当分野で周知の任意の方法で得ることができる。このような方法は、ポリヌクレオチドの発現を変化させる場合、一般に市販されている或いは専売の天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づいて化合物を合理的にデザインする場合、更に組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効である。ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには、例えば無傷細胞、透過化処理した細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞遊離系または再構成生化学系が含まれ得る。ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーションの収量を定量し、その値が１或いは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較における基準となり得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現の変化が検出される場合は、ポリヌクレオチドの発現の変化に試験化合物が有効であることを示している。特定のポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物を調べるために、例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞株（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングする。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるための、各オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、及び修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリのスクリーニングを含む（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２３５】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用でき、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏでの使用に等しく適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療の場合、患者から採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すためにクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−６６：を参照）。
【０２３６】
上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０２３７】
本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような組成物は、ＨＥＭ、ＨＥＭの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＨＥＭのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物またはホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０２３８】
本発明に用いられる組成物は、様々な経路を用いて投与するが可能である。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０２３９】
肺投与用の組成物は、液状または乾燥粉末状に調製することができる。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば、従来の低分子量有機薬剤）の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送が当分野で周知である。高分子（例えばより大きなペプチドやタンパク質）の場合には、肺の肺胞領域を介する肺輸送の技術が近年向上したため、インスリン等の薬剤を実際に血中に輸送することが可能となった（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺輸送は、針注射を用いないで投与できるという点で優れており、潜在的に有毒な浸透エンハンサーが必要でなくなる。
【０２４０】
本発明に用いる好適な組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、十分に自身の能力で効果的な服用量を決めることができる。
【０２４１】
ＨＥＭまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。別法では、ＨＥＭまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして作製された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入されることが確認されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２４２】
どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができる。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、サル、またはブタなどが用いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定することができる。
【０２４３】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＨＥＭまたはその断片、ＨＥＭの抗体、ＨＥＭのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ５０（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある用量）またはＬＤ５０（服用に対して集団の５０％に致命的である用量）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０と示すことができる。高い治療指数を示す組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０２４４】
正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるため或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮されるものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答が含まれる。作用期間が長い組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与され得る。
【０２４５】
通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇまでの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの運搬は、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０２４６】
（診断）
別の実施例では、ＨＥＭに特異的に結合する抗体が、ＨＥＭの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＨＥＭやＨＥＭのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。ＨＥＭの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＨＥＭを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。
【０２４７】
ＨＥＭを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＨＥＭの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＨＥＭの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＨＥＭに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体形成の量は、測光法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）などの種々の方法で定量され得る。被験者のＨＥＭの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較される。基準値と被験者との間の偏差が、診断の指標となる。
【０２４８】
本発明の別の実施例によれば、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＨＥＭを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＨＥＭの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のＨＥＭ値の調節を監視する。
【０２４９】
一実施形態では、ＨＥＭまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＨＥＭをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがＨＥＭをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２５０】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＨＥＭをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２の配列、或いはＨＥＭ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２５１】
ＨＥＭをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＨＥＭ及びＨＥＭ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。
【０２５２】
ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＨＥＭの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には自己免疫／炎症性の疾患、遺伝性疾患、神経疾患、及び癌を含む細胞増殖異常が含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、日光性角化症、副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷、並びにリンパ腫、白血病、および骨髄腫を含む造血性の癌が含まれ、遺伝性疾患の中には、副腎白質ジストロフィー、アルポート症候群、コロイデレミア、デュシェンヌ−ベッカー型筋ジストロフィー、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン病、マルファン症候群、筋ジストロフィー、筋緊張性異栄養、頻繁骨形成不全（ｐｙｃｎｏｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ）、レフサム症候群、網膜芽腫、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ウェルナー症候群、フォン‐ウィルブランド病、ウィルムス腫瘍、ツェルヴェーガー症候群、ペルオキシソームアシル−ＣｏＡ酸化酵素欠損症（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｏｘｉｄａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ペルオキシソームチオラーゼ欠損症、ペルオキシソーム２官能タンパク質欠損症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ及びカルニチン欠損症、ミトコンドリ超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリ短鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリ電子伝達フラボタンパク質及び電子伝達フラボタンパク質：ユビキノンオキシドレダクターゼ欠損症、ミトコンドリ３官能タンパク質欠損症、ミトコンドリ短鎖３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症が含まれ、また、神経疾患の中には、新生児発作、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む精神薄弱および中枢神経系の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、季節性の感情の障害（ＳＡＤ）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上性麻痺、皮質基底変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、及び家族性前頭側頭痴呆が含まれ、また、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれる。ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＨＥＭの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。
【０２５３】
ある実施態様では、ＨＥＭをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＨＥＭをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して基準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＨＥＭをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特定の治療効果を推定することが可能である。
【０２５４】
ＨＥＭの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＨＥＭをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。基準値と被験者の値との偏差を用いて罹患しているかどうを決定する。
【０２５５】
疾患の存在が確定され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いることができる。
【０２５６】
癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる。
【０２５７】
ＨＥＭをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、酵素を用いた生成、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得る。オリゴマーは、好ましくはＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＨＥＭをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェントな条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いることが可能である。
【０２５８】
或る実施態様において、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、ヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となる場合が多いヌクレオチドの置換、挿入及び欠失である。限定するものではないが、ＳＮＰの検出方法には、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）法が含まれる。ＳＳＣＰでは、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。このＤＮＡは、例えば病変或いは正常な組織、生検サンプル、体液等に由来し得る。このＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ産物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。この差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光標識することによって、ＤＮＡシークエンシング装置などのハイスループット機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出をすることが可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ：ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列の構築に用いられる個々の重複するＤＮＡ断片の配列を比較することによって、多型を同定することができる。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析及び統計モデルを用いたシークエンシングエラーや研究室でのＤＮＡの調整に起因する配列のばらつきを排除する。別法では、例えばハイスループットのＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２５９】
ＨＥＭの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．ら（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．ら（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６を参照）。多数のサンプルの定量速度は、ハイスループット型のアッセイを用いることで速くなるであろう。このアッセイでは、目的のオリゴマーやポリヌクレオチドが様々な希釈液中に含まれ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速である。
【０２６０】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いることができる。マイクロアレイを、上記したように多数の遺伝子の相対的な発現レベルを同時にモニタリングする転写イメージング技術に用いてることができる。マイクロアレイはまた、遺伝子変異、突然変異及び多型の同定に用いることができる。この情報を用いて、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を解明し、疾患を診断し、遺伝子発現に関連する疾病の進行／後退をモニタリングし、疾患の治療における治療薬の開発や活性のモニタリングを行うことができる。特に、患者にとって最適かつ有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを作成することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づいて、患者に対して極めて効果的でありながら副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２６１】
別の実施例では、ＨＥＭ、ＨＥＭの断片、ＨＥＭに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようにタンパク質間相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロファイルをモニタリング及び測定することが可能である。
【０２６２】
特定の実施例は、或る組織または細胞型の転写イメージを生成する本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞型により遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Ｓｅｉｌｌｉａｍｅｒ 他、米国特許第５，８４０，４８４号の”Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ” を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞型の転写物または逆転写物の全てに本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列をハイブリダイズすることにより、転写イメージが生成され得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列がマイクロアレイ上に複数のエレメントのサブセットを構成するハイスループット型でハイブリダイゼーションさせる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルとなり得る。
【０２６３】
転写イメージは、組織、細胞株、生検サンプル、またはその他の生体サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。従って、転写イメージは、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または細胞株の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遺伝子発現を反映する。
【０２６４】
本発明のポリヌクレオチドの発現プロファイルを示す転写イメージはまた、合成化合物または天然化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用され得る。全ての化合物は、作用及び毒性の機構を示唆する、頻繁に分子フィンガープリント若しくは毒性シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）と称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを引き起こす（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５ ３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、また言及することを以って本明細書の一部とする）。試験化合物が、毒性を有する既知の化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性が高い。フィンガープリンまたはシグネチャが、より多くの遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいれば、より有用かつ正確になる。理想としては、発現のゲノム全域にわたって測定し、最高品質のシグネチャを提供することである。任意の試験化合物によっても発現が変化しない遺伝子も同様に重要である。それは、これらの遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを標準化することができるためである。標準化処理は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャのエレメントへの遺伝子機能を割り当てることは毒性機構の解明に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的な一致には遺伝子機能の知識は必要ではない（例えば２０００年２月２９日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる毒性スクリーニングにおいて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要でありまた望ましいことである。
【０２６５】
一実施例では、試験化合物の毒性は、核酸を含有する生体サンプルをその試験化合物で処理して評価する。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１若しくは複数のプローブでハイブリダイズさせ、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量することができる。処理した生体サンプル中の転写レベルを、非処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差が、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示唆する。
【０２６６】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞型のプロテオームを分析することに関連する。「プロテオーム」という用語は、或る特定の組織または細胞型におけるタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームを構成する各タンパク質は、個々に更なる分析をすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロファイルは、所定の条件下で所定の時間に発現したタンパク質の数及びそれらの相対的な存在量を定量することにより分析する。従って、ある細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞型のポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、このような分離は２次元ゲル電気泳動によって行う。この２次元ゲル電気泳動法では、まず、１次元の等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、次に、２次元のドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に従って分離する（前出のＳｔｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。これらのタンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの染色剤を用いてゲルを染色して、分散した個別の位置にあるスポットとしてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理済みまたは未処理のいずれかの生体サンプルから得られる等位置にあるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を調べる。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的に切断した後、質量分析する標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基であるその部分的な配列を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２６７】
プロテオームのプロファイルは、ＨＥＭに特異的な抗体を用いてＨＥＭ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上のエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝露して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． ら． （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． ら． （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２６８】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行して分析するべきである。或る組織における或るタンパク質では、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関性が低いことがあるため（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． ａｎｄ Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、プロテオーム毒性シグネチャは、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを変化させる化合物の分析において有用たり得る。更に、体液中での転写の分析は、ｍＲＮＡが急速に分解するため困難である。しがたがって、このような場合にはプロテオームのプロファイル作成はより信頼でき、情報価値がある。
【０２６９】
別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその試験化合物で処理して評価する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質を分離して、各タンパク質の量が定量できるようにする。各タンパク質の量を、未処理生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプル中のタンパク質の量の差は、処理されたサンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する。個々のタンパク質は、それらのアミノ酸残基をシークエンシングし、これらの部分配列を本発明のポリペプチドと比較することで同定する。
【０２７０】
別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその試験化合物で処理することにより評価する。生体サンプルから得たタンパク質を、本発明のポリペプチドに特異的な抗体と共にインキュベートする。その抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生体サンプル中のタンパク質の量を、未処理生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差が、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する。
【０２７１】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他 （１９９５） 米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他 （１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； 及び Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが周知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， ｅｄ． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。また、この文献を引用することを以って本明細書の一部とする。
【０２７２】
本発明の別の実施例ではまた、ＨＥＭをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コーディング配列または非コーディング配列の何れかを用いることができるが、或る例では、コーディング配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー間にコーディング配列が保存されていることにより、染色体マッピング時に望ましくない交差ハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。この配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５、Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４、Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４等を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である（Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０２７３】
ｉｎ ｓｉｔ蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝子地図データと相関し得る（例えば、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他による（１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， 前出， ｐｐ． ９６５−９６８を参照）。遺伝子地図データの例は、種々の科学誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のワールドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体地図上のＨＥＭをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連するＤＮＡ領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われる。
【０２７４】
染色体標本のｉｎ ｓｉｔハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子地図を拡張することもできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置させることにより、たとえ正確なヒト染色体の位置が分かっていなくても、関連するマーカーが明らかになる場合が多い。この情報は、位置クローニング或いは別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって価値がある。疾患や症候群に関与する１つ或いは複数の遺伝子の位置が、例えば血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表す（例えば、Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他による（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。
【０２７５】
本発明の別の実施例では、ＨＥＭ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細胞内に存在する。ＨＥＭと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２７６】
薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，他による（１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４を参照）。この方法では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基板の上に合成される。試験用化合物は、ＨＥＭ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたＨＥＭが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたＨＥＭはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０２７７】
別の実施例では、ＨＥＭと結合可能な中和抗体がＨＥＭと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＨＥＭと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０２７８】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＨＥＭをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０２７９】
当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０２８０】
前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願第６０／１８６，３０７号および同第６０／１９２，５３２号に言及することをもって本明細書の一部とする。
【０２８１】
（実施例）
１　ｃＤＮＡライブラリの作製
インサイトｃＤＮＡはＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に含まれているｃＤＮＡライブラリに由来し、表４の列５に示されている。組織の一部をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解する一方、この組織の別の一部をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、或いはＴＲＩＺＯＬ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおいて遠心分離によって、或いはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２８２】
ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ． Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてポリ（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。別法では、ＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【０２８３】
ある場合には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社が対応するｃＤＮＡライブラリを作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて当分野で周知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリを作製した。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７，前出，ユニット５．１−６．６を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１つの制限酵素或いは複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ １０００または ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ（３００〜１０００ｂｐ）を選択した。ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐｃＤＮＡ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｌＮＣＹプラスミド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、またはそれらの誘導体などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを結合させた。この組換えプラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ， ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦ、ＳＯＬＲ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５αまたはＤＨ １０Ｂ、ＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ １０Ｂを含むコンピテント大腸菌細胞に導入し組み込んだ。
【０２８４】
２　ｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように得たプラスミドを、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）或いは細胞溶解を利用したｉｎ ｖｉｖｏ切除によって宿主細胞から回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、ＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの内の少なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２８５】
別法では、ハイスループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した。（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理してから３８４−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０２８６】
３　シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したインサイトｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンシング反応は標準的な方法で行うか、またはＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）或いはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ） 液体移送装置と共にＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） サーマルサイクラー或いはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などのハイスループット装置を用いて行った。ｃＤＮＡのシークエンシング反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の試薬、またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのＡＢＩシークエンシングキットに含まれる試薬を用いて行った。ｃＤＮＡシークエンシングの反応物の電気泳動的による分離及び標識したポリヌクレオチドの検出は、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、または当分野で周知のその他の配列解析システムを用いて行った。ｃＤＮＡ配列内の読み枠は、標準的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７， 前出， ｕｎｉｔ ７．７）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長した。
【０２８７】
インサイトｃＤＮＡに由来する本ポリヌクレオチド配列の確認は、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング、およびジヌクレオチドの分布による解析（ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー、およびポリＡ配列を取り除き、更にあいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、インサイトｃＤＮＡ配列およびそれらの翻訳を、公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生物のデータベース、およびＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、およびＰＦＡＭなどの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にしたタンパク質ファミリーのデータベースから選択した配列に対して問合せた（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス主構造を分析する確率的手法である。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６ ： ３６１−３６５を参照）。このような問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ、およびＨＭＭＲに基づいたプログラムを用いて行った。インサイトｃＤＮＡ配列を組み立てて、完全長ポリヌクレオチド配列を作製した。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡｓ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチ配列（ｓｔｉｔｃｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ストレッチ配列（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、またはＧｅｎｓｃａｎ−推定コード配列（実施例４および５を参照）を用いて、インサイトｃＤＮＡ群を完全長の配列に伸長した。配列の組み立ては、Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、およびＣｏｎｓｅｄに基づいたプログラムを用いて行い、ＧｅｎｅＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ、およびＦＡＳＴＡに基づいたプログラムを用いて、オープンリーディングフレームを決定するべくｃＤＡＮ群をスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長ポリペプチド配列を得た。別法では、本発明のポリヌクレオチドは、完全長翻訳ポリヌクレオチドの任意のメチオニン残基から始まり得る。次に、完全長ポリペプチド配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、Ｐｒｏｓｉｔｅ、およびＰＦＡＭなどの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づいたタンパク質ファミリーデータベースに対して問合せて分析した。こられの完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯ ソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアラインメントを、アライメントした配列間のパーセント同一性も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれたＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって指定されたデフォルトパラメータを用いて作成した。
【０２８８】
表７は、インサイトｃＤＮＡおよび完全長配列の組み立て、および組み立てた配列の分析に利用したツール、プログラム、およびアルゴリズム、並びにそれらの説明、引用文献、閾値パラメータを簡単に示す。表７の列１は用いたツール、プログラム、およびアルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の一部とした引用文献、列４の記載されている部分は２つの配列の一致の程度を評価するために用いたスコア、確率値、およびその他のパラメータを示す（スコアが高くなれば高くなるほど即ち確率値が低ければ低いほど、配列間の相同性が高くなる）。
【０２８９】
完全長のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。
【０２９０】
４　ゲノムＤＮＡからのコード配列の同定および編集
推定上の酵素分子は、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物に由来するゲノムＤＮＡ配列を分析するための汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８ ： ７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８ ： ３４６−３５４を参照）。このプログラムは推定エキソンを連結して、メチオニンから停止コドンまで伸長した組み立てｃＤＮＡ配列を構築する。Ｇｅｎｓｃａｎにより得られる配列は、ＦＡＳＴＡデータベースのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列になる。Ｇｅｎｓｃａｎによって一回で解析できる配列の最大長さは３０ｋｂに設定されている。これらのＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列の内、どの配列がヒト酵素分子をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいてヒト酵素分子について問合せて分析した。潜在的なヒト酵素分子が、ヒト酵素分子としてアノテーションが付けられたインサイトｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定された。次に、これらの選択されたＧｅｎｓｃａｎ推定配列を、ＢＬＡＳＴ解析を用いてｇｅｎｅｐｔおよびｇｂｐｒｉ公共データベースの配列と比較した。必要に応じて、Ｇｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を、ｇｅｎｅｐｔにおいてＢＬＡＳＴで最もヒットした配列と比較して、Ｇｅｎｓｃａｎ推定配列における余分なエキソンや省いてしまったエキソンなどのエラーを修正し、編集した。ＢＬＡＳＴ解析を用いてＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を含むインサイトｃＤＮＡまたは公共のｃＤＮＡを見つけ出すことにより、転写の証拠が得られる。インサイトｃＤＮＡがＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を含む場合、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ推定配列を修正或いは確認できる。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に説明した組み立て方法でＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列とインサイトｃＤＮＡおよび／または公共のｃＤＮＡ配列を組み立てて作製した。別法では、完全長ポリヌクレオチド配列は、その全てが編集した或いは未編集のＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列から作製した。
【０２９１】
５　ｃＤＮＡ配列データを用いたゲノム配列データの組み立て
ステッチ配列（Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分的なｃＤＮＡ配列を、実施例４に記載したＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムによって推定されたエキソンで伸長した。実施例３に記載されたように組み立てられた部分的なｃＤＮＡをゲノムＤＮＡにマッピングし、１或いは複数のゲノム配列から推定されるＧｅｎｓｃａｎエキソンおよび関連ｃＤＮＡを含む複数のクラスターに分けた。各クラスターを、グラフ理論および動的計画法に基づいたアルゴリズムを用いて、ｃＤＮＡおよびゲノム情報を統合して分析し、可能性のあるスプライスバリアントを生成して、続いて確認、編集、または伸長して完全長の配列を作製した。区間の全長が或るクラスターの２つ以上の配列に存在する配列区間を同定し、このように同定した区間は移行によるもので同等と考える。例えば、或る区間がｃＤＮＡおよび２つのゲノム配列のそれぞれに存在する場合、これら３つ全ての区間を同等と考える。この方法によって、関連性がないが連続するゲノム配列をｃＤＮＡ配列によって繋ぎ合わせる。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムを用いて順に縫い合わせ、可能な最長の配列および変異配列を作製する。或るタイプの親配列（ｃＤＮＡとｃＤＮＡ、またはゲノム配列とゲノム配列）に沿って連結される区間と区間との繋ぎ合わせは、親配列のタイプが異なる（ｃＤＮＡとゲノム配列）連結より好ましい。得られたステッチ配列を翻訳し、ＢＬＡＳＴ解析でｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉ公共データベースにおける配列と比較した。Ｇｅｎｓｃａｎによって推定された不適当なエキソンを、ｇｅｎｅｐｔにおいてＢＬＡＳＴで最もヒットした配列と比較して修正する。このような配列を更なるｃＮＤＡ配列で伸長し、必要に応じてゲノムＤＮＡで検査した。
【０２９２】
ストレッチ配列（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分的なＤＮＡ配列をＢＬＡＳＴ解析に基づいたアルゴリズムで完全長に伸長した。まず、実施例３に記載したように組み立てた部分的なｃＤＮＡを、ＢＬＡＳＴプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生物のデータベースなどの公共のデータベースに対して問い合わせた。次に、ＧｅｎＢａｎｋの相同性の最も高いタンパク質を、実施例４に記載したインサイトｃＤＮＡ配列或いはＧｅｎＳｃａｎエキソン推定配列の何れかとＢＬＡＳＴ分析により比較した。得られた複数の高スコアのセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を作製し、ＧｅｎＢｎａｋの相同タンパク質上に翻訳した配列をマッピングした。元のＧｅｎＢｎａｋタンパク質相同体に対して、キメラタンパク質に挿入や欠失が起こり得る。公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を探し出すために、ＧｅｎＢｎａｋタンパク質相同体、キメラタンパク質、またはそれらの両方をプローブとして用いた。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。完全な遺伝子を含んでいるか否かを判定するために得られたストレッチ配列を検査した。
【０２９３】
６　ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２を組み立てるために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、インサイトＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐ（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｎｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ （ＳＨＧＣ）、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＷＩＧＲ）及びＧｅｎｅｔｈｏｎなどの公共の情報源から入手できる放射線ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）及び遺伝子マッピングのデータを用いて、クラスター化した配列がすでにマッピングされているかを調べる。クラスターにマッピングされた配列が含まれている場合は、そのクラスターの全ての配列（特定のＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含む）をそのマッピング位置に割り当てた。
【０２９４】
遺伝子地図の位置は、範囲、区間、またはヒト染色体によって表される。センチモルガンで示したマッピング位置の範囲は、染色体の短腕（ｐ）の末端から測定した（センチモルガン（ｃＭ）は、同一染色体上の遺伝子間の乗換え率に基づいた距離を表す単位である。平均すると、１ｃＭはヒトの染色体の１メガベースに概ね等しいいが、組換え率の高い部分と低い部分があるため、大きく変化し得る）。距離ｃＭは、配列がそれぞれのクラスターに含まれている放射線ハイブリッドマーカーの境界を検出できるＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝子マーカーに基づいている。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｐｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの公衆が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２９５】
このようにして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２が、第２０染色体の１１．０〜２０．９センチモルガンの範囲内にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５は、第２染色体の１７５．０〜１８０．６センチモルガンおよび１９０．８〜１９６．８センチモルガンの範囲内にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１は、第１染色体の２３５．８〜２３７．２センチモルガンおよび２４３．３〜２４５．２センチモルガンの範囲内にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７は、第２染色体の１１８．０〜１２７．４センチモルガンの範囲内にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１では複数のマッピング位置を示したが、これは異なったマッピング位置が１つのクラスター内に集められたことを表す。例えば、高い類似性を有するが完全には同一でない配列が１つのクラスター内に集められた場合に生じる。
【０２９６】
７　ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出， ７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． 他、前出， ４章及び１６章を参照）。
【０２９７】
ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなｃＤＮＡデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索の基準は、
【０２９８】
【数１】
2004504008.tif 000002
として定義される積スコアである。積スコアは、０〜１００の標準化された値であり、以下のように求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチド配列の一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアのセグメントの対（ＨＳＰ）において一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより離隔される）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、ＢＬＡＳＴアラインメントの断片的重複と質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合にのみ得られる。積スコア７０は、１００％の同一性で重畳が７０％であるか、或いは８８％の同一性で重畳が１００％であるかの何れかの場合である。積スコア５０は、１００％の同一性で重畳が５０％であるか、或いは７９％の同一性で重畳が１００％であるかの何れかの場合である。
【０２９９】
或いは、ＨＥＭをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば、ある完全長の配列は、少なくとも部分的にインサイトｃＤＮＡ配列をオーバーラップさせて組み立てられる（実施例３を参照）。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーにおけるライブラリの数をカウントし、その合計数を全カテゴリーのライブラリ数で除す。同様に、各ヒト組織は、癌、細胞系、発生、炎症、神経、外傷、心血管、プール（ｐｏｏｌｅｄ）などの１つの疾患／症状のカテゴリーに分類され、各カテゴリーにおけるライブラリの数をカウントし、その合計数を全カテゴリーのライブラリ数で除す。得られるパーセンテージは、ＨＥＭをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０３００】
８　ＨＥＭをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列は、完全長分子の好適な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を伸長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを伸長した。
【０３０１】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。
【０３０２】
当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）用いて９６ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【０３０３】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長することに成功したかを決定する。
【０３０４】
伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて伸長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３０５】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０３０６】
同様に上述の手順で、完全長のポリヌクレオチド配列を検査したり、或いは完全長のポリヌクレオチド配列を利用して、この伸長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適なゲノムライブラリを用いて５′調節配列を得た。
【０３０７】
９　個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用法
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７−５２から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの［γ‐３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超精細排除デキストランビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１或いはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０３０８】
各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブラン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に転写する。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーションパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して比較する。
【０３０９】
１０　マイクロアレイ
マイクロアレイ上のアレイエレメントの連結または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾプリント（インクジェットプリンター、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一な非多孔性の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９）．前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。別法では、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱や紫外線、または化学的或いは機械的な結合手段で基板の表面にエレメントを配置して結合させることができる。通常のアレイは利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正な数のエレメントを含めることができる（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他 （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． ａｎｄ Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１．を参照）。
【０３１０】
完全長ｃＤＮＡ、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）、或いはそれらの断片やオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントとなり得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片やオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの当分野で周知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。このアレイエレメントを、生体サンプル中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに結合する。ハイブリダイゼーションの後、生体サンプルからハイブリダイズしなかったヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおけるハイブリダイゼーションを検出する。別法では、レーザー脱離及び質量スペクトロメトリーを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の程度及び相対的存在量は、算定することができる。一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０３１１】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルは、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第１鎖緩衝液、０．０３単位／μｌのＲＮアーゼインヒビター、５００μＭ ｄＡＴＰ、５００μＭ ｄＧＴＰ、５００μＭ ｄＴＴＰ、４０μＭ ｄＣＴＰ、４０μＭ ｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。この逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いて、２００ ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含む２５ ｍｌ容量で行う。特異的なコントロールポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により非コーディング酵母ゲノムＤＮＡから合成する。３７０℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（一方はＣｙ３標識、他方はＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ 水酸化ナトリウムで処理し、８５０℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを変性する。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。結合後、２つの反応サンプルを、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌ ５×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３１２】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡ挿入断片を含むベクターを含有する細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ挿入断片に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。
【０３１３】
精製したアレイエレメントを、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定する。顕微鏡スライドガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に大量の蒸留水での洗浄と、０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波による洗浄を行う。スライドガラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中の０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
【０３１４】
米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。次にこの装置が、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを分注する。
【０３１５】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１回洗浄し、蒸留水で３回洗浄する。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）における０．２％カゼイン中で６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートし、その後上述したように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することによってブロックする。
【０３１６】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液にＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成産物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合液を、６５℃で５分間加熱し、マイクロアレイ表面上に一定量分注してから１．８ｃｍ２ のカバーガラスで覆う。このアレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバーに移す。チャンバーの角に１４０μｌの５×ＳＳＣを加えて、チャンバー内を湿度１００％に保持する。このアレイを含むチャンバーを、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間それぞれ３回洗浄し、その後乾燥させる。
【０３１７】
検出
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３を励起するための４８８ｎｍ、及びＣｙ３を励起するための６３２ｎｍのスペクトル線を生成し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０倍の顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザー光を集中させる。このアレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御Ｘ−Ｙステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンする。
【０３１８】
２つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは２つの蛍光体を連続的に励起する。放射された光は、波長に基づいて２つの蛍光体に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に分割される。アレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフィルタを用いて信号をフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルタを用いて、蛍光体１つにつき１回スキャンし、各アレイを通常２回スキャンする。
【０３１９】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡコントロール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズする種の重量比１：１００，０００に相関するようにする。異なる試料（例えば検査細胞及びコントロール細胞を代表する）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光体で標識し、他と異なって発現する遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズさせる場合には、較正は２つの蛍光体を有する較正するｃＤＮＡのサンプルを標識して、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えて行う。
【０３２０】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（ＡＩＤ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、リニア２０色変換を用いてシグナル強度が青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示される。データはまた、定量的に分析される。２つの異なる蛍光体を同時に励起して測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間の光学的漏話（重複発光スペクトルに起因する）に対して補正される。
【０３２１】
グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルがグリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シグナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３２２】
１１　相補的ポリヌクレオチド
ＨＥＭをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のＨＥＭの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＨＥＭのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＨＥＭをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３２３】
１２　ＨＥＭの発現
ＨＥＭの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＨＥＭが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＨＥＭを発現する。真核細胞でのＨＥＭの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＨＥＭをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７； Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．を参照）。
【０３２４】
殆どの発現系では、ＨＥＭが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６キロダルトンの酵素ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＥＭからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性の精製が可能となる。６個の連続するヒスチジン残基のストレッチである６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５，前出， ｃｈ １０， １６）に記載されている。これらの方法で精製したＨＥＭを直接用いて以下の実施例１６および１７のアッセイを行うことができる。
【０３２５】
１３　機能のアッセイ
ＨＥＭの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＨＥＭをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。このようなベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）及びｐＣＲ ３．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．による （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記載されている。
【０３２６】
遺伝子発現におけるＨＥＭの影響は、ＨＥＭをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。ＨＥＭ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３２７】
１４　ＨＥＭに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８１６−３０８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＨＥＭを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３２８】
別法では、ＨＥＭアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０３２９】
通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＨＥＭ活性を検査するには、ペプチドまたはＨＥＭを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３３０】
１５　特異的抗体を用いる天然ＨＥＭの精製
天然ＨＥＭ或いは組換えＨＥＭを、ＨＥＭに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＨＥＭ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従ってブロッキング処理し洗浄する。
【０３３１】
ＨＥＭを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＨＥＭを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＨＥＭとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＨＥＭを回収する。
【０３３２】
１６　ＨＥＭと相互作用する分子の同定
ＨＥＭまたは生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ．及びＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９を参照）で標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＨＥＭと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＨＥＭ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＨＥＭ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＨＥＭの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３３３】
別法では、ＨＥＭと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）やＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３３４】
ＨＥＭはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３３５】
１７　ＨＥＭ活性の実証
補助因子生合成酵素活性
ＨＥＭのｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎシンターゼスルフリラーゼ活性は、例えば、アスペルギルス‐ニデュランスｃｎｘＦ変異体をＨＥＭのポリヌクレオチド配列を含む適切な発現ベクターで形質転換し、アスペルギルス‐ニデュランス細胞が硝酸塩またはヒポキサンチンを含む培地で成長できるか否かを観察して測定する（前出のＡｐｐｌｅｙａｒｄ， Ｍ． らを参照）。ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎシンターゼスルフリラーゼ活性がアスペルギルス‐ニデュランスｃｎｘＦ変異体に存在せず、この活性が硝酸塩またはヒポキサンチンを役立たせるために必要であるため、この変異体をＨＥＭのポリヌクレオチド配列を含む適切な発現ベクターで救出することは、ＨＥＭがｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎシンターゼスルフリラーゼ活性を有することを意味する。また、ｍｏｌｙｂｄｏｐｔｅｒｉｎおよび生合成経路における中間体のレベルを、ＨＰＬＣ分析で測定する（前出のＡｐｐｌｅｙａｒｄ， Ｍ． らを参照）。
【０３３６】
イソメラーゼ活性
ＨＥＭのイソメラーゼ活性は、様々な特異的酵素活性によって実証される。そのうちの幾つかを以下に記載する。
【０３３７】
ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ活性
ＨＥＭのペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ活性は、記載のようにアッセイすることができる（Ｒａｈｆｅｌｄ， Ｊ． Ｕ． ら （１９９４） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３５２ ： １８０−１８４）。このアッセイは、３５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．８、キモトリプシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）および様々な濃度のＨＥＭを含む）で１０℃で行う。このアッセイでは、基質は、４つの疎水性残基を含むペプチドである。このペプチドは、Ｎ末端にコハク酸基、Ｃ末端にｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ基を含む。この基質は、プロリル結合に対して、８０〜９５％がトランス構造で、５〜２０％がシス構造で平衡状態である。ジメチルスルホキシド（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解した基質のアリコット（２μｌ）を上記したように反応液に加える。基質のシス異性体のみが、キモトリプシンによる切断のための基質である。従って、基質がＨＥＭにより異性化すると、生成物がキモトリプシンにより切断され４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅが生成される。４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅは、３９０ｎｍでその吸光度を測定して検出される。４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅの生成は、時間およびＨＥＭの濃度に依存する。
【０３３８】
別法では、ＨＥＭのペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ活性は、キモトリプシンを用いる結合アッセイで色素生産性ペプチドを用いて測定できる（Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｇ． ら （１９８４） Ｂｉｏｍｅｄ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ４３ ： １１０１−１１１１）。
【０３３９】
チオレドキシン活性
ＨＥＭチオレドキシン活性は、記載のようにアッセイする（Ｌｕｔｈｍａｎ， Ｍ． （１９８２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１ ： ６６２８−６６３３）。チオレドキシンは、ジスルフィド結合の形成を触媒し、細胞中のレドックス環境を調節してチオール：ジスルフィド交換を可能にする。チオール：ジスルフィド交換を測定する１つの方法は、混合液（０． １Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．０、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１６μＭインスリン、０．３３ ｍＭ ＤＴＴ、および０．４８ ｍＭ ＮＡＤＰＨ）におけるインスリンの減少を測定することである。様々な濃度のＨＥＭを反応液に加えて、３４０ ｎＭでＮＡＤＰＨの酸化をモニタリングして反応速度を測定する。
【０３４０】
トランスフェラーゼ活性
ＨＥＭトランスフェラーゼ活性は、供与体基質と受容体基質との間の標識したメチル基の転移を測定するメチルトランスフェラーゼアッセイによって測定する（Ｂｏｋａｒ， Ｊ． Ａ． ら （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ ： １７６９７−１７７０４）。最終容量５０μｌの反応液は、１５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ ｍＭジチオスレイトール、３％ポリビニルアルコール、供与体基質（１．５μＣｉ ［メチル−３Ｈ］ ＡｄｏＭｅｔ （０．３７５μＭ ＡｄｏＭｅｔ） （ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ））、０．６μｇ ＨＥＭ、および受容体基質（最終濃度１ ｍＭまでの６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）または０．４μｇ ［３５Ｓ］ ＲＮＡ）を含む。反応液を３０℃で３０分間インキュベートし、次に６５℃で５分間インキュベートする。生成物は、クロマトグラフィー若しくは電気泳動法で分離し、メチルトランスフェラーゼ活性のレベルを回収したメチル−３Ｈ−ＲＮＡ若しくはメチル−３Ｈ−６ＭＰを定量して測定する。
【０３４１】
ヒドロラーゼ活性
例を示す目的で、ＨＥＭ分子のβ−グルコシダーゼ活性を測定するアッセイを記載する。様々な量のＨＥＭを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）において様々な時間（通常は１〜５分間）、１ ｍＭ ４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｄ−ｇｌｙｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（基質）と共にインキュベートする。反応は、１００℃で２分間加熱して停止させる。分光光度計を用いて４１０ｎｍで吸光度を測定する。この吸光度の変化がサンプル中のＨＥＭの活性に比例する（Ｈｒｍｏｖａ， Ｍ． ら （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ ： １１１３４−１１１４３）。
【０３４２】
当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれる。
【０３４３】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列に対する系統的な名称を示す。
【０３４４】
表２は、本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋの相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号およびアノテーションを示す。ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋの相同体との間の一致を表す確率値スコアも示す。
【０３４５】
表３は、推定上のモチーフおよびドメインを含むポリペプチド配列の構造的な特徴、並びにポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズム、および検索可能なデータベースを示す。
【０３４６】
表４は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたｃＤＮＡ断片のリスト、並びにポリヌクレオチド配列の選択された断片のリストを示す。
【０３４７】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３４８】
表６は、表５に示すｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織およびベクターを示す付録である。
【０３４９】
表７は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並びにその説明、引用文献、閾値パラメータを示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504008.tif 000177
【国際調査報告】
2004504008.tif 000178
2004504008.tif 000179
2004504008.tif 000180
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