(57)【要約】【課題】【解決手段】ブタのＫＩＴ遺伝子型を決定する方法が提供される。具体的には、この方法は、ブタの核酸試料を取得する工程(i)、及び工程(i)で得られた核酸を分析して、ＫＩＴ遺伝子に存在するスプライス変異型コピーのパーセンテージを定量化する工程(ii)を含む。この方法は外被色の遺伝子型を決定する際、血統を決定する際及び多産を生じ易いブタ及び／又は多産を生じ難いブタを決定するためブタをスクリーニングする際に有用である。このような方法に使用するためのキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタのＫＩＴ遺伝子型を決定する方法であって、
(i)  ブタの核酸試料を取得する工程、及び
(ii)  工程(i)で得られた核酸を分析して、ＫＩＴ遺伝子に存在するスプライス変異型コ      ピーのパーセンテージを定量化する工程、
を含む方法。
【請求項２】
ブタのＫＩＴ遺伝子型を決定する方法であって、
(i)  ブタの核酸試料を取得する工程、及び
(ii)  工程(i)で得られた核酸を分析して、重複切断点の一つ以上のコピーの存在又は非      存在を同定する工程、
を含む方法。
【請求項３】
工程(ii)がミニ配列決定及び／又はピロ配列決定技術を用いて実施されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程(ii)がＰＣＲ技術を用いて実施されるものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該ＰＣＲ技術が次のプライマー対、即ち
5' −ＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣ−3'及び
5' −ＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧ− 3'、
又は
5' −ＣＴＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴ− 3' 及び
5' −ＴＴＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴ−3'、
又は
5' −ＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＴＡＣ− 3' 及び
5' −ＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣ− 3' 、
又は
5' −ＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣ−3'  及び
5' −ＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣ−3'、
又は
5' −ＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣ−3'  及び
5' −ＴＴＴＴＡＡＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧＧＡＣＣＡＡＣ3'、
又は
5' −ＴＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＧＡＧ− 3' 及び
5' −ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＣ− 3' 、
の一つ以上の使用を含むものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
直接的又は間接的のいずれかでＫＩＴと連結する少なくとも一つのＤＮＡマーカーと関連する少なくとも対立遺伝子の存在を決定する工程を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項７】
該ＤＮＡマーカーがミクロサテライトである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該ＤＮＡマーカーがＳ００８６、Ｓ００１７、Ｓｗ５２７、Ｓｗｒ７５０又はＳＷ９１６である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
外被色遺伝子型を決定するために用いられる、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
血統決定に用いられる、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
より多くの一腹多産を生じる可能性のあるブタ、及び／又はより多くの一腹多産を生ずる可能性の少ないブタを決定することを目的としてブタをスクリーニングするために用いられる、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＫＩＴ遺伝子型によって変わる他の経済的特性に対する好ましい能力について動物を選択するために用いられる、請求項１から請求項８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＫＩＴ遺伝子に存在するスプライス変異型コピーのパーセンテージを定量化するために、ブタから得た核酸試料を分析することにより、該ブタのＫＩＴ遺伝子型を決定するためのキット。
【請求項１４】
プライマー  5'−ＴＡＡＴＴＡＣＸＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣ−3'（Ｘ＝イノシン）を含む、請求項９記載のキット。
【請求項１５】
重複切断点の一つ以上のコピーの存在又は非存在を同定するために、ブタから得られた核酸試料を分析することにより該ブタのＫＩＴ遺伝子型を決定するためのキット。
【請求項１６】
ＰＣＲプライマーの対を一つ以上含む、請求項１１記載のキット。
【請求項１７】
該ＰＣＲプライマーが、次のいずれか
5' −ＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣ−3'及び
5' −ＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧ− 3'、
又は
5' −ＣＴＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴ− 3' 及び
5' −ＴＴＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴ−3'、
又は
5' −ＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＴＡＣ− 3' 及び
5' −ＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣ− 3' 、
又は
5' −ＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣ−3'  及び
5' −ＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣ−3'、
又は
5' −ＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣ−3'  及び
5' −ＴＴＴＴＡＡＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧＧＡＣＣＡＡＣ3'、
又は
5' −ＴＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＧＡＧ− 3' 及び
5' −ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＣ− 3' 、
から選択されるものである、請求項１２記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＫＩＴ優性対立遺伝子を識別できるようにブタの遺伝子型を決定する方法に関する。このような方法で使用するためのキットも提供される。
【背景技術】
【０００２】
中世時代以来白色の国内産ブタに対する選択が行なわれてきたことは明らかである（ワイズマン 1986)。着色斑を有する白色ブタは通常ランドレースやラージホワイトのような白色血統では繁殖の際除去される。少なくとも１００年の間白色を強力に選択したにもかかわらず、畜産業者は望ましい表現型である着色斑を持たない白色の外被を完全に固定させることができなかった。ブタにおける優勢な白い外被色の遺伝がヨーロッパワイルドボアとラージホワイト国内産ブタの間の交雑において研究された（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照）。これらの研究から、白色の優性表現型はＫＩＴにおける二つの突然変異により惹き起こされ、一つは全コード配列の重複であり、一つはスプライス突然変異であることが明らかにされた。
【０００３】
ＫＩＴは肥満／幹細胞成長因子受容体をコードする。ＫＩＴ及びそのリガンドである肥満／幹細胞成長因子（ＭＧＦ）の正常な発現は神経冠由来のメラノサイト前駆体の移動及び生存に不可欠である。この遺伝子の突然変異はマウスで優性白色斑点／Ｗと呼ばれ（シャポーら 1988 、ガイスラーら 1988)、ヒトでピーバルト特性と呼ばれる（フライシュマンら 1991 、ギーベルら 1991)着色障害を惹き起こす。ＫＩＴの構造的突然変異はマウスではホモ接合体でしばしば致死的か又は致死に近く、メラノサイト、造血細胞、最初の胚細胞、小腸の間質性細胞に対する多面発現性の効果を示し、そして聴覚にも影響を与える。
【０００４】
ブタの優性白色／ＫＩＴ遺伝子座でこれまで４個の対立遺伝子が同定されてきた。正常な色に対しては劣勢形質のｉ対立遺伝子、パッチ表現型に対しては半優性のＩP対立遺伝子、優性白色表現型に対しては完全な優性Ｉ対立遺伝子、そして優勢なベルト表現型に対してはＩBeである。パッチ表現型は白色と明確な境界によって分離された完全に着色した斑点（パッチ）を有する。Ｉ対立遺伝子とＩP対立遺伝子は共にＫＩＴの重複と関連する（非特許文献２、特許文献１を参照）ことが示されてきた。該重複の大きさは約４００ｋｂであり、完全なコード配列を含む。この重複は調節の突然変異である可能性が最も高い。これは二つの遺伝子コピーの発現による単純な用量効果、又は該重複したコピーが調節因子の一部を欠き調節障害を起こしている可能性があろう。この改変されたＫＩＴ発現はリガンドの利用可能性に影響を与え、これが今度はメラノサイト前駆体の移動を妨害することもあろう。二つのＫＩＴコピーの間の高い配列同一性（＞９９％）はこの重複が最近の事象であること、そしてそれが家畜化された後に起こった可能性がある（非特許文献３を参照）ことと矛盾しない。この重複に加え、Ｉ対立遺伝子は一つのＫＩＴコピー中のイントロン１７の最初のヌクレオチドのスプライス突然変異、即ちＧからＡへの置換、を有する（非特許文献３、特許文献２を参照）。このスプライス突然変異は５’スプライス部位の高度に保存されたＧＴジヌクレオチドを破壊し、エキソン１７をスキップさせることになり、それ故、構造的突然変異である。エキソン１７は、チロシンキナーゼの高度に保存された領域の４１アミノ酸、これは触媒ループを含み且つ活性化ループの部分を含む、をコードする（ハブバードら 1994)。スプライス突然変異を有する受容体型が白色ブタの胚で種々の細胞で発現するという明確な証拠があり、本発明者らはこの突然変異受容体が正常なリガンド結合を行なうがチロシンキナーゼ活性を持たないと仮定する（非特許文献３を参照）。造血に対する多面発現性の軽い効果を示唆する、Ｉ／Ｉホモ接合体のブタでの白血球の数の減少も観察された。ベルト表現型は肩から前脚にかけての白色のベルトを構成する。このＩBe対立遺伝子は重複又はスプライス突然変異を含まず、原因となる突然変異を示唆するものは全コード配列の配列決定からは同定されなかった（ギウフラら 1999)。本発明者らはこのベルトはＫＩＴの調節的突然変異によるものであると考える。
【０００５】
ブタのＫＩＴ遺伝子座の遺伝子型を決定することは困難である。というのは一部の遺伝子型の間で知られている相違は定性的ではなく定量的であるに過ぎないからである。Ｉ／ＩP、Ｉ／ｉ、及びＩ／Ｉ遺伝子型の間の相違はイントロン１７の最初のヌクレオチドにおけるスプライス突然変異と正常型の間での比であり、それぞれ２５％、３３％、及び５０％である。本発明者らはここに、ピロ配列決定（pyrosequencing)(非特許文献４を参照）及びミニ配列決定(minisequencing)（非特許文献５を参照）を利用して、このスプライス部位における野性型ヌクレオチド／突然変異ヌクレオチドの比を定量化した。このミニ配列決定検定法は先にヒト染色体４上の一つの対立遺伝子の１、２、及び３コピーを識別するために適用され（ラーンら 1995)、そしてプールされたＤＮＡ試料中の１％から９９％までに及ぶ比で存在する対立遺伝子を正確に定量するために適用された（オルソンら 2000)。
【特許文献１】
ＷＯ９７／０５２７８。
【特許文献２】
ＷＯ９９／２０７９５。
【非特許文献１】
ヨハンソン，エム．，エイチ．エレグレン，エル．マークルント，ユー．グスタブソン，イー．リングマール−ツェーダーバーグ，ら「ブタの優性白色の遺伝子は染色体８のＡＬＢ及びＰＤＧＦＲＡに密接に関連している。」，Genomics 14: 965-969 (1992) 。
【非特許文献２】
ヨハンソン  モラー，エム．，アール．チョードリー，イー．ヘルメン，ビー．ホイハイム，ビー．チョードリー，ら「優性白外被色表現型を持つブタは肥満／幹細胞成長因子受容体をコードするＫＩＴ遺伝子の重複を保持する。」，Mamm. Genome 7: 822-830 (1996)。
【非特許文献３】
マークルント，エス．，ジェイ．キジァス，エイチ．ロドリゲス−マルチネス，エル．レンシュトラント，ケイ．フナ，ら「国内産ブタの優性白色表現型の分子的基礎」Genome Res. 8: 826-833 (1998) 。
【非特許文献４】
ロナギ，エム．，エム．ウーレン及びピー．ニーレン「実時間ピロホスフェートに基づく配列決定法」Science 281: 363-365 (1998) 。
【非特許文献５】
シヴェネン, エイ.-シー.,エイ．サジァンチラ及びエム．ルッカ「ＰＣＲ及び固相ミニ配列決定を用いる２対立遺伝子ＤＮＡマーカーの解析による個体の同定」Am. J. Hum. Genet. 52: 46-59 (1993) 。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的はブタのＫＩＴ遺伝子座の遺伝子型を決定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この研究の結果、本発明者らはここにＫＩＴ遺伝子座に幾つかの優性白色対立遺伝子が存在することを決定した。こうして、本発明の第一の側面では、ブタのＫＩＴ遺伝子型を決定する方法であって、
（i)    ブタの核酸試料を取得する工程、及び
(ii)   工程(i) で得られた核酸を分析して存在するＫＩＴ遺伝子のスプライス変異型コピーのパーセンテージを定量する工程、
を含む方法を提供する。
【０００８】
こうして、ＫＩＴ遺伝子の比較的単純な定量分析に基づいて、種々の外被色の遺伝子型を決定することができる。こうして、予想された遺伝子型：スプライス％は次表に示すようになる。
（外１）
2004529649.tif 000002
【０００９】
工程 (ii) における決定は本明細書で記載されるようなミニ配列決定法及び／又はピロ配列決定法を用いて行なわれる。
【００１０】
さらに、本発明者らはＫＩＴ遺伝子をも調べ、そして重複したＫＩＴ遺伝子の間の境界にユニークな配列が存在することを決定した。本発明者らはこれを「重複切断点」と名付けた。こうして、第二の側面において、本発明はブタのＫＩＴ遺伝子型を決定する方法であって、
(i)    ブタの核酸試料を取得する工程、及び
(ii)   工程 (i)で得られた核酸を分析して重複切断点の一つ以上のコピーの存在又は非存在を確定する工程、
を含む方法を提供する。
【００１１】
実施例２で論ずるように、図１１に示すＢＡＣクローンであるＢＡＣ９５３Ｆ１１は該重複切断点を表す。
【００１２】
工程 (ii) での分析は適当なプライマーを用いるＰＣＲにより行ないうる。適当なプライマーの例は実施例２で示すが、９５３Ｒ２、９５３Ｆ１、９５３Ｆ９及び９５３Ｒ３が含まれる。
【００１３】
ＫＩＴ遺伝子の重複は重複する配列の間の境界でユニークな配列を生ずる。この配列はＫＩＴの三つ以上のコピー（例えば、Ｉ2及びＩ3）を含む対立遺伝子中にも存在する。この配列は、従って、ＫＩＴの増加したコピーを持つ対立遺伝子の少なくとも一つのコピーを含む動物（又は動物に由来する試料）を同定するための優性マーカーとして使用することができる。
【００１４】
ｉｉ又はＩBeＩBe又はｉＩBeである試料はこの重複を含まず、一方、対立遺伝子ＩP，Ｉ1，Ｉ2及びＩ3は全て該境界配列を含む。
【００１５】
この配列は、血統に基づく追跡可能システムの一部として単独で使用することも他の血統の特定のマーカーと組み合わせて使用することもできる。例えば、この配列はラージホワイト集団の完全性をチェックするために使用することができる。
【００１６】
（ラージホワイト及びランドレース血統と同様に）パイトレーン及びバークシャー血統は共に伸長遺伝子座に同じ対立遺伝子（ＭＣ１Ｒ遺伝子、対立遺伝子Ｅｐ）を含むので、ＭＣ１Ｒ遺伝子座はこれら二つの血統を識別するために利用することはできない。しかしながら、バークシャー試料は、この配列のためのテスト、即ちバークシャーはユニークな境界配列を含まないが、他方パイトレーン動物はこの配列に対して陽性であるというテスト、を用いてパイトレーンと容易に識別することができる。
【００１７】
一部の市場では、バークシャー血統の肉が求められるので、バークシャーの生肉及び精肉はプレミアムを付けて売られる。この状況では、肉をその起源を確認するためにテストできることが有利である。ＭＣ１Ｒ  Ｅｐ対立遺伝子についてホモ接合体である試料はパイトレーン、ラージホワイト、ランドレース又はバークシャー動物に由来しうるであろうが、バークシャー血統由来の試料は、該境界配列に対して陽性でない唯一のものとなる。
【００１８】
第一及び第二の側面の方法は外被色遺伝子型を決定する際に使用することが好ましい。これらの方法は、例えば、ＷＯ９７／０５２７８又はＷＯ９９／２０７９５に記載された方法と組み合わせて使用してもよい。さらに、これらの方法は、ＫＩＴ遺伝子型に基づいて血統を識別することにより血統の決定を可能とする。本方法は、例えば、ＷＯ９８／５４３６０に記載された血統決定法の信頼性を増加させる別の方法である。
【００１９】
さらに、第一及び第二の側面の方法は一腹多産をより生じ易いブタ、及び／又は一腹多産を生じ難いブタを決定するためにブタをスクリーニングする際に使用できる。
【００２０】
さらに、本発明の方法はＫＩＴ遺伝子型に従って変化する他の経済的特性のための好ましい生産性について動物を選別する際に使用することもできる。
【００２１】
異なるＫＩＴ対立遺伝子（コピー数及びＫＩＴ変異／多型の両方）を完全に特性決定する能力は、育種系統及びこれらの血統若しくは系統の増殖及び親の雄ブタ及び雌ブタの生産の両面における最適なＫＩＴ遺伝子型を維持するための基礎を与える。
【００２２】
例えば、育種会社は次世代を生産するために選択された動物が好ましいＫＩＴ遺伝子型のものであることを確実にするため該動物の各世代をスクリーニングできる。
【００２３】
このようにしてＫＩＴ遺伝子座における変化は、着色した屠殺されるブタの出現頻度を最後には減少させるように低減させられる。動物は、対立遺伝子の頻度に依存して増殖／生産ピラミッドの異なるレベルでスクリーニングすることができる。一部の状況では、所望の遺伝子型を持つものであることを確実にするため親雌ブタとして生産された雌ブタ（屠殺用ブタを生産するために売られる雌）をスクリーニングすることが必要になることがある。望ましくない対立遺伝子を形成する全ての組換え事象を同定するため、本発明は誕生時にこのスクリーニングを行なうことを可能とする。
【００２４】
本発明を用いて異なるＫＩＴ対立遺伝子を除く選別は、生産力に及ぼす負の多面発現性の効果を持ちうる有害な対立遺伝子の頻度を低減させるという利点をも有する。ＫＩＴ遺伝子産物は多数の異なる発育過程に関与し、とりわけ排卵、胚発生、及び造血と関連するので、新しいＫＩＴ対立遺伝子（例えば、ＫＩ２又はＫＩ３のコピー数の増加）の形成は繁殖力、免疫反応及び／又は生存を低減させうる。
【００２５】
本発明は重複切断点の遺伝子型を決定するため及びＫＩＴ配列（野性型及びスプライス突然変異）の定量化のための新たな方法を提供し、ブタのＫＩＴ遺伝子座における異なる対立遺伝子を有効にスクリーニングするための手段を提供する。
【００２６】
今や異なるＫＩＴ対立遺伝子及びそれらの組み合わせ（ＫＩＴ遺伝子座の４個以上のコピーを持つ対立遺伝子を含む）を識別することが可能であるので、本発明は対立遺伝子の多面発現性の効果を測定することを可能とする。次いで、異なる系統又は血統及び異なる使用のために最適な対立遺伝子を選択することが可能となる。
【００２７】
こうして、本明細書に記載されたデータはＫＩＴ遺伝子座における対立遺伝子の実質的変異が存在することを示す。
【００２８】
この集団の好ましい優性な白色遺伝子型はＩ1／Ｉ1であり、これは比５０％（スプライス型／野性型配列の％）を有する。この比の頻度はほぼ０．５である。しかしながら、これは、付加的な対立遺伝子が該集団中に存在し、他の対立遺伝子の組み合わせが５０％の比を与えることが明らかであるので、対立遺伝子Ｉ1の頻度の過大評価となっている。
【００２９】
この遺伝子型を選択するために、集団を遺伝子型に分け、動物を次世代のための親を選択するため０．５のスプライス型／野性型配列の比で選択する。選択された動物は望ましくない対立遺伝子であるｉ、ＩBe、Ｉ2及びＩ3を含む可能性がある。選択された動物の子孫を、次に、望ましくない対立遺伝子を検出するためそれらのＫＩＴ比をスクリーニングする。このようにして、望ましくない対立遺伝子はそれらの頻度に応じて全て時間をかけて検出でき、例えば
世代１−世代２のための親として選択すべき有望な動物、
５０％ＫＩＴスプライスを含む動物は、Ｉ3／ｉ、Ｉ3／ＩBe、Ｉ2／Ｉ3及びＩ1／Ｉ1でありうる、
これらの対立遺伝子は次の構造ＫＩＴ／スプライス（図２を参照）を有し、
ｉ及びＩBe          １／０
Ｉ1                ２／１
Ｉ2                ３／１
Ｉ3                ３／２
である、
世代２−選択された親からの子孫はＫＩＴ／スプライス比についてスクリーニングされる、
Ｉ1／Ｉ1遺伝子型を持つ２頭の親からの子孫は全て、両方の対立遺伝子が２／１であるから比０．５を持つことになる。
【００３０】
他の遺伝子型の組み合わせを持つ親からの子孫は種々の比を持ち、
例えば、遺伝子型Ｉ1／Ｉ1を持つ雄ブタと遺伝子型Ｉ3／ｉを持つ雌ブタの間の交雑はＩ1／Ｉ3（２／１＋３／２＝５／３＝０．６）及びＩ1／ｉ（２／１＋１／０＝３／１＝０．３３）を持つ子孫を形成することになる。
【００３１】
さらに、遺伝子型Ｉ1／Ｉ1を持つ雄ブタと遺伝子型Ｉ2／Ｉ3を持つ雌ブタの間の交雑はＩ1／Ｉ2（２／１＋３／１＝５／２＝０．４）及びＩ1／Ｉ3（２／１＋３／２＝５／３＝０．６）を持つ子孫を形成することになる。
【００３２】
ＫＩＴ遺伝子の構造を決定するための第三の方法は該重複の存在又は非存在と密接に関連する連結した遺伝子の多型を用いることである。このような多型はＫＩＴ遺伝子それ自体に起こることもあり又はＫＩＴに連結した染色体の領域中に起こることもある。重複の存在／非存在と完全に関連している１個の連結マーカー又は部分的関連を示すマーカー群の組み合わせを用いることにより、高度な情報を与えるテストを開発することができる。例えば、ＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型）法はこのような多型を開発するために使用することができる。この方法の原理はＰＣＲによって生産された二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに変性され、これが次いで非変性ゲル電気泳動により分離されるというものである。非変性条件下でこの一本鎖ＤＮＡは鎖内の相互作用により二次構造を形成するが、一本鎖ＤＮＡのある割合は再生し、二本鎖ＤＮＡを形成する。多型の二つの型はこの方法により明らかになりうる。第一に、二つの対立遺伝子間のヌクレオチド配列の相違は一本鎖ＤＮＡの二次構造に影響を与えうる、これは電気泳動の過程で移動速度の相違として現れる。第二に、ヌクレオチド配列の相違はしばしばヘテロ二本鎖ＤＮＡ（ヘテロ二本鎖は異なる対立遺伝子を表す二つの一本鎖分子により形成される二本鎖ＤＮＡ分子である）の移動度に影響を与える。
【００３３】
重複している領域のコピーの数に関連するＫＩＴ遺伝子の構造を決定する別の方法はパルスフィールドゲル電気泳動の使用を含む。パルスフィールドゲル電気泳動は大きなＤＮＡ断片の大きさを分析できる技術である。この適用では、このプロセスはＫＩＴ遺伝子のＩ対立遺伝子を保持する動物のＤＮＡで重複しているのが見出された領域の両側の特異的部位でゲノムＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを利用することになるであろう。このような酵素で切断されたゲノムＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動にかけ、次いでＤＮＡ結合膜に移送することになろう。次に、重複している領域に特異的なプローブを使用して該ゲル上の元の位置を決定し、従って、適当なＤＮＡサイズの標準品との比較によりその断片の大きさを決定できるであろう。動物由来のＤＮＡがＫＩＴ遺伝子の一部の重複を含むとするならば、この特異的断片はサイズが増加するであろう。ヘテロ接合体の動物は、二つの異なった大きさの特異的バンドを示し、その小さい方は重複していない対立遺伝子ｉ、大きい方は重複した対立遺伝子Ｉ又はＩPを表すことが見出されることになる。この技法は、重複の単位の長さだけサイズがさらに増加した断片の存在を通して重複した領域の三つ以上のコピーを含む対立遺伝子をも明らかにする。
【００３４】
遺伝マーカーと特定形質の原因となる遺伝子の間の関連は遺伝子組換えにより破壊することができる。こうして、該マーカーと問題の遺伝子の間の物理的距離を短くすればする程、組換えがそれらを分離する可能性は小さくなる。
【００３５】
代わりのＤＮＡマーカーの特異的対立遺伝子と、特定の形質と関連することが既に示された特定の遺伝子（例えば、本明細書で論じられるＫＩＴ遺伝子）と関連することが知られているＤＮＡマーカーの対立遺伝子の間の連結を確定することも可能である。こうして、この状況では、ＫＩＴ遺伝子を例に取れば、少なくとも短い期間で、代わりの染色体８マーカーの特異的対立遺伝子の選択を通してＫＩＴ遺伝子関連マーカーの特定の対立遺伝子を選択することにより、間接的に特定の外被色を持つブタを選択することが可能となるであろう。ブタの染色体８の上のＫＩＴ遺伝子に連結することが知られているこのようなマーカーの例には、ＫＩＴ遺伝子それ自体の遺伝子多型、又は血小板のα−サブユニットに由来する増殖因子（ＰＤＧＦＲＡ）やアルブミンの、密接に関連した遺伝子における遺伝子多型が含まれる。
【００３６】
ＫＩＴ遺伝子と関連する特定の遺伝マーカーはミクロサテライトである。これらは４、３又はより普通には２ヌクレオチドの単純な配列反復であり、ほぼ５００００塩基（ハプロイドゲノム当たり約６００００のミクロサテライト）ごとに本質的に無差別にゲノム全体に現れる。複製の過程でのＤＮＡポリメラーゼの不正常な動きや組換えの過程での不均等な乗換えが反復単位の減少又は増加を結果として生じると考えられる。これは、ミクロサテライトが通常多型性であり、数反復長の対立遺伝子を有し得ることを意味する。
【００３７】
連結したミクロサテライト配列の例には、Ｓ００８６（エレグレンら，Genomics,16: 431-439 (1993)) 、Ｓ００１７（コピーターズら，Animal Genetics24: 163-170 (1993)) 、Ｓｗ５２７、Ｓｗｒ７５０及びＳＷ９１６（ローレルら，Genetics,136:231-245 (1994))が含まれる。上のマーカーのいずれかを用い、又は実際ブタ染色体８の上の任意の他の連結したマーカーを用いて外被色に連結したＫＩＴ遺伝子の対立遺伝子を間接的に選択することが可能となるであろう。
【００３８】
こうして、さらなる側面では、本発明はブタのＫＩＴ遺伝子型を決定する方法であって、ＫＩＴと直接的か又は間接的に連結した少なくとも一つのＤＮＡマーカーと関連する少なくとも対立遺伝子の存在を決定する工程を含む方法を提供する。このＤＮＡマーカーはミクロサテライトであることが好ましい。特にＤＮＡマーカーはＳ００８６、Ｓ００１７、Ｓｗ５２７、Ｓｗｒ７５０又はＳＷ９１６でありうる。第一及び第二の側面に関して、この方法は、血統決定のため、及び大きな同腹多産をより生じ易いもの、及び／又は同腹多産を生じ難いものを決定すべくブタをスクリーニングするため、外被色遺伝子型を決定するために使用することができる。
【００３９】
本明細書で論じたように、本発明はＫＩＴ遺伝子ＤＮＡ配列のコピー数の決定に依存する。その目的のため、重複したＫＩＴセグメントを表すヌクレオチドプローブ若しくはその部分、又は実際はそのようなブタプローブに十分な類似性を示す任意の他のヌクレオチドプローブを使用してもよい。例えば、次の方法
(i)   例えば、マウス（ゴッケルら， Oncogene7:1423-1429 (1992))及び／又はヒト（ギーベルら， Oncogene7:2207-2217 (1992))由来のＫＩＴ遺伝子のＤＮＡの少なくとも一部、及びそれに由来するＲＮＡのヌクレオチド配列から誘導されるヌクレオチドプローブを使用する工程、このようなプローブは、保存性のため、ブタの遺伝子にハイブリッド形成をするであろう、
(ii)  動物のＫＩＴタンパク質のアミノ酸配列が知られている場合、このタンパク質又はその部分をコードするＤＮＡの考えられるヌクレオチド配列が演繹可能である、これに基づき、混合オリゴヌクレオチド調製品をブタＫＩＴ遺伝子のプローブとして使用することができる、
(iii) プローブは、ＫＩＴ遺伝子の全体又は一部、例えば、ν−ＫＩＴ（ベスマーら，Nature320: 415-421 (1986)) に対し機能的相同性を有するタンパク質のためにそのタンパク質配列（及び対応するヌクレオチド配列）に基づいて設計することができる、
が、このような決定を行なうために使用できる。
【００４０】
このように誘導されたプローブは全て、サザン、ノーザン又はドットブロッティングにより、ナイロン膜（例えば、ハイボンドＮ，アマシャム・インターナショナル）などのハイブリッド形成用の適当な媒体に移送された動物由来の核酸調製物を精査するために使用しうる。該媒体に結合した核酸にハイブリッド形成するＫＩＴプローブと対照プローブの量の比を用いてＫＩＴコピーの数を決定できる。結合したプローブの量は放射性同位元素でプローブを標識することにより定量化できる。他の、非同位元素核酸標識キットが現在では入手可能であり、使用することもできる。
【００４１】
動物由来の核酸の媒体へのハイブリッド形成を含むこの手順の逆も可能である。この場合、プローブを該媒体に結合させ、ハイブリッド形成計画により、前述したような方法でゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを捕捉するために使用し、こうして結合した量を定量化できる。この結合した量は、条件が正しい場合は、存在するＫＩＴ核酸配列の総量（又はコピー数）及び対照の核酸配列の総量と関係している。
【００４２】
ＰＣＲ増幅したＤＮＡを定量化する他の方法には、放射標識に基づいた方法が含まれる。一例はオリゴヌクレオチドプライマーの一方又は両方を放射標識化した後、ＤＮＡゲルのオートラジオグラフの密度測定によりＰＣＲ産物中の放射活性を定量化する方法である。代替的手順は、沈降法、濾過、分画遠心分離法、又は他の手法により組み込まれなかった標識化オリゴヌクレオチドを除去した後、分離した各産物を定量できる、ＰＣＲ反応の二つの産物のオリゴヌクレオチドを異なる同位元素で差別標識化する方法である。ＰＣＲ産物はエチジウム・ブロミド又はＳＹＢＲグリーン（モレキュラー・プローブズ，インク．）などの色素を利用する他の染色手順を用い、密度測定法又は蛍光定量法と組み合わせても定量できる。
【００４３】
本明細書に記述されたように、二つのＰＣＲが二つの別々の産物を同一の管の中で生産する混合ＰＣＲ（differential PCR) の産物を定量化する別の方法は、ＴａｑＭａｎ（商標）システム（パーキン・エルマー社）の使用である。このシステムでは、増幅すべき領域の両側に隣接する二つのオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、増幅される領域に結合する第三のオリゴヌクレオチドプローブを使用する。これらの隣接するプライマーは標識しないが、該プローブは二つの蛍光標識を保持する。該プローブの３’末端にはレポーター色素があり、その蛍光は該プローブの５’末端に別の発蛍光団が付着することにより消光する。ＰＣＲの過程でこのプローブは生産物ＤＮＡ分子に結合する。ＰＣＲが進行するにつれ、これらの生産物は鋳型として使用され、その過程でタックＤＮＡポリメラーゼは該プローブの５’消光性色素を切り離し、それにとって代わる。消光性因子のこの除去により、レポーター色素からの蛍光が検出可能となる。蛍光の程度は生産されたＰＣＲ生産物の量に比例し、従ってその尺度となる。反応は、それぞれが別のゲノムＤＮＡ領域に相当する、ＰＣＲプライマーの二つの別の組みと二つのプローブを含んでもよい。このようにして、定量的ＰＣＲの基準に従う限り、各鋳型領域の相対量が測定できる。
【００４４】
本明細書に記述された方法を行なうためのキットが調製できる。これらのキットは、ＰＣＲ法、ミニ配列決定法、又はピロ配列決定法を行なうための一つ以上の周知の試薬類で満たされた一つ以上の容器を含んでもよい。ミニ配列決定法又はピロ配列決定法により、存在するＫＩＴ遺伝子のスプライス変異型コピーのパーセンテージを定量するためのキットは、ヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、酵素混合物（ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、及びアピラーゼ（apyrase)) 、基質混合物（ＡＰＳ及びルシフェリン）、及び使用説明書などのこれらの方法で利用される周知の試薬類を含んでもよい。酵素混合物及び基質混合物は個々の成分として供給することも予め調製した混合物として供給することもできる。さらに、これらのキットには、プライマー、例えば、５’−ＴＡＡＴＴＡＣＸＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣ−３’、Ｘ＝イノシン、を含めてもよい。ＰＣＲ法を利用するＫＩＴ遺伝子型決定用キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、適当な緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチドプライマー、及びこれらの使用説明書などの試薬を含んでもよい。
【００４５】
ヌクレオチド三リン酸の一部はさらに標識を組み込んでもよい。標識は、放射活性、蛍光性、又は酵素などのタンパク質、又は例えばｄＡＴＰαＳのためのビオチンであってもよい。
【００４６】
該試薬は凍結乾燥状態、又はライオファイル状態、又は調製済み溶液として提供されうる。このようなキットは、該キットを利用するための他の容器又は装置を、そして説明書を含んでもよい。
【００４７】
このキットと共に提供されるオリゴヌクレオチドプライマーはブタのＫＩＴ遺伝子型を決定するのに適切なものとなろう。とりわけ、オリゴヌクレオチドの下記の対の一つ以上が使用されうるであろう。
5' −ＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣ−3'及び
5' −ＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧ− 3'、
又は
5' −ＣＴＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴ− 3' 及び
5' −ＴＴＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴ−3'、
又は
5' −ＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＴＡＣ− 3' 及び
5' −ＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣ− 3' 、
又は
5' −ＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣ−3'  及び
5' −ＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣ−3'、
又は
5' −ＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣ−3'  及び
5' −ＴＴＴＴＡＡＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧＧＡＣＣＡＡＣ3'、
又は
5' −ＴＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＧＡＧ− 3' 及び
5' −ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＣ− 3' 、
【実施例１】
【００４８】
動物：２頭のヨーロッパワイルドボア及び８頭のラージホワイト創始動物、２３頭のＦ1、１７８頭のＦ2の動物を含む交雑血統を使用した。この血統は、外被色遺伝の研究に幅広く使用されてきた（ヨハンソンら 1992、ヨハンソン  モラーら 1996、マリアーニら 1996、マークルントら 1998、キジァスら 1998）。商業用集団におけるＫＩＴ対立遺伝子の分布を、３３頭のスウェーデンラージホワイトブタと４８頭のスウェーデンランドレースブタのサンプルを使用して調査した。
【００４９】
ＰＣＲ増幅：ＫＩＴのエキソン１７とイントロン１７の一部はＰＣＲプライマーＫＩ３１，５’−ＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣ−３’及びＫＩＴ３５，５’−ＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧ−３’を用いて増幅した（マークルントら 1998）。プライマーＫＩＴ３５は、ＰＣＲ産物をアビジンで被覆した固体支持体上で補足できるように５’−ビオチン化した。ＰＣＲ反応は４０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、２００μＭのｄＮＴＰ、１.２５Ｕのアンプリタック・ゴールドＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ・アプライドバイオシステムズ，米国）及び１０ｐｍｏｌの前向きプライマーと逆向きプライマーの両方を含む全容積５０μｌ中で実施した。
【００５０】
ピロ配列決定：２５μｌのビオチン化ＰＣＲ産物を、結合−洗浄緩衝液（５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、０.５ｍＭのＥＤＴＡ、０.０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７.６）を用いて全容積９０μｌ中で４３℃で３０分間、ストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズ上に固定した。この固定されたＰＣＲ産物を５０μｌの０.５ＭのＮａｏＨ中で１分間インキュベートし、そのビーズを１００μｌの結合−洗浄緩衝液で一度洗浄して、１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを得た。スプライス突然変異のすぐ上流にその３’末端を持つように設計された１５ｐｍｏｌの検出プライマーＫｉｔＳｅｑ（５’−ＴＡＡＴＴＡＣＸＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣ−３’、Ｘ＝イノシン）を、４０μｌのアニーリング緩衝液（２０ｍＭのトリス−酢酸、５ｍＭのＭｇＡｃ2、ｐＨ７.６）中のｓｓＤＮＡと８０℃で２分間ハイブリッドを形成させ、その後室温に冷却した。ピロ配列決定は、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、酵素混合物（ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ及びアピラーゼ）及び基質混合物（ＡＰＳ及びルシフェリン）、及びＰＳＱ９６装置（ピロ配列決定ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を含むＳＮＰ試薬キットを用いて実施した。このピロ配列決定検定の結果は組み込まれたｄＡＴＰαＳからの信号とｄＧＴＰからの信号の間の比率として表され、この配列中に次に組み込まれたｄＡＴＰαＳとｄＧＴＰの比率で標準化された。
【００５１】
ミニ配列決定：各ＰＣＲ産物の１０μｌの部分標本の四つを、ストレプトアビジンで被覆されたマイクロタイタープレート穴中で、４０μｌの結合緩衝液（０.１５ｍＭのＮａＣｌと０.１％のＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７.５）と混合し、３７℃で１.５時間、シェーカー（ラブシステムズ・サーモミクス１４１５、フィンランド）中でインキュベートした。この穴を自動プレート洗浄機（ウェルウォッシュ・ラブシステムズ、フィンランド）で４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ及び０.１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄した。該ＰＣＲ産物のビオチン化されていない鎖は６０μｌの０.１ＭのＮａＯＨで３分間変性させて除去した。上記のとおり洗浄した後、ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、０.２Ｕのタックポリメラーゼ（ＰＥ・アプライドバイオシステムズ、米国）、０.１μＣｉの［3Ｈ］−ｄＡＴＰ（ＴＲＫ６３３、５７−７６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）又は［3Ｈ］−ｄＧＴＰ（ＴＲＫ６２７、２４−３４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク、英国）、及び１０ｐｍｏｌの検出プライマーＫｉｔＳｅｑを含む５０μｌのミニ配列決定反応混合物を、これらの穴に添加した。これらの穴は５０℃で１０分間インキュベートした。組み込まれなかった標識は上記の通り洗浄して除去し、配列決定用プライマーを１００μｌの０.１ＭのＮａｏＨで放出させ、リキッドシンチレーションカウンター（１４１４、ウォラック、フィンランド）で測定した。このミニ配列決定検定の結果は組み込まれた［3Ｈ］−ｄＡＴＰからの信号と［3Ｈ］−ｄＧＴＰからの信号の間の比率として表される。
【００５２】
実時間ＰＣＲを用いたＫＩＴコピー数の相対的定量化：異なる遺伝子型におけるＫＩＴのコピー数を、別々の管で標的ＫＩＴ遺伝子及び単一コピー対照遺伝子（ＥＳＲ、エストロゲン受容体遺伝子）のＰＣＲ増幅に基づく比較ＣT法を用いて既に記載された（ギウフラら 1999）とおりに測定した。このＫＩＴに対するＰＣＲプライマーは、前向きが５’−ＣＴＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴ−３’で逆向きが５’−ＴＴＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴ−３’で、ＥＳＲに対しては前向きが５’−ＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＣＣＡ−３’で逆向きが５’−ＴＧＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＴＴＧ−３’である。ＰＣＲ反応はＡＢＩ７７００装置（ＰＥアプライドバイオシステムズ、米国）を使用し、２５μｌ反応量でタックマン・ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＰＥアプライドバイオシステムズ、米国）を用いて行った。ＫＩＴに特異的なタックマン・プローブ、５’−ＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＧＧＣＴ−３’はその５’末端をＦＡＭで標識し、ＥＳＲに特異的なプローブ、５’−ＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣＴＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＡ−３’はその５’末端をＶＩＣで標識した。熱サイクリングの時間と温度は、アンプエラーゼ活性化及びアンプリタックゴールド活性化に対して最初が５０℃で２分間、及び９５℃で１０分間それぞれ保持し（ＰＥアプライドバイオシステムズ、米国）、続いて９５℃で１５秒と６０℃で１分を４０サイクル行った。それぞれの動物について二連のＤＮＡ試料をテストした。
【００５３】
結果
ワイルドボア／ラージホワイト交雑種における優性白色／ＫＩＴ対立遺伝子のセグリゲーション分析は追加のＫＩＴ対立遺伝子を明らかにする：ミニ配列決定とピロ配列決定を使用して、ワイルドボア／ラージホワイト交雑種中の全動物のイントロン１７の最初の位置におけるスプライス突然変異を含むＫＩＴ配列と、正常なヌクレオチドを持つＫＩＴ配列の間の比率を決定した。次の四つのグループの比率は以下のように予測された。スプライス変異種（ｉ／ｉ，ＩP／ｉ）は０％、（Ｉ／ＩP）は２５％、（Ｉ／ｉ）は３３％、及び（Ｉ／Ｉ）は５０％。上記二つの方法で得られた比率をプロットすることにより、この血統のＫＩＴ対立遺伝子の構成に対する本発明者らのこれまでの解釈に合致する群が観察された（図１）。しかしながら、さらなる対立遺伝子が存在するという異質性に対する明らかな証拠が観察された。該創始動物（図１Ａ）は五つの異なる群に割当てられた。即ち、０％スプライスにｉ／ｉである２頭のワイルドボア、２５％スプライスにパッチ対立遺伝子についてヘテロ接合であるＩ／ＩPのラージホワイトの雌ブタ１頭（Ｗ８）、３３％スプライスに単一のＫＩＴコピーを保持する対立遺伝子についてヘテロ接合であり、スプライス突然変異を持たないラージホワイト雌ブタ１頭（Ｗ６）、４０％スプライスにＫＩＴの３コピーを持つ新たな対立遺伝子についてヘテロ接合であった３頭の雌、５０％スプライスには８頭のラージホワイトの雌ブタのうち３頭のみがホモ接合Ｉ／Ｉであった。
【００５４】
Ｗ６の雌がコピーを一つだけしか持たずスプライス突然変異を持たない新規の対立遺伝子を保持するという解釈は、そのＦ1子孫の約半分とそのＦ2孫の割合がスプライス突然変異を全く保持しなかったという本発明者らの観察によって確認された。この対立遺伝子を保持するＦ2動物はどれも野生型の色を示さなかったので、我々はこの対立遺伝子が野生型の対立遺伝子（ｉ）と同一であるということを排除することができる。この対立遺伝子がベルト対立遺伝子（ＩBe）と同一であるという可能性を正式に排除することができないので、分子レベルでの特性決定又は情報の多い血統材料がこれらが二つの異なる対立遺伝子であるかどうかを明らかにできるまでは、同一の対立遺伝子命名が与えられるものとすることを提案する。この対立遺伝子は、Ｉ／ＩBeヘテロ接合体が白色であったので、優性白色に対して劣性であった。ヘテロ接合ＩBe／ｉであるＦ2動物は、この交雑でセグリゲートする拡張／ＭＣ１Ｒ遺伝子座との総合作用により二つの異なる表現型を示した（キジァスら 1998、ギウフラら 1999）。遺伝子型ＩBe／ｉ、Ｅ＋／−を持つＦ2動物は、着色毛と混ざった白毛を特徴とする別のローン（Roan）表現型を示したが、遺伝子型ＩBe／ｉ、ＥP／ＥPを持つＦ2動物は大部分が白色でいくつかの黒い斑点を伴っていた。
【００５５】
ラージホワイトの創始動物雌ブタの３頭（Ｗ４、Ｗ５及びＷ１０）はスプライス部位においてＩ／Ｉホモ接合体で予測された５０％とは明らかに異なる約４０％のＡ対Ｇの比率を示した（図１Ａ）。これらの創始動物由来のＦ1子孫はＡが２５％のものと３３％のものの二つのグループに分かれたが、一方Ｉ／Ｉホモ接合体由来のＦ1子孫は３３％の群のみで見つかった（図１Ｂ）。３３％のＡを持つ子孫グループは表現型Ｉ／ｉと一致したが、一方２５％のグループの動物はＫＩＴの三つのコピーを持つ変異優性白色対立遺伝子を受け取り、そのコピーの一つだけがスプライス突然変異体を保持すると本発明者らは仮定する。この血統でのセグリゲーションデータはこの解釈と一致した。該優性白色対立遺伝子のこの二つの型の間には、明らかな表現型の差異はなかった。二つのＫＩＴコピーと一つのスプライス突然変異を持つ対立遺伝子をＩ1と命名し、三つのコピーと一つのスプライス突然変異を持つ対立遺伝子をＩ2と命名することを提案する。
【００５６】
Ｆ2子孫間のスプライス突然変異の予測比率は、創始動物とＦ1動物のＫＩＴ遺伝子型に対する本発明者らの解釈と、外被色及び前に研究した密接に連結するミクロサテライトセグリゲーションの組み合わせに基づいて予測できるであろう。ミニ配列決定とピロ配列決定を組み合わせて使用して得られたスプライス突然変異の予測比率と観測比率の間には、優れた相関性があった（図１Ｃ）。
【００５７】
観測したＫＩＴ対立遺伝子とそれに相当する表現型の構造を図２と下表にそれぞれまとめる。
【００５８】
（表）
2004529649.tif 000003
【００５９】
ＫＩＴ対立遺伝子間の遺伝子コピー数の変動し易さは定量的実時間ＰＣＲ分析により確認される：スプライス突然変異の比率で観測された変動し易さの一部はバイアスされたＰＣＲ増幅によるものである（例えば、プライマー部位における多型性によるものである）という可能性を排除するため、本発明者らは実時間ＰＣＲ分析を用いて異なるＫＩＴ対立遺伝子中の遺伝子コピー数についての我々の解釈をテストした。このテストは、ＫＩＴと単一コピー対照配列の（エストロゲン受容体遺伝子、ＥＳＲ）を増幅することにより実施した。ゲノムＤＮＡの試料中のＫＩＴ配列とＥＳＲ配列のコピー数は、与えられた蛍光の閾値に達するのに必要なサイクル数の評価であるＣｔ値と相関する。Ｃｔ（ＥＳＲ）とＣｔ（ＫＩＴ）の差異は、ワイルドボア交雑種の全動物を我々の解釈に従った異なる遺伝子型におけるＫＩＴコピーの予測数に対してプロットされた（図３）。遺伝子型の分類には大きな重なりがあるが、Ｃｔ（ＥＳＲ）対Ｃｔ（ＫＩＴ）の差異は予測コピー数と高度に有意な正の相関を示した（Ｐ＜０.０００１）。異なる遺伝子型分類のＣｔ差異に対する評価された平均値は次の通りであった。２コピー：−０.５７±０.１７、３コピー：−０.１８±０.１３、４コピー：０.３６±０.１７、５コピー：１.１９±０.４０。この結果は、ＤＮＡ配列の該コピー数が２倍である場合に、−１.０というΔＣｔ値の理論的予測と良く一致する。この結果はＫＩＴ対立遺伝子のコピー数の変化及びＫＩＴ３重化の存在に対する本発明者らの解釈を支持する。遺伝子型分類の間でのΔＣｔ値の大きな重なりのため、少なくともこの研究で使用した実験手順で遺伝子型を決定するためには、タックマン検定は不適切となる。
【００６０】
商業用白色集団における対立遺伝子の大きな多様性：８頭のラージホワイト創始動物のみの間で少なくとも四つの異なる対立遺伝子（Ｉ1，Ｉ2，ＩBe，ＩP）がＫＩＴ遺伝子座に存在するという本発明者らの観察が、商業用白色集団における対立遺伝子多様性の研究に本発明者らを駆り立てた。３３頭のスウェーデンラージホワイトブタと４８頭のスウェーデンランドレースブタから得たゲノムＤＮＡ試料をピロ配列決定分析及びミニ配列決定分析にかけた（図３）。その結果は、両方の集団で相当な対立遺伝子の多様性が明らかになった。これは世界中のほとんどの白色集団に共通する特性である可能性がある。これらの２集団でどの対立遺伝子がセグリゲートしているかを何の血統データなしに正確に推定することは不可能であるが、スプライス突然変異を持たない対立遺伝子が両方の集団でセグリゲートしていることは明らかである。４頭のラージホワイト動物が約６０％の比率のスプライス突然変異を示し、これが上記の対立遺伝子により形成されるどの遺伝子型の組み合わせよりも有意に高いので、優性白色／ＫＩＴ遺伝子座の６番目の対立遺伝子に対する証拠が得られた。ＫＩＴとＥＳＲを用いた実時間ＰＣＲ分析は、これらの４頭の動物がＫＩＴのコピーを五つ持っていたことを示した。従って、本発明者らは、これらがＫＩＴ対立遺伝子のヘテロ接合であり、三つの遺伝子コピーを持ち、三つのうち二つがスプライス突然変異を持つと仮定する。本発明者らはこの対立遺伝子をＩ3と命名した（図２、表）。このＩ3対立遺伝子を保持する４頭の動物のうち２頭は半血縁関係（half-sib) であり、そしてこの４頭全てが共通の祖父を共有していた。これはこれらの動物がこの共通の祖先からＩ3を遺伝で継承していたことを示唆している。
【００６１】
もし５０％集団の動物の殆どがホモ接合体Ｉ1／Ｉ1であると仮定するなら、この遺伝子型分類の頻度の平方根によってこの対立遺伝子の頻度の推定概算値を得ることができる。このことから、これらのラージホワイト集団とランドレース集団でＩ1に対しそれぞれ０.４９と０.５８の頻度推定値が得られる。これらの値は、他の遺伝子型分類も５０％の比率を示しているため（表）、若干過大評価である可能性が高い。
【００６２】
討論
本研究で検出されたブタ優性白色／ＫＩＴ遺伝子座の大きな遺伝子多様性は、１００年以上もの間、白色を強く選択してきたことを考えると、予想外であった。また、白色血統がホモ接合Ｉ／Ｉであると仮定されているブタの外被色についての文献（例えば、リゴールト 1998）からも予想されなかった。本研究はこの遺伝子座が遺伝的に不安定であることをはっきりと示す。これに対する理由は、重複が大きいこと（約４００Ｋｂ）、そしてこの二つのコピーが、不均等な交差により恐らくは遺伝子変換により新たな対立遺伝子の形成を促進する極めて高い配列同一性（＞９９％）を示すこと、である可能性が極めて高い。この現象は縦列に重複したＤＮＡ断片については極めてよく記載されているものである（オータら 1990）。例えば、ヒトのＸ染色体上の赤色／緑色の目色素の遺伝子における該遺伝子の縦列コピー間の不均等な交差は色盲と関連するハプロタイプを形成した（ナイツとナイツ 1995）。
【００６３】
本発明者らは、ここに少なくとも六つの異なる優性白色／ＫＩＴ対立遺伝子を記載する。ハンプシャーブタのベルト表現型と関連する対立遺伝子と我々のワイルドボア交雑種のローン表現型と関連する対立遺伝子とが同一であるかどうかは議論の余地がある。両方の対立遺伝子共スプライス突然変異を持たない単一のＫＩＴコピーを含む。本発明者らは、これらの二つの表現型ＩBeと関連する対立遺伝子は伝統的なものと命名した。該対立遺伝子が既に述べた対立遺伝子とは異なるものであるという説得力のある証拠なしでは新たな対立遺伝子の命名をを導入しない。我々が慎重になる理由は、ＫＩＴ対立遺伝子の表現型の発現は他の遺伝子とりわけＭＣ１Ｒ／伸長遺伝子座（マークルントら 1998 、ギウフラら 1999 、本研究) との相互作用を示すからである。我々は同じ遺伝的背景では、ベルト−関連対立遺伝子とローン−関連対立遺伝子をこれまで観察しなかった。
【００６４】
白色ブタの血統における複数のＫＩＴ対立遺伝子の存在は、突然変異の比率が高いことにより単純に説明することが可能である。しかしながら、平衡選択（balancing selection）が対立遺伝子多様性の維持に貢献しているかもしれない。マウスでは、ＫＩＴの構造的突然変異が造血と多産に及ぼす多面発現的効果と関連があり、機能を失ったホモ接合体は致死的である（ジャクソン 1994）ということが十分に記載されている。マウスの対応する領域での一定のミスセンス突然変異は機能喪失でありかつホモ接合的に致死的であるため、Ｉ対立遺伝子に存在するスプライス突然変異はＫＩＴの信号発信に関する完全な機能喪失である可能性はきわめて高い。本発明者らは、Ｉ／Ｉホモ接合体が有する白色細胞の数がワイルドボア交雑種中のＩ／ｉ動物及びｉ／ｉ動物よりも少ないと報告したが、これはＩ対立遺伝子が造血に及ぼす軽い負の効果と関連する（マークルントら 1998）ことを示唆する。従って、異なるＫＩＴ遺伝子型における造血パラメータ及び可能なら多産特性を研究すること、特に発現したＫＩＴタンパク質の６６％がチロシンキナーゼ領域の４１アミノ酸を欠いたスプライス型を持つと予測されるＩ3／Ｉ3ホモ接合体における表現型効果を研究することは極めて興味深いものであろう。単一のＫＩＴコピーとスプライス突然変異を含む対立遺伝子がいくつかの白色集団で低い頻度で発生し、この対立遺伝子がホモ接合的に致死的であると予測されるということも可能である。
【００６５】
本研究の結果は、実践的なブタの育種に重大な意味を持つ。第一に、本研究で適用したピロ配列決定法とミニ配列決定法は共にＫＩＴ遺伝子型決定という観点で重要な改良点である。従来ＫＩＴ対立遺伝子の定量的分析に使用されてきたＴａｑＭａｎ法もＰＣＲ−ＲＦＬＰ断片の定量的分析も、本明細書で報告したのと同程度には対立遺伝子多様性を解決できない。例えば、診断テストを使用して、白色雄ブタはホモ接合Ｉ／Ｉであるので着色系統との交雑でも白色系統が維持されること（多くの市場では白い表皮を持つブタの肉が消費者に強く好まれる）を確実にすることができる。第二に、本発明は、選択能力の一部が白色の維持に費やされているから、ＫＩＴ遺伝子座の遺伝的不安定性がブタの育種の費用の原因となっていることを示唆する。それぞれの世代での経済的影響は恐らくは少ないが、多くの世代にわたって合計すれば相当なものになるであろう。最後に、優性白色／ＫＩＴ対立遺伝子の一部が他の形質に及ぼす負の多面発現的効果と関連するかどうかを調査する価値がある。もしそうなら、ＤＮＡ診断テストはそのような有害な対立遺伝子の頻度を低い状態に保つことを確実にするために使用されるべきである。
【００６６】
優性白色／ＫＩＴ遺伝子座の不安定性の別の興味深い意義は、野生のブタを確立できる白色優性ブタはＫＩＴ遺伝子座の野生型の遺伝子型や有色の表現型に戻ると予測されることである。これは白色が、太陽露出に対する高度な感受性と捕食及び人間による狩に対する高い感受性の両方のため、野生での適合性に負の効果を有するからである。
【実施例２】
【００６７】
パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）及びサザンブロット分析。ＤＮＡプラグをデュロック（ｉ／ｉ）、ハンプシャー（ＩBe／ＩBe）及びラージホワイト（Ｉ／Ｉ）ブタの新鮮な血液又は凍結した血液から調製した。白血球を、等張性溶解し、リン酸緩衝化食塩水で２〜３回洗浄し、２５×１０6細胞／ｍｌの濃度となるように再懸濁し、約５０℃まで冷却したリン酸緩衝化食塩水中で等量の１.５％低溶解性アガロースと混合することにより調製した。該アガロース細胞懸濁液の一部をプラグ鋳型（バイオラッド）に入れ、４度で凝固させた。プラグを、０.５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０、１％のサーコシル（Sarkosyl）、０.５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で絶えず振盪して、５０℃で１〜２日間消化した。ＴＥ中で平衡化した後、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（phenylmethylsulfonyl fluoride)を含むＴＥ中でインキュベートし、残留プロテインキナーゼＫ活性を不活性化した。ＴＥ中で徹底的に洗浄した後、該プラグを０.５ＭのＥＤＴＡ中、４℃で保存するか、又は制限消化に直接使用した。各プラグを約３５μｌの２個の部分に分割し、製造者（ニューイングランドバイオラブズ、米国）により提供された制限緩衝液中で約３〜４時間、氷上で平衡化させた。この緩衝液を約５０Ｕの酵素を含む新しい緩衝液に取り替え、この酵素を１６℃で１６時間、プラグ中に拡散させた。３７℃で１６時間インキュベートした後、約２０単位の酵素を付加し、１６℃で４〜５時間、プラグ中に拡散させ、３７℃でさらに５〜６時間インキュベートした。
【００６８】
この消化されたプラグのＰＦＧＥを、ＣＨＥＦマッパーＸＡ装置(バイオラッド、米国)を用い、０.５ｘＴＢＥ中の１％のアガロースゲル中１４℃で行った。電気泳動条件は、予想される断片サイズ、通常は５０ｋｂ〜８００ｋｂの間（６Ｖ／ｃｍの電場で２７時間、パルス時間６秒〜１.３分）にとって最適な分解能を得るため、オートアルゴリズムモードで設定した。酵母染色体とラムダラダーをサイズマーカーとして使用した。ＰＦＧＥにより分離されたＤＮＡは、サザンブロットの標準条件で３時間、ハイボンドＮ＋（アマシャム、英国）膜に移送した。
【００６９】
ブロットハイブリッド形成は、製造者に勧められた条件でエクスプレスハイブ（ExpressHyb）ハイブリッド形成溶液（クローンテック、米国）中で実施した。使用したＤＮＡプローブは、ブタＫＩＴｃＤＮＡの２.４ｋｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片（マークルントら 1998）、ヒトＰＤＧＦＲＡの３.４ｋｂのＢａｍＨＩ断片（クレソン−ウェルシュら 1989）、ヒトＫＤＲｃＤＮＡの４.５ｋｂのＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断片（ジェンバンクＡＦ０６３６５８）、２２９ｂｐのＫＩＴイントロン１８ＰＣＲ断片（ヨハンソン  モラーら 1996）、及びコンティグのＢＡＣクローンの末端配列決定から得られた四つのＳＴＳプローブ、即ちＳＴＳ１０００Ｄ２５’、ＳＴＳ２１１Ｅ１２５’、ＳＴＳ６４５Ｄ５３’、及びＳＴＳ９５３Ｆ１１３’である。プローブは、メガプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム、英国）を用いて32Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。ハイブリッド形成したブロットを、ホスフォルイメイジャー（PhosphorImager）（モレキュラーダイナミクス、米国）に少なくとも１６時間曝した。ＨｉｎｄIII 消化したＢＡＣ・ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡのサザンブロット分析は、前に記載されたとおりに（ヨハンセン  モラーら 1996）に実施した。３’−５’重複切断店を含む３.９ｋｂのサブクローンｐ９５３Ｈｉｎｄ４から得た８９７ｂｐのＰＣＲ産物をプローブとして使用した。
【００７０】
ＢＡＣコンティグの構築。ＩＮＲＡブタＢＡＣライブラリーは、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクター（ローゲル−ガイラードら、1999）を用いて構築した。ＢＡＣクローンはＰＣＲに基づく３次元スクリーニングにより単離した。ＰＣＲは０.２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ2、８ｐｍｏｌの各プライマー、２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及び反応緩衝液（アドバンスドバイオテック、英国）を含む２０μｌの反応容量中で実施した。サイクル条件は次のサイクルを含むものであった。初期培養が９４℃で５分、その後９４℃で１分、所定のプライマーセットに最適なアニーリング温度＋２℃で１分、及び７２℃で１分を含む３サイクル、次いで９４℃で２０秒、最適なアニーリング温度で３０秒、及び７２℃で３０秒を３５サイクル。
【００７１】
ＢＡＣ末端配列は、Ｍ１３ＲプライマーとＭ１３Ｆプライマーを用いて選択されたＢＡＣの５’末端と３’末端の両方を直接配列決定することにより決定した。簡単に言えば、１００ｍｌ液体培養（ＬＢ＋１２.５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）から、ＢＡＣ・ＤＮＡをアルカリ溶解法で調製した。粗ＢＡＣ・ＤＮＡを４０単位のＥｃｏＲＶで消化した。消化されたＤＮＡを、ＱＩＡＥＸIIキット（キアゲン、ドイツ）を用いて製造者の説明に従って精製し、次にエタノール沈殿を行い、ビッグダイ・ターミネーター化学反応（ＰＥ  アプライドバイオシステムズ、米国）を用いる１０μｌの配列決定反応液中で使用した。９５℃で５秒、５０℃で１０秒、及び６０℃で４分のサイクルを４５回適用し、伸長した産物をエタノール沈殿させ、４％の変性ゲルに乗せ、ＡＢＩ３７７シーケンサー（ＰＥ  アプライドバイオシステムズ、米国）で分離した。通常は約４００〜５００ｂｐの良質な配列が得られた。これらの配列は、リピートマスカー（http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker）を用いて分散した反復、及び複雑さが低いブタＤＮＡ配列をマスクした。マスクされた配列を、ＢＬＡＳＴのアドバンストバージョン２.０ネットワークサービス（http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/）を用いてＮＣＢＩでＤＮＡデータベースに対するＢＬＡＳＴ（アルチュールら 1990）検索（ｎｒ，ｍｏｎｔｈ，及びｄｂｅｓｔ）に付した。該ＢＡＣ末端配列は、ライブラリーを再びスクリーニングし、コンティグを拡大するのに用いられる新しい配列標識部位（ＳＴＳ）を決定した。該ＢＡＣクローンの順序と重なりはコンティグ内の全クローンに対してＳＴＳをスクリーニングすることにより決定された。
【００７２】
ＢＡＣクローンの間の重なりと物理的距離は制限マップで概算した。レアカット酵素ＳｍａＩ及びＮｏｔＩ（アマシャム、英国）を用いて完全消化及び部分的消化した。断片を上述の通りＰＦＧＥで分離し、ハイボンドＮ＋ハイブリダイゼーション膜（アマシャム、英国）に移送した。ベクターに特異的なプライマーＳＰ６とＴ７をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラボズ、英国）を用いて32Ｐで末端標識し、ハイブリッド形成に用いた。
【００７３】
ＦＩＳＨ分析。これは既に詳細に記されている（チョードリーら 1995）通りに実施した。ＢＡＣはギブコＢＲＬバイオニック標識システム（ＢＲＬ 18247−015）を用いてビオチン−１４−ｄＡＴＰで標識し、約２００ｎｇのプローブを各染色体のスライドに付加した。ＫＩＴコード配列の一部を含むコスミドクローン（ヨハンソン  モラーら 1996）をニックトランスレーション法及び新しい各ＢＡＣクローンとの共ハイブリッド形成により、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識化した。そのビオチンシグナルは２層のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合アビジン（ベクター）で検出され、ジゴキセニン（digoxenin）シグナルはアンチディグ（anti-dig）ローダミン（ベーリンガーーマンハイム）で検出された。該染色体はＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）で対比染色し、染色体特定のためのＧ−バンド様のパターンを形成させた。。
【００７４】
重複切断点のサブクローニング及び配列分析。重複切断点のＰＣＲ増幅。ワイルドボア、ラージホワイト、ランドレース、パイトレーン、バークシャー、デュロック、ハンプシャー、リンデレード、及びメイシャンの各血統を代表するブタゲノムＤＮＡ試料から、切断点を覆う断片を増幅した。プライマー８３２Ｆ２（５’−ＣＣＡＣＡＡＴＡＴＡＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＴＴＡＣ−３’）及び９５３Ｒ２（５’−ＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣ−３’）を用いてＢＡＣ８３２Ｅ１１中に存在する５’切断点を覆う９６８ｂｐを増幅し、９５３Ｆ１（５’−ＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣ−３’）及び９５３Ｒ２を用いてＢＡＣ９５３Ｆ１１中に存在する３’−５’切断点を覆う８６４ｂｐを増幅し、９５３Ｆ１と１０４１Ｒ１（５’−ＴＴＴＴＡＡＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧＧＡＣＣＡＡＣ−３’）を用いてＢＡＣ１０４１Ｂ３中に存在する３’切断点を覆う１０２２ｂｐを増幅した。ＰＣＲ反応は、１.５ｍＭのＭｇＣｌ2、０.２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２.５ｐｍｏｌの各プライマー、５％のＤＭＳＯ、２５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１ｘＰＣＲゴールド緩衝液、及び０.７５ＵのアンプリＴａｑゴールドポリメラーゼ（ＰＥ・アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア、米国）を含む１０μｌの反応液中で実施した。熱サイクルはＰＴＣ２００装置（ＭＪリサーチ、ウォータータウン、マサチューセッツ、米国）を用いて実施した。最初のサイクルの温度条件は９４℃で１０分間、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒であり、一方残りのサイクルは９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、及び７２℃で９０秒で実施した。該ＰＣＲ産物は、上述の通り直接配列決定した。
【００７５】
プライマー９５３Ｆ９（５’−ＴＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＧＡＧ−３’）及び９５３Ｒ３（５’−ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＣ−３’）を用いて、３’−５’切断点を覆う１５２ｂｐ産物を重複の診断テストとして形成させた。該産物を標準的なアガロースゲル電気泳動法で分離した。
【００７６】
結果
パルスフィールドゲル電気泳動法（ＰＦＧＥ）
デュロック、ハンプシャー、及びラージホワイトの三つの血統を代表するブタからのＤＮＡ試料、及び三つの優性白色／ＫＩＴ遺伝子型、それぞれｉ／ｉ、ＩBe／ＩBe、及びＩ／Ｉを使用した。高分子量のゲノムＤＮＡを含むＤＮＡプラグを、三つのレアカット酵素ＮａｒＩ、ＢｓｓＨII、及びＰｍｅＩで消化した。この消化したＤＮＡをＰＦＧＥで分離し、ハイブリダイゼーション膜にブロットした。この膜は、最初にＰＤＧＦＲＡ遺伝子及びＫＤＲ遺伝子用のＫＩＴプローブ及びｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成した。これはそれぞれヒトゲノムのＫＩＴの上流及び下流に位置するものである（スプリッツら 1994）。この結果は、ラージホワイトブタのＮａｒＩとＢｓｓＨIIの両方について２〜３個の断片が得られたが、非白色ブタでは一つの断片しか得られなかったので（表１、図１Ａ）、予測どおり、ＫＩＴが重複領域とハイブリッド形成をしたことを示した。該ＰＤＧＦＲＡプローブは、全酵素で及び全ての遺伝子型において単一断片とハイブリッド形成した。このことは我々の先のＦＩＳＨ分析（ヨハンソン  モラーら 1996）と一致して、重複がこの遺伝子を含んでいないことを示唆した。同様に、該ＫＤＲプローブはラージホワイトブタでは三つの酵素全てで単一断片とハイブリッドを形成した。
【００７７】
この結果は、一つの重複切断点がＰＤＧＦＲＡとＫＩＴの間に位置しており、また別の重複切断点がＫＩＴとＫＤＲの間に位置していることを示唆した（図１Ｂ）。前者の重複切断点の位置を正確にするために、ＫＩＴとＰＤＧＦＲＡの間の領域から得られる二つのＳＴＳ断片、６４５Ｄ５３’と２１１Ｅ１２５’を使用した。これらのプローブをＰＦＧＥブロットとハイブリッド形成させた。その結果、重複切断点がこれらの二つのＳＴＳ間に位置していることが分かった（表１、図５）。
【００７８】
このＰＦＧＥのデータは、単一のＮａｒＩ断片が重複領域内に存在し、その結果重複のサイズが約６００ｋｂになることを示唆した。
【００７９】
ＢＡＣコンティグの構築
ホモ接合体Ｉ／Ｉであると想定されるラージホワイトブタからＢＡＣライブラリーを構築した。本発明者らは、任意に正常な遺伝子コピーＫ１２とスプライス突然変異種Ｋ１３を含むコピーを指定した。ＢＡＣコンティグの構築は、ＫＩＴエキソンを増幅するプライマーを用いてこのライブラリーをスクリーニングすることで開始した。スプライス突然変異の診断テストを用いて、これらのＢＡＣクローンをＫ１２又はＫ１３に属すると割り当てることができた（図６）。これらの二つのコピーがＰＤＧＦＲＡ及びＫＤＲに関連してどの順序で構成されるのかは分からないことに注意されたい。該コンティグは、ＢＡＣ末端配列決定で開発したＳＴＳを用いた染色体歩行により両側で拡張した。クローン２１１Ｅ１２はＫＩＴエキソン１と上流領域の一部を含むが、クローン５４９Ｃ３はＫＩＴ下流領域を表す。Ｋ１２とＫ１３の領域の間ではまだ診断的多型は検出されていないので、これらのクローンをＫ１２又はＫ１３の領域に割り当てることはできなかった。
【００８０】
密接に連結したＰＤＧＦＲＡ遺伝子をＢＡＣコンティグ構築の第２の開始点に選んだ。ＰＣＲプライマーは人とマウスの間で保存されたＰＤＧＦＲＡ配列を用いて設計した（表２）。二つの陽性のクローンが確認された（図６）。そのＢＡＣ末端を配列決定し、新たなＳＴＳプライマーを開発するのに使用し、今度はＰＤＧＦＲＡの両端でこのコンティグを拡大するのに用いた。さらに六つのクローンが確認され、ＢＡＣ末端配列決定の対象とされた。ＳＴＳ６４２Ｄ４３’を用いたＢＬＡＳＴ検索で、ヒトＰＤＧＦＲＡプロモーター領域の極めて重要な同族体が明らかになった。ＰＤＧＦＲＡ及びＫＩＴがヒトと同様にブタでも頭から尾の方へ向いているという仮説（スプリッツら 1994）によれば、この結果はこのサブコンティグの向きを明らかにした。そして染色体歩行はＰＤＧＦＲＡの３’末端から連続していた。ＳＴＳ６４５Ｄ５３’を用いてこのＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることにより、二つの新たなクローンが同定された。これらの８３２Ｅ１１の一つはクローン２１１Ｅ１２と重なっていた。これは、ＰＤＧＦＲＡとＫＩＴ間の完全なコンティグが構築されたことを示すものである（図６）。ブタのこれら二つの遺伝子間の距離は、マウスの場合の相当する概算値（ハフら 1998）と極めて類似しており、約３５０ｋｂと推定された。
【００８１】
このＰＦＧＥデータは、ＫＩＴ５’重複切断点が重複断片とハイブリッド形成しなかったＳＴＳ６４５Ｄ５３’とＫＩＴ領域の２コピーとハイブリッド形成した２１１Ｅ１２５’の間に位置するものであることを示した（図５）。これら二つのＳＴＳは約１００ｋｂ離れて、どちらも５’重複切断点を含むＢＡＣ８３２Ｅ１１に存在する。次いで、このＳＴＳが３’−５’重複切断点からだけでなく５’重複切断点からもＢＡＣを同定できる筈であるとの仮説に立って、ＳＴＳ２１１Ｅ１２５’を用いて該ＢＡＣライブラリーをスクリーニングした（図６参照）。後者のタイプのクローンの特徴的な性質はこのクローンがＰＤＧＦＲＡ−ＫＩＴコンティグに属さない末端を一つ含む筈だということであろう。ＳＴＳ２１１Ｅ１２５’を用いて三つの新たなクローンを単離し、新たなＳＴＳをＢＡＣ末端配列決定により形成させた。このコンティグからＢＡＣをＰＣＲスクリーニングすると、７６３Ｆ１３’と９５３Ｆ１１３’の両方が自分自身同士でのみ陽性であることが明らかになった。これは対応するクローンが３’−５’重複切断点である可能性があることを示している。７６３Ｆ１及び７６３Ｆ１３’で単離された新たなＢＡＣクローンのＦＩＳＨ分析では、このクローンが染色体８上のＫＩＴ領域由来の一方の末端及び染色体５由来のもう一方の末端でキメラ的であることが分かった。しかしながら、クローン９５３Ｆ１１のＦＩＳＨ分析は、ＳＳＣ８ｑ１２上のＫＩＴ領域からのシグナルのみという結果に終わった。ＳＴＳ９５３Ｆ１１３’は次に四つの新たなＢＡＣを単離するために用いられた（図２）。ＢＡＣ末端配列決定及びジェンバンクに対するＢＬＡＳＴ検索では、異なる種におけるクローン１０４１Ｂ３の３’末端とＫＤＲコード配列の間に極めて重要なヒットが得られた。ヒトＫＤＲであるＡＦ０６３６５８に対して、最も高いスコア（９３ヌクレオチドにわたり９４％の配列同一性、Ｐ＝ｌｅ-32）が得られたのである。これは、ＫＤＲが重複していないことを示すＰＦＧＥデータと併せれば、クローン９５３Ｆ１１が３’−５’重複切断点を含み、クローン１０４１Ｂ３が３’重複切断ポイントを含むという証拠となる。ＫＩＴの３’領域から得たＢＡＣ５４９Ｃ３から単離されたＳＴＳを用いたＰＣＲスクリーニングでは、５’ＳＴＳが３９１Ｂ８と５６８Ｅ１に陽性であることが明らかにされた。このことは、ＫＩＴからＫＤＲまでのコンティグが閉じたことを示唆している。このことから、ＫＩＴとＫＤＲの間の距離が約２５０ｋｂであり、ＫＩＴ重複全体の大きさが約４５０ｋｂであると概算できた（図６）。
【００８２】
重複切断点の同定と特性決定
三つの重複切断点を含む三つのＢＡＣクローン、８３２Ｅ１１、９５３Ｆ１１、及び１０４１Ｂ３由来のＨｉｎｄIII 消化ＤＮＡのサザンブロットを、９５３Ｆ１１から得た放射活性で標識されたＢＡＣ・ＤＮＡとハイブリッド形成させた。ＢＡＣライブラリーの構築に部分的なＨｉｎｄIII 消化が用いられたので、この方法にＨｉｎｄIII を選んだ。図３Ａは、ＢＡＣ９５３Ｆ１１がこのクローンでは一つだけである３.９ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を含んでいたが、他の断片はどれも８３２Ｅ１１、１０４１Ｂ３、又は両方（ＢＡＣベクターを表す断片）に存在したことを示している。この結果から、ＢＡＣ９５３Ｆ１１が３’−５’重複切断点を表すこと、そしてＨｉｎｄIII 制限部位が得られも失われもしなかったことそして重複事象以降に大きな挿入／欠失が発生しなかったことから、これが最近の重複であるらしいことが確認される。
【００８３】
９５３Ｆ１１由来の３.９ｋｂのＨｉｎｄIII 断片はこれをｐＵＣ１８にサブクローニングし、クローンｐＵＣ９５３Ｈ４を作成した。該断片は、ベクタープライマーとプライマー歩行を用いて配列決定した。これに対応するＢＡＣ８３２Ｅ１１及び１０４１Ｂ３由来の配列はＰＣＲ増幅及び直接配列決定により作成した。この配列比較で、９５３Ｆ１１が予測どおり、８３２Ｅ１１と１０４１Ｂ３の配列間のハイブリッドであることが明らかにされた。リピートマスカー（ref）を用いたバイオインフォーマティクス的分析により、この３.９ｋｂの断片がいくつかの反復要素を含んでいること、そして実際の重複切断点が一部は８３２Ｅ１１内のＬＩＮＥ要素に相当し、一部は１０４１Ｂ３内のＬＩＮＡＥ要素に相当するハイブリッドＬＩＮＥ要素内で発生すること（図８）が示された。ＢＬＡＳＴ分析は、重複切断点の３’側約１ｋｂの領域及び８３２Ｅ１１にも存在する領域が、ＰＤＧＦＲＡとＫＩＴ（ref）の間の領域由来のヒトのドラフトゲノム配列に対して、幾つかの極めて重要なヒットを示した。このヒト領域はＫＩＴエキソン１の上流約１５０ｋｂに位置し、これはブタの対応する領域の位置と良く一致している（図６）。
【００８４】
１１９５ｂｐの９５３Ｆ１１と１０４１Ｂ３中の対応する領域の配列比較では、配列の相違は明らかにされず、約２４５０ｋｂの９５３Ｆ１１と８３２Ｅ１１中の対応する領域の間の比較では二つの差異、即ちモノヌクレオチド反復での余分なヌクレオチドと一つの塩基置換（データは示さず）が明らかにされた。この結果は、ＫＩＴ重複が最近発生し、該配列が遺伝子変換によって均質化されたことを示唆する。
【００８５】
ブタの血統の間におけるＫＩＴ重複の分布
ＢＡＣ９５３Ｆ１１が真の重複切断点を表し、クローニングによる人工物ではなかったことを確認するため、ＨｉｎｄIII ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を使用した。サブクローンｐＵＣ９５３Ｈ４由来の既知の反復配列を含まないＰＣＲ断片をプローブとして使用した。その結果から、４.５ｋｂ断片が様々な優性白色対立遺伝子を保持するラージホワイト及びランドレース動物に存在するが、ワイルドボアには存在しないことが明らかになった（図７Ｂ）。興味深いことに、顕著な変化が３.９ｋｂ断片のハイブリッド形成シグナルで観察され、その結果は、本発明者らの白色血統におけるＫＩＴコピー数の変動についての最近の分析と一致した（ピールバークら投稿中）。ラージホワイトのメスＷ５（レーン３）は重複及び三重化に対してヘテロ接合体であり（全部でＫＩＴ５コピー）、Ｗ６（レーン４）は重複に対してヘテロ接合体（３コピー）であり、一方Ｗ７とＷ８（レーン５とレーン６）は重複に対してホモ接合体（４コピー）であった（図７Ｂ）。
【００８６】
ＰＣＲスクリーニングは、該ＫＩＴ重複がラージホワイトとランドレース動物には存在するが、ワイルドボア、デュロック、ハンプシャー、リンデレード又はメイシャンブタには予想通り存在しないことを示した（表２）。予測とは異なり、パイトレーンブタの５頭中４頭が、黒色反転を持つこの白色ブタはホモ接合体ｉ／ｉであると想定されているという事実にも関わらず、ＫＩＴ重複が陽性であった。面白いことに、重複を持たなかった１頭のパイトレーンブタが、その血統としては異型でほとんど全体が黒色であったため、本発明者らの元に送られてきた。その両親は通常の色を持ち、両者ともＫＩＴ重複を保持していた。スプライス突然変異に対するＰＣＲテスト（マークルントら 1998）では、全てのパイトレーンブタがＩP対立遺伝子を保持することを示す陰性であることが明らかとなった。
【００８７】
【表１】
2004529649.tif 000004
【００８８】
【表２】
2004529649.tif 000005
【実施例３】
【００８９】
繁殖記録のある３７５頭の雌ブタの試料をＫＩＴスプライス変異型について遺伝子型決定を行なった。
【００９０】
全ての雌ブタは同じ農場で生まれ、同腹から生まれた９５４頭は同じ血統由来の雄ブタとの交配から生まれ、残りの１４９頭は交雑種交配から生まれた。三つの特性、即ち出産総数（ＴＮＢ）、生きて生まれた数（ＮＢＡ）及び死産の数（ＮＢＤ）を分析した。
【００９１】
データは、ＳＡＳのＰＲＯＣ・ＭＩＸＥＤ手順を用いて分析した。このモデルに含まれる固定効果は、分娩の年月、サイクル（１，２，３＋）及び種付けの数（１，２）であった。。雌ブタの種親はｈ2＝０.１０の無作為の効果として含めた。ＫＩＴ遺伝子型は固定効果として含めた。交雑一腹多産種又はＫＩＴ遺伝子型若しくは色表現型によるサイクルの間の相互作用をテストしたが、有意ではなかった。
【００９２】
この結果は、ｉｉ（ＫＩＴ野生種）がより低いＴＮＢを有し、死産する子豚の数もより低くなるという傾向を示す。子宮内の胎児の数が極めて高い状況では、ｉｉ遺伝子型を持つ雌ブタはスプライス突然変異を有する雌ブタより有利であることがある。さらに、スプライス突然変異がＫＩＴシグナル発信の点で完全な機能喪失変異である可能性があるから、スプライス突然変異のコピーを二つ含むＩ3対立遺伝子がスプライス突然変異のコピーを１個（Ｉ1又はＩ2）又は０個（Ｉ、ＩBe又はＩP）含む対立遺伝子よりも低い一腹多産の数と関係がありうるということが予測される。
【００９３】
（外２）
2004529649.tif 000006
【実施例４】
【００９４】
一腹多産の数が大きい又は小さいラージホワイト集団からの試料群を、出産総数に対する繁殖値（ＢＶ）に基づいて特定した（ＰＥＳＴプログラムを使用）。各グループ毎に上位５０頭と下位５０頭の雌ブタをＤＮＡ試料で特定し、ＤＮＡをＫＩＴ型決定に付した。追加の試料も、この集団におけるスプライス率の分布を評価するため、遺伝子型決定を行なった。
【００９５】
得られたスプライス率は図１２に示すようなグループに分かれた。この図はこの動物グループにおけるスプライス率の分布をも表している。
【００９６】
一腹多産の数が上位（Ｔ）又は下位（Ｂ）の動物グループについて、スプライス率の最小二乗平均を計算した。一腹多産の数が大きいグループと小さいグループの間にスプライス率に有意の相違はなかった（表３）。
【００９７】
【表３】
2004529649.tif 000007
【００９８】
最小二乗平均を、スプライス率グループ（１，２５，４０，５０，６０）毎の一腹多産の数という特性について評価した。スプライスグループ間で、ＢＶの有意の差異が見られた（Ｐ＜０.０１、図１３）。
【００９９】
頻度に何らかの歪みがあるかどうかをテストするため、ＢＶ一腹多産数特性内でのスプライス率グループの間の頻度を比較した。その結果は、Ｂの雌ブタで２５と５０のスプライスグループの過剰表示があり、Ｔグループで４０スプライスグループの過剰表示があった場合、０、４０、５０のグループで頻度の歪みを示した。
【０１００】
【表４】
2004529649.tif 000008
【０１０１】
結論
一腹多産の数が大きい動物と小さい動物の間におけるスプライスグループの頻度の歪みをＢＶ特性について検出した。
【０１０２】
ＢＶが明らかに低い遺伝子型の類はＫＩＴ率が２５％（有意ではないが）及び５０％のものである。この率に対しては他の可能性があり、集団に特異的である可能性があるが、この集団ではこれらの率は優性白色対立遺伝子（Ｉ）のコピーを少なくとも一つ含む遺伝子型に相当する。この事例では、最も可能性の高い組み合わせはＩPとＩ（２５％）及びＩのホモ接合体（５０％）である。しかしながら４０％の類は明らかにより好ましく、この遺伝子型の類が優性白色対立遺伝子（Ｉ）を含むことが予測されてもいるが、この場合それは１個のスプライス部位を持つ三重化遺伝子のコピーを伴う。このことは、その機構は明らかでないが、一腹多産の数に及ぼすスプライス変異型の負の効果がありうることを示唆する。有意の効果が、スプライス突然変異の二つのコピーと「正常」なＫＩＴ遺伝子の三つのコピーが存在するＩ（５０％、ＫＩＴの二つのスプライス突然変異と二つの「正常」コピーの二つ）及び４０％の二つのコピーで見られた。一腹多産の数に及ぼす負の影響がスプライス変異型の減少を伴う対立遺伝子の累積をもたらすであろうことが仮定される。
【実施例５】
【０１０３】
ラージホワイト、ランドレース及び合成系統（又は集団）に基づく八つの異なる白色の母親系統から試料を集めた。
【０１０４】
ＫＩＴスプライス変異型と「正常な」ＫＩＴ遺伝子の比率は、ピロ配列決定法を用いて測定した。
【０１０５】
この比率は、次に単純な頻度分析によるもっとも可能性の高い対立遺伝子と最も可能性の高い適合値に変換した。その結果は表６と図１４に示す。
【０１０６】
【表５】
2004529649.tif 000009
【０１０７】
この見積もりは、保守的で稀な対立遺伝子の可能性を考慮に入れていない。Ｆの系統の一部の試料（これは遺伝子型Ｉ／Ｉ3をもつ動物に相当するものであろう）で大きなスプライス率が同定されたので、対立遺伝子Ｉ3はＦの系統にあったと同定された。
【０１０８】
しかしながら、この制限にも関わらず、この結果は、優性白色Ｉ対立遺伝子ばかりでなく大抵の系統で同定されるＩ2とＩPを持つ異なる白色系統のブタにおいて、ＫＩＴ対立遺伝子頻度に有意の変化があることを確認する。
【０１０９】
一般的に、ＩＰ対立遺伝子の頻度は低いか軽度である（この対立遺伝子が野生型のｉ対立遺伝子と組み合わさった場合［例えば、ＩＰ対立遺伝子と有色血統を有する動物若しくはヘテロ接合体Ｉｉ動物の間の交配で］、連結していない延長遺伝子座で対立遺伝子によって部分的に決定される子孫の色の程度で、色に関連する）。しかしながら、この対立遺伝子はラージホワイト系統の二つ（系統Ａと系統Ｄ）では検出されなかった。
【０１１０】
スプライス突然変異のコピーを一つ持つ三重化対立遺伝子は、この系統の一つ（系統Ｂ）を除く全てで頻度がかなり緩やかであるか又は高かった。この対立遺伝子は一腹多産の数に及ぼす優性対立遺伝子Ｉの負の効果を緩和すると仮定された。これは一腹多産の数で選択されたこれらの母親系統におけるその頻度の高さを説明するかもしれない。
【０１１１】
スプライス突然変異のコピーを二つ持つ三重化対立遺伝子は極めて稀にしか見つからず、系統Ｆのみがこの対立遺伝子を示した。対立遺伝子の割当ては、この対立遺伝子の頻度がきわめて低いと想定（上記参照）する保守的なシステムに基づくものではあるが。
【０１１２】
有色血統と交雑したこれらの系統からの子孫がその有色血統の遺伝子型とは無関係に白色であることを保証するために、Ｉｐ対立遺伝子を排除する選択を行なうことが考えられる。選択の決定は成果（又は色）との関連に基づき、Ｉ2対立遺伝子とＩ3対立遺伝子でも行われうるであろう。
【実施例６】
【０１１３】
一腹多産の数の記録がある優性白色対立遺伝子（Ｉ）及び「野生型」対立遺伝子をセグリゲートする合成系統からの雌ブタを、そのＫＩＴ遺伝子型について分析した。この場合、識別はＩとｉの間でしか行わなかった。「ｉ」と関連するマーカー対立遺伝子のコピーを０個、１個、又は２個のいずれかの数有する動物を比較した。結果は表６に示すとおりである。
【０１１４】
【表６】
2004529649.tif 000010
【０１１５】
４列目にある「−」（「i」の２コピーの下）はこのクラスでの数字が小さすぎてＬＳ平均値を計算できなかったことを意味する。ｐ値は「０」クラスと「１」クラスの間の差異をテストするためのものである。
【０１１６】
この結果は、Ｉ（優性白色）についてホモ接合体である雌ブタからの一腹多産Ｉ対立遺伝子のＬＳに対し負の効果があり、各一腹多産につき、Ｉ対立遺伝子のコピーを一つしか持たない動物よりも約０.２頭子豚が少ないことを示唆する。
【０１１７】
このことは、優性白色対立遺伝子中に存在するスプライス変異型が一腹多産の数に負の影響を与えることがあることを示唆する。従って、これは該系統で白い外皮色を維持する必要性に応じてＩとＩ3のような他の対立遺伝子型の頻度を制御するために一腹多産の数が重要なである場合に、有益であると思われる。
【０１１８】
引用文献
シャボット，ビー．，ディー.エイ．スチーブンソン，ヴイ．エム．チャップマン，ピー．ベスマー及びエイ．バースタイン「マウスのＷ遺伝子座に位置する膜貫通型チロシンキナーゼ受容体をコードするプロト癌遺伝子ｃ−ｋｉｔ」 Nature335: 88-89, 1988。
【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２３】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３４】
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【０１３８】
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【０１３９】
チョードリー，ビー．ピー．，シー．デ・ラ・セーナ，アイ．ハービッツ，エル．エリクソン及びアイ．グスタフソン「中期及び間期染色体上のＦＩＳＨはブタのＧＰＩ、ＣＲＣ及びＬＩＰＥの遺伝子の物理的順序を明らかにする」Cytogenet. Cell Genet.71:175-178, 1995。
【０１４０】
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【０１４１】
ハフ，アール．ビー．，エイ．レンゲリング，ヴイ．ベディアン，シー．ロ及びエム．ブカン「マウスのランプ白色反転はジペプチジル・アミノペプチダーゼ様タンパク質６を破壊し、Ｋｉｔ発現の調節異常を生じさせる」Proc Natl Acad Sci U S A95:13800-13805, 1998。
【０１４２】
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【０１４３】
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【０１４４】
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【０１４５】
スプリッツ，アール．エイ．，ケイ．エム．ストランク，エス．ティー．リー，ジェイ．エム．ル−クォ，ディー．シー．ウォードら「染色体セグメント４ｑ１２内のヒトIII 型受容体タンパク質チロシンキナーゼ遺伝子（ＰＤＧＦＲＡ−ＫＩＴ−ＫＤＲ）のクラスターを覆うＹＡＣコンティグ」Genomics22: 431-436, 1994。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】ピロ配列決定（ＰＳ）とミニ配列決定（ＭＳ）を用いて、ワイルドボア／ラージホワイト交雑種のＫＩＴ遺伝子中のイントロン１７の最初のヌクレオチドにおけるスプライス突然変異（ｐＡ）と正常体（ｐＧ）の比率を測定する定量的分析。ピロ配列決定の場合、ｐＡ／ｐＧの比率は該配列内の次のＡ（ｎＡ）及び次のＧ（ｎＧ）の比率によって標準化された。（Ａ）創始動物（Ｗ１−Ｗ１０）、ｎ＝１０。（Ｂ）Ｆ1動物、ｎ＝２３。（Ｃ）Ｆ2動物、ｎ＝１７８。記号はスプライス突然変異に対する推定比率を表し、図１Ｃの？は系図データに基づいてスプライス比率をはっきりと演繹出来なかったことを意味する。
【図２】ブタの優性白色／ＫＩＴ対立遺伝子の略図。重複は約４００ｋｂである。Ｇ及びＡは、イントロン１７中のヌクレオチド１での正常体とスプライス突然変異をそれぞれ表す。Ｒ（？）はベルト対立遺伝子が調節突然変異に起因すると本発明者らが仮定したことを示す。ベルト表現型及びローン表現型は、どちらもスプライス突然変異を持たないＫＩＴの単一コピーを含む異なる対立遺伝子により制御される可能性がある（本文参照）。本発明者らはＩ3対立遺伝子と関連する表現形を観察しなかったが、それは優性白色である可能性が高い。
【図３】ＥＳＲ（エストロゲン受容体遺伝子）を単一コピー対照として用いたＫＩＴの遺伝子コピー数の相対的定量化。このデータはヨーロッパワイルドボア／ラージホワイト交雑種を含む。創始動物，ｎ＝１０。Ｆ1，ｎ＝２３。Ｆ2，ｎ＝１７８。Ｘ軸はスプライス突然変異の定量化と家系のセグリゲーション分析を用いた予測コピー数を表す。Ｙ軸はゲノムＤＮＡ試料中のＫＩＴとＥＳＲのコピー数の相対差を反映するＣｔ（ＥＳＲ）−Ｃｔ（ＫＩＴ）を表す。データポイントはΔＣｔ±ＳＥである。
【図４】白色ランドレースブタとラージホワイトブタの商業集団においてピロ配列決定（ＰＳ）とミニ配列決定（ＭＳ）を用いたＫＩＴ遺伝子中のイントロン１７の最初のヌクレオチドにおけるスプライス突然変異（ｐＡ）と正常体（ｐＧ）の比率を評価する定量的分析。ランドレースはｎ＝４８、ラージホワイトはｎ＝３３。対照はヨーロッパワイルドボア／ラージホワイト交雑種由来のもので、スプライス型の比率の演繹はこれらの動物については大変確実であった。
【図５】ブタにおけるＰＤＧＦＲＡ−ＫＩＴ−ＫＤＲ領域のＰＦＧＥ分析の結果。（Ａ．）ＫＩＴイントロン１８プローブとハイブリッド形成したＮａｒＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析。デュロック（Ｄ）ＫＩＴ−ｉ／ｉ、ハンプシャー（Ｈ）ＫＩＴ−ＩBe／ＩBe、ラージホワイト（ＬＷ）ＫＩＴ−Ｉ／Ｉ、デュロック／ハンプシャー交雑種動物、及びハンプシャー／ラージホワイト交雑種動物由来の試料を使用した。断片の推定サイズはキロベース対で右に記載する。（Ｂ．）ＰＧＦＥデータの解釈をまとめた略図。重複切断点のおよその位置を矢印で表し、制限部位の位置を垂直線で表し、ハイブリッド形成に用いた遺伝子とＳＴＳプローブの位置を表す。（＊）は、密接に連結したＢｓｓＨＩＩ部位でのメチル化の異なる状態に恐らくは起因する、ラージホワイト動物で異なる断片が見られたことを意味する。
【図６】ブタ染色体８上のＰＤＧＦＲＡ−ＫＩＴ−ＫＤＲ領域のＢＡＣコンティグの地図。遺伝子とＳＴＳの位置を表す。Ｋ１２とＫ１３の相対的順序はまだ決まっていない。遺伝子の方向は、今のところＰＤＧＦＲＡ、Ｋ１２及びＫ１３について決定しており、一方ＫＤＲの向きはヒトで確立されたもの（スプリッツら 1994）に従って与えてある。重複切断点の位置は垂直矢印で表す。ＢＡＣクローン２１１Ｅ１２及び５４９Ｃ３は星印でマークしており、これらがＫ１２又はＫ１３に属するかどうかがまだ確立されていないため、２度表示してある。
【図７】ブタＫＩＴ領域及びブタゲノムＤＮＡ由来のＨｉｎｄIII 消化ＢＡＣクローンのサザンブロット分析。（Ａ．）ＫＩＴ３’−５’重複領域由来のクローン９５３Ｆ１１から得たＢＡＣ・ＤＮＡとハイブリッド形成したＢＡＣクローン８３２Ｅ１１（レーン１）、９５３Ｆ１１（レーン２及び３）、及び１０４１Ｂ３（レーン４）。重複切断点に存在する唯一の３.９ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を示す。（Ｂ）重複領域由来のＰＣＲ断片とハイブリッド形成したワイルドボア／ラージホワイト交雑種由来の創始動物のゲノムサザンブロット。１：Ｗ１、ｉ／ｉ。Ｗ２、ｉ／ｉ。Ｗ５、ｉ1／ｉ2。Ｗ６、Ｉ1／ＩBe。Ｗ７、Ｉ1／Ｉ1。Ｗ８、Ｉ1／ＩP。重複切断点からの唯一の３.９ｋｂのＨｉｎｄIII 断片を示す。９.０ｋｂの断片は単一形で、ＢＡＣ８３２Ｅ１１で表される領域を起源とする。
【図８】非重複染色体上に存在する配列を含むＢＡＣ１０４１Ｂ３及びＢＡＣ８３２Ｅ１１中の対応する領域と比較したＫＩＴ重複と関連する唯一の重複切断点を含むＢＡＣ９５３Ｆ１１由来の断片の一部の配列比較。ダッシュはマスター配列との同一性を示す。
【図９】実施例２記載のＢＡＣ１０４１Ｂ３の配列。
【図１０】実施例２記載のＢＡＣ８３２Ｅ１１の配列。
【図１０−１】実施例２記載のＢＡＣ８３２Ｅ１１の配列の続き。
【図１１】実施例２記載のＢＡＣ９５３Ｆ１１の配列。
【図１１−１】実施例２記載のＢＡＣ９５３Ｆ１１の配列の続き。
【図１２】スプライス比率の分布（横線の上の数字は、スプライス％についての当研究室の分類である）。
【図１３】スプライス比率グループ毎の一腹多産特性のＬＳ平均
【図１４】スプライス比率を分析した八つの白色血統の評点の分布
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０−１】
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【図１１】
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【図１１−１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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2004529649.tif 000091
2004529649.tif 000092
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529649.tif 000093
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月16日(2003.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ブタのＫＩＴ遺伝子型を決定する方法であって、
(i)  ブタの核酸試料を取得する工程、及び
(ii)  工程(i)で得られた核酸を分析して、重複切断点の一つ以上のコピーの存在又は非存在を同定する工程、
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
ブタのＫＩＴ遺伝子型を決定する請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法であって、
(iii)工程(i)で得られた核酸を分析して、ＫＩＴ遺伝子に存在するスプライス変異型コピーのパーセンテージを定量化する工程、
をさらに含む方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
工程(iii) がミニ配列決定及び／又はピロ配列決定技術を用いて実施されるものである、請求項４記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
直接的又は間接的のいずれかでＫＩＴと連結する少なくとも一つのＤＮＡマーカーと関連する少なくとも一つの対立遺伝子の存在を決定する工程を含む、請求項１又は請求項４記載の方法。
【国際調査報告】
2004529649.tif 000094
2004529649.tif 000095
2004529649.tif 000096
2004529649.tif 000097
2004529649.tif 000098