(57)【要約】細胞内のプロテアーゼを検出する系が開示される。ある実施態様では、本発明の系は共有結合によって連結された以下の成分で構成されたキメラタンパク質を含む：１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質；２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位；及び３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列。本発明は、細胞内及び組織内で新規なプロテアーゼ阻害剤を検出するために使用することを含む多様な用途を有する。
2004538006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内小器官へ誘導するトラフィッキングシグナルを有する少なくとも１つのシグナルタンパク質及び１つのプロテアーゼに対する少なくとも１つのタンパク分解切断部位を含むキメラタンパク質であって、以下の（ａ）−（ｃ）のように構築される前記キメラタンパク質：
（ａ）前記全てのシグナルタンパク質の前記トラフィッキングシグナルが、前記シグナルタンパク質のＮ−又はＣ−末端に前記タンパク分解部位を、又はシグナル隠蔽タンパク質を前記タンパク分解部位を介して連結することによって不活化されており、従って前記キメラタンパク質が細胞質ゾルに存在し、
（ｂ）少なくとも１つのシグナルタンパク質の前記トラフィッキングシグナルが、前記タンパク分解切断部位が前記プロテアーゼによって切断されたときに活性化され、その結果、前記活性化されたシグナルタンパク質を含む少なくとも１つのフラグメントタンパク質が細胞内小器官に輸送され、更に
（ｃ）前記キメラタンパク質が少なくとも１つの蛍光性タンパク質で標識され、前記蛍光標識シグナルの細胞内の位置及び強度分布が前記プロテアーゼの前記切断に応じて変化する。
【請求項２】
細胞内小器官へ誘導するトラフィッキングシグナルを有する少なくとも２つのシグナルタンパク質及び１つのプロテアーゼに対する少なくとも１つのタンパク分解切断部位を含むキメラタンパク質であって、以下の（ａ）−（ｄ）のように構築される前記キメラタンパク質：
（ａ）１つのシグナルタンパク質の前記トラフィッキングシグナルが活性を維持し、前記シグナルタンパク質の残りのトラフィッキングシグナルは、前記シグナルタンパク質のＮ−又はＣ−末端に前記タンパク分解部位を、又はシグナル隠蔽タンパク質を前記タンパク分解部位を介して連結することによって不活化されており、従って前記キメラタンパク質は、前記活性なシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルによって誘導されて特定の細胞内小器官に輸送され、
（ｂ）前記キメラタンパク質が前記細胞内小器官に輸送された後、少なくとも１つのタンパク分解部位及び少なくとも１つの不活化されたシグナルタンパク質が細胞質ゾルに露出され、
（ｃ）前記タンパク分解切断部位がプロテアーゼによって切断されたときに、細胞質ゾルに露出された少なくとも１つの不活化されたシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが活性化され、その結果、前記活性化されたシグナルタンパク質を含むフラグメントタンク質が、前記キメラタンパク質が輸送された細胞内小器官とは異なる細胞内小器官に輸送され、更に
（ｄ）前記キメラタンパク質が少なくとも１つの蛍光性タンパク質で標識され、前記蛍光シグナルの細胞内の位置及び強度分布は前記プロテアーゼの切断に応じて変化する。
【請求項３】
前記タンパク分解切断によって生成されたフラグメントタンパク質の中で、異なる細胞内局在特性をもつ少なくとも２つのフラグメントタンパク質が各々において１つの蛍光性タンパク質を有し、更に使用される蛍光性タンパク質が異なる波長をもつ少なくとも２つの蛍光性タンパク質から成る請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
その不活化されてあるトラフィッキングシグナルがタンパク分解切断によって活性化されるシグナルタンパク質を含むフラグメントタンパク質の中で、少なくとも１つのフラグメントタンパク質が蛍光性タンパク質を含む請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
細胞内小器官へ誘導するトラフィッキングシグナルを有する１つのシグナルタンパク質及び１つのプロテアーゼのタンパク分解切断部位を介して前記シグナルタンパク質に連結された蛍光性タンパク質を含むキメラタンパク質であって、以下の（ａ）−（ｃ）のように構築される前記キメラタンパク質：
（ａ）前記シグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが前記キメラタンパク質で活性を維持し、従って前記キメラタンパク質は細胞内小器官に輸送され、
（ｂ）前記キメラタンパク質が前記細胞内小器官に輸送された後、前記タンパク分解切断部位及び前記蛍光性タンパク質が細胞質ゾルに露出され、更に
（ｃ）その結果、細胞質ゾルに露出された前記タンパク分解切断部位が前記プロテアーゼによって切断されるとき、細胞質ゾルに露出された前記蛍光性タンパク質が細胞質ゾルに遊離される。
【請求項６】
前記活性を維持するシグナルタンパク質が、細胞質ゾルに露出された前記蛍光性タンパク質の蛍光の波長と異なる蛍光波長を有する蛍光性タンパク質で更に標識され、前記タンパク分解切断が生じた後も前記の更に加えられた蛍光性タンパク質が前記活性なシグナルタンパク質に付着したままである請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
前記不活化されてあるシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが、ミトコンドリア、葉緑体及びペルオキシソームから成る群から選択される細胞内小器官へ誘導するシグナルである請求項１及び２のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
不活化されてある前記シグナルタンパク質が、シロイヌナズナ外皮膜タンパク質７（ＡｔＯＥＰ７）、ルビスコ小サブユニット（ＲｂｃＳ）、葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質（Ｃａｂ）、ルビスコアクチヴァーゼ（ＲＡ）、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ及びペルオキシソーム誘導モチーフ（ＳＫＬ）から成る群から選択される完全長タンパク質又はトラフィッキングシグナルを含むその部分である請求項１及び２のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
前記活性を維持するシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが、ミトコンドリア、葉緑体及び核の外膜、ペルオキシソーム膜並びに細胞質膜から成る群から選択されるものへ誘導するシグナルである請求項２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記活性を維持するシグナルタンパク質が特定のリン脂質と特異的に結合するタンパク質である請求項２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記活性を維持するシグナルタンパク質が、シロイヌナズナ外皮膜タンパク質７（ＡｔＯＥＰ７）、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ、プレックストリン相同ドメイン（ＰＨ）及びＦＡＰＰ（ファミリーＡ（ホスホイノシチド結合特異的）メンバー３）のプレックストリン相同ドメインから成る群から選択される完全長タンパク質又は前記トラフィッキングシグナルを含むその部分である請求項２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記シグナル隠蔽タンパク質がアミノ酸、ペプチド及びタンパク質から成る群から選択される請求項１及び２のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記蛍光性タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、その変異体及びその誘導体から成る群から選択される蛍光性タンパク質である請求項１、２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
細胞内で前記キメラタンパク質を発現させるために構築されてある、請求項１、２及び５のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列を含むリコンビナント遺伝子。
【請求項１５】
請求項１４に記載のリコンビナント遺伝子で形質転換された細胞。
【請求項１６】
前記細胞が真核細胞である請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記真核細胞が植物細胞である請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
in vivoでプロテアーゼの活性を分析する方法であって、以下の工程、
（ａ）細胞を請求項１４のリコンビナント遺伝子で形質転換する工程、
（ｂ）工程（ａ）の前、後又は工程（ａ）と同時に、前記細胞を形質転換して、前記プロテアーゼを発現させる工程、
（ｃ）前記形質転換細胞をインキュベートして前記タンパク質を発現させる工程、
（ｄ）前記インキュベート細胞の蛍光シグナルの分布像を観察する工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）で観察される蛍光像を工程（ｂ）を実施されていないコントロール形質転換細胞の蛍光像と比較することによって前記プロテアーゼの活性を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
in vivoでプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程、
（ａ）細胞を請求項１４のリコンビナント遺伝子で形質転換する工程、
（ｂ）工程（ａ）の前、後又は工程（ａ）と同時に前記細胞を形質転換して、前記プロテアーゼを発現させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の前、後又は工程（ｂ）と同時に、に前記形質転換細胞を薬剤候補物質で処理して、前記プロテアーゼを阻害する工程、
（ｄ）前記形質転換細胞をインキュベートして前記タンパク質を発現させる工程、
（ｅ）前記インキュベート細胞の蛍光シグナルの分布像を観察する工程、及び
（ｆ）工程（ｅ）で観察される蛍光像を、工程（ｂ）を実施しないで調製したコントロール形質転換細胞、工程（ｃ）を実施しないで調製したコントロール形質転換細胞、及び工程（ｂ）及び（ｃ）を実施しないで調製したコントロール形質転換細胞の蛍光像の少なくとも１つと比較することによって前記薬剤のプロテアーゼ阻害活性を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記プロテアーゼを発現させるために細胞を形質転換する工程が、前記プロテアーゼの発現のためにリコンビナント遺伝子を挿入する工程、又は前記プロテアーゼを発現することができるウイルスを感染させる工程である請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記形質転換されるべき細胞が真核細胞である請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記形質転換されるべき細胞が植物細胞である請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
共有結合で連結された成分として以下の１）−３）を含むキメラタンパク質を含む、細胞内のプロテアーゼを検出する系。
１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質
２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び
３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列。
【請求項２４】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記シグナルタンパク質、２）前記プロテアーゼ特異的切断部位、及び３）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２５】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）隠蔽配列、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）前記シグナルタンパク質、及び４）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２６】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記シグナルタンパク質、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）前記隠蔽配列、及び４）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２７】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一のシグナルタンパク質、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）第二のシグナルタンパク質、及び４）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項２８】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記第一のシグナルタンパク質、２）第一のプロテアーゼ切断部位、３）前記隠蔽配列、４）前記第二のシグナルタンパク質、及び５）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２７に記載の系。
【請求項２９】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記隠蔽配列；２）第一のプロテアーゼ切断部位、３）第一のシグナルタンパク質、４）第二のプロテアーゼ切断部位、５）第二のシグナルタンパク質、及び６）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３０】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一のシグナルタンパク質、２）第一のプロテアーゼ切断部位、３）第二のシグナルタンパク質、４）第二のプロテアーゼ切断部位、５）隠蔽配列、及び６）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３１】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）前記プロテアーゼ特異的切断部位、２）前記シグナルタンパク質、及び３）前記検出可能なアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３２】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一のシグナルタンパク質、２）第一の検出可能な配列、３）前記プロテアーゼ切断部位、及び４）第二の検出可能な配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３３】
前記キメラタンパク質が更に、前記プロテアーゼ切断部位のＣ−末端と前記第二の検出可能な配列のＮ−末端との間に共有結合で連結された第二のシグナルタンパク質を含む請求項３２に記載の系。
【請求項３４】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一のシグナルタンパク質、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）第二のシグナルタンパク質、及び４）第二の検出可能な配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３５】
前記キメラタンパク質が、共有結合により連続的に連結された、１）第一の検出可能な配列、２）前記プロテアーゼ切断部位、３）前記シグナルタンパク質、及び４）第二の検出可能な配列を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３６】
前記成分のいずれかが前記キメラタンパク質のＮ−末端を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３７】
前記成分のいずれかが前記キメラタンパク質のＣ−末端を含む請求項２３に記載の系。
【請求項３８】
前記シグナルタンパク質が、前記キメラタンパク質又はその成分の少なくとも１つを植物細胞又は動物細胞小器官に局在させるために十分である請求項２３に記載の系。
【請求項３９】
前記シグナルタンパク質が、前記キメラタンパク質又はその成分の少なくとも１つを核、ゴルジ小体、溶解小胞、貯蔵小胞、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、小胞体、細胞質膜、又は植物細胞の葉緑体に局在させる請求項３８に記載の系。
【請求項４０】
前記シグナルタンパク質が、ＡｔＯＥｐ７、ＲｂｃＳ、Ｃａｂ、ＲＡ、ＳＫＬ、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ、ＰＨ、ＦＡＰＰ、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ、又はその機能的フラグメントの１つである請求項３９に記載の系。
【請求項４１】
前記シグナルタンパク質が、前記キメラタンパク質を核、ゴルジ小体、貯蔵小胞、リソソーム、ペルオキシソーム、小胞体、細胞質膜、又は動物細胞のミトコンドリアに局在させる請求項３８に記載の系。
【請求項４２】
前記シグナルタンパク質が、ヒトのペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲＡ）、チトクロームｂ２、11−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β−ＨＳＤ）、Ｇ９−ＡＫＬ、ペルオキシソーム必須膜タンパク質47（ＰＭＰ47）；又はその機能的フラグメントの１つである請求項４１に記載の系。
【請求項４３】
前記切断部位が哺乳類又はウイルスのプロテアーゼで特異的に切断される請求項２３に記載の系。
【請求項４４】
前記切断部位がヒトの病原体に附随するプロテアーゼで特異的に切断される請求項４３に記載の系。
【請求項４５】
前記プロテアーゼが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、肝炎ウイルス、マラリア原虫、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、カポジ肉腫附随ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、黄熱病ウイルス、フラビウイルス、又はライノウイルスによって発現される請求項４４に記載の系。
【請求項４６】
前記プロテアーゼがセリン型プロテアーゼである請求項４３に記載の系。
【請求項４７】
前記マラリア原虫が熱帯熱マラリア原虫であり、前記プロテアーゼがプラスメプシンＩ及びプラスメプシンＩＩの１つである請求項４５に記載の系。
【請求項４８】
切断部位がＨＳＶの成熟のためのプロテアーゼによって特異的に切断される請求項４５に記載の系。
【請求項４９】
前記肝炎ウイルスがＣ型である請求項４５に記載の系。
【請求項５０】
前記ヒトの病原体が酵母菌、細菌、真菌、線虫、ウイルス又は原虫である請求項４４に記載の系。
【請求項５１】
前記切断部位が、血液凝固、アポトーシス又は細胞外マトリックスに附随する哺乳類のプロテアーゼによって特異的に切断される請求項４３に記載の系。
【請求項５２】
前記検出可能な配列の少なくとも１つが、蛍光性、リン光性又は化学発光性配列である請求項２３に記載の系。
【請求項５３】
前記検出可能な配列の１つの放出波長が、前記検出可能配列の他の少なくとも１つとは異なる請求項５２に記載の系。
【請求項５４】
前記検出可能な配列がクラゲの蛍光性タンパク質又はその誘導体である請求項５２に記載の系。
【請求項５５】
共有結合で連結された成分として以下を含む実質的に純粋なキメラタンパク質、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列。
【請求項５６】
細胞内のプロテアーゼ活性を検出するためのキメラタンパク質をコードする配列を含む核酸であって、前記キメラタンパク質が共有結合で連結された成分として以下を含む前記核酸、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列。
【請求項５７】
請求項５６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５８】
請求項５７に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項５９】
細胞内のプロテアーゼを検出するためのキットであって、
ａ）共有結合で連結された成分として、ｉ）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、ii）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及びiii）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列を含むキメラタンパク質、及び
ｂ）前記キメラタンパク質をコードする配列を含む核酸を含むベクター、
の少なくとも１つを含むことを特徴とするキット。
【請求項６０】
細胞内又は組織内のプロテアーゼを検出する方法であって、以下の工程、
ａ）対象の細胞又は組織に、共有結合で連結された成分として、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む第一のベクターを導入する工程、
ｂ）前記第一のベクターによってコードされたキメラタンパク質を発現させることができる条件下で前記細胞又は組織をインキュベートする工程、及び
ｃ）前記キメラタンパク質の細胞内局在の変化を、前記細胞内プロテアーゼの存在の指標として検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６１】
前記方法が、更に、前記対象の細胞又は組織に前記プロテアーゼをコードする核酸配列を含む第二のベクターを導入し、更に前記細胞又は組織内の前記第二のベクターを発現させてその中の前記プロテアーゼを生成する工程を含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
プロテアーゼ阻害剤をin vivoで検出する方法であって、以下の工程、
ａ）対象の細胞又は組織に、共有結合で連結された成分として、１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位、及び３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む第一のベクターを導入する工程、
ｂ）前記細胞又は組織に対象のプロテアーゼをコードするベクターを導入する工程、
ｃ）前記細胞又は組織を候補化合物と接触させる工程、
ｄ）前記第一のベクターによってコードされたキメラタンパク質及び前記第二のベクターによってコードされた前記プロテアーゼを発現させることができる条件下で前記細胞又は組織をインキュベートする工程、及び
ｃ）前記キメラタンパク質の細胞内局在の変化を、前記プロテアーゼ阻害剤の存在の指標として検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６３】
前記方法が、更に、前記キメラタンパク質の細胞内局在の変化を検出するために自動化又は半自動化装置を使用することを含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記自動化又は半自動化装置が、前記細胞又は組織内で前記検出可能な配列を検出するために適合させた光学系を含む請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は韓国特許出願10-2001-0048123号（2001年8月10日出願、発明の名称：プロテアーゼ阻害剤のin vivoスクリーニング系）（前記文献は参照により本明細書に含まれる）の継続出願である。
技術分野
本発明は一般に細胞内のプロテアーゼを検出する系に関する。好ましい系はキメラ基質タンパク質を含み、前記タンパク質は、（１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、（２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位及び（３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列を含む。本発明は、１つ又は２つ以上のヒトの病原体によって産生されるプロテアーゼを阻害する化合物を検出するスクリーンニングでの使用を含む、広範囲の重要な用途を有する。
【０００２】
背景技術
プロテアーゼはタンパク質の特定のペプチド結合を切断する酵素である。生物体では、特定のタンパク分解活性を有するプロテアーゼ及びそれらの阻害剤は種々の生物学的機能の調節に中心的に関与する。多様な生物学的プロセスにおいて生物学的に要求される機能は、ポリプロテイン前駆体のプロテアーゼによるタンパク分解切断（前記は活性なタンパク質を生成させる）によって活性化するか又は調節することができる。前記の例には血液凝固、免疫防御プロセス、細胞内側膜を介するタンパク質の選択的輸送、ホスト細胞におけるウイルスの増殖などが含まれる。従って、プロテアーゼは、特定のプロテアーゼの阻害剤を新規な薬剤として開発する場合の主要な標的である。
ウイルスプロテアーゼの阻害剤は、新規薬剤として開発されたプロテアーゼ阻害剤の代表的な例である。ウイルスプロテアーゼはタンパク分解切断によりポリプロテイン前駆体の活性化に参画するので、前記プロテアーゼはウイルス増殖の開始、従ってホスト細胞内で複製される正確なキャプシド集合に必須の成分である。
プロテアーゼ阻害剤は、後天性免疫不全症候群（エイズ）をひき起こすＨＩＶの増殖を阻止するために開発された。例えばアンプレナビア（amprenavir）、ネルフィナビア（nelfinavir）、インジナビア（indinavir）、リトナビア（ritonavir）及びスクイナビア（squinavir）がＨＩＶのプロテアーゼを阻害する薬剤としてＦＤＡに承認され、ロピナビア（lopinavir）及びエファビレンツ（efavirenz）は臨床試験中である。上記の医薬を投与された患者ではＨＩＶ粒子の数が薬剤処置前の数の約10％に減少することが示された。これは、前記プロテアーゼ阻害剤を効果的な医薬として用いることができることを示している。しかしながら、いくつかの副作用がこのような処置の間に報告され（T.L. Miller et al. 2001）、更に変異プロテアーゼを有する変異体が長期的処置の症例で報告された（H. Jacobsen et al. 1996; H. Cote et al. 2001）。従って、種々の変異ＨＩＶウイルスの増殖を特異的に阻止することができるより多様なプロテアーゼ阻害剤の開発が要求される。
【０００３】
プロテアーゼ阻害剤は、他のヒト及び動物ウイルス（例えばＨＣＶ（N. Kasai et al. 2001）及びＨＥＲＶ（R. Kuhelj et al. 2001））を抑制するために研究されてきた。植物ウイルス病の研究者らもまた同じ概念で研究してきた。例えば、ＴＥＶ（タバコ腐れ病ウイルス）及びＰＶＹ（モザイク病ウイルス）によって生成されるポリプロテインのタンパク分解切断の阻害は、遺伝子導入植物でプロテアーゼ阻害剤としてリコンビナントタンパク質を発現させることによって研究されてきた（R. Gutierres-Campos et al. 1999）。植物ウイルス由来のプロテアーゼのタンパク分解部位を特定する研究もまた行われてきた（H.Y. Yoon et al. 2000）。
プロテアーゼ阻害剤開発の試みが続けられてきた。例えば、多くの場合プロテアーゼ阻害剤のスクリーニングは、プロテアーゼ、その基質ペプチド又はタンパク質及び候補化学物質を混合してin vitroで反応させた後、電気泳動を用いて基質の切断を測定することによって実施された。タンパク分解部位の重要性が認識されていたので、前記タンパク分解部位と同様なアミノ酸配列を有するペプチドが合成され、プロテアーゼ阻害剤の発見に用いられてきた（C.A. Kettner and B.D. Korant, 1987）。タンパク質の三次元構造の決定が容易になり、更にコンピュータシミュレーションによって化合物をデザインすることが可能になったので、多くの研究者が酵素の活性部位と特異的に結合する分子をデザイン及び合成しようとした（A. Wlodawer and J.W. Erickson, 1993; J.D. Rodgers et al. 1998; K.L. Mardis et al. 2001）。更にまた、蛍光標識基質を用いてプロテアーゼ活性の測定効率を高める試み（J. Ermolief et al. 2000）、及び大腸菌のペリプラズムで発現させた抗体フラグメントをプロテアーゼ阻害剤として用いてプロテアーゼ阻害剤の骨格構造を拡大する試みが（N. Kasai et al. 2001）為された。
【０００４】
現在用いられているプロテアーゼ活性をスクリーニングする方法の大半はin vitroで実施される。しかしながら、in vitroスクリーニング法では種々の複雑な作用（例えば候補薬剤の細胞への輸送効率、候補薬剤の安定性及び細胞毒性など）を調べることはできない。in vitroスクリーニング法で選別した候補薬剤を生体で調べる前に、従って更に別の多くの時間のかかる実験が要求される。従って、プロテアーゼ阻害剤の候補物質の細胞への機能を調べ、更により特異的なプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングするためにより単純で普遍的なin vivoスクリーニング法を開発することが必要である。
タンパク分解切断を検出し、よりin vivoの条件又はin vivoに類似した条件でプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする努力が為されてきた。
例えば、単離小胞内に存在するプロテアーゼを用いる方法が報告された（V.Y. Hook, 2001）。開示された他の方法には、組織切片を用いたin situザイモグラフィー（C.-F. Yi et al. 2001）及びプロテアーゼのポリペプチド基質で細胞を処理する方法（R. Kuhelj et al. 2001）が含まれる。
しかしながら、前記の方法及び関連する方法には欠点が附随することがますます認識されつつある。
例えば、前記の方法の多くはin vivoの環境に単に近似しているだけであると考えられる。従って、そのような方法は、プロテアーゼ機能に実質的に影響を与えることができる細胞内環境を常に再現しているとはかぎらない。
更にまた、従来の方法の多くは感度、選択性及び利便性に関して限界があると考えられる。前記の欠点及び他の欠点は、これまでのスクリーニングの試みの効率及び信頼性を低下させていると考えられる。
より感度が高く使用が容易な、細胞内のプロテアーゼを検出するより優れたin vivoの方法が所望されるであろう。哺乳類及びウイルスプロテアーゼの阻害剤の検出に容易に応用できるin vivoの方法が希求されるであろう。
【０００５】
発明の開示
本発明は、細胞内又は組織内のプロテアーゼを検出する系に関する。ある実施態様では、本発明の系は、共有結合で連結された成分として以下を含む少なくとも１つのキメラタンパク質を含む：１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質；２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位；及び３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列。好ましいキメラタンパク質は、プロテアーゼの存在下で細胞内の位置を変える“分子信号”として機能する。本発明は広範囲の用途を有し、前記用途には、ヒトの病原体に附随するプロテアーゼを阻害又は阻止する化合物を検出するためのin vivoスクリーニングにおける使用が含まれる。
本発明の好ましい使用では、対象の細胞又は組織が少なくとも1つの活性なプロテアーゼをその中に含むことが要求される。適切なプロテアーゼには細胞にとって内因性であるもの、例えば“ハウスキーピング”酵素として知られているものが含まれる。更に別の適切なプロテアーゼには、細胞又は組織にとって天然には存在しないものが含まれる。例えばそのようなプロテアーゼは病原体感染の結果であってもよい。また別には、細胞内又は組織内のプロテアーゼの存在は、それら細胞又は組織にプロテアーゼを導入するために実験的に処理した結果であってもよい。これらの実施態様では、前記キメラタンパク質（又はその検出可能成分）の細胞内の位置の変化は、細胞又は組織内のプロテアーゼの存在の指標として利用される。従って、本発明は、その細胞内又は組織内の位置が対象のプロテアーゼの存在（又は非存在）の指標となる、位置的感度が高い“分子信号”を提供する。
【０００６】
以下で明確になるとおり本発明は普遍的用途をもつ発明である。すなわち、本発明を用いて細胞内又は組織内の多様なプロテアーゼを検出できる。好ましいプロテアーゼは、キメラタンパク質内の切断部位を好ましくは特異的に切断（加水分解）することができる。本明細書では、問題のプロテアーゼによる切断可能性を示すために、前記キメラタンパク質は時にはキメラ基質タンパク質と称されるであろう。位置特異的切断は、キメラ分子を一般的には特異的切断部位又は切断部位の近くで分断し、少なくとも１つの成分（例えば場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、切断部位又は検出可能なアミノ酸配列）を前記キメラ分子から遊離させる。好ましい遊離は少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列を含むが、前記遊離は使用に応じてキメラ分子の他の成分を含んでいてもよい。
キメラ分子の１つ又は２つ以上の成分のより好ましい放出では、位置的感度が高い分子信号を提供することが意図される。例えば、ある実施態様では、検出可能なアミノ酸配列がキメラ基質タンパク質から遊離され、ホスト細胞又は組織全体に本質的に自由に拡散する。この拡散シグナルは容易に検出することができ、プロテアーゼの存在の指標として利用することができる。しかしながら、本発明の別の実施態様では、１つ又は２つ以上の検出可能なアミノ酸配列の遊離は、場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質により別の細胞内部位への前記分子の誘導を伴なう。この実施例では、より一点集中的でより強いシグナルがプロテアーゼの指標として利用される。
【０００７】
本発明のいくつかの実施態様では、細胞内又は組織内にプロテアーゼが存在する場合に前記キメラ分子が好ましくはインフレーム融合物として検出可能なアミノ酸配列の少なくとも１つを保持することは有用であろう。この事例では、キメラ分子の局在は、プロテアーゼが存在するとき検出可能なアミノ酸配列を参考にしてモニターすることができる。ほとんどの事例では、検出可能なアミノ酸配列（単独又は検出可能なキメラタンパク質のまた別の成分と組み合わされている）の遊離及びそれに続く細胞内局在は、通常の検出方法の１つ又はそれらの組合せによって容易にin situで可視化することができる。
従って、本発明の目的は、問題のプロテアーゼの存在及び好ましくは活性をキメラタンパク質の局在の変化と結びつけることである。そのような変化はシグナルの位置及び好ましくは強度の増加又は減少として容易に検出できる。例として、検出できるように標識されたキメラタンパク質（又は１つ又は２つ以上の成分）の細胞内分布は最初は比較的小さな場所（例えば細胞内小器官）に限定することができる。前記の限定性によって比較的高いシグナル強度が得られる。しかしながら、前記キメラタンパク質を特異的に切断するプロテアーゼの存在下では、前記の分布ははるかに拘束性が低く拡散性ですらある。前記限定性の欠如によって比較的低いシグナル強度が得られる。この例では、プロテアーゼによる特異的な切断は、キメラタンパク質（又は標識成分）の細胞内小器官からより広い空間（例えば細胞質ゾル）への移動を伴なう。また別には、活性なプロテアーゼの存在が標識タンパク質の細胞質ゾルからより限定的空間（例えば細胞内小器官又は空胞）への細胞内移動として本発明により示される実施態様では、シグナル強度は急激に増加する。更に別の実施態様では、活性なプロテアーゼの存在はシグナル強度の変化をほとんど又は全く伴なわないが、その代わりに、前記変化は、ある細胞部位から別の部位への標識タンパク質の移動によってモニターされる（例えばキメラ基質タンパク質の１つの細胞内小器官から別の小器官又は空胞への移動のように）。
【０００８】
本発明の実施によって多数の重要な利点が提供される。
例えば、本発明は、対象のプロテアーゼによって特異的に切断される標識された（及び無標識の）成分タンパク質を生じるキメラタンパク質を提供する。本発明の好ましい実施によって、標識タンパク質の細胞内局在及び好ましくはシグナル強度が対象のプロテアーゼの存在（又は不在）と結びつく。この“二要素”検出法は、高い感度をもつ信頼性の高い検出を提供する。すなわち、細胞内又は組織内の標識タンパク質の位置及びそのシグナル強度はともに活性なプロテアーゼの存在の指標として利用される。本発明はまた高度に選択性であり、すなわち本発明は、異なるプロテアーゼ又はアイソザイムの細胞内存在を、同じプロテアーゼの不活性型及び活性型と同様にそれぞれ容易に識別することができる。本発明の好ましいキメラタンパク質は、利用可能な試薬及び標準的なリコンビナント技術を用いて製造することができ、本発明の使用を容易にしている。
更にまた、本発明には融通性があり、広範囲の細胞、典型的には真核細胞（植物、酵母菌、真菌、動物及び昆虫に由来するものを含む）内の活性なプロテアーゼを検出するために用いることができる。好ましいキメラタンパク質は細胞内又は組織内の遺伝子発現に最小限の影響しか与えず、それによって潜在的に複雑な遺伝学的影響が回避される。本発明はまた、種々の適切なプロテアーゼ切断部位及び検出可能なアミノ酸配列と適合する。
従ってある実施態様では、本発明は、好ましくは前述のキメラタンパク質の少なくとも１つを含む、細胞内プロテアーゼを検出する系を提供する。前記キメラタンパク質に関しては、各タンパク質成分（場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、プロテアーゼ切断部位及び検出可能配列）の連結順序は、目的の結果が達成されるかぎり重要ではない。しかしながら、典型的には連結順序は、１つの成分のＮ末端から開始し、別の成分のＣ末端で終わる。
【０００９】
既に述べたように、本キメラタンパク質は共有結合によって連結された以下の成分を含む：少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質；２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位；３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列。好ましくは、前記キメラタンパク質は約10個未満の場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、より好ましくは約５個未満の前記タンパク質、典型的には約１つ、２つ又は３つの前記シグナルタンパク質を含む。“場合によって隠蔽された”という語句は、シグナルタンパク質の目的の機能（典型的にはトラフィッキングシグナル）が隠蔽されてあるか、又は隠蔽されていないことを意味する。“隠蔽されている”という用語は、少なくとも１つの隠蔽配列をシグナルタンパク質に共有結合により連結することによって、前記シグナルタンパク質の目的の機能が可逆的又は不可逆的に実質的に低下させられてあるか、又は好ましくは完全に阻止されていることを意味する。典型的には、隠蔽されるシグナルタンパク質は約１つ又は約２つの前記のような隠蔽配列を含む。一般的に好ましい隠蔽配列は約200未満のアミノ酸残基、好ましくは50未満のアミノ酸残基から成り、多くの応用例では約３から約20残基の間が好ましい。多くの使用例で特に好ましい隠蔽配列は少なくとも１つの位置特異的プロテアーゼ切断部位、例えば１つ、２つ、３つ又は４つの前記部位である。
更にまた、本発明の好ましいキメラタンパク質は、共有結合により連結された成分として、約10未満のプロテアーゼ特異的切断部位、好ましくは５つ未満の前記切断部位を含み、約１つ、２つ、３つ又は４つの前記のような部位がしばしば好ましい。
更に好ましいキメラタンパク質は、共有結合により連結された成分として、約10未満の検出可能なアミノ酸配列、好ましくは５つ未満の前記アミノ酸配列を含み、約１つ、２つ、３つ又は４つの前記のような検出可能なアミノ酸配列が一般的には好ましい。ある実施態様では、前記配列は蛍光性、リン光性又は化学発光性タンパク質又はその機能的フラグメントである。検出可能なアミノ酸配列の機能的フラグメントは、完全長配列と実質的に同じ感度で検出が可能である。別の実施態様では、前記アミノ酸配列は、適切な基質と接触したとき蛍光性、リン光性又は化学発光性にさせることができる酵素又はその触媒性フラグメントである。前記検出可能なアミノ酸配列から生じるシグナルを検出及び場合によって定量する方法は当分野で公知であり、下記でより詳しく説明される。
別の特徴では、本発明は、共有結合によって連結された以下の成分を含む実質的に純粋なキメラタンパク質を提供する：１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質；２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位；及び少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列。
【００１０】
更に別の特徴では、本発明はキメラタンパク質をコードする配列を含む核酸である。ある実施態様では、前記コードされたキメラタンパク質は共有結合によって連結された成分として以下を含む：１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質；２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位；及び少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列。
更にまた本発明によって提供されるものは、本明細書で開示されるキメラタンパク質をコードする核酸を含むベクターである。更に提供されるものは、前記キメラタンパク質を含み、好ましくはまた前記キメラタンパク質を発現する細胞、例えば植物、酵母、動物、真菌又は昆虫細胞である。
更に本発明によって提供されるものは細胞内プロテアーゼを検出するためのキットである。ある実施態様では、前記キットは本明細書に記載された系を含み、前記系は好ましくは以下の少なくとも１つを含む：ａ）本明細書に記載されたキメラタンパク質；及びｂ）本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸のいずれかを含むベクター。場合によって前記キットは更に、前記キメラタンパク質に特異的なプロテアーゼをコードする核酸を含むベクター、及び／又は前記キメラタンパク質及びプロテアーゼを含み、更に好ましくはそれらを発現する細胞を含む。前記キットはまたプロテアーゼ阻害剤のスクリーニングに用いることができる。
本発明は更に別の使用及び利点を提供する。例えば本発明の目的はまた、あるプロテアーゼに特異的な阻害剤のin vivoスクリーニングのために効果的で普遍化された方法を提供することである。従って、ある実施態様では、本発明は以下を提供する：
（１）細胞内小器官への輸送を誘導する少なくとも１つのシグナルタンパク質、あるプロテアーゼに特異的な少なくとも１つのタンパク分解切断部位、及び少なくとも１つの蛍光性タンパク質標識を含むキメラ基質タンパク質、並びに前記キメラ基質タンパク質を構築する普遍化された方法；
（２）前記キメラ基質タンパク質をコードする核酸配列を含むリコンビナント遺伝子、前記遺伝子を用いて細胞を形質転換させ、前記キメラ基質タンパク質を発現させることができる；
（３）前記キメラ基質タンパク質及びその特異的プロテアーゼが生細胞に同時に存在し、それによって前記基質のプロテアーゼによるタンパク分解切断が生細胞内で生じることが可能な系；
（４）前記生細胞内での前記プロテアーゼによる前記キメラタンパク質の切断を、前記基質に結合させた蛍光性タンパク質標識から放出される蛍光シグナルを示す細胞を直接観察することにより確認することによって前記プロテアーゼ活性をin vivoで測定する効果的な段階的方法；及び
（５）生細胞内での前記プロテアーゼ活性の測定のために構築された上記の系を用いることによって、あるプロテアーゼに対して特異的な阻害剤をスクリーニングする効果的な段階的方法。
【００１１】
附随する技術的問題を熟慮することにより、本発明は、特定のプロテアーゼの活性を分析し、更に前記プロテアーゼの阻害剤をスクリーニングするより実際的なin vivoの方法を提供する。前記方法では、プロテアーゼ及びその特異的基質は生細胞に同時に存在し、それにより前記プロテアーゼによる基質の切断が生細胞内で生じ、その結果を前記生細胞で直接観察することができる。
関連する特徴で、本発明は、細胞内又は組織内のプロテアーゼを検出する極めて有用な方法を提供する。本発明を詳述すれば、前記方法は以下の工程の１つ、好ましくは全てを含む：
ａ）対象の細胞又は組織に、共有結合で連結された以下の成分を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む第一のベクターを導入し：１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質；２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位；及び３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列；
ｂ）前記第一のベクターによってコードされたキメラタンパク質を発現させることができる条件下で前記細胞又は組織をインキュベートし；更に
ｃ）前記キメラタンパク質（又は検出できるように標識されたその成分）の細胞内局在及びシグナル強度の少なくとも１つにおける変化を、前記細胞内における前記プロテアーゼの存在の指標として検出する。
考察されるように、本方法は融通性をもち、目的の使用に適合するように容易に調整することができる。例えば必要な場合には、本方法は更に、対象の細胞又は組織に、プロテアーゼをコードする核酸配列を含む第二のベクターを導入し、更に前記第二のベクターを前記細胞又は組織で発現させ前記プロテアーゼを前記細胞内又は組織内で産生させる工程を含むことができる。
【００１２】
本発明はまた、プロテアーゼ阻害剤のin vivo活性を検出し、場合によって定量する方法を提供する。好ましい阻害剤は問題の細胞又は組織にとって内因性でもよい。しかしながら、本発明の多くの実施態様では、前記阻害剤は前記細胞又は組織に投与されるもので、天然に存在する分子、合成及び半合成分子が含まれるであろう。そのような分子はケミカルライブラリーから入手することができるが、それら分子には、公知の阻害剤、疑いのある阻害剤又は完全に未知の阻害剤活性を有するものが含まれる。例えば、特定のプロテアーゼ活性が確定されている実施態様では、特定の細胞、組織タイプ又は培養条件で前記プロテアーゼの活性を確認するために本発明を用いることができる。他の実施態様では、本発明を用いて候補化合物をケミカルライブラリーからスクリーニングすることができる。本発明のある実施態様では、本検出方法は以下の工程の少なくとも１つ、好ましくは全てを含む：
ａ）対象の細胞又は組織に、共有結合で連結された以下の成分を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む第一のベクターを導入し：１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質；２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位；及び３）少なくとも１つの検出可能なアミノ酸配列；
ｂ）前記細胞又は組織に、少なくとも１つの対象のプロテアーゼ、好ましくは１つの対象のプロテアーゼをコードする第二のベクターを導入し；
ｃ）前記細胞又は組織を候補化合物と接触させ；
ｄ）前記第一のベクターによってコードされたキメラタンパク質及び前記第二のベクターによってコードされたプロテアーゼを発現させることができる条件下で前記細胞又は組織をインキュベートし；更に
ｅ）前記キメラタンパク質（又は検出できるように標識されたその成分）の細胞内局在及びシグナル強度の少なくとも１つにおける変化を、前記プロテアーゼ阻害剤の存在の指標として検出する。
【００１３】
前述の検出方法は融通性を有し、単一処理、標準処理又は高処理態様で候補化合物をスクリーニングするために容易に調整することができる。例を挙げればある実施態様では、本方法は更に、検出できるように標識されたキメラタンパク質もしくは標識されたその成分タンパク質の細胞内局在又はシグナル強度における変化を検出することを目的とする、自動化又は半自動化装置の使用を含む。より具体的な装置には、細胞内又は組織内の検出可能な配列を検出できるように適応させた光学系が含まれる（前記の系は使用者に即時出力又は保存出力を提供することができる）。
所望の場合には、キメラタンパク質（又は検出できるように標識されたその成分）の細胞内局在、シグナル強度（又はその両方）における検出可能な変化は適切なコントロールを参考にモニターすることができる。適切なコントロールの１つは、工程ｃ）での被検化合物の代わりに水、食塩水又は緩衝液の添加である。もちろん、コントロールの使用は、キメラタンパク質、ホスト細胞又は組織などの特徴が個々の方法において既に確立されている実施態様では必要とされないかもしれない。
考察されるように、本発明はプロテアーゼ阻害剤の検出に適している。本発明に適した公知のプロテアーゼ阻害剤はウイルス疾患阻害剤であろう。ウイルスプロテアーゼはウイルスキャプシドの複製及び再組み立てに必須であるので、前記プロテアーゼの阻害剤は、前記プロテアーゼを阻害しウイルスの増殖を抑制することによってウイルス疾患の治療に用いることができる。動物ウイルスは例えばエイズ及び肝炎などの疾患を惹起し、植物ウイルスは葉を萎れさせ斑入りにして作物の収量を低下させるであろう。
ある特徴では、本発明は、複数の基質を提供することによって種々のプロテアーゼに特異的な阻害剤を効果的に開発する体制、及び種々のプロテアーゼに特異的な阻害剤をin vivoでスクリーニングする方法を提供する。本方法はまた、通常のin vitroの方法によってスクリーニングされた薬剤候補物質の有効性を決定するために用いることができる。
【００１４】
発明の最良の実施態様
考察するように、本発明は、細胞内又は組織内のプロテアーゼを検出する極めて有用な系を提供する。所望する場合には、本発明の系は、２つ以上のプロテアーゼ、好ましくは約３つ未満のプロテアーゼ、通常は約１つのプロテアーゼを検出するために容易に適合させることができる。好ましくは本発明の系は共有結合で連結された成分として以下を含むキメラタンパク質を含む：１）少なくとも１つの場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質；２）少なくとも１つのプロテアーゼ特異的切断部位；及び３）少なくとも１つの検出することができるアミノ酸配列。典型的には好ましいキメラタンパク質は約20未満の成分、より好ましくは約10未満の成分から成り、一般的にはほとんどのタンパク質の場合約３から約６成分が好ましい。本発明は広範囲の重要な用途を有し、前記にはin vivoでプロテアーゼ活性を低下させるか、又は完全に阻止する候補化合物を検出するスクリーニングにおける使用が含まれる。
本発明の“系”は、本明細書に記載されている１つ又は２つ以上のキメラ分子を、前記に加えることができる任意の付加成分とともに含んでいる。前記付加成分は、前記キメラ分子の可溶性又は安定性を促進することができる成分である。前記の例には、血清タンパク質（例えばウシ血清アルブミン）、緩衝液（例えばリン酸緩衝食塩水）又は許容される賦形剤又は安定剤が含まれるが、ただしこれらに限定されない。許容可能な賦形剤、安定化剤などについては例えば一般的には以下を参照された：Reminington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980。本発明の典型的な系はまた、本明細書に記載した核酸、ベクター、遺伝的改変（manipulated）細胞又は組織の少なくとも１つを含むであろう。本発明の実施態様では、前記キメラタンパク質は有用な実験的コントロールとして機能することができる。好ましい系は約１から10、好ましくは約５未満、より好ましくは約１つのキメラタンパク質を含み、前記キメラタンパク質は許容可能な担体（例えば水又は緩衝食塩水）に溶解されている。好ましくは、前記系は滅菌状態で提供される。
【００１５】
“シグナルタンパク質”という語句は、細胞内小器官へ誘導する固有のトラフィッキングシグナル又は細胞内でのその局在に関係する固有の特性（例えば集合塊形成）のいずれかを有するポリペプチド配列を意味する。好ましいシグナルタンパク質は、実施例の章を含む本明細書を通して見出すことができよう。
本発明の好ましいキメラタンパク質は、場合によって隠蔽されたシグナルタンパク質、プロテアーゼ特異的切断部位、及び検出可能なアミノ酸配列を含む。前記は遺伝子組換えの方法、化学的方法又は他の適切な方法によって共有結合により一緒に連結（すなわち融合）されてある。ほとんどの実施態様では遺伝子組換えによるアプローチが好ましいであろう。ほとんどの実施態様で一般的には要求されるわけではないが、ペプチドリンカー配列を介して１つ又は２つ以上の成分を１つの部位又はいくつかの部位で融合させることができる。具体的なペプチドリンカー配列は約30未満のアミノ酸、より好ましくは約15未満のアミノ酸、更に好ましくは約１から約５アミノ酸であろう。
前記ペプチド配列は、病原体誘発又はホスト誘発プロテアーゼによって切断される１つ又は２つ以上の部位を含むことができる。また別には、前記ペプチドリンカーは前記キメラタンパク質の構築を促進するために用いてもよい。特に好ましいキメラタンパク質は“インフレーム”融合分子と称されるであろう。
【００１６】
記載したように、本明細書に開示したキメラタンパク質の成分は、前記タンパク質がその目的の機能を有することを条件にほぼ任意の態様で編成させることができる。更に既に述べたように、前記キメラタンパク質の各成分は少なくとも１つの適切なペプチドリンカー配列によって互いに一定の間隔を置いて配置することができる。
例えば、前記キメラタンパク質成分のいずれも前記タンパク質のＮ−末端を含むことができる。更にまた、前記成分のいずれも前記キメラタンパク質のＣ−末端を含むことができ、その末端には下記で考察するようにまた別の成分（例えば精製タグ配列）を含むことができる。別に特定しないかぎり、アミノ酸配列に関して“共有結合により連続的に連結された”という語句は、ＮからＣの方向に一緒に連結されたペプチド結合を意味する。ヌクレオチド配列に関しては、前記語句は５’から３’方向への１つのヌクレオシドと別のヌクレオシドとの結合を意味する。
本発明の系のより具体的な例として、前記キメラタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含む：１）シグナルタンパク質；２）プロテアーゼ特異的切断部位；及び３）検出可能なアミノ酸配列。また別には、前記キメラタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含む：１）隠蔽配列；２）プロテアーゼ切断部位；３）シグナルタンパク質；及び４）検出可能なアミノ酸配列。また別に実施態様では、本発明の系の特徴的な使用のために前記キメラタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含む：１）シグナルタンパク質；２）プロテアーゼ切断部位；３）隠蔽配列；及び４）検出可能なアミノ酸配列。
【００１７】
２つ以上のシグナルタンパク質がキメラタンパク質で要求される実施態様では、前記のタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含む：１）第一のシグナルタンパク質；２）プロテアーゼ切断部位；３）第二のシグナルタンパク質；及び４）検出可能なアミノ酸配列。より具体的には、前記のようなタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含む：１）第一のシグナルタンパク質；２）第一のプロテアーゼ切断部位；３）隠蔽配列；４）第二のシグナルタンパク質；及び５）検出可能なアミノ酸配列。
いくつかの事例では、前記キメラタンパク質が２つ以上（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のプロテアーゼ切断部位を含む系をもつことが有用であろう。そのような場合には、前記キメラタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含むことができる：１）隠蔽配列；２）第一のプロテアーゼ切断部位；３）第一のシグナルタンパク質；４）第二のプロテアーゼ切断部位；５）第二のシグナルタンパク質；及び６）検出可能なアミノ酸配列。また別には、前記キメラタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含むことができる：１）第一のシグナルタンパク質；２）第一のプロテアーゼ切断部位；３）第二のシグナルタンパク質；４）第二のプロテアーゼ切断部位；５）隠蔽配列；及び６）検出可能なアミノ酸配列。
また別の実施態様では、前記キメラタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含む：１）プロテアーゼ特異的切断部位；２）シグナルタンパク質；及び３）検出可能なアミノ酸配列。また別には前記キメラタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含むことができる：１）第一のシグナルタンパク質；２）第一の検出可能なアミノ酸配列；３）プロテアーゼ切断部位；及び４）第二の検出可能な配列。この実施例では、前記タンパク質は更に前記プロテアーゼ切断部位のＣ−末端と前記第二の検出可能配列のＮ−末端との間に共有結合により連結された第二のシグナル配列を含むことができる。
【００１８】
本発明は、共有結合により連続的に連結された以下を含む更に別のキメラタンパク質を提供する：１）第一のシグナルタンパク質；２）プロテアーゼ切断部位；３）第二のシグナルタンパク質；及び４）検出可能なアミノ酸配列。また別には前記キメラタンパク質は共有結合により連続的に連結された以下を含むことができる：１）第一の検出可能な配列；２）プロテアーゼ切断部位；３）シグナルタンパク質；及び４）第二の検出可能な配列。
本発明のより好ましいキメラタンパク質は、適切な分子量マーカーを用いて標準的なSDSPAGEゲル電気泳動によって決定したとき、約250kDa未満、好ましくは約200ｋDa未満の分子サイズ、より好ましくは約25から約175ｋDaの分子サイズを有するであろう。
“ポリペプチド”とは任意のポリマーを指し、前記は本質的にそのサイズとは無関係に天然の20個のアミノ酸のいずれかから成る。比較的大きなポリペプチドを指してしばしば“タンパク質”と称し、小さなポリペプチドを指してしばしば“ペプチド”と称するが、当分野におけるこれらの用語の使用はしばしばオーバーラップする。“ポリペプチド”という用語は、別に特定されないかぎり、一般的にタンパク質、ポリペプチド及びペプチドを指す。
本明細書で用いられるように、“細胞”という用語は任意の初代細胞又は不朽化細胞株、前記のような細胞の任意の群、組織又は器官を含むことが意図される。好ましい細胞には哺乳類細胞（例えばヒト起源のもの）、植物細胞、酵母、真菌及び昆虫細胞が含まれる。本発明の“ホスト細胞”は感染細胞であってもよく、また本明細書に記載されているように核酸又はベクターの増殖に用いることができる例えば大腸菌のような細胞でもよい。
【００１９】
本発明を個々に用いる場合キメラタンパク質の固有の構造がしばしば要求されることは理解されよう。個々のキメラタンパク質成分又は成分群の選択は認識されているパラメーターによって教示されるであろう。前記パラメーターには以下が含まれる：選択されるシグナルタンパク質、プロテアーゼ特異的切断部位及び検出可能なアミノ酸配列、モニターされるべきプロテアーゼ、並びに使用のために要求される感度及び選択性のレベル。
例示すれば、本発明は、前記キメラタンパク質が１つのシグナルタンパク質、１つの検出可能な配列及び１つのプロテアーゼ特異的切断部位を含む実施態様を含む。この実施例では、前記シグナルタンパク質のＮ−末端又はＣ−末端に連結された隠蔽配列を含むことがしばしば有用であろう。すなわち、隠蔽配列の前記検出可能配列への連結は、本発明の使用例のいくつかではあまり望ましくないであろう。
本発明の他の特定の使用例では、典型的にはまた別の特定のキメラタンパク質構造が要求されるであろう。例えば、個々のタンパク質が１つのシグナルタンパク質、及び２つの検出可能なアミノ酸配列の間に位置する１つのプロテアーゼ特異的切断部位を有する場合、前記検出可能アミノ酸配列の１つを除いて前記の系を最適化することがしばしば所望されるであろう。
本発明のまた別の使用は、多数の隠蔽配列を含むことによって促進されるであろう。前記隠蔽配列はシグナル配列でも、検出可能アミノ酸配列でも又は他の適切な配列（例えばプロテアーゼ特異的切断配列）でもよい。これらの実施態様では、１つ又は２つ以上の更に別の隠蔽配列（例えばプロテアーゼ切断部位）を有することは、前記系の効果を最大にするために必ずしも必要ではないであろう。しかしながら、２つの異なるシグナルタンパク質を含む実施態様では、１つのプロテアーゼ切断部位及び２つの検出可能アミノ酸配列、その上に付加される１つ又は２つの隠蔽配列は有益であろう。
【００２０】
更にまた、個々のキメラタンパク質は除去可能なタグ配列を含むことができる。前記はいくつかの実施態様では前記キメラタンパク質の特定及び／又は精製に役立つであろう。前記の例は６ＸＨｉｓ及びＭＹＣタグである。他の適切なタグ配列は当分野で周知であり、所望の場合本発明で用いることができる。
本発明の実施は、隠蔽されてあるか又は隠蔽されていない、多様なシグナルタンパク質及びその機能的フラグメントと完全に適合する。好ましい例は、細胞小器官又は他の細胞内小区画に前記キメラタンパク質（又は前記タンパク質の検出可能成分（例えば検出可能配列））を一般的に局在させるために十分である。“小区画”という用語は内部が限定された空間（例えば空胞、ペルオキシソーム、ミトコンドリアなど）を意味する。
好ましい植物シグナルタンパク質は、キメラタンパク質又はその成分の少なくとも１つを植物細胞の核、ゴルジ小体、溶解小胞、貯蔵小胞、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、小胞体、細胞質膜又は葉緑体に局在させる。より好ましい植物シグナルタンパク質には、ＡｔＯＥＰ７；ＲｂｃＳ；ＲＡ；ＳＫＬ；Ｆ１−ＡＴＰアーゼ；ＰＨ；ＦＡＰＰ；Ｈ+−ＡＴＰアーゼ；又はその機能的フラグメントが含まれる。好ましい動物シグナルタンパク質は、キメラタンパク質又はその成分の少なくとも１つを動物細胞の核、ゴルジ小体、貯蔵小胞、リソソーム、ペルオキシソーム、小胞体、細胞質膜又はミトコンドリアに局在させる。前記の例には、ヒトのペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲＡ）、チトクロームｂ２、11−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β−ＨＳＤ）、Ｇ９−ＡＫＬ、ペルオキシソーム必須膜タンパク質７（ＰＭＰ47）；又はその機能的フラグメントが含まれる。好ましい動物シグナルタンパク質の配列については下記実施例を参照されたい。
【００２１】
考察されるように、本発明の実施は、動物細胞で機能するシグナルタンパク質の使用と適合する。典型的な例には下記の表Ｉに示されている動物のシグナルが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
表Ｉ
2004538006.tif 000003
1タイプＡ：シグナルタンパク質は隠蔽シグナルタンパク質として用いることができる。
タイプＢ：シグナルタンパク質は非隠蔽シグナルタンパク質として用いることができる。
以下の文献を参照されたい：A. Hansel et al., FASEB J, 16:911-31(2002)（ヒトのペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＭＳＲＡ））；U. Bomer et al., J. Biol. Chem. 272:30439-30446(1997)（チトクロームｂ12）；A. Naray-Fejes-Toth and G. Fejes-Toth,  J. Biol. Chem. 15436-15444(1996)（11β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β−ＨＳＤ））；J.A. McNew and J.M. Godman, J. Cell Biol. 127:1245-1257(1994)（Ｇ９−ＡＫＬ）；Dyer et al., J. Cell Biol. 133:269-280(1996)（ＰＭＰ47（ペルオキシソーム必須膜タンパク質７））。
【００２２】
“機能的フラグメント”という用語は、本明細書でシグナルタンパク質について用いる場合は、個々のシグナルタンパク質のフラグメントであって、完全長配列のシャトル機能の少なくとも約70％、好ましくは約90％を越える機能を提供することができる前記フラグメントを意味する。シグナルタンパク質機能の検出及び定量方法は公知であり、実施例の章に記載したように蛍光画像化技術を用いたシグナル強度の局在及び定量化が含まれる。
明白なように本発明は融通性を有し、いずれのプロテアーゼ特異的切断部位の使用にも限定されない。例えば、前記切断部位は哺乳類のプロテアーゼ又はウイルスプロテアーゼによって特異的に切断される。“特異的に切断される”という語句は、固有のプロテアーゼ切断部位のペプチド結合が対象のプロテアーゼによって特異的に破壊されることを意味する。すなわち、前記プロテアーゼ切断部位は、ホスト細胞に天然に存在するプロテアーゼ（一般にハウスキーピングプロテアーゼと称されるものを含む）によって特異的に破壊されることはない。前記プロテアーゼ切断部位の特異的な切断は、多様な技術（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を含む）によってモニターすることができる。
【００２３】
好ましいプロテアーゼ切断部位は、ヒトの病原体（例えば酵母菌、細菌、真菌、線虫、ウイルス又は原虫に附随するプロテアーゼによって特異的に加水分解される部位である。より具体的な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）；肝炎ウイルス（好ましくはＡ又はＣ型）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；カポジ肉腫附随ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；黄熱病ウイルス；フラビウイルス；ライノウイルス；マラリア原虫（例えば熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P.vivax）又は卵形マラリア原虫（P. ovale）、四日熱マラリア原虫（P. malariae））が含まれる。典型的には、マラリア原虫はマラリア及びマラリアに関連する多様な合併症をひき起こす。プロテアーゼのプラスメプシンＩ及びIIが関与しているとの認識がある。ＨＳＶが問題となる実施態様では、プロテアーゼはＨＳＶの成熟に関するプロテアーゼである。
種々の具体的なＨＩＶ−１及びＨＣＶプロテアーゼ特異的切断部位が報告されている。例えば以下を参照されたい：I.Y. Gluzman et al., J. Clin. Invest. 94:1602(1994); A. Grakoui et al., J. Virol. 67:2832(1993); A.A. Kolykholov et al., J. Virol. 68:7525(1994); K.A. Barrie et al., Virology 219:407(1996)（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
更に別の病原体特異的プロテアーゼ及び特定の切断部位が報告されているが、本発明に従って用いることができる。例えば、ＨＳＶ−１成熟に関するプロテアーゼ及びプロテアーゼ切断部位が記載されている。例えば以下を参照されたい：M.R.T. Hall and W. Gibson, Virology 227:160(1997)。更に、プラスメプシンＩ及びIIは熱帯熱マラリア原虫の消化小胞で見出されている。その対応するプロテイナーゼ切断部位もまた報告された。例えば以下を参照されたい：R.P. Moon, J. Biochem. 244:552(1997)。
【００２４】
更に別の本発明で使用されるプロテアーゼ特異的切断部位は、血液凝固、アポトーシス又は細胞外マトリックスに附随する哺乳類プロテアーゼによって特異的に切断される。下記の実施例及び考察を参照されたい。
本発明の実施は、例えば直接的又は間接的に蛍光性、リン光性、冷光性又は化学発光性である検出可能なアミノ酸の１つ又はそれらの組合せの使用に適合する。２つ又は３つ以上のそのような検出可能配列が用いられる実施態様では、検出可能配列の１つの放出波長はしばしば少なくとも１つの他の検出可能配列とは異なっているであろう。例えば、好ましい検出可能配列はある種のクラゲの周知の蛍光タンパク質に由来する。前記蛍光タンパク質には、緑色光、赤色光及び黄色光を適切な励起条件下で放出するものが含まれる。
考察されるように、本発明は更に実質的に純粋なキメラタンパク質を提供する。そのようなキメラタンパク質は、公知の技術の適切な組合せによって分離及び精製することができる。所望する場合は、そのようなタンパク質は本明細書に記載するように１つ又は２つ以上の精製タグを含むことができる。これらの方法には、例えば可溶性を利用する方法（例えば塩沈澱及び溶媒沈澱）、分子量における相違を利用する方法（例えば透析、限外ろ過、ゲルろ過及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、荷電の相違を利用する方法（例えばイオン交換カラムクロマトグラフィー）、固有の親和性を利用する方法（例えばアフィニティークロマトグラフィー）、疎水性の相違を利用する方法（例えば逆相高速液体クロマトグラフィー）及び等電点の相違を利用する方法（例えばイソエレクトリックフォーカシング、金属親和性カラム（例えばＮｉ−ＮＴＡ））が含まれる。これらの方法に関する記載については一般的には以下を参照されたい：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989); and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1999)。
【００２５】
本発明のキメラタンパク質は実質的に純粋であるのが好ましい。すなわち、前記キメラタンパク質は天然の状態で細胞置換物に附随するものから単離され、従って前記キメラタンパク質は好ましくは少なくとも80％（w/w）又は90から95％（w/w）の均一性で存在する。少なくとも98から99％（w/w）の均一性を有するキメラタンパク質が多くの医薬用途、臨床用途及び研究用途にとって極めて好ましいであろう。いったん実質的に精製されたら、前記キメラタンパク質は、細胞培養及び関連用途に対して夾雑物を実質的に含まないはずである。いったん部分的又は実質的に精製されたら、前記可溶性キメラタンパク質は治療のために、又は本明細書で開示されるようにin vitroもしくはin vivoアッセイの実施に用いることができる。実質的精製度は多様な標準的技術（例えばクロマトグラフィー及びゲル電気泳動）によって決定することができる。
適切なホスト細胞を調製目的で使用して所望のキメラタンパク質をコードする核酸を増殖させることができる。従ってホスト細胞には、前記キメラたんぱく質の製造を特に目的とする原核細胞、植物又は真核細胞が含まれる。従ってホスト細胞には、前記キメラタンパク質をコードする核酸を増殖させることができる、特に酵母、ハエ、蠕虫、植物、カエル、哺乳類細胞、植物細胞及び器官が含まれる。使用することができる哺乳類細胞の非限定的な例には、ＣＨＯdhfl-細胞（Urlaub and Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980) ）、293細胞（Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59(1977)）、ＳＰ２又はＮＳＯのようなミエローマ細胞（Galfre and Milstein, Meth. Enzymol. 73(B):3(1981)）が含まれる。他の適切な細胞は上掲書に記載されている（Sambrook et al.）。
【００２６】
所望のキメラタンパク質をコードする核酸を増殖させることができるホスト細胞には非哺乳類真核細胞が同様に含まれ、前記には昆虫細胞（例えばSp. Frungiperda）、酵母細胞（例えばS. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, K, lactis, H. polymorpha；一般的には以下で概括されている：R. Fleer, Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486-496(1992)）、真菌細胞及び植物細胞（例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis）及びタバコ（Nicotinia））が含まれる。更に、ある種の原核細胞（例えば大腸菌（E. coli）及びバチルス）の使用も意図される。
所望のキメラタンパク質をコードする核酸を、細胞をトランスフェクトする標準的な技術によってホスト細胞に導入することができる。“トランスフェクト”又は“トランスフェクション”という用語は、核酸をホスト細胞に導入する通常の全ての技術を包含し、前記技術には以下の方法が含まれる：カルシウムリン酸塩同時沈澱、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチン、電気穿孔、マイクロインジェクション、ウイルスによる形質導入及び／又は組み込み。ホスト細胞のトランスフェクションに適した方法は上掲書（Sambrook et al.）及び他の実験用テキストで見出すことができる。
【００２７】
本発明は更に問題のキメラタンパク質の単離のための製造方法を提供する。前記方法では、問題のタンパク質をコードする核酸（調節配列に機能的に連結されてある）が導入されたホスト細胞（例えば酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞）を、問題のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するために、前記キメラタンパク質の存在下で培養液中で大量に増殖させる。続いて、採集したホスト細胞又は培養液から前記問題のキメラタンパク質を単離する。標準的なタンパク質精製技術を用いて、培養液又は採集細胞から問題のタンパク質を単離することができる。特に、多様な装置（ローラーボトル、スピンナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター又はファーメンターを含む）で大規模に（すなわち少なくともミリグラム単位で）所望のキメラタンパク質を発現及び精製するために、前記精製技術を用いることができる。
従って、本発明は更にキメラ基質タンパク質をコードする核酸配列を提供する。前記キメラ基質タンパク質をコードする核酸を用いて、細胞を形質転換し細胞内で前記キメラ基質タンパク質を発現させることができる。細胞を形質転換させるために、リコンビナント遺伝子は、前記キメラ基質タンパク質のコード領域に機能的に連結されたプロモーター及び他の調節核酸配列を含まねばならない。プロモーターの選択は、認識されているパラメーター（典型的にはホスト細胞の選択）によって教示されるであろう。
【００２８】
考察されるように、本発明はまた、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸配列及び特にＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、前記ＤＮＡ配列は、染色体外複製に適したベクター（例えばファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ又はエピソーム）によって担持される。特に、所望のキメラタンパク質をコードするＤＮＡベクターを用いて本明細書で開示する調製方法を容易にし、相当量のキメラタンパク質を得ることができる。前記ＤＮＡ配列を適切な発現ベクター（すなわち前記挿入タンパク質をコードする配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入することができる。多様なホスト−ベクター系を利用して、前記タンパク質をコードする配列を発現させることができる。前記系には、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）を感染させた哺乳類細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む微生物（例えば酵母）、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡで形質転換した細菌が含まれる。利用するホスト−ベクター系に応じて、多数の適切な転写及び翻訳エレメントのいずれも使用することができる。一般的には上掲書（Sambrook et al.; Ausubel et al.）を参照されたい。
一般的に、本発明の好ましいＤＮＡベクターは、本明細書に記載したキメラタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列の導入のために、５’から３’方向にホスホジエステル結合によって連結された第一のクローニング部位を含むヌクレオチド配列を含む。所望される場合には、前記タンパク質は１つ又は２つ以上の適切なタグ配列をコードするＤＮＡに連結することができる。図７（ａ）−（ｊ）；８（ａ）−（ｂ）；及び９（ａ）−（ｃ）はそのようなベクターの例を提供する。
【００２９】
本発明のいくつかの実施態様では、前記ＤＮＡベクターによって提供されるキメラタンパク質が“カセット形式”で提供されるのが好ましいであろう。“カセット”という用語は、コードされたタンパク質（又はその成分）が標準的な遺伝子組換え方法によって別の成分と容易に置換できることを意味する。特に、カセット形式で構成されたＤＮＡベクターは、１つの位置特異的プロテアーゼ切断部位又は検出可能なアミノ酸配列を別の配列に“交換”することが有用な場合に特に所望される。コアベクターを用いて種々のキメラタンパク質を発現させる、図７（ａ）−（ｊ）；８（ａ）−（ｂ）；及び９（ａ）−（ｃ）を参照されたい。
より具体的には、いくつかの事例では、個々のプロテアーゼ切断部位はある種の病原体の血清タイプ（特にウイルス株）に特異的であることが意図される。前記に関しては、薬剤耐性ＨＩＶ血清タイプの出現が特に問題である。この場合は、カセット形式のＤＮＡベクター内の１つ又は２つ以上の現存のプロテアーゼ切断部位を、必要とされる他の予め定めたプロテアーゼ切断部位と置き換えることができる。具体的なプロテアーゼ切断部位は、個々の患者に存在する病原体に従って選択することができる。
重要なことには、本発明は、対象細胞又は組織におけるプロテアーゼ活性の変化を記録することができる効果的な“警告システム”として機能することができる。例えば、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション実験が病原体附随プロテアーゼをコードするゲノムＤＮＡの存在を示した場合に、本発明を使用することによって細胞内又は組織内の活性なプロテアーゼの存在を検出することができる。本発明のこの特徴は多様な設定（病原体の夾雑が判明しているか疑われる細胞培養を含む）で有用である。
考察されるように、本発明を用いて問題のホスト細胞内又は組織内の１つ又は２つ以上のプロテアーゼの存在を検出することができる。本明細書に開示した本方法及び組成物は、プロテアーゼ阻害分子（考察されるように、前記は天然に存在するものでもそのような分子群（すなわちケミカルライブラリー）の一部分でもよい）の検出及び分析に特に有用である。
【００３０】
Ａ．プロテアーゼ阻害剤の候補物質のスクリーニングにおける本発明の使用
１．一般的考察
本発明で述べる実施例で用いられる植物プロトプラストの他に、細胞壁をもつ正常な植物細胞、ヒト、動物又は昆虫の細胞もまた、本発明のプロテアーゼ阻害剤のスクリーニングに用いることができる。形質転換及び培養が容易であり、更にプロトプラストの規則的な球体のためにタンパク質の局在の特定が促進されるという理由から植物細胞がしばしば好ましいであろう。しかしながら、例えば問題のプロテアーゼが植物細胞内では活性形として発現させることができない場合は、他の細胞及び組織も有用であろう。例えばそのようなプロテアーゼは不適切な翻訳後修飾のために発現させることが困難であるかもしれない。このような問題が生じる場合は、適切な動物又は昆虫細胞を用いて解決することができるであろう。前記のような事例では、選択された細胞で機能することができるシグナルタンパク質を使用する必要がある。例えば、ヒト、動物又は昆虫細胞がスクリーニングに用いられる場合は、葉緑体誘導シグナルタンパク質（例えばＡｔＯＥＰ７、ＲｂｃＳ、Ｃａｂ及びＲＡ）は上記細胞には存在しないので用いることができない。ヒト、動物又は昆虫細胞の場合、他の細胞内小器官（例えばミトコンドリア、ペルオキシソーム、細胞質膜など）に誘導するシグナルタンパク質を用いることができる。更にまた、プロモーター及び他の調節エレメントを含むベクター系も使用する細胞に応じて適切に選択する必要がある。
本発明のプロテアーゼ阻害剤のin vivoスクリーニングの場合、問題のプロテアーゼ及び前記プロテアーゼに特異的なキメラ基質タンパク質の両者を発現することができる形質転換細胞を調製する。前記形質転換細胞を調製するもっとも好ましい方法は、前記プロテアーゼをコードするリコンビナントプラスミド及び本発明によって提供されるキメラ基質タンパク質をコードするリコンビナントプラスミドで細胞を同時形質転換させることである。前記プロテアーゼがウイルスのプロテアーゼである場合は、ウイルス感染もまた形質転換細胞内でのプロテアーゼ発現に用いることができる。
【００３１】
極めて多様な植物、動物、酵母、真菌及び昆虫細胞を形質転換する方法が確立されている。例えば、リコンビナントプラスミドを導入することによって細胞を形質転換する方法には、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、リン酸カリウムもしくはＤＥＡＥ−デキストランを用いる化学物質仲介方法、陽イオン性脂質仲介リポフェクチン、マイクロインジェクション、電気穿孔、電気融合及びＤＮＡ衝撃法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。使用する細胞タイプに応じて、適切な形質転換方法を選択し、条件を最適化して効率的な形質転換を達成する必要がある。植物細胞のプロトプラスト（例えばシロイヌナズナ又はタバコのプロトプラスト）を用いる場合は、実施例1（ｃ）に記載されているＰＥＧ仲介形質転換法が好ましい方法である。実施例１（ｃ）に示されている条件はシロイヌナズナ（Arabidopsis）のプロトプラストに最適化されている。細胞壁を有する正常な植物細胞を用いる場合は、遺伝子銃によるＤＮＡ衝撃法又はＰＥＧ−仲介形質転換法が植物の細胞タイプに応じて用いられるであろう。ヒト、動物又は昆虫細胞の場合、リン酸カリウム仲介もしくはＤＥＡＥデキストラン仲介トランスフェクション法、又は陽イオン性脂質仲介リポフェクチン法を用いて細胞を形質転換することができる。
【００３２】
プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングするために、前記プロテアーゼ及びキメラ基質タンパク質の発現中に前記形質転換細胞を候補化合物と接触させる必要がある。典型的には、形質転換細胞を含む溶液に候補化合物を添加し、得られた溶液を適切な温度でインキュベートする。前記候補阻害剤は、化合物、ペプチド、化合物又はペプチドの混合物、及び天然生成物の抽出物から成る群から選択されたものであろう。前記タンパク質を発現させるためのインキュベーション時間は細胞のタイプ及びインキュベーション温度に応じて変動するであろう。前記時間は約１時間から数日であろう。シロイヌナズナのプロトプラストの場合、インキュベーション時間は、インキュベーションの条件に応じて約４時間から約１週間であろう。シロイヌナズナのプロトプラストをＷ５溶液中で22℃でインキュベートするときは、好ましいインキュベーション時間は12から48時間の範囲である。検査される候補阻害剤の濃度は約0.1から100μg/mLである。典型的なスクリーニングでは、約１から数μg/ｍLの濃度を用いることができる。多数の候補化合物をスクリーニングする必要がある場合には、約５から30の候補阻害剤の混合物を１回のスクリーニングで用いることができる。
【００３３】
ほぼ任意の化合物又は化合物群を本発明の抗プロテアーゼ活性についてスクリーニングすることができる。これら化合物の例にはサイトカイン、腫瘍抑制物質、抗生物質、レセプター、ミューテイン、前記タンパク質のフラグメントもしくは部分、及び活性なＲＮＡ分子（例えばアンチセンスＲＮＡ分子又はリボザイム）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。スクリーニングのために好ましい化合物は合成又は半合成薬剤（時に“小分子”と称される）である。例えば、ヒトのウイルス病原体の公知の阻害剤の誘導体集合物を本発明の方法によって容易に検査することができる。例えば以下を参照されたい：米国特許第6,420,438号、6,329,525号、6,287,840号、6,147,188号及び6,046,190号（前記は多様な検査可能分子及びその誘導体を開示する）。
更に別の化合物をスクリーニングするために本発明を用いることができる。以下の文献を参照されたい：Pillay et al., Rev. Med. Virol.(1995)（種々の可能なウイルスプロテアーゼ阻害物質を開示する）；Wei et al., Nature 373:117(1995)（インディナビア（indinavir）、ABT-538を開示する）；Ho et al., Ann. Intern. Med. 113:111(1992)（抗ヘルペス剤を開示する）。更にまた、前述の特定の化合物の誘導体を本発明によりスクリーニングすることができる。前記特定の化合物にはサクィナビア（saquinavir）及びその誘導体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００３４】
候補化合物によるプロテアーゼ活性の阻害を確認するために、形質転換細胞の蛍光画像を時間の関数としてモニターするのが好ましい。発現時間は細胞の条件に応じて変化させることができ、従ってタンパク分解活性又は阻害は種々の時間で出現するであろう。使用される細胞がシロイヌナズナのプロトプラストである場合、蛍光画像をモニターする好ましい一連の時間は、発現開始後12、18、24、36及び48時間である。キメラ基質タンパク質が２つ又は３つ以上の異なる蛍光標識を含む場合、蛍光画像を前記蛍光標識に特異的な２つ又は３つ以上の蛍光波長でモニターするのが好ましい。明視野画像は細胞内小器官の特定を容易にするので明視野画像をモニターするのが好ましい。プロテアーゼ阻害剤の特定を容易にするために、候補阻害剤と接触させていない形質転換細胞の蛍光画像を比較のためにモニターすることもまた好ましい。多色蛍光フィルターセットを搭載した標準的蛍光顕微鏡（例えばツァイスアキシオプラン（Zeiss Axioplan）蛍光顕微鏡又はニコンE800蛍光顕微鏡）を用い、倍率200倍、400倍又は600倍で蛍光画像をモニターできる。走査共焦点顕微鏡を用いてより高解析の画像を得ることができる。
本発明は広い範囲のキメラ基質タンパク質の構築及び使用に適合することは明白であろう。例えば実施例１を参照されたい。
【００３５】
２．Ｎｉａプロテアーゼの例証的使用
上記に記載したように構築されたキメラ基質タンパク質を用いてプロテアーゼ活性を測定するために、タバコ葉脈萎縮ウイルス（Tobacco Vein Mottling Virus;ＴＶＭＶ）のＮＩａプロテアーゼを本発明の実施例でモデル系として用いた。ＮＩａプロテアーゼはもっとも性状が明らかにされたウイルスプロテアーゼの１つであり、前記はＴＶＭＶによって産生されるポリプロテインで７つの特異的部位を切断することが知られている。最適なプロテアーゼ活性を達成するために、Ｎ末端の６つのアミノ酸残基（Ｐ６−Ｐ１）及びＣ末端の４つのアミノ酸残基（Ｐ１’−Ｐ４’）が要求され、更に４つの保存アミノ酸残基（Ｖ−Ｒ−Ｆ−Ｑ）が基質タンパク質のＰ４−Ｐ１に含まれていなければならない。前記４つの保存アミノ酸残基のいずれかがグリシン（Gly）に変異した場合、前記基質タンパク質のタンパク分解切断は生じない（H.Y. Yoon et al., 2000）。
ＮＩａプロテアーゼのタンパク分解部位（ＰＳ（ＮＩａ））を含むキメラ基質タンパク質発現のためのリコンビナント遺伝子、ＰＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰをポリエチレングリコール仲介形質転換法によってプロトプラストに導入したとき、ＧＦＰ及びＲＦＰが大きな集合物として細胞質ゾルに蓄積した（図４）。この結果は、前記プロテアーゼが機能しない場合に一致する。この場合には、集合物の細胞質ゾルでの蓄積は、ＡｔＯＰＥ７タンパク質の疎水性領域間の疎水性相互作用により生じたと考えられる。キメラ基質タンパク質の赤色蛍光シグナルを葉緑体の自家蛍光と容易に識別することができない場合には（図４（ｂ））、２つの異なる蛍光標識を用い、緑色蛍光がオーバーラップ蛍光画像として赤色蛍光と同時に発生するか否かを観察することによって前記基質の反応を明瞭に識別することができる（図４（ｃ））。ＮＩａプロテアーゼをコードするプラスミド及びＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰをコードするプラスミドが形質転換により一緒に導入されたとき、緑色及び赤色蛍光シグナルは葉緑体の外皮膜（envelope membrane）及び細胞質ゾルにそれぞれ分離した（図５）。この結果は、ＮＩａプロテアーゼはキメラ基質タンパクをそのタンパク分解部位で切断し、２つのタンパク質、ＲＦＰ及びＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰを生成することができたことを示している。前記プロテアーゼの反応は、緑色蛍光シグナルがシグナルタンパク質の作用によって葉緑体外皮膜に移動し（図５（ａ））、赤色蛍光シグナルは細胞質ゾルに分散し（図５（ｂ））、更に両蛍光シグナルのオーバーラップ画像（図５（ｃ））を観察することによって確認することができる。
酵素反応の結果を特定する本発明の有効性は、コントロール実験と比較することによって更に明瞭に観察することができる。図４（ａ）及び図５（ａ）を比較することによって、タンパク分解切断により前記シグナルタンパク質の隠蔽トラフィッキングシグナルが活性化されることが、蛍光の分布における変化とともに観察することができる。図４（ｂ）及び５（ｂ）を比較することにより、シグナル隠蔽タンパク質として用いられた赤色蛍光タンパク質は、トラフィッキングシグナルの隠蔽の他に蛍光シグナルの分布の変化において役割を果たすことが観察される。
従って、シグナルタンパク質及び蛍光タンパク質を含むキメラタンパク質、並びにタンパク分解部位を含むシグナル隠蔽タンパク質を含むキメラ基質タンパク質を基質として用いて、プロテアーゼの活性を測定し、更にその阻害剤をin vivoでスクリーニングすることができることが提唱される。
【００３６】
３．高処理スクリーニングアッセイ：一般的考察
本発明によって提供されるin vivoプロテアーゼ阻害剤スクリーニング方法は高処理アッセイでの使用に容易に適合させることができる。高処理スクリーニング方法は、プロテアーゼ及びそのキメラ基質タンパク質を発現するように形質転換した細胞を候補化合物と接触させ、前記形質転換細胞をインキュベートし、前記形質転換細胞の蛍光画像を入手し、前記蛍光画像をデジタルデータに変換し、更に前記デジタルデータを分析して前記候補化合物が前記プロテアーゼを阻害したか否かを決定することを含む。
本発明の高処理スクリーニングでは、等量の形質転換細胞の溶液を96ウェル又は384ウェルの標準的マイクロタイタープレートのウェル列にロードし、更に種々の候補化合物を各ウェルに加える。続いてマイクロタイタープレートの前記形質転換細胞をインキュベートしてプロテアーゼ及びそのキメラ基質タンパク質を管理環境下で（適切な温度、湿度及び空気成分下で）発現させる。予め選択したインキュベーション時間の後で、蛍光顕微鏡を用いて各ウェルの形質転換細胞の蛍光画像を得る。
前記高処理スクリーニング装置は以下から成る：（１）多数のマイクロタイタープレート中の形質転換細胞サンプル列のためのインキュベーター、（２）自動サンプリング装置、（３）ＸＹ軸平行移動サンプルステージ及び高解析デジタルカメラ搭載自動蛍光顕微鏡。予め選択したインキュベーション時間後、前記自動サンプリング装置で少量の形質転換細胞溶液を各ウェルからサンプリングし、それを観察用プレート（例えばスライドガラス）にロードする。サンプリングは、多数のチップもしくはピペットを用いて並行的に実施するか、又はただ１つのチップもしくはピペットを用いて連続的態様で実施することができる。各サンプリングの後で、チップ又はピペットを適切な洗浄溶液で洗浄する。前記形質転換細胞サンプルを予め定めた位置に並べた観察用プレートにロードする。ＸＹ軸平行移動ステージによって前記観察用プレートを保持し、これをＸＹ方向に移動させて各サンプルを顕微鏡の対物レンズ下に位置させる。Ｚ軸フォーカスドライブは、焦点を合わせるために顕微鏡の単物レンズを移動させるか、又は観察用プレートをＺ軸方向に移動させる。各サンプルについて、デジタルカメラを用いて予め選択した蛍光波長の蛍光画像を得てＰＣに供給し、更にデジタルデータとして保存する。自動制御装置は、サンプリングピペット、ＸＹ軸平行移動ステージ及びＺ軸フォーカスドライブの制御のために提供される。ＰＣはディスプレー及びデータ分析ソフトを提供する。
【００３７】
プロテアーゼ阻害剤として適合しているか否かは細胞内蛍光分布を調べることによって自動的に決定することができる。一般に、観察細胞サイズ内の蛍光シグナルの局在又は分散の程度をデジタル画像データから算出し、決定の基準として用いることができるであろう。いくつかの事例では、蛍光シグナル分布のパターン又は形状を決定基準に用いることができるであろう。
本発明での使用に適した高処理スクリーニングプロトコルの例は、米国特許第5,989,835号及びＰＣＴ出願WO00/79241A2に開示されている。
以下の表２及び３は本発明で使用される配列情報を提供する。
表２：ＰＣＲプライマーの配列番号
2004538006.tif 000004
表３：シグナルタンパク質の配列番号
2004538006.tif 000005
【００３８】
以下は本発明で使用される核酸及びタンパク質の配列情報の実例である。プロテアーゼ及びそれらの切断部位の例は配列番号：45−50、55−74及び77−120で提供される。前記の例には以下が含まれる：ＮＩａプロテアーゼ（配列番号：45及び46）及びその切断部位（配列番号：47−50）、ＨＩＶ−１プロテアーゼ（配列番号：55及び56）及びその切断部位（配列番号：57−74）、ＨＣＶＮＳ３プロテアーゼ（配列番号：77及び78）及びその切断部位（配列番号：79−84）、ＨＳＶ−１プロテアーゼ（配列番号：85及び86）及びその切断部位（配列番号：87−90）、ＨＴＬＶ−１プロテアーゼ（配列番号：91及び92）及びその切断部位（配列番号：93−96）、ＨＣＭＶプロテアーゼ（配列番号：97及び98）及びその切断部位（配列番号：99−102）、ＡＰＰβ−セクレターゼ（配列番号：103及び104）及びその切断部位（配列番号：105−106）、カスパーゼ３（配列番号：107及び108）及びその切断部位（配列番号：113−114）、カスパーゼ３の大サブユニット（配列番号：109及び110）、カスパーゼ３の小サブユニット（配列番号：111及び112）、ヒト血液凝固第II因子（配列番号：115及び116）及びその切断部位（配列番号：117−118）、並びにヒト血液凝固第XI因子（配列番号119及び120）。
２つのＮＩａプロテアーゼ基質タンパク質の核酸及びタンパク質配列は配列番号：51−54で提供され、HIV-1プロテアーゼ基質タンパク質の核酸及びタンパク質配列は配列番号：55−56で提供される。
【００３９】
以下の考察は、本発明のまた別の使用及び利点が開示されている韓国特許出願第10-2001-00481213号に関する。
前記に提供されているように、本発明は、in vivoでプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングするために用いることができる重要なキメラ基質タンパク質を提供する。前記で特に開示されているように、本発明はプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする系に関し、以下を提供する：（ｉ）プロテアーゼの特異的機能によって蛍光の細胞内局在及び分布の変化を誘発するように構築されたキメラ基質タンパク質、（ii）細胞内でキメラ基質タンパク質を発現させるために用いることができるキメラ基質タンパク質をコードする核酸配列を含むリコンビナント遺伝子、（iii）前記プロテアーゼ及びキメラ基質タンパク質が一緒に細胞内に存在し、それによって前記プロテアーゼによるタンパク分解切断が前記細胞内で生じる環境下で細胞内蛍光の局在及び分布を検出することによって前記プロテアーゼの活性を特定する方法、及び（iv）前記キメラ基質タンパク質及び上記の方法を用いてin vivoでプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする方法。
より具体的には、前記韓国特許出願第10-2001-00481213号では、細胞内で発現されたときに前記シグナルタンパク質が細胞内小器官への通行（トラフィッキング）を誘導する前記のようなキメラ基質タンパク質を１個の細胞内で使用できることが開示されている。更に詳しくは、特定の細胞内小器官に向かう前記トラフィッキングシグナル（前記シグナルタンパク質に包含されている）は、シグナル隠蔽タンパク質を前記シグナルタンパク質のＮ−末端又はＣ−末端に連結することによって不活化することができる。本発明では、シグナルタンパク質は、あるプロテアーゼのタンパク分解切断部位を含むシグナル隠蔽タンパク質と連結され、それによって前記シグナルタンパク質のトラフィッキングが、前記タンパク分解部位での切断に応じて活性化されたり不活化されたりすることができる。換言すれば、前記キメラ基質タンパク質のトラフィッキング（この場合前記シグナルタンパク質及びシグナル隠蔽タンパク質はタンパク分解部位で連結されている）は、前記シグナル隠蔽タンパク質が前記プロテアーゼによって切断されるまで生じない。そのような切断によって前記シグナルタンパク質の正常なトラフィッキングが誘発される。本発明では、シグナルタンパク質及び／又はシグナル隠蔽タンパク質は蛍光タンパク質で標識され、それによってプロテアーゼの活性は、蛍光シグナルの局在及び分布の特徴における変化を測定することによって決定することができる。従って、本発明でプロテアーゼの基質として用いられるキメラタンパク質は以下の特徴を有する：
（１）本キメラタンパク質は、特定の細胞内小器官への輸送を誘導するトラフィッキングシグナルを有する少なくとも１つのシグナルタンパク質を含む。
（２）本キメラ基質タンパク質は、特定のプロテアーゼに対する少なくとも１つのタンパク分解切断部位を含む。
（３）（１）で規定されたシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルは、前記タンパク分解切断部位をシグナルタンパク質に連結するか、又はシグナル隠蔽タンパク質をタンパク分解切断部位を介してシグナルタンパク質に連結することによって不活化される。
（４）シグナルタンパク質の不活性なトラフィッキングシグナルは、前記タンパク分解部位での切断が前記プロテアーゼによって惹起されたときに活性化される。
（５）前記キメラ基質タンパク質は少なくとも１つの蛍光タンパク質で標識され、前記細胞から発する蛍光シグナルは前記プロテアーゼによるタンパク分解切断に応じて変化する。
【００４０】
韓国特許出願第10-2001-00481213号で考察されたように、本発明は更に、本明細書に記載した前記キメラ基質タンパク質を用いてin vivoでプロテアーゼ活性を測定する方法を提供する。更にまた提供されるものは、前記プロテアーゼ活性を測定する方法を用いたプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする方法である。
韓国特許出願第10-2001-00481213号で更に開示されているように、in vivoでプロテアーゼ活性を測定するために、プロテアーゼ及び前記プロテアーゼに特異的なキメラ基質タンパク質は細胞内で同時に存在する必要がある。
更にまた、本発明の特徴の１つであるキメラ基質タンパク質のためのリコンビナント遺伝子が細胞内に導入され、細胞内で前記キメラタンパク質が発現される。プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングする標的プロテアーゼは前記細胞内に存在する内因性プロテアーゼであっても、リコンビナント遺伝子による形質転換又はウイルスによる感染で発現される外因性プロテアーゼでもよい。しかしながら、内因性プロテアーゼが標的である場合は、例えば前記プロテアーゼの発現の調節及び低レベルのプロテアーゼ発現の検出の難しさのために、スクリーニングの正確さ及び効率は低下するであろう。従って本発明は、in vivoでプロテアーゼ活性をより効率的に決定する系を提供する。前記の系では、細胞をリコンビナント遺伝子で形質転換するか、又はウイルスで細胞を感染させることによって特定のプロテアーゼを過剰に発現させるか、又は調節された態様で発現させることができる。ウイルスプロテアーゼの場合にはウイルス感染を用いることができる。しかしながら、ウイルスプロテアーゼ発現の調節は完全には理解されていないので、プロテアーゼをコードするリコンビナント遺伝子で細胞を形質転換させることによって発現されたプロテアーゼを用いることがより好ましい。前記発現されたプロテアーゼは細胞質ゾルに局在するので、キメラ基質タンパク質も同様に細胞質ザルに局在させることが必要である。従って、in vivoで効率的にプロテアーゼ活性を測定する系は、本発明の第一の特徴のキメラ基質タンパク質を用いることによって構築することができる（この場合、キメラタンパク質に包含されるシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルは隠蔽されている）。
【００４１】
更にまた、プロテアーゼ阻害剤は蛍光シグナルの局在及び分布の変化を検出することによって選別することができる。前記変化は、プロテアーゼ及びキメラ基質タンパク質が細胞内で発現される前、後又は発現と同時に候補化合物で細胞を処理することによって惹起される。
多くの酵素反応において、反応物質を完全に生成物に変換することはできない。前記反応物質が阻害剤によって阻害される場合、前記反応物質はまた完全に阻害されるのではなく部分的に阻害されるであろう。更にまた、多数の細胞を観察するとき、各細胞におけるプロテアーゼ活性レベルは大きく変動するであろう。従って、プロテアーゼ活性の決定に用いられる方法の感度又はコントラストが低い場合、前記プロテアーゼ阻害剤の阻害活性の決定には相当なあいまいさが存在するであろう。そのようなあいまいさを回避するために、キメラ基質タンパク質の構築において、蛍光シグナルの細胞内局在及び分布における明瞭に識別可能な変化をタンパク分解切断に応じて誘発することができるシグナルタンパク質を選択することは重要である。更に、阻害活性決定効率は、異なる蛍光波長を有する２つ又は３つ以上の蛍光タンパク質を用いて強化することができる。本発明の実施例２では、ＧＦＰ及びＲＦＰをキメラ基質タンパク質の構築に用い、それによって前記をタンパク分解切断に際して異なる細胞内小器官に局在させることができる。
【００４２】
上記で考察したように、本発明のある種のシグナルタンパク質は場合によって隠蔽される。この実施態様では、本発明によって提供されるキメラ基質タンパク質に含まれる前記シグナルタンパク質は、前記タンパク分解部位又は前記シグナルタンパク質に連結されたシグナル隠蔽タンパク質によるシグナル隠蔽のために不活化され、従って前記キメラ基質タンパク質は細胞質ゾルに存在する。前記シグナルタンパク質はタンパク分解切断によって活性化され、細胞内小器官へのその通行を誘導することができる。そのトラフィッキングシグナルがキメラ基質タンパク質で不活化されてあるシグナルタンパク質の選択では、シグナルタンパク質の種々の特徴が考慮されなければならない。エンドソームトラフィッキングタンパク質は、合成されると直ちにゴルジ小体、溶解小胞、貯蔵小胞又は小胞体の中に包まれた細胞質膜に移される。エンドソームトラフィッキングタンパク質のトラフィッキングシグナルは翻訳過程の最中に認識される。従って、シグナル隠蔽タンパク質があろうとなかろうと、単純にタンパク分解部位を連結及び除去することによってエンドソームトラフィッキングタンパク質のトラフィッキングシグナルを不活化及び活性化することは可能ではないかもしれない。従って、これらエンドソームトラフィッキングタンパク質は、そのトラフィッキングシグナルが不活化されてあるシグナルタンパク質として本発明で使用するにはあまり適切ではない。細胞質ゾルで発現され、細胞内小器官に直接輸送されるタンパク質は、それらのトラフィッキングシグナルが本発明に従って隠蔽することができるのでシグナルタンパク質として用いることができる。後者のシグナルタンパク質の中では、核占有シグナル（nuclear location signal, NLS）を有するシグナルタンパク質はＮ−末端又はＣ−末端に従属していないので、従って、シグナル隠蔽タンパク質の存在にかかわらずタンパク分解部位を連結及び除去することによってこれらシグナルタンパク質の通行を制御することは困難である。従って、ミトコンドリア、葉緑体又はペルオキシソームに誘導するトラフィッキングシグナルを有するシグナルタンパク質を選択するのが望ましい。植物細胞の場合、葉緑体は比較的大きく、従ってその形状及び分布をより容易に検出できるので葉緑体誘導シグナルタンパク質を用いるのがより好ましい。
【００４３】
本発明のキメラ基質タンパク質に含まれるシグナル隠蔽タンパク質は、シグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルをタンパク分解部位を介してシグナルタンパク質に連結することによって前記シグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルを不活化する。前記シグナル隠蔽タンパク質は、タンパク分解部位を介してシグナルタンパク質に連結されたアミノ酸、ペプチド又はタンパク質であろう。いくつかの事例では、前記シグナルタンパク質にタンパク分解部位だけを連結することによってシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルを不活化することができるであろう。前記シグナル隠蔽タンパク質とタンパク分解部位は基質とプロテアーゼの結合を妨害してはならない。前記単純なシグナル隠蔽の他に、シグナル隠蔽タンパク質はまた、キメラ基質タンパク質の全体的な特徴を変化させるために、又は更に別のトラフィッキングシグナルもしくは蛍光標識を結合させるために用いてもよい。例えば、別のシグナルタンパク質がシグナル隠蔽タンパク質として選択される場合は、このシグナルタンパク質は、プロテアーゼによって切断されたときその標的小器官へ移動するであろう。そのような事例では、このシグナルタンパク質がまた蛍光標識で標識されている場合は、２つの異なる蛍光シグナルを検出することによって基質タンパク質の切断をより明瞭に特定することが可能であろう。別の例では、蛍光タンパク質をシグナル隠蔽タンパク質として用いることができる。この場合には、タンパク分解切断によって生成された蛍光タンパク質は細胞質ゾルに留まるであろう。従って、細胞質ゾル由来の蛍光シグナルとタンパク分解切断によって生成されたシグナルタンパク質が移動した細胞内小器官由来の蛍光シグナルが別個に観察されることによって、プロテアーゼ活性の測定又はプロテアーゼ阻害剤の阻害活性の検出効率を高めることが可能である。
【００４４】
標準的な遺伝子組換え方法の１つ又はそれらを組み合わせて用いて、本明細書に開示したキメラ基質タンパク質を作製することができる。すなわち、キメラ基質タンパク質を構築する本方法はその拡張性を特徴とする。例えば、少なくとも２つのタンパク分解部位をプロテアーゼのキメラ基質タンパク質に包含させる場合は、２つ又は３つ以上のシグナルタンパク質のトラフィッキングを観察することができる。２つ又は３つ以上の異なるプロテアーゼのためのタンパク分解部位が導入される場合は、２つ又は３つ以上のプロテアーゼの活性を同時に調べることができる。
シグナルタンパク質及びシグナル隠蔽タンパク質を選択する詳細な方法、並びにキメラ基質タンパク質を構築する詳細な方法は以下のとおりである。−//−で表した記号はプロテアーゼのタンパク分解部位を示し、Ｍはシグナル隠蔽タンパク質を示している。
（１）シグナルタンパク質のＮ−末端にトラフィッキングシグナルが存在する場合（ｎＳ）には、シグナル隠蔽タンパク質はシグナルタンパク質のＮ−末端側に配置される：（Ｍ−//−ｎＳ）。
（２）トラフィッキングシグナルがシグナルタンパク質のＣ−末端に存在する場合（Ｓｃ）には、シグナル隠蔽タンパク質は前記シグナルタンパク質のＣ−末端に配置される：
（Ｓｃ−//−Ｍ）。
（３）別のシグナルタンパク質Ｓ’がシグナル隠蔽タンパク質として用いられる場合には、Ｓ’はＳのそれと比較してトラフィッキングシグナルを反対側に持つように選択される。２つのシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルは、前記２つのシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナル部分が連結されるように前記キメラ基質タンパクを構築することによって同時に隠蔽することができる：（Ｓｃ−//−ｎＳ’又はＳ’ｃ−//−ｎＳ）。
（４）（３）のような構築で、２つのタンパク分解部位が導入される場合は、前記シグナル隠蔽タンパク質は２つのシグナルタンパク質の間に配置されねばならない：（Ｓｃ−//−Ｍ−//−ｎＳ’又はＳ’ｃ−//−Ｍ−//−ｎＳ）。
（５）シグナルタンパク質（Ｓ）及びシグナル隠蔽タンパク質として作用する他のシグナルタンパク質（Ｓ’）のトラフィッキングシグナルが同じ側に存在する場合、Ｓ’のトラフィッキングシグナルを隠蔽する別のシグナル隠蔽タンパク質が連結されねばならない：（Ｍ−//−ｎＳ’−//−ｎＳ又はＳｃ−//−Ｓｃ’−//−Ｍ）。
上記に記載した（１）から（５）の構築物を拡大することによって、キメラ基質タンパク質は３つ又は４つ以上のタンパク分解部位を含むように構築することができる：（Ｓｃm−//−．．．．．．−//−Ｓｃ2−//−Ｓｃ1−//−Ｍ−//−ｎＳ1−//−ｎＳ2−//−．．．．．．−//−ｎＳn）。
上記に記載した構築方法は可能な構築方法の代表的な例である。
【００４５】
上記に記載した事例の他に、キメラ基質タンパク質に含まれる全てのシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが隠蔽される場合は、そのタンパク分解切断が細胞質ゾルで出現するキメラ基質タンパク質を提供できる。キメラ基質タンパク質に含まれるただ１つのシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが活性を維持し、更に残りのシグナルタンパク質の全てのトラフィッキングシグナルが隠蔽されている場合は、前記キメラ基質タンパク質は、前記活性なシグナルタンパク質の標的である細胞内小器官に移動するであろう。ここでは、前記移動したキメラ基質タンパク質が細胞内小器官の膜上に存在する場合は、少なくとも１つのタンパク分解部位及び少なくとも１つの不活性なシグナルタンパク質が細胞質ゾルに露出され、それによってシグナルタンパク質の全てのトラフィッキングシグナルが隠蔽されているキメラ基質タンパク質を用いた場合と同じ効果を達成できるように前記キメラ基質タンパク質を構築することができる。活性を維持するただ１つのシグナルタンパク質を有するこのキメラタンパク質が基質として用いられる場合は、前記タンパク分解反応は、前記タンパク分解部位が細胞質ゾルに露出しているので細胞質ゾルに存在するプロテアーゼによって生じることができるが、ただし前記キメラ基質タンパク質は細胞質ゾルで自由に拡散することはない。この場合には、細胞質ゾルに露出された前記不活性なシグナルタンパク質はタンパク分解切断によって活性化する。従って、この活性化されたシグナルタンパク質を含むフラグメントタンパク質は、前記キメラ基質タンパク質が存在する細胞内小器官とは異なる固有の細胞内小器官に移動し、前記活性化されたシグナルタンパク質に結合させた蛍光シグナルの局在及び分布に変化をもたらす。
【００４６】
活性を維持するただ１つのシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルを有するキメラ基質タンパク質を構築するまた別の可能な方法は、トラフィッキングシグナルをもたない蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ又はＲＦＰ）を、シグナルタンパク質を連結する代わりに細胞質ゾルに露出されたタンパク分解部位に連結することである。この場合には、タンパク分解切断によって生成された蛍光タンパク質は細胞質ゾルに分散され、蛍光シグナルの分布は固有の細胞内小器官から細胞質ゾルへと変化する。しかしながらこの場合には、蛍光シグナルが膜に局在するか細胞質ゾルに局在するかの識別は、酵素反応の不完全さのためにあまり明瞭ではない。更にまた、ただ１つのシグナルタンパク質が活性を維持するキメラ基質タンパク質の構築は、詳細な情報が、前記シグナルタンパク質が移動する細胞内小器官についてだけでなく、移動するシグナルタンパク質の向き及び位置についても要求されるために相当困難であろう。
ミトコンドリア、葉緑体及び核の外膜、ペルオキシソーム膜、並びに細胞質膜へ誘導するシグナルタンパク質は、キメラ基質タンパク質で活性を維持するシグナルタンパク質として用いることができる。リン脂質と特異的に結合することができるシグナルタンパク質もまた用いることができる。前記の例には、プレックストリン（Pleckstrin）相同ドメイン（ＰＨ）（図２（ｈ）に示されるようにホスファチジルイノシトール４，５−ジホスフェート（PI(4,5)P2）と結合する）、及びＦＡＰＰ（ファミリーＡ（ホスホイノシチド結合特異的）メンバー３）のプレックストリン相同ドメイン（ホスホチジルイノシトール４−ホスフェート（PI(4)P）と結合する）が含まれる。
【００４７】
実施例２では、プロテアーゼ及び本発明に従って構築したキメラ基質タンパク質を発現させるために形質転換した細胞でウェスタンブロット分析を実施し、前記プロテアーゼ反応が正確に生じることが確認された。細胞を溶解し、粗抽出物を電気泳動し、更に抗体を用いて確認されるウェスタンブロット分析と比較した場合、本発明によって提供される系（前記の確認は細胞自体を単に観察することによって実施することができる）は時間と経費に関してより効率的である。
本発明の実施例１では、タンパク質の通行（トラフィッキング）及び分布を細胞内の観察によって決定できる系が構築された。キメラタンパク質は、細胞内小器官に向かうトラフィッキングシグナルを有するシグナルタンパク質を選択し、蛍光タンパク質で標識することによって移動後に前記タンパク質の局在を可視化することができるように構築された。キメラタンパク質の局在は、前記キメラタンパク質のリコンビナント遺伝子を含むリコンビナントプラスミドで形質転換した細胞の蛍光画像を観察することによって確認することができる。
これらのキメラタンパク質の中で、ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰを選択し、あるプロテアーゼのタンパク分解部位を連結してキメラ基質タンパク質を構築した。前記タンパク質を用いてin vivoでプロテアーゼ阻害剤のスクリーニングに使用することができる。ＡｔＯＥＰ７は、シロイヌナズナ葉緑体の外皮膜へ誘導するタンパク質であり、前記を植物細胞で葉緑体誘導タンパク質として選択するのが好ましいことは既に述べた。ＡｔＯＥＰ７はＮ−末端にそのトラフィッキングシグナルを有するので、シグナル隠蔽タンパク質はＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのＮ−末端に連結した。シグナル隠蔽タンパク質として、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を選択した。従って、基質キメラタンパク質は、タンパク分解切断の後で、緑色蛍光が葉緑体の外皮膜に局在し、赤色蛍光が細胞質ゾルに分布するように構築された。
【００４８】
一般的に、本発明の融合分子の製造には、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの作製、ＤＮＡの制限酵素による切断、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡの連結、ｍＲＮＡの単離、ＤＮＡの適切な細胞内への導入及び前記細胞の培養を必要とする通常の遺伝子組換え工程が含まれる。更にまた、本明細書に記載したキメラタンパク質は、標準的な電気泳動、遠心分離及びクロマトグラフィーによる操作を含む方法を含む周知の技術に従って単離及び精製することができる。これらの方法に関しては一般的には例えば上掲書（Sambrook et al.; Ausubel et al.）を参照されたい。
本明細書に開示したＤＮＡ及びタンパク質配列は、前記の特に記載したものを含む公開情報源から入手できる。好ましい供給源は、国立医学図書館のNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）−Genetic Sequence Data Bank（GenBank）（38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, MD20894）である。GneBankはまたインターネットでも利用できる。GenBankについては一般的には以下を参照されたい：D.A. Benson et al., Nucl. Acids Res. 25:1(1997)。
実施例で用いられた他の試薬、例えば抗体、細胞及びウイルスは公知の販売元又は公的供給源（例えば、Linscott's Directory（40 Glen Drive, Mill Valley, California 94941）及びアメリカ菌培養収集所（ATCC; 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852））から入手できる。
本明細書に記載した全ての文書は参照により本明細書に含まれる。
本発明は以下の実施例によって更に実証されるであろう。これら実施例は本発明の理解を容易にするために提供され、本発明を制限するものと解してはならない。
【００４９】
実施例１：キメラタンパク質の検出及び細胞内小器官への誘導
（ａ）キメラタンパク質発現用リコンビナントプラスミドの構築
シロイヌナズナ（Arabidopsis）の外皮膜（outer envelope membrane）タンパク質、ＡｔＯＥＰ７（前記はエンドウマメのＯＥＰ１４の相同体である）のコード領域を、その天然の末端コドンを除くようにデザインした下記の２つの固有プライマーを用いてシロイヌナズナ（Arabidopsis）のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた：
５’−ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＴＧ及び
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＴＧＧＡＴＧＴ。
続いて、前記を緑色又は赤色蛍光タンパク質のコード領域の５’末端にインフレームで連結して、それぞれＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ及びＡｔＯＥＰ７：ＲＦＰのためのプラスミドを構築した。前記連結遺伝子をリコンビナントプラスミド内で35Ｓプロモーターの調節下に置いた。同じ方法を用いて以下に記載した他のリコンビナントプラスミドを構築した。
ルビスコ（ルビロースビスホスフェートカルボキシラーゼ；Rubisco）複合タンパク質のキメラタンパク質を発現させる場合は、ルビスコ複合体の小サブユニットのトランシットペプチドのコード領域を以下の２つの固有プライマーを用いてλZAPIIｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅させた：
５’−ＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＧ及び
５’−ＡＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＴＣＧＧＴＡＡＧＧＴＣＡＧ。
得られたＰＣＲ生成物をpBluescriptでサブクローニングし、続いてＧＦＰ又はＲＦＰのコード領域の５’末端にインフレームで連結し、それぞれＲｂｃＳ：ＧＦＰ又はＲｂｃＳ：ＲＦＰのためのリコンビナントプラスミドを構築した。
【００５０】
葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質を発現させる場合は、対応する遺伝子を以下の２つの固有プライマーを用いてλZAPIIｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅させてＣａｂ：ＧＦＰのためのリコンビナントプラスミドを構築した：
５’−ＴＡＧＡＧＡＧＡＡＡＣＧＡＴＧＧＣＧ及び
５’−ＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＣ。
ルビスコアクチヴァーゼ（ＲＡ）のトランシットペプチドのコード領域を以下の２つの固有プライマーを用いてλZAPIIｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅させ、更にＧＦＰのコード領域の５’末端に連結してＲＡ：ＧＦＰのためのリコンビナントプラスミドを構築した：
５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＴＴＴＣＣ及び
５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＴＴＧ。
Ｆ１−ＡＴＰアーゼ（アクセッション番号：D88374）のトランシットペプチドのコード領域を以下の２つの固有プライマーを用いてλZAPIIｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅させ、更にＧＦＰのコード領域の５’末端に連結してＦ１−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰのためのリコンビナントプラスミドを構築した：
５’−ＣＴＴＴＡＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＴＧ及び
５’−ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＣＴＡＡＧＣＴＴ。
ペルオキシソーム誘導タンパク質のリコンビナントプラスミド、ＧＦＰ：ＳＫＬは以下の２つの固有プライマーを用い鋳型として326ＧＦＰ（S.J. Davis and R.D. Viestra, 1998）を使用してＰＣＲ増幅で構築した：
５’−ＣＣＧＴＡＴＧＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣ及び
５’−ＴＴＡＴＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴ。
完全長のＨ＋−ＡＴＰアーゼ（シロイヌナズナのＡＨＡ２）は上記の方法により２つの固有プライマーを用いて増幅させ、更にＧＦＰのコード領域の５’末端に連結してＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰのためのリコンビナントプラスミドを構築した：
５’−ＧＡＧＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＴＣＧＡＡ及び
５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＡＣＴＧＧ。
ＰＨドメイン（プレックストリン相同ドメイン）のキメラタンパク質のリコンビナントプラスミド、ＧＦＰ：ＰＨは文献（B. Kost et al. 1998）に記載された方法に従って構築した。
上記方法に従って構築されたリコンビナントプラスミドから発現されるキメラタンパク質の模式的構造は図1に示されている。
【００５１】
（ｂ）プロトプラストの調製
温室内の土壌で生育させた３−４週齢のシロイヌナズナの葉の組織を小さな立方体（５−10mm2）に新しいカミソリの刃で切り出し、50ｍLの酵素溶液（0.25％マセロザイムR-10、1.0％セルラーゼR-10、400ｍMのマンニトール、８mMのCaCl2、５mMのMes-KOH、pH5.6）中で22℃で穏やかに攪拌しながら（50から75rpm）インキュベートした。インキュベーションの後で、プロトプラスト懸濁液を100μmのメッシュでろ過し、プロトプラストを46ｘｇで５分遠心して採集した。沈澱させたプロトプラストを５から10mLのW５溶液（154mMのNaCl、125ｍMのCaCl2、5mMのKCｌ、5mMのグルコース、1.5ｍMのMes-KOH、ｐH5.6）に再度懸濁させ、20ｍLの21％ショ糖の上に重層して78ｘｇで10分遠心分離した。境界面の完全なプロトプラストを20ｍLのW５溶液に移した。前記プロトプラストを55ｘｇで５分再び沈澱させ、更に20ｍLのW５溶液に再度懸濁し、続いて氷上で30分インキュベートした。
（ｃ）リコンビナントプラスミドの単離及びプロトプラストの形質転換
リコンビナントプラスミドをキアゲン（Qiagen）カラム（Valencia, CA）を用い製造元のプロトコルに従って精製した。前記ＤＮＡでプロトプラストを形質転換するために、前記プロトプラストを46ｘｇで再び５分遠心し、ＭａＭｇ溶液（400mMのマンニトール、15mMのMgCl2、５ｍMのMes-KOH、pH5.6）に５ｘ106プロトプラスト／ｍLの濃度で再懸濁した。前記リコンビナントプラスミド構築物をシロイヌナズナプロトプラストにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）仲介形質転換法によって導入した（Jin et al. 2001）。約20から50μgのプラスミドＤＮＡ（濃度２μg/μL）を300μLのプロトプラスト懸濁液と混合し、更に325μLのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液（400mMマンニトール、100ｍMのCa(NO3)2、40％のPEG400）を加えて穏やかに混合した。前記混合物を30分室温でインキュベートした。インキュベーション後、混合物を10ｍLのW５溶液で希釈した。50ｘｇで５分遠心してプロトプラストを回収し、３mLのW５溶液に再度懸濁し、暗所で22℃でインキュベートした。
【００５２】
ｄ）キメラタンパク質の発現及びそれらの細胞内局在の観察
実施例１（ａ）で構築したリコンビナントプラスミドＤＮＡを用い、実施例１（ｃ）で述べた方法に従ってプロトプラストを形質転換した。形質転換の後、キメラタンパク質の発現は、充電装置付き冷却カメラを搭載した（cooled charge-coupled device camera）蛍光顕微鏡（アキシオプラン蛍光顕微鏡、Zeiss, Germany）を用いて画像を時間の関数として捕捉することによってモニターした。使用したフィルターセットは、ＧＦＰ、ＲＦＰ及び葉緑素の自家蛍光についてそれぞれ、ＸＦ116（エキサイター：474AF20、ジクロイック：500DRLP、エミッター：510AF23）、ＸＦ33/Ｅ（エキサイター：535DF35、ジクロイック：570DRLP、エミッター：605DF50）、及びＸＦ137（エキサイター：540AF30、ジクロイック：570DRLP、エミッター：585ALP）（Omega, Inc., Brattleboro, VT）であった。続いてデータをアドーブフォトショップソフト（Mountain View, CA）を用いて加工し、擬似カラーフォーマットで提示した。
ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのキメラタンパク質の緑色蛍光は葉緑体の外皮膜で観察された（図２（ａ））。この結果は、葉緑体外皮誘導シグナルペプチド及び蛍光タンパク質標識を含むキメラタンパク質は正確に葉緑体の外皮膜に誘導されることを示している。
キメラタンパク質、Ｒｂ：ＧＦＰ、Ｃａｂ：ＧＦＰ及びＲＡ：ＧＦＰの緑色蛍光の局在は図2の（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）に示されている。図に示されているように、ＲｂｃＳ：ＧＦＰは葉緑体の間質に局在し、更にＣａｂ：ＧＦＰ及びＲＡ：ＧＦＰもまた葉緑体内で蛍光を放出した。これらの結果は、ＲｂｃＳ、Ｃａｂ又はＲＡのシグナルペプチド及び蛍光タンパク質標識を含むキメラタンパク質は葉緑体に誘導されることを示した。
【００５３】
キメラタンパク質、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ、ＧＦＰ：ＳＫＬ、及びＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰの緑色蛍光シグナルは、ミトコンドリア、ペルオキシソーム及び細胞質膜でそれぞれ観察された（図２（ｅ）から（ｇ））。これらの結果で見られる赤色蛍光は葉緑体の自家蛍光であった。
ＧＦＰ：ＰＨ（リン脂質と特異的に結合するＰＨドメイン（プレックストリン相同ドメイン）を含む）の緑色蛍光は、ホスファチジル４，５−ジフォスフェート（PI(4,5)P2）が存在する細胞質膜上に分布していた（図２（ｈ））。図７（ａ）から（ｊ）は以下のようにより詳細に解説される。この図は、図１に示した融合タンパク質の発現に用いられたリコンビナントプラスミドのマップを示している。これらのリコンビナントプラスミドを構築する方法は本実施例に記載されている。これらの融合タンパク質に含まれるシグナルタンパク質の核酸配列及びタンパク質配列は配列番号：29−42に示されている。更にまた、ＦＡＰＰ（ファミリーＡ（ホスホイノシチド結合特異的）メンバー３）の部分的プレックストリン相同ドメインの核酸配列及びタンパク質配列は配列番号：43及び44に示されている。
これらのシグナルタンパク質は、本発明の不活性なシグナルタンパク質又は活性なシグナルタンパク質として用いることができるシグナルタンパク質の例である。ＡｔＯＥＰ７、ＲｂｃＳ、Ｃａｂ、ＲＡ、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ及びＳＫＬ（ペルオキシソーム誘導配列）は、キメラ基質タンパク質内で隠蔽によって不活化されてあるシグナルタンパク質の例である。ＡｔＯＥＰ７、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ、ＰＨ及びＦＡＰＰは、キメラ基質タンパク質内で活性を維持するシグナルタンパク質の例である。
【００５４】
実施例２：キメラ基質タンパク質のプロテアーゼによる切断の検出
（ａ）リコンビナントプラスミドの構築
ｐＵＣベクターにＮＩａプロテアーゼのコード領域を35Ｓプロモーターの制御下に配置することによって、ＮＩａプロテアーゼのリコンビナントプラスミドを構築した。
326ＧＦＰベクター（シロイヌナズナ＝バイオロジカルリソース＝センター、Ohio, University, USA）内の緑色蛍光タンパク質のコード領域の５’末端に、終了コドンを含まないＡｔＯＥＰ７のコード領域を連結することによって、シロイヌナズナの外皮膜タンパク質：緑色蛍光タンパク質のためのリコンビナントプラスミド（ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ）を構築した。以下の２つのプライマーを用いて前記プラスミドをＰＣＲ増幅することによって、プロテアーゼの切断部位、ＶＲＦＱをＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのＮ−末端に連結した：
５’−ＣＣＣＧＧＧＧＴＧＴＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ（５’プライマー）及び５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣ（３’プライマー）。続いて前記ＰＣＲ生成物（SmaI及びXhoIフラグメント）を326RFP-ntベクターのHindIII（一本鎖部分充填（filled-in））及びXhoI部位に連結し、キメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＶＲＦＱ：ＡとＥＰ７：ＧＦＰのためのリコンビナントプラスミドを構築した（図３（ａ））。
【００５５】
（ｂ）リコンビナントプラスミドによる形質転換
形質転換は実施例１の（ｂ）及び（ｃ）のように実施した。
（ｃ）蛍光顕微鏡による蛍光タンパク質の検出
蛍光タンパク質の検出を実施例１（ｄ）のように実施した。キメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＶＲＦＱ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰの発現のための最終的なリコンビナントプラスミドをプロトプラストに導入し、形質転換後24から36時間の間細胞内通行を調べた。図４に示すように、前記キメラ基質タンパク質はプロトプラスト内に大きな斑点又は集合物として局在したが、葉緑体には誘導されなかった。赤色及び緑色蛍光シグナルの両方が同じ斑点内で観察された。
次ぎの実験では、ＮＩａプロテアーゼがキメラ基質タンパク質の切断部位を切断することができるか否かを調べた。前記プロトプラストをＮＩａプロテアーゼのリコンビナントプラスミドで同時に形質転換したとき、前記緑色蛍光シグナルは葉緑体の外皮膜で観察されたが、一方、赤色蛍光シグナルは、図５に示されているように不均一に細胞質ゾルに拡散されているのが観察された。更にまた、赤色及び緑色蛍光シグナルはもはや互いにオーバーラップせず、ＮＩａプロテアーゼはin vivoで前記キメラ基質タンパク質を切断することを強く示唆した。
【００５６】
（ｄ）ウェスタンブロット分析
形質転換プロトプラストを採集し、50μLの細胞溶解緩衝液（50mMトリス−HCl（pH7.5）、1mMのDTT、1mMのEDTA、50ｍMのNaCl）に溶解した。キメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＶＲＦＱ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰの発現及びＮＩａプロテアーゼによるキメラ基質タンパク質のＲＦＰとＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰへの切断を、モノクローナル抗体抗ＧＦＰ抗体（Clontech, Inc.）及びＥＣＬキット（Amersham）を用いてウェスタンブロット分析によって確認した。
図６に示すように、ＮＩａプロテアーゼで同時に形質転換しなかったときは、キメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＶＲＦＱ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰは70kDaの予想サイズでは検出されなかった。対照的に、ＮＩａプロテアーゼで同時形質転換したときは、抗ＧＦＰ抗体によって35kDa（ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰの予想されるサイズ）のタンパク質が検出された。この結果は、キメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＶＲＦＱ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰは２つのタンパク質（ＲＦＰ及びＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ）に切断されたことを示している。従ってこの結果は、ＮＩａプロテアーゼはin vivoでキメラ基質タンパク質を切断することができ、更に前記切断反応は、葉緑体外皮膜における緑色蛍光シグナルの局在及び赤色蛍光シグナルの細胞質ゾルにおける拡散分布を検出することによって容易に調べることができることを明瞭に示している。
図８（ａ）−（ｂ）はより詳細に以下のように解説される。図は、本実施例でＮＩａプロテアーゼ及びそのキメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＶＲＦＱ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰをそれぞれ発現させるために用いたリコンビナントプラスミドのプラスミドマップを示す。ＮＩａプロテアーゼ及びその切断部位の核酸配列及びタンパク質配列は配列番号：45−50に示されている。本キメラ基質タンパク質の完全な核酸配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号：51及び52に示されている。
【００５７】
実施例３：ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤のためのin vivoスクリーニング系
ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）プロテアーゼの阻害剤検出のために便利なin vivoスクリーニング系を以下のように実施した。
（ａ）ＨＩＶ−１プロテアーゼ発現のためのリコンビナントプラスミドの構築
ＨＩＶ−１プロテアーゼのリコンビナントプラスミドを構築するために、ＨＩＶ−１プロテアーゼのコード領域を以下の２つのプライマーを用い、鋳型としてpHX-2BΔRTを用いＰＣＲで増幅した：
５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＣＴＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＴＴＧＧ−３’及び
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣ−３’。
pHX-2BΔRTは、ＨＸ２Ｂ（GenBankアクセッション番号K03455）を含み、逆転写酵素のコード領域をもたないプラスミドクローンである。前記増幅生成物をpBluescript-Tベクターでサブクローニングし、続いて35Ｓプロモーターの制御下でｐＵＣベクターのXbaI及びXhoI部位でクローニングした。
ＨＩＶ−１プロテアーゼのプラスミドマップは図９（ａ）に示されている。更にその核酸配列及びタンパク質配列は、それぞれ配列番号：55及び56に提示されている。
【００５８】
（ｂ）ＨＩＶ−１プロテアーゼ用キメラ基質タンパク質の発現のためのリコンビナントプラスミドの構築
９つのキメラ基質タンパク質の全てのためのリコンビナントプラスミドを構築した。
使用したプライマーは以下のとおりであった。順方向プライマーは以下のとおりである：
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’、
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＧＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’、
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＡＣＣＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’、
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’、
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’、
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’、
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＡＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’、
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’、及び
５’−ＣＣＣＧＧＧＴＡＧＧＡＡＡＧＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’。
使用した共通の逆方向プライマーは、５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’であった。これらのプライマーはＨＩＶ−１のタンパク分解部位を含むようにデザインした。順方向プライマーの下線領域はタンパク分解部位配列と一致する（配列番号：57、59、61、63、65、67、69、71及び73）。ＰＣＲ増幅は、上記に記載した順方向プライマーの１つ及び共通の逆方向プライマーを用い、鋳型としてＮＩａプロテアーゼ基質タンパク質のためのプラスミド（配列番号：51）を使用して実施した。ＰＣＲ生成物は、SmaI及びXhoIで制限消化を実施し、HindIII（一本鎖部分充填(filled-in)）及びXhoIで消化した326RFT-ntベクターでサブクローニングした。従って、得られた９つのプラスミドの各々は、ＨＩＶ−１プロテアーゼのタンパク分解部位配列の１つであるＰＳ（ＨＩＶ−１）を有する組成物ＲＦＰ：ＰＳ（ＨＩＶ−１）：ＡｔＯＰＥ７：ＧＦＰのキメラ基質タンパク質の１つをコードするＤＮＡ配列を含む。これらキメラ基質タンパク質の１つの核酸配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号：75及び76に提示されている。
【００５９】
（ｃ）ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤のin vivoスクリーニング
シロイヌナズナの葉の組織のプロトプラストの調製及び形質転換は実施例１（ｂ）及び（ｃ）に記載した方法に従って実施した。形質転換されたプロトプラストの蛍光画像の検出は実施例１（ｄ）に記載したように実施した（ただし同じタイプのフィルターセットを使用しニコンE800蛍光顕微鏡を用いた）。
in vivoでＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害を検出する実際の作業例として、プロトプラストをＨＩＶ−１プロテアーゼ基質タンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＨＩＶ−１）：ＡｔＯＰＥ７：ＧＦＰのためのリコンビナントプラスミドで形質転換した。前記キメラ基質タンパク質に含まれるタンパク分解部位配列はＲＱＡＮＦＬＧ（配列番号：64）であった。前記形質転換プロトプラストをＷ５溶液中で18から48時間22℃でインキュベートして前記キメラ基質タンパク質を発現させ、発現されたキメラ基質タンパク質に由来する蛍光シグナルの細胞内局在を、蛍光顕微鏡を用いてモニターした。
図１１に示したように、緑色及び赤色の両蛍光が大きな斑点又は集合体として細胞質ゾル中の同じ位置で観察されたが、葉緑体には誘導されなかった。この結果は、前記キメラ基質タンパク質は切断されず、従ってそれらは未切断形として細胞質ゾルに存在することを示している。このデータはＨＩＶ−１プロテアーゼの完全な阻害が発生したときの結果と一致する。
【００６０】
ＨＩＶ−１タンパク分解活性の検出は以下のように実施した。プロトプラストをＨＩＶ−１プロテアーゼのリコンビナントプラスミド及びＨＩＶ−１プロテアーゼ基質タンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＨＩＶ−１）：ＡｔＯＰＥ７：ＧＦＰのリコンビナントプラスミドで同時形質転換した。前記キメラ基質タンパク質に含まれるタンパク分解部位配列はＲＱＡＮＦＬＧ（配列番号：64）であった。発現されたキメラ基質タンパク質に由来する蛍光シグナルの局在は、蛍光顕微鏡を用いて形質転換後18時間から48時間モニターした。図１２に示されたように、赤色蛍光シグナルは細胞質ゾルに均質に拡散され、一方、緑色蛍光の大半は葉緑体周辺に認められた。これらの結果は、キメラ基質タンパク質はＨＩＶ−１プロテアーゼによって切断されたことを示している。
この系は、分散する赤色蛍光シグナル及び葉緑体に誘導される緑色シグナルを減少させ、従って前記プロトプラスト内でＨＩＶ−１プロテアーゼ活性を阻止又は阻害する分子を検出するために使用することができる。
図９（ａ）及び（ｂ）はより詳細に以下のように解説される。図は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ及びそのキメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＨＩＶ−１）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのリコンビナントプラスミドのプラスミドマップを示す。これらリコンビナントプラスミドを用いて、ＨＩＶ−１プロテアーゼ及びキメラ基質タンパク質を植物細胞（例えばアラビドプシス＝タリアーナ（Arabidopsis thaliana）、タバコなど）で発現させることができる。ＨＩＶ−１プロテアーゼ及びその切断部位の核酸配列及びタンパク質配列は配列番号：55−74に示されている。実施例３で用いたキメラ基質タンパク質の完全な核酸配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号：75及び76に示されている。
【００６１】
実施例４：１つのシグナルタンパク質が活性を維持している場合によって隠蔽されたキメラタンパク質の調製及び使用
上記で考察されたように、シグナルタンパク質の少なくともいくつかが少なくとも１つの適切なアミノ酸配列で隠蔽されてあるリコンビナントキメラタンパク質を提供することは本発明の目的である。例えば、本発明の特定のキメラタンパク質の全てのシグナルタンパク質を隠蔽することが可能であり、また必要に応じてそれらの隠蔽を解除することができる。また別には、キメラタンパク質のシグナル成分の一部分の隠蔽を解除し、残りのシグナルを隠蔽することもできる。そのような“場合によって隠蔽された”キメラタンパク質は本発明に顕著な融通性を提供し、広範囲の重要な用途を示す。
例えば、キメラタンパク質の１つ又は２つ以上の蛍光シグナルの細胞内局在の変化によって、in vivoでプロテアーゼ活性を検出するスクリーニングにそのようなキメラタンパク質を用いることができる。そのようなスクリーニングは、換言すれば、キメラタンパク質の空間的分布におけるわずかな変化を記録することができるので高度に鋭敏である。対象のキメラ分子内に含まれる１つ又は２つ以上のシグナルタンパク質を隠蔽するか隠蔽しないかの選択は本発明の目的とする用途によって決定されるであろう。
【００６２】
図１０は“場合によって隠蔽された”キメラタンパク質の実例を集めたものである。より具体的には、前記の図は、１つのシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが活性を維持しているキメラ基質タンパク質をコードするリコンビナント遺伝子の模式図を示している。Ｈ+−ＡＴＰアーゼが、そのトラフィッキングシグナルがキメラ基質タンパク質内で隠蔽されていない活性なシグナルタンパク質の例として用いられる。活性なシグナルタンパク質として用いることができる他の例には、ＡｔＯＥＰ７、ＰＨ及びＦＡＰＰが含まれる。ＡｔＯＥＰ７は、そのトラフィッキングシグナルがタンパク分解切断部位との連結又はタンパク分解切断部位を介するシグナル隠蔽タンパク質との連結によって隠蔽された不活化されてあるシグナルタンパク質の例として用いられる。不活性なシグナルタンパク質として用いることができる他の例には、ＲｂｃＳ、Ｃａｂ、ＲＡ、Ｆ１−ＡＴＰアーゼ及びＳＫＬが含まれる。これらのキメラ基質タンパク質は、タンパク分解切断に際して細胞内蛍光シグナル分布の変化を誘発するようにデザインされる。本明細書に開示したほぼいずれのプロテアーゼ切断配列も、図１０に示したキメラタンパク質の切断部位（ＰＳ）を提供するために用いることができる。従って、そのような場合によって隠蔽されたキメラタンパク質を用いて、多様なプロテアーゼ阻害剤分子を検出することができる。もちろんのこと、本明細書に開示したほぼいずれのプロテアーゼ切断配列も、図１０に示したキメラタンパク質の切断部位（ＰＳ）を提供するために用いることができる。
図１０は以下のように更に詳細に解説される。図１０（ａ）は、蛍光シグナル（ＦＰ−１）がタンパク分解切断に際して細胞質膜から細胞質ゾルに移動する構築物を示す。図１０（ｂ）の事例では、１つの蛍光シグナル（ＦＰ−２）は図１０（ａ）と同じ態様で移動するが、他の蛍光シグナル（ＦＰ−１）は細胞質膜に残留する。図１０（ｃ）の事例では、蛍光シグナル（ＦＰ−１）はタンパク分解切断に際して細胞質膜から葉緑素に移動する。図１０（ｄ）の場合には、１つの蛍光シグナル（ＦＰ−２）は図１０（ｃ）と同じ態様で移動するが、他の蛍光シグナル（ＦＰ−１）は細胞質膜に残留する。
【００６３】
（ａ）１つのシグナルタンパク質が活性を維持するキメラ基質タンパク質を発現させるリコンビナントプラスミドの構築
図１０に示したリコンビナントプラスミドの例は以下のように構築した。
タンパク分解切断部位配列がＶＲＦＱ（配列番号：48）及びＲＱＡＮＦＬＧ（配列番号：64）を有するＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＰＳ：ＧＦＰをコードする２つのリコンビナントプラスミド（図１０（ａ））を以下のように構築した。
順方向プライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＰＳＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’（ＰＳはＮＩａ切断部位ＶＲＦＱのためのＧＴＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧ、又はＨＩＶ−１切断部位ＲＱＡＮＦＬＧのためのＡＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧである）及び逆方向プライマー５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’を326GFPベクターのＰＣＲ増幅に用いた。ＮＩａ又はＨＩＶ−１プロテアーゼのための切断部位、サブクローニング用制限部位（XhoI及びSacI）及びＧＦＰのＣ−末端に終止コドンを含むこれらのＰＣＲ生成物をpBluescript-Tベクターでサブクローニングした。これらのサブクローンのXhoI／SacIフラグメントをXhoI及びSacIで消化したｐＨ+ＡＴＰアーゼ−Ｇベクターに連結した（図7（ｉ））。
【００６４】
タンパク分解切断部位配列がＶＲＦＱ（配列番号：48）及びＲＱＡＮＦＬＧ（配列番号：64）を有するＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ：ＰＳ：ＲＦＰをコードする２つのリコンビナントプラスミド（図１０（ｂ））を以下のように構築した。
終止コドンをもたないＧＦＰを調製するために、プライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴ−３’及び５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴ−３’を用いてＰＣＲ増幅を実施した。XhoI及びSacI部位を含むＰＣＲ生成物をpBluescript-Tベクターでサブクローニングし、続いてXhoI及びSacIで制限消化を実施した。このXhoI／SacIフラグメントをXhoI及びSacIで消化したｐＨ+ＡＴＰアーゼ−Ｇベクター（図7（ｉ））でサブクローニングした。
ＲＦＰの上流にタンパク分解切断部位を配置するために、順方向プライマー５’−ＧＡＧＣＴＣＰＳＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧ−３’（ＰＳはＮＩａ切断部位ＶＲＦＱのためのＧＴＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧ、又はＨＩＶ−１切断部位ＲＱＡＮＦＬＧのためのＡＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧである）及び逆方向プライマー５’−ＧＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧ−３’を326RFPベクターのＰＣＲ増幅に用いた。ＰＳ：ＲＦＰを含む構築物（これもまたSacI部位を含む）をSacIで制限消化し、これらSacIフラグメントを上記のように調製したＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ（終止コドンをもたない）サブクローンのSacI部位でサブクローニングし、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ：ＰＳ：ＲＦＰのためのリコンビナントプラスミドを作製した。
【００６５】
そのタンパク分解切断部位がＶＲＦＱ（配列番号：48）及びＲＱＡＮＦＬＧ（配列番号：64）であるＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＰＳ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ（図１０（ｃ））をコードする２つのリコンビナントプラスミドを以下のように構築した。
PSub-Nia1ベクター（図８（ｂ））を、プライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＰＳＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧ−３’（ＰＳはＮＩａ切断部位ＶＲＦＱのためのＧＴＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧ、又はＨＩＶ−１切断部位ＲＱＡＮＦＬＧのためのＡＧＡＣＡＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧである）及び５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’を用いてＰＣＲで増幅した。従ってＰＣＲ生成物はXhoI及びSacI部位を含んでいた。これらサブクローンのXhoI／SacIフラグメントをXhoI及びSacIで消化したｐＨ+ＡＴＰアーゼ−Ｇベクター（図7（ｉ））に連結し、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＰＳ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのためのリコンビナントプラスミドを作製した。
タンパク分解切断部位配列がＶＲＦＱ（配列番号：48）及びＲＱＡＮＦＬＧ（配列番号：64）であるＨ+−ＡＴＰアーゼ：ＲＦＰ：ＰＳ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰをコードする２つのリコンビナントプラスミド（図１０（ｄ））を以下のように構築した。
プライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧ−３’及び５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’を用いてPSub-Nia1ベクター（図８（ｂ））及びPSub-HIV4ベクター（図９（ｂ））をＰＣＲで増幅した。従ってこれらＰＣＲ生成物はXhoI及びSacI部位を含んでいた。これらサブクローンのXhoI／SacIフラグメントをXhoI及びSacIで消化したｐＨ+ＡＴＰアーゼ−Ｇベクター（図7（ｉ））に連結し、Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＲＦＰ：ＰＳ：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのためのリコンビナントプラスミドを作製した。
【００６６】
（ｂ）図1０（ａ）で示されるリコンビナントプラスミドを用いる作業例
シロイヌナズナの葉の組織のプロトプラストの調製及び形質転換は実施例１（ｂ）及び（ｃ）に記載した方法に従って実施した。形質転換されたプロトプラストの蛍光画像の検出は実施例１（ｄ）に記載したように実施した（ただし同じタイプのフィルターセットを使用しニコンE800蛍光顕微鏡を用いた）。
ＮＩａプロテアーゼの阻害を検出する実際の作業例として、プロトプラストを基質タンパク質Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＰＳ：ＧＦＰをコードするリコンビナントプラスミドで形質転換した。前記キメラ基質タンパク質に含まれるタンパク分解部位配列はＶＲＱＦ（配列番号：48）であった。前記形質転換プロトプラストをＷ５溶液中で18から48時間22℃でインキュベートして前記キメラ基質タンパク質を発現させ、蛍光顕微鏡を用いて発現されたキメラ基質タンパク質に由来する蛍光シグナルの細胞内局在をモニターした。図１３（ａ）に示されるように、緑色蛍光シグナルは細胞質膜に局在した。この結果は、予想したように前記キメラ基質タンパク質は切断されず、従って結合させた緑色蛍光シグナルはＨ+−ＡＴＰアーゼのトラフィッキングシグナルによって細胞質膜に誘導されたことを示している。このデータはプロテアーゼの完全な阻害が発生したときの結果と一致する。
ＮＩａタンパク分解活性の検出は以下のように実施した。ＮＩａプロテアーゼのためのリコンビナントプラスミド（配列番号：45）及びキメラ基質タンパク質Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＰＳ：ＧＦＰ（配列番号：53）のためのリコンビナントプラスミドでプロトプラストを同時に形質転換した。前記キメラ基質タンパク質に含まれるタンパク分解部位配列はＶＲＱＦ（配列番号：48）であった。蛍光顕微鏡を用いて発現されたキメラ基質タンパク質に由来する蛍光シグナルの局在を形質転換後18時間から48時間モニターした。図１３（ｃ）に示されたように、緑色蛍光シグナルは細胞質ゾルに観察されたが細胞質膜には誘導されなかった。この結果は、ＧＦＰはキメラ基質タンパク質から切断されたことを示している。
本明細書に記載した全ての参考文献は参照により本明細書に含まれる。以下の参考文献は特に参照により本明細書に含まれる。
【００６７】
参考文献
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【００６８】
これまで本発明をその好ましい実施態様を参考に詳細に記載してきた。しかしながら、本発明の開示から当業者が本発明の範囲内で改変及び改善を実施できることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】細胞内小器官へのトラフィッキングシグナルを有し、更に蛍光タンパク質で標識されているシグナルタンパク質の模式図を示す。
【図２】（ａ）−（ｈ）は、蛍光タンパク質で標識されたシグナルタンパク質の、それらが正確に細胞内で発現されたときの局在分布を示す蛍光写真である。  （ａ）：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識されたシロイヌナズナ外皮タンパク質（ＡｔＯＥＰ７）は葉緑体エンベロープに局在する；  （ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）：ＧＦＰで標識したルビスコ小サブユニット（ＲｂｃＳ）、葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質（Ｃａｂ）及びルビスコアクチヴァーゼ（ＲＡ）は葉緑体間質に局在する；  （ｅ）：ＧＦＰで標識したＦ１−ＡＴＰアーゼはミトコンドリアに局在する；  （ｆ）：ＧＦＰで標識したペルオキシソーム誘導モチーフ（ＳＫＬ）はペルオキシソームに局在する；  （ｇ）及び（ｈ）：ＧＦＰで標識したＨ+−ＡＴＰアーゼ及びプレックストリン相同ドメイン（ＰＨ）は細胞質エンベロープに局在する。
【図３】ＮＩａプロテアーゼ及びＮＩａプロテアーゼのin vivo基質ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのためのリコンビナント遺伝子の模式図を示す。  （ａ）：本発明の実施例２でＮＩａプロテアーゼのin vivo基質として用いられるキメラタンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰを発現させるために構築されたリコンビナント遺伝子の構造。ＲＦＰ、ＧＦＰ、ＰＳ（ＮＩａ）、ＡｔＯＥＰ７及び35Ｓは、それぞれ赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼのタンパク分解切断部位、シロイヌナズナの外皮（outer envelope）タンパク質及びＣａＭＶ35Ｓプロモーターを示す。  （ｂ）：実施例２で用いられるＮＩａプロテアーゼを発現させるために構築されたリコンビナント遺伝子の構造。ＮＩａはＴＶＭＶのＮＩａプロテアーゼのコード領域を示す。
【図４】図３（ａ）に示したリコンビナント遺伝子で形質転換したシロイヌナズナのプロトプラストでキメラタンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰを発現させた後で観察された蛍光写真である。  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ緑色蛍光シグナル画像、赤色蛍光シグナル画像並びに緑色及び赤色蛍光シグナルのオーバーラップ画像、及び明視野で捕捉された画像である。葉緑体で観察される赤色蛍光シグナルは葉緑体の自家蛍光シグナルであり、細胞質ゾルで観察される赤色蛍光シグナルは赤色蛍光タンパク質から発する。
【図５】図３（ａ）及び３（ｃ）に示したリコンビナント遺伝子で形質転換したシロイヌナズナのプロトプラストでキメラタンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ及びＮＩａプロテアーゼを同時発現させた後で観察された蛍光画像である。前記蛍光写真には以下のようなＮＩａプロテアーゼによるＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰの切断が示されている：  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ緑色蛍光シグナル画像、赤色蛍光シグナル画像並びに緑色及び赤色蛍光シグナルのオーバーラップ画像、及び明視野で捕捉された画像である。葉緑体で観察される赤色蛍光シグナルは葉緑体の自家蛍光シグナルであり、細胞質ゾルで観察される赤色蛍光シグナルは赤色蛍光タンパク質から発する。
【図６】ＮＩａプロテアーゼによるキメラタンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰの切断はシロイヌナズナのプロトプラストで生じることを示すウェスタンブロットである。  図３（ａ）に示したＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ及び図３（ｂ）に示したＮＩａプロテアーゼを同時発現させた事例（＋）が、ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのみを発現させた事例（−）と比較されている。70kD及び35ｋDで観察されるタンパク質バンドは、完全なキメラタンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ及びタンパク分解切断によって生じたフラグメントタンパク質ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰにそれぞれ一致する。
【図７】（ａ）−（ｊ）は、図1に示した融合タンパク質を発現させるために用いた種々の構築物のプラスミドマップを示す図である。（ａ）ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ、（ｂ）ＡｔＯＥＰ７：ＲＦＰ、（ｃ）ＲｂｃＳ：ＧＦＰ、（ｄ）ＲｂｃＳ：ＲＦＰ、（ｅ）Ｃａｂ：ＧＦＰ、（ｆ）ＲＡ：ＧＦＰ、（ｇ）Ｆ１−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ、（ｈ）ＧＦＰ：ＳＫＬ、（ｉ）Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＧＦＰ、（ｊ）ＧＦＰ：ＰＨ。
【図８】（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＮＩａプロテアーゼ及びそのキメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのためのプラスミドマップを示す。前記キメラ基質タンパク質の核酸配列の重要な部分が示されている。
【図９】（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＨＩＶ−１プロテアーゼ及びそのキメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＨＩＶ−１）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰのためのプラスミドマップを示す。タンパク分解切断部位の核酸配列及びタンパク質配列（配列番号：57−74）が示されている。
【図１０】１つのシグナルタンパク質のトラフィッキングシグナルが活性を維持している、場合によって隠蔽されたキメラ基質タンパク質例をコードするリコンビナント遺伝子の模式図を示す。ＰＳはタンパク分解切断部位配列を示す。ＦＰ−１及びＦＰ−２は異なる蛍光波長を有する蛍光タンパク質のコード配列を示す。
【図１１】図９（ｂ）に示したリコンビナントプラスミドの１つで形質転換したシロイヌナズナのプロトプラストでキメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＨＩＶ−１）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰを発現させた後で観察された蛍光画像である。図１１（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれ緑色蛍光シグナル画像、赤色蛍光シグナル画像並びに緑色及び赤色蛍光シグナルのオーバーラップ画像である。緑色蛍光画像中に認められる弱い赤色蛍光シグナルは葉緑体の自家蛍光である。
【図１２】図９（ａ）及び（ｂ）に示したリコンビナント遺伝子で形質転換したシロイヌナズナのプロトプラストでキメラ基質タンパク質ＲＦＰ：ＰＳ（ＨＩＶ−１）：ＡｔＯＥＰ７：ＧＦＰ及びＨＩＶ−１プロテアーゼを同時発現させた後で観察された蛍光画像を示す。図１２（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれ緑色蛍光シグナル画像、赤色蛍光シグナル画像並びに緑色及び赤色蛍光シグナルのオーバーラップ画像である。緑色蛍光画像中に認められる弱い赤色蛍光シグナルは葉緑体の自家蛍光である。
【図１３】（ａ）及び（ｂ）はキメラ基質タンパク質Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＧＦＰを発現させた後で観察された画像を示す。（ｃ）及び（ｄ）はＮＩａプロテアーゼ及びキメラ基質タンパク質Ｈ+−ＡＴＰアーゼ：ＰＳ（ＮＩａ）：ＧＦＰを同時発現させた後で観察された画像を示す。図1３（ａ）及び（ｃ）は緑色蛍光シグナル画像であり、図１３（ｂ）及び（ｄ）は明視野下で得られた画像である。緑色蛍光画像中に認められる弱い赤色蛍光は葉緑体の自家蛍光である。
【図１】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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【図９（ａ）】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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