(57)【要約】本発明は、表面吸着ポリマーを用いて表面を処理する方法、処理したデバイスまたは容器の表面上への有機物質の吸着を低減する方法、表面の処理を含む流体操作を実施する方法、および処理した表面を含む装置およびシステムを提供する。さらに、本発明は、マイクロ流体チャンネルの表面を処理する方法を提供し、その方法では、マイクロ流体チャンネル表面を不活性化するためにコーティングし、このコーティングは容易に再生することができる。本発明は、プラスチックデバイスの表面を処理する方法もまた提供する。本発明の表面吸着ポリマーは、特に温度サイクルまたはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの重合を伴う用途において、生化学反応に必要とされる温度および条件で特に安定である。
2004526939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）有機物質を含有する流体試料を提供する段階；
ｂ）前記流体試料に有効量の表面吸着ポリマーを添加する段階；
ｃ）前記有機物質と前記表面吸着ポリマーとを含有する前記流体試料を表面に接触させる段階；
ｄ）流体操作を行う段階；を含む、表面への有機物質の吸着を低減する方法であって、前記表面吸着ポリマーが、前記表面に非共有結合で結合し；前記表面吸着ポリマーが、前記表面への前記有機物質の吸着の量を低減し；前記表面吸着ポリマーが、前記流体操作の反応物の１つではないか、または前記流体試料に通常添加される量を超える量で添加され、好ましくは流体操作を妨げない方法。
【請求項２】
前記表面吸着ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド、またはポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドおよびポリジメチルシロキサンからなる群から選択される２種類以上のポリマーを含むブロック共重合体のうちのいずれか１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面が、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリメチルペンテン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン、フルオロポリマー、ポリアミド、シリコーンおよびエラストマーからなる群から選択されるポリマーを含み、かつさらに前記装置が、９６ウェル・マイクロタイタープレート、３８４ウェル・マイクロタイタープレート、１５３６ウェル・マイクロタイタープレート、１５３６ウェルを超えるマイクロタイタープレート、マイクロ遠心管、チャンネル、試験管、マルチウェルプレート、および反応ウェルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記：
ａ）流体試料が水溶液であり；
ｂ）流体試料が非水溶液であり；
ｃ）流体操作がＰＣＲ反応またはプライマー伸長反応であり；
ｄ）有機物質がｄＮＴＰを含み；
ｅ）表面吸着ポリマーが少なくとも１×１０６ダルトンの分子量を有し；
ｆ）表面がマイクロタイタープレートの一部であり；
ｇ）流体操作がマイクロ流体デバイスにおいて行われ；
ｈ）有機物質が核酸、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、アミノ酸、タンパク質、脂質、または化学化合物であり；または
ｉ）表面吸着ポリマーが核酸、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、アミノ酸、タンパク質、脂質、または他の生体分子でない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ａ）表面を含む装置を提供する段階；
ｂ）流体試料および表面吸着ポリマーを前記装置に加える段階であって、前記表面吸着ポリマーが前記表面に非共有結合で結合することが可能な段階；
ｃ）同じ前記装置において１つまたは複数の流体操作を行う段階；
ｄ）最高反応収率または前記表面への前記有機物質の最低量の吸着を得ることが可能な、前記表面吸着ポリマーの最適量を決定する段階；を含む、請求項１に記載の流体操作に加えられる表面吸着ポリマーの量を決定する方法。
【請求項６】
ａ）基板に配置されるチャンネルを提供する段階；
ｂ）前記チャンネルに少なくとも２つの流体試料を導入し、その結果２つの流体試料ゾーンが作られる段階であって、前記少なくとも２つの流体試料のそれぞれが、対象の試料を含む段階；
ｃ）前記流体試料ゾーンの２つの間に位置する少なくとも１つの分離流体ゾーンを提供する段階；を含む方法であって、（ｉ）少なくとも１つの流体試料が表面吸着ポリマーを含有し、（ｉｉ）少なくとも１つの分離ゾーンが表面吸着ポリマーを含有し、（ｉｉｉ）少なくとも１つの分離ゾーンおよび少なくとも１つの流体試料ゾーンが表面吸着ポリマーを含有し、（ｉｖ）前記流体試料ゾーンのそれぞれが、表面吸着ポリマーを含有し、（ｖ）各分離ゾーンが表面吸着ポリマーを含有し、または（ｖｉｉ）各分離ゾーンおよび各流体試料ゾーンが表面吸着ポリマーを含有する、マイクロチャンネル表面上に吸着されたポリマーコーティングを動力学的に維持または再生する方法。
【請求項７】
ａ）少なくとも最初の前記流体試料ゾーンが、前記チャンネルの表面に非共有結合で結合することが可能な表面吸着ポリマーを含有し；または
ｂ）少なくとも１つの分離流体ゾーンが、対象の試料を含有する２つの流体試料ゾーンの間に位置する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応混合物が、緩衝溶液中に表面吸着ポリマーを含有し、前記反応混合物の前記表面吸着ポリマーの量が、表面への有機物質の吸着を低減することが可能な量である、請求項１に記載の方法で使用される反応混合物。
【請求項９】
前記反応混合物が、ＰＣＲ、ＬＳＲ、ＭＩＳ、または核酸重合に使用され、前記表面吸着ポリマーが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含むポリマーのブロック共重合体であり、前記反応混合物が緩衝溶液であり、または前記反応混合物が少なくとも１種類の反応物を含有し、かつ前記反応混合物が流体操作の少なくとも１種類の反応物を含有する、請求項８に記載の反応混合物。
【請求項１０】
ａ）請求項８に記載の反応混合物；
ｂ）流体操作を行うための、または表面への有機物質の吸着を低減するための指示を含む、書類、ラベル、またはコンピュータ可読媒体；を備える、流体操作を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
関連出願の情報
本出願は、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」の２０００年１０月１０日出願の米国特許仮出願第６０／２３９，３１６号；および発明の名称「Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｄｓｏｒｂｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ ｔｏ Ｔｒｅａｔ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」の２００１年９月２８日出願の米国特許仮出願第６０／３２６，０９１号に対して優先権を請求するものである。
発明の分野
本発明は、疎水性または親水性表面（例えば、ポリマー表面）への有機物質（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、および細胞）の吸着を低減する方法に関する。本発明はまた、かかる方法によって処理されたデバイス、容器および装置（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロ流体チャンネルおよびキット）と、それらにおいて流体操作を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
背景
ペプチド、タンパク質、核酸、および細胞などの生物材料は、プラスチックもしくは他の非極性材料から製造されたマルチウェルプレート、マイクロ遠心管およびピペットなどのデバイスおよび装置において、保存、移動、または反応させることが多い。生物学的化合物がかかるデバイスの表面に吸着／結合することは、一般的な所見である。これは、水溶液中でいくらかの疎水性を示す有機物質、例えばアクリジニウム化合物、ＰＣＢ等にも当てはまる。
【０００３】
多くの用途では、かかる結合は好ましくない。例えば、その結合によって、酵素および抗体などの貴重な物質が減少し、特に少量が関係する場合、結果として有機物質の分配にばらつきが生じる可能性がある。タンパク質、細胞および血小板の疎水性表面への結合は、様々な血液取り扱い手順においても関心事である。
これらを考慮した結果として、タンパク質および他の有機化合物の様々な表面への結合を低減する方法を提供するために、広範な努力がなされてきた。考察されてきたアプローチの例は、Ｃａｌｄｗｅｌｌ等、米国特許第５，５１６，７０３号；Ｄｉｎｇ等、国際特許出願公開ＷＯ９４／０３５４４；Ａｍｉｊｉ等， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， １３：６８２−６９２， １９９２； Ｊ． Ａｎｄｒａｄｅ， ”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ” ｉｎ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｊ． Ａｎｄｒａｄｅ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １−８０， １９８５； Ｌｅｅ 等， Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ Ｅｎｇ．， ５７：６１３−６１７， １９８７； Ｌｅｅ 等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２３：３５１−３６８， １９８９； Ｌｅｅ 等， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， １１：４５５−４６４， １９９０； Ｌｅｅ 等， Ｐｒｏｇ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．， ２０：１０４３−１０７９， １９９５； Ｍｅｒｒｉｌｌ 等， ＡＳＡＩＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， ６：６０−６４， １９８３； Ｏｋａｎｏ 等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０：１０３５−１０４７， １９８６； Ｏｋｋｅｍａ 等， Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．， １：４３−６２， １９８９； Ｏｗｅｎｓ 等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ８７：６６７−６７５， １９８７； Ｒａｂｉｎｏｗ 等， Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．， ６：９１−１０９， １９９４； Ｓｃｈｒｏｅｎ 等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ８０：２６５−２７４， １９９３； Ｓｈｅｕ 等， Ｊ． Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ６：９９５−１００９， １９９２； Ｓｈｉｍａｄａ 等， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ， １５：６４９−６５６， １９８３； およびＴｈｕｒｏｗ 等， Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ２７：２１２−２１８， １９８４で見つけ出すことができる。
【０００４】
様々な条件下での複数の反応を可能にする少量反応のデバイスの処理が、特に興味の対象である。マイクロ流体工学およびマイクロタイタープレート技術において、かかる進歩がなされており、したがって、汚染を減少し、反応収率を高め、かつ貴重な試薬の無駄をなくすために、これらのデバイスを処理する方法が必要とされている。
【０００５】
マイクロ流体工学は、試験管またはマイクロプレートの代わりにマイクロチャンネルを使用して、分析および反応を行うことを含む。これらのマイクロチャンネルおよび超小型回路は、シリコン、石英、ガラス、セラミックまたはプラスチックにエッチングされる。これらのチャンネルのサイズは、マイクロメートルオーダーであり、反応容積は、ナノリットルまたはマイクロリットルオーダーである。原則は、プロトコルの異なる段階に対応するゾーンにわたって、試薬および試料を含有する反応媒体を導くことである。反応器、クロマトグラフのカラム、キャピラリー電気泳動、および小型検出システムをこれらのマイクロ流体システムに集積化することは、１つの土台にそれらを集積化することによって、複雑なプロトコルを自動化することを可能とする。これらの「チップ上の実験室」は、反応速度の面、生成物の節約の面、および持ち運びできるデバイスの開発を可能にする小型化の面から、有効である結果を得ることを可能にしている。多くの操作をしばしば必要とする生物化学もしくは分子生物学プロトコルなどの複雑なプロトコルの一体化および自動化に関して、注目に値する結果も得られている。これらの操作は特に、試薬および試料を混合し、反応温度を調節し、熱サイクルおよび検出を行うことを含む。例えば、Ｗｏｌｌｅｙ等 （Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６８， ４０８１−４０８６， １９９６）は、単一デバイスにおけるＰＣＲマイクロリアクター、キャピラリー電気泳動システムおよび検出器の集積化を記述している。試薬を混合する段階と酵素反応段階を一体化することを可能にする、チップ上のデバイスが、Ｈａｄｄ等 （Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６９， ３４０７−３４１２， １９９７）によって記述されている。これらのデバイスは、ガラス基板にエッチングされたチャンネルおよびリザーバの超小型回路を提供し、液体の移動および混合が動電学によって行われる。このように、プロトコルを集積化、および分析を集積化するための多くのマイクロ流体システムが、特に国際特許出願番号：ＷＯ９８／４５４８１に記述されており、その開示内容を参照により本明細書中に組み込む。
【０００６】
これらのデバイスを実現するのに非常に困難なことの１つは、チャンネルを通って流体が移動する間に、チャンネル表面に試料および試薬が多量に吸着されることにある。一般に、マイクロ流体デバイスは、大きな表面積対体積比（従来のマイクロタイタープレートの表面積対体積比の約１０〜１００倍）を有する、マイクロメートルサイズ範囲のチャンネルを含む。これによって、マイクロ流体デバイスにおける表面特性／品質／化学の重要性が増大する。それと同時に、生体試料（例えば、タンパク質試料、またはＰＣＲ混合物、ＬＣＲ混合物、マイクロシークエンシング（ＭＩＳ）混合物等の反応混合物）は、固体基板、ならびに液体／液体界面および液体／空気界面に対する強い親和性を有する、異なる極性の大分子および小分子（例えば、ＤＮＡおよびタンパク質分子、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、蛍光標識等）の複合混合物である。特にタンパク質は、シリカ材料に強く吸着することが知られている（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ， Ｐ．Ｇ．， ｅｄ．， １９９６， Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）。これらの理由から、マイクロ流体デバイスの表面は、かかるミクロ構造で生物学的反応を行う前に不活性化される。表面を不活性化することによって、その表面上への有機物質の吸着が低減される。一般に、生物学的反応は、表面を不活性化することなく、シリコン（シリカ）マイクロチャンネルにおいて行うことはできない［Ｓｈｏｆｆｎｅｒ， Ｍ．Ａ． 等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ３７５−３７９ （１９９６） ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ， Ｊ． 等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ３８０−３８５ （１９９６）］。
【０００７】
表面の不活性化に対して、いくつかの可能性が示されている。一般に、不活性化の方策は、マイクロ流体デバイスが製造される材料によって異なる。例えばシラン処理反応によって、シリカ表面（シリコンチップ）に、化学的に官能性を持たせることができる （Ｓｎｙｄｅｒ， Ｌ．Ｒ．， Ｋｉｒｋｌａｎｄ， Ｊ．Ｊ．， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｍｏｄｅｒｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９７９， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｓｈｏｆｆｎｅｒ， Ｍ．Ａ． 等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４： ３７５−３７９ （１９９６）； および Ｋｏｐｐ， Ｍ． 等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８０： １０４６−１０４８ （１９９８））。シラン処理されたチップは、生物学的反応に直接使用することが可能であり、あるいは表面上にポリマーコーティング層を作製することによって、さらに改質することができる。
【０００８】
コーティングを用いた表面の不活性化は、２つのアプローチ：共有結合および非共有結合コーティングを含む。その一部がポリマーブラシ、および吸着ポリマー層と呼ばれる共有結合コーティングの安定性は、３つの因子：（ａ）表面の化学安定性、（ｂ）ポリマー表面相互作用の安定性、および（ｃ）表面改質に用いられるポリマーの化学安定性に依存する。一般に、単一のポリマー／表面相互作用の安定性（ａ）に関して、共有結合（共有結合コーティング）は、吸着ポリマー層における非共有結合ポリマー／表面相互作用（数分の１ｋＢＴ単位（ｋＢＴはボルツマン定数であり、Ｔは温度である））よりも安定である。しかしながら、吸着ポリマー層における表面と相互作用する多数のセグメント（時に、ポリマー中のセグメント／モノマー総数の１０％を超える）のために、ポリマー分子１個当たりの全吸着エネルギーが非常に大きくなり、数ｋＢＴ単位に達し、その結果ポリマー吸着が実質上不可逆性になる。
【０００９】
共有結合コーティングは、官能化シリカ表面からのポリマーの伸長［Ｈｊｅｒｔｅｎ， Ｓ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， ３４７， １９１−１９８ （１９８５）； および Ｃｏｂｂ， Ｋ．Ａ． 等， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６２： ２４７８−２４８３ （１９９０）］および／またはシリカ表面上へのポリマー鎖のグラフト［Ｈｅｒｒｅｎ， Ｂ．Ｊ． 等， Ｊ． Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．， １１５：４６ （１９８７）；およびＢａｌａｃｈａｎｄｅｒ， Ｎ． 等， Ｌａｎｇｍｕｉｒ ６： １６２１ （１９９０）， Ｂｕｒｎｓ， Ｎ．Ｌ． 等， Ｌａｎｇｍｕｉｒ １１：２７６８ （１９９５）］のいずれかを含む。化学反応による表面の不活性化は、表面上の官能基（−ＯＨ）と反応性シランもしくは官能化ポリマー分子［例えば、シラン処理されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）］との間の共有結合の形成を含む。有機溶媒中で行われる場合が多い、表面のこの化学改質は、多大な時間を要し、完了前にいくつかの合成段階を必要とする。したがって、表面の不活性化の方策は一般に、費用がかかり、簡単な手法で大量のチップを改質するように、うまく適応されない。共有化学結合（特に「−Ｓｉ−Ｏ−Ｘ」結合）は、加水分解する（例えば、アルカリ性ｐＨで）傾向があり、時間が経つにつれて共有結合コーティングを劣化させる［Ｃｏｂｂ， Ｋ．Ａ． 等， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６２， ２４７８−２４８３ （１９９０）］。これらのコーティングは簡単に再生することができないことから、かかる表面の寿命、およびその結果としてデバイス全体に限りがあり、化学的に改質されたマイクロ流体デバイスにおける表面品質の日々の再現性が不十分である。さらに、例えば、表面の不純物および／または使用する有機溶媒の表面湿度調節のために、良好なバッチ間再現性を維持することは難しい。
【００１０】
非共有結合コーティングを有するマイクロ流体素子表面を不活性化する他の可能性は、表面上へのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の吸着である。ＢＳＡは、ＰＣＲチップの表面不活性化にうまく用いられている［Ｎｏｒｔｈｒｕｐ， Ｍ．Ａ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７０： ９１８−９２２ （１９９８）； Ｗａｔｅｒｓ， Ｌ．Ｃ． 等，  Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７０： １５８−１６２ （１９９８）；およびＷａｔｅｒｓ， Ｌ．Ｃ． 等， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７０：５１７２−５１７６ （１９９８）］。ＢＳＡは、シリカ上に吸着し、表面吸着部位を飽和させ、高い表面積対体積比を有するデバイスで生物学的反応を行うことを可能にする。しかしながら、ＢＳＡは、５５〜６５℃を超える温度で変性し、その結果凝固して、大きな凝集塊を形成する可能性がある（ＢＳＡ濃度に応じて）［Ｗｅｔｚｅｌ， Ｒ． 等， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０４： ４６９−４７８ （１９８０）；およびＯａｋｅｓ， Ｊ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｆａｒａｄａｙ， Ｉ７２： ２２８−２３７ （１９７６）］。高温でのＢＳＡのこの凝固（変性）は不可逆であり、つまりＢＳＡは、温度が低くなった場合でも水溶液中で再溶解しないということである。生物学的反応を、静止モード（液体流れが無い）で、例えばマイクロウェルで行った場合、ＢＳＡによる表面不活性化が強く、うまくいく［Ｎｏｒｔｈｒｕｐ， Ｍ．Ａ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０： ９１８−９２２ （１９９８）， Ｗａｔｅｒｓ， Ｌ．Ｃ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７０： １５８−１６２ （１９９８）；および Ｗａｔｅｒｓ， Ｌ．Ｃ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７０： ５１７２−５１７６ （１９９８）］。しかしながら、生物学的反応を、流路（つまり、固体／液体界面でのずれ応力がゼロではない）および小さなチャンネルで行った場合には、溶液中の大きなＢＳＡ凝集塊が下流に運ばれ、最終的にマイクロチャンネルまたはキャピラリーを閉塞させる。液体の流れによって、一方の位置から他方の位置へ試薬が運ばれる、マイクロ流体デバイスの表面を不活性化するために、ＢＳＡを使用する不利点は、生物学的反応（ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＭＩＳ等）に通常使用される温度範囲でのＢＳＡの溶解性の変化である。
【００１１】
試料および試薬のマイクロ流体素子表面への吸着を防ぐためのポリマーの使用が今まで考察されてきたが、シリコン、石英、ガラス、セラミックもしくはプラスチック（ポリマー）で作製された表面などの他の表面、および他の界面（つまり、液体／液体および液体／空気界面）に同じ技術を適用することができる。これらの表面には、限定されないが、試験管、マルチウェルプレート、ピペット、ピペット先端、マイクロタイタープレート、反応ウェルもしくはマイクロ遠心管などの、流体試料の保存、分配、または反応に使用する装置の表面が含まれる。
【００１２】
かかる処理技術は、少量での同一反応ウェルにおける連続段階を必要とする場合が多い、生物学的反応に使用されることから、マイクロタイタープレートに対して特定の用途を有する。例えば、一塩基伸長方法によるゲノタイピング法には、３つの生物学的逐次反応（つまり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、酵素精製およびマイクロシークエンシング（ＭＩＳ））が必要である。このように、１つの特別なマイクロタイタープレートの同一ウェル中で２つ以上の逐次反応を行うことは効率的かつ有益である。このような場合には、反応間の汚染はなく、前の反応からの生体分子が、その後の反応を汚染しないことを確実にしなければならない。しかしながら、マイクロタイタープレート上への残留生体分子の吸着が高いか、または液体／液体もしくは液体／空気界面中へのかかる分子の濃度が高いために、これは達成するのが困難であると立証することができる。
【００１３】
マイクロタイタープレートなどの多くの装置は非極性であり、生体分子（例えば、タンパク質試料、またはＰＣＲ試薬およびＭＩＳ試薬などの反応混合物）は、固体基板に対して強い親和性を有する場合が多い、異なる極性の大分子と小分子（例えば、ＤＮＡおよびタンパク質分子、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、蛍光標識等）の複合混合物である。マイクロタイタープレートの表面上に生体分子が吸着することによって、これらの生体分子は、生物学的反応中に酵素への到達が不可能となるか、または酵素への到達性が低くなる。
【００１４】
一般に遭遇する問題は、特にゲノタイピングプロセス中に、マイクロタイタープレート表面上にデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が吸着することである。ゲノタイピング手順の第１段階（つまり、ＰＣＲ）中に添加されるｄＮＴＰがマイクロタイタープレート表面上に吸着することによって、その後の段階（つまり、酵素精製）中にエビ由来アルカリホスファターゼへのｄＮＴＰの到達性が低くなり、吸着されたｄＮＴＰは脱リン酸化されない。ｄＴＮＰは、高温では（例えば、ＥＸＯおよびＳＡＰ酵素の変性中またはＭＩＳ反応の温度サイクル中）マイクロタイタープレートの表面から放出されるため、ゲノタイピングプロセスの第３段階（つまり、ＭＩＳ）を劇的に汚染する可能性がある。結果として、ＭＩＳオリゴヌクレオチド産物は、複数の塩基（ｄＮＴＰ）によって伸長され；したがって、ＳＮＰ特異的な蛍光標識ｄｄＮＴＰが、対象のＳＮＰ部位から下流のオリゴヌクレオチド産物のいくつかの塩基中に不正確に取り込まれる。したがって、サイズ識別能力のない検出技術を用いた場合、これによって、ゲノタイピングのエラーが生じる可能性がある（例えば、同型接合試料は、異型接合試料として現れ得る）。しかしながら、ＰＣＲから残されたｄＮＴＰによる、ＭＩＳオリゴヌクレオチドの更なる延長は、用いられる任意の検出技術に不利な場合がある特異的シグナルを減少させる原因となる。
【００１５】
マイクロタイタープレート表面上への生体分子の吸着に関連する他の不利点は、生物学的反応の収量が減少することである。貴重な生体分子の吸着によって、目的の産物の収量が減少する結果となる。吸着に対する試薬の損失を埋め合わせる試みでは、プレート表面上の吸着部位を飽和させるために、試薬濃度がしばしば増大される。しかしながら、これは、吸着を防ぐ経済的な解決策ではない。
【００１６】
汚染を防ぐ可能性は、２つの逐次反応間で新しいマイクロタイタープレート中に試料を移すことである。ゲノタイピングプロセスの場合には、ＰＣＲは１つのマイクロタイタープレートで行われ、酵素精製、続いてＭＩＳが、もう１つのマイクロタイタープレートで行われる。しかしながら、汚染を防ぐためのこの方法は、ＭＩＳ反応の約１０％が、ＰＣＲ反応で残されたｄＮＴＰによって依然として汚染されるため（Ｇｅｎｓｅｔ、Ａｎａｌｙｓｅ Ｇｅｎｏｍｉｑｕｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔからのデータ）、完全に有効なわけではない。反応容積が減少すると、大量の溶液からの分子と表面との相互作用の数が急速に増加するため、この汚染は、非常に少量で反応が行われる場合に（例えば、高密度プレート）さらに明らかとなる。さらに、新しいマイクロタイタープレートに試料を移す必要のない方法を使用することが技術的にさらに簡便かつ安価である。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、同じチップ、マイクロタイタープレートにおける表面または他の表面の品質の、良好な日々の再現性を提供し、生物学的用途に関連する温度で安定な表面を提供し、複雑かつ高価な合成プロセスを含まない、表面を不活性化する方法が必要とされている。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、表面に競合的に吸着するポリマーを使用して、液体（例えば、水性）試料中の有機物質（生体分子）の前記表面への吸着を低減する方法を提供する。代替方法としては、本発明は、ポリマーを使用して、液体／空気または液体／液体界面上への有機物質の吸着を低減する方法を提供する。前記表面は、シリコン、石英、ガラス、セラミックス、または例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、フルオロポリマー、ポリアミド、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、およびエラストマーなどのプラスチックで製造されている。これらの表面には、限定されないが、流体試料の保存、分配、または反応に使用されるデバイスまたは容器などの装置の表面が含まれる。かかる装置は、限定されないが、試験管、マルチウェルプレート、ピペット、ピペット先端、マイクロタイタープレート、反応ウェル、マイクロチャンネル、マイクロ流体装置、キャピラリーおよびマイクロ遠心管を含む。本発明はさらに、流体試料中の有機物質の吸着が、表面吸着ポリマーを導入することによって最小限に抑えられるように、前記表面に流体操作を行う方法を含む。流体操作には、限定されないが、反応、インキュベーション、希釈、滴定、精製、検出、混合、結合アッセイ、薬物スクリーニングアッセイ、および測定アッセイ（例えば、キネティックスの測定）が含まれる。酵素に関わる流体操作もまた好ましい。流体試料には、限定されないが、ＰＣＲ混合物、ＬＣＲ混合物、プライマー伸長反応混合物およびゲノタイピング反応混合物（例えば、マイクロシークエンシング混合物）などの反応混合物が含まれる。好ましい流体試料は、水溶液試料である。有機物質には、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰなどのｄＮＴＰ、およびｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰなどのｄｄＮＴＰ）、アミノ酸（例えば、タンパク質ポリペプチド、ペプチド、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、システイン、およびチロシンなどのアミノ酸）、脂質、化学化合物（例えば、蛍光標識）、およびさらに具体的には受容体または抗体およびそれらのリガンド、細胞および成長因子、成長抑制物質、酵素および基質が含まれる。生体分子は、様々な表面に対して強い親和性を有する上記の分子など、異なる極性の大分子と小分子との複合混合物を含むことが好ましい。具体的には、上記の表面、装置、流体操作または有機物質のいずれかの特質または種類は、本発明の実施形態含まれてもよいし、または除外されてもよい。
【００１９】
本発明の方法は、流体試料がデバイスまたは容器（例えば、マイクロチャンネル）などの装置において逐次的に流れる表面の動力学的再生を可能にする実施形態にもまた関する。さらに、本発明の方法は、その後の流体操作を同一面上で逐次的に行うことを可能にし、その結果汚染を最小限に抑え、かつ反応収率を最大限にする実施形態に関する。
【００２０】
表面に非共有結合で結合する表面吸着ポリマーの導入によって、表面上への有機物質の好ましくない吸着が妨げられ、その結果汚染が低減され、かつ反応収率が増大する。その表面は、水溶液試料の極性よりも小さい極性であることが好ましい。かかる非共有結合コーティングは、流体操作で使用される化学（共有結合）コーティングと比較して、いくつかの重要な利点を有する：非共有結合の不活性化方法は、複雑かつ時間のかかる化学合成を伴わず、そのため安価であり、流体試料の保存、分配、もしくは反応に用いる大量の装置を、簡単な手法で改良するようにうまく適応される。
【００２１】
第一の態様では、本発明は、有機物質の表面上への吸着を低減する方法であって：ａ）前記有機物質および表面吸着ポリマーを含有する流体試料を前記表面に添加することを含み、前記吸着ポリマーが、前記表面に非共有結合で結合することが可能である方法を包含する。好ましい実施形態では、その表面は、シリコン、石英、ガラス、セラミックス、またはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、フルオロポリマー、ポリアミド、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、およびエラストマー）で作製されている。さらに、有機物質は、装置の表面に対して強い親和性を有する、上記の生体分子などの異なる極性の大分子と小分子との複合混合物である。流体試料は、ＰＣＲ反応混合物、ＬＣＲ混合物、プライマー伸長反応混合物またはゲノタイピング反応混合物（例えば、マイクロシークエンシング（ＭＩＳ）混合物）などの反応混合物を含む。他の好ましい実施形態では、表面吸着ポリマーは、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）などのポリアクリルアミドのファミリーからのポリマーである。他の好ましい実施形態では、プロピレングリコール（ＰＧ）およびエチレングリコール（ＥＧ）、およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリグリコールなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに他の好ましい実施形態では、プロピレンオキシド（ＰＯ）およびエチレンオキシド（ＥＯ）、およびポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリオキシドなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに好ましい実施形態では、表面吸着ポリマーは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリビニルピロリドンである。最も好ましい実施形態では、例えばＰＰＧおよびＰＥＧおよびＰＡＭおよびＮＩＰＡＭおよびＰＤＭＳのブロック共重合体を含む、本明細書に記載のポリマーのブロック共重合体が使用される。具体的には、いずれかの特質または種類の表面吸着ポリマーが、本発明の実施形態に含まれてもよいし、または除外されてもよい。特にＢＳＡは、本発明の表面吸着ポリマーから除外される。
【００２２】
他の態様において、本発明は：（ａ）有機物質を含有する流体試料を得る段階；（ｂ）前記流体試料に、有効量の表面吸着ポリマーを添加する段階；（ｃ）前記有機物質と前記表面吸着ポリマーとを含有する前記流体試料を、表面に接触させる段階；（ｄ）１つまたは複数の流体操作を行う段階；を含む、表面上への有機物質の吸着を低減する方法を包含する。好ましい流体試料は通常、流体操作を実施する前に、本発明の表面吸着ポリマーを全く含有しないことが好ましい。代替方法としては、流体試料は通常、本発明の方法のうちの１つを実施する前に、本発明の表面吸着ポリマーを含有してもよい。好ましい流体操作は、通常本発明の表面吸着ポリマーを全く含まない流体操作である。他の好ましい流体操作は、前記表面吸着ポリマーが反応物の１つではない、または前記表面吸着ポリマーが、反応物に対して活性化または抑制効果を及ぼさない反応である。さらに他の好ましい流体操作は、反応を起こすために前記表面吸着ポリマーが必要ではない反応である。代替方法としては、表面吸着ポリマーは、流体操作の反応物の１つであることが可能である。代替方法としては、流体操作を行うのに必要な、または通常使用されるポリマーと比較して、質量またはモル濃度のいずれかの過剰量で表面吸着ポリマーを添加する。表面吸着ポリマーは、表面吸着ポリマーが反応物である反応を行うのに必要な量に対して、または表面吸着ポリマーが反応物ではない場合に通常使用される量に対して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、または１０，０００倍過剰量であることが好ましい。好ましい実施形態では、前記表面は、流体試料の保存、分配、または反応に使用される装置の一部であり、限定されないが、マイクロチャンネル、試験管、マルチウェルプレート、ピペット、ピペット先端、マイクロタイタープレート、反応ウェル、マイクロチャンネルまたはマイクロ遠心管が含まれる。
【００２３】
さらに他の実施形態において、本発明は：（ａ）表面を含む、または本質的に表面からなる装置を提供する段階；（ｂ）前記有機物質および表面吸着ポリマーを含有する流体試料を前記装置に添加する段階であって、前記表面吸着ポリマーが、前記表面に非共有結合で結合することが可能である段階；（ｃ）同じ前記装置で１つまたは複数の流体操作を行う段階；を含む、装置の表面上への有機物質の吸着を低減する方法を包含する。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は：（ａ）表面を含む、または本質的に表面からなる装置を提供する段階；（ｂ）有機物質および表面吸着ポリマーを含有する流体試料を前記装置に添加する段階であって、前記表面吸着ポリマーが、前記表面に非共有結合で結合することが可能である段階；（ｃ）同じ前記装置で１つまたは複数の流体操作を行う段階；（ｄ）最も高い収率を得ることが可能な前記表面吸着ポリマーの最適量を選択する段階；を含む、流体操作に添加される表面吸着ポリマーの量を選択する方法を包含する。前記表面は、前記流体試料の極性よりも低い極性であることが好ましい。前記流体操作はＰＣＲであることが好ましい。
【００２５】
他の実施形態では、本発明は：（ａ）表面を含む、または本質的に表面からなる装置を提供する段階；（ｂ）有機物質および表面吸着ポリマーを含有する流体試料を前記装置に添加する段階であって、前記表面吸着ポリマーが、前記表面に非共有結合で結合することが可能である段階；（ｃ）同じ前記装置で１つまたは複数の流体操作を行う段階；（ｄ）吸着または汚染を最大限に低減する、前記表面吸着ポリマーの最適量を選択する段階；を含む、流体操作に添加される表面吸着ポリマーの量を選択する方法を包含する。任意に、その後の流体操作の前記汚染の結果、表面への吸着が原因で、好ましくないｄＮＴＰが存在する。前記表面は、前記流体試料の極性よりも低い極性であることが好ましい。前記流体操作はマイクロシークエンシングであり、前記汚染または吸着は、シークエンシングの人工産物の存在によって検出可能であることが好ましい。
【００２６】
他の態様において、本発明は：（ａ）流体操作を行うための流体試料；（ｂ）水溶液中の表面吸着ポリマー；（ｃ）流体試料に添加すべき、前記表面吸着ポリマーの量を推奨する注意書き；を備えるキットを包含する。任意に、前記キットは、本質的に表面からなる装置もまた含む。任意に、前記表面吸着ポリマーは、反応混合物中に含まれる。流体試料に添加すべき前記表面吸着ポリマーの推奨量は、本発明の方法のうちの１つを用いて選択される。前記キットはゲノタイピングキットであることが好ましい。
【００２７】
さらに他の態様では、本発明は、流体操作を行うための反応混合物を包含し、前記反応混合物は、本発明の表面吸着ポリマーを含有し、かつ前記反応混合物中に含まれる前記表面吸着ポリマーの量は、本発明の方法を用いて選択される。その反応混合物は、ＰＣＲ反応混合物、ＬＣＲ混合物、プライマー伸長反応混合物またはゲノタイピング反応混合物（例えば、マイクロシークエンシング（ＭＩＳ）混合物）であることが好ましい。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明は、マイクロチャンネルの表面上に吸着されたポリマーコーティングを動力学的に維持または再生する方法であって：（ａ）基板に配置されるチャンネルを提供する段階；（ｂ）前記チャンネルに少なくとも２つの流体試料ゾーンを導入する段階であって、前記少なくとも２つの流体試料ゾーンのそれぞれが、対象の流体試料を含む段階；（ｃ）前記流体試料ゾーンの２つの間に位置する少なくとも１つの分離流体ゾーンを提供する段階であって、前記少なくとも１つの分離流体ゾーンまたは少なくとも１つの流体試料ゾーンが、前記チャンネルの表面に非共有結合で結合することが可能な表面吸着ポリマーを含有する段階；を含む方法を包含する。任意に、少なくとも１つの流体試料ゾーンが、表面吸着ポリマーを含む。任意に、少なくとも１つの分離流体ゾーンが、表面吸着ポリマーを含む。任意に、少なくとも２つの流体試料ゾーンが、表面吸着ポリマーを実質的に含まない。任意に、少なくとも１つの流体分離ソーンおよび少なくとも１つの流体試料ゾーンが、表面吸着ポリマーを含む。任意に、前記流体試料ゾーンのそれぞれが、表面吸着ポリマーを含む。任意に、各流体分離ゾーンが、表面吸着ポリマーを含む。任意に、各流体分離ゾーンおよび各流体試料ゾーンが、表面吸着ポリマーを含む。任意に、１〜１００の少なくともいずれか１つの整数の流体試料ゾーンがチャンネルに設けられ、具体的には各整数は、本発明の実施形態含まれてもよいし、あるいは除外されてもよい。任意に、少なくとも１つの流体試料ゾーンおよび前記少なくとも１つの分離流体ゾーンは、チャンネルにおいて流動する。
【００２９】
他の態様において、本発明は：（ａ）基板に配置されるチャンネルを提供する段階；（ｂ）前記チャンネルに第１流体ゾーンを導入する段階であって、前記第１流体ゾーンが、前記チャンネルの表面に非共有結合で結合することが可能な表面吸着ポリマーを含有する段階；（ｃ）対象の流体試料を含む第２流体ゾーンを前記チャンネルに逐次的に導入する段階であって、前記第２流体ゾーンが、前記チャンネルに導入された場合に、前記表面吸着ポリマーを実質的に含まない段階；を含む、マイクロチャンネルの表面を処理する方法を包含する。その表面は、マイクロチャンネルと流体ゾーンとの間の界面を意味する。好ましい実施形態において、表面吸着ポリマーは、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）などのポリアクリルアミドのファミリーからのポリマーである。他の好ましい実施形態では、プロピレングリコール（ＰＧ）およびエチレングリコール（ＥＧ）、およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリグリコールなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに他の好ましい実施形態では、プロピレンオキシド（ＰＯ）およびエチレンオキシド（ＥＯ）、およびポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリオキシドなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに好ましい実施形態では、表面吸着ポリマーは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリビニルピロリドンである。最も好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリマーのブロック共重合体が使用され、例えばＰＰＧおよびＰＥＧおよびＰＡＭおよびＮＩＰＡＭおよびＰＤＭＳのブロック共重合体が含まれ、ポリアクリルアミド−ブロック−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルシロキサン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＤＭＳ−ＰＥＧ）がさらに含まれる。
【００３０】
さらに他の態様において、本発明は：（ａ）基板に配置されるチャンネルを提供する段階；（ｂ）前記チャンネルに少なくとも２つの流体試料ゾーンを導入する段階であって、前記少なくとも２つの流体試料ゾーンのそれぞれが、対象の流体試料を含み、かつ前記少なくとも２つの流体試料ゾーンのそれぞれが、前記チャンネルの表面に非共有結合で結合することが可能な表面吸着ポリマーを含む段階；を含む、マイクロチャンネルの表面上に吸着されたポリマーコーティングを動力学的に維持または再生する方法を包含する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも２つの流体ゾーンまたは流体試料ゾーンが、個々のチャンネルに設けられる。特に好ましい実施形態では、５〜１０００の少なくともいずれか１つの整数の流体ゾーンまたは流体試料ゾーンが、個々のチャンネルに設けられる。隣接する流体ゾーンまたは流体試料ゾーンは、少なくとも１つの流体分離ゾーンによって隔てられていることが好ましい。
【００３２】
流体試料および表面吸着ポリマーが、互いの存在下で提供される場合、流体試料およびポリマー溶液は、混合物として、または別々に本発明の装置に導入することができる；別々に導入された試料およびポリマーは、装置において混合される。
好ましい実施形態では、ポリマー溶液は、チャンネルを通って流れる。さらに記述するように、ポリマー溶液は、チャンネルを通って連続流れで移動することが好ましい。さらに好ましい方法では、チャンネルにおける溶液、流体試料ゾーンもしくは流体分離ゾーンなどの液体の移動は、圧力勾配によって生じる。任意に、前記溶液の移動は、電気浸透、界面動電、電磁流体力学によって、または温度勾配系によって生じる。
【００３３】
他の態様では、本発明は：（ａ）ポリマーが装置表面上に非共有結合で吸着するように、表面吸着ポリマーを含有する溶液を装置に導入する段階；（ｂ）前記装置に流体試料を導入する段階；（ｃ）前記装置において流体操作を行う段階；を含む、装置において流体操作を行う方法に関する。前記装置は、マイクロタイタープレートまたはマイクロ流体装置であることが好ましい。
【００３４】
本発明は、本発明の方法に従って処理されたチャンネルを含む、マイクロチャンネルおよびマイクロ流体デバイスもまた包含する。具体的には、本発明は、基板と、前記基板に配置された少なくとも１つのチャンネルとを備えるチャンネルまたはマイクロ流体デバイスに関するものであり、そのチャンネルは、その上に非共有結合で吸着された本発明による表面吸着ポリマーを有する。
【００３５】
そのチャンネルは、幅約１μｍ〜約３ｍｍを有することが好ましい。前記基板は、シリコン、石英、ガラス、セラミックス、または例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、フルオロポリマー、ポリアミド、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、およびエラストマーなどのプラスチックから本質的になることが好ましい。
【００３６】
本発明のマイクロ流体デバイスはさらに、前記チャンネル全体に圧力勾配を生じさせ、それによって、前記チャンネルにおいて液体の移動を生じさせる手段、および／または前記チャンネルにおける液体の温度を調節するための温度調節手段を備えることが可能である。
本発明の方法はさらに、前記チャンネルおよび／前記デバイスにおいて、少なくとも１つの流体操作を行うことを含む。本発明の方法は、逐次的な流体操作を行うのに特に適している。本発明の方法は、チャンネルまたは装置において、２〜１０００の少なくともいずれか１つの整数の流体操作を行うことを含むことが可能である。
【００３７】
他の態様では、本発明は、装置において流体操作を行うための、流体試料中の表面吸着ポリマーの使用を包含し、前記表面吸着ポリマーは、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）などのポリアクリルアミドのファミリーからなる群から選択される。他の好ましい実施形態では、プロピレングリコール（ＰＧ）およびエチレングリコール（ＥＧ）、およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリグリコールなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに他の好ましい実施形態では、プロピレンオキシド（ＰＯ）およびエチレンオキシド（ＥＯ）、およびポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリオキシドなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに好ましい実施形態では、表面吸着ポリマーは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリビニルピロリドンである。最も好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリマーのブロック共重合体が使用され、例えばＰＰＧおよびＰＥＧおよびＰＡＭおよびＮＩＰＡＭおよびＰＤＭＳのブロック共重合体が含まれ、ポリアクリルアミド−ブロック−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルシロキサン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＤＭＳ−ＰＥＧ）がさらに含まれる。任意に、流体操作を行う前記段階は、反応、インキュベーション、希釈、滴定、精製、検出および薬物スクリーニングアッセイ、結合アッセイ、および測定アッセイ（例えば、キネティックスの測定）からなる群から選択される流体操作を実施することを含む。
【００３８】
本発明の方法、システムおよび装置のさらに好ましい実施形態では、流体試料または対象の流体試料は、試験分析物または試薬を含む。流体試料は、有機物質を含むことがさらに好ましい。好ましくは、前記有機物質は生体分子であり、前記生体分子は：核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰなどのｄＮＴＰ、およびｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰなどのｄｄＮＴＰ）、アミノ酸（例えば、ポリペプチド、ペプチド、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、システイン、およびチロシンなどのアミノ酸）、脂質、化学化合物（例えば、蛍光標識）、およびさらに具体的には受容体または抗体およびそれらのリガンド、細胞および成長因子、成長抑制物質、酵素および基質からなる群から選択することができる。前記生体分子は、固体基板に対して強い親和性を有する、異なる極性の大分子と小分子との複合混合物（例えば、核酸およびタンパク質分子、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、蛍光標識等）を含むことが可能である。多数の生体分子が、本発明の個々の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。他の態様では、流体試料は、ＰＣＲ反応混合物、ＬＣＲ混合物、プライマー伸長反応混合物またはゲノタイピング反応混合物（例えば、マイクロシークエンシング（ＭＩＳ）混合物）を含むことが可能であり、それらのいずれかが、本発明の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。
【００３９】
本発明の方法、システムおよび装置を、広範囲の流体操作に従って有利に用いることが可能であり、その一部が本明細書中でさらに説明される。いくつかの態様では、流体操作を行う段階は、反応、インキュベーション、希釈、滴定、精製、検出、混合および薬物スクリーニングアッセイからなる群から選択される流体操作を実施することを含むことが可能であり、それらの操作のいずれかが、本発明の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。本発明の好ましい実施形態において、流体操作は、生化学反応を行うことを含む。さらに詳細には、生化学反応は、プライマー伸長反応、温度サイクル、核酸増幅反応、または酵素精製を含むことが可能であり、それらのいずれかが、本発明の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。特に好ましい温度サイクル反応には、ＰＣＲまたはＭＩＳ反応が含まれる。任意の数または組み合わせの液体操作を本発明に従って行うことが可能である。一態様において、装置は、１つの流体操作に使用され、他の態様では、本発明のチャンネルまたは装置において、少なくとも２つの逐次的な流体操作が行われる。前記の逐次的流体操作は、本発明の同じチャンネルまたは装置で行われることが好ましい。好ましい実施形態において、本発明は、２０〜０．１μｌのいずれかの整数よりも少ない容積での流体操作に関する。具体的には、いずれかの整数が、本発明の実施形態に含まれてもよいし、または除外されてもよい。
【００４０】
本発明の装置を構成する好ましい表面は、ガラス、石英、シリコン、金属またはプラスチックで製造されているか、またはガラス、石英、シリコン、金属またはプラスチックから本質的になり、それらのいずれかは、本発明の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。前記プラスチックはポリマーであることが好ましく、前記ポリマーは様々な極性のポリマーであることがさらに好ましい。その表面は、極性、非極性、親水性または疎水性である。好ましい表面は極性の疎水性表面、非極性の疎水性表面、極性の親水性表面、および非極性の親水性表面であり、そのいずれかは、本発明の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。そのポリマーは、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、フルオロポリマー、ポリアミド、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、およびエラストマーからなる群から選択されることがさらに好ましく、そのいずれかは、本発明の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。本発明で用いられる、「基板」という用語は、被覆またはコーティング（例えば、ポリマーコーティング）の下にある構造面を意味する。本発明では、マイクロチャンネルを基板に配置してもよいし、または装置を基板で作製してもよい。好ましい実施形態において、「装置」という用語は、本明細書においてデバイスまたは容器と同義で用いられている。本発明の装置は、流体試料の保存、分配または反応に使用される。前記装置は、基板に配置されたチャンネル、または試験管、マルチウェルプレート、ピペット、ピペット先端、マイクロタイタープレート、反応ウェル、マイクロチャンネル、マイクロ流体装置、キャピラリーおよびマイクロ遠心管、試験管、マルチウェルプレート、ピペット、ピペット先端、マイクロタイタープレート、反応ウェル、マイクロチャンネル等の前記表面を有するデバイスおよび容器のどちらも含み、それらのいずれかが、本発明の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。前記チャンネルはマイクロチャンネルであることが好ましい。本発明のマイクロ流体デバイスに配置されたマイクロチャンネルを含む、本発明のマイクロチャンネルは、約１μｍ〜約３ｍｍの幅を有することが好ましい。
【００４１】
特定の態様では、前記デバイス、容器または装置の表面は未処理の表面であり；シリコン基板を用いた場合には、シラン処理していない表面であることが好ましい。前記表面は疎水性でもよいし、または親水性でもよい。他の態様では、本発明によるポリマーで処理する前に、その表面を前処理してもよい。
本発明はまた、反応ウェルを含むマイクロ流体デバイス、および反応ウェルで行われる流体操作に関する。一実施形態において、本発明は、本発明の方法に従って処理したチャンネルにおける流体操作によって流体試料を移動すること、またはそのチャンネルにおいて流体操作を行うこと、および本発明に従って処理した反応ウェルにおいて生化学反応を行うことを含む。前記反応ウェルは、マイクロタイタープレート中にあることが好ましい。前記マイクロタイタープレートはポリプロピレン製マイクロタイタープレートであることがさらに好ましい。本発明のマイクロタイタープレートは、９６、３８４、１５３６ウェル以上を有するマイクロタイタープレートなどの、高密度マイクロタイタープレートであることが好ましい。
【００４２】
本発明の特に好ましい実施形態において、表面吸着ポリマーは、水溶性ポリマーまたは非極性液体可溶性ポリマーである；他の好ましい実施形態では、表面吸着ポリマーは非荷電ポリマーである。そのポリマーはシリカ吸着ポリマーであることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、ポリマーは、少なくとも１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６または５×１０６ダルトンの分子量を有する。ポリマーは、少なくとも１×１０６ダルトンの分子量を有することがさらに好ましい。表面吸着ポリマーは、ポリアクリルアミドのファミリーから選択されることが好ましい。さらに好ましくは、前記表面吸着ポリマーは、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）などのポリアクリルアミドのファミリーから選択される。他の好ましい実施形態では、プロピレングリコール（ＰＧ）およびエチレングリコール（ＥＧ）、およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリグリコールなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに他の好ましい実施形態では、プロピレンオキシド（ＰＯ）およびエチレンオキシド（ＥＯ）、およびポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリオキシドなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに好ましい実施形態では、表面吸着ポリマーは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリビニルピロリドンである。最も好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリマーのブロック共重合体が使用され、例えばＰＰＧおよびＰＥＧおよびＰＡＭおよびＮＩＰＡＭおよびＰＤＭＳのブロック共重合体が含まれ、ポリアクリルアミド−ブロック−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルシロキサン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＤＭＳ−ＰＥＧ）がさらに含まれ、それらのいずれかが、本発明の種類として含まれてもよいし、または除外されてもよい。ポリマーは、水溶液または非水溶液中に存在することが可能である。最も好ましい実施形態において、表面吸着ポリマーは、流体試料の生体分子よりも、表面に対して高い親和性を有する。ポリマー分子１個当たりの全吸着エネルギーは、少なくとも１以上のｋＢＴ単位に達する。
【００４３】
本発明の方法および装置の他に、本発明は、本発明の表面吸着ポリマーを含有する組成物もまた包含する。本明細書にさらに記述するように、例えば、本発明による表面吸着ポリマーと対象の流体試料とを含有する組成物が含まれ、その表面吸着ポリマーは、反応物の１つではない。例えば、これらの組成物を調製し、続いて本発明の装置に混合物として提供することが可能である。
【００４４】
本発明はさらに、特にマイクロチャンネルまたはプラスチック装置において流体操作を行うための表面吸着ポリマーの使用を含み、その表面吸着ポリマーは流体操作の試薬のうちの１つではなく、または前記表面吸着ポリマーは反応物に対して活性化または抑制効果を及ぼさない、または前記吸着ポリマーは反応を生じさせるのに必要ではない。表面吸着ポリマーは、例えば流体操作が行われるはずの試料を含有する混合物中の添加剤として使用することができる。前記流体操作は、混合段階、反応、インキュベーション、希釈、滴定、検出、薬物スクリーニングアッセイ、結合アッセイ、および測定アッセイ（例えば、キネティックスの測定）からなる群から選択される操作であることが好ましい。最も好ましくは、流体操作は生化学反応であり；さらに好ましくは、その生化学反応は温度サイクルを含む。
詳細な説明
流体操作、特に生物学的反応は、効率を最大にし、コストを最小限に抑えるために、同じ装置における少量での逐次段階を必要とする場合が多い。例えば、一塩基伸長によるゲノタイピングには、３つの生物学的逐次反応［つまり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、酵素精製およびマイクロシークエンシング（ＭＩＳ）］が必要である。このように、同一装置において２つ以上の逐次反応を行うことは効率的かつ有益である。このような場合には、吸着が原因となる反応間の汚染がなく、前の反応からの生体分子は、不要な吸着が原因で次の反応を汚染することがない、ということが保証されなければならない。しかしながら、装置の表面上に残りの生体分子が多量に吸着するために、これは達成するのが困難であることが判明している。
【００４５】
したがって、本発明は、表面吸着ポリマーを用いて、様々な表面上への有機物質の吸着を低減する方法を提供する。具体的には、表面に非共有結合で結合し、その結果前記表面上への有機分子の好ましくない吸着を防ぐ、表面吸着ポリマーを添加することを含む、流体操作を行う方法である。本発明は、表面吸着ポリマーを含む装置およびシステム（例えば、キット）もまた提供する。さらに、本発明は、マイクロ流体チャンネルの表面を処理する方法であって、そのマイクロ流体素子表面が、不活性化するためにコーティングされ、かつこのコーティングを容易に再生することができる方法を提供する。本発明の表面吸着ポリマーは、特に温度サイクルまたはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの重合を含む用途において、生化学反応に必要な温度および条件で安定性である。
【００４６】
本発明の表面不活性化の方法は、表面吸着ポリマーで表面を動力学的コーティングする手段もまた提供する。その表面は、表面上への有機物質の吸着を低減するために前処理されていないことが好ましい。動力学的コーティング方法によって、表面を必要な回数再生することが可能となり、表面を含む装置の寿命が延び、かつ本発明のいずれかの表面のバッチ間再現性が高まる。この方法によって、表面を特別に前処理する必要もなくなる。
【００４７】
本明細書で使用される「基板」という用語は、被覆またはコーティング（例えば、ポリマーコーティング）の下にある構造面を意味する。基板は、シリコン、石英、ガラス、セラミックスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、フルオロポリマー、ポリアミド、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、およびエラストマー）であることが可能である。プラスチック基板はポリスチレンを含むことが好ましい。本発明では、マイクロチャンネルを基板に配置してもよいし、または装置を基板で作製してもよい。基板は、水性流体試料の極性よりも低い極性のプラスチックであることが好ましい。
【００４８】
本明細書で使用される「装置」という用語は、本明細書全体を通して、装置と同義で用いられている「デバイス」および「容器」という用語を含む。装置は、特定の用途または目的のために設計された要素、ツールまたは構成要素を意味する。前記使用は、試料、好ましくは流体試料の保存、分配または反応を含む。装置の例には、限定されないが、マイクロチャンネル、マイクロ流体装置、キャピラリー、試験管、マルチウェルプレート、ピペット、ピペット先端、マイクロタイタープレート、反応ウェル、マイクロ遠心管が含まれる。
【００４９】
本明細書で使用される「マイクロタイタープレート」という用語は、流体試料の保存および反応に使用される、または流体操作を行うのに使用されるマルチウェルプレートを意味する。通常、そのプレートは、シリコン、石英、ガラス、セラミックスまたはプラスチックなどの基板で作製されており、９６、３８４、１５３６ウェル以上を含む。同じマイクロタイタープレートを逐次流体操作を行うために使用してもよい。前記流体操作は、温度サイクル（例えば、ＰＣＲ）、酵素精製、プライマー伸長反応（例えば、ＭＩＳ）などの生化学反応であることが好ましい。
【００５０】
本明細書で使用される「チャンネル」という用語は、「マイクロチャンネル」という用語を包含する。また、本明細書で使用される「マイクロ流体素子基板」は、マイクロチャンネルが配置される固体基板を意味するものである。マイクロ流体デバイスは、通常１個を超えるマイクロチャンネルを備え、任意に、流体操作の実施に関連する他の構成要素または特徴、例えばリザーバ、入口／出口ポートならびに検出装置、試薬保存手段および分配手段、温度調節手段等を備える、マイクロ流体素子基板を含む。
【００５１】
新規な不活性化方法に基づいて、本発明は、流体操作、特に化学および生化学反応、特に生体分子を含有する流体の取り扱いを含む流体操作を行う方法もまた提供する。
本明細書で使用される「流体操作」とは、流体の移動または液相での作業の実施を含む、任意の流体の取り扱いを意味する。流体操作には、限定されないが、反応、インキュベーション、分離、希釈、滴定、混合、精製、検出、薬物スクリーニングアッセイ、結合アッセイ、測定アッセイ（例えば、キネティックスの測定）ならびに一般に多数の逐次操作を伴う任意の操作、および特に試験分析物または試薬が生体分子である場合に、流体が試験分析物、試薬もしくは生体分子を含有する任意の流体操作が含まれる。
【００５２】
本明細書で使用される「化学反応」または「生化学反応」とは、１種または複数種の物質が、１種または複数種の異なる物質に化学的または生化学的に変化するプロセスを意味する（例えば：反応物＋反応物（１種または複数種）−任意にいずれかの触媒（１種または複数種）−−＞生成物（１種または複数種））。生化学反応は通常、生体分子によって仲介される、または生体分子を含む反応である。
【００５３】
反応混合物は、化学または生化学反応を起こすのに必要な成分を含有する１つの混合物を意味する。その例には、限定されないが、ＰＣＲ混合物およびＭＩＳ混合物が含まれる。
本明細書で使用される「流体試料」または「対象の流体試料」は、限定されないが、流体操作が行われるはずの任意の分子を包含し、任意の生体分子または化学分子が包含される。流体試料または対象の流体試料には、限定されないが、試験分析物または試薬が含まれる。「試験分析物」という用語は、分析手順で測定される物質を包含し、化学物質ならびに生体分子が含まれる。「試薬」という用語は、化学または生化学反応における反応物を意味する。
【００５４】
本明細書で使用される「生体分子」とは、生体によって合成される有機分子、およびその誘導体、変異体および断片を意味する。好ましい生体分子は巨大分子である。さらに好ましい生体分子は、制限されないが、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰなどのｄＮＴＰ、およびｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰなどのｄｄＮＴＰ）、アミノ酸（例えば、ポリペプチド、ペプチド、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、システイン、およびチロシンなどのアミノ酸）および脂質を含む。本発明のいずれかの部類または種類は含まれてもよいし、または本発明の実施形態から除外されてもよい。
【００５５】
本発明の第１の態様において、特にマイクロタイタープレートなどのマイクロ流体デバイスおよびプラスチックデバイスで使用される、試験管、マルチウェルプレート、ピペット、ピペット先端、マイクロタイタープレート、反応ウェル、マイクロチャンネル、マイクロ流体装置、キャピラリー、およびマイクロ遠心管等の表面改質に用いられる水溶性非荷電表面吸着ポリマーを提供する。ＢＳＡとは異なり、そのポリマーの溶解性は、生物学的反応に重要な温度範囲内（つまり、３７〜９４℃）で劇的に変化しないことが好ましい。そのポリマーはホモポリマーであってもよいし、またはコポリマーであってもよい。マイクロ流体デバイスにおけるチャンネルの表面改質によって、かかるマイクロデバイスが化学反応または生化学反応に適するようになる。任意の適切な表面吸着ポリマーを使用することができるが、好ましいポリマーには、例えばポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）などのポリアクリルアミド、プロピレングリコール（ＰＧ）およびエチレングリコール（ＥＧ）、およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリグリコールなどの他のポリマーが含まれる。他の好ましいポリマーは、プロピレンオキシド（ＰＯ）およびエチレンオキシド（ＥＯ）、およびポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリオキシドである。さらに他の好ましいポリマーは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリビニルピロリドンである。最も好ましいポリマーは、本明細書に記載のポリマーのブロック共重合体であり、例えばＰＰＧおよびＰＥＧおよびＰＡＭおよびＮＩＰＡＭおよびＰＤＭＳのブロック共重合体が含まれ、ポリアクリルアミド−ブロック−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルシロキサン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＤＭＳ−ＰＥＧ）がさらに含まれる。表面吸着ポリマーの分子量は、吸着されたポリマー層の安定性に対して重要である可能性がある。任意の分子量のポリマーを選択することができるが、ポリマーは、高温で吸着されたポリマー層の安定性を向上させる、１×１０６ダルトンを超える分子量であることが好ましい。約１×１０６ダルトン以上の分子量を有するポリマーが、生物学的用途、特に温度サイクルを含む反応に特に有用である。ポリマーをさらに本明細書中で説明する。
【００５６】
本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、共に共有結合した小さなモノマーサブユニットで構成される分子を意味する。「ポリマー」という用語は、１種類のモノマーのみで構成されるポリマーを示す「ホモポリマー」という用語、ならびに２種類以上のモノマーで構成されるポリマーを示す「コポリマー」という用語を包含する。
【００５７】
そのポリマーは、ポリマー溶液として、好ましくは流体試料中の添加剤、例えば反応混合物として、表面に導入することができる。溶媒中にて単独で、または例えば生体分子、化学物質もしくは細胞と組み合わせて、ポリマーを導入することができる。表面改質に有用なポリマー濃度は、好ましくは約０．００１％〜約５％（重量／体積）の範囲である。好ましい濃度は約０．１％（重量／体積）である。「ポリマーおよび溶液」の題名のセクションで本明細書においてさらに記述するように、ポリマー濃度、ポリマー長さおよびポリマーを含有する溶液の粘度は、異なるチャンネルおよび流体操作に適するように適応させることができことを理解されよう。
【００５８】
本発明のポリマーは、従来から使用されている表面不活性化方法と比較していくつかの利点を有する。ＰＤＭＡなど、本発明の特定のポリマーは、生物学的反応に重要な温度範囲で水溶性であるが、ＢＳＡは高温（＞約６０℃）で変性し、極性が低くなる（疎水性が高くなる）。ＰＤＭＡなどのポリマーはまた、非荷電であり（ＰＤＭＡは、アルカリ緩衝液中にて高温で加水分解すると負に帯電するが）、ＢＳＡよりも化学的に単純な分子であり、改質表面と試薬との非特異的な相互作用の可能性が低減される。
【００５９】
装置、デバイスおよび容器、さらに具体的には、それらが作られている基板は、任意の形をとることが可能であり、それらの例をさらに本明細書で説明する。例えば、プラスチックを使用して、独立したキャピラリーなどにおいて管状チャンネルを作製することができる。管状チャンネルまたは薄い基板層に通常配置されるチャンネルは、例えばマイクロ流体システムで用いられる液体貯蔵または分配デバイス、例えばキャピラリーピペッター、流体試料をマイクロチャンネルもしくはマイクロ流体デバイスに移すのに使用されるキャピラリーにおいて、あるいはその開示内容が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開番号：ＷＯ  ００／２１６６６に記載のマイクロチャンネルに流体試料を導入するためのデバイスを含む、貯蔵チャンネルおよび／または流体リザーバを備える独立した貯蔵デバイスにおいて用いられる。マイクロチャンネルを使用して、多種多様な流体操作を行うことが可能であるが、チャンネル表面の不活性化に関連するポリマーおよびその方法は、ＰＣＲおよび単一ヌクレオチドプライマ伸長、ならびに特にタンパク質が１種または複数種の異なる温度にさらされる場合のタンパク質の一般的な操作など、温度サイクルを含む流体操作に特に有利であることが理解されよう。したがって、好ましい態様において、マイクロ流体デバイスは、温度調節手段、特にチャンネルの内容物の温度を循環させる手段を備えるだろう。好ましくは、マイクロ流体デバイスは、１つまたは複数のチャンネル全体にわたり圧力勾配を生じさせることを含む流体移動手段を有するだろう。関連する温度調節手段、流体移動手段を含むマイクロ流体デバイス、ならびに流体操作を本明細書でさらに説明する。
【００６０】
表面上にポリマーを吸着するための数種類の異なる方法を提供する。ポリマー吸着の原理に関する更なる説明を、本明細書に示す。一例において、ポリマー溶液は、本発明のデバイスに試料を添加する前に、流体試料に添加される。他の例では、試験分析物または試薬を含有するような流体試料の存在下または非存在下のポリマー溶液は、ポリマーがチャンネル表面に吸着するようにチャンネルを通って移動する。ポリマー溶液の移動は、シリンジ、ぜん動ポンプおよび／または加圧ガスにより提供することができるような圧力勾配を生じさせることによって行うことが好ましい。チャンネルをポリマーでコーティングすると、任意の数の流体試料が、逐次的にチャンネルを通過することが可能である。ポリマー溶液、流体操作にかけられる流体の注入手段、および流体移動手段を本明細書でさらに説明する。本発明の方法に従って使用することができるマイクロ流体もまた本明細書でさらに説明する。多種多様なチャンネル基板、チャンネル外形、および流体試料を保存、取り扱い、注入および／または検出するための構成要素を本発明の方法に従って使用できることを理解されよう。
【００６１】
本発明に従ってポリマーで処理された任意の表面は、新しい表面吸着ポリマー溶液で再生することが可能である。上述のコーティングプロセスは、チャンネルを通してポリマー溶液を移動することによって任意の所望の回数で繰り返し行うことが可能である。ポリマー溶液は、同時に（つまり、対象の流体試料の存在下で）チャンネルを通して移動するか、または更なる試料を流す前にチャンネルを通して移動することができる。特に好ましい実施形態において、本発明は、動力学的コーティング方法を含む。その動力学的コーティング法は、チャンネルを繰り返し使用する場合に、変わらない表面品質を維持するために定期的にチャンネル表面を再生することを含む。これは、多くの試料がチャンネルで逐次的に流される、マイクロ流体用途に特に有用である。
【００６２】
本明細書で用いられるように、チャンネルに注入される個々の流体試料は、流体試料ゾーンと呼ばれるものを形成する。例えば、いくつかの流体試料ゾーンは逐次的に注入される。特定の実施形態において、ゾーン含有物の混合を防ぐために、流体試料ゾーンの間に流体分離ゾーンを設けることによって、流体試料ゾーンを分離することが好ましい。
【００６３】
本発明の方法の第１の例において、１つ、２つ以上の流体試料ゾーンがチャンネルに逐次的に設けられる。かかる実施形態では、表面吸着ポリマーは流体試料ゾーンに提供される。表面吸着ポリマーは、各流体試料ゾーンに、または特定の流体試料ゾーンのみに、または適切な間隔で提供することができる。
他の実施形態において、表面吸着ポリマーは、１つの流体試料ゾーンに、または２つ以上の流体試料ゾーンに提供されるが、流体分離ゾーン（１つまたは複数）には提供されない。他の実施形態では、表面吸着ポリマーは、１つまたは２つ以上の流体分離ゾーンに提供されるが、流体試料ゾーン（１つまたは複数）には提供されない。他の実施形態において、ポリマーは少なくとも１つの流体分離ゾーンに提供されるが、少なくとも１つの流体試料ゾーンには本質的に存在しない。さらに他の実施形態では、ポリマーは、少なくとも１つの流体分離ゾーンに、および少なくとも１つの流体試料ゾーンに提供される。
【００６４】
表面吸着ポリマーは、流体試料と共に含まれ、混合物としてチャンネル中に供給することができる。代替方法としては、表面吸着ポリマー溶液および流体試料を、別々の入口ポートを通して通常のチャンネル中に供給するか、または通常のポートを通して同時に供給することができる。流体試料は、例えば任意の試験分析物、試薬、反応混合物または生体分子を含む。したがって、表面吸着ポリマーは反応混合物中で添加剤として使用することができる。注入後、次いで表面吸着ポリマー溶液がチャンネル表面を再生するように、好ましくは連続流れ方式で、チャンネルを通してその溶液を移動することができる。
【００６５】
表面吸着ポリマー濃度は、特定の流体操作、または好ましくは特定の生化学反応に従って最適化することができる。一般に、チャンネルにおける液体媒体の粘度が劇的に増大しないように、かつ使用する表面吸着ポリマーの量が過剰でないように、ポリマー濃度を最小限にすべきである。最適なポリマー濃度を選択するために、マイクロ流体デバイスにおいて、可変ポリマー濃度で生化学反応を行うことがきる。例えば、実施例２に示すプロトコルを用いて、許容可能な生成物品質または収率が得られるポリマー濃度を決定することによって、最適ポリマー濃度を容易に選択することができる。
【００６６】
本発明は、本発明の表面吸着ポリマーでコーティングされたチャンネルにおいて様々な流体操作を実施する方法もまた提供する。動力学的コーティング法において、流体操作、特に生化学反応の実施は、試験分析物または試薬、好ましくは生体分子、反応混合物またはタンパク質を含む液体を、表面吸着ポリマーの存在下でチャンネルに提供することを含む。逐次的流体操作が同じチャンネルで行われる場合、表面吸着ポリマーを、各流体操作または各流体ユニットに添加する必要はないが、例えば２番目、３番目、４番目、５番目、１０番目、２０番目の流体操作ごとにのみ添加してもよい。
【００６７】
したがって、多種多様な流体操作を行うことができる。流体操作を実施する方法は、反応、インキュベーション、分離、希釈、滴定、精製、検出、薬物スクリーニングアッセイ、混合、結合アッセイ、測定アッセイ（例えば、キネティックスの測定）ならびに一般に多数の逐次操作を含む任意の操作、および特に試験分析物または試薬が生体分子である場合に、さらに好ましくは試験分析物または試薬が核酸またはアミノ酸である場合に、流体試料が試験分析物または試薬を含む任意の流体操作を行うことを含む。
１．ポリマーおよび溶液
本発明は、独立したキャピラリーチャンネルなどのチャンネルの表面改質およびマイクロ流体デバイスにおける表面改質に用いられる、水溶性の非荷電表面吸着ポリマーを提供する。任意の適切なポリマーを使用することが可能であり、その溶解性が生物学的反応に関連する温度範囲内（例えば、約２０〜１００℃、さらに好ましくは約３７〜９４℃）で劇的に変化しないポリマーが好ましい。好ましくは、シリカ吸着ポリマーが指定される。そのポリマーは、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）などのポリアクリルアミドのファミリーからのポリマーである。他の好ましい実施形態では、プロピレングリコール（ＰＧ）およびエチレングリコール（ＥＧ）、およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリグリコールなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに他の好ましい実施形態では、プロピレンオキシド（ＰＯ）およびエチレンオキシド（ＥＯ）、およびポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリオキシドなどの他のポリマーを、表面吸着ポリマーとして使用してもよい。さらに好ましい実施形態では、表面吸着ポリマーは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはポリビニルピロリドンである。最も好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリマーのブロック共重合体が使用され、例えばＰＰＧおよびＰＥＧおよびＰＡＭおよびＮＩＰＡＭおよびＰＤＭＳのブロック共重合体が含まれ、ポリアクリルアミド−ブロック−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルシロキサン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＤＭＳ−ＰＥＧ）がさらに含まれる。
【００６８】
ポリマーの合成は、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。適切なポリマー合成方法の例は、Ｏｄｉａｎ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， ＮＹ， １９９１）に記述されており、その開示内容全体を参照により本明細書に組み込む。
好ましいポリマー、ＰＤＭＡは、よく知られている方法に従って合成することができる。その開示内容が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６７，２９２号では、ＰＤＭＡの合成方法の一例が挙げられている。以下の実施例１に記述するように、その開示内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｖｉｏｖｙ， Ｊ．−Ｌ．， Ｈｏｕｒｄｅｔ， Ｄ．， Ｓｕｄｏｒ， Ｊ．， フランス特許番号９８  １６６７６に記述されるように、ＰＤＭＡを合成することも可能である。
【００６９】
ＰＰＧおよびＰＥＧのブロックコポリマー（ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＰＧおよびＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマー）またはＥＯおよびＰＯのブロックコポリマーが市販されている。ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）およびＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｒブロックコポリマー（ＥＯ−ＰＯ−ＥＯおよびＰＯ−ＥＯ−ＰＯ）が、例えばＢＡＳＦ社（ドイツ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）から入手可能である。
【００７０】
本明細書に記述するように、表面上へポリマーを吸着させる数種類の異なる方法が提供される。一例では、流体試料の存在下または非存在下のポリマー溶液を、ポリマーがチャンネル表面に吸着するようにチャンネルを通して移動させる。そのポリマー濃度は、チャンネルにおける液体媒体の粘度が劇的に増大しないように、かつ使用する表面吸着ポリマーの量が過剰ではないように最小限にされる。ポリマー溶液が試験分析物または試薬を含有する場合には、可能性のある生物学的反応のキネティックスに対するポリマー溶液粘度の影響を考慮すべきであることは理解されよう。ポリマー溶液の粘度は、それが生物学的反応に影響を及ぼさないように選択されることが好ましい。
ポリマーの特性
ポリマー分子（ＰＤＭＡ、ＤＮＡ等）は、鎖の外形長さＬの平方根（またはモノマーの数Ｎ）に比例する、その回転半径Ｒｇを有するランダムコイルとして挙動する：Ｌ＝Ｎ．ｌおよびＲｇ〜Ｌ１／２．ｌ１／２またはＲ〜Ｎ１／２．ｌ（ｌは、１つのモノマーの長さである）。その結果、ポリマー分子は、完全に伸ばした場合に考えられるサイズよりも、かなり小さなサイズで現れる。
【００７１】
一般に、所定の温度での、所定の溶媒中のポリマー溶液は、ポリマー質量濃度Ｃ、平均分子質量Ｍｗによって、およびポリマー溶液の粘度ηによって特徴づけることができる。
ポリマー溶液の濃度に関して、３つの異なる状態：（ａ）希釈；（ｂ）半希釈；および（ｃ）濃縮を認識することができる。希釈状態では、ポリマー鎖は、ポリマー／溶媒相互作用が望ましい良溶媒中で互いに単離される。ポリマー溶液の濃度が、臨界濃度（Ｃ＊）を超えて増大するに従って、ポリマー鎖は絡み合うようになる。それらの間のクロスオーバー（Ｃ〜Ｃ＊）を有する、希釈（Ｃ＜Ｃ＊）および半希釈（Ｃ＞Ｃ＊）状態を図１に示す。閾値（臨界濃度）は鋭くはないが、２つの状態の間のクロスオーバーの領域として定義される。スケーリングの独立変数から、Ｃ＊は、単一ポリマーコイル内の局所濃度に相当すると考えられる。
【００７２】
良溶媒において、これは：
Ｃ＊〜Ｎ／Ｒｇ３＝ａ−３Ｎ１−３γ＝ａ−３Ｎ−４／５  （１）
（式中、Ｎは、ポリマーコイル中のモノマーの数であり、Ｒｇ３は、ポリマーコイルの体積であり、ａは、ポリマーの持続長さである）を意味する。ポリマー分子の持続長さはその柔軟性を定義する。持続長さの物理的意味は、鎖の方向の記憶が、ｌよりも短い長さのスケールでのみ保持されることである（鎖の方向の記憶は、ｌよりも大きな長さのスケールでは失われる）。さらに実際面では、重複する閾値濃度は：
Ｃ＊＝１．５／［η］  （２）
としての、ポリマー溶液の固有粘度に関係する。
【００７３】
ポリマー溶液の固有粘度は、還元粘度ηｒｅｄ＝（η−ηｓ）／ηｓをポリマー濃度ゼロまで外挿することによって得られる（Ｓｕｎ Ｓ．Ｆ．， Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４）。ポリマー溶液の固有粘度は、Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの関係式：［η］＝ＫＭｗａ（式中、Ｋおよびａは、Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ係数である）にもまた関係する。
【００７４】
Ｃ＜Ｃ＊の場合、ポリマー溶液は、ポリマーコイルの希釈系としてみなすことができる。そのポリマーコイルは、剛体球として挙動する。これは、２つのコイルが良溶媒で重なるように押しやられ、各ポリマー／ポリマー接触は、ｋＢＴオーダー（ｋＢはボルツマン定数であり、Ｔは温度である）のエネルギーを生じさせる。重なり合ったポリマーコイルの間で多くの接触が起こらなければならないことから、全重複エネルギーは数ｋＢＴであり、ボルツマンの指数関数が非常に小さくなり、その結果、ポリマーコイルは互いに重なり合わない。
【００７５】
半希釈状態（Ｃ＞Ｃ＊）では、ポリマーコイルは互いに重なり合い、ポリマー溶液は、動力学的網目として挙動する。かかる溶液のすべての熱力学的性質（例えば、局所エネルギー、エントロピー等）は、溶液の濃度Ｃによってのみ制御されており、ポリマー鎖の長さＮによっては制御されていない。かかる動力学的網目の重要な長さのスケールは、異なるポリマー鎖間の平均距離（平均メッシュサイズ）である。ポリマー溶液の動力学的メッシュサイズＳは、Ｃ〜Ｃ＊に対するスケーリングの独立変数から誘導することが可能であり、ポリマー溶液濃度Ｃ９に反比例する（Ｃ＞Ｃ＊の場合のみ）：
Ｓ〜Ｒｇ（Ｃ＊／Ｃ）３／４  （３）
分子の拡散係数は、Ｅｉｎｓｔｅｉｎ−Ｓｔｏｋｅｓの関係式：
Ｄ＝ｋＢＴ／６πηＲ  （４）
（式中、Ｄは、分子拡散係数であり、ηは、ポリマー溶液の粘度であり、Ｒは、分子半径である）により、それらのサイズ、それらが拡散する媒体の粘度、および温度に関連する。生体分子の拡散係数は、溶液の粘度の増大に伴って減少するであろうことは明らかである。希釈状態（Ｃ＜Ｃ＊）のポリマー溶液の粘度ηは、ポリマー濃度に線形従属であるが（η〜Ｃ）、この従属は、半希釈状態（Ｃ＞Ｃ＊）でα＞１の場合には、非線形、つまりη〜Ｃαとなる。このように、生物学的試薬の拡散は、半希釈状態（Ｃ＞Ｃ＊）でのポリマー濃度のわずかな変化によって劇的に影響を受ける。
Ｄ＝ｋＢＴ／６πＣαＲ  （５）
ポリマー吸着
試薬の混合物を含む、表面改質に使用されるポリマー溶液のバルク濃度は、以下の重複閾値濃度Ｃ＊であることが好ましい。重複閾値濃度は、ポリマーの大きさが増大するのに伴って減少し、それによって、大きなポリマー（Ｍｗ＞１０６）を表面改質に使用した場合、低濃度のポリマー溶液（Ｃｂｕｌｋ＜１％）を用いるべきであることが示唆されている。
【００７６】
ポリマーと表面との間の相互作用が、溶媒と表面との相互作用よりも有利である場合に、表面へのポリマーの吸着が起こる。したがって、固体基板が、溶媒分子ではなくポリマーと相互作用する方を「選ぶ」場合には、溶媒（例えば、水）に高い可溶性のポリマーでさえ、固体基板上に吸着することができる。所定の溶媒に溶解したポリマーが、表面上に吸着するかどうかを推定する簡単な方法は、純粋溶媒の表面張力γｓ（例えば、水）および純粋なポリマーの表面張力γｐを測定することである。γｓ＞γｐである場合には、ポリマーは、特定の溶媒に溶解されれば表面上に吸着すると考えられる。表面へのポリマーの吸着を決定する、２つの主要な因子がある。第１の因子は、固体基板／モノマー（ポリマーの最小部分）相互作用（ポリマーの吸着に有利に働くエネルギー）である。第２の因子は、基板でのポリマーの立体配座状態の減少（鎖のエントロピーの低下）である。これは、モノマーに対する基板の不可入性が原因であり、それは、ポリマーが表面から離れようとするエネルギーである。さらに、良溶媒中の反発的なモノマー／モノマー相互作用は、ポリマーを表面から押しやるのに有利に働く（つまり、排除体積の相互作用が、良溶媒中の吸着ポリマー層の厚さを増大する傾向がある）。このように、ポリマーの吸着の強さは、引力と斥力との比によって得られる。
【００７７】
長いポリマーから形成された場合、吸着されたポリマーの層は安定である。例えば、ポリマー／表面相互作用は、吸着ポリマー層では比較的弱い（数分の１ｋＢＴ単位）。しかしながら、ポリマー中のセグメント／モノマーの総数の１０％を超える場合がある、表面と相互作用する多数のセグメントが原因で、ポリマー分子１個当たりの総吸着エネルギーは非常に大きくなり、数ｋＢＴ単位に達し、したがって、特に長いポリマーを使用した場合には、ポリマーの吸着は実質上不可逆性となる。さらに、表面に吸着された長いポリマーは、短いポリマーよりも高い自由度を有し、結果としてさらに安定な表面コーティングが得られる。それにもかかわらず、表面に吸着されたポリマーは、バルク溶液中のポリマーと交換される可能性があることが実験で示されている（Ｔｈｉｅｓ， Ｃ．， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ７０ （１９７６） ３７８３， ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ−Ｓｔｕａｒｔ， Ｊ． 等， Ｊ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ． （Ｐｈｙｓ．）， １８ （１９８０） ５５９）。最初の観察によって、表面に吸着されたポリマーは、バルク溶液中に存在する場合には大きなポリマーによって置き換えられることが示され、大きなポリマーから作られた吸着ポリマー層は、短いポリマーから作られた吸着ポリマー層よりも安定性が高いことが示唆されている。その結果として、Ｐｈｅｆｆｅｒｋｏｒｎ， Ｅ．， 等 （Ｊ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ． （Ｐｈｙｓ．）， ２３ （１９８５） １９９７） は、表面上に吸着されたポリマー鎖とバルク溶液中の同一の鎖との間の交換は、２次のキネティックス：
（吸着されたポリマー）＊＋（自由ポリマー）→（自由ポリマー）＊＋（吸着されたポリマー）
によって支配されていることを示しており、脱着率が、表面上のポリマー鎖の濃度Ｃ＊およびバルク溶液中のポリマー鎖の濃度Ｃに比例することを示唆している（−ｄＣ＊／ｄｔ＝ｋＣ＊Ｃ（ｋは定数である））。
【００７８】
吸着されたポリマー層の有意な特性は、隣接するポリマー分子間で強い反発相互作用である。これは、表面上のポリマーの数が増加すると、（ポリマーを有する）表面と吸着ポリマーとの間の引力エネルギーが減少することを意味する。言い換えれば、表面の「品質」は、吸着ポリマーによって変化し、したがって表面上に吸着する最初のポリマーおよびｎ番目のポリマー分子に対して、表面品質は同じではない。ポリマー鎖によって、表面に対する有限（平衡状態の）被覆率（濃度、Ｃｅ）が存在する。平衡状態の被覆率によって得られるよりも多いポリマーが表面上に吸着する場合、これらの分子の自由エネルギーがバルク溶液中のポリマーの自由エネルギーよりも高くなり、それらは速く脱着する。言い換えれば、平衡状態の被覆率を一定に保つ復元力が存在する。ほぼ一定な平衡状態の被覆率の条件は、飽和状態と呼ばれる。飽和状態は、一定のＣｅを維持するために、バルク溶液からのポリマーが直ちにそれらと置き換わる場合にのみ、ポリマー分子が吸着された層から逃げることができることを示す。
【００７９】
固体基板上に吸着された単一ポリマーを、図２に示す末端−ループ−列の構造の面から説明する。列に属するポリマーセグメントは表面に付着し、末端およびループのセグメントは溶液中にある。吸着されたポリマーのコンホメーションは、吸着された層の厚さ（Ｄ）のオーダーの長さで落ち着いている。かなり大きい長さのスケールでは、図３に示すように、ポリマーが分解して、相関しないポリマー小塊になる。
【００８０】
吸着されたポリマーは、図４に示すように、３つの領域：近位（ポリマー−固体相互作用の細部に非常に感受性である）、中心（この層は、自己相似である、つまり、濃度対距離（表面に垂直な）の依存性がべき法則によって支配されている）、および遠位（いくつかの大きなループおよび末端によって制御されている）から構成されている層を形成する。表面上に形成されるポリマー層（図４）は、相互作用を防ぎ、その結果として、立体（エントロピー）反発により表面で／表面に生体分子が吸着するのを防ぐ。
【００８１】
ポリマーの平均分子量は、マイクロチャンネルに対して考えられる用途に応じて変化することを読者は理解されよう。特定の実施形態では、ポリマー溶液は、少なくとも１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６または５×１０６ダルトンの平均分子量を有する。好ましい実施形態では、表面吸着ポリマーの分子量は１×１０６を超え、したがって、短いポリマー分子（＜１×１０６ダルトン）と比較して、表面上の鎖のエントロピー（不規則性）が増大するために、吸着されたポリマーの安定性が向上する。長いポリマーから形成された吸着ポリマー層の増大した安定性は、温度を変化させる／循環させることを含むプロトコル（例えば、ＰＣＲおよびＭＩＳ反応）には重要である。一般に、系の熱（ランダム化）エネルギーが増大したために、温度が上昇した場合、ポリマーは表面から脱着し得る。
【００８２】
さらに本明細書に記述するように、表面吸着分子、好ましくは本明細書に列挙したポリマーは、試料、試験分析物と共に、または好ましくは生体分子と共に、好ましくは反応混合物への添加剤として提供することが可能である。他の実施形態では、表面吸着分子は、特に試料、試験分析物、生体分子、または反応混合物の本質的に非存在下で、溶液中に提供されて、好ましくは同じマイクロチャンネル中の試験分析物間で表面を再生する。ポリマー溶液は一般に、適切な緩衝液もまた含むが、これは必要条件ではない。
【００８３】
表面改質に用いられる溶液中のこのポリマーの濃度は、約０．００１％〜約５％（重量／体積）の範囲である。
ポリマーの表面吸着特性は、公知の手段に従って決定することができる。ポリマーによる全表面被覆率（モノマー数／表面積ｃｍ２）および吸着ポリマー層の厚さは、流体力学的測定（ｄｅ Ｇｅｎｎｅｓ， Ｐ．Ｇ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ． ２７：１８９−２０９ （１９８７））によって、または偏光解析法（Ａｚｚａｍ， Ｒ．， Ｂａｓｈａｒａ， Ｎ．， Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｌｉｇｈｔ， Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ， １９７７； Ｃｈａｒｍｅｔ， Ｊ．Ｃ．， ｄｅ Ｇｅｎｎｅｓ， Ｐ．Ｇ．， Ｊ． Ｏｐｔ． Ｓｏｃ． Ａｍ． ７３： １７７７ （１９８３））によって容易に調べることができる。これらの文献の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
流体力学実験において、速度Ｖでポリマー層中に移動する、半径Ｒのコロイド粒子は、摩擦力（６πη（Ｒ＋ｅＨ）Ｖ）（式中、ｅＨは、吸着ポリマー層の流体力学的厚さである）に遭遇するだろう。偏光解析実験において、ブルースター角での面内偏光の残留反射率は、全表面被覆率に依存する（つまり、表面に吸着されたポリマーが存在しない場合、反射係数はゼロとなる）。偏光解析法を用いて、１〜１０００オングストロームの範囲のフィルム厚さを決定することが可能である。表面上のポリマー層について調べるための、さらに綿密な技術では、例えばエバネッセント波（その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｌａｉｎ， Ｃ．， 等， Ｐｈｙｓ． Ｒｅｖ． Ｌｅｔｔ． ４９： １６９４ （１９８２））または中性子散乱（その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｎｅｔｔ， Ｋ． 等， Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｏｎ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， Ｔａｄｒｏｓ， Ｊ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８２）が利用される。さらに、表面に吸着されたポリマー層の粘性および弾性は、表面力装置（ＳＦＡ）［Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ， Ｊ．Ｎ． 等， Ｆａｒａｄａｙ Ｔｒａｎｓ． Ｉ， ７４： ９７５ （１９７８）； Ｋｌｅｉｎ， Ｊ． 等， Ｎａｔｕｒｅ ３００： ４２９ （１９８２）； Ｋｌｅｉｎ， Ｊ．， 等， Ｎａｔｕｒｅ ３０８： ８３６ （１９８４）；および Ｄｈｉｎｉｊｗａｌａ， Ａ．， 等， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３０： １０７９−１０８５ （１９９７）］によって調べることができる。上記の参照文献のそれぞれの開示内容を参照により本明細書に組み込む。
２．動力学的モードでのポリマーの吸着
一実施形態において、チャンネルは、試験分析物または試薬とチャンネルが接触する前にポリマー溶液と接触する。例えば、ポリマーがチャンネル表面に吸着するように、チャンネルを通してポリマー溶液を移動させる。好ましくはその溶液は、チャンネル全体に圧力勾配を生じさせることによって移動され、例えば、注入シリンジまたは液体送出手段に基づく圧力または真空の使用によって生じさせることができる。代替方法としては、チャンネル、特に独立したキャピラリーなどにおけるチャンネルをポリマー溶液中に直接配置することができる；次いで、ポリマー溶液は、キャピラリーによってチャンネル中に吸い上げられるか、または圧力勾配によってチャンネル中に引き込むことが可能である。
【００８５】
チャンネルをポリマーでコーティングした後は、対象の流体試料を含有する溶液を、例えば任意の望ましい流体操作の一部としてチャンネルに導入することができる。
ポリマーコーティングが吸着されている任意の適切な表面は、本発明による新たな表面吸着ポリマーコーティングで再生または保持することができる。上述のコーティングプロセスは、チャンネルを通してポリマー溶液を移動させることによって所望の回数繰り返し行うことができる。このように、特に好ましい実施形態では、本発明は、動力学的コーティング方法を含む。動力学的コーティング方法を用いて、チャンネルが多数回使用される場合に、つまり連続流れとも呼ばれるチャンネルにおける逐次的流体操作で、一定した表面品質を提供するために、使用中にチャンネル表面を再生または保持することができる。
【００８６】
一実施形態において、表面吸着ポリマーは、対象の流体試料を含有する液体に添加剤として使用される。表面吸着ポリマーは、チャンネルに導入される各流体体積に、または２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、８番目、１０番目、２０番目、５０番目または１００番目の液体ごとに添加される。例えば、本発明の例示的なプロセスでは、表面吸着ポリマーは、ＰＣＲ混合物に、エキソヌクレアーゼ／エビ由来アルカリホスファターゼ（ＥＸＯ／ＳＡＰ）精製混合物に、およびマイクロシークエンシング（ＭＩＳ）混合物に添加される。この表面吸着ポリマーは表面上に吸着し、固体／液体界面でポリマー層を形成する。表面上の吸着層のポリマー濃度は、平衡値に達する。表面改質のためのポリマー濃度は通常、約０．００１％〜約５％（重量／体積）の範囲である。ポリマー濃度は、約０．０１％〜約１％（重量／体積）の範囲であることが好ましい。しかしながら、吸着されたポリマーの平衡濃度は、因子の中でも特に、温度およびチャンネルの表面材料に依存し、したがって溶液中のポリマー濃度は、特定の用途に従ってさらに最適化することができることは理解されよう。
【００８７】
上述のように、チャンネルに導入される液体の体積は、チャンネル中に逐次的に注入される場合にそうであるように、流体ゾーンと呼ぶことができる。流体ゾーンは、限定されないが、例えば水または緩衝液を含む、任意の適切な流体を含むか、または任意の適切な流体からなる。流体ゾーンはまた、試料を含んでもよい。流体ゾーン、特に試料（流体試料ゾーン）を含む流体ゾーンを、試料の拡散を低減するために流体ゾーンを分離することによって分離することが可能であり、またはいくらかの拡散が起こるように単に続けて導入することができる。好ましい実施形態では、流体操作はチャンネルにおいて逐次的に行われる。
【００８８】
少なくとも２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０または１００、２００または１０００の逐次的流体ゾーンがチャンネルに提供されることが好ましい。したがって、試料を含む少なくとも１つの流体ゾーン、または少なくとも１つの流体分離ゾーンにおいて、表面吸着ポリマーが提供される。表面吸着ポリマーは、少なくとも２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００もしくは１０００の試料または流体試料ゾーンに、あるいは少なくとも２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００もしくは１０００の流体分離ゾーンに存在することが好ましい。他の実施形態では、表面吸着ポリマーは、少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００もしくは１０００の流体分離ゾーンに提供され、流体試料ゾーンの少なくとも１つ、またはすべてに存在しない。代替方法としては、表面吸着ポリマーは、流体試料ゾーンと流体分離ゾーンのどちらにも提供される。表面吸着ポリマーは、１、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００もしくは１０００の流体試料ゾーンおよび少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００もしくは１０００の流体分離ゾーンに存在することが好ましい。表面吸着ポリマーは、すべての流体分離ゾーンに存在することが好ましい。
【００８９】
チャンネルをポリマー溶液で前処理してもよい（例えば、チャンネルを試験分析物または試薬と接触させる前に、チャンネルはポリマー溶液と接触する）ことは理解されよう。代替方法としては、ポリマーが添加されている流体試料を含む流体操作を、ポリマー溶液でチャンネルを前処理することなく行うことができる。
【００９０】
一例において、シリコン製マイクロ流体デバイスのチャンネル（数百μｍのサイズ範囲）を、最適化された濃度（例えば、現時点では０．１％）のＰＤＭＡの溶液（約１０μｌ）で充填し、１０分間平衡化する。続いて、ＰＤＭＡ（０．１重量／体積％）を含有する流体試料の交互のゾーン、および非極性流体分離ゾーンをデバイスに押し通す。各流体試料ゾーンは、生体成分（つまり、タンパク質試料、ＰＣＲ、ＥＸＯ／ＳＡＰまたはＭＩＳ反応混合物）およびＰＤＭＡを含有する。このように、マイクロ流体デバイスの表面は、生体成分を含有する試料がシステムに入る前にプレコーティングされ、次いで、各反応に対してチャンネル表面を再生するために、生体試料を含有する各流体ゾーンにＰＤＭＡが提供される。
【００９１】
表面吸着ポリマーは任意の適切な手段によってチャンネルに導入することができることは理解されよう。ポリマーは、試料との混合物として、または共通のもしくは別々の入口ポートを通して別々に導入することができる。
３．マイクロ流体デバイス
マイクロ流体素子基板は、多くの異なる形をとることができる。基板は、現在入手可能なポリマーもしくは石英ガラスキャピラリーなどの管状基板などにおける、チャンネルを取り囲む薄い基板層であることが可能である。他の実施形態において、基板は平面基板であり、その基板には１つまたは複数のチャンネルが配置される。通常、その平面基板には溝が作られ、被覆要素または適合する溝を含む第２基板で閉じられる。好ましい実施形態において、マイクロ流体デバイスは、複数のチャンネルが１つのマイクロ流体素子基板に配置されている、かかる集積化マイクロチャンネルシステムを含む。
【００９２】
基板は、任意の適切な材料である。好ましい基板材料は、シリカ、シリコン、ガラス、石英などのケイ酸をベースとする基板である。適切な基板材料には、金属ならびに、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、フルオロポリマー、ポリアミド、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、およびエラストマーを含むプラスチックなどのポリマーも含まれる。他の適切な基板は当技術分野で公知であり、それらもまた使用することができる。基板は、改質されていない表面を有してもよいし、または表面の特性を改質するために処理されてもよい；例えば、流体操作で使用する前に、シラン処理段階をシリコン基板上に行うことが可能である。
【００９３】
それに配置されたマイクロチャンネルを有する基板は、本明細書中でさらに記述するように、様々な用途で使用することができる。例えば、マイクロチャンネルは、反応チャンネルで流体を移動するために、マイクロ流体デバイス、サンプルもしくは試薬分配手段（例えば、デバイスへ、またはデバイスから流体を移動するための）において反応チャンネルまたはチャンバーへ流体を移動するために、あるいはデバイス（例えば、マイクロ流体デバイス）で使用される流体を保存するために使用することができる。
【００９４】
本発明に従って使用することができるマイクロ流体デバイスの一例は、いずれも２０００年７月２８日出願の、発明の名称「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｏｗ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ」の係属中の米国特許出願およびＰＣＴ出願番号：ＰＣＴ／ＩＢ００／０１１３７に示されている。
チャンネルは任意の適切な形状をとることが可能であり、マイクロ流体デバイスに任意の適切な形式で配置することが可能である。チャンネルの断面は、管状チャンネル、長方形チャンネル、ひし形チャンネル、半球形チャンネル等、または精密度が低い製造技術、例えばレーザーアブレーションから得られるような、さらに任意の形を含む様々な異なる形状のいずれかであることも可能である。通常、キャピラリーチャンネルの形状は、使用する基板の種類および製造方法に応じて異なるだろう。例えば、通常の石英ガラスキャピラリーでは、キャピラリーチャンネルは管状であるだろう。一方、平面基板を用いたシステムでは、チャンネルは通常、チャンネルの基板材料およびチャンネルの製造方法に応じて、ひし形、長方形または半球形の断面形状のいずれかを含むだろう。
【００９５】
微細加工チャンネルシステムを製作するための様々な製造技術が当技術分野で公知である。例えば、かかるデバイスには、半導体産業で一般に見られる基板が用いられており、それらの産業で通常使用されている製造方法は、容易に適用することができる、例えばフォトリソグラフィー、湿式化学エッチング、化学蒸着法、スパッタリング、電鋳法等である。同様に、ポリマー基板にかかるデバイスを製造する方法もまた容易に利用可能であり、その方法には、成形、型押し、レーザーアブレーション、ＬＩＧＡ技術等が含まれる。他の有用な製造技術には、中間のマイクロスケール構造を提供して、特定のマイクロスケールのデバイス要素を定義するために使用される貼り合わせまたは積層技術が含まれる。その技術は、Ｓｏｒａｂ Ｋ． Ｇｈａｎｄｉ， ＶＬＳＩ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ：  Ｓｉｌｉｃｏｎ ａｎｄ Ｇａｌｌｉｕｍ Ａｒｓｅｎｉｄｅ， ＮＹ， Ｗｉｌｅｙにも記述されている。
【００９６】
通常チャンネルは、内部断面寸法、例えば約１μｍ〜約３ｍｍの幅、深さまたは直径を有し、かかるチャンネルの大部分は、範囲約１０μｍ〜約１０００μｍの断面寸法を有するだろう。
特に好ましい態様では、複数の集積チャンネルを用いた平面のマイクロ流体素子基板が使用される。一般にその平面マイクロ流体デバイスでは、平面基板の表面に作製された集積チャンネルネットワークが用いられる。それに形成された相補的なチャンネルを有する、または有さない第２基板を、第１基板の表面上に重ね合わせて、チャンネルを被覆し、かつ封止し、それによってチャンネルが定義される。
【００９７】
流体リザーバまたは供給チャンネルが第一の流体操作、または反応、チャンネルに連絡する実施形態のように、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８５８，１９５号に記載のように、チャンネルが１つまたは複数の交点で連絡するようにチャンネルを配置することが可能である。代替方法としては、それらが他のチャンネルと連絡しないようにチャンネルを配置することが可能である。チャンネルは本質的に一直線に形成されるか、または曲がりくねったチャンネルなどにおける曲がり目を有することが可能である。特定の実施形態では、多数の並行分析を同時に行うために、多数のチャンネルが平行に配置される。
【００９８】
マイクロ流体デバイスは、反応ウェルもまた備えることが可能である。例えば、本発明に従って処理されたチャンネルを通して、流体サンプルを反応ウェルに移動することが可能であり、次いで反応は、その反応ウェルで行われる。次いで、その流体を、入口、更なる反応チャンバー、貯蔵リザーバ等にさらに移動することができる。
【００９９】
本明細書中で使用する、流体移動システムは、マイクロチャンネルを通して流体を移動または流すシステムである。公知の流体移動システムには、圧力または真空に基づくシステム、動電学的システム、電気浸透システムおよび電気流体力学的システム（ＷＯ９８／４５４８１および米国特許第６，０４６，０５６号）ならびに熱勾配移動手段（米国特許第６，０５７，１４９号）が含まれる。上記参考資料の開示内容を参照として本明細書に組み込む。好ましい実施形態において、マイクロポンプ、マイクロバルブおよびシリンジの使用を含む広範囲なメカニズムによって行うことができる、圧力または真空に基づく流体移動手段が使用される。流体移動手段は、１つまたはいくつかの連続的流体移動を生じさせるか、またはチャンネルを通る連続流れで流体の移動を生じさせることができる。
【０１００】
高温および変化温度条件でポリマーコーティングが安定性であるために、本発明は、チャンネルの内容物を加熱および／または冷却することが可能な温度調節手段を有するマイクロ流体デバイスにおいても有利に行われる。
任意に、対象のデバイスは、チャンネルに流体試料を導入するのを補助する界面手段（例えば、シリンジ）、他のマイクロ流体デバイス、リザーバ、流体貯蔵、分配デバイス等の広範囲な追加の構成要素を含むことも可能である。流体試料をマイクロチャンネルに導入するための装置の例は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開番号：ＷＯ００／２１６６６に記述されている。対象のデバイスは任意に、試薬、試験分析物等の流体成分を貯蔵するための１つまたは複数のリザーバを有することが可能である。そのデバイスは、試料または生化学反応からのシグナルをモニターすることができる検出ゾーン、および任意にシグナルを測定する検出手段を備えることが可能である。
４．流体操作
本発明の方法、およびポリマーコーティングされたチャンネルおよびそのチャンネルを含むマイクロ流体デバイスを、広範囲な流体操作に有利に用いることができる。
【０１０１】
流体操作には、操作の中でも、混合、反応の実施、インキュベーション、分離、希釈、滴定、精製、検出、混合、結合アッセイ、測定アッセイ（例えば、キネティックスの測定）および薬物スクリーニングアッセイが含まれる。流体操作は一般に、１種類または数種類の異なる温度に流体をさらすこともまた含む。流体操作はまた、多数の連続的操作を一般に伴う操作を含む。流体操作は、特に試験分析物または試薬が生体分子である場合、さらに好ましくは試験分析物または試薬が核酸またはアミノ酸である場合に、流体が試験分析物もしくは試薬などの試料を含有する任意の流体操作もまた含む。マイクロチャンネルで行うことができる流体操作の数例が、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開番号：ＷＯ９８／４５４８１に記述されている。流体操作の好ましい例は、プロテオミク分野などのチャンネルにおけるタンパク質の操作もまた含み、その例示的な応用が、いずれも２０００年７月２８日出願の、発明の名称「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｏｗ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ」の係属中の米国特許出願およびＰＣＴ出願番号：ＰＣＴ／ＩＢ００／０１１３７に示されている。
【０１０２】
一例では、マイクロ流体デバイスを用いて、例えば反応混合物に試薬を配合するために、複数の組成物中に試薬を配分するために、試薬の流体操作を実施する。一態様において、少量の試料または試薬の希釈を行うことが可能であり、特に希釈は連続方式で行われる。他の例において、アッセイの正規化のためのアッセイの滴定などの滴定を行うことができる。例えば、個々の成分が、定量的結果が得られる範囲にあるダイナミックレンジを定義するために、アッセイの様々な成分を滴定することができる。試薬および試験分析物に限定されず、マイクロ流体デバイスは、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開番号：ＷＯ９９／６７６３９に記述されている細胞の操作にもまた使用することができる。チャンネルおよびマイクロ流体デバイスは、数種類の成分を混合し、インキュベーションし、検出段階での結果を試験することを一般に含む薬物スクリーニングアッセイで使用することもできる。任意の所望の試薬または試験分析物を使用することが可能であり；その例には、制限されないが、核酸、アミノ酸、脂質、化学化合物、およびさらに具体的には受容体または抗体およびそれらのリガンド、細胞および成長因子および成長抑制物質、および酵素および基質が含まれることは理解されよう。マイクロ流体デバイスは、診断試験などにおいて、任意の所望の試験分析物を検出するためにもまた使用することができる。例えば、検出装置が特定のシグナルが存在すること、または存在しないことを決定するチャンネルに、核酸またはタンパク質試料などの試験分析物を通すことが可能である。マイクロ流体デバイスは、電気泳動などによって、成分を分離するためのチャンネルまたは手段をさらに備えることが可能である。特定の実施形態において、表面吸着ポリマーは、分離マトリックスの存在下で提供される。他の実施形態では、表面吸着ポリマーは、本質的に分離マトリックスの非存在下で溶液中に提供される。表面吸着ポリマーは、表面吸着ポリマーが結合することが可能な自由粒子（例えば、シリコン）の前記チャンネルにおける存在下または非存在下で提供することも可能である。
【０１０３】
本発明のチャンネルおよびマイクロ流体デバイスは多くの種類の生化学反応に有利であることもまた理解されよう。特に、本発明の表面吸着ポリマーコーティングは、多くの反応に必要とされる高温で安定であり、かつそのコーティングは、熱サイクル反応で遭遇する温度範囲全体で安定であることから、本発明は、核酸増幅などの反応およびプライマー伸長反応、例えばシークエンシングまたは様々なゲノタイピング方法によく適している。本発明に従ったデバイスおよびプロセスは、熱サイクルを伴う段階を含む生化学的プロトコルを連続流れで実施することを可能にする。本発明は、遺伝分析で広く使用されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に特によく適している。
【０１０４】
しかしながら、遺伝分析で使用することができる本発明は、生化学および分子生物学分野における多くのプロトコルにもまた使用することができる。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、生化学反応を行う方法を含み、その方法では、反応混合物が、表面吸着ポリマーでコーティングされたチャンネルに形成または提供され、熱サイクルが前記反応混合物に対して行われる。温度サイクルを必要とし、かつＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）から得られる好ましいプロトコルの例には、ＲＴ−ＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｗｈｉｔｅ， Ｂ．Ａ． Ｅｄ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６７：  Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ （１９９７） および「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」という題名の出版物， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）］が含まれる。ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）技術もまた公知であり、例えばＬＣＲ、Ｇａｐ  ＬＣＲ、ＲＴ−ＬＣＲ、非対称的ギャップＬＣＲ（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｒ．Ｌ． 等， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４：８０−８４， １９９４， ｔｈｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ （ＯＬＡ） ａｎｄ ＰＣＲ−ＯＬＡ ［Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ， Ｔ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２７（１）：２０１−９ （１９９５）］， ［Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｒ．Ｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． ４（２）：８０−４ （１９９４）］， （Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ａ． 等， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．８７（２２）：８９２３−７ （１９９０））が挙げられる。クローンまたはＰＣＲ反応を用いた環状シークエンシング反応、ならびに環状マイクロシークエンシング（一塩基プライマー伸長）反応（Ｃｏｈｅｎ， Ｄによる国際特許公開番号：ＷＯ９１／０２０８７）もまた公知である。上記の参考文献のそれぞれの開示内容を参照により本明細書に組み込む。
【０１０５】
実施可能な温度サイクル反応の最もよく知られている例は、核酸増幅である。当技術分野で好ましい方法は、試料の核酸配列の１本の鎖を使用して、その鎖の相補鎖を形成することを含み、その相補鎖がさらに、更なる反応サイクルのための核酸鋳型としての役割を果たすＰＣＲである。一般に、産生される標的の核酸断片の異なる末端に対して相補的な２つのプライマー配列を、試料の核酸とハイブリダイズとハイブリダイズさせるか、またはアニールさせる。ポリメラーゼ酵素およびヌクレオシド三リン酸の存在下でインキュベートした場合、プライマーは、反対側のプライマーの方向に標的配列に沿って伸長する。次いで、温度を上げることによって、伸長したプライマーを鋳型核酸から解離させ、そのプロセスを繰り返す。
【０１０６】
本発明に従って実施される他の好ましい反応は、シークエンシング反応である。サンガー・ジオキシチェーンターミネーター法（その開示内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓａｎｇｅｒ 等， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７ （１９７７））、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング（その開示内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｄｒｍａｎａｃ 等，米国特許第５，２０２，２３１号）、およびマクサム・ギルバート（化学分解）法を含む、核酸をシークエンシングするための数種類の異なる技術が公知である。マイクロチャンネルにおけるシークエンシングは、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開番号：ＷＯ９８／４５４８１に記述されている。
５．プラスチック表面上へのポリマー吸着
一実施形態において、本発明は：（ａ）水溶液中に含まれるポリマーを流体試料に添加すること；（ｂ）前記プラスチック装置に１つまたは複数の流体操作を行うこと；を含む、プラスチック装置の表面上への有機物質の吸着を低減する方法を提供する。代替方法としては、本発明の方法は、任意の他の極性／非極性界面（例えば、水／油または水／空気界面）上への有機物質の吸着を低減するために適用することができる。
【０１０７】
本発明の方法は、少量で流体操作を行う場合に特に有用である。少量で作業する場合、分子が界面に到達するまでの距離が減少した結果として、有機分子と界面（例えば、プラスチックデバイスと反応混合物との間の液体／固体界面、油および反応混合物との間の液体／液体界面、または水／空気界面）との相互作用の回数が無視できなくなる。その相互作用回数は、球面幾何学に関して体積でＶ−１／３として示され、同時に、界面対体積比（ＩＶＲ）は、体積が減少するにつれて増大する（ＩＶＲ〜Ｖ−１）。結果として、有機分子吸着の確率は、少量で作業した場合、劇的に増大する。しがたって、本発明の方法は、２０〜０．１μｌを含む任意の整数よりも少ない量で流体操作を行うことに向けられることが好ましい。
【０１０８】
本発明の方法を用いて、プラスチック装置の表面上への有機物質の吸着を低減することは、生化学反応の収率を増大することに関する。所定量の所定の反応混合物中に添加されるべきポリマーの最適量は、（ｉ）水溶液中に含まれる、異なる量の前記ポリマーを反応混合物に添加する段階；（ｉｉ）プラスチックデバイスで反応を行う段階；（ｉｉｉ）最高収率を得るために、添加すべきポリマーの量を決定する段階；を含む方法によって決定することができる。
【０１０９】
本発明の方法を用いて、プラスチックデバイスの表面上への有機物質の吸着を低減することは、第１流体操作からの有機分子による、その後の流体操作の汚染を低減することにもまた関するものである。所定量の所定の流体試料中に添加されるべきポリマーの最適量は、（ａ）水溶液中に含まれる、異なる量の前記ポリマーを第１流体試料に添加する段階；（ｂ）プラスチックデバイスで連続流体操作を行う段階；（ｃ）第１流体操作からの有機分子による連続流体操作の汚染を最低限にするために添加すべきポリマーの量を決定する段階；を含む方法によって決定することができる。本発明の好ましい実施形態において、前記汚染は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の望ましくない存在を含む。
【０１１０】
本発明の方法は、プラスチックデバイスの表面上への広範囲な有機分子の吸着を低減するために使用することができる。例えば、有機分子は、核酸、アミノ酸、アミノ酸、脂質および化学分子を含む。本発明の方法は、制限されないが、反応、インキュベーション、分離、希釈、滴定、精製、検出、混合、結合アッセイ、測定アッセイ（例えば、キネティックスの測定）および薬物スクリーニングアッセイを含む、プラスチックデバイスで行われる広範囲な流体操作に従って使用することができる。任意の回数または組み合わせの流体操作を本発明の方法に従って行うことができる。さらに具体的には、連続流体操作は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、エビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いた酵素精製およびマイクロシークエンシング（ＭＩＳ）からなるゲノタイピングプロセスを行うことを含む。特に好ましい第１流体操作はＰＣＲである。
【０１１１】
本発明の方法は、多種多様なプラスチックデバイスで流体操作を行うために使用することができる。かかるデバイスには、限定されないが、試験管、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、ピペット先端、反応ウェル、マイクロ遠心管が含まれる。かかるデバイスは、例えばポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリエチレン、フルオロポリマーおよびエラストマーで製造することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法は、様々な生物学的手順で通常使用されるマイクロタイタープレートにおいて流体操作を行うことに関する。一般に、１つの生物学的反応が、１つのマイクロタイタープレートの１つのウェル中で行われる。しかしながら、いくつかのプロセスでは、逐次反応が必要とされており、したがって、１つの特別なマイクロタイタープレートの同一ウェル中で２つ以上の逐次反応を行うために、マイクロタイタープレートウェルの表面上への有機物質の吸着を低減することが効率的かつ有益である。特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、高密度マイクロタイタープレート、例えば９６、３８４、１５３６ウェル以上のマイクロタイタープレートで行われる連続流体操作に関する。
【０１１２】
プラスチックデバイスで流体操作を行うのに使用する好ましいポリマーは、限定されないが、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）などのポリアクリルアミド、プロピレングリコール（ＰＧ）およびエチレングリコール（ＥＧ）、およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリグリコール、プロピレンオキシド（ＰＯ）およびエチレンオキシド（ＥＯ）、およびポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）およびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含むポリオキシド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、およびポリビニルピロリドンを含むホモポリマーのファミリーからのポリマーである。最も好ましい実施形態において、ブロック共重合体が使用され、例えば、本明細書中に記載のポリマーのブロック共重合体が使用され、例えばＰＰＧおよびＰＥＧおよびＰＡＭおよびＮＩＰＡＭおよびＰＤＭＳのブロック共重合体が含まれ、ポリアクリルアミド−ブロック−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＡＭ−ＮＩＰＡＭ）およびポリジメチルシロキサン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＤＭＳ−ＰＥＧ）などのブロック共重合体がさらに含まれる。
【０１１３】
本発明はまた、本発明の方法を用いて、プラスチックデバイスにおいて流動操作を行うためのキットに関する。かかるキットは、（ａ）本明細書に記載のポリマーを含む水性組成物；（ｂ）流体操作を行うための試薬；および（ｃ）試薬に添加すべき前記組成物の量を推奨する注意書き；を備える。代わりに、ポリマーが試薬中に含まれてもよい。そのキットは、１つの流体操作またはいくつかの流体操作を含むプロセスを行うために作られている。流体操作のいずれかを行うために、前記ポリマーを含む組成物を、すべての試薬または少なくとも１種類の試薬に添加することが可能である。特に好ましい実施形態において、本発明の方法を用いたキットは、ＰＣＲを行うための、またはＰＣＲ反応を含むプロセスを行うためのキットである。さらに好ましくは、本発明の方法を用いたキットは、ゲノタイピングプロセスを行うためのキットである。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態を説明かつ記述しているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって、それに様々な変更を加えることができることは理解されよう。
【０１１５】
【発明の実施の形態】
実施例
実施例１：表面吸着ポリマーの調製
好ましいポリマー、ＰＤＭＡを以下のプロトコルに従って合成した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド２．８ｇをＭｉｌｉＱ水３０ｍｌに溶解し、窒素で２時間脱気した。続いて、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５、０．４５１ｍｌ、濃度２．５ｇ／ｌ）、過流酸アンモニウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ８、０．４５１ｍｌ、濃度２０ｇ／ｌ）からなる酸化還元対を、アクリルアミド溶液に添加した。常に攪拌しながら、その溶液を３時間重合させた（Ｖｉｏｖｙ， Ｊ．−Ｌ．， Ｈｏｕｒｄｅｔ， Ｄ．， Ｓｕｄｏｒ， Ｊ．， フランス特許番号：９８ １６６７６； Ｊ．Ｓｕｄｏｒ 等， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２００１， ２２：７２０−２８）。重合したポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）を、１０００００ダルトンの分画分子量を有する膜（ミリポア、米国）を用いた限外濾過によって精製した。精製されたＰＤＭＡを一晩凍結乾燥させた。
実施例２：生物学的反応：ＰＣＲの実施
それに配置されたチャンネルを有するシリコン製マイクロ流体素子基板を、使用前に熱水（約９０℃）ですすいだ。５ｍｌポリプロピレン製シリンジを用いて水１ｍｌで、各チャンネル（体積１０μｌ）をすすいだ。次いで、シリンジを用いて、チャンネルに空気を吹きつけることによって、その基板を乾燥させた。
【０１１６】
１０μｌのマイクロピペットを使用して、ＰＣＲ混合物でチャンネルを充填した。ピペット円錐の先端をチャンネルの入口に置き、１０μｌの混合物をチャンネル中に放出した。
ＰＤＭＡでコーティングされるチャンネルは、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（各２００μＭ）、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（各３００ｎＭ）、ＴａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）（０．０４Ｕ／μｌ）、ＤＮＡ（１ｎｇ／μｌ）、ＰＤＭＡ（０．１％）およびＨ２Ｏを含有するＰＣＲ混合物を受け入れた。
【０１１７】
ＢＳＡでコーティングされるチャンネルは、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、ヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（各２００μＭ）、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（各３００ｎＭ）、ＴａｑＧｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）（０．０４Ｕ／μｌ）、ＤＮＡ（１ｎｇ／μｌ）、ＢＳＡ（０．５％）およびＨ２Ｏを含有するＰＣＲ混合物を受け入れた。
【０１１８】
接着アルミニウムシートを使用して、チャンネルを封止し、熱サイクル中の蒸発を防いだ。シートは、チップの上面にただ置いただけであった。熱サイクル中に最良の熱伝達を得るために、チップの裏面を「きれいに」しておいた。
封止したら次に、Ｔｅｔｒａｄ−サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）の平らなブロック上にそのチップを置いた。チップと平らなブロックとの間に油の小さな液滴を置いて、より良い熱接触、その結果としてより良い熱伝達を提供した。
【０１１９】
ＰＣＲ混合物を有するチップを、Ｔａｑポリメラーゼで予め活性化（９４℃で１０分）した後、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒、および７２℃で３０秒の３５回のサイクルで循環させた。
次いで、その混合物をチャンネルから回収し、ゲル電気泳動（アガロースゲル）、および蛍光色素ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを挿入することによる二本鎖ＤＮＡの定量で、結果を分析した。
実施例３：マイクロタイタープレートにおけるマイクロシークエンシング
以下のプロトコルによって、ウェルを取り替えることなく、３８４ウェル・マイクロタイタープレートでゲノタイピング手順を行うことが可能となる。
マイクロシークエンシング
Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ１０５ブロック共重合体（最終濃度０．５％）、ＤＮＡ２μｌ（１ｎｇ／μｌ）、ＴａｑＧｏｌｄ２μｌ（０．０２Ｕ／μｌ）、ＰＣＲプライマー２μｌ（３００ｎＭ）で、ＰＣＲ混合物を調製した。精製混合物を、ＳＡＰ４μｌ（０．４Ｕ／μｌ）およびＥＸＯ４μｌ（０．２Ｕ／μｌ）で調製した。ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ８μｌ（０．０５Ｕ／μｌ）、ＭＩＳオリゴヌクレオチド８μｌ（０．５μｍ）および標識ｄｄＮＴＰＳ８μｌ（９ｎＭ）で、ＭＩＳ混合物を調製した。
【０１２０】
マイクロタイタープレートのウェルにＰＣＲ混合物２μｌを加えた。マイクロタイタープレートを、Ｔａｑポリメラーゼで予め活性化（９４℃で１０分）した後、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒、および７２℃で３０秒の３５回のサイクルで循環させた。伸長段階はサイクリングの最後（７２℃で７分）で行った。精製混合物２μｌを同じウェルに加え、マイクロタイタープレートを３７℃で３０分間、９４℃で１０分間インキュベートした。最後に、ＭＩＳ混合物４μｌを同じウェルに加え、マイクロタイタープレートを９４℃で１分間インキュベートし、５５℃で１５秒、７２℃で５秒、および９４℃で１０秒の２０回のサイクルで循環させた。
ゲノタイピングデータの分析
Ｇｅｎｓｅｔ社が独自に開発したソフトウェアを用いて、マイクロシークエンシング手順から得た蛍光シグナルを分析する。しかしながら、ゲノタイピング手順で通常遭遇する問題は、特にゲノタイピングプロセス中、マイクロタイタープレートの表面上にデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が吸着することである。ゲノタイピング手順の第１段階（例えば、ＰＣＲ）中に添加されるｄＮＴＰのマイクロタイタープレート表面上への吸着によって、その後の段階（例えば、酵素精製）中にエビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）への到達性が低くなり、吸着されたｄＮＴＰは脱リン酸化されない。高温でマイクロタイタープレート表面からｄＮＴＰが放出されるため（例えば、ＥＸＯおよびＳＡＰ酵素の変性中、またはＭＩＳ反応の温度サイクル中）、それらは劇的に、ゲノタイピングプロセスの第３段階（つまり、ＭＩＳ）を汚染する。結果として、ＭＩＳオリゴヌクレオチド産物は、複数の塩基（ｄＮＴＰ）によって伸長され；この結果、ＳＮＰ特異的な蛍光標識ｄｄＮＴＰは、非特異的シグナルを生じる対象のＳＮＰ部位から下流にあるオリゴヌクレオチド産物のいくつかの塩基中に不正確に取り込まれる（図５および６を参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリマー濃度の関数として、それらの間のクロスオーバーを有する、２通りの異なる状態におけるポリマー鎖の相互作用を図示したものである。
【図２】末端−ループ−列のコンホメーションで固体基板上に吸着された表面吸着ホモポリマーを示す図である。
【図３】チャンネル表面上に吸着された吸着ホモポリマーのコンホメーションを示す図である。
【図４】吸着された表面からのポリマーの距離（ｘ）の関数としてポリマー濃度（ｃ）を表す。吸着されたポリマーは、ポリマー表面相互作用の細部に対して異なる感受性を有する、近位、中心および遠位領域から構成される層を形成する。
【図５】実施例３で記述するように行われたゲノタイピングプロセス後に得られた特異的シグナル強度に対するコポリマー添加の効果を示す図である。
【図６】実施例３で記述するように行われたゲノタイピングプロセス後に得られたシグナルの特異性に対するコポリマー添加の効果を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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