(57)【要約】固体表面に固定された分子アレイを備えたデバイスについて開示されている。該アレイは、比較的短い分子と比較的長いポリヌクレオチドが固体支持体の表面に高密度で固定されたものであり、該ポリヌクレオチドは、比較的短い分子を超えて伸張するポリヌクレオチド部分について個々に解像度を与えられる密度になっている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体の表面に固定された、比較的短い分子と比較的長いポリヌクレオチドの高密度アレイを備えたデバイスであって、ポリヌクレオチドは、比較的短い分子を超えて伸張するポリヌクレオチド部分が個々に解像される密度になっている、前記デバイス。
【請求項２】
各ポリヌクレオチドが、共有結合によって表面に固定されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
ポリヌクレオチドと短い分子が、固体支持体に結合する同一の反応基を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、中間体分子への共有結合を介して固体支持体に固定されており、短い分子は、ポリヌクレオチドに対して同一の共有結合を経ることができない、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
中間体分子及び短い分子がシラン化合物である、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
アレイの隣接ポリヌクレオチドが、少なくとも１０ｎｍの距離だけ離れている、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、少なくとも１００ｎｍの距離だけ離れている、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、少なくとも２５０ｎｍの距離だけ離れている、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
１ｃｍ３当たり１０６個から１０９個のポリヌクレオチドの密度を有する、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
密度が、１ｃｍ３当たり１０７個から１０８個の分子である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
比較的短い分子がポリヌクレオチドである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
単一のポリヌクレオチドとの相互作用をモニターするための、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のデバイスの使用であって、イメージングデバイスを用いて、アレイ化されたポリヌクレオチドを解像することを含む、前記使用。
【請求項１３】
個々に解像される密度にあるポリヌクレオチドのアレイを製造する方法であって、
固体支持体の表面に、比較的長いポリヌクレオチドと比較的短い分子の混合物をアレイ化するステップであって、該短い分子は、ポリヌクレオチドより過剰である、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドと短い分子の各々が、固体支持体又は中間体分子に結合する同一の反応基を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドと短い分子が、単一の配合で、固体支持体に接触せしめられる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
短い分子が固体支持体に最初に接触せしめられ、短い分子とポリヌクレオチドとが離れてアレイ化される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
アレイ化された短い分子の少量部が、ポリヌクレオチドの官能基と共有結合反応してポリヌクレオチドがアレイ化されることを可能にする官能基を備える、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アレイ化される前に、短い分子の少量部が、ポリヌクレオチドの官能基と相補的な官能基を提供するように溶液中で修飾される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
短い分子が、ポリヌクレオチドの相補的官能基と共有結合反応をすることができる官能基を含み、ポリヌクレオチドが、短い分子の少量部だけがポリヌクレオチドと反応することを許容する濃度で固体支持体と接触せしめられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドと反応しない分子はキャッピング剤と反応する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
キャッピング剤が、比較的短いポリヌクレオチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
比較的短い分子がポリヌクレオチドであり、長いポリヌクレオチドと短いポリヌクレオチドの両方が官能基と反応し、その後、固体支持体に直接的に又は固体支持体に結合した中間体分子にアレイ化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
短い分子はＵ字型の構造をしたポリヌクレオチドであり、比較的長いポリヌクレオチドは、短い分子が固体支持体に結合する前又は後に、短い分子の少量部の上へリゲートされる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドアレイの製造及びその分析学的応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子に関する研究の進歩は、部分的には、分子又はその生物学的反応を特徴付けるために使われる技術の改善によってもたらされた。特に、核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡの研究は、配列分析のために使われる技術の開発及びハイブリダイゼーション・イベントの研究から利益を受けてきた。
【０００３】
核酸についての研究を改善した技術の例として、固定された核酸の製造されたアレイの開発がある。これらのアレイは、一般には、固体支持体材料の上に固定されたポリヌクレオチドの高密度マトリックスから成る。Ｆｏｄｏｒ等は、マスクで保護されているが画定された領域だけが露光されることによって適切な修飾ヌクレオチドの結合を許容する化学的感光性のガラス表面を使うことによって、核酸アレイをアセンブルする方法について記載している（Trends in Biotechnology (1994) 12: 19-26）。一般に、これらのアレイは、１つの特定種のポリヌクレオチドを含んで別個の領域が固体支持体上に形成されているので、「多数分子」アレイと記述される。
【０００４】
代替的アプローチは、Ｓｃｈｅｎａ等によって記載されている（Science (1995) 270:467-470）。この記載では、ＤＮＡサンプルが、ロボットマイクロピペット技法によってガラス顕微鏡スライド上の予め決められた部位に配置される。ＤＮＡは、非共有結合の静電的相互作用によってその全長に沿ってガラス表面に結合する。しかし、相補的ＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションは起こることができても、このアプローチでは、他の成分（例えば、ポリメラーゼ酵素、ＤＮＡ結合タンパク質等）との相互作用についてＤＮＡを自由自在に利用可能とはさせない。
【０００５】
ＷＯ−Ａ−９６／２７０２５は、単一分子アレイについての一般的な開示である。シークエンシング手順について開示されているが、アレイが適用され得る応用についての記載はほとんどない。また、アレイをいかに調製するかについて一般的議論があるだけである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明に従えば、デバイスは、固体支持体の表面に固定された、比較的短い分子と比較的長いポリヌクレオチドの高密度アレイを備える。ここで、ポリヌクレオチドは、比較的短い分子を超えて伸張するポリヌクレオチド部分について個々の解像度を与えられる密度になっている。この態様では、短い分子が、ポリヌクレオチド密度の調節を助ける。これにより、単一ポリヌクレオチド分子のより均一なアレイが提供されることになり、イメージングが改善される。小さな分子は、試薬が固体支持体へ非特異的に結合することを防ぎ、バックグランド干渉を減少させる。例えば、長いポリヌクレオチドに相補的なストランド上にヌクレオシド三リン酸を取り込むためのポリメラーゼ反応との関係では、小さな分子は、ポリメラーゼ及びヌクレオシドが固体支持体表面に結合することを防ぐ。そうでなければ、イメージング処理を干渉することになる。
【０００７】
また、短い分子は、各ポリヌクレオチドが垂直状態に維持されることを確保し、ポリヌクレオチドが固体支持体と縦方向に相互作用することを防ぐ。そうでなければ、試薬（例えばポリメラーゼ）との効率的相互作用が妨げられる。これにより、フルオロホアが表面によって消光することが防がれ、単一ポリヌクレオチドのより正確なイメージングが導びかれる。
【０００８】
本発明の第二の態様に従うと、個々の解像度を許容するポリヌクレオチドアレイの生産方法は、固体支持体の表面上に、比較的短い分子と比較的長いポリヌクレオチドの混合物を配列させるステップを備える。ここで、短い分子は、ポリヌクレオチドよりも過度の量で配列される。
【０００９】
本発明のアレイは、分析可能な単一ポリヌクレオチドの有効なものを備える。これには、ポリヌクレオチド及びそれらと他の生物学的分子との相互作用の研究に関して多くの重要な利点がある。特に、各ポリヌクレオチドで起こる蛍光イベントは、感度の良い検出器に連結した光学顕微鏡を使って検出することができる結果、各ポリヌクレオチドについての明瞭なシグナルが得られる。
【００１０】
従来技術の高密度（マルチ分子）アレイを使うことで直面するフェージング問題は、単一ポリヌクレオチドの集団が多段階分析に使われる場合に、削減又は除去され得る。従って、該アレイは、また、ポリヌクレオチド上の蛍光イベント又は他のイベントをモニターするための大規模並列処理アプローチを許容する。このような大規模並列データ収集により、ポリヌクレオチドの異質混合物のスクリーニング／特徴付けに関与する広範囲の分析手順において該アレイは非常に有用になる。
【００１１】
アレイの調製は、少量のポリヌクレオチドサンプルと他の試薬のみを必要とし、単純な手段によって実行され得る。
【発明の説明】
【００１２】
本発明の単一ポリヌクレオチドアレイのデバイスは、固体支持体材料の表面を被覆し、且つ、単一ポリヌクレオチドの密度を調節して固体支持体への試薬の非特異的結合を随意に防ぐ柔軟な手段を提供する比較的短い分子の「単層」を含むように製造される。
【００１３】
本発明との関連で、用語「比較的短い」及び「比較的長い」は、アレイ化された場合に、「比較的長い」ポリヌクレオチドが「比較的短い」分子を超えて伸張することを意味するように解釈されるべきである。
【００１４】
固体支持体の表面上に固定された単一ポリヌクレオチドは、光学的手段によって解像され得る。このことは、使用される特定のイメージングデバイスの解像領域内で、一つ以上の明瞭なイメージの各々が一つのポリヌクレオチドを表示することができることを意味する。一般的に、アレイのポリヌクレオチドは、感度の良い検出器（例えば、電化結合デバイス（ＣＣＤ））を備えた単一分子蛍光顕微鏡を使って解像される。アレイの各ポリヌクレオチドは、同時に又はアレイを走査することによってイメージングされ、迅速な配列分析を実行することができる。
【００１５】
核酸擬態（例えば、ＰＮＡ又は２´Ｏ−Ｍｅｔｈ−ＲＮＡ）は本発明の範囲内であるが、アレイのポリヌクレオチドは、一般的には、ＤＮＡ又はＲＮＡである。ポリヌクレオチドは、他の分子との相互作用を許容するようにアレイ状に形成される。したがって、固体支持体に物理的に結合していないポリヌクレオチドの部分が呼びかけられ得るようにポリヌクレオチドを固定することが重要である。幾つかの応用においては、単一アレイの全ポリヌクレオチドは、同一である。そして、主として異なる分子を捕らえるように使われ得る。他の応用では、アレイ上のポリヌクレオチドの全部（又は実質的に全部）が異なる。例えば、５０％未満、好ましくは３０％未満のポリヌクレオチドが同一である。
【００１６】
用語「単一分子」は、本明細書において、従来技術の高密度マルチ分子（ポリヌクレオチド）アレイ（同一種の多数ポリヌクレオチドの異なるクラスターを備えるもの）から区別するために使われている。
【００１７】
用語「個々に解像される」は、本明細書において、可視化された場合にアレイ上のポリヌクレオチドをその隣接するポリヌクレオチドから区別することが可能なことを示すように使われている。固体支持体上には、個々に解像され得ないポリヌクレオチドが幾つか存在するだろうが、これらは、ポリペプチドの大多数が単一分子レベルで解像されることを考慮してイメージングの間にカウントされない。
【００１８】
用語「呼びかける」は、本明細書において、アレイ化されたポリヌクレオチドと他の分子（例えば、ポリメラーゼ又はヌクレオシド三リン酸）とのあらゆる相互作用を指すために使われている。
【００１９】
アレイの密度は、重要ではない。しかし、本発明は、高密度の単一ポリヌクレオチドを利用することができ、それが好ましい。例えば、１ｃｍ２当たり１０６−１０９個のポリヌクレオチドの密度を備えたアレイを使うことができる。好ましくは、密度は、少なくとも１０７／ｃｍ２であり、一般には１０８／ｃｍ２までである。このような高密度アレイは、技術分野において「高密度」と記述されてはいるものの、必ずしも高くはなく、及び／又は単一分子解像を許容するものではない他のアレイを比較的である。
【００２０】
短い分子は、一般には、固体支持体の残部表面を被覆するために、より高密度でアレイ上に存在する。短い分子は、従って、過剰の濃度で固体支持体に接触させられる。好ましくは、短い分子は、１０８分子／ｃｍ２から１０１４分子／ｃｍ２の密度であり、より好ましくは、１０１２分子／ｃｍ２よりも高い。
【００２１】
本発明の方法と装置を使用することにより、１０５個／ｃｍ２から１０８個／ｃｍ２のポリヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１０７個／ｃｍ２のポリヌクレオチドをイメージングすることが可能である。スキャニング装置を使って迅速なシーケンシャルイメージングを達成することができる。イメージ間のシフト及びトランスファーにより、より多くのポリヌクレオチドがイメージングされる。
【００２２】
一つには、個々のポリヌクレオチドを解像するために使われる特定の手法により、アレイ上の個々のポリヌクレオチド間の分離程度が決定される。分子アレイをイメージングするための装置は、当業者には既知である。例えば、レーザーを用いて、アレイの表面を走査するために共焦点走査型顕微鏡を使うことができ、蛍光により、個々のポリヌクレオチド上に取り込まれたフルオロホアを直接にイメージングすることができる。代替的に、感度の良い２−Ｄ検出器（電荷結合デバイス等）を使って、アレイ上の個々のポリヌクレオチドを表示する２−Ｄイメージを提供することができる。
【００２３】
アレイ上の単一ポリヌクレオチドは、１００倍の拡大率であれば、隣接するポリヌクレオチドが少なくとも約２５０ｎｍ、好ましくは少なくとも３００ｎｍ、より好ましくは少なくとも３５０ｎｍの距離だけ離れていると、２−Ｄ検出器を用いて解像される。これらの距離は、拡大率に依存することが認識されよう。当業者であれば他の値を決定することができよう。
【００２４】
より高い光学的解像度の走査型近接場光学顕微鏡法（ＳＮＯＭ）等の他の手法も利用可能であり、より高密度のアレイの使用が許容される。例えば、ＳＮＯＭを使うことによって、隣接ポリヌクレオチドは、１００ｎｍ未満の距離（例えば、１０ｎｍ）で離れていてよい。走査型近接場光学顕微鏡法の記載については、Ｍｏｙｅｒ等（Laser Focus World (1993) 29 (10)）を参照されたい。
【００２５】
使用することができる追加の技術として、表面特定全反射蛍光顕微鏡検査法（ＴＩＲＦＭ）がある。例えば、Ｖａｌｅ等（Nature (1996) 380: 451-453）を参照されたい。この手法を使うと、単一分子の感度で（１００μｍ×１００μｍに至る）広視野イメージングを達成することができる。これにより、１ｃｍ２当たり１０７個以上の解像可能なポリヌクレオチドのアレイが許容される。
【００２６】
更に、走査型トンネル顕微鏡法（Ｂｉｎｎｉｎｇ等、Helvetica Physica Acta (1982) 55: 726-735）及び原子間力顕微鏡法（Ｈａｎｓｍａ等、Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (1994) 23: 115-139）の手法も、本発明のアレイをイメージングするために適切である。顕微鏡法に依存しない他のデバイスもまた、固体支持体上の分離した領域内をイメージングすることができれば、使うことができる。
【００２７】
本発明に従うデバイスは、固定されたポリヌクレオチド及び他の固定された分子を備える。他の分子は、ポリヌクレオチドに比べると比較的短く、ポリヌクレオチドの密度を調節するために使われる。他の分子は、また、試薬（例えば、ヌクレオシド三リン酸）が固体支持体と非特異的に結合することを防ぐことができ、これによりバックグランド干渉が減少する。一つの実施形態では、短い分子もまたポリヌクレオチドである。しかし、当業者には明らかなように、多くの異なる分子（例えば、ペプチド、タンパク質、ポリマー及び合成化学物質）が使われてもよい。好ましい分子は、固体支持体の表面と反応することができる基を含む有機分子である。
【００２８】
デバイスの調製は、比較的長いポリヌクレオチドと比較的短い分子の混合物をまず調製することによって実行される。一般に、後者の濃度は、長いポリヌクレオチドの濃度よりも過剰である。その後、混合物を適切に調製された固体支持体と接触させて、固体化を生じさせる。
【００２９】
単一のポリヌクレオチドは、十分な分離を確実にするために使われる適切な条件が提供される限り、既知のあらゆる手法によっても、固体支持体の表面に固定され得る。ポリヌクレオチド分子の密度は、希釈によって調節可能である。ポリヌクレオチド間のギャップは、有機分子又は異なる成分のポリヌクレオチドであってよい短い分子（キャッピング基）で充填することができる。個々に解像可能な「より長い」ポリヌクレオチドのアレイを形成することにより、バルクの分子からは異なるポリヌクレオチドに呼びかけが可能となる。
【００３０】
適切な固体支持体は商業上利用可能であり、当業者には明らかである。支持体は、ガラス、セラミック、シリカ及びシリコン当の材料から製造されてよい。金表面を備えた支持体も使われ得る。支持体は、通常、平坦な（平らな）表面、又は、呼びかけられるポリヌクレオチドが少なくとも同一面にある構造物を備える。いかなる適切なサイズが使われてもよい。例えば、支持体は、各方向において１−１０ｃｍのオーダーである。
【００３１】
固定化は、特定共有結合又は非共有結合の相互作用による。共有結合が好ましい。ポリヌクレオチドの固定化は、５´又は３´位置のいずれかにおいて実行される。これにより、ポリヌクレオチドは、一つの末端のみにより固体支持体に結合する。しかし、ポリヌクレオチドは、その長さに沿ういずれの位置においても固体支持体に結合されてよい。結合は、固体支持体にポリヌクレオチドを鎖でつなぐ働きをする。このことは、以下に記載されるヘアピン構築物について示される。固定された（比較的長い）ポリヌクレオチドは、その後、固体支持体から離れた位置で、他の分子又は同性質のものと相互作用を起こすことができる。固定化の結果、このようにして、十分に離れた長いポリペプチドになる。この利点は、アレイの呼びかけを妨害することになるかもしれない、アレイ上で隣接する長いポリヌクレオチド間の相互作用が防がれることである。
【００３２】
比較的短い分子と比較的長いポリヌクレオチドとを備えたデバイスを形成するために適切な方法は、従来の化学に基づき、当業者には明らかであろう。目的は、比較的長いポリヌクレオチドが各単一ポリヌクレオチドの解像を許容する密度で散在した、比較的短い分子の高密度の層を生産することである。
【００３３】
アレイ製造の第一のステップは、通常、固体支持体の表面を機能化させて、分子／ポリヌクレオチドの結合にとって適切にさせることである。例えば、シランは、固体支持体材料（通常はガラススライド）に分子を付けるために使われる既知の官能基である。その後、比較的短い分子と比較的長いポリヌクレオチドが、適切な濃度及び別々又は複合サンプルで、機能化された固体支持体と接触せしめられてアレイが形成される。
【００３４】
一つの好ましい実施形態では、長いポリヌクレオチドと短い分子の各々は、固体支持体又は中間体分子に付く同一反応基を有する。
【００３５】
ある代替的実施形態では、支持体表面は、異なる官能基で処理されていてよい。異なる官能基のうちの一つは、比較的短い分子と特異的に反応するものであり、もう一つは、比較的長いポリヌクレオチドと特異的に反応するものである。各官能基の濃度を調節することは、分子／ポリヌクレオチドの密度を調節する便利な方法である。
【００３６】
また更なる実施形態では、比較的短い分子は、固体支持体の表面上に高密度に固定化されている。これらの分子は、それらと適切な濃度で接触せしめられるポリヌクレオチドと反応し、要求される密度が提供される。従って、ポリヌクレオチドは、分子の単層の上面に固定化される。ポリヌクレオチドと接触しない分子は、更なる分子と反応して反応部位がブロック（又はキャップ）される。これは、ポリヌクレオチドをアレイ化する前、その途中、その後に実行することができる。ブロック（キャップ）基そのものは、比較的短いポリヌクレオチドであってもよい。
【００３７】
代替的に、固体支持体上に高密度でアレイ化される短い分子のほんの少しの部分のみが、ポリヌクレオチドと反応する基を備え、主な部分は、非反応性である。例えば、短い分子は、混合されたシランであってよく、その少量部がポリヌクレオチドの官能基と反応でき、残りの部分は非反応性であって、デバイス上に短い分子のアレイを形成する。従って、短い分子の少量部の濃度を調節することはまた、ポリヌクレオチドの密度を調節することになる。
【００３８】
この実施形態では、短い分子は、アレイ上への固定化の前に溶液中で修飾されてもよい。これは、短い分子の少量部のみが、ポリヌクレオチド上の相補的官能基に共有結合を起こすことができる官能基を含むようにするためである。
【００３９】
関連する実施形態では、短い分子はポリヌクレオチドである。そして、比較的長いポリヌクレオチドと比較的短いポリヌクレオチドの両方の適切な濃度が、官能基と反応して固体支持体上にアレイ化されるか、又は固体支持体に結合した中間体分子と反応する。
【００４０】
適切な官能基は、当業者には明らかであろう。例えば、適切な官能基には、アミン、エステル、活性化された酸、酸ハロゲン化物、アルコール、チオール、ジスルフィド、オレフィン、ジエン、ハロゲン化された求電子試薬及びホスホロチオネートが含まれる。好ましい官能基にはシランが含まれる。
【００４１】
比較的小さい分子は、固体支持体への非特異的結合に対抗するバリアを提供することができる分子であればいかなるものでもよい。
【００４２】
適切な小分子は、表面の要求される特性及び存在する機能性に基づいて選択され得る。
【００４３】
好ましい実施形態では、分子はＲｎＳｉＸ（４−ｎ）のタイプのシランである（ここで、Ｒは支持体表面に表示される不活性成分であり、Ｘは、Ｃｌ又はＯ−アルキルタイプの反応性脱離基である）。シランには、テトラエトキシシラン、トリエトキシメチルシラン、ジエトキシジメチルシラン又はグリシドキシプロピルトリエトキシシランが含まれるが、当業者には他の多くの適切な例示が明らかであろう。
【００４４】
本発明のある実施形態では、短い分子は、固体支持体の表面とポリヌクレオチドがランダムに会合することを防ぐための表面ブロックとしての役割を果たす。従って、分子には、表面と反応する基（好ましくは、表面にポリヌクレオチドを付けるために使われるものと同一の機能を有する）と、表面上で要求される特性によって定義される不活性基とが必要である。ある実施形態では、表面はエポキサイドで機能化されており、小さな分子はグリシンである。しかし、アミノ基を含む他の化合物でも十分である。
【００４５】
また、小さな分子が親水性であってアニオンの結合をはじく場合でも好ましい。従って、分子は、酸、リン酸塩、硫酸エステル、ヒドロキシル又はポリオールであってよく、ＰＥＧ等のポリエーテル含んでよい。
【００４６】
一つの実施形態では、比較的短い分子は、ポリヌクレオチドである。これらは、いかなる適切な手法を使って調製することができる。これらの手法には、技術分野で知られる合成法が含まれる。一つの末端で固体支持体に固定され、非反応他基（例えば、更なるヌクレオチドを取り込むことができないジデオキシヌクレオチド）を他の末端に含む短いポリヌクレオチドを使うことが好ましいであろう。また、短いポリヌクレオチドは、ポリメラーゼと相互作用をしなければ、ヘアピン構築物であってもよい。
【００４７】
本発明の一つの実施形態では、アレイの比較的長いポリヌクレオチドの各々は、ヘアピンループ構造を含む。その一末端は、標的ポリヌクレオチドを含み、他の末端は、ポリメラーゼ反応のプライマーとして作用することができる比較的短いポリヌクレオチドを含む。これにより、プライマーは、ポリメラーゼ・ベースのシークエンシングプロシージャの間、そのプリンティング機能を実行することが確実され、プロシージャ中のいかなる洗浄ステップの間にも除去されない。標的ポリヌクレオチドは、呼びかけられ得る。
【００４８】
用語「ヘアピンループ構造」は、共有連結された相補的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される分子の軸及びループ構造を指す。該軸はハイブリダイズされたポリヌクレオチドを含み、ループは２つの相補的ポリヌクレオチドを共有連結させる領域である。軸を形成するためには、５塩基対から２５塩基対（又は、それ以上）の二重ストランド（二重鎖）領域を使うことができる。一つの実施形態では、構造は、相補敵領域を有する単鎖ポリヌクレオチドから形成されてもよい。この実施形態のループは、２以上のハイブリダイズされていないヌクレオチドであってよい。第二の実施形態では、構造は、相補的領域を有する二つの別々のポリヌクレオチドから形成される。この二つのポリヌクレオチドは、連結成分によって連結されている（そしてループが少なくとも部分的に形成される）。連結成分は、二つのポリヌクレオチド末端間に共有結合を形成する。この実施形態での使用に適切な連結成分は、当業者には明らかであろう。例えば、連結成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってよい。
【００４９】
短い分子がヘアピン構築物中のポリヌクレオチドである場合には、ヘアピンのちょっとした部分に、固体支持体上にヘアピンをアレイ化する前又はアレイ化した後に、比較的長いポリヌクレオチドをリゲートすることができる。
【００５０】
アレイは、ポリヌクレオチドとの生物学的又は科学的相互作用の検出に依存する方法において多数の応用がある。例えば、アレイは、同性質の分子の性質又は素性を決定するために使うことができる。一般に、アレイとの生物学的又は化学的相互作用は、溶液中で実行される。
【００５１】
特に、アレイは、アレイ化されたポリヌクレオチドについての情報を得るために、蛍光ラベルの検出に依存する従来のアッセイで使われる。アレイは、多段階アッセイにおいて特に適している。多段階アッセイでは、段階における同調化の損失がアレイの使用限界と以前考えられていた。アレイは、遺伝学的配列情報を得るための従来手法において使われてよい。これらの手法の多数が、適切にラベル化されたヌクレオチドの段階を追った同定に依存する。ＵＳ−Ａ−５６３４４１３では、「単一ベース」シークエンシング法とされていることを参照せよ。
【００５２】
本発明の態様では、標的ポリヌクレオチドの配列は、ＵＳ−Ａ−５６３４４１３に記載されているのと同様の方法で、取り込まれたヌクレオチドへ付着した蛍光ラベルの検出を介して、発生しようとするストランド内へのヌクレオチドの取り込みを検出することによって決定される。標的ポリヌクレオチドは、適切なプライマー（又は、ヘアピン構築物として調製されたものでヘアピンの一部としてプライマーを含むもの）を使ってプライムされる。発生しようとする鎖は、ポリメラーゼ反応によって段階を追って伸張する。異なるヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ）の各々は、調節されないポリメリゼーションを防ぐためのブロック基としての役割を果たすユニークなフルオロホアを３´位置に取り込む。ポリメラーゼ酵素は、標的に相補的な発生しようとする鎖にヌクレオチドを取り込む。ブロック基は、ヌクレオチドが更に取り込まれることを防止する。その後、取り込まれなかったヌクレオチドがアレイの表面から除去され、取り込まれた各ヌクレオチドは、レーザー励起及びフィルターを使い電荷結合型デバイスによって光学的に「読まれる」。３´ブロック基は、その後、除去され、更なるヌクレオチドの取り込みのために発生しようとする鎖が晒される。
【００５３】
アレイが光学的に明瞭に解像できるポリヌクレオチドで構成されているので、蛍光イベントが検出されて、標的ヌクレオチドの各々は、明瞭なシグナルのシリーズを発生させる。その後、全配列の詳細が決定される。
【００５４】
他の適切なシークエンシングプロシージャは、当業者には明らかであろう。特に、シークエンシング法は、アレイ化されたポリヌクレオチドの分解に依存する。分解産物は、配列の決定のために特徴付けされる。
【００５５】
適切な分解手法の例示が、ＷＯ−Ａ−９５／２００５３に開示されている。ポリヌクレオチド上の塩基は、１回に決められた数だけ、塩基に特異的なラベル化されたアダプターの使用を介して、定義されたエキソヌクレアーゼ開裂で、順番に除去される。
【００５６】
非破壊的方法を使ったシークエンシングの結果は、更なる特徴化研究のために空間的にアドレスできるアレイを形成することが可能である。従って、非破壊的シークエンシングが好まれる。この関連で、用語「空間的にアドレスできる」は、本明細書において、異なる分子が、アレイ上のそれらの位置に基づいていかに同定されるかを記述するために使われる。
【００５７】
一端シークエンスされると、空間的にアドレスされたアレイは、異質の個体群から個々の分子を特性付けするために必要とされる種々のプロシージャ−で使うことができる。
【００５８】
以下の実施例により、添付の図面を参照して本発明を例示する。
【００５９】
実施例１
ガラススライドを、使用する前に、デコン９０（decon 90）で１２時間にわたり室温にて洗浄し、水、エタノールでリンスし、乾燥させた。９５％酸性エタノール（５０ｍｌ）中のグリシドキシプロピルトリメトキシシラン（０．５ｍＬ）及びメルカプトプロピルトリメトキシシラン（０．０００５ｍＬ）の溶液を５分間にわたり混合した。この混合物の中に洗浄されて乾燥したスライドを加え、室温にて１時間放置し、エタノールでリンスし、乾燥させ、且つ、１００℃で１時間にわたって硬化させた。ＤＭＦ／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）／水（８９／１／１０）中、１時間にわたって室温にて、アミノ-ＤＮＡ（５´Ｃｙ３−ＣｔｇＣＴｇＡＡｇＣｇＴＣｇｇＣＡｇｇＴ−ｈｅｇ−ａｍｉｎｏｄＴ−ｈｅｇ−ＡＣＣＴｇＣＣｇＡＣｇＣＴ；配列番号１）（１０μＭ、１０μＬ）とＮ［γ−マレイミドブチリロキシ］スクシンイミド・エステル（ＧＭＢＳ）；（Ｐｉｅｒｃｅ）（１ｍＭ）の溶液からマレイミドで修飾されたＤＮＡを調製した。サイズ排除カートリッジ（ＮＡＰ５）を使って過剰の架橋剤を除去し、溶出されたＤＮＡをアリコートで凍結乾燥させ、使用前に新たに希釈した。マレイミド−ＧＭＢＳ−ＤＮＡのアリコート（１００ｎＭ）を、５０ｍＭリン酸カリウム／１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）中でチオール表面に置き、同一の緩衝液で洗浄する前に、室温にて１２時間にわたって放置した。
【００６０】
チャンバーカバーガラスが倒立顕微鏡（ニコンＴＥ２００）の対物レンズに浸漬油インターフェイスを介して接触するようにスライドをひっくり返した。６０°石英ガラス分散プリズムを、グリセリンの薄膜を介して、スライドの背面に光学的に連結させた。ガラス／サンプルのインターフェイスで、レーザー光がスライドの垂線に約６８°の角度で境界を作り、その後全反射（ＴＩＲ）を経るように、レーザー光をプリズムに向けた。ＴＩＲによって発生した表面特異的エバネッセンス波で励起されることによって産生される、表面からの蛍光を、顕微鏡の対物レンズによって収集し、強化された電荷結合型デバイス（ＩＣＣＤ）カメラ（Pentamax, Princeton Instruments）上に映した。
【００６１】
５３２Ｎｄ：ＹＡＧレーザーと５８０ＤＦ３０発光フィルター（Omega Optics）との組み合わせを使ってイメージを記録した。露光は５００ｍｓ、カメラの最大ゲイン及びプリズムでのレーザー出力は５０ｍＷであった。
【００６２】
グリシドキシプロピルトリメトキシシランが存在することにより、グリシドキシプロピルトリメトキシシランの不在で実行されたコントロールに比較して改善された結果が得られた（図１ａ）。
【００６３】
実施例２
スライドを、使用する前に、デコン９０（decon 90）で１２時間にわたり室温にて洗浄し、水、エタノールでリンスし、乾燥させた。９５％酸性エタノール（３５ｍｌ）中、テトラエトキシシシラン（０．７ｍＬ）及びＮ−（３トリエトキシシリルプロピル）ブロモアセトアミド（０．０００７ｍＬ）の溶液を５分間にわたり混合した。この混合物の中に洗浄して乾燥したスライドを加え、室温にて１時間放置し、エタノールでリンスし、乾燥させ、且つ、１００℃で１時間にわたって硬化させた。酢酸ナトリウム（３０ｍＭ、ｐＨ４．５）中のホスホロチオ酸で修飾されたＤＮＡ（５´−ＴＭＲ−ＴＡＣＣｇＴＣｇＡＣｇＴＣｇＡＣｇＣＴｇｇＣｇＡｇＣｇＴｇＣＴｇＣｇｇＴＴｓＴｓＴｓＴｓＴＡＣＣｇＣＡｇＣＡＣｇＣＴＣｇＣＣＡｇＣｇ；配列番号２）（ｓ＝ホスホロチオ酸（１００ｐＭ、１００μＬ））を、表面に加え、室温にて１時間にわたって放置した。スライドを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液で洗浄した。
【００６４】
イメージングは、実施例１に記載したように実行した。単一分子の良好な分散が観察された（図１ｂ）。
【００６５】
実施例３
スライドを、使用する前に、デコン９０（decon 90）で１２時間にわたり室温にて洗浄し、水、エタノールでリンスし、乾燥させた。グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（０．５ｍＬ）の９５％エタノール酸性溶液を調製し、この溶液中に洗浄されたスライドを１時間にわたって置き、エタノールでリンスし、乾燥させた。アミノ修飾ＤＮＡ（５´Ｃｙ３−ＣｔｇＣＴｇＡＡｇＣｇＴＣｇｇＣＡｇｇＴ−ｈｅｇ−ａｍｉｎｏｄＴ−ｈｅｇ−ＡＣＣＴｇＣＣｇＡＣｇＣＴ；配列番号１）（１μＭ、１００μＬ）を、表面に置き、室温にて１２時間にわたって放置した。スライドを、ｐＨ９の１ｍＭグリシン溶液で１時間にわたって洗浄し、５０ｍＭ リン酸カリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）でフラッシュさせた。実施例１に記載されたように、結合した単一分子の良好な分散がＴＩＲ顕微鏡法によって観察された。
【００６６】
その後、スライドを、Ｃｙ５−ＵＴＰ（２０μＭ）及びＴ４エキゾポリメラーゼ（２５０ｎＭ）及びトリス（４０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（４ｍＭ）、ＤＴＴ（２ｍＭ）、リン酸カリウム（１ｍＭ）、ＢＳＡ（０．２ｍｇｓ／ｍｌ）（１００μＬ）を含む混合物に室温にて１０分間にわたり曝し、その後、トリス／ＥＤＴＡ緩衝液でフラッシュさせた。
【００６７】
６７０ＤＦ４０発光フィルターを備えたポンプ色素レーザーを使い、４０ｍＷのレーザー出力で、先に記載したＴＩＲセットアップを使い、６３０ｎｍでイメージングを実行した。三リン酸塩の非特異的結合がグリシンを使ったケースでは、グリシンで処理されていないコントロールに比べて低レベルにあることが観察された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、単一ポリヌクレオチドアレイのイメージである。単一ポリヌクレオチドは、アレイ上で発生した蛍光シグナルの検出によって表示されている。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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