(57)【要約】本発明は、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体をコードする単離された核酸、デュアルインテグリン、ベクター、宿主細胞、トランスジェニック動物もしくは植物を包含する、少なくとも一つの新規な抗−デュアルインテグリン抗体、並びに治療的組成物、方法及び装置を包含するその製造及び使用方法に関する。
2004510414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：７もしくは８を含んでなる少なくとも一つの可変領域を含んでなる少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体。
【請求項２】
該抗体が少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍもしくは少なくとも１０−１２Ｍから選択される少なくとも一つの親和性でデュアルインテグリンに結合する請求項１に記載のデュアルインテグリン抗体。
【請求項３】
該抗体が少なくとも一つのデュアルインテグリンタンパク質の少なくとも一つの活性を実質的に中和する請求項１に記載のデュアルインテグリン抗体。
【請求項４】
配列番号：７もしくは８を含んでなる少なくとも一つの可変領域を有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体をコードする単離された核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の単離された核酸を含んでなる単離された核酸ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の単離された核酸を含んでなる原核もしくは真核宿主細胞。
【請求項７】
該宿主細胞がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその任意の誘導体、不死化もしくはトランスフォーム細胞から選択される少なくとも一つである請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
デュアルインテグリン抗体が検出可能なもしくは回収可能な量で発現されるように、インビトロ、インビボもしくはインサイチューにおける条件下で請求項４に記載の核酸を翻訳することを含んでなる、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を製造する方法。
【請求項９】
配列番号：７もしくは８を含んでなる少なくとも一つの可変領域を有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体及び少なくとも一つの製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤を含んでなる組成物。
【請求項１０】
検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物をさらに含んでなる請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
配列番号：７もしくは８を含んでなる少なくとも一つの可変領域を有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体に特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体もしくはフラグメント。
【請求項１２】
（ａ）配列番号：７もしくは８を含んでなる少なくとも一つの可変領域を有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の有効量を含んでなる組成物を細胞、組織、器官もしくは動物と接触させることもしくはそれに投与すること、
を含んでなる該細胞、組織、器官もしくは動物におけるデュアルインテグリン関連症状を診断もしくは処置する方法。
【請求項１３】
該有効量が該細胞、組織、器官もしくは動物のキログラム当たり０．００１−５０ｍｇである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該接触させることもしくは該投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によってである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該（ａ）接触させることもしくは投与することの前に、同時にもしくは後に、検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物を投与することをさらに含んでなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号：７もしくは８を含んでなる少なくとも一つの可変領域を有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる医療装置であって、該少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によって接触させることもしくは投与することに適当な装置。
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【請求項２７】
該宿主細胞がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその任意の誘導体、不死化もしくはトランスフォーム細胞から選択される少なくとも一つである請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
デュアルインテグリン抗体が検出可能なもしくは回収可能な量で発現されるように、インビトロ、インビボもしくはインサイチューにおける条件下で請求項２４に記載の核酸を翻訳することを含んでなる、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を製造する方法。
【請求項２９】
（ｉ）配列番号：１、２及び３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て；もしくは（ｉｉ）配列番号：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全てのいずれかを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体、並びに少なくとも一つの製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤を含んでなる組成物。
【請求項３０】
検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物をさらに含んでなる請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
（ｉ）配列番号：１、２及び３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て；もしくは（ｉｉ）配列番号：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全てのいずれかを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体に特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体もしくはフラグメント。
【請求項３２】
（ａ）配列番号：１、２及び３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て；もしくは（ｉｉ）配列番号：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全てのいずれかを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の有効量を含んでなる組成物を細胞、組織、器官もしくは動物と接触させることもしくはそれに投与すること、
を含んでなる該細胞、組織、器官もしくは動物におけるデュアルインテグリン関連症状を診断もしくは処置する方法。
【請求項３３】
該有効量が該細胞、組織、器官もしくは動物のキログラム当たり０．００１−５０ｍｇである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該接触させることもしくは該投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によってである請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該（ａ）接触させることもしくは投与することの前に、同時にもしくは後に、検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物を投与することをさらに含んでなる請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
（ｉ）配列番号：１、２及び３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て；もしくは（ｉｉ）配列番号：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全てのいずれかを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる医療装置であって、該少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によって接触させることもしくは投与することに適当な装置。
【請求項３７】
包装材料、並びに（ｉ）配列番号：１、２及び３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て；もしくは（ｉｉ）配列番号：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全てのいずれかを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の溶液もしくは凍結乾燥形態を含んでなる容器を含んでなるヒト製薬学的もしくは診断用途の製品。
【請求項３８】
該容器が非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮送達装置もしくは系の成分である請求項３７の製品。
【請求項３９】
（ｉ）配列番号：１、２及び３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て；もしくは（ｉｉ）配列番号：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全てのいずれかを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を回収可能な量で発現することができる宿主細胞もしくはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物もしくは植物細胞を提供することを含んでなる、該抗体を製造する方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法により製造する少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体。
【請求項４１】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体。
【請求項４２】
該抗体が少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍもしくは少なくとも１０−１２Ｍから選択される少なくとも一つの親和性でデュアルインテグリンに結合する請求項４１に記載のデュアルインテグリン抗体。
【請求項４３】
該抗体が少なくとも一つのデュアルインテグリンタンパク質の少なくとも一つの活性を実質的に中和する請求項４１に記載のデュアルインテグリン抗体。
【請求項４４】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体をコードする単離された核酸。
【請求項４５】
請求項４４に記載の単離された核酸を含んでなる単離された核酸ベクター。
【請求項４６】
請求項４５に記載の単離された核酸を含んでなる原核もしくは真核宿主細胞。
【請求項４７】
該宿主細胞がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその任意の誘導体、不死化もしくはトランスフォーム細胞から選択される少なくとも一つである請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
デュアルインテグリン抗体が検出可能なもしくは回収可能な量で発現されるように、インビトロ、インビボもしくはインサイチューにおける条件下で請求項４４に記載の核酸を翻訳することを含んでなる、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を製造する方法。
【請求項４９】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体及び少なくとも一つの製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤を含んでなる組成物。
【請求項５０】
検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物をさらに含んでなる請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体に特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体もしくはフラグメント。
【請求項５２】
（ａ）配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の有効量を含んでなる組成物を細胞、組織、器官もしくは動物と接触させることもしくはそれに投与すること、
を含んでなる該細胞、組織、器官もしくは動物におけるデュアルインテグリン関連症状を診断もしくは処置する方法。
【請求項５３】
該有効量が該細胞、組織、器官もしくは動物のキログラム当たり０．００１−５０ｍｇである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該接触させることもしくは該投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によってである請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
該（ａ）接触させることもしくは投与することの前に、同時にもしくは後に、検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物を投与することをさらに含んでなる請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる医療装置であって、該少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によって接触させることもしくは投与することに適当な装置。
【請求項５７】
包装材料、並びに配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の溶液もしくは凍結乾燥形態を含んでなる容器を含んでなるヒト製薬学的もしくは診断用途の製品。
【請求項５８】
該容器が非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮送達装置もしくは系の成分である請求項５７の製品。
【請求項５９】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を回収可能な量で発現することができる宿主細胞もしくはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物もしくは植物細胞を提供することを含んでなる、該抗体を製造する方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法により製造する少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体。
【請求項６１】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体と同じデュアルインテグリンタンパク質領域に結合する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体。
【請求項６２】
該抗体が少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍもしくは少なくとも１０−１２Ｍから選択される少なくとも一つの親和性でデュアルインテグリンに結合する請求項６１に記載のデュアルインテグリン抗体。
【請求項６３】
該抗体が少なくとも一つのデュアルインテグリンタンパク質の少なくとも一つの活性を実質的に中和する請求項６１に記載のデュアルインテグリン抗体。
【請求項６４】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体と同じデュアルインテグリンタンパク質領域に結合する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体をコードする単離された核酸。
【請求項６５】
請求項６４に記載の単離された核酸を含んでなる単離された核酸ベクター。
【請求項６６】
請求項６５に記載の単離された核酸を含んでなる原核もしくは真核宿主細胞。
【請求項６７】
該宿主細胞がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその任意の誘導体、不死化もしくはトランスフォーム細胞から選択される少なくとも一つである請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項６８】
デュアルインテグリン抗体が検出可能なもしくは回収可能な量で発現されるように、インビトロ、インビボもしくはインサイチューにおける条件下で請求項６４に記載の核酸を翻訳することを含んでなる、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を製造する方法。
【請求項６９】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体と同じデュアルインテグリンタンパク質領域に結合する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体及び少なくとも一つの製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤を含んでなる組成物。
【請求項７０】
検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物をさらに含んでなる請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体と同じデュアルインテグリンタンパク質領域に結合する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体に特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体もしくはフラグメント。
【請求項７２】
（ａ）配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体と同じデュアルインテグリンタンパク質領域に結合する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の有効量を含んでなる組成物を細胞、組織、器官もしくは動物と接触させることもしくはそれに投与すること、
を含んでなる該細胞、組織、器官もしくは動物におけるデュアルインテグリン関連症状を診断もしくは処置する方法。
【請求項７３】
該有効量が該細胞、組織、器官もしくは動物のキログラム当たり０．００１−５０ｍｇである請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
該接触させることもしくは該投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によってである請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
該（ａ）接触させることもしくは投与することの前に、同時にもしくは後に、検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物を投与することをさらに含んでなる請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体と同じデュアルインテグリンタンパク質領域に結合する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる医療装置であって、該少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によって接触させことかもしくは投与することに適当な装置。
【請求項７７】
包装材料、並びに配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体と同じデュアルインテグリンタンパク質領域に結合する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の溶液もしくは凍結乾燥形態を含んでなる容器を含んでなるヒト製薬学的もしくは診断用途の製品。
【請求項７８】
該容器が非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮送達装置もしくは系の成分である請求項７７の製品。
【請求項７９】
配列番号：１、２、３、４、５もしくは６の少なくとも一つのアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体と同じデュアルインテグリンタンパク質領域に結合する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を回収可能な量で発現することができる宿主細胞もしくはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物もしくは植物細胞を提供することを含んでなる、該抗体を製造する方法。
【請求項８０】
請求項７９に記載の方法により製造する少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体。
【請求項８１】
配列番号：９の少なくとも１−３個〜全アミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも一つのヒトＣＤＲを含んでなる少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体。
【請求項８２】
該抗体が少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍもしくは少なくとも１０−１２Ｍから選択される少なくとも一つの親和性でデュアルインテグリンに結合する請求項８１に記載のデュアルインテグリン抗体。
【請求項８３】
該抗体が少なくとも一つのデュアルインテグリンタンパク質の少なくとも一つの活性を実質的に中和する請求項８１に記載のデュアルインテグリン抗体。
【請求項８４】
配列番号：９の少なくとも１−３個〜全アミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも一つのヒトＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体をコードする単離された核酸。
【請求項８５】
請求項８４に記載の単離された核酸を含んでなる単離された核酸ベクター。
【請求項８６】
請求項８５に記載の単離された核酸を含んでなる原核もしくは真核宿主細胞。
【請求項８７】
該宿主細胞がＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはその任意の誘導体、不死化もしくはトランスフォーム細胞から選択される少なくとも一つである請求項８６に記載の宿主細胞。
【請求項８８】
デュアルインテグリン抗体が検出可能なもしくは回収可能な量で発現されるように、インビトロ、インビボもしくはインサイチューにおける条件下で請求項８４に記載の核酸を翻訳することを含んでなる、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を製造する方法。
【請求項８９】
配列番号：９の少なくとも１−３個〜全アミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも一つのヒトＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体及び少なくとも一つの製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤を含んでなる組成物。
【請求項９０】
検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物をさらに含んでなる請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
配列番号：９の少なくとも１−３個〜全アミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも一つのヒトＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体に特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体もしくはフラグメント。
【請求項９２】
（ａ）配列番号：９の少なくとも１−３個〜全アミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも一つのヒトＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の有効量を含んでなる組成物を細胞、組織、器官もしくは動物と接触させることもしくはそれに投与すること、
を含んでなる該細胞、組織、器官もしくは動物におけるデュアルインテグリン関連症状を診断もしくは処置する方法。
【請求項９３】
該有効量が該細胞、組織、器官もしくは動物のキログラム当たり０．００１−５０ｍｇである請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
該接触させることもしくは該投与することが、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によってである請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
該（ａ）接触させることもしくは投与することの前に、同時にもしくは後に、検出可能な標識もしくはレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストの少なくとも一つから選択される少なくとも一つの化合物もしくはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも一つの組成物を投与することをさらに含んでなる請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
配列番号：９の少なくとも１−３個〜全アミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも一つのヒトＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる医療装置であって、該少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選択される少なくとも一つの形態によって接触させることもしくは投与することに適当な装置。
【請求項９７】
包装材料、並びに配列番号：９の少なくとも１−３個〜全アミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも一つのヒトＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体の溶液もしくは凍結乾燥形態を含んでなる容器を含んでなるヒト製薬学的もしくは診断用途の製品。
【請求項９８】
該容器が非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮送達装置もしくは系の成分である請求項９７の製品。
【請求項９９】
配列番号：９の少なくとも１−３個〜全アミノ酸配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも一つのヒトＣＤＲを有する少なくとも一つの単離された哺乳動物抗−デュアルインテグリン抗体を回収可能な量で発現することができる宿主細胞もしくはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物もしくは植物細胞を提供することを含んでなる、該抗体を製造する方法。
【請求項１００】
請求項９９に記載の方法により製造する少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体。
【請求項１０１】
本明細書において記述する任意の発明。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本願は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、２０００年８月７日に出願された米国仮６０／２２３，３６３に部分的に基づき、そしてそれに対する優先権を請求する。
【０００２】
本発明は、少なくとも一つのアルファ−ｖ−ベータ３、アルファ−ｖ−ベータ５デュアルインテグリン（デュアルインテグリン）タンパク質もしくはそのフラグメントに特異的な、特定の部分もしくは変異体を包含する抗体、並びにそのような抗−デュアルインテグリン抗体をコードする核酸、相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びに治療的配合物、投与及び装置を包含するその製造及び使用方法に関する。
関連技術
現在、進行性の腫瘍増殖は、栄養分及び酸素を腫瘍に供給するため、廃棄物を運び去るため、そして遠隔部位への腫瘍細胞の転移の導管の役割を果たすために、新しい血管の形成である血管新生に依存するというかなりの証拠がある（Ｇａｓｔｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．５４：１７７−１８４）。最近の研究により、血管新生プロセスにおけるインテグリンの役割がさらに特定されている。インテグリンは、細胞内シグナリングによって今度は細胞生存、増殖及び移動をもたらす細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への細胞接着において重要な役割を果たすヘテロダイマー膜貫通タンパク質である。血管新生中に、活性化内皮細胞の表面上に発現される多数のインテグリンは、細胞移動、増殖及び分化のような異なる生物学的事象を調節するために様々なＥＣＭタンパク質との重要な接着性相互作用を調節する。特に、近縁であるが異なるインテグリンαＶβ３及びαＶβ５は、血管新生プロセスにおける独立した経路をもたらすことが示されている。αＶβ３に対して作製した抗体は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）により誘導される血管新生を阻止し、一方、αＶβ５に特異的な抗体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により誘導される血管新生を阻害した（Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２２７−１２３０（１９９９）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：１５００−１５０２（１９９５））。
【０００３】
非ヒト哺乳動物、キメラ、ポリクローナル（例えば抗血清）及び／もしくはモノクローナル抗体（Ｍａｂ）及びフラグメント（例えばそのタンパク質分解消化もしくは融合タンパク質生成物）は、ある種の疾患を処置しようとするためにある場合において調べられている潜在的な治療薬である。しかしながら、そのような抗体もしくはフラグメントは、ヒトに投与した場合に免疫応答を引き出すことができる。そのような免疫応答は、免疫複合体による循環からの抗体もしくはフラグメントのクリアランスをもたらし、そして反復投与を治療に不適当にし、それにより、患者に対する治療利益を減らし、そして抗体もしくはフラグメントの再投与を制限する可能性がある。例えば、非ヒト部分を含んでなる抗体もしくはフラグメントの反復投与は、血清病及び／もしくはアナフィラキシー（ａｎａｐｈａｌａｘｉｓ）を引き起こすことができる。これら及び他の問題を防ぐために、当該技術分野において周知であるように、キメラ化及びヒト化を包含する、そのような抗体及びその一部の免疫原性を下げる多数の方法が取られている。しかしながら、これら及び他の方法は、それにもかかわらず、いくらかの免疫原性、低い親和性、低いアビディティーを有する、または細胞培養、スケールアップ、製造における問題、及び／もしくは低い収量を有する抗体もしくはフラグメントをもたらす可能性がある。従って、そのような抗体もしくはフラグメントは、治療タンパク質としての製造もしくは使用に理想的に適しているとはいえない可能性がある。
【０００４】
従って、一つもしくはそれ以上のこれらの問題、並びに既知の抗体もしくはそのフラグメントより優れた改善を克服する抗−デュアルインテグリン抗体もしくはフラグメントを提供する必要がある。
【０００５】
発明の要約
本発明は、当該技術分野において既知であるものと組み合わせた、本明細書において記述しそして可能にするような、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化及び／もしくはＣＤＲ移植した抗−デュアルインテグリン抗体、免疫グロブリン、切断生成物及び他のその特定の部分及び変異体、並びに抗−デュアルインテグリン抗体組成物、コードするもしくは相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、配合物、装置、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、並びにその製造及び使用方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、本明細書において記述するような少なくとも一つの単離された抗−デュアルインテグリン抗体も提供する。本発明による抗体には、本発明の抗体に導入することができる、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはその任意の部分のようなしかしこれらに限定されるものではない、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含んでなる分子を含有する任意のタンパク質もしくはペプチドが包含される。本発明の抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、もしくはその任意の組み合わせなどのようなしかしこれらに限定されるものではない任意の哺乳動物を含むことができ、もしくはそれから得ることができる。
【０００７】
本発明は、一つの態様として、その少なくとも一つの特定の配列、ドメイン、部分もしくは変異体を含んでなる、特定の抗−デュアルインテグリン抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、それに相補的な、もしくはハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。本発明はさらに、該抗−デュアルインテグリン抗体核酸分子を含んでなる組換えベクター、そのような核酸及び／もしくは組換えベクターを含有する宿主細胞、並びにそのような抗体核酸、ベクター及び／もしくは宿主細胞を製造及び／もしくは使用する方法を提供する。
【０００８】
本発明の少なくとも一つの抗体は、少なくとも一つのデュアルインテグリンタンパク質、サブユニット、フラグメント、部分もしくはその任意の組み合わせに特異的な少なくとも一つの特定のエピトープに結合する。少なくとも一つのエピトープは、該タンパク質の少なくとも一つの部分を含んでなる少なくとも一つの抗体結合領域を含んでなることができ、そのエピトープは、好ましくは、配列番号：９、１６及び１７のそのそれぞれ（ａ）２９−４８、５８−６３、６９−７９、８２−８５、８８−１３４、１４０−１５７、１６１−１８３、１８６−１９０、１９２−１９８、２０２−２１２、２１５−２１７、２２３−２３７、２４０−２４４、２４８−２５５、２５９−２６８、２８７−３０１、３１３−３２２、３２６−３２８、３３２−３４４、３４８−３５１、３５４−３６５、３７６−３８７、３９３−４０１、４０７−４１４、４１７−４１９、４２２−４３３、４４３−４５１、４５８−４６１、４６５−４６９、４７２、（ｂ）３２−４１、４６−４７、５３−５５、５８−６９、７２−７４、７７−７９、８５−８８、９１−９４、９６−１０５、１１０−１１３、１１７−１２５、１２９−１４２、１４５−１５３、１５５−１５９、１６１−１６３、１６６−１７０、１７２−１７４、１８４−１９７、２００−２０９、２１５−２１８、２２１−２２５、１８４−１９７、２００−２０９、２１５−２１８、２２１−２２５、２２７−２５０、２５９−２６１、２６３−２６７、２６９−２７０、２７５−２８１；及び（ｃ）２９−３５、４３−４５、４８−６３、６７−６９、７２−７４、８０−８２、８４−８７、９５−１０５、１０８−１１３、１１７−１４２、１４５−１６３、１６６−１７０、１７２−１７６、１８４−１８６、１９１−２０１、２０４−２０６、２１６−２１９、２２４−２２６、２２９−２５１、２６０−２６２、２６４−２６８、２７６−２８２、２８６−２８８、２９４−２９９、３０１−３１８、３２３−３２５、３２８−３３０、３３８−３４２、３４５−３４９、３５３−３５８のようなしかしこれらに限定されるものではない、または該デュアルインテグリンタンパク質、サブユニットもしくはその任意の部分の少なくとも一つの機能性、細胞外、可溶性、親水性、外側もしくは細胞質ドメインのようなしかしこれらに限定されるものではない、デュアルインテグリンの少なくとも一つの部分の少なくとも１−５個のアミノ酸を含んでなる。
【０００９】
少なくとも一つの抗体は、場合により、少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、重鎖もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３）及び／または少なくとも一つの定常もしくは可変フレームワーク領域またはその任意の部分の少なくとも一つの特定の部分を含んでなることができる。少なくとも一つの抗体アミノ酸配列はさらに、場合により、本明細書において記述するようなもしくは当該技術分野において既知であるような少なくとも一つの特定の置換、挿入もしくは欠失を含んでなることができる。
【００１０】
本発明はまた、本明細書において記述するような少なくとも一つの単離された抗−デュアルインテグリン抗体も提供し、ここで、該抗体は、ビトロネクチン結合の阻害、アルファ−ｖベータ−３リガンドもしくは受容体の少なくとも一つへのアルファ−ｖベータ−３の結合の阻害、アルファ−ｖベータ−５リガンドもしくは受容体の少なくとも一つへのアルファ−ｖベータ−５の結合の阻害、血管新生調節、デュアルインテグリンもしくは単一インテグリン発現細胞への結合のようなしかしこれらに限定されるものではない少なくとも一つの活性を有する。従って、抗−デュアルインテグリン抗体は、デュアルインテグリンタンパク質に対する少なくとも一つの生物学的活性のようなしかしこれに限定されるものではない、対応する活性に関して既知の方法に従ってスクリーニングすることができる。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の少なくとも一つのデュアルインテグリン抗体に対する少なくとも一つのデュアルインテグリン抗−イディオタイプ抗体を提供する。抗−イディオタイプ抗体には、本発明の抗体に導入することができる、重鎖もしく軽鎖の少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはその任意の部分のようなしかしこれらに限定されるものではない、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含んでなる分子を含有する任意のタンパク質もしくはペプチドが包含される。本発明の抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類などのようなしかしこれらに限定されるものではない任意の哺乳動物を含むことができ、もしくはそれから得ることができる。
【００１２】
本発明は、一つの態様として、その少なくとも一つの特定の配列、ドメイン、部分もしくは変異体を含んでなる、少なくとも一つのデュアルインテグリン抗−イディオタイプ抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、それに相補的な、もしくはハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。本発明はさらに、該デュアルインテグリン抗−イディオタイプ抗体をコードする核酸分子を含んでなる組換えベクター、そのような核酸及び／もしくは組換えベクターを含有する宿主細胞、並びにそのような抗−イディオタイプ抗体核酸、ベクター及び／もしくは宿主細胞を製造及び／もしくは使用する方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体が検出可能な及び／もしくは回収可能な量で発現される条件下で本明細書において記述するような宿主細胞を培養することを含んでなる、宿主細胞において少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体もしくはデュアルインテグリン抗−イディオタイプ抗体を発現する少なくとも一つの方法も提供する。
【００１４】
本発明はまた、（ａ）本明細書において記述するような単離された抗−デュアルインテグリン抗体をコードする核酸及び／もしくは抗体；並びに（ｂ）適当な担体もしくは希釈剤を含んでなる少なくとも一つの組成物も提供する。担体もしくは希釈剤は、場合により、既知の担体もしくは希釈剤に従って、製薬学的に許容しうることができる。組成物はさらに、場合により、少なくとも一つのさらなる化合物、タンパク質もしくは組成物を含んでなることができる。
【００１５】
本発明はさらに、当該技術分野において既知であるようにそして／もしくは本明細書において記述するように、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つのデュアルインテグリン関連症状を、そして／または関連症状の前、後もしくは間に調節もしくは処置するために治療的に有効な量を投与するための少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体方法もしくは組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、本発明による少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の治療的もしくは予防的に有効な量の少なくとも一つの組成物、装置及び／もしくは送達の方法も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、当該技術分野において既知であるようにそして／もしくは本明細書において記述するように、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つのデュアルインテグリン関連症状を、そして／または関連症状の前、後もしくは間に診断するための少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体方法もしくは組成物を提供する。
【００１８】
本発明はまた、本発明による少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の診断のための少なくとも一つの組成物、装置及び／もしくは送達の方法も提供する。
発明の記述
本発明は、単離された、組換え及び／もしくは合成の抗−デュアルインテグリンヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化及び／もしくはＣＤＲ移植した抗体及びそれに対するデュアルインテグリン抗−イディオタイプ抗体、並びに組成物及び少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体もしくは抗−イディオタイプ抗体をコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを含んでなるコード核酸分子を提供する。本発明にはさらに、診断及び治療組成物、方法及び装置を包含する、そのような核酸及び抗体及び抗−イディオタイプ抗体を製造及び使用する方法が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本明細書において用いる場合、「抗−アルファ−ｖ−ベータ３、アルファ−ｖ−ベータ５デュアルインテグリン抗体」、「抗−デュアルインテグリン抗体」、「抗−デュアルインテグリン抗体部分」もしくは「抗−デュアルインテグリン抗体フラグメント」及び／もしくは「抗−デュアルインテグリン抗体変異体」などには、本発明の抗体に導入することができる、重鎖もしく軽鎖の少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはその任意の部分のようなしかしこれらに限定されるものではない、免疫グロブリン分子の少なくとも一部、あるいはデュアルインテグリン受容体もしくは結合タンパク質の少なくとも一つの部分を含んでなる分子を含有する任意のタンパク質もしくはペプチドが包含される。そのような抗体は場合によりさらに、特定のリガンドに影響を及ぼし、例えば、ここで、そのような抗体は、インビトロ、インサイチュー及び／もしくはインビボにおいて、少なくとも一つのデュアルインテグリン活性もしくは結合またはデュアルインテグリン受容体活性もしくは結合を調節し、減少し、増加し、中和し、作動し（ａｎｇｏｎｉｚｅｓ）、軽減し、緩和し、阻止し、抑制し、阻害し、そして／もしくは妨げるが、これらに限定されるものではない。非限定的な例として、本発明の適当な抗−デュアルインテグリン抗体、特定の部分もしくは変異体は、少なくとも一つのデュアルインテグリンまたはその特定の部分、変異体もしくはドメインに結合することができる。適当な抗−デュアルインテグリン抗体、特定の部分もしくは変異体はまた、場合により、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質合成、デュアルインテグリン放出、デュアルインテグリン受容体シグナリング、膜デュアルインテグリン切断、デュアルインテグリン活性、デュアルインテグリン生産及び／もしくは合成のようなしかしこれらに限定されるものではない、少なくとも一つのデュアルインテグリン活性もしくは機能に影響を及ぼすこともできる。「抗体」という用語はさらに、一本鎖抗体及びそのフラグメントを包含する、抗体模倣物を包含するあるいは抗体またはその特定のフラグメントもしくは部分の構造及び／もしくは機能によく似る抗体の部分を含んでなる、抗体、その消化フラグメント、特定の部分及び変異体を包含するものとする。機能性フラグメントには、哺乳動物デュアルインテグリンに結合する抗原結合フラグメントが包含される。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分還元による）及びＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシンもしくはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分還元及び再結合による）、ＦｖもしくはｓｃＦｖ（例えば、分子生物学技術による）フラグメントが包含されるがこれらに限定されるものではない、デュアルインテグリンもしくはその一部に結合することができる抗体フラグメントは、本発明により包含される（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，上記を参照）。
【００２０】
そのようなフラグメントは、当該技術分野において既知であるようにそして／もしくは本明細書において記述するように、酵素切断、合成もしくは組換え技術により製造することができる。抗体はまた、一つもしくはそれ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて様々な欠失形態で製造することもできる。例えば、重鎖のＣＨ１ドメイン及び／もしくはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むようにＦ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子を設計することができる。抗体の様々な部分を通常の技術により化学的に一緒につなぐことができ、もしくは遺伝子工学技術を用いて連続したタンパク質として製造することができる。
【００２１】
本明細書において用いる場合、「ヒト抗体」という用語は、ほんのわずかな配列変化もしくは変異を有する、タンパク質の実質的にあらゆる部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））がヒトにおいて実質的に非免疫原性である抗体をさす。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなど）及び他の哺乳動物と称する抗体は、そのような種、亜属、属、亜科、科特異的抗体を表す。さらに、キメラ抗体には、上記の任意の組み合わせが包含される。そのような変化もしくは変異は、場合によりそして好ましくは、改変していない抗体に対してヒトもしくは他の種における免疫原性を保持するかもしくは下げる。従って、ヒト抗体は、キメラもしくはヒト化抗体と異なる。ヒト抗体は、機能的に再編成したヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／もしくは軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核もしくは真核細胞により製造できるということを指摘する。さらに、ヒト抗体が一本鎖抗体である場合、それは天然のヒト抗体に存在しないリンカーペプチドを含んでなることができる。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域をつなぐ、２〜約８個のグリシンもしくは他のアミノ酸残基のような、リンカーペプチドを含んでなることができる。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源であると考えられる。
【００２２】
少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒトもしくはヒト化、抗体である二重特異性、ヘテロ特異性、ヘテロコンジュゲートもしくは同様の抗体もまた用いることができる。本発明の場合、結合特異性の一方は少なくとも一つのデュアルインテグリンタンパク質に対してであり、もう一方は任意の他の抗原に対してである。二重特異性抗体を製造する方法は、当該技術分野において既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え製造は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、ここで、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ　３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の任意の取り合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ））は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、これらの一つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によって行う、正しい分子の精製はかなり面倒であり、そして生成物収率は低い。同様の方法は、例えば、各々、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ９３／０８８２９、米国特許第６２１０６６８号、第６１９３９６７号、第６１３２９９２号、第６１０６８３３号、第６０６０２８５号、第６０３７４５３号、第６０１０９０２号、第５９８９５３０号、第５９５９０８４号、第５９５９０８３号、第５９３２４４８号、第５８３３９８５号、第５８２１３３３号、第５８０７７０６号、第５６４３７５９号、第５６０１８１９号、第５５８２９９６号、第５４９６５４９号、第４６７６９８０号、ＷＯ ９１／００３６０、ＷＯ ９２／００３７３、ＥＰ ０３０８９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１２１：２１０（１９８６）に開示されている。
【００２３】
本発明の方法及び組成物において有用な抗−デュアルインテグリン抗体（デュアルインテグリン抗体とも称する）は、場合により、デュアルインテグリンへの高親和性結合及び場合によりそして好ましくは低い毒性を有することを特徴とすることができる。特に、可変領域、定常領域及びフレームワークのような個々の成分が、個々にそして／もしくは集合的に、場合によりそして好ましくは低い免疫原性を有する場合の本発明の抗体、特定のフラグメントもしくは変異体は、本発明において有用である。本発明において用いることができる抗体は、場合により、症状の測定可能な軽減及び低いそして／もしくは許容しうる毒性で長い期間にわたって患者を処置できることを特徴とする。低いもしくは許容しうる免疫原性及び／または高い親和性、並びに他の適当な性質は、得られる治療結果に寄与することができる。「低い免疫原性」は、処置する患者の約７５％未満、もしくは好ましくは約５０％未満において有意なＨＡＨＡ、ＨＡＣＡもしくはＨＡＭＡ応答を引き起こす、そして／または処置する患者において低い力価（二重抗原酵素免疫アッセイで測定して約３００未満、好ましくは約１００未満）を引き起こすと本明細書において定義する（引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ｅｌｌｉｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　３４４：１１２５−１１２７（１９９４））。
有用性
本発明の単離された核酸は、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体もしくはその特定の変異体の製造に用いることができ、それらは、免疫障害もしくは疾患、心臓血管障害もしくは疾患、感染性、悪性及び／もしくは神経学的障害もしくは疾患、または他の既知のもしくは特定のデュアルインテグリン関連症状の少なくとも一つから選択されるが、これらに限定されるものではない少なくとも一つのデュアルインテグリン症状を診断する、モニターする、調節する、処置する、軽減する、その発生を防ぐのに役立つ、もしくはその症状を減らすために、細胞、組織、器官もしくは動物（哺乳動物及びヒトを包含する）において測定するかもしくはもたらすために用いることができる。
【００２４】
そのような方法は、症状、効果もしくは機構におけるそのような調節、処置、軽減、予防もしくは減少を必要とする細胞、組織、器官、動物もしくは患者に少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる組成物もしくは製薬学的組成物の有効量を投与することを含んでなることができる。有効量は、本明細書において記述するかもしくは関連技術分野において既知であるように、既知の方法を用いて行いそして決定する場合に、単一（例えばボーラス）、複数もしくは連続投与当たり約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇの量、または単一、複数もしくは連続投与当たり０．０１〜５０００μｇ／ｍｌ血清濃度の血清濃度を達成する量、またはその中の任意の有効な範囲もしくは値を含んでなることができる。
引用
本明細書において引用する全ての公開もしくは特許は、それらが本発明の時点で最新技術を示すようにそして／もしくは本発明の記述及び使用可能性を提供するために引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。公開は、任意の科学もしくは特許公開、または全ての記録、電子もしくは印刷形態を包含する任意の媒体形態で利用可能な任意の他の情報をさす。以下の参考文献は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる：Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７−２００１）。
本発明の抗体
本発明の少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体は、場合により、当該技術分野において周知であるように、細胞系、混合細胞系、不死化細胞もしくは不死化細胞のクローン集団により製造することができる。例えば、各々、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７−２００１）を参照。
【００２５】
ヒトデュアルインテグリンタンパク質もしくはそのフラグメントに特異的なヒト抗体は、単離された及び／もしくはデュアルインテグリンタンパク質もしくはその一部（合成ペプチドのような合成分子を包含する）のような適切な免疫原性抗原に対して作製することができる。他の特定のもしくは一般的な哺乳動物抗体を同様に作製することができる。免疫原性抗原の製造及びモノクローナル抗体製造は、任意の適当な技術を用いて行うことができる。
【００２６】
一つの方法として、適当な不死細胞系（例えば、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、ＳＰ２ ＳＳ１、ＳＰ２ ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａなどのようなしかしこれらに限定されるものではない骨髄腫細胞系、もしくはその融合生成物、ヘテロ骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｌｏｍａｓ）、またはそれから得られる任意の細胞もしくは融合細胞、または当該技術分野において既知であるような任意の他の適当な細胞系、例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍなどを参照）を、単離されたもしくはクローン化した脾臓、末梢血、リンパ、扁桃、または他の免疫もしくはＢ細胞含有細胞、あるいは組換えもしくは内因性、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖、ハイブリダイズしたなど、またはその任意の組み合わせのような、内因性もしくは異種起源の核酸のいずれかとして、重鎖もしくは軽鎖定常もしくは可変もしくはフレームワークもしくはＣＤＲ配列を発現する任意の他の細胞のようなしかしこれらに限定されるものではない抗体産生細胞と融合することによりハイブリドーマを製造する。例えば、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記及びＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，上記、２章を参照。
【００２７】
抗体産生細胞はまた、目的の抗原で免疫化しているヒトもしくは他の適当な動物の末梢血または好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得ることもできる。また、本発明の抗体、その特定のフラグメントもしくは変異体をコードする異種起源もしくは内因性の核酸を発現するために任意の他の適当な宿主細胞を用いることもできる。融合した細胞（ハイブリドーマ）もしくは組換え細胞を選択的培養条件もしくは他の適当な既知の方法を用いて単離し、そして限界希釈もしくはセルソーティング、または他の既知の方法によりクローン化することができる。所望の特異性を有する抗体を生産する細胞を適当なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により選択することができる。
【００２８】
当該技術分野において既知であるようにそして／もしくは本明細書において記述するように、ペプチドもしくはタンパク質ライブラリー（例えば、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，ＤＥ；Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ；ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ、Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ｄｙａｘ　Ｃｏｒｐ．，Ｅｎｚｏｎ，Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ；Ｘｏｍａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ；Ｉｘｓｙｓから入手可能であるような、展示ライブラリー；例えば、各々、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、ＥＰ ３６８，６８４、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５；ＰＣＴ／ＧＢ９２／００２２４０；ＰＣＴ／ＧＢ９２／００８８３；ＰＣＴ／ＧＢ９３／００６０５；ＵＳ ０８／３５０２６０（５／１２／９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１４２２；ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２６６２；ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１８３５；（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；ＷＯ９０／１４４４３；ＷＯ９０／１４４２４；ＷＯ９０／１４４３０；ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２３４；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９６／０７７５４；（Ｓｃｒｉｐｐｓ）；ＥＰ ６１４ ９８９（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）；ＷＯ９５／１６０２７（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）；ＷＯ８８／０６６３０；ＷＯ９０／３８０９（Ｄｙａｘ）；ＵＳ ４，７０４，６９２（Ｅｎｚｏｎ）；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２９８９（Ａｆｆｙｍａｘ）；ＷＯ８９／０６２８３；ＥＰ ３７１ ９９８；ＥＰ ５５０ ４００；（Ｘｏｍａ）；ＥＰ ２２９ ０４６；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７１４９（Ｉｘｓｙｓ）を参照；または確率的に作製したペプチドもしくはタンパク質−ＵＳ ５７２３３２３、５７６３１９２、５８１４４７６、５８１７４８３、５８２４５１４、５９７６８６２、ＷＯ８６／０５８０３、ＥＰ ５９０ ６８９（Ｉｘｓｙｓ、現在、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＭＥ）、しかしこれらに限定されるものではない）から組換え抗体を選択する方法またはヒト抗体のレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、各々、引用することにより全部が組み込まれる、Ｎｇｕｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１−９０７（１９９７）；Ｓａｎｄｈｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５−１１８（１９９６）；Ｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４−１６１（１９９８）、並びに関連特許及び出願）の免疫に頼る方法が包含されるがこれらに限定されるものではない、必要な特異性の抗体を製造もしくは単離する他の適当な方法を用いることができる。そのような技術には、リボソーム展示（Ｈａｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４９３７−４９４２（１９９７年５月）；Ｈａｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４１３０−１４１３５（１���９８年１１月））；単一細胞抗体生産技術（例えば、選択リンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号，Ｗｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７−８９２（１９８７）；Ｂａｂｃｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：７８４３−７８４８（１９９６））；ゲル微小液滴及びフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３−３３７（１９９０）；Ｏｎｅ　Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５−１６３（１９９５）；Ｋｅｎｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７−７９０（１９９５））；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９：１２５−１３４（１９９４）；Ｊｏｎａｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．５，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８８））が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
非ヒトもしくはヒト抗体を設計するもしくはヒト化する方法もまた用いることができ、そして当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化もしくは設計した抗体は、非ヒトである、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類もしくは他の哺乳動物、しかしこれらに限定されるものではない起源からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、たいてい、「移入」残基と呼ばれ、それらは典型的に、既知のヒト配列の「移入」可変、定常もしくは他のドメインから取られる。既知のヒトＩｇ配列は、例えば、各々引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ＿ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）に開示されている。
【００３０】
そのような移入配列は、当該技術分野において既知であるように、免疫原性を減らす、または結合、親和性、オン率（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフ率（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、アビディティー、特異性、半減期もしくは任意の他の適当な特性を減らす、高める、もしくは改変するために用いることができる。一般に、非ヒトもしくはヒトＣＤＲ配列の一部もしくは全部を保持し、一方、可変及び定常領域の非ヒト配列をヒトもしくは他のアミノ酸で置換する。抗体はまた、場合により、抗原に対する高い親和性の保持及び他の好ましい生物学的性質を有してヒト化することもできる。この目的を達成するために、ヒト化抗体は、場合により、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列及び様々な概念的ヒト化生成物の分析の方法により製造することができる。三次元免疫グロブリンモデルは市販されており、そして当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される三次元配置構造を例示及び表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の予想される役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能である。このようにして、ＦＲ残基を選択し、そして標的抗原（一つもしくは複数）に対する増加した親和性のような所望の抗体特性が得られるように共通及び移入配列から組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接そして最も実質的に関与している。本発明の抗体のヒト化もしくは設計は、各々、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４（１９８８）），Ｓｉｍｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ　ａｎｄ　Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５７２３３２３号、第５９７６８６２号、第５８２４５１４号、第５８１７４８３号、第５８１４４７６号、第５７６３１９２号、第５７２３３２３号、第５７６６８８６号、第５７１４３５２号、第６２０４０２３号、第６１８０３７０号、第５６９３７６２号、第５５３０１０１号、第５５８５０８９号、第５２２５５３９号；第４８１６５６７号、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６号、その中に引用される含まれる参考文献に記述されているもののようなしかしこれらに限定されるものではない任意の既知の方法を用いて行うことができる。
【００３１】
抗−デュアルインテグリン抗体はまた、場合により、本明細書において記述するようにそして／もしくは当該技術分野において既知であるように、ヒト抗体のレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類など）の免疫により作製することもできる。ヒト抗−デュアルインテグリン抗体を生産する細胞をそのような動物から単離し、そして本明細書において記述する方法のような適当な方法を用いて不死化することができる。
【００３２】
ヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリーを生産することができるトランスジェニックマウスは、既知の方法により製造することができる（例えば、各々、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌに発行された米国特許：第５，７７０，４２８号、第５，５６９，８２５号、第５，５４５，８０６号、第５，６２５，１２６号、第５，６２５，８２５号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号及び第５，７８９，６５０号；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ　ｅｔ　ａｌ．ＷＯ ９８／５０４３３、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ　ｅｔ　ａｌ．ＷＯ ９８／２４８９３、Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．ＷＯ ９８／２４８８４、Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．ＷＯ ９７／１３８５２、Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．ＷＯ ９４／２５５８５、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ　ｅｔ　ａｌ．ＷＯ ９６／３４０９６、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ　ｅｔ　ａｌ．ＥＰ ０４６３ １５１ Ｂ１、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ　ｅｔ　ａｌ．ＥＰ ０７１０ ７１９ Ａ１、Ｓｕｒａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．米国特許第５，５４５，８０７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．ＷＯ ９０／０４０３６、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．ＥＰ ０４３８ ４７４ Ｂ１、Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．ＥＰ ０８１４ ２５９ Ａ２、Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．ＧＢ ２ ２７２ ４４０ Ａ、Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）５７９−５９１（１９９４）、Ｇｒｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７：１３−２１（１９９４）、Ｍｅｎｄｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２０（２３）：６２８７−６２９５（１９９２）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０（８）３７２０−３７２４（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３（１）：６５−９３（１９９５）及びＦｉｓｈｗａｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１４（７）：８４５−８５１（１９９６）、しかしこれらに限定されるものではない）。一般に、これらのマウスは、機能的に再編成しているもしくは機能的再編成を受けることができる少なくとも一つのヒト免疫グロブリン遺伝子座からのＤＮＡを含んでなる少なくとも一つの導入遺伝子を含んでなる。そのようなマウスにおける内因性免疫グロブリン遺伝子座は、内因性遺伝子によりコードされる抗体を生産する動物の能力を除くために破壊もしくは削除することができる。
【００３３】
同様のタンパク質もしくはフラグメントへの特異的結合に関して抗体をスクリーニングすることは、ペプチド展示ライブラリーを用いて都合よく行うことができる。この方法は、所望の機能もしくは構造を有する個々のメンバーについてのペプチドの大収集物のスクリーニングを伴う。ペプチド展示ライブラリーの抗体スクリーニングは、当該技術分野において周知である。展示ペプチド配列は、３〜５０００もしくはそれ以上のアミノ酸の長さ、しばしば５〜１００アミノ酸の長さ、そしてたいてい約８〜２５アミノ酸の長さであることができる。ペプチドライブラリーを作製するための直接化学合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ法が記述されている。一つのタイプは、バクテリオファージもしくは細胞の表面上でのペプチド配列の展示を伴う。各バクテリオファージもしくは細胞は、特定の展示ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。そのような方法は、ＰＣＴ特許公開第９１／１７２７１号、第９１／１８９８０号、第９１／１９８１８号及び第９３／０８２７８号に記述されている。ペプチドのライブラリーを作製するための別の系は、インビトロ化学合成及び組換え法の両方の特徴を有する。例えば、ＰＣＴ特許公開第９２／０５２５８号、第９２／１４８４３号及び第９６／１９２５６号を参照。また、米国特許第５，６５８，７５４号；及び第５，６４３，７６８号も参照。ペプチド展示ライブラリー、ベクター及びスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のような供給業者から市販されている。例えば、Ｅｎｚｏｎに譲渡された米国特許第４７０４６９２号、第４９３９６６６号、第４９４６７７８号、第５２６０２０３号、第５４５５０３０号、第５５１８８８９号、第５５３４６２１号、第５６５６７３０号、第５７６３７３３号、第５７６７２６０号、第５８５６４５６号；Ｄｙａｘに譲渡された第５２２３４０９号、第５４０３４８４号、第５５７１６９８号、第５８３７５００号；Ａｆｆｙｍａｘに譲渡された第５４２７９０８号、第５５８０７１７号；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された第５８８５７９３号；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された第５７５０３７３号；Ｘｏｍａに譲渡された第５６１８９２０号、第５５９５８９８号、第５５７６１９５号、第５６９８４３５号、第５６９３４９３号、第５６９８４１７号；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，上記；Ａｕｓｕｂｅｌ，上記；もしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，上記を参照、上記の特許及び公開の各々は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本発明の抗体はまた、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどのような、そのような抗体をそれらの乳中に生産するトランスジェニック動物もしくは哺乳動物を提供するために少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体をコードする核酸を用いて製造することもできる。そのような動物は、既知の方法を用いて提供することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；第５，８４９，９９２号；第４，８７３，３１６号；第５，８４９，９９２号；第５，９９４，６１６号；第５，５６５，３６２号；第５，３０４，４８９号などを参照、しかしこれらに限定されるものではない、これらの各々は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【００３５】
本発明の抗体はさらに、そのような抗体、特定の部分もしくは変異体を植物の一部においてもしくはそれから培養した細胞において生産するトランスジェニック植物及び培養した植物細胞（例えば、タバコ及びトウモロコシ、しかしこれらに限定されるものではない）を提供するために少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体をコードする核酸を用いて製造することができる。非限定的な例として、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉は、例えば誘導性プロモーターを用いて、大量の組換えタンパク質を提供するためにうまく用いられている。例えば、Ｃｒａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８（１９９９）及びその中に引用される参考文献を参照。また、トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系において生産されるかもしくは天然起源から精製されるものと同等の生物学的活性を有して、商業生産レベルで哺乳動物タンパク質を発現するために用いられている。例えば、Ｈｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７−１４７（１９９９）及びその中に引用される参考文献を参照。抗体はまた、タバコ種子及びジャガイモ塊茎を包含する、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）のような抗体フラグメントを含むトランスジェニック植物種子から大量に製造されてもいる。例えば、Ｃｏｎｒａｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１−１０９（１９９８）及びその中に引用される参考文献を参照。従って、本発明の抗体はまた、既知の方法に従って、トランスジェニック植物を用いて製造することもできる。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９−１０８（１９９９年１０月）、Ｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２−７（１９９５）；Ｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１−６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０−９４４（１９９４）及びその中に引用される参考文献も参照。また、一般に抗体の植物発現に関しても参照、しかしこれらに限定されるものではない。上記の参考文献の各々は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本発明の抗体は、広範囲の親和性（ＫＤ）でヒトデュアルインテグリンに結合することができる。好ましい態様として、本発明の少なくとも一つのヒトｍＡｂは、場合により、高い親和性でヒトデュアルインテグリンに結合することができる。例えば、ヒトｍＡｂは、０．１−９．９（またはその中の任意の範囲もしくは値）Ｘ１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３またはその中の任意の範囲もしくは値のようなしかしこれらに限定されるものではない、約１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトデュアルインテグリンに結合することができる。
【００３７】
抗原に対する抗体の親和性もしくはアビディティーは、任意の適当な方法を用いて実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ　ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書において記述する方法を参照。）特定の抗体−抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定する場合に異なる可能性がある。従って、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは、抗体及び抗原の標準溶液、並びに本明細書において記述するバッファーのような標準バッファーで行う。
核酸分子
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８の少なくとも一つの連続したアミノ酸の少なくとも７０−１００％をコードするヌクレオチド配列、その特定のフラグメント、変異体もしくは共通配列、またはこれらの配列の少なくとも一つを含んでなる寄託ベクターのような、本明細書において提供する情報を用いて、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体をコードする本発明の核酸分子を本明細書において記述するもしくは当該技術分野において既知であるような方法を用いて得ることができる。
【００３８】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくは任意の他の形態のようなＲＮＡの形態、またはクローニングにより得るもしくは合成的に製造するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが包含されるがこれらに限定されるものではないＤＮＡの形態、またはその任意の組み合わせであることができる。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖もしくは一本鎖、またはその任意の組み合わせであることができる。ＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも一つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られているコーディング鎖であることができ、もしくはそれはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コーディング鎖であることができる。
【００３９】
本発明の単離された核酸分子には、例えば、少なくとも一つの重鎖（例えば配列番号：１−３）もしくは軽鎖（例えば配列番号：４−６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／もしくはＣＤＲ３のような少なくとも一つのＣＤＲの少なくとも一つの特定の部分、しかしこれらに限定されるものではない、場合により１個もしくはそれ以上のイントロンを有する、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなる核酸分子；抗−デュアルインテグリン抗体もしくは可変領域のコーディング配列を含んでなる核酸分子（例えば配列番号：７、８）；及び本明細書において記述するようにそして／もしくは当該技術分野において既知であるように、上記のものと実質的に異なるヌクレオチド配列を含んでなるが遺伝暗号の縮重のためにそれでもなお少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体をコードする核酸分子を包含することができる。もちろん、遺伝暗号は当該技術分野において周知である。従って、本発明の特定の抗−デュアルインテグリン抗体をコードするそのような縮重核酸変異体を作製することは当業者にとって日常的である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，上記を参照、そしてそのような核酸変異体は本発明に包含される。本発明の単離された核酸分子の非限定的な例には、それぞれ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域をコードする核酸の非限定的な例に相当する配列番号：１０、１１、１２、１３、１４、１５が包含される。
【００４０】
別の態様として、本発明は、　　　　に寄託した、それぞれ、指定クローン名　　　　及びＡＴＣＣ寄託番号　　　　として寄託するプラスミドに含まれる核酸によりコードされるようなアミノ酸配列を有する抗−デュアルインテグリン抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００４１】
本明細書において示すように、抗−デュアルインテグリン抗体をコードする核酸を含んでなる本発明の核酸分子には、単独で、抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードするもの；全抗体もしくはその一部のコーディング配列；抗体、フラグメントもしくは一部のコーディング配列、並びに転写、スプライシング及びポリアデニル化シグナルを包含するｍＲＮＡプロセシング（例えば、リボソーム結合及びｍＲＮＡの安定性）において役割を果たす転写され翻訳されない配列のような、非コーディング５’及び３’配列が包含されるがこれらに限定されるものではない、追加の非コーディング配列と一緒に、少なくとも一つのイントロンのような、上記の追加のコーディング配列があるもしくはない、少なくとも一つのシグナルリーダーもしくは融合ペプチドのコーディング配列のような追加の配列；追加の機能性を提供するもののような追加のアミノ酸をコードする追加のコーディング配列を包含することができるが、これらに限定されるものではない。従って、抗体をコードする配列は、抗体フラグメントもしくは一部を含んでなる融合した抗体の精製を容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列に融合することができる。
本明細書において記述するようなポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本発明は、本明細書において開示するポリヌクレオチドに選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離された核酸を提供する。従って、この態様のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含んでなる核酸を単離、検出及び／もしくは定量することに用いることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、寄託ライブラリーにおける部分もしくは全長クローンを同定、単離もしくは増幅するために用いることができる。ある態様として、ポリヌクレオチドは、ヒトもしくは哺乳動物核酸ライブラリーから単離されるゲノムもしくはｃＤＮＡ配列であり、そうでなければそれからのｃＤＮＡに相補的である。
【００４２】
好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％の全長配列、好ましくは少なくとも８５％もしくは９０％の全長配列、そしてより好ましくは少なくとも９５％の全長配列を含んでなる。ｃＤＮＡライブラリーは、稀な配列の表示を増やすために正規化することができる。低いもしくは中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、典型的には、相補的配列に対して減少した配列同一性を有する配列で用いるが、これに限らない。中程度及び高いストリンジェンシーの条件は、場合により、さらに大きい同一性の配列に用いることができる。低いストリンジェンシーの条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、そしてオーソロガスもしくはパラロガス配列を同定するために用いることができる。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、場合により、本明細書において記述するポリヌクレオチドによりコードされる抗体の少なくとも一部をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに用いることができる核酸配列を包含する。例えば、各々、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，上記を参照。
核酸の構築
本発明の単離された核酸は、当該技術分野において周知であるように、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、もしくはその組み合わせを用いて製造することができる。
【００４４】
核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて配列を都合よく含んでなることができる。例えば、ポリヌクレオチドの単離を促進するために１個もしくはそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含んでなるマルチクローニング部位を核酸に挿入することができる。また、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離を促進するために翻訳可能な配列を挿入することもできる。例えば、ヘキサ−ヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するために都合のよい手段を提供する。コーディング配列を除く本発明の核酸は、場合により、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び／もしくは発現のためのベクター、アダプターもしくはリンカーである。
【００４５】
そのようなクローニング及び／もしくは発現配列にクローニング及び／もしくは発現におけるそれらの機能を最適化するため、ポリヌクレオチドの単離を促進するため、もしくは細胞へのポリヌクレオチドの導入を向上するために追加の配列を付加することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター及びリンカーの使用は、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記；もしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，上記を参照）。
核酸を構築するための組換え法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくはその任意の組み合わせのような本発明の単離された核酸組成物は、当業者に既知である任意の数のクローニング方法論を用いて生物学的起源から得ることができる。ある態様として、本発明のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリーにおける所望の配列を同定するために用いる。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築は、当業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記；もしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，上記を参照）。
核酸スクリーニング及び単離方法
ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーは、本明細書において開示するもののような、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを用いてスクリーニングすることができる。プローブは、同じもしくは異なる生物体における相同遺伝子を単離するためにゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズするように用いることができる。ハイブリダイゼーションの様々な程度のストリンジェンシーをアッセイに用いることができ；そしてハイブリダイゼーションもしくは洗浄媒質のいずれかがストリンジェントであることができることを当業者は理解する。ハイブリダイゼーションの条件がよりストリンジェントになるにつれて、二本鎖形成が起こるためにはプローブと標的間のいっそう大きい相補性の程度がなければならない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ及びホルムアミドのような部分的に変性する溶媒の存在の一つもしくはそれ以上により制御することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、０％〜５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作によって反応物溶液の極性を変えることにより都合よく変えられる。検出可能な結合のために必要とされる相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質及び／もしくは洗浄媒質のストリンジェンシーに従って変わる。相補性の程度は、最適には１００％、もしくは７０−１００％、またはその中の任意の範囲もしくは値である。しかしながら、プローブ及びプライマーにおけるわずかな配列変異は、ハイブリダイゼーション及び／もしくは洗浄媒質のストリンジェンシーを下げることにより補うことができると理解されるべきである。
【００４６】
ＲＮＡもしくはＤＮＡの増幅の方法は当該技術分野において周知であり、そして本明細書において提示する教示及びガイダンスに基づいて、過度の実験なしに本発明に従って用いることができる。
【００４７】
ＤＮＡもしくはＲＮＡ増幅の既知の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連増幅方法（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ　ａｌへの米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第４，９６５，１８８号；Ｔａｂｏｒ，ｅｔ　ａｌへの第４，７９５，６９９号及び第４，９２１，７９４号；Ｉｎｎｉｓへの第５，１４２，０３３号；Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ　ａｌへの第５，１２２，４６４号；Ｉｎｎｉｓへの第５，０９１，３１０号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ，ｅｔ　ａｌへの第５，０６６，５８４号、Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｔ　ａｌへの第４，８８９，８１８号；Ｓｉｌｖｅｒ　ｅｔ　ａｌへの第４，９９４，３７０号；Ｂｉｓｗａｓへの第４，７６６，０６７号；Ｒｉｎｇｏｌｄへの第４，６５６，１３４号を参照）並びに二本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを用いるＲＮＡによる増幅（商標ＮＡＳＢＡを有する、Ｍａｌｅｋ，ｅｔ　ａｌへの米国特許第５，１３０，２３８号）が包含されるがこれらに限定されるものではなく、これらの参考文献の全内容は、引用することにより本明細書に組み込まれる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記；もしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，上記を参照）。
【００４８】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーから直接本発明のポリヌクレオチドの配列及び関連遺伝子を増幅するために用いることができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現するタンパク質をコードする核酸配列をクローン化するため、サンプルにおける所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用する核酸を製造するため、核酸塩基配列決定のため、もしくは他の目的のために有用であることもできる。インビトロ増幅法によって当業者を導くために十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ，上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記及びＡｕｓｕｂｅｌ，上記、並びにＭｕｌｌｉｓ，ｅｔ　ａｌ．，米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）；及びＩｎｎｉｓ，ｅｔ　ａｌ．，ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に見出される。ゲノムＰＣＲ増幅のための市販されているキットは、当該技術分野において既知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノムＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照。さらに、例えばＴ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は、長いＰＣＲ産物の収量を向上するために用いることができる。
核酸を構築するための合成法
本発明の単離された核酸はまた、既知の方法による直接化学合成により製造することもできる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，上記を参照）。化学合成は一般に一本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、それを相補的配列とのハイブリダイゼーションによりもしくは鋳型として一本鎖を用いるＤＮＡポリメラーゼでの重合により二本鎖ＤＮＡに転化することができる。ＤＮＡの化学合成は約１００個もしくはそれ以上の塩基の配列に限定され得るが、短い配列の連結によりさらに長い配列を得ることができることを当業者は認識する。
組換え発現カセット
本発明はさらに、本発明の核酸を含んでなる組換え発現カセットを提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードするｃＤＮＡもしくはゲノム配列は、少なくとも一つの所望の宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築するために用いることができる。組換え発現カセットは、典型的に、意図する宿主細胞におけるポリヌクレオチドの転写を導く転写開始調節配列に操作可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含んでなる。本発明の核酸の発現を導くために異種起源及び非異種起源（すなわち、内因性）プロモーターの両方を用いることができる。
【００４９】
ある態様として、本発明のポリヌクレオチドの発現をアップもしくはダウンレギュレーションするために本発明のポリヌクレオチドの非異種起源形態の適切な位置（上流、下流もしくはイントロン中）にプロモーター、エンハンサーもしくは他の要素として働く単離された核酸を導入することができる。例えば、内因性プロモーターを突然変異、欠失及び／もしくは置換によりインビボもしくはインビトロにおいて改変することができる。
ベクター及び宿主細胞
本発明はまた、当該技術分野において周知であるような、本発明の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子的に設計する宿主細胞、及び組換え技術による少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の製造にも関する。例えば、各々、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，上記；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ　ａｌ．，上記を参照。
【００５０】
ポリヌクレオチドは、場合により、宿主における増殖の選択可能なマーカーを含有するベクターにつなぐことができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物において、もしくは荷電脂質との複合体において導入する。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞系を用いてインビトロにおいてそれをパッケージングし、そして次に宿主細胞に導入することができる。
【００５１】
ＤＮＡインサートは、適切なプロモーターに操作可能に連結すべきである。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位及び転写される領域には翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。構築物により発現される成熟転写産物のコーディング部分は、好ましくは、最初に翻訳開始及び翻訳されるｍＲＮＡの最後に適切に位置する終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡもしくはＵＡＧ）を含み、哺乳動物もしくは真核細胞発現にはＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。
【００５２】
発現ベクターは、好ましくはしかし場合により、少なくとも一つの選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーには、例えば、真核細胞培養にはメトトレキセート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号；第４，６３４，６６５号；第４，６５６，１３４号；第４，９５６，２８８号；第５，１４９，６３６号；第５，１７９，０１７号）、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸もしくはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；第５，７７０，３５９号；第５，８２７，７３９号）耐性、そしてエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の細菌もしくは原核生物における培養にはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性遺伝子が包含されるが、これらに限定されるものではない（上記の特許は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞の適切な培養培地及び条件は、当該技術分野において既知である。適当なベクターは、当業者に容易に明らかである。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、陽イオン脂質によるトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染もしくは他の既知の方法によりもたらすことができる。そのような方法は当該技術分野において記述されている、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記，１−４及び１６−１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ，上記，１，９，１３，１５，１６章など。
【００５３】
本発明の少なくとも一つの抗体は、融合タンパク質のような改変された形態で発現することができ、そして分泌シグナルだけでなく、追加の異種起源の機能性領域も含むことができる。例えば、精製中、もしくはその後の処理及び保存中に、宿主細胞における安定性及び持続性を向上するために追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を抗体のＮ末端に付加することができる。また、精製を容易にするためにペプチド成分を本発明の抗体に付加することもできる。そのような領域は、抗体もしくはその少なくとも一つのフラグメントの最終調製の前に取り除くことができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記，１７．２９−１７．４２及び１８．１−１８．７４章；Ａｕｓｕｂｅｌ，上記，１６，１７及び１８章のような多数の標準的な実験マニュアルに記述されている。
【００５４】
当業者は、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現のために利用可能な多数の発現系に精通している。
【００５５】
あるいはまた、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞において（操作により）作動させることにより宿主細胞において発現することができる。そのような方法は、例えば、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８０，７３４号、第５，６４１，６７０号、第５，７３３，７４６号及び第５，７３３，７６１号に記述されているように、当該技術分野において周知である。
【００５６】
抗体、その特定の部分もしくは変異体の製造に有用な細胞培養の実例は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、哺乳動物細胞懸濁液もしくはバイオリアクターもまた用いることができるが、たいてい、細胞の単層の形態である。完全なグリコシル化タンパク質を発現することができる多数の適当な宿主細胞系が当該技術分野において開発されており、そしてＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）及びＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞系、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが包含され、これらは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞のようなリンパ系起源の細胞が包含される。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８５１）である。特に好ましい態様として、組換え細胞はＰ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３もしくはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。
【００５７】
これらの細胞の発現ベクターは、一つもしくはそれ以上の以下の発現制御配列を含むことができる、例えば、複製起点；プロモーター（例えば、後期もしくは初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも一つのヒト免疫グロブリンプロモーター；エンハンサー、及び／もしくはリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えばＳＶ４０ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）のようなプロセシング情報部位、及び転写ターミネーター配列など、しかしこれらに限定されるものではない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．，上記を参照。本発明の核酸もしくはタンパク質の製造に有用な他の細胞は既知であり、そして／あるいは例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）または他の既知のもしくは商業的供給者から入手可能である。
【００５８】
真核宿主細胞を用いる場合、典型的に、ポリアデニル化もしくは転写ターミネーター配列をベクターに導入する。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写産物の正確なスプライシングのための配列もまた含むことができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１（１９８３））。さらに、当該技術分野において既知であるように、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列をベクターに導入することができる。
抗体の精製
抗−デュアルインテグリン抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが包含されるがこれらに限定されるものではない周知の方法により組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）もまた、精製に用いることができる。例えば、各々、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、もしくはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７−２００１），例えば、１，４，６，８，９，１０章を参照。
【００５９】
本発明の抗体には、天然に精製される生成物、化学合成方法の生成物、並びに例えば酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を包含する真核生物宿主から組換え技術により製造される生成物が包含される。組換え製造法に用いる宿主により、本発明の抗体をグリコシル化することができ、もしくは非グリコシル化することができ、グリコシル化するのが好ましい。そのような方法は、全て、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記，１７．３７−１７．４２節；Ａｕｓｕｂｅｌ，上記，１０，１２，１３，１６，１８及び２０章、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，上記，１２−１４章のような多数の標準的な実験マニュアルに記述されている。
抗−デュアルインテグリン抗体
本発明の単離された抗体は、任意の適当なポリヌクレオチドによりコードされる本明細書において開示する抗体アミノ酸配列、または任意の単離されたもしくは調製された抗体を含んでなる。好ましくは、ヒト抗体もしくは抗原結合フラグメントはヒトデュアルインテグリンに結合し、そしてそれにより該タンパク質の少なくとも一つの生物学的活性を部分的にもしくは実質的に中和する。少なくとも一つのデュアルインテグリンタンパク質もしくはフラグメントの少なくとも一つの生物学的活性を部分的にもしくは好ましくは実質的に中和する抗体またはその特定の部分もしくは変異体は、該タンパク質もしくはフラグメントに結合し、そしてそれによりデュアルインテグリン受容体へのデュアルインテグリンの結合または他のデュアルインテグリン依存性もしくは介在機構を通してもたらされる活性を阻害することができる。本明細書において用いる場合、「中和抗体」という用語は、デュアルインテグリン依存性活性をアッセイによって約２０−１２０％、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％もしくはそれ以上阻害することができる抗体をさす。デュアルインテグリン依存性活性を阻害する抗−デュアルインテグリン抗体の能力は、好ましくは、本明細書において記述するようにそして／もしくは当該技術分野において既知であるように、少なくとも一つの適当なデュアルインテグリンタンパク質もしくは受容体アッセイにより評価する。本発明のヒト抗体は、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）もしくはアイソタイプであることができ、そしてカッパもしくはラムダ軽鎖を含んでなることができる。一つの態様として、ヒト抗体は、ＩｇＧ重鎖もしくは特定のフラグメント、例えば、アイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の少なくとも一つを含んでなる。このタイプの抗体は、本明細書において記述するようなそして／もしくは当該技術分野において既知であるような少なくとも一つのヒト軽鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ（例えば、γ１、γ２、γ３、γ４）導入遺伝子を含んでなるトランスジェニックマウスもしくは他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることにより製造することができる。別の態様として、抗−ヒトデュアルインテグリンヒト抗体は、ＩｇＧ１重鎖及びＩｇＧ１軽鎖を含んでなる。
【００６０】
本発明の少なくとも一つの抗体は、少なくとも一つのデュアルインテグリンタンパク質、サブユニット、フラグメント、部分もしくはその任意の組み合わせに特異的な少なくとも一つの特定のエピトープに結合する。少なくとも一つのエピトープは、該タンパク質の少なくとも一つの部分を含んでなる少なくとも一つの抗体結合領域を含んでなることができ、このエピトープは、好ましくは、該タンパク質の少なくとも一つの細胞外、可溶性、親水性、外部もしくは細胞質部分を含んでなる。少なくとも一つの特定のエピトープは、配列番号：９、１６もしくは１７の連続したアミノ酸の少なくとも１−３アミノ酸〜全特定部分の少なくとも一つのアミノ酸配列の任意の組み合わせを含んでなることができる。
【００６１】
一般に、本発明のヒト抗体もしくは抗原結合フラグメントは、少なくとも一つの重鎖可変領域の少なくとも一つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）もしくは変異体及び少なくとも一つの軽鎖可変領域の少なくとも一つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）もしくは変異体を含んでなる抗原結合領域を含んでなる。非限定的な例として、抗体もしくは抗原結合部分もしくは変異体は、配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；及び／もしくは配列番号：６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３の少なくとも一つを含んでなることができる。特定の態様として、抗体もしくは抗原結合フラグメントは、対応するＣＤＲ１、２及び／もしくは３（例えば配列番号：１、２及び／もしくは３）のアミノ酸配列を有する少なくとも一つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／もしくはＣＤＲ３）の少なくとも一部を含んでなる抗原結合領域を有することができる。別の特定の態様として、抗体もしくは抗原結合部分もしくは変異体は、対応するＣＤＲ１、２及び／もしくは３（例えば配列番号：４、５及び／もしくは６）のアミノ酸配列を有する少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／もしくはＣＤＲ３）の少なくとも一部を含んでなる抗原結合領域を有することができる。好ましい態様として、抗体もしくは抗原結合フラグメントの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、本明細書において記述するような、ｍＡｂ　Ｇｅｎ０９５、Ｇｅｎ０１０１、ＣＮＴＯ９５、Ｃ３７２Ａの少なくとも一つの対応するＣＤＲのアミノ酸配列を有する。そのような抗体は、通常の技術を用いて抗体の様々な部分（例えば、ＣＤＲｓ、フレームワーク）を化学的に一緒につなぐことにより、組換えＤＮＡ技術の通常の技術を用いて抗体をコードする核酸分子（すなわち、一つもしくはそれ以上）を調製しそして発現することにより、もしくは任意の他の適当な方法により製造することができる。
【００６２】
抗−デュアルインテグリン抗体は、特定のアミノ酸配列を有する重鎖もしくは軽鎖可変領域の少なくとも一つを含んでなることができる。例えば、好ましい態様として、抗−デュアルインテグリン抗体は、場合により配列番号：７のアミノ酸配列を有する、少なくとも一つの重鎖可変領域；及び／もしくは場合により配列番号：８のアミノ酸配列を有する、少なくとも一つの軽鎖可変領域の少なくとも一つを含んでなる。ヒトデュアルインテグリンに結合しそして特定の重鎖もしくは軽鎖可変領域を含んでなる抗体は、当該技術分野において既知であるようにそして／もしくは本明細書において記述するように、ファージ展示（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ．Ｍｅｄ，１（５）：８６３−８６８（１９９８））のような適当な方法またはトランスジェニック動物を用いる方法を用いて製造することができる。例えば、機能的に再編成したヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子及び機能的再編成を受けることができるヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座からのＤＮＡを含んでなる導入遺伝子を含んでなるトランスジェニックマウスを、抗体の生産を引き出すためにヒトデュアルインテグリンもしくはそのフラグメントで免疫化することができる。所望に応じて、本明細書において記述するようにそして／もしくは当該技術分野において既知であるように、抗体産生細胞を単離することができ、そしてハイブリドーマもしくは他の不死化した抗体産生細胞を製造することができる。あるいはまた、抗体、特定の部分もしくは変異体は、コードする核酸もしくはその一部を適当な宿主細胞において用いて発現することができる。
【００６３】
本発明はまた、本明細書において記述するアミノ酸配列と実質的に同じである配列におけるアミノ酸を含んでなる抗体、抗原結合フラグメント、免疫グロブリン鎖及びＣＤＲにも関する。好ましくは、そのような抗体もしくは抗原結合フラグメント及びそのような鎖もしくはＣＤＲを含んでなる抗体は、高い親和性（例えば、約１０−９Ｍ以下のＫＤ）でヒトデュアルインテグリンに結合することができる。本明細書において記述する配列と実質的に同じであるアミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換、並びにアミノ酸欠失及び／もしくは挿入を含んでなる配列が包含される。保存的アミノ酸置換は、第一のアミノ酸のものと同様である化学的及び／もしくは物理的性質（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第二のアミノ酸での第一のアミノ酸の置換をさす。保存的置換には、以下のグループ内のあるアミノ酸の別のものでの置換が包含される：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパルテート（Ｄ）及びグルタメート（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）及びグリシン（Ｇ）：Ｆ、Ｗ及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴ。
アミノ酸コード
本発明の抗−デュアルインテグリン抗体を構成するアミノ酸は、多くの場合、短縮して書く。アミノ酸名称は、当該技術分野において十分に理解されるようなその１文字コード、その３文字コード、名称もしくは３ヌクレオチドコドン（１つもしくは複数）によってアミノ酸を表すことにより示すことができる（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９４を参照）：
2004510414.tif 000003
本発明の抗−デュアルインテグリン抗体は、本明細書において特定するように、天然の突然変異もしくはヒト操作のいずれかから、１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を含むことができる。
【００６４】
もちろん、当業者が行うアミノ酸置換の数は、上記のものを包含する多数の因子により決まる。一般的に言えば、任意の既定の抗−デュアルインテグリン抗体のアミノ酸置換、挿入もしくは欠失の数は、本明細書において特定するように、１−３０またはその中の任意の範囲もしくは値のような、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１以下である。
【００６５】
機能にとって必須である本発明の抗−デュアルインテグリン抗体のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発もしくはアラニン走査突然変異誘発のような、当該技術分野において既知である方法により同定することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，上記，８章，１５；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　ａｎｄ　Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の方法は、分子のあらゆる残基で単一のアラニン突然変異を導入する。得られる突然変異体分子を次に少なくとも一つのデュアルインテグリン中和活性のようなしかしこれに限定されるものではない生物学的活性に関して試験する。抗体結合にとって重要である部位はまた、結晶化、核磁気共鳴もしくは光親和性標識のような構造分析により同定することもできる（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）及びｄｅ　Ｖｏｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００６６】
本発明の抗−デュアルインテグリン抗体は、配列番号：１、２、３、４、５、６の少なくとも一つの連続したアミノ酸の５個〜全部から選択される少なくとも一つの部分、配列もしくは組み合わせを包むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
抗−デュアルインテグリン抗体はさらに、場合により、配列番号：７、８の少なくとも一つの連続したアミノ酸の７０−１００％の少なくとも一つのポリペプチドを含んでなることができる。
【００６８】
一つの態様として、免疫グロブリン鎖もしくはその一部（例えば、可変領域、ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号：７、８の少なくとも一つの対応する鎖のアミノ酸配列に約７０−１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその中の任意の範囲もしくは値）を有する。例えば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：８の配列と比較することができ、もしくは重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号：７と比較することができる。好ましくは、７０−１００％のアミノ酸同一性（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはその中の任意の範囲もしくは値）は、当該技術分野において既知であるように、適当なコンピューターアルゴリズムを用いて決定する。
【００６９】
典型的な重鎖及び軽鎖可変領域配列を配列番号：７、８に提供する。本発明の抗体もしくはその特定の変異体は、本発明の抗体からの任意の数の連続したアミノ酸残基を含んでなることができ、ここで、その数は、抗−デュアルインテグリン抗体における連続した残基の数の１０−１００％からなる整数の群より選択される。連続したアミノ酸のこの部分配列は、場合により、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０，６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０もしくはそれ以上のアミノ酸の長さ、またはその中の任意の範囲もしくは値である。さらに、そのような部分配列の数は、少なくとも２、３、４もしくは５のような１〜２０からなる群より選択される任意の整数であることができる。
【００７０】
当業者が理解するように、本発明には、本発明の少なくとも一つの生物学的に活性のある抗体が包含される。生物学的に活性のある抗体は、天然（非合成）の、内因性のもしくは関連したそして既知の抗体のものの少なくとも２０％、３０％もしくは４０％、そして好ましくは少なくとも５０％、６０％もしくは７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％、９０％もしくは９５％−１００％の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性の測定量をアッセイ及び定量する方法は、当業者に周知である。
【００７１】
別の態様として、本発明は、有機成分の共有結合付加により改変される、本明細書において記述するようなヒト抗体及び抗原結合フラグメントに関する。そのような改変により、向上した薬物動態学的性質（例えば増加したインビボ血清半減期）を有する抗体もしくは抗原結合フラグメントを製造することができる。有機成分は、線状もしくは分枝状の親水性ポリマー基、脂肪酸基、もしくは脂肪酸エステル基であることができる。特定の態様として、親水性ポリマー基は約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、そしてポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマーもしくはポリビニルピロリドンであることができ、そして脂肪酸もしくは脂肪酸エステル基は、約８〜約４０個の炭素原子を含んでなることができる。
【００７２】
本発明の改変された抗体及び抗原結合フラグメントは、抗体に直接的もしくは間接的に共有結合的に結合する１つもしくはそれ以上の有機成分を含んでなることができる。本発明の抗体もしくは抗原結合フラグメントに結合する各有機成分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基もしくは脂肪酸エステル基であることができる。本明細書において用いる場合、「脂肪酸」という用語には、モノカルボン酸及びジカルボン酸が包含される。「親水性ポリマー基」は、該用語を本明細書において用いる場合、オクタンにおけるより水において可溶性である有機ポリマーをさす。例えば、ポリリシンは、オクタンにおけるより水において可溶性である。従って、ポリリシンの共有結合付加により改変される抗体は、本発明により包含される。本発明の抗体を改変するために適当な親水性ポリマーは線状もしくは分枝状であることができ、そして例えばポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖類、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパルテートなど）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）及びポリビニルピロリドンが包含される。好ましくは、本発明の抗体を改変する親水性ポリマーは、別個の分子存在として約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００を用いることができ、ここで、下付き文字はダルトン単位のポリマーの平均分子量である。親水性ポリマー基は、１〜約６個のアルキル、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸もしくは脂肪酸エステル基で置換される親水性ポリマーは、適当な方法を用いることにより製造することができる。例えば、アミン基を含んでなるポリマーは、脂肪酸もしくは脂肪酸エステルのカルボキシレートに連結することができ、そして、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化する）は、ポリマー上のヒドロキシル基に連結することができる。
【００７３】
本発明の抗体を改変するために適当な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和していることができ、もしくは１つもしくはそれ以上の単位の不飽和を含有することができる。本発明の抗体を改変するために適当な脂肪酸には、例えば、ｎ−ドデカノエート（Ｃ１２，ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（Ｃ１４，ミリステート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ１８，ステアレート）、ｎ−エイコサノエート（Ｃ２０，アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ２２，ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ４０）、シス−Δ９−オクタデカノエート（Ｃ１８，オレエート）、全てのシス−Δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート（Ｃ２０，アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが包含される。適当な脂肪酸エステルには、線状もしくは分枝状低級アルキル基を含んでなるジカルボン酸のモノエステルが包含される。低級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含んでなることができる。
【００７４】
改変されたヒト抗体及び抗原結合フラグメントは、１つもしくはそれ以上の改質剤との反応によるような適当な方法を用いて製造することができる。「改質剤」は、該用語を本明細書において用いる場合、活性化基を含んでなる適当な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）をさす。「活性化基」は、適切な条件下で、第二の化学基と反応しそれにより改質剤と第二の化学基間で共有結合を形成することができる化学成分もしくは官能基である。例えば、アミン反応性活性化基には、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などのような求電子性基が包含される。チオールと反応することができる活性化基には、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などが包含される。アルデヒド官能基は、アミンもしくはヒドラジドを含有する分子に連結することができ、そしてアジド基は三価のリンを含む基と反応してホスホロアミデートもしくはホスホルイミド結合を形成することができる。分子に活性化基を導入する適当な方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）を参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接、もしくはリンカー成分、例えば、二価のＣ１−Ｃ１２基（ここで、１個もしくはそれ以上の炭素原子は、酸素、窒素もしくは硫黄のようなヘテロ原子で置換することができる）によって結合することができる。適当なリンカー成分には、例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−が包含される。リンカー成分を含んでなる改質剤は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でモノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えば、モノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を脂肪酸と反応させて遊離アミンと脂肪酸カルボキシレート間でアミド結合を生成せしめることにより製造することができる。Ｂｏｃ保護基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により生成物から取り除いて記述するような別のカルボキシレートに連結することができる第一級アミンを露出することができ、もしくは無水マレイン酸と反応させそして得られる生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成せしめることができる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，ＷＯ ９２／１６２２１を参照、この全教示は、引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００７５】
本発明の改変された抗体は、ヒト抗体もしくは抗原結合フラグメントを改質剤と反応させることにより製造することができる。例えば、アミン反応性改質剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを用いることにより有機成分を非部位特異的に抗体に結合することができる。改変されたヒト抗体もしくは抗原結合フラグメントはまた、抗体もしくは抗原結合フラグメントのジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元することにより製造することもできる。還元された抗体もしくは抗原結合フラグメントを次にチオール反応性改質剤と反応させて本発明の改変された抗体を生成せしめることができる。本発明の抗体の特定の部位に結合する有機成分を含んでなる改変されたヒト抗体及び抗原結合フラグメントは、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，３：１４７−１５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，５：４１１−４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３−２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９−６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６−４６３（１９９７））、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）に記述されている方法のような適当な方法を用いて製造することができる。
抗−デュアルインテグリン抗体組成物に対する抗−イディオタイプ抗体
モノクローナルもしくはキメラ抗−デュアルインテグリン抗体に加えて、本発明はまた、本発明のそのような抗体に特異的な抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体にも関する。抗−Ｉｄ抗体は、一般に別の抗体の抗原結合領域と関連する独特な決定基を認識する抗体である。抗−Ｉｄは、Ｉｄ抗体の起源と同じ種及び遺伝子タイプの動物（例えばマウス系統）を抗体もしくはそのＣＤＲ含有領域で免疫化することにより製造することができる。免疫化動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識しそしてそれに応答し、抗−Ｉｄ抗体を生産する。抗−Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物における免疫応答を誘導していわゆる抗−抗−Ｉｄ抗体を生産するために「免疫原」として用いることもできる。
抗−デュアルインテグリン抗体組成物
本発明はまた、天然に存在しない組成物、混合物もしくは形態において提供する本明細書において記述するようなそして／もしくは当該技術分野において既知であるようなその少なくとも一種、少なくとも二種、少なくとも三種、少なくとも四種、少なくとも五種、少なくとも六種もしくはそれ以上の抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物も提供する。そのような組成物は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８またはその特定のフラグメント、ドメインもしくは変異体の連続したアミノ酸の７０−１００％からなる群より選択される抗−デュアルインテグリン抗体アミノ酸配列の少なくとも一つもしくは二つの全長、Ｃ及び／もしくはＮ末端欠失変異体、ドメイン、フラグメントまたは特定の変異体を含んでなる天然に存在しない組成物を含んでなる。好ましい抗−デュアルインテグリン抗体組成物は、配列番号：１、２、３、４、５、６またはその特定のフラグメント、ドメインもしくは変異体の７０−１００％の抗−デュアルインテグリン抗体配列の少なくとも一つのＣＤＲもしくはＬＢＲ含有部分のような少なくとも一つもしくは二つの全長、フラグメント、ドメインもしくは変異体を含む。さらに好ましい組成物は、配列番号：１、２、３、４、５、６またはその特定のフラグメント、ドメインもしくは変異体の７０−１００％の少なくとも一つを４０−９９％含んでなる。そのような組成物パーセンテージは、当該技術分野において既知であるようにもしくは本明細書において記述するように、重量、体積、濃度、重量モル濃度、または液体もしくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、エマルジョンもしくはコロイドとしての重量モル濃度による。
【００７６】
本発明の抗−デュアルインテグリン抗体組成物は、少なくとも一つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ抗体もしくはフラグメント、可溶性ＴＮＦ受容体もしくはフラグメント、その融合タンパク質、または小分子ＴＮＦアンタゴニスト、しかしこれらに限定されるものではない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキセート、オーラノフィン、金チオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン（ｆｌｕｒｏｒｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗微生物剤）、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、鉱物、栄養、甲状腺薬（ｔｈｙｒｏｉｄ　ａｇｅｎｔ）、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、下痢止め薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、緩下薬、抗凝固薬、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｉｅｉｔｉｎ）（例えばエポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳剤、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂インヒビター、放射性薬品、抗鬱薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経様作用薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエンインヒビター、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくは類似体、ドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストもしくは抗体から選択される少なくとも一つを場合によりさらに含んでなる、そのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、器官、動物もしくは患者に対する少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる組成物もしくは製薬学的組成物の任意の適当なそして有効な量の少なくとも一つをさらに含んでなることができる。そのようなサイトカインの非限定的な例には、ＩＬ−１〜ＩＬ−２３のいずれか、ＩＬ−６、抗腫瘍抗体、化学療法剤もしくは放射線治療が包含されるがこれらに限定されるものではない。適当な投与量は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）；ＰＤＲ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ　Ｐｏｃｋｅｔ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ　２０００，Ｄｅｌｕｘｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ　Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照、これらの参考文献の各々は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【００７７】
そのような抗癌もしくは抗感染薬はまた、本発明の少なくとも一つの抗体と会合する、結合する、共調合するもしくは共投与する毒素分子を含むこともできる。毒素は、場合により、病理細胞もしくは組織を選択的に殺すように作用することができる。病理細胞は、癌もしくは他の細胞であることができる。そのような毒素は、例えば、リシン、ジフテリア毒素、毒液毒素もしくは細菌毒素の少なくとも一つから選択される、毒素の少なくとも一つの機能性細胞傷害性ドメインを含んでなる精製されたもしくは組換えの毒素もしくは毒素フラグメントであることができるが、これらに限定されるものではない。毒素という用語にはまた、死をもたらすことができる、毒素ショックを包含する、ヒト及び他の哺乳動物における任意の病理学的症状を引き起こすことができる任意の天然に存在する、突然変異体もしくは組換え細菌もしくはウイルスにより生産される内毒素及び外毒素の両方も包含される。そのような毒素には、腸毒素産生性エシェリキア・コリ非耐熱性腸毒素（ＬＴ）、耐熱性腸毒素（ＳＴ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）細胞毒、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）腸毒素、中毒性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、スタヒロコッカス腸毒素Ａ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）もしくはＣ（ＳＥＣ）、ストレプトコッカス腸毒素などが包含されるが、これらに限定されるものではない。そのような細菌には、腸毒素産生性エシェリキア・コリ（ＥＴＥＣ）の種の株、腸出血性エシェリキア・コリ（例えば血清型Ｏ１５７：Ｈ７の株）、スタヒロコッカス種（例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、スタヒロコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、シゲラ種（例えば、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレキシネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｂｏｙｄｉｉ）及びシゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種（例えば、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、サルモネラ・エンテリチディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種（例えば、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ジフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆｅｔｕｓ））、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ））、アエロモナス種（例えば、アエロモナス・ソブリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｏｂｒｉａ）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・カビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ））、プレイソモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｉｓｏｍｏｎａｓ　ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）、エルジニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏｓ）種（例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏｓ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏｓ　ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びストレプトコッカスが包含されるが、これらに限定されるものではない。例えば、Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，ＩＮＴＥＲＮＡＬ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ，３ｒｄ　ｅｄ．，ｐｐ １−１３，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９９０）；Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，２ｄ．Ｅｄ．，ｐｐ ２３９−２５４，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）；Ｍａｎｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３ｄ．Ｅｄ．，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｂｅｒｋｏｗ　ｅｔ　ａｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ　ａｎｄ　Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２；Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７６：１２１−１３４（１９９１）；Ｍａｒｒａｃｋ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：７０５−７１１（１９９０）を参照、これらの参考文献の内容は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本発明の抗−デュアルインテグリン抗体化合物、組成物もしくは組み合わせはさらに、希釈剤、結合剤、安定剤、バッファー、塩類、親油性溶媒、防腐剤、添加剤などのようなしかしこれらに限定されるものではない任意の適当な助剤の少なくとも一つを含んでなることができる。製薬学的に許容しうる助剤が好ましい。そのような滅菌溶液の非限定的な例及び製造する方法は、当該技術分野において周知である、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）１９９０など、しかしこれに限定されるものではない。当該技術分野において周知であるようなもしくは本明細書において記述するような抗−デュアルインテグリン抗体、フラグメントもしくは変異体組成物の投与の形態、可溶性及び／もしくは安定性のために適当である製薬学的に許容しうる担体を慣例的に選択することができる。
【００７９】
本発明において有用な製薬学的賦形剤及び添加剤には、単独でまたは組み合わせて１−９９．９９重量もしくは体積％を含んでなる、単独でもしくは組み合わせて存在することができる、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質及び炭水化物（例えば、単糖類、二、三、四及びオリゴ糖類を包含する糖類；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖類などのような誘導化糖類；並びに多糖類もしくは糖ポリマー）が包含されるが、これらに限定されるものではない。典型的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）のような血清アルブミン、ゼラチン、カゼインなどが包含される。緩衝能力においても機能を果たすことができる代表的なアミノ酸／抗体成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが包含される。一つの好ましいアミノ酸はグリシンである。
【００８０】
本発明における使用のために適当な炭水化物賦形剤には、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどのような単糖類；ラクトース、ショ糖、トレハロース、セロビオースなどのような二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、澱粉などのような多糖類；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）ミオイノシトールなどのようなアルジトールが包含される。本発明における使用のために好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース及びラフィノースである。
【００８１】
抗−デュアルインテグリン抗体組成物はまた、バッファーもしくはｐＨ調整剤を含むこともでき；典型的に、バッファーは有機酸もしくは塩基から製造される塩である。代表的なバッファーには、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸もしくはフタル酸の塩のような有機酸塩；Ｔｒｉｓ、トロメタミン塩酸塩、もしくはリン酸バッファーが包含される。本発明の組成物における使用のために好ましいバッファーは、クエン酸塩のような有機酸塩である。
【００８２】
従って、本発明の抗−デュアルインテグリン抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン）、ポリエチレングリコールのようなポリマー賦形剤／添加剤、香料、抗微生物剤、甘味料、酸化防止剤、静電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ２０」及び「ＴＷＥＥＮ８０」のようなポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート化剤（例えばＥＤＴＡ）を含むことができる。
【００８３】
本発明による抗−デュアルインテグリン抗体、部分もしくは変異体組成物における使用のために適当なこれら及び追加の既知の製薬学的賦形剤及び／もしくは添加剤は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｏｎ：Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　＆　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，”１９ｔｈ　ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）及び“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，”５２ｎｄ　ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）に記載されているように、当該技術分野において既知であり、これらの開示は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。好ましい担体もしくは賦形剤材料は、炭水化物（例えば、糖類及びアルジトール）及びバッファー（例えばクエン酸塩）もしくはポリマー剤である。
配合物
上記のように、本発明は、製薬学的に許容しうる配合物において少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる、好ましくは食塩水もしくは選択した塩を含むリン酸バッファーである安定な配合物、並びに防腐剤を含有する保存溶液及び配合物、並びに製薬学的もしくは獣医学的使用のために適当な多目的保存配合物を提供する。保存配合物は、少なくとも一つの既知のまたは場合により少なくとも一つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール、もしくは水性希釈剤におけるその混合物よりなる群から選択される防腐剤を含有する。０．００１−５％またはその中の任意の範囲もしくは値のような、例えば、０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９またはその中の任意の範囲もしくは値、しかしこれらに限定されるものではない、任意の適当な濃度もしくは混合物を当該技術分野において既知であるように用いることができる。非限定的な例には、防腐剤なし、０．１−２％ ｍ−クレゾール（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、０．１−３％ベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１−０．５％チメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、０．００１−２．０％フェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５−１．０％アルキルパラベン（１種もしくは複数）（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などが包含される。
【００８４】
上記のように、本発明は、包装材料並びに場合により水性希釈剤において規定バッファー及び／もしくは防腐剤と少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の溶液を含んでなる少なくとも一つのバイアルを含んでなる製品を提供し、ここで、該包装材料は、そのような溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間もしくはそれ以上の期間にわたって保持できることを示すラベルを含んでなる。本発明はさらに、包装材料、凍結乾燥した少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる第一のバイアル、及び規定バッファーもしくは防腐剤の水性希釈剤を含んでなる第二のバイアルを含んでなる製品を含んでなり、ここで、該包装材料は、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を水性希釈剤において再構成して２４時間もしくはそれ以上の期間にわたって保持できる溶液を生成せしめるように患者に指示するラベルを含んでなる。
【００８５】
本発明に従って使用する少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体は、本明細書において記述するようにもしくは当該技術分野において既知であるように、哺乳動物細胞もしくはトランスジェニック調製物からを包含する組換え手段により製造することができ、もしくは他の生物学的起源から精製することができる。
【００８６】
本発明の製品における少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の範囲は、さらに低い及びさらに高い濃度が使用できそして意図する送達媒体により決まるが、例えば、溶液配合物は、経皮パッチ、肺、経粘膜、または浸透圧もしくはマイクロポンプ法と異なるが、乾湿系における場合、再構成の際に、約１．０μｇ／ｍｌ〜約１０００ｍｇ／ｍｌの濃度をもたらす量を包含する。
【００８７】
好ましくは、水性希釈剤は、場合により、製薬学的に許容しうる防腐剤をさらに含んでなる。好ましい防腐剤には、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール、もしくはその混合物よりなる群から選択されるものが包含される。配合物において使用する防腐剤の濃度は、抗微生物作用をもたらすために十分な濃度である。そのような濃度は、選択する防腐剤により決まり、そして当業者により容易に決定される。
【００８８】
場合によりそして好ましくは、他の賦形剤、例えば、等張剤、バッファー、酸化防止剤、防腐剤エンハンサーを希釈剤に加えることができる。グリセリンのような等張剤は、既知の濃度で一般に用いられる。好ましくは、向上したｐＨ制御を与えるために生理学的に許容されるバッファーを加える。配合物は、約ｐＨ４〜約ｐＨ１０のような広範囲のｐＨ、そして約ｐＨ５〜約ｐＨ９の好ましい範囲、そして約６．０〜約８．０の最も好ましい範囲に及ぶことができる。好ましくは、本発明の配合物は、約６．８〜約７．８の間のｐＨを有する。好ましいバッファーには、リン酸バッファー、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が包含される。
【００８９】
Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような製薬学的に許容しうる可溶化剤、あるいはポリソルベート２０もしくは８０またはポロキサマー１８４もしくは１８８、ＰｌｕｒｏｎｉｃＲ　ｐｏｌｙｌｓ、他のブロックコポリマーのような非イオン性界面活性剤、並びにＥＤＴＡ及びＥＧＴＡのようなキレート化剤のような他の添加剤を、場合により、凝集を減らすために配合物もしくは組成物に加えることができる。これらの添加剤は、配合物を投与するためにポンプもしくはプラスチック容器を用いる場合に特に有用である。製薬学的に許容しうる界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する傾向を軽減する。
【００９０】
本発明の配合物は、水性希釈剤において少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体並びにフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサールもしくはその混合物よりなる群から選択される防腐剤を混合することを含んでなる方法により製造することができる。水性希釈剤において少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体及び防腐剤を混合することは、通常の溶解及び混合方法を用いて実施する。適当な配合物を製造するために、例えば、緩衝溶液中の少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の測定した量を、所望の濃度のタンパク質及び防腐剤を与えるために十分な量で緩衝溶液において所望の防腐剤と合わせる。この方法の変形は、当業者により認識される。例えば、成分を加える順序、追加の添加剤を用いるかどうか、配合物を製造する温度及びｐＨは全て、用いる濃度及び投与の手段に関して最適化することができる因子である。
【００９１】
請求する配合物は、清澄溶液として、または水性希釈剤において、水、防腐剤及び／もしくは賦形剤、好ましくはリン酸バッファー及び／もしくは食塩水及び選択した塩を含有する第二のバイアルと再構成する凍結乾燥した少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体のバイアルを含んでなる２バイアルとして患者に提供することができる。単一溶液バイアルもしくは再構成を必要とする２バイアルのいずれも複数回再使用することができ、そして単一もしくは複数サイクルの患者処置のために十分であることができ、従って、現在利用できるより都合のよい処置処方計画を提供することができる。
【００９２】
本発明の請求する製品は、即時〜２４時間もしくはそれ以上の期間にわたる投与に有用である。従って、現在請求する製品は、患者に著しい利益を提供する。本発明の配合物は、場合により、約２〜約４０℃の温度で安全に保存することができ、そして長い期間にわたってタンパク質の生物学的活性を保持することができ、従って、該溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２もしくは９６時間またはそれ以上の期間にわたって保持及び／もしくは使用できることを示す包装ラベルを可能にする。保存希釈剤を用いる場合、そのようなラベルは、１−１２ヶ月、半年、１年半及び／もしくは２年までの使用を含むことができる。
【００９３】
本発明における少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の溶液は、水性希釈剤において少なくとも一つの抗体を混合することを含んでなる方法により製造することができる。混合は、通常の溶解及び混合方法を用いて実施する。適当な希釈剤を製造するために、例えば、水もしくはバッファー中の少なくとも一つの抗体の測定した量を、所望の濃度のタンパク質及び場合により防腐剤もしくはバッファーを与えるために十分な量で合わせる。この方法の変形は、当業者により認識される。例えば、成分を加える順序、追加の添加剤を用いるかどうか、配合物を製造する温度及びｐＨは全て、用いる濃度及び投与の手段に関して最適化することができる因子である。
【００９４】
請求する製品は、清澄溶液として、または水性希釈剤を含有する第二のバイアルと再構成する凍結乾燥した少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体のバイアルを含んでなる２バイアルとして患者に提供することができる。単一溶液バイアルもしくは再構成を必要とする２バイアルのいずれも複数回再使用することができ、そして単一もしくは複数サイクルの患者処置のために十分であることができ、従って、現在利用できるより都合のよい処置処方計画を提供する。
【００９５】
請求する製品は、清澄溶液もしくは水性希釈剤を含有する第二のバイアルと再構成する凍結乾燥した少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体のバイアルを含んでなる２バイアルを薬局、診療所、もしくは他のそのような施設及び設備に提供することにより患者に間接的に提供することができる。この場合、清澄溶液は１リットルまでもしくはさらに大きいサイズであることができ、少なくとも一つの抗体溶液の少量部分をさらに小さいバイアルへの移し換えのために１回もしくは複数回取り出しそして薬局もしくは診療所によってそれらの顧客及び／もしくは患者に提供することができる大容器を提供する。
【００９６】
これらの単一バイアル系を含んでなる承認装置には、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ；Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ　Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）により製造もしくは開発されるような、ＢＤ　Ｐｅｎｓ、ＢＤ　ＡｕｔｏｊｅｃｔｏｒＲ、ＨｕｍａｊｅｃｔＲ、ＮｏｖｏＰｅｎＲ、Ｂ−ＤＲ Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎＲ、及びＯｐｔｉＰｅｎＲ、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎＲ、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ　ＰｅｎＲ、Ｈｕｍａｔｒｏ　ＰｅｎＲ、Ｒｅｃｏ−ＰｅｎＲ、Ｒｏｆｅｒｏｎ　ＰｅｎＲ、ＢｉｏｊｅｃｔｏｒＲ、ｉｊｅｃｔＲ、Ｊ−ｔｉｐ　Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ　ＩｎｊｅｃｔｏｒＲ、ＩｎｔｒａｊｅｃｔＲ、Ｍｅｄｉ−ＪｅｃｔＲのような溶液の送達のためのペン−インジェクター（ｐｅｎ−ｉｎｊｅｃｔｏｒ）装置が包含される。２バイアル系を含んでなる承認装置には、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎＲのような再構成溶液の送達のためのカートリッジにおいて凍結乾燥した薬剤を再構成するペン−インジェクター系が包含される。
【００９７】
現在請求する製品は、包装材料を含む。包装材料は、管理機関により要求される情報に加えて、製品を使用することができる条件を提供する。本発明の包装材料は、２バイアルの乾湿製品に関して少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を水性希釈剤において再構成して溶液を生成せしめそして該溶液を２−２４時間もしくはそれ以上の期間にわたって使用するための使用説明書を患者に提供する。単一バイアルの溶液製品では、ラベルは、そのような溶液を２−２４時間もしくはそれ以上の期間にわたって使用できることを示す。現在請求する製品は、ヒト製薬学的製品使用に有用である。
【００９８】
本発明の配合物は、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体及び選択したバッファー、好ましくは食塩水もしくは選択した塩を含有するリン酸バッファーを混合することを含んでなる方法により製造することができる。少なくとも一つの抗体及びバッファーを水性希釈剤において混合することは、通常の溶解及び混合方法を用いて実施する。適当な配合物を製造するために、例えば、水もしくはバッファー中の少なくとも一つの抗体の測定した量を、所望の濃度のタンパク質及びバッファーを与えるために十分な量で水において所望の緩衝剤と合わせる。この方法の変形は、当業者により認識される。例えば、成分を加える順序、追加の添加剤を用いるかどうか、配合物を製造する温度及びｐＨは全て、用いる濃度及び投与の手段に関して最適化することができる因子である。
【００９９】
請求する安定なもしくは保存配合物は、清澄溶液として、または水性希釈剤において防腐剤もしくはバッファー及び賦形剤を含有する第二のバイアルと再構成する凍結乾燥した少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体のバイアルを含んでなる２バイアルとして患者に提供することができる。単一溶液バイアルもしくは再構成を必要とする２バイアルのいずれも複数回再使用することができ、そして単一もしくは複数サイクルの患者処置のために十分であることができ、従って、現在利用できるより都合のよい処置処方計画を提供する。
【０１００】
本明細書において記述する安定なもしくは保存配合物もしくは溶液のいずれかにおける少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体は、当該技術分野において周知であるように、ＳＣもしくはＩＭ注入；経皮、肺、経粘膜、移植、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、もしくは当業者により認識される他の手段を包含する様々な送達方法により本発明に従って患者に投与することができる。
治療的応用
本発明はまた、本発明の少なくとも一つのデュアルインテグリン抗体を用いて、当該技術分野において既知であるようなもしくは本明細書において記述するような、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つのデュアルインテグリン関連疾患を調節もしくは処置する方法も提供する。
【０１０１】
本発明はまた、肥満症、免疫関連疾患、心臓血管疾患、感染症、悪性疾患もしくは神経学的疾患の少なくとも一つが包含されるがこれらに限定されるものではない、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つのデュアルインテグリン関連疾患を調節もしくは処置する方法も提供する。
【０１０２】
本発明はまた、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性発症若年性慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、セロネガティブ関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性脈管炎／ウェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管切除術を戻す手術、アレルギー／アトピー疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、臓器移植拒絶、対宿主性移植片病、全身性炎症性応答症候群、敗血症症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、熱傷、電離放射線暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、慢性関節リウマチ、アルコール誘導性肝炎、慢性炎症性病変（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）、サルコイドーシス、クローン病変（Ｃｒｏｈｎ’ｓ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー疾患、過敏性反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、好酸球増多性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、じんま疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の臓器もしくは組織の移植片拒絶、腎臓移植拒絶、心臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、皮膚同種移植片拒絶、軟骨移植拒絶、骨移植拒絶、小腸移植拒絶、胎児胸腺移植拒絶、上皮小体移植拒絶、任意の臓器もしくは組織の異種移植片拒絶、同種移植片拒絶、抗受容体過敏性反応、グレーヴス病、レーノー病、Ｂ型インシュリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体依存性細胞傷害、ＩＩＩ型過敏性反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性ニューロパシー、臓器巨大症、内分泌障害、単一クローン性高ガンマグロブリン血症及び皮膚変化症候群（ｓｋｉｎ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ））、多発性ニューロパシー、臓器巨大症、内分泌障害、単一クローン性高ガンマグロブリン血症及び皮膚変化症候群、抗リン脂質抗体症候群、天疱瘡、強皮症、混合結合組織病、特発性アディソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、脈管炎、ＭＩ心術後症候群、ＩＶ型過敏症、接触皮膚炎、過敏性肺臓炎、同種移植片拒絶、細胞内生物体による肉芽腫、薬剤感受性、代謝性／特発性、ウィルソン病、血色素症、アルファ−１−アンチトリプシン欠損症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗しょう症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性血球貪食細胞リンパ組織球増多症（ｆａｍｉｌｉａｌ　ｈｅｍａｔｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ）、皮膚科学症状、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子かん前症、ｏｋｔ３療法、抗−ｃｄ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線治療（例えば、無力症、貧血、悪液質などが包含されるがこれらに限定されるものではない）、慢性サリチレート中毒などの少なくとも一つが包含されるがこれらに限定されるものではない、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つの免疫関連疾患を調節もしくは処置する方法も提供する。例えば、各々、引用することにより全部が組み込まれる、Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ−１７ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９）、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）を参照。
【０１０３】
本発明はまた、心臓スタン症候群（ｃａｒｄｉａｃ　ｓｔｕｎ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋梗塞、うっ血性心不全、発作、虚血性発作、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化性疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ　ａｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ）、高血圧症、動脈性高血圧症、腎血管性高血圧症、失神、ショック、心臓血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧症、不整脈、心房異所性収縮、心房粗動、心房細動（持続性もしくは発作性）、灌流後症候群、心肺バイパス炎症応答、無秩序な（ｃｈａｏｔｉｃ）もしくは多病巣性心房性頻拍、規則正しい狭いＱＲＳの頻拍（ｒｅｇｕｌａｒ　ｎａｒｒｏｗ　ＱＲＳ　ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠状動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈（ａｏｒｄｉｃ）もしくは周囲動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分枝の閉塞、末梢血管障害、閉塞性動脈疾患、周囲アテローム性動脈硬化性疾患、閉塞性血栓性血管炎、機能性周囲動脈疾患、レーノー現象及びレーノー病、先端チアノーゼ、先端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、拡張蛇行静脈、動静脈フィステル、リンパ水腫、脂肪水腫、不安定狭心症、再灌流障害、ポンプ後症候群（ｐｏｓｔ　ｐｕｍｐ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、虚血−再灌流障害などの少なくとも一つが包含されるがこれらに限定されるものではない、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つの心血管疾患を調節もしくは処置する方法も提供する。そのような方法は、場合により、そのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、器官、動物もしくは患者に少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる組成物もしくは製薬学的組成物の有効量を投与することを含んでなることができる。
【０１０４】
本発明はまた、急性もしくは慢性細菌感染、細菌、ウイルス及び真菌感染を包含する、急性及び慢性の寄生もしくは感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶニューロパシー、髄膜炎、肝炎（Ａ、ＢもしくはＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、咽頭蓋炎、エシェリキア・コリＯ１５７：ｈ７、溶血性尿毒症症候群／血栓崩壊性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、らい病、中毒性ショック症候群、ストレプトコッカス筋炎、ガス壊疽、マイコバクテリウム結核、マイコバクテリウム　アビウム　イントラセルラーエ、ニューモシスティスカリニ肺炎、骨盤炎症疾患、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、ウイルス関連血球貪食細胞症候群（ｖｉｔａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｈｅｍａｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウイルス（ｖｉｔａｌ）脳炎／無菌性髄膜炎などの少なくとも一つが包含されるがこれらに限定されるものではない、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つの感染症を調節もしくは処置する方法も提供する。
【０１０５】
本発明はまた、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞もしくはＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、組織球増殖症、腫瘍随伴性症候群／悪性疾患の高カルシウム血症、充実性腫瘍、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨疼痛などの少なくとも一つが包含されるがこれらに限定されるものではない、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つの悪性疾患を調節もしくは処置する方法も提供する。
【０１０６】
本発明はまた、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、エイズ痴呆複合症、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎のような脱髄疾患；皮質脊髄系の損傷のような錐体外路及び小脳障害；脳幹神経節の障害もしくは小脳障害；ハンチントン舞踏病及び老年舞踏病のような多動運動障害；ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬剤により誘導されるもののような薬剤性運動障害；パーキンソン病のような運動低下運動障害；進行性核上性麻痺；小脳の構造損傷；脊髄性運動失調、フリートライヒ運動失調、小脳皮質変性、多系統変性（Ｍｅｎｃｅｌ，Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）のような旧小脳変性；全身疾患（レフサム病、無β−リポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張症及びミトコンドリア多系統障害）；多発性硬化症、急性横断性脊髄炎のような脱髄コア疾患（ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ　ｃｏｒｅ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）；並びに神経原性筋萎縮（筋萎縮性側索硬化症、小児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症のような前角細胞変性）のような運動単位の障害；アルツハイマー病；中年におけるダウン症候群：び漫性レビ小体病、；レビ小体型の老年痴呆；ヴェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒症；クロイツフェルト−ヤコブ病；亜急性硬化性汎脳炎、ハレルフォルデン−シュパッツ病；並びに拳闘家痴呆などの少なくとも一つが包含されるがこれらに限定されるものではない、細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも一つの神経学的疾患を調節もしくは処置する方法も提供する。そのような方法は、場合により、そのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、器官、動物もしくは患者に少なくとも一つのＴＮＦ抗体または特定の部分もしくは変異体を含んでなる組成物もしくは製薬学的組成物の有効量を投与することを含んでなることができる。例えば、Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９９２）を参照。
【０１０７】
本発明の任意の方法は、そのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、器官、動物もしくは患者に少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる組成物もしくは製薬学的組成物の有効量を投与することを含んでなることができる。そのような方法は、場合により、そのような免疫疾患を処置するための共投与もしくは組み合わせ治療をさらに含んでなることができ、ここで、該少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体、その特定の部分もしくは変異体の投与は、少なくとも一つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ抗体もしくはフラグメント、可溶性ＴＮＳ受容体もしくはフラグメント、その融合タンパク質、または小分子ＴＮＦアンタゴニスト、しかしこれらに限定されるものではない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキセート、オーラノフィン、金チオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗微生物剤）、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、鉱物、栄養、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、下痢止め薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、緩下薬、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えばエポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳剤、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂インヒビター、放射性薬品、抗鬱薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経様作用薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエンインヒビター、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくは類似体、ドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも一つを前に、同時に、そして／もしくは後に投与することをさらに含んでなる。適当な投与量は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）；ＰＤＲ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ　Ｐｏｃｋｅｔ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ　２０００，Ｄｅｌｕｘｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ　Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照、これらの参考文献の各々は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
（本発明の少なくとも一つの抗体、その特定の部分及び変異体をさらに含んでなる）本発明の組成物、組み合わせ治療、共投与、装置及び／もしくは方法のために適当なＴＮＦアンタゴニストには、抗−ＴＮＦ抗体、その抗原結合フラグメント、及びＴＮＦに特異的に結合する受容体分子；サリドマイド、テニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）、ホスホジエステラーゼインヒビター（例えば、ペントキシフィリン及びロリプラム）、Ａ２ｂアデノシン受容体アゴニスト及びＡｂ２アデノシン受容体エンハンサーのような、標的細胞上でのＴＮＦ合成、ＴＮＦ放出もしくはその作用を妨げそして／もしくは阻害する化合物；マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼインヒビターのような、ＴＮＦ受容体シグナリングを妨げそして／もしくは阻害する化合物；メタロプロテイナーゼインヒビターのような、膜ＴＮＦ切断を阻止しそして／もしくは阻害する化合物；アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター（例えばカプトプリル）のような、ＴＮＦ活性を阻止しそして／もしくは阻害する化合物；並びにＭＡＰキナーゼインヒビターのような、ＴＮＦ生産及び／もしくは合成を阻止しそして／もしくは阻害する化合物が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
本明細書において用いる場合、「腫瘍壊死因子抗体」、「ＴＮＦ抗体」、「ＴＮＦα抗体」もしくはフラグメントなどは、インビトロ、インサイチュー及び／もしくは好ましくはインビボにおいてＴＮＦα活性を減少するか、妨害するか、阻害するか、阻止するかもしくは妨げる。例えば、本発明の適当なＴＮＦヒト抗体はＴＮＦαに結合することができ、そして抗−ＴＮＦ抗体、その抗原結合フラグメント、及びＴＮＦαに特異的に結合するその特定の突然変異体もしくはドメインが包含される。適当なＴＮＦ抗体もしくはフラグメントはまた、ＴＮＦ ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体シグナリング、膜ＴＮＦ切断、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ生産及び／もしくは合成を減少するか、妨害するか、阻止するか、妨げるか、防ぐか、そして／もしくは阻害することもできる。
【０１１０】
キメラ抗体ｃＡ２は、Ａ２と称する高親和性中和マウス抗−ヒトＴＮＦα ＩｇＧ１抗体の抗原結合可変領域、及びヒトＩｇＧ１、カッパ免疫グロブリンの定常領域からなる。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、同種異系抗体エフェクター機能を向上し、循環血清半減期を増加し、そして抗体の免疫原性を減少する。キメラ抗体ｃＡ２のアビディティー及びエピトープ特異性は、マウス抗体Ａ２の可変領域から得られる。特定の態様として、マウス抗体Ａ２の可変領域をコードする核酸の好ましい起源はＡ２ハイブリドーマ細胞系である。
【０１１１】
キメラＡ２（ｃＡ２）は、天然及び組換えヒトＴＮＦαの両方の細胞傷害作用を用量依存的に中和する。キメラ抗体ｃＡ２及び組換えヒトＴＮＦαの結合アッセイから、キメラ抗体ｃＡ２の親和性定数は１．０４ｘ１０１０Ｍ−１であると計算された。競合的阻害によりモノクローナル抗体特異性及び親和性を決定する好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ　ａｌ．，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｃｏｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９２−２０００）；Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４：７２−７９（１９８３）；Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７−２０００）；及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：５８９−６０１（１９８３）に見出すことができ、これらの参考文献は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
特定の態様として、マウスモノクローナル抗体Ａ２は、ｃ１３４Ａと称する細胞系により生産される。キメラ抗体ｃＡ２は、ｃ１６８Ａと称する細胞系により生産される。
【０１１３】
本発明において用いることができるモノクローナル抗−ＴＮＦ抗体のさらなる例は、当該技術分野において記述されている（例えば、米国特許第５，２３１，０２４号；Ｍｏｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　２（３）；１６２−１６９（１９９０）；米国出願第０７／９４３，８５２号（１９９２年９月１１日に出願）；Ｒａｔｈｊｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開第ＷＯ ９１／０２０７８号（１９９１年２月２１日に公開）；Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＰＯ特許公開第０ ２１８ ８６８号（１９８７年４月２２日に公開）；Ｙｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＰＯ特許公開第０ ２８８ ０８８号（１９８８年１０月２６日）；Ｌｉａｎｇ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３７：８４７−８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６：３０５−３１１（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６：３５９−３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６：４８９−５０７（１９８７）；及びＨｉｒａｉ、ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９６：５７−６２（１９８７）を参照、これらの参考文献は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる）。
ＴＮＦ受容体分子
本発明において有用な好ましいＴＮＦ受容体分子は、ＴＮＦαに高い親和性で結合し（例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，国際公開第ＷＯ ９２／０７０７６号（１９９２年４月３０日に公開）；Ｓｃｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　６１：３６１−３７０（１９９０）；及びＬｏｅｔｓｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　６１：３５１−３５９（１９９０）を参照、これらの参考文献は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる）そして場合により低い免疫原性を有するものである。特に、５５ｋＤａ（ｐ５５ ＴＮＦ−Ｒ）及び７５ｋＤａ（ｐ７５ ＴＮＦ−Ｒ）ＴＮＦ細胞表面受容体は、本発明において有用である。受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）もしくはその機能性部分（例えば、Ｃｏｒｃｏｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：８３１−８４０（１９９４））を含んでなる、これらの受容体の欠失形態もまた、本発明において有用である。ＥＣＤを含んでなる、ＴＮＦ受容体の欠失形態は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａ ＴＮＦα阻害結合タンパク質として尿及び血清において検出されている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５３１−１５３６（１９９０））。ＴＮＦ受容体マルチマー分子及びＴＮＦ免疫受容体融合分子、並びに誘導体及びそのフラグメントもしくは一部は、本発明の方法及び組成物において有用なＴＮＦ受容体分子のさらなる例である。本発明において用いることができるＴＮＦ受容体分子は、症状の良好なないし優れた軽減及び低い毒性で長い期間にわたって患者を処置できることを特徴とする。低い免疫原性及び／もしくは高い親和性、並びに他の特定されていない性質は、得られる治療結果に寄与することができる。
【０１１４】
本発明において有用なＴＮＦ受容体マルチマー分子は、一つもしくはそれ以上のポリペプチドリンカー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような他の非ペプチドリンカーによって連結される二つもしくはそれ以上のＴＮＦ受容体のＥＣＤの全部もしくは機能性部分を含んでなる。マルチマー分子はさらに、マルチマー分子の発現を導くために分泌タンパク質のシグナルペプチドを含んでなることができる。これらのマルチマー分子及びそれらの製造方法は、米国出願第０８／４３７，５３３号（１９９５年５月９日に出願）に記述されており、その内容は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
本発明の方法及び組成物において有用なＴＮＦ免疫受容体融合分子は、一つもしくはそれ以上の免疫グロブリン分子の少なくとも一つの部分及び一つもしくはそれ以上のＴＮＦ受容体の全部もしくは機能性部分を含んでなる。これらの免疫受容体融合分子は、モノマー、またはヘテロもしくはホモマルチマーとして組み立てることができる。免疫受容体融合分子はまた、一価もしくは多価であることもできる。そのようなＴＮＦ免疫受容体融合分子の例は、ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質である。ＴＮＦ免疫受容体融合分子及びそれらの製造方法は、当該技術分野において記述されている（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１：２８８３−２８８６（１９９１）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１）；Ｋｏｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：２１５−２１９（１９９４）；Ｂｕｔｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　６（６）：６１６−６２３（１９９４）；Ｂａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２０４０−２０４８（１９９４）；Ｂｅｕｔｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許第５，４４７，８５１号；及び米国出願第０８／４４２，１３３号（１９９５年５月１６日に出願）、これらの参考文献の各々は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる）。免疫受容体融合分子を製造する方法はまた、Ｃａｐｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許第５，１１６，９６４号；Ｃａｐｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，米国特許第５，２２５，５３８号；及びＣａｐｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３３７：５２５−５３１（１９８９）にも見出すことができ、これらの参考文献は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
ＴＮＦ受容体分子の機能性同等物、誘導体、フラグメントもしくは領域は、本発明において用いることができるＴＮＦ受容体分子に機能的に類似する（例えば、高い親和性でＴＮＦαに結合しそして低い免疫原性を有する）ために十分な大きさ及び配列であるＴＮＦ受容体分子の部分、もしくはＴＮＦ受容体分子をコードするＴＮＦ受容体分子配列の部分をさす。ＴＮＦ受容体分子の機能性同等物にはまた、本発明において用いることができるＴＮＦ受容体分子に機能的に類似する（例えば、高い親和性でＴＮＦαに結合しそして低い免疫原性を有する）改変されたＴＮＦ受容体分子も包含される。例えば、ＴＮＦ受容体分子の機能性同等物は、「サイレント（ＳＩＬＥＮＴ）」コドンまたは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を含有することができる（例えば、あるアミノ酸の別のアミノ酸での置換；または同じもしくは異なる疎水性アミノ酸をコードするあるコドンの疎水性アミノ酸をコードする別のコドンでの置換）。Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７−２０００）を参照。
【０１１７】
サイトカインには、任意の既知のサイトカインが包含される。例えば、ＣｏｐｅｗｉｔｈＣｙｔｏｋｉｎｅｓ．ｃｏｍを参照。サイトカインアンタゴニストには、任意の抗体、フラグメントもしくは模倣物、任意の可溶性受容体、フラグメントもしくは模倣物、任意の小分子アンタゴニスト、またはその任意の組み合わせが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
治療的処置．　本発明の任意の方法は、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる組成物もしくは製薬学的組成物の有効量をそのような調節、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、器官、動物もしくは患者に投与することを含んでなる、デュアルインテグリンによりもたらされる疾患を処置する方法を含んでなることができる。そのような方法は、場合により、そのような免疫疾患を処置するための共投与もしくは組み合わせ治療をさらに含んでなることができ、ここで、該少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体、その特定の部分もしくは変異体の投与は、少なくとも一つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ抗体もしくはフラグメント、可溶性ＴＮＦ受容体もしくはフラグメント、その融合タンパク質、または小分子ＴＮＦアンタゴニスト、しかしこれらに限定されるものではない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキセート、オーラノフィン、金チオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗微生物剤）、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、鉱物、栄養、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、下痢止め薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、緩下薬、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えばエポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、免疫、免疫グロブリン、免疫抑制剤（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳剤、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂インヒビター、放射性薬品、抗鬱薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経様作用薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエンインヒビター、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくは類似体、ドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも一つを前に、同時に、そして／もしくは後に投与することをさらに含んでなる。
【０１１９】
典型的に、病理学的症状の処置は、組成物に含まれるものの比活性により、平均して、用量当たり患者のキログラムにつき少なくとも約０．０１〜５００ミリグラムの範囲の少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体、そして好ましくは単一もしくは複数投与当たり患者のキログラムにつき少なくとも約０．１〜１００ミリグラムの抗体に合計がなる少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物の有効量もしくは投与量を投与することによりもたらされる。あるいはまた、有効血清濃度は、単一もしくは複数投与当たり０．１−５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含んでなることができる。適当な投与量は医師に既知であり、そしてもちろん特定の疾病状態、投与する組成物の比活性、及び処置を受ける特定の患者により決まる。ある場合には、所望の治療量を達成するために、反復投与、すなわち、特定のモニター用量もしくは定量の反復個別投与を与えることが必要である可能性があり、ここで、個別投与は、所望の日量もしくは効果が得られるまで繰り返される。
【０１２０】
好ましい用量は、場合により、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び／もしくは１００−５００ｍｇ／ｋｇ／投与、またはその中の任意の範囲、値もしくは割合、あるいは単一もしくは複数投与当たり０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、２０、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、１２、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４、１４．５、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００及び／もしくは５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、またはその任意の範囲、値もしく割合の血清濃度を達成することを包含することができる。
【０１２１】
あるいはまた、投与する投与量は、特定の因子の薬力学的性質、並びにその形態及び投与の経路；レシピエントの年齢、健康及び体重；症状の性質及び程度、同時処置の種類、処置の頻度、並びに所望の効果のような既知の因子により異なることができる。通常、有効成分の投与量は、体重のキログラム当たり約０．１〜１００ミリグラムであることができる。通常、投与当たりもしくは徐放性形態で０．１〜５０、そして好ましくは０．１〜１０ミリグラム／キログラムが、所望の結果を得るために有効である。
【０１２２】
非限定的な例として、ヒトもしくは動物の処置は、単一、注入もしくは反復用量を用いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０日の少なくとも一つ、あるいはまたもしくはさらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１もしくは５２週の少なくとも一つ、あるいはまたもしくはさらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０年の少なくとも一つ、またはその任意の組み合わせに、一日当たり、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｋｇのような、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの本発明の少なくとも一つの抗体の一回もしくは周期投与量として与えることができる。
【０１２３】
内部投与のために適当な剤形（組成物）は、一般に、単位もしくは容器当たり約０．１ミリグラム〜約５００ミリグラムの有効成分を含有する。これらの製薬学的組成物において、有効成分は、通常、組成物の総重量に基づき約０．５−９９．９９９重量％の量で存在する。
【０１２４】
非経口投与には、製薬学的に許容しうる非経口賦形剤と会合するかもしくは別個に提供する溶液、懸濁液、エマルジョンもしくは凍結乾燥粉末として抗体を調合することができる。そのような賦形剤の例は、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液及び１−１０％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び不揮発性油のような非水性の賦形剤もまた用いることができる。賦形剤もしくは凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性（例えば、バッファー及び防腐剤）を維持する添加剤を含有することができる。配合物は、既知のもしくは適当な技術により滅菌する。
【０１２５】
適当な製薬学的担体は、この分野の標準的な参考指定図書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記述されている。
代わりの投与
本発明による少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の製薬学的に有効な量を投与するために多数の既知の及び開発される形態を本発明に従って用いることができる。以下の記述では肺投与を用いるが、他の投与形態を適当な結果を有して本発明に従って用いることができる。
【０１２６】
本発明のデュアルインテグリン抗体は、吸入もしくは本明細書において記述するもしくは当該技術分野において既知である他の形態による投与のために適当な任意の様々な装置及び方法を用いて、溶液、エマルジョン、コロイドもしくは懸濁液として、または乾燥粉末として、担体において送達することができる。
非経口配合物及び投与
非経口投与のための配合物は、一般的な賦形剤として滅菌水もしくは食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含有することができる。注入のための水性もしくは油性の懸濁液は、既知の方法に従って、適切な乳化剤もしくは加湿剤及び沈殿防止剤を用いることにより製造することができる。注入のための因子は、水溶液または溶媒における滅菌した注入可能な溶液もしくは懸濁液のような無毒の非経口的に投与可能な希釈剤であることができる。使用できる賦形剤もしくは溶媒として、水、リンガー溶液、等張食塩水などが可能であり；通常の溶媒もしくは懸濁溶媒として、滅菌した不揮発性油を用いることができる。これらの目的のために、天然もしくは合成もしくは半合成の脂肪油もしくは脂肪酸；天然もしくは合成もしくは半合成のモノ−もしくはジ−もしくはトリ−グリセリドを包含する任意の種類の不揮発性油及び脂肪酸を用いることができる。非経口投与は当該技術分野において既知であり、そして通常の注入手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記述されているようなガス加圧無針注入装置（ｇａｓ　ｐｒｅｓｓｕｒｅｄ　ｎｅｅｄｌｅ−ｌｅｓｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｄｅｖｉｃｅ）、及び引用することにより全部が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８３９，４４６号に記述されているようなレーザー穿孔器装置が包含されるが、これらに限定されるものではない。
代わりの送達
本発明はさらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮手段による少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の投与に関する。少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物は、特に液体溶液もしくは懸濁液の形態の非経口（皮下、筋肉内もしくは静脈内）もしくは任意の他の投与の使用のために；クリーム及び座薬のようなしかしこれらに限定されるものではない特に半固体形態の膣もしくは直腸投与における使用のために；錠剤もしくはカプセル剤の形態のようなしかしこれらに限定されるものではない頬もしくは舌下投与のために；粉末、点鼻薬もしくはエーロゾル剤もしくはある種の薬剤の形態のようなしかしこれらに限定されるものではない鼻内的に；あるいは、皮膚構造を改変するためもしくは経皮パッチにおける薬剤濃度を上げるためのいずれかのジメチルスルホキシドのような化学エンハンサーを有する（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，ｅｔ　ａｌ．“Ｄｒｕｇ　Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，”Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．５９−９０（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９９４、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる）または皮膚上へのタンパク質及びペプチドを含有する配合物の施用を可能にする酸化剤を有する（ＷＯ ９８／５３８４７）ゲル、軟膏、ローション、懸濁液もしくはパッチ送達系、あるいは電気穿孔のような一時的輸送経路を生じさせるためもしくはイオン導入法のような皮膚を通した荷電薬剤の移動を増すための電場の施用、あるいは超音波導入法（米国特許第４，３０９，９８９号及び第４，７６７，４０２号）のような超音波の施用のようなしかしこれらに限定されるものではない経皮的に製造することができる（上記の公開及び特許は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる）。
肺／鼻投与
肺投与には、好ましくは、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物を、肺の下気道もしくは副鼻腔（ｓｉｎｕｓｅｓ）に到達するために有効な粒子サイズで送達する。本発明によれば、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体は、吸入による治療薬の投与のために当該技術分野において既知である任意の様々な吸入もしくは経鼻装置により送達することができる。患者の副鼻腔（ｓｉｎｕｓ　ｃａｖｉｔｙ）もしくは肺胞にエーロゾル配合物を入れることができるこれらの装置には、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生器、噴霧器などが包含される。抗体の肺もしくは鼻投与を導くために適当な他の装置もまた、当該技術分野において既知である。全てのそのような装置は、エーロゾルで抗体を与える投与に適当な配合物を用いることができる。そのようなエーロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）もしくは固体粒子のいずれか含んでなることができる。ＶｅｎｔｏｌｉｎＲ定量噴霧式吸入器のような定量噴霧式吸入器は、典型的に、噴射ガスを使用し、そして吸気中の作動を必要とする（例えば、ＷＯ ９４／１６９７０、ＷＯ ９８／３５８８８を参照）。Ｉｎｈａｌｅ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより販売される装置、ＴｕｒｂｕｈａｌｅｒＴＭ（Ａｓｔｒａ）、ＲｏｔａｈａｌｅｒＲ（Ｇｌａｘｏ）、ＤｉｓｋｕｓＲ（Ｇｌａｘｏ）、ＳｐｉｒｏｓＴＭ吸入器（Ｄｕｒａ）、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒＲ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）のような乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を用いる（引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、ＵＳ ４６６８２１８　Ａｓｔｒａ、ＥＰ ２３７５０７　Ａｓｔｒａ、ＷＯ ９７／２５０８６　Ｇｌａｘｏ、ＷＯ ９４／０８５５２　Ｄｕｒａ、ＵＳ ５４５８１３５　Ｉｎｈａｌｅ、ＷＯ ９４／０６４９８　Ｆｉｓｏｎｓ）。ＡＥＲｘＴＭ　Ａｒａｄｉｇｍ、ＵｌｔｒａｖｅｎｔＲネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）及びＡｃｏｒｎ　ＩＩＲネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ＵＳ ５４０４８７１　Ａｒａｄｉｇｍ、ＷＯ ９７／２２３７６）のようなネブライザー（上記の参考文献は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる）は、溶液からエーロゾルを生成し、一方、定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エーロゾルを生成する。市販されている吸入装置のこれらの特定の例は、本発明の実施のために適当な特定の装置の代表であるものとし、そして本発明の範囲を限定するものではない。好ましくは、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含んでなる組成物は、乾燥粉末吸入器もしくは噴霧器により送達する。本発明の少なくとも一つの抗体を投与するための吸入装置のいくつかの望ましい特徴がある。例えば、吸入装置による送達は、都合よく信頼性が高く、再現性がありそして正確である。吸入装置は、場合により、十分に呼吸が可能であるために例えば約１０μｍ未満、好ましくは約１−５μｍの小乾燥粒子を送達することができる。
スプレーとしてのデュアルインテグリン抗体組成物の投与
デュアルインテグリン抗体組成物タンパク質を含むスプレーは、圧力下でノズルを通して少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の懸濁液もしくは溶液を押し出すことにより製造することができる。ノズルのサイズ及び形状、加える圧力、及び液体供給速度は、所望の出力及び粒子サイズを得るように選択することができる。エレクトロスクレーは、例えば、毛管もしくはノズル供給と連結した電場により製造することができる。スプレーにより送達する少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物タンパク質の粒子は、都合よく、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの範囲、そして最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの粒子サイズを有する。
【０１２７】
噴霧器での使用のために適当な少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物タンパク質の配合物は、典型的に、溶液のｍｌ当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇもしくはｍｇ／ｇｍの少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物タンパク質、またはその中の任意の範囲もしくは値、例えば、．１、．２、．３、．４、．５、．６、．７、．８、．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｍｌもしくはｍｇ／ｇｍ、しかしこれらに限定されるものではない濃度で水溶液において抗体組成物タンパク質を含む。配合物は、賦形剤、バッファー、等張剤、防腐剤、界面活性剤及び好ましくは亜鉛のような因子を含むことができる。配合物はまた、バッファー、還元剤、バルクタンパク質（ｂｕｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ）もしくは炭水化物のような、抗体組成物タンパク質の安定性のための賦形剤もしくは因子を含むこともできる。抗体組成物タンパク質を調合することにおいて有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが包含される。抗体組成物タンパク質を調合することにおいて有用な典型的な炭水化物には、ショ糖、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが包含される。抗体組成物タンパク質配合物はまた界面活性剤を含むこともでき、これは、エーロゾルを生成せしめる際に溶液の噴霧によって引き起こされる抗体組成物タンパク質の表面により誘導される凝集を減らすかもしくは防ぐことができるる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルのような様々な通常の界面活性剤を用いることができる。量は、一般に、配合物の０．００１〜１４重量％の間に及ぶ。本発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。デュアルインテグリン抗体、または特定の部分もしくは変異体のようなタンパク質の配合物のための当該技術分野において既知である追加の因子もまた、配合物に含むことができる。
ネブライザーによるデュアルインテグリン抗体組成物の投与
抗体組成物タンパク質は、噴射ネブライザーもしくは超音波ネブライザーのようなネブライザーにより投与することができる。典型的に、噴射ネブライザーでは、オリフィスを通した高速空気噴射を生じさせるために圧縮空気源を用いる。気体がノズルを越えて膨張するにつれて、低圧領域がもたらされ、それは液体容器につながる毛管を通して抗体組成物タンパク質の溶液を引き出す。毛管からの液体の流れは、それが管を出るにつれて不安定なフィラメント及び液滴に剪断され、エーロゾルを生じさせる。既定の噴射ネブライザーから所望の性能特性を得るために一連の形状、流速及びバッフルタイプを用いることができる。超音波ネブライザーでは、典型的に圧電性変換器を用いて、振動性の機械エネルギーを生じさせるために高周波数電気エネルギーを用いる。このエネルギーは、抗体組成物タンパク質の配合物に直接もしくはカップリング液を通して伝達され、抗体組成物タンパク質を含むエーロゾルを生じさせる。ネブライザーにより送達する抗体組成物タンパク質の粒子は、都合よく、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの範囲、そして最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍの粒子サイズを有する。
【０１２８】
噴射もしくは超音波のいずれかのネブライザーでの使用のために適当な少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の配合物は、典型的に、溶液のｍｌ当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇの少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体タンパク質の濃度を含む。配合物は、賦形剤、バッファー、等張剤、防腐剤、界面活性剤及び好ましくは亜鉛のような因子を含むことができる。配合物はまた、バッファー、還元剤、バルクタンパク質もしくは炭水化物のような、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物タンパク質の安定性のための賦形剤もしくは因子を含むこともできる。少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物タンパク質を調合することにおいて有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが包含される。少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を調合することにおいて有用な典型的な炭水化物には、ショ糖、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが包含される。少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体配合物はまた界面活性剤を含むこともでき、これは、エーロゾルを生成せしめる際に溶液の噴霧によって引き起こされる少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の表面により誘導される凝集を減らすかもしくは防ぐことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビタール脂肪酸エステルのような様々な通常の界面活性剤を用いることができる。量は、一般に、配合物の０．００１〜４重量％の間に及ぶ。本発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。抗体タンパク質のようなタンパク質の配合物のための当該技術分野において既知である追加の因子もまた、配合物に含むことができる。
定量噴霧式吸入器によるデュアルインテグリン抗体組成物の投与
定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）において、噴射剤、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体、及び任意の賦形剤もしくは他の添加剤を、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスターに入れる。計量弁の作動は、好ましくは、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍ、そして最も好ましくは約２μｍ〜約３μｍのサイズ範囲の粒子を含有する、エーロゾルとして混合物を放出する。所望のエーロゾル粒子サイズは、噴射微粉砕、噴霧乾燥、臨界点濃度などを包含する当業者に既知である様々な方法により製造する抗体組成物タンパク質の配合物を用いることにより得ることができる。好ましい定量噴霧式吸入器には、３ＭもしくはＧｌａｘｏにより製造されるもの及びヒドロフルオロカーボン噴射剤を用いるものが包含される。
【０１２９】
定量噴霧式吸入器装置での使用のための少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体の配合物は、一般に、例えば、界面活性剤の助けによって噴射剤に懸濁する、非水性媒質における懸濁液として少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を含有する細かく分割した粉末を含む。噴射剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、ＨＦＡ−１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン−１３４ａ）、ＨＦＡ−２２７（ヒドロフルオロアルカン−２２７）などを包含する、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンもしくは炭化水素のような、この目的のために用いる任意の通常の材料であることができる。好ましくは、噴射剤はヒドロフルオロカーボンである。噴射剤における懸濁液として少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を安定させるため、有効因子を化学分解から守るためなどに界面活性剤を選択することができる。適当な界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、オレイン酸などが包含される。ある場合には、エタノールのような溶媒を用いる溶液エーロゾルが好ましい。タンパク質のようなタンパク質の配合物のための当該技術分野において既知である追加の因子もまた、配合物に含むことができる。
【０１３０】
本発明の方法は、本明細書において記述していない装置による少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体組成物の肺投与により実施できることを当業者は認識する。
経口配合物及び投与
経口用配合物は、腸壁の透過性を人工的に増すための添加剤（例えば、レゾルシノール並びにポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤）の共投与、並びに酵素分解を防ぐための酵素インヒビター（例えば、膵臓トリプシンインヒビター、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＦ）及びトラジロール）の共投与に頼る。経口投与のための固体タイプ剤形の有効成分化合物は、ショ糖、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、澱粉、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成ポリマー、及びグリセリドを包含する少なくとも一つの添加剤と混合することができる。これらの剤形はまた、他のタイプ（一つもしくは複数）の添加剤、例えば、不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウム、パラベンのような潤滑剤、ソルビン酸、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロールのような防腐剤、システインのような酸化防止剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、調味料、香料などを含有することもできる。
【０１３１】
錠剤及び丸剤は、腸溶被覆製剤にさらに加工することができる。経口投与のための液体製剤には、医学的使用のために許容しうる乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤及び液剤製剤が包含される。これらの製剤は、該分野において通常使用する不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。リポソームもまた、インシュリン及びヘパリンの薬剤送達系として記述されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。より最近では、混合アミノ酸の人工ポリマーのミクロスフェア（プロテイノイド）が、製薬を送達するために用いられている（米国特許第４，９２５，６７３号）。さらに、生物学的に活性のある因子を経口的に送達するために用いられる、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，８７１，７５３号に記述されている担体化合物は、当該技術分野において既知である。
粘膜配合物及び投与
粘膜表面を通した吸収には、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体を投与する組成物及び方法は、多数のサブミクロン粒子、粘膜付着性高分子、生物活性ペプチド、及び水性連続相を含んでなるエマルジョンを含み、これは、エマルジョン粒子の粘膜付着を成し遂げることにより粘膜表面を通した吸収を促進する（米国特許第５，５１４，６７０号）。本発明のエマルジョンの施用のために適当な粘液表面には、角膜、結膜、頬、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸、及び直腸投与経路を包含することができる。膣もしくは直腸投与のための配合物、例えば座薬は、賦形剤として例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバターなどを含有することができる。鼻内投与のための配合物は固体であることができ、そして賦形剤として例えばラクトースを含有することができ、または点鼻薬の水性もしくは油性溶液であることができる。頬投与では、賦形剤には、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、糊化済澱粉（ｐｒｅｇｅｌｉｎａｔｉｎｅｄ　ｓｔａｒｃｈ）などが包含される（米国特許第５，８４９，６９５号）。
経皮配合物及び投与
経皮投与には、少なくとも一つの抗−デュアルインテグリン抗体をリポソームもしくはポリマーナノ粒子、微粒子、マイクロカプセルもしくはミクロスフェアのような送達装置（他に記載しない限り、集合的に微粒子と称する）に被包化する。ポリ乳酸、ポリグリコール酸のようなポリヒドロキシ酸及びそのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、及びポリホスファゼンのような合成のポリマー、並びにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン及び他のタンパク質、アルギネート及び他の多糖類のような天然のポリマー、並びにその組み合わせから作られる微粒子を包含する多数の適当な装置が既知である（米国特許第５，８１４，５９９号）。
長期投与及び配合物
本発明の化合物を長い期間にわたって、例えば単一投与から１週〜１年の期間にわたって被検体に送達することが時折望ましい可能性がある。様々な徐放性、デポ（ｄｅｐｏｔ）もしくは移植剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液における低い溶解度を有する化合物の製薬学的に許容しうる無毒の塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ−もしくはジ−スルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような多塩基酸との酸付加塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどのような多価金属陽イオン、または例えばＮ，Ｎ’−ジベンジル−エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから生じる有機陽イオンとの塩；あるいは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含有することができる。さらに、本発明の化合物もしくは好ましくは上記のもののような比較的不溶性の塩はゲル、例えば、注入のために適当な、例えばゴマ油を含むアルミニウムモノステアレートゲルに調合することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモン酸塩などである。注入のための徐放性デポ配合物の別のタイプは、例えば米国特許第３，７７３，９１９号に記述されているようなポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーのようなゆっくり分解する無毒の非抗原性ポリマーに被包化するために分散した化合物もしくは塩を含有する。化合物もしくは好ましくは上記のもののような比較的不溶性の塩はまた、特に動物における使用のために、コレステロールマトリックスシラスティックペレットに調合することもできる。さらなる徐放性、デポもしくは移植配合物、例えば気体もしくは液体リポソームは、文献において既知である（米国特許第５，７７０，２２２号及び“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，”　Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９７８）。
【０１３２】
本発明を一般的に記述しているが、本発明は、例示のために提供しそして限定するものではない以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解される。実施例１：哺乳動物細胞におけるデュアルインテグリン抗体のクローニング及び発現
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始をもたらす少なくとも一つのプロモーター要素、抗体コーディング配列、並びに転写の終結及び転写産物のポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。追加の要素には、エンハンサー、コザック配列、並びにＲＮＡスプライシングの供与及び受容部位が隣接する介在配列が包含される。非常に効率のよい転写は、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、レトロウイルス、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長い末端反復（ＬＴＲＳ）、並びにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターで行うことができる。しかしながら、細胞性要素もまた用いることができる（例えばヒトアクチンプロモーター）。本発明を実施することにおける使用のために適当な発現ベクターには、例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮもしくはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）もしくはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）及びｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７１０９）のようなベクターが包含される。用いることができる哺乳動物宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が包含される。
【０１３３】
あるいはまた、染色体に組み込まれた遺伝子を含有する安定な細胞系において遺伝子を発現することができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシンもしくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとの共トランスフェクションは、トランスフェクション細胞の同定及び単離を可能にする。
【０１３４】
トランスフェクション遺伝子はまた、大量のコード抗体を発現するように増幅することもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、数百もしくはさらに数千コピーの目的遺伝子を保有する細胞系を開発するために有用である。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞系は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子（一つもしくは複数）を含有する。抗体の製造には、たいてい、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＮＳＯ細胞を用いる。
【０１３５】
発現ベクターｐＣ１及びｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５））とＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　４１：５２１−５３０（１９８５））を含有する。例えば制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８を有する、複数のクローニング部位は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化及び終結シグナルを含有する。
ＣＨＯ細胞におけるクローニング及び発現
ベクターｐＣ４をデュアルインテグリン抗体の発現に用いる。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。該プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクションするジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣もしくは他の細胞は、化学療法剤メトトレキセートを補足した選択培地（例えば、アルファマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において細胞を増殖させることにより選択することができる。メトトレキセート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に解説されている（例えば、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｊ．Ｌ．Ｈａｍｌｉｎ　ａｎｄ　Ｃ．Ｍａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１０９７：１０７−１４３（１９９０）；及びＭ．Ｊ．Ｐａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｒｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：６４−６８（１９９１）を参照）。増加する濃度のＭＴＸにおいて増殖する細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰生産することにより薬剤に対する耐性を持つようになる。第二の遺伝子をＤＨＦＲ遺伝子に連結すると、通常、それは共増幅され、そして過剰発現される。この方法は、１，０００コピーより多くの増幅遺伝子（一つもしくは複数）を保有する細胞系を開発するために使用できることが当該技術分野において既知である。次に、メトトレキセートの使用をやめると、宿主細胞の一つもしくはそれ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含有する細胞系が得られる。
【０１３６】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のためにラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５））とヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離したフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　４１：５２１−５３０（１９８５））を含有する。プロモーターの下流には、遺伝子の組込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８制限酵素切断部位がある。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドは、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロン及びポリアデニル化部位を含有する。他の高効率プロモーター、例えば、ヒトβ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶＩからの長い末端反復もまた発現に用いることができる。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−Ｏｆｆ及びＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系及び同様の系は、哺乳動物細胞において調節してデュアルインテグリンを発現するために用いることができる（Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ，ａｎｄ　Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：５５４７−５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化には、例えばヒト成長ホルモンもしくはグロビン遺伝子からの他のシグナルを同様に用いることができる。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞系はまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８もしくはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーとの共トランスフェクションの際に選択することもできる。最初に一種より多くの選択可能なマーカー、例えばＧ４１８とメトトレキセートを使用することが有益である。
【０１３７】
プラスミドｐＣ４を制限酵素で消化し、そして次に当該技術分野において既知である方法により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸する。次に、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。
【０１３８】
既知の方法工程に従って、本発明のデュアルインテグリン抗体のＨＣ及びＬＣ可変領域に対応する、完全なデュアルインテグリン抗体をコードするＤＮＡ配列を用いる。適当なヒト定常領域（すなわち、ＨＣ及びＬＣ領域）をコードする単離された核酸もこれに使用する。
【０１３９】
次に、単離された可変及び定常領域をコードするＤＮＡ並びに脱リン酸したベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次に、エシェリキア・コリＨＢ１０１もしくはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含有する細菌を同定する。
【０１４０】
活性のあるＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクションに用いる。リポフェクチンを用いて５μｇの発現プラスミドｐＣ４を０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏと共トランスフェクションする。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、優性の選択可能マーカー、Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含有する。１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補足したアルファマイナスＭＥＭに細胞を接種する。２日後に、細胞をトリプシン消化し、そして１０、２５もしくは５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキセートと１μｇ／ｍｌのＧ４１８を補足したアルファーマイナスＭＥＭにおいてハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接種する。約１０−１４日後に単一クローンをトリプシン消化し、そして次に異なる濃度のメトトレキセート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて６ウェルペトリ皿もしくは１０ｍｌフラスコに接種する。最も高い濃度のメトトレキセートで増殖するクローンを次にさらに高い濃度のメトトレキセート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含有する新しい６ウェルプレートに移す。１００−２００ｍＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで同じ方法を繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより、もしくは逆相ＨＰＬＣ分析により分析する。
実施例２：完全にヒトデュアルインテグリン抗体の非限定的な例の製造方法及び特性化
要約．重鎖及び軽鎖の両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／Ｊ ｘ Ｃ５７／ＢＬ６／Ｊ）Ｆ２ハイブリッドマウス（Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　６：５７９−５９１（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４：８２６（１９９６）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４：８４５−８５１（１９９６））をヒト胎盤αＶβ３で免疫化した。１つの融合は、ＧｅｎＯ．９５及びＧｅｎＯ．１０１と命名する２種の完全にヒトαＶβ３反応性ＩｇＧ１κモノクローナル抗体をもたらした。これらの完全にヒト抗−αＶβ３抗体をさらに特性化し、そして両方ともαＶβ３及びαＶβ５ヘテロダイマーに反応することが判明し、両分子の共有されるアルファ鎖に対する特異性を示唆した。ＣＮＴＯ９５としても知られている一方のＭａｂ、ＧｅｎＯ．９５は、細胞に基づくアッセイにおいてビトロネクチンへのαＶβ３及びαＶβ５の両方の結合を阻害する。
略語：
ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン
ＣＯ２−二酸化炭素
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド
ＥＩＡ−酵素免疫アッセイ
ＦＢＳ−ウシ胎仔血清
Ｈ２Ｏ２−過酸化水素
ＨＣ−重鎖
ＨＲＰ−西洋ワサビペルオキシダーゼ
Ｉｇ−免疫グロブリン
ＩＰ−腹腔内
ＩＶ−静脈内
Ｍａｂ−モノクローナル抗体
ＯＤ−光学密度
ＯＰＤ−ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩
ＰＥＧ−ポリエチレングリコール
ＰＳＡ−ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン
ＲＴ−室温
ＳＱ−皮下
ＴＢＳ−トリス緩衝食塩水
ｖ／ｖ−体積／体積
ｗ／ｖ−重量／体積
導入：
我々は、αＶインテグリンに特異的な完全にヒトモノクローナル抗体を作製するためにヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを利用した。これらの新規な抗体は、αＶインテグリンがそれらのそれぞれのＥＣＭリガンドに結合することを阻止することにより血管新生プロセスを阻害するために治療的に用いることができ、そして様々な癌の処置におけるさらなる手段を提供する。
材料及び方法
動物
ヒト免疫グロブリンを発現するがマウスＩｇＭもしくはＩｇκを発現しないトランスジェニックマウスは、ＧｅｎＰｈａｒｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより開発されている。これらのマウスは、ヒト配列免疫グロブリンのレパートリーを生成するためにＶ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞突然変異を受けるヒト配列導入遺伝子を含有する（Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　６：５７９−５９１（１９９３））。軽鎖導入遺伝子は、生殖系列ヒトＶκ領域のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンから部分的に得られる。いくつかのＶＨ遺伝子に加えて、重鎖（ＨＣ）導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１の両方（Ｌｏｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３６８：８５６−８５９（１９９４））並びに／もしくはγ３定常領域をコードする。ＨＣ０１２遺伝子型系統から得られるマウスをこれらのモノクローナル抗体を作製するために免疫及び融合プロセスに使用した。
ヒトαＶβ３の精製
ヒト胎盤（肉挽き機を用いて分断する）もしくはαＶβ３インテグリンを発現するＭ２１ヒト黒色腫細胞を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、１００ｍＭオクチルチオグルコシド（ＰｉｅｒｃｅからのＯＴＧ）、０．０５％アジ化ナトリウム及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルクロリド（Ｓｉｇｍａ）を含有する食塩水で抽出した。混合物を室温で１時間攪拌し、そして１０，０００ｘｇで遠心分離により清澄化した。胎盤抽出物からの上清を、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを除くためにセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結したＭａｂ １０Ｅ５からなるアフィニティーカラムにかけ、そして素通り画分を、αＶβ３を結合するためにセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結したＭａｂ ｃ７Ｅ３ Ｆａｂからなるアフィニティーカラムにかけた。ｃ７Ｅ３カラムを、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２及び０．１％ ＯＴＧを含有するＰＢＳ、続いて０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ４．５、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２及び０．１％ ＯＴＧ、ｐＨ ３．０で洗浄した。カラムを０．１Ｍグリシン、２％酢酸、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２及び０．１％ ＯＴＧで溶出した。精製されたαＶβ３を含有する溶出液を２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．５を用いて中和した。調製物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ汚染を除外するためにＥＬＩＳＡにより特性化した（Ｗａｙｎｅｒ、ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１１３：９１９−９２９（１９９１））。
免疫
ＧｅｎＰｈａｒｍから入手した１５〜１７週齢の外科的に去勢したオスマウスを等容量の完全フロイントアジュバントで乳化した全部で２０μｇの胎盤αＶβ３（プレップＶ画分、ＪＧ２１１９７）でＩＰ（２００μＬ）及び２部位においてＳＱ（部位当たり１００μＬ）で免疫化した（０日）。２週後にマウスを等容量の不完全フロイントアジュバントで乳化したαＶβ３で同じように免疫化した。２８、４２及び５６日に不完全フロイントアジュバントでの３回の続く１０μｇ ＩＰ／１０μｇ ＳＱ注射を投与した。次に、４２及び５６日にマウスから抗凝固剤なしに後部−眼窩穿刺により瀉血した。血液をＲＴで１時間凝固させ、そして血清を集め、αＶβ３固相ＥＩＡアッセイを用いて滴定した。反復注射が力価を上げない場合にＧｅｎＯと命名する融合を行った。この時点で、αＶβ３に対する１：１２８０の特異的ヒトＩｇＧ力価を有するマウスに１００μＬの生理食塩水に希釈した１０μｇのαＶβ３の最終ＩＶブースター注射を与えた。３日後に、マウスを頸部脱臼により安楽死させ、そして脾臓を無菌的に取り出し、そして１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＰＳＡ）を含有する１０ｍＬの冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浸した。脾臓をＰＳＡ−ＰＢＳで無菌的に灌流することにより脾臓細胞を採取した。細胞を冷ＰＳＡ−ＰＢＳにおいて１回洗浄し、トリパンブルー色素排除を用いて計数し、そして２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。
細胞系
非分泌性マウス骨髄腫融相手ＳＰ２／０は、９−１−９３にＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＢＳ）グループに入れられた。細胞系を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ　Ｃｕｔｕｒｅ　Ｌａｂｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）を補足したαＭＥＭ（改変）培地（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において増やし、そして９５％ ＦＢＳ及び５％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）において低温保存し、次にＣＢＳの蒸気相液体窒素フリーザーにおいて保存した。細胞バンクは無菌であり（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ）、そしてマイコプラズマを含まなかった（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。細胞を融合まで対数期培養で維持した。それらをＰＢＳにおいて洗浄し、計数し、そして融合の前にトリパンブルー色素排除により生存能力を決定した（＞９５％）。
【０１４１】
αＶβ３及びαＶβ５インテグリンを発現するヒト黒色腫、Ｍ２１細胞系を増やし、そして低温保存した。１０バイアルの研究細胞バンクをＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓに入れ、液体窒素において保存した。細胞バンクは無菌であり、そしてマイコプラズマを含まなかった（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。インテグリンαＶβ３を発現するヒト乳癌、ＭＤＡＭＢ４３５Ｌ２細胞系は、Ｊａｎｅｔ　Ｐｒｉｃｅ博士（ＭＤ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ　ＴＸ）からの贈与であった。細胞系をＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓにおいて低温保存した。細胞バンクは無菌であり、そしてマイコプラズマを含まなかった（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。Ｍ２１及びＭＤＡＭＢ４３５Ｌ２細胞を融解し、適切な培地において増やし、そしてバイオアッセイにおける使用の前に数日間対数期で維持するかもしくはαＶβ３タンパク質の精製における使用のために合流に到達させた（Ｍ２１細胞）。
細胞融合
融合は、１：１の比率のマウス骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）：生存可能な脾臓細胞で実施した。簡潔に言えば、脾臓細胞及び骨髄腫細胞を一緒にペレットにした。ペレットを３７℃で１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液（ＰＥＧ分子量３，０００，Ｓｉｇｍａ）において３０秒にわたってゆっくり再懸濁した。１ｍｌのダルベッコのＰＢＳ（ＪＲＨ）（３７℃）を１分にわたってゆっくり加えることにより融合を止めた。さらに１９ｍＬのＰＢＳを次の９０秒にわたって加えた。融合した細胞を７５０ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に細胞をＨＡＴ培地（２０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、２．５％ Ｏｒｉｇｅｎ培養サプルメント（Ｆｉｓｈｅｒ）、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを含有するαＭＥＭ培地）に再懸濁し、そして次に１３枚の９６ウェル平底組織培養プレートにおいて２００μＬ／ウェルで平板培養した。次にプレートを５％のＣＯ２及び９５％の空気を含有する給湿３７℃インキュベーター中に７−１０日間置いた。
マウス血清におけるヒトＩｇＧ抗−αＶβ３抗体の検出
ヒトαＶβ３に特異的なヒトＩｇＧ抗体に関してマウス血清をスクリーニングするために固相ＥＩＡを用いた。簡潔に言えば、プレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのαＶβ３で一晩被覆した。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１５Ｍ食塩水において洗浄した後、ウェルをＣａ＋＋及びＭｇ＋＋を含むＨＢＳＳ中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、２００μＬ／ウェルでＲＴで１時間ブロックした。プレートはすぐに使用するかもしくは将来の使用のために−２０℃で凍結した。マウス血清を５０μＬ／ウェルでαＶβ３被覆プレート上で倍加希釈でＲＴで１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、次に１％ ＢＳＡ−ＰＢＳにおいて１：３０，０００に希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異的（Ａｃｃｕｒａｔｅ）でＲＴで１時間調べた。プレートを再び洗浄し、そして１００μＬ／ウェルのクエン酸−リン酸基質溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％ Ｈ２Ｏ２及び１ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ）をＲＴで１５分間加えた。次に停止溶液（４Ｎ硫酸）を２５μＬ／ウェルで加え、そしてＯＤを自動プレート分光光度計により４９０ｎｍで読み取った。
ハイブリドーマ上清における完全にヒト免疫グロブリンの検出
ＧｅｎＰｈａｒｍマウスはマウス及びヒト免疫グロブリン鎖の両方を生成することができるので、完全にヒト免疫グロブリンを分泌する増殖陽性ハイブリドーマを２種の別個のＥＩＡ系を用いて検出した。プレートを上記のように被覆し、そして希釈していないハイブリドーマ上清をプレート上で３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、そして１％ ＢＳＡ−ＨＢＳＳにおいて１：１０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗−ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体もしくは１％ ＢＳＡ−ＨＢＳＳにおいて１：３０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体のいずれかで３７℃で１時間調べた。次にプレートを上記のように基質溶液とインキュベーションした。
アイソタイピング
抗体のアイソタイプ決定は、比力価に関してマウス免疫血清をスクリーニングするために用いたものと同様の形態のＥＩＡを用いて実施した。αＶβ３を上記のように９６ウェルプレート上に被覆し、そして２μｇ／ｍＬの精製した抗体をプレート上でＲＴで１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、そして１％ ＢＳＡ−ＨＢＳＳにおいて１：４０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ１（ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ）もしくはＨＲＰ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ３（Ｚｙｍｅｄ）でＲＴで１時間調べた。プレートを再び洗浄し、そして上記のように基質溶液とインキュベーションした。
ＥＩＡによるヒトモノクローナル抗体の結合特性
抗体の結合特性をαＶβ３捕獲ＥＩＡを用いて評価した。Ｌｉｎｂｒｏプレートを２ｍＭのカルシウムを含むＴＢＳ中１μｇ／ｍＬのαＶβ３で４℃で一晩被覆した。プレートを洗浄し、そしてＴＢＳ／１％ ＢＳＡ／カルシウムで室温で少なくとも１時間ブロックした。精製した抗体を２μｇ／ｍＬの開始濃度から倍加希釈でインキュベーションした。プレートを洗浄し、そして結合抗体（１：３０，０００のＨＲＰ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃ）を加え、そしてプレート上で室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、ＯＰＤ基質をウェルに加えた。プレートを自動プレート分光光度計により読み取った。
様々な市販の抗−インテグリンＭａｂによるＭ２１細胞へのＧｅｎＯ９５の結合の競合
Ｍ２１細胞を培養フラスコからトリプシン消化し、洗浄し、そしてＨＢＳＳ／カルシウムにおいて２ｘ１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。ＧｅｎＯ９５をＦＩＴＣ−ヤギ抗−ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ）でＲＴで３０分間あらかじめ標識した。２００μｇ／ｍＬもしくは２０μｇ／ｍＬの１０Ｘ濃度のＧｅｎＯ９５を２５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−ヤギ抗−ヒトＩｇＧとインキュベーションした。Ｍ２１細胞の１００μＬのアリコート（２ｘ１０５細胞）を高い（最終２０μｇ／ｍＬ）及び低い（最終２μｇ／ｍＬ）濃度の１２μＬの１０Ｘ ＧｅｎＯ９５±１２μＬの以下のマウス抗体：ｍ７Ｅ３ ＩｇＧ、抗−αＶβ３（クローンＬＭ６０９，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗−αＶβ５（クローンＰ１Ｆ６，Ｇｉｂｃｏ）、抗−β３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＭＡＣ）もしくは抗−αＶ（クローンＶＮＲ１３９，Ｇｉｂｃｏ）抗体（２０μｇ／ｍＬで）と３７℃で４５分間インキュベーションした。各チューブからアリコートを取り出し（２色分析（ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ）用）、そして残りを１％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメーター上で分析した。２色分析では、マウス抗−αＶβ３、抗−αＶβ３、抗−β３もしくは抗−αＶ抗体を２色分析用に標識するためにアリコート（５０μＬ）をＰＥ−ヤギ抗−マウスＩｇＧとＲＴで３０分間インキュベーションした。全てのチューブを１％パラホルムアルデヒドで固定した。
αＶβ３／αＶβ５特異的Ｍａｂによるビトロネクチン被覆プレートへのαＶβ３もしくはαＶβ５依存性Ｍ２１細胞もしくはＭＤＡＭＢ４３５Ｌ２細胞接着の阻害
Ｌｉｍｂｏプレートを２ｍＭのカルシウムを含むＴＢＳ中５μｇ／ｍＬの５０μＬ／ウェルのビトロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で室温で１時間被覆した。プレートをＨＢＳＳ／カルシウムで洗浄し、そして２ｍＭカルシウム及び１％ ＢＳＡを含有するＴＢＳでＲＴで３０分間ブロックした。Ｍ２１細胞をトリプシン消化し、ＦＣＳを含有する培地で１回洗浄し、そしてカルシウムなしの３ｍＬのＨＢＳＳに再懸濁した。全ての洗浄は、Ｓｏｒｖａｌｌ卓上遠心分離機において１０００ｒｐｍで１０分の回転で行った。細胞を蛍光的に標識するために、カルセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）（ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＬの円錐チューブ（アルミホイルに包む）において１００μｇ／ｍＬの最終濃度に細胞に加えた。細胞を３７℃で１０〜１５分インキュベーションした。カルセイン標識した細胞をＨＢＳＳで１回洗浄し、そして０．１％ ＢＳＡ及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を補足したＨＢＳＳに再懸濁した。抗体を１０Ｘ最終濃度でＨＢＳＳ／０．１％ ＢＳＡ／２ｍＭカルシウムにおいて滴定した（１４倍希釈シリーズ）。細胞（７．５ｘ１０６／ｍｌで３００μＬ）を抗体滴定物（３７μＬの１０Ｘ溶液）±抗−αＶβ５（Ｐ１Ｆ６）腹水（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（３７μＬの１：６００（１０Ｘ））と３７℃で１５分間プレインキュベーションした。細胞−抗体混合物をビトロネクチン被覆プレートに三重反復で１００μＬ／ウェルで加えた（約６ｘ１０５細胞／ウェル）。プレートを３７℃で４５分間インキュベーションした。結合していない細胞をＨＢＳＳ／カルシウム（１５０μＬ／ウェル）で２回の洗浄により取り除いた。１００μｌのＨＢＳＳ／カルシウムを各ウェルに加え、そしてプレートを４８５−５３８ｎｍでＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ上で読み取った。
【０１４２】
別個のアッセイにおいて、ＭＤＡＭＢ４３５Ｌ２ヒト乳癌細胞をベルセンで採取し、そして５００，０００細胞／ｍＬで無血清培地に懸濁し、様々な濃度のＧｅｎＯ９５とインキュベーションした。１０分のインキュベーション後に腫瘍細胞懸濁液（１００μＬ）をビトロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）被覆Ｌｉｎｂｒｏプレートに加え、そして３７℃でインキュベーションした。１時間後に、ウェルを無血清培地（２００μＬ／洗浄）で３回洗浄し、そしてＭＴＴに基づくＣｅｌｌ　Ｔｉｔｅｒ　ＡＱ色素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。細胞接着の程度をＥＬＩＳＡプレート読み取り装置において決定し、ここで、ＯＤ４９０ｎｍは細胞接着に直接比例する。ＢＳＡ被覆ウェルへの細胞接着を陰性コントロールとして用いた。
抗ヒトαＶβ３／αＶβ５ Ｍａｂのそれらのリガンドへの結合のＣａ＋＋依存性の決定
αＶβ３もしくはαＶβ５へのＣＮＴＯ９５及びＣ３７２の結合における陽イオン依存性を決定するために、液相ＥＩＡを利用した。ＥＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をカーボネート被覆バッファー中１０μｇ／ｍＬのＣＮＴＯ９５、Ｃ３７２、ｃ７Ｅ３もしくはＬＭ６０９ ＩｇＧ Ｍａｂで４℃で一晩被覆した。プレートを２ｍＭ Ｃａ＋＋の存在下もしくは非存在下でＨＢＳＳに希釈した１％ ＢＳＡで３７℃で少なくとも１時間ブロックした。１０μｇ／ｍＬから開始するαＶβ３（ｌｏｇ　ＪＧ５２５９９）もしくはαＶβ５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の倍加希釈物をＣａ＋＋なしの１％ ＢＳＡ／ＨＢＳＳ中５０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）ともしくはＣａ＋＋を含む１％ ＢＳＡ／ＨＢＳＳと３７℃で３０分間プレインキュベーションした。次に混合物をプレートに加え、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。次にプレートを洗浄し、そして競合しないＭａｂを以下のようにプレートに加え：αＶβ３結合を検出するためのＣＮＴＯ９５、Ｃ３７２、ｃ７Ｅ３被覆プレートには、Ｍａｂ ＬＭ６０９を１％ ＢＳＡ／ＨＢＳＳ ∀ Ｃａ＋＋中２０μｇ／ｍＬで加え；αＶβ３結合を検出するためのＬＭ６０９被覆プレートには、Ｍａｂ ＣＮＴＯ９５を１％ ＢＳＡ／ＨＢＳＳ ∀ Ｃａ＋＋中２０μｇ／ｍＬで加え；αＶβ５結合を検出するためのＣＮＴＯ９５、Ｃ３７２、ｃ７Ｅ３被覆プレートには、Ｍａｂ ＶＮＲ１３９（Ｇｉｂｃｏ）を１％ ＢＳＡ／ＨＢＳＳ ∀ Ｃａ＋＋中１０μｇ／ｍＬで加え、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを再び洗浄し、そして適切なバッファーにおいてＨＲＰ標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ ＦｃもしくはＨＲＰ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃのいずれかで調べ、そして３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、ＯＰＤ基質を加え、そしてＯＤ４９０を前記のように測定した。
結果及び説明
完全にヒト抗−ヒトαＶβ３インテグリンモノクローナル抗体の作製
αＶβ３タンパク質で免疫化したＧｅｎＰｈａｒｍマウスからＧｅｎＯと命名する一つの融合を行った。この融合から、１２９個の増殖陽性ハイブリッドをスクリーニングした。ヒトαＶβ３と反応する完全にヒトＩｇＧ抗体を分泌する２つのハイブリドーマ細胞系を同定した。これら二つの細胞系、ＧｅｎＯ．９５．９．１２及びＧｅｎＯ．１０１．１７．２２は各々、ヒトＩｇＧ１κアイソタイプの免疫グロブリンを分泌し、そして両方とも安定な細胞系を得るために限界希釈により２回サブクローン化した（＞９０％均質）。ＧｅｎＯ．９５．９．１２にはＣ−コード＃ＣＮＴＯ９５を割り当て、そしてＧｅｎＯ．１０１．１７．２２にはＣ−コード＃Ｃ３７２Ａを割り当てた。各々の細胞系をＬＮ２に保存する１２バイアルの研究細胞バンクで凍結した。
ＥＩＡによるヒトモノクローナル抗体の結合特性
ＥＬＩＳＡ分析は、２つのハイブリドーマ、ＣＮＴＯ９５及びＣ３７２Ａからの精製抗体が、濃度に依存してαＶβ３に結合することを裏付けた。図１は、抗体の相対結合効率の結果を示す。５０％結合は、Ｃ３７２Ａ及びＣＮＴＯ９５ではそれぞれ０．０７及び０．７μｇ／ｍＬで得られる。同じアッセイにおいて、ｃ７Ｅ３ ＩｇＧは０．０７μｇ／ｍＬで５０％最大結合を示した。
市販されている抗−インテグリンＭａｂによるＭ２１細胞へのＭａｂ ＧｅｎＯ９５の結合の競合
単色分析（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｌｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ）により、マウス抗−αＶβ３、抗−αＶβ５、抗−β３もしくは抗−αＶ抗体はいずれもＭ２１細胞への結合に関してＣＮＴＯ９５と競合しなかった（表１）。この実験はまた、ＣＮＴＯ９５が用量に依存してＭ２１細胞に結合することも示す。２色分析は、マウス抗−αＶβ３、抗−αＶβ５、抗−β３もしくは抗−αＶ抗体がＭ２１細胞に結合できることを示した（データは示さない）。
【０１４３】
【表１】
2004510414.tif 000004
【０１４４】
αＶβ３／αＶβ５特異的Ｍａｂによるビトロネクチン被覆プレートへのαＶβ３もしくはαＶβ５依存性Ｍ２１細胞もしくはＭＤＡＭＢ４３５Ｌ２細胞接着の阻害
Ｍ２１細胞は、αＶβ３及びαＶβ５に依存してビトロネクチン被覆プレートに接着する。従って、αＶβ３及びαＶβ５の両方の阻害が、ビトロネクチン被覆プレートへのＭ２１細胞接着を完全に阻害するために必要とされる。Ｃ３７２Ａは、抗−αＶβ５腹水、Ｐ１Ｆ６の存在下もしくは非存在下でＭ２１細胞接着を阻害しなかった（図２）。ＧｅｎＯ９５（ＣＮＴＯ９５）は、抗−αＶβ５（Ｐ１Ｆ６）腹水があるもしくはない両方でビトロネクチン被覆プレートへのＭ２１細胞接着を完全に阻害し、該抗体がαＶβ３及びαＶβ５の両方をブロックすることを示した。アッセイパラメーターのコントロールとして、αＶβ３（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに加えて）をブロックするＲｅｏＰｒｏ（ｃ７Ｅ３ Ｆａｂ）を含んだ。ＲｅｏＰｒｏ単独では、Ｍ２１細胞接着を部分的にのみ阻害し、抗−αＶβ５（Ｐ１Ｆ６）腹水の存在下でＲｅｏＰｒｏは、接着を完全に阻害し、これは、Ｍ２１細胞がαＶβ３もしくはαＶβ５インテグリンの両方によってビトロネクチンに結合することを示す。データは、アンタゴニスト＋／−抗−αＶβ５（Ｐ１Ｆ６）腹水の非存在下での最大Ｍ２１細胞結合のパーセントに正規化した。Ｐ１Ｆ６なしのアンタゴニスト滴定では、データをアンタゴニストもしくはＰ１Ｆ６の非存在下での最大Ｍ２１細胞結合に正規化した。Ｐ１Ｆ６の存在下でのアンタゴニスト滴定では、データをアンタゴニストの非存在下であるがＰ１Ｆ６の存在下での最大結合に正規化した。データを最大結合（抗体なし）のパーセントとしてグラフで表し、そしてＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍを用いて非線形回帰を行った。
【０１４５】
ＧｅｎＯ９５ Ｍａｂはまた、１．５μｇ／ｍＬの最小濃度でビトロネクチンへのＭＤＡＭＢ４３５Ｌ２細胞接着を完全に阻害できることも示した（図３）。これらのデータは、Ｍ２１細胞接着の阻害を示すデータと組み合わせて、ビトロネクチンとのαＶβ３及び／もしくはαＶβ５受容体相互作用を機能的に阻害するＧｅｎＯ９５の能力を裏付ける。
抗−ヒトαＶβ３／αＶβ５ Ｍａｂのそれらのリガンドへの結合のＣａ＋＋依存性の決定
図４ｃ及び４ｄにおいてそれぞれ示すように、陽イオンカルシウムの存在は、Ｍａｂ ｃ７Ｅ３がαＶβ３に結合するために必要でありそしてαＶβ３へのＭａｂ ＬＭ６０９の結合には必要条件でないことが既知である。この実験は、カルシウム依存性がαＶβ３もしくはαＶβ５インテグリンに対するＣＮＴＯ９５もしくはＣ３７２の結合特性にも当てはまるかどうかを評価するために実施した。インテグリンヘテロダイマーの結合ポケット内に存在するＣａをキレート化するために過剰濃度のＥＤＴＡをアッセイ形態に導入し、従って、結合を陽イオンの非存在下で評価した。αＶβ３へのＣＮＴＯ９５及びＣ３７２結合は、Ｃａの存在に依存しないことが判明した（図４ａ、図４ｂ）。同じことがαＶβ５へのＣＮＴＯ９５結合に当てはまるが、しかしながら、αＶβ５へのＣ３７２結合では、Ｃａの存在下で結合は増加するようであるので、そうではない（図４ｅ、４ｆ）。
結論
ヒトαＶβ３で免疫化したヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾臓細胞を利用してＧｅｎＯ融合を行った。ＩｇＧ１κアイソタイプの２つの完全にヒトαＶβ３反応性ＩｇＧモノクローナル抗体を作製した。これらのＭａｂをさらに特性化し、そして両方ともαＶβ３及びαＶβ５インテグリンに結合することが判明した。２つのＭａｂの結合は、αＶβ３に対してはカルシウム非依存性でありそしてＣ３７２結合に関してのみαＶβ５に対してカルシウム依存性であることが示された。さらに、一方のＭａｂ、ＧｅｎＯ９５（ＣＮＴＯ９５）は、細胞に基づくアッセイにおいてリガンドビトロネクチンへのαＶβ３及びαＶβ５の結合を完全に阻害することができる。このＭａｂは、抗−血管新生及び他の癌関連用途において有用となり得る。
【０１４６】
【表２】
2004510414.tif 000005
【０１４７】
実施例３：デュアルインテグリン抗体の結合親和性
導入
ＣＮＴＯ９５としても知られているＧｅｎＯ．９５は、ヒト胎盤から精製されたαＶβ３インテグリンで（ＣＢＡ／ＪｘＣ５７／ＢＬ６／Ｊ，ＧｅｎＰｈａｒｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）Ｆ２ハイブリッドマウスを免疫化することにより作製したヒトモノクローナル抗体である。該抗体は、ヒト可変及びＩｇＧ１カッパ定常領域からなり、そしてαＶβ３及びαＶβ５の両方に反応することが判明し、両方のインテグリン分子により共有されるアルファ鎖に対する特異性を示唆する。
目的
本研究の目的は、αＶβ３及びαＶβ５精製インテグリンに対するそしてベータインテグリンを発現する細胞系に対するＧｅｎＯ．９５の結合親和性を特性化することである。さらなる特性化には、結合値をＧｅｎＯ．９５及びＲｅｏＰｒｏ間で比較する。
略語
Ｋｄ，Ｍ単位で表す、平衡解離定数
Ｂｍａｘ＝結合部位の最大数
材料及び方法
細胞系
αＶβ３及びαＶβ５インテグリンを発現するヒト黒色腫細胞系、Ａ３７５Ｓ２細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌａｂｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）を含有するダルベッコの最小培地（ＤＭＥＭ）において培養した。
【０１４８】
αＶβ５及び最小αＶβ３（ＮＢ４５４６，ｐ２０７）を発現するヒト結腸癌細胞系、ＨＴ２９細胞は、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭにおいて培養した。
【０１４９】
Ｊ．Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ博士（Ｅｌｉ　Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｃ．）から入手した、αＶβ３及びαＶβ５インテグリンを発現するヒト黒色腫、Ｍ２１細胞は、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ培地（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において培養した。
インテグリン
αＶβ３ロットＪＧ２２４９９は、ヒト胎盤からＣｅｎｔｏｃｏｒで精製された。別のαＶβ３インテグリンロット（オクチル配合物、ロット１９１００９９１）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから購入した。αＶβ５（Ｔｒｉｔｏｎ配合物、ロット２００３００５５、ロット１９１０９９０及びオクチル配合物，ロット１９０６０７４７）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから購入した。
抗体
ＧｅｎＯ．９５は、プロテインＡクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。ＲｅｏＰｒｏは、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．で製造された。マウス抗−ヒトαＶβ３抗体、ＬＭ６０９（１９７６ＺＫ、ロット２００２０５５９及びロット１９１０３２９）及びマウス抗−ヒトαＶβ５抗体、Ｐ１Ｆ６（１９６１　Ｐ−Ｋ、ロット１７１１０５６０）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから購入した。
放射性標識
Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＩＬ）を用いて抗体を１２５−Ｉ Ｎａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＩＬ）で１−２μＣｉ／μｇの比活性に放射性標識した。抗体濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、２８０ｎｍでの吸収（ＯＤ／ｍｌ）を１．４で割ることにより決定した。ヨウ素化抗体の比活性は、抗体を希釈しそしてアリコートをガンマカウンターもしくはＴｏｐｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）において計数することにより決定した。
【０１５０】
比活性（ｃｐｍ／μｇ）＝ｃｐｍ／体積（ｍｌ）ｘ希釈係数
濃度（ＯＤ２８０の読み取りにより決定するμｇ／ｍｌ）
インテグリン被覆プレート結合アッセイ
αＶβ３もしくはαＶβ５インテグリンを２ｍＭ塩化カルシウムを含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）（ＴＢＳ／Ｃａ＋＋）において１μｇ／ｍｌに希釈し、そして９６ウェルポリスチレンＬｉｎｂｒｏプレート（Ｆｌｏｗ／ＩＣＮ）上にウェル当たり５０μｌで４℃で一晩被覆した。プレートをＴＢＳ／Ｃａ＋＋で洗浄し、そしてＴＢＳ／Ｃａ＋＋中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温で１時間ブロックした。被覆したウェルに５０μｌの希釈した抗体を三重反復で加え、そして３７℃で２時間インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー（ＴＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、ペルオキシダーゼを結合したヤギ抗−ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎロット１６８６９）を１％ ＢＳＡ−ＴＢＳにおける１：４０，０００希釈で加え、そして室温で１時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄し、そして０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％ Ｈ２Ｏ２及び１ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤからなるｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩基質溶液（ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）で発色させた。室温で１５分後に発色を０．３Ｎ Ｈ２ＳＯ４で止め、そしてプレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓプレート読み取り装置においてＯＤ４９０ｎｍで読み取った。
【０１５１】
結合曲線をＧｒａｐｈＰａｄ　ＰＲＩＳＭ（バージョン３，ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で作製した。結果を飽和値の％最大結合として表した。平衡解離結合定数（Ｍとして表す）、Ｋｄは、ＰＲＩＳＭを用いてデータの非線形回帰適合から決定した。
細胞結合アッセイ
２％ウシ血清アルブミン（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する２％ ＲＰＭＩ培地中の５０μｌの希釈した放射性標識抗体を９６ウェル組織培養プレート（Ｐａｃｋａｒｄ）において培養した合流細胞に三重反復で加えた。細胞を３７℃で１．５時間インキュベーションし；カルシウム及びマグネシウムを含有するハンクス緩衝食塩水（ＨＢＳＳ＋＋，ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３回穏やかに洗浄し、そして次に吸引した。ウェル当たり１００μｌのＭｙｃｏｓｉｎｃｔ ２０（Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、そして細胞結合放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）において定量した。
【０１５２】
非特異的結合を決定するために、１００倍過剰の標識していない抗体の存在下で同様の一組の希釈物で実験を行った。
【０１５３】
各ウェルにおいて平板培養した細胞の数を決定するために、いくつかのウェルからの細胞をトリプシンではがし、プールし、そして顕微鏡下で計数した。細胞当たりの受容体数は以下のように計算した：
受容体数／細胞＝特異的結合ｃｐｍｘ６．０２３ｘ１０２３分子／モル
比活性（ｃｐｍ／ｇ）ｘｍｏｌ．ｗｔ．（ｇ／モル）ｘ細胞数
細胞当たりの最大結合部位、Ｂｍａｘ及びＫｄは、ＰＲＩＳＭを用いてデータの非線形回帰適合から決定した。
結果及び説明
結合親和性値の決定は、平衡で、精製したαＶβ３及びαＶβ５インテグリン並びに細胞表面受容体への様々な濃度のＧｅｎＯ．９５（及びＲｅｏＰｒｏ）の結合を測定することによって行った。飽和結合曲線は等辺双曲線であり、ＧｅｎＯ．９５及びＲｅｏＰｒｏの単一受容体結合部位を示唆した（図５−６；Ｍｏｔｕｌｓｋｙ　Ｈ，１９９９）。これらの飽和結合データの分析（スキャッチャード実験と呼ばれることもある）は、親和性、Ｋｄ及び受容体数、Ｂｍａｘを得るためにＰＲＩＳＭにおける１部位双曲線非線形回帰適合を用いて行った（Ｍｏｔｕｌｓｋｙ　Ｈ，１９９９）。
【０１５４】
結合親和性値の正確な決定を保証するために数ロットのＧｅｎＯ．９５、ＲｅｏＰｒｏ及び精製インテグリンを用いた。αＶβ３被覆プレート上のＧｅｎＯ．９５の飽和結合曲線（図５Ａ）及びαＶβ３被覆プレート上のＲｅｏＰｒｏの結合曲線（図５Ｂ）は、６回の別個の実験の平均及び標準偏差を表す。αＶβ３のＴｒｉｔｏｎ配合物で得られる結果は、オクチル配合物から得られるものより再現性があると判明した。αＶβ被覆プレート上で、ＧｅｎＯ．９５平均Ｋｄは２．１±１．３３ｘ１０−１０Ｍであり；そして平均ＲｅｏＰｒｏＫｄは２．５±１．４６ｘ１０−１０Ｍであった。
【０１５５】
αＶβ５被覆プレート上のＧｅｎＯ．９５の飽和結合曲線（図６Ａ）及びαＶβ５被覆プレート上のＲｅｏＰｒｏの結合曲線（図６Ｂ）は、６回の別個の実験の平均及び標準偏差として示す。オクチル配合物で得られる結果は、Ｔｒｉｔｏｎ配合物で得られるものより一貫した。αＶβ５上のＧｅｎＯ．９５平均Ｋｄは２．５±１．０４ｘ１０−１１Ｍであった。ＲｅｏＰｒｏは、αＶβ５被覆プレート上でいかなる結合及び用量応答も示さなかった。
【０１５６】
精製したインテグリンに対する結合親和性値を様々な細胞系上で発現される受容体への結合と比較した。図７Ａ−Ｃは、αＶβ３及びαＶβ５を発現するＡ３７５Ｓ２細胞と１２５−Ｉ ＧｅｎＯ．９５との結合を示す（図７Ａ）。Ａ３７５Ｓ２細胞上の平均親和性値は：Ｋｄ＝５．２±２．０４ｘ１０−９Ｍ；及び１２０，０００±３７，０００受容体／細胞であった。ＨＴ−２９細胞はαＶβ５を発現する。ＨＴ−２９細胞への１２５−Ｉ ＧｅｎＯ．９５結合の親和性値は：Ｋｄ＝１．３±３．７６ｘ１０−１０Ｍ；及び８１，０００±２４，０００受容体／細胞であった（図７Ｂ）。Ｍ２１細胞はαＶβ３及びαＶβ５インテグリンを発現する。Ｍ２１細胞への１２５−Ｉ ＧｅｎＯ．９５結合は：Ｋｄ＝８．５±３．０３ｘ１０−９Ｍ；及び２００，０００±８０，０００受容体／細胞であった（図７Ｃ）。
【０１５７】
同様の細胞結合研究を様々な細胞系上で１２５−Ｉ ＲｅｏＰｒｏで行った。図８Ａ−Ｃは、Ａ３７５Ｓ２細胞と１２５−Ｉ ＲｅｏＰｒｏとの結合を示し、そして得られる平均値は：Ｋｄ＝２２±３．７ｘ１０−９Ｍ；及び３７０，０００±１９０，０００受容体／細胞であった（図Ａ）。ＨＴ−２９細胞上で、１２５−Ｉ ＲｅｏＰｒｏは最小の結合を示した（図８Ｂ）。Ｍ−２１細胞への１２５−Ｉ ＲｅｏＰｒｏ結合は：Ｋｄ＝１０±２．００ｘ１０−９Ｍ及び６６０，０００±１２０，０００受容体／細胞を示した（図８Ｃ）。Ｍ２１細胞上の１２５−Ｉ ＲｅｏＰｒｏの結合値は、以前に公開された値（Ｔａｍ　ｅｔ　ａｌ，１９９８）と一致する。
【０１５８】
結合結果の要約を表２−３に示す。
【０１５９】
【表３】
2004510414.tif 000006
【０１６０】
【表４】
2004510414.tif 000007
【０１６１】
（７５頁）
三次元フィブリンマトリックスおいて培養する−−−−、それにより、この抗体は潜在的抗−血管新生特性を有し得ることを示す。
導入
現在、進行性の腫瘍増殖は、新しい血管の形成である血管新生に依存するというかなりの証拠がある。これらの血管は、栄養分及び酸素を腫瘍に供給し、廃棄物を運び去り、そして遠隔部位への腫瘍細胞の転移のための導管の役割を果たす（１）。最近の研究により、血管新生プロセスにおけるインテグリンの様々な役割がさらに特定されている。インテグリンは、細胞接着、移動、生存及び増殖をもたらすことにおいて重要な役割を果たすヘテロダイマー膜貫通タンパク質である（２）。インテグリンαＶβ３の発現は、休止もしくは正常な血管上で最小であるが、血管新生血管細胞上で著しくアップレギュレーションされる（１−３）。近縁であるが異なるインテグリンαＶβ５もまた、血管新生プロセスをもたらすことが示されている。αＶβ３に対して作製した抗体は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）により誘導される血管新生を阻止し、一方、αＶβ５に特異的な抗体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により誘導される血管新生を阻害した（１−５）。
【０１６２】
血管新生は、内皮出芽アッセイ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　ａｓｓａｙ）によりインビトロにおいて模倣することができる。この系は、内皮細胞移動及び増殖を伴う。ＧｅｎＯ９５は、インテグリンαＶβ３及びαＶβ５を認識するヒトモノクローナル抗体であり、そしてこれらのインテグリンは、内皮細胞移動及び増殖を調節する。従って、ＧｅｎＯ９５が内皮細胞の出芽を阻害できるかどうかを決定した。本実施例は、ＧｅｎＯ９５が、フィブリンマトリックスにおいて増殖するヒト内皮細胞の出芽を阻害することを示す実験を記述する。
材料
ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びヒト血管内皮増殖因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）は、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。インテグリンαＶβ３に対するモノクローナル抗体、ＭＡＢ １９７６Ｚ（ＬＭ６０９）及びインテグリンαＶβ５に対するモノクローナル抗体、ＭＡＢ１９６１（Ｐ１Ｆ６）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。ＲｅｏＰｒｏ及びＧｅｎＯ９５は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ’ｓ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから入手した。ヒトフィブリノーゲン（プラスミノーゲンを含まない、＞９５％凝固可能なタンパク質）及びウシ皮膚ゼラチンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）から購入した。
細胞系
ヒト臍静脈内皮細胞、Ｈｕｖｅｃｓは、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＡ）から購入した。Ｈｕｖｅｃｓは、１０％ ＦＢＳ、ロングＲインシュリン様増殖因子−１、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮増殖因子、ヒト血管内皮増殖因子、ｈＦＧＦ−ｂ、硫酸ゲンタマイシン及びアンホテリシン−Ｂを含有する内皮基礎培地（ＥＢＭ）キット（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）において培養した。細胞を３７℃及び５％ ＣＯ２でインキュベーションし、そして培地を２〜３日ごとに交換した。３〜８継代のみを全ての実験において用いた。
フィブリンマイクロキャリアに基づく出芽アッセイ
３次元のフィブリンに基づくマトリックスにおける毛管形成を測定するためにＮｅｈｌｓ及びＤｒｅｎｃｋｈａｈｎの方法（６）の改変を用いた。ゼラチンを被覆したｃｙｔｏｄｅｘ−３マイクロキャリア（ＭＣｓ，Ｓｉｇｍａ）を供給業者の推奨に従って調製した。新しくオートクレーブしたＭＣをＥＢＭ−２＋２０％ ＦＢＳに懸濁し、そして内皮細胞を４０細胞／ＭＣの最終濃度に加えた。細胞を３７℃で４時間のインキュベーション中にＭＣに付着させた。次にＭＣを大容量の培地に懸濁し、そして５％ ＣＯ２大気中３７℃で２〜４日間培養した。細胞を被覆したビーズの凝集を防ぐためにＭＣを時折攪拌した。以下のように製造したフィブリンゲルにＭＣを包埋した：ヒトフィブリノーゲン（２ｍｇ／ｍｌ）を純粋な（ｐｌａｉｎ）ｂＦＧＦもしくは血清を含有するＥＢＭ−２培地に溶解した。この溶液はまた、様々な抗体も含有した。フィブリンに包埋した細胞による過剰のフィブリン溶解を防ぐために、アプロチニンをフィブリノーゲン溶液及び増殖培地に２００Ｕ／ｍｌで加えた。細胞を被覆したマイクロキャリヤをフィブリノーゲン溶液に１００〜２００ＭＣ／ｍｌ（５０−１００ビーズ／ウェル−４８ウェルプレート）の密度で加え、そしてトロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）の添加により凝固を誘導した。凝固が完了した後、０．５ｍｌの溶液（フィブリノーゲン及びトロンビンを除いた上記の全ての成分を含有する）をフィブリンマトリックスに加えた。プレートを３７℃及び５％ ＣＯ２で１〜３日間インキュベーションした。１−３日後に、ＰＢＳに溶解した３％ホルムアルデヒドでゲルを固定し、そしてＭＣビーズの直径（１５０μｍ）を超える長さを有する毛管出芽の数を定量した。
結果及び説明
Ｈｕｖｅｃｓは、フィブリンゲルにおいて培養すると毛管様出芽を形成することができる（図９）。内皮細胞は、ゼラチン被覆ビーズから外側に移動し、そして長い糸状仮足に伸びる。長い出芽は、管腔を形成するいくつかの細胞からなる。このプロセスは、内皮細胞移動、浸潤及び細胞増殖を伴うので、ビンビボにおける微小毛管形成に似ている。出芽形成の定量により、ＧｅｎＯ９５がｂＦＧＦもしくは完全培地における内皮細胞出芽形成を阻害することが示された（図１０）。ＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６の組み合わせは、決まって、ＧｅｎＯ９５より効果的に出芽を阻害した（図１１）。
結論
存在する血管からの新しい血管の形成は、血管新生の特徴である。このプロセスは、内皮出芽アッセイによりインビトロにおいて模倣することができる。これらの出芽は、ｂＦＧＦもしくは血清に存在する様々な刺激のような血管新生刺激に応答して形成される微小毛管である。ＧｅｎＯ９５は、ｂＦＧＦ及び完全培地により刺激される内皮細胞出芽を用量依存的に阻害し、この抗体がαｖβ３及びαｖβ５機能を効果的に阻害できることを示唆した。ＧｅｎＯ９５がＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６の組み合わせほど効果的でない理由は不明であるが、ＧｅｎＯ９５が、それぞれ、ＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６と比較した場合に低い親和性でαＶβ３及びαＶβ５を認識することが可能である。合わせると、これらのデータは、ＧｅｎＯ９５がインビトロにおける微小毛管形成の複雑なプロセスを阻害できることを示す。
【０１６３】
【表５】
2004510414.tif 000008
【０１６４】
実施例５：内皮及び腫瘍細胞接着、移動及び浸潤に対するデュアルインテグリン抗体の影響
要約
重鎖及び軽鎖の両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／Ｊ ｘ Ｃ５７／ＢＬ６／Ｊ）Ｆ２ハイブリッドマウス（１−４）をヒト胎盤αＶβ３で免疫化した。１つの融合は、ＧｅｎＯ９５と命名する完全にヒトαＶβ３反応性ＩｇＧ１κモノクローナル抗体をもたらした。この完全にヒト抗体は、αＶβ３及びαＶβ５インテグリンに反応することが判明した（５）。これらのインテグリンは、内皮及び腫瘍細胞接着、移動及び浸潤に関与する。従って、我々は、インテグリンによりもたらされる細胞運動性に対するＧｅｎＯ９５の影響を特性化した。ＧｅｎＯ９５は、ビトロネクチン、変性コラーゲン、フィブリノーゲン及びフィブリンへのヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）及びヒト黒色腫細胞結合を阻害するが、フィブロネクチン及びＩ型コラーゲンへの細胞接着を阻止しない。ＧｅｎＯ９５はまた、塩基性繊維芽細胞増殖因子及び低用量血清で刺激されている内皮細胞の移動も阻害する。ＧｅｎＯ９５は、フィブリンゲルを通した腫瘍細胞の浸潤を阻害する。要するに、ＧｅｎＯ９５は、インビトロにおける様々な細胞に基づくアッセイにおいてαＶβ３及びαＶβ５を機能的に妨げる。
略語：
ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン
ＣＯ２−二酸化炭素
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド
ＦＢＳ−ウシ胎仔血清
Ｉｇ−免疫グロブリン
Ｍａｂ−モノクローナル抗体
ＯＤ−光学密度
ＲＴ−室温
ＨＵＶＥＣＳ−ヒト臍静脈内皮細胞
ｂＦＧＦ−ウシ塩基性繊維芽細胞増殖因子
導入
現在、進行性の腫瘍増殖は、血管新生に依存するというかなりの証拠がある。新しい血管の形成は、栄養分及び酸素を腫瘍に供給し、廃棄物を運び去り、そして遠隔部位への腫瘍細胞の拡散のための導管の役割を果たす。いくつかの研究により、血管新生プロセスにおけるインテグリンの役割が特定されている。インテグリンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への細胞接着において重要な役割を果たしそして細胞生存、増殖及び移動をもたらすヘテロダイマー膜貫通タンパク質である（６）。血管新生プロセス中に、αＶβ３及びαＶβ５は、活性化内皮細胞の表面上でアップレギュレーションされ、これは今度はこれらの細胞が移動及び増殖するのに役立つ（６）。αＶβ３に対して作製した抗体は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）により誘導される血管新生を阻止し、一方、αＶβ５に特異的な抗体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により誘導される血管新生を阻害する（６，７）。血管新生を調節することに加えて、αＶβ３及びαＶβ５は、腫瘍細胞転移に必要とされるプロセス、腫瘍細胞接着、移動及び浸潤を調節する。以前の研究により、ＧｅｎＯ９５は、精製したαＶβ５及びαＶβ３インテグリンに結合することが示され、それ故、この抗体が、αＶβ３及びαＶβ５によりもたらされる内皮及び腫瘍細胞接着、移動及び浸潤を機能的に阻止できるかどうかを決定した。
材料及び方法
材料
ウシ繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びヒト血管内皮増殖因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）は、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。インテグリンαＶβ３に対するモノクローナル抗体、ＭＡＢ １９７６Ｚ（ＬＭ６０９）及びインテグリンαＶβ５に対するモノクローナル抗体、ＭＡＢ１９６１（Ｐ１Ｆ６）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。ＲｅｏＰｒｏ（ロット：９４Ａ０４ＺＥ）及びＧｅｎＯ９５（ロット：ＪＧ１００８９９）は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒから入手した。ＢＩＯＣＯＡＴ細胞培養インサート（孔サイズ：８μｍ）は、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。ＶｙｂｒａｎｔＴＭ細胞接着アッセイキット（Ｖ−１３１８１）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。プラスミノーゲンを含まないヒトフィブリノーゲン（ＶＷＦ／Ｆｎ枯渇）は、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ（Ｓｏｕｔｈ　Ｂｅｎｄ，ＩＮ）から購入した。ウシ皮膚ゼラチンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヒトビトロネクチンはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入し、そしてＩ型コラーゲンはＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。
細胞系
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＡ）から購入し、そして１０％ ＦＢＳ、ロングＲインシュリン様増殖因子−１、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮増殖因子、ヒト血管内皮増殖因子、硫酸ゲンタマイシン及びアンホテリシン−Ｂを含有するＥＢＭ培地キット（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）において培養した。細胞を３７℃及び５％ ＣＯ２で増殖させ、そして培地を２〜３日ごとに交換した。細胞は、８０％合流に達すると継代した。３〜８継代のみを全ての実験において用いた。
【０１６５】
αＶβ３及びαＶβ５インテグリンを発現するＡ３７５Ｓ．２ヒト黒色腫細胞系はＣｅｎｔｏｃｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋから入手し、ここで、細胞系はマイコプラズマ及び細菌汚染がないとみなされた。細胞は、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補足したＤＭＥＭ培地において培養した。
【０１６６】
ヒト結腸癌ＨＴ２９細胞は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから入手し、ここで、細胞系はマイコプラズマ及び細菌汚染がないとみなされた。細胞は、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補足したα−ＭＥＭ培地において培養した。
フローサイトメトリー
表面インテグリンの検出のために、細胞を採取し、すすぎ、補足していないＲＰＭＩ培地に懸濁し、そして抗−インテグリンｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）及びＦＩＴＣで標識したヤギ抗−マウス抗体（１：１００）もしくはＦＩＴＣで標識した抗−インテグリン抗体（１０μｇ／ｍｌ）と氷上で６０分間順次インキュベーションした。一次抗体の欠如もしくはアイソタイプが合う抗体での一次抗体の置換を陰性コントロールとして用いた。細胞をＦＡＣＳ　Ｓｃａｎ　ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）ですぐに分析した。
接着アッセイ
マイクロタイタープレート（Ｌｉｎｂｒｏ−Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）をビトロネクチン（１μｇ／ｍｌ）、ゼラチン（０．１％）、フィブリノーゲン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｉ型コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）もしくはフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩被覆した。使用する直前にプレートをＰＢＳですすぎ、そして１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１時間ブロックした。フィブリンを被覆したマイクロタイターウェルは、フィブリノーゲンのトロンビン処理（１Ｕ／ｍｌ）により生成せしめた。接着性細胞（ＨＵＶＥＣＳ、ＨＴ２９及びＡ３７５Ｓ．２）をカルセインＡＭ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で製造業者の説明書に従って標識し、採取し、２回洗浄し、そしてＤＭＥＭ培地中０．１％のＢＳＡに懸濁した。細胞密度を５ｘ１０５／ｍｌに調整した後、細胞を様々な濃度の抗体と３７℃で１５分間インキュベーションした。細胞−抗体混合物をウェルに加え（ウェル当たり１００μｌ）、そして３７℃で１時間インキュベーションした。結合していない細胞を除くためにプレートをＰＢＳで２回すすぎ、そして接着を蛍光プレート読み取り装置（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ）において４８５−５３８ｎｍで測定した。ＢＳＡを被覆したウェルへの細胞接着を陰性コントロールとして用いた。アイソタイプの合う抗体を陰性コントロールとして用いた。
走化性移動アッセイ
ポリスチレン膜（６．５ｍｍの直径、１０μｍの厚さ及び８μｍの孔サイズ）を有する２４−Ｔｒａｎｗｅｌｌ室において細胞移動アッセイを行った。ほとんど合流した２４時間細胞培養物（ＨＵＶＥＣＳもしくはＡ３７５Ｓ．２）をトリプシン−ＥＤＴＡで採取し、２回洗浄し、そして０．１％ ＢＳＡを含有するそれらのそれぞれの無血清培地に再懸濁した。細胞（１００，０００／５００μｌ）を抗体の存在下もしくは非存在下で上部室に加えた。走化性細胞移動を促進するために、０．１％ ＢＳＡ及びビトロネクチン（２μｇ／ｍｌ）もしくは血清（ＨＵＶＥＣＳには２％そしてＡ３７５Ｓ２細胞には１０％）を含有する７５０μｌの培地を下部室に加え、そしてプレートを組織培養インキュベーター中に置いた。綿棒で上面の細胞を取り除くことにより４〜８時間後に移動を終わらせ、そして次にフィルターを３％ホルムアルデヒドで固定し、そしてクリスタルバイオレットで染色した。細胞移動の程度を光学顕微鏡検査により決定し、そして画像をＰｈａｓｅ　３画像分析ソフトウェア（Ｇｌｅｎ　Ｍｉｌｌｓ，ＰＡ）を用いて分析した。該ソフトウェアは、フィルターの裏側上の染色される細胞により占められる総面積を分析し、そしてこれは細胞移動の程度に直接比例する。
接触走行性移動アッセイ
わずかに改変して上記のようなＴｒａｎｗｅｌｌ室を用いて細胞移動アッセイを行った。簡潔に言えば、膜の下側をビトロネクチン（２μｇ／ｍｌ）で室温で６０分間被覆し、そして次に１％ ＢＳＡ／ＰＢＳの溶液で室温で６０分間ブロックした。次に膜をＰＢＳで洗浄し、そして風乾した。０．１％ ＢＳＡ及びｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有する無血清培地（７５０μｌ）を下部室に加えた。ほとんど合流した２４時間培養物をトリプシン−ＥＤＴＡで採取し、２回洗浄し、そして無血清培地に再懸濁した。細胞（１００，０００／５００μｌ）を抗体の存在下もしくは非存在下で上部室に加えた。室を組織培養インキュベーター中に置き、そして移動を６時間続けさせた。細胞移動の程度を上記のように決定した。
浸潤アッセイ
フィブリノーゲン（プラスミノーゲンを含まない、１０ｍｇ／ｍｌを１００μｌ）及び１００μｌの１Ｕ／ｍｌのトロンビンを混合し、そしてすぐに２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（６．５ｍｍの直径、１０μｍの厚さ及び８．０μｍの孔サイズ、Ｃｏｓｔａｒ）の上部室に加えた。フィブリンゲルを生成せしめるためにプレートを３７℃で３０分間インキュベーションした。合流した腫瘍細胞（Ａ３７５Ｓ．２）をトリプシン消化し、遠心分離し、そして様々な濃度の抗体を有する０．１％ ＢＳＡ及び１０μｇ／ｍｌのプラスミノーゲン（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ，Ｓｏｕｔｈ　Ｂｅｎｄ，ＩＮ）を補足した基礎培地に再懸濁し、そして室温で１５分間インキュベーションした。細胞（１００，０００／５００μｌ）を抗体の存在下もしくは非存在下で上部室に加えた。浸潤室の下部区画には、化学走性誘引物質の機能を果たす０．７５ｍｌの１０％ ＦＢＳ−ＤＭＥＭを満たし、そしてプレートを組織培養インキュベーターに移した。２４時間後に、綿棒で上面の細胞を取り除くことにより浸潤を終わらせ、そしてフィルターを３％ホルムアルデヒドで固定し、そしてクリスタルバイオレットで染色した。細胞移動の程度を上記のようにＰｈａｓｅ　３画像分析ソフトウェアを用いて分析した。
結果及び説明
ＧｅｎＯ９５は、αＶβ３及びαＶβ５によりもたらされる細胞接着を阻害する　ＧｅｎＯ９５はαＶβ３及びαＶβ５インテグリンに結合するので、我々の腫瘍細胞（Ａ３７５Ｓ．２及びＨＴ２９）及び内皮細胞がこれらのインテグリンを発現するかどうかを決定した。フローサイトメトリーにより、Ａ３７５Ｓ．２及びＨＵＶＥＣ細胞はαＶβ３及びαＶβ５インテグリンの両方を発現するが、ＨＴ２９細胞はαＶβ５を発現するがαＶβ３インテグリンを発現しないことが示された（図１２Ａ−Ｉ）。
【０１６７】
ＨＴ２９細胞（１２Ａ、Ｂ及びＣ）は、それらの表面上にαＶβ５を発現するが、αＶβ３インテグリンを発現しない。ＨＵＶＥＣ（１２Ｄ、Ｅ及びＦ）及びＡ３７５Ｓ．２（１２Ｇ、Ｈ及びＩ）細胞は、それらの表面上にαＶβ５及びαＶβ３インテグリンを発現する。腫瘍細胞及び内皮細胞を免疫蛍光により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。左側のヒストグラムは、アイソタイプの合う抗体の存在下でのバックグラウンド蛍光を示す。右側のヒストグラムは、陽性染色を示す。Ａ、Ｄ、Ｇ，ＬＭ６０９（αＶβ３に対するｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）；Ｂ、Ｅ、Ｈ，Ｐ１Ｆ６（αＶβ５に対するｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）；及びＣ、Ｆ、Ｉ，ＧｅｎＯ９５（１０μｇ／ｍｌ）。
【０１６８】
様々なマトリックスタンパク質へのＨＵＶＥＣ、Ａ３７５Ｓ．２及びＨＴ２９細胞の接着に対するＧｅｎＯ９５の影響を詳細に決定した。ＧｅｎＯ９５は、ビトロネクチンへのＨＵＶＥＣ及びＡ３７５Ｓ．２細胞の接着を完全に、そしてフィブリノーゲン、ゼラチン及びフィブリン被覆プレートへの接着を部分的に阻害し、該抗体がαＶβ３及びαＶβ５をブロックできることを示した（図２及び３、表１及び２）。
（８３頁）
【０１６９】
【表６】
2004510414.tif 000009
【０１７０】
ビトロネクチンへのヒト結腸癌ＨＴ２９細胞の接着．　接着アッセイを方法において記述したように実施した。ＢＳＡを被覆したウェルへの細胞接着を陰性コントロールとして用いた。図１５に示すデータは、最大結合（抗体なし）のパーセントとしてプロットし、そして三重反復測定の平均（＋／−ＳＤ）である。
ＧｅｎＯ９５は、ヒト黒色腫及び内皮細胞移動を阻止する
インテグリンαＶβ３及びαＶβ５は細胞移動に関与し、従って、ＧｅｎＯ９５が、ビトロネクチンにより刺激される細胞移動を阻止できるかどうかを決定した。ビトロネクチンにより刺激される細胞移動は、αＶβ３及びαＶβ５を伴う。ＧｅｎＯ９５は、ビトロネクチンを化学走性誘引物質として用いる場合に内皮細胞移動を用量依存的に阻害した（図５及び６）。興味深いことに、ＧｅｎＯ９５はまた、血清へのＨＵＶＥＣＳ及びＳ３７５Ｓ．２細胞の両方の移動も阻害した（図７−８）。これらの結果は、ＧｅｎＯ９５の標的、αＶβ３及びαＶβ５が、血清に存在する様々な移動因子により活性化される中心的受容体であることを示唆するので、血管新生及び腫瘍治療にとって潜在的に重要であり得る。
【０１７１】
２μｇ／ｍｌのビトロネクチンに向かうＨＵＶＥＣＳの移動．　アッセイを方法において記述したように実施し、そして細胞を６時間移動させた。顕微鏡写真は、（図１６Ａ），抗体なし、（１６Ｂ），ＧｅｎＯ９５（５μｇ／ｍｌ）、（１６Ｃ），ＧｅｎＯ９５（４０μｇ／ｍｌ）における細胞移動の代表的視野（１０ｘ対物レンズ）である。図１６Ｄは、様々な濃度のＧｅｎＯ９５の存在下での細胞移動の図示である。データは、１００％とみなすコントロール（抗体なし）のパーセントに正規化し、そして各点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。
【０１７２】
αＶβ３及びαＶβ５に対する抗体の存在下で２μｇ／ｍｌのビトロネクチンに向かうＨＵＶＥＣＳの移動．　方法において記述したように移動アッセイを実施し、そして細胞を６時間移動させた。ＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６は、それぞれ、αＶβ３及びαＶβ５に対するｍＡｂである。図１７に示すデータは、１００％とみなすコントロール（抗体なし）のパーセントに正規化し、そして各棒は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。ＢＳＡ、マウスＩｇＧ及びヒトＩｇＧを陰性コントロールとして用いた。ＬＭ６０９−Ｐ１Ｆ６は両方の抗体の組み合わせを表す。抗体及びＢＳＡは、１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【０１７３】
２％ ＦＢＳに向かうＨＵＶＥＣＳの移動．　移動アッセイを４時間続行させ、そして方法において記述したようにデータを捕獲した。図１８（Ａ）は、ＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６、ＬＭ６０９＋Ｐ１Ｆ６の組み合わせ、アイソタイプの合うコントロール抗体（ヒト及びマウス）の存在下での細胞移動の図示である。抗体及びタンパク質は、１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。図１８（Ｂ）は、ＲｅｏＰｒｏ及びＧｅｎＯ９５の存在下での細胞移動の図示である。顕微鏡写真は、図１８（Ｃ），抗体なし、図１８（Ｄ），ＧｅｎＯ９５（５μｇ／ｍｌ）及び図１８（Ｅ），ＧｅｎＯ９５（２０μｇ／ｍｌ）における細胞移動の代表的視野（１０ｘ対物レンズ）である。データは、１００％とみなすコントロール（抗体なし）のパーセントに正規化し、そして各点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。
【０１７４】
１０％ ＦＢＳに向かうＡ３７５Ｓ．２細胞の移動．　移動アッセイを４時間続行させ、そして方法において記述したようにデータを捕獲した。抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。図１９（Ａ）は、様々な濃度のＧｅｎＯ９５の存在下での細胞移動の図示である。図１９（Ｂ）は、ＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６、ＬＭ６０９＋Ｐ１Ｆ６の組み合わせ、アイソタイプの合うコントロール抗体（ヒト及びマウス）の存在下での細胞移動の図示である。データは、１００％とみなすコントロールのパーセントに正規化し、そして各点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。顕微鏡写真は、図１９（Ｃ），抗体なし、図１９（Ｄ），ＧｅｎＯ９５（５μｇ／ｍｌ）及び図１９（Ｅ），ＧｅｎＯ９５（２０μｇ／ｍｌ）における細胞移動の代表的視野（１０ｘ対物レンズ）である。
【０１７５】
上記の結果は、ＧｅｎＯ９５がビトロネクチン及び血清への腫瘍及び内皮移動を阻止することを示す。次に、この抗体がｂＦＧＦにより刺激される細胞移動を阻止できるかどうかを決定した。図９において示すように、ｂＦＧＦはビトロネクチンに向かうＨＵＶＥＣ細胞移動を刺激し、そしてＧｅｎＯ９５はこの刺激される細胞移動を有意に阻止した。
【０１７６】
ｂＦＧＦの存在下でビトロネクチンに向かうＨＵＶＥＣＳの移動．　移動室フィルターの下側を２μｇ／ｍｌのビトロネクチンで被覆し、そして方法において記述したようにアッセイを実施した。細胞を６時間移動させた。図２０Ａ−Ｅにおいて、各データ点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。図２０（Ａ），ｂＦＧＦ；図２０（Ｂ），ＧｅｎＯ９５（５μｇ／ｍｌ）；図２０（Ｃ），ＧｅｎＯ９５（４０μｇ／ｍｌ）；図２０（Ｄ）ｂＦＧＦなし。図２０（Ｅ），様々な抗体の存在下での細胞移動の阻害を図式的に示す。
ＧｅｎＯ９５はヒト黒色腫細胞浸潤を阻止する．
上記の結果は、ＧｅｎＯ９５が細胞接着及び移動を阻害できることを示す。従って、細胞接着、マトリックスの分解及び分解したマトリックスを通した細胞の移動を伴う多段階プロセスである腫瘍細胞浸潤をこの抗体が阻止できるかどうかを調べた。ＧｅｎＯ９５はフィブリンへの腫瘍細胞接着を阻止することができたので（図３）、腫瘍細胞のマトリックスとしてフィブリンを選択した。図１０において示すように、Ａ３７５Ｓ．２細胞の浸潤をＬＭ６０９により阻害することができ、このプロセスにおける少なくともαＶβ３の関与を示唆した。ＧｅｎＯ９５は、フィブリンを通した腫瘍細胞浸潤を用量依存的に阻害した。関係のないＩｇＧ及び血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するｍＡｂ（１０Ｅ５）を陰性コントロールとして用いた。合わせると、これらのデータは、ＧｅｎＯ９５がヒト黒色腫細胞の浸潤を効果的に阻止できることを示唆する。
【０１７７】
フィブリンゲル（５ｍｇ／ｍｌ）を通したＡ３７５Ｓ．２細胞の浸潤．
浸潤アッセイを２４時間続行させ、そして方法において記述したようにデータを捕獲した。顕微鏡写真は、図２１（Ａ），抗体なし、図２１（Ｂ），ＧｅｎＯ９５（１０μｇ／ｍｌ）における細胞浸潤の代表的視野（４ｘ対物レンズ）であり、図２１（Ｃ）及び（Ｄ）は、ＧｅｎＯ９５、１０Ｅ５ Ｆ（ａｂ’）２、ＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６、ＬＭ−Ｐ１Ｆ６（ＬＭ６０９＋Ｐ１Ｆ６）、ヒト及びマウスＩｇＧ（Ｈ−ＩｇＧ及びＭ−ＩｇＧ）の存在下での細胞浸潤の図示である。グラフ図２１（Ｄ）：全ての抗体及びタンパク質の濃度は１０μｇ／ｍｌである。データは、１００％とみなすコントロール（抗体なし）のパーセントに正規化し、そして各点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。
結論
細胞接着、移動及び浸潤は、αＶβ３及びαＶβ５のようなインテグリンを必要とする。ＧｅｎＯ９５は、内皮及び腫瘍細胞により発現されるαＶβ３及びαＶβ５インテグリンを機能的に妨げることができる。ＧｅｎＯ９５は、ｂＦＧＦもしくは血清により刺激される細胞の移動及び浸潤を阻止することができた。これらの結果は、ＧｅｎＯ９５が、腫瘍及び内皮細胞により発現されるαＶβ３及びαＶβ５インテグリンの強力なインヒビターであることを示唆する。
【０１７８】
【表７】
2004510414.tif 000010
【０１７９】
本発明は、先の記述及び実施例において特に記述するのとは別のやり方で実施できることが明らかである。
【０１８０】
本発明の多数の改変及び変形が、上記の教示を考慮に入れて可能であり、従って、添付の請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
抗−αＶβ３ Ｍａｂの倍加希釈物をαＶβ３被覆プレート上でＲＴで１時間インキュベーションしたグラフを示す。プレートを２回洗浄し、そしてＨＲＰで標識したヤギ抗−ヒトＩｇＧカッパ特異的抗体でＲＴで１時間調べた。プレートを再び洗浄し、ＯＰＤ基質で発色させ、そして４９０ｎｍでＯＤを測定した。
【図２】
カルセインで標識したＭ２１細胞をＰ１Ｆ６、抗−αＶβ５腹水の非存在下もしくは存在下で抗体サンプルと３０分間プレインキュベーションし、次にビトロネクチン被覆プレートに４５分間加えたグラフを示す。結合していないＭ２１細胞は、カルシウムを含むＨＢＳＳでの２回の１５０μＬ／ウェル洗浄で取り除いた。プレートを４８５−５３８ｎｍで蛍光計上で読み取った。
【図３】
ＭＤＡＭＢ４３５Ｌ２細胞を採取し、そして様々な濃度のＧｅｎＯ９５と１０分間プレインキュベーションした場合の細胞接着のグラフを示す。次に腫瘍細胞をビトロネクチン被覆Ｌｉｎｂｒｏプレートに加え、そして３７℃で１時間インキュベーションした。ウェルを３回洗浄し、そしてＭＴＴに基づくＣｅｌｌ　Ｔｉｔｅｒ　ＡＱ色素を各ウェルに加えた。細胞接着をＥＬＩＳＡプレート読み取り装置において決定し、ここで、ＯＤ４９０ｎｍは細胞接着に直接比例する。ＢＳＡ被覆ウェルへの細胞接着を陰性コントロールとして用いた（データは示さない）。各データ点は、三重反復測定の平均である。
【図４Ａ−Ｄ】
αＶβ３への抗体結合のグラフを示し、ここで、このリガンドは、１％ ＢＳＡ−ＨＢＳＳ（Ｃａ＋＋なし）中５０ｍＭのＥＤＴＡでもしくは１％ ＢＳＡ−ＨＢＳＳ（Ｃａ＋＋を含む）で１０μｇ／ｍＬから開始する倍加希釈物において３７℃で３０分間プレインキュベーションした。ＣＮＴＯ９５、Ｃ３７２、ｃ７Ｅ３もしくはＬＭ６０９ ＩｇＧを被覆したプレートに混合物を加え、そして３７℃で１時間インキュベーションした。ＬＭ６０９もしくはＣＮＴＯ９５を適切なバッファー（＋／−Ｃａ＋＋）において２０μｇ／ｍＬで３７℃で３０分間加えた。プレートをヤギ抗−マウスＩｇＧ Ｆｃ，ＨＲＰもしくはヤギ抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃ，ＨＲＰで調べた。
【図４Ｅ−Ｇ】
αＶβ５への抗体結合のグラフを示し、ここで、このリガンドは、１％ ＢＳＡ−ＨＢＳＳ（Ｃａ＋＋なし）中５０ｍＭのＥＤＴＡでもしくは１％ ＢＳＡ−ＨＢＳＳ（Ｃａ＋＋を含む）で１０μｇ／ｍＬから開始する倍加希釈物において３７℃で３０分間プレインキュベーションした。ＣＮＴＯ９５、Ｃ３７２、ｃ７Ｅ３ ＩｇＧを被覆したプレートに混合物を加え、そして３７℃で１時間インキュベーションした。ＶＮＲ１３９を適切なバッファー（＋／−Ｃａ＋＋）において１０μｇ／ｍＬで３７℃で３０分間加えた。プレートをヤギ抗−マウスＩｇＧ Ｆｃ，ＨＲＰで調べた。
【図５Ａ−Ｂ】
αＶβ３被覆プレート上のＧｅｎＯ．９５（図５Ａ）及びＲｅｏＰｒｏ（図５Ｂ）の飽和結合曲線のグラフを示す。
（６頁）
免疫蛍光−−−−−そしてフローサイトメトリーにより分析した。左側のヒストグラムは、アイソタイプの合う抗体の存在下でのバックグラウンド蛍光を示す。右側のヒストグラムは陽性染色を示す。Ａ、Ｄ、Ｇ，ＬＭ６０９（αＶβ３に対するｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）；Ｂ、Ｅ、Ｈ，Ｐ１Ｆ６（αＶβ５に対するｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）；及びＣ、Ｆ、Ｉ，ＧｅｎＯ９５（１０μｇ／ｍｌ）。
【図１３】
マトリックスタンパク質を被覆したプレートへのＨＵＶＥＣＳの接着。実施例５の方法において記述したように接着アッセイを実施した。プレートを４８５−５３８ｎｍで蛍光計上で読み取った。ＢＳＡ被覆ウェルへの細胞接着を陰性コントロールとして用いた。図１３において、様々な濃度の抗体の存在下での細胞接着の程度は、１００％とみなす抗体の非存在下での細胞接着のパーセントとしてプロットした。各データ点は、三重反復測定の平均（＋／−ＳＤ）である。
【図１４】
マトリックスタンパク質を被覆プレートへのヒト黒色腫細胞の接着。方法において記述したように接着アッセイを実施した。ＢＳＡ被覆ウェルへの細胞接着を陰性コントロールとして用いた。図１４において、様々な濃度の抗体の存在下での細胞接着の程度は、１００％とみなす抗体の非存在下での細胞接着のパーセントとしてプロットした。各データ点は、三重反復測定の平均（＋／−ＳＤ）である。
【図１５】
ビトロネクチンへのヒト結腸癌ＨＴ２９細胞の接着。方法において記述したように接着アッセイを実施した。ＢＳＡ被覆ウェルへの細胞接着を陰性コントロールとして用いた。図１５におけるデータは、最大結合（抗体なし）のパーセントとしてプロットし、そして三重反復測定の平均（＋／−ＳＤ）である。
【図１６Ａ−Ｄ】
２μｇ／ｍｌのビトロネクチンに向かうＨＵＶＥＣＳの移動。方法において記述したようにアッセイを実施し、そして細胞を６時間移動させた。顕微鏡写真は、（図１６Ａ），抗体なし、（１６Ｂ），ＧｅｎＯ９５（５μｇ／ｍｌ）、（１６Ｃ），ＧｅｎＯ９５（４０μｇ／ｍｌ）における細胞移動の代表的視野（１０ｘ対物レンズ）である。図１６Ｄは、様々な濃度のＧｅｎＯ９５の存在下での細胞移動の図示である。データは、１００％とみなすコントロール（抗体なし）のパーセントに正規化し、そして各点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。
【図１７】
αＶβ３及びαＶβ５に対する抗体の存在下で２μｇ／ｍｌのビトロネクチンに向かうＨＵＶＥＣＳの移動。方法において記述したように移動アッセイを実施し、そして細胞を６時間移動させた。ＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６は、それぞれ、αＶβ３及びαＶβ５に対するｍＡｂである。図１７に示すデータは、１００％とみなすコントロール（抗体なし）のパーセントに正規化し、そして各棒は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。ＢＳＡ、マウスＩｇＧ及びヒトＩｇＧを陰性コントロールとして用いた。ＬＭ６０９−Ｐ１Ｆ６は、両方の抗体の組み合わせを表す。抗体及びＢＳＡは、１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【図１８Ａ−Ｅ】
２％ ＦＢＳに向かうＨＵＶＥＣＳの移動。移動アッセイを４時間続行させ、そして方法において記述したようにデータを捕獲した。図１８（Ａ）は、ＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６、ＬＭ６０９＋Ｐ１Ｆ６の組み合わせ、アイソタイプの合うコントロール抗体（ヒト及びマウス）の存在下での細胞移動の図示である。抗体及びタンパク質は、１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。図１８（Ｂ）は、ＲｅｏＰｒｏ及びＧｅｎＯ９５の存在下での細胞移動の図示である。顕微鏡写真は、図１８（Ｃ），抗体なし、図１８（Ｄ），ＧｅｎＯ９５（５μｇ／ｍｌ）及び図１８（Ｅ），ＧｅｎＯ９５（２０μｇ／ｍｌ）における細胞移動の代表的視野（１０ｘ対物レンズ）である。データは、１００％とみなすコントロール（抗体なし）のパーセントに正規化し、そして各点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。
【図１９Ａ−Ｅ】
１０％ ＦＢＳに向かうＡ３７５Ｓ．２細胞の移動。移動アッセイを４時間続行させ、そして方法において記述したようにデータを捕獲した。抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。図１９（Ａ）は、様々な濃度のＧｅｎＯ９５の存在下での細胞移動の図示である。図１９（Ｂ）は、ＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６、ＬＭ６０９＋Ｐ１Ｆ６の組み合わせ、アイソタイプの合うコントロール抗体（ヒト及びマウス）の存在下での細胞移動の図示である。データは、１００％とみなすコントロールのパーセントに正規化し、そして各点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。顕微鏡写真は、図１９（Ｃ），抗体なし、図１９（Ｄ），ＧｅｎＯ９５（５μｇ／ｍｌ）及び図１９（Ｅ），ＧｅｎＯ９５（２０μｇ／ｍｌ）における細胞移動の代表的視野（１０ｘ対物レンズ）である。
【図２０Ａ−Ｅ】
ｂＦＧＦの存在下でビトロネクチンに向かうＨＵＶＥＣＳの移動。移動室フィルターの下側を２μｇ／ｍｌのビトロネクチンで被覆し、そして方法において記述したようにアッセイを実施した。細胞を６時間移動させた。図２０Ａ−Ｅにおいて、各データ点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。図２０（Ａ），ｂＦＧＦ；図２０（Ｂ），ＧｅｎＯ９５（５μｇ／ｍｌ）；図２０（Ｃ），ＧｅｎＯ９５（４０μｇ／ｍｌ）；図２０（Ｄ）ｂＦＧＦなし。図２０（Ｅ），様々な抗体の存在下での細胞移動の阻害を図式的に示す。
【図２１Ａ−Ｄ】
フィブリンゲル（５ｍｇ／ｍｌ）を通したＡ３７５Ｓ．２細胞の浸潤。浸潤アッセイを２４時間続行させ、そして方法において記述したようにデータを捕獲した。顕微鏡写真は、図２１（Ａ），抗体なし、図２１（Ｂ），ＧｅｎＯ９５（１０μｇ／ｍｌ）における細胞浸潤の代表的視野（４ｘ対物レンズ）である。図２１（Ｃ）及び（Ｄ）は、ＧｅｎＯ９５、１０Ｅ５ Ｆ（ａｂ’）２、ＬＭ６０９、Ｐ１Ｆ６、ＬＭ−Ｐ１Ｆ６（ＬＭ６０９＋Ｐ１Ｆ６）、ヒト及びマウスＩｇＧ（Ｈ−ＩｇＧ及びＭ−ＩｇＧ）の存在下での細胞浸潤の図示である。グラフ図２１（Ｄ）：全ての抗体及びタンパク質の濃度は、１０μｇ／ｍｌである。データは、１００％とみなすコントロール（抗体なし）のパーセントに正規化し、そして各点は３枚のＴｒａｎｓｗｅｌｌフィルターの平均（＋／−ＳＤ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ｇ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図２０Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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