(57)【要約】標的細胞の表面における野生型ＣＤ１５４の発現を減少（例えば、阻害）するための方法およびＣＤ１５４媒介疾患に罹患した患者またはＣＤ１５４媒介疾患にかかりやすい患者を処置するための方法。これの方法において、腫瘍壊死因子相同ドメイン（「ＴＦＴＨ」）の少なくとも一部を欠く変異ＣＤ１５４の発現を指向する核酸は、標的細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞または傷害性Ｔ細胞）に導入される。発現した変異ＣＤ１５４は、細胞内の野生型ＣＤ１５４に結合し、野生型タンパク質が、細胞表面に到達するのを不可能にする。
2004503237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の表面における野生型ＣＤ１５４の発現を減少させる方法であって、該方法は、核酸構築物を該細胞に導入する工程を包含し、該核酸構築物は、野生型ＣＤ１５４の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも５個のアミノ酸残基を欠いた変異ＣＤ１５４の発現を指向し、それによって、発現した変異ＣＤ１５４が、該細胞内で該野生型ＣＤ１５４に結合し、該野生型ＣＤ１５４が、該細胞表面に到達することを不可能にする、方法。
【請求項２】
ＣＤ１５４媒介疾患に罹患した患者またはＣＤ１５４媒介疾患にかかりやすい患者を処置するための方法であって、該方法は、核酸構築物を該患者に送達する工程を包含する、該核酸構築物は、該患者の細胞において野生型ＣＤ１５４の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも５個のアミノ酸残基を欠いた変異ＣＤ１５４の発現を指向し、それによって、発現した変異ＣＤ１５４が、該細胞内で該野生型ＣＤ１５４に結合し、該野生型ＣＤ１５４が、該細胞表面に到達することを不可能にする、方法。
【請求項３】
前記核酸構築物が、ウイルス由来のベクターを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルス由来のベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルス由来のベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルス由来のベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルス由来のベクターが、アデノ関連ウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸構築物が、ウイルスの形質導入を介して前記細胞に導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、Ｔ細胞または巨核球である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１または２の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸構築物が、インビボで前記細胞に導入される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸構築物が、エキソビボで前記細胞に導入される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＤ１５４媒介疾患が、移植拒絶である。請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＤ１５４媒介疾患が、自己免疫疾患である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＤ１５４媒介疾患が、炎症性疾患である、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
請求項２に記載の方法であって、前記ＣＤ１５４媒介疾患が、狼瘡、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス神経炎、ぜん息、慢性閉塞性肺疾患、細気管支炎、気腫、多発性硬化症、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷、発作、アテローム硬化症、冠状再狭窄、虚血性うっ血性心不全、肝硬変、Ｃ型肝炎ウイルス、糖尿病ニューロパシー、糸球体腎炎、自己免疫疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症、放射誘導線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発骨髄腫、眼球炎症性疾患、対宿主性移植片病、移植拒絶および悪液質からなる群から選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１または２に記載の方法であって、前記変異ＣＤ１５４が、野生型ＣＤ１５４の一部を欠き、該部分が、配列番号１の（１）アミノ酸残基１１６〜１３６、（２）アミノ酸残基１３７〜２６１、（３）アミノ酸残基１１５〜２６１または（４）アミノ酸９７〜２６１に対応する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記変異ＣＤ１５４が、野生型ＣＤ１５４の一部を欠き、該部分が、配列番号１のアミノ酸残基１１６〜２６１に対応する、方法。
【請求項２１】
核酸構築物を含む薬学的組成物であって、該核酸構築物は、野生型ＣＤ１５４の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも５個のアミノ酸残基を欠いた変異ＣＤ１５４の発現を指向し、それによって、発現した変異ＣＤ１５４が、細胞内で野生型ＣＤ１５４に結合し、該野生型ＣＤ１５４が、該細胞表面に到達することを不可能にする、薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の薬学的組成物であって、前記変異ＣＤ１５４が、野生型ＣＤ１５４の一部を欠き、該部分が、配列番号１の（１）アミノ酸残基１１６〜１３６、（２）アミノ酸残基１３７〜２６１、（３）アミノ酸残基１１５〜２６１または（４）アミノ酸９７〜２６１に対応する、薬学的組成物。
【請求項２３】
該核酸は、細胞表面における野生型ＣＤ１５４の発現を減少するための医薬品を製造するための核酸の使用であって、該野生型ＣＤ１５４の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも５個のアミノ酸残基を欠いた変異ＣＤ１５４の発現を指向する、使用。
【請求項２４】
核酸の使用であって、該核酸は、ＣＤ１５４媒介疾患を処置するための医薬品を製造するために野生型ＣＤ１５４の腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも５個のアミノ酸残基を欠いた変異ＣＤ１５４の発現を指向する、使用。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の使用であって、前記変異ＣＤ１５４が、野生型ＣＤ１５４を欠き、該一部が、配列番号１の（１）アミノ酸残基１１６〜１３６、（２）アミノ酸残基１３７〜２６１、（３）アミノ酸残基１１５〜２６１または（４）アミノ酸９７〜２６１に対応する、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、標的細胞の表面における野生型ＣＤ１５４の発現を阻害するために腫瘍壊死因子相同ドメインの少なくとも一部を欠くＣＤ１５４改変体を使用する方法に関する。本発明の方法は、ＣＤ１５４依存免疫障害の処置または阻害において有用である。
【０００２】
（発明の背景）
ＣＤ１５４（すなわち、ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０Ｌ）は、活性化Ｔ細胞において主に発現されるＩＩ型膜タンパク質である。ＣＤ１５４とそのレセプター（ＣＤ４０）の相互作用は、Ｂ細胞において分化、増殖および免疫グロブリンイソ型の転換を誘導するＴヘルパー細胞の機能に重要である（概説に関して、Ｆｏｙら，Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４：５９１−６１７（１９９６）；ｖａｎ　Ｋｏｏｔｅｎら，Ｊ　Ｌｅｕｋｏｃ　Ｂｉｏｌ　６７：２−１７（２０００）を参照のこと）。ＣＤ１５４遺伝子（染色体領域Ｘｑ２．６−２．７に位置される）は、１２キロベースを越えるペアに及び、そして５個のエキソンを含む（Ｖｉｌｌａら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９１：２１１０−４（１９９４））。
【０００３】
第１のエキソンは、細胞質領域、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの６個のアミノ酸をコードする。第２および第３のエキソンは、細胞外ストーク領域をコードする。第４および第５のエキソンは、Ｃ末端１４７アミノ酸（Ｖｉｌｌａら，上述）（腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）ファミリーの他のメンバーと有限の相同性を共有する領域）をコードし、従って、ＴＮＦ相同（「ＴＮＦＨ」）ドメインと称される。ＣＤ１５４ＴＮＦＨドメインのＸ線構造は、ゼリーロール形態またはＧｒｅｅｋキー形態を伴う２つのβシートのサンドイッチ様折り畳み形態を含むことが明らかである。ＴＮＦファミリーのメンバーは、ＩＩ型膜タンパク質の配置を共有するが、これらのメンバー間の有限の相同性は、約１５０アミノ酸残基のＣ末端ＴＮＦＨドメインに位置する。
【０００４】
ＴＮＦ様およびリンフォトキシン−α、野生型ＣＤ１５４は、トリマーとして存在する（Ｋａｒｐｕｓａｓら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　３：１０３１−９（１９９５））。ＣＤ１５４トリマーの形成は、ＴＮＦＨドメインによって媒介される。ＴＮＦＨドメインは、単独でトリマーを形成し得ることが示されている（ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９７／００８９５；Ｋａｒｐｕｓａｓら，上述；Ｍａｚｚｅｉら，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７０：７０２５−８（１９９５））。このドメインの主要な部分を欠いた欠失変異体は、トリマーとして存在しないようである（Ｇａｒｂｅｒら，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７４：３３５４５−５０（１９９９））。従って、ＴＮＦＨドメインは、トリマーＣＤ１５４タンパク質のアセンブリに必要かつ十分であることが明らかである。
【０００５】
機能的ＣＤ１５４タンパク質の発現を防止するＣＤ１５４遺伝子の変異は、血清中の増大したＩｇＭレベルならびに低いＩｇＧレベルおよびＩｇＡレベルによって特徴付けられる免疫不全に導き得る。ＣＤ１５４遺伝子は、ヒトにおけるＸ染色体に位置するので、この免疫不全は、Ｘ結合高ＩｇＭ症候群（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ　ｈｙｐｅｒ−ＩｇＭ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（「ＸＨＩＭ」）と呼ばれる（Ａｌｌｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：９９０−３（１９９３）；Ｋｏｒｔｈａｕｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ　３６１：５３９−４１（１９９３）；ＤｉＳａｎｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ　３６１：５４１−３（１９９３）；Ａｒｕｆｆｏら，Ｃｅｌｌ　７２：２９１−３００（１９９３）；Ｆｕｌｅｉｈａｎら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：２１７０−３（１９９３））。ＣＤ１５４遺伝子の７０を超える固有の変異は、１００を越えるＸＨＩＮ患者において同定されている（Ｎｏｔａｒａｎｇｅｌｏら，Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　１７：５１１−６（１９９６））。これらの変異は、非常に異質である。これらは、挿入、欠失および点変異を含む。従って、ＸＨＩＮ患者におけるＣＤ１５４の機能的欠失の関する潜在的な機構は、異なることが考えられる（Ｇａｒｂｅｒら，上述；Ｓｅｙａｍａら，Ｂｌｏｏｄ　９２：２４２１−３４（１９９８））。
【０００６】
ＣＤ１５４遺伝子は、Ｘ結合型であるので、正常な個体またはＸＨＩＭ患者由来の各細胞は、ＣＤ１５４コード転写物の単一種を作製する。しかし、いく人かのＸＨＩＮ患者において、ドナースプライシング部位における変異（Ｓｅｙａｍａら，上述；および本明細書中に引用される参考文献）またはアクセプタースプライシング部位における変異（Ａｍｅｒａｔｕｎｇａら，Ｃｌｉｎ　Ｄｉａｇｎ　Ｌａｂ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　３：７２２−６（１９９６））は、単細胞においてｍＲＮＡ転写物の複数の種の産生を導く。これら転写物は、野生型ＣＤ１５４をコードする正常スプライス転写物およびＴＮＦＨドメインの主要な部分または完全なＴＮＦＨドメインのいずれかを欠く改変体ＣＤ１５４タンパク質をコードするミススプライス転写物を含む（Ｓｅｙａｍａら，上述；Ａｍｅｒａｔｕｎｇａら，上述）。
【０００７】
ＴＮＦＨドメインは、単独でトリマーＣＤ１５４タンパク質のアセンブリの原因であることが明らかであるので、ＴＮＦＨドメインを欠く改変体は、野生型タンパク質のトリマー化に影響しないことが予測された。従って、ＣＤ１５４遺伝子のスプラシング部位における変異を有する患者が、なぜ、機能性ＣＤ１５４タンパク質の欠損の結果によっておそらく生じる、ＸＨＩＮ症候群を示すのかは明らかではない。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ＴＮＦＨドメインの少なくとも一部を欠くＣＤ１５４改変体が、それにもかかわらず、ストーク領域を介して野生型ＣＤ１５４タンパク質に相互作用し得るという発明者らの発見に基づく。この相互作用は、野生型ＣＤ１５４タンパク質を細胞内に保持し、それによって、細胞表面に野生型タンパク質が発現されることを防止し、そして任意のＣＤ１５４機能的活性に関与する。この発見は、ＣＤ１５４トリマーアセンブリに起因する以前に認識されていない構造的エレメントとしてＣＤ１５４タンパク質のストーク領域を明らかにする。
【０００９】
従って、本発明は、標的細胞の表面における野生型ＣＤ１５４タンパク質の発現を減少する（阻害することを含む）方法を提供する。この方法において、組換え核酸構築物は、ＣＤ１５４発現標的細胞に導入され、ここでこの構築物は、野生型タンパク質の機能的ＴＮＦＨドメインを欠いたＣＤ１５４改変体タンパク質の発現を指向し得る。その結果、改変体タンパク質は、トリマー化できず、そしてなお野生型タンパク質に結合し得、野生型タンパク質が、細胞表面に到達するのを不可能にする。例えば、改変体は、ＴＮＦＨドメインの少なくとも一部を欠く。この例に関して、本発明に有用なＣＤ１５４改変体は、ＴＮＦＨドメインの少なくとも５個（例えば、少なくとも１０個；少なくとも１５個；または少なくとも２０個）アミノ酸を欠き得る。１つの実施形態において、ＣＤ１５４改変体は、完全にＴＮＦＨドメインを欠き得る。別の実施形態において、ＣＤ１５４改変体は、挿入変異および／または点変異を有するＴＮＦＨドメインを含み得る。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、ＣＤ１５４のＴＮＦＨドメインは、以下の配列番号１のアミノ酸残基１１６〜２６１の範囲の領域に対応する。
【００１１】
【表１】
2004503237.tif 000003
配列番号１は、ヒトＣＤ１５４の全長配列を示し、そして登録番号ＣＡＡ４８５５４下でＧｅｎＧａｎｋにおいて利用可能である（Ｇｒａｆら，Ｅｕｒ，Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１２）：３１９１−４（１９９２）に参照される）。配列番号１の対立遺伝子アイソフォームはまた、本発明において有用なＣＤ１５４改変体についての同族の配列として使用され得る。
【００１２】
本発明において有用であるＣＤ１５４改変体の例としては、配列番号の１の以下：（１）アミノ酸残基１１６〜１３６、（２）アミノ酸残基１３７〜２６１、（３）アミノ酸残基１１５〜２６１、および（４）アミノ酸残基９７〜２６１をそれぞれ欠失するものが挙げられる。ＣＤ１５４改変体を作製する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｇａｒｂｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３５４５〜５５０（１９９９）の図１および表１を参照のこと。
【００１３】
本発明はさらに、被験体（すなわち、霊長類のような哺乳動物、好ましくはヒト）において、ＣＤ１５４依存性疾患（例えば、ＣＤ１５４：ＣＤ４０相互作用によって媒介される免疫障害）を処置または阻害する方法を提供する。この方法は、この被験体の標的細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞）または巨核球）に、本発明のＣＤ１５４改変体を投与し、それによって標的細胞の表面上の野生型ＣＤ１５４の発現を減少させる工程を包含する。１つの実施形態において、ＣＤ１５４改変体は、標的細胞の内部で産生され、これは、その改変体をコードする核酸配列を含む遺伝子発現構築物の細胞による取り込みに基づく。
【００１４】
本発明の方法論はまた、他のＴＮＦリガンドファミリータンパク質（例えば、ＦＡＳリガンド）の改変体を産生するためにも使用され得、ここで、これらのタンパク質のＴＮＦＨドメインは、変異（例えば、欠失、挿入、および／または点変異）によってトリマー形成が不可能になり、その結果、生じた改変体が、対応する野生型タンパク質に結合し、そしてこのタンパク質を細胞内に保持し、野生型タンパク質の細胞表面の発現を妨害する。ＴＮＦレセプターファミリーの一般的な総説については、Ｆａｈｒｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　４０９：８３６〜８（２００１）およびＬｏｃｋｓｌｅｙら、Ｃｅｌｌ　１０４：４８７〜５０１（２００１）を参照のこと。
【００１５】
本発明の方法において有用なＣＤ１５４変異体の発現を指向する核酸構築物を含む薬学的組成物もまた、本発明の範囲内である。本発明はまた、標的細胞の表面上の野生型ＣＤ１５４の発現を減少させるため、および／またはＣＤ１５４媒介疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい患者を処置するための、医薬を製造するためのこのような構築物の使用を提供する。
【００１６】
本発明は、被験体の身体における治療的処置を必要とする部位で、局所送達および標的細胞による取り込みのために非常に適切である。例えば、本明細書中に記載される遺伝子発現構築物は、脾臓もしくは他のリンパ組織に、または炎症の部位（例えば、損傷部位もしくは病変）に、局所的に（例えば、注射によって）投与され得る。このような局所処置は、免疫調節剤の全身送達で遭遇し得る、いずれの合併症も回避する。
【００１７】
さらに、この遺伝子発現構築物は、細胞外免疫調節剤（例えば、抗体）の潜在的な弱点を無効にする。細胞表面抗原に結合する場合、抗体は、例えば、抗体依存性細胞の細胞傷害性応答を介して、またはその細胞表面上にＦｃレセプターを示すマクロファージまたは他のエフェクター細胞によって、細胞破壊を誘引し得る。このような細胞破壊は、特定の治療的設定において望ましいものではあり得ない。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の図および詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からもまた、明らかである。
【００１９】
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価なものもまた、本発明の実施において使用され得る。
本明細書中において言及される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が、支配する。材料、方法、および実施例は、例示のみであり、限定を意図するものではない。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
過去１０年間において、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞抗原レセプター（「ＴＣＲ」）媒介シグナルと、同時に送達される同時刺激シグナルとの両方を必要とすることが確証されてきた。例えば、タンパク質抗原に対する応答における、Ｂ細胞による抗体産生は、Ｂ細胞とヘルパーＴ細胞との間の抗原特異的な相互作用、およびＢ細胞とＴ細胞との間の非抗原特異的な同時刺激レセプターリガンドの相互作用を必要とする。これらの非抗原特異的な相互作用としては、Ｂ細胞上のＣＤ４０の、Ｔ細胞上のＣＤ１５４に対する結合が挙げられる。
【００２１】
ヒトＣＤ４０は、成熟Ｂ細胞、マクロファージおよび活性化された内皮細胞上で発現する、５０ｋＤの細胞表面タンパク質である。ＣＤ４０は、増殖およびアポトーシスに関連するレセプター（Ｆａｓ／ＣＤ９５、ＴＮＦレセプターおよびリンホトキシンレセプターを含む）のクラスに属する。ヒトＣＤ１５４は、主に活性化されたＴ細胞上で一過的に発現する、３２ｋＤのＩＩ型膜糖タンパク質である。ＣＤ４０：ＣＤ１５４の相互作用は、基本的に全てのＴ細胞依存性免疫応答（抗体応答を含む）のために必要とされる。特に、ＣＤ４０：ＣＤ１５４の相互作用は、抗アポトーシス刺激性シグナルおよび／またはリンホカイン刺激性シグナルを提供する。
【００２２】
本発明は、ＴＮＦＨドメインの少なくとも一部を欠失するＣＤ１５４の変異性改変体が、野生型ＣＤ１５４と細胞内で結合し得、そして野生型タンパク質が細胞表面に達することを阻害するという驚くべき発見に基づく。従って、被験体のＴ細胞におけるこのようなＣＤ１５４改変体の発現は、野生型ＣＤ１５４の細胞表面発現を排除することによって、ＣＤ１５４依存性免疫応答を特異的に抑制し得る。
【００２３】
（疾患の処置）
ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用は、タンパク質抗原に対するＴ細胞依存性免疫応答（抗体媒介体液性免疫応答およびＴ細胞媒介炎症性応答を含む）の誘導において中心的であることが知られている。好ましくない免疫応答もしくは病的な免疫応答を防ぐためまたは処置するために、この相互作用に介入する手段を開発する、多くの試みがいくつかの研究者のグループによってなされてきたが、治療的な設定において、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を妨害する手段を改善する必要性が残存する。
【００２４】
本発明は、この改善された手段を提供する。本発明に従って、機能的ＴＮＦＨドメインを欠失するＣＤ１５４改変体（例えば、ＴＮＦＨ−マイナスＣＤ１５４変異体）は、有意な炎症系または免疫系の関与によって特徴付けられ得るＣＤ１５４依存性疾患を処置（例えば、緩和、遅延もしくは無効化）するためか、または阻害（例えば、発症もしくは進行の予防）するために、被験体中の標的Ｔ細胞中に導入され得る。このような疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：狼瘡、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス神経炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気腫、多発性硬化症、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷、発作、アテローム性硬化症、冠動脈再狭窄、虚血性うっ血性心不全、肝硬変、Ｃ型肝炎、糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎、自己免疫疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症、放射線誘導性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性骨髄腫、眼球の炎症性疾患、対宿主性移植片病、移植拒絶（例えば、角膜および網膜の移植拒絶）、または悪液質。
【００２５】
ＣＤ１５４変異性改変体はまた、疾患の症状をまだ示していない患者に、予防的に投与され得る。例えば、ＣＤ１５４改変体を使用して、移植を受ける患者を、可能性のある移植拒絶を予防または緩和するように処置し得る。
【００２６】
１つの実施形態において、ＣＤ１５４改変体タンパク質は、改変体タンパク質を含むリポソームまたは他の適切なキャリア（例えば、ミクロスフェア）の局所注射によって、標的細胞に導入され得る。標的化を増大するために、リポソームまたは他の適切なキャリアは、組織特異的レセプターのリガンドとして機能する分子でコーティングされ得る。
【００２７】
（遺伝子治療）
本発明に従って、ＴＮＦＨ−マイナスＣＤ１５４変異体はまた、変異体ＣＤ１５４タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸構築物を細胞内で発現することによって、標的細胞に導入され得る。
【００２８】
（（１）ベクター）
本発明に従う核酸構築物は、複製していない直鎖状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡベクターから誘導され得るか、あるいは自己複製プラスミドもしくはウイルスベクターから誘導され得る。あるいは、この構築物は、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。Ｔ細胞をトランスフェクトまたは形質転換し得る任意のベクターが使用され得る。好ましいベクターは、ウイルスベクター（複製欠損レトロウイルス（例えば、ＷＯ　８９／０７１３６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３（９）：５７０〜５７８（１９９０）を参照のこと）、アデノウイルス（例えば、Ｍｏｒｓｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、補遺、１７Ｅ（１９９３）を参照のこと）、アデノ随伴ウイルス（Ｋｏｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７；２２１１〜２２１５（１９９０））、複製欠損単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；Ｌｕら、Ａｂｓｔｒａｃｔ、６６頁、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、９月、２２〜２６、１９９２、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、ワクシニアウイルス（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．７：６６３〜７０（２０００））由来のウイルスベクターを含む）、およびこれらのベクターの任意の改変バージョンである。発現ベクターを構築するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと。
【００２９】
本発明のベクターは、Ｔ細胞を特異的に標的化し得る。遺伝子治療において有用なＴ細胞特異的ウイルスベクターは、当該分野で公知である。例えば、（１）Ａｎｎｅｎｋｏｖら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：７１４〜２２（２０００）；Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８８：６６９〜７２（２０００）；およびＦａｒｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎｅ　Ｍｅｄ．１：１９５〜２０９（１９９９）のレトロウイルスベクター；（２）Ｈｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：６６４〜７４（２０００）のヘルペスウイルスｓａｉｍｉｒｉベクター；（３）Ｋｕｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３６６８〜８１（２０００）のＨＩＶベースのハイブリッドベクター；（４）Ｃｏｓｔｅｌｌｏら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：５９６〜６０４（２０００）のＨＩＶ誘導レンチウイルスベクター；または（５）上記で言及したベクターの任意の改変バージョンを使用し得る。
【００３０】
（（２）発現制御配列）
これらのベクターにおいて、発現制御配列は、本発明の変異体タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。Ｔ細胞における所望のレベルの転写を指向し得る任意の発現制御配列が、使用され得る。真核生物細胞について、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー（免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどから誘導されるようなもの）、およびポリアデニル化配列を含み得る。本発明の核酸構築物はまた、内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）（「ＩＲＥＳ」）、および望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と変異体ＣＤ１５４コード配列との間に位置し得るイントロンを含み得る。これらおよび他の通常のベクターエレメントの選択は、慣習的である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．（１９８９）；およびそれらに引用される参考文献を参照のこと。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、ＣＤ１５４についてのネイティブなプロモーターが使用される。このネイティブなプロモーターは、変異体ＣＤ１５４の発現がネイティブな発現を模倣すべきであることが要求される場合、好ましくあり得る。変異体ＣＤ１５４の発現が、時間的もしく発育的に、または組織特異的な様式で、または特定のネイティブの転写刺激に応答して調節されなければならない場合、このネイティブなプロモーターが使用され得る。さらなる実施形態において、他のネイティブな発現制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはＫｏｚａｋコンセンサス配列）はまた、ネイティブな発現を模倣するために使用され得る。
【００３２】
本発明の別の実施形態において、Ｔ細胞特異的プロモーターが所望される。このようなプロモーターとしては、２つのクラスが挙げられる：細胞型特異的プロモーターおよび活性化特異的プロモーター。このようなプロモーターの例としては、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、Ｔ細胞レセプターα鎖およびＴ細胞レセプターβ鎖、ならびにＩＬ−２の遺伝子から誘導されるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
長期の免疫抑制を防ぐために、変異体ＣＤ１５４の発現を調節する誘導性プロモーターを使用することが望ましくあり得る。このようなプロモーターは、当該分野で公知である。これらのプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６８：１７６６〜１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２〜５１８（１９９８））；（２）テトラサイクリン抑制プロモーター（Ａｌｖｅｒｅｚ−Ｖａｌｌｉｎａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：５２６〜９（２０００）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：５５４７〜５５５１（１９９２））；（３）ラパマイシン誘導性プロモーター系（Ｙｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：８８〜９１（１９９９）；Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５〜２８７２（１９９７）；およびＲｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２：１０２８〜１０３２（１９９６））；（４）亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター；（５）デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；（６）Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；（７）エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：３３４６〜３３５１（１９９６））；（８）ＲＵ４８６誘導性プロモーター系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９〜２４３（１９９７）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．４：４３２〜４４１（１９９７））；ならびに（９）上記のプロモーター系の改変バージョン。本発明において有用な他の型の誘導性プロモーターは、特定の、生理学的状態（例えば、体温）急性期によってか、または複製細胞においてのみ調節されるプロモーターである。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態において、高レベルの構造的な発現が所望される。この目的のための例示的なプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター／エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサー（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ　４１：５２１〜５３０（１９８５）を参照のこと）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β−アクチンプロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター。
【００３５】
本出願によって提供される手引きを使用して、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく上記の発現制御配列およびそれらの改変バージョンの間での選択を行い得る。
【００３６】
（（３）核酸構築物の投与）
本発明の核酸構築物は、インビボおよびインビトロにおける、一過性の遺伝子転移および／または安定な遺伝子転移の任意の形態において使用するための薬学的組成物として、処方され得る。この組成物は、少なくとも、核酸構築物および生理食塩水のような薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアであると公知であり、そして当業者に周知である、他の滅菌した水性懸濁液および非水性懸濁液もまた、使用され得る。この構築物は、インビボおよびエキソビボの遺伝子治療、インビトロにおけるタンパク質産生および診断的アッセイのために使用され得る。
【００３７】
核酸構築物は、裸のＤＮＡとしてか、または、例えば、リポソーム融合（例えば、Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：１２８５〜８（１９９０）；Ｌｅｄｌｅｙ，Ｊ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　１１０：１〜８および１６７〜７４（１９８７）；Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：１０６８〜７２（１９８３）を参照のこと）、赤血球ゴースト、またはミクロスフェア方法（微粒子；例えば、米国特許第４，７８９，７３４号、同第４，９２５，６７３号、および同第３，６２５，２１４号）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２８７〜３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９７９を参照のこと）によって標的細胞中に導入され得る。あるいは、核酸構築物は、Ｔ細胞特異的レセプターのリガンドに結合され、それによってレセプター媒介エンドサイトーシスを介してＴ細胞に侵入し得る。
【００３８】
核酸構築物がウイルスベースの場合、これはまた、ビリオンとしてパッケージされ得、次いでこれは細胞（例えば、患者から単離された自系Ｔ細胞）をエキソビボで形質導入するために使用され得る。次いでこの感染細胞は、患者の身体に戻される。あるいは、組換えウイルスは、遺伝子治療分野の当業者によって決定されるように、患者に直接的に投与され得る（例えば、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、および／または皮内投与）。徐放性デバイス（例えば、移植可能なポンプ）は、組換えウイルスを細胞に送達することを促進するために使用され得る。ウイルスが被験体に投与される場合、感染されるべき特定の細胞は、送達方法を制御することによって標的化され得る。例えば、ウイルスの静脈内注射は、ウイルスを循環Ｔ細胞に標的化することを促進するために使用され得る。局所送達部位についての身体の標的領域としては、例えば、肺、皮膚、リンパ節、胸腺、脾臓および骨髄が挙げられる。このような送達は例えば、局所的送達、吸入、エアロゾルもしくは局所注射経路（例えば、門脈カテーテルが挙げられる）によす送達であり得る。本発明の処置は、必要に応じて、当業者によって決定されたように、繰り返され得る。
【００３９】
遺伝子治療における本発明の核酸構築物の投与量は、処置される状態のような因子に主に依存する。この投与量はまた、患者の年齢、体重および健康によって変化し得る。例えば、変異体ＣＤ１５４コードウイルスの効果的なヒト投与量は、一般に、投与される用量あたり約１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、または１×１０１６ウイルス粒子の濃度でウイルスを含む生理食塩水溶液の、約０．５ｍｌ〜５０ｍｌの範囲である。この投与量は、任意の有害な副作用に対して補正する利点のバランスを取るように調整される。変異体ＣＤ１５４の発現レベルは、投与量の投与の型および頻度を決定するためにモニターされ得る。
【００４０】
本発明の薬学的組成物は、単独で、あるいは１つ以上の物質（タンパク質もしくは組換えベクターの生物学的安定性を増大する他のタンパク質または組換えベクターを含む）との、または、Ｔ細胞を選択的に標的化する組成物の能力を増大する物質との混合物において、あるいはこれらの物質との化合中において使用され得る。
【００４１】
（併用治療）
さらに、本発明の薬学的組成物は、別の免疫調節レジメンと組み合わせて使用され得、所望の免疫抑制（例えば、霊長類レシピエントへの、長期間、無拒絶の異種ドナー組織の組み込み）を達成し得る。例えば、ＣＤ１５４：ＣＤ４０相互作用をブロックするか、またはＣＤ２８、ＣＤ８０またはＣＤ８６を介する、同時刺激をブロックする、薬剤が使用され得る。
【００４２】
例示的なＣＤ１５４：ＣＤ４Ｏ相互作用インヒビターは、ＣＤ１５４に対する抗体（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　１０９１６を有する、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）５ｃ８；これは米国特許第５，４７４，７７１号で開示される）；ＩｍｘＭ９０、ＩｍｘＭ９１、ＩｍｘＭ９２（米国特許第５，９６１，９７４号に開示される）；およびＡｎｃｅｌｌから市販される抗体（クローン２４−３１、カタログ番号３５３−０２０、Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，カタログ番号８０−３７０３−０１）、およびＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、カタログ番号３３５８０Ｄ））である。多くのさらなる抗ＣＤ１５４抗体が、作製され、そして特徴づけられる（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　ＳｑｕｉｂｂのＰＣＴ特許出願ＷＯ　９６／２３０７１を参照のこと）。
【００４３】
ＣＤ１５４：ＣＤ４０相互作用をブロックする、他の公知のイムノレギュレーターとしては、例えば、以下の他の型の抗ＣＤ１５４分子が挙げられる：完全Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２化合物、ＶＨ領域、ＦＶ領域、単鎖抗体（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ　９６／２３０７１を参照のこと）、ポリペプチド、融合タンパク質（例えば、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８８：１−７（１９９５）中のＣＤ４０Ｉｇを参照のこと）、および低分子化合物（低分子半ペプチド性化合物または低分子非ペプチド性化合物）。これらの全てのイムノレギュレーターは、ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用をブロックまた中断することが可能である。低分子を設計し、スクリーニングし、そして最適化するための手順は、ＰＣＴ特許公開ＷＯ　９７／００８９５中に提供され、これの明細書は、本明細書中で参考として援用される。
【００４４】
遺伝子治療の間、組換えウイルスに対する潜在的な免疫応答を回避するために、Ｏｈｉｒｍｕｌｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３３４５−５２（２０００）に記載の処置レジメンに同一かまたは類似の処置レジメンを採用することが所望され得る。このレジメンにおいて、患者は先ず、（１）変異体ＣＤ１５４挿入物がない組換えウイルスと、（２）ヒト化抗ＣＤ１５４抗体または他の同時刺激インヒビターのようなイムノレギュレーターとで同時に処置される。次いで、この患者を、変異体ＣＤ１５４コードウイルスで処置する。このような２工程のレジメンは、遺伝子治療患者においてしばしば副作用を生じる、組換えウイルス特異的体液性応答の、有意でありかつ延長された阻害を生じることが実証された。
【００４５】
また、米国特許第５，８７２，１７４号およびＰＣＴ特許出願ＷＯ　９６／２６２８５を参照のこと。
【００４６】
（変異体ＣＤ１５４遺伝子治療レジメンを評価するための、前臨床モデル系）　変異体ＣＤ１５４遺伝子治療レジメンの効力を試験するための例示的なモデル系は、Ｋｉｒｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：８７８９−８７９４（１９９７）に開示される、霊長類腎臓同種移植片モデルである。これの教示は、本明細書中で参考として援用される。このアカゲザルモデルは、免疫操作の綿密な試験として役割を果たし得、すなわち、同種移植片機能における軽微な変化またはレシピエントの創傷治癒および免疫系機能における悪影響に対してもこの上なく見事に感受性であるモデルである。さらに、これは、ヒト腎臓移植に対する生物学的な類似性を有し、すなわち、特に、ＭＨＣタンパク質をコードする遺伝子は、アカゲザルとヒトとの間で十分に保存されており、そしてアカゲザルの血管新生された器官の拒絶は、臨床的にみられる拒絶と極めて類似する。
【００４７】
このモデル系が、腎（腎臓）組織を含む移植片を評価するために適切であることが容易に理解される。他の技術的に認められた（ａｒｔ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ）前臨床モデル系（好ましくは、霊長類モデル系）は、他の移植片移植型（例えば、肝臓、心臓、肺、膵臓、膵島、皮膚、末梢神経、中枢神経の拒絶を抑制する際の、変異体ＣＤ１５４遺伝子治療の効力を評価するのに適切である。さらに、本発明に従う、変異体ＣＤ１５４遺伝子治療の効力は、ループス腎炎の動物モデル（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ　９８／３０２４０および同ＷＯ　９８／３０２４１に記載されるモデル）で評価され得る。このような効力はまた、動物角膜同種移植片モデル（例えば、マウス角膜同種移植片モデル）で評価され得る。
【００４８】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の方法および材料を例示することを意味する。当業者にとって明白であり、通常、当該分野で出会う、記載された条件およびパラメーターの適切な改変および適合は、本発明の精神および範囲の内にある。
【００４９】
（実施例１：手順）
（（１）細胞株、抗体、およびＩｇ融合タンパク質）
ＢＪＡＢ、ヒトＢ細胞株は、Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＳｃｈｏｏｌのＤｒ．Ｇｅｏｒｇｅ　Ｍｏｓｉａｌｏｓから寄贈された。この細胞株は、ペニシリン、ストレプトマイシン、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、および４ｍＭのグルタミンを補充した、ＲＰＭＩ培地で維持した。ｍＡｂ　９Ｅ１０が、産生され、そしてこれを９Ｅ１０ハイブリドーマの培養物から精製した。このハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。また、ｍＡｂ　９Ｅ１０およびＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ　ｍｙｃタグに関しては、Ｇ．Ｉ．Ｅｖｅｎら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｃｏｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　ｃ−ｍｙｃ　Ｐｒｏｔｏ−Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ」、Ｍｅｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　５：３６１０−３８１６（１９８５）を参照のこと。ＣＤ４０−Ｆｃ融合タンパク質、ヒト化５ｃ８、およびウサギのポリクローナル抗体Ｒｂ７７９およびポリクローナル抗体Ｒｂ７８４を操作、産生、および精製をするための手順を、Ｈｓｕら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７２：９１１−９１５（１９９７）に記載されるように実施した。
【００５０】
（（２）野生型ＣＤ１５４タンパク質および変異体ＣＤ１５４タンパク質の一過性発現）
野生型ＣＤ１５４　ｃＤＮＡを、活性化ヒト末梢血細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから単離した。このｃＤＮＡのコード配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。ＣＤ１５４の変異体を構築する手順を、Ｇｅｒｂｅｒら（前出）に記載のように実施した。この野生型ｃＤＮＡおよび変異体ｃＤＮＡを、確認された配列を有する制限フラグメントから、ＣＭＶであり、前初期プロモーター駆動の、発現ベクター（ＣＯＳ７細胞中のＳＶ４０複製起点を含む）の中の独特のＮｏｔＩ部位に、サブクローンニングまたは再構築した。ＣＯＳ７細胞を、超らせんプラスミドＤＮＡで、製造者の指示書に従ってリポフェクチン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を使用してトランスフェクトした。全ての実施例において、ＣＤ１５４コード配列を欠くプラスミドＤＮＡをネガティブコントロールとして使用し、野生型ＣＤ１５４コード配列を含むベクターを、ポジティブコントロールとして使用した。ＣＤ１５４およびこれの改変体の発現を、トランスフェクションの７２時間後に回収した、トランスフェクトされた細胞に基づいて分析した。細胞表面タンパク質の代謝標識化およびビオチン化、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）、およびウェスタンブロット分析を、Ｈｓｕら（前出）に記載の手順を使用して実施した。
【００５１】
トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞からの膜画分の調製およびリンフォトキシン−αアップレギュレーションの分析のための手順を、以前に記載（Ｇａｒｂｅｒら、前出）のように実施した。
【００５２】
（実施例２：ＴＮＦＨ（−）変異体は、野生型ＣＤ１５４に関連する）
野生型ＣＤ１５４の発現におけるＴＮＦＨ（−）変異体の効果を調べるために、代謝的に標識した、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡで同時トランスフェクションされたＣＯＳ７細胞の溶解物を、ＣＤ１５４特異的抗体を使用して免疫沈降によって分析した。変異体タンパク質を野生型ヘテロ３量体複合体のｐ１８成分から識別するために（Ｈｓｕら、前出）、ｍｙｃタグを、ＣＤ１５４第１の９６アミノ酸のＣ末端で操作して、異常なスプライシングを受ける転写産物で予測される非ＣＤ１５４アミノ酸（１１アミノ酸または２１アミノ酸）を置換した（Ｓｅｙａｍａら（前出）中の、患者１９、患者２０および患者２１）。
【００５３】
ＣＤ１５４変異体と野生型のタンパク質との関連性を決定するために、３５Ｓで代謝標識した、全長野生型ＣＤ１５４もしくはｍｙｃタグ化変異体ＣＤ１５４（配列番号１において、アミノ酸残基１〜９６）のいずれか、またはこれらの両方をコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞から調製した細胞溶解物を、抗ｍｙｃ　ｍＡｂ　９Ｅ１０、抗ヒトＣＤ１５４　ｍＡｂ　５ｃ８、または抗ＣＤ１５４−Ｃ末端ペプチド抗血清Ｒｂ７８４（また「７８４」）で免疫沈降した。免疫沈降物を、１０〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける電気泳動、その後のオートラジオグラフィーで分析した（図１）。
【００５４】
図１は、野生型ＣＤ１５４が単独で発現される場合に、抗ＣＤ１５４Ｎ末端ペプチド抗血清Ｒｂ７８４の免疫沈降物（レーン３）および抗ＣＤ１５４　ｍＡｂ　５ｃ８の免疫沈降物（レーン４）は、主に全長ｐ３３タンパク質、いくつかのｐ３１タンパク質、および少量のｐ１８を含んだ（ｐ３３、ｐ３１、およびｐ１８は、野型ＣＤ１５４の成分である）。これは、本発明者らの以前の観察と一貫性がある（Ｈｓｕら、前出）。このｐ３３成分、ｐ３１成分、ｐ１８成分は、抗ｍｙｃ　ｍＡｂ　９Ｅ１０（レーン１）またはコントロールのウサギ抗血清（レーン２）のいずれの免疫沈降物中にも観察されなかった。変異ＣＤ１５４タンパク質（配列番号１のアミノ酸残基１〜９６を含み、そしてｍｙｃタグに連結される）（「ＴＮＦＨ（−）」）が単独で発現される場合、ｐ１７成分（変異体タンパク質自体に対応する）は、９Ｅ１０およびＲｂ７８４のいずれによっても免疫沈降したが、ｍＡｂ　５ｃ８またはコントロールのウサギ抗血清（レーン５〜８）により免疫沈降しなかった。変異体タンパク質および野生型タンパク質が同時に発現したとき、９Ｅ１０の免疫沈降物は、ｐ１７　ｍｙｃタグ化変異体タンパク質のみではなく、ｐ３３、ｐ３１、およびｐ１８の野生型タンパク質（レーン９）も含んだ。同様のタンパク質パターンが、Ｒｂ７８４およびｍＡｂ　５ｃ８の免疫沈降物中に見出されたが、コントロールの血清（レーン１０〜１２）の中には見出されない。著しいのは、ｍＡｂ　５ｃ８免疫沈降物は、より少量のこれらのタンパク質を提示し、これは、全ての発現した野生型タンパク質が、５ｃ８によって認識されたわけではないことを示唆する。
【００５５】
上記のデータは、３つの重要な知見を明らかにした。第１に、変異体ＣＤ１５４タンパク質は、安定して産生され、容易に検出され得る。第２に、ＴＮＦＨドメインを欠く変異体ＣＤ１５４タンパク質は、野生型ＣＤ１５４と結合し得る。第３に、少なくともいくつかの野生型タンパク質は、変異体タンパク質と結合するが、その結合エピトープが、ＣＤ４０ついてのＣＤ１５４結合部位に対する立体配座であり、そしてＣＤ４０ついてのＣＤ１５４結合部位に対して類似することを示すｍＡｂ　５ｃ８と相互作用し得る。
【００５６】
（実施例３：ＴＮＦＨ（−）変異体タンパク質との結合によって、用量依存的様式で、野生型タンパク質のレセプター結合活性は減少する）
図１に示されるデータは、ＴＮＦＨ（−）ＣＤ１５４の、野生型ＣＤ１５４との結合が、野生型タンパク質のレセプターと結合する野生型タンパク質の能力を危うくし得ることを示唆する。これをさらに調べるために、発明者らは、ＣＯＳ７細胞を、（１）全長ＣＤ１５４をコードするｃＤＮＡを含む定量のプラスミド、およびＴＮＦＨ（−）ＣＤ１５４をコードするｃＤＮＡを含む可変量のプラスミドでトランスフェクトした。次いで、このトランスフェクト体を、３５Ｓで代謝的に標識し、そして溶解した。この溶解産物の免疫沈降物は、１０〜２０％勾配のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、その後のオートラジオグラフィーで分析した（図２）。
【００５７】
図２は、Ｒｂ７８４によって免疫沈降された野生型ＣＤ１５４の量が、トランスフェクションに使用したＴＮＦＨ（−）ＤＮＡの量にかかわらず、同一であることを示す（図２、下端のパネル）。レーン１においては、細胞を、野生型ＣＤ１５４をコードするプラスミドのみを用いてトランスフェクションした。レーン２〜４においては、細胞を、同量の野生型ＣＤ１５４プラスミドおよび可変量のＴＮＦＨ（−）プラスミドでトランスフェクションした；前者のプラスミド　対　後者のプラスミドの比が、それぞれ、３：１、１：１、および１：３であった。レーン６においては、細胞をコントロールプラスミドのみでトランスフェクションした。
【００５８】
図２に示されるデータは、野生型タンパク質の発現が、ＴＮＦＨ（−）変異体の導入によって影響を受けなかったことを示す。しかし、ＣＤ４０−Ｆｃ融合タンパク質によってか、またはｍＡｂ　５ｃ８によって認識される、野生型タンパク質の量は、トランスフェクションに使用されたＴＮＦＨ（−）プラスミドの量に対して反比例した（図２、それぞれ、上端のパネルおよび中央のパネル）。興味深いことに、発現された総ＴＮＦＨ（−）変異体の少しの部分のみ（図２、下端パネル）が、ＣＤ４０−ＦｃまたはｍＡｂ　５ｃ８のいずれかによって免疫沈降された。これらの結果は、ＴＮＦＨ（−）変異体の発現が、用量依存的様式で、野生型ＣＤ１５４のレセプター相互作用活性に影響を与えたが、野生型ＣＤ１５４の発現レベルに影響は与えなかったことを示す。
【００５９】
（実施例４：野生型ＣＤ１５４の機能に対する、ＴＮＦＨ（−）変異体タンパク質の効果）
変異体ＣＤ１５４の同時発現が野生型タンパク質の機能に影響を与えるか否かを試験するために、野生型ＣＤ１５４および／または変異体ＣＤ１５４をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションした、ＣＯＳ７細胞由来のＵＶ照射膜を、ＢＪＡＢ細胞とともに２４時間インキュベートした。ＣＯＳ７トランスフェクションに使用される変異体ｃＤＮＡに対する、野生型の比を、図３Ｂに示す。このＢＪＡＢ細胞を、ビオチン標識抗リンフォトキシン−α、ｍＡｂ、ＮＣ２で標識し、次いで、フィコエリトリン−標識ストレプトアビジンで染色し、そして最終的に、１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＢＪＡＢ細胞のＦＡＣＳ分析を、細胞表面上のアップレギュレーションしたリンフォトキシンαのレベルを決定するために続いて使用した（図３Ａ、この中で、バーは、平均の蛍光強度を表現する）。
【００６０】
図３Ａおよび図３Ｂは、野生型タンパク質と変異体ＣＤ１５４タンパク質との同時発現が、原形質膜上に存在する野生型タンパク質のリンフォトキシン−αのアップレギュレーション能力を減少したことを示す。この阻害効果は用量依存的であった。トランスフェクションのために使用される、野生型ｃＤＮＡの量は、変異体ｃＤＮＡの３分の１であり、ＣＤ１５４の機能活性はバックグラウンドレベルの下であった。
【００６１】
（実施例５：ＴＮＦＨ（−）変異体は、細胞表面において発現しない）
変異体ＣＤ１５４が野生型ＣＤ１５４の機能を用量依存様式で阻害する、少なくとも２つの可能な機構が存在する。第１に、変異体ＣＤ１５４と結合する野生型ＣＤ１５４は、ＣＤ４０と相互作用する際に、より低い活性であり得る。第２に、変異体ＣＤ１５４に結合する野生型ＣＤ１５４は、全く機能し得ないこともあり、そしてリンフォトキシン−αのアップレギュレーションにおいて観察される活性は、変異体タンパク質との結合がない野生型タンパク質に排他的に起因し得る。これらの２つの可能性を識別するために、次に、発明者らは、細胞表面に発現する、ＣＤ１５４タンパク質の生物化学的な特性を調べた。
【００６２】
これを行うために、ＣＯＳ７細胞を、第１日目に野生型ＣＤ１５４をコードするｃＤＮＡ、またはＴＮＦＨ（−）変異体をコードするｃＤＮＡ、あるいはこれらの両方を用いてトランスフェクションした。このトランスフェクト体を、第４日目に、ＰＢＳでリンスし、細胞の破片および付着していない細胞を除去し、次いで、インサイチュにて、ビオチンで標識した。標識化は、細胞上に残った水の中で０．５ｍｇ／ｍｌであるビオチン−スルホ−ＮＨＳを、室温にて３分間使用して実施した。この反応をグリシンを使用して停止して、このトランスフェクト体細胞を、膨大なモル濃度のグリシンで、１５分間残留させ、その後これらをＰＢＳでリンスした。
【００６３】
次いで、このトランスフェクト体細胞を溶解し、遠心分離して細胞破片を除去し、そしてＣＤ４０−Ｆｃ、Ｒｂ７７９、Ｒｂ７８４、または９Ｅ１０で免疫沈降した。免疫沈降物を、１０〜２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで、電気泳動に供し、ニトロセルロースメンブレン上に移し、西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンでプローブした（図４）。
【００６４】
図４は、ＣＤ４０−Ｆｃ融合タンパク質、Ｒｂ７８４、およびＲｂ７７９はビオチン標識野生型タンパク質を、免疫沈降するが、９Ｅ１０は免疫沈降させないことを示す。さらに、細胞表面で検出された野生型ＣＤ１５４の量は、同時トランスフェクションに使用された、野生型ｃＤＮＡに対する変異体ｃＤＮＡの割合に、反比例した。従って、ＴＮＦＨ（−）変異体タンパク質の発現は、用量依存的様式での、野生型タンパク質の表面おける発現を阻止する。重要なことに、発明者らは、ＣＤ４０−Ｆｃ融合タンパク質、Ｒｂ７８４、およびＲｂ７７９での免疫沈降物中にビオチン標識変異体タンパク質（ｐ１７）を検出しなかった。これは、このビオチン標識（すなわち、細胞表面で発現される）、野生型タンパク質が、ＴＮＦＨ（−）変異体タンパク質と結合しかったことを示唆する。ＴＮＦＨ（−）変異体の細胞外ドメイン中に総数８のリジン残基が存在するので、これらのリジン残基のうちどれもが、表面に存在する変異体タンパク質が検出されないように、実験条件下で、ビオチン化について接触可能ではないということはなさそうである。さらに、９Ｅ１０が任意の野生型タンパク質を免疫沈降させないという事実は、この細胞表面野生型タンパク質のいずれもが、ＴＮＦＨ（−）変異体に結合しなかったことを示している。
【００６５】
図１に示される結果と一緒に、これらのデータは、ＴＮＦＨ（−）変異体と結合していない野生型ＣＤ１５４タンパク質が、細胞表面で発現されたことを示している。しかし、ＴＮＦＨ（−）変異体と複合体化する野生型タンパク質は、細胞内に保持されていた。従って、ＴＮＦＨ（−）変異体との結合は、野生型ＣＤ１５４が細胞表面で発現することを阻止する。
【００６６】
図５は、この阻害プロセスを示している。野生型タンパク質および変異体タンパク質が同時に発現した場合に、野生型タンパク質は、結合したＴＮＦＨ（−）変異体を伴うか、または伴わずして、３量体を形成し得る。しかし、この変異体タンパク質によって結合された野生型タンパク質は、細胞表面上へ成熟し得ない。ｓｅ毎のＴＮＦＨ（−）自体との結合は、野生型タンパク質がそのレセプターである、ＣＤ４０と相互作用する能力を損なわない。
【００６７】
（実施例６：実験結果の考察）
ＣＤ１５４に対するＴＮＦＨ（−）変異体の潜在的なドミナントネガティブ効果を研究するために、発明者らは、これらの２つのタンパク質をＣＯＳ細胞で同時発現し、そしてこれらの生化学的特性および機能的特性を調べた。発明者らの結果は、野生型タンパク質の複合体化によって、この変異体タンパク質が、野生型ＣＤ１５４の細胞表面発現を阻止していることを示している。この観察は、少なくとも２つの局面において、有意である。第１に、患者の細胞は、野生型タンパク質およびＴＮＦＨ（−）変異体ＣＤ１５４タンパク質の両方を産生し得るが、これらは、細胞表面上で機能的なＣＤ１５４を産生することができず、そしてこれは、超（ｈｙｐｅｒ−）ＩｇＭ表現型を生じることを意味する。第２に、発明者らの観察によって、ＴＮＦＨドメインに加えて、ＣＤ１５４の他の部位がまた、ＣＤ１５４　３量体のアセンブリに関与していることが明らかになった。
【００６８】
ＣＤ１５４は、活性化においてＴリンパ細胞の細胞表面上で一過的に発現するので、このタンパク質の表面発現の部分的な減少でさえ、望まないＴ細胞媒介免疫応答の抑制において有益である。従って、標的Ｔ細胞に対する機能的ＴＮＦＨドメインを欠くＣＤ１５４改変体の誘導によって、機能的ＣＤ１５４の標的細胞表面における発現の効果的なブロッキングによる治療機会が提供される。
【００６９】
（他の実施形態）
本発明が、本発明の詳細な説明と合わせて記載されるが、前述の記載は、本発明を例示することを意図し、本発明の範囲を限定することは意図しないことが理解される。本発明の発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【００７０】
他の局面、利点、および改変は、上記の特許請求の範囲のうちに含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＴＮＦＨ（−）ＣＤ１５４の野生型ＣＤ１５４との関連を示したオートラジオグラフである。
【図２】
図２は、機能的ＣＤ１５４トリマーの産生に対するＴＮＦＨ（−）ＣＤ１５４の用量依存性の抑制効果を示す、オートラジオグラフのパネルである。
【図３】
図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれ、ＣＤ１５４変異体が、野生型ＣＤ１５４の、リンフォトキシン−αの上方制御活性を減少することを示す、棒グラフおよび表である。
【図４】
図４は、ＴＮＦＨ（−）ＣＤ１５４が、野生型ＣＤ１５４の細胞表面発現を妨げることを示す、オートラジオグラフのパネルである。
【図５】
図５は、ＴＮＦＨ（−）ＣＤ１５４が、細胞内部で野生型ＣＤ１５４に結合し、そしてこれが細胞表面に達することを阻害することを例示した説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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