(57)【要約】本発明は、ｎ＝２（すなわちハリントニン）またはｎ＝３（すなわちホモハリントニン）である下記の化学式のそれらの互変異性体およびそれらの塩を含む天然、合成または半合成のハリントニンであって、鏡像異性体を含むことのある不純物の総含有率が１％未満であり、および／または主な不純物の含有率が０．９％未満であり、および／またはクロマトグラフィー分析が９７．５％を超えるハリントニン含有率を示すハリントニンに関するものである。
2004523586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ＝２（すなわちハリントニン）またはｎ＝３（すなわちホモハリントニン）である化学式：
【化１】
2004523586.tif 000007
の、それらの互変異性体およびそれらの塩を含む天然、合成または半合成ハリントニンにおいて、
・鏡像異性体を含むことのある不純物の総含有率が１％未満であり、および／または
・主な不純物の含有率が０．９％未満であり、および／または
・クロマトグラフィー分析が、９７．５％を超えるハリントニン含有率を示す、ハリントニン。
【請求項２】
その互変異性体およびその塩を含む天然、合成または半合成ホモハリントニンにおいて、
・鏡像異性体を含むことのある不純物の総含有率が１％未満であり、および／または
・主な不純物の含有率が０．９％未満であり、および／または
・クロマトグラフィー分析が、９７．５％を超えるホモハリントニン含有率を示す、
ホモハリントニン。
【請求項３】
・鏡像異性体を含むことのある不純物の総含有率が１％未満であり、および／または
・主な不純物の含有率が０．９％未満であり、および／または
・クロマトグラフィー分析が、９７．５％を超えるハリントニン含有率を示す、ことを特徴とする、その互変異性体およびその塩を含む天然、合成または半合成ハリントニン。
【請求項４】
図１に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線を有する、結晶性の天然、合成または半合成ホモハリントニン。
【請求項５】
図２に示したものとほぼ同一のＸ線回折図、および図３に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトルを有する、結晶性の天然、合成または半合成ホモハリントニン。
【請求項６】
図１に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線、図２に示したものとほぼ同一のＸ線回折図、および図３に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトルを有する、結晶性の天然、合成または半合成ホモハリントニン。
【請求項７】
図４に示したものとほぼ同一の、ＤＳＣ曲線を有する、結晶性の天然、合成または半合成ハリントニン。
【請求項８】
図５に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトルを有する、結晶性の天然、合成または半合成ハリントニン。
【請求項９】
図４に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線、および図５に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトルを有する、結晶性の天然、合成または半合成ハリントニン。
【請求項１０】
単独でまたは一つもしくは複数の他の活性成分との組み合わせで、それぞれが１％未満の総不純物含有率を有するか、０．９％未満の主な不純物の含有レベルを示す、抗腫瘍効果のある量の、一つまたは複数の天然、合成または半合成ハリントニンを、担体、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤などの、医薬品として許容できる一つまたは複数の他の不活性成分とともに含む医薬品組成物。
【請求項１１】
１％未満の総不純物含有率を有するか、０．９％未満の主な不純物の含有レベルを示す、抗腫瘍効果のある量の、天然、合成または半合成ホモハリントニンを、担体、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤などの、医薬品として許容できる一つまたは複数の不活性成分とともに含む医薬品組成物。
【請求項１２】
１％未満の総不純物含有率を有するか、０．９％未満の主な不純物の含有レベルを示す、抗腫瘍効果のある量の、天然、合成または半合成ハリントニンを、担体、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤などの、医薬品として許容できる一つまたは複数の不活性成分とともに含む医薬品組成物。
【請求項１３】
図２に示したものとほぼ同一のＸ線回折図、および図３に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトルを有する、抗腫瘍効果のある量の、天然、合成または半合成ホモハリントニンを、担体、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤などの、医薬品として許容できる一つまたは複数の不活性成分とともに含む医薬品組成物。
【請求項１４】
図２に示したものとほぼ同一のＸ線回折図、図３に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトル、および図１に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線を有する、抗腫瘍効果のある量の、天然、合成または半合成ホモハリントニンを、担体、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤などの、医薬品として許容できる一つまたは複数の不活性成分とともに含む医薬品組成物。
【請求項１５】
図５に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトル、および図４に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線を有する、抗腫瘍効果のある量の、天然、合成または半合成ハリントニンを、担体、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤などの、医薬品として許容できる一つまたは複数の不活性組成物とともに含む医薬品組成物。
【請求項１６】
場合によっては鏡像異性体の濃縮のためを含む、請求項１から９に含まれる特性を示す純粋なハリントニンの調製のための、天然、合成または半合成粗ハリントニンの精製方法において、
・１つまたは複数のクロマトグラフィー精製
・溶媒が水または低級Ｃ1-4アルカノールまたは一つもしくは複数の有機溶媒を含む水性溶媒混合物である、一つまたは複数の結晶化、
とから成る方法。
【請求項１７】
溶媒が水である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
溶媒が水または一つもしくは複数の有機溶媒を含む水性溶媒混合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
有機溶媒混合物が一つまたは複数の低級Ｃ1-4アルカノールを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
低級アルカノールがメタノールである、請求項１６および１９に記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィー精製を逆相で行い、溶媒が、低級Ｃ1-4アルカノールを含む水性溶剤、同等の選択性の溶媒混合物、および、場合によっては、好適にはリン酸に基づく、塩である緩衝溶液である、請求項１６から２０に記載の精製法。
【請求項２２】
ハリントニンがホモハリントニンである、請求項１６から２１に記載の方法。
【請求項２３】
ハリントニンがハリントニンである、請求項１６から２１に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳類の疾患を治療するための請求項１０から１５に定義した医薬品組成物を調製するための、請求項１から９に定義した精製されたおよび／または固体のハリントニンの使用。
【請求項２５】
腫瘍もしくは寄生性疾患の治療のための、または免疫抑制療法もしくは改善剤としての請求項１０から１５に定義した医薬品組成物を調製するための、請求項１から９に定義した精製されたおよび／または固体のハリントニンの使用。
【請求項２６】
他の薬剤との組み合わせを含む、ガンおよび白血病、とくに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ならびに慢性骨髄性白血病を含む骨髄増殖性疾患の治療のための請求項１０から１５に定義した医薬品組成物を調製するための、請求項１から９に定義した精製されたおよび／または固体のハリントニンの使用。
【請求項２７】
寄生性疾患の治療のための請求項１０から１５に定義した医薬品組成物を調製するための、請求項１から９に定義した精製されたおよび／または固体のハリントニンもしくはそれらの塩の使用。
【請求項２８】
他の化学療法剤への抵抗性のアジュバント療法としての１０から１５に定義した医薬品組成物を調製するための、請求項１から９に定義した精製されたおよび／または固体のハリントニンの使用。
【請求項２９】
薬が非経口投与法で与えられる、請求項２４から２８に記載の治療法。
【請求項３０】
薬が経口投与法で与えられる、請求項２４から２８に記載の治療法。
【請求項３１】
薬が経肛門投与法で与えられる、請求項２４から２８に記載の治療法。
【請求項３２】
薬が局所投与法で与えられる、請求項２４から２８に記載の治療法。
【請求項３３】
薬の投与法がインプラントである、請求項２４から２８に記載の治療法。
【請求項３４】
非経口投与法が皮下投与である、請求項２９に記載の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その固体の分析パターンによって限定された、高純度で結晶性形状のハリントニン、および経口投与法を使用してのガンの治療にとくに有益な医薬品組成物に単体でまたは組み合わせて配合するための薬物として使用することを可能にする、天然、合成または半合成の供給源から得られる粗アルカロイドの精製によるハリントニンの調製法に関するものである。
【０００２】
ハリントニン（すなわち、ハリントニン＝ＨＡおよびホモハリントニン＝ＨＨＴ）は、イヌガヤ属に属する稀少な、かつ絶滅に瀕した針葉樹から単離されたアルカロイドである、特定のセファロタキシンエステルである。セファロタキシンとその天然エステルは、セファロタクサンという総称でまとめられる。
【０００３】
定義（図式１参照）：
・セファロタクサンは構造式１を示すイヌガヤ科からのみ今日抽出される、特定のアルカロイドである。このコア構造でいくつかの置換基が見られる：ヒドロキシル基、エーテル基、アシロキシ基など。いくつかの補足的な二重結合または分子内架橋が存在する場合は、明確なセファロタクサンを実現する。セファロタキシン２とハリントニン３はセファロタクサンの例である。様々な種のイヌガヤから、数十のセファロタクサンが単離された。
・セファロタキシン２は、アシロキシ側鎖がないセファロタクサンである。セファロタキシン２ａとドルパシン２ｂは、セファロタキシンの例である。
・ハリントニン３は、各種のセファロタキシン部分の３−位置に分岐ヒドロキシアシロキシ側鎖をつけることによって形成された、特定のセファロタクサンである。ハリントニンは、一般的に強い細胞毒性を示すセファロタキシンの天然エステルである。しかしながら、この最小構造のただ一つの原子でも失われると、活性が劇的に喪失することになる（後述）。ハリントニンのいくつかの例は、ハリントニン３ａ、ホモハリントニン３ｂ、ドルパントニン３ｃ、アンヒドロハリントニン３ｄおよびネオハリントニン３ｅである。
【０００４】
二つのハリントニンは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの特定の白血病の治療にきわめて有望な医薬品である。全ての既存の治療法に抵抗性があるか不適であるＣＭＬ患者に対する特別な使用が現在行われており、いくつかの第ＩＩ相および第ＩＩＩ相の臨床試験がフランスと米国で現在行われている。
【０００５】
医薬当局、例えば、米国食品医薬局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、新しい薬剤の承認の前に、特にこれらの薬剤が天然の供給源から単離されたときに、鏡像異性を含めた、高いレベルの純度を要求している。例えば０．１％の不純度は適格とされなければならず、毒物学的研究を実施しなければならない。鏡像異性的に純粋でない、あるいはラセミ混合物としての新薬は、もはやＦＤＡによって承認されない。くわえて、環境条件で関連不純物の特徴が大幅に変動するために、医薬当局は、生物から直接抽出したものから調製した薬物に対してとくに懐疑的である。
【０００６】
【化１】
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ホモハリントニンとハリントニンは、数十のアルカロイドの複合混合物としてイヌガヤ抽出物の中に存在する（図式１参照）。例えば、ＨＡとＨＨＴは、中国においてガンおよび白血病の治療のための混合物として初めに使用された。米国においては、ＦＤＡによって要求された一定の質に対する薬物の遵守レベルは、治験薬の開発の過程（すなわち初期の第Ｉ相臨床試験から第ＩＩＩ相まで）で上がっている。くわえて、ＦＤＡは、関連化合物の点からの不純物の特徴を上市段階の間バッチごとに再現できることを要求しているが、それは、薬物を天然の供給源から調製する場合にはきわめて困難である。天然の供給源から調製されたホモハリントニンは、米国、国立ガン研究所によって開発され、その初期の臨床試験に使用された。酢酸エチル内での結晶化を用いる最終精製にもかかわらず、最終薬物は、二つの天然の同族体、および精製溶媒とのエステル交換反応の結果得られる精製の人為的な産物であるＨＨＴのエチル類似体を含む、三つの主な不純物を含有している［Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎ．  ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  ２２，  ｐｐ５４１−５３４（２０００）］。参照文献［Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００］から採った下記の表はこのＨＨＴの品質を実証しており、実際にそれは現状技術の精製法を用いて得られた最良の品質である。
【表１】
2004523586.tif 000004
【０００７】
図６、７、１０、１２は、各種の供給源に由来するハリントニンのクロマトグラフィーの特徴を示す。
【０００８】
不確かな不純物特徴を示すＨＨＴ薬物による第ＩＩＩ相臨床試験［Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００］。ＮＣＩは最終的に第ＩＩＩ相臨床試験での使用に適したＨＨＴを入手したが、その努力にもかかわらず、使用された製品には１％を超える含有率で除去できない不純物が含まれている。［Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００］。ＮＣＩ生産物の精製のために記載された方法にくわえて［Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００］。
【０００９】
セファロタキシン部分に、完全に前もって形成したアシル側鎖を付けることにより、ハリントニンとホモハリントニンを含むハリントニン類を発明者が最近半合成したことは、この状況を激変させた：最終薬物のクロマトグラフィー純度は常に９９．８％を超え、それに対して上述のＮＣＩ製品は９８．５％（これまで開示された中でもっとも純度が高い）、中国の製品は９５％〜９７％で、これらは０．２％、１．５および３〜５％の不純物に対応する（図６、７および１２参照）。くわえて、半合成のＨＡおよびＨＨＴの前駆体としてのセファロタキシンは樹木の再生可能な部分に豊富なので、この半合成法は、稀少で絶滅に瀕している植物の破壊によって引き起こされる深刻な環境問題を克服する。
【００１０】
例えば経口投与に有益な薬の信頼できる固体の最終形状を得るためには、薬物の明確な結晶の形がきわめて重要な条件になる。
【００１１】
ＨＨＴとＨＡはＣＭＬ患者の治療にきわめて有望な薬になるだろうが、連続中心静脈注入（ＣＩＶＩ）による現在の投与法は、数年にわたりこの治療を行うには大きな障害となる。くわえて、ＨＨＴ／ＨＡの非血液毒性は軽微であるが、カテーテルによる感染の発生はこの治療法の主たる毒性である。これらの薬の経口型の使用はこの状況を一変させ、この製品の市場を飛躍的に広げるであろう。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、下記の化学式の、それらの互変異性体およびそれらの塩を含む天然、合成または半合成のハリントニンを提供する：
【化２】
2004523586.tif 000005
この式において、ｎ＝２（すなわちハリントニン）またはｎ＝３（すなわちホモハリントニン）であり、
・鏡像異性体を含むことのある不純物の総含有率が１％未満であり、および／または
・主な不純物の含有率が０．９％未満であり、および／または
・クロマトグラフィー分析が９７．５％を超えるハリントニン含有率を示す。
【００１３】
本発明の推奨実施態様は、
・鏡像異性体を含むことのある不純物の総含有率が１％未満であり、および／または
・主な不純物の含有率が０．９％未満であり、および／または
・クロマトグラフィー分析が９７．５％を超えるホモハリントニン含有率を示す、その互変異性体およびその塩を含む天然、合成または半合成のホモハリントニンを提供する。
【００１４】
本発明のさらなる推奨実施態様は、
・鏡像異性体を含むことのある不純物の総含有率が１％未満であり、および／または
・主な不純物の含有率が０．９％未満であり、および／または
・クロマトグラフィー分析が９７．５％を超えるハリントニン含有率を示す、その互変異性体およびその塩を含む天然、合成または半合成のハリントニンを提供する。
【００１５】
本発明のさらなる推奨の側面は、図１に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線を有する、結晶性の天然、合成または半合成のホモハリントニンである。
【００１６】
さらに、本発明のさらなる実施態様は、図２に示したものとほぼ同一のＸ線回折図および図３に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトルを有する、結晶性の天然、合成または半合成のホモハリントニンを提供する。
さらに、本発明のもう一つ別の実施態様は、図１に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線、図２に示したものとほぼ同一のＸ線回折図、および図３に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトルを有する、結晶性の天然、合成または半合成のホモハリントニンを提供する。
【００１７】
さらに、本発明の別の推奨実施態様は、図４に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線を有する、結晶性の天然、合成または半合成のハリントニンを提供する。
さらに、本発明の推奨の側面は、図２に示したものとほぼ同一のＸ線回折図、図３に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトル、および図１に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線を有する、抗腫瘍効果のある量の、天然、合成または半合成のホモハリントニンを、担体、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤などの、医薬品として許容できる一つまたは複数の不活性成分とともに含む医薬品組成物を提供する。
【００１８】
本発明の別の側面は、図５に示したものとほぼ同一の、ＫＢｒ中のＩＲスペクトルおよび図４に示したものとほぼ同一のＤＳＣ曲線を有する、抗腫瘍効果のある量の、天然、合成または半合成のハリントニンを、担体、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤などの、医薬品として許容できる一つまたは複数の不活性成分とともに含む医薬品組成物を提供する。
【００１９】
本発明の別の推奨の側面は、場合によっては鏡像異性体の濃縮のためを含む、上記に含まれる特性を示す純粋なハリントニンの調製のための、天然、合成または半合成の粗ハリントニンの精製方法を提供し、該方法は下記の連続する過程から成る：
（ｉ）好適には、低級アルカノールまたはテトラヒドロフランまたはアセトニトリル、精製水、および、好適にはリン酸に基づいた、塩である酸性緩衝溶液などの水性移動相の逆相での、少なくとも一つのクロマトグラフィー精製。固定相は、標準的な化学結合相、好適にはアルキルシランまたはアルキルニトリル、不活性な核で結合したもの、好適にはシリカゲルとすることができる；
（ｉｉ）水、または有機溶媒、好適には低級Ｃ1-4アルカノールを含む水性溶媒内での、少なくとも一つの結晶化。
【００２０】
精製方法の進行は、ＨＰＬＣ分析と、固体状態でのいくつかの熱分析によって監視される。鏡像異性体の純度の進行は、乾燥固体形状の旋光検査によって監視される。
【００２１】
推奨実施態様は、好適にはベータ−シクロデキストリンに基づいたキラルの固定相を用いたＨＰＬＣを使用する、セファロタクサンの鏡像異性体の純度を監視する新規な方法を提供する。
【００２２】
本発明の別の推奨実施態様は、低級Ｃ1-4アルカノールがメタノールであり、セファロタクサンがハリントニンである、上述の精製方法である。
【００２３】
本発明のさらなる推奨の側面は、低級Ｃ1-4アルカノールがメタノールであり、セファロタクサンがホモハリントニンである、上述の精製方法である。
【００２４】
本発明はまた、抗腫瘍効果のある量の、少なくとも一つの上述のハリントニンまたはホモハリントニンを、医薬品として許容できる一つまたは複数の担体、賦形剤、または希釈剤とともに含む医薬品組成物を含み、従って、例えば、錠剤、カプセル、インプラントまたは座薬などの前記固体医薬品組成物の調製方法を含む。
【００２５】
本発明の別の側面は、（ｉ）化学療法剤、（ｉｉ）他の化学療法剤の増強剤、（ｉｉｉ）腫瘍の成長を抑制するもの、（ｉｖ）哺乳類の寄生生物を抑制するもの、（ｖ）免疫抑制剤、または（ｖｉ）改善剤としての、上述の医薬品組成物を調製するために、本発明に記載の一つのハリントニンまたはホモハリントニンの少なくとも上述の固体形状を使用することである。
【００２６】
本発明はさらに、非経口の、局所の、皮下または経肛門の様式で、抗腫瘍効果のある量の、本発明に記載の少なくとも一つのハリントニンまたはホモハリントニンの固体形状を哺乳類に投与することをもって成る、哺乳類の腫瘍を治療する方法を記載する。
【００２７】
本発明の推奨実施態様は、抗腫瘍効果のある量の、本発明に記載の少なくとも一つのハリントニンまたはホモハリントニンの固体形状を哺乳類に経口投与することをもって成る、哺乳類の腫瘍を治療する方法を記載する。
本発明のさらなる推奨実施態様は、抗腫瘍効果のある量の、本発明に記載の少なくとも一つのハリントニンまたはホモハリントニンの固体形状を哺乳類にインプラント医薬製剤投与することをもって成る、哺乳類の腫瘍を治療する方法を記載する。
【００２８】
最後に、本発明は、ガンおよび白血病、とくに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ならびに慢性骨髄性白血病を含む骨髄増殖性疾患の治療のための医薬品組成物を調製するために、先に定義したような、精製されたおよび／または固体のハリントニンを使用することにも関するものである。
【実施例１】
【００２９】
市販の天然ハリントニンの精製によるハリントニン薬物の調製
【００３０】
Ａ．開始物質の分析的特徴
ＨＰＬＣ分析とＵＶ検出（図６参照）および質量分析検出（図７および８参照）との組み合わせによって、合計６．５％の関連化合物（ｂ、ｃとして識別：ハリントニンの位置異性体＝３．４％；ｄ：ホモハリントニン＝３％；ｅ：４’−デメチルハリントニン＝０．０１％；ｆ：ドルパシン誘導体：０．０５％）が開始物質内に検出された。
【００３１】
Ｂ．天然ハリントニンのクロマトグラフィー
天然ハリントニン（５グラム）を、固定相としての基礎化合物専用の逆相のオクタデシルシランを１０００グラム含有する、分取高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｐｒｏｃｈｒｏｍステンレス鋼；永久的軸圧縮；直径：８０ｍｍ；長さ：１０００ｍｍ）に注入する。次に、移動相としてｐＨ３の緩衝メタノール・水混合溶液の勾配を使用して、溶出を実施する（圧力１２００ｐｓｉ）。インラインＵＶ分光光度検出に基づいて不所望の画分を廃棄する。残した画分を１６個の別個の容器に回収し、それぞれを、異なる選択性のパターンを示す分析ＨＰＬＣシステムを用いて個別に検査する（オクタデシルシランが固定相、緩衝アセトニトリル・水混合系が移動相）。展開の間に、デュアルインラインＵＶ−ＭＳ検出を使用する。ハリントニンの総含有率が０．５％を超える画分を廃棄した後、あらかじめ定めた仕様に合致した画分を集め、中和し、ついで減圧蒸発させた。ついでハリントニンの粗濃縮溶液をアンモニア水でｐＨ８．５にアルカリ化し、ジクロロメタンで溶離した。得られた有機溶液は、高真空で濃縮する。工程中のＨＰＬＣ分析は、関連化合物の合計が１．５％未満であることを示した。
【００３２】
Ｃ．未精製ハリントニンの結晶化
層流フード内で、上記の未精製ハリントニン（４．１グラム）を３０℃でメタノール（５ｍｌ）に溶解した。得られたアルコール溶液を０．２５μの殺菌したミリポアフィルターで濾過して微粒子と細菌を除去し、殺菌した回転フラスコに回収した。ついで、脱イオン水（５０ｍＬ）を添加し、浄化したロータリーエバポレーターを用いて３０℃の真空下で完全にメタノールを除去する。メタノールを除去した後、加熱を中止し、ハリントニンの水溶液を真空下に保持し、純粋なハリントニンの白い結晶が出現する間回転を継続する。攪拌は、結晶が発生しなくなるまで継続する。層流フードの下で、懸濁液をハウスバキュームで焼結ガラスフィルター上に注ぐ。得られた結晶性の固体の塊を低温の脱イオン水で二回洗浄する（１０ｍＬ×２）。白い半透明の結晶をつぎに４０℃で２４時間、高真空を用いて乾燥させる。全体的な収率は７６％である。すべての作業は文書化してから処理を開始し、全ての現行の医薬品の製造管理および品質管理に関する基準を適用した。この臨床バッチは、１０ｍｇの用量で４００治療単位に対応する。
【００３３】
Ｄ．分析
通常の分析手順には、溶剤の残滓、乾燥での損失、水分測定、融点、ＩＲならびにＮＭＲスペクトル、関連化合物およびＨＰＬＣによる評価が含まれる。図７と９は、この方法を用いる精製の前後のＨＰＬＣクロマトグラムを比較している。表ＩＩは、対応する関連化合物含有率の比較を示している。
【表２】
2004523586.tif 000006
さらに特性を明らかにするために、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、熱重量測定法、２Ｄ ＮＭＲ、固体ＮＭＲおよびＸ線粉末回折法を含む、更に進んだ研究を実施した。
【００３４】
赤外線分光分析：
ＫＢｒ錠剤法および／または鉱物油のムル調製技術のいずれにおいても、同一のＩＲスペクトルが得られた。図５は、本工程によって得られた結晶性ハリントニンを固体状態で明白に識別するための典型的な赤外線スペクトル（ＫＢｒ）を示している。一連の鋭い吸収帯が、６１５、６５４、６７４、６８９、７０９、７２２、７５０、７６１、８０５、８５０、９２８、９８９、１０２２、１０３３、１０６２、１０８３、１１１２、１１６２、１２０５、１２２４、１２６２、１２７７、１３０８、１３４０、１３６４、１３８２、１４３８、１４８６、１５０８、１６２５、１６５６、１７２５、１７４５、２８８３、２９３６、２９７２、３０７９、３３５３、３５５２および３６４７ｃｍ-1に認められる。
【００３５】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）および 熱重量測定法（ＴＧ）
ＤＳＣとＴＧの測定は、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＳＴＡＲ Ｓｙｓｔｅｍで得られた。およそ１２ｍｇのハリントニン薬物をＤＳＣ皿に正確に秤量した（１２．４４７１ｍｇ）。サンプルを１０℃／分の速度で２５℃から２００℃まで加熱した。ＤＳＣのデータは、この技術の標準的方法に従って得られた。結晶性ハリントニン薬物のＤＳＣ曲線（図４）は、７９．５℃で融解吸熱を示す。試験最高温度である２００℃まで、その後いっさいの分解は発生しなかった。同時のＴＧ測定は乾燥で１．３％の損失を示したが、それは溶剤または水の構造分子の喪失にはあたらない。
【実施例２】
【００３６】
粗半合成（半−合成）ホモハリントニンの精製による、ホモハリントニン薬物の調製
【００３７】
Ａ．開始物質の分析的特徴
未精製ホモハリントニンの粗反応混合物は、２５０グラムのホモハリントニンＤＳの見込みとともに、工程不純物、例えば、触媒、変化しなかった開始物質（無水−ホモ−ハリントニン）、およびいくつかの関連副生成物を含有している。ＵＶ検出によるＨＰＬＣ分析（図１０の左側のクロマトグラム参照）は、合計９％の関連不純物を示した。
【００３８】
Ｂ．半合成ホモハリントニンのクロマトグラフィー
未精製の半合成ホモハリントニン（５５０グラム）を、固定相としての基礎化合物専用の逆相のオクタデシルシランを４８，０００グラム含有する、分取高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｐｒｏｃｈｒｏｍステンレス鋼；永久的軸圧縮；直径：４５０ｍｍ；長さ：１０００ｍｍ）に注入する。次に、移動相としてｐＨ３の緩衝メタノール・水混合溶液の勾配を使用して、溶出を実施する（圧力１２００ｐｓｉ、流速５４０Ｌ／時）。バイパスしたインラインＵＶ分光光度検出に基づいて不所望の画分を廃棄する。残した画分を３０個の別個のステンレス鋼容器（それぞれ２０または５０Ｌ）に回収し、それぞれを、異なる選択性のパターン（オクタデシルシランが固定相、緩衝アセトニトリル・水混合系が移動相）を示し、ダイオードアレイ検出器を備えた分析ＨＰＬＣシステムを用いて、個別に検査する。ホモハリントニンの総含有率が０．５％を超える画分を廃棄した後、あらかじめ定めた仕様に合致した画分を集め、中和し、ついで機械攪拌式薄膜蒸発機で減圧蒸発させた。ついでホモハリントニンの粗濃縮溶液をアンモニア水でｐＨ８．５にアルカリ化し、ジクロロメタンで溶離した。得られた有機溶液は、高真空で濃縮する。工程中のＨＰＬＣ分析は、関連化合物の合計が０．５％未満であることを示した（図１０の右側のクロマトグラム参照）。
【００３９】
Ｃ．ホモハリントニンＤＳの結晶化
管理されたクリーンルーム内で、層流フードの下で、上記の未精製ホモハリントニンＤＳ（２１０グラム）を３０℃でメタノール（２４０ｍＬ）に溶解した。得られたアルコール溶液を０．２５μの殺菌したミリポアフィルターで濾過して微粒子と細菌を除去し、殺菌したパイロット回転フラスコに回収した。ついで、脱イオン水（２４００ｍＬ）を添加し、浄化したパイロットロータリーエバポレーターを用いて３０℃の真空下で完全にメタノールを除去する。メタノールを除去した後、加熱を中止し、ホモハリントニンＤＳの水溶液を真空下に保持し、純粋なホモハリントニンの白い結晶が出現する間回転を継続する。攪拌は、結晶が発生しなくなるまで継続する。層流フードの下で、懸濁液をハウスバキュームで焼結ガラスフィルター上に注ぐ。得られた結晶性の固体の塊を低温の脱イオン水で二回洗浄する（４５０ｍＬ×２）。白い結晶をつぎに６０℃で４８時間、高真空を用いて乾燥させる。全体的な収率は、未精製の半合成ホモハリントニンの潜在的なホモハリントニンの含有率の８８％である。すべての作業は文書化してから処理を開始し、全ての現行の医薬品の製造管理および品質管理に関する基準を適用した。この臨床バッチは、５ｍｇの用量で４０，０００の治療単位に対応する。
【００４０】
Ｄ．分析
通常の分析手順には、溶剤の残滓、乾燥での損失、水分測定、融点、ＩＲおよびＮＭＲスペクトル、関連化合物およびＨＰＬＣによる分析が含まれる。図１１は、結晶化の前後のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。ホモハリントニンＤＳの関連不純物の合計は０．０３％である。
さらに特性を明らかにするために、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、 熱重量測定法（ＴＤ）、２Ｄ ＮＭＲ、固体ＮＭＲおよびＸ線粉末回折法を含む、更に進んだ研究を実施した。
【００４１】
赤外線分光分析：
ＫＢｒ錠剤法および／または鉱物油のムル調製技術のいずれにおいても、同一のＩＲスペクトルが得られた。図３は、本工程によって得られた結晶性ホモハリントニンを固体状態で明白に識別するための典型的な赤外線スペクトル（ＫＢｒ）を示している。一連の鋭い吸収帯が、６１２、７０３、７７１、８０４、８２６、８５５、８７９、９３２、１０２９、１０８２、１１１９、１１３５、１１６１、１１９１、１２２９、１２７４、１３４４、１３６７、１４３６、１４５７、１４８８、１５０５、１６５３、１７４３、２８１４、２９１１、２９５８、３４２０および３５５２ｃｍ-1に認められる。
【００４２】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）および熱重量測定法（ＴＧ）
ＤＳＣとＴＧの測定は、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＳＴＡＲ Ｓｙｓｔｅｍで得られた。およそ１１ｍｇのホモハリントニン薬物をＤＳＣ皿に正確に秤量した（１０．６２５１ｍｇ）。サンプルを５℃／分の速度で２５℃から２５０℃まで加熱した。ＤＳＣのデータは、この技術の標準的方法に従って得られた。結晶性ホモハリントニン薬物のＤＳＣ曲線（図１）は、１４５．６℃で融解吸熱を示す。毛細管法（Ｂｕｃｃｈｉ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）で行った融解範囲は、１４３〜１４５℃であった。文献には１４４〜１４６℃と示されていた。［“Ｔｈｅ  Ａｌｋａｌｏｉｄｓ”、ｖｏｌ．ＸＸＩＩＩ、ｐｐ１５７に掲載された、Ｌ．ＨｕａｎｇおよびＺ．Ｘｕｅによる、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ  Ａｌｋａｌｏｉｄｓ（１９８８）に引用された、Ａｃｔａ  Ｂｏｔ．Ｓｉｎ．２２，１５６、著者不明（１９８０）。結晶化の媒体は公表されていない。ＨＨＴの結晶性形状の融点に関する参考文献はこれだけである］。
【００４３】
Ｘ線粉末回折法
Ｘ線粉末回折パターンは、ＩＮＥＬ小型回折計、モデルＤＩＦＦＲＡＣＴＩＮＥＬで収集した。粉末化したホモハリントニンＤＳをガラス製毛細管に充填し、この技術の標準的方法に従って分析した。Ｘ線発生機は銅Ｋａｌｐｈａラインを放射線源として使用して、４５ｋＶ、４０ｍＡで作動させた。サンプルはカイ軸にそって回転させ、データは０と１２０度２−シータの間で収集した。収集時間は１２００秒とした。図２に示したごとく、ホモハリントニンのこの結晶性形状のためのＸ線粉末回折は、およそ７．９、９．２、１０．９、１４．９、１６．０、１７．７、１９．５、１９．７、２１．７８、２３．１、２５．３、２５．４および２５．７度２−シータでの大きな反射のピークを含む典型的なパターンを示す。
【実施例３】
【００４４】
中国の供給源からの不純物の入ったホモハリントニンの市販のサンプルの精製によるホモハリントニン薬物の調製
【００４５】
Ａ．開始物質の分析的特徴
天然ホモハリントニン（Ｃｈｉｎａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の分析ＨＰＬＣクロマトグラムは図１２（左下）に表示した。
【００４６】
Ｂ．天然ホモハリントニンのクロマトグラフィー
天然ホモハリントニン（２５グラム）を、固定相としての基礎化合物専用の逆相のオクタデシルシランを１２，０００グラム含有する分取高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｐｒｏｃｈｒｏｍステンレス鋼；永久的軸圧縮；直径：２００ｍｍ；長さ：１０００ｍｍ）に注入する。つぎに移動相としてｐＨ３の緩衝メタノール・水混合溶液の勾配を使用して、溶出を実施する（圧力１２００ｐｓｉ、流速１２０Ｌ／時）。バイパスしたインラインＵＶ分光光度検出に基づいて不所望の画分を廃棄する。残した画分を２２個の別個のステンレス鋼容器に回収し、それぞれを、異なる選択性のパターン（オクタデシルシランが固定相、緩衝アセトニトリル・水混合系が移動相）を示し、ダイオードアレイ検出器を備えた分析ＨＰＬＣシステムを用いて、個別に検査する。ホモハリントニンの総含有率が０．５％を超える画分を廃棄した後、あらかじめ定めた仕様に合致した画分を集め、中和し、ついで機械攪拌式薄膜蒸発機で減圧蒸発させた。ついでホモハリントニンの粗濃縮溶液をアンモニア水でｐＨ８．５にアルカリ化し、ジクロロメタンで溶離した。得られた有機溶液は、高真空で濃縮する。工程中のＨＰＬＣ分析は、関連化合物の合計が０．５％未満であることを示した。
【００４７】
Ｃ．ホモハリントニンＤＳの結晶化
管理されたクリーンルーム内で、層流フードの下で、上記のクロマトグラフィーにかけたホモハリントニンＤＳ（１８グラム）を３０℃でメタノール（３５ｍＬ）に溶解した。得られたアルコール溶液を、０．２５μの殺菌したミリポアフィルターで濾過して微粒子と細菌を除去し、殺菌したパイロット回転フラスコに回収した。ついで、脱イオン水（３００ｍＬ）を添加し、浄化したパイロットロータリーエバポレーターを用いて３０℃の真空下で完全にメタノールを除去する。メタノールを除去した後、加熱を中止し、ホモハリントニンＤＳの水溶液を真空下に保持し、純粋なホモハリントニンの白い結晶が出現する間回転を継続する。攪拌は、結晶が発生しなくなるまで継続する。層流フードの下で、懸濁液をハウスバキュームで焼結ガラスフィルター上に注ぐ。得られた結晶性の固体の塊を低温の脱イオン水で二回洗浄する（５０ｍＬ×２）。白い結晶をつぎに６０℃で４８時間、高真空を用いて乾燥させる。全体的な収率は、未精製の半合成ホモハリントニンの潜在的なホモハリントニン含有率の８４％である。すべての作業は文書化してから処理を開始し、全ての現行の医薬品の製造管理および品質管理に関する基準を適用した。
【００４８】
Ｄ．分析
通常の分析手順には、溶剤の残滓、乾燥での損失、水分測定、融点、ＩＲおよびＮＭＲスペクトル、関連化合物およびＨＰＬＣによる分析が含まれる。図１２（右下）は結晶化後のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。ホモハリントニンＤＳの関連不純物の合計は０．０５％である。
さらに特性を明らかにするために、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、 熱重量測定法（ＴＤ）、２Ｄ ＮＭＲ、固体ＮＭＲおよびＸ線粉末回折法を含む、更に進んだ研究を実施した。
赤外線スペクトル、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）およびＸ線粉末回折法で得られたパターンは、半合成ホモハリントニンで得られた実施例２のものと完全に重なる（それぞれ図３、１および２）。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】結晶性ホモハリントニンの識別に特有のＤＳＣサーモグラム。
【図２】結晶性ホモハリントニンの識別に特有のＸ線粉末回折図。
【図３】結晶性ホモハリントニンの識別の赤外線スペクトル。
【図４】結晶性ハリントニンの識別に特有のＤＳＣ図。
【図５】結晶性ハリントニンの識別に特有の赤外線スペクトル。
【図６】ＵＶ検出を用いた、市販の天然ハリントニンのＨＰＬＣクロマトグラム。
【図７】質量分析およびＵＶ検出と組み合わせた液体クロマトグラフィーを用いた市販の天然ハリントニンの拡大クロマトグラム。
【図８】液体クロマトグラフィーおよび質量分析ならびにＵＶ検出を用いた市販の天然ハリントニンの主な不純物の識別を示したグラフ。
【図９】液体クロマトグラフィーおよび質量分析ならびにＵＶ検出を用いた高度に精製された天然ハリントニンの拡大クロマトグラム。
【図１０】未精製の半合成ハリントニンＤＳとクロマトグラフィーした半合成ハリントニンＤＳ間の純度の進行を示したＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１１】クロマトグラフィーをした半合成ホモハリントニンＤＳと結晶化した半合成ホモハリントニンＤＳ間の純度の進行を示すＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１２】各種の天然源の３つのサンプルのＨＰＬＣの特徴を示したグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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