(57)【要約】本発明は、関節炎の予防及び治療のための薬剤抽出物を含む組成物及びその製造方法に関する。より具体的に、牛膝の根及び蒼朮の根から抽出された薬剤学的組成物は関節炎に特効があり、さらに、前記組成物の発酵産物は従来の関節炎治療薬の製造物質に比べ、関節炎治療及び予防の側面で卓越した効能を有する。
2004503595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）牛膝及び蒼朮を抽出する段階、及び
ｂ）前記抽出物を発酵する段階を含む関節炎の予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記発酵段階後濃縮する段階をさらに含む関節炎予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項３】
請求項１のａ）段階において、前記抽出に用いる溶媒は精製水、エタノール、メタノール、プロパノール又はブタノールであることを特徴とする関節炎予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項１のａ）段階において、前記抽出に用いられる牛膝と蒼朮の比率は０：５〜５：０であることを特徴とする関節炎予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１において、前記牛膝及び蒼朮は乾燥薬材或いは生薬材であることを特徴とする関節炎予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１において、前記牛膝はＡｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ（ＭＩＱ．） ＮＡＫＡＩ又はＡｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ ｂｉｄｅｎｔａｔａ ＢＬＵＭＥ のものを用い、蒼朮はＡｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ ＫＯＩＤＺ．又はＡｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ Ｋｏｒｅａｎａ Ｋｉｔａｍであることを特徴とする関節炎予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１のｂ）段階において、前記の発酵は麦芽、麹、葡萄及び葡萄酒発酵酵素源及び酵母から選択される一つ又は二つ以上の発酵源を用い、発酵副原料として米飯又は米、トウモロコシ澱粉、小麦、パパイン、キウイ又は梨を直接用いるか、又はこれらの澱粉を精製したもの、又はこれらの葡萄糖シロップのうち一つ又は二つ以上を０〜５０％用いることを特徴とする関節炎予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項１のｂ）段階において、前記発酵は発酵源及び発酵副原料と助酵素材を薬材抽出液に直接投入して行うか又は発酵液を製造し、さらに、薬材抽出液をそれぞれ製造し共に合わせて発酵する方法を含む関節炎予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項９】
請求項１のｂ）段階において、前記発酵条件は２０〜７５℃で２〜３６時間であることを特徴とする関節炎予防及び治療用組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項９までの何れか１項の製造方法により製造された関節炎予防及び治療用組成物。
【請求項１１】
請求項１のａ）段階により製造された牛膝抽出物、蒼朮抽出物又はこれらの混合物を有効成分に含むことを特徴とする関節炎予防及び治療用組成物。
【請求項１２】
請求項１又は請求項２において、前記発酵濃縮物を主要薬効成分にして賦形剤を適量用い、有効量及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とするエキス剤、丸剤、顆粒剤、散剤及びこれらのハードカプセル剤又は軟質カプセル剤の経口用関節炎予防及び治療用薬剤組成物。
【請求項１３】
請求項１０において、前記組成物は体内ＴＧＦ−βの生成を促進することを特徴とする薬剤組成物。
【請求項１４】
請求項１０において、前記組成物は体内ＩＮＦ−γの生成を抑制することを特徴とする薬剤組成物。
【請求項１５】
請求項１０において、前記組成物は体内ＴＮＦ−αの生成を抑制することを特徴とする薬剤組成物。
【請求項１６】
請求項１０において、前記組成物は体内ＩＬ−４の生成を促進することを特徴とする薬剤組成物。
【請求項１７】
請求項１０において、前記組成物はマウスの免疫グロブリンＧ１の生成を促進することを特徴とする薬剤組成物。
【請求項１８】
請求項１０において、前記組成物が炎症治療及び予防を目的にする組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、関節炎を効果的に治療、予防する薬草抽出物の組成物およびその調整方法に関する。
詳しくは、本発明は、薬草抽出物を基礎にした薬剤組成物に関する。本発明は関節炎の治療のため腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α、ＴＮＦ−α）の生成を抑制するだけでなく、形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒβ、ＴＧＦ−β）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）の生成を促進させて抗炎症及びコラーゲン合成促進等の骨芽細胞、軟骨組織の再生に優れた効果を示す牛膝抽出物、蒼朮抽出物又はこれらの混合物を含む組成物及び発酵等の製造方法を介して得た産物を含む関節炎治療用薬剤組成物とその製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
一般に関節炎、即ち、関節の炎症疾患はリュウマチ関節炎及び関節炎症関連疾患のような多様な形で発生する。
関節炎は、特に関節嚢内層の滑液膜に炎症性変化に特徴付けられる慢性多関節炎として全身の関節で浮腫と痛みが誘発され、酷い場合は身体障害者になり得る慢性的に進行する疾患である。さらに、リュウマチ関節炎のような関節炎疾患は進行性で変形及び関節不屈のような関節障害を発生させ、度々効果的な治療の欠乏と継続した悪化による深刻な肉体的障害を引き起こす。
【０００３】
関節炎が誘発される直接的な原因は未だ明確でなく、これに対し継続的に研究が進められており、現在までリュウマチ関節炎等の関節炎に対する効果的な予防方法は知られているものがなく、一旦発病する場合もその治療のため解決すべき点等が多く残っている。
【０００４】
伝統的にこのような関節炎の治療には、コルチゾン及び他の副腎皮質ホルモンのようなステロイド系、アスピリン、ピロキシカム及びインドメタシンのような非ステロイド系抗炎症剤、金チオリンゴ酸のような禁作用剤、クロロキノン製剤及びＤ−ペニシラミンのような抗リュウマチ剤、コルヒチンのような通風抑制剤、及びシクロフォスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート及びレバミソールのような免疫抑制剤を含み多様な作用剤をもって化学療法で治療されてきた。
【０００５】
前記で言及した治療剤等は根源的な治療法でなく、ステロイドホルモン剤が関節炎治療剤に知られながら広く用いられたこともあったが、その副作用が明らかになるに従いその使用は困難になった。
【０００６】
なお、関節炎、特に慢性リュウマチ関節炎は患者に激しい痛みを誘発するので、必ず抗炎症剤等を服用しなければならず、現在までこのような痛みを緩和させるか、又は関節の腫れを除去する薬剤としてアスピリン剤及びブタゾリン剤等が長い間広く用いられてきた。しかし、アスピリン等は人の胃腸に致命的な影響を及ぼすので、関節炎を治療するのに必要な量を継続的に服用するのは困難である。
【０００７】
今までのこのような化学療法的薬剤は、薬剤の長期間使用を妨げる副作用、抗炎症効果の欠乏、及び既に発生した関節炎に対する効能の不足のような欠点を有しており、現在は関節炎の治療に鎮痛作用に優れたインドメタシン及びフルフェナム酸と非ステロイド性の各種の消炎剤位が調剤して用いられている実情である。
【０００８】
したがって、このような問題に対する解決策と急性炎症性症状と苦痛に対し症状的な効果を示す関節炎治療剤の開発が要望されており、現在用いられている大部分の関節炎治療剤は程度の差や個人的な差が認められるが、全て或る程度の副作用を持っており、特に、リュウマチ関節炎の治療のためには薬剤を長期間の間服用する必要があるため、副作用の少ない薬剤を開発するのが非常に重要である。
【０００９】
さらに、前記薬剤のうち一部は静脈注射や腹腔注射で投与する場合があるが、この場合は厄介なだけでなく、反復する静脈注射等はアレルギー、ショックだけでなく、衛生上の問題も発生することがある。したがって、服用が容易で安全な治療剤が必要になった。
【００１０】
【発明の開示】
本発明は前記の問題点を解決し、前記の必要性により案出されたものであり、本発明の目的は関節炎の予防及び治療用組成物の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記製造方法に基づき製造された組成物を提供することにある。
【００１１】
前記のような目的を達成するため、牛膝及び蒼朮を抽出する段階及び前記抽出物を発酵する段階を含む関節炎の予防及び治療用組成物の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明は、前記発酵段階後濃縮する段階をさらに含むのが好ましく、本発明の抽出に用いる溶媒は精製水、エタノール、メタノール、プロパノール又はブタノール及びこれらの混合溶媒であるのが好ましく、精製水、エタノール又はメタノールがより好ましい。
【００１３】
なお、本発明の牛膝と蒼朮は乾燥又は生薬剤であるのが好ましい。本発明に用いられる牛膝と蒼朮の比率は０：５〜５：０であるのが好ましく、１：１０〜１０：１であるのがより好ましく、特に、１：２であるのが最も好ましい。このとき、乾燥していない生牛膝を用いる場合は含まれた水分含量を考慮して換算した重量比率にする。
【００１４】
本発明の組成物のうち牛膝、蒼朮抽出物の全てが関節炎治療に重要な薬剤として作用するが、特に、牛膝の含有の可否、及びこの発酵産物がＴＮＦ−αの生成抑制及びコラゲナーゼの活性阻害等の破骨細胞の活性抑制と、骨芽細胞の活性促進で関節炎治療に一層重要な役割を担当する。
【００１５】
なお、本発明の発酵条件は２０℃以下と５０℃以上では発酵効率が少なくなるので、２０〜５０℃で４〜３６時間であるのが好ましいが、工程時間の短縮のため糖化過程中３０〜７５℃まで徐々に昇温させ、５２℃蛋白質休止期及び６５℃糖化休止期をそれぞれ３０分間置いた浸漬法（Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ）を含む。
【００１６】
さらに、本発明は前記の製造方法に基づき製造された関節炎の予防及び治療用組成物を提供する。
本発明の組成物は牛膝抽出物、蒼朮抽出物及びその混合物を含み、それぞれを別々に抽出することもでき、共に抽出して前記の製造方法に基づき製造した発酵産物を含んだ薬剤組成物である。
【００１７】
本発明の組成物は、通常用いられる賦形剤、崩解劑、甘味剤、滑澤劑、香味剤等を追加して含むことができ、通常の方法に基づき錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒、懸濁剤、乳剤、シロップ、液剤又は非経口投与用製剤のような単位投与用又は数回投与用薬剤学的製剤に製形化することができる。本発明に係る実施例ではゲル又は軟条エキス状に製形化した。
【００１８】
本発明に係る組成物の特定患者に対する投与容量水準は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度等に従い変化することがある。
【００１９】
本発明において関節炎とは全ての種類の関節炎を意味し、そのうち特に打撲性関節炎、リュウマチ関節炎、退行性関節炎、通風性関節炎、細菌により膿が溜まる化膿性関節炎と結核性関節炎を意味する。
【００２０】
その他、本発明に係る組成物は全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）とアミロイド症（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ ）等の自己免疫疾患にも効果がある。
【００２１】
【本発明の好ましい態様の詳細な説明】
以下、本発明を説明する。
イノコズチ（ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｆａｕｒｉｅｉ ＬＥＶＥＩＬＬＥ ｅｔ ＶＡＮＩＯＴ又はＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｂｉｄｅｎｔａｔａ Ｂｌｕｍｅ ）はヒユ科（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ ）の植物で高さは約９０ｃｍの多年生草である。根（牛膝、Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ Ｂｉｄｅｎｔａｔａｅ Ｒａｄｉｘ）には水分解すればオレアノール酸（Ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）とグルクロン酸に分解されるサポニンがあり、水に溶解されるアルカロイドのアキランチン（Ｃ６ Ｈ１１Ｏ２ Ｎ・Ｈ２ Ｏ）とその他アルカロイド、多量の粘液がある。水抽出液の灰分は約８％であり、その中でカリウム塩は２４． ５％である。その他にシトステロール、スチグマステロール、アスパラギン酸を始めにアミノ酸と、琥珀酸等を始めに多価塩基酸がある。藥理作用には鎮痛効果、鎮痙効果（ａｎｔｉｓｐａｓｍｏｄｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）、利尿効果、抗アレルギー効果等がある（リュクチャンス等、現代生薬学、ソウル、学窓社、２４−１２８、１９９３）。
【００２２】
イノコズチ根（牛膝）の煎薬は東医治療で淨血剤、利尿剤、通經剤等に用いられており、新農本草経に上品として収録されており東洋医薬で造血劑に区分して用いられる。
【００２３】
本発明に用いた牛膝は、国内の自然産（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ（ＭＩＱ．） ＮＡＫＡＩ）及び中国産懐牛膝（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｂｉｄｅｎｔａｔａ Ｂｌｕｍｅ ）を購入・使用しており、その根は文献資料によれば産後子宮無力症、幾多の原因の子宮出血、過多月経等各種の婦人病の治療に用いられてきた。
【００２４】
蒼朮（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ Ｒｈｉｚｏｍａ）は、高さが８０ｃｍに至る多年生草のオケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ ＫＯＩＤＺ．）の根茎で春又は秋に掘り出して水に洗い、側根を手入れし日干しにしたものであり、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）に属するオケラ属の多年生草本で各地の山に自生する。
【００２５】
オケラの根（蒼朮）には約１． ５％の精油とカロチン、イヌリン、ゴム質、アルカロイド反応があり、さらに、全草はサポニン、クマリン反応がある。精油の主成分はセスキテルペン類（Ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ ）のアトラクチロン（Ｃ１５Ｈ２０Ｏ、融点３８℃、約２０％）であり、その他にフルフラール、β−ユーデスモール（β−Ｅｕｄｅｓｍｏｌ）、ヒネソールがある。他の資料を見ればアトラクチルロール、イソヴァレリアン酸エステル、アトラックチラートカリウム等があるという。さらに、朝鮮オケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ Ｋｏｒｅａｎａ Ｋｉｔａｍ）根（蒼朮）の精油の主成分はアトラクチルロジンであり、アセチルアトラクチロジノール、アトラクチロジノール、エレモールが少量含まれている。オケラ精油の主成分のアトラクチロンは極めて少ないか或いは無い。
【００２６】
昔の東医文献の叙述資料と図を見れば、朝鮮オケラの根が蒼朮により該当するということができ、蒼朮は甘くて辛く温かくて鎮静作用、造血作用、利尿作用があり、東医治療では実証による腎臓機能障害で小便が少ないとき、胃腸炎、腫れ、目眩症と全身が痛いときの利尿、発汗剤等で東医処方に配合する非常に重要な東薬である。民間では下痢と吐瀉を止めることと消化不良症、糖尿病、咳及び通風治療にしばしば用いて長期間服用すると長生きするという話しが伝えられている。
【００２７】
本発明者等は、前記のような薬効を有する牛膝と蒼朮混合物の抽出物が毒と副作用がなく、関節炎に優れた治療効果を有する韓方組成物であることを確認しており、さらに、このように製造した組成物の発酵産物がさらに薬効の著しい増加を示すことを確認して本発明を完成することになった。
【００２８】
したがって、牛膝と蒼朮をそれぞれ或いは共に水又はアルコールで抽出し、これを発酵等の製造工程を介して得た産物は関節炎の予防及び治療に副作用がなく、効能の卓越した生薬成分の薬剤学的組成物治療剤を提供し、既存の化学療法的治療剤を取り替えて有効に利用されるはずである。
【００２９】
本発明者等は、関節炎の治療に現在用いられている大部分の関節炎治療剤が化学療法剤として程度の差や個人的な差が認められるが、全て或る程度の副作用を有しているので薬剤の長期間使用を妨げる副作用、抗炎症効果の欠乏、及び既に発生した関節炎に対する効能の不足のような欠点を克服するため、相対的に副作用の発現が少ないと考えられる天然物由来の生薬成分の関節炎治療用韓方組成物を長いあいだ研究してきた。その結果、Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ Ｒａｄｉｘ で牛膝科Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ の根として蒼朮の薬剤学的韓方組成物の抽出物が動物実験等の結果、リュウマチ関節炎の治療に効果を表わすことを確認し、さらに、その抽出組成物の発酵産物がより優れた薬効を示すことを証明した。このとき、乾燥牛膝或いは自然状態の生牛膝を用いて蒼朮と配合条件及び抽出条件と発酵工程を確立し、本発明を完成することになった。
【００３０】
したがって、本発明は牛膝と蒼朮の薬剤学的韓方組成物の抽出物及びその発酵産物、さらに、その製造方法に関し、好ましくは発酵工程に米飯、澱粉等を用いることができ、麦芽、麹等で発酵して溶媒を蒸発・濃縮させた濃縮エキス又は丸剤、散剤、カプセル剤等の関節炎予防及び治療用薬学的組成物及びその製造方法に関する。
【００３１】
さらに、本発明は牛膝及び蒼朮を炭素数１〜４の低級アルコールで抽出して残留溶媒を除去した濃縮抽出物を含み、またこのように製造した抽出物に発酵工程を適用することができる。
【００３２】
本発明は、牛膝と蒼朮の薬剤学的韓方組成抽出物及びこの発酵産物の関節炎予防及び治療効果をラットに投与して調査する。さらに、薬剤投与群及び対照群ラットの組織細胞を採取して臨床評価と共に関節炎及び炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）関連サイトカイン等の濃度を分析し、ＬＰＳで刺激したマウスマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）で各薬材のｉｎ−ｖｉｔｒｏ実験を行った。
【００３３】
本発明によると、イノコズチ（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ ）の根として牛膝は中国産Ａｃｈｙｒａｎｔｈｉｓ ｂｉｄｅｎｔａｔａ ＢＬ． の乾燥牛膝、又は自然状態のＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ（ＭＩＱ．） ＮＡＫＡＩの韓国産未乾燥生牛膝を用い、オケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｊａｐｏｎｉｃａ ）の根として蒼朮を合わせて薬剤学的韓方組成物を作った後これを溶媒で抽出し、再びここに麦芽又は麹等を添加して発酵した産物が関節炎の予防及び治療に卓越な効能を有する動物実験結果及び細胞組織学的分析結果を得た。
【００３４】
本発明の牛膝及び蒼朮抽出物は、次のような生薬抽出法により抽出することができる。
牛膝と蒼朮を抽出溶媒に投入して５０〜１２０℃で５〜２４時間のあいだ加温する。この抽出液を４０〜６０℃に冷却させて濾過し上澄液を取るか、又は濾過過程なく本発明で用いる発酵工程を適用することができる。このような抽出及び濾過操作を１回以上繰り返して上澄液を合わせ、溶媒を蒸発させて濃縮する。牛膝と蒼朮をそれぞれ抽出して合わせて用いることもできるが共に抽出するのが工程が簡単であり、加温するとき１２０℃ Ｏｉｌ−ｂａｔｈ で温めるか、又はＳｔｅａｍ Ｄｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ 法を利用することもあるが、好ましくは水浴槽で８０〜１００℃で温める方法を利用する。さらに、溶媒として精製水を用いる場合は乾蒼朮使用量の６〜１６倍条件で実験した結果、１２倍で抽出量が最適であった。
【００３５】
或いは、牛膝及び蒼朮を抽出溶媒に投入して常温又は４℃で５〜７日間冷浸し、濾過して上澄液を取る。このような抽出及び濾過操作を１回以上繰り返して上澄液を合わせ、溶媒を蒸発させて濃縮する。
【００３６】
前記のような２種類の抽出法で、好ましくは牛膝と蒼朮を小さな大きさに粉砕して用いることができ、抽出溶媒の好ましい例として純粋な水又は２０〜５０％エタノール、５０〜１００％メタノール等アルコール水溶液を用いることができるが、本発明の発酵工程の適用のため有機溶媒は完全に除去する。
本発明で用いる発酵工程は、次のような生薬発酵法に従い行うことができる。
【００３７】
生薬抽出物に２０〜６０℃で麦芽、麹等を添加して同一の温度範囲で４〜３６時間のあいだ発酵する。このとき、生薬抽出物は前記で記載した抽出法により得られたものを用いて濾過した上澄液を用いるか、又は濾過過程なく製造した抽出物を発酵後に濾過することができ、生薬抽出液を濾過過程なく発酵して濾過した場合、抽出液を濾過した上澄液を発酵して濾過したときより発酵産物が約５％多く得られた。
【００３８】
或いは、生薬抽出物を３０℃で徐々に昇温させながら５２℃で蛋白質休止期、及び６５℃で糖化休止期をそれぞれ３０分間置いた浸出法による速やかな発酵法を用いることもできる。この場合、発酵最終温度の７５℃まで２時間４５分の時間がかかっており、高温濾過により濾過時間を相当短縮することができた。
【００３９】
本発明は自然発酵や麦芽、麹、葡萄及び葡萄酒発酵酵素源又は酵母のような発酵微生物を処理して発酵を進めることができる。特に、本発明に係る組成物を発酵させると薬効及び味、最終製形の形態維持（ゲル状態）に肯定的な効果をもたらして薬の効能及び保管上の利点を有する。さらに、米飯を麦芽又は麹等により発酵したあと濾過し、上澄液を取ったあと前記の生薬抽出物に添加して発酵することもできる。
【００４０】
麦芽を用いる場合、麦芽酵素により既に含まれている多量の澱粉は糖化（ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）させて発酵に適した抽出物を得ることができ、麦芽澱粉を補う副原料は多くは麦芽の５０％まで用いる。このとき、廉価の副原料を用いることにより発酵時間の短縮及び発酵抽出量の増加等の経済的な発酵効率の増進と共に香味増進、混濁度の減少等の付随的な効果も期待するすることができる。通常多用される副原料にはトウモロコシ、米、小麦、パパイン（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ の乳液から得る）、キウイ又は梨等の澱粉を精製したもの（ｒｅｆｉｎｅｄ ｓｔａｒｃｈ）があり、さらに、これらの澱粉を酸又は酵素に糖化させたコーンシロップ（ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ）のような葡萄糖シロップ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｙｒｕｐ ）もある。
【００４１】
麹（ｋｏｊｉ）原料の種類は小麦、米に小麦粉を着せたものを普通原料に用いるが、ぶんどう、もち米、麦等が用いられることもある。酵母源は空気、オナモミ、麦藁、稲藁、クワ、ヨモギ、チシャ、蓮華、ユキザサの葉、ヤナギタデの幼葉、松の葉等がある。原料外蒸煮の可否は煎ったもの、蒸したもの、やや蒸したもの、生小麦があり、原料の粒度は１２割から微分までにする。副原料の種類にはクワの葉、ヨモギ、シュユを煎じた汁、桃種の粉末、杏種の粉末、マクワウリの粉末等があり、ここに助酵素剤を処理して製造する。助酵素剤は、在来の麹の株菌であるＲｈｙｚｏｐｕｓとＵｓａｍｉ 及びＯｒｙｚａｅ等の菌を培養して糖化力を高めたもので、自然麹の複雑な味と糖化力を同時に追求したものである。
【００４２】
【発明を実施する最良の形態】
実施例
次の具体的な実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例にのみ限定するものではない。本明細書及び実施例に記載された％は容量％を意味する。
【００４３】
実施例１
生牛膝（水分含量５０％）８５ｇをよく洗浄して陰乾したものと乾蒼朮８５ｇを細切し、２Ｌの円形フラスコに投入して水５００ｍＬを添加し、還流冷却器を装置した後１２０℃で１０時間の間スチーム抽出した。この抽出液を７５℃程度に冷却して高温濾過し、その上澄液を取って溶媒を蒸発・濃縮し、凍結乾燥して５５ｇの丸剤を得た（１Ｂサンプルの製造）。
【００４４】
実施例２
生牛膝（水分含量５０％）８５ｇをよく洗浄して陰乾したものと乾蒼朮８５ｇを細切し、２Ｌの円形フラスコに投入して水５００ｍＬを添加し、還流冷却器を装置した後１２０℃で１０時間の間スチーム抽出した。この抽出液を５０℃程度に冷却したあと麦芽６０ｇ及び米飯８５ｇを投入して４５℃で１２時間のあいだ発酵した。この抽出液を濾過し、溶媒を蒸発・濃縮して流動性エキスを得た。凍結乾燥して６４ｇの丸剤を得た（４Ｂサンプルの製造）。
【００４５】
実施例３
生牛膝（水分含量５０％）４０ｇをよく洗浄して陰乾したものと乾蒼朮４０ｇを細切し、５Ｌの円形フラスコに投入して精製水１２８０ｍＬを添加し、還流冷却器を装置した後８０〜１００℃の水浴槽で１０時間のあいだ抽出した。この抽出液を５０℃程度に冷却したあと麦芽１２ｇ及び米飯３２ｇを投入して常温（３０℃程度の温かい場所）で３６時間のあいだ発酵した。このとき、米飯が液の上にふかふかと浮かび上がったときを発酵過程の終結点にし、この抽出液を７５℃まで昇温して高温濾過し、溶媒を蒸発・濃縮して８５ｍＬの流動性エキスを得た（実験例２のサンプル）。
【００４６】
実施例４
乾燥牛膝（水分含量０． ７％）２０ｇと乾蒼朮４０ｇを細切し、２Ｌの円形フラスコに投入して水４８０ｍＬを添加し、還流冷却器を装置した後１２０℃のＯｉｌ−ｂａｔｈで１０時間のあいだ抽出した。この抽出液を７５℃程度に冷却して高温濾過し、その上澄液を取って溶媒を蒸発・濃縮し３１． ５ｇの固形粉を得た。実施例１の結果と比較して２０％程度の粗抽出物をさらに得ることができた。
【００４７】
実施例５〜実施例７
生牛膝（水分含量５０％）４０ｇをよく洗浄して陰乾したものと乾蒼朮４０ｇを細切し、２Ｌの円形フラスコに投入して精製水を添加し、還流冷却器を装置した後１２０℃のＯｉｌ−ｂａｔｈで１０時間のあいだ抽出した。この抽出液を５０℃程度に冷却したあと麦芽７ｇを投入して４５℃で１２時間のあいだ発酵した。この抽出液を濾過し、溶媒を蒸発・濃縮して固形粉を得た。
【００４８】
実施例８
乾燥牛膝（水分含量０． ７％）２０ｇと乾蒼朮４０ｇを細切し、２Ｌの円形フラスコに投入して水４８０ｍＬを添加し、還流冷却器を装置した後１２０℃のＯｉｌ−ｂａｔｈで１０時間のあいだ抽出した。この抽出液を５０℃程度に冷却したあと麦芽７ｇ、澱粉３ｇを投入して４５℃で６時間のあいだ発酵した。この抽出液を濾過し、溶媒を蒸発・濃縮して３６． ８ｇの固形粉を得た。
【００４９】
実施例９
乾燥牛膝（水分含量０． ７％）２０ｇと乾蒼朮４０ｇを細切し、２Ｌの円形フラスコに投入して水４８０ｍＬを添加し、還流冷却器を装置した後１２０℃のＯｉｌ−ｂａｔｈで１０時間のあいだ抽出した。この抽出液を７５℃程度に冷却したあと濾過して上澄液を集め、麦芽７ｇ、ｓｔａｒｃｈ３ｇを投入して４５℃で６時間のあいだ発酵した。この抽出液を濾過し、溶媒を蒸発・濃縮して３４． ６ｇの固形粉を得た。
【００５０】
実施例１０
乾燥牛膝（水分含量０． ７％）２０ｇと乾蒼朮４０ｇを細切し、２Ｌの円形フラスコに投入して水４８０ｍＬを添加し、還流冷却器を装置した後１２０℃のＯｉｌ−ｂａｔｈで１０時間のあいだ抽出した。この抽出液を７５℃程度に冷却したあと濾過して上澄液を集めた。麦芽７ｇ、澱粉３ｇを投入して３０〜７５℃まで温度を徐々に高めながら５２℃で３０分間、６５℃で３０分間休止期を置いた。２時間３０分後溶液の温度が７５℃に至ってから１５分間放置した後、６時間のあいだ濾過して前記で集めた生薬抽出物と合わせて６時間のあいだ発酵した。溶媒を蒸発・濃縮して３４． １ｇの固形粉を得た。
【００５１】
実施例１１〜実施例１４
乾燥牛膝２０ｇと乾蒼朮４０ｇを細切して２Ｌの円形フラスコに投入し、１００％のメタノール溶媒を４８０ｍＬ添加して８０℃の水浴槽で１０時間のあいだ抽出した。この抽出液を濾過してその上澄液を取り、溶媒を蒸発・濃縮・除去して固形粉を得た。
精製水８０ｍＬを投入し発酵液を添加して６時間のあいだ発酵した。
【００５２】
実施例１５
乾燥牛膝２０ｇと乾蒼朮４０ｇを細切して２Ｌの円形フラスコに投入し、８０％のメタノール（メタノール：水＝４：１ｖ／ｖ）溶媒を４８０ｍＬ添加して４℃で７日間冷浸した。この抽出液を濾過してその上澄液を取り、溶媒を蒸発・濃縮して残留メタノールを完全に除去したあと固形粉１５． ５ｇを得た。
【００５３】
実施例１６
精製水４００ｍＬに麦芽１００ｇと米飯或いは小麦、トウモロコシ、パパイン等の発酵副原料澱粉（ｓｔａｒｃｈ）１００ｇ を投入して３０〜７５℃まで昇温浸漬法により発酵液を製造した。溶液を７５℃で高温濾過して澄んだ上澄液を用いる。
【００５４】
実施例１７
原料の小麦を選別して洗浄し充分に乾燥させたあと粉砕し、２０〜２５％程度に撒水しながら練り混ぜた。一定量を麹枠に投入して圧着・成形し、種麹［緑色が一層濃い長毛性の黄麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を用い、白麹菌（Ａｓｐ ．Ｎｉｇａｒ ｍｕｔ ．Ｋａｗａｃｈｉｉ）等を用いることもある。］を混ぜた小麦粉を着せて表面接種を行った。これを麹室の殺菌済みの藁布団を敷いた棚に載せてさらに殺菌済みの藁布団で覆って入麹する。その後、通風しながら品温を３５℃以下に調節すると共に毎日又は隔日で裏返しをすれば、入麹４〜５日後に黄緑色の胞子が現われ品温が４０℃以上に上昇して麹の表面が乾燥し始めた。その後品温が次第に下降し、放置しながら入麹後８〜１０日に出麹して７日前後に熟成させて乾燥した貯蔵室で保管・使用した。
【００５５】
実施例１８
乾燥牛膝と蒼朮を正確に秤量して蒼朮使用量の８倍数（ｖ／ｗｔ）メタノールで１２時間還流抽出し、この抽出物を濾過して溶媒を減圧・濃縮・除去する。発酵過程は各抽出液に実施例１６と実施例１７で製造した発酵液を共に混合して４５℃で１２時間発酵した。
【００５６】
実施例１９
実施例８で同じ方法で製造して賦形剤を添加し、顆粒剤、散在を得てこれをハードカプセル（Ｈａｒｄ ｃａｐｓｕｌｅ）に製造した。
【００５７】
実施例２０
実施例８で同じ方法で製造して少量の酒精用エタノール、及び精製水を混合して軟質カプセルを製造した。
【００５８】
実験例１；Ｐａｗ Ｖｏｌｕｍｅ Ｃｈａｎｇｅ 評価
熱処理されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ はＤｉｆｃｏ 、Ｄｅｔｒｏｉｔ 、ＭＩで購入しており、雄性ウィスタールイスラット（Ｗｉｓｔａｒ Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ ．で購入し、ラットは購入後（約１８０ｇ）約２５０ｇに体重を調節した。フロイント不完全アジユバンド（Ｆｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ）等の他の試薬等はＳｉｇｍａ で購入した。
【００５９】
ＡＡ（ａｃｕｔｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ）は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ （ＭＢ）をフロイントアジユバンドに懸濁液を作り（５ｍｇ／ｍＬ）Ｗｉｓｔａｒ Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ１匹当り１００μＬずつ右側の足裏の皮下層に１回注入して対照群にし、基準群はＭＢなくフロイントアジユバンドのみ同量で皮下に投入した。両足の嵩は、ｗａｔｅｒ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ法により３〜４日毎に測定されており約２８日間測定された。薬は固形量を基準に２ｇ／ｋｇの容量で投与しており、約６〜７ずつ各群を形成した（Ｔｕｒｕｌｌ ａｎｄ Ｑｕｅｒａｌｔ、２０００；Ｉｍｍｕｎｏ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ．４６（２０００）７１〜７７．）
【００６０】
図における各群の名称と用いられた動物の数は次の通りである。
Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｇｒｏｕｐ ：対照群（６匹）
１Ｂ、４Ｂ Ｇｒｏｕｐ：薬物使用実験群（各７匹ずつ）
基準群（６匹）
【００６１】
足の嵩の変化（Ｐａｗ Ｖｏｌｕｍｅ Ｃｈａｎｇｅ ）は、対照群と実験群でそれぞれ基準群の嵩を削減する値に定義しており、実験群の投与薬の急性関節炎阻害効果は次の式で定義した（Ｂａｄｇｅｒ ｅｔ ａｌ． ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２９１（１９９９） １３８０ 〜１３８６）。
【００６２】
本実験で１Ｂは発酵しない薬材抽出物（実施例１）を示し、４Ｂは薬材抽出物を発酵したもの（実施例２）を意味する。
【００６３】
阻害効果（％）＝｛１−［ 実験群−基準群］ ／［ 対照群−基準群］ ｝×１００
【００６４】
統計分析は、実験群の足の嵩値を対照群の足の嵩値に対しＳｔｕｄｅｎｔ ’ｓ ｔ ｔｅｓｔを介してｐ値を求めて比較しており、０． ０５以下の場合有意なものにした。
その結果は、次の通りである。
【００６５】
図１は、ＭＢ注射後時間に伴う足の嵩の変化を要約したものである。図に示されているように、対照群において３日目に最初の変化が現われて基準日より２．６倍増加した。１６日目まで増加した現象を維持しながら２０日目に１回追加増加が観測されて初期嵩の３． ７倍に増加した。その後、減少傾向に変化して３１日目頃、初期の２． ９倍程度になった。４Ｂの投与時に大体の傾向は対照群と類似したが、４Ｂ群が３日目の嵩を以後の実験終結時まで維持乃至減少傾向を示すとの点で対照群と異なる様態を示した。嵩においても４Ｂの場合２０日目に対照群の５５％に減少し（ｐ＜０． ００１）、全ての時間帯で対照群より減少した傾向を示した。その反面、基準群の場合初期３日に足の嵩は最大であり（最初の日より１． ８倍増加）、以後順次減少して初期値よりやや増加した水準に回復された。
【００６６】
実験群と対照群、そして基準群の平均体重は２７０ｇ程度に殆ど一致した値であったが、急性関節炎誘発後約２０日目の体重は４Ｂ、１Ｂ群と対照群は２５ｇほどずつ減少した値を示した。その反面、基準群は６０ｇほど増加した値を示した。左足の嵩は２群とも初期値との差を示さなかった。
【００６７】
図２に示されているように、１Ｂの投与時に対照群の場合類似して初期に嵩が増加しながら、一定時間（この場合、２週間後）が経過した後再び増加する傾向を著しく示した。このような傾向は、図１の４Ｂ投与時に示した傾向性と著しい差を示している。さらに、１Ｂは対照群と比較してみるとき、浮腫を減少させるのに効果があるものと判明された。一方、４Ｂは対照群と比較してみるとき、浮腫を減少させるのに１Ｂに比べて優れた効果があるものと判明された。
【００６８】
【表１】
2004503595.tif 000003
【００６９】
表１は４Ｂ、１Ｂの投与時に右足の浮腫を測定して基準群値との差を整理したものである。図１に示されているように、４Ｂは対照群に比べて２週から４週の間に著しい浮腫好転効果を示しているが、１Ｂ投与結果は依然と平均的に効果があるにも拘らず有効性の弱い結果を示している。
【００７０】
【表２】
2004503595.tif 000004
【００７１】
表２は、前記の結果を阻害効果に換算した結果であり、再び４Ｂ薬剤の投与が最も優れたものであることを示している。４Ｂの投与は３週目にＭＢによる浮腫の約４０〜４５％の減少を誘発させており、１Ｂ薬剤はこのような効果が２５％の結果を示して牛膝、蒼朮の抽出発酵産物（４Ｂ）が発酵しない薬材抽出物（１Ｂ）より高い治療効果を示した。
【００７２】
実験例２；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｒｔｈｒｉｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ評価
米国のＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ ．起源の、１９８８年韓国科学技術院（ＫＩＳＴ）で分譲されたＤＢＡ／１実験用マウス４８匹を平均体重２１． ５ｇに合わせて２週間安定化して基準群及び実験群と比較群に分類した後、タイプ２コラーゲン（ＴｙｐｅＩＩ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ）で関節炎を誘発させるため（ＴｙｐｅＩＩ Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｕｓｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｔｅｓｔ）尻尾に１次免疫化（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）させた。再び２週後左側の後足裏に同様の方法でブーストさせ、実験群２０匹は以後２週間７回に亘って１回／２日間隔で実施例３の薬材抽出物を発酵した薬物を固形粉基準０． ６ｇ／ｋｇ容量（１２２． ５μＬ／１匹）で経口投与した。比較群（ＣＩＡ群）に対し実験群（薬剤処理群、Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ 群）の時間経過に伴う関節炎インシデンス（Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ）と、関節炎誘発の程度を臨床関節炎指数（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｒｔｈｒｉｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ、以下「ＡＩ」と記す）で観察しており、実験例３ではブースター後２日後基準群ラット４匹を犠牲にし、薬剤の関節炎治療効果を細胞組織学的分析を介して評価するため標準検量線を確保し、再び実験開始５週目の薬剤処理が完了した時点で実験群及び比較群のラットのそれぞれ４匹を２次犠牲して摘出した細胞組織の細胞培養を介してＥＬＩＳＡ及びＲＴ−ＰＣＲ方法等で本薬剤の抗炎症及び関節炎治療効果を分析した。
【００７３】
免疫化時に用いたＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）試薬はＣｈｏｎｄｒｅｘ社のＡｒｔｈｒｏｇｏｎ −ＣＩＡ　（５ｍＬ／ｖｉａｌ Ｌｏｔ． １１２７００）を用いており、Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＩはＳｉｇｍａ 社のＢｏｖｉｎｅ ｎａｔｉｖｅ Ｃ ＩＩを用いてＣＦＡと１：１に混合し１匹当り１００μＬをラットの尻尾に注入した。ブースター時にはＤｉｆｃｏ 社で購入したＩＦＡ（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）をＢｏｖｉｎｅ ｎａｔｉｖｅ Ｃ ＩＩと１：１に混合し、やはり１匹当り１００μＬをラットの左側の後足Ｆｏｏｔ ｆａｄに注入した。実験で関節炎誘発の程度は臨床関節炎指数として、左側の後足を除いた残りの三つの足での関節炎誘発の程度を観察し、程度に従い０〜４点を与えることにより（０点：異常状況未発見、１点：発赤（赤く腫れ上がる）、２点：発赤及び浮腫発現、３点：関節炎の発生と見なす、左側の後足ほど浮腫により腫れ上がる、４点：激しい炎症、亀裂、足で突っ立っているのが困難である）合算測定し、インシデンスは三つの足のうち一つでも確然な浮腫の発現（ＡＩ評価３点以上）を観察することができるマウスの数を％で表わした。
【００７４】
表３と表４は、実験群に薬材を服用させ始めた３週目から臨床評価を行ってＡＩ及びインシデンスを評価整理したものであり、これを図３と図４に示した。以後４週目まで薬剤を処理した後８週目で対照群（ＣＩＡ群）の関節炎誘導程度が５７． １％に最高点を示し、ＡＩ評価もまた平均３点以上の確実な関節炎誘導がなされてから以後減少傾向を示した。薬剤処理群においても薬物投与が完了した６週目以後インシデンスが増加する傾向を示すが、薬物処理期間内では関節炎誘発及び程度が殆ど見えないので、本薬剤の関節炎治療及び予防効果を明らかにした。さらに、ＡＩ評価分析においても５週目でＡＩ評価値が１次増加した後７週目で２次増加する、実験例１の結果と同様の傾向を著しく示している。以後の経過でもＡＩ評価の最高点で薬剤処理群が平均１点台を超過しない、ＣＩＡ群に対し６６． ４％の著しい関節炎の治療効果を記録した。
【００７５】
【表３】
2004503595.tif 000005
【００７６】
【表４】
2004503595.tif 000006
【００７７】
実験例３　関節炎誘発マウス適切細胞組織学的分析
実験例２の動物実験で２週目後ブースターしてから薬剤投入前に基準群マウス４匹を１次犠牲し、再び２週後薬剤投入が完了した後比較群（ＣＩＡ群）及び薬剤処理群のラットのそれぞれ４匹を２次犠牲して各部位の組織細胞を摘出し、細胞培養してＥＬＩＳＡ及びＲＴ−ＰＣＲ法で細胞内炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）及び免疫関連サイトカイン濃度の変化を測定、抗炎症及び関節炎治療の効果を分析した。併せて、眼球で採取した血漿中の免疫グロブリンの量を抗体滴定（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）し、総免疫蛋白及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２の量を測定してＴ細胞に対する薬剤作用の程度を測定した。
【００７８】
実験ラットの組織細胞の摘出はｄＬＮ（ｄｒａｉｎｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）、ｍＬＮ（ｍｅｎｓｅｎｔｅｒｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）、Ｓｐｌｅｅｎ及びＰ． Ｐ（Ｐｅｙｅｒ ’ｓ Ｐａｔｃｈｅｓ ）の４部位で行い、ＲＰＭＩ１６４０培地／１０％溶液で細胞スープ（Ｃｅｌｌ ｓｏｕｐ ）を作って遠心分離（３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、５×１０５ 細胞濃度／ウェル濃度でシーディングした。ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ ）法は、ＳＰＥＣＴＡＭＡＸ２５０機種を用いてＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β）及びＩＮＦ−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）分析に利用し、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ）分析はＰｅｒｋｉｎＥＬＭＥＲ９６００を用いてＣＩＡ群及びトラレンス（Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ）群の組織細胞内ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ −α）、ＩＬ−４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ −４）及びＴＧＦ−β濃度の差を測定し、抗炎症及び関節炎治療の効果を比較・分析した。
【００７９】
表５と表６は、ＴＧＦ−β及びＩＮＦ−γのＥＬＩＳＡ分析過程を示したものであり、このときＢｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ はＧＩＢＣＯＢＲＬＴＭのＰＢＳ試薬を用い、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ９． ６ｇを精製水適量で１Ｌを合わせ１％ＢＳＡ（ＴＭ−ＵＳＢ． Ｌｏｔ．１０６２６８）１０ｇと０． １％酢酸ナトリウムを添加した溶液にした。ＴＧＦ−β測定の抗体に米国Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ 社の＃２４４（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ． ＭＡＢ１８３５）及び＃１９（Ｌｏｔ Ｎｏ． ＷＳ０４）を用いており、ＰＥＰＲＯ　Ｔｅｃｈ　ＥＣ　ＬＴＤ（Ｕ． Ｓ． Ａ）の＃１７（Ｃａｔ． Ｎｏ．１００−２１）及びＧｅｎｚｙｍｅ ／Ｔｅｃｈｎｅ社の＃１８（Ｃａｔ． Ｎｏ．８０−１８３５）を標準に利用してカタログマニュアルを参照した。
【００８０】
【表５】
2004503595.tif 000007
【００８１】
【表６】
2004503595.tif 000008
【００８２】
ＩＮＦ−γのＥＬＩＳＡ分析は、やはりＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ 社の♯３５２（Ｃａｔ． Ｎｏ． ＭＡＢ７８５ ）、♯３５３（Ｃａｔ． Ｎｏ． ＭＡＦ４８５ ）及び♯３４４（Ｃａｔ． Ｎｏ． ４８５−ＭＩ ）を抗体標準試薬に用い、カタログマニューアルを参照した。
【００８３】
図５は、ＩＩ形コラーゲンで関節炎誘発されたＣＩＡ群と薬剤処理群のラットの眼球から採取した血漿で測定した免疫グロブリン濃度を示した図である。２０μｇ／ｍｌ 濃度のＮａｔｉｖｅ ｂｏｖｉｎｅ ＣＩＩを５０μｇ／Ｗｅｌｌコーティング（ ｃｏａｔｉｎｇ）し、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社で購入した♯２５０及び１８２、１８３の検出試薬を用いて血漿のうち総免疫グロブリン濃度、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２の濃度を定量した。
【００８４】
ＤＢＡ／１実験用マウスは、体内免疫グロブリンのうちＩｇＧ１がＴ−ヘルプ２細胞（Ｔｈ２）から誘導された免疫蛋白で抗炎症に関係し、Ｔｈ１⇒ＩｇＧ２に抗原をプレゼンティングして炎症を誘導するＩｇＧ２、及び総免疫グロブリンの濃度ＩｇＧは差がないのに反し、ＩｇＧ１は対照群に対し薬剤処理群で２倍以上の著しい増加を見せた。即ち、薬剤処理群がＴ細胞の中、特異にＴｈ２⇒ＩｇＧ２に作用して抗炎症を誘導作用した。（１１５．５％　ＩｇＧ１濃度増加）
【００８５】
２次犠牲したラットの摘出細胞に対しＴＧＦ−β及びＩＮＦ−γのＥＬＩＳＡ分析を行い図６と図７に示した。ブースター２週後測定結果で、腸間膜リンパ節でＣＩＡ群に比べトラレンス群が著しいＴＧＦ−βの増加（約２． ５倍）を見せており、炎症に関与するＩＮＦ−γの測定値もまたｍＬＮ及びｄＬＮで薬剤処理群が減少（２０〜４０％）結果を得た。
【００８６】
骨芽細胞のうち存在するＴＧＦ−βは、骨基質で不活性に蓄積されているが、骨吸収時に破骨細胞が放出する酸により活性化されて骨芽細胞の増殖及びコラゲン合成を促進し、破骨細胞に対して抑制的作用を行う。さらに、ＴＧＦ−βはモノカイン（マクロファージによる生産）であるとの一説もあるが、未だに骨や骨髄の細胞で生成して上皮、肝葉細胞の活性化に作用するのが一般的な内容であり、従ってＴ細胞でＭＨＣ２（一種のマーカー）に対する抑制作用に抗炎症作用がある。
【００８７】
本実験ではさらにｍＬＮ、ｄＬＮ、Ｐ．Ｐ及び脾臓組織の細胞を１０ｇ用いてＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α及びＩＬ−４の濃度をＲＴ−ＰＣＲ法で分析し、電気移動してＩＯＤ値を測定した（量単位：ｎｇ）。ＲＴ−ＰＣＲ法は細胞内で発現されたＲＮＡを検出し、分析するセンシティブな方法で摘出細胞のうち測定しようとする特定ＲＮＡ を分離して逆伝写反応でｃＤＮＡを合成してＰＣＲで増幅し対照群及び検量線と比較分析する。
図８、図９、図１０は、ＰＣＲ 法で分析したＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＴＧＦ−αの電気移動写真であり、４５０ｎｍ蛍光検出器でＩＯＤ値を測定して表７、表８及び表９に示した。
【００８８】
【表７】
2004503595.tif 000009
【００８９】
【表８】
2004503595.tif 000010
【００９０】
【表９】
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【００９１】
前記結果、ｃＤＮＡ初期β２Ｍ　ＩＯＤ値に対しＰＣＲ増幅後、ＩＯＤ値の変化量を換算した時、ＴＧＦ−βの量はブースター位置及び腸間膜リンパ節で２． ５倍の増加を記録してＥＬＩＳＡ分析結果を裏付けており、脾臓及びＰｅｙｅｒ’ｓ Ｐａｔｃｈ でも相当増加して抗炎症及び骨芽細胞増殖に関与したことが分かる。（表７）
【００９２】
Ｂ細胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ）刺激因子として休止期Ｂ細胞の活性化に関与するＩＬ−４もまた、ブースター位置及び腸間膜リンパ節で１００〜２００％のＩＬ−４濃度増加を見せ活発なＢ細胞活性化に関与していることが分かり、脾臓及びＰ．Ｐ等のように骨髄細胞と関係ない器官での濃度は大きい差がなかった。（表８）
【００９３】
細胞内ＴＮＦ−αは腫瘍壊死因子として炎症誘発に関与する。
本実験結果、脾臓及びＤｒａｉｎｉｃ ＬＮではＴＮＦ−αの濃度があまり差を見せていないが、腸間膜及びＰ．Ｐで大きく減少するものと見て関節炎の移行及び分化抑制に相当な影響を及ぼしていることが分かる。即ち、薬剤処理群でブースター後、インシダンス測定結果ＣＩＡ誘導群と異なりＡＩ及び関節炎誘発程度が著しく少ないことが分かる。（表９）
【００９４】
実験例４　マウスマクロファージのｉｎ−ｖｉｔｒｏ実験
実施例１８で製造した本薬材の１１個のサンプル及び比較薬物としてＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎ とのマウスマクロファージをＬＰＳで刺激した細胞のＴＮＦ−α及びコラゲナーゼ阻害効果を測定した。実験の結果、ＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ結果はＬＰＳ群と陰性群が有意に相違し、本薬材の発酵工程中に発酵液の効果はないものと表われており、薬剤の二つの成分である牛膝及び蒼朮のそれぞれの抽出物で全てＴＮＦ−α阻害効果を記録した。併せて、それぞれの抽出物に発酵工程を加えたサンプル群においてもＴＮＦ−α阻害効果を記録しており、このとき発酵液による重量偏差（牛膝９． ２ｇ→２３． １ｇ、蒼朮１２． ２ｇ→２２． ９ｇ）を差し引く場合、著しい阻害効果を換算することができるので前記実験例３の結果を裏付けている。これは、図１１に図示されている。
【００９５】
コラゲナーゼ活性阻害実験は、やはり前記実施例１８で製造した牛膝、蒼朮の各抽出及び抽出発酵産物の１０個のサンプル及び発酵液自体を陰性対照群と比較して測定した。先ず、Ａｚｏ ｄｙｅ−ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ（ｓｉｇｍａ 社）２％、ＣａＣｌ２１ｎＭ、Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ５０ｍＭ、コラゲナーゼ Ｔｙｐｅ ＩＩ（１２５ｎｇ／０． ５ｍＬ）が含まれた０． ５ｍＬ溶液にそれぞれの薬物を添加して３７℃で１５時間のあいだ酵素反応した。５４０ｎｍｄｅＵＶ／ｖｉｓ．分光器で反応により分離されたａｚｏ染料の量を測定・比較した。本実験の結果、薬材の各成分の抽出物及び抽出発酵物で全てコラゲナーゼ活性阻害に優れた効果を示していることが分かる。これは表１０及び図１２に示されている。
【００９６】
【表１０】
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【００９７】
【産業上の利用可能性】
前記の構成を有する本発明によると、牛膝と蒼朮の抽出物も部分的に関節炎症状の緩和に活性を有するが、その抽出物の発酵産物である本発明の場合、発酵しないものに比べて２倍程度の関節炎緩和に対する効果を示した。
さらに、本発明で前記構成の発酵産物は関節炎の予防及び治療効果において薬剤投与中に関節炎移行率が全くなく予防効果を確実にしており、治療効果もまた６７％の関節炎誘導減少の結果を得た。さらに、体内浮腫及び関節炎に係わるサイトカインの濃度を著しく調節し、関節炎の治療だけでなく浮腫の治療にも卓越した効果を有していることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、結核菌注射後時間に伴う発酵した薬剤（４Ｂ）処理群と対照群の足の嵩の変化を示す図。
【図２】図２は、結核菌注射後時間に伴う未発酵薬剤（１Ｂ）処理群と対照群の足の嵩の変化を示す図。
【図３】図３は、ＩＩ型コラーゲンで関節炎が誘発されたラットの時間に伴う薬剤処理群と対照群のＣｌｉｎｉｃａｌ Ａｒｔｈｒｉｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ評価の結果を示す図。
【図４】図４は、ＩＩ型コラーゲンで関節炎が誘発されたラットの時間に伴う薬剤処理群と対照群の関節炎Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ 評価の結果を示す図。
【図５】図５は、ＩＩ型コラーゲンで関節炎が誘発された薬剤処理群及び対照群のラットの眼球で採取した血漿で測定した免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の濃度を示す図。
【図６】図６は、ＩＩ型コラーゲンで関節炎が誘発された薬剤処理群及び対照群のラットの各部位の摘出細胞内ＴＧＦ−β濃度をＥＬＩＳＡで分析・比較した図。
【図７】図７は、ＩＩ型コラーゲンで関節炎が誘発された薬剤処理群及び対照群のラットの各部位の摘出細胞内のＩＮＦ−γ濃度をＥＬＩＳＡで分析・比較した図。
【図８】図８は、ＩＩ型コラーゲンで関節炎が誘発された薬剤処理群及び対照群のラットの各部位組織から採取した細胞のＲＴ−ＰＣＲ後ＴＧＦ−βの電気泳動図。
【図９】図９は、ＩＩ型コラーゲンで関節炎が誘発された薬剤処理群及び対照群のラットの各部位組織から採取した細胞のＲＴ−ＰＣＲ後ＩＬ−４の電気泳動図。
【図１０】図１０は、ＩＩ型コラーゲンで関節炎が誘発された薬剤処理群及び対照群のラットの各部位組織から採取した細胞のＲＴ−ＰＣＲ後ＴＮＦ−αの電気泳動図。
【図１１】図１１は、ＬＰＳ刺激を受けたマウスのマクロファージに実施例１８で製造したそれぞれの薬材を処理し、対照群とヒドロコーチジョン比較薬物群とのＴＮＦ−α濃度を比較した図。
【図１２】図１２は、実施例１８で製造したそれぞれの薬材のコラゲナーゼ活性阻害効果を比較した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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