(57)【要約】結腸直腸癌の診断および予後について使用され得る方法が、本明細書中に記載される。結腸直腸癌を調節する能力について、候補の生物活性薬剤をスクリーニングするために使用され得る方法もまた、本明細書中に記載される。さらに、結腸直腸癌および他の癌における治療的介入の為の方法および分子標的（遺伝子およびその産物）が記載される。薬物候補をスクリーニングする工程であって、該方法は、以下：ａ）表１または表２にしめされた発現プロファイル遺伝子またはそのフラグメントからなる群より選択される発現プロファイル遺伝子を発現する細胞を提供する工程；ｂ）該細胞に薬物候補を添加する工程；およびｃ）該発現プロファイル遺伝子の発現に対する該薬物候補の効果を決定する工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物候補をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）表１または表２に示された発現プロファイル遺伝子またはそのフラグメントからなる群より選択される発現プロファイル遺伝子を発現する細胞を提供する工程；
ｂ）該細胞に薬物候補を添加する工程；および
ｃ）該発現プロファイル遺伝子の発現に対する該薬物候補の効果を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記決定する工程が、前記薬物候補の非存在下での発現レベルを、該薬物候補の存在下での発現レベルと比較する工程を包含する、方法。
【請求項３】
結腸直腸癌モジュレータータンパク質（結腸直腸癌モジュレータータンパク質）に結合し得る生物活性薬剤についてスクリーニングする方法であって、該結腸直腸癌モジュレータータンパク質が、表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントからなる群より選択される核酸によってコードされ、該方法は、以下：
ａ）該結腸直腸癌モジュレータータンパク質と候補生物活性薬剤とを合わせる工程；および
ｂ）該結腸直腸癌モジュレータータンパク質に対する該候補薬剤の結合を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
結腸直腸癌モジュレータータンパク質の活性を調節し得る生物活性薬剤についてスクリーニングするための方法であって、該結腸直腸癌モジュレータータンパク質が、表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントからなる群より選択される核酸によってコードされ、該方法は、以下：
ａ）該結腸直腸癌モジュレータータンパク質と候補生物活性薬剤とを合わせる工程；および
ｂ）該結腸直腸癌モジュレータータンパク質の生物活性に対する該候補薬剤の効果を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
候補結腸直腸癌薬物の効果を評価する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該薬物を患者に投与する工程；
ｂ）該患者から細胞サンプルを取り出す工程；および
ｃ）表１または表２の核酸からなる群より選択される遺伝子の発現を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
前記発現プロファイルを、健康な個体の発現プロファイルと比較する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結腸直腸癌を診断する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第一の個体の第一の組織型において、表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントからなる群より選択される１以上の遺伝子、あるいは該遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を、決定する工程；および
ｂ）該第一の個体または第二の非罹患個体由来の第二の正常組織型からの該遺伝子の発現を比較する工程、
を包含し、ここで、該発現における差異が、該第一の個体が結腸直腸癌を有する
ことを示す、方法。
【請求項８】
結腸直腸癌モジュレータータンパク質（結腸直腸癌モジュレータータンパク質）またはそのフラグメントと該結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントに結合する抗体との結合を妨害し得る生物活性薬剤についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
ａ）結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメント、候補生物活性薬剤および該結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントに結合する抗体を合わせる工程；ならびに
ｂ）該結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントおよび該抗体の結合を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
結腸直腸癌モジュレータータンパク質（結腸直腸癌モジュレータータンパク質）の活性を阻害するための方法であって、該結腸直腸癌モジュレータータンパク質は、表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントからなる群より選択される核酸によってコードされ、該方法は、該結腸直腸癌モジュレータータンパク質にインヒビターを結合させる工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記インヒビターが抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結腸直腸癌を処置する方法であって、該方法は、結腸直腸癌モジュレータータンパク質のインヒビターを患者に投与する工程を包含し、ここで、該結腸直腸癌モジュレータータンパク質は、表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントからなる群より選択される核酸によってコードされる、方法。
【請求項１２】
前記インヒビターが抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントの効果を中和する工程であって、該方法は、該タンパク質に特異的な薬剤を、中和をもたらすに十分な量で、該タンパク質に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１４】
治療的部分を、結腸直腸癌組織に局在化させるための方法であって、該方法は、結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントに対する、該治療的部分に結合体化した抗体に、該組織を曝露する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
前記治療的部分が、細胞傷害性薬剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療的部分が、放射性同位体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
細胞において結腸直腸癌を阻害するための方法であって、該方法は、表１または表２の核酸に対するアンチセンス分子を含有する組成物を細胞に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントによってコードされるタンパク質に特異的に結合する、抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体フラグメントである、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２２】
表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントからなる群より選択される１以上の核酸セグメントを含むバイオチップであって、該バイオチップは、１０００未満の核酸プローブを含む、バイオチップ。
【請求項２３】
表１もしくは表２の核酸またはその相補体の配列に対して、少なくとも９５％相同な配列を有する、核酸。
【請求項２４】
表１もしくは表２の核酸またはその相補体に対して、高いストリンジェンシーの下でハイブリダイズする、核酸。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項２６】
個体において免疫応答を誘発する方法であって、該方法は、請求項２５に記載のポリペプチドまたはそのフラグメントを含有する組成物を、該個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
個体において免疫応答を誘発する方法であって、該方法は、表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントの配列を含む核酸を含有する組成物を、該個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
結腸直腸癌を有する個体の予後を決定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第一の個体の第一の組織型において、表１もしくは表２の核酸またはそのフラグメントからなる群より選択される１以上の遺伝子の発現を決定する工程；および
ｂ）該第一の個体または第二の非罹患個体由来の第二の正常組織型からの該遺伝子の発現を比較する工程、
を包含し、ここで、該発現における実質的な差異が、乏しい予後を示す、方法。
【請求項２９】
結腸直腸癌を処置する方法であって、該方法は、治療的部分に結合体化された、結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントに対する抗体を、結腸直腸癌を有する患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記治療的部分が、細胞傷害性薬剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療的部分が、放射性同位体である、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年９月１５日に出願された米国特許出願第０９／６６３，７３３号および２００１年８月１４日に出願され出願番号がまだ分からない米国特許出願の一部継続出願であり、これらはその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、結腸直腸癌に関連する発現プロファイルおよび核酸の同定と、このような発現プロファイルおよび核酸の、結腸直腸癌の診断および予後における使用とに関する。さらに本発明は、結腸直腸癌を調節する候補薬剤および／または標的を同定および使用するための方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
結腸および／または直腸の癌（「結腸直腸癌」と呼ばれる）は西洋人に多く、特に米国において多い。結腸および直腸の癌は、男女共に、５０歳を過ぎてから発生するのが最も一般的である。これらは、正常な結腸上皮が浸潤癌へ病理学的に形質転換した結果として発生する。２つのクラスの遺伝子、腫瘍サプレッサ遺伝子およびプロトオンコジーンにおける変異を含め、結腸直腸癌に関連するとされている多数の遺伝子改変が近年特徴付けられており、最近の研究では、ＤＮＡ修復遺伝子の変異も腫瘍形成に関連し得ることが示唆されている。例えば、腫瘍サプレッサ遺伝子である腺腫性結腸ポリポーシス（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ）（ＡＰＣ）遺伝子の両対立遺伝子の不活性化変異は結腸直腸癌の最も初期の事象の１つであると思われ、開始事象ですらあるかもしれない。結腸直腸癌に関連する他の遺伝子としては、ＭＣＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＤＣＣ（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）遺伝子および他の染色体１８ｑ遺伝子、ならびにＴＧＦ−βシグナル伝達経路の遺伝子が挙げられる。総説としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ，ｐｐ．２３８−２９９，ｉｎ  Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂｌ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｅｐｔ／Ｏｃｔ  １９９７を参照されたい；また、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）、Ｋｉｎｓｅｌｌａ＆Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：Ａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（１９９３）、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（Ｓｃｈｍｉｅｇｅｌ＆Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ  ｅｄｓ．，２０００）、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｎｅｗ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｈａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ  ２０００）、ＭｃＡｒｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００）、Ｗａｎｅｂｏ，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）、Ｌｅｖｉｎ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｎｏｒｄｌｉｎｇｅｒ＆Ｊａｅｃｋ  ｅｄｓ．，１９９３）、Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｄｕｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９８）、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｄｅｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．２００１）、Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．２００１）、Ｏｆｆｉｔ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｒｉｓｋ  Ｃｏｕｎｓｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（１９９７）、Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ａｂｒａｍｓ＆Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ  ｅｄｓ．２０００）、Ｆｌｅｍｉｎｇ，ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９８）、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｌｅｉｂｅｌ＆Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｄｓ．２０００）、およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ａｂｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．２０００）も参照されたい。
【０００４】
診断のための結腸直腸癌の画像化には問題があり、制限がある。さらに、腫瘍の管腔への転移、および腫瘍細胞の局所リンパ節への転移は、重要な予後因子である（例えば、ＰＥＴ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  （Ｒｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．１９９９）を参照）。例えば、５年生存率は、リンパ節転移のない患者では８０％であるが、リンパ節転移のある患者では４５〜５０％へ低下する。最近の報告では、結腸直腸癌の大部分に存在するが正常組織には存在しないことが既に明らかにされている癌胎児抗原のｍＲＮＡの存在に基づいて、逆転写酵素−ＰＣＲ法を用いてリンパ節から微小転移を検出することができることが示された。Ｌｉｅｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３３９（４）：２２３（１９９８）。
【０００５】
従って、結腸直腸癌の診断および予後のために使用することができる方法が望ましい。従って、本明細書には、結腸癌の診断および予後で使用可能な方法が提供される。さらに、結腸直腸癌を調節する能力について候補生物活性薬剤をスクリーニングするために使用することができる方法が提供される。さらに、結腸直腸癌およびその他の癌における治療的介入のための分子標的が本明細書で提供される。
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、結腸直腸癌の診断および予後評価のための新規の方法、ならびに結腸直腸癌を調節する組成物のスクリーニング方法を提供する。結腸直腸癌の処置方法ならびに組成物も本明細書中に提供される。
【０００７】
１つの局面では、薬物候補のスクリーニング方法は、表Ｉから選択される発現プロファイル遺伝子を発現する細胞を提供する工程を包含する。この方法はさらに、薬物候補を当該細胞へ添加する工程、および発現プロファイル遺伝子の発現に対する薬物候補の効果を決定する工程を包含する。
【０００８】
１つの実施形態では、薬物候補のスクリーニング方法は、薬物候補の非存在下での発現レベルを、薬物候補の存在下での発現レベルと比較する工程を包含し、ここで、薬物候補が存在する場合にはその濃度を変更することができ、薬物候補の添加または除去の後で比較を行うことができる。好ましい実施形態では、細胞は少なくとも２つの発現プロファイル遺伝子を発現する。プロファイル遺伝子は増加または減少を示し得る。
【０００９】
また、本明細書中には、結腸直腸癌モジュレータータンパク質へ結合することができる生物活性薬剤のスクリーニング方法も提供される。この方法は、結腸直腸癌モジュレータータンパク質と候補生物活性薬剤とを組み合わせる工程、およびこの候補薬剤の結腸直腸癌モジュレータータンパク質への結合を決定する工程を包含する。好ましくは、結腸直腸癌モジュレータータンパク質は、表１または表２の遺伝子によってコードされる産物である。
【００１０】
さらに本明細書中には、結腸直腸癌モジュレータータンパク質の活性を調節することができる生物活性薬剤のスクリーニング方法が提供される。１つの実施形態では、この方法は、結腸直腸癌モジュレータータンパク質と候補生物活性薬剤とを組み合わせる工程、および結腸直腸癌モジュレータータンパク質の生物活性に対する候補薬剤の効果を決定する工程を包含する。好ましくは、結腸直腸癌モジュレータータンパク質は、表１または表２の遺伝子によってコードされる産物である。
【００１１】
また、結腸直腸癌モジュレータータンパク質を発現また過剰発現するトランスジェニック動物か、あるいは結腸直腸癌モジュレータータンパク質が欠乏している（たとえば遺伝子ノックアウトの結果として）動物に薬物を投与する工程を包含する、候補結腸直腸癌薬物の効果を評価する方法も提供される。
【００１２】
さらに、患者に薬物を投与する工程、および患者から細胞サンプルを取り出す工程を包含する、候補結腸直腸癌薬物の効果を評価する方法が本明細書中で提供される。次に細胞の発現プロファイルが決定される。この方法は、さらに、発現プロファイルを健康な個体の発現プロファイルと比較する工程を包含し得る。好ましい実施形態では、上記発現プロファイルは表１または表２の遺伝子を含む。
【００１３】
さらには、表１または表２の１以上の核酸セグメントを含むバイオチップが本明細書中で提供され、ここでバイオチップは１０００個未満の核酸プローブを含む。好ましくは少なくとも２つの核酸セグメントが含まれる。
【００１４】
さらには、結腸直腸癌に関連する障害の診断方法が提供される。この方法は、第１の個体の第１の組織型において、表１または表２の遺伝子の発現を決定する工程、およびその分布を、第１の個体由来の第２の正常な組織型または第２の冒されていない個体からの遺伝子の発現と比較する工程を包含する。発現の差異は、第１の個体が結腸直腸癌に関連する障害を有することを示す。
【００１５】
別の局面では、本発明は、表１または表２の核酸もしくはそのフラグメントによってコードされるタンパク質へ特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。抗体は本明細書中にさらに記載される単鎖抗体などの抗体のフラグメントでもよいし、別の分子に結合されてもよい。１つの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【００１６】
１つの実施形態では、結腸直腸癌調節タンパク質（結腸直腸癌モジュレータータンパク質）またはそのフラグメントと、上記結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントへ結合する抗体との結合を妨害することができる生物活性薬剤のスクリーニング方法が提供される。好ましい実施形態では、この方法は、結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントと、候補生物活性薬剤と、上記結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントへ結合する抗体とを組み合わせる工程を包含する。この方法はさらに、上記結腸直腸癌モジュレータータンパク質またはそのフラグメントと上記抗体との結合を決定する工程を包含する。結合の変化がある場合、薬剤は妨害剤であると同定される。妨害剤はアゴニストでもアンタゴニストでもよい。好ましくは、薬剤は結腸直腸癌を阻害する。
【００１７】
さらなる局面では、結腸直腸癌の阻害方法が提供される。この方法は個体に対してインビトロまたはインビボで実行することができ、好ましくはインビボで実行される。好ましい実施形態では、癌を有する個体に対して結腸直腸癌の阻害方法が提供される。本明細書に記載されるように、結腸直腸癌の阻害方法は、遺伝子またはその遺伝子産物に対するアンチセンス分子を含む、表１または表２の核酸によってコードされるタンパク質の活性のインヒビターを投与する工程によって実行することができる。
【００１８】
また、本明細書には、個体における免疫反応を誘発する方法も提供される。１つの実施形態では、本明細書で提供される方法は、結腸直腸癌調節タンパク質またはそのフラグメントを含む組成物を個体に投与する工程を包含する。別の実施形態では、タンパク質は表１または表２から選択される核酸によってコードされる。別の局面では、上記組成物は、結腸直腸癌調節タンパク質またはそのフラグメントをコードする配列を含む核酸を含む。
【００１９】
さらに、本明細書には、個体において免疫反応を誘発することができる組成物が提供される。１つの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、好ましくは表１または表２の核酸によってコードされる結腸直腸癌調節タンパク質またはそのフラグメントと、薬学的に許容可能なキャリヤとを含む。別の実施形態では、上記組成物は、好ましくは表１または表２の核酸から選択される結腸直腸癌調節タンパク質をコードする配列を含む核酸と、薬学的に許容可能なキャリヤとを含む。
【００２０】
また、結腸直腸癌タンパク質またはそのフラグメントの効果を中和する方法も提供され、この方法は、上記タンパク質に特異的な薬剤と上記タンパク質とを、中和をもたらすのに十分な量で接触させる工程を包含する。別の実施形態では、タンパク質は、表１または表２から選択される核酸によってコードされる。
【００２１】
本発明の別の局面では、結腸直腸癌に対して個体を処置する方法が提供される。１つの実施形態では、この方法は、結腸直腸癌調節タンパク質のインヒビターを上記個体に投与する工程を包含する。別の実施形態では、方法は、治療部分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）に結合された結腸直腸癌調節タンパク質に対する抗体を結腸直腸癌を有する患者に投与する工程を包含する。このような治療部分は、細胞傷害性薬剤でも放射性同位体でもよい。
【００２２】
また、化合物および組成物も提供される。本発明のその他の局面は、本発明の以下の記載によって当業者に明らかになる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、結腸直腸癌の診断および予後評価のための新規の方法、ならびに結腸直腸癌を調節する組成物のスクリーニング方法を提供する。本明細書中の方法は、米国特許出願第０９／５２５，９９３号および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０７０４４号の方法に関連し、これらはそれぞれ、本明細書にその全体が援用される。
【００２４】
本明細書中の「結腸直腸癌」とは、デュークス段階ＡもしくはＢと分類される結腸および／または直腸の腫瘍または癌、ならびにデュークス段階ＣもしくはＤと分類される転移性腫瘍を意味する（例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｌｏｎ，ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１１４４−１１９７（Ｄｅｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，５ｔｈ  ｅｄ．１９９７）が参照され、また、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．１２８９−１２９（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１２ｔｈ  ｅｄ．，１９９１）も参照される）。「結腸直腸癌の処置、モニタリング、検出または調節」には、結腸直腸疾患（デュークス段階Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ）を有する患者における結腸直腸疾患の処置、モニタリング、検出、または調節が含まれ、表１または表２の遺伝子からの遺伝子発現が増加または減少されると、その被験者は、表１または表２の遺伝子の遺伝子発現が増加または減少しない患者よりも、転移性疾患へ進行する可能性が高いことが示される。デュークス段階Ａでは、腫瘍は腸管壁内に浸透するが、貫通はしない。デュークス段階Ｂでは、腫瘍は腸管壁を貫通するが、まだリンパ関与は起こらない。デュークス段階Ｃでは、癌は局所リンパ節に関連している。デュークス段階Ｄでは、例えば肝臓、肺などの遠位の転移が起こる。
【００２５】
表１は、結腸直腸癌サンプルにおいて発現の増加を示す遺伝子のヌクレオチド配列のためのｕｎｉｇｅｎｅクラスタの識別番号を提供する。また表１は、ｕｎｉｇｅｎｅクラスタの一部であるヌクレオチド配列を提供するｅｘｅｍｐｌａｒ寄託番号も提供する。表２はＣＢＦ９遺伝子の核酸およびタンパク質配列、ならびにＣＢＦ９のＵｎｉｇｅｎｅおよびＥｘｅｍｐｌａｒ寄託番号を提供する。
【００２６】
１つの局面では、遺伝子の発現レベルは、診断情報または予後情報のいずれかを必要とする種々の患者サンプルにおいて決定されて、発現プロファイルを提供する。特定のサンプルの発現プロファイルは、本質的に、そのサンプルの状態の「フィンガープリント」であるが、同様に発現された任意の特定の遺伝子を２つの状態が有することもでき、多数の遺伝子を同時に評価すると、細胞の状態に対して独特である遺伝子発現プロファイルの作成が可能になる。すなわち、正常組織を結腸直腸癌組織と区別することができ、結腸直腸癌組織内において、種々の予後状態（例えば、長期生存予想が良好または不良）を決定することができる。既知の種々の状態における結腸組織の発現プロファイルを比較することによって、これらの状態のそれぞれにおいてどの遺伝子が重要であるかについての情報（遺伝子の上方制御および下方制御を含む）が得られる。結腸直腸癌と正常結腸組織とで差次的に発現される配列の同定、ならびに異なる予後結果をもたらす差次的発現によって、この情報を多数の方法で使用することができるようになる。例えば、特定の治療レジメンの評価を見積もることができ、特定の患者の長期間の予後を改良するために化学療法剤を作用させる。同様に、患者のサンプルを既知の発現プロファイルと比較することによって、診断を実行または確認することができる。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（または個々の遺伝子）によって、特定の発現プロファイルを模倣または変更することを目的とする薬物候補のスクリーニングが可能になる。例えば、結腸直腸癌発現プロファイルを抑制する、または悪い予後プロファイルをより良い予後プロファイルへ変換する薬物についてのスクリーニングを実行することができる。これは、重要な結腸直腸癌遺伝子のセットを含むバイオチップを作製することによって実行でき、このバイオチップは次にこれらのスクリーニングにおいて使用することができる。これらの方法はタンパク質ベースで実行することもできる。すなわち、診断目的および予後目的のために、あるいは候補薬剤をスクリーニングするために、結腸直腸癌タンパク質のタンパク質発現レベルを評価することができる。さらに、結腸直腸癌の核酸配列を遺伝子治療目的のために投与するか（アンチセンス核酸の投与を含む）か、あるいは結腸直腸癌タンパク質（その抗体および他のモジュレーターを含む）が治療薬物として投与される。
【００２７】
従って、本発明は、結腸直腸癌において差次的に発現される核酸配列およびタンパク質配列（本明細書では「結腸直腸癌配列」と称される）を提供する。以下に概説されるように、結腸直腸癌配列には、結腸直腸癌において上方制御される（すなわち、高レベルで発現される）配列、ならびに結腸直腸癌において下方制御される（すなわち、低レベルで発現される）配列が含まれる。好ましい実施形態では、結腸直腸癌配列はヒト由来であるが、当業者に理解されるように、他の生物体由来の結腸直腸癌配列が、疾患および薬物評価の動物モデルにおいて有用であり得、従って、齧歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを含む）を始めとする哺乳動物を含む脊椎動物から、他の結腸直腸癌配列が提供される。以下に概説される技法を用いて、他の生物体由来の結腸直腸癌配列を得ることができる。
【００２８】
結腸直腸癌配列は、核酸およびアミノ酸の両方の配列を含むことができる。好ましい実施形態では、結腸直腸癌配列は組換え核酸である。本明細書中の「組換え核酸」と言う用語は、一般的にはポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼによる核酸の操作によってもともとインビトロで形成され、天然には通常見られない形態の核酸を意味する。従って、直鎖型の単離された核酸、または通常は接合されないＤＮＡ分子と連結することによりインビトロで形成された発現ベクターはいずれも、本発明の目的においては組換え型であると考えられる。一旦組換え核酸が作製されて宿主細胞または生物体中に再導入されると、非組換え的に、すなわちインビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製することが理解される。しかしながら、このような核酸は、ひとたび組換え的に産生されると、次に非組換え的に複製されても、本発明の目的においては、やはり組換え型であると考えられる。
【００２９】
同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技法を用いて、すなわち上記のような組換え核酸の発現によって作製されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも１以上の特徴によって天然に存在するタンパク質とは区別される。例えば、タンパク質は、その野生型宿主において通常関連されるタンパク質および化合物のいくつかまたは全てから単離または精製され得、従って実質的に純粋であり得る。例えば、単離したタンパク質はその天然の状態で通常関連される物質の少なくともいくつかを伴わず、この物質は、好ましくは所与のサンプル中の全タンパク質の少なくとも約０．５重量％、さらに好ましくは少なくとも約５重量％を構成する。実質的に純粋なタンパク質は、全タンパク質の少なくとも約７５重量％を構成し、少なくとも約８０％が好ましく、少なくとも約９０％が特に好ましい。定義には、ある生物体からの結腸直腸癌タンパク質の、異なる生物体または宿主細胞における産生が含まれる。あるいは、タンパク質は、タンパク質が増大した濃度レベルで作製されるように誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターを使用して、通常見られるよりも有意に高い濃度で作製され得る。あるいは、タンパク質は、以下に記載されるように、エピトープタグの付加、またはアミノ酸の置換、挿入および欠失のように、天然には通常見られない形態でもよい。
【００３０】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌配列は核酸である。当業者に理解され、以下に更に詳細に概説されるように、結腸直腸癌配列は、天然に存在する核酸を検出する診断用途、ならびにスクリーニング用途を含む種々の用途において有用であり、例えば、結腸直腸癌配列に対する核酸プローブを含むバイオチップを作成することができる。次いで、もっとも広い意味では、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」もしくは文法的に等価な用語は、本明細書では、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般的にホスホジエステル結合を含むものであるが、以下に概説されるようにいくつかの場合には、例えば、ホスホルアミデート（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：  １９２５  （１９９３）およびその中の参考文献、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ，３５：３８００（１９７０）、Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）、Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）、およびＰａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）、および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホスホロアミダイト（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、ならびにペプチド核酸骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）および結合（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）、Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）、Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７（１９９６）を参照、これらの全ては参考として援用される）を含む代替骨格を有し得る核酸アナログが含まれる。その他のアナログ核酸には、正の骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７（１９９５）、非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号、Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕ��ｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７（１９９４）、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ３，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、  Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）、Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７（１９９４）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、ならびに非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されるものを含む）が含まれる。１以上の炭素環式の糖質を含有する核酸も、核酸の１つの定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９−１７６を参照）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎｅ  ２，１９９７  ｐａｇｅ３５に記載される。これらの参考文献は全て、本明細書中に明確に参考として援用される。リボース−リン酸骨格のこれらの改変は様々な理由で行われ、例えば、生理的環境において、またはバイオチップ上のプローブとして、このような分子の安定性および半減期を増大するために行われる。
当業者に理解されるように、これらの核酸アナログは全て、本発明における用途を見出すことができる。さらに、天然に存在する核酸およびアナログの混合物も作製でき、あるいは、異なる核酸アナログの混合物、および天然に存在する核酸およびアナログの混合物も作製することができる。
【００３１】
特に好ましいのは、ペプチド核酸アナログを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）である。これらの骨格は、天然に存在する核酸の高電荷ホスホジエステル骨格とは対照的に、中性条件下では実質的に非イオン性である。これは２つの利点をもたらす。第１に、ＰＮＡ骨格はハイブリダイゼーション速度論の改良を示す。ＰＮＡは、完全にマッチした塩基対に対して、ミスマッチの塩基対の融解温度（Ｔｍ）の変化がより大きい。ＤＮＡおよびＲＮＡは、内部ミスマッチでは典型的にＴｍの２〜４℃の降下を示す。非イオン性のＰＮＡ骨格では、降下は７〜９℃に近づく。同様に、その非イオン性の性質のために、これらの骨格へ付着した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に比較的影響されない。さらに、ＰＮＡは細胞酵素により分解されず、従って、より安定であり得る。
【００３２】
核酸は指定されるように一本鎖でも二本鎖でもよく、あるいは、二本鎖または一本鎖配列の両方の部分を含むこともできる。当業者に理解されるように、一方の鎖（「ワトソン」）の描写は、他方の鎖（「クリック」）の配列も定義し、従って、本明細書に記載される配列は配列の相補体も含む。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく、ここで核酸は、デオキシリボヌクレオチド、およびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを包含する。本明細書中で用いられる場合、「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドならびにヌクレオチドアナログと、アミノ改変ヌクレオシドなどの改変ヌクレオシドとを含む。さらに、「ヌクレオシド」は、天然に存在しないアナログ構造を含む。従って、例えば、それぞれが塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、本明細書ではヌクレオシドと称される。
【００３３】
結腸直腸癌配列は、本明細書中で概説される結腸直腸癌配列への核酸および／またはアミノ酸配列の実質的な相同性によって、最初に同定することができる。このような相同性は全体的な核酸またはアミノ酸配列に基づくことができ、一般的に、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション条件のいずれかを用いて、以下に概説されるように決定される。
【００３４】
ｍＲＮＡの単離は、細胞を崩壊させて分画遠心分離法を実行することによって全細胞ＲＮＡを単離することを含む。一旦全ＲＮＡが単離されると、実質的に全ての真核生物のｍＲＮＡ分子のその３’末端に見られるポリ（Ａ）テールとして当業者に公知のアデニンヌクレオチド残基を使用することによって、ｍＲＮＡが単離される。デオキシチミジンだけから構成されるオリゴヌクレオチド［ｏｌｇｏ（ｄＴ）］をセルロースへ連結させ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−セルロースを小型カラム内に充填する。全細胞ＲＮＡの調製物をこのようなカラムに通過させると、ｍＲＮＡ分子はポリ（Ａ）テールによってｏｌｉｇｏ（ｄＴ）に結合するが、残りのＲＮＡはカラムから流出する。次いで、結合したｍＲＮＡをカラムから溶出させて回収する。
【００３５】
本発明の結腸直腸癌配列は次のように同定することができる。核酸プローブを含むバイオチップに、正常および腫瘍組織のサンプルを適用させる。適用できれば、サンプルはまず顕微解剖され、ｍＲＮＡの調製のために上記のように処理される。適切なバイオチップは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販されている。本明細書に記載される遺伝子発現プロファイルが作製され、データが分析される。
【００３６】
好ましい実施形態では、正常状態と疾患状態の間のように発現の変化を示す遺伝子は、肺、心臓、脳、肝臓、胸部、腎臓、筋肉、前立腺、小腸、大腸、脾臓、骨および胎盤を含む（しかし、これらに限定されない）他の正常組織で発現される遺伝子と比較される。好ましい実施形態では、他の組織においてかなりの量で発現される、結腸直腸癌スクリーニング中に同定された遺伝子は、プロファイルから除去されるが、いくつかの実施形態では、これは必要ではない。すなわち、薬物をスクリーニングする際、起こりうる副作用を最小限にするために、標的が疾患特異性であることが好ましい。
【００３７】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌配列は、結腸直腸癌において上方制御されるものである。すなわち、これらの遺伝子の発現は、正常な結腸組織と比較して、結腸直腸癌ではより高い。本明細書で使用される「上方制御」は、少なくとも約１．１倍の変化、好ましくは１．５または２倍の変化、好ましくは少なくとも約３倍の変化を意味し、少なくとも約５倍以上の変化が好ましい。本明細書中の全ての寄託番号はＧｅｎＢａｎｋの配列データベースのためであり、寄託番号の配列は参照によって本明細書中に明確に援用される。ＧｅｎＢａｎｋは当該技術分野において知られており、例えば、Ｂｅｎｓｏｎ，ＤＡら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：１−７（１９９８）およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい。さらに、これらの遺伝子は、心臓、脳、肺、肝臓、胸部、腎臓、前立腺、小腸および脾臓では、限られた量で発現されるか、あるいは全く発現されないことが分かった。
【００３８】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌配列は、結腸直腸癌において下方制御されるものである。すなわち、これらの遺伝子の発現は、正常な結腸組織と比較して結腸直腸癌ではより低い。本明細書で使用される「下方制御」は、少なくとも約２倍の変化、好ましくは少なくとも約３倍の変化を意味し、少なくとも約５倍以上の変化が好ましい。
【００３９】
本発明の結腸直腸癌タンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質として分類することができる。好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は細胞内タンパク質である。細胞内タンパク質は、細胞質および／または核中に見出すことができる。細胞内タンパク質は、細胞の機能および複製（例えば、シグナル伝達経路を含む）の全ての局面に関与し、このようなタンパク質の異常な発現は、無調節または無制御の細胞プロセスをもたらす。例えば、多くの細胞内タンパク質は、タンパク質キナーゼ活性、タンパク質ホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、およびポリメラーゼ活性などの酵素活性を有する。また細胞内タンパク質は、タンパク質の複合体を組織化するのに関与するドッキングタンパク質、あるいは種々の細胞下の局在化（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）に対する標的タンパク質としても働き、細胞小器官の構造完全性を保持するのに関与する。
【００４０】
細胞内タンパク質の特徴付けにおいて理解が高まっている概念は、定義された機能が帰属すると考えられている１つまたは複数のモチーフがタンパク質中に存在することである。タンパク質の酵素領域に見られる高保存配列に加えて、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質においても高保存配列が同定されている。例えば、Ｓｒｃ−相同性−２（ＳＨ２）ドメインは、チロシン−リン酸化標的と配列に依存して結合する。ＳＨ２ドメインと区別することができるＰＴＢドメインも、チロシンリン酸化標的に結合する。ＳＨ３ドメインはプロリンリッチ標的に結合する。さらに、数例だけを挙げると、ＰＨドメイン、テトラトリコペプチド反復、およびＷＤドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することが分かっている。またこれらのうちのいくつかは、リン脂質または他の第二メッセンジャーへの結合にも関与することができる。当業者には理解されるように、これらのモチーフは一次配列に基づいて同定することができ、したがって、タンパク質の配列の分析は、タンパク質が関連し得る分子（単数および／または複数）の両方の酵素の可能性の洞察を提供することができる。
【００４１】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌配列は膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質は、細胞のリン脂質二重層にまたがる分子である。これらは、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、またはその両方を有することができる。このようなタンパク質の細胞内ドメインは、細胞内タンパク質について既に記載したものを含む多数の機能を有することができる。例えば、細胞内ドメインは酵素活性を有し、かつ／またはさらなるタンパク質のための結合部位として機能することができる。膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは両方の役割を果たすことが多い。例えば特定の受容体チロシンキナーゼは、タンパク質キナーゼ活性およびＳＨ２ドメインの両方を有する。さらに、受容体分子自体におけるチロシンの自己リン酸化は、さらなるＳＨ２ドメイン含有タンパク質のための結合部位を形成する。
【００４２】
膜貫通タンパク質は、１個〜多数の膜貫通ドメインを含むことができる。例えば、受容体チロシンキナーゼ、特定のサイトカイン受容体、受容体グアニリルシクラーゼ、および受容体セリン／トレオニンタンパク質キナーゼは、単一の膜貫通ドメインを含有する。しかしながら、チャネルおよびアデニリルシクラーゼを含む種々の他のタンパク質は、多数の膜貫通ドメインを含有する。多くの重要な細胞表面受容体は、７個の膜貫通領域を含有するので、「７回膜貫通ドメイン」タンパク質と分類される。重要な膜貫通タンパク質受容体には、インシュリン受容体、インシュリン様成長因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、グルコース輸送体、トランスフェリン受容体、上皮成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体、上皮成長因子受容体、レプチン受容体、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−２受容体）などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
膜貫通ドメインの特徴は約２０個の連続した疎水性アミノ酸を含み、その後に、荷電アミノ酸が続くことができる。したがって、特定のタンパク質のアミノ酸配列の分析において、タンパク質内の膜貫通ドメインの局在性および数が予測することができる。
【００４４】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインはさまざまであるが、保存モチーフは、種々の細胞外ドメインの間に繰り返し見られる。保存構造および／または機能の原因は、異なる細胞外モチーフにあるとされている。例えば、サイトカイン受容体は、システインのクラスタおよびＷＳＸＷＳ（Ｗ＝トリプトファン、Ｓ＝セリン、Ｘ＝任意のアミノ酸）モチーフによって特徴付けられる。免疫グロブリン様ドメインは保存性が高い。ムチン様ドメインは細胞接着に関与でき、ロイシンリッチ反復はタンパク質−タンパク質相互作用に関係する。
【００４５】
多くの細胞外ドメインは他の分子との結合に関与する。１つの局面では、細胞外ドメインは受容体である。受容体ドメインと結合する因子は循環リガンドを含み、これはペプチド、タンパク質、またはアデノシンなどの小分子でよい。例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦなどの成長因子は、種々の細胞応答を開始させるためにその同族受容体に結合する循環成長因子である。その他の因子には、サイトカイン、分裂促進因子、および神経栄養性因子などがある。また、細胞外ドメインは細胞関連分子に結合する。この点では、これらは細胞−細胞相互作用を媒介する。細胞関連リガンドは、例えばグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞へ拘束されてもよいし、それ自体が膜貫通タンパク質であってもよい。また、細胞外ドメインは細胞外行列と関連し、細胞構造の維持に寄与する。
【００４６】
膜貫通性の結腸直腸癌タンパク質は、本明細書に記載されるように免疫治療のための優れた標的なので、本発明において特に好ましい。さらに、以下に概説されるように、膜貫通タンパク質はイメージング様式においても有用であり得る。
【００４７】
当業者には理解されるように、膜貫通タンパク質は、例えば組換え法で膜貫通配列を除去することによって可溶性にすることもできる。さらに、可溶性にされた膜貫通タンパク質は、適切なシグナル配列を付加することによって、組換え手段により、分泌されるようにすることができる。
【００４８】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は分泌タンパク質であり、その分泌は構成的であっても、調節されてもよい。これらのタンパク質は、分泌経路への分子を標的とするシグナルペプチドまたはシグナル配列を有する。分泌タンパク質は多数の生理的現象に関与し、その循環的な性質によって、種々の他の細胞型へシグナルを伝達する働きをする。分泌タンパク質は、自己分泌的（因子を分泌した細胞に作用する）、パラ分泌的（因子を分泌した細胞に極めて近接する細胞に作用する）、または内分泌的（少し離れた細胞に作用する）に機能することができる。したがって、分泌分子は、多数の生理学的局面の調節または変更において用途を見出される。分泌タンパク質である結腸直腸癌タンパク質は、例えば血液検査などの診断マーカー用の優れた標的として働くので、本発明において特に好ましい。
【００４９】
結腸直腸癌配列は、本明細書中に概説される結腸直腸癌配列への核酸および／またはアミノ酸配列の実質的な相同性によって、最初に同定される。このような相同性は全体的な核酸またはアミノ酸配列に基づくことができ、一般的に、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション条件を用いて、以下に概説されるように決定される。
【００５０】
本明細書における使用では、「結腸直腸癌核酸」、「結腸直腸癌タンパク質」、または「結腸直腸癌ポリヌクレオチド」、もしくは「結腸直腸癌関連転写物」という用語は、核酸およびポリペプチド多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間相同体を示し、これらは、（１）表１または表２のｕｎｉｇｅｎｅクラスタの、またはそれに関連する、ヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチドの領域上の領域にわたって、約６０％よりも大きいヌクレオチド配列の同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％もしくはそれ以上のヌクレオチド配列の同一性を持ったヌクレオチド配列を有するか、（２）表１または表２のｕｎｉｇｅｎｅクラスタのヌクレオチド配列、またはそれに関連するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、および保存的に修飾されたその変異体を含む免疫原に対して産生された抗体（例えば、ポリクローナル抗体）へ結合するか、（３）表１または表２の核酸配列またはその相補体、および保存的に修飾されたその変異体に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイゼーションするか、あるいは（４）表１または表２のｕｎｉｇｅｎｅクラスタの、またはそれに関連する、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上のアミノ酸の領域上の領域にわたって、約６０％よりも大きいアミノ酸配列の同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％もしくはそれ以上のアミノ酸配列の同一性を持ったアミノ酸配列を有する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は通常哺乳動物からのものであり、例えばヒトなどの霊長類、例えばラット、マウス、ハムスターなどの齧歯類、雌ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。「結腸直腸癌ポリペプチド」および「結腸直腸癌ポリヌクレオチド」には、天然に存在するかまたは組換えの両方が含まれる。
【００５１】
この状況における相同性は配列の類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。相同性のために好ましい比較は、配列決定の誤りを有する配列を正しい配列と比較することである。この相同性は当該技術分野で既知の標準技法を用いて決定することができ、これらの技法としては、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによるもの、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によるもの、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によるもの（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、好ましくはデフォルト設定を用いたＤｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）によって記載されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、あるいは検査によるものなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
好ましい実施形態では、配列の同一性または類似性を決定するために使用される配列は、表１または表２に列挙される配列から選択される。１つの実施形態では、本明細書で利用される配列は、表１または表２に示されるものである。別の実施形態では、配列は、表１または表２に示される配列の天然に存在する対立遺伝子の変異体である。別の実施形態では、配列は本明細書にさらに記載される配列変異体である。
【００５３】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して、「同一の」または％「同一性」という用語は、以下に記載されるデフォルトパラメータによるか、または手動アラインメントおよび目視検査により、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定される場合に、同一であるか、あるいは同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大に対応するように比較および整列させた場合に、特定の領域にわたって、約６０％同一性、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列を示す（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照）。続いて、このような配列は、「実質的に同一である」と言われる。この定義は試験配列の相補体にも当てはまり、あるいはそれに適用することができる。またこの定義には、欠失および／または付加を有する配列、および置換を有する配列、ならびに天然に存在する、例えば多型または対立遺伝子変異体、および人工の変異体が含まれる。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明することができる。好ましくは、少なくとも約２５個のアミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、さらに好ましくは５０〜１００個のアミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、同一性が存在する。
【００５４】
配列比較では、通常１つの配列がリファレンス配列の機能を果たし、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験およびリファレンス配列がコンピュータへ入力され、必要であれば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用でき、あるいは代替パラメータを指定することができる。配列比較アルゴリズムは、次に、プログラムパラメータに基づいて、リファレンス配列に対する試験配列の％配列同一性を計算する。
【００５５】
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、通常２０個〜６００個、通常は約５０個〜約２００個、さらに通常は約１００個〜約１５０個からなる群から選択される連続位置数のうちの１つのセグメントへの参照を含み、２つの配列が最適に整列されたあと、同じ連続位置数のリファレンス配列と配列を比較することができる。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年補遺）を参照）によって実施することができる。
【００５６】
％配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの好ましい実施例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明の核酸およびタンパク質の％配列同一性を決定するために、本明細書に記載されるパラメータと共に使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって公的に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、まず、データベース配列において同じ長さのワードで整列された場合に、クエリー配列において、いくらか正の値のしきい値スコアＴと一致または満足させる長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近接ワードのスコアしきい値と称される（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌら）。これらの最初の近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するための種の役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大される限りは、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（一対のマッチ残基のための報酬スコア、常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア、常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列では、スコアリング行列を用いて累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ低下した場合、１つまたは複数の負得点の残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ以下になった場合、あるいは配列のどちらかの末端に到達した場合に、各方向のワードヒットの延長は中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【００５７】
またＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の類似性の統計的分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こり得る確率の表示を提供する。例えば、試験核酸とリファレンス核酸の比較における最小合計確率が約０．２よりも小さい、さらに好ましくは約０．０１よりも小さい、最も好ましくは約０．００１よりも小さい場合に、核酸はリファレンス配列に類似すると考えられる。対数値は、大きい負の数、例えば、５、１０、２０、３０、４０、４０、７０、９０、１１０、１５０、１７０などでもよい。
【００５８】
１つの実施形態では、核酸の相同性は、ハイブリダイゼーション研究によって決定される。したがって、例えば、表１または表２に特定されるペプチドまたはその相補体をコードする核酸配列と高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする核酸は、結腸直腸癌配列と考えられる。高ストリンジェンシー条件は当該技術分野で知られている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９およびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編が参照され、これらは両方とも参照によって本明細書中に援用される。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境では異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３）に見られる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨにおいて特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡において標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下の）である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡において占有されるため）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、通常、ｐＨ７．０〜８．３において約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば１０〜５０個のヌクレオチド）では温度が少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０個のヌクレオチドよりも大きい）では少なくとも約６０℃であるような条件であろう。またストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定剤の添加により達成することもできる。
【００５９】
別の実施形態では、よりストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件が使用され、例えば、当該技術分野で知られるように、ストリンジェンシーが中程度または低い条件を使用することができる。Ｍａｎｉａｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）およびＴｉｊｓｓｅｎ（上記）が参照される。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、正のシグナルは少なくともバックグラウンドの２倍であり、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。典型的なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は次のとおりでよい。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃においてインキュベート、あるいは、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。
【００６０】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードにより許可される最大コドン縮重度を用いて作製される場合に発生する。このような場合には、核酸は通常、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。典型的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、４０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中３７℃におけるハイブリダイゼーションおよび４５℃で１×ＳＳＣにおける洗浄が含まれる。正のハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。同様のストリンジェンシーの条件を提供するために代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用することができることは、当業者によって容易に認識されるであろう。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなる指針は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編などの多数の参考文献で提供される。
【００６１】
ＰＣＲでは、低ストリンジェンシーの増幅のためには約３６℃の温度が典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依存して、約３２℃と４８℃の間で変動することができる。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅では、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して、約５０℃から約６５℃の範囲でよい。高および低ストリンジェンシーの両方の増幅のための典型的なサイクル条件には、９０℃〜９５℃で３０秒〜２分間の変性段階、３０秒〜２分間継続するアニーリング段階、および約７２℃で１〜２分間の伸長段階が含まれる。高および低ストリンジェンシー増幅反応のためのプロトコルおよび指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９０）で提供される。
【００６２】
さらに、本発明の結腸直腸癌の核酸配列はより大きい遺伝子のフラグメントであり、すなわち、それらは核酸セグメントである。この場合の「遺伝子」には、コード領域、非コード領域、およびコードおよび非コード領域の混合物が含まれる。したがって、当業者には理解されるように、より長い配列または完全長の配列をクローニングするために当該技術分野でよく知られている技法を使用して、本明細書に提供される配列を用いて結腸直腸癌遺伝子のさらなる配列を得ることができる。ＭａｎｉａｔｉｓらおよびＡｕｓｕｂｅｌら（上記）（参照によって本明細書中に明確に援用される）を参照されたい。
【００６３】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという表示は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であることを示す。したがって、ポリペプチドは一般的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の表示は、上述のように２つの分子またはその相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の表示は、配列を増幅するために同一のプライマーを使用することができることを示す。
【００６４】
結腸直腸癌核酸がいったん同定されれば、必要な場合にはクローニングすることができ、その成分は結腸直腸癌核酸全体を形成するために再結合される。いったんその自然源（例えば、プラスミドまたは他のベクター内に含まれる）から単離されたら、あるいは線状核酸セグメントとしてそこから切除されたら、組換え結腸直腸癌核酸は、他の結腸直腸癌核酸、例えばさらなるコード領域を同定および単離するために、プローブとしてさらに使用することができる。また、修飾または変異結腸直腸癌核酸およびタンパク質を作製するために、「前駆体」核酸としても使用することができる。
【００６５】
本発明の結腸直腸癌核酸はいくつかの方法で使用される。第１の実施形態では、結腸直腸癌核酸への核酸プローブが作製され、バイオチップへ取り付けられて、以下に概説されるスクリーニングおよび診断方法において使用されるか、または、例えば遺伝子治療および／またはアンチセンス用途に関する投与のために使用される。あるいは、結腸直腸癌タンパク質のコード領域を含む結腸直腸癌核酸は、結腸直腸癌タンパク質の発現のために発現ベクター内に配置することができる（この場合も、スクリーニングのため、あるいは患者への投与のため）。
【００６６】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌核酸（表１または表２に概説されるペプチドおよび／またはその相補体をコードする両核酸配列）への核酸プローブが作製される。バイオチップに取り付けられた核酸プローブは、結腸直腸癌核酸、すなわち標的配列（サンプルの標的配列、または、例えばサンドイッチアッセイにおいては、他のプローブ配列）に対して実質的に相補的であるように設計されるので、標的配列と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが生じる。以下に概説されるように、この相補性は完全である必要はなく、標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨害することになる任意の数の塩基対ミスマッチがあってもよい。しかしながら、突然変異の数が非常に大きくて、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが最低であってもハイブリダイゼーションが発生できない場合には、配列は相補的な標的配列ではない。したがって、本明細書中の「実質的に相補的」とは、本明細書に概説されるように通常の反応条件（特に、高ストリンジェンシー条件）下でハイブリダイズするために、プローブが標的配列と十分に相補的であることを意味する。
【００６７】
核酸プローブは一般的に一本鎖であるが、一部が一本鎖で、一部が二本鎖でもよい。プローブの鎖の状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は、標的配列の構造、組成および特性によって決定される。一般に、核酸プローブの範囲は約８個〜約１００個の塩基の長さであり、約１０個〜約８０個の塩基が好ましく、約３０個〜約５０個の塩基が特に好ましい。すなわち、一般的に遺伝子全体は使用されない。いくつかの実施形態では、最大数百の塩基までの、非常に長い核酸を使用することができる。
【００６８】
好ましい実施形態では、１つの配列につき２つ以上のプローブが使用され、重なり合うプローブか、または標的の異なる部分に対するプローブが使用される。すなわち、特定の標的に対して重複して構築するために、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のプローブ（３つが好ましい）を使用する。プローブは重なり合う（すなわち、いくつかの共通の配列を有する）こともできるし、離れていてもよい。
【００６９】
当業者には理解されるように、核酸は、種々の方法で固体支持体に付着または固定化される。本明細書中の「固定化」および文法的に等価な用語は、核酸プローブと固体支持体との間の会合または結合が、以下に概説される結合、洗浄、分析、および除去の条件下で十分に安定であることを意味する。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。本明細書中の「非共有結合」および文法的に等価な用語は、静電的、親水性、および疎水性相互作用のいずれか１つまたは複数を意味する。非共有結合には、ストレプトアビジンなどの分子の支持体への共有結合、およびストレプトアビジンへのビオチン化プローブの非共有結合が含まれる。本明細書中の「共有結合」および文法的に等価な用語は、２つの部分、固体支持体およびプローブが、シグマ結合、π結合、および配位結合を含む少なくとも１つの結合によって付着されることを意味する。共有結合はプローブと固体支持体の間に直接形成されてもよいし、架橋剤によって、あるいは固体支持体またはプローブのどちらか、もしくは両方の分子上の特定の反応基の包含によって形成されてもよい。また固定化は、共有結合および非共有結合的な相互作用の組み合わせを含むこともできる。
【００７０】
一般的に、当業者には理解されるように、プローブは各種の方法でバイオチップに付着される。本明細書に記載されるように、核酸は初めに合成されて、次にバイオチップに付着されてもよいし、バイオチップ上で直接合成されてもよい。
【００７１】
バイオチップは、安定な固体基材を含む。本明細書中の「基材」または「固体支持体」または他の文法的に等価な用語は、核酸プローブの付着または会合に適切な離れた個々の部位を含有するように修飾可能であり、かつ少なくとも１つの検出方法を施すことができる任意の材料を意味する。当業者には理解されるように、可能性のある基材の数は非常に多く、ガラス、変性または機能性ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊなどを含む）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリカベースの材料（ケイ素および変性ケイ素を含む）、炭素、金属、無機ガラス、プラスチックなどが含まれるが、これらに限定されない。一般に、基材は、光学的検出を可能にし、感知することができるほどの蛍光を発しない。好ましい基材は、「Ｒｅｕｓａｂｌｅ  Ｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｉｐ」という表題の係属中の出願（米国特許出願第０９／２７０，２１４号、１９９９年３月１５日出願）に記載されており、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００７２】
一般に、基材は平面であるが、当業者には理解されるように、他の形状の基材も同様に使用することができる。例えば、プローブは、サンプル体積を最小限にするために、流動サンプル分析では、管の内部表面に配置されてもよい。同様に、基材は、特定のプラスチックで製造された独立気泡を含む軟性発泡体のように、柔軟性でもよい。
【００７３】
好ましい実施形態では、バイオチップおよびプローブの表面は、次にこの２つを付着させるために化学官能基で誘導体化してもよい。したがって、例えば、バイオチップは、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基およびチオール基を含むが、これらに限定されない化学官能基、特に好ましくはアミノ基で誘導体化される。これらの官能基を使用して、プローブ上の官能基を用いてプローブを付着することができる。例えば、アミノ基を含有する核酸は、例えば既知のホモまたはヘテロ二官能性リンカーなどの、例えば当該技術分野で公知のようなリンカーを用いて、アミノ基を含む表面へ付着することができる（１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｃａｔａｌｏｇ，  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，  ｐａｇｅｓ  １５５−２００を参照のこと、本明細書中で参考として援用される）。さらに、場合によっては、アルキル基（置換およびヘテロアルキル基を含む）などのさらなるリンカーを使用することができる。
【００７４】
この実施形態では、オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知のように合成され、次に、固体支持体表面に付着される。当業者に理解されるように、５’または３’末端のいずれかを固体支持体に付着することができる。あるいは、付着は内部ヌクレオシドを介して行われてもよい。
【００７５】
さらなる実施形態では、固体支持体への固定化は非常に強力であるが、非共有結合である。例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドが作製され、ストレプトアビジンで共有結合的に被覆された表面へ結合して、付着をもたらすことができる。
【００７６】
あるいは、オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知のように、表面で合成することができる。例えば、光重合化合物および技法を利用する光活性化技法が使用される。好ましい実施形態では、国際公開第９５／２５１１６号、国際公開第９５／３５５０５号、米国特許第５，７００，６３７号、および同第５，４４５，９３４号、ならびにこれらに引用された参考文献（これらは全て、参照によって明確に援用される）に記載されるように、公知のフォトリソグラフィ技法を用いて核酸をインサイチュで合成でき、これらの付着方法はＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭテクノロジーの基礎を成す。
【００７７】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質をコードする結腸直腸癌核酸は、種々の発現ベクターを作製して、結腸直腸癌タンパク質を発現させるために使用され、これは、次に、以下に記載されるようにスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターか、あるいは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであってもよい。一般的に、これらの発現ベクターには、結腸直腸癌タンパク質をコードする核酸へ作動可能に連結された転写および翻訳調節核酸が含まれる。「制御配列」という用語は、特定の宿主生物体において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を示す。原核生物に適する制御配列は、例えば、プロモーターと、任意のオペレータ配列と、リボソーム結合部位とを含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００７８】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されると、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されれば、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される。プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるならば、コード配列へ作動可能に連結される。あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されれば、コード配列へ作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には、近接しており、かつ読み取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接していなくてもよい。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、従来の実施にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーが使用される。転写および翻訳調節核酸は、一般的に、結腸直腸癌タンパク質を発現するために使用される宿主細胞に適するであろう。例えば、バシラス属からの転写および翻訳調節核酸配列は、好ましくは、バシラス属において結腸直腸癌タンパク質を発現するために使用される。種々の宿主細胞に対して、多数の型の適切な発現ベクターおよび適切な制御配列が当該技術分野で公知である。
【００７９】
一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、調節配列は、プロモーターならびに転写開始および停止配列を含む。
【００８０】
プロモーター配列は構成的または誘導性のプロモーターをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターでも、ハイブリッドプロモーターでもよい。また、２つ以上のプロモーターのエレメントと結合するハイブリッドプロモーターも当該技術分野で公知であり、本発明において有用である。
【００８１】
さらに、発現ベクターはさらなるエレメントを含むことができる。例えば、発現ベクターは２つの複製系を有することができ、したがって、２つの生物体において、例えば、発現のための哺乳動物または昆虫細胞、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において、維持されることが可能になる。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同性の少なくとも１つの配列を含み、好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組込みベクターは、ベクター中の含有に関して適切な相同配列を選択することによって、宿主細胞において特定の位置へ誘導される。ベクターを組み込むための構築物は当該技術分野で周知である。
【００８２】
さらに、好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含有する。選択遺伝子は当該技術分野で周知であり、使用される宿主細胞により変化する。
【００８３】
本発明の結腸直腸癌タンパク質は、結腸直腸癌タンパク質の発現を誘発または発生させるのに適切な条件下で、結腸直腸癌タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって産生される。結腸直腸癌タンパク質発現に適切な条件は発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変化し、日常的な実験により当業者により容易に解明されるであろう。例えば、発現ベクター中の構成的プロモーターの使用は宿主細胞の成長および増殖を最適化することを必要とするが、誘導性プロモーターの使用は誘導のために適切な成長条件を必要とするであろう。さらに、ある実施形態では、回収のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウィルス系は溶解性ウィルスであり、したがって、回収時間の選択は産物の収率のために重要であろう。
【００８４】
適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、古細菌、真菌、ならびに昆虫および動物細胞（哺乳動物細胞を含む）が挙げられる。特に重要なのは、ショウジョウバエ  メランガスタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ）細胞、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母、大腸菌、枯草菌、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、パンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ１細胞株（マクロファージ細胞株）、ならびにヒト細胞および細胞株である。
【００８５】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は哺乳動物細胞内で発現される。哺乳動物の発現系も当該技術分野において公知であり、レトロウィルス系を含む。好ましい発現ベクター系は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９号およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８号（両方とも、本明細書中で参考として援用される。）に概略的に記載されるような、レトロウィルスベクター系である。ウィルス遺伝子は高レベルで発現されることが多く、幅広い宿主範囲を有するので、哺乳動物プロモーターとして特に有用なのは、哺乳動物ウィルス遺伝子からのプロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウィルスＬＴＲプロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、単純ヘルペスウィルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーターが挙げられる。通常、哺乳動物細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンに対して３’に配置された調節領域であり、したがって、プロモーターエレメントとともに、コード配列に隣接する。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０に由来するものがある。
【００８６】
哺乳動物宿主および他の宿主に外来性の核酸を導入する方法は当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞により変化するであろう。技法には、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウィルス感染、リポソームにおけるポリヌクレオチド（単数または複数）の封入、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが含まれる。
【００８７】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は細菌系において発現される。細菌発現系は当該技術分野において周知である。バクテリオファージ由来のプロモーターも使用でき、当該技術分野で公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターも有用であり、例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼと結合して転写を開始させる能力を有する、非細菌性起源の天然に存在するプロモーターを含むことができる。機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が望ましい。また発現ベクターは、細菌中で結腸直腸癌タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列を含むことができる。タンパク質は成長培地（グラム陽性菌）内か、あるいは細胞の内膜および外膜の間に配置される細胞膜周辺腔（グラム陰性菌）内へ分泌される。また細菌発現ベクターは、形質転換された細菌株の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含むことができる。適切な選択遺伝子には、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンなどの薬物に対して、細菌を耐性にする遺伝子が含まれる。また選択マーカーは、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるように、生合成遺伝子を含むことができる。これらの成分は発現ベクター内に構築される。細菌のための発現ベクターは当該技術分野において周知であり、中でも、枯草菌、大腸菌、ストレプトコッカス  クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、およびストレプトコッカス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）のためのベクターを含む。細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理やエレクトロポレーションなどの当該技術分野で周知の技法を用いて、細菌宿主細胞内へ形質転換される。
【００８８】
１つの実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は、昆虫細胞内で産生される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、特に、バキュロウィルスベースの発現ベクターは、当該技術分野で周知である。
【００８９】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は、酵母細胞内で産生される。酵母発現系は当該技術分野で周知であり、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＣ．マルトーサ（Ｃ．  ｍａｌｔｏｓａ）、ハンゼヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス  フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびＫ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）、ピシア  ギレリモンディイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス  ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ならびにヤロウィア  リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための発現ベクターが含まれる。
【００９０】
また結腸直腸癌タンパク質は、当該技術分野で公知の技法を用いて、融合タンパク質として製造することもできる。したがって、例えば、モノクローナル抗体の形成では、所望のエピトープが小さい場合、結腸直腸癌タンパク質は、免疫原を形成するために担体タンパク質へ融合されてもよい。あるいは、結腸直腸癌タンパク質は、発現を増大させるため、または他の理由のために、融合タンパク質として製造されてもよい。例えば、結腸直腸癌タンパク質が結腸直腸癌ペプチドである場合、ペプチドをコードする核酸は、発現のために他の核酸へ連結されてもよい。
【００９１】
１つの実施形態では、本発明の結腸直腸癌核酸、タンパク質および抗体は標識される。本明細書中の「標識」とは、化合物が、化合物の検出を可能にするために付着された少なくとも１つの元素、同位体または化学的化合物を有することを意味する。一般に、標識は、ａ）放射性同位体または重同位体などである同位体標識と、ｂ）抗体または抗原などである免疫標識と、ｃ）着色色素または蛍光色素との３つの種類に分類される。標識は、結腸直腸癌核酸、タンパク質および抗体内に任意の位置で組み込むことができる。例えば、標識は、検出可能なシグナルを直接または間接的に生成できなければならない。検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光または化学発光化合物、もしくはアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはホースラディシュペルオキシダーゼなどの酵素であってもよい。Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １４４：９４５  （１９６２）、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３：１０１４  （１９７４）、Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  ４０：２１９  （１９８１）、およびＮｙｇｒｅｎ，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，  ３０：４０７  （１９８２）によって記載される方法を含め、抗体を標識に結合するために当該技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。
【００９２】
したがって、本明細書は結腸直腸癌タンパク質配列も提供する。本発明の結腸直腸癌タンパク質は、いくつかの方法で同定することができる。この意味での「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドという用語を含み、アミノ酸残基のポリマーを示すために、本明細書では交換可能に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応の天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、修飾残基を含有するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００９３】
当業者には理解されるように、本発明の核酸配列は、タンパク質配列を生成するために使用することができる。これを行うためには種々の方法があり、遺伝子全体をクローニングして、そのフレームおよびアミノ酸配列を確認することが含まれる。あるいは、これを公知の配列と比較して、使用中のデータベース中のあるタンパク質に対して結腸直腸癌タンパク質が相同性を有すると仮定して、フレームを提供するために相同性について検索する。一般的に、核酸配列は、相同性について３つ全てのフレームを検索することができるプログラムに入力される。これは、好ましい実施形態では、以下のＮＣＢＩ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴパラメータを用いて実行される。プログラムはｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓｔｎである。データベースはｎｒである。入力データは「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ＦＡＳＴＡ  ｆｏｒｍａｔ」とされる。生物体リストは「ｎｏｎｅ」である。「ｅｘｐｅｃｔ」は１０、フィルタはデフォルトである。「ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ」は５００、「ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」は５００、「ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｖｉｅｗ」はペア（ｐａｉｒｗｉｓｅ）である。「Ｑｕｅｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅｓ」は標準（１）である。行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ存在コスト（ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｃｏｓｔ）は１１、残基あたりのギャップコスト（ｐｅｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔ）は１、ラムダ比は０．８５デフォルトである。この結果、推定のタンパク質配列の生成が得られる。
【００９４】
また、結腸直腸癌タンパク質の１つの実施形態には、本明細書中で決定されるように、天然に存在する配列のアミノ酸変異体も含まれる。好ましくは、変異体は、野生型配列に対する相同性が好ましくは約７５％より高く、さらに好ましくは約８０％より高く、さらにより好ましくは約８５％よりも高く、最も好ましくは９０％よりも高い。ある実施形態では、相同性は約９３〜９５または９８％ほど高い。核酸に関しては、この場合の相同性は、配列の類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。この相同性は、核酸相同性について上記で概説したように当該技術分野で公知の標準技法を用いて決定され得る。
【００９５】
本発明の結腸直腸癌タンパク質は、野生型アミノ酸配列よりも短くても長くてもよい。したがって、好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質の定義には、本明細書では、野生型配列の一部またはフラグメントが含まれる。さらに、上記に概説されるように、本発明の結腸直腸癌核酸は、当該技術分野で公知の技法を用いて、更なるコード領域、したがって更なるタンパク質配列を得るために使用することができる。
【００９６】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は、野生型配列と比較して、誘導体または変異結腸直腸癌タンパク質である。すなわち、以下により詳細に概説されるように、誘導体結腸直腸癌ペプチドは少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含むものであり、アミノ酸置換が特に好ましい。アミノ酸置換、挿入または欠失は、結腸直腸癌ペプチド内の任意の残基において発生することができる。
【００９７】
また、本発明の結腸直腸癌タンパク質の実施形態には、アミノ酸配列変異体が含まれる。これらの変異体は３つの種類、置換、挿入または欠失変異体のうちの１つまたは複数に分類される。これらの変異体は、通常、変異体をコードするＤＮＡを産生するために、カセットまたはＰＣＲ突然変異誘発もしくは当該技術分野で周知の他の技法を用いて、結腸直腸癌タンパク質をコードするＤＮＡにおいてヌクレオチドを部位特異性突然変異誘発させ、その後、上記に概説される組換え細胞培養においてＤＮＡを発現させることによって調製される。しかしながら、最大約１００個〜１５０個の残基を有する変異結腸直腸癌タンパク質フラグメントは、確立された技法を用いてインビトロ合成で調製することができる。アミノ酸配列変異体は、変化の所定の性質、結腸直腸癌タンパク質アミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子または種間変化からそれらを切り離す特性によって特徴付けられる。変異体は通常、天然に存在するアナログと同じ定性的生物活性を示すが、以下にさらに詳細に概説されるように、変更された特徴を有する変異体を選択することもできる。
【００９８】
アミノ酸配列変化の導入部位または領域は予め定められるが、突然変異自体は予め定められる必要はない。例えば、所定部位における突然変異の実行を最適化するために、ランダムな突然変異誘発が標的コドンまたは領域において実行され、発現された結腸直腸癌変異体は、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされることができる。既知の配列を有するＤＮＡの所定部位において置換突然変異を起こすための技法は公知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発などがある。突然変異体のスクリーニングは、結腸直腸癌タンパク質活性のアッセイを用いて実行される。
【００９９】
アミノ酸置換は、通常単一の残基であり、挿入は通常約１〜２０個程度のアミノ酸とされるが、かなり大きい挿入も容認することができる。欠失の範囲は約１個〜約２０個の残基であるが、いくつかの場合には、欠失はかなり大きくてもよい。
【０１００】
置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組み合わせを使用して最終誘導体に到達することができる。一般的にこれらの変化は、分子の変更を最小限にするために数個のアミノ酸において行われる。しかしながら、特定の状況では、より大きい変化も許容することができる。結腸直腸癌タンパク質の特徴に小さい変更が所望される場合、置換は一般的に、以下のチャートに従って行われる。
【０１０１】
【表１】
2004515225.tif 000002
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、チャートＩに示されるよりも保存性の低い置換を選択することによって成される。例えば、変更領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、αへリックスまたはβシート構造）、標的部位における分子の電荷または疎水性、もしくは側鎖のかさに対して、より大きな影響を与える置換が行われる。ポリペプチド特性に最大変化を起こすことが一般に期待される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）で（または、それらによって）置換される、（ｂ）システインまたはプロリンが他の任意の残基で（または、それらによって）置換される、（ｃ）正に荷電した側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジル）が負に荷電した残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）で（または、それらによって）置換される、あるいは（ｄ）大きい側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）で（または、それらによって）置換されるような置換である。
【０１０２】
変異体は通常、天然に存在するアナログと同じ性質の生物活性を示し、同じ免疫反応を誘発し得るが、変異体は、必要に応じて結腸直腸癌タンパク質の特徴を変更するようにも選択される。あるいは、変異体は、結腸直腸癌タンパク質の生物活性が変更されるように設計することができる。例えば、グリコシル化部位が変更または除去される。
【０１０３】
結腸直腸癌ポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内に包含される。共有結合修飾の１つの型は、結腸直腸癌ポリペプチドの標的アミノ酸残基と、結腸直腸癌ポリペプチドの選択された側鎖もしくはＮまたはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤とを反応させることを含む。二官能性試薬による誘導体化は、例えば、以下にさらに詳細に記載されるように、抗結腸直腸癌抗体の精製方法またはスクリーニングアッセイで使用するために、結腸直腸癌を水に不溶性の支持体行列または表面へ架橋させるのに有用である。一般に使用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾ−アセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（例えば、４−アジゾ−サリチル酸とのエステル）、ホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）イミドエステル（３，３’−ジチオビス−（スクシンイミジル−プロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含む）、二官能性マレイミド（ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなど）、ならびにメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミデートなどの試薬が含まれる。
【０１０４】
その他の修飾には、それぞれ対応のグルタミルおよびアスパルチル残基へのグルタミニルおよびアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル、トレオニルまたはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ｐｐ．  ７９−８６  （１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１０５】
本発明の範囲内に含まれる結腸直腸癌ポリペプチドの別の型の共有結合修飾は、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンを変更することを含む。「天然のグリコシル化パターンを変更する」とは、本明細書では、天然配列結腸直腸癌ポリペプチド中に見られる１つまたは複数の糖質部分の欠失、および／または天然配列結腸直腸癌ポリペプチド中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位の付加を意味することを意図するためのものである。
【０１０６】
結腸直腸癌ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を変更することによって達成することができる。変更は、例えば、天然配列の結腸直腸癌ポリペプチド（Ｏ−連結グリコシル化部位）に対する１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはこれらによる置換によって行うことができる。結腸直腸癌アミノ酸配列は、ＤＮＡレベルの変化によって、特に、所望のアミノ酸へ翻訳されるコドンが生成されるように予め選択された塩基において結腸直腸癌ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、任意で変更されてもよい。
【０１０７】
結腸直腸癌ポリペプチドの糖質部分の数を増大させる別の手段は、グリコシドをポリペプチドへ化学的または酵素的にカップリングさせることによる。このような方法は、例えば、国際公開第８７／０５３３０号（１９８７年、９月１１日公開）およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｐｐ．  ２５９−３０６  （１９８１）  のように、当該技術分野において記載されている。
【０１０８】
結腸直腸癌ポリペプチドに存在する糖質部分の除去は、化学的または酵素的に、あるいはグリコシル化のための標的として働くアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異置換によって達成することができる。化学的な脱グリコシル化技法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ２５９：５２（１９８７）  およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１８：１３１  （１９８１）  によって記載される。ポリペプチドの糖質部分の酵素による切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １３８：３５０  （１９８７）  により記載されるように、種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０１０９】
結腸直腸癌の別の型の共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に示されるようにして、結腸直腸癌ポリペプチドと、種々の非タンパク性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つとを連結させることを含む。
【０１１０】
また、本発明の結腸直腸癌ポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列へ融合された結腸直腸癌ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾することもできる。１つの実施形態では、このようなキメラ分子は、結腸直腸癌ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合可能なエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合物を含む。エピトープタグは、一般的に、結腸直腸癌ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。結腸直腸癌ポリペプチドのこのようなエピトープタグ付き型の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供により、結腸直腸癌ポリペプチドは、抗タグ抗体、またはエピトープタグに結合する別の型のアフィニティマトリクスを用いて、アフィニティ精製によって容易に精製することができるようになる。代替の実施形態では、キメラ分子は、結腸直腸癌ポリペプチドと、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との融合物を含むことができる。キメラ分子の二価型では、このような融合物はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対することもあり得る。
【０１１１】
種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は当該技術分野で周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ、ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］、ｃ−ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］、ならびに単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が挙げられる。その他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇペプチド［Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］、ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］、チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］、およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］が挙げられる。
【０１１２】
また、１つの実施形態における結腸直腸癌タンパク質の定義には、結腸直腸癌ファミリーのその他の結腸直腸癌タンパク質、および他の生物体からの結腸直腸癌タンパク質が含まれ、これらは、以下に概説されるようにクローニングおよび発現される。したがって、ヒトまたは他の生物体から他の関連結腸直腸癌タンパク質を見出すために、プローブまたは変性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を使用することができる。当業者には理解されるように、特に有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、結腸直腸癌核酸配列の独特な領域を含む。当該技術分野において一般に知られるように、好ましいＰＣＲプライマーは約１５個〜約３５個のヌクレオチド長であり、約２０個〜約３０個が好ましく、必要に応じてイノシンを含むことができる。ＰＣＲ反応の条件は当該技術分野において周知である。
【０１１３】
さらに、本明細書中に概説されるように、例えば、更なる配列の解明、エピトープまたは精製タグの付加、他の融合配列の付加などによって、表１または表２に示されるよりも長い結腸直腸癌タンパク質を作製することができる。
【０１１４】
また結腸直腸癌タンパク質は、結腸直腸癌核酸によりコードされることが確認することができる。したがって、結腸直腸癌タンパク質は、本明細書に概説されるように、配列表の配列またはその相補体へハイブリダイズすることができる核酸によりコードされる。
【０１１５】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質が抗体を生成するために使用される場合（例えば、免疫療法のために）、結腸直腸癌タンパク質は、完全長タンパク質と、少なくとも１つのエピトープまたは決定基を共有すべきである。本明細書中の「エピトープ」または「決定基」とは、ＭＨＣとの関連において抗体またはＴ細胞受容体を産生および／または結合するタンパク質の部分を意味する。したがって、多くの場合、より小さい結腸直腸癌タンパク質へ作製された抗体は、完全長タンパク質へ結合することができるであろう。好ましい実施形態では、エピトープは独特である。すなわち、独特のエピトープに対して産生された抗体は、交差反応性をわずかに示すか、あるいは全く示さない。好ましい実施形態では、エピトープは、表１の核酸によってコードされるペプチドから選択される。別の好ましい実施形態では、エピトープは表２に示されるＣＢＦ９ペプチド配列から選択される。
【０１１６】
１つの実施形態では、「抗体」という用語には、当該技術分野で公知なように、全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の修飾により産生されるか、あるいは組換えＤＮＡ技法を用いて新規に合成される抗体フラグメントが含まれ、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖抗体（例えばＦｖ）、キメラ抗体などが含まれる。
【０１１７】
ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤と、所望される場合にはアジュバントとを１回または複数回注入することによって哺乳動物中で産生することができる。通常、免疫剤および／またはアジュバントは、複数の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物に注入される。免疫剤には、表２のＣＢＦ９ペプチド、または表１の核酸によってコードされるペプチド、またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質が含まれ得る。免疫化されている哺乳動物において免疫原性であることが分かっているタンパク質へ免疫剤を結合することは有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが含まれるが、これらに限定されない。使用することができるアジュバントの例には、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度の実験を行わなくても当業者には選択することができる。
【０１１８】
あるいは、抗体はモノクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載されるように、ハイブリーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、通常、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘発するために、免疫剤により免疫化される。あるいは、リンパ球はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化することができる。免疫剤は通常、ＣＢＦ９ポリペプチド、または表１の核酸によりコードされるペプチドまたはそのフラグメントまたはその融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト由来の細胞が所望される場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいはヒト以外の哺乳動物源が所望される場合には脾臓細胞、またはリンパ節細胞が使用される。次にリンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融剤を用いて、不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３］。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、特に、齧歯類、ウシおよびヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合不死化細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する適切な培地において培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を防止する。
【０１１９】
１つの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル（好ましくは、ヒトまたはヒト化）抗体である。この場合、結合特異性のうちの１つは、結腸直腸癌タンパク質またはそのフラグメントに対するものであり、他方は他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニット、好ましくは腫瘍特異性の抗原に対する。
【０１２０】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌に対する抗体は、以下に記載されるように、結腸直腸癌の生物体学的機能を低下または排除することができる。すなわち、結腸直腸癌（または結腸直腸癌を含む細胞）への抗結腸直腸癌抗体（ポリクローナルまたは好ましはモノクローナル）の添加は、結腸直腸癌活性を減少または排除することができる。一般に、少なくとも２５％の活性の減少が好ましく、少なくとも約５０％が特に好ましく、約９５〜１００％の減少が特に好ましい。
【０１２１】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質に対する抗体はヒト化抗体である。ヒト以外（例えば、マウス）の抗体のヒト化形態は、免疫グロブリンのキメラ分子、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ  Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列など）であり、ヒト以外の免疫グロブリン由来の最小配列を含有する。ヒト化抗体は、レシピエントの相補的決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、アフィニティおよび能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応のヒト以外の残基で置換される。またヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見られない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができ、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域はヒト以外の免疫グロブリンの領域に相当し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列の領域である。またヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリンの定常部（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンの定常部の少なくとも一部を含む［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０１２２】
ヒト以外の抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらのヒト以外のアミノ酸残基は移入残基と言われることが多く、これらは通常移入可変ドメインから取り出される。Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、齧歯類ＣＤＲ（複数または単数）配列をヒト抗体の対応の配列の代わりに使用することによって、ヒト化を実質的に実行することができる。したがって、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、実質的に決して無傷とは言えないヒト可変ドメインは、ヒト以外の種からの対応の配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、通常いくつかのＣＤＲ残基と、おそらくいくつかのＦＲ残基とが齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１２３】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］を含む当該技術分野で公知の種々の技法を用いて産生することができる。ヒトモノクローナル抗体の調製のために、ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技法も利用することができる［Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、マウス）内に導入することによって作製でき、ここで、内因性免疫グロブリン遺伝子は部分的または完全に不活化されている。このチャレンジでは、ヒト抗体の産生が観察され、これは、遺伝子再配列、構築、および抗体レパートリーを含む全ての点で、ヒトにおいて見られるものと極めて類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、および、以下の科学出版物、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）に記載される。
【０１２４】
免疫療法とは、結腸直腸癌タンパク質に対して産生された抗体による結腸直腸癌の処置を意味する。本明細書における使用では、免疫療法は受動的でも能動的でもよい。本明細書で定義される受動的免疫療法は、抗体のレシピエント（患者）への受動的移行である。能動的免疫化は、レシピエント（患者）における抗体および／またはＴ細胞応答の誘発である。免疫応答の誘発は、抗体が産生される抗原をレシピエントへ提供した結果である。当業者には理解されるように、抗体が産生されることが所望されるポリペプチドをレシピエントに注入することによって、あるいは、抗原の発現のための条件下で抗原を発現することができる核酸をレシピエントに接触させることによって、抗原を提供することができる。
【０１２５】
好ましい実施形態では、抗体が産生される結腸直腸癌タンパク質は、上記のように、分泌タンパク質である。理論により束縛されることなく、処置に使用される抗体は、分泌タンパク質と結合し、分泌タンパク質がその受容体と結合するのを防止し、それにより、分泌結腸直腸癌タンパク質を不活化する。
【０１２６】
別の好ましい実施形態では、抗体が産生される結腸直腸癌タンパク質は膜貫通タンパク質である。理論により束縛されることなく、処置に使用される抗体は結腸直腸癌タンパク質の細胞外ドメインと結合して、それが、循環リガンドまたは細胞関連分子などの他のタンパク質と結合するのを防止する。抗体は、膜貫通結腸直腸癌タンパク質の下方制御を引き起こすことができる。当業者には理解されるように、抗体は、結腸直腸癌タンパク質の細胞外ドメインへ結合するタンパク質の競合的、非競合的（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）、または不競合的（ｕｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）なインヒビターであり得る。また抗体は、結腸直腸癌タンパク質のアンタゴニストである。さらに、抗体は膜貫通結腸直腸癌タンパク質の活性化を防止する。１つの局面では、抗体が結腸直腸癌タンパク質への他の分子の結合を防止する場合、抗体は細胞の成長を防止する。また抗体は、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−２を含むが、これらに限定されない細胞傷害剤、または５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、およびメトトレキサートなどを含む化学療法剤に対する細胞の感受性を高める。場合によっては、抗体は、膜貫通タンパク質と複合体化されたときに血清補体を活性化するサブタイプに属し、それにより、細胞傷害性が媒介される。したがって、結腸直腸癌は、膜貫通結腸直腸癌タンパク質に対して誘導される抗体を患者に投与することによって処置される。
【０１２７】
別の好ましい実施形態では、抗体は治療部分へ結合される。１つの局面では、治療部分は、結腸直腸癌タンパク質の活性を調節する小分子である。別の局面では、治療部分は結腸直腸癌タンパク質と関連する分子、または結腸直腸癌タンパク質にきわめて近接する分子の活性を調節する。治療部分は、結腸直腸癌に関連するプロテアーゼまたはタンパク質キナーゼ活性などの酵素活性を阻害することができる。
【０１２８】
好ましい実施形態では、治療部分は細胞傷害剤でもよい。この方法では、細胞傷害剤を腫瘍組織または細胞に標的化することによって、病変（ａｆｆｌｉｃｔｅｄ）細胞の数が減少され、それにより、結腸直腸癌に関連する症状が低減される。細胞傷害剤は多数の様々なものがあり、細胞傷害性薬物または毒素、あるいはこのような毒素の活性フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。適切な毒素およびその対応のフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが挙げられる。また細胞傷害剤には、結腸直腸癌タンパク質に対して産生される抗体へ放射性同位体を結合させることによって、あるいは抗体へ共有結合されたキレート剤に放射性核種を結合することによって製造される放射化学物質も含まれる。治療部分を膜貫通結腸直腸癌タンパク質に標的化することは、結腸直腸癌の病変領域において治療部分の局所濃度を増大する働きをするだけでなく、治療部分に関連付けられる有害な副作用を低減する働きもする。
【０１２９】
別の好ましい実施形態では、抗体が産生される結腸直腸癌タンパク質は、細胞内タンパク質である。この場合、抗体は細胞への侵入を容易にするタンパク質へ結合され得る。場合によっては、抗体はエンドサイトーシスによって細胞に侵入する。別の実施形態では、抗体をコードする核酸が個体または細胞に投与される。さらに、結腸直腸癌タンパク質が細胞内、すなわち核を標的とすることができる場合、それに対する抗体は、標的局在化のためのシグナル、すなわち核局在性化シグナルを含む。
【０１３０】
本発明の結腸直腸癌抗体は、結腸直腸癌タンパク質に特異的に結合する。本明細書における「特異的に結合する」とは、少なくとも１０−４〜１０−６Ｍ−１の範囲の結合定数で抗体がタンパク質に結合することを意味し、好ましい範囲は１０−７〜１０−９Ｍ−１である。
【０１３１】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は、発現後に精製または単離される。結腸直腸癌タンパク質は、サンプル中に他のどんな成分が存在するかによって、当業者に公知の種々の方法で単離または精製することができる。標準的な精製方法としては、電気泳動、分子的、免疫学的およびクロマトグラフィ技法（イオン交換、疎水性、アフィニティ、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ、ならびにクロマトフォーカシングを含む）が挙げられる。例えば、結腸直腸癌タンパク質は、標準抗結腸直腸癌抗体カラムを用いて精製することができる。また、限外ろ過およびダイアフィルトレーション技法も、タンパク質濃縮と共に有用である。適切な精製技法の全般的指針としては、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９８２）が参照される。必要な精製度は、結腸直腸癌タンパク質の使用に応じて変わる。場合によっては、精製は全く必要とされない。
【０１３２】
一旦、発現され、必要に応じて精製されたら、結腸直腸癌タンパク質および核酸は多数の用途において有用である。
【０１３３】
１つの局面では、遺伝子の発現レベルは、結腸直腸癌表現型における種々の細胞状態に対して決定される。すなわち、正常な結腸組織および結腸直腸癌組織の遺伝子の発現レベル（いくつかの場合には、以下に概説されるように、予後に関連する結腸直腸癌の様々な重症度について）が評価されて、発現プロファイルを提供する。特定の細胞状態または発生点の発現プロファイルは、実質的に、その状態の「フィンガープリント」であり、二つの状態は、同様に発現された任意の特定の遺伝子を有することができるが、多数の遺伝子を同時に評価することにより、細胞の状態に対して独特である遺伝子発現プロファイルの作成が可能になる。異なる状態にある細胞の発現プロファイルを比較することによって、これらの状態にあるそれぞれにおいてどの遺伝子が重要であるかについての情報（遺伝子の上方および下方制御を含む）が得られる。次に、診断を実行または確認することができ、特定の患者からの組織は、正常または結腸直腸癌組織の遺伝子発現プロファイルを有する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合の「差次的発現」または文法的に等価な用語は、細胞内および細胞間で、遺伝子の一時的および／または細胞発現パターンにおける質的差異および量的差異の両方を示す。したがって、差次的に発現された遺伝子は、例えば、正常組織対結腸直腸癌組織において、その発現が質的に変更されている（活性化または不活性化を含む）。すなわち、遺伝子は、特定の状態では、別の状態に対して、オンまたはオフにされ得る。当業者には明らかなように、２つ以上の状態の比較を行うことができる。このように質的に調節された遺伝子は状態または細胞型内の発現パターンを示し、これは、このような状態または細胞型の１つでは標準技法により検出可能であるが、両方では検出できない。あるいは、決定は量的であり、発現は増加または減少される。すなわち、遺伝子の発現は上方制御されて転写量の増大をもたらすか、あるいは下方制御されて転写量の減少をもたらす。発現の異なる度合いは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ発現アレイの使用（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０（１９９６）、参考として本明細書に明確に援用される）などのように、以下に概説されるような標準特性化技法により定量化するのに十分な大きさだけ必要とされる。他の技法としては、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析、およびＲＮＡ分解酵素保護が挙げられるが、これらに限定されない。上記に概説されるように、好ましくは、発現における変化（すなわち、上方制御または下方制御）は少なくとも約５０％であり、さらに好ましくは少なくとも約１００％であり、さらに好ましくは少なくとも約１５０％であり、さらに好ましくは少なくとも約２００％であり、３００％から少なくとも１０００％が特に好ましい。
【０１３５】
当業者に理解されるように、これは、遺伝子転写またはタンパク質レベルのいずれかの評価によって行うことができる。すなわち、遺伝子発現量は、遺伝子転写のＤＮＡまたはＲＮＡ等価物に対する核酸プローブを用いてモニターすることができ、遺伝子発現レベルの定量化、あるいは最終遺伝子産物自体（タンパク質）は、例えば、結腸直腸癌タンパク質への抗体の使用および標準イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡなど）、または他の技法（質量分析アッセイ、２Ｄゲル電気泳動アッセイなどを含む）の使用によりモニターすることができる。したがって、結腸直腸癌遺伝子に相当するタンパク質、すなわち結腸直腸癌表現型において重要であると同定されたタンパク質は、結腸直腸癌診断試験で評価することができる。
【０１３６】
好ましい実施形態では、遺伝子発現モニタリングが行われ、多数の遺伝子、すなわち発現プロファイルが同時にモニターされるが、多重タンパク質発現モニタリングも行うことができる。同様に、これらのアッセイは個体ベースで行うこともできる。
【０１３７】
この実施形態では、結腸直腸癌核酸プローブは、特定の細胞における結腸直腸癌配列の検出および定量化のために本明細書中に概説されるバイオチップへ付着される。このアッセイは、実施例中で以下にさらに記載される。
【０１３８】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質をコードする核酸が検出される。結腸直腸癌タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを検出することができるが、特に重要なのは、結腸直腸癌タンパク質をコードするｍＲＮＡが検出される方法である。サンプル中のｍＲＮＡの存在は、ｍＲＮＡを形成するために結腸直腸癌遺伝子が転写されたことを示し、タンパク質が発現されることが示唆される。ｍＲＮＡを検出するためのプローブは、ｍＲＮＡに相補的で、ｍＲＮＡとの塩基対であり、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡを含むが、これらに限定されない任意のヌクレオチド／デオキシヌクレオチドプローブでよい。またプローブは、本明細書中に定義されるように、検出可能な標識を含有すべきである。１つの方法では、検査すべき核酸をナイロン膜などの固体支持体上に固定化し、プローブをサンプルとハイブリダイズした後、ｍＲＮＡが検出される。非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄した後、標識が検出される。別の方法では、ｍＲＮＡの検出はインサイチュで実行される。この方法では、透過処理した細胞または組織サンプルを、プローブが標的ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるのに十分な時間、検出可能に標識された核酸プローブと接触させる。非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄した後、標識が検出される。例えば、結腸直腸癌タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なジゴキシゲニン標識リボプローブ（ＲＮＡプローブ）はジゴキシゲニンを抗ジゴキシゲニン二次抗体と結合させることによって検出され、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートで発色される。
【０１３９】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される３つの種類のタンパク質（分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質）のどれでも、診断アッセイにおいて使用される。結腸直腸癌配列を含む結腸直腸癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質および細胞は、診断アッセイにおいて使用される。これは、個々の遺伝子または対応するポリペプチドレベルにおいて行うことができる。好ましい実施形態では、発現プロファイルが使用され、好ましくは、発現プロファイル遺伝子および／または対応のポリペプチドのモニタリングを可能にするために、ハイスループットスクリーニング技法と併せて使用される。
【０１４０】
本明細書中に記載および定義されるように、細胞内タンパク質、膜貫通タンパク質または分泌タンパク質を含む結腸直腸癌タンパク質は、結腸直腸癌のマーカーとしての用途を見出す。推定の結腸直腸癌組織または患者におけるこれらのタンパク質の検出は、結腸直腸癌の決定または診断を可能にさせる。当業者に公知の多数の方法は、結腸直腸癌の検出における用途が見出される。１つの実施形態では、抗体を使用して結腸直腸癌タンパク質を検出する。好ましい方法は、ゲル上の電気泳動（通常、変性および還元タンパク質ゲルであるが、等電点電気泳動ゲルなどを含む他の任意のタイプのゲルでもよい）によって、サンプルまたは患者からタンパク質を分離する。タンパク質の分離に続いて、結腸直腸癌タンパク質は、結腸直腸癌タンパク質に対して産生された抗体との免疫ブロットによって検出される。免疫ブロットの方法は、当業者に周知である。
【０１４１】
別の好ましい方法では、結腸直腸癌タンパク質に対する抗体は、インサイチュイメージング技法において用途が見出される。この方法では、細胞は、結腸直腸癌タンパク質（単数または複数）に対する１個〜多数の抗体と接触される。非特異性の抗体結合を除去するための洗浄に続いて、抗体（単数または複数）の存在が検出される。１つの実施形態では、抗体は、検出可能な標識を含有する二次抗体と共にインキュベートすることによって検出される。別の実施形態では、結腸直腸癌タンパク質（単数または複数）に対する一次抗体は、検出可能な標識を含有する。別の好ましい実施形態では、多数の一次抗体のそれぞれが、別々の検出可能な標識を含有する。この方法は、複数の結腸直腸癌タンパク質の同時スクリーニングにおいて特定の用途が見出される。当業者には理解されるように、多数の他の組織学的イメージング技法が本発明において有用である。
【０１４２】
好ましい実施形態では、標識は、異なる波長の発光を検出および区別することができる蛍光光度計で検出される。さらに、この方法では蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用することができる。
【０１４３】
別の好ましい実施形態では、抗体は血液サンプルからの結腸直腸癌の診断において用途を見出す。既に記載されたように、特定の結腸直腸癌タンパク質は、分泌／循環分子である。血液サンプルは、したがって、分泌結腸直腸癌タンパク質の存在について探索または検査されるサンプルとして有用である。当業者には理解されるように、抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（ウェスタンブロット）、免疫沈降、ＢＩＡＣＯＲＥテクノロジーなどを含む既に記載したイムノアッセイ技法のいずれかによって、結腸直腸癌を検出することができる。
【０１４４】
好ましい実施形態では、組織アレイに対して標識結腸直腸癌核酸プローブのインサイチュハイブリダイゼーションが行われる。例えば、結腸直腸癌組織および／または正常組織を含有する組織サンプルのアレイが作製される。次に、当該技術分野で公知のインサイチュハイブリダイゼーションを行うことができる。
【０１４５】
個体とスタンダードとの間でフィンガープリントを比較する場合、当業者は、診断および予後を行うことができることが理解される。診断を示す遺伝子は、予後を示す遺伝子とは異なり得ることがさらに理解される。
【０１４６】
好ましい実施形態では、予後アッセイにおいて、結腸直腸癌配列を含む結腸直腸癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質および細胞が使用される。上記のように、長期的予後の観点から、結腸直腸癌の重症度と相関する遺伝子発現プロフィールが作成され得る。この場合もやはり、これは、タンパク質または遺伝子レベルで行われ得る、遺伝子の使用が好ましい。上記のように、結腸直腸癌プローブは、組織または患者における結腸直腸癌配列の検出および定量化のためにバイオチップへ付着される。アッセイは診断について概説したように進行する。
【０１４７】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される３つの種類のタンパク質のどれも、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用される。結腸直腸癌配列を含む結腸直腸癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質および細胞は、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用される。あるいは、「遺伝子発現プロフィール」またはポリペプチドの発現プロフィールに対する薬物候補の影響を評価することによって使用される。好ましい実施形態では、発現プロフィールが使用され、好ましくは、候補薬剤で処置された後の発現プロフィール遺伝子のモニタリングを可能にするために、ハイスループットスクリーニング技法と併せて使用される（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，８４−８（１９９８），Ｈｅｉｄ，１９９６＃６９）。
【０１４８】
好ましい実施形態では、スクリーニングアッセイにおいて、ネイティブまたは修飾された結腸直腸癌タンパク質を含有する結腸直腸癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質および細胞を使用する。すなわち、本明細書は、結腸直腸癌の表現型を調節する組成物をスクリーニングするための新規の方法を提供する。上記のように、これは、個々の遺伝子レベルにおいて、あるいは「遺伝子発現プロフィール」に対する薬物候補の影響を評価することによって実施され得る。好ましい実施形態では、発現プロフィールが使用され、好ましくは、候補薬剤で処置された後の発現プロフィール遺伝子のモニタリングを可能にするために、ハイスループットスクリーニング技法と併せて使用される（上記のＺｌｏｋａｒｎｉｋを参照）。本明細書における差次的に発現された遺伝子を同定したら、種々のアッセイを実行し得る。好ましい実施形態では、アッセイは個々の遺伝子またはタンパク質レベルで行われ得る。すなわち、特定の遺伝子が結腸直腸癌中で上方制御されることを同定したら、この遺伝子の応答を調節する（好ましくは遺伝子を下方制御するが、いくつかの状況では遺伝子を上方制御する）ために、候補生物活性薬剤がスクリーニングされ得る。
【０１４９】
結腸直腸癌タンパク質または結腸直腸癌核酸の活性を調節する化合物を検査するアッセイとの関連における「機能的効果」という語句は、細胞増殖を増加または減少する能力などのように、間接または直接的に結腸直腸癌タンパク質または核酸の影響（例えば、物理的（直接的）、もしくは表現型または化学的効果（間接的））下にあるパラメータの決定を含む。それには、細胞周期の停止、細胞の増殖能力、および増殖細胞の他の特性が含まれる。「機能的効果」には、インビトロ、インビボ、およびエキソビボの活性が含まれる。
【０１５０】
「機能的効果を決定する」とは、間接または直接的に、例えば物理的、表現型、および化学的効果などの結腸直腸癌タンパク質または核酸の影響下にあるパラメータを増加または減少させる化合物をアッセイすることを意味する。このような機能的効果は当業者に既知の任意の手段によって測定され得る、例えば、分光学的特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的（例えば、形状）、クロマトグラフィ、またはタンパク質の溶解度特性における変化、リガンド結合活性の測定または結合アッセイ（例えば、抗体への結合）、リガンド結合活性の変化の測定などの物理的効果、ならびにタンパク質の誘導性マーカーまたは転写活性化の測定、細胞増殖の測定、細胞表面マーカー発現の測定、結腸直腸癌関連配列のタンパク質レベルの変化の測定、ＲＮＡ安定性の測定、リン酸化または脱リン酸化、例えばレセプター−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度（例えば、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、または細胞内Ｃａ２＋）などのシグナル伝達、例えば化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合および誘導性マーカーなどによる下流またはレポータ遺伝子発現（ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、β−ｇａｌ、ＧＦＰなど）の同定などの化学的または表現型効果である。
【０１５１】
結腸直腸癌ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の「インヒビター」、「活性化因子」および「モジュレーター」は、結腸直腸癌ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のインビトロおよびインビボアッセイを用いて同定された活性化分子、阻害分子または調節分子を示すために使用される。インヒビターは、例えば、結腸直腸癌タンパク質または核酸の活性を、部分的または完全に遮断、減少、防止、活性化を遅延、不活性化、脱感作する、あるいは活性または発現を下方制御するために結合する化合物、例えばアンタゴニストである。「活性化因子」は、結腸直腸癌タンパク質または核酸活性を増大、開放、活性化、促進、活性化を増強、増感、アゴナイズ（ａｇｏｎｉｚｅ）、または上方制御する化合物である。また、インヒビター、活性化因子またはモジュレーターには、結腸直腸癌タンパク質の遺伝子改変型（例えば、活性が変更された型）、ならびに天然に存在するリガンドおよび合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、アンチセンス分子、ペプチド、リボザイム、小化学分子などが含まれる。インヒビターおよび活性化因子のこのようなアッセイには、例えば、上記のように、結腸直腸癌タンパク質をインビトロ、細胞内、または細胞膜で発現させ、推定のモジュレーター化合物を適用させ、次に活性に対する機能的効果を決定することが含まれる。
【０１５２】
潜在的な活性化因子、インヒビター、またはモジュレーターで処置された結腸直腸癌タンパク質または結腸直腸癌核酸を含むサンプルまたはアッセイは、阻害の程度を調べるために、インヒビター、活性化因子またはモジュレーターを含まないコントロールサンプルと比較される。コントロールサンプル（インヒビターによる処置なし）は、相対活性値を１００％とされる。結腸直腸癌の抑制は、コントロールに対する活性値が約８０％、好ましくは５０％、さらに好ましくは２５〜０％である場合に達成される。結腸直腸癌の活性化は、コントロール（活性化因子による処置なし）に対する活性値が１１０％、好ましくは１５０％、より好ましくは２００〜５００％（すなわち、コントロールに対して２〜５倍高い）、さらに好ましくは１０００〜３０００％高い場合に達成される。
【０１５３】
当業者には理解されるように、これは、遺伝子またはタンパク質レベルにおける評価によって行われ得る。すなわち、遺伝子発現量は核酸プローブおよび遺伝子発現レベルの定量化を用いてモニターされ得るか、あるいは遺伝子産物自体は、例えば、結腸直腸癌タンパク質に対する抗体および標準イムノアッセイの使用によってモニターされ得る。
【０１５４】
好ましい実施形態では、遺伝子発現のモニタリングが行われ、多数の遺伝子、すなわち発現プロフィールが同時にモニターされるが、多重タンパク質発現モニタリングも同様に行われ得る。
【０１５５】
この実施形態では、結腸直腸癌核酸プローブは、特定の細胞の結腸直腸癌配列の検出および定量化のために本明細書中に概説されるバイオチップへ付着される。このアッセイは、以下にさらに記載される。
【０１５６】
一般的に、好ましい実施形態では、分析の前に、候補生物活性薬剤が細胞に添加される。さらに、結腸直腸癌を調節するか、結腸直腸癌タンパク質を調節するか、結腸直腸癌タンパク質に結合するか、あるいは結腸直腸癌タンパク質および抗体の結合の間を妨害する候補生物活性薬剤を同定するための、スクリーニングが提供される。
【０１５７】
「候補生物活性薬剤」または「試験化合物」または「薬物候補」または「モジュレーター」という用語もしくは文法的に等価な用語は、本明細書で使用される場合、核酸およびタンパク質配列の両方を含む結腸直腸癌配列を直接または間接的に調節する能力について検査される天然に存在するまたは合成の任意の分子を説明し、例えば、タンパク質、オリゴペプチド（例えば、約５〜約２５個のアミノ酸長、好ましくは約１０〜２０個、または１２〜１８個のアミノ酸長、好ましくは１２、１５、または１８個のアミノ酸長）、小有機分子、多糖類、脂質、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどである。試験化合物は、コンビナトリアルライブラリまたはランダムライブラリなどの、十分な多様性範囲を提供する試験化合物のライブラリの形態でもよい。試験化合物は、任意で、例えば、ターゲッティング化合物、救出化合物（ｒｅｓｃｕｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、二量体化合物、安定化化合物、アドレス可能な化合物、および他の機能性部分などの融合パートナーへ連結される。従来、有用な特性のある新規化学物質は、例えば阻害活性などのある望ましい特性または活性を有する試験化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定し、リード化合物の変異体を形成し、これらの変異化合物の特性および活性を評価することによって生成される。このような分析のために、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法を使用することが多い。
【０１５８】
好ましい実施形態では、生物活性薬剤は、本明細書で提供される発現プロフィール、もしくは発現プロフィール核酸またはタンパク質を調節する。特に好ましい実施形態では、候補薬剤は、例えば正常結腸組織フィンガープリントへの結腸直腸癌表現型を抑制する。同様に、候補薬剤は、好ましくは、重症の結腸直腸癌表現型を抑制する。一般的に、種々の濃度に対する差次的な応答を得るために異なる薬剤濃度で、平行して複数のアッセイの混合が実行される。通常、これらの濃度のうちの１つはネガティブコントロール、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満の役割を果たす。
【０１５９】
１つの局面では、候補薬剤は、結腸直腸癌タンパク質の効果を中和し得る。「中和する」とは、タンパク質の活性が、細胞に対して実質的に効果を有さないように阻害されるか、逆に作用されることを意味する。
【０１６０】
候補薬剤は多数の化学的クラスを包含するが、通常は有機分子であり、好ましくは、１００ダルトンより大きく、約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。好ましい小分子は、２０００Ｄ未満、または１５００Ｄ未満、または１０００Ｄ未満、または５００Ｄ未満である。候補薬剤はタンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、通常少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み、好ましくは、少なくとも２つの官能化学基を含む。候補薬剤は、上記の官能基のうちの１つまたは複数で置換された環状炭素または複素環式構造、および／または芳香族または多芳香族構造を含むことが多い。また、候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログ、またはそれらの組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。特に好ましいのは、ペプチドである。
【０１６１】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリを含む各種の供給源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、様々な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向性合成のために、多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリを利用可能であるか、または容易に生成され得る。さらに、天然または合成により生成されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾される。既知の薬理学的薬剤は、構造的アナログを生成するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの指向性またはランダム化学修飾に供され得る。
【０１６２】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤はタンパク質である。本明細書における「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドが含まれる。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成的なペプチド擬似構造で構成され得る。したがって、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、本明細書で使用される場合、天然に存在するおよび合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的ではアミノ酸と考えられる。また「アミノ酸」は、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含む。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）立体配置のいずれかであり得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−立体配置である。天然に存在しない側鎖が使用される場合、例えばインビボでの分解を防止または遅延するために、非アミノ酸置換基が使用され得る。
【０１６３】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤は、天然に存在するタンパク質か、または天然に存在するタンパク質のフラグメントである。したがって、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、またはタンパク性の細胞抽出物のランダムまたは指向性消化物が使用され得る。このような方法で、本発明の方法でスクリーニングするための原核生物および真核生物タンパク質のライブラリを作成し得る。この実施形態で特に好ましいのは、細菌、真菌、ウィルス、および哺乳動物タンパク質のライブラリであり、後者が好ましく、ヒトのタンパク質が特に好ましい。
【０１６４】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤は、約５〜約３０個のアミノ酸のペプチドであり、約５〜約２０個のアミノ酸が好ましく、約７〜約１５個が特に好ましい。ペプチドは、上記に概説されるような天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または「偏った（ｂｉａｓｅｄ）」ランダムプペプチドであり得る。本明細書中の「ランダム化」または文法的に等価な用語は、それぞれの核酸およびペプチドが、それぞれ実質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般的にこれらのランダムペプチド（または核酸、以下に検討される）は化学合成されるので、これらは、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を任意の位置に組み込むことができる。配列にわたって全てまたはほとんどの可能な組み合わせを形成可能にするよう、ランダム化タンパク質または核酸を生成する合成プロセスを設計し得、それにより、ランダム化候補生物活性タンパク性薬剤のライブラリが形成される。
【０１６５】
１つの実施形態では、ライブラリは完全にランダム化され、どの位置においても、配列の優先性または一定性は存在しない。好ましい実施形態では、ライブラリは偏っている。すなわち、配列内のいくつかの位置は一定性が保持されるか、あるいは限られた数の可能性から選択される。例えば、好ましい実施形態では、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、核酸結合ドメインの形成、システイン（架橋のため）、プロリン（ＳＨ−３ドメインのため）、セリン、トレオニン、チロシン、またはヒスチジン（リン酸化部位のため）などの形成に対して、あるいはプリンに対してなど、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（小さい、または大きい）残基などの規定した種類内でランダム化される。
【０１６６】
好ましい実施形態では、上記で規定したように、候補生物活性薬剤は核酸である。
【０１６７】
タンパク質について上記で一般的に記載されたように、核酸候補生物活性薬剤は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「偏った」ランダム核酸であり得る。例えば、タンパク質について上記に概説したように、原核生物および真核生物ゲノムの消化物が使用され得る。
【０１６８】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤は有機化学的部分であり、その様々な種類が文献において利用可能であり得る。
【０１６９】
「抗体」は、抗原を特異的に結合および認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントからのフレームワーク領域を含むポリペプチドを示す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパー（κ）、ラムダ（λ）、アルファ（α）、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、およびミュー（μ）定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はκまたはλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これは次に、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの免疫グロブリンのクラスを定義する。通常、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重要であろう。
【０１７０】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含む。それぞれの四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識の原因となる約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を示す。
【０１７１】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、あるいは種々のペプチダーゼによる消化により生成される、多数の十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド連結の下で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ（それ自体はジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１へ連結された軽鎖である）の二量体を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断し、それにより、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は、実質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｐａｕｌ  ｅｄ．，３ｄ  ｅｄ．１９９３）を参照）。インタクトな抗体の消化に関して種々の抗体フラグメントが定義されるが、当業者は、化学的または組換えＤＮＡ方法論の使用によって、このようなフラグメントを新規に合成することができることを認識している。したがって、抗体という用語は、本明細書における使用では、抗体全体の修飾によって生成された抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成された（例えば、一本鎖Ｆｖ）抗体フラグメント、あるいはファージディスプレイライブラリを用いて同定された抗体フラグメントも含む（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４  （１９９０）  を参照）。
【０１７２】
例えば組換え、モノクローナルまたはポリクローナル抗体などの抗体の調製では、当該技術分野分野で公知の多くの技術が使用され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．７７−９６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；およびＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ  ｅｄ．１９８６）を参照）。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローニングすることができ、組換えモノクローナル抗体を生成するために使用される。また、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリは、ハイブリドーマまたは形質細胞から作製することができる。重鎖および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを作成する（例えば、Ｋｕｂｙ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （３ｒｄ  ｅｄ．  １９９７）  を参照）。単鎖抗体または組換え抗体の生成のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号、同第４，８１６，５６７号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を生成するのに適合され得る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物などの他の生物体は、ヒト化またはヒト抗体を発現させるために使用され得る（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）、およびＬｏｎｂｅｒｇ  ＆  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照）。あるいは、ファージディスプレイ技術が、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定するために使用され得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）を参照）。また、二重特異性、すなわち２つの異なる抗原を認識することができる抗体が作製さ��得る（例えば、国際公開第９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）、およびＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照）。また抗体は、例えば２つの共有結合された抗体、または免疫毒素などのヘテロ結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であり得る（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、および欧州特許第０３０８９号を参照）。
【０１７３】
ヒト以外の抗体をヒト化または霊長類化するための方法は、当該技術分野分野において公知である。一般的に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、通常は移入可変ドメインから取り出される。Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照）に従って、齧歯類ＣＤＲ（複数または単数）配列をヒト抗体の対応の配列で置換することによって、ヒト化を実質的に実施し得る。したがって、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、この場合、実質的に、インタクトでないヒト可変ドメインは、ヒト以外の種からの対応の配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は通常、いくつかのＣＤＲ残基と、おそらくいくつかのＦＲ残基とが齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１７４】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、もしくは新しい特性がキメラ抗体へ付与された完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）へ連結されるように、定常領域またはその一部が変更、置換または交換された抗体分子；または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換された抗体分子である。
【０１７５】
１つの実施形態では、抗体は「エフェクター」部分へ結合される。エフェクター部分は、放射標識または蛍光標識などの標識用部分を含む任意の数の分子であり得るか、あるいは、治療部分であり得る。１つの局面では、抗体はタンパク質の活性を調節する。
【０１７６】
候補薬剤を添加し、一定時間の間、細胞をインキュベートさせた後、分析すべき標的配列を含有するサンプルをバイオチップへ添加する。必要に応じて、標的配列は公知の技術を用いて調製される。当業者には理解されるように、例えば、サンプルは、既知の溶解緩衝液、エレクトポレーションなどを用いて細胞を溶解させるために処理され得、必要に応じてＰＣＲなどの精製および／または増幅が行われる。例えば、ヌクレオシドへ共有結合した標識と共にインビトロ転写が行われる。一般的に、核酸はビオチン−ＦＩＴＣまたはＰＥ、もしくはｃｙ３またはｃｙ５で標識される。
【０１７７】
好ましい実施形態では、標的配列は、例えば、蛍光、化学発光、化学物質、また放射性シグナルで標識されて、標的配列のプローブへの特異的結合を検出する手段を提供する。また標識は、適切な基質と共に与えられた場合に検出可能な産物を生成する、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。あるいは、標識は、結合はするが、酵素により触媒または変更されない酵素阻害剤などの標識化合物または小分子であり得る。また標識は、ストレプトアビジンへ特異的に結合するエピトープタグまたはビオチンなどの部分または化合物であり得る。ビオチンの例では、ストレプトアビジンは上記のように標識され、それにより、結合された標的配列のための検出可能なシグナルが提供される。当該技術分野において知られるように、結合されない標識ストレプトアビジンは、分析の前に除去される。
【０１７８】
当業者には理解されるように、これらのアッセイは直接的なハイブリダイゼーションアッセイであり得るし、米国特許第５，６８１，７０２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５９４，１１７号、同第５，５９１，５８４号、同第５，５７１，６７０号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５７１，６７０号、同第５，５９１，５８４号、同第５，６２４，８０２号、同第５，６３５，３５２号、同第５，５９４，１１８号、同第５，３５９，１００号、同第５，１２４，２４６号、および同第５，６８１，６９７号（これらは全て、参照によって本明細書に援用される）に一般的に概説されるように、多数のプローブの使用を含む「サンドイッチアッセイ」を含み得る。この実施形態では、一般に、標的核酸は、上記に概説されるように調製され、次に、ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で、複数の核酸プローブを含むバイオチップへ添加される。
【０１７９】
本発明では、上記のように、高度、中程度および低度にストリンジェントの条件を含む種々のハイブリダイゼーション条件が使用され得る。アッセイは、一般的に、標的の存在下でだけ標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするストリンジェンシーの条件下で実行される。ストリンジェンシーは、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度などを含むが、これらに限定されない熱力学的変数であるステップパラメータを変更することによって制御され得る。
【０１８０】
また、これらのパラメータは、米国特許第５，６８１，６９７号に概説されるように、非特異的結合を制御するために使用され得る。したがって、非特異的結合を減少するために特定の工程をより高いストリンジェンシー条件で実行することが望ましくあり得る。
【０１８１】
本明細書中に概説する反応は、当業者には理解されるように、種々の方法で達成され得る。反応の成分は同時に添加されても、任意の順序で順次添加されてもよく、好ましい実施形態は以下に概説する。さらに、反応は、アッセイに含まれ得る種々の他の試薬を含み得る。これらには、最適なハイブリダイゼーションおよび検出を容易にするため、および／または非特異性またはバックグラウンド相互作用を減少するために使用され得る、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような試薬が含まれる。また、サンプル調製方法および標的の純度に依存して、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などの、それ以外ではアッセイの効率を改良する試薬が使用され得る。
【０１８２】
アッセイが実行されたら、データを分析して、発現レベルおよび個々の遺伝子の状態間の発現レベルの変化を決定し、遺伝子発現プロフィールを形成する。
【０１８３】
結腸直腸癌表現型を調節する薬物または生物活性薬剤を同定するために、スクリーニングが行われる。特に、実行可能ないくつかのタイプのスクリーニングが存在する。好ましい実施形態は、特定の発現プロフィールを誘導または抑制し得、したがって、好ましくは関連する表現型を発生する候補薬剤のスクリーニングにおける。すなわち、正常な結腸組織の発現プロフィールと同様の結腸直腸癌の発現プロフィールを模倣または生成し得る候補薬剤は、結腸直腸癌表現型の抑制をもたらすことが期待される。したがって、この実施形態では、発現プロフィールを模倣する、または１つのプロフィールを別のプロフィールへ変化させることが目標である。
【０１８４】
好ましい実施形態では、診断および予後の用途に関して、差次的に発現された遺伝子が１つの状態で重要であることが確認された場合、個々に遺伝子の発現を変更するためにスクリーニングが実施され得る。すなわち、単一の遺伝子発現の制御の調節のためのスクリーニングが実施され得、すなわち、発現プロフィールの全てまたは一部を模倣しようとするのではなく、個々の遺伝子の調節のためのスクリーニングが実施され得る。したがって、例えば、特に、その存在または非存在が２つの状態間で特有である標的遺伝子の場合には、スクリーニングは標的遺伝子発現のモジュレーターについて行われる。
【０１８５】
好ましい実施形態では、スクリーニングは、差次的に発現された遺伝子の発現産物の生物学的機能を変更するために実行される。この場合もまた、以下にさらに詳細に概説されるように、特定の状態の遺伝子の重要性が確認された場合、遺伝子産物に結合し、そして／または生物学的活性を調節する薬剤のスクリーニングが実行され得る。
【０１８６】
したがって、遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルのいずれかにおいて結腸直腸癌表現型を調節する候補薬剤のスクリーニングが実行され得る。
【０１８７】
さらに、候補薬剤に応答して誘導される新規な遺伝子に対して、スクリーニングが実行され得る。結腸直腸癌発現パターンを抑制して正常の発現パターンをもたらす能力、または正常組織からの遺伝子の発現を模倣するように単一の結腸直腸癌遺伝子発現プロフィールを調節する能力に基づいて、候補薬剤を同定した後、上記のようなスクリーニングを実行して、薬剤に応答して特異的に調節される遺伝子が同定され得る。正常組織と薬剤で処置された結腸直腸癌組織との間で発現プロフィールを比較することにより、正常組織または結腸直腸癌組織では発現されないが、薬剤で処置された組織では発現される遺伝子が明らかにされる。これらの薬剤特異性配列は、結腸直腸癌遺伝子またはタンパク質について本明細書中で説明される任意の方法によって、同定および使用され得る。特にこれらの配列およびそれがコードするタンパク質は、薬剤で処置された細胞のマーキングまたは同定において用途が見出される。さらに、薬剤誘導タンパク質に対する抗体を生成して、処置された結腸直腸癌組織サンプルに対する新規治療を目標として使用され得る。
【０１８８】
したがって、１つの実施形態では、候補薬剤は、このように関連の結腸直腸癌発現プロファイルを有する結腸直腸癌細胞集団に投与される。本明細書における「投与」または「接触」は、取り込みおよび細胞内作用か、または細胞表面での作用のいずれによっても、この薬剤が細胞に作用することができるような様式で候補薬剤を細胞に添加することを意味する。いくつかの実施形態では、タンパク質性候補薬剤（すなわち、ペプチド）をコードする核酸をレトロウイルス構築物などのウイルス構築物に入れて、ペプチド薬剤の発現が達成されるように細胞へ添加し得る。ＰＣＴ  ＵＳ９７／０１０１９号（参考として本明細書中に明確に援用される）を参照されたい。
【０１８９】
一旦候補薬剤が細胞に投与されたら、必要に応じて細胞を洗浄し得、ある期間にわたって、好ましくは生理的条件下でインキュベートさせる。本明細書に概説されるように、次に細胞は回収され、新しい遺伝子発現プロファイルが作成される。
【０１９０】
したがって、例えば、結腸直腸癌組織は、結腸直腸癌表現型を減少または抑制する薬剤に対してスクリーニングされ得る。発現プロファイルの少なくと別の遺伝子の変化は、この薬剤が結腸直腸癌活性に対する効果を有することを示す。結腸直腸癌表現型のこのようなサインを定義することによって、表現型を変更する新しい薬物に対するスクリーニングを考案することができる。このアプローチでは、薬物標的は既知である必要はなく、元々の発現スクリーニングプラットフォームにおいて示される必要もなく、そして、標的タンパク質についての転写レベルが変化する必要もない。
【０１９１】
好ましい実施形態では、上記に概説されるように、スクリーニングは、個々の遺伝子および遺伝子産物（タンパク質）において実行し得る。すなわち、差次的に発現された特定の遺伝子が特定の状態で重要であると同定したら、遺伝子の発現または遺伝子産物自体のいずれかのモジュレーターのスクリーニングを実行することができる。差次的に発現された遺伝子の遺伝子産物は、本明細書中で「結腸直腸癌モジュレータータンパク質」と呼ばれることがある。結腸直腸癌モジュレータータンパク質はフラグメントでもよいし、あるいは本明細書に示されるフラグメントに対する完全長のタンパク質でもよい。好ましくは、結腸直腸癌モジュレータータンパク質は約１４〜２４アミノ酸長のフラグメントである。さらに好ましくは、このフラグメントは可溶性フラグメントである。
【０１９２】
好ましい実施形態では、フラグメントは荷電し、ｃ末端由来である。１つの実施形態では、フラグメントのｃ末端は遊離酸のままであり、ｎ末端は、結合に役立つ、すなわちシステインへの遊離アミンである。別の実施形態では、フラグメントは、タンパク質の親水性のストレッチを重複する内部ペプチドである。好ましい実施形態では、末端はブロックされる。別の好ましい実施形態では、フラグメントはＮ末端由来の新規なフラグメントである。１つの実施形態では、フラグメントはＮ末端の外側の配列を排除し、別の実施形態ではフラグメントはＮ末端の少なくとも一部を含む。「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）」は、本明細書では、上記でさらに記載される「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」と交換可能に使用される。
【０１９３】
１つの実施形態では、結腸直腸癌タンパク質は、本明細書で考察されるように、免疫原性薬剤へ結合体化される。１つの実施形態では、結腸直腸癌タンパク質はＢＳＡへ結合体化される。
【０１９４】
したがって、好ましい実施形態では、特定の遺伝子の発現のモジュレーターについてのスクリーニングを実行することができる。これは、上記に概説したように実行されるが、一般的に、ただ１つまたは数個の遺伝子の発現が評価される。
【０１９５】
好ましい実施形態では、差次的に発現されたタンパク質へ結合することができる候補薬剤をまず見出すようにスクリーニングを設計し、次に、差次的に発現された活性を調節する候補薬剤の能力を評価するアッセイにおいて、これらの薬剤を使用し得る。したがって、当業者には理解されるように、実行され得る多数の異なるアッセイ（結合アッセイおよび活性アッセイ）が存在する。
【０１９６】
好ましい実施形態では、結合アッセイが行われる。一般に、精製または単離された遺伝子産物が使用される。すなわち、差次的に発現された１つ以上の核酸の遺伝子産物が作製される。一般にこれは、当該技術分野で知られるように行われる。例えば、タンパク質遺伝子産物に対する抗体が産生され、存在するタンパク質の量を決定するために標準イムノアッセイが実行される。あるいは、結腸直腸癌タンパク質を含む細胞をアッセイで使用することができる。
【０１９７】
このように、好ましい実施形態では、方法は、結腸直腸癌タンパク質と候補生物活性薬剤とを組み合わせる工程、および候補薬剤の結腸直腸癌タンパク質への結合を決定する工程を含む。好ましい実施形態はヒト結腸直腸癌タンパク質を利用するが、たとえば、ヒトの疾病の動物モデルの開発のために、他の哺乳動物タンパク質もまた使用し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に概説されるように、改変体または誘導体の結腸直腸癌タンパク質を使用し得る。
【０１９８】
一般的に、本明細書の方法の好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質または候補薬剤は、単離サンプルの受入領域（例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど）を有する不溶性支持体へ拡散しないように結合される。不溶性支持体は組成物が結合することができる任意の組成物から製造され得、可溶性材料から容易に分離され、その他の点ではスクリーニング方法全体と適合性がある。このような支持体の表面は中実（ｓｏｌｉｄ）でも多孔質でもよく、任意の便利な形状であり得る。適切な不溶性支持体の例としては、マイクロタイタープレート、アレイ、膜、およびビーズが挙げられる。これらは通常、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、テフロン（登録商標）などから製造される。マイクロタイタープレートおよびアレイは、少量の試薬およびサンプルを用いて多数のアッセイを同時に実行することができるので、特に便利である。本発明の試薬および方法全体と適合性があり、組成物の活性を維持し、拡散しない限りは、特定の組成物結合様式は重要ではない。好ましい結合方法には、抗体（タンパク質が支持体へ結合される際に、リガンド結合部位または活性化配列のいずれかを立体的にブロックしない）の使用、「粘着性」またはイオン性支持体への直接結合、化学的な架橋、表面におけるタンパク質または薬剤の合成などが含まれる。タンパク質または薬剤の結合に続いて、過剰な非結合材料が洗浄により除去される。次に、サンプル受入領域は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の無害なタンパク質あるいは他の部分とのインキュベーションによってブロックされ得る。
【０１９９】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質を支持体へ結合させ、候補生物活性薬剤をアッセイへ添加する。あるいは、候補薬剤を支持体へ結合させ、結腸直腸癌タンパク質を添加する。新規の結合剤には、特定の抗体、化学的ライブラリのスクリーニングで同定された非天然結合剤、ペプチドアナログなどが含まれる。特に興味深いのは、ヒト細胞に対して毒性が低い薬剤のスクリーニングアッセイである。この目的のために、標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についてのイムノアッセイ、機能性アッセイ（リン酸化アッセイなど）などを含む広範な種類のアッセイを使用し得る。
【０２００】
結腸直腸癌タンパク質への候補生物活性薬剤の結合の決定は、多数の方法で行い得る。好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤が標識され、結合が直接決定される。例えば、これは、結腸直腸癌タンパク質の全てまたは一部を個体支持体へ付着させ、標識候補薬剤（例えば、蛍光標識）を添加し、過剰な試薬を洗浄して除去し、標識が固体支持体上に存在するかどうかを決定することによって行い得る。当該技術分野で知られるように、種々のブロックおよび洗浄工程を利用し得る。
【０２０１】
本明細書における「標識」とは、例えば、放射性同位体、蛍光剤、酵素、抗体、磁性粒子などの粒子、化学発光剤、または特定の結合分子などの検出可能なシグナルを提供する標識で、化合物が直接的にかまたは間接的にかのいずれかで標識されることを意味する。特定の結合分子には、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどの対が含まれる。特定の結合メンバーでは、相補的メンバーは、通常、上記に概説したように既知の手順に従って検出を提供する分子で標識される。標識は検出可能なシグナルを直接または間接的に提供することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ただ１つの成分が標識される。例えば、タンパク質（またはタンパク性候補薬剤）は、１２５Ｉを用いて、またはフルオロフォアで、チロシン位置において標識され得る。あるいは、例えばタンパク質に１２５Ｉを用い、候補薬剤にフルオロフォアを用いて、異なる標識で複数の成分を標識し得る。
【０２０３】
好ましい実施形態では、候補生物活性薬剤の結合は、競合的結合アッセイの使用により決定される。この実施形態では、競合剤は、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどの標的分子（すなわち、結腸直腸癌）へ結合することが分かっている結合部分である。ある状況下では、生物活性薬剤と結合部分との間のように、競合的結合が存在し得、結合部分は生物活性薬剤を置換する。
【０２０４】
１つの実施形態では、候補生物活性薬剤は標識される。候補生物活性薬剤または競合剤のいずれかまたは両方は、まず、結合（存在する場合）を可能にするのに十分な時間タンパク質へ添加される。インキュベーションは最適な活性を促進する任意の温度で実施され得、代表的には４〜４０℃の間である。インキュベーション時間は最適活性のために選択されるが、高速ハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化されてもよい。代表的には、０．１〜１時間の間で十分である。過剰な試薬は一般的には除去または洗浄される。第２の成分が次に添加され、結合を示すために、標識成分の有無が追跡される。
【０２０５】
好ましい実施形態では、競合剤が初めに添加され、次に候補生物活性薬剤が添加される。競合剤の置換は、候補生物活性薬剤が結腸直腸癌タンパク質に結合しており、したがって、結腸直腸癌タンパク質の活性へ結合して潜在的に調節することができることを示す。この実施形態では、いずれかの成分を標識することができる。したがって、例えば、競合剤が標識される場合、洗浄溶液中の標識の存在はこの薬剤による置換を示す。あるいは、候補生物活性薬剤が標識される場合、支持体上の標識の存在は置換を示す。
【０２０６】
代替の実施形態では、候補生物活性薬剤が初めに添加され、インキュベーションおよび洗浄され、次に競合剤が添加される。競合剤による結合が存在しないことは、生物活性薬剤が結腸直腸癌タンパク質とより高い親和性で結合することを示し得る。したがって、候補生物活性薬剤が標識される場合、競合剤の結合なしで結合された支持体上の標識の存在は、候補薬剤が結腸直腸癌タンパク質に結合することができることを示し得る。
【０２０７】
好ましい実施形態では、この方法は、結腸直腸癌タンパク質の活性を調節することができる生物活性薬剤を同定するためのディファレンシャルスクリーニングを含む。この実施形態では、方法は、結腸直腸癌タンパク質および競合剤を第１のサンプル中で組み合わせる工程を含む。第２のサンプルは、候補生物活性薬剤、結腸直腸癌タンパク質、および競合剤を含む。競合剤の結合は両方のサンプルについて決定され、２つのサンプル間の結合の変化または差異は、結腸直腸癌タンパク質へ結合してその活性を潜在的に調節することができる薬剤の存在を示す。すなわち、競合剤の結合が第１のサンプルに対して第２のサンプルで異なる場合、この薬剤は結腸直腸癌タンパク質へ結合することができる。
【０２０８】
あるいは、好ましい実施形態はディファレンシャルスクリーニングを利用して、天然結腸直腸癌タンパク質へ結合するが、修飾結腸直腸癌タンパク質へ結合できない薬物候補を同定する。結腸直腸癌タンパク質の構造はモデル化することができ、その部位と相互作用をする薬剤を合成するために、合理的な薬物設計において使用され得る。結腸直腸癌生物活性に影響を及ぼす薬物候補はまた、タンパク質の活性を増強するかまたは減少するかのいずれかの能力について薬物をスクリーニングすることによって同定される。
【０２０９】
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをアッセイにおいて使用することができる。好ましくは、全てのコントロールおよび試験サンプルは、統計的に有意な結果を得るために少なくとも連で実行される。全てのサンプルのインキュベーションは、この薬剤のタンパク質への結合に十分な時間行われる。インキュベーションに続いて、全てのサンプルは非特異的に結合した材質がないように洗浄され、結合された、一般に標識された薬剤の量が決定される。例えば、放射標識が使用される場合には、結合化合物の量を決定するために、シンチレーションカウンタでサンプルを計数し得る。
【０２１０】
スクリーニングアッセイには、種々の他の試薬が含まれてもよい。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進するため、および／または非特異性もしくはバックグラウンド相互作用を減少するために使用され得る、塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような試薬が含まれる。また、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などの、別のやり方でアッセイの効率を改良する試薬を使用し得る。成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で添加され得る。
【０２１１】
結腸直腸癌タンパク質の活性を調節する薬剤のスクリーニングもまた、実行することができる。好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質の活性を調節することができる生物活性薬剤のスクリーニングのための方法は、上記のように結腸直腸癌タンパク質のサンプルへ候補生物活性薬剤を添加する工程と、結腸直腸癌タンパク質の生物活性の変更を決定する工程とを含む。「結腸直腸癌の活性を調節する」には、活性の増大、活性の減少、または存在する活性の型もしくは種類の変化が含まれる。したがって、この実施形態では、候補薬剤は結腸直腸癌タンパク質へ結合する（これは必要でないかもしれないが）と共に、本明細書中で定義されるその生物学的または生化学的活性を変更しなければならない。この方法には、結腸直腸癌タンパク質の存在、分布、活性または量の変更についての、インビトロスクリーニング法（上記で一般的に概説される）および細胞のインビボスクリーニングの両方が含まれる。
【０２１２】
したがって、この実施形態では、方法は、結腸直腸癌サンプルと候補生物活性薬剤とを組み合わせる工程、および結腸直腸癌活性に対する効果を評価する工程を含む。本明細書中の「結腸直腸癌活性」または文法的に等価な用語は、結腸直腸癌の生物活性の１つを意味し、好ましくは結腸組織における細胞分裂、細胞増殖、腫瘍増殖、細胞の形質転換などが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、結腸直腸癌活性は、表１の核酸によって同定される遺伝子の活性化を含む。結腸直腸癌活性のインヒビターは、任意の１つ以上の結腸直腸癌活性の阻害である。
【０２１３】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質の活性は増大され、別の好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質の活性は減少される。したがって、ある実施形態ではアンタゴニストである生物活性薬剤が好ましく、他の実施形態ではアゴニストである生物活性薬剤が好まれ得る。
【０２１４】
好ましい実施形態では、本発明は、結腸直腸癌タンパク質の活性を調節することができる生物活性薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、結腸直腸癌タンパク質を含む細胞へ、上記のような候補生物活性薬剤を添加することを含む。好ましい細胞型には、ほとんどどの細胞も含まれる。細胞は、結腸直腸癌タンパク質をコードする組換え核酸を含む。好ましい実施形態では、候補薬剤のライブラリが複数の細胞において試験される。
【０２１５】
１つの局面では、アッセイは、例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、化学療法剤を含む薬理学的薬剤、放射線、発癌性物質または他の細胞（すなわち、細胞−細胞接触）などの、生理的シグナルの存在または非存在下、あるいは生理的シグナルに前または後での曝露で評価される。別の例では、決定は細胞周期プロセスの種々の段階で決定される。
【０２１６】
このようにして、生物活性薬剤が同定される。薬理活性を有する化合物は、結腸直腸癌タンパク質の活性を増強または妨害することができる。１つの実施形態では、本明細書で使用される「結腸直腸癌タンパク質活性」は、以下の、結腸直腸癌活性、結腸直腸癌タンパク質への結合、結腸直腸癌タンパク質の活性化、または結腸直腸癌タンパク質による結腸直腸癌タンパク質の基質の活性化のうちの少なくとも１つを含む。１つの実施形態では、結腸直腸癌活性は、結腸組織の調節されない増殖、あるいは結腸組織の癌の増殖として定義される。１つの局面では、本明細書に定義される結腸直腸癌活性は、結腸癌組織の結腸直腸癌タンパク質の上方制御における結腸直腸癌タンパク質の活性に関連する。
【０２１７】
別の実施形態では、結腸直腸癌タンパク質活性は、以下：結腸直腸癌活性、ＣＢＦ９核酸もしくは表２のポリペプチドへの結合、表１の核酸もしくは表１の核酸によりコードされるペプチドへの結合、または表１の核酸により同定される遺伝子産物の基質、もしくは表２に示されるＣＢＦ９の基質の活性化、のうちの少なくとも１つを含む。１つの局面では、本明細書に定義される結腸直腸癌活性は、結腸癌組織において、表１の核酸により定義される遺伝子の活性、または表２に定義されるＣＢＦ９の活性に関連する。
【０２１８】
１つの実施形態では、結腸癌細胞分裂を阻害する方法が提供される。この方法は、結腸直腸癌インヒビターの投与を含む。
【０２１９】
別の実施形態では、腫瘍の増殖を阻害する方法が提供される。この方法は、結腸直腸癌インヒビターの投与を含む。
【０２２０】
さらなる実施形態では、細胞または癌を有する個体を処置する方法が提供される。この方法は、結腸直腸癌インヒビターの投与を含む。
【０２２１】
１つの実施形態では、結腸直腸癌インヒビターは、上記のように抗体である。別の実施形態では、結腸直腸癌インヒビターはアンチセンス分子である。本明細書で使用されるアンチセンス分子としては、結腸直腸癌分子の標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましいアンチセンス分子は、表１もしくは表２に参照される結腸直腸癌配列、またはそのリガンドもしくは活性化剤に対するものである。本発明に従うアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドのフラグメントを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）、ならびにｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，１９８８）に記載される。
【０２２２】
アンチセンス分子は、ＷＯ  ９１／０４７５３号に記載されるように、リガンド結合分子との結合体を形成することによって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞内へ導入し得る。適切なリガンド結合分子には、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の結合体化は、リガンド結合分子がその対応の分子またはレセプターと結合する能力、あるいはセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合体化バージョンが細胞に侵入するのをブロックする能力を実質的に妨害しない。あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ  ９０／１０４４８号に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含有する細胞内へ導入され得る。また、アンチセンス分子の使用またはノックアウトおよびノックインモデルは、処置方法に加えて、上記のスクリーニングアッセイにおいても使用され得ることが理解される。
【０２２３】
所望の薬理活性を有する化合物は、既に記載したように、生理学的に受容可能なキャリヤ中で宿主へ投与され得る。薬剤は、経口、非経口（例えば、皮下、腹腔内、血管内）などの種々の方法で投与され得る。導入の仕方に依存して、化合物を種々の方法で処方し得る。治療的に活性な化合物の処方物中の濃度は、約０．１〜１００重量％で変化し得る。薬剤は単独で投与されても、他の処置、すなわち放射線と組み合わせられてもよい。
【０２２４】
薬学的組成物は、顆粒、錠剤、丸薬、坐剤、カプセル、懸濁液、軟膏、ローションなどの種々の形態で調製され得る。経口および局所的な使用に適切な薬学的グレードの有機または無機のキャリヤおよび／または希釈剤を使用して、治療的に活性な化合物を含有する組成物を作製することができる。当該技術分野で知られている希釈剤としては、水性媒体、植物油、動物油および脂肪がある。安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩または適切なｐＨ値を確保するための緩衝液、ならびに皮膚浸透増強剤は、補助剤として使用することができる。
【０２２５】
理論に拘束されずに、結腸直腸癌において種々の結腸直腸癌配列が重要であると思われる。したがって、変異体または改変体の結腸直腸癌遺伝子に基づく障害を決定し得る。１つの実施形態では、本発明は、細胞中の少なくと別の内因性結腸直腸癌遺伝子の配列の全てまたは一部を決定する工程を含む、改変体結腸直腸癌遺伝子を含有する細胞を同定するための方法を提供する。当業者には理解されるように、これは、多数の配列決定技法を用いて実行され得る。好ましい実施形態では、本発明は、個体の少なくと別の結腸直腸癌遺伝子の配列の全てまたは一部を決定する工程を含む、個体の結腸直腸癌遺伝子型を同定する方法を提供する。これは、一般的に、個体の少なくと別の組織において行われ、多数の組織または同じ組織の異なるサンプルの評価を含み得る。方法は、配列決定された結腸直腸癌遺伝子の配列を既知の結腸直腸癌遺伝子、すなわち野生型遺伝子と比較する工程を含み得る。
【０２２６】
結腸直腸癌遺伝子の全てまたは一部の配列は、次に、既知の結腸直腸癌遺伝子の配列と比較され、任意の差異が存在するかどうかを決定することができる。これは、Ｂｅｓｔｆｉｔなどの多数の既知の相同性プログラムを用いて行うことができる。好ましい実施形態では、患者の結腸直腸癌遺伝子と既知の結腸直腸癌遺伝子との間の配列の差異の存在は、本明細書に概説されるように、疾患状態または疾患状態の傾向を示す。
【０２２７】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌遺伝子は、ゲノムにおける結腸直腸癌遺伝子のコピー数を決定するためにプローブとして使用される。
【０２２８】
別の好ましい実施形態では、結腸直腸癌遺伝子は、結腸直腸癌遺伝子の染色体局在を決定するためにプローブとして使用される。染色体局在のような情報は、特に、転座などのような染色体異常が結腸直腸癌遺伝子座において同定される場合に、診断または予後の提供において用途が見出される。
【０２２９】
したがって、１つの実施形態では、細胞または生物体において結腸直腸癌を調節する方法が提供される。１つの実施形態では、方法は、内因性結腸直腸癌タンパク質の生物学的活性を減少または排除する抗結腸直腸癌抗体を細胞に投与する工程を含む。あるいは、方法は、結腸直腸癌タンパク質をコードする組換え核酸を細胞または生物体へ投与する工程を含む。当業者には理解されるように、これは、多数の方法で達成され得る。好ましい実施形態では、例えば、結腸直腸癌において結腸直腸癌配列が下方制御される場合、例えば内因性結腸直腸癌を過剰発現させて、細胞中の結腸直腸癌の量を増大させることによるか、あるいは例えば既知の遺伝子治療技法を用いて、結腸直腸癌配列をコードする遺伝子を投与することによって、結腸直腸癌遺伝子の活性は増大される。好ましい実施形態では、遺伝子治療技法は、例えばＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８（参考としてその全体が本明細書中に援用される）に記載されるように、増強された相同組換え（ＥＨＲ）を用いる発情（ｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子の組み込みを含む。あるいは、例えば、結腸直腸癌において結腸直腸癌配列が上方制御される場合、内因性結腸直腸癌遺伝子の活性は、例えば結腸直腸癌アンチセンス核酸を投与することによって減少される。
【０２３０】
１つの実施形態では、本発明の結腸直腸癌タンパク質を使用して、結腸直腸癌タンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生することができ、これは本明細書に記載されるように有用である。同様に、結腸直腸癌タンパク質は、標準技術を用いて、アフィニティクロマトグラフィカラムへ結合され得る。次に、これらのカラムを使用して、結腸直腸癌抗体を精製することができる。好ましい実施形態では、抗体は、結腸直腸癌タンパク質に独特なエピトープに対して産生される。すなわち、抗体は他のタンパク質に対して交差反応性をほとんど示さないか、あるいは全く示さない。これらの抗体は、多数の応用における用途が見出す。例えば、結腸直腸癌抗体は標準アフィニティクロマトグラフィカラムへ結合され、結腸直腸癌タンパク質を精製するために使用され得る。抗体はまた、結腸直腸癌タンパク質に特異的に結合するので、上記のように、ブロッキングポリペプチドとして使用され得る。
【０２３１】
１つの実施形態では、治療的に有効な用量の結腸直腸癌またはそのモジュレーターが患者に投与される。本明細書中の「治療的に有効な用量」とは、投与されて効果を生成する用量を意味する。正確な用量は治療の目的に依存し、既知の技法を用いて、当業者によって確かめられる。当該技術分野において知られるように、結腸直腸癌の分解、全身的な送達対局所的な送達、および新しいプロテアーゼ合成の速度の調整、ならびに年齢、体重、全体的な健康、性別、食習慣、投与時間、薬物の相互作用および状態の重症度が必要とされ得、当業者によって、日常的な実験で確かめられる。
【０２３２】
本明細書の目的のための「患者」は、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物、ならびに生物体を含む。したがって、方法は、ヒトの治療および獣医的用途の両方に適用可能である。好ましい実施形態では、患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施形態では患者はヒトである。
【０２３３】
本発明の結腸直腸癌タンパク質およびモジュレーターの投与は、上記の種々の方法で行うことができ、経口、皮下、静脈内、経鼻、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、経膣、経腸、または眼内が含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、例えば創傷および炎症の処置では、結腸直腸癌タンパク質およびモジュレーターは、溶液またはスプレーで直接適用され得る。
【０２３４】
本発明の薬学的組成物は、患者へ投与するのに適切な形態の結腸直腸癌タンパク質を含む。好ましい実施形態では、薬学的組成物は水溶性の形態であり、例えば、薬学的に許容可能な塩として存在し、これは酸および塩基付加塩の両方を含むことを意味する。「薬学的に許容可能な酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、生物学的または他の点で望ましい塩のことを示し、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などの無機酸と、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸などの有機酸とで形成される。「薬学的に許容可能な塩基付加塩」とは、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、およびアルミニウム塩などの無機塩基由来の塩基を含む。特に好ましいのはアンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマンガン塩である。薬学的に許容可能な無毒性の有機塩基由来の塩には、第一アミン、第二アミン、および第三アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンなど）の塩が含まれる。
【０２３５】
また、薬学的組成物は、以下の、担体タンパク質（血清アルブミンなど）、緩衝液、充填剤（微結晶性セルロース、ラクトース、コーンまたは他のスターチなど）、結合剤、甘味剤およびその他の風味剤、着色剤、およびポリエチレングリコールのうちの１つ以上を含むことができる。添加剤は当該技術分野において周知であり、種々の処方で使用される。
【０２３６】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌タンパク質およびモジュレータは治療剤として投与され、上記のように処方され得る。同様に、結腸直腸癌遺伝子（完全長配列、部分配列の両方、または結腸直腸癌コード領域の調節配列を含む）は、当該技術分野で知られるように、遺伝子治療の応用において投与され得る。これらの結腸直腸癌遺伝子は、当業者に理解されるように、遺伝子治療（すなわち、ゲノムへの組み込み）として、またはアンチセンス組成物としてのいずれかのアンチセンス適応を含むことができる。
【０２３７】
好ましい実施形態では、結腸直腸癌遺伝子は、単一の遺伝子または結腸直腸癌遺伝子の組み合わせのいずれかのＤＮＡワクチンとして投与される。裸のＤＮＡワクチンは、当該技術分野において一般的に知られている。Ｂｒｏｗｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：１３０４−１３０５（１９９８）。
【０２３８】
１つの実施形態では、本発明の結腸直腸癌遺伝子は、ＤＮＡワクチンとして使用される。遺伝子をＤＮＡワクチンとして使用するための方法は当業者に周知であり、発現のプロモーターの制御下で、結腸直腸癌遺伝子または結腸直腸癌遺伝子の一部を結腸直腸癌患者に配置することを含む。ＤＮＡワクチンに使用される結腸直腸癌遺伝子は、完全長の結腸直腸癌タンパク質をコードすることができるが、より好ましくは、結腸直腸癌タンパク質由来のペプチドを含む結腸直腸癌タンパク質の一部をコードする。好ましい実施形態では、患者は、結腸直腸癌遺伝子由来の複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫化される。同様に、本明細書に定義されるように、複数の結腸直腸癌遺伝子またはその一部で患者を免疫化することが可能である。理論で拘束されずに、ＤＮＡワクチンによりコードされるポリペプチドの発現、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、および抗体が誘発され、結腸直腸癌タンパク質を発現する細胞を認識および破壊または排除する。
【０２３９】
好ましい実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンと共にアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。このようなアジュバント分子には、ＤＮＡワクチンによりコードされる結腸直腸癌ポリペプチドに対する免疫原性応答を増大するサイトカインが含まれる。さらなるまたは代替のアジュバントは当業者に知られており、本明細書において用途が見出される。
【０２４０】
別の好ましい実施形態では、結腸直腸癌遺伝子は、結腸直腸癌の動物モデルの作成における用途が見出される。当業者には理解されるように、同定された結腸直腸癌遺伝子が結腸直腸癌組織において抑制または減少される場合、アンチセンスＲＮＡが結腸直腸癌遺伝子へ向けられる遺伝子治療技法もまた、遺伝子の発現を抑制または減少するであろう。このように作成された動物は結腸直腸癌の動物モデルとして役に立ち、生物活性薬物候補のスクリーニングにおける用途が見出される。同様に、遺伝子ノックアウトテクノロジーにより、例えば適切な遺伝子ターゲッティングベクターとの相同組換えの結果、結腸直腸癌タンパク質は存在しなくなるであろう。所望される場合には、結腸直腸癌タンパク質の組織特異的発現またはノックアウトが必要とされ得る。
【０２４１】
また、結腸直腸癌タンパク質は結腸直腸癌で過剰発現されることも可能である。このように、結腸直腸癌タンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物を作成することができる。所望の発現レベルに応じて、種々の強度のプロモーターを使用して、導入遺伝子を発現させることができる。また、組み込まれた導入遺伝子のコピー数を決定し、導入遺伝子の発現レベルの決定のために比較することができる。このような方法で作成された動物は結腸直腸癌の動物モデルとしての用途があり、さらに、結腸直腸癌を処置するための生物活性分子のスクリーニングにおいても有用である。
【０２４２】
（実施例）
本明細書に記載される実施例は、決して本発明の真の範囲を限定することはなく、例示的な目的で提供されるものであることを理解されたい。本明細書中に引用される全ての参考文献および寄託番号の配列は、参照によってその全体が援用される。
【０２４３】
（実施例１）
（組織の調製、標識用チップ、およびフィンガープリント）
ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて、組織から全ＲＮＡを精製する。
【０２４４】
組織重量を測定する。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ３１００ホモジナイザーを用いて、５０ｍｇの組織当たり１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ中で組織サンプルをホモジナイズする。使用する発生器／プローブは組織の大きさに依存する。ホモジナイズされる組織の量に対して大きすぎる発生器はサンプルの損失を引き起こし、ＲＮＡ収率が減少する。０．６ｇよりも重い組織に対しては、２０ｍｍ発生器を使用する。作業容積が２ｍｌよりも大きい場合には、１５ｍｌのポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  ２０５９）中で組織をホモジナイズする。チューブに充填するのは１０ｍｌ以下である。
【０２４５】
（ホモジナイゼーション）
発生器を使用する前に、最後に使用した後、セッケンＨ２０により流して十分にすすぐことによって清浄化されてなければならない。滅菌のためにＥｔＯＨで流す。準備できるまで組織を凍結保存する。ＴＲＩｚｏｌを凍結組織へ直接添加してから、ホモジナイズする。
【０２４６】
ホモジナイゼーションに続いて、Ｓｏｒｖａｌｌスーパースピードでは７５００×ｇで１５分間、あるいはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機では１２，０００×ｇで１０分間、４℃における遠心分離によって不溶性材質をホモジネ−トから除去する。透明ホモジネートを新しいチューブへ移す。サンプルはこの時点で−６０〜−７０℃で凍結でき（および少なくとも１ヶ月間は保存することができる）、あるいは精製を続けることもできる。
【０２４７】
（相分離）
ホモジナイズされたサンプルを室温で５分間インキュベートする。
【０２４８】
最初のホモジナイゼーションで使用したＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍｌあたり０．２ｍｌのクロロホルムを添加する。
【０２４９】
チューブにしっかりと蓋をし、１５秒間、チューブを手で激しく振る（ボルテックスにしない）。
【０２５０】
サンプルを室温で２〜３分間インキュベートする。Ｓｏｒｖａｌｌスーパースピードにおいて、６５００ｒｐｍ、４℃で３０分間、サンプルを遠心分離する（最高１２，０００×ｇで１０分間回転させてもよいが、遠心分離機中でチューブが壊れる危険がある）。
【０２５１】
（ＲＮＡ沈殿）
水相を新たなチューブへ移す。ＤＮＡまたはタンパク質の単離が所望される場合には、有機相を保存しておく。最初のホモジナイゼーションで使用したＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍｌあたり０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを添加する。チューブにしっかりと蓋をし、反転させて混ぜ合わせる。サンプルを室温で１０分間インキュベートする。Ｓｏｒｖａｌｌにおいて、６５００ｒｐｍ、４℃で２０分間、サンプルを遠心分離する。
【０２５２】
（ＲＮＡ洗浄）
上清を注ぎ出す。ペレットを７５％冷エタノールで洗浄する。最初のホモジナイゼーションで使用したＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍｌあたり１ｍｌの７５％エタノールを使用する。チューブにしっかりと蓋をし、数回反転させてペレットをバラバラにする（ボルテックスにしない）。８０００ｒｐｍ未満（７５００×ｇ未満）、４℃で５分間、遠心分離する。
【０２５３】
洗浄液を注ぎ出す。ペレットをエッペンドルフチューブへ注意深く移す（チューブから新しいチューブへ滑り落とす、必要であればピペットチップを用いて導入を助ける）。作業する容積に応じて、ＲＮＡを沈殿させるためにどの大きさのチューブが必要であるかを決定することができる。１５ｍｌの大きいチューブにＲＮＡを入れたままで試みたら、乾燥するのに非常に時間がかかった（すなわち、乾燥しなかった）ため、結局は、より小さいチューブへ移さなければならなかった。ペレットをフード内で乾燥させる。ＲＮＡを適切な容積のＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ中に再懸濁させる。２〜５ｕｇ／ｕｌを試みる。吸光度を読み取る。
【０２５４】
全ＲＮＡからポリＡ＋ｍＲＮＡを精製するか、あるいはＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットで全ＲＮＡをクリーンアップする。
【０２５５】
全ＲＮＡからポリＡ＋ｍＲＮＡを精製する。ＲＮＡへ添加する直前に、ｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を３７℃に加熱して混合する。７０℃でＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒをインキュベートする。緩衝液中に沈殿があれば、２×Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを６５℃へ暖める。Ｏｌｉｇｏｔｅｘハンドブックの１６頁の表２に従って、全ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水、２×Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、およびＯｌｉｇｏｔｅｘと混合する。６５℃で３分間インキュベートする。室温で１０分間インキュベートする。
【０２５６】
１４，０００〜１８，０００ｇで２分間遠心分離する。遠心機に「弱設定」があれば、それを使用する。Ｏｌｉｇｏｔｅｘペレットを乱すことなく上清を除去する。Ｏｌｉｇｏｔｅｘの損失を低くするために、ほんのわずかな溶液を残すこともできる。ポリＡ＋ｍＲＮＡの満足することができる結合および溶出が生じたことを確認するまで、上清を保存する。
【０２５７】
Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＯＷ２中に徐々に再懸濁し、スピンカラム上にピペットで取る。スピンカラムを最高速度で（できれば弱設定）１分間遠心分離する。
【０２５８】
スピンカラムを新しい収集チューブへ移し、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＯＷ２中に徐々に再懸濁し、本明細書中に記載されるように遠心分離する。
【０２５９】
スピンカラムを新しいチューブへ移し、２０〜１００ｕｌの予熱（７０℃）したＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで溶出させる。ピペットで上下させて、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ樹脂を徐々に再懸濁する。上記のように遠心分離する。新しい溶出緩衝液で溶出を繰り返すか、または溶出容積を小さくために、最初の溶出液を用いる。
【０２６０】
希釈したＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒをブランクとして使用して、吸光度を読み取る。
【０２６１】
ｃＤＮＡ合成を進める前に、ｍＲＮＡを沈殿させなければならない。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ精製手順からの残りの幾つかの成分、またはＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中の幾つかの成分は、ｍＲＮＡの下流の酵素反応を阻害するであろう。
【０２６２】
（エタノール沈殿）
０．４容量の７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ＋２．５容量の１００％冷エタノールを添加する。−２０℃で１時間から一晩（または、−７０℃で２０〜３０分）沈殿させる。１４，０００〜１６，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離する。ペレットを０．５ｍｌの８０％エタノール（−２０℃）で洗浄し、次に１４，０００〜１６，０００×ｇで５分間、室温で遠心分離する。８０％エタノール洗浄を繰り返す。フード中でペレットから最後の一滴までエタノールを乾燥させる（スピード真空処理しない）。１ｕｇ／ｕｌの濃度でペレットをＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ中に懸濁する。
【０２６３】
（ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを用いる全ＲＮＡのクリーンアップ）
ＲＮｅａｓｙカラムへ１００ｕｇ以下を添加する。ＲＮＡ分解酵素を含まない水を用いて、サンプルを１００ｕｌの容積に調整する。サンプルに３５０ｕｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを添加し、次に２５０ｕｌのエタノール（１００％）を添加する。ピペットにより混合し（遠心分離しない）、次に、サンプルをＲＮｅａｓｙミニスピンカラムへ適用する。１０，０００より速いｒｐｍで１５秒間遠心分離する。収率が心配である場合には、流出液（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）を再度カラムへ適用し、もう一度遠心分離する。
【０２６４】
カラムを新しい２ｍｌの収集チューブへ移す。５００ｕｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥを添加し、１０，０００より速いｒｐｍで１５秒間遠心分離する。流出液を廃棄する。５００ｕｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥを添加し、１０，０００より速いｒｐｍで１５秒間遠心分離する。流出液を廃棄し、次に、最大速度で２分間遠心分離して、カラム膜を乾燥させる。カラムを新しい１．５ｍｌの収集チューブへ移し、３０〜５０ｕｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水をカラム膜へ直接適用する。１０，０００より速いｒｐｍで１分間遠心分離する。溶出を繰り返す。
【０２６５】
吸光度を読み取る。必要であれば、酢酸アンモニウムおよび２．５×容量の１００％エタノールによりエタノール沈殿を行う。
【０２６６】
Ｇｉｂｃｏの「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」キットを用いて、ｃＤＮＡを作製する。
【０２６７】
（第１鎖ｃＤＮＡ合成）
出発物質として、５ｕｇの全ＲＮＡまたは１ｕｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを用いる。全ＲＮＡでは、２ｕｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴを使用する。ポリＡ＋ｍＲＮＡでは、１ｕｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴを使用する。第１鎖合成混合物の最終容積は２０ｕｌである。ＲＮＡは１０  ｕｌ以下の容積でなければならない。１ｕｌの１００ｐｍｏｌのＴ７〜Ｔ２４オリゴと共にＲＮＡを７０℃で１０分間インキュベートする。氷上で、４ｕｌの５×１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ、２ｕｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、および１ｕｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物を７ｕｌ添加する。３７℃で２分間インキュベートし、次にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴを添加する。
【０２６８】
３７℃で１時間インキュベートする。
【０２６９】
（第２鎖合成）
第１鎖反応物を氷上に配置する。
【０２７０】
添加する：９１ｕｌ  ＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ
３０ｕｌ  ５×２ｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ
３ｕｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物
１ｕｌ  １０Ｕ／ｕｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ
４ｕｌ  １０Ｕ／ｕｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ
１ｕｌ  ２Ｕ／ｕｌ  ＲＮＡ分解酵素Ｈ
２つより多いサンプルがある場合には、上記を混合物にする。混合して、１６℃で２時間インキュベートする。
【０２７１】
２ｕｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを添加する。１６℃で５分間インキュベートする。１０ｕｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加する。
【０２７２】
ｃＤＮＡをクリーンアップする。
【０２７３】
Ｐｈａｓｅ−Ｌｏｃｋゲルチューブを用いて、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）精製：
ＰＬＧチューブを最大速度で３０秒間遠心分離する。ｃＤＮＡ混合物をＰＬＧチューブへ移す。同容積のフェノール：クロロホルム：イスアミルアルコールを添加し、激しく振とうする（ボルテックスにしない）。最大速度で５分間遠心分離する。上部の水溶液を新しいチューブへ移す。エタノール沈殿：７．５×５Ｍ  ＮＨ４Ｏａｃおよび２．５×容積の１００％エタノールを添加する。最大速度で２０分間、室温で直ちに遠心分離する。上清を除去し、次にペレットを８０％冷エタノールで２回洗浄する。エタノール洗浄液をできるだけ多く除去し、次にペレットを空気乾燥させる。３ｕｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水中にペレットを再懸濁させる。
【０２７４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）およびビオチンによる標識
薄壁ＰＣＲチューブ内に１．５ｕｌのｃＤＮＡをピペットで取る。
【０２７５】
ＮＴＰ標識用混合物の作製：
室温で組み合わせる：２ｕｌ  Ｔ７  １０×ＡＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
２ｕｌ      Ｔ７  １０×ＧＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
１．５ｕｌ  Ｔ７  １０×ＣＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
１．５ｕｌ  Ｔ７  １０×ＵＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
３．７５ｕｌ  １０ｍＭ  Ｂｉｏ−１１−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ／Ｒｏｃｈｅ  ｏｒ  Ｅｎｚｏ）
３．７５ｕｌ  １０ｍＭ  Ｂｉｏ−１６−ＣＴＰ（Ｅｎｚｏ）
２ｕｌ        １０×Ｔ７転写緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）
２ｕｌ        １０×Ｔ７酵素混合物（Ａｍｂｉｏｎ）
全反応の最終容積は２０ｕｌである。ＰＣＲ機において３７℃で６時間インキュベートする。
【０２７６】
（ＩＶＴ産物のＲＮｅａｓｙクリーンアップ）
ＲＮｅａｓｙカラムついての前述の指示に従うか、あるいはＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙプロトコルハンドブックを参照する。
【０２７７】
ｃＲＮＡは、たいてい、エタノール沈殿されることを必要とするであろう。フラグメント化工程と適合する容積に再懸濁される。
【０２７８】
（フラグメント化）
１５ｕｇの標識ＲＮＡが通常フラグメント化される。フラグメント化の反応容積を最小限にすることを試みる：１０ｕｌ容積が推奨されるが、２０ｕｌでも大丈夫である。フラグメント化緩衝液中のマグネシウムがハイブリダイゼーション緩衝液における沈殿に寄与するので、２０ｕｌよりも多くならないようにする。
【０２７９】
１×フラグメント化緩衝液中、９４℃で３５分間のインキュベーションによりＲＮＡをフラグメント化する。
【０２８０】
５×フラグメント化緩衝液
２００ｍＭ  トリス酢酸塩、ｐＨ８．１
５００ｍＭ  ＫＯＡｃ
１５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ
フラグメント化の前後に、標識ＲＮＡ転写を分析することができる。サンプルを６５℃で１５分間加熱し、１％アガロース／ＴＢＥゲル上で電気泳動させ、転写サイズ範囲のおおよその見解を得ることができる。
【０２８１】
（ハイブリダイゼーション）
２００ｕｌ（１０ｕｇのｃＲＮＡ）のハイブリダイゼーション混合物をチップ上に配置する。多数のハイブリダイゼーションが実行される場合（５チップセットによるサイクリングなど）には、３００ｕｌ以上の初期ハイブリダイゼーション混合物を作製することが推奨される。
【０２８２】
ハイブリダイゼーション混合物：フラグメント標識ＲＮＡ（５０ｎｇ／ｕｌ最終濃度）
５０ｐＭ９４８−ｂコントロールオリゴ
１．５ｐＭ  ＢｉｏＢ
５ｐＭ  ＢｉｏＣ
２５ｐＭ  ＢｉｏＤ
１００ｐＭ  ＣＲＥ
０．１ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡ
０．５ｍｇ／ｍｌ  アセチル化ＢＳＡ
１×ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液で３００ｕｌへ
本明細書中で使用される製品の取扱説明書は、本明細書中にその全体が援用される。
【０２８３】
本明細書中で提供される標識プロトコル
ハイブリダイゼーション反応：
非ビオチン化ＩＶＴ（ＲＮｅａｓｙカラムにより精製）と共に開始
（組織からＩＶＴへの工程については実施例１を参照）
ＩＶＴアンチセンスＲＮＡ；４μｇ：    μｌ
Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒｓ（１μｇ／μｌ）：４μｌ
Ｈ２Ｏ：                              μｌ
１４μｌ
−  ７０℃で１０分間インキュベート。氷上に配置する。
【０２８４】
逆転写：
2004515225.tif 000003
−  ハイブリダイゼーション反応へ添加
−  ４２℃で３０分間インキュベート
−  １μｌのＳＳＩＩを添加し、さらに１時間放置する
氷上に配置する。
【０２８５】
−  ５０×ｄＮＴＰ混合物（２５ｍＭの冷ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、１０ｍＭのｄＴＴＰ：それぞれ２５μｌの１００ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；１５μｌのＨ２Ｏへの１０μｌの１００ｍＭ  ｄＴＴＰ。ｄＮＴＰはＰｈａｒｍａｃｉａ製）
（ＲＮＡ分解）
８６μｌＨ２Ｏ
−  １．５μｌの１Ｍ  ＮａＯＨ／２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加、６５℃で１０分間インキュベート。
【０２８６】
１０μｌの１０Ｎ  ＮａＯＨ
４μｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ
Ｕ−Ｃｏｎ  ３０
５００μｌ  ＴＥ／サンプルは７０００ｇで１０分間回転する。流出液は精製のために保存する。
【０２８７】
（Ｑｉａｇｅｎ精製）
−  ｕ−ｃｏｎ回収物質を５００μｌの緩衝液ＰＢ中に懸濁
−  正常（ｗ／ｎｏｒｍａｌ）Ｑｉａｇｅｎプロトコルを用いて進行
ＤＮＡｓｅ消化：
−  ＤＮＡｓｅ／３０μｌ  Ｒｘの１／１００希釈液１μｌを添加し、３７℃で１５分間インキュベート
−  酵素を変性させるために、５分間９５℃にする
（サンプル調製）
−  添加：
Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ：１０μｌ
５０×ｄＮＴＰｓ：１μｌ
ピロリン酸Ｎａ：７．５μｌ
１０ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡ  １／１０希釈液の１μｌ
２１．８最終容積
−  スピード真空乾燥する。
【０２８８】
−  １５μｌ  Ｈ２Ｏ中に再懸濁する。
【０２８９】
−  ０．３８μｌ  １０％ＳＤＳを添加する。
【０２９０】
−  ９５℃で２分間加熱
−  ２０分間で室温へゆっくり冷却する。
【０２９１】
スライド上に置き、６４℃で一晩ハイブリダイズする。
【０２９２】
（ハイブリダイゼーション後の洗浄）
３×ＳＳＣ／０．０３％ＳＤＳ：    ２分間、２５０ｍｌ  Ｈ２Ｏ中、３７．５ｍｌ  ２０×ＳＳＣ＋０．７５ｍｌ  １０％ＳＤＳ
１×ＳＳＣ：５分間      ２５０ｍｌ  Ｈ２Ｏ中、１２．５ｍｌの２０×ＳＳＣ
０．２×ＳＳＣ：５分間  ２５０ｍｌ  Ｈ２Ｏ中、２．５ｍｌの２０×ＳＳＣ
遠心分離機内で、１０００ＲＰＭで１分間スライドを乾燥させる。
【０２９３】
適切な光電子増倍チューブ（ＰＭＴ）および蛍光励起および発光チャネルを用いて走査する。
【０２９４】
結果は表１および表２に示される。遺伝子の一覧は、疾病の種々の段階からの結腸直腸腫瘍に由来する。また、腫瘍内で上方制御される遺伝子（全体的に）は、身体マップ（ｂｏｄｙ  ｍａｐ）において、限られた量で発現されるか、あるいは全く発現されないことがわかった。身体マップは少なくとも２８の組織型からなり、副腎、膀胱、骨髄、脳、胸部、頚部、結腸、横隔膜、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、前立腺、直腸、唾液腺、皮膚、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、および子宮が挙げられる。示されるように、寄託番号のうちのいくつかは、発現配列タグ（ＥＳＴ）を含む。したがって、本明細書中の１つの実施形態では、発現プロファイル内の遺伝子はまた、発現プロファイル遺伝子とも呼ばれ（ＥＳＴを含む）、完全長である必要はない。
【０２９５】
表１は、結腸腫瘍組織において上方制御される１７４７個の遺伝子の寄託番号を示す。この表は、ｅｘｅｍｐｌａｒ寄託番号、ＵｎｉｇｅｎｅＩＤ番号、独自のＥｏｓコード、コードされる遺伝子の記述、および他の正常身体組織における発現と比較した発現の相対量を提供する。
【０２９６】
【表２】
2004515225.tif 000004
2004515225.tif 000005
2004515225.tif 000006
2004515225.tif 000007
2004515225.tif 000008
2004515225.tif 000009
2004515225.tif 000010
2004515225.tif 000011
2004515225.tif 000012
2004515225.tif 000013
2004515225.tif 000014
2004515225.tif 000015
2004515225.tif 000016
2004515225.tif 000017
2004515225.tif 000018
2004515225.tif 000019
2004515225.tif 000020
2004515225.tif 000021
2004515225.tif 000022
2004515225.tif 000023
2004515225.tif 000024
2004515225.tif 000025
2004515225.tif 000026
2004515225.tif 000027
2004515225.tif 000028
2004515225.tif 000029
2004515225.tif 000030
（表１Ａ）
表１Ａは、ｕｎｉｇｅｎｅＩＤを欠く表１のプライムキーについての登録番号を示す。オリゴヌクレオチドを設計した遺伝子クラスター（ＣＡＴ）番号が、各々のプローブセットについて示される。Ｇｅｎｂａｎｋ  ＥＳＴおよびｍＲＮＡ由来の配列を用いて遺伝子クラスターを編集した。これらの配列を、Ｇｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＤｏｕｂｌｅＴｗｉｓｔ、Ｏａｋｌａｎｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて配列類似性に基づきクラスター化した。各々のクラスターを含む配列についてのＧｅｎｂａｎｋ登録番号を「登録」の列に列挙する。
【０２９７】
【表３】
2004515225.tif 000031
2004515225.tif 000032
2004515225.tif 000033
2004515225.tif 000034
2004515225.tif 000035
2004515225.tif 000036
2004515225.tif 000037
2004515225.tif 000038
2004515225.tif 000039
2004515225.tif 000040
（表１Ｂ）
表１Ｂは、ｕｎｉｇｅｎｅＩＤおよび登録番号を欠く表１のプライムキーについてのゲノム位置を示す。各々の推定エキソンについて、推定のために使用されたゲノム配列供給源を列挙する。各々の推定エキソンのヌクレオチド位置もまた列挙する。
【０２９８】
【表４】
2004515225.tif 000041
2004515225.tif 000042
2004515225.tif 000043
2004515225.tif 000044
2004515225.tif 000045
2004515225.tif 000046
2004515225.tif 000047
2004515225.tif 000048
（表２）
表２は、ＣＢＦ９およびＢＦＯ８遺伝子の核酸およびタンパク質配列ならびにＣＢＦ９およびＢＦＯ８のＵｎｉｇｅｎｅおよびＥｘｅｍｐｌａｒ登録番号を提供する。
【０２９９】
【表５】
2004515225.tif 000049
2004515225.tif 000050
2004515225.tif 000051
【国際公開パンフレット】
2004515225.tif 000052
2004515225.tif 000053
2004515225.tif 000054
2004515225.tif 000055
2004515225.tif 000056
2004515225.tif 000057
2004515225.tif 000058
2004515225.tif 000059
2004515225.tif 000060
2004515225.tif 000061
2004515225.tif 000062
2004515225.tif 000063
2004515225.tif 000064
2004515225.tif 000065
2004515225.tif 000066
2004515225.tif 000067
2004515225.tif 000068
2004515225.tif 000069
2004515225.tif 000070
2004515225.tif 000071
2004515225.tif 000072
2004515225.tif 000073
2004515225.tif 000074
2004515225.tif 000075
2004515225.tif 000076
2004515225.tif 000077
2004515225.tif 000078
2004515225.tif 000079
2004515225.tif 000080
2004515225.tif 000081
2004515225.tif 000082
2004515225.tif 000083
2004515225.tif 000084
2004515225.tif 000085
2004515225.tif 000086
2004515225.tif 000087
2004515225.tif 000088
2004515225.tif 000089
2004515225.tif 000090
2004515225.tif 000091
2004515225.tif 000092
2004515225.tif 000093
2004515225.tif 000094
2004515225.tif 000095
2004515225.tif 000096
2004515225.tif 000097
2004515225.tif 000098
2004515225.tif 000099
2004515225.tif 000100
2004515225.tif 000101
2004515225.tif 000102
2004515225.tif 000103
2004515225.tif 000104
2004515225.tif 000105
2004515225.tif 000106
2004515225.tif 000107
2004515225.tif 000108
2004515225.tif 000109
2004515225.tif 000110
2004515225.tif 000111
2004515225.tif 000112
2004515225.tif 000113
2004515225.tif 000114
2004515225.tif 000115
2004515225.tif 000116
2004515225.tif 000117
2004515225.tif 000118
2004515225.tif 000119
2004515225.tif 000120
2004515225.tif 000121
2004515225.tif 000122
2004515225.tif 000123
2004515225.tif 000124
2004515225.tif 000125
2004515225.tif 000126
2004515225.tif 000127
2004515225.tif 000128
2004515225.tif 000129
2004515225.tif 000130
2004515225.tif 000131
2004515225.tif 000132
2004515225.tif 000133
2004515225.tif 000134
2004515225.tif 000135
2004515225.tif 000136
2004515225.tif 000137
2004515225.tif 000138
2004515225.tif 000139
2004515225.tif 000140
2004515225.tif 000141
2004515225.tif 000142
2004515225.tif 000143
2004515225.tif 000144
2004515225.tif 000145
2004515225.tif 000146
2004515225.tif 000147
2004515225.tif 000148
2004515225.tif 000149
2004515225.tif 000150
2004515225.tif 000151
2004515225.tif 000152
2004515225.tif 000153
2004515225.tif 000154
2004515225.tif 000155
2004515225.tif 000156
2004515225.tif 000157
2004515225.tif 000158
2004515225.tif 000159
2004515225.tif 000160
2004515225.tif 000161
2004515225.tif 000162
2004515225.tif 000163
2004515225.tif 000164
2004515225.tif 000165
2004515225.tif 000166
2004515225.tif 000167
2004515225.tif 000168
2004515225.tif 000169
2004515225.tif 000170
2004515225.tif 000171
2004515225.tif 000172
2004515225.tif 000173
2004515225.tif 000174
2004515225.tif 000175
2004515225.tif 000176
2004515225.tif 000177
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004515225.tif 000178
【国際調査報告】
2004515225.tif 000179
2004515225.tif 000180
2004515225.tif 000181