(57)【要約】Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの一ファミリーが開示されており、その各構成員は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化する。Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、アベルメクチンからエマメクチンを生成させるための方法および処方物において使用される。また、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼの精製方法、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼに特異的に結合する結合剤、および本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼを発現する遺伝子操作された細胞も開示されている。また、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼにより活性を示すフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、式(II)
【化１】
2004529651.tif 000028
［式中、
Ｒ１−Ｒ７は、互いに独立して水素または置換基を表し、
ｍは、０、１または２であり、
ｎは、０、１、２または３であり、そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで示した結合は、互いに独立して２個の隣接炭素原子が、二重結合、単結合、式
【化２】
2004529651.tif 000029
の単結合およびエポキシド架橋、または式
【化３】
2004529651.tif 000030
の単結合およびメチレン架橋により連結されていることを示す］
で示され、適用可能な場合、そのＥ／Ｚ異性体、Ｅ／Ｚ異性体混合物、および／または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を包含する化合物の４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより、式(III)
【化４】
2004529651.tif 000031
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(II)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を生産し得るポリペプチドをコード化する精製核酸分子。
【請求項２】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する核酸配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドであって、配列番号２のポリペプチドと実質的に類似しており、それと少なくとも５０％および９９％間のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコード化する核酸配列を含む、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
ａ)配列番号１で与えられた通りであり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号１で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
ヌクレオチド配列を含む、請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号１と少なくとも６６％同一性である核酸配列を含む、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項６】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５のポリペプチドと実質的に類似しており、それと少なくとも６０％および９９％間のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコード化する核酸配列を含む、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項７】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５のポリペプチドに対して産生した抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコード化する核酸配列を含む、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項８】
ａ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４で与えられた通りであり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
ヌクレオチド配列を含む、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３および配列番号９４から成る群から選択された核酸配列を含む、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１０】
核酸分子がストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離されたものである、請求項１〜９のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項１１】
さらに共有結合を介してＰ４５０モノオキシゲナーゼに結合されている標識をコード化する核酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項１２】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、式(II)
【化５】
2004529651.tif 000032
［式中、
Ｒ１−Ｒ７は、互いに独立して水素または置換基を表し、
ｍは、０、１または２であり、
ｎは、０、１、２または３であり、そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで示した結合は、互いに独立して２個の隣接炭素原子が、二重結合、単結合、式
【化６】
2004529651.tif 000033
の単結合およびエポキシド架橋、または式
【化７】
2004529651.tif 000034
の単結合およびメチレン架橋により連結されていることを示す］
で示され、適用可能な場合、そのＥ／Ｚ異性体、Ｅ／Ｚ異性体混合物、および／または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を包含する化合物の４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより、式(III)
【化８】
2004529651.tif 000035
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(II)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を生産し得るポリペプチド。
【請求項１３】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチド。
【請求項１４】
ａ)配列番号１で与えられた通りまたはその相補配列であり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号１で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
核酸分子によりコード化されるアミノ酸配列を含む、請求項１２または１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ａ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４で与えられた通り、またはその相補配列であり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチド、またはその相補配列を含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
核酸分子によりコード化されるアミノ酸配列を含む、請求項１２または１３記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４および配列番号９５から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１６記載のポリペプチド。
【請求項１８】
さらに標識を含む、請求項１２〜１７のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか１項記載のポリペプチドに特異的に結合する結合剤。
【請求項２０】
結合剤が抗体である、請求項２０記載の結合剤。
【請求項２１】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドのファミリーであって、その各構成員が、式(II)
【化９】
2004529651.tif 000036
［式中、
Ｒ１−Ｒ７は、互いに独立して水素または置換基を表し、
ｍは、０、１または２であり、
ｎは、０、１、２または３であり、そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで示した結合は、互いに独立して２個の隣接炭素原子が、二重結合、単結合、式
【化１０】
2004529651.tif 000037
の単結合およびエポキシド架橋、または式
【化１１】
2004529651.tif 000038
の単結合およびメチレン架橋により連結されていることを示す］
で示され、適用可能な場合、そのＥ／Ｚ異性体、Ｅ／Ｚ異性体混合物、および／または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を包含する化合物の４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより、式(III)
【化１２】
2004529651.tif 000039
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(II)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を生産し得る、ファミリー。
【請求項２２】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドのファミリーであって、その各構成員がアベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンに酸化するファミリー。
【請求項２３】
ファミリーの各構成員が配列番号２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１または２２記載のファミリー。
【請求項２４】
それぞれフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素の酵素活性を示すポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子であって、式(II)
【化１３】
2004529651.tif 000040
［式中、
Ｒ１−Ｒ７は、互いに独立して水素または置換基を表し、
ｍは、０、１または２であり、
ｎは、０、１、２または３であり、そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで示した結合は、互いに独立して２個の隣接炭素原子が、二重結合、単結合、式
【化１４】
2004529651.tif 000041
の単結合およびエポキシド架橋、または式
【化１５】
2004529651.tif 000042
の単結合およびメチレン架橋により連結されていることを示す］
で示され、適用可能な場合、そのＥ／Ｚ異性体、Ｅ／Ｚ異性体混合物、および／または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を包含する化合物の４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより、式(III)
【化１６】
2004529651.tif 000043
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(II)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を生産し得るＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される核酸分子。
【請求項２５】
それぞれフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素の酵素活性を示すポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、核酸分子がアベルメクチンを４''ケト‐アベルメクチンへ位置選択的に酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される、請求項２４記載の精製核酸分子。
【請求項２６】
配列番号３５および配列番号３７から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２７】
配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２および配列番号１０４から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項２５記載の核酸分子。
【請求項２８】
それぞれフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素の酵素活性を示すポリペプチドであって、式(II)
【化１７】
2004529651.tif 000044
［式中、
Ｒ１−Ｒ７は、互いに独立して水素または置換基を表し、
ｍは、０、１または２であり、
ｎは、０、１、２または３であり、そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで示した結合は、互いに独立して２個の隣接炭素原子が、二重結合、単結合、式
【化１８】
2004529651.tif 000045
の単結合およびエポキシド架橋、または式
【化１９】
2004529651.tif 000046
の単結合およびメチレン架橋により連結されていることを示す］
で示され、適用可能な場合、そのＥ／Ｚ異性体、Ｅ／Ｚ異性体混合物、および／または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を包含する化合物の４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより、式(III)
【化２０】
2004529651.tif 000047
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(II)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を生産し得るＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離されるポリペプチド。
【請求項２９】
それぞれフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素の酵素活性を示すポリペプチドであって、フェレドキシンタンパク質が、アベルメクチンを４''ケト‐アベルメクチンへ位置選択的に酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される、ポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号３６および配列番号３８から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項２９記載のフェレドキシンタンパク質。
【請求項３１】
配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３および配列番号１０５から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項２９記載のフェレドキシン還元酵素タンパク質。
【請求項３２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載のＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドをコード化する核酸分子を含むように遺伝子操作が加えられた細胞。
【請求項３３】
さらにフェレドキシンタンパク質およびフェレドキシン還元酵素タンパク質をそれぞれ、またはその組み合わせをコード化する核酸分子を含む、請求項３２記載の細胞。
【請求項３４】
核酸分子が、細胞で発現されるように配置されている、請求項３２または３３記載の細胞。
【請求項３５】
細胞が、ストレプトマイセス(Streptomyces)株細胞およびシュードモナス(Pseudomonas)株細胞およびエシェリキア・コリ(Escherichia coli)株細胞から成る群から選択される遺伝子操作された細胞である、請求項３２〜３４のいずれか１項記載の細胞。
【請求項３６】
細胞がＮＲＲＬ指定番号Ｂ−３０４７８およびＮＲＲＬ指定番号Ｂ−３０４７９をそれぞれ有する、請求項３５記載の細胞。
【請求項３７】
式
【化２１】
2004529651.tif 000048
［式中、
Ｒ１−Ｒ９は、互いに独立して水素または置換基を表し、
ｍは、０、１または２であり、
ｎは、０、１、２または３であり、そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで示した結合は、互いに独立して２個の隣接炭素原子が、二重結合、単結合、式
【化２２】
2004529651.tif 000049
の単結合およびエポキシド架橋、または式
【化２３】
2004529651.tif 000050
の単結合およびメチレン架橋により連結されていることを示す］
で示され、適用可能な場合、そのＥ／Ｚ異性体、Ｅ／Ｚ異性体混合物、および／または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を包含する化合物の生産方法であって、
１）式
【化２４】
2004529651.tif 000051
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を、４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化し得る本発明ポリペプチドと接触させることにより、式
【化２５】
2004529651.tif 000052
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を形成させ、そして
２）式(III)の化合物を、還元剤の存在下、式ＨＮ(Ｒ８)Ｒ９[式中、Ｒ８およびＲ９は式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]の公知アミンと反応させ、
そしてそれぞれの場合に、所望ならば、本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の化合物、またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を、式(Ｉ)で示される異なる化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態に変換し、本方法にしたがって得られるＥ／Ｚ異性体の混合物を分離して所望の異性体を単離し、および／または本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の遊離化合物、またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体を塩に変換し、または本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体の塩を、式(Ｉ)の遊離化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体または異なる塩に変換する
工程を含む方法。
【請求項３８】
式
【化２６】
2004529651.tif 000053
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは請求項３７記載の式(III)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物の生産方法であって、
１）式
【化２７】
2004529651.tif 000054
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を、４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化し得る本発明ポリペプチドと接触させ、酸化反応を行なわせるのに十分な時間接触状態を維持し、式(II)の化合物を単離および精製する工程を含む方法。
【請求項３９】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンに位置選択的に酸化するポリペプチドを、アベルメクチンを含む反応混合物に加え、ポリペプチドにアベルメクチンから４''ケト−アベルメクチンへの位置選択的酸化を行わせる条件下反応混合物をインキュベーションする工程を含む、エマメクチン生産についての請求項３７または３８にいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
反応混合物がさらにフェレドキシンタンパク質を含む、請求項３７〜３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
反応混合物がさらにフェレドキシン還元酵素タンパク質を含む、請求項３７〜４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドを含むエマメクチン生産用処方物。
【請求項４３】
さらにフェレドキシンタンパク質を含む、請求項４２記載の処方物。
【請求項４４】
さらにフェレドキシン還元酵素タンパク質を含む、請求項４２または４３記載の処方物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、農薬の分野、および特に殺虫剤に関するものである。さらに具体的には、この発明は、特にエマメクチン合成についての、アベルメクチンの誘導体化に関するものである。
【０００２】
エマメクチンは、強力な殺虫剤であり、多くの害虫、例えばアザミウマ、葉もぐり虫およびぜん虫害虫、例えばアルファルファ毛虫、シロイチモジヨトウガ幼虫、キャベツシャクトリムシ、オオタバコガ、ネキリムシ、コナガ、オオタバコガ近縁種、トマトフルーツウォームおよびトマトピンウォームを制御する。エマメクチン(４''−デオキシ−４''−エピ−Ｎ−メチルアミノアベルメクチンＢｌａ／Ｂｌｂ)は、米国特許第４８７４７４９号およびCvetovich,R.J.et.al.,J.Organic Chem.５９：７７０４−７７０８、１９９４(ＭＫ−２４４として)に記載されている。
【０００３】
米国特許第５２８８７１０号は、農薬として特に貴重であるエマメクチンの塩類について報告している。これらのエマメクチン塩類は、昆虫およびダニ目の代表的なものと戦う上で貴重な殺虫剤である。戦う上でエマメクチンが有用である害虫については、欧州特許出願ＥＰ−Ａ７３６２５２に列挙されているものもある。
【０００４】
エマメクチンの使用に対する一つの障害は、アベルメクチンからのその合成が困難なことである。これは、アベルメクチンの４''−カルビノール基をケトンに酸化しなければならない、最も費用および時間を消耗するエマメクチン生産工程である、その工程の第一段階に起因する。４''−カルビノール基の酸化は、酸化前に化学的に保護し、酸化後脱保護しなければならない２個の他のヒドロキシル基が分子に存在する故に問題を含んでいる。すなわち、この第一段階は、アベルメクチンからのエマメクチン生産に要する全体的費用および時間を著しく増加させる。
【０００５】
殺虫剤としてのエマメクチンの有効性および効力故に、アベルメクチンの４''−カルビノール基を位置選択的に酸化して、アベルメクチンからエマメクチンを生産するのに必要な中間体である４''−ケト−アベルメクチンを生産するための費用および時間に対して効果の高い方法および／試薬の開発が要望されている。
【０００６】
本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの新規ファミリーを提供するもので、その各構成員は、非保護アベルメクチンの４''−カルビノール基を位置選択的に酸化し得、それによってエマメクチン生産における必要な中間体である、４''−ケト−アベルメクチンの安価で有効な生産方法を提供し得る。本発明は、(１)酸化前に化学的に保護されなければならない４''−カルビノール基の酸化前にアベルメクチン分子上の２個の他のヒドロキシル基を化学的に保護し、(２)これら２個の他のヒドロキシル基を酸化後化学的に脱保護する費用と時間の浪費的工程の排除を可能にする。すなわち本発明は、アベルメクチンからのエマメクチン生産の全体的費用を著しく低減化する試薬および方法を提供する。
【０００７】
したがって、一態様において、本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する精製核酸分子を提供する。
【０００８】
一実施態様において、本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドであって、配列番号２のポリペプチドと実質的に類似しており、好ましくは少なくとも５０％および９９％間のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子に関するものであり、この５０％および９９％間の範囲内における個々の各数も本発明の一部である。
【０００９】
さらに別の実施態様において、本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドであって、配列番号２のポリペプチドに対して産生した抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子に関するものである。
【００１０】
さらに本発明は、
ａ)配列番号１で与えられた通りであり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号１で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
ヌクレオチド配列を含む精製核酸分子を提供する。
【００１１】
一実施態様において、本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドであって配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５のポリペプチドと実質的に類似しており、それと少なくとも６０％および９９％間のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子に関するものであり、この６０％および９９％間の範囲内における個々の各数も本発明の一部である。
【００１２】
さらに別の実施態様において、本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５のポリペプチドに対して産生した抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子に関するものである。
【００１３】
さらに本発明は、
ａ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４で与えられた通りであり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
ヌクレオチド配列を含む精製核酸分子を提供する。
【００１４】
ある種の態様において、核酸分子は、配列番号１と少なくとも６６％および９９％間の同一性を有する核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され、この６６％および９９％間の範囲内における個々の各数もまた本発明の一部である。
【００１５】
ある種の態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４と少なくとも７０％および９９％間の同一性を有する核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され、この７０％および９９％間の範囲内における個々の各数もまた本発明の一部である。
【００１６】
幾つかの態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４と少なくとも８０％同一である核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００１７】
ある種の態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００１８】
ある種の態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４と少なくとも９５％同一である核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００１９】
幾つかの態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３および配列番号９４から成る群から選択される核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００２０】
特定実施態様において、核酸分子はストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。ある種の態様では、ストレプトマイセス(Streptomyces)株は、ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)、ストレプトマイセス・リディクス(Streptomyces lydicus)、ストレプトマイセス・プラテンシス(Streptomyces platensis)、ストレプトマイセス・チャッタノオゲンシス(Streptomyces chattanoogensis)、ストレプトマイセス・カスガエンシス(Streptomyces kasugaensis)、ストレプトマイセス・リモスス(Streptomyces rimosus)およびストレプトマイセス・アルボファシエンス(Streptomyces albofaciens)から成る群から選択される。
【００２１】
この態様の幾つかの具体例では、核酸分子はさらに共有結合を介してＰ４５０モノオキシゲナーゼに結合される標識をコード化する核酸配列を含む。ある種の態様において、標識は、Ｈｉｓ標識、ＧＳＴ標識、ＨＡ標識、ＨＳＶ標識、Ｍｙｃ標識およびＶＳＶ−Ｇ−標識から成る群から選択される。
【００２２】
別の態様において、本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化する精製ポリペプチドを提供する。
【００２３】
幾つかの態様において、ポリペプチドは、
ａ)配列番号１で与えられた通り、またはその補体であり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号１で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
核酸分子によりコード化されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００２４】
幾つかの態様において、ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも５０および９９％間の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され、この５０％および９９％間の範囲内における個々の各数もまた本発明の一部である。
【００２５】
幾つかの態様において、ポリペプチドは、
ａ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４で与えられた通り、またはその相補配列であり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチド、またはその相補配列を含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
核酸分子によりコード化されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００２６】
幾つかの態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも６０％および９９％間の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され、この６０％および９９％間の範囲内における個々の各数もまた本発明の一部である。
【００２７】
ある種の態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００２８】
幾つかの態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００２９】
幾つかの態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００３０】
ある種の態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００３１】
本発明のこの態様の幾つかの実施例において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４および配列番号９５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００３２】
ある種の態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明ポリペプチドはさらに標識を含む。幾つかの実施態様において、標識は、Ｈｉｓ標識、ＧＳＴ標識、ＨＡ標識、ＨＳＶ標識、Ｍｙｃ−標識およびＶＳＶ−Ｇ−標識から成る群から選択される。
【００３３】
別の態様において、本発明は、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに位置選択的に酸化する、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明ポリペプチドに特異的に結合する結合剤を提供する。実施態様によっては、結合剤が抗体の場合もある。ある種の態様において、抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
【００３４】
さらに別の態様において、本発明はＰ４５０モノオキシゲナーゼポリペプチドの一ファミリーを提供し、その場合ファミリーの各構成員は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化する。
【００３５】
ある種の実施態様において、ファミリーの各構成員は、配列番号２と少なくとも５０％および９９％間の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され、この５０％および９９％間の範囲内における個々の各数もまた本発明の一部である。
【００３６】
ある種の実施態様において、ファミリーの各構成員は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも６０％および９９％間の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され、この６０％および９９％間の範囲内における個々の各数もまた本発明の一部である。
【００３７】
幾つかの実施態様において、ファミリーの各構成員は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００３８】
ある種の実施態様において、ファミリーの各構成員は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。幾つかの実施態様において、ファミリーの各構成員は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００３９】
ある種の実施態様において、ファミリーの各構成員は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００４０】
本発明のこの実施態様の幾つかの実施例において、ファミリーの各構成員は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４および配列番号９５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００４１】
さらに別の態様において、本発明は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドをコード化する核酸分子を含むように遺伝子操作が加えられた細胞を提供する。
【００４２】
幾つかの実施態様において、核酸分子は細胞で発現されるように配置されている。ある種の実施態様において、細胞は、さらにフェレドキシンタンパク質の酵素活性を示す本発明ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
【００４３】
幾つかの実施態様において、細胞は、さらにフェレドキシン還元酵素タンパク質の酵素活性を示す本発明ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。
【００４４】
ある種の実施態様において、細胞は遺伝子操作されたストレプトマイセス(Streptomyces)株である。ある種の実施態様において、細胞は遺伝子操作されたストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株である。特定実施態様において、遺伝子操作されたストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株は、ＮＲＲＬ指定番号Ｂ−３０４７８を有する。幾つかの実施態様において、細胞は遺伝子操作されたシュードモナス(Pseudomonas)株である。幾つかの実施態様において、細胞は遺伝子操作されたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)株である。ある種の実施態様において、遺伝子操作されたシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)株は、ＮＲＲＬ指定番号Ｂ−３０４７９を有する。幾つかの実施態様において、細胞は、遺伝子操作されたエシェリキア・コリ(Escherichia coli)株である。
【００４５】
別の態様において、本発明は、フェレドキシンの酵素活性を示す本発明ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子を提供し、その場合、核酸分子は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。
【００４６】
一実施態様において、本発明は、フェレドキシンの酵素活性を示す本発明ポリペプチドであって、配列番号３６または配列番号３８のポリペプチドと実質的に類似しており、そして好ましくは少なくとも８０％および９９％間のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子に関するものであり、この８０％および９９％間の範囲内における個々の各数もまた本発明の一部である。
【００４７】
さらに別の実施態様において、本発明は、フェレドキシンの酵素活性を示すポリペプチドであって、配列番号３６または配列番号３８のポリペプチドに対して産生した抗体と免疫学的に反応性であるポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子に関するものである。
【００４８】
さらに本発明は、
ａ)配列番号３５または配列番号３７で与えられた通りであり、
ｂ)(ａ)との実質的類似性を有し、
ｃ)(ａ)またはその相補配列とハイブリダイズし得、
ｄ)配列番号３５または配列番号３７で与えられたヌクレオチド配列、またはその相補配列の５０〜２００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む核酸分子とハイブリダイズし得、
ｅ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)と相補的であり、
ｆ)(ａ)、(ｂ)または(ｃ)の逆相補配列であり、または
ｇ)依然としてフェレドキシンの酵素活性を示し、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するポリペプチドをコード化する(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)または(ｆ)の機能性部分である
ヌクレオチド配列を含む精製核酸分子を提供する。
【００４９】
ある種の実施態様において、本発明のフェレドキシンをコード化する核酸分子は、配列番号３５または配列番号３７と少なくとも８１％の同一性を示す核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。幾つかの実施態様において、核酸分子は、配列番号３５または配列番号３７と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を示す核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。ある種の実施態様において、本発明のフェレドキシンをコード化する核酸分子は、配列番号３５または配列番号３７の核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００５０】
さらに別の態様において、本発明は精製フェレドキシンタンパク質を提供し、その場合、フェレドキシンタンパク質は、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。ある種の実施態様において、本発明のフェレドキシンは、配列番号３６または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。幾つかの実施態様において、核酸分子は、配列番号３６または配列番号３８と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９９％の同一性を示すアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００５１】
特定実施態様において、本発明のフェレドキシンは、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００５２】
別の態様において、本発明は、フェレドキシン還元酵素の酵素活性を示す本発明ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子を提供し、その場合、核酸分子は、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。
【００５３】
ある種の実施態様において、フェレドキシン還元酵素の酵素活性を示す本発明ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子は、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、または配列番号１０４の核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００５４】
さらに別の態様において、本発明は、フェレドキシン還元酵素タンパク質の酵素活性を示す精製ポリペプチドを提供し、その場合ポリペプチドは、アベルメクチンを４''ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。ある種の実施態様において、本発明ポリペプチドは、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５のアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００５５】
別の態様において、本発明は、式
【化１】
2004529651.tif 000002
［式中、
Ｒ１−Ｒ９は、互いに独立して水素または置換基を表し、
ｍは、０、１または２であり、
ｎは、０、１、２または３であり、そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで示した結合は、互いに独立して２個の隣接炭素原子が、二重結合、単結合、式
【化２】
2004529651.tif 000003
の単結合およびエポキシド架橋、または式
【化３】
2004529651.tif 000004
の単結合およびメチレン架橋により連結されていることを示す］
で示され、適用可能な場合、そのＥ／Ｚ異性体、Ｅ／Ｚ異性体混合物、および／または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を包含する化合物の生産方法であって、
１）式
【化４】
2004529651.tif 000005
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を、４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化し得る本発明ポリペプチドと接触させることにより、式
【化５】
2004529651.tif 000006
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を形成させ、そして
２）式(III)の化合物を、還元剤の存在下、式ＨＮ(Ｒ８)Ｒ９[式中、Ｒ８およびＲ９は式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]の公知アミンと反応させ、
そしてそれぞれの場合に、所望ならば、本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の化合物、またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を、式(Ｉ)で示される異なる化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態に変換し、本方法にしたがって得られるＥ／Ｚ異性体の混合物を分離して所望の異性体を単離し、および／または本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の遊離化合物、またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体を塩に変換し、または本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体の塩を、式(Ｉ)の遊離化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体または異なる塩に変換する
工程を含む方法を提供する。
【００５６】
幾つかの実施態様においては、式(II)の化合物を、さらにフェレドキシンの酵素活性を示す本発明ポリペプチドと接触させる。ある種の実施態様では、式(II)の化合物を、さらにフェレドキシン還元酵素の酵素活性を示す本発明ポリペプチドと接触させる。幾つかの実施態様においては、式(II)の化合物を、さらに還元剤(例、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ)と接触させる。
【００５７】
さらに別の実施態様において、本発明は、式
【化６】
2004529651.tif 000007
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは請求項１記載の式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物の生産方法であって、
１）式
【化７】
2004529651.tif 000008
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を、４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化し得る本発明ポリペプチドと接触させ、酸化反応を行なわせるのに十分な時間接触状態を維持し、そして式(II)の化合物を単離および精製する工程を含む方法を提供する。
【００５８】
さらに別の態様で、本発明は、式(Ｉ)において、ｎが１であり、ｍが１であり、Ａが二重結合であり、Ｂが単結合または二重結合であり、Ｃが二重結合であり、Ｄが単結合であり、Ｅが二重結合であり、Ｆが二重結合、または単結合およびエポキシ架橋、または単結合およびメチレン架橋であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がＨであり、Ｒ４がメチルであり、Ｒ５が、Ｃ１−Ｃ10アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルまたはＣ２−Ｃ10アルケニルであり、Ｒ６がＨであり、Ｒ７がＯＨであり、Ｒ８およびＲ９が互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ10アルキル、Ｃ１−Ｃ10アシルであるか、または一緒になって−(ＣＨ２)ｑ−を形成し、そしてｑが４、５または６である化合物の本発明生産方法を提供する。
【００５９】
さらに別の態様で、本発明は、式(Ｉ)において、ｎが１であり、ｍが１であり、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦが二重結合であり、Ｄが単結合であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がＨであり、Ｒ４がメチルであり、Ｒ５が、ｓ−ブチルまたはイソプロピルであり、Ｒ６がＨであり、Ｒ７がＯＨであり、Ｒ８がメチルであり、Ｒ９がＨである化合物の本発明生産方法を提供する。
【００６０】
さらに別の態様において、本発明は、４''−デオキシ−４''−Ｎ−メチルアミノアベルメクチンＢ1a／Ｂ1ｂ安息香酸塩の本発明生産方法を提供する。
【００６１】
別の態様において、本発明はエマメクチンの生産方法を提供する。この方法では、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに位置選択的に酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明ポリペプチドを、アベルメクチン含有反応混合物に加え、ポリペプチドがアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに位置選択的に酸化し得る条件下で反応混合物をインキュベーションする。幾つかの実施態様において、反応混合物は、さらにフェレドキシンの酵素活性を示す本発明ポリペプチドを含む。ある種の実施態様において、反応混合物は、さらにフェレドキシン還元酵素の酵素活性を示す本発明ポリペプチドを含む。幾つかの実施態様において、反応混合物は、さらに還元剤(例、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ)を含有する。
【００６２】
さらに別の態様において、本発明は、４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより式(II)の化合物を形成させ得るＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を示す本発明ポリペプチドを含む式(Ｉ)の化合物を生産するための処方物を提供する。幾つかの実施態様において、処方物は、さらにフェレドキシン(例、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが単離または誘導された細胞または株からのフェレドキシン)の酵素活性を示す本発明ポリペプチド含有する。
【００６３】
さらに別の態様において、本発明は、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに位置選択的に酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むエマメクチンを生産するための処方物を提供する。幾つかの実施態様において、処方物は、さらにフェレドキシン(例、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが単離または誘導された細胞または株からのフェレドキシン)を含有する。
【００６４】
ある種の実施態様において、処方物は、さらにフェレドキシン還元酵素(例、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが単離または誘導された細胞または株からのフェレドキシン)の酵素活性を示す本発明ポリペプチドを含有する。幾つかの実施態様において、処方物は、さらに還元剤(例、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ)を含有する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、プラスミドｐＴＢＢＫＡの地図を示す概略図である。示された制限エンドヌクレアーゼによる認識部位は、プラスミドのヌクレオチド配列における部位の位置と一緒に示されている。また、遺伝子(例、カナマイシン耐性「ＫａｎＲ」)、およびプラスミドに含まれる他の機能的特徴(例、Ｔｉｐプロモーター)が示されている。
【図２】図２は、プラスミドｐＴＵＡ１Ａの地図を示す概略図である。示された制限エンドヌクレアーゼによる認識部位は、プラスミドのヌクレオチド配列における部位の位置と一緒に示されている。また、遺伝子(例、アンピシリン耐性「ＡｍｐＲ」)、およびプラスミドに含まれる他の機能的特徴(例、Ｔｉｐプロモーター)が示されている。
【図３】図３は、プラスミドｐＲＫ−ｅｍａ１／ｆｄ２３３の地図を示す概略図である。このプラスミドは、単一転写単位で組織されたｅｍａ１およびｆｄ２３３遺伝子を含むＢｇｌIIフラグメントを広宿主範囲プラスミドｐＲＫ２９０のＢｇｌII部位へライゲーションすることにより誘導された。ｅｍａ１／ｆｄ２３３遺伝子は、ｔａｃプロモーター(Ｐｔａｃ)により発現され、それらにｔａｃターミネーター(Ｔｔａｃ)が続く。示されている制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、ＢｇｌII「Ｂ」、ＥｃｏＲＩ「Ｅ」、ＰａｃＩ「Ｐｃ」、ＰｍｅＩ「Ｐｍ」、およびＳａｌＩ「Ｓ」である。
【００６６】
本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、式(II)の化合物、例えばアベルメクチンの４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより、式(III)の化合物、特に４''−ケト−アベルメクチンを生成させ得るポリペプチドの一ファミリーを提供する。
【００６７】
さらに特定すれば、本発明ポリペプチドのファミリーは、式
【化８】2004529651.tif 000009
［式中、
Ｒ１−Ｒ９は、互いに独立して水素または置換基を表し、
ｍは、０、１または２であり、
ｎは、０、１、２または３であり、そして
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦで示した結合は、互いに独立して２個の隣接炭素原子が、二重結合、単結合、式
【化９】2004529651.tif 000010
の単結合およびエポキシド架橋、または式
【化１０】2004529651.tif 000011
の単結合およびメチレン架橋により連結されていることを示す］
で示され、適用可能な場合、そのＥ／Ｚ異性体、Ｅ／Ｚ異性体混合物、および／または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を包含する化合物の生産方法であって、
１）式
【化１１】2004529651.tif 000012
[式中、Ｒ１−Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、式(II)の４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化し得る本発明ポリペプチドと接触させることにより、式
【化１２】2004529651.tif 000013
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、ｎ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]
で示される化合物を形成させ、そして
２）式(III)の化合物を、還元剤の存在下、式ＨＮ(Ｒ８)Ｒ９[式中、Ｒ８およびＲ９は式(Ｉ)の場合と同じ意味を有する]の公知アミンと反応させ、
そしてそれぞれの場合に、所望ならば、本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の化合物、またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態を、式(Ｉ)で示される異なる化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体のそれぞれの場合における遊離形態または塩形態に変換し、本方法にしたがって得られるＥ／Ｚ異性体の混合物を分離して所望の異性体を単離し、および／または本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の遊離化合物、またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体を塩に変換し、または本方法にしたがって、または別の方法により得られる式(Ｉ)の化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体の塩を、式(Ｉ)の遊離化合物またはそのＥ／Ｚ異性体または互変異性体または異なる塩に変換する
工程を含む方法で使用され得る。
【００６８】
式(Ｉ)で示される化合物の合成方法は文献に記載されている。しかしながら、文献で知られている方法は、基本的には低収率および使用しなければならない単調で退屈な手順のために生産中に考慮すべき問題を誘発することが見出された。したがって、公知方法はその点で満足できるものではないことから、それらの化合物の利用可能な改良された生産方法を開発する要望が生じている。
【００６９】
化合物(Ｉ)、(II)および(III)は、互変異性体形態であり得る。したがって、前記および後記において、適切な場合に化合物(Ｉ)、(II)および(III)は、それぞれの場合において具体的に挙げていない場合でも、対応する互変異性体を包含するものと解釈すべきである。
【００７０】
化合物(Ｉ)、(II)および(III)は酸付加塩を形成し得る。それらの塩類は、例えば、無機強酸、例えば無機酸、例えば過塩素酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、燐酸またはハロゲン化水素酸、強い有機カルボン酸、例えば非置換または置換、例えばハロ置換されたＣ１‐Ｃ４アルカンカルボン酸、例えば酢酸、飽和または不飽和ジカルボン酸、例えばしゅう酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸またはフタル酸、ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはクエン酸、または安息香酸、または有機スルホン酸、例えば非置換または置換、例えばハロ置換されたＣ１‐Ｃ４アルカン−またはアリール‐スルホン酸、例えばメタン‐またはｐ−トルエン‐スルホン酸により形成される。さらに、少なくとも１個の酸性基を有する式(Ｉ)、(II)および(III)の化合物は、塩基との塩類を形成し得る。塩基による適切な塩類は、例えば、金属塩類、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩類、例えばナトリウム、カリウムまたはマグネシウム塩類、またはアンモニアまたは有機アミン、例えばモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ‐、ジ‐またはトリ‐低級アルキルアミン、例えばエチル‐、ジエチル‐、トリエチル‐またはジメチル‐プロピル‐アミン、またはモノ‐、ジ‐またはトリ‐ヒドロキシ‐低級アルキルアミン、例えばモノ‐、ジ‐またはトリ‐エタノールアミンによる塩類である。さらに、対応する内部塩類もまた形成され得る。本発明の範囲内で好ましいものは、農薬として有利な塩類である。式(Ｉ)、(II)および(III)で示される化合物の遊離形態およびそれらの塩類形態間における密接な関係を考慮すると、前記または後記において式(Ｉ)、(II)および(III)の遊離化合物またはそれらの各塩類といえば、適切で好都合な場合、式(Ｉ)、(II)および(III)の対応する塩類または遊離化合物をも包含するものとして解釈すべきである。同じことは、式(Ｉ)、(II)および(III)で示される化合物の互変異性体およびそれらの塩類の場合にも適用される。遊離形態は、一般的にそれぞれの場合において好ましい。
【００７１】
この発明の範囲内で好ましいのは、式(Ｉ)において、ｎが１であり、ｍが１であり、Ａが二重結合であり、Ｂが単結合または二重結合であり、Ｃが二重結合であり、Ｄが単結合であり、Ｅが二重結合であり、Ｆが二重結合、または単結合およびエポキシ架橋、または単結合およびメチレン架橋であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がＨであり、Ｒ４がメチルであり、Ｒ５が、Ｃ１−Ｃ10アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルまたはＣ２−Ｃ10アルケニルであり、Ｒ６がＨであり、Ｒ７がＯＨであり、Ｒ８およびＲ９が互いに独立してＨ、Ｃ１−Ｃ10アルキルまたはＣ１−Ｃ10アシルであるか、または一緒になって−(ＣＨ２)ｑ−を形成し、そしてｑが４、５または６である化合物の生産方法である。
【００７２】
この発明の範囲内で特に好ましいのは、式(Ｉ)において、ｎが１であり、ｍが１であり、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦが二重結合であり、Ｄが単結合であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がＨであり、Ｒ４がメチルであり、Ｒ５が、ｓ−ブチルまたはイソプロピルであり、Ｒ６がＨであり、Ｒ７がＯＨであり、Ｒ８がメチルであり、Ｒ９がＨである化合物の生産方法である。
【００７３】
特に極めて好ましいのはエマメクチン、さらに特定すればエマメクチンの安息香酸塩の生産方法である。エマメクチンは、４''−デオキシ−４''−Ｎ−メチルアミノアベルメクチンＢ１ａ／Ｂ1ｂの混合物であり、米国特許第４４８７４７４９号およびJournal of Organic Chemistry、第５９巻(１９９４)、７７０４−７７０８にＭＫ−２４４として記載されている。特に農薬として貴重なエマメクチンの塩類は、米国特許第５２８８７１０号に記載されている。前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すこのペプチドファミリーの各構成員は、４''位において位置選択的に非保護アベルメクチンを酸化し得ることから、新規でより経済的なエマメクチン生産経路を開拓するものである。
【００７４】
ファミリー構成員は、それぞれ以下の反応を触媒する：
【化１３】2004529651.tif 000014
【００７５】
したがって、本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、式(II)の化合物、例えばアベルメクチンの４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより、式(III)の化合物、特に４''−ケト−アベルメクチンを生産し得るポリペプチドをコード化する精製核酸分子を提供する。
【００７６】
特に、本発明は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する精製核酸分子を提供する。「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)またはＤＮＡまたはＲＮＡの類似体をいう。
【００７７】
本発明はまた、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示し、式(II)の化合物、例えばアベルメクチンの４''位にあるアルコールを位置選択的に酸化することにより、式(III)の化合物、特に４''−ケト−アベルメクチンを生産し得る精製ポリペプチドを提供する。
【００７８】
特に、本発明はまた、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化する精製Ｐ４５０モノオキシゲナーゼを提供する。
【００７９】
本明細書で使用されている「精製(された)」は、本来それに伴う成分から分離された核酸分子またはポリペプチド(例、酵素または抗体)をいう。供給源から「精製された」興味の対象であるかかるヌクレオチド配列またはセグメントの一例は、化学的手段により、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用により供給源から切除または除去され、そこで本発明での使用に供するため、遺伝子工学技法によりさらに操作が加えられ、例えば増幅され得るヌクレオチド配列またはセグメントである。かかるヌクレオチド配列またはセグメントは、一般的に「組換え体」と称される。一実施態様において、精製核酸分子は、染色体で天然に存するように核酸分子の両側に隣接するヌクレオチド配列、例えばプロモーターまたはエンハンサー配列から分離され得る。
【００８０】
タンパク質またはポリペプチドの場合、精製タンパク質およびポリペプチドは、それぞれ細胞でそれに随伴する成分、例えば細胞膜の他のタンパク質またはフラグメントから分離される。勿論、通常レベルの分子生物学業界の者であれば、水、緩衝液および他の小分子が精製核酸分子または精製タンパク質調製物に追加的に存在し得ることは理解できるはずである。本発明の精製核酸分子または精製ポリペプチド(例、酵素)は、天然で核酸分子またはポリペプチドに随伴する成分の少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％、または少なくとも９９重量％、または１００重量％を含まない。
【００８１】
本発明によると、精製核酸分子は、例えば核酸分子を染色体から切り取ることにより生成され得る。次いで、それは発現プラスミドへライゲーションされ得る。本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する精製核酸分子の他の生産方法も利用可能であり、限定するわけではないが、核酸合成装置における核酸分子の人工合成法を含む。
【００８２】
同様に、本発明の精製Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、例えばＰ４５０モノオキシゲナーゼが天然には存しない細胞におけるＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する核酸分子の組換え発現により生成され得る。勿論、本発明の精製Ｐ４５０モノオキシゲナーゼを得る他の方法には、ポリペプチド合成装置におけるＰ４５０モノオキシゲナーゼの人工合成法および例えばＰ４５０モノオキシゲナーゼと特異的に結合する抗体を用いることによるそれが天然に存する細胞からのＰ４５０モノオキシゲナーゼの単離があるが、限定はされない。
【００８３】
ストレプトマイセス(Streptomyces)菌による２級アルコールからケトンへの生物変換は、デヒドロゲナーゼまたはオキシダーゼにより触媒されることが知られている。しかしながら、アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの位置選択的酸化に関与するストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２からのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの本発見前に、ストレプトマイセス(Streptomyces)からの別のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが２級アルコールをケトンに酸化する実験データは全く報告されていない。
【００８４】
本発明の幾つかの実施態様によると、核酸分子および／または核酸分子によりコード化されたポリペプチドは、ストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。すなわち、核酸分子(またはそれによりコード化されたポリペプチド)は、ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)、ストレプトマイセス・リディクス(Streptomyces lydicus)、ストレプトマイセス・プラテンシス(Streptomyces platensis)、ストレプトマイセス・チャッタノオゲンシス(Streptomyces chattanoogensis)、ストレプトマイセス・カスガエンシス(Streptomyces kasugaensis)、ストレプトマイセス・リモスス(Streptomyces rimosus)およびストレプトマイセス・アルボファシエンス(Streptomyces albofaciens)から単離され得るが、限定はされない。
【００８５】
上記および下記で詳述している通り、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化し得るＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドの全ファミリーがここでは提供される。これらのファミリー構成員は全て、アミノ酸レベルでの少なくとも６０％同一性により関連している。Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む有用な核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４と少なくとも７０％同一である核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。ある種の実施態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４と少なくとも８０％同一、または少なくとも８５％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００８６】
同様に、本発明は、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ位置選択的に酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す精製ポリペプチドを提供するもので、幾つかの実施態様において、それらは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。ある種の実施態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明の精製ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも７０％同一、または少なくとも８０％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００８７】
幾つかの実施態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４の核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。同様に、幾つかの実施態様において、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明の精製ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５のアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。
【００８８】
２個またはそれ以上の核酸またはポリペプチド間の配列関係を説明するため、以下の語を使用する：(ａ)「レファレンス配列」、(ｂ)「比較ウインドウ」、(ｃ)「配列同一性」、(ｄ)「配列同一性パーセント」、および(ｅ)「実質的同一性」。
【００８９】
(ａ)本明細書で使用されている「レファレンス配列」は、配列比較用の基礎として使用される規定配列である。レファレンス配列は、例えば完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列、または完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のような特定配列のサブセットまたは全体であり得る。
【００９０】
(ｂ)本明細書で使用されている「比較ウインドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続した特定セグメントをいい、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２配列の最適アラインメントについてのレファレンス配列(付加または欠失を含まない)と比較される付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。一般的に、比較ウインドウは、長さが少なくとも２０の連続ヌクレオチドであり、所望により３０、４０、５０、１００またはそれ以上であり得る。当業者であれば、ポリヌクレオチド配列にギャップが含まれることによるレファレンス配列との高い類似を回避するため、典型的にはギャップペナルティーを導入し、マッチの数から控除する。
【００９１】
比較用配列のアラインメント方法は当業界ではよく知られている。すなわち、任意の２配列間の同一性パーセントの測定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。上記数学アルゴリズムの好ましい非限定的実例は、MyersおよびMiller(１９８８)のアルゴリズム、Smith et al.(１９８１)の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch(１９７０)の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman(１９８８)の類似性検索(search-for-similarity)方法、KarlinおよびAltschul(１９９３)で修正されたKarlinおよびAltschul(１９９０)のアルゴリズムである。
【００９２】
これらの数学アルゴリズムのコンピューターインプリメンテーション(実装)を配列比較に用いることにより、配列同一性が測定され得る。上記インプリメンテーションには、ＰＣ／ジーンプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ(インテリジェネティクス、マウンテンビュー、カリフォルニア)、ＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２.０)およびウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェアパッケージ、バージョン８におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ(ジェネティクス・コンピューターグループ(ＧＣＧ)から入手可能、５７５サイエンス・ドライブ、マディソン、ウィスコンシン、米国)があるが、限定されるわけではない。これらのプログラムを用いたアラインメントは、デフォルトパラメーターを用いて遂行され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Higgins et al.(１９８８)、Higgins et al.(１９８９)、Corpet et al.(１９８８)、Huang et al.(１９９２)およびPearson et al.(１９９４)により詳述されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、MyersおよびMiller(前出)のアルゴリズムに基いている。Altschul et al.(１９９０)のＢＬＡＳＴプログラムは、KarlinおよびAltschul(前出)のアルゴリズムに基いている。
【００９３】
ＢＬＡＳＴ解析を遂行するためのソフトウェアは、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公的に入手され得る。このアルゴリズムは、まず、検索配列における長さＷの短いワードを同定することによる高スコアリング配列対(ＨＳＰ)の同定を含み、それらはデータベース配列における同じ長さのワードと平行整列させたとき正に評価された閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たす。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される(Altschul et al.,１９９０)。これらの初回近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始させるシードとして作用する。次いで、累積アラインメントスコアが増加され得るとき、ワードヒットは各配列に沿って両方向に伸長される。ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ(一対のマッチする残基についての報酬スコア：常に＞０)およびＮ(ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０)を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値からの量Ｘにより落込み、一つまたはそれ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積故に、累積スコアが０またはそれ以下になるか、またはいずれかの配列の末端に達したとき、各方向でのワードヒットの伸長は停止される。
【００９４】
配列同一性パーセントを計算するのに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２配列間の類似性の統計的分析を遂行する(例、Karlin & Altschul(１９９３)参照)。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一尺度は、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))であり、それは２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、レファレンス核酸配列と試験核酸配列の比較における最小合計確率が約０.１より小、さらに好ましくは約０.０１より小、そして最も好ましくは約０.００１より小である場合、試験核酸配列はレファレンス配列と類似していると考えられる。
【００９５】
比較目的用のギャップアラインメントを得るためには、Altschul et al.(１９９７)の記載にしたがってギャップＢＬＡＳＴ(ＢＬＡＳＴ２.０で)が使用され得る。別法として、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ(ＢＬＡＳＴ２.０で)を用いることにより、分子間の遠い関係を検出する反復検索が遂行され得る。Altschul et al.(前出)参照。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用するとき、各プログラムのデフォルトパラメーターが使用され得る(例、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質についてはＢＬＡＳＴＸ)。ＢＬＡＳＴＮプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルト値として１１のワード長(Ｗ)、１０の期待値(Ｅ)、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルト値として３のワード長(Ｗ)、１０の期待値(Ｅ)、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる(Henikoff & Henikoff、１９８９参照)。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。アラインメントはまた、検査により手動操作的に遂行され得る。本発明の目的の場合、本明細書で開示されているヌクレオチド配列との配列同一性パーセントを測定するためのヌクレオチド配列の比較は、好ましくはそのデフォルトパラメーターによるＢｌａｓｔＮプログラム(バージョン１.４.７またはそれ以降)または均等内容プログラムを用いて為される。「均等内容プログラム」とは、問題の２配列について、好ましいプログラムにより作成された対応するアラインメントと比較したとき同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを作成する配列比較プログラムをいう。
【００９６】
(ｃ)２つの核酸またはポリペプチド配列について本明細書で使用されている「配列同一性」または「同一性」は、特定された比較ウインドウ全体にわたって最大類似について整列させたときに同一である２配列における残基についていう。配列同一性パーセントをタンパク質に関連して使用するとき、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が化学特性(例、電荷または疎水性)の類似した他のアミノ酸残基により置換されているため、分子の機能的特性を変えることのない、同類アミノ酸置換により異なっている場合が多いと認められている。配列が同類置換の点で異なるとき、配列同一性パーセントを上方に調節することにより、同類置換の性質について補正され得る。上記同類置換が異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調節を行う手段は、当業者にはよく知られている。典型的には、この場合、完全ミスマッチではなく部分ミスマッチとして同類置換をスコアリングすることにより、配列同一性パーセントを増加させる。すなわち、例えば、同一アミノ酸には１のスコアが与えられ、非同類置換にはゼロのスコアが与えられる場合、同類置換にはゼロおよび１の間のスコアが与えられる。同類置換のスコアリングは、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ(インテリジェネティクス、マウンテン・ビュー、カリフォルニア)で実行される要領にしたがって算出される。
【００９７】
(ｄ)本明細書で使用されている「配列同一性(の)パーセント」は、比較ウインドウ全体にわたって２つの最適に平行整列された配列を比較することにより測定された値をいい、その場合比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２配列の最適アラインメントについてのレファレンス配列(付加または欠失を含まない)と比べて付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。パーセントは、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列において見出される位置の数を測定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、そして結果を１００倍して配列同一性パーセントを得ることにより計算される。
【００９８】
(ｅ)(ｉ)ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」の語は、ポリヌクレオチドが、標準パラメーターを用いて記載されたアラインメントプログラムの一つを用ることにより、レファレンス配列と比べて、少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％または７９％、好ましくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、および最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者であれば、コドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠配置などを考慮することにより、これらの値を適切に調節して２つのヌクレオチド配列によりコード化される対応するタンパク質同一性を測定し得ることは認めるはずである。これらの目的に関するアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、９０％および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００９９】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２個の分子がストリンジェントな条件(下記参照)下で互いにハイブリダイズするか否かである。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特定配列についての熱融解点(Ｔｍ)より約５℃低くなるように選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、ここで別の方法で制限されている所望のストリンジェンシー度によって、約１℃〜約２０℃の範囲における温度を包含する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコード化するポリペプチドが実質的に同一である場合は依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝コードにより許容される最大コドン縮重を用いて１コピーの核酸が作成されるときに生じ得る。２核酸配列が実質的に同一であることの一指標は、第一核酸によりコード化されたポリペプチドが、第二核酸によりコード化されたポリペプチドと免疫学的交差反応性を示すときである。
【０１００】
(ｅ)(ii)ポリペプチドに関する場合における「実質的同一性」の語は、ポリペプチドが、特定比較ウインドウ全体にわたってレファレンス配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％または７９％、好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、またはさらに好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。好ましくは、最適アラインメントは、NeedlemanおよびWunsch(１９７０)の相同性アラインメントアルゴリズムを用いて実施される。２つのポリペプチド配列が実質的に同一であることの指標は、一方のポリペプチドが第二のポリペプチドに対して産生した抗体と免疫学的反応性を示すことである。すなわち、例えば、２つのペプチドが同類置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。
【０１０１】
配列比較について、典型的に一配列は、試験配列が比較されるレファレンス配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いて、試験およびレファレンス配列をコンピューターに入力するとき、必要ならば部分列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基いて、レファレンス配列に対する試験配列(複数も可)についての配列同一性パーセントを計算する。
【０１０２】
上記の通り、２核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。「特異的にハイブリダイズする」の語は、特定ヌクレオチド配列が複合体混合物(例、全細胞性)ＤＮＡまたはＲＮＡに存在するとき、ストリンジェントな条件下でそのヌクレオチド配列のみについての分子の結合、二重らせん形成またはハイブリダイズをいう。「実質的に結合する」は、プローブ核酸および標的核酸間における相補的ハイブリダイゼーションをいい、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低減化することにより適応され得る僅かのミスマッチを包含することにより、標的核酸配列の所望の検出が達成される。
【０１０３】
核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザーンおよびノーザンハイブリダイゼーションのコンテクストにおける「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメーター下では異なる。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全マッチしたプローブにハイブリダイズする温度(規定のイオン強度およびｐＨ下)である。特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、決定因子は最終洗浄液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、MeinkothおよびWahl(１９８４)の方程式：Ｔｍ８１.５℃＋１６.６(ｌｏｇ Ｍ)＋０.４１(％ＧＣ)−０.６１(％形)−５００／Ｌ(式中、Ｍは１価カチオンのモル数であり、％ＧＣはＤＮＡにおけるグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセントであり、％形はハイブリダイゼーション溶液中におけるホルムアミドのパーセントであり、そしてＬは塩基対におけるハイブリッドの長さである)から概算され得る。Ｔｍは、誤対合の各１％について約１℃ずつ下げられる。すなわち、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするように調節され得る。例えば、＞９０％の同一性を有する配列を求める場合、Ｔｍは１０℃減らされ得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特異的配列およびその相補配列についての熱融解点Ｉより約５℃低いように選択される。しかしながら、厳密なストリンジェント条件は、熱融解点Ｉより１、２、３または４℃低温でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用い得る。中度のストリンジェント条件は、熱融解点Ｉよりも６、７、８、９または１０℃低温でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用い得る。低ストリンジェンシー条件は、熱融解点Ｉよりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低温でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用い得る。方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄液組成、および所望のＴを用いると、通常レベルの当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄液のストリンジェンシーの変動が固有に報告されることは理解できるはずである。所望の程度の誤対合が４５℃(水溶液)または３２℃(ホルムアミド溶液)より低いＴをもたらす場合、さらに高い温度を用い得るようにＳＳＣ濃度を高めるのが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての徹底ガイドは、Tijssen(１９９３)に報告されている。一般的に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特異的配列について熱融解点Ｔｍより約５℃低温であるように選択される。
【０１０４】
高ストリンジェント洗浄条件の一例は、約１５分間７２℃で０.１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェント洗浄条件の一例は、１５分間６５℃で０.２ＸＳＳＣ洗浄である(ＳＳＣ緩衝液の記載について、Sambrook、下記参照)。多くの場合、高ストリンジェンシー洗浄には低ストリンジェンシー洗浄が先行することにより、バックグラウンドプローブシグナルが除去される。例えば１００を越えるヌクレオチドの二重らせんについての中程度ストリンジェンシー洗浄の一例は、１５分間４５℃で１ＸＳＳＣである。例えば１００を越えるヌクレオチドの二重らせんについての低ストリンジェンシー洗浄の一例は、１５分間４０℃で４〜６ＸＳＳＣである。短いプローブ(例、約１０〜５０ヌクレオチド)の場合、ストリンジェントな条件には、典型的にはｐＨ７.０〜８.３で約１.５Ｍ未満の塩濃度、さらに好ましくは約０.０１〜１.０ＭのＮａイオン濃度(または他の塩類)が含まれ、温度は典型的には少なくとも約３０℃および長いプローブ(例、＞５０ヌクレオチド)については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤、例えばホルムアミドの添加により達成され得る。一般に、特定ハイブリダイゼーション検定法において非関連プローブについて観察される値の２Ｘ(またはそれより高い)のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下では互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコード化するタンパク質が実質的に同一であれば依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝コードにより許容される最大コドン縮重を用いて１コピーの核酸が作成されるときに見られる。
【０１０５】
非常にストリンジェントな条件は、特定プローブについてのＴｍと等しくなるように選択される。サザーンまたはノーザンブロットにおけるフィルターで１００を越える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについてのストリンジェント条件の一例は、５０％ホルムアミド、例えば５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃、０.１ＸのＳＳＣ中での洗浄である。低ストリンジェンシー条件の例には、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝液によるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃で１Ｘ〜２ＸのＳＳＣ(２０ＸＳＳＣ＝３.０ＭのＮａＣｌ／０.３Ｍのクエン酸三ナトリウム)が含まれる。中程度のストリンジェンシー条件の例には、４０〜４５％ホルムアミド、１.０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃、０.５Ｘ〜１ＸのＳＳＣ中での洗浄が含まれる。
【０１０６】
以下は、本発明のレファレンスヌクレオチド配列と実質的に同一であるオーソロガスヌクレオチド配列のクローニングに使用され得るハイブリダイゼーション／洗浄条件設定の実例である。レファレンスヌクレオチド配列を、望ましくは５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中でレファレンスヌクレオチド配列とハイブリダイズさせ、５０℃、２ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで洗浄し、さらに望ましくは５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中でハイブリダイズさせ、５０℃、０.５ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで洗浄し、好ましくは５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中でハイブリダイズさせ、５０℃、０.１ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで洗浄し、さらに好ましくは５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中でハイブリダイズさせ、６５℃、０.１ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで洗浄する。
【０１０７】
位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明精製ポリペプチドの非限定的一供給源は、下記実施例に記載されている無細胞抽出物である。本発明によるＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドの別の精製方法は、タンパク質への標識の結合であり、それによりその精製が容易になる。したがって、本発明は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す精製ポリペプチドを提供するもので、その場合ポリペプチドは標識に共有結合される。さらに本発明は、かかる標識ポリペプチドをコード化する核酸分子を提供する。
【０１０８】
本明細書で使用されている「標識」は、本発明ポリペプチドに共有結合したポリペプチドまたは他の分子をいい、その場合、結合剤(例、ポリペプチドまたは分子)は標識と特異的に結合する。本発明によると、「特異的に結合する」とは、結合剤(例、抗体またはＮｉ２＋樹脂)が、特定ポリペプチドまたは化学物質を認識し、それに結合するが、実質的に試料中における他の分子を認識したり、またはそれに結合することは無いことを意味する。幾つかの実施態様において、リガンドと特異的に結合する結合剤は、水中、生理学的条件下、またはイオン強度に関して適切な生理学的条件に近い条件下、例えば１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２中で、少なくとも１０６Ｍ−１、または少なくとも１０７Ｍ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１の親和力でそのリガンドとの会合を形成する。例えば、Ｈｉｓ標識はニッケル(例、ウィスコンシン、マディソンのノヴァゲン・インコーポレイテッドからＨｉｓ・Ｂｉｎｄ(登録商標)樹脂として市販されているＮｉ２＋荷電カラム)により特異的に結合される。同様に、Ｍｙｃ標識は、Ｍｙｃと特異的に結合する抗体により特異的に結合される。
【０１０９】
下記によると、Ｈｉｓ標識は、Ｈｉｓ標識ポリペプチドをコード化する核酸分子を作製し、エシェリキア・コリ(E.coli)でポリペプチドを発現させることにより、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明精製ポリペプチドに結合される。これらのポリペプチドは、一旦エシェリキア・コリ(E.coli)により発現されると、標準的技術(例、ノヴァゲンから市販されているＨｉｓ・Ｂｉｎｄ(登録商標)キットの一つを用いるかまたはカリフォルニア、パロアルトのクロンテック・ラボラトリーズ、インコーポレイテッドから市販されているＴＡＬＯＮ(登録商標)樹脂(および生産業者の使用説明書)を用いる)により容易に精製される。
【０１１０】
追加的標識を本発明ポリペプチドのいずれかまたは全部に結合することにより、精製が簡便化され得る。これらの標識には、ＨＡ標識(アミノ酸配列：ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ(配列番号３９))、Ｍｙｃ標識(アミノ酸配列：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ(配列番号４０))、ＨＳＶ標識(アミノ酸配列：ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ(配列番号４１))、およびＶＳＶ−Ｇ標識(アミノ酸配列：ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ(配列番号４２))があるが、限定されるわけではない。本発明ポリペプチドへのこれらの標識の共有結合(例えばポリペプチド結合による)により、それぞれ抗ＨＡ抗体、抗Ｍｙｃ抗体、抗ＨＳＶ抗体、または抗ＶＳＶ−Ｇ抗体を用いて標識ポリペプチドが精製され得る。これらの抗体は全て市販されている(例えば、メリーランド、ウォータータウンのＭＢＬインターナショナル・コーポレーション、ノヴァゲン・インコーポレイテッド、ニュージャージー、フランダースのリサーチ・ディアグノスティックス・インコーポレイテッドから)。
【０１１１】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を示す本発明の標識ポリペプチドはまた、化学物質、例えばストレプトアビジンと特異的に結合するビオチンに共有結合により標識され得るため、ストレプトアビジンカラムで精製され得る。同様に、本発明の標識Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、抗体の定常域に(例えば、ポリペプチド結合により)共有結合され得る。かかる標識Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、例えばプロテインＡセファロースで精製され得る。
【０１１２】
本発明の標識Ｐ４５０モノオキシゲナーゼはまた、ＧＳＴ(グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ)または免疫グロブリンの定常域に標識され得る。例えば、本発明の核酸分子(例、配列番号１を含む)は、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック、インコーポレイテッド(ピスキャタウェイ、ニュージャージー)から市販されているｐＧＥＸプラスミドの一つにクローン化され、プラスミドはエシェリキア・コリ(E.coli)で発現され得る。核酸分子によりコード化されて生成したＰ４５０モノオキシゲナーゼを、ＧＳＴ(グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ)に共有結合する。これらのＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオンアガロースカラム(例えば、アマーシャム・ファルマシア・バイオテックから市販されている)で精製され得、上記要領で精製され得る。ｐＧＥＸプラスミドの多くは、融合タンパク質からＧＳＴ部分を容易に除去させ得る。例えば、ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドは、興味の対象である挿入された核酸分子およびＧＳＴエンコーディング核酸配列間にトロンビン認識部位を含む。同様に、ｐＧＥＳ−３ＴプラスミドはＸａ因子部位を含む。適切な酵素で融合タンパク質を処理し、次いでグルタチオンアガロース(ＧＳＴが特異的に結合する)を用いて本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼからＧＳＴ部分を分離することにより、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼは精製され得る。
【０１１３】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性を示す本発明の精製ポリペプチドを得るさらに別の方法は、かかるポリペプチドに特異的に結合する結合剤の使用である。したがって、本発明は、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼへ特異的に結合する結合剤を提供する。本発明のこの結合剤は、化学的化合物(例、タンパク質)、金属イオン、または小分子であり得る。
【０１１４】
特定実施態様において、結合剤は抗体である。「抗体」の語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント(例、Ｆａｂ、ＦｖまたはＦａｂ'フラグメント)、一本鎖抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、イソ型(例、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ)の抗体、および任意の種(例、ウサギ、マウスおよびヒト)由来の抗体を包含するが、これらに限定はされない。
【０１１５】
非限定的な一例では、本発明の結合剤はポリクローナル抗体である。別の非限定的な例では、本発明の結合剤はモノクローナル抗体である。モノクローナルおよびポリクローナルの両抗体の生産方法はよく知られている(例えば、Current Protocols in Immunology、John E.Coligan編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、インコーポレイテッド(１９９３)、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、インコーポレイテッド(２０００)参照)。
【０１１６】
位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本明細書記載のポリペプチドは、新規Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの一ファミリーに属する。したがって、本発明はまた、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼポリペプチドの一ファミリーを提供するもので、ファミリーの各構成員は位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化する。幾つかの実施態様において、ファミリーの各構成員は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４または配列番号９５と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれにより構成される。特定実施態様において、ファミリーの各構成員は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３または配列番号９４と少なくとも６６％同一である核酸配列を含むかまたはそれにより構成される核酸分子によりコード化される。
【０１１７】
本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの全ファミリーを提供しており、その各構成員は位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化し得るもので、天然には存し得ないが、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに効果的に酸化し、望ましくない副産物も低減化した、改良されたＰ４５０モノオキシゲナーゼを生成させ得る。例えば、本発明Ｐ４５０モノオキシゲナーゼファミリーの構成員の一つ、Ｐ４５０Ｅｍａ１酵素は、３''−Ｏ−デメチル−４''−ケト−アベルメクチンの形成がストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２およびｅｍａ１遺伝子を含むストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)による反応において検出されたことから、望ましいものではないさらなる酸化を触媒する。３''−Ｏ−デメチル−４''−ケト−アベルメクチンの形成は、３''−Ｏ−メチル基の酸化によりもたらされ、加水分解によりホルムアルデヒドおよび３''−ヒドロキシル基を形成する加水分解的に不安定な３''−Ｏ−ヒドロキシメチル基が形成される。
【０１１８】
位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドの一ファミリーを提供することにより(例えば、下記表３参照)、本発明の最適化Ｐ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する新規ハイブリッド遺伝子を生産するためにファミリーの個々の構成員は、ファミリー遺伝子混ぜ合わせ(シャッフリング)作業にかけられ得る。非限定的な一例では、Ｐ４５０Ｅｍａ１タンパク質のＯ２結合部位をコード化するｅｍａ１遺伝子の一部分は、Ｐ４５０Ｅｍａ２タンパク質のＯ２結合部位をコード化するｅｍａ２遺伝子の部分とスワップされ得る。かかるキメラｅｍａ１／２タンパク質は、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼの定義内に含まれる。
【０１１９】
また、位置指定突然変異導入または定方向進化技術を用いることにより、全体的活性の向上および／または副産物形成の減少を含めて特性が改善された酵素をコード化するｅｍａ１遺伝子の誘導体が生成され得る。かかる突然変異体を誘導する一方法は、下記ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２のＵＶ突然変異誘発と類似した方法による、ストレプトマイセス(Streptomyces)株自体の突然変異誘発である。
【０１２０】
追加的誘導体は、同類または非同類変化をＰ４５０モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列に加えることにより生産され得る。同類および非同類アミノ酸置換は公知である(例えば、Stryer、Biochemistry、第３版、W.H.フリーマン・アンド・カンパニー、ニューヨーク１９８８参照)。同様に、本発明Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの切頭形は、タンパク質をそのＮ−末端(例えば下記ｅｍａ１Ａ遺伝子参照)、そのＣ−末端で切頭化するか、またはタンパク質の半ばから切頭化する(すなわちアミノ酸残基を除去する)ことにより生成され得る。
【０１２１】
かかる突然変異体、誘導体または切頭形Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化し得る限り、その突然変異体、誘導体または切頭形Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼである。
【０１２２】
別の局面において、本発明は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドをコード化する核酸分子を含むように遺伝子操作された細胞を提供する。「遺伝子操作された」とは、核酸分子が、それが導入される細胞にとって外性であることを意味する。遺伝子操作された細胞への外性核酸分子の導入は、限定はされないが、トランスフェクション、形質導入および形質転換を含む任意の手段により達成され得る。
【０１２３】
ある種の実施態様において、核酸分子は、遺伝子操作された細胞で発現するように位置決めされる。「発現するように位置決めされる」とは、ポリペプチドをコード化する外性核酸分子が、細胞へ導入された時に核酸分子を発現させ得るように調節配列に結合されていることを意味する。「調節配列」とは、それらが機能し得るように結合されているタンパク質コーディング配列の発現を制御する、核酸配列、例えば開始シグナル、ポリアデニル化(ポリＡ)シグナル、プロモーター、およびエンハンサーを包含する。タンパク質またはポリペプチドフラグメントをコード化する核酸分子の「発現」とは、タンパク質および／またはｍＲＮＡとしてのその核酸分子の発現を意味する。
【０１２４】
本発明の遺伝子操作された細胞は、原核生物細胞(例、エシェリキア・コリ(E.coli))または真核生物細胞(例、サッカロマイシス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)または哺乳類細胞(例、ヒーラ))であり得る。本発明の幾つかの実施態様によると、遺伝子操作された細胞は、野生型(すなわち遺伝子操作されていない)細胞であれば挿入された核酸分子を天然では含まず、挿入された核酸分子によりコード化されるタンパク質を本来は発現しない細胞である。したがって、細胞は、遺伝子操作されたストレプトマイセス(Streptomyces)株、例えばストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)またはストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)株であり得る。別法として、細胞は、遺伝子操作されたシュードモナス(Pseudomonas)株、例えばシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)株またはシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)株であり得る。別の方法において、細胞は遺伝子操作されたエシェリキア・コリ(E.coli)株であり得る。
【０１２５】
ただし、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドをコード化する核酸分子を含むように遺伝子操作された細胞の型によっては、実際の遺伝子操作された細胞、それ自体が、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに変換できない場合もあり得るものとする。むしろ、かかる遺伝子操作細胞により異種(heterogously)発現されたＰ４５０モノオキシゲナーゼがその細胞から精製され得、そこで本発明の精製Ｐ４５０モノオキシゲナーゼを用いることにより、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化し得る。すなわち、本発明の遺伝子操作細胞は、それ自体、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに変換できる必要は無い。むしろ、本発明の遺伝子操作細胞は、ポリペプチドがその細胞の内側で活性を示すか否かとは関係無く、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドをコード化する核酸分子を含むだけでよい。
【０１２６】
さらに、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示す本発明のポリペプチドをコード化する核酸分子を含むように遺伝子操作された細胞(例、エシェリキア・コリ(E.coli))は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化し得ないが、遺伝子操作細胞から精製されたＰ４５０モノオキシゲナーゼは位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化できる。しかしながら、同じ細胞が、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、本発明のフェレドキシン、および／または本発明のフェレドキシン還元酵素の酵素活性を示す本発明のポリペプチドを含むように遺伝子操作されている場合、フェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素と一緒にＰ４５０モノオキシゲナーゼは、全てその細胞から精製され、そして還元剤(例、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ)の存在下において、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化できる。さらに、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼ、本発明のフェレドキシン、および本発明のフェレドキシン還元酵素を含む遺伝子操作細胞、それ自体はこの酸化を実施し得ない。
【０１２７】
さらに、細胞(例、エシェリキア・コリ(E.coli))が本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼ、フェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素タンパク質を発現するように遺伝子操作されている非限定的な一例において、これら３種のタンパク質は全て、遺伝子操作されたエシェリキア・コリ(E.coli)から精製されたとき、一緒の状態であり、還元剤(例、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ)の存在下において活性を示し、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化し得るため、エマメクチン生産方法において有用である。
【０１２８】
本発明にしたがって、以下の材料は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約のもと、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス、パテント・カルチャー・コレクション(ＮＲＲＬ)(イリノイ６１６０４、ペオリア、ノースユニバーシティー・ストリート１８１５)に寄託されている：(１)ストレプトマイセス・リビダンスＺＸ７(ｅｍａ１／ｆｄ２３３−ＴＵＡ１Ａ)ＮＲＲＬ指定番号Ｂ−３０４７８、および(２)プラスミドｐＲＫ２９０−ｅｍａ１／ｆｄ２３３を含むシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)ＮＲＲＬ Ｂ−４０６７。
【０１２９】
位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼの酵素活性を示すポリペプチドの新規ファミリーを同定したとき、新規フェレドキシンおよび新規フェレドキシン還元酵素もまた、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが見出されたのと同じ菌株で同定された。したがって、さらに別の局面において、本発明は、フェレドキシンの酵素活性を示すポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子を提供し、その場合、核酸分子は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するポリペプチドを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。同様に、本発明は、フェレドキシン還元酵素の酵素活性を示すポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む精製核酸分子を提供し、その場合、核酸分子は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するポリペプチドを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。本発明はまた、フェレドキシンの酵素活性を示す精製タンパク質、およびフェレドキシン還元酵素の酵素活性を示す精製タンパク質を提供し、その場合、フェレドキシンタンパク質およびフェレドキシン還元酵素タンパク質は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するポリペプチドを含むストレプトマイセス(Streptomyces)株から単離される。
【０１３０】
フェレドキシンの酵素活性を示すポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む有用な核酸分子は、配列番号３５または配列番号３７と少なくとも８１%同一である核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。別法として、核酸分子は、配列番号３５または配列番号３７と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。フェレドキシンの酵素活性を示すポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子は、配列番号３５または配列番号３７の核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され得る。
【０１３１】
フェレドキシン活性を示す本発明タンパク質は、配列番号３６または配列番号３８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され得る。幾つかの実施態様において、核酸分子は、配列番号３６または配列番号３８と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。本発明フェレドキシンは、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され得る。
【０１３２】
フェレドキシン還元酵素の活性を示す本発明タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む有用な核酸分子は、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、または配列番号１０４と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成される。本発明の特定実施態様では、本発明のフェレドキシン還元酵素をコード化する核酸分子は、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、または配列番号１０４のアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され得る。
【０１３３】
本発明のフェレドキシン還元酵素は、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５と少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され得る。本発明の特定実施態様において、本発明のフェレドキシン還元酵素は、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、または配列番号１０５のアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれにより構成され得る。
【０１３４】
フェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素タンパク質並びに上記フェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素タンパク質をコード化する核酸分子の精製方法は、当業界では公知であり、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する核酸分子の精製について上述した方法と同じである。
【０１３５】
本発明の精製Ｐ４５０モノオキシゲナーゼを精製フェレドキシンと共に得る非限定的な一例では、ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)株(またはシュードモナス・プチダ(P.putida)株または本発明のＰ４５０オキシゲナーゼが天然には存しない他の細胞)に対し、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する第一核酸分子およびフェレドキシンタンパク質をコード化する第二核酸分子を含むように遺伝子操作が加えられ得、その場合第一および第二核酸分子は両方とも遺伝子操作された細胞で発現するように位置決めされている。第一および第二核酸分子は、別々のプラスミドに配置され得るか、または同じプラスミドに配置され得る。すなわち、同じ遺伝子操作細胞または株が、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび本発明のフェレドキシンタンパク質の両方を生産する。
【０１３６】
本発明の精製Ｐ４５０モノオキシゲナーゼを本発明の精製フェレドキシンおよび精製フェレドキシン還元酵素と共に得るさらに別の非限定的な一例では、ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)株(またはシュードモナス・プチダ(P.putida)株または本発明のＰ４５０オキシゲナーゼが天然には存しない他の細胞)に対し、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する第一核酸分子および本発明のフェレドキシンタンパク質をコード化する第二核酸分子および本発明のフェレドキシン還元酵素タンパク質をコード化する第三核酸分子を含むように遺伝子操作が加えられ得、その場合第一および第二および第三核酸分子は全て遺伝子操作された細胞で発現するように位置決めされている。第一および第二および第三核酸分子は、別々のプラスミド、または同じプラスミドに配置され得る。すなわち、同じ遺伝子操作細胞または株が、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび本発明のフェレドキシンおよびフェレドキシン還元酵素タンパク質を生産する。
【０１３７】
本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼについて上述したところによると、フェレドキシンタンパク質および／またはフェレドキシン還元酵素タンパク質は、さらに標識を含み得る。さらに、本発明では、フェレドキシンタンパク質に特異的に結合する結合剤(例、抗体)、および本発明のフェレドキシン還元酵素タンパク質に特異的に結合する結合剤が考慮に入れられる。標識フェレドキシンタンパク質、標識フェレドキシン還元酵素タンパク質、およびフェレドキシンまたはフェレドキシン還元酵素に特異的に結合する結合剤(例、抗体)を生成させる方法は、本発明の標識Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの生成および本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼと特異的に結合する結合剤の生成についての上記方法と同じである。
【０１３８】
本発明はまた、エマメクチンの製法を提供する。この方法では、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを、アベルメクチン含有反応混合物に加える。次いで、反応混合物を、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化させ得る条件下でインキュベーションする。反応混合物は、さらにフェレドキシン、例えば本発明のフェレドキシンを含み得る。特定実施態様において、反応混合物は、さらにフェレドキシン還元酵素、例えば本発明のフェレドキシン(還元酵素)を含む。反応混合物は、さらに還元剤、例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを含み得る。
【０１３９】
さらに、本発明は、４''−ケト−アベルメクチンの製法を提供する。この方法では、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを、アベルメクチンを含む反応混合物に加え、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化させ得る条件下で反応混合物をインキュベーションする。幾つかの実施態様において、反応混合物は、さらにフェレドキシン、例えば本発明のフェレドキシンを含む。反応混合物はまた、さらにフェレドキシン還元酵素、例えば本発明のフェレドキシン(還元酵素)を含み得る。特定実施態様において、反応混合物は、さらに還元剤、例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを含む。
【０１４０】
本発明はまた、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含むエマメクチンを生産するための処方物を提供する。幾つかの実施態様において、処方物は、さらにフェレドキシン、例えば本発明のフェレドキシンを含む。特定実施態様では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが単離または誘導されたのと同じ種の細胞または株からフェレドキシンを単離する。処方物は、さらにフェレドキシン還元酵素、例えば本発明のフェレドキシン還元酵素を含み得る。特定実施態様では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが単離または誘導されたのと同じ種の細胞または株からフェレドキシン還元酵素を単離する。幾つかの実施態様において、処方物は、さらに還元剤、例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを含む。
【０１４１】
さらに、本発明は、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化するＰ４５０モノオキシゲナーゼを含む４''−ケト−アベルメクチンを生産するための処方物を提供する。幾つかの実施態様において、処方物は、さらにフェレドキシン、例えば本発明のフェレドキシンを含む。特定実施態様では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが単離または誘導されたのと同じ種の細胞または株からフェレドキシンを単離する。幾つかの実施態様において、処方物は、さらにフェレドキシン還元酵素、例えば本発明のフェレドキシン還元酵素を含む。特定実施態様では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが単離または誘導されたのと同じ種の細胞または株からフェレドキシン還元酵素を単離する。処方物は、さらに還元剤、例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを含み得る。
【０１４２】
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい実施態様の説明を意図したものであって、全く限定的なものではない。
【０１４３】
実施例１
ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２についての最適化成長条件
非限定的な一例において、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ高度に酸化し得るストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２の細胞の安定供給を提供するのに必要とされる発酵条件を最適化した。
【０１４４】
まず、以下の溶液を調製した。ＩＳＰ−２寒天については、４ｇの酵母抽出物(イギリス国、ベイシングストークのオキソイド・リミテッドから市販されている)、４ｇのＤ(＋)‐グルコース、１０ｇのバクト麦芽抽出物(ディフコ番号０１８６−１７−７(例えばミズーリ、カンサスシティーのヴォイト・グローバル・ディストリビューションから市販されているディフコ製品))および２０ｇの寒天(ディフコ番号０１４０−０１)を１リットルの脱塩水に溶かし、ｐＨを７.０に調節する。溶液を１２１℃で２０分間滅菌し、冷まし、寒天平板の即時調製に要する期間５５℃に保った。
【０１４５】
ＰＨＧ培地については、１０ｇのペプトン(シグマ０５２１、ミズーリ、セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニーから市販されている)、１０ｇの酵母抽出物(ディフコから市販されている)、１０ｇのＤ−(＋)‐グルコース、２ｇのＮａＣｌ、０.１５ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１.３ｇのＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ、および４.４ｇのＫ２ＨＰＯ４を、１リットルの脱塩水に溶かし、ｐＨを７.０に調節した。
【０１４６】
ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２を、２８℃のＩＳＰ−２寒天でのペトリ皿で成長させた。この培養物を用いて、各々１００ｍｌのＰＨＧ培地を含む、４本のバッフル付き５００ｍｌ振盪フラスコに接種した。これらの前培養物を７２時間２８℃、１２０ｒｐｍのオービタルシェーカーで成長させ、次いでこれらを用いて、機械的スターラーを備え、８リットルのＰＨＧ培地を含む１０リットルの発酵槽に接種した。この主培養物を、５００ｒｐｍで攪拌しながら、１.７５ｖｖｍ(１４リットル／分)のエアレーションおよび０.７バールの圧力をかけて２８℃で成長させた。指数的成長の最後、約２０時間後に、細胞を遠心分離により採取した。生細胞収率は培養物１リットル当たり７０〜８０ｇであった。
【０１４７】
実施例２
全細胞生体触媒検定法
本発明にしたがって測定されたところによると、以下の全細胞生体触媒検定法を用いることにより、位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化し得るストレプトマイセス(Streptomyces)細胞からの活性がＰ４５０モノオキシゲナーゼにより触媒されることを測定した。
【０１４８】
ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２をＰＨＧ培地で成長させ、そしてストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｉ−１５２９をＭ−１７またはＰＨＧ培地で成長させた。ＰＨＧ培地は、１０ｇ／ｌのペプトン(シグマ、０.５２１)、１０ｇ／ｌの酵母抽出物(ディフコ、０１２７−１７−９)、１０ｇ／ｌのＤ−グルコース、２ｇ／ｌのＮａＣｌ、０.１５ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１.３ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４×１Ｈ２Ｏ、および４.４ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４(ｐＨ７.０)を含む。Ｍ−１７培地は、１０ｇ／ｌのグリセリン、２０ｇ／ｌのデキストリン白色、１０ｇ／ｌのソイトン(ディフコ０４３７−１７)、３ｇ／ｌの酵母抽出物(ディフコ０１２７−１７−９)、２ｇ／ｌの(ＮＨ４)２ＳＯ４、および２ｇ／ｌのＣａＣＯ３(ｐＨ７.０)を含む。
【０１４９】
細胞を成長させるため、ＩＳＰ２寒天平板(１〜２週間より古くはない)に接種し、良好な成長が達成されるまで３〜７日間インキュベーションした。次に、過剰成長寒天片を、５０ｍｌのＰＨＧ培地を含む１つのバッフルを備えた２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコへ(接種ループにより)移した。この前培養物を２８℃および１２０ｒｐｍで２〜３日間インキュベーションする。次に、５ｍｌの前培養物を、１００ｍｌのＰＨＧ培地を含む１つのバッフルを備えた５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移した。主要培養物を２８℃および１２０ｒｐｍで２日間インキュベーションした。次に、培養物をベックマンローターＪＡ−１４において１０分間８０００ｒｐｍの遠心分離にかけた。次に、細胞を５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７.０で１回洗浄した。
【０１５０】
全細胞生体触媒検定法を遂行するため、５００ｍｇの生細胞を２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に入れ、そこへ１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.０)を加えた。細胞を磁気攪拌棒で攪拌して、細胞を分散させた。次に、イソプロパノール(３０ｍｇ／ｍｌ)中のアベルメクチンＢ１ａの溶液１５μｌを加え、混合物を１６０ｒｐｍおよび２８℃のオービタルシェーカーで振とうした。株Ｒ−９２２を２時間反応させ、株Ｉ−１５２９を３０時間反応させた。
【０１５１】
全細胞生体触媒検定法において培養物を後処理するため、１０ｍｌのメチル−ｔ−ブチル−エーテルを、休止細胞を含むエルレンマイヤーフラスコに加え、細胞混合物全体を３０ｍｌ遠心管に移し、激しく振とうし、次いで、１６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。エーテル相をピペットで５０ｍｌナシ型フラスコ中に移し、ロータリー蒸発装置手段により真空下で蒸発させた(≦０.１ｍｂａｒ)。残さを１.２ｍｌのアセトニトリルに再溶解し、ＨＰＬＣ試料バイアルへ移した。アベルメクチンＢ１ａから４''−ヒドロキシアベルメクチンＢ１ａおよび４''−ケト−アベルメクチンＢ１ａ(４''−オキソ−アベルメクチンＢ１ａとも呼ばれる)への変換および生体触媒反応による副産物の形成は、ＨＰＬＣプロトコルＩを用いたＨＰＬＣ分析により観察され得る。
【０１５２】
ＨＰＬＣプロトコルＩについては、以下のパラメーターを使用した：
ハードウェア
ポンプ：            Ｌ−６２５０メルク−日立
オートサンプラー：  ＡＳ−２０００Ａメルク−日立
インターフェース・モジュール：  Ｄ−６０００メルク−日立
チャンネル１−検出装置：  Ｌ−７４５０Ａ  ＵＶダイオードアレイメルク−日立
カラムオーブン：  無し
カラム：          ７０ｍｍ×４ｍｍ
吸光度：        クロマシル１００オングストローム‐３.５μ−Ｃ１８
【０１５３】
2004529651.tif 000015
【０１５４】
実施例３
ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２からの無細胞抽出液による生体内変換
位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化し得るストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２からの無活性細胞抽出液を調製するため、以下の溶液を調製し、４℃で貯蔵し、使用時まで氷上に保った。
【表１】2004529651.tif 000016
【０１５５】
ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２からの生細胞６グラムをＰＰ−緩衝液中で洗浄し、次いで３５ｍｌの破壊緩衝液に再懸濁し、４℃のフレンチプレス中で破壊した。生成した懸濁液を１時間３５０００×ｇの遠心分離にかけた。無細胞抽出液の上清を集めた。１μｌの基質を４９９μｌの澄明無細胞抽出液に加え、３０℃で１時間インキュベーションした。次いで、１ｍｌのメチル−ｔ−ブチルエーテルを反応混合物に加え、十分に混合した。次に、混合物を２分間１４０００ｒｐｍの遠心分離にかけ、メチル−ｔ−ブチルエーテル相を１０ｍｌのフラスコ中に移し、ロータリー蒸発装置により真空下で濃縮した。残さを２００μｌのアセトニトリルに溶かし、ＨＰＬＣ試料バイアル中へ移した。
【０１５６】
ＨＰＬＣについては、ＨＰＬＣプロトコルＩを使用した。
１μｌの基質を４９９μｌの澄明無細胞抽出液に加え、３０℃でインキュベーションしたとき、ＨＰＬＣプロトコルＩを用いたＨＰＬＣ分析によりアベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの変換は全く観察されなかった。
【０１５７】
しかしながら、ホウレンソウフェレドキシンおよびホウレンソウフェレドキシン還元酵素およびＮＡＤＰＨを無細胞抽出液に加えることにより生体触媒活性を回復させる可能性について調査した(総括的には、D.E.CaneおよびE.I.Graziani,J.Am.Chem.Soc.１２０：２６８２、１９８８参照)。
【０１５８】
したがって、以下の溶液を調節した：
【表２】2004529651.tif 000017
基質溶液を４℃で貯蔵し、他の溶液を−２０℃で貯蔵し、使用時には氷上で保った。
【０１５９】
すなわち、４７５μｌの澄明無細胞抽出液に、以下の溶液を加えた：１０μｌのフェレドキシン、１０μｌのフェレドキシン還元酵素および１μｌの基質。基質を細胞に加えた後、混合物を即時十分に混合し、曝気した。次いで、５μｌのＮＡＤＰＨを加え、混合物を３０分間３０℃でインキュベーションした。次いで、１ｍｌのメチル−ｔ−ブチルエーテルを反応混合物に加え、十分に混合した。次に、混合物を２分間１４０００ｒｐｍの遠心分離にかけ、メチル−ｔ−ブチルエーテル相を１０ｍｌのフラスコ中へ移し、ロータリー蒸発装置により真空下で濃縮した。残さを２００μｌのアセトニトリルに溶かし、ＨＰＬＣ試料バイアル中へ移し、ＨＰＬＣプロトコルＩを用いてＨＰＬＣ分析を遂行した。
【０１６０】
４''−ケト−アベルメクチンの形成は、ＨＰＬＣ分析により観察可能であった。すなわち、ホウレンソウフェレドキシンおよびホウレンソウフェレドキシン還元酵素およびＮＡＤＰＨを無細胞抽出液に加えることにより、生体触媒活性が回復された。
【０１６１】
３０μｌ試料を注入すると、ピークが４.８３分で現れたことから、４''−ケト−アベルメクチンＢ１ａの存在が示された。ＨＰＬＣ質量分析法により、このピークには、４''−ケト−アベルメクチンＢ１ａの分子量に対応する８７０Ｄの質量が割当てられ得た。
【０１６２】
ただし、ＨＰＬＣおよびＨＰＬＣ質量分析法により生成物の形成を分析したとき、４''−ケト−アベルメクチンに加えて、対応するケト水和物４''−ヒドロキシ−アベルメクチンもまた見出され、２.１２分でピークを生じた。この発見は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼが、４''−ケト−アベルメクチンが脱水により形成される、４''−ヒドロキシ−アベルメクチンへのヒドロキシル化によりアベルメクチンを変換することを示していた。興味深いことに、ホウレンソウフェレドキシンをクロストリジウム・パステウリアヌム(Clostridium pasteurianum)菌または紅藻ポルフィラ・ウンビリカリス(Porphyra umbilicalis)からのフェレドキシンと置き換えても、依然としてアベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの生体内触媒変換が行われたことから、この酵素は還元均等内容物の受容について特異的なフェレドキシンに左右されないことが示された。
【０１６３】
実施例４
活性が向上した突然変異体ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２の単離
位置選択的にアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化する能力が高められたストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２の株を得るため、ＵＶ突然変異体を生産した。これを行うため、ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２の胞子を集め、−２０℃の１５％グリセリン中で貯蔵した。このストック溶液は２×１０９の胞子を含んでいた。
【０１６４】
次に、胞子ストック溶液を希釈し、１０ｍｌの滅菌水を含むペトリ皿に移し、懸濁液をストラタリンカーＵＶクロスリンカー２４００(カリフォルニア、ラジョラのストラタジーンから市販されている)においてＵＶ光線に暴露した。ストラタリンカーＵＶクロスリンカーは２５４ｎｍ光源を使用し、試料の照射に使用されるエネルギー量は「エネルギーモード」に設定され得る。
【０１６５】
実験を通して、８０００マイクロジュールのＵＶ照射(２５４ｎｍ)被曝量が胞子の９９.９％を殺すのに必要とされることが測定された。このＵＶ被曝レベルを突然変異誘発に使用した。
【０１６６】
生残っているＵＶ突然変異誘発胞子を平面培地に接種し、培養し、最小培地に移した。生存し得る胞子の約０.３〜０.４％は栄養要求性であることが測定され、集団における突然変異誘発レベルが良好であることが示された。
【０１６７】
突然変異を起したクローンを、実施例２記載の全細胞生体触媒検定法における活性についてスクリーニングした。ＨＰＬＣクロマトグラムで示されている通り、一突然変異体(「Ｒ−９２２ＵＶ突然変異体」)は、野生型Ｒ−９２２と比べてアベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの位置選択的酸化能力の２〜３倍増加を示した。位置選択的酸化活性に関与するＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する遺伝子、ｅｍａ１は、Ｒ−９２２ＵＶ突然変異体において突然変異していないにもかかわらず、この突然変異体はｅｍａ１タンパク質を含む無細胞抽出液についての優れた供給源を提供する。
【０１６８】
実施例５
ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２からのＰ４５０モノオキシゲナーゼの単離
Ｐ４５０酵素を濃厚化するため、３５ｍｌの活性無細胞抽出液を４５μｍフィルターにより濾過し、アニオン交換クロマトグラフィーにより分画した。アニオン交換クロマトグラフィー条件は以下の通りであった：
2004529651.tif 000018
【０１６９】
酵素活性は３５％〜４０％緩衝液Ｂにより溶離した。活性画分をプールし、５０００ｒｐｍで排除限界５ｋＤのバイオマックス(登録商標)フィルター(マサチューセッツ、ベッドフォードのミリポア・コーポレーションから市販されている)による遠心濾過により濃縮し、次いで２０％グリセリン含有破壊緩衝液で、３〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む５ｍｌ量に再希釈した。この濃厚化酵素溶液は、もとの酵素活性の少なくとも２５％を含んでいた。
【０１７０】
サイズ排除クロマトグラフィーにより酵素をさらに精製した。サイズ排除クロマトグラフィー条件は以下の通りであった：
2004529651.tif 000019
【０１７１】
酵素活性は２０５〜２３５ｍｌ間の溶離緩衝液により溶離した。活性画分をプールし、５０００ｒｐｍで排除限界５ｋＤのバイオマックス(登録商標)フィルター(ミリポアから)による遠心濾過により濃縮し、２０％グリセリン含有破壊緩衝液で再希釈することにより、２〜５ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む０.５〜１ｍｌの溶液を形成させた。この濃厚化酵素溶液は、もとの酵素活性の１０％を含んでいた。この酵素調製物をＳＤＳｐａｇｅにより純度についてチェックし(総括的には、Laemmli,U.K.、Nature２２７：６８０−６８５、１９７０およびCurrent Protocols in Molecular Biology、前出参照)、クーマシーブルーにより染色すると、既知分子量のレファレンスタンパク質にしたがって、分子量が４５〜５０ｋＤである一つの顕著なタンパク質バンドを示した。
【０１７２】
実施例６
ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２およびＩ−１５２９から試みられたＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子の単離
アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの位置特異的酸化に関与するＲ−９２２株由来の酵素がＰ４５０モノオキシゲナーゼであると示唆している上記結果に基づき、この株からＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子をクローン化する直接なＰＣＲに基く方法を開始した(総括的には、Hyun et al.、J.Microbiol.Biotechnol.８(３)：２９５−２９９、１９９８参照)。この方法は、全てのＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素が、ヌクレオチドレベルでも保存されている高度に保存された酸素結合およびヘム結合ドメインを含むという事実に基づいている。これらの保存ドメインに対しプライミングし、鋳型としてＲ−９２２またはＩ−１５２９ゲノムＤＮＡを用いてＰ４５０遺伝子からＤＮＡフラグメントを増幅するようにＰＣＲプライマーを設計した。使用されるＰＣＲプライマーを表１に示す。
表１
【表３】2004529651.tif 000020
＊アミノ酸配列は上の行に示されており、対応するヌクレオチド配列は下の２番目の行に示されている。Ｓ＝ＧまたはＣ。
＆このプライマーは、Hyun et al.(前出)により報告された。
【０１７３】
ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２またはＩ−１５２９からのヘム結合ドメインおよびゲノムＤＮＡをコード化するヌクレオチド配列に特異的なプライマーのいずれかと共にＯ２−結合ドメインをコード化するヌクレオチド配列に特異的なプライマーのいずれかを用いたＰＣＲ増幅により、約３５０ｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅された。Ｏ２−結合およびヘム結合部位をコード化する遺伝子セグメントのＰ４５０遺伝子において約３５０ｂｐが分離されるため、これはまさしくこのＰＣＲ増幅から予測される大きさである。
【０１７４】
３５０ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングプラスミド(カリフォルニア、カールスバッドのインビトロゲンから市販されている)へクローン化し、エシェリキア・コリ(E.coli)株ＴＯＰ１０(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア)に形質転換した。Ｒ−９２２およびＩ−１５２９株からの個々の約１５０クローンを配列決定することにより、どの程度特有なＰ４５０遺伝子フラグメントが表されるかを測定した。配列分析は、それらがＲ−９２２株からの８個の特有なＰ４５０遺伝子フラグメントおよびＩ−１５２９株からの７個の特有な同フラグメントを含むことを示した。
【０１７５】
ユニバーシティー・オブ・ウィスコンシン・パッケージバージョン１０.１からのプログラムＰｒｅｔｔｙによるＢｌａｓｔ分析(ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２およびストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｉ−１５２９にそれぞれ由来するＰ４５０遺伝子特異的ＰＣＲフラグメントの推定アミノ酸配列、およびカルボマイシンの合成に関与するストレプトマイセス・テルモトレランス(S.thermotolerans)からのＰ４５０モノオキシゲナーゼ(Ｓｔｏｌ−ＯＲＦＡ)(ジェンバンク受託番号Ｄ３０７５９)のアラインメント)(Altschul et al.,Nucl.Acids Res.２５：３３８９−３４０２)は、Ｒ−９２２およびＩ−１５２９の両株からの特有なＰ４５０遺伝子フラグメントは全て、Ｐ４５０遺伝子に由来し、Ｏ２−結合およびヘム結合ドメイン間の領域をコード化することを立証した。
【０１７６】
次に、ＰＣＲフラグメントが誘導された完全長遺伝子をクローン化するため、ＰＣＲによりクローン化されたＤＮＡフラグメントを、Ｒ−９２２およびＩ−１５２９株からのゲノムＤＮＡを含む遺伝子ライブラリーとのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。これを行うため、Ｒ−９２２およびＩ−１５２９株からのゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ(ＣＩＰ)により脱リン酸化し、コスミドｐＰＥＨ２１５、すなわちＳｕｐｅｒＣｏｓ１の修正版(カリフォルニア、ラジョラのストラタジーンから市販されている)へライゲーションした。ギガパックIII ＸＬパッケージング抽出物を用いてライゲーション生成物をパッケージし、エシェリキア・コリ(E.coli)ＸＬ１ブルーＭＲ宿主細胞へ導入した。ＰＣＲ生成Ｐ４５０遺伝子フラグメントと強くハイブリダイズする１２のコスミドがＲ−９２２ライブラリーから同定され、そこから３つの特有なＰ４５０遺伝子をサブクローニングおよび配列決定した。ChurchおよびGilbertのプロトコル(ChurchおよびGilbert、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８１：１９９１−１９９５、１９８４)にしたがって高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを遂行させた。簡単に述べると、これらの高ストリンジェンシー条件には、５００ｍＭのＮａリン酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡを含有するハイブリッド緩衝液、４０ｍＭのＮａ−リン酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％ＳＤＳ、０.５％ＢＳＡを含有する洗浄緩衝液１、および４０ｍＭのＮａ−リン酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＳＤＳを含有する洗浄緩衝液２が含まれる(ただし、他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology(前出)に記載されている)。１９の強くハイブリダイズするコスミドがＩ−１５２９ライブラリーから同定され、これらから、４つの特有なＰ−４５０遺伝子をサブクローニングおよび配列決定した。
【０１７７】
Ｒ−９２２およびＩ−１５２９株から種々のＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子を単離するさらに別の方法においては、別の細菌からの既知Ｐ４５０遺伝子をハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、Ｒ−９２２およびＩ−１５２９株からの相同性Ｐ４５０遺伝子を含むコスミドクローンを同定した。エポチロン類の合成(Molnar et al.、Chem Biol.７(２)：９７−１０９、２０００)に関与するソランギウム・セルロスム(Sorangium cellulosum)株Ｓｏ ｃｅ９０からのｅｐｏＦ Ｐ４５０遺伝子をこの作業におけるプローブとして使用した。ｅｐｏＦ Ｐ４５０遺伝子プローブを用いて、１コスミドがＲ−９２２株から同定され(クローンＬＣ)、３コスミドがＩ−１５２９株から同定された(クローンＬＡ、ＬＢおよびＥＡ)。それぞれの場合において、相同性遺伝子フラグメントをサブクローニングおよび配列決定したところ、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ酵素をコードすることが見出された。
【０１７８】
しかしながら、実施例７(下記)で同定された１７のポリペプチド配列を比較しても、これらのクローン化遺伝子はいずれともマッチし得なかった。ポリペプチド配列の２つ(すなわち、ＬＶＫＤＤＰＡＬＬＰＲおよびＡＶＨＥＬＭＲ)はＯ２およびヘム結合ドメイン間の領域にマッピング(位置決定)し、そこでこれらは当然ＰＣＲ方法により誘導された部分的遺伝子フラグメントのいずれかを同定した。すなわち、Hyun et al.(前出)の公知ＰＣＲ技術に基き、既知Ｐ４５０遺伝子をハイブリダイゼーションプローブとして用いる標準的方法では、アベルメクチンの位置選択的酸化を担う特異的Ｐ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する遺伝子を同定し得なかった。したがって、本発明のＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード化する遺伝子を単離するのに追加実験が必要とされることが決定された。
【０１７９】
実施例７
ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２からのＰ４５０モノオキシゲナーゼの部分的配列決定
ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２からのＰ４５０モノオキシゲナーゼの部分的アミノ酸配列決定は、スイス国バーゼルのフリードリヒ・ミーシェル・インスティテュートにより実施された。ＳＤＳｐａｇｅにおける主要バンドのタンパク質をトリプシン消化し、形成されたペプチドを質量分析法およびエドマン分解法により分離および配列決定した(総括的には、Zerbe‐Burkhardt et al.、J.Biol.Chem.２７３：６５０８、１９９８参照)。以下の１７ペプチドの配列が見出された。
【０１８０】
2004529651.tif 000021
【０１８１】
アクチノマイセテ(actinomycete)Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ配列の抜粋に対するこれらのペプチドのアラインメントは、全ペプチドが単一Ｐ４５０モノオキシゲナーゼのフラグメントであることを示していた。
【０１８２】
実施例８
アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの酸化を担う酵素をコード化するＲ−９２２株からのＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
Ｒ−９２２株のＰ４５０酵素から誘導されたペプチドの幾つかのアミノ酸配列からの逆翻訳により、ＰＣＲプライマーを設計した(実施例７および下表２参照)。５種の前進プライマー(２ａＦ、２ｂＦ、３Ｆ、１Ｆおよび７Ｆ)の各々は、鋳型としてのＲ−９２２ゲノムＤＮＡとのＰＣＲ反応において一つの逆プライマー(５Ｒ)と対合した。各反応において、予測された大きさのＤＮＡフラグメントが生成された。
【０１８３】
表２
【表４】2004529651.tif 000022
*両存性コード: Y=C または T; R=A または G; S=C または G; W=A またはT
**プライマーをプライマー５Ｒと対にしたときのＰＣＲ生成物の予測された大きさ
【０１８４】
プライマー(２ｂＦおよび５Ｒ)および(２ａＦおよび５Ｒ)をそれぞれ用いることにより生成された５８０および６００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯクローニングプラスミド(カリフォルニア、カールスバッドのインビトロゲンから市販されている)へクローン化し、エシェリキア・コリ(E.coli)株ＴＯＰ１０(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア)へ形質転換した。次いで、挿入されたＤＮＡフラグメントを配列決定した。配列を調べると、６００および５８０ｂｐのフラグメントは、それらが共通して有する５８０ｂｐの配列において同一であることが示された。また、６００ｂｐおよび５８０ｂｐフラグメントのヌクレオチド配列から誘導された推定アミノ酸配列(配列番号２)および単離遺伝子のこの領域で整列する精製Ｐ４５０Ｅｍａ１酵素から単離されたペプチドのアミノ酸配列間には完全なマッチが存在した。この結果は、これらのクローンで単離された遺伝子フラグメントが、アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの酸化を担うＰ４５０Ｅｍａ１酵素をコード化する遺伝子から誘導されることを強く示唆していた。
【０１８５】
プライマー２ａＦ(配列番号８０)および５Ｒ(配列番号９０)を用いて生産された６００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、Ｒ−９２２株から単離されたゲノムＤＮＡのコスミドライブラリー(実施例６記載のコスミドライブラリー)とのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。プローブと強くハイブリダイズするｐＰＥＨ２４９およびｐＰＥＨ２５０と命名された２種のコスミドが同定された。Ｐ４５０酵素をコード化する各コスミドの部分を配列決定すると、２種のコスミド間における配列は同一であることが見出された。ｅｍａ１遺伝子の完全コーディング配列が同定された(配列番号１)。Ｐ４５０Ｅｍａ１からの全ポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、ｅｍａ１遺伝子からの推定アミノ酸配列と完全にマッチした。ＢＬＡＳＴＰ(Altschul et al.、前出)を用いたｅｍａ１遺伝子によりコード化されたタンパク質の推定アミノ酸配列の比較により、データベースにおける最も密接なマッチは、カルボマイシンの生合成においてある一定の役割を有し(Arisawa et al.,Biosci.Biotech.Biochem.５９(４)：５８２−５８８、１９９５)、ｅｍａ１とのその同一性が４９％に過ぎない(同一性＝２０２／４０９(４９％)、陽性＝２７１／４０９(６５％)、ギャップ＝２／４０９(０％))ストレプトマイセス・テルモトレランス(S.thermotolerans)からのＰ４５０モノオキシゲナーゼに対するものであることが測定された。Ｂｌａｓｔ分析において、以下の設定を使用した：
【０１８６】
BLASTP 2.0.10
ラムダ     K      H
0.322    0.140    0.428
ギャップ
ラムダ     K      H
0.270   0.0470    0.230
マトリックス: BLOSUM62
ギャップ・ペナルティ: 存在: 11,伸長: 1
DBに対するヒットの数: 375001765
配列の数: 1271323
伸長の数: 16451653
有効な伸長の数: 46738
10.0より良好な配列の数: 2211
ギャップを伴わず10.0より良好なHSPの数: 628
予備試験で有効にギャップ形成したHSPの数 : 1583
予備試験でギャップ形成を試みたHSPの数 : 43251
ギャップ形成したHSPの数(非予備試験): 2577
質問の長さ: 430
データベースの長さ: 409,691,007
有効なHSPの長さ: 55
質問の有効な長さ: 375
データベースの有効な長さ: 339,768,242
有効な検索空間: 127413090750
使用した有効な検索空間: 127413090750
【０１８７】
これら２遺伝子のヌクレオチド配列の類似比較は、それらがヌクレオチドレベルでは６５％同一であることを立証していた。これらの結果は、Ｐ４５０Ｅｍａ１が新規酵素であることを証明している。
【０１８８】
実施例９
ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株ＺＸ７におけるｅｍａ１遺伝子の異種発現
ｅｍａ１遺伝子のコーディング配列を、チオストレプトン誘導性プロモーター(ｔｉｐＡ)に融合した(Murakami et al.,J.Bacteriol.１７１：１４５９−１４６６、１９８９)。ｔｉｐＡプロモーターは、プラスミドｐＳＩＴ１５１(HerronおよびEvans、FEMS Microbiology Letters １７１：２１５−２２１，１９９９)から誘導された。
【０１８９】
ｔｉｐＡプロモーターおよびｅｍａ１コーディング配列の融合は、まずｅｍａ１コーディング配列を以下のプライマーで増幅して５'末端におけるＰａｃＩクローニング部位および３'末端におけるＰｍｅＩ適合末端を導入した。
【０１９０】
前進プライマー：下線部の配列はＰａｃＩ認識配列であり、肉太活字の配列はｅｍａ１のコーディング配列の開始点である。
【化１４】2004529651.tif 000023
逆プライマー：下線部の配列はＰｍｅＩ認識配列の半分である。肉太活字配列はｅｍａ１翻訳停止コドン、次いでｅｍａ１コーディング配列の３'末端の逆相補配列である。
【化１５】2004529651.tif 000024
【０１９１】
ｅｍａ１コーディング配列を含むＰａｃＩ−消化ＰＣＲフラグメントを、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩにより制限(すなわち消化)されたプラスミドｐＴＢＢＫＡ(図１参照)へクローン化し、ライゲーションしたプラスミドをエシェリキア・コリ(E.coli)へ形質転換した。４つのクローンを配列決定した。４つのうち３つは完全で正確なｅｍａ１コーディング配列を含んでいた。第４のｅｍａ１遺伝子クローンは、ｅｍａ１遺伝子の切形バージョンを含んでいた。完全長ｅｍａ１遺伝子は、アミノ酸配列ＭＳＥＬＭＮＳ(配列番号９３)で始まるタンパク質をコード化する。切形遺伝子は、最初の４アミノ酸を欠き、第２メチオニン残基から始まるタンパク質をコード化する。この遺伝子はｅｍａ１Ａと命名された。ｅｍａ１Ａのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３３および配列番号３４として提供する。これらのプラスミド、ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１およびｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１Ａにおけるｅｍａ１およびｅｍａ１Ａ遺伝子は、ｔｉｐＡプロモーターと正確な並列位置にあることにより、このプロモーターからの遺伝子の発現が誘発される。
【０１９２】
プラスミドｐＴＢＢＫＡは、ストレプトマイセス(Streptomyces)種の染色体へのプラスミドの部位特異的組込みを触媒するインテグラーゼをコード化するストレプトマイセス(Streptomyces)挿入エレメントＩＳ１１７からの遺伝子を含む(Henderson et al.,Mol.Microbiol.３：１３０７−１３１８、１９８９およびLydiate et al.,Mol.Gen.Genet.２０３：７９−８８、１９８６)。プラスミドｐＴＢＢＫＡは、エシェリキア・コリ(E.coli)複製起点のみを有し、動態化部位を含むため、それが複製しない接合によりエシェリキア・コリ(E.coli)からストレプトマイセス(Streptomyces)株へ導入され得る。しかしながら、それはＩＳ１１７インテグラーゼ故に染色体へ組込まれ得、染色体組込みを含むストレプトマイセス(Streptomyces)クローンは、プラスミドにより運ばれたカナマイシン耐性遺伝子故にカナマイシン耐性により選択され得る。
【０１９３】
また、ｅｍａ１コーディング配列を、ストレプトマイセス(Streptomyces)で複製能を示すか、またはｐＴＢＢＫＡのように、ストレプトマイセス(Streptomyces)宿主への導入時に染色体へ組込まれる他のプラスミドにクローン化した。例えば、ｅｍａ１を、プラスミドｐＴＢＢＫＡと類似しているが、ｔｉｐＡプロモーター含有ＫｐｎＩ／ＰａｃＩフラグメントをｅｒｍＥ遺伝子プロモーターと置き換えたプラスミドｐＥＡＡへクローン化した(Schmitt‐JohnおよびEngels、Appl Microbiol Biotechnol.３６(４)：４９３−４９８、１９９２)。さらに、ｐＥＡＡはカナマイシン耐性遺伝子を含まない。ｅｍａ１遺伝子をＰａｃＩ／ＰｍｅＩフラグメントとしてｐＥＡＡへクローン化してプラスミドｐＥＡＡ−ｅｍａ１を作製したが、そこでｅｍａ１遺伝子が構成的ｅｒｍＥプロモーターから発現される。
【０１９４】
プラスミドｐＴＵＡ１Ａは、ｔｉｐＡプロモーターを含むストレプトマイセス(Streptomyces)−エシェリキア・コリ(E.coli)シャトルプラスミドである(図２参照)。また、ｅｍａ１遺伝子をプラスミドｐＴＵＡ１ＡにおけるＰａｃＩ／ＰｍｅＩ部位へクローン化することにより、プラスミドｐＴＵＡ−ｅｍａ１を作製した。
【０１９５】
また、ｅｍａ１Ａ遺伝子フラグメントを、ｅｍａ１遺伝子フラグメントと同じ方法でＰａｃＩ／ＰｍｅＩフラグメントとしてプラスミドｐＴＵＡ１ＡおよびｐＥＡＡへライゲーションすることにより、それぞれプラスミドｐＴＵＡ−ｅｍａ１ＡおよびｐＥＡＡ−ｅｍａ１Ａを作製した。
【０１９６】
ｅｍａ１またはｅｍａ１Ａ遺伝子を含むｐＴＢＢＫＡ、ｐＴＵＡ１ＡおよびｐＥＡＡに基くプラスミドを、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)ＺＸ７へ導入したところ、それぞれの場合において形質転換体が得られ、立証された(それぞれ、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株ＺＸ７::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１またはｅｍａ１Ａ、ＺＸ７(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１または−ｅｍａ１Ａ)、およびＺＸ７::ｐＥＡＡ−ｅｍａ１または−ｅｍａ１Ａ)。
【０１９７】
野生型ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株ＺＸ７を試験したところ、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化できないことが見出された。形質転換されたストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株ＺＸ７::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１、ＺＸ７::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１Ａ、ＺＸ７(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１)、ＺＸ７(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１Ａ)、ＺＸ７::ｐＥＡＡ−ｅｍａ１、およびＺＸ７::ｐＥＡＡ−ｅｍａ１Ａを、休止細胞を用いてアベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの酸化能力について各々試験した。これを行うため、上記の全細胞生体触媒検定法(分析法を含む)を遂行した。ただし、全細胞生体触媒検定法については、Ｒ−９２２株と同様、形質転換ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)をＰＨＧ培地で成長させ、再びＲ−９２２と同様、１６時間反応させた(すなわち、その期間、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.０)中の５００ｍｇの形質転換ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)生細胞を、イソプロパノール中のアベルメクチンの溶液(３０ｍｇ／ｍｌ)１５μｌの存在下２８℃、１６０ｒｐｍで振とうした)。
【０１９８】
誘導物質、チオストレプトン(５μｇ／ｍｌ)の存在下、ｅｍａ１−またはｅｍａ１Ａ−含有株ＺＸ７::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１、ＺＸ７::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１Ａ、ＺＸ７(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１)、ＺＸ７(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１Ａ)は、酸化された４''−ケト−アベルメクチン化合物の出現で立証された通り、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ酸化することが見出された(表３参照)。
【０１９９】
表３
【表５】2004529651.tif 000025
1pTBBKA= IS117インテグラーゼ、ｔｉｐＡプロモーター；ｐＴＵＡ＝複製プラスミド、ｔｉｐＡプロモーター；ｐＥＡＡ＝ＩＳ１１７インテグラーゼ、ｅｒｍＥプロモーター
２測定されず
【０２００】
これらの結果は、ｅｍａ１遺伝子によりコード化されるＰ４５０Ｅｍａ１酵素が、ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｒ−９２２においてアベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの酸化を担っていることを立証している。さらに、データは、天然ｅｍａ１遺伝子よりもＮ−末端が４アミノ酸短いｅｍａ１Ａ遺伝子もまた活性Ｐ４５０Ｅｍａ１酵素をコード化することを立証している。ＨＰＬＣ分析により立証され得るところによると、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株ＺＸ７::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１によるアベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの酸化、次いで０、０.５または５.０μｇ／ｍｌチオストレプトンによるｅｍａ１発現の誘導は、ｅｍａ１の発現の誘導に使用されるチオストレプトンの量により変化し得る。ただし、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)株ＺＸ７::ｐＥＡＡ−ｅｍａ１およびＺＸ７::ｐＥＡＡ−ｅｍａ１Ａ(表３参照)は、これらの株においてｅｍａ１またはｅｍａ１Ａ遺伝子が誘導を必要としないｅｒｍＥプロモーターから発現されることから、チオストレプトンの非存在下におけるこの酸化活性を立証していた。
【０２０１】
実施例１０
ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｉ−１５２９からのｅｍａ１−相同遺伝子の単離
ストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｉ−１５２９もまた、アベルメクチンの生体触媒において活性を示すことにより４''−ケト−アベルメクチン誘導体を形成させることが見出された。実施例６記載のＩ−１５２９株からのコスミドライブラリーを、前記のプライマー２ａＦ(配列番号８０)および５Ｒ(配列番号９０)を用いて生成された６００ｂｐのｅｍａ１ ＰＣＲフラグメントによるChurchおよびGilbertの高ストリンジェンシー条件(ChurchおよびGilbert、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１：１９９１−１９９５、１９８４)でプローブすることにより、株Ｉ−１５２９からのｅｍａ１相同体を含むクローンが同定された。これらの強くハイブリダイズするコスミドが同定された。コスミドｐＰＥＨ２５２およびｐＰＥＨ２５３の２つにおけるＰ４５０遺伝子領域を配列決定すると、同一であることが見出された。ＤＮＡ配列の分析は、Ｒ−９２２株のｅｍａ１遺伝子と高い相同性をもつ遺伝子の存在を示した。Ｅｍａ２(すなわち、Ｐ４５０Ｅｍａ２)、Ｅｍａ１(すなわち、Ｐ４５０Ｅｍａ１)、およびカルボマイシンの生合成を担うストレプトマイセス・テルモトレランス(Streptomyces thermotolerans)由来のＰ４５０モノオキシゲナーゼ(Ｃａｒｂ−４５０)(ジェンバンク受託番号Ｄ３０７５９)の推定アミノ酸配列を比較すると、Ｒ−９２２およびＩ−１５２９の両株からの特有なＰ４５０遺伝子フラグメントは全てＰ４５０遺伝子から誘導され、Ｏ２−結合およびヘム結合ドメイン間の領域をコード化することが立証された。
【０２０２】
ｅｍａ２と命名されたストレプトマイセス・ツベルシディクス(Streptomyces tubercidicus)株Ｉ−１５２９からの遺伝子は、Ｐ４５０Ｅｍａ１酵素とアミノ酸レベルで９０％の同一性およびヌクレオチドレベルで９０.６％の同一性を有する酵素をコード化する。ｅｍａ２遺伝子のヌクレオチド配列およびＰ４５０Ｅｍａ２の推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および配列番号４に提供する。
【０２０３】
ｅｍａ２コーディング配列を、ｅｍａ１およびｅｍａ１Ａ遺伝子の場合と同様に、プラスミドｐＴＢＢＫＡ、ｐＴＵＡ１ＡおよびｐＥＡＡへ、コーディング配列がこれらのプラスミドにおいてｔｉｐＡまたはｅｒｍＥ＊プロモーターと機能的に融合されるようにクローン化した。生成したプラスミドｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ２、ｐＴＵＡ−ｅｍａ２およびｐＥＡＡ−ｅｍａ２をエシェリキア・コリ(E.coli)からストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)ＺＸ７へコンジュゲーションにより導入して、染色体に組込まれているかまたはプラスミドに維持されている形でｅｍａ２遺伝子を含む株ＺＸ７::ＴＢＢＫＡ−ｅｍａ２およびＺＸ７(ｐＴＵＡ−ｅｍａ２)、およびＺＸ７::ｐＥＡＡ−ｅｍａ２を作製した。
【０２０４】
次に、株ＺＸ７::ＴＢＢＫＡ−ｅｍａ２、ＺＸ７(ｐＴＵＡ−ｅｍａ２)、およびＺＸ７::ｐＥＡＡ−ｅｍａ２を、アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの酸化能力について試験した。ｅｍａ２遺伝子もまた、ｅｍａ１遺伝子と比べて定レベルではあるが(表３参照)、生体触媒活性を提供することが示された。
【０２０５】
これらの結果は、ストレプトマイセス・ツベルシディクス(S.tubercidicus)株Ｉ−１５２９由来のｅｍａ２遺伝子もまた、アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへ酸化し得るＰ４５０酵素(Ｐ４５０Ｅｍａ２)をコード化することを示している。
【０２０６】
実施例１１
他の生体触媒株からのｅｍａ１相同体の特性検定
Ｒ−９２２およびＩ−１５２９株を含む１７のストレプトマイセス(Streptomyces)種の株が、アベルメクチンの４''−カルビノールのケトンへの位置特異的酸化を触媒し得るものとして同定された。次に、これらの株の全てからの生体触媒酵素をコード化する遺伝子の単離および特性検定を行った。
【０２０７】
これを行うため、ゲノムＤＮＡを株から単離し、幾つかの制限エンドヌクレアーゼによる制限およびｅｍａ１遺伝子とのサザーンハイブリダイゼーションにより評価した。特異的制限エンドヌクレアーゼが、ｅｍａ１遺伝子がハイブリダイズする規定サイズの単一ＤＮＡフラグメントを生じる各ＤＮＡについて同定された。各株について、唯一の強くハイブリダイズするＤＮＡフラグメントがあったことから、これらの実験で使用された高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下では他のＰ４５０遺伝子は全く検出されないことが示唆された。各ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけた。ｅｍａ１ハイブリダイズフラグメントのサイズを含む狭いサイズ範囲におけるＤＮＡをゲルから切除した。サイズ選別されたＤＮＡを適切なクローニングプラスミドへライゲーションし、このライゲーションしたプラスミドを用いてエシェリキア・コリ(E.coli)を形質転換した。各実験からのエシェリキア・コリ(E.coli)クローンを、ｅｍａ１遺伝子フラグメントとのコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることにより、ｅｍａ１相同性ＤＮＡフラグメントを含むクローンが同定された。
【０２０８】
各ｅｍａ１−相同性クローンにおけるクローン化ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、ｅｍａ１との相同性を有するＰ４５０酵素をコードする遺伝子の存在について調べた。この方法では、ｅｍａ１相同性遺伝子を他の１５活性株のうちの１４株から単離した。これらのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、表４で配列番号５〜３２および９４〜９５として参照できるように示している。これらの酵素の関係は、系統樹の形で示され得る。かかる系統樹は、市販されているＧＣＧウィスコンシンソフトウェアプログラム１.０バージョン(マディソン、ウィスコンシン)を用いて作成され得る。
【０２０９】
表４
【表６】2004529651.tif 000026
＊この株は、１６ｓ ｒＤＮＡ分析によりチャッタノオゲンシス(chattanoogensis)種にあることが示された。しかしながら、ジャーマンカルチャーコレクション(ＤＳＭＺ)により使用された古典的分類方法は、それがサラセティクス(saraceticus)であることを示した。
【０２１０】
実施例１２
酵素精製を容易にするためのＨｉｓ標識ｅｍａ１およびｅｍａ１相同体の構築
Ｐ４５０Ｅｍａ１酵素および他の生体触媒株からのｅｍａ１相同体によりコード化されたＰ４５０酵素を精製するため、Ｐ４５０遺伝子の各々をエシェリキア・コリ(E.coli)発現プラスミドｐＥＴ−２８ｂ(＋)(ウィスコンシン、マディソンのノヴァゲンから市販されている)にクローン化した。Ｎ−またはＣ−末端でのＨｉｓ標識融合を容易にし、Ｔ７ファージプロモーターからエシェリキア・コリ(E.coli)で遺伝子を強く発現させるようにｐＥＴ−２８プラスミドを設計した。多くの場合において、ｅｍａ遺伝子のコーディング配列は配列ＡＴＧＴから始まる。５'端部におけるプライマーが５'末端にＰｃｉＩ認識部位(５'ＡＴＡＴＧＴ３')を組込むようにこれらの遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰｃｉＩ部位の最後の４塩基は、ｅｍａ遺伝子コーディング配列の開始時にＡＴＧＴに対応する。
【０２１１】
ｅｍａ遺伝子コーディング配列の最後における翻訳停止コドンを除去し、３'末端にＸｈｏＩ認識部位を付加するように遺伝子の３'端部におけるＰＣＲプライマーを設計した。生じたＰＣＲフラグメントをＰｃｉＩおよびＸｈｏＩで制限して、５'末端にＰｃｉＩ端および３'末端にＸｈｏＩ端を生成させることにより、先にＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで制限しておいたｐＥＴ−２８ｂ(＋)へのフラグメントのクローニングを容易にした。ＰｃｉＩおよびＮｃｏＩ端は適合し得るため、フラグメントを、プラスミドにおけるＴ７プロモーターおよびリボソーム結合部位に対し適切な配向でｐＥＴ−２８ｂ(＋)にクローン化することにより遺伝子を発現させた。
【０２１２】
各ｅｍａ遺伝子の３'端において、コーディング配列を、Ｈｉｓ標識配列、次いで翻訳停止コドンにＸｈｏＩ部位で枠内融合させた。これによって、６個のヒスチジン残基がＣ−末端に付加されたＥｍａ酵素が生成され、ニッケルカラムでの精製が容易になった。
【０２１３】
ＡＴＧ翻訳開始コドンの次にＴヌクレオチドが続かないｅｍａ遺伝子の場合、５'末端についての異なる戦略を用いてｅｍａ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。５'末端のプライマーを、ＡＴＧ翻訳開始コドンに直接先行するＣを組込むように設計し、３'末端におけるプライマーについては上記と同じであった。増幅されたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩで制限して３'末端にＸｈｏＩ端を作製し、５'端部は平滑末端として残した。これらのフラグメントを、ＮｃｏＩで制限しておいたｐＥＴ−２８ｂ(＋)へクローン化したが、ヤエナリエキソヌクレアーゼでの処理によりＮｃｏＩ末端を平滑末端にし、ＸｈｏＩにより制限した。
【０２１４】
この方法で、ｅｍａ遺伝子をｐＥＴ−２８ｂ(＋)へクローン化することにより、先述のＴ７プロモーターおよびＨｉｓ標識をＣ−末端に伴う機能的融合体を調製した。全Ｈｉｓ標識ｅｍａ遺伝子を配列決定することにより、エラーがＰＣＲにより全く導入されていないことが確認された。
【０２１５】
大量のＰ４５０Ｅｍａ１およびＰ４５０Ｅｍａ２酵素を標準的プロトコルにより単離および精製した。誘導性ｔａｃプロモーターの制御下のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子および適切なｐＥＴ−２８／ｅｍａプラスミドを含むエシェリキア・コリ(E.coli)株ＢＬ２１ ＤＥ３(カリフォルニア、カールスバッドのインビトロゲンから市販されている)を培養し、細胞を採取し、溶解した。ライゼートをＮｉ−ＮＴＡカラム(カリフォルニア、バレンシアのキアゲン、インコーポレイテッドから市販されている)に適用し、生産業者により推奨された手順にしたがってタンパク質を精製した。
【０２１６】
精製Ｈｉｓ標識Ｐ４５０Ｅｍａ１およびＰ４５０Ｅｍａ２は、アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの高い変換率により証明されたようにインビトロ活性検定法で高い活性を示した。
【０２１７】
実施例１３
シュードモナス(Pseudomonas)におけるｅｍａ１の発現
次に、ｅｍａ１遺伝子構築物を、シュードモナス・プチダ(P.putida)(ヴァージニア、マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから市販されている野生型シュードモナス・プチダ(P.putida)、ＡＴＣＣ番号７００８０１および１７４５３)へ導入した。ｅｍａ１およびｅｍａ１／ｆｄ２３３遺伝子フラグメントを、ＰａｃＩ／ＰｍｅＩフラグメントとしてプラスミドｐＵＫ２１(VieraおよびMessing、Gene １００：１８９−１９４、１９９１)へクローン化した。フラグメントを、ｔａｃプロモーターからの発現に適切な配向でｐＵＫ２１におけるｔａｃプロモーター(Ｐｔａｃ)およびターミネーター(Ｔｔａｃ)間に設定された位置へクローン化した。Ｐｔａｃ−ｅｍａ１−ＴｔａｃおよびＰｔａｃ−ｅｍａ１／ｆｄ２３３−Ｔｔａｃ遺伝子フラグメントを、ｐＵＫ２１からＢｇｌIIフラグメントとして除去し、これらを広域宿主範囲の伝達性プラスミド、ｐＲＫ２９０(Ditta et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA ７７：７３４７−７３５１、１９８０)へクローン化することにより、プラスミドｐＲＫ−ｅｍａ１およびｐＲＫ−ｅｍａ１／ｆｄ２３３を調製した(図３)。これらのプラスミドを、標準的方法によるエシェリキア・コリ(E.coli)宿主からの接合(conjugal)導入によりシュードモナス・プチダ(P.putida)株ＡＴＣＣ７００８０１およびＡＴＣＣ１７４５３へ導入した(Ditta et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA ７７：７３４７−７３５１、１９８０)。
【０２１８】
プラスミドｐＲＫ−ｅｍａ１またはｐＲＫ−ｅｍａ１／ｆｄ２３３を含むシュードモナス・プチダ(P.putida)ＡＴＣＣ７００８０１およびＡＴＣＣ１７４５３を、アベルメクチン酸化の触媒能力について試験した。表３に示された結果は、これらの株がこの反応を触媒し得ることを立証している。
【０２１９】
実施例１４
Ｐ４５０Ｅｍａ１モノオキシゲナーゼとの活性を示すフェレドキシンをコード化する遺伝子の同定
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、触媒された各ヒドロキシル化反応について２個の電子を必要とする(Mueller et al.,''Twenty−five years of P450ｃａｍresearch: Mechanistic Insights into Oxygenase Catalysis''、Cytochrome P450、第２版、P.R.Ortiz de Montellano(編)８３−１２４頁、プレナム・プレス、ニューヨーク、１９９５)。これらの電子は、フェレドキシンにより一度にＰ４５０モノオキシゲナーゼへ伝達される。電子は最終的にＮＡＤ(Ｐ)Ｈから誘導され、フェレドキシン還元酵素によりフェレドキシンへ移される。特異的Ｐ−４５０モノオキシゲナーゼ酵素は、それらが特異的フェレドキシンと相互作用するときにさらに高い活性を有する。多くの場合、所定のＰ４５０モノオキシゲナーゼと特異的に相互作用するフェレドキシンをコード化する遺伝子は、Ｐ４５０酵素をコード化する遺伝子と隣接したところに位置する。
【０２２０】
上記によると、ｅｍａ１遺伝子に加えて、Ｒ−９２２株からの４個のＰ４５０遺伝子およびＩ−１５２９株からの７個のＰ４５０遺伝子が単離および配列決定された(実施例６参照)。これらの中には、会合したフェレドキシン遺伝子の存在を捜すのに十分な、Ｐ４５０遺伝子の両端に隣接するＤＮＡに関する配列情報が存在するものもあった。この方法により、２個の特有なフェレドキシン遺伝子が２種の株の各々から同定された。フェレドキシン遺伝子ｆｄ２２９およびｆｄ２３０が、Ｒ−９２２株から同定され、ｆｄ２３３およびｆｄＥＡがＩ−１５２９株から同定された。さらに、フェレドキシン還元酵素遺伝子は、Ｉ−１５２９株からのｆｄＥＡ遺伝子に隣接して存することが見出された。
【０２２１】
Ｐ４５０Ｅｍａ１と組合わせたこれらフェレドキシンの各々の生物活性を試験するため、個々の各フェレドキシン遺伝子をＰＣＲにより増幅して、平滑５'末端、天然リボソーム結合部位およびフェレドキシン遺伝子コーディング配列、および３'末端にＰｍｅＩ制限部位を含む遺伝子フラグメントを生産した。上記の各フェレドキシン遺伝子フラグメントを、プラスミドｐＴＵＡ−ｅｍａ１においてｅｍａ１遺伝子に対し３'に位置するＰｍｅＩ部位へクローン化した。この方法で、ｅｍａ１遺伝子および機能性プロモーターと機能し得るように結合されたフェレドキシン遺伝子の一つから成る人工オペロンが生成された。
【０２２２】
フェレドキシン還元酵素遺伝子、ｆｒｅＥＡがｆｄＥＡ遺伝子に隣接したところに位置することが見出されたｄｆＥＡフェレドキシン遺伝子の場合、ｆｄＥＡおよびｆｒｅＥＡの両遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを類似ＰＣＲ戦略により生成した。この遺伝子フラグメントもまた、他のフェレドキシン遺伝子について報告されたプラスミドｐＴＵＡ−ｅｍａ１のＰｍｅＩ部位でクローン化された。
【０２２３】
各ｅｍａ１−フェレドキシン遺伝子組み合わせを、ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)株ＺＸ７への個々のｅｍａ１−フェレドキシン遺伝子プラスミドの導入による生物活性について試験した。ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)において各プラスミドから誘導された生体触媒活性を測定した。異なる４構築物のうち、Ｉ−１５２９株に由来するフェレドキシン遺伝子ｆｄ２３３のみが、同じプラスミド宿主バックグラウンドにおけるｅｍａ１単独の発現と比べて高い活性を示した(表３)。ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)におけるｐＴＵＡ−ｅｍａ１／ｆｄ２３３プラスミドは、ｐＴＵＡ−ｅｍａ１プラスミドと比べて約１.５〜３倍高い活性を示した。他のフェレドキシン遺伝子を含む他の３プラスミドは、ｅｍａ１遺伝子のみを含むプラスミドと本質的に同じ結果を生じた。同様に、ｐＴＵＡ−ｅｍａ１／ｆｄＥＡ／ｆｒｅＥＡプラスミドは、ｐＴＵＡ−ｅｍａ１の場合と異なる結果を生じなかった。ｆｄ２３３遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３５および３６で示されている。
【０２２４】
ｆｄ２３３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ分析は、ストレプトマイセス・コエリコロール(S.coelicolor)(ジェンバンク受託番号ＡＬ４４５９４５)およびストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)(ジェンバンク受託番号ＡＦ０７２７０９)からのフェレドキシンに対し最も緊密なマッチが認められることを示した。ヌクレオチドレベルでは、ｆｄ２３３は、ストレプトマイセス・コエリコロール(S.coelicolor)およびストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)からのフェレドキシン遺伝子とそれぞれ８０および７９.８％の同一性を共有する。ペプチドレベルでは、ｆｄ２３３は、ストレプトマイセス・コエリコロール(S.coelicolor)およびストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)からのフェレドキシンとそれぞれ７９.４および７７.８％の同一性を共有する。
【０２２５】
ｆｄ２３３はＩ−１５２９株から誘導され、ｅｍａ１はＲ−９２２株から誘導されるため、２遺伝子によりコード化されるタンパク質は、本来は互いに相互作用し得ない。ｆｄ２３３遺伝子と相同性であり、Ｐ４５０Ｅｍａ１と最適に相互作用するフェレドキシンをコード化し得るＲ−９２２株からのフェレドキシン遺伝子を同定するために設計された方法では、ｆｄ２３３遺伝子を、Ｒ−９２２株からのＤＮＡの遺伝子ライブラリーとのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。強くハイブリダイズするコスミド、ｐＰＥＨ２３２が同定され、ハイブリダイズしているＤＮＡをクローン化し、配列決定した。ｆｄ２３３およびコスミドｐＰＥＨ２３２におけるフェレドキシン遺伝子、ｆｄ２３２からの推定アミノ酸配列を比較すると、僅か１個のアミノ酸の点でそれらは異なることが示された。
【０２２６】
同様に、プラスミドｐＴＵＡ−ｅｍａ１−ｆｄ２３２を構築し、ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)ＺＸ７で試験した。このプラスミドは、プラスミドｐＴＵＡ−ｅｍａ１−ｆｄ２３３により得られた結果と類似した結果を生じた(表３参照)。ｆｄ２３２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３７および８に示されている。
【０２２７】
ｅｍａ１−ｆｄ２３３オペロンについても、ＰａｃＩ−ＰｍｅＩフラグメントとして、同じ制限酵素で消化しておいたｐＴＢＢＫＡおよびｐＥＡＡへサブクローニングした。ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)ＺＸ７::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１−ｆｄ２３３およびストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)ＺＸ７::ｐＥＡＡ−ｅｍａ１−ｆｄ２３３を、アベルメクチン変換検定法で試験したところ、同等のプラスミドにおいてｅｍａ１遺伝子のみを含む株よりも高い活性を有することが見出された(表３参照)。
【０２２８】
実施例１５
他の細胞におけるＰ４５０Ｅｍａ１およびＰ４５０Ｅｍａ２の異種発現
発現構築物ｐＲＫ−ｅｍａ１(実施例１３)およびｐＲＫ−ｅｍａ２(ｐＲＫ−ｅｍａ１について実施例１３で記載したのと同様の方法で生産)を、３種の蛍光土壌シュードモナス(Pseudomonas)株へのコンジュゲーションにより動態化した。コンジュゲーションは、標準的方法にしたがって行った(Ditta et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA ７７：７３４７−７３５１、１９８０)。株は、シュードモナス・フルオレセンス(P.fluorescens)ＭＯＣＧ１３４、シュードモナス・フルオレセンス(P.fluorescens)Ｐｆ５およびシュードモナス・フルオレセンス(P.fluorescens)ＣＨＡＯであった。アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの変換についての標準休止細胞検定法を、トランスコンジュガントの各々について実施した。Ｐｆ−５およびＣＨＡＯ株について、変換レベルは検出限界未満であった。ＭＯＣＧ１３４株は、ｅｍａ１については３％およびｅｍａ２については５％の変換率を示した。
【０２２９】
さらに、表５に列挙した構築物を、ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)ＭＯＳ−０００１へプロトプラスト伝達形質転換により導入した(Kieser,T.、Bibb,M.J.、Buttner,M.J.、Chater,K.F.、Hopwood,D.A.(編)：Practical Streptomyces Genetics．The John Innes Foundation、ノーウィッチ(英国)、２０００)(Stutzman‐Engwall,K.et al.(１９９９)Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B２:B１avermectins、ＷＯ９９／４１３８９)。
【０２３０】
表５
【表７】2004529651.tif 000027
【０２３１】
野生型ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)ＭＯＳ−０００１を試験したところ、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに酸化し得ないことが見出された。
【０２３２】
形質転換ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)株ＭＯＳ−０００１::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１、ＭＯＳ−０００１(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１)、ＭＯＳ−０００１::ｐＥＡＡ−ｅｍａ１、ＭＯＳ−０００１::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１Ａ／ｆｄ２３３、およびＭＯＳ−０００１(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１Ａ／ｆｄ２３３)を、休止細胞を用いてアベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへのそれらの酸化能力について各々試験した。これを行うため、上記全細胞生体触媒検定法(分析法を含む)を実行した。ただし、全細胞生体触媒検定法については、Ｒ−９２２株と同様、形質転換ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)をＰＨＧ培地で成長させ、またＲ−９２２と同様、１６時間反応させた(すなわち、その期間、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.０)中の５００ｍｇの形質転換ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)生細胞を、イソプロパノール中のアベルメクチンの溶液(３０ｍｇ／ｍｌ)１５μｌの存在下２８℃、１６０ｒｐｍで振とうした)。
【０２３３】
表５に示されている通り、誘導物質、チオストレプトン(５μｇ／ｍｌ)の存在下、ｅｍａ１−またはｅｍａ１Ａ／ｆｄ２３３含有株ＭＯＳ−０００１::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１、ＭＯＳ−０００１::ｐＴＢＢＫＡ−ｅｍａ１Ａ／ｆｄ２３３、ＭＯＳ−０００１(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１)、ＭＯＳ−０００１(ｐＴＵＡ−ｅｍａ１Ａ／ｆｄ２３３)は、酸化された４''−ケト−アベルメクチン化合物の出現で立証された通り、アベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンへ酸化することが見出された。ただし、ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)株ＭＯＳ−０００１::ｐＥＡＡ−ｅｍａ１は、この株においてｅｍａ１遺伝子が誘導を必要としないｅｒｍＥプロモーターから発現されることから、チオストレプトンの非存在下におけるこの酸化活性を立証していた。
【０２３４】
すなわち、様々なストレプトマイセス(Streptomyces)およびシュードモナス(Pseudomonas)株におけるｅｍａ１Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子の発現により、休止細胞検定法においてアベルメクチンを４''−ケト−アベルメクチンに変換し得る組換え体細胞が提供された。
【０２３５】
次に、Ｐ４５０Ema1モノオキシゲナーゼの発現および活性をエシェリキア・コリ(E.coli)において試験した。これを行うため、ｅｍａ１遺伝子を、前記と同様エシェリキア・コリ(E.coli)発現プラスミドｐＥＴ−２８ｂ(＋)(ウィスコンシン、マディソンのノヴァゲンから市販されている)へクローン化した。誘導性ｔａｃプロモーター制御下のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子およびｐＥＴ−２８／ｅｍａ１プラスミドを含むエシェリキア・コリ(E.coli)株ＢＬ２１ ＤＥ３(カリフォルニア、カールスバッドのインビトロゲンから市販されている)を、３７℃で１６時間、一つのバッフルを伴う２５０ｍｌフラスコにおいて１３０ｒｐｍで振とうしながら、５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５０ｍｌのＬＢ培地中で培養した。この培養物０.５ｍｌを用いて、一つのバッフルを伴う２リットルのフラスコ中５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５００ｍｌＬＢ培地に接種し、培養物を終始１３０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で４時間、次いで３０℃で４時間インキュベーションした。細胞を遠心分離により採取し、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で洗浄し、再び遠心分離した。
【０２３６】
休止細胞検定法については、９０ｍｇの生細胞を深いウェルプレート中へトリプリケイトで秤量し、０.５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。無細胞抽出液については、８ｍｌ破壊緩衝液中の４グラムの生細胞をフレンチプレスで破壊した。
【０２３７】
休止細胞検定法については、５μｇの基質(２−プロパノール中の２.５ｍｇ／ｍｌ)を細胞懸濁液に加えた。プレートを透気性ホイルで密閉し、反応物を２２時間２８℃で、１０００ｒｐｍのオービタルシェーカーにおいてインキュベーションした。アベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの変換は全く検出されなかった。
【０２３８】
無細胞検定法については、１００μｌ無細胞抽出液、２−プロパノール中の１μｌ基質溶液(２０ｍｇ／ｍｌ)、５μｌの１００ｍＭのＮＡＤＰＨ、１０μｌのフェレドキシン、１０μｌのフェレドキシン還元酵素および３７４μｌのリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.０)を実施例３の記載と同様に加え、検定物を６００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２０時間インキュベーションした。アベルメクチンの９.２％＋／−０.３％が４''−ケトアベルメクチンへ変換された。
【０２３９】
すなわち、エシェリキア・コリ(E.coli)におけるｅｍａ１遺伝子の発現の結果、細胞から精製されたとき、アベルメクチンを４''−ケトアベルメクチンに変換し得る活性Ｅｍａ１ Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ酵素が生産された。
【０２４０】
実施例１６
Ｐ４５０Ｅｍａ１モノオキシゲナーゼの活性増強を促すフェレドキシン還元酵素をコード化する遺伝子の同定およびクローニング
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼの活性を支える電子伝達経路はまた、フェレドキシン還元酵素も含む。これらのタンパク質は、電子をフェレドキシンに与え、フェレドキシンおよびＰ４５０モノオキシゲナーゼによる場合と同様、特異的フェレドキシン還元酵素は、他よりもある種のフェレドキシンについての優れた電子供与体であることが知られている。
【０２４１】
したがって、ストレプトマイセス(Streptomyces)株からの若干のフェレドキシン還元酵素遺伝子をクローン化し、それらの生体触媒反応に対するそれらの影響力について評価した。これを行うため、多数の細菌性フェレドキシン還元酵素(Ｆｒｅ)タンパク質配列をＮＣＢＩから引出し、ＧＣＧパッケージからのＰｒｅｔｔｙプログラムにより平行整列させた。約２６６アミノ酸残基離れた２つの保存領域を用いることにより、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドを生産した。前進プライマー(ＣＧＳＣＣＳＣＣＳＣＴＳＷＳＳＡＡＳ(配列番号９６、「Ｓ」はＣまたはＧであり、「Ｗ」はＡまたはＧである))および逆プライマー(ＳＡＳＳＧＣＳＴＴＳＢＣＣＣＡＲＴＧＹＴＣ(配列番号９７、「Ｓ」はＣまたはＧであり、「Ｂ」はＣ、ＧまたはＴであり、「Ｒ」はＡまたはＧであり、そして「Ｙ」はＣまたはＴである))を用いて、生体触媒活性ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２およびＩ−１５２９から８００ｂｐ生成物を増幅した。これらの生成物プールをＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター(カリフォルニア、カールスバッドのインビトロゲン・インコーポレイテッドから市販されている)へクローン化し、Ｒ９２２およびＩ−１５２９からの各２０クローンを標準的方法にしたがって配列決定した(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、インコーポレイテッド(２０００)参照)。配列決定は、４つの特有なｆｒｅ遺伝子フラグメントが株から単離されていることを示した：すなわち、Ｒ９２２から３つ(ｆｒｅ３、ｆｒｅ１２、ｆｒｅ１４)、およびＩ−１５２９から１つ(ｆｒｅ１６)。ｆｒｅ３、ｆｒｅ１２、ｆｒｅ１４およびｆｒｅ１６遺伝子フラグメントをプローブとして使用することにより、ストレプトマイセス(Streptomyces)株Ｒ−９２２およびＩ−１５２９のゲノムクローンバンクから完全長フェレドキシン還元酵素が同定された。この方法により、異なる４ｆｒｅ遺伝子の各々の完全コーディング配列をクローン化し、配列決定した。核酸およびアミノ酸配列を以下の通り提供する：ｆｒｅ３(配列番号９８および９９)、ｆｒｅ１２(配列番号１００および１０１)、ｆｒｅ１４(配列番号１０２および１０３)およびｆｒｅ１６(配列番号１０４および１０５)。
【０２４２】
Ｅｍａ１の活性に関する各ｆｒｅ遺伝子の生物活性を評価するため、各遺伝子を上記ｅｍａ１／ｆｄ２３３オペロン、３'〜ｆｄ２３３遺伝子へ挿入した。この結果、ｅｍａ１、ｆｄ２３３、および同じプロモーターから発現される個々のｆｒｅ遺伝子から成る人工オペロンが形成された。ｅｍａ１／ｆｄ２３３／ｆｒｅオペロンをシュードモナス(Pseudomonas)プラスミドｐＲＫ２９０へクローン化し、３種の異なるシュードモナス・プチダ(P.putida)株へ導入した。次いで、全細胞検定法を用いてこれらの株をＥｍａ１生体触媒活性について分析し、遺伝子の一つ、Ｉ−１５２９株からのｆｒｅ遺伝子ｆｒｅ１６は、Ｐ４５０Ｅｍａ１モノオキシゲナーゼの活性を約２倍増加させることが見出された。この作用は、シュードモナス・プチダ(P.putida)株の一つ、ＡＴＣＣ受託番号１７４５３においてのみ見られ、他の２つでは見られなかったことから、株特異的であった。シュードモナス・プチダ(P.putida)株ＡＴＣＣ１７４５３では、ｆｒｅ遺伝子ｆｒｅ１６の存在により、この遺伝子が存在しない場合の２３％と比べてアベルメクチンから４''−ケト−アベルメクチンへの変換が４４％の率で行なわれた。他のｆｒｅ遺伝子は、試験されたシュードモナス・プチダ(P.putida)株のいずれにおいても生体触媒活性に対して影響力を全くもたなかった。
【０２４３】
同様の方法で、ｅｍａ１／ｆｄ２３３／ｆｒｅオペロンの各々をストレプトマイセス(Streptomyces)プラスミドｐＴＵＡ、ｐＴＢＢＫＡおよびｐＥＡＡへクローン化し、ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)株ＺＸ７へ導入した。それぞれの場合において、生体触媒活性に対しｆｒｅ遺伝子のいずれによってもストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)において影響力は無かった。
【０２４４】
均等内容のものについて
当業者であれば、特別な実験法を用いなくとも、本明細書記載の特定物質および手順と均等内容である多数の物質および手順を認めるか、または確認できるはずである。上記の均等内容のものも、この発明の範囲内に含まれるものと考えられる。
【０２４５】
本明細書で引用されている特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立するものである。ジェンバンクデータベース配列を含む、本明細書で引用されている刊行された特許、出願および参考文献は、各々具体的で個々に明細書の一部として示されているかのごとく同程度のものとして出典明示で援用する。本明細書で引用されている参考文献とこの明細書で具体的に説明されている内容の間で何らかの対立がある場合、本明細書の方に沿った形で解決されるべきである。同様に、当業界で理解されている語や句の定義とこの明細書で具体的に示された語や句の定義の間に何らかの対立がある場合、この明細書の方に沿った形で解決されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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