(57)【要約】本発明は、抗テロメラーゼ効果を有する薬品を製造するために、Ｇ−四重鎖構造に結合できる芳香族化合物の使用を目的とするものである。そのような化合物は式（Ｉ）に対応するものであり、該式において、互いに同一、あるいは異なるＲ１、Ｒ２およびＲ３が示すのは、水素原子、または−ＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの基であり、該基において、ｎは２から４の整数で、Ｘは−ＮＨ２基、−Ｎ（ＣＨ３）２基、ピペリジル基、イミダゾリル基、モルホリニル基のような複素環基、またはインドール型の縮合した複素環基から選ばれたものであり、−Ｚが示すのは、ＣＨまたはＮで、各化合物は、位置「Ｚ」で二個の窒素を有する。抗癌剤の製造への応用。
2004505082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗テロメラーゼ効果を有する薬品を製造するための、Ｇ−四重鎖構造に結合可能な芳香族化合物の使用であって、前記化合物が以下の式（Ｉ）に対応しており、
【式１】2004505082.tif 000014
該式において、
−互いに同一か、あるいは異なるＲ１、Ｒ２およびＲ３が示すのは、水素原子、または−ＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの基であり、該基において、ｎは２から４の整数で、Ｘは−ＮＨ２基、−Ｎ（ＣＨ３）２基、ピペリジル基、イミダゾリル基、モルホリニル基のような複素環基、またはインドール型の縮合した複素環基から選ばれたものであり、
−Ｚが示すのは、ＣＨまたはＮで、各化合物が位置「Ｚ」で二個の窒素を有することを特徴とする、Ｇ−四重鎖構造に結合可能な芳香族化合物の使用。
【請求項２】
以下の式（ＩＩ）の誘導体
【式２】2004505082.tif 000015
以下の式（ＩＩＩ）の誘導体
【式３】2004505082.tif 000016
または以下の式（ＩＶ）の誘導体
【式４】2004505082.tif 000017
または以下の式（Ｖ）の誘導体
【式５】2004505082.tif 000018
または以下の式（ＶＩ）の誘導体
【式６】2004505082.tif 000019
または以下の式（ＶＩＩ）の誘導体
【式７】2004505082.tif 000020
または以下の式（ＶＩＩＩ）の誘導体
【式８】2004505082.tif 000021
または以下の式（ＩＸ）の誘導体
【式９】2004505082.tif 000022
の、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
新規なジベンゾフェナントロリンであって、該ジベンゾフェナントロリンが、式（ＩＶ）に対応しており、
【式１０】2004505082.tif 000023
該式において、Ｒ１およびＲ３は同一で、−ＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの基を示し、該基において、ｎは２から４の整数で、Ｘは−ＮＨ２基、Ｎ（ＣＨ３）２基、ピペリジル基、イミダゾリル基のような複素環基、またはインドール型の縮合した複素環基から選ばれたものであることを特徴とする、新規なジベンゾフェナントロリン。
【請求項４】
薬学的に不活性な賦形剤と一体にして、請求項３に記載の化合物の少なくとも一つを治療効果的のある量で含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項５】
経口投与、経鼻投与、口腔内投与、注射投与、非経口投与、直腸投与、膣投与または局所投与のための薬品を製造するための、請求項１に記載の化学式Ｉの化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、テロメラーゼ抑制特性を有し、また特に癌の治療に使用可能な薬品を製造するために、多環芳香族化合物を使用することを目的とするものである。
【０００２】
ヒトにおけるテロメアのＤＮＡは、基本的には一つの二本鎖で構成されており、その中にＴＴＡＧＧＧ／ＣＣＣＴＡＡの反復モチーフが含まれる。その一方、その末端は、モチーフＧが多い３’領域を有する一本鎖である。この一本鎖ＤＮＡは、図１に示したようなＧ−カルテットを伴う４重鎖構造をとってもよいし、Ｔループを形成するものであってもよい。
【０００３】
生物学的に見ると、テロメラーゼは、細胞分裂の際に、テロメアの末端にこの反復ＤＮＡ配列を付加することができる。この働きにより、テロメラーゼは細胞を不死化させる。事実、この酵素活性がないと、細胞は分裂するごとに１００から１５０個の塩基を失い、その結果、該細胞は急速に老化する。急速に分裂する癌細胞が発生する場合には、これら細胞には、その細胞分裂を通じて安定した長さを維持されるテロメアが存在することが認められる。これら癌細胞においては、テロメラーゼは強い活性を有しており、それによりテロメアの末端にテロメア配列の反復モチーフを付加することが可能になり、その結果、癌細胞のテロメアの長さを保存することが可能になることが判明している。癌細胞の８５％を越えるものが、テロメラーゼの存在に陽性の試験結果を示す一方で、ほとんどの体細胞はこのような特徴を示さない。
【０００４】
そういうわけで、テロメラーゼは、癌細胞を治療する為に非常に求められる対象なのである。テロメラーゼを阻害する為の明らかなの第一のアプローチは、ヌクレオチドの構造を利用することからなる（Ｃｈｅｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　１９９６，９３（７），２６３５−２６３９）。先行技術で用いられた非ヌクレオチド化合物の中で取り上げるのは、ジアミノアントラキノン（Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０（１４），２１１３−６）、あるいは、ジエチルオキサジカルボシアニン（Ｗｈｅｅｌｈｏｕｓｅ　Ｒ．Ｔ．ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８（１２０）３２６１−２）である。国際特許出願ＷＯ９９／４００８７号明細書には、上記のＧ−四重鎖構造と相互作用できる化合物の使用について記載されている。それはつまり、ペリレン化合物、および、二つが複素環の、少なくとも七つの環を含むカルボシアニンである。
【０００５】
本発明者等が研究した結果、明らかになったのは、意外なことに、三日月形の平面構造の芳香族化合物、つまり、幾つかが三重鎖を安定させる効果をもつものとして周知のジベンゾフェナントロリンが、化学的な見地からは遥かに単純な構造のものと、少なくとも同等の結果をもたらし得るということである。
【０００６】
このような研究を展開することにより、それ自体がＧ−四重鎖構造に固定することができ、またそのことによりテロメラーゼを抑制する活性を示すタイプの、新しい芳香族化合物を合成することも可能になった。
【０００７】
様々な局面の一つによると、本発明は、したがって、抗テロメラーゼ効果を有する薬品を製造するために、ジベンゾフェナントロリン化合物を使用することを目的とする。
【０００８】
本発明はまた、もう一つの別の局面では、新しいジベンゾフェナントロリンを提供すること、および該ジベンゾフェナントロリンを薬品の有効成分として使用することを目的としている。
【０００９】
本発明による抗テロメラーゼ効果を有する薬品を製造するための、Ｇ−四重鎖構造に結合可能な芳香族化合物の使用は、前記化合物が以下の式（Ｉ）に対応していることを特徴としており：
【式１１】
2004505082.tif 000003
該式において、
−互いに同一か、あるいは異なるＲ１、Ｒ２およびＲ３が示すのは、水素原子、または−ＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの基であり、該基において、ｎは２から４の整数で、Ｘは−ＮＨ２基、−Ｎ（ＣＨ３）２基、ピペリジル基、イミダゾリル基、モルホリニル基のような複素環基、または、インドール型の縮合した複素環基から選ばれたものであり、
−Ｚが示すのは、ＣＨまたはＮで、各化合物は４つの位置「Ｚ」で二個の窒素を有する。
【００１０】
本発明が特に目的とするのは、以下の式（ＩＩ）の化合物の使用、
【式１２】
2004505082.tif 000004
または以下の式（ＩＩＩ）の化合物の使用、
【式１３】
2004505082.tif 000005
または以下の式（ＩＶ）の化合物の使用、
【式１４】
2004505082.tif 000006
または以下の式（Ｖ）の化合物の使用、
【式１５】
2004505082.tif 000007
または以下の式（ＶＩ）の化合物の使用、
【式１６】
2004505082.tif 000008
または以下の式（ＶＩＩ）の化合物の使用、
【式１７】
2004505082.tif 000009
または以下の式（ＶＩＩＩ）の化合物の使用、
【式１８】
2004505082.tif 000010
または以下の式（ＩＸ）の化合物
【式１９】
2004505082.tif 000011
の使用である。
【００１１】
本発明による、薬品の有効成分として用いられる式（Ｉ）の化合物は、Ｇ−四重鎖構造の融解温度（Ｔｍ）を、１μＭの濃度で２から２０℃に、特に式（ＩＶ）から（ＩＸ）の化合物については７から２０℃に上昇させることができることを特徴とする。このＴｍの上昇は、インビトロでのそれらの抗テロメラーゼ効果の上昇と相関関係にあった。
【００１２】
興味深いことに、それら化合物のＩＣ５０値は、１μＭから３μＭ未満で、好適であるということが明らかになった。
【００１３】
目的とする治療への適用を考慮に入れると、興味深く注目すべきは、式（Ｉ）の化合物は、さらに１０−８Ｍ程度の解離定数を示し、それによりＧ−四重鎖構造と強く結合する一方で、今日周知の四重鎖構造リガンドの解離定数は、１０−６から１０−５Ｍ程度であるということである。
【００１４】
別の局面によると、本発明が新規な生成物としてさらに目的とするのは、以下の式（Ｘ）の多環式の芳香族化合物であり、
【式２０】
2004505082.tif 000012
該式において、
− 互いに同一、あるいは異なるＲ１、Ｒ２およびＲ３が示すのは、水素原子、または−ＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの基であり、該基において、ｎは２から４の整数で、Ｘは−ＮＨ２基、−Ｎ（ＣＨ３）２基、ピペリジル基、イミダゾリル基、モルホリニル基のような複素環基、またはインドール型の縮合した複素環基から選ばれたものである。
【００１５】
実施例において報告されている試験によって、これらの生成物を研究したところ、明らかになったのは、該生成物は、テロメアの四重鎖構造を安定化させる能力を有し、およびその結果、抗テロメラーゼ効果を有する薬品、特に抗腫瘍薬品の合成に用いることができるということである。
【００１６】
それゆえ本発明はまた、薬学的に不活性な賦形剤と一体にして、これら新しい化合物の少なくとも一つを治療効果のある量で含む薬学的組成物をも目的とする。
【００１７】
本発明による薬品または本発明により製造された薬品には、癌を治療する上で、他には全く見られない利点がある。該薬品は、このタイプの治療で望まれる投与法に適切な形態に合成される。最も一般的なものは、経口投与、経鼻投与、口腔内投与、注射投与、非経口投与、直腸投与、膣投与または局所投与による投与のための形態である。
【００１８】
経口投与を行うために、従来の方法で、錠剤、糖衣錠、丸薬、ゼラチンカプセル、カプセルおよびそれらと類似のものが得られるように、薬品組成物を製剤する。服用単位ごとの薬量は、所望の治療効果が得られるように、当業者によって適合されるべきである。
【００１９】
注射投与については、皮下投与、静脈投与、皮内投与、筋肉内投与または非経口投与によって投与可能な、滅菌溶液または滅菌可能な溶液を調製する。これらの溶液には、所望の効果を得るのに必要な量の有効成分が含まれる。
【００２０】
これら投与は、１回あるいは複数回行われてもよい。
【００２１】
他の投与形態については、通常の生薬の製剤法によって調製されるのが好適である。
【００２２】
本発明の他の特徴と利点は、以下の実施例で明らかになり、ここにおいて、それぞれ、示されている図１から３を参照する：
・図１Ａは、Ｇ−カルテット、図１Ｂは、分子間の四重鎖構造を示し、
・図２Ａは、Ｇ−カルテットリガンドとして試験したジベンゾフェナントロリンの化学式を、図２Ｂは、本発明によるジベンゾフェナントロリン誘導体を、Ｊ．Ｏ．Ｃ．，１９９７，６２，５４４８におけるＢａｕｄｏｉｎらのプロトコルに従って合成した概略図であり、
・図３Ａは、本発明によるジフェナントロリンによるテロメラーゼの抑制を、図３Ｂは、この抑制とＧ−カルテットの安定化との相関関係を示す。
【００２３】
材料及び方法
オリゴヌクレオチド
修飾された、もしくは修飾しない、オリゴヌクレオチドは全て、ベルギーのスランにある、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ　Ｓ．Ａ．により合成されたものである。蛍光性の研究には、使用するオリゴヌクレオチドの５’末端にフルオレセイン一分子を、３’末端にテトラメチルローダミン一分子を連結する。サンプルの濃度測定は、分光光度法により、そこでは、２２０と７００ｎｍの間の吸収スペクトルを記録し、供給元から通知されたモル吸光係数を用いる。
【００２４】
ジベンゾフェナントロリン
１から６の化合物の合成を、ＢａｕｄｏｉｎらによってＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：ａ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　４，１５０４−１５０８（１９９８）に記載された方法で行った。化合物７、つまり６−［（２−（ピペリジン−１−イル）エチル）アミノメチル］ジベンゾ［ｂ，ｊ］［４，７］フェナントロリンは、Ｂａｕｄｏｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，５４５８−５４７０（１９９７）によって、化合物２および３について記載されたプロトコルに従って合成した。化合物８から１２の合成もまた、このプロトコルに従って行った（図２Ｂの合成概略図参照）。
【００２５】
緩衝液
全ての実験は、０．１Ｍの塩化リチウム（または塩化ナトリウム）を含む、１０ｍＭ、ｐＨ７．６のカコジル酸ナトリウム緩衝液中で行った。緩衝液に蛍光性のコンタミネーションがないことは、予め点検済である。蛍光標識したオリゴヌクレオチドを添加し、最終濃度を０．２μＭとする。
【００２６】
ＦＲＥＴ法
Ｇ−カルテットリガンドは、ＦＲＥＴ（蛍光エネルギー移動）法により蛍光性で識別したが、該方法は、互いに近い二つの分子間の双極子共鳴相互作用に対応するものであり、そのうちの一分子であるドナーは、その励起エネルギーを、他方の分子、ないしアクセプターに移動させる。分子内のＧ−カルテット構造の形成は、２つの発色団を十分に近づけることになり、それにより、エネルギー移動を観察できるようになる。
【００２７】
蛍光性の研究
蛍光性の測定はすべて、Ｓｐｅｘ　Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ　ＤＭ１Ｂ装置で行い、幅１．８ｎｍの励起光と幅４．５ｎｍの発光を用いた。サンプルを、０．２×１ｃｍの小さな石英セルの中に置く。サンプルの温度は、外部からの湯浴によって制御する。オリゴヌクレオチドのみの分析を、２０、３０、４０、５０、６０、７０および８０℃で行った。発光スペクトルを、４７０ｎｍの励起波長を用いて記録した。励起スペクトルの記録には、５１５ｎｍまたは５８８ｎｍの発光波長を用いた。スペクトルは、標準曲線で、機器の感度について補正した。室温において、フルオレセインの蛍光の大幅な消光（８０−９０％）が観察されるが、それはＧ−四重鎖構造の形に基づく、２０℃でのオリゴヌクレオチドの分子内フォールディングと合致し、そこでは、フルオレセイン、およびテトラメチルローダミン（略称ｔａｍｒａ）にそれぞれ結合した、５’および３’末端が並置する。この並置の結果、既に述べたＦＲＥＴによるドナーの蛍光性の消光という現象、および、アクセプターの、感光による発光が引き起こされる。
【００２８】
蛍光性のＴｍ
ｐＨ７．６の、０．１Ｍ　ＬｉＣｌ、１０ｍＭカコジル酸塩の緩衝液中の、鎖の濃度が０．２μＭのオリゴヌクレオチドのストック溶液を予め調製しておき、９０℃まで短時間加熱して２０℃までゆっくりと冷却した後に、蛍光槽に６００μｌずつ分け入れる。つぎに、３μｌの水（コントロール）または試験対象の生成物３μｌ（２００μＭのストック、最終濃度１μＭ）を、そこに加えて混ぜる。サンプルは、それから、各測定の前に、２０℃で最低１時間培養した。更に長い時間（２４時間まで）培養しても、得られる結果に影響はない。
【００２９】
各実験で、サンプルは一つしか測定できなかった。これをまず、最初の温度２０℃で培養し、４０分で８０℃に上げ、８０℃で５分間放置し、次に２０℃まで６２分間冷却する。この間に、蛍光性の測定を、４７０ｎｍの励起波長を用いて、二つの発光波長（５１５ｎｍおよび５８８ｎｍ）で同時に行った。測定は３０秒ごとに行う。湯浴の温度を並行して記録し、そして、温度に応じた蛍光特性を、それらの測定値に基づいて再構成する。次に、その蛍光特性を２０℃と８０℃の間で正規化し、５１５ｎｍの発光強度が、高温と低温での発光強度の平均となる温度を、Ｔｍと呼ぶ。このような条件下で、生成物を添加しない標準サンプルのＴｍは、塩化リチウム緩衝液において４４℃である。この温度を、塩化ナトリウム緩衝液において５５℃を越えるようにする。Ｇ−四重鎖構造を安定化させる化合物を添加すると、Ｔｍが上昇する。この上昇が３℃を越えると、上昇は有意なものと判断される。
【００３０】
抗テロメラーゼ生体活性を以下の実験プロトコロルによって測定する。
【００３１】
ヒトテロメラーゼ活性を高めた抽出物の調製
白血病ＨＬ６０の細胞株を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＵＳＡ）から入手する。細胞を懸濁状態で培養するが、それは２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン２００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン２００μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地において行い、熱で不活性化した１０％ウシ胎児血清を添加した。
【００３２】
１０５個の細胞に等分したものを、３０００×Ｇで遠心分離し、上澄みを分離する。細胞の沈渣物を、何度か続けてピペッティングによって、ＣＨＡＰＳ　０．５％、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５　１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２　１ｍＭ、ＥＧＴＡ　１ｍＭ、β−メルカプトエタノール　５ｍＭ、ＰＭＳＦ　０．１ｍＭ、およびグリセロール１０％を含む２００μｌの溶菌用緩衝液に再懸濁し、それを３０分間、氷中に維持する。その溶菌液を４℃で２０分間、１６０００×Ｇで遠心分離器し、１６０μｌの上澄みを回収する。抽出物の蛋白質の定量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により行った。抽出物は−８０℃で保存する。
【００３３】
テロメラーゼ活性の定量
テロメラーゼ活性の抑制を、オリゴヌクレオチドＴＳ（５’ＡＡＴＣＧＴＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ３’）を伸長するプロトコルにより測定するが、それはテロメラーゼ活性を高めた細胞抽出物、および様々な濃度（１０、１、０．１ならびに０．１μｇ／ｍｌ）で添加した化合物の存在下で行う。伸長反応の後に、オリゴヌクレオチドＴＳおよびＣＸｅｘｔ（５’ＧＴＧＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡ３’）を用いて、伸長産物のＰＣＲ増幅を行った。
【００３４】
反応環境は、以下の組成により調製する。
ＴｒｉｓＨＣ１　ｐＨ８．３を、２０ｍＭ、
ＭｇＣｌ２を、１．５ｍＭ、
Ｔｗｅｅｎ２０を、０．００５％（Ｐ／Ｖ）、
ＥＧＴＡを、１ｍＭ、
ｄＡＴＰを、５０μＭ、
ｄＧＴＰを、５０μＭ、
ｄＣＴＰを、５０μＭ、
ｄＴＴＰを、５０μＭ、
オリゴヌクレオチドＴＳを、２μｇ／ｍｌ、
オリゴヌクレオチドＣＸｅｘｔを、２μｇ／ｍｌ、
牛アルブミン血清を、０．１ｍｇ／ｍｌ、
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを、１Ｕ／ｍｌ、
アルファ３２Ｐ　ｄＣＴＰ（３０００　Ｃｉ／ｍモル）を、０．５μｌ、
テロメラーゼ抽出物を、体積１０μｌで２００ｎｇ、
試験対象の生成物または溶媒を、体積５μｌで、
二回蒸留水ＱＤを５０μｌ
【００３５】
オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）から入手したもので、蒸留水中に１ｍｇ／ｍｌのストック濃度で、−２０℃で保存する。
【００３６】
反応サンプルを、０．２ｍｌのＰＣＲチューブに集め、一滴のパラフィン油を、各実験反応物上に落とし、チューブを閉じる。
【００３７】
それらの反応サンプルをつぎに、以下の温度条件に従ってＣｅｔｕｓ４８００型のＰＣＲ装置で培養する：
３０℃で１５分間、
９０℃で１分間、
その後
９４℃で３０秒間、
５０℃で３０秒間、
そして７２℃で１分３０秒間、
を３０サイクル、
その後、７２℃で２分間を最後に一回行う。
【００３８】
各サンプルにつき、１０μｌに等分したものをその油層の下でピペッティングし、以下を含む沈着用緩衝液５μｌと混ぜ合わせる：
ＴＢＥを、３Ｘ、
グリセロールを、３２％（Ｐ／Ｖ）、
ブロモフェノールブルーを、０．０３％、
キシレンシアノールを、０．０３％。
【００３９】
それらのサンプルをつぎに、電気泳動システムＮｏｖｅｘを用いて、２００ボルトの電圧の下で１時間、ＴＢＥ　１Ｘ緩衝液中の１２％アクリルアミドゲルで電気泳動して分析する。
【００４０】
アクリルアミドゲルをつぎに、一枚のワットマン３ＭＭ紙の上で８０℃で１時間乾燥させ、分析し、そして定量する。
【００４１】
試験対象の化合物の各濃度について、実験結果を、反応の抑制のパーセンテージで表し、また次の式により、未処理の酵素コントロール、および酵素無しのサンプル（ブランク）から計算する：
（化合物の値−ブランクの値／酵素コントロールの値−ブランクの値）×１００。
【００４２】
テロメラーゼ反応を５０％抑制する化合物の濃度（ＩＣ５０）を、試験対象の化合物の各濃度に応じて得られた抑制値を片対数グラフに表すことにより、決定する。
【００４３】
化合物が抗テロメラーゼ剤として活性なのは、テロメラーゼ反応の５０％を抑制する量が、特に５μＭ未満の場合であると考える。
【００４４】
特異的Ｇ−４リガンド
以下に示す結果が得られた分析において用いたのは、配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１およびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２の二つのオリゴヌクレオチドであり、それは５’をフルオレセイン（略称ｆｌｕｏ）の基で、また３’をｔａｍｒａの基で置換しており、
ｆｌｕｏ−ＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−ｔａｍｒａ、
ｆｌｕｏ−ＴＴＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−ｔａｍｒａ、
という配列に対応している。
【００４５】
ジベンゾフェナントロリンの１３の化合物を試験した。それらの化学式は，図２Ａに示す通りである。
【００４６】
色素濃度１μＭで，１から７の化合物を比較する。その結果を表１にまとめる。
【表１】
2004505082.tif 000013
【００４７】
これらの結果は、ジベンゾフェナントロリン化合物が、ＤＮＡ四重鎖に結合していることを裏付けるものである。
【００４８】
同一条件において、テトラ［Ｎ−メチルピリジル］ポルフィリンおよび２，６−二置換ジアントラキノンは、約４℃で安定化させる。
【００４９】
ΔＴｍのこれらの値は、ジベンゾフェナントロリンリガンドの大部分で得られる値よりも有意に小さい。特に注目することは、リガンド５のΔＴｍは＋１２．５℃であり、リガンド１３のそれは＋１９．７℃であることである。
【００５０】
ΔＴｍの効果を、テロメラーゼ抑制効率と比較した。
【００５１】
Ｋｒｕｐｐ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５，９１９−９２１（１９９７）に従って作業し、同一条件下で、化合物１から７について、ＴＲＡＰ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｅａｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）分析を行った。テロメラーゼの由来源として、ＨＬ６０細胞の溶解物を用いた。ＴＲＡＰ反応混合物を、化合物およびテロメラーゼ抽出物の混合物に直接添加した。
【００５２】
つぎに、前述したＰＣＲによる増幅を行った。
【００５３】
テロメラーゼ伸長産物を、非変性条件下で、１２％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。
【００５４】
図３Ａは、化合物１および２によってテロメラーゼをインビトロで抑制することに関するものであり、そこでＢは、核抽出物なしでの試験に対応しており、またＥは、テロメラーゼ活性を有する核抽出物が存在する試験に対応している。化合物１と２についての試験を、３つの異なる濃度で行った（右から左に向かって０．１、１および１０μＭ）。
【００５５】
図３Ｂが示すのは、インビトロでのテロメラーゼ活性の抑制（Ｙ軸、標準的なＴＲＡＰ試験においてテロメラーゼ活性の５０％を抑制するために必要な濃度で表される）および、Ｇ４の安定化（Ｘ軸、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１のオリゴヌクレオチドのΔＴｍで表す）の間の相関関係である。結果は、個別の少なくとも二つの実験の平均に対応している。
【００５６】
特に化合物１に関して、図３Ａを検討することで明らかになるのは、濃度が上がると、テロメラーゼ伸長産物に対応する、移動距離の小さいバンドが消失することである。化合物２もまたテロメラーゼを抑制することが確認された。表１に示された結果を図３Ｂに図示しており、該図３Ｂでは、テロメラーゼの抑制効率とΔＴｍとの関係を示している。インビトロでテロメラーゼを効率的に抑制する化合物、特に化合物１、３、４、５、６および１３はすべて、９℃より高い温度でのＧ−カルテット構造を安定化させることが確認された。化合物２および７は、それぞれ１．４および２μＭのＩＣ５０値を示す。
【００５７】
ジベンゾフェナントロリン化合物の抗増殖効果
癌細胞株を、様々な濃度の化合物１の存在下で３日間培養する。
【００５８】
テロメラーゼに対して最も活性のある化合物１の細胞毒性を、ヒト腫瘍株ヒトＨｅＬａについて試験した。
【００５９】
これらの細胞はＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養したが、該培地には、補体を欠いた１０％ウシ胎児血清、グルタミン、非必須アミノ酸（１％）、および抗生物質（ペニシリンならびにストレプトマイシン）が含まれる。９６ウェルプレートに細胞を付着させた（一ウェルあたり２５００個の細胞）後、リガンドを培養培地で希釈する。細胞数は、Ｐｒｏｍｅｇａの「Ｃｅｌｌ　ｔｉｔｅｒ　９６　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ」キットで測定する。各測定は、四回ずつ行った。それら細胞を、化合物の存在下で１から４日間放置し、その後、計数した。
【００６０】
化合物１について測定したＩＣ５０は、２４時間化合物１が存在する状態で、ＨｅＬａ細胞では０．５マイクロモル濃度である。５マイクロモル濃度以上の濃度では、１００％の死亡率が観察される。９６時間、生成物の存在下で細胞を培養すると、該生成物の毒性は高まる（０．５マイクロモルで死亡率１００％）。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇ−カルテット構造と、分子間の四重鎖構造を示した図。
【図２Ａ】Ｇ−カルテットリガンドとして試験したジベンゾフェナントロリンの化学式。
【図２】Ｇ−カルテットリガンドとして試験したジベンゾフェナントロリンの化学式。
【図２Ｂ】本発明によるジベンゾフェナントロリンの誘導体合成の概略図。
【図３Ａ】本発明によるジフェナントロリンによるテロメラーゼの抑制を示した写真。
【図３Ｂ】テロメラーゼ抑制とＧ−カルテットの安定化との相関関係を示したグラフ。
【図２Ａ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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