(57)【要約】本発明は、シグナル伝達が変化した受容体を同定する方法を提供する。特に、本発明は、リガンド依存性のシグナル伝達またはリガンド非依存性のシグナル伝達が変化した受容体を同定するアッセイ法を提供する。本発明の方法によって同定することができるリガンド依存性のシグナル伝達が変化した受容体として、高感受性受容体または低感受性受容体ならびに効力が増加または減少した受容体が挙げられる。本発明の方法はまた、基礎活性が変化した受容体（例えば、構成的に活性のある受容体またはサイレンシング変異を有する受容体）の同定にも適用することができる。さらなる用途として、シグナル伝達が変化した多型受容体または変異受容体および薬物応答が変化した受容体の同定が挙げられる。最後に、同定された受容体は薬物発見のツールとして有用である。図（１）は、構成的に活性のあるクラスＩ Ｇタンパク質共役受容体（配列番号：２〜７５）の表である。2004526415.tif 000007
2004526415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル伝達が変化した多型受容体を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）第１の宿主細胞を、レポーター構築物および発現ベクターと同時トランスフェクトする段階であって、該レポーター構築物が、レポーター遺伝子に機能的に連結された応答エレメントおよびプロモーターを含み、該応答エレメントが、該受容体によって誘導されたシグナルに対して感受性があり、該発現ベクターが、遺伝子多型を有する候補受容体に機能的に連結されたプロモーターを含む、段階；
ｂ）第２の宿主細胞を、該レポーター構築物および陰性対照ベクターと同時トランスフェクトする段階；および
ｃ）該第１の宿主細胞および該第２の宿主細胞における該レポーター構築物の発現レベルを測定する段階であって、第２の宿主細胞と比較した第１の宿主細胞における発現レベルの増加または減少によって、該候補受容体がシグナル伝達が変化した多型受容体であると同定される段階。
【請求項２】
シグナル伝達がリガンド依存性のシグナル伝達である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
シグナル伝達がリガンド非依存性のシグナル伝達である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
シグナル伝達が変化した多型受容体が、基礎シグナル伝達が増加または減少した多型受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
シグナル伝達が変化した多型受容体が、リガンドによって誘導されるシグナル伝達に対する感受性が増加または減少した多型受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
シグナル伝達が変化した多型受容体が、効力が増加または減少した多型受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
シグナル伝達が変化した多型受容体が、シグナル伝達が存在しない多型受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
シグナル伝達が変化した多型受容体がＧタンパク質共役受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｇタンパク質共役受容体が、Ｇαｑ、Ｇαｓ、およびＧαｉからなる群より選択されるＧタンパク質と共役している、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
シグナル伝達が変化した多型受容体が一回膜貫通受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
一回膜貫通受容体がエリスロポエチン受容体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
シグナル伝達が変化した多型受容体が核受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
核受容体がステロイドホルモン受容体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
シグナル伝達が変化した多型受容体が、リガンドによって誘導される応答の変化についてさらにスクリーニングされる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
リガンドが薬物である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
段階（ｃ）において、レポーター構築物の基礎発現レベルが第１の宿主細胞および第２の宿主細胞において測定され、該第２の宿主細胞と比較した該第１の宿主細胞における基礎発現レベルの増加によって、多型受容体が構成的に活性のある受容体であると同定される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
転写レポーターアッセイ法を用いて測定が達成される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
応答エレメントが、ソマトスタチンプロモーターエレメント、血清応答エレメント、およびｃＡＭＰ応答エレメントからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
受容体が天然に生じる受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
多型受容体が構成的に活性のある受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
多型受容体が高感受性受容体または低感受性受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
多型受容体が非機能性受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
シグナル伝達が変化したＧタンパク質共役受容体を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）第１の宿主細胞を、
ｉ）レポーター遺伝子に機能的に連結されたＧタンパク質応答エレメントおよびプロモーターを含む、レポーター構築物、
ｉｉ）候補Ｇタンパク質共役受容体に機能的に連結されたプロモーターを含む、第１の発現ベクター、および
ｉｉｉ）キメラＧタンパク質に機能的に連結されたプロモーターを含む、第２の発現ベクター
と同時トランスフェクトする段階であって、該キメラＧタンパク質が該候補Ｇタンパク質共役受容体からシグナルを受け取り、該レポーター構築物の発現を増大させることが可能な段階；
ｂ）第２の宿主細胞を、該レポーター構築物、該第２の発現ベクター、および陰性対照ベクターと同時トランスフェクトする段階；および
ｃ）該第１の宿主細胞および該第２の宿主細胞における該レポーター構築物の発現レベルを測定する段階であって、第２の宿主細胞と比較した第１の宿主細胞における発現レベルの増加または減少によって、該候補受容体がシグナル伝達が変化したＧタンパク質共役受容体であると同定される段階。
【請求項２４】
キメラＧタンパク質が、Ｃ末端の３アミノ酸が別のＧタンパク質のアミノ酸に変えられているＧタンパク質を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
キメラＧタンパク質が、Ｇｑ５ｉ、Ｇｑ５ｏ、Ｇｑ５ｚ、Ｇｑ５ｓ、Ｇｓ５ｑ、またはＧ１３Ｚからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
レポーター構築物が、ルシフェラーゼ構築物、β−ガラクトシダーゼ構築物、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ構築物からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
レポーター構築物がルシフェラーゼ構築物である、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
応答エレメントが、ソマトスタチンプロモーター、血清応答エレメント、およびｃＡＭＰ応答エレメントからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
Ｇタンパク質共役受容体が、構成的に活性のある受容体、高感受性受容体、低感受性受容体、非機能性受容体、サイレント受容体、および部分的なサイレント受容体からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
Ｇタンパク質共役受容体が、Ｇαｑ、Ｇαｓ、ＧαＩ、およびＧｏからなる群より選択されるＧタンパク質と共役している、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
シグナル伝達がリガンド依存性のシグナル伝達である、請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
シグナル伝達がリガンド非依存性のシグナル伝達である、請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
Ｇタンパク質共役受容体が、リガンドによって誘導される応答の変化についてさらにスクリーニングされる、請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
リガンドが、薬物、アゴニスト、アンタゴニスト、およびインバースアゴニスト（ｉｎｖｅｒｓｅ ａｇｏｎｉｓｔ）からなる群より選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
シグナル伝達活性が減少した受容体を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）第１の宿主細胞を、レポーター構築物および発現ベクターと同時トランスフェクトする段階であって、該レポーター構築物が、レポーター遺伝子に機能的に連結された応答エレメントおよびプロモーターを含み、該応答エレメントが、該受容体によって誘導されたシグナルに対して感受性があり、該発現ベクターが、候補受容体に機能的に連結されたプロモーターを含む段階；
ｂ）第２の宿主細胞を、該レポーター構築物および陰性対照ベクターと同時トランスフェクトする段階；および
ｃ）該第１の宿主細胞および該第２の宿主細胞における該レポーター構築物の発現レベルを測定する段階であって、第２の宿主細胞と比較した第１の宿主細胞における発現レベルの減少によって、該候補受容体がシグナル伝達活性が減少した受容体であると同定される段階。
【請求項３６】
受容体がシグナル伝達活性を有さない、請求項３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
連邦政府の助成を受けた研究に関する申告
本願は一部がＮＩＨ助成金ＤＫ４６７６７によって支援された。政府は本発明に対して一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の背景
多くの疾患および他の副作用が異常な受容体活性に起因し得るという事実のために、シグナル伝達が変化した受容体は薬物発見の重要なツールである。シグナル伝達が変化した受容体の同定はまた、多型受容体（この場合、変化したシグナル伝達が疾患の一因となる）の同定においても価値がある。同様に、変異受容体または多型受容体（この場合、変異または多型によって特定のリガンド（例えば、薬物またはペプチドホルモン）に対する受容体の応答が変化する）を同定することも重要である。
【０００３】
シグナル伝達が変化した受容体として、リガンド依存性のシグナル伝達またはリガンド非依存性（基礎）のシグナル伝達の変化を示す受容体が挙げられる。例えば、リガンド依存性受容体はシグナル伝達の増加または減少を示すことがある。リガンド刺激に対する感受性が増加したリガンド依存性受容体として、高感受性受容体および効力が増加した受容体が挙げられる。または、リガンドに対する感受性が減少した受容体または効力が減少した受容体を同定することができる。対照的に、基礎活性の増加を示す受容体は構成的に活性のある受容体として分類される。基礎活性が低下した受容体は、例えば、サイレンシング変異を有する受容体である。他の受容体は実際には機能しないこともある（すなわち、これらの受容体には検出可能な基礎活性もリガンドにより誘導される活性もない）。
【０００４】
ハイスループット薬物スクリーニングアッセイ法において使用することができる、シグナル伝達が変化した受容体を同定する方法が存在していなかった。例えば、基礎シグナル伝達が変化した受容体（例えば、構成的に活性のある受容体）を同定することは特に困難である。構成的に活性のある受容体は、薬物発見のための感度の高い検出系として特に価値がある。シグナル伝達が変化した受容体（特に、リガンド非存在下での基礎シグナル伝達レベルが変化した受容体）を日常的に同定するための標準化されたスクリーニングアッセイ法が必要とされている。
【０００５】
発明の概要
本発明は、受容体のリガンド依存性のシグナル伝達およびリガンド非依存性のシグナル伝達の変化を検出することができるアッセイ法（好ましくは、転写レポーターアッセイ法）を用いることによって、シグナル伝達が変化した受容体（例えば、多型受容体）を同定する方法を提供する。この方法は、候補受容体によって生じたシグナルと陰性対照によって生じたシグナルとを比較することを含む。シグナル伝達が変化した受容体は、転写レポーターアッセイ法を用いて、陰性対照と比較して、候補受容体のリガンド刺激活性レベルまたは基礎活性レベルの増加または減少を検出することによって同定される。
【０００６】
関連した態様において、本発明は、シグナル伝達が変化した受容体を同定する方法を提供する。この方法は、まず最初に、野生型受容体と少なくとも１つのシグナル伝達が変化した受容体との間の相同性領域を同定することを含む。次いで、変異を野生型受容体に導入して、変異受容体を得る（この変異は、野生型受容体とシグナル伝達が変化した受容体との間の相同性領域に基づいている）。次いで、野生型受容体と比較した変異受容体のシグナル伝達の変化を検出するためにアッセイ法を行う。野生型受容体と比較した変異受容体のシグナル伝達の増加または減少によって、変異受容体は、シグナル伝達が変化した受容体であると同定される。
【０００７】
前記のシグナル伝達の変化を検出する方法は、多くの種類のシグナル伝達の変化の検出において適用することができる。例えば、この方法は、基礎シグナル伝達が増加または減少した受容体、リガンド刺激に対する感受性が増加または減少した受容体、効力が増加または減少した受容体を検出することができ、シグナルを伝達しない受容体さえも検出することができる。本発明は、このような活性変化を有する変異受容体および／または多型受容体を迅速かつ再現可能に同定することができるので特に価値がある。このような変化を有する、このような変異受容体および多型受容体として、Ｇタンパク質共役受容体（例えば、Ｇαｑ、Ｇαｓ、またはＧαｉと共役するＧタンパク質共役受容体）、膜貫通受容体、および核受容体（例えば、ステロイドホルモン受容体）が挙げられる。このような受容体が同定されたら、リガンドにより誘導される応答の変化（例えば、薬物に対する応答の変化）についてさらにスクリーニングすることができる。
【０００８】
さらに詳細に述べると、本発明は、構成的に活性のある受容体を同定する多数の方法を提供する。第１の方法において、このような受容体は、（１）構成的に活性のない受容体と少なくとも１つの構成的に活性のある受容体との間の相同性領域を同定し；（２）構成的に活性のない受容体に変異を導入して、変異受容体を得（この変異は構成的に活性のない受容体と構成的に活性のある受容体との間の相同性領域に基づいている）；（３）構成的に活性のない受容体と比較した基礎活性の増加について変異受容体をアッセイすることによって検出される。構成的に活性のない受容体と比較した変異受容体の基礎活性の増加によって、変異受容体は、構成的に活性のある受容体であると同定される。好ましくは、アッセイ法は、転写レポーターアッセイ法（例えば、ルシフェラーゼアッセイ法またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイ法）である。
【０００９】
関連した局面において、本発明は、（１）第１の宿主細胞を、レポーター構築物および発現ベクターと同時トランスフェクトし（レポーター構築物は、レポーター遺伝子に機能的に連結された応答エレメントおよびプロモーターを含み、応答エレメントは、受容体によって誘導されたシグナルに対して感受性があり、発現ベクターは、候補受容体に機能的に連結されたプロモーターを含む）；（２）第２の宿主細胞を、レポーター構築物および陰性対照ベクターと同時トランスフェクトし；（３）第１の宿主細胞および第２の宿主細胞におけるレポーター構築物の基礎発現レベルを測定することよって、構成的に活性のある受容体（例えば、多型受容体）を同定する第２の方法を提供する。第２の宿主細胞と比較した第１の宿主細胞における基礎発現レベルの増加によって、候補受容体は、構成的に活性のある受容体であると同定される。
【００１０】
本明細書に記載の構成的に活性のある受容体を同定する方法は、構成的に活性のあるＧタンパク質共役受容体（特に、Ｇαｑ、Ｇαｓ、またはＧαｉと共役するＧタンパク質共役受容体）を同定するのに有用である。または、この方法は、構成的に活性のある一回膜貫通受容体（例えば、構成的に活性のあるエリスロポエチン受容体）の同定に関連している。別の好ましい態様において、この方法は、構成的に活性のある核受容体（例えば、構成的に活性のあるステロイドホルモン受容体）の同定に関連している。
【００１１】
本発明のアッセイ法において用いられる特定の応答エレメントは、特定の受容体を介したシグナル伝達に対して感受性のある任意の応答エレメントでよい。好ましい応答エレメントの例として、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達に対して感受性のある応答エレメントである、ソマトスタチンプロモーター（多くの異なる応答エレメントを含んでいる）の一部（ＳＭＳ）、血清応答エレメント（ＳＲＥ）、およびｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）が挙げられる。他の好ましい応答エレメントとして、一回膜貫通受容体または核受容体を介したシグナル伝達に対して感受性のある応答エレメントが挙げられる。
【００１２】
別の局面において、本発明は、第１の宿主細胞を、レポーター構築物（レポーター構築物は、レポーター遺伝子に機能的に連結されたＧタンパク質応答エレメントおよびプロモーターを含む）、第１の発現ベクター（第１の発現ベクターは、候補Ｇタンパク質共役受容体に機能的に連結されたプロモーターを含む）、および第２の発現ベクター（第２の発現ベクターは、キメラＧタンパク質に機能的に連結されたプロモーターを含み、キメラＧタンパク質は、候補Ｇタンパク質共役受容体からシグナルを受け取り、レポーター構築物の発現を増大させることができる）と同時トランスフェクトし；第２の宿主細胞を、レポーター構築物、第２の発現ベクター、および陰性対照ベクターと同時トランスフェクトし；第１の宿主細胞および第２の宿主細胞におけるレポーター構築物の発現レベルを測定することによって、シグナル伝達が変化したＧタンパク質共役受容体を同定する一般的な方法を提供する。ここで、第２の宿主細胞と比較した第１の宿主細胞における発現レベルの増加または減少によって、候補受容体は、シグナル伝達が変化したＧタンパク質共役受容体であると同定される。
【００１３】
この第２の局面の態様において、キメラＧタンパク質として、Ｃ末端の３アミノ酸が別のＧタンパク質のアミノ酸に変えられているＧタンパク質が挙げられる。この第２の局面の別の態様において、キメラＧタンパク質は、Ｇｑ５ｉ、Ｇｑ５ｏ、Ｇｑ５ｚ、Ｇｑ５ｓ、Ｇｓ５ｑ、またはＧ１３Ｚでもよい。レポーター構築物は、ルシフェラーゼ構築物、β−ガラクトシダーゼ構築物、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ構築物でもよい。応答エレメントは、ソマトスタチンプロモーター、血清応答エレメント、またはｃＡＭＰ応答エレメントでもよい。
【００１４】
本発明の他の態様において、Ｇタンパク質共役受容体は、構成的に活性のある受容体、高感受性受容体、低感受性受容体、非機能性受容体、サイレント受容体、または部分的なサイレント受容体でもよい。本発明の他の態様において、Ｇタンパク質共役受容体は、Ｇタンパク質（例えば、Ｇαｑ、Ｇαｓ、Ｇαｉ、またはＧｏ）と共役してもよい。シグナル伝達は、リガンド依存性のシグナル伝達でもリガンド非依存性のシグナル伝達でもよい。この局面の別の態様において、シグナル伝達が変化した受容体は、リガンドにより誘導される応答の変化についてさらにスクリーニングすることができる。リガンドは、薬物、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニスト（ｉｎｖｅｒｓｅ ａｇｏｎｉｓｔ）であってもよい。
【００１５】
さらに、特定の応答エレメントによって検出されるシグナル伝達は、基礎シグナル伝達の増加（構成的シグナル伝達）、基礎シグナル伝達の減少（サイレンシング）、ならびに高感受性シグナル伝達および低感受性シグナル伝達を含む任意の受容体シグナル伝達でよいことが理解されると思われる。
【００１６】
最後の好ましい態様において、本発明は、シグナル伝達の変化を示す受容体ポリペプチドの配列の集まりを含むデータベースを提供する。このデータベースはスタティックなデータベースである必要はないが、シグナル伝達の変化を示すさらなるポリペプチドが同定され、その集まりに加えられるにつれてサイズが絶えず大きくなるデータベースでもよい。好ましくは、データベースには１００〜１０００個の配列がある。このようにして、データベースは経時的に頻繁に改善される。
【００１７】
データベースを構成する受容体ポリペプチドは、リガンド依存性のシグナル伝達またはリガンド非依存性のシグナル伝達が変化した受容体を含んでもよい。このような受容体ポリペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体、一回膜貫通受容体、および核受容体を含んでもよい。Ｇタンパク質共役受容体、一回膜貫通受容体、または核受容体の定義された集まりの中で、この集まりを、構成的に活性な、サイレンシングされた、高感受性の、非機能性の、または効力が増加もしくは減少したＧタンパク質共役受容体、一回膜貫通受容体、または核受容体の集まりとしてさらに定義することができる。このような受容体は、もちろん、野生型、変異体、または多型ポリペプチド受容体であってもよい。
【００１８】
「構成的に活性のある受容体」は、対応する野生型受容体より高い基礎活性レベルを有する受容体、すなわち正のアゴニスト（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｇｏｎｉｓｔ）による活性化の非存在下で自発的にシグナルを伝達する能力を有する受容体を意味する。この用語は、天然で構成的に活性があり（例えば、天然に生じる多型受容体および野生型受容体を含む天然に生じる受容体）、受容体をコードする遺伝子の無い対応するベクターより高い基礎活性レベルを有する野生型受容体を含む。受容体の構成的活性はまた、変異受容体のシグナル伝達（例えば、セカンドメッセンジャーシグナル伝達）の基礎レベルと、野生型受容体のシグナル伝達の基礎レベルを比較することによって確かめることもできる。構成的に活性のある受容体は、陰性対照または野生型受容体と比較して、少なくとも２５％の基礎活性増加、好ましくは少なくとも５０％の基礎活性増加、より好ましくは少なくとも７５％の基礎レベル活性増加、最も好ましくは１００％を超える基礎レベル活性増加を示す。疾患表現型に関連する構成的に活性のある受容体（例えば、構成的に活性のある多型受容体）が、構成的活性の比較的小さな増加（例えば、２５％と小さな増加）を示すことはよくあることである。好ましくは、構成的に活性のある受容体の基礎活性は、インバースアゴニストの存在下での基礎活性減少によって確かめることができる。
【００１９】
「基礎」活性は、受容体特異的リガンド（例えば、正のアゴニスト）による刺激の非存在下での、受容体の活性（例えば、特定の生化学経路またはセカンドメッセンジャーシグナル伝達事象の活性化）のレベルを意味する。好ましくは、基礎活性は、野生型受容体のリガンド刺激活性レベルより小さい。しかしながら、ある特定の場合では、基礎活性が増大した変異受容体が、対応する野生型受容体のリガンド刺激活性レベルに近いか、等しいか、またはそれを上回りさえするシグナル伝達レベルを示すことがある。
【００２０】
「天然に生じる」受容体は、動物において存在するような受容体の形態もしくは配列、または「野生型」配列として当業者に知られている配列と相同な受容体の形態を意味する。当業者は、「野生型」受容体が、その受容体の従来より認められている「野生型」アミノ酸コンセンサス配列、またはリガンド結合およびシグナル伝達の正常な生理パターンを有する「天然に生じる」受容体を意味することを理解すると思われる。
【００２１】
「変異受容体」は、天然で生じる最も優勢な受容体（例えば、天然に生じる野生型受容体）の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が欠失または置換されている受容体の一形態であることが理解される。または、さらなるアミノ酸残基が挿入されている。
【００２２】
「シグナル伝達の変化」は、効能、効力、または基礎シグナル伝達のパラメータによって測定されるような、一般的に受容体によって生じたリガンド依存性のシグナルまたはリガンド非依存性のシグナルの変化を意味する。この変化または変更は、リガンド依存性のシグナル伝達またはリガンド非依存性のシグナル伝達の増加でも減少でもよい。シグナル伝達の変化の例として、リガンドに対する感受性が増加した受容体（すなわち、高感受性受容体）が挙げられる。このリガンドに対する感受性の増加は、アゴニスト刺激に応答した効力の増加または効能の増加の形で生じてもよい。シグナル伝達が変化した受容体の他の例として、リガンドに対する感受性が減少した受容体（すなわち、低感受性受容体またはサイレンシングされた受容体）、基礎活性の変化を示す受容体（例えば、構成的に活性のある受容体などの基礎シグナル伝達レベルが増加した受容体、またはサイレンシング変異を有する受容体（すなわち、完全にもしくは部分的にサイレンシングされた受容体）などの基礎シグナル伝達レベルが減少した受容体）が挙げられる。シグナル伝達の変化または変更はまたシグナル伝達が存在しないことでもよい（例えば、リガンドを結合しない非機能性受容体、またはリガンドを結合するがリガンド誘導シグナルを伝達しない受容体）。シグナル伝達が変化した受容体は、適切な陰性対照と比較して、少なくとも２５％の基礎活性の増加もしくは減少、または少なくとも５０％の基礎活性の増加もしくは減少、または少なくとも７５％の基礎活性の増加もしくは減少、または１００％を超える基礎活性の増加もしくは減少を示す。または、もしくはさらに、基礎シグナル伝達が変化した受容体は、ホルモンで誘導された最大活性のパーセントとして表された時に、少なくとも５％の基礎活性の増加もしくは減少、または少なくとも１０％、１５％、２０％、もしくは２５％の基礎活性の増加もしくは減少、または少なくとも５０％、６０％、もしくは７５％の基礎活性の増加もしくは減少、または１００％を超える基礎活性の増加もしくは減少を示す（全て適切な陰性対照と比較）。少なくとも、シグナル伝達が変化した受容体は、一般に認められた統計解析法を用いて統計的に有意であるとみなされる、適切な陰性対照に対する基礎またはリガンド誘導性のシグナル伝達または効能または効力の変化を示す。
【００２３】
「実質的に純粋な核酸」は、本発明のＤＮＡが得られた生物の天然に生じるゲノムにおいて隣接している遺伝子を含まない核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。従って、この用語は、例えば、ベクター；自己複製プラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立した別々の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じたｃＤＮＡまたはゲノム断片またはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。この用語はまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。
【００２４】
「形質転換細胞」は、組換えＤＮＡ法によって、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、μオピオイド受容体ポリペプチド）を（本明細書で使用するように）コードするＤＮＡ分子が導入されている細胞（または祖先に導入された細胞）を意味する。
【００２５】
「プロモーター」は、転写を指向するのに十分な最小配列を意味する。プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的レギュレーターもしくは組織特異的レギュレーターで制御可能にするか、または外部シグナルもしくは薬剤で誘導性にするのに十分なプロモーターエレメントも本発明に含まれる。このようなエレメントはネイティブな遺伝子の５’領域に位置してもよく、３’領域に位置してもよい。プロモーターエレメントは、ＤＮＡ配列に隣接して配置された場合に配列転写を指向できるように、発現のために配置することができる。
【００２６】
「機能的に連結された」は、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が１つまたはそれ以上の調節配列に結合した時に遺伝子発現できるように、遺伝子および１つまたはそれ以上の調節配列が連結されていることを意味する。
【００２７】
「発現ベクター」は、発現させようとする遺伝子に機能的に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。
【００２８】
「レポーター構築物」は、レポーター遺伝子に機能的に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。このようなレポーター遺伝子は、（例えば、目視検査もしくは計器による検出によって）直接的に検出されてもよく、（例えば、抗体とレポーター遺伝子産物との結合もしくはレポーター産物を介した第２の遺伝子産物の誘導によって）間接的に検出されてもよい。標準的なレポーター遺伝子の例として、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、またはアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖ１−３，２０００を参照のこと）。レポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子によってコードされるポリペプチドの活性を直接的または間接的に測定するアッセイ法を用いて検出することができる。好ましいレポーター構築物は応答エレメントも含む。
【００２９】
「応答エレメント」は、特定のシグナル伝達経路（例えば、セカンドメッセンジャーシグナル伝達経路）に対して感受性のある核酸配列であり、レポーター遺伝子の転写を駆動するのを助ける。本発明によれば、応答エレメントはプロモーターでもよい。
【００３０】
本明細書で使用する「セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性」は、受容体活性化に応答した細胞内刺激（ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｐｐＧｐｐ、イノシトールリン酸、もしくはカルシウムイオンが挙げられるが、これに限定されることはない）の生成、または受容体活性化に応答したタンパク質（キナーゼ、ホスファターゼが挙げられるが、これに限定されない）の活性化、または膜チャンネルの活性化もしくは阻害を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する「陰性対照」は、候補受容体のシグナル伝達の変化を識別するのに使用することができる任意の構築物である。任意の候補受容体にとって適切な陰性対照は、アッセイ法およびシグナル伝達の変化のタイプによって異なる。例えば、構成的に活性のある受容体を同定するためには、適切な陰性対照は、受容体ヌクレオチド配列が全く無いベクターでもよく、構成的に活性のない野生型受容体ヌクレオチド配列を含むベクターでもよい。シグナル伝達が変化した受容体を同定するのに用いられる適切な陰性対照は当業者に明らかであろう。
【００３２】
好ましい態様の説明
本発明は、受容体のシグナル伝達活性の変化を検出するための迅速かつ再現可能なスクリーニングアッセイ法を提供する。このアッセイ法は、リガンドが既知の受容体ならびにリガンドが現在知られていない受容体（すなわち、オーファン受容体）に適用することができる。このアッセイ法はまた多型受容体にも適用することができる。１つの好ましい態様において、スクリーニングアッセイ法は、受容体のシグナル伝達の基礎レベルの変化を検出するのに用いられる。本発明によれば、基礎レベルシグナル伝達が増加した受容体は、構成的に活性のある受容体として同定される。構成的に活性のある受容体として、構成的に活性のあるＧタンパク質共役受容体（例えば、オピエート受容体）、１回膜貫通ドメイン受容体（例えば、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ受容体））、および核受容体（例えば、エストロゲン受容体などのステロイドホルモン受容体）が挙げられる。別の好ましい態様において、スクリーニングアッセイ法は、特定の（例えば、天然に生じる構成的に活性のある）受容体（例えば、サイレンシング変異を有する受容体）の基礎レベルシグナル伝達の減少を検出するのに用いられる。さらに別の好ましい態様において、シグナル伝達の変化は、リガンド刺激に対する高感受性をもたらす変化である。
【００３３】
本発明によれば、構成的に活性のある受容体として、天然に生じる構成的に活性のある受容体および天然に生じない（すなわち、変異体の）構成的に活性のある受容体が挙げられる。本発明は、天然に生じる構成的に活性のある受容体および天然に生じない構成的に活性のある受容体を両方とも同定する方法を提供する。本発明によれば、基礎活性が増加した構成的に活性のある受容体と、適切な陰性対照を比較する。例えば、天然に生じる構成的に活性のある受容体は、受容体をコードする遺伝子が無いベクターの活性と比較してシグナル伝達の基礎レベルの増加を示すことによって同定することができる。または、構成的活性を有する変異受容体は、構成的に活性のある変異受容体のシグナル伝達の基礎レベルと野生型受容体のシグナル伝達の基礎レベルを比較することによって同定することができる。対照または野生型受容体と比較した候補受容体における基礎レベル活性の増加（例えば、少なくとも２５％の増加）は、構成的に活性のある受容体の同定を示している。
【００３４】
多くの天然に生じるおよび天然に生じない構成的に活性のある受容体が以前に同定されており、当技術分野において利用することができる。本明細書に記載のように、さらなる構成的に活性のある受容体を同定するためのツールとして、この情報を利用および使用することができる。本発明によれば、既知の構成的に活性のある受容体のアミノ酸配列および／または核酸配列がデータベースに集められる。次いで、構成的活性に重要な保存ドメインを同定するために、または構成的活性を特定の受容体に付与する、ドメイン内の変異を同定するために、集められたデータベースが用いられる。次いで、このようなデータベースの構成的に活性のあるポリペプチドの配列（天然に生じる構成的に活性のある受容体および構成的活性を有する変異受容体の両方を含む）と、ある特定の構成的に活性のない受容体の配列を比較し、構成的に活性のない受容体と構成的に活性のある受容体との間で保存ドメインが同定される。変異によってある特定の構成的に活性のない（例えば、野生型）受容体に構成的活性を付与する可能性が高い、構成的に活性のない受容体内の特定の残基を同定するために、この情報がさらに用いられる。
【００３５】
ある特定の構成的に活性のない受容体における特定の位置が変異の対象となったら、同定された変異を含む受容体が日常的な方法を用いて作成され、構成的活性の増加についてスクリーニングされる（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、サンブルック，Ｊ．ら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、またはアウスベルら、「分子生物学の最新プロトコール」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖ１−３，２０００を参照のこと）。好ましくは、基礎レベル活性の増加は、野生型受容体と比較した変異受容体における基礎レベルシグナル伝達の増加を測定することによって検出される。当業者は、変異受容体の基礎レベル活性を測定するために、野生型受容体のリガンド刺激活性の測定に一般的に用いられる任意のアッセイ法も使用できることを理解するだろう。このようなアッセイ法は本明細書以下でさらに詳細に述べる。
【００３６】
当業者は、基礎レベル活性が増加した受容体（構成的に活性のある受容体）の同定に適用する基本原理が、基礎レベル活性が低下した受容体（例えば、サイレンシング変異を有する受容体）の同定に直接適用することができ、高感受性受容体にも適用できることを理解するだろう。
【００３７】
当業者は、サイレンシング変異を有する受容体を同定するために、基礎活性レベルが増加するのではなく基礎活性レベルが減少した受容体をスクリーニングすることをはっきりと理解しているだろう。高感受性受容体が同様に同定される。高感受性受容体は、リガンドに応答して、野生型受容体と比較して増加した受容体誘導シグナルを送達する受容体である。好ましい態様において、野生型受容体のリガンド誘導活性と変異受容体のリガンド誘導活性を比較することによって、天然に生じない高感受性受容体が同定される。高感受性受容体は、ある特定の濃度のリガンドに対して、野生型受容体より強いシグナルを示す能力によって同定される。高感受性受容体は、同じ濃度のリガンドに対する野生型受容体の応答と比較して増加した、ある特定の濃度のリガンドに対する応答を示す点で特徴付けることができる。例えば、５μＭリガンドが、陰性対照と比較して野生型受容体において５倍の活性刺激を誘導するのであれば、５μＭリガンドは、同じ陰性対照と比較して高感受性受容体において１０倍の活性刺激を刺激することがある。
【００３８】
シグナル伝達が変化した受容体の同定
本発明は、構成的に活性のある受容体を同定する方法を提供する。前記のように、受容体（例えば、野生型受容体）の中には天然で構成的に活性があるものもある。このような天然に生じる構成的に活性のある受容体は、野生型受容体の基礎活性と陰性対照の基礎活性を単に比較することによって同定される。適切な陰性対照は、例えば、天然の野生型受容体の発現を欠く細胞（例えば、空の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞、野生型ベクターでトランスフェクトされた細胞、または構成的活性が無いことが以前に証明されている異なる受容体でトランスフェクトされた細胞）である（好ましくは、空の発現ベクターおよび野生型ベクターの両方が用いられる）。または、本発明は、変異により誘導された構成的に活性のある受容体を同定する方法を提供する。好ましくは、変異により誘導された構成的に活性のある受容体は、治療上対象となる受容体である。本発明によれば、変異により誘導された構成的に活性のある受容体は、（１）構成的に活性のない野生型受容体と１つまたはそれ以上の構成的に活性のある受容体との間の相同性領域を同定する段階；（２）同定された相同性領域に基づいて構成的に活性のない受容体の１つまたはそれ以上の領域に変異を導入する段階；および（３）変異受容体を構成的活性についてアッセイする段階によって系統立って同定することができる。これらの段階のそれぞれを達成する方法は以下で詳細に説明される。
【００３９】
当業者は、当技術分野において標準的な任意のランダム変異誘発法によって変異を導入できることを理解すると思われる。実際に、様々なランダム変異誘発キットが市販されている。同定されたら、受容体の構成的活性は、例えば、哺乳動物発現系、特に、酵母発現系を用いて確かめることができる。
【００４０】
当業者により理解されるように、非常に多くの構成的に活性のある受容体（天然に生じる受容体および天然に生じない受容体）が以前に同定されている。このような受容体は、さらなる構成的に活性のある受容体を同定するために使用できる多くの情報を提供する。前記の段階（１）を完了するために、野生型受容体および変異受容体を含む、利用可能な核酸配列および／またはアミノ酸配列の情報（好ましくは、アミノ酸配列の情報）をまとめて、構成的に活性のある受容体配列のデータベースを作成する。次に、ある特定の治療上対象となる構成的に活性のない受容体（任意のオーファン受容体を含む）（例えば、アゴニストの受容体であることが知られている受容体）と１つまたはそれ以上の構成的に活性のある受容体との間で保存されている領域を同定するために、構成的に活性のない受容体の配列と、データベースの構成的に活性のある受容体の多くの配列を比較する。本発明は、構成的に活性のあるクラスＩ Ｇタンパク質共役受容体の大規模なデータベース（図１を参照のこと）を作成することによって段階（１）を証明する。当業者は、他のタイプの受容体分子（例えば、クラスＩＩ Ｇタンパク質共役受容体）について、さらなるデータベースを容易に作成できることを理解すると思われる（ジュプナー（Ｊｕｐｐｎｅｒ）ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．３（４）：３７１−３７８、図１、ｐ３７３（１９９４）を参照のこと）。データベースはまた多型受容体についても作成することができる。
【００４１】
段階（２）を完了するために、構成的に活性のない受容体と１つまたはそれ以上の構成的に活性のある受容体との間の同定された相同性領域に基づいて、構成的に活性のない野生型受容体における特定の残基を変異の対象とする。この残基は、構成的活性を構成的に活性のない受容体に付与する可能性が高い。例えば、構成的に活性のない受容体と構成的に活性のある受容体との間の相同性領域が１つを除く全てのアミノ酸において同一であると確かめられれば、構成的に活性のない受容体の保存領域を構成的に活性のある受容体の保存領域と同一にするように、構成的に活性のない受容体に変異が導入される。または、構成的に活性のない受容体と構成的に活性のある受容体との間で保存されている領域が高度のアミノ酸類似性を示せば、受容体を構成的に活性にするように、相同性の程度および当業者の知識に基づいて、可能性の高い対象となる変異の一続きが構成的に活性のない受容体に導入される。別の例として、構成的に活性のない受容体は、ある特定の１つまたはそれ以上の変異の導入によって構成的に活性にされたことのある別の構成的に活性のない受容体と相同性領域を有することがある。この場合、同じ変異または類似する変異が特定の構成的に活性のない受容体に導入される。
【００４２】
または、治療上対象となる天然に生じる受容体と１つまたはそれ以上の構成的に活性のある受容体との間の相同性領域を同定するために、データベースが用いられる。同定された相同性領域があれば、当業者は、天然に生じる受容体を構成的活性について試験すると思われる。
【００４３】
出願人らは、構成的に活性のない受容体における特定の残基を変異の対象とするために、段階（１）において作成された構成的に活性のあるクラスＩ Ｇタンパク質共役受容体のデータベース（図１）を使用することによって段階（２）を証明する。簡単に述べると、いくつかの構成的に活性のない受容体とデータベースの多数の構成的に活性のあるクラスＩ Ｇタンパク質共役受容体との間で高度に保存された領域が同定された。この情報は、構成的に活性のない受容体における特定の残基を変異の対象とするために用いられた。以下で詳細に説明するように、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体（ＣＣＫ−ＢＲ）、メラノコルチン−４（ＭＣ−４）、およびμオピオイド受容体に、構成的に活性のない受容体に構成的活性を付与する対象とされた点変異が導入された（実施例１、２、および３を参照のこと）。前記の段階（１）および（２）において示したように、相同性領域を変異の対象とする目的で、保存領域を同定するために構成的に活性のない受容体と構成的に活性のある受容体を比較するこの方法は任意の関連受容体ファミリーを用いて繰り返すことができることが理解されると思われる。
【００４４】
段階（３）は、変異受容体の基礎活性増加をアッセイすることによって、変異受容体を構成的活性についてアッセイすることを含む。本発明は、特定の受容体によるシグナル伝達に応答する応答エレメントが転写プロモーターと共にレポーター遺伝子に取り付けられたレポーターアッセイ系を提供する。詳細に述べると、レポーター遺伝子の発現は、選択された受容体の活性によって制御される。この方法は、（１）（例えば、受容体活性化による遺伝子発現の増加または減少の誘発によって）特定の受容体ポリペプチドによるシグナル伝達に対して感受性の応答エレメントを同定する段階；（２）応答エレメントおよびプロモーター（プロモーターが応答エレメントに含まれない場合）をレポーター遺伝子に機能的に連結する段階；および（３）推定上の構成的に活性のある受容体の基礎レベルレポーター活性と陰性対照の基礎レベルレポーター活性を比較する段階を含み、陰性対照と比較した基礎レベルレポーター活性の増加によって、構成的に活性のある受容体が同定される。好ましくは、基礎活性の増加は、陰性対照の基礎活性の少なくとも２倍、好ましくは３倍、最も好ましくは少なくとも６倍である。好ましい態様において、このアッセイ系は、構成的活性を示す変異受容体をスクリーニングするのに用いられる。
【００４５】
受容体は、構成的に活性のある受容体の候補として同定された任意の受容体でよいことが理解されると思われる。さらに、当業者は、この応答アッセイ法において用いられる応答エレメントが、同定された構成的に活性のある受容体の候補によるシグナル伝達に対して感受性の任意の応答エレメントでよいことを理解するだろう。例えば、異なるＧタンパク質と共役する構成的に活性のある受容体を同定するためのレポーターアッセイ法では、Ｇタンパク質と共役する受容体によるシグナル伝達に対して感受性の応答エレメントを選択する。特定の例では、ソマトスタチンプロモーターエレメント（ＳＭＳ）は、受容体とＧαｑまたはＧαｓを共役させることによって活性化され、血清応答エレメント（ＳＲＥ）はＧαｑとの受容体共役によって活性化され、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）はＧαｓとの受容体共役によって活性化され、Ｇαｉとの共役によって阻害され、ＴＰＡ応答エレメント（ホルボールエステル感受性）はＧαｑとの受容体共役によって活性化される。特定のＧタンパク質共役受容体の基礎レベル活性を測定するために、これらのどの応答エレメントもレポーターアッセイ法において使用することができる。
【００４６】
さらに、受容体シグナル伝達を検出するためのレポーター構築物は、特定の受容体によるシグナル伝達に対して感受性のプロモーターである応答エレメントを含んでもよい。Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達を検出するために、例えば、表皮増殖因子、ガストリン、またはｆｏｓをコードする遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子に機能的に連結することができる。
【００４７】
特定の受容体によるシグナル伝達により誘導された様々な任意のシグナル伝達経路（例えば、セカンドメッセンジャーシグナル伝達経路）に対して感受性のある、様々なレポーター構築物を作成できることが理解されるだろう。従って、このアッセイ系は、単に、特定の受容体に対して感受性の応答エレメントを選択し、レポーター構築物においてレポーター遺伝子の上流に応答エレメントを配置することによって、一回膜貫通受容体または核受容体の受容体を含む他のタイプの構成的に活性のある受容体を同定するのに使用することができる。レポーター遺伝子発現を得るために、例えば、エレメントＡＰ−１、ＮＦ−κｂ、ＳＲＦ、ＭＡＰキナーゼ、ｐ５３、ｃ−ｊｕｎ、ＴＡＲＥの全てをレポーター遺伝子の上流に配置することができる。プロモーターエレメントを含むさらなる応答エレメントは、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）カタログ（ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ（登録商標）ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＭａｎｕａｌまたはＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ（登録商標）ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｔｒａｎｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，ストラタジーン，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に見られる。
【００４８】
１つの好ましい態様において、本発明は、（１）レポーター遺伝子に機能的に連結された、特定のＧタンパク質によるシグナル伝達に感受性の応答エレメントおよびプロモーターを含むレポーター構築物を、好ましくは（２）受容体をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクターと共に含む、Ｇタンパク質共役レポーターアッセイ系を提供し、ここで、受容体はＧタンパク質または他の下流メディエーターと共役しており、これらに対して、選択された応答エレメントは感受性がある。
【００４９】
本発明は、Ｇαｑ、Ｇαｓ、およびＧαｉのそれぞれを介したシグナル伝達に対して感受性の特定の応答エレメントの使用を証明する。例えば、ＳＭＳおよびＳＲＥ応答エレメントはそれぞれ、Ｇαｑと共役するＬｅｕ３２５Ｇｌｕ ＣＣＫ−ＢＲ変異受容体の基礎活性の増加を検出する（図２を参照のこと）。
【００５０】
同様に、構成的に活性のあるラットμオピオイド受容体が、Ｇαｉ共役に対して感受性のレポーター構築物を用いて同定された（図３を参照のこと）。このアッセイ法において用いられた応答エレメントは、Ｇαｉを介した細胞内ｃＡＭＰ濃度変化に対して感受性のｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）であった。Ｇαｉを介したラットμオピオイド受容体によるシグナル伝達はアデニル酸シクラーゼを阻害し、細胞内ｃＡＭＰを減少させる。従って、ラットμオピオイド受容体シグナル伝達の増加は、ＣＲＥを介したレポーター活性の減少を誘導する。
【００５１】
本発明の前に、（１）アデニル酸シクラーゼの受容体非依存性活性化を引き起こし、ｃＡＭＰの細胞内プールを生じさせるフォルスコリンで、細胞を刺激し；（２）リガンドで細胞を刺激し；（３）（例えば、ラジオイムノアッセイ法（例えば、ニューイングランドニュークリアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ），Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて）リガンドにより誘導され受容体依存性の、Ｇαｉを介した細胞内ｃＡＭＰプール減少を測定することによって、Ｇαｉを介した細胞内ｃＡＭＰ減少が測定された。本明細書で証明されたように、本発明のアプローチは、構成的に活性のあるラットμオピオイド受容体を同定することができた（図３）。詳細に述べると、ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター構築物（ストラタジーン，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および野生型または変異体のラットμオピオイド受容体のいずれかをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を、細胞内ｃＡＭＰプールを増加させるために０．５μＭまたは２μＭフォルスコリンで刺激した。次いで、標準的なルシフェラーゼアッセイ法を用いて、受容体活性の基礎レベル（およびリガンド誘導レベル）を測定した（図３を参照のこと）。関心対象の受容体とルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物との同時発現によって、基礎シグナル伝達の測定値として発光を測定することが可能になる。
【００５２】
図３に示した結果は、野生型ラットμオピオイド受容体と比較したラットμオピオイド変異受容体における基礎活性の低下を示す。この活性減少は、ラットμオピオイド変異受容体の基礎レベル活性の増加を示している。なぜなら、ラットμオピオイド受容体の活性化は、ＣＲＥを介したレポーター活性の減少を誘導するからである（図３、０．５μＭ野生型と０．５μＭ変異体を比較のこと）。ラットμオピオイド受容体の構成的活性レベルが、野生型受容体のリガンド刺激活性レベルに近いことに注目することが重要である。
【００５３】
本発明のアッセイ法を使用してＧαｉ共役を直接測定することは成功したが、これにはいくつかの不都合がある。第１に、Ｇαｉを介したｃＡＭＰ阻害の検出には、アデニル酸シクラーゼに対するフォルスコリンの同時に起こる正の効果を克服することが必要である。例えば、図４は、同時トランスフェクトされる受容体タンパク質の非存在下でのＣＲＥ−Ｌｕｃの応答に対する、ＨＥＫ２９３細胞におけるフォルスコリンの正の効果を示している。さらに、リガンドで刺激された細胞内ｃＡＭＰ減少の検出は、細胞の十分な大きな割合が首尾よく受容体分子でトランスフェクトされ、受容体分子を発現するかどうかに依存している。さらに、安定にトランスフェクトされた細胞株の代わりに一過的トランスフェクションアッセイ法を使用する場合、実験ごとにトランスフェクトされる細胞の割合が制御しにくいので、実験間の変化が生じる。
【００５４】
Ｇαｉ共役のポジティブアッセイ法（すなわち、受容体活性化によってルシフェラーゼ活性が減少するネガティブアッセイ法ではなく、受容体活性化によってルシフェラーゼ活性が増加するアッセイ法）によって、より検出可能なアウトプットシグナルが得られ、アッセイ間の変化が小さくなる。Ｇαｉ共役は、Ｇαｉ共役受容体によって生じるシグナル伝達経路を変えることによって検出することができると仮説を立てた。Ｇαｉからの５つのＣ末端アミノ酸がＧαｑのＣ末端に取り付けられた全Ｇαｑタンパク質を含むキメラＧタンパク質（Ｇｑ５ｉ）（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）およびトーナー（Ｔｈｏｒｎｅｒ），Ｎａｔｕｒｅ ３８４（補遺）：１４−１６（１９９６））が作成されている。このキメラＧタンパク質はＧαｉ共役受容体によってＧαｉとして認識されるが、受容体誘導シグナル伝達をＧαｉからＧαｑに切り換える。これによって、Ｇαｑ応答性ＳＭＳ−ＬｕｃまたはＳＲＥ−Ｌｕｃ構築物（ストラタジーン，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いたポジティブアッセイ法を用いてＧαｉ受容体共役を検出することが可能になる。ＳＭＳおよびＳＲＥは、好ましくは、Ｇαｑを介したイノシトールおよびカルシウムの産生に応答する。さらに、細胞をフォルスコリンで前刺激することなく検出することができる。
【００５５】
本発明の方法に従って使用することができる他のキメラＧタンパク質は、付録１（Ｇタンパク質ユーザーズマニュアル、ｈｔｔｐ：／／ｇｗｅｂｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｌａｂｓ／Ｃｏｎｋｌｉｎ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ＧｐｒｏｔｅｉｎＭａｎｕａｌ．ｈｔｍｌ）に示されたものを含み、参照として本明細書に組み入れられるミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ），Ｇ．およびＳ．リーズ（Ｒｅｅｓ），ＴＩＰＳ ２０：１１８−１２４，１９９９ならびにコンクリン（Ｃｏｎｋｌｉｎ）ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：２７４−２７６，１９９３で述べられている。さらに、Ｇタンパク質（例えば、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｚ、またはＧｏ）のカルボキシル末端からの少なくとも３アミノ酸、通常少なくとも５アミノ酸を、完全長であるか、またはアミノ末端アミノ酸の少なくとも５０％を含む第２のＧタンパク質（例えば、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｚ、またはＧｏ）に置換または付加することによって、他の任意のキメラＧタンパク質を構築することができる。
【００５６】
一般的に、Ｇαタンパク質サブユニットのカルボキシル末端は受容体特異性の重要な決定要因である。例えば、Ｇｑαサブユニット（αｑ）は、そのカルボキシル末端を対応するＧｉ２α、Ｇｏα、またはＧｚα残基で置換することによってＧｉα共役受容体に応答するように作成することができる。さらに、Ｇｑα／ＧｉαキメラのＣ末端変異は重要なアミノ酸が−３および−４の位置にあることを示し、ＧｑαとＧｓαとのカルボキシル末端の交換はそのＣ末端残基に特有の受容体による活性化を可能にする。さらに、Ｇｑαの５つのカルボキシル末端アミノ酸をＧｓα配列で置換することによって、ある特定のＧｓα共役受容体がホスホリパーゼＣを刺激できるようになった（Ｖ２バソプレッシン受容体はホスホリパーゼＣを刺激できたが、β２−アドレナリン作動性受容体は刺激できなかった）。Ｇｓαの５つのカルボキシル末端アミノ酸をＧｑα残基で置換することによって、ある特定のＧｑα共役受容体がアデニルシクラーゼを刺激できるようになった（ボンベシンおよびＶ１ａバソプレッシン受容体はアデニルシクラーゼを刺激できたが、オキシトシン受容体は刺激できなかった）。従って、新たな受容体への共役を可能にするためのＧαカルボキシル末端の相対的な重要性は、対になる受容体によって左右される。
【００５７】
図５において証明されたように、Ｇｑ５ｉは、ラットμオピオイド受容体とＧαｉとの共役を検出するのに使用することができる。図５は、ＳＭＳのみまたはＳＲＥのみを有するルシフェラーゼ構築物を用いて、リガンド刺激に応答したリガンド刺激ルシフェラーゼ活性が検出されないが（左から２つのカラム）、ＳＲＥ−ＬｕｃとＧｑ５ｉを用いて、リガンド刺激ルシフェラーゼ活性の大きな増加が検出されること（最も右のカラム）を示している。このアッセイ法はまた、Ａｓｎ１５０Ａｌａラットμオピオイド変異受容体の構成的活性を測定するのにも用いられた（図６）。
【００５８】
シグナル伝達をあるＧタンパク質共役受容体から別の経路に切り換えることができる他の任意のＧタンパク質キメラも本発明に従って使用することができる。
【００５９】
適用
１つの好ましい態様において、本発明のスクリーニングアッセイ法によって同定された構成的に活性のある受容体は、ある特定の受容体のリガンド（ペプチド、非ペプチド、および低分子リガンドを含む）を同定するツールとして用いられる。例えば、特定の構成的に活性のある受容体に結合するリガンド（例えば、ホルモンまたは薬物）は、（１）受容体活性化に対して感受性の応答エレメントおよびプロモーターをレポーター遺伝子に機能的に連結して、受容体活性化に対して感受性のレポーター構築物を作成し；（２）細胞を、レポーター構築物および構成的に活性のある受容体をコードする核酸を含む発現ベクターと同時トランスフェクトし；（３）細胞とリガンドを接触させ；（４）レポーター構築物のリガンド依存性活性化または阻害をアッセイすることによって、レポーターアッセイ系を用いて同定することができる。リガンド非依存性のシグナル伝達と比較したリガンド依存性活性化の増加または減少によって、それぞれアゴニストまたはインバースアゴニストが存在することが分かる。受容体活性を増加または減少させることによって特定の受容体を活性化または阻害するリガンドは、さらなる実験によって、疾患を治療するための価値のある治療薬であることが判明する可能性がある。
【００６０】
さらに別の好ましい態様において、特定の受容体によって生じる基礎シグナルまたはリガンド刺激シグナルを変える（すなわち、増加または減少させる）遺伝子多型または変異をスクリーニングするために、本発明のアッセイ系を使用することができる。１つの特に好ましい態様において、同定された多型または変異は、アゴニスト非依存性のシグナル伝達（特に、疾患を引き起こす可能性のあるアゴニスト非依存性のシグナル伝達）をもたらす。または、同定された多型または変異は、薬物に対する応答の変化をもたらす。別の好ましい態様において、（例えば、高感受性受容体を同定することによって）変異により誘導された、リガンド結合に対する受容体の感受性を検出するために、本発明のアッセイ系を使用することができる。薬理ゲノミクスの出現によって、機能的に重要な多型または変異の迅速なスクリーニング法は非常に価値がある。実際に、任意の変異受容体または多型受容体を発現ベクターに配置し、本発明のアッセイ系において使用することができる。
【００６１】
別の好ましい態様において、構成的に活性のあるオーファン受容体（野生型または変異体）に適用する場合、内因性受容体リガンドによって活性化されるセカンドメッセンジャー経路（例えば、ｃＡＭＰ、イノシトールリン酸の産生）を予想するために、異なるシグナル伝達経路に対して感受性のレポーター遺伝子構築物のパネル（例えば、ＳＲＥ−Ｌｕｃ、ＳＭＳ−Ｌｕｃ、およびＣＲＥ−Ｌｕｃ）を使用することができる。この情報は、本発明のハイスループットスクリーニングに基づく技法の使用によるコグネイト内因性リガンドの同定（すなわち、受容体のデオーファニング（ｄｅ−ｏｒｐｈａｎｉｎｇ））およびオーファン受容体に作用する薬物の発見を容易にし、促進する。
【００６２】
関連する態様において、本発明は、Ｇタンパク質を同定するための新規のアッセイ系を提供する。このＧタンパク質と特定の受容体は、Ｇαｑ、Ｇαｓ、またはＧαｉを介したシグナル伝達に応答するレポーター構築物の形で共役している。１つの好ましい態様において、本発明は、特定の受容体が、どのＧタンパク質（Ｇαｑ、Ｇαｓ、およびＧαｉから選択される）と共役しているかを確かめることができるレポーター構築物のパネルを提供する。このアッセイ系は、（１）レポーター遺伝子に機能的に連結された、特定のＧタンパク質（Ｇαｑ、Ｇαｓ、およびＧαｉから選択される）に対して感受性の応答エレメントならびにプロモーターを含むレポーター構築物のパネル；（２）Ｇタンパク質共役受容体をコードする発現ベクター；ならびに（３）（１）および（２）の成分が送達される細胞を必要とする。
【００６３】
別の好ましい態様において、本発明は、受容体が共役しているＧタンパク質を同定する方法を提供する。この方法は、（１）Ｇタンパク質共役受容体を選択する段階；（２）選択されたＧタンパク質共役受容体をコードする発現ベクターと、（前記のような）Ｇαｑ、Ｇαｓ、またはＧαｉとの共役を検出することができるレポーターアッセイ法のパネルを使用する段階；および（３）リガンド刺激に応答して各アッセイ法により生じたシグナルを比較する段階を含み、あるレポーターアッセイ法においてレポーター活性が増加し、他の２つのレポーターアッセイ法において増加していなければ、レポーターアッセイ法が感受性を示したＧタンパク質と共役していることが分かる。特に好ましい応答エレメントの中にはＳＭＳ、ＳＲＥ、およびＣＲＥも含まれる。ある特定の好ましい態様において、レポーターアッセイ法は、受容体のシグナル伝達を野生型受容体とは異なる経路に切り換えることができるキメラＧタンパク質をさらに含む。好ましくは、このシグナル伝達経路は、レポーターアッセイ法において負のシグナルではなく正のシグナルを生じる。１つの特に好ましいキメラＧタンパク質は、前記のキメラＧタンパク質Ｇｑ５ｉ（ブローチおよびトーナー，前記）である。
【００６４】
μオピオイド受容体
本発明によれば、臨床上有用な構成的に活性のある受容体をコードする核酸が同定される。本発明者らは、構成的に活性のあるμオピオイド受容体を同定することによって本発明のこの局面を証明する。
【００６５】
μオピオイド受容体は、Ｇタンパク質共役７回膜貫通ドメイン神経ペプチド受容体ファミリーに含まれるオピエート受容体である。一般的に、オピエート受容体（μ（ｍｕ）、κ、δ、およびオピエート様受容体（ＯＬＲ）を含む）はグアニンヌクレオチド結合（Ｇ）タンパク質と共役している（リー（Ｌｉ）ら，前記）（図１２および図１３を参照のこと）。例えば、オピエートはＧＴＰ加水分解を変化させることができ、ＧＴＰ類似体および百日咳毒素はオピエート受容体結合を変化させることができ、オピエートはＧタンパク質共役セカンドメッセンジャー系およびイオンチャンネルに影響を及ぼすことができる。さらに詳細に述べると、μオピオイド受容体は、モルヒネならびに他のオピエート薬物およびペプチドに対して特徴的な高親和性を有する。モルヒネとμオピオイド受容体との結合は、オピエート薬物に共通して見られる鎮痛作用および多幸感作用をもたらす。
【００６６】
１つの点変異（アミノ酸１５０位でのＡｓｎからＡｌａへの点変異）が、ラットμオピオイド受容体（配列番号：１）の３番目の膜貫通領域に導入された。このＡｓｎ残基は、μオピオイド受容体、ブラジキニンＢ２受容体、およびアンギオテンシンＩＩ ＡＴ１Ａ受容体の間で高度に保存されていることに基づいて変異の対象となった。さらに、ブラジキニンＢ２およびアンギオテンシンＩＩ ＡＴ１Ａ受容体におけるこの残基での相応する変異は、構成的活性を有する受容体をもたらした。実際に、Ａｓｎ１５０Ａｌａ μオピオイド変異受容体は、リガンド刺激セカンドメッセンジャーシグナル伝達の最大レベルの５０％を超える基礎活性レベルを示した（実施例１を参照のこと）。
【００６７】
実施例
以下の限定しない実施例を考慮することによって、本発明をさらに理解することができる。
【００６８】
実施例１：構成的に活性のあるμオピオイド受容体
本実施例は、新規の構成的に活性のあるラットμオピオイド受容体の同定について説明する。
【００６９】
μオピオイド受容体における相同性領域の同定
既知の構成的に活性のあるクラスＩ Ｇタンパク質共役受容体についての配列情報を含むデータベースを、先行技術から入手可能な情報をまとめることによって作成した（図１を参照のこと）。次いで、データベースを使用して、構成的活性に重要な、クラスＩ Ｇタンパク質共役受容体内の重要な残基を同定した。これらの高度に保存された残基を図８に示す。特に関心のあるものは、ラットμオピオイド受容体、ブラジキニンＢ２受容体、およびアンギオテンシンＩＩ ＡＴ１Ａ受容体の間で保存されている、膜貫通ドメインＩＩＩにある配列番号：１の１５０位のＡｓｎ残基であった（図８を参照のこと）。配列番号：１の１６４〜１６６位の「ＤＲＹ」モチーフは、オキシトシン受容体、バソプレッシン−Ｖ２受容体、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）受容体、メラノコルチン−４（ＭＣ−４）受容体、およびα１Ｂアドレナリン作動性受容体の間で保存されている（図９を参照のこと）。さらに、ＣＷＬＰモチーフの１３残基および２０残基Ｎ末端側に対応する位置は、１Ａアドレナリン作動性受容体、α２Ｃアドレナリン作動性受容体、β２アドレナリン作動性受容体、ＣＣＫ−Ｂ受容体、血小板活性化因子受容体、および甲状腺刺激ホルモン受容体の間で保存されている（図１１を参照のこと）。
【００７０】
μオピオイド変異受容体の作成
配列番号：１の１５０位のＡｓｎ残基でのμオピオイド受容体、ブラジキニンＢ２、およびアンギオテンシンＩＩ ＡＴ１Ａ受容体間の相同性に基づいて、本発明者らは、この位置で点変異を有するラットμオピオイド受容体を作成することにした。標準的な分子生物学的技法を用いて、Ａｓｎ１５０Ａｌａ変異をラットμオピオイド受容体に導入した。次いで、この変異遺伝子を発現ベクターｐｃＤＮＡ１（サンブルックら，前記）にサブクローニングした。
【００７１】
構成的活性についてのμオピオイド変異受容体のアッセイ法
試薬および溶液：以下に記載のアッセイ法において使用した細胞培地はギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）番号１２１００−０４６であった。この培地を製造業者の配合法に従って作成し、ｐＨを７．２に調節し、濾過し（０．２２ミクロン孔）、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ギブコ番号１５１４０−１２２；１００％ペニシリンＧ １０，０００単位／ｍｌおよびストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍｌ）ならびに１０％胎児ウシ血清を添加した。１０％胎児ウシ血清を含まない細胞培地も作成した。トランスフェクション実験において使用するＤＮＡを精製し、ＯＤ２６０での吸光度を測定することで定量した。ルシフェラーゼ活性を定量するために、ＬｕｃＬｉｔｅルシフェラーゼアッセイキット（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ））を使用した。トランスフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｒｅａｇｅｎｔ（ギブコ番号１８３２４−０１２）を用いて行った。
【００７２】
Ａｓｎ１５０Ａｌａラットμオピオイド変異受容体の構成的活性を、ルシフェラーゼアッセイ法を用いて評価した。ラットμオピオイド受容体はＧαｉ共役受容体である。従って、本発明者らは、信頼性の高い正の測定値のためにシグナル伝達経路をＧαｉからＧαｑに切り換える前記で詳細に述べたＧｑ５ｉレポーター系（ブローチおよびトーナー，前記）を使用することにした。ＨＥＫ２９３細胞を、レポーター構築物ＳＲＥ−Ｌｕｃ、Ｇｑ５ｉをコードする核酸を含む発現ベクター（ブローチおよびトーナー，前記）、ならびに野生型またはＡｓｎ１５０Ａｌａ変異体のラットμオピオイド受容体のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターでトランスフェクトした。基礎ルシフェラーゼ活性およびリガンド刺激ルシフェラーゼ活性を測定した。このアッセイ法において使用したリガンドは、［Ｄ−Ａｌａ２−ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］エンケファリン］（ＤＡＭＧＯ）であった。陰性対照として、ＨＥＫ２９３細胞を、ｐｃＤＮＡ１（空のベクターＤＮＡ）、ＳＲＥ−Ｌｕｃ、およびＧｑ５ｉをコードする核酸を含む発現ベクター（ブローチおよびトーナー，前記）でトランスフェクトした。
【００７３】
ルシフェラーゼアッセイ法を以下のように行った。１日目に、Ｔ７５フラスコ中のＨＥＫ２９３細胞を無血清培地（またはＰＢＳ）１５ｍｌで洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコ番号２５３００−０６２）５ｍｌでトリプシン処理し、３７℃で３分間インキュベートし、この時、ＨＥＫ２９３完全培地（ギブコ番号１２１００−０４６）および１０％胎児ウシ血清（インテルゲン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）番号１０５０−９０）６〜７ｍｌを添加した。その後、細胞を５０ｍｌ遠心管に集め、８００〜９００ｒｐｍ（ＲＣＦ−２７５）でペレット化し、完全培地２０ｍｌに再懸濁した。細胞を血球計を用いて計数し、完全培地で８５，０００細胞／ｍｌに希釈した。リピートピペッターまたはセルプレーターを用いて、細胞１００μｌをＰｒｉｍａｒｉａ ９６ウェルプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）番号３５３８７２）の各ウェルに添加した。次いで、細胞を、４８時間で使用するまで３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【００７４】
３日目に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）を用いて製造業者のプロトコールに従って（ギブコ番号１８３２４−０１２，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、細胞をトランスフェクトした。
【００７５】
４日目に、細胞を以下のように刺激した。受容体のリガンド（ＤＡＭＧＯまたは非ペプチドリガンド（例えば、ナルトレキセンまたはナロニン））を、０．１５ｍＭ ＰＭＳＦ（または他のプロテアーゼ阻害剤）を含む無血清培地で望ましい濃度まで希釈した。次いで、トランスフェクション培地を細胞から完全に除去し、刺激培地（すなわち、候補リガンドを含む培地または対応するリガンドを含まない溶媒）５０〜１００μｌを各ウェルに添加した。細胞を、望ましい時間（標準は一晩である）、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートしたが、最適の刺激時間は、使用する特定の受容体に応じて異なってもよい。最適インキュベーション時間は、インキュベーション時間の範囲を試験し、どのインキュベーション時間が最高レベルの刺激をもたらすかを確かめることによって系統立って決定することができる。２種類のリガンド（例えば、フォルスコリン刺激ＣＲＥ活性のリガンド誘導阻害）を同時に評価するために、各刺激剤を望ましい最終濃度の２倍の濃度で調製し、細胞に添加する前に等量で混合した。
【００７６】
５日目に、ルシフェラーゼ発現についてのアッセイ法を製造業者の説明書（パッカード，Ｍｅｒｉｄｉｎ，ＣＴ）に従って行った。
【００７７】
結果：μオピオイド受容体
配列番号：１の１５０位のＡｓｎ残基をＡｌａに変異させることによって、構成的に活性のあるラットμオピオイド受容体が得られた。図６および以下の表１において、野生型およびＡｓｎ１５０Ａｌａ変異体のラットμオピオイド受容体の結果を横に並べて比較した。野生型ラットμオピオイド受容体の基礎活性は、陰性対照ベクター（コード遺伝子が全く無いｐｃＤＮＡ１）の基礎活性に近い。対照的に、Ａｓｎ１５０Ａｌａ μオピオイド変異受容体の基礎活性は著しく増加しており（約６．５倍）、これはμオピオイド変異受容体が構成的に活性であることを示している。
【００７８】
【表１】
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＊基礎レベル活性の６．５倍の刺激
【００７９】
実施例２：コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体（ＣＣＫ−ＢＲ）
本実施例は、ベインボルン（Ｂｅｉｎｂｏｒｎ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２３）：１４１４６−１４１５１（１９９８）およびベインボルンら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１０，（補遺）Ａ１０５９）（１９９６））から採用された構成的に活性のあるＣＣＫ−ＢＲ受容体の同定について説明する。さらに、本実施例は、ＣＣＫ−ＢＲ変異体の構成的活性の検出における本発明のアッセイ法の成功を証明する。
【００８０】
相同性領域の同定およびＣＣＫ−ＢＲ変異受容体の作成
ヒトＣＣＫ−ＢＲの３番目の細胞内ループの分子的特徴付けによって、構成的ＣＣＫ−ＢＲ活性をもたらす点変異（Ｌｅｕ３２５Ｇｌｕ）が同定された（ベインボルンら，前記（１９９６）を参照のこと）。簡単に述べると、このストラテジーは、異なるセカンドメッセンジャー共役を有する関連ポリペプチド間のドメイン交換によって、基礎活性が増加した受容体を得ることができるという理論に基づいた。ＣＣＫ−ＢＲの３番目の細胞内ループにおいて、４〜５アミノ酸からなるセグメントを、ＣＣＫ−ＢＲと３０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質であるバソプレッシン２受容体からの対応する配列で置換した。しかしながら、これらのタンパク質は異なるシグナル伝達経路と共役している。ＣＣＫ−ＢＲはホスホリパーゼＣ活性化と共役しているが、バソプレッシン２受容体は、最も優勢なシグナル伝達経路としてアデニルシクラーゼと共役している（ベインボルンら，前記（１９９６））。
【００８１】
構成的活性についてのＣＣＫ−ＢＲ変異受容体のアッセイ法
ベインボルンらに記載のように、組換え受容体をＣＯＳ−７細胞において一過的に発現させ、１２５Ｉ ＣＣＫ−８競合結合実験によってリガンド親和性を評価した。さらに、ホスホリパーゼＣを介したイノシトールリン酸産生を、アゴニストの非存在下および存在下で測定した。バソプレッシン２受容体からのブロック置換体の１つである２５０ＡＨＶＳＡは、ＣＣＫ−ＢＲの３番目の細胞内ループの対応する領域に導入された時、アゴニスト非依存性構成的活性を付与した。ＣＣＫ−ＢＲ変異体は、野生型ＣＣＫ−ＢＲと比較して１０倍高いイノシトールリン酸基礎代謝回転を引き起こした。同じセグメント内での２５３ＳＡ置換、および２５３Ｓ置換だけでも構成的活性を付与するのに十分であった（ベインボルンら（要約）前記（１９９６））。
【００８２】
さらなる研究をベインボルンら（前記（１９９８））に記載のように行った。特に、Ｌｅｕ３２５Ｇｌｕ ＣＣＫ−ＢＲ変異体は、野生型ＣＣＫ−ＢＲを上回るレベルまでイノシトールリン酸の構成的産生を引き起こした（ベインボルンら，図１Ａ前記（１９９８））。簡単に述べると、ヒト野生型ＣＣＫ−ＢＲおよび構成的に活性のあるＬｅｕ３２５Ｇｌｕ ＣＣＫ−ＢＲ変異体をＣＯＳ−７細胞において一過的に発現させた。対照細胞（「受容体なし」）は空の発現ベクターｐｃＤＮＡ１でトランスフェクトされた。細胞を［３Ｈ］ミオイノシトールで予め標識し、次いで、１０ｍＭ ＬｉＣｌの存在下でリガンドで３０分間刺激した。構成的に活性のあるＣＣＫ−ＢＲ変異体は、アゴニストの非存在下でイノシトールリン酸産生を引き起こす能力によって野生型受容体とはっきりと区別された。
【００８３】
本発明のアッセイ法を使用して、Ｌｅｕ３２５Ｇｌｕ ＣＣＫ−Ｂｒ変異体の構成的活性を首尾よく検出できることを証明するために、本発明者らは、Ｌｅｕ３２５Ｇｌｕ ＣＣＫ−Ｂｒ変異体の構成的活性を測定するためにルシフェラーゼアッセイ法を行った。（前記のように）ＨＥＫ２９３細胞を、ＳＭＳ−ＬｕｃおよびｐｃＤＮＡ１、野生型ＣＣＫ−ＢＲ、またはＬｅｕ３２５Ｇｌｕ ＣＣＫ−ＢＲのいずれか１つをコードする発現ベクターでトランスフェクトした。図２の左パネルにおいて証明したように、Ｌｅｕ３２５Ｇｌｕ ＣＣＫ−ＢＲ変異体は、野生型ＣＣＫ−ＢＲと比較して基礎レベル活性を増加させた。
【００８４】
実施例３：構成的に活性のあるメラノコルチン−４受容体
本実施例は、構成的に活性のあるメラノコルチン−４（ＭＣ−４）受容体の同定について説明する。
【００８５】
相同性領域の同定およびＭＣ−４変異受容体の作成
図９に示すように、「ＤＲＹ」モチーフは、クラスＩ Ｇタンパク質共役オキシトシン、バソプレッシン−Ｖ−２、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）、メラノコルチン−４（ＭＣ−４）、およびα１Ｂアドレナリン作動性受容体の間で保存されている（図９）。この相同性と、ＤＲＹモチーフ内のアスパラギン酸置換が構成的に活性のあるオキシトシン、バソプレッシンＶ−２、ＣＣＫ−Ａ、およびα１Ｂ受容体をもたらすという前例に基づいて、本発明者らは、ＭＣ−４の１４６位のＤ（Ａｓｐ）残基を非荷電残基で置換することによって、構成的に活性のある受容体が得られると仮説を立てた（ＭＣ−４配列は、ゲンバンクアクセッションがＬ０８６０３であるので入手可能である）。日常的な方法を用いて、Ａｓｐ１４６Ｍｅｔ ＭＣ−４変異受容体を作成した。
【００８６】
構成的活性についてのＭＣ−４変異受容体のアッセイ法
図１０において証明したように、本発明のアッセイ法は、Ａｓｐ１４６Ｍｅｔ ＭＣ−４変異受容体の構成的活性を検出することができた。簡単に述べると、前記のように、ＨＥＫ２９３細胞を、野生型ＭＣ−４受容体またはＡｓｐ１４６Ｍｅｔ ＭＣ−４変異受容体のいずれかをコードする発現ベクターおよびレポーター構築物ＳＭＳ−Ｌｕｃと同時トランスフェクトした。陰性対照として、細胞をＳＭＳ−ＬｕｃおよびｐｃＤＮＡ１でトランスフェクトした。陰性対照、野生型ＭＣ−４受容体、およびＡｓｐ１４６Ｍｅｔ ＭＣ−４変異受容体の基礎活性およびリガンド（αＭＨＳ）誘導活性を、前記のルシフェラーゼアッセイ法を用いて測定した。Ａｓｐ１４６Ｍｅｔ ＭＣ−４変異受容体は、その野生型対応物より高い基礎レベル活性をはっきりと示した。
【００８７】
他の態様
当業者はまた、本発明のアッセイ法が、構成的に活性のあるＧタンパク質共役受容体の同定に限定されず、他のタイプの受容体（例えば、一回膜貫通受容体および核受容体）の同定に広げることができることも理解するだろう。
【００８８】
本明細書に引用された全ての参考文献が参照として本明細書に組み入れられる。
【００８９】
Ｇタンパク質キメラユーザーズマニュアル
序論
受容体のシグナル伝達表現型を変えることができるＧタンパク質キメラが最初に述べられてから、多くの研究者が、Ｇタンパク質キメラが様々な研究目的に有用であることを発見している。Ｇｉ共役受容体を研究する数人の研究者は、アデニルシクラーゼ阻害よりホスホリパーゼＣ刺激の研究をするのが簡単であることを発見している。いくつかのグループは、変異体またはアゴニスト薬物のスクリーニングに使用することができる迅速な受容体活性化アッセイ法を開発するのにキメラを使用した。他の研究者らは、詳細な構造−機能研究において変異受容体を補完するのにキメラを使用した。
【００９０】
過去４年にわたって、私は６０を超えるキメラ試料を送り出した。このキメラコレクションはだんだんと増加し、エピトープタグ化バージョンが加わることで改良されてきた。この最新情報はキメラを最も効率的に使用するのに役立つはずである。最初のクローンを受け取った多くの人々は、新たなバージョンに更新したいと考えているだろう。
【００９１】
Ｇタンパク質を用いた構造−機能研究
Ｇαタンパク質サブユニットのカルボキシル末端は受容体特異性の重要な決定要因である。我々は、Ｇｑαサブユニット（αｑ）は、そのカルボキシル末端を対応するＧｉ２α、Ｇｏα、またはＧｚα残基で置換することによってＧｉα共役受容体に応答するように作成できることを以前に示している（２）。我々は、最近、これらの発見を以下の３つの点で展開した。１．Ｇｑα／ＧｉαキメラのＣ末端変異は重要なアミノ酸が−３および−４の位置にあることを示している。２．ＧｑαとＧｓαとのカルボキシル末端の交換はそのＣ末端残基に特有の受容体による活性化を可能にする。３．我々は、予想されるＣ末端キメラ（Ｇｑα／Ｇｉα、Ｇｑα／Ｇｓα、Ｇｓα／Ｇｑα）を活性化する受容体または活性化しない受容体を同定している。Ｇｑαの５つのカルボキシル末端アミノ酸をＧｓα配列で置換することによって、Ｇｓα共役受容体がホスホリパーゼＣを刺激できるようになった（Ｖ２バソプレッシン受容体はホスホリパーゼＣを刺激できたが、β２−アドレナリン作動性受容体はホスホリパーゼＣを刺激できなかった）。Ｇｓαの５つのカルボキシル末端アミノ酸をＧｑα残基で置換することによって、ある特定のＧｑα共役受容体がアデニルシクラーゼを刺激できるようになった（ボンベシンおよびＶ１ａバソプレッシン受容体はアデニルシクラーゼを刺激できたが、オキシトシン受容体はアデニルシクラーゼを刺激できなかった）。従って、新たな受容体への共役を可能にするためのＧαカルボキシル末端の相対的な重要性は、対になる受容体によって左右される。これらの研究は、受容体−Ｇα特異性の基礎についての我々の理解を精緻なものにする。最近、Ｇｑαおよび他のＧαサブユニットのＣ末端置換は、Ｇタンパク質共役受容体の新たなアゴニストのハイスループットスクリーニングを開発するのに貢献した（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）Ｊ．Ｒ．およびソーナー（Ｔｈｏｒｎｅｒ）Ｊ．（１９９６）薬物発見のためのハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）Ｎａｔｕｒｅ ３８４（補遺）：１４−１６）。
【００９２】
キメラの概要
キメラについての留意点：
１．全てがｐｃＤＮＡ−１のＢａｍＨＩ／ＮｓｉＩカセットにサブクローニングされている。「ｑ」キメラの親構築物としてｑ４ＷＴを使用し、「ｓ」キメラの親構築物としてＧｓ−ＷＴ−ＨＡを使用した（親構築物の説明については以下を参照のこと）。
２．全てが内部ＨＡエピトープを有する。内部ＨＡエピトープは受容体共役に影響を及ぼさず、（精製モノクローナル抗体としてベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手可能であり、ウェスタンに便利なＨＲＰに直接結合している） １２ＣＡ５抗体による認識を可能にする。
３．構築物は全てｐｃＤＮＡ−１にあり、ＡｍｐおよびＴｅｔ耐性のためにｓｕｐ Ｆ選択を必要とする。これは、ほとんどの研究室において入手可能であるが、インビトロゲンから購入することも可能な（例えば、ｍｃ１０６１／ｐ３）、特殊なコンピテント細菌を必要とする。
【００９３】
・ｑｉ５−ＨＡ：これは、Ｃ末端アミノ酸がＧｑα残基からＧｉα残基に（ＥＹＮＬＶからＤＣＧＬＦに）変えられたＧｑαである。この構築物は、多くのＧｉ共役受容体がホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を刺激するのを可能にする。これは、恐らく「ｑｏ５」または「ｑｚ５」ではなく「ｑｉ５」とＧｉ共役受容体との共役について論じやすいために、最も普及しているキメラである。
ｑｉ５の配列を見るには、ここをクリックする。
【００９４】
・ｑｏ５−ＨＡ：これは、Ｃ末端アミノ酸がＧｑα残基からＧｏα残基に（ＥＹＮＬＶからＧＣＧＬＹに）変えられたＧｑαである。わずかに低い基礎ＰＬＣ活性を有する以外は（理由は分からない）、ｑｉ５と同じように働く。これはシグナル対ノイズ比を増大させることができるので、私は最も多く使用する傾向がある。
ｑｏ５の配列を見るには、ここをクリックする。
【００９５】
・ｑｚ５−ＨＡ：これは、Ｃ末端アミノ酸がＧｑα残基からＧｚα残基に（ＥＹＮＬＶからＹＩＧＬＣに）変えられたＧｑαである。ｑｉ５と同じように働くが、Ｇｚαが天然で実際に何をするのか誰も分かっていないので最も普及していない。ｑｚ５は百日咳毒素に対して感受性がないので、百日咳毒素で処理された細胞においてＧｉ共役受容体により活性化される唯一のＧタンパク質であるかもしれない。この巧みなやり方は、正確なＧタンパク質および活性化される受容体の実験対照が必要とされる場合に実験上有用である可能性がある。特定の受容体について、この構築物は他の構築物よりうまく働くことが理論的に可能であるが、これが起こるのを私は見たことがない。
【００９６】
・ｑｓ５−ＨＡ：これは、Ｃ末端アミノ酸がＧｑα残基からＧｓα残基に（ＥＹＮＬＶからＱＹＥＬＬに）変えられたＧｑαである。この構築物は、一部のＧｓ共役受容体がホスホリパーゼＣを刺激するのを可能にする。
ｑｓ５の配列を見るには、ここをクリックする。
【００９７】
・ｓｑ５−ＨＡ：これは、Ｃ末端アミノ酸がＧｓα残基からＧｑα残基に（ＱＹＥＬＬからＥＹＮＬＶに）変えられたＧｓαである。この構築物は、Ｇｑ共役受容体がアデニル酸シクラーゼを刺激するのを可能にする。今のところ、このキメラを使用した経験は多くない。これは、ＡＣ刺激がＰＬＣ刺激より優れた受容体活性化測定値であることを発見した人にとって有用であるかもしれない。
【００９８】
・１３Ｚ：これは、Ｃ末端アミノ酸がＧ１３α残基からＧｚα残基に（ＱＬＭＬＱからＹＩＧＬＣに）変えられたＧ１３αである。この構築物は、一部のＧｉ共役受容体が細胞ｐＨの増加を刺激するのを可能にする。今のところ、このキメラを使用した経験は多くないが、１３ＺはＤ２−ドーパミン受容体と共に首尾よく用いられた（ボイノヤセネツカヤ（Ｖｏｙｎｏ−Ｙａｓｅｎｅｔｓｋａｙａ）ら（１９９４）ＪＢＣ ２６９：４７２１−４７２４を参照のこと）。
この構築物は、Ｇ１３α用の信頼性の高い内部タグを誰も作成していないので、エピトープタグ化されていないことに注意してほしい。
【００９９】
親構築物
ｑ４ＷＴ：これは、多くの研究において受容体共役に影響を及ぼすように見えない内部部位にＨＡエピトープが導入されたＧｑαである。ポール・ウィルソン（Ｐａｕｌ Ｗｉｌｓｏｎ）によってエピトープタグ化されている（ウェデガエルトナー（Ｗｅｄｅｇａｅｒｔｎｅｒ），ＪＢＣ ２６８：２５００１−２５００８を参照のこと）。ストラスマン（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ）およびシモン（Ｓｉｍｏｎ）（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：９１１３−９１１７のように、５’非コード配列は除去されたが、３’非コード配列は残っている。親構築物はボーンラボ（Ｂｏｕｒｎｅ Ｌａｂ．）によってＡＴＣＣに寄託されている。
ｑ４ＷＴの配列を見るには、ここをクリックする。
【０１００】
Ｇｓ−ＷＴ−ＨＡ：この構築物はボーンラボでは「ＧＳＬ」としても知られている。これは、多くの研究において受容体共役に影響を及ぼすように見えない内部部位にＨＡエピトープが導入された、ｐｃＤＮＡ−１中の「野生型」Ｇｓαである。（レビス（Ｌｅｖｉｓ）およびボーン（Ｂｏｕｒｎｅ）（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１９：１２９７−１３０７を参照のこと）。親構築物はボーンラボによってＡＴＣＣに寄託されている。
Ｇｓ−ＷＴ−ＨＡの配列を見るには、ここをクリックする。
【０１０１】
以下は、我々がＧαのＣ末端キメラをどのように使用したかについて述べている刊行物のリストである：
キメラについての最初の記述：
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最近の研究において使用したキメラ
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私はこの情報が有用であると考えています。キメラを使用した論文の前刷りを送って下さい。意見がありましたら、どうぞ気軽にご連絡ください。
【０１０２】
郵送先住所：
ブルース．Ｒ．コンクリン（Ｂｒｕｃｅ Ｒ．Ｃｏｎｋｌｉｎ），Ｍ．Ｄ．
Ｔｈｅ Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＵＣＳＦ
Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ４１９１００
Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ ９４１４１−９１００
他の情報：
オフィス：（４１５）６９５−３７５８
ラボ：（４１５）６９５−３７８４
ファックス：（４１５）２８５−５６３２
ｂｃｏｎｋｌｉｎ＠ｇｌａｄｓｔｏｎｅ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ
【０１０３】
さらなる情報については、コンクリン・ラボ・テクニカル・インフォメーション（Ｃｏｎｋｌｉｎ Ｌａｂ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を参照のこと
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・コンクリンホームページ（Ｃｏｎｋｌｉｎ Ｈｏｍｅ Ｐａｇｅ）に戻る
最終更新日：１９９８年１０月
【図面の簡単な説明】
【図１】構成的に活性のあるクラスＩ Ｇタンパク質共役受容体（配列番号：２〜７５）の表である。受容体に構成的活性を付与する変異を示す。
【図２】ルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いてアッセイされた、Ｌ３２５Ｅ ＣＣＫ−ＢＲ受容体の構成的活性を示すグラフである。
【図３】ルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いてアッセイされた、Ａｓｎ１５０Ａｌａラットμオピオイド受容体の構成的活性を示すグラフである。これは以下によって証明された：（１）受容体のアゴニスト（ＤＡＭＧＯ）刺激がフォルスコリン誘導性活性の減少につながる（これは、受容体が阻害経路を介して働くことを示している）；（２）変異受容体の同時発現によって、ＤＡＭＧＯ非存在下でのフォルスコリン誘導性活性が（野生型受容体と比較して）低い（これは、阻害経路のリガンド非依存性活性を示している）。
【図４】ｐｃＤＮＡ１およびＣＲＥ−Ｌｕｃレポーター構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対するフォルスコリン刺激作用を示すグラフである。
【図５】μオピオイド受容体のリガンド媒介活性化に対するレポーター構築物ＳＭＳ−Ｌｕｃ、ＳＲＥ−Ｌｕｃ、およびＳＲＥ−Ｌｕｃ＋Ｇｑ５ｉの感受性を示すグラフである。
【図６】ＳＲＥ−Ｌｕｃ／Ｇｑ５ｉルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いてアッセイされた、Ａｓｎ１５０Ａｌａラットμオピオイド受容体の構成的活性を示すグラフである。
【図７】７回膜貫通ドメインクラスＩ Ｇタンパク質共役受容体の図である。選択された残基を示す。
【図８】μオピオイド受容体、ブラジキニンＢ２受容体、およびアンギオテンシンＩＩ ＡＴ１Ａ受容体の間で保存されているアミノ酸残基を示す図である。
【図９】オキシトシン、バソプレッシン−Ｖ２、コレシストキニン−Ａ、メラノコルチン−４、およびα１ｂアドレナリン作動性受容体の間で保存されているアミノ酸残基を示す図である。
【図１０】ルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いてアッセイされた、Ｄ１４６Ｍ ＭＣ−４受容体の構成的活性を示すグラフである。
【図１１】１Ａアドレナリン作動性受容体、α２Ｃアドレナリン作動性受容体、β２アドレナリン作動性受容体、セロトニン２Ａ受容体、コレシストキニン−Ｂ受容体、血小板活性化因子受容体、および甲状腺刺激ホルモン受容体の間で保存されているＣＷＬＰモチーフと比較した位置（−１３位および−２０位）を示す図である（保存残基を１文字記号で示す）。
【図１２】ヒトκオピオイド受容体（ｏｒｋ）、ラットκオピオイド受容体（ｏｒｋｒ）、ヒトμオピオイド受容体（ｏｒｍ）、ラットμオピオイド受容体（ｏｒｍｒ）、ヒトδオピオイド受容体（ｏｒｄ）、ラット１Ａ型アンギオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１Ａ）、およびヒトブラジキニン受容体（Ｂ２）（配列番号：７６−８２）の配列アラインメントを示す図である。
【図１３】マウスμオピオイド受容体、ラットμオピオイド受容体、ウシμオピオイド受容体、ヒトμオピオイド受容体、ブタμオピオイド受容体、ホワイトサッカー（ｗｈｉｔｅ ｓｕｃｋｅｒ）（ｗｓ）オピオイド受容体、アンギオテンシンＡＴ−１受容体、およびブラジキニン−Ｂ２受容体（配列番号：８３、７９、８４〜８７、８１、および８２）のアミノ酸配列を（上から下に）示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004526415.tif 000107
【国際調査報告】
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