(57)【要約】本発明は髄膜炎菌に対するワクチンのための成分、特に髄膜炎菌のリポオリゴ糖のエピトープを模倣するペプチド、およびそのような成分を含有するワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープであって、４ＢＥ１２Ｃ１０、Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０およびＨ４４／７８からなる群から選択されるモノクローナル抗体を用いてペプチドライブラリーをスクリーニングして得られるペプチドエピトープを含んでなる前記ミモトープ。
【請求項２】
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープであって、４ＢＥ１２Ｃ１０、Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０およびＨ４４／７８からなる群から選択されるモノクローナル抗体との抗原としての交叉反応性を有する前記ミモトープ。
【請求項３】
配列番号１〜１４０および２８９〜２９６のペプチドのうちのいずれか１つまたはそのレトロ配列に含有されるペプチドエピトープを含んでなる、請求項１または２に記載のミモトープ。
【請求項４】
ペプチドエピトープがノナペプチド中に存在する、請求項３に記載のミモトープ。
【請求項５】
４ＢＥ１２Ｃ１０、Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０およびＨ４４／７８からなる群から選択されるモノクローナル抗体との交叉反応性を保持している、配列番号１〜１４０および２８９〜２９６のペプチドのうちのいずれか１つもしくはそのレトロ配列または該ペプチドもしくはレトロ配列の改変体のうちのいずれか１つ、を含んでなる、請求項３または４に記載のミモトープ。
【請求項６】
ペプチドエピトープがアミノ酸配列ＰＰ［ＹまたはＦまたはＷ］を含有する、請求項３〜５のいずれか１項に記載のミモトープ。
【請求項７】
ペプチドエピトープがアミノ酸配列ＰＰ［ＹまたはＦまたはＷ］Ｄを含有する、請求項６に記載のミモトープ。
【請求項８】
ペプチドエピトープがアミノ酸配列ＰＰＹＤを含有する、請求項７に記載のミモトープ。
【請求項９】
ペプチドエピトープがアミノ酸配列ＷＹを含有する、請求項３〜５のいずれか１項に記載のミモトープ。
【請求項１０】
ペプチドエピトープがアミノ酸配列ＷＹＸＸＰを含有する、請求項９に記載のミモトープ。
【請求項１１】
ペプチドエピトープがアミノ酸配列［ＹまたはＷ］ＸＹを含有する、請求項３〜５のいずれか１項に記載のミモトープ。
【請求項１２】
ミモトープが、前記ペプチドエピトープを含むオリゴペプチドであってそのオリゴペプチドの非置換の直鎖状形態よりも構造的に拘束されている前記オリゴペプチドを含んでなる、請求項３〜１１のいずれか１項に記載のミモトープ。
【請求項１３】
オリゴペプチドが、前記ペプチドエピトープを含む環状ペプチドを含んでなる、請求項１２に記載のミモトープ。
【請求項１４】
環状ペプチドがアミノ酸配列からなる環状部分を含み、かつそのアミノ酸配列の両末端のアミノ酸が共有結合によって連結されている、請求項１３に記載のミモトープ。
【請求項１５】
環状ペプチドが配列番号１４１〜２８０および２９７〜３０１のペプチドのうちのいずれか１つ、またはそのレトロ配列である、請求項１４に記載のミモトープ。
【請求項１６】
ミモトープの免疫原性を増強するために該ミモトープにキャリアーをコンジュゲートさせた、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のミモトープ。
【請求項１７】
キャリアーが免疫原性タンパク質を含む、請求項１６に記載のミモトープ。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のミモトープおよび適切な賦形剤または希釈剤を含むワクチン。
【請求項１９】
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープおよびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ２ ＬＯＳのミモトープを含む、血清型Ｂ、Ｃ、Ｙ、またはＷ−１３５の髄膜炎菌に対するワクチン。
【請求項２０】
ミモトープが、それぞれの髄膜炎菌の表面ＬＯＳに対して高い特異性を有するモノクローナル抗体との抗原としての交叉反応性を有するものである、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
ミモトープの各々がペプチドエピトープを含んでなる、請求項１９または２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
ペプチドエピトープが、請求項２０に規定されたそれぞれのモノクローナル抗体を用いてペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られるものである、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
Ｌ３，７，９およびＬ２ ミモトープが同一の分子内に含まれる、請求項２１または２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープが請求項２〜１７のいずれか１項に記載のミモトープである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２５】
表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープが、以下：
ＩＨＲＱＧＩＨ、ＨＩＧＱＲＨＩ、ＬＰＡＲＴＥＧ、ＧＥＴＲＡＰＬ、ＡＰＡＲＱＬＰ、ＰＬＱＲＡＰＡ、ＫＱＡＰＶＨＨ、ＨＨＶＰＡＱＫ、
ＬＱＡＰＶＨＨ、ＨＨＶＰＡＱＬ、ＬＰＳＩＱＬＰ、ＰＬＱＩＳＰＬ、ＮＥＬＰＨＫＬ、ＬＫＨＰＬＥＮ、ＫＳＰＳＭＴＬ、ＬＴＭＳＰＳＫ、
ＡＧＰＬＭＬＬ、ＬＬＭＬＰＧＡ、ＷＳＰＩＬＬＤ、ＤＬＬＩＰＳＷ、ＬＳＭＨＰＱＮ、ＮＱＰＨＭＳＬ、ＨＳＭＨＰＱＮ、ＮＱＰＨＭＳＨ、
ＳＭＹＧＳＹＮ、ＮＹＳＧＹＭＳ、ＴＮＨＳＬＹＨ、ＨＹＬＳＨＮＴ、ＨＡＩＹＰＲＨ、ＨＲＰＹＩＡＨ、ＴＴＹＳＲＦＰ、ＰＦＲＳＹＴＴ、
ＴＤＳＬＲＬＬ、ＬＬＲＬＳＤＴ、ＳＦＡＴＮＩＰ、およびＰＩＮＴＡＦＳ
からなる群より選択されるペプチドを含んでなる、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２６】
表面のＬ２ ＬＯＳのミモトープが、Ｆ１−５Ｈ ５／ＩＤ９モノクローナル抗体との抗原としての交叉反応性を有する、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２７】
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープ、およびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ１０ ＬＯＳのミモトープを含む、血清型Ａの髄膜炎菌に対するワクチン。
【請求項２８】
表面のＬ１０ ＬＯＳのミモトープが、Ｌ１０ ＬＯＳに対して高い特異性を有するモノクローナル抗体との抗原としての交叉反応性を有する、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項２９】
モノクローナル抗体が５Ｂ４−Ｆ９−Ｂ１０である、請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
表面のＬ１０ ＬＯＳのミモトープがペプチドエピトープを含んでなる、請求項２８または２９に記載のワクチン。
【請求項３１】
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープ、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ１０ ＬＯＳのミモトープ、およびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ２ ＬＯＳのミモトープを含む、髄膜炎菌ワクチン。
【請求項３２】
請求項３１に記載のワクチンおよびコンジュゲート化インフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜多糖を含む、髄膜炎ワクチン。
【請求項３３】
特許手続上の寄託に関するブダペスト条約に基づいて２０００年９月２２日付で仮受託番号９２２０９によりＥＣＡＣＣに寄託された、Ｈ４４／２４ハイブリドーマ。
【請求項３４】
特許手続上の寄託に関するブダペスト条約に基づいて２０００年９月２２日付で仮受託番号９２２１０によりＥＣＡＣＣに寄託された、Ｈ４４／５８ハイブリドーマ。
【請求項３５】
特許手続上の寄託に関するブダペスト条約に基づいて２０００年９月２２日付で仮受託番号９２２１１によりＥＣＡＣＣに寄託された、Ｈ４４／７０ハイブリドーマ。
【請求項３６】
特許手続上の寄託に関するブダペスト条約に基づいて２０００年９月２２日付で仮受託番号９２２１２によりＥＣＡＣＣに寄託された、Ｈ４４／７８ハイブリドーマ。
【請求項３７】
請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体。
【請求項３８】
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープを同定するための、請求項３７に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項３９】
請求項３７に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
【請求項４０】
医薬として使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のミモトープ、または請求項１８〜３２のいずれか１項に記載のワクチン、または請求項３７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４１】
髄膜炎菌疾患の治療または予防のための医薬を製造するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のミモトープ、または請求項１８〜３２のいずれか１項に記載のワクチン、または請求項３７に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項４２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のミモトープを製造すること、および該ミモトープをアジュバントともに製剤化することを含む、ワクチンの製造方法。
【請求項４３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のミモトープ、または請求項１８〜３２のいずれか１項に記載のワクチン、または請求項３７に記載のモノクローナル抗体を、髄膜炎菌疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい患者へ投与することを含む、患者の治療方法。
【請求項４４】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のミモトープをコードするＤＮＡ配列。
【請求項４５】
患者の血清中のＬ３，７，９ ＬＯＳに対する抗体を検出するために請求項１〜１６のいずれか１項に記載のミモトープを使用することを含む、髄膜炎菌感染に対する診断用アッセイ。
【請求項４６】
患者から得たサンプル中のＬ３，７，９免疫型髄膜炎菌の存在を検出するために請求項３７に記載のモノクローナル抗体を使用することを含む、髄膜炎菌感染に対する診断用アッセイ。
【請求項４７】
配列番号２８１〜２８８のＤＮＡ配列によってコードされるＣＤＲ領域をコードするＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は髄膜炎菌に対するワクチンの成分、好ましくは髄膜炎菌のリポオリゴ糖のエピトープを模倣するペプチド、及びそのような成分を含むワクチンに関する。
【０００２】
発明の背景
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（髄膜炎菌）はヒト上気道から頻繁に単離されるグラム陰性細菌である。この細菌は、菌血症や髄膜炎等の重篤な侵入性細菌性疾患の原因である。髄膜炎菌疾患の発生数には、地理的、季節的および年次的な差異が見られる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．， Ｍｏｏｒｅ，Ｐ．Ｓ．， Ｂｒｏｏｍｅ， Ｃ．Ｖ．；Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）， Ｓ１８−Ｓ２４，１９８９）。この細菌は通常はその莢膜多糖の血清型に従って分類される。
【０００３】
温暖な国々で最も多い疾患は血清型Ｂ株によるものであって、その発生数は １〜１０／１００，０００／年・総人口の間で変動し、しばしばより高値に達する（Ｋａｃｚｍａｒｓｋｉ，Ｅ．Ｂ．（１９９７）， Ｃｏｍｍｕｎ．Ｄｉｓ．Ｒｅｐ．Ｒｅｖ．７：Ｒ５５−９，１９９５；Ｓｃｈｏｌｔｅｎ，Ｒ．Ｊ．Ｐ．Ｍ．， Ｂｉｊｌｍｅｒ， Ｈ．Ａ．， Ｐｏｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １６：２３７−２４６， １９９３；Ｃｒｕｚ，Ｃ．， Ｐａｖｅｚ，Ｇ．， Ａｇｕｉｌａｒ，Ｅ．，ら、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１０５：１１９−１２６，１９９０）。
【０００４】
血清型Ａの髄膜炎菌が優位を占める流行は、その大部分が中央アフリカで発生し、しばしば １０００／１００，０００／年のレベルにまで達する（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．， Ｍｏｏｒｅ，Ｐ．Ｓ．， Ｂｒｏｏｍｅ， Ｃ．Ｖ． Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）， Ｓ１８−Ｓ２４，１９８９）。髄膜炎菌疾患全体からみて殆ど全ての症例が血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５およびＹの髄膜炎菌により引き起こされ、４価のＡ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｙ型莢膜多糖ワクチンが利用可能である（Ａｒｍａｎｄ，Ｊ．， Ａｒｍｉｎｊｏｎ，Ｆ．， Ｍｙｎａｒｄ，Ｍ．Ｃ．， Ｌａｆａｉｘ，Ｃ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ． １０：３３５−３３９，１９８２）。
【０００５】
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の感染頻度は過去数十年の間に劇的に上昇している。これは、複数の抗生物質に耐性な株の出現および免疫系が弱められた人口数の増大を原因とする。幾つかのまたは全ての標準的な抗生物質に耐性であるナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株が単離されることは、もはや珍しいことではない。この現象は、新たな抗菌剤、ワクチン、薬剤のスクリーニング法、およびこれらの生物用の診断試験といった、現在のところ満たされていない医薬の必要性および需要を生み出した。
【０００６】
利用可能な前記の多糖ワクチンについては、それらをキャリアータンパク質に化学的にコンジュゲートさせることによる改良が現在行われている（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍ．， Ｃｈｉｕ，Ｓ．Ｓ．， Ｗｏｎｇ，Ｖ．Ｋ．ら、ＪＡＭＡ ２７５：１４９９−１５０３， １９９６）。
【０００７】
しかしながら、血清型Ｂのワクチンは利用できない。血清型Ｂの莢膜多糖は免疫原性を有しないことが見出されている−それはおそらくこの血清型Ｂの莢膜多糖が宿主成分との構造類似性を有しているためであろう（Ｗｙｌｅ，Ｆ．Ａ．， Ａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｓ．， Ｂｒａｎｄｔ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １２６：５１４−５２２， １９７２；Ｆｉｎｎｅ，Ｊ．Ｍ．， Ｌｅｉｎｏｎｅｎ，Ｍ．，Ｍａｋｅｌａ，Ｐ．Ｍ．Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ．：３５５−３５７，１９８３）。従って外膜小胞からまたはそれから得た精製タンパク質成分から血清型Ｂのワクチンの開発を試みることに努力が集中されてきた。
【０００８】
ワクチン開発のための別の髄膜炎菌抗原としては、髄膜炎菌のリポオリゴ糖（ＬＯＳ）がある。それらリポオリゴ糖は外膜に結合した糖脂質であり、腸内細菌科細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）とはＯ側鎖が欠けている点で異なっており、従って、Ｒ型のＬＰＳに似ている（Ｇｒｉｆｆｉｓｓら、Ｒｅｖ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８８， １０：Ｓ２８７−２９５）。ＬＯＳのオリゴ糖部分における不均一性のために種々の髄膜炎菌の株間での構造的及び抗原性の多様性が作り出されている（Ｇｒｉｆｆｉｓｓら、Ｉｎｆ． Ｉｍｍｕｎ． １９８７， ５５：１７９２−１８００）。このことは髄膜炎菌の株を１２種類の免疫型にさらに分けるために用いられている。免疫型Ｌ３、Ｌ７、Ｌ９は同一の炭水化物構造を有し、従ってＬ３，７，９と名付けられている。髄膜炎菌のＬＯＳ３，７，９、Ｌ２、およびＬ５はシアリル化によって、またはシチジン５’−一リン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸の添加により修飾することができる。ＬＯＳに対する抗体は実験用ラットを感染から保護し、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に感染した小児での殺菌活性に寄与することが示されている（Ｇｒｉｆｆｉｓｓら、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８４， １５０：７１−７９）。
【０００９】
ＬＯＳの毒性成分は、他のグラム陰性細菌由来のエンドトキシンの場合と同様に、分子のリピドＡ部分にあり、免疫原性を有するオリゴ糖部分にはない。この分子の免疫原性を有する部分から毒性のある部分を分離することは可能かもしれないが、分離してしまえばその分子の天然のコンフォメーションは保持することができないであろう。
【００１０】
このような困難性の解決法はＬＯＳのオリゴ糖部分にあるエピトープを模倣することのできるミモトープを同定することである。このようなやり方で代理抗原を作製することができる。
【００１１】
多糖を模倣するペプチドが報告されている。例えば、髄膜炎菌Ｂ群莢膜多糖のミモトープ（Ｍｏｅら、１９９９， ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２６：２０９−２２６）、および髄膜炎菌Ｃ群莢膜多糖のミモトープ（Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら、１９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：４０２１−４０２５）が同定されている。さらに、ＷＯ ００／２５８１４はいくつかの血清型ＢのＬＯＳ Ｌ３，７，９ヘプタペプチドミモトープを開示している。
【００１２】
ミモトープをワクチン中に含有させる場合の適合性はかなり様々であり（すなわち、その炭水化物に対して防護液性免疫応答を誘導することのできる免疫原性ミモトープからなるものであるか否か）、髄膜炎菌（特に血清型Ｂ）のＬＯＳのペプチドミモトープのさらに別のクラスを同定することの必要性は依然としてある。
【００１３】
本発明の要旨
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ） ＬＯＳの表面に露出されるエピトープを模倣するペプチドミモトープをさらに同定するために、本発明者らは２ファージディスプレイランダムペプチドライブラリーを、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ） ＬＯＳに対する５種類のモノクローナル抗体を用いてスクリーニングした。
【００１４】
本発明はナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープであって、４ＢＥ１２Ｃ１０、Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０およびＨ４４／７８からなる群から選択されるモノクローナル抗体との抗原としての交叉反応性を有する前記ミモトープを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープであって、４ＢＥ１２Ｃ１０、Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０およびＨ４４／７８からなる群から選択されるモノクローナル抗体を用いてペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られるペプチドエピトープを含んでなる前記ミモトープを提供する。
【００１６】
上記のミモトープを含むワクチン組成物も提供される。
【００１７】
本発明の別の１態様は、血清型Ｂ、Ｃ、Ｙ、またはＷ−１３５の髄膜炎菌に対するワクチンであって、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープ、およびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ２ ＬＯＳのミモトープを含む前記ワクチンに関する。
【００１８】
本発明のさらに別の１態様は、血清型Ａの髄膜炎菌に対するワクチンであって、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープ、およびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ１０ ＬＯＳのミモトープを含む前記ワクチンに関する。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、髄膜炎菌ワクチンの成分として用いるためのナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ） ＬＯＳのミモトープのさらに別のクラスを提供することを目的としている。
【００２０】
本発明はナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープであって、４ＢＥ１２Ｃ１０、Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０およびＨ４４／７８からなる群から選択されるモノクローナル抗体との抗原としての交叉反応性を有する前記ミモトープを提供する。これらのモノクローナル抗体の各々については後に説明するが、これらを「本発明のｍＡｂ（モノクローナル抗体）」と呼ぶ。これらのｍＡｂは、Ｌ３，７，９ ＬＯＳに対して高い特異性および／またはアフィニティーを有している。ミモトープの意味は、天然の髄膜炎菌ＬＯＳのエピトープを認識する抗体が結合しうるような、天然の髄膜炎菌ＬＯＳのエピトープと十分に類似した実体物、として定義される。「抗原としての交叉反応性を有する」とは、本発明の目的とするところからは、当該ミモトープを発現している組換えファージについてのＥＬＩＳＡ試験（好ましくは実施例３で行うような）またはイムノブロットで、そのミモトープが陽性であることが示されることを意味する。好ましくは、該ミモトープは天然のアミノ酸配列を持たない。
【００２１】
好ましくは、ＬＯＳと特異的に交叉反応し、かつ好ましくはＬＯＳを含んでいる細菌の細胞全体と交叉反応する抗体が産生されるように、本発明のミモトープを用いて宿主を免疫することができる。
【００２２】
本発明はさらに、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープであって、４ＢＥ１２Ｃ１０、Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０およびＨ４４／７８からなる群から選択されるモノクローナル抗体を用いてペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られるペプチドエピトープを含んでなる前記ミモトープを提供する。好ましくは、該ミモトープは天然のアミノ酸配列を持たない。
【００２３】
典型的には、該ペプチドエピトープは、ＬＯＳに対する高い特異性および／または高いアフィニティーを有するモノクローナル抗体を用いてペプチドライブラリー（好ましくはランダムで高度に多様なもの）をスクリーニングすることによって得られるものである。ファージディスプレイ法（ＥＰ ０ ５５２ ２６７ Ｂ１）などの一般的技法を用いてそのようなライブラリーを（好ましくは実施例２に記載のようにして）スクリーニングすることができる。この技法は多くのペプチドミモトープを同定できる可能性があるという利点を有することから、それによりＬ３，７，９ ＬＯＳのペプチドミモトープ内に含まれているエピトープの本質的な特徴（または化学的性質）を定義するための認識パターンを確立することができる。
【００２４】
本発明では、ノナマーペプチドライブラリー（直鎖状のもの、またはジスルフィド結合で拘束されたもののいずれかであり、例えばＦｅｌｉｃｉら［１９９３ Ｇｅｎｅ １２８：２１−２７］およびＬｕｚｚａｇｏら［１９９３ Ｇｅｎｅ １２８：５１−５７］によって報告されているようなもの）は、該ライブラリーから単離される配列番号１〜１４０、２８９〜２９６のペプチドミモトープ内に含まれているペプチドエピトープを同定する目的で、本発明のｍＡｂをチャレンジさせるために好都合に用いることができると考えられた。従って、本発明のミモトープは、好ましくは、配列番号１〜１４０および２８９〜２９６のペプチドのうちのいずれか１つ、またはそのレトロ配列に含有されるペプチドエピトープを含んでなる。
【００２５】
本発明では、ペプチドエピトープは、配列番号１〜１４０および２８９−２９６のうちのいずれか１つの部分配列、またはそのレトロ配列を含んでなるものであってよく、あるいは、配列番号１〜１４０および２８９〜２９６のうちのいずれか１つ（もしくはそのレトロ配列）またはそれに由来する部分配列を組み込んだより長いペプチド中に存在するものであってもよい。従って、本発明のミモトープは、配列番号１〜１４０および２８９〜２９６のペプチドの一方の末端または両端において、多数の他の天然の残基からなるＮ末端および／またはＣ末端の伸長部が付加されたものであってもよい。
【００２６】
好ましくは、本発明のミモトープは、配列番号１〜１４０および２８９〜２９６のペプチド（本発明のペプチド）のいずれか１つ、もしくはそのレトロ配列、または該ペプチドもしくはレトロ配列の改変体を含んでなる。最も好ましくは、本発明のペプチドのレトロ配列および改変体を含んでなるミモトープは、４ＢＥ１２Ｃ１０、Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０およびＨ４４／７８からなる群から選択されるモノクローナル抗体との交叉反応性を保持するはずである。最も好ましくは、本発明のミモトープは、配列番号１５３、１５４、１５７、１６２、１６７、１６８、１６９、１７０、１７９、４５、４７、１９０、１９１、５３、１９４、５５、５８、６１、６３、２０６、７５、２２２、８３、８５、８６、２２７、８８、９３、２４３、１０４、２４５、２５５、１２４、２７１、２７２、２７３、２７９、２８０、２９７、２９８、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、および２９６（これらは、実施例２の表２に示しているペプチドＮｏ． １３、１４、１７、２２、２７、２８、２９、３０、３９、４５、４７、５０、５１、５３、５４、５５、５８、６１、６３、６６、７５、８２、８３、８５、８６、８７、８８、９３、１０３、１０４、１０５、１１５、１２４、１３１、１３２、１３３、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、および１４８にそれぞれ対応する）のペプチドのいずれか１つ、または、実施例３のＥＬＩＳＡ試験において１種以上のｍＡｂにより依然として認識されるそれらのペプチドのレトロ配列および改変体のいずれか１つを含んでなる。
【００２７】
ペプチド配列についての「レトロ配列 （ｒｅｔｒｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、配列の方向性を逆転させたペプチド配列を意味する。すなわち、ペプチドＡＧＤＴのレトロ配列はＴＤＧＡである。ペプチドミモトープのレトロ配列はしばしばペプチドミモトープそれ自体であることが当業界では見出されている。本発明のミモトープ配列は、その全体または一部がＤ−立体異性体アミノ酸からなるもの（インベルソ配列； ｉｎｖｅｒｓｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であってもよい。またそのペプチド配列は、配列の方向性が逆転されておりアミノ酸がＤ−立体異性体であるという意味で、レトロ−インベルソの性質を持つものであってよい。そのようなレトロペプチド、インベルソペプチド、またはレトロ−インベルソペプチドは、免疫原として投与された場合、宿主中でより安定でありかつ／またはより免疫原性の強いものとなりうるという利点を有している。Ｄ−アミノ酸を作成しそれらをタンパク質中に組み入れる方法は当業界では周知である［例えば、Ｔｈｏｒｓｏｎら， （１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７７：４３−７３、およびＣｈａｒｔｒａｉｎら （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１：２０９−１４を参照せよ］。
【００２８】
本発明のペプチドを含んでなるペプチドミモトープは、特定の目的のために、選択されたアミノ酸の付加、欠失、または置換によって改変することができる（本発明のペプチドの改変体）。
【００２９】
例えば、配列番号１〜１４０、２８９〜２９６のペプチドの各々の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸を、そのアミノ酸に非常に類似しているアミノ酸で置換することができる。例えば、下記の表に示すとおり、ＡはＶ、Ｌ、またはＩで置換することができる。
【００３０】
2004526418.tif 000002
【００３１】
さらに、本発明のペプチドはタンパク質キャリアーとのコンジュゲーションを容易にする目的で改変することができる。例えば、該ペプチドに末端システインを含有させることが、いくつかの化学的コンジュゲーション法のためには望ましいであろう。さらに、タンパク質キャリアーに結合されるペプチドについて、そのペプチドのコンジュゲートされる末端から遠位側に疎水性末端を含有させて、それによりそのペプチドの遊離の非コンジュゲーション末端がキャリアータンパク質の表面と会合した状態のままとなるようにすることが望ましい。このことは該ペプチドのコンフォメーションの自由度を減らし、それによって該ペプチドが分子全体としてのＬ３，７，９ ＬＯＳに非常によく類似したコンフォメーションを示すこととなる可能性が増大する。例えば、該ペプチドを改変して、Ｎ末端システインを有し、Ｃ末端に疎水性のアミド化テイルを有するようにしてもよい。あるいはまた、有益な誘導体を得るため、例えば、ペプチドの安定性を増大させるために、１個以上のアミノ酸のＤ−立体異性体を付加または置換してもよい。当業者であれば、そのような改変されたペプチドまたはミモトープは、全体としてまたは部分的に非ペプチド性のミモトープであってもよく、その場合にその構成残基は２０種類の天然アミノ酸に必ずしも限定されない。さらに、本発明のモノクローナル抗体と交叉反応できるエピトープを保持する限りは、本発明のペプチドから１個以上のアミノ酸を欠失させてもよい。典型的には、そのようなエピトープは少なくとも４、５、６、７、または８個のアミノ酸を有する。さらに、本発明のペプチドは、そのペプチド配列がＬＯＳ分子全体と関連する場合にはその形状とよく類似するコンフォメーションとなるようそのペプチドを拘束するために、当業界では既知の技法によって環状化させてもよい。
【００３２】
従って、さらなる好ましい実施形態においては、本発明のミモトープは、そのオリゴペプチドの直鎖状形態のものよりも構造的に強く拘束されているオリゴペプチドを含んでいてもよい。より少数のコンフォメーションしか取りえないペプチド、またはロックされたコンフォメーションを有するペプチドは、免疫応答をより惹起しやすいと考えられるが、それは、そのようなペプチドが抗体の結合部分に対して構造的に拘束されたエピトープを提示するからである。
【００３３】
別のペプチド鎖への共有結合による連結または分子内結合などの置換基は、そのオリゴペプチドを構造的に拘束する。例えば、本発明のオリゴペプチドは、該オリゴペプチドのアミノ酸配列を含んでいるより大きなポリペプチドの一次構造の一部を形成するものであってもよい。好ましくは、本発明のオリゴペプチドは、下記にさらに詳述するとおり、環状ペプチドを含む。
【００３４】
その他の置換基としては、生物学的および非生物学的構造物を含む巨大分子構造物などの他の要素との共有結合を包含する。生物学的構造物の例としては、ミモトープの免疫原性を増強するための、下記に記載したものなどのキャリアータンパク質が含まれる。非生物学的構造物の例としては、ミセルなどの脂質小胞が含まれる。
【００３５】
好ましい実施形態においては、本発明のオリゴペプチドは環状ペプチドを含む。環状ペプチドの使用。典型的には、該環状ペプチドは、好ましくはアミノ酸配列からなる環状部分を含み、かつそのアミノ酸配列の両末端アミノ酸は共有結合によって互いに連結されている。その共有結合は、システイン残基間に見られるようなジスルフィド架橋であることが都合がよい。その環状部分は典型的にはノナペプチドを含み、かつこのノナペプチドは、共有結合によって連結されて環状部分を形成させるアミノ酸に隣接する前記アミノ酸配列の一部分を形成するものであることが都合がよい。
【００３６】
システイン残基のペアを含むことによりジスルフィド架橋を形成することができる好ましい環状ペプチドの例としては、配列番号１４１〜２８０および２９７〜３０１（ならびに上記で定義した、それらのレトロ配列、インベルソ配列、またはレトロ−インベルソ配列）が挙げられる。
【００３７】
上述のとおり、ファージディスプレイ法で同定される多数のペプチドミモトープにより、Ｌ３，７，９ ＬＯＳのミモトープのエピトープ（またはエピトープの一部）を規定するパターンを同定することが可能となる。従って本発明の別の態様は、以下のアミノ酸配列（直鎖状または環状）を含むＬ３，７，９ ＬＯＳのペプチドミモトープである： ＷＹ、ＰＰ、ＡＰ、ＰＹ、ＰＰＹ、ＰＰＦ、ＰＰＷ、ＡＰＰ、ＷＹＳ、ＷＹＴ、ＬＷＹ、ＧＧＹ、ＧＰＹ、ＰＰＹＤ（好ましいモチーフ）、ＰＰＦＤ、ＦＤＰＰ、ＧＧＹＬ、ＰＰＷＤ、ＳＬＷＹ、ＰＸＷＹ、ＷＹＸＸＰ、ＹＸＹ、ＰＷＳＴ、ＥＫＫＸＦまたはＷＸＹ ［式中、それぞれのＸは、同一であるかまたは異なるアミノ酸であり、好ましくは天然アミノ酸である］。
【００３８】
好ましい実施形態においては、上記で同定した本発明のエピトープまたはペプチドミモトープを組み込んでいるペプチドは、サイズの小さなものである。従って、ペプチドミモトープはその長さが１００アミノ酸未満であるのがよく、好ましくは７５アミノ酸未満、より好ましくは５０アミノ酸未満、最も好ましくは４〜２５アミノ酸長の範囲内であることを意図している。特定の実施形態においては、本発明のペプチドはその長さが９アミノ酸である。
【００３９】
髄膜炎菌に対するワクチンにおける使用に適したミモトープとしてのある特定の構築物の状況を確認するために種々の技法を用いうることは、当業者には明白なことであろう。そのような技法としては次の例が挙げられる。すなわち、推定上のミモトープについてアッセイして、その際その推定上のミモトープによって生成された抗血清が天然Ｌ３，７，９ ＬＯＳ分子と交叉反応し、かつ、Ｌ３，７，９免疫型のナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する殺菌アッセイにおいて有効であることから、その構築物の免疫原性を確認することができる。典型的な殺菌アッセイは実施例１．４中に記載するとおり行われる。また、そのようなアッセイは、幼若ラットなどの動物モデルでの標準的なオプソニン食菌（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）実験で行うこともできる。
【００４０】
本発明の実施形態においては、ペプチドエピトープまたはミモトープを組み込んでいる上述の少なくとも１種のペプチドをキャリアー分子と連結させて、ワクチン接種プロトコール用の免疫原を形成させる。該ペプチドは、化学的共有結合により連結してもよく、あるいは遺伝子工学的に作製された融合パートナーとの発現により、場合によりリンカー配列を介するものの発現により連結してもよい。
【００４１】
本発明のペプチドの免疫原性を有するキャリアーへの共有結合カップリングは、当技術分野で周知の方法で行うことができる。従って、例えば、直接的な共有結合カップリングのためには、ＣＤＡＰおよびＳＰＤＰなどの一般的な市販のヘテロ二官能性リンカーを（製造業者の使用説明書に従って）用いて、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、または（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］）スクシンイミドエステルを利用することができる。そのカップリング反応の後、免疫原は透析法、ゲルろ過法、分画法等の手段によって容易に単離精製することができる。
【００４２】
本発明の免疫原中に用いるキャリアーの種類は当業者であれば容易に分かるであろう。そのようなキャリアーの役割は、本発明のペプチドに対する免疫応答の誘導を助けるためのサイトカインの助力を提供することである。全てを網羅したものではないが、本発明で用いることのできるキャリアーとしては以下のものが挙げられる： キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、破傷風毒素もしくはジフテリア毒素（ＴＴ、ＤＴ）などの不活化細菌性毒素、またはそれらの組換え断片（例えば、ＴＴのフラグメントＣのドメイン１、またはＤＴの転移ドメイン（Ｔドメイン））、ＣＲＭ１９７、あるいはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）。あるいはまた、本発明のミモトープまたはエピトープはリポソームキャリアーに直接的にコンジュゲートさせてもよく、それがさらにＴ細胞の助力をもたらすことのできる免疫原を含んでいてもよい。好ましくは、ペプチドとキャリアーとの比は１：１〜２０：１のレベルであり、好ましくはそれぞれのキャリアーが３〜１５個のペプチドを担持すべきである。
【００４３】
本発明の実施形態においては、好ましいキャリアーは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のプロテインＤ（ＩｇＤ結合性タンパク質）である（ＷＯ ９１／１８９２６、ＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１）。場合によっては、例えば組換え免疫原発現系においては、プロテインＤの断片、例えばプロテインＤの１番目の３分の１断片（プロテインＤのＮ末端から１００〜１１０個のアミノ酸からなる（ＷＯ ９９／１０３７５））を使用することが望ましい。
【００４４】
本発明のペプチドを提示させる方法として好ましい別の方法は、組換え融合分子を用いるものである。例えば、ＥＰ ０ ４２１ ６３５ Ｂは、ウイルス様粒子において外来ペプチド配列を提示させるためのキメラヘパドナウイルスのコア抗原粒子の使用について述べている。本発明の免疫原は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原から構成されるキメラ粒子において提示されたペプチドを含んでもよい。さらに、本発明の組換え融合タンパク質は、本発明のミモトープと、インフルエンザウイルスのＮＳ１などのキャリアータンパク質とを含んでなるものであってもよい。
【００４５】
あるいは、本発明のペプチドを、外膜タンパク質（好ましくは髄膜炎菌起源のもの、例えばＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｉｌＣ、ＴｂｐＡ、ＦｒｐＢ、またはＬｂｐＡ）の表面に露出されているループ内に、またはそれと置換する形で挿入することができる。これは、本発明のペプチドをＬＯＳエピトープを模倣しうる形状に拘束しておける利点がある。さらにこれは、免疫原を、その免疫原を発現している髄膜炎菌株から得られる外膜小胞調製物（またはブレブ調製物）中に含有させて宿主に投与することに関して、有利であろう。そのような改良されたブレブ調製物は、本発明のさらなる態様である。
【００４６】
本発明の一部を形成する任意の組換え発現タンパク質については、そのような免疫原をコードする核酸配列もまた本発明の１態様を形成する。さらに、上述の本発明のペプチドまたはミモトープのうちの任意のものをコードするＤＮＡ配列も、さらなる態様である。
【００４７】
本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、例えばプラスミドは、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０００ １６５：６２３−６２７） が述べている様式で免疫原として用いることができる。その方策は、宿主中のＬＯＳに対する交叉反応性のＴｈ１免疫応答の引き金を引くのに有益であろう。そのようなＤＮＡ分子を含むワクチン、およびそのようなワクチンの髄膜炎菌疾患の治療または予防のための使用は、本発明のさらなる態様である。
【００４８】
本発明に用いられるペプチドは、当技術分野で周知の固相法によって容易に合成することができる。「Ｔ−ｂｏｃ法」または「Ｆ−ｍｏｃ法」を利用して適切な合成を行うことができる。環状ペプチドは、周知の「Ｆ−ｍｏｃ法」とポリアミド樹脂を用いて全自動装置での固相法によって合成することができる。あるいは、当業者であればこの手法を手動で行うために必要な実験操作は認識しているであろう。固相合成の技術および手順は、「固相ペプチド合成：実際的なアプローチ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｅ． ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄによる。Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰｒｅｓｓのＩＲＬにより刊行。（１９８９））に記載されている。あるいは、本発明のペプチドは組換え法で製造することができ、その方法には、ミモトープをコードする核酸分子を細菌または哺乳類細胞系にて発現させた後、その発現したミモトープを精製することが含まれる。ペプチドおよびタンパク質を組換え法で発現させる技術は当業界において知られており、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）に記載されている。
【００４９】
本発明のモノクローナル抗体、およびそれらを含む医薬組成物は、本発明の一部を形成する。これらの抗体（Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０、Ｈ４４／７８、および４ＢＥ１２Ｃ１０）は、髄膜炎菌疾患の改善または予防のために該抗体を患者に投与することによって、受動的予防または治療に用いることができる。これらの抗体は好ましくはハイブリドーマから産生されるものである。本発明のＨ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０、およびＨ４４／７８ハイブリドーマは、ブダペスト条約に基づく特許手続上の寄託として、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ＯＪＧ ＵＫ）に、２０００年９月２２日付で寄託されており、それらの仮受託番号はそれぞれＮｏ． ９２２０９、９２２１０、９２２１１、および９２２１２である。これらのハイブリドーマにより産生される抗体は、配列番号２８１〜２８８で示されるそれら抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列によってさらに定義される。４ＢＥ１２Ｃ１０抗体は、国立生物学的製剤研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）， Ｂｌａｎｃｈｅ Ｌａｎｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｍｉｍｍｓ， Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｂａｒ， Ｈｅｒｔｓ， ＥＮ６ ３ＱＧ， ＵＫから入手することができる。これらの抗体は、配列番号２８１〜２８８の配列および当技術分野で公知の技法を用いて、治療用途のためにヒト化またはＣＤＲ移植することができる［例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＢｏｈｌｅｎ、（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． １８：４１１−９、ＧａｖｉｌｏｎｄｏおよびＬａｒｒｉｃｋ、（２０００） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：１２８−３２， １３４−６， １３８、ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｉｔｔｌｅ、（１９９９） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：１７３−２０１を参照せよ］。本明細書では「抗体」という用語は有用な抗原結合特異性を有する分子を意味する。当業者であれば、この用語が、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントであり、かつそのモノクローナル抗体と同一または非常に類似した機能性を示しうるポリペプチドをも包含することは容易に理解されよう。そのような抗体フラグメントまたは誘導体は、本明細書で用いられている抗体という用語に包含されることが意図されている。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体と結合できるＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープ、およびそれらのミモトープを含む免疫原は、本発明の重要な態様を形成する。これらの抗体と結合できるミモトープを含むワクチンは、髄膜炎菌疾患の治療または予防において有用である。
【００５１】
本発明のモノクローナル抗体を髄膜炎菌のＬ３，７，９ ＬＯＳの新規のミモトープを同定するために使用すること、さらにそれを免疫原として使用することも、本発明の重要な態様を形成する。
【００５２】
本発明は、本発明のエピトープまたはミモトープ（上記で定義したもの）を含む新規ペプチドの、髄膜炎菌疾患の予防または治療のための医薬組成物の製造における使用を提供する。また、本発明のミモトープまたはペプチドとキャリアー分子とを含む免疫原が、髄膜炎菌疾患の免疫学的予防または治療のためのワクチンにおける使用のために提供される。従って、本発明のミモトープ、ペプチド、または免疫原は、医薬における使用、および髄膜炎菌疾患の内科的治療または予防における使用のために提供される。従って、髄膜炎菌疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい患者に本発明のワクチンまたは医薬を投与することを含む、髄膜炎菌疾患の治療法が提供される。
【００５３】
本発明のワクチンには適切な賦形剤または希釈剤も含めることができる。アジュバントを含めることが有利である。本発明のワクチンのための適切なアジュバントとしては、本発明の免疫原に対する抗体応答を増強させることのできるアジュバントが含まれる。アジュバントは当技術分野では周知のものである（「ワクチンデザイン−サブユニットとアジュバントを用いるアプローチ（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ − Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」 １９９５， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， 第６巻， Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ， Ｍ．Ｊ．編， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ， ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。本発明の免疫原と共に用いるための好ましいアジュバントとしてはアルミニウム塩またはカルシウム塩（例えば、水酸化物塩またはリン酸塩）が含まれる。他のアジュバントとしては、ＱＳ２１（米国特許第５，０５７，５４０号）および３Ｄ−ＭＰＬ（英国特許第２２２０ ２１１号）などのサポニンアジュバントが含まれる。
【００５４】
本発明のワクチンは、通常は初回免疫投与と追加免疫投与の両方に用いられる。追加免疫投与は十分な間隔をおいて、または、好ましくは毎年もしくは循環血液中の抗体レベルが所望のレベル未満となった際に、行われることが期待される。追加免疫投与は、最初に用いたキャリアー分子を含まないペプチドから構成されるものであってよい。そのようなブースター（追加免疫）構築物は、別のキャリアーを含んでもよく、またはキャリアーを全く含まなくてもよい。
【００５５】
本発明のワクチン調製物は、全身経路または粘膜経路によって該ワクチンを投与することにより、髄膜炎菌疾患に罹患しやすいかまたは罹患している哺乳類を保護または治療するために用いることができる。このような投与には、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、もしくは皮下経路による注射、または、口腔／消化管、呼吸器、泌尿生殖管への粘膜投与が含まれる。
【００５６】
ワクチンの各用量に含めるタンパク質、ペプチド、またはコンジュゲート化ペプチドの量は、典型的な被ワクチン接種者において著しい有害な副作用を生じることなく免疫防御応答を惹起する量が選択される。そのような量は、どの特定の免疫原を用いるか、どのようにその免疫原を提示させるかに応じて変動する。一般的には、各用量は、１〜１０００μｇ、好ましくは１〜５００μｇ、好ましくは１〜１００μｇのタンパク質／ペプチドを含むと考えられ、そのうち１〜５０μｇが最も好ましい範囲である。ある特定のワクチンに対して最適な量は、被験体において適切な免疫応答が生ずることを観察することを含む標準的な研究によって、確かめることができる。初回ワクチン接種後、被験者は適切に間隔をあけて、１回または数回の追加免疫を受けるであろう。
【００５７】
本発明の態様はまた、診断用アッセイにおいても用いることができる。例えば、本発明のペプチドまたはミモトープは、患者の血清中のＬ３，７，９ ＬＯＳに対する抗体を検出するために用いることができる。同様に、本発明のモノクローナル抗体は患者から得たサンプル中のＬ３，７，９免疫型髄膜炎菌の存在を検出するために用いることができる。
【００５８】
ワクチン調製物については「ワクチンの新潮流と開発（Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」 Ｖｏｌｌｅｒら編， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ． １９７８中に総説として記述されている。タンパク質の巨大分子へのコンジュゲーションは、Ｌｉｋｈｉｔｅ， 米国特許第４，３７２，９４５号およびＡｒｍｏｒら、米国特許第４，４７４，７５７号によって開示されている。
【００５９】
本発明の別個の態様は、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープおよびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ２ ＬＯＳのミモトープを含む、血清型Ｂ、Ｃ、Ｙ、またはＷ−１３５の髄膜炎菌に対するワクチンである。このワクチンは、場合により、Ｃ、Ｙ、およびＷ−１３５からなる群から選択される、１種以上の、髄膜炎菌莢膜多糖そのものまたはコンジュゲート化髄膜炎菌莢膜多糖を、さらに含むことが有利である。
【００６０】
さらに別の態様は、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープおよびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ１０ ＬＯＳのミモトープを含む、血清型Ａの髄膜炎菌に対するワクチンである。このワクチンは、場合により、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清型Ａの莢膜多糖そのものまたはそのコンジュゲート化形態をも含むことが有利である。
【００６１】
さらなる態様は、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープ、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ１０ ＬＯＳのミモトープ、およびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ２ ＬＯＳのミモトープを含む、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、またはＷ−１３５の髄膜炎菌に対するワクチンである。このワクチンは、Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ−１３５からなる群から選択される、１種以上の、髄膜炎菌莢膜多糖そのものまたはコンジュゲート化髄膜炎菌莢膜多糖を、さらに含むことが有利である。
【００６２】
本発明者らは、上記製剤が、上述の髄膜炎菌血清群内に包含される変異株の大多数に対する哺乳類宿主の免疫保護において非常に有効であることを見出した。好ましくは、本発明のミモトープを用いて宿主を免疫することにより、ＬＯＳと特異的に交叉反応する抗体、好ましくはＬＯＳを含んでいる細菌の細胞全体と交叉反応する抗体を産生させることができる。
【００６３】
各ミモトープはペプチド性または非ペプチド性のものであってよい。非ペプチド性のミモトープは、分子量の点ではペプチド性の対応物と同程度のサイズを有するものを意図している。好ましくは、そのようなミモトープは、それぞれの髄膜炎菌の表面ＬＯＳに対して高い特異性および／またはアフィニティーを有するモノクローナル抗体との抗原としての交叉反応性を有する。好ましくは、上述のワクチンの組み合わせに含まれる一方または両方のミモトープは、ペプチドエピトープを含んでなる。
【００６４】
ペプチドエピトープは、髄膜炎菌のそれぞれの表面ＬＯＳに特異的な（および／または高いアフィニティーを有する）モノクローナル抗体を用いてペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。本発明においては、「高いアフィニティー」とは、通常は少なくとも１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０６Ｍ−１のアフィニティー定数を示すことを意味している。
【００６５】
ＬＯＳに対して高い特異性および／またはアフィニティーを有するモノクローナル抗体は、免疫原として外膜複合体を用い、確立されているプロトコールに従って（例えば、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９８３． Ｉ＆Ｉ ４０：２５７−２６４； Ａｂｄｉｌｌａｈｉら、１９８８． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ４：２７−３２）抗原を検出することにより、製造することができる。
【００６６】
本発明のミモトープは、好ましくは、モノクローナル抗体を用いてペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定することのできるペプチドエピトープを含んでなる。典型的には、ヘプタペプチドまたはノナペプチド（上記参照）ライブラリーなどのペプチドライブラリーであって好ましくは可能性のあるアミノ酸配列を全て含むライブラリーを用いることにより、該モノクローナル抗体との抗原としての交叉反応性が評価されうる潜在的エピトープについて、最大の多様性をもたらすようにすべきである。典型的には、このような性質を有するランダムペプチドライブラリーが用いられる。
【００６７】
好ましくは本発明のミモトープは、選択手段として用いる以下のモノクローナル抗体との交叉反応性を利用して得られるものである：Ｌ３，７，９ ＬＯＳミモトープに対してはＨ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０、Ｈ４４／７８、４ＢＥ１２Ｃ１０、４Ａ８−Ｂ２、または９−２−Ｌ３９７； Ｌ２ ＬＯＳミモトープに対してはＦ１−５Ｈ ５／ＩＤ９； そしてＬ１０ ＬＯＳミモトープに対しては５Ｂ４−Ｆ９−Ｂ１０。
【００６８】
Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０、Ｈ４４／７８、および４ＢＥ１２Ｃ１０抗体については上述のとおりである。４Ａ８−Ｂ２、９−２−Ｌ３９７、Ｆ１−５Ｈ ５／ＩＤ９、および５Ｂ４−Ｆ９−Ｂ１０モノクローナル抗体は、国立生物学的製剤研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）， Ｂｌａｎｃｈｅ Ｌａｎｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｍｉｍｍｓ， Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｂａｒ， Ｈｅｒｔｓ， ＥＮ６ ３ＱＧ， ＵＫから入手することができ、また、ＥＣＡＣＣからも入手することができる。
【００６９】
上述の製剤のペプチドミモトープは、上述のとおりコンフォメーションが拘束されたものでもよい。それぞれの製剤についての各ミモトープは単一の分子内に含有されていてもよい。それらのミモトープは上述したような同一または異なるキャリアー分子と連結させることができる。例えば、それらのミモトープを、髄膜炎菌の同一の外膜タンパク質の、同一のまたは異なる露出ループ領域内に挿入するか、またはそれと置換することができる（上述）。
【００７０】
本発明の製剤に用いられるＬ３，７，９ ミモトープは、好ましくは上述の本発明のミモトープおよびペプチドである。あるいは、Ｌ３，７，９ ＬＯＳのミモトープは、ＷＯ ００／２５８１４に開示されているペプチド、好ましくは以下： ＩＨＲＱＧＩＨ、ＨＩＧＱＲＨＩ、ＬＰＡＲＴＥＧ、ＧＥＴＲＡＰＬ、ＡＰＡＲＱＬＰ、ＰＬＱＲＡＰＡ、ＫＱＡＰＶＨＨ、ＨＨＶＰＡＱＫ、ＬＱＡＰＶＨＨ、ＨＨＶＰＡＱＬ、ＬＰＳＩＱＬＰ、ＰＬＱＩＳＰＬ、ＮＥＬＰＨＫＬ、ＬＫＨＰＬＥＮ、ＫＳＰＳＭＴＬ、ＬＴＭＳＰＳＫ、ＡＧＰＬＭＬＬ、ＬＬＭＬＰＧＡ、ＷＳＰＩＬＬＤ、ＤＬＬＩＰＳＷ、ＬＳＭＨＰＱＮ、ＮＱＰＨＭＳＬ、ＨＳＭＨＰＱＮ、ＮＱＰＨＭＳＨ、ＳＭＹＧＳＹＮ、ＮＹＳＧＹＭＳ、ＴＮＨＳＬＹＨ、ＨＹＬＳＨＮＴ、ＨＡＩＹＰＲＨ、ＨＲＰＹＩＡＨ、ＴＴＹＳＲＦＰ、ＰＦＲＳＹＴＴ、ＴＤＳＬＲＬＬ、ＬＬＲＬＳＤＴ、ＳＦＡＴＮＩＰおよびＰＩＮＴＡＦＳ、から選択されるペプチドを含んでなるものであってよい。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態は、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープ、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ１０ ＬＯＳのミモトープ、およびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の表面のＬ２ ＬＯＳのミモトープを含み、場合により、Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ−１３５からなる群から選択される１種以上の髄膜炎菌莢膜多糖そのものまたはコンジュゲート化髄膜炎菌莢膜多糖をさらに含む、髄膜炎菌疾患の治療または予防に特に有益な汎用性のあるワクチンである。
【００７２】
本発明のさらに好ましい実施形態は、上述したワクチンの組み合わせ（好ましくはＬ３，７，９、Ｌ２およびＬ１０ペプチドミモトープを含み、場合により１種以上の髄膜炎菌莢膜多糖をさらに含むもの）、および１種以上の肺炎球菌莢膜多糖そのものまたはコンジュゲート化肺炎球菌莢膜多糖を含む、髄膜炎の治療または予防に特に有益な汎用性のあるワクチンである。肺炎球菌莢膜多糖抗原は、好ましくは、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから（最も好ましくは血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆから）選択されるものである。
【００７３】
本発明におけるまた別の好ましい組み合わせは、Ｌ３，７，９、Ｌ２、およびＬ１０からなるリストからの１種または２種以上（２または３種）のペプチドミモトープと、他のものと結合させたインフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜多糖とを含む、髄膜炎の治療または予防に特に有益な汎用性のあるワクチンである。
【００７４】
上述のワクチンの組み合わせは医薬としての使用に適しており、髄膜炎菌疾患の治療または予防のための医薬品の製造に用いることができる。上述のワクチンの組み合わせを患者に投与することを含む、髄膜炎菌疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい患者を治療する方法は、本発明のさらなる態様である。
【００７５】
実施例
下記の実施例は標準的な技法を用いて行われたものであり、そのような技法は、特に詳細に説明しない限りは、当業者にはよく知られた日常的に行われているものである。これらの実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【００７６】
実施例１：ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬ３，７，９ ＬＯＳに対するモノクローナル抗体
１．１  モノクローナル抗体の単離と機能的特徴付け
免疫
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂの細胞（Ｈ４４／７６単離体、Ｂ：１５：Ｐ１．７、１６、ＬＯＳ ３，７，９、由来の熱不活化細胞）を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに０日目、２１日目、および４２日目の３回注射した（５匹／群）。水中油型／３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１アジュバント（ＷＯ ９５／１７２１０に記載のとおり）中に製剤化した細胞を皮下経路および腹腔内経路の両方で注射した。第３回目の注射の７日後に、全細胞ＥＬＩＳＡで動物の抗体応答を評価した。
【００７７】
特異的ハイブリドーマ細胞系を得るための融合法
融合の１０日前および７日前に、Ｓｐ２／０ Ａｇ １４ミエローマ細胞を解凍してそれをフラスコ中で培養し、培養物１ｍｌあたり１０５細胞に達して融合を行う日（０日目）までそれが維持されるようにした。融合の１日前に骨髄腫細胞の濃度を１０５細胞／ｍＬに調整した。同時に、腹腔マクロファージを使用するフィーダー細胞のプレートを用意した（１０５マクロファージ／ｍＬ； １００μＬ／ウェル）。
【００７８】
０日目に、選択したマウスの脾臓を（滅菌条件下で）摘出し、ペトリ皿中の１０〜２０ｍＬのＤＭＥＭ培地中に分散させた。細胞を計数し（Ｓｙｓｍｅｘカウンター、および赤血球を溶解させるための２滴の「Ｑｕｉｃｋｌｙｓｅｒ」を用いて）、１５０〜２００ｇで１０分間遠心分離した（１０００ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＰＲ 遠心機使用）。Ｓｐ２／０および脾臓細胞を洗浄、計数し、１５０〜２００ｇで１０分間遠心分離した後、１：５（Ｓｐ２／０：脾臓細胞）の比で混合した。この１：５という混合比は２５ｍＬのＤＭＥＭ中で達成され、それを４００ｇで５分間遠心分離した（ＧＰＲ遠心機、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブを用いて１５００ｒｐｍで行った）。上清を棄て、チューブを軽くはじいてペレットを懸濁させた。細胞を水浴中にてできる限り３７℃で維持した。３７℃に維持した１ｍＬのＰＥＧ溶液（５％ ＤＭＳＯ， ４０％ ｖ／ｖとしたＰＥＧ４０００， ｐＨ８．０〜８．２）を、そのチューブを軽く揺らしながら１分間以内で少量ずつ（滴下して）添加した。細胞の温度はできる限り３７℃に近くしなければならなかった。このＰＥＧステップ以後は、細胞を穏和な操作で取り扱った。３０秒〜１分後に、１ｍＬのＤＭＥＭを１分間以内で添加し、次いで２ｍＬのＤＭＥＭを２分間以内で添加し、次いで４ｍＬのＤＭＥＭを４分間以内で添加した。最後にそのチューブにＤＭＥＭ＋添加剤を満たして液量を約２０ｍＬとし、４００ｇで１０分間遠心分離した。
【００７９】
その後、凝集物をほぐすために、２５ｍＬピペットを用いてペレットを１５〜２５ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ、ＦＣＳ＋ＨＳ（Ｖｏｌｋｅｒ）、ＨＡＴ、およびＮｕｔｒｉｄｏｍａ）中に穏和に懸濁した。
【００８０】
そのチューブを、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で２時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を適切な濃度（２．５×１０４から１０５細胞／ウェル）まで希釈し、細胞１００μＬをあらかじめフィーダー細胞を播種しておいた９６ウェルのマイクロプレートにプレーティングした。
【００８１】
１．２  全細胞ＥＬＩＳＡによる細胞表面エピトープの認識
動物血清中、ならびに脾臓細胞を融合させた後のハイブリドーマ培養物の上清中の、特異的な抗ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗体を検出するために、被覆される細菌としてＨ４４／７６ ＭｅｎＢ類似株（Ｂ：１５：Ｐ１．７， １６）を用いた。簡潔に述べれば、６時間にわたる培養物から得たＨ４４／７６菌液（含有される細菌は４００μｇ／ｍＬのテトラサイクリンで殺滅した）の１／１０希釈物（ＰＢＳ中）を１００μＬ用いて、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ， Ｎｕｎｃ）を被覆した。プレートを３７℃で少なくとも１６時間、プレートが完全に乾燥するまでインキュベートした。次いで、プレートを３００μＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ − ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した。その後、プレートをさらに１００μＬのＰＢＳ−０．３％ カゼインにより上から被覆し、振盪しつつ室温で３０分間インキュベートした。プレートを抗体とのインキュベーション前に行った方法と同じ方法を用いて再度洗浄した。動物血清をＰＢＳ−０．３％ カゼイン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中へ２倍に連続希釈し、マイクロプレート中に入れた後、振盪しつつ室温で３０分間インキュベートし、その後再度同じ洗浄ステップを実施した。モノクローナル抗体のスクリーニング用には、上清をそのまま（希釈せずに）マイクロプレート中に入れた。細胞表面の複数の抗原に対して特異的な抗体を検出するために、ビオチンとコンジュゲートさせた抗マウス免疫グロブリン（ウサギＩｇ、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ Ｅ０４１３）をＰＢＳ−０．３％カゼイン−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中に１／２０００に希釈して用いた。最後の洗浄ステップ（前述）の後、プレートを同じ溶液中に１／４０００に希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体溶液を加えて、振盪しつつ室温で３０分間インキュベートした。モノクローナル抗体を特徴付けるために、上述と同じ方法を用いて被覆される細菌として他の数種のナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ株も用いたが、それらは次のとおりである： 英国でヒトから単離されたＭ９７２５０ ６８７（Ｂ：４：Ｐ１．１５）株およびＭ９７２５２０７８株。莢膜多糖を欠いており変異型のＬＯＳを有している形質転換Ｈ４４／７６Ｄ細胞も、これらのモノクローナル抗体を特徴付けるための全細胞ＥＬＩＳＡに用いられる（次の節を参照せよ）。これらの抗体の全細胞ＥＬＩＳＡでの反応性は、シグナル検出なし（−）から強い反応性（＋＋＋）まで様々であった。
【００８２】
１．３  株の形質転換
プラスミドｐＭＦ１２１（Ｆｒｏｓｃｈら， １９９０）を、莢膜多糖を欠くナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ株を構築するために用いた。このプラスミドは、Ｂ型多糖（Ｂ ＰＳ）生合成経路をコードする遺伝子クラスターの末端に対応する組換え領域に隣接したエリスロマイシン耐性遺伝子を含んでいる。Ｂ ＰＳを欠失させるとＢ型の莢膜多糖の発現の喪失ならびにｇａｌＥの活性コピーの欠失がもたらされ、それはガラクトース欠損リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の合成をもたらす。
【００８３】
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ株のＨ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７， １６； ＬＯＳ ３，７，９）を形質転換に用いた。Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）プレート（エリスロマイシン不含）上で一晩にわたるＣＯ２インキュベーションを行った後、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するＭＨ液中に細胞を集め（一枚のＭＨプレートあたり２ｍＬを用いた）、ＯＤ（５５０ｎｍ）が０．１となるまで希釈した。この液の２ｍＬに対して４μＬのプラスミドｐＭＦ１２１ストック溶液（０．５μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で（振盪しつつ）６時間インキュベートした。対照群では、同量のナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）菌を用いて、プラスミドは添加せずに行った。インキュベーション後、エリスロマイシンを５、１０、２０、４０、または８０μｇ／ｍＬ含有するＭＨプレート中に、培養物の原液、１／１０希釈物、１／１００希釈物、および１／１０００希釈物を１００μＬ入れて、その後３７℃で４８時間インキュベートした。
【００８４】
コロニーブロッティング：
プレートをインキュベーションした後、形質転換体を選択し、エリスロマイシン／ＭＨプレート（１０〜８０μｇエリスロマイシン／ｍＬ）上で増殖させた。翌日、目視し得るコロニーを全て、エリスロマイシン不含の新たなＭＨプレート上にて増殖させた。次いで、それらのコロニーをニトロセルロースシート上に転写し（コロニーブロッティング）、Ｂ型多糖の存在をプローブ検出した。簡潔に述べれば、コロニーをニトロセルロースシート上にブロットし、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中で直接すすいだ後、細胞をＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（希釈バッファー）中で５６℃で１時間かけて細胞を不活化した。その後、ニトロセルロース膜に希釈バッファーを重層して室温（ＲＴ）で１時間置いた。次いで、膜を再度希釈バッファー中で５分間×３回洗った後、希釈バッファー中に１／３０００に希釈した抗Ｂ ＰＳ ７３５ Ｍａｂ（Ｄｒ． ＦｒｏｓｃｈからＢｏｅｒｈｉｎｇｅｒを通じて入手）と共に室温で２時間インキュベートした。新たな洗浄ステップ（３回、５分間）の後、モノクローナル抗体は、希釈バッファー中に５００倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手）（ＲＰＮ １００１）を用いて検出し、続いて次の洗浄ステップ（上述のステップと同じ）にかけた。その後、ニトロセルロースシートを、希釈バッファー中に１／１０００に希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体の溶液と共に室温で１時間インキュベートした。最後の３回の洗浄を上述と同じ方法を用いて行った後、ニトロセルロースシートを顕色溶液（Ｍｅｒｃｋから入手した、１０ｍｌエタノール＋４０ｍＬ ＰＢＳ中に３０ｍｇの４−クロロ−１−ナフトールを含有する溶液、および３０μＬのＨ２Ｏ２ ３７％）を用いて暗所で１５分間インキュベートした。この反応は蒸留水での洗浄ステップで停止させた。抗Ｂ ＰＳ Ｍａｂとの反応性を示さないクローンをさらに全細胞ＥＬＩＳＡで特徴付けした。
【００８５】
全細胞ＥＬＩＳＡ：
全細胞ＥＬＩＳＡは、被覆される細菌（２０μｇ／ｍＬ）としての形質転換コロニーおよび野生型株（Ｈ４４／７６）、およびナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株を特徴付けるために用いる種々のモノクローナル抗体のセットを使用して行った。次のモノクローナル抗体を試験した。抗Ｂ ＰＳ（Ｄｒ． Ｆｒｏｓｃｈからの７３５）、および国立生物学的製剤研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｌｏｎｄｏｎ）から入手したその他のモノクローナル抗体：抗Ｂ ＰＳ（Ｒｅｆ ９５／７５０）、抗Ｐ１．７（Ａ−ＰｏｒＡ， Ｒｅｆ ４０２５）、抗Ｐ１．１６（Ａ−ＰｏｒＡ， Ｒｅｆ ９５／７２０）、抗ＬＯＳ ３，７，９（Ａ−ＬＰＳ， Ｒｅｆ ４０４７）、抗ＬＯＳ ８（Ａ−ＬＰＳ， Ｒｅｆ ４０４８）、および抗Ｐ１．２（Ａ−ＰｏｒＡ， Ｒｅｆ ９５／６９６）。
【００８６】
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ， Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中で約２０μｇ／ｍＬの濃度の組換え髄膜炎菌Ｂ株細胞溶液を約２０μｇ／ｍＬで含むＰＢＳを１００μＬ用いて、３７℃で一晩かけて被覆した。その後、プレートを３００μＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、１００μＬのＰＢＳ−０．３％ カゼインを重層し、振盪しつつ室温で３０分間インキュベートした。プレートを前述と同じ方法で再度洗った後、抗体と共にインキュベートした。モノクローナル抗体（１００μＬ）をＰＢＳ−０．３％ カゼイン−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中に種々の希釈度で希釈したものをマイクロプレートに入れた後、振盪しつつ室温で３０分間インキュベーションし、次いで前述と同じ洗浄ステップを行った。ビオチンをコンジュゲートさせてＰＢＳ−０．３％ カゼイン−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中に１／２０００希釈した抗マウスＩｇ（ウサギ由来、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ Ｅ０４１３）の１００μＬをウェルに添加し、結合したモノクローナル抗体を検出した。洗浄ステップ（前述のとおり）の後、同じ使用溶液中に１／４０００に希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体溶液（１００μＬのＡｍｅｒｓｈａｍ ＲＰＮ １０５１）をプレートに加えて、振盪しつつ室温で３０分間インキュベートした。このインキュベーションおよび最後の洗浄ステップの後、１００μＬの発色溶液（４ｍｇのオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含有する５μＬのＨ２Ｏ２を１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）に添加したもの）をプレートに加えて、暗所で１５分間インキュベートした。次いで、プレートを分光光度計を用いて４９０／６２０ｎｍで読み取った。
【００８７】
通常、形質転換体の約１０％が二重乗り換えによって得られる。ＢＰＳおよびＬＯＳに対する反応性を欠いているがＰ１．７とＰ１．１６モノクローナル抗体に対しては依然として反応性を有する細菌クローンＨ４４／７６Ｄを、さらに研究するために選択した。
【００８８】
１．４ 殺菌アッセイ
これらのモノクローナル抗体の殺菌活性を測定した。簡潔に述べれば、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ（第１の株としてＨ４４／７６株）を用いて抗体（動物もしくはヒトの血清、またはモノクローナル抗体）の殺菌活性を測定する。Ｕ底の９６ウェルマイクロプレート（ＮＵＮＣ）中で、５０μＬ／ウェルの２倍連続希釈血清を、２．５×１０４ ＣＦＵ／ｍＬに調整した対数増殖期の髄膜炎菌懸濁液 ３７．５μＬ／ウェルと共に、２１０ｒｐｍで振盪しつつ３７℃で１５分間インキュベートした（Ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ， Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。次いで、１２．５μＬの新生児ウサギ補体（Ｐｅｌ−ｆｒｅｅｚｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， ＵＳ）を添加した後、同一条件でさらに１時間インキュベートした。その後、各ウェルからのその混合液の１０μＬのアリコートを、１％のＩｓｏｖｉｔａｌｅｘと１％の熱不活化ウマ血清とを含有するＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート上にスポットし、５％ ＣＯ２下で３７℃で一晩インキュベートした。翌日、試験した各希釈率についてコロニー数を数え、血清不含の補体対照と比較して５０％殺滅する血清の希釈率として殺菌力価を決定する、。この方法では、個々のコロニーを１スポットあたり１００ＣＦＵまで計数することができる。力価は５０％の殺滅をもたらす希釈率として表され、回帰分析によって計算される。
【００８９】
１．５  結果
表１はナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＨ４４／７６株で免疫したマウスから得られた脾臓細胞を用いた２つの融合実験で４種類の抗ＬＯＳモノクローナル抗体を用いて得た結果を示している。４種のモノクローナル抗体のＬＯＳ特異性は、これらの抗体が全細胞ＥＬＩＳＡにおいてＨ４４／７６Ｄ（Ｂ ＰＳ、ＬＯＳ変異型）と反応しないが野生型のＨ４４／７６株とは容易に反応することによって確かめられる。ＢＰＳには免疫原性がないことを考慮すると、これらのモノクローナル抗体が莢膜多糖と反応するとは全く考えられない。４種のモノクローナル抗体は全て野生型のＨ４４／７６株に対して殺菌活性を示した。モノクローナル抗体Ｈ４４／２４とＨ４４／５８は全細胞ＥＬＩＳＡによりナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＭ９７２４０６８７株およびＭ９４２５２０７８株と交叉反応することが示された。
【００９０】
【表１】
2004526418.tif 000003
【００９１】
１．６ ４種類の選択したモノクローナル抗体の構造的特徴付け
モノクローナル抗体の一次構造を、重鎖と軽鎖の可変領域をコードしているｃＤＮＡの配列決定によって決定した。これを行うためにこれら４種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから総ＲＮＡを抽出した。配列決定は、重鎖または軽鎖に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行った後に得られるＲＴ−ＰＣＲ産物について行った。
【００９２】
ハイブリドーマからのＲＮＡの抽出
細胞数をトーマ血球計算盤で計数して決定された１０６個の細胞から抽出を行う。細胞を１２００ＲＰＭで１０分間遠心分離し上清を除去する。細胞を１２００ＲＰＭで再度遠心分離し、微量の上清を全て除去する。細胞を２００μＬのＲＮａｓｅ不含のＰＢＳ中に再懸濁する。ＲＮＡの抽出は「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて製造業者の使用説明書に従って行う。溶出は１００μＬの溶出バッファーで行う。
【００９３】
逆転写
１０μＬの精製ＲＮＡを１．２５μｇのｄＴ１５プライマーと混合し最終液量を２０μＬとした。そのＲＮＡ−プライマー混合物を７０℃で１０分間加熱し、次いで４℃に冷却した。逆転写は下記のプロトコールで行った：
０．２ｍＬチューブに次のものを添加した：
・上述のアニールしたプライマー−ＲＮＡ混合物  １０μＬ
・０．１Ｍ ＤＴＴ  ５μＬ
・ｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭ）  ２．５μＬ
・ＲＮａｓｅインヒビター（１０ｕ／μＬ， ＧｉｂｃｏＢＲＬ）  ０．５μＬ
・Ｍ−ＭＬＶ 逆転写酵素（２００Ｕ／μＬ， ＧｉｂｃｏＢＲＬ）  ２．５μＬ
・ＲＴバッファー（５×）  １０μＬ
・Ｈ２Ｏ  総量５０μＬとなるまで添加。
【００９４】
この溶液を３７℃で１時間インキュベートし、９５℃で５分間かけて酵素を不活化し氷上で冷却した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を含まないこと以外は同じ成分を含んでいるチューブを陰性対照として用いた。
【００９５】
ｃＤＮＡに対するＰＣＲ
軽鎖および重鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために用いたプライマーは、Ｋａｎｇら（Ｋａｎｇら、１９９１， Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２（２）：１１１−１１８）の報告に従って以下のとおりデザインした。
【００９６】
2004526418.tif 000004
【００９７】
ＰＣＲは次のとおり行った：
０．２ｍＬの反応チューブ中に次のものを混合した：
・鋳型（ＲＴ−ＰＣＲ産物または陰性対照）  ５μＬ
・反応バッファー（１０×）  ５μＬ
・ｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭ）  １μＬ
・各プライマー（２０μＭストック）  １．５μＬ
・ＲＥＤＴａｑ ポリメラーゼ（１Ｕ／μＬ， Ｓｉｇｍａ）  ２．５μＬ
・Ｈ２Ｏ  総量５０μＬとなるまで添加。
【００９８】
ＰＣＲ反応は次の温度サイクルで行った：
９４℃で４分間
９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３５回
７２℃で４分間
４℃。
【００９９】
これらの反応はＲＴ反応（Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は含まず）からの陰性対照についても行って、ＰＣＲ産物がｃＤＮＡから得たものであってゲノムＤＮＡからのものでないことを確認した。陰性対照からはＰＣＲ産物は全く得られなかった。得られたＰＣＲ産物を「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて製造業者の使用説明書に従って精製した。
【０１００】
精製ＰＣＲ産物の配列決定
配列決定をＰＣＲ産物について行ったため、配列のエラーが生じていないことを確認するために、配列決定すべき各ｃＤＮＡから独立に２回行ったＰＣＲで得た産物について配列決定した。
【０１０１】
シークエンシング反応は、１μＬの精製ＰＣＲ産物について、「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」を製造者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の使用説明書に従って使用して行い、さらにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７シークエンサーで分析した。４種のモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の配列は配列番号２８１〜２８８に示している。
【０１０２】
実施例２：ファージディスプレイペプチドライブラリーからのナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＬＯＳのペプチドミモトープの単離
上述のナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＬＯＳに対する抗体のような細菌性多糖のエピトープに対するモノクローナル抗体は、分子の大規模なレパートリーをスクリーニングするために用いることができる。そのような分子ライブラリーは化学的に様々なものであってよく、例えばペプチド、ペプトイド、またはヌクレオチドのライブラリーであってよい。ペプチドライブラリーは、合成によって（可溶性のペプチドとしてまたは支持体に結合したペプチドとして）、または生物学的に（例えば細胞質のタンパク質もしくは表面タンパク質との融合体として）得ることができる。最もよく使われている系の１つは、ＰＩＩＩおよびＰＶＩＩＩタンパク質などの線状バクテリオファージのコートタンパク質と融合させたペプチドのディスプレイである。これらのライブラリーは、それら２種のタンパク質のうちの１つをコードするＯＲＦの５’領域に、縮重配列を含むオリゴヌクレオチドを挿入することによって得られる。線状ファージが構造タンパク質に囲まれたファージ環状一本鎖ＤＮＡからなるために、ファージの表面でＰＩＩＩまたはＰＶＩＩＩタンパク質と融合して発現されるペプチドは、それらのペプチドをコードするＤＮＡと物理的に連結されている。この研究では、２種類のファージディスプレイされたペプチドライブラリーを、５種のモノクローナル抗体を用いたペプチドの選択のために用いた。これらの２つのライブラリーは既に報告されているノナマー直鎖状ペプチドライブラリーおよびノナマージスルフィド拘束ペプチドライブラリーである（Ｆｅｌｉｃｉら、１９９３， Ｇｅｎｅ １２８：２１−２７； Ｌｕｚｚａｇｏら、１９９３， Ｇｅｎｅ １２８：５１−５７）。これらのライブラリーはファージミド中に構築され、縮重オリゴヌクレオチドは主要莢膜タンパク質であるｐＶＩＩＩをコードする遺伝子に融合される。大腸菌での形質転換とファージヘルパーでの重感染の後、得られるファージ粒子は組換えｐＶＩＩＩと非組換えｐＶＩＩＩタンパク質の両方が含まれ、その組換えｐＶＩＩＩタンパク質の割合は正確には規定されない。ペプチドの選択に用いる５種のモノクローナル抗体は、上述の４種と、Ｉａｎ Ｆｅａｖｅｒｓから入手したモノクローナル抗体４ＢＥ１２Ｃ１０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｌｏｎｄｏｎ）である。
【０１０３】
４ＢＥ１２Ｃ１０はまた、他の４つのライブラリーの混合物からのペプチドの選択にも用いた。これらのライブラリーは、ｆ８８−４線状ファージのｐＶＩＩＩタンパク質に融合させた１４〜１６個のアミノ酸の長さのペプチドを発現する。このベクターはＧｅｏｒｇｅｓ Ｓｍｉｔｈ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ−Ｃｏｌｕｍｂｉａ）から入手したものであり、２個の遺伝子ＶＩＩＩ、すなわち野生型遺伝子と、ｔａｃプロモーターの制御下にありｆｄ−ｔｅｔファージ由来の合成組換え遺伝子とを有する（Ｓｍｉｔｈ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６７， １５６−１６５， １９８８）。大腸菌に感染させた後、得られたファージ粒子は野生型および組換えｐＶＩＩＩタンパク質の両方を含んでおり、その組換えｐＶＩＩＩタンパク質はｐＶＩＩＩタンパク質全体の１０％未満である。これらの４つのライブラリーは、３、４、５、または６個の残基で隔てられた２個の内部システインを有するペプチドを発現するものであり、それらライブラリーはそれぞれＣｙｓ３、Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ５、およびＣｙｓ６と呼ばれる。
【０１０４】
２．１  パニング方法
３サイクルのパニングを行った。モノクローナル抗体Ｈ４４／２４とＨ４４／５８に対しては、ファージ−抗体複合体の固定に次の２つの方法を用いた。すなわち、プロテインＡを被覆したイムノプレート上での捕捉（以下ＰＡ法と呼ぶ）、またはプロテインＡを被覆した磁性ビーズ上での捕捉（以下ＤＹ法と呼ぶ）である。モノクローナル抗体Ｈ４４／７０、Ｈ４４／７８、および４ＢＥ１２Ｃ１０については、ファージ−抗体複合体をプロテインＬＡを被覆したイムノプレート上での捕捉によって回収した。
【０１０５】
２．１．１  プロテインＡを被覆したイムノプレート（ＰＡ）法（Ｈ４４／２４およびＨ４４／５８について）
第１サイクルとしては、Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を、０．１Ｍ 炭酸ナトリウム中に１０μｇ／ｍＬの濃度で含まれるプロテインＡ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）を用いて４℃で一晩かけて被覆した（用いるモノクローナル抗体のそれぞれについて１００μＬのプロテインＡ溶液を入れた４個のウェルを用いた）。同時に、ライブラリー混合物のサンプル（２つのライブラリーの各々につき５×１０１０ ｐｆｕ）を１０μｇのモノクローナル抗体を液量を最小限として（典型的には４０μＬ未満）加えて、４℃で一晩インキュベートした。翌日、１時間飽和させ（５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１μｇ／ｍＬのプロテインＡを含有する０．１Ｍ 炭酸ナトリウム溶液）、次いでＴｗｅｅｎ ２０ ０．５％（ｖ／ｖ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５）で４回洗浄した後、抗体−ファージ混合物に洗浄溶液を加えて４００μＬとし、４等分にした１００μＬのアリコートのそれぞれを、プロテインＡを被覆したディッシュ上で室温で３時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５％で１０回洗浄した後、結合したファージをグリシンバッファー（ｐＨ２．２）で室温で２０分間溶出させた。溶出液を直ちに中和し、感染性ファージ粒子の増幅と力価測定に用いた。増幅と力価測定に用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株はＤＨ１１Ｓ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）であった。その後のバイオパニングのサイクルでは、モノクローナル抗体の量を１μｇまで減らしたことを除いては、同じプロトコールを用いた。
【０１０６】
２．１．２  プロテインＡを被覆した磁性ビーズ（ＤＹ）法（Ｈ４４／２４およびＨ４４／５８について）
第１サイクルとしては、ライブラリー混合物のサンプル（２つのライブラリーの各々について５×１０１０ ｐｆｕ）を１０μｇのモノクローナル抗体を液量を最小限として（典型的には４０μＬ未満）加えて、４℃で一晩インキュベートした。翌日、４０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ プロテインＡ（Ｄｙｎａｌ， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）を、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、１時間飽和させ（５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１μｇ／ｍＬのプロテインＡを含有する０．１Ｍ 炭酸ナトリウム溶液）、次いでＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに２回洗浄した。抗体−ファージ混合物に洗浄溶液を加えて４０μＬとし、飽和させたＤｙｎａｂｅａｄｓ プロテインＡと混合し、室温で３時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５％で１０回洗った後、結合したファージをグリシンバッファー（ｐＨ２．２）を用いて室温で２０分間溶出させた。溶出液を実施例２．１．１のとおり処理した。その後のバイオパニングのサイクルでは、モノクローナル抗体の量を１μｇまで減らしたことを除いては同じプロトコールを用いた。
【０１０７】
２．１．３  プロテインＬＡを被覆したイムノプレート法（Ｈ４４／７０、Ｊ４４／７８、および４ＢＥ１２Ｃ１０について）
この方法で用いるプロトコールは、プロテインＡをプロテインＬＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＵＳＡ）と置き換えたこと、および精製していない濃縮ハイブリドーマ上清を用いたことを除いては、プロテインＡを被覆したイムノプレート法と同じである。
【０１０８】
２．１．４ Ｃｙｓ３からＣｙｓ６までのライブラリー混合物からの、モノクローナル抗体４ＢＥ１２Ｃ１０を用いた選択
プロトコールは下記の事項を除き、上述の２．１．１で述べたＰＡ法と同様であった：
・１回目のパニングには各ライブラリーについて３×１０１０ ＴＵを用いた。
【０１０９】
・３回のパニングサイクルについてモノクローナル抗体４ＢＥ１２Ｃ１０を３種類の異なる量で用いた。すなわち第１サイクルでは１０μｇ、第２サイクルでは１μｇ、および第３サイクルでは０．１μｇであった。
【０１１０】
・１回目と３回目のパニングのラウンドにおいてはファージ−抗体複合体を捕捉するためにプロテインＧ（１０μｇ／ｍＬ）を用い、２回目のパニングのラウンドにおいてはファージ−抗体複合体を捕捉するためにプロテインＡ（１０μｇ／ｍＬ）を用いた。
【０１１１】
２．２  ファージの増幅
ノナマーライブラリーからのファージ溶出物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＨ１１Ｓ）への感染によって増幅させ、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７により重感染させた。溶出物のサンプル（１回目のパニングラウンドの総量４７５μＬ中の４５０μＬ、または２回目もしくは３回目のパニングラウンドの総量４７５μＬ中の１００μＬ）を、１ｍＬのｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ細胞（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ中で、１０倍希釈でＯＤ６００ｎｍが０．１２５から０．２５の間となるまで増殖させたＤＨ１１Ｓ）と混合した。細菌は感染の直前と直後に緩徐に撹拌しつつ３７℃で１５分間保持した。次いで感染した細菌を、強く撹拌しつつ３７℃で３０分間増殖させ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した大きなＬＢプレート（ＬＢ Ａｍｐ）上に播いた。翌日、そのプレートを掻き取り、そのサンプルを１００ｍＬのＬＢ Ａｍｐに加えて、ＯＤ６００ｎｍが０．０５となるまで増殖させた。この培養物をＯＤ６００ｎｍが０．２から０．２５の間となるまで増殖させ、撹拌を遅くして１０分間行い、さらにＭ１３Ｋ０７を添加してＭＯＩ（感染の多重度）が２０となるようにヘルパーウイルスによる重感染を行った。この時点でＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭとなるように添加した。この培養物を撹拌せずに３７℃で１５分間インキュベートし、強く撹拌しつつ３７℃で５時間増殖させた。清澄化した上清をＰＥＧ−ＮａＣｌで沈殿させることによりファージを回収し、それを大腸菌（ＤＨ１１Ｓ）に感染させてＬＢ Ａｍｐプレート上に播くことによって力価測定を行った。
【０１１２】
Ｃｙｓ３／４／５／６ライブラリーからのファージ溶出物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｋ９１ｋａｎ）に感染させることによって増幅させた。溶出物のサンプル（１回目のパニングラウンドの総量４７５μＬ中の４５０μＬ、または２回目もしくは３回目のパニングラウンドの総量４７５μＬ中の１００μＬ）を１ｍＬのｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ細胞（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ中で、１０倍希釈でＯＤ６００ｎｍが０．１２５から０．２５の間となるまで増殖させたＫ９１ｋａｎ）と混合した。細菌は感染の直前と直後に緩徐に撹拌しつつ３７℃で１５分間保持した。次いで感染した細菌を０．２μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを添加したＬＢ培地中で強く撹拌しつつ３７℃で３０分間増殖させた。次いでテトラサイクリンを２０μｇ／ｍＬまで添加し、強く撹拌しつつ３７℃で一晩増殖させた。清澄化した上清をＰＥＧ−ＮａＣｌで沈殿させることによりファージを回収し、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｋ９１ｋａｎ）に感染させてＬＢ Ａｍｐプレート上に播くことによって力価測定を行った。
【０１１３】
２．３  イムノブロッティングによるスクリーニング
２．３．１  コロニーイムノブロッティングによるスクリーニング
コロニーイムノブロッティングによるスクリーニングを、３回のパニングサイクル後に得られたファージを感染させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＨ１１Ｓ）を用いて行った。７種類のファージサンプルを用いた：モノクローナル抗体Ｈ４４／７０、Ｈ４４／７８、および４ＢＥ１２Ｃ１０の各々を用いて選択したファージの１種類ずつのサンプル、ならびにモノクローナル抗体Ｈ４４／２４およびＨ４４／５８の各々を用いて選択した２種類ずつのサンプルを用いた。後者では２種類のサンプルはパニングに用いた２つの方法（上記のＰＡ法およびＤＹ法と呼ばれる方法）に対応したものである。
【０１１４】
アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）および１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するペトリ皿を使用して、ファージに感染している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を播いた。新鮮なコロニーをナイロン両性膜（Ｐｏｒａｂｌｏｔ ＮＹ ａｍｐ， Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ， Ｄｕｒｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に３７℃で２時間かけてブロットした。その膜を５％スキムミルクを含有するＴＢＳで飽和し（３７℃で２時間）、対応するモノクローナル抗体と共にインキュベートした。モノクローナル抗体の組換えｐＶＩＩＩタンパク質への結合は、飽和溶液中に１０００倍に希釈したＧＡＭ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて示した。次いで二次抗体の存在をＨＲＰ発色試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＵＳＡ）を用いて検出した。
【０１１５】
２．３．２  培養上清のイムノブロッティングによるスクリーニング
２種のナノマーライブラリーのモノクローナル抗体４ＢＥ１２Ｃ１０を用いたスクリーニングの場合には、コロニーイムノブロッティング技法では、２回目または３回目のラウンドのパニングからは、陽性クローンは示されなかった。個々の陽性クローンをいくつか単離することを試みるために、新たな実験を準備したが、それは各パニングラウンドから４８クローンを単離し、それらの単離されたクローンから９６ウェルフォーマットで重複してファージを産生させて、それにより培養上清のイムノブロット実験で陽性クローンの単離が迅速に行えるようにしたものである。培養と、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いた重感染によるファージ産生とは、９６ウェルフォーマットに合わせて培養体積を５００μＬに減らしたことを除いては、２．２節に記載したとおりに行った。培養上清１００μＬを９６ウェルフォーマットのドットブロッティング装置（ＢｉｏＲａｄ）中でニトロセルロース膜上に直接的にブロットし、コロニーイムノブロッティング実験の膜と同様にして処理した。
【０１１６】
モノクローナル抗体の結合は化学発光検出法によって示した。すなわち、膜をＬｕｍｉＬｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と共に室温で１０分間、暗所でインキュベートし、オートラジオグラフィーカセット中でその膜をオートラジオグラフィーフィルムと３０秒〜２、３分間接触させることにより、発光を検出した。同様のブロット膜を抗ファージ血清と共にインキュベートして、ファージを含有しているウェルの全てにおいてファージ粒子が同程度の量で存在することを確認した。
【０１１７】
２．４  選択されたペプチドの配列の決定
選択されたペプチドの配列は２段階の方法を用いて決定した。第１ステップでは提示されたペプチドをコードする領域の上流にアニーリングするオリゴヌクレオチド（ノナマーライブラリーについては５’−ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＡＴＴＡＣＧＣＣ−３’、またはＣｙｓ３／４／５／６ライブラリーについては５’−ＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴ−３’）および下流にアニーリングするオリゴヌクレオチド（ノナマーライブラリーについては５’−ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴ−３’、またはＣｙｓ３／４／５／６ライブラリーについては５’−ＡＴＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＴＡＴＣＴ−３’）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により組換え遺伝子８を増幅した。ＰＣＲは、Ｔｔｈ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯＴＯＯＬＳ， Ｍａｄｒｉｄ， Ｓｐａｉｎ）を用いて、増幅時に起こりうるエラーのリスクを確認するために重複して行った。ＰＣＲ産物は、Ｍ１３−４０フォワードプライマー（５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）（ノナマーライブラリー由来のペプチド用）、または５’−ＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴ−３’（Ｃｙｓ３／４／５／６ライブラリー由来のペプチド用）を使用し、「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」を製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の使用説明書に従って用いてシークエンシング反応させて、その後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７シークエンサーで分析した。
【０１１８】
１４８種類の異なる配列が得られ、それらは次のとおり分類された。
・モノクローナル抗体Ｈ４４／２４、Ｈ４４／５８、Ｈ４４／７０、およびＨ４４／７８により選択された１種類のペプチド（Ｎｏ．１の配列）
・モノクローナル抗体Ｈ４４／２４によってのみ（ＤＹ法またはＰＡ法のいずれかで）選択された１１種類のペプチド（Ｎｏ．２〜１２の配列）
・モノクローナル抗体Ｈ４４／５８によってのみ（ＤＹ法またはＰＡ法のいずれかで）選択された３０種類のペプチド（Ｎｏ．１３〜４３の配列、但しＮｏ．１７の配列を除く）
・モノクローナル抗体Ｈ４４／５８（ＤＹ法またはＰＡ法のいずれかにより）およびモノクローナル抗体Ｈ４４／７０によって選択された１種類のペプチド（Ｎｏ．１７の配列）
・モノクローナル抗体Ｈ４４／７０とＨ４４／７８によって選択された３種類のペプチド（Ｎｏ．４４〜４６の配列）
・モノクローナル抗体Ｈ４４／７０によってのみ選択された２８種類のペプチド（Ｎｏ．４７〜７４の配列）
・モノクローナル抗体Ｈ４４／７８によってのみ選択された２１種類のペプチド（Ｎｏ．７５〜９５の配列）
・モノクローナル抗体４ＢＥ１２Ｃ１０によってのみ選択された５３種類のペプチド（Ｎｏ．９６〜１４８の配列）。Ｎｏ．１４１および１４２の配列はシステイン架橋されたノナマーライブラリー由来のファージから得たもの。Ｎｏ．１４３〜１４５の配列は直鎖状ノナマーライブラリー由来のファージから得たもの。Ｎｏ．１４６〜１４８の配列はＣｙｓ６、Ｃｙｓ５、およびＣｙｓ３ライブラリーのそれぞれに由来するファージから得たもの。
【０１１９】
これらの配列を下記の表２に示す。
【０１２０】
【表２】
2004526418.tif 000005
【０１２１】
実施例３  ファージ上ペプチドとモノクローナル抗体との相互作用に関するＥＬＩＳＡ試験
多数のファージ上ペプチドに対するモノクローナル抗体の結合を調べるために、下記のプロトコールを用いて全てのクローンを独立に作製した。
【０１２２】
ノナマーライブラリ由来のクローン（表２、ペプチドＮｏ．１〜１４５）について
ファージを感染させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１１Ｓの前培養を一晩行って増殖させた。この前培養のサンプルを用いて新たな５０ｍＬの培養液に接種し、その開始時のＯＤ６００ｎｍを０．０５０とした。この培養物をＯＤ６００ｎｍが０．２０〜０．２５となるまで強く振盪しつつ３７℃で増殖させた。次いで線毛の再生を行わせるために培養を１５分間減速させた。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージをＭＯＩを２０として添加し、緩徐に撹拌しつつ３７℃で１５分以上置くことによって重感染させた。次いでＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、強く撹拌しつつ５時間増殖させた。
【０１２３】
Ｃｙｓ３／４／５／６ライブラリー由来のクローン（表２、ペプチドＮｏ．１４６〜１４８）について
対象のクローンを含んでいるＫ９１ｋａｎのコロニー（ＬＢ Ｔｅｔプレート上）を５０ｍＬの２０μｇ／ｍＬテトラサイクリン補充ＬＢ培地に添加し、強く撹拌しつつ３７℃で一晩増殖させた。
【０１２４】
全てのクローンについて
培養物を４０００ＲＰＭで１５分間遠心した。０．１５倍量のＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を上清に添加してファージを沈殿させ、４℃で一晩保持した。４０００ＲＰＭで４５分間遠心してファージを回収した。ＴＢＳ中に再懸濁した後、ファージを６５℃で１５分間加熱して、残存細菌を殺滅しサンプル中に存在する可溶性タンパク質を変性させた。次いでその溶液を遠心分離し、ペレットを棄てた。次いで上清中のファージを上述の方法で再度沈殿させた。最後にファージを２００μＬのＴＢＳ中に再懸濁した。ファージ粒子の濃度は２６９ｎｍ〜３２０ｎｍにおけるΔＯＤを測定して求めた。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡ試験
ファージをＭａｘｉｓｏｒｐ マルチウェルプレート上で５×１０１１粒子／ｍＬにて被覆した。被覆は１００μＬ／ウェルを用いて４℃で一晩かけて行った。プレートを５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＴＢＳにより３７℃で２時間かけて飽和させ、さらにＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（ｖ／ｖ）で５回洗った。次いで、モノクローナル抗体を被覆したウェル中で３７℃で１時間インキュベートし、５回洗い、ＧＡＭ−ＨＲＰコンジュゲート（１５００倍希釈、Ｄａｋｏ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を添加して３７℃で１時間かけて該モノクローナル抗体のファージへの結合を検出した。５回洗った後、ペルオキシダーゼ活性を、Ｋ−Ｂｌｕｅ（登録商標）基質（Ｎｅｏｇｅｎ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＵＳＡ）を添加して室温で２０分間反応させることによりモニターした。反応は２５μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させた。読み取りは４５０〜６３０ｎｍにて行った。各ファージの被覆は、それぞれのモノクローナル抗体を用いる試験用に、３回重複して行った。対照モノクローナル抗体は、選択するモノクローナル抗体と同じアイソタイプのものであるがナイセリア・メニンギチジス（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂとは反応しないものを用いた。
【０１２６】
結果
１つ以上のモノクローナル抗体を用いて陽性であることが示されたファージの全てについて、その結果を確認するために２回目の試験を行った。４６種のペプチドが少なくとも１種のモノクローナル抗体を用いて陽性であることが示された。それらのペプチド番号（表２を参照）は次のとおりである：１３、１４、１７、２２、２７、２８、２９、３０、３９、４５、４７、５０、５１、５３、５４、５５、５８、６１、６３、６６、７５、８２、８３、８５、８６、８７、８８、９３、１０３、１０４、１０５、１１５、１２４、１３１、１３２、１３３、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８。このことは、これらのペプチドが髄膜炎菌のＬ３，７，９ ＬＯＳのミモトープとして特に適するものであるという考えを支持する。
【０１２７】
１４８種の選択されたペプチドのうち１０２種はこの試験では陽性として検出されなかった。その理由は、それらのうちの少なくともいくつかについて、特に、この試験で陽性を示した他のペプチドとの間で保存モチーフを共有しているそれらのペプチドについては、そのペプチドは当該ファージの表面上での発現が良好ではないためと考えられる。そのような場合には、より高感度な試験で、それらのペプチドのうちのいくつかは実際には１種以上のモノクローナル抗体によって認識されることが示されるであろう。
【０１２８】
実施例４ ＳＰＯＴペプチド
免疫を試みるための最良のペプチド候補を決定する別の実験は、化学的に合成されたペプチドが少なくとも１種の抗ＭｅｎＢ ＬＯＳモノクローナル抗体によって認識されるかどうか（および好ましくは無関係なモノクローナル抗体によって認識されないかどうか）を調べるものである。このことをＳＰＯＴ合成ペプチド（セルロース膜上に直接的に合成されたペプチド）について調べることができる。この膜を種々のモノクローナル抗体を用いて反復的イムノブロッティングと化学発光による検出で試験すればよい。ペプチドは、そのペプチドの両末端の各々にｐＶＩＩＩタンパク質配列に由来する３個の残基を有する形で合成することができる。バクテリオファージの表面上でｐＶＩＩＩとの融合体として発現されるそのようなペプチドの一次構造は、次のとおりである（ｘはライブラリー中の何らかの残基を示す）：
・直鎖状ペプチド（９アミノ酸）：  ＡＡＥＧＥＦｘｘｘｘｘｘｘｘｘＤＰＡＫＡＡＦ．．．
・環状ペプチド（Ｃ ９アミノ酸 Ｃ）：  ＡＡＥＧＥＦＣｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣＧＤＰＡＫＡＡＦ．．．
直鎖状および環状ペプチドは別個の膜上に合成して環状ペプチドの特異的な再生が可能なようにすることができる。
【０１２９】
例えば、表２のペプチドＮｏ．６１（ＧＥＦＰＲＰＨＦＧＡＰＰＤＰＡ）およびＮｏ．８３（ＧＥＦＡＥＲＳＬＷＹＹＰＤＰＡ）を含んでなる直鎖状ペプチドは１枚の膜上に合成し、表２のペプチドＮｏ．５０（ＧＥＦＣＳＳＹＳＹＶＨＤＳＣＧＤＰ）、Ｎｏ．１４（ＧＥＦＣＳＨＡＰＰＹＤＲＶＣＧＤＰ）、およびＮｏ．２５（ＧＥＦＣＲＡＰＰＹＤＴＩＭＣＧＤＰ）は別の膜上に合成した。
【０１３０】
これらの膜をモノクローナル抗体でプローブするために用いたプロトコールはＧｅｎｏｓｙｓから提供されているものにいくつかの改変、特に環状ペプチドを有する膜の再生のための改変を加えたものである。簡潔に述べれば、膜を３回各１０分間洗浄し（洗浄バッファーはＴＴＢＳ：ＴＢＳ ｐＨ８、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％）、次いでブロッキングバッファー中で室温で１時間飽和させ（ブロッキングバッファー濃縮液Ｇｅｎｏｓｙｓ ＳＵ−０７−２５０を、ＴＴＢＳ、 ０．０５ｇ／ｍＬショ糖中に１０倍に希釈）、ＴＴＢＳで再度１分間洗浄し、室温で２時間かけて（穏やかに振盪しながら）ブロッキングバッファー中に希釈したモノクローナル抗体と共にインキュベートし、ＴＴＢＳを用いて２×１分間、および３×１０分間洗浄し、さらにブロッキングバッファー中に１５００倍に希釈した二次抗体（ヤギ抗マウスＨＲＰ， Ｄａｋｏ）と共に室温で１時間３０分（穏やかに振盪しながら）インキュベートし、ＴＴＢＳを用いて２×１分間、および３×１０分間洗浄し、化学発光検出により測定した（すなわち、ＬｕｍｉＬｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と共に暗所で室温にて１０分間インキュベートし、発光をＦｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）で３〜３０秒間検出するか、またはＸ線フィルム上でのオートラジオグラフィーで検出した）。
【０１３１】
結果は下記の表に示している。第１のカラムはペプチドの番号である。モノクローナル抗体（ボールド体または下線で示す）は、一連の実験で用いた順に示している。
【０１３２】
用いたモノクローナル抗体：モノクローナル抗体 ２４ （Ｈ４４／２４）、５８（Ｈ４４／５８）、４７（４ＢＥ１２Ｃ１０）、および２Ｃ８（無関係のモノクローナル抗体）はＩｇＧ３である； モノクローナル抗体 ７０（Ｈ４４／７０）、７８（Ｈ４４／７８）、Ｍ４（連鎖球菌多糖に対する抗体）、Ｍ１３（同上）、およびＦ７６（ペプチドエピトープに対して産生された抗体）は、ＩｇＭである。ＧはＧＡＭ−ＨＲＰ単独（一次モノクローナル抗体なし）を表す。
【０１３３】
2004526418.tif 000006
【０１３４】
検出後、ブロットを下記のようにして再生した。ＴＴＢＳ中で３×１０分間洗浄し、再生バッファー中で５０℃で２×１分間および３×１０分間洗浄し（再生バッファーは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ６．７； ２％ ＳＤＳ； ２−メルカプトエタノール １００ｍＭ）、ＰＢＳ中で３ ｘ １０分間洗浄し（環状ペプチドの場合のみ）、ＰＢＳ−ＤＭＳＯ １０％中で２×１分間、次いで一晩かけて洗浄し（環状ペプチドの場合のみ）、ＴＴＢＳ中で３×１０分間洗浄した。
【０１３５】
この実験から、ペプチド６１はモノクローナル抗体Ｈ４４／７０によって特異的に認識され、一方、ペプチド５０はモノクローナル抗体Ｈ４４／７０、Ｈ４４／７８、およびＭ１３に認識されるがそのシグナルのレベルはモノクローナル抗体Ｈ４４／７０による場合が他のものによる場合よりも高い。ペプチド８３は全てのＩｇＭによって認識されるがそのシグナルはモノクローナル抗体Ｈ４４／７０による場合が他のものによる場合よりも高い。このペプチドもＨ４４／２４およびＨ４４／５８により認識されるが他のＩｇＧ３によっては認識されない。ペプチド１４および２５はファージＥＬＩＳＡではモノクローナル抗体Ｈ４４／５８によってのみ陽性を示すが、これらのペプチドはＳＰＯＴ合成の場合には同じモノクローナル抗体により陽性を示す一方で他のＩｇＧ３によっては陽性を示さなかった。
【０１３６】
実施例５  ペプチド構造の解析
本研究で単離したペプチドはＷＯ ００／２５８１４に開示されたＬ３，７，９ ＬＯＳペプチドミモトープのセットとは全く異なるように思われる。
【０１３７】
本研究では１４８個のペプチドが見出された（表２参照）。それらの大部分は、意図的に、１個ずつのＣｙｓ残基を両末端に有し、それによりジスルフィド架橋を介して環状となるようにされている。アラインメント法およびパターン検索法においてこれらのＣｙｓによってバイアスがかかることを避けるために、それらのペプチドからは末端システインを取り除いてある。それらのペプチド中に元々はシステインが存在していることは、それらのペプチドの名称の最後の２文字で判るようになっている（ＣＣは、１個ずつのＣｙｓを両末端に有することを、ＣＮは、Ｎ末端に１個のＣｙｓを有しＣ末端にはＣｙｓを有しないことを、ＮＣはその逆を、ＮＮはどちらの末端にも末端Ｃｙｓを有しないことを表す）。
【０１３８】
これらのペプチドの平均アミノ酸組成は２つの驚くべき特徴を示す。すなわち、これらのペプチドはプロリンに富んでいるようであり（１４８種中９８種は少なくとも１個のプロリンを有する）、さらに芳香族アミノ酸残基（Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅ）についてはいっそう富んでいるようである（１２６種のペプチドが少なくとも１つの芳香族残基を有する）。
【０１３９】
特に、７種のペプチド（１、２、１８、５０、６４、８３、１２３）は［ＹＷ］ｘＹというモチーフを有しており、このモチーフは炭水化物サブユニットを模倣することができると報告されているものである（Ｃ．Ｄ．Ｐａｒｔｉｄｏｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｖｏｌ ２， ｐｐ７４−７９， ２０００）。
【０１４０】
ジスルフィド架橋の存在によりペプチド中でプロリンが好まれるのであろうとも考えられるが、拘束されていないペプチドでもほぼ同程度にプロリンを含んでいる。
【０１４１】
それらに対して保存されたパターンを検索し、下記の結果を得た。
【０１４２】
一部のペプチドに共有されている高い類似性
一部のペプチドは、以下の表に示すように、いくつかの連続残基を共通に有する。
【０１４３】
2004526418.tif 000007
【０１４４】
ＰＰＹＤモチーフを共有している以下の多数（１０種）のペプチドには特に注目すべきである：
2004526418.tif 000008
【０１４５】
ＰＰ［ＹＦＷ］モチーフを有するペプチドは１７種ある。
ＷＹのペアはこのペプチドセットには特に高頻度に存在しており、２６種のペプチドが数えられる。
【０１４６】
２番目に頻度の高いジペプチドはＰＰ（２４）であり、その次はＡＰ（２０）である。
【０１４７】
多数のペプチドに共有されているより弱い類似性
介在するミスマッチを許容すれば、以下のような関連ペプチドのセットが見出される。
【０１４８】
2004526418.tif 000009
2004526418.tif 000010
【０１４９】
より弱いパターンを許容すれば、最後の２つのセットをパターンＷＹｘｘＰでグループ化することができ、さらに以下の別のペプチドを加えることができる。
【０１５０】
2004526418.tif 000011
【０１５１】
アライメントにおいてギャップを許容することにより高い自由度をもちこめば、さらに多くのペプチドをグループ化でき、それは例えば以下のとおりである。
【０１５２】
2004526418.tif 000012
【０１５３】
その他のコンセンサス配列は以下のとおりである。
【０１５４】
2004526418.tif 000013
【０１５５】
実施例３で選択された選択ペプチドの比較
これらのペプチドの３分の２はジスルフィド架橋により拘束されており、このことはその特徴が必ずしも必須のものではないことを意味している。
【０１５６】
配列番号１      ＮＴＫＷＹＰＹＡ
配列番号２      ＦＶＰＳＰＹＶＹＥ
配列番号３      ＲＳＳＬＰＧＤ
配列番号４      ＦＹＲＥＬＡＧＤＬ
配列番号５      ＭＲＲＴＡＳＥＩＭ
配列番号６      ＭＲＰＬＴＷＱＴＴ
配列番号７      ＲＭＲＩＩＰＥＧＴ
配列番号８      ＭＲＤＶＭＰＱＨＷ
配列番号９      ＨＫＰＴＤＨＰＳＷ
配列番号１０     ＳＥＴＹＧＲＰＧＬ
配列番号１１     ＥＲＰＩＧＧＤＳＧ
配列番号１２     ＲＭＲＤＩＰＧＡＰ
配列番号１３     ＩＳＥＹＡＫＧＴＴ
配列番号１４     ＳＨＡＰＰＹＤＲＶ
配列番号１５     ＶＴＩＰＹＲＧＴＱ
配列番号１６     ＦＡＰＰＹＤＰＬＰ
配列番号１７     ＡＰＹＳＩＦＩＧＥ
配列番号１８     ＴＨＬＹＨＹＧＴＳ
配列番号１９     ＬＣＱＡＹＫＧＲＲ
配列番号２０     ＤＰＲＬＬＤＬ
配列番号２１     ＫＴＡＬＰＰＹＤＲ
配列番号２２     ＦＡＲＰＦＱＧＴＷ
配列番号２３     ＳＬＳＬＰＰＹＤＲ
配列番号２４     ＤＲＴＬＳＡＬＡＬ
配列番号２５     ＲＡＰＰＹＤＴＩＭ
配列番号２６     ＣＰＰＹＤＥＧＣＲＶＡ
配列番号２７     ＦＧＬＩＡＦＨＰＤ
配列番号２８     ＱＰＩＧＰＰＹＤＲ
配列番号２９     ＴＡＮＹＹＦＧＴＹ
配列番号３０     ＡＮＳＲＰＧＧＹＬ
配列番号３１     ＭＳＳＹＧＲＧＶＲ
配列番号３２     ＶＳＴＰＦＲＧＴＦ
配列番号３３     ＤＰＲＩＴＰＤＦＧ
配列番号３４     ＧＰＰＹＤＰＦＰＡ
配列番号３５     ＨＴＶＲＦＲＧＴＬ
配列番号３６     ＴＡＰＰＹＤＡＹＧ
配列番号３７     ＲＳＰＬＬＧＡＰＶ
配列番号３８     ＴＴＴＹＧＴＧＴＷ
配列番号３９     ＳＳＬＹＹＨＧＴＡ
配列番号４０     ＬＹＥＰＬＲＧＴＬ
配列番号４１     ＡＰＰＰＹＤＱＳＦ
配列番号４２     ＰＰＰＷＹＳＲＳＳ
配列番号４３     ＳＲＡＬＧＹＶＳＥ
配列番号４４     ＰＴＷＹＫＬＫＳＶ
配列番号４５     ＲＧＳＥＧＳＦＡＲ
配列番号４６     ＫＱＴＩＧＳＦＤＧ
配列番号４７     ＰＬＷＹＤＰＡＰＰ
配列番号４８     ＥＳＰＹＳＡＨＲＷ
配列番号４９     ＷＹＤＥＲＴＩＬＫ
配列番号５０     ＳＳＹＳＹＶＨＤＳ
【０１５７】
配列番号５１     ＲＦＴＹＤＰＰＦＭ
配列番号５２     ＲＬＹＳＦＶＦＤＫ
配列番号５３     ＳＱＷＲＳＡＡＰＴ
配列番号５４     ＲＰＡＦＤＰＰＹＨ
配列番号５５     ＨＧＲＴＬＷＹＴＰ
配列番号５６     ＳＳＶＳＡＴＹＰＩ
配列番号５７     ＳＬＶＱＳＰＫＲＦ
配列番号５８     ＳＮＷＹＥＮＴＰＴ
配列番号５９     ＰＲＰＧＷＧＱＳＡ
配列番号６０     ＣＴＤＰＲＧＣＧＭＦＡ
配列番号６１     ＰＲＰＨＦＧＡＰＰ
配列番号６２     ＶＴＲＡＴＹＰＳＷ
配列番号６３     ＷＹＩＡＰＲＫＴＬ
配列番号６４     ＹＧＹＳＡＬＲＤＴ
配列番号６５     ＩＩＴＧＳＧＷＹＶ
配列番号６６     ＴＨＹＳＦＹＧＤＩ
配列番号６７     ＨＷＹＳＴＥＡＡＷ
配列番号６８     ＨＲＩＡＱＳＬＰＱ
配列番号６９     ＡＬＹＲＦＡＡＤＳ
配列番号７０     ＲＰＱＦＤＰＰＮＤ
配列番号７１     ＨＰＡＬＡＲＷＰＬ
配列番号７２     ＱＰＫＳＬＷＹＳＶ
配列番号７３     ＲＧＹＳＨＶＳＤＡ
配列番号７４     ＤＰＶＲＴＩＹＰＩ
配列番号７５     ＷＹＴＴＰＴＲＰＶ
配列番号７６     ＱＲＱＳＬＷＹＳＳ
配列番号７７     ＮＰＤＹＳＳＰＨＥ
配列番号７８     ＰＰＷＹＰＥＨＫＴ
配列番号７９     ＡＳＬＧＬＡＫＴＴ
配列番号８０     ＷＹＶＤＧＰＬＡＴ
配列番号８１     ＲＧＷＹＡＤＰＳＡ
配列番号８２     ＬＷＲＰＩＤＰＦＬ
配列番号８３     ＡＥＲＳＬＷＹＹＰ
配列番号８４     ＰＰＷＹＮＱＳＥＬ
配列番号８５     ＤＳＡＰＡＶＫＳＳ
配列番号８６     ＰＧＷＹＤＡＨＰＴ
配列番号８７     ＲＧＬＱＧＨＩＡＹ
配列番号８８     ＷＹＳＡＰＥＮＡＬ
配列番号８９     ＷＹＴＡＰＳＬＳＬ
配列番号９０     ＷＹＴＮＰＳＩＡＡ
配列番号９１     ＷＹＦＳＮＥｎＬＧ
配列番号９２     ＷＹＴＬＤＩＧＰＴ
配列番号９３     ＧＰＷＨＧＰＳＳＳ
配列番号９４     ＧＤＷＰＰＦＳＡＰ
配列番号９５     ＷＹＶＧＳＶＲＳＱ
配列番号９６     ＡＬＤＩＡＧＧＹｌ
配列番号９７     ＰＰＰＳＲＧＧＹＩ
配列番号９８     ＱＡＦＤＴＳＷＴＡ
配列番号９９     ＦＬＰＣＲＲＣＧＳ
配列番号１００    ＲＰＷＱＴＡＨＦＡ
【０１５８】
配列番号１０１    ＧＱＹＳＳＳＰＦＰ
配列番号１０２    ＧＲＰＧＰＹＰＡＤ
配列番号１０３    ＴＰＬＰＤＧＧＩＬ
配列番号１０４    ＬＫＷＧＤＧＳＳＡ
配列番号１０５    ＹＰＱＬＳＨＡＮＰ
配列番号１０６    ＳＡＹＨＲＳＬＧＡ
配列番号１０７    ＦＰＬＰＳＲＥＦＡ
配列番号１０８    ＹＲＱＳＲＳＳＷＰ
配列番号１０９    ＳＨＲＦＤＡＬＲＲ
配列番号１１０    ＶＲＦＰＤＧＳＨＳ
配列番号１１１    ＳＰＡＡＦＳＤＲＬ
配列番号１１２    ＶＴＤＱＷＧＧＹＬ
配列番号１１３    ＶＰＳＧＲＳＰＮＴ
配列番号１１４    ＰＫＷＳＤＫＲＰＱ
配列番号１１５    ＡＰＰＧＩＡＶＲＴ
配列番号１１６    ＭＫＷＧＰＮＳＨＳ
配列番号１１７    ＬＱＤＲＡＧＧＹＬ
配列番号１１８    ＣＧＲＬＥＧＲＣＳＨＡ
配列番号１１９    ＹＦＩＡＫＨＧＷＡ
配列番号１２０    ＰＰＲＳＳＲＧＦＬ
配列番号１２１    ＴＧＩＳＴＧＥＹＬ
配列番号１２２    ＧＰＶＦＹＡＴＧＬ
配列番号１２３    ＬＳＱＹＡＤＷＴＹ
配列番号１２４    ＡＲＷＹＰＩＳＱＴ
配列番号１２５    ＱＧＦＰＧＡＰＱＤ
配列番号１２６    ＷＨＦＲＴＦＰＡＴ
配列番号１２７    ＴＲＲＰＦＤＰＰＡ
配列番号１２８    ＣＡＳＰＬＧＰＣＦＷ
配列番号１２９    ＷＴＤＴＹＧＤＬＬ
配列番号１３０    ＩＳＡＧＰＥＳＳＨ
配列番号１３１    ＨＳＶＱＰＡＴＲＡ
配列番号１３２    ＰＫＡＰＦＳＰＦＫ
配列番号１３３    ＩＤＡＧＳＨＧＷＬ
配列番号１３４    ＲＲＧＳＰＬＳＲＹ
配列番号１３５    ＳＷＤＥＩＩＤＬＧ
配列番号１３６    ＲＳＰＡＧＥＷＳＳ
配列番号１３７    ＡＹＨＶＬＲＹＳＡ
配列番号１３８    ＡＫＴＶＲＧＤＹＹ
配列番号１３９    ＬＡＡＳＡＤＴＡＡ
配列番号１４０    ＰＹＴＳＷＡＲＥＧ
配列番号１４１    ＣＮＴＫＷＹＰＹＡＣ
配列番号１４２    ＣＦＶＰＳＰＹＶＹＥＣ
配列番号１４３    ＣＲＳＳＬＰＧＤＣ
配列番号１４４    ＣＦＹＲＥＬＡＧＤＬＣ
配列番号１４５    ＣＭＲＲＴＡＳＥＩＭＣ
配列番号１４６    ＣＭＲＰＬＴＷＱＴＴＣ
配列番号１４７    ＣＲＭＲＩＩＰＥＧＴＣ
配列番号１４８    ＣＭＲＤＶＭＰＱＨＷＣ
配列番号１４９    ＣＨＫＰＴＤＨＰＳＷＣ
配列番号１５０    ＣＳＥＴＹＧＲＰＧＬＣ
【０１５９】
配列番号１５１    ＣＥＲＰＩＧＧＤＳＧＣ
配列番号１５２    ＣＲＭＲＤＩＰＧＡＰＣ
配列番号１５３    ＣＩＳＥＹＡＫＧＴＴＣ
配列番号１５４    ＣＳＨＡＰＰＹＤＲＶＣ
配列番号１５５    ＣＶＴＩＰＹＲＧＴＱＣ
配列番号１５６    ＣＦＡＰＰＹＤＰＬＰＣ
配列番号１５７    ＣＡＰＹＳＩＦＩＧＥＣ
配列番号１５８    ＣＴＨＬＹＨＹＧＴＳＣ
配列番号１５９    ＣＬＣＱＡＹＫＧＲＲＣ
配列番号１６０    ＣＤＰＲＬＬＤＬＣ
配列番号１６１    ＣＫＴＡＬＰＰＹＤＲＣ
配列番号１６２    ＣＦＡＲＰＦＱＧＴＷＣ
配列番号１６３    ＣＳＬＳＬＰＰＹＤＲＣ
配列番号１６４    ＣＤＲＴＬＳＡＬＡＬＣ
配列番号１６５    ＣＲＡＰＰＹＤＴＩＭＣ
配列番号１６６    ＣＰＰＹＤＥＧＣＲＶＡＣ
配列番号１６７    ＣＦＧＬＩＡＦＨＰＤＣ
配列番号１６８    ＣＱＰＩＧＰＰＹＤＲＣ
配列番号１６９    ＣＴＡＮＹＹＦＧＴＹＣ
配列番号１７０    ＣＡＮＳＲＰＧＧＹＬＣ
配列番号１７１    ＣＭＳＳＹＧＲＧＶＲＣ
配列番号１７２    ＣＶＳＴＰＦＲＧＴＦＣ
配列番号１７３    ＣＤＰＲＩＴＰＤＦＧＣ
配列番号１７４    ＣＧＰＰＹＤＰＦＰＡＣ
配列番号１７５    ＣＨＴＶＲＦＲＧＴＬＣ
配列番号１７６    ＣＴＡＰＰＹＤＡＹＧＣ
配列番号１７７    ＣＲＳＰＬＬＧＡＰＶＣ
配列番号１７８    ＣＴＴＴＹＧＴＧＴＷＣ
配列番号１７９    ＣＳＳＬＹＹＨＧＴＡＣ
配列番号１８０    ＣＬＹＥＰＬＲＧＴＬＣ
配列番号１８１    ＣＡＰＰＰＹＤＱＳＦＣ
配列番号１８２    ＣＰＰＰＷＹＳＲＳＳＣ
配列番号１８３    ＣＳＲＡＬＧＹＶＳＥＣ
配列番号１８４    ＣＰＴＷＹＫＬＫＳＶＣ
配列番号１８５    ＣＲＧＳＥＧＳＦＡＲＣ
配列番号１８６    ＣＫＱＴＩＧＳＦＤＧＣ
配列番号１８７    ＣＰＬＷＹＤＰＡＰＰＣ
配列番号１８８    ＣＥＳＰＹＳＡＨＲＷＣ
配列番号１８９    ＣＷＹＤＥＲＴＩＬＫＣ
配列番号１９０    ＣＳＳＹＳＹＶＨＤＳＣ
配列番号１９１    ＣＲＦＴＹＤＰＰＦＭＣ
配列番号１９２    ＣＲＬＹＳＦＶＦＤＫＣ
配列番号１９３    ＣＳＱＷＲＳＡＡＰＴＣ
配列番号１９４    ＣＲＰＡＦＤＰＰＹＨＣ
配列番号１９５    ＣＨＧＲＴＬＷＹＴＰＣ
配列番号１９６    ＣＳＳＶＳＡＴＹＰＩＣ
配列番号１９７    ＣＳＬＶＱＳＰＫＲＦＣ
配列番号１９８    ＣＳＮＷＹＥＮＴＰＴＣ
配列番号１９９    ＣＰＲＰＧＷＧＱＳＡＣ
配列番号２００    ＣＴＤＰＲＧＣＧＭＦＡＣ
【０１６０】
配列番号２０１    ＣＰＲＰＨＦＧＡＰＰＣ
配列番号２０２    ＣＶＴＲＡＴＹＰＳＷＣ
配列番号２０３    ＣＷＹＩＡＰＲＫＴＬＣ
配列番号２０４    ＣＹＧＹＳＡＬＲＤＴＣ
配列番号２０５    ＣＩＩＴＧＳＧＷＹＶＣ
配列番号２０６    ＣＴＨＹＳＦＹＧＤＩＣ
配列番号２０７    ＣＨＷＹＳＴＥＡＡＷＣ
配列番号２０８    ＣＨＲＩＡＱＳＬＰＱＣ
配列番号２０９    ＣＡＬＹＲＦＡＡＤＳＣ
配列番号２１０    ＣＲＰＱＦＤＰＰＮＤＣ
配列番号２１１    ＣＨＰＡＬＡＲＷＰＬＣ
配列番号２１２    ＣＱＰＫＳＬＷＹＳＶＣ
配列番号２１３    ＣＲＧＹＳＨＶＳＤＡＣ
配列番号２１４    ＣＤＰＶＲＴＩＹＰＩＣ
配列番号２１５    ＣＷＹＴＴＰＴＲＰＶＣ
配列番号２１６    ＣＱＲＱＳＬＷＹＳＳＣ
配列番号２１７    ＣＮＰＤＹＳＳＰＨＥＣ
配列番号２１８    ＣＰＰＷＹＰＥＨＫＴＣ
配列番号２１９    ＣＡＳＬＧＬＡＫＴＴＣ
配列番号２２０    ＣＷＹＶＤＧＰＬＡＴＣ
配列番号２２１    ＣＲＧＷＹＡＤＰＳＡＣ
配列番号２２２    ＣＬＷＲＰＩＤＰＦＬＣ
配列番号２２３    ＣＡＥＲＳＬＷＹＹＰＣ
配列番号２２４    ＣＰＰＷＹＮＱＳＥＬＣ
配列番号２２５    ＣＤＳＡＰＡＶＫＳＳＣ
配列番号２２６    ＣＰＧＷＹＤＡＨＰＴＣ
配列番号２２７    ＣＲＧＬＱＧＨＩＡＹＣ
配列番号２２８    ＣＷＹＳＡＰＥＮＡＬＣ
配列番号２２９    ＣＷＹＴＡＰＳＬＳＬＣ
配列番号２３０    ＣＷＹＴＮＰＳＩＡＡＣ
配列番号２３１    ＣＷＹＦＳＮＥｎＬＧＣ
配列番号２３２    ＣＷＹＴＬＤＩＧＰＴＣ
配列番号２３３    ＣＧＰＷＨＧＰＳＳＳＣ
配列番号２３４    ＣＧＤＷＰＰＦＳＡＰＣ
配列番号２３５    ＣＷＹＶＧＳＶＲＳＱＣ
配列番号２３６    ＣＡＬＤＩＡＧＧＹｌＣ
配列番号２３７    ＣＰＰＰＳＲＧＧＹＩＣ
配列番号２３８    ＣＱＡＦＤＴＳＷＴＡＣ
配列番号２３９    ＣＦＬＰＣＲＲＣＧＳＣ
配列番号２４０    ＣＲＰＷＱＴＡＨＦＡＣ
配列番号２４１    ＣＧＱＹＳＳＳＰＦＰＣ
配列番号２４２    ＣＧＲＰＧＰＹＰＡＤＣ
配列番号２４３    ＣＴＰＬＰＤＧＧＩＬＣ
配列番号２４４    ＣＬＫＷＧＤＧＳＳＡＣ
配列番号２４５    ＣＹＰＱＬＳＨＡＮＰＣ
配列番号２４６    ＣＳＡＹＨＲＳＬＧＡＣ
配列番号２４７    ＣＦＰＬＰＳＲＥＦＡＣ
配列番号２４８    ＣＹＲＱＳＲＳＳＷＰＣ
配列番号２４９    ＣＳＨＲＦＤＡＬＲＲＣ
配列番号２５０    ＣＶＲＦＰＤＧＳＨＳＣ
【０１６１】
配列番号２５１    ＣＳＰＡＡＦＳＤＲＬＣ
配列番号２５２    ＣＶＴＤＱＷＧＧＹＬＣ
配列番号２５３    ＣＶＰＳＧＲＳＰＮＴＣ
配列番号２５４    ＣＰＫＷＳＤＫＲＰＱＣ
配列番号２５５    ＣＡＰＰＧＩＡＶＲＴＣ
配列番号２５６    ＣＭＫＷＧＰＮＳＨＳＣ
配列番号２５７    ＣＬＱＤＲＡＧＧＹＬＣ
配列番号２５８    ＣＧＲＬＥＧＲＣＳＨＡＣ
配列番号２５９    ＣＹＦＩＡＫＨＧＷＡＣ
配列番号２６０    ＣＰＰＲＳＳＲＧＦＬＣ
配列番号２６１    ＣＴＧＩＳＴＧＥＹＬＣ
配列番号２６２    ＣＧＰＶＦＹＡＴＧＬＣ
配列番号２６３    ＣＬＳＱＹＡＤＷＴＹＣ
配列番号２６４    ＣＡＲＷＹＰＩＳＱＴＣ
配列番号２６５    ＣＱＧＦＰＧＡＰＱＤＣ
配列番号２６６    ＣＷＨＦＲＴＦＰＡＴＣ
配列番号２６７    ＣＴＲＲＰＦＤＰＰＡＣ
配列番号２６８    ＣＡＳＰＬＧＰＣＦＷＣ
配列番号２６９    ＣＷＴＤＴＹＧＤＬＬＣ
配列番号２７０    ＣＩＳＡＧＰＥＳＳＨＣ
配列番号２７１    ＣＨＳＶＱＰＡＴＲＡＣ
配列番号２７２    ＣＰＫＡＰＦＳＰＦＫＣ
配列番号２７３    ＣＩＤＡＧＳＨＧＷＬＣ
配列番号２７４    ＣＲＲＧＳＰＬＳＲＹＣ
配列番号２７５    ＣＳＷＤＥＩＩＤＬＧＣ
配列番号２７６    ＣＲＳＰＡＧＥＷＳＳＣ
配列番号２７７    ＣＡＹＨＶＬＲＹＳＡＣ
配列番号２７８    ＣＡＫＴＶＲＧＤＹＹＣ
配列番号２７９    ＣＬＡＡＳＡＤＴＡＡＣ
配列番号２８０    ＣＰＹＴＳＷＡＲＥＧＣ
配列番号２８９    ＰＰＰＷＳＴＨＤ
配列番号２９０    ＳＥＰＷＳＴＳＮ
配列番号２９１    ＡＩＴＧＶＲＡＲＷ
配列番号２９２    ＥＫＫＨＦＮＹＧＴ
配列番号２９３    ＥＫＫＲＦＥＳＮＴ
配列番号２９４    ＥＱＧＹＣＴＶＮＩＥＱＣＡＫＹＲ
配列番号２９５    ＳＰＡＤＣＤＹＴＴＬＣＡＫＰＴ
配列番号２９６    ＮＳＰＴＳＣＫＷＬＣＮＥＫＦ
配列番号２９７    ＣＰＰＰＷＳＴＨＤＣ
配列番号２９８    ＣＳＥＰＷＳＴＳＮＣ
配列番号２９９    ＣＡＩＴＧＶＲＡＲＷＣ
配列番号３００    ＣＥＫＫＨＦＮＹＧＴＣ
配列番号３０１    ＣＥＫＫＲＦＥＳＮＴＣ
【０１６２】
配列番号２８１  Ｈ４４／２４モノクローナル抗体の軽鎖の配列
2004526418.tif 000014
【０１６３】
配列番号２８２  Ｈ４４／２４モノクローナル抗体の重鎖の配列
2004526418.tif 000015
【０１６４】
配列番号２８３  Ｈ４４／５８モノクローナル抗体の軽鎖の配列
2004526418.tif 000016
【０１６５】
配列番号２８４  Ｈ４４／５８モノクローナル抗体の重鎖の配列
2004526418.tif 000017
【０１６６】
配列番号２８５  Ｈ４４／７０モノクローナル抗体の軽鎖の配列
2004526418.tif 000018
【０１６７】
配列番号２８６  Ｈ４４／７０モノクローナル抗体の重鎖の配列
2004526418.tif 000019
【０１６８】
配列番号２８７  Ｈ４４／７８モノクローナル抗体の軽鎖の配列
2004526418.tif 000020
【０１６９】
配列番号２８８  Ｈ４４／７８モノクローナル抗体の重鎖の配列
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【０１７０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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