(57)【要約】不均一組織を操作するための複合性足場（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）を提供する。複合性足場には：（ａ）第一の足場上での第一の組織種の形成を支持可能な、前記の第一の足場；および（ｂ）第二の足場上での第二の組織種の形成を支持可能な、前記の第二の足場が含まれ；第一の足場および第二の足場は、第一の足場が第一の組織種を支持し、そして第二の足場が第二の組織種を支持する際、第二の組織種および第一の組織種のいかなる細胞間の距離も２００μｍを超えないように、互いに関して配置される。
2004528101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均一組織を操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）ための複合性足場（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）であって：
（ａ）第一の足場上での第一の組織種の形成を支持可能な、前記の第一の足場；および
（ｂ）第二の足場上での第二の組織種の形成を支持可能な、前記の第二の足場
を含んでなり；前記の第一の足場および前記の第二の足場が、前記の第一の足場が前記の第一の組織種を支持し、そして前記の第二の足場が前記の第二の組織種を支持する際、前記の第二の組織種および前記の第一の組織種のいかなる細胞間の距離も２００μｍを超えないように、互いに関して配置される、前記複合性足場。
【請求項２】
請求項１の複合性足場を用いて生成される、操作組織移植片。
【請求項３】
前記の第一の足場が、４〜５００μｍの範囲から選択される直径を有するフィラメントで構成されるフィラメント状足場である、請求項１の複合性足場。
【請求項４】
前記の第二の足場が多孔連続性足場である、請求項１の複合性足場。
【請求項５】
前記の第一の足場および／または第二の足場が、あらかじめ決定した環境条件への曝露に際して、分解可能である、請求項１の複合性足場。
【請求項６】
前記のあらかじめ決定した環境条件が、加水分解酵素の存在、プロテオソーム酵素の存在、５未満のｐＨの存在および還元条件の存在からなる群より選択される、請求項５の複合性足場。
【請求項７】
前記の第一の足場が、該足場上に、前記の第一の組織種が実質的な管状構造を形成するのを可能にするように選択される、請求項１の複合性足場。
【請求項８】
前記の第一の組織種が血管組織である、請求項１の複合性足場。
【請求項９】
前記の第二の組織種が、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、結合組織および筋組織からなる群より選択される、構造組織である、請求項１の複合性足場。
【請求項１０】
前記の第一の足場および／または前記の第二の足場に、該足場と関連する生理活性剤がさらに含まれる、請求項１の複合性足場。
【請求項１１】
前記生理活性剤が、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞誘引因子および薬理学的活性因子からなる群より選択される、請求項１０の複合性足場。
【請求項１２】
前記の第一の足場が、前記の第一の組織種を構成する少なくとも１つの細胞種のコロニー形成および／または増殖を可能にするように選択される、請求項１の複合性足場。
【請求項１３】
前記の第二の足場が、前記の第二の組織種を構成する少なくとも１つの細胞種のコロニー形成および／または増殖を可能にするように選択される、請求項１の複合性足場。
【請求項１４】
（ａ）第一のポリマー主鎖に付着したリンカー分子；および
（ｂ）第二のポリマー主鎖に付着した、前記リンカー分子の立体異性体
を含んでなる組成物であって；重合条件に曝露した際、前記の第一のポリマー主鎖および前記の第二のポリマー主鎖が、前記リンカー分子および前記リンカー分子の前記立体異性体の少なくとも１つを介して、前記の第一のポリマー主鎖および／または前記の第二のポリマー主鎖の少なくとも１つの分子と架橋して、それによって、足場構造を形成する、前記組成物。
【請求項１５】
前記リンカー分子が乳酸のコポリマーである、請求項１４の組成物。
【請求項１６】
前記ポリマー主鎖が親水性ポリマーである、請求項１４の組成物。
【請求項１７】
前記親水性ポリマーが、天然多糖、タンパク質、エチレングリコールに基づくポリマーおよびプロピレングリコールに基づくポリマーからなる群より選択される、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
前記の第一のポリマー主鎖が、前記の第二のポリマー主鎖と同一である、請求項１４の組成物。
【請求項１９】
前記足場構造が三次元である、請求項１４の組成物。
【請求項２０】
（ａ）リンカー分子；および
（ｂ）前記リンカー分子の立体異性体
に付着したポリマー主鎖を含んでなる組成物であって；重合条件に曝露した際、前記ポリマー主鎖が、前記リンカー分子および前記リンカー分子の前記立体異性体の少なくとも１つを介して、少なくとも１つのさらなるポリマー主鎖と架橋して、それによって、足場構造を形成する、前記組成物。
【請求項２１】
前記リンカー分子が乳酸のコポリマーである、請求項２０の組成物。
【請求項２２】
前記ポリマー主鎖が親水性ポリマーである、請求項２０の組成物。
【請求項２３】
前記親水性ポリマーが、天然多糖、タンパク質、エチレングリコールに基づくポリマーおよびプロピレングリコールに基づくポリマーからなる群より選択される、請求項２２の組成物。
【請求項２４】
前記足場構造が三次元である、請求項２２の組成物。
【請求項２５】
リンカー分子のＬおよびＤ立体異性体を介して、間が架橋された、複数分子のポリマー主鎖を含んでなる足場。
【請求項２６】
前記の複数分子の前記ポリマー主鎖が親水性ポリマーである、請求項２５の足場。
【請求項２７】
前記親水性ポリマーが、天然多糖、タンパク質、エチレングリコールに基づくポリマーおよびプロピレングリコールに基づくポリマーからなる群より選択される、請求項２６の足場。
【請求項２８】
前記リンカー分子が乳酸のコポリマーである、請求項２５の足場。
【請求項２９】
生理活性剤をさらに含んでなる、請求項２５の足場。
【請求項３０】
前記生理活性剤が、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞誘引因子および薬理学的活性因子からなる群より選択される、請求項２９の足場。
【請求項３１】
生理活性剤を放出可能であり、ポリマー主鎖および生理活性剤を含んでなる足場であって、前記ポリマー主鎖が、あらかじめ決定した環境条件に曝露されると、足場からの生理活性剤の放出を導くように選択される、前記足場。
【請求項３２】
生理活性剤が、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞誘引因子および薬理学的活性因子からなる群より選択される、請求項３１の足場。
【請求項３３】
前記ポリマー主鎖が、セルロース、ヒドロキシルアルキル酸ポリエステル、ポリホスファゼン、ポリカーボネート、ラクチド酸（ｌａｃｔｉｄｅ  ａｃｉｄ）およびグリコリド酸（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される、請求項３１の足場。
【請求項３４】
生理活性剤が前記ポリマー主鎖内に取り込まれ、そして一方、生理活性剤が、前記環境条件において、前記ポリマー主鎖の分解および／または崩壊後に放出される、請求項３１の足場。
【請求項３５】
生理活性剤が負荷電生理活性剤であり、そして一方、前記負荷電生理活性剤が、前記ポリマー主鎖のあらかじめカチオン化した領域内に取り込まれている、請求項３１の足場。
【請求項３６】
前記ポリマー主鎖が、足場からの生理活性剤の持続放出を可能にするように設計され、そして構築されている、請求項３１の足場。
【請求項３７】
前記のあらかじめ決定した環境条件が、加水分解酵素の存在、プロテオソーム酵素の存在、５未満のｐＨの存在および還元条件の存在からなる群より選択される、請求項３１の足場。
【請求項３８】
フィラメント状ポリマーを含んでなる足場であって：
（ａ）あらかじめ決定した環境条件に曝露した際、前記フィラメント状ポリマーの分解を促進可能な親水性分子；
（ｂ）前記フィラメント状ポリマーに柔軟性を与えることが可能な可塑化剤；および
（ｃ）前記フィラメント状ポリマーと少なくとも１つのさらなるフィラメント状ポリマーを架橋し、それによって足場を形成可能なコポリマー性立体複合体（ｓｔｅｒｅｏｃｏｍｐｌｅｘ）
を含む、前記足場。
【請求項３９】
前記フィラメント状ポリマーが４〜５００μｍの範囲から選択される直径を有する、請求項３８の足場。
【請求項４０】
前記フィラメント状ポリマーが、該ポリマー上の管状組織構造の形成を支持するように設計され、そして構成されている、請求項３８の足場。
【請求項４１】
前記フィラメント状ポリマーが、ヒドロキシルアルキル酸ポリエステル、ポリホスファゼン、ポリカーボネートおよびポリホスフェートエステルからなる群より選択される、請求項３８の足場。
【請求項４２】
前記フィラメント状ポリマーが、あらかじめ決定した環境条件への曝露に際して、分解可能である、請求項３８の足場。
【請求項４３】
前記のあらかじめ決定した環境条件が、加水分解酵素の存在、プロテオソーム酵素の存在、５未満のｐＨおよび還元条件からなる群より選択される、請求項４２の足場。
【請求項４４】
前記管状組織が血管組織である、請求項４０の足場。
【請求項４５】
前記親水性分子が、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンプロピレングリコールである、請求項３８の足場。
【請求項４６】
前記可塑化剤が、クエン酸トリブチル、クエン酸酢酸トリブチル、リン脂質およびオレイン酸エステルからなる群より選択される、請求項３８の足場。
【請求項４７】
前記コポリマー性立体複合体にラクチド酸立体異性体が含まれる、請求項３８の足場。
【請求項４８】
足場と関連する生理活性剤をさらに含んでなる、請求項３８の足場。
【請求項４９】
前記生理活性剤が、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞誘引因子および薬理学的活性因子からなる群より選択される、請求項４８の足場。
【請求項５０】
不均一組織の形成を誘導する方法であって：
（ａ）第一の足場上に第一の組織種の形成を支持可能な、前記の第一の足場を提供し；
（ｂ）第二の足場上に第二の組織種の形成を支持可能な、前記の第二の足場を提供し；
（ｃ）前記の第二の足場に前記の第一の足場を包埋して、それによって複合性足場を形成し；そして
（ｄ）個体に、前記複合性足場を移植する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項５１】
前記の第一の足場が前記の第一の組織種を支持し、そして前記の第二の足場が前記の第二の組織種を支持する際、前記の第二の組織種および前記の第一の組織種のいかなる細胞間の距離も２００μｍを超えないように、前記包埋工程が達成される、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記の第一の足場が０．５ｍｍを超えない直径を有するフィラメント状足場である、請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記の第二の足場が多孔連続性足場である、請求項５０の方法。
【請求項５４】
前記フィラメント状足場が、該足場上に、前記の第一の組織種が実質的な管状構造を形成するのを可能にするように選択される、請求項５２の方法。
【請求項５５】
前記の第一の組織種が血管組織である、請求項５０の方法。
【請求項５６】
前記の第二の組織種が、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、結合組織および筋組織からなる群より選択される、構造組織である、請求項５０の方法。
【請求項５７】
前記の第一の足場および／または前記の第二の足場に、該足場と関連する生理活性剤がさらに含まれる、請求項５０の方法。
【請求項５８】
前記生理活性剤が、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞誘引因子および薬理学的活性因子からなる群より選択される、請求項５０の方法。
【請求項５９】
工程（ｃ）の前に、前記の第一の足場上で前記の第一の組織種を増殖させる工程および／または前記の第二の足場上で前記の第二の組織種を増殖させる工程をさらに含んでなる、請求項５０の方法。
【請求項６０】
工程（ｃ）または工程（ｄ）の前に、前記の第二の足場上で前記の第二の組織種を増殖させることをさらに含んでなる、請求項５０の方法。
【請求項６１】
前記の第一の足場が、前記の第一の組織種を構成する少なくとも１つの細胞種のコロニー形成および／または増殖を可能にするように選択される、請求項５０の方法。
【請求項６２】
前記の第二の足場が、前記の第二の組織種を構成する少なくとも１つの細胞種のコロニー形成および／または増殖を可能にするように選択される、請求項５０の方法。
【請求項６３】
前記の第一の足場および／または第二の足場が、あらかじめ決定した環境条件への曝露に際して、分解可能である、請求項５０の方法。
【請求項６４】
前記のあらかじめ決定した環境条件が、加水分解酵素の存在、プロテオソーム酵素の存在、５未満のｐＨおよび還元条件からなる群より選択される、請求項５０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野および背景）
本発明は、複雑な組織の増殖を支持可能な複合性足場（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）に関し、そして該複合性足場を製造し、そして用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器の機能不全のための伝統的な医学的治療は、こうした機能不全を置換する薬剤組成物を使用することに重点を置いてきた。しかし、ある場合では、臓器の機能がしばしば複雑で、そして／または完全には理解されていないため、薬学的置換療法を行うことが不能である。
【０００３】
こうした場合、唯一の実行可能な代替法は、機能しない臓器の外科的置換であるが、大部分の場合、臓器移植は、臓器の免疫学的拒絶を防御するため、免疫抑制剤の連続的な使用を必要とし、免疫系の完全な防御機構を患者から剥奪する。
【０００４】
さらに、ドナー臓器に対する必要性は、供給をはるかに超える。臓器不足の結果、移植のための成人臓器の分割など、新たな外科的技術が生じてきている。かなり優れた結果にも関わらず、こうした技術はなお、ドナー組織の欠乏に苦しむ。
【０００５】
生存ドナー組織の欠乏は、置換処置で使用するための操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）組織の生成に向けた方法の出現を導いてきた。こうした方法は、典型的には、三次元ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞培養を生成するため、物理的マトリックスを使用する（例えば、米国特許第４，０６０，０８１号；第４，４８５，０９７号；第４，４５８，６７８号；第４，５２０，８２１号；第５，０４１，１３８号；第５，７８６，２１７号；第５，８５５，６１０号；および第６，１４３，２９３号を参照されたい）。
【０００６】
組織操作の基本的な概念は、移植前に、支持体上に植え付けられた細胞が、組織化し、そして望ましい組織に発展することが可能である、前記支持体を提供する、足場（マトリックス）を使用する。足場は、細胞が適切な細胞外マトリックスを産生可能になるまで、置換組織のための最初の生体力学的プロフィールを提供する。新たに生成されるマトリックスの形成、沈着および編成中、足場は分解するかまたは代謝されるかいずれかであり、最終的にその代わりに移植組織を残す。
【０００７】
典型的には、足場は、その移植が不都合な免疫応答または毒性誘導を生じないように、生体適合性材料で製造する。さらに、足場は、典型的には、移植細胞の増殖を促進するのに有用な薬剤または栄養素の装填を容易にするように、あらかじめ決定した多孔性を持つように製造される。
【０００８】
足場製造アプローチ：
適切な足場の製作は、生成しようとする組織の種類によって決定される。多様な足場製造法は、ポリマー発泡体の製作および鋳造（ｃａｓｔｉｎｇ）に頼る。組織操作適用に用いられる、大部分のポリマー発泡体は、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、または２つの組み合わせ（ＰＬＧＡ）で作成される。
【０００９】
非毒性分解産物を生じるポリマー、特に生物分解性ポリマーの開発と共に、非常に相互連結された孔ネットワークを持つ多孔三次元足場を調製するプロセシング技術の開発が、研究の重要な分野になってきている。
【００１０】
繊維結合：繊維結合は、臓器移植のために、構造的な相互連結繊維ネットワークを調製するのに一般的な技術である。この方法を利用して、ＰＧＡなどのポリマーＡの非結合繊維構造を、ポリマーＡを溶解しない溶媒を用いて、ポリマーＢ（例えばポリＬ−乳酸）（ＰＬＬＡ）の溶液に浸すことによって、共に結合させて、織られていない繊維にする。その後、溶媒を蒸発させる。ポリマーＢのマトリックスに包埋されたポリマーＡ繊維からなる複合体を、ポリマーＡの融解温度より高く加熱して、交差点で繊維を結合させ、そしてその後、ポリマーＢを選択的に溶解させる（Ｍｉｋｏｓら  １９９３  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｌ．  Ｒｅｓ．  ２７：１８３−１８９）。生じたポリマーＡの結合繊維構造は、実質的な硬性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）を持つが、孔の数およびその分布は、製造に用いた繊維メッシュのものに制限される。
【００１１】
溶媒鋳造および微粒子浸出（ｌｅａｃｈｉｎｇ）：この技術では、塩化ナトリウム結晶などのふるった塩粒子をＰＬＬＡ／クロロホルム溶液中で広げて、その後、膜を鋳造するのに用いる。溶媒を蒸発させた後、ＰＬＬＡ／塩複合性膜をＰＬＬＡ融解温度より高く加熱し、そしてその後、制御された速度で冷却することによって、急冷するかまたはアニーリングして、非晶型または調節された結晶化度の半結晶型を生じる。選択的溶解によって、塩粒子を最終的に浸出して、多孔ポリマーマトリックスを生じる（Ｍｉｋｏｓら  １９９２  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，  ２５２：３５２−３５８）。しかし、この方法における多孔性の最大レベルは、ポリマー溶液中に塩微粒子を懸濁することが困難であるため、限定される。さらに、塩化ナトリウム塩の結晶構造は、生じる発泡体の孔を裏打ちする鋭いエッジを生じさせ、孔内での細胞増殖を実質的に減少させる。これらの問題のいくつかは、発泡体の薄いフィルムを作成し、そしてそれを積層する（ｌａｍｉｎａｔｉｎｇ）ことによって克服可能である。にもかかわらず、複雑な形状の移植物は、容易に成形することが不能であり、そしてこの方法にはかなり時間がかかる。
【００１２】
融解鋳造（ｍｅｌｔ  ｍｏｌｄｉｎｇ）：融解鋳造は、ＴｅｆｌｏｎＴＭ鋳型を用い、細かいＰＬＧＡ粉末およびゼラチン微小球体の混合物をポリマーのガラス遷移温度より高い温度で加熱する。その後、鋳型からＰＬＧＡ−ゼラチン複合体を取り除き、そして再蒸留脱イオン水中での選択的溶解によってゼラチン微小球体を浸出する。
【００１３】
上述の足場製造技術の多くは、本質的な限界を持つ足場を生成する。
こうした技術は、厳しい熱または化学処理工程の使用を必要とするため、細胞の植え付けは足場製造中には開始不能である。さらに、化学的に処理した足場は、しばしば、移植後に炎症反応を引き起こす可能性がある。
【００１４】
操作組織の血管新生：
ｉｎ  ｖｉｖｏで移植した肝細胞の生存は、十分な血管新生がないと、移植数日後に１０％と同程度に低い可能性があることを立証した、肝細胞移植研究において、操作組織における血管ネットワークの必要性が立証されている（Ｍｏｏｎｅｙら、１９９７）。同様の知見は、平滑筋細胞移植で観察された（Ｃｏｈｅｎら  １９９７、Ｃｏｌｔｏｎ  １９９５）。
【００１５】
現在まで、栄養素、増殖因子および酸素に対する移植物浸透性増加を目指す方法は大部分、受動的分散、あるいは人工的血管での移植物の外部裏打ちに頼っている。
操作組織を生成するのに適した多くの足場設計が当該技術分野に知られるが、こうした足場を用いて操作した組織は、典型的には、天然組織の完全な機能的能力を欠く。これは、こうした足場が、完全な機能的構造を有する（例えば血管新生された）複雑な組織を生成不能であるか、またはまったく複雑な組織の増殖を支持不能であるという事実のためである。
【００１６】
したがって、先行技術の足場につきものの制限を避けつつ、例えば血管新生組織移植片などの複雑な組織移植片を、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで生成するのに使用可能な足場に対する広く認識される必要性があり、そしてこうした足場を有することが非常に好適であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
（発明の概要）
本発明の１つの側面にしたがって、不均一組織を操作するための複合性足場であって：（ａ）第一の足場上での第一の組織種の形成を支持可能な、前記の第一の足場；および（ｂ）第二の足場上での第二の組織種の形成を支持可能な、前記の第二の足場を含んでなり；第一の足場および第二の足場が、第一の足場が第一の組織種を支持し、そして第二の足場が第二の組織種を支持する際、第二の組織種および第一の組織種のいかなる細胞間の距離も２００μｍを超えないように、互いに関して配置される、前記複合性足場を提供する。
【００１８】
以下に記載する本発明の好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、上述の複合性足場を用いて生成した操作組織移植片を提供する。
本発明の別の側面にしたがって、不均一組織の形成を誘導する方法であって：（ａ）第一の足場上に第一の組織種の形成を支持可能な、前記の第一の足場を提供し；（ｂ）第二の足場上に第二の組織種の形成を支持可能な、前記の第二の足場を提供し；（ｃ）第二の足場に第一の足場を包埋して、それによって複合性足場を形成し；そして（ｄ）個体に、複合性足場を移植することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１９】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第一の足場が第一の組織種を支持し、そして第二の足場が第二の組織種を支持する際、第二の組織種および第一の組織種のいかなる細胞間の距離も２００μｍを超えないように、該包埋工程が達成される。
【００２０】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第一の足場は、４〜５００μｍの範囲から選択される直径のフィラメントを有するフィラメント状足場である。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第二の足場は多孔連続性足場である。
【００２１】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、フィラメント状足場上に、第一の組織種が実質的な管状構造を形成するのを可能にするように、前記フィラメント状足場を選択する。
【００２２】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第一の組織種は血管組織である。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第二の組織種は、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、結合組織および筋組織からなる群より選択される、構造組織である。
【００２３】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第一の足場および／または第二の足場には、該足場と関連する生理活性剤がさらに含まれる。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、生理活性剤は、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞誘引因子および薬理学的活性因子からなる群より選択される。
【００２４】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、工程（ｃ）の前に、第一の足場上で第一の組織種を増殖させる工程および／または第二の足場上で第二の組織種を増殖させる工程がある。
【００２５】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、該方法は、工程（ｃ）または工程（ｄ）の前に、第二の足場上で第二の組織種を増殖させることをさらに含んでなる。
【００２６】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第一の足場は、第一の組織種を構成する少なくとも１つの細胞種のコロニー形成および／または増殖を可能にするように選択される。
【００２７】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第二の足場は、第二の組織種を構成する少なくとも１つの細胞種のコロニー形成および／または増殖を可能にするように選択される。
【００２８】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第一の足場および／または第二の足場は、あらかじめ決定した環境条件への曝露に際して、分解可能である。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、あらかじめ決定した環境条件は、加水分解酵素の存在、プロテオソーム酵素の存在、５未満のｐＨおよび還元条件からなる群より選択される。
【００２９】
本発明のさらに別の側面にしたがって：（ａ）第一のポリマー主鎖に付着したリンカー分子；（ｂ）第二のポリマー主鎖に付着した、該リンカー分子の立体異性体を含んでなる組成物であって；重合条件に曝露した際、第一のポリマー主鎖および第二のポリマー主鎖が、該リンカー分子および該リンカー分子の該立体異性体の少なくとも１つを介して、第一のポリマー主鎖および／または第二のポリマー主鎖の少なくとも１つの分子と架橋して、それによって、足場構造を形成する、前記組成物を提供する。
【００３０】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、第一のポリマー主鎖は第二のポリマー主鎖と同一である。
本発明のさらに別の側面にしたがって：（ａ）リンカー分子；および（ｂ）該リンカー分子の立体異性体に付着したポリマー主鎖を含んでなる組成物であって；重合条件に曝露した際、該ポリマー主鎖が、該リンカー分子および該リンカー分子の該立体異性体の少なくとも１つを介して、少なくとも１つのさらなるポリマー主鎖と架橋して、それによって、足場構造を形成する、前記組成物を提供する。
【００３１】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、リンカー分子は乳酸のコポリマーである。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、足場構造は三次元である。
【００３２】
本発明のさらに別の側面にしたがって、リンカー分子のＬおよびＤ立体異性体を介して、間が架橋された、複数分子のポリマー主鎖を含んでなる足場を提供する。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、ポリマー主鎖は親水性ポリマーである。
【００３３】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、親水性ポリマーは、天然多糖、タンパク質、エチレングリコールに基づくポリマーおよびプロピレングリコールに基づくポリマーからなる群より選択される。
【００３４】
記載する好ましい態様において、さらなる特徴にしたがって、複数分子のポリマー主鎖は親水性ポリマーである。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、親水性ポリマーは、天然多糖、タンパク質、エチレングリコールに基づくポリマーおよびプロピレングリコールに基づくポリマーからなる群より選択される。
【００３５】
本発明のさらに別の側面にしたがって、生理活性剤を放出可能であり、ポリマー主鎖および生理活性剤を含んでなる足場であって、ポリマー主鎖が、あらかじめ決定した環境条件に曝露されると、足場からの生理活性剤の放出を導く、前記足場を提供する。
【００３６】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、生理活性剤は、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞誘引因子および薬理学的活性因子からなる群より選択される。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、ポリマー主鎖は、セルロース、ヒドロキシルアルキル酸ポリエステル、ポリホスファゼン、ポリカーボネート、ラクチド酸（ｌａｃｔｉｄｅ  ａｃｉｄ）およびグリコリド酸（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ａｃｉｄ）からなる群より選択される。
【００３７】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、生理活性剤はポリマー主鎖内に取り込まれ、そして一方、生理活性剤は、環境条件において、ポリマー主鎖の分解および／または崩壊後に放出される。
【００３８】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、生理活性剤は負荷電生理活性剤であり、そして一方、負荷電生理活性剤は、ポリマー主鎖のあらかじめカチオン化した領域内に取り込まれている。
【００３９】
記載される好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、足場からの生理活性剤の持続放出を可能にするように、ポリマー主鎖を設計し、そして構築する。
記載される好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、あらかじめ決定した環境条件は、加水分解酵素の存在、プロテオソーム酵素の存在、５未満のｐＨの存在および還元条件の存在からなる群より選択される。
【００４０】
本発明のさらなる側面にしたがって、フィラメント状ポリマーを含んでなる足場であって：（ａ）あらかじめ決定した環境条件に曝露した際、フィラメント状ポリマーの分解を促進可能な親水性分子；（ｂ）フィラメント状ポリマーに柔軟性を与えることが可能な可塑化剤；および（ｃ）フィラメント状ポリマーと少なくとも１つのさらなるフィラメント状ポリマーを架橋し、それによって足場を形成可能なコポリマー性立体複合体（ｓｔｅｒｅｏｃｏｍｐｌｅｘ）を含む、前記足場を提供する。
【００４１】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、フィラメント状ポリマーは４〜５００μｍの範囲から選択される直径を有する。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、フィラメント状ポリマーは、該ポリマー上の管状組織構造の形成を支持するように設計され、そして構成されている。
【００４２】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、フィラメント状ポリマーは、ヒドロキシルアルキル酸ポリエステル、ポリホスファゼン、ポリカーボネートおよびポリホスフェートエステルからなる群より選択される。
【００４３】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、フィラメント状ポリマーは、あらかじめ決定した環境条件への曝露に際して、分解可能である。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、あらかじめ決定した環境条件は、加水分解酵素の存在、プロテオソーム酵素の存在、５未満のｐＨおよび還元条件からなる群より選択される。
【００４４】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、管状組織は血管組織である。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、親水性分子は、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンプロピレングリコールである。
【００４５】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、可塑化剤は、クエン酸トリブチル、クエン酸酢酸トリブチル、リン脂質およびオレイン酸エステルからなる群より選択される。
【００４６】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、コポリマー性立体複合体にはラクチド酸立体異性体が含まれる。
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、足場は、該足場と関連する生理活性剤をさらに含んでなる。
【００４７】
記載する好ましい態様における、さらなる特徴にしたがって、生理活性剤は、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞誘引因子および薬理学的活性因子からなる群より選択される。
本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、肝臓、膵臓、腎臓等のような血管新生された組織および臓器などの、複雑な組織を生成するのに使用可能な、新規足場立体配置を提供することによって、現在知られる立体配置の欠点に成功裡に対処する。
【００４８】
本発明は、本明細書において、ほんの一例として、付随する図に言及して記載される。ここで、図に対する詳細な特定の言及に伴って、示す詳細は、一例であり、そして本発明の好ましい態様の例示的議論のみを目的とし、そして最も有用と考えられるものを提供するために提示し、そして本発明の原理および概念的側面の容易に理解される説明である。これに関連して、本発明の基本的な理解に必要であるよりも詳細には、本発明の構造的詳細を示す試みは行わず、図と共に説明を解釈すると、本発明のいくつかの型が、実際問題として、どのように具体化可能であるか、当業者には明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【００４９】
（好ましい態様の説明）
本発明は、新規ポリマー性組成物、および複雑な組織を操作するために該組成物を使用する方法である。具体的には、本発明を用いて、機能する構築で同時に配置される、少なくとも２つの組織種で構成される複雑な組織移植片を生成可能である。
【００５０】
本発明の原理および実行は、図および付随する説明を参照すると、よりよく理解可能である。
本発明の少なくとも１つの態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に示すか、または実施例セクションに記載する図に例示する、構成要素の構築および配置の詳細への適用に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の態様が可能であり、あるいは多様な方式で実施するかまたは実行することが可能である。また、本明細書に使用する語法および専門用語は、説明の目的のためであり、そして限定とみなしてはならないことも理解すべきである。
【００５１】
ヒトドナー臓器の要求および入手可能性の間の格差は開きつつあり、このため、臓器置換療法に対する代替アプローチの集中的な検索が促されてきている。
バイオ人工移植物が１つの提唱される解決法である。しかし、現在製造されるバイオ人工移植物は、劣った生体適合性、移植失敗または組織機能不全を含む、多様な理由のため、満足できないものであることが立証されている。
【００５２】
バイオ人工移植物の主な問題の１つは、移植部位で、酸素および栄養素の連続的な供給を操作組織に提供可能な、よく分岐した血管ネットワークの必要性である。現在まで、この問題に取り組んだ試みはすべて、移植組織の劣った血管新生を生じてきた。
【００５３】
本発明は、血管新生された構造組織などの複雑な組織を操作し、こうして、移植した操作組織の許容率を実質的に増進する、新規アプローチを提供する。
以下に、そしてそれに続く実施例セクションに例示するように、本発明の複雑な組織は、新規複合性足場、並びにｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏ組織操作アプローチを用いて生成される。
【００５４】
したがって、本発明の１つの側面にしたがって、不均一組織を操作するための複合性足場を提供する。
本明細書において、用語「足場」は、細胞コロニー形成および／または増殖の物理的支持体として働く、操作したプラットホームを指す。
【００５５】
「複合性足場」は、共に「不均一組織」を構成する、２以上の組織種のコロニー形成および／または増殖を支持するために操作した、支持体を指す。
したがって、本発明の複合性足場には、第一の足場上での第一の組織種の形成を支持する、前記の第一の足場、および第二の足場上での第二の組織種の形成を支持する、前記の第二の足場が含まれる。
【００５６】
本発明の１つの好ましい態様にしたがって、第一の足場および第二の足場は、第一の足場が第一の組織種を支持し、そして第二の足場が第二の組織種を支持する際、第二の組織種および第一の組織種のいかなる細胞間の距離も２００μｍを超えないように、互いに関して配置される。こうした配置は、足場上に形成される不均一組織内で、機能的構築が維持されることを確実にする。
【００５７】
例えば、不均一組織が血管新生された構造組織である場合、こうした足場配置は、形成された組織移植片中のすべての細胞に栄養素および酸素などのガスの拡散と共に、移植片組織内の廃棄物の局在による細胞毒性および同時に起こる死を最小限にするように、移植片からの細胞廃棄物の拡散を提供することによって、細胞生存を確実にする。
【００５８】
本発明の複合性足場の設計は、足場操作組織が模倣しようとする、天然組織の細胞編成に影響される。例えば、臓器組織が、各々栄養素供給源から２２５μｍより離れない細胞で構成される機能的単位に配置されることが先に示されてきている（ＰＣＴ／ＵＳ９８／００５９４を参照されたい）。こうした編成は、十分なガスおよび栄養素交換、そしてしたがって細胞生存および機能性を確実にする。したがって、臓器組織移植片を操作するのに、本発明の複合性足場を用いる場合、こうした複合性足場は、該足場上に形成される組織が、臓器機能単位の細胞配置を模倣するであろうように配置される、少なくとも２つの足場構成要素を有するであろう。
【００５９】
したがって、本発明の複合性足場は、該足場上の操作した組織が、ｉｎ  ｖｉｖｏで対応する組織に見られるのと緊密に近い細胞要素の空間的分布を示すであろうように設計される。これは、移植プロセス中、移植片組織の高率の生存を確実にする一方、操作した組織の迅速な移植を可能にするであろう。
【００６０】
本発明の複合性足場は、少なくとも２つの異なる足場構造から生成される。各足場構造は、特定の細胞種の増殖を組織化し、そして刺激するのに適した足場材料および微細構造で構成される。
【００６１】
例えば、血管新生構造組織の場合、本発明の複合性足場には、血管組織形成細胞のコロニー形成／増殖を支持するフィラメント状足場、および構造組織を形成する細胞種のコロニー形成／増殖を支持する連続性足場が含まれる。
【００６２】
本発明の複合性足場は、２つの異なる足場の完全な同時一体化を可能にして、機能的構築を維持する不均一組織の形成を可能にするように設計される。血管新生構造組織の場合、好ましくは、構造組織が血管組織を被包するように、連続性足場がフィラメント状足場の周囲に配置される。
【００６３】
本発明の複合性足場の多様な足場構成要素は、特に、足場が、以下に詳細に記載するように、不均一組織のｉｎ  ｖｉｖｏ生成に利用される場合、好ましくは、生体適合性材料で生成される。
【００６４】
用語「生体適合性」は、免疫応答または線維症を誘導しない物質を指す。生体適合性材料の例には、限定されるわけではないが、多糖、アルギネート、ポリアルコール、有機酸、アガロース、アガロース／ポリ（スチレンスルホン酸）、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート・コポリマー、ポリビニルアルコールおよびプロタミン−ヘパリンが含まれる。
【００６５】
本発明の複合性足場の多様な足場構成要素はまた、特に組織形成後、足場材料を除くことが重要である場合、好ましくは、生物分解性材料で生成される。
用語「生物分解性」は、加水分解酵素、タンパク質分解酵素、極端なｐＨ条件等の作用によって化学的に分解される物質を指す。生物分解性材料の例には、ポリヒドロキシ酸、修飾多糖およびその組み合わせなどのポリマー組成物が含まれる。
【００６６】
上に言及するように、血管新生構造組織を支持するための複合性足場には、好ましくは、２つの足場構造、血管組織形成のためのフィラメント状足場および構造組織形成のための連続性足場が含まれる。以下は、これらの２つの足場構造の詳細な説明である。
【００６７】
フィラメント状足場：
本発明にしたがったフィラメント状足場の生成は、以下の検討材料に配慮する：
（ｉ）フィラメントは、該フィラメント上での細胞接着および増殖中、損なわれない（ｉｎｔａｃｔ）ままでなければならないが、同時に、血流を支持する連続管腔を持つ、機能する血管を得るため、その後、１４〜３０日以内に迅速に侵食されなければならない。
【００６８】
（ｉｉ）フィラメント状足場への細胞の効率的な接着に続いて、フィラメント状足場周囲に細胞が増殖して、連続的でそして均質な細胞層を形成する。好ましくは、本発明のフィラメント状足場は、該足場上での細胞増殖を支持可能な固形の足場である。こうした足場は、血管管腔を模倣し、そして４〜５０ミクロンの均等な小さい毛細管直径を有する血管を形成することが可能である。
【００６９】
（ｉｉｉ）フィラメント状足場は、４〜５００ミクロンの間の範囲の直径を有する柔軟で薄いフィラメントの形成を可能にするのに十分に強く、そして柔軟でなければならない。
【００７０】
例えば薄いセルロース繊維を含む、多様な種類の生物分解性ポリマーがこれらの規準を満たす。セルロース繊維は、繊維を加水分解的分解（生物分解）により感受性にする、例えば、水性媒体中の過ヨウ素酸塩での酸化によって修飾可能である。酸化の度合いは、繊維の強度およびその分解プロフィールを決定する。これらの酸化繊維は、生物分解により感受性であるように、ポリ（ラクチド−グリコリド）などの生物分解ポリマーでの含浸によって、さらに修飾可能である。場合によって、アミノ酸を含む、親水性または疎水性の安全なアミノ含有分子と、繊維アルデヒド基を反応させることが可能である。
【００７１】
あるいは、ヒドロキシアルキル酸ポリエステル、ポリホスファゼン、ポリ（カーボネート）およびポリ（ホスフェートエステル）に基づくポリマーおよびコポリマーもまた使用可能である。ラクチド酸およびグリコリド酸に基づくポリマーは、こうした材料が、細胞増殖を支持可能であり、そしてヒトにおいて安全に移植可能であることが先に示されている（ＳｈａｎｄおよびＨｅｇｇｉｅ  ２０００）ため、本発明のフィラメント状足場と共に使用するのにより適している。
【００７２】
これらのポリマーはまた、上述の必要条件を満たすために修飾することも可能である。例えば、１０，０００を超える分子量を有する、ラクチド酸およびグリコール酸のブロックおよびランダムコポリマーを、薄いフィラメントにつむぐことが可能である。分解酵素が豊富な環境に曝露された際に、侵食が加速されるのを妨げるため、３０〜７０％の乳酸を含むコポリマーを使用して、移植数週間後まで、分解を遅延することが可能である。
【００７３】
フィラメント柔軟性の増加は、例えばクエン酸トリブチル、クエン酸酢酸トリブチル、リン脂質、オレイン酸エステル等の可塑化剤をポリマー混合物に添加することによって、またはポリマー鎖に、例えばリシノール酸などの剤を取り込むことによって、得ることが可能である。
【００７４】
フィラメント状足場の機械的特性は、高血圧に対する抵抗性を示す必要がある、動脈などの血管の形成を支持する際に最大化しなければならない。これは、多様な架橋法によって、上述のフィラメント状ポリマーを架橋して、達成可能である。
【００７５】
好ましくは、架橋は、ポリマー主鎖の立体架橋のためのリンカー分子として、乳酸のコポリマーの立体異性体などの立体異性体を利用する、立体複合体化を介して達成する（さらなる詳細に関しては、実施例セクションの実施例１を参照されたい）。
【００７６】
連続性足場：
本発明の連続性足場は、フィラメント状足場中のそして足場周囲の組織形成を支持するように設計される。連続性足場は、上述のポリマーいずれかおよび／または構造組織コロニー形成／増殖を支持するのに適した他のポリマーいずれかで構成可能である。
【００７７】
例えば、デキストラン、アラビノガラクタン、キトサン、アルギネート、プルラン、ヒアルロン酸等などの多糖、およびゼラチン、コラーゲン、フィブリン、フィブリノーゲン、アルブミン等などのタンパク質を用いて、あらかじめ決定した孔サイズを持つ、連続性（架橋）足場を形成可能である。あるいは、ラクチドおよびグリコリド発泡体などの合成ポリマーもまた使用可能である。
【００７８】
好ましくは、連続性足場構成要素は、穏やかな条件下で生成される。これによって、すでに細胞が植え付けられたフィラメント状足場構成要素上に、連続性足場構成要素を形成することが可能になる。粘性のヒアルロン酸溶液、カルシウム塩に架橋されたアルギネート、および変性または非毒性分子によって架橋されたタンパク質に基づく組成物を用いて、既に植え付けられたフィラメント状足場構成要素上に連続性足場構成要素を形成することが可能である。
【００７９】
あるいは、天然多糖、タンパク質、並びにエチレングリコールに基づくポリマーおよびプロピレングリコールに基づくポリマー、並びにそれらの混合物を含む、立体複合体化親水性ポリマーもまた、使用可能である。
【００８０】
複合性足場またはその構成要素いずれかはまた、生物活性（生理活性）剤も含むことが可能である。
多様な型の生物活性剤を、足場材料に取り込むか、または付着させることが可能である。取り込みまたは付着は、適切な条件下での、１以上の生理活性剤の遅延放出または持続放出のために設定可能である。
【００８１】
用いる生理活性剤は、わずかに水可溶性であり、好ましくは穏やかに水可溶性であり、そしてポリマー組成物を通じて拡散性である。これらは、酸性、塩基性、または塩であることも可能である。これらは、中性分子、極性分子、または水素結合可能な分子複合体であることも可能である。これらは、ヒトまたは動物の体に注射した際に、生物学的に活性化される、エーテル、エステル、アミド等の形であることが可能である。
【００８２】
本発明の複合性足場で使用するのに適した生理活性剤には、多様な細胞種の増殖／分化を誘導するサイトカインおよび増殖因子、疾患または疾病の治療、予防、診断、治癒または緩和のために使用する療法剤および診断剤が含まれる。
【００８３】
サイトカインおよび増殖因子の例には、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、ＰＤＧＦ、トランスフォーミング増殖因子ｂファミリメンバー、骨形成タンパク質ファミリーメンバー、線維芽細胞増殖因子ファミリーメンバーが含まれる。療法剤には、限定されるわけではないが、タンパク同化薬、制酸薬、抗喘息薬、抗高コレステロール血症薬および抗脂質薬、抗凝固薬、抗痙攣薬、止瀉薬、鎮吐薬、抗感染薬、抗炎症薬、抗躁薬（ａｎｔｉ−ｍａｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、制吐薬、抗腫瘍薬、抗肥満薬、解熱薬および鎮痛薬、鎮痙薬、抗血栓症薬、抗尿酸血症薬（ａｎｔｉ−ｕｒｉｃｅｍｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、抗狭心症薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、食欲抑制薬、生物学的製剤、脳拡張薬、冠拡張薬、充血除去薬、利尿薬、診断薬、赤血球生成薬、去痰薬、胃腸鎮静高血糖薬（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｅｄａｔｉｖｅｓ  ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、睡眠薬、血糖降下薬、イオン交換樹脂、緩下薬、ミネラル・サプリメント、粘液溶解薬、神経筋薬剤、末梢血管拡張薬、向精神薬、鎮静薬、興奮薬、甲状腺および抗甲状腺薬、子宮弛緩薬、ビタミン、抗原材料、およびプロドラッグが含まれる。
【００８４】
生理活性剤は、化学薬品、ペプチドまたはポリペプチド、あるいは組織発現可能構築物の一部を形成可能な核酸分子の形で提供することが可能である。
足場における活性剤の取り込みは、足場調製中に行うことが可能である。
【００８５】
例えば、負荷電生理活性剤（例えばＤＮＡ分子）を、足場形成前、足場形成中、または足場形成後に、あらかじめカチオン化した足場材料に付着させることが可能である。
生理活性剤を搬送系（例えば微小球体、リポソーム）内に被包した後、調製した足場に搬送系を付着させることが可能である。
【００８６】
多様な機構を用いて、足場移植後の生理活性物質の放出速度に影響を及ぼすことが可能である。例えば、移植後に分解するように足場材料を配合して、それによって、足場からの生理活性物質の放出を促進することが可能である。例えばペプチドまたはタンパク質のように水に低い可溶性を有する物質の放出は、典型的には、ポリマーマトリックスの実質的な部分が分解して、物質が直接、周囲の組織流体に曝露されることを必要とする。したがって、足場からの生物学的活性物質の放出は、例えば、とりわけ、水における生理活性物質の溶解度、足場内の生理活性物質の分布、または足場材料の大きさ、形状、多孔性、溶解度および生物分解性によって、多様である可能性がある。
【００８７】
足場からの生理活性物質の放出はまた、足場材料の分子量を変化させることによっても、そして酸化剤または親水性分子などの速度修飾剤を添加することによっても制御可能である。
【００８８】
足場に１より多い生理活性剤が含まれる場合、各生理活性剤に関して、特定の放出速度および／または時間を設定することが可能である。こうした特定の放出制御は、組織形成を誘導するのに生理活性剤を用いる場合、特に望ましい。
【００８９】
例えば、血管組織形成において、ＶＥＧＦの持続放出、並びにその後のアンギオポエチン１、２および３の持続放出が、効率的な血管形成および成熟のために必須である。
療法的に有効な量で、生物学的活性剤を用いる。生物学的活性剤の有効量は、用いる特定の物質、搬送系および放出速度に応じるであろう。
【００９０】
ｅｘ  ｖｉｖｏの組織操作の成功は、多様な決定的な実験条件を満たすかどうか次第である。１つは、再生適格細胞およびキャリアー足場両方を含む、必要な構成要素を有することである（上に論じる）。別の必要条件は、細胞増殖、分化および移植後の周囲の組織との最終的な一体化を実行可能な環境である。
【００９１】
したがって、本発明の別の側面にしたがって、不均一組織をｅｘ  ｖｉｖｏで形成する方法を提供する。例示目的のため、不均一組織は、血管新生された構造組織に代表される。
【００９２】
第一の工程は、典型的には、血管構造基盤の構築を伴う。血管細胞は、分化して、そして血管および毛細管を裏打ちする細胞を生じることが可能な細胞種、すなわち大血管、皮膚組織、包皮組織、骨髄等由来の内皮細胞または周皮細胞いずれの細胞種であることも可能である。血管細胞を、上述のフィラメント状足場のポリマーフィラメント上に植え付ける。この工程は、スピナーフラスコまたは攪拌試験管を用いて、達成可能である。植え付けたフィラメント状足場を、３７℃インキュベーター中で７〜１４日間インキュベーションする。この結果、フィラメント状足場が血管細胞で覆われ、そして血管ベッド系または血管構造基盤と称される、分岐管状血管構造の複合体が形成される（実施例セクションの実施例６を参照されたい）。
【００９３】
上述のように、フィラメント状足場材料に、血管組織の分化および成熟を促進する多様な血管形成因子（すなわち血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン１、２、３）を取り込むことが可能である（以下の実施例セクションの実施例６を参照されたい）。これらの因子の持続放出は、生物学的状態を模倣し、したがって、血管形成性分化および血管形成を可能にする。
【００９４】
血管形成構成要素の形成後、形成された血管ベッドを連続性足場に包埋する。
例えば、ヒアルロン酸、アルギネート、酸化セルロース、高分子量デキストラン、プルランまたはアラビノガラクタンなどの、天然または半天然多糖またはタンパク質水性溶液を用いることによって、包埋を達成することが可能である。骨形成細胞または筋形成細胞などの特定の組織細胞を、コロイド分散中に混合し、そして血管構造基盤上に鋳造して、植え付けられた複合性足場を形成する。酸性多糖（すなわちアルギネート、ヒアルロン酸等）の場合はカルシウム塩、あるいは一級アミノ含有タンパク質（すなわちゼラチン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン等）またはキトサンの場合は、酸化アルデヒド含有多糖などのゲル化成分を添加することによって、細胞を含有する連続性足場材料を凝固可能である。あるいは、上述のような多糖に基づく連続性足場の立体複合体化によって、ゲル化を得ることが可能である。
【００９５】
あるいは、連続性足場溶液をフィラメント状足場上に鋳造し、そして重合後、その上に細胞を植え付けることが可能である。続く実施例セクションの実施例４は、２つの細胞構成要素をｅｘ  ｖｉｖｏで同時培養する足場を例示する。
【００９６】
本発明の複合性足場はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織生成にも使用可能である。
したがって、本発明の別の側面にしたがって、不均一組織をｉｎ  ｖｉｖｏで形成する方法を提供する。
【００９７】
個体において、本発明の複合性足場を移植することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織生成を達成可能である（例えば図２、パラダイム１を参照されたい）。
こうした場合、足場材料には、好ましくは、１以上の組織種のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖を促進する生理活性剤（例えば血管形成因子）が含まれる。
【００９８】
本発明の複合性足場はまた、ｅｘ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏ組織生成の組み合わせにも使用可能である。
したがって、本発明の別の側面にしたがって、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ組織操作アプローチを組み合わせて、不均一組織を形成する方法を提供する（図２、パラダイム２および３に例示される）。
【００９９】
例えば、血管細胞を所持する血管構造基盤足場を、組織連続性足場に包埋し、そして形成された複合性足場を個体内に移植する。こうした足場の移植は、宿主血管系と一体化される用意ができた、血管構造基盤を提供し、そしてこうしたものとして、組織の内殖および再生に最適なセッティングを提供する。
【０１００】
あるいは、そして図２にもまた示すように（パラダイム３を参照されたい）、構造組織は、血管形成因子（類）を含むフィラメント状足場の周囲の連続性足場上に、ｅｘ  ｖｉｖｏで形成することが可能である。移植後、血管形成因子（類）は、移植構造組織への毛細管および血管の内殖を促進するであろう。
【０１０１】
したがって、本発明は、複合性足場、および不均一組織のｅｘ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏ生成に該足場を用いる方法を提供する。
本発明は、本明細書に記載する足場／組織形成順序に制限されず、そして本発明の複合性足場を用いて、いかなる足場／組織形成順序を達成することも可能であると認識されるであろう。
【０１０２】
本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴は、限定を意図しない、以下の実施例を調べた際に、一般の当業者には明らかであろう。さらに、上記に記載するような、そして請求項セクションに請求するような、本発明の多様な態様および側面は各々、以下の実施例に実験的支持を見出す。
【０１０３】
（実施例）
ここで以下の実施例に言及し、実施例は、上記の説明と共に、限定しない様式で、本発明を例示する。
【０１０４】
一般的に、本明細書に用いる命名法および本発明に利用する実験法には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。こうした技術は、文献に十分に説明される。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｉ−ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．監修（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  メリーランド州ボルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら，  “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら（監修）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，  １−４巻，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に示されるような方法論；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，  Ｉ−ＩＩＩ巻  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．監修（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  ニューヨーク（１９９４），  第三版；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，  Ｍ．Ｊ．監修（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．監修（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．監修（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．監修（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．（１９８４）および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  １−３１７巻，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら，  “Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい；これらはすべて、本明細書に完全に示さ���るかのように、本明細書に援用される。
【実施例１】
【０１０５】
（実施例１）
デキストランに基づくポリマー性足場とポリＤおよびＬ乳酸の立体複合体化
ポリマー性細胞足場の機械的特性の改善は、組織操作の分野において、特に、高い破裂力（ｂｕｒｓｔ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を示すに違いない血管組織細胞足場の場合、主要な優先事項である。こうした足場は、ポリマー主鎖の架橋によって、機械的に強化することが可能である。この目的を達成するため、デキストランに基づくポリマー性足場の立体複合体化を以下のように達成した：
材料および方法：
デキストランに基づく２種類のブロックコポリマーであって、一方は、少なくとも１０のモノマー単位の鏡像異性体Ｄ−乳酸の部分を含有し、そしてもう一方は、少なくとも１０のモノマー単位の鏡像異性体Ｌ−乳酸の部分で構成される、前記コポリマーを調製した。その後、これらの２つのコポリマーを共に混合して、ポリマー鎖に沿って、相補的ＤおよびＬ鏡像異性ブロック間に特定の立体複合体相互作用を形成した。１５００の分子量を有するポリＤおよびＬ乳酸のコポリマー鎖（ＰＬＡ）を、デキストランヒドロキシル基を介して、デキストラン４０，０００または５００，０００に別個にコンジュゲート化することによって、ポリマー主鎖の立体複合体化を達成した。
【０１０６】
Ｏ−ｐ−ニトロフェニル誘導体を用いたＰＬＡの活性化：ガラスバイアル中、ＰＬＡ（１等量）、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（４等量）およびトリエチルアミン（６等量）を１００ｍｇ  ＰＬＡあたり１ｍｌジクロロメタンに溶解した。混合物を室温で一晩攪拌し、その後、濃縮された溶液が得られるまで、ジクロロメタンを蒸発させて、これをイソプロパノール中で沈殿させ、ＰＬＡ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルを得た（＞９０％収率）。
【０１０７】
デキストランへのＰＬＡ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルのコンジュゲート化：デキストラン（１ｇ）、ＰＬＡ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニル（１０糖単位あたり１等量）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１等量）を無水ＤＭＳＯ中で混合し、そして混合物を室温で４８時間、密封して攪拌した。その後、イソプロパノールを添加した後、遠心分離することによって、混合物を沈殿させた。沈殿物にジクロロメタンを添加して、未結合ＰＬＡ残渣を洗い流した。アノマープロトンの代表として４．９および４．５百万分率（ｐｐｍ）のピークを、そして三級ＰＬＡプロトンの代表的ピークとしてピーク５．３ｐｐｍを用いたＨ  ＮＭＲによって、コンジュゲート化の度合いを評価した。
【０１０８】
図１に示すように、Ｌ−ＰＬＡ移植デキストランおよびＤ−ＰＬＡ移植デキストランの溶液または分散系を、室温で２４時間、架橋条件下で混合した後、Ｄ−およびＬ−乳酸オリゴマーは、デキストランポリマー鎖と共に、ラクチド残基の立体複合体化のため、三次元デキストランマトリックスを形成する。
【実施例２】
【０１０９】
（実施例２）
血管組織の増殖のための、ラクチド−グリコリド・ポリマーに基づくフィラメント状細胞足場の合成
単一の一体化細胞足場内で、標的置換組織および支持血管組織両方を最適に増殖させるため、各々の増殖を最適にして、そして２つの間に適切な構造的および機能的関係を確立するように、各組織種に関してこうした一体化された足場内の特別の下位区画が必要である。これは、標的置換組織の増殖のため、連続性スポンジマトリックス内に包埋された血管組織の増殖のための、フィラメント状足場の使用を介して、構造的に達成可能である。
【０１１０】
したがって、連続性スポンジマトリックス細胞足場内に包埋した際、血管組織の最適な増殖を支持可能なポリ（ラクチド−グリコリド）ポリマーに基づくフィラメント状の細胞足場を合成した。こうしたポリマーの使用は、ポリペプチド、核酸または脂質などの剤の取り込みをさらに可能にして、中の血管細胞の増殖および分化を促進する。
【０１１１】
材料および方法：
血管組織足場のためのフィラメントは、メタノールまたはヘキサンなどの貧溶媒（ａｎｔｉｓｏｌｖｅｎｔ）に注入溶液を通過させることによって、ジクロロメタン中のポリ（ラクチド−グリコリド（１：１））Ｍｗ＝５０，０００の粘性溶液（１０〜３０％ｗ／ｖ）をスプーンで入れてフィラメントにして、該溶液から調製した。フィラメント束の三次元ネットワークを形成するように、ランダムフィラメントをわずかに圧縮し、これを細胞植え付けに使用した。スプーンで入れてフィラメントにする前に、活性剤をポリマー性材料中に混合することによって、こうした足場への生理活性剤の取り込みを達成した。未結合（ｆｒｅｅ）粉末状化合物として、あるいは生物分解性ポリマーナノまたはミクロ球体中にあらかじめ被包するなどの配合型中で、活性剤を添加することが可能である。活性剤はまた、溶媒蒸発後、活性剤を含有する薄いコーティングを形成する、活性剤含有ポリマー性溶液でフィラメントをコーティングすることによって、形成されたフィラメント上に適用可能である。
【実施例３】
【０１１２】
（実施例３）
一体化三次元細胞足場内の標的置換組織およびその支持血管系で構成される、ハイブリッド組織増殖のパラダイム
三次元人工的細胞足場中で増殖させた組織を用いた、体組織の再構築は、疾患、不全または欠損組織または臓器の置換の非常に望ましいゴールに相当し、そしてこうした再構築が自己組織で達成されない際の移植ドナー組織の拒絶を避ける、際立った利点がある。このゴールを達成するのを妨げる主な障害は、三次元の生物学的に操作された置換組織の血管新生が必要なことである。この望ましい目的を達成するため、標的置換組織およびその支持血管組織両方の、組み合わされ、そして調節された増殖を可能にする人工的細胞足場を構築した。こうした足場の構造は、標的置換組織の増殖を支持するように設計された、三次元連続性マトリックススポンジポリマー内に一体化して包埋される、内皮細胞による支持血管系の管状増殖のために設計された、第一のフィラメント状ポリマー構成要素で構成される。これらのポリマー構成要素はどちらも、各構成要素に望ましい細胞の特異的な分化を促進する因子の調節された搬送のために、さらに設計された。
【０１１３】
したがって、こうした組織置換法の完全な最適化および利用を実施し、そして可能にするため、置換標的組織およびその支持血管系のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ増殖の多様な組み合わせを使用した様式を練り上げた。
【０１１４】
材料および方法：
一体化細胞足場内の標的置換組織および支持血管組織両方のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖のためのパラダイム：この様式において、血管細胞の増殖のためのフィラメント状ポリマー足場を標的置換組織の増殖のための連続性マトリックス足場内に一体化して包埋する。フィラメント状ポリマー足場周囲で連続性マトリックスポリマー足場の重合を誘導することによって、これを達成する。それぞれの組織のｉｎ  ｖｉｖｏ移植、増殖および／または分化を最適にするように、足場を構成するポリマーをあらかじめ処理した。足場構成要素が化学誘引剤、接着分子、分化因子および／または増殖因子を発現するか、そして／またはこうした因子の産生を導く核酸を取り込むようにあらかじめ処理することによって、これを達成した。天然遊走、接着、分化および／または既定の組織種に特異的な増殖刺激を要約するような、これらの因子の連続的持続放出によって、この方法をさらに増進した。例えば、血管形成を刺激するため、血管組織増殖の初期段階中に、ＶＥＧＦを放出し、そして分化および血管新生が進行するにつれて、順々に、アンギオポエチン１、２および３と交換した。
【０１１５】
したがって、この組織置換療法様式では、前駆細胞をあらかじめ植え付けずに、一体化細胞足場をｉｎ  ｖｉｖｏで移植して、その中で、レシピエントのコロニー形成細胞由来の血管組織および標的置換組織の分化コロニー形成および増殖を促進した（図２、パラダイム１）。
【０１１６】
標的置換組織のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖と組み合わせた一体化細胞足場内の支持血管組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖：上述の方法と同様、この様式で、それぞれの組織の移植、増殖および／または分化を最適にするように、足場を構成する標的置換組織特異的ポリマーおよび血管系特異的ポリマーをあらかじめ処理するが、この場合、血管系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、それに続く標的置換組織のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を最適にするように、血管系特異的ポリマーをあらかじめ処理する（図２、パラダイム２）。したがって、この様式で、以下のように、内皮細胞などの血管細胞を足場に植え付け、その後、血管細胞の増殖に最適な条件下で、バイオリアクター中で培養することによって、血管組織の増殖をまず、ｅｘ  ｖｉｖｏで行う（Ｖａｉｌｈｅ  Ｂ．ら，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００１，  ８１：４３９）：
試験管中、９６ウェルで、足場上に血管細胞の培地中の細胞懸濁物を添加し、その後、スピナーフラスコまたは攪拌試験管中で２０時間培養することによって、足場に、足場あたり２００万〜４００万の血管細胞を植え付ける。これらの血管細胞には、患者由来またはドナー由来の大血管、皮膚組織、包皮組織または骨髄等由来の内皮細胞または周皮細胞が含まれることが可能である。その後、これらのあらかじめ植え付けた血管形成性足場を、バイオリアクター中またはスピナーフラスコ中で、７〜１４日間、さらに培養する。この血管形成構成要素の形成後、生じた血管ベッドを標的置換組織ポリマー溶液中に包埋して、これを誘導して血管構造基盤周囲に重合させる。
【０１１７】
この段階後、あらかじめ血管新生させた足場を、標的置換組織のコロニー形成、増殖および分化に望ましい解剖学的位置で、レシピエントに移植する。
【０１１８】
一体化細胞足場内の標的置換組織および支持血管組織両方のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖のためのパラダイム：この組織置換療法様式では、標的置換組織および支持血管組織両方を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの移植前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、一体化した細胞足場中で増殖させた（図２、パラダイム３）。先の様式で記載したように、それぞれの組織の移植、増殖および／または分化を最適にするように、足場を構成する標的置換組織特異的ポリマーおよび血管系特異的ポリマーをあらかじめ処理したが、この場合、レシピエントにおける移植前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのそれらの増殖および分化を最適にするように、これらをあらかじめ処理した。したがって、この様式では、以下のように、血管細胞を足場に植え付けることによって、ｅｘ  ｖｉｖｏで血管組織および標的置換組織両方の増殖を行い、そして両組織種の増殖および分化を可能にする条件下で、植え付けた足場をバイオリアクター中で培養した：
フィラメント状ポリマーの細胞足場に、足場あたり２００万〜４００万の内皮細胞を植え付け、そして植え付けた足場を、スピナーフラスコまたは攪拌試験管中で２０時間インキュベーションし、その後、回転バイオリアクター中またはスピナーフラスコ中で、７〜１４日間、足場をさらにインキュベーションした。
【０１１９】
この血管形成構成要素の形成後、生じた血管ベッドを、標的置換組織細胞を含有する重合連続性マトリックスポリマー溶液に浸して包埋した。あるいは、スピナーフラスコ中または攪拌試験管中で４〜１０時間培養することによって重合した後、一体化した細胞足場に標的置換組織前駆細胞を植え付けることが可能である。バイオリアクター中で、植え付けた足場をさらに７〜１４日間培養することによって、足場と共に標的置換組織の増殖を達成した。
【０１２０】
この段階後、再構築し、そして血管新生した組織を含有する足場を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、構成要素組織のさらなるコロニー形成および増殖に望ましい解剖学的位置で、レシピエントに移植した。
【実施例４】
【０１２１】
（実施例４）
骨形成タンパク質−２をコードするＤＮＡを装填した細胞足場内でのｉｎ  ｖｉｖｏ軟骨増殖の異所性（ｅｃｔｏｐｉｃ）誘導
人工的細胞足場内の細胞のホーミング、接着、分化および増殖を最適にするため、これらのプロセスを支持するのに必要な生物学的環境を、足場内に生成することが必要である。これは、望ましい組織特異的細胞のホーミング、接着、分化および増殖を促進するポリペプチド因子を示すかまたは放出するように、足場をあらかじめ処理することによって、達成可能である。この目的を達成するために取ることが可能な１つの強力なアプローチは、足場内に存在する細胞、または足場にごく近接して存在する細胞によって取り込まれ、そして発現されることが可能な型の核酸を足場内に取り込むことである。
【０１２２】
この目的を達成するため、ＤＮＡ搬送系として働く、デキストラン複合体化プラスミドまたはリポソーム複合体化プラスミドを装填した細胞足場を使用する方法を開発した。
【０１２３】
材料および方法：
β−ガラクトシダーゼをコードするリポソーム複合体化プラスミドのＭＳＣへのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション：リポソーム−ＤＮＡ複合体を装填した細胞足場のこうしたトランスフェクションを行う前に、図３ａに示すように、ＭＳＣにリポソーム−ＤＮＡ複合体をトランスフェクションして、このトランスフェクション様式の実行可能性を決定した。以下は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこうしたトランスフェクションのためのプロトコルを記載する。
【０１２４】
以下のように、培養したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２  ＭＳＣに、β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードする、リポソーム複合体化プラスミドｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬをトランスフェクションした：１．３ｘ１０５細胞を、６ウェルプレート中の２ｍｌ完全培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２を含む３７℃加湿インキュベーター中で、２４時間培養して、細胞単層の増殖を生じた。２．２ｍｌの２．２ｍＭ  ｐＮＧＶＬ−ｎｔｂＧＡＬを９８ｍｌの血清不含培地と混合し、その後、簡単にボルテックスすることによって、ＤＮＡ−リポソーム複合体を調製した。この混合物に、８２ｍｌの「Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ」（ＱＵＩＡＧＥＮ）リポソーム懸濁物を添加して、そしてこの混合物を５〜１０分間置いておき、プラスミドおよびリポソームの複合体化を可能にし、その後、複合体化混合物に、４８６ｍｌの完全培地を添加した。続いて、細胞単層を１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そしてリポソーム−プラスミド複合体と２〜３時間インキュベーションした。
【０１２５】
β−ガラクトシダーゼ発現の検出のため、Ｘ−ｇａｌで培養を染色することによって、２４時間後、トランスフェクション効率を決定した。
【０１２６】
デキストラン・ポリカチオン複合体化ＤＮＡを用いた、ＭＳＣへのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション：細胞足場に装填したデキストラン−ＤＮＡ複合体のこうしたトランスフェクションを行う前に、このトランスフェクション様式の実用性を決定するため、図４ａに示すように、ＭＳＣ株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に、β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードするデキストラン複合体化プラスミドｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬをトランスフェクションした。トランスフェクションのためのデキストランへのＤＮＡの複合体化を、以下のように行った：
１．３ｘ１０５ＭＳＣ細胞を、６ウェルプレート中の２ｍｌ完全培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２を含む３７℃加湿インキュベーター中で、２４時間培養して、細胞単層の増殖を生じた。３０ｍｌの０．２ｍＭ  ｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬ、２４ｍｌのデキストラン・ポリカチオンおよび２９ｍｌのＨＢＳＳからなるトランスフェクション混合物を調製し、そして３０分間置いておき、ＤＮＡおよびデキストランの複合体化を可能にした。１ｍｌの１ｘＰＢＳで細胞単層を洗浄し、そして６９ｍｌのＤＮＡ−デキストラン複合体溶液を含有する１ｍｌの血清不含培地の混合物中に再懸濁した。トランスフェクション混合物を、５％ＣＯ２を含む３７℃加湿インキュベーター中で、４時間インキュベーションして、そして１ｍｌ  ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、そして１ｍｌ完全培地中に再懸濁した。
【０１２７】
β−ガラクトシダーゼ発現の検出のため、Ｘ−ｇａｌで培養を染色することによって、２４時間後、トランスフェクション効率を決定した。
【０１２８】
アラビノガラクタン−キトサン・ポリマー性足場の調製：アラビノガラクタン−キトサン足場が細胞コロニー形成を誘導し、そしてＤＮＡを装填した際には、コロニー形成細胞における導入遺伝子の取り込みおよび発現を導くことが可能なＤＮＡ搬送系として働く能力を試験するため、アラビノガラクタン−キトサン足場にデキストラン複合体化ＤＮＡまたはリポソーム複合体化ＤＮＡを装填した。
【０１２９】
アラビノガラクタン−キトサン細胞足場を以下のように調製した：
６００ｍｇのキトサンを３０ｍｌの２％酢酸溶液に溶解して、これに２０％（ｗ／ｗ）アラビノガラクタンを添加した。ゲル形成後、１５０ｍｌ／ウェルでマイクロタイタープレートに試料をアリコットし、そして３７℃で４８時間インキュベーションした。試料を−８０℃で凍結し、凍結乾燥し、そして中性ｐＨに到達するまで、０．５Ｍ  ＮａＯＨおよび再蒸留水で洗浄した。その後、足場を再凍結し、凍結乾燥し、そしてＵＶ照射によって滅菌した。
【０１３０】
その後、以下のように、アラビノガラクタン−キトサン足場への取り込みのため、非複合体化プラスミド、デキストラン複合体化プラスミドおよびリポソーム複合体化プラスミドを調製した：
細胞足場のＤＮＡ装填：細胞足場に装填するためのプラスミドＤＮＡの組成物は以下のように調製した：
非複合体化プラスミド：５１ｍｌの１．５ｍＭ  ｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬを４９ｍｌの５％デキストロースと混合した。
【０１３１】
リポソーム複合体化プラスミド：２１ｍｌの７．４ｍＭ  ＤＯＴＡＰ−コレステロール（ＲＯＣＨＥ）溶液を、５１ｍｌの１．５ｍＭプラスミドＤＮＡおよび２８ｍｌの５％デキストロースと混合した。
【０１３２】
デキストラン複合体化プラスミド：２７ｍｌのデキストランポリマー（４ｍｇ／ｍｌ）を５１ｍｌのプラスミドＤＮＡおよび２２ｍｌの５％デキストロースと混合した。
アラビノガラクタン−キトサン足場を非複合体化プラスミド、リポソーム複合体化プラスミドまたはデキストラン複合体化プラスミドを含有する溶液（上述）に浸し、そして続いて凍結乾燥した。各足場に７０ｍｇのプラスミドＤＮＡが堆積するまで、浸す工程および凍結乾燥工程を反復した。
【０１３３】
β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミド組成物を装填した足場のｉｎ  ｖｉｖｏ移植：β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードする、リポソーム複合体化プラスミドおよびデキストラン複合体化プラスミドｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬのＭＳＣへのトランスフェクション成功を立証した（以下を参照されたい）後、こうしたプラスミドを装填した足場がｉｎ  ｖｉｖｏでコロニー形成細胞を補充する能力および装填したプラスミドでこれらを遺伝的に形質転換する能力を決定するため、非複合体化、デキストラン複合体化またはリポソーム複合体化ｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬを装填した、アラビノガラクタン−キトサン・ポリマー性細胞足場をマウスに皮下移植した。プラスミドを装填した細胞足場の移植および試料の採取を、以下のように行った：
プラスミドを装填した足場をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスに皮下移植し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現の解析のため、移植２週間後および４週間後、ｉｎ  ｖｉｖｏで継代した足場試料を採取した。
【０１３４】
骨形成因子ＢＭＰ−２をコードするプラスミドの組成物を装填した細胞足場のｉｎ  ｖ
ｉｖｏ移植：β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードする、リポソーム複合体化プラスミドおよびデキストラン複合体化プラスミドｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬを装填した、アラビノガラクタン−キトサン細胞足場にコロニー形成する細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子の発現成功を立証した（以下に記載する）後、ヒトＢＭＰ２をコードする裸のプラスミドｐＢＭＰ２を装填した足場をｉｎ  ｖｉｖｏで移植した。これは、組織特異的分化因子をコードするプラスミドを装填した、こうした細胞足場が、足場内で細胞のコロニー形成を誘導する能力、および装填したプラスミドでこれらを遺伝的に修飾する能力を試験するため、行った。
【０１３５】
プラスミドを装填した細胞足場の移植および試料の採取を、以下のように行った：
アラビノガラクタン−キトサン細胞足場に裸のまたはリポソーム複合体化ヒトＢＭＰ−２コードプラスミドを装填した。ＤＮＡ複合体化および足場への装填を上述のように行った。上述のように足場をプロセシングしたが、これらに足場あたり２００ｍｇのＢＭＰ−２コードプラスミドＤＮＡを装填した点が変更されていた。その後、プラスミドを装填した細胞足場をＣ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣＤヌードマウスに皮下移植し、そして移植４週間後、試料を採取して、そして組織学解析および免疫組織化学解析のためにプロセシングした。
【０１３６】
結果：
リポソーム複合体化ＤＮＡ発現ベクターのＭＳＣへの効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション：「Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ」リポソーム−ＤＮＡ（β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードするプラスミドｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬ）複合体でのＭＳＣ発現のトランスフェクションのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効率は、有意に上昇していることが見出され、検出のため、Ｘ−ｇａｌで培養を染色することによって、２４時間後に測定すると、形質導入細胞の５０％がβ−ガラクトシダーゼの産生を示した（図３ｂおよび３ｃ）。
【０１３７】
したがって、これらの結果は、リポソーム複合体化ＤＮＡ発現ベクターでの細胞足場のこうした装填が、人工的細胞足場にコロニー形成する細胞を遺伝的に修飾するための効率的なＤＮＡ搬送系として働くことが可能であることを示す。
【０１３８】
デキストラン複合体化ＤＮＡ発現ベクターのＭＳＣへの高効率ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション：デキストラン・ポリカチオン−ＤＮＡ（β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードするプラスミドｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬ）複合体でのＭＳＣ発現のトランスフェクションのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効率は、非常に上昇していることが見出され、検出のため、Ｘ−ｇａｌで培養を染色することによって、２４時間後に測定すると、形質導入細胞の８０％がβ−ガラクトシダーゼの産生を示した（図４ｂおよび４ｃ）。
【０１３９】
したがって、これらの結果は、デキストラン複合体化ＤＮＡ発現ベクターでの細胞足場のこうした装填が、人工的細胞足場にｉｎ  ｖｉｔｒｏでコロニー形成する細胞を遺伝的に修飾するための効率的なＤＮＡ搬送系として働くことが可能であることを示す。
【０１４０】
β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドの組成物を装填した細胞足場にコロニー形成する細胞の効率的なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝的形質転換：β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードする、リポソーム複合体化プラスミドおよびデキストラン複合体化プラスミドｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬを装填し、ｉｎ  ｖｉｖｏで継代した、アラビノガラクタン−キトサン細胞足場を、β−ガラクトシダーゼの発現に関して解析した。Ｘ−ｇａｌでの染色による足場の解析によって、移植２週間後（データ未提示）および４週間後（図５）、リポソーム−プラスミド複合体およびデキストラン−プラスミド複合体を装填した足場に隣接した領域で、有意な比率のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞が検出された。
【０１４１】
移植した足場の組織学的解析によって、病的または不都合な免疫応答の非存在下での足場ポリマーの生物分解がさらに確認された。
したがって、これらの結果は、こうしたリポソーム−プラスミド複合体およびデキストラン−プラスミド複合体を装填した足場が、移植物の近傍で、細胞を遺伝的に修飾することが可能なｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＮＡ搬送系として安全に働く能力を立証する。
【０１４２】
ヒトＢＭＰ−２コードプラスミドの組成物を装填した細胞足場の移植物において、ｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨形成が効率的に誘導される：ｉｎ  ｖｉｖｏで移植されている、裸のまたはデキストラン複合体化ヒトＢＭＰ−２コードプラスミドを装填したアラビノガラクタン−キトサン細胞足場を、顕微鏡解析によって、軟骨増殖に関して解析した。足場は、移植４週間後、有意な軟骨増殖を示すことが見出された（図６）。
【０１４３】
したがって、これらの結果は、裸のまたはデキストラン複合体化ＢＭＰ−２コードプラスミドを装填した細胞足場が、移植した細胞足場の近傍で、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を遺伝的に修飾可能なＤＮＡ搬送系として働く能力を立証する。デキストラン複合体化プラスミドを装填した足場が、裸のプラスミドＤＮＡを装填したものに比較した際、より高いレベルの軟骨形成を誘導することが、さらに観察された。
【実施例５】
【０１４４】
（実施例５）
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた一体化細胞足場内での骨形成組織および血管組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖
組織置換のための１つの戦略は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、標的置換組織の増殖および分化を促進する因子を発現するよう遺伝的に修飾されている標的置換組織に特異的な前駆細胞を細胞足場に植え付け、そして培養することである。標的置換組織の効率的再構成のため、植え付けたこうした足場をその後、ｉｎ  ｖｉｖｏで再移植することが可能である。
【０１４５】
三次元置換組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養によって達成される組織置換の主な障害は、こうした組織に血管新生される必要があることである。上述のように、これは、標的置換組織の増殖および分化を支持する、連続性スポンジマトリックスポリマー内に包埋された血管細胞の増殖のため、フィラメント状ポリマー構成要素を含有する、一体化細胞足場を使用することによって、達成可能である。したがって、こうした一体化細胞足場に、標的置換細胞前駆細胞および血管形成細胞両方を植え付け、これによって、支持血管新生を含む、標的置換組織を形成することが可能である。
【０１４６】
材料および方法：
ＢＭＰ−２を発現するＭＳＣの遺伝子修飾：β−ガラクトシダーゼを発現するよう遺伝的に修飾したネズミＭＳＣにさらにトランスフェクションして、骨形成因子である組換えヒトＢＭＰ−２を発現させた。こうした細胞を細胞足場に植え付けた際、骨形成を刺激するため、ＭＳＣ中で骨形成因子ＢＭＰ−２を発現し、そしてこれらの二重トランスフェクタントによって同時に産生されるβ−ガラクトシダーゼを使用して、トランスフェクタントを同定した。テトラサイクリン類似体ドキシサイクリンの存在下で、ＢＭＰ−２発現の誘導性遮断を可能にするため、テトラサイクリン／ドキシサイクリンに阻害されるプロモーターの制御調節下で、ＢＭＰ−２を発現させた。
【０１４７】
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた細胞足場内の骨形成組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成：骨組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させるため、アラビノガラクタン−キトサン細胞足場に、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた。以下のように細胞足場に植え付け、そして培養した：
実施例４に記載するように調製した、アラビノガラクタン−キトサン足場を、１５ｍｌの完全培地中で６時間攪拌することによって水和した。その後、水和した足場に、足場あたり１ｍｌの完全培地体積中で、ＢＭＰ−２およびβ−ガラクトシダーゼを発現するよう遺伝的に修飾した２ｘ１０６ＭＳＣを植え付け、そして１００ＲＰＭで２０時間攪拌しながら培養した。その後、５０ｍｌ容器あたり４つの足場で、４８時間ごとに培地を交換しながら、回転バイオリアクター（ＳＹＮＴＨＥＣＯＮ）中で、植え付けた足場をさらに２週間培養した。
【０１４８】
マッソン三色を用いて、骨性組織に存在するコラーゲンＩを検出し、そして軟骨細胞検出のため、アルシアンブルーを用いて、骨性組織の形成を組織学的に解析した。
【０１４９】
内皮細胞およびＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けたアラビノガラクタン−キトサン細胞足場のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養：一体化した細胞足場条件内で、支持血管系を含めて標的置換組織を増殖させるための１つの様式は、標的置換組織および支持血管組織両方を生じさせる細胞種を、一体化した足場に同時に植え付けて、そしてこうした植え付けた足場をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することである。しかし、これを達成するため、両方の組織種が、細胞足場内で共に、そして同一培養条件下で、コロニー形成し、そして分化することが可能であると立証しなければならない。
【０１５０】
したがって、以下のように、内皮細胞、並びにＢＭＰ−２およびβ−ガラクトシダーゼを発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣ両方を細胞足場に植え付け、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した：
アラビノガラクタン−キトサン細胞足場を調製し、水和し、そして足場あたり、遺伝的に修飾したＭＳＣおよび内皮細胞各々を１０６細胞用いて（総計２ｘ１０２）、上述のように、ネズミ内皮細胞株β−ＥＮＤ−２またはＭＢＡ２．１と共に、遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた。５０ｍｌ容器あたり４つの足場で、回転バイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ）中で、植え付けた足場を培養して、そしてその後、採取し、そして組織学的解析のため、プロセシングした。培養した足場の凍結１５ｍｍ切片を、それぞれ軟骨組織および遺伝的に修飾されたＭＳＣ由来の細胞を検出するため、Ｈ＆ＥまたはＸ−ｇａｌいずれかで染色した。
【０１５１】
結果：
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた、アラビノガラクタン−キトサン細胞足場における、骨形成組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖：回転バイオリアクター中で２週間、アラビノガラクタン−キトサン細胞足場内で、遺伝的に修飾したＭＳＣを培養すると、それぞれ、マッソン三色およびアルシアンブルーでの組織特異的染色によって決定した際、骨表現型および軟骨表現型を示す、密集した骨形成組織を形成することが見出された（図７、左から三番目の列）。
【０１５２】
したがって、これらの結果は、この系が、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾した間葉幹細胞の培養によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、分化した軟骨および骨標的置換組織を効率的に生成可能であることを立証する。
【０１５３】
これは、したがって、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾した間葉幹細胞を用いた組織置換療法で利用して、骨性組織を再生する、組織置換療法で利用しようとする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組織増殖の実行可能性を立証する。
【０１５４】
内皮細胞およびＢＭＰ−２発現ＭＳＣを植え付けた細胞足場内のハイブリッド骨形成組織および血管組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形成：
ＢＭＰ−２およびβ−ガラクトシダーゼを発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣ、およびＭＢＡ２．１またはβ−ＥＮＤ−２内皮細胞株いずれかの細胞を植え付けたアラビノガラクタン−キトサン細胞足場の組織学的解析によって、培養した足場中のＸ−ｇａｌ陽性細胞およびＸ−ｇａｌ陰性細胞の視覚化によって決定されるように、両細胞種で構成されるハイブリッド組織の形成が明らかになった（図７、それぞれ左から１番目および２番目の列）。２つの細胞種はさらに、ハイブリッド組織の内部ゾーンを占める遺伝的に修飾したＭＳＣおよびその外層を裏打ちする内皮細胞で構成される、組織化構造を形成することが観察された。
【０１５５】
したがって、これらの結果は、骨形成細胞および血管形成細胞を、細胞足場内で、同時に、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養することが可能であり、そしてこうした条件下では、これらの細胞種はそれ自体、それぞれ、組織特異的間葉構造および上皮構造を装うように組織化することが可能であることを立証する。したがって、これは、両細胞種に特異的な前駆細胞由来の血管新生ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養骨性組織を用いた、組織置換療法が、構想可能であることを示す。
【実施例６】
【０１５６】
（実施例６）
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣ由来の骨性組織のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖
組織置換のための１つの戦略は、標的置換組織の増殖および／または分化に特異的な因子を発現するよう遺伝的に修飾されている、標的置換組織に特異的な前駆細胞を細胞足場に植え付けることである。その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に続いて、標的置換組織を再構成するため、植え付けたこうした足場をｉｎ  ｖｉｖｏで移植することが可能である。これは、置換組織のｉｎ  ｖｉｖｏ培養を可能にするため、意図するレシピエントにおいて、またはドナーにおいて、いずれかで、こうした足場を異所性に移植することによって、達成可能である。あるいは、置換組織が必要とする解剖学的位置内で、植え付けた足場を正所性に直接移植することが可能である。
【０１５７】
こうした遺伝的に修飾した前駆細胞における導入遺伝子の発現を調節するため、制御可能導入遺伝子プロモーター系を使用して、導入遺伝子発現遮断を可能にしうる。遺伝的に修飾した細胞を、組織置換療法の背景で移植する際、これは、重要な安全性の特徴を構成する。
【０１５８】
材料および方法：
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けたコラーゲンマトリックスの異所性移植：ＭＳＣを遺伝的に修飾して、骨形成因子を発現させたが、こうした遺伝的に修飾した細胞が、骨組織の異所性増殖を導くことが可能であるかどうかを決定するため、以下のように、これらの細胞を植え付けたマトリックスを調製し、移植し、そして解析した：
あらかじめ切断したコラーゲンスポンジ（３ｘ３ｘ２ｍｍ、Ｃｏｌａｓｔａｔ（登録商標）＃ＣＰ−３ｎ、Ｖｉｔａｐｈｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）に、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ中で培養した、ＢＭＰ−２およびβ−ガラクトシダーゼを同時に発現する、およそ１０６のＭＳＣを植え付けた。その後、植え付けたマトリックスをＣ３Ｈ／ＨＥＮマウスの腹筋に移植した。マウスの対照群１つを、０．５ｍｇ／ｍｌドキシサイクリンを含有する水で維持した。
【０１５９】
それぞれ、腹筋組織から採取した１ｍｇゲノムＤＮＡおよび２ｍｇ  ｍＲＮＡのＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ解析によって、移植物中のＢＭＰ−２  ＤＮＡおよびｍＲＮＡの検出を行った。ＢＭＰ−２タンパク質を認識する抗体で、免疫組織化学的に、移植細胞を検出した。
【０１６０】
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けたコラーゲンマトリックスの正所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）（骨）移植：遺伝的に修飾したＭＳＣが、骨組織のｉｎ  ｓｉｔｕ置換を誘導する能力を所持するかどうか決定するため、以下のように、これらの細胞を植え付けたマトリックスを調製し、移植し、そして解析した：
遺伝的に修飾したＭＳＣをＶｉｔｒｏｇｅｎコラーゲンゲル上で２４〜４８時間培養し（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  １００（登録商標）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）、そしておよそ４ｘ１０４細胞を含有する、培養したゲルを、老化した（１８〜２０ヶ月齢）骨減少性ＢＡＬＢ／ｃマウスの橈骨に生成した、長さ２．５ｍｍの分節間隙（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｇａｐ）に移植した。
移植２０日後、マイクロ−ＣＴ形態計測解析によって、骨再生を解析した。
【０１６１】
結果：
ｉｎ  ｖｉｖｏで移植した、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣ由来の骨性組織の異所性増殖および分化：ＢＭＰ−２およびβ−ガラクトシダーゼを同時に発現するＭＳＣをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹筋に移植し、これは、第１０日に軟骨および骨表現型を示す組織に発展し（図６ａ、ｅ）、そして第２０日に骨髄表現型を示す組織に発展する（図６ｃおよびｅ）ことが観察された。軟骨組織および骨を裏打ちする小柱状組織中の遺伝的に修飾された細胞は、Ｘ−ｇａｌ染色によって決定されるように、それぞれ軟骨細胞および骨芽細胞形態を示すことが見出された（それぞれ図６ｊおよび６ｋ）。免疫組織化学解析によって、両遺伝子を発現するよう遺伝的に修飾した細胞由来の軟骨細胞におけるＢＭＰ−２およびβ−ガラクトシダーゼの同時発現を確認し（それぞれ図６ｌおよび６ｍ）、そして第２０日の移植細胞によるＢＭＰ−２  ｍＲＮＡの転写を、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって確認した（図６ｏ）。
【０１６２】
上に記載するようなドキシサイクリンの非存在下で観察された、軟骨、骨および骨髄表現型を示す細胞への遺伝的に修飾したＭＳＣの分化は、ドキシサイクリンの存在下では、抑制されていることが示された（図８ｆ〜ｉ）。
【０１６３】
これらの結果は、骨形成因子ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾した間葉幹細胞を筋組織に異所性に移植した際、軟骨、骨および骨髄を含む組織化骨性組織が形成可能であることを立証した。したがって、こうした方法を利用して、骨置換療法のため、置換骨性組織を異所性に増殖させることが可能である。
【０１６４】
テトラサイクリン／ドキシサイクリンに阻害されるプロモーターの制御調節下でＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣにおけるＢＭＰ−２  ｍＲＮＡ転写、およびＢＭＰ−２誘導骨形成のドキシサイクリンが仲介する阻害：ＢＭＰ−２発現のための陰性調節を提供するため、テトラサイクリンに阻害されるプロモーターの制御調節下の導入遺伝子でＭＳＣを遺伝的に修飾し、こうしてＭＳＣの分化に対するその影響の決定を可能にし、そしてまた、誘導性遮断系を提供して、組織置換療法において使用する、遺伝的に修飾した前駆細胞による導入遺伝子の発現を終結させた。テトラサイクリン類似体であるドキシサイクリンを、遺伝的に修飾した細胞の移植物を受け入れた動物の１つの対照群において、飲料水中で投与した。
【０１６５】
したがって、テトラサイクリン類似体であるドキシサイクリンの存在下で、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって決定されるように、第２０日の遺伝的に修飾したＭＳＣによるＢＭＰ−２  ｍＲＮＡの転写が、効率的に阻害されることが示された（図８ｏ）。これは、ドキシサイクリン存在下で、遺伝的に修飾したＭＳＣの骨性組織への分化が、有意に阻害されたという上述の観察に論理的根拠を提供した。
【０１６６】
したがって、これらの結果は、骨性組織への間葉幹細胞の効率的な分化には、ＢＭＰ−２発現が必要であり、そして使用するテトラサイクリンに阻害されるプロモーター系は、導入遺伝子転写を効率的に遮断するよう働くことが可能であることを立証した。これは、組織置換療法に、こうした遺伝的に修飾した標的置換組織前駆細胞を使用した際、導入遺伝子発現を調節する、重要なそして非常に効果的な手段を提供する。
【０１６７】
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けたコラーゲンマトリックスの移植による、ｉｎ  ｖｉｖｏでの骨組織の非常に効率的な正所性再生：マイクロＣＴ形態計測画像化解析を介して立証されるように（図９ａ）、ＢＭＰ−２、およびテトラサイクリン／ドキシサイクリンに阻害されるプロモーターの制御調節下のβ−ガラクトシダーゼを同時発現するＭＳＣを植え付けたコラーゲンマトリックスは、ネズミ橈骨中に生成した分節間隙に移植した際、骨を再生する能力を有することが示された。ドキシサイクリンの存在下でＢＭＰ−２発現を下方制御した際（図９ａ）、骨再生は、再生骨体積および表面面積に関して測定すると、有意に減少したことが観察され、それぞれ、２倍および４倍減少していた（図９ｃ）。
【０１６８】
これらの結果は、したがって、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾した間質幹細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで損傷されるかまたは失われた骨組織を効率的に再生する能力を有することを示した。これは、こうした遺伝的に修飾した前駆細胞を用いた骨組織置換療法が、実行可能であることを立証する。これは、ＭＳＣが増殖因子に応答して分化し、そして軟骨および骨細胞を生じさせることを示す、公表された報告と一致する（Ｔｒｉｆｆｉｔｔ，  ＪＴ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ，  ＪＰ．ら監修，  Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  ニューヨーク  １９９６，  ｐ．３９）。
【実施例７】
【０１６９】
（実施例７）
細胞足場内での血管組織のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖
細胞足場内で増殖させた置換組織での体組織の置換に対する主な障害は、こうした組織に血管新生する必要があることである。こうした細胞足場で増殖させた置換組織の血管新生は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、血管形成を促進する因子によって、例えば置換組織細胞自体によって、例えばこうした因子を発現するようトランスフェクションされた置換組織前駆細胞によって分泌される因子によって、誘導可能である。あるいは、細胞足場で増殖させた置換組織の血管形成は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、移植前に、足場に血管形成細胞をあらかじめ植え付けることによって、達成可能である。細胞足場において増殖する置換組織の血管形成を最適化する重要な手段は、上述のように、血管組織の管状増殖のためのフィラメント状ポリマーを、標的置換組織の増殖を支持する連続性の三次元スポンジマトリックス内に、一体化して包埋する足場を使用することである。
【０１７０】
材料および方法：
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けたコラーゲンマトリックスのｉｎ  ｖｉｖｏ移植および血管新生の解析：骨組織増殖に使用したＭＳＣなどの、置換組織前駆細胞を植え付けた細胞足場の血管新生が、こうした組織の効率的な増殖に必要である。したがって、骨形成因子ＢＭＰ−２が、置換骨組織および支持血管系両方の形成を誘導する潜在能力を決定するため、ＭＳＣに産生された際、ＢＭＰ−２が血管形成を促進する能力を調べた。こうした細胞での細胞足場の植え付け、足場移植およびｉｎ  ｖｉｖｏでの血管形成の評価を以下のように行った：
Ｖｉｔｒｏｇｅｎコラーゲンゲル（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  １００；Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、米国）に、テトラサイクリン／ドキシサイクリンに阻害されるプロモーターの制御調節下で、骨形成因子ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付け、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。その後、培養したマトリックスをＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスに皮下移植した。移植２０日後、移植試料を採取し、そして組織像によって血管形成に関して、そして内皮マーカーＰＥＣＡＭの検出のため免疫組織化学染色によって、解析した。コンピュータ化組織形態計測を介して、移植物中に形成される血管の表面面積を定量化した。
【０１７１】
ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）血管形成アッセイ：ＢＭＰ−２の血管形成潜在能力を決定するため、先に記載されるように、ニワトリＣＡＭアッセイによって、２５ｍｇのＢＭＰ−２タンパク質を装填したディスクを解析した（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｍ．Ｓ．ら，  Ｃｅｌｌ  １９９４，  ７９：３１５）。
【０１７２】
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた細胞足場において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる骨組織によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで誘導される血管形成の解析：テトラサイクリン／ドキシサイクリンに阻害されるプロモーターの制御調節下でのＢＭＰ−２およびβ−ガラクトシダーゼを同時発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨形成組織を形成した（上の実施例５を参照されたい）。培養した骨組織をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスに筋内移植し、そして移植１２日後、それぞれＭＲＩおよび組織像によって、血管形成および骨形成に関して移植物を解析した。
【０１７３】
フィラメント状細胞足場内の血管組織のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖：細胞足場で増殖させた置換組織の血管形成の最適化は、続いて生物分解して、損なわれていない血管管腔を残す、フィラメント周囲の血管組織の管状増殖のためのフィラメント状ポリマーを含んでなる細胞足場を使用することによって達成可能である。こうしたフィラメント状足場を用いて、血管組織のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を以下のように達成した：
足場および細胞を２０時間、攪拌しながら培養し、その後、これらをさらに培養するために回転バイオリアクターに移すことによって、実施例２に記載するように調製したフィラメント状細胞足場にＢ−ＥＮＤ−２内皮細胞株の細胞を植え付けた。足場試料を採取し、そしてバイオリアクター培養の３日後に、Ｈ＆Ｅ染色による軟骨形成の解析用にプロセシングした。バイオリアクターインキュベーション２週間後、植え付けた足場をＣＤヌードマウスに皮下移植した。
【０１７４】
結果：
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾し、コラーゲンマトリックス移植物に植え付けたＭＳＣによって誘導されるｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生：ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた、２０日目のコラーゲンマトリックス筋内移植物は、顕微鏡解析（それぞれ図１０ａおよび１０ｃ）、組織学的解析（それぞれ図１０ｂおよびｄ）によって測定されるように、ＢＭＰ−２の発現を妨げる条件下で維持したこうした移植物に比較して、血管形成増加を示した。足場はまた、内皮マーカーＰＥＣＡＭの免疫組織化学染色によって（図１０ｆ）、そしてコンピュータ化組織形態計測を介して（図１０ｅ）、有意な血管形成を示すことも示された。さらに、血管新生された異所性の骨および軟骨小骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｏｓｓｉｃｌｅ）の形成を、ドキシサイクリン処理を欠乏させたＭＳＣの移植物において観察した（図１０ｆ）。
【０１７５】
これらの結果は、したがって、ＭＳＣによって発現されるＢＭＰ−２が血管形成を誘導し、そしてＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣが、骨組織置換療法のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで足場内に移植した際、骨形成および支持血管形成両方を誘導可能であることを示す。
【０１７６】
ニワトリＣＡＭアッセイにおいて、１０ｍｇ  ＢＭＰ−２によって誘導される血管形成：ＢＭＰ−２に誘導される血管形成のニワトリＣＡＭアッセイは、このタンパク質が、ビヒクル注射のゼロに比較して、１０ｍｇの量で、血管形成効果を有する（それぞれ図１０ｇおよびｈ）ことを明らかに示し、この因子が血管形成性であり、そして骨組織置換療法のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで足場内に移植した際、骨組織および支持血管系両方を生成するのに使用可能であるという観察をさらに支持した。
【０１７７】
ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた細胞足場を培養することによって形成した骨性組織によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで誘導した血管形成および軟骨形成：ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを細胞足場に植え付けることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された骨性組織の筋内移植物は、移植され、そして顕微鏡およびＭＲＩによって視覚化される多くの血管によって立証されるように、第１２日に、非常に高レベルの血管新生を経ることが示された（それぞれ図１１ａおよび１１ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色した凍結切片の組織学的解析によって、移植領域での軟骨の有意な増殖がさらに立証された（図１６ａ、ｃ）。
【０１７８】
これらの結果は、したがって、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを細胞足場に植え付けることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された骨性組織の移植物を利用した骨組織置換療法が、ｉｎ  ｖｉｖｏで非常に血管新生された置換骨組織を生成することを立証する。こうした血管新生を誘導する能力は、細胞足場で増殖させた組織置換移植片の最適な移植に非常に重要である。
【０１７９】
内皮細胞と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したフィラメント状細胞足場の移植物における、ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管組織の形成：Ｂβ−ＥＮＤ−２内皮細胞株の細胞を植え付けたフィラメント状細胞足場のバイオリアクターインキュベーション６日後、凍結切片のＨ＆Ｅ染色によって立証されるように、内皮細胞が足場フィラメントを覆うことが示された（図１２）。
【０１８０】
皮下移植２週間後（２週間のバイオリアクターインキュベーションに続く）、Ｂ−ＥＮＤ−２内皮細胞株の細胞を植え付けたフィラメント状細胞足場は、大規模な血管新生を示した（図１３）。これらの結果は、したがって、内皮細胞でのこうしたフィラメント状細胞足場の植え付けが、血管組織置換療法において血管組織を再生するのに、または標的組織置換療法において支持血管系を提供するのに使用可能であり、こうして、こうした細胞足場で増殖させた置換組織の移植を非常に最適化する血管系を生成する、非常に効率的な技術に相当することを示す。
【０１８１】
本発明は、特定の態様と組み合わせて記載されてきているが、多くの代替法、修飾および変動が当業者には明らかであろうことが明らかである。したがって、付随する請求項の精神および広い範囲内に属する、こうした代替法、修飾および変動すべてを含むことが意図される。本明細書に言及される、刊行物、特許、特許出願、および寄託番号によって同定される配列はすべて、個々の刊行物、特許、特許出願、または寄託番号によって同定される配列が、具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いで、本明細書に完全に援用される。さらに、本出願中のいかなる参考文献の引用または同定も、こうした参考文献が、本発明の先行技術として利用可能であるという承認とみなしてはならない。
【０１８２】
参考文献
（さらなる参考文献は本文中に引用される）
【０１８３】
【化１】
2004528101.tif 000003
【０１８４】
【化２】
2004528101.tif 000004
【０１８５】
【化３】
2004528101.tif 000005
【０１８６】
【化４】
2004528101.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、デキストランとポリＤおよびポリＬ乳酸の立体複合体化によって生成される、架橋ポリマー性細胞足場の形成を示す。
【図２】図２は、置換組織の三次元増殖のため、連続スポンジマトリックスポリマー内に一体化して包埋された血管組織の管状増殖用のフィラメント状ポリマーで構成される細胞足場を用いた組織置換療法のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ様式の多様な組み合わせを示す。
【図３】図３ａ〜ｃは、β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードするリポソーム複合体化プラスミドを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションしたネズミ間葉幹細胞株の遺伝的修飾を示す。図３ａは、β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドのリポソーム複合体化および標的細胞へのトランスフェクションを示す概略図である。図３ｂおよび３ｃは、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードするリポソーム複合体化プラスミドを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションしたネズミ間葉幹細胞株による、β−ガラクトシダーゼ産生を立証する、低倍率および高倍率顕微鏡写真である。
【図４】図４ａ〜ｃは、β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードするデキストラン・ポリカチオン複合体化プラスミドを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションしたネズミ間葉幹細胞株の遺伝的修飾を示す。図４ａは、β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドのデキストラン・ポリカチオン複合体化および標的細胞のトランスフェクションを示す概略図である。図４ｂおよび４ｃは、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ・マーカー遺伝子をコードするデキストラン・ポリカチオン複合体化プラスミドを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクションしたネズミ間葉幹細胞株による、β−ガラクトシダーゼ産生を立証する、低倍率および高倍率顕微鏡写真である。
【図５】図５は、β−ガラクトシダーゼをコードする、リポソーム複合体化プラスミドおよびデキストラン複合体化プラスミドｐＮＧＶＬ１−ｎｔｂＧＡＬを装填した、アラビノガラクタン−キトサン細胞足場（ＡＧ）にコロニー形成した間葉幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子形質転換変換を示す、一連の顕微鏡写真である。Ｄ：真皮。
【図６】図６は、ヒトＢＭＰ−２をコードする裸のプラスミドおよびリポソーム複合体化プラスミドを装填した、アラビノガラクタン−キトサン細胞足場のｉｎ  ｖｉｖｏ移植によって誘導される軟骨形成および骨形成を示す、一連の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、それぞれ、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを単独で、または内皮細胞と組み合わせて植え付けた、アラビノガラクタン−キトサン細胞足場における、骨性組織または骨性組織および血管組織の組み合わせいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を示す、一連の顕微鏡写真である。
【図８】図８ａ〜ｏは、コラーゲンマトリックスに植え付け、そして腹筋に移植した、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣ由来の、軟骨（Ｃ）、骨（Ｂ）および骨髄（ＢＭ）組織の異所性増殖および分化を示し、そしてＢＭＰ−２  ｍＲＮＡ転写のドキシサイクリンが仲介する阻害、およびテトラサイクリン／ドキシサイクリンに阻害されるプロモーターの制御調節下でＢＭＰ−２を発現しているＭＳＣによるＢＭＰ−２誘導性骨形成を示す。図８ａおよび８ｆは、それぞれ、ドキシサイクリンの非存在下（−Ｄｏｘ）および存在下（＋Ｄｏｘ）での組織の増殖および分化を示す、拡大写真である。図８ｇおよび８ｂは、それぞれ、ドキシサイクリンの存在下ではまったくないのに比較して、ドキシサイクリンの非存在下での、石灰化した組織の増殖を示す、Ｘ線写真である。図８ｈおよび８ｃは、それぞれ、ドキシサイクリンの存在下ではまったくないのに比較して、ドキシサイクリンの非存在下での、筋組織（Ｍ）における、軟骨（Ｃ）、骨（Ｂ）および骨髄（ＢＭ）で構成される骨形成組織の増殖および分化を示す、顕微鏡写真である。図８ｊおよび８ｋは、それぞれ、第２０日のＸ−ｇａｌ染色によって決定されるような、軟骨細胞形態および骨芽形態を示す、小柱状組織を裏打ちする移植操作細胞の増殖および分化を示す顕微鏡写真である。図８ｌおよび８ｍは、それぞれ、免疫組織化学解析によって決定されるような、両遺伝子を発現するよう遺伝的に修飾した細胞由来の軟骨細胞における、ＢＭＰ−２およびβ−ガラクトシダーゼの発現を示す顕微鏡写真である。図８ｏは、それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって決定されるような、第１０日の移植細胞（Ｃ９）における、ドキシサイクリンの非存在下および存在下のＢＭＰ−２  ｍＲＮＡ転写の存在および非存在を示す。
【図９】図９は、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣ（Ｃ９）を植え付けたコラーゲンマトリックスの移植による、骨組織の正所性再生を示す。図９ａおよび９ｂは、それぞれ、ドキシサイクリンの非存在下（−Ｄｏｘ）または存在下（＋Ｄｏｘ）の骨再生を示す、ＣＴマイクロＣＴ画像データである。図９ｃは、ドキシサイクリンの非存在下（−Ｄｏｘ）または存在下（＋Ｄｏｘ）での再生骨体積、表面面積および表面面積対体積比を示す、一連の形態計測解析図である。
【図１０】図１０は、テトラサイクリン／ドキシサイクリンに阻害されるプロモーターの制御調節下で、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けたコラーゲンマトリックス移植物において誘導されるｉｎ  ｖｉｖｏ血管新生、ニワトリＣＡＭアッセイにおいて、１０μｇ  ＢＭＰ−２によって誘導される血管形成、およびＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた細胞足場を培養することによって形成される骨組織において、ｉｎ  ｖｉｖｏで誘導される血管形成を示す。図１０ａおよび１０ｃは、それぞれ、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた、コラーゲンマトリックス移植物における、ドキシサイクリンの非存在下および存在下での血管形成を示す、顕微鏡写真である。図１０ｂおよび１０ｄは、それぞれ、組織学的に決定されるように、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた、コラーゲンマトリックス移植物における、ドキシサイクリンの非存在下および存在下での血管形成を示す、顕微鏡写真である。図１０ｅは、血管表面面積の形態計測解析によって決定されるような、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣ（Ｃ９）を植え付けたコラーゲンマトリックス移植物における、ドキシサイクリンの非存在下または存在下での、血管形成を示す図である。図１０ｆは、内皮マーカーＰＥＣＡＭの免疫組織化学染色によって決定されるような、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けたコラーゲンマトリックス移植物における血管形成を示す、顕微鏡写真である。図１０ｇおよび１０ｈは、それぞれ、ニワトリＣＡＭアッセイにおいて、１０μｇのヒトＢＭＰ−２タンパク質および対照としてのビヒクルによって誘導される血管形成を示す、顕微鏡写真である。
【図１１】図１１ａ〜ｂは、顕微鏡解析およびＭＲＩ解析によって決定されるような、ＢＭＰ−２を発現するよう遺伝的に修飾したＭＳＣを植え付けた細胞足場を培養することによって形成される骨組織において、ｉｎ  ｖｉｖｏで誘導される血管形成を示す。図１１ａは、移植物の低倍率顕微鏡写真である（矢印は血管を示す）。図１１ｂは、移植物を含む領域のＭＲＩデータを表す（ｓＢＶ：小血管、ｍＢｖ：大血管、Ｌ：後肢、Ｖ：脊柱）。
【図１２】図１２は、内皮細胞と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したフィラメント状細胞足場上での血管組織の形成を示す顕微鏡写真である。
【図１３】図１３ａ〜ｂは、内皮細胞と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したフィラメント状細胞足場のｉｎ  ｖｉｖｏ移植物の血管新生を示す。図１３ａは、回転バイオリアクターにおける２週間のインキュベーション後の、植え付けた移植物の低倍率および高倍率顕微鏡写真を示す（内皮細胞を矢印で示す）。図１３ｂは、植え付け／非移植足場（「ｅｘ  ｖｉｖｏ」）、並びに移植２週間後の植え付け移植物および非植え付け移植物の低倍率顕微鏡写真を示す。Ｐ：ポリマー。
【図１４】図１４ａ〜ｇは、ｔｅｔ制御下で、ｒｈＢＭＰ２を条件的に発現する、遺伝的に操作したＡＭＳＣ（Ｃ９細胞）の染色およびＲＴ−ＰＣＲ解析を例示する。集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで、静置培養条件下で細胞を増殖させ、そしてその後、９６ウェルプレート中、アラビノガラクタン−キトサン足場上に２４時間植え付けた（２ｘ１０６細胞／足場；各足場：直径５ｍｍおよび幅２〜３ｍｍ）。足場を回転バイオリアクターに入れた（５０ｍｌ容器あたり４足場）。１５〜１８ＲＰＭで容器を回転させた。培地体積の半量を１日おきに５週間交換し、そして骨形成補充物を添加した（１０ｍＭグリセロホスフェートおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸）。図１４ａ−空の足場；図１４ｂ−足場上のＣ９細胞；図１４ｃ−ＲＴ−ＰＣＲを介したコラーゲンＩＩ検出；図１４ｄ−Ｈ＆Ｅ染色；図１４ｅ−抗オステオカルシン染色；図１４ｆ−抗βガラクトシダーゼ染色；図１４ｇ−抗コラーゲンＸ染色。
【図１５】図１５ａ〜ｂは、図１４に記載するように、３０日間増殖させた、遺伝的に操作したＡＭＳＣ（Ｃ９細胞）の走査型電子顕微鏡写真（図１５ａ）およびコンピュータでの再生（図１５ｂ）を例示する。図２ａは、ポリマー構造に付着した細胞を明らかに例示する。この細胞を蛍光染色（ヨウ化プロピディウム）で染色し、そして足場内の異なる光学切片で見た。図１５ｂに提示する画像は、すべての光学切片のコンピュータでの再構築である（異なる色は、足場表面からの異なる距離を表す）。
【図１６】図１６ａ〜ｃは、免疫不全マウス（ＣＤ−１ヌードマウス）に６週間移植した、細胞を植え付けた足場から採取した組織切片を例示する。組織切片をヘマトキシリンおよびエオジン（図１６ａおよびｃ）、並びにマッソン三色（図１６ｂ）で染色した。染色は明らかに、移植物内での骨小柱の形成を立証する。
【図１７】図１７ａ〜ｆは、ｔｅｔ制御下で、ｒｈＢＭＰ２を条件的に発現する、遺伝的に操作したＡＭＳＣ（Ｃ９細胞）を植え付けた足場を例示する。集密まで、静置培養条件下で細胞を増殖させた。その後、細胞をアラビノガラクタン−キトサン・ビーズと混合し、そして回転バイオリアクター中で１週間培養した。平行して、２ｘ１０６  Ｂ−ＥＮＤ−２細胞（内皮細胞株）をＰＬＡフィラメント上に植え付けて、そして異なる容器の回転バイオリアクター中で１週間培養した。その後、アラビノガラクタン・ビーズおよびＰＬＡフィラメントを、単一容器の回転バイオリアクター中で同時培養し、そしてハイブリッド構造を形成させた（図１７ｅ〜ｆ）。Ｃ９細胞はマーカー遺伝子ＬＡＣＺを発現するように操作されており、そしてＢ−ＥＮＤ−２細胞はマーカー遺伝子ＧＦＰを発現するように操作されているため、２つの細胞種間の空間的関係を示すことが可能であった（図１７ａ〜ｄ）。Ｍ：ＡＭＳＣ；ＥＣ：ｂ−ＥＮＤ−２内皮細胞；＃：フィラメント様ポリマー性足場；アステリスク：マイクロビーズ足場。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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