(57)【要約】新規ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び関連する組成物及び方法が、新規サイトカインアンタゴニストとして使用され、そして造血、リンパ及び骨髄性細胞の増殖及び／又は進化をインビトロ及びインビボで刺激するリガンドを検出するための方法内に使用され得る可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体に関して開示される。リガンド結合受容体ポリペプチド及び抗体はまた、ＴＩＦ活性をインビトロ及びインビボで阻止するために使用され得、そして免疫系を選択的に刺激するために、ＴＩＦ及び他のサイトカインと共に使用され得る。本発明はまた、タンパク質の生成方法、その使用方法及びそれに対する抗体を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがＩＬ−ＴＩＦ（配列番号８）を結合するか、又は拮抗することを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、ホモダイマー受容体複合体を形成する請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成することを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項３記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項３記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項３記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成するすることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体をさらに含んで成る請求項７記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項７記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがさらに、細胞内ドメインをコードする請求項７記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがさらに、親和性標識を含んで成る請求項３記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
次の作用可能に連続された要素：
（ａ）転写プロモーター；配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーター；及び
（ｂ）第２転写プロモーター；可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体ポリペプチドをコードする第２ＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記第１及び第２ＤＮＡセグメントが単一の発現のベクター内に含まれるか、又は独立した発現ベクター内に含まれることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１３】
前記第１及び第２ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る請求項１２記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記第２ＤＮＡセグメントが、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をコードする請求項１２記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１２記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項１６】
請求項１２記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、前記第１及び第２ＤＮＡセグメントが独立した発現ベクター上に位置し、そして細胞中に同時トランスフェクトされ、そして細胞が前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項１７】
請求項１２記載の発現ベクターを導入されている培養された細胞であって、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体ポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドヘテロダイマー又はマルチマー複合体を分泌する請求項１５記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、ＩＬ−ＴＩＦを結合し、又はＩＬ−ＴＩＦ活性を拮抗する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドヘテロダイマー又はマルチマー複合体を分泌する請求項１５記載の細胞。
【請求項２０】
下記成分：
配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び
可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体ポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体であって、
前記第１及び他のＤＮＡセグメントが読み取り枠の整合して連結され；そして
前記第１及び他のＤＮＡセグメントが前記融合タンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ構造体。
【請求項２１】
少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントが、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をコードする請求項２０記載のＤＮＡ構造体。
【請求項２２】
次の作用可能に連結された要素：
転写プロモーター：
請求項２０記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体：及び
転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターであって、
前記プロモーターが前記ＤＮＡ構造体に作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡ構造体が前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２３記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、前記ＤＮＡ構造体によりコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項２４】
融合タンパク質の生成方法であって、
請求項２３記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項２５】
配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る、ＩＬ−ＴＩＦを結合するか又はＩＬ−ＴＩＦ活性を拮抗する単離された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチド。
【請求項２６】
前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、ホモダイマー受容体複合体を形成する請求項２５記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリぺプチドであって、前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成することを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項２７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項２７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項２７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る単離された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドであって、前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成することを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項３１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＥＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）を含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する請求項３１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、親和性標識、化学的成分、毒素又はラベルをさらに含んで成る請求項３１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
可溶性受容体サブユニットを含んで成る単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体であって、ここで前記可溶性受容体サブユニットの少なくとも１つが、配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体。
【請求項３６】
可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体ポリペプチドをさらに含んで成る請求項３５記載の単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体。
【請求項３７】
可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成る請求項３５記載の単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体。
【請求項３８】
ヘテロダイマー又はマルチマー複合体を形成する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドの生成方法であって、
請求項１５記載の細胞を培養し；そして
前記細胞により生成される可溶性受容体ポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項３９】
可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドに対する抗体を生成するための方法であって、
下記群：
（ａ）ホモダイマー可溶性サイトカイン受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
（ｂ）可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
（ｃ）可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
（ｄ）可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；及び
（ｅ）可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチドから選択された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドにより動物を接種し；ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために前記動物において免疫応答を誘発し；そして
前記動物から抗体を単離することを含んで成る方法。
【請求項４０】
可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成るホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体に対して特異的に結合する請求項３９記載の方法により生成される抗体。
【請求項４１】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項４０記載の抗体。
【請求項４２】
請求項３５記載のホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体に対して特異的に結合する抗体。
【請求項４３】
造血細胞及び造血細胞前駆体のＩＬ−ＴＩＦ−誘発された増殖を阻害するための方法であって、可溶性サイトカイン受容体の不在下で培養された骨髄又は末梢血液細胞に比較して、骨髄又は末梢血液細胞における造血細胞の増殖を低めるのに十分な量の可溶性サイトカイン受容体を含んで成る組成物と共に骨髄又は末梢血液細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項４４】
前記造血細胞及び造血前駆体細胞が、リンパ球である請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記リンパ球が、マクロファージ又はＴ細胞である請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
ＩＬ−ＴＩＦ−誘発された又はＩＬ−９誘発された炎症を低めるための方法であって、炎症を低めるために十分な量の可溶性サイトカイン受容体の組成物を、炎症を有する哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項４７】
抗原又は病原体に対して暴露された哺乳類において免疫応答を抑制するための方法であって、
（１）抗原−又は病原体−特異的抗体のレベルを決定し；
（２）医薬的に許容できるビークル中、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る組成物を投与し；
（３）抗原−又は病原体−特異的抗体の後−投与レベルを決定し；
（４）段階（３）における抗体のレベルに、段階（１）における抗体のレベルを比較し、ここで抗体レベルの上昇又は下降の欠失が免疫応答の抑制の表示である方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
サイトカインは、多くの細胞型の増殖及び分化に影響を及ぼす可溶性タンパク質である。それらの受容体は、高い親和性でサイトカインを結合し、そしてこの結合現象を、一定の受容体サブユニットの細胞質部分を通して細胞に形質導入する１又は複数の内在性膜タンパク質から構成される。サイトカイン受容体は、それらの細胞外リガンド結合ドメインにおける類似性に基づいて、いくつかの種類のグループ分けされている。例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）の効果の結合及び／又は形質導入を担当する受容体鎖は、特徴的な２００個の残基の細胞外ドメインに基づいて、第ＩＩ型サイトカイン受容体ファミリー（ＣＲＦ２）のメンバーである。それらのインターフェロンの例示されるインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの莫大な臨床学的可能性及びそれらのための必要性を表示する。
【０００２】
発明の記載：
本発明は、新規サイトカイン受容体、及び関連する組成物及び方法を提供することによってこの必要性を満たす。特に、本発明は、他方ではまた、トランスメンブランドメイン、又は細胞内ドメイン及びトランスメンブランドメインの両者のいずれかを含む、哺乳類Ｚｃｙｔｏｒ１１受容体の細胞外リガンド−結合領域を提供する。
さらに、本発明は、一定のヒト疾病状態におけるＴ−細胞誘発因子（ＩＬ−ＴＩＦ）の効果を拮抗するために使用され得る新規の可溶性サイトカイン受容体を提供することによって、この必要性を満たす。特に、本発明は、ホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマーのいずれかである、哺乳類Ｚｃｙｔｏｒ１１受容体の細胞外リガンド−結合領域を提供する。
【０００３】
１つの観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがＩＬ−ＴＩＦ（配列番号８）を結合するか、又は拮抗することを特徴とする。１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、ホモダイマー受容体複合体を形成する。
【０００４】
第２の観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成するすることを特徴とする。１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【０００５】
もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【０００６】
第３の観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成することを特徴とする。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体をさらに含んで成る。
【０００７】
もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはさらに、細胞内ドメインをコードする。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはさらに、親和性標識を含んで成る。
【０００８】
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連続された要素：（ａ）転写プロモーター；配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーター；及び（ｂ）第２転写プロモーター；可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体ポリペプチドをコードする第２ＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記第１及び第２ＤＮＡセグメントが単一の発現のベクター内に含まれるか、又は独立した発現ベクター内に含まれることを特徴とする発現ベクターを提供する。
【０００９】
１つの態様においては、上記に開示される発現ベクターは、前記第１及び第２ＤＮＡセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る。１つの態様においては、前記発現ベクターは、上記に開示される通りであり、ここで前記第２ＤＮＡセグメントは、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をコードする。
【００１０】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成る培養された細胞を提供し、ここで前記細胞はＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。もう１つの観点においては、前記培養された細胞は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成り、ここで前記第１及び第２ＤＮＡセグメントは独立した発現ベクター上に位置し、そして細胞中に同時トランスフェクトされ、そして細胞は前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。もう１つの観点においては、前記培養された細胞は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成り、ここで前記細胞はＤＮＡセグメントによりコードされるヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体ポリペプチドを発現する。
【００１１】
もう１つの観点においては、前記培養された細胞は、上記に開示される通りであり、ここで前記細胞は、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドヘテロダイマー又はマルチマー複合体を分泌する。もう１つの観点においては、前記培養された細胞は、上記に開示される通りであり、ここで前記細胞は、ＩＬ−ＴＩＦを結合し、又はＩＬ−ＴＩＦ活性を拮抗する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドヘテロダイマー又はマルチマー複合体を分泌する。
【００１２】
もう１つの観点においては、本発明は、下記成分：配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント；及び可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体ポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体を提供し、ここで前記第１及び他のＤＮＡセグメントが読み取り枠の整合して連結され；そして前記第１及び他のＤＮＡセグメントが前記融合タンパク質をコードすることを特徴とする。
【００１３】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるよう融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体を提供し、ここで少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントは、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をコードする。
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター：上記に開示されるような融合タンパク質をコードするＤＮＡ構造体：及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供し、ここで前記プロモーターは前記ＤＮＡ構造体に作用可能に連結され、そして前記ＤＮＡ構造体が前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成る培養された細胞を提供し、ここで前記細胞はＤＮＡ構造体によりコードされるポリペプチドを発現する。
もう１つの観点においては、本発明は、融合タンパク質の生成方法を提供し、ここで上記に開示されるような細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る、ＩＬ−ＴＩＦを結合するか又はＩＬ−ＴＩＦ活性を拮抗する単離された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを提供する。１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、ホモダイマー受容体複合体を形成する。
【００１６】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリぺプチドを提供し、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成するすることを特徴とする。１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【００１７】
もう１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記ポリペプチドは、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【００１８】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る単離された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを提供し、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成することを特徴とする。もう１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【００１９】
もう１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＥＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）を含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。もう１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に開示される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、親和性標識、化学的成分、毒素又はラベルをさらに含んで成る。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明は、可溶性受容体サブユニットを含んで成る単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体を提供し、ここで前記可溶性受容体サブユニットの少なくとも１つは、配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る。１つの態様においては、上記に開示される単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体は、さらに可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る。１つの態様においては、前記単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体は、さらに可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）、可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）、又は可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）を含んで成る。
【００２１】
もう１つの観点においては、本発明は、ヘテロダイマー又はマルチマー複合体を形成する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドの生成方法を提供し、ここで上記に開示されるような細胞を培養し；そして前記細胞により生成される可溶性受容体ポリペプチドを単離することを含んで成る。
【００２２】
もう１つの観点においては、本発明は、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドに対する抗体を生成するための方法を提供し、ここで下記群：
（ａ）ホモダイマー可溶性サイトカイン受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
（ｂ）可溶性クラスＩ又はクラスＩＩサイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
（ｃ）可溶性ＣＲＦ２−４受容体ポリペプチド（配列番号３３）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
【００２３】
（ｄ）可溶性ＩＬ−１０受容体ポリペプチド（配列番号３４）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；及び
（ｅ）可溶性ＤＩＲＳ１受容体ポリペプチド（配列番号３５）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチドから選択された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドにより動物を接種し；ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために前記動物において免疫応答を誘発し；そして前記動物から抗体を単離することを含んで成る。
【００２４】
もう１つの観点においては、本発明は、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成るホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体に対して特異的に結合する上記に開示されるような方法により生成される抗体を提供する。１つの観点においては、前記抗体はモノクローナル抗体である。
もう１つの観点においては、本発明は、ホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体に対して特異的に結合する抗体を提供する。
【００２５】
もう１つの観点においては、本発明は、可溶性サイトカイン受容体の不在下で培養された骨髄又は末梢血液細胞に比較して、骨髄又は末梢血液細胞における造血細胞の増殖を低めるのに十分な量の可溶性サイトカイン受容体を含んで成る組成物と共に骨髄又は末梢血液細胞を培養することを含んで成る、造血細胞及び造血細胞前駆体のＩＬ−ＴＩＦ−誘発された増殖を阻害するための方法を提供する。１つの態様においては、本発明は上記に開示される通りであり、ここで前記造血細胞及び造血前駆体細胞は、リンパ球である。１つの態様においては、本発明は上記に開示される通りであり、ここで前記リンパ球は、マクロファージ又はＴ細胞である。
もう１つの観点においては、本発明は、炎症を低めるために十分な量の可溶性サイトカイン受容体の組成物を、炎症を有する哺乳類に投与することを含んで成る、ＩＬ−ＴＩＦ−誘発された又はＩＬ−９誘発された炎症を低めるための方法を提供する。
【００２６】
もう１つの観点においては、本発明は、（１）抗原−又は病原体−特異的抗体のレベルを決定し；（２）医薬的に許容できるビークル中、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る組成物を投与し；（３）抗原−又は病原体−特異的抗体の後−投与レベルを決定し；（４）段階（３）における抗体のレベルに、段階（１）における抗体のレベルを比較し、ここで抗体レベルの上昇又は下降の欠失が免疫応答の抑制の表示である、抗原又は病原体に対して暴露された哺乳類において免疫応答を抑制するための方法を提供する。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の詳細な記載に基づいて明らかに成るであろう。
【００２７】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおいて変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００２８】
用語“〜に対応する”とは、ヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して使用される場合、２種の配列が最適に一列整列される場合、対照位置と一列整列する第２配列における位置を示す。
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状ＤＮＡ分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００２９】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。
“作用可能に連結された”とは、ＤＮＡセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
【００３０】
“ポリヌクレオチド”は、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡ ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【００３１】
用語“受容体”は、生物活性分子（すなわち“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質、又はそのようなタンパク質のポリペプチドサブユニットを示す。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化（及び多くの場合、受容体多重化、すなわち同一油又は異なった受容体サブウニットの会合）をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、細胞増殖、ｃＡＭＰ生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。用語“受容体ポリペプチド”とは、受容体ポリペプチド鎖及びその一部、例えば単離された機能的ドメイン（例えば、リガンド−結合ドメイン）を表すために使用される。
【００３２】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００３３】
“可溶性受容体”とは、細胞膜に結合されない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、最も通常には、トランスメンブラン及び細胞質ドメインを欠いているリガンド−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、追加のアミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供し、又は基質へのポリペプチドの結合のための部位、又は免疫グロブリン不変領域配列を提供する親和性標識を含んで成る。多くの細胞−表面受容体は、タンパク質加水分解により、又は交互にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される天然に存在する可溶性相対物を有する。受容体ポリペプチドは、それがそれぞれ、膜固定化又はシグナルトランスダクションを提供するために、それらのセグメントの十分な部分を欠いている場合、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないと言われる。
【００３４】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００３５】
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、正確には±１０％であることが理解されるであろう。
【００３６】
サイトカイン受容体サブユニットは、リガンド−結合ドメイン、典型的には、シグナルトランスダクションに関与するエフェクタードメインを含んで成る多重−ドメイン構造により特徴づけられる。マルチマーサイトカイン受容体は、ホモダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αα及びββイソフォーム、エリトロポエチン受容体、ＭＰＬ（トロンボポイエチン受容体）及びＧ−ＣＳＦ受容体）、サブユニットがそれぞれリガンド−結合及びエフェクタードメインを有するヘテロダイマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体αβイソフォーム）、及び種々の機能を有する成分サブユニットを有するマルチマー（例えば、ＩＬ−２， ＩＬ−３， ＩＬ−４， ＩＬ−５， ＩＬ−６， ＩＬ−７及びＧＭ−ＣＳＦ受容体）を包含する。
【００３７】
いくつかの受容体サブユニットは、多くの受容体に共通する。例えば、単独ではリガンドを結合できないが、しかし細胞内シグナルトランスダクションドメインを包含するＡＩＣ２Ｂサブユニットは、ＩＬ−３， ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−５受容体の成分である。多くのサイトカイン受容体は、その構造及び機能に基づいて、４種の関連するファミリーの１つに配置され得る。例えば、クラスＩ造血受容体は、保存されたシステイン残基及びＷＳＸＷＳモチーフを含むドメインの存在により特徴づけられる。タンパク質キナーゼドメイン；フィブロネクチン第ＩＩＩ型ドメイン；及びジスルフィド結合されたループにより特徴づけられる免疫グロブリンドメインを包含する追加のドメインは、一定の造血受容体に存在する。
【００３８】
サイトカイン受容体構造は、Ｕｒｄａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２６： ２２１−２２８， １９９１及びＣｏｓｍａｎ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５：９５−１０６， １９９３により再考されている。新規生物学的機能を生物が獲得するための選択的圧力下で、新規のファミリーメンバーは、多重遺伝子ファミリーの存在を導く存在する受容体遺伝子の重複から、たぶん生まれると思われる。従って、ファミリーメンバーは、祖先遺伝子の痕跡を含み、そしてそれらの特徴は、追加のファミリーメンバーの単離及び同定において利用され得る。
【００３９】
細胞表面サイトカイン受容体はさらに、追加のドメインの存在により特徴づけられる。それらの受容体は、正に荷電された残基（Ｌｙｓ又はＡｒｇ）を通常、両端に有する疎水性アミノ酸残基（典型的には、約２１〜２５個の残基）の配列に特徴づけられるトランスメンブランドメインにより細胞膜に固定される。細胞外ドメインからの、及びそれからトランスメンブランにより分離されるタンパク質の反対側の末端に、細胞内ドメインが存在する。
【００４０】
ｚｃｙｔｏｒ１１受容体は、クラスＩＩサイトカイン受容体である。それらの受容体は通常、４−ヘリックス−束サイトカインに結合する。インターロイキン−１０及びインターフェロンは、このクラスに受容体を有する（例えば、インターフェロン−γ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖）。クラスＩＩサイトカイン受容体は、それらのドメインに１又は複数のサイトカイン受容体モジュール（ＣＲＭ）の存在により特徴づけられる。クラスＩＩサイトカイン受容体のＣＲＭは、クラスＩサイトカイン受容体のより知られているＣＲＭとは幾分異なる。クラスＩＩ ＣＲＭは２種のＩＩＩ型フィブロネクチン−様ドメインを含むが、それらは構成的に異なる。
【００４１】
インターフェロン−α／β受容体α鎖を除いて、すべての既知のクラスＩＩ受容体と同様にｚｃｙｔｏｒ１１は、その細胞外ドメインに単一のクラスＩＩ ＣＲＭのみを有する。ｚｃｙｔｏｒ１１は、インターフェロン／ＩＬ−１０クラスのヘリカルサイトカインのための受容体である。上記に言及されたように、ｚｃｙｔｏｒ１１は、インターフェロンα受容体α鎖に類似する。Ｕｚｅなど．， Ｃｅｌｌ ６０： ２５５−２６５ （１９９６）を参照のこと。ｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号１）をコードするヒトｃＤＮＡクローンの分析は、約２１１個のアミノ酸残基（配列番号２の残基１８〜２２８；配列番号３）の細胞外リガンド−結合ドメイン、約２３個のアミノ酸残基（配列番号２の残基２２９〜２５１）のトランスメンブランドメイン、及び約３１３個のアミノ酸残基（配列番号２の残基２５２〜５７４）の細胞内ドメインを含んで成る５７４個のアミノ酸（配列番号２）をコードする読み取り枠を表した。当業者は、それらのドメイン境界がおおよそであり、そして既知タンパク質との一列整列及びタンパク質折りたたみの予測に基づかれていることを認識するであろう。ドメインの末端からの残基の欠失は可能である。
【００４２】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体は、Ｔ−細胞誘発因子（ＴＩＦ又はＩＬ−ＴＩＦ）と呼ばれるリガンドを結合することが知られている（ＷＩＰＯ公開ＷＯ ００／２４７６８号；Ｄｕｍｏｎｔｉｅｒなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４： １８１４−１８１９， ２０００； 及びＸｉｅなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． 出版物Ｍ００５３０４２００における原稿を参照のこと）。ヒトＩＬ−ＴＩＦヌクレオチド配列は、配列番号７に示され、そして対応するポリペプチド配列は、配列番号８に示される。好ましい態様においては、ｚｃｙｔｏｒ１１， すなわち配列番号２の残基１８〜２２８（配列番号３）の可溶性受容体形は、ＩＬ−ＴＩＦの効果をインビボで拮抗する、ホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマーである。そのようなホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマーに対する抗体はまた、ＩＬ−ＴＩＦ活性のアンタゴニストとしても作用する。
【００４３】
ＩＬ−ＴＩＦは、ＩＬ−９の存在下で誘発されることが示されており、そしてＴｈ１−型免疫応答の促進に関与すると思われる。ＩＬ−９は、種々の手段で、免疫機能の増殖、活性化、分化及び／又は誘発を刺激し、そしてぜん息、肺肥満細胞症及び他の疾病に関与し、並びにＳＴＡＴ経路を活性化する。ＩＬ−ＴＩＦ又はＩＬ−９機能のアンタゴニストは、そのようなヒト疾病に対して有益に使用され得る。本発明は、ＩＬ−ＴＩＦのそのような新規アンタゴニストを提供する。
【００４４】
本発明は、クラスＩＩサイトカイン受容体の構造を有する新規ヘテロダイマー可溶性受容体タンパク質、及びそれに対する抗体の発見に基づかれる。ヘテロダイマー可溶性受容体は、所有のアメリカ特許第５，９６５，７０４号に開示される少なくとも１つのｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体サブユニットを含む。ヘテロダイマー可溶性受容体に包含される第２可溶性受容体ポリペプチドは、インターロイキン−１０（ｌｉｕ Ｙなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： １８２１−１８２９， １９９４ （ＩＬ−１０Ｒ ｃＤＮＡ）（配列番号３４）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ、α及びβ鎖、及びインターフェロン−α／β受容体α及びβ鎖）、ＣＲＦ２−４ （Ｇｅｎｂａｎｋ 受容体Ｚ１７２２７号；配列番号３３）、及びＤＩＲＳ１（ＷＩＰＯ公開ＷＯ９９／４６３７９号，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， １９９９； 配列番号３５）を包含する受容体サブファミリーに属する。
【００４５】
ＣＲＦ２−４及びＩＬ−１０受容体に関連してのｚｃｙｔｏｒ１１受容体は、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体、すなわちＩＬ−ＴＩＦのための天然リガンドに応答してシグナルＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路に示された（Ｘｉｅなど．，前記）。本発明によれば、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体＋可溶性ＣＲＦ２−４受容体へテロダイマー（ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４）の好ましい態様により例示されるようなヘテロダイマー可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体は、ＩＬ−ＴＩＦの有能なアンタゴニストとして作用することができる。他の態様は、可溶性ヘテロダイマーｚｃｙｔｏｒ１１／ＩＬ−１０Ｒ、ｚｃｙｔｏｒ１１／ＩＬ−９Ｒ及び他のクラスＩＩ受容体サブユニット、並びにマルチマー受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４／ＩＬ−１０Ｒ及びｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４／ＩＬ−９Ｒ（但し、それらだけには限定されない）を包含する。
【００４６】
ｚｃｙｔｏｒ１１ ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの組織分布の分析は、ｍＲＮＡレベルが膵臓において最高であり、続いて胸腺、結腸、肝臓、皮膚、肺、腎臓及び小腸においてはより低いレベルであったことを示した。従って、本発明の特定の態様は、炎症及び免疫疾患又は次のような病状、例えば膵炎、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、膵癌、グレーヴス病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、結腸及び腸癌、憩室症、自己免疫疾患、敗血症、ぜん息、最終段階腎疾患、器官又は骨髄移植においてアンタゴニストとしての可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーの使用に向けられ；そして炎症の阻害、すなわち免疫抑制の場合、造血、免疫、炎症又はリンパ細胞、マクロファージ、Ｔ−細胞（Ｔｈ１及びＴｈ２細胞を包含する）の増殖の低下、病原体又は抗原に対する免疫応答の抑制、又はＩＬ−ＴＩＦ又はＩＬ−９サイトカイン生成の阻害が所望される。
【００４７】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１１、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマー及び本明細書に記載さらるマルチマーを認識する抗体、及び／又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマー及びマルチマー自体は、次のようなために有用である：
１）ｚｃｙｔｏｒ１１を通して免疫細胞（例えば、リンパ球、単球、白血球）におけるシグナル化を妨げるか又は阻害するために、自己免疫疾患、ＩＤＤＭ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、リウマチ様関節炎及びＩＢＤの処理においてＩＬ−ＴＩＦ受容体を通してシグナル化を拮抗するか又は阻止するために（Ｈｕｇｈｅｓ Ｃ． など．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３： ３３１９−３３２５， １９９４）。
【００４８】
他方では、抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１、抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマー又はマルチマーモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が、自己免疫疾患を処理するために、所望しない免疫細胞を消耗するためのアンタゴニストとして使用され得る。ぜん息、アレルギー及び他のアトピー性疾患は、免疫応答を阻害するか又は攻撃性を消耗するために、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマーに対するＭＡｂにより処理され得る。本発明のポリペプチド及び抗体を用いて、ｚｃｙｔｏｒ１１を通してシグナル化を阻止するか又は阻害することはまた、膵臓、腎臓、下垂体及びニューロン細胞の疾病のために有益であり得る。ＩＤＤＭ， ＮＩＤＤＭ， 膵炎及び膵臓も有益であり得る。
【００４９】
ｚｃｙｔｏｒ１１は、拮抗性ＭＡｂが癌増殖を阻害し、そして免疫−介在性殺害を標的化する、癌のＭＡｂ治療のための標的物として作用することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅ Ｐ． ａｎｄ Ｈｏｕｇｅｎｂｏｕｍ， Ｈ： Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６： １０１５−１０１６， １９９８）。可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１、及び可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマー及びマルチマーに対するＭＡｂはまた、ネフロパシー、例えば糸球体硬化症、膜ニューロパシー、アミロイドーシス（他の組織の中で腎臓に影響を及ぼす）、腎動脈硬化症、種々の起源の糸球体腎炎、腎臓の線維増殖性疾患、及びＳＬＥ、ＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、腎腫瘍及び他の疾病に関連する腎不全を処理するためにも有用であり得る。
【００５０】
２）自己免疫疾患、例えばＩＤＤＭ、ＭＳ、ＳＬＥ、重症筋無力症、リウマチ様関節炎及びＩＢＤの処理においてＩＬ−ＴＩＦを通してシグナル化を作用せしめるか又は開始するために。抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１、抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマー及びマルチマーモノクローナル抗体は、自己免疫を改善するサイトカイン又は細胞表面タンパク質を増殖し、その増殖を変更するか又はその生成を変えるために、リンパ球又は他の免疫細胞をシグナル化することができる。特に、他のパターンのサイトカイン分泌に対するＴ−ヘルパー細胞応答の調節は、疾病を改善するために自己免疫応答を変更することができる（Ｓｍｉｔｈ ＪＡなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： ４８４１−４８４９， １９９８）。
【００５１】
同様に、作用性抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１、抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマー及びマルチマーモノクローナル抗体は、ぜん息、アレルギー及びアトピー性疾病に関与する免疫細胞をシグナル化し、消耗し、そして偏向するために使用され得る。ｚｃｙｔｏｒ１１を通してのシグナル化はまた、膵臓、腎臓、下垂体及びニューロン細胞の疾病のために有益である。ｚｃｙｔｏｒ１１は、シグナル化ＭＡｂが癌増殖を阻害し、そして免疫介在性殺害を標的化する、膵癌のＭＡｂ治療のための標的物として作用することができる（Ｔｕｔｔ， ＡＬなど．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１： ３１７５−３１８５， １９９８）。同様に、腎細胞癌は、本発明のｚｃｙｔｏｒ１１含有可溶性受容体に対するモノクローナル抗体により処理され得る。
【００５２】
本明細書に記載される可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマー及びマルチマーは、上記に記載されるような自己免疫疾患、アトピー性疾患、ＮＩＤＤＭ、膵炎及び腎不全の処理においてＩＬ−ＴＩＦ活性を中和するか又は阻止するために使用され得る。可溶性形のｚｃｙｔｏｒ１１は、Ｔｈ細胞により介在される抗体応答を促進するために、そして／又はリンパ球又は他の免疫細胞によるＩＬ−４又は他のサイトカインの生成を促進するために使用され得る。
【００５３】
本発明の可溶性受容体は、ＩＬ−ＴＩＦサイトカインのアンタゴニストとして使用である。アンタゴニスト使用の他に、本発明の可溶性受容体は、身体内の異なった組織、器官及び細胞リガンドを輸送するために、ＩＬ−ＴＩＦを結合し、そしてＩＬ−ＴＩＦサイトカインのためのキャリヤータンパク質として作用することができる。本発明の可溶性受容体は、特定部位、例えば組織、特定の免疫細胞又は腫瘍に可溶性−受容体−リガンド複合体を向ける、分子、ポリペプチド又は化学分子に融合されるか又はカップリングされ得る。従って、本発明の可溶性受容体は、ＩＬ−ＴＩＦの作用を特異的に方向づけるために使用され得る。Ｃｏｓｍａｎ， Ｄ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５： ９５−１０６， １９９３； 及びＦｅｒｍａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ， Ｒ． Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ ９： ４９７−５１３， ２０００を参照のこと。
【００５４】
さらに、本発明の可溶性受容体は、分解又はクリアランスからリガンドを安定化するか、又は身体内の作用部位にリガンドを標的化することによって、リガンドの生物利用性、治療持続性及び／又は効能を高めるために、ＩＬ−ＴＩＦの安定化に使用され得る。例えば、天然に存在するＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６Ｒ複合体は、ＩＬ−６を安定化し、そしてｇｐ１３０受容体を通してシグナル化することができる。Ｃｏｓｍａｎ， Ｄ． 前記及びｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｒａｎ， Ｒ． 前記を参照のこと。
【００５５】
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３、又はそれに対して相補的な配列の類似するサイズの領域に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くあるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。典型的な緊縮条件は、塩濃度がｐＨ７で少なくとも約０．０２Ｍであり、そして温度が少なくとも約６０℃であるそれらの条件である。前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
【００５６】
ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的に、ｃＤＮＡはまた、他の組織からのＲＮＡを用いて調製され得るか化又はゲノムＤＮＡとして単離され得るが、膵臓又は前立腺からＲＮＡを単離することが好ましい。全ＲＮＡは、グアニジン　ＨＣｌ抽出、続くＣｓＣｌグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２−９４， １９７９）。ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡは、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９： １４０８−１４１２， １９７２ ）の方法を用いて全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、既知の方法を用いて、ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡから調製される。次に、ｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はＰＣＲにより同定され、そして単離される。
【００５７】
当業者は、配列番号３に開示される配列及び配列番号１のその対応するヌクレオチドが、ヒトｚｃｙｔｏｒ１１受容体の単一の対立遺伝子を表すことを認識するであろう。それらの配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００５８】
本発明はさらに、他の種（“種オルト体”）からの相対物受容体及びポリヌクレオチドを供給する。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類ポリペプチドからのｚｃｙｔｏｒ１１受容体である。ヒトｚｃｙｔｏｒ１１受容体の種オルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃＤＮＡは、前記受容体を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン　ブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。
【００５９】
次に、受容体−コードのｃＤＮＡが種々の方法、例えばヒト又は他の霊長類の完全な又は部分的なｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応又はＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ， アメリカ特許第４，６８３，２０２号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃＤＮＡライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現が前記受容体に対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム　クローンの単離に適用され得る。
【００６０】
本発明はまた、配列番号３の受容体ポリペプチドに実質的に相同である少なくとも１つのｚｃｙｔｏｒ１１受容体サブユニットを含んで成る、単離された可溶性モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体ポリペプチドを提供する。“単離された”とは、その生来の環境以外の、例えば血液及び動物組織とは別の状態において見出されるタンパク質又はポリペプチドを意味する。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。高く精製された形、すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度の形で、ポリペプチドを供給することが好ましい。用語“実質的に同一である”とは、配列番号３に示される配列に対して、５０％，好ましくは６０％、及びより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【００６１】
そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号３に対して、少なくとも　９０％、及び最も好ましくは９５％又はそれ以上同一であろう。％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ． ４８ ： ６０３−６１６， １９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ：１０９１５−１０９１９， １９９２を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ延長ペナルティー、及び第２表（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （前記）の“ｂｌｏｓｕｍ ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
【００６２】
【数１】
2004505641.tif 000002
【００６３】
【表１】
2004505641.tif 000003
【００６４】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて、類似する方法により決定される。
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体ｚｃｙｔｏｒ１１のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。
【００６５】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号３）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【００６６】
“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。ＦＡＳＴＡ 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【００６７】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、誤りとして設定される他のＦＡＳＴＡパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。
【００６８】
ＢＬＯＳＵＭ６２表（第２表）は、関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９９２） ］。従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。化学的性質に基づいてのみアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記のように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
【００６９】
実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（第３表を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、例えばポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，　ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ　トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）、又は 他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ｆｏｒｄ など．， Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７， １９９１を参照のこと。ＤＮＡコードの親和性標識は、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）から入手できる。
【００７０】
【表２】
2004505641.tif 000004
【００７１】
本発明の受容体ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９； Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２， １９９１）。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（例えば、リガンド結合及びシグナルトランスダクション）について試験される。
【００７２】
リガンド−受容体相互作用の部位はまた、核磁気共鳴、結晶学、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、結晶構造の分析により決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ など．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２， １９９２； Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４， １９９２； Ｗｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９−６４， １９９２を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連する受容体との相同性の分析からも推定され得る。
【００７３】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。
【００７４】
手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。
【００７５】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発された受容体の活性を検出するために高処理量のスクリーニング方法と組み合わされ得る。これに関する好ましいアッセイは、下記に記載される、細胞増殖アッセイ及びバイオセンサーに基づくリガンド−結合アッセイを包含する。活性受容体又はその一部（例えば、リガンド−結合フラグメント）をコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【００７６】
上記に論じられる方法を用いて、当業者は、配列番号３又はその対立遺伝子変異体に対して実質的に相同である可溶性受容体サブユニットを含んで成り、そして野生型受容体のリガンド−結合性質を保持する種々のポリペプチドを調製することができる。そのようなポリペプチドは、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、又はトランスメンブラン及び細胞内ドメインの一部又はすべてからの追加のアミノ酸を包含することができる。そのようなポリペプチドはまた、上記に一般的に開示されるような追加のポリペプチドセグメントを包含することができる。
【００７７】
本発明の受容体ポリペプチド、例えば可溶性ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体、十分な長さの受容体、受容体フラグメント（例えば、リガンド−結合フラグメント）、及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するための技法は次の文献に開示される：Ｓａｍｂｒｏｏｌ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９， 及びＡｕｓｕｂｅｌ など．， ｅｄｓ．， 前記（それらの文献は引用により本明細書に組み込まれる）。
【００７８】
一般的に、ｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又はヘテロダイマー又はマルチマーｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体、例えばＣＲＦ２−４又はＩＬ１０Ｒポリペプチドの追加のサブユニットをコードするＤＮＡ配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。
【００７９】
プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。可溶性受容体複合体の複数成分が、個々の発現ベクター上に同時トランスフェクトされ得、又は単一の発現ベクターに包含され得る。タンパク質複合体の複数成分を発現するそのような技法は、当業界において良く知られている。
【００８０】
ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマーｚｃｙｔｏｒ１１受容体ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、受容体の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばｔ−ＰＡ ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、ｚｃｙｔｏｒ１１ ＤＮＡ配列に正しく読み取り枠を整合して、作用可能に連結さる。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるＤＮＡ配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【００８１】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性ＤＮＡを 、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒなど．， Ｃｅｌｌ １４ ： ７２５， １９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７ ：６０３， １９８１； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２； ４５６， １９７３），エレクトロポレーション（ Ｎｅｕｍａｎｎ など．， ＥＭＢＯ Ｊ． １： ８４１−８４５， １９８２ ）； ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ など．，ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， １９８７））、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ −Ｎｅｌｓｏｎ など．， Ｆｏｃｕｓ １５： ７３， １９９３； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ　など．，Ｆｏｃｕｓ １５： ８０， １９９３ ）を包含する（それらの文献は引用により本明細書に組み込まれる）。
【００８２】
培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばｌｅｖｉｎｓｏｎ など．， アメリカ特許第４，７１３，３３９ 号； Ｈａｇｅｎ など．， アメリカ特許第４，７８４，９５０ 号； Ｐａｌｍｉｔｅｒ など．， アメリカ特許第 ４，５７９，８２１ 号； 及びＲｉｎｇｏｌｄ， アメリカ特許第 ４，６５６，１３４ 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６３２）、ＢＨＫ ５７０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １０３１４ ）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １５７３ ； Ｇｒａｈａｍ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏ． ３６： ５９−７２， １９７７ ）、及びチャイニーズ　ハムスター卵巣（例えば　ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ６１ ）細胞系を包含する。
【００８３】
追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えば Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、例えばＳＶ−４０ 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第４，９５６，２８８ 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許 ４，５７９，８２１ 号及び第 ４，６０１，９７８ 号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【００８４】
薬物選択は一般的に、外来性ＤＮＡが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。
【００８５】
“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン　アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。
【００８６】
他の高等真核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Ｇｕａｒｉｎｏ など．，アメリカ特許第５，１６２，２２２号；Ｂａｎｇなど．，アメリカ特許４，７７５，６２４号；及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３号により公開される（それらの文献は引用により本明細書に組み込まれる）。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒなど．、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． （ Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ） １１： ４７−５８， １９８７ により再考されている。
【００８７】
菌類細胞、例えば酵母細胞、及び特に、サッカロミセス属の細胞はまた、例えば受容体フラグメント又はポリペプチド融合体を精製するために、本発明内で使用され得る。外因性ＤＮＡにより酵母細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ など．， アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ， アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙ など．， アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【００８８】
酵母への使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉ など． （アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．， アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ， アメリカ特許第４，９７７，０９２ 号を参照のこと）及びアルコール　デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第４，９９０，４４６ 号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６ 号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。
【００８９】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ）、ピチア・パストリス（ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【００９０】
例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２： ３４５９−３４６５， １９８６ 及びＣｒｅｇｇ， アメリカ特許第４，８８２，２７９ 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ など．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ．， アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。
【００９１】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
【００９２】
本発明の１つの観点においては、本発明の新規可溶性受容体は、培養された細胞により生成され、そして細胞は、受容体のためのリガンド、例えば天然のリガンド、ＩＬ−ＴＩＦ及び天然のリガンドのアゴニスト及びアンタゴニストについてスクリーンするために使用される。このアプローチを要約すると、受容体をコードするｃＤＮＡ又は遺伝子がその発現のために必要とされる他の遺伝子要素（例えば、転写プロモーター）と組合され、そしてその得られる発現ベクターが宿主細胞中に挿入される。ＤＮＡを発現し、そして機能的受容体を生成する細胞が選択され、そして種々のスクリーニングシステム内に使用される。ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体複合体の個々の成分は、その同じ細胞において発現され得る。
【００９３】
ｚｃｙｔｏｒ１１受容体を発現し、そして受容体介在性シグナルを形質導入することへの使用のために適切な哺乳類細胞は、ｚｃｙｔｏｒ１１と共に機能的複合体を形成できる他の受容体サブユニットを発現する細胞を包含する。それらのサブユニットは、インターフェロン受容体又は他のクラスＩＩ又はＩサイトカイン受容体、例えばＣＲＦ２−４、ＩＬ−１０Ｒ及びＩＬ−９Ｒのそれらのサブユニットを包含する。発現される受容体と同じ種からの細胞を使用することがまた好ましい。好ましい態様においては、細胞は、その増殖のための外因的に供給された造血成長因子に依存する。このタイプの好ましい細胞系は、ＧＭ−ＣＳＦ−依存性ヒト白血病細胞系、及びＩＬ−３依存性ネズミプレ−Ｂ細胞系であるＢａＦ３（Ｐａｌａｃｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ， Ｃｅｌｌ４１： ７２７−７３４ （１９８５））である、ヒトＴＦ−１細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−２００３）及びＡＭＬ−１９３細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−９５８９）である。他の細胞系は、ＢＨＫ、ＣＯＳ−１及びＣＨＯ細胞を包含する。
【００９４】
適切な宿主細胞は、必要な受容体サブユニット、又は所望する細胞応答のために必要とされる他の細胞成分を生成するために構築され得る。このアプローチは、細胞系がいずれかの種からの受容体サブユニットを発現するために構築され得、それにより、種特異性から生じる可能性ある制限を克服するので、好都合である。ヒト受容体ｃＤＮＡの種オルト体は、同じ種からの細胞系、例えばＢａＦ３細胞系におけるマウスｃＤＮＡ内にクローン化され、そして使用され得る。従って、１つの造血成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−３に依存する細胞系が、ＩＬ−ＴＩＦに依存性に成るよう構築され得る。
【００９５】
機能的受容体を発現する細胞が、スクリーニングアッセイ内に使用される。種々の適切なアッセイは、当業界において良く知られている。それらのアッセイは、標的細胞における生物学的反応の検出に依存する。１つのそのようなアッセイは、細胞増殖アッセイである。細胞は、試験化合物の存在又は不在下で培養され、そして細胞増殖は、例えばトリチウム化されたチミジンの組み込みを測定することにより、又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Ｍｏｓｍａｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６５： ５５−６３， １９８３）の代謝性分解に基づく比色分析により検出される。他のアッセイ型は、レポーター遺伝子を発現するよう、さらに構築される細胞を用いる。
【００９６】
レポーター遺伝子は、レポーター−連結経路に応答するプロモーター要素に連結され、そしてアッセイは、レポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。これに関しての好ましいプロモーター要素は、血清応答要素、又はＳＲＥである（例えば、Ｓｈａｗなど．， Ｃｅｌｌ ５６３−５７２， １９８９を参照のこと）。好ましいそのようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である（ｄｅ Ｗｅｔなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７： １９８７）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当業界において知られている方法を用いて発光により検出される（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： １９０９４−２９１０１， １９９４； Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｇｏｉｆｆｉｎ， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ ４１； １１， １９９３）。ルシフェラーゼアッセイキットは、例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩから市販されている。
【００９７】
この型の標的細胞系は、化学物質、細胞−ならし培養培地、菌類ブイヨン、土壌サンプル、水サンプル及び同様のもののライブラリーをスクリーンするために使用され得る。例えば、細胞−又は組織−ならし培地サンプルのバンクが、リガンドを生成する細胞を同定するために標的細胞に対してアッセイされ得る。次に、陽性細胞が、プールに分けられ、宿主細胞中にトランスフェクトされ、そして発現される、哺乳類細胞発現ベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを生成するために使用される。次にトランスフェクトされた細胞からの培地サンプルがアッセイされ、続くプールの分割、トランスフェクション、継代培養、及び陽性細胞の再アッセイが伴ない、リガンドをコードするクローン化されたｃＤＮＡが単離され得る。
【００９８】
Ｚｃｙｔｏｒ１１受容体のための天然のリガンドはまた、十分な長さの受容体を発現する細胞系を突然変異誘発し、そしてそれを、オートクライン増殖について選択する条件下で培養することによって同定され得る。ＷＩＰＯ公開ＷＯ９５／２１９３０号を参照のこと。典型的な方法においては、ｚｃｙｔｏｒ１１及び必要な追加のサブユニットを発現するＩＬ−３依存性ＢａＦ３細胞が、例えば２−エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）により突然変異誘発される。次に、細胞が、ＩＬ−３の存在下で回収され、次に、ＩＬ−３及びＩＬ−４を欠いている培養培地にトランスファーされる。生存細胞が、ＩＬ−ＴＩＦ生成のために、可溶性受容体を、培養培地に添加することにより、又は受容体を発現する野生型ＢａＦ３細胞及びＢａＦ３細胞に基づくならし培地をアッセイすることによりスクリーンされる。この方法を用いて、ＩＬ−ＴＩＦを発現する細胞及び組織が同定され得る。
【００９９】
本発明により提供される追加のスクリーニングアプローチは、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を包含する。それらのハイブリッドポリペプチドは、２種の一般的なクラスに分けられる。第１のクラスにおいては、配列番号２の残基２５２〜５７４を含んで成るｚｃｙｔｏｒ１１の細胞内ドメインは、第２受容体のリガンド−結合ドメインに連結される。好ましくは、第２受容体は造血サイトカイン受容体、例えばｍｐｌ受容体である（Ｓｏｕｙｒｉなど．， Ｃｅｌｌ ６３： １１３７−１１４７， １９９０）。ハイブリッド受容体はさらに、いずれかの受容体に由来するトランスメンブランドメインを含んで成るであろう。次に、ハイブリッド受容体をコードするＤＮＡ構造体が宿主細胞中に挿入される。
【０１００】
ハイブリッド受容体を発現する細胞が、結合ドメインのためのリガンドの存在下で培養され、そして応答についてアッセイされる。このシステムは、容易に入手できるリガンドを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１１により介在されるシグナルトランスダクションを分析するための手段を提供する。このシステムはまた、特定の細胞系が本発明のｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー及びマルチマーにより形質導入されたシグナルに応答できるかどうかを決定するためにも使用され得る。第２クラスのハイブリッド受容体ポリペプチドは、第２受容体、好ましくは造血サイトカイン受容体の細胞質ドメイン及びトランスメンブランドメインと共に、ｚｃｙｔｏｒ１１の細胞外（リガンド結合）ドメイン（配列番号２及び３の残基１８〜２２８）を含んで成る。
【０１０１】
この第２クラスの本発明の受容体のハイブリッドｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー及びマルチマーは、第２受容体により形質導入されるシグナルに応答することが知らされている細胞において発現される。それらの２種のハイブリッド受容体は、ＩＬ−ＴＩＦを検出するためのアッセイの開発のための応答性細胞型の同定を可能にする。さらに、そのような細胞は、競争型アッセイにおいて本発明の可溶性受容体アンタゴニストをアッセイするために、ＩＬ−ＴＩＦの存在下で使用され得る。そのようなアッセイにおいては、本発明の可溶性受容体の存在下でのＩＬ−ＴＩＦの増殖又はシグナルトランスダクション活性の低下が拮抗活性を示す。さらに、ＩＬ−ＴＩＦ−可溶性受容体結合アッセイが、可溶性受容体がＩＬ−ＴＩＦ活性を拮抗するかどうかを評価するために使用され得る。
【０１０２】
次に、前記リガンドを発現することが見出された細胞が、リガンド−コードのｃＤＮＡが上記に開示されるように単離され得るｃＤＮＡライブラリーを調製するために使用される。従って、本発明は、新規受容体ポリペプチドの他に、受容体のためのポリペプチドリガンドをクローニングするための方法を提供する。
【０１０３】
ｚｃｙｔｏｒ１１発現の組織特異性は、膵臓、小腸、結腸及び胸腺の成長において役割を演じることができる。この受容体に関して観察される組織特異性の観点から、アゴニスト（天然のリガンドを包含する）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。受容体アゴニストに同定される化合物は、インビトロ及びインビボで、標的細胞の増殖及び進化を刺激するために有用である。
【０１０４】
例えば、アゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の成分として有用であり、そして細胞培養において通常使用される血清を置換するために、単独で又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。アゴニスト又はアンタゴニストは、培養における膵臓、胃腸又は胸腺由来の細胞の増殖及び／又は進化を特異的に調節することにおいて有用である。それらの化合物は、リガンド−受容体相互作用の部位を特徴づけるための調査用試薬として有用である。インビボで、受容体アゴニスト又はアンタゴニストは、膵臓、胃腸又は胸腺疾患の処理に使用される。
【０１０５】
ｚｃｙｔｏｒ１１に対するアゴニスト又はアンタゴニストは、小ファミリーのペプチドを包含することができる。それらのペプチドは、当業界において知られている親和性選択条件を用いて、ペプチドライブラリーに存在する候補体の集団から同定され得る。ペプチドライブラリーは、固体支持体上で化学的に合成され、そして提供される結合ライブラリーを包含し（Ｌａｍなど．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４： ８２−８４ （１９９１））、又は溶液において存在し（Ｈｏｕｇｈｔｅｎなど．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３： ４１２−４２１ （１９９２））、発現され、次にプラスミドＤＮＡに連結され（Ｃｕｌｌなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １８６５−１８６９ （１９９２））、又はウィルス又は細胞の表面上で発現され、そして続いて表示される（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５： ５５３−５５７ （１９９７）； Ｃｗｉｒｌａ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： １６９５−１６９９ （１９９７））。
【０１０６】
ｚｃｙｔｏｒ１１ホモダイマー、ヘテロダイマー／及びマルチマーはまた、循環レベルのＩＬ−ＴＩＦリガンドの検出のために診断システム内で使用され得る。関連する態様においては、本発明のｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体に対して特異的に結合する抗体又は他の剤が循環受容体ポリペプチドを検出するために使用され得る。高められた又は低められたレベルのリガンド又は受容体ポリペプチドが、病理学的状態、例えば癌の表示であり得る。
【０１０７】
ｚｃｙｔｏｒ１１ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体ポリペプチドは、細胞外ドメインをコードする切断されたＤＮＡ、例えば配列番号３又はヒト受容体のその対応する領域を含むポリペプチドを発現することによって調製され得る。好ましくは、細胞外ドメインポリペプチドは、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さない形で調製される。例えば、受容体ポリペプチドのＣ−末端は、配列番号２の残基２２８、又は対立遺伝子変異体又は非ヒト受容体のその対応する領域に存在することができる。
【０１０８】
宿主細胞からの受容体ドメインの輸送を方向づけるために、受容体ＤＮＡが、分泌シグナル、例えばｔ−ＰＡ分泌ペプチドをコードする第２ＤＮＡセグメントに連結される。分泌された受容体ドメインの精製を促進するために、Ｃ−末端延長、ポリ−ヒスチジン標識、物質Ｐ、ＦｌａｇＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０ （１９８８）；Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴから入手できる）、又は抗体又は他の特異的結合剤が利用できるもう１つのポリペプチド又はタンパク質が、受容体ポリペプチドに融合され得る。さらに、ヘテロダイマー及びマルチマー非−ｚｃｙｔｏｒ１１サブユニット細胞外サイトカイン結合ドメインがまた、上記のようにして調製される。
【０１０９】
もう１つのアプローチにおいては、ｚｃｙｔｏｒ１１又は他のクラスＩ又はＩＩサイトカイン受容体成分の受容体細胞外ドメインは、２種の不変領域ドメイン及びヒンジ領域を含み、そして可変領域を欠いている、免疫グロブリンＨ鎖不変領域、典型的には、Ｆｃフラグメントとの融合体として発現され得る（Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉ， ＡＺなど．， アメリカ特許第６，０１８，０２６号及び第５，７５０，３７５号を参照のこと）。本発明の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマー及びマルチマーはそのような融合体を包含する。そのような融合体は典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここでＦｃ部分はお互いジスルフィド結合され、そして２種の受容体ポリペプチドがお互い密接に接近して整列されている。
【０１１０】
このタイプの融合体は、溶液から同種リガンドを親和性精製するために、インビトロアッセイ手段として、リガンドを特異的に滴定することによってインビボでシグナルを阻止するために、及び循環リガンドを結合し、そしてそれを循環から洗浄するために、それらを非経口投与することによってインビボでのアンタゴニストとして使用され得る。リガンドを精製するためには、ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｉｇキメラが、リガンドを含むサンプル（例えば、細胞−ならし培地又は組織抽出物）に、受容体−リガンド結合を促進する条件（典型的には、生理学的に近い温度、ｐＨ及びイオン強度）下で添加される。次に、キメラ−リガンド複合体が、固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）上に固定されているタンパク質Ａを用いて、混合物により分離される。
【０１１１】
次に、リガンドは、従来の化学的技法、例えば塩又はｐＨグラジエントを用いて溶出される。他方では、キメラ自体は、固体支持体に結合され、そして結合及び溶出は上記のようにして行われる。キメラは、胃腸、膵臓又は胸腺機能を調節するためにインビボで使用され得る。高い結合親和性を有するキメラは、非経口に投与される（例えば、筋肉内、皮下又は静脈内注射により）。循環分子は、リガンドを結合し、そして通常の生理学的工程により循環からクリアランスされる。アッセイに使用のためには、キメラは、Ｆｃ領域を通して支持体に結合され、そしてＥＬＩＳＡ型に使用される。
【０１１２】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体、及び１又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質を提供する。例えば、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４は、アメリカ特許第５，１５５，０２７号及び第５，５６７，５８４号に開示されるようなダイマータンパク質への融合として調製され得る。それに関しての好ましいダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメイン、例えばＩｇＧγ１、及びヒトκＬ鎖を包含する。免疫グロブリン−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は免疫グロブリン−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば免疫グロブリン−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ ＣＲＦ２−４融合体は、種々のマルチマーｚｃｙｔｏｒ１１受容体類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。
【０１１３】
補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子（例えば、コラーゲン、又はＩＬ−ＴＩＦを発現する細胞）に対してそれらを標的化するために可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４に融合され得る。ｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチドは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができる。Ｔｕａｎなど．， Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： １−９， １９９６を参照のこと。
【０１１４】
リガンド−結合受容体フラグメントを用いる好ましいアッセイシステムは、市販のバイオセンサー装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用し、ここで受容体フラグメントが、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５： ２２９−４０， １９９１ 及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２３４： ５５４−６３，１９９３により開示される。受容体フラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンドがサンプルに存在する場合、それは、固定された受容体ポリペプチドに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化学量の評価が可能にされる。
【０１１５】
リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のアッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスカチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０−７２， １９４９）及び熱量測定アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３： ５４５−４８， １９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： ８２１−２５， １９９１）を包含する。
【０１１６】
受容体リガンド−結合ポリペプチドはまた、ＩＬ−ＴＩＦリガンドの精製のためにも使用される。前記受容体ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド又は使用の条件下で安定している同様の材料のビーズ上に固定される。固体支持体にポリペプチドを結合するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアノゲン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒体は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてリガンドを含む流体が、受容体ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にするために、カラムに１又は複数回、通される。次に、リガンドが、塩濃度の変化、又はリガンド−受容体結合を破壊するｐＨを用いて溶出される。
【０１１７】
さらに、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４は、リガンドの存在が所望されない治療又は他の用途において、インビボ又はインビトロでリガンドを結合するために、“リガンドシンク（ｌｉｇａｎｄ ｓｉｎｋ）”、すなわちアンタゴニストとして使用され得る。
【０１１８】
例えば、多量の生物活性ＩＬ−ＴＩＦを発現する癌においては、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４は、インビボで、リガンドの直接的なアンタゴニストとして使用され得、そして疾病に関連する進行及び病状の低下を助けることができ、そして進行及び徴候を低め、そして再発を妨げることにおいて治療の効果を増強するために、他の療法（例えば、化学療法）と組合して使用され得る。さらに、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４は、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体を過剰発現する癌の進行を、それらの癌の増殖を増強するリガンドをインビボで結合することによって遅延するために使用され得る。
【０１１９】
さらに、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４は、インビボで、又は組織サンプルにおいて、ＩＬ−ＴＩＦ−発現性癌を検出するために、インビボで又は診断用途において使用され得る。例えば、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４は、本明細書に記載されるような放射性ラベル又は蛍光ラベルに接合され得、そしてインビトロリガンド−受容体型結合アッセイ又は蛍光イメージングアッセイを用いて、組織サンプルにおけるＩＬ−ＴＩＦの存在を検出するために使用され得る。さらに、放射性ラベルされた可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４は、当業界において知られている放射性−イメージングを通して、リガンド発現性固形腫瘍を検出するために、インビボで投与され得る。
【０１２０】
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドはまた、抗原内に含まれるエピトープ、ペプチド又はポリペプチドに結合する抗体を調製するために使用される。ｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチド又はそのフラグメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するために抗原（免疫原）として作用する。当業者は、抗原又は免疫原性エピトープが、長いポリペプチド内の一連のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜ポリペプチドのほぼ完全な長さのアミノ酸、又はポリペプチドに依存してより長いアミン酸から成ることを認識するであろう。適切な抗原は、配列番号３によりコードされるｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチド、又は連続した９〜２１１個のＡＡのそのアミノ酸フラグメントを包含する。
【０１２１】
抗原として使用するための好ましいペプチドは、本明細書に開示されるサイトカイン結合ドメイン、ｚｃｙｔｏｒ１１親水性ペプチオド、例えば隠されたＧ， Ｓ及びＴ残基及び暴露されたＨ， Ｙ及びＷ残基の無視を伴なって、スライドする６個の残基の窓に基づいてのＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールから、又はＤＮＡ★ＳＴＡＲプログラムを用いての配列番号３のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプロットから決定される、親水性プロットから当業者により推定されるそれらのペプチドである。さらに、保存されるモチーフ、及びｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体の保存されるモチーフ間の可変領域が適切な抗原である。適切な抗原はまた、もう１つのクラスＩ又はＩＩサイトカイン細胞外ドメイン、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４からのそれらのドメインと組合して、上記に開示されるｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチドを包含する。
【０１２２】
さらに、マウス可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体ポリペプチド（配列番号３）の対応する領域が、可溶性マウスｚｃｙｔｏｒ１１受容体に対する抗体を生成するために使用され得る。さらに、この免疫応答から生成される抗体は、本明細書に記載のようにして単離され、そして精製され得る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など．， （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５； Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； 及びＨｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．Ｇ．Ｒ．， Ｅｄ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８２ を参照のこと。
【０１２３】
当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えばその可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチド又はフラグメントにより接種することにより生成され得る。Ｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。
【０１２４】
免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン　ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばｚｃｙｔｏｒ１１又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２及びＦａｂタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。
【０１２６】
非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（ｃｌｏａｋｉｎｇ）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。
【０１２７】
抗体は、１）それらが限界レベルの結合活性を示す場合、及び２）それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合すると考えられる。限界レベルの結合は、本明細書における抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４抗体が対照（非−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４）ポリペプチドへの結合親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性を伴って、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合するかどうか決定される。好ましくは、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、及び最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を示す。抗体の結合親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ 分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ｇ．， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１： ６６０−６７２， １９４９）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。
【０１２８】
抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４抗体は関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しないかどうかは、例えば、標準のウェスターンブロット分析を用いて、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドであるが、しかし知られていない関連するポリペプチドを検出する抗体により示される（Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記）。既知の関連するポリペプチドの例は、従来技術に開示されているそれらのもの、例えば既知のオルト体及びパラ体、及びタンパク質ファミリーの類似する既知メンバーである。
【０１２９】
スクリーニングはまた、非ヒト可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４及び可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポチペプチドを用いて行われ得る。さらに、抗体は、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドに対して特異的に結合する集団を単離するために、既知の関連するポリペプチドに“対してスクリーンされ得る”。例えば、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４に対して生ぜしめられた抗体は不溶性マトリックスに付着される関連するポリペプチドに吸着され；可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４に対して特異的な抗体は適切な緩衝液条件下で前記マトリックスを通して流れるであろう。
【０１３０】
スクリーニングは、既知の溶接に関連するポリペプチドに対して交差反応しないポリクローナル及びモノクローナル抗体の単離を可能にする（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｏｌｉｇａｎ， など． （ｅｄｓ．）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５）。特異的抗体のスクリーニング及び単離は当業界において当業界において良く知られている。
【０１３１】
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｕｌ （ｅｄｓ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９３； Ｇｅｔｚｏｆｆなど．， Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３： １−９８， １９８８； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｇｏｄｉｎｇ， Ｊ．Ｗ． （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， １９９６； Ｂｅｎｊａｍｉｎ など．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２： ６７−１０１， １９８４を参照のこと。特異的に結合する抗−ｚｃｙｔｏｒ１７抗体は、当業界において知られており、そして下記に開示される多くの方法により検出され得る。
【０１３２】
当業者に知られている種々のアッセイが可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ ｌａｎｅ （Ｅｄｓ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｅｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８ に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ、及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
【０１３３】
本明細書において有用な抗体を生成するか又は選択するための他の技法は、インビトロで、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４タンパク質又はペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされた可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。
【０１３４】
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドのための可能性ある結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。
【０１３５】
それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。そのようなランダム　ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，４０３，４８４ 号及びＬａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，５７１，６９８ 号、及びＫａｙなど．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６））、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） 及びＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． （Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ， ＭＪ） から市販されている。
【０１３６】
ランダムペプチド表示ライブラリーは、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示される可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４配列を用いてスクリーンされ得る。可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合ペプチド”は、細胞を標識するために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得る；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に接合され得る。
【０１３７】
それらの結合ペプチドはまた、分析方法に、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するために、例えばＩＬ−ＴＩＦリガンドと受容体、又は受容体に結合するウィルスとの間の相互作用を阻止するためにも使用され得る。結合ペプチドはまた、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断アッセイにも使用され得る。
【０１３８】
それらの結合ペプチドはまた、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又はｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えばｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４結合及びシグナルトランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するために、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又はｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えばｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ “アンタゴニス”として使用することができる。それらの抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４結合ペプチドは、ＩＩＬ−ＴＩＦ活性、及び受容体活性又はタンパク質結合を阻害するために有用である。本発明のヘテロダイマー又はマルチマー組合せに対して生ぜしめられた抗体は、それらがＩＬ−ＴＩＦに対してより特異的に、又はわずか１つのサブユニットに対して生ぜしめられた抗体よりも有力に作用するので、好ましい態様である。さらに、本発明の抗体のアンタゴニスト及び結合活性は、ＩＬ−ＴＩＦ増殖、及び本明細書に記載される他の生物学的アッセイによりアッセイされ得る。
【０１３９】
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４に対する抗体は、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４を発現する細胞を標識するために；アフィニティー精製により可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドを単離するために；可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４を検出し又は定量化するために；ＦＡＣＳ を使用する分析方法において、発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗−インディオタイプ抗体を生成するために；及びインビトロで可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４、又はＩＬ−ＴＩＦ活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。
【０１４０】
適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。
【０１４１】
さらに可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、例えば当業界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変性され手入る可又は変性されていない可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得る。
【０１４２】
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４に対する抗体は、その対応する受容体を発現する細胞を標識し、そしてそれらの発現レベルをアッセイするために、可溶性受容体ポリペプチドの循環レベルを決定するために診断アッセイ内での親和性精製のために、蛍光−活性化された細胞分類を用いる分析方法のために有用である。さらに、二価抗体は、ＩＬ−ＴＩＦの効果を模倣するアゴニストとして使用され得る。
【０１４３】
本明細書における抗体はまた、薬剤、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体は、治療用途を研究するためのネズミモデルにおいて、又は治療の用途において、インビボ診断のために使用される。例えば、本発明の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４ポリペプチドを認識する抗体又は結合ポリペプチドは、対応する抗−相補的分子（すなわち、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又はｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。
【０１４４】
より特定には、抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４抗体又はその生物活性フラグメント又は一部が、検出可能な又は細胞毒性の分子に連結され、そしてｚｃｙｔｏｒ１１受容体又はｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４受容体分子を発現する細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。
【０１４５】
適切な検出可能分子は、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４（上記に開示される結合ペプチドを包含する“結合ポリペプチド”、抗体、又はその生物活性フラグメント又は一部に直接的に又は間接的に結合され得る。適切な検出可能分子は、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばＩ−１３１、レニウム−１８８又はイットニウム−９０（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ−ト成分により間接的に結合される）を包含する。
【０１４６】
結合ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は細胞毒性分子は相補的／抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメンバーは結合ポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビオチン／ストレプタビジンが典型的な相補的／抗相補的対である。
【０１４７】
もう１つの態様においては、結合ポリペプチド−毒素融合タンパク質又は抗体−毒素融合タンパク質は、標的化された細胞又は組織阻害又は除去（例えば、癌細胞又は組織を処理するために）のために使用され得る。他方では、結合ポリペプチドが複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン、及び標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを包含する融合タンパク質は、検出可能分子、細胞毒性分子又は相補的分子を、興味ある細胞又は組織型に向けるために適切である。例えば、単一のドメインのみのを包含する融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗−相補的分子は検出可能又は細胞毒性分子に接合され得る。従って、そのようなドメイン−相補的分子融合タンパク質は、一般的抗−相補的−検出可能／細胞毒性分子接合体のための一般的標的化ビークルを表す。
【０１４８】
もう１つの態様においては、可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４結合ポリペプチド−サイトカイン又は抗体―サイトカイン融合タンパク質は、結合ポリペプチドサイトカイン又は抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４抗体が過剰増殖性細胞を標的化する場合、標的組織（例えば、膵臓、血液、リンパ球、結腸及び骨髄癌）のインビボ殺害を増強するために使用され得る（一般的には、Ｈｏｒｎｉｃｋなど．， Ｂｌｏｏｄ ８９： ４４３７−４４４７， １９９７を参照のこと）。
【０１４９】
記載される融合タンパク質は、作用の所望する部位へのサイトカインの標的化を可能にし、それにより、サイトカインの高められた局部濃度を提供する。適切な抗−ｚｃｙｔｏｒ１１ホモダイマー及びヘテロダイマー抗体は、所望しない細胞又は組織（例えば、腫瘍又は白血病）を標的化し、そして融合されたサイトカインはエフェクター細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。例えば、この目的のための適切なサイトカインは、インターロイキン−２及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＭ）を包含する。
【０１５０】
他方では、本明細書に記載される可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４結合ポリペプチド又は抗体融合タンパク質は、ｚｃｙｔｏｒ１１−調節されたアポプトシス経路を直接的に刺激することにより、標的組織のインビボ殺害の増強のために使用され、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体又はｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー受容体、例えば可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４受容体を発現する高増殖性細胞の細胞死がもたらされる。
本発明は、次の非−例示的な例によりさらに例示される。
【０１５１】
実施例
例１．次のｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体を発現する哺乳類発現ベクターの構成：ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＥＥ， ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＦＬＧ，ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＨＩＳ及びｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃ４
Ａ． ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＥＥ， ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＦＬＧ及びｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＨＩＳを含むｚｃｙｔｏｒ１１哺乳類発現ベクターの構成
発現ベクター、すなわちｐＣ４ｚａｌｐｈａ１１ ＣＥＥを、ｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチド（配列番号３）の可溶性、細胞外ドメインの発現のために調製し、ここで前記構造体は、予測される開始メチオニンから成り、そして予測されるトランスメンブランドメインに隣接して切断され、そしてＣ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識（配列番号４）を有するｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチドを発現するよう企画されている。
【０１５２】
ｚｃｙｔｏｒ１１細胞外サイトカイン結合ドメインを含んで成るｚｃｙｔｏｒ１１ ＤＮＡフラグメント（配列番号３）を、ＰＣＲを用いて創造し、そして精製した。切断されたＤＮＡを、シグナルペプチド、例えば生来のｚｃｙｔｏｒ１１シグナルペプチドを有し、そしてＧｌｕ−Ｇｌｕ標識（配列番号４）を、ｚｃｙｔｏｒ１１ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド配列のＣ−末端に結合するプラスミド発現ベクター中にサブクローン化する。そのような発現ベクターである哺乳類ベクターは、哺乳類プロモーター、コード配列の挿入のための複数の制限部位、停止コドン及び哺乳類ターミネーターを有する発現カセットを含む。プラスミドはまた、複製のＥ．コリ起点、ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製の起点を有する哺乳類選択マーカー発現単位、ＤＨＦＲ遺伝子及びＳＶ４０ターミネーターを有することができる。
【０１５３】
制限消化されたｚｃｙｔｏｒ１１挿入体及び前もって消化されたベクターを、標準の分子生物学技法を用いて、連結し、そして、コンピテント細胞、たとえばＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中に、製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートし、そして５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートした。コロニーを、個々のコロニーから調製されたＤＮＡの制限分析によりスクリーンした。陽性クローンの挿入体配列を、配列分析により確かめた。大規模プラスミド調製を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）Ｍａｘｉ ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って行った。
【０１５４】
同じ方法を用いて、一列に並んでの６個のＨｉｓ残基から成るＣ−末端ｈｉｓ標識及びＣ−末端フラッグ（配列番号５）標識、すなわちｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＦ１．ＡＧを有するｚｃｙｔｏｒ１１可溶性ホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマー受容体（非−ｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体サブユニット、例えば可溶性ＣＲＦ２−４又はＩＬ−１０Ｒを包含する）を調製した。それらの構造体を調製するためには、前記ベクターは、ｇｌｕ−ｇｌｕ標識（配列番号４）の変わりにＨＩＳ又はＦＬＡＧ（商標）標識のいずれかを有する。
【０１５５】
Ｂ．可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃ４の哺乳類発現構造体
ｚｃｙｔｏｒ１１をコードするポリヌクレオチドのすべて又は一部を含む発現プラスミドを、相同組換えを通して構成した。ｚｃｙｔｏｒ１１ ｃＤＮＡのフラグメントを、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体の細胞外ドメインからのポリヌクレオチド配列を包含するＰＣＲを用いて単離した。ｚｃｙｔｏｒ１１フラグメントの生成のためのＰＣＲに使用されるプライマーは、５’側から３’側の方に向かって、次のものを有した：（１）ベクターを端に有する配列（挿入体の５’末端）の４０ｂｐ及びｚｃｙｔｏｒ１１細胞ドメインの３’末端に対応する１７ｂｐを包含し；そして（２）Ｆｃ４ポリヌクレオチド配列の５’末端の４０ｂｐ（配列番号６）及びｚｃｙｔｏｒ１１細胞外ドメインの３’末端に対応する１７ｂｐを包含する。
【０１５６】
ｚｃｙｔｏｒ１１との融合のためのＦｃ４のフラグメントを、類似する態様でＰＣＲにより生成した。Ｆｃ４フラグメントの生成に使用される２種のプライマーは、次のものであった：（１）ｚｃｙｔｏｒ１１細胞外ドメインの３’末端からの４０ｂｐの配列及びＦｃ４の５’末端からの１７ｂｐの配列（配列番号６）から成る５’プライマー；及び（２）ベクター配列（挿入体の３’側）の４０ｂｐの配列及びＦｃ４の３’末端の１７ｂｐの配列（配列番号６）から成る３’プライマー。次に、上記反応の個々のＰＣＲ増幅を、当業界における標準の条件を用いて行った。
【０１５７】
典型的な発現ベクターを、ＳａｍＩ（ＢＲＬ）により切断される、プラスミドｐＣＺＲ１９９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託された； 寄託番号９８６６８号）から誘導する。発現ベクターを、プラスミドｐＣＺＲ１９９から誘導し、そしてそれは、ＣＭＶ即時初期プロモーター、マウス免疫グロブリンＨ鎖遺伝子座の可変領域からのコンセンサスイントロン、コード配列の挿入のための複数の制限部位、停止コドン及びヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カッセイトを含む哺乳類発現ベクターである。発現ベクターはまた、複製のＥ．コリ起点、ＳＶ４０プロモーター、エンハンサー及び複製の起点を有する哺乳類選択マーカー発現単位、ＤＨＦＲ遺伝子及びＳＶ４０ターミネーターを有する。使用される発現ベクターを、ＣＭＶ即時初期プロモーターによるメタロチオネインプロモーターの置換によりｐＣＺＲ１９９から構成した。
【０１５８】
コンピテント酵母細胞（Ｓ．セレビシアエ）を、それぞれ約１μｇのｚｃｙｔｏｒ１１及びＦｃ４挿入体及びＳｍａＩ（ＢＲＬ）消化された発現ベクター１００ｎｇと共に組合し、そしてエレクトロポレートする。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、“無限”Ω、２５μＦで、電気パルスした。個々のキュベットに、１．２Ｍのソルビトール６００μｌを添加し、そして酵母を、２種のＵＲＡ−Ｄプレート上の２つの３００μｌアリコートにプレートし、そして３０℃でインキュベートした。
【０１５９】
約４８時間後、単一のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を、採取し、ＤＮＡを単離し、そしてエレクトロコンピテントＥ．コリ細胞（ＤＨ１０Ｂ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を形質転換し、そして標準の方法を用いてプレートする。０．５−２ｍｌの酵母ＤＮＡ調製物及び４０μｌのＤＨ１０Ｂ細胞により行った。ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃ４のための正しい発現構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定し、ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃ４挿入体の存在を確かめ、そして種々のＤＮＡ配列がお互いに正しく連結されていることを確かめた。陽性クローンの挿入体を配列分析した。大規模プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離する。
類似する方法を用いて、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体の非−ｚｃｙｔｏｒ１１サブユニット、例えばＦｃ４により標的化されたＣＲＦ２−４及びＩＬ−１０Ｒを調製した。
【０１６０】
例２．可溶性受容体ポリペプチドのトランフェクション及び発現
ＢＨＫ ５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）， ＤＧ４４ ＣＨＯ， 又は他の哺乳類細胞を、８００μｌの適切な血清フリー（ＳＦ）培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ） において、約１．２×１０６個の細胞／ウェル（６−ウェルプレート）でプレートする。細胞を、血清フリー（ＳＦ）培地において、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） を用いて、製造業者の説明書に従って、ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＥＥ， ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＦＬＧ， ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＨＩＳ又はＦｃ４（例１）、又はヘテロダイマー及びマルチマー受容体の非−ｚｃｙｔｏｒ１１サブユニット、例えば−ＣＥＥ−、ＣＦＬＧ、−ＣＨＩＳ、又は−Ｆｃ４標識されたＣＲＦ２−４及びＩＬ−１０Ｒを含む発現プラスミドによりトランスフェクトする。可溶性受容体を発現する単一のクローンを単離し、スクリーンし、そして細胞培養培地において増殖せしめ、そして標準の方法を用いて精製する。
【０１６１】
例３．Ｅ．コリにおけるｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体の発現
Ａ．ｈｕｚｃｙｔｏｒ１１／ＭＢＰ−６Ｈ融合ポリペプチドを発現する発現ベクターｐＣＺＲ２２５の構成
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）にＣ−末端で融合されるｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、相同組換えにより構成する。融合ポリペプチドは、ｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体（配列番号３）に融合される約３８８個のＮ−末端アミノ酸ＭＢＰ部分を含む。ｚｃｙｔｏｒ１１ ｃＤＮＡのフラグメント（配列番号３）を、本明細書に記載のようなＰＣＲを用いて単離する。次の２種のプライマーを、標準のＰＣＲ反応におけるｚｃｙｔｏｒ１１フラグメントの生成に使用する：（１）１つは、約４０ｂｐのベクターフランキング配列及び約２５ｂｐのアミノ末端に対する配列を含み、及び（２）もう１つは、前記フランキングベクター配列に対応する３’末端約４０ｂｐ及びｚｃｙｔｏｒ１１のカルボキシル末端に応答する配列約２５ｂｐを含む。
【０１６２】
１００μｌのＰＣＲ反応物２μｌを、分析するために、１×ＴＢＥ緩衝液中、１．０％アガロースゲル上で試験し、そして予測されるおおよそのフラグメントが見られる。残るＰＣＲ反応物を、第２のＰＣＲ管において組合し、そして無水エタノール４００μｌにより沈殿せしめる。沈殿されたＤＮＡを、下記のようにして、ＳｍａＩ切断された受容体ベクターｐＴＡＰ９８中への組換えのために使用し、ＭＢＰ−ｚｃｙｔｏｒ１１融合体をコードする構造体を生成する。
【０１６３】
プラスミドｐＴＡＰ９８は、プラスミドｐＲＳ３１６及びｐＭＡＬ−ｃ２に由来する。プラスミドｐＲＳ３１６は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シャトルベクターである（Ｈｉｅｔｅｒ Ｐ． ａｎｄ Ｓｉｋｏｒｓｋｉ， Ｒ．， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２： １９−２７， １９８９）。ｐＭＡＬ−Ｃ２ （ＮＥＢ）は、Ｅ．コリ発現プラスミドである。それは、ｔａｃプロモーター駆動ＭａｌＥ（ＭＢＰコードの遺伝子）、続いて、Ｈｉｓ標識、トロンビン切断部位、クローニング部位及びｒｒｎＢターミネーターを担持する。ベクターｐＴＡＰ９８を、酵母相同組換えを用いて構成する。１００ｎｇのＥｃｏＲＩ切断された、ｐＭＡＬ−ｃ２を、１μｇのＰｖｕＩ切断されたｐＲＳ３１６， １μｇのリンカーと共に組合し、そして１μｇのＳｃａＩ／ＥｃｏＲＩ切断されたｐＲＳ３１６を、ＰＣＲ反応において組合す。ＰＣＲ生成物を、１００％エタノール沈殿により濃縮する。
【０１６４】
コンピテント酵母細胞（Ｓ．セレビシアエ）を、約１μｇの上記ｚｃｙｔｏｒ１１受容体ＰＣＲ生成物及び１００ｎｇのＳｍａＩ消化されたｐＴＡＰ９８ベクターを含む混合物数１０μＬと共に組合し、そして標準方法を用いてエレクトロポレートし、そしてＵＲＡ−Ｄプレート上にプレートし、そして３０℃でインキュベートする。
【０１６５】
約４８時間後、単一プレートからＵｒａ＋酵母形質転換体を採取し、ＤＮＡを単離し、そしてエレクトロコンピテントＥ．コリ細胞（例えば、ＭＣ１０６１， Ｃａｓａｄａｂａｎなど．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３８， １７９−２０７）を形質転換し、そして標準方法を用いて、ＭＭ／ＣＡ＋ＡＭＰ １００ｍｇ／ｌプレート（Ｐｒｙｏｒ ａｎｄ Ｌｅｉｔｉｎｇ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｚｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． １０：３０９−３１９， １９９７）上にプレーｔする。細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと共に、ＭＭ／ＣＡにおいて、２時間、３７℃で、振盪しながら増殖する。その培養物１ｍｌを、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘発する。
【０１６６】
２〜４時間後、個々の培養物２５０μｌを、酸により洗浄されたガラスビーズ２５０μ、及び５％βＭＥ及び色素を含むＴｈｏｍｅｒ緩衝液（８Ｍの尿酸、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．０， １０％グリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ，５％ＳＤＳ）２５０μｌと共に混合する。サンプルを１分間、振盪し、そして６５℃に１０分間、加熱する。その２０μｌを、４％〜１２％ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ）上のライン当たりに負荷する。ゲルを、１×ＭＥＳ緩衝液において試験する。陽性クローンを、ｐＣＺＲ２２５と命名し、そして配列決定分析にゆだねる。
【０１６７】
１μｌの配列決定ＤＮＡを用いて、ＢＬ２１株を形質転換する。細胞を、２．０ｋＶ， ２５μＦ及び４００オームで電気パルスする。エレクトロポレーションに続いて、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＭＭ／ＣＡ溶液０．６ｍｌ上にプレートする。細胞を、ＭＭ／ＣＡにおいて増殖し、そして上記のようにして、ＩＰＴＧにより誘発する。陽性クローンを用いて、ｈｕｚｃｙｔｏｒ１１／ＭＢＰ−６Ｈ融合タンパク質のタンパク質精製のために、標準技法により増殖する。
【０１６８】
例４．ｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を、精製されたｈｕｚｃｙｔｏｒ１１／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチド（例３）、又は精製された組換えｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体（例１）により、雌Ｎｅｗ ｚｅａｌａｎｄ 白色ウサギを免疫化することによって、調製する。ウサギは、完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）中、精製されたタンパク質２００ｍｇの初期腹腔内（ＩＰ）注射、続いて、不完全フロイトアジュバント中、精製されたタンパク質１００ｍｇの追加免疫ＩＰ注射を、３週ごとに与えられる。第３の追加免疫注射の投与後７〜１０日で、動物は放血され、そして血清が集められる。次に、ウサギを、追加免疫し、そして３週ごとに放血する。
【０１６９】
ｚｃｙｔｏｒ１１−特異的ポリクローナル抗体を、ＣＮＢｒ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ １ｇ当たり約１０ｍｇの精製されたｈｕｚｃｙｔｏｒ１１／ＭＢＰ−６Ｈポリペプチドを用いて調製されるＣＮＢｒ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ４Ｂタンパク質カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）を用いて、ウサギ血清から親和性精製し、続いて、ＰＢＳにおける２０倍の透析を一晩、行う。ｚｃｙｔｏｒ１１−特異的抗体を、抗体標的物として適切な１ｍｇ／ｍｌのタンパク質抗原を用いてのＥＬＩＳＡ力価調査により特徴づけるウサギ抗−ｚｃｙｔｏｒ１１親和性精製された抗体の検出の下限（ＬＬＤ）を、標準方法を用いて決定する。
【０１７０】
例５．ｚｃｙｔｏｒ１１受容体モノクローナル体
ｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体モノクローナル抗体を、本明細書に記載される精製された組換え可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１タンパク質により、雄ＢａｌｂＣマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を免疫化することによって、調製する。マウスは、完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）中、精製されたタンパク質２０ｍｇの初期腹腔内（ＩＰ）注射、続いて、不完全フロイトアジュバント中、精製されたタンパク質１０ｍｇの追加免疫ＩＰ注射を、２週ごとに与えられる。第３の追加免疫注射の投与後７〜１０日で、動物は放血され、そして血清が集められ、そして抗体力化を評価する。
【０１７１】
脾臓細胞を、高い力価のマウスから収穫し、そして４：１の融合比の脾臓細胞：骨髄腫細胞を用いての２つの別々の融合方法において、ＰＥＧ １５００ （Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ＵＫ） を用いて、ネズミＳＰ２／０骨髄腫細胞に融合する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。融合の後、１０日間の増殖に続いて、特定の抗体−生成ハイブリドマーを、抗体標的物として、精製された組換えｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体タンパク質（例６Ｃ）を用いて、ＥＬＩＳＡにより、そして抗体標的物として、ｚｃｙｔｏｒ１１配列を発現するＢａ Ｆ３細胞（例８）を用いて、ＦＡＣＳにより同定する。両方法によるその得られる陽性ハイブリドマーを、限界希釈法により３度クローン化する。
【０１７２】
例６．ＯＲＩＧＥＮアッセイを用いてのｚｃｙｔｏｒ１１受容体へテロダイマー化の評価
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体ｚｃｙｔｏｒ１１ ＣＦＬＡＧ （例１１）、又はｇｐ１３０ （Ｈｉｂｉ， Ｍ． など．， Ｃｅｌｌ６３： １１４９−１１５７， １９９０） を、５倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｃｅ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）との反応により、製造業者のプロトコールに従って、ビオチニル化する。可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体及び他の可溶性受容体サブユニット、例えば可溶性ＩＬ−１０ Ｒ（ｓＩＬ−１０ Ｒ）又はＣＲＦ２−４受容体（ＣＲＦ２−４）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、又は可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体（アメリカ特許出願第５，９６５，７０４号）を、５倍モル過剰のＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＳ（Ｉｇｅｎ、Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）により、製造業者のプロトコールに従って、ラベルする。
【０１７３】
可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体のビオチニル化され、そしてＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＰ−ラベルされた形は、それぞれＢｉｏ−ｚｃｙｔｏｒ１１受容体及びＲｕ−ｚｃｙｔｏｒ１１と命名され；他の可溶性受容体サブユニットのビオチニル化され、そしてＲｕ−ＢＰＹ−ＮＨＳ−ラベルされた形も同様に命名され得る。アッセイを、ｚｃｙｔｏｒ１１へテロダイマー受容体を結合するリガンド、例えばＩＬ−ＴＩＦを発現する細胞からのならし培地を用いて、又は精製されたＩＬ−ＴＩＦを用いて行うことができる。
【０１７４】
初期受容体結合特徴化のために、一連サイトカイン又はならし培地を、それらがｚｃｙｔｏｒ１１受容体ホモダイマー化を介在することができるかどうか、及びそれらが上記の可溶性サブユニットｚｃｙｔｏｒ１１受容体へのヘテロダイマー化を介在できるかどうかを決定するために試験する。これを行うために、５０μｌのならし培地又はＴＢＳ−Ｂ含有の精製されたサイトカインを、例えば４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ−ｚｃｙｔｏｒ１１受容体及びＢｉｏ−ｚｃｙｔｏｒ１１、又は４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ−ｚｃｙｔｏｒ１１受容体及びＢｉｏ−ｇｐ１３０、又は４００ｎｇ／ｍｌのＲｕ−ＣＲＦ２−４及びＢｉｏ−ｚｃｙｔｏｒ１１を含むＴＢＳ−Ｂ（２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．２）５０μｌと組合す。
【０１７５】
室温での１時間のインキュベーションに続いて、３０μｇのストレプタビジン被覆された、２．８ｍｍの磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ， Ｉｎｃ．， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）を添加し、そしてその反応を、室温でさらに１時間インキュベートする。次に、２００μｌのＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝液（Ｉｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を添加し、そして受容体会合の程度を、Ｍ８　ＯＲＩＧＥＮ分析機（Ｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて測定する。
【０１７６】
例７．ｚｃｙｔｏｒ１１受容体ヘテロダイマーを生成するための構造体
分泌されたヒトｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマーを発現するベクターを構成した。この構造体においては、ｚｃｙｔｏｒ１１の細胞外サイトカイン−結合ドメインを、そのＣ−末端でＧｌｕ−Ｇｌｕ標識を有するＩｇＧγ１ｐＨ鎖（配列番号４）に融合し、そしてヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニット（例えば、ＣＲＦ２−４， ＩＬ−９， ＩＬ−１０ ＩＬ−４受容体成分）の細胞外部分を、そのＣ−末端でＨｉｓ標識を有するＩｇＧγ１のＨ鎖に融合した。
【０１７７】
Ａ．ＩｇＧγ１ ６−Ｈｉｓ及びＩｇＧγ１ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ融合ベクターの構成
６−Ｈｉｓ　Ｃ−末端標識を有するＩｇＧγ１のＨ鎖（配列番号１３）を、ｐＺＰ−９哺乳発現ベクター（ＡＴＣＣ寄託番号９８６６８号）中にクローン化し、その結果、５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＢａｍＨＩ部位を有するいずれかの所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインをクローン化でき、Ｎ−末端細胞外ドメイン−Ｃ−末端ＩｇＧγ１融合体をもたらすことができる。この構造体に使用されるＩｇＧγ１フラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ２９，２３９（配列番号１４）及びＺＣ２９，２３２（配列番号１５）を用いて、ＩｇＧγ１配列を単離するために、ＰＣＲを用いることにより製造する。ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて、精製し、そしてＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、そしてゲル精製した。
【０１７８】
ＣＲＦ２−４（配列番号１８）の細胞外部分を、オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ３９，３１９（配列番号１６）及びＺＣ３９，３２５（配列番号１７）を用いて、ＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、そして続いて、ゲル精製した。上記由来のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ ＩｇＧγフラグメント及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ ＣＲＦ２−４フラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより前もって消化されたｐＺＰ−９中に連結し、Ｃ−末端で６−ＨＩＳ標識を有するＩｇＧγ１に融合されたＣＲＦ２−４細胞外サイトカイン結合ドメインの細胞外部分を有する構造体を誘導した。
【０１７９】
続いて、この構造体を修飾し、ＣＲＦ２−４の３’側及び６−ＨＩＳ標識の５’側にトロンビン切断部位を導入した。これは、オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ３８，９８１（配列番号２０）及びＺＣ３９，０４２（配列番号２１）と共に、ＰＣＲにおける鋳型として上記構造体を用いることによって行われた。ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩにより消化した。このＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩにより前もって消化された、上記構造体中に連結した。６−ＨＩＳ標識を有するＩｇＧγに融合されたＣＲＦ２−４細胞外サイトカイン結合ドメインのポリヌクレオチド配列は、配列番号２２に示され、そしてその対応するポリペプチド配列は配列番号２３に示される。
【０１８０】
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ Ｃ−末端標識（配列番号４）を有するＩｇＧγ１のＨ鎖を、５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＢａｍＨＩ部位を有するいずれかの所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインがクローン化され、Ｎ−末端サイトカイン細胞外ドメイン−Ｃ−末端ＩｇＧγ１融合が得られるよう、Ｚｅｍ２２８Ｒ哺乳類発現ベクター（ＡＴＣＣ寄託番号６９４４６号）中にクローン化した。この構造体に使用されるＩｇＧγ１フラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ２９，２３８（配列番号２４）及びＺＣ２９，２３１（配列番号２５）を用いてＩｇＧγ１配列を単離するために、ＰＣＲを用いることによって製造した。ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、そして続いてゲル精製した。
【０１８１】
ｈｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号１）の細胞外部分を、オリゴヌクレオチドＺＣ３９，３３５（配列番号２６）及びＺＣ２８，９８１（配列番号２７）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、そして続いて、ゲル精製した。次に、上記のように誘導されたＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ ＩｇＧγＩフラグメント及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ　ｈｚｃｙｔｏｒ１１フラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより前もって消化されたＺｅｍ２２８Ｒ中に連結し、Ｃ−末端でＧｌｕ−Ｇｌｕエピトープ標識を有するＩｇＧγ１に融合されたｈｚｃｙｔｏｒ１１の細胞外ドメインを有する構造体を誘導した。
【０１８２】
続いて、この構造体を修飾し、ＣＲＦ２−４の３’側及び６−ＨＩＳ標識の５’側にトロンビン切断部位を導入した。これは、オリゴヌクレオチドプライマーＺＣ３８，９８１（配列番号２７）及びＺＣ３９，０４３（配列番号２８）と共に、ＰＣＲにおける鋳型として上記構造体を用いることによって行われた。ＰＣＲ生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩにより消化した。このＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＳａｃＩＩ及びＸｈｏＩにより前もって消化された、上記構造体中に連結した。６−ＨＩＳ標識を有するＩｇＧγに融合されたＣＲＦ２−４細胞外サイトカイン結合ドメインのポリヌクレオチド配列は、配列番号２９に示され、そしてその対応するポリペプチド配列は配列番号３０に示される。
【０１８３】
Ｂ．ｚｃｙｔｏｒ１１及びヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニット細胞外ドメインの同時−発現
約１６μｇの個々の上記ベクターを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓＴＭ 試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、製造業者の説明書に従って、哺乳類細胞、例えばＢＨＫ−５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）中に同時トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、１μＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）及び０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）において、１０日間、選択する。得られるトランスフェクタントのプールを、１０μｍのＭＴＸ及び０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８において再び選択する。
【０１８４】
得られる二重選択された細胞のプールを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４可溶性受容体タンパク質を生成する。このプールの３種の画分（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、血清フリーのならし培地１０Ｌを生成する。このならし培地を、ニッケルカラム、続いてＧｌｕ−Ｇｌｕカラム上に通し、そしてホモダイマーからヘテロだ合間−を精製した。
【０１８５】
例８．ｚｃｙｔｏｒ１１受容体とヘテロダイマー化又は多重化する受容体サブユニットの決定
本明細書に記載される標準の方法を用いて、追加のヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニットによりトランスフェクトされたＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１１キメラ細胞は、ＴＰＯの存在下でルシフェラーゼレポーターへのヘテロダイマーｚｃｙｔｏｒ１１受容体複合体のシグナルトランスダクション応答を測定するために、バイオアッセイ細胞系として作用する。
【０１８６】
ＴＰＯの存在下で、ＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１１細胞はシグナル化せず、このことは、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体がシグナルにヘテロダイマー化すべきであることを示唆する。ＴＰＯリガンドの存在下でシグナル化する追加のＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体融合体によるＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１１細胞トランスフェクションは、ヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニットがｚｃｙｔｏｒ１１受容体シグナル化のために必要とされることを決定する。この目的のためへのＭＰＬ−受容体融合体の使用は、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体のための天然のリガンドの存在についての必要性を緩和する。
【０１８７】
ＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体融合体を、ＭＰＬ受容体の細胞外ドメイン及びトランスメンブランドメイン、及び所望するクラスＩサイトカイン受容体の細胞内シグナルドメインを用いて、例５に従って製造する。ＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１１バイオアッセイ細胞系を、例６におけるようにして、個々のＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体融合体により同時トランスフェクトし、ＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１１／ＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体細胞系を形成する。受容体複合体は、１又は複数のＣＲＦ２−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１０ＩＬ−４受容体成分を含んで成るＭＰＬ−サイトカイン受容体融合体と組合してのｚｃｙｔｏｒ１１受容体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。次に、個々の独立した受容体複合体細胞系を、ＴＰＯ（例６）の存在下でアッセイし、そして増殖性を、通常の方法（例えば、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイ）を用いて測定する。
【０１８８】
ＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１１バイオアッセイ細胞系は、バックグラウンドルシフェラーゼ活性についての対照として作用し、そして従って、種々の受容体複合体組み合わせによりシグナル化を比較するための基線として使用される。さらに、ＢａＦ３／ＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体細胞系を構成し、ホモダイマー化に基づいてシグナル化することが知られているそれらのクラスＩサイトカイン受容体についてのＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体ホモダイマー化効果を制御することができる。正しい受容体複合体の存在下でのＴＰＯは、ＴＰＯの存在下で、バックグラウンドより約５倍又はそれ以上、ＢａＦ３／ＭＰＬ−ｚｃｙｔｏｒ１１／ＭＰＬ−クラスＩサイトカイン受容体細胞系の増殖を高めることが予測される。
【０１８９】
類似する増殖アッセイは、ヘテロダイマー及びマルチマー複合体を表示する追加の非−ｚｃｙｔｏｒ１１サブユニットについてスクリーンするために十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号２）を使用する。十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号２）を発現する細胞を、非−ｚｃｙｔｏｒ１１サブユニットによりトランスフェクトし、そしてＩＬ−ＴＩＦリガンドの存在下で増幅についてアッセイする。Ｚｃｙｔｏｒ１１ヘテロダイマー及びマルチマー受容体の成分を発現する細胞は、ＩＬ−ＴＩＦの存在下で増殖するべきである。
【０１９０】
例９．インビトロでのｚｃｙｔｏｒ１１受容体の再構成
ｚｃｙｔｏｒ１１−シグナル化複合体に包含される成分を同定するために、受容体再構成の研究を、次の通りにして行う。ルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクタープラスミドにより、本明細書に記載される標準方法を用いて、トランスフェクトされたＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）は、ＩＬ−ＴＩＦの存在下でルシフェラーゼレポーターに対する、トランスフェクトされたｚｃｙｔｏｒ１１受容体複合体からのシグナルトランスダクション応答を測定するために、バイオアッセイ細胞系として作用する。ＢＨＫ細胞は、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体を内因的に発現しない。
【０１９１】
典型的なルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクターは、次の４種の遺伝子からのＳＴＡＴ転写因子結合要素を含む相補的オリゴヌクレオチドにより構成されたＫＺ１３４プラスミドである：修飾されたｃ−ｆｏｓ Ｓｉｓ誘発性要素（ｍ６７ＳＩＥ又はｈＳＩＥ）（Ｓａｄｏｗｓｋｉ， Ｈ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： １７３９−１７４４， １９９３）、 ｐ２１ ＷＡＦ１遺伝子からのｐ２１ ＳＩＥ１（Ｃｈｉｎ，Ｙ． など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２： ７１９−７２２， １９９６）、β−カゼイン遺伝子の乳腺応答要素（Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｎｅｙ， Ｍ． など．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１： ３７４５−３７５５， １９９１）、及びＦｃｇ ＲＩ遺伝子のＳＴＡＴ誘発性要素（Ｓｅｉｄｅｌ，Ｈ． など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２： ３０４１−３０４５， １９９５）。
【０１９２】
それらのオリゴヌクレオチドは、Ａｓｐ７１８−ＸｈｏＩ適合性末端を含み、そして同じ酵素により消化されたｃ−ｆｏｓプロモーター（Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｌ．Ｋ． など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ６２２９−６２３２， １９９８）を有し、そしてネオマイシン選択マーカーを含む受容体ホタルルシフェラーゼレポーターベクター中に、標準の方法を用いて連結された。ＫＺ１３４プラスミドを用いて、ＢＨＫ又はＢａＦ３細胞を標準のトランスフェクション及び選択方法により安定してトランスフェクトし、それぞれ、ＢＨＫ／ＫＺ１３４又はＢａＦ３／ＫＺ１３４細胞系を製造する。
【０１９３】
バイオアッセイ細胞を、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体のみによりトランスフェクトし、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体及び種々の他の既知受容体サブユニットの１つにより同時にトランスフェクトする。受容体複合体は、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体のみ、１又は複数のＣＲＦ２−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１０ ＩＬ−４受容体成分、クラスＩＩサイトカイン受容体サビユニット、又はＩＬ−２受容体成分（ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ）を有するｚｃｙｔｏｒ１１受容体、１又は複数のＩＬ−４／ＩＬ−１３受容体ファミリー受容体成分（ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα’）を有するｚｃｙｔｏｒ１１受容体、及び他のインターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＩＬ−２１Ｒ（Ｚａｌｐｈａ １１受容体））と、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体との種々の組み合わせを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１９４】
次に、個々の独立した受容体複合体細胞系を、サイトカイン−ならし培地又は精製されたサイトカインの存在下でアッセイし、そしてルシフェラーゼ活性を通常の方法を用いて測定する。トランスフェクトされていないバイオアッセイ細胞系は、バックグランドルシフェラーゼ活性のための対照として作用し、そして従って、種々の受容体複合体組み合わせによるシグナルを比較するための基線として使用される。正しい受容体複合体の存在下でｚｃｙｔｏｒ１１受容体を結合するならし培地又はサイトカインは、バックグラウンドよりも約５倍又はそれ以上のルシフェラーゼ読み取りを付与することが予測される。
他方では、ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１１−ｍｐｌ及びＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞系が上記のように同時−トランスフェクトされ、そして増殖が測定される類似するアッセイを行うことができる。
【０１９５】
例１０．ＣＥＥ−標識されたＩＬ−ＴＩＦを生成するための構造体
オリゴヌクレオチドを、Ｋｏｚａｋ配列及びＩＬ−ＴＩＦのためのコード領域を含むが、その停止コドンを有さないＰＣＲフラグメントを生成するために企画した。それらのオリゴヌクレオチドを、５’末端でＫｐｎＩ部位及び３’末端でＢａｎＨＩ部位を有するよう企画し、Ｃ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識された（配列番号４）タンパク質の哺乳類発現のための本発明の標準ベクターのｐＨＺ２００−ＣＥＥ中へのクローニングを促進した。ｐＨＺ２００ベクターはＭＴ−１プロモーターを含む。
【０１９６】
ＰＣＲ反応を、ＩＬ−ＴＩＦ ｃＤＮＡフラグメントを増幅するために、Ｔｕｒｂｏ Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。約２０ｎｇのヒトＩＬ−ＴＩＦポリヌクレオチド鋳型（配列番号７）、及びオリゴヌクレオチドＺＣ２８，５９０（配列番号９）及びＺＣ２８，５８０（配列番号１０）を、ＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応条件は次の通りであった：９０℃で６０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で６０秒（３０サイクル）；及び７２℃で１０分；続いて４℃での維持。ＰＣＲ生成物を、アガロース電気泳動により分離し、そしてＱｉａＱｕｉｃｋＴＭ （Ｑｉａｇｅｎ） ゲル抽出キットを用いて精製した。単離された約６００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により消化し、上記のようにしてゲル精製し、そしてＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにより前もって消化されたｐＨＺ２００−ＣＥＥ中に連結した。
【０１９７】
約１μｌの連結反応物を、ＤＨ１０Ｂ ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＴＭ コンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中に、製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートし、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートした。コロニーを採取し、そして上記のようなＰＣＲ条件と共に、オリゴヌクレオチドＺＣ２８，５９０（配列番号９）及びＺＣ２８，５８０（配列番号１０）を用いて、ＰＣＲによりスクリーンした。次に、挿入体を含むクローンを配列決定し、誤りのないＩＬ−ＴＩＦ挿入体を確認した。配列分析により確かめられるような正しいｐＨＺ２００−ＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥ構造体のＭａｘｉｐｒｅｐｓを行った。
【０１９８】
例１１．ＩＬ−ＴＩＦポリペプチドのトランスフェクション及び発現
ＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１０３１４）を、８００μｌの血清フリー（ＳＦ）ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ， Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）において、約１．２×１０６個の細胞／ウェル（６−ウェルプレート）でプレートした。細胞を、血清フリー（ＳＦ）ＤＭＥＭ中、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ） を用いて、製造業者の説明書に従って、上記（例１０）ＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥ包含発現プラスミドによりトランスフェクトした。
【０１９９】
細胞を、３７℃で約５時間インキュベートし、次に、３０ｍｌのＤＭＥＭ／５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）の最終体積で１５０ｍｍのＭＡＸＩプレートを分離するために移した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートし、そしてＤＮＡ：ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ 混合物を、選択培地（５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ及び１μＭのメトトレキセート（ＭＴＸ））により次の日、置換した。
【０２００】
トランスフェクションの約１０〜１２日後、コロニーを、５μＭのＭＴＸを有する５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ １ｍｌを含む１２−ウェルプレートに機械的に採取し、次に、集密性まで増殖した。次に、陽性の発現クローンコロニーのならし培地サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターン分析により、発現レベルについて試験した。高い発現性のクローンを採取し、そして前記細胞により発現されるＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥの精製についてのならし培地のアンプル生成のために拡張した（例１２）。
【０２０１】
例１２．ＢＨＫ５７０細胞からのＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥポリペプチドの精製
特にことわらない限り、すべての操作は４℃で行われた。次の方法を、Ｃ−末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＥ）標識（配列番号４）を含むＩＬ−ＴＩＦポリペプチドを精製するために使用した。ＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥ（例１１）を発現するＢＨＫ細胞からのならし培地を、ＰｒｏＦｌｕｘ Ａ３０上でＡｍｉｃｏｎ Ｓ１０Ｙ３スパイラル遠心分離機により濃縮した。プロテアーゼインヒビター溶液を、前記濃縮されたならし培地に添加し、２．５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、０．００３ｍＭのロイペプチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）、０．００１ｍＭのペプスタチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び０．４ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の最終濃度にした。サンプルを分析のために除去し、そして多量の体積を、精製を開始するまで、−８０℃で凍結した。濃縮されたならし培地の合計の標的物タンパク質濃度を、抗−ＥＥ ＨＲＰ接合された抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンブロット分析により決定した。
【０２０２】
約１００ｍｌカラムの抗−ＥＥ Ｇ−Ｓｅｐｈｒｏｓｅ（下記のように調製された）を、Ｗａｔｅｒｓ ＡＰ−５， ５ｃｍ×１０ｃｍガラスカラムに充填した。カラムを流動充填し、そしてリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）により、ＢｉｏＣａｄ Ｓｐｒｉｎｔ （ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ） 上で平衡化した。濃縮されたならし培地を融解し、０．２ミクロンの無菌膜を通して濾過し、ｐＨを７．４に調節し、次に、約１ｍｌ／分の流速で一晩カラム上に負荷した。カラムを、１０カラム体積（ＣＶ）のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ， ｐＨ７．４ ）により洗浄し、次に、５ｍｌ／分で、０．５ｍｇ／ｍｌのＥＥペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ） を含むＰＢＳ（ｐＨ６．０）２００ｍｌによりプラグ溶出した。
【０２０３】
使用されるＥＥペプチドは、配列ＥＹＭＰＭＥ（配列番号４）を有する。カラムを１０ＣＶのＰＢＳにより洗浄し、次に、５ＣＶの０．２Ｍグリシン（ｐＨ３．０）により溶出した。グリシン溶出されたカラムのｐＨを、２ＣＶの５×ＰＢＳにより７．０に調節し、次にＰＢＳ（ｐＨ２４）により平衡化した。５ｍｌの画分を、全溶出クロマトグラフィーにおいて集め、そして２８０及び２１５ｎＭでの吸光度をモニターし；通過及び洗浄プールをまた、保存し、そして分析した。ＥＥ−ポリペプチド溶出ピーク画分を、抗−ＥＥ ＨＲＰ接合抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色及びウェスターンブロットを通して標的タンパク質について分析した。興味あるポリペプチド溶出画分をプールし、そして１０，０００ドルトン分子量カットオフ膜回転濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を用いて、その製造業者の説明書に従って、６０ｍｌから５．０ｍｌに濃縮した。
【０２０４】
他の同時精製タンパク質からＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥを分離するために、前記濃縮されたポリペプチド溶出のプールされた画分を、ｐＨ８．０で、ＰＯＲＯＳ ＨＱ−５０ （ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡからの強アニオン交換樹脂） にゆだねた。１．０×６．０ｃｍのカラムを充填し、そしてＢｉｏＣａｄ Ｓｐｒｉｎｔ上に流動充填した。カラムを、対向イオンに荷電しし、次に２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））により平衡化した。
【０２０５】
サンプルを、１：１３に希釈し（ＰＢＳのイオン強度を低めるために）、次に５ｍｌ／分でＰｏｒｏｓ ＨＱカラム上に充填した。カラムを、１０ＣＶの２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）により洗浄し、次に、４０ＣＶグラジエントの２０ｍＭのトリス／１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）により１０ｍｌ／分で溶出した。１．５ｍｌの画分を、全クロマトグラフィー上で集め、そして２８０及び２１５ｎＭでの吸光度をモニターした。溶出ピーク画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色により分析した。興味ある画分をプールし、そして１０，０００ドルトン分子カットオフ膜回転濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を用いて、製造業者の説明に従って、１．５〜２ｍｌに濃縮した。
【０２０６】
遊離ＥＥペプチド及びいずれかの汚染性同時精製タンパク質からＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥポリペプチドを分離するために、プールされた濃縮画分を、ＰＢＳにより平衡化し、そしてＢｉｏＣａｄ Ｓｐｒｉｎｔを用いて、１．０ｍｌ／分の流速で充填される、１．５×９０ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｓ２００ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ） カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー処理にゆだねた。１．５ｍｌの画分を、全クロマトグラフィーを通して集め、そして２８０及び２１５ｎＭでの吸光度をモニターした。ピーク画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色により特徴づけ、そして最も純粋な画分のみをプールした。この材料は、精製されたＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥポリペプチドを提供した。
【０２０７】
この精製された材料を、最終的に、４ｍｌのＡｃｔｉＣｌｅａｎ Ｅｔｏｘ （Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ） カラムにゆだね、いずれかの存存する内毒素を除去した。サンプルを、ＰＢＳにより平衡化された重力カラム上に４度、通し、次にカラムを１回の３ｍｌ体積のＰＢＳにより洗浄し、これを“清浄された”サンプルとしてプールした。次に、その材料を、０．２ミクロンの無菌膜を通して濾過し、そしてそれを等分するまで、−８０℃で貯蔵した。
ウェスターンブロットされた、クーマシーブルー及び銀色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、ＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥポリペプチドは、１つの主要バンドであった。精製された材料のタンパク質濃度を、ＢＣＡ分析（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）により行い、そしてタンパク質を等分し、そして標準の方法に従って、−８０℃で貯蔵した。
【０２０８】
抗−ＥＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを調製するために、１００ｍｌの層体積のプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を、５００ｍｌのＮａｌｇｅｎｅ ０．４５ミクロンフィルターユニットを用いて、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ１００ｍｌにより３度、洗浄した。ゲルを、６．０体積の２００ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．２）（ＴＥＡ， Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）により洗浄し、そして９００ｍｇの抗体を含む、等体積のＥＥ抗体溶液を添加した。４℃での一晩のインキュベーションの後、結合されなかった抗体を、上記のように、５体積の２００ｍＭのＴＥＡにより樹脂を洗浄することによって除去した。
【０２０９】
樹脂を２体積のＴＥＡに再懸濁し、適切な容器に移し、そしてＴＥＡに溶解されたジメチルピリミデート−２ＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルに添加し、３６ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。ゲルを室温で４５分間、揺り動かし、そして液体を、上記のようにしてフィルターユニットを用いて除去した。次に、ゲル上の非特異的部位を、２００ｍＭのＴＥＡ中、５体積の２０ｍＭのエタノールアミンと共に室温で１０分間インキュベートすることによってブロックした。次に、ゲルを、０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ５体積により洗浄し、そしてこの溶液において４℃で貯蔵した。
【０２１０】
例１３．ＩＬ−ＴＩＦポリペプチドのインビボ効果
マウス（雌、Ｃ５７Ｂ１、生後８週；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， ＮＹ）を、３種のグループに分けた。ＩＬ−ＴＩＦポリペプチド（配列番号８）を発現するアデノウィルスを、標準方法を用いて前もって製造した。日０で、親又はＩＬ−ＴＩＦアデノウィルスを、第１グループ（ｎ＝８）及び第２グループ（ｎ＝８）にそれぞれ、尾の静脈を通して投与し、そして個々のマウスは、約０．１ｍｌの体積中、約１×１０１１の粒子の用量を受けた。第３グループ（ｎ＝８）は、処理を受けなかった。日１２で、マウスを計量し、そして血液をマウスから採血した。サンプルを、完全な血液計数（ＣＢＣ）及び血清化学について分析した。
【０２１１】
好中球及び血小板計数の統計学的に有意な上昇が、親アデノウィルス処理グループに対して、ＩＬ−ＴＩＦアデノウィルス投与されたグループからの血液サンプルにおいて検出された。また、リンパ球及び赤血球細胞計数が、親アデノウィルス処理のグループに対して、ＩＬ−ＴＩＦアデノウィルス投与されたグループから有意に低められた。さらに、ＩＬ−ＴＩＦアデノウィルス処理されたマウスは、体重が低下し、ところが親アデノウィルス処理されたマウスは体重が増加した。ＳＡＡ及びグロブリンレベルが高められ、そしてグルコースレベルが低められた。アデノ−ｚｃｙｔｏ１８マウスは、るいそう症候群を表した。要約すると、ｚｃｙｔｏ１８は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びｇｐ１３０サイトカインの前炎症活性に影響を及ぼす急性相応答（ＡＰＲ）を引き起こす。
【０２１２】
その結果は、ＩＬ−ＴＩＦがインビボで免疫及び炎症応答に関与する前炎症因子であることを示唆した。ＩＬ−ＴＩＦ受容体（ｚｃｙｔｏｒ１１）の組織分布は、ＩＬ−ＴＩＦの循環又は特定の組織における高められた発現が、一定の急性／慢性炎症疾患、例えば膵炎、ＩＢＤ（クローン病、大腸塩）、ぜん息、ＥＳＲＤ（最終段階腎臓疾患）、リウマチ様関節炎、乾癬及び自己免疫疾患（ＧＶＨＤ、狼痕、敗血症）を導くことができることを示した。
【０２１３】
前記結果は、ＩＬ−ＴＩＦが造血、すなわちインビボでの血液細胞形成に影響を及ぼすことを示した。ＩＬ−ＴＩＦ自体は、異なった血液幹細胞に影響を及ぼす生物学的活性を有し、従って、特定の系統において一定の分化された血液細胞の上昇又は低下をもたらす。例えば、ＩＬ−ＴＩＦは、リンパ球を低めると思われ、これはたぶん、リンパ細胞を高める傾倒した前駆体の阻害のためである。この発見は、骨髄球性幹細胞の増殖及び／又は成長に対するＩＬ−ＴＩＦの阻害効果と一致し（例１３）、これは、ＩＬ−ＴＩＦが、それらの工程に関与する血液細胞に影響を及ぼすことによって、貧血、感染、炎症及び／又は免疫疾患において役割を演じることができる概念を支持する。ＩＬ−ＴＩＦに対するアンタゴニスト、例えば本発明の抗体又はｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体は、それらの疾病における治療剤として使用され得る。
【０２１４】
さらに、マウスにおけるＩＬ−ＴＩＦアデノウィルスを用いるそれらの実験は、ＩＬ−ＴＩＦの過剰発現がインビボで好中球及び血小板のレベルを高めることを示唆する。完全な動物システムにおいてＩＬ−ＴＩＦに対する応答に関与する他の因子（例えば、サイトカイン及びモディファイアー遺伝子）が存在すると思われる。それにもかかわらず、ＩＬ−ＴＩＦ及びその受容体は、種々の障害、例えば炎症、免疫障害、感染、貧血、造血及び他の癌及び同様のものの診断及び処理のための適切な試薬／標的物である。
【０２１５】
例１４．現場ハイブリダイゼーションを用いてのｚｃｙｔｏｒ１１を発現する細胞の同定
特にヒト組織を単離し、そして現場ハイブリダイゼーションによりｚｃｙｔｏｒ発現についてスクリーンした。虫垂、脳、軟骨、結腸、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、皮膚、脾臓及び胸腺に関する種々のヒト組織を調製し、断片化し、そして現場ハイブリダイゼーションにゆだねた。組織を、標準方法を用いて、１０％の緩衝化されたホルマリンに固定し、そしてパラフィンにおいてブロックした。
【０２１６】
組織を、４〜８ミクロンに断片化した。組織を、標準のプロトコール（”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” ａｔ Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ （ＬＥＰ）， ＮＩＥＨＳ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， ＮＣ； Ｗｅｂアドレスｈｔｔｐ：／／ｄｉｒ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｒｌｅｐ／ｉｓｈ．ｈｔｍｌ）を用いて調製した。手短には、組織断片を、ＨｉｓｔｏＣｌｅａｒ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ） により脱パラフィン化し、そして次に、エタノールにより脱水した。次に、それらを、３７℃で２〜７分間、プロティナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）により消化した。この段階に続いて、組織をアセチル化し、そして脱水した。
【０２１７】
１つの現場プローブを、ヒトｚｃｙｔｏｒ１１配列（配列番号１におけるヌクレオチド２３４−１１０５）に対して企画し、そして標準方法を用いて、配列番号１を含むプラスミドから単離した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、アンチセンスプローブを生成した。そのプローブを、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） を用いて、ジゴキシゲニン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により、製造業者の説明書に従ってラベルした。
【０２１８】
現場ハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニンによりラベルされたｚｃｙｔｏｒ１１プローブ（上記）により行った。プローブを、６０℃で１２〜１６時間、１〜５ｐモル／ｍｌの濃度でスライドに付加した。続いて、スライドを、２×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣにより５５℃で洗浄した。シグナルを、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）（ＴＳＡ、現場間接的キット；ＮＥＮ）を用いて増幅し、そしてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）により、その製造業者の説明書に従って可視化した。次に、スライドを、ヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）により対比染色した。
【０２１９】
シグナルを、試験されるいくつかの組織において観察した：小節の副皮質における細胞を含むリンパ節が強い陽性であった。リンパ腫サンプルにおいては、試験されるサンプルにはシグナルはほとんどか又はまったく存在しない。脾臓においては、陽性シグナルが、小胞の末梢で拡散された単核細胞に見出された。胸腺においては、陽性のシグナルが、皮質及び骨髄の両者において拡散された単核細胞において見出された。胎児肝臓においては、強いシグナルが、洞様空間において、単核細胞の混合された集団において観察された。いくつかの循環単核細胞はまた、陽性であった。肝細胞は陰性であった。
【０２２０】
炎症性虫垂においては、Ｐｅｙｅｒパッチ及び炎症部位における単核細胞が陽性であった。腸においては、層状プロプリア（ｐｒｏｐｒｉａ）及びＰｅｙｅｒパッチにおける細胞が強い陽性であった。筋肉における神経節細胞は陽性であった。正常な肺においては、ｚｃｙｔｏｒ１１が、肺胞上皮、及び間隙組織及び循環における単核細胞において発現された。肺癌組織においては、弱いシグナルが、癌細胞、及び癌部位の末梢における単核細胞において観察された。卵巣癌においては、上皮細胞は強い陽性であった。いくつかの間隙細胞、たぶん単核細胞もまた陽性であった。正常な卵巣においては、シグナルは観察されなかった。腎臓においては、腎小体におけるボーマン被膜の壁側層における有定突起及び単純上皮細胞は陽性であった。
【０２２１】
遠位渦巻管の立方骨上皮細胞もまた陽性であった。正常及び膵炎の膵臓サンプルにおいては、線房細胞、及び腸間膜におけるいくつかの単核細胞が陽性であった。膵臓のランゲルハンス島における細胞に弱いシグナルがまた存在する。初期（８週）胎盤において、シグナルが栄養膜に観察された。皮膚においては、強いシグナルが、ケラチノサイト、及び表皮における炎症浸潤物における単核細胞に観察された。脳においては、側頭葉における大部分のニューロンは陽性であったが、前頭葉は陰性のように思える。関節軟骨においては、軟骨細胞は陽性であった。試験された他の組織、例えば正常卵巣、皮膚メラノーマ、前立腺癌及びＢＰＨは陰性であった。
【０２２２】
要約すると、現場データは、ｚｃｙｔｏｒ１１についての上記の発現データと一致した。ｚｃｙｔｏｒ１１発現は、単核細胞の混合された集団において主として観察され、そしてそこにおいて一定して発現された。上皮はまた陽性であった。それらの結果は、ヒト細胞におけるｚｃｙｔｏｒ１１発現の存在、及び炎症、自己免疫疾患、又は他の免疫機能における、例えばプロ−炎症サイトカイン、例えばＩＬ−ＩＬＦ（但し、それだけには限定されない）の結合における役割点を確証した。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１１発現の検出は、例えば組織学的サンプルにおける単核細胞のためのマーカーとして使用され得る。
【０２２３】
ｚｃｙｔｏｒ１１は、単核細胞、例えば正常組織（リンパ節、脾臓、胸腺、膵臓、腎臓、肝臓及び肺）、及び異常組織（炎症虫垂、肺癌、卵巣癌、膵炎、炎症性皮膚及び前立腺癌）において発現される。リンパ節、腸及び肺癌における血漿細胞がｚｃｙｔｏｒ１１に関して陽性であることは、注目すべきである。血漿細胞は、抗体合成を担当する、免疫学的に活性化されたリンパ球である。さらに、ＩＬ−ＴＩＦは、活性化されたＴ細胞において発現され、そしてｚｃｙｔｏｒ１１の発現は静止ＣＤ１９＋細胞においてのみ検出された（例１３）（但し、活性化された細胞においては検出されなかった）。従って、ｚｃｙｔｏｒ１１は、一定のリンパ球、例えば単核リンパ球及び制限された型の活性化されたリンパ球、例えば静止ＣＤ１９＋の単離においてマーカーとして又は標的物として使用され得る。
【０２２４】
さらに、免疫細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるｚｃｙｔｏｒ１１発現の存在は、ｚｃｙｔｏｒ１１が外来性侵入体、例えば微生物及び細胞残骸に対する身体の免疫防御反応に関与し、そして炎症及び癌形成の間、免疫応答において役割を演じることを示した。ｚｃｙｔｏｒ１１受容体の活性化は、自己免疫及び炎症疾患、例えばＧＶＨＤ、敗血症及び狼痕を引き起こすことができる。
【０２２５】
さらに、本明細書において論じられるように、いくつかの上皮形組織、例えば皮膚、腎臓、腸、肝細胞（内皮由来の上皮）、肺胞上皮（内皮由来の上皮）及び卵巣癌上皮（中胚葉由来の上皮）は、ｚｃｙｔｏｒ１１発現に関して陽性であった。それらの組織における炎症応答は、急性／慢性炎症疾患、例えば乾癬（皮膚）、最終段階腎疾患ＥＳＲＤ（腎臓）、ＩＢＤ（クローン病、大腸炎）（腸）及びぜん息／呼吸アレルギー／慢性気管支炎（肺）を引き起こすことができる。
【０２２６】
ｚｃｙｔｏｒ１１の上皮発現は、肝臓及び肺における炎症応答及び／又は癌状態において変更され得る。従って、ｚｃｙｔｏｒ１１、例えばＩＬ−ＴＩＦ又はその受容体結合フラグメントのためのリガンドが、炎症又は癌の結果として、それらの組織における変化をモニターするためにマーカーとして使用され得る。さらに、ｚｃｙｔｏｒ１１現場発現の分析は、正常卵巣上皮がｚｃｙｔｏｒ１１発現に関して陰性であり、ところがそれは、卵巣癌上皮において強い陽性であることを示し、このことは、ＩＬ−ＴＩＦポリペプチド又はその受容体結合フラグメントが、本明細書に記載されるように、卵巣癌の診断及び処理のために診断マーカー及び／又は治療標的物として使用され得る証拠をさらに提供する。
【０２２７】
ｚｃｙｔｏｒ１１はまた、他の組織、例えば膵臓（正常及び膵炎組織）における腺房細胞、胎盤（外胚葉由来の）における栄養膜、軟骨（中胚葉由来のにおける軟骨細胞、及び腸（外胚葉由来の）における神経節細胞においても検出された。ｚｃｙｔｏｒ１１自体は、それらの器官における対応する細胞の分化及び／又は正常機能に関与している。ｚｃｙｔｏｒ１１の可能性ある使用は、正常な代謝及び妊娠、骨形成／恒常性、及び腸の生理学的機能の維持及び同様のものを包含する。さらに、ＩＬ−ＴＩＦのアップ−レギュレーションは、一定の炎症性疾患、例えば膵炎、リウマチ様関節炎、ＩＢＤ（大腸炎及びクローン病）を導くそれらの組織における炎症応答を実質的に引き起こすことができる。
【０２２８】
例１５．ノザンブロット及びＰＣＲを用いての組織パネルにおけるヒトｚｃｙｔｏｒ１１組織分布
Ａ． ＰＣＲを用いての組織パネルにおけるヒトｚｃｙｔｏｒ１１組織分布
ヒト組織からのｃＤＮＡのパネルを、ＰＣＲを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１１発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして種々の正常及び癌性ヒト組織からの９４種のマラソンｃＤＮＡ及びｃＤＮＡサンプルを包含し、そして細胞系は下記表４に示される。ＰＣＲ反応の他に、使用される方法は、例１２に示される通りであった。ＰＣＲ反応は、オリゴヌクレオチドＺＣ１４，６６６（配列番号１１）及びＺＣ１４，７４２（配列番号１２）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）及びＲｅｄｉｌｏａｄ色素（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて設定された。
【０２２９】
増幅を、次の通りにして行った：９４℃で２分（１サイクル）、９４℃で１５秒、５１℃で３０秒、及び７２℃で３０秒（４０サイクル）、続いて７２℃で７分（１サイクル）。正しい予測されるＤＮＡフラグメントは、膀胱、脳、頸部、結腸、胎児脳、胎児心臓、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、胎児皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、メラノーマ、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、直腺、唾液腺、小腸、卵巣、胸腺、気管支、脊椎、甲状腺、肺腫瘍、卵巣腫瘍、直腸腫瘍、及び胃腫瘍において観察された。ｚｃｙｔｏｒ１１発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系においては観察されなかった。
【０２３０】
市販の第１鎖ｃＤＮＡパネル（Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）をまた、上記のようにしてアッセイした。パネルは次のサンプルを含んだ：単核細胞、活性化された単核細胞、静止ＣＤ４＋細胞、活性化されたＣＤ４＋細胞、静止ＣＤ８＋細胞、活性化されたＣＤ８＋細胞、静止ＣＤ１４＋細胞、静止ＣＤ１９＋細胞及び活性化されたＣＤ１９＋細胞。活性化されたＣＤ８＋及び活性化されたＣＤ１９＋を除くすべてのサンプルは、ｚｃｙｔｏｒ１１の発現を示した。
【０２３１】
【表３】
2004505641.tif 000005
【０２３２】
Ｂ． ＲＴ−ＰＣＲを用いてのヒト細胞系及び組織パネルにおけるｚｃｙｔｏｒ１１の組織分布
ヒト細胞系からのＲＮＡのパネルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１１発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして第５表〜第８表に示されるように、種々の正常及び癌性ヒト組織及び細胞系からの８４種のＲＮＡを含んだ。ＲＮＡは、自家又は購入された組織及び細胞系から、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｄｉ又はＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて製造された。パネルは、サンプル当たり１００ｎｇのＲＮＡを用いて、９６−ウェル型で設定された。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、オリゴヌクレオチドＺＣ１４，６６６（配列番号１１）及びＺＣ１４，７４２（配列番号１２）、Ｒｅｄｉｌｏａｄ組織及びＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｏｎｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ） を用いて設定された。
【０２３３】
増幅を次の通りにして行った：５０℃で３０分（１サイクル）、続いて９４℃で１５秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒、次に７２℃で７分の最終延長（４５サイクル）。８〜１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。正しい推定されるｃＤＮＡフラグメントは、副腎、膀胱、乳房、気管支、正常結腸、結腸癌、十二指腸、子宮内膜、食道、胃癌、胃食道癌、心室、腸骨、正常腎臓、肝臓癌、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、耳下腺、皮膚、小腸、胃、甲状腺及び子宮において観察された。
【０２３４】
ｚｃｙｔｏｒ１１の発現を示す細胞系は、Ａ−４３１、 分化されたＣａＣｏ２、 ＤＬＤ−１、 ＨＢＬ−１００、 ＨＣＴ−１５、 ＨｅｐＧ２、 ＨｅｐＧ２＋ＩＬ６、 ＨｕＨ７及びＮＨＥＫ＃１−４であった。ｚｃｙｔｏｒ１１発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系においては観察されなかった。Ｚｃｙｔｏｒ１１の発現パターンは、特定組織及び組織特異的腫瘍における発現を示す。当業者は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体及び結合パターンが、生検、組織又は組織学的サンプル、特にｚｃｙｔｏｒ１１が発現される組織における癌又は癌性組織を検出するための診断剤として使用され得る。本発明の分子のためのそのような診断使用は、当業界において知られており、そして本明細書に記載されている。
【０２３５】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１１、すなわちＩＬ−ＴＩＦ受容体の１つの発現パターンは、一定の特定の組織における発現を示すので、天然のリガンドＩＬ−ＴＩＦを包含する結合パターンはまた、生検、組織又は組織学的サンプルにおける、特にＩＬ−ＴＩＦ受容体が発現される組織における特定の組織（正常又は異常）、癌又は癌組織を検出するための診断剤として使用され得る。ＩＬ−ＴＩＦはまた、その受容体、例えばｚｃｙｔｏｒ１１及びＣＲＦ２−４が発現される他の組織を標的化するために使用され得る。さらに、そのような結合パターンは、腫瘍又は疾病組織の部位に治療を標的化するために、化学療法剤、毒性成分及び同様のものに結合され得る。そのような診断及び標的化された治療は、当業界において知られており、そして本明細書に記載されている。
【０２３６】
ｚｃｙｔｏｒ１１の発現パターン（上記）は、ＩＬ−ＴＩＦの作用のための標的組織及び細胞型、及び従って、ＩＬ−ＴＩＦアンタゴニスト、例えば本発明の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体を示した。ｚｃｙｔｏｒ１１は一般的に、次の３種の生理学的システムにおいて発現される：消化系、女性生殖系及び免疫系。受容体系（ｚｃｙｔｏｒ１１）の発現パターンは、本発明の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体のＩＬ−ＴＩＦアンタゴニストが、次の２種の領域、すなわち炎症（例えば、ＩＢＤ、クローン症、膵炎）及び癌（例えば、卵巣、結腸）におけるヒト疾病のための治療に使用されることを示した。すなわち、本発明のポリヌクレオチド及び抗体は、炎症、及びｚｃｙｔｏｒ１１受容体を発現する細胞とのＩＬ−ＴＩＦ相互作用の他のサイトカイン誘発効果を拮抗するために使用され得る。
【０２３７】
さらに、ｚｃｙｔｏｒ１１の発現は、潰瘍性大腸炎組織、ＩＬ−６により誘発されたＨｅｐＧ２肝臓細胞系、活性化されたＣＤ８＋Ｔ−細胞及びＣＤ１９＋Ｂ−細胞においてダウンレギュレートされるか又は不在であると思われた。それらのＲＴ−ＰＣＲ実験は、ＣＤ１０＋末梢血液細胞、すなわちＢリンパ球がＩＬ−ＴＩＦのための受容体、すなわちｚｃｙｔｏＲ１１を発現することを示す。本発明の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体は、Ｂ細胞に対するＩＬ−ＴＩＦの効果を中和するためにアンタゴニストとして作用する。
【０２３８】
これは、Ｂ細胞がキープレーヤーである次の疾患において有益である：自己免疫疾患、例えば全身性エリトーマシス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、免疫複合体病、及びＩＬ−ＴＩＦにより悪化されるＢ−細胞癌。また、Ｂ細胞が疾病病理学に寄与する次の自己免疫患者は、ｚｃｙｔｏｒ１１可溶性受容体治療のための標的である：多発性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及びリウマチ様関節炎。可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体治療は、アトピー性疾患、例えばぜん息、アレルギー性及びアトピー性皮膚炎（ＩｇＥの生成が疾病の病原に寄与する）においてＩｇＥを生成するＢ細胞を低めるか又は阻害するために有益である。
【０２３９】
Ｂ細胞悪性疾患は、サイトカイン、例えばＩＬ−ＴＩＦによる調節の欠失を示すことができる。手術による再切開又は化学療法に続いての本発明の可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１受容体の投与は、Ｂ細胞悪性疾患を有する患者における最少の残存疾患を処理するために有用であり得る。調節の欠失は、ｚｃｙｔｏＲ１１の高められた発現の維持を導くことができる。従って、ｚｃｙｔｏＲ１１包含受容体、例えば本明細書に記載されるそれらを標的化する治療用モノクローナル抗体のための標的物を創造する。
【０２４０】
【表４】
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【０２４１】
【表５】
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【０２４２】
【表６】
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【０２４３】
【表７】
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【０２４４】
【表８】
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【０２４５】
Ｃ． ＲＴ−ＰＣＲを用いてのヒトＯｒｉｇｅｎｅＴＭ 組織及びヒト血液画分ＭＴＣパネルにおけるｚｃｙｔｏｒ１１の組織分布
ヒト組織、すなわちヒトＯｒｉｇｅｎｅＴＭ 組織ヒト血液画分ＭＴＣパネル（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｅｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ；及びＣｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）からのＲＮＡのパネルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｚｃｙｔｏｒ１１発現についてスクリーンした。パネルは、下記第９表〜第１０表に示されるように、上昇する濃度での種々の正常ヒト組織からの２４種のＲＮＡを含んだ。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、オリゴヌクレオチドＺＣ３７，６９３（配列番号３１）及びＺＣ３７，４４９（配列番号３２）を用いて設定した。増幅を次の通りにして行った：９４℃で２分（１サイクル）、９４℃で１５秒、７２℃で１．５分、７２℃で２分（３５サイクル）、続いて４℃での維持。８〜１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。
【０２４６】
第９表に示されるように、Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｐａｎｅｌを用いて、正しい推定されるｃＤＮＡフラグメントサイズ（４４０ｂｐ）が、膵臓、筋肉、胎盤、ＰＢＬ、骨髄及び胎児脳を除くすべての組織に観察された。しかしながら、小腸、結腸、腎臓、皮膚、肺、膵臓及び肝臓において、特に高い発現が存在した。ｚｃｙｔｏｒ１１の弱い発現がまた、卵巣、子宮、前立腺、脳、心臓、卵巣、胃及び甲状腺において観察された。ｚｃｙｔｏｒ１１発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系においては観察されなかった。
【０２４７】
ｚｃｙｔｏｒ１１の発現パターンは、特定の組織における発現を示す。当業者は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体及び結合パートナーが、生検、組織、又は組織学的サンプル、特にｚｃｙｔｏｒ１１が発現される組織におけるそのような組織、癌又は癌組織を検出するための診断剤として使用され得ることを認識する。本発明の分子についてのそのような診断使用は、当業界において知られており、そして本明細書に記載される。
【０２４８】
第１０表に示されるように、ヒト血液画分ＭＴＣパネルを用いて、正しい推定されるｃＤＮＡフラグメントサイズ（４４０ｂｐ）が、単核細胞、静止ＣＤ８＋細胞、静止ＣＤ１９＋細胞及び胎盤において観察された。ｚｃｙｔｏｒ１１発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系、例えば活性化されたＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞において観察された。ｚｃｙｔｏｒ１１の発現パターンは、特定の組織における発現を示す。当業者は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体及び結合パターンが、生検、組織又は組織学的サンプル、特にｚｃｙｔｏｒ１１が発現される組織におけるそのような組織、癌又は癌組織を検出するための診断剤として使用され得ることを認識する。本発明の分子についてのそのような診断使用は、当業界において知られており、そして本明細書に記載される。
【０２４９】
【表９】
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【０２５０】
【表１０】
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【０２５１】
Ｄ． ＲＴ−ＰＣＲを用いてのヒト一次免疫細胞及び免疫細胞系におけるｚｃｙｔｏｒ１１の組織分布
一次ヒト免疫細胞集団及びヒト免疫細胞系からのＲＮＡのパネルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いてｚｃｙｔｏｒ１１発現についてスクリーンした。パネルは、自家製造され、そして下記表１１に示されるように、種々の静止及び活性化された細胞集団及び細胞系からの２４種のＲＮＡを含んだ。すべての一次免疫細胞集団は、何人かの匿名のドナーの血液から単離された。次に、種々の免疫細胞サブセット（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１９＋及びＣＤ５６＋）を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからの微小ビース及び磁気細胞分離システムを用いて単離した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｄｉｐｒｅｐＴＭ キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて、その製造業者の説明書に従って、それらの静止状態でのＣＤ１９＋及びＤＣ５６＋集団から調製した。
【０２５２】
ＣＤ４＋及びＤＣ８＋集団を、２００ｎｇ／ｍｌのプレート−結合された抗−ＣＤ３抗体及び５μｇ／ｍｌの可溶性抗−ＣＤ２８抗体を用いて活性化し、そして細胞を、０、４及び６時間で、ＲＮＡ単離のために集めた。ＣＤ１９＋サンプルを、ヒト扁桃から単離し、そして０．５μｇ／ｍｌのイノマイシン及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡにより活性化された。次に、細胞を、０、４及び２４時間で集め、そしてＲＮＡを単離した。ヒトＣＤ１４＋単球を、０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は１．０μｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかにより、２０時間、活性化した。次に、静止及び活性化された細胞を集め、そしてＲＮＡを単離した。さらに、ＲＮＡを、静止及び活性化された（１０．０μｇ／ｍｌのＬＰＳ）ヒト単球細胞系ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１及びＵ９３７から単離した。また、静止Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ， Ｄａｕｄｉ及びＪｕｒｋａｔ ＲＮＡを試験した。
【０２５３】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、白金Ｔｇｑと共にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｑ ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用した。個々の２５μｌの反応物は、次のものから成った：１２．５μｌの２×反応緩衝液、０．５μｌ（２０ｐモル／μｌ）のＺＣ１４，６６６（配列番号１１）、０．５μｌ（２０ｐモル／μｌ）のＺＣ１４，７４２（配列番号１２）、０．４μｌのＲＴ／Ｔａｑポリメラーゼ混合物、１０μｌのＲＮアーゼを含まない水、１．０μｌの鋳型ＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）。増幅を次の通りに行った。５０℃で３０分（１サイクル）、続いて、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で６０秒（３５サイクル）、次に７２℃で７分間の最終延長。
【０２５４】
８〜１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、２％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。正しい推定されるｃＤＮＡフラグメントサイズは、静止ＣＤ１９＋Ｂ細胞において観察され、そして活性化されたＣＤ１９＋Ｂ細胞、静止ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞及び活性化されたＣＤ１４＋単球においては、より低く観察された。ｚｃｙｔｏｒ１１の発現を示す細胞系は、Ｊｕｒｋａｔ、活性化されたＴＨＰ−１及び活性化されたＨＬ−６０であった。ｚｃｙｔｏｒ１１発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系においては観察されなかった。それらの結果は、いくつかの免疫細胞集団及び免疫細胞系におけるｚｃｙｔｏｒ１１の発現を示す。
【０２５５】
【表１１】
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【０２５６】
例１６．ＣＲＦ２−４受容体を発現するＢａＦ３細胞（ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞）及びｚｃｙｔｏｒ１１受容体と共にＣＲＦ２−４受容体を発現するＢａＦ３細胞（ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞）の構成
十分な長さのＣＦＲ２−４受容体を発現するＢａＦ３細胞を、下記ＣＦＲ２−４発現ベクター３０μｇを用いて構成した。ＣＦＲ２−４受容体を発現する前記ＢａＦ３細胞を、ＢａＦ３／ＣＦＲ２−４を命名した。それらの細胞を対照として使用し、そしてさらに、十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１１受容体によりトランスフェクトし（アメリカ特許第５，９６５，７０４号）、そして下記のようにしてＩＬ−ＴＩＦ活性についてのスクリーンを構成するために使用した。
【０２５７】
Ａ．ＣＲＦ２−４受容体を発現するＢａＦ３細胞の構成
ＣＲＦ２−４（Ｇｅｎｂａｎｋ受容体番号Ｚ１７２２７号）の十分な長さのｃＤＮＡ配列を、Ｄａｕｄｉ細胞系ｃＤＮＡライブラリーから単離し、そして次に、発現ベクターｐＺＰ７Ｐ中にクローン化した。
ＢａＦ３、すなわちネズミ骨髄に由来するインターロイキン−３ （ＩＬ−３） 依存性プレ−リンパ球細胞系（Ｐａｌａｃｉｏｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ， Ｃｅｌｌ ４１： ７２７−７３４， １９８５； Ｍａｔｈｅｙ−Ｐｒｅｖｏｔ など．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：４１３３−４１３５， １９８６）を、１０％熱−不活性化されたウシ胎児血清、２ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ−３ （ｍＩＬ−３） （Ｒ＆Ｄ． Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａＭａｘ−１ＴＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）， １ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及びＰＳＮ抗生物質（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により補充された完全倍地（ＲＰＭＩ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ））において維持した。
【０２５８】
エレクトロポレーションの前、ＣＲＦ２−４／ｐＺＰ７Ｐを調製し、そしてＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って精製した。エレクトロポレーションのためのＢａＦ３細胞を、血清フリーＲＰＭＩ培地により１度洗浄し、そして次に、血清フリーＲＰＭＩ培地に１０７個の細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁した。１ｍｌの再懸濁されたＢａＦ３細胞を、３０μｇのＣＲＦ２−４／ｐＺＰ７ＰプラスミドＤＮＡと共に混合し、そして別々の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に移した。
【０２５９】
室温で、１５分間のインキュベーシヨンの後、細胞に、エレクトロポレーション装置（ＣＥＬＬ−ＰＯＲＡＴＯＲＴＭ； ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により供給される２回の連続したショック（８００ １Ｆａｄ／３００Ｖ．； １１８０ １Ｆａｄ／３００Ｖ．）を与えた。５−分間の回収時間の後、エレクトロポレートされた細胞を、５０ｍｌの完全培地に移し、そしてインキュベーターに、１５−２４時間（３７℃、５％ＣＯ２）配置した。次に、細胞を回転沈降し、そしてＴ−１６２フラスコにおいて、２μｇ／ｍｌのプロマイシンを含む完全培地５０ｍｌに再懸濁し、プロマイシン耐性プールを単離した。この後、ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞と呼ばれる、トランスフェクトされたＢａＦ３細胞のプールを、下記のようにして、シグナル化能力についてアッセイした。さらに、それらの細胞を、下記のようにして、ｚｃｙｔｏｒ１１受容体によりトランスフェクトした。
【０２６０】
Ｂ．ＣＲＦ２−４及びｚｃｙｔｏｒ１１受容体を発現するＢａＦ３細胞の構成
十分な長さのｚｃｙｔｏｒ１１受容体を発現するＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞を、上記例６に記載されるｚｃｙｔｏｒ１１発現ベクター３０μｇを用いて、上記例５Ａに従って構成した。回収に続いて、トランスフェクタントを、２００μｇ／ｍｌのゼオシン及び２μｇ／ｍｌのプロマイシンを用いて選択した。ｚｃｙｔｏｒ１１受容体を発現するＢａＦ３／ＣＲＦ２−４細胞を、ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞として命名した。それらの細胞を用いて、ＩＬ−ＴＩＦ活性、及び例１７に記載されるｚｃｙｔｏｒ１６アンタゴニスト活性についてスクリーンした。
【０２６１】
例１７．Ａｌａｍａｒブルー増幅アッセイにおけるＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞を用いてのＣＲＦ２−４ ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃ活性についてのスクリーニング
ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞（例１６）を、回転沈降し、そしてＰＢＳにより２度、洗浄し、ｍＩＬ−３除去を確証し、そして次に、回転し、そして上記例１６に記載される完全培地（ＲＰＭＩ １６４０，１０％ＦＢＳ， １％ＧｌｕｔａＭＡＸ， １％ピルビン酸ナトリウム）（但し、ｍＩＬ３を含まない）（この後、“ｍＩＬ−３フリー培地”と言及する）に再懸濁した。次に、細胞を、血液計により計数した。細胞を、ｍＩＬ−３フリー培地を用いて、ウェル当たり５０μｌの体積でウェル当たり５００個の細胞で、９６−ウェルプレートにプレートした。
【０２６２】
ＩＬ−ＴＩＦタンパク質を、ｍＩＬ−３フリー培地により、及びまた、トランスフェクトされたＢＨＫ細胞（例７）から製造された約０．４μｇ／ｍｌの濃度でのＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃならし培地により、２００ｐｇ／ｍｌに希釈した。ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃ ＣＭを、ｍＩＬ−３フリー／ＩＬ−ＴＩＦ培地により、９６−ウェルプレート上のすべての８個の横列上に連続して１：２希釈度で、個々のウェルに５０μｌの体積を残しながら希釈した。次に、これを、５０μｌの細胞に添加し、すべてのウェルにおいて１００ｐｇ／ｍｌの最終ＩＬ−ＴＩＦ濃度及び約２００， １００， ５０， ２５， １２．５， ６．２５， ３．１及び１．６ｎｇ／ｍｌの最終ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃ濃度、及び１００μｌの合計アッセイ体積にした。
【０２６３】
アッセイプレートを、３７℃、５％ＣＯ２下で４日間インキュベートし、この時点で、Ａｌａｍａｒブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ，Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）を、２０μｌ／ウェルで添加した。プレートを再び、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。Ａｌａｍａｒブルーは、生存細胞の数に基づいて蛍光読み出しを付与し、そして従って、負の対照に比較しての細胞増殖の直接的な測定を付与する。プレートを、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ （Ｗａｌｌａｃ， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ） 上で、５３０（励起）及び５９０（発光）の波長で読み取った。
【０２６４】
結果は、ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞に対するＩＬ−ＴＩＦの増殖効果のＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃによる用量依存性阻害を確証した。ＩＬ−ＴＩＦは単独で、バックグラウンドよりも３０倍、細胞を刺激した。ＣＲＦ２−４／ｚｃｙｔｏｒ１１−Ｆｃは、２５〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度でその増殖を完全に阻害し、３．１〜１２．５ｎｇ／ｍｌで増殖を部分的に阻害し、そして阻害１．６ｎｇ／ｍｌでほとんど検出できなかった。同じ設定が、ｍＩＬ−ＴＩＦにより行われ、そして類似する結果を生成した。
【０２６５】
例１８．ｚｃｙｔｏｒ１１のみ、ＣＲＦ２−４のみ、ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ−４又はｚｃｙｔｏｒ１１／ｐＤＩＲＳ１を発現するＢａＦ３−トランスフェクタントの流動細胞計測分析
ｚｃｙｔｏｒ１１のみ、ＣＲＦ２−４のみ、ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４又はｚｃｙｔｏｒ１１／ｐＤＩＲＳ１によりトランスフェクトされたＢａＦ３細胞を、例１６に記載のようにして、それぞれのサイトカイン受容体により生成した。手短には、３０μｇのｚｃｙｔｏｒ１１／ｐＺＰ７Ｚを、エレクトロポレーションを用いて、ＢａＦ３細胞中にトランスフェクトし、そして安定したトランスフェクタント（ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１１）を、２００μｇ／ｍｌのゼオシンにより選択した。同様に、ＢａＦ３細胞を、ＣＲＦ２−４／ｐＺＰ７Ｐによりトランスフェクトし、そしてトランスフェクタント（ＢａＦ３／ＣＲＦ２−４）を、２μｇ／ｍｌのプロマイシンにより選択した。
【０２６６】
続いて、３０μｇのＣＲＦ２−４／ｐＺＰ７Ｐを、エレクトロポレーションを用いて、ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞中にトランスフェクトし、そして安定した細胞系（ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１１／ＣＲＦ２−４）を、２００μｇ／ｍｌのゼオシン及び２μｇ／ｍｌのプロマイシンにより選択した。同様に、３０μｇのｐＤＩＲＳ１／ｐＺＰ７Ｐを、エレクトロポレーションを用いて、ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１１細胞中にトランスフェクトし、そして安定した細胞系（ＢａＦ３／ｚｃｙｔｏｒ１１／ｐＤＩＲＳ１）を、２００μｇ／ｍｌのゼオシン及び２μｇ／ｍｌのプロマイシンにより選択した。ＢＨＫトランスフェクタントを、ＢａＦ３トランスフェクタントのためのｚｃｙｔｏｒ１１，ＣＲＦ２−４又はｐＤＩＲＳ１のいずれかの同じ発現ベクターを用いて生成した。ＤＮＡを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ） を用いて、ＢＨＫ細胞中に、製造業者の説明書に従ってトランスフェクトし、選択を、ＢａＦ３選択についての同じプロトコールに従って、トランスフェクションの４８時間後、開始した。
【０２６７】
ヒトＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥ（例１２）タンパク質のビオチニル化を次の通りにして行った：ＤＭＳＯに溶解された１．６μｌの１０％Ｔｗｅｅｎ２０、５０μｌの１Ｍの硼酸（ｐＨ８．５）及び４２μｌの０．９ｍｇ／ｍｌのＥＺ−様Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を、１００μｌの２．２ｍｇ／ｍｌのＩＬ−ＴＩＦ−ＣＥＥ中に添加した。室温での１時間のインキュベーションの後、反応を、２Ｍのグリシン１０μｌにより１０分間、急冷した。
【０２６８】
いくつかの可能性ある受容体成分へのＩＬ−ＴＩＦリガンドの結合性質を試験するために、ＢａＦ３及びＢＨＫ細胞を、発現プラスミド、例えばｚｃｙｔｏｒ１１のみ、ＣＲＦ２−４のみ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ１７２２７号）、ｚｃｙｔｏｒ１１（配列番号１）及びＣＲＦ２−４、又はｚｃｙｔｏｒ１１及びｐＤＩＲＳ１（ＷＩＰＯ公開ＷＯ９９／４６３７９号、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， １９９９） により、上記のようにしてトランスフェクトした。トランスフェクトされていないＢａＦ３及びＢＨＫ細胞は、対照として包含された。細胞を、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＷＢ：３％ヒトＵｌｔｒａｓｐｅｒｍ（Ｇｅｍｉｎｉ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｃａｌａｂａｓａｓ， ＣＡ）により補充されたＰＢＳ／１％ＢＳＡ）に再懸濁し、計数し、そして１×１０６個の個々のタイプを、５ｍｌのポリスチレン管中に等分した。
【０２６９】
細胞を洗浄し、そしてペレット化し、次に、１００μｌのＷＢのみ、又はＷＢ＋１０μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌビオチニル化されたｚｃｙｔｏ１０タンパク質と共に氷上で２０％間インキュベートした。細胞を、１．５ｍｌのＷＢにより洗浄し、そしてペレット化し、次に、１００μｌの２．５μｇ／ｍｌのフィコリリトリン−接合ストレプタビシン（ＰＥ−ＳＡ， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）において、氷上でさらに２０分間、インキュベートした。細胞を、前記のようにして洗浄し、０．４ｍｌのＷＢに再懸濁し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）を用いて、ＦＡＣＳｃａｍ上で分析した。
【０２７０】
ビオチン−ＩＬ−ＴＩＦは、ｚｃｙｔｏｒ１１（すなわち、単独で、又はＣＲＦ２−４又はＤＩＲＳ１と組合してトランスフェクトされたｚｃｙｔｏｒ１１）を含む、すべての３種のトランスフェクトされたＢａＦ３細胞系に対して、用量依存性態様で結合したが、しかし親系又はＢａＦ３×ＣＲＦ２−４トランスフェクトに対して結合しなかった。同じ結果が、その対応するＢＨＫトランスフェクタントにより得られた。
前述から、本発明の特定の態様が例示のために本明細書において記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。従って、本発明は、請求の範囲を除いて制限されない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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