(57)【要約】本発明は、突然変異体ｐ５３蛋白質のアポプトシス誘発機能を再活性化することができる、それぞれ式ＩおよびＩＩに相当する新規な化合物を提供する。この再活性化は、突然変異体ｐ５３蛋白質に対する配列特異性ＤＮＡ結合活性および転写トランス活性化機能の回復、並びにｐ５３蛋白質のコンフォメーション依存性エピトープの変調によって与えられる。従って、本発明による物質は、色々なタイプの腫瘍に悩む患者を治療する製剤組成物および方法において使用される。
2004509890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
2004509890.tif 000008
による化合物：但し、上記の式において、Ｒ２またはＲ３は同一または異なり、そして水素、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１５アルケニル、Ｃ１−１５アルキニル、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルアミノ、アリール、Ｃ６−１５アリールアルキル、Ｃ１−１５アルキルカルボキシ、Ｃ２−１５アルキルアルキルカルボキシレート、Ｃ１−１５アルキルチオ、Ｃ１−１５アルキルヒドロキシの群から選ばれ、ここで該基は場合によってハロゲンにより置換されていることができる。
【請求項２】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２，２，２］オクタン−３−オンまたは９−（アザビシクロ［２，２，２］オクタン−３−オン）−６−クロロ−９Ｈ−プリンである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式ＩＩ
2004509890.tif 000009
による化合物：但し、上記の式において、Ｒ１は水素、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１５アルケニル、Ｃ１−１５アルキニル、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルアミノ、アリール、Ｃ６−１５アリールアルキル、Ｃ１−１５アルキルカルボキシ、Ｃ２−１５アルキルアルキルカルボキシレート、Ｃ１−１５アルキルチオ、Ｃ１−１５アルキルヒドロキシの群から選ばれ、ここで該基は場合によってハロゲンにより置換されていることができる。
【請求項４】
１−Ｎ−（プロピオニルオキシメチル）−マレイミド、Ｎ−アセチルオキシ−メチル−マレイミドまたはＮ−ヒドロキシメチル−マレイミドである、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
医療用途のための、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を製剤上許容できるキャリアー、希釈剤および／または賦形剤と共に含む製剤組成物。
【請求項７】
癌腫瘍治療用の製剤組成物を製造するための、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項８】
製剤上有効な量の請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を、該化合物を必要とする哺乳動物に投与することを含む癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、突然変異体ｐ５３のアポプトシス誘発機能を回復させることができる新規な低分子量化合物に関する。本発明は、また、この新規な化合物を含む製剤組成物、並びにこれら新規化合物を、それらを必要とする哺乳動物に投与することを含む癌の治療方法に関する。
【０００２】
（背景）
腫瘍中の最も一般的な突然変異標的はｐ５３遺伝子である。ヒトの全腫瘍のおよそ半分がこの遺伝子中に突然変異を持っているという事実は、腫瘍サプレッサーとしての決定的役割に関して強力な証拠である。ｐ５３は細胞周期を停止させ、および／またはＤＮＡ損傷、低酸素症および腫瘍遺伝子の活性化を含めて種々のストレス刺激に応答してアポプトシスを誘発する（ＫｏおよびＰｒｉｖｅｓ、１９９６年； Ｓｈｅｒｒ、１９９８年）。活性化により、ｐ５３は、そのＤＮＡ結合作因を持つ特異性標的遺伝子の転写トランス活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）によりｐ５３依存性生体応答を開始させる。加えて、多面ｐ５３蛋白質は、ｐ５３結合点を欠くある種特定の遺伝子を抑制することによって、そしてまた転写依存性機構によってアポプトシスを促進することができる（Ｂｅｎｎｅｔｔ等、１９９８年； ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＯｒｅｎ、１９９８年； ＫｏおよびＰｒｉｖｅｓ、１９９６年）。ヒトの腫瘍中の非常に多数の突然変異体ｐ５３遺伝子の分析は、ｐ５３の特異性ＤＮＡ結合機能を不活性化する突然変異に対する強い選択性を明らかにした；腫瘍中におけるほとんどの突然変異は、特異性ＤＭＡ結合活性を含んでいるｐ５３のコアドメイン（残基９４−２９２）中に集中発生せしめられる点突然変異である（ＢｅｒｏｕｄおよびＳｏｕｓｓｉ、１９９８年）。
【０００３】
ｐ５３誘発細胞周期の停止およびアポプトシスは、共に、ｐ５３媒介腫瘍抑制に関係があり得るだろう。ｐ５３誘発細胞周期停止は異なる仕方で逆転され得ると思われるが、ｐ５３誘発細胞死には不可逆的であるという利点があるだろう。実際、動物の生体内モデル（Ｓｙｍｏｎｄｓ等、１９９４年）およびヒトの腫瘍（Ｂａｒｄｅｅｓｙ等、１９９５年）から、ｐ５３依存性アポプトシスが、特に腫瘍原生信号発生に反応した発生腫瘍の排除において主要な役割を果たすことを示す証拠がある。さらに、ｐ５３のアポプトシス誘発能は癌治療の効力を決めることが多い（Ｌｏｗｅ等、１９９４年）。ヒト腫瘍の５０％より多くがｐ５３突然変異を伴っているという事実を考慮すると、腫瘍に対する野生型ｐ５３媒介増殖抑制の機能を回復させることが極めて望ましいと思われる。このアプローチの利点は、突然変異体ｐ５３を持っている腫瘍細胞の選択的排除を可能にするということである。腫瘍細胞は、多分２つの主たる理由から、ｐ５３の再活性化に特に敏感である。第一に、腫瘍細胞は腫瘍遺伝子の活性化に因りアポプトシスに対して敏感になる（（ＥｖａｎおよびＬｉｔｔｌｅｗｏｏｄ、１９９８年）で概説されている）。第二に、突然変異体ｐ５３蛋白質は、腫瘍細胞中に高いレベルで蓄積する傾向がある。従って、豊富な、そしておそらくは「活性化した」突然変異体ｐ５３に対する野生型機能の回復は、すでに敏感になっている腫瘍細胞中で大量のアポプトシス応答を引き起こすと思われ、これに対してｐ５３を低いまたは検出できないレベルで発現させる正常細胞は影響を受けないだろう。ｐ５３再活性化の抗癌剤戦略としての実行可能性は、広範囲の突然変異体ｐ５３蛋白質が再活性化を受けやすいという事実によって支持される。ｐ５３誘発アポプトシスを取り戻すことに基づく治療戦略は、従って、強力、かつ同時に広範に適用可能であろう。
【０００４】
これらの知見は、それらを併せ考えると、ｐ５３機能の薬理学的回復がその結果として腫瘍細胞を排除させるだろうことを強く示唆している。従って、この分野には、ｐ５３機能のそのような回復を可能にする物質および方法を明らかにする必要が存在する。
【０００５】
上記の目的に対して、ｐ５３は細胞の増殖と死を制御する遺伝子の転写活性化因子として作用する特異性ＤＮＡ結合蛋白質であることが明らかにされている。かくして、ｐ５３蛋白質のアポプトシス誘発能は、その特異性ＤＮＡ結合機能に依存性である。ｐ５３のコアドメイン中に、特異性ＤＮＡ結合を破壊するアミノ酸置換基を持っている突然変異体ｐ５３蛋白質は、細胞中にアポプトシスを誘発させることはできない。従って、上記で定義したそのような物質および方法を得るためには、ｐ５３の特異性ＤＮＡ結合の再活性化が、病的状態の間に腫瘍中にｐ５３依存性アポプトシスを誘発するために不可欠である。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、突然変異体ｐ５３蛋白質のアポプトシス誘発機能を再活性化することができる、式ＩおよびＩＩにそれぞれ対応する新規な化合物を提供するものである。この再活性化は、突然変異体ｐ５３蛋白質に対する配列特異性ＤＮＡ結合活性および転写トランス活性化機能の回復、およびそのｐ５３蛋白質のコンフォメーション依存性エピトープの変調によって与えられる。よって、本発明による物質は、色々なタイプの腫瘍を患っている患者を治療するための製剤組成物および方法において使用される。
表Ｉは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、異なるヒト腫瘍細胞株の増殖をいかにして突然変異体ｐ５３依存様式で抑制するかを例証する。
表ＩＩは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、コロニーの形成をいかにして突然変異体ｐ５３依存様式で阻害するかを説明する。
表ＩＩＩは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、いかにして突然変異体ｐ５３の転写トランス活性化機能を回復させるかを説明する。
表ＩＶは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、いかにして異なる突然変異体ｐ５３蛋白質の配列特異性ＤＮＡ結合を回復させるかを例証する。
表Ｖは、ＭＩＲＡ−３およびＰＲＩＭＡ−２が、コロニーの形成をいかにして突然変異体ｐ５３依存様式で阻害するかを説明する。
【０００７】
定義
本発明においては、次の用語が用いられる：
【０００８】
本発明に開示される用語「物質Ｓ」または「化合物Ｓ」は、共に、以下の式Ｉによる化合物に関する：
2004509890.tif 000003
【０００９】
但し、上記の式において、Ｒ２またはＲ３は同一または異なり、そして水素、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１５アルケニル、Ｃ１−１５アルキニル、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルアミノ、アリール、Ｃ６−１５アリールアルキル、Ｃ１−１５アルキルカルボキシ、Ｃ２−１５アルキルアルキルカルボキシレート、Ｃ１−１５アルキルチオ、Ｃ１−１５アルキルヒドロキシの群から選ばれ、ここで該基は場合によってハロゲンにより置換されていることができる。好ましい化合物は、以下に示される２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２，２，２］オクタン−３−オンである。この化合物はＰＲＩＭＡ−１とも称される：
2004509890.tif 000004
【００１０】
式Ｉによるもう１つの好ましい化合物は、以下に示される９−（アザビシクロ［２，２，２］オクタン−３−オン）−６−クロロ−９Ｈ−プリンである：
2004509890.tif 000005
【００１１】
本発明に開示される用語「物質Ｆ」または「化合物Ｆ」は、共に、以下の式ＩＩによる化合物に関する：
2004509890.tif 000006
【００１２】
但し、上記の式において、Ｒ１は水素、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１５アルケニル、Ｃ１−１５アルキニル、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルアミノ、アリール、Ｃ６−１５アリールアルキル、Ｃ１−１５アルキルカルボキシ、Ｃ２−１５アルキルアルキルカルボキシレート、Ｃ１−１５アルキルチオ、Ｃ１−１５アルキルヒドロキシの群から選ばれ、ここで該基は場合によってハロゲンにより置換されていることができる。好ましい化合物は、以下に示される１−Ｎ−Ｃｌ−（プロピオニルオキシメチル）−マレイミドである：
2004509890.tif 000007
【００１３】
この化合物はＭＩＲＡ−１とも称される。式ＩＩによる他の好ましい化合物は、Ｎ−アセチルオキシ−メチル−マレイミドおよびＮ−ヒドロキシメチル−マレイミドである。
【００１４】
用語「ハロゲン」、「ハロ」または「ハリド」（「ハライド」）は、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。用語「立体異性体」は、同じ結合によって結合されている同じ原子からできているが、相互に変換できない異なる三次元構造を有する化合物を意味する。本発明の化合物は遊離形、例えば両性形をしていてもよいし、或いは塩、例えば酸付加塩またはアニオン性塩の形をしていてもよい。遊離形の化合物はこの技術分野で公知の方法で塩の形に転化させることもできるし、その逆も可能である。
【００１５】
式Ｉの化合物の製剤上許容できる塩（水溶性または油溶性若しくは油分散性の生成物の形をしている）には、これら化合物の、例えば無機または有機の酸または塩基から形成される常用の無毒性の塩または四級アンモニウム塩がある。このような酸付加塩の例を挙げると、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パエモエート（ｐａｅｍｏａｔｅ）、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラートおよびウンデカン酸塩がある。塩基の塩には、アンモニウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基との塩並びにアルギニン、リシンのようなアミノ酸との塩等がある。また、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピルおよびブチルクロリド、ブロミドおよびヨージッドのような低級アルキルハリド；ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルスルフェートのようなジアルキルスルフェート；デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルクロリド、ブロミドおよびヨージッドのような長鎖ハリド、ベンジルおよびフェネチルブロミドのようなアラルキルハリド、その他のような試剤で四級化することができる。
【００１６】
本発明で使用される用語「アルキル」は、一般に、外に指摘されなければ、直鎖、分枝鎖およびそれらの環化したもの、特にメチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、−ＣＨ２−ｔ−ブチル、シクロプロピル、ｎ−プロピル、ペンチル、シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシルおよびシクロヘキシルメチルのような部分を包含する。同じことが用語「アルケニル」および「アルキニル」にも当てはまる。用語「アラルキル」が用いられるとき、それはアルキレン橋掛け部分、好ましくはメチレンまたはエチレンに結合されているそのようなアリール部分を包含する。
【００１７】
「アリール」は炭素環式および複素環式の両部分を包含し、その内ではフェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、インダゾリル、フリルおよびチエニルが主に興味深いものである；これらの部分は、例えば２−、３−または４−ピリジル、２−または３−フリルおよびチエニル、１−、２−または３−インドリル或いは１−および３−インダゾリル、並びにフリルおよびチエニル部分のジヒドロおよびテトラヒドロ類似体のような上記部分の位置異性体を包含する。用語「アリール」には、また、ペンタレニル、インデニル、ナフタレニル、アズレニル、ヘプタレニル、アセナフチレニル、フルオレニル、フェナレニル、フェナントレニル、アントラセニル、アセフェナントリレニル、アセアントリレニル、トリフェニレニル、ピレニル、クリセニルおよびナフタセニルのような縮合カルボン酸部分も包含される。用語「アリール」には、また、２−または３−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−または３−ナフト［２，３−ｂ］チエニル、２−または３−チアントレニル、２Ｈ−ピラン−３−（または４−若しくは５−）イル、１−イソベンゾフラニル、２Ｈ−クロメニル−３−イル、２−または３−フェノキサチイニル、２−または３−ピロリル、４−または３−ピラゾリル、２−ピラジニル、２−ピリミジニル、３−ピリダジニル、２−インドリジニル、１−イソインドリル、４Ｈ−キノリジン−２−イル、３−イソキノリル、２−キノリル、１−フタラジニル、１，８−ナフチリジニル、２−キノキサリニル、２−キナゾリニル、３−シンノリニル、２−プテリジニル、４ａＨ−カルバゾール−２−イル、２−カルバゾリル、ベータ−カルボリン−３−イル、３−フェナントリジニル、２−アクリジニル、２−ペリミジニル、１−フェナジニル、３−イソチアゾリル、２−フェノチアジニル、３−イソオキサゾリル、２−フェノオキサジニル、３−イソクロマニル、７−クロマニル、２−ピロリン−３−イル、２−イミダゾリジニル、２−イミダゾリン−４−イル、２−ピラゾリジニル、３−ピラゾリン−３−イル、２−ピペリジル、２−ピペラジニル、１−インドリニル、１−イソインドリニル、３−モルホリニル、ベンゾ［ｂ］イソキノリニルおよびベンゾ［ｂ］フラニルのような他の複素環式基も包含される；上記複素環式基は、その複素環式部分がそれらの窒素、Ｃ１−６アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アミノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、ハロ、メルカプト、ニトロ、カルボキサアルデヒド、カルボキシ、カルボアルコキシおよびカルボキサミドから独立に選ばれる１個、２個または３個の置換基を介して直接結合され得ないことを除けば、それら基の位置異性体を包含する。
【００１８】
全ての（Ｃ１−１５）部分は好ましくは（Ｃ１−６）部分であり、そしてＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アレニル、Ｃ１−６アルコキシおよびヒドロキシＣ１−６アルキルのような全ての（Ｃ１−６）部分は、さらに好ましくは（１−６個の炭素原子の代わりに１−３個の炭素原子を含む）Ｃ１−３部分である。
【００１９】
「誘導体」は、元の物質Ｆおよび／またはＳの化学構造を変えることによって変更された物質である。上記物質のこのような誘導体は、その物質の本質的活性を基本的に変えずに１個または２個以上の官能基を挿入、削除または置換を伴っていることができる。
【００２０】
「官能性類似物質（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、ＦおよびＳの断片または活性部分を含まなくてもよいが、物質ＦおよびＳの性質の一部または全部、特にその類似物質に結合することによって突然変異体ｐ５３のアポプトシス誘発機能を再活性化する性質を有する物質を意味する。さらに具体的に述べると、好ましい官能性類似物質は、構造の一部分または全部がもう１つの構造によって置換されている化合物であることができる。本発明によるこのような官能性類似物質は、本発明による物質Ｆおよび／またはＳ中の活性基の三次元配置によく似ている反応性化学的部分の空間配置を与える。この同様の活性部位幾何配置の結果として、この官能性類似物質は生体系に対して元の分子の生物活性と同様の効果を有する。
【００２１】
「官能性部分」は、物質Ｆおよび／またはＳ由来でない分子（ｎｏｎ−ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｆ ａｎｄ／ｏｒ Ｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、例えば標識、薬物またはキャリアー分子を意味する。
【００２２】
本発明で用いられる用語「標識」は、検出可能な信号を与えるために本発明の物質に共有結合かまたは非共有結合のいずれかで結合されている部分を意味する。従って、このような「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段で検出することができる。例えば、有用な標識に、３２−Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用される酵素）、ビオチン、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、または抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用できるハプテン類および蛋白質がある（例えば、前記式の物質は、例えば物質に放射性標識を組み込むことによって検出可能にすることができるか、またはその物質に対して特に高められた抗体を検出するために使用することができる）。
【００２３】
用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子若しくは免疫グロブリン遺伝子類、または分析物（抗原）を特に結合および認識するそれら遺伝子（類）の断片によって実質的にコード化されたポリペプチドを意味する。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
従って、本発明は、第一の面において、突然変異体ｐ５３の野生型コンフォメーション、並びに配列特異性ＤＮＡ結合、転写トランス活性化、およびアポプトシス誘発機能を回復させる能力がある物質ＦおよびＳに関する。物質Ｓは２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２，２，２］オクタン−３−オン（ＰＲＩＭＡ−１）（図１Ｂ）、またはその構造の官能性類似物質を含む。物質Ｆは１−（プロポキシメチル）−マレイミド（ＭＩＲＡ−１）（図１Ａ）、またはその構造の官能性類似物質を含む。かくして、これら物質は式ＩおよびＩＩの構造と同一である必要はなく、それらの活性が保存されている限り変種を包含し得ることが理解されるべきである。しかして、この物質は、また、式ＩおよびＩＩの構造を有する誘導体またはその活性部分であることもできる。この文脈において、「活性部分」とは、物質Ｆまたは物質Ｓの完全な構造よりも少ない基を含むが、突然変異体ｐ５３の機能を取り戻す性質を保持している上記物質の一部分を意味する。また、本出願においては、たとえ他の起源のｐ５３分子も考え得るとしても、ヒトｐ５３が特に好ましいことも理解されるべきである。
【００２５】
かくして、ＷＯ９３／２４５２５号明細書は、ヒトｐ５３蛋白質から誘導されたアミノ酸配列がｐ５３の過剰発現を含む疾患の治療において有用であるだろうことを示唆したけれども、低分子量化合物ＦおよびＳに、突然変異体ｐ５３蛋白質のアポプトシス誘発機能の再活性化によってそのような効果を発揮する能力があることを特定して述べるのは、本発明が最初である。
【００２６】
さらに具体的に述べると、本発明による物質は、突然変異体（欠損性）ｐ５３に対して配列特異性ＤＮＡ結合活性を回復させることによってｐ５３のアポプトシス誘発機能の上記再活性化を与えることができる。かくして、たとえ、ＷＯ９５／１９３６７号明細書が、ＤＮＡ結合点に対するｐ５３の結合がアポプトシス調節遺伝子の発現に影響することがあることを示唆していたとしても、物質ＦおよびＳによる突然変異体ｐ５３のアポプトシス誘発機能の再活性化が本発明以前に確認されたことはいまだかってなかった。
【００２７】
本発明のある好ましい態様においては、前記物質またはその官能性類似物質がその物質のｐ５３再活性化効果を高める官能性部分にカップリングされている。前記のように、このような部分は、例えば標識、薬物またはキャリアー分子であることができる。１つの態様において、官能性部分は本発明の物質にカップリングされているキャリアー分子である。もう１つ別の態様では、官能性部分はｐ５３再活性化性分子である。
【００２８】
かくして、１つの態様では、本発明の物質は検出可能な信号を与える標識にカップリングされている。広範囲の標識および結合技術が知られ、かつ科学および特許の両文献で広く報告されている。適した標識に、各種の放射性標識、酵素、基質、補助因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子等がある。
【００２９】
本発明の物質の製造に関し、例えば１９８７年３月の文献に一般的方法が見いだされる。一旦合成されると、本発明による分子は、ＨＰＬＣ精製技術または他のクロマトグラフィー技術、ゲル電気泳動法等を含めてこの技術分野の標準的な方法に従って精製することができる；Ｓｃｏｐｅｓ著・蛋白質の精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ＮＹ州、１９８２年を一般的に参照されたい。官能性類似物質の製造には、元の物質よりも高い効力および／またはより大きなバイオアベイラビリティーおよび／またはより大きな安定性を持つ新規な組成物の開発技術が、例えば１９８７年３月の文献に見いだすことができる。
【００３０】
ＷＯ９５／１７２１３号明細書は、ｐ５３が行い、それによってｐ５３の転写が活性化され得る同じＤＮＡに結合する分子に関する。かくして、ＷＯ９５／１７２１３号明細書はｐ５３調節遺伝子の転写の活性化に関するけれども、それは異なる分子の使用によって本発明とは別の他の問題を解決するものである。
【００３１】
ＷＯ９７／１４７９４号明細書およびＦｏｓｔｅｒ等による刊行物（１９９９年）も、潜在性ｐ５３の配列特異性ＤＮＡ結合活性の活性化法の問題に関する。これを達成するために、ｐ５３のＣ−末端調節用ドメインの断片、または低分子量化合物が使用される。しかし、野生型を活性化するためにＣ−末端調節用ドメイン（ＷＯ９７／１４７９４号）が使用されたが、本発明が述べる突然変異体ｐ５３蛋白質ではなかった。さらに、Ｆｏｓｔｅｒ等の文献（１９９９年）に記載されるものとは異なる薬理作用団を有する低分子量合成化合物が本発明の基礎をなしている。
【００３２】
よって、ｐ５３のアポプトシス誘発機能を再活性化するのに使用できる低分子量化合物が確認された。突然変異体ｐ５３の機能の回復は、生存細胞において、それら細胞を組織培養培地中で上記物質により処理することによって達成することができる。加えて、物質ＦおよびＳには、ｐ５３の配列特異性ＤＮＡ結合活性を再活性化する能力があることも見いだされた。物質ＦおよびＳは、試験管内におけるｐ５３のＤＮＡ結合および生存細胞中おけるｐ５３のトランス活性化機能を回復することが明らかにされる。
【００３３】
第二の面において、本発明は、本発明による物質を、上で定義したように製剤上許容できるキャリアーと共に含む製剤組成物に関する。本発明による、本発明に従って使用するための製剤組成物は、上記物質の１つに加えて、製剤上許容できる添加剤、緩衝剤若しくは安定剤、またはこの技術分野の当業者によく知られている、意図した用途に適切な他の任意の材料を含むことができる。このような材料は無毒性でなければならず、また活性成分の効力を妨害すべきでない。この目的に対する技術およびプロトコルの例は、例えば、Ｏｓｏｌ， Ａ．（編）のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０年に見いだすことができる。
【００３４】
本発明による組成物は任意の投与ルート用に、例えば経口、静脈内、皮膚若しくは皮下、鼻、筋肉内または腹腔内投与用に調製することができる。キャリアーまたは他の材料の正確な性状は投与ルートに依存する。非経口投与には、発熱性物質を含まず、そして必要なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口投与に許容できる水溶液が用いられる。この技術分野の当業者はふさわしい溶液を調製することが十分にでき、そして数多くの方法が文献に記載されている（薬物を送達する方法の簡潔な概観については、ＬａｎｇｅｒのＳｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照されたい）。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤を必要に応じて含めることができる。投薬レベルは、この技術分野の当業者であれば、治療されるべき疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、その他の因子を考慮して決めることができる。上記の技術およびプロトコルの例は、Ｏｓｏｌ， Ａ．（編）のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０年に見いだすことができる。
【００３５】
もう１つの態様において、本発明による組成物は１種または２種以上の追加のｐ５３再活性化剤をさらに含む。
【００３６】
本発明の第三の目的は、上記で定義した物質の医薬品としての使用である。特に、本発明は、これら物質の、突然変異体または野生型ｐ５３蛋白質を含んでいる、異なる起源のヒトの腫瘍を治療するための医薬品としての使用に関する。従って、本発明は、また、ヒト腫瘍の治療用医薬品の製造における上記で定義した物質の使用に関する。
【００３７】
本発明のもう１つの面は、突然変異体ｐ５３蛋白質に対して増殖抑制機能を回復する能力のある化合物をスクリーニングする方法であって、本発明による物質が使用される上記の方法である。本発明の物質は、上記の物質、またはｐ５３分子上の同じ部位に結合している化合物の生物活性の１つまたは２つ以上を有する化合物をスクリーニングする方法で使用することができる。従来の方法においては、候補化合物は合成組み合わせライブラリー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）から選ぶことができる。類似物質のスクリーニング法の例には次のものがある：
【００３８】
Ａ．調節可能プロモーターの（例えばテトラサイクリンによる）制御下で突然変異体ｐ５３を発現する細胞を９６ウエルの微量定量プレートに接種し、続いて低分子量化合物のライブラリーで処理し、そして処理の２４−４８時間後にＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて候補化合物による増殖抑制を検出する方法。
【００３９】
Ｂ．前記物質、および無標識候補化合物のライブラリーを用いて、突然変異体ｐ５３に対する増殖抑制機能の回復において上記物質と相乗作用をする候補化合物を見いだす方法。
【００４０】
本発明のさらなる面は、突然変異体ｐ５３蛋白質の増殖抑制機能を再活性化する能力がある有機化合物を設計する方法であって、本発明による物質が「導出（ｌｅａｄ）」化合物として用いられる上記の方法である。その１つの好ましい態様においては、その有機化合物は、好ましくは実質的に同じ活性を示す、式Ｉまたは／および式ＩＩの三次元構造、或いはこれら構造のより短い断片に似るようにモデル化されている。
【００４１】
既知の製剤活性化合物に対する類似物質の設計は、「導出」化合物に基づく医薬の開発に対する既知のアプローチである。このアプローチは、活性な化合物が合成困難であるかまたはその合成コストが高いか、或いは有毒な作用を有するときに、またはその化合物が特定の投与方法に不適当であるときに望ましいかもしれない。類似物質の設計、合成および試験は、一般に、非常に多数の分子を目標の性質のためにランダムスクリーニングすることを避けるために使用される。
【００４２】
目標とする所定の性質を有する化合物からの類似物質の設計においては、一般に採用される幾つかの工程がある。まず、目標の性質を決定するに当たって決定的および／または重要である化合物の特定の部分を決める。これは、物質中の側基（ｓｉｄｅ ｇｒｏｕｐｓ）を系統的に変えることによって、例えば各基を順番に置き換えることによって行うことができる。その化合物の活性領域を構成する物質部分が、その「薬理作用団」として知られるものである。
【００４３】
薬理作用団を見いだしたら、その構造を、ある範囲のデータ源（分光技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲ）からのデータを用いて、その物理的性質、例えば立体化学、結合、大きさおよび／または電荷に従ってモデル化する。このモデル化法では、コンピューター解析技術、相似マッピング技術（原子間の結合ではなく薬理作用団の電荷および／または容積をモデル化する）、その他の技術が使用できる。
【００４４】
このアプローチのある１つの変形では、配位子およびその結合相手の三次元構造がモデル化される。これは、配位子および／または結合相手が結合すると直ちにコンフォメーションを変え、モデルをしてこれを類似物質の設計において考慮できるようにするときに特に有用である可能性がある。
【００４５】
次に、薬理作用団をまねる化学的基をグラフトさせることができるテンプレート分子が選ばれる。テンプレート分子およびその分子に対してグラフトされる化学的基は、普通、その類似物質がその合成が容易であり、薬理上許容できる見込みがあり、そして生体内で分解せず、同時に導出化合物の生物活性を保持しているように選ぶことができる。このアプローチで見いだされる類似物質または類似物質類は、次に、それらが目標の性質を有しているかどうか、またはそれらがどの程度その性質を示すかを見るために、スクリーニングに掛けることができる。生体内または臨床試験用の１種または２種以上の最終類似物質に至るために、さらなる最適化または修飾を行うことができる。
【００４６】
この関係において、文献に記載される方法が所望とされる結合活性に関してライブラリーの効率的スクリーニングを可能にする（ＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＧｅの Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、３０， ２９６−２９８（１９９１）；米国特許第５，７３３，７３１号、同第５，８７２，０１５号および同第５，６１２，８９５号明細書を参照されたい）。さらに、三次元データベース比較のためのアルゴリズムが文献において入手できる；例えば、Ｃｏｏｐｅｒ等のＪ． Ｃｏｍｐｕｔ．−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ． Ｄｅｓｉｇｎ、３：２５３−２５９（１９８９）およびその中の引用文献；Ｂｒｅｎｔ等のＪ． Ｃｏｍｐｕｔ．−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ． Ｄｅｓｉｇｎ、２：３１１−３１０（１９８８）およびその中の引用文献を参照されたい。このようなサーチのための市販ソフトウエアも、カリフォルニア州９２７１４、ＩｒｖｉｎｅのＤａｙ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．およびカリフォルニア州９４５７７、Ｓａｎ ＬｅａｎｄｒｏのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ， ２１３２ Ｆａｒａｌｔｏｎ Ｄｒｉｖｅのような売り主から入手できる。
【００４７】
最後に、本発明は、また、本発明による物質が用いられる医学的治療法に関する。
【００４８】
図面の詳細な説明
図１は、１−（プロポキシメチル）−マレイミド（Ａ）および２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２，２，２］オクタン−３−オン（Ｂ）の構造式を示す。
【００４９】
図２は、物質ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１が突然変異体ｐ５３を発現させる細胞の増殖をどのようにして抑制したか、しかしｐ５３の発現を欠く細胞の増殖にはどのようにして影響を及ぼさなかったかを例証するものである。さらに具体的に述べると、図２Ａは、ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１化合物が突然変異体ｐ５３を発現するＳａｏｓ−２ Ｈｉｓ−２７３細胞の増殖をどのようにして抑制するかを示す。これに対して、ｐ５３の発現を欠くＳａｏｓ−２細胞に対する処理効果はかなり小さかった。このグラフは、突然変異体ｐ５３の存在下および非存在下で化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１により処理された細胞の、無処理細胞と比較しての、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬の低下百分率として表される生存率間の違いを例証している。ＷＳＴ−１低下の程度は生存細胞の数を反映するもので、ミクロ平板読み取り装置でメーカー（Ｒｏｃｈｅ）に従ってλ４９０ｎｍにおいて測定された。増殖抑制率は無処理細胞と処理細胞との間のλ４９０ｎｍにおける吸光度の違いとして計算され、無処理対照からのパーセントで表された。増殖抑制率＝１００％×（対照細胞吸光度−処理細胞吸光度）／対照細胞吸光度。２つの化合物、即ち化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は突然変異体ｐ５３を発現する細胞の増殖を抑制するが、ｐ５３の発現を欠く細胞の増殖には影響を及ぼさないことが確認された。図２Ｂは、ＰＲＩＭＡ−１が、ドキシサイクリン依存性プロモーターの制御下で、ｐ５３のＨｉｓ−２７３およびＨｉｓ−１７５突然変異体を発現する３細胞株の増殖を抑制することを示す。これら３細胞株において、ＰＲＩＭＡ−１は細胞に対する増殖抑制効果を突然変異体ｐ５３依存様式で示す。図２Ｃは、突然変異体ｐ５３の非存在下または存在下におけるＰＲＩＭＡ−１処理Ｓａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞の増殖曲線を示す。図２Ｄは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が突然変異体ｐ５３発現性細胞の増殖を支配的に抑制することを示す。化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１のこの増殖を抑制する能力は、異なるｐ５３状態を持つ１６細胞系、即ちｐ５３を発現しない細胞（ｐ５３なし）、野生型ｐ５３を発現する細胞、および異なる突然変異体ｐ５３蛋白質を発現する細胞を用いて試験された。実験の設定は、図２Ａで説明されるとおりであった。生存率の違いは、独立ｔ−試験によれば統計的に有意であった。
【００５０】
図３は、Ｓａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞系におけるＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１によるアポプトシスのｐ５３依存誘発性を例証するものである。さらに具体的に述べると、図３Ａは、カスパーゼ阻害剤がＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞において化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１による細胞死誘発をいかにして抑制するかを示す。アポプトシスの誘発は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色されたエタノール固定細胞のＦＡＣＳ分析によって、サブ−Ｇ１母集団の百分率として測定された。ドキシサイクリンの非存在下で増殖されたＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３に、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１（それぞれ２５μＭおよび１００μＭ）による処理前に、カスパーゼ阻害剤・Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫおよびＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＣＡ州）が５μｇ／ｍＬの濃度で加えられた。無処理培養物中およびカスパーゼ阻害剤だけで処理された対象培養物中の死亡細胞の百分率が差し引かれた。図３Ｂは、ＰＲＩＭＡ−１で２５μＭの濃度で４８時間処理されたＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞のＴＵＮＥＬ染色を述べるものである。細胞核を染色するのにＨｏｅｃｈｓｔ染色が用いられた。図３Ｃは、Ｓａｏｓ−２細胞およびＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞における化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１によるアポプトシスの誘発を示す。アポプトシス性細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）の百分率は図Ａで説明されたＦＡＣＳ分析によって測定された。上部パネル：アポプトシスは１０μＭのＭＩＲＡ−１による処理の４８時間後にｐ５３を発現するＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞（ドキシサイクリンなし）中に誘発されたが、ｐ５３なしのＳａｏｓ−２細胞中には誘発されなかった。物質ＰＲＩＭＡ−１（５０、７５および１２５μＭ）およびＭＩＲＡ−１（１０μＭ）。下部パネル：アポプトシスはＰＲＩＭＡ−１（５０、７５および１２５μＭ）で突然変異体ｐ５３発現性Ｓａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞中に誘発されたが、これに対して、Ｓａｏｓ−２細胞にｐ５３の発現がない場合ＰＲＩＭＡ−１は効率がはるかに低かった。
【００５１】
図４は、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、ＥＬＩＳＡを使用するとき、ｐ５３本来（野生型）のコンフォメーションをいかにして安定化するかを示す。さらに具体的に述べると、図４Ａは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、３７℃における３０分間のインキュベーションによって、ｐ５３蛋白質の加熱不活化によるコンフォメーション依存性ＰＡｂ１６２０エピトープをどのように保存するかを例証している。上部パネル：ＧＳＴ−野生型ｐ５３蛋白質；中央パネル：ＧＳＴ−Ｈｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３蛋白質；下部パネル：ＧＳＴ−Ｇｌｎ−２４８突然変異体ｐ５３蛋白質。蛋白質プレパラートはＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の存在下かまたは非存在下のいずれかで加熱され、そしてＥＬＩＳＡで分析された。氷上でインキュベートされた対照試料の吸光度を１００％として選んだ。図４Ｂは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、３７℃で加熱したときにｐ５３蛋白質中でのＰＡｂ２４０エピトープの出現として測定されるｐ５３蛋白質の変性をいかにして防ぐかを示す。上部パネル：ＧＳＴ−野生型ｐ５３蛋白質；下部パネル：ＧＳＴ−Ｈｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３蛋白質。図４Ｃは、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１はコンフォメーション依存性エピトープＤＯ−１に影響を及ぼさないことを示す。ｐ５３蛋白質の３７℃におけるインキュベーションによってＤＯ−１エピトープに変化は観察されなかった。上部パネル：ＧＳＴ−野生型ｐ５３蛋白質；下部パネル：ＧＳＴ−Ｇｌｎ−２４８突然変異体ｐ５３蛋白質。
【００５２】
図５は、物質ＰＲＩＭＡ−１およびＦによるＧＳＴ−野生型ｐ５３蛋白質の特異性ＤＮＡ結合の保存を例証するものである。バンドシフト検定法（ｂａｎｄ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）は、本質的に前に述べたとおり（Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ等、１９９６年）行われた。ＧＳＴ−野生型ｐ５３蛋白質は、物質ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の存在下または非存在下での３７℃における３０分間のインキュベーションによって不活性化され、次いでＤＮＡ結合について試験された。レイン１および２では、ＰＲＩＭＡ−１およびモノクローナル抗体ＰＡｂ４２１が加えられた。レイン３：加熱によるｗｔｐ５３のＤＮＡ結合の不活性化。レイン４−７および８−１１：化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１の濃度をそれぞれ上げると共にインキュベーションすることによる特異性ＤＮＡ結合の回復。
【００５３】
図６は、Ｈｉｓ−１７５ ｐ５３突然変異体を発現するＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞における野生型ｐ５３エピトープＰＡｂ１６２０の回復を示す。ｐ５３の野生型コンフォメーションを検出するためにＰＡｂ１６２０マウスモノクローナル抗体が用いられたが、これに対して抗−ｐ５３ウサギポリクローナル抗体による染色はｐ５３の総レベルを示す。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔにより染色された。図６Ａ：ＰＲＩＭＡ−１による処理後におけるＰＡｂ１６２０エピトープの出現。図６Ｂ：ＭＩＲＡ−１と共にインキュベートした後のＰＡｂ１６２０エピトープの回復。
【００５４】
図７は、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１によるＧＳＴ−Ｈｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３蛋白質の特異性ＤＮＡ結合の回復を示す。図７Ａのレイン１−３：ＧＳＴ−Ｈｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３はＤＮＡを結合することができない。レイン４−６およびレイン７−９：化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１の濃度（４５ｎｇ、４５０ｎｇおよび１８μｇ）をそれぞれ上げると共にインキュベーションすることによる突然変異体ｐ５３特異性ＤＮＡ結合の回復。全ての反応混合物にＰＡｂ４２１抗体が加えられた。図７Ｂ：化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１は、バンドシフト検定法で検出されるバーキットリンパ腫ＢＬ−６０細胞からの細胞抽出物中の内因性Ｔｒｐ−２８２突然変異体ｐ５３の配列特異性ＤＮＡ結合を回復することができる。レイン１：バーキットリンパ腫ＢＬ−６０細胞からの細胞抽出物中の内因性Ｔｒｐ−２８２突然変異体ｐ５３はＤＮＡを結合しない。レイン２および９：モノクローナル抗体ＰＡｂ４２１および／またはＰＡｂ１８０１は、Ｔｒｐ−２８２突然変異体ｐ５３のＤＮＡ結合を回復しない。化合物ＭＩＲＡ−１（レイン３−５および１０−１２）または化合物ＰＲＩＭＡ−１（レイン６−８および１３−１５）の濃度（９０ｎｇ、９００ｎｇおよび１８μｇ）を上げると共にインキュベーションすると、Ｔｒｐ−２８２突然変異体ｐ５３蛋白質のＤＮＡ結合が回復せしめられた。レイン２−８の反応混合物にモノクローナル抗体ＰＡｂ４２１が加えられた；ＰＡｂ１８０１はレイン９−１５の反応混合物に加えられた。
【００５５】
図８は、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の、突然変異体ｐ５３の特異性ＤＮＡ結合およびアポプトシス誘発機能を回復させる能力間の相関関係を例証するものである。さらに具体的に述べると、ＫＲＣ／Ｙ腎癌細胞中におけるＰｈｅ−１７６突然変異体ｐ５３蛋白質のアポプトシス誘発機能は、ＦＡＣＳ分析で測定して、Ｓａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞中におけるＨｉｓ−２７３突然変異体ｐ５３とは対照的に、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１によっては回復されなかった。アポプトシス性細胞の百分率は図３Ａで説明したＦＡＣＳ分析により調べられた。アポプトシスはｐ５３を発現するＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞（ドキシサイクリンなし）中に物質ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１による処理の４８時間後に誘発されたが、ＫＲＣ／Ｙ細胞またはｐ５３なしのＳａｏｓ−２細胞には誘発されなかった。
【００５６】
図９は、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１による突然変異体ｐ５３に対する転写トランス活性化機能の回復を証明するものである。図９Ａ：ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１は、Ｈｉｓ−２７３突然変異体ｐ５３を持っているＡ−４３１細胞中に野生型ｐ５３応答性ＬａｃＺレポーターを誘発した。図９Ｂ：ＰＲＩＭＡ−１処理ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞中における野生型ｐ５３応答性ＥＧＦＰレポーターの突然変異体ｐ５３依存性活性化。ドキシサイクリンの非存在下で培養された細胞（突然変異体ｐ５３を発現させる）だけがＥＧＦＰの発現を示した。図９Ｃ：ＭＩＲＡ−１がＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞中に野生型ｐ５３応答性ＥＧＦＰレポーターを誘発した。
【００５７】
図１０は、ｐ５３標的遺伝子のｐ２１およびＭＤＭ−２の誘発を証明するものである。図１０Ａは、２５μＭのＰＲＩＭＡ−１または１０μＭのＭＩＲＡ−１で処理されたＨ１２９９−Ｈｉｓ−１７５細胞中における内因性ｐ２１およびＭＤＭ−２の誘発を示す。蛋白質の発現はウエスタン法を用いて分析された。図１０Ｂは、Ｈ１２９９−Ｈｉｓ−１７５細胞中のｐ５３標的遺伝子が突然変異体ｐ５３の存在下でＰＲＩＭＡ−１によってのみ誘発されることを示す。図１０Ｃは、内因性Ｈｉｓ−２７３／Ｓｅｒ−３０９突然変異体ｐ５３を持っているＰＲＩＭＡ−１処理ＳＷ４８０結腸癌細胞中でのｐ５３標的遺伝子の誘発を描く。ＰＲＩＭＡ−１は、野生型ｐ５３を持っているＨＣＴ−１１６結腸癌細胞中に同じｐ５３標的遺伝子を誘発しなかった。
【００５８】
図１１はＰＲＩＭＡ−１の抗腫瘍活性を説明するものである。ＳＣＩＤマウスにＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞を注射した。ＰＲＩＭＡ−１の静脈内（２０または１００ｍｇ／ｋｇ）または腫瘍内（２０ｍｇ／ｋｇ）注射は細胞の注射の３日後に始め、１日につき２回、連続３日間続けた。腫瘍体積は３日に１回、２ヶ月間測定された。
【００５９】
図１２は、ＭＩＲＡ−１（図１２Ａ）およびＰＲＩＭＡ−１（図１２Ｂ）の構造類似体が突然変異体ｐ５３を発現する細胞の増殖をいかにして抑制し、ｐ５３の発現のない細胞にいかにして影響を及ぼさなかったかを例証するものである。ＭＩＲＡ−１の類似体：ＭＩＲＡ−２、ＭＩＲＡ−３およびＰＲＩＭＡ−１の類似体：ＰＲＩＭＡ−２、ＰＲＩＭＡ−３は、処理の４８時間後に測定して、突然変異体ｐ５３を発現するＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞の増殖を阻害した。このグラフは、化合物ＰＲＩＭＡ−２、ＰＲＩＭＡ−３およびＭＩＲＡ−２、ＭＩＲＡ−３は突然変異体ｐ５３含有細胞の増殖を元のＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１化合物よりも低い濃度で選択的に抑制したことを示す。実験の設定は図２Ａで説明したとおりであった。
【００６０】
図１３は、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の類似体がテトラサイクリン依存性プロモーターの制御下（細胞はドキシサイクリンの存在下では突然変異体ｐ５３を発現しない）で異なるｐ５３突然変異体を発現する細胞の増殖をどのように抑制し得るかを示す。図１３Ａ：ＰＲＩＭＡ−２およびＰＲＩＭＡ−３はＳＫＯＶ細胞中のＨｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３の増殖抑制機能を回復させた。図１３Ｂ：ＰＲＩＭＡ−３はＨ１２９９肺腺癌細胞中のホットスポットｐ５３突然変異体Ｔｒｐ−２４８を再活性化した。図１３Ｃ：ＭＩＲＡ−２およびＭＩＲＡ−３はＳＫＯＶ細胞中のｐ５３のＨｉｓ−１７５突然変異体を再活性化した。図１３Ｄ：ＭＩＲＡ−２およびＭＩＲＡ−３はＳＫＯＶ細胞中のＨｉｓ−２７３突然変異体ｐ５３の増殖抑制機能を回復させる。図１３Ｅ：ＭＩＲＡ−３はＨ１２９９細胞中のＨｉｓ−１７５の増殖抑制機能を回復させた。図１３Ｆ：ＰＲＩＭＡ−３はＨ１２９９細胞中のＨｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３の増殖抑制機能を回復させた。図１３Ｇ：ＰＲＩＭＡ−２はＳＫＯＶ細胞中の突然変異体ｐ５３Ｈｉｓ−２７３を再活性化した。
【００６１】
図１４：ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の類似体によるｐ５３標的遺伝子の誘発。図１４Ａ： ＭＩＲＡ−２およびＰＲＩＭＡ−２によるＨ１２９９−Ｈｉｓ−１７５細胞中におけるｐ２１およびＭＤＭ−２の誘発。図１４Ｂ：ＰＲＩＭＡ−３によるＳＷ４８０−Ｈｉｓ−２７３結腸癌細胞中におけるＭＤＭ−２の誘発。
【００６２】
図１５：類似体により誘発される増殖抑制は、ｐ５３の転写トランス活性化機能に依存性である。図１５Ａ：シクロヘキシミドによる処理は、Ｈ１２９９−Ｈｉｓ−１７５をＭＩＲＡ−３による処理に対して耐性にした。シクロヘキシミドの効果は突然変異体ｐ５３の発現のない細胞（ｄｏｘ＋）中で著しかったが、その効果は突然変異体ｐ５３を発現する細胞（ｄｏｘ−）に比較してかなり小さかった。図１５Ｂは、Ｈｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３のトランス活性化ドメイン中における突然変異がＳＫＯＶ細胞をＰＲＩＭＡ−２による処理に対して保護したことを示す。
【００６３】
図１６は、化合物ＭＩＲＡ−２、ＭＩＲＡ−３（図１３Ａ）、並びにＰＲＩＭＡ−２およびＰＲＩＭＡ−３（図１３Ｂ）の構造式を示すものである。
【００６４】
実験
以下において本発明は実施例でさらに詳細に説明される。それら実施例はいかなる点でも本発明の範囲を限定しようとするものではない。以下および本明細書の外の場所に与えられる文献は全て、それらを参照することによって本明細書に含まれるものである。
【００６５】
材料および方法
プラスミド
ＧＳＴ−ヒト野生型ｐ５３融合蛋白質およびＧＳＴ−ヒト突然変異体ｐ５３蛋白質Ｈｉｓ−１７５をコード化するプラスミドは以前から記載されていた（Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ等、１９９６年）。ｐ５３−ＥＧＦＰプラスミドは、ＥＧＦＰコーディング配列の前に１３個の合成ｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合点を含んでいる。メーカー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）の推奨により、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて一時的トランスフェクション実験を行った。
【００６６】
化学ライブラリー
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、米国から低分子量化合物のライブラリーを得た。さらなる情報については、ウエブサイトｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００６７】
化学ライブラリーのスクリーニングおよび増殖抑制検定
突然変異体Ｈｉｓ−２７３ ｐ５３の発現をテトラサイクリン依存様式で可能にするコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）により安定にトランスフェクトしたＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞系をスクリーニングに使用した（Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ等、１９９７年）。ｐ５３の発現を、細胞をドキシサイクリン（５μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートすることによって阻害した。細胞を、９６ウエルの平板中で、３０００細胞／ウエルの密度において、ドキシサイクリンあり、またはなしで増殖させ、そして低分子量（ＬＭＷ）化合物のＮＣＩライブラリーから得た２５μＭの化合物で処理した。４８時間のインキュベーション後に、上記細胞に増殖性細胞試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。細胞生存率を反映するＷＳＴ−１低下の程度を、ミクロ平板読み取り装置でそのメーカー（Ｒｏｃｈｅ）に従ってλ４９０ｎｍにおいて測定した。
【００６８】
ＦＡＣＳ分析
細胞を１２ウエルの平板に３００００／ｃｍ２の密度で入れ、そして化合物で処理した。４８時間のインキュベーション後に、細胞をトリプシン処理により採収し、７０％エタノールで固定し、ＲＮａｓｅ Ａ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）で処理し、そしてヨウ化プロピジウム（０．０２ｍｇ／ｍＬ）で染色した。試料をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎで分析した。データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア・バージョン３．２．１で解析した。
【００６９】
コロニー形成検定
細胞を化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１で処理し、そして平板に５００細胞／平板で接種した。コロニーをギムザ液で染色し、そして接種１４日後に計数した。
【００７０】
ルシフェラーゼ検定
ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＰＧ−ｌｕｃ）に結合したｐ５３応答性プロモーターコンストラクトを用いるトランス活性化検定を、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりそのメーカーに従って行った。ルシフェラーゼレポータープラスミドＰＧ−ｌｕｃ（２ｍｇ）で安定に形質移入されたＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞系を、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１でそれぞれ５０および１０μＭの濃度において処理した。ルシフェラーゼ活性を、処理後１、３．５および１５時間に検定した。
【００７１】
ＤＮＡ結合検定
ＧＳＴ−ｐ５３蛋白質を、記載（Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ等、１９９７年）されたように製造した。バンドシフト検定を、本質的に（Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ等、１９９６年）におけるように、１００ｍＭ、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＤＴＴを含む結合用緩衝液中で行った。
【００７２】
ＥＬＩＳＡ
２０ｎｇのＧＳＴ−ｗｔｐ５３、ＧＳＴ−ｍｔｐ５３−１７５およびＧＳＴ−ｍｔｐ５３−２４８を３７℃で３０分間加熱するか、または氷上に保持した。この手順は試験化合物あり、またはなしで行われた。ＥＬＩＳＡ分析を（Ｆｏｓｔｅｒ等、１９９９年）が記載するとおりに行った。簡単に述べると、上記処理後に、試料を１０ｍＭのＤＴＴが補充されたコーティング緩衝液（１５０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ）で希釈した。この混合物全体をＥＬＩＳＡ平板（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に塗布し、そして＋４℃で３５分間インキュベートした。それらウエルをコーティング緩衝液で洗浄した。それらウェルを、ＰＢＳ中５％の脱脂乳により、＋４℃で１時間インキュベートすることによって封鎖した。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、続いてコーティング緩衝液中１：２５０希釈のマウス一次抗体（ＰＡｂ １６２０またはＰＡｂ ２４０）を加えた。試料を＋４℃で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。その後に、二次抗体（ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗マウス）を試料と共に＋４℃で３０分間インキュベートした。次に、平板をＰＢＳで５回洗浄し、そしてペルオキシダーゼ基質を加えた。λ４０５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡ読み取り装置でモニターした。
【００７３】
ＴＵＮＥＬ染色、免疫組織染色、ｌａｃＺ染色、細胞抽出物の調製、細胞抽出物によるＥＬＩＳＡ、およびウエスタンブロッティングは、標準的な手順に従って行われた。
【００７４】
生体内実験
動物研究は全てローカル動物倫理委員会（ｌｏｃａｌ ａｎｉｍａｌ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認され、そして動物の世話は制度上のガイドラインに依った。毒性評価のために、１２匹のＳＣＩＤマウス（平均体重２５ｇ）を４群に分けた。３群は、毎日、１、１０および１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ中ＰＲＩＭＡ−１の静脈注射を５日間受けた。対照動物にはＰＢＳを注射した。本発明者らは、マウスの体重を最後の注射後１ヶ月間測定した。ＰＲＩＭＡ−１の抗腫瘍活性の評価のために、１２匹のＳＣＩＤマウスの右側腹部に、その皮下および片側において、９０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｌｅ Ｐｏｎｔ−Ｄｅ−Ｃｌａｉｘ、フランス）中、１×１０６個のＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞を接種した。３日後にマウスを４群に分けた。２群はＰＲＩＭＡ−１の静脈注射を２０ｍｇ／ｋｇかまたは１００ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量で受け、１群はＰＲＩＭＡ−１の腫瘍内注射を２０ｍｇ／ｋｇの用量で受け、そして最後の群は対照として用いられた。注射は１日２回、３日間行われた。２ヶ月の間腫瘍体積を測定した。
【００７５】
結果および考察
化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１による増殖抑制は突然変異体ｐ５３の発現に依存する。
本発明によれば、低分子量化合物のＮＣＩライブラリーは、ヒト腫瘍細胞の増殖を突然変異体ｐ５３依存様式で抑制できる化合物についてスクリーンされた。
【００７６】
突然変異体Ｈｉｓ−２７３ ｐ５３の発現をテトラサイクリン依存様式で可能にするコンストラクトにより安定にトランスフェクトされたＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞系をスクリーニングに使用した（Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ等、１９９７年）。細胞を、９６ウェルの平板中で、３０００細胞／ウェルの密度において、ドキシサイクリンあり、またはなしで増殖させた。処理は、２５μＭの、低分子量（ＬＭＷ）化合物のＮＣＩライブラリーからの各化合物の濃度で行われた。４８時間のインキュベーション後に、上記細胞に増殖性細胞試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。細胞生存率に比例するＷＳＴ−１低下の程度を、ミクロ平板読み取り装置でそのメーカー（Ｒｏｃｈｅ）に従ってλ４９０ｎｍにおいて測定した。ｐ５３を発現するＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞の増殖を抑制することはできるが、突然変異体ｐ５３を発現しないＳａｏｓ−２細胞の増殖には影響を及ぼさない２つの化合物が確認された（図１Ａ）。
【００７７】
化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の、突然変異体ｐ５３発現性細胞の増殖を抑制する能力を、コロニー形成検定法を用いてさらに評価した。Ｓａｏｓ−２細胞またはＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞を、平板中に接種された、異なる用量の化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１で処理した。細胞をギムザ染色し、そして１４日後にコロニーの出現数を数えた。表ＩＩに示されるように、５μＭの化合物ＭＩＲＡ−１による処理は、Ｈｉｓ−２７３発現性Ｓａｏｓ−２細胞により形成されるコロニー数を劇的に減少させた（無処理対照の１５％）が、ｐ５３を欠くＳａｏｓ−２細胞を阻害するときの効率はより低かった（４８％阻害率）。化合物ＰＲＩＭＡ−１による処理は、およそ５０−１００μＭのより高い用量において突然変異体ｐ５３依存様式で阻害した。
【００７８】
次に、本発明者らは、異なるｐ５３の状態（ｐ５３なし、野生型ｐ５３、突然変異体ｐ５３）を有する一連のヒト腫瘍細胞系を使用して腫瘍細胞を突然変異体ｐ５３依存様式で抑制する、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の能力を試験した。ヒト細胞系は次のとおりであった。ｐ５３なし：Ｓａｏｓ−２骨肉腫、Ｋ５６２急性骨髄性白血病、およびＨＬ６０前骨髄球白血病。野生型ｐ５３発現性細胞：ＮＨＦ正常ヒト線維芽細胞、ＨｅＬａ子宮頚癌（ＨＰＶ Ｅ６蛋白質を持ち、ｐ５３の分解をもたらす）、Ｕ２ＯＳ骨肉腫、およびＥＢＶ陽性ＩＡＲＣ １７１リンフォブラストイド（ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞系。突然変異体ｐ５３発現性系：バーキットリンパ腫系ＢＬ４１（Ｇｌｎ−２４８突然変異体ｐ５３）；ＤＧ７５（Ｈｉｓ−２８３）、ラジ（Ｇｌｎ−２１３、Ｈｉｓ−２４３）、ラモス（Ｒａｍｏｓ：Ａｓｐ−２４５）；ＢＪＡＢ（Ａｒｇ−１９３）、並びにドキシサイクリン依存性プロモーターの制御下でｐ５３突然変異体を発現するＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−２７３およびＨ１２９９−Ｈｉｓ−１７５。さらに、マウスｐ５３なしのＪ３Ｄ Ｔ−細胞リンパ腫系が使用された。表Ｉに見ることができるように、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は、突然変異体ｐ５３発現性細胞の増殖を、ｐ５３なしの細胞および野生型ｐ５３含有細胞より効率的に抑制した。これらの実験からのデータを図２Ｂに示すグラフにまとめた。細胞系（ｐ５３なし、野生型ｐ５３および突然変異体ｐ５３）の群間における応答性の相違は、独立ｔ−試験によって証明されるように統計上有意であった。
【００７９】
図２Ｃに示されるように、ＰＲＩＭＡ−１は突然変異体ｐ５３を発現するＳａｏｓ−２− Ｈｉｓ−２７３細胞の増殖を完全に阻害した。突然変異体ｐ５３の発現がない状態では、ＰＲＩＭＡ−１は小さい増殖速度の低下を引き起こすだけであった。
【００８０】
化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１による突然変異体ｐ５３に対するアポプトシス誘発機能の回復
化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１により誘発される増殖抑制が、アポプトシスの誘発に起因して起こるのかどうかの問題を扱うために、本発明者らは、カスパーゼ阻害剤がＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１誘発増殖抑制を阻害できるかどうかについて試験した。Ｓａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞を、カスパーゼ阻害剤である阻害剤Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫおよびＢＯＣ−Ｄ−ＦＭＫ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＣＡ州）の存在下または非存在下で、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１により処理した。細胞死の誘発は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色されたエタノール固定細胞のＦＡＣＳ分析によって、サブ−Ｇ１母集団の百分率として測定された。図２Ａから明らかなように、カスパーゼ阻害剤は化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１により誘発される細胞死を抑制した。従って、本発明者らは、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１はアポプトシスを誘発することができると結論する。加えて、アポプトシスの形態が、化合物ＰＲＩＭＡ−１による処理後にＨｏｅｃｈｓｔ染料で染色されたＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞中に検出された。化合物ＰＲＩＭＡ−１で処理されたＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞のＴＵＮＥＬ染色もアポプトシスの誘発を確認した（データは示さない）。本発明者らは、また、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＦによるアポプトシス誘発の速度論にも違いを観察した：ＰＲＩＭＡ−１により誘発されたアポプトシスは処理の４８時間後に明らかになったが、これに対して化合物ＭＩＲＡ−１はそれよりはるかに早く、処理後６−１２時間以内に細胞死を誘発した（データは示さない）。これらの結果は、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１がアポプトシスを異なる経路で引き起こすことを示唆している。
【００８１】
本発明者らは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１により誘発されるアポプトシスが、ドキシサイクリンの存在下または非存在下で増殖したＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ− ２７３細胞を使用するとき、ｐ５３依存性であるかどうかを調べた。図３Ｂに示されるように、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１によるアポプトシスの誘発はｐ５３の発現がある状態でのみ起こった。これらの結果は、それらを併せ考えると、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１による増殖抑制は突然変異体ｐ５３によって媒介されるもので、非特異性細胞毒性には因らないことを明白に示している。
【００８２】
化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１によるｐ５３コアドメインのコンフォメーションの変調
突然変異体ｐ５３の化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１媒介再活性化の分子機構を洞察するために、本発明者らは、ｐ５３のコンフォメーションがこれら化合物によって影響されるかどうかを試験した。ｐ５３における点突然変異は、その結果としてｐ５３コアドメイン本来のコンフォメーションを不安定化させ、その結果モノクローナル抗体ＰＡｂ１６２０について野生型特異性のコンフォメーション依存性エピトープを損失させ、そしてモノクローナル抗体ＰＡｂ２４０で認識される新しいエピトープを出現させることが示された（Ｃｈｏ等、１９９４年）。加えて、野生型ｐ５３の熱変性にも同様な効果がある。それ故、本発明者らは、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１がｐ５３本来（野生型）のコンフォメーションを安定化することができるかどうかを調べた。図４Ａに与えられる結果は、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、３７℃で３０分間加熱された組換え野生型および突然変異体ｐ５３蛋白質のＰＡｂ１６２０抗体の場合に、コンフォメーション依存性エピトープを保存することを証明している。ＧＳＴ−ｗｔｐ５３蛋白質では、化合物ＰＲＩＭＡ−１による処理後にＰＡｂ１６２０エピトープを残すときの処理試料と無処理試料との相違は、対ｔ−試験（ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）によれば、ｐ＝０．０５（ｎ＝５）で統計的有意に達した。重要なことであるが、図４Ｂに与えられる結果は、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、３７℃で加熱したときのｐ５３蛋白質におけるＰＡｂ２４０エピトープの出現率として測定されるｐ５３蛋白質の変性を防ぐことができることを証明している。対ｔ−試験によれば、ＧＳＴ−ｗｔｐ５３蛋白質およびＧＳＴ突然変異体ｐ５３−Ｈｉｓ１７５蛋白質の場合、対照試料とＰＲＩＭＡ−１処理試料との間のＰＡｂ２４０エピトープの出現率における違いは、それぞれｐ＝０．０１およびｐ＝０．１で統計的有意に達した。図４Ｃは、ＤＯ−１抗体で認識されるｐ５３のＮ−末端における非コンフォメーションエピトープが、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１と共にインキュベートすることによって影響されないことを示している。かくして、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は、突然変異体ｐ５３蛋白質本来のコンフォメーションを保存することができる。
【００８３】
試験管内および生存細胞中における野生型ｐ５３のコンフォメーションの回復
ＰＲＩＭＡ−１が突然変異体ｐ５３を野生型ｐ５３コンフォメーションに転化できるかどうかを試験するために、本発明者らはコンフォメーション特異性抗体ＰＡｂ１６２０およびＰＡｂ２４０を用いた。組換えＧＳＴ−野生型ｐ５３蛋白質のＰＲＩＭＡ−１による処理は、ＰＡｂ１６２０＋画分に４０％の増加を、またＰＡｂ２４０＋画分に上記に対応する減少をもたらしたが、一方ＤＯ−１＋画分は不変であった。ＭＩＲＡ−１による同様の実験においては、ＰＡｂ１６２０＋画分で約４０％の増加が、ＰＡｂ２４０＋画分で〜２０％の減少が観察された。本発明者らは、ＰＲＩＭＡ−１処理ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞からの蛋白質抽出物中におけるＰＡｂ１６２０＋ｐ５３の画分を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。１５０μＭのＰＲＩＭＡ−１による処理後に、ＰＡｂ１６２０＋画分は１４６±１８％（無処理細胞の値が１００％に設定された）に達したが、これに対してＤＯ−１画分は８８±９％であった。これは、ＰＲＩＭＡ−１が試験管内および生存細胞中の両者において突然変異体ｐ５３を野生型コンフォメーションで安定化することができることを証明するものである。
【００８４】
さらに、ＰＡｂ１６２０による免疫組織染色は、生存細胞中において突然変異体ｐ５３を野生型コンフォメーションに転化するＰＲＩＭＡ−１の能力を証明した。図６Ａに示されるように、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞のＰＲＩＭＡ−１による処理は、細胞中におけるＰＡｂ１６２０陽性ｐ５３の出現と、それに付随する、ポリクローナル抗−ｐ５３抗体での染色による総ｐ５３レベルの減少をもたらした。同様の効果がＭＩＲＡ−１により処理された細胞でも観察された（図６Ｂ）。
【００８５】
化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は突然変異体ｐ５３蛋白質の配列特異性ＤＮＡ結合を回復できる。
次に、本発明者らは、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１による突然変異体ｐ５３蛋白質のアポプトシス誘発機能の回復がｐ５３の特異性ＤＮＡ結合活性により生ずるかどうかの問題を扱った。化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１はｐ５３の特異性ＤＮＡ結合を回復させるのだろうか。本発明者らは、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１の存在下または非存在下におけるｐ５３蛋白質のＤＮＡ結合を、前記（Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ等、１９９６年；Ｓｅｌｉｖａｎｏｖａ等、１９９７年）のバンドシフト検定法で調べた。図５Ａに与えられる結果は、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１が、３７℃で３０分間インキュベートすることにより不活性化されたＧＳＴ−野生型ｐ５３蛋白質の特異性ＤＮＡ結合を回復させることができることを証明している。さらに、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は、図５Ｂに示されるように、ＧＳＴ−Ｈｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３蛋白質の特異性ＤＮＡ結合を回復させることができた。位置１７５におけるアルギニンの置換は、ｐ５３のＤＮＡ結合コアドメインの著しい変性を引き起こす。それ故、この突然変異体のＤＮＡ結合の回復は例外的に困難な課題と見なされた。Ｈｉｓ−１７５ ｐ５３突然変異体のＤＮＡ結合の回復は、これら確認された化合物の高い効力を証明している。Ｈｉｓ−１７５突然変異体は腫瘍原性機能を獲得することが明らかにされたから、この結果は特に重要なことであると思われる。化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１は、また、図６Ｂに示されるように、バーキットリンパ腫ＢＬ−６０細胞からの細胞抽出物中の内因性Ｔｒｐ−２８２突然変異体ｐ５３の配列特異性ＤＮＡ結合を回復させることもできた。
【００８６】
本発明者らは、内因性ｐ５３蛋白質源として異なるｐ５３突然変異体を持っているヒト腫瘍細胞系の細胞抽出物を使用して、広い一連のホットスポットｐ５３突然変異体の特異性ＤＮＡ結合特性を回復させる、化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の能力を試験した。化合物ＰＲＩＭＡ−１は、バンドシフト検定法で試験された１４種の突然変異体ｐ５３蛋白質中１３種の特異性ＤＮＡ結合を、残留ＤＮＡ結合に関わらず回復させた（表ＩＩＩを参照されたい）。化合物ＭＩＲＡ−１は１４種の突然変異体ｐ５３蛋白質中３種のＤＮＡ結合を回復させた（表ＩＩＩ）。かくして、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は、組換え突然変異体ｐ５３蛋白質のＤＮＡ結合を回復することができただけでなく、細胞抽出物中における多数の内因性突然変異体ｐ５３蛋白質のＤＮＡ結合を再活性化した。化合物ＰＲＩＭＡ−１の唯一の例外はＰｈｅ−１７６突然変異体で、それはこれら化合物のいずれによっても再活性化されなかった。
【００８７】
化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１にＫＲＣ／Ｙ細胞中におけるＰｈｅ−１７６突然変異体ｐ５３蛋白質の特異性ＤＮＡ結合を回復させる能力はないという本発明者らの結果を考慮に入れて、本発明者らは、この突然変異体のアポプトシス誘発機能が、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１によって再活性化され得るかどうかを試験した。ＫＲＣ／Ｙ細胞をそれぞれ５０μＭおよび７５μＭ濃度の化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１で処理し、そして前記のＦＡＣＳ分析で死亡細胞の百分率を測定した。図５で証明されるように、ＫＲＣ／Ｙ細胞中におけるアポプトシスの誘発は、Ｓａｏｓ−２− Ｈｉｓ−２７３細胞に比較して顕著さがはるかに小さかった。事実、処理に対するＫＲＣ／Ｙ細胞の応答性は、ｐ５３を発現しないＳａｏｓ−２細胞のそれと比較できる程度であった。かくして、位置１７６のＣｙｓ残基の置換により引き起こされる欠陥は、不可逆的なものであるように見える。このＣｙｓ残基の置換は、ｐ５３コアドメインのＤＮＡ結合ループを一緒に保持するＺｎ原子の結合を破壊する。従って、この突然変異体ｐ５３蛋白質の変性は、それを回復させるには、おそらくは多過ぎるものである。
【００８８】
ＰＲＩＭＡ−１誘発アポプトシスはｐ５３のトランス活性化機能に依存する。
ＰＲＩＭＡ−１がその効果をｐ５３媒介転写トランス活性化および新規の蛋白質合成によって発揮することをさらに確かめるために、本発明者らはＰＲＩＭＡ−１誘発増殖阻害／アポプトシスに及ぼすシクロヘキシミドの影響を試験した。ＰＲＩＭＡ−１の添加前のシクロヘキシミドによるＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞の予備処理は、ＷＳＴ−１増殖検定法による細胞生残率に４倍の増加をもたらした。このシクロヘキシミド処理は、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５をＭＩＲＡ−１に対して同様に耐性にし、その結果細胞生残率に４倍の増加をもたらす。さらに、本発明者らは、不活性化されたトランス活性化ドメインを有するＨｉｓ−１７５−２２／２３突然変異体ｐ５３を持っているＳＫＯＶ細胞の生存率は、ＰＲＩＭＡ−１処理後にＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞の生存率の少なくとも２倍も高かったことを見いだした。加えて、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞は、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５−２２／２３細胞と比較して、ＭＩＲＡ−１による処理に対してそれより少なくとも３倍敏感であった。これらの結果を併せ考えると、それら結果は、ｐ５３による転写トランス活性化はＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１誘発細胞死にとって決定的であることの説得力のある証拠となる。
【００８９】
化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は生存細胞中の突然変異体ｐ５３の転写トランス活性化機能を回復させることができる。
化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は突然変異体ｐ５３の特異性ＤＮＡ結合を生体内で再活性化できることを確認したが、本発明者らは、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１が生存細胞中の突然変異体ｐ５３の転写トランス活性化機能を回復させることができるかどうかの問題を扱った。ｐ５３応答性のＰＧ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持っているＳａｏｓ−２− Ｈｉｓ−２７３細胞を化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１で処理し、そしてルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、そのメーカーに従って測定した。表ＩＶに示されるように、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１は、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を１．５−２倍刺激した。興味深いことに、ルシフェラーゼ遺伝子発現の誘発の速度論は化合物ＭＩＲＡ−１とＰＲＩＭＡ−１とで異なっていた。化合物ＭＩＲＡ−１が３．５時間経過した後にルシフェラーゼの発現を既に２倍刺激したのに対して、化合物ＰＲＩＭＡ−１による２倍の誘発は処理１５時間後に達成されたに過ぎなかったのである。ルシフェラーゼ遺伝子発現の誘発の速度論は、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１による速いおよび遅いアポプトシスの誘発とそれぞれ相関する。
【００９０】
内因性Ｈｉｓ−２７３突然変異体ｐ５３およびトランスフェクトｐ５３応答性ｌａｃＺレポーターを持っているＡ４３１細胞の、５０μＭのＰＲＩＭＡ−１による２０時間の処理は、ｌａｃＺ陽性細胞の出現をもたらしたが、これに対して無処理細胞は陰性であった（図９Ａ）。同様の結果が５μＭのＭＩＲＡ−１による１２時間の処理後に得られた。
【００９１】
本発明者らは、また、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞をｐ５３応答性ＥＧＦＰレポーターにより一時的にトランスフェクトした。図９Ｂは、ＰＲＩＭＡ−１による２４時間の処理後に突然変異体ｐ５３を発現するＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞中におけるＥＧＦＰ発現の強い誘発を示す。これに対して、ドキシサイクリンの存在下で増殖したＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞（ｐ５３なし）は、検出可能レベルのＥＧＦＰを発現させなかった。ＥＧＦＰの誘発は、５μＭのＭＩＲＡ−１により２４時間処理された細胞でも観察された（図９Ｃ）。
【００９２】
ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が突然変異体ｐ５３の転写トランス活性化性を取り戻せるという最終確認として、本発明者らは、ＰＲＩＭＡ−１またはＭＩＲＡ−１が２種の古典的ｐ５３標的遺伝子であるｐ２１およびＭＤＭ２を誘発することができるかどうかを調べた。突然変異体ｐ５３を発現するＨ１２９９−Ｈｉｓ−１７５細胞のＰＲＩＭＡ−１かまたはＭＩＲＡ−１のいずれかによる処理は、ＭＤＭ２およびｐ２１の両遺伝子の均質誘発（ｓｏｌｉｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）をもたらした（図１０Ａ）。重要なことであるが、突然変異体ｐ５３の発現がない状態での同じ細胞のＰＲＩＭＡ−１またはＭＩＲＡ−１化合物による処理は、ＭＤＭ２の誘発も、ｐ２１の誘発ももたらさなかった（図１０Ｂ）。加えて、この両化合物は、内因性Ｈｉｓ−２７３突然変異体ｐ５３を持っているＳＷ４８０結腸癌細胞中にＭＤＭ２およびｐ２１を誘発させたが（図１０Ｃ）、野生型ｐ５３を持っているＨＣＴ１１６結腸癌細胞中にはＭＤＭ２およびｐ２１蛋白質レベルのいかなる有意な変化も引き起こさなかった。
【００９３】
化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１による転写トランス活性化機能の刺激は、バンドシフト実験で得られたデータと相関せしめられ、そして化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１が、ｐ５３の特異性ＤＮＡ結合およびトランス活性化機能の再活性化剤として、試験管内および生体内の両方で作用できることを証明する。
【００９４】
生体内におけるＰＲＩＭＡ−１の毒性および抗腫瘍活性
ＰＲＩＭＡ−１のマウスへの静脈注射は、無処理対照動物と比較して行動または体重に何らの明白な変化ももたらさなかった。無処理対照マウスの平均体重は２０±０．６ｇ（平均±ＳＥ、ｎ＝３）であり、またＰＲＩＭＡ−１により１００ｍｇ／ｋｇの最高使用用量で処理されたマウスの平均体重は、１ヶ月の観察後に２０±０．２ｇであった。ヒト腫瘍異種移植に対するＰＲＩＭＡ−１の効果を評価するために、本発明者らは、突然変異体ｐ５３を発現するＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞をマウスに接種した。これら動物はＰＲＩＭＡ−１の腫瘍内（２０ｍｇ／ｋｇ）または静脈内（２０または１００ｍｇ／ｋｇ）注射を１日２回、３日間受けた。無処理対照群において、５９日後の平均腫瘍体積は５５５．７±２８４ｍｍ３（平均±ＳＥ、ｎ＝３）であった。このとき、ＰＲＩＭＡ−１の静脈注射を１００ｍｇ／ｋｇの用量で受けたマウスは平均腫瘍体積が１１．７±８ｍｍ３であり、また２０ｍｇ／ｋｇのＰＲＩＭＡ−１ によりｉ．ｖ．で処理されたマウスは５３±４８．５ｍｍ３の平均腫瘍体積を有していた（図５）。２０ｍｇ／ｋｇのＰＲＩＭＡ−１の腫瘍内注射を受けたマウスの平均腫瘍体積は５．３±２．７ｍｍ３であった。無処理対照マウスとＰＲＩＭＡ−１で処理されたマウスとの間の腫瘍体積の違いは全て統計的に有意である（２０ｍｇ／ｋｇの腫瘍内注射の場合、Ｐ＝０．０４１；２０ｍｇ／ｋｇの静脈注射の場合、Ｐ＝０．０６６；そして１００ｍｇ／ｋｇの静脈注射の場合、Ｐ＝０．０４５；全観察期間にわたり対ｔ−試験による）。かくして、ＰＲＩＭＡ−１は、この動物腫瘍モデルで生体内抗腫瘍活性を有する。
【００９５】
突然変異体ｐ５３含有細胞の増殖を特異的に抑制することができる、化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１の構造類似体の確認
ｐ５３再活性化用化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の活性基を確認するために、化合物ＭＩＲＡ−１（２３種の化合物）およびＰＲＩＭＡ−１（１６種の化合物）の一連の構造類似体を試験した。ドキシサイクリンの存在下または非存在下で増殖したＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞、および親Ｓａｏｓ−２細胞をそれら構造類似体で処理し、そして前記のように分析した。構造類似体の細胞増殖に対する効果を、２．５〜２５μＭの範囲の異なる化合物濃度を用いて試験した。突然変異体ｐ５３を発現するＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞（ｔｅｔ−）の増殖を抑制できる化合物ＭＩＲＡ−２、ＭＩＲＡ−３、およびＰＲＩＭＡ−２、ＰＲＩＭＡ−３が同定された。同時に、これらの同定された類似体は、ドキシサイクリンの存在下では突然変異体ｐ５３を発現しないＳａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３細胞（ｔｅｔ＋）、またはｐ５３を欠く親細胞系Ｓａｏｓ−２の増殖には影響を及ぼさなかった。これらの構造類似体は元の同定済み化合物よりも高い活性を有してはいなかったけれども、化合物ＰＲＩＭＡ−２およびＰＲＩＭＡ−３は突然変異体ｐ５３含有細胞の増殖をより低い濃度（それぞれ２．５μＭおよび５μＭ）で選択的に抑制し、そのときその選択的効果を達成するのに化合物ＰＲＩＭＡ−１では（１０μＭ）が必要とされた。加えて、化合物ＭＩＲＡ−２およびＭＩＲＡ−３は細胞の増殖を１０μＭ濃度において突然変異体ｐ５３依存様式で抑制したが、これとは対照的にこの選択的効果に化合物ＭＩＲＡ−１は２５μＭ濃度を要した。
【００９６】
ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の構造類似体は異なる起源の腫瘍細胞中における３種のホットスポットｐ５３突然変異体の増殖抑制機能を回復することができる。
本発明者らは、選択された類似体が、細胞系を使用する、異なるｐ５３ホットスポット突然変異体の増殖抑制機能を、Ｈｉｓ−１７５およびＧｌｎ−２４８ ｐ５３突然変異体のドキシサイクリン依存性抑制と共に回復できるかどうかを調べた。ｐ５３の発現がある状態またはない状態での類似体による増殖抑制を、図１に記載されるように測定した。図１３Ａで証明されるように、ＰＲＩＭＡ−１の類似体であるＰＲＩＭＡ−２およびＰＲＩＭＡ−３は、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞中のＨｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３に対して増殖抑制機能を回復した。もう１つのホットスポットｐ５３突然変異体であるＧｌｎ−２４８のＰＲＩＭＡ−３による再活性化は図１３Ｂに示される。ＭＩＲＡ−１の類似体は、ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−１７５細胞中に突然変異体ｐ５３依存性増殖抑制を誘発した（図１３Ｃ）。注目に値するが、増殖のこのｐ５３依存性抑制を達成するのに必要とされるこれら類似体の濃度は、全ての場合に、類似体でより低く、類似体の効力がより高いことを示していた。
【００９７】
次に、本発明者らは、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の類似体によるｐ５３依存性増殖抑制効果が異なる起源の腫瘍細胞系中で再現され得るかどうかの問題を扱う。本発明者らは、Ｈｉｓ−２７３ ｐ５３突然変異体を発現する２つの腫瘍細胞系、即ち骨肉腫系Ｓａｏｓ−２−Ｈｉｓ−２７３および卵巣癌系ＳＫＯＶ−Ｈｉｓ−２７３におけるＭＩＲＡ−１の類似体による増殖阻害を比較し、そして両腫瘍系においてＨｉｓ−２７３突然変異体が回復されることを見い出した（図１３Ｄ）。Ｈｉｓ−１７５突然変異体ｐ５３発現性Ｈ１２９９−Ｈｉｓ−１７５肺癌細胞の増殖もまた、ＭＩＲＡ−３によって突然変異体ｐ５３依存様式で阻害された（図１３Ｅ）。かくして、ＭＩＲＡ−１の類似体による突然変異体ｐ５３の再活性化は、腫瘍細胞の起源には左右されない。
【００９８】
ＰＲＩＭＡ−１の類似体を使用する実験でも同じ結論に達した。ＰＲＩＭＡ−２およびＰＲＩＭＡ−３は共にＳＫＯＶおよびＨ１２９９細胞中のＨｉｓ−１７５突然変異体を再活性化した（図１３Ｆ）。Ｓａｏｓ−２およびＳＫＯＶ細胞の両細胞におけるＰＲＩＭＡ−２によるＨｉｓ−２７３突然変異体機能の回復は図１３Ｇに示される。
【００９９】
本発明者らは、ｐ５３の発現がある、またはない状態での腫瘍細胞の長期生残に対する類似体の効果をコロニー形成検定法で評価した。表Ｖに示されるように、ＰＲＩＭＡ−２およびＭＩＲＡ−３は、Ｈ１２９９−Ｈｉｓ−１７５細胞中におけるコロニーの形成を突然変異体ｐ５３依存様式で抑制した。
【０１００】
かくして、ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１の類似体は、３種の最も一般的なホットスポットｐ５３突然変異体の増殖抑制機能を、元の化合物より低い濃度で、遺伝子の背景とは無関係に回復することができる。
【０１０１】
類似体による突然変異体ｐ５３の転写トランス活性化機能の取り戻し
突然変異体ｐ５３の転写トランス活性化機能に対する類似体の効果を評価するために、本発明者らは、内因性Ｈｉｓ−２７３突然変異体ｐ５３を発現する結腸癌細胞ＳＷ４８０の類似体による処理後のｐ５３標的遺伝子の発現を試験した。ウェスタンブロッティングを用いて証明されるように、ＭＩＲＡ−２およびＭＩＲＡ−３のみならずＰＲＩＭＡ−２およびＰＲＩＭＡ−３も、ｐ５３標的遺伝子ｐ２１およびＭＤＭ−２の発現を突然変異体ｐ５３依存様式で誘発した（図１４）。かくして、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の類似体は突然変異体ｐ５３の転写トランス活性化機能を回復することができる。
【０１０２】
本発明者らは、次に、類似体による増殖抑制がｐ５３媒介転写トランス活性化に依存性であるかどうかの問題を扱った。Ｈ１２９９−Ｈｉｓ−１７５細胞のシクロヘキシミドによる処理は、ＭＩＲＡ−３による増殖抑制を妨げたが、これは新しい蛋白質合成の必要を示している（図１５Ａ）。図１５Ｂに示されるように、ＰＲＩＭＡ−２の増殖抑制効果は、位置１７５に加えて位置２２および２３に置換を持つ転写欠陥性突然変異体ｐ５３を発現するＨ１２９９−Ｈｉｓ１７５−２２／２３細胞中で完全に破壊された。これらの結果は、本発明者らをして、類似体の抑制効果には突然変異体ｐ５３の転写トランス活性化機能が必要であると結論させるものである。
【０１０３】
Ｂａｒｄｅｅｓｙ， Ｎ．、Ｂｅｃｋｗｉｔｈ， Ｊ．Ｂ．およびＰｅｌｌｅｔｉｅｒ， Ｊ．（１９９５）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５， ２１５−９。
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【０１０４】
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【０１０５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ−Ｂは化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の分子構造を示す。
【図２】
図２Ａ−Ｃは、突然変異体ｐ５３を発現させる腫瘍細胞の、本発明による物質ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１による増殖抑制を例証する。
【図３】
図３Ａ、ＢおよびＣは、本発明による物質ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、どのようにしてヒト腫瘍細胞中にアポプトシスを突然変異体ｐ５３依存様式で誘発するかを例証する。
【図４】
図４Ａ−Ｃは、本発明による化合物ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１が、どのようにしてｐ５３蛋白質の野生型コンフォメーションを保存するかを説明する。
【図５】
図５は、物質ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、野生型ｐ５３の配列特異性ＤＮＡ結合を熱不活性化の際にどのように保存できるかを説明する。
【図６】
図６Ａ−Ｂは、物質ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、細胞中の突然変異体ｐ５３蛋白質に対して野生型コンフォメーションを回復させることを例証する。
【図７】
図７Ａ−Ｂは、本発明による物質ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１が、特異性ＤＮＡ結合のための突然変異体ｐ５３蛋白質をいかにして再活性化するかを例証する。
【図８】
図８は化合物ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１の特異性ＤＮＡ結合回復能と突然変異体ｐ５３のアポプトシス誘発機能との間の相関関係を例証する。
【図９】
図９Ａ−Ｃは、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、細胞中の突然変異体ｐ５３に対していかにして転写トランス活性化機能を回復させるかを示す。
【図１０】
図１０Ａ−Ｃは、ＰＲＩＭＡ−１およびＭＩＲＡ−１が、ｐ５３標的遺伝子の発現をいかにして突然変異体ｐ５３依存様式でトランス活性化するかを示す。
【図１１】
図１１はＰＲＩＭＡ−１の生体内抗腫瘍活性を例証する。
【図１２】
図１２Ａ−Ｂは、物質ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１の構造類似体による、突然変異体ｐ５３を発現する腫瘍細胞の増殖抑制を例証する。
【図１３】
図１３Ａ−Ｇは、類似体が異なるｐ５３突然変異体の増殖抑制機能を回復できることを示す。
【図１４】
図１４は、ＭＩＲＡ−２およびＰＲＩＭＡ−２によるＨ１２９９細胞中でのｐ２１、ＭＤＭ−２の誘発、およびＰＲＩＭＡ−３によるＳＷ４８０細胞中でのＭＤＭ−２の誘発を示す。
【図１５】
図１５は類似体による増殖抑制がｐ５３の転写トランス活性化機能に依存性であることを示す。
【図１６】
図１６は物質ＭＩＲＡ−１およびＰＲＩＭＡ−１の類似体の分子構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月6日(2002.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異体ｐ５３蛋白質のアポプトシス誘発機能を回復させることができる化合物の、突然変異体ｐ５３蛋白質により引き起こされる状態の治療用製剤を製造するための使用であって、上記化合物が、式Ｉ
2004509890.tif 000091
（式中、Ｒ２またはＲ３は同一または異なり、そして水素、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１５アルケニル、Ｃ１−１５アルキニル、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルアミノ、アリール、Ｃ６−１５アリールアルキル、Ｃ１−１５アルキルカルボキシ、Ｃ２−１５アルキルアルキルカルボキシレート、Ｃ１−１５アルキルチオ、Ｃ１−１５アルキルヒドロキシの群から選ばれ、ここで該基は場合によってハロゲンにより置換されていることができる。）
を有する化合物から、または２−ヒドロキシメチル−３，３−ジヒドロキシ−１−アザビシクロ［２，２，２］オクタンから、および式ＩＩ
2004509890.tif 000092
（式中、Ｒ１は水素、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１５アルケニル、Ｃ１−１５アルキニル、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルアミノ、アリール、Ｃ６−１５アリールアルキル、Ｃ１−１５アルキルカルボキシ、Ｃ２−１５アルキルアルキルカルボキシレート、Ｃ１−１５アルキルチオ、Ｃ１−１５アルキルヒドロキシの群から選ばれ、ここで該基は場合によってハロゲンにより置換されていることができる。）
を有する化合物から選ばれる上記の使用。
【請求項２】
式Ｉ
2004509890.tif 000093
（式中、Ｒ２またはＲ３は同一または異なり、そして水素、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１５アルケニル、Ｃ１−１５アルキニル、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルアミノ、アリール、Ｃ６−１５アリールアルキル、Ｃ１−１５アルキルカルボキシ、Ｃ２−１５アルキルアルキルカルボキシレート、Ｃ１−１５アルキルチオ、Ｃ１−１５アルキルヒドロキシの群から選ばれ、ここで該基は場合によってハロゲンにより置換されていることができる。）
を有する化合物、または２−ヒドロキシメチル−３，３−ジヒドロキシ−１−アザビシクロ［２，２，２］オクタンの、癌の治療用製剤を製造するための使用。
【請求項３】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２，２，２］オクタン−３−オン、９−［２−（１−アザビシクロ［２，２，２］３−オキソオクチル）］−メチル−６−クロロ−９Ｈ−プリンまたは２−ヒドロキシメチル−３，３−ジヒドロキシ−１−アザビシクロ［２，２，２］オクタンである、請求項１または２記載の化合物の使用。
【請求項４】
式ＩＩ
2004509890.tif 000094
（式中、Ｒ１は水素、Ｃ１−１５アルキル、Ｃ１−１５アルケニル、Ｃ１−１５アルキニル、Ｃ１−１５アルコキシ、Ｃ１−１５アルキルアミノ、アリール、Ｃ６−１５アリールアルキル、Ｃ１−１５アルキルカルボキシ、Ｃ２−１５アルキルアルキルカルボキシレート、Ｃ１−１５アルキルチオ、Ｃ１−１５アルキルヒドロキシの群から選ばれ、ここで該基は場合によってハロゲンにより置換されていることができる。）
を有する化合物の、突然変異体ｐ５３蛋白質により引き起こされる癌の治療用製剤を製造するための使用。
【請求項５】
１−Ｎ−（プロピオニルオキシメチル）−マレイミド、Ｎ−アセチルオキシ−メチル−マレイミドまたはＮ−ヒドロキシメチル−マレイミドである、請求項１または４記載の化合物の使用。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物の、製剤上許容できるエンハンサーキャリアー、希釈剤および／または賦形剤と一緒の使用。
【請求項７】
製剤上有効な量の請求項１、４および５のいずれかに記載の化合物を、該化合物を必要とする哺乳動物に投与することを含む、突然変異体ｐ５３蛋白質により引き起こされる病理学的状態の治療方法。
【請求項８】
製剤上有効な量の請求項２または３のいずれかに記載の化合物を、該化合物を必要とする哺乳動物に投与することを含む癌の治療方法。
【請求項９】
製剤上有効な量の請求項４および５のいずれかに記載の化合物を、該化合物を必要とする哺乳動物に投与することを含む、突然変異体ｐ５３蛋白質により引き起こされる癌の治療方法。
【国際調査報告】
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