(57)【要約】本開示は、アトラクチン／マホガニー様ポリペプチドおよびその断片、こうしたポリペプチドおよび断片をコードするポリヌクレオチド、こうしたポリペプチドの組換え型を産生する方法、これらのポリペプチドまたは断片に対して生成された抗体、並びにこれらのポリペプチド、抗体、およびポリヌクレオチドを使用するアッセイおよび方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡＭポリペプチドを含んでなる実質的に精製されたポリペプチドであって、ＨＡＭポリペプチドが、配列番号２または１９に示す配列に、少なくとも８０％同一である、前記ポリペプチド。
【請求項２】
ＨＡＭポリペプチドが、配列番号２または１９に示す配列に、少なくとも９０％同一である、請求項１の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項３】
ＨＡＭポリペプチドが、配列番号２または１９に示す配列を有する、請求項１の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項４】
配列が、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１３７９または配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１３７６を含んでなる、請求項１の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項５】
配列が、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０もしくはその断片、または配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１２２７もしくはその断片を含んでなる、請求項１の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項６】
ＨＡＭポリペプチドを含んでなる実質的に精製されたポリペプチドであって、ＨＡＭポリペプチドが、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０もしくはその断片、または配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１２２７もしくはその断片に示す配列に、少なくとも８０％同一であり、そして該ＨＡＭポリペプチドがＨＡＭポリペプチド活性を有する、前記ポリペプチド。
【請求項７】
配列が、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０もしくはその断片、または配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１２２７もしくはその断片に示す配列に、少なくとも９０％同一である、請求項６の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０または配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１２２７に示すアミノ酸配列を含んでなる、実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項９】
第二のポリペプチドに機能可能であるように連結された第一のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドであって、第一のポリペプチドが：
（ｉ）配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０に示す配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１２２７に示す配列を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１３７９に示す配列を有するポリペプチド；および
（ｉｖ）配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１３７６に示す配列を有するポリペプチド；
からなる群より選択される、前記融合ポリペプチド。
【請求項１０】
第二のポリペプチドがＦｃポリペプチドである、請求項９の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
第二のポリペプチドがロイシンジッパーポリペプチドである、請求項９の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドを分離し、そして第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドに機能可能であるように連結されているリンカーポリペプチドを含んでなる、請求項９の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１、６、または９のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ａ）配列番号１または１８；
ｂ）ＴがまたＵであることも可能である、配列番号１または１８；
ｃ）配列番号１または１８に相補的な配列；および
ｄ）少なくとも長さ５０塩基であり、そして中程度の（ｍｏｄｅｒａｔｅ）条件下から非常にストリンジェントな条件下で、配列番号２または１９に示す配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子にハイブリダイズするであろう、ａ）、ｂ）またはｃ）の断片
からなる群より選択される配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ａ）配列番号１のほぼヌクレオチド１８１〜４１３７；
ｂ）配列番号１のほぼヌクレオチド１８１〜３６９０；
ｃ）配列番号１８のほぼヌクレオチド１７８〜４１２８；
ｄ）配列番号１８のほぼヌクレオチド１７８〜３６８１；
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）に相補的な配列；並びに
ｆ）ＴがまたＵであることも可能である、ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）のいずれか
からなる群より選択される配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１４または１５のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１７】
ベクターがプラスミドである、請求項１６のベクター。
【請求項１８】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１６のベクター。
【請求項１９】
請求項１６のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２０】
異種制御配列の調節下の、請求項１４または１５のポリヌクレオチドを含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項２１】
細胞が原核である、請求項２０の宿主細胞。
【請求項２２】
細胞が真核である、請求項２０の宿主細胞。
【請求項２３】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で、請求項２０の宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチド産生法。
【請求項２４】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で、請求項２０の宿主細胞を培養することによって産生されたポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号２または１８に示す配列からなるポリペプチドに特異的に結合する、精製抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である、請求項２５の抗体。
【請求項２７】
ヒトまたはヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体である、請求項２５の抗体。
【請求項２８】
請求項２５の抗体または：
（ａ）配列番号２のアミノ酸６１〜１３７９；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸６１〜１２３０；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸６０〜１３７６；および
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸６０〜１２２７；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、並びに薬学的キャリアー、賦形剤または希釈剤を含んでなる、薬剤組成物。
【請求項２９】
配列番号１または１８に示す配列を含んでなるポリヌクレオチドの発現を変調する剤を同定する方法であって、該ポリヌクレオチドを含有する試料を試験剤と接触させ、そして対照に比較したポリヌクレオチドの発現を測定する、ここで対照に比較した発現の変化が、ポリヌクレオチドの発現を変調する剤の示標となることを含んでなる、前記方法。
【請求項３０】
剤がポリペプチド、ペプチド、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、核酸、および小分子からなる群より選択される、請求項２９の方法。
【請求項３１】
試料が被験者由来の生物学的試料である、請求項２９の方法。
【請求項３２】
試料が細胞を含んでなる、請求項２９の方法。
【請求項３３】
発現の変化が発現の増加である、請求項２９の方法。
【請求項３４】
測定がＰＣＲまたはノーザンブロットによる、請求項２９の方法。
【請求項３５】
測定が、ポリヌクレオチドに発現されるポリペプチドを検出することによる、請求項２９の方法。
【請求項３６】
配列番号２または１９に示す配列を含んでなるポリペプチドの活性を変調する剤を同定する方法であって、該ポリペプチドを含有する試料を試験剤と接触させ、そして対照に比較したポリペプチドの活性を測定する、ここで対照に比較した活性の変化が、ポリペプチドの活性を変調する剤の示標となることを含んでなる、前記方法。
【請求項３７】
剤がポリペプチド、ペプチド、ペプチド擬似体、核酸、および小分子からなる群より選択される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
試料が被験者由来の生物学的試料である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
試料が細胞を含んでなる、請求項３６の方法。
【請求項４０】
活性の変化が活性の増加である、請求項３６の方法。
【請求項４１】
測定が、試料中のポリペプチド量を定量化することによる、請求項３６の方法。
【請求項４２】
ＨＡＭ関連障害または疾患を治療する方法であって、ＨＡＭ関連障害または疾患を治療するのに有効な量のＨＡＭポリペプチド、ＨＡＭポリヌクレオチド、またはＨＡＭポリペプチドに特異的に結合する抗体と、被験者を接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項４３】
ＨＡＭ関連障害が、リウマチ学的障害、骨髄または固形臓器移植障害、移植片対宿主障害、炎症性障害、自己免疫障害、神経学的障害、髄鞘形成障害、細胞増殖障害、感染、心臓血管障害、血液学的障害、肝臓障害、代謝障害、体重障害、および骨障害からなる群より選択される、請求項４２の方法。
【請求項４４】
ＨＡＭポリペプチドが、配列番号２または１９に示す配列、あるいはその生理活性断片を有する、請求項４２の方法。
【請求項４５】
生理活性断片が、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０に示す配列、または配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１２２７に示す配列を有する、請求項４２の方法。
【請求項４６】
ＨＡＭポリヌクレオチドが、配列番号１または１８に示す配列を有する、請求項４２の方法。
【請求項４７】
被験者が哺乳動物である、請求項４２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願へのクロスリファレンス）
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて、米国仮出願第６０／２９３，６０８号、２００１年５月２５日提出、および米国仮出願第６０／３２４，６２６号、２００１年９月２４日提出の優先権を主張し、前記出願の開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規アトラクチン／マホガニー様ポリペプチドおよびその断片、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、こうしたポリペプチドの組換え型を産生する方法、これらのポリペプチドまたは断片に対して生成された抗体、並びにこれらのポリペプチド、抗体、およびポリヌクレオチドを使用するアッセイおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アトラクチン（ＤＰＰＴ−Ｌ）は、細胞接着およびガイダンスタンパク質のＣＵＢファミリーと称するタンパク質ファミリーに属する、ヒト糖タンパク質である。アトラクチンは、通常、活性化ヒトＴリンパ球に分泌され、そして免疫細胞相互作用を変調する。
【０００４】
アトラクチンは、他のドメインと共に、４つのＥＧＦ様ドメインを含有する、１１９８アミノ酸タンパク質である。ＥＧＦ様ドメインを持つタンパク質は、典型的には、細胞外シグナル伝達または細胞ガイダンスに役割を有する。例えば、精製血清アトラクチンおよび組換えアトラクチンは、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖応答を増進して、破傷風トキソイドなどの抗原をリコールする（Ｄｕｋｅ−Ｃｏｈａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９５：１１３３６−４１，  １９９８）。アトラクチンは、リンパ球が付着する接着性単球の蔓延を引き起こす（Ｄｕｋｅ−Ｃｏｈａｎら、上記）。これらの接着細胞は、Ｔリンパ球クラスター形成の中心（ｆｏｃｉ）となり、そしてアトラクチンは、細胞間結合、抗原提示に影響を及ぼすことによって、またはタンパク質分解的修飾によって、Ｔ細胞およびマクロファージ間の相互作用を仲介するのに関与すると考えられる。さらに、アトラクチンはまた、色素沈着およびエネルギー代謝の調節に関連して、ネズミ・マホガニータンパク質と関連すると同定されてきている（Ｔａｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９７（１１）：６０２５−３０，  ２０００）。
【０００５】
マホガニーは、ヒト・アトラクチンのオルソログであるネズミタンパク質である（Ｇｕｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９８：１５２，  １９９９）。ネズミ・マホガニーは、１４２８アミノ酸の膜貫通タンパク質であり、単一の膜貫通ドメインを含有する。ネズミ・マホガニーの細胞外ドメインは、アトラクチンに相同性を有する。ネズミ・マホガニーは、肥満抑制に関与することが示されてきている（Ｎａｇｌｅら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９８：１４８−１５２，  １９９９；本明細書に完全に援用される、米国特許第６，２７４，３３９号もまた参照されたい）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、配列番号２または１９に示す配列に、少なくとも８０％、９０％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１３７９に示す配列に、少なくとも８０％、９０％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。
【０００８】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸１〜６１、６１〜１２３０、６１〜１３７９、１２３１〜１２５２、または１２５２〜１３７９に示す配列を含んでなる、配列番号２の生理活性断片も提供する。
【０００９】
本発明は、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０に示す配列に、少なくとも８０％、９０％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明は、配列番号２のほぼアミノ酸１２５２〜１３７９に示す配列に、機能可能であるように連結された、配列番号２のアミノ酸６１〜１２３０に示す配列を有する、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明はまた、第二のポリペプチドに機能可能であるように連結された、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０に示すアミノ酸配列を含んでなる第一のポリペプチドを含んでなる、融合ポリペプチドも提供する。１つの側面において、第二のポリペプチドはＦｃポリペプチドである。別の側面において、第二のポリペプチドはロイシンジッパーポリペプチドである。さらに別の側面において、第二のポリペプチドは配列番号２また１９に示す配列を有し、これにはその生理活性断片が含まれる。さらなる側面において、リンカーポリペプチドは、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドを分離し、そして第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドに機能可能であるように連結されている。
【００１２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドを提供する。１つの態様において、単離ポリヌクレオチドは：配列番号１または１８；ＴがまたＵであることも可能である、配列番号１または１８；配列番号１または１８に相補的な配列；および少なくとも長さ２０塩基であり、そして中程度の（ｍｏｄｅｒａｔｅ）条件下から非常にストリンジェントな条件下で、配列番号２または１９に示す配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズするであろう、ａ）、ｂ）またはｃ）の断片からなる群より選択される配列を含んでなる。さらなる態様において、単離ポリヌクレオチドは：配列番号１のほぼヌクレオチド１８１〜４１３７；配列番号１のほぼヌクレオチド１８１〜３６９０；配列番号１のほぼヌクレオチド１８１〜４１３７に相補的な配列；配列番号１のほぼヌクレオチド１８１〜３６９０に相補的な配列；およびＴがまたＵであることも可能である、ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）のいずれかからなる群より選択される配列を含んでなる。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の融合ポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。１つの態様において、ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。
【００１４】
本発明はまた、本発明のベクターを含んでなる宿主細胞も提供する。本発明はさらに、異種制御配列の調節下の、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる、組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核または真核であることが可能である。
【００１５】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドの発現を促進する条件下で、本発明の宿主細胞または組換え宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチド産生法を提供する。
本発明の別の側面において、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、本発明の宿主細胞を培養することによって産生したポリペプチドを提供する。
【００１６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、精製抗体も提供する。１つの側面において、抗体はモノクローナル抗体である。別の側面において、抗体はヒトまたはヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体である。
【００１７】
本発明は、本発明の抗体または：配列番号２のアミノ酸６１〜１３７９；および配列番号２のアミノ酸６１〜１２３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、並びに薬学的キャリアー、賦形剤または希釈剤を含んでなる、薬剤組成物を提供する。
【００１８】
別の側面において、本発明は、配列番号１または１８に示す配列を含んでなるポリヌクレオチドの発現を変調する剤を同定する方法であって、該ポリヌクレオチドを含有する試料を試験剤と接触させ、そして対照に比較したポリヌクレオチドの発現を測定する、ここで対照に比較した発現の変化が、ポリヌクレオチドの発現を変調する剤の示標となることを含んでなる、前記方法を提供する。剤は、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、核酸、および小分子であることが可能である。
【００１９】
本発明がやはり提供するのは、配列番号２または１９、配列番号２のほぼ６１〜１３７９、配列番号２のほぼ６１〜１２３０からなる群より選択される配列を含んでなるポリペプチドの活性を変調する剤を同定する方法であって、該ポリペプチドを含有する試料を試験剤と接触させ、そして対照に比較したポリペプチドの活性を測定する、ここで対照に比較した活性の変化が、ポリペプチドの活性を変調する剤の示標となることを含んでなる、前記方法である。
【００２０】
本発明はさらに、ＨＡＭ関連障害または疾患を治療する方法であって、ＨＡＭ関連障害または疾患を治療するのに有効な量のＨＡＭポリペプチド、ＨＡＭポリヌクレオチド、またはＨＡＭポリペプチドに対する抗体と、被験者を接触させることを含んでなる、前記方法を提供する。ＨＡＭ関連障害は、リウマチ学的障害、骨髄または固形臓器移植障害、移植片対宿主障害、炎症性障害、自己免疫障害、神経学的障害、髄鞘形成障害、細胞増殖障害、感染、心臓血管障害、血液学的障害、肝臓障害、代謝障害、体重障害、および骨障害からなる群より選択される。１つの側面において、ＨＡＭポリペプチドは、配列番号２または１９に示す配列、あるいはその生理活性断片を有する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、本明細書において、アトラクチンおよびマホガニー相同体（Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ａｔｔｒａｃｔｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｈｏｇａｎｙ）を表す「ＨＡＭ」と称される、アトラクチンおよびマホガニータンパク質に相同性を有する最初の新規ポリペプチドを提供する。やはり提供するのは、新規ＨＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチオドと共に、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用法である。
【００２２】
アトラクチン分子は、Ｔ細胞およびマクロファージおよび単球間の相互作用を変調し、より迅速な、そして／またはより効果的な抗原提示を可能にする。３つの細胞種の会合は、同時発生的でも、またランダムでもない。むしろ、抗原提示細胞は、まずヘルパーＴ細胞とクラスター形成し、そしてこのクラスターは、エフェクター細胞による認識の中心として作用する。抗原の非存在下では、単球およびＴ細胞の可溶性アトラクチン−１誘導クラスターにおいて、増殖はまったく生じないが、破傷風トキソイドなどのリコール抗原が存在する場合；細胞のクラスター形成は、抗原に対する潜在的な応答を最大限にする。アトラクチンは、結合および提示に影響を及ぼすことによって、またはタンパク質分解的修飾によって、いずれかで、局所サイトカイン活性を制御可能である。可溶性アトラクチン−１は、最近、Ｎ末端ジペプチドを切断することが示されてきており、これは、強力な単球化学誘引物質である全長ＲＡＮＴＥＳ  １〜６８（アミノ酸残基１〜６８からなる）を、単球走化性の同等に強力な阻害剤であるＲＡＮＴＥＳ  ３〜６８に変換する。可溶性アトラクチン−１はまた、マクロファージおよび単球に結合することもまた見出された。アトラクチンが、そのいずれの型においても、マクロファージおよび単球の活性を制御可能であるのは、この結合を介してである可能性がある。例えば、拡散を誘導し、そしてそれに続いてＴ細胞クラスター形成を増進するのに必要なシグナルを提供することによる。あるいは、該分子は、マクロファージ／単球上の受容体への別の分子の結合を補足することが可能である。さらに、該分子は、Ｔ細胞およびマクロファージ／単球間の架橋を形成可能である。膜アトラクチン−１および−２は細胞質ドメインを有するため、膜アトラクチンの細胞外領域への推定上のリガンドの結合が、Ｔ細胞へのシグナル伝達を生じる可能性がある。しかし、本発明は、作用の特定の機構に限定されないことを理解すべきである。
【００２３】
アトラクチンへの相同性に基づいて、本発明のＨＡＭ分子は、アトラクチンと同様の生物学的活性を有すると予測され、そしてしたがって、炎症および炎症性反応において役割を果たすと予測される。ＨＡＭ分子の他の生物学的活性には、エネルギー代謝および色素沈着が含まれ、この活性は、マホガニータンパク質へのＨＡＭの相同性および肥満制御におけるマホガニーの役割に基づく（Ｎａｇｌｅら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９８：１４８−１５２，  １９９９）。２種類の活性（例えば炎症および肥満）の相関は、肥満小児におけるより高い白血球数によって示されてきており（Ｖｉｓｓｅｒら、上記）、これはおそらく、炎症細胞活性化によって誘導されるサイトカインと共に、前脂肪細胞を含む、さらなる細胞種のためである。前脂肪細胞は、食作用および抗菌活性などの、マクロファージの機能的特徴を示し、前脂肪細胞が、炎症過程または免疫応答に役割を果たす可能性が示唆される（Ｃｏｕｓｉｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １８６：３８０−６，  ２００１）。
【００２４】
同様の機能的特性は、ｏｂ遺伝子産物、レプチンに見出すことも可能であり、該分子は、体脂肪量に比例する循環レベルを持つ、脂肪細胞由来ペプチドである。血清レプチンレベルは、体脂肪蓄積と相関し、そして肥満のヒトでは、３〜４倍と同程度に高く増加する。このレベルは、絶食によって低下し、そして炎症によって増加する。レプチンは、食物摂取、代謝および内分泌機能を制御する多面的な分子であり、そして免疫、炎症、および造血を制御する役割を有する（ＦａｎｔｕｚｚｉおよびＦａｇｇｉｏｎｉ，  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，  ６８（４）：４３７−４６，  ２０００）。満腹シグナルとしての役割に加えて、レプチンはまた、炎症誘発性でもある：レプチン受容体は、サイトカイン受容体のクラスＩファミリーに属し、そしてマクロファージおよびＴ細胞を含む、多様な造血細胞上に示されてきており、これらの細胞において、レプチンは炎症性サイトカインの放出を促進する。したがって、炎症および肥満間の連関が存在する（Ｖｉｓｓｅｒら，  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，  １０７（１）：Ｅ１３，  ２００１）。エネルギー代謝および炎症におけるレプチンの役割は、ＨＡＭの役割を予測する。したがって、ＨＡＭは、肥満、炎症性反応、炎症、代謝、色素沈着および神経（例えば髄鞘形成関連障害）において役割を果たす可能性がある。
【００２５】
本明細書において提供するＨＡＭポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、炎症性疾患、肥満、エネルギー代謝、食欲の治療、および炎症性反応の変調に使用を見出す。
本発明は、本明細書において「ＨＡＭポリペプチド」と称されるポリペプチドを提供する。本明細書において、本発明の「ＨＡＭポリペプチド」は、配列番号２または１９に示すアミノ酸配列を含有するかまたは含んでなるポリペプチド；配列番号２または１９に示す配列に実質的な相同性または実質的な同一性を有するポリペプチド；前述の配列の断片（例えば生理活性断片）；および前述のものの保存的変異体を意味する。ＨＡＭポリペプチドは、アトラクチンおよびマホガニーポリペプチドに相同性を有することが示されてきており、そしてしたがって、アトラクチンおよびマホガニーポリペプチドに類似の予測される機能および生物学的活性を有する。
【００２６】
本明細書において、「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）に関わりなく、アミノ酸（Ｌ−またはＤ−アミノ酸を含む）のいずれかの鎖を意味し、そして天然タンパク質、合成または組換えポリペプチドおよび断片と共に、例えばＨＡＭポリペプチドアミノ酸配列のすべてまたは一部を有する第一の部分および目的のポリペプチドのすべてまたは部分を含んでなる第二の部分とのハイブリッドからなる組換え分子を含む。典型的には、ＨＡＭポリペプチドは、通常、天然に存在する他の構成要素に対して実質的に純粋である。用語「実質的に純粋」または「精製された」は、ポリペプチドに言及する際、天然に関連しているタンパク質および天然存在有機分子を少なくとも３０％含まないポリペプチドを意味する。好ましくは、本発明の実質的に純粋なポリペプチドは、他の天然存在有機分子から、重量にして、少なくとも３５〜５０％、好ましくは６０〜７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９９％精製されている。本発明の実質的に純粋なポリペプチドは、例えば、天然供給源からの抽出によって、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの発現によって、またはポリペプチドを化学的に合成することによって、得ることが可能である。純度は、適切な方法のいずれか、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ解析によって、測定可能である。
【００２７】
一般的に、組換えポリペプチドまたは断片は、分泌されていなければ宿主細胞から、または、可溶性でそして分泌されていれば培地もしくは上清から、分離した後、１周期以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、単離することが可能である。望ましい場合、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過装置を用いて、培地をまず、濃縮することが可能である。濃縮工程後、濃縮物をゲルろ過媒体などの精製マトリックスに適用することが可能である。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは支持体が使用可能である。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般的に使用される他の種類であることが可能である。あるいは、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含んでなる多様な不溶性マトリックスを含む、陽イオン交換工程が使用可能である。さらに、等電点電気泳動工程、あるいは疎水性相互作用クロマトグラフィー工程が使用可能である。適切なマトリックスは、樹脂に結合したフェニルまたはオクチル部分であることが可能である。さらに、組換えタンパク質に選択的に結合するマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィーが使用可能である。使用されるこうした樹脂の例は、レクチンカラム、色素カラム、および金属キレートカラムである。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えばペンダントメチル、オクチル、オクチルデシルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルまたはポリマー樹脂）を使用する、１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチドをさらに精製することが可能である。多様な組み合わせの前述の精製工程のいくつかまたはすべてが公知であり、そしてこれを使用して、実質的に精製された、本発明のポリペプチドを提供することが可能である。
【００２８】
本発明のポリペプチドに対して生成したモノクローナル抗体などのポリペプチド結合タンパク質を含んでなるアフィニティーカラムを利用して、発現されたポリペプチドをアフィニティー精製することもまた可能である。これらのポリペプチドは、慣用的な技術を用いて、例えば利用するアフィニティーマトリックスに応じて、高塩溶出緩衝液中で、そしてその後、使用のためより低塩の緩衝液中に透析することによって、またはｐＨもしくは他の構成要素を変化させることによって、アフィニティーカラムからはずす（ｒｅｍｏｖｅ）ことが可能であるし、あるいは本発明から得られるポリペプチドなどの、アフィニティー部分の天然存在基質を用いて、競合的にはずすことが可能である。
【００２９】
したがって、抗ポリペプチド抗体、または本発明のポリペプチドと相互作用可能な他のタンパク質などの、ポリペプチド結合タンパク質を、その表面上に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定するか、分離するかまたは精製するのに適したカラムクロマトグラフィーマトリックスなどの固相支持体または類似の支持体に結合させることが可能である。固相接触表面への本発明のポリペプチド結合タンパク質の接着は、いかなる手段によって達成してもよく、例えば、磁気微小球体を、これらのポリペプチド結合タンパク質でコーディングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器中に保持してもよい。細胞混合物の懸濁物を、こうしたポリペプチド結合タンパク質を有する固相と接触させる。表面上に本発明のポリペプチドを有する細胞が、固定ポリペプチド結合タンパク質に結合し、そしてその後、非結合細胞を洗い流す。このアフィニティー結合法は、溶液から、こうしたポリペプチド発現細胞を精製するか、スクリーニングするか、または分離するのに有用である。細胞は、例えば、好ましくは細胞表面結合パートナーを切断する非毒性酵素を用いることによって、または緩衝液の組成を修飾することによりこうした放出を達成することによって、放出されることが可能である。
【００３０】
あるいは、本発明のＨＡＭポリペプチド発現細胞を含有すると推測される細胞混合物を、ビオチン化した、抗ＨＡＭ抗体などのポリペプチド結合タンパク質とインキュベーションすることが可能である。通常、約１時間以内で十分な結合が生じ、その後、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに混合物を通過させると、該ビーズにビオチン部分が高い親和性で結合するであろう（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９，  １９８６を参照されたい）。慣用法にしたがって、非結合細胞をカラムから洗い流し、そして結合細胞を溶出させる。この方法を用いて、膜結合ＨＡＭポリペプチドを発現する細胞を単離することが可能である。
【００３１】
ポリペプチドを精製する際、望ましい純度は、ポリペプチドの意図される使用に依存するであろう。例えば、ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで投与しようとするとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチドは、典型的には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、他のタンパク質に相当するバンドがまったく検出不能であるように精製される。当業者は、異なるグリコシル化、異なる翻訳後プロセシング等のため、該ポリペプチドに相当する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化される可能性があることを認識するであろう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一のタンパク質バンドによって示されるように、実質的に均一に精製される。バンドは、銀染色、クーマシーブルー染色によって、または（タンパク質が放射標識されている場合は）オートラジオグラフィーによって、視覚化可能である。
【００３２】
本発明のヒトＨＡＭポリペプチド内に、いくつかの異なる領域を識別することが可能である。これらのポリペプチドには、シグナルペプチドとも称されるリーダー配列が存在する。例えば、本発明の全長ポリペプチドに存在するリーダー配列は、配列番号２のアミノ酸１〜６０を含むと予測される。ＨＡＭのシグナルペプチド切断部位は、コンピュータアルゴリズムを用いて予測された。しかし、当業者は、シグナル配列の切断部位は、ポリペプチドを発現させる生物を含む、いくつかの要因に応じて多様である可能性があることを認識するであろう。したがって、本発明のＨＡＭポリペプチドの成熟型のＮ末端は、約２〜５アミノ酸異なる可能性がある。したがって、配列番号２を含んでなるＨＡＭポリペプチドの成熟型は、そのＮ末端で、配列番号２のアミノ酸５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５を含むことが可能である。したがって、成熟型は、配列番号２のアミノ酸５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５からほぼアミノ酸１３７９まで（または可溶性ポリペプチドの場合、アミノ酸１２３０まで）を含むことが可能である。配列番号２のＨＡＭポリペプチドの細胞外領域は、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０に位置する。ＥＧＦ様ドメイン、ＣＵＢドメイン、Ｃ型レクチンまたは炭水化物認識ドメイン（ＣＬＥＣＴドメイン）、ＫＥＬＣＨモチーフおよびラミニンＥＧＦ様ドメイン割り当てと共に、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの割り当ては、コンピュータアルゴリズムおよび先の報告（Ｇｕｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：１５２−１５７，  １９９９）に基づく。例えば、ヒトＨＡＭの細胞外領域は、推定上、それぞれ、配列番号２のほぼアミノ酸６３〜９０、２１１〜２４４、２６１〜２８０、９３〜２０８、５８１〜６１２、７４９〜８７３、６７０〜６８６、および１０１４〜１０５５に位置する、３つのＥＧＦ様ドメイン、ＣＵＢドメイン、ＫＥＬＣＨモチーフ、Ｃ型レクチンまたは炭水化物認識ドメイン、共通のガンマサイトカイン鎖の推定上のリガンド結合モチーフ、およびラミニンＥＧＦ様ドメインを含有する（図３を参照されたい）。ＨＡＭポリペプチドの膜貫通領域は、配列番号２のほぼアミノ酸１２３１〜１２５１に位置する。細胞内領域は、配列番号２のほぼアミノ酸１２５２〜１３７９に位置する。図２および３は、ＨＡＭの相対ドメインおよび保存システイン残基を示し、アトラクチンまたはマホガニーポリペプチドを示す。図４Ａ〜Ｂに提供する並列を利用して、ヒトＨＡＭポリペプチド（配列番号２）の対応するドメインに基づいて、ネズミＨＡＭポリペプチド（配列番号１９）の推定上のドメインを決定可能である。ネズミＨＡＭポリペプチド（配列番号１９）の相対ドメインおよびこうしたドメインをコードする対応するポリヌクレオチド断片（例えば配列番号１８の断片）が、本発明に特に含まれる。
【００３３】
したがって、本発明のネズミＨＡＭポリペプチド内に、いくつかの異なる領域を識別することが可能である。これらのポリペプチドには、シグナルペプチドとも称されるリーダー配列が存在する。例えば、本発明の全長ポリペプチドに存在するリーダー配列は、配列番号１９のアミノ酸１〜５９を含むと予測される。ネズミＨＡＭのシグナルペプチド切断部位は、コンピュータアルゴリズムおよびヒトＨＡＭとの並列を用いて予測された。しかし、当業者は、シグナル配列の切断部位は、ポリペプチドを発現させる生物を含む、いくつかの要因に応じて多様である可能性があることを認識するであろう。したがって、本発明のネズミＨＡＭポリペプチドの成熟型のＮ末端は、約２〜５アミノ酸異なる可能性がある。したがって、配列番号１９を含んでなるネズミＨＡＭポリペプチドの成熟型は、そのＮ末端で、配列番号１９のアミノ酸５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、または６４を含むことが可能である。したがって、成熟型は、配列番号２のアミノ酸５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、または６４からほぼアミノ酸１３７６まで（または可溶性ポリペプチドの場合、アミノ酸１２３０まで）を含むことが可能である。配列番号１９のネズミＨＡＭポリペプチドの細胞外領域は、配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１２２７に位置する。ＥＧＦ様ドメイン、ＣＵＢドメイン、Ｃ型レクチンまたは炭水化物認識ドメイン（ＣＬＥＣＴドメイン）、ＫＥＬＣＨモチーフおよびラミニンＥＧＦ様ドメイン割り当てと共に、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの割り当ては、コンピュータアルゴリズム、ヒトＨＡＭ（配列番号２）との並列および先の報告（Ｇｕｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：１５２−１５７，  １９９９）に基づく。例えば、ネズミＨＡＭの細胞外領域は、推定上、それぞれ、配列番号１９のほぼアミノ酸６２〜８９、２１０〜２４３、２６０〜２７７、９２〜２０７、５７８〜６０９、７４６〜８７０、６６７〜６８３、および１０１１〜１０５２に位置する、３つのＥＧＦ様ドメイン、ＣＵＢドメイン、ＫＥＬＣＨモチーフ、Ｃ型レクチンまたは炭水化物認識ドメイン、共通のガンマサイトカイン鎖の推定上のリガンド結合モチーフ、およびラミニンＥＧＦ様ドメインを含有する。ネズミＨＡＭポリペプチドの膜貫通領域は、配列番号１９のほぼアミノ酸１２２８〜１２４８に位置する。細胞内領域は、配列番号１９のほぼアミノ酸１２４９〜１３７６に位置する。
【００３４】
本発明は、ＨＡＭポリペプチドの全長および成熟型どちらも提供する。全長ポリペプチドは、最初に翻訳されるようなポリペプチドの完全一次アミノ酸配列を有するものである。全長ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ分子の完全オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）の翻訳によって、得ることが可能である。単一の遺伝子座から、選択的スプライシングによって、または多数の翻訳開始部位の使用によって、多数のｍＲＮＡ型が産生される場合、その遺伝子座に、いくつかの全長ポリペプチドがコードされることが可能である。本発明の全長ＨＡＭポリペプチドの例は、配列番号２のアミノ酸１〜１３７９および配列番号１９の１〜１３７６を含んでなる。こうした全長ポリペプチドは、例えば、それぞれ、配列番号２のアミノ酸１〜ほぼアミノ酸６０、および配列番号１９のアミノ酸１〜ほぼアミノ酸５９を含んでなるシグナルペプチドを含むよう意図される。
【００３５】
ポリペプチドの「成熟型」は、あるとすれば、例えばシグナル配列の切断またはプロドメインを除去するタンパク質分解的切断などの、翻訳後プロセシング工程を経たポリペプチドを指す。特定の全長ポリペプチドの多数の成熟型は、例えば、シグナル配列の不正確な切断によって、またはポリペプチドを切断するプロテアーゼの差別的制御によって、産生可能である。こうしたポリペプチドの成熟型（類）は、全長ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞において発現することによって、得ることが可能である。ポリペプチドの成熟型の配列はまた、シグナル配列またはプロテアーゼ切断部位の同定を通じて（例えば配列番号２の６０位および６１位のＳｅｒ−Ｌｙｓ残基間に、プロテアーゼ切断部位が予測される）、全長型のアミノ酸配列から決定可能である可能性もある。本発明のＨＡＭポリペプチドの成熟型の例は、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜アミノ酸１３７９に示す配列を含んでなる。
【００３６】
本発明のＨＡＭポリペプチドはまた、一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が、生物学的に活性であるポリペプチド、例えばポリペプチドの天然存在可溶性型を生じることが可能な選択的ｍＲＮＡプロセシングなどの転写後または翻訳後プロセシング事象から生じるポリペプチドも含む。本発明内にやはり含まれるのは、ポリペプチドからの１以上の末端アミノ酸（一般的には１〜５の末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去による、異なる種類の宿主細胞における発現に際する、ＮまたはＣ末端の相違などのタンパク質分解に起因しうる変異である。
【００３７】
別の態様において、本発明は、ＨＡＭポリペプチドの生理活性断片を提供する。「生理活性断片」によって、アトラクチンおよび／またはマホガニーポリペプチドと関連する生物学的活性、並びに／あるいは本発明の全長または成熟型のＨＡＭポリペプチドと関連する生物学的活性を有する、配列番号２または１９の断片を意味する。生理活性断片は、例えば単球およびマクロファージ活性化を誘導し、炎症誘発性サイトカイン（例えばＩＬ−６）の分泌および／または発現を促進し、代謝活性を変調し、体重獲得／損失を変調し、そして食欲およびエネルギー消費を変調することを含む、１以上の生物学的活性を有することが可能である。ＨＡＭポリペプチド分子の生理活性断片の例には、ほぼアミノ酸６１〜１２３０を含んでなる配列番号２に示される配列、ほぼアミノ酸６０〜１２２７を含んでなる配列番号１９に示される配列、および前述のいずれかの断片が含まれる。こうした生理活性断片は、予測される膜貫通ドメイン（例えば配列番号２のほぼアミノ酸１２３１で始まり、アミノ酸１２５１までのドメイン）を欠く潜在的な可溶性分子に相当する。ＨＡＭポリペプチドの生理活性断片は、例えばＨＡＭポリペプチド同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）、あるいは配列番号２または１９のＨＡＭポリペプチドに対して発展させた抗体と相互作用することが可能である。本発明のＨＡＭポリペプチドまたはＨＡＭポリペプチドの生理活性断片が、望ましい活性を有するかどうか決定する方法は、以下に記載する方法いずれかによりポリペプチドをアッセイすることによって、達成可能である。
【００３８】
したがって、本発明のポリペプチドは膜結合であることも可能であり、または分泌され、そしてしたがって可溶性であることも可能である。可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能である。一般的に、可溶性ポリペプチドは、培地から、例えば遠心分離によって、望ましいポリペプチドを発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を分離し、そして望ましいポリペプチドの存在に関して培地（上清）をアッセイすることによって、または培養から得られる細胞不含培地を、ＨＡＭに特異的な抗体と接触させることによって、同定可能である（そして非可溶性膜結合対応物と区別可能である）。培地中のポリペプチドの存在は、ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがって、該ポリペプチドの可溶性型であることを示す。
【００３９】
１つの態様において、可溶性ポリペプチド（例えばＨＡＭポリペプチドの生理活性断片）は、細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでなるが、細胞膜におけるポリペプチドの保持を引き起こすであろう膜貫通ドメインを欠く。いくつかの態様において、可溶性ポリペプチドは、例えばシグナル配列または細胞質ドメインを含む、１以上のさらなるドメインに加えて、膜貫通ドメインを欠く。本発明にしたがった可溶性ポリペプチドは、産生される細胞から分泌される限り、細胞質ドメイン、またはその一部を含むことも可能である。
【００４０】
一般的に、可溶性型の使用が、特定の適用に好適である。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易である。さらに、可溶性ポリペプチドは、一般的に、静脈内投与により適している。
【００４１】
本発明はまた、炎症性反応、免疫系活性、体重獲得／損失、および／またはエネルギー代謝を変調する能力を保持するポリペプチドおよび細胞外ドメインの断片も提供する。こうした断片は、上述のように、可溶性ポリペプチドであることも可能である。
【００４２】
やはり本明細書に提供するのは、配列番号２または１９に示す配列の少なくとも２５、または少なくとも３０の隣接するアミノ酸を含んでなるポリペプチド断片である。細胞質ドメインに由来する断片は、シグナル伝達の研究に、そして阻害性シグナルなどの生物学的シグナルの伝達に関連する細胞過程を制御するのに、そしてシグナル伝達分子との受容体相互作用の小分子模倣物（ｍｉｍｉｃｓ）または阻害剤を同定するのに使用を見出す。抗体を生成する免疫原として、配列番号２または１９の少なくとも約８〜１１、またはより好ましくは、１０〜３０の隣接するアミノ酸を含んでなるポリペプチド断片と共に、より大きいポリペプチドが使用可能である。
【００４３】
開示するポリペプチドおよび断片の天然存在変異体およびこれらから得られる変異体を本明細書に提供する。変異体は、開示するポリペプチドおよび断片に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示すことが可能である。やはり提供するのは、本明細書に開示するアミノ酸配列に、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたは断片である。パーセント同一性は、視覚的検査および数学的計算によって決定可能である。あるいは、２つのタンパク質配列のパーセント同一性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ４８：４４３，  １９７０）に基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能な、ＧＡＰプログラムなどのコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータには：（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５，  １９９２）に記載されるようなスコアリングマトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ加重長；および（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。同様の比較パラメーターは、例えばＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ（例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．を参照されたい）、またはＰＩＬＥＵＰ（Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３５：３５１−３６０（１９８７）の進行性並列法の単純化）などの他のコンピュータプログラムを用いて実行可能である。
【００４４】
本発明の変異体には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象またはタンパク質分解的切断から生じるものが含まれる。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、例えば、タンパク質の天然存在可溶性型などの一部切除されているが生物学的に活性であるタンパク質を生じる可能性がある。タンパク質分解に起因しうる変異には、例えば、タンパク質からの１以上の末端アミノ酸（一般的には１〜５の末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去による、異なる種類の宿主細胞における発現に際する、ＮまたはＣ末端の相違が含まれる。アミノ酸配列の相違が遺伝子多型（タンパク質を産生する個体間の対立遺伝子変動）に起因しうるタンパク質もまた、本明細書に意図される。
【００４５】
本発明の範囲内のさらなる変異体には、グリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基等などの他の化学部分と共有結合的コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートを形成することによって、修飾されて誘導体を生成することが可能なポリペプチドが含まれる。共有結合的誘導体は、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基、またはＮ末端もしくはＣ末端に、化学部分を連結することによって、調製可能である。以下により詳細に論じるように、付着している診断用（検出可能）剤または療法剤を含んでなるコンジュゲートが本明細書に意図される。
【００４６】
他の誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体としての組換え培養中での合成によるなど、他のタンパク質またはポリペプチドと該ポリペプチドの共有結合コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートが含まれる。融合ポリペプチドの例は、オリゴマーと関連して、以下に論じる。さらに、融合ポリペプチドは、精製および同定を容易にするため付加するペプチドを含んでなることが可能である。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つがＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３）であり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えポリペプチドの迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ９２５９としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネティカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００４７】
本明細書に提供する変異ポリペプチドの中に、配列番号２または１９の成熟ＨＡＭポリペプチドの天然結合特性または生物学的活性を保持する、天然ＨＡＭポリペプチドの変異体またはその実質的な同等物がある。例えば、変異体には、天然型と本質的に同じ結合親和性で結合パートナーに結合する分子が含まれる。結合親和性は、例えば米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるように、そして以下に示すように、慣用的な方法によって測定可能である。
【００４８】
変異体には、天然型に実質的に相同であるが、１以上の欠失、挿入または置換のため、天然型と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。特定の態様には、限定されるわけではないが、天然配列と比較した際、アミノ酸残基の１〜１０の欠失、挿入または置換を含んでなるポリペプチドが含まれる。
【００４９】
既定のアミノ酸を、例えば類似の物理化学的特性を有する残基によって置換することが可能である。こうした保存的置換の例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するなどの、１つの脂肪族残基の別のものでの置換；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基の別のものでの置換；あるいはＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するなどの、１つの芳香族残基の別のものでの置換が含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換を伴うものが公知である。やはり含まれるのは、Ｄ−アミノ酸に対するＬ−アミノ酸の置換である。Ｄ−アミノ酸の存在は、プロテアーゼに対する抵抗性を提供し、そしてポリペプチドまたはその断片の安定性を増加させる。本発明のＨＡＭポリペプチドに対するアミノ酸置換および他の改変（欠失、挿入等）は、これらが、図２Ａ〜Ｃに示す「コンセンサス」に示される保存残基への変化を生じる場合、ＨＡＭポリペプチド活性を改変するかまたは破壊する可能性がより高いと予測される。逆に、その保存される位のＨＡＭポリペプチド残基に対して、１以上の図２のコンセンサス配列残基の置換が生じる変化をＨＡＭポリペプチドに行う場合、こうした改変がＨＡＭポリペプチド機能に影響を及ぼす可能性はより低い。１つの側面において、本発明は、１〜１０のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有するＨＡＭポリペプチドを提供する。
【００５０】
同様に、本発明のポリヌクレオチドには、１以上の欠失、挿入または置換のため、天然ＨＡＭポリヌクレオチドと異なるが、生物学的に活性であるポリペプチドをコードする変異体が含まれる。
【００５１】
さらに、「保存的に修飾された変異体」は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド両方にあてはまる。特定のポリヌクレオチドに関して、保存的に修飾された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド中のコドンを指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一のポリヌクレオチドが、既定のタンパク質いずれかをコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定されるすべての位で、コードされるポリペプチドを改変することなく、記載した対応するコドンのいずれかに、コドンを改変することが可能である。こうした変異は「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾される変異の１つの種類である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべてのポリヌクレオチド配列はまた、核酸のすべてのありうるサイレント変異も記載する。当業者は、ポリヌクレオチド中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を生じることが可能であることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が、記載する配列各々に潜在する。
【００５２】
本発明には、結合する天然パターングリコシル化を含むまたは含まない本発明のポリペプチドがさらに含まれる。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７細胞）で発現したポリペプチドは、発現系の選択に応じて、分子量およびグリコシル化パターンにおいて、天然ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異なる可能性もある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌発現系での本発明のポリペプチドいずれかの発現は、ポリペプチドの非グリコシル化型を提供する。さらに、既定の調製は、多数の異なってグリコシル化されたタンパク質種を含む可能性がある。グリコシル基は、慣用法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じて、除去可能である。一般的に、本発明のグリコシル化ポリペプチドは、モル過剰のグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションすることによって、その炭水化物部分を除去可能である。
【００５３】
真核ポリペプチドにおけるＮグリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙによって特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏを除くアミノ酸いずれかであり、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。本発明のＨＡＭポリペプチドは、いくつかの推定上のグリコシル化部位を有する。例えば、１以上の以下の位のＡｓｎ残基が潜在的なグリコシル化部位である：配列番号２の７６Ｎ、１７４Ｎ、１９８Ｎ、２１４Ｎ、２７２Ｎ、３２６Ｎ、３８０Ｎ、５４２Ｎ、５９０Ｎ、６９７Ｎ、７０４Ｎ、７６３Ｎ、７７８Ｎ、８１７Ｎ、８３１Ｎ、８４２Ｎ、８９８Ｎ、９４２Ｎ、１０３３Ｎ、１１４９Ｎ、１１５７Ｎ、１２０１Ｎ、および１２１０Ｎ。ネズミＨＡＭもまた、配列番号１９の７５Ｎ、１７３Ｎ、１９７Ｎ、２１３Ｎ、２７１Ｎ、３２３Ｎ、３７８Ｎ、５３９Ｎ、５８７Ｎ、６９４Ｎ、７０１Ｎ、７６０Ｎ、７７５Ｎ、８１４Ｎ、８２８Ｎ、８３９Ｎ、８９５Ｎ、９３９Ｎ、１０３０Ｎ、１１４６Ｎ、１１５４Ｎ、１１９８Ｎ、および１２０７Ｎに、推定上のグリコシル化部位を有する。ポリペプチド細胞外ドメインにおけるＮグリコシル化部位を修飾し、グリコシル化を排除して、哺乳動物発現系および酵母発現系における炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ）の発現を可能にしうる。したがって、これらの残基の修飾（例えばグリコペプチダーゼでの処理）または置換または欠失は、本発明の成熟ＨＡＭポリペプチドの活性を変調することが可能である。
【００５４】
これに対応して、アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは配列の末端または内部残基の欠失をコードする、類似のポリヌクレオチド構築物が、本発明に含まれる。これらのトリプレット（例えばＡｓｎ−Ｘ−Ｙ）をコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加、または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の付着の防止を生じるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって交換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎグリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは、トリプレット中のＳｅｒまたはＴｈｒを、Ａｌａなどの別のアミノ酸で交換することが可能である。タンパク質のＮグリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ  ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。当業者は、上述のようなＨＡＭのＡｓｎ残基と共に、Ａｓｎ−Ｘ−ＹトリプレットのＳｅｒおよびＴｈｒ残基に対応するコドンを同定可能である。
【００５５】
変異体の別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を改変して、Ｃｙｓ残基が欠失されるかまたは他のアミノ酸で置換されるようにして、フォールディングまたは再生に際して、誤った分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することが可能である。本発明のＨＡＭポリペプチドの、いくつかの推定上の保存されるＣｙｓ残基が、図２および図４に提供される並列に同定される。
【００５６】
隣接する二塩基性アミノ酸残基の修飾によって他の変異体を調製して、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増進する。ＥＰ  ２１２，９１４は、タンパク質におけるＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変するように、残基を欠失させ、付加し、または置換することによってこれらの隣接する塩基性残基の発生を排除して、ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化する。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断に大幅により感受性でなく、そしてＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する、保存的でそして好ましいアプローチに相当する。
【００５７】
オリゴマー
本発明に含まれるのは、目的のポリペプチドに連結されたＨＡＭポリペプチドまたはその生理活性断片を含んでなる、オリゴマーおよび融合ポリペプチドである。好ましい態様において、融合パートナーは、ＨＡＭポリペプチドまたはその生理活性断片のＣ末端に連結される。こうしたオリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーを含む、共有結合または非共有結合多量体型であることが可能である。上述のように、好ましいポリペプチドは可溶性であり、そしてしたがって、これらのオリゴマーは、典型的には、可溶性ポリペプチドを含んでなる。本発明の１つの側面において、オリゴマーはポリペプチド構成要素の結合能を維持し、そしてしたがって、二価、三価等の結合部位を提供する。
【００５８】
本発明の１つの態様は、ポリペプチドに融合しているペプチド部分間の共有または非共有相互作用を介して連結している多数のポリペプチドを含んでなるオリゴマーに関する。こうしたペプチド部分は、ペプチドリンカー（スペーサー）であることも可能であるし、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであることも可能である。ペプチドリンカーの例には、−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−−、ＧＧＧＧＳ（配列番号４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号６）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号７）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９）、またはＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１０）が含まれる。連結部分は、例えばＨｕｓｔｏｎ，  Ｊ．Ｓ．ら，  ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、Ｗｈｉｔｌｏｗ，  Ｍ．ら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９８９−９９５（１９９３）、およびＮｅｗｔｏｎ，  Ｄ．Ｌ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：５４５−５５３（１９９６）に記載される。他の適切なペプチドリンカーは、本明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものである。望ましいペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、適切な慣用的技術いずれかを用いて、本発明のＨＡＭポリペプチドまたは生理活性断片をコードするポリヌクレオチドの間に、そして該ポリヌクレオチドと同じ読み枠で挿入可能である。特定の態様において、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって分離された、２〜４のＨＡＭポリペプチドの生理活性断片（例えば可溶性断片）を含んでなる。１つの態様において、本発明は、ＦｃポリペプチドドメインおよびＨＡＭポリペプチドまたはその生理活性断片（例えば配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０に示すような断片）を有する融合ポリペプチドを提供する。以下により詳細に記載するように、付着するポリペプチドのオリゴマー化を促進可能なペプチドの中に、ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドがある。
【００５９】
１つの代替法として、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーまたは融合ポリペプチドを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された特定の異種ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドの調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，  １９９１）；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７，  １９９０）；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（“免疫グロブリン融合タンパク質の構築”，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌ．４，  １０．１９．１−１０．１９．１１ページ，  １９９２中）に記載されている。
【００６０】
本発明の１つの態様は、本発明のＨＡＭポリペプチドまたは生理活性断片を抗体由来のＦｃポリペプチドに融合させることによって生成される２つの融合タンパク質を含んでなる二量体に関する。ＨＡＭポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞でＨＡＭポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質を発現させ、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されて、二価分子を生じるのを可能にする。
【００６１】
Ｆｃポリペプチドには、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいずれかまたはすべてを含んでなる抗体のＦｃ領域で構成される、ポリペプチドの天然型および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除型もまた含まれる。好ましいポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペプチドを含んでなる。Ｆｃポリペプチドは、好ましくは、本発明のＨＡＭポリペプチドまたは生理活性断片のＣＯＯＨ末端に連結される。
【００６２】
ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／１０１５１（本明細書に援用される）に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る、一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、本明細書に援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３９９２−４００１，  １９９４）に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ  ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。
【００６３】
Ｆｃ部分を含んでなる上述の融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。
【００６４】
他の態様において、本発明のポリペプチドは、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関して置換可能である。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、４つものＨＡＭ細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能である。
【００６５】
本発明のオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９，  １９８８）、そして以来、多様な異なるタンパク質で見出されてきている。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する、天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。
【００６６】
ジッパードメイン（本明細書において、オリゴマー化、またはオリゴマー形成ドメインとも呼ばれる）は、繰り返される７残基反復を含んでなり、しばしば４つまたは５つのロイシン残基が、他のアミノ酸中に点在する。ジッパードメインの例は、酵母転写因子ＧＣＮ４に見られるものおよびラット肝臓に見られる熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１，  １９８９）である。２つの核トランスフォーミングタンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎもまたジッパードメインを示し、ネズミプロトオンコジーンｃ−ｍｙｃの遺伝子産物も同様である（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４０：１７５９，  １９８８）。核発癌遺伝子、ｆｏｓおよびｊｕｎの産物は、ヘテロ二量体を優先して形成するジッパードメインを含んでなる（Ｏ’Ｓｈｅａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５；６４６，  １９８９、ＴｕｒｎｅｒおよびＴｉｊａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８９，  １９８９）。
【００６７】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）タンパク質もまた、ジッパードメインを所有する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉｌｄ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５４７，  １９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：３９４，  １９９１；ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏｓ，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：７０３，  １９９０）。これらの融合体形成性ウイルスタンパク質のジッパードメインは、該タンパク質の膜貫通領域の近くにあり；ジッパードメインが、該融合体形成性タンパク質のオリゴマー構造に寄与する可能性が示唆されてきている。融合体形成性ウイルスタンパク質のオリゴマー化は、融合孔（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｒｅ）形成に関与している（Ｓｐｒｕｃｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８８：３５２３，  １９９１）。ジッパードメインはまた、熱ショック転写因子のオリゴマー化に役割を果たしているとも報告されてきている（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：２３０，  １９９３）。
【００６８】
ジッパードメインは、短い、平行コイルドコイル（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ）として折りたたまれている（Ｏ’Ｓｈｅａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５３９，  １９９１）。平行コイルドコイルの一般的構造は、Ｃｒｉｃｋにより提唱されたような「ノブを穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」パッキング（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ６：６８９）によって、特徴付けられている。ジッパードメインによって形成された二量体は、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗｅｒｔ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９８：２９３；１９７５）の表記にしたがって、（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎと表される、７残基反復によって安定化され、ここでａおよびｄは一般的に疎水性残基であり、ｄはロイシンであり、これらはらせんの同じ面に並ぶ。逆に荷電した残基は普通、ｇおよびｅ位に存在する。したがって、２つのらせん状ジッパードメインから形成される平行コイルドコイルにおいて、第一のらせんの疎水性側鎖によって形成された「ノブ」は、第二のらせんの側鎖間に形成された「穴」にパッキングされる。
【００６９】
ｄ位の残基（しばしばロイシン）は、巨大な疎水性安定化エネルギーに寄与し、そしてオリゴマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．  ３８：２２９，  １９９１）。Ｌｏｖｅｊｏｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１２８８，  １９９３）は、らせんが上−上−下に走る、三重鎖αらせん束合成を報告した。彼らの研究によって、疎水性安定化エネルギーが、らせん単量体からのコイルドコイルの形成のための主要な原動力を提供していることが裏付けられた。これらの研究はまた、静電相互作用がコイルドコイルの化学量論および形状に寄与していることも示している。ロイシンジッパーの構造のさらなる議論は、Ｈａｒｂｕｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１，  ２６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９３）に見られる。
【００７０】
可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例には、ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９４／１０３０８号に記載されるロイシンジッパーおよび本明細書に援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１，  １９９４）に記載される肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーが含まれる。修飾ロイシンジッパーに融合している異種タンパク質の安定した三量体化を可能にする、該修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら（Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：２６７−２７８，  １９９４）に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合された本発明の生理活性断片（例えば可溶性断片）を含んでなる組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現し、そして形成される可溶性オリゴマーを培養上清から回収する。
【００７１】
特定のロイシンジッパー部分は、三量体を形成する。１つの例は、本明細書に完全に援用されるＨｏｐｐｅらおよび米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるような、肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。この肺ＳＰＤ由来ロイシンジッパーペプチドは、アミノ酸配列：Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（配列番号１１）を含んでなる。
【００７２】
三量体化を促進するロイシンジッパーの別の例は、米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるような、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号１２）を含んでなるペプチドである。１つの別の態様において、Ｎ末端Ａｓｐ残基が付加され；別の態様では、該ペプチドはＮ末端Ａｒｇ残基を欠いている。
【００７３】
オリゴマー化を促進する特性を保持する、前述のジッパーペプチドの断片もまた、使用可能である。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、前述のアミノ酸配列に示される１つまたは２つのＮ末端またはＣ末端残基を欠くペプチドが含まれる。ロイシンジッパーは、天然存在ロイシンジッパーペプチドから、例えばオリゴマー化を促進するペプチドの能力が保持されるような、天然アミノ酸配列の保存的置換（類）を介して、得ることが可能である。特定の態様において、ロイシンジッパー部分のロイシン残基を、イソロイシン残基によって置換する。イソロイシンを含んでなるこうしたペプチドは、イソロイシンジッパーと呼ぶことも可能であるが、本明細書において使用するような用語「ロイシンジッパー」に含まれる。
【００７４】
抗体
上述した、ポリペプチド、断片（例えば可溶性または生理活性断片）、変異体、融合タンパク質等は、これらと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用可能である。より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質等は、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含有する。適切な抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもコンホメーション性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは、互いに共有結合によって連結される一連の直鎖アミノ酸で構成されるが、コンホメーション性または断続的エピトープは、タンパク質フォールディングに際してごく近接するポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分で構成される（Ｃ．Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙ，  Ｊｒ．およびＰ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  第２版，  １９９６））。フォールディングされたタンパク質は、複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多い；しかしながら、タンパク質のコンホメーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ．  Ｊａｎｅｗａｙ，  Ｊｒ．およびＰ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  第２版，  １９９６））。エピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定することも可能である。
【００７５】
開示するポリペプチドに由来するエピトープは、モノクローナル抗体を含む抗体を作成するのに有用であり、そしてアッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの材料から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に周知の技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて、産生可能である。
【００７６】
開示するポリペプチドによって引き出されるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっても、慣用的技術によって調製可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｋｅｎｎｅｔら（監修），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【００７７】
本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図され、そしてこうした細胞株は、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し；そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含んでなる。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
【００７８】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し、そして療法目的などで、抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供することが可能である。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変部（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常部を含んでなる。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変部断片（抗原結合部位を欠く）を含んでなることが可能である。キメラおよび工学技術で作成されるさらなるモノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，  １９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，  １９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，  １９８９）、およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９，  Ｍａｙ  １９９３）に記載されるものが含まれる。トランスジェニック的に抗体を生成する方法は、ＧＢ  ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号、並びにそれらから優先権を請求する関連特許に見出すことが可能であり、該特許はすべて本明細書に援用される。トランスジェニック的に抗体を生成する方法は、ＧＢ  ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号、並びにそれらから優先権を請求する関連特許に見出すことが可能であり、該特許はすべて本明細書に援用される。好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒトであり；こうしたヒト抗体を生成する技術もまた知られ、そしてこうした抗体を生成するのに有用なトランスジェニックマウスが、例えばＭｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ（ニュージャージー州プリンストン）およびＡｂｇｅｎｎｉｘ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）から商業的に入手可能である。
【００７９】
慣用的技術によって産生可能な、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【００８０】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで、本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するアッセイにおいて使用可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって本発明のポリペプチドまたは断片を精製するのにも使用可能である。
【００８１】
本発明のポリペプチドの結合パートナーへの結合を遮断する抗体を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害することが可能である。こうした遮断抗体は、ＨＡＭポリペプチドまたは生理活性断片の結合パートナーを発現している特定の細胞へのＨＡＭポリペプチドまたは生理活性断片の結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて、同定することも可能である。あるいは、遮断抗体は、標的細胞への本発明のポリペプチドの結合から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて同定可能である。抗体は、例えば、ＨＡＭポリペプチドが仲介する細胞活性を阻害する能力に関してアッセイすることが可能である。
【００８２】
こうした抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用するか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、抗体が結合するポリペプチドによって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。このように、本発明のポリペプチドと細胞表面（結合パートナー）受容体との相互作用によって、（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療可能である。療法は、ＨＡＭポリペプチドが仲介する生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片を使用する。さらに、診断標識の療法剤を、本発明の抗体とコンジュゲート化して、それによって、ＨＡＭポリペプチドを発現している細胞に、療法剤または診断用剤をターゲティングすることが可能である。
【００８３】
抗体は、アゴニスト性（すなわちＨＡＭ模倣性）特性に関してスクリーニング可能である。アゴニスト性抗体には、ＨＡＭに結合し、そしてＨＡＭを活性化する（例えばＨＡＭ分子を架橋することによって）抗体が含まれる。こうした抗体は、細胞表面上のＨＡＭ同族体への結合に際して、ＨＡＭポリペプチドが細胞表面リガンドに結合する際に誘導される生物学的影響と同様の生物学的影響（例えば生物学的シグナルの伝達）を誘導する。
【００８４】
ＨＡＭポリペプチドまたはその断片に対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、またはキャリアーを含んでなる組成物が、本明細書に提供される。こうした組成物の適切な構成要素は、本明細書に記載されるとおりであり、そしてＨＡＭポリペプチドまたはその断片を含有する組成物に関して記載されるものと同様である。やはり本明細書に提供するのは、抗体に付着している検出可能な剤（例えば診断用剤）または療法剤を含んでなるコンジュゲートである。該コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法に使用を見出す。
【００８５】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、ＨＡＭポリペプチドおよびその生理活性断片をコードするポリヌクレオチドも提供する。用語「ポリヌクレオチド」は、長さ少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー型を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型であることが可能である。該用語には、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖および二本鎖型が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（例えばイントロンおよびエクソンを含有する配列）、化学的に合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、全長遺伝子およびｃＤＮＡ分子と共に、その断片の組み合わせが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、優先的に、ヒト供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種に由来するものもまた、含む。
【００８６】
「単離ポリヌクレオチド」によって、由来する生物の天然存在ゲノムにおいて、すぐ隣接している（５’端にあるものおよび３’端にあるもの）コード配列のどちらとも、すぐには隣接していないポリヌクレオチドを意味する。該用語にはしたがって、例えば、ベクター、例えば発現ベクターに；自律複製プラスミドもしくはウイルスに；または原核もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれた、あるいは他の配列と独立の別個の分子（例えばｃＤＮＡ）として存在する、組換えポリヌクレオチド分子が含まれる。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドは、（１）配列番号１または１８に示す配列；（２）配列番号１または１８に示す配列に相補的な配列；（３）中程度の条件下から非常にストリンジェントな条件下で、（１）または（２）のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、長さ約５０〜１００の連続する塩基、長さ２００〜３００の連続する塩基、または長さ５００〜１０００またはそれ以上の連続する塩基である、配列番号１または１８の断片、あるいはその相補体；および（４）ＴがまたＵであることも可能である（例えばＲＮＡ配列）、（１）、（２）、または（３）の配列を含んでなる。本発明にやはり含まれるのは、本発明のポリヌクレオチドの相同体である。これらの相同体は、適切な供給源からのゲノムまたはｃＤＮＡ分子の単離、あるいは入手可能な配列データベースのコンピュータ検索を含む、いくつかの方法で、同定可能である。本明細書に記載するアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド相同体単離のためのプローブまたはプライマーとして、あるいはデータベース検索のためのクエリー配列として、使用可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列は、アミノ酸配列（例えば配列番号２または１９の配列）から「逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」することによって、得ることが可能である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して、ＨＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、そして増幅することが可能である。本発明のポリヌクレオチドの断片は、本発明のＨＡＭポリヌクレオチドの関連配列を同定するかもしくは増幅する、または本発明のＨＡＭポリヌクレオチドの全長配列を得る、プローブおよびプライマーとして有用である。オリゴヌクレオチドは、発現ベクターに、ＤＮＡ断片の増幅された組み合わせを挿入するのを容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を、さらに含有することが可能である。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，  Ｗｕら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，サンディエゴ（１９８９），  ｐｐ．１８９−１９６；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｎｉｓら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。
【００８８】
本発明にはまた、減少したストリンジェンシー条件下、より好ましくは中程度にストリンジェントな条件下、そして最も好ましくは、非常にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載するＨＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドも含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｅ．Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  第９章および第１１章；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ，  セクション２．１０および６．３−６．４、本明細書に援用される）によって示されており、そして例えば核酸の長さおよび／または塩基組成に基づいて、一般の当業者によって容易に決定可能である。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または約４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、並びに約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄条件の使用を伴う。一般的に、非常にストリンジェントな条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件と定義されるが、およそ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）をＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に対して置換することが可能である；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間行う。当業者に知られるように、そして以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応および二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することによって、必要に応じて、望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するよう、洗浄温度および洗浄塩濃度を調整可能であることを理解すべきである（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい）。核酸を未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる際、ハイブリッド長は、ハイブリダイズする核酸のものと仮定される。既知の配列の核酸をハイブリダイズさせる際、ハイブリッド長は、核酸の配列を並列し、そして最適配列相補性を持つ、単数または複数の領域を同定することによって、決定可能である。長さ５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５から１０℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式にしたがって決定する。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）である。長さ１８塩基対を超えるハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、ハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）の長さを有し、そしてハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドと、少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。
【００８９】
本発明の他の態様には、配列番号２または１９に示す配列を有するＨＡＭポリペプチドの別個のドメインをコードする配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。コンピュータ解析は、ＨＡＭポリペプチドのシグナルペプチドが配列番号２の残基６０の後で、そして配列番号１９の残基５９の後で切断される可能性が最も高いと予測するが、他のありうる切断部位には、アミノ酸５４、５５、５９、１７２、または１７３の後が含まれる。これらの切断部位は、成熟ＨＡＭポリペプチドが、配列番号２のほぼアミノ酸５５〜１３７９、ほぼ５６〜１３７９、ほぼ６０〜１３７９、ほぼ６１〜１３７９、またはほぼ１７４〜１３７９、および配列番号１９のほぼ５５〜１３７６、ほぼ５６〜１３７６、ほぼ６０〜１３７６、ほぼ６１〜１３７６、またはほぼ１７３〜１３７６を含んでなることを予測する。例えば配列番号２のほぼアミノ酸６３〜９０、２１１〜２４３、および２６１〜２８０に位置するＥＧＦ様ドメインは、細胞外シグナル伝達または細胞ガイダンスに関与する可能性がある。ＣＵＢドメイン、ＫＥＬＣＨモチーフ、Ｃ型レクチンまたは炭水化物認識ドメイン、共通のガンマサイトカイン鎖の推定上のリガンド結合モチーフ、およびラミニンＥＧＦ様ドメインは、それぞれ、配列番号２のほぼアミノ酸９３〜２０８、５８１〜６１２、７４９〜８７３、６７０〜６８６、および１０１４〜１０５５に位置する（図３を参照されたい）。膜貫通領域は、配列番号２のほぼアミノ酸１２３１〜１２５１に、そして細胞質ドメインは、ほぼアミノ酸１２５２〜１３７９に存在する。したがって、本発明は、これらの別々のポリペプチド断片と共に、各ドメインを別個に、または多様な組み合わせで含んでなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、配列番号２のほぼアミノ酸１〜５４、１〜５５、１〜５９、１〜６０、または１〜１７３にあるシグナルペプチドをコードする、配列番号１のほぼヌクレオチド１〜１６２、ほぼ１〜１６５、ほぼ１〜１７７、ほぼ１〜１８０、またはほぼ１〜５２２；配列番号２のそれぞれアミノ酸５５〜１３７９、５６〜１３７９、６０〜１３７９、６１〜１３７９、または１７４〜１３７９を含んでなる成熟ＨＡＭポリペプチドをコードする、配列番号１のほぼヌクレオチド１６３〜４１３７、ほぼ１６６〜４１３７、ほぼ１７８〜４１３７、ほぼ１８１〜４１３７、またはほぼ５２３〜４１３７；配列番号２のアミノ酸１２３１〜１２５１を含んでなる膜貫通領域をコードする、配列番号１のヌクレオチド３６９１〜３７５３；配列番号２のそれぞれアミノ酸５５〜１２３０、５６〜１２３０、６０〜１２３０、６１〜１２３０、または１７４〜１２３０を含んでなるＨＡＭポリペプチドの細胞外ドメインをコードする、配列番号１のヌクレオチド１６３〜３６９０、１６６〜３６９０、１７８〜３６９０、１８１〜３６９０、または５２３〜３６９０；および配列番号２のアミノ酸１２５２〜１３７９を含んでなる細胞質ドメインをコードする、配列番号１のヌクレオチド３７５４〜４１３７を提供する。
【００９０】
さらに、本発明は、配列番号１９のほぼアミノ酸１〜５９にあるシグナルペプチドをコードする、配列番号１８のほぼヌクレオチド１〜１７７；配列番号１９のほぼアミノ酸６０〜１３７６を含んでなる、成熟ネズミＨＡＭポリペプチドをコードする、配列番号１８のほぼヌクレオチド１７８〜４１２８；および配列番号１９のアミノ酸６０〜１２２７を含んでなる、ネズミＨＡＭポリペプチドの細胞外ドメインをコードする、配列番号１８のほぼヌクレオチド１７８〜３６８１を提供する。
【００９１】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに相当する遺伝子の不全または不十分な量によって（直接または間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのにも使用可能である。本発明のポリヌクレオチドに対応する配列の本明細書の開示によって、不全遺伝子の検出、および正常遺伝子でのその置換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列と、該遺伝子に不全を宿すると疑われる被験者由来の遺伝子のものとを比較することによって、検出可能である。
【００９２】
本発明のポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、当該技術分野に知られるものと共に本明細書に記載するものなどの発現系の利用を含む、適切な技術いずれによって達成することも可能である。１つの態様において、本発明は、本発明のＨＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを提供する。当該技術分野に知られる組換え技術によって、例えば商業的に入手可能な発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチド（例えば配列番号１または１８に示す配列を含んでなるポリヌクレオチド）を、機能可能であるように挿入することが可能である。典型的には、ポリヌクレオチドは、調節配列または制御配列の下流（または３’）に、該配列に機能可能であるように連結されて挿入されるであろう。本明細書において、「調節配列」または「制御配列」は、交換可能に用いられ、プロモーター、エンハンサー−プロモーターの組み合わせ、あるいは下流ポリヌクレオチド配列の発現または転写に影響を及ぼす他の配列が含まれる。プロモーターは、転写が始まる点の前の（上流の）、典型的には１００ヌクレオチド対以内のＤＮＡ分子の領域で構成される、転写制御要素である。別の転写制御要素はエンハンサーであり、これは、時間、位置、および発現レベルに関して、特異性を提供する。プロモーターと異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在していれば、転写部位から多様な距離に位置しても、機能することが可能である。エンハンサーはまた、転写開始部位の下流に位置することも可能である。他の制御配列には、転写終結配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）等が含まれる。
【００９３】
典型的には、コード配列をプロモーターの調節下に置くには、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流（３’）に、ペプチドまたはポリペプチドの翻訳読み枠の翻訳開始部位を配置する必要がある。こうした制御要素には、限定されるわけではないが、いくつかのみを挙げると、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ極初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、および酵母α−接合因子のプロモーターが含まれる。
【００９４】
発現ベクターおよびその構築法は、当業者に知られる（Ａｕｓｕｂｅｌら、本明細書に引用）。適切なベクターには、プラスミド、並びに、とりわけヘルペスウイルス、レトロウイルス、カナリア（ｃａｎａｒｙ）ポックスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどのウイルスベクター、並びにその誘導体が含まれる。
【００９５】
ポリヌクレオチドおよび制御配列は、例えば発現ベクター内で、ポリヌクレオチドのコード配列（例えばＨＡＭコード配列）が制御配列に結合されている際、発現を可能にするような方式で連結されている場合、「機能可能であるように連結」されている。一般的に、望ましい宿主細胞において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子（例えばｋａｎｒ、ａｍｐｒ）が発現ベクターに取り込まれる。
【００９６】
本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドにコードされる本発明のポリペプチドまたは断片を調製することが可能である。ポリペプチド産生法は、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、その後、細胞から、または宿主細胞を増殖させた培地から、発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる。発現されたポリペプチドを精製する方法は、使用する宿主細胞種、およびポリペプチドが膜結合であるか、またはポリペプチドの分泌された可溶性型であるかにしたがって、多様であろう。
【００９７】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種）をコードする配列を発現ベクターに取り込むことが可能である。ポリヌクレオチドがまず転写され、そしてｍＲＮＡが翻訳され、シグナルペプチドを含んでなる融合タンパク質になるように、シグナルペプチドのＤＮＡ配列を、本発明のポリヌクレオチド配列に、インフレームで融合させることが可能である。膜貫通タンパク質を細胞表面に導くシグナルペプチドが使用可能であるし、またはタンパク質の可溶性型の分泌を促進する、異なるシグナルペプチドが使用可能である。一般的に、シグナルペプチドは、タンパク質の成熟中に切断される。シグナルペプチドが、生じる融合ポリヌクレオチド／ポリペプチドのアミノ末端に位置するように、ＨＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に、局在化配列、またはシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを連結するかまたは融合することが可能である。真核生物において、シグナルペプチドは、小胞体を横断して、融合ポリペプチドを輸送するよう機能する。その後、分泌タンパク質は、ゴルジ体を通して、分泌小胞に、そして細胞外空間または好ましくは外部環境に輸送される。本発明にしたがって利用可能なシグナルペプチドには、タンパク質分解酵素認識部位を含有するプレプロペプチドが含まれる。
【００９８】
局在化配列は、核局在化配列、小胞体局在化配列、ペルオキシソーム局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、または局在化タンパク質であることが可能である。局在化配列は、例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版），  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  １９９５の“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”，  第３５章に記載されるターゲティング配列であることが可能である。いくつかの重要な局在化配列には、核（例えばＫＫＫＲＫ（配列番号１３））、ミトコンドリア（ＭＬＲＴＳＳＬＦＴＲＲＶＱＰＳＬＦＲＮＩＬＲＬＱＳＴ（配列番号１４））、小胞体（ＫＤＥＬ（配列番号１５））、ペルオキシソーム（ＳＫＦ）、プレニル化または形質膜への挿入（ＣＡＡＸ（配列番号１６）、ＣＣ、ＣＸＣ、またはＣＣＸＸ（配列番号１７））、形質膜の細胞質側（ＳＮＡＰ−２５への融合）、またはゴルジ体（フューリンへの融合）をターゲティングするものが含まれる。哺乳動物宿主細胞で機能する、異種シグナルペプチドの他の例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ  ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ  ４６０，８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。
【００９９】
当業者は、シグナルペプチドが切断される位（類）が、コンピュータプログラムに予測されるものと異なる可能性があり、そして組換えポリペプチドを発現するのに使用した宿主細胞の種類などの要因に応じるであろうことも認識するであろう。タンパク質調製物は、１より多い部位でのシグナルペプチドの切断から生じる、異なるＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含んでもよい。天然シグナル配列を有する、本明細書に提供する成熟ＨＡＭポリペプチドの特定の態様には、限定されるわけではないが、Ｎ末端アミノ酸が、配列番号２の５５〜６１の間のいずれかのアミノ酸であるポリペプチドが含まれる。
【０１００】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核（例えば大腸菌）、酵母、植物細胞、および昆虫またはより高次の真核細胞が含まれる。最も典型的には、酵母または哺乳動物細胞を用いる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング用および発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  エルゼビア、ニューヨーク州（１９８５）に記載されている。無細胞翻訳系もまた、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて、ポリペプチドを産生するのに使用可能である。
【０１０１】
形質転換に適した原核宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性生物であることが可能であり、そして、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれる。大腸菌などの原核宿主細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞における発現を容易にするため、ポリペプチドはＮ末端メチオニン（ｍｅｔ）残基を含むことも可能である。Ｎ末端Ｍｅｔは、発現された組換えポリペプチドから切断可能である。
【０１０２】
原核宿主細胞に用いるための発現ベクターは、一般的に、１以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含んでなり、該マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるか、または独立栄養必要条件を供給するタンパク質をコードする遺伝子であることが可能である。有用な原核発現ベクターには、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）など、商業的に入手可能なプラスミド由来のものが含まれる。他の適切なベクターには、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。適切なプロモーターおよび望ましいポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、ベクターに挿入することが可能である。
【０１０３】
組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５，  １９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４，  １９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８：４０５７，  １９８０）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第１版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ｐ．４１２，  １９８２）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能な、λＰＬプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ  ３７０９２に常住）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１、ＡＴＣＣ  ５３０８２に常住）が含まれる。
【０１０４】
あるいは、ポリペプチドは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来などの酵母宿主細胞において発現可能である。あるいは、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、または酵母の他の属も使用可能である。酵母ベクターは、しばしば、２ミュー酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。適切なプロモーター配列には、酵母メタロチオネインまたは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：２０７３，  １９８０）または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの解糖酵素をコードする他の遺伝子（Ｈｅｓｓら，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．  ７：１４９，  １９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７：４９００，  １９７８）由来のものが含まれる。酵母発現に用いるのに適した他のベクターおよびプロモーターが当該技術分野に知られる（例えば、Ｈｉｔｚｅｍａｎ，  ＥＰＡ−７３，６５７；Ｒｕｓｓｅｌｌら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：２６７４，  １９８２；およびＢｅｉｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７２４，  １９８２を参照されたい）。
【０１０５】
酵母α−因子リーダー配列を使用して、ポリペプチドを分泌させることが可能であり、そしてα−因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される（例えば、Ｋｕｒｊａｎら，  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３，  １９８２およびＢｉｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：５３３０，  １９８４）。
【０１０６】
酵母形質転換プロトコルが当業者に知られ、こうしたプロトコルには、酵母窒素基剤、カザミノ酸、グルコース、１０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび２０ｍｇ／ｍｌウラシルを含有する培地中でのＴｒｐ＋形質転換体の選択を伴うプロトコルが含まれる（例えば、Ｈｉｎｎｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１９２９，  １９７８を参照されたい）。他のプロトコルでは、ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターによって形質転換された酵母細胞は、「リッチ」培地中で増殖させることが可能である。リッチ培地の例は、８０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。
【０１０７】
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えポリペプチドを発現するのに使用可能であり、例えば、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に概説されるバキュロウイルス系がある。哺乳動物起源の樹立細胞株もまた、使用可能である。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，  １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるようなアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。
【０１０８】
哺乳動物細胞内にポリヌクレオチドを導入するための確立された方法が記載されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  １９９０，  ｐｐ．１５−６９）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬などの商業的に入手可能な試薬を用いた、さらなるプロトコルを用いて、細胞をトランスフェクションすることが可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，  １９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９におけるもののような慣用法を用いて、哺乳動物細胞をトランスフェクションすることも可能である。安定形質転換体の選択は、例えば細胞毒性薬剤に対する耐性など、当該技術分野に知られる方法を用いて、実行可能である。Ｋａｕｆｍａｎら，  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７−５１１，  １９９０は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性などのいくつかの選択計画を記載する。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲ不全であるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１である（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０，  １９８０）。ＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを発現しているプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入可能であり、そしてそのプラスミドを含有する細胞のみを適切な選択培地中で増殖させることが可能である。選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与える遺伝子が含まれ、該遺伝子は、これらの剤に対する耐性に基づいて、該ベクターを宿する細胞の選択を可能にする。
【０１０９】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルスゲノムより切り出されることが可能である。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のポリヌクレオチド配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供可能である。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含有することが可能な断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，  １９７８；Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９９０）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位からＢｇｌ  Ｉ部位に渡るおよそ２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた使用可能である。
【０１１０】
哺乳動物発現ベクターからの異種遺伝子の発現を改善することが示されたさらなる調節配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７，  ｐｐ．５２９−５３４およびＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／２５４２０）、並びにアデノウイルス２由来の三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：１３４７５−１３４９１，  １９８２）などの要素が含まれる。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって、二シストロン性ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：２９５−３００，  １９９３；Ｒａｍｅｓｈら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：２６９７−２７００，  １９９６）。選択可能マーカー（例えばＤＨＦＲ）遺伝子が続く、二シストロン性ｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション可能性および異種ポリヌクレオチドの発現を改善することが示されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９９０）。二シストロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１５０−１６１，  １９９７に記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７，  ｐｐ．５２９−５３４に記載されるｐ２Ａ５Ｉである。
【０１１１】
有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙら，  Ｃｅｌｌ  ５９：３３５−３４８，  １９８９に記載されてきている。哺乳動物宿主細胞において用いるための他の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２８０，  １９８３）に開示されるように構築可能である。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系は、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：９３５，  １９８６）に記載されるように構築可能である。Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，  １９８４に記載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ  ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ  ９１／１８９８２に記載されている。さらに別の代替法として、ベクターは、レトロウイルス由来であることが可能である。
【０１１２】
さらなる有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧ（登録商標）およびｐＤＣ３１１もまた、使用可能である。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、低分子量（１ｋＤ）親水性ＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドを、ｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターによって発現される組換えタンパク質のＮ末端に融合させることを中心とする。ｐＤＣ３１１は、ＣＨＯ細胞でタンパク質を発現させるために用いる、別の特殊化ベクターである。ｐＤＣ３１１は、目的の遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を、ＤＨＦＲ翻訳のための内部リボソーム結合部位、発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、三分割リーダー配列、およびポリアデニル化部位と共に含有する、二シストロン性配列によって特徴付けられる。
【０１１３】
開示するポリヌクレオチドの他の有用な断片には、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合可能な一本鎖ポリヌクレオチド配列（ＲＮＡまたはＤＮＡいずれか）を含んでなる、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、本発明にしたがって、配列番号１または１８に示す配列を有するポリヌクレオチドの断片を含んでなる。こうした断片は、一般的に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜約３０ヌクレオチドを含んでなる。既定のタンパク質をコードする核酸配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２６５９，  １９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，  １９８８）に記載されている。
【０１１４】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸への結合は、ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡ分解の増進、スプライシングの阻害、転写または翻訳の未成熟な終結、あるいは他の手段によるものを含む、いくつかの手段の１つによって、タンパク質発現を遮断するかまたは阻害する二重鎖の形成を生じる。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質の発現を遮断することが可能である。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、修飾糖−ホスホジエステル主鎖（または、ＷＯ９１／０６６２９に記載されるものなど、他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含んでなり、そしてこうした糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖結合を持つこうしたオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することが可能である）が、標的核酸に結合可能な配列特異性を保持する。
【０１１５】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されるものなどの有機部分、およびポリ−（Ｌ）−リジンなどの標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、エリプチシンなどの挿入剤、およびアルキル化剤または金属錯体がセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに付着させて、標的ヌクレオチド配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾することが可能である。
【０１１６】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポフェクション、ＣａＰＯ４仲介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む、遺伝子トランスファー法いずれかによって、あるいはエプスタイン・バーウイルスまたはアデノウイルスなどの遺伝子トランスファーベクターを用いることによって、標的核酸を含有する細胞に導入可能である。
【０１１７】
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ９１／０４７５３に記載されるように、リガンド結合分子とのコンジュゲートの形成によって、標的核酸を含有する細胞に導入可能である。適切なリガンド結合分子には、限定されるわけではないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子のコンジュゲート化は、リガンド結合分子がその対応する分子または受容体に結合する能力に実質的に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲート型が細胞内に進入するのを遮断しない。
【０１１８】
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ  ９０／１０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸を含有する細胞に導入可能である。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって、細胞内で解離される。
【０１１９】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＨＡＭポリペプチド、またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクター（例えば発現ベクター）の構築；該ベクターでトランスフェクションまたは形質転換した宿主細胞の構築；生物学的に活性であるポリペプチドおよびその生理活性断片を産生し、そして精製する方法の構築；関連するアトラクチンまたはマホガニーファミリータンパク質をコードする核酸を同定するプローブとしてのポリヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの使用；本発明のＨＡＭポリペプチドをコードする遺伝子の位置と、ヒト疾患に関連する染色体領域を相関させるための、ポリヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの使用；腫瘍、免疫障害、症候群または他のヒト疾患と関連する遺伝子を同定するための、ポリヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの使用；ＨＡＭポリペプチドをコードする遺伝子における突然変異によって、またはＨＡＭポリペプチドの過剰もしくは欠乏によって特徴付けられる障害の治療のための、開示するタンパク質またはその断片の投与；およびＨＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害するための一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を可能にする。さらに、本発明は、リガンド、同族体、または対構造（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）結合パートナーへの天然ＨＡＭポリペプチドの結合の競合的阻害剤としての、開示するポリペプチドおよびその可溶性断片の使用；ユニークな分子量マーカーとしての、またはペプチド断片化の対照としての、ＨＡＭポリペプチドおよびその断片の使用と共に、これらの試薬を含んでなるキット；抗体を生成するための、ＨＡＭポリペプチドおよびその断片の使用；並びにＨＡＭポリペプチドを精製するためのこうした抗体の使用；該タンパク質を発現する造血細胞の分離のためのアフィニティー試薬として、それと共にＨＡＭポリペプチド生物学的活性の変調における抗体の使用を可能にする。ヒトの治療のため、典型的には、ヒトＨＡＭポリペプチド、断片および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる。
【０１２０】
活性アッセイ
本発明の精製ポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、および他の型を含む）を、ＨＡＭ結合パートナーに結合する能力に関して試験することが可能である。こうした活性は、慣用的な結合または酵素アッセイなど、いかなる適切なアッセイでも測定可能である。例えば、典型的な結合アッセイにおいて、ポリペプチドを検出可能試薬（例えば、放射性核種、発色団、比色または蛍光分光反応を触媒する酵素等）で標識し、そしてその後、表面上にＨＡＭ結合パートナーを発現している細胞と接触させることが可能である。細胞を洗浄して、非結合標識ポリペプチドを除去し、そして細胞に結合している標識の存在を、適切な技術によって、決定する。例えば、当該技術分野に公知の方法にしたがって、Ｆｃ領域に融合させたＨＡＭポリペプチド（またはその生理活性断片）をコードするポリヌクレオチドを含有する、組換え発現ベクターを構築する。発現に際して、ポリヌクレオチドは、例えば、ＨＡＭポリペプチドの細胞外部分を含んでなる可溶性ＨＡＭポリペプチド、または膜貫通領域が除去され、細胞外ドメインおよび細胞質ドメインを含んでなる可溶性ＨＡＭポリペプチドをコードする。例えば、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる組換え発現ベクターで、宿主細胞をトランスフェクションする。トランスフェクション細胞を培養した後、本発明のＨＡＭまたは他の可溶性ポリペプチドを含有する培地をトランスフェクション細胞から収集し、そして標準法を用いて、ポリペプチドの量を定量化する。
【０１２１】
ＨＡＭ結合パートナーを発現する細胞を培養して、そしてＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。ＢＭ−ＮＦＤＭは５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳が添加されている結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２を含有するＲＰＭＩ  １６４０）である。その後、該細胞を、多様な濃度の、例えば上述のように作成された可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質とインキュベーションする。細胞を洗浄し、そして結合培地中で、１２５Ｉマウス抗ヒトＩｇＧの一定の飽和濃度で、穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションする。徹底した洗浄の後、トリプシン処理を介して細胞を遊離させる。
【０１２２】
上に使用されるマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そしてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。抗体は標準的クロラミン−Ｔ法を用いて、放射ヨウ素標識される。該抗体は、細胞に結合しているいかなるポリペプチド／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分にも結合するであろう。すべてのアッセイにおいて、１２５Ｉ抗体の非特異的結合をＦｃ融合タンパク質／Ｆｃの非存在下でアッセイすると共に、Ｆｃ融合タンパク質および２００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でもアッセイする。
【０１２３】
細胞結合１２５Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ  Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンターで定量化する。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０，  １９４９）はＭｉｃｒｏｖａｘコンピュータ上で実行されるＲＳ／１（ＢＢＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボストン）上で生み出される。
【０１２４】
例えば、基質を検出可能試薬（例えば放射性核種、発色団等）で標識し、そしてその後、ＨＡＭポリペプチドまたはその断片を含有する細胞または試料と接触させることが可能である。標識基質は、典型的には、マイクロタイタープレート等に結合される。２つの構成要素のインキュベーション後、プレートを洗浄し、そして対照プレートと比較して、プレート上になお存在する標識の量を定量化する。プレート上の標識の減少が、酵素活性の示標となる。
【０１２５】
別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例えば、変異体の生物学的活性は、該変異体が、結合パートナーへの結合に関し、天然タンパク質と競合する能力をアッセイすることによって、決定可能である。
【０１２６】
競合結合アッセイは、慣用的方法論によって、実行可能である。競合結合アッセイに使用可能な試薬には、放射標識可溶性ＨＡＭポリペプチド、またはＨＡＭポリペプチド（内因性または組換え）を細胞表面に発現している、損なわれていない細胞が含まれる。例えば、ＨＡＭポリペプチドの放射標識生理活性断片を用いて、細胞表面結合パートナーへの結合に関して、可溶性変異体と競合させることが可能である。損なわれていない細胞の代わりに、Ｆｃ部分と（固相上の）プロテインＡまたはプロテインＧの相互作用を通じて固相に結合しているＨＡＭポリペプチドの生理活性断片／Ｆｃ融合タンパク質が使用可能である。プロテインＡおよびプロテインＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイより入手可能なものが含まれる。
【０１２７】
別の種類の競合結合アッセイは、ＨＡＭポリペプチドの放射標識可溶性生理活性断片、例えば可溶性生理活性断片／Ｆｃ融合タンパク質、およびＨＡＭ結合パートナーを発現する、損なわれていない細胞を利用する。定性的結果は、競合オートラジオグラフプレート結合アッセイによって得ることが可能であり、一方、定量的結果を生成するのにＳｃａｔｃｈａｒｄプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０，  １９４９）が利用可能である。
【０１２８】
診断アッセイ
本明細書に提供するポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、機能不全または突然変異ＨＡＭ遺伝子を検出するアッセイにおいて、診断用試薬として有用である。診断のための試料は、被験者の組織、例えば喉のスワブ、血液、血清、尿、唾液、脳脊髄液、糞便、組織生検などから得ることが可能である。同様の試料を正常な個体（問題の障害または突然変異に苦しんでいない個人）から採取して、そしてこれらの正常または標準試料は、比較のための基盤を提供する。あるいは、精製試薬（例えばＨＡＭポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体）を診断アッセイの標準として使用可能である。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドの断片を、ノーザンまたはサザンブロットのプローブとして、あるいは標的核酸にコードされるＨＡＭポリペプチドの突然変異型を検出するためのＰＣＲプライマーとして、使用する。
【０１２９】
診断可能な状態には、ＨＡＭポリペプチドの過剰または欠乏によって特徴付けられるもの、あるいはこうしたポリペプチドの突然変異型によって特徴付けられるものが含まれる。こうした状態には、限定されるわけではないが、その発現が必要な細胞におけるポリペプチドの欠如、改変された酵素活性、改変されたシグナル伝達能、正常な条件下でこうした活性を有する細胞における過剰発現または過少発現が含まれる。
【０１３０】
これらのアッセイを用いる、診断可能な特定の状態には、限定されるわけではないが：リウマチ学的疾患（例えば慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、血清陰性脊椎関節症）、炎症性異常、骨髄または固形臓器移植、移植片対宿主疾患、アレルギー（例えば喘息、アレルギー性鼻炎）、神経学的障害（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆、脳癌、ベル麻痺、ヘルペス後神経痛）、新生物または癌を含む細胞増殖障害（例えばリンパ腫、Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞白血病）、感染（例えば細菌、寄生虫、原生動物およびＡＩＤＳを含むウイルス感染）、化学療法または放射線誘導毒性、悪液質、心臓血管障害（例えばうっ血性心不全、心筋梗塞、虚血／再灌流傷害、動脈炎、脳卒中）、胃腸障害（例えば炎症性腸疾患、クローン病、セリアック病）、糖尿病、皮膚疾患（例えば乾癬、強皮症、皮膚筋炎）、血液学的障害（例えば骨髄異形性症候群、後天性またはファンコニ再生不良性貧血）、敗血症ショック、肝疾患（例えばウイルス性肝炎またはアルコール関連肝炎）、骨障害（例えば骨粗しょう症、大理石骨病）が含まれる。
【０１３１】
本発明のいくつかの態様において、診断する状態は、血液学的障害であり、そして組織試料は、血液またはリンパ節生検である。
【０１３２】
ＨＡＭポリペプチドおよびポリヌクレオチドの変調因子のスクリーニング
本明細書に開示するＨＡＭポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それぞれ、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現または活性を変調する剤を同定するためのスクリーニングアッセイに使用を見出す。ひとたび同定されたら、ＨＡＭポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現または活性を変調する剤を投与して、例えばＨＡＭまたは他のアトラクチン／マホガニー関連タンパク質の過剰産生に特徴付けられる状態において、ＨＡＭ発現を抑制することが可能である。同様に、状態がＨＡＭの正常内因性活性化因子の欠乏に特徴付けられる場合、培養細胞における、または被験者におけるＨＡＭポリペプチドの生物学的活性または発現を刺激する剤を投与して、活性または発現を刺激することが可能である。
【０１３３】
本明細書に提供する解説を用いて、ＨＡＭポリペプチドの活性または発現を変調する剤を同定する方法を行うことが可能である。例えば、ＨＡＭポリペプチド活性を変調する剤を同定するため、本発明のＨＡＭポリペプチドを含有する試料と、試験剤を接触させる。その後、試料をアッセイして、ＨＡＭ活性を測定し、そして試験剤の存在下でのＨＡＭ活性を、該剤が存在しない標準（すなわち対照）試料に存在する活性に比較する。試料は、例えば、無細胞試料、細胞含有試料（例えば細胞培養物）、または組織試料（例えば被験者から得られるかまたは被験者に由来する組織試料）であることが可能である。標準試料には、例えば、試験剤と接触させる前の試料または正常活性に相当する試料が含まれる。活性は、本明細書に同定するアッセイ法のいずれか（例えば競合結合アッセイ、酵素アッセイ等）を用いて測定することも可能である。対照または標準試料に比較した活性の変化が、活性を変調する（例えば増加させるかまたは減少させる）剤の示標となる。
【０１３４】
同様に、本発明は、ＨＡＭポリペプチドの発現を変調する剤を同定する方法を提供する。こうした方法には、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる試料を試験剤と接触させ、そして標準または対照試料に比較した、ポリヌクレオチドの発現を測定することが含まれる。発現レベルは、（例えばウェスタンブロットによって）タンパク質を検出することによるか、または（例えばＰＣＲによって）転写されるｍＲＮＡ量を検出することによるものを含む、当該技術分野に知られる方法によって測定可能である。上述のように、試料は、細胞試料、組織試料等であることが可能である。対照または標準試料に比較した発現の変化が、発現を変調する（例えば増加させるかまたは減少させる）剤の示標となる。
【０１３５】
試験剤には、例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬似体、および抗体、小分子、またはポリヌクレオチド（例えばアンチセンスまたはリボザイム）が含まれることが可能である。試験剤の例は、ＨＡＭポリペプチドに特異的に結合するリガンド、またはＨＡＭポリペプチドと共に、機能するヘテロマーを形成可能な他の分子である。
【０１３６】
これらのスクリーニングアッセイに使用する細胞には、例えば、天然にＨＡＭポリペプチドを発現する細胞、例えばグリア細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞および他の造血細胞、またはＨＡＭポリペプチド発現を指示する異種核酸で形質転換またはトランスフェクションされている、好適な細胞種いずれかが含まれることが可能である。
【０１３７】
他のアッセイにおいて、ＨＡＭポリペプチドの生理活性断片（例えば可溶性型）を発現する細胞を試験分子と培養して、該分子が、細胞に産生される生理活性断片量を変調する能力を有するかどうかを決定することが可能である。酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、生理活性断片に結合する抗体を使用するドットブロット、または固相結合アッセイを含む、いかなる適切な方法によって、産生される生理活性断片の量を測定することも可能である。
【０１３８】
療法
本発明は、医学的障害、そして特にＨＡＭが仲介する障害を患う被験者、好ましくは哺乳動物被験者、そして最も好ましくはヒト被験者を治療するための化合物、組成物、および方法を提供する。ＨＡＭが仲介するこうした障害には、ＨＡＭポリペプチドおよび結合パートナー間の結合によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される状態が含まれる。本開示の目的のため、用語「疾病」、「疾患」、「医学的状態」、「異常な状態」等は、用語「医学的障害」と交換可能に用いられる。用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、本明細書において、治癒的、防御的（例えば予防的）および対症的または寛解的治療が含まれる。
【０１３９】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ＨＡＭポリペプチドの過剰または欠乏、あるいは該ポリペプチドの有害な突然変異体型の発現を含む、機能不全ＨＡＭ遺伝子またはポリペプチドを伴う障害を有する、哺乳動物被験者（例えばウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、霊長類）、好ましくはヒト被験者に療法的に投与可能である。こうした障害には、ポリペプチドのこうした型によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される状態が含まれる。投与がヒト被験者に行われる場合、分子は、好ましくは、ヒトＨＡＭ配列（例えば配列番号１または２に示す配列）に基づく。
【０１４０】
これらの療法のため、それぞれ、ＨＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性または発現を変調する剤が使用可能である。こうした変調剤を、本明細書に開示するスクリーニング法を使用することによるなどのスクリーニングによって同定する。ＨＡＭポリペプチドまたはそのリガンドと特異的に結合する抗体は、ＨＡＭポリペプチドの生物学的活性を変調可能である。
【０１４１】
本発明の方法および組成物によって治療可能な障害および疾患には、限定されるわけではないが：リウマチ学的障害（例えば慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、血清陰性脊椎関節症）、骨髄または固形臓器移植、移植片対宿主反応、炎症性異常、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、シェーグレン症候群）、アレルギー（例えば喘息、アレルギー性鼻炎）、神経学的障害（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆、脳癌、ベル麻痺、ヘルペス後神経痛）、癌（例えばリンパ腫、Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞白血病）、感染（例えば細菌、寄生虫、原生動物およびＡＩＤＳを含むウイルス感染）、化学療法または放射線誘導毒性、悪液質、心臓血管障害（例えばうっ血性心不全、心筋梗塞、虚血／再灌流傷害、動脈炎、脳卒中）、糖尿病、皮膚疾患（例えば乾癬、強皮症、皮膚筋炎）、血液学的障害（例えば骨髄異形性症候群、後天性またはファンコニ再生不良性貧血）、敗血症ショック、肝疾患（例えばウイルス性肝炎またはアルコール関連肝炎）、骨障害（例えば骨粗しょう症、大理石骨病）、および肥満を含む体重関連またはエネルギー代謝障害が含まれる。
【０１４２】
上述の１以上のいずれかを治療するため、治療する障害の１以上の徴候または症状を測定可能に減少させるのに有効な量で、療法剤を投与可能である。さらに、こうした障害は、機能不全が存在する細胞種に、機能不全遺伝子の非不全型を搬送するベクターまたはリポソームを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで投与することによって、治療可能である。
【０１４３】
療法組成物は、天然ポリペプチド、変異体、誘導体、オリゴマー、および生理活性断片などの、本明細書に記載する型いずれかの、実質的に精製されたＨＡＭポリペプチドを含んでなることが可能である。組成物は、可溶性ポリペプチド、または可溶性ＨＡＭポリペプチドを含んでなるオリゴマーを含んでなることが可能である。別の態様において、組成物は、少なくとも１つのＨＡＭポリペプチドエピトープに対して向けられる抗体を含んでなる。さらに別の態様において、療法剤を抗体に付着させ、そして該抗体を用いて、ＨＡＭポリペプチドを発現している細胞に療法剤をターゲティングする。
【０１４４】
別の薬理学的に活性な剤を本発明の療法剤と同時投与する、併用療法もまた、想定される。同時投与に適した他の剤には、限定されるわけではないが、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、化学療法剤、抗炎症剤、ＤＭＡＲＤ類、抗血管形成剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）、または標的疾患または障害を治療するのに有効な他の化合物いずれかが含まれる。
【０１４５】
本発明の薬剤組成物はさらに、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、または賦形剤などの他の構成要素を含んでなることが可能であり、そして既知の方法にしたがって処方する。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の活性成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合して組み合わせることが可能である。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版，  １９８０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ペンシルバニア州イーストンに記載されるものが含まれる。
【０１４６】
さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化しているか、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル類、デキストラン等のポリマー化合物に取り込まれているか、またはリポソーム、微小乳剤、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていることが可能である。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、そしてしたがって意図される適用にしたがって、選択される。
【０１４７】
本発明の組成物は、例えば経口、局所、非経口、または吸入によるなど、適切な方式いずれかで、投与可能である。用語「非経口」には、例えば皮下、静脈内、あるいは筋内経路による注射が含まれ、また例えば疾患または損傷の部位での局所化投与も含まれる。移植物からの持続放出もまた、意図される。適切な投薬量は、治療しようとする障害の性質、患者の体重、年齢、および全身状態、並びに投与経路などの要因に応じて、多様であろう。予備的用量は動物試験にしたがって決定可能であり、そしてヒト投与のための投薬量の見積もりを、当該技術分野に認められる実施にしたがって行う。
【０１４８】
用量、投与経路、投与頻度および治療の有効な措置の期間は、治療しようとする特定の状態、状態の重症度、被験者の年齢、体重、および健康状態等などの要因に応じて多様であろうし、そして被験者の医師によって、相応に調整可能である。
【０１４９】
治療の１つの方法において、活性剤はポリペプチドであり、そして０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、またはより好ましくは０．４〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、毎週１〜３回、注射によって投与される。治療は、被験者の状態に測定可能な改善が確認されるまで続け、これは大部分の場合、少なくとも２週間〜８週間以上の治療を必要とするであろう。その後、維持用量を投与可能であり、そして疾患の徴候が再出現したら、治療を再開することが可能である。当該技術分野に知られる方法にしたがって、他の投与経路に適した措置を決定可能である。同様に、抗体、小分子、アンチセンスまたは遺伝子療法試薬を投与するのに適した措置を、当該技術分野に知られる方法にしたがって、決定可能である。
【０１５０】
本発明の範囲内に含まれるのは、記載する経路の各々による投与に適した組成物を含む、記載する療法剤を含んでなる、薬理学的に許容しうる組成物である。こうした組成物を、標準的実施にしたがって処方する。
【０１５１】
本発明の特定の態様をさらに例示するために、以下の例を提供し、そしてこれは、本発明の範囲を制限すると解釈してはならない。
【実施例】
【０１５２】
実施例
（実施例１）
ＨＡＭの同定、クローニング、および配列決定
マウス樹状細胞（ＤＣ）ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、新規ＤＣ関連遺伝子を同定した。Ｆｌｔ３Ｌ処理／休止およびＦｌｔ３Ｌ処理／ＳＥＢ刺激マウスの脾臓から単離した、ＣＤ１１ｃ＋マウスＤＣから調製したｃＤＮＡライブラリー由来の挿入物から、高密度ナイロンアレイを調製した。その後、いくつかの刺激条件下で得たマウスＤＣサブセット由来の標識第一鎖ｃＤＮＡと、これらのアレイをハイブリダイズさせた。ディファレンシャルアレイシグナルによって、示差的に発現される遺伝子を同定した。シグナルパターンの変化を同定し、そして対応するクローンを配列決定し、そして解析した。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＣで、ＣＤ８＋／ＣＤ１１ｂ低で上方制御された配列（すぐ下の表を参照されたい）を含有する１つの同定クローンが、ＢＬＡＳＴ検索によって、アトラクチンに最も緊密に関連すると同定され、アトラクチンは、免疫制御（Ｔ細胞接着とカップリングしたマクロファージ蔓延の促進；複合可変免疫不全（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）における発現欠損）、髄鞘形成（ジッター（Ｚｉｔｔｅｒ）ラットにおける突然変異遺伝子）、および代謝（マホガニーマウスにおける突然変異遺伝子）を含む、多数の生物学的機能を持つ、Ｉ型膜タンパク質である。ＤＣクローンから得た配列を用いたＢＬＡＳＴ検索もまた、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＣ１２９６６を同定し、これは、マウスＤＣ配列にオルソロガスであるようであり、そしてアトラクチンのＮ末端に相同なようである、ヒトゲノムコンティグ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＬ３５５５３０）から予測されるＯＲＦである。さらなるＢＬＡＳＴ解析は、アトラクチンの３’端に相同性を示す、ヒト脳ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０１１１０６）由来のＥＳＴを同定した。ＣＡＣ１２９６６およびＡＢ０１１１０６はどちらも、本明細書に援用される。
【０１５３】
ＣＤ８＋／ＣＤ１１ｂ低における上方制御配列
【０１５４】
【表１】
2004535185.tif 000002
【０１５５】
ＡＬ３５５５３０およびＡＢ０１１１０６配列に基づくＰＣＲプライマーを用いて、６つの部分で、全長ｃＤＮＡを増幅した。ヒト卵巣ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲのテンプレートとして用いた。図１に示す配列上の矢印は、各断片のプライマーの位置を示す。
【０１５６】
【表２】
2004535185.tif 000003
【０１５７】
配列決定のため、各増幅由来のいくつかのＰＣＲ断片をクローニングベクターに連結した。標準的方法論を用いて、配列決定を行った。
【０１５８】
（実施例２）
配列解析
ヒトＨＡＭのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１）は、２９のエクソン上にコードされると予測される。ＰＣＲ増幅中に、４つの推定上の選択的スプライシング変異体が見出され、これにはエクソン７の欠失、エクソン１０の欠失、エクソン１９の欠失、およびエクソン２１の欠失が含まれた。これらの変異体／欠失は、個々にまたは組み合わせて生じることが可能である。さらに、配列番号１に関して、以下のように、多様なヌクレオチド置換が同定された。
【０１５９】
【表３】
2004535185.tif 000004
【０１６０】
配列番号２または１９に示す配列の解析は、本発明のＨＡＭポリペプチドの別個の領域を同定した。これらのポリペプチドには、シグナルペプチドとも称されるリーダー配列が存在する。例えば、本発明の全長ヒトＨＡＭポリペプチドに存在するリーダー配列は、配列番号２のアミノ酸１〜６０および配列番号１９のアミノ酸１〜５９を含むと予測される。ＨＡＭのシグナルペプチド切断部位は、コンピュータアルゴリズムを用いて予測した。しかし、当業者は、シグナル配列の切断部位は、ポリペプチドを発現させる生物を含む、いくつかの要因に応じて多様である可能性があることを認識するであろう。したがって、本発明のＨＡＭポリペプチドの成熟型のＮ末端は、約２〜５アミノ酸異なる可能性がある。したがって、本発明のヒトＨＡＭポリペプチドの成熟型は、そのＮ末端で、配列番号２のアミノ酸５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５を含むことが可能である。したがって、成熟型ヒトＨＡＭは、配列番号２のアミノ酸５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５からほぼアミノ酸１３７９まで（または可溶性ポリペプチドの場合、アミノ酸１２３０まで）を含むことが可能である。ヒトＨＡＭポリペプチドの細胞外領域は、配列番号２のほぼアミノ酸６１〜１２３０に位置する。ＥＧＦ様ドメイン、ＣＵＢドメイン、Ｃ型レクチンまたは炭水化物認識ドメイン（ＣＬＥＣＴドメイン）、ＫＥＬＣＨモチーフおよびラミニンＥＧＦ様ドメイン割り当てと共に、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの割り当ては、コンピュータアルゴリズムおよび先の報告（Ｇｕｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：１５２−１５７，  １９９９）に基づく。ヒトＨＡＭの細胞外領域は、推定上、それぞれ、配列番号２のほぼアミノ酸６３〜９０、２１１〜２４３、２６１〜２８０、９３〜２０８、５８１〜６１２、７４９〜８７３、６７０〜６８６、および１０１４〜１０５５に位置する、３つのＥＧＦ様ドメイン、ＣＵＢドメイン、ＫＥＬＣＨモチーフ、Ｃ型レクチンまたは炭水化物認識ドメイン、共通のガンマサイトカイン鎖の推定上のリガンド結合モチーフ、およびラミニンＥＧＦ様ドメインを含有する（図３を参照されたい）。ヒトＨＡＭポリペプチドの膜貫通領域は、配列番号２のほぼアミノ酸１２３１〜１２５１に位置する。細胞内領域は、配列番号２のほぼアミノ酸１２５２〜１３７９に位置する。さらに、上記の認識される配列、配列ＲＸＸＨＳＡＶＸＩＮＧＸＭＸＩＦＧＧが、本発明のヒトＨＡＭ配列において反復していることが見出された（例えば配列番号２のアミノ酸５２１〜５４０および５８１〜６００を参照されたい）。この反復配列のＢＬＡＳＴは、いくつかのアトラクチンおよびマホガニー配列を同定した。したがって、この反復配列は、推定上のＨＡＭ保存ドメインである。図３は、ＨＡＭの相対ドメインおよび保存残基を示し、アトラクチンまたはマホガニーポリペプチドを示す。
【０１６１】
（実施例３）
ＨＡＭの組織発現
アトラクチン相同体に関するＰＣＲは、コード領域の予測される３’端からほぼ６５０ｂｐの断片を増幅するように設計された、以下のプライマーを用いた。該プライマーは、ゲノム配列内に見出される、予測されるコード領域に基づき、そしてＡＢ０１１１０６配列に見出される配列と同一である：
【０１６２】
【化１】
2004535185.tif 000005
【０１６３】
ＰＣＲは、これらの第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて：胎盤、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、精巣、リンパ節、心臓、骨格筋、脳、卵巣、小腸、食道、胎児肝臓、胎児脳、胎児肺、胎児脾臓、胎児胸腺、胎児腎臓、および胎児骨格筋において、陽性シグナルを示した。胃、骨髄、肺、結腸、前立腺、胸腺、白血球および皮膚では、ＰＣＲ産物は検出不能であった。したがって、ＨＡＭは、組織特異的マーカーとして使用可能である。
【０１６４】
（実施例４）
ＨＡＭポリペプチドに結合するモノクローナル抗体
実質的に精製されたＨＡＭポリペプチドまたはその断片を用い、米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるものなどの慣用的技術を用いて、それと免疫反応性であるモノクローナル抗体を生成することが可能である。簡潔には、ＨＡＭポリペプチド免疫原を完全フロイントアジュバント中で乳化し、そして１０〜１００μｇの範囲の量を皮下または腹腔内注射して、該免疫原でマウスを免疫する。１０〜１２日後、免疫した動物に、不完全フロイントアジュバント中で乳化した、さらなるＨＡＭポリペプチドまたはその断片を追加免疫する。その後、毎週から隔週（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）の免疫スケジュールで、マウスに定期的に追加免疫する。後眼窩出血または尾先端切除によって、血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、またはＨＡＭポリペプチド結合パートナーへのＨＡＭポリペプチドの結合阻害によって、ＨＡＭ抗体に関して試験する。
【０１６５】
適切な抗体力価を検出した後、陽性動物に、生理食塩水中のＨＡＭポリペプチドまたは断片を最後に一度、静脈内注射する。３〜４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）に融合させる。融合によってハイブリドーマ細胞が生成され、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中、マルチマイクロタイタープレートに蒔く。
【０１６６】
ハイブリドーマ細胞は、Ｅｎｇｖａｌｌら（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．  ８：８７１，  １９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適応によって、実質的に純粋なＨＡＭポリペプチドに対する反応性に関して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４：４２１２，  １９９０）に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＨＡＭポリペプチド・モノクローナル抗体を含有する腹水を産生することが可能である。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によって、フラスコまたはローラーボトル中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させてもよい。マウス腹水中で産生したモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿によって、続いてゲル排除クロマトグラフィーによって、精製可能である。あるいは、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた使用可能であり、ＨＡＭポリペプチドへの結合に基づくクロマトグラフィーも使用可能である。
【０１６７】
（実施例５）
染色体マッピング
染色体マッピングは、例えば以下の２つの方法の１つで実行可能である。ＨＡＭポリペプチドに対応する遺伝子は、ＰＣＲに基づくマッピング戦略を用いてマッピングする。最初のヒト染色体割り当ては、ＨＡＭ特異的ＰＣＲプライマーを用い、そして製造者の指示にしたがって、ＢＩＯＳ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（コネティカット州ニューヘブン）のＢＩＯＳ体細胞ハイブリッドＰＣＲ可能ＤＮＡキットを用いて作成する。より詳細なマッピングは、Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ  ４放射ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、アラバマ州ハンツビル；Ｗａｌｔｅｒ，  ＭＡら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：２２−２８，  １９９４に記載される）を用いて行う。その後、この解析から得たデータを、含まれる指示にしたがって、ＭＩＴ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍａｐｐｅｒ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）に電子的に提出する。この解析は、電子的にＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅｍａｐブラウザ（ｗｗｗ−ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ８０／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｎｔｅｒｅｚ／ｈｕｍ＿ｓｒｃｈ？ｃｈｒ＝ｈｕｍ＿ｃｈｒ．ｉｎｇ＆ｇｕｅｒｙ）に提出した際に特定の染色体間隔を生じる、特定のマーカー名称を生じる。
【０１６８】
あるいは、データベース解析によって、ＨＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の位置に関する情報を得ることが可能である。Ｃｅｌｅｒａヒトゲノムデータベースを用いたヒトゲノムコンティグの解析によって、ＨＡＭ配列が、ヒト染色体１０ｑ２６に位置すると同定された。
【０１６９】
（実施例６）
結合アッセイ
ＨＡＭポリペプチドまたはその断片を、組換えＤＮＡ技術によって発現させ、精製し、そして多様な細胞系譜の多様な細胞（例えば造血細胞）と結合する能力に関して試験する。結合アッセイはＨＡＭポリペプチドを使用し、該ポリペプチドには、これらのポリペプチドの可溶性型、および以下に記載するように形成するオリゴマーが含まれる。
【０１７０】
アッセイ用のオリゴマーは以下のように調製する。ＨＡＭポリペプチドのＣＯＯＨ末端に融合させたロイシンジッパーペプチドを含んでなる融合タンパク質を、上述のように構築する。該ポリペプチドは、ＨＡＭポリペプチドの細胞外領域など、ＨＡＭポリペプチドの可溶性型を含んでなることが可能である。本質的に、Ｂａｕｍら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３９９２−４００１，  １９９４）に記載されるように、発現構築物を調製する。発現ベクターｐＤＣ４０９中の該構築物は、ヒト・サイトメガロウイルス由来のリーダー配列、その後、可溶性ＨＡＭポリペプチドのＣ末端に融合させたロイシンジッパー部分をコードする。あるいは、ＨＡＭポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクターに挿入する。組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞において、ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質を発現させ、そしてＦｃ部分間の鎖間ジスルフィド結合の形成によってアセンブルを可能にして、こうして二量体分子を生じる。
【０１７１】
発現させたＦｃ／ＨＡＭポリペプチドまたはロイシンジッパー／ＨＡＭポリペプチド融合タンパク質を、ＨＡＭポリペプチド結合パートナーを発現していると推測される細胞と接触させる。１つの態様において、いくつかの示標因子いずれかを介する、エネルギー代謝または免疫細胞活性化の変化を検出することによって、融合タンパク質活性を測定する。別の態様において、融合タンパク質の存在下および非存在下で、天然ＨＡＭポリペプチドを発現する細胞が、ＨＡＭポリペプチド結合パートナーを発現する細胞と結合するかまたは相互作用する能力を検出することによって、融合タンパク質の活性を測定する。さらに別の態様において、例えば標識抗ＩｇＧ抗体を用いて、ＨＡＭポリペプチド同族体への融合タンパク質の結合を検出することによって、融合構築物の結合活性を検出する。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１−ａ】図１Ａ〜Ｄは、本発明のｃＤＮＡ配列および対応するポリペプチド配列を示す。矢印は、コード配列の多様な断片を増幅するのに用いたプライマーを示す。
【図１−ｂ】図１Ａ〜Ｄは、本発明のｃＤＮＡ配列および対応するポリペプチド配列を示す。矢印は、コード配列の多様な断片を増幅するのに用いたプライマーを示す。
【図１−ｃ】図１Ａ〜Ｄは、本発明のｃＤＮＡ配列および対応するポリペプチド配列を示す。矢印は、コード配列の多様な断片を増幅するのに用いたプライマーを示す。
【図１−ｄ】図１Ａ〜Ｄは、本発明のｃＤＮＡ配列および対応するポリペプチド配列を示す。矢印は、コード配列の多様な断片を増幅するのに用いたプライマーを示す。
【図２−ａ】図２Ａ〜Ｃは、アトラクチン／マホガニーのヒト相同体（ＨＡＭ）、ヒト・アトラクチンおよびネズミ・マホガニー配列の並列を示す。
【図２−ｂ】図２Ａ〜Ｃは、アトラクチン／マホガニーのヒト相同体（ＨＡＭ）、ヒト・アトラクチンおよびネズミ・マホガニー配列の並列を示す。
【図２−ｃ】図２Ａ〜Ｃは、アトラクチン／マホガニーのヒト相同体（ＨＡＭ）、ヒト・アトラクチンおよびネズミ・マホガニー配列の並列を示す。
【図３−ａ】図３Ａ〜Ｂは、本発明のＨＡＭポリペプチドの推定上のドメインを示す。
【図３−ｂ】図３Ａ〜Ｂは、本発明のＨＡＭポリペプチドの推定上のドメインを示す。
【図４−ａ】図４Ａ〜Ｂは、配列番号２のヒトＨＡＭポリペプチドと、配列番号１９のネズミＨＡＭポリペプチドの並列を示す。
【図４−ｂ】図４Ａ〜Ｂは、配列番号２のヒトＨＡＭポリペプチドと、配列番号１９のネズミＨＡＭポリペプチドの並列を示す。
【図５−ａ】図５Ａ〜Ｄは、配列番号１９のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図５−ｂ】図５Ａ〜Ｄは、配列番号１９のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図５−ｃ】図５Ａ〜Ｄは、配列番号１９のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図５−ｄ】図５Ａ〜Ｄは、配列番号１９のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図１−ａ】
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【図１−ｂ】
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【図１−ｃ】
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【図１−ｄ】
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【図２−ａ】
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【図２−ｂ】
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【図２−ｃ】
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【図３−ａ】
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【図３−ｂ】
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【図４−ａ】
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【図４−ｂ】
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【図５−ａ】
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【図５−ｂ】
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【図５−ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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