(57)【要約】本発明は、一般に、遺伝子発現およびタンパク質生成に関し、より具体的には、組換えタンパク質の過剰発現のための組成物および方法に関する。このような組成物および方法は、組換えタンパク質の高レベルの大規模生成において有用である。組換えタンパク質の高レベルな大規模生成のための組成物および方法が開示される。無血清懸濁培養液中で増殖し得る不死化宿主細胞株と組み合わせて、高レベルのタンパク質および／またはポリペプチド発現をし得る１つ以上の発現ベクターを含む。二方向ＵＣＯＥベクターは、単一のＵＣＯＥベースのプラスミドベクターから同時に、２つ以上の組換えタンパク質および／またはポリペプチドを発現し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高レベルで大規模なタンパク質および／またはポリペプチドの発現を達成するための組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）培養液中で連続的に増殖し得る不死化された宿主細胞株であって、ここで、該宿主細胞株は、無血清懸濁培養液中で増殖し得る宿主細胞株、および
（ｂ）組換えタンパク質および／またはポリペプチドの持続した過剰発現のためのベクター、
を含み、該宿主細胞株は、該ベクターでトランスフェクトされている、組成物。
【請求項２】
前記不死化された宿主細胞株が、１６時間以下である倍加時間を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記倍加時間が、１２時間以下である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
トランスフェクション効率が少なくとも７０％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
トランスフェクション効率が少なくとも７５％である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
トランスフェクション効率が少なくとも８５％である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも９５％のトランスフェクション効率を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記宿主細胞株が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、およびピューロマイシンからなる群から選択される選択剤に感受性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記宿主細胞株が、前記組換えタンパク質および／またはポリペプチドのｇａｌ−ｇａｌグリコシル化の非存在によって特徴付けられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記宿主細胞株が、ＣＨＯ−Ｓ、２９３−Ｆ、２９３−Ｈ、ＣＯＳ−７Ｌ、Ｄ．Ｍｅｌ−２、Ｓｆ２１、およびＳｆ９からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ベクターが、（ａ）前記不死化された宿主細胞株中での高レベルで大規模な発現を促進する１種以上のエレメントの含有、および（ｂ）前記組換えタンパク質および／またはポリペプチドの抑制に対する耐性、からなる群から選択される特性をさらに備える、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ベクターが、１つ以上のユニバーサルクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、培養液１リットルあたり少なくとも５０ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドのレベルの発現を達成し得ることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、培養液１リットルあたり少なくとも１００ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドのレベルの発現を達成し得ることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、培養液１リットルあたり少なくとも２００ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドのレベルの発現を達成し得ることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、少なくとも１００リットルのスケールまでスケールアップされ、そして、該組成物が、少なくとも１グラムのタンパク質および／またはポリペプチドの収量であり得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、少なくとも１０グラムのタンパク質および／またはポリペプチドの収量であり得る、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、少なくとも２０グラムのタンパク質および／またはポリペプチドの収量であり得る、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
タンパク質および／またはポリペプチドの、高レベルな大規模生成のための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）懸濁液中で増殖し得る不死化宿主細胞株を得る工程；
（ｂ）該不死化宿主細胞株を無血清培地中での増殖のために適合させる工程；
（ｃ）組換えタンパク質および／またはポリペプチドの高レベルの発現に適切なベクターを用い、無血清増殖を適用して不死化細胞株をトランスフェクトする工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記不死化された宿主細胞株が、１６時間以下である倍化時間を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記倍加時間が、１２時間以下である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも７０％のトランスフェクション効率を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記トランスフェクション効率が少なくとも７５％である、請求２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記トランスフェクション効率が少なくとも８５％である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記トランスフェクション効率が少なくとも９５％である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞株が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、およびピューロマイシンからなる群から選択される選択剤に感受性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞株が、前記組換えタンパク質および／またはポリペプチドのｇａｌ−ｇａｌグリコシル化の非存在によって特徴付けられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞株が、ＣＨＯ−Ｓ、２９３−Ｆ、２９３−Ｈ、ＣＯＳ−７Ｌ、Ｄ．Ｍｅｌ−２、Ｓｆ２１、およびＳｆ９からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターが、（ａ）前記不死化された宿主細胞株中での高レベルで大規模な発現を促進する１種以上のエレメントの含有、および（ｂ）前記組換えタンパク質および／またはポリペプチドの抑制に対する耐性、からなる群から選択される特性をさらに備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記ベクターが、１つ以上のユニバーサルクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、培養液１リットルあたり少なくとも５０ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドのレベルの発現を達成し得ることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組方法が、培養液１リットルあたり少なくとも１００ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドのレベルの発現を達成し得ることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、培養液１リットルあたり少なくとも２００ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドのレベルの発現を達成し得ることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、少なくとも１００リットルのスケールまでスケールアップされ得、ここで、該方法は、少なくとも１グラムのタンパク質および／またはポリペプチドの収量であり得る、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、少なくとも１０グラムのタンパク質および／またはポリペプチドの収量であり得る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、少なくとも２０グラムのタンパク質および／またはポリペプチドの収量であり得る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
多サブユニットタンパク質および／またはポリペプチドの高レベルな大規模発現のための二方向ベクターであって、該ベクターは、以下：
（ａ）少なくとも１つのＵＣＯＥエレメント；
（ｂ）第１の転写プロモーター；および
（ｃ）第２の転写プロモーター；
を含み、ここで、該ＵＣＯＥ成分は、該第１の転写プロモーターおよび該第２の転写プロモーターに作動可能に連結され、ここで、該第１の転写プロモーターは、該第２の転写プロモーターの反対方向に配向される、二方向ベクター。
【請求項３８】
前記ＵＣＯＥエレメントが、ＲＮＰ  ＵＣＯＥである、請求項３７に記載の二方向ベクター。
【請求項３９】
前記第１の転写プロモーターが、ヒトＣＭＶプロモーター、マウスＣＭＶプロモーターおよびヒトβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項３７に記載の二方向ベクター。
【請求項４０】
高レベルで大規模なタンパク質および／またはポリペプチドの発現を達成するための組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）培養液中で連続的に増殖し得る不死化された宿主細胞株であって、ここで、該宿主細胞株は、無血清懸濁培養液中で増殖し得る、宿主細胞株、および
（ｂ）請求項３７に記載の二方向ベクター、
を含み、該宿主細胞株は、該ベクターでトランスフェクトされている、組成物。
【請求項４１】
タンパク質および／またはポリペプチドの、高レベルな大規模生成のための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）連続的に増殖し得る宿主細胞株を得る工程；
（ｂ）該宿主細胞株を無血清培地中での増殖に適合させ、無血清培地中で、連続的に増殖し得る宿主細胞株を作製する工程；
（ｃ）請求項３７に記載のベクターを用いて、無血清培地中で、連続的に増殖し得る該細胞株をトランスフェクトする工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記連続的に増殖し得る宿主細胞株がまた、懸濁液中で増殖し得る、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記懸濁液中で連続的に増殖し得る宿主細胞株が、ＣＨＯ−Ｓ細胞株である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
多サブユニットタンパク質および／またはポリペプチドの高レベルな大規模発現のための二方向ベクターであって、該ベクターは、以下：
（ａ）少なくとも１つのＵＣＯＥエレメント；および
（ｂ）転写プロモーター；
を含み、該ベクターは、表４および図１４に示されるとおりの、ΔＢＳ、ΔＥｃｏＮＩ、ΔＥＭ、ΔＭｌｕＩ、およびΔＲＶからなる群から選択されるＲＮＰ  ＵＣＯＥの領域内に１つ以上の欠失をさらに含む、
ベクター。
【請求項４５】
前記欠失が、表４および図１４中のΔＢＳによって示されるＲＮＰ  ＵＣＯＥの領域内にある、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記欠失が、少なくとも１００ｂｐである、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４７】
前記欠失が、少なくとも１，０００ｂｐである、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４８】
前記欠失が、少なくとも４，０００ｂｐである、請求項４４に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、遺伝子発現およびタンパク質生成に関し、より具体的には、組換えタンパク質の過剰発現のための組成物および方法に関する。このような組成物および方法は、組換えタンパク質の高レベルの大規模生成において有用である。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
バイオテクノロジー産業の主な目標は、組換えタンパク質（例えば、組換え抗体）の大規模発現のための、安定な細胞ベースの系を開発することである。標準的な方法論は、適切な組換え宿主細胞株の時間浪費的かつ労働集約的な開発を必要とする。従来、細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ  ＤＵＸのような）は、ウシ胎仔血清の存在下で増殖し、そして目的の発現ベクターによってトランスフェクトされる。細胞の全集団は、引き続いて、発現ベクターを取り込み損ねた細胞を除去するために、選択プロセスを経る。次いで、ベクター含有プールは、代表的に、サブクローニングされ、そして高レベルの発現についてスクリーニングされる。得られた高レベル発現クローンの各々は、次いで、拡大され、そして無血清の懸濁培養物にゆっくりと適合され、この適合は、組換えタンパク質および／またはポリペプチドの発現の損失をしばしば生じる。
【０００３】
組換えタンパク質発現におけるこれらの一般的な制限に加えて、多サブユニットのタンパク質（例えば、抗体）の効率的な機能的発現は、両方のサブユニット鎖のほぼバランスの取れた発現を必要とする。例えば、抗体重鎖および抗体軽鎖の発現のための従来の方法論は、等コピー数の維持を困難にし、そしてベクターがゲノム中で互いに近接して組み込まれる場合に、遺伝子間の転写干渉の可能性を提供する、重鎖コード領域および軽鎖コード領域を独立して保有するプラスミドの同時トランスフェクションに依存する。
【０００４】
従って、かなりの研究にもかかわらず、組換えタンパク質および／またはポリペプチド（抗体の重鎖および軽鎖を含む）の高レベルの大規模発現のための改善された組成物および方法の必要性が、当該分野にいまだ存在する。本発明は、これらの要求を満たし、そしてさらに、組換えタンパク質発現のために適切な発現ベクターと組み合わせて、無血清の懸濁培養物に予め適合された宿主細胞株を利用することによって、他の関連する利点を提供する。本明細書中には、単一のＵＣＯＥベースのプラスミドベクターから、２種以上の組換えタンパク質および／またはポリペプチドの同時の高レベル発現を可能にする、二方向性のＵＣＯＥベクターもまた提供される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、一般に、組換えタンパク質および／またはポリペプチドの高レベルの大規模な開発および製造に適切な、組換え細胞株の迅速かつ効果的な開発のための組成物および方法に関する。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、以下を含む組成物を提供する：
（ａ）培養物中で連続的に増殖し得る不死化宿主細胞株であって、この宿主細胞株は、無血清の懸濁培養物中で増殖し得る、および（ｂ）組換えタンパク質および／またはポリペプチドの持続した過剰発現のためのベクター（例えば、本明細書中に記載されるＵＣＯＥベースのベクター）。
【０００７】
別の局面において、本発明は、ポリペプチドの高レベルの大規模生成のための方法を提供する。特定の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）懸濁物中で増殖し得る不死化宿主細胞株を獲得する工程；（ｂ）無血清培地中での増殖のために、この宿主細胞株を適合する工程；（ｃ）懸濁物および無血清培地中で増殖し得る得られた不死化宿主細胞株を、組換えタンパク質および／またはポリペプチドの過剰発現に適切なベクターでトランスフェクションする工程。
【０００８】
本発明の組成物および方法によれば、適切な不死化宿主細胞株は、以下の特性のうち、１以上を保有し得る：（ａ）１６時間以下、好ましくは１２時間と１６時間との間の倍加時間；（ｂ）少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のトランスフェクション効率；（ｃ）標準的な選択因子（例えば、ハイグロマイシン、Ｇ４１８およびプロマイシン）に対する感受性；（ｄ）組換えタンパク質および／またはポリペプチドのｇａｌ−ｇａｌグリコシル化の非存在。
【０００９】
本願発明における使用のために適合され得る例示的な不死化宿主細胞株としては、限定ではなく、以下の市販の宿主細胞株が挙げられる：（ａ）ＣＨＯ−Ｓ（チャイニーズハムスター卵巣宿主細胞株）；（ｂ）２９３−Ｆ（ヒト宿主細胞株）；（ｃ）２９３−Ｈ（ヒト宿主細胞株）；（ｄ）ＣＯＳ−７Ｌ（サル宿主細胞株）；（ｅ）Ｄ．Ｍｅｌ−２（昆虫宿主細胞株）；（ｆ）Ｓｆ２１（昆虫宿主細胞株）；および（ｇ）Ｓｆ９（昆虫宿主細胞株）。あるいは、適切な宿主細胞株は、本明細書中に開示される方法論に従う、慣用的な実験によって獲得され得る。
【００１０】
本発明の組成物および方法における使用のために適切な、組換えタンパク質および／またはポリペプチドの過剰発現のためのベクターは、以下の特性のうち、１つ以上を保有し得る：（ａ）不死化宿主細胞株における高レベルの大規模発現を促進する、１以上のエレメントを含むこと、ならびに（ｂ）組換えタンパク質および／またはポリペプチドの抑制に対して耐性であること。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明のベクターは、本明細書中以下に記載されるように、１以上のユニバーサルクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）をさらに含み得る。さらに、またはあるいは、本明細書に開示されるようなベクターは、１以上の転写プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターのような）を含み得る。
【００１２】
本発明の好ましい組成物および方法は、培養物１リットル当たり、少なくとも５０ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドの発現レベル、より好ましくは、１リットル当たり、少なくとも１００ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドの発現レベル、そしてなおより好ましくは、１リットル当たり、少なくとも２００ｍｇの組換えタンパク質および／またはポリペプチドの発現レベルを達成し得る。
【００１３】
本発明はさらに、少なくとも１ｇのタンパク質および／またはポリペプチド、より好ましくは少なくとも５ｇのタンパク質および／またはポリペプチド、なおより好ましくは、少なくとも１０ｇのタンパク質および／またはポリペプチド、そして最も好ましくは、少なくとも２０ｇのタンパク質および／またはポリペプチドの収率（培養物１００リットル当たり）で、少なくとも１００リットルの規模までスケールアップし得る組成物および方法を提供する。
【００１４】
本発明は、単一のＵＣＯＥベースのプラスミドベクターでの、２種以上の組換えタンパク質の高レベルの発現のための、二方向性ベクター系を使用する組成物および方法をなおさらに提供する。例示的な二方向性ベクター系は、マウスＣＭＶプロモーター、ヒトＣＭＶプロモーターおよびヒトβ−アクチンプロモーターからなる群より選択される１以上の転写プロモーターを含み得る。
【００１５】
本発明はまた、ＲＮＰ  ＵＣＯＥベースのプラスミドベクター（例えば、ＣＥＴ７２０ＧＦＰ）を含み、必要に応じて８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥ部分内に１以上の欠失を含む、１以上の組換えタンパク質の改善された発現のための、組成物および方法を提供する。例示的なＵＣＯＥ欠失構築物は、好ましくは、本明細書中に記載される８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥエレメントの活性と比較して、有意なＵＣＯＥ活性（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％以上のＵＣＯＥ活性）を保持する。表４および図１４に示されるように、例示的な欠失は、必要に応じて、ΔＢＳ、ΔＥｃｏＮＩ、ΔＥＭ、ΔＭｌｕＩおよびΔＲＶからなる群より選択される、ＲＮＰ  ＵＣＯＥの領域内の欠失を含み得る。本発明の範囲内の欠失は、好ましくは、少なくとも１００ｂｐ、より好ましくは少なくとも２５０ｂｐ、なおより好ましくは少なくとも１０００ｂｐ、なおより好ましくは少なくとも２５００ｂｐ、そしてなおより好ましくは少なくとも４０００ｂｐである。従って、本発明の特定の例示的なＵＣＯＥベクターは、最小で少なくとも１以上のＵＣＯＥ部分を含み、ここで、ＵＣＯＥ部分は、ＵＣＯＥ活性の所望のレベルを保持する。１つの例示的な実施形態において、ＣＥＴ７２０ＧＦＰ（配列番号９）のヌクレオチド残基５１５２〜９２５４に対応する少なくとも約４．１ｋｂのＵＣＯＥ部分が使用される。このＵＣＯＥ部分は、例えば、ＣＥＴ７２０ＧＦＰ（配列番号９）のヌクレオチド残基２２２５〜１０５２５に対応する、全長８ｋｂのＵＣＯＥエレメントで観察されたレベルと匹敵するレベルのＵＣＯＥ活性を保持することが、本明細書中で実証されている。これらおよび他のＵＣＯＥ部分は、本明細書中で提供された開示に照らして、慣用的かつ当該分野で認識された技術を介して、容易に同定され得、そしてその活性が評価され得る。
【００１６】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して、明らかとなる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、その各々が個々に援用されるかのように、その全体が本明細書によって参考として援用される。
【００１７】
（配列識別子の簡単な説明）
配列番号１は、ｐＢＤＵｎｅｏ１００のポリヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号２は、ｐＢＤＵｎｅｏ２００のポリヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号３は、ｐＢＤＵｐｕｒｏ３００のポリヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号４は、ｐＢＤＵｐｕｒｏ４００のポリヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号５は、ｐＢＤＵｎｅｏ５００のポリヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号６は、ｐＢＤＵｎｅｏ６００のポリヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号７は、ｐＢＤＵｐｕｒｏ７００のポリヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号８は、ｐＢＤＵｐｕｒｏ８００のポリヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号９は、ベクターＣＥＴ７２０ＧＦＰのポリヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号１０〜２６は、本発明に従う改良ＵＣＯＥベクターの生成のために、実施例４において使用される例示のプライマー配列を示す。
【００２７】
配列番号２７は、ｐＢＤＵｐｕｒｏ３５０のポリヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号２８は、ｐＢＤＵｐｕｒｏ４５０のポリヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号２９は、ｐＢＤＵｎｅｏ１２００のポリヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号３０は、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１４５０のポリヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号３１は、ｐＢＤＵｎｅｏ１６００のポリヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号３２は、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１８００のポリヌクレオチド配列である。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、概して、組換えタンパク質および／または組換えポリペプチドの高レベルで大規模な生成において使用するための組成物および方法に関する。以下でさらに記載するように、本発明の例示の組成物としては、組換えタンパク質および／または組換えポリペプチドの高レベルで大規模な発現に適した１つ以上の発現ベクターと組み合わせて、不死化された、無血清の懸濁宿主細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
本発明の実施には、逆のことが具体的に記載されない限り、当業者の技術範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来方法を使用する。これらの多くは、例示の目的で、以下に記載されている。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００３５】
本明細書（上記も下記も）中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明示的に示さない限り、複数の言及物を包含する。
【００３７】
（無血清懸濁宿主細胞株の調製および選択）
本発明の組成物および方法における使用のために理想的に適切な宿主細胞株は、以下の特性の１つ以上を有し得る：（ａ）培養中に不死化で連続的に増殖し得る；（ｂ）懸濁物中での増殖に適合される；（ｃ）迅速な増殖（好ましくは、１２〜１６時間の倍加時間）；（ｄ）高いトランスフェクション効率（好ましくは、少なくとも７０％）；（ｅ）標準的な選択剤（好ましくは、ハイグロマイシン、Ｇ４１８またはピューロマイシン）による選択に対する感受性；（ｆ）ヒト治療薬としての使用に合わせたタンパク質グリコシル化パターン（好ましくは、ｇａｌ−ｇａｌグリコシル化パターンが存在しない）；および（ｇ）無血清培地中での増殖（好ましくは、間接的な動物由来成分を含まない、化学的に規定されたタンパク質を含まない増殖）に適合される。
【００３８】
これらの特性の１つ以上を有する宿主細胞株を使用して、組換えタンパク質および／またはポリペプチドの高レベルな大規模産生のための既存の方法論と比較して減少した労力および時間での開発および操作に移行され得る、組換え宿主細胞株の迅速な開発のための系を開発し得る。
【００３９】
組換えタンパク質の長期の高収率産生について、安定な発現が一般に好ましい。例えば、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を同一または別々のベクター上に含み得る発現ベクターを使用してトランスフェクトされ得る。ベクターの導入後、選択培地に交換する前に富化された培地中で、細胞を１〜２日増殖させ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、導入した配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して増殖され得る。
【００４０】
任意の数の選択系を使用して、形質転換された細胞株を回収し得る。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：それぞれｔｋ．ｓｕｐ．細胞またはａｐａｒｔ．ｓｕｐ．細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍら（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ，Ｉら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）。また、代謝拮抗物質耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択の基礎として使用され得る：例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０）；グルタミン依存的増殖およびメチオニンスルフォキシイミン（ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）に対する耐性を付与するグアニンシンセターゼ（ＧＳ）（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（２）：１６９−７５およびＣｏｃｋｅｔｔら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１９（２）３１９−２５）；アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆら（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）；ならびに、それぞれクロルサルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）およびホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ）のアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するａｌｓおよびｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ（上述））。さらなる選択（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）遺伝子が記載されている。例えば、細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させ得るｔｒｐＢ、または細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させ得るｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。可視マーカーの使用は、形質転換体を同定するためだけでなく特定のベクター系に起因し得る一過性タンパク質発現もしくは安定なタンパク質発現の量を定量するためにも広範に使用される、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーを用いて評判を得た（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【００４１】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子がまた存在することを示唆するが、その存在および発現は、確認される必要があり得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含有する組換え細胞が、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの制御下でポリペプチドコード配列とタンデムに置かれ得る。誘導または選択に応じたマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデム遺伝子の発現をなおも示す。
【００４２】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含みそして発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質のバイオアッセイ技術または免疫アッセイ技術（例えば、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜ベースの技術、溶液ベースの技術またはチップベースの技術を含む）。
【００４３】
ポリヌクレオチドがコードする産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する、その産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルが、当該分野において公知である。例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を使用する、２つの部位の（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）モノクローナルベースの免疫アッセイが、いくつかの適用に好ましくあり得るが、競合結合アッセイもまた使用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイが、他の場所（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に記載される。
【００４４】
広範な種々の標識技術および複合体技術が、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを生成するための手段としては、オリゴ標識、ニック翻訳、末端標識または標識ヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、配列またはその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためのベクター中にクローニングされ得る。このようなベクターは当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することによって、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販のキットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または色原体因子、ならびに基質、補因子、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【００４５】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養でのタンパク質の発現および細胞培養物からのタンパク質の回収に適切な条件下で培養され得る。組換え体細胞によって産生されたタンパク質は、使用した配列および／またはベクターに依存して分泌されても細胞内に含まれてもよい。当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物細胞膜または真核生物細胞膜を介するそのコードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え体構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結し得る。このような精製を容易にするドメインとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：金属キレートペプチド（例えば、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファン分子）、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）において使用されるドメイン。この精製ドメインとこのコードポリペプチドとの間で切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に特異的な配列）の包含を使用して、精製を容易にし得る。このような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドとチオレドキシン切断部位またはエンテロキナーゼ切断部位の前にある６ヒスチジン残基をコードする核酸とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら（１９９２；Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるようなＩＭＩＡＣ（固定化された金属イオンアフィニティクロマトグラフィー）上での精製を容易にし、その一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、所望のポリペプチドをその融合タンパク質から精製する手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターについての考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１−４５３）に提供される。
【００４６】
無血清の不死化宿主細胞株は、例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）；Ｃｅｌｏｘ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；欧州および日本の細胞バンク（それぞれ、ＥＣＡＣＣ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ（ＵＫ）およびＪＣＲＢ，Ｓｈｉｎｊｕｋｙ，Ｊａｐａｎ）のような、種々の公的供給源および／または商業的供給源より容易に入手可能である。
【００４７】
適切な宿主細胞株は、１つ以上の上記の特性を有する、現存する宿主細胞株を選択することによって取得され得、そして残りの特性を得るためにその宿主細胞株の改変体を適合および／または選択し得る。予め適合した宿主細胞株の使用は、トランスフェクションプロセスおよび組換えタンパク質の発現プロセスを開始する前に、この細胞が所望の状態を達成し得ることを確実にする。以下に注記されるように、このような細胞株は、ＵＣＯＥ含有発現ベクターと組合わせた使用に理想的に適切である。なぜなら、これらのベクターはタンパク質を安定して長期間高レベルで発現することによって特徴付けられる。
【００４８】
本発明の組成物および方法に従う使用のために改変および／または適合され得る適切な宿主細胞株の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ａ）２９３−Ｆヒト宿主細胞株；（ｂ）２９３−Ｈヒト宿主細胞株；（ｃ）ＣＯＳ−７Ｌサル宿主細胞株；（ｄ）Ｄ．ＭＥＬ−２昆虫宿主細胞株；（ｅ）ＳＦ２１昆虫宿主細胞株；（ｆ）ＳＦ９昆虫宿主細胞株；および（ｇ）ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞株。
【００４９】
例えば、市販の、化学的に規定された、タンパク質を含まない培地に適合された、チャイニーズハムスター卵巣サブクローン（ＣＨＯ−Ｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）は、本発明の組成物および方法において適切に使用され得る。Ｄ’Ａｎｎａら、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４８：２６０−２７１（１９９７）；Ｄ’Ａｎｎａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８：１１５−１２５（１９９６０；Ｄｅａｖｅｎら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  ４１：１２９−１４４（１９７３）；Ｇｏｒｆｅｉｎら、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ＆Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ９：２４７−２５２（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９９８）を参照のこと。ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞株は、ピーク細胞密度９〜１１×１０６生存細胞／ｍｌに達する攪拌フラスコ培養中での１２〜１６時間の倍加時間を有する。これらの細胞は、４００μｇ／ｍｌでのハイグロマイシンおよび６００μｇ／ｍｌでのジェネティシン（Ｇ４１８）に感受性である。これらの細胞は、静置培養においてでさえ接着依存的単一細胞として増殖する。
【００５０】
使用される組換えタンパク質上のＧａｌα１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｇａｌ−Ｇａｌ）炭水化物残基の存在は、臨床的には血清からの迅速なタンパク質クリアランスに関連する。げっ歯類細胞は、典型的には、分泌された糖タンパク質の炭水化物構造に終末Ｇａｌ−Ｇａｌ二糖類を導入するが、Ｇａｌ−Ｇａｌ残基は、ヒト糖タンパク質には見出されない。結果として、この特定の炭水化物構造を有さない組換えタンパク質産生能は有利である。
【００５１】
ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞株は、本明細書中以下に注記されるように、１つ以上のＵＣＯＥエレメントを含む発現ベクターと組合わせた使用に特に十分適切である。この宿主細胞株は、好都合な増殖特性を有し、そしてその表面糖タンパク質中に検出不可能なレベルのＧａｌ−Ｇａｌ炭水化物部分を作製する。よって、ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞株は、臨床使用のために産生される組換えタンパク質および／またはポリペプチドの発現に適切である。
【００５２】
（発現ベクターの調製および選択）
本発明に従う組換えタンパク質および／またはポリペプチドの発現に適切なベクター系は、以下の特性の１つ以上を含み得る：（ａ）操作容易性；（ｂ）組込み部位に非依存的な高レベルの発現を作り上げるエレメント；（ｃ）サイレンシング／抑制に対して耐性でありこれにより持続的で長期間にわたって安定な発現を可能にする発現を作り上げるエレメント；および（ｄ）種々の細胞型および種々の種において高レベルで発現するエレメント。
【００５３】
所望のタンパク質および／またはポリペプチドを発現するために、このポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列が、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）中に挿入され得る。当業者に周知の方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが挙げられる。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【００５４】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ポリヌクレオチド配列を含み得そして発現し得る。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系。
【００５５】
発現ベクター中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域）であり、これらは、転写および翻訳を実施するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。このようなエレメントは、その強さおよび特異性において変化し得る。使用されるベクター系および宿主に依存して、多くの適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成プロモーターおよび誘導プロモーターを含む）が使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする複数のコピーの配列を含む細胞株を生成することが必要である場合、ＧＳ選択マーカーまたはＤＨＦＲ選択マーカーを含むベクターあるいはＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターは、適切な選択マーカーとともに有利に使用され得る。
【００５６】
昆虫系をまた使用して、目的のポリペプチドを発現し得る。例えば、このような１つの系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このポリペプチドをコードする配列は、このウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中にクローニングされ得、そしてポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。このポリペプチドをコードする配列の首尾よい挿入は、このポリヘドリン遺伝子を不活性にし、そして組み換えウイルスを欠くコートタンパク質を産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得るＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅ（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）を感染させ得る。
【００５７】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系が、一般に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３連のリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１領域またはＥ３領域への挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る生存ウイルスを獲得し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加し得る。
【００５８】
特定の開始シグナルをまた使用して、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成し得る。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が、適切な発現ベクター中に挿入される場合、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳シグナルは、必要とされ得ない。しかし、コード配列またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の転写制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレームにあるべきである。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）のものであり得る。発現効率は、使用される特定の細胞系（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるような細胞系）に適切であるエンハンサーの包含によって増強され得る。
【００５９】
高レベルの発現の組込み独立部位（ｓｉｔｅ−ｏｆ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）を作製するために適切な例示的な好ましいエレメントとしては、例えば、ユニバーサルクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）が挙げられる。ＵＣＯＥは、クロマチンを「開いた」構造に維持するポリヌクレオチド配列である。例えば、Ｃｒｏｍｂｉｅら，ＰＣＴ特許出願第ＷＯ０００５３９３号（２０００）を参照のこと。ＵＣＯＥを発現ベクター中でプロモーターの上流に含むことは、組込み部位とは独立し、そしてサイレンシングに耐性である、高レベルの発現を提供する。効率的な発現は、組み込まれた１コピーの遺伝子部位から誘導され得、選択されたプールにおいてマーカー遺伝子を発現する細胞を標準的な非ＵＣＯＥ含有ベクターと比較してより高い百分率でもたらし得る。従って、無血清の利用と組合せて、懸濁適合親細胞株は、短期間での大量のタンパク質の迅速な産生を可能にする。ＵＣＯＥベクターを用いて得られた増大した効率は、高産生性サブクローンを得るために選択される必要があるトランスフェクタントの数を有意に低減する。
【００６０】
懸濁適合宿主細胞株における１以上のＵＣＯＥを含むベクターの利用は、タンパク質および／またはポリペプチド（例えば、抗体またはそのフラグメント）の迅速な開発および規模拡大を可能にする。ＵＣＯＥは、少数のサブクローンをスクリーニングして、無血清条件下で５週間の期間で少なくとも５０ｍｇ／Ｌのタンパク質および／またはポリペプチド、より好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌのタンパク質および／またはポリペプチド、そしてさらにより好ましくは少なくとも２００ｍｇ／Ｌのタンパク質および／またはポリペプチドを産生し得るクローンを獲得することを可能にする。
【００６１】
好ましくは、本発明の組成物および方法において使用するに適切な発現ベクター系は、懸濁培養物１リットルあたり１ｇのタンパク質および／またはポリペプチドを超える発現レベルを生じ得る。より好ましくは、発現ベクターは、適切な宿主細胞株において用いられ得、ここで、１細胞あたり少なくとも２０ｐｇのタンパク質および／またはポリペプチドが１日あたり達成される。
【００６２】
本明細書中以下で詳細に考察するように、本発明の特定の実施形態では、タンパク質および／またはポリペプチドは、１以上のサブユニット（例えば、抗体の重鎖および軽鎖またはそれらのフラグメント）を含み得る。当該分野で充分に理解されるように、効率的な機能的抗体産生は、重鎖および軽鎖の適切にバランスの取れた発現を必要とする。別個のプラスミド上のこれらの２つの鎖のトランスフェクションは、等しいコピー数の維持を困難にし、そしてこれらのベクターがゲノム中で互いに近位に組み込まれた場合、これらの遺伝子の間での転写妨害の可能性を提供する。従って、同じベクター上での２つの遺伝子の同時発現のための二方向性ベクターが用いられ得る。本明細書中以下の実施例においてさらに詳細に開示されるように、本発明の範囲内の例示的な二方向性ＵＣＯＥベースのベクター系は、必要に応じて、「ハイブリッド」ＲＮＰ／β−アクチンＵＣＯＥ（Ｃｏｂｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に基づいて構築され得る。ベクターは、１以上の抗生物質耐性マーカー（例えば、ネオマイシン耐性マーカーまたはピューロマイシン耐性マーカー）を含み得るか、および／または軽鎖発現または重鎖発現を駆動するために１以上の哺乳動物プロモーター（例えば、マウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）、ヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ）、またはヒトアクチンプロモーター）を含み得る。
【００６３】
（本発明の発現ベクターでの宿主細胞株のトランスフェクション）
大規模設定で増殖するように予め適合させた標準的宿主細胞株のトランスフェクションは、より迅速な細胞株の開発を可能にし、それによって、研究から開発および製造までの推移速度を増大させる。対照的に、トランスフェクション後に無血清および懸濁適合を必要とする親細胞株を用いた伝統的アプローチは、多数のサブクローンをスクリーニングする必要性をさらに増大させる。なぜなら、サブクローンの多くは、大規模なタンパク質賛成を可能にする条件下で増殖させることができないからである。適合させた細胞株の使用は、細胞株の開発に必要な時間を、数ヶ月から数週間へと短縮し得る。タンパク質を含まない化学的に規定された培地に細胞株を予め適合させ、そして振盪フラスコまたはバイオリアクターにおいて高細胞密度まで迅速に増殖させる。
【００６４】
適切なトランスフェクションプロトコルは、当業者に容易にわかり、そして容易に入手可能である。高レベルの大規模トランスフェクションを達成するために適切である例示的なトランスフェクションプロトコルは、ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞株のトランスフェクションに関してＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏによって推奨されるプロトコルである。一般に、トランスフェクトした細胞のポジティブ選択は、薬剤（例えば、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、およびピューロマイシン）を用いて達成され得る。トランスフェクション効率は代表的に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。トランスフェクションおよび選択後、得られるクローンのプールは、必要に応じて、さらにサブクローニングされて、最高レベルのタンパク質発現を有する個々のクローンが同定され得る。
【００６５】
（細胞培養条件の選択）
本発明による不死化した懸濁細胞の培養に適切な無血清培地の選択および試験は、日常的な実験により当業者によって達成され得る。本明細書中で記載のＣＨＯ−Ｓ細胞にとって、このＣＤ−ＣＨＯ培地が適切である（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＧｉｂｃｏから入手可能である）。
【００６６】
（高レベルの大規模発現にとって適切な例示的なタンパク質および／またはポリペプチド）
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、それらの従来の意味、すなわち、一続きのアミノ酸の配列として使用される。これらのポリペプチドは、特定の長さの産物に限定されることはなく；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義の内に包含され、そして、このような用語は、別段具体的に指し示されない限り交換可能に使用され得る。この用語はまた、ポリペプチドの翻訳後修飾（翻訳後改変）（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）ならびに天然に存在するかまたは天然に存在しない当該分野で公知な他の改変をいわずまた排除する。しかし、上述したように、本発明に記載の好ましいタンパク質および／またはポリペプチドは、Ｇａｌ−Ｇａｌグリコシル化を欠く。ポリペプチドはその全長または部分配列である。本発明の状況において本発明の特定のポリペプチドは、エピトープ（すなわち、ポリペプチドの免疫原性特性を実質的に担いそして免疫応答を誘引し得る抗原決定基）を含むアミノ酸部分配列である。
【００６７】
特定の好ましい実施形態において、本発明に従って産生されるかそして／または使用されるポリペプチドは、免疫原性である（すなわち、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＴ細胞刺激アッセイ）において、これらのポリペプチドは癌を有する患者由来の抗血清および／またはＴ細胞と検出可能に反応する）。免疫原性活性についてスクリーニングすることは、当業者に周知な技術を使用して実施され得る。例えば、このようなスクリーニングは、以下に記載の方法のような方法を使用して実施され得る：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８。１つの例示的な例において、ポリペプチドは、固体相支持体に固定されそして患者の血清と接触させて、この固定化されたポリペプチドに対する血清中の抗体との結合を可能にする。次いで、結合していない血清が除去され得、そして結合した抗体は、例えば、１２５Ｉ標識プロテインＡを使用して検出され得る。
【００６８】
当業者によって認識されるように、本明細書によって提供される開示に従って産生されるポリペプチドの免疫原性部分はまた、本発明に包含される。「免疫原性部分」とは、本明細書中で使用される場合、それ自体がそのポリペプチドを認識するＢ細胞および／またはＴ細胞の表面抗原レセプターと免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に結合する）本発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントである。免疫原性部分は、当該分野で公知の技術（例えば、Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびその中で引用されている参考文献に概説されている技術を使用して同定され得る。このような技術としては、抗原特異的抗体、抗血清、および／またはＴ細胞株もしくはＴ細胞クローンと反応する能力についてのポリペプチドのスクリーニングが挙げられる。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合するとき（すなわち、これらの抗血清および抗体は、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてそのタンパク質と反応し、そして関連しないタンパク質とは検出可能には反応しないとき）に「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載のようにおよび周知の技術を使用して調製され得る。
【００６９】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、全長ポリペプチドの（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおける）反応性よりも実質的に低くないレベルで、抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。好ましくは、免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドについての免疫原性の、少なくとも約５０％であり、好ましくはその少なくとも約７０％であり、そして最も好ましくはその約９０％を超える。いくつかの例において、対応する全長ポリペプチドの免疫原性活性レベルよりも高い免疫原活性レベルを有する（例えば、約１００％以上または１５０％以上の免疫原活性を有する）好ましい免疫原性部分が同定される。
【００７０】
他の特定の実施形態において、例示的な免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失した、ペプチドを含み得る。他の例示的な免疫原性部分は、成熟タンパク質に対して、小さなＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは、５〜１５アミノ酸）を含む。
【００７１】
別の実施形態において、本発明によって作製および／または使用されるタンパク質および／またはポリペプチドはまた、本発明のポリペプチド（特に、本明細書中に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）に対して、またはその免疫原性フラグメントもしくは改変体に対して生成する、Ｔ細胞および／または抗体と免疫学的に反応性の、１つ以上のポリペプチドを含み得る。
【００７２】
ポリペプチド「改変体」とは、この用語が本明細書中において使用される場合、本明細書中に具体的に開示されるポリペプチドと、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入が代表的に異なるポリペプチドである。このような改変体は、天然に存在し得るか、または例えば、本発明の１つ以上の上記ポリペプチド配列を修飾し、そしてこれらの活性を、本明細書中に開示されるように、そして／もしくは当該分野において周知の多数の技術のいずれかを使用して評価することによって、合成的に生成され得る。本発明による例示的な改変体配列は、本明細書中に提供される８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥ配列に対する相同性によって関連付けられる、所望の程度のＵＣＯＥ活性を保持する配列、またはその部分配列である。
【００７３】
１つの実施形態において、例えば、本発明の特に例示的な改変体配列は、本明細書中に具体的に開示されるＵＣＯＥポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％またはそれより大きい同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、このような改変体は、本明細書中に開示される８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥエレメントによって示されるＵＣＯＥ活性と比較される場合に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％、またはそれより大きいＵＣＯＥ活性を示す。
【００７４】
多くの例において、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」とは、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換され、その結果、ペプチド化学の当業者が、そのポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）性質が実質的に変化しないと予測する置換である。上記のように、修飾は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そして所望の特徴を有する（例えば、免疫原性特徴を有する）改変体ポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする、機能的分子を依然として得る。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させて、本発明のポリペプチドに等価な、または改善さえされた改変体または部分を作製することが望ましい場合には、当業者は、代表的に、表１に従って、コードＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変化させる。
【００７５】
例えば、特定のアミノ酸が、構造（例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような）との相互作用性結合能の相当な損失を伴わずに、タンパク質構造において他のアミノ酸について置換され得る。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは、そのタンパク質の相互作用能および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列およびもちろんその基礎をなすＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにもかかわらず、類似の性質を有するタンパク質を獲得し得る。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の相当な損失を伴わずに、開示される組成物のペプチド配列またはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが意図される。
【００７６】
【表１】
2004535189.tif 000002
このような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質への相互作用性の生物学的機能の付与におけるヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、一般に、当該分野で理解される（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２（本明細書中に参考として援用される））。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特性が、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これは、次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのタンパク質の相互作用を規定することが認められる。各々のアミノ酸は、その疎水性および荷電特性に基づいて、ヒドロパシー指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００７７】
当該分野において、特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そして類似の生物学的活性を有するタンパク質をなおもたらす（すなわち、生物学的な機能が等価なタンパク質をなお得る）ことが公知である。このような変化を行う際に、ヒドロパシー指標が、±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が、特に好ましく、そして±０．５以内の置換が、なおより特に好ましい。当該分野において、類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることがまた理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中において参考として具体的に援用される）は、タンパク質の最も大きな局所平均親水性が、その近傍のアミノ酸の親水性によって支配されるように、このタンパク質の生物学的性質に相関することを述べる。
【００７８】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に対して割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸について置換され得、そして生物学的に等価に、そして特に、免疫学的に等価なタンパク質をなお獲得することが理解される。このような変化において、親水性値が、±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が、特に好ましく、そして±０．５以内の置換が、なおより特に好ましい。
【００７９】
従って、上記で略述されるように、アミノ酸置換は、一般的には、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。種々の上述の特性を考慮する例示的な置換は、当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００８０】
さらに、任意のポリペプチドは、インビボで安定的に増加するようにさらに改変され得る。可能な改変としては、５’末端および／または３’末端における隣接配列の付加；骨格中のホスホジエステラーゼ結合以外のホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいはイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）およびワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）のような慣用でない塩基、ならびにアセチル形態、メチル形態、チオ形態、ならびに他の改変形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンの封入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
アミノ酸置換体は、さらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電されたアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性値を有する荷電されていない極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；およびセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的電荷を表し得るアミノ酸の他の基としては、以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた、（またはあるいは）非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によってネイティブ配列とは異なる。改変体はまた、（またはあるいは）例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）特性に最小の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【００８２】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時または翻訳後に、タンパク質の移動を指向する。このポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製または同定の容易さのために、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫原性Ｆｃ領域に結合体化され得る。
【００８３】
ポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列は、以下に記載されるように、最大の一致のために整列化されるとき、２つの配列中のアミノ酸の配列が同一である場合、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較を、代表的に、比較ウインドウにより配列を比較して、配列の局所領域の類似性を同定および比較することによって、実施される。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも２０個の連続部分（通常３０〜約７５、４０〜約５０）のセグメントをいい、ここで、配列は、２つの配列が最適に整列化された後に、同数の連続部分の参照配列と比較され得る。
【００８４】
配列の比較のための最適整列は、デフォルトパラメータを使用する、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ.，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、実施され得る。このプログラムは、以下の参考文献中に記載されるいくつかの配列スキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  第５巻，補遺３，第３４５−３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  第６２６−６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｉｔｏｕ、Ｎ．Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ、Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００８５】
あるいは、配列の比較のための最適の整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所識別アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の識別アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似方法のための検索、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ.，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のコンピュータでの実行、または検査によって、実施され得る。
【００８６】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの一つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のそれぞれに記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０を、例えば、本明細書中に記載されるパラメータを用いて使用し、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対する配列同一性パーセントを決定し得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公共利用可能である。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算し得る。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアが、その達成される最大値から量Ｘまで低下した場合；累積スコアが、１以上のネイティブスコアリング残基アライメントの累積に起因して、０以下に動いた場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータ（Ｗ、ＴおよびＸ）は、アルゴリズムの感度および速度を決定する。
【００８７】
一つの好ましいアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０個の位置の比較ウインドウにより２本の最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、この比較ウインドウ中のポリペプチド配列の位置は、この２本の配列の最適整列に対して、参照配列（この参照配列は、付加または欠失を含まない）と比較した場合、２０パーセント以下（通常、５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセント）の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。同一アミノ酸残基が、両方の配列において生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、一致した位置の数を参照配列の全ての位置の数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、そしてその値に１００を掛け、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、このパーセンテージを計算した。
【００８８】
他の例示の実施形態において、本発明に従って産生および／または使用され得るポリペプチドは、上記のように、ヒトポリペプチド（自己抗原とも呼ばれる）に対して、実質的な配列同一性を有するポリペプチドを含む異種ポリペプチドであり得、これは、参照ポリペプチドとして役に立つが、この異種ポリペプチドは、異なる非ヒト種由来である。当業者は、「自己」抗原が、しばしば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答の乏しい刺激物であり、従って、腫瘍ポリペプチドに対して特異的である免疫治療の効果的なストラテジーが、特定の自己腫瘍ポリペプチドに対する免疫寛容を克服するための、方法の開発を必要としていることを認識する。例えば、異種（非ヒト）起源由来の前立腺タンパク質で免疫されたヒトは、対応するヒトタンパク質（例えば、ヒトの腫瘍細胞情に存在するヒト前立腺腫瘍タンパク質）に対する免疫応答を備え得る。従って、本発明の一つの局面は、本明細書中に記載されるタンパク質および／またはポリペプチドの異種改変体を提供する。
【００８９】
より具体的には、本発明は、マウス、ラット、サル、ブタおよび他の非ヒトポリペプチドに関し、これらは、本明細書中に記載されるヒトポリペプチドの異種形態として使用され得る。
【００９０】
他の例示的な実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されているように、複数のポリペプチドおよび／またはポリペプチドサブユニットを含む融合ポリペプチド、または本明細書中に記載されているような少なくとも１種のポリペプチドおよび関連しない配列を含む融合ポリペプチドを使用および／または産生し得る。融合パターンは、例えば、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくは、ヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープの提供を補助し得るか、またはネイティブ組換えタンパク質よりも高収率でタンパク質（発現エンハンサー）を発現するのを補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性を上げるか、またはこのポリペプチドを所望される細胞内コンパートメントに対して標的化し得るように、選択され得る。なおさらなる融合パートナーとしては、ポリペプチドの精製を促進する、親和性タグを含む。
【００９１】
融合ポリペプチドは、一般的に、標準的技術（化学結合を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、本発明の組成物および方法を使用し、発現系において増加したレベルの産生を可能にする、組換えポリペプチドとして発現される。簡単に述べると、例えば、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別々に構築され得、そして適切な発現ベクターに連結され得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結され、その結果、その配列のリーディングフレームが、同相（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）である。これは、両方の成分のポリペプチドの生物学的活性を保持する単一融合ポリペプチドへの翻訳を可能にする。
【００９２】
ペプチドリンカー配列を使用して、各ポリペプチドがその２次構造および３次構造に折り畳まれることを確実にするのに十分な距離で、第１ポリペプチド成分と第２ポリペプチド成分を分離し得る。このようなペプチドリンカー配列を、当該分野で周知の標準的な技術を使用して、融合ポリペプチドに組み込む。適切なペプチドリンカー配列を、以下の因子に基づいて、選択し得る：（１）可撓性伸長コンフォメーションを採用するそれらの能力；（２）第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの機能性エピトープと相互作用し得る２次構造を採用しないそれらの能力；および（３）ポリペプチド機能性エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基がないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。他の中性付近のアミノ酸（例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ）もまた、リンカー配列に使用され得る。アミノ酸酸配列（リンカーとして有用に使用され得る）としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に、１〜約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドが、機能性ドメインを分離し、そして立体的妨害を妨げるために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要ではない。
【００９３】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ配置される。同様に、翻訳を停止するために必要とされる終止コドンおよび転写終結シグナルは、第２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【００９４】
融合ポリペプチドは、本明細書中で作製および／または記載されたポリペプチドを、無関係タンパク質（例えば、リコール応答（ｒｅｃａｌｌ  ｒｅｓｐｏｓｅ）を誘発し得る免疫原性タンパク質）とともに含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３６：８６−９１，１９９７）。
【００９５】
１つの好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．に由来する（例えば、Ｍｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメント）。Ｒａ１２組成物および異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増強する際のそれらの使用の方法は、米国特許出願第６０／１５８，５８５号（この開示は、その全体が本明細書中において参考として援用される）に記載される。簡単に述べると、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａ核酸の下位配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性株および非病原性株の遺伝子によってコードされる３２ＫＤ分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、記載されている（例えば、米国特許出願第６０／１５８，５８５号；Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８−４００７（本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは、高レベルで発現し、そして精製過程の間ずっと、可溶性ポリペプチドのままである。さらに、Ｒａ１２は、融合される異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する、１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般的に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする、少なくとも約１５個連続したヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約６０個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、または少なくとも約３００個のヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含み得るか、またはこのような配列の改変体を含み得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、コードされる融合ポリペプチドの生物学的活性が、ネイティブＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドに対して、実質的に減少しないように、１つ以上の置換、追加、欠損および／または挿入を含み得る。改変体は、好ましくは、ネイティブＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性を示す。
【００９６】
他の好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、プロテインＤ（グラム陰性細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質）である（ＷＯ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質の最初のおよそ３分の１（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化され得る。特定の好ましい実施形態において、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基は、Ｎ末端に含まれて、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供し、そしてＥ．ｃｏｌｉにおける発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テールは、抗原提示細胞に対する抗原の最適な提示を確実にする。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス、ＮＳ１（赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ））由来の非構造的なタンパク質を含む。Ｔ−ヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが使用され得るが、代表的に、Ｎ末端８１アミノ酸が使用される。
【００９７】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質またはその一部（好ましくは、Ｃ末端部分）である。ＬＹＴＡは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来であり、これは、アミダーゼＬＹＴＡとして公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（ＬｙｔＡ遺伝子によってコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５−２９２、１９８６）を合成する。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格において特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために開拓された。Ｃ−ＬＹＴＡフラグメントをアミノ末端に含むハイブリッドタンパク質の精製は、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５−７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８から開始するＣ末端領域において見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を含む。
【００９８】
なお別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、この融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載されるように、ポリペプチドをエンドソーム／リソソーム区画へと方向付け得る標的化シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的化シグナルと融合された場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子とより効率的に会合し、これによって、ポリペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の増強されたインビボ刺激を提供する。
【００９９】
一般的に、本発明のタンパク質および／またはポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）は、単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元の環境から取り除かれたポリペプチドである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、天然の系において共存する物質のいくらかまたは全てから分離される場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドはまた、精製され、例えば、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは、少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは、少なくとも約９９％純粋である。
【０１００】
本発明の方法によって生成される特に好ましいポリペプチドとしては、結合剤（例えば、特定の疾患状態と関連するポリペプチドのような目的の標的ポリペプチド（またはその一部、改変体、または誘導体）に対して免疫学的結合を示す、抗体およびその抗原結合フラグメント）を含む。抗体、またはその抗原結合フラグメントは、検出可能なレベルで（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイで）ポリペプチドと反応し、類似の条件下で、無関係なポリペプチドと検出可能に反応しない場合、本発明のポリペプチドに、「特異的に結合する」、「免疫学的に結合する」、および／または「免疫学的に反応性である」といわれる。
【０１０１】
この文脈において使用される場合、免疫学的結合は、一般的に、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こる型の非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合の相互作用の強度（すなわち、親和性）は、その相互作用の解離定数（Ｋｄ）によって表され得、ここでは、より小さなＫｄは、より大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原の複合体の形成速度および解離速度を測定することを必要とし、ここでこれらの速度は、複合体パートナーの濃度、その相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数（ｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度と、結合および解離の実際の速度との計算によって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連していないすべてのパラメーターの帳消しを可能にし、従って、解離定数Ｋｄと等しくなる。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照のこと。
【０１０２】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、免疫グロブリン分子のなかの抗原結合に関与する部分をいう。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内にある高度に多様な３つのストレッチは「超可変領域」と呼ばれ、この超可変領域は、「フレームワーク領域」、すなわち「ＦＲ」として知られるより保存された隣接ストレッチの間に挿入されている。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンにおいて超可変領域の間および超可変領域の隣に天然で見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において、抗原結合表面を形成するように互いに関連して配置される。抗原結合表面は、結合される抗原の三次元表面に対して相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」、すなわち「ＣＤＲ」と呼ばれる。
【０１０３】
特定の結合因子（例えば、腫瘍関連タンパク質に特異的な結合因子）はさらに、本明細書中に提供される代表的なアッセイおよび当該分野で公知の代表的なアッセイを使用して、癌を有する患者と癌を有さない患者との間を識別し得る。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは、疾患（癌）を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは、患者の少なくとも約３０％において癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、またはさらに、この抗体は、癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、その疾患が存在しないことを示す陰性シグナルを生成する。結合因子がこの要件を満たすか否かを決定するために、癌を有する患者および癌を有さない患者（標準的な臨床試験を使用して決定されるような）由来の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）を、その結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書中に記載のようにしてアッセイし得る。好ましくは、疾患を有する統計学的に有意な数のサンプルおよび疾患を有さない統計学的に有意な数のサンプルをアッセイする。各々の結合因子は、上記の判断基準を満たすべきである；しかし、当業者は、結合因子が、感度を改善するために組み合わせて使用され得ることを理解する。本発明に従って生成される他の結合因子もまた、腫瘍関連ポリペプチド配列に対するその特異性に基づいて、治療的価値を有する。
【０１０４】
上記要件を満たす任意の因子が、結合因子であり得る。例えば、結合因子はリボソームであり得、このリボソームは、ペプチド成分、ＲＮＡ分子またはポリペプチドを有しても有さなくても良い。好ましい実施形態では、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の任意の技術によって調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。本発明に従って、本明細書中で例示された方法に加えて、多数の抗体産生技術が当業者に利用可能である。例えば、抗体はまた、本明細書中に記載されるモノクローナル抗体の生成を含む細胞培養技術か、または適切な細菌細胞宿主もしくは哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、組換え抗体の生成を可能にすることによって生成され得る。１つの技術において、ポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の任意の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）に注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を伴わずに免疫原として作用し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、そのポリペプチドをキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に連結した場合に、優れた免疫応答が誘発され得る。免疫原を、好ましくは、１回以上のブースター免疫を組み込んだ予め決められたスケジュールに従って、動物宿主に注射し、そしてその動物を周期的に採血する。次いで、そのポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、例えば、適切な固体支持体に連結されたポリペプチドを使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製し得る。
【０１０５】
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術およびその改善技術を使用して調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（例えば、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のようにして免疫された動物から得られる脾臓細胞から産生され得る。次いで、この脾臓細胞を、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化する。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間にわたって非イオン性界面活性剤と合わせられ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが骨髄腫細胞の増殖を支持しない選択培地上に、低密度でプレーティングされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常、約１〜２週間）後に、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一のコロニーを選択し、そしてその培養上清を、そのポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０１０６】
モノクローナル抗体を、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離し得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注射）を使用して、収量を増大させ得る。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から収集し得る。夾雑物は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿および抽出のような従来技術によって、抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
【０１０７】
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む、多数の治療的に有用な分子が、当該分野で公知である。タンパク質分解性酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかのフラグメントを産生し、そのフラグメントのうちの２つ（「Ｆ（ａｂ）」フラグメント）はそれぞれ、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合性ヘテロダイマーを含む。酵素のペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含むいくつかのフラグメントを与え得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭの優先的なタンパク質分解性切断（および稀にＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子で起こる）によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、より一般的には、当該分野で公知の組換え技術を使用して誘導される。Ｆｖフラグメントは、ネイティブ抗体分子の抗原認識能力および結合能力の大半を保持する抗原結合部位を含む、非共有結合性のＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【０１０８】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、これは、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体のＶ領域由来の天然では凝集されているが化学的には分離した軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造に実質的に類似した三次元構造へと折り畳まれるｓＦｖ分子へと変換するための化学的構造を識別するための多くの方法が記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに同第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
【０１０９】
上記の分子の各々は、それぞれ、重鎖ＦＲセットと軽鎖ＦＲセットとの間に挿入された重鎖ＣＤＲセットおよび軽鎖ＣＤＲセットを含み、これは、ＣＤＲに対する支持を提供し、そして互いに関してＣＤＲの空間的関係を規定する。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域に関する。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と示される。よって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々由来のＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識単位」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的解析は、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合した抗原との広範な接着を形成することを実証した。ここで、広範な抗原の接着のほとんどが、重鎖ＣＤＲ３とである。よって、分子認識単位は、主に抗原結合部位の特異性に応答性である。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを形作る、隣接する４つのアミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合した抗原と接着し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域の抗原結合部位内へのホールディングに応答性であり、特にこのＦＲ残基は、ＣＤＲに直接隣接する。ＦＲにおいて、特定のアミノ残基および特定の構造特性は、非常に高く保存される。この点において、Ｖ領域配列の全てが、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が結合部位にホールディングする場合、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、特定の「規範的な」構造内にＣＤＲループがホールディングされた形状をもたらす、ＦＲの保存された構造領域が存在することは、一般に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する、非共有結合間ドメイン接着に関与することが知られている。
【０１１１】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む多くの「ヒト化」抗体分子が記載されており、これには、以下が挙げられる：げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常ドメインに融合した関連ＣＤＲを有するキメラ抗体（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）；適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前のＦＲを支持する、ヒトに移植されたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５）；ならびに組換え的に張り合わされた（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（１９９２年１２月２３日に公開された欧州特許公開番号５１９，５９６号）。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療適用の持続および有効性を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、用語「張り合わされたＦＲ」および「組換え的に張り合わされたＦＲ」は、ネイティブなＦＲポリペプチドホールディング構造の実質的に全てが残る抗原結合部位を含む異種分子を提供するための、例えば、ヒトＦＲ残基を用いる、げっ歯類重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域からのＦＲ残基の選択的置換をいう。ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性が主に抗原結合表面内の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの構造および相対的配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。よって、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、これらの互いの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとの相互作用が注意深く維持される場合にのみ、ヒト化抗体において保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、免疫系によって容易に遭遇され得る外部（例えば、溶媒接近可能な）ＦＲ残基は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性または非免疫原性のいずれかの張り合わされた表面を含むハイブリッド分子を提供する。
【０１１３】
ベニアリングのプロセスは、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４編（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７））によって編集されたヒト抗体可変ドメインについて利用可能な配列データの使用を作製し、Ｋａｂａｔデータベース、他の接近可能なＵ．Ｓ．データベースおよび外国のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）にアップデートする。Ｖ領域アミノ酸の溶媒接近性は、ヒト抗体フラグメントおよびマウス抗体フラグメントについて公知の３次元構造より推測され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に一般的な２つの工程が存在する。第１に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記で同定された供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同なヒトＶ領域は、対応するマウスアミノ酸と残基ごとに（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｂｙ  ｒｅｓｉｄｕｅ）比較される。ヒト対照物とは異なるマウスＦＲ中の残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用してヒト部分に存在する残基と置換される。残基スイッチング（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）は、少なくとも部分的に曝露される（溶媒接近可能）部分を用いてのみ実施され、そしてＶドメインの３次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび電荷アミノ酸）の置換において、注意が払われる。
【０１１４】
この様式において、得られる「張り合わされた」マウス抗原結合部位は、マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋没した（ｂｕｒｉｅｄ）またはほとんど埋没したと同定された残基（溶媒接近可能）、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合（例えば、静電結合および疎水結合）に関与すると考えられている残基、ならびにＣＤＲループの「規範的な」３次構造に影響すると考えられるＦＲの保存された構造領域からの残基を保持するように設計される。次いで、これらの設計基準を使用して、マウス抗原結合部位の重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲを、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得るヒトに見られるＦＲに結合する組換えヌクレオチド配列を調製する。
【０１１５】
本発明の別の実施形態において、本発明に従って産生される抗体は、１つ以上の治療因子に結合される。この点において適切な因子としては、放射性核種、分化誘導因子、薬物、毒素およびこれらの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンのアナログが挙げられる。好ましい分化誘導因子としては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シゲラ毒素、およびアメリカヤマゴボウ高ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０１１６】
治療因子は、直接的にかまたは間接的（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで適切なモノクローナル抗体に結合（例えば、共有結合）され得る。因子と抗体との間の直接反応は、各々が互いと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、１つの上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、別の上のカルボニル含有基（例えば、無水物または酸ハライド）または互いに対して良好な脱離基（例えば、ハライド）を含有するアルキル基と反応し得る。
【０１１７】
あるいは、治療因子および抗体をリンカー基を介して結合することが望ましくあり得る。リンカー基は、結合能との干渉を避けるために因子から抗体を隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、因子または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させ、よって結合効率を増加させるために働き得る。化学的反応性の増加はまた、さもなくば可能でない、因子または因子上の官能基の使用を容易にし得る。
【０１１８】
種々の二官能性試薬または多官能性試薬（ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方）（例えば、ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログに記載されるもの）がリンカー基として使用され得ることは、当業者に明白である。結合は、例えば、結合は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化された炭化水素残基を介して、もたらされ得る。このような方法論を記載する多くの参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０１１９】
治療因子は、本発明の免疫複合体の抗体部分がない場合により強力であり、細胞内への内部局在化の間またはその際に切断可能であるリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多くの種々の切断リンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの因子の細胞内放出のための機構としては、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒに対する米国特許第４，４８９，７１０号）、光不安定な結合の照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらに対する米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、Ｋｏｈｎらに対する米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらに対する米国特許第４，５６９，７８９号）が挙げられる。
【０１２０】
（タンパク質および／またはポリペプチドを発現するのに適したポリヌクレオチド）
本発明は、他の局面では、本明細書の上で開示される、組換えタンパク質および／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」とは、特定の種の総ゲノムＤＮＡを含まない単離されているＤＮＡ分子をいうために、本明細書中で本質的に交換可能に用いられる。本明細書中で用いられる場合、「単離された」とは、ポリヌクレオチドが実質的に他のコード配列から離れており、そしてＤＮＡ分子が、多くの割合の無関係なコードＤＮＡ（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域）を含まないことを意味する。もちろん、このことは、本来単離されたＤＮＡ分子をいい、そして人の手によりセグメントに後から加えられた遺伝子またはコード領域を除外しない。
【０１２１】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、タンパク質および／またはポリペプチド（例えば、抗体またはその一部）をコードする内在性の配列）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体または誘導体（好ましくは、免疫原性の改変体または誘導体）をコードする配列を含み得る。特定の実施形態では、このポリヌクレオチド配列は、上記のように、免疫原性ポリペプチドをコードし得る。
【０１２２】
代表的には、ポリヌクレオチド改変体は、好ましくは、この改変体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの免疫原性が、本明細書中に具体的に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して、実質的に低下しないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含む。用語「改変体」はまた、異種の起源の相同遺伝子を含むことが理解されるべきである。
【０１２３】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、コード配列自体の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニングサイト、他のコードセグメントなどのような、他のＤＮＡ配列と組合され得、その結果、これらの全体の長さは、著しく変化し得る。従って、好ましくは、意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さにより制限される全長を有する、任意の殆どの長さの核酸フラグメントが用いられ得ることが意図される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的ポリヌクレオチドセグメントは、本発明の多くの実施において有用であることが意図される。
【０１２４】
本発明に従う、高レベルで大規模な発現に適切なポリヌクレオチドは、種々の十分に確立された技術（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９および他の同様の参考文献を参照のこと）のいずれかを用いて、同定、調製および／または操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、腫瘍に関連した発現について、ｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることにより同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のマイクロアレイ技術を使用して、製造業者の指示書に従って（および本質的には、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５,１９９７により記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）から調製されたｃＤＮＡから増幅され得る。
【０１２５】
多くのテンプレート依存プロセスは、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最も知られている増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に詳細に記載される。簡単には、ＰＣＲＴＭにおいて、２つのプライマー配列が調製され、これらは、標的配列の反対の相補鎖上の領域に相補的である。過剰なデオキシヌクレオチド三リン酸が、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）と共に反応混合物に加えられる。標的配列が、サンプル中に存在する場合、プライマーはこの標的に結合し、そしてこのポリメラーゼは、プライマーを、ヌクレオチドを付け加えることによって、標的配列に沿って伸長させる。反応混合物の温度の増加または低下により、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰なプライマーはこの標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが繰り返される。好ましくは、逆転写手段およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために行われ得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０１２６】
任意の多数の他のテンプレート依存プロセス（これらの多くはＰＣＲＴＭ増幅技術のバリエーションである）は、当該分野において、既に知られており、そして利用可能である。例として、いくつかのこのような方法としては、例えば、欧州特許出願公開第３２０，３０８号、および米国特許第４，８８３，７５０号に記載される、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲといわれる）；ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載される、Ｑβレプリカーゼ；鎖置換増幅（ＳＤＡ）ならびに修復連鎖反応（ＲＣＲ）が挙げられる。さらに他の増幅方法は、英国特許出願第２  ２０２  ３２８号およびＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に記載される。他の核酸増幅手順としては、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲを含む、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ８８／１０３１５）が挙げられる。欧州特許出願公開第３２９，８２２号は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）を繰返し増幅することを伴う核酸増幅プロセスを記載する。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０６７００は、標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、引き続いて、配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく、核酸配列増幅スキームを記載する。「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ，１９９０）、および「ワンサイド（ｏｎｅ−ｓｉｄｅ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ，１９８９）のような他の増幅方法もまた、当業者に周知である。
【０１２７】
本発明のポリヌクレオチドの増幅された部分は、周知の技術を用いて適切なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から全長遺伝子を単離するために用いられ得る。このような技術において、ライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）は、増幅に適切な１つ以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングされる。好ましくは、ライブラリーは、より大きな分子を含むようにサイズ選択される。ランダムプライマーライブラリーはまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定に好適であり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを得るためおよび５’配列を伸長させるために好適である。あるいは、またはさらに、本質的に任意の増幅されたポリヌクレオチドは、本発明に従うＵＣＯＥベースのベクターに到達するために、慣用的なサブクローニング技術において用いられ得る。
【０１２８】
ハイブリダイゼーション技術について、部分配列は、周知の技術を用いて（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識によって）標識され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーが、通常、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターを、標識したプローブとハイブリダイズさせることにより、スクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーおよび菌叢は、選択および増殖され、そしてＤＮＡがさらなる分析のために単離される。ｃＤＮＡクローンは、例えば、部分配列由来のプライマーおよびベクター由来のプライマーを用いるＰＣＲにより、さらなる配列の量を決定するために分析され得る。制限地図および部分配列は、１つ以上の重複するクローンを同定するために作製され得る。次いで、完全配列は、一連の欠失クローンを作製することに関与し得る標準的な技術を用いて決定され得る。得られた重複配列は、単一の連続配列へとアセンブリされ得る。全長ｃＤＮＡ分子は、周知の技術を用いて、適切なフラグメントを連結することにより作製され得る。
【０１２９】
あるいは、上記の増幅技術のような増幅技術は、ｃＤＮＡの部分配列から全長コード配列を得るために有用であり得る。そのような増幅技術の１つは、逆ＰＣＲ（Ｔｒｉｇｌｉａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６、１９８８を参照のこと）であり、これは、制限酵素を使用して、遺伝子の既知の領域中のフラグメントを作製する。次いでこのフラグメントは、分子内連結により環状にされ、そして既知の領域由来の分枝プライマーを用いるＰＣＲのためのテンプレートとして用いられる。代替的なアプローチにおいて、部分配列に隣接する配列は、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを用いる増幅により回収され得る。増幅された配列は、典型的には、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを用いる第２ラウンドの増幅に供される。既知の配列から反対の方向への伸長を開始する２つのプライマーを用いる、この手順のバリエーションは、ＷＯ９６／３８５９１に記載されている。別のこのような技術は、「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」すなわちＲＡＣＥとして公知である。この技術は、既知の配列の５’および３’である配列を同定するために、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする内部プライマーおよび外部プライマーの使用を含む。さらなる技術としては、捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）ＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９、１９９１）およびウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）ＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０、１９９１）が挙げられる。増幅を用いる他の方法もまた、全長ｃＤＮＡ配列を得るために用いられ得る。
【０１３０】
特定の例において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースに提供された配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能な配列）の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を得ることが可能である。オーバーラップするＥＳＴについての検索は、一般的に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索）を用いて実施され得、そしてそのようなＥＳＴは、連続する全長配列を作製するための用いられ得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により得ることができる。
【０１３１】
本発明の特定の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントが、ＵＣＯＥに基づくベクターの構築および／または使用において用いられ、このポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、１つ以上の目的のポリペプチド（例えば、抗体もしくは融合タンパク質またはそれらの機能的等価物）をコードする。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じであるかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列は、所定のポリペプチドをクローニングし、そして発現するために用いられ得る。
【０１３２】
当業者により理解されるように、いくつかの例において、天然に存在しないコドンを保有する、ポリペプチドをコートするヌクレオチド配列を産生することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好ましいコドンが選択されて、タンパク質発現の速度を増加させ得るか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から作製された転写物の半減期より長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生し得る。
【０１３３】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を改変する変化（これらに限定されない）を含む種々の理由により、ポリペプチドのコード配列を変化させるために当該分野で一般的に公知の方法を用いて操作され得る。例えば、ランダムフラグメンテーションならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲリアセンブリによるＤＮＡシャッフリングが、ヌクレオチド配列を操作するために用いられ得る。さらに、部位特異的変異誘発は、新しい制限部位を挿入するか、グルコシル化パターンを変更するか、コドン嗜好性を変更するか、またはスプライス改変体を産生するか、または変異を導入するなどのために用いられ得る。
【０１３４】
新規に合成されたペプチドは、例えば、調製用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な適合可能な他の技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成が、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列、またはその任意の部分は、改変体ペプチドを産生するために、直接的な合成の間に変更され得、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列もしくはその任意の部分と結合され得る。
【０１３５】
以下の実施例を、限定のためではなく例示のために提供する。
【実施例】
【０１３６】
（実施例１）
（ＵＣＯＥベースの発現ベクターにおける組換え抗体の発現）
（系）
本実施例は、ＵＣＯＥを有するベクターを用いた組換え抗体の発現レベルとＵＣＯＥを有さないベクターを用いた組換え抗体の発現レベルとの間の比較を開示する。
【０１３７】
操作されたヒト抗体Ａｂ３を、図１に示すヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥを含むベクターから発現させた。同一であるがＵＣＯＥエレメントを有さないベクターもまた構築した。本実施例におけるＩｇ重鎖のコード配列は、ヒトＩｇγ−１定常領域をコードするゲノムＤＮＡフラグメントをその上流にインフレームで導入した、操作されたヒトＶ領域配列を含む。Ｉｇ軽鎖のコード配列は、ヒトＩｇκ定常領域をコードするｃＤＮＡフラグメントをその上流にインフレームで導入した、操作されたヒトＶ領域配列を含む。Ｉｇ重鎖を発現するためのベクターは、ｎｅｏ選択マーカー遺伝子をさらに含み、そしてＩｇ軽鎖を発現するためのベクターは、ハイグロマイシン選択マーカーを含む。図２Ａを参照のこと。
【０１３８】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示書に従って用い、軽鎖および重鎖のベクターで同時トランスフェクトした。細胞を、ハイグロマイシンおよびＧ４１８を用いて選択した。トランスフェクト株のプールを維持し、そして培養培地中に分泌されたアセンブルされた免疫グロブリンのレベルを、ＥＬＩＳＡにより、トランスフェクション後、種々の時間で測定した。（図３）。ＲＮＰ  ＵＣＯＥの非存在下において、抗体発現レベルは、トランスフェクションの４８時間後に低く（約４８ｎｇ／ｍｌ）、その後減少した。対照的に、ＲＮＰ  ＵＣＯＥを含む発現ベクターからのトランスフェクションプールにおいて、トランスフェクトされた培養物が増殖するにつれて、抗体レベルは増大しつづけ、トランスフェクションの１５日後に３μｇ／ｍｌに達した。従って、ＵＣＯＥの使用は、組換え免疫グロブリンを高レベルで発現するトランスフェクトされた細胞のプールの迅速な産生を可能にした。
【０１３９】
（実施例２）
（ＵＣＯＥベースの発現ベクター系でトランスフェクトしたＣＨＯ宿主細胞株において達成された高レベルで大容量の発現）
ＣＨＯ−Ｓ細胞を、ＵＣＯＥ抗体発現カセット（図１に示す）を含むベクターで同時トランスフェクトして、操作されたヒト抗体Ａｂ１を産生した。Ｉｇ重鎖コード配列は、ヒトＩｇγ−４定常領域をコードするゲノムＤＮＡフラグメントをその上流にインフレームで導入した、操作されたヒトＶ領域配列を含む。Ｉｇ軽鎖のコード配列は、ヒトＩｇκ定常領域をコードするｃＤＮＡフラグメントをその上流にインフレームで導入した、操作されたヒトＶ領域配列を含む。Ｉｇ重鎖を発現するためのベクターは、ｎｅｏ選択マーカー遺伝子をさらに含み、そしてＩｇ軽鎖を発現するためのベクターは、ハイグロマイシン選択マーカーを含む。図２Ｂを参照のこと。
【０１４０】
トランスフェクションを、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示書に従って用いて実施した。細胞を、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でハイグロマイシンおよびＧ４１８を用いて選択し、そしてサブクローンを選択した。このプロセスに約５週間かけた。１つのサブクローンを、１００Ｌのバイオリアクタに調製する前に、２Ｌのバイオリアクタに調製して、最終的なパラメーターの最適化を実施した。組換え抗体を発現するトランスフェクト株の大多数からの産生速度は、このアプローチを用いて、代表的に、約５ｐｇ／細胞／日であった。懸濁液培養物における１つの抗体の収率は、約２００ｍｇ／ｌであった。図４を参照のこと。ＣＨＯ−Ｓ細胞に同時トランスフェクトした２つの発現ベクターへのＵＣＯＥの封入は、規定された培地における懸濁液中で直ちに培養され得るトランスフェクト株クローンの迅速な単離を生じた。
【０１４１】
（実施例３：ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓ宿主細胞株における低レベルのＧＡＬ−ＧＡＬ残基）
本明細書中で上記したように、ヒト治療薬として使用した抗体におけるＧａｌα１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｇａｌ−Ｇａｌ）炭水化物残基の存在は、血清からの迅速なタンパク質クリアランスに関連している。結果として、この残基を有さない組換えタンパク質を生成する能力は、有利である。例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４：４７７〜４７９（１９９３）およびＫａｇａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７５０８〜１７５１５（１９８８）を参照のこと。ＦＩＴＣ標識化ＩＢ４レクチンおよびフローサイトメトリーを利用して、Ｇａｌ−Ｇａｌ残基がＣＨＯ−Ｓ細胞の表面に存在しないことを実証した。図５；Ｃｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３６２２〜１３６２８（１９９７）およびＧｏｒｅｌｉｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４１８５〜４１７３（１９９５）に開示される方法論を参照のこと。この観点において、ＣＨＯ−Ｓは、試験される他の広く使用されるＣＨＯ株、ＣＨＯ−Ｋ１に類似する。対照的に、この実験において試験されるマウスハイブリドーマ細胞株は、高レベルの細胞表面関連Ｇａｌ−Ｇａｌ炭水化物を示した。この細胞株において生成された精製組換えタンパク質の質量分析は、Ｇａｌ−Ｇａｌ残基が存在しないことを実証した（データは示されていない）。
【０１４２】
（実施例４：マルチサブユニット組換えタンパク質の改善された発現レベルについての二方向ＵＣＯＥベクター）
この実施例は、二方向ＵＣＯＥベクター系における組換え抗体の重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質の改善された発現を開示する。
【０１４３】
ｐＯＲＴ１（Ｃｏｂｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の２つのＳｆｉ  Ｉ部位を、アニールしたオリゴＭｆｅ．Ｆ，５’−ＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣＧＧＣ（配列番号１０）およびＭｆｅ．Ｒ，５’−ＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣ（配列番号１１）から構成されるアダプター分子の導入によってＭｆｅ  Ｉ部位に変換した。次いで、ＨＳＶ  ＴＫポリＡ部位を、プライマーＴＫ．Ｆ，５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＡＴＡＣＣＧＧＡＡＧ  （配列番号１２）およびＴＫ．Ｒ，５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡ（配列番号１３）を用いてｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅し、そしてＳａｌ  ＩからＸｈｏ  Ｉのフラグメントを、Ｓａｌ  Ｉ部位に挿入した。この後、マウスＰＧＫポリＡ部位を、プライマーｍＰＧＫ．Ｆ，５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧ（配列番号１４）およびｍＰＧＫ．Ｒ，５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＡ（配列番号１５）を用いて雄ＢＡＬＢ／ｃゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅し、そしてＢａｍＨ  ＩからＢｇｌ  ＩＩのフラグメントを、ＢａｍＨ  Ｉ部位にクローニングした。ｎｅｏ発現カセットを含むｐｃＤＮＡ３．１のＡｓｅ  ＩからＳａｌ  Ｉフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｓｐｅ  Ｉリンカー（５’−ＧＡＣＴＡＧＴＣ；配列番号１６）に連結させ、次いで、Ｓｐｅ  ＩフラグメントをＳｐｅ  Ｉ部位にクローニングしてｐＯＲＴｎｅｏＦを得たか；または、ピューロマイシン耐性カセットを保有するＣＥＴ７００（Ｃｏｂｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）のＥｃｏＲ  ＩからＮｏｔ  Ｉのフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｘｂａ  Ｉリンカーに連結させ、そしてこのＸｂａ  ＩフラグメントをＸｂａ  Ｉ部位にクローニングしてｐＯＲＴｐｕｒｏＦを得た。ｐＣＭＶＥＧＦＰＮ−１（Ｃｏｂｒａ）からのＨｉｎｄ  ＩＩＩからＢａｍＨ  ＩのマウスＣＭＶプロモーターフラグメントを、ＢＫＳ＋  （Ｃｏｂｒａ）中のハイブリッドＵＣＯＥのＨｉｎｄ  ＩＩＩからＢａｍＨ  Ｉの部位にサブクローニングした。次いで、ヒトＣＭＶプロモーターを、プライマーｈＣＭＶＦ，５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴ（配列番号１７）およびｈＣＭＶＲ，５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号１８）を用いてプラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅し、そしてＸｈｏ  ＩからＳａｌ  Ｉのフラグメントを、Ｓａｌ  Ｉ部位にクローニングした。次いで、ＢａｍＨ  ＩからＳａｌ  Ｉのフラグメントを、ｐＯＲＴｎｅｏＦのＢａｍＨ  ＩからＳａｌ  Ｉの部位にクローニングして、ｐＢＤＵｎｅｏ１００を得たか、またはｐＯＲＴｐｕｒｏＦにクローニングしてｐＢＤＵｐｕｒｏ３００を得た。ＢＫＳ＋におけるハイブリッドＵＣＯＥ中のＳａｌ  Ｉクローニング部位の上流の２つのＡＴＧコドンを、部位特異的変異によって改変し、次いでＢａｍＨ  ＩからＳａｌ  Ｉのフラグメントを、ｐＯＲＴｎｅｏＦのＢａｍＨ  ＩからＳａｌ  Ｉの部位にクローニングしてｐＢＤＵｎｅｏ２００を得たか、または��ＯＲＴｐｕｒｏＦにクローニングしてｐＢＤＵｐｕｒｏ４００を得た。
【０１４４】
ヒト抗体軽鎖を、４つ全ての二方向ＵＣＯＥベクター（ｐＢＤＵｎｅｏ１００，  ｐＢＤＵｎｅｏ２００，  ｐＢＤＵｐｕｒｏ３００およびｐＢＤＵｐｕｒｏ４００；それぞれ図６〜９および配列番号１〜４）のＢａｍＨ  ＩまたはＳａｌ  Ｉ部位のいずれかにクローニングし、続いて残りのＢａｍＨ  ＩまたはＳａｌ  Ｉクローニング部位で重鎖をクローニングして、ｐＢＤＵｎｅｏ１１２、ｐＢＤＵｎｅｏ１２１、ｐＢＤＵｎｅｏ２１２、ｐＢＤＵｎｅｏ２２１、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１１２、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１２１、ｐＢＤＵｐｕｒｏ２１２およびｐＢＤＵｐｕｒｏ２２１を得た。
【０１４５】
２つ以上の組換えタンパク質の同時発現に適したさらなる二方向ＵＣＯＥベクターが、図１０〜１３（配列番号５〜８）に開示され、そしてそれぞれｐＢＤＵｎｅｏ５００、ｐＢＤＵｎｅｏ６００、ｐＢＤＵｐｕｒｏ７００およびｐＢＤＵｐｕｒｏ８００といわれる。これらのベクターは、例えば、抗体発現のためのハイブリッドＵＣＯＥ方向を最適化するため、および最適化のための代替のプロモーターの組み合わせを提供するために用いられ得る。
【０１４６】
プラスミドｐＯＲＴｐｕｒｏＦを、ＸｂａＩ（部分的）およびＮｓｉＩで消化して、ウシ成長ホルモンポリＡ部位を除き、次いで、ＳＶ４０初期ポリＡ部位に連結し、これを、プライマー１４５０６，５’ＣＣＡＡＴＧＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＡＴＣＧＴ  （配列番号１９）、および１４５０７，５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴ  （配列番号２０）を用いて増幅させ、続いてＸｂａＩおよびＮｓｉＩで消化してプラスミドｐＯＲＴｐｕｒｏＦ２を得た。ヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥの下流にマウスＣＭＶプロモーターを含み、そしてアクチンプロモーターとＳａｌ  Ｉ部位との間に２つの変異したＡＴＧコドンを有するハイブリッドＵＣＯＥベクターを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化してマウスＣＭＶプロモーターを除き、次いでヒトＣＭＶプロモーターに連結した。このプロモーターは、プライマー：１４４２５，５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴ（配列番号２１）および１４４２６，５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号２２）を用いて増幅し、続いてＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたものである。次いで、アニールしたオリゴ１４４６６，５’−ＴＣＧＡＧＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧ（配列番号２３）および１４４６５，５’−ＴＣＧＡＣＴＡＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＣ（配列番号２４）を、ＳａｌＩ部位で挿入し、ＰｍｅＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてマウスＣＭＶプロモーターに連結させた。このプロモーターは、プライマー：１４４３５，５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＴＡＴ（配列番号２５）および１４４３６，５’−ＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴ（配列番号２６）を用いて増幅し、続いてＳａｌＩで消化しておいたものである。次いで、マウスＣＭＶプロモーターを有するプラスミド、または有さないプラスミドのいずれかを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ消化ｐＯＲＴｎｅｏＦに連結して、プラスミドｐＢＤＵｎｅｏ５００およびｐＢＤＵｎｅｏ６００を得たか；あるいはＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ消化プラスミドｐＯＲＴｐｕｒｏＦ２に連結させてプラスミドｐＢＤＵｐｕｒｏ７００およびｐＢＤＵｐｕｒｏ８００をそれぞれ得た。
【０１４７】
抗体重鎖および軽鎖を発現するＧ４１８またはピューロマイシン耐性二方向ＵＣＯＥベクターを、製造者の指示に従い、それぞれリポフェクタミンまたはＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ−Ｋ１またはＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトし、そして５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ｎｅｏベクター）または１２．５μｇ／ｍｌピューロマイシン（ｐｕｒｏベクター）を用いて選択した。プールを選択し、そして抗体産生速度を、異なる構築物間で比較して、ＣＨＯ細胞における抗体発現のための最適なプロモーターと選択マーカーとの組み合わせを決定した。
【０１４８】
ＣＨＯ−Ｓ懸濁細胞における発現研究の結果は、表２に記載される。これらのデータは、マウスＣＭＶプロモーターから発現される軽鎖を含むベクターが、最良の抗体発現を与えることを実証した。ピューロマイシン−耐性マーカーまたはＧ４１８−耐性マーカーを含むベクターを使用した。さらに、２つの二方向ベクター（１つは、ピューロマイシン耐性マーカーを含み、そして１つはＧ４１８耐性マーカーを含む）を同時トランスフェクトした。プールを選択し、そして抗体産生速度を決定した。別に、Ｇ４１８耐性トランスフェクトプールまたはピューロマイシン耐性トランスフェクトプールは、同様の産生速度を示したが、同時トランスフェクトされたプールの産生速度は、わずかに速かった。これは、抗体発現ベクターの２つのコピーが異なる選択マーカーと共に維持されていることによって産生速度を増加すると考えられ得ることを示唆する。より高いレベルのピューロマイシン（２５〜５０μｇ／ｍｌ  対  １２．５μｇ／ｍｌ）を用いてプールを選択することは、産生の増加と相関しなかった。
【０１４９】
クローン株を、ｐＢＤＵｐｕｒｏ４２１を保有するピューロマイシン耐性プールから単離した。２２株のクローン細胞株の１５株が、測定可能な量の抗体を発現した。開始産生速度決定は、細胞株が、１６ｐｇ／細胞／日までの抗体分泌速度を有することを示した（表３）。サザンブロット分析は、１３ｐｇ／細胞／日の産生速度を有する少なくとも１つのクローンを同定し、そして約１個のコピーのベクターＤＮＡ（クローンＳ４２１．  ７）を有していることを同定した。このプールから３〜１８ｐｇ／細胞／日の産生速度を有するのクローンを、単離した。約５ｐｇ／細胞／日を発現するクローンを初期発酵実験に使用した。
（表２）
（両方向性（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）ＵＣＯＥベクターからのｈＡｂ１（ＩｇＧ４）の発現）
【０１５０】
【表２】
2004535189.tif 000003
＊＊４ｋｂのＵＣＯＥ  ＣＭＶベクター（ハイグロマイシンおよびネオマイシンの選択）から各々駆動される同一の抗体遺伝子を使用する同時トランスフェクションを、以前に実施した。
【０１５１】
（表３）
（ｐＢＤＵｐｕｒｏ４２１でトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞株クローンにおけるｈＡｂ１の発現）
【０１５２】
【表３】
2004535189.tif 000004
（実施例５）
（ＲＮＰ  ＵＣＯＥの欠失分析）
本実施例は、組換えタンパク質の発現向上のための、ＲＮＰ  ＵＣＯＥプラスミドベクター内でのポリヌクレオチド欠失を、開示する。簡潔に述べると、８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥ内での一連の欠失を調製して、ＵＣＯＥ機能に影響せずに取り除き得る、重要な機能エレメントおよび機能領域の両方を同定した。緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）を、プラスミドＣＥＴ７２０（Ｃｏｂｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）中にクローニングし、続いてＵＣＯＥ領域中に欠失を導いた（図１４）。これらの欠失の最初のセットを、ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトし、そしてＧＦＰを発現する能力について試験した。一過性アッセイ（トランスフェクション後２日）において、蛍光顕微鏡によって測定すると、全てのプラスミドがＧＦＰを発現し得た。次いで、異なる構築物を保有する安定なプールを選択し、そしてＦＡＣＳ分析によってＧＦＰ発現を測定した。トランスフェクション後１ヶ月に、全ての欠失体は、ＵＣＯＥを含まないコントロールプラスミドよりも、より高割合のポジティブな細胞（１０％のＵＣＯＥ非含有に対して、５０％超）、およびＵＣＯＥを含まないコントロールベクターよりも、ポジティブな集団についてのより高い平均蛍光の両方を提示した（表４）。
【０１５３】
これらのデータは、完全な活性に必要とされるヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥの領域をより正確に規定し、そして完全な活性を有する、より短い（約７ｋｂ）ＵＣＯＥエレメントを同定した。この新しい７ｋｂのＵＣＯＥエレメントは、欠失体ΔＲＶとして規定され、そして図１４においてヌクレオチド２２２５〜９２５４位の範囲である。
（表４）
（８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥ中での欠失を含むプラスミドからのＧＦＰ発現）
【０１５４】
【表４】
2004535189.tif 000005
ベクターＣＥＴ７２０ＧＦＰ（配列番号９に示され、これは８ｋｂのヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥを含む）をＥｃｏＲＶ、ＭｌｕＩ、ＥｃｏＮＩ、またはＢａｍＨＩとＳａｌＩを用いて消化し、その末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、そして再びライゲーションして、それぞれ、ΔＲＶ、ΔＭｌｕＩ、ΔＥｃｏＮＩ、ΔＢＳのベクターを生成した。ＣＥＴ７２０をＰｆｌＭＩを用いて消化し、そしてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化し、次いでＢａｍＨＩを用いて切断した。平滑化ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶ部位〜ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＰＢ７２０を得た。ｐＰＢ７２０を、ＥｃｏＮＩおよびＭｌｕＩ、ＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ（部分的）、またはＥｃｏＮＩおよびＸｈｏＩ（部分的）を用いて消化し、末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理し、そして再び環化させた。得られたベクターの各々からのＰｓｈＡＩフラグメントを、ＣＥＴ７２０ＧＦＰのＰｓｈＡＩ部位にクローニングして、それぞれ、図示するベクターΔＥＭ、ΔＥＸおよびΔＭＸを得た。
【０１５５】
（実施例６）
（ＲＮＰ  ＵＣＯＥのさらなる欠失分析）
これまでの実施例は、ベクターＣＥＴ７２０ＧＦＰ（配列番号９）のヌクレオチド２２２５〜６９１６位、およびヌクレオチド９２５４〜１０３４２位に由来のＵＣＯＥ領域が、ＵＣＯＥ活性の消失なしに取り除き得ることを、欠失分析によって同定した（上記、実施例５を参照のこと）。この実施例において、活性に重要である８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥの最小領域をさらに規定する。重要なこちに、この分析は、完全な活性を保持するヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥの例示的な４．１ｋｂの領域をさらに正確に規定する。
【０１５６】
簡潔に述べると、８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥフラグメントを平滑末端化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；カタログ番号Ｓ１０９８Ｓ）とライゲーションして、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ消化して仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理したベクターＣＥＴ７００ＧＦＰとライゲーションした。ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ベクターをＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。ここで、全ての構築物は、一過性アッセイにおいてＧＦＰを発現し得た（データは示さず）。ピューロマイシン選択の２週間後、ポジティブな集団の相乗平均の蛍光を、ＦＡＣＳによって測定し、そしてコントロール（ＣＥＴ７２０ＧＦＰ）の割合として表した。これらの結果を以下の表５に要約する。ＣＥＴ７２０ＧＦＰのヌクレオチド残基５１５２〜９２５４位に対応する、ＲＮＰ  ＵＣＯＥの４．１ｋｂのＭｆｅＩ〜ＥｃｏＲＶフラグメントを含む、ベクター７００ＦＲＶは、ＣＥＴ７２０ＧＦＰのヌクレオチド残基２２２５〜１０５２５位の８ｋｂのＵＣＯＥ領域に対して、完全なＵＣＯＥ活性を保持していた。従って、この４．１ｋｂのＵＣＯＥフラグメントは、全８ｋｂのＵＣＯＥエレメントについての活性に匹敵し得るレベルで活性を保持する、新しい最小ＵＣＯＥエレメントを示す。
【０１５７】
（表５）
【０１５８】
【表５】
2004535189.tif 000006
７００ＨＲＶ．Ｒ、７００ＦＲＶ．Ｒおよび７００ＢＲＶ．Ｒの中に含まれるが、ＵＣＯＥフラグメントが反対向きで挿入された３つのＵＣＯＥフラグメントが、それぞれプラスミド７００ＨＲＶ．Ｆ、７００ＦＲＶ．Ｆおよび７００ＢＲＶ．Ｆを生じる活性もまた、測定した。この場合もまた、全てのプラスミドは一過性アッセイにおいてＧＦＰを発現し得た。ピューロマイシン選択の３週間後、ポジティブな集団の相乗平均の蛍光を、ＦＡＣＳによって測定し、そしてコントロール（ＣＥＴ７２０ＧＦＰ）の割合として表した。これらの結果を以下の表６に要約する。反対向きのＵＣＯＥを含むプラスミドについて、より低いレベルの活性を観察したが、それでもなお全てのフラグメントはＵＣＯＥ活性を保持していた。
【０１５９】
（表６）
【０１６０】
【表６】
2004535189.tif 000007
（実施例７）
（例示的な２方向性ＵＣＯＥベクターのさらなる調製）
以前の例は、多くの例示的なＵＣＯＥベクターの調製および評価を記載してきた。この例において、さらなるＵＣＯＥベクターを、構築した。例えば、ベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ３５０（配列番号２７）およびｐＢＤＵｐｕｒｏ４５０（配列番号２８）は、ピューロマイシン耐性遺伝子に続くｐｏｌｙＡ部位を、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ部位に交換したこと（図１５および１６もまた参照のこと）を除いて、以前に記載されたベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ３００およびｐＢＤＵｐｕｒｏ４００と等価であるように調製した。いくつかのさらなるベクターを、８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥエレメントを全ＵＣＯＥ活性を保持する欠失分析によって、本明細書中の上記で同定された４．１ｋｂのＭｆｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントで置換する。ｐＢＤＵｐｕｒｏベクターシリーズのピューロマイシン耐性カセットのｐｏｌｙＡ部位を変更するために、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ部位を、ポリメラーゼ連鎖反応によってｐＢＳｎｅｏ．２３から増幅し、この反応生成物を、ＮｓｉＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＯＲＴｐｕｒｏＦのＮｓｉＩ部位からＸｂａＩ部位に挿入し、ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ部位を交換する。この新規ベクター（ｐＯＲＴｐｕｒｏＦ’）を、続いてＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、ＨＵＣＭＶ（マウスＣＭＶプロモーターを有するハイブリッドＵＣＯＥ）のＢａｍＨＩ部位からＳａｌＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＢＤＵｐｕｒｏ３５０（配列番号２７；図１５もまた参照のこと）を得るか、またはｐＵＣＯＥａｃｔ３（アクチンプロモーターにおいてＡＴＧコドンの部位特異的変異を有するハイブリッドＵＣＯＥ）のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＢＤＵｐｕｒｏ４５０（配列番号２８；図１６もまた参照のこと）を得る。さらなるＵＣＯＥベクターを、プラスミドｐＵＣＯＥａｃｔ３およびｐＵＣＯＥａｃｔ３ｈＣＭＶにおいて、ヒトβ−アクチンとＲＮＰ  ＵＣＯＥフラグメントとの間の境界のＫｐｎＩ部位の位置に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入することによって構築する。ＲＮＰ  ＵＣＯＥを保有する４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、次いで、除去し、７００ＦＲＶ．Ｒ．からの４．１ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥフラグメントと交換する。ＳａｌＩからＢａｍＨＩ（部分）フラグメントを、次いで、ｐＯＲＴｎｅｏＦおよびｐＯＲＴｐｕｒｏＦ’のＳａｌＩ部位からＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１２００（配列番号２９；図１７もまた参照のこと）、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１４５０（配列番号３０；図１８もまた参照のこと）、ｐＢＤＵｐｕｒｏ１６００（配列番号３１；図１９もまた参照のこと）、およびｐＢＤＵｐｕｒｏ１８００（配列番号３２；図２０もまた参照のこと）を得る。
【０１６１】
（実施例８）
（２方向性ＵＣＯＥ活性のために重要なベクター特性の評価）
（１．ＣＨＯ−Ｓ細胞における抗体産生速度に対する２方向性ＵＣＯＥベクターコピー数の影響）
ＣＨＯ−Ｓ細胞株Ｓ４２１．７は、ｈＡｂ１（ＩｇＧ４）を発現するベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ４２１の単一コピーを含むことが示された。さらなるベクターコピーが抗体発現レベルを増加し得るかどうかを決定するために、Ｓ４２１．７は、ｈＡｂ１もまた発現するが、異なる選択マーカー（Ｇ４１８耐性）を保有するベクターｐＢＤＵｎｅｏ２２１で再トランスフェクトした。クローン化細胞株を、単離し、産生速度について分析した（図２１）。多くの細胞株は、親株Ｓ４２１．７よりも速い産生速度を有し、このことは、さらなるベクターコピーが産生を増加し得ることを示すようである。最初のコピー数分析によって、細胞株Ｓ７．１６、Ｓ７．２０およびＳ７．２３は１〜２コピーのベクターｐＢＤＵｎｅｏ２２１を含むことを示した（データは示さず）。
【０１６２】
（２．ＣＨＯ−Ｓ細胞における抗体産生に対するハイブリッドＵＣＯＥの方向およびプロモーター選択の効果）
ｈＡｂ１（ＩｇＧ４）を発現する種々の２方向性ＵＣＯＥベクターを保持するＣＨＯ−Ｓ細胞の安定なプールを、抗体発現速度に対する、抗体遺伝子と比較したハイブリッドＵＣＯＥの方向の効果および異なるプロモーターの効果の両方を決定するために分析した。ＣＨＯ−Ｓ細胞を、ｈＡｂ１（ＩｇＧ４）を発現する一連の２方向性ＵＣＯＥベクターでトランスフェクトし、そして安定なプールを、１２．５μｇ／ｍｌピューロマイシンまたは５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８のいずれかで選択した。ハイブリッドＵＣＯＥエレメントに対する重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｋ）の位置（アクチン末端対ＲＮＰ末端）および使用されるプロモーターを、以下の表７に示す。抗体産生速度を、ＥＬＩＳＡによって測定し、ウェスタンブロット分析を実施して、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）に対する、上清（ｓｕｐｅ）中の軽鎖および重鎖の分布を決定した。ハイブリッドＵＣＯＥの方向は、抗体発現レベルに対してほんの小さな効果のみを示したが、プロモーターの組み合わせの選択によって、産生速度にいくらかの相違を生じた。最も速い産生速度を、重鎖をヒトβ−アクチンプロモーターから、そして軽鎖をマウスＣＭＶプロモーターまたはヒトＣＭＶプロモーター（例えば、ｐＢＤＵｐｕｒｏ４５４およびｐＢＤＵｐｕｒｏ８０４）のいずれかから発現する例示的なベクターを使用するこれらの実験において得た。
【０１６３】
（表７）
【０１６４】
【表７】
2004535189.tif 000008
（３．ＣＨＯ−Ｓ細胞中の転写対産生速度）
クローン化された細胞株を、ｐＢＤＵｐｕｒｏ４５２、ｐＢＤＵｐｕｒｏ４５４およびｐＢＤＵｐｕｒｏ８０４を保持するピューロマイシン耐性プールから単離した。ｐＢＤＵｐｕｒｏ４５４およびｐＢＤＵｐｕｒｏ８０４を保持するクローン化された株の約２／３は、１〜１０ｐｇ／細胞／日までの測定可能な抗体産生速度を有し、これは、ベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ４２１から得られた以前の結果に類似した（データは示さず）。ゲノムＤＮＡサンプルに対するＴａｑＭａｎアッセイは、クローン化された株Ｓ４５２．３、Ｓ４５４．５およびＳ８０４．４が、それぞれ単一コピーの二方向性ＵＣＯＥベクター（ｐＢＤＵｐｕｒｏ４５２、ｐＢＤＵｐｕｒｏ４５４およびｐＢＤＵｐｕｒｏ８０４）を保持することを示唆した。サザン分析によって単一コピーのｐＢＤＵｐｕｒｏ４２１（ヒトアクチンプロモーターから発現される重鎖およびマウスＣＭＶプロモーターから発現される軽鎖を有するｐＢＤＵｐｕｒｏ４００）を有することが以前に示された細胞株Ｓ４２１．７を、コントロールとして包含した。抗体鎖の産生速度と転写との間の相関を研究するために、ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイをこれらの細胞株に対して実施した。この結果を以下の表８に要約する。株Ｓ４５２．３中の重鎖ＲＮＡレベルおよび軽鎖ＲＮＡレベルの両方は、コントロール株Ｄ６およびＳ４２１．７において観察されるＲＮＡレベルより有意に低く、このことが抗体を良好に発現することを示した。しかし、株Ｓ４５４．５およびＳ８０４．４は、ポジティブコントロール株に類似するＲＮＡレベルおよび産生レベルを有した。ウェスタンブロット分析（データは示さず）と一緒にして、これらの結果は、これらの株において観察される抗体重鎖および軽鎖のＲＮＡレベルは、観察される産生速度と相関することを示す。
【０１６５】
（表８）
【０１６６】
【表８】
2004535189.tif 000009
Ｃｔ、サイクル数閾値；ＣＨＯ−Ｓ、親細胞株；Ｄ６、ｈＡｂ１に対するｈＣＭＶプロモーターから発現される軽鎖および４〜８コピーの重鎖を発現する２片のベクターを保有するクローン化された細胞株；Ｓ４２１．７、単一コピーのｐＢＤｕｐｕｒｏ４２１を保有するクローン化された細胞株；Ｓ４５４．５、単一コピーのｐＢＤｐｕｒｏ４５４を保有するクローン化された細胞株；Ｓ８０４．４、単一コピーのｐＢＤｐｕｒｏ８０４を保有するクローン化された細胞株；およびＳ４５２．３、単一コピーのｐＢＤｐｕｒｏ４５２を保有するクローン化された細胞株。
【０１６７】
本明細書に参照され、そして／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願刊行物、米国特許出願、外国特許、外国特許刊行物および非特許刊行物は、それらの全体を参考として本明細書中に援用される。
【０１６８】
前記から、本発明の特定の実施形態は、例示の目的のために本明細書中に記載されるものの、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく作製され得ることは理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いて制限されない。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】図１は、ＵＣＯＥに基づく抗体発現カセットの図示である。
【図２Ａ】図２Ａは、組換えヒト抗体の発現のために使用され得るベクターのプラスミドマップである。図２Ａは、組換えヒトＩｇ重鎖の発現のためのプラスミドを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、組換えヒト抗体の発現のために使用され得るベクターのプラスミドマップである。図２Ｂは、組換えヒトＩｇκ軽鎖の発現のためのプラスミドを示す。
【図３】図３は、ＵＣＯＥでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞およびＵＣＯＥでトランスフェクトしていないＣＨＯ細胞における抗体発現レベルを示すグラフである。
【図４】図４は、振盪フラスコ培養および２リットルバイオリアクターにおける、抗体Ａｂ１の重鎖および軽鎖を発現するベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ細胞株のスケールアップの結果である。左側のパネルは、ＥＬＩＳＡにより決定した抗体力価を示す。右側のパネルは、細胞増殖を示す。
【図５】図５は、マウスハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＣＨＯ−Ｓ細胞の表面上のＧａｌ−Ｇａｌ残基のレベルを示すグラフである。
【図６】図６は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｎｅｏ１００の図示である。
【図７】図７は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｎｅｏ２００の図示である。
【図８】図８は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ３００の図示である。
【図９】図９は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ４００の図示である。
【図１０】図１０は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｎｅｏ５００の図示である。
【図１１】図１１は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｎｅｏ６００の図示である。
【図１２】図１２は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ７００の図示である。
【図１３】図１３は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ８００の図示である。
【図１４】図１４は、ＣＥＴ７２０ＧＦＰの８ｋｂ  ＲＮＰ  ＵＣＯＥ内での欠失の図示である。
【図１５】図１５は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ３５０の図示である。
【図１６】図１６は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ４５０の図示である。
【図１７】図１７は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｎｅｏ１２００の図示である。
【図１８】図１８は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ１４５０の図示である。
【図１９】図１９は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｎｅｏ１６００の図示である。
【図２０】図２０は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターｐＢＤＵｐｕｒｏ１８００の図示である。
【図２１】図２１は、二方向性ＵＣＯＥプラスミドベクターを含む例示の細胞株についての抗体生成速度を示すグラフである。
【図１】
2004535189.tif 000010
【図２Ａ】
2004535189.tif 000011
【図２Ｂ】
2004535189.tif 000012
【図３】
2004535189.tif 000013
【図４】
2004535189.tif 000014
【図５】
2004535189.tif 000015
【図６】
2004535189.tif 000016
【図７】
2004535189.tif 000017
【図８】
2004535189.tif 000018
【図９】
2004535189.tif 000019
【図１０】
2004535189.tif 000020
【図１１】
2004535189.tif 000021
【図１２】
2004535189.tif 000022
【図１３】
2004535189.tif 000023
【図１４】
2004535189.tif 000024
【図１５】
2004535189.tif 000025
【図１６】
2004535189.tif 000026
【図１７】
2004535189.tif 000027
【図１８】
2004535189.tif 000028
【図１９】
2004535189.tif 000029
【図２０】
2004535189.tif 000030
【図２１】
2004535189.tif 000031
【国際公開パンフレット】
2004535189.tif 000032
2004535189.tif 000033
2004535189.tif 000034
2004535189.tif 000035
2004535189.tif 000036
2004535189.tif 000037
2004535189.tif 000038
2004535189.tif 000039
2004535189.tif 000040
2004535189.tif 000041
2004535189.tif 000042
2004535189.tif 000043
2004535189.tif 000044
2004535189.tif 000045
2004535189.tif 000046
2004535189.tif 000047
2004535189.tif 000048
2004535189.tif 000049
2004535189.tif 000050
2004535189.tif 000051
2004535189.tif 000052
2004535189.tif 000053
2004535189.tif 000054
2004535189.tif 000055
2004535189.tif 000056
2004535189.tif 000057
2004535189.tif 000058
2004535189.tif 000059
2004535189.tif 000060
2004535189.tif 000061
2004535189.tif 000062
2004535189.tif 000063
2004535189.tif 000064
2004535189.tif 000065
2004535189.tif 000066
2004535189.tif 000067
2004535189.tif 000068
2004535189.tif 000069
2004535189.tif 000070
2004535189.tif 000071
2004535189.tif 000072
2004535189.tif 000073
2004535189.tif 000074
2004535189.tif 000075
2004535189.tif 000076
2004535189.tif 000077
2004535189.tif 000078
2004535189.tif 000079
2004535189.tif 000080
2004535189.tif 000081
2004535189.tif 000082
2004535189.tif 000083
2004535189.tif 000084
2004535189.tif 000085
2004535189.tif 000086
2004535189.tif 000087
2004535189.tif 000088
2004535189.tif 000089
2004535189.tif 000090
2004535189.tif 000091
2004535189.tif 000092
2004535189.tif 000093
2004535189.tif 000094
2004535189.tif 000095
2004535189.tif 000096
2004535189.tif 000097
2004535189.tif 000098
2004535189.tif 000099
2004535189.tif 000100
2004535189.tif 000101
2004535189.tif 000102
2004535189.tif 000103
2004535189.tif 000104
2004535189.tif 000105
2004535189.tif 000106
2004535189.tif 000107
2004535189.tif 000108
2004535189.tif 000109
2004535189.tif 000110
2004535189.tif 000111
2004535189.tif 000112
2004535189.tif 000113
2004535189.tif 000114
2004535189.tif 000115
2004535189.tif 000116
2004535189.tif 000117
2004535189.tif 000118
2004535189.tif 000119
2004535189.tif 000120
2004535189.tif 000121
2004535189.tif 000122
2004535189.tif 000123
2004535189.tif 000124
2004535189.tif 000125
2004535189.tif 000126
2004535189.tif 000127
2004535189.tif 000128
2004535189.tif 000129
2004535189.tif 000130
2004535189.tif 000131
2004535189.tif 000132
2004535189.tif 000133
2004535189.tif 000134
2004535189.tif 000135
2004535189.tif 000136
2004535189.tif 000137
2004535189.tif 000138
2004535189.tif 000139
2004535189.tif 000140
2004535189.tif 000141
2004535189.tif 000142
2004535189.tif 000143
2004535189.tif 000144
2004535189.tif 000145
2004535189.tif 000146
2004535189.tif 000147
2004535189.tif 000148
2004535189.tif 000149
2004535189.tif 000150
2004535189.tif 000151
2004535189.tif 000152
2004535189.tif 000153
2004535189.tif 000154
2004535189.tif 000155
2004535189.tif 000156
2004535189.tif 000157
2004535189.tif 000158
2004535189.tif 000159
2004535189.tif 000160
2004535189.tif 000161
2004535189.tif 000162
2004535189.tif 000163
2004535189.tif 000164
2004535189.tif 000165
2004535189.tif 000166
2004535189.tif 000167
2004535189.tif 000168
2004535189.tif 000169
2004535189.tif 000170
2004535189.tif 000171
2004535189.tif 000172
2004535189.tif 000173
2004535189.tif 000174
2004535189.tif 000175
2004535189.tif 000176
【国際調査報告】
2004535189.tif 000177
2004535189.tif 000178