(57)【要約】多重鎖核酸分子などの分子を固定するための種々の方法が記載される。これらの方法は、固体支持体の活性化と、更に、たとえば、核酸分子の末端を表面上での固定に対してより受入易くするための処理、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重鎖非変性核酸分子を固体支持体に固定する方法であって、
前記多重鎖非変性核酸分子の少なくとも１つの鎖の一部を、前記固体支持体に対して結合可能に修飾する工程と、
前記多重鎖核酸分子を、それに対する固定化に有利な条件下で前記固体支持体に接触させる工程とを有する、
多重鎖非変性核酸分子を固体支持体に固定する方法。
【請求項２】
前記修飾工程は、前記１つの鎖の末端を修飾する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記末端をアミノ化する工程を有する、請求項２の方法。
【請求項４】
前記修飾工程は、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジン分子を前記１つの鎖の末端に付加する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記固体支持体はガラスを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
前記固体支持体はプラスチックを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
前記固体支持体はナイロン膜を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
前記プラスチックは、スクラッチングされて、三次元表面を呈する、請求項６の方法。
【請求項９】
前記プラスチックは、紫外線放射によって処理されている、請求項６の方法。
【請求項１０】
前記修飾工程は、前記多重鎖核酸分子の少なくとも１つの末端をそれが別の核酸分子鎖にハイブリダイズしないように、処理する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記多重鎖核酸分子の１つの鎖の全表面を処理して、前記多重鎖核酸分子全体を前記固体支持体に対して結合可能にする工程を有する、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記多重鎖核酸分子は、２−１０の核酸分子鎖を有する、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記多重鎖核酸分子は、２−５の核酸分子鎖を有する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記多重鎖核酸分子は、核蛋白質複合体、核化学物質複合体、核薬剤複合体、又は光切断核酸分子である、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記光切断核酸分子は、金属キラル複合体を含む、請求項１４の方法
【請求項１６】
前記核酸分子はＺ−ＤＮＡである、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記Ｚ−ＤＮＡは、それをＺ−ＤＮＡとして恒久的に安定的にするために処理されている、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子はＢ−ＤＮＡである、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記多重鎖核酸分子は、環状である、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子の少なくとも一部がスーパーコイル状である、請求項１の方法。
【請求項２１】
前記多重鎖核酸分子の少なくとも２つの末端をそれを前記固体支持体に対して結合可能とするべく修飾する工程を有し、少なくとも１つの修飾末端は鎖の５’−末端であり、少なくとも１つの修飾末端は鎖の３’末端である、請求項１２の方法。
【請求項２２】
前記多重鎖核酸分子は、少なくとも２つの鎖において修飾される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記固体支持体は、アルデヒド基を含み、前記修飾工程は、少なくとも１つの鎖の前記部分をアミノ化することを含む、請求項１の方法。
【請求項２４】
前記固体支持体は、ポリ−Ｌ−リジンによってコーティングされ、前記修飾工程は、少なくとも１つの鎖の前記部分をチオリン酸化することを含む、請求項１の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体はアミノ化されており、前記修飾工程は、少なくとも１つの鎖の前記部分をカルボキシル化又はリン酸化することを含む、請求項１の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの鎖の前記部分は、アミノ化され、前記固体支持体は、イソシアネート、アルデヒド、エポキシド、又はカルボキシル酸によって活性化されている、請求項１の方法。
【請求項２７】
前記固体支持体は、リン酸化されており、少なくとも１つの鎖の前記部分は、アミノシラン成分によって修飾されている、請求項１の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの鎖の前記部分は、チオール基によって修飾されており、前記固体支持体は、ヘテロ二官能性クロスリンカーによってリンクされた、メルカプトプロピルシラン又はアミノシランを含む、請求項１の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの鎖の前記部分は、ジスルフィドによって修飾されており、前記固体支持体は、ヘテロ二官能性クロスリンカーによってリンクされた、メルカプトシラン又はアミノシランによって修飾されている、請求項１の方法。
【請求項３０】
前記固体支持体は、アクリルアミドモノマーを含み、少なくとも１つの鎖の前記部分はアクリルアミドを含む、請求項１の方法。
【請求項３１】
分子機能を分析するのに有用な装置であって、
紫外線レーザ照射によって活性化されて複数の共有結合性分子がそれに固定されている、或いは、エッチング又はスクラッチングによって処理されてそれに対する分子結合を受容する三次元構造を呈している固体支持体を有する、
分子機能を分析するのに有用な装置。
【請求項３２】
前記固体支持体は、ナイロン膜を含む、請求項３１の装置。
【請求項３３】
前記ナイロン膜は、ガラス又はプラスチック支持体に付着されている、請求項３２の装置。
【請求項３４】
前記複数の共有結合性分子は、多重鎖核酸分子である、請求項３１の装置。
【請求項３４】
前記多重鎖核酸分子は、２−６の核酸分子鎖を含む、請求項３３の装置。
【請求項３５】
前記多重鎖核酸分子は、Ｂ−ＤＮＡ又はＺ−ＤＮＡである、請求項３３の装置。
【請求項３６】
対象の分子を固定する方法であって、
前記分子を、請求項３１の装置に接触させて、前記分子をそれに固定する工程を有する、
対象の分子を固定する方法。
【請求項３７】
前記分子は完全に固定される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記分子は、多重鎖核酸分子である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
前記分子はタンパク質である、請求項３６の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質は抗体である、請求項３４の方法。
【請求項４１】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記モノクローナル抗体は、Ｂ−ＤＮＡに特異的に結合する、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である、請求項３９の方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡ結合タンパク質はゼータクリスタリンである、請求項４３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
これは、ここに参考文献として合体させる２００１年７月３１日出願の出願番号第６０／３０８，９３６号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、固相に対して分子を固定するための方法に関する。好適実施例において、それは、固相に固定される多重鎖（multistranded；即ち、少なくとも二本鎖の核酸）分子に関する。固定されると、それらの分子は、スクリーニングアッセイ等の種々のアッセイに使用することが可能となる。これらの分子の固定化に使用されるべく調製される固相も本発明の特徴構成のひとつである。
【背景技術】
【０００３】
ｄｓ（二本鎖：double stranded）−ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその他の非伝統的、無傷（intact） の非変性核酸の三次元構造の決定は、それらの、タンパク質、更に、とりわけ、原核又は真核細胞的調節、遺伝子発現、及び修復、に関連するその他の生体分子及び非生体分子との相互作用の理解のために極めて重要である。サンガー，ダブリュ（Sanger, W.）Principles of Nucleic Acid Structure. 1984, Springer-Verlag, NY; シンデン，アール・アール（Sinden, R.R.），1994, DNA Structure and Function. pp.1-398. Academic Press, NY; サーマ，アール・エイチ（Sarma, R.H.）Nucleic Acid Geometry and Dynamics. 1980, pp.1-424, PergamonPress; ジンマーマン，エス・ビー（Zimmerman, S.B.）Ann. Rev. Biochem. 1982; 51-395-427; ディカーソン，アール・イー（Dickerson, R.E.）1983. Scientific American, 249（6）; 94-111, ディッカーソン，アール・イー（Dickerson, R.E.）Methods in Enzym.211: 67-111, 1992; リッチ，エイ（Rich, A.）Ann. Rev. Biochem. 53: 791-846 1984）を参照。それは、又、核酸分子の正確な読み取りを阻止する可能性のある薬剤、等の分子と非変性核酸との相互作用の理解のためにも重要である。ｄｓ−ＤＮＡは、Ｂ−からＺ−ＤＮＡへの変化をもたらす螺旋変形（helical change）などの高次構造の周期的変動（conformational fluctuation）を受けることがある。ｄｓ−ＤＮＡ及び他の非変性核酸分子の湾曲又は屈曲は、それ自身単体で、或いは、分子が、単数又は複数のタンパク質などの他の物質と複合する時、に起こりうる。タンパク質−ＤＮＡ複合体は、ｄｓ−ＤＮＡ又はＲＮＡにおいて、主溝に向かう鋭利な屈折、屈曲などの、大きな高次構造の変化をもたらす可能性がある（ジェイ・キム（J. Kim）他, 1993 Nature 365: 512-520; ジェイ・エル・キム（J. L. Kim）他, 1993 Nature 365: 520-527）。たとえば、ヒト１７０ＫＤａトポイソメラーゼＩＩは、湾曲した左巻きＺ−ＤＮＡに優先的に結合する（J. Biomol. Struc. & Dyn. 12:605-623, 1994）。変異状態と構造のＤＮＡは、バルクＤＮＡのそれらと異なる生物学的及び物理的特性を有する。そのような変異状態の具体例には、塩基ミスマッチ部位、ＤＮＡ膨出（DNA bulges）、ＤＮＡ−ヒストン複合体、螺旋軸の屈曲を誘導するＤＮＡ配列、十字部、Ｈ−ＤＮＡ、及びその他の分枝種（branched species）（クーパー，ジェイ・ピー（Cooper, J. P.）他, Proc. Natl. Acad., Sci. USA 86: 7336-7340, 1989）及び所謂左巻きＺ−ＤＮＡ、が含まれる。これらの状態の一部は、突然変異生成、転写および／又は遺伝子発現の制御）又は遺伝子組換えを含む生物機能に関連つけられている。
【０００４】
Ｚ−ＤＮＡ等の高エネルギ形状のｄｓ−ＤＮＡの生物学的役割を評価する方法の１つは、別のＤＮＡ（及びその他の核酸構造）の安定化にとって有利な、環境条件（たとえば、ｐＨ，イオン強度、温度、環境極性（milieu polarity）、高圧、光熱力学的損傷）を明らかにすることである。しかし、そのような研究には、その後の研究に使用可能な、安定した固定化分子源が必要である。
【０００５】
マイクロアレイ又は、それに固定された何百、何千もの分子を含む固相構造体は、分子生物学、特に、ゲノム学、及びスクリーニングアッセイなどの分野において分子生物学の重要な特徴となっているが、現時点において分子一般、及び特に核酸分子、の固定化に利用可能な方法は限られている。Ｚ形高次構造、２−１０、好ましくは２−６の鎖を含む核酸分子等の多重鎖分子、プラスミド等の環状分子で、その全部又は一部がスーパーコイル形成可能な、比較的一般的でない分子を固定する方法は特に限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、そのような分子を固定するのに有用な方法と装置、更に、それらによって得られる分子と利用可能なアッセイ、を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のこれらの特徴構成がいかにして達成されるかは、下記の詳細説明から理解されるであろう。
【０００８】
この新規な発明は、特に、核酸分子等の分子が、予め合成され、次に、固定支持表面（たとえば、ガラススライド、プラスチックスライド、ナイロン膜、又はシリコン）上に固定されるスポテッドマイクロアレイ（spotted  microarray）、又は、チー，エム（Chee, M.）Science, 27:610-614 （1996）に記載されているもののようなフォトリソグラフィー法を使用して、核酸分子が固体支持体上において原位置（in site）で合成される高密度核酸アレイ、を使用する、迅速で、費用効果的なスクリーニング法に関する。好適には、前記非変性核酸分子は、公知の技術を使用して外部で合成され、その後、前記固体支持表面上に固定される。本発明によれば、核酸分子などの非変性分子の物理学的および化学的性質の特徴付け、更に、ヌクレアーゼ高感受性部位、無傷のクロマチン（intact chromatin）、ｄｓ−ＤＮＡの配列定方向湾曲（sequence-directed curvature）、位相幾何学的応力下における平行型鎖ＤＮＡの螺旋周期性（helical periodicity）、ＤＮＡ／タンパク質複合体などの核酸分子と相互作用する物質の三次元構造、ｄｓ−ＤＮＡ結合の構造的基盤、非変性核酸分子又はその他の分子のその他多くの構造、の測定も可能である。
【０００９】
核酸マイクロアレイ法は、将来、医学において支配的なものとなると予想されるが、分子生物学者、生物薬剤学科学者、等の、より多くの人々にとって利用可能な、改良、低コストでより優れた製品が提供されることが依然望まれている。本発明の方法は、診断、疾患管理、及び治療に使用される、ｄｓ−ＤＮＡ及びＲＮＡ、結合タンパク質、抗体、転写因子、エンドヌクレアーゼ標識タンパク質、キラル金属分子プローブ、薬剤、化学物質、酵素、等、を含む、製品のより経済的で生産性の高い改良に道を開くものである。本発明は、当該技術に、たとえば、年齢に関係するｄｓ−ＤＮＡのデチオライゼーション（detiorization）の研究を可能にすることによって、細胞死、細胞の分化と老化、を含む様々な疾患プロセスを特徴付ける可能性を提供する。それは、更に、正確で迅速なタンパク質プロファイリングを可能にする。更に、それは、ｄｓ−ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＲＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ−又はＲＮＡ薬剤、又は、タンパク質−薬剤複合物、および、その他のより複雑な多重相互作用の研究を可能にする。ＤＮＡ−タンパク質又はタンパク質−薬剤相互作用等の多くの要素に関連する核酸分子相互作用も研究可能であり、競合結合測定法を実行することも可能である。
【００１０】
核酸螺旋構造の維持と改変とにおいて温度が役割を果たしているので、本発明のシステムは、固定化された非変性核酸分子に結合する、タンパク質などの核酸要素の特徴付けを補助するべく種々のカチオン溶液と組み合わせて様々な温度を使用することができる。正常なタンパク質と変異したタンパク質との両方を広範囲に特徴付けることができる。たとえばＤＮＡ結合タンパク質等の、特異的認識のために必要な残基における欠陥を有する、変異核酸結合タンパク質を、本発明の非変性核酸マイクロアレイ・システムを通じて分析することができる。本発明は、抑制化合物などの薬剤や、タンパク質などのその他の要素の、特定環境内での螺旋転移（helical transition）等の高次構造転移（conformational transition）を受けている様々な正常及び変異遺伝子に対する相互作用のモニタリングを可能にする。これの具体例として、右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡから左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡへの塩基転移（transition）（４Ｍ  ＮａＣｌ）、右巻きＢ−ＲＮＡからｄｓ−Ｚ−ＲＮＡへの転移（１０Ｍ  ＮａＣｌ）がある。右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ結合タンパク質の特徴付けは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ等の低イオン強度の溶液中で行うことができる。
【００１１】
ｄｓ−二本鎖ＤＮＡの螺旋転換（helical transformation）は、真核及び原核生物遺伝子発現において重要な役割を果たしている。本発明は、たとえば、生物薬剤産業や、薬理ゲノミクス、毒性ゲノミクス（toxocogenomics）及びヒト診断、等のその他の分野の発達プロセスにおいて有用である。
【００１２】
現在利用可能な標準ＤＮＡマイクロアレイは、ｃＤＮＡからの変性ｓｓ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用している。オリゴヌクレオチドは、特定の条件（たとえば、実験動物に与えられる抗がん剤）下において特定の組織から単離されたｍ−ＲＮＡの遺伝子発現を調べるために、合成されるか、又は、固体支持体上に直接載置される。これらの標準ＤＮＡマイクロアレイは、ハイブリダイゼーションを介して発現された遺伝子をプロファイルする。
【００１３】
本発明は、たとえば、遺伝発現を調節する、螺旋変化などの高次構造変化を受けている遺伝子の構造の両方の特徴付けを可能にする。たとえば、ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡからｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ、その後、二本鎖Ｂ−ＤＮＡへの転移、および／又は、前記分子と、Ｚ−ＤＮＡ結合タンパク質などの、遺伝子発現を抑制又は促進する可能性のある、タンパク質又は非タンパク質薬剤等のその他の物質との相互作用を研究することができる。もしも、各核酸プローブに、異なる標識を付着させるならば、本発明によって、複数の要素を同時に研究することが可能である。
【００１４】
本発明を使用して、ｄｓ−又は多重鎖非変性核酸を、前記固体支持体表面上に直接載置又は、この表面上で合成することが可能である。ｄｓ−ＤＮＡ又はＲＮＡ、三重鎖(triplex)ＤＮＡ、四重鎖（quadruple）ＤＮＡ、五重鎖（pentaplex）ＤＮＡ、天然ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、活性化されたＤＮＡ、共有結合性閉環状ｄｓ−ＤＮＡプラスミドを、本発明を使用して、固体支持体上に固定することができる。
【００１５】
本発明の別態様は、たとえばプラスミドＤＮＡと使用される固定化技術である。種々のイオン溶液（たとえば、１５０ｍＭ，５００ｍＭ，７５０ｍＭ，１Ｍ，１．５Ｍ，２．０Ｍ, ２．５Ｍ，３．０，３．５Ｍ，４．０Ｍおよび４．５Ｍ  ＮａＣｌ）を使用することによって、研究者は、タンパク質、抗体、薬剤、又は金属キラルプローブなどの核酸結合因子を、その、固定化非変性核酸高次構造との相互作用において特徴つけることかができる。前記核酸結合因子を使用して、薬剤を特定のＤＮＡ部位にまで運ぶことができる。これの一例は、抗がん剤を付着させた抗体の使用であり、或いは、それは、ＤＮＡ結合タンパク質等のような、遺伝子を直接遮断することも可能である。数千の変性遺伝子（ｃＤＮＡ）をマイクロアレイ上に載置する代わりに、本発明の場合は、ｄｓ−ＤＮＡである数千の遺伝子を載置する。特定の高次構造の核酸分子を、たとえば４００μｍのスポットの中心内で前記表面上に直接置いた場合、より優れた結果が得られる。
【００１６】
本発明の１つの特徴構成は、固定化手順法であって、これは、タンパク質などの核酸プローブを特徴付けるために、標識化されていないｄｓ−および／又は多重鎖核酸を、特定の環境（たとえば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液）内で、固相上において結合させ保持するために使用することができる。又、後述するように、プラスミド等の固定化と、三次元表面を提供する改変又はスクラッチされたプラスチックのＵＶ機能化表面は発明の他の特徴構成である。本発明は、たとえば、アルデヒド、シリコン／セラミックウエハ、ポリ−Ｌ−リジン、ナイロン膜、ゲルパッド、等によって機能化され、その後、核酸高次構造を変化させることが可能なイオン溶液を保持するマイクロ容器に入れられた、ガラスやプラスチックスライドなどの固相上の固定化非標識化非変性ｄｓ−核酸分子又は多重鎖核酸分子を使用する。次に、前記固定化ｄｓ−核酸分子又は多重鎖核酸分子は、前記右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ高次構造を維持している溶液を数マイクロリットルの前記マイクロ容器に注入することによって、種々の核酸結合因子を特徴付けるために使用することができる。別の方法は、前記マイクロアレイ表面上の特定の分離した領域と相互作用する、複数種類の注入可能溶液を使用して、前記スライド上で微小小型ラボラトリー（たとえば、微小流体チップ）を構築する方法である。これによって、ユーザが、マイクロスケールのチャンネルを通じて、一体化された微小流体デバイス上に、極めて微量の流体を移動することが可能となる。これによって、分子生物学的反応がマイクロスケールレベルで起こることを可能にする。前記溶液はイオン強度を漸次に上げることが可能である。たとえば、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの転移を研究する場合、１５０ｍＭ，４５０ｍＭ，１Ｍ，１．５Ｍ，２．０Ｍ，２．５Ｍ，３．０Ｍ，３．５Ｍ及び４．０ＭのＮａＣｌを使用することができる。これによって、特定の核酸結合因子とのそれの相互作用を同時に調べながら、既知の塩基対で、特定の遺伝子内における、右巻き二本鎖Ｂ−ＤＮＡから左巻き二本鎖Ｚ−ＤＮＡへの漸次的な転移の特徴付けが可能となる。異なるｄｓ−、三本鎖（triple-stranded）、四本鎖（four-stranded）及び五本鎖（five-stranded）核酸に対するそれらの結合を通じた、生物的及び非生物的要素の特徴付けは、たとえば、蛍光染料、酵素、等、によって直接的又は間接的に標識化して、定量化することができる。このシステムに使用可能な核酸プローブの非限定的な具体例は、抗体、タンパク質、キラル金属分子プローブ、ピコグリーン（PicoGreen）に本鎖ＤＮＡ蛍光プローブ、薬剤、酵素、転写因子、等である。たとえば、蛍光染料によって標識化されたタンパク質プローブは、既知の配列又は螺旋高次構造（たとえばＺ−ＤＮＡ）の前記固定化非変性核酸とのその結合反応を、その蛍光によって定量化することができる。この技術は、薬剤、化学物質、キラル金属分子プローブ、ｄｓ−ＤＮＡ  ピコグリーン（PicoGreen）プローブ、抗体、ＤＮＡ−（ＲＮＡ）結合タンパク質、転写因子、の結合反応の特徴付け、制限酵素及びその他多くの核酸因子の、１５０ｍＭ  ＮａＣｌや４Ｍ  ＮａＣｌ等の非生理的強度イオン溶液など、イン・ヴィヴォ条件に類似することが可能な、多種多様��生理学的条件下に於ける、ｄｓ−ＤＮＡ、ｄｓ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ｓｓ−ＤＮＡ（ｓｓ−ＲＮＡ）、三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、五重鎖ＤＮＡ、及び共有結合性閉環状二本鎖ＤＮＡプラスミドの多様な螺旋高次構造に対するモデリングの特徴付け、に使用することができる。これらのイオン溶液によって、固定化核酸分子の１つの螺旋高次構造が、構造−機能分析を可能にする、僅かに異なった、あるいは完全に異なった、螺旋高次構造に変換される。
【００１７】
螺旋高次構造と同程度に非常に重要であるのは、遺伝子、遺伝子フラグメント又は合成コポリマーに対する、塩基対の選択である。ｄｓ−又は多重鎖核酸は、配列特異的及び非配列特異的タンパク質および／又はタンパク質結合部位の両方の特徴付けに使用することができる。ＤＮＡ−タンパク質相互作用のなかには、ｄｓ−ＤＮＡが修飾を持つことを必要とするものがある。本発明によれば、メチル化ＤＮＡ等の、いかなるタイプの生化学的に修飾されたｄｓ−ＤＮＡ（ＲＮＡ）又は多重鎖核酸でも、予め、アルデヒド又はポリ−Ｌリジンでのコーティングによって、機能化された前記固体支持体表面上に堆積させることが可能である。このように、本発明の前記非変性ｄｓ−、多重鎖核酸構造−転移マイクロアレイは、従来技術に見られるマイクロアレイと異なったものである。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は、高スループットスクリーニングのみならず、低スループットアッセイにも使用できる。それは、完全なゲノム（たとえば、ｄｓ−ＤＮＡ、フラグメント化ゲノムＤＮＡライブラリ）の大雑把（“broad-brush”）な理解を得るために使用することができ、或いは、標的部位が見つかった後に、特定の遺伝子を更に特徴付けることができる。放射性化学物質等の薬剤と、ｄｓ−ＤＮＡ、ｓｓ−ＤＮＡ、ｄｓ−ＲＮＡ、ｓｓ−ＲＮＡ、ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ、Ｚ−ＤＮＡ、ペプチドＤＮＡ、タンパク質−核酸複合体、三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、プラスミドの共有結合性閉環状ｄｓ−ＤＮＡ、五重鎖ＤＮＡ構造との結合能力及び／又は機序、のこれらすべてを調べることができる。本発明において、即ち、推定既知結合薬及びタンパク質などの２つ以上の核酸プローブが、ｄｓ−、又は、多重鎖核酸分子結合部位に対して同時に競合するアッセイ、において競合結合アッセイを使用することができる。たとえば、結合能力を特徴付け、薬剤治療に対する応答において遺伝子発現を同時に予測するために、異なる薬剤とＺ−ＤＮＡ結合タンパク質とをテストすることができる。競合結合を、二種類、三種類、四種類、又は五種類以上の要素と同時に使用することができる。
【００１９】
共有結合性閉環状プラスミド（二本鎖ＤＮＡ）は、たとえば、ＤＮＡ結合タンパク質などの核酸因子を特徴付けるため、或いは、既知のＤＮＡ転写因子などの既に特徴つけられている核酸因子との、新たに発見された遺伝子を特徴付けるために使用することができる。ｄｓ−ＤＮＡプラスミドを使用することによって、研究者は、ＤＮＡスーパーコイル構造、及びこのプロセスが、核酸因子のｄｓ−ＤＮＡに対する結合の態様にいかに影響するか、を研究することが可能となる。プラスミド（遺伝子有り、又は無し）−核酸プローブ相互作用を特徴付けるためにＤＮＡスーパーコイル構造を研究するように設計された実験においてトポイソメラーゼを使用することができる。トポイソメラーゼを使用した、又は使用しない、競合結合アッセイを含めて、複数のストラテジーを使用することができる。本発明は、共有結合性閉環状プラスミド（二本鎖ＤＮＡ）の固定化を可能にする。更に、三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、及び五重鎖ＤＮＡ分子を、スーパーコイル条件下において特徴付けのために前記プラスミドに導入することができる。
【００２０】
多くのｄｓ−オリゴヌクレオチドと合成ポリヌクレオチドは、約２０−ｍｅｒの長さを有する。本発明の実施において、たとえば、約５０−ｍｅｒのオリゴマーなどのより長いオリゴヌクレオチドのほうがうまく行く。約５０−ｍｅｒから約７０−ｍｅｒ又はそれ以上のｄｓ−オリゴヌクレオチドによって、最良の全体的結果が得られ、高いシグナル強度と高い特異性とが可能となる。
【００２１】
ｄｓ−、又は多重鎖の核酸と核酸プローブとの反応を可視化するために、前記プローブを、直接的又は間接的に標識化することができる。蛍光又は放射性又はその他の標識を使用することができ、そして、それぞれを異なる標識、たとえば、fluorで標識化して、複数種のプローブを同時に使用するために多重化を使用することも可能である。直接標識化の場合、核酸プローブは、それ自身が直接標識化される。間接標識化の場合は、ビオチン−アビジン染色法等の標準法が使用される。走査蛍光顕微鏡、又は、標識に基づいた、その他のシステム、によって各スポットを照射し、各fluorの蛍光（又は他のシグナル）を別々に測定する。
【００２２】
ＤＮＡは高弾性の巨大分子である。それは、又、多形性であり、種々の螺旋の高次構造（ｄｓ−Ａ−ＤＮＡ，ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ、及びｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ）を採りうる。タンパク質に関連するいくつかのＤＮＡ相互作用の場合、ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ螺旋は歪められ、幾分、巻き戻される。ｄｓ−ＤＮＡは、弛緩状態（右巻き二本鎖Ｂ−ＤＮＡ）から、測定されるとより長い、緊張状態へと変化する物理的能力を有する。これの一例は、時に、ガラスマイクロアレイスライドの機能化固体支持体に取付けられた時のｄｓ−および／又は多重鎖核酸で起こりうる。
【００２３】
本発明は、とりわけ、マイクロアレイなどの機能化固体支持表面上への閉環状プラスミド（二本鎖ＤＮＡ）の固定化に関する。これは、その配列が、プラスミド等の共有結合性閉環状ｄｓ−ＤＮＡの一部に対応する単数又は複数の短いｓｓ−オリゴヌクレオチドを使用することによって達成される。３’及び５’末端は、たとえば、アミノ化されることによって修飾される。修飾されたＤＮＡは、前記機能化表面上でアルデヒドと共有結合する。前記単一又は複数の短いオリゴヌクレオチドは、三重鎖ＤＮＡを形成し、これは、前記ｄｓ−ＤＮＡプラスミドに対して悪影響を与えない。この三重鎖ＤＮＡは、ＢＱＱ又は三重鎖ＤＮＡ結合タンパク質などの物質によって安定化され、その後、ソラレン等の物質を使用して、不可逆的複合体、たとえば、共有結合、を作る。本発明の別の部分は、前記ソラレンをＤＮＡに対して架橋化するためのＵＶレーザ（通常のＵＶ照射の代わり）の使用に関する。これによって、ｄｓ−ＤＮＡに対する損傷の虞を少なくすることが可能である。この付着によって、前記プラスミドの大部分が対象溶液中において自由に浮遊することが可能となる。従って、たとえば４Ｍ  ＮａＣｌ、又はスペルミンによって、研究対象の遺伝子のある配列又は配列内においてネガティブなスーパーコイル形成とＺ−ＤＮＡ形成とを可能にする。本発明は、ｄｓ−及び多重鎖核酸（ＰＣＲ  ｄｓ−ＤＮＡ、遺伝子フラグメント、遺伝子、オリゴヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、及びｄｓ−ＤＮＡプラスミド）を、予め活性化された、又は機能化されたガラス、プラスチック、又はその他の固体表面に固定することを可能にする。ｄｓ−ＤＮＡは、１つ又は２つのテイルによって共有的に固定することができる。たとえば、分子の一部を処理して一本鎖とし、次に、アミノ化等によって修飾して、前記機能化表面のアルデヒド基と反応させることができる。これらの成分を使用して、前記ｄｓ−、又は多重鎖核酸を前記機能化マイクロアレイスライドに固定する。前記修飾ＤＮＡとガラス表面のアルデヒドとを、室温ではなく、共に真空チャンバ内に載置すれば、付着の効率が改善される。
【００２４】
複数のアンカーを、三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、五重鎖ＤＮＡ、又はその他の多重鎖ＤＮＡで、更に、共有結合性閉環状ｄｓ−ＤＮＡと使用することも可能である。これらの固定化された非変性核酸は、共有結合を介して前記機能化マイクロアレイ表面に強固に結合され、熱、洗浄及びその後の染色処理に耐えることができる。
【００２５】
核酸結合タンパク質の特徴付けに関して、たとえば、ＤＮＡ結合タンパク質を、二本鎖ＤＮＡが前記機能化固体支持面上に固定された状態で、前記新規なマイクロアレイに添加される。前記タンパク質は、特定の配列又は、固定化Ｚ−ＤＮＡ等の螺旋高次構造と相互作用される。次に、前記タンパク質は、ｄｓ−Ｚ−ＤＮＡに架橋化される。この架橋化は、たとえば、８−１アジドアデニンを使用したＤＮＡタンパク質複合体のＵＶ照射によって達成することができる。前記タンパク質に対す抗体を使用して、標準ビオチン（ストレプト）アビジン法等で、前記複合体を可視化することができ、或いは、前記タンパク質を蛍光タグによって直接標識化することができる。
【００２６】
前記固定化ＤＮＡ−タンパク質複合体のタンパク質分解性消化も行うことができる。これによって、ＤＮＡ結合ドメイン、前記ＤＮＡフラグメントの配列特徴付けと、タンパク質分解された複合体の特徴付けとに関するデータが得られる。この処理は、三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、五重鎖ＤＮＡ、その他の多重鎖ＤＮＡ、更に、プラスミドに適用することができる。
【００２７】
本発明は、特に、たとえば、Ｚ−ＤＮＡ等の左巻き分子の特徴付けに有用である。左巻きＺ−ＤＮＡは、真核生物遺伝子内における転写エンハンサーとして作用すると考えられており、従って、イン・ヴィヴォで遺伝子発現を調節することができる。
【００２８】
交互プリン−ピリミジン塩基の配列は、左巻き螺旋構造（Ｚ−ＤＮＡ）をとることができ、これは、最初、ヘキサヌクレオチド５リン酸（ｄＣ−ｄＧ）３について、原子分解ｘ線結晶構造解析によって定義された。この高次構造において、逆平行ポリヌクレオチド鎖は、まだ、ワトソン−クリック塩基対合によって結合されているが、グアニン塩基は、グリコシド（glycosidic）結合の回りで回転して、ｓｙｎ形高次構造となっている。ＣｐＧ配列の塩基対は、互いに共有され、それによってシトシン残基は互いに重なり合っている。グアニン残基はもはや平面状の塩基上に重ね合わせされておらず、その代わり、隣接する糖環の０１’原子と一方側で相互作用する。これらの特徴の結果、塩基対は、分子の周囲の位置を占め、シトシンのＣ−５位置と、グアニンのＮ−７とＣ−８位置とを分子の外側に対して露出させている。更に、糖リン酸骨格鎖は、スムースな螺旋状ではなく、ジグザグ状である。溶液中の左巻きＺ−ＤＮＡは、高濃度のＮａＣｌ（＞２.５Ｍ）に晒された合成ポリヌクレオチドポリ［ｄ（Ｇ−Ｃ）］によって提供される。当該技術において文書化されている多くの結晶学的及びその他の研究によって、Ｚ−ＤＮＡ高次構造の多型性が示され、Ｂ−Ｚ転移の蓋然性を大幅に高めうる数多くの要因が記載されている。即ち（１）イオン強度の増加、（２）水分活性の減少、（３） カチオンとアニオンの部位特異的相互作用、（４）温度の上昇、（５）ネガティブな超螺旋密度の増加、（６）ポリアミン、抗体及びコアヒストンを含む、ペプチドとタンパク質の結合、そして（７）ＧのＣ−８位置における置換、ＧのＮ−７における陽電荷の配置、Ｇの２−アミノ基のアルキル化、ＣのＣ−５におけるメチル又臭素置換、糖−リン酸骨格鎖のチオリン酸置換、等のＤＮＡの一次構造の化学修飾。上述した条件の大半は相乗的に作用する。それらのうちでＺ形状をとりうる条件は公知である。Ｂ−Ｚ転移の中間点は、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）＠ポリ（ｄＧ−ｄＣ）では２．５Ｍ  ＮａＣｌ、ポリ（ｄＧ−ｍ５ｄＣ）＠ポリ（ｄＧ−ｍ５ｄＣ）では０．７Ｍ  ＮａＣｌ、そして、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）ジエン−Ｐｔ（０．１２では０．２Ｍ  ＮａＣｌである。 ポリ（ｄＧ−ｂｒ５ｄＣ）＠ポリ（ｄＧ−ｂｒ５ｄＣ）（Ｚ−ＤＮＡ）の中間点は、５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ−３Ｍ  ＮａＣｌの塩範囲である。ポリ（ｄＩ−ｂｒ５ｄＣ）＠ポリ（ｄＩ−ｂｒ５ｄＣ）は、その塩濃度によって、Ｂ形状又はＺ形状をとりうる。これは、Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡの変換を特徴付けるために前記新規なマイクロアレイシステムを使用する研究者にとって極めて有用な少数の中間値に過ぎない。
【００２９】
本発明の別実施例において、それは、たとえば、ＤＮＡの変質を引き起こす、又はそれに導く、潜在的に有用な物質のスクリーニングに利用することができる。本発明は、たとえば、ここに記載される、薬剤及び抗体のスクリーニングに有用である。疾患は、時として、細胞内において核酸分子を変質させる様々な要因によって引き起こされる。リガンド相互作用によって、間接的又は直接的な遺伝子／リガンド相互作用を促進、又は妨害することができる。生理学的システムのリガンド作用における重要な役割は、生体分子とエフェクタ薬剤の間の立体選択的水素結合の役割である。エフェクタ薬剤は、核酸転写反応の相互作用に対して直接的に影響を与えうる。リガンド相互作用は、２つの潜在的供与体／受容体パートナーが結合する時はいつでも、核酸分子の特定の部位に主として関与している。水分子は、おおくの場合、水素結合の媒介を補助する。これらのシステムにおいて、親水性相互作用は、疎水性相互作用と競合する。
【００３０】
核酸とタンパク質とは共に両親媒性（amphiphatic）巨大分子である。従って、両親媒性物質として作用する薬剤のようなエフェクタは、核酸とタンパク質の折りたたみを指示することができる。本発明によれば、ｄｓ−ＤＮＡ又はＲＮＡ及び多重鎖核酸−薬剤相互作用分析のみならず、ＤＮＡ−ヒストン／薬剤複合体の分析も可能である。尚、ＤＮＡを屈曲すべく結合することが可能ないくつかのタンパク質は、微小核様構造の数に顕著な影響を与えることが銘記されなければならない。高等生物の細胞において、ＤＮＡは、塩基性クロマチン繊維を含む反復ヌクレオソームアレイにおけるカチオン性ヒストンタンパク質八量体の回りに巻回された左巻きスーパーコイルとしての縮合された形状として存在する。堅いＤＮＡパッケージによって螺旋内相互作用が可能とされる。一般に、二次構造における変化は、生物の死滅と、更に、メカニズムの保護とをもたらしうる。
【００３１】
ＤＮＡ／薬剤結合は、又、薬剤治療において決定的な役割を有する。薬剤の遺伝子型相互作用によって、時に、微小核の出現が増加する。薬剤と、生体分子との間では、インタカレーション、溝への結合、塩基とのスタッキング相互作用、骨格鎖との反応、等の複数の相互作用が可能である。いくつかの薬剤は、ｄｓ−ＤＮＡに対する広範囲な干渉を引き起こす可能性があり、又、微小核形成の増大の原因となりうる。その生物的な帰結として、生物学的帰結論の具体例として、化学療法中に、細胞発生損傷と微小核形成が頻繁に観察される。いくつかの薬剤（たとえば、アドリアマイシン）は、又、染色体異常を引き起こすのに対して、他の薬剤は、微小核形成を阻止することがわかっている。
【００３２】
現在の研究によって、スーパーコイルＤＮＡと、微小核の誘導との間の関係が指摘されている。従って、新しい薬及び薬剤治療の開発において、細胞における染色体異常と微小核形成が、益々注目されていることは驚くに値しない。薬剤の効能の理解における新しい理論は、二次ＤＮＡ構造（たとえば、湾曲誘発）と、細胞の微小核の形成又は阻止に対する薬剤の影響である。これは、治療における構造-機能関係の理解にとって重要であると考えられる。いくつかの薬剤によって誘発される二本鎖の超分子アセンブリを、研究のためのモデルとして使用することができる。
【００３３】
本発明は、弛緩した（裸の（ｎａｋｅｄ）核酸）溶液環境と高度に縮合した（スーパーコイルＤＮＡ−ヒストン／薬剤複合体）溶液環境との両方におけるＤＮＡ／薬剤複合体を特徴付けを可能にする。薬剤によって誘発されるｄｓ−、及びその他の多重鎖核酸の超分子アセンブリを、本発明を介して、研究のためのモデルとして使用することができる。本発明は、ｄｓ−及びその他の多重鎖核酸分子の、縮合構造へのパッケージ化に関して多価結合剤を調べることを可能にする。
【００３４】
二本鎖ＤＮＡは、癌治療において使用される多くの薬剤にとっての分子標的である。これらの薬剤の多くは、細胞傷害性薬剤の非特異的標的であるが、特異的にＤＮＡ関連プロセスを標的化する新たな世代のＤＮＡ薬剤が現在研究されている。これらの薬剤は、より特異的であり、従って、より効果的な治療剤である。多くの抗生物質、抗がん、及び抗ウイルス薬剤は、ＤＮＡとＲＮＡとに可逆的に作用することによって、それらの生物的作用を示す。二本鎖及び多重鎖核酸は、癌、白内障、エイズ、及びその他多くの疾患のための新たな治療薬を作り出すべく開発されている薬剤開発戦略における主要な標的となっている。新しい薬剤を開発したり、あるいは、古い薬剤を改良するためには、研究者が、ＤＮＡ−薬剤、ＲＮＡ−薬剤、および／又は、核酸タンパク質／薬剤複合システムを調節する特定の分子生物学的メカニズムを理解することが重要である。薬剤−核酸複合構造、動力学的反応論、熱力学に関与するすべての因子を特徴付けなければならない。本発明は、これらの必要に対するアプローチを容易にする。「遺伝子を遮断する」ことによって、又は、ガンを抑制可能な薬剤によって標識された抗体、によってガン細胞の複製を抑制することが可能な薬剤を、本発明を使用することによって特徴付けることができる。本発明は、又、研究者が、アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ技術で有用な核酸標的化薬剤設計に関する情報を得ることも可能にする。この方法は、どこで核酸／核酸プローブ相互作用が発生しているか、その結合機序、又、ＤＮＡ結合に伴う恒久的な結合、水和変化であるか否か、その結合機序、関連する塩基対、螺旋高次構造、又、その薬剤がＤＮＡにおいて領域特異的傷害を形成するものか否か、を明らかにする。これらのマイクロアレイによって、たとえば、薬剤の特徴付けが可能となり、従って、これらは、より効果的な薬剤を将来設計するための理論的根拠を発展するのに役立つ。
【００３５】
新しい薬剤をいかにして特徴付けることができるかを示す一つのフローチャートは以下のとおりである。
【００３６】
１．  ＤＮＡ−薬剤複合体との局所的水相互作用。水中における、特定のＤＮＡ相互作用の変化を測定することは、水和作用に於ける変化を、結合の強度と特異性とに相関させるのに役立つ。
２．  薬剤−核酸解離カイネティクス
３．  薬剤−核酸温度相互作用
４．  薬剤−核酸ｐＨ相互作用
５．  薬剤−核酸イオン強度相互作用
６．  薬剤−核酸競合アッセイ
７．  薬剤−核酸複合体
８．  薬剤−核酸結合機序
９．  薬剤／核酸結合の部位（単数又は複数）
１０．薬剤／核酸結合の部位；塩基対
１１．ＵＶ照射によって別の核酸に架橋された核酸との薬剤−核酸相互作用
１２．薬剤−核酸複合体の安定化
１３．薬剤−核酸複合体に対する核酸の高次構造的影響
１４．核酸上のメチル基
１５．核酸に対する細胞傷害性薬剤の特異的機序
１６．薬剤−ＤＮＡ複合体の高次構造的及びエネルギ的結果の理解。
【００３７】
更に、本発明の前記マイクロアレイは、確立された又は新規なモノクローナル又はポリクローナル抗体を特徴付け、診断的又は治療的に有用なものを同定するのに使用することができる。治療用抗体は、遺伝子を、その転写および／又は翻訳機構と相互作用することによって、シャットダウンするために使用することができ、あるいは、それは、核酸に結合して、酵素、毒素、薬剤又は放射線を提供することができる。従って、本発明の使用は、医薬製剤としての抗体の製造に役立つことができる。治療標的に対して開発された高親和性モノクローナルおよび／又はポリクローナル抗体を、それらの核酸に対して結合する能力を分析することによって特徴付けることができる。
【００３８】
組換え抗体とそのフラグメントは、治療及び診断のための臨床試験中の全生物学的タンパク質の３０％を超える。本発明は、たとえば、特別設計された治療抗体の特徴付けに有用である。抗体は右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡと左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ配列の両方に結合可能である。特定の配列のｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ及び特定の配列のＺ−ＤＮＡに対する特異的抗体の生産は、大きな可能性を有する。治療用抗ＤＮＡ抗体を使用して悪い遺伝子を遮断することができる。Ｚ−ＤＮＡは、転写エンハンサーとして作用すると考えられており、もしも、抗Ｚ−ＤＮＡ抗体が腫瘍形成遺伝子の転写機構に結合すれば、これによってその遺伝子発現は遮断されるであろう。同様のアプローチを、抗Ｂ−ＤＮＡ抗体を使用して、Ｂ−ＤＮＡ配列に対しても採ることができる。
【００３９】
この新規なアレイシステムに使用される、ｄｓ−核酸（たとえば、ｄｓ−ＤＮＡ、ｄｓ−ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、Ｚ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ、平行型核酸）分子は、それらが低分子量のものであれ、高分子量のものであれ、ｄｓ−右巻き核酸螺旋高次構造［たとえば、ｄｓ−Ａ−ＤＮＡ、低湿度溶液、ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ、高湿度溶液、Ｃ−ＤＮＡ、Ｄ−ＤＮＡ、Ｔ−ＤＮＡ、Ａ−ＲＮＡ、ＤＮＡ-ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ（Ａ’及びＡ−形態）、又はｄｓ−左巻き[たとえば、Ｚ−ＲＮＡ又はＺ−ＤＮＡ、ＺＩ，ＺＩＩ及びＺ−‘，ＤＮＡ、Ｚ＊−ＤＮＡ（ファン・デ・サンデ，ジェイ・エイチ（van de Sande, J.H.）他, EMBO J. 1:115-120, 1982）、Ｚ（ＷＣ）−ＤＮＡ（アンセヴィン，エイ・ティ（Ansevin, A.T.）他, NAR 18:6119-6126, 1990）]核酸高次螺旋構造のいずれかである。ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ中の異なる塩基対による局所高次構造バリエーションも、同様に分析することができる。これらのｄｓ−核酸のいくつかは、化学的修飾によって、左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ、等の特定の螺旋高次構造へと恒久的に安定化され、ブロム化（Ｂｒ）、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−アセチル−２−アミノフルオレン（N-acetoxy-N-acetyl-2-aminofluorence:ＡＡＦ）、又はクロロジエチレントリアミノ白金（ＩＩ）塩化物（chlorodiethylenetriaminoplatinum(II)chloride:dien-pt）のいずれかによって、左巻きＺ−ＤＮＡ構造へと恒久的に安定化され、その後、核酸プローブと相互作用するべく前記固体支持機能化基質表面上に固定化されて、研究者によって特徴付けられる。
【００４０】
以下に、右巻きＤＮＡを使用した本発明の実施について説明する。これはその一実施例であって、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４１】
右巻き二本鎖Ｂ−ＤＮＡを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液などの緩衝液中に核酸プローブを含む、バイオチップ反応チャンバに載置する。この緩衝液は、ヒトの生理学的範囲に近く、前記右巻きＢ−ＤＮＡ高次構造を維持する（シンデン，アール・アール（Sinden, R.R），1994, DNA Structure, and Function. pp.1-398. Academic Press, NY）。ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡマイクロ及びマクロアレイは、遺伝子フラグメント等の天然ＤＮＡ、又は、ｄｓ−ＤＮＡポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の合成ポリマー、正常遺伝子、又は、ｄｓ−発ガン遺伝子などの変異遺伝子のいずれか、から構成することができる。
【００４２】
右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ合成ポリマーの具体例は、１．ポリ（ｄＡ−ｄＴ）．ポリ（ｄＡ−ｄＴ）、２．ポリ（ｄＩ−ｄＣ）．ポリ（ｄＩ−ｄＣ），３．ポリ（ｄＧ−ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｄＣ）、４．ポリ（ｄＡ−ｄＵ）．ポリ（ｄＡ−ｄＵ）、５．ポリ（ｄＡ−ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｄＴ）、６．ポリ（ｄＧ−ｍｅ５ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｍｅ５ｄＣ）、７．ポリ（ｄＡ−ｂｒ５ｄＵ）．ポリ（ｄＡ−ｂｒ５ｄＵ）、８．ポリ（ｄＡ−ｉｏ５ｄＵ）．ポリ（ｄＡ−ｉｏ５ｄＵ）、９．ポリ（ｄＩ−ｂｒ５ｄＣ）．ポリ（ｄＩ−ｂｒ５ｄＣ）である。当業者にとってその他多くも周知であろう。
【００４３】
抗Ｂ−ＤＮＡ-２Ｃ１０モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、抗ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ（Ｂ１０３）ＭＡｂ，Ｂ１１，４２６０，２１２２及びＢ１４抗ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡポリクローナル抗体などのいくつかの抗ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ抗体が知られている。これら及びその他多くの抗体を使用して、固定化された非変性核酸を特徴付けることができる。ここでも、ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ結合タンパク質などの核酸プローブを先ず添加し、次に、抗−抗体核酸プローブを添加することができる。前記抗−抗体核酸プローブは、たとえば、ＰＡＰ、ビオチン−（ストレプト）アビジン系又は免疫蛍光法で標識化した抗体を使用して、直接的又は間接的免疫化学法によって同定することができる。
【００４４】
同様に、本発明は、左巻きＺ−ＤＮＡにも使用可能である。ＤＮＡスーパーコイル、高塩濃度、スペルミン、相対湿度、架橋、３−４Ｍ  ＮａＣｌ濃度（ハサン，アール（Hasan, R.）他，Biochem. Inter. 20:1077-1088, 1990），Ｚ−ＤＮＡ結合タンパク質、抗Ｚ−ＤＮＡ抗体（レイファー，イー・エム（Lafer, E.M.）他，EMBO J. 4:3655-3660 1985）、ポリアルギニン、等の因子、更にその他の因子によって、周知のＢ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの転移が駆動される（サンガー，ダブリュ（Sanger, W.），Ed., Principles of Nucleic Acid Structure, Chapter 12, pp. 283-297, 1984,Sanger-Verlag, NY; サンガー，ダブリュ（Sanger, W.），Ed., Principles of Nucleic Acid Structure, Chapter 12, pp. 220-241, 1984,Sanger-Verlag, NY;ディッカーソン，アール・イー（Dickerson, R.E.），Science, 216:475-485, 1982; ブラホ，ジェイ・エイ（Blaho, J.A.），Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 37:107-126, 1989; ハービュールト，エイ・ジェイ（Herbuert, A.J.），Biol. Chem. 271（20）: 11595-11598, 1996）。臭素、ＡＡＦ、又はクロロジエチレントリアミノ白金（ＩＩ）塩化物等による修飾等の化学的修飾は、Ｚ−ＤＮＡ高次構造を恒久的に安定化することができる。二核ビス（白金）複合体は、合成ポリマーにおけるＢ６Ｚ転移を誘導する（NAR 7:1697-1703）。ヒドララジンは、ポリ（ｄＧ−ｍ５ｄＣ）においてＢからＺ−ＤＮＡへの転移を引き起こす。サブミリモル濃度、即ち、生理学的範囲、のＭｎＣｌ２は、ポリ[ｄ−（Ｇ−Ｃ）]におけるＢ６からＺ−ＤＮＡへの転移を誘導する。生理学的イオン強度でのＢ−からＺ−への転移を駆動するのに必要な負の高次螺旋構造形成エネルギーは、十分に、細胞からのＤＮＡにみられるスーパーコイル形成のレベル内である。Ｚ−ＤＮＡを形成するのに必要な負のスーパーコイル構造形成のレベルは長さの関数である。一般に、Ｚ−ＤＮＡ形成配列が長いほど、Ｂ−からＺ−への転移を駆動するために必要な負のスーパーコイル構造形成は少なく、これは本発明において重要である。Ｚ−ＤＮＡは、スーパーコイルＤＮＡ中において非常に安定している。というのは、Ｚ−ＤＮＡの形成によって、ＤＮＡが効果的に解かれ、これによってスーパーコイルが弛緩するからである。Ｚ−ＤＮＡは、高エネルギ形態のＤＮＡであり、従って、Ｂ−ＤＮＡほど安定的ではない。それは、Ｂ−ＤＮＡと違って、極めて感光感度が高く、従って、それを使用する時には、使用する固相を透明にすることはできない。本発明は、いかにＺ−ＤＮＡ高次構造が、その非Ｚ−ＤＮＡ隣接部及びＢ／Ｚ−ＤＮＡ結合部に影響を及ぼすか、そして、ヌクレオソーム配置に対するＺ−ＤＮＡの影響を理解するのに役立つ。
【００４５】
ＢからＺ−ＤＮＡ高次構造のみならず、Ｚ−ＤＮＡからＢ−ＤＮＡへもどる螺旋転移も分析することができる。ポリ（ｄＡ−ｄＴ）．ポリ（ｄＡ−ｄＴ）等の、合成ｄｓ−ＤＮＡポリマーのＺ−からＢ−ＤＮＡの逆転は、ネトロプシンやジスタマイシン等の薬剤によって誘導可能であることが知られている（J. Biomol. Struc.& Byna. 13:671, 1996）。従って、対象化合物をスクリーニングして、それらが、それを妨害することによってそれを加速することで、この転移を、仲介するか否かを調べることができる。このアレイを使用して酵素的研究も行うことができる。Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの転移などの、テンプレート高次構造上のＲＮＡポリメラーゼＩＩの一般的酵素的結合特性を調べることができる（Eur. J. Biochem. 206: 49-58, 1992）。
【００４６】
左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡアレイは、この左巻きＺ−ＤＮＡ高次構造において高い割合のｄｓ−ＤＮＡを維持する、３又は４Ｍ  ＮａＣｌ溶液、０．７Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液、アルコール溶液、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ  ７.２／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／３.５ Ｍ  ＮａＣｌ）、１１０ｍＭ  ＮｉＣｌ２−５．０Ｍ  ＮａＣｌ（０．０１Ｍ  トリス−ＨＣＬ  ｐＨ．４）、又はその他のイオン溶液、中に載置される。更に、ｄｓ−Ｚ−ＤＮＡマイクロアレイを、１ｍＭ  ＬｉＣｌの溶液、ヒトの生理学的範囲に近い溶液、に投入することができる。これによって、Ｚ−ＤＮＡ高次構造において高率のｄｓ−ＤＮＡが維持される。他方、Ｂｒ−ｄｓ−Ｚ−ＤＮＡは、左巻きｄｓ−ＤＮＡ高次構造へと恒久的に安定化されるのに対して、非−Ｂｒ−ｄｓ−Ｚ−ＤＮＡは、恒久的な安定化されないので、従って、ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡからｄｓ−Ｚ−ＤＮＡへ、更にｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ螺旋高次構造へ戻るいくらかの周期的変動の余地がある。合成ＤＮＡポリマー（このタイプの固定化ＤＮＡの約１００％）と天然ｄｓ−ＤＮＡ（遺伝子におけるｄｓ−Ｚ−ＤＮＡは、総配列の約４２％から６２％を占める）は、ブロム化によってＺ−ＤＮＡへ恒久的に安定化することができる。ｄｓ−Ｚ−ＤＮＡマイクロ又はマクロアレイも、合成、非変性ポリマー、正常遺伝子又は変異遺伝子のいずれかから構成することができる。１価又は２価のカチオンを使用することによって、ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡをｄｓ−Ｚ−ＤＮＡへ変換することができる。Ｚ−ＤＮＡは、３Ｍ  ＮａＣｌでの合成ポリマーポリ（ｄＧ−ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｄＣ）において観察することができる（レイファー，イー・エム（Lafer, E.M.）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3546-3550, 1981）。高濃度の１価のカチオン（たとえば、Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｒｂ＋，Ｃｓ＋，Ｌｉ＋）は負の電荷を遮蔽し、これによって、左巻きＺ−ＤＮＡ立体配置を安定化する。負電荷を遮蔽するために、１価のカチオンよりも、低い濃度の、Ｍｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋等の２価のカチオンが必要であり、これによって、左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ高次構造を安定化する。たとえば、左巻きＺ−ＤＮＡは、ミリモル濃度、生理学的範囲、でコバルトヘキサミン塩化物によって安定化することができる。これらの分子のブロム化は極めて有用であるので、その手続きの一例をここに提供するが、これは本発明を限定するものと解釈されるものではない。Ｚ−ＤＮＡをブロム化する標準的方法は以下の通りである。その他の方法も可能であると理解される。
【００４７】
１．１００Ａ２６０ユニットのポリ（ｄＧ−ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｄＣ）を、１ｍｌの超高純度のＨ２Ｏ（氷浴）中に溶解する。実験室の照明を暗くする。超高純度の分子生物学的グレードの試薬のみを使用すべきである。
２．５０Ａ２６０ユニットを除去し、５Ｍ  ＮａＣｌを３．８Ｍの最終濃度まで添加する。この時点における容量は、後の処理の便宜のために約４ｍｌとすべきである。Ｂ−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡ高次構造への完全な変換のために、暗中で１０分間、６００℃にまで加熱する。
３．０．１ｍｌのＢｒ２飽和水溶液（飽和を確実にするために十分に振とうする：５〜１０分）を、超純度水で２ｍｌに希釈する（最終濃度、１１ｍＭ）。臭素でのすべての処理は、照明を非常に低くして、ドラフトチャンバー中に行われるべきである。
４．前記ＤＮＡ溶液に１／１１容量の０．２２Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）を添加する（前記ｐＨは、それは塩と臭素の添加時に約６．４へと低下するので極めて重要である）。実験室における低照明が必須である。
５．１／１１容積の５％飽和臭素水を添加し、全暗中で３分間、室温でインキュベートする。直ぐに、ブロム化された分子を取り除くために、２インチの注射針を使用して、Ｚ−ＤＮＡ溶液を通して緩やかな空気流を起泡させる。
６．超純度水で３０μｌを５５０μｌに希釈し、Ａ２９５／Ａ２６０比を測定する（分光光度的に）。ＣＤスペクトルも使用可能である。
７．右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡの場合、低塩（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中におけるＡ２９５／Ａ２６０比は、約０．１２である。ｄｓ−ＤＮＡがＺ−ＤＮＡ高次構造であるためには、前記比率は少なくとも０．３（０．３３−０．３８）でなければならない。もしも比率が低すぎる場合は、工程５と６を繰り返し、インキュベーション時間を短くする。（Ａ２６０は、ブロム化で約３０％低下し、従って、Ａ２６０をＤＮＡ濃度に変換するために、それに６５μｇ／ｍｌを掛ける。時間が経つと、特に光の存在下では、左巻きＺ−ＤＮＡは徐々に脱プリン化し、Ａ２９５／Ａ２６０比は、０．６に増加する）。最後に、Ｚ−ＤＮＡを一晩（２４時間）１０ｍＭ  トリス１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して、全暗で冷蔵庫内で透析する。０．３３−０．３６の最終Ａ２９５／Ａ２６０比が好適である。
【００４８】
いかなるゲノムにおいても、ＤＮＡの０．０１％未満が左巻きＺ−ＤＮＡ高次構造である。ヒト遺伝子において、その配列の約４２％から６２％（シュロート，ジー・ピー（Schroth, G.P.）他，J. Biol. Chem. 267:11846-11855, 1992）が左巻きＺ−ＤＮＡ高次構造である。前記Ｚ−ＤＮＡマイクロ及びマクロアレイは、ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ遺伝子内における潜在的左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ配列の同定を可能にする。この方法は、抗生物質（ブレオマイシン−ニッケル（ＩＩＩ）（BBA1308:169-176 1996, Guan, L.L.）等の様々なプローブによって、Ｚ形状ＤＮＡのグアニン残基などの、塩基の特異的検査を可能にする。
【００４９】
恒久的に安定化されたｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ分子のいくつかの例は、Ｂｒ−ポリ（ｄＧ−ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｄＣ）；ＡＡＦ−ポリ（ｄＧ−ｄＣ＿・ポリ（ｄＧ−ｄＣ）；ポリ（ｄＧ−５ＢｒｄＣ）．ポリ（ｄＧ−６ＢＲＤＣ）；ポリ（ｄＧ−５−ｍｅｄＣ）．ポリ（ｄＧ−５ｍｅｄＣ）；ｄｉｅｎｔ−ポリ（ｄＧ−ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｄＣ）；ポリ（ｄＡ−ｄＣ）．ポリ（ｄＴ−ｄＧ）；ハロゲン化ポリ（ｄＩ−ｄＢＲ５Ｕ）；コバルトヘキサミン[Ｃｏ]ＮＨ３）６３＋）ポリ（ｄＧ−ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｄＣ）である。その他も公知である。
【００５０】
臭素やその他の材料を使用して、多くの異なる合成ｄｓ−Ｂ−ＤＮＡポリマーを、恒久的にではないが、左巻きＺ−ＤＮＡ高次構造に変換することができるが、これらの非ブロム化の、従って、非恒久的に安定化されたＺ−ＤＮＡは、いくらかのＺ−ＤＮＡからＢ−ＤＮＡへの周期的変動を有するかもしれないことが銘記される。最初にリストした、即ちポリ（ｄＧ−ｄＣ）．ポリ（ｄＧ−ｄＣ）は、下記のものを含む様々な溶液を使用して、Ｚ−ＤＮＡ高次構造に維持することができる。（Ｇ−Ｃ）ｎ等の交互プリン−ピリミジン配列は容易にＺ−ＤＮＡを形成する。
【００５１】
ａ．  ４Ｍ  ＣｓＣｌ
ｂ．  ４Ｍ  ＬｉＣｌ
ｃ．  ６Ｍ  ＬｉＣｌ
ｄ．  ２．５Ｍ  ＮａＣｌ中間（midpoint）高次構造変化
ｅ．  ０．７Ｍ  ＭｇＣｌ２中間（midpoint）高次構造変化
ｆ．  ４Ｍ  ＮａＣｌ（３Ｍ  ＮａＣｌ）
ｇ．  ｍＭ濃度のＭｇＣｌ２＋４５℃、その後冷却し、Ｚ−ＤＮＡに維持
ｈ．  ＬｉＣｌ＋昇温
ｉ．  ０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１０％  ＥｔＯＨ
ｊ．  ６８℃の４Ｍ  ＬｉＣｌ
ｋ．  エタノール溶液
ｌ．  メチル化
ｍ．  ４ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１０−２０％  ＥＴＯＨ
ｎ．  亜鉛
ｏ．  バイオポリマーのプロトン付加
ｐ．  新規なＺ−ＤＮＡ安定化溶液
【００５２】
第２分子はＺ−ＤＮＡを形成するが、それらの形成のために、（ＧＣ）ｎよりも大きな安定化エネルギを必要とする。たとえば１０ｍＭ  ＮｉＣｌ２＋０．２Ｍ  ＮａＣｌ等の溶液が、Ｚ−ＤＮＡ高次構造を安定化するために良い。ポリ（ｄＴ．ｄＧ）．ポリＢ−からＺ−ＤＮＡ発展溶液の場合、有用な溶液としては、４．８Ｍ  ＮａＣｌ＋２０％  ＥＴＯＨ，４０ｍＭ  Ｎｉ２＋＋４Ｍ  ＮａＣｌ，ＺｎＮ４  及び１００μｍ  Ｚｎがある。このＤＮＡ配列は困難であるが、Ｂ−からＺ−ＤＮＡへの変換は不可能ではない。
【００５３】
負のスーパーコイルＳＶ４０ゲノム（小環状ＤＮＡ）プラスミドのような分子が可能であるように、２０の左巻き螺旋部位を含む、ＰＲＷ７５１等のプラスミドは、基質表面に固定することができる。このプラスミドは、そのエンハンサー領域においてＺ−ＤＮＡ高次構造をとることが可能な複数の部位を含んでおり、基質表面に対して固定化可能である。同様に、ｐＢＲ３２２は、負荷電、スーパーコイルプラスミドであり、Ｚ−ＤＮＡを形成することが可能な、３２ｂｐと１４ｂｐとの交互ＣＧ配列のインサートを有している。プローブに関しては、Ｃ４４，Ｃ１１，Ｚ２２，Ｚ４４、ＭＡｂ，及びＧ４ｅｌ，４２５５ＩｇＧ，ヤギ＃１０  ＩｇＧ，Ｒａ４４２，Ｒａ４４３ａ，Ｒａ４４１，２１２２ポリクローナル抗体を含む、Ｚ−ＤＮＡに対する多くの抗体が知られている。Zuotin（EMBO J. 11（１０）:3787, Zhang, S.）又はゼータ−クリスタリン（J. Histochem. Cytochem. 45:1511-1521, 1997）等、種々多様なＺ−ＤＮＡ結合タンパク質が入手可能である。
【００５４】
プロモータ等の特定の遺伝子領域の正確なパラメータを知っている研究者は、本発明を利用して、遺伝子のプロモータ領域内におけるＺ−ＤＮＡの発生と統計物理的モデリングを調べることができる。更に、たとえば、リプレッサー−オペレータ相互作用内における、負のスーパーコイルのＺ−ＤＮＡ配列に対する影響を調べることもできる。又、遺伝子内におけるこの対象領域を、他の核酸結合因子とのその相互作用において特徴付けることができる。
【００５５】
三本鎖ＤＮＡの場合、前記アレイは、特定のタイプの核酸を調べるために、適当なイオン溶液とともにマイクロアレイチャンバに載置される。三重鎖ＤＮＡの一例は（ｄＡ）（ｄＴ）２であり、三重鎖ＲＮＡの一例は（ｒＡ）（ｒＵ）２である。三重鎖ＤＮＡの開発に使用可能なその他の配列は、ポリ（Ｉ）．ポリ（Ａ）．ポリ（Ｉ）（Chandrasekaran, J. Biom. Struc. & Dynamics. 17:1035-45,200）；及びポリ（Ｕ）．ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）（Chandrasekaran, 17:1023-34, 2000）、ポリ（ｄＴ）．ポリ（ｄＡ）．ポリ（ｄＴ）（Chandrasekaran, J. Biom. Struc. & Dynamics 17:1011-22, 2000）である。２’−ＯＭeを含む三重鎖形成オリゴヌクレオチドも本発明で使用可能である。分子内三重鎖ＤＮＡは、Ｍｇ２＋無しでｐＨ５等の低ｐＨで、スーパーコイルＤＮＡの単一のホモプリン．ホモピリミジン二重鎖（ｄｓ−）ＤＮＡ領域内において形成可能である。ある種の分子内三重鎖ＤＮＡ構造も、特にプロトン付加が不要な場合、Ｍｇ２＋と自然ｐＨでスーパーコイル形成したＤＮＡ内において形成可能である。具体例は、（ｄＧ）３０．（ｄＣ）３０とポリ（Ｐｕ）．ポリ（Ｐｙ）である。その他の三重鎖ＤＮＡ螺旋体は、ｄ（ＣＴ）ｎ．ｄ（ＧＡ）ｎと、ｄ（ＧＡ）ｎ．ｄ（ＣＴ）ｎである。三重鎖ＤＮＡは、原位置で、即ち、チップ上で、固体支持体上において直接合成することができ、あるいは、チップの外部で合成して、その後、機能化固体支持体上に固定することも可能である。三重鎖ＤＮＡの合成は、マクガヴァン（ＭcGavin）（J. Mol. Biol. 55:293-298; 1971）、セン（Sen）およびギルバート（Gilbert）（Nature 334:364-366; 1988）及びリー  ジェイ・エス（Lee JS）（J. Biol. Chem. 269: 7019-23; 1994; J. Biol. Chem. 269:3615-22, 1994）によって記載されているように行うことができる。前記分子は、自然ｐＨと酸性ｐＨとの両方で、８−アミノグアニンによって安定化することができる（NAR 28:4531-9, 2000）。三重鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、本発明のマイクロアレイ処理を使用して、特徴付けることができる（キヤマ，アール（Kiyama, R.），Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10450-10454, 1991）。ポリアミン、トランス[Ｐｔ（ＮＨ３）２]２＋、ベンゾ[ｅ]ピリドインドール誘導体等のその他の物質を使用して、三重鎖ＤＮＡを安定化することができる（Science 256:1681, 1992）。
【００５６】
四重鎖ＤＮＡ（四本鎖ＤＮＡ；Ｇ−カルテット（G-quartet）ＤＮＡ構造）の場合は、マイクロ又はマクロアレイは、特定タイプの固定化核酸のための反応溶液を含むマイクロアレイチャンバに投入される。四本鎖ＤＮＡを研究することによって、研究者は、テロメア：（Ｇ４Ｔ２）ｎ又は（Ｇ４Ｔ４）ｎの構造を調べることができる。分子間又は分子内四重鎖ＤＮＡ（Ｇ４又は五重鎖ＤＮＡ）が、ハン（Han）（Biochemistry 38:6981-6 1999），マラティアス（Marathias）（Biochemistry 38:4355-64, 1999）及びハーディン（Hardin）（Biochemistry 36: 15428-50, 1997）によって記載されているように合成された。四重鎖ＤＮＡも、また、基質表面上で合成することも、あるいは、基質表面から離れて合成し、その後、基質表面に固定することもできる。カリウムとナトリウムによって四重鎖ＤＮＡを安定化することができる（マラティアス，ヴィ・エム（Marathias, V.M.）NAR 28:1969-1977;2000）：ｄ（GGTTGGTGTGGTTGG）。又、五重鎖ＤＮＡに関しては、マイクロアレイは、暗所でマイクロアレイチャンバ溶液内に載置される。（チャプット，ジェイ・シー（Chaput, J.C.）Proc. Natl. Acad. Sci, USA96: 10614-10619, （1999）による核酸塩基クインテットを含むＤＮＡ五重体を、固体支持アレイ上に固定化した。セシウムイオンを使用して、この核酸の形成を誘導した。五重鎖分子は、「オン・チップ」又は「オフ・チップ」で合成することができ、その後、「核酸プローブ」又は固定化された五重鎖ＤＮＡ自身、を分析するために使用することができる。
【００５７】
ここに記載して合成核酸ポリマーとオリゴマーのすべては、超高純度分子生物学的グレードの水、又はｐＨ７.０又はそれに近い希釈緩衝液中で溶解可能である。製品の表面上でのゲル形成のために、凍結乾燥核酸ポリマーを濡らすことは時に困難であるが、可溶化が困難な場合において、ボルテックスミキサー上での攪拌などの技術を使用することが極めて有用である。デオキシグアノシン含有ポリマーは、多くの場合、それらの溶液が凍結されたとき、又は、それらが、凍結乾燥されたときに、凝集する傾向があり、溶液が必要な場合に特に困難な問題を提供する。これらの場合においては、緩やかな超音波処理が有効である。前記ポリマーは、一般に酸中において不溶性であり、実験用蒸留水は、多くの場合酸性であるので、そのｐＨを７.０まで高めてポリマーを溶解するためには、希釈水酸化ナトリウム又はアンモニア溶液をいくらか添加することが必要となるかもしれない。超高純度分子学的グレード水を使用すべきである。ポリマー溶液を５−１０分間、４０−５０℃で加熱することは有害ではない。もしも加熱が望ましくないと考えられるならば、困難なデオキシポリマーを溶解する別の方法は、懸濁液を一旦アルカリ性にして、その後、ポリマーが溶解した後に、その溶液を注意深く中和する方法である。
【００５８】
本発明の実施において、核酸ポリマーとオリゴマーは、凍結温度で保存された時に、中性凍結乾燥粉体又はファイバ、として何年間も安定していることが銘記される。凍結中性溶液は、短い期間（１−４ヶ月間）は十分安定しているが、ヌクレオチド間結合と末端のリン酸塩との漸進的な加水分解が不可避的に起こる。高い温度ではこのプロセスが加速される。従って、核酸は、２−３週間以内に合成され、載置され、使用されるべきである。
【００５９】
ここにおける前記分子の記載において、ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとは、重量ではなく、ユニットで記載される。「ユニット」は、１ｍｌ中に溶解された時に、１ｃｍのキュベット中での測定で、１．０の吸光度を有する核酸の量として定義される。ポリヌクレオチドと二重体（duplex）との紫外線吸光度は、それらがその中で保持される溶液のイオン強度と温度とによって影響される。ここに記載の測定はすべて、０．１Ｍ  塩化ナトリウム，０．２２Ｍ  リン酸塩，ｐＨ７．０中で２０℃で行われるものである。大半の核酸製品は、２６０ｎｍで測定されるユニットとして特徴付けられるが、ポリ（ｄＩ）及びポリ（ｄＧ）は、２５０ｎｍで測定され、ポリ（ｄＣ）は２７０ｎｍ、でそれぞれ測定される。
【００６０】
本発明の方法は、又は、「ホモポリマー」と称されるクラスの分子によって実施することができる。これらは、３’，５’−リン酸ジエステル結合によって結合された、単一種の２’−デオキシリボヌクレオチドから成る分子である。前記核酸ポリマーは、たとえば、純粋２’−デオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸の酵素的重合によって調製することができる。除タンパク質後、それらは、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム及び超高純度水に対して十分に透析して、すべての低分子量物質と、前記酵素反応及び核酸単離処理から生じるその他の汚染物質との除去を確実にする。最終生成物は、ｍｇ当たり１４−２０の吸光度ユニットを含む凍結乾燥ナトリウム塩である。次に、各ポリマーを、紫外線吸光光度測光法、浮遊密度測定法、及び沈降測定法によって特徴付ける。
【００６１】
いくつかのＤＮＡホモポリマー、たとえば、ポリ（ｄＡ）、は、水溶液又は塩溶液中で溶解することが困難である。もしもポリマーを加熱することが望ましくないと考えられるならば、分子を溶解させる別の方法は、懸濁液をアルカリ性にして、次に、核酸ポリマーが溶解した後で溶液を注意深く中和するという方法である。各ポリマーのＳ２０−ｗは、通常、４．０から１２．０であるが、６−９が理想的である。このタイプのポリマーの具体例は、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＩ）、ポリ（ｄＴ）及びポリ（ｄＵ）である。ユニットは、０．１ Ｍ  ＮａＣｌ， ｐＨ７．０中で、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＵ）及びポリ（ｄＴ）の場合は２６０ｎｍで、ポリ（ｄＩ）とポリ（ｄＧ）の場合は２５０ｎｍで、そしてポリ（ｄＣ）の場合は２７０ｎｍで測定される。上述したポリヌクレオチドのすべては−２０℃で保存されるのが最善である。
【００６２】
本発明において利用可能な別のクラスの分子はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。これらの核酸分子のそれぞれは、１つのＲＮＡ−ホモポリマーと１つのＤＮＡ−ホモポリマーとから成る二本鎖複合体である。それらは、これらホモポリマーを別々に、たとえば、０．２Ｍの塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸塩ｐＨ７．０中で溶解させ、次に、これら等モル量の前記二種類の溶液（適当な消散係数を使用して測定）を混合し、その後、その混合物を５分間、４５−５０℃で加熱する。アニーリング後、前記溶液を透析して、前記塩の大半を除去し、凍結乾燥して、前記複合体のナトリウム塩を得る。もしも二本鎖核酸立体配置が望ましいのであれば、凍結乾燥された生成物は、０．１Ｍ塩化ナトリウム、又は、より低い濃度の二価イオン等の塩類溶液に溶解することができる。溶解後、溶液を４５−５０℃で５分間加熱し、前記二本鎖をアニーリングし、核酸の二本鎖高次構造を確実にする。
【００６３】
このタイプの合成ポリマーの具体例は、ポリ（ｒＡ）・ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｒＵ）・（ｄＡ）、ポリ（ｒＧ）・ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｒＩ）・ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｒＣ）・ポリ（ｄＩ）、ポリ（ｒＣｍ）・ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｒＡｍ）・ポリ（ｄＴ）、そしてポリ（ｒＧｍ）・ポリ（ｄＣ）である。ユニットは、ｐＨ７．０の０．１Ｍ  ＮａＣｌ中で２６０ｎｍで測定される。これの溶液のすべては−２０℃で保存されるのが最善である。
【００６４】
本発明に利用可能な更に別のタイプの分子は、ＤＮＡ−交互コポリマーである。これらの分子において、ポリマーの各鎖は、３’，５’−リン酸ジエステル結合によって結合された、正確な交互配列の２つの相補的２’−デオキシリボヌクレオシドから成る。これらの核酸調製物は、M.leteusからのＤＮＡポリメラーゼと、純粋な２’−デオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸とを使用して合成されるが、その他の合成方法も可能であり、それらは当業者にとって周知である。合成後、核酸分子は凍結乾燥され、２６０ｎｍでの測定で、ｍｇ当たり１４−２０の吸光度ユニットを含む。
【００６５】
もしも、これらかの核酸生成物の１つの濃縮中性溶液（＜１０ユニット／ｍｌを水中で調製するのであれば、その核酸生成物は、二本鎖の立体配置で存在する。希釈溶液を水中で調製するのであれば、その生成物は、ほとんど確実に、一本鎖形態で存在する。二本鎖の立体配置の存在を確実にするために、溶液は、少なくとも０．１ Ｍ  ＮａＣｌ又はより低濃度の二価塩類を含む塩類緩衝混合物中で調製されるべきである。
【００６６】
前記核酸ポリマーのそれぞれは、紫外線吸光光度測光法、浮遊密度測定法、及び沈降係数測定法によって特徴付けることができる。すべての分光測定は、０．０２Ｍリン酸塩によってｐＨ７．０で緩衝された０．１Ｍ  ＮａＣｌ中で行うことができる。ＤＮＡ交互コポリマーの観察される分析値は、以下の通りである。即ち、各ポリマーのＳ２０、ｗは、４．０から１２．０であるが、大半のロットは６−９の範囲である。ここに記載されるその他の分子と同様、それらも−２０℃で最善保存される。
【００６７】
このタイプのポリマーの具体例は、ポリ（ｄＡ−ｄＴ）・ポリ（ｄＴ−ｄＴ）、ポリ（ｄＩ−ｄＣ）・ポリ（ｄＩ−ｄＣ）、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）・ポリ（ｄＧ−ｄＣ）、ポリ（ｄＡ−ｄＵ）・ポリ（ｄＡ−ｄＵ）、ポリ（ｄＡ−ｄＣ）・ポリ（ｄＧ−ｄＴ）、ポリ（ｄＧ−ｍｅ５ｄＣ）・ポリ（ｄＧ−ｍｅ５ｄＣ）、ポリ（ｄＡ−ｂｒ５ｄＵ）． ポリ（ｄＡ−ｂｒ５ｄＵ）、ポリ（ｄＡ−ｉｏ５ｄＵ）・ ポリ（ｄＡ−ｉｏ５ｄＵ）、及びポリ（ｄＩ−ｂｒ５ｄＣ）・ポリ（ｄＩ−ｂｒ５ｄＣ）である。ユニットは、ｐＨ７．０の０．１Ｍ  ＮａＣｌ中で２６０ｎｍで測定される。
【００６８】
本発明において有用な更に別のタイプの分子は、「ＤＮＡ−ランダムコポリマー」である。これらは、デオキシヌクレオシド三リン酸と、末端付加酵素とから調製される。各核酸ポリマーは、完全にランダムな配列に配列されるほぼ同量の２つの塩基を含む。それらの生化学的利益とは別に、これらの核酸ポリマーは、塩基特異的デオキシリボヌクレアーゼのサーチに有用であるかもしれない。
【００６９】
これらのポリマーの具体例は、ポリ（ｄＡ，ｄＣ）、ポリ（ｄＡ，ｄＴ）、ポリ（ｄＣ，ｄＧ）、ポリ（ｄＣ，ｄＴ）及びポリ（ｄＩ，ｄＴ）である。ユニットは、ｐＨ７．０の０．１Ｍ  ＮａＣｌ中で２６０ｎｍで測定される。上述したものはすべて、−２０℃で最善保存される。
【００７０】
ＤＮＡ二本鎖が考慮される次のクラスの分子を構成する。これらの核酸生成物は、２つのＤＮＡホモポリマーの二本鎖複合体である。ポリ（ｄＡ）・ポリ（ｄＴ）とポリ（ｄＩ）・ポリ（ｄＣ）は、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸塩、ｐＨ７．０中にホモポリマーを別々に溶解し、消散係数を使用して測定された等モル量の前記二種類の溶液を混合し、その混合物を、ポリ（ｄＡ）・ポリ（ｄＴ）は４０℃、ポリ（ｄＩ）・ポリ（ｄＣ）は５０℃で加熱することによって調製される。アニーリング後、溶液を透析して塩の大半を除去し、凍結乾燥して、前記複合体のナトリウム塩を得る。もしも二本鎖立体配置が望ましいのであれば、これらの核酸を、０．１Ｍ 塩化ナトリウム又はより低濃度の二価イオン等の適当な塩溶液中で溶解することが望ましい。これは、一般的な二本鎖のなかでもっとも安定性の低いポリ（ｄＩ）・ポリ（ｄＣ）の場合に特に当てはまる。核酸二本鎖生成物をアニーリングするためには、溶解後、前記溶液を上述した温度にまで加熱すべきである。ポリ（ｄＧ）・ポリ（ｄＣ）は、ｄＧとｄＣとの同等の組込みを確実にするために、リットマン，アール・エム（Litman, R.M.）[J. Mol. Biol. 61:1（1969）]の方法によって、調製される酵素的に合成された核酸である。
【００７１】
ポリ（ｄＧ）・ポリ（ｄＣ）は、凝集する傾向があるので、その条件下においては溶解が特に困難となりうる。この核酸二重体は、０．０５Ｍ  塩化ナトリウム溶液から凍結乾燥することができる。その結果、このポリマーのＡ２６０ユニット／ｍｇは、他の核酸二重体生成物の場合の１５−２０ユニット／ｍｇと比較して、８−１０の範囲である。各二本鎖ポリマーは、紫外線分光光度測光法、そして適当な場合には、浮遊密度測定法、及び沈降測定法によって特徴付けられる。ポリマーは−２０℃で保存される。
【００７２】
このクラスのポリマーの具体例は、ポリ（ｄＡ）・ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＩ）・ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）・ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＡ）．ポリ（ｄＵ）を含む。ユニットは、０．１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０中で２６０ｎｍで測定される。
【００７３】
オリゴチミジル酸は、オリゴ（ｄＴ）２からオリゴ（ｄＴ）２０の範囲の２つの完全なシリーズの分子を構成する。それらは、公知の方法によって調製され、たとえば、セファデックスＡ−２５クロマトグラフィなどによる分離後、ナトリウム塩類として単離される。これらの核酸の相同的性質は、ｎ−プロパノール／濃縮ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２：５５／１０／３５（ｖ／ｖ）中のペーパークロマトグラフィによって明らかにされる。オリゴデオキシチミジル酸、たとえば、オリゴ（ｄＴ）ｎは、すべてナトリウム塩類の形態で凍結乾燥され、２６０ｎｍでミリグラム当たり約２０吸光度ユニットを含む。
【００７４】
更に別のクラスの有用な化合物は、脱リン酸化オリゴデオキシチミジル酸を有する分子、即ち、５’−末端リン酸塩の無い分子、である。これらは、たとえば、アルカリフォスファターゼでの処理によって、５’−リン酸塩を含む対応するオリゴヌクレオチドから調製することができる。アルカリによるリン酸塩の除去後、オリゴマーは、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製することができる。更に、オリゴデオキシシチジル酸、オリゴデオキシグアニル酸、及びオリゴデオキシアデニル酸を、固定化核酸として使用することができる。このタイプのポリマーの具体例は、オリゴ（ｄＴ）３０、オリゴ（ｄＡ）２−６０、オリゴ（ｄＣ）２−６０、及びオリゴ（ｄＧ）２−６０である。
【００７５】
最後に、使用可能なその他のＤＮＡ−オリゴヌクレオチドは、デオキシジヌクレオチド、デオキシジヌクレオシド一リン酸、デオキシトリヌクレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、自己相補的オリゴマーの混合物、及び、交互塩基配列を有する非相補的オリゴマー、である。ユニットは、０．１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０中で２６０ｎｍで測定される。上述したものはすべて−２０℃で保存される。
【００７６】
ポリリボヌクレオチドは、本発明に含まれる更に別のタイプの分子である。二本鎖ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）は、適当な緩衝生理食塩溶液中に溶解された、等モル量のポリイノシン酸と、ポリシチジル酸とを組み合わせることによって調製することができる。二本鎖ポリマーの純度を確保するために、最も高純度のポリイノシン酸と、ポリシチジル酸とを使用すべきである。二本鎖ポリマーの形成は、大きな淡色効果を通じて観察することができ、その後、超遠心分離測定によって確認することができる。二本鎖ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）は、塩の不在下で、ホモポリマーに解離する傾向があるので、二本鎖立体配置を保持するために、十分なイオン強度の緩衝生理食塩溶液中で使用されるべきである。使用可能のその他のポリデオキシヌクレオチドは、ポリ（Ａ）・ポリ（Ｕ）を含む（マイケルソン（Michelson），Progress in Nucleic Acid Res. & Mol. Biol. 6:107; 1967）。他のポリリボヌクレオチドは、ランダムコポリマー、及び、ポリ（Ａ，Ｃ）、ポリ（Ａ，Ｇ），ポリ（Ａ，Ｉ）、ポリ（Ａ，Ｕ）、ポリ（Ｃ，Ｉ）、ポリ（Ｃ，Ｕ）、ポリ（Ｉ，Ｇ）、ポリ（Ｕ，Ｇ）、及びポリ（Ｕ，Ｉ）等の、一本鎖ポリヌクレオチドを含む。
【００７７】
ポリリボヌクレオチドの溶解性は、そのポリマーの浸潤容易性に依存する。ボルテックスミキサーによる攪拌が有効である。水が溶媒である時は、溶液のｐＨを考慮すべきである。というのは、ポリリボヌクレオチドは、酸条件下で不溶性であり、アルカリによって分解されるからである。これらのポリマーは、中性ｐＨで数分間、４０−５０℃への加熱によって害を受けない。二本鎖ポリヌクレオチドの無菌溶液が必要な場合は、個々のホモポリマーを無菌ろ過し、次に、上述したように混合、アニーリングすることが最善である。これによって、二本鎖ポリマーの粘稠性溶液を無菌ろ過しようと試みるときに発生する損失と問題が回避される。ポリマー濃度が低い（１ｍｇ／ｍｌ以下）の時に最善の結果が得られる。一般に、ｐＨ７．０のポリヌクレオチド溶液は、冷蔵温度で数日間、そして、冷凍温度で数ヶ月間安定である。各調製物は、タンパク質除去のために、非常に広範な、少なくとも５回のフェノール抽出、処理されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
以下の例は、本発明の方法を使用することが可能ないくつかの方法を記載するものであるが、本発明は、これらの具体的実施例に限定されるものと見なされるべきではない。
【実施例】
【００７９】
例１：
この例は、いかにして多重鎖、及び環状核酸分子をナイロン部材上に固定するかを記載するものである。ｄｓ−ＤＮＡ（及びＲＮＡ）は、ナイロン膜と、ニトロセルロースフィルタに同等に良好に結合するが、三重鎖、四重鎖、及び五重鎖ＤＮＡは、ナイロン膜に対してはるかに良好に結合する。更に、ニトロセルロースフィルタは、壊れやすく、無処理非変性核酸は、非共有的に結合する[核酸結合は７５−１１０μｇ（ｃｍ２）]。ナイロン膜との核酸結合は４７０−６１０μｇ核酸／ｃｍ２である。ニトロセルロースフィルタは、高イオン強度溶液中においてのみ核酸に結合し、これによって、たとえば、低イオン強度溶液中での右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡを調べることはできない。ナイロン膜は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中のＢ−ＤＮＡ等の低イオン強度溶液中でも、或いは、４Ｍ  ＮａＣｌ溶液中のＺ−ＤＮＡ等の高イオン強度溶液中のいずれでも核酸に結合する。従って、それらは、本発明の新規なマイクロアレイ用としてより優れた固体支持システムである。ナイロン膜は、核酸をそれらの表面に架橋し、共有結合を形成することができる。これらの結合は非常に壊れにくく、従って、核酸はそのような膜に実質的に恒久的に結合される。架橋は、ＵＶ処理および／又は乾燥を介して起こる。本発明は、非蛍光検出システムによって、高結合能力及び低バックグランドノイズを可能にする。真空、ベーキング、及びＵＶ照射処理の同時使用によって、最適な固定化、特に、ナイロン膜に対する複数の螺旋核酸の固定化、が可能となる。この固定化は、下記のプロトコルを使用して達成することができる。
【００８０】
１．すべての非変性核酸と核酸−因子複合体（たとえば、核酸タンパク質複合体）を、−２０℃で保存し、サンプル調製前に室温にまで暖めた。
・核酸−因子複合体のサンプルは、中性生理食塩水中で調製されるべきである。
・固定化の直前に、すべての核酸高次構造を、ＵＶ吸収スペクトルおよび／又は円偏光二色性スペクトルを介して特徴付けるべきである。
・約６℃／分の加熱及び冷却範囲で、２０−９０℃の範囲での固定化の前に、ＤＮＡ−薬剤複合物に関して示差走査熱量測定を行うべきである。
・すべての手続きは、クリーンな室内環境でおこなわれなければならない。
・純中性帯電又は正電荷帯電のナイロン膜を使用することができる。この膜の選択は、塩基対の螺旋高次構造数、及び分子量などの、固定される分子の特性に応じて行われなければならない。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎが特に好適な実施例である。
【００８１】
マイクロアレイスライドの調製
ａ．超高純度Ｈ２Ｏで、１５分間、５０℃で表面を濡らす。
ｂ．Ｈ２Ｏを除去：吸引
ｃ．直ちに、核酸を、それらの適当なトランスファー緩衝液に添加する、即ち、
１）二本鎖（ｄｓ−）ＤＮＡ：１０Ｘ  ＳＳＣ（Ｆｏｒｄｓ−ＤＮＡ，＜０．２μｍ孔サイズの膜が最良の保持効率を可能にする）。
２）前記ナイロン膜は、約３４０ｂｐ以下の核酸配列を支持することができる。
３）三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、及び五重鎖ＤＮＡの場合、＞０．２μｍ孔サイズを使用することができ、０．２μｍ孔が好ましい。
４）４８０ｂｐ未満の非変性、ｄｓ−及び多重鎖核酸の場合は、１０Ｘ  ＳＳＣを、２０Ｘ  ＳＳＣ核酸トランスファー緩衝液：３．０Ｍ  ＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０で置き換えるべきである。
非ブロム化（Ｂｒ−）左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡは、たとえば、４Ｍ  ＮａＣｌの溶液に入れるべきである。
６）左巻きｄｓ−Ｂｒ−Ｚ−ＤＮＡは、たとえば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液に入れるべきである。
７）右巻きｄｓ−Ｂ− ＤＮＡは、たとえば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液に入れるべきである。
８）右巻きｄｓ−Ａ−ＲＮＡは、たとえば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶液に入れるべきである。
９）左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡは、たとえば、４Ｍ  ＮａＣｌの溶液に入れるべきである。
１０）三重鎖ＤＮＡは、ｂｐ組成に応じて、低ｐＨの溶液に入れるべきである。
１１）四重鎖ＤＮＡは、長さに応じて変化する高Ｋ＋溶液の溶液に入れるべきである。
【００８２】
核酸は、ロボット又はマニュアルのアレイ装置からの確立されたプロトコルを使用して、スポッティング、即ち、マイクロアレイ表面上に直接アレイ処理されるべきである。
【００８３】
核酸は、適切に固定されるためには、真空条件下で固体支持体上に約５時間、保持される必要がある。核酸は、上述した適当な緩衝液中の２５０−４２０μｇ／ｍｌのソース・プレート濃度からアレイ処理されるべきである。浸潤したスライド上へのアレイ化によって、スポッティングされた核酸は拡散可能となる。
【００８４】
核酸固定化手順：
ａ）共有結合形成を通じて、前記ナイロン膜上に核酸を恒久的に固定するために、三つの工程が使用される。これは、順々に、或いは、より好ましくは、同時に行われる。即ち、真空、ベーキング（６５−８０℃）とＵＶレーザ光源、又は標準ＵＶ照射（２５４−２３０ ｎｍ，２−６分間、源（光源）から２２ｃｍ離間）。総露光は、湿ったナイロン膜の場合、１２０ｍＪ／ｃｍ２でなければならない。ＵＶレーザ光が好ましい。
ｂ）ナイロン膜は、それらを核酸プローブ（たとえば、ｄｓ−ＤＮＡ結合タンパク質）と使用する前に、室温で真空状態、等の環境制御チャンバ内で乾燥することもできる。真空乾燥機中での乾燥は、たとえば、８０℃で２時間、行うことができる。
ｃ）前記ベーキング及びＵＶ照射工程は、別々に行うことも可能である。
ｄ）マイクロ波照射を、それ自身で、又は、上述した固定化工程と組み合わせて、たとえば、７５０−９００Ｗで、２−４分間使用することができる。
【００８５】
・核酸は、４００μｍスポットに分配されるべきである。
・「原位置」合成よりもマイクロ堆積のほうが好ましい。
・核酸濃度は、約１００ｎｇ／μｌ（１−ｎｌ堆積の場合の１００ｐｇ／スポットに対応）とするべきである。各スポット当たりの堆積容量は、１０ｐＬから１０ｎＬの範囲とすることができる。
・データの信頼性をより高いものとするために、すべてのサンプルは、３回スポッティングされるべきである。
・種々のｄｓ−および／又は多重鎖核酸の堆積の前に、ブロッキング溶液を使用することができる。具体例は、デンハルト試薬−１Ｘ（０．２％，フィコール，０．２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン）である。前記スライドを乾燥し、それらを塵埃の無い環境で保存する（−２００℃）。
【００８６】
固定化後、核酸を、標識化プローブと接触させる。
【００８７】
そのようなプローブの具体例は、タンパク質、抗体、又は、後述するその他のプローブである。これらプローブの標識化には様々な方法を使用することができる。タンパク質の場合は、ギーセン，エイ・ダブリュ（Giesen, A.W.），2002, Journal of Bimolecular NMR. 22（1）:ページ21-62を参照、蛍光ホスホイノシチド誘導体等の薬剤を使用することができる[トゥオマイン，イー・ケイ（Tuomine, E.K.）1992, European Journal of Biochemistry, 263（1）：85-92]。核酸プローブは、直接的又は間接的に標識化することができる。
【００８８】
１．マイクロアレイスポッタを使用して前記プローブを堆積させることができる。たとえば、適当な量の核酸プローブをピペットし、次に、混合物を４℃で暗中で、５から１２時間、又は一晩インキュベートすることができる。
２．次に溶液を吸引し、アレイを、たとえば、三回、ＰＢＳ−ＢＳＡ−ツイーン溶液で、３分間室温で洗浄することができる。
３．もしも必要又は望ましいのであれば、マイクロアレイスライド上で残りの部位を、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液によって室温で１時間、ブロックすることができる。
【００８９】
追加の洗浄後、使用されるプロトコルは、使用されるプローブに応じて異なる。たとえば、もしも、アルカリフォスファターゼ抱合抗体が使用されるならば、１／５０からのＰＢＳ−ＢＳＡ中の抗体の二倍希釈液を調製し、別々のウェルに反復して２００μｌの各希釈液を添加する。これらを室温で２時間インキュベートし、その後、三回洗浄する。次に、ＰＢＳ−ツイーン中のアルカリフォスファターゼ結合抗免疫グロブリンの１／５００希釈液を調製し、各ウェルにこれを２００μｌ添加する。これを室温で２時間インキュベートし、その後、三回洗浄する。次に、各ウェルに２００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸溶液を添加し、室温で３０分間インキュベートする。その後、５０μｌの３Ｍ  水酸化ナトリウムを各スポット（４００ミクロン）に添加し、混合し、４００ｎｍでの各ウェルの吸光率を分光光度計、マイクロエライザ（microelisa）リーダ、又はマイクロアレイスキャナで読み取る。
【００９０】
キラル金属ＤＮＡプローブの場合は、３μＭ  Ｃｏ（ＤＩＰ）３３＋と共に約５０μＭ  ＤＮＡ−ヌクレオチドを使用する。比率は、様々であるかもしれないが、それでも反応は効率的である。典型的には、２０μｌ溶液を３１５ｎｍで９０秒間照射する。最適条件を決定するために、ラセミＣｏ（ＤＩＰ）３３＋を使用することができる。ニッキング反応は、対掌体のそれに直接匹敵するものとなる。
【００９１】
水性媒体中での溶解度は低いので、最終Ｃｏ（ＤＩＰ）３３＋濃度は、緩衝液中で１０μＭを超えるべきではない。
【００９２】
２０ｍＭ  トリス−アセテート，１８ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２等の緩衝液を使用することができる。この緩衝液（カチオンとアニオンとの両方、即ちＥＤＴＡ）のイオン強度は、Ｃｏ（ＤＩＰ）３３＋のＤＮＡに対する結合に影響するので、十分に低いものとすべきである。ｐＨは、ニッキング反応に影響する。
【００９３】
使用されるレーザに関しては、３２５ｎｍのＨｅ／Ｃｄレーザ、又は、Ｈｇ／Ｘｅランプ（１０００Ｗ，３１５±１０ｎｍ）が好適な例である。これらの両方の最終出力は、９ｎＷ以上であり、９０秒間の照射によって約５０％のニッキングが得られる。
【００９４】
もしもＤＮＡ結合タンパク質が使用されるならば、ここに参考文献として合体させるギャグナ（Gagna）他, 64:379-391（2001）の方法を使用することができる。
【００９５】
結合の検出は、たとえば、発色、蛍光、放射線標識、または、化学発光によって行うことができる[カー，エム・エイ（Kerr, M.A.）およびソープ，アール（Thorpe R.）（Ed.）Immunochemistry: Lab Fax. BIOS Scientific Publishers, Academic Press, pp. 1-256]。直接的又は間接的検出法の両方を使用することができる。放射線標識化抗体と同様、酵素結合抗体を使用することができる。
【００９６】
結合の測定は、たとえば、マイクロアレイスキャナ、及びマイクロアレイデータ管理プログラムを使用して行われる。当業者にとって、これらの分野の様々なオプションを周知であり、使用される標識化システムのタイプに応じて、適当なものを選択するであろう。
【００９７】
例２：
ガラス又はプラスチックスライドをサンディング（sanding）することによって、これらのスライドは高核酸結合能力の３次元固体支持表面となる。これらの表面は、ポリ−Ｌ−リジンなどの物質を予めコーティングすることによっても機能化することができ、或いは、プラスチック製マイクロアレイスライドの場合には、ＵＶ照射することも可能である。
【００９８】
これらのスライドは、予め、たとえば９５％分子生物学グレードのエタノールによって洗浄されなければならず、すべての手順は、層流フード下でグローブを着用して行われなければならない。
【００９９】
前記表面は、好ましくはサンドペーパによって、スクレーピング（scraped）又はサンディングされる。
【０１００】
前記サンディングは、目の粗いものでの処理の前に、非常に細かい材料からはじめて、複数の段階で行われる。余剰のガラスとサンドペーパの残滓は除去され、表面は、暖かいＰＢＳ緩衝液で２０回洗浄される。ガラスが使用される場合は、材料を酸性溶液中で１３時間洗浄し、流れるｄｄ−ｄＨ２Ｏ中で一晩濯ぎを行うべきである。
【０１０１】
プラスチック製スライドは、「酸洗浄」される必要はない。
【０１０２】
例３：
この実施例において、表面は、紫外線光を使用して機能化される。固定化分子の螺旋高次構造を変化させる可能性のあるコーティング剤としてポリ−Ｌ−リジンなどのＤＮＡ−タンパク質結合物の使用を避けるために、紫外線レーザ光を使用して、ｄｓ−及び多重鎖核酸を固定するために、ポリスチレンプラスチック製マイクロアレイシステムを開発した。すべての手順は、クリーンな室内環境で行われなければならない。ポリスチレンプラスチック製スライドをモデルとして使用して、これらを穏和な界面活性剤中で洗浄し、超高純度分子生物学的グレードのＨ２Ｏで一晩濯いだ。プラスチックスライドを室温で乾燥し、将来の認識のために標識化した。つぎに、それらに殺菌灯等のＵＶ光源で、１２０μＷ、１ｍで照射を行う。前記距離は約７０ｃｍであるべきである。ＵＶ照射は、一晩又は約１５時間継続すべきである。これによって、マイクロアレイ表面は機能化され、対象分子との処理に使用可能となる。
【０１０３】
前記機能化表面上への分子の固定化は、約２．５時間（ｄｓ−ＤＮＡの場合）、及び約３−４時間（その他の多重鎖分子の場合）かかる。
【０１０４】
前記スライドは、たとえばＴＢＳによって５回、一回の洗浄３分間、低照明環境で洗浄されなければならない。
【０１０５】
たとえば、固定化された核酸および／又はＵＶ照射無しから構成される対照スライドを調製することができる。ＵＶ光処理されたマイクロアレイスライドは、もしも４℃で保存される場合には、７−１０日間、或いは、Ｂ−ＤＮＡの場合は、スライド・ボックス及び真空封止状態で４℃では１０−２０日間、或いは、Ｚ−ＤＮＡの場合は暗中、４℃で６−９日間、或いは、４℃で常時点灯状態では４−６日間、ｓｓ−ＤＮＡ及びｄｓ−Ｂ−ＤＮＡを保持するであろう。
【０１０６】
Ｂ−ＤＮＡとＺ−ＤＮＡとの両方の反応性は、−２０℃では数週間、真空封止で無光の場合にはそれ以上に維持される。
【０１０７】
ＵＶ光は、抗−ｓｓ−ＤＮＡ  Ａｂｓによってテストされたように、ｄｓ−ＤＮＡをｓｓ−ＤＮＡに変性しない。
【０１０８】
この方法は、スライド調製のために好適である。というのは、ポリ−Ｌ−リジンの使用は極めて困難かつ、手間がかかり、又、もしも適切に行われなかった場合には、不利な結果をもたらすからである。空気分子の存在下におけるポリスチレンのＵＶ前処理は、開環酸化と、更に、化学反応性のムコン酸ジアルデヒド（muconic aldehyde）構造の形成と関連していると考えられている（Rabek, 1985 in Singlet 02. Vol. 14 Polymers & Biomolecules, ed. AA Frimer CRC Press. Boca Raton, Fl.pp.16）。もしも該技術が例２の前記新規なサンディング表面技術に使用されるならば、前記３次元表面によって、更に効果的な固定化が可能となる。
【０１０９】
例４：
上述したこの新規な非変性マイクロアレイは、無傷の非変性核酸を、前記マイクロアレイの機能化表面に固定する。従って、対象の核酸は、それは、たとえば、プライマーＤＮＡ配列によって、又は、ＥｘｏＩＩＩエクソヌクレアーゼ消化によって形成可能な、単数又は複数の一本鎖アームによって固定されているので、「浮遊状態」となっている。ｓｓ−ＤＮＡテイルへのその他様々な固定機構に加えて、種々多様な機能化マイクロアレイ表面を使用することができる。以下は、様々な機能化表面固体支持体と、一本鎖修飾ＤＮＡテイルに付着した特定の固定化エレメントとの非限定的リストである。即ち、ビオチン標識化ＤＮＡ／ストレプトアビジン機能化表面、チオリン酸化−ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リジン機能化表面、カルボキシル化−ＤＮＡ／アミノ化機能化表面、リン酸化−ＤＮＡ／アミノ化機能化表面、アミノ化−ＤＮＡ／イソチオシアネート機能化表面、アミノ化−ＤＮＡ／アルデヒド機能化表面、アミノ化−ＤＮＡ／エポキシド機能化表面、アミノ化−ＤＮＡ／カルボン酸機能化表面、アミノ化−ＤＮＡ／リン酸化機能化支持体、チオ修飾ＤＮＡ／３−メルカプトプロピル−シラン機能化表面、ジスルフィド修飾ＤＮＡ／メルカプトシラン機能化表面、ジスルフィド−修飾−ＤＮＡ／アミノシラン機能化表面（ヘテロ二官能性クロスリンカーを介した）、チオール−修飾ＤＮＡ／アミノシラン機能化表面（ヘテロ二官能性クロスリンカーを介した）、及び５’−末端アクリルアミド修飾ＤＮＡ／アクリルアミドモノマー機能化表面。非限定的に、ｄｓ−ＤＮＡ（ＲＮＡ）、三重鎖−ＤＮＡ、四重鎖−ＤＮＡ、五重鎖−ＤＮＡ、四重鎖−ＤＮＡ及び共有結合性閉環状ｄｓ−ＤＮＡプラスミドを含む、種々のタイプの核酸分子を固定するために、少なくとも１４種類の方法を使用することができる。従って、少なくとも１４種類の標準固定化手順を使用して、少なくとも種々の螺旋形態の核酸分子を固定することができる。活性化されたガラス表面に修飾核酸を付着させることによって、研究者は、核酸／プローブ相互作用を特徴付けることが可能となる。
【０１１０】
すべての固定化核酸は、それらがマイクロアレイの機能化ガラス表面に固定化可能とされるために１つ（又は複数）のテイルを有していなければならない。もしも、前記テイルを調製するためにＥｘｏＩＩＩ等の制限エンドヌクレアーゼを使用するのであれば、その場合、核酸分子は、消化から保護された無傷の非変性核酸の対生末端（opposite end）を有したものでなければならない。従って、この対生末端は、たとえば、ｄｓ−ＤＮＡの場合、３’末端に、アルファ−ホスホロチオネートｄＮＴＰ類を使用して、キャッピングされる。三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、及び五重鎖ＤＮＡは、それらの端部が、それぞれ、３，４及び５アルファ−ホスホロチオネートｄＮＴＰ類によって覆われるべきである。
【０１１１】
固定化核酸分子の特定タイプ、その塩基対組成、その長さおよび／又は分子量、他の物質とのその相互作用、及びその螺旋高次構造、に応じて、研究者は、固着における、温度、湿度及びその他の要因を考慮しなければならない。
【０１１２】
ｄｓ−核酸が使用される場合は、１つのテイル５’末端、たとえば、２つのテイル（一方のＤＮＡ鎖の５’末端と他方のＤＮＡ鎖の３’末端、ＤＮＡ分子のすべて同じ末端、３つのテイル１つのＤＮＡ鎖の５’末端と３’末端、ＤＮＡの１つの末端での、および、他の鎖の５’末端、ｄｓ−ＤＮＡの他方の末端での、によってマイクロアレイスライドの機能化表面に固定することができ、又は、ｄｓ−ＤＮＡの４つ全てのＤＮＡ修飾末端のテイルを、同時に固体支持システムに固定することもできる。ここで、最後に述べた２つの固定化手順の場合、ｄｓ−ＤＮＡは、逆転Ｕ形状を形成する。たとえば、ｄｓ−ＤＮＡの同じ側で、一方の鎖の５’末端と他方の鎖の３’末端をアミノ化することができる。アミノ化されたＤＮＡの５’末端及び３’末端リン酸基は、アルデヒド基によって正に荷電された前記機能化固体支持体の４００μｍスポット領域内で共有結合を形成する。これによって、ｄｓ−ＤＮＡ分子は、選択された溶液内で、その二重の固着部を介して、浮遊することが可能となる。これにより、研究者は、溶液を代えて、および／又は、核酸因子を添加して、および／又は、競合結合アッセイを使用して核酸結合プローブの種々の結合特性を特徴付けることが出来る。従って、ｄｓ−ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを使用して、２つが浮遊型の直線状ｄｓ−ＤＮＡであり、２つが浮遊型の上下逆転Ｕ形状ｄｓ−ＤＮＡである、四つの異なる方法により、核酸を固定することができる。
【０１１３】
ｄｓ−ＤＮＡについて上述したものと同じ原理が、多重鎖分子にも適用される。１つの三重鎖ＤＮＡ鎖の１つ、２つ又は３つの末端を、機能化表面への固定化のために修飾することができる。更に、螺旋の他端部からの１つ、２つ又は３つの鎖を、様々な組み合わせで使用することができ。これらの種々の組み合わせによって、三重鎖ＤＮＡの１つの端部のみにおいて固定された３つの「浮遊型」直線状ＤＮＡと、核酸分子が両端部において固定された、９つの「浮遊型」上下逆転Ｕ形状三重鎖ＤＮＡとが得られる。
【０１１４】
同様に、四重鎖ＤＮＡの場合、１つの四重鎖ＤＮＡ鎖の１つ、２つ、３つ又は４つの末端を、機能化固体支持マイクロアレイ表面への固着のために修飾することができる。更に、四重鎖ＤＮＡ鎖の１つ、２つ、３つ、又は、４つの鎖を様々な組み合わせで使用して、２５種類以上の固定化組み合わせとすることができる。これらの種々の組み合わせによって、４つの「浮遊型」直線状四重鎖ＤＮＡ（すべて四重鎖ＤＮＡの１端部で結合）と、１６の「浮遊型」上下逆転Ｕ形状四重鎖ＤＮＡ（分子の両端部で結合）とが得られる。
【０１１５】
五重鎖ＤＮＡに関しては、１つの五重鎖ＤＮＡ鎖の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの末端を、すべてこの分子の１つの端部で機能化固体支持体表面への固着のために修飾することができる。更に、五重鎖ＤＮＡの他端部からの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの鎖を、様々な組み合わせで使用してこの他端部に固定することができる。これらの種々の組み合わせによって、５つの「浮遊型」直線状五重鎖ＤＮＡと、２５の「浮遊型」上下逆転Ｕ形状五重鎖ＤＮＡとが得られる。
【０１１６】
例５：
この例は、機能化ガラス支持体への、核酸分子を含む非変性分子の固定化を記載する。機能化固体支持表面は、上述したように調製される。たとえば、アミノ化ｄｓ−又は多重鎖での、アルデヒドによって機能化されたガラス固体支持体への固定化が、好ましく、これによって、種々のタイプの核酸分子との共有結合が形成される。
【０１１７】
更に、この方法は、いかなるカップリング剤も必要としない。
【０１１８】
アビジン又はストレプトアビジン機能化表面を有するビオチン標識化ＤＮＡ、表面を機能化するためにポリ−Ｌ−リジンが使用されるチオリン酸ＤＮＡ、及び上述したその他の材料、を含めて、非変性核酸を固定するために他の修飾ＤＮＡテイルも使用することができる。
【０１１９】
非変性核酸は、０．２ｍｍ径のピンツール（pin tool）等の、標準方法を使用して、マイクロアレイスライドの機能化固体支持体上に載置される。隣接するスポット間の距離は、６００μｍとすべきである。この新規なマイクロアレイシステムでスポット当たりに堆積される用量は、５０から５００ｐＬであるが、１．０ｐＬから１０ｐＬが実用的である。スポットの直径は、１００μｍから１，０００μｍとすることができる。本発明のマイクロアレイによって形成されるスポットの数は、２００から５０，０００であるが、アレイ当たり１００，０００スポットが実用的である。堆積用ピンが無傷の非変性核酸に対してダメージを与えない限り、接触式と非接触式の両方のマイクロアレイ機器を使用することができる。すべての堆積された核酸がダメージを受けないように、適切な制御を使用すべきである。
【０１２０】
固体支持表面上に固定されるべく選択される前記非変性核酸分子は、たとえば、ｄｓ−ＤＮＡ（ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）、右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡ、左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ、左巻きＢｒ−ｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ（恒久的に安定化）、三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、五重鎖ＤＮＡ、共有結合性閉環状二本鎖ＤＮＡプラスミド、核酸−核酸プローブ複合体、及び一本鎖ＤＮＡ、その他、を含むものとすることができる。
【０１２１】
核酸の適切な非変性螺旋高次構造の維持のために適当な緩衝液を選択する。たとえば、右巻きｄｓ−Ｂ−ＤＮＡには、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用し、左巻きｄｓ−Ｚ−ＤＮＡには４Ｍ  ＮａＣｌを使用する。アレイ化されたスライドは、固定化核酸分子のタイプに応じて、それらが、約１時間から４時間、適当な緩衝液に曝露されるまでは、実験のために使用されるべきではない。Ｂｒ−ｄｓ−Ｚ−ＤＮＡ等の、特定の螺旋高次構造に恒久的に安定化された核酸の場合、それらは、３Ｘ標準クエン酸−生理食塩水（ＳＳＣ）中で０．６μｇ／ｍｌの濃度で懸濁させることができる。核酸は、適当な緩衝液中で２５０−４２０μｇ／ｍｌのソースプレート濃度からアレイ処理されるべきである。分与される非変性核酸の容量は、１ｎｌであるべきである。湿度は核酸の螺旋高次構造に影響を与えるので湿度制御は非常に重要である。研究者は、対象となる特定の非変性核酸に対して適当な湿度（％）を選択しなければならない。たとえば、ｄｓ−ＰＣＲ核酸は、２２℃、４５％の相対湿度でスライド上にスポッティングできる。もしも必要であれば、固定化核酸のタイプに応じて、マイクロアレイ上の残存結合部位を、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液によって室温で１時間、ブロックする。この後、ＰＢＳ−ＢＳＡ−ツイーンを２回交換して３分間の洗浄を行う。
【０１２２】
すべての核酸プローブは、ＤＮＡを固定するために、一本鎖ＤＮＡのテイルが追加されたものでなければならない。複数のテイルは、固定化された核酸、特に、三重鎖、四重鎖、及び五重鎖ＤＮＡ、をより強固に保持するので、多重鎖分子には好適である。
【０１２３】
このマイクロアレイの保存は、先ず、空気乾燥し、暗所で２５℃で保存することによって行うことができる。空気乾燥は、過剰な湿分を除去するために窒素スチームを使用することによって置き換えることができる。核酸プローブ（たとえば、薬剤）の特徴付けは、ほかで記載されていのように行うことができる。コントロールは、機能化表面からの非変性核酸の省略を含むことができる。染色処理中に、追加のコントロールを使用することができる（たとえば、ビオチン−アビジン抗体検出。一次抗体を省略）。
【０１２４】
例６：
アレイに使用される核酸は、それを行うためのいかなる標準方法によっても得ることができる。遺伝子、又は遺伝子フラグメント等の天然の核酸は、たとえば、フェノール−クロロホルム抽出等によって容易に得ることができ、その後、標準分子生物学的方法によって精製することができる。合成ポリマーは、市販のものを購入することができ、合成、クローニング、又はｓｓ−プライマーによって修飾することができる。一本鎖ＤＮＡのプライマーは、ｄｓ−ＤＮＡ又は多重鎖核酸の５’又は３’末端に固着させることができる。別の方法は、市販されているＥｘｏＩＩＩエクソヌクレアーゼ消化システム（ヘニコフ，エス（Henikoff, S.）Gene 28:351）を使用することである。対象の核酸は、その両端部に、２５−３０の追加の塩基対等のいくつかの塩基対が追加されたものであるべきである。これは、当業者に知られている種々のいかなる方法によっても容易に行うことができる。これらの追加された核酸対は、たとえば、ＥｘｏＩＩＩ塩基消化によるテイルの発達と、アルファ−ホスホロチオネートｄＮＴＰ類の追加とを可能にする。塩基は、ｓｓ−ＤＮＡテイルを必要な長さにするために、「噛み切る（chewed off）」ことができる。テイルのための塩基除去の程度は当業者によって決定される。エクソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）消化を使用して、５’突出又は平滑末端制限部位からＤＮＡを特異的に除去する。ＥｘｏＩＩＩがその機能を果たすことができるように、「粘着末端」を作り出すために特定の制限エンドヌクレアーゼを選択することができる。隣接する配列化プライマー結合部位は、４−塩基３’−突出（overhang）制限部位、又は、アルファ−ホスホロチオネート充填末端（filled end）によってＥｘｏＩＩＩ消化から保護される。一定（均一）速度の消化によって、５’突出又は平滑末端制限部位からの所定の長さの除去を、反応から時限的にアリコットを除去することによって可能にする。塩基は、対象の核酸配列と無関係に、いかなる所望の長さにも、ｄｓ−ＤＮＡの３’側から５’側へ「噛み切る（chewed off）」ことができる。その後、ｓｓ−ＤＮＡテイルを、機能化固体支持表面への固定化のために、上述したように修飾することができる。
【０１２５】
例７：
この例では、プラスミドなどの環状ＤＮＡを固定するための方法について記載する。遺伝子又は遺伝子フラグメントインサートを含む、又は含まないかもしれない共有結合性閉環状ｄｓ−ＤＮＡプラスミド、或いは、二本鎖ＤＮＡプラスミドの中間に、挿入された三重鎖ＤＮＡ、四重鎖ＤＮＡ、又は五重鎖ＤＮＡ配列を有する、ｄｓ−ＤＮＡプラスミド、を強固に固定するための方法が開発された。上述した核酸分子のいずれも、ＵＶ架橋化タンパク質などの、特定の因子が共有結合されたものとして、その後、固体支持体に固定することが可能である。これによって、それが肯定的なものであれ否定的なものであれ、ＤＮＡスーパーコイル形成の影響と、又、多重鎖核酸分子の、薬剤、化学物質、タンパク質、酵素、及びキラル金属分子プローブなどの、核酸因子との相互作用を調べることが可能である。
【０１２６】
ＤＮＡスーパーコイル形成は、真核細胞遺伝子発現を調節する強力なイン・ヴィヴォ機構であると認識されている。
【０１２７】
この技術は、各片が５’及び３’末端においてたとえばアミノ化によって標識化された、５’リン酸化５９ｍｅｒフラグメント化５９ｍｅｒ等の非常に短いｓｓ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ファージの複製開始点、１８ｂｐオリゴプリン−オリゴピリミジンなどのｄｓ−ＤＮＡプラスミドの非常に小さな部分に固着させ、その後、非共有結合性三重鎖ＤＮＡ螺旋高次構造を形成するものを含む。この固着は、プラスミドの非転写領域に対して起こる。ｐＧＬ３，ｐＥＧＦＰＣ１及びｐＧＡ２等のすべてのｐＵＣファミリのプラスミドを使用することができる。５’−リン酸化オリゴは、ｄｓ−標的ＤＮＡ周りに巻きつく。このオリゴヌクレオチドは、ビオチン、カルボキシル化、アミノ化、ジスルフィド−修飾又はアクリルアミド修飾等によって標識化される。これらのＤＮＡ修飾は、上述した５９ｍｅｒ  ５’−リン酸化オリゴヌクレオチド固着端部の両方で行われ、その後、分子を固体支持体の機能化表面に固着する。この方法は、大きなプラスミドを固定し、競合結合アッセイを使用した新規な薬剤の特徴付けを可能にする。
【０１２８】
次の工程は、ＴＧ−を強力に安定化するがＡＧ−含有トリプレットは安定化しない多環式化合物ＢｅＰＩ、および／又はＢＢＱおよび／又は天然三重鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む三重鎖ＤＮＡ安定化剤の添加である。これらのリガンドは、新たに形成された三重鎖ＤＮＡ高次構造を安定化する。安定化三重鎖ＤＮＡの形成は非共有結合的である。次に、ソラレンを添加するが、これは、ＵＶレーザ処理時に前記三重鎖ＤＮＡを共有結合的な架橋化する。
【０１２９】
５’−リン酸化の場合、３７６ｐｍｏｌの前記５９ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、５５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼの溶液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，２６℃，ｐＨ７．９）に投入した。これに、１０Ｕ  Ｔ４ＰＮＫを９５分間で３７℃で添加した。ｄｓ−ＤＮＡプラスミドと前記５９ｍｅｒオリゴヌクレオチドとの間の結合を作り出すために、４００ｎＭのオリゴヌクレオチドを、前記プラスミドと、２００ｎＭ（１０μｌ中４．３μｇ）と、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中の１０−１５μＭ  ＢＱＱ（又は、その他の三重体安定化剤）を含む緩衝液中で混合した。この溶液を、７７ＥＣ（５分間）までゆっくりと加熱し、３７ＥＣまでゆっくりと冷却した。次に、ソラレンを添加し[Ussery DW, Sinden RR. 1993. Biochemistry 32（24）:6206-13]、クイックフラッシュＵＶ露光を行った[VedaldiD, Piazza G etc., 1997. Farmaco 52（11）:645-52]。
【０１３０】
例８：
上記諸例は、本発明によって核酸分子を固定する方法を記載したものである。以下は、抗体等のタンパク質を固体支持体に対して固定するためのプロトコルの例である。この方法は、全てのタイプの抗体、更に、ゼータクリスタリンなどのＤＮＡ結合タンパク質を含む他のタイプのタンパク質に適用可能である。
【０１３１】
種々のサンドペーパを使用して、上述したようにプラスチック支持体をサンディングして三次元表面を形成する。この後、表面を、これも上述したように紫外線照射によって処理して表面を活性化する。
【０１３２】
次に、前記表面にタンパク質を添加する。抗体の場合は、その濃度は、たとえば、ポリクローナル抗体の場合には、約１０−約１００マイクログラム／ｍｌ、そして、モノクローナル抗体の場合には約１−１０マイクログラム／ｍｌ等のように変化する。但し、これらの範囲は勿論拡大することが可能である。核酸結合タンパク質等のタンパク質の場合には、濃度は変化可能であるが、好適濃度は約５０マイクログラム／ｍｌである。
【０１３３】
前記タンパク質溶液を、たとえば、５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５及び５０ｍＭ  ＮａＣｌ等を含む免疫化学的緩衝液等の、適当な緩衝液で希釈する。このタンパク質溶液を、暗中で、固体支持体にマイクロピペッティングし、真空乾燥機中に載置して、溶液が蒸発するまで緩やかに加熱する。
【０１３４】
或いは、前記真空乾燥機での加熱と同時に、上述したように固体支持体を紫外線放射で照射することができる。第３実施例において、前記溶液は室温で蒸発させることができる。
【０１３５】
使用されるプロトコルの如何に拘わらず、言うまでも無く、適切な実験の実行によって、塵埃の無い部屋がタンパク質を固定するために使用することが理解される。
【０１３６】
固定化後、固体支持体は、０．０５％ｗ／ｖツイーン２０を含むＰＢＳ−ＢＳＡを使用して、又は、室温でその他の緩やかな緩衝液を使用して、三回洗浄され、その後、暗所で保存される。
【０１３７】
以上の開示によって、特に、多重鎖核酸分子等の分子を固体支持体に固定するための方法を含む、本発明の様々な特徴を記載した。ここでの使用において「多重鎖」とは、二本以上の鎖から成る任意の核酸分子を指す。好ましくは、前記分子は、２−１０の鎖、より好ましくは、それらは、２，３，４，５又は６本の鎖から成る。少なくとも１つの鎖が単数又は複数のその他の鎖よりも短い分子も多重鎖核酸分子の一部を構成する。「核酸分子」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、更に、ｐＤＮＡ等のより複雑な構造物、更に、核酸分子とその他の非核酸分子の他の複合体、を指しうる。これらの核酸分子は、直線状、又は、少なくとも部分的にスーパーコイル形成されたプラスミド等の、環状のものとすることができる。
【０１３８】
前記多重鎖核酸分子は、様々な方法で固体相に固定することができる。所謂「浮遊型」構造を形成する、一実施例において、核酸分子は、少なくとも１つの鎖の一部を、一方又は両方の端部で修飾することによって固定される。一般に、これには、前記分子の少なくとも一部が「一本鎖」形状、即ち、分子の多くのヌクレオチドが、他に対してハイブリダイズされていない形状であることが必要である。そのような構造は、多重鎖分子の単数又は複数の鎖の一部を、実質的に「噛みとり」、１つの鎖の長い１つの鎖部分を作り出すエクソヌクレアーゼなどの酵素の使用、たとえば、ＤＮＡリガーゼ又はその他の手段によるプライマーの付着、ＰＣＲによる伸長、等、を含む様々な方法で作り出すことができる。
【０１３９】
適当な構造が形成されると、それを、固体支持体への付着を容易にするために修飾することができる。修飾のタイプは、固体支持体の性質に応じて、異なったものとなる。一実施例では、たとえば、一本鎖核酸分子を、公知技術を使用して、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、で標識化して、他方、固体支持体を、ビオチン（核酸分子がアビジン又はストレプトアビジンで標識化される場合）、又はアビジン又はストレプトアビジン（核酸分子がビオチンで標識化される場合）でコーティングすることができる。当業者にとって、アミノ化、チオリン酸化、カルボキシル化、リン酸化、アミノシリル化、チオール基の付加、アクリルアミドの付加、等、を含めて、効果的な結合をもたらすその他の組み合わせは周知であろう。他方、固体支持体は、アルデヒド基（核酸がアミノ化される場合）を含むように処理され、ポリ−Ｌ−リジン（核酸がチオリン酸化される場合）によってコーティングされ、アミノ化（核酸分子がカルボキシル化又はリン酸化される場合）され、単数又は複数のイソシアネート、エポキシド、又はカルボキシル酸基（同様に核酸がアミノ化される場合）を含むように処理され、リン酸化（核酸がアミノシラン成分を含む場合）メルカプトプロピルシラン又はアミノシラン、を含むように処理され、ヘテロ二官能性クロスリンカー（核酸がスルフィドを含むように処理されている場合）、アクリルアミドモノマー（核酸がアクリルアミドを含む場合）、及び当業者に知られているその他の対合によってリンクされることができる。
【０１４０】
尚、前記固体相が、上述したシステムの１つのみによって、機能化されることは必ずしも必要ではないことが銘記されなければならない。更に、多重鎖核酸分子の１つの鎖の１つの端部以上が修飾可能であるので、任意の数の種々の組み合わせの多重鎖分子に対する修飾が可能であり、考慮されると理解されるべきである。たとえば、三重鎖核酸分子は、三つの５’末端と、三つの３’末端とを有し、６つの部位が修飾可能とされる。１から６の任意の数の端部を、１−６種類の修飾体（modifier）を使用して修飾することができる。一般に、”ｎ”の鎖の多重鎖核酸分子は、２ｎの末端を有し、これらの内の１−２ｎを、１−２ｎの修飾体を使用して修飾することができる。
【０１４１】
上述したように、全てのタイプの核酸分子を、本明細書に記載したように、固体支持体に固着させることができる。Ｂ−ＤＮＡ、Ｚ−ＤＮＡ、等を含めて、様々な立体配置の核酸分子を固定することができる。核酸分子は、又、核蛋白質複合体、核化学物質（nucleochemical）複合体、核薬剤（nucleodrug）複合体、光切断核酸分子、当業者に知られているその他の構造体でもありうる。これらの分子は、たとえば、Ｚ−ＤＮＡのブロム化等によって、それらを更に又は恒久的に安定化させるべく処理することも可能である。
【０１４２】
使用される固体支持体のタイプは様々なものとすることができる。ガラス、ポリスチレンなどのプラスチック、ナイロン膜などの公知の固体支持材の全てを使用することができる。
【０１４３】
本発明の更に別の特徴は、特定の方法で、核酸分子と他のタイプの分子との両方に対してより反応するように処理されている個体支持体の使用に関する。一実施例において、ガラス又はプラスチック等の固体支持体は、スクラッチ、又はエッチング、或いは、その他の方法でその表面が侵食されて、核酸又はタンパク質などの分子の固定化を完全にするために適合可能な、複雑な三次元表面を形成する。
【０１４４】
別実施例において、プラスチック表面などの表面は、ここでも、核酸分子又はタンパク質などの分子の完全な固定化を容易にするべく、紫外線放射によって機能化することができる。「完全な」固定化は、完全固定化においては、分子の全表面が固定される点で、上述した１端部の固定化と対比されるべきものである。これを、上述したように「垂直的」固定化に対する、「水平的」な固定化と見なすことができる。上述した核酸分子に加えて、ＤＮＡのＢ立体配置に対して特異的な抗体を含む抗体、等のタンパク質、ゼータクリスタリンを含むＤＮＡ結合タンパク質などの他のタンパク質、も、固定化可能であり、他のタンパク質、その他の分子も、固定化可能であり、そのような分子は当業者に知られているであろう。
当業者は本発明のその他の特徴を理解するであろうから、ここで繰り返す必要はない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月7日(2003.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重鎖非変性核酸分子を固体支持体に固定する方法であって、
前記多重鎖非変性核酸分子の少なくとも１つの鎖の一部を、前記固体支持体に対して結合可能に修飾する工程と、
前記多重鎖核酸分子を、それに対する固定化に有利な条件下で前記固体支持体に接触させる工程とを有し、
前記多重鎖非変性核酸分子は、少なくとも３つの核酸鎖を有する、
多重鎖非変性核酸分子を固体支持体に固定する方法。
【請求項２】
前記修飾工程は、前記１つの鎖の末端を修飾する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記末端をアミノ化する工程を有する、請求項２の方法。
【請求項４】
前記修飾工程は、ビオチン、アビジン又はストレプトアビジン分子を前記１つの鎖の末端に付加する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記固体支持体はガラスを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
前記固体支持体はプラスチックを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
前記固体支持体はナイロン膜を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
前記プラスチックは、スクラッチングされて、三次元表面を呈する、請求項６の方法。
【請求項９】
前記プラスチックは、紫外線放射によって処理されている、請求項６の方法。
【請求項１０】
前記修飾工程は、前記多重鎖核酸分子の少なくとも１つの末端をそれが別の核酸分子鎖にハイブリダイズしないように、処理する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記多重鎖核酸分子の１つの鎖の全表面を処理して、前記多重鎖核酸分子全体を前記固体支持体に対して結合可能にする工程を有する、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記多重鎖核酸分子は、３−１０の核酸分子鎖を有する、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記多重鎖核酸分子は、３−５の核酸分子鎖を有する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記多重鎖核酸分子は、核蛋白質複合体、核化学物質複合体、核薬剤複合体、又は光切断核酸分子である、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記光切断核酸分子は、金属キラル複合体を含む、請求項１４の方法
【請求項１６】
前記核酸分子はＺ−ＤＮＡである、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記Ｚ−ＤＮＡは、それをＺ−ＤＮＡとして恒久的に安定的にするために処理されている、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子はＢ−ＤＮＡである、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記多重鎖核酸分子は、環状である、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子の少なくとも一部がスーパーコイル状である、請求項１の方法。
【請求項２１】
前記多重鎖核酸分子の少なくとも２つの末端をそれを前記固体支持体に対して結合可能とするべく修飾する工程を有し、少なくとも１つの修飾末端は鎖の５’−末端であり、少なくとも１つの修飾末端は鎖の３’末端である、請求項１２の方法。
【請求項２２】
前記多重鎖核酸分子は、少なくとも２つの鎖において修飾される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記固体支持体は、アルデヒド基を含み、前記修飾工程は、少なくとも１つの鎖の前記部分をアミノ化することを含む、請求項１の方法。
【請求項２４】
前記固体支持体は、ポリ−Ｌ−リジンによってコーティングされ、前記修飾工程は、少なくとも１つの鎖の前記部分をチオリン酸化することを含む、請求項１の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体はアミノ化されており、前記修飾工程は、少なくとも１つの鎖の前記部分をカルボキシル化又はリン酸化することを含む、請求項１の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの鎖の前記部分は、アミノ化され、前記固体支持体は、イソシアネート、アルデヒド、エポキシド、又はカルボキシル酸によって活性化されている、請求項１の方法。
【請求項２７】
前記固体支持体は、リン酸化されており、少なくとも１つの鎖の前記部分は、アミノシラン成分によって修飾されている、請求項１の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの鎖の前記部分は、チオール基によって修飾されており、前記固体支持体は、ヘテロ二官能性クロスリンカーによってリンクされた、メルカプトプロピルシラン又はアミノシランを含む、請求項１の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの鎖の前記部分は、ジスルフィドによって修飾されており、前記固体支持体は、ヘテロ二官能性クロスリンカーによってリンクされた、メルカプトシラン又はアミノシランによって修飾されている、請求項１の方法。
【請求項３０】
前記固体支持体は、アクリルアミドモノマーを含み、少なくとも１つの鎖の前記部分はアクリルアミドを含む、請求項１の方法。
【請求項３１】
分子機能を分析するのに有用な装置であって、
紫外線レーザ照射によって活性化されて複数の共有結合性分子がそれに固定されている、或いは、エッチング又はスクラッチングによって処理されてそれに対する分子結合を受容する三次元構造を呈している固体支持体を有する、
分子機能を分析するのに有用な装置。
【請求項３２】
前記固体支持体は、ナイロン膜を含む、請求項３１の装置。
【請求項３３】
前記ナイロン膜は、ガラス又はプラスチック支持体に付着されている、請求項３２の装置。
【請求項３４】
前記複数の共有結合性分子は、多重鎖核酸分子である、請求項３１の装置。
【請求項３４】
前記多重鎖核酸分子は、２−６の核酸分子鎖を含む、請求項３３の装置。
【請求項３５】
前記多重鎖核酸分子は、Ｂ−ＤＮＡ又はＺ−ＤＮＡである、請求項３３の装置。
【請求項３６】
対象の分子を固定する方法であって、
前記分子を、請求項３１の装置に接触させて、前記分子をそれに固定する工程を有する、
対象の分子を固定する方法。
【請求項３７】
前記分子は完全に固定される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記分子は、多重鎖核酸分子である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
前記分子はタンパク質である、請求項３６の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質は抗体である、請求項３４の方法。
【請求項４１】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記モノクローナル抗体は、Ｂ−ＤＮＡに特異的に結合する、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である、請求項３９の方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡ結合タンパク質はゼータクリスタリンである、請求項４３の方法。
【請求項４５】
多重鎖非変性核酸分子を固体支持体に対して固定し、かつ、保持する方法であって、
前記多重鎖非変性核酸分子の少なくとも１つの鎖の一部を、前記固体支持体に対して結合可能に修飾する工程と、
前記多重鎖核酸分子を、それに対する固定化および保持に有利な条件下で前記固体支持体に接触させる工程とを有する、
多重鎖非変性核酸分子を固体支持体に対して固定し、かつ、保持する方法。
【請求項４６】
多重鎖非変性核酸分子を固体支持体に対して固定する方法であって、
実質的に、前記多重鎖非変性核酸分子の少なくとも１つの鎖の一部を、前記固体支持体に対して結合可能に修飾する工程と、
前記多重鎖核酸分子を、それに対する固定化に有利な条件下で前記固体支持体に接触させる工程とから成る、
多重鎖非変性核酸分子を固体支持体に対して固定する方法。
【国際調査報告】
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2004538456.tif 000061
2004538456.tif 000062