(57)【要約】本発明は、活性化リンパ球、ＮＫ細胞およびＮＫ様細胞によって引き起こされた損傷から器官および細胞を保護するための新規組成物および方法、より詳しく述べると、血管内皮細胞を免疫系媒介損傷から保護するための組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織、器官、または内皮細胞以外の細胞にＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドの免疫保護量を接触させる段階を含む、細胞、組織または器官に対する免疫媒介損傷を減少させる方法。
【請求項２】
上記Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドが、Ｘ１がＶ、Ｌ、ＡまたはＴ、Ｘ２がＬまたはＨ、Ｘ３がＳまたはＶ、Ｘ４がＤまたはＥ、Ｘ５がＱ、Ｋ、またはＲ、そしてＸ６がＬ、またはＶである配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｒを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３が任意のアミノ酸となりうる配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＥＱＬＲを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｘ１がＶまたはＡ、Ｘ２がＬまたはＨ、およびＸ３がＳまたはＶである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
上記ポリペプチドが配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記免疫媒介損傷が自己免疫疾患、移植片対宿主病、または宿主対移植片病によって引き起こされる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記接触段階がエクスビボである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含む、細胞または組織に対する免疫媒介損傷を減少させる方法：
組織、器官、または内皮細胞以外の細胞に、Ｈｓｐ４７ポリペプチドを含む組成物の免疫保護量を接触させる段階。
【請求項９】
上記Ｈｓｐ４７ポリペプチドが以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８記載の方法：
（ａ）図１に示すアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の免疫保護断片；および
（ｄ）（ａ）または（ｂ）の免疫保護変異体。
【請求項１０】
Ｈｓｐ４７の上記免疫保護断片がアミノ酸配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｈｓｐ４７の上記免疫保護変異体が配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲの保存された変異体である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
Ｈｓｐ４７の上記免疫保護変異体が配列ＡＡＨＶＡＥＱＬＲを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
上記Ｈｓｐ４７ポリペプチドが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８記載の方法：
（ａ）図１に示すアミノ酸配列；
（ｂ）図１に示すアミノ酸配列をコードする核酸とハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の免疫保護断片；および
（ｄ）（ａ）または（ｂ）の免疫保護変異体。
【請求項１４】
上記接触段階がインビボである、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
上記免疫媒介損傷が自己免疫疾患、移植片対宿主病または宿主対移植片病によって引き起こされる、請求項８記載の方法。
【請求項１６】
以下の段階を含む、組織、器官、または細胞に対する免疫媒介損傷を減少させる方法：
組織、器官、または内皮細胞以外の細胞に、ブレフェルディンを含む組成物の免疫保護量を接触させる段階。
【請求項１７】
上記免疫媒介損傷が自己免疫疾患、移植片対宿主病、または宿主対移植片病によって引き起こされる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記接触段階がエクスビボである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
以下の段階を含む、組織、器官、または細胞に対する免疫媒介損傷を減少させる方法：
組織、器官、または内皮細胞以外の細胞に、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を接触させる段階。
【請求項２０】
上記Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドが、Ｘ１がＶ、Ｌ、ＡまたはＴ、Ｘ２がＬまたはＨ、Ｘ３がＳまたはＶ、Ｘ４がＤまたはＥ、Ｘ５がＱ、Ｋ、またはＲ、そしてＸ６がＬ、またはＶである配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｒを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
上記４７関連免疫保護ポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸となりうる配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＥＱＬＲを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
Ｘ１がＶまたはＡ、Ｘ２がＬまたはＨ、およびＸ３がＳまたはＶである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
上記ポリペプチドが配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
上記免疫媒介損傷が自己免疫疾患、移植片対宿主病、または宿主対移植片病によって引き起こされる、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
上記接触段階がエクスビボである、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
以下の段階を含む、癌を治療するための養子免疫治療の方法：
上記Ｔ−リンパ球の特定のサブセットが増殖する条件でドナーからＴリンパ球を培養する段階；および
ブレフェルディンおよびＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドからなる群より選択される免疫保護物質の免疫保護量と共に、上記の増殖したＴリンパ球のサブセットを患者に導入する段階。
【請求項２７】
上記免疫保護ポリペプチドが、Ｘ１がＶ、Ｌ、ＡまたはＴ、Ｘ２がＬまたはＨ、Ｘ３がＳまたはＶ、Ｘ４がＤまたはＥ、Ｘ５がＱ、Ｋ、またはＲ、且つＸ６がＬまたはＶである配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｒを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
上記免疫保護ポリペプチドが、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３が任意のアミノ酸となりうる配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＥＱＬＲを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
Ｘ１がＶまたはＡ、Ｘ２がＬまたはＨ、且つＸ３がＳまたはＶである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
以下の段階を含む、ポリペプチドに結合する細胞を同定する方法：
上記ポリペプチドが検出可能な標識をさらに含む、Ｘ１がＶ、Ｌ、ＡまたはＴ、Ｘ２がＬまたはＨ、Ｘ３がＳまたはＶ、Ｘ４がＤまたはＥ、Ｘ５がＱ、Ｋ、またはＲ、且つＸ６がＬ、またはＶである、配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｒを含むポリペプチドを、上記細胞に接触させる段階、および
上記標識されたポリペプチドに結合する細胞を検出する段階。
【請求項３１】
上記の検出可能な標識が蛍光標識であり、上記検出が蛍光活性化細胞ソーティングによるものである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
Ｈｓｐ４７関連ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む物質の組成物。
【請求項３３】
配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲと標識とを含むＨｓｐ４７ポリペプチド。
【請求項３４】
上記標識が蛍光標識である、請求項３３記載のＨｓｐ４７ポリペプチド。
【請求項３５】
細胞、組織または器官と併用したＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチド。
【請求項３６】
配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＥＱＬＲを含むＨｓｐ４７ポリペプチドエピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項３７】
配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲを含むポリペプチドに対する抗イディオタイプ抗体。
【請求項３８】
ベクターによって形質転換された宿主細胞によって認識される調節配列に機能的に結合されたヒトＨｓｐ４７ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター。
【請求項３９】
請求項３８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４０】
請求項３９記載の宿主細胞を、上記Ｈｓｐ４７ポリペプチドの発現に適した条件で培養する段階、および培養細胞から上記Ｈｓｐ４７ポリペプチドを回収する段階を含む、Ｈｓｐ４７ポリペプチドを生産する方法。
【請求項４１】
Ｈｓｐ４７ポリペプチドに融合した異種アミノ酸配列を含むキメラ分子。
【請求項４２】
上記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域またはビオチンである、請求項４１記載のキメラ分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は、免疫系が媒介する損傷から組織、器官および細胞を保護するための組成物および方法である。
【０００２】
発明の背景
骨髄移植（ＢＭＴ）は、悪性疾患患者に対する治癒的治療の一つである。ＢＭＴの有用な作用は、高用量化学療法および放射線療法によるのみならず、移植片対白血病作用（ＧｖＬ）と呼ばれる免疫メカニズムによる（サリバンら（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）、Ｂｌｏｏｄ ７３：１７２０（１９８９）；バイデンら（Ｗｅｉｄｅｎ）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３００：１０６８〜１０７３（１９７９））。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とＴ細胞サブセットはいずれもＧｖＬに関与する（アンチン（Ａｎｔｉｎ）、Ｂｌｏｏｄ ８２：２２７３〜２２７７（１９９３）；ハウチら（Ｈａｕｃｈ）、Ｂｌｏｏｄ ７５：２２５０〜２２６２（１９９０））。このことは、幹細胞産物からＴリンパ球を除去すると、同種異系ＢＭＴ後の再発率が劇的に増加するという知見に基づいている（マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ）、Ｂｌｏｏｄ ６６：６６４〜６７２（１９８５））。同様に、Ｔ細胞を除去した同種異系ＢＭ移植後に再発した患者にドナーリンパ球を注入すると、有意な割合の患者が完全寛解に至ることも最近証明された（コリンズら（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５：４３３〜４４４（１９９７）；コルブら（Ｋｏｌｂ）、Ｂｌｏｏｄ ８６：２０４１〜２０５０（１９９５）；ポーターら（Ｐｏｒｔｅｒ）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３０：１００〜１０６（１９９４））。自然発生的または後天的ＧｖＬ抗腫瘍活性を有するＮＫおよびＴ細胞サブセットを同定してインビトロで増殖させることは、積極的に研究される領域である。
【０００３】
古典的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生物学と、標的細胞上での適当なＭＨＣ Ｉ発現という意味においてそれらがＴＣＲ α／β、ＣＤ３およびＣＤ８を利用することに関する理解は前進している（ガイドスら（Ｇｕｉｄｏｓ）、Ｊ． ｏｆ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２：８３５〜８４５（１９９０）；ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）、Ｃｅｌｌ ７６：２０７〜２１８（１９９４））。しかし、古典的なＭＨＣ Ｉ拘束細胞障害性の意味において、上記分子を使用しない細胞障害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞のよりまれなサブセットに関する生物学は、なおも課題である。例えば、腫瘍免疫学の分野は、ＭＨＣ Ｉによる拘束の古典的な特徴を示さず、腫瘍標的の自己および同種異系反応性に関して正統でないＴ細胞の細胞障害活性と増殖に関する一貫した知見が得られたことによって異議を唱えられている（ホグルンドら（Ｈｏｇｌｕｎｄ）ら、Ｉｍｍｕｎ． Ｒｅｖ． １５５：１１〜２８（１９９７））。幾つかの明確なＴ細胞およびＮＫ細胞集団がインビトロで増殖されており、養子免疫治療のイフェクター細胞としてインビボで利用されている。
【０００４】
リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞は、ＮＫ細胞に由来する増殖能が制限されたＩＬ−２依存的短期培養産物である。ＬＡＫ細胞は、広範囲の腫瘍細胞標的および自己腫瘍細胞をインビトロで認識するが、そのインビボ有効性は、ＩＬ−２の同時投与を必要とするために限られている（ブレイズら（Ｂｌａｉｓｅ）、Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ． ２：１２１〜１２９（１９９１）；フォーティスら（Ｆｏｒｔｉｓ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３３：１２８〜１３２（１９９１）；リーら（Ｌｅｅ）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄ． ７：４３〜５３（１９８８）；ナレスニクら（Ｎａｌｅｓｎｉｋ）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６３：１２００〜１２０５（１９９７）；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄ． ３：５０１〜５１１（１９８４）；ローゼンバーグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ． ３１６：８８９〜８９７（１９８７）；ローゼンバーグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ． ｏｆ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６１：１１６９〜１１８８（１９８５）；テイクマンら（Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ）、Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ． １６：２８７〜９８（１９９２））。ＩＬ−２の全身投与は、インビトロおよびインビボの双方における内皮の破壊を特徴とするかなりの毒性に関連する（シーゲルら（Ｓｉｅｇｅｌ）、Ｊ． ｏｆ Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ９：６９４〜７０４（１９９１））。ＬＡＫ細胞治療を行うと、血管滲出症候群（ＶＬＳ）に関連した有意な罹患および死亡にさえ至った（グラウサーら（Ｇｌａｕｓｅｒ）、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９６：４０６〜４１２（１９８８）；コタセクら（Ｋｏｔａｓｅｋ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：５５２８〜５５３２（１９８８）；コゼニーら（Ｋｏｚｅｎｙ）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６：１１７０〜１１７６（１９８８）；ローゼンバーグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ａｎｎ． Ｓｕｒｇ． ２１０：４７４〜４８４）。
【０００５】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、外科的標本からの単離が必要である。それらは通常、それぞれの腫瘍に対して高い選択性を有する。しかし、その生産は厄介で収率が低い傾向がある。連続的な治療または用量増加を行うためにインビトロで十分に増殖させるために、特異的腫瘍抗原はほとんど利用できない（ローゼンバーグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｎｅｗ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１９：１６７６〜１６８０（１９８８）；ローゼンバーグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ． Ｎａｔ． Ｃａｎｃ． Ｉｎｓｔｉ． ８６：１１５９〜１１６６（１９９４））。
【０００６】
サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞は、ＩＦＮ−γ、ＯＫＴ−３、およびＩＬ−２の存在下で、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のインビトロ培養によって、標的細胞の非存在下で生成される。ＣＩＫ細胞は、ＬＡＫと比較してインビボＧｖＫ活性が優れており、ＳＣＩＤマウスから致死的骨髄腫瘍の負荷を一掃することができる（ルら（Ｌｕ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１６８７〜１６９６（１９９４）；シュミット・ウルフら（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ）、Ａｎｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ７４：５１〜５６（１９９７）；シュミット・ウルフら（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ）、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２１：１６７３〜１６７９（１９９３））。活性化ＮＫまたはＴ細胞の他の型と同様に、大量培養したＣＩＫは、インビトロ培養内皮（ＥＣ）に対して何らかの望ましくない細胞障害性を示す。
【０００７】
血管滲出症候群（ＶＬＳ）は、癌のような疾患を治療するための養子免疫治療に関連した有意な副作用である。特に、ＩＬ−２および様々な型のＩＬ−２活性化ＮＫ細胞およびＴ細胞は、ＶＬＳを含む有意な毒性を生じる場合があると報告されている。しかし、活性化、非古典的ＭＨＣクラスＩ拘束ＮＫ細胞およびＴ細胞による内皮の溶解を阻害することができる物質は報告されていない（ブラエタら（Ｂｌａｈｅｔａ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９４：２１３〜２２０（１９９８）；フィネガンら（Ｆｉｎｎｅｇａｎ）、Ｃａｎｃｅｒ ８２：１８６〜１９９（１９９８）；ウトグチら（Ｕｔｏｇｕｃｈｉ）、Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ ２１：２２３〜２３３（１９９７））。
【０００８】
免疫系による血管損傷は、免疫系が全体的に活性化されたことの一つの現れである。免疫応答の活性化は、宿主の健康と適切な機能にとって極めて重要であるが、そのような活性化が望ましくない状況も多く存在する。一つの特定の領域は、移植に関連しており、この場合ＭＨＣ抗原がドナーとレシピエントのあいだで同一に適合することはまれである。もう一つの臨床状況は自己免疫疾患である。ＣＴＬは、インスリン依存的真正糖尿病（ＩＤＤＭ）のような疾患の場合に起こるように、ＭＨＣおよび関連ペプチドがいずれも内因性である場合に細胞を攻撃する。他の望ましくない免疫系の活性化事象は、敗血症ショック、リウマチ性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、喘息、移植片対宿主病、冠動脈疾患および他の心筋症、成人呼吸窮迫症候群、ウイルス性肝硬変等のような疾患に関連している。
【０００９】
免疫抑制は、ＣＴＬ、ＮＫおよび他のＮＫ様細胞の活性化の阻害が望ましい状況における一般的なアプローチとなった。しかし、コルチコステロイド、シクロスポリン、ＦＫ５０６等のような免疫抑制剤は、例えば、宿主の全免疫系に対する全身性の免疫抑制作用を含む多数の望ましくない副作用を有する。したがって、外来性の感染症から保護するために免疫系の実質的な部分を宿主に残しておくために、免疫系に対する普遍的な免疫抑制作用が比較的弱く且つ比較的副作用が少ない、Ｔリンパ球および他のＮＫ様細胞、特にＣＴＬのような細胞によって引き起こされる損傷から組織を特異的に保護することができる新しい組成物を同定することにかなりの関心が集まっている。そのような特異的免疫抑制を行うための方法および組成物を本明細書において提供する。
【００１０】
関連文献
ホッペ＆ネグリン（Ｈｏｐｐｅ ａｎｄ Ｎｅｇｒｉｎ、Ｂｌｏｏｄ、アメリカ血液学会、第３９回総会、１２月５〜９日（１９９７）、抄録番号２０１９）；ジアンら（Ｊｉａｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８７（３）：４８１〜４８６（１９９６））；ワダら（Ｗａｄａ、Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８４（８）：９０６〜９１３（１９９３））、およびクレンスキーら（Ｋｒｅｎｓｋｙ、Ｅｘｐ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ ５：８０９（１９９６））。
【００１１】
発明の概要
リンパ球、ＮＫ細胞、およびＮＫ様細胞によって引き起こされる損傷から、血管内皮細胞のような細胞、器官、および他の組織を保護するための組成物および方法を本明細書において提供する。これらの組成物は、単独で、または他の免疫抑制剤もしくは他の治療化合物と共に併用療法として用いられる。本組成物は、エクスビボで細胞、組織または器官と接触させてもよい。幾つかの態様において、次に処置した材料をレシピエントに移植する。本組成物はまた、何らかの都合のよい手段によって、細胞、器官、および／または他の組織を免疫系媒介損傷から実質的に保護するために十分量をインビボで導入してもよい。本組成物は好ましくはＨｓｐ−４７関連免疫保護ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸である。
【００１２】
好ましい態様において、細胞、組織、または器官を、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドの免疫保護量に接触させる。一つの局面において、ポリペプチドは、配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｒを含む。この好ましい態様において、Ｘ１はＶ、Ｌ、ＡまたはＴ、Ｘ２はＬまたはＨ、Ｘ３はＳまたはＶ、Ｘ４はＤまたはＥ、Ｘ５はＱ、Ｋ、またはＲ、且つＸ６はＬまたはＶである。もう一つの局面においてポリペプチドは配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＥＱＬＲを含み、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸となりうる。特に好ましい態様において、ポリペプチドは配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲを含む。これらの配列を含むポリペプチドは、本明細書に開示のＨｓｐ４７を含むと共に、ＨＬＡ−Ａ抗原およびＩＬ−１２分子を含む。さらなる態様において、本方法は、組織または器官を、ブレフェルディン（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）を含む組成物の免疫保護量に接触させる段階を含む。免疫媒介損傷を引き起こす疾患状態の例としては、自己免疫疾患、移植片対宿主病、および宿主対移植片病が含まれる。
【００１３】
本発明はまた、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドとその標識型とのキメラ分子を含む。増殖させた一組のＴリンパ球をブレフェルディンまたはＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドの免疫保護量と共に患者に戻す、養子免疫療法に関する方法も開示する。
【００１４】
Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドに結合する細胞を同定する方法も開示する。
【００１５】
発明の詳細な説明
血管内皮細胞のような細胞、器官、および組織を、活性化リンパ球、ＮＫおよび他のＮＫ様細胞によって引き起こされた免疫系媒介損傷から保護するための方法および組成物を提供する。本方法および組成物は、例えば、敗血症ショック、強皮症、リウマチ性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、喘息、移植片対宿主病、冠動脈疾患および他の心筋症、成人呼吸窮迫症候群およびウイルス性肝硬変等を含む、活性化免疫系細胞によって媒介される多様な有害な適応を治療するために用いられる。
【００１６】
本発明の免疫保護組成物は、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチド、および既知の市販の治療薬である薬剤ブレフェルディンＡ（１，６，７，８，９，１１ａ，１２，１３，１４，１４ａ−デカヒドロ−１，１３−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−シクロペント［ｆ］オキサシクロトリデシン−４−オン）を含む（ハエリら（Ｈａｅｒｒｉ）、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ４６：１２３５（１９６３）；シングルトンら（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）、Ｎａｔｕｒｅ １８１ １０７２（１９５８）；およびベティナら（Ｂｅｔｉｎａ）、Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７：３５３（１９６２））。
【００１７】
本明細書において用いられるように、「Ｈｓｐ関連免疫保護ポリペプチド」という用語は、本明細書に定義するようにＨｓｐ４７ポリペプチドと類似の免疫保護特性を有する任意のポリペプチドを意味する。例えば、ヒトＨｓｐ４７ポリペプチドは、ＣＩＫ細胞による溶解から内皮細胞を保護することが示されている。Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、ヒトＨｓｐ４７のこの免疫保護特性または他の免疫保護特性を定性的または定量的に共有するポリペプチドである。
【００１８】
本発明の一つの局面において、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、さらに、図１に示す全体的なコンセンサス配列に対応するアミノ酸モチーフを特徴とする。これは、配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＸ４Ｘ５Ｘ６Ｒとして表すことができる。この好ましい態様において、Ｘ１はＶ、Ｌ、ＡまたはＴ、Ｘ２はＬまたはＨ、Ｘ３はＳまたはＶ、Ｘ４はＤまたはＥ、Ｘ５はＱ、Ｋ、またはＲ、且つＸ６はＬまたはＶである。これはまたはＡ（ｖ，ｌ，ａ，ｔ）（ｌ，ｈ）（ｓ，ｖ）Ａ（ｄ，ｅ）（ｋ，ｑ，ｒ）（ｌ，ｖ）Ｒとして表すことができる。
【００１９】
Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは同様に、図２に示す配列のようにＩＬ−１２コンセンサス配列を含みうる。これはＡＸ１ＬＳＡＥＸ５Ｘ６Ｒとして表すことができ、Ｘ１は好ましくはＶ、ＬまたはＴ、Ｘ５は好ましくはＱ、ＫまたはＲ、且つＸ６はＬまたはＶである。本発明のこの局面はまたＡ（ｖ，ｌ，ｔ）ＬＳＡＥ（ｑ，ｋ，ｒ）（ｌ，ｖ）Ｒとして表すことができる。
【００２０】
本発明のなおさらなる局面において、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、図１に示すようにＨＬＡ−Ａに関して述べたようにコンセンサス配列を含む。これは、ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＥＱＬＲとして表すことができる。この態様において、Ｘ１は好ましくはＶまたはＡ、Ｘ２は好ましくはＬまたはＨ、Ｘ３は好ましくはＳまたはＶである。本発明のこの局面はまたＡ（ｖ，ａ）（ｌ，ｈ）（ｓ，ｖ）ＡＥＱＬＲとして表すことができる。
【００２１】
本発明の特に好ましい局面において、Ｈｓｐ４７関連ポリペプチドは図２に示すＨｓｐのコンセンサス配列を含む。これはＡＶＬＳＡＸ４Ｘ５ＬＲとして表すことができる。この態様において、Ｘ４は好ましくはＤまたはＥ、且つＸ５は好ましくはＫまたはＱである。本発明のこの局面はＡＶＬＳＡ（ｄ，ｅ）（ｋ，ｑ）ＬＲとして表すことができる。
【００２２】
さらにもう一つの好ましい態様において、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、配列ＡＸ１Ｘ２Ｘ３ＡＥＱＬＲを有し、式中Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は如何なるアミノ酸ともなり得て、Ｈｓｐ４７ポリペプチドは好ましくは配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲを含む。
【００２３】
図２は、他の特異的ＨＬＡ−Ａ抗原分子およびＩＬ−１２において認められる類似のモチーフと比較した、ヒトＨｓｐ４７の残基９６位〜１０４位に及ぶペプチド配列との関連を示す。したがって、免疫媒介損傷を減少させる方法において、任意のＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、Ｈｓｐ４７、およびＩＬ−１２、ならびに免疫保護断片またはその変異体を含む。
【００２４】
本明細書において用いられるように、「Ｈｓｐ４７ポリペプチド」という用語は図１に示す配列を有するポリペプチドを意味する。この用語はまた、図１に示す配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは、図１に示す配列と９５％以上の同一性を有する蛋白質を含む。この用語はまた、後により詳細に記載する中等度またはストリンジェントな条件において、図１に示す配列を有する核酸とハイブリダイズすることができる核酸によってコードされる蛋白質を意味する。Ｈｓｐ４７ポリペプチドの定義にはまた、免疫保護断片および対立遺伝子変異と共に、組換え技術によって１つまたは複数のアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失するよう導入された改変が含まれる。
【００２５】
ヒトＨｓｐ４７の全ｃＤＮＡ配列を図１Ａに示す。精製された組換え型または合成Ｈｓｐ４７ポリペプチドを調製することは、当技術分野の技術レベルの範囲内である。同様に、哺乳類のような脊椎動物から他のＨｓｐ４７ ｃＤＮＡおよびポリペプチドを同定すること、そして本組成物および方法にそれらのヒト以外のｃＤＮＡおよびＨｓｐ４７ポリペプチドを用いることも当技術分野の技術レベルの範囲内である。例えば、ヒトＨｓｐ４７の相対物はニワトリおよびラットにおいて既知である。このため、本明細書において用いられるＨｓｐ４７ポリペプチドには、全ての脊椎動物、好ましくは哺乳類および最も好ましくはヒトからのＨｓｐ４７ポリペプチドならびにその免疫保護断片および変異体が含まれる。本明細書において用いられる完全長のＨｓｐ４７蛋白質の変異体および断片に関して、「免疫保護」およびその文法的に同等の表現は、変異体または断片が、免疫保護物質の非存在下でそのような細胞によって引き起こされる細胞、器官、または組織に対する損傷と比較して、活性化リンパ球、ＮＫ細胞、またはＮＫ様細胞によって引き起こされる細胞、器官または組織に対する損傷を、減少または消失させることができることを意味する。
【００２６】
本明細書において用いられる完全長のＨｓｐ４７ポリペプチドまたは他のＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドのペプチド断片に関して、それらのアミノ酸配列断片は一般的に、Ｈｓｐ４７蛋白質配列の連続アミノ酸少なくとも約８個、通常連続アミノ酸少なくとも約１０個、好ましくは連続アミノ酸少なくとも約１５個、より好ましくは連続アミノ酸少なくとも約２０個を有する。活性配列は、様々な目的のために、他のペプチドまたは蛋白質の鎖内でまたは側鎖として結合または非共有結合してもよい。
【００２７】
本明細書において用いられるＨｓｐ４７免疫保護ポリペプチドと共にその他のＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を含んでもよい。典型的な保存的置換は、好ましい置換の見出しの下に表Ｉに示す。そのような置換の結果、生物活性の変化が起これば、表１において例としての置換として示す、またはアミノ酸のクラスに関して下記にさらに記述するような、より実質的な変化を導入して、産物をスクリーニングする。
【００２８】
【表１】
2004503463.tif 000002
【００２９】
本組成物および方法において用いられるＨｓｐ４７ポリペプチドコード核酸は、図１Ａにおいて示される対応するヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、通常少なくとも約７５％、より通常少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を有すると考えられる。
【００３０】
本明細書において同定されたＨｓｐ４７ポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、配列を配置して、必要であれば最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部として見なさずに、野生型ヒトＨｓｐ４７配列においてアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される（図１Ａ参照）。本明細書において同定されたＨｓｐ４７ポリペプチドコード配列に関して「パーセント（％）ヌクレオチド配列同一性」とは、配列を配置して、必要であれば最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入した後、図１に示すヌクレオチド配列と同一である候補配列におけるヌクレオチドの割合として定義される。本明細書において用いられる％同一性値は、［アルツシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０〜４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ． ｈｔｍｌ］から得たＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって生成する。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、幾つかの検索パラメータを用い、そのほとんどがデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップス範囲＝１、オーバーラップ分画＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成、および関係配列が検索される特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自身が決定する；しかし、感度を増加するために値を調節してもよい。％アミノ酸配列同一性値は、マッチングした同一残基数を、配置した領域における「より長い」配列の残基の総数で除することによって決定する。「より長い」配列は、配置した領域において最も実際的な残基を有する配列である（配置スコアを最大限にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されたギャップは無視する）。
【００３１】
本明細書において用いられるＨｓｐ４７ポリペプチドまたは他のＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、本発明において用いられるキメラまたは融合蛋白質を提供するために、異種アミノ酸配列に融合してもよい。さらに、本明細書において用いられるＨｓｐ４７ポリペプチドおよびＨｓｐ４７関連ポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組換え型発現から得てもよい。この点において、本発明のＨｓｐ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、図１に示すヌクレオチド配列と、中等度にストリンジェントな条件、好ましくはストリンジェントな条件でハイブリダイズする。本明細書において用いられるように、「ストリンジェントな条件」とは、（１）洗浄に低いイオン強度と高温、例えば１５ ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ ｍＭクエン酸ナトリウム（０．１×ＳＳＣ）／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムと５０℃を用いる、または（２）ハイブリダイゼーションの際に、ホルムアミドのような変性剤、例えば５０％（容積／容積）ホルムアミドの０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ ｎＭ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ６．５の溶液に７５０ ｍＭ塩化ナトリウム、７５ ｍＭクエン酸ナトリウム（５×ＳＳＣ）を加えたものを４２℃で用いる。もう一つの例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ ｍＭ ＮａＣｌ、７５ ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０ μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で用い、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにおいて４２℃で洗浄することである。さらにもう一つの例は、１０％硫酸デキストラン、２×ＳＳＣ、および５０％ホルムアミドの緩衝液を５５℃で用いてハイブリダイゼーションを行い、その後ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で行う。
【００３２】
「中等度にストリンジェントな条件」とは、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記）が記述し、上記よりストリンジェントでない洗浄液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）を用いることを含む。中等度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ ｍＭ ＮａＣｌ、７５ ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液で３７℃で一晩インキュベーションを行い、その後１×ＳＳＣ中で約３７〜５０℃において濾紙を洗浄するような条件である。当業者は、プローブの長さ等のような要因を適合させるために必要に応じて、温度、イオン強度等を調節する方法を認識していると思われる。
【００３３】
本明細書に開示の様々なＨｓｐ４７ポリペプチドまたはＨｓｐ４７関連ポリペプチドを記述するために用いられる「単離された」とは、同定されて、その天然の環境の成分から分離および／または回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の混入物質は、ポリペプチドの診断または治療的用途を典型的には妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質様、または非蛋白質様溶質を含んでもよい。好ましい態様において、ポリペプチドは（１）スピンカップシーケネータを用いることによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（２）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて非還元もしくは還元条件において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製される。単離されたポリペプチドには、Ｈｓｐ４７ポリペプチドの天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから、組換え型細胞におけるインサイチューポリペプチドが含まれる。しかし通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製段階によって調製される。単離されたＨｓｐ４７ポリペプチドは好ましくは、それに結合したＨｓｐ４７特異的抗体を含まない。
【００３４】
Ｈｓｐ４７ポリペプチドまたはＨｓｐ４７関連ポリペプチドをコードする「単離された」核酸は、Ｈｓｐ４７関連ポリペプチドコード核酸の天然起源において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から同定および分離されている核酸分子である。単離されたＨｓｐ４７関連ポリペプチドコード核酸分子は、天然に存在する形または状態以外の分子である。したがって、単離されたＨｓｐ４７関連ポリペプチドコード核酸分子は、天然の細胞に存在するＨｓｐ４７関連ポリペプチドコード核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＨｓｐ４７関連ポリペプチドコード核酸分子には、例えば、核酸分子が天然の細胞の位置とは異なる染色体上の位置に存在する、Ｈｓｐ４７ポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＨｓｐ４７ポリペプチドコード核酸分子が含まれる。
【００３５】
「調節配列」という用語は、特定の宿主生物において機能的に結合したコード配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を意味する。原核細胞に適した調節配列には、例えばプロモーター、選択的にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【００３６】
核酸は、それがもう一つの核酸配列と機能的関係で存在する場合に「機能的に結合」している。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現される場合に、ポリペプチドに関してＤＮＡに機能的に結合している；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に結合している；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するような位置に存在する場合にコード配列に機能的に結合している。一般的に、「機能的に結合」とは、結合されるＤＮＡ配列が隣接している、そして分泌リーダーの場合には隣接して読みとり相に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は都合のよい制限部位でのライゲーションによって行う。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の実践に従って用いる。
【００３７】
「抗体」という用語は、広い意味において用いられ、特に単一の抗Ｈｓｐ４７ポリペプチドモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、およびポリエピトープ特異性を有する抗Ｈｓｐ４７抗体組成物を含む。抗体は好ましくは、Ｍａｂ Ｎ６またはＭａｂ ＳＰＡ４７０と反応するエピトープには結合しない。一つの局面において、抗体は、上記のコンセンサス配列によって定義されるエピトープに特異的である。本明細書において用いられるように「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体、すなわち集団を構成する個々の抗体が、少量存在してもよい天然に存在する変異を例外として同一であることを意味する。
【００３８】
本明細書において用いられる「治療する」、「治療」または「療法」という用語は、治癒的治療、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療、および予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）治療を意味する。
【００３９】
本明細書において用いられる「哺乳類」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌおよびネコを含む哺乳類として分類される如何なる動物も意味する。本発明の好ましい態様において、哺乳類はヒトである。
【００４０】
Ｈｓｐ４７関連ポリペプチドまたはその断片は、標準的な技術を用いて、放射性標識、例えば３２Ｐ、蛍光標識等を取り込むように標識してもよい。ポリペプチドの精製を促進するために、さらなる部分を単独で、または細胞と結合させて加えることができる。例えば、蛍光標識を含むＨｓｐ４７ポリペプチドは、蛍光活性化細胞ソーティングを容易にする。さらに、磁場と相互作用することができる部分をＨｓｐ４７に結合させることができる。後者の場合、アビジンに結合させた磁気ビーズを、ビオチン標識Ｈｓｐ４７ポリペプチドと混合することによって用いることができる。
【００４１】
Ｈｓｐ４７は、ブレフェルディンＡによって処置した内皮細胞において誘導される蛋白質として同定された。Ｈｓｐ４７（図１４Ａにおいて４６５ ｋＤａのバンドとして、そして図１４Ｂにおいてｐ４７として示される）の他に、ブレフェルディンＡによって他の蛋白質も誘導される。これらの中には、図１４Ｂにおいてｐ２７と命名された蛋白質、および図１４Ｂにおいてｐ４７の上に存在する、分子量約６０〜７０ ｋＤａのかすかなバンドが含まれる。そのようなさらなる蛋白質はまた、単独で、またはブレフェルディンＡによって誘導される他の全ての蛋白質と併用して、免疫応答を阻害するために有用な免疫保護ポリペプチドであってもよい。
【００４２】
前述の分子は、Ｈｓｐ４７ポリペプチドまたはその断片に結合する細胞を同定するために用いることができる。そのような標識の有無の検出は、用いた改変されたＨｓｐ４７ポリペプチドの特定のタイプに応じて、放射線造影、蛍光検出、蛍光活性化細胞ソーティング、および磁場での拡散のような従来の技術によって行うことができる。
【００４３】
本組成物は多様な方面において用いられる。研究目的の場合、それらは、免疫保護および／またはＴリンパ球、ＮＫ細胞および他のＮＫ様免疫系細胞の活性化および不活化と共に、血管内皮を含む様々な哺乳類組織の免疫保護に関連した生理学的経路を分析するために用いてもよい。例えば、リンパ球、特にＣＴＬが拘束される抗原提示細胞の存在下または非存在下において、既知のペプチド標的を有するＣＴＬ細胞株を本組成物と混合することができる。ＣＴＬによる溶解の後、マーカーＣＤ６９を用いて静止期ＣＴＬ細胞から活性化ＣＴＬ細胞を分離してもよく、そのマーカーは活性化されるとインビトロでアップレギュレートされる。分離はＦＡＣＳおよび蛍光標識抗ＣＤ６９を用いて行うことができる。
【００４４】
ほとんどの蛍光細胞、例えば最高で２５％の蛍光細胞を単離することによって、次に細胞を溶解して、本マーカーに会合した蛋白質を、例えばクロマトグラフィー、非変性電気泳動等によって単離する。または、電気泳動を用いて蛋白質を分離した後、標識ペプチドによるウェスタンブロットまたは他の技術を用いて、それに対して本ペプチドが結合する蛋白質を同定する。放射性標識の代わりに、他の如何なるタイプの標識を用いてもよく、通常、ビオチンのような有機小分子、蛍光剤等を用いてもよい。ビオチンを用いる場合、アビジンがこれまでに記述されたように標識によって標識されている場合、分離後、アビジンを加えてもよい。
【００４５】
抗原提示細胞と混合したリンパ球を、本免疫保護組成物の存在下および非存在下で比較してもよい。ｃＤＮＡライブラリをそれぞれの場合について調製して、代表的な示差分析、サブトラクション等を用いて、本組成物の存在下および非存在下において活性化された細胞の発現の差を検出してもよい。同様に、リンパ球または他の免疫系細胞の特定のサブセットが、１つまたはそれ以上の蛋白質、特に表面膜蛋白質を発現する、または発現しないことによって、本免疫調節組成物に対して、他のサブセットとは異なるように反応するか否かを決定してもよい。このようにしてリンパ球を同定してもよく、組織に対する望まないリンパ球の攻撃を減少させるために、これを白血球除去法によって回収してもよい。
【００４６】
その目的とする用途に応じて、特に哺乳類宿主に投与する場合、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチド、例えばＨｓｐ４７ポリペプチドは、血流における分布が変化するように、血液成分との結合を減少または増強するように、血流におけるポリペプチドの寿命を増加させる等のために改変してもよい。免疫保護ポリペプチドは、血液の生理学的環境において切断可能または切断不可能であるリンカーによってこれらの他の成分に結合してもよい。免疫保護ポリペプチドは、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アミノ等のような官能基が存在する場合、ポリペプチドの如何なる点で結合してもよい。望ましくは、結合はＮ末端またはＣ末端のいずれかに存在する。
【００４７】
本発明のＨｓｐ４７関連免疫保護組成物はまた、多様な目的のために多様な他のオリゴペプチドまたは蛋白質に結合してもよい。例えば、抗体が同等の構造を有する他のペプチドの同定に役立つ可能性がある場合には、本組成物の成分を免疫原に共有結合させて、本組成物の成分に対する抗体を産生してもよい。さらに、抗体を用いて、標的部位との結合に関して本蛋白質またはペプチドと競合する可能性がある抗イディオタイプ抗体を調製してもよい。これらの抗イディオタイプ抗体を用いて、本蛋白質および／またはペプチドが結合する蛋白質を同定してもよい。または、免疫保護ポリペプチドは、内部またはＮ末端もしくはＣ末端で鎖の一部となるように、他のペプチドまたは蛋白質と共に発現させてもよい。本蛋白質およびペプチドの発現を提供することによって、様々な発現後改変を行ってもよい。例えば、適当なコード配列を用いることによって、例えば、プレニル化またはミリストイル化のような脂質付加を行ってもよい。この場合、免疫保護ポリペプチドは、リポソームのような脂質膜に結合することができるように、末端部で脂質基に結合すると考えられる。投与するために、リポソームを用いてもよいが、この場合、免疫系媒介損傷から組織を保護するために本ポリペプチドと協力して作用するように、薬剤をリポソームの内腔内に導入してもよい。このように、本組成物および免疫抑制物質が局所的に作用するように、免疫抑制物質を内腔内に含めてもよい。
【００４８】
Ｈｓｐ４７のようなＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、ポリエチレンオキシ基が血流での寿命の増加を提供する場合には、ＰＥＧ付加を行ってもよい。Ｈｓｐ４７由来ポリペプチドまたは他の免疫保護ポリペプチドはまた、補体結合であってもよく、もしくは補体に結合しなくともよいＩｇＧアイソタイプのＦｃのような他の蛋白質、またはリシン、アブリン、ジフテリア毒素等、特にＡ鎖のような毒素に結合させてもよい。
【００４９】
Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、多様な方面において改変してもよい。それぞれの位置のアミノ酸のアラニン、またはバリン、特にアラニンとの段階的置換を用いたオリゴペプチド合成によって、配列類似体を調製してもよい。一般的に、置換されるアミノ酸の総数は、３個を超えず、１〜３個の範囲であり、通常１〜２個である。「スキャン」変異を生成する方法は当技術分野で既知であり、多くの異なるペプチドについて首尾よく用いられている。スキャン変異のプロトコールの例は、グスチンら（Ｇｕｓｔｉｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：２２（１９９３））；バラニー（Ｂａｒａｎｙ、Ｇｅｎｅ ３７：１１１〜１２３（１９８５））；コリチェリら（Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９９：５３７〜５３９（１９８５））；およびプレンツキら（Ｐｒｅｎｔｋｉ、Ｇｅｎｅ ２９：３０３〜３１３（１９８４））に記載される。
【００５０】
これらの組成物は、Ｈｓｐ４７ポリペプチド（例えば図１Ａを参照のこと）のようなＨｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドをコードする遺伝子を調製することによって調製することができる。遺伝子は、多くの発現ベクターが市販されている適当な発現ベクターに導入してもよく、それによって遺伝子を適当な宿主に発現させる。例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）の「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９年を参照のこと。
【００５１】
Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドは、合成によって、または上記のように組換え型技術を用いて調製してもよい。様々な市販の合成装置、例えば、アプライドバイオシステムズインク、フォスターシティ、カリフォルニア州、ベックマン等による自動シンセサイザーが利用できる。シンセサイザーを用いることによって、天然に存在するアミノ酸を非天然アミノ酸、特に側鎖が異なる長さまたは官能基等を有するＤ−立体異性体に置換してもよい。組換え技術を行う場合、複数の本ポリペプチドを、アミノ酸または配列が介在する形で縦に並べてコードする核酸配列を調製してもよく、これを単一のポリペプチドまたは頭部と尾部が結合したダイマーに切断することができる。メチオニンが存在しない場合、単一のアミノ酸切断を可能にするメチオニンを介在させてもよい。または酵素的に切断するため、特定のプロテアーゼによって認識されるコンセンサス配列を導入してもよい。特定の配列および調製方法は、利便性、費用、必要な純度等によって決定されると考えられる。
【００５２】
たいてい、用いられる組成物は、産物の調製方法およびその精製に関連した混入物質に関して、所望のポリペプチド産物を重量で少なくとも２０％、より通常、重量で少なくとも７５％、好ましくは重量で少なくとも約９５％を含み、治療目的の場合、通常、重量で少なくとも約９９．５％を含む。通常、百分率は総ポリペプチドに基づく。
【００５３】
「ブレフェルディンＡ」とは、一般的にブレフェルディンＡとして知られる、化学式１，６，７，８，９，１１ａ，１２，１３，１４，１４ａ−デカヒドロ−１，１３−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ−シクロペント［ｆ］オキサシクロトリデシン−４−オンを有する化合物のみならず、ブレフェルディンＡクラスの他のメンバー、または同じもしくは類似の作用機序を有する他の薬剤を意味する。
【００５４】
「免疫保護量」とは、組織、好ましくは血管内皮組織のリンパ球、ＮＫ細胞、またはＮＫ様細胞媒介破壊を減少または消失させることができる、ブレフェルディンＡ、免疫保護ポリペプチド、またはそれをコードする発現可能な核酸の量を意味する。免疫保護量は、それに対して組成物が用いられる適応に応じて異なってもよく、当業者はさらに実験を行うことなく経験的に決定してもよい。
【００５５】
ブレフェルディンＡに関して、この薬剤は、同じクラスの薬剤および同じまたは類似の作用機序を有する薬剤と共に周知であり、当技術分野において日常的に用いられている（例えば、ジアンら（Ｊｉａｎｇ）、上記およびワダら（Ｗａｄａ）、上記を参照のこと）。ブレフェルディンＡを投与するための方法および投与様式は当技術分野で既知であり、本明細書において免疫系細胞媒介障害から組織を保護するために用いてもよい。
【００５６】
ブレフェルディン、Ｈｓｐ４７関連ポリペプチドおよびそのような免疫保護ポリペプチドをコードする発現可能な核酸、またはその組合せを含む本組成物は、インビトロにおいて、ＴまたはＮＫ細胞による標的抗原提示細胞、特に血管内皮細胞の溶解を阻害するために用いることができる。このように、細胞の混合物を維持することを望む研究において、リンパ球が活性化されて、マクロファージもしくはＢリンパ球、または標的細胞として作用する可能性がある他の細胞、例えば新生物細胞、ウイルス感染細胞等のような抗原提示細胞を殺す場合、試験のあいだ細胞集団が維持されるように、溶解を阻害することができる。
【００５７】
ブレフェルディン、Ｈｓｐ４７関連ポリペプチドおよびそのような免疫保護ポリペプチドをコードする発現可能な核酸またはそれらの組み合わせを含む本組成物は、エクスビボで用いてもよい。器官または細胞を移植する場合、より詳しくは固形器官または特定の細胞、例えば骨髄を移植する場合、それらが異種であれ同種異系であれ、ドナーの器官または細胞は本組成物を含む培地中に液浸させてもよい。このようにして、インプラントと共に存在するリンパ球は、移植片対宿主病に関与しないように阻害される。一般的に、組成物の濃度は組成物の活性、所望の阻害レベル、ＣＴＬ活性化に影響を及ぼす他の組成物の存在等に応じて、培地中で変化してもよい。通常、濃度はポリペプチド約０．１〜１００ μｇ／ｍｌの範囲であり、より通常約１〜１０ μｇ／ｍｌの範囲であるが、これらの範囲外の濃度を用いてもよい。ブレフェルディンＡの濃度は一般に経験的に決定してもよく、薬剤のインビボ投与に関して当技術分野で既知の濃度に関連する。液浸培地の他の成分は、一般的に器官保存液、例えばＨＢＳＳにおいて通常用いられる構成成分であると考えられる。器官を培地において維持する期間は、一般的に約２〜７２時間の範囲である。
【００５８】
ブレフェルディン、Ｈｓｐ４７関連ポリペプチドおよびそのような免疫保護ポリペプチドをコードする発現可能な核酸またはその組合せを含む本組成物はまた、インビボで用いてもよく、自己免疫疾患を治療するために、または器官もしくは細胞（例えば骨髄）移植を促進するために都合のよい任意の手段によって投与する。移植の場合、本組成物は、移植前に投与してもよく、投与は通常、移植前約１４日以内に開始し、好ましくは、投与の３日以内に少なくとも１回の投与を行う。本組成物は、移植前約６時間に開始する期間において投与してもよく、その後既定のスケジュールに従って、通常３０日以内、より通常２０日以内継続してもよい。しかし、移植後、器官または細胞に対するレシピエントの反応に応じて、必要に応じて本組成物を投与してもよい。場合によっては、本組成物は、移植片が宿主に存在する限り、慢性的に投与してもよい。インビボで用いられる他の型は、本組成物を炎症領域、例えば関節、靱帯、腱等と共に、肝臓のような様々な器官に注射することを含む。
【００５９】
インビトロ、エクスビボ、またはインビボ治療の際に存在してもよいその他の免疫抑制物質には、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、改変コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、イムラン、アザチオプリン、Ｄ−ペニシラミド、ＭＭＦ（モフェチル）、メトトレキセート、シクロフォスファミド、金製剤、サリチル酸塩、スルファザリシン、抗マラリア薬およびＮＳＡＩＤＳの注射可能、非経口、または局所型が含まれる。抗ＣＤ５、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）Ｍａｂ、抗ＣＤ４、ジフテリアＩＬ−２融合毒素、可溶性ＴＮＦ−Ｒおよびダイマー、可溶性ＩＬ−１−Ｒ、キメラ抗ＴＮＦ−αＭａｂ、抗ＩＣＡＭ−１ Ｍａｂ、ＯＫＴ３、抗胸腺血清／Ａ６、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−２、抗ＣＤ７と共に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＬＦＡ−１およびＣＤ２８に対する抗体を含む生物薬剤を本組成物と共に用いてもよい。一般的に、存在する場合には治療下用量、すなわち通常用量の約５％以上で、約７５％以下、通常約１０％〜６０％の範囲の用量を用いる。
【００６０】
場合によっては、本組成物は様々な免疫刺激物質と共に投与してもよい。そのような態様は、免疫系が例えば化学療法剤によって損なわれている場合に存在する。そのような場合、免疫応答を強化することが望ましい。本組成物をＩＬ−２および他のインターロイキン、インターフェロン、サイトカインまたはケモカインのような免疫刺激物質と共に用いると、それらに関連する副作用が減少する。そのような副作用は、免疫刺激物質による治療にしばしば関連する血管滲出症候群の改善を含む。
【００６１】
一般的に、投与される本組成物の１回投与は、宿主の約０．１〜５０、より通常約１〜２５ ｍｇ／ｋｇの範囲であると考えられる。宿主は、家畜動物、ペット、実験動物、霊長類、特にヒトを含む如何なる哺乳類であってもよい。量は一般的に、免疫保護剤またはポリペプチドの半減期に応じて調節されるが、半減期は一般的に少なくとも１分、より通常少なくとも約１０分、望ましくは約１０分〜１２時間である。個々の用量または持続的注入または反復用量に関して有効性が得られる限り、短い半減期も許容される。薬剤またはポリペプチドの半減期が長い場合、または粒子を含む徐放性組成物のようなデポーとして提供する場合、長期間にわたってペプチドを維持するマトリクス、例えばコラーゲンマトリクスに導入される場合、実質的に持続的な速度で長期間にわたってペプチドを持続的に注入するポンプを用いる場合、範囲の低い方の用量およびさらに低い用量を用いてもよい。
【００６２】
移植は、器官または細胞が同種異系または異種である、特にクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ抗原の１つまたは複数がレシピエントと比較してドナーとは異なる、心臓、腎臓、肺、眼、肝臓、消化管、血管、または他の器官およびβ島細胞、骨髄細胞、または他の細胞のような如何なる器官または細胞を含んでもよい。
【００６３】
ブレフェルディン、Ｈｓｐ４７関連免疫保護ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸を含む本免疫保護組成物は、それ自身の結合物またはその組合せとして、薬学的に許容される媒体、例えば、生理食塩液、ＰＢＳ、水性エタノール、グルコース、プロピレングリコール等の中で製剤として調製してもよく、または一般的に薬学的に有効な用量で固形製剤として調製してもよい。ブレフェルディンＡ、Ｈｓｐ４７ポリペプチドまたはその他の免疫保護ポリペプチドの濃度は、特定の目的に関して従来の方法に従って経験的に決定される。製剤は、殺菌剤、安定化剤、緩衝剤等を含んでもよい。宿主に投与される量は、投与される宿主、予防または治療のような投与の目的、宿主の状態、投与様式、投与回数および投与間隔等に応じて変化すると考えられる。本組成物の半減期を増強するために、組成物をカプセルに封入する、リポソームの内腔に導入する、コロイドとして調製してもよく、またはエクスビボもしくはインビボでの組成物の寿命を増加させる他の従来の技法を用いてもよい。一般的に、免疫保護量の用量は、バイアル等のような適当な容器に、液体または固体（例えば凍結乾燥）型として充填することができる。液体の場合、組成物は好ましくは薬学的に許容される媒体（担体）中に存在する。個体の場合、液体（例えば水、または薬学的担体）として再調製した際に、薬学的に許容される組成物が形成されるように調製すべきである。
【００６４】
実施例は、ヒト臍帯試料に由来する内皮細胞培養物のＣＩＫ細胞溶解に及ぼすブレフェルディンＡと、ポリペプチドＡＶＬＳＡＥＱＬＲを含むＨｓｐ４７ポリペプチドの作用を開示する。これらの実験から、内皮細胞のＣＩＫ溶解がブレフェルディンＡによって、そして内皮細胞とブレフェルディンＡとの接触の際に発現される少なくともＨｓｐ４７によって阻害されることが示された。以下の考察は、他の実験結果と共に本明細書において記載した実施例を要約する。しかし、そのような結果は、本発明の方法および組成物が内皮細胞の望ましくない溶解のみならず、他の細胞、組織、および器官に対する免疫媒介損傷を改善するために用いることができるという点において、本発明の範囲の単なる例示である。その上、そのような組成物および方法の作用は、ＣＩＫ細胞に限定されず、非ＭＨＣ Ｉ拘束細胞障害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞全般に及ぶ。この点において、本発明の方法および組成物が非ＭＨＣ Ｉ拘束ＣＴＬを阻害するが、他の免疫応答の様式は有意に影響を受けないことに注目すべきである。この点において、Ｈｓｐ４７ポリペプチドによって処置した、またはＨｓｐ４７ポリペプチドを処置しない全身放射線照射マウスについてＢＭＴ実験を実施した。移植片対宿主病は、非Ｈｓｐ４７処置群において認められた。Ｈｓｐ４７処置群のメンバーの中で、移植片対宿主病を発症したマウスはなかった。その上、調べた期間において、免疫系全体が抑制されれば起こると予想される日和見感染症を発症したマウスはなかった。
【００６５】
実施例は、同種異系および自己ＣＩＫが、リンパ腫瘍、骨髄腫瘍および固形腫瘍を含む多様な造血および固形腫瘍標的のみならずインビトロ培養ＥＣに対して高い細胞障害性を有することを示している。ＣＩＫはまた、さらなる癌標的を溶解する（ロペスら（Ｌｏｐｅｚ）、Ｆａｓｅｂ． Ｊ． ９：Ａ１０２４（１９９５）；ルら（Ｌｕ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１６８７〜１６９６（１９９４）；メータら（Ｍｅｈｔａ）、Ｂｌｏｏｄ ８６：３４９３〜３４９９（１９９５）；シュミット・ウルフら（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｆ）、Ａｎｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ７４：５１〜５６（１９９７））。調べた標的は全て正常レベルのＭＨＣ Ｉを発現している。インビトロにおいてＭＨＣ Ｉ／ＴｃＲ相互作用を予防または破壊できることが証明された抗体である、抗ＭＨＣクラスＩ Ｍａｂ Ｗ６／３２（シールズら（Ｓｈｉｅｌｄｓ）、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ５１：５６７〜５７０（１９９８））は、ＣＩＫ媒介標的溶解を遮断しない。ＣＩＫ媒介ＧｖＬ作用の特性は、同じドナーからの臍帯由来ＣＩＫおよびヒト臍帯由来内皮細胞を用いた５１Ｃｒ放出アッセイ法において純粋に自己プロセスであることが示された。これは、ＣＩＫが非古典的なＭＨＣ Ｉ拘束細胞障害性Ｔ細胞を表すという考え方と一貫し、この認められた溶解が同種異系を認識した結果を表す可能性は除外される。
【００６６】
ＣＩＫは、マウスモデルにおいて測定可能なＧｖＨＤを引き起こさずに強いＧｖＬ作用を示すことから注目すべきであるが、これはヒトにおいても確認された知見である。この知見は、Ｂ細胞リンパ腫ＳＵ−ＤＨＬ４および慢性骨髄性白血病に関するＳＣＩＤ／ｈｕインビボ腫瘍追放モデルに関して報告された（ルら（Ｌｕ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１６８７〜１６９６（１９９４）；ホイルら（Ｈｏｙｌｅ）、Ｂｌｏｏｄ ９２：３３１８〜３３２７（１９９８））。この例では、完全な厚みの正所性ヒト皮膚異種移植片を有するマウスＳＩＣＤシステムを用いて、皮膚移植片の血管壁にヒト細胞接着分子を提供した。これは、ＣＩＫによる同種異系認識とＧｖＨＤの可能性がないことを証明した。固形腫瘍のヒト由来血管新生のみがＣＩＫ媒介免疫監視の選択的な標的となるのであって、腫瘍の近傍外の生理学的に正常な血管床は標的とはならない。
【００６７】
ＣＩＫ標的認識における明確な差は、細胞接着分子の分析を行うと明らかとなる。本発明者らの研究は、腫瘍標的上のＩＣＡＭ−１とＣＩＫイフェクター細胞上のＬＦＡ−１との相互作用が、腫瘍標的のＣＩＫ媒介溶解のプロセスにとって重要であることを示している。このＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用は、ＣＩＫ媒介ＥＣ溶解に関与していないように思われる。これらの知見は、ＥＣとの相互作用とは反対に、標的細胞に接着するためのＣＤ３＋５６＋ Ｔリンパ球の必要条件に関するこれまでの報告と一致する（ルら（Ｌｕ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１６８７〜１６９６（１９９４）；シュミット・ウルフ（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｆ）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６９：８５〜９０（１９９６））。ＣＴＬは、腫瘍標的との相互作用においてＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１を利用する。ＭＨＣ Ｉ／ＴｃＲライゲーションが存在しなければＮＫ細胞は、ＩＡＣＭ−１／ＬＦＡ−１が確認された唯一の刺激シグナルを提供する状況では、十分な非殺シグナル伝達を提供しない標的を溶解する。ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１ライゲーションを通じてのＴ細胞共刺激のメカニズムは、Ｔ細胞／腫瘍標的界面におけるミオシン運動蛋白質によって媒介される共刺激シグナル伝達分子の蓄積を伴うことが最近発見され、増幅された持続的なシグナル伝達プロセスが起こることが最近見出された（ウルフィング（Ｗｕｌｆｉｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２２６６〜２２６９（１９９８））。このプロセスは、ｓｙｎキャッピングマイクロビデオ撮影法を通じてリアルタイムで得ることができる（ウルフィングら（Ｗｕｌｆｉｎｇ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：６３０２〜６３０７（１９９８））。このＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用はまた、高内皮細静脈でのリンパ節ホーミングのプロセスにとっても重要である（ローレンスら（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：１０２５〜１０３１（１９９５）；オッペンハイマー・マークスら（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ−Ｍａｒｋｓ）、Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４５：１４０〜１４８（１９９０）；ロゼンマンら（Ｒｏｓｅｎｍａｎ）、Ｊ． ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ． ５３：１〜１０（１９９３））。ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用は、このプロセスは、ＥＣとの相互作用において、ＬＦＡ−１とＴｃＲのキャッピングを欠損することが判明したため、非活性化ＥＣとの相互作用にとって必要でないように思われる（コゼニーら（Ｋｏｚｅｎｙ）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ６：１１７０〜１１７６（１９８８））。ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１依存的腫瘍溶解およびＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１依存的ＥＣ溶解プロセスが存在することは、ＣＩＫ媒介細胞障害性に関して少なくとも２つの異なる経路が存在することを示唆している。
【００６８】
ＣＩＫの単細胞クローニングによって、抗腫瘍活性を有する活性化非古典的ＭＨＣ Ｉ拘束キラーＴ細胞の内皮細胞溶解が、活性化Ｔ細胞のクローン特性であることが初めて証明された。細胞障害性内皮および腫瘍認識のメカニズムは、標的認識能を発現しない、２つのうちのいずれか１つ、または双方を発現する個々のＣＤ３＋５６＋ ＣＩＫクローンに互いに独立して分離する。ＣＩＫクローンの大多数はα／β Ｔ細胞であるが、本発明者らは、γ／δ Ｔ細胞も細胞障害性ＣＩＫに分化することができることを証明した。
【００６９】
腫瘍またはＥＣ標的のいずれかに対してＣＩＫが溶解能を示さないことから、少なくとも３つの異なるクローン集団が存在する可能性がある。それぞれの標的クラスは、それを認識するために特定のカスケードのシグナル伝達分子を必要としてもよい；特定のＣＩＫクローンにおいて特定のシグナル伝達カスケードメンバーが存在しなければ、所定の標的に対して無効なシグナル伝達が起こる可能性がある。または、細胞障害性認識事象の実施を妨害する多くの独立した阻害シグナル伝達経路が存在する可能性がある；ＣＩＫ溶解からの保護は、標的細胞のそれぞれのリガンドの発現能に起因する可能性がある。最後に、特定のＣＩＫ殺細胞メカニズムに対する感受性は、腫瘍標的とＥＣとでは異なる可能性があり、したがって、個々のクローン発現パターンおよび代わりの標的攻撃メカニズムのレベルが、有効な標的溶解において認められた差の説明となる可能性がある。ＦＡＣＳ分析によって、標的がＭＨＣ Ｉの高レベルを発現すること、そして機能的ＣＩＫはα／β ＴｃＲ（＞９５％）、またはγ／δ ＴｃＲ（＜５％）、ＣＤ３／ＣＤ５（＞９８％）、ＣＤ８（＞８０％）、またはＣＤ４（＜１５％）、ＫＩＲ分子（ＤＸ９に関して５〜８％染色）、およびＣＤ５６（バルク培養において＞２５％、機能的クローンの＞９８％）を発現することが示されている（ルら（Ｌｕ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１６８７〜１６９６（１９９４））。しかし、本発明者らは、表２に要約する上記のＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１以外の任意の細胞接着分子に関しても、または主要なＴおよびＮＫ表面蛋白質に関しても、ＣＩＫによる標的認識および溶解に機能的に関与していることを証明することができなかった。
【００７０】
これらの標的に対するパーフォリン／グランザイム対Ｆａｓに基づくＣＩＫ細胞障害性の関与を推定するために、５１Ｃｒ放出細胞障害性アッセイ法の前に、イフェクター細胞をＣＭＡおよびＢＦＡ（ブレフェルディンＡ）によって処置した（カタオカら（Ｋａｔａｏｋａ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６：３６７８〜１６８６（１９９６））。本発明者らの結果は、ＥＣ溶解が実質的に完全にパーフォリンおよびグランザイムに基づくのに対し、腫瘍標的は双方の経路を利用して死滅させられることを証明する。これまでの研究から、腫瘍標的のＣＩＫ媒介溶解はｃＡＭＰおよびＣａ２＋依存的であることが証明されている（メータら（Ｍｅｈｔａ）、Ｂｌｏｏｄ ８６：３４９３〜３４９９（１９９５））。
【００７１】
ＢＦＡによるＦａｓＬ表面発現の阻害試験と、コンカナマイシンＡによるパーフォリン枯渇試験の結果を組みあわせると、腫瘍標的に対する細胞障害性がグランザイム／パーフォリンを通じて媒介され、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路が重要に関与していることが示される。対照的にＥＣ溶解は、独占的にグランザイム／パーフォリンを通じて媒介される。この結果は、ＥＣと腫瘍標的生理学には、ＣＩＫに対するその感受性に関与する差が存在することを確認する。
【００７２】
ＣＩＫはアネルギー限定自己反応性Ｔ細胞の可能性がある（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：３５１〜３５７（１９９７））。もしそうであるならば、それらは、その点で機能を喪失してもしていなくてもよい異種の分化したＣＤ補体を有するＴ細胞のプールを表すと考えられる（ガイドスら（Ｇｕｉｄｏｓ）、Ｊ． ｏｆ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２：８３５〜８４５（１９９０））。ＣＩＫ培養に類似した条件は、高用量ＩＬ−２刺激を提供して、それによりアネルギーを克服することによって、アネルギーＴ細胞を救済する可能性がある（マドレナスら（Ｍａｄｒｅｎａｓ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９３：９７３６〜９７４１（１９９６））。
【００７３】
等しく機能的なクローンにおいて発現された表面マーカーが複数であると仮定すると、ＣＩＫ Ｔ細胞の特異的系列の存在および末梢血において認められる明確な前駆細胞タイプからの選択的な増殖は、起こり得ないように思われる。むしろ、機能を調べた際にその有効なシグナル伝達能を喪失しているＴ細胞およびＮＫ細胞上に表面マーカーが存在することは、アネルギー細胞の顕著な特徴として報告されている（フィンクら（Ｆｉｎｋ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：４２７０〜４２８１（１９９４））。アネルギー状態におけるＴ細胞およびＮＫ細胞の生物学に関する本発明者らの理解はなおもわずかである。しかし、高レベルのＩＬ−２が、これまでアネルギーであったＴおよびＮＫ細胞に細胞分裂を再開させ、もはや自己反応性でない新しい機能的特異性を発生させることが示されている（アルターズら（Ａｌｔｅｒｓ）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５６：６３３〜６３８；ホグルンドら（Ｈｏｇｌｕｎｄ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５５：１１〜２８（１９９７）；カルプスら（Ｋａｒｐｕｓ）、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：７２１〜７３０（１９９４）；カーレ（Ｋａｒｒｅ）、Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ２：２９５〜３０９（１９９１）；リュングレンら（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １１：２３７〜２４４（１９９０）；マドレナスら（Ｍａｄｒｅｎａｓ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：９７３６〜９７４１（１９９６）；ノッサル（Ｎｏｓｓａｌ）、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６９０：３４〜４１（１９９３）；ローゼンバーグ（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ）、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５１：８５〜２１４（１９９２））。このように、ＣＩＫ培養において得られた高用量のＩＬ−２は、救済プロセスにおいて、これまで持っていた自己反応能を回復しないアネルギーＰＢＭＣ Ｔ細胞の不均一なプールを救済する可能性がある。したがって、新たに獲得した抗腫瘍機能に関係するイフェクター分子の新規発現の他に、ＣＩＫは今は非機能的である受容体の、これまでの個々の細胞表面発現パターンを単に維持する可能性がある。このモデルは、等しく機能的なＣＩＫ上に存在するＦＡＣＳマーカーについて認められた不均一性と共に、本発明者らの機能的分析において認められたＴｃＲ／ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ４、およびＣＤ８に関連した機能の喪失も考慮する。
【００７４】
細胞障害性ＴおよびＮＫのＥＣとの相互作用のプロセスにおけるさらなる洞察は、ＢＦＡがＥＣ溶解を用量依存的に特異的に阻害するという知見から得られた。これは、活性化ＮＫまたはＴ細胞によってＥＣ溶解を抑制することができる物質に関する最初の報告である。ＢＦＡは、物質の除去後少なくとも６時間持続する抵抗性ＥＣ状態を誘導する。
【００７５】
ＢＦＡ処置は、シスと内側ゴルジ体との蛋白質輸送に関与するＧ蛋白質の選択的中毒によって、処置細胞において複雑な一連の変化を引き起こすと報告されている。この輸送が阻害されると、肥大ＥＲ系への分泌指向蛋白の支援（ｂａｃｋｉｎｇ−ｕｐ）が起こり、最終的にＥＲとシスゴルジ体との融合に至る（リッピンコット・シュワルツら（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ）、Ｃｅｌｌ ５６：８０１〜８１３（１９８９））。ＥＲ体が肥大すればＥＲ常在蛋白質の合成が増加する。ＥＲ常在蛋白質は、Ｃ末端の４つのアミノ酸「ＫＤＥＬ」または「ＲＤＥＬ」−ＥＲ保持シグナルを特徴とする。そのようなＥＲ常在蛋白質の例は、Ｈｓｐ４７、カルレチクリン、Ｇｒｐ７８、およびＧｒｐ９４である（フェレイラら（Ｆｅｒｒｅｉｒａ）、Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １３８：２７３〜２８５（１９９４）；フェレイラら（Ｆｅｒｒｅｉｒａ）、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：５１８〜５２６（１９９４）；フェレイラら（Ｆｅｒｒｅｉｒａ）、Ｃｏｎｎｅｃｔ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ３３：２６５〜２７３（１９９６）；スミスら（Ｓｍｉｔｈ）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１８３２３〜１８３２８（１９９５））。これらのＥＲ常在蛋白質は、それらがＫＤＥＬ／ＲＤＥＬ受容体、Ｅｒｄ２．１、およびＥｒｄ２．２によってＣａ２＋依存的に認識され、結合してＥＲに戻されるために、ＥＲ体から分泌されない。ＥＲは、主な細胞内Ｃａ２＋貯蔵体として作用する。ＢＦＡ処置によってＥＲが肥大すると、細胞Ｃａ２＋恒常性が乱れ、ＫＤＥＬ／ＲＤＥＬ受容体の不活化が起こる（レウェリンら（Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２４０：３６〜４０（１９９７））。Ｈｓｐ４７を含むＥＲ常在蛋白質は、このようにして自由に分泌されるようになる（ヒュら（Ｈｕ）、Ｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９：３５０〜３６７（１９９５）；ヒュら（Ｈｕ ）、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９：２１４〜２３４（１９９５））。したがって、ＥＣのＢＦＡ処置によって、Ｈｓｐ４７の産生の増加と、そうでなければこのＥＲ常在蛋白質の自由な分泌が起こる。生理的条件では、Ｈｓｐ４７の細胞外への輸送は、シャペロンコラーゲンＩおよびＩＶの発現と同時輸送とに結びついている（ヤマムラら（Ｙａｍａｍｕｒａ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２４４：６８〜７４（１９９８））。
【００７６】
ＢＦＡによって誘導されるＥＣの抵抗性状態の３５Ｓ＊パルス追跡標的蛋白質抽出物を、無処置の感受性表現型と比較した。ＢＦＡ処置ＥＣの抽出物において増加した一貫した放射性標識蛋白質は、４６．５ ｋＤａの蛋白質ｐ４６．５であった。トライトン−Ｘ−１１４による０〜４℃での相分配を用いて、本発明者らは、処置したＥＣの細胞膜にｐ４６．５が少なくとも部分的に局在することを証明することができた。無傷のＢＦＡ処置ＥＣ単層の表面蛋白質を水溶性の、脂質不溶性試薬ビオチン−ＳＳ−ＮＨＳによってビオチン化すると、Ｈｓｐ４７および２５〜２７ ｋＤａ関連蛋白質がＢＦＡ処置後に細胞表面でアップレギュレートされることが示された。図１４Ａおよび１４Ｂを参照のこと。生化学的に、ｐ４６．５は、ゼラチンセファロースに結合してそれによって精製することができ、ＦＰＬＣ調製の際に競合的ＲＧＤペプチド結合および低ｐＨ溶出緩衝液の双方で溶出させることができる。ｐ４６．５の全ての生化学的特徴は、齧歯類Ｈｓｐ４７について公表されたデータと適合していた（ヒラヨシら（Ｈｉｒａｙｏｓｈｉ）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：４０３６〜４０４４（１９９１）；ジェインら（Ｊａｉｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０４：６１〜６８（１９９４）；ナンダンら（Ｎａｎｄａｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６８：１０５７〜１０６１（１９９０）；バイランコート（Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２７４：７９３〜７９８（１９９１））。機能的分析を行ったところ、ＢＦＡ処置と同様に、ゼラチン精製ｐ４６．５によってもこれまでＣＩＫ感受性であったＥＣの用量依存的な保護能が得られることが証明された。これは、５１Ｃｒ細胞障害アッセイ法の前に、ＥＣをｐ４６．５と共にプレインキュベートすることによって示された。これは、ＥＣを非ＭＨＣ Ｉ拘束細胞障害性から保護する、外から加えた蛋白質に関する最初の報告である。このｐ４６．５蛋白質は、リンパ芽球様細胞の抵抗性状態の膜蛋白質に対して作製された抗血清と、そして精製全抗熱ショック蛋白質モノクローナル抗体Ｎ６との免疫沈降物において交叉反応した。
【００７７】
ｐ４６．５は、特異的抗Ｈｓｐ４７モノクローナル抗体ＳＰＡ−４７０を通じてＮ６免疫沈降の最初の膜上でヒトＨｓｐ４７に対して陽性に同定された。
【００７８】
ヒトｈｓｐ４７の完全な配列は、ヒトｈｓｐ４７遺伝子全体に及ぶ部分的であるが、重なり合うｃＤＮＡ遺伝子断片のＰＣＲに基づく単離後に、クラーク＆サンドワル（Ｃｌａｒｋｅ ａｎｄ Ｓａｎｄｗａｌ）によって初めて記述された（クラークら（Ｃｌａｒｋｅ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１２９：２４６〜２４８（１９９２））。２つのプラスミドがサンドワル博士によって提供され、それぞれ、３５０ ｂｐと１３００ ｂｐの重なり合う部分的ｈｓｐ４７ ｃＤＭＡ断片に対応した。より小さい断片も同様に、ｈｓｐ４７遺伝子の成熟遺伝子産物をコードしない５’非翻訳領域を含んでいた。断片の重なり領域内において、共有される制限酵素部位はなかった。ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発を用いて、２つのｃＤＮＡ断片を増幅して、最終的にヒトＨｓｐ４７蛋白質をコードする１つの隣接するリーディングフレームに結合させた。公表された配列データおよび本発明者らのクローニング部位の選択に基づいて、プライマーの２つの組をＰＣＲのためにデザインした。人工的ＢａｍＨＩ部位をコード配列の５’末端に隣接して導入した。人工的ＥｃｏＲＩ部位をコード配列の３’末端に導入すると共に、ｃＤＮＡの結合を容易にするためにＭｓｃＩ部位を２つのクローンの間の重複領域のそれぞれの側に導入した。２つのプラスミドをＰＣＲ増幅した後、より小さい断片をＭｓｃＩ制限消化して、ゲル精製した。このより小さい断片を１３００ ｂｐ断片上で鋳型として５’プライマーとして用い、それによりヒトｈｓｐ４７について最初に報告された発現可能な遺伝子カセットを作製した。この反応のＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ制限細菌蛋白質発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ１に定方向にライゲーションして、形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌宿主細胞の単一のコロニーからインビボで増幅した。
【００７９】
シグナルペプチド「ＭＲＳＬＬＬＧＴＬＣＬＬＡＶＡＬＡ」を有しないヒトｈｕｈｓｐ４７をクローニングした。ｐＧＥＸ−４Ｔ細菌蛋白質発現系をＩＰＴＧ誘導のために用いて、Ｈｓｐ４７を過剰発現させて、ヒトＨｓｐ４７とＮ−末端タグを付けたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質を得た。後者によって、クロスリンクした還元型グルタチオンによるＧＳＴ基質カラム上での１段階アフィニティ精製プロトコール、およびこの融合パートナーと遊離の可溶性の還元型グルタチオンとの競合的結合を通じての溶出を用いることができる。ＧＳＴそのものは、ほとんどの細胞アッセイ法において毒性がないことが示されており、５１Ｃｒ放出アッセイ法において標的細胞障害性を増加または減少させなかった。精製組換え型ｈｕＨｓｐ４７は、ＥＣを用量依存的に保護する。
【００８０】
最適な真核細胞発現のために、コザックの鋳型として真核生物バキュロウイルス蛋白質発現ベクターｐＭｅｌ−Ｂａｃおよびメリチン分泌リーダー配列を用いて、コザック開始配列および機能的分泌シグナルを、ＰＣＲと制限酵素クローニングの組合せによって導入した。高レベルの蛋白質発現を確実にするために、強いＣＭＶＩＥプロモーターの選択を行った。ＥＣのＢＦＡ処置によって、Ｈｓｐ４７上のＥＲ保持シグナル「ＲＤＥＬ」の存在にもかかわらず、細胞外Ｈｓｐ４７の著しい分泌の増加を認めた。上記のように、ＢＦＡ処置によってＥＲ部分のＣａ２＋流動の混乱が起こり、その結果Ｈｓｐ４７を含むＫＤＥＬ／ＲＤＥＬ蛋白質の機能障害ＥＲ保持が起こる。ＢＦＡ処置の非存在下においてＨｓｐ４７を分泌させるために、本発明者らは、構築物の一つにおいて、Ｈｓｐ４７の「ＲＶＥＬ」配列を欠失させた。この考え方と一致して、この構築物のトランスフェクションによって、コラーゲンＩ型とＩＶ型との共輸送を通じて細胞表面に輸送されるようになるほとんどのＥＲ保持型によって媒介される場合より、Ｈｓｐ４７蛋白質の分泌の増加とより高い（総）レベルでのＥＣのＣＩＫからの保護が得られる（ヒュージズら（Ｈｕｇｈｅｓ）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６３：５７〜６５（１９８７））。Ｈｓｐ４７とプロコラーゲンＩの発現は、強く結合していることが判明した（クラークら（Ｃｌａｒｋｅ）、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２１：１９３〜１９９（１９９３））。
【００８１】
ｅＧＦＰ蛋白質融合タグを用いたＨｓｐ４７の原核細胞および真核細胞蛋白質発現ベクターの双方へのさらなるＰＣＲ指向クローニングによって、完全長および切断変異型Ｈｓｐ４７遺伝子カセットによるＦＡＣＳ分析を実施することが可能となった。完全長のｅＧＦＰ−Ｇｓｐ４７蛋白質によるＦＡＣＳ分析によって、成熟ＣＩＫの２６％サブセットが染色された。
【００８２】
ヒトＨｓｐ４７遺伝子の推定ペプチド配列と、上記に引用した利用できる公表データ（クラークら（Ｃｌａｒｋｅ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１２９：２４６〜２４８（１９９２）とを比較分析すると、少なくとも３つの異なる機能的蛋白質ドメインが存在することが示される。本発明者らは、本研究においてさらに１つのドメインが存在することを見出した。このように、Ｈｓｐ４７は、４つのドメイン蛋白質として最も単純化して示すことができる（図１５Ａを参照のこと）。互い違いのプライマーによるＰＣＲならびにその後の原核生物および真核生物蛋白質発現ベクターへのクローニングを通じて、Ｈｓｐ４７の切断型の保護機能を比較した。図１５Ｃを参照のこと。切断は、その推定されるドメイン構造に従って、ｈｓｐ４７遺伝子断片を欠失するように選択した。図１５Ｂを参照のこと。
【００８３】
配列相同性から、Ｈｓｐ４７は、入ってくるセリンプロテアーゼの活性部位でリジンに対する理論的特異性を有するセリンプロテアーゼ阻害剤である。セルピンは、切断可能な基質を表す「おとり（ｂａｉｔ）」として作用し、これはセリンプロテアーゼの活性中心との一過性ではなくて安定な共有結合を形成する。次に、それらはもはや放出されないため、このようにしてそれらが反応するセリンプロテアーゼの活性部位が阻害される。このように、セルピンは化学量論的な１：１の比でセリンプロテアーゼを不活化する。配列の相関にもかかわらず、Ｈｓｐ４７に関してはセリンプロテアーゼの基質はこれまで同定されていない。一部の著者が、その「活性部位」アミノ酸が改変しているために、セルピンドメインが非機能的であると予測している（ヒラヨシら（Ｈｉｒａｙｏｓｈｉ）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：４０３６〜４０４４（１９９１））。本発明者らは、ＣＩＫ様のグランザイムＡの顆粒含有量を有する非常に特異的なセリンプロテアーゼを評価するために、セルピンドメインに及ぶ切断分析においてＨｓｐ４７変異体を作製したが、ＢＬＴエステラーゼまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシフトアッセイ法においてグランザイムを攻撃する非可逆的阻害剤としてのＨｓｐ４７の機能を証明することはできなかった（データは示していない）。本発明者らのデータは、インビトロＢＬＴエステラーゼアッセイ法において主なセリンプロテアーゼを阻害することができなかった、精製マウスＨｓｐ４７を用いた研究に一致する（ダビッズら（Ｄａｖｉｄｓ）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：４３７〜４３８（１９９５））。５１Ｃｒ放出アッセイ法において、セルピンドメインが枯渇すれば、影響を受ける切断変異体の機能が喪失した。しかし、遺伝子をさらに欠失させると、下記に示すＨＬＡ−Ａ２コンセンサス領域のみを発現する、より小さい切断型Ｈｓｐ４７変異体に対して完全な機能を再度確立したことから、本発明者らは、Ｈｓｐ４７のセルピンドメインのＣ−末端切断の機能の喪失が、さらなる切断によって正常化する蛋白質において構造の変化を引き起こすと仮定する。
【００８４】
第二のドメインは上記のような短いＣ末端ＥＲ保持シグナル「ＲＤＥＬ」である。
【００８５】
第三のドメインは、機能的に明白なコラーゲン／ＲＧＤ結合ドメインである。これまで、これは直接に存在位置が示されていなかった。マウスＨｓｐ４７のＣ末端アミノ酸３２個、またはＮ末端アミノ酸３４個のいずれかを切断すると、ｍＨｓｐ４７のゼラチン結合活性が減少することが報告されている（ダビッズら（Ｄａｖｉｄｓ）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：４３７〜４３８（１９９５））。しかし、現時点では、これらの作用がＨｓｐ４７切断変異体における構造的変化に副次的なものであるか否か、またはそれらが機能的ＲＧＤ結合ドメインの正確な位置を示しているか否かは明確でない。ｍＨｓｐ４７の有意な配列相同性は、結晶化コラーゲン結合ヒトプロテインＣ阻害剤（ｈＰＣＩ）についても存在する。これによって、Ｈｓｐ４７の三次元構造の理論的モデルを形成して、蛋白質のＣ末端でのＲＧＤ結合ループを予測する試みを行った（ダビッズら（Ｄａｖｉｄｓ）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：４３７〜４３８（１９９５））。
【００８６】
第四のドメインは、ＨＬＡ−Ａ２および関連ＭＨＣ Ｉ蛋白質のａ２ドメインのα２−ヘリックスに隣接するペプチド結合溝に非常に類似したαヘリックス側鎖を含む。このＨＬＡ−Ａ２コンセンサスペプチドを合成した。このペプチドはＣＩＫ媒介殺細胞からＥＣを用量反応的に保護することができる（図１２）。したがって、Ｈｓｐ４７の免疫保護ドメインは、それ自身、非ＭＨＣ拘束殺細胞からＥＣを保護することができ、それを説明するために十分な比較的小さいペプチドドメインを含む。
【００８７】
本発明者らは、Ｈｓｐ４７と推定ペプチドが、ＭＨＣ Ｉの典型と「ミッシングセルフ（ｍｉｓｓｉｎｇ ｓｅｌｆ）仮説」（カーレ（Ｋａｒｒｅ）、Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ２：２９５〜３０９（１９９１）；カーレら（Ｋａｒｒｅ）、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：６７５〜６７８（１９８６）；リュングレンら（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １１：２３７〜２４４（１９９０））に従って、非殺細胞シグナルを通じてＥＣの保護を媒介すると仮定する。そのような関係はキラー阻害受容体（ＫＩＲ）経路について記述されている（ヘグルンドら（Ｈｏｇｌｉｎｄ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５５：１１〜２８（１９９７）。非殺細胞シグナルはＣＩＫ細胞において、コラーゲン沈着の近傍におけるコラーゲンシャペロンＨｓｐ４７の定性的および／または定量的存在を認識する、まだ同定されていない対受容体を通じて誘発される可能性があるように思われる。そのようなモデルはＣＩＫによる腫瘍の監視およびインビボでの他の活性化ＮＫおよびＴ細胞集団のメカニズムの説明となる：Ｈｓｐ４７は、コラーゲンＩまたはＩＶを含む細胞外マトリクスを能動的に沈着させる全ての細胞によってコラーゲンシャペロンとして同時に分泌される（ブリュワーら（Ｂｒｅｗｅｒ）、Ｅｍｂｏ． Ｊ． １６：７２０７〜７２１６（１９９７））。この分泌されたＨｓｐ４７は、分泌細胞の細胞表面の近傍においてフィブロネクチン、オステオネクチン、ヘパリン、およびコラーゲン分子上に偏在するフィブロネクチンコンセンサス配列（ＲＧＤ）に結合することができる（ナカイら（Ｎａｋａｉ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １６４：２５９〜２６４（１９８９））。ごく最近、Ｈｓｐ４７が細胞の表面においてテトラスパニンＣＤ９に結合することが報告された（ヘべールら（Ｈｅｂｅｒｔ）、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７３：２４８〜２５８（１９９９））。テトラスパニンは、Ｔ細胞レパートリーの形成に関与する重要な膜シグナル伝達分子である（レビーら（Ｌｅｖｙ）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６：８９〜１０９（１９９８））。関連するテトラスパニンであるＣＤ８２は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合して、ＮＫ細胞のＫＩＲ媒介非殺細胞シグナルを妨害することが最近報告された（ラガウドリエール・ゲスベールら（Ｌａｇａｕｄｒｉｅｒｅ−Ｇｅｓｂｅｒｔ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：２７９０〜２７９７（１９９７））。適当なＭＨＣ Ｉ発現レベルがなければ、ＮＫ標的監視の意味において「ミッシングセルフ仮説」に従って不履行によって殺細胞に至る。同様にして、転移細胞による適当なコラーゲン産生がなければ、そしてそれらの血管が転移組織に貢献する細胞外マトリクス（ＥＭ）産生を欠損すれば、ＣＩＫ、ＮＫ、およびＴ細胞媒介転移腫瘍監視の意味において、Ｈｓｐ４７によって媒介される非殺細胞シグナルの欠損に至ることがあり得る。
【００８８】
同様に、腫瘍の生理学的に異常な血管床は、窓状の基底膜と、正常なＥＭ産生が起こらないことを特徴とする。健康な被験者では、脾臓と肝臓の楕円形の網目構造のみが、窓状構造の基底膜を有するＥＣを有する。それらの生理学的な窓状構造の基底膜に接着するＥＣは、異常に高いＨｓｐ４７量を有することが報告されている（カサイら（Ｋａｓａｉ）、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ２８１：１３５〜１４１（１９９５））。コンフルエント５日目のＥＣと比較して、新たにコンフルエントとなったＥＣに対するインビトロでのＣＩＫ細胞障害性が高いことは、ＴＣフラスコに新鮮に播種した後になお不完全に存在する基底膜に二次的な、表面局在Ｈｓｐ４７非殺細胞シグナルの欠損を表す可能性がある（サウクら（Ｓａｕｋ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １７２：１３５〜１４２（１９９０））。Ｈｓｐ４７媒介非殺細胞シグナル理論は、細胞外マトリクス産生およびコラーゲン産生に関して組織常在細胞のＣＩＫ媒介インビボスクリーニングに対するメカニズムを提供しうる。この理論に従って、転移性固形腫瘍細胞の検出と破壊は、コラーゲンとＨｓｐ４７産生を欠損する後者が原因であると考えられる。この考え方をさらに支持するのは、Ｈｓｐ４７が腫瘍発生形質転換を受けている細胞においてダウンレギュレートされている報告である（クラークら（Ｃｌａｒｋｅ）、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２１：１９３〜１９９（１９９３）；ヒラヨシら（Ｈｉｒａｙｏｓｈｉ）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：４３０６〜４０４４（１９９１））。広範囲の固形腫瘍を比較したインビボ研究において、腫瘍がより悪性になるにつれてＨｓｐ４７の発現がますます減少していることがさらに判明し、癌患者における腫瘍の進行を臨床的に追跡するために、Ｈｓｐ４７レベルのスクリーニングを行うことが提案された（モリノら（Ｍｏｒｉｎｏ）、Ｉｎ Ｖｉｖｏ ８：２８５〜２８８（１９９４））。このように、転移性腫瘍結節およびそのＨｓｐ４７枯渇周囲は、細胞のインビボ腫瘍監視の主な標的となりうる。窓状構造の基底膜の内側に存在するＥＣは、腫瘍の血管新生血管にのみ認められ、それ自身、特異的攻撃およびその後の腫瘍血管の壊死に至るさらなる標的となる。本発明者らのＳＩＣＤ／ｈｕ−黒色種のＣＩＫ結果は、この理論と完全に一致する。
【００８９】
ＫｉＲまたはｐ４０に対する遮断抗体は、腫瘍または内皮標的の殺細胞を増強しない。しかし、その他のキラー阻害受容体の関与の可能性はなおも存在する。
【００９０】
これまでの研究は、バルク生成ＣＩＫの９５％以上がＣＤ３、ＴｃＲα／β＞ＴｃＲγ／δおよびＣＤ８＞ＣＤ４を発現するというＦＡＣＳ分析によって証明された（ルら（Ｌｕ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１６８７〜１６９６（１９９４））。遮断抗体の研究から、これらの分子はいずれもＥＣまたは腫瘍標的のいずれかに対する細胞障害性に機能的に関与していないことが示されている（表２）。
【００９１】
【表２】モノクローナル抗体によるＣＩＫ細胞障害性遮断試験
2004503463.tif 000003
【００９２】
Ｍａｂ ＮＫ−Ｂ１およびＮＫｐ４０の阻害は同様に、５１Ｃｒ放出細胞障害アッセイ法においても調べた。腫瘍またはＥＣ標的に対するＣＩＫ媒介細胞障害性におけるいずれかの分子の機能的関与は示していない。これらの受容体は、これらのＮＫマーカーの発現が非古典的ＭＨＣ Ｉ拘束細胞障害性Ｔ細胞について起こると報告されているため、アッセイした（ダンドレアら（Ｄ’Ａｎｄｒｅａ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５：２３０６〜２３１０（１９９５）；ガンペルツら（Ｇｕｍｐｅｒｚ）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１：１１３３〜１１４４（１９９５）；ラニエら（Ｌａｎｉｅｒ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：２４１７〜２４２８（１９９４）；ラニエら（Ｌａｎｉｅｒ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １７：８６〜９１（１９９６）；フィリップスら（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：１６３〜１７２（１９９６）；ロウレら（Ｒａｕｌｅｔ）、Ｃｅｌｌ ８２：６９７〜７００（１９９５）；ソダーストロムら（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：１０７２〜１０７５（１９９７））。
【００９３】
ＣＩＫはＩＬ−２との同時注射を行わずにインビボで用いることができる（ルら（Ｌｕ）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：１６８７〜１６９６（１９９４））。これは、ＩＬ−２活性化ＣＤ５６＋細胞、ＩＬ−２単独（ヤング（Ｙａｎｇ）、Ｃａｎｃｅｒ ７６：６８７〜６９４（１９９５））、またはその組合せ（フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ５：１９３３〜１９４（１９８７））による、患者の過去の治療と現在の治療との有意な差である。後者のアプローチからおそらく致命的な血管滲出症候群（ＶＬＳ）を発症する有意なリスクが報告されたが、ＶＬＳはＳＣＩＤ／ｈｕマウスのインビボ腫瘍追放モデルでは認められなかった。移植した正常なヒト皮膚においても有意なＣＩＫ浸潤は認められなかった。
【００９４】
非常に特異的な抗腫瘍活性の信頼できる増幅と生成は、臨床的用途を目的とした如何なる養子免疫療法の細胞生成にとっても必要条件である。α／βＴ細胞にＩＦＮ−γ、ＯＫＴ−３、およびＩＬ−２による高用量Ｔｈ１型ホルモン刺激を行うと、悪性造血および固形腫瘍標的に対して優れた細胞障害性を有するＣＩＫ ＡＩ細胞が得られる。タービンによって攪拌するバイオリアクターを用いると、都合がよいことが証明され、細胞溶解性ＣＤ３＋５６＋サブセットの迅速、安全、および改善された選択的増殖が得られた。細胞１０１１個の生成は、単一のバフィーコート起源から日常的に得られる。これは、その臨床適用において高用量および／または反復治療スケジュールにとって十分な数のイフェクター細胞である。ＣＩＫは、純粋なＴ細胞起源から産生して、長期間培養で維持して、凍結保存し、インビトロおよびインビボでＩＬ−２の同時投与を行うことなく適用することができる。これらの特徴によって、ＣＩＫはＬＡＫ ＮＫ誘導体と比較して、癌の養子免疫療法にとって優れた選択となる。
【００９５】
実施例１
インビトロ細胞培養
ＣＩＫ細胞の産出及び維持
スタンフォード血液センターにより得られた、正常な共同体のドナーからの全静脈血、臍帯血、および軟膜を末梢血液リンパ細胞（ＰＢＬ）源として使用した。ＰＢＬ細胞はフィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃｌａｓ、 Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心を用いて単離した。５０μｍのβ−メルカプトエタノール（ＭＥ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンＧ、１００ＩＵ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１０％ＦＣＳ（全て：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に、ＰＢＬを０．５〜２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。大顆状リンパ球（ＬＧＬ）及びＴ細胞の濃厚な集団を、その後のプラスチック及びナイロンウール粘着細胞の排除により得た。ソースのＬＧＬを、５％二酸化炭素下で３７℃にて、加湿インキュベーター内で培養した。ホルモン刺激は培養０日目の開始時、組換えヒトインターフェロンガンマ（ｒｈｕ ｇ−ＩＦＮ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡからの御厚意による贈与）の１０００ＩＵ／ｍｌの添加及び、その後の１日目（ｄ１）の５０ｎｇ／ｍｌの可溶性抗−ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ−３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤのハイブリドーマから派生）、及び３００〜５００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈｕＩＬ−２）（Ｃｅｔｕｓ／Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡからの御厚意による贈与）から成る。２１日〜２８日間、３〜４日毎に５０％の新鮮な培地及び３００〜５００ＩＵのｒｈｕＩＬ−２を添加して培養物を維持した。１４日目に腫瘍及びＥＣ標的に対する５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイ法において溶解活性を確認した。ＣＩＫのＣＤ３＋、ＣＤ５６＋二重陽性表現型の優先的な拡大が、培養物において早くも１０日目から見られ、平均１２〜１５％の細胞が二重陽性であった。初期のＣＩＫ培養物をさらにＣＤ５６−磁気ビーズカラムで濃厚にして、平均６０％ＣＤ３＋及びＣＤ５６−の二重陽性表現型（図２参照）の培養物を産出することが可能であった（図２参照）。単細胞ＣＩＫクローニング用に、Ｔ細胞をＣＤ３もしくはＣＤ５６が存在し且つＣＤ１６が存在しない細胞についてＦＡＣＳソーティングにより下記の通り供給源となるＬＧＬから精製した。９６穴プレート上のウェルにつき０．６細胞の平均密度で細胞を選別し、大量培養用の記載と同一のホルモン刺激で、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌにて２回照射自己フィーダーＣＩＫで共培養を行い拡大させた。細胞はそれぞれ２ｘ１０６細胞より多くまで拡大させ、その後下記のようにクローンの細胞毒性を調べた。
【００９６】
単一ドナーＣＩＫの大量生産には、健康なドナーのアフェレーシス産物を上記の通り処理し、ＬＧＬを単離した。ＬＧＬを上記と同一のホルモン刺激と共に、しかし、１０倍の５〜１０ｘ１０６細胞／ｍｌ密度で、タービン／インペラー撹拌の５００ｍｌ、１，０００ｍｌ（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）及びｐＯ２及びｐＨを制御した１５，０００ｍｌ（Ｃｈｅｍａｐ、Ｖｏｌｋｅｔｓｖｉｌ、Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）容積のバイオリアクター内で３７℃で培養した。１５Ｌのバイオリアクターを使用し、６００倍を超えるＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の拡大を伴う、単一ドナーからの３ｘ１０１１細胞までの拡大が可能であった。
【００９７】
ＥＣ培養、ＥＣの産出及び維持
新たに単離された単一ドナーヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙｈ博士及びＪ． Ａｌｖａｒｎａｓ博士（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄｉｖ、 Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、 Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡ）から親切にも贈与された。プールされたドナーＨＵＶＥＣは市販品を購入した（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。ＨＵＶＥＣを、それぞれ１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧ、１００ＩＵ／ｍＬのストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌブタヘパリン、２０％ＦＣＳ（全て：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び８０μｇ／ｍｌ内皮マイトジェン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）を補充したＴＣ−１９９またはＨａｍ’ｓ Ｆ１２−Ｋを満たした、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングした組織培養フラスコ、６穴及び２４穴プレート上で、５％二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで３７℃にて培養した。Ｃａ２＋Ｍｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．２５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを用い、９０％コンフルエンスに達するまでＨＵＶＥＣを継代した。
【００９８】
ミクロ担体ビーズ上のＥＣ培養を、９０μｍ及び１５０μｍ直径の球状コラーゲンでコーティングしたアクリルの細胞担体（Ｋｏｎｔｅｓ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）上で、それぞれ１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧ、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌブタヘパリン、２０％ＦＣＳ（全て：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び８０μｇ／ｍｌ内皮マイトジェン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）を補充したＴＣ−１９９またはＨａｍｓ−Ｆ１２Ｋを磁気スターラーで撹拌した培地中で、５％二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで３７℃にて行った。
【００９９】
腫瘍標的細胞株の産出及び維持
造血腫瘍細胞株のＳＵ−ＤＨＬ、ＯＣＩ−Ｌｙ８、Ｋ５６２及びリンパ芽球細胞株ＡＭＫ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＣＡのＡ． Ｋｒｅｎｓｋｙ博士からの御厚意による贈与）及びＲＤＬ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＣＡのＲ． Ｌｏｐｅｚ博士からの御厚意による贈与）を、５０μｍのβ−メルカプトエタノール（ＭＥ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧ、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ＦＣＳ（全て：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で、０．５〜２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で、５％二酸化炭素下、３７℃の加湿インキュベーター内で培養した。
【０１００】
メラノーマ細胞株のＷＭ９及び１２０５ＬＵ（Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡのＭ． Ｈｅｒｌｙｎ博士からの御厚意による贈与）を組織培養処理フラスコ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＰＡ）上で、５μｇ／ｍｌのインスリン及び２％ＦＣＳを補充したＭＣＤＢ１５３培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で、５％二酸化炭素下、３７℃の加湿インキュベーター内で維持した。
【０１０１】
構成的に細胞質ルシフェラーゼを発現する頚部癌種細胞株ＨｅＬａｌｕｃ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＣＡのＣ． Ｃｏｎｔａｇ博士からの御厚意による贈与）を、５０μｍのβ−メルカプトエタノール（ＭＥ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧ、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％ＦＣＳ（全て：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で、５％二酸化炭素下、３７℃の加湿インキュベーター内で培養した。
【０１０２】
ＣＴＬ細胞株ＡＪＹ及び特異なＣＴＬ標的細胞株ＡＪ（リンパ芽球）は、Ａ． Ｋｒｅｎｓｋｙ博士（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＣＡ）の研究室からの御厚意により提供された。
【０１０３】
実施例２
Ｈｓｐ４７遺伝子のクローニング及び発現
ＲＴ−ＰＣＲ由来のｈｕＨｓｐ４７遺伝子部分断片（Ｏｎｔａｒｉｏ、ＣａｎａｄａのＳａｎｗａｌ博士からの親切なる贈与）をインビトロで増幅させ、ＰＣＲで人工的なクローニング部位を導入した。これらの断片は図１Ａの塩基に対応する。Ｈｓｐ４７のアミノ末端の３９アミノ酸をコードする核酸（シグナル配列及び成熟タンパク質の最初のアミノ酸は除く）は、次のプライマー：５’プライマーＡＣＧＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡ、３’プライマー：ＧＴＣＣＴＴＧＧＣＣＡＴを用いて増幅させた。５’プライマーは他のベクターへのクローニングを容易にするようにＢａｍ ＨＩ部位を取り込んだ。３’プライマーは、該タンパク質のアミノ末端部分及びカルボキシ末端部分をコードする核酸の融合を容易にするようにＭｌｕ ＮＩ部位を取り込んだ。カルボキシ末端の３６０アミノ酸をコードする核酸を、次の５’プライマー：ＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧ、及び３’プライマー：ＡＣＧＣＴＣＴＧＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡを用いて増幅させた。５’プライマーは該遺伝子の二つの部分を一つの連続したリーデイングフレームへと融合させることを容易にするようにＭｌｕ ＮＩ部位を取り込み、３’プライマーは、他のベクターへのクローニングを容易にするようにＥｃｏ ＲＩ部位を取り込んだ。当業者が一般的に周知の、標準的なＰＣＲ条件を、始めのクローンからの二つの断片を増幅するために用いた（図８参照）。得られた増幅産物をＭｌｕ ＮＩで消化し、精製して、それぞれを連結させた。得られた核酸をさらにＢａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで消化し、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、構築目的用に使用されたｐＵＣ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）へｈｕＨｓｐ４７遺伝子カセットを、定方向でクローニングした。得られたプラスミドｐＵＣ／ｈｕＨｓｐ４７を、ＲｅｃＡ細菌宿主ＤＨ５α株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ）内で増幅させた。クローニングされた遺伝子カセットの配列は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＡＢＩシーケンサー（ＡＢＩ）上の蛍光シーケンシングで確認した。
【０１０４】
細菌タンパク質発現用のＢａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ ＲＩ発現可能な遺伝子カセットをもたらす別のプライマーセットを用いてｈｕＨｓｐ４７遺伝子カセットをＰＣＲ増幅させた。ＩＰＴＧ誘導可能Ｌａｑｑプロモーターの制御下でＧＳＴ融合蛋白質を産生させるｐＧＥＸ４Ｔ１ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）へ発現可能な遺伝子カセットをクローニングし、細菌宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）株内で増殖させた。
【０１０５】
細菌宿主細胞内の組換えＧＳＴ融合タンパク質の発現を、ラクトースプロモーターＬａｑｑを用いて２０ｍＭのＩＰＴＧで誘導させ、過剰発現させたタンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上のアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液中の５〜２０ｍＭ還元グルタチオオンを用いて室温で溶出させ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ法により量的分析を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより質的分析を行った。溶出バッファーを、使用前にＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）ゲル濾過を用いて、ｐＨ７．４のＰＢ５と交換した。ＧＳＴ融合パートナーの除去が望ましい時には、ＧＳＴと関心の組換えタンパク質との間のリンカーアミノ酸内に存在するトロンビン切断部位を用いて、３７℃で１０〜１２時間、融合ＧＳＴ部分１μｇあたり１０ＩＵのトロンビン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）での切断を行った。グルタチオンアフィニティーＦＰＬＣを用いてｐＧＥＸ−４Ｔ−Ｈｓｐ４７で形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞４リットルあたり、５〜１０ｍｇの組換えｈｕＨｓｐ４７融合タンパク質が通常的に得られた。精製ｈｕＨｓｐ４７は上記の５１ＣＲ放出細胞毒性アッセイ法に用いた。
【０１０６】
ｈｕＨｓｐ４７の個々のドメインの、ＣＩＫ誘導細胞毒性からのＥＣの保護における役割を分析するために、ｈｕＨｓｐ４７のドメイン特異的欠失変異体を、図１に記載の配列及び先に発表されたｈｕＨｓｐ４７の配列に基づいたネスティッドプライマーを用いてＰＣＲで産出させた。ｈｕＨｓｐ４７は少なくとも、四つの特徴的な機能ドメインを有する。該タンパク質のアミノ末端の始めから、それらは、コラーゲン／ＲＧＤ結合ドメイン、ヒトＨＬＡ−Ａ２分子のα−２ドメインと相同なドメイン、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）ドメイン、及びＥＲ保持シグナルＲＤＥＬドメインである。三つの特異的な欠失が産出された。欠失１はＲＤＥＬドメインを除去し、欠失２はＲＤＥＬ及びセルピンドメインを除去し、欠失３はセルピン及びＲＤＥＬを含むカルボキシ末端の１５０アミノ酸を除去した。全ての三つの欠失変異体を産出するためのＰＣＲ反応において、同一の５’プライマーを用いた。５’プライマー配列はＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣである。ＲＤＥＬ欠失変異体を産出するための３’プライマーは、ｈｕＨｓｐ４７−ＧＦＰ融合タンパク質を産出するために使用されたものと同一のプライマーであり、配列：ＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＡＣＧＡＣＣＴＡＧＧＧＣを有する。欠失２の３’プライマーは：ＡＡＣＴＣＡＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＧＧＧＣである。欠失３の３’プライマーは：ＡＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＡＣＣＴＡＧＧＧＣ（図１４参照）である。５’及び３’プライマーはその後のクローニングの段階を容易にするためにそれぞれＢａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位を取り込んだ。５’及び個々の３’プライマーはｈｕＨｓｐ４７遺伝子カセットを含むｐＵＣ／ｈｕＨｓｐ４７プラスミドと混合し、個々の欠失変異体をコードする核酸は別の反応においてＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ産物は精製され、Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで消化され、細胞毒性アッセイ法（下記参照）用のｈｕＨｓｐ４７欠失ＧＳＴ融合タンパク質を生産するためのｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター、またはＦＡＣＳプローブとして使用するためのｅＧＦＰ−Ｈｓｐ４７欠失融合タンパク質生産用の、上記のｍｅｌ分泌シグナルもまた含むｐＥＧＦＰ−Ｎ１へ連結させた。
【０１０７】
プローブとしてのアガロースゲル精製完全長ｈｕＨｓｐ４７ｃＤＮＡ、及び内部対照プローブとしてのヒトベータアクション（Ｓ． Ｎ． Ｃｏｈｅｎ博士からの親切なる贈与）ｃＤＮＡのα３２Ｐ−ＡＴＰニック翻訳標識により、ｈｕＨｓｐ４７ ＲＮＡ発現のノーザン分析を行った。ＢＦＡ処理中のＥＣから、全ＲＮＡを０時間、２時間、及び６時間の時点で回収した。それぞれの時点でのＲＮＡを精製、変性させ、ホルムアミドフラットベッドアガロースゲル電気泳動に供し、ニトロセルロースへ転写させ、３２Ｐ標識プローブとプレハイブリダイズ、及びハイブリダイズさせ、ストリンジェントな条件下で洗浄し、当業者によく知られた技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照）を用いて、−８０℃にて補助液スクリーンなしにオートラジオグラフィーに供した。その結果、ＢＦＡ処理はハウスキーピング遺伝子ベータ作用の拡大には影響しなかったが、評価期間中、ｈｕＨｓｐ４７遺伝子発現をアップレギュレートすることが示された。図１０参照。これらのデータはＢＦＡ処理された細胞内で見られ、免疫沈降実験により単離されたＨｓｐ４７タンパク質内の観察された増加に一致していた。図５参照。
【０１０８】
プロテアーゼ阻害剤を含まない、グランザイムＡアッセイ法用のｒｈｕＨｓｐ４７の生産は、ＩＰＴＧ誘導を行っている宿主細菌用の栄養ペプチド源としての、トリプシンカゼインアミノ酸の代わりにカゼイン酸性加水分解物を用いて、ａｍｐ選択ＮＺＣＹＭ培地中での、プロテアアーゼを含まない形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌の増殖により行われた。培養時間を最短化するために、タンパク質抽出物はグルタチオン樹脂上でバッチ培養し、非ＧＳＴタンパク質の最初の除去は改変されたスピンカラムの方法で実施された。プロトコールの残りは変化させず、トロンビンは使用されなかった。
【０１０９】
実施例３
細胞毒性アッセイ法
５１Ｃｒ−放出アッセイ法
１ｘ１０６細胞を３００ｍＣｉ５１Ｃｒ内に３７℃で１〜１．５時間インキュベートして、標的細胞を５１Ｃｒ（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で代謝的に標識した。標識された細胞は、０．１％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で三回洗浄された。標識された細胞は、２ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で、平底の９６穴マイクロタイタープレートに、三連で分配した。エフェクター（ＣＩＫ）細胞は示された比率で加えられた。エフェクター細胞の添加前にＭａｂを添加し、室温で１５〜３０分間インキュベートした。各ウェルのアッセイ混合物の最終用量は０．２ｍｌであった。３７ ℃で４時間後、該細胞を遠心処理して回収し、上清のアリコートをガンマカウンター（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）においてカウントした。特異的な５１Ｃｒ放出の百分率は次の式を用いて計算した：
【式】
2004503463.tif 000004
自然放出は完全培地のみで標識細胞をインキュベートすることによって得られ、最大放出は１％ＮＰ−４０で細胞を処理することによって得られた。
【０１１０】
成体及び臍帯由来ＣＩＫ細胞の抗腫瘍活性を細胞毒性アッセイ法において比較した。両ソースから派生したＣＩＫ細胞の細胞毒性の結果は、Ｂ細胞リンパ腫ＯＣＩ−Ｌｙ８及びＳＵ−ＤＨＬ４／ＬＡＭ５３、及び骨髄性白血病標的Ｋ５６２に対して重ね合わされた。両集合のＣＩＫ細胞は、インビトロでメラノーマＷＭ９に対してわずかに細胞毒性を示した。両集合のＣＩＫ細胞は、新鮮なコンフルエントのＨＵＶＥＣに対して細胞毒性があり、より長い期間コンフルエントなＥＣ単層に対してはそれほどの細胞毒性はなかった（図３参照）。
【０１１１】
図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、ｄ２１ＣＩＫ及び様々な標的を用いた４時間の５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイ法を示す。ＣＩＫは、下記を補充した完全ＲＰＭＩ中での培養によるＰＢＭＣから誘導される：ｄ０に：１０００ｕ／ｍｌ１ＩＦＮ−ｇ、ｄ１に：５ｎｇ／ｍｌの可溶性ＯＫＴ−３、及び５００ｕ／ｍｌのＩＬ−２、ｄ５、ｄ９、ｄ１３、ｄ１７及びｄ２１に：５００ｕ／ｍｌのＩＬ−２。全ての細胞は５％二酸化炭素を含む３７℃の加湿インキュベーター内に置かれた。造血腫瘍系統Ｋ５６２、ＯＣＩ−Ｌｙ８及びＳＵ−ＤＨＬ４は完全ＲＰＭＩ培地中で維持され、メラノーマ系統Ｗ９は５μｇ／ｍｌのインシュリン及び２％ＦＣＳを補充したＭＣＤＢ１５３培地中で培養された。ＨＵＶ−ＥＣはＡＴＣＣから得られた。これらを２％ゼラチンでコーティングした２４穴プレート上で、それぞれ２０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌのブタヘパリン、及び８０μｇ／ｍｌ内皮マイトジェンを補充したＴＣ−１９９又はＨａｍ’ｓＦ１２−Ｋ培地中で増殖させた。ＨＵＶＥＣが８０％より高いコンフルエンシーに達した時に、定期的にトリプシン継代を行い、５１Ｃｒ放出アッセイ法は新しいコンフルエンシーの時点で定期的に行った。
【０１１２】
図３Ａは成体及び臍帯血のＣＩＫｄ２１の細胞毒性の特徴である。ＣＩＫはＢ細胞リンパ腫ＯＣＩ−Ｌｙ８及びＳＵ−ＤＨＬ４（青）、並びにエリスロミエロイド白血病Ｋ５６２（黄）に対して高い細胞毒性を示した。中程度の細胞毒性が、結節メラノーマ系統ＷＭ９（赤）、及び新たにコンフルエントなＨＵＶ−ＥＣ（濃い緑）に対して存在した。
【０１１３】
図３Ｂはコンフルエンシー到達後のＥＣ培養期間の、ｄ２１ＣＩＫ溶解に対するＥＣの感度への影響を示す：新たにコンフルエントなＥＣ（濃い緑）は、コンフルエンシー到達後さらに５日間培養したＥＣ（黄緑）よりも、有意に容易に溶解する。
【０１１４】
図３Ｃでは、ＣＩＫのクローンは９６穴プレートの１ウェルにつき平均「０．６細胞」を播いて増殖させ、その後、大量培養用の上記と同一のホルモン刺激を用い、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌで二回照射された自己フィーダー細胞と共に共培養することにより増殖させた。個々のクローンが２ｘ１０６細胞より多く増殖させた後、５：１のＥ：Ｔ比で、クローンの細胞毒性の特徴を試験した。ＣＩＫの標的特性は、クローンレベルで決定される。
【０１１５】
増殖されたＣＩＫ単細胞クローンは、上記の通り行われた細胞毒性アッセイ法において、細胞の副集団が標的特異性を示すかどうかを決定するために試験された。標的特異性が観察され、系統特異的であり、腫瘍細胞のみ、ＥＣ細胞のみ、あるいは両細標的に対して検出され、後者が最も一般的であった。試験した２Ｄ１０ＣＩＫ細胞系統はＯＣＩ−Ｌｙ８腫瘍細胞系統に対しては細胞毒性を示したが、ＨＵＶＥＣ細胞系統には示さなかった。５Ｆ７ＣＩＫ細胞系統はＨＵＶＥＣ細胞系統に対しては細胞毒性を示したが、ＯＣＩ−Ｌｙ８腫瘍細胞系統に対しては示さなかった。２Ｃ１０ＣＩＫ細胞系統は、ＯＣＩ−Ｌｙ８及びＨＵＶＥＣ細胞系統の両方に対して細胞毒性を示した。
【０１１６】
標的のＢＦＡ処理
ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）処理として、新たにコンフルエトなＨＵＶＥＣ単層、非付着標的細胞、またはＣＩＫ細胞を０．５〜２ｘ１０６細胞／ｍｌで、培地１ｍｌあたり０．５〜１０μｇのブレフェルディンＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した培地中にインキュベートし、、２〜６時間、５％二酸化炭素下、３７℃の加湿インキュベータ内で培養した。ＢＦＡは７０％エタノール中、１００μｇ／ｍｌで溶解し、そのまま使用するか、または４週間−２０ ℃で保存した。細胞毒性アッセイ法の前に、この細胞をＰＢＳで三回すすぎ、ＢＦＡを含まない新しい培地を残りのこのアッセイ法用に加えた（図４）。
【０１１７】
ＢＦＡ処理は、細胞内小胞が小胞体から基部または中間ゴルジコンパートメントへ移動することを妨害し、分泌に向けたタンパク質のグリコシル化及び成熟タンパク質の細胞表面への能動的小胞移動を妨げた（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９０； Ｌｉｐｐｏｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９１； Ｌｉｐｐｏｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９８９； Ｏｒｃｉら、１９９１； Ｖｏｇｅｌら １９９３）。内皮細胞のブレフェルディン処理は、ＭＡＢ ＳＡＰ４７０を用いた免疫検出により、現在、Ｈｓｐ４７と同定された４６．５ｋＤａのタンパク質阻害剤のアップレギュレーション及び分泌をもたらす。図５はＢＦＡ誘導の６時間後の、３５ＳのＭａｂ Ｎ６及びビオチン標識ＨＵＶＥＣ抽出物を用いた免疫保護の結果を示す。レーン：Ｍ＝マーカー。１＝ｗｔ、２＝１０μＭ、３＝μＭ ＢＦＡ
【０１１８】
図５Ａは銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１０％ポリアクリルアミドゲルを示す。ｐ４６．５特異的検出は保護的ＢＦＡ用量でのみ起る。Ｎ６ Ｍａｂ ＩｇＧの重鎖及び軽鎖に注目のこと。
【０１１９】
図５Ｂは、ＮＣ膜に転写させた１２％ポリアクリルアミドゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラフィーを示す。４６．５ＫＤａの３５Ｓで放射標識されたバンドが１０μＭのＢＦＡの存在下でのみ存在した。
【０１２０】
図５Ｃは、ｐ４６．５の陽性同定を示す。これは、ｈｕＨｓｐ４７特異的Ｍａｂ ＳＰＡ ４７０を用いたｈｕＨｓｐ４７免疫検出である。Ｈｓｐ４７は、この１２％ ＰＡＧＥにおいて、放射標識されたペプチドと同一の４６，５００Ｍで移動した。ｐ４６．５及びｈｕＨｓｐ４７のタンパク質バンドは重ね合わされた。ＩＰ用のマウスＩｇＧＭａｂ Ｎ６の使用、及び二次ヤギ−抗マウスペルオキシダーゼＡｂを用いた一次マウス抗−Ｈｓｐ４７ Ｍａｂ ＳＰＡ４７０の検出のため、Ｎ６ Ｍａｂの重鎖及び軽鎖もまた、このＥＣＬアッセイ法において検出される。
【０１２１】
標的のＢＦＡ処理は用量依存的にＥＣのＣＩＫ媒介溶解を抑制することができたが、しかし、ＣＩＫ細胞が腫瘍標的を溶解する能力には影響しなかった（図４）。ＨＵＶＥＣ及びＯＣＩ−Ｌｙ８の両細胞を０μＭ、２．５μＭ、５μＭ、７．５μＭ、及び１０μＭの濃度のＢＦＡと共に、上記の通り６時間、インキュベートし、洗浄し、５１Ｃｒで標識し、２０：１のＥ：Ｔ比でのｄ２１ＣＩＫ細胞を用いた細胞毒性アッセイ法において使用された。２．５μＭのＢＦＡとＥＣ標的とのプレインキュベーションはＣＩＫ媒介細胞毒性を４０％減少させた。より多い用量はさらに細胞毒性を減少させ、１０μＭのＢＦＡ中でのプレインキュベーションは、ＨＵＶＥＣのＣＩＫ媒介溶解を完全に遮断するに十分であった。
【０１２２】
Ｍａｂ遮断を用いた５１Ｃｒ放出細胞毒性抑制アッセイ法
精製した５μｇのエフェクター細胞の添加前、ＮａＮ３を含まないモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を培地ｍｌあたりに、標的細胞に添加し、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。エフェクター細胞は処理された標的に直接添加された。このアッセイ法の残りは上記の通り、５％二酸化炭素の加湿大気中で、３７℃行った。
【０１２３】
ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）、Ｔ細胞マーカーＣＤ２（ＬＦＡ−２）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴｃＲα／β、又はγ／σ、及びＮＫマーカーＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫ−Ｂ１（ＮＫＴＡ２５５）及びＮｋｐ４０（ＤＸ９）に対するＭａｂは、腫瘍及びＥＣ標的に対してともに、ＣＩＫ細胞における細胞毒性を遮断しなかった。ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、及びＬＦＡ−１（ＣＤ１８／１１、ＬＡＦ−１β鎖、ＬＡＦ−１α鎖）は、腫瘍細胞に対してはＣＩＫの細胞毒性を遮断したが、ＥＣ標的に対しては遮断しなかった。試験した他のどの抗ＣＡＭ Ｍａｂ（ＣＲ４α鎖、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＶＡＰ−１又はＮ−カドヘリン）も、腫瘍標的に対してＣＩＫ細胞における細胞毒性を遮断しなかった。試験した抗体のいずれもＥＣ標的に対してＣＩＫ細胞の細胞毒性を遮断せず、ＣＩＫ細胞は腫瘍標的と異なった相互作用をすることを示した（表２参照）。
【０１２４】
ペプチド及びペプチド添加を伴う５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイ法
５１Ｃｒ標識後であるが、エフェクター細胞の添加前に、ｐＨ７．４の滅菌ＰＢＳ中で、ＲＰＭＩで最終濃度に希釈された１０〜２００μｇのＦＰＬＣ精製Ｈｓｐ４７（実施例７）タンパク質、または１０ｎＭ〜１００μＭのＨＰＬＣ精製ペプチドＡＶＬＳＡＥＱＬＲ（実施例８）を培地１ｍｌあたりの標的に加え、３０分間、３７℃で、５％二酸化炭素加湿大気内でインキュベートした。精製タンパク質を用いたアッセイ法においては、この標的細胞に新鮮は標準培養培地を加える前に、標的を１０倍量のＣＡ２＋、Ｍｇ２＋、及び５％ＦＣＳを含むＰＢＳで３度続けて洗浄した。精製ペプチドを使用するアッセイ法においては、添加されたペプチドは全てのアッセイ法において存在した。アッセイ法の残りは上記に詳細に説明の通り、５％二酸化炭素の加湿大気中で３７℃で行われた。
【０１２５】
３００μｌあたり２０μｇｍのゼラチンアフィニティー精製（下記）ｈｕＨｓｐ４７とのインキュベーションは、上記の６時間、１０μＭのＢＦＡ処理で観察された保護と同様に、ＣＩＫ媒介溶解から標的を完全に保護するに十分であった（図７参照）。
【０１２６】
１ｎＭの少量のｈｕＨｓｐ４７−ＧＳＴタンパク質の添加は、ＥＣ溶解を５０％減少させることが可能であった。１０μＭのｈｕＨｓｐ４７−ＧＳＴタンパク質とのプレインキュベーションは、ＣＩＫ媒介溶解からＥＣを完全に保護する（図９参照）。ペプチドＡＶＬＳＡＥＱＬＲもまた、Ｅ：Ｔ比が２０：１であるアッセイ法において、用量依存的にＣＩＫ媒介溶解からＥＣを完全に保護することができた（図１２参照）。１μＭの濃度のペプチドは５０％ＥＣ溶解を減少させることができ、１０μＭの濃度のペプチドはほぼ完全にＣＩＫ媒介溶解を抑制することができた。該ペプチドは、 Ｅ：Ｔ比が２０：１のＣＩＫ−ＯＣＩ−Ｌｙ８腫瘍細胞５１Ｃｒ細胞毒性アッセイ法において、１０μＭで使用された場合には、１０％未満、特異的標的溶解を減少させることができた。
【０１２７】
個々のｈｕＨｓｐ４７欠失変異体の保護作用（図１５Ｂ）も分析された。図１５Ｃ参照。ＲＤＥＬドメインを欠失する欠失１変異タンパク質は、ＣＩＫ媒介溶解を４０％減少させ、ＲＤＥＬドメインが細胞毒性由来のＥＣ細胞の保護に関係しないことを示した。セルピンドメイン及びＲＤＥＬドメインの両方を欠失する欠失２変異タンパク質は、ＣＩＫ媒介溶解を２０％減少させ、セルピンドメインが細胞毒性からのＥＣ細胞の保護に関係し、又は結果として得られたタンパク質が折り畳まれ、正常ではない低い活性形態のタンパク質となることを示した。カルボキシル末端の１５０アミノ酸を欠失する欠失３変異タンパク質は、ＣＩＫ媒介溶解からのＥＣの保護において欠失１変異体タンパク質と同様に効果的であり、欠失２変異タンパク質に見られた保護の減少は、このタンパク質の高次構造の変化のためであり、保護に参加するセルピンドメインのためではないことを示した。欠失３変異タンパク質はコラーゲン／ＲＧＤ結合ドメインと、ＡＶＬＳＡＥＱＬＲペプチド配列を含むα２−ＨＬＡ−Ａ２相同性ドメインとの両方を保持する。
【０１２８】
Ｈｓｐ４７タンパク質発現ベクターでのトランスフェクションによる内皮細胞の保護
ｈｕＨｓｐ４７をコードする核酸及び断片を真核生物発現ベクターへクローニングした。カルボキシル末端ＲＤＥＬアミノ酸配列が欠失したｈｕＨｓｐ４７の断片をコードする核酸を、次のプライマーを用いてｐＵＣ／ｈｕＨｓｐ４７プラスミドからＰＣＲ増幅させた：５’プライマーＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣ、３’プライマーＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＡＣＧＡＣＣＴＡＧＧＧＡ。増幅産物をｐＭｅｌ−Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）由来のメリチン分泌シグナルおよびコサック配列に連結し、得られた断片を、当業者に周知の一般的な技術を用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のマルチプルクローニングサイトへクローニングした。得られたプラスミド、ｅＧＦＰ−Ｈｓｐ４７をＥＣにトランスフェクトした。
【０１２９】
完全長ｈｕＨｓｐ４７及びｈｕＨｓｐ４７σＲＤＥＩをコードする核酸を、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にクローニングし、ＥＣ内で発現させた。ｐＢＫベクターをＬａｃプロモーター、ＭＣＳの多く、及びＬａｃＺ遺伝子の一部を除くために、Ｎｈｅ Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化した。メリチン分泌ペプチド及びコサック配列を上記の様にｐＭｅｌ−ＢａｃベクターからＰＣＲ増幅させ、ＣＭＶ ＩＥプロモーターに隣接するｐＢＫベクターへライゲーションさせた。完全長ｈｕＨｓｐ４７またはｈｕＨｓｐ４７σＲＤＥＩをコードする遺伝子カセットを、メリチン分泌シグナルに隣接するｐＢＫベクターへライゲーションし、得られたベクターをＥＣに形質転換するために用いた。ＣＭＶ−ｎｅｏ−ｍｅｌ−ｈｕＨｓｐ４７完全長、及びＣＭＶ−ｎｅｏ−ｍｅｌ−ｈｕＨｓｐ４７σＲＤＥＬベクターを個々のベクターを含む宿主細胞培養物から精製し、低用量のリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ＮＹ）トランスフェクションのプロトコールを用いてＥＣをトランスフェクトするために用いた。トランスフェクトされたＥＣをその後ＣＩＫ細胞毒性アッセイ法にて分析した。
【０１３０】
ｅＧＦＰ−Ｈｓｐ４７、ＣＭＶ−ｎｅｏ−ｍｅｌ−ｈｕＨｓｐ４７完全長、及びｐＣＭＶ−ＣＤ２０（ＣＭＶプロモーターの制御下、ＣＤ−２０を発現するベクター、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡのＳ． ｖＨｅｕｖｅｌ博士からの親切なる贈与）のベクターに組み合わせを用いて、低用量のリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ＮＹ）トランスフェクションのプロトコールを使用して、ＥＣも同時トランスフェクトした。細胞は同時トランスフェクトの２４時間後ＦＡＣＳ分析に供した。
【０１３１】
ＥＣ標的は、ＣＭＶ−ｎｅｏ−ｍｅｌ−ｈｕＨｓｐ４７完全長またはＣＭＶ−ｎｅｏ−ｍｅｌ−ｈｕＨｓｐ４７σＲＤＥＬのいずれかにおける、以前に感受性のＥＣへのリポフェクタミン媒介トランスフェクションの２４時間後の、細胞毒性アッセイ法において使用された。成熟ｄ２１ＣＩＫ細胞を２０：１のＥ：Ｔ比で使用した。完全長ｈｕＨｓｐ４７過剰発現ＥＣは、ＣＩＫ媒介溶解において２５％の減少を示した。。ｈｕＨｓｐ４７σＲＤＥＬ過剰発現ＥＣは、ＣＩＫ媒介溶解に対して完全に抵抗性であった（図１１参照）。小胞体（ＥＲ）保持シグナルとして働くＲＤＥＬペプチドのｈｕＨｓｐ４７からの欠失は、該タンパク質が遊離して分泌されることを可能にし、ＣＩＫ媒介溶解からこのタンパク質を発現するＥＣ標的を保護する。
【０１３２】
実施例４
蛍光活性細胞分離及びイメージング
蛍光活性細胞分離（ＦＡＣＳ）用に、１０６エフェクター細胞または標的細胞をＣａ２＋、Ｍｇ２＋、及び５％ＦＣＳ を含むＰＢＳバッファーで２回洗浄し、この緩衝液５０μｌに懸濁し、０〜４℃で暗黒下に放置した。１０６細胞の染色反応当たり、１μｇのＦＩＴＣ−、ＰＥ−、Ｐｅｒ−ＣＰ又はＴｒｉＣｏｌｏｒ標識モノクローナル抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）をこの細胞と混合し、１５〜３０分間０〜４℃で暗黒下でインキュべートした。染色した細胞を１０倍量のＣａ２＋、Ｍｇ２＋、及び５％ＦＣＳ を含むＰＢＳバッファーで三回連続して洗浄し、分析用または励起４８８ｎｍでのＦＡＣＳｃａｎ／ＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）及び適切な発光検出用チャンネルフィルターを用いた分離用にこの５００μｌを取り出した。
【０１３３】
免疫蛍光顕微鏡検査用の細胞染色を同様の方法で行い、染色した細胞をＡｘｉｏｐｈｏｔ蛍光カメラシステム（Ｚｅｉｓｓ、Ｈａｎａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。
【０１３４】
ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下で発現させたｈｕＨｓｐ４７σＲＤＥＬ強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）融合タンパク質を、上記の通り単離し、ｈｕＨｓｐ４７細胞表面結合タンパク質を探索するためのＦＡＣＳプローブとして使用された。先ずＰＥ−Ｍａｂでの染色、望ましいのであれば特異的にＰＥ−ＣＤ５６で染色し、その後ＰＢＳ１ｍｌあたりｅＧＥＰ− ｈｕＨｓｐ４７１０μｇ中に洗浄したＣＩＫを懸濁し、０〜４℃で１５分間、暗黒下でインキュべートし、冷却したエッペンドルフ遠心分離機で１０００ｐｒｍで０〜４℃遠心処理して、比結合タンパク質を除去し、分子プローブとしてのｅＧＥＰ標識したｒｈｕＨｓｐ４７を用いて、成熟ｄ２１ＣＩＫのＦＡＣＳ分析を行った。染色した細胞のペレットをＦＡＣＳ分析直前に５００〜１０００μｌのＰＢＳ、或いは、分析前に３％（ｗ／ｖ）ホルムアミデヒドを含むＰＢＳフィキサン（ｆｉｘａｎ）に再懸濁した。染色後、細胞をＦＩＴＣチャンネルを用いて分離した。分析した該細胞の２６％がｅＧＦＰ−ｈｕＨｓｐ４７及びＰＥ−ＣＤ５６プローブの両方に陽性であり、ＣＩＫ細胞の特徴的なサブセットはｈｕＨｓｐ４７のレセプターを有することを示した。
【０１３５】
低用量のリポフェクタミントランスフェクションのプロトコールを用いてｅＧＦＰ−ｈｕＨｓｐ４７、ＣＭＶ−ｎｅｏ−ｍｅｌ−ｈｕＨｓｐ４７完全長、及びｐＣＭＶ−ＣＤ２０と同時トランスフェクトしたＥＣ細胞を、同時トランスフェクトの２４時間後分析した。細胞をＰＥ−ＣＤ２０Ｍａｂで染色し、ＣＤ−２０抗原及びｅＧＦＰ−ｈｕＨｓｐ４７の双方の存在をＦＩＴＣチャンネルを用いて分析した。この細胞の７９％以上が両プローブに陽性で、非常に高いトランスフェクション効率が存在することが示された。
【０１３６】
実施例５
天然タンパク質精製及び分析
標的細胞からのタンパク質精製
細胞の回収前に、標的を上記のように培養、またはＢＦＡで処理し、密度勾配遠心で、非付着標的から、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含むＰＢＳで洗浄して、ＥＣ単層から死滅細胞を除去した。１％トリトン−Ｘ１００（Ｔｘ−１００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＰＢＳ緩衝液中で、超音波細胞破砕（Ｂｒａｎｓｏｎ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）を用いて細胞溶解を行った。
【０１３７】
代謝３５Ｓメチオニン／システイン標識するため、ＢＦＡ対照処理の開始時の、１００μＣｉ／ｍｌの代謝トランスラベル（Ｔｒａｎｓｌａｂｅｌ）（ＰＩＥＲＣＥ／Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）３５Ｓメチオニン／システインの添加前に、標識細胞をチチオニン及びシステインを含まない透析されたＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０またはＨａｍｓ−Ｆ１２Ｋ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）培地で２２時間培養し、そうでなければ上記のように培養し、指示された時間インキュべートした。パルス−チェイス標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタン分析またはオートグラフィー及び銀染色で分析した。
【０１３８】
適用可能なＢＦＡによる処理、及びその後の死滅細胞のストリンジェントな除去の後、ビオチン化による膜タンパク質の標識を行った。水溶性、脂質不溶性２３−原子リンカーアーム改変ビオチン類似体ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン及びＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を最終的に１ｍｇ／ＰＢＳ １ ｍｌで加え、細胞単層を３０分間室温でインキュベートした。反応をビオチン標識反応の除去及び、残留ＮＨＳ−基と反応する過剰アミン供給しながら、ｐＨ７．４の１００ｍＭの Ｔｒｉｓ−塩酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡバッファーを、１０倍容量を用いた三度の洗浄により停止させた。
【０１３９】
ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンビオチン化タンパク質の精製は、ＵＶ２６０ｎｍ制御下（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、６％架橋アガロース（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に固定したストレプトアビジンの樹脂上で、アフィニティークロマトグラフィーにより行った。結合したタンパク質は、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノールで、２３原子−ＳＳ−ビオチンリンカーアームのジスルフィド結合を切断して、ストレプトアビジンマトリックスから放出させた。これは、以前にストレプトアビジン樹脂にビオチン部位を結合させていたビオチン−標識タンパク質の溶出につながる。特異的に溶出されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、オートラジオグラフィー、及び銀染色により分析された。ＮＨＳ−Ｌ−ビチン化タンパク質の検出を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後の固体支持体膜への転写、及びストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）との反応により行った。結合したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼは比色ＢＣＩＰ／ＮＢＴブロットアッセイ法により検出された。その後のオートラジオグラフィーは、代謝３２Ｓメチオニン／システイン標識抽出物により行った。
【０１４０】
実施例６
抗体の生産及び調製
ポリクローナル抗体の生産及び調製
ポリクローナルウサギ血清の生産は、三羽のメスニュージーランドウサギからの非免疫／前血清（ｐｒｅｓｅｒｕｍ）の回収後行った。１ｍｇの全タンパク質を免疫化１日あたり、動物一羽に対して用いた。超遠心分離由来の野生型（ｗｔ）及びＴＭ処理リンパ芽標的細胞膜の標品を抗原として用いた。抗原は完全フロイントのアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中の乳剤として調製し、皮下注射した。この後三回、上記のように、しかし、ＦＣＡをフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）のかわりに、６週間の間隔で追加免疫化した。力値の上昇を、追加免疫の時点で得られたウサギ耳静脈血試料の抗原スポットアッセイ法によりモニターした。凝縮により回収された標本細胞産物から血清を分離し、その後遠心分離し、吸引して、使用するまで−２０℃で凍結させた。
【０１４１】
モノクローナル抗体の調製
モノクローナルＮ６抗体のインビボにおける制限された生産 ：Ｐａｎ−抗−熱ショックタンパク質ＭａｂＮ６ハイブリドーマ（日本、京都市のＮａｇａｔａ博士からの親切なる贈与）を６週齢メスＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射した。腹水を回収し、液体Ｎ２内でショック凍結させ、必要とするまで−２０℃で凍結させた。
【０１４２】
抗体精製
血清または腹水からのポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のＦＰＬＣ精製は、ＰＢＳ中での７倍の希釈、及ＵＶ２６０ｎｍ制御のタンパク質Ａセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上のクロマトグラフィー後に行った。結合したＩｇ画分をｐＨ２．５の２５ｍＭグリシンバッファーで溶出させ、ＴＲＩＺＭＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）塩を添加して迅速に滴定し、ｐＨ７．４まで戻した。タンパク質量はＤＵ−６５０分光光度計で５９５ｎｍでのＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ法により測定した（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）。
【０１４３】
免疫沈降は、まず予め形成した免疫複合体を次のように調製して行った：精製した特異的マウスモノクローナル抗体またはウサギポリクローナル抗体を１５０ｍｌのＮａＣｌ、１０ｍＭ のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ４０、ｐＨ７．８の１ｍｌ中に１０μｇの濃度の精製二次ヤギ抗マウス抗体又は抗ウサギ抗体と共に化学量数比で、４℃にて、静かに撹拌しながら３時間インキュベートした。別の反応に於いて、これらのそれぞれのアイソタイプに適合した対照抗体をタンパク質Ａセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）と結合させた。形成された免疫複合体を、冷却したエッペンドルフ遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１５分間４℃にて、１３，０００ｒｐｍで遠心分離して回収し、ｐＨ７．５の１倍量の５００ｍＭのＨＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２％のＢＳＡ、０．２５％の（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｘ−１０、ｐＨ７．５で二度洗浄し、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ４０、ｐＨ７．８の１２０μ１に取り出した。タンパク質の抽出は、１ｍｌのバッファーあたり２ｘ１０７細胞を１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ４０、１ｍＭのＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８内で音波処理して溶解させた。細胞の破片を４℃で１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して除去した。この溶解物をタンパク質Ａセファロースビーズと結合したアイソタイプ適合対照抗体と、４℃で３時間撹拌し、その後４℃、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、ビーズを除去して清浄した。特異的抗体との免疫沈降は３０μｌの清浄したタンパク質抽出物を、２００μｌのｐＨ７．５の１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＮＰ４０に添加し、１反応あたり１０μｌの予め形成させた特異的免疫複合体と、４℃で３時間ゆっくりと撹拌して行った。特異的免疫沈降は、１３，０００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離し、ｐＨ６．８の１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後の銀染色にて分析し、固相支持体へ転写し、ストレプトアビジン−ＡＰ検出及びオートラジオグラフィーで実施した。
【０１４４】
ＡＭＫ標的はまず５μｇ／ｍｌのＴＭと１６時間処理する、または非処理のままで、その後上記の通りＢＦＡ及び３５Ｓメチオチン／システイン（最初処理した群でのＴＭの存在下で）で同時に処理し、２時間追跡して行った。粗細胞抽出物を上記のＡＭＫ膜標品に対するポリクローナル血清調製品または、Ｐａｎ−抗−熱ショックＭａｂＮ６のいずれかで免疫沈降（ＩＰ）させた。全細胞タンパク質のいずれかの抗体でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離させたＩＰのオートラジオグラフィーは、ＴＭ処理細胞では不在である、３５Ｓ標識４６．５ＫＤａタンパク質の、ＣＩＫ抵抗性非処理リンパ芽細胞における存在を示した。
【０１４５】
ＥＣ標的を上記の通り、３５Ｓメチオチン／システインと同時に、非ＢＦＡ、１０μｍのＢＦＡの保護的用量、または３０μＭのＢＦＡの非保護的用量の存在下で培養した。検体をＡＭＫ細胞用に上記の通り加工した。ＢＦＡの存在下で培養されたＥＣ標的は３５Ｓ標識４６．５ＫＤａタンパク質を含んでいた。このタンパク質はＢＦＡ非存在下で、または３０μＭのＢＦＡの非保護的用量の存在下で培養されたＥＣからのＩＰにおいては検出可能ではなかった（図５参照）。
【０１４６】
この４６．５ｋＤａタンパク質はＭａｂ ＳＰＡ−４７０抗体を用いたウエスタン分析に於いてＨｓｐ４７であると同定された。上記のＢＦＡ処理細胞から調製された３５Ｓ標識ＨＵＶＥＣ抽出物はＮ６ ｐａｎ−熱ショックＭａｂを用いて上記の通り免疫沈降された。沈降物は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、ＮＣ膜に転写し、ブロックされ、当業者に周知の方法でＳＰＡ−４７０抗体と反応させた。４６．５ＫＤａタンパク質に結合したＳＰＡ−４７０抗体の存在、及びＮ６重鎖及び軽鎖の存在が、ヤギ−抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ染色アッセイ法（ＥＣＬ）により検出された。
【０１４７】
上記の様に予備形成された水溶性、脂質不溶性のビオチン類似体ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを用いての、生きた付着ＥＣのビオチン化、抗−ＡＭＫポリクローナル抗体またはＮ６ Ｍａｂのいずれかを用いて細胞抽出物のＩＰを行い、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＮＣ膜へ転写し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ系による検出を行うと、ＢＦＡ処理により誘導されるＨｓｐ４７タンパク質及びマイナーな２７ｋＤａのタンパク質がＥＣ標的の細胞表面上に局在することが示された。
【０１４８】
実施例７
Ｈｓｐ４７タンパク質の精製及び分析
天然及び組換えタンパク質の精製を、タンパク質粗抽出物を、ｐＨ７．４及びｐＨ６．８でのＱ−セファロース（登録商標）上での陰イオン−交換ＦＰＬＣクロマトグラフィーに供し、分離した画分をイオン強度を増加させて溶出し、その後、ＵＶ−Ｍモニター２１４ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで制御され、アナログモードにおいて記録された溶出体積Ｖｅを増加させて、セファロース１２分離画分上のサイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィーで実施した（全ての機器及び樹脂：Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）（図６参照）。タンパク質量は記録された吸収ピーク（ＡｕＰ）下の面積の集積及びサンプルの画分のＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ法によりオンラインで定量化された。定性分析はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び、その後のクーマシー及び銀染色、ならびに膜への転写、及び特異的抗体が入手可能な時はウエスタンブロッティングにより行った。
【０１４９】
図６ＡはｐＨ８．９でのＱ−セファロースＦＦ陰イオン交換樹脂上のＥＣからの天然Ｈｓｐ４７精製のＵＶ２６０ｎｍプロフィールを示す。１７５フラスコのコンフルエントなＨＵＶＥＣを、上記の通り１０μＭのＢＦＡで誘導した。イオン交換精製の最初の段階ではタンパク質をｐＨ７．４で同じ樹脂で分離させ、ｈｓｐ４７を含む画分をプールした。その後、このタンパク質をバッファーＡ（７５ｍＭのＴｒｉｓ・Ｃｌ ｐＨ８．９、１７５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＰＭＳＦ）を産出するｐＨ８．９の低塩バッファー中で５倍希釈し、イオン交換カラムにロードした。結合したタンパク質はバッファーＢ＝Ａ＋１００ｍＭ ＮａＣｌを用いた直線塩勾配に供した。個々のタンパク質のピークの分離は、ＯＤ吸光に基づき、手動変換段階塩濃度プラトーにより改善された。
【０１５０】
図６Ｂは回収したｐ４６．５を含む画分の銀染色を用いた１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。これらはプールされ、ＹＤ１０膜により１．０ｍｌに濃縮した。
【０１５１】
図６Ｃは、セファロース１２上のサイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィー後の、回収されたｐ４６．５を含む画分の銀染色を用いた１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。収量：２４０μｇ。
【０１５２】
アフィニテーＦＰＬＣクロマトグラフィーは、ｗｔ及びＢＦＡ処理ＥＣのタンパク質抽出物を、蠕動ポンプの補助で、ゼラチン−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）マトリックスへロードし、０〜４℃で３０分間該抽出物をインキュベートして行った。非結合及び非特異的に結合したタンパク質は、高塩バッファーの７カラム量で洗浄し、ＡＵ０．０２でのＵＶ２６０ｕｍ検出がべースラインに戻るまで、最初のタンパク質抽出バッファーで洗浄して除去した。ｐＨ特異的溶出はｐＨ５．５のＰＢＳバッファー、又はｐＨ ７．４のＰＢＳ中１００ｍＭのＡＴＰ及びｐＨ ７．４のＰＢＳ中１００μＭのＲＧＤペプチドを含む溶離液で行った。
【０１５３】
免疫アフィニティーＦＰＬＣクロマトグラフィーは、特異的なＭａｂカラムにロードしたタンパク質中の抽出物と共に類似の方法で行った：１０ｍｇの精製Ｍａｂ Ｎ６は１３原子スペーサーアームを有する共有チオエステル結合で、活性化したクロスリンクアガロースへ、スルフォリンク（Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）プロトコールを用いて結合させた。非特異的に結合したタンパク質は上記のようにカラムから除去され、特異的に免疫認識されるタンパク質は５０ｍＭクエン酸ナトリウム＊バッファー中のｐＨ２．５溶離液を用いて溶出された。
【０１５４】
Ｈｓｐ４７もまたゼラチンアフィニティー精製されうる。１７５フラスコのコンフルエントなＨＵＶＥＣを、上記の通り１０μＭのＢＦＡで、２０％ＦＣＳ及び標準的なＥＣ培養補充物を補充したＦ１２Ｋ培地内で、６時間３７℃で５％二酸化炭素下で誘導した。その後付着ＥＣを界面活性剤バッファー（７５ｍＭのＴｒｉｓ・Ｃｌ、１７５ｍＭ のＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｘ−１００、２ｍＭのＰＭＳＦ）内で掻き取って収集し、音波処理で溶解させ、冷却エッペンドルフ遠心機で１５，０００ｒｐｍにて遠心分離して細胞破片から抽出物を清浄した。清浄した抽出物は０．５ｍｌ／分の蠕動ポンプを用い、５ｍｌの共有結合したゼラチン４Ｂセファロースカラム上にロードした。非結合タンパク質は廃棄した。カラムを、その後界面活性剤を含まないバッファー（上記のように、ｗ／ｏ Ｔｘ−１００）、低塩バッファー（ＮａＣｌなし）、および高塩バッファー（プラス５００ｍＭのＮａＣｌ）で、べースラインの測定値が得られるまでＵＶ２６０ｎｍの制御下で洗浄した。Ｈｓｐ４７の特異的溶出は、界面活性剤を含まないバッファーのｐＨをｐＨ４．８まで低下させて行った。回収した溶出物はすぐにｐＨ７．４まで滴定して戻した。カラムは直ちに再生させ、ｐＨ７．４のバッファーで洗浄した。
【０１５５】
図２は５１Ｃｒ放出ＣＩＫ細胞毒性アッセイ法の前に、３０分間、２１℃でゼラチンアフィニティー精製Ｈｓｐ４７と共にＥＣをインキュベートした結果を示す。過剰な非結合Ｈｓｐ４７タンパク質は、ＣＩＫのエフェクター細胞の添加前に３回洗浄してウェルから除去した。対照としての非処理ＢＦＡ誘導ＨＵＶＥＣ標的は、タンパク質処理群と比較した。ゼラチンマトリックスから、ｐＨ特異的溶出を用いて精製した４６．５ｋＤａのタンパク質である、ヒトＨｓｐ４７はＥＣを保護する。
【０１５６】
実施例８
Ｈｓｐ４７ペプチド
ペプチド合成
Ｈｓｐ４７とＨＬＡ−Ａ２とに共通な相同領域に対応する配列ＡＶＬＳＡＥＱＬＲの親水性９量体ペプチドは、ＢｉｏＡｐｐｌｉｅｄ（登録商標）ペプチド合成機で、ＳｔａｎｆｏｒｄのＰＡＮ施設により合成され、ＨＰＬＣ精製され、アミノ酸配列が確認された。純粋なペプチドは凍結乾燥され、−２０℃で保存された。このペプチドは水溶液中では可溶性であり、示された濃度でＰＢＳ及びＲＰＭＩ １６４０中で使用された。
【０１５７】
精製された天然ｐ４６及びこれから派生したタンパク質分解断片のアミノ酸配列決定はＡ． Ｗｉｌｌｉｓ（Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＭＲＣ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、 Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）により行われた。
【０１５８】
実施例９
インビボアッセイ法
ＳＣＩＤ／ｈｕ皮膚移植片−メラノーマ−ＣＩＫ腫瘍パージモデル
メス６週齢ｂａｌｂｃ／ＳＣＩＤマウスを、皮膚移植の前日に５００Ｒａｄで照射した。ヒト完全厚包皮移植片は、無菌で皮下の血管床を暴露し、それらの縁をそろえて、２０ｘ３０ ｍｍの移植片を産出して調製した。少量移植片のみ産出する包皮、または架の齢（ｓｈｅｌｆ ａｇｅ）の２４時間より古い包皮は拒絶された。痲酔された動物は３７℃に加熱した手術可能な環境で、それらの近隣の適合する領域を無菌で表皮剥落させて調製された。完全厚皮膚移植片を、切断した吸収可能な縫合糸で縫い付け、無菌で包帯し、完全な生着が判明するまで、移植した動物を個々に収容した。生着後、ＰＢＳ中、１ｘ１０５メラノーマＷＮ９又は１２０５ＬＵ細胞を、三匹ずつの動物のヒト完全厚皮膚の単一部位の皮膚内に注入し、観察及び触診により増殖を監視した。直径５ｍｍを超えるはっきりした結節腫瘍組織量を有する動物に、溶解活性の判明した１ｘ１０７ＣＩＫ細胞（ＦＣＳもＩＬ−２も含まないＲＰＭＩ中に懸濁された）を、ＣＩＫ培養１４〜２１目の５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイ法と同日に腹腔内に注入した。ＣＩＫ注入の０時間、２４時間、４８時間、７２時間後に動物を屠殺し、内部器官、及びヒト皮膚／メラノーマ移植片を別々に固定し、Ｈ＆Ｅの及び免疫−ペルオキシダーゼ抗−ヒトＣＤ３、ヒトＰＥ−ＣＡＭ及びヒトＫｉｒ抗原染色組織面の光学顕微鏡検査法で分析した。ＩＰ注入ＣＩＫ細胞は選択的にメラノーマ腫瘍の血管床に浸潤し、これは、抗−ヒトＰＥ−ＣＡＭ Ｍａｂを用いたＩＰＯＸ組織学的免疫検出により確認された。マウス肝臓の門領域への中程度の浸潤を除き、正常ヒト皮膚移植片またはマウス宿主の脈間構造及び皮膚組織ともインビボでは、ＣＩＫにより浸潤しなかった。
【０１５９】
ＳＣＩＤ／ｈｕ ＨｅＬａルシフェラーゼＨｓｐ４７分泌
ＣＩＫ腫瘍パージ生存画像化モデル
メス６週齢のＢａｌｂｃ／ＳＣＩＤを画像化可能なインビボ蛍光が可能な２ｘ１０４Ｈｅｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ頚部癌腫細胞の腹腔内注入の前日に５００Ｒａｄで照射した。ＣＩＫ処理群はＨｅＬａ細胞の抗原投与時に尾静脈への注射により２０：１のＥ：Ｔ比（１ｘ１０６細胞）でＣＩＫを注入した。これらのＨｅｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞は強制的に注入の２４時間前に、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ＮＹ）のプロトコールにより、前初期ＣＭＶプロモーター制御下での分泌に向けた完全長ｈｕＨｓｐ４７を強制発現するベクター、またはそれぞれに無関係な対照ベクターを用いて一過性的に形質転換させた。トランスフェクション効率を、その後の、上記Ａｘｉｏｐｈｏｔ（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）蛍光顕微鏡を用いた、形質転換ＨａＬａＬｕｃ単層の蛍光レ−ザ−顕微鏡検査法分析により、ｅＧＦＰ及びＨｓｐ４７コンストラクトの共トランスフェクションによりモニターした。Ｃ． Ｃｏｎｔａｇ博士と協力し、定量的デジタルイメージング過程を用いて、残留したＨｅｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのインビボ化学蛍光を、ＣＩＫ抗原投与後の０、２、及び７日目にモニターした（図１３参照）。ＣＩＫ注入を受けた動物は、ＣＩＫパージの１週間後、生きた発光腫瘍組織量の著しい減少を示した。ＣＩＫ注入を受けなかった動物は、ＨｅＬａ細胞の広範囲にわたるＩＰの増殖を示した。ＣＩＫ細胞は高く且つ迅速な固体腫瘍パージの可能性を示した。
【０１６０】
マウスＧｖＨＤモデル
オスＢａｌｂ／ｃマウスを移植前に５００Ｒａｄで照射した。骨髄（ＢＭ）及び脾臓由来幹細胞を、Ｂ１０Ｄ２（Ｈ−２ｄバックグラウンド）マウスから得た。２．５Ｘ１０６ ＢＭ及び１ｘ１０６脾臓細胞を個々のレシピエントのオスＢａｌｂ／ｃ動物の移植片源としてプールした。この非増菌幹細胞の細胞集団を総量３００μｌ中３００μｇのＨｓｐ４７−Ｇｓｔタンパク質を含むＲＰＭＩまたは１００μｇのＧｓｔ対照タンパク質のみを含むバッファー中に懸濁した。細胞及びタンパク質を０日目に単回注入により与えた。他の免疫抑制処理は与えなかった。動物は骨髄移植後４週間モニターした。Ｈｓｐ４７−Ｇｓｔタンパク質処理を受けた５匹の全ての動物はＧｖＨＤの開始、毛皮の逆毛、体重減少及び死から防御された。Ｇｓｔタンパク質のみの処理を受けた動物全てが、ＧｖＨＤの徴候、毛皮の逆毛、体重減少を示し、５匹のうち４匹が死亡した（図１５参照）。
【０１６１】
実施例１０
ＦＡＣＳ分析
この実施例は、免疫細胞サブセットを同定し、分離するための改変Ｈｓｐ４７の使用について開示する。
【０１６２】
種々の免疫細胞がＨｓｐ４７に反応し、内皮細胞を攻撃しない。これらの非内皮反応細胞細胞からＨｓｐ４７存在下でこのような細胞を同定し、養子免疫治療集団を増殖させるために、蛍光標識したＨｓｐ４７を標準的細胞ソーティング装置において使用し、このような細胞を同定し分離することができる。このような細胞はまた、様々な疾病の状態における免疫細胞サブセット分析用の診断ツールとしても機能できる。
【０１６３】
ｅＧＦＰ標識Ｈｓｐ４７ＦＡＣＳプローブを、他の遺伝子操作を用いて生産できる（図８Ａ）。これにより可能性のあるｈｕＨｓｐ４７レセプター及びこのようなＨｓｐ４７結合タンパク質を発現するＣＩＫサブセットを検索することが可能となった。ＦＩＴＣチャンネル用のＦＡＣＥプローブとしてのｅＧＦＰ標識ＨｕＨｓｐ４７を用いた、ＣＥ５６−ＰＥとの共染色を伴う成熟ｄ２１ＣＩＫのＦＡＣＳ分析は、分析したＣＩＫのＨｓｐ４７結合能における違いに基づく。ｅＧＦＰ標識Ｈｓｐ４７プローブは４分の１の成熟ＣＩＫを染色した（２６％）。
【０１６４】
前述の説明は、本発明を実施するために行うことが可能な具体的な方法を詳細に示している。このような具体的な方法を詳細に記したため、当業者は、本発明の成果を用いることにおいて、同様の情報に到達した際、他の信頼性のある方法の工夫の仕方を十分に認識すると思われる。従って、前述の詳細は本文に記されるが全体の範囲を制限するものではなく、むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲の法律的な構成によってのみ決定されるものであるべきである。本明細書に引用されている全ての文書は参照として完全に組み込まれる。
【図面の詳細な説明】
【図１】図１はそれぞれヒトＨｓｐ４７ｃＤＮＡの塩基配列及びそれに対応するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２はＨｓｐ４７、ＨＬＡ−Ａ抗原、及びＩＬ−１２間の関連する配列並びに共通配列を示す。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃは腫瘍標的及び内皮細胞（ＥＣ）のＣＩＫ媒介溶解を示す。
【図４】図４はＣＩＫ腫瘍溶解及びＥＣ溶解をブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）濃度の機能として示したものである。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、未処理、３μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのＢＦＡで処理した内皮細胞抽出物内のＨｓｐ４７の誘導を免疫検出したものを示す。
【図６】図６Ａ及び図６ＢはＢＦＡ誘導したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）抽出物からのｐ４６のＦＰＬＣ精製を示す。
【図７】図７は精製天然Ｈｓｐ４７（ｐ４６．５）のＨＵＶＥＣ−ＣＩＫ保護検定アッセイ法の結果を示す。
【図８】図８Ａは及び図８Ｂは、ＰＣＲによるクローニングサイトの導入を通じてのｈｕＨｓｐ４７遺伝子カセットのクローニング、及び発現産物の電気泳動分離を示す。
【図９】図９は外部から提供されたｒＨｓｐ４７は、ＣＩＫ媒介溶解からＨＵＶＥＣ細胞を保護することを示す。
【図１０】図１０は、ＢＦＡ処理によるＨｓｐ４７ｍＲＮＡのアップレギュレーションを確認するノーザン分析の結果である。
【図１１】図１１は、ｈｕＨｓｐ４７の組換え発現が、ＨＵＶＥＣ細胞をＣＩＫ媒介溶解に対して抵抗性にすることを示す。
【図１２】図１２は、Ｈｓｐ４７及びＨＬＡ−Ａ２＊２０１の両方に共有されるペプチド「ＡＶＬＳＡＥＱＬＲ」が、ＨＵＶＥＣ細胞をＣＩＫ媒介溶解から保護することを示す。
【図１３】図１３は、移植、対、骨髄移植に関連した組換えＨｓｐ４７による宿主疾病保護を示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＢＦＡによるＨｓｐ４７及び他のタンパク質の誘導を示す。
【図１５】図１５Ａ、図１５Ｂ、及び図１５Ｃは、Ｈｓｐ４７の構造ドメイン、種々のドメインのＣ末端トランケーション、およびそれらのＥＣ細胞溶解への影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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