(57)【要約】分子の製剤を投与して、プリオンなどの感染性タンパク質による感染に対する抵抗性を細胞に与える方法を開示する。本製剤は、好ましくは、（1）目的のタンパク質上のある範囲のエピトープ（例えば、PrP上のエピトープ）を認識して選択的に結合し、かつ（2）タンパク質の高次構造を、タンパク質の感染型高次構造へと変化させる一連の事象を妨げるエピトープに結合する、複数のFab断片を含む。本分子および製剤は、感染性タンパク質の細胞からの除去にも有用である。
2004535387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
PrPScタンパク質による感染を予防するための方法であって、：
細胞を、PrPCタンパク質上の複数のエピトープと結合する分子の製剤と接触させる段階；ならびに
分子とPrPC上の複数のエピトープとの間で結合が起こるような期間、および条件下で、分子を細胞と接触した状態に保たせておき、それによって分子がPrPCタンパク質からPrPScタンパク質への高次構造の変化を妨げる段階
を含む方法。
【請求項２】
分子がPrPCと結合する抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
分子が、D13、D18、R1およびR2からなる群より選択されるFab断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
病的高次構造のタンパク質を細胞から除去する方法であって：
第1の非病的高次構造を呈するタンパク質に感染しており、かつ両方の高次構造が内部に存在する細胞を、分子の製剤と接触させる段階；
分子と第1の高次構造のタンパク質上の複数のエピトープとの間で結合が起こるような期間、および条件下で、分子を細胞と接触した状態に保たせておき、それによって、第2の高次構造のタンパク質への変換が、細胞が第2の高次構造を持つタンパク質を細胞から除去することを可能にする、十分に長い期間にわたって妨げられる段階
を含む方法。
【請求項５】
タンパク質がPrPタンパク質であって、第1の高次構造がPrPCであり、かつ第2の高次構造がPrPSCである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
分子がPrPCと結合する抗体である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
分子が、D13、D18、R1およびR2からなる群より選択されるFab断片を含む、請求項5記載の方法。
【請求項８】
PrPCへの結合を妨げる分子に関してアッセイする方法であって：
PrPC分子を提供する段階；
被験化合物を提供する段階；
PrPCに結合する抗体を提供する段階；
抗体のPrPC分子への結合が予想される期間、および条件下で、被験化合物をPrPC分子および抗体と相互作用させておく段階；
PrPCの抗体への結合レベルを決定する段階；ならびに
抗体とPrPC分子との結合をもたらす被験化合物の効果を算出する段階
を含む方法。
【請求項９】
抗体がD18およびD13からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
抗体が支持体表面と結合しており、PrPCおよび被験化合物が溶液中または懸濁液中に提供される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
PrPCが支持体と結合しており、抗体および被験化合物が溶液中または懸濁液中に提供される、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
PrPCに結合する抗体の治療的有効量を被験者に投与する段階を含み、ここで抗体は、薬学的に許容される担体中に存在する、治療の方法。
【請求項１３】
抗体がD13およびD18からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
被験者による抗体の産生を引き起こす抗原を被験者に投与する段階を含み、ここで抗体はPrPCと結合する、治療の方法。
【請求項１５】
PrPScタンパク質による感染を予防するための組成物であって：
薬学的に許容される担体、およびPrPCタンパク質上の複数のエピトープと結合する分子を含む製剤であって、その分子とPrPC上の複数のエピトープとの間で結合が起こるような期間、および条件下で、分子がエピトープと結合した状態を保ち、それによって分子がPrPCタンパク質からPrPScタンパク質への高次構造の変化を妨げる製剤
を含む組成物。
【請求項１６】
分子がPrPC上のエピトープと結合する抗体である、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
分子が、D13、D18、R1およびR2からなる群より選択されるFab断片を含む、請求項15記載の組成物。
【請求項１８】
病的高次構造のタンパク質を細胞から除去するための組成物であって：
薬学的に許容される担体、および、第1の高次構造のタンパク質上の複数のエピトープと結合し、それによって、第2の高次構造のタンパク質への変換を、細胞が第2の高次構造を持つタンパク質を細胞から除去することを可能にする、十分に長い期間にわたって妨げる分子を含む製剤
を含む組成物。
【請求項１９】
タンパク質がPrPタンパク質であって、第1の高次構造がPrPCであり、かつ第2の高次構造がPrPScである、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
分子がPrPCと結合する抗体である、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
分子が、D13、D18、R1およびR2からなる群より選択されるFab断片を含む、請求項19記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の援助を受けた研究としての申告
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）により授与された助成金番号NS14069およびAG02132の下で、米国政府による支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有しうる。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に治療学および治療方法に関し、より詳細には、プリオンなどの感染性タンパク質による感染を治療、または予防するための、治療学および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
プリオン複製に関して支持されているモデルでは、病的プリオンタンパク質（PrPSc）テンプレートと内因性細胞PrP（PrPC）タンパク質との直接的な相互作用により、新生感染性プリオンの形成が引き起こされると提唱されている（Telling, G.C.ら、「プリオンタンパク質の病的アイソフォームの高次構造がプリオンの多様性の暗号化および伝播を行っていることの証拠（Evidence for the conformation of the pathologic isoform of the prion protein enciohering and propagating prion diversity）」Science 274、2079-2082 (1996)；Prusiner, S.B.、「プリオン（Prions）」、Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 13363-13383 (1998)）。PrP配座異性体のいずれかと特異的に結合する試薬は、この相互作用を阻害することにより、プリオン産生を妨げる可能性がある。
【０００４】
ウシ海綿状脳症プリオンに対する曝露と密接な関連のある、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病の発生が続いていることに対する懸念から、有効なプリオン治療法に対する需要が高まっている（Brown, P.、Will, R.G.、Bradley, R.、Asher, D.M.およびDetwiler, L.、「ウシ海綿状脳症および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病：背景、進化および現在の懸念（Bovine spongiform encephalopathy and variant Creutzfeldt-Jakob disease: Background, evolution, and current concerns）」、Emerging Infectious Diseases 7、6-16 (2001)；Bruce, M.E.ら、「マウスへの伝染は「新たな変異型」CJDがBSEの原因物質に起因することを示している（Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent）」、Nature 389, 498-501 (1997)）。プリオンの増殖は、おそらくは別の細胞因子の存在下における、PrPCとPrPScとの特異的相互作用が関与する機構を介して進行すると考えられている（Prusiner, S.B.、「プリオン（Prions）」、Proc. Natl Acad. Sci USA 95, 13363-13383 (1998)；Prusiner, S.B.、「新たなタンパク性感染性粒子がスクレイピーを引き起こす（Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie）」、Science 216、136-144 (1982)；Kaneko, K.ら、「スクレイピープリオン増殖時に、プロテインXが細胞プリオンタンパク質上の不連続的エピトープと結合するという証拠（Evidence for protein X binding to a discontinuous epitope on the cellular prion protein during scrapie prion propagation）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94、10069-10074 (1998)；Zulianello, L.ら、「プリオン形成のドミナントネガティブな阻害は、プリオンタンパク質の欠失変異誘発により減少する（Dominant-negative inhibition of prion formation diminished by deletion mutagenesis of the prion protein）」、J. Virol. 74、4351-4360 (2000)）。本発明は一部には、PrPCを認識する抗体が、必要不可欠な分子相互作用を阻止し、PrPScの形成を妨げるという発見に基づく。特異抗体が、アルツハイマー病のインビボにおける病態を転換する効率の報告は、この見方を支持する（Schenk, D.ら、「アミロイド-βによる免疫処置はPDAPPマウスにおけるアルツハイマー病様の病態を軽減する（Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse）」、Nature 400, 173-177 (1999)；Bard, F.ら、「末梢投与したアミロイドβペプチドに対する抗体は中枢神経系内部に入り、アルツハイマー病のマウスモデルの病態を軽減する（Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease）」、Nat. Med. 6、916-919 (2000)）。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
（a）感染性タンパク質（例えば、プリオン）の形成を防止する能力；および／または（b）プリオンなどの感染性タンパク質を感染細胞から除去する能力、を特徴とする分子、特に抗体を開示する。抗体などの分子、および治療活性のあるその断片を、好ましくは医薬製剤中に含めて、それをタンパク質（例えば、PrPタンパク質）の特定の高次構造（例えば、PrPSc）と関係のある、プリオン関連疾患などの疾患を治療および／または予防するために、本発明の方法によって投与する。
【０００６】
PrPScタンパク質による感染を予防する方法、および／または、成立したPrP感染を治療してPrPScを除去する方法を開示する。本方法は、特定の分子を細胞と接触させる段階、ならびに、分子がPrPC上のエピトープと結合し、それによってPrPCタンパク質からPrPScタンパク質への高次構造の変化を妨げるような期間、および条件下で、そのような分子を細胞と接触した状態に保たせる段階を含む。分子は好ましくは医薬製剤中にあり、より好ましくはD13、D18、R1およびR2からなる群より選択されるFab断片を含む。
【０００７】
本発明は、PrP上の種々のエピトープ領域を認識して、PrPScに感染した培養マウス神経芽腫細胞（ScN2a）におけるプリオン増殖を阻害する、一群の組換え抗体Fab断片を対象とする。本明細書に開示する抗体は細胞表面のPrPCと結合し、それによってPrPScの形成を用量依存的な様式で阻害する。最も効力のある抗体であるFab D18で処理した細胞では、プリオンの複製が完全に消失するとともに既存のPrPScが迅速に除去され、この抗体に成立したPrPSc感染を治癒させる能力があることを示している。Fab D18の強力な活性は（1）他の抗体と比較して、細胞表面にあるPrPC分子の全集団をより完全に認識する能力、（2）Fab D18が結合するPrPCタンパク質上のエピトープの位置、と関係している。提示された結果は、抗体にプリオン病を予防および治療する能力、ならびに薬物ターゲティング用のPrPCの領域を同定する能力があることを示している。
【０００８】
本発明はさらに、アッセイ装置およびアッセイ法を行うための方法を含む。本方法は、ハイスループットのスクリーニング方法を用いて、D18などの抗体とPrPCとの間の結合を妨害しうる分子を同定することを含む。続いて、同定された分子を、本明細書にさらに述べる方法を用いて検討し、PrPCタンパク質のPrPScタンパク質への変換を、そのような変換が通常であれば起こると考えられる自然な環境の下で阻止する能力を、明らかにすることができると考えられる。
【０００９】
本発明の1つの面は、感染性タンパク質の形成および／または細胞からの除去をもたらす、抗体およびその断片を含む分子である。
【００１０】
本発明には、治療的な性質を持つさらに2つの面がある。第1に、既存のプリオン病を治療するため、および／または動物がプリオン病を発症するのを予防するために、抗体を投与する。第2に、免疫応答を生じる（すなわち、抗体を産生する）抗原を投与し、産生された抗体が、既存のプリオン病を治療するか、および／または動物がプリオン病を発症するのを予防する。
【００１１】
本発明の上記およびその他の目的、利点および特徴は、以下により詳しく説明する分子、抗体および方法の詳細を読むことにより、当業者には明らかになると考えられる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の分子、抗体および方法を説明する前に、本発明が、記載される特定の分子、抗体および方法には限定されず、それらは当然ながら異なってもよいことが理解される必要がある。また、本発明の範囲は添付する特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書中に用いる用語は特定の態様を説明することのみを目的としていて、制限を意図したものではないことも理解される必要がある。
【００１３】
ある範囲の値が示される場合、その範囲の上限と下限との間にある各値、および別の指定された値またはその指定された範囲内にある値は、その文脈で明らかに別の指示がなされない限り、下限の単位の10分の1までが本発明に含まれるものと解釈される。これらの小範囲の上限および下限は別個にその小範囲に含まれてもよく、それも本発明に含まれ、指定された範囲に特定の除外される限界がある場合はその対象となる。指定された範囲が一方または両方の限界を含む場合、これらの含まれる限界のいずれか一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００１４】
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。本発明の実施または検討のために、本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に説明するものである。本明細書で言及するすべての刊行物は、その刊行物の引用と関係のある方法および／または材料の開示および記載のために参照として本明細書に組み入れられる。
【００１５】
本明細書および添付する特許請求の範囲において用いる場合、単数形の「1つの（a）」「1つの（an）」および「その（the）」は、その文脈で明らかに別の指示がなされない限り、複数のものに関する言及も含むことに留意されたい。したがって、例えば、「1つの抗原」に対する言及は複数のこのような抗原を含み、「その分子」に対する言及は1つまたは複数の分子ならびに当業者に知られたその等価物に関する言及を含み、その他も同様である。
【００１６】
本明細書で考察する刊行物は、本出願の提出日の以前にさかのぼってそれらの開示を提供する目的のみで提供される。本明細書中のいかなる記載も、本発明者らが先行発明によるこのような開示に先行する権利を持たないことを認めたものとみなされるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の刊行日とは異なる可能性があり、それらは個別に確認される必要があると考えられる。
【００１７】
定義
「治療」「治療すること」などの用語は、本明細書では一般に、望ましい薬理的および／または生理的効果を得ることを意味する。この効果は感染症、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に防止する点で予防的であってもよく、ならびに／または、感染性タンパク質（例えば、プリオン）を部分的または完全に除去し、疾患および／もしくはその疾患に起因する有害作用を治癒させる点で治療的であってもよい。本明細書において用いる「治療」は、細胞系、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療をカバーし、これには、（a）感染症および／もしくは疾患に対する素因がある可能性はあるが、まだそれを有するとは診断されていない被験者における疾患の発生を予防すること；（b）感染症もしくは疾患を抑制すること、すなわちその発症を停止させること；または（c）感染症もしくは疾患を緩和すること、すなわち疾患の緩解をもたらすこと、が含まれる。本発明の治療は、感染性タンパク質、特にプリオンが関係する病状のある患者を治療することを目標とする。したがって、本発明の治療は、感染性タンパク質、特にプリオンが関係する任意の感染症または病状を予防、抑制または緩和することを含むと考えられる。
【００１８】
本明細書で用いる場合、「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗体」（Mab）という用語は、完全な分子のほかに、タンパク質と特異的に結合しうる抗体断片（例えば、Fab断片およびF(ab')2断片など）も含むことを意味する。Fab断片およびF(ab')2断片は完全な抗体のFc断片を欠いており、循環路から明らかにより迅速に除去される上、完全な抗体よりも非組織的な組織結合が少ないと考えられる；例えば、Wahi, J. Nucl. Med. 24 (1983)、316-325を参照されたい。このため、これらの断片、さらにはFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の抗体には、ファージディスプレイ、ヒト免疫グロブリン遺伝子および／もしくはヒト染色体を有するトランスジェニックマウス、ヒト体内から単離された免疫細胞、ヒト免疫細胞のインビトロもしくはエキソビボ免疫処置、またはその他の任意の利用可能な方法によってか、またはそれから入手可能な、キメラ抗体、一本鎖抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体が含まれる。PrPタンパク質に対する抗体は、米国特許第5,846,533号；第6,290,954号、ならびに、1986年10月8日に寄託された細胞系ATCC HB9222により産生されたモノクローナル抗体263K 3F4を開示している、公開済みのPCT出願・国際公開公報第02／10335号および第4,806,627号に開示および記載されており、これらはすべてその全体が参照として本明細書に組み入れられる。抗体を産生する細胞系は、American Type Culture Collection、12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852）から入手しうる。
【００１９】
「プリオン」「プリオンタンパク質」「PrPScタンパク質」「PrPSc」などの用語は、PrPタンパク質の感染性PrPSc形態を指すために、本明細書において互換的に用いられ、これは「タンパク質（protein）」および「感染（infection）」という単語の短縮である。この粒子は、（それのみではないにせよ）主として、PrP遺伝子によってコードされるPrPSc分子から構成される。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。既知のプリオンには、動物を感染させて、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性疾患であるスクレイピーのほか、ウシ海綿状脳症（BSE）すなわち「狂牛病」、およびネコのネコ海綿状脳症を引き起こすものがある。ヒトが罹患するプリオン病としては、（1）クールー、（2）クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、（3）ゲルストマン・ストラッサー・シャインカー病（GSS）、および（4）致死性家族性不眠症（FFI）の4種類が知られている。本明細書において用いる「プリオン」には、以上の疾患のすべてもしくは任意の1つ、または用いられる任意の動物、特にヒトおよび家畜における他の疾患を引き起こすすべての型のプリオンが含まれる。
【００２０】
「高次構造的に変質した（conformationally altered）タンパク質」「タンパク質の疾患関連高次構造」などの用語は、疾患と関連のある三次元高次構造を有するタンパク質を説明するために、本明細書において互換的に用いられる。高次構造的に変質したタンパク質は、疾患の原因となること、疾患のある症状の要因であること、または疾患と関連のある他の要因の結果として現れることが考えられる。高次構造的に変質したタンパク質は、同じアミノ酸配列を有するものとは別の高次構造として現れる。一般に、形成される高次構造的に変質したタンパク質は、疾患と関連のない他の「弛緩した」高次構造と比べて、高次構造の点で「拘束」されている。本開示を読んだ当業者は、本発明は概してプリオンに関して説明されているにもかかわらず、本発明の抗体製剤を他の高次構造的に変質したタンパク質にも適用しうることを認識すると考えられる。2つまたはそれ以上の異なる高次構造を組み立て、少なくとも1つの高次構造が、高次構造的に変質したタンパク質の一例であるようなタンパク質と関連のある、疾患の非制限的なリストを以下に示す。
【００２１】
2004535387.tif 000003
【００２２】
「無効化する（sterilizing）」「無効にする（making sterile）」などの用語は、本明細書において、何かを非感染性にすること、または何かが疾患を引き起こせないようにすることを意味する。これは詳細には、タンパク質を非感染性にすること、または疾患もしくは疾患の症状を引き起こせないようにすることを指す。これはさらにより詳細には、高次構造的に変質したタンパク質（例えば、プリオンとして知られるPrPSc）が、疾患もしくは疾患の症状を引き起こせないようにすることを指す。
【００２３】
「有効用量」または「有効量」とは、所望の無効化の結果を得るのに十分な化合物の量を意味する。これは、（1）用いる活性物質、（2）製剤中の抗体の組み合わせ、（3）無効化しようとする対象または材料の種類、および（4）存在する可能性のある感染性タンパク質の量または濃度、などの要因によって異なると考えられる。本発明の製剤、またはより詳細には本発明の抗体製剤は、無効化しようとする材料1mlまたは1mg当たり1〜500μgの範囲にある抗体の量として、材料と混合しうると考えられる。濃度は、結果として得られる組成物が、時間をかけて処理した材料が感染を引き起こさないように高次構造的に変質したタンパク質の感染性を低下させる（好ましくは消失させる）のに有効であれば、十分である。（1）一部の材料には変質したタンパク質が他のものよりも高い濃度で存在すると考えられる、（2）一部の材料は他のものよりも高い頻度で接触する、および（3）個々のタンパク質の感染性の程度は異なる、という理由から、無効化を行うのに必要な有効用量または濃度の範囲にはかなり幅があると考えられる。また、ある一定の量の材料を処理するのに必要な用量は、処理を行うpH、化合物を所望の低pH（例えば、4.5またはそれ未満）レベルの下で材料と接触した状態に保つ時間の長さ、ならびに周囲の温度および圧力によっても幾分異なりうることも指摘されている。
【００２４】
本明細書において用いる「LD50」という用語は、投与した実験動物全体のうち50％が死亡すると考えられる、作用物質の用量のことである。これは通常、経口的、非経口的などの侵襲的な投与のことを指すが、これを、作用物質、例えば抗体含有製剤の局所塗布のような、より侵襲度の低い投与方法に適用してもよい。
【００２５】
「PrP遺伝子」という用語は、本明細書において、既知の多型および病的変異を含む、タンパク質を発現する遺伝物質を説明するために用いられる。「PrP遺伝子」という用語は一般に、何らかの形態のプリオンタンパク質をコードするあらゆる種のあらゆる遺伝子を指す。一般的に知られたPrP配列のいくつかは、Gabrielら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097-9101 (1992)ならびに米国特許第5,565,186号および第5,792,901号に記載されており、これらはそのような配列を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられるが、これについては添付した図1〜3の配列を参照されたい。PrP遺伝子は任意の動物、ならびにそれらの任意およびすべての多型、および変異に由来するものでよく、これにはまだ発見されていない他のこのようなPrP遺伝子も含まれるものと認識される。このような遺伝子によって発現されるタンパク質は、PrPC（非病的）またはPrPSc（病的）形態のいずれかをとると想定しうる。
【００２６】
「標準化されたプリオン標本」「プリオン標本」「標本」などの用語は、プリオン病の徴候を呈する哺乳動物であって、（1）本明細書に記載の導入遺伝子を含みうる、（2）切除された（ablated）内因性プリオンタンパク質遺伝子を有しうる、（3）遺伝的に異なる種由来のプリオンタンパク質遺伝子の多数のコピーを有しうる、および／または（4）切除された内因性プリオンタンパク質遺伝子と遺伝的に異なる種からのPrP遺伝子との雑種でありうる、動物の脳組織から得られた組成物（例えば、脳ホモジネート）を説明するために、本明細書において互換的に用いられる。1および2というように、1〜4のさまざまな組み合わせが可能である。標準化されたプリオン標本を得るための哺乳動物は、プリオンの接種の結果として、および／または遺伝的に改変された構成（例えば、PrP遺伝子の多数のコピー）に起因する疾患の発症のために、CNS機能障害の臨床徴候を呈する。標準化されたプリオン標本およびそのようなものを作製する方法は、1999年6月1日に発行された米国特許第5,908,969号、および2000年2月1日に発行された米国特許第6,020,537号に記載および開示されており、これらは標準化されたプリオン標本の開示および説明のためにその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００２７】
本明細書において用いる「アルツハイマー病」（本明細書では「AD」と略記する）という用語は、主として海馬および大脳皮質におけるアミロイドβタンパク質を含む神経斑の形成、ならびに学習および記憶の障害を伴う疾患を指す。本明細書で用いる「AD」は、ADならびにAD型病態の両方を含むものとする。
【００２８】
「AD型病態」という用語は、本明細書で用いる場合、海馬および大脳皮質におけるアミロイドβタンパク質を含む神経斑の形成を、非制限的に含むCNS変化の組み合わせのことを指す。このようなAD型病態には、必ずしもこれらには限定されないが、APPの異常発現および／または沈着、APPの過剰発現、異常なAPP遺伝子産物の発現、ならびにADと関連のある他の異常な現象を伴う障害が含まれる。AD型病態の例には、APPの過剰発現を伴うダウン症候群に付随するAD型病態が非制限的に含まれる。
【００２９】
「アルツハイマー病に付随する現象」という用語は、本明細書で用いる場合、ADに付随する構造的、分子的または機能的な事象、特に動物モデルにおいて容易に評価可能な事象を指す。この種の事象には、アミロイド沈着、神経病態の発症、学習および記憶の障害、ならびにADに付随する他の特徴が非制限的に含まれる。
【００３０】
「脳アミロイド血管症」（本明細書ではCAAと略記する）という用語は、本明細書で用いる場合、大脳血管内部のアミロイド沈着の形成に付随し、大脳実質の出血によって悪化する疾患を指す。CAAでは、脳卒中のほかに、小脳出血およびクモ膜下出血のリスクも増大する（Winters (1987) Stroke 18: 311-324；Haanら(1994) Dementia 5: 210-213；Itohら(1993) J. Neural. Sci. 116: 135-414）。CAAは出血開始前の痴呆とも関連がある。CAAでみられる血管アミロイド沈着はADでなくとも存在することがあるが、ADに付随して存在する頻度の方が高い。
【００３１】
「脳アミロイド血管症に付随する現象」という用語は、本明細書で用いる場合、CAAに付随する構造的、分子的または機能的な事象、特に動物モデルにおいて容易に評価可能な事象を指す。この種の事象には、アミロイド沈着、脳実質出血およびCAAに付随する他の特徴が非制限的に含まれる。
【００３２】
「β-アミロイド沈着」という用語は、本明細書で用いる場合、Aβならびに他の物質から構成される脳内の沈着物のことを指す。
【００３３】
本明細書で用いる略号には以下のものが含まれる：
CNSは中枢神経系；
BSEはウシ海綿状脳症；
CJDはクロイツフェルト・ヤコブ病；
FFIは致死性家族性不眠症；
GSSはゲルストマン・ストラッサー・シャインカー病；
ADはアルツハイマー病
CAAは脳アミロイド血管症
Huはヒト；
HuPrPはヒトプリオン蛋白質；
Moはマウス；
MoPrPはマウスプリオン蛋白質；
SHaはシリアンハムスター；
SHaPrPはシリアンハムスタープリオン蛋白質；
PAMAMはポリアミドアミドデンドリマー；
PETはポリエチレンイミン；
PKはプロテイナーゼK；
PPIはポリプロピレンイミン；
PrPScはプリオンタンパク質のスクレイピー型アイソフォーム；
PrPcは、プリオンタンパク質の、細胞に含まれる一般的な正常型アイソフォーム；
PrP 27-30またはPrPSc 27-30は、処理耐性型またはプロテアーゼ耐性型のPrP；
M0PrPScはマウスプリオンタンパク質のスクレイピー型アイソフォーム；
N2aは本研究に用いる樹立された神経芽腫細胞株；
ScN2aは、スクレイピーに長期的に感染させた神経芽腫細胞株；
ALSは筋萎縮性側索硬化症；
HDはハンチントン病；
FTDは前頭側頭型痴呆；
SDSはドデシル硫酸ナトリウム；
SODはスーパーオキシドジスムターゼ、のことである。
【００３４】
発明の概論
本発明は一般に、非病的形態のタンパク質が病的形態のタンパク質に変換するのを阻止することを目標とする。1つの好ましい態様において、PrPCのPrPScへの変換が通常であれば予想される、自然な環境が周囲環境に存在する状態で、PrPC（これは非病的である）のPrPSc（これは病的である）への変換が阻止される。タンパク質の非病的形態から病的形態への変換は一般に、ある化合物（抗体など）が非病的形態のタンパク質と結合することによって阻止される。
【００３５】
何らかの作用機序に拘束されるわけではないが、化合物（抗体など）が非病的タンパク質（PrPCタンパク質など）と結合することにより、非病的形態のタンパク質は、病的形態のタンパク質（PrPScなど）への変換が起こるのに必要な、別の1つまたは複数の分子との相互作用を行えなくなると考えられている。例えば、D18はPrPCと結合してPrPCがPrPScと相互作用するのを阻止し、それによってPrPCのPrPScへの変換を阻止する。PrPScなどの病的タンパク質の形成を阻止することにより、細胞は（単独で、または結合抗体の助けを借りて）PrPScを系から除去しうる。
【００３６】
PrPCと結合する抗体などの分子は、単独で用いてもよく、または任意の所望の組み合わせで用いてもよい。さらに、結合分子または抗体を、種々の哺乳動物（例えば、ウシ、ヒト、ヒツジ、マウスなど）由来のPrPCおよび種々のPrPバリアントと結合するように設計することもできる。
【００３７】
本発明は、目的の化合物を発見するために用いられるアッセイ法を含む。本アッセイ法は、どの化合物がPrPCとD18との結合反応のような既知の結合反応を阻止するかを判定するために、化合物のスクリーニング、特に有機化合物のライブラリーのスクリーニングを行うことを含む。本アッセイにおいて同定された化合物は、プリオン病を治療するための治療薬、ならびにプリオンを非感染性および非病的にするための消毒薬（disinfectant）の両方として有用な可能性がある。したがって、このような化合物を薬学的に許容される担体と配合することによって薬学的形成物を調製することが可能であり、このような化合物を外科用石鹸を含む石鹸などの他の組成物（これはさらに抗菌薬および抗ウイルス薬を含んでもよい）と配合することによって、消毒のための組成物を調製することができる。
【００３８】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施および使用の方式に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、発明とみなしている内容の範囲を制限するものではなく、示した実験が実施したすべての実験、または唯一の実験に過ぎないことを表現または意味するものでもない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して正確であるように努力は払っているが、ある程度の実験的誤差および偏差は許容されるべきである。別に特記しない限り、各部分は総重量にしめる部分重量であり、分子量は平均分子量であり、温度は℃で示され、圧力は大気圧またはその近傍圧である。
【００３９】
実施例1
Fab断片はPrPCのPrPScへの変換を阻止する
プリオン増殖の抗体性阻害を、組換えPrP特異的Fab断片D13、D18、R1、R2およびR72を用いて検討した（Williamson, R.A.ら、「プリオンタンパク質に対する自家モノクローナル抗体の産生のための寛容の回避（Circumventing tolerance in order to generate autologous monoclonal antibodies to the prion protein）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93、7279-7282 (1996)；Peretz, D.ら、「プリオンタンパク質のN末端での高次構造の転換はスクレイピー型アイソフォームの形成における特徴である（A conformational transition at the N-terminus of the prion protein features in formation of the scrapie isoform）」、J. Mol. Biol. 273, 614-622 (1997)；Williamson, R.A.ら、「組換え抗体を用いたプリオンタンパク質のマッピング（Mapping the prion protein using recombinant antibodies）」、J. Virol. 72, 9413-9418 (1998)）が、それらの結合エピトープは以下の表1に示されている。
【００４０】
（表１）
PrP特異的Fabと、リフォールディングしてα-ヘリックス高次構造となった組換えPrP（29-231）との結合に関する認識エピトープおよび解離定数。結合定数は表面プラズモン共鳴によって決定した。表1の全体にわたる、特に「エピトープ」列における残基の番号は、図1に示したマウスPrPの残基番号に対応する番号である。
2004535387.tif 000004
【００４１】
表面プラズモン共鳴（SPR）による評価では、抗体は組換えα-ヘリックスPrP（29-231）と強固に結合した（表1）。Fab R72はSPRにおける、または細胞表面上のPrPを認識しないが、ELISAウェルの表面にコーティングされたPrPCとは結合する（Peretz, D.ら、「プリオンタンパク質のN末端での高次構造の転換はスクレイピー型アイソフォームの形成における特徴である（A conformational transition at the N-terminus of the prion protein features in formation of the scrapie isoform）」、J. Mol. Biol. 273, 614-622 (1997)）。
【００４２】
一定範囲の濃度（0.3〜20μg/ml）の各抗体をScN2a培養物に添加して、7日間おいた。7日後に細胞を回収し、培養物中のPrPレベルを免疫ブロット法によって分析した。
【００４３】
図4に示したゲルの像は、Fab R72で処理した細胞を除き、抗体で処理した細胞におけるPrPScレベルが（処理していない細胞と比べて）用量依存的な様式で著しく低下したことを示している。これらの結果は図5のグラフにプロットされている。
【００４４】
この分析によれば、Fab D13およびD18がほぼ同程度の効果を有すると思われ、IC５０値はそれぞれ0.45μg/ml（9nM）および0.6μg/ml（12nM）であった。Fab R1およびR2は有意に効率が低く、IC50値はそれぞれ2.5μg/ml（50nM）および2.5μg/ml（40nM）であった。Fab R72による処理では、抗体を20μg/mlの濃度で用いてもScN2a培養物におけるPrPScレベルは低下せず、これは図4に明らかに示されている。
【００４５】
PrP特異的組換え抗体Fabによる、ScN2a細胞培養物におけるPrPSc形成の用量依存的阻害は、図4のゲルの像によって示されている。ScN2a細胞におけるPrPScレベルを、濃度0〜20μg/mlの抗体D13、D18、R72、R1またはR2の存在下で7日間培養した後に免疫ブロット法によって測定した。図4のレーン0は抗体処理前のScN2a培養物におけるPrPScレベルを示している。図4に示した免疫ブロットにおいて、PrPScバンドの濃度測定値が同定された。各値は濃度測定による絶対単位（DU）で表されており、100％は抗体処理を行わない場合のPrPScバンドの強度に等しく、0％は培養物におけるPrPScレベルが検出不能であることを示す（バンドなし）。図5中にプロットしたデータは、3回の独立した実験の平均を表している。
【００４６】
これらの実験の間、抗体で処理した細胞および非処理細胞におけるPrPCおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼのレベルは変化しないことが明らかになり、このことから、用いたPrP特異的抗体は、PrPScの産生に間接的に悪影響を及ぼす可能性のある、細胞傷害作用を引き起こさないことが示された。
【００４７】
実施例2
Fab断片は細胞に免疫性を付与する
実施例1の結果からScN2a細胞におけるPrPScレベルを著しく低下させうることが示されたため、PrP特異的抗体を実験系から除去した後にもPrPScが検出不能なレベルに維持されうるか否かを明らかにするために研究の範囲を広げた。10μg/mlの各々の組換えFabの存在下で最低7日間、ScN2a細胞を独立に継代した。
【００４８】
続いて抗体を培養物から除去し、細胞をFab非含有培地中でさらに継代した後に、PrPScレベルを再び測定した。その結果を図6のゲルの像に示している。
【００４９】
プリオン感染細胞からのPrPScの経時的な消失を図6に示している。10μg/mlのFab D13、D18、R72、R1もしくはR2の存在下または抗体の非存在下で、ScN2a細胞を1、2または3週間培養した。続いて、図6の抗体処理の終了直後（レーン0）または細胞を抗体の非存在下でさらに1週間（レーン1）もしくは2週間（レーン2）継代した後に、培養物中のPrPScレベルを免疫ブロット法によって分析した。
【００５０】
図6は、Fab D18の存在下で1週間継代したScN2a細胞におけるPrP濃度が、検出不能なレベルに低下したが、D18の非存在下でさらに1週間増殖させた後には、処理していない対照培養物のレベルの約50％に復帰したことを示している。しかし、細胞をFab D18の存在下で2週間培養した場合には、抗体非含有培地中でさらに4週間培養した後にもPrPは検出不能なレベルに維持されていた。同様に、プリオン感染細胞をFab D13で3週間連続して処理した後に、抗体を含まない培地中で1週間増殖させた場合にもPrPScは全く検出されなかったが、Fabの非存在下でさらに1週間培養した後には、PrPScは非処理対照培養物で認められたレベルの5％に再び上昇した。しかし、細胞をFab D13で4週間連続して処理した場合は、抗体の非存在下で4週間培養した後にもPrPScは検出可能なレベル未満に維持された。何も検出されなかったため、図6には4週間の結果は示していない。
【００５１】
10μg/mlの濃度で用いた場合には、Fab R1にもFab R2にも、抗体を除去した後の培養物におけるPrPScの再出現を防止する効力はなかった。Fab R72は、3週間または9週間連続して処理した後の培養物におけるPrPScレベルに何ら影響を及ぼさなかった。
【００５２】
実施例3
Fab断片のマウスに対する効果
プリオン力価の第2の指標として、抗体（10μg/ml）で処理したScN2a細胞および非処理ScN2a細胞をCD-1スイスマウスに接種するバイオアッセイ法を行った。D18、D13またはR2で処理した細胞の脳内接種を受けたマウスは、230日間を経た後にも疾患を発症しなかったが、非処理細胞またはR72処理細胞を接種されたマウスにおける疾患の平均潜伏期が、それぞれ169日および165日であった。この潜伏期の延長は、処理細胞における感染性プリオンの力価が3 log以上低下したことに対応する（Butler, D.A.ら、「スクレイピーに感染したマウス神経芽腫細胞はプロテアーゼ抵抗性のあるプリオンタンパク質を産生する（Scrapie-infected murine neuroblastoma cells produce protease-resistant prion proteins）」、J. Virol. 62, 1558-1564 (1988)）。
【００５３】
実施例4
既存のPrPScの除去
以上の実施例の結果は、抗体処理の開始時点のScN2a培養物中に既に存在するPrPScが、その後に細胞からどの程度の効率で消失するかについては示していない。以上のデータは、PrPScレベルが急速に低下することを示すと解釈しうる。実際に、プリオン増殖の阻害について述べた他の研究で報告されたデータではこのような解釈がなされている（Caughey, B.およびRaymond, G.J.、「培養細胞におけるスクレイピーに伴うPrP蓄積の硫酸化アニオンによる阻害（Sulfated polyanion inhibition of scrapie-associated PrP accumulation in cultured cells）」、J. Virology 67, 643-650 (1993)；Chabry, J.ら、「保存されたPrP配列を含むペプチドによる異常プリオンタンパク質（PrP）形成の種非依存的な阻害（Species-independent inhibition of abnormal prion protein (PrP) formation by a peptide containing a conserved PrP sequence）」、J. Virol. 73, 6245-6250 (1999)；Perrier, V.ら、「構造に基づく薬剤設計によるプリオン複製のドミナントネガティブ阻害の模倣（Mimicking dominant negative inhibition of prion replication through structure-based drug design）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97、6073-6078 (2000)；Caughey, W.S.、Raymond, L.D.、Horiuchi, M.およびCaughey, B.、「プロテアーゼ抵抗性プリオンタンパク質形成のポルフィリンおよびフタロシアニンによる阻害（Inhibition of protease-resistant prion protein formation by porphyrins and phthalocyanines）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12117-12122 (1998)；Supattapone, S., Nguyen, H.O., Cohen, F.E., Prusiner, S.B.およびScott, M.R.、「分岐ポリアミンによるプリオンの消失、および治療法に対する意味（Elimination of prions by branched polyamines and implications for therapeutics）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 14529-14534 (1999)）。しかし、このような解釈は、培養下にあるScN2a集団の動的な増加を考慮に入れていない。極めて重要なこととして、抗体または他の試薬が新生PrP分子の形成を抑制するならば、細胞分裂が連続して何回も起こると、培養物中の残存PrPの有効濃度の希釈を招き（総量は必ずしもそうでない）、PrPSc除去に対して誤った印象を生む可能性がある。このため、PrPScがScN2a培養物から除去される速度の正確な補正は、実験過程において生じた細胞集団の増加およびそれに対応したPrPSc濃度の低下を説明するものでなければならない。
【００５４】
この実験系におけるプリオン除去の動態をより詳細に分析するために、ScN2a細胞を、10μg/mlの各々のPrP特異的Fabの存在下で独立して増殖させた。1、2、3および4日間の抗体処理後に細胞を回収し、それぞれの場合における細胞タンパク質の総量を細胞数の指標として測定した。Fabで処理した細胞および非処理細胞におけるこれらの時点でのPrPSc濃度を、図7に示すように免疫ブロット法によって測定した。続いて、それぞれの場合における総細胞量を考慮することにより、各時点の培養物における総PrPScを算出した。これらのデータを抗体処理期間に対してプロットしたところ、個々のFabがプリオン感染を消失させる有効性に関して、より意味のある違いが明らかになった―図8参照。
【００５５】
図7のゲルの像は、抗体により媒介されるPrPSc除去の時間経過を示している。PrP特異的Fab（10μg/ml）の存在下で、1、2、3または4日間増殖させたScN2a細胞における、PrPScレベルを免疫ブロット法によって評価した。ScN2a細胞培養物におけるPrPScの総量に対する抗体処理の効果。データは3回の実験の平均を表しており、これを図8のグラフにプロットしている。
【００５６】
この実施例は、Fab D18がより有効な抗体であることを示している点で、他の実施例と同様である。D18による初回処理からPrPScの50％が細胞から消失するまでに要した時間（t1/2）は28時間であった。ScN2a細胞におけるPrPScのt1/2は24時間を上回ると考えられており（Borchelt, D.R.、Scott, M.、Taraboulos, A.、Stahl, N.およびPrusiner, S.B.、「スクレイピーおよび細胞プリオンタンパク質は培養細胞における合成動態およびトポロジーの点で異なる（Scrapie and cellular prion proteins differ in their kinetics of synthesis and topology in cultured cells）」、J. Cell Biol. 110, 743-752 (1990)）、このことはFab D18が10μg/mlの濃度でプリオン増殖を完全に消失させること、および既存のPrPScがその後に細胞から除去されることを示唆する。この所見は、ScN2a培養物から、少なくともある特定の量のPrPScが、通常の分解経路によって連続的に排除されていることを意味する。Fab D13はその次に効力のある抗体であり、同じく培養物におけるPrPScレベルを低下させたが、その程度はD18で処理した細胞よりも小さく、このことからこのFabの存在下では残存PrPScの合成レベルが極めて低いことが示された。Fab R1およびR2は、ScN2a細胞におけるプリオン増殖速度を明らかに低下させるが、培養物中に存在するPrPScの全体量を減少させるには不十分であった。処理していない培養物またはFab R72で処理した培養物におけるプリオン増殖は影響されないままであり、PrPScレベルはScN2a細胞集団の増殖に並行して上昇した。
【００５７】
ここに提示した結果は、D18などの特定の分子が感染細胞培養物におけるプリオン複製を強力に阻害するだけでなく、このプロセスの効率が個々の抗体によって大きく異なることも明らかに示している。この阻害効果は機構的には、抗体が細胞表面上のPrPC分子と特異的に結合し、それによってPrPテンプレートまたはPrPCのPrPScへの変換に不可欠な、他の補助因子のドッキングが妨げられることによって、最も容易に説明される。この仮説によく合致するように、今回評価した中で際立って最も有効な抗体であったFab D18は、Fab D13、R1またはR2よりも有意に多い数の細胞表面PrPC分子と結合する能力によって特徴づけられた（図9参照）。
【００５８】
図9にプロットした結果は、PrP特異的抗体FabとScN2a細胞の表面との結合を示している。PrP特異的Fab D13、D18、R72、R1およびR2の、ScN2a細胞の表面との反応性を、フローサイトメトリーによって評価した。図9にプロットした結果は3回の実験の平均を表している。
【００５９】
これに対して、プリオン増殖に全く影響を及ぼさなかったFab R72は、濃度が20μg/mlでも細胞表面PrPCを認識することができなかった。これらの結果は、細胞表面PrPC全体のうち所定の抗体によって占有される割合が、その抗体の阻害効力の重要な決定因子であることを示している。さらに、図9に提示したデータは、抗体の反応性によって区別される異なるPrPC集団が、ScN2a細胞の表面に存在する可能性を示唆する。これらの集団は高次構造的に互いに異なるか、翻訳後修飾に違いがあるか、またはある割合のPrPCの、他のPrP分子をおそらくは含むと考えられる、他の細胞表面成分との相互作用に起因する可能性がある。
【００６０】
実施例5
PrPCのPrPScへの変換をもたらすPrP結合領域
各抗体が結合するPrPの領域が、その阻害効力に対して固有の意義を持つか否かを示すために別の研究を行った。この課題に取り組むために、本発明者らは、同じ量の2種類のFabがScN2a細胞表面に結合する条件を検討した。例えば、0.6μg/mlの濃度で用いた場合、同じ量のFab D18およびD13が細胞表面と結合したが（図9）、D18の方がプリオン複製をはるかに効率的に阻害した（図4）。同様に、それぞれ0.6μg/mlおよび2.5μg/mlの濃度では、同じ量のFab D18およびR1がScN2a細胞と結合したが、培養物におけるPrPScレベルを低下させる効果はD18が明らかに強かった。なお、濃度2.5μg/mlのFab D13およびR1は、同じ量が細胞表面と結合したが、D13の方がPrPSc合成を抑制する作用は強かった。
【００６１】
この分析により、所定の抗体が結合するPrPCの領域はその阻害能力の重要な決定因子であり、このためにプリオン増殖の詳細な機構に関する新たな洞察をもたらすことが示された。Fab D18の既知の結合エピトープは、PrP残基132〜156の範囲にわたり（Williamson, R.A.ら、「組換え抗体を用いたプリオンタンパク質のマッピング（Mapping the prion protein using recombinant antibodies）」、J. Virol. 72, 9413-9418 (1998).）、PrPCのヘリックスA（残基145〜155）を組み込む―図1〜3および図10の三次元構造を参照のこと。
【００６２】
図10の構造は、Fab D13（青色、「B」により表記）、D18（赤色、「R」により表記）およびR1/R2（緑色、「G」により表記）によって認識される配列領域を、組換えPrP（90-231）のNMR構造の3つの像に重ね合わせて示している（James, T.L.ら、「スクレイピーアイソフォームの感染性断片に対応する142残基の組換えプリオンタンパク質の溶液構造（Solution structure of a 142-residue recombinant prion protein corresponding to the infectious fragment of the Scrapie isoform）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94、10086-10091 (1997)）。Asn 180およびAsn 196に結合した糖質部分は、それぞれオレンジ色（「O」により表記）および黄色（「Y」により表記）で示されている（Rudd, P.M.ら、「正常および病的なプリオンタンパク質アイソフォーム間のグリコシル化の違い（Glycosylation differences between the normal and pathogenic prion protein isoforms）」、Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 13044-13049 (1999)）。COOH末端のGPIアンカーはシアン色で示され（「C」により表記）、細胞膜（黒、「K」により表記）内に伸長している。プリオン増殖に重要な細胞補助因子と結合すると提唱されている、残基Q167、Q171、T214およびQ218の側鎖（紫色、「P」により表記）を含めている。
【００６３】
空間的には、残基145〜155の配列は、タンパク質において、プリオン増殖に不可欠な補助分子の結合に関与するとの仮説が提唱されている、残基Q167、Q171、T214およびQ218とは反対側の面に位置する（Kaneko, K.ら、「スクレイピープリオン増殖時にプロテインXが細胞プリオンタンパク質上の不連続エピトープと結合するという証拠（Evidence for protein X binding to a discontinuous epitope on the cellular prion protein during scrapie prion propagation）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94、10069-10074 (1998)；Zulianello, L.ら、「プリオン形成のドミナントネガティブな阻害はプリオンタンパク質の欠失変異誘発により減少する（Dominant-negative inhibition of prion formation diminished by deletion mutagenesis of the prion protein）」、J. Virol. 74、4351-4360 (2000)）。このことは、D18が機序として、補助因子の結合を阻害するのではなく、PrPCのPrPScとの相互作用を直接的に阻止、または改変することによって作用することを示している。数多くの他の報告からも、本タンパク質の132〜156領域が、プリオン合成および種間伝達に重要なものとして同定されている（Scott, M.ら、「キメラPrP遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおける人工的特性を有するプリオンの増殖（Propagation of prions with artificial properties in transgenic mice expressing chimeric PrP genes）」、Cell 73, 979-988 (1993)；Priola, S.A.およびChesebro, B.、「単一のハムスターPrPアミノ酸が、スクレイピーに感染したマウス神経芽腫細胞におけるプロテアーゼ抵抗性PrPへの変換を阻止する（A single hamster PrP amino acid blocks conversion to protease-resistant PrP in scrapie-infected mouse neuroblastoma cells）」、J. Virology 69, 7754-7758 (1995)；Kocisko, D.A.ら、「プリオンタンパク質のプロテアーゼ抵抗性形態への無細胞変換における種特異性：スクレイピーの種間障壁のモデル（Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3923-3927 (1995).）が、プリオン増殖は残基140〜175の間の配列がなくとも進行可能であり（Supattapone, S.ら、「106残基のプリオンタンパク質はトランスジェニックマウスにおけるプリオン複製の人工的な伝達障壁を生じる（Prion protein of 106 residues creates an artificial transmission barrier for prion replication in transgenic mice）」、Cell 96, 869-878 (1999)）、このことはPrPCのヘリックスAがPrPSc結合の必要条件ではないことを示す。ここで得られた結果に基づき、PrPCの132〜140部分は抗プリオン薬の開発の標的となることが示された。
【００６４】
D18とは対照的に、Fab R1およびR2は、プリオン増殖に対する比較的弱い阻害物質である。これらの抗体はいずれもPrPのC側最末端と結合し、これは、Q167、Q171、T214およびQ218クラスターと非常に近く、D18エピトープとは隔たっている―図10参照。これらの抗体はPrPSc結合に対してほとんど影響を及ぼさないと思われるが、PrPC結合に関しては、細胞補助因子と推定されるものと直接の競合関係にあると考えられる。Fab R1およびR2で観察された細胞表面結合がD18よりも低かったこと（図9）は一部にはこの競合によって説明されうるが、このエピトープがGPI-アンカーおよび細胞表面と近接していることもこの点に関しては重要と思われる。
【００６５】
Fab D13の阻害活性からはPrPSc-PrPC相互作用の機序に関する洞察はほとんど得られないが、これはそのエピトープ（残基95〜103）が本タンパク質の非構造性部分に認められるためである。PrPCのこの部分は、プリオンが感染性を獲得する際に大きな高次構造の再配列を経ると考えられている（Peretz, D.ら、「プリオンタンパク質のN末端での高次構造の転換はスクレイピー型アイソフォームの形成における特徴である（A conformational transition at the N-terminus of the prion protein features in formation of the scrapie isoform）」、J. Mol. Biol. 273, 614-622 (1997)；Leclerc, E., Peretz, D., Ball, H., Sakurai, H., Legname, G., Serban, A., Prusiner, S. B., Burton, D. R.およびWilliamson, R.A.、「固定化されたプリオンタンパク質は感染型と共通した特徴を有する高次構造への自発的な再配列を起こす（Immobilized prion protein undergoes spontaneous rearrangement to a conformation having features in common with the infectious form）」。D13の阻害効力は、それがタンパク質のこの区域においてPrPC様の高次構造を保持させる能力に由来する可能性がある。重要なことに、Fab R1およびR2を除き、本明細書に記載の抗体はいずれも細胞表面PrPCとの結合に関して互いに競合しなかった。したがって、これらの抗体を組み合わせて治療的に用いることにより、最大の阻害効果が得られると考えられる。
【００６６】
本明細書に提示した結果は、抗体とPrPCの規定された領域との結合によってプリオン複製が効率的に阻害されることを示している。インビボの適用に関して、Fab断片には半減期が短いという欠点があり、末梢循環からCNS内に効率的に移行しない可能性がある。Fab断片から調製した完全抗体分子はより有用と考えられるが、抗体で覆われた細胞に対する免疫エフェクター機構の動員を防ぐための、人為的操作が必要と思われる（Xu, D.ら、「5種類のヒト化OKT3エフェクター機能変異型抗体のインビトロでの特徴づけ（In vitro characterization of five humanized OKT3 effector function variant antibodies）」、Cell. Immunol. 200、16-26 (2000)；Idusogie, E.E.ら、「ヒトIgG1 Fcとのキメラ抗体であるrituxan上のC1q結合部位のマッピング（Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc）」、J. Immunol. 164、4178-4184 (2000)）。以上の研究を、アルツハイマー病を対象とする最近の進展（Schenk, D.ら、「アミロイド-βによる免疫処置はPDAPPマウスにおけるアルツハイマー病様の病態を軽減する（Immunization with amyloid-beta attenuates like-disease-like pathology in the PDAPP mouse）」、Nature 400, 173-177 (1999)；Bard, F.ら、「末梢投与したアミロイドβペプチドに対する抗体は中枢神経系内部に入り、アルツハイマー病のマウスモデルの病態を軽減する（Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease）」、Nat. Med. 6、916-919 (2000)）とあわせると、特異抗体はフォールディングに誤りのあるタンパク質の蓄積に起因する神経変性疾患との戦いにおける強力な武器になることが示される。
【００６７】
方法および材料
実施例の項に用いたさまざまな方法および材料に関する詳細を以下に示す。
【００６８】
組換えPrP特異的抗体の発現および精製
PrP特異的Fabをコードするプラスミドにより形質転換を行った大腸菌33B6株を、Biostat（登録商標）B制御装置（B.Braun、Germany）、ならびにMT-8塩（1リットル当たり、0.26gの第二リン酸カリウム、0.13gの第一リン酸ナトリウム二水和物、0.5gの硫酸アンモニウム、0.1gのクエン酸ナトリウム二水和物、および0.15gの塩化カリウム）、0.5gのイソロイシン、20％NZアミン、20％酵母エキス、1mM硫酸マグネシウム、50％グルコース、微量金属および100μg/mlアンピシリンを含む、1Lの培地を用いて48時間発酵させた。細菌ペーストを5倍容積の2mMイミダゾール、20mMリン酸ナトリウム、250mM塩化ナトリウム、pH 7.0中に再懸濁し、Microfluidizer（登録商標）M-110 EH（Microfluidics Co.、USA）による処理を2回行った。処理したペーストを0.1％PEI（5％保存溶液、pH 8.0）に対して滴下し、4℃で30分間攪拌した後に10,000rpm、4℃で30分間遠心した。上清を等量の20mMイミダゾール、pH 7.0で希釈し、SP-Fast Flow Sepharose（Amersham Pharmacia、Sweden）カラムにかけた。組換えFabを0％〜100％の20mMイミダゾール、500mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0の線状勾配により溶出させた後、そのままIMACカラムにかけた。抗体をこのカラムから200mMイミダゾール、pH 7.0により溶出させ、続いて4℃の10mM Tris-HCl、pH 7.2に対して十分に透析した。透析した試料を0〜100％の10mM Tris-HCl、500mM塩化ナトリウム、pH 7.2の線状勾配でQS-Fast Flow Sepharoseカラムから溶出させることによってさらに精製し、濾過により滅菌した。
【００６９】
細胞培養
マウス神経芽腫細胞（N2a）はAmerican Type Culture Collectionから入手した。プリオンに感染したマウス神経芽腫（ScN2a）細胞については以前に記載した（Butler, D.A.ら、「スクレイピーに感染したマウス神経芽腫細胞はプロテアーゼ抵抗性のあるプリオンタンパク質を産生する（Scrapie-infected murine neuroblastoma cells produce protease-resistant prion proteins）」、J. Virol. 62, 1558-1564 (1988)；Race, R. E., Fadness, L. H.およびChesebro, B.、「マウス神経芽腫細胞におけるスクレイピー感染の特徴づけ（Characterization of scrapie infection in mouse neuroblastoma cells）」、J. Gen. Virol. 68、1391-1399. 87）。ScN2a細胞およびN2a細胞の保存培養物は、MEM、10％ウシ胎仔血清（FBS）、2mM Glutamax（GIBCO BRL）、100単位/mlペニシリンおよび100μg/ml硫酸ストレプトマイシン中において、加湿した37℃のインキュベーター内で5％CO２下で維持した。0.05％（w/v）トリプシン-EDTA（GIBCO BRL）を用いて細胞を毎週1：15に分割した。
【００７０】
抗体阻害試験
PrP特異的抗体を2×105個のScN2a細胞に対して添加し、個々の実験プロトコールに従って適切な期間インキュベートした。細胞には週3回、適切な量の抗体を含む置換培地を与えた。ScN2a培養物の分割を要する阻害実験では、酵素活性がPrPScレベルに影響する恐れがあるため、トリプシンではなく細胞解離用バッファー（GIBCO BRL）を用いて、細胞を培養プレートから剥離させた。カルシウムおよびマグネシウム非含有PBSで3回洗うことによって細胞をインサイチューで回収し、1mlの可溶化バッファー（10mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.5％ノニデントP-40を含む）中に再懸濁した。2,000×g、2分間の遠心処理によって細胞核を除去し、上清のタンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイ（BCA, Pierce）によって測定した。
【００７１】
ウエスタンブロット法および濃度測定によるPrPScの定量
ScN2a細胞の可溶化物（1mg/ml）を20μg/mlのプロテイナーゼK（総タンパク質／酵素比、50：1）により37℃で1時間処置した。PMSFを最終濃度2mMとして添加することによって、タンパク質加水分解消化を停止させた。消化された細胞可溶化物の40μgを同容積の2×非還元性SDSサンプルバッファーと混合し、5分間煮沸した後に、遠心分離によって清澄化し、SDS/PAGE（14％）により分離した。試料をエレクトロブロットによってPVDF膜に移行させ、カルシウムおよびマグネシウム非含有PBS中にて5％（w/v）脱脂乳タンパク質によりブロックした。PrPは、あらかじめ活性化されたアミン反応性西洋ワサビワサビペルオキシダーゼ（Pierce）と架橋させた、0.5μg/mlのD18抗体を用いて検出した。ブロットを化学発光増強（ECL）試薬（Amersham）により1分間現像し、ECL Hypermaxフィルム（Amersham）に対して露出させた。PrPScバンドの濃度測定スキャニングは、Chemi Imager 4000 Low Light Imaging SystemをAlphaEaseソフトウエアバージョン3.3e（Alpha Innotech, CA）とともに用いることによって行った。PrPScの見かけの量（濃度測定単位）を、収集日における同じ量のScN2a細胞培養物に認められた、PrPScに対する比率としてプロットした。
【００７２】
バイオアッセイ法
抗体で処理したScN2a細胞（60日）および非処理ScN2a細胞を1mlのPBS中に再懸濁した。容積30μlの細胞再懸濁液をCD-1スイスマウスの10匹の群に脳内接種した。マウスをスクレイピーの臨床徴候の早期発現および晩期発現に関して毎日評価した。CD-1スイスマウスにおけるマウスプリオンの感染性力価は、式 Log T＝1.52＋[Log D]＋(185−Y)/12.66を用いて導き出した；ここでTはID5０単位/mlである；Dは希釈度であり、これは希釈試料の希釈割合として定義される；Yは接種から末期疾患の発現までの平均期間（日単位）である（Butler, D.A.ら、「スクレイピーに感染したマウス神経芽腫細胞はプロテアーゼ抵抗性のあるプリオンタンパク質を産生する（Scrapie-infected murine neuroblastoma cells produce protease-resistant prion proteins）」、J. Virol. 62、1558-1564 (1988)）。
【００７３】
フローサイトメトリー
ScN2a細胞を細胞解離用バッファー（GIBCO BRL）により再懸濁し、FACSバッファー（MEM、5％（v/v）細胞解離用バッファーおよび2％（v/v）FBS）で2回洗った。種々の濃度のPrP特異的Fabを細胞10６個のアリコートに対して添加した。室温で15分間インキュベートした後、細胞をFACSバッファーで4回洗い、FACS緩衝液で1：200に希釈したフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合ヤギ抗ヒトIgG Fab（Jackson Immunologicals）により室温で15分間染色した。続いて細胞をFACSバッファーで3回洗い、新たに調製した0.4％（v/v）パラホルムアルデヒドにより固定し、Becton Dickenson FACscan装置を用いて分析した。
【００７４】
本発明をその特定の態様を参照しながら説明してきたが、当業者には、発明の真の趣旨または範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を加えうること、および同等物を代用しうることは理解されるはずである。さらに、本発明の目的、趣旨および範囲に適合させるために、多くの変更を特定の状況、材料、物質の組成、工程、工程の1つまたは複数の段階に加えることも可能である。このような変更はすべて本明細書に添付される特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】マウスPrPタンパク質のアミノ酸配列を、マウスPrPとヒトPrPとの間の明確な差異とともに示したものである。
【図２】マウスPrPのアミノ酸配列を示したものであり、特にマウスPrPとウシPrPとの間の明確な差異を示している。
【図３】マウスPrPのアミノ酸配列を示したものであり、特にマウスPrPとヒツジPrPとの間の明確な差異を示している。
【図４】5種類の抗体D13、D18、R72、R1およびR2を種々の抗体濃度（μg/ml単位）でScN2a細胞培養物に対して用いたものに対して行った、ウエスタンブロットゲルの像を示している。
【図５】図4による5種類の抗体のうち4つを用いて得られた結果のグラフであり、濃度依存的な効果を示している。
【図６】5種類の抗体または対照（図4参照）を、ScN2a細胞培養物とともに1、2および3週間おいたものに対して行った、ウエスタンブロットゲルの像を示している。
【図７】対照ならびに抗体D13およびD18、R72、R1およびR2を、ScN2a細胞ともに1、2、3および4日間おいたものに対して行ったウエスタンブロットゲルの像を示している。
【図８】図7によるScN2a細胞培養物における、PrPScの総百分率と処理日数の関係をみたグラフである。
【図９】5種類の抗体のそれぞれに関して抗体濃度（μg/ml）と平均蛍光チャンネルの関係を示した、3回の実験を平均したデータのグラフである。
【図１０】PrPタンパク質の3種類の異なる三次元構造である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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