(57)【要約】【課題】新規な骨吸収抑制剤の提供。【解決手段】ビタミンＤアンタゴニストを有効成分とする骨吸収抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＤアンタゴニストを患者に投与することを含んでなる、骨吸収を抑制する方法。
【請求項２】
ビタミンＤアンタゴニストを患者に投与することを含んでなる、骨パジェット病を治療する方法。
【請求項３】
前記アンタゴニストが下記式 （１） ：
【化１】
2004528269.tif 000011
［式中、ｍは１から３の整数を表し、ｑは０から３の整数を表し、ｒは０から３の整数を表し、Ｘは炭素原子または酸素原子表す。ただし、１ ≦ ｑ ＋ ｒ ≦ ３である。］
で表される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンタゴニストが下記式 （１） ：
【化２】
2004528269.tif 000012
［式中、ｍは１から３の整数を表し、ｑは０から３の整数を表し、ｒは０から３の整数を表し、Ｘは炭素原子または酸素原子表す。ただし、１ ≦ ｑ ＋ ｒ ≦ ３である。］
で表される化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ｍが１または２である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｍが１または２である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ｍが１であり、ｑが０であり、ｒが１であり、そしてＸが酸素原子である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ｍが１であり、ｑが０であり、ｒが１であり、そしてＸが酸素原子である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ｍが１であり、ｑが０であり、ｒが１であり、そしてＸが炭素原子である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ｍが１であり、ｑが０であり、ｒが１であり、そしてＸが炭素原子である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
ｍが２であり、ｑが０であり、ｒが１であり、そしてＸが酸素原子である、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
ｍが２であり、ｑが０であり、ｒが１であり、そしてＸが酸素原子である、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
ｍが１であり、ｑが１であり、ｒが０であり、そしてＸが炭素原子である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
ｍが１であり、ｑが１であり、ｒが０であり、そしてＸが炭素原子である、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンタゴニストが下記式 （２） ：
【化３】
2004528269.tif 000013
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は水素原子であるか、あるいはそれらは一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３は単結合、メチレンまたはビニレンであり、Ｒ４は直鎖状または分枝鎖状のＣ１−Ｃ７アルキル、アルケニル、アルコキシまたはアルキルアミノであり、Ｒ５は水素原子またはメチルである。］
で表される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンタゴニストが下記式 （２） ：
【化４】
2004528269.tif 000014
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は水素原子であるか、あるいはそれらは一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３は単結合、メチレンまたはビニレンであり、Ｒ４は直鎖状または分枝鎖状のＣ１−Ｃ７アルキル、アルケニル、アルコキシまたはアルキルアミノであり、Ｒ５は水素原子またはメチルである。］
で表される化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ４が、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、１−ペンテニル、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、２−メチルプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシまたはｎ−ヘプチルオキシ、ｎ−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、ｎ−ヘプチルアミノ、ｎ−ペンテニルアミノである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ４が、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、１−ペンテニル、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、２−メチルプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシまたはｎ−ヘプチルオキシ、ｎ−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、ｎ−ヘプチルアミノ、ｎ−ペンテニルアミノである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３が単結合であり、Ｒ４がｎ−ブトキシまたは２−メチルプロポキシであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３が単結合であり、Ｒ４がｎ−ブトキシまたは２−メチルプロポキシであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３が単結合であり、Ｒ４がｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘプチルまたは１−ペンテニルであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３が単結合であり、Ｒ４がｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘプチルまたは１−ペンテニルであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３が単結合であり、Ｒ４がｎ−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、ｎ−ヘプチルアミノまたは１−ペンテニルアミノであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３が単結合であり、Ｒ４がｎ−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、ｎ−ヘプチルアミノまたは１−ペンテニルアミノであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３がビニレンであり、Ｒ４がエトキシまたはｔ−ブトキシであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ１およびＲ２が一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３がビニレンであり、Ｒ４がエトキシまたはｔ−ブトキシであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ１およびＲ２の各々が水素であり、Ｒ３が単結合であり、Ｒ４がｎ−ブトキシであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
Ｒ１およびＲ２の各々が水素であり、Ｒ３が単結合であり、Ｒ４がｎ−ブトキシであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ１およびＲ２の各々が水素であり、Ｒ３がビニレンであり、Ｒ４がエトキシであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ１およびＲ２の各々が水素であり、Ｒ３がビニレンであり、Ｒ４がエトキシであり、Ｒ５が水素原子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
ビタミンＤアンタゴニストを含んでなる、骨吸収を抑制する医薬組成物。
【請求項３２】
ビタミンＤアンタゴニストを含んでなる、骨パジェット病を治療する医薬組成物。
【請求項３３】
前記アンタゴニストが下記式 （１） ：
【化５】
2004528269.tif 000015
［式中、ｍは１から３の整数を表し、ｑは０から３の整数を表し、ｒは０から３の整数を表し、Ｘは炭素原子または酸素原子表す。ただし、１ ≦ ｑ ＋ ｒ ≦ ３である。］
で表される化合物である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記アンタゴニストが下記式 （１） ：
【化６】
2004528269.tif 000016
［式中、ｍは１から３の整数を表し、ｑは０から３の整数を表し、ｒは０から３の整数を表し、Ｘは炭素原子または酸素原子表す。ただし、１ ≦ ｑ ＋ ｒ ≦ ３である。］
で表される化合物である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記アンタゴニストが下記式 （２） ：
【化７】
2004528269.tif 000017
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は水素原子であるか、あるいはそれらは一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３は単結合、メチレンまたはビニレンであり、Ｒ４は直鎖状または分枝鎖状のＣ１−Ｃ７アルキル、アルケニル、アルコキシまたはアルキルアミノであり、Ｒ５は水素原子またはメチルである。］
で表される化合物である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記アンタゴニストが下記式 （２） ：
【化８】
2004528269.tif 000018
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は水素原子であるか、あるいはそれらは一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３は単結合、メチレンまたはビニレンであり、Ｒ４は直鎖状または分枝鎖状のＣ１−Ｃ７アルキル、アルケニル、アルコキシまたはアルキルアミノであり、Ｒ５は水素原子またはメチルである。］
で表される化合物である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
骨吸収を抑制する薬剤を製造するためのビタミンＤアンタゴニストの使用。
【請求項３８】
骨パジェット病を治療する薬剤を製造するためのビタミンＤアンタゴニストの使用。
【請求項３９】
前記アンタゴニストが下記式 （１） ：
【化９】
2004528269.tif 000019
［式中、ｍは１から３の整数を表し、ｑは０から３の整数を表し、ｒは０から３の整数を表し、Ｘは炭素原子または酸素原子表す。ただし、１ ≦ ｑ ＋ ｒ ≦ ３である。］
で表される化合物である、請求項３７に記載の使用。
【請求項４０】
前記アンタゴニストが下記式 （１） ：
【化１０】
2004528269.tif 000020
［式中、ｍは１から３の整数を表し、ｑは０から３の整数を表し、ｒは０から３の整数を表し、Ｘは炭素原子または酸素原子表す。ただし、１ ≦ ｑ ＋ ｒ ≦ ３である。］
で表される化合物である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４１】
前記アンタゴニストが下記式 （２） ：
【化１１】
2004528269.tif 000021
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は水素原子であるか、あるいはそれらは一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３は単結合、メチレンまたはビニレンであり、Ｒ４は直鎖状または分枝鎖状のＣ１−Ｃ７アルキル、アルケニル、アルコキシまたはアルキルアミノであり、Ｒ５は水素原子またはメチルである。］
で表される化合物である、請求項３７に記載の使用。
【請求項４２】
前記アンタゴニストが下記式 （２） ：
【化１２】
2004528269.tif 000022
［式中、Ｒ１およびＲ２の各々は水素原子であるか、あるいはそれらは一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３は単結合、メチレンまたはビニレンであり、Ｒ４は直鎖状または分枝鎖状のＣ１−Ｃ７アルキル、アルケニル、アルコキシまたはアルキルアミノであり、Ｒ５は水素原子またはメチルである。］
で表される化合物である、請求項３８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の属する分野］
本発明は、骨吸収を抑制する有効成分としてビタミンＤアンタゴニストを含有する治療剤の１グループに関する。詳しくは、本発明は、骨パジェット病の治療的理学療法剤としてこれらの物質の使用に関する。
【０００２】
［従来の技術］
骨は吸収および引き続く新しい骨の形成のサイクルを行う動的組織である。このプロセスは、骨格を通じて、骨のリモデリング単位と呼ばれる個々の多細胞単位において連続する。成人において、骨は吸収および引き続く新しい骨の形成は骨のリモデリングと呼ばれ、リモデリングプロセスを通じて、骨量は維持されるか、あるいは寿命の間に増減する。相対的骨量は、骨吸収レベルと骨形成レベルとの間のバランスに依存する。代謝的骨疾患において、この骨吸収と骨形成との間のバランスは変化する。例は骨粗しょう症と骨パジェット病である。
【０００３】
骨粗しょう症は、骨の有機成分および無機質の両方が減少する疾患である。骨粗しょう症において、骨量は減少し、骨折がいっそう起こり易くなる。骨粗しょう症は、閉経後にみられるＩ型と、高齢者にみられるＩＩ型の２つに分類される。Ｉ型骨粗しょう症とも呼ばれる閉経後の骨粗しょう症において、エストロゲン欠乏はサイトカイン、例えば、インターロイキン−６、インターロイキン−１１およびインターロイキン−１の局所的レベルを増加させる。閉経後の骨粗しょう症の治療は、例えば、エストロゲンまたはその誘導体、ビスホスホネートを投与して、破骨細胞による骨吸収をブロックすることを包含する。同様に、骨代謝回転アクチベーター、例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤおよび１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３調製誘導体、および骨形成エンハンサー、例えば、ビタミンＫ２製剤のすべてはこの疾患の治療に使用されてきている。
【０００４】
骨パジェット病は、異常な骨のリモデリングの最も激しい例である。骨パジェット病において、骨吸収は顕著に増加し、次いで豊富な新しい骨の形成が起こる。形成された骨は構造が混乱しており、曲がりかつ折れる、弱化した骨が生ずる。骨パジェット病における主要な細胞の異常性は、破骨細胞、すなわち、骨を吸収する細胞にある。骨パジェット病において、破骨細胞はパラミクソウイルス様核封入体を含有し、これは骨パジェット病がパラミクソウイルスにより引き起こされる遅い疾患でありうることを示唆する。さらに、骨パジェット病に対する遺伝的成分が存在しうる。これらの患者の４０％までは、この疾患で比較的に影響を受けた第１度を有する。
【０００５】
骨パジェット病は骨粗しょう症にひきつづく第２の最も一般的な骨疾患であり、そして米国において２〜３百万人までが罹患している。骨パジェット病は、通常、破骨細胞活性および骨吸収を抑制するビスホスホネート製剤またはカルシトニン製剤で治療される。しかしながら、骨パジェット病の患者において破骨細胞前駆体の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３感受性の異常が存在することが最近の発見から示唆された（Ｊ． Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｒｅｓ． ｖｏｌ． １５、２２８−２３６（２０００））。本発明者らは、骨パジェット病の患者からの破骨細胞前駆体が正常の破骨細胞形成に必要な濃度よりも１〜２  ｌｏｇだけ低い１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度において破骨細胞を形成することを示した。さらに、これらの研究において、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の感受性増加はビタミンＤレセプターのアクチベーターの誘導を通して仲介されるように思われることが示された。
【０００６】
レセプターに対する１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の結合を抑制するか、あるいは破骨細胞前駆体に対する１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の作用を阻害する化合物は新規であり、骨パジェット病の治療に潜在的に有効であろう。骨パジェット病患者における１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の血中レベルが正常に類似する場合、これらのレベルの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は通常起こらない骨吸収を惹起するために十分であろう。従って、骨パジェット病において１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３または過敏性破骨細胞前駆体の作用をブロックする薬剤は、非常に有効な治療的理学療剤であろう。このような薬剤は、骨パジェット病についての現在の療法を超えた利点を有するであろう。例えば、経口的形態のビスホスホネートは重大な胃腸管の副作用を有し、そしてカルシトニンの治療効果は究極的に経時的に喪失する。
【０００７】
本発明のビタミンＤ３アンタゴニストは、国際特許公開ＷＯ ９５／３３７１６号明細書（式 （１） の化合物）、 ＷＯ ００／２４７１２号明細書（式 （１） の化合物）、ＷＯ ９４／０７８５３号明細書（式 （２） の化合物）、およびＷＯ ９７／００２４２号明細書（式 （２） の化合物）に記載されている方法により合成することができる。式 （１） の化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３レセプター（ＶＤＲ） との間の結合（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． 、ｖｏｌ． ２７４、１６３９２−１６３９９（１９９９））、ＶＤＲと９−シス−レチノイン酸レセプター（ＲＸＲ） との間の結合、およびＶＤＲと転写調節因子のステロイドレセプターコアクチベーター１（ＳＲＣ−１） との間の結合（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． 、ｖｏｌ． ２７４、３２３７６−３２３８１（１９９９）） を阻害することによって、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の作用を直接抑制する。式 （２） の化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の作用に拮抗する。下記の文献を参照のこと：Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． 、ｖｏｌ． ２７５、１６５０６−１６５１２（２０００））。
【０００８】
［発明の開示］
本発明者らは、ビタミンＤアンタゴニストが、正常の骨髄細胞および骨パジェット病患者の骨髄細胞による、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞の形成を強く抑制することを発見した。この破骨細胞形成の減少は骨吸収を減少させる。本発明者らは、また、ビタミンＤアンタゴニストはビタミンＤ欠乏動物における１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される骨吸収を抑制することを発見し、これによりこれらのアンタゴニストがｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において骨吸収に対して高い抑制作用を有することが証明される。
したがって、本発明の目的は、骨パジェット病の患者において骨吸収を抑制するためにビタミンＤアンタゴニストを使用することである。これらのアンタゴニストは、血清中カルシウムレベルを増加させないで骨吸収を抑制するであろう。
【０００９】
［発明を実施するための最良の形態］
本発明のビタミンＤアンタゴニストのサンプルとしては、下記式 （１） ：
【化１３】
2004528269.tif 000002
【００１０】
［式 （１） において、ｍは１から３の整数を表し、ｑは０から３の整数を表し、ｒは０から３の整数を表し、Ｘは炭素原子または酸素原子表す。ただし、１ ≦ ｑ ＋ ｒ ≦ ３である。］
により表される化合物があげられる。
【００１１】
この中で、ｍが１または２である化合物は好ましい。さらに、ｍ、ｑ、ｒおよびＸの組み合わせに関すると、表１に示す化合物は好ましく、この中で特に化合物Ｎｏ． １１、１３、１６、２１、２３および２６は好ましい。表１に示す化合物において、構造中に不斉炭素原子が存在する場合、それは（Ｓ） 配置および（Ｒ） 配置の両方を含む。
【００１２】
【表１】
2004528269.tif 000003
【００１３】
さらに、本発明のビタミンＤアンタゴニストのサンプルとしては、下記式 （２） ：
【化１４】
2004528269.tif 000004
【００１４】
［式 （２） において、Ｒ１およびＲ２の各々は水素原子であるか、あるいはそれらは一緒になって環外メチレンを形成し、Ｒ３は単結合、メチレンまたはビニレンであり、Ｒ４は直鎖状または分枝鎖状のＣ１−Ｃ７アルキル、アルケニル、アルコキシまたはアルキルアミノであり、Ｒ５は水素原子またはメチルである。］
により表される化合物があげられる。
【００１５】
この中で、表２に示す化合物は好ましい。表２に示す化合物において、構造中に不斉炭素原子が存在する場合、化合物は（Ｓ） 配置および（Ｒ） 配置の両方を含む。Ｒ３がビニレンであるとき、二重結合の立体配置は（Ｅ）配置および（Ｚ）配置の両方を含む。
【００１６】
【表２】
2004528269.tif 000005
【００１７】
本発明の１つの目的は、血清中カルシウム濃度を増加させないでビタミンＤアンタゴニストで骨吸収を抑制することである。第２の目的は、骨パジェット病患者を治療するために本発明の組成物を使用することであり、ここで骨パジェット病患者の骨吸収活性は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の作用により極端に加速されている。
本発明者らは、本発明のビタミンＤアンタゴニストが、骨パジェット病患者の骨髄細胞からの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞の形成を強く抑制し、そしてビタミンＤ欠乏ラットにおいて１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞の形成を抑制することを発見した。
【００１８】
上記化合物を有効成分として含有する骨パジェット病治療骨吸収抑制剤は、経口剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤、錠剤またはシロップ剤）、または適当な賦形剤を使用して注射剤として製剤化することができる。例えば、骨粗しょう症患者を治療するために、経口剤は適切であるが、骨吸収が顕著に亢進した骨パジェット病患者において、注射剤が好ましい。注射剤はより大きいバイオアベイラビリティを有するにちがいない。
【００１９】
本発明において使用する非経口剤用の賦形剤は、例えば植物油、鉱物油、白色ワセリン、分岐鎖状の脂肪または油脂、高分子量アルコール等であろう。それらのなかで、例えば綿実油、トウモロコシ油、ココナッツ油またはアーモンド油のような植物油は好ましい。トリグリセリドの一部分として中鎖脂肪酸を含有する油は好ましい。
経口剤の賦形剤の好ましい例は、セルロース誘導体、例えば、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デキストリン、シクロデキストリン、カゼイン、ラクトース、マンニトール、ゼラチン等である。
【００２０】
本発明において骨吸収を抑制する有効成分の量はそれぞれ疾患の状態に応じて決められるが、一般的には、有効成分の量は０．００００４から０．２重量％、好ましくは０．０００１から０．１重量％である。
有効成分の投与量も、それぞれ患者の症状に応じて決められるが、一般的には、それは０．１から１０００ μｇ／日、好ましくは約１から１００ μｇ／日である。投与回数は通常１から３回／日である。これらの条件を満足するような方法で、製剤を調製することが好ましい。
【００２１】
実施例
以後実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により限定されない。さらに、各実施例における化合物Ｎｏ．は上記表１に示す化合物Ｎｏ．である。
【００２２】
実施例１．
正常のヒトの骨髄細胞からの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞形成に対する（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−２６，２３−ラクトン［化合物１１、（２３Ｓ異性体）］の破骨細胞形成抑制活性
Ｋｕｒｉｈａｒａ他の方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １２６、２７３３−２７４１（１９９０）） に従い、健康な正常人の骨髄細胞から、単核細胞を分画した。簡単に述べると、骨髄細胞を正常人から獲得し、単核細胞画分をハイパーク−フィコール （Ｈｙｐａｑｕｅ−Ｆｉｃｏｌｌ） 密度勾配遠心により収集し、細胞画分をα−ミニマルエッセンシャルメディア（α−ＭＥＭ） で３回洗浄し、１０％の胎仔ウシ血清を含有するα−ＭＥＭの中に分散させた。この単核細胞懸濁液を１００ ｍｍの組織培養プレートの中に播種し、培養プレートを４％ＣＯ２−空気雰囲気中で３７ ℃において９０分間保持し、非接着性細胞を収集した。２０％ウマ血清を含有するα−ＭＥＭの中に非接着性単核細胞を１０６細胞／ｍｌで分散させ、細胞懸濁液を９６ウェルのマルチプレートの中に１００ μｌ／ウェルで播種した。
【００２３】
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞形成を抑制する化合物１１（２３Ｓ異性体） の能力を次のようにして評価した：種々の濃度の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、種々の濃度の化合物１１（２３Ｓ異性体） または１０− ８Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３溶液と種々の濃度の化合物１１（２３Ｓ異性体） 溶液との組み合わせを各ウェルに添加した。培地を毎週取替え、４％ＣＯ２−空気雰囲気中で３７ ℃において培養を３週間続けた。形成した破骨細胞を２３Ｃ６抗体に結合する能力により同定した。核をメチルグリーンで対比染色した。２３Ｃ６抗体と反応し、３またはそれ以上の核を有する細胞を骨芽細胞としてスコアを付けた。結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
2004528269.tif 000006
【００２５】
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、１０−９から１０−７ Ｍの濃度の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３において濃度依存的に破骨細胞形成を惹起させた。破骨細胞形成は１０−９Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３において最大であった。化合物１１（２３Ｓ異性体） は破骨細胞形成を惹起しなかった。１０−８ Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および種々の濃度の化合物１１（２３Ｓ異性体） を正常の骨髄培養物に同時に添加したとき、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞形成は化合物１１（２３Ｓ異性体） により１０−９から１０−６ Ｍの濃度において抑制された。
【００２６】
実施例２．
骨パジェット病患者からの骨髄培養物において１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞形成に対する（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−２６，２３−ラクトン［化合物１１、（２３Ｓ異性体）］ の作用
骨髄細胞を骨パジェット病患者の関係する骨から獲得し、正常の骨細胞について前述したように処理し、培養した。培養物を実施例１に記載されているのと同一の方法で１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および／または化合物１１（２３Ｓ異性体） で処理した。結果を表４に示す。
【００２７】
【表４】
2004528269.tif 000007
【００２８】
骨パジェット病患者からの骨髄培養物において、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は１０−１１ Ｍ程度に低い濃度において破骨細胞形成を惹起した。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は１０−１１から１０−７Ｍにおいて濃度依存的にこれらの培養物において破骨細胞形成を惹起した。破骨細胞形成はこれらの培養物において１０−１０ Ｍと１０−９ Ｍとの間で最大であった。これらは、正常の骨髄培養物における最大の破骨細胞形成に必要な濃度よりも１から２ ｌｏｇだけ低い、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度である。化合物１１（２３Ｓ異性体） はそれ自体破骨細胞形成を惹起せず、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の不存在下に、または１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を添加したとき、破骨細胞形成を抑制した。
【００２９】
さらに、１０−１０ Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を様々の濃度の化合物１１（２３Ｓ異性体） と組み合わせてこれらの培養物に添加したとき、破骨細胞形成は１０−１１ Ｍと１０−６ Ｍとの間の化合物１１（２３Ｓ異性体） 濃度において濃度依存的に抑制された。化合物１１（２３Ｓ異性体） は骨パジェット病患者の培養物における基底破骨細胞形成の増加を抑制し、これは正常の骨髄からの培養物において見られなかったことに注意すべきである。これらのデータが示唆するように、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の生理的濃度において、化合物１１（２３Ｓ異性体） は骨パジェット病患者において破骨細胞形成を正常レベルに戻すことができる。
【００３０】
実施例３．
骨パジェット病患者からの骨髄培養物における１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞形成に対する様々のビタミンＤアンタゴニストの破骨細胞抑制能力
実施例１に記載されているように骨髄培養を実施したが、ただし１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３で刺激した骨髄培養物に、様々のビタミンＤアンタゴニストを様々の濃度で添加した。骨髄細胞を骨パジェット病患者の関係する細胞から採取し、実施例２に記載されているように培養を実施した。化合物１３および１６において、２３位における不斉炭素原子に基づいて、２つのジアスレオマーが存在する。逆相ＨＰＬＣ上でより短い保持時間を有する異性体はより高い極性の異性体であり、そしてより長い保持時間を有する異性体はより低い極性の異性体であった。結果を表５に示す。
【００３１】
【表５】
2004528269.tif 000008
【００３２】
表５に示すように、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は１０−１１ Ｍから１０−８ Ｍにおいて濃度依存的に破骨細胞形成を惹起した。化合物１１（２３Ｒ異性体）、化合物１３（より高い極性の異性体およびより低い極性の異性体） および化合物１６（より高い極性の異性体） 単独は破骨細胞形成を惹起せず、むしろ破骨細胞形成を抑制した。１０−１０ Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞形成は、化合物１１（２３Ｒ異性体）、化合物１３（より高い極性の異性体およびより低い極性の異性体） または化合物１６（より高い極性の異性体） により１０−９ Ｍから１０−７ Ｍにおいて濃度依存的に抑制された。１０−７ Ｍの濃度において、１０−１０ Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される破骨細胞形成はすべての化合物によりほとんど完全に抑制された。
【００３３】
実施例４．
骨パジェット病患者および同様な年齢の正常人の血液中のビタミンＤ代謝物質の測定
血液試料（７から１０ ｍｌ）を９人の骨パジェット病患者および１０人の同様な年齢の正常人から収集し、血液試料を室温に３時間保持した。その後、それらを３０００ ｒｐｍで３０分間遠心して血清を得た。血清中のビタミンＤ代謝物質の濃度をＩｓｈｉｚｕｋａ他の方法により測定した（Ｊ． ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ． ２７、７１−７５（１９８１） およびＡｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ． １０４、９６−１０２（１９８３））。
【００３４】
簡単に述べると、３から５ ｍｌの各血清試料を水で１：３に希釈し、希釈した血清体積の２倍の体積のクロロホルム：メタノール（１：１） 混合溶液を添加し、この懸濁液を激しく震蘯させ、次いでクロロホルム層を収集した。水層をクロロホルムで再び抽出した。得られたクロロホルム層をプールし、ロータリーエバポレーターで濃縮し、残留物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） ＬＨ−２０カラム（１．２×１０ ｃｍ） にのせ、ｎ−ヘキサン：クロロホルム：メタノール（９：１：１） の混合溶媒で溶離した。８から１７ ｍｌの溶離液および１９から６０ ｍｌの溶離液を、それぞれ、２５−ＯＨ−Ｄ画分および２４，２５−（ＯＨ）２Ｄ ＋ １α，２５−（ＯＨ）２Ｄ画分として収集した。
【００３５】
さらに、２５−ＯＨ−Ｄ画分および２４，２５−（ＯＨ）２Ｄ ＋ １α，２５−（ＯＨ）２Ｄ画分の各々をゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ） ＳＩＬカラム（４．６×２５０ ｍｍ） にのせ、ｎ−ヘキサン中の１２％のイソプロパノールで溶離して２５−ＯＨ−Ｄ、２４，２５−（ＯＨ）２Ｄおよび１α，２５−（ＯＨ）２Ｄ画分を精製した。ビタミンＤ欠乏ラットからの血清の中に存在するビタミンＤ結合性タンパク質を使用する、競合タンパク質結合アッセイにより、精製された２５−ＯＨ−Ｄ画分および２４，２５−（ＯＨ）２Ｄ画分の濃度を測定した。ビタミンＤ欠乏ヒヨコの小腸からのビタミンＤレセプターを使用する、放射性レセプターアッセイにより、精製された１α，２５−（ＯＨ）２Ｄの濃度を測定した。結果を表６に示す。
【００３６】
【表６】
2004528269.tif 000009
【００３７】
骨パジェット病患者からの血清中のビタミンＤ代謝物質濃度は、同様な年齢の正常人のものと有意に異ならなかった。ビタミンＤ代謝物質の異常性は骨パジェット病患者において検出されなかった。これらのデータが示すように、骨パジェット病患者からの血清中の１α，２５−（ＯＨ）２Ｄの濃度は４１．０±９．１ ｐｇ／ｍｌ血清（１０−１０ Ｍ）であった。
【００３８】
実施例１および２から明らかなように、骨パジェット病患者からの骨髄細胞による破骨細胞形成は１０−１０ Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される。対照的に、正常人の骨髄細胞からの破骨細胞形成は１０−１０ Ｍの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起されなかった。Ｓｕｄａ他は、破骨細胞形成と骨吸収との間の陽性の相互関係が存在することを示した（Ｓｕｄａ、ＴおよびＴａｋａｈａｓｈｉ、Ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ 、ｖｏｌ． ２０、３４５−３５７（１９９９））。すなわち、破骨細胞形成を刺激する化合物はまた骨吸収活性に影響を与える。
【００３９】
実施例５．
ビタミンＤ欠乏ラットにおける１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される骨吸収に対する（２３Ｓ）−２５−デヒドロ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−２６，２３−ラクトン［化合物１１、（２３Ｓ異性体）］ の骨吸収抑制活性
４週齢のウィスター系雄性ラットは、日本エスエルシー（ＳＬＣ、静岡） から購入したものを用いた。動物は、３匹ずつ金網ケージに入れ、動物飼育用ビタミンＤ欠乏飼料（Ｃａ、０．００３６％；Ｐ、０．３％；Ｈａｒｌａｎ Ｔａｋｌａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ、ＷＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．） および飲料水（０．４±０．２ ｐｐｍの次亜塩素酸塩で処理した井水） を７週間自由摂取させた。温度を２３±１ ℃、湿度を５５±１０％に保持した。用いた動物は、１実験群あたり５匹とした。
【００４０】
対照動物には溶媒（５％エタノール／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／生理的食塩水） を静脈内投与し、実験動物に１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を０．２５ μｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与した。ビタミンＤ誘導体を投与した動物について、２ μｇ／ｋｇ、１０ μｇ／ｋｇまたは５０ μｇ／ｋｇの投与量の化合物１１（２３Ｓ異性体） を投与するか、あるいは化合物１１（２３Ｓ異性体） 単独または化合物１１（２３Ｓ異性体） と０．２５ μｇ／ｋｇの投与量の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３との組み合わせを投与した。体積は各動物について２ ｍｌ／ｋｇであった。投与２４時間後にエーテル麻酔下に腹部下降大動脈より採血し、定法にしたがって血清を得た後、血清中のカルシウム濃度を測定した。カルシウム濃度は日立製作所製７０７０型自動分析装置を用い、ＯＣＰＣ法（Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｖｏｌ． ４５、２９０−２９６（１９６６）） で測定した。結果を表７に示す。
【００４１】
【表７】
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【００４２】
これらの結果が示すように、０．２５ μｇ／ｋｇの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の投与２４時間後に、動物は対照に比較して有意な血清中カルシウム濃度上昇を示した。これらのラットはカルシウムを含まない飼料で飼育したので、血清中カルシウム濃度上昇は破骨細胞による骨吸収により骨から放出されたカルシウムによる（Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｖｏｌ． ２１６、１３５１−１３５９（１９６９））。化合物１１（２３Ｓ異性体） を投与した動物について、血清中カルシウム濃度上昇は５０ μｇ／ｋｇの投与量においてさえ観測されなかった。したがって、この化合物は投与２４時間後に骨吸収を惹起しない。しかしながら、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と化合物１１（２３Ｓ異性体） を２ μｇ／ｋｇ、１０ μｇ／ｋｇまたは５０ μｇ／ｋｇの投与量で同時に投与したとき、骨吸収は上昇しなかった。これらのデータが証明するように、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される骨吸収は用量依存的に化合物１１（２３Ｓ異性体） の投与により抑制された。
【００４３】
以上の結果から、本発明のビタミンＤアンタゴニストはｉｎ ｖｉｖｏにおいて血清中カルシウム濃度を上昇させないで１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３により惹起される骨吸収を抑制することが明らかになった。従って、本発明のビタミンＤアンタゴニストは骨パジェット病患者において見られる１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３で惹起される骨吸収の亢進の治療に有用である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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