(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのペプチド組成物と、アルデヒド官能基を有する少なくとも１つの親油性ベクターとを溶液中で結合させるための方法に関し、該カップリングは、該ペプチド化合物と該親油性ベクターとの間にヒドラゾン結合を形成させることを含む工程を含む。本発明はまた、該方法における使用のための親油性ベクター、該方法によって得られるリポペプチド、細胞スクリーニングのための該リポペプチドの使用、および特に生理学的バリア（例えば、細胞膜）を介してペプチド種（例えば、ホルモンまたは神経ペプチド）の有効成分の標的化を調製するための、本発明の適用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのペプチド化合物と、アルデヒド官能基を有する少なくとも１つの親油性ベクターとを、溶液中でカップリングするための方法であって、前記カップリングが、前記ペプチド化合物と前記親油性ベクターとの間にヒドラゾン結合を形成させる工程を含み、前記親油性ベクターが、非ペプチドタイプであり、そして以下の一般式（Ｉ）：
［（Ｒ１）（Ｒ２）ｉ］Ｄ−ＣＨＯ　　　（Ｉ）
［ここで：
−　ｉは０または１を示し、
−　ｉが０に等しい場合、Ｄは結合を示し、
−　ｉが１に等しい場合、Ｄは、単−または多環式、飽和、不飽和または芳香族ヘテロ環を示し、そして
−　Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり得、各々、式Ｌ−ｆ−Ｅ−ｆ’を有する基を示し、ここで、Ｌは脂質の残基を示し、Ｅはスペーサーアームを示し、そしてｆおよびｆ’は、それぞれ、ＬをＥへおよびＥをＤへ結合させる官能基を示す］に従うことを特徴とする、方法。
【請求項２】
以下の工程：
ａ）そのＮ末端、または該ペプチド配列のあるポイントに場合によっては存在するリシンもしくはオルニチンの側鎖の末端いずれかに、式−ＣＯ−ＣＨＲ’−ＮＲ−ＮＨ２を有する１〜４のヒドラジン誘導体基を有する、少なくとも１つの完全に脱保護されたペプチド化合物の調製［ここで、ＲおよびＲ’は、互いに独立して、水素原子、あるいは分枝または環式、直鎖、飽和または不飽和アルキル基（１〜１０炭素原子、ならびに場合によっては、酸素、硫黄、および窒素から選択される１〜３のヘテロ原子を含み、そしてヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミノアルキル、アミノアリール、チオ、チオアルキル、カルボニル、グアニジノおよびカルボキサミド基から選択される１〜６の基によって置換され得る）を示す］；
ｂ）工程ａ）において得られる前記ペプチド化合物と、アルデヒド官能基を有する、請求項１に記載の式（Ｉ）の非ペプチドタイプの少なくとも１つの親油性ベクターとの、溶液中での反応、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｂ）において行われる反応が、水および少なくとも１つの水混和性親油性溶媒の混合物中で行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記水混和性親油性溶媒が、ｔｅｒｔ−ブタノールであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドラジン誘導体基がα−ヒドラジノアセティック基であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチド化合物がペプチドおよびペプチド誘導体によって構成される群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド誘導体が、グリコペプチド、シュードペプチドおよびペプチドタイプのデンドリマー状グリコミメティック（ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドタイプのデンドリマー状グリコミメティックが、以下の一般式（ＩＩ）：
（Ｂ２Ｍ）ｍ（ＸＮ）ｎＡ　　　（ＩＩ）
［ここで：
−　Ｂ２は、１以上の以下の一般式（ａ）または（ｂ）：
【化１】
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（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子または保護基を示し、そしてここでＷは、結合、あるいは飽和または不飽和、分枝または環式、直鎖炭素鎖｛１〜１８の炭素原子ならびに場合によっては酸素、硫黄、および窒素から選択される１〜１２の原子を含み、前記炭素鎖は、場合によっては、１〜１６のハロゲン原子で置換されている｝を示す）に対応し、
−　Ｘは、１〜６のアミノ酸を含むオリゴペプチドＸ’の残基を示し、
−　Ａは、少なくとも三官能性のＡ’化合物の残基を示し、
−　ｍは１〜３２の整数であり、
−　ｎは０〜３２の整数であり、そして
−　ＭおよびＮは、各々、それぞれ、Ｂ２とＡとの間（ｎ＝０の場合）またはＢ２とＸとの間（ｎが０以外である場合）、およびＸとＡとの間（ｎが０以外である場合）の連結を示し、そして互いに独立して、オキシム、ヒドラゾン、アミド、エステル、チオエステル、ヒドラジド、ヒドロキサメート、エーテル、チオエーテル、アミン、カーボネート、カルバメート、チオカーボネート、チオカルバメート、ウレア、チオウレアおよびチアゾリジン官能基から選択される官能基を含む］に対応することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物Ａ’が、リシン、ヒドロキシリシン、セリン、トレオニン、システイン、オルニチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸によって形成される群から選択される同一であるかまたは異なるアミノ酸の鎖を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一般式（ＩＩ）を有する化合物が、ｍは４〜１６の整数であり、ｎは２〜８の整数であり、Ｘは２〜４残基のアミノ酸を含むオリゴペプチドの残基を示し、Ａは２〜８残基のリシンを含みそしてデンドリマーの形態をとる鎖の残基を示すようなものであることを特徴とする、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記一般式（ＩＩ）を有する化合物が、Ｂ２は（−）−シキミ酸および（−）−キナ酸から選択される１以上の化合物の残基を示すようなものであることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
いくつかの異なるペプチド化合物および／またはいくつかの異なる親油性ベクターを使用することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）において、アルデヒド官能基を有する少なくとも１つの親油性ベクターと、ペプチド、グリコペプチドおよびシュードペプチド、ならびに請求項８〜１１のいずれか１項に定義される一般式（ＩＩ）を有する少なくとも１つのデンドリマー状グリコミメティックから選択される少なくとも１つのペプチド化合物とを使用することを特徴とする、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に定義される一般式（Ｉ）：
［（Ｒ１）（Ｒ２）ｉ］Ｄ−ＣＨＯ　　　（Ｉ）
に対応することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の方法において使用可能な親油性ベクター。
【請求項１５】
ｉが１に等しく、そしてＤがヘテロ環１−アザ−３，７−ジオキサビシクロ（３．３．０）−オクタンを示すことを特徴とする、請求項１４に記載の親油性ベクター。
【請求項１６】
Ｌが、ステロール、ステロール誘導体、あるいは４〜３０の炭素原子を含む、直鎖または分枝、飽和または不飽和炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項１４または請求項１５に記載の親油性ベクター。
【請求項１７】
前記ステロール誘導体がコレステロール誘導体であり、そして前記炭素鎖が、式ＣＨ３−（ＣＨ２）１４−またはＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−に対応することを特徴とする、請求項１６に記載の親油性ベクター。
【請求項１８】
Ｅが、１〜１８の炭素原子および、場合によっては、１〜１６のヘテロ原子および／またはカルボニル基、ヘテロ環、ヘテロアリール、炭素環およびアリールから選択される１〜７の基を含む、飽和または不飽和、分枝または環式、直鎖炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の親油性ベクター。
【請求項１９】
Ｅが、１〜８のヒドロキシルもしくはアミノ基および／または１〜１６のハロゲン原子によって置換されていることを特徴とする、請求項１８に記載の親油性ベクター。
【請求項２０】
ｆが−ＣＯ−ＮＨ−または−ＣＯ−Ｏ−結合を示し、そしてｆ’が−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−ＣＯ−結合を示すことを特徴とする、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の親油性ベクター。
【請求項２１】
式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）：
【化２】
2004510709.tif 000022
［ここで、Ｌは、請求項１、１６または１７のいずれか１項に定義される通りである］
に対応することを特徴とする、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の親油性ベクター。
【請求項２２】
Ｌが、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）において、式ＣＨ３−（ＣＨ２）１４−を有する炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項２１に記載の親油性ベクター。
【請求項２３】
Ｌが、式（ＩＩＩ）において、式ＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−を有する炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項２１に記載の親油性ベクター。
【請求項２４】
請求項１４〜２３のいずれか１項に定義される式（Ｉ）の非ペプチドタイプの少なくとも１つの親油性ベクターへ、ヒドラゾン結合によって結合された、少なくとも１つのペプチド化合物によって本質的に構成されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に定義されるカップリング方法によって得られ得るリポペプチド。
【請求項２５】
請求項２４に定義されるいくつかの異なるリポペプチドの混合物。
【請求項２６】
細胞標的化のための請求項２４に記載のリポペプチドの使用。
【請求項２７】
細胞標的化のために有用な、少なくとも１つの親油性化合物によってベクター化されたペプチドタイプの少なくとも１つの有効成分を含む薬物の調製のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのペプチド化合物と、アルデヒド官能基を有する少なくとも１つの親油性ベクターとを、溶液中でカップリングするための方法、この方法において使用され得る親油性ベクター、このように得られるリポペプチド、ならびに特に薬物を得るためのこの方法の適用に関する。
【０００２】
薬理学的特性を有する種々の物質を生存細胞へ導入する問題は、治療的に非常に重要である。合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが細胞膜を通過することは困難である。細胞に浸透するそれらの能力を改善するための１つの興味深いアプローチは、親油性部分でそれらを修飾することである。従って、単純な脂肪族鎖によって修飾されたペプチドは、膜を介して受動輸送によって細胞に浸透し得、そして細胞質内（ｉｎｔｒａ−ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）標的と相互作用し得ることが、実証された。従って、リポペプチドは、細胞内に機能的ユニット（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｕｎｉｔ）を運搬する（ｖｅｃｔｏｒｉｚｉｎｇ）ことにおいて、興味のある分子である。
【０００３】
リポペプチドは、例えば、特にＫ．ＴＨＩＡＭらによってＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９８， ２５３， ６３９−６４７においておよびｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９９， ４２， ３７３２−３７３６において、ならびにＣ．ＫＬＩＮＧＵＥＲらによってＶａｃｃｉｎｅ， ２０００， １８， ２５９−２６７において記載されるように、固相におけるペプチドへ脂肪酸をカップリングすることによって合成され得る。合成終了時に、ペプチド／固相支持体結合の切断および強酸でのペプチド側鎖の脱保護を含む工程を行うことが必要である。この処理は、相当に、親油性部分の選択を制限し；それは、特に、不飽和脂肪酸の使用を妨げる。更に、逆相高速液体クロマトグラフィーを使用してのリポペプチドの精製（これは、ペプチド／支持体結合の切断後に必要とされる）は、実施することが困難であり、そして合成終了後に存在する多数の不純物に起因して、低収率へ導く。
【０００４】
蛋白質を溶液中でパルミトイル−補酵素Ａ基とカップリングすることが提案されており、後者は、システインのチオール基部位に導入される。１つのこのようなカップリングは、チオエステル結合の形成を生じさせ、これは、あまり安定でないという欠点を有する。他方で、このストラテジーは、いくつかの蛋白質をパルミトイル−補酵素Ａで修飾することに限られ、そしてリポペプチド合成を含むように拡張され得ない。
【０００５】
リポペプチド合成のための最近のストラテジーはまた、化学的連結（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を使用することを含む。化学的連結は、予め精製されそして完全に脱保護された２つのペプチド構造物を、溶液中および非常に穏やかな条件下で、結合することを可能にする。
【０００６】
従って、緩衝水溶液中でジスルフィド結合を使用してペプチドへ脂肪酸を結合することが提案された。しかし、ジスルフィド結合は、多数の問題を引き起こす：このような結合は、実際に、不安定でそしてチオールの存在下で分解する傾向にあり、従って、生成物を溶解させるために使用される溶媒が、チオールによって汚染されることを防止することが必要であり、ならびに運搬されるペプチド配列へシステインを導入することは不可能である。チオール化学の使用は、更に、チオールの酸化を防止するために、不活性雰囲気中で行うことを必要とする。
【０００７】
Ｗ．ＺＥＮＧら （Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃ．， １９９６， ２， ６６−７２） はまた、完全に脱保護されてプレ精製されたペプチドを、ペプチドへ結合された多官能性脂質性構造物（これは、オキシム結合によって活性化される）へ、溶液中で結合させることを提案している。親油性部分が固相においてペプチド配列へ導入され、このような方法は、上述の欠点、即ち親油性部分の選択についての制限、および脂質性構造物の精製に関連する困難性を有している。
【０００８】
同様に、Ｏ．ＭＥＬＮＹＫら（Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．， １９９８， ５２， １８０−１８４）は、親油性鎖およびアルデヒド官能基を有するペプチドと、そのリシン側鎖がヒドラジノ基で修飾されている別のペプチドとの間の、溶液中およびヒドラゾン結合による、連結を記載する。ヒドラジン結合は溶液中で行なわれるが、ペプチドタイプである親油性化合物は、固相合成され、そして制限は上述のものと同一である。
【０００９】
更に、Ｃ．ＫＬＩＮＧＵＥＲら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９６， ３７， ４０， ７２５９−７２６２）は、シクロヘキサンカルボキシアルデヒド（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）と、ヒドラジン官能基を有するペプチドとの間の、水／アセトニトリル混合液中での、連結を記載する。しかし、これらの著者によって記載される方法は、有効成分の運搬について使用可能な安定である化合物を得ることを可能にしない：ヒドラジンとアルデヒドとの間に形成されるヒドラゾン結合は、実際に、広範なｐＨ値に渡って不安定である。
【００１０】
最後に、Ｄ．ＢＯＮＮＥＴら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２０００， ４１， ４５−４８）は、脂肪酸の活性エステルとα−ヒドラジノアセティック残基によって官能化されたペプチドとの、溶液中そしてヒドラジド結合による、連結を記載する。この方法は、フランス特許出願番号９９１０６２６にも記載され、ペプチドへ複合脂肪酸を導入することを可能にする。しかし、反応媒体中に存在する塩、活性化試薬および不純物（特に、ポリアシル化ペプチド）からリポペプチドを分離するために、ＨＰＬＣを使用しての精製が、合成終了時に行なわれなければならない。この精製は、溶液中でのカップリングの質によって簡略化されるが、にもかかわらず、上記に言及される理由のために必要である。従って、このカップリング方法は、特定のワクチンにおいて使用されるもののような、リポペプチド混合物の合成に好適でなない（Ｈ． ＧＡＨＥＲＹ−ＳＥＧＡＲＤら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０００， ７４， ｎｏ４， １６９４−１７０３； Ｃ． ＫＬＩＮＧＵＥＲら， Ｖａｃｃｉｎｅ， ｉｂｉｄ）。
【００１１】
上述の技術水準の欠点を考慮して、本発明者らは、溶液中での化学的連結による、リポペプチドの、そして一般的に言えば、脂質性タイプの種々の化合物によって修飾されたペプチドの合成のための新規のストラテジーを提供するという課題に自らを差し向けた。
【００１２】
この新規の合成ストラテジーは、特に、以下の基準を満たさなければならない：
−　脂質性タイプ化合物とペプチドとのカップリングを溶液中で行う、
−　カップリングを、完全に脱保護されたペプチドをとること、反応は化学選択的（ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）であることに基づいて行う、
−　カップリングの反応条件は、モノおよびポリ不飽和複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）脂肪酸の誘導体、およびコレステロールの市販の誘導体を含む、脂肪酸誘導体の使用を可能にする、
−　カップリングの間に形成される結合は、広範囲のｐＨ値に渡って非常に安定である、
−　カップリングは、予備精製工程なしに直接使用可能なリポペプチド混合物を得ることを可能にする。
【００１３】
本発明者らはまた、化学的連結によって得られ得るリポペプチドを提供するという課題に自らを差し向け、ここで、脂質／ペプチド結合は非常に安定でありそして先行技術のジスルフィド結合の欠点を有さない。
【００１４】
これらの目的は、溶液中での収束的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）合成の間の、ペプチドと非ペプチドタイプの親油性ベクターとの間のヒドラゾン結合の形成によって達成される。
【００１５】
本発明の目的は、少なくとも１つのペプチド化合物と、アルデヒド官能基を有する少なくとも１つの親油性ベクターとを、溶液中でカップリングするための方法であって、該カップリングが、前記ペプチド化合物と前記親油性ベクターとの間にヒドラゾン結合を形成させる工程を含み、この方法は、前記親油性ベクターが、非ペプチドタイプであり、そして以下の一般式（Ｉ）：
［（Ｒ１）（Ｒ２）ｉ］Ｄ−ＣＨＯ　　　（Ｉ）
［ここで：
−　ｉは０または１を示し、
−　ｉが０に等しい場合、Ｄは結合を示し、
−　ｉが１に等しい場合、Ｄは、単−または多環式、飽和、不飽和または芳香族ヘテロ環を示し、そして
−　Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり得、各々、式Ｌ−ｆ−Ｅ−ｆ’を有する基を示し、ここで、Ｌは脂質の残基を示し、Ｅはスペーサーアームを示し、そしてｆおよびｆ’は、それぞれ、ＬをＥへおよびＥをＤへ結合させる官能基を示す］に対応することを特徴とする。
【００１６】
特に有用な様式において、溶液中で行なわれる、本発明に従う方法は、このようにして得られる修飾化ペプチド化合物の支持体からの切断の工程を不要とすることを可能にする。この切断は、上述のように、相当に、ペプチド化合物へカップリングされる親油性部分の選択を制限する。
【００１７】
本発明に従う方法の実施形態の１つの有用な形態によれば、この方法は、以下の工程を含む：
ａ）そのＮ末端、または該ペプチド配列のあるポイントに場合によっては存在するリシンもしくはオルニチンの側鎖の末端いずれかに、式−ＣＯ−ＣＨＲ’−ＮＲ−ＮＨ２を有する１〜４のヒドラジン誘導体基［ここで、ＲおよびＲ’は、互いに独立して、水素原子、あるいは分枝または環式、直鎖、飽和または不飽和アルキル基（１〜１０炭素原子、ならびに場合によっては、酸素、硫黄、および窒素から選択される１〜３のヘテロ原子を含み、そしてヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミノアルキル、アミノアリール、チオ、チオアルキル、カルボニル、グアニジノおよびカルボキサミド基から選択される１〜６の基によって置換され得る）を示す］を有する、少なくとも１つの完全に脱保護されたペプチド化合物の調製；
ｂ）工程ａ）において得られる前記ペプチド化合物と、アルデヒド官能基を有する、上記に定義される式（Ｉ）の非ペプチドタイプの少なくとも１つの親油性ベクターとの、溶液中での反応。
【００１８】
上記に定義されるように、ヒドラジンから誘導される基は、ペプチドのＮ末端、またはペプチド配列のあるポイントに場合によっては存在するリシンもしくはオルニチンの側鎖の末端いずれかに、当業者に公知の任意の手段によって、導入され得る。
【００１９】
本発明に従う方法の工程ａ）に記載の、ペプチド化合物によって保有されるヒドラジン誘導体基は、好ましくは、α−ヒドラジノアセティック基（α−ｈｙｄｒａｚｉｎｏａｃｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）、即ち式−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ２基である。このような基は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＦＲ００／０２３３６、ならびにＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２０００， ４１， ４５−４８において発行されたＤ．ＢＯＮＮＥＴらによる論文に開示されるように、Ｎ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ酢酸またはＮ，Ｎ’−ジ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ酢酸を使用して、ペプチド化合物へ導入され得る。反応は固相において行なわれ、次いで、官能化ペプチドは、当業者に公知の方法に従って、固相から分離されそして脱保護される。
【００２０】
特に有用な様式において、式（Ｉ）の親油性ベクターと、上述のように官能化された、上記完全に脱保護されたペプチド化合物との間のカップリング反応は、カップリング反応に続いての、強酸での該ペプチド化合物の側鎖の脱保護工程を不要とすることを可能にし、これは、感受性脂肪酸誘導体を親油性ベクターとして使用することを可能にする。従って、本発明に従う方法は、修飾化ペプチド化合物、即ち、親油性ベクターへカップリングされたものを直接得ることを可能にする。
【００２１】
本発明に従う方法の間に行なわれるカップリング反応（工程ｂ））は、非常に穏やかな操作条件下で行なわれ、そして先行技術のある方法（特に、ジスルフィド結合を使用してペプチドと脂肪酸をカップリングすることを含むもの）の場合のような、不活性条件下での実行を必要としない。カップリングは、有効かつ迅速であり、そして化学量論条件下で行なわれる。副生成物および未消費の前駆体は、存在しないかまたは非常に僅かであり、このことは、精製される必要無しに、直接有用であるリポペプチドを得ることを可能にする。これは、リポペプチドが高速液体クロマトグラフィーまたは他の方法で精製することが困難である分子である場合（溶解性、凝集などの既知の問題）、特に有用である。本発明に従う方法において、ペプチド前駆体は、親油性ベクターへカップリングされる前に、容易に精製され得る。従って、得られるリポペプチドは、必ずしも精製される必要はない。
【００２２】
更に、式（Ｉ）の親油性ベクターのアルデヒド官能基と、ペプチド化合物によって保有される式−ＣＯ−ＣＨＲ’−ＮＲ−ＮＨ２を有するヒドラジン誘導体基との間で、本発明に従う方法の工程ｂ）の間に形成されるヒドラゾン結合は、特に安定であり、そして、いずれにせよ、アルデヒドとヒドラジン基（−ＮＨ−ＮＨ２）との間に形成されるヒドラゾン官能基、特にＣ．ＫＬＩＮＧＵＥＲら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９６， ３７， ４０， ７２５９−７２６２）によって記載されるヒドラゾン結合のタイプよりも、遥かに安定である。実際に、本発明の枠組みにおいて使用されるペプチド化合物によって保有されるヒドラジン誘導体基における、カルボニル官能基の存在は、ヒドラジン官能基の反応性を修飾し、そして形成されるヒドラゾン結合を安定化させる。
【００２３】
本発明に従う方法の工程ｂ）において行なわれる反応は、有利には、水（ペプチド化合物を溶解化するため）と少なくとも１つの水混和性（ｗａｔｅｒ−ｍｉｓｃｉｂｌｅ）親油性溶媒（親油性ベクターを溶解化するため）（好ましくは、ｔｅｒｔ−ブタノール）との混合物中において行なわれる。
【００２４】
本発明に従う方法において使用されるペプチド化合物は、ペプチドおよびペプチド誘導体、例えば、グリコペプチド（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、シュードペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、およびペプチドタイプのデンドリマー状グリコミメティック（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）によって形成される群から選択され得る。
【００２５】
本発明の意味内で、“ペプチド”は、それらの性質および数に関わらず、いくつかのアミノ酸の配列を意味するとして理解され；従って、用語“ペプチド”は、オリゴペプチド（ジペプチドまたはトリペプチド）およびポリペプチドまたは蛋白質の両方を意味する。“グリコペプチド”は、それらが単糖類（例えば、中性のもの（ｎｅｕｔｒａｌ ｏｓｅｓ））または多糖類であるかにかかわらず、炭水化物と、共有結合によって結合されたペプチドを意味するものとして理解される。≪シュードペプチド≫は、その１以上のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）が非ペプチド結合（例えば、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、または−ＣＯ−ＮＨ−Ｏ−結合）によって置換されている、ペプチドを意味するとして理解される。≪ペプチドタイプのデンドリマー状グリコミメティック≫は、その構造がアミノ酸またはそれらの誘導体に基づいており、そして樹状タイプの、高度に枝分かれした形態をとるグリコミメティック（ｇｌｙｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を意味するとして理解される。
【００２６】
本発明に従うカップリング方法において有用なペプチドおよびペプチド誘導体は、有利には、薬理学的活性および治療学的関心を示し得る：それらは、例えば、神経ペプチド、ペプチドホルモン、またはサイトカインのレセプターの活性を調節する傾向にある物質であり得る。本発明の方法に従って、親油性ベクターへこれらのペプチドまたはペプチド誘導体をカップリングすることは、それらに、関連する細胞に関わらず、細胞膜の通過によって細胞に浸透する能力を与える。
【００２７】
本発明に従う方法の実施形態の１つの有利な形態によれば、使用されるペプチド化合物は、以下の一般式（ＩＩ）に対応するペプチドタイプのデンドリマー状グリコミメティックである：
（Ｂ２Ｍ）ｍ（ＸＮ）ｎＡ　　　（ＩＩ）
ここで：
−　Ｂ２は、１以上の以下の一般式（ａ）または（ｂ）：
【００２８】
【化３】
2004510709.tif 000003
【００２９】
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子または保護基を示し、そしてここでＷは、結合、あるいは飽和または不飽和、分枝または環式、直鎖炭素鎖｛１〜１８の炭素原子ならびに場合によっては酸素、硫黄、および窒素から選択される１〜１２の原子を含み、前記炭素鎖は、場合によっては、１〜１６のハロゲン原子で置換されている｝を示す）に対応し、
−　Ｘは、１〜６のアミノ酸を含むオリゴペプチドＸ’の残基を示し、
−　Ａは、少なくとも三官能性のＡ’化合物の残基を示し、
−　ｍは１〜３２の整数であり、
−　ｎは０〜３２の整数であり、そして
−　ＭおよびＮは、各々、それぞれ、Ｂ２とＡとの間（ｎ＝０の場合）またはＢ２とＸとの間（ｎが０以外である場合）、およびＸとＡとの間（ｎが０以外である場合）の連結基を示し、そして互いに独立して、オキシム、ヒドラゾン、アミド、エステル、チオエステル、ヒドラジド、ヒドロキサメート、エーテル、チオエーテル、アミン、カーボネート、カルバメート、チオカーボネート、チオカルバメート、ウレア、チオウレアおよびチアゾリジン官能基から選択される官能基を含む。
【００３０】
式（ＩＩ）の化合物は、国際出願ＰＣＴ／ＦＲ００／０２１９４に記載されている。
【００３１】
本発明の意味内において、≪保護≫基は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔ．Ｗ． ＧＲＥＥＮＥ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ． ＷＵＴＳ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９１， Ｊ． ＷＩＬＥＹ ａｎｄ Ｓｏｎｓという表題の研究において定義されるように、ヒドロキシル官能基またはジオール（この場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４から選択される２つの基は、互いに共有結合し、一緒になって環を形成し得る）を保護する基を意味するとして理解される。例としてそして非限定的に、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、第３級ブチルジメチルシリル（ｔｅｒｔｉｏｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）、第３級ブチルジフェニルシリル（ｔｅｒｔｉｏｂｕｔｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌｓｉｌｙｌ）、トリメチルシリルエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、メトキシ−メチル、ベンジルオキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、メチルチオメチル、アセチル、または２’，３’−ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル基が、挙げられ得る。
【００３２】
例として、そして非限定的に、一般式（ａ）および（ｂ）において：
−　好適なハロゲン原子は、臭素、塩素およびフッ素であり；そして、
−　好適な炭素鎖は、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、第３級ブチル（ｔｅｒｔｉｏｂｕｔｙｌ）、ペンチルなど）、アルケニル基（ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニルなど）、アルキニル基（エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルなど）、シクロアルキル基（シクロペンチル、シクロヘキシルなど）、ヘテロ環（ピペラジンなど）、アリール基（フェニル、クレジル（ｃｒｅｓｙｌ）など）、ヘテロアリール基（ピリジン、ピリミジン、ピラジンなど）、ポリエチレングリコール基または再度、ポリアミンである。
【００３３】
式（ａ）および（ｂ）は、キナ酸およびシキミ酸の、ならびに環の１、３、４および／または５位に保有されるヒドロキシルを保護することによって得られるそれらの誘導体のいくつかの、残基を示す。
【００３４】
一般式（ａ）および（ｂ）に対応する化合物は、それらが少なくとも２つのビシナル遊離ヒドロキシル官能基を有する場合、Ｄ−マンノースの模倣物（ｍｉｍｉｃｓ）であり：これらの化合物および従ってそれらを有する一般式（ＩＩ）の化合物は、マンノースレセプターによって認識され得、そして後者へまたはマンノースレセプターに関連するＣ−レクチンのファミリーのあらゆるレセプターへ結合され得る。
【００３５】
化合物Ａ’は、有利には、共有結合によって互いに結合された、少なくとも三官能性の（ｔｒｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）化合物のいくつかの残基を含む鎖から形成され、そしてこれらの残基の遊離官能基（即ち、共有結合に関連しない官能基）のレベルで、一般式（ａ）および／または（ｂ）の化合物（単数または複数）あるいはＸが存在する場合には化合物Ｘ’についてのいくつかのアンカリング部位（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）を提供するに好適である。
【００３６】
化合物Ａ’は、好ましくは、三官能性化合物の２〜３２、そしてより良くは、４〜１６の残基を含む。
【００３７】
好ましくは、化合物Ａ’は、リシン、ヒドロキシリシン、セリン、トレオニン、システイン、オルニチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸によって形成される群から選択される同一であるかまたは異なるアミノ酸の鎖を含む。このアミノ酸は、Ｌ系またはＤ系のいずれかであり得、そして化合物Ａ’はまた、Ｌ系の残基およびＤ系の残基の両方を含み得る。リシン−ベースの化合物Ａ’は、リシン−ベースのマクロ分子は固有の免疫原性を持っていないということが示されたという点で、好ましい（ＴＡＭ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８８， ８５， ５４０）。
【００３８】
しかし、Ａ’化合物として、上述のアミノ酸以外の三官能性化合物の鎖を使用することが、それらが満足な生体適合性を提供する限り、可能である。例として、そして非限定的に、３，３’−イミノビス（プロピルアミン）、２，２’−イミノビス（エチルアミン）、没食子酸、トリス（２−カルボキシエチル）ニトロメタン（Ｍ．ＢＲＥＴＴＥＩＣＨら， Ｓｙｎｌｅｔｔ， １９９８， １３９６）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｐ．Ｒ．ＡＳＨＴＯＮら， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９９８， ６３， ３４２９）、および（ジヒドロキシ）プロピルアミンが挙げられ得る。
【００３９】
一般式（ＩＩ）を有する化合物中に存在する残基Ｘの数を示すインデックスｎは、以下であり得る：
・０に等しい（この場合、残基Ｂ２（単数または複数）は、残基Ａへ直接結合されている）、
・あるいは、１〜３２（この場合、ｎが１に等しい場合、残基Ｂ２（単数または複数）は、単一の残基Ｘを介して残基Ａへ結合されており、一方、ｎが１以外である場合、各残基Ｘは、１以上の残基Ｂ２と残基Ａとの間の結合エレメントとして役立ち得る）。
【００４０】
連結基ＭおよびＮについて、これらは、オキシム、ヒドラゾン、アミド、エステル、チオエステル、ヒドラジド、ヒドロキサメート、エーテル、チオエーテル、アミン、カーボネート、カルバメート、チオカーボネート、チオカルバメート、ウレア、チオウレアおよびチアゾリジン官能基から選択される官能基を含む連結基から、互いに独立して、選択される。非限定的な例として：
−　オキシム結合は、Ｏ−アルキルアミン基とカルボニル基とを反応させることによって形成され得、
−　ヒドラゾン結合は、ヒドラジン基とカルボニル基とを反応させることによって形成され得、
−　アミド（それぞれ、エステル）結合は、アミン（それぞれ、アルコール）基と活性化酸基または無水物または酸ハライドとを反応させることによって形成され得、
−　チオエステル結合は、チオール基と活性化酸基または酸無水物またはハライドとを反応させることによって形成され得、
−　ヒドラジド結合は、ヒドラジン基と活性化酸基または無水物または酸ハライドとを反応させることによって形成され得、
−　エーテル結合は、アルコール基とアルキルハライド基とを反応させることによって形成され得、
−　チオエーテル結合は、アルコール基とアルキルハライド基とを反応させることによって形成され得、
−　アミン結合は、アルコール基とアルキルハライド基とを反応させることによって形成され得、
−　カーボネート結合は、クロロホルメート（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）基とアルコール基とを反応させることによって形成され得、
−　カルバメート結合は、クロロホルメート基とアミン基とを反応させることによって形成され得、
−　チオカーボネート結合は、クロロチオホルメート（ｃｈｌｏｒｏｔｈｉｏｆｏｒｍａｔｅ）基とアルコール基とを反応させることによって形成され得、
−　チオカルバメート結合は、クロロチオホルメート基とアミン基とを反応させることによって形成され得、
−　ウレア結合は、イソシアネート基とアミン基とを反応させることによって形成され得、
−　チオウレア結合は、イソチオシアネート基とアミン基とを反応させることによって形成され得、
−　チアゾリジン結合は、β−アミノチオール基とカルボニル基とを反応させることによって形成され得、一方、
−　ヒドロキサメート（ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）結合は、活性化酸基とヒドロキシルアミン基との間の反応によって形成され得る。
【００４１】
従って、一般式（ＩＩ）において、Ｂ２、ＡおよびＸは、互いに反応することによって上記に定義されるようなＭおよびＮ連結基の生成に至るに好適な官能基を天然に有している化合物の、またはこのような官能基を有するように修飾された化合物の、残基を示すことが理解されるだろう。
【００４２】
一般式（ＩＩ）を有する化合物は、有利には、ｍは４〜１６の整数であり、ｎは２〜８の整数であり、Ｘは２〜４残基のアミノ酸を含むオリゴペプチドの残基を示し、Ａは２〜８のリシン残基を含みそしてデンドリマーの形態をとる鎖の残基を示すようなものである。
【００４３】
一般式（ａ）および／または（ｂ）を有する化合物は、有利には、−ＯＲ２および−ＯＲ３基がトランス関係にあるように選択され、その結果、この化合物とそのレセプターとの間の結合に関与するようである、Ｄ−マンノース環によって保有される２つのヒドロキシルを模倣する。
【００４４】
式（ｂ）化合物は、有利には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、水素原子を示すようなものである。更に、−ＯＲ１および−ＯＲ２基がシス関係にあり、そして−ＯＲ２および−ＯＲ３基がトランス関係にある場合（立体配置は、３Ｒ、４Ｓおよび５Ｒである）、得られる化合物は、（−）−シキミ酸（即ち、３，４，５−トリヒドロキシ−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸）の残基からなる。
【００４５】
式（ａ）化合物について、有利には、それは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が水素原子を示すようなものである。更に、−ＯＲ２および−ＯＲ３基がトランス関係にあり、一方−ＯＲ１および−ＯＲ４基が各々−ＯＲ２基に対してシス関係にある場合（立体配置は、１ｓｎ、３Ｒ、４ｓｎおよび５Ｒである）、得られる化合物は、（−）−キナ酸（即ち、１，３，４，５−テトラヒドロキシ−シクロヘキサン−カルボン酸）の残基からなる。
【００４６】
従って、一般式（ＩＩ）を有する化合物は、好ましくは、Ｂ２が（−）−シキミ酸および（−）−キナ酸（場合によっては保護形態のもの）から選択される１以上の化合物の残基を示すようなものである。（−）−シキミ酸および（−）−キナ酸は、例えば、ＡＬＤＲＩＣＨ社またはＡＣＲＯＳ社から市販されている。
【００４７】
本発明に従うカップリング方法は、いくつかの異なるペプチド化合物および／またはいくつかの異なる親油性ベクターを利用し得、従って、親油性ベクターによって官能化されたペプチド化合物の混合物を合成することを可能にする。
【００４８】
このような混合物は、本発明の方法の工程ｂ）に従う単一工程において得られる：工程ｂ）においていくつかの異なるペプチド化合物および／またはいくつかの異なる親油性ベクターを使用することは、親油性ベクターによって官能化されたペプチド化合物の混合物へと直接導く。この混合物は、前もっての精製工程または脱塩（ｄｅｓａｌｉｚａｔｉｏｎ）なしに、反応媒体の直接的凍結乾燥、または水で希釈することによって得られる成分の沈殿によるものを直接使用可能である。
【００４９】
本発明に従うカップリング方法の実施形態の１つの有利な形態によれば、この方法は、工程ｂ）において、アルデヒド官能基を有する少なくとも１つの親油性ベクター、ペプチド、グリコペプチドおよびシュードペプチド、ならびに上記に定義される一般式（ＩＩ）を有する少なくとも１つのデンドリマー状グリコミメティックから選択される少なくとも１つのペプチド化合物を使用する。
【００５０】
本発明に従うカップリングの工程ｂ）の間に式（ＩＩ）を有する少なくとも１つの化合物を使用することは、有利に各々が１以上の親油性ベクターへ結合された、ペプチド、グリコペプチドおよびシュードペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド化合物、ならびに式（ＩＩ）を有する少なくとも１つのデンドリマー状グリコミメティックを含む混合物の生成へ至る。親油性鎖の存在のために、該混合物は、混合ミセル（ｍｉｘｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅｓ）の形態で構成される。これらのミセルにおける式（ＩＩ）化合物の存在に起因して、該ペプチド化合物は、マンノースレセプターまたはマンノースレセプターに関連するＣ−レクチンファミリーのレセプターを有する細胞へと選択的に運搬され得る。
【００５１】
本発明はまた、上記に定義される一般式（Ｉ）：
［（Ｒ１）（Ｒ２）ｉ］Ｄ−ＣＨＯ　　　（Ｉ）
に対応することを特徴とする、上記に定義されるカップリング方法において使用可能な親油性ベクターに関する。
【００５２】
このような親油性ベクターは、有利には、ｉが１に等しく、そしてＤがヘテロ環１−アザ−３，７−ジオキサビシクロ（３．３．０）−オクタンを示すようなものである。
【００５３】
基Ｌ（Ｒ１およびＲ２に関して定義された、式Ｌ−ｆ−Ｅ−ｆ’中）は、例えば、ステロール、ステロール誘導体（例えば、コレステロール誘導体）、あるいは４〜３０の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和炭素鎖を示す。このような炭素鎖は、パルミチン酸［Ｌが、式ＣＨ３−（ＣＨ２）１４−に対応する場合］、またはオレイン酸［Ｌが、式ＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−に対応する場合］のような脂肪酸の親油性部分を構成する。
【００５４】
更に、Ｅは、有利には、１〜１８の炭素原子および、必要に応じて、１〜１６のヘテロ原子（例えば、窒素または酸素）および／またはカルボニル基、ヘテロ環、ヘテロアリール、炭素環およびアリールから選択される１〜７の基を含む、飽和または不飽和、直鎖、分枝鎖または環式炭素鎖を示す。Ｅは、場合によっては、１〜８のヒドロキシルもしくはアミノ基および／または１〜１６のハライド原子（例えば、塩素またはフッ素）によって置換されていてもよい。
【００５５】
本発明の意味内で：
−　≪炭素環≫（≪シクロアルキル≫とも呼ばれる）は、３〜８炭素原子を含む単−または多環式炭素環（例えば、シクロペンチルまたはシクロヘキシル）を意味すると理解され；
−　≪アリール≫は、５〜１４炭素原子を含む単−または多環式芳香族炭素環（例えば、フェニル、ナフチルまたはクレシル（ｃｒｅｓｙｌ））を意味すると理解され；
−　≪ヘテロ環≫は、窒素、酸素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を含む炭素環（例えば、ピペラジン）を意味すると理解され；
−　≪ヘテロアリール≫は、窒素、酸素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を含むアリール（例えば、ピリジン、ピリミジンまたはピラジン）を意味すると理解される。
【００５６】
ｆおよびｆ’について、これらの官能基は、例えば、それぞれ、−ＣＯ−ＮＨ−または−ＣＯ−Ｏ−、および−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−ＣＯ−結合を示す。
【００５７】
本発明に従う好ましい親油性ベクターの例は、以下の式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に対応する：
【００５８】
【化４】
2004510709.tif 000004
【００５９】
ここで、Ｌは、上記に定義される通りであり、そして例えば、以下を示す：
−　式ＩＩＩおよびＩＶにおいて、式ＣＨ３−（ＣＨ２）１４−を有する炭素鎖（即ち、パルミチン酸の親油性部分）、またはステロール誘導体．
−　式ＩＩＩにおいて、式ＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−を有する炭素鎖（即ち、オレイン酸の親油性部分）。
【００６０】
本発明に従う親油性ベクターは、前もっての活性化を必要とせずに、前述のカップリング方法においてのような使用に、特に好適である。
【００６１】
本発明はまた、上記に定義される式（Ｉ）の非ペプチドタイプの少なくとも１つの親油性ベクターへ、ヒドラゾン結合によって結合された、少なくとも１つのペプチド化合物によって実質的に構成されることを特徴とする、上記に定義されるカップリング方法を使用して得られ得るリポペプチドに関する。前記ペプチド化合物は、有利には、本発明に従うカップリング方法に関連して上記に定義される通りである。
【００６２】
前述のように、このようなリポペプチドは、非選択的様式で、細胞膜を介する受動輸送によって細胞へ浸透する能力を有する。
【００６３】
本発明はまた、上記に定義されるいくつかの異なるリポペプチドの混合物に関する。このような混合物は、上述のような本発明に従うカップリング方法で得られ得る。
【００６４】
本発明はまた、細胞標的化のための上記に定義のリポペプチドの使用に関する。
【００６５】
本発明はまた、細胞標的化のために有用な、少なくとも１つの親油性化合物によってベクター化されたペプチドタイプの少なくとも１つの有効成分を含む薬物の調製のための、上記に定義のカップリング方法の使用に関する。
【００６６】
このような薬物において、親油性化合物によってベクター化されたペプチドタイプ有効成分（例えば、抗原、ホルモンまたは神経ペプチド）は、非選択的様式で（即ち、関連する細胞に関わらず）、細胞膜のような親油性生理学的バリアを通過し得る。有効成分の物理的特性は、このように改変され、何故ならば、有効成分は、親油性鎖の存在によって、ミセルまたは凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）の形態をとり、これは、特に、混合ミセル（ｍｉｘｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅｓ）の場合、同一環境に異なるタイプのペプチドを寄せ集める（ｇｒｏｕｐ ｔｏｇｅｔｈｅｒ）ことを可能にするからである。これらのミセルまたは凝集体がまたヒドラゾン結合によって少なくとも１つの親油性ベクターへ結合された式（ＩＩ）の化合物を含む場合、得られる薬物は、マンノースレセプターに関連するＣ−レクチンのファミリーのレセプターを標的化することを可能にする。
【００６７】
前述の提供に加えて、本発明は、本発明に従う方法の実施および本発明に従うリポペプチドの合成の実施例ならびに添付の図面に言及する以下の説明から明らかとなるであろうなお他のものを含む。
【００６８】
しかし、これらの実施例は、本発明の主題の例示によってのみ与えられ、それらは決して本発明を限定しないことが、明確に理解されるべきである。
【００６９】
以下の実施例において、以下の略語が使用される：ｅｑ．：当量；　Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル；　Ｆｍｏｃ：９−フルオレニル−メトキシカルボニル；　Ｍｔｔ：４−メチル−トリチル；　ＤＭＦ：ジメチルフォルムアミド；　ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；　ＣＨ２Ｃｌ２：ジクロロメタン；　ＭｅＯＨ：メタノール；　ＥｔＯＨ：エタノール；　ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；　ＡｃＯＨ：酢酸；　ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル；　Ｈ２Ｏ：水；　ＡｃＯ−ＮＨ４＋：酢酸アンモニウム；　ＣＤＣｌ３：　重水素化クロロホルム；　ＥＤＴ：エタンジチオール；　ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン；　ＤＭＳＯ−ｄ６：ジメチルスルホキシド−ｄ６（完全に重水素化された）；　ＮａＩＯ４：　過ヨウ素酸ナトリウム；　ＮａＣｌ：塩化ナトリウム；　Ｎａ２ＳＯ４：　硫酸ナトリウム；　ＭｇＳＯ４：　硫酸マグネシウム；　ＫＨ２ＰＯ４：二水素リン酸カリウム；　ＰＡＬ：≪ペプチド−アミドリンカー≫；　ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；　ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；　ＨＢＴＵ：Ｎ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド；　ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン；　ＴＥＡＰ：トリエチルアミンフォスフェート；　ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー；　ＲＰＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー；　ＥＳ−ＭＳ：エレクトロスプレイ質量分析；　ＴＯＦ−ＰＤＭＳ：プラズマ脱着質量分析；　ＬＣ−ＭＳ：液体クロマグラフィーを使用しての分析と結合された質量分析；　ＮＭＲ１Ｈ：プロトン核磁気共鳴；　ＮＭＲ１３Ｃ：カーボン核磁気共鳴。
【００７０】
実施例１：α−ヒドラジノアセティック基によって官能化されたペプチドの合成
それらのＮ−末端またはペプチド配列に存在するリシン（Ｋ）の側鎖の末端のいずれかでα−ヒドラジノアセティック基によって官能化された以下のペプチドを、調製した：
【００７１】
【数１】
2004510709.tif 000005
【００７２】
これらのヒドラジノペプチドは、以下で記載されるプロトコルに従って固相合成される。
【００７３】
１）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ２ＮＮ（Ｂｏｃ）ＣＨ２ＣＯ）−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂の調製
出発樹脂は、０．１６ｍｍｏｌ／ｇ充填材（ｆｉｌｌｅｒ）を有するＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂である（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，２５ｇ）。それを、ＤＭＦ中ピペラジン２０％で処理する。固体支持体中に存在する反応性アミノ酸に対して４ｅｑ．の割合で使用する、アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、１分間、ＤＭＦ中ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ混合液（４ｅｑ．／４ｅｑ．／８ｅｑ．）によって活性化させる。次いで、活性化酸を樹脂に添加する。１時間撹拌後、樹脂をＤＭＦ次いでＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、そしてＣＨ２Ｃｌ２中４℃で保存する。
【００７４】
Ｍｔｔ基を、ＣＨ２Ｃｌ２中ＴＦＡ１％での一連の洗浄操作によって脱保護する。その脱保護に続いて、Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳゲル（を備える）、ＴＳＫ　ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）上でのＲＰＨＰＬＣを行なう。脱保護は、１３〜１６洗浄操作後に完了される。樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２中ジイソプロピルエチルアミン５％で２回洗浄して中性化し、次いでＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。
【００７５】
Ｎ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ酢酸のカップリング［これは、国際出願ＰＣＴ／ＦＲ００／０２３３６に開示されるように行なわれる］を、固体支持体上に存在する反応性アミノ官能基に対して１．２ｅｑ．のＮ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ酢酸を使用して行なう。Ｎ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ−酢酸を、ＤＭＦ中ＢＯＰ／ＤＩＥＡ（Ｍ． ＧＡＩＲＩ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９０， ５０， ７３６３）またはＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの混合液を使用して活性化し［Ｎ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）−ヒドラジノ−酢酸／ＢＯＰ／ＤＩＥＡ：１／１／３、またはＮ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ−酢酸／ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ：１／１／１／３］、次いで、ＤＭＦ中懸濁液の固体支持体へ単一操作で添加した。３０分後、支持体をＤＭＦおよびＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。
【００７６】
このようにして調製されるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ２ＮＮ（Ｂｏｃ）ＣＨ２ＣＯ）−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂を、支持体上でのペプチド合成のために直接使用する。
【００７７】
２）ペプチドＳＩＶ１〜ＳＩＶ７およびＴＴの合成
・合成プロトコル
ヒドラジノペプチドＳＩＶ１−７およびＴＴを、例えば、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化（Ｍ． ＳＣＨＮＯＬＺＥＲ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， １９９２， ４０， １８０）を伴う、≪Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ≫（Ｗ．Ｃ． ＣＨＡＮ ＆ Ｐ．Ｄ． ＷＨＩＴＥ Ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ ２０００）またはＧ．Ｂ． ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ， １９９０， ３５， １６１において記載されるような、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチル化学を使用して、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ２ＮＮ（Ｂｏｃ）ＣＨ２ＣＯ）−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂上で、固相合成する。合成をＰｉｏｎｅｅｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行なう。合成試薬は、以下の通りである：
−アミノ官能基の脱保護：ＤＭＦ中ピペリシン２０％、
−アミノ酸のアクチベーター：ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（この２試薬は、ＤＭＦ中０．５Ｍの濃度で使用される）、
−ＤＭＦ中ＤＩＥＡ，１Ｍの溶液、
≪キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）≫溶液（即ち、反応していない反応性官能基をブロックすること）：ＤＭＦ中無水酢酸３％およびＤＩＥＡ０，３％。
【００７８】
ヒドラジノペプチドＳＩＶ１およびＳＩＶ２を、１０当量のアミノ酸を使用して、０．１ミリモルのスケールで合成した。ペプチドＳＩＶ３〜ＳＩＶ７およびＴＴについて、これらを、４当量のアミノ酸を使用して０．２５ミリモルのスケールで合成した。合成を、以下の一連の工程において、≪キャッピング≫とのダブルカップリングにおいて行った：アミン官能基の脱保護、アミノ酸の活性化およびカップリング（２回）、続いて無水酢酸溶液での≪キャッピング≫。
【００７９】
・ヒドラジノペプチドＳＩＶ１−７およびＴＴの切断および脱保護。
【００８０】
ヒドラジノペプチドを、カルボカチオントラップ（ｃａｒｂｏ−ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｐｓ）の存在下でのＴＦＡの作用によって、固体支持体から切断しそして同時に脱保護する。使用される混合物は以下の通りである：
ペプチドＳＩＶ１およびＳＩＶ２の場合：ＴＦＡ　９５％、ＴＩＳ　２．５％、Ｈ２Ｏ　２．５％、
ペプチドＳＩＶ４の場合：ＴＦＡ　９５％、ＥＤＴ　２．５％、Ｈ２Ｏ　２．５％、
ペプチドＳＩＶ３、ＳＩＶ５、ＳＩＶ６、ＳＩＶ７およびＴＴの場合：ＴＦＡ／ＥＤＴ／チオアニソール／Ｈ２Ｏ／フェノール（１０ｍｌ／０．２５ｍｌ／０．５ｍｌ／０．５ｍｌ／０．７５ｇ）。
【００８１】
固体支持体からのヒドラジノペプチドの切断反応の期間は、撹拌を伴って、１＋（１／２）時間〜２＋（１／２）時間の間で変化する。次いで、ペプチドを冷エチルエーテル中で沈殿させ、そして遠心分離する。
【００８２】
・ヒドラジノペプチドＳＩＶ１−７およびＴＴの精製。
【００８３】
ヒドラジノペプチドを、Ｋｉｐｐ＆ＺｏｎｅｎプロッティングテーブルおよびＧｉｌｓｏｎフラクションコレクターを備えるＳｈｉｍａｄｚｕ ６Ａ ＨＰＬＣ鎖Ｃ３固定相（Ｚｏｒｂａｘ）を備える分取カラム（直径１５ｍｍおよび５００ｍｍ長）上のＲＰ−ＨＰＬＣによって精製する。溶出溶媒（溶媒ＡおよびＢ）は、以下の通りである：
−溶媒Ａ：ＴＦＡ０．０５％を含む脱イオン水、
−溶媒Ｂ：ＴＦＡ０．０５％を含む脱イオン水中イソプロパノール４０％（ペプチドＳＩＶ４およびＳＩＶ５の場合）、またはＴＦＡ０．０５％を含む脱イオン水中ｎ−プロパノール４０％（他のペプチドの場合）。
【００８４】
粗製ヒドラジノペプチドを、ペプチドに依存して、４０〜８０ｍｇの範囲の注入量について１０〜２０ｍｇ／ｍｌ 水／酢酸混合液の溶液に置く。精製勾配は、注入ヒドラジノペプチドに従って変化する：
ＳＩＶ１：２５分で緩衝溶液Ｂの１５〜４０％（４ｍｌ／分、５０℃）、
ＳＩＶ２：３０分で緩衝溶液Ｂの１５〜３０％（３ｍｌ／分、５０℃）、
ＳＩＶ３：２０分で緩衝溶液Ｂの２０〜４０％（３ｍｌ／分、５０℃）、
ＳＩＶ４：３０分で緩衝溶液Ｂの２０〜５０％（３ｍｌ／分、５０℃）、
ＳＩＶ５：１５分で緩衝溶液Ｂの１５〜３０％（３ｍｌ／分、５０℃）、
ＳＩＶ６：２５分で緩衝溶液Ｂの３０〜６０％（３ｍｌ／分、５０℃）、
ＳＩＶ７：３０分で緩衝溶液Ｂの３０〜４０％（３ｍｌ／分、５０℃）、
ＴＴ：２５分で緩衝溶液Ｂの０〜２５％（３ｍｌ／分、５０℃）。
【００８５】
ＵＶ検出を、その検出については２８０ｎｍで行なうＳＩＶ７の場合を除いて、２２５ｎｍで行なう。回収されたフラクションを、３０分で緩衝溶液Ｂの０から１００％への線形勾配用いて、Ｃ３カラム（Ｚｏｒｂａｘ、直径４．６ｍｍ、１６０ｍｍ長）上での、ＲＰＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　１０Ａ　ｃｈａｉｎ／ｓｙｓｔｅｍ）を使用して分析する（２１５ｎｍで検出、流速：１ｍｌ／分、５０℃）。ヒドラジノペプチドを含むフラクションを、一緒に集め、そして凍結乾燥させた。
【００８６】
表Ｉは、ヒドラジノペプチドＳＩＶ１〜ＳＩＶ７およびＴＴについて、合成後に得られる粗製ペプチドの重量、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用しての精製後に得られる精製ペプチドの重量、およびこれらの精製ペプチドの純度パーセンテージを一緒に集める。
【００８７】
【表１】
2004510709.tif 000006
【００８８】
・ヒドラジノペプチドＳＩＶ１−７およびＴＴの分析
それらのアイデンティティーを確認するために、精製ヒドラジノペプチドを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ　Ｑｕａｔｒｏ分光計を使用するＥＳ−ＭＳによって分析する。計算された（≪ｃａｌｃ．≫）および観察された（≪ｏｂｓ．≫）分子量は、以下の通りである：：ＳＩＶ１ ｃａｌｃ． ３２５８．９， ｏｂｓ． ３２５７．５； ＳＩＶ２ ｃａｌｃ． ２９６９．３５， ｏｂｓ． ２９６８； ＳＩＶ３ ｃａｌｃ． ３１１３．５， ｏｂｓ． ３１１１．５； ＳＩＶ４ ｃａｌｃ． ３１８８．５， ｏｂｓ． ３１８７； ＳＩＶ５ ｃａｌｃ． ３４５３．７， ｏｂｓ． ３４５２．５； ＳＩＶ６ ｃａｌｃ． ３５０２．９， ｏｂｓ． ３５０１．５； ＳＩＶ７ ｃａｌｃ．４８０６．５， ｏｂｓ． ４８０４．５； ＴＴ ｃａｌｃ． ２２２２．５７， ｏｂｓ． ２２２０．５。
【００８９】
ヒドラジノペプチドをまた、キャピラリー電気泳動を使用して分析する（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　２７０Ａ−ＨＴ）。操作条件は、以下の通りである：
−ＳＩＶ４、ＳＩＶ５およびＳＩＶ６：ホウ酸塩（ｂｏｒａｔｅ）緩衝液、５０ｍＭ、３０ｋＶ、１０分、２００ｎｍ、４５°Ｃ、１．５秒間の注入、
−他のヒドラジノペプチドの場合、クエン酸緩衝液、２０ｍＭ、ｐＨ２，１、３０ｋＶ、１０分、２００ｎｍ、４５℃、１．５秒間の注入。
【００９０】
ヒドラジノペプチドが、更に、２４時間および１１０℃での、塩酸６Ｎでの全酸加水分解後のアミノ酸組成の分析に供される。それらのアイデンティティーの第３確認を提供することは別として、この分析は、凍結乾燥生成物中のペプチドのパーセンテージを評価することを可能にする。この分析の結果は、以下の通りである：ＳＩＶ１： ９１．９％； ＳＩＶ２： ７８．２％； ＳＩＶ３： ９７．９％； ＳＩＶ４： １００％； ＳＩＶ５： ９２．７％； ＳＩＶ６： ７４．９％； ＳＩＶ７： ９５．１％； ＴＴ： １００％。
【００９１】
３）ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ、Ｍｕ−ＩＦＮγ ａ、Ｍｕ−ＩＦＮγ ｂ、Ｍｕ−ＩＦＮγ ｃおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｄの合成
一方でペプチドＭｕ−ＩＦＮγおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｃ、および他方でＭｕ−ＩＦＮγ ａに存在する配列は、特に番号ＷＯ９９／４０１１３で公開された国際ＰＣＴ出願において、およびＫ．ＴＨＩＡＭらによってＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９８， ２５３， ６３９−６４７ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９９， ４２， ３７３２−３７３６において記載されるように、それぞれ、マウスインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のＣ末端の３８および２０連続アミノ酸に対応する。Ｍｕ−ＩＦＮγ ｂおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｄ中に存在する配列について、これは、それぞれ、ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｄに存在するものの≪スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）≫配列、即ち、アミノ酸の順序がオリジナルペプチドとの連続的関係（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を回避するように配置されている配列である。このようなペプチドは、以下に記載される生物学的テストにおいてコントロール（ペプチド）として役立つだろう。
【００９２】
・ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγの合成
ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγを、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチルストラテジー（ヒドラジノペプチドＳＩＶ１〜ＳＩＶ７およびＴＴの合成に関連して上述したように）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０　Ａ　ペプチドシンセサイザーを使用する慣用的活性化に従って、０．２５ミリモルのＲｉｎｋアミド樹脂ＭＢＨＡ ＰＳの０．７４ｍｍｏｌ／ｇフィルター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）を使用して調製する。合成終了時、ペプチジル−樹脂の一部（３１．２５μｍｏｌ）をＮ−末端でＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ基によって修飾する。ピペリジン２０％のＤＭＦ溶液によるＦｍｏｃ基の脱離後、Ｎ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ−酢酸（３６．４８ｍｇ、１アミノ基当たり１．２ｅｑ．）を、上記１）に記載されるように、インサイチュでのＢＯＰ活性化を使用して、手動で導入した。
【００９３】
ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγの切断および脱保護を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／フェノール／ＥＤＴ／チオアニソール混合液（１ｇの乾燥樹脂／１０．０ｍｌのＴＦＡ／０．５ｍｌの水／０．７５ｇのフェノール／０．２５ｍｌのＥＤＴ／０．５ｍｌのチオアニソール）の存在下で行う。エーテル／ヘプタン混合液（容積で１／１）中での沈殿および遠心分離後、ペプチドを、水／酢酸混合液（容積で８０／２０）中で回収し、凍結させそして凍結乾燥させた。
【００９４】
ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγを、ヒドラジノペプチドＳＶ１〜ＳＶ７およびＴＴの精製の場合に記載したように、Ｃ３固定相（Ｚｏｒｂａｘ）を備える分取カラム（直径１５ｍｍおよび３００ｍｍ長）におけるＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製した。溶出流速は、溶媒Ａ（０．０５％のＴＦＡを含む脱イオン水）中の溶媒Ｂ（０．０５％のＴＦＡを含む脱イオン水中イソプロパノール４０％）の２５から９０％への勾配を使用する３ｍｌ／分である。凍結乾燥後、ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγ（１６．１ｍｇ、収率８．５％）を、−２０℃で保存する。そのＥＳ−ＭＳ分析は、以下の通りである：［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値４８４６．６；実測値４８４５．５。
【００９５】
・ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｂの合成
手順は、ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγの合成についてのものと同一である。切断および脱保護段階の後、ペプチドをエチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、水／酢酸混合液（容積で９０／１０）中で回収し、凍結させそして凍結乾燥させる。粗製形態の４３０ｍｇおよび５９４．４ｍｇのペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｂを、それぞれ得る。ペプチドを、５０分間、溶媒Ｂの０から５０％への勾配を使用して、ペプチドＭｕ−ＩＦＮγの場合において上述のように精製した。それぞれ、６１．４ｍｇおよび１０４．２ｍｇの精製ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｂが、このようにして得られる。Ｍｕ−ＩＦＮγ ａ：ＴＯＦ−ＰＤＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値２６５９．２２；実測値２６６０．９。Ｍｕ−ＩＦＮγ ｂ：ＥＳ−ＭＳ　［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値２６５８．２２；実測値２６５７．０。
【００９６】
・ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｃおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｄの合成
ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｃおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｄを、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチルストラテジー（ヒドラジノペプチドＳＩＶ１〜ＳＩＶ７およびＴＴの合成の場合において上述した通り）およびＰｉｏｎｅｅｒペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するアクティブクラシフィケーション（ａｃｔｉｖｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に従って、０．１ミリモルのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して調製した。合成を、単一カップリング、およびペプチジル−樹脂の理論的負荷量（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｌｏａｄ）に対して１０のアミノ酸過剰を使用して行う。合成終了時に、ペプチジル−樹脂を、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ残基によってＮ−末端で修飾する。ＤＭＦ中ピペリジン２０％の溶液によってＦｍｏｃ基の脱離後、Ｎ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ−酢酸（３９０ｍｇ、１０当量）をまた、自動的に導入する。切断および脱保護工程を、Ｍｕ−ＩＦＮγの調製に関して上述したように行う。ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｃおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｄの精製を、それぞれ、７５分で緩衝溶液Ｂ中２５〜１００％および８０分で緩衝溶液Ｂの２０から１００％への勾配を使用して、ペプチドＭｕ−ＩＦＮγの場合に上述されるように行う。
このようにして、１５８ｍｇ（２６％）のペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｃを、凍結乾燥後に得る。ＥＳ−ＭＳ　計算値４７７２．６；実測値４７７１．５：　ｍ／ｚ　１１９３．５　［Ｍ＋４Ｈ］４＋，　９５５．１　［Ｍ＋５Ｈ］５＋，　７９６．０　［Ｍ＋６Ｈ］６＋，　６８２．２　［Ｍ＋７Ｈ］７＋。
このようにして、１２０ｍｇ（２０％）のＭｕ−ＩＦＮγ ｄを、凍結乾燥後に得る。ＥＳ−ＭＳ　計算値４７７２．６；実測値４７７１．０；　ｍ／ｚ　１１９３．７，　［Ｍ＋４Ｈ］４＋，　９５５．３　［Ｍ＋５Ｈ］５＋，　７９６．２　［Ｍ＋６Ｈ］６＋，　６８２．５　［Ｍ＋７Ｈ］７＋。
【００９７】
４）ペプチドＯＶＡの合成
ヒドラジノペプチドＯＶＡを、Ｐｉｏｎｅｅｒペプチドシンセサイザーを使用して、ヒドラジノペプチドＳＩＶ１〜ＳＩＶ７およびＴＴの合成の場合において上述されるように、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチル化学およびＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化を使用して、０．１６ｍｍｏｌ／ｇフィルターのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂０．１０ミリモル（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して固相合成する。合成終了時に、リシンのα−ＮＨ２官能基を、ＤＭＦ中ピペリジン２０％の存在下で２０分間処理し、次いで無水酢酸１０％のＣＨ２Ｃｌ２溶液を使用して１０分間アセチル化する。リシンのε−ＮＨ２官能基の保護基Ｍｔｔを、ＴＦＡ１％のＣＨ２Ｃｌ２溶液を使用して除去する。各回、この溶液２０ｍｌでの処理を含む１３サイクルが必要である。最後に、樹脂を２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄する。
【００９８】
次いで、Ｎ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ酢酸（４７ｍｇ、０．１２ミリモル）を、ヒドラジノペプチドＳＩＶ１〜ＳＩＶ７およびＴＴの合成に関連して上述されるように、６０分間のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化（１．１２ミリモル／０．１２ミリモル／０．２４ミリモル）を使用して、リシンのε−ＮＨ２官能基へカップリングする。ぺプチジル−樹脂を洗浄しそして乾燥した後、それを室温で２時間、９５％ＴＦＡ／２．５％Ｈ２Ｏ／２．５％ＴＩＳの存在下で処理する（ヒドラジノペプチドＳＩＶ１およびＳＩＶ２の切断および脱保護に関して上述される通り）。ヒドラジノペプチドを最終的に沈殿させ、水／酢酸混合液中に溶解させ、凍結させそして凍結乾燥させる。
【００９９】
粗製形態のこのように得られるヒドラジノペプチドＯＶＡを、Ｚｏｒｂａｘ　Ｃ３カラム上で精製する。溶出流速は、脱イオン水／０．０５％ＴＦＡ混合液中、０．０５％ＴＦＡを含む脱イオン水／イソプロパノール混合液（２／３）の０から２０％への線形勾配（２０分）を使用する４ｍｌ／分である。凍結乾燥後、７４ｍｇ（収率３０％）のヒドラジノペプチドＯＶＡを得る。ＥＳ−ＭＳを使用するペプチドＯＶＡの分析は、以下の通りである：［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値２０１６．１；実測値２０１５．０。
【０１００】
５）ペプチドＧ１８Ｒの合成
合成を、ペプチドＳＩＶ１〜７およびＴＴの合成に関して上述したプロトコルに従って、０．２ミリモルのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂とともに、Ｐｉｏｎｅｅｒオートマチックシンセサイザー（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行う。切断および脱保護の工程を、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ混合液（容積で９４％／１％／２，５％／２．５％）を使用して行う。エチルエーテル中での沈殿後、３６０ｍｇの粗製ペプチドを得る。このペプチドを、脱イオン水／０．０５％ＴＦＡ混合液中、０．０５％ＴＦＡを含む脱イオン水／イソプロパノール混合液（４０容積％）の０から３０％への線形勾配（３０分）を使用する４ｍｌ／分で、Ｚｏｒｂａｘ　Ｃ３カラム上で精製する。凍結乾燥後、１１７ｍｇのヒドラジノペプチドＧ１８Ｒが得られる。ＴＯＦ−ＰＤＭＳを使用してのその分析は、以下の通りである：［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値１８８３．２；実測値１８８１．１。
【０１０１】
実施例２：一般式（ＩＩ）［（Ｑｕｉ）４ＡＫＨｄｚ］に従う、ヒドラジノ基を有するテトラキノイル化リシンツリー（ｔｅｔｒａｑｕｉｎｏｙｌａｔｅｄ ｌｙｓｉｎｅ ｔｒｅｅ）の合成　（Ｑｕｉ）４ＡＫＨｄｚツリーを、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチルストラテジー（ヒドラジノペプチドＭｕ−ＩＦＮγの合成の場合において上述される通り）に従って、０．７５ミリモル／ｇフィルターのアミドＲｉｎｋ樹脂Ｎｌｅｕ　ＡＭ−ＰＳから０．１２５ミリモルのスケールで調製する。合成を、溶媒としてＤＭＦを使用して、固体支持体上に存在する反応性アミノ基に対して４過剰のアミノ酸およびＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化、４／４／８当量（Ｍ． ＳＣＨＮＯＬＺＥＲ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， １９９２， ４０， １８０）を使用して手動で行う。Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨを先ず、樹脂へ、続いて、化合物Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨの形態の最初のリシン残基をカップリングする。４−メチルトリチル基（Ｍｔｔ）を、Ｌ． ＢＯＵＲＥＬ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．， ２０００， ６， ２６４に記載のようにジクロロメタン中１％トリフルオロ酢酸溶液で処理することによって除去する。次いで、Ｎ，Ｎ’−トリ（Ｂｏｃ）ヒドラジノ酢酸を、ＤＭＦ中ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ混合液（１．２／１．２／２．４）を使用しての前活性化後に、側鎖のアミノ官能基へカップリングする（１反応性アミノ官能基当たり１．２当量の過剰量を使用する）。ツリーの調製を、それらのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ誘導体の形態の１、次いで２のリシンをカップリングすることによって続ける。２つのカップリング段階に続いて、各々、“キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）”工程（即ち、反応されていないあらゆるアミノ官能基のブロッキング）を、５分間Ａｃ２Ｏ／ＤＩＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２混合液（１０／５／８５）でペプチジル−樹脂を処理することにより行う。２０分間ＤＭＦ中２０％ピペラジン溶液での処理によるＦｍｏｃ基の除去後、ペプチジル−樹脂を、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ／ＤＩＥＡ混合液（それぞれ、反応性アミノ官能基に対して２および４当量）によってインサイチュで活性化された、（１ｓｎ，３Ｒ，４Ｓｎ，５Ｒ）−１，３，３，５−テトラ−アセトキシシクロヘキサン−１−カルボン酸（反応性アミノ官能基に対して２および４当量）と反応させる。カップリングを、最初の反応性アミノ官能基に対して１／１／２当量の割合で、同一試薬を使用して繰り返す。次いで、樹脂を、ジクロロメタン（３×２分）次いでエチルエーテル（２×１分）で洗浄し、そして乾燥させる。
【０１０２】
ペプチジル−樹脂を、次いで、室温で１時間、３０分間、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ混合液（９５／２．５／２．５）（６ｍｌ）で処理する。切断の粗製生成物を、エチルエーテル／ヘプタン（１：１）の冷却混合液（６０ｍｌ）中での濾過後に沈殿させる。遠心分離後、粗製生成物を、ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ混合液に溶解させ、十分に凍結させ、次いで凍結乾燥させる。
【０１０３】
残渣を、２５％酢酸水溶液中で回収し、次いで、３ｍｌ．ｍｉｎ−１の流速、５０℃および２１５ｎｍでの検出で、Ｃ−１８　Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ｈｙｐｅｒｐｒｅｐカラム（３００Å、８μｍ、１０×２６０ｍｍ）を使用して、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＬＣ−４Ａシステムを備える半分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製する：システムＡ溶媒：脱イオン水中０．０５％ＴＦＡ；システムＢ溶媒：脱イオン水中イソプロパノール４０％中０．０５％ＴＦＡ（勾配：３０分間緩衝溶液Ｂの０から３０％へ、次いで２０分間緩衝溶液Ｂの３０から４０％へそして５０分間４０から５０％へ）。テトラ−キノイル化ツリー（ｔｅｔｒａ−ｑｕｉｎｏｙｌａｔｅｄ ｔｒｅｅ）を回収し、十分に凍結させ、次いで凍結乾燥させる。残渣の一部（５４ｍｇ）を、室温で１時間、水中ヒドラジン１０％の混合液（４ｍｌ）中に回収し、キノイル残渣のアルコール官能基の脱保護を可能にする。次いで、反応媒体を、既に記載の条件下で直接精製し（勾配：４０分間緩衝溶液Ｂの０から２０％へ）、凍結乾燥後に粉末の形態の１５ｍｇ（４０％）のテトラ−キノイル化ツリーを得る。ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値１３６９．７；実測値１３６９．８；［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値１３９１．８；実測値１３９１．７。
【０１０４】
【化５】
2004510709.tif 000007
【０１０５】
実施例３：式−ＣＯ−ＣＨＲ’−ＮＨ−ＮＨ２（ここで、Ｒ’＝Ｈ）を有するヒドラジンから誘導された基によって官能化されたペプチドの合成
ペプチドＨ２Ｎ−ＫＶＧＦＦＫＲ−ＮＨ２（Ｒ’＝４−アミノブチル）およびＨ２Ｎ−ＶＹＫＡＬ−ＮＨ２（Ｒ’＝イソプロピル）を、０．２５ミリモルのスケールで、実施例１，§２に記載のように、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチル化学を使用してＲｉｎｋアミド樹脂ＡＭ−ＰＳ１％ＤＶＤ（０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００メッシュ、Ｓｅｎｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＧ）上で固相合成する。合成を、単一カップリングで、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａオートマチックシンセサイザーを使用して行う。
【０１０６】
ペプチド配列を完全にした後、リシンおよびバリンのＮα−アミノ官能基を、ＮＭＰ中ピペラジン２０％の溶液を使用して脱保護する。次いで、ペプチジル樹脂を、文献（Ｄ． ＢＯＮＮＥＴ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．， １９９９， ５４， ２７０ ａｎｄ Ｏ． ＭＥＬＮＹＫ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．， １９９８， ５２， １８０）に記載されるように、Ｎ−Ｂｏｃ−３（４−シアノフェニル）オキサジリジン−ＢＣＰＯ）を使用する、固相求電子性Ｎ−アミノ化反応において、ヒドラジン誘導体へ変換する。
【０１０７】
手短に言えば、ペプチジル−樹脂を、３時間、ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍｌ）の溶液中６０ｍｇ（０．２４４ミリモル）のＢＣＰＯと反応させる。ＣＨ２Ｃｌ２、次いでＤＭＦで洗浄後、樹脂を、ＤＭＦ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（８．５／１／０．５）（５ｍｌ）（３×１０分）中の溶液でそのクロロヒドレート（ｃｈｌｏｒｈｙｄｒａｔｅ）形態のＮ−ベンジルヒドラジン５０ｍｇ（０．２５ミリモル）で処理する。ＤＭＦ次いでＣＨ２Ｃｌ２での洗浄後、ペプチジル−樹脂を、ＣＨ２Ｃｌ２中のＤＩＥＡ５％の溶液（２×２分）で中和し、そして最後にＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。この一連の操作を１０回繰り返す。
【０１０８】
ヒドラジノペプチドを、１時間３０分、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／チオアニソール／ＴＩＳ混合液（９４／２．５／２．５／１）１０ｍｌでの処理を使用して、脱保護および樹脂から切断する。樹脂を、焼結ガラス上で濾過し、そしてペプチドを冷エチルエーテル／ペンタン混合液（１／１）１００ｍｌ中で沈殿させる。残渣を遠心分離し、凍結乾燥して、それぞれ１４９および１３３ｍｇの粗製生成物を得、次いで、３ｍｌ．ｍｉｎ−１の流速、５０℃および２１５ｎｍでの検出で、Ｃ−１８Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ｈｙｐｅｒｐｒｅｐカラム（３００Å、８μｍ、１０×２６０ｍｍ）を使用するＳｈｉｍａｄｚｕ　ＬＣ−４Ａシステムを備える半分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製する：システムＡ溶媒：脱イオン水中０．０５％ＴＦＡ；システムＢ溶媒：脱イオン水中イソプロパノール４０％中０．０５％ＴＦＡ。
【０１０９】
１２３ｍｇ（３６％）の化合物Ｈ２Ｎ−ＫＶＧＦＦＫＲ−ＮＨ２が、精製（勾配：７０分間で緩衝溶液Ｂの０から７０％まで）続いて凍結乾燥後に得られる。ＴＯＦ−ＰＤＭＳ：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値８９５．９；実測値８９５．５。
【０１１０】
２７．８ｍｇ（１３．３％）の化合物Ｈ２Ｎ−ＶＹＫＡＬ−ＮＨ２が、精製（勾配：２００分間で緩衝溶液Ｂの０から４０％まで）続いて凍結乾燥後に得られる。ＴＯＦ−ＰＤＭＳ：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値６０７．８；実測値６０７．５。
【０１１１】
実施例４：本発明に従う親油性ベクター（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＶａ）の合成
以下に示される親油性ベクター（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）は、それぞれ、Ｌが式ＣＨ３−（ＣＨ２）１４−または式ＣＨ３−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）７−を有する炭素鎖を示す、本発明の一般式（ＩＩＩ）に対応する。
【０１１２】
【化６】
2004510709.tif 000008
【０１１３】
以下に示される親油性ベクター（ＩＶａ）は、ＬがＣＨ３−（ＣＨ２）１４−を有する炭素鎖を示す、本発明に従う一般式（ＩＶ）に対応する。
【０１１４】
【化７】
2004510709.tif 000009
【０１１５】
Ｉ）親油性ベクター（ＩＩＩａ）の合成（図１）
・化合物２の合成
５００ｍｌフラスコ中、１０ｇ（６６．６ミリモル）の酒石酸１を、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ １５樹脂の１重量％の存在下、無水エタノール２００ｍｌに溶解させる。フラスコに、４Ａ活性化モレキュラーシーブを含有するｓｏｘｈｌｅｔシステムを備え付ける。エタノールを４８時間還流する。次いで、反応媒体を、ｎｏ４焼結ガラスを用いて濾過し、樹脂を除去する。濾液を減圧下で濃縮し、そして淡黄色オイルが得られる。残渣２をＰ２Ｏ５上で一晩乾燥させ、そして精製の形態を用いずに使用する（ｍ＝１３．４６ｇ、収率＝９８．０％）。
【０１１６】
薄層クロマトグラフィーを使用する、以下に示される、化合物２の分析によって、移動指数（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）Ｒｆ＝０．７６（溶離液ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨ（９０／１０／０．１／０．０５）中）が得られる。
【０１１７】
【化８】
2004510709.tif 000010
【０１１８】
・化合物３の合成
１３．４６ｍｇ（６５．２６ミリモル）の化合物２を、無水エタノール１５５ｍｌに溶解させ、そして１，３−ジアミノプロパン５６ｍｌ（６６５．２６ミリモル）に滴下する。次いで、反応媒体を、周囲温度で３時間撹拌する。次いで、過剰の１，３−ジアミノプロパンを、減圧下での蒸発およびエタノール（３×２００ｍｌ）の存在下での共沸飛沫同伴（ａｚｅｏｔｒｏｐｉｃ ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ）によって、除去する。得られた黄色オイルをＰ２Ｏ５上で一晩乾燥させ、次いで、エタノール／トルエン混合液（１／１）中で回収し、そして減圧下で濃縮する（３×２００ｍｌ）。ペースト形態の黄色化合物をこのようにして得る。この化合物を、エチルエーテル／エタノール混合液（５／１）５０ｍｌ中に沈殿させ、次いで濾過し、そして白っぽい沈殿物を、エチルエーテルの存在下０℃で１時間３０分間撹拌する。次いで、それを焼結ガラスで濾過し、そして最小限のエチルエーテルで２回（冷）洗浄する。残渣固体３を、Ｐ２Ｏ５上で一晩乾燥させる（ｍ＝１３．９２ｇ、収率＝８１．３％）。
【０１１９】
下記に示される化合物３の分析は、以下の通りである：
【０１２０】
【化９】
2004510709.tif 000011
【０１２１】
・化合物（ＩＩＩａ）の合成
９９６．９ｍｇ（３．８ミリモル）の化合物３を、１５ｍｌの水に溶解させる。８．５に等しい溶液のｐＨを、クエン酸１．４６ｇを使用して３．２５へ低下させる。次いで、１．０６ｇ（４．９ミリモル）の固体ＮａＩＯ４を、水浴を使用して室温に維持された反応媒体へ、５分間４段階で添加する。１０分間の攪拌後、５７０ｍｇの酒石酸（３．８ミリモル）を添加して、反応していない過剰のＮａＩＯ４を中和する。周囲温度で１０分間撹拌後、ｐＨを、２４ｍｌのＮ−メチル−モルホリンで８．６へ調整する。反応媒体を、７０ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールおよび２０ｍｌの水で希釈する。次いで、２．１６ｇ（１．６ｅｑ．）のスクシンイミジルパルミトエート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐａｌｍｉｔｏａｔｅ）を溶液へ添加し、これを室温で一晩撹拌する。次いで、ｐＨを、７．１１ｇのクエン酸で３．５に調整する。媒体をＮａＣｌで飽和された溶液４０ｍｌで希釈し、そして１４０ｍｌのジクロロメタン次いで１００ｍｌのクロロホルムで抽出する。有機相を、ＫＨ２ＰＯ４で飽和された溶液１００ｍｌで２回、ＮａＣｌで飽和された溶液１００ｍｌで２回洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮する。残渣固体化合物を、溶離液としてＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ混合液（７０／２２／５）を使用してシリカにおいて精製する。９５１．４ｍｇの親油性ベクター（ＩＩＩａ）、即ち収率４２．３％が得られる。
【０１２２】
水和物形態で下記に示される、化合物（ＩＩＩａ）の分析は、以下の通りである：
【０１２３】
【化１０】
2004510709.tif 000012
【０１２４】
２）親油性ベクター（ＩＩＩｂ）の合成（図１）
Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルの形態の活性化オレイン酸を、先ず、８５９ｍｇ（３．０ミリモル）のオレイン酸、３５３ｍｇ（３．０ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび３７０μｌ（２．３ミリモル）のジイソプロピルカルボジイミドから調製し、これを、３０ｍｌのＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２混合液（１／１）３０ｍｌに溶解する。４℃で一晩放置した後、媒体を減圧下で濃縮し、そしてあらゆる他の形態の精製なしに合成の以下の部分のために使用する。
【０１２５】
次いで、上述のように、手順は親油性ベクター（ＩＩＩａ）を得るための通りである。前述のように調製した５００ｍｇ（１．９ミリモル）の化合物３を、１０ｍｌの水に溶解する。８．５に等しい溶液のｐＨを、クエン酸６６７ｍｇｓで３．５へ調整する。５３０ｍｇ（２．４ミリモル）の固体ＮａＩＯ４を、水浴を使用して媒体を室温に維持しながら、５分間、４段階で添加する。１０分間の撹拌後、２８６ｍｇの酒石酸（１．９ミリモル）を加えて、過剰のＮａＩＯ４を中和する。１０分間の撹拌後、ｐＨを、１２ｍｌのＮ−メチルモルホリンで８．６に調整する。媒体を、３５ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールおよび２０ｍｌの水で希釈する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル形態の活性化オレイン酸を、５０ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールに溶解し、該溶液へ添加する。一晩撹拌後、媒体のｐＨを、１５ｇのクエン酸で３．５へ調整し、そしてＮａＣｌで飽和された溶液２０ｍｌで希釈する。混合液を、７０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機相を、ＫＨ２ＰＯ４で飽和された溶液５０ｍｌで２回、次いでＮａＣｌで飽和された溶液５０ｍｌで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮する。残渣固体を、溶離液としてＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ混合液（７０／２２／５）を使用してシリカ上で精製する。３３６．３ｍｇの親油性ベクター（ＩＩＩｂ）、即ち収率２７％が、このようにして得られる。
【０１２６】
３）親油性ベクター（ＩＩＩｃ）の合成（図１）
合成を、上記の親油性ベクター（ＩＩＩａ）の調製に関して記載したようにＮ−コレステリルカルボニルオキシスクシンイミドを使用して行う。上述のように調製した５０．３ｍｇ（０．１９０５ミリモル）の化合物３を、２ｍｌの水に溶解させる。１１．０５に等しい溶液のｐＨを、１２６ｍｇのクエン酸で３．０８に調整する。５３．６ｍｇ（０．２４８ミリモル）の固体ＮａＩＯ４を、媒体を冷水浴を使用して室温に維持しながら、５分間に渡って４操作で添加する。１０分間の撹拌後、２４ｍｇの酒石酸（０．１９ミリモル）を添加して、過剰のＮａＩＯ４を中和する。１０分間の撹拌後、次いでｐＨを、２．４ｍｌのＮ−メチルモルホリンで８．５１へ調整する。媒体を、１０ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールで希釈する。１６１．１ｍｇ（０．３０５ミリモル）のＮ−コレステリルカルボニルオキシ−スクシンイミドを、溶液へ、固体形態で添加する。室温で１時間次いで６０℃で２時間撹拌した後、１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を添加して、Ｎ−コレステリルカルボニルオキシ−スクシンイミドを完全に溶解させる。室温で１時間撹拌した後、水相のｐＨを、１．８ｇのクエン酸で３．８へ調整する。混合液を、１５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機相を、ＫＨ２ＰＯ４飽和溶液３０ｍｌで２回次いでＮａＣｌ飽和溶液３０ｍｌで洗浄する（該相の分離を可能にするために、１５ｍｌのエチルエーテルの添加を伴う）。次いで、有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、そして減圧下で濃縮する。残渣固体を、溶離液としてＣＨＣＬ３／ＡｃＯＨ混合液（９５／５）を使用してシリカゲル上で精製し、５３．４ｍｇの親油性ベクター（ＩＩＩｃ）、即ち収率３２．２％を得る。
【０１２７】
４）親油性ベクター（ＩＶａ）の合成（図２）
１ｇ（３．８ミリモル）の化合物３（この合成は、上記に説明された）を、１０ｍｌの水に溶解させる。ｐＨを、クエン酸（１．８ｇ）で３．２５へ調整する。次いで、１．０６ｇ（４．９５ミリモル）ＮａＩＯ４を、水浴を使用して室温に維持された反応媒体へ、４段階で添加する。添加が完了すると、混合物を１０分間撹拌する。反応の進行を、ＴＨＦ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＡｃＯ−ＮＨ４＋溶離液　（３５／２０／１０／１重量％）を使用した薄膜クロマトグラフィーによってモニターする。
【０１２８】
過剰のＮａＩＯ４を、３ｅｑ．の酒石酸を添加することによって消費する。周囲温度で５分間撹拌した後、反応媒体のｐＨを、７ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを添加することによって８．５５へ調整する。７０ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール、および１，２１ｇ（３．４ミリモル）の固体スクシンイミジルパルミトエート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅ ｐａｌｍｉｔｏａｔｅ）を添加する。混合物を、一晩激しく撹拌し、ＫＨ２ＰＯ４飽和水５０ｍｌで希釈し、次いでＣＨ２Ｃｌ２／ｔｅｒｔ−ブタノール混合液（１００ｍｌ／５０ｍｌ）で２回抽出する。有機相を、ＮａＣｌ−飽和溶液で２回洗浄し、次いでＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮する。残渣のペースト状黄色固体を、エタノールに溶解させ、そして溶液を減圧下で濃縮する。操作を２回行い、残留ｔｅｒｔ−ブタノールを除去する。還元形態の親油性ベクター（ＩＶａ）に相当する、白色固体の形態の化合物４が、親油性ベクター（ＩＩＩａ）との混合物中に、得られる。
【０１２９】
ＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ混合液（７０／２０／１０）を用いてのシリカ上でのクロマトグラフィーを使用して３０１．４ｍｇのこの固体を精製することによって、１５７．７ｍｇ（収率＝５２．２％）の化合物４および３７．６ｍｇ（収率＝１３．２％）の親油性ベクター（ＩＩＩａ）が得られる。
【０１３０】
下記に示される化合物４の分析は、以下の通りである：
【０１３１】
【化１１】
2004510709.tif 000013
【０１３２】
次いで、化合物４を酸化して、親油性ベクター（ＩＶａ）を得る：４０ｍｇ（４８．６μモル）の化合物４を、７５０μｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、そして１．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解された６１．８ｍｇ（１４５．８μモル）のＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎパーヨージナン（ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ）（即ち、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９８３， ４８， ４１５６ ａｎｄ ｉｎ Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９１， １１３， ７２７７に記載の化合物１，１，１−トリアセトキシ−１，１−ジヒドロ−１，２−ベンズイオデクソール−３（１Ｈ）−オン（１，１，１−ｔｒｉａｃｅｔｏｘｙ−１，１−ｄｉｈｙｄｒｏ−１，２−ｂｅｎｚｉｏｄｅｘｏｌ−１−３（１Ｈ）−ｏｎｅ））へ添加する。混合物を室温で１８時間撹拌する。次いで、反応混合物を、１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２、１０ｍｌのエチルエーテルおよび１０ｍのＮａＨＣＯ３飽和溶液で希釈する。次いで、４６．１ｍｇのＮａ２Ｓ２Ｏ４を溶液へ添加する。５分間の撹拌後、５ｍｌのエチルエーテルおよび５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を添加し、そして２相を分離する。有機相を、ＮａＨＣＯ３で飽和された溶液１５ｍｌで２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮する。残渣の黄色オイルを、ＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ／Ｅｔ３Ｎ混合液（７０／２０／１５／０，５％）を使用してのシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製する。２３ｍｇ（５７．７％）の親油性ベクター（ＩＶａ）をこのようにして得る。
【０１３３】
下記に示される親油性ベクター（ＩＶａ）の分析は、以下の通りである：
【０１３４】
【化１２】
2004510709.tif 000014
【０１３５】
実施例５：親油性ベクター（ＩＩＩａ）の合成のための別のプロトコル（図２）
実施例２に記載のプロトコルの代替法として、本発明に従う親油性ベクター（ＩＩＩａ）は、以下のプロトコルに従って、還元形態の親油性ベクター（ＩＶａ）（即ち、化合物４）から合成され得る。
【０１３６】
精製前の実施例２で得られた化合物４と親油性ベクター（ＩＩＩａ）との混合物２４５．０ｍｇを、水中のｔｅｒｔ−ブタノール／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ１０％の混合液（１５ｍｌ／１０ｍｌ／１ｍｌ）に溶解させる。混合液を周囲温度で一晩撹拌し、次いでＮａＣｌで飽和された溶液（１５ｍｌ）で希釈する。次いで、反応媒体を、ＣＨ２Ｃｌ２／ｔｅｒｔ−ブタノール混合液（２０ｍｌ／２０ｍｌ）で２回抽出する。有機相を、ＮａＣｌで飽和された溶液１５ｍｌで２回洗浄し、濾過しそして減圧下で濃縮する。このようにして得られる白色固体（ＩＩＩａ）を、式（ＩＩＩａ）の親油性ベクターを得ることに関する実施例２に記載の条件下でのシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製する。１３６．２ｍｇの化合物（ＩＩＩａ）、即ち収率５６．２％が、このようにして得られる。
【０１３７】
実施例６：親油性ベクター（ＩＶａ）の合成のための別のプロトコル（図２）
実施例２に記載のプロトコルの代替法として、以下のプロトコルに従って、親油性ベクター（ＩＩＩａ）から、還元形態の化合物４（即ち、親油性ベクター（ＩＶａ））を得ることが可能である。
【０１３８】
２４２．３ｍｇ／ｍｌの水中トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン溶液を調製し、次いで濃塩酸を用いてｐＨ８．５へ調整する。次いで、この溶液を、ＮａＣｌで飽和し、この後、それを濾過する。６００μｌの２−メチル−プロパン−２−オール中に溶解された２０．２５ｍｇ（５５．０μモル）の親油性ベクター（ＩＩＩａ）を、前もって調製した該溶液６００μｌへ添加する。反応媒体を、周囲温度で４時間撹拌し、そして２ｍｌの水で希釈し、そして生成物をＣＨ２Ｃｌ２／２−メチル−プロパン−２−オール（１／１）溶液２ｍｌで抽出する。有機相を、ＫＨ２ＰＯ４で飽和された溶液１ｍｌで２回洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮する。２ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オール中に溶解された２０．１４ｍｇ（５４．７μモル）の親油性ベクター（ＩＩＩａ）を、前もって得られた固体残渣へ添加する。３０℃で１３時間撹拌後、反応媒体を、４ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で希釈する。有機相を、ＮａＣｌで飽和された溶液２ｍｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮させる。固体残渣を、溶離液としてＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ混合液（７０／２２／１２）を使用してシリカカラムにおいて精製し、２３．１ｍｇの化合物４、即ち収率５１％を得る。次いで、後者を実施例２に記載のように酸化させて、親油性ベクター（ＩＶａ）を生成させる。
【０１３９】
実施例７：親油性ベクター（ＩＶｂ）の合成（図３）
親油性ベクター（ＩＶａ）の合成のプロトコルの代替法として、以下のプロトコルに従って、親油性ベクター（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）から、化合物６、即ち還元形態の親油性ベクター（ＩＶｂ）を得ることが可能である。
【０１４０】
水中トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンの２４２．３ｍｇ／ｍｌ（２ｍｏｌ／ｌ）溶液を調製し、次いで濃塩酸でｐＨ８．５へ調整する。次いで、この溶液を、ＮａＣｌで飽和し、そして濾過する。３ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オール中に溶解された９９．９ｍｇ（２７０ミリモル）の親油性ベクター（ＩＩＩａ）を、３ｍｌの前もって調製された溶液へ添加する。反応媒体を、６時間室温で撹拌し、５ｍｌの水で希釈し、そして生成物をＣＨ２Ｃｌ２／２−メチル−プロパン−２−オール（１／１）溶液５ｍｌで抽出する。有機相を、ＫＨ２ＰＯ４で飽和された溶液２ｍｌで２回洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過しそして減圧下で濃縮して、固体残渣形態のパルミトイル化（ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｅｄ）オキサゾリジン５を生成させる。
【０１４１】
１０ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オール中に溶解された９９．２ｍｇ（２７０ミリモル）の親油性ベクター（ＩＩＩｂ）を、次いで、前もって得られた中間体５へ添加する。３０℃で２０時間撹拌後、反応媒体を２０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で希釈する。有機相をＮａＣｌで飽和された溶液１０ｍｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過しそして減圧下で濃縮する。固体残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ混合液（７０／２２／１２）を使用してシリカゲル上で精製し、１３３ｍｇの化合物６、即ち収率５３％を得る。
【０１４２】
オキサゾリジン５のキャラクタライゼーション：
【０１４３】
【化１３】
2004510709.tif 000015
【０１４４】
ビス−オキサゾリジン６のキャラクタライゼーション：
【０１４５】
【化１４】
2004510709.tif 000016
【０１４６】
次いで、後者を、実施例２に記載のように酸化させて、親油性ベクター（ＩＶｂ）を生成させる：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ＋］計算値８４７．２；実測値８４６．６。
【０１４７】
実施例８：１以上のペプチドとアルデヒド官能基を有する非ペプチドタイプ親油性ベクターとの間での溶液中でのカップリング
１）ペプチドＳＩＶ１〜７およびＴＴの混合物と親油性ベクター（ＩＩＩａ）とのカップリング（図３）
実施例１に従って調製されたヒドラジノペプチドＳＩＶ１〜７およびＴＴの混合物を、約２ｍｇの各凍結乾燥化生成物から製造する。ペプチドによって保有されるヒドラジノアセティック官能基（各凍結乾燥生成物のカウンターイオンおよびペプチド含有量を考慮する）の総量に対して１．１当量の量の、実施例２または実施例３に従って調製された親油性ベクター（ＩＩＩａ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を調製する。カップリング反応（化学的連結）は、ｔｅｒｔ−ブタノール／水混合液（容積で９５／５）中で生じ、最終ペプチド濃度は、１．３ｍｍｏｌ／ｌのオーダーである。脱イオン水を、先ず、ヒドラジノペプチドの混合物へ添加し、それを湿潤化し、ｔｅｒｔ−ブタノール中の親油性ベクター（ＩＩＩａ）の溶液を次いで添加する。
【０１４８】
連結反応は、リポペプチド７の混合物の生成に至り、用語≪配列≫（図３）は、ペプチドＳＩＶ１〜７またはＴＴのペプチド配列を意味する。この反応を、以下のようにＲＰ−ＨＰＬＣによって追跡する。２０μｌの反応媒体を採取し；これらへ、８０μｌの酢酸／水混合液（２０／８０）を添加する。この容積５０μｌを、３０分で０から１００％へ（１ｍｌ／分、２１５ｎｍ、５０℃）、溶媒Ｂ勾配（例えば、ペプチドＳＩＶ１〜７およびＴＴの精製に関して実施例１において記載したもの）で、分析Ｃ３カラム（Ｚｏｒｂａｘ、直径４．６ｍｍ、３００ｍｍ長）上に注射する。この技術は、ヒドラジノペプチドから同一クロマトグラム上へ連結されたペプチドへの変換、同一の溶離時間を有していない親油性ベクターへ化学的に連結されたペプチド（“連結”ペプチド）およびヒドラジノペプチドをモニターすることを可能にする。ヒドラジノペプチドおよび連結ペプチドのピークの積分合計割合は、反応の変換率を評価することを可能にする。
【０１４９】
約２０時間のカップリング反応後、反応媒体のフラクションを凍結乾燥させ、そして混合物中のリポペプチドのＬＣ−ＭＳ分析を行う。この目的のために、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｒｃｋａｒｄ　ＨＰＬＣシステムを、キャピラリーチューブを介してＭｉｃｒｏｍａｓｓ　Ｑｕａｔｒｏ質量分析器へ接続する。ＨＰＬＣ条件は、カップリング反応をモニターするために使用されるものと同一であり、しかし、使用される流速は、Ｃ３カラム（Ｚｏｒｂａｘ、直径２．１ｍｍ、２００ｍｍ長）において０．２ｍｌ／分である。ヒドラジノペプチドのみの混合物（１ｍｇ／ｍｌ水溶液）を、３０分間、溶媒Ｂ中０から１００％への勾配で２０μｌの割合で注入する。ヒドラジノペプチドの流出オーダー（ｅｘｉｔ ｏｒｄｅｒ）、それらの保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）（ｒｔ、分で）およびそれらの観察される分子量は、以下の通りである：ＴＴ（１７．１；２２２）；　ＳＩＶ５（１７．５；３４５２）　ＳＩＶ２（１８．３；２９６８）；　ＳＩＶ１（１９．４；３２５８）；ＳＩＶ６（２０．９；３５０１．５）　ＳＩＶ７（２１．０；４８０４）；　ＳＩＶ４（２１．２；３１８６）；　ＳＩＶ３（２１．６；３１１２）。
【０１５０】
カップリング反応を約２０時間後に停止し、そして凍結乾燥させた反応媒体を、１ｍｇ／ｍｌの割合で水溶液に置き換える。この溶液を、１０分間で溶媒Ｂ中０から５０％までの範囲、次いで３０分間５０から１００％までの範囲、続いて数分間１００％で、より分解能のある勾配を除いて、ペプチド混合物の場合において上述されるものと同一条件下で注入する。この段階で、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳを使用してヒドラジノペプチドＳＩＶ１〜７およびＴＴの存在を検出することが、常に可能である。しかし、それらは、バックグラウンドノイズおよび溶媒Ｂ中の勾配の最初の部分の間に蓄積する不純物によって、部分的にマスクされる。５つの主なピークを、ＬＣ−ＭＳで観察される６のＴＩＣ（トータルイオンカウント（Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｏｕｎｔ））ピークと並行して用いるＨＰＬＣを使用して観察する。これらのピークは、親油性ベクター（ＩＩＩａ）へカップリングされたＳＩＶ１〜７およびＴＴに対応し、これらのうちのいくつかは共に溶離する（ｃｏ−ｅｌｕｔｅ）。しかし、表ＩＩに示されるように、それらの流出順序（ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｅｘｉｔ）およびそれらの観察重量（ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｅｉｇｈｔｓ）を測定することは可能である。
【０１５１】
【表２】
2004510709.tif 000017
【０１５２】
２）ペプチドＭｕ−ＩＦＮγと２つの親油性ベクター（ＩＩＩａ）とのカップリング（図５）
６４０μｌのｔｅｒｔ−ブタノールに溶解させた実施例２または実施例３に従って調製される７０８．２μｇ（１．９２μモル）の親油性ベクター（ＩＩＩａ）を、予め３５μｌの水中の懸濁液中に配置させた実施例１に従って調製される５．０４ｍｇ（即ち、約１μモル）のペプチドＭｕ−ＩＦＮγへ添加する。室温で５時間撹拌後、反応媒体を凍結させそして凍結乾燥させる。ＥＳ−ＭＳを使用しての得られたリポペプチド８についての分析は、以下の通りである：［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値５５４７．７、実測値５５４７．５。
【０１５３】
３）ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｂと親油性ベクター（ＩＩＩｂ）とのカップリング
１．８８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に溶解させた１．０６７ｍｇの親油性ベクター（ＩＩＩａ）を、水１０５μｌ中のペプチド１０ｍｇ（即ち、ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａまたはペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｂのいずれか）へ添加する。室温で４時間後、溶液を、同一容積の水で希釈し、そして凍結乾燥させる。Ｍｕ−ＩＦＮγ ａから９．２ｍｇのリポペプチド（≪Ｌ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａ≫と呼ばれるリポペプチド）、そしてＭｕ−ＩＦＮγ ｂから９．３ｍｇのリポペプチド（≪Ｌ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｂ≫と呼ばれるリポペプチド）が得られる。ＥＳ−ＭＳを使用してのそれらの分析は、以下の通りである：Ｌ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａ：［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値３００８．７；　実測値３００７．５。Ｌ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｂ：［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値３００８．７；実測値３００７．０。
【０１５４】
４）ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｃ、Ｍｕ−ＩＦＮγ ｄ、Ｍｕ−ＩＦＮγ ａおよびＭｕ−ＩＦＮγ ｂと親油性ベクター（ＩＩＩｃ）とのカップリング
５．８ｍｇの親油性ベクター（ＩＩＩｃ）を、６．３０２ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールに溶解させる。
【０１５５】
５０μｌの水に溶解された５ｍｇ（１．３２μモル）のペプチド（即ち、ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａまたはＭｕ−ＩＦＮγ ｂのいずれか）へ、上記で調製した親油性ベクター（ＩＩＩｃ）を含有する９６５μｌ（１．５８μモル）の溶液を添加する。室温で５時間反応後、溶液を、同一容積の水で希釈し、そして凍結乾燥させる。Ｍｕ−ＩＦＮγ ａから６．３ｍｇのリポペプチド（Ｃｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａと呼ばれるリポペプチド）、およびＭｕ−ＩＦＮγ ｂから６．４ｍｇのリポペプチド（Ｃｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｂと呼ばれるリポペプチド）が得られる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用してのそれらの分析は、以下の通りである：
Ｃｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａ：　ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋　計算値３１８４．０：実測値３１８３．２。
Ｃｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｂ：　ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋　計算値３１８４．０；実測値３１８４．３。
【０１５６】
同一様式で、５０μｌの水に溶解された８ｍｇ（１．３μモル）のペプチド（即ち、ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｃまたはペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｄのいずれか）へ、親油性ベクター（ＩＩＩｃ）を含有する溶液９５２μｌを添加する。室温で５時間反応後、溶液を、同一容積の水で希釈し、そして凍結乾燥させる。Ｍｕ−ＩＦＮγ ｃから８．６ｍｇのリポペプチド［Ｃｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｃと呼ばれるリポペプチド、または９図７］、およびＭｕ−ＩＦＮγ ｄから８．４ｍｇのリポペプチド（Ｃｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｄと呼ばれるリポペプチド）が得られる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用してのそれらの分析は、以下の通りである：
Ｃｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｃ：　ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋　計算値５２９８．４；実測値５２９８．０。
Ｃｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｄ：　ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋　計算値５２９８．４；実測値５２９９．７。
【０１５７】
５）ペプチドＧ１８Ｒと親油性ベクター（ＩＩＩｂ）とのカップリング
１５ｍｇ（６．７５μモル）のペプチドを、２５４μｌの水で浸し、次いでｔｅｒｔ−ブタノール４．８２ｍｌの溶液中３．７３ｍｇの親油性ベクター（ＩＩＩａ）を添加する。室温で４８時間後、溶液を凍結乾燥させる。１７ｍｇのリポペプチド６が得られ、そのＴＯＦ−ＰＤＭＳ分析は、以下の通りである：［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値２２５９．８、実測値２２５９．４。
【０１５８】
６）ペプチドＯＶＡと親油性ベクター（ＩＶａ）とのカップリング（図６）
実施例１に従って調製した１ｍｇ（０．４０μモル）のペプチドＯＶＡを、７５μｌの２５ｍＭホスフェート／シトレート緩衝溶液（ｐＨ６．２）に溶解させる。この緩衝溶液は、Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．２Ｍの溶液１６０．５μｌおよび８９．５μｌのクエン酸０．１Ｍを使用し、この混合液を水で１ｍｌまで注ぎ足す（ｔｏｐ ｕｐ）ことによって得られる。実施例２または実施例６に従って調製された６６３μｇ（０．８１μモル）の親油性ベクター（ＩＶａ）を、７５μｌのｔｅｒｔ−ブタノールに溶解させる。次いで、２つの溶液を混合し、そして５０℃で５時間加熱する。反応の進行を、８０％アセトニトリル／２０％ＴＥＡＰ（２５ｍＭ、ｐＨ７．１）の混合液によって構成される溶媒Ｂの０から１００％への線形勾配を３０分間、次いで溶媒Ｂ中１００％で１０分間使用して、Ｚｏｒｂａｘ　Ｃ３カラム上でのＨＰＬＣを使用してモニターする（流速：１ｍｌ／分、２１５ｎｍで検出）。５時間後、リポペプチド１０を、５００μｌの水を添加することによって沈殿させ、遠心分離し、そして５００μｌのイソプロパノール中で回収する。粗製リポペプチドを、ＥＳ−ＭＳを使用して分析する：［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値２８１８．４；実測値２８１８．６。
【０１５９】
７）グリコミメティック［（Ｑｕｉ）４ＡＫＤｈｚ］と親油性ベクター（ＩＩＩａ）とのカップリング
９．４ｍｇ（６．４ｍｍｏｌ）の化合物［（Ｑｕｉ）４ＡＫＤｈｚ］を、２４４ｍｌの水に溶解させ、次いで５．０７ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールの溶液中の２．４４ｍｇの親油性ベクター（ＩＩＩａ）に添加する。反応媒体を、５時間３０℃で撹拌し、次いで水で希釈し、十分に凍結させ、そして凍結乾燥させて、定量的に、白色残渣形態の誘導体ＱｕｉＡＫ−Ｐａｍが得られる。
【０１６０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：　ｍ／ｚ　（Ｍ＋Ｎａ）＋　計算値１７４２．０；実測値１７４２．９；　（Ｍ＋Ｋ）＋　計算値１７５８．１；実測値１７５７．９　（Ｑｕｉ）４ＡＫ−Ｐａｍ。
【０１６１】
８）ペプチドＳＩＶ１〜７、ＴＴおよび（Ｑｕｉ）４ＡＫＤｈｚと親油性ベクター（ＩＩＩａ）とのカップリング
観察されるプロトコルは、実施例８，１）に記載のものである。
【０１６２】
各々のペプチドＳＩＶ１〜７（対イオンおよび各々の凍結乾燥生成物のペプチド含有量を考慮に入れた、平均値１２．１ミリモルの各ペプチドに対応する）の等質量（ｅｑｕｉｍａｓｓ）混合物５２．５ｍｇを、０．４６４ｍｌの水に溶解する。並行して、１２．９４ｍｇ（８．７２ミリモル）の化合物（Ｑｕｉ）４ＡＫＤｈｚを、０．３３５ｍｌの水に溶解する。前もって合わせた２つの溶液へ、１５．１９８ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールの溶液中の９．６３ｍｇ（２４．９ミリモル、１．２当量）の親油性ベクター（ＩＩＩａ）へ添加する。従って、各ペプチドの最終濃度は、２−メチル−プロパン−２−オール／水混合液（９５／５）中約１．３ｍｏｌ．ｌ−１である。反応媒体は直ちに透明になる。後者を、窒素雰囲気中３０℃で撹拌する。反応の進行のＲＰ−ＨＰＬＣ（１）において記載のように使用される）でのモニタリングによって、連結は僅か５分後にほぼ完了していることが判る。５時間後、反応媒体を水で希釈し、十分に凍結させ、次いで凍結乾燥させる。ミクロ分取（ｍｉｃｒｏ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＲＰ−ＨＰＬＣを、粗製反応生成物のサンプルへ適用して、質量分析による各リポペプチドの同定を可能にする。
【０１６３】
【表３】
2004510709.tif 000018
【０１６４】
９）化合物Ｈ２Ｎ−ＫＶＧＦＦＫＲ−ＮＨ２−およびＨ２Ｎ−ＶＹＫＡＬ−ＮＨ２と親油性ベクター（ＩＩＩａ）とのカップリング
１．７３ｍｇ（４．５ミリモル）および０．６８（１．８ミリモル）の親油性ベクター（ＩＩＩａ）を、それぞれ、３．６０および１．４１ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールに溶解させ、そして次いで、それぞれ、１９０ｍｌのＨ２Ｏに溶解させた５．８ｍｇ（４．３ミリモル）の化合物Ｈ２Ｎ−ＫＶＧＦＦＫＲ−ＮＨ２−へ、そして７７ｍｌのＨ２Ｏに溶解させた１．４ｍｇ（１．０７ミリモル）の化合物Ｈ２Ｎ−ＶＹＫＡＬ−ＮＨ２へ添加する。反応媒体を、３０℃で５時間撹拌し、次いで水で希釈し、十分に凍結させ、そして凍結乾燥させて、それぞれ、化合物１１および１２を得る。
【０１６５】
４．５ｍｇ（６６ｍｇ）の化合物１３を、３ｍｌ ｍｉｎ−１の流速で、６０℃で、そして２１５ｎｍでの検出でＺｏｒｂａｘ　Ｃ３カラムを使用して、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＬＣ−４Ａシステムでの半分取ＲＰ−ＨＰＬＣ精製：システムＡ溶媒：脱イオン水中０．０５％ＴＦＡ；　システムＢ溶媒：脱イオン水中イソプロパノール６０％中０．０５％ＴＦＡ（勾配：１０分間２０から４０％までの緩衝溶液Ｂ、次いで１０分間一定組成（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、次いで１０分間４０％から１００％まで、そして２０分間一定組成）続いて凍結乾燥後に得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：　ｍ／ｚ　［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値１２４５．７；実測値１２４５．８；　［Ｍ＋Ｎａ］＋　計算値１２６７．７；　実測値１２６７．８。
【０１６６】
化合物１１のキャラクタライゼーション：　ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：　ｍ／ｚ　［Ｍ＋Ｈ］＋　計算値９５７．３；実測値９５７．８；　［Ｍ＋Ｎａ］＋　計算値　９７９．３；　実測値９７９．７。
【０１６７】
実施例９：本発明に従うリポペプチドと共にこれらの細胞のインキュベーションによって誘発された、細胞の表面での、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩＩの分子の発現の分析および定量化
１）使用されるリポペプチド
これらの実験において使用される本発明に従うリポペプチドは、リポペプチドＬ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａおよびＬ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ｂであり、これらの合成は、上記の実施例５のパラグラフ３において記載される。上記の実施例１のパラグラフ３で言及されるように、ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａは、マウスインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のＣ−末端に隣接する２０のアミノ酸に対応する。ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ｂは、ペプチドＭｕ−ＩＦＮγ ａに存在する配列の≪スクランブル≫配列、即ち該アミノ酸（配列中のそれらの順序）が混合された配列である。
【０１６８】
リポペプチドＬ−ｍＩＦＮγ ９５−１３２は、Ｋ．ＴＨＩＡＭらによってＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， １９９９， ４２， ３７３２−３７３６において発行された論文に記載されている。それは、マウスインターフェロン−ガンマのＣ末端に隣接する３８アミノ酸に対応する配列９５−１３２のＮ末端でリシンによって保有されるパルミトイル残基のカップリングの結果である。ペプチド配列上での親油性部分のカップリングは、Ｋ．ＴＨＩＡＭらによる上記の論文において記載されている：それは、化合物Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（パルミトイル）−ＯＨの固相での導入から生じる。このように得られるリポペプチドは、次いで、脱保護されそして固体支持体から分離される。
【０１６９】
リポペプチドＳＬ−ｍＩＦＮγ９５−１３２はまた、Ｋ．ＴＨＩＡＭらによる上記の論文に記載されている：これは、リポペプチドＬ−ｍＩＦＮγ９５−１３２の≪スクランブル≫バージョンである。
【０１７０】
リポペプチドＬ−ｍＩＦＮγ１１３−１３２はまた、Ｋ．ＴＨＩＡＭらによる上記の論文に記載されている：このリポペプチドは、本発明に従うリポペプチドＬ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａと同一のペプチド配列を含むが、パルミトイル残基は、リポペプチドＬ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａの場合と同一様式で導入されておらず、そしてペプチド配列と親油性部分との間の結合は、２つのリポペプチドにおいて同一でない（Ｌ−ｍＩＦＮγ１１３−１３２の場合、パルミチン酸とリシンの側鎖のアミノ官能基との間のアミド結合（リポペプチドは固相合成される）、一方、ヒドラゾン結合および溶液中でのカップリングは、Ｌ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａの場合に関連する）。
【０１７１】
２）細胞表面での主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩＩの分子の発現の定量化のためのプロトコル
ＣＯＬＯ ２０５細胞（結腸の悪性腫瘍から得られたヒト細胞系）は、ＡＴＴＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）セルバンクからである。それらを、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および５ｍＭのピルビン酸ナトリウム含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｃｏｕｒｂｅｖｏｉｅ，Ｆｒａｎｃｅ）において培養し、そして５％のＣＯ２存在下でインキュベートする。細胞を、種々の濃度（３５、４２または５０μＭ）のリポペプチドで２４時間刺激する。次いで、細胞を、１０μｌの、ＦＩＴＣ（クローンＴＡＬ、１Ｂ５、Ｃｙｍｂｕｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ．，Ｈａｎｔｓ，Ｇｒｅａｔ　Ｂｒｉｔａｉｎ）とカップリングされた、クラスＩＩ ＤＲ抗−ＨＬＡ抗体で（表ＩＩＩａに示される結果）またはＡＬＥＸＡ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）へカップリングされた二次抗体によって明らかにされるＬ２４３抗体で（表ＩＩＩｂに示される結果）、１時間マークする。
【０１７２】
ＭＨＣのクラスＩＩ分子の表面発現を、１サンプル当たり１０，０００事象（ｅｖｅｎｔｓ）の割合で、Ｃｏｕｌｔｅｒ　ＥＰＩＣＳ　ＩＩサイトメーターを用いるフローサイトメトリーを使用して分析する。観察される蛍光強度は、細胞表面上に存在するＭＨＣのクラスＩＩ分子の量に正比例する。未処理細胞および処理細胞について観察された平均蛍光値（表ＩＩＩにおける“平均”の欄）は、未処理細胞の平均蛍光値と処理細胞の平均蛍光値との比を算出することを可能にする（表ＩＩＩにおける“比”の欄）。コントロールは、リポペプチドが存在しない細胞をインキュベートすることを含む。
【０１７３】
３）結果
２つの独立した経験シリーズ（ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ）から得られる結果を、表ＩＩＩａおよびＩＩＩｂに示す。
【０１７４】
【表４】
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【０１７５】
【表５】
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【０１７６】
表ＩＩＩａにおいて、４２μＭおよび５０μＭでのＬ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａおよびＬ−ｍＩＦＮγ１１３−１３２（同一ペプチド配列を含むが、親油性部分とペプチド配列との間の結合の性質が互いに異なる、同一サイズのリポペプチド）について得られた結果の比較は、細胞表面でのＭＨＣのクラスＩＩ分子の発現は、細胞が本発明に従うリポペプチドとインキュベートされた場合により大きいことを示す。
【０１７７】
表ＩＩＩｂにおいて、表ＩＩＩａにも記載の生成物Ｌ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａ、およびコレステロールＣｈｏ−Ｍｕ−ＩＦＮγ ａ−ｄから誘導された親油性部分を含む誘導体を用いて得られた結果間の比較は、細胞表面でのクラスＩＩ分子の発現は、細胞がパルミチン酸の誘導体とよりもコレステロールの誘導体とインキュベートされた場合になおより強くなることを示す。
【０１７８】
従って、親油性部分とペプチド配列との間の結合（ヒドラゾン結合）の性質が与えられると、本発明に従うリポペプチドの膜を介しての通過がより有効である。
【０１７９】
これらの結果は、本発明のリポペプチドが、先行技術のリポペプチドよりもより有効に細胞膜を介して通過し得ることを示す。従って、本発明に従うリポペプチドは、細胞における有効成分の運搬に好適である。
【０１８０】
上記から明らかであるように、本発明は、より明白にたった今説明したその実行、実施形態および適用様式のものに決して限定されず；逆に、それは、本発明の枠または範囲を逸脱することなく、当業者に予想され得る全ての改変を含む。特に、説明したカップリング方法は、ペプチドを、本発明に従う親油性ベクターを含む親油性表面へ、あるいは脂質二重膜（ｌｉｐｉｄｉｃ ｂｉｌａｙｅｒｓ）、リポソームまたは多層粒子のような分子上システム（ｓｕｐｒａ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍｓ）へ固定するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明に従う式（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）の親油性ベクターの合成を示す。
【図２】
図２は、式（ＩＩＩａ）の親油性ベクターの合成の別のプロセス、および本発明に従う式（ＩＶａ）の親油性ベクターの合成を示す。
【図３】
図３は、本発明に従う式（ＶＩｂ）の親油性ベクターの合成を示す。
【図４】
図４は、本発明に従う方法を使用して、ＳＩＶ１〜７およびＴＴと言及されるペプチドの混合物と、式（ＩＩＩａ）の親油性ベクターとのカップリングを示す。
【図５】
図５は、本発明に従う方法を使用して、Ｍｕ−ＩＦＮγと言及されるペプチドと、式（ＩＩＩａ）の２つの親油性ベクターとのカップリングを示す。
【図６】
図６は、本発明に従う方法を使用して、ＯＶＡと言及されるペプチドと、式（ＩＶａ）の親油性ベクターとのカップリングを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004510709.tif 000080
【国際調査報告】
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2004510709.tif 000082
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2004510709.tif 000084
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