(57)【要約】本出願において、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質中に単一アミノ酸変異を有するアデノウイルス変異体が、記載される。この変異は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ領域が欠失されたアデノウイルス変異体と比較した場合に、このようなウイルスが癌を処置する効率を増強する様式で、ｐ５３結合／ｐ５３不活化およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の後期機能をもたらす。本発明は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子中に変異を含む組換えアデノウイルスを開示し、ここでこの遺伝子は、単一アミノ酸変異を含む変異Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードし、この変異は、このＥ１Ｂ−５５Ｋ変異タンパク質が腫瘍サプレッサーｐ５３に結合する能力を実質的に減少させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子中に変異を含む組換えアデノウイルスであって、該遺伝子は、単一アミノ酸変異を含む変異Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードし、該変異は、該Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異タンパク質が腫瘍サプレッサーｐ５３に結合する能力を実質的に減少させる、組換えアデノウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えアデノウイルスであって、該ウイルスは、Ｏｎｙｘ０５１およびＯｎｙｘ０５３からなる群より選択される、組換えアデノウイルス。
【請求項３】
請求項２に記載の組換えアデノウイルスであって、該ウイルスはＯｎｙｘ０５１である、組換えアデノウイルス。
【請求項４】
請求項２に記載の組換えアデノウイルスであって、該ウイルスはＯｎｙｘ０５３である、組換えアデノウイルス。
【請求項５】
請求項１に記載の組換えアデノウイルスであって、該ウイルスは、該ウイルスの後期機能を実質的に保持するさらなる特性を有する、組換えアデノウイルス。
【請求項６】
単一アミノ酸変異を含む単離されたアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質であって、該変異は、該タンパク質の２４０位のアミノ酸または２６０位のアミノ酸からなる群より選択される、単離されたアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質。
【請求項７】
単一アミノ酸変異を含む単離されたアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質であって、該変異は、該タンパク質の２４０位にある、単離されたアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質。
【請求項８】
単一アミノ酸変異を含む単離されたアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質であって、該変異は、該タンパク質の２６０位にある、単離されたアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質。
【請求項９】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードする変異アデノウイルスＤＮＡを含み、該タンパク質は、該タンパク質が腫瘍サプレッサーｐ５３に結合する能力を実質的に減少させる単一アミノ酸変異を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドはＲＮＡである、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
癌の処置が必要な患者において癌を処置する方法であって、該方法は、一定投与量の組換えアデノウイルスを該患者に投与する工程、および該アデノウイルスが該癌に感染するに十分な時間を与える工程、そして所望される場合は該処置を反復する工程を包含し、ここで該アデノウイルスは、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子中に変異を含み、該遺伝子は、単一アミノ酸変異を含む変異Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードし、該変異は、該Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異タンパク質が腫瘍サプレッサーｐ５３に結合する能力を実質的に減少させる、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、化学療法剤とともに前記組換えアデノウイルスを投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記アデノウイルスは、Ｏｎｙｘ０５１およびＯｎｙｘ０５３からなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
癌の処置が必要な患者において癌を処置する方法であって、該方法は、一定投与量の単離されたポリヌクレオチドを該患者に投与する工程、および所望される場合は該処置を反復する工程を包含し、ここで該ポリヌクレオチドは、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードする変異アデノウイルスＤＮＡを含み、該タンパク質は、単一アミノ酸変異を含み、該変異は、該タンパク質が腫瘍サプレッサーｐ５３に結合する能力を実質的に減少させる、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の癌を処置する方法であって、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の癌を処置する方法であって、前記ポリヌクレオチドは、前記Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードし、かつ該タンパク質は、該タンパク質の２４０位に変異を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の癌を処置する方法であって、前記ポリヌクレオチドは、前記Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードし、かつ該タンパク質は、該タンパク質の２６０位に変異を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドを化学療法剤とともに投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドが、リポソームとともに投与される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、癌治療の分野にあり、そして変異体Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を発現する組換え細胞壊死性アデノウイルスの組成物、および新形成疾患を治療するために、このようなアデノウイルスを使用する方法を提供する。
【０００２】
（背景）
今世紀の初頭から、ウイルスが癌の処置に用いられている。このアプローチは、２つの要素を有している；初めに、新形成細胞において選択的に複製し、そして新形成細胞を選択的に殺す一方で、正常な細胞を許容する、腫瘍崩壊性のウイルスを単離または産生することである。研究者は、始めに、野生型ウイルスを用い、そしてこのアプローチは、限定されているがいくつかの成功を収めた。腫瘍崩壊および腫瘍増殖の減速は、正常な組織に対して殆ど損傷なしにまたは全く損傷なしに起こったが、疾患の経過における有意な変化はなかった。Ｓｍｉｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ　９：１２１１−１２１８（１９５６），Ｃａｓｓｅｌ，Ｗ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　１８：８６３−８６８（１９６５），Ｗｅｂｂ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｌａｎｃｅｔ　１：１２０６−１２０９（１９６６）を参照のこと。Ｋｅｎｎｅｙ，ＳおよびＰａｇａｎｏ，Ｊ．　Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．，ｖｏｌ．８６，ｎｏ．１６，ｐ．１１８５（１９９４）もまた参照のこと。
【０００３】
さらに最近では、野生型ウイルスの用途の限定された効力と関連した疾患の再発生のために、研究者は、高用量で送達され得、そして新形成細胞における複製に適するが正常細胞における複製には適さない、組換えウイルスを用いることに頼っている。このようなウイルスは、それら自身が有効な腫瘍崩壊性因子であり、そしてさらに、このウイルスの抗新形成活性を増強する導入遺伝子を運びそして発現するように操作され得る。このクラスのウイルスの例は、ウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域の変異体であるアデノウイルスである。米国特許第５，６７７，１７８号、およびＢｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．，Ｄ．Ｈ．Ｋｉｒｎ，Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｈｅｉｓｅ，Ｓ．Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｍｕｎａ，Ｌ．Ｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｎｙｅ，Ａ．Ｓａｍｐｓｏｎ　Ｊｏｈａｎｎｅｓ，Ａ．Ｆａｔｔａｅｙ，およびＦ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ．１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：３７３−６を参照のこと。
【０００４】
米国特許第５，６７７，１７８号（発明者、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）に記載されるアプローチは、癌細胞（特にｐ５３）における腫瘍抑制タンパク質の減少を利用する。ｐ５３の機能は、ＤＮＡ損傷に応答する細胞周期を通じる哺乳動物細胞の進行を阻害することである。野生型アデノウイルスのＥ１ｂ−５５Ｋタンパク質は、ｐ５３を表すアデノウイルス感染細胞中のｐ５３に結合し、そしてｐ５３機能の実質的不活化を生じる。機能的アデノウイルスＥ１ｂ−５５Ｋタンパク質は、機能的ｐ５３を含む細胞における、有効なアデノウイルス複製に必須である。ｐ５３に結合する能力を実質的に欠くアデノウイルス変異体は、機能的ｐ５３の正常なレベルを有する非複製非新形成細胞における複製が欠けている。しかし、このようなアデノウイルス変異体は、ｐ５３機能を欠く細胞（例えば、実質的に除去されたｐ５３対立遺伝子にホモ接合性である細胞、本質的に非機能的である変異体ｐ５３タンパク質を含む細胞）において複製表現型を示し、従ってこのような細胞の死を生じる。
【０００５】
Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質における変異に起因して、ｐ５３に結合する能力を実質的に欠くアデノウイルス変異体についていくつか報告がある。このようなウイルスは、一般に、欠失したＥ１Ｂ−５５Ｋ領域の一部または全部を有する。
【０００６】
米国特許第５，６７７，１７８号（発明者、ＭｃＣｏｒｎｉｃｋ）は、とりわけ、ｐ５３に結合し得る、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質またはＥ４　ｏｒｆ６である、ウイルス癌タンパク質を欠く、アデノウイルス変異体を記載する。
【０００７】
米国特許第６，０８０，５７８号は、とりわけ、ｐ５３の結合の原因である、Ｅ１ｂ−５５Ｋタンパク質の領域において欠失を有する、アデノウイルス変異体を記載する。
【０００８】
ｐ５３を有する特定の腫瘍細胞において、ｐ５３の存在が、ｐ５３の結合を欠くＥ１ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするアデノウイルスの効力を予想し得ないことを示唆する、いくつかの刊行物が存在する。例えば、ＧｏｏｄｒｕｍおよびＯｒｎｅｌｌｅｓ　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８，Ｖｏｌ．７２：９４７９−９４９０；Ｈａｌｌら、１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４；１０６８−１０７２；Ｈａｙら、１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１０：５７９−５９０；Ｒｏｔｈｍａｎｎら、１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４７０−９４７８；およびＴｕｒｎｅｌｌら、１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２０７４−２０８３を参照のこと。これらの細胞において、ｐ５３経路における欠損が存在し、従ってこのような細胞が機能的ｐ５３を欠き、そして結果的に、ｐ５３の結合を欠くＥ１ｂ−５５Ｋタンパク質をコードするアデノウイルス変異体の複製もまた支持すると考えられている。
【０００９】
アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質は、ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）の生産的感染の間に、重要な役割を果たす。感染の初期において、Ｅ１Ｂ−５５Ｋは、ｐ５３と安定な複合体を形成し（Ｓａｒｎｏｗ，Ｐ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８２，ｖｏｌ．１２０：ｐ．５１０−５１７）、そしてｐ５３媒介転写活性化を阻害する（Ｙｅｗ，Ｐ．Ｒ．およびＡ．Ｊ．Ｂｅｒｋ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，ｖｏｌ．３５７：ｐ．８２−８５；およびＹｅｗ、Ｐ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．８：１９９４）。さらに、Ｅ１Ｂ−５５Ｋおよび別のアデノウイルスタンパク質であるＥ４ｏｒｆ６は、協同して、能動的分解のために、ｐ５３を細胞質に再配置する（Ｑｕｅｒｉｄｏ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７，ｖｏｌ．７１：ｐ．３７８８−３７９８；Ｒｏｔｈ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；ｖｏｌ．７２：ｐ．８５１０−８５１６；およびＳｔｅｅｇｅｎｇａ，Ｗ．Ｔ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８，ｖｏｌ．１６：ｐ．３４９−３５７）。ｐ５３のこの不活化は、細胞がＳ期へ入ることを必要とする、アデノウイルスの複製に重要である。Ａｄ５による感染の後期の間、ウイルスｍＲＮＡは、細胞質へと選択的に運び出され、そして有効に翻訳される一方で、殆どの宿主細胞ｍＲＮＡの核原形質輸送は阻害される（Ｂｅｌｔｚ，Ｇ．Ａ．およびＳ．Ｊ．Ｆｌｉｎｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７９，ｖｏｌ．１３１：ｐ．３５３−３７３；Ｂａｂｉｓｓ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８５，ｖｏｌ．５：ｐ．２５５２−２５５８；Ｐｉｌｄｅｒ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８６：ｖｏｌ．６：ｐ．４７０−４７６）。感染の後期の間のウイルスｍＲＮＡのこの選択的蓄積は、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６を含むタンパク質複合体により媒介される（Ｓａｒｎｏｗ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８４，ｖｏｌ．４９：ｐ．６９２−７００；およびＨａｌｂｅｒｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８５，ｖｏｌ．５６：ｐ．２５０−２５７；およびＢｒｉｄｇｅ，Ｅ．およびＧ．Ｋｅｔｎｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９０，ｖｏｌ．１７４：ｐ．３４５−３５３）。この複合体は、核と細胞質との間を能動的に往復して、ウイルスｍＲＮＡのための核原形質トランスポーターとして働く（Ｄｏｂｂｅｌｓｔｅｉｎ，Ｍ．ら、ＥＭＢＯ　Ｊ．，１９９７，ｖｏｌ．１６：ｐ．４２６７−４２８４）。
【００１０】
まだ継続中の臨床試験において、アデノウイルス変異体であるＯＮＹＸ−０１５（これはｐ５３に結合する能力を欠く）は、生物学的に活性であり、そして頭頸部の癌において、部分的腫瘍壊死を生じることが示されている。ＯＮＹＸ−０１５（当初はｄ１１５２０と命名された）は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を発現しない変異体アデノウイルスである（Ｂａｋｅｒ，Ｄ．Ｄ．およびＡ．Ｊ．Ｂｅｒｋ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８７，ｖｏｌ．１５６：１０７−１２１）。このウイルスは、翻訳開始コドンＡＴＧの直ぐ後に停止コドンを含み、そしてＥ１Ｂ−５５Ｋコード配列の大きな欠失を含む。これらの変異は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ発現の完全な抑止を生じるが、重複するオープンリーディングフレームにコードされるＥ１Ｂ−１９Ｋタンパク質の発現を変化させない。従って、このウイルスは、ｐ５３に結合しそして不活化する能力を欠き、このことは、ｐ５３機能を欠く腫瘍細胞において実質的に選択的な複製を可能とするが、ｐ５３機能が正常である正常細胞においては実質的に選択的な複製をしない（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６，ｖｏｌ．２７４：ｐ．３７３−３７６；およびＨｅｉｓｅ，Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７，ｖｏｌ．３：ｐ．６３９−６４５）。これは、抗腫瘍因子としてＯＮＹＸ−０１５を利用する基礎を作る。
【００１１】
ＯＮＹＸ−０１５におけるＥ１Ｂ−５５Ｋ機能の欠如は、ｐ５３機能を欠く腫瘍細胞におけるウイルス複製を可能とする一方で、このウイルスはまた、ウイルス後期ｍＲＮＡの細胞質蓄積、宿主細胞シャットオフ（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）、および後期ｍＲＮＡの翻訳を欠いている。従って、ＯＮＹＸ−０１５における変異は、変異体ウイルスが腫瘍細胞においてそれ自身を複製する能力を損なう。このように、ｐ５３に結合しそして不活化することが出来ないが、なおも後期ウイルス機能を実行し得る、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体を作製することが非常に望ましい。このような変異は、腫瘍細胞において複製するウイルスの効率を損なうことなく、ウイルスをｐ５３機能を欠く細胞において選択的に複製することを可能にする。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たしている。
【００１２】
本明細書中で議論される参考文献は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにもっぱら提供される。本明細書中のいずれもが、本発明者らが、先の発明によってこのような開示を遡及させる権利がないという承認として解釈されるべきではない。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、新規のクラスのＥ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス変異体、および新形成細胞を除去するためにこの変異体を作製および使用する方法を提供する。
【００１４】
本明細書中に記載される発明の別の局面は、腫瘍抑制因子であるｐ５３に実質的に結合できないが、野生型アデノウイルスと関連した特定のウイルス機能を保持する、Ｅ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス変異体の記載である。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、腫瘍抑制因子であるｐ５３を結合するＥ１Ｂ−５５Ｋの領域において変異され、従って、このような変異したタンパク質はｐ５３に実質的に結合出来ないが、野生型アデノウイルスと関連した特定の複製機能を保持する、Ｅ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス点変異体の記載である。
【００１６】
本発明の別の局面では、５５Ｋの領域において変異されたＥ１Ｂ５５Ｋアデノウイルス点変異体を用いて、正常細胞および新形成細胞からなる細胞集団において、新形成細胞を選択的および実質的に除去するための方法である。このような変異体は、腫瘍抑制因子であるｐ５３に結合する単一アミノ酸を欠くか、またはこのようなアミノ酸がｐ５３に結合しない別のアミノ酸と置換されているかのいずれかである。とにかく、このような変異体は、野生型アデノウイルスと関連した特定の複製機能を保持する。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、新形成を処置するための方法の記載であり、この方法は、このような処置の必要な患者に、化学療法と併用して、腫瘍抑制因子であるｐ５３に結合する５５Ｋの領域において変異しているが野生型アデノウイルスと関連した特定の複製機能を保持する、Ｅ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス点変異体を投与する工程からなる。
【００１８】
本発明のこれらの目的および他の目的は、明細書の以下の本発明の種々の局面の記述を読めば当業者に明かとなる。本発明の上記の局面および他の局面は、図面、詳細な説明、および以下に示す実施例に、より詳細に説明されている。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が、詳細かつ個々に参考として援用されるように示されたのと同程度に、本明細書中に参考として援用される。
【００２０】
（定義）
他のように定義されなければ、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書中で使用される命名法および以下に記載の実験手順は、当該分野において周知であり、かつ一般に用いられるものである。組換え核酸方法、ポリヌクレオチド合成、および微生物培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために、標準的な技術が使用される。一般に、酵素反応および精製工程は、製造者の仕様書に従って実施される。本文書を通じて提供される技術および手順は、一般に、当該分野および種々の一般的な参考文献における従来の方法に従って実施される（一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第二版（１９８９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。本明細書中で使用される命名法および以下に記載の分析化学、有機合成化学、および薬学的処方における実験手順は、当該分野において周知であり、かつ一般に用いられるものである。化学合成、化学分析、薬学的処方および送達、および患者の処置のために、標準的な技術が使用される。
【００２１】
本開示を通じて使用される以下の用語は、他に示されなければ、以下の意味を有するとして理解される：
用語「アデノウイルス」は、ヒトから単離された、４０を超えるアデノウイルスサブタイプ、ならびに他の哺乳動物および鳥類由来の同数のサブタイプを示す。Ｓｔｒａｕｓｓ、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ」、Ｔｈｅ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、４５１〜５９６頁（１９８４）を参照のこと。この用語は、好ましくは、２つのヒト血清型Ａｄ２およびＡｄ５に適用される。
【００２２】
アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質に関連して本明細書中で言及される文脈における「変異」または「変異体」とは、欠失または置換が腫瘍抑制因子ｐ５３へのＥ１Ｂ−５５Ｋの結合活性の実質的な損失を引き起こす、単一アミノ酸の欠失または置換を意味する。
【００２３】
Ａｄ遺伝子の発現について言及される用語「初期」および「後期」は、ウイルス生活環の初期相および後期相の間に発現される遺伝子を意味する。初期遺伝子は、ゲノムの複製前に転写される遺伝子であり、一方、後期遺伝子は、複製後に転写される。初期遺伝子は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、およびＥ４を含む。Ｅ１ａ遺伝子産物は、転写調節に関与する；Ｅ１ｂ遺伝子産物は、宿主細胞機能およびｍＲＮＡ輸送の遮断に関与する。Ｅ２ａは、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードする；Ｅ２ｂは、ウイルスＤＮＡポリメラーゼおよびプレターミナルタンパク質（ｐＴＰ）をコードする。Ｅ３遺伝子産物は、細胞培養物においてウイルス増殖に必須ではない。Ｅ４領域は、ウイルス遺伝子発現の転写調節および転写後調節に関与する調節タンパク質をコードする；Ｅ４タンパク質のサブセットは、ウイルス増殖に必須である。後期遺伝子の産物（Ｌ１−５）は主に、ビリオンの構成成分、ならびにビリオンの集合に関与するタンパク質である。
【００２４】
「新形成細胞」または「新形成」とは、細胞増殖の制御の有意な喪失によって特徴付けられる異常な増殖の表現型を示すような、比較的自律性の増殖を示す細胞をいう。新形成細胞は、活発に複製中であり得るか、または一時的に複製しない休止状態であり得る（Ｇ１またはＧ０）細胞を含む；同様に、新形成細胞は、十分に分化した表現型を有する細胞、不十分にしか分化していない表現型を有する細胞、またはこれらの両タイプの細胞の混合物を含み得る。従って、全ての新形成細胞が所定の時点で必ずしも細胞を複製しているわけではない。新形成細胞として定義されたセットは、良性新形成中の細胞および悪性（または明らかな（ｆｒａｎｋ））新形成中の細胞からなる。本明細書中において明らかな新形成の細胞は、しばしば、癌または癌細胞をいい、代表的には、内胚葉または外胚葉組織起源の細胞に起因する場合、癌腫と呼ばれ、または中胚葉に由来する細胞型に起因する場合、肉腫と呼ばれる。新形成細胞の定義の中には、ｐ５３機能を欠くが、明らかな新形成ではない細胞が含まれる。米国特許第５，６７７，１７８号を参照のこと。後者のカテゴリー内の細胞の例は、バレット症候群または白斑症と関連した細胞である。
【００２５】
「生理学的条件」または「生理学的溶液」は、インタクトな哺乳動物細胞または生存哺乳動物の組織隙または器官における状態に実質的に類似するイオン強度、ｐＨ、および温度を有する水性環境をいう。代表的には、生理学的条件としては、約１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．５−７．６および約２２〜３７℃の温度を有する水溶液が挙げられる。一般には、生理学的条件は、生物学的高分子の分子間会合のために適切な結合状態である。例えば、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３７℃での生理学的条件が、一般に適切である。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「標識」または「標識された」は、検出可能なマーカーの取り込み（例えば、放射性標識アミノ酸の取り込み、またはマーカーアビジン（例えば、光学または比色方法により検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの付着による）をいう。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野で公知であり、そして使用され得る。ポリペプチドのための標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識は、種々の長さのスペーサーアームによって付着され、潜在的な立体障害を減少させる。
【００２７】
本明細書中の化学用語は、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ、Ｓ．編、１９８５）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（本明細書中に参考として援用される）により例証されるように、当該分野における従来の用法に従って用いられる。
【００２８】
本発明の選択された特定の実施形態を表す式において、アミノおよびカルボキシル末端基は、しばしば詳細に示されないが、他に示されない限り生理学的ｐＨ値で呈する形態であると理解される。従って、生理学的ｐＨでのＮ末端のＨ２＋およびＣ末端のＯ−は、特定の例または一般式のいずれにおいても、特定されそして示される必要はないが、存在することが理解される。本明細書中で使用されるポリペプチド表記では、標準的な用法および慣例に従って、分子の左手の端がアミノ末端であり、そして右手の端がカルボキシ末端である。もちろん、非生理学的ｐＨ値で形成される塩を含む塩基性塩および酸付加塩もまた、本発明の化合物に含まれる。本明細書中に記載のアミノ酸残基は、好ましくは、「Ｌ」イソ型である。２０の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄアミノ酸）、天然でないアミノ酸（例えば、α，α−分布アミノ酸）、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来でないアミノ酸もまた、ポリペプチドによって所望の機能特性が維持される限り、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。示したペプチドについては、割り当てられた各々のコードされた残基は、３文字表記によって示され、標準的なポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３、３５５２−５９（１９６９）に記載され、そして３７ＣＦＲ　１．８２２（ｂ）（２）に採用される）に従う、従来のアミノ酸の慣用名に対応する。非干渉性置換基（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｒｉｎｇ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）と呼ばれる遊離官能基（カルボキシ末端またはアミノ末端の基を含む）もまた、アミド化、アシル化、または他の置換によって修飾され得、これは、例えば、それらの活性に影響することなく化合物の可溶性を変更し得る。
【００２９】
本明細書中でいわれる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれか、またはいずれかのヌクレオチド型の改変された形態の、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖または二本鎖の形態を含む。
【００３０】
本明細書中でいわれる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するオリゴヌクレオチド連結または天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび改変されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、２００塩基長以下を有するポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、（例えば、プローブのために）通常一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、（例えば、遺伝子変異体の構築における使用のために）二本鎖でもあり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。本明細書中でいわれる場合、用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書中でいわれる場合、用語「改変されたヌクレオチド」は、改変されたかまたは置換された糖基および当該分野において公知の同様のものを有するヌクレオチドを含む。
【００３１】
ＤＮＡ領域は、互いに機能的に関連させる場合、作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、コード配列の転写を制御する場合、この配列に作動可能に連結される；リボソーム結合部位は、翻訳を可能にするように位置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるとは、連続することを意味し、リーダー配列の場合、連続し、そしてリーディングフレームにあることを意味する。
【００３２】
全てのヌクレオチド配列は、標準的表記に従い、そして５’から３’の方向である。
【００３３】
用語「機能的に等価なコドン」は、同一のアミノ酸をコードするコドンをいい、そしてさらに、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンをいう。表１はそのようなコドン、ならびに２０個の必須アミノ酸の１文字表記および３文字表記を示す。
【００３４】
（表１：機能的に等価なコドン）
【００３５】
【表１】
2004505633.tif 000002
【００３６】
手引きとして参照され得るアデノウイルス生物学の一般的記載について、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｉｅｌｄｓ　ＢＮおよびＫｎｉｐｅ　ＤＭ編，Ｖｏｌ．２，ｐｐ１６５１−１７４０，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。以下の特定の記述は、アデノウイルス血清型５およびアデノウイルス血清型２についていわれるが、これらに限定されない。他のアデノウイルス血清型が使用され得ると考えられているが、アデノウイルス血清型５は、ウイルスポリヌクレオチドのヌクレオチド番号付けの決まり、ならびにＥ１ａウイルス遺伝子領域および他のウイルス遺伝子のウイルスコードポリペプチドのアミノ酸番号付けについて共通の参照点を提供する。アデノウイルス血清型２は、Ｅ１ｂウイルス遺伝子領域、および他のウイルス遺伝子領域の番号付けの決まりについて、都合よい参照を提供する。当業者が他のアデノウイルス血清型における対応する部位を容易に同定すると考えられている。
【００３７】
細胞内リン酸化タンパク質ｐ５３の機能は、細胞周期を介する哺乳動物細胞の発達を阻害することである。野生型アデノウイルスＥ１ｂ　ｐ５５タンパク質は、ｐ５３を有する感染細胞中でｐ５３に結合し、そしておそらく不活化形態でｐ５３を封鎖することによってｐ５３機能の実質的な不活性化を生成する。機能的Ｅ１ｂ　ｐ５５タンパク質は、機能的ｐ５３を含む細胞における効率的なアデノウイルス複製に必須である。しかし、ｐ５３結合能を実質的に欠くアデノウイルス改変体は、正常レベルの機能的ｐ５３を有する、複製しない新生物ではない細胞において複製欠損である。
【００３８】
ヒト腫瘍細胞は、しばしば変異された（例えば、置換変異体、欠失変異体、フレームシフト変異体）ｐ５３対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり、そして細胞周期の正常な制御に必要なｐ５３機能を欠く（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３：４９；Ｌｅｖｉｎｅら（１９９１）ｏｐ．ｃｉｔ、本明細書中に参考として援用される）。従って、多くの新生物細胞は、ｐ５３（−）である。なぜなら、これらは、十分なレベルのｐ５３タンパク質を欠くか、および／または、これらは、たとえ野生型ｐ５３が存在し得ても、（例えば、機能的マルチマーの形成を阻害することによって）実質的ｐ５３機能がなくかつｐ５３機能が実質的に減少され得るｐ５３の変異形態を発現するかのいずれかであるからである。いくつかの新生物細胞は、本質的な野生型ｐ５３タンパク質をコードする対立遺伝子を含み得るが、ｐ５３機能を実質的に排除する第二の部位変異（例えば、ｐ５３タンパク質が核よりも細胞質に局在化されることを生じる変異）を含み得る。このような第二の部位変異もまた、ｐ５３機能を実質的に欠く。
【００３９】
ｐ５３を複合体化させる能力を欠くが、他の本質的なウイルス複製機能を実質的に維持する複製欠損アデノウイルス種は、ｐ５３機能を欠損する細胞（例えば、実質的に欠失されたｐ５３対立遺伝子についてホモ接合性である細胞、実質的に非機能的である変異体ｐ５３タンパク質を含む細胞）において、複製表現型を示すが、複製しない新生物でない細胞において複製的表現型を実質的に示さない。このような複製欠損アデノウイルス種は、本明細書中で便宜上、Ｅ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠損アデノウイルスといわれる。
【００４０】
特定のクラスのＥ１ｂ−ｐ５３（−）複製欠損アデノウイルスは、翻訳開始コドンＡＴＧの直後に終止コドンならびにＥ１Ｂ−５５Ｋコード配列の大きな欠失を含む。これらの変異は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ発現の完全な排除を生じ、この型のウイルスの例はＯＮＹＸ−０１５（元々、ｄｌ１５２０（Ｂａｒｋｅｒ，ＤＤ，１９８８）と称された）である。この型のベクターは、ウイルスの後期ｍＲＮＡの細胞質集積、宿主細胞シャットオフ（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）および後期ｍＲＮＡの翻訳を欠損し、従って、変異ウイルスの自身を高レベルで再生する能力を損なう。従って、ｐ５３に結合せずかつｐ５３を不活性化しないが、後期機能をなお実行し得るＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体を作製することが所望される。このような変異は、腫瘍細胞中でそのウイルスを複製する効率を損なうことなく、ｐ５３機能を欠損する細胞中でそのウイルスを強くかつ選択的に複製し得る。
【００４１】
本発明の基礎は、これらの機能を媒介するＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の領域が互いに重複するようであるということである。ｐ５３との相互作用を媒介するＥ１Ｂ−５５Ｋの領域は、アミノ酸２２４〜３５４にマッピングされている（Ｋａｏ，Ｃ．Ｃ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，ｖｏｌ．１７９：ｐ．８０６−８１４；および、Ｙｅｗ，Ｐ．Ｒ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，ｖｏｌ．１７９：ｐ７９５−８０５）。同一の領域は、ｍＲＮＡ転写物を媒介するＥ１Ｂ−５５Ｋの安定性に重要なようである。これらの領域は、Ｅ４ｏｒｆ６への結合に必要とされ（Ｒｕｂｅｎｗｏｌｆ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．７１：ｐ．１１１５−１１２３）、これらの領域は、核細胞質輸送に関連する細胞質タンパク質であるＥ１Ｂ−ＡＰ５（Ｇａｂｌｅｒ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，ｖｏｌ．７２：ｐ．７９６０−７９７１）、およびＲＮＡ結合能を有するＥ１Ｂ−５５Ｋの領域（Ｈｏｒｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｊ．およびＫ．Ｎ．Ｌｅｐｐａｒｄ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，ｖｏｌ．７２：ｐ．９３７４−９３７９）への結合に必要とされ、全てがｐ５３結合に必要とされる領域と部分的に重複する。今までのところ、ｐ５３結合／相互作用およびこのタンパク質の後期機能を分離する全ての試みは、首尾よくいかなかった。
【００４２】
ｐ５３結合／相互作用機能およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の後期機能を分離するために、本発明者らは、ｐ５３との相互作用を媒介するＥ１Ｂ−５５Ｋの領域（すなわち、アミノ酸２２４〜３５４）および他の領域におけるＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質中に単一のアミノ酸変異を作製した（Ｋａｏ　Ｃ．Ｃ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，ｖｏｌ．１７９：ｐ．８０６−８１４；および、Ｙｅｗ，Ｐ．Ｒ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，ｖｏｌ．１７９：ｐ．７９５−８０５）。次いで、これらの変異は、ｐ５３レベル／活性を調節する能力、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質と相互作用する能力、ウイルス後期遺伝子発現を媒介する能力およびヒト癌細胞におけるウイルス複製を支持する能力について、ＯＮＹＸ０１５または野生型アデノウイルスに関して特徴付けられた。
【００４３】
（アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体の構築）
アデノウイルス変異体の構築についての方法は、一般に当該分野において公知である。Ｍｉｔｔａｌ．Ｓ，Ｋ．，Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．，１９９３，ｖｏｌ：２８，６７−９０頁；およびＨｅｒｍｉｓｔｏｎ，Ｔ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｃｏｌｓ，Ｗ．Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ編，Ｈｕｍａｎｓ　Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。さらに、アデノウイルス５ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号＃Ｍ７３２６０として登録され、そしてこのウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）からアクセッション番号ＶＲ−５として利用可能である。
【００４４】
一般に、アデノウイルスベクター構築は、標準的技術を使用するプラスミドカセット中のアデノウイルスゲノム（好ましくは、Ａｄ５ゲノム）の所望の領域の最初の欠失または改変を含む。
【００４５】
アデノウイルス変異体を構築するために使用される特定の材料および方法は、Ｈａｎｋｅ，Ｔ．ら，（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７７，４３７−４４４頁、およびＢｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６７，５９１１−５９２１頁、ならびにＰＣＴ／ＣＡ９６／００３７５に記載される。Ｍｉｃｒｏｂｉｘ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（３４１Ｂｅｒｉｎｇ　Ａｖｅｎｕｅ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ　Ｃａｎａｄａに位置する）は、アデノウイルス変異体を構築するために使用される多くの材料、およびこれらをどのように作製するかについてのＰｒｏｄｕｃｔ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｈｅｅｔｓを提供する。Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ，Ｔ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗ．Ｓ．Ｗｏｌｄ編，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，１９９９もまた参照のこと。
【００４６】
本明細書中に記載される実験を実施するために使用される腫瘍細胞株は、容易に入手可能である。例えば、Ａ５４９細胞、２９３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｈ１２９９細胞を、ＡＴＣＣより得た。ｐ５３遺伝子ノックアウトを有する、ＨＣＴ１１６の誘導体であるＨＣＴ１１６−／−は、Ｄｒ．Ｆ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ＵＣＳＦより惜しみなく贈られた。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍｌ　非必須アミノ酸、１０Ｕ／ｍｌ　ペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、標準的増殖条件下で、好ましくは、単層培養として増殖させた。全てのアデノウイルス感染を、２％　ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌ　非必須アミノ酸、１０Ｕ／ｍｌ　ペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンを補充した高グルコースＤＭＥＭ中で実施した。
【００４７】
本発明のアデノウイルスＥ１ｂ−５５ｋ変異体を構築するための好ましい手順は、十分確立された分子生物学の技術、またはこれらの技術の改変（本明細書中で参照される）を使用して、プラスミドカセット中のアデノウイルスゲノム中に部位特異的変異を作製することである。これは、種々の材料および方法を使用することが理解され得る。
【００４８】
本発明がアデノウイルス５型について記載されるが、他の同様のアデノウイルス血清型を用いて実施され得ることは、注目すべきことである。アデノウイルスゲノムの一般的組織は、血清型の中で保存され、そして特定の機能が同様にある。
【００４９】
より具体的には、本発明者らは、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質のｐ５３結合ドメインおよび転写抑制ドメイン中に２６の単一アミノ酸置換変異を構築した。これらの変異を、ｐ５３レベルおよび活性を調節する能力、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質と相互作用する能力、ウイルス後期遺伝子発現および宿主細胞シャットオフを媒介する能力、低温（ｃｏｌｄ）感受性表現型、ならびにヒト腫瘍細胞中でのウイルス複製を支持する能力について背景を有しかつ特徴付けられた、感染性ウイルスであるｄｌ３０９（Ｊｏｎｅｓ，ＮおよびＴ．Ｓｈｅｎｋ，Ｃｅｌｌ，１９７９，ｖｏｌ．１７：ｐ．６８３−６８９を参照のこと）中に組み換えた。２つのＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体であるＲ２４０ＡおよびＨ２６０Ａは、ｐ５３を不活性化する能力を喪失したが、野生型タンパク質の後期機能を少なくとも部分的には残存するようである。Ｒ２４０Ａは、ＯＮＹＸ−０１５のヒト癌細胞中での野生型複製能を完全に保持したが、Ｈ２６０Ａは、部分的でしかなかった。ｐ５３不活性化活性とＥ１Ｂ−５５Ｋの後期機能とを分離する能力は、ＯＮＹＸ−０１５よりも効率的に複製するがＯＮＹＸ−０１５の腫瘍感受性を保持するアデノウイルス改変体を作製する可能性がある。
【００５０】
本発明の１つの実施形態は、２４０位および２６０位で、それぞれ、アルギニンおよびヒスチジンをアラニンに置換したＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体であるが、別の実施形態がこれらの部位でのアルギニンおよびヒスチジンを欠くＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質であることに注目することが重要である。
【００５１】
アラニンはアルギニンおよびヒスチジンを置換するために好ましいアミノ酸であるが、同様のヒドロパシー指標を有する他のアミノ酸もまた利用され得る。例えば、Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５７：１０５−１３２頁（１９８２）を参照のこと。本発明のＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質中のアルギニンおよびヒスチジンについてのアミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の関連類似性（例えば、これらの疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づいて選択される。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状および型の分析は、アラニン、グリシンおよびセリンがすべて同様のサイズであることを示し、そして生物学的に機能的な等価物として本明細書中に規定される。
【００５２】
このような変化を作製する際に、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮され得る。各アミノ酸は、これらの疎水性および電荷特性に基づいてヒドロパシー指標を割り当てられ、それは、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００５３】
タンパク質に関して類似の生物学的機能を確立することにおける疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、当該分野で理解されている（Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１５７：１０５−１３２頁，１９８２を参照のこと）。特定のアミノ酸が、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換され得、なお同様の生物学的活性を保持し得ることは公知である。疎水性親水性指標に基づく変化を作製することにおいて、疎水性親水性指標が±０．２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±０．１以内のものが特に好ましく、そして±０．０５以内のものが特により好ましい。
【００５４】
同様のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効率的に作製され得ることもまた、当該分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性指数が、隣接するアミノ酸の親水性指数によって支配されるように、その免疫原性および抗原性、すなわち、このタンパク質の生物学的特性と相関することを示す。アミノ酸は、類似の疎水性親水性値を有する別のアミノ酸と置換され得、なお生物学的に等価なタンパク質を獲得し得ることが理解される。
【００５５】
米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±０．１）；グルタミン酸（＋３．０±０．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±０．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を作製することにおいて、親水性値が±０．２以内のアミノ酸置換が好ましく、±０．１以内のものが特に好ましく、そして±０．０５以内のものがなおより特に好ましい。
【００５６】
本発明の別の局面は、変異Ｅ１Ｂ−Ｋ５５タンパク質の発現を妨害しない様式で、アデノウイルスゲノムへ異種遺伝子を組み込むことである。従って、このようなウイルスは、好ましくは、Ｅ３領域、必要に応じてＥ１ＡまたはＥ４ｏｒｆ６に異種遺伝子を含む。生物学的に活性なペプチドをコードするこのような異種遺伝子、またはこれらのフラグメントの例は、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子、およびプロドラッグアクチベーターを含む（すなわち、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、米国特許第５，３５８，８６６号および同第５，６７７，１７８号）。前者の例としては、インターロイキン２（米国特許第４，７３８，９２７号または同第５，６４１，６６５号）；インターロイキン７（米国特許第４，９６５，１９５号または同第５，３２８，９８８号）；およびインターロイキン１２（米国特許第５，４５７，０３８号）；腫瘍壊死因子α（米国特許第４，６７７，０６３号または同第５，７７３，５８２号）；インターフェロンγ（米国特許第４，７２７，１３８号または同第４，７６２，７９１号）；あるいはＧＭ−ＣＳＦ（米国特許第５，３９３，８７０号または同第５，３９１，４８５号）が挙げられる。さらなる免疫調節性タンパク質は、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−３が挙げられる）（Ｗｅｌｌ，Ｔ．Ｎ．およびＰｅｉｔｓｃｈ，ＭＣ．　Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．６１（５）：５４５−５０頁，１９９７を参照のこと）、および細胞自殺誘導タンパク質、すなわちアポトーシス誘導タンパク質（ＢＡＤおよびＢＡＸが挙げられる）が挙げられる。Ｙａｎｇ，Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．８０，２８５−９１頁（１９９５）；およびＳａｎｄｅｅｐ，Ｒ．ら　Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．９１，２３１−２４１頁（１９９７）を参照のこと。単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−３α）もまた用いられ得る。異種遺伝子の好ましい実施形態は、好ましくは、癌に対して毒性であるが、正常な細胞に対しては毒性でないタンパク質をコードする遺伝子に融合された、細胞膜を横切るタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＶＰ２２またはＴＡＴ）からなるキメラ遺伝子である。
【００５７】
本発明のアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体はまた、複製に重要なウイルス遺伝子を制御することによって変異体の複製を駆動するか、あるいは別の遺伝子（好ましくは、ネガティブ選択遺伝子）の発現を駆動する組織特異的プロモーター（米国特許第５，９９８，２０５号）または細胞周期特異的プロモーター（Ｅ２Ｆ応答性プロモーターを含む）（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１７１４３）を取り込み得る。組織特異的プロモーターの例としては、前立腺特異的抗原プロモーターが挙げられる。ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４４６１または米国特許第５，６９８，４４３号を参照のこと。特定のネガティブ選択遺伝子の例としては、シトシンデアミナーゼ、およびチミジンキナーゼが挙げられる。シトシンデアミナーゼに関しては、米国特許第５，３５８，８６６号および同第５，６７７，１７８号を参照のこと。
【００５８】
例えば、ＨＳＶ　ｔｋ遺伝子カセットは、本発明のアデノウイルスＥ１ｂ５５Ｋ変異体の１つにおいてＥ３プロモーターの下流に作動可能に連結され得る。頻繁には、アデノウイルスゲノムの非必須タンパク質（すなわち、ウイルス複製およびパッケージングに必須でない）を欠失させて、ネガティブ選択カセットを提供することが望ましい；従って、Ｅ３遺伝子領域の実質的部分が欠失され得、そしてネガティブ選択カセット（例えば、Ｅ３プロモーターまたは組織特異的プロモーター（およびエンハンサー）または他の適切なプロモーター／エンハンサーのいずれかに作動可能に連結したＨＳＶ　ｔｋ遺伝子）と置換され得る。あるいは、ネガティブ選択遺伝子は、アデノウイルス後期領域プロモーターに作動可能に連結されて、後期遺伝子プロモーターからの転写により特徴付けられる複製表現型を発現する細胞におけるネガティブ選択遺伝子産物の効率的発現をもたらし得る。
【００５９】
細胞におけるＨＳＶ　ｔｋ遺伝子の発現は、この細胞がガンシクロビルもしくはＦＩＡＵのようなネガティブ選択薬剤に曝されなければ、この細胞に対して直接毒性があるわけではない。ネガティブ選択遺伝子が実質的に発現されている複製表現型を発現する感染細胞は、ネガティブ選択薬剤（例えば、ガンシクロビル）が効率的選択投薬量で投与されるまで、さらなる細胞傷害性を本質的に生成しない。この時点で、ｔｋ遺伝子を発現する感染細胞およびその周辺腫瘍細胞は、選択的に除去される；従って、ネガティブ選択は、細胞変性殺傷の増強のためおよび／または複製表現型を示す細胞を殺傷することによってさらなるウイルス複製を阻むために用いられ得る。
【００６０】
好ましい実施形態は、ポリアデニル化部位を有する適切なプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結されて、ｔｋ発現カセットを形成する、ＨＳＶ　ｔｋ遺伝子カセットである（Ｚｊｉｌｓｔｒａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５；Ｍａｎｓｏｕｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３６：３４８；Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５：１２３４：Ａｄａｉｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：４５７４；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８）（本明細書中に参考として援用される）。このｔｋ発現カセット（または他のネガティブ選択発現カセット）は、例えば、Ｅ３領域の実質的欠失の代わりとして、アデノウイルスゲノムに挿入される。
【００６１】
（治療方法）
疾患（好ましくは新生物疾患）（ここで、この疾患は、ｐ５３の喪失またはｐ５３経路の欠損から生じる）の治療は、本発明のアデノウイルスＥ１Ｂ５５Ｋ変異体を含む組成物、さらにネガティブ選択遺伝子を含む組成物を患者に投与する工程によりもたらされ得る。後者の例としては、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼが挙げられる。
【００６２】
種々のヒト新生物は、特に、ウイルスゲノムの別の領域（好ましくはＥ３領域）が疾患の遺伝子治療に有用なタンパク質をコードする場合、本発明のアデノウイルス構築物を用いて処置され得る。例は、サイトカインであり、好ましくはインターロイキンである。例えば、限定ではないが、気管支原生癌、鼻咽頭癌腫、咽頭癌腫、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、肺の腺癌、悪性肝癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、乳癌、頚部癌、卵巣癌腫、またはリンパ性白血病を有するヒト患者または非ヒト哺乳動物は、適切なアデノウイルスの有効な抗新生物投薬量を投与することによって処置され得る。感染性アデノウイルス粒子の懸濁物は、種々の経路（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、および局所的経路が挙げられる）により新生物組織に適用され得る。１ｍｌあたり約１０３〜１０１４以上のビリオン粒子を含むアデノウイルス懸濁物が、霧状で吸入され得るか（例えば、肺に送達して、気管支原生癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌または咽頭癌種を処置するために）、または腫瘍（例えば、気管支原生癌、鼻咽頭癌腫、咽頭癌種、頚部癌種）を処置するために腫瘍部位に直接塗布（ｓｗａｂ）され得るか、または注入により（例えば、卵巣癌を処置するために腹腔内に、悪性肝癌もしくは他の非肝臓原発性腫瘍からの肝臓転移を処置するために門脈に）あるいは他の適切な経路への直接注入（腫瘍塊（例えば、乳癌）、浮腫（例えば、結腸癌）またはカテーテル（例えば、膀胱癌）で注入され得る。
【００６３】
本発明のアデノウイルス変異体は、新生物細胞の移植物を有するｎｕ／ｎｕマウスにおいて、新生物細胞の等価な移植物を有する未処置マウスと比較して、腫瘍形成性または新生物細胞負荷を低下させる能力によりさらに評価され得る。
【００６４】
本発明のＥ１Ｂ５５Ｋ変異体ウイルスを用いたアデノウイルス治療は、他の抗新生物プロトコル（例えば、従来の化学療法）と併用され得る。また、本発明のアデノウイルス変異体は、宿主動物においてそれらの効果を阻む免疫応答を誘発する事象において、適切な免疫抑制薬物とともに投与され得る。
【００６５】
（変異体アデノウイルスの増殖）
本発明のアデノウイルス変異体は、代表的に、細胞株（例えば、２９３細胞株、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９、またはＡ５４９細胞）中のウイルスストックとして増殖され、これらは、必要であれば、感染性変異体ビリオンの複製および形成を支持するためにトランスで特定の所望されるウイルス機能を提供し得る。
【００６６】
（処方物）
アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体は、患者への治療的投与および診断的投与のために処方され得る。治療的用途もしくは予防的用途のために、薬理学的に有効な投薬量の１以上のアデノウイルス変異体種を含む滅菌組成物は、例えば、新生物状態の処置のために、ヒト患者または脊椎動物非ヒト患者に投与される。一般に、この組成物は、水性懸濁物中に約１０３〜１０１５以上のアデノウイルス粒子を含む。薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤は、しばしば、このような滅菌組成物中で用いられる。種々の水性溶液が用いられる（例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなど）。これらの溶液は、滅菌であり、そして概して、所望のアデノウイルスビリオン以外の特定の物質を含まない。この組成物は、適切な生理学的状態に必要な薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節薬剤および緩衝化薬剤、毒性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を含み得る。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤が含まれ得る。
【００６７】
本発明のアデノウイルス、またはアデノウイルスに含まれるＤＮＡは、リポソーム送達もしくは免疫リポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）送達により新生物細胞に送達され得る；このような送達は、新生物細胞集団に存在する細胞表面特性（例えば、免疫リポソーム中の免疫グロブリンを結合する細胞表面タンパク質の存在）に基づいて選択的に新生物細胞に標的化され得る。代表的には、ビリオンを含む水性懸濁物は、リポソームまたは免疫リポソーム中にカプセル化される。例えば、アデノウイルスビリオンの懸濁物は、従来の方法によりミセルにカプセル化されて、免疫リポソームを形成し得る（米国特許第５，０４３，１６４号、同第４，９５７，７３５号、同第４，９２５，６６１号；ＣｏｎｎｏｒおよびＨｕａｎｇ（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０１：５８２；Ｌａｓｉｃ　ＤＤ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５５：２７９；Ｎｏｖｅｌ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ｅｄｓ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ　ＬＦ　ａｎｄ　Ｎｉｍｍｏ　ＷＳ）；Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｒｅｄｄｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５頁を参照のこと）。個体の癌細胞に存在する癌細胞抗原（例えば、ＣＡＬＬＡ、ＣＥＡ）に特異的に結合する抗体を含む免疫リポソームは、これらの細胞にビリオンまたはビリオンＤＮＡを標的化するために用いられ得る。
【００６８】
本発明のアデノウイルスまたはそれらのカクテルを含む組成物は、新生物疾患の予防的処置および／または治療的処置のために投与され得る。治療的適用において、組成物は、特定の新生物疾患に既に罹患した患者に、その状態およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に停止するに十分な量で投与される。このことを達成するために適切な量は、「治療的に有効な用量」または「有効用量」として規定される。この用途に有効な量は、状態の重篤度、患者の全般的な状態、投与経路およびウイルスの効力に依存する。
【００６９】
予防的適用において、本発明のアデノウイルスまたはそのカクテルを含む組成物は、現在は新生物疾患状態にない患者に投与されて、その患者の新生物の再発に対する耐性が増強されるか、または寛解時間が長期化される。このような量は、「予防的に有効な用量」と規定される。この用途において、正確な量は、患者の健康状態および免疫の全般的なレベルに再び依存する。
【００７０】
この組成物の単一の用量または複数の用量が行われ得、用量レベルおよびパターンは、処置する医師により選択され得る。いずれにしても、薬学的処方物は、患者を有効に処置するに十分な量の本発明の抗新生物アデノウイルスを提供するはずである。
【００７１】
本発明の抗新生物アデノウイルス治療は、他の抗新生物プロトコル（例えば、従来の化学療法）と併用され得る。好ましい化学療法剤は、シスプラチンおよび５−フルオロウラシルである。化学療法は、当業者に周知の方法により（全身的にか、癌への直接注射によるか、または所望の化学療法剤と適切な徐放性物質とを結合することにより癌の部位に局在化させることによるか、または腫瘍を動脈内還流することによるものが挙げられる）施され得る。
【００７２】
好ましい化学療法剤は、シスプラチンであり、そして好ましい用量は、処置される癌の性質およびシスプラチンの投与において慣用的に考慮される他の因子に基づいて、医師により選択され得る。好ましくは、シスプラチンは、３〜６時間にわたり、５０〜１２０ｍｇ／ｍ２の用量で静脈内に投与される。より好ましくは、４時間にわたり、８０ｍｇ／ｍ２の用量で静脈内に投与される。さらに、好ましくは、アデノウイルスでの処置の１日目に投与される。
【００７３】
第２の化学療法剤投与レジメンは、シスプラチンと５−フルオロウラシルとの組み合わせである。５−フルオロウラシルの好ましい用量は、５日間連続で（連続注入）１日あたり８００−１２００ｍｇ／ｍ２である。
【００７４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態およびその種々の用途の例示である。これらは、例示目的に記載されているに過ぎず、本発明を限定するとはみなされない。
【００７５】
（実施例１）
（Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体ウイルスの構築）
全てのＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔを製造業者の推奨するプロトコルに従って使用して、生成した。各変異について、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用した。変異およびそれらの各プライマーを、以下の表２に要約する。手短に言うと、２０ｎｇのｐＸＣ−１を、テンプレートとして使用し、そしてサイクリングパラメーターは、以下のとおりであった：９５℃で３０秒の１サイクル、９５℃で３０秒、５５℃で１分および６８℃で２０分の１６サイクル。プラスミドｐＸＣ−１は、３４１　Ｂｅｒｉｎｇ　Ａｖｅｎｕｅ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ　ＣａｎａｄａのＭｉｃｒｏｂｉｘ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手し、これは、Ｅ１領域全体、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを含む。親ＤＮＡを、各サンプルに１０ＵのＤｐｎ　Ｉを添加し、そして３７℃で１時間インキュベートすることによって消化した。最終産物を、ＸＬ−１細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏｒｐ．）に形質転換し、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００７６】
ウイルスを、２９３細胞に、それらの変異を含むプラスミド（３４１　Ｂｅｒｉｎｇ　Ａｖｅｎｕｅ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ　ＣａｎａｄａのＭｉｃｒｏｂｉｘ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；ＭｃＧｒｏｙ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８８，ｖｏｌ．１６３：ｐ６１４−６１７）と共にｐＪＭ１７を同時トランスフェクトすることによって構築した。２回のプラーク精製を行って、野生型の混入を妨げた。変異を、ＰＣＲ、その後のＥ１Ｂ−５５Ｋ領域の配列決定によって確認した。全てのウイルス（野生型Ｄ、ｄｌ３０９およびＯＮＹＸ−０１５、ならびにＥ１ｂ−５５Ｋ変異体ウイルスを含む）を、２９３細胞中で増殖させ、ＣｓＣｌ勾配（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｓ．Ｍ．Ｗｏｌｄ編、１９９９、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓに記載）で精製し、そしてプラークアッセイおよび／またはＥＬＩＳＡによって定量した。ウイルスｄｌ３０９は、Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．およびＴ．Ｓｈｅｎｋ，Ｃｅｌｌ，１９７９，ｖｏｌ．１７：ｐ．６８３−６８９に記載される。
【００７７】
【表２】
2004505633.tif 000003
2004505633.tif 000004
【００７８】
＊Ｏｎｘｙ−０７０は、Ｇｌｙ３１８からＡｌａ、およびＡｓｎ３１９からＴｈｒへと、２つのアミノ酸が変化されていた。
【００７９】
（実施例２）
（ｐ５３およびＥ４ｏｒｆ６とのＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体の結合）
実施例１に記載されるように生成した２６個の変異体アデノウイルスを最初にスクリーニングして、Ａ５４９細胞におけるｐ５３の定常状態レベルに対するそれらの効果を決定した。この実験を行うための原理は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋが、Ｅ４ｏｒｆ６と協同して、ｐ５３を活性な分解へと標的化することである。従って、この活性を欠くＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体を同定するために、本発明者らは、ウエスタンブロット分析によって、感染されたＡ５４９細胞におけるｐ５３の定常状態レベルを試験した（図１）。類似の実験を、Ｏｎｙｘ　０１５、野生型Ｄ（ＷｔＤ）アデノウイルス、およびｄｌ３０９を用いて行った。
【００８０】
ウエスタンブロット分析を、以下のように行った。Ａ５４９細胞に、種々のウイルスをＭＯＩ　１０で感染させた。感染後２４時間で、細胞を、ＳＤＳゲルローディング緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ　６．８）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　ＳＤＳ、５％　β−メルカプトエタノール）中に溶解させた。タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄプレキャストタンパク質ゲル上での電気泳動によって分画した。電気泳動後、これらのタンパク質を、ナイロンメンブレンに電気泳動的に転写した。次いで、ブロットを、１％　脱脂粉乳および０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で、希釈した抗体と共にインキュベートし、そしてＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化した。抗ｐ５３抗体ＤＯ−Ｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１：１０００希釈し；抗Ｅ１Ｂ−５５Ｋ抗体２Ａ６（Ｓａｒｎｏｗ，Ｐら、Ｃｅｌｌ，１９８２，ｖｏｌ．２８：ｐ．３８７）および抗Ｅ２Ａ抗体Ｂ６−６（Ｄｒ．Ｌｅｖｉｎｅ、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより提供された）を、組織培養上清として使用し、使用前に１：１０希釈した。抗線維抗体を、１：１０００希釈した。
【００８１】
図１は、結果を示す。ｄｌ３０９またはＷｔＤを感染させた細胞において、ｐ５３レベルは、有意に減少し、これは、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６によって媒介される標的化された分解に起因する。対照的に、ＯＮＹＸ−０１５を感染させた細胞は、ｐ５３レベルの増加を示した。ほとんどのウイルス変異体は、ｐ５３レベルの減少を生じた。しかし、変異体Ｅ１Ｂ−５５ＫウイルスＯＮＹＸ−０５１およびＯｎｙｘ０５３（それぞれ、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体Ｒ２４０ＡおよびＨ２６０Ａを発現する）を感染させた細胞は、偽感染させたＡ５４９細胞と比較して、ｐ５３レベルの有意な増加を示した。全ての変異体アデノウイルスは、感染時と等価レベルでＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を蓄積した（図１）。この観察は、２つのアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体、Ｒ２４０ＡおよびＨ２６０Ａが、ｐ５３および／またはＥ４ｏｒｆ６を結合しないことを示唆する。
【００８２】
このことは、感染させたＡ５４９細胞由来のＳ３５標識細胞抽出物を使用する免疫沈降実験によって、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体Ｒ２４０ＡおよびＨ２６０Ａがｐ５３と相互作用する能力を直接試験することによって確認された（図２）。これらの実験を、以下のように行った。Ａ５４９細胞に、適切なＥ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス変異体をＭＯＩ　１０で感染させた。感染後２４時間で、細胞を、２％の透析したウシ胎仔血清および１００ｕＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］エクスプレス標識化ミックス（ＤｕＰｏｎｔ）を補充したメチオニンおよびシステインフリーのＤＭＥＭを用いて、３７℃で３時間放射標識した。標識した細胞を、冷生理食塩水で洗浄し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ　８．０）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％　ＮＰ−４０、３ｍＭ　２−メルカプトエタノール、および１×ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼインヒビターミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中に回収しそして可溶化した。細胞溶解物を、１０分間の微量遠心分離によって清澄化した。免疫沈降を、以前に記載されたように行った（Ｓｈｅｎ，Ｙ．およびＴ．Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，ｖｏｌ．９１：ｐ．８９４０−８９４４）。ｐ５３（ｍＡｂ４２１）またはＥ１Ｂ−５５Ｋ（２Ａ６）に対する抗体を使用して、タンパク質複合体を沈降させた。タンパク質を、４〜２０％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって分離し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。
【００８３】
結果を、図２Ａおよび２Ｂに示す。予測されたように、抗ｐ５３抗体ｍＡｂ４２１は、ｄｌ３０９およびＷｔＤ感染細胞由来の少量の野生型Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を共沈降した（図２Ａ）。Ｒ２４０ＡおよびＨ２６０Ａ変異体タンパク質もまた、共沈降され、これは、それらが、ｐ５３に結合し得ることを示す。抗Ｅ１Ｂ−５５Ｋ抗体２Ａ６での免疫沈降は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質を沈降させたが（図２Ｂ）、ｐ５３が共沈降されたか否かを決定することは難しい。なぜなら、両方のタンパク質は、類似の分子量を共有し、そしてＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質は、さらにより多量に存在するからである。免疫沈降によって検出されたＯＮＹＸ−０５１および０５３感染細胞中のｐ５３の量は、偽感染細胞よりも少なく、一方、ウエスタン分析において、ｐ５３レベルは、ＯＮＹＸ−０５１および０５３感染細胞においてより高かったことは興味深い。これは、ウエスタンブロット分析が、定常状態レベルのｐ５３を検出するのに対して、免疫沈降は、新たに合成されたｐ５３のみを検出するという事実に起因する。従って、Ｒ２４０ＡおよびＨ２６０Ａは、宿主細胞のシャットオフ（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）を媒介し得（以下を参照のこと）、これが、ｐ５３が偽感染細胞において合成される速度よりもより低い速度で合成されることを生じる。ＯＮＹＸ−０５１および０５３を感染させた細胞におけるｐ５３の遅い合成速度およびそのより高い定常状態レベルはまた、これらのウイルスが、ｐ５３を分解へと標的化する能力を欠失したことを確認する。
【００８４】
種々の細胞抽出物中のｐ５３のレベルにおける差異が、上記に記載の共免疫沈降実験からのｐ５３への種々のＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体タンパク質の結合効率に影響していないことを保証するために、さらなる実験を行った。従って、ｐ５３への異なるＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体タンパク質の結合効率をより正確に比較するために、本発明者らは、インビトロ結合アッセイ（Ｗｉｅｎｚｅｋ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．７４：ｐ．１９３−２０２）を採用した。種々のアデノウイルスを感染させたＡ５４９細胞の溶解物を、［３５Ｓ］標識したｐ５３と共にインビトロでインキュベートし、そして抗Ｅ１Ｂ−５５Ｋ抗体２Ａ６を、免疫沈降のために使用した。Ｒ２４０ＡおよびＨ２６０が、野生型Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質よりも有意に低い親和性でｐ５３を結合することが、この実験より明らかである（図２Ｃ）。このｐ５３の非効率的な沈降は、ＯＮＹＸ−０５１または０５３を感染させた細胞におけるより低いレベルの変異体Ｅ１−５５Ｋタンパク質に起因せず；ウエスタン分析は、同様のレベルまたはわずかに高いレベルのＥ１Ｂ−５５Ｋが、ＯＮＹＸ−０５１または０５３感染細胞由来の細胞抽出物中に存在することを確認した（図２Ｄ）。ｐ５３へのＲ２４０ＡおよびＨ２６０Ａの非効率的な結合は、何故、ｐ５３が、ＯＮＹＸ−０５１または０５３を感染させた細胞において分解に対して効率的に標的化されなかったかを、少なくとも部分的に説明し得る。
【００８５】
ｐ５３へのＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質結合、それによる、ｐ５３媒介転写活性化のブロックに加えて、Ｅ１Ｂ−５５Ｋは、もう１つのアデノウイルスタンパク質Ｅ４ｏｒｆ６と共同して、ｐ５３を細胞質中における活性な分解へと標的化する。細胞質へのｐ５３の転移に対するＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体の影響を評価することによって、ｐ５３へのＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体の結合活性の変化を確かめるために、さらなる実験を行った。従って、ｐ５３およびＥ１Ｂ−５５Ｋの免疫蛍光染色を行って、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体Ｒ２４０Ａ（Ｏｎｙｘ　０５１）およびＨ２６０Ａ（Ｏｎｙｘ　０５３）が、ｐ５３を細胞質へ転移し得るか否かを決定した（図３）。
【００８６】
実験を、以下のように行った。Ａ５４９細胞およびＵ２ＯＳ細胞を、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩ　Ｃｈａｍｂｅｒスライドに播種し、感染の前日までに約６０％のコンフルエンシーにした。次いで、細胞に、以下のウイルスをＭＯＩ　１０で感染させた：ｄｌ３０９、Ｏｎｙｘ　０１５　Ｏｎｙｘ−０５１（Ｒ２４０Ａ）、およびＯｎｙｘ−０５３（Ｈ２６０Ａ）。感染後２４時間で、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中の４％　ホルムアルデヒドを使用して室温にて３０分間固定した。細胞を、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０、および１０％　ヤギ血清を補充したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で室温にて３０分間、透過化およびブロックし、次いで、適切に希釈した一次抗体と共に室温にて１時間インキュベートした。全ての抗体を、この透過化／ブロッキング溶液中に希釈した。ｐ５３抗体ＤＯ−１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１：１００希釈し；抗Ｅ１Ｂ−５５Ｋ抗体９Ｃ１０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１：１００希釈し、そしてウサギ抗Ｅ４ｏｒｆ６抗体１８０７−３（Ｐｈｉｌｉｐ．Ｅ．Ｂｒａｎｔｏｎより寄贈）を、１：５００希釈した。抗原を、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（赤）−結合体化二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）で可視化した。
【００８７】
図３は、結果を示す。偽感染Ａ５４９細胞において、ｐ５３は、核において排他的に検出された。野生型ウイルスｄｌ３０９を感染させた細胞において、ｐ５３は、細胞質中に非常に低レベルで排他的に存在し、そしてＥ１Ｂ−５５Ｋタンパクと共存した。ＯＮＹＸ−０１５での感染は、予測されたように、細胞核において局在する高レベルのｐ５３を生じた。Ｒ２４０Ａ変異体ウイルス（ＯＮＹＸ−０５１）を感染させたＡ５４９細胞において、ｐ５３レベルは、ＯＮＹＸ−０１５感染の場合と同様に、核において上昇した（ＯＮＹＸ−０５１および偽感染と比較して）。これは、Ｒ２４０Ａが非常に弱くｐ５３に結合するという事実と一致する。対照的に、ＯＮＹＸ−０５３（Ｈ２６０Ａ）を感染させた細胞の約２／３は、検出可能でないレベルのｐ５３を有し、一方、残りの細胞は、核における高レベルのｐ５３を示した。おそらく、これは、細胞が感染されたときの細胞の細胞周期状態を反映し得る。Ｕ２ＯＳ細胞（野生型ｐ５３を保持する）において、ｐ５３は、ＯＮＹＸ−０１５、０５１および０５３を感染させた場合に、核において高レベルで存在したが、ｄｌ３０９を感染させた場合には低レベルで存在した。これらの結果は、本発明のＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体ＯＮＹＸ−０５１およびＯＮＹＸ−０５３が、実質的に減少したｐ５３の結合を示し、そして細胞質へ輸送するという観察を、さらに支持する。
【００８８】
（実施例３）
（後期ウイルス機能に対するＥ１Ｂ−５５Ｋ変異の効果）
（低温感受性）　Ｅ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子の部分欠失または完全欠失を有するアデノウイルスの複製が、温度依存性であることが公知である（Ｌｅｐｐａｒｄ，Ｋ．Ｎ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３，ｖｏｌ．７４：ｐ．５７５−５８２；Ｇｏｏｄｒｕｍ，Ｆ．Ｄ．ａｎｄ　Ｄ．Ａ．Ｏｒｎｅｌｌｅｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，ｖｏｌ．７２：ｐ．９４７９−９４９０；およびＨａｒａｄａ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ　Ａ．Ｊ．Ｂｅｒｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，ｖｏｌ．７３：ｐ．５３３３−５３４４）。３９℃で、これらは、野生型アデノウイルスとほぼ同程度に複製する。しかし、３２℃では、それらの複製は、野生型ウイルスと比べて有意に減少する。Ｅ１Ｂ−５５Ｋ欠損ウイルスのこの低温感受性表現型は、より低温でのｍＲＮＡ輸送または後期遺伝子発現におけるより重い欠損を反映すると解釈される（Ｇｏｏｄｒｕｍ，Ｆ．Ｄ．ａｎｄ　Ｄ．Ａ．Ｏｒｎｅｌｌｅｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８，ｖｏｌ．７２：ｐ．９４７９−９４９０；およびＨａｒａｄａ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ　Ａ．Ｊ．Ｂｅｒｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，ｖｏｌ．７３：ｐ．５３３３−５３４４）。本発明者らのＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体ＯＮＹＸ−０５１（Ｒ２４０Ａ）およびＯＮＹＸ−０５３（Ｈ２６０Ａ）が、この低温感受性表現型をレスキューし得るか否かを見出すために、本発明者らは、ｄｌ３０９およびＯＮＸＹ−０１５をコントロールとして使用して、低温感受性アッセイを行った（図４）。
【００８９】
この低温感受性アッセイを、以下のように行った：Ｈ１２９９細胞の感染を、２つの温度、３２℃および３９℃で行った。３２℃での感染を、３９℃からの温度シフト後１時間で行った。全ての感染を、ＭＯＩ　５で行った。感染された細胞を、３２℃および３９℃で、それぞれインキュベートした。示された時点で、感染された細胞および培養培地を収集し、プールし、そして３回凍結融解して、ウイルス粒子を放出させた。ウイルスの収率を、２９３細胞単層に対するＥＬＩＳＡによって決定した。
【００９０】
図４は、結果を示す。３９℃で、全てのウイルスは、同程度に複製した。ｄｌ３０９の収率は、ＯＮＹＸ−０１５の収率の約４倍高く、そしてＯＮＹＸ−０５１およびＯＮＹＸ−０５３の収率は、その間にあった。しかし、３２℃では、ＯＮＹＸ−０１５の収率は、ｄｌ３０９の収率と比べて約３５倍減少し、これは、以前の報告と一致する。ＯＮＹＸ−０１５の複製は、ｄｌ３０９の複製と本質的に同じであるが、ＯＮＹＸ−０５３の複製は、わずかに（４倍）減少した。これらの結果は、変異体Ｒ２４０Ａが、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ欠損アデノウイルスの低温感受性表現型を完全にレスキューし得、Ｈ２６０Ａは、そのように実質的にレスキューし得ることを示す。
【００９１】
（総タンパク質発現）　ウイルス感染の後期における総タンパク質発現を決定するために、実験を行った。この原理は、Ｅ１ｂ−５５Ｋ変異体が、ｐ５３を結合しないが、後期ウイルス機能を維持するならば、このような変異体（例えば、Ｏｎｙｘ　０５１およびＯｎｙｘ　０５３）が、ｄｌ３０９またはＷｔＤに類似する総タンパク質発現パターンを有するはずであるということである。このタンパク質発現パターンはまた、Ｏｎｙｘ　０１５（ｐ５３を結合せず、そして後期ウイルス機能を欠く）とは区別可能であるはずである。
【００９２】
実験を、以下のように行った。Ａ５４９細胞に、偽感染させたか、あるいは種々のアデノウイルス変異体、またはＯｎｙｘ０１５、ｄｌ３０９もしくはＷｔＤを、ＭＯＩ　１０で感染させた。感染後２４時間で、細胞を、［３５Ｓ］メチオニン−システインで３時間標識した。標識した細胞を、冷生理食塩水で洗浄し、回収し、そして５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ　８．０）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％　ＮＰ−４０、３ｍＭ　β−メルカプトエタノール、および１×　ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼインヒビターミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍｅｎｎｈｅｉｍ）で可溶化した。清澄化した細胞抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）で分離し、そしてオートラジオグラフィーで可視化した。
【００９３】
図５は、その結果を示す。後期ウイルスタンパク質の発現は、ｄｌ３０９感染細胞およびＷｔＤ感染細胞において効率的であったが、ＯＮＹＸ−０１５感染細胞においては乏しかった。同時に、細胞タンパク質のデノボ合成は、偽感染細胞と比較して、ｄｌ３０９およびＷｔＤを感染させた細胞において減少したが（これは、宿主細胞のシャットオフに起因する）、ＯＮＹＸ−０１５感染細胞においては減少しなかった。ＯＮＹＸ−０５１および０５３を感染させた細胞におけるタンパク質合成プロフィールは、野生型ウイルスｄｌ３０９およびＷｔＤを感染させた細胞のプロフィールと類似した。この観察は、Ｏｎｙｘ　０５１（変異体Ｒ２４０Ａ）およびＯｎｙｘ　０５３（Ｈ２６０Ａ）が、後期ウイルスｍＲＮＡ核輸送に有利なｍＲＮＡ輸送を調節し得ることを示唆する。
【００９４】
まとめると、これらの結果は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体Ｏｎｙｘ　０５１（変異体Ｒ２４０Ａ）およびＯｎｙｘ　０５３（Ｈ２６０Ａ）が、野生型タンパク質の正常な後期機能を維持することを示す。
【００９５】
（実施例４）
（アデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体の細胞傷害活性）
各Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体ウイルスを、ヒト腫瘍細胞株Ｕ２ＯＳおよびＤＵ１４５において複製し、そしてそれらの細胞を殺傷し得る能力について試験した。実験を、以下のように行った。ＭＴＴアッセイを使用し、ここでは、５０％の細胞が殺傷される感染多重度（ＭＯＩ）を決定した。ＤＵ１４５およびＵ２ＯＳ細胞を、２％　ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００μｇ／ｍｌ　非必須アミノ酸、１０Ｕ／ｍｌ　ペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ−Ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅを使用して、２．５×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。播種後２４時間で、これらの細胞に、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体ウイルス、またはｄｌ３０９およびＯＮＸＹ−０１５を感染させた。感染を、ＭＯＩ　３０で開始し、段階的に３倍希釈した。感染させた細胞を、３７℃でインキュベートし、そして毎日モニターした。インキュベーション時間は、経験的に決定した。ＭＴＴアッセイを、製造業者の説明書に従ってＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌ　Ｔｉｔｅｒ　９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙを使用することによって行った。
【００９６】
図６は、結果を示す。両方の細胞株において、ＯＮＹＸ−０１５は、野生型対応型ｄｌ３０９と比較して有意に減弱された。本発明者らが本研究のために作製した全てのウイルスの中で、ＯＮＹＸ−０５１を含むほとんどが、腫瘍細胞に感染し、そしてそれらの細胞を殺傷する能力において、ｄｌ３０９に匹敵し、いくつかの細胞（ＯＮＹ−０５３、０８３および０８５）は、野生型ウイルスよりも効力が有意に低下したが、ＯＮＹＸ−０１５よりも活性であった。ＯＮＹＸ−０５３の場合、その腫瘍細胞傷害活性は、ｄｌ３０９の３５〜１００倍低く、ＯＮＹＸ−０１５より４〜５倍活性であった。
【００９７】
本発明は、理解の明確さの目的のための例示目的で幾分詳細に記載されてきたが、特定の変更および改変が、特許請求の範囲内で実施され得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｐ５３蓄積およびウイルス遺伝子発現に対するＥ１Ｂ−５５Ｋ変異の効果を示す。Ａ５４９細胞を、モック感染させるか、またはｄｌ３０９、ＷｔＤ、ＯＮＹＸ−０１５、または種々のＥ１Ｂ−５５Ｋ変異体を発現するウイルスに感染させるかのいずれかを行った。全ての感染は、１０のＭＯＩで行った。細胞抽出物を感染後（ｈｐｉ）２４時間で調製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体、ｐ５３、Ｅ２Ａ、およびｆｉｂｅｒの定常レベルを、それぞれ、モノクローナル抗体２Ａ６、ＤＯ−１、Ｂ６−６、およびｆｉｂｅｒに対するポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティングにより決定した。ブロットを、実施例に記載されるように、ＥＣＬを用いて可視化した。
【図２】
図２（ＡおよびＢ）は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体によるｐ５３の結合を示す。共同免疫沈降実験。Ａ５４９細胞に対して、モック感染させるか、または１０のＭＯＩで種々のウイルス変異体に感染させるかのいずれかを行った。２４ｈｐｉで、細胞を［３５Ｓ］メチオニン−システインを用いて３時間標識した。細胞抽出物を、抗ｐ５３抗体であるＡｂ４２１（Ａ）または抗Ｅ１Ｂ−５５Ｋ抗体である２Ａ６（Ｂ）を用いて免疫沈降させ、そして材料および方法に記載されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体であるＲ２４０Ａを、ＯＮＹＸ−０５１から発現させ、そしてＨ２６０ＡをＯＮＹＸ−０５３から発現させた（ＣおよびＤ）。インビトロでの結合実験。ｐ５３を合成し、そしてインビトロでの転写および翻訳により、［３５Ｓ］メチオニンを用いて放射性標識した。溶解物を、２４ｈｐｉにて、放射性標識なしで、感染したＡ５４９細胞から調製し、そして放射性標識化ｐ５３と共にインキュベートし、そして２Ａ６抗体を用いて免疫沈降させた。沈殿した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてオートラジオグラフィー（Ｃ）により直接か、または２Ａ６抗体を用いるウェスタンブロッティング（Ｄ）によってかのいずれかで可視化した。
【図３】
図３は、アデノウイルス感染細胞およびモック感染細胞の間接的免疫蛍光染色を示す。チャンバスライドで増殖させたＡ５４９細胞に、１０のＭＯＩで、ｄｌ３０９、ＯＮＹＸ−０１５、０５１、０５２、または０５３を感染させるか、またはモック感染させるかのいずれかを行った。感染の２４時間後に、細胞を固定し、透過処理し、そしてＥ１Ｂ−５５Ｋ特異的モノクローナル抗体である９Ｃ１０（αＥ１Ｂ）、ｐ５３特異的モノクローナル抗体であるＤＯ−１（αｐ５３）、およびＥ４ｏｒｆ６特異的ポリクローナル抗体であるＰ８０７−３（αＥ４）を用いる間接的免疫蛍光染色により分析した。代表的視野を全ての場合について示す。
【図４】
図４は、３２℃および３９℃でのｐ５３−ヌルＩＩ１２９９細胞における、感染後の時間を関数とした、ｄｌ３０９、ＯＮＹＸ−０１５、０５１、および０５３の複製を示す。ＩＩ１２９９細胞を、２つの温度（３２℃および３９℃）で感染させた。３２℃での感染を、３９℃から温度をシフトさせた１時間後に行った。全ての感染を、５のＭＯＩで行った。感染した細胞を、それぞれ、３２℃および３９℃でインキュベートした。示した時間で、感染した細胞および培養培地を、収集し、プールし、そして凍結−融解を３回行って、ウイルス粒子を放出させた。ウイルス収量を、２９３細胞の単層に対するＥＬＩＳＡにより決定した。総ウイルス収量を、感染時の細胞の数で除算して、１細胞あたりのウイルス産生を決定した。結果は、２つの独立した実験の平均である。
【図５】
図５は、アデノウイルス感染の後期の間のタンパク質発現を示す。Ａ５４９細胞を、モック感染させるか、または１０のＭＯＩで種々のアデノウイルス変異体に感染させるかのいずれかを行った。感染の２４時間後、細胞を、［３５Ｓ］メチオニン−システインを用いて３時間標識した。細胞抽出物を、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルにより分離した。分子量マーカーの位置を左に示す。
【図６】
図６は、腫瘍細胞における細胞溶解活性を示す。ＤＵ１４５細胞およびＵ２ＯＳ細胞を、２％ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌ非必須アミノ酸、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ−高グルコースを用いて、９６ウェルプレートに２．５×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。播種の２４時間後、細胞を、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ変異体ウイルスの連続３倍希釈物（３０のＭＯＩで開始）で感染させた。ｄｌ３０９およびＯＮＹＸ−０１５をコントロールとして含んだ。細胞の５０％を殺すＭＯＩをＩＣ５０として規定し、そして各ウイルスについてプロットした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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