(57)【要約】本発明は、血清中のガン標識形質を同定する質量分析に基づいた方法およびヒトおよびヒト以外の被験体におけるガン診断における前記ガン標識形質の使用を提供する。当該発明は更に単離したガン標識形質を提供する。
2004504621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン標識形質を同定する、以下を含む方法：
（ｉ）ガンに罹ったヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離すること；
（ｉｉ）健常なヒトまたは動物被験体から得た血液画分を質量分析で分離すること；そして
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）における分子種のプロフィールを比較し、（ｉ）において（ｉｉ）と比較して加減したレベルを有する分子種を同定すること、ここで当該分子種の増加または減少したレベルは当該分子種がガン標識形質であることを示す。
【請求項２】
質量分析がマトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ）を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
質量分析がエレクトロスプレイ質量分析を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
ガン標識形質が糖脂質である、請求項１の方法。
【請求項５】
糖脂質がガングリオシドである、請求項４の方法。
【請求項６】
ガン標識形質がオリゴ糖である、請求項１の方法。
【請求項７】
ガンが、ヒトの卵巣ガン、結腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、肺ガン、前立腺ガン、尿道ガン、子宮ガン、急性リンパ白血病、ホジキン病、小細胞肺ガン、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および軟組織肉腫からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項８】
ガンが、ヒトではない動物のリンパ腫（数種）、黒色腫、肉腫および癌腫からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項９】
癌腫が腺ガンである、請求項７の方法。
【請求項１０】
血液画分が血清画分である、請求項１の方法。
【請求項１１】
ガンに罹った被験体からの血液画分を得る最初の工程を更に含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
健常な被験体からの血液画分を得る最初の工程を更に含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
ガンに罹った被験体からの血液画分または健常被験体からの血液画分に存在するガン標識形質の存在量を測定すること、或いは前記血液画分に存在する分子種の相対量を測定することを更に含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
ある特定のガンを示すガン標識形質を同定する、以下を含む方法：
（ｉ）ガンに罹ったヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離すること；
（ｉｉ）（ｉ）のガン以外のガンに罹ったヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離すること；
（ｉｉｉ）健常なヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離すること、そして
（ｉｖ）（ｉ）並びに（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における分子種のプロフィールを比較し、（ｉｉｉ）と比較して（ｉ）または（ｉｉ）において加減したレベルを有する分子種を同定すること、ここで当該加減したレベルは当該分子種がある特定のガンを示すガン標識形質であることを示す。
【請求項１５】
質量分析がマトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ）を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
質量分析がエレクトロンスプレイ質量分析を含む、請求項１４の方法。
【請求項１７】
がん標識形質が糖脂質である、請求項１４の方法。
【請求項１８】
糖脂質がガングリオシドである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
ガン標識形質がオリゴ糖である、請求項１４の方法。
【請求項２０】
ガン標識形質が、ヒトの卵巣ガン、結腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、肺ガン、前立腺ガン、尿道ガン、子宮ガン、急性リンパ白血病、ホジキン病、小細胞肺ガン、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および軟組織肉腫からなる群より選択される特定のガンを示すものである、請求項１４の方法。
【請求項２１】
ガン標識形質が、ヒトではない動物のリンパ腫（数種）、黒色腫、肉腫および癌腫からなる群より選択される特定のガンを示すものである、請求項１４の方法。
【請求項２２】
癌腫が腺ガンである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
血液画分が血清画分である、請求項１４の方法。
【請求項２４】
被験体のいずれか一つ以上からの血液画分を得る最初の工程を更に含む、請求項１４の方法。
【請求項２５】
前記血液画分のいずれか一つ以上におけるガン標識形質の存在量または相対量を測定することを更に含む、請求項１４の方法。
【請求項２６】
ある特定のガンを示すガン標識形質を同定する、以下を含む方法：
（ｉ）ヒトまたは動物の被験体から得た血液画分のパネルを質量分析で分離すること（ここで前記パネルの各要素は別個のガンに罹った被験体から得たものである）；
（ｉｉ）健常なヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離すること；
（ｉｉｉ）（ｉ）における血液画分の前記パネルの各要素から得た分子種のプロフィールを、互いに及び（ｉｉ）における血液画分から得た分子種のプロフィールと比較すること、そして
（ｉｖ）（ｉｉｉ）から、（ｉｉ）における血液画分のプロフィールと比較して（ｉ）における前記パネルの一つの要素において加減したレベルを有する分子種を同定すること、ここで当該加減したレベルは当該分子種がある特定のガンを表すガン標識形質であることを示す。
【請求項２７】
質量分析がマトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ）を含む、請求項２６の方法。
【請求項２８】
質量分析がエレクトロンスプレイ質量分析を含む、請求項２６の方法。
【請求項２９】
ガン標識形質が糖脂質である、請求項２６の方法。
【請求項３０】
糖脂質がガングリオシドである、請求項２９の方法。
【請求項３１】
ガン標識形質がオリゴ糖である、請求項２６の方法。
【請求項３２】
ガン標識形質が、ヒトの卵巣ガン、結腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、肺ガン、前立腺ガン、尿道ガン、子宮ガン、急性リンパ白血病、ホジキン病、小細胞肺ガン、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および軟組織肉腫からなる群より選択される特定のガンを示すものである、請求項２６の方法。
【請求項３３】
ガン標識形質がヒトではない動物のリンパ腫（数種）、黒色腫、肉腫および癌腫からなる群より選択される特定のガンを示すものである、請求項２６の方法。
【請求項３４】
癌腫が腺ガンである、請求項３３の方法。
【請求項３５】
血液画分が血清画分である、請求項２６の方法。
【請求項３６】
いずれか一つ以上の被験体からの血液画分を得る最初の工程を更に含む、請求項２６の方法。
【請求項３７】
前記血液画分のいずれか一つ以上においてガン標識形質の存在量または相対量を測定することを更に含む、請求項２６の方法。
【請求項３８】
ヒトまたは動物被験体におけるガンの診断または検出のための、以下を含む方法：
（ｉ）ガンに罹っている疑いがあるヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を含む試験試料を質量分析で分離すること；
（ｉｉ）健常な被験者から得た血液画分を含む対照試料を質量分析で分離すること；そして
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）においてガン標識形質のレベルを比較すること、ここで対照試料と比較して試験試料中の前記ガン標識形質の増加または減少したレベルは（ｉ）における被験体がガンに罹っていることを示す。
【請求項３９】
質量分析がマトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ）を含む、請求項３８の方法。
【請求項４０】
質量分析がエレクトロンスプレイ質量分析を含む、請求項３８の方法。
【請求項４１】
ガン標識形質が糖脂質である、請求項３８の方法。
【請求項４２】
糖脂質がガングリオシドである、請求項４１の方法。
【請求項４３】
糖脂質が、質量分析で測定された以下からなる群より選択される分子量を有する、請求項４１または４２に記載の方法：
（ｉ）１４３９から１４５９　Ｄａ（平均質量１４５４　Ｄａ）の範囲の分子量；
（ｉｉ）１５８７から１５９７　Ｄａ（平均質量１５９２　Ｄａ）の範囲の分子量；
（ｉｉｉ）１６１６から１６２６　Ｄａ（平均質量１６２１　Ｄａ）の範囲の分子量；
（ｉｖ）１６７１から１６８１　Ｄａ（平均質量１６７６　Ｄａ）の範囲の分子量；
（ｖ）１６８１から１６９１　Ｄａ（平均質量１６８６　Ｄａ）の範囲の分子量。
【請求項４４】
ガン標識形質がオリゴ糖である、請求項３８の方法。
【請求項４５】
オリゴ糖が、質量分析で測定された以下からなる群より選択される分子量を有する、請求項４４に記載の方法：
（ｉ）８０９から８１９Ｄａ（平均質量８１４Ｄａ）の範囲である分子量；および
（ｉｉ）１０１６から１０２６Ｄａ（平均質量１０２１Ｄａ）の範囲である分子量。
【請求項４６】
ガンを持つ疑いのある被験体および健常被験体がヒトである、請求項３８の方法。
【請求項４７】
ガンが、卵巣ガン、結腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、肺ガン、前立腺ガン、尿道ガン、子宮ガン、急性リンパ白血病、ホジキン病、小細胞肺ガン、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および軟組織肉腫からなる群より選択されるものである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
ガンを持つ疑いのある被験体および健常被験体がヒトでない動物である、請求項３８の方法。
【請求項４９】
ガンは、リンパ腫（数種）、黒色腫、肉腫および癌腫からなる群より選択したものである、請求項４８の方法。
【請求項５０】
癌腫が腺ガンである、請求項４９の方法。
【請求項５１】
血液画分が血清画分である、請求項３８の方法。
【請求項５２】
いずれか一つ以上の被験体からの血液画分を得る最初の工程を更に含む、請求項３８の方法。
【請求項５３】
前記血液画分のいずれか一つ以上におけるガン標識形質の存在量または相対量を測定することを更に含む、請求項３８の方法。
【請求項５４】
ヒトまたは動物の被験体中のガン進行を監視するのに用いる際の、請求項３８の方法。
【請求項５５】
ヒトまたは動物の被験体におけるガンの診断または検出のための、以下を含む方法：
（ｉ）ガン標識形質を同定するために請求項１から１４の方法を実施すること；そして
（ｉｉ）ガンを持つ疑いがあるヒトまたは動物の被験体からの血液画分に存在する前記ガン標識形質のレベルを測定すること、ここで健常な血液画分と比較して前記ガン標記形質の加減したレベルは、当該被験体がガンに罹っていることを示す。
【請求項５６】
血液画分中のガン標識形質のレベルを、質量分析、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫検定法からなる群より選択される方法で測定する、請求項５５の方法。
【請求項５７】
（ｉ）１４３９から１４５９Ｄａ（平均質量１４５４Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｉ）１５８７から１５９７Ｄａ（平均質量１５９２Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｉｉ）１６１６から１６２６Ｄａ（平均質量１６２１Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｖ）１６７１から１６８１Ｄａ（平均質量１６７６Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｖ）１６８１から１６９１Ｄａ（平均質量１６８６Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｖｉ）８０９から８１９Ｄａ（平均質量８１４Ｄａ）の範囲の分子量を有するオリゴ糖；および
（ｖｉｉ）１０１６から１０２６Ｄａ（平均質量１０２１Ｄａ）の範囲の分子量を有するオリゴ糖
からなる群より選択される単離ガン標識形質。
【請求項５８】
ガン標識形質が癌腫用の標識形質である、請求項５７の方法。
【請求項５９】
癌腫のためのガン標識形質を同定する、以下を含む方法：
（ｉｖ）癌腫を持つ被験体から得た血液画分をマトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ）により分離すること；
（ｖ）健常な被験体からの血液画分をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳにより分離すること；そして
（ｖｉ）（ｉ）および（ｉｉ）における分子種のプロフィールを比較し、（ｉｉ）と比較して（ｉ）において加減したレベルを有する分子種を同定すること、ここで当該分子種の増加または減少したレベルは当該分子種が癌腫を示すガン標識形質であることを示す。
【請求項６０】
被験体における癌腫を診断または検出するための、以下を含む方法：
（ｉ）ガンの疑いがある被験体からの血液画分を含む試験試料をマトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ）で分離すること；
（ｉｉ）健常被験体からの血液画分を含む対照試料をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分離すること；そして
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）におけるガン標識形質のレベルを比較すること、ここで対照試料と比較して試験試料中における前記ガン標識形質の増加または減少したレベルは（ｉ）における被験体がガンに罹っていることを示し、ここで当該ガン標識形質は以下からなる群より選択されるものである：
（ａ）１４３９から１４５９Ｄａ（平均質量１４５４Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｂ）１５８７から１５９７Ｄａ（平均質量１５９２Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｃ）１６１６から１６２６Ｄａ（平均質量１６２１Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｄ）１６７１から１６８１Ｄａ（平均質量１６７６Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｅ）１６８１から１６９１Ｄａ（平均質量１６８６Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｆ）８０９から８１９Ｄａ（平均質量８１４Ｄａ）の範囲の分子量を有するオリゴ糖；および
（ｇ）１０１６から１０２６Ｄａ（平均質量１０２１Ｄａ）の範囲の分子量を有するオリゴ糖。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はガンの診断、より詳しくは質量分析（ＭＳ），特にマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法（以後“ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ”）またはエレクトロスプレイＭＳを用いたガンの診断用方法に関する。本発明の方法は、ヒトまたは動物の被験体における一つ以上のガン性細胞または腫瘍の存在を検出し、場合により一つ以上の分子種、詳しくは糖脂質、ガングリオシドまたはオリゴ糖の増加および／または低減したレベルにつき前記被験体の血液または血清を検定することでガンまたは悪性腫瘍の型を同定することを目的に実施することができる。
【０００２】
一般的事項
本明細書を通して、当該文脈が他に要求しなければ単語“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”または“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”或いは“含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”ような変形は、陳述した工程または要素または完全体或いは工程の群または要素の群または完全体の群の包含を意味し、他のいかなる工程または要素または完全体或いは要素の群または完全体の群の排除を意味しないと理解されるものである。
【０００３】
当技術分野の当業者であれば、本明細書で説明した発明は限定して説明したもの以外は変更および修正を受ける余地があることは理解するであろう。当該発明には全てのそのような変更および修正が含まれることは理解されるべきである。当該発明には同様に本明細書で個々にまたはまとめて言及または示した全ての工程、特徴、組成物と化合物および前記した工程、特徴、組成物および化合物のいずれか並びに全ての組合せまたはいずれか二つ以上が含まれる。
【０００４】
本発明は本明細書で説明した特定の態様は例示目的のみを意図としたもので、範囲を制限するものではない。本明細書で説明したように機能的に同等な生産物、組成物および方法は明らかに当該発明の範囲内である。
【０００５】
本明細書におけるいずれの先行技術文書についての参照は、単に本特許を更に説明する目的のみでなされたもので、前記文書がオーストラリアまたは他地域における当業者の一般常識の一部を形成していることの証拠または認定として受け取るものではない。
【０００６】
本明細書で用いる単語“から（ｆｒｏｍ）”または“の（ｏｆ）”および用語“から由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ）”は、一定の生成物、特に例えばポリペプチド、蛋白質、遺伝子または核酸分子、抗体分子、Ｉｇ画分または他の分子のような分子または前記分子を含んでいる生体試料は一定の原料、生物、組織、器官または細胞から、直接その原料、生物、組織、器官または細胞からの必要性はないが得ることができるということを示している。
【０００７】
本明細書で用いる“ガン”は、例えばリンパ系および／または血流を通じてのようにヒトまたは動物の身体またはその一部の全体に侵襲的成長および転移できるものを含んだ広い範囲の良性または悪性腫瘍のいずれか一つ以上を意味すると受け取るべきものである。本明細書で用いる用語“腫瘍”には良性または悪性腫瘍の両方または固形物成長が含まれるが、本発明は特に悪性腫瘍および固形ガンの診断および検出について述べる。典型的なガンには例えばヒトの卵巣ガン、結腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、肺ガン、前立腺ガン、尿道ガン、子宮ガン、急性リンパ白血病、ホジキン病、小細胞肺ガン、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および軟組織肉腫のような癌腫、リンパ腫または肉腫；および動物のリンパ腫（数種）、黒色腫、肉腫および腺ガンを含むが、これに限らない。
【０００８】
本明細書で説明し、当該請求項で定義した本発明の文脈における用語“ガン標識形質”はヒトまたは動物被験体の血液画分中で検出できて、被験体内のガンを示唆し、とりわけ被験体のガン細胞または平常細胞に産生されまたは存在する分子で、そのレベルがガンを有する被験体の循環系では健常被験体の循環系におけるレベルと比較して加減を受けているいずれかの分子を意味すると受け止めるべきものである。当該用語“ガン標識形質”には同じように（ｉ）ガン細胞から、またはガン細胞上に発現され、その発現は正常細胞に比べてガン細胞上で増加している分子；または（ｉｉ）正常細胞により、または正常細胞上に発現されるがガン細胞上では発現しない、またはガン細胞から発する分子或いはその発現が正常細胞と比較してガン細胞により低減されるかガン細胞上で低減する分子が含まれる。
【０００９】
当該用語“ガン細胞標識形質”は当技術分野の当業者であれば、ガン細胞上に特異的に発現する、またはその発現は正常細胞と比較してガン細胞上では増加するいずれの分子を意味すると理解されるものである。
【００１０】
典型的ガン標識形質またはガン細胞標識形質には、例えば蛋白質、核酸、脂質、糖脂質、糖蛋白質、糖（単糖、二糖類、オリゴ糖など）が含まれるが、とりわけ要求される唯一のものはそれらが一定の異常、表現型または細胞型に関連し、検定法で検出できるものである。
【００１１】
本明細書で用いられる“糖脂質”とは一つ以上の炭水化物部分を有する脂質または脂肪酸分子で、ガングリオシドを含む。
当分野の当業者であれば“ガングリオシド”とはシアル酸（即ち、脂肪酸置換スフィンゴシンがＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよび／またはＮ−アセチルノイラミン酸を含むオリゴ糖に結合した糖脂質）を含有したスフィンゴ糖脂質で、哺乳類細胞膜の大半で発現していることを知っているものである。ガングリオシド類はシアル酸のグリコシル化程度によりモノ、ジ、トリまたはポリ−シアロガングリオシド類がある。標準命名法では、用語“ＧＭｎ”、“ＧＤｎ”、“ＧＴｎ”が使用され、そこでは“Ｇ”はガングリオシドを示し；“Ｍ”はモノシアリルガングリオシドを示し、“Ｄ”はジシアリルガングリシドを示し、“Ｔ”はトリシアリルガングリオシドを示し；そこでは“ｎ”は少なくとも１の値を有する数指標または少なくとも１ａ（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃなど）の値を有する文字数字式で、当該分子で見られる結合様式を示している［Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｉｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．２９４〜２９６（Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１）；Ｗｉｅｇａｎｄｔ，Ｉｎ：Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ：Ｎｅｗ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．１９９〜２６０（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他，編集，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５）］。
【００１２】
本明細書で称する分子の分子量はドルトンで、正式に受け入れられている命名法に一致している略号“Ｄａ”で示している。
発明の背景
医学研究における多くの進歩に関わらず、ガンは世界中で主な死因のままであり、外科的切除、放射線治療、化学的治療または他の既知治療法による適切な治療行為を容易にするガンの早期診断用の迅速で簡易な方法に対しての必要性がある。ガンについての良い診断用方法の有用性は処置に対する患者の反応を評価し、または発生部位または転移における再生による再発の評価を行うのにも同様に重要である。
【００１３】
例えば腫瘍遺伝子生成物、成長因子および成長因子受容体、脈管形成性因子、プロテアーゼ、接着因子および腫瘍抑制遺伝子生成物などのガン標識形質の特徴付けは、ヒトまたは動物被験体におけるガンの危険性、存在、状態または将来挙動に関する重要な情報を提供する。一つ以上のガン標識形質の存在、発現のレベルを測定するのは、例えば悪性を良性の異常から識別するなど不明確な臨床上の異常を持つ患者の識別診断で役に立つことができる。更に、認められた悪性を示す患者では、ガン標識形質は将来再発の危険性または選択する治療コースに対する一定の患者における反応の見込を予測するのに有用でありうる。高度に特異的なガン標識形質または標識形質の組合せを分析すれば更により明白な情報が得られ、特異な薬剤または治療選択肢に対する患者の反応を予測できるだろう。
【００１４】
被験体のガン細胞を検出するための多くの既知方法は、患者試料中の一つ以上の高分子量種または高分子量分子種の検出に頼っている。免疫検定法は試料中の特定のガン細胞標識形質に特異に結合する抗体分子、特にモノクローナル抗体と共に試料をインキュベーションすることを含有する。或いは、遺伝的試験は、例えば腫瘍性蛋白質のような蛋白性ガン細胞標識形質をコードしている試料中の核酸に核酸プローブを結合させることを包含する。免疫検定法または遺伝的検定法の出現以前は、多くのガン細胞標識形質は一般的に多くの試験試料を必要とする従来の生化学的検定方法を用いて検出または測定することができるだけであったので、多くの臨床的応用には不適であった。対照的に、現代の免疫検定法および遺伝的検定手法は生検を含む比較的極少量の試料または血清でガン細胞標識形質を検出および測定できる。
【００１５】
高分子量（ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ／ｍａｓｓ）ガン細胞標識形質を同定するための存在する検定手法の利点に関わらず、そのような方法は当該標識形質の前もっての同定、当該標識形質の次なる検出を容易にする適切なプローブの前もっての単離および検定手順それ自体で時間がかかる結合工程を必要とする。高および低分子量のガン標識形質（およびガン細胞標識形質）の両方を検出し、試料処理および分析を容易にする迅速処理方法（例えば、プローブの単離またはそのようなプローブを利用する結合反応を必要としない工程のような）に対して明確な必要性が存在する。
【００１６】
それに付け加え、免疫検定法および遺伝的検定法はおそらく検出された抗体または核酸が腫瘍に特異的なので、試料中のある特定なガン細胞標識形質の存在を測定するのに一般的に使用される。すべての特定ガン標識形質の増加または減少レベルを検出するための一般的な方法が必要とされている。
【００１７】
これに加えて、循環における腫瘍特異な抗原の検出に依存しているガン特異な血液試験が数多く開発された（Ｃａｔａｌｏｎａ他，Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ．Ｍｅｄ．３２４，１１５６〜１１６１，１９９１；Ｂａｒｒｅｎｅｔｘｅａ他，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　５５，４４７〜４４９，１９９８；Ｃａｉｒｎｓ他，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１４２３，Ｃ１１〜Ｃ１８，１９９９）にも関わらず、ガン標識形質検定法に対し一般的に血清試料を用いる努力は限られた成功で満足するに過ぎなかった。そのような限られた成功は、免疫検定法または遺伝的検索手法を用いても血清ではある特定の標識形質が検出されないか、或いはある特定の標識形質のレベルでの変化が血清では測定できないからである。明らかに、血清中でのガン標識形質の存在を検出するための再現性があり、信頼性のある工程の必要性が存在する。
【００１８】
発明の概要
本発明への序盤となる研究では、当該発明者はヒトまたは動物の被験体の血液中に存在する高および低分子量ガン標識形質の両方を同定するための一般的工程の開発およびガン標識形質または腫瘍特異標識形質（即ち、正常細胞と比べて腫瘍細胞において増加したガン標識形質）の検出への応用に限られることなく、および／または例えば抗体または核酸プローブのような分子プローブの単離に依存せず、および／またはそのような分子プローブを用いる時間のかかる結合工程を必要としない悪性疾患の検出をする際の関連した高処理能の診断方法を開発することを求めた。
【００１９】
当該発明者は質量分析法（ＭＳ）が，被験体の血液または血清中に存在する一連のガン標識形質、とりわけ健常被験者に比べガンに罹った被験体の循環系ではその存在量が加減を受ける（即ち、増加または減少する）糖脂質またはオリゴ糖の同定に特に適していることを発見した。
【００２０】
当技術分野の当業者であれば、例えばエレクトロスプレイＭＳまたはＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳのような質量分析法が、任意の化合物の質量の分析に適当であるかどうかは実験的に決定しなければならないということには気がつくであろう。これは質量分析計の性能は単に質量分解能で部分的に定義されているに過ぎないからである。他の重要な特質は質量の正確さ、感度、信号‐雑音比およびダイナミックレンジである。全体の性能を規定する種々の因子の相対的重要性は試料の型および分析の目的に依存するが、一般的にはある一定の用途に際して満足な性能を得るためには幾つかのパラメータを特定して同時に最適化しなければならない。本発明者は血液または血清画分に存在するガン標識形質の同定の際、およびガン細胞標識形質における加減の分析によりガンの迅速で正確な診断を補助する際の質量分析の有用性をここで示した。
【００２１】
従って、本発明の一つの側面ではガン標識形質を同定する方法を提供するが、それは：
（ｉ）ガンが存在するヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉ）健常なヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し、そして
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）における分子種のプロフィールを比較し、（ｉ）において（ｉｉ）と比較して加減したレベルを有する分子種を同定すること、ここで前記分子種のレベルの増加または減少は当該分子種がガン標識形質であることを示唆する、を含む。
【００２２】
当該発明の本側面に従って同定された当該ガン標識形質が、ヒトまたは動物被験体におけるガンのある特定型を示すことができ、それによりその型のガンの診断または検出の補助ができるのは当業者に明らかであろう。従って、当該発明の二番目の側面はある特定のガンを示すガン標識形質を同定する方法を提供し、前記方法は：
（ｉ）ガンに罹ったヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉ）（ｉ）のガン以外のガンに罹ったヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉｉ）健常なヒトまたは動物の被験者から得た血液画分を質量分析で分離し、そして
（ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における分子種のプロフィールを比較し、（ｉｉｉ）と比較するとき（ｉ）または（ｉｉ）で加減したレベルを有する分子種を同定すること、ここでこの加減したレベルは、当該分子種が特定のガンを示すガン標識形質であることを示す、を含む。
【００２３】
別の態様では、当該発明の側面はある特定のガンを示すガン標識形質の同定方法を提供するが、前記方法は：
（ｉ）ヒトまたは動物の被験体から得た血液画分のパネルを質量分析で分離し（ここで前記パネルの各要素は別個のガンに罹った被験体から得たもの）；
（ｉｉ）健常なヒトまたは動物からの血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉｉ）（ｉ）における血液画分の前記パネルの各要素から得た分子種のプロフィールを互いに比較し、及び（ｉｉ）における血液画分から得た分子種のプロフィールと比較し、そして
（ｉｖ）（ｉｉ）における血液画分のプロフィールと比較したとき（ｉ）における前記パネルの一つの要素において加減したレベルを有する分子種を（ｉｉｉ）から同定すること、ここで加減したレベルを持つ分子種は、当該分子種がある特定のガンを表すガン標識形質であることを示唆する、を含んでなる。
当該発明の三番目の側面は、ヒトまたは動物の被験体におけるガンの診断または検出に関し、前記方法は少なくとも一つの質量分析の工程を採用している。
【００２４】
本側面の一つの態様では、当該発明はヒトまたは動物の被験体中のガンを診断または検出する方法を提供するが、それは：
（ｉ）ガンに罹っているとの疑いがあるヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を含む試験試料を質量分析で分離し；
（ｉｉ）健常な被験者から得た血液画分を含む対照試料を質量分析で分離し；そして
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）におけるガン標識形質のレベルを比較すること、ここで対照試料と比較して試験試料中の前記ガン標識形質のレベル増加または減少は（ｉ）における当該被験体はガンに罹っていることを示す、を含んでなる。
【００２５】
本明細書で提示した説明から、当該発明に従い質量分析を用いてガン標識形質を同定した後は、いかなる技術的に認められた方法でも被験体中の当該ガン標識形質のレベルが加減されたかどうかを測定するのに用いることができ、前記加減したレベルでガンの診断になることは明らかであろう。従って、質量分析は当該ガン標識形質の同定に使用されるのであって、実際の診断に使用する必要はない。従って、当該発明の別の態様はヒトまたは動物の被験体中のガンを診断または検出する方法を提供し、それは；
（ｉ）本明細書で説明した一つ以上の態様に従って質量分析でガン標識形質を同定し；そして
（ｉｉ）ガンに罹っていると疑われているヒトまたは動物の被験体から得た血液画分中に存在する前記ガン標識形質のレベルを測定すること、ここで健常血液画分と比較して前記ガン標識形質が加減を受けていれば当該被験体はガンに罹っていることを示唆する、を含む。
【００２６】
当該発明の四番目の側面は：
（ｉ）１４３９から１４５９Ｄａ（平均質量１４５４Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｉ）１５８７から１５９７Ｄａ（平均質量１５９２Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｉｉ）１６１６から１６２６Ｄａ（平均質量１６２１Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｖ）１６７１から１６８１Ｄａ（平均質量１６７６Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｖ）１６８１から１６９１Ｄａ（平均質量１６８６Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｖｉ）８０９から８１９Ｄａ（平均質量８１４Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質またはオリゴ糖；および
（ｖｉｉ）１０１６から１０２６Ｄａ（平均質量１０２１Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質およびオリゴ糖、からなる群から選択した単離ガン標識形質を提供する。
【００２７】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の一つの側面はガン標識形質を同定する方法を提供するが、これは：
（ｉ）ガンに罹っているヒトおよび動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉ）健常なヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；そして
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）における分子種のプロフィールを比較し、（ｉｉ）と比較して（ｉ）において加減したレベルを有する分子種を同定すること、ここで前記分子種のレベルの増加または減少は当該分子種がガン標識形質であることを示す、を含む。
【００２８】
好ましくは、本発明は例えばヒトの卵巣ガン、結腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、肺ガン、前立腺ガン、尿道ガン、子宮ガン、急性リンパ白血病、ホジキン病、小細胞肺ガン、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および軟組織肉腫のような癌腫、リンパ腫または肉腫；および動物のリンパ腫（数種）、黒色腫、肉腫および腺ガンのような癌腫、リンパ腫または肉腫からなる群から選択したガンについてのガン標識形質の同定に関する。当該発明の特に好ましい態様では、当該ガンは癌腫で、より好ましくは腺ガンである。
【００２９】
当技術分野の当業者であれば、質量分析は分子量の正確な測定、化学構造の同定、混合物の組成の測定および定性的元素分析用の分析手法であることは知っているはずである。操作において、質量分析計は検討する試料分子のイオンを発生させ、それらの質量‐電荷比によって当該イオンを分離し、各イオンの相対的量を測定する。好ましくは、本発明を実施する際に用いる質量分析系はＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦまたはエレクトロスプレイＭＳである。
【００３０】
質量分析分析を実施する一般的な工程は以下のようなものである：
（ｉ）試料からガス相イオンを作り出し；
（ｉｉ）それらの質量‐電荷比に基づいて空間または時間によりイオンを分離し；そして
（ｉｉｉ）各選択した質量‐電荷比のイオンの量を測定する。
【００３１】
当該用語“質量分析により血液画分を分離する”または本明細書で用いる同様な用語には前記工程の一つ以上が含まれると解釈する。
飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析は、例えば米国特許出願番号第５，０４５，６９４および米国特許出願番号第５，１６０，８４０に記載されているように、検討している試料材料のイオンを発生させ、発生したイオンが検出器に到着する時間を測定することでそれらのイオンをそれらの質量‐電荷比に従って分離する。ＴＯＦ質量分析計は、それらが比較的単純で、比較的高価であるがほとんど無制限な質量‐電荷比範囲を持つという利点がある。ＴＯＦ質量分析計は各イオン化現象から発生するイオン類を全て記録できるので走査型装置より高感度の可能性がある。ＴＯＦ質量分析計は従来の磁場型質量分析計では感度がない大きな有機分子の質量‐電荷比を測定するのに特に有効である。
【００３２】
ある電圧で加速されたイオンの飛行時間は質量‐電荷比に比例している。そこで、イオンの飛行時間はその質量‐電荷比の関数で、質量‐電荷比の平方根にほぼ比例している。単に一つの電荷を持つイオンの存在を考えると、イオン群の最も軽い群が最初に検出器に到達し、連続してより重い質量群の群が続く。
ＴＯＦ質量分析計は検討している分子種の分子量の非常に正確な推定値をこうして提供し、誤差は一般的に５Ｄａに過ぎないが、この大部分が検出器へ正確に同一の時間で到着しない質量および電荷の等しいイオンの結果である。この誤差は発生したイオンの初期の時間的、空間的および熱力学的エネルギー分布により質量スペクトルピークの広がりをもたらし、ＴＯＦ質量分析計の分解能を制限することで主に生じる。当該初期の時間的分布はイオン生成の時間における不確実性から生じる。
【００３３】
例えばプラズマ脱離およびレーザー脱離のようなパルスイオン化を用いると、試料上の極めて規定された範囲からイオンが生じ、イオン生成の初期空間の不確実性は無視できるほどなので、非常に短時間の間にイオンが生成し、最小限の初期空間分布を生じることになり、イオン生成の時間の確実性は更に増強される。
【００３４】
プラズマ脱離（ＰＤ）イオン化およびレーザー脱離（ＬＤ）イオン化のようなパルスイオン化は空間および時間において最小限の不確実性を伴うが、比較的広い初期エネルギー分布を伴うイオンを生成する。長いパルス長は質量分解能を極めて制限できるので、従来のＬＤは典型的には時間的不確実性を最小にするために十分短いパルス（しばしば１０ナノ秒未満）を用いる。
【００３５】
レーザーの波長を強く吸収する少量の有機マトリックス分子を試料材料に添加するとＬＤの性能が向上する（即ち、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、爾後“ＭＡＬＤＩ”）。当該マトリクッスは当該試料の脱離およびイオン化を容易にする。ＭＡＬＤＩは１００，０００　Ｄａ分子量を越す大きな生体分子を分裂なしで脱離およびイオン化を容易にするので特に生物応用で都合がよい。本発明を実施する際に好ましいマトリックスは４−ヒドロキシベンゼン−２−カルボン酸としても知られている２−（４−ヒドロキシアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）を含む。
【００３６】
ＭＡＬＤＩでは、試料は通常平滑な金属表面に析出させ、パルスレーザー光を当該試料上に当てることによりガス相に脱離させる。こうしてイオンは当該レーザーパルスの照射間にほぼ相当する短時間、および固体マトリックスおよび試料の部分に相当する非常に小さな区間領域で、蒸発するのに十分なエネルギーを吸収して生じる。ＭＡＬＤＩは飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析用の理想に近いイオン源を提供し、特に初期のイオン速度が小さい。ＭＡＬＤＩイオン源においてパルスイオン抽出法を用いると質量分解能において相当な改良が得られる。イオンレフレクター（一つ以上の均一で減速させる静電場で構成され、イオンミラーおよびリフレクトロンとも呼ばれる）は特に自由飛行領域の端において分析対象物の初期運動エネルギー分布効果を補うことで同じように知られている。当分野でのＭＡＬＤＩに対する追加的改良は、例えば米国特許出願第６，０５７，５４３号に記載されたように、分解能の改良、質量の正確さの向上、信号強度の増加およびバックグランドノイズの減少によるＭＡＬＤＩへの改良は、表面からのイオン生成に関する技術が知られている。
【００３７】
本発明は、血液画分に存在するガン標識形質の測定および／またはガンの診断を補助するための、全ての修正したＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ系の使用に及ぶ。　エレクトロスプレイＭＳまたはエレクトロスプレイイオン化ＭＳは液体試料マトリックスからガス相イオンを生成させ、試料を質量分析計に導入する。エレクトロスプレイＭＳはそのために液体クロマトグラフと質量分析計のインターフェースを提供するのに有効である。エレクトロスプレイＭＳにおいて、液体の分析対象物につき毛細管（爾後“ニードル”）を通過させ、そしてニードルの先端と対置の壁、毛細管入口または同様な構造体の間に電位差（例えば３千から４千ボルト）をかける。当該ニードルから流出する液体の流れは電場で高荷電の液滴へと拡散させられてエレクトロスプレイを形成する。例えば乾燥窒素ガスのような不活性乾燥ガスを流体の流れの噴霧化を強めるために取り囲んでいる毛細管に導入してもよい。エレクトロスプレイ液滴は電場に運ばれ、高真空に保たれた質量分析計に注入される。乾燥ガスおよび真空の組合せ効果により、液滴中のキャリアー液体は次第に蒸発し、より小さく不安定さを増した液滴が生じて表面イオンは分析用真空へと放たれる。脱溶媒和イオンは試料コーンおよびスキマーレンズを通過し、ＲＦレンズで収束された後、質量分析計の高真空部に突入し、そこで質量に従って分離され、適当な検出器（例えば光増倍管）で検出される。好ましい液体流速は当該溶媒組成に依存するが２０〜３０マイクロリットル／分が用いられる。早すぎる流体速度は溶解している試料の不安定で不充分なイオン化が生じるので、その場合は空気支援エレクトロスプレイニードルを使用するのがよい。
【００３８】
当技術分野の当業者であればＭＳ環境に導入するために、分析する血液画分を調製する必要があることは同様に知っているはずである。好ましくは、当該試料は少なくとも実施例１に記述したように必ず脱塩しておく。より好ましくは、当該試料は分析前に少なくとも一つの標準的クロマトグラフィーまたは精製工程を用いて分画しておく。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳを使用する場合、当該試料は適切なマトリックスと混合して乾燥しておくのに対し、エレクトロスプレイＭＳの場合、当該試料は適当なキャリアー溶液に溶かした液体試料として直接注入されるだろう。
【００３９】
当該用語“ガンに罹っている被験体”とは、当該発明した方法により試験試料として用いる血液画分を採取する時に、当該被験体はガンに関する一つ以上の症状を示すか、以前にガンに罹っていることを診断された被験者であることを意味すると理解される。
【００４０】
本明細書で用いる用語“健常な被験体”とは、血液画分を採取するときはガンに関連した症状をなにも示していないか、または血液画分を採取するときには症状が寛解しているか、または血液画分を採取するとき血液または血清中に以前診断された腫瘍の転移を示さない被験体を意味すると受け取る。従って、“健常な被験体”はガンに罹っていると疑われる被験者と違う必要はない。例えばガン発生の危険がある個体のように、ある個体が異なる時に血液画分を提供することもあり得て、その場合何かの症状発生に先立って採取した初期の血液画分は後期の試験を受ける血液画分に対する対照試料として用いられる。代わりに、寛解期または随伴治療時の被験体からの血液画分は、同じ被験体でも例えば病気の進行を監視するために早期または後期に採取した血液画分に対する対照試料として用いてよい。
【００４１】
“対照試料”とは、ある完全体の既知なる組成または内容を有している試料を意味し、これに対して試験試料の比較がなされる。対照試料の源に対して唯一必要なことは、試料が検出するガン標識形質を病気と一致したレベルを含有しないことである。
【００４２】
全血または細胞全体を質量分析で分画させるのは通常ではないことは前に述べた説明から明らかである。その代わり、分析すべき分子種を含有している画分、特に糖脂質またはオリゴ糖を含む血液画分、より好ましくはガングリオシドを含む血液画分を当該質量分析計にかける。そのような血液画分は当技術分野の当業者であれば知っている標準方法で調製できるし、過度の実験をせずに本明細書に記述した方法に従って調製できる。
【００４３】
“血液画分”とは血液のいずれかの派生物を意味し、血液の上澄みまたは沈殿物、血清画分または血漿画分、バッフィーコート画分、Ｔ細胞濃縮画分、血小板濃縮画分、血小板赤血球濃縮画分、好塩球濃縮画分、好酸球濃縮画分、リンパ球濃縮画分、単球濃縮画分、好中球濃縮画分またはいずれか部分精製或いは精製した成分或いは、なにか他の血液成分を混合したかまたはしない血液が含まれていると解釈する。血液画分は、例えば沈殿剤（例えば、低温、酸、塩基、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールなど）またはクロマトグラフィーによる分画（例えば、サイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、質量分析など）による血液の処理で得られる。
【００４４】
当該発明を実施する際に使用する特に好ましい血液画分は血清画分である。本明細書において、用語“血清画分”は血清からの由来試料を意味する。血清画分の例には血漿蛋白質画分（例えば、アルブミン画分、フィブリノーゲン（第Ｉ因子）画分、血清グロブリン画分、第Ｖ因子画分、第ＶＩＩＩ因子画分または第ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ因子を含むプロトロンビン複合画分）、血漿の寒冷型上清成分または寒冷型沈降物、新鮮凍結血漿の寒冷型上清成分または寒冷型沈降物、血漿画分の寒冷型上清成分または寒冷型沈降物、或いは血清の部分精製成分または精製した成分のいずれでも他の血清成分のいずれかと混合物した或いはしないものが含まれる。血清画分は、例えば血清を沈殿剤（例えば、低温、酸、塩基、硫酸アンモニア、ポリエチレングリコール他）で処理するか、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、質量分析他）を用いた分画で得られる。
【００４５】
好ましくは、当該発明の本側面では更に当該血液画分、好ましくは血清の沈降物として得て、および／または好ましくは脱塩、および／または好ましくは例えばポリカーボンマトリックスを用いるような疎水性相互作用クロマトグラフィーで分画する最初の工程が含まれる。当業者に知られている手順に従った当該血液画分を得る他の方法も本明細書では明らかに予想される。
【００４６】
本発明の方法は血液または血清につき実施されるので、実施するのは簡便であり非侵襲的である。
本発明の通りで同定される“分子種”は糖脂質、特にガングリオシドまたはオリゴ糖化合物である。好ましいが必ずしも必要としないのは、当該分子種がその発現のために活性化免疫系または機能的免疫系の存在を必要としている限り、免疫系依存であることである。本明細書で例証した如く、１０２１Ｄａ（分子量範囲は１０１６〜１０２６Ｄａ）のガン標識形質は硫酸デキストランで処理したマウスの血清画分で検出され、ヌードマウス血清画分には検出されないので、その標識形質の発現は免疫系に強く依存し、腫瘍の形成はその発現を減少させまたは細胞表面からのその脱落を引き起こす。本明細書で用いる如く、用語“免疫系依存”には、当該ガン標識形質が確実に発現するようにというＴ細胞機能の要求、またはある特定のガン標識形質が通常Ｔ細胞にて発現する、またはその代わりに腫瘍形成期間好ましくは転移以前のいずれかの段階でＴ細胞から放出される徴候が含まれる。
【００４７】
“分子種のプロフィールを比較すること”はガン試料から得た血液画分の分子量プロフィールをガン試料から得た血液画分の分子量プロフィールと比較または並べてその違いを表示することを意味する。当技術分野の当業者であれば、試料の質量分析用の条件を操作してある分子種のピーク高さまたはあるピークの面積は試料中のその分子量種の存在量に比例するのを保証できることは知っているものである。従って、二つの試料の分子質量スペクトルを重ねてピーク高さの違いを測定することができるので、そこにある分子種の存在量を定量するのに集めたピーク試料を更に定量する必要性は厳密にはない。それにもかかわらず、当該発明にはガンに罹った被験体または健常被験体の血液画分のいずれかで同定した全ての候補分子種の存在量、および／または前記血液画分に存在する分子種の相対量を定量する工程が明らかに含まれている。これには血液画分が由来する血液または血清中に存在するその分子種の量および相対量の定量が含まれる。試料中に存在するガングリオシドまたはオリゴ糖のレベルの測定用標準検定法、例えば当該ピーク画分に関する免疫化学分析のようなものを使用してもよい。
【００４８】
好ましくは、当該発明のこの側面による方法にはガン標識形質の更なる特性決定、特にその分子量による特性決定が含まれる。ガン標識形質の分子量（Ｄａ）は既知の質量の標準化合物に対する質量分析により、分子量計算値での最大誤差±５　Ｄａ、より好ましくは±４Ｄａ，更により好ましくは±３Ｄａ、もっと好ましくは±２Ｄａおよび更にもっと好ましくは±１Ｄａで容易に測定される。
【００４９】
当該ガン標識形質は同じように、例えば当分野の当業者であれば知っている他の手法の中でＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ／ＱＴＯＦを用いたフラグメンテーション研究或いはグリコシルまたは脂質部分の酵素的代謝のようなもので更に構造的に特性決定もできる。
【００５０】
本発明者らはガンに罹った被験体の血清中で存在量が増加するガン標識形質を以下のように数多く同定した：
（ｉ）１４３９から１４５９Ｄａ（平均質量１４５４Ｄａ）の範囲の分子量を持つ糖脂質；
（ｉｉ）１５８７から１５９７Ｄａ（平均質量１５９２Ｄａ）の範囲の分子量を持つ糖脂質；
（ｉｉｉ）１６１６から１６２６Ｄａ（平均質量１６２１Ｄａ）の範囲の分子量を持つ糖脂質；
（ｉｖ）１６７１から１６８１Ｄａ（平均質量１６７６Ｄａ）の範囲の分子量を持つ糖脂質；および
（ｉｖ）１６８１から１６９１Ｄａ（平均質量１６８６Ｄａ）の範囲の分子量を持つ糖脂質。
これら５種類のガン標識形質の中で、種（ｉｖ）は健常被験体の血清中に低レベルであるが同様に検出でき、他の残りの標識形質は標準ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳでは検出できなかった。
【００５１】
本発明者は同じようにガンに罹った被験体の血清中でその存在量が減少している二つのガン標識形質を同定した。
（ｉ）８０９から８１９Ｄａ（平均質量８１４Ｄａ）の範囲の分子量を持つ糖脂質またはオリゴ糖；および
（ｉｉ）１０１６から１０２６Ｄａ（平均質量１０２１Ｄａ）の範囲の分子量を持つ糖脂質またはオリゴ糖。
【００５２】
当業者には、当該発明の本側面の通りに同定された当該ガン標識形質はヒトまたは動物被験体におけるガンの特定型を示すことができ、そしてガンの型を診断または検出する際に補助ができることは明らかである。例えば、生体外（インビトロ）研究にて異なるガン型はガングリオシドを独特なスペクトルで分泌するので（Ｋｏｎｇ他，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ　１３９４，４３〜５６，１９９８）、本明細書に記述した質量分析法が患者に存在するガン型の診断を補助するのにも使えることを示唆している。
質量分析を用いてガン特異的ガン標識形質を同定する際の唯一の必要事項は、当該特定標識形質がガン細胞のある特定型に限られ、全てのガン細胞型で一般的でないことを決定するために十分な数の血液画分を選別にかけることである。別個のガンを有する被験体から得た少なくとも二つの血液画分はこの決定を容易にするのに必要とされる。好ましくは、数種類の血液画分が使用される。
従って、当該発明の二番目の側面はある特定のガンを示すガン標識形質を同定するための方法を提供するが、前記方法は：
（ｉ）ガンに罹ったヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉ）（ｉ）のガンではないガンに罹っているヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉｉ）健常なヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における分子種のプロフィールを比較し；そして
（ｖ）（ｉｉｉ）と比較するとき、（ｉ）または（ｉｉ）においてレベルが加減された分子種を同定すること、ここでレベルが加減された当該分子種は一定のガンを示すガン標識形質である、を含む。
本態様では、当該分子種のレベルが３種血液画分の全て（即ち、ガンに罹った被験体から得た二つの試料および一つの健常被験体から得た対象血液画分）の血液で変動する必要性はない。これはある一定のガンを示すガン標識形質は、定義では単一のガンについてのみ量で変化するからで他の試料では正常なレベルで存在する。対照的に、二つのガン由来試料において異なるレベルで存在しない分子種はある特定のガンを示すことにはならないだろうが、もしこれらが正常細胞においてそれらのレベルにつき量で異なるならば本明細書で説明した当該発明の範囲内ではガン標識形質であろう。分析した試料のいずれにおいても異なるレベルで存在しない分子種はガン標識形質ではないということである。
別の態様では、当該発明の本側面ではある特定のガンを示すガン標識形質を同定する方法を提供するが、前記方法は：
（ｉ）ヒトまたは動物の被験体から得た血液画分のパネル、前記パネルの各要素は別個のガンに罹った被験体から得たものを質量分析で分離し；
（ｉｉ）健常なヒトまたは健常な動物から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉｉ）（ｉ）における血液画分の前記パネルの各要素から得た分子種のプロフィールを互いに比較し、（ｉｉ）における血液画分から得た分子種のプロフィールと比較し、そして
（ｉｖ）（ｉｉ）における血液画分のプロフィールと比較したとき（ｉ）における前記パネルの一つの要素において加減したレベルを有する分子種を（ｉｉｉ）から同定すること、ここでレベルが加減された当該分子種は特定のガンを表すガン標識形質であることを示す、を含む。
【００５３】
本明細書で使用する用語“別個のガン”は異なるガンの型を意味すると理解する。
正常細胞に比較して腫瘍細胞におけるいずれか特定な分子種のレベルの加減、特にガン標識形質のレベルの加減はガンの診断になりえる。従って、当該発明の三番目の側面はヒトまたは動物の被験体におけるガンの診断または検出に関係する。
【００５４】
本側面の一つの態様では、当該発明はヒトまたは動物の被験体におけるガンの診断または検出に関係する方法を提供し、それは：
（ｉ）ガンに罹っている疑いを持たれているヒトおよび動物の被験体から得た血液画分を質量分析で分離し；
（ｉｉ）健常なヒトまたは動物の被験体から得た血液画分を含む対照試料を質量分析で分離し；そして
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）におけるガン標識形態のレベルを比較すること、ここで対照試料と比較して試験試料中における前記ガン標識形質のレベルの増加または減少は（ｉ）の被験者がガンであることを示唆する、を含む。
【００５５】
本明細書において、用語“ガンの疑いがある被験体”とは被験体が単に検査をしていることを示していると理解するのであって、当該発明が当該被験体に対しある癌腫瘍形成または転移に関連するなんらかの症状を示すことを要求したり、または本明細書で記述する発明の診断検査の前になにか先行して診断検査をしなければならないというように理解するものではない。事実、本発明は特にガンの早期診断に馴染みやすいので、当該発明を実施する際に前もっての検査または評価は必須ではないが、そのような追加検査をいずれかの診断を確認するために採用してもよい。
【００５６】
当該ガンは好ましくは、癌腫、リンパ腫、肉腫、卵巣ガン、結腸ガン、乳ガン、膵臓ガン、肺ガン、前立腺ガン、尿道ガン、子宮ガン、急性リンパ白血病、ホジキン病、小細胞肺ガン、黒色腫、神経芽細胞腫および軟組織肉腫、リンパ腫（数種）、黒色腫、肉腫および腺ガンからなる群より選択する。特に好ましい当該発明の態様では、当該ガンは癌腫、より好ましくは腺ガンである。
【００５７】
前の検討から本明細書で説明した診断方法はガンの診断だけには限られないということは明らかで、ある被験体における病気の進行を、時間をかけ被験体の一つ以上のガン標識形質につきレベルを比較して観察するのに応用できる。寛解期の患者の場合、寛解期の初期に採取した試料は後の血液画分に対する比較用の標準として使用して被験体の状態を測定でき、ガン標識形質のレベルについての何らかの更なる加減は寛解期が終了したことを示唆する。同様に寛解または治癒へ導く治療が成功した、またはなにも転移を示さない患者については、治療後直ぐまたは転移の前に採取した試料は、それより後の血液画分に対する比較の標準として使うことができ、当該患者が腫瘍の再発または転移を起こしているかいないかは、ガン標識形質におけるレベルの加減のどちらかが再発または転移を示すことから決定できる。
【００５８】
当ガン診断方法を実施する際の質量分析用の試料調製は、ガン標識形質の同定のために前に記述したのと本質的に同じである。
前に列挙した小節（ｉｉｉ）の方法におけるガン標識形質の比較は、先行する解説で質量分析を用いてガン標識形質の同定に関して説明したのと同じように実施できる。
【００５９】
好ましくは当該発明の本側面には、更に当該血液画分を得る最初の工程、好ましくは血清の沈殿物としておよび／または好ましくは脱塩、および／または好ましくは例えばポリカーボンマトリックスを用いたような疎水性相互作用クロマトグラフィーでの分画が含まれる。当該血液画分を当業者に知られている手順に従って得る他の方法は明らかに本明細書でも予想される。
【００６０】
好ましくは、本発明の本側面に従った方法にはガン標識形質、特にその分子量による更なる特性決定が含まれる。当該ガン標識形質の分子量（Ｄａ）は質量分析によれば、既知の分子量をもつ標準化合物と対比することで、最大誤差が分子量計算値の±５Ｄａ、より好ましくは±４Ｄａ、更により好ましくは±３Ｄａ、一層より好ましくは±２Ｄａ、更に一層より好ましくは±１Ｄａで容易に測定される。
【００６１】
好ましくは、当該発明の診断方法の通りに比較した当該ガン標識形質は：
（ｉ）１４３９から１４５９Ｄａの範囲の分子量を有する糖脂質（平均質量１４５４Ｄａ）；
（ｉｉ）１５８７から１５９７Ｄａの範囲の分子量を有する糖脂質（平均質量１５９２Ｄａ）；
（ｉｉｉ）１６１６から１６２６Ｄａの範囲の分子量を有する糖脂質（平均質量１６２１Ｄａ）；
（ｉｖ）１６７１から１６８１Ｄａの範囲の分子量を有する糖脂質（平均質量１６７６Ｄａ）；
（ｖ）１６８１から１６９１Ｄａの範囲の分子量を有する糖脂質（平均質量１６８６Ｄａ）；
（ｖｉ）８０９から８１９Ｄａの範囲の分子量を有する糖脂質またはオリゴ糖（平均質量８１４Ｄａ）；および
（ｖｉｉ）１０１６から１０２６Ｄａの範囲の分子量を有する糖脂質またはオリゴ糖（平均質量１０２１Ｄａ）、からなる群より選択したものである。
【００６２】
本明細書で提供した説明から、ガン標識形質を一旦当該発明の通りに質量分析を用いて同定すると、技術的に認められた方法であればいずれの方法でも被験体中において当該ガン標識形質が受けた加減のレベルがどの程度かを測定する際に使用でき、前記加減したレベルはガンの診断に役立つものである。従って、質量分析はガン標識形質の同定に使用されれば、実際の診断で使用する必要はない。
【００６３】
従って、当該発明のそれに代わる態様では、ヒトまたは動物の被験体におけるガンを診断または検出する方法を提供し、それは：
（ｉ）本明細書に記載する一つ以上の態様の通りに質量分析でガン標識形質を同定し；そして
（ｉｉ）ガンの疑いがあるヒトまたは動物の被験体から得た血液画分中に存在する前記ガン標識形質のレベルを測定すること、ここで健常な血液画分との比較で前記ガン標識形質の加減したレベルは当該被験体がガンに罹っていることを示す、を含む。
【００６４】
一旦同定および特性決定すれば、質量分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）‐質量分析、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは他の技術的に認められた方法を含む標準方法を血液中のガン標識形質のレベル測定に使用することができる。
【００６５】
例えば、当該ガン標識形質を含む質量分析に基づいたピーク画分、特にガングリサイドに対するモノクローナル抗体を調製し、次なるガンの診断のための標準免疫検定手法に用いることができる。
【００６６】
当該発明の本態様の実施において、マウスまたは他の哺乳動物にサプレッサー細胞活性を低下させるには低用量のシクロホスファミド（１５ｍｇ／動物体重ｋｇ）を注射する前処理が可能で、それから本質的には米国特許出願第５，８１７，５１３号に記載されているように短い間隔でのガングリオシド含有リポソーム製剤の種々な用量（即ち、３〜４日と一週間の間）で免疫を与えた。免疫性を与えるのは標準手順の通りに皮下、静脈または腹腔内注射で実施できる。免疫性を与える前およびその間に、動物血液血清試料を採取し、抗原‐抗体反応を検出する何れかの既知免疫方法にて、抗原として用いたガングリオシドに対する動物に生じた抗体力価を観測する。一般的に、短期間におけるリポソーム調剤の約５〜９倍の累積用量は抗体のガングリオシドへの反応を促進するであろう。ガングリオシドに対する血清抗体力価を伴うマウスにつき抗体生産細胞を得る約３日前に当該リポソーム調剤にて新しい免疫を与え、それから当該抗体生産細胞、好ましくは脾臓細胞を単離する。これらの細胞を骨髄腫細胞と融合させてモノクローナル抗体を調製するために標準手順の通りのハイブリドーマを作る。その後当該ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体の力価を免疫検定法で検査する。好ましくは免疫‐酵素検定法を使用するが、そこではハイブリドーマ上澄み液がガングリオシド抗体を含有する試験試料に結合し、その後抗原‐抗体結合をモノクローナル抗体に結合する二次酵素標識抗体を用いて検出する。一旦当該望ましいハイブリドーマを選択し、例えば限界希釈法のようなものでサブクローニングすれば、得られたモノクローナル抗体は適切な培地中にて適当な期間生体外で増幅でき、その後に望ましい抗体を上澄み液から回収できる。当該選択した培地および適切な培養期間は当業者によれば既知であるか、容易に決定される。
【００６７】
他の製造方法は当該ハイブリドーマを例えば同系のマウスなどの動物への注射を含む。このような状態で、当該ハイブリドーマは非固形腫瘍の形成を起こすが、それは血流中および宿主動物の腹膜滲出液（腹水）に望みの抗体を高濃度で産生する。
【００６８】
従って標準免疫検定法はガンの疑いがある被験体から得た血液画分中のガングリオシド抗体の存在を検定するのに使用されている。健常被験者から得た血液画分についての検査結果との比較で適切な診断を行うことができる。
【００６９】
当該発明の４番目の側面は：
（ｉ）１４３９から１４５９Ｄａ（平均質量１４５４Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｉ）１５８７から１５９７Ｄａ（平均質量１５９２Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｉｉ）１６１６から１６２６Ｄａ（平均質量１６２１Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｉｖ）１６７１から１６８１Ｄａ（平均質量１６７６Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｖ）１６８１から１６９１Ｄａ（平均質量１６８６Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質；
（ｖｉ）８０９から８１９Ｄａ（平均質量８１４Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質またはオリゴ糖；および
（ｖｉｉ）１０１６から１０２６Ｄａ（平均質量１０２１Ｄａ）の範囲の分子量を有する糖脂質またはオリゴ糖、からなる群より選択した単離したガン標識形質を提供する。
【００７０】
“単離した”とは、例えば本明細書で明らかにした条件の質量分析のような遣り方で測定して、同種の糖脂質またはオリゴ糖が実質的に存在しないことを意味する。高分解能のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳによれば、本明細書で例示した糖脂質またはオリゴ糖ピークが本明細書で定義した単離分子種に相当することは当業者であれば理解されるであろう。
【００７１】
好ましくは、当該単離したガン標識形質は免疫系依存性ガングリオシドまたはオリゴ糖であり、より好ましくはＴ細胞依存ガングリオシドまたはオリゴ糖である。
【００７２】
以下に示す実施例でＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析は、免疫系由来分子種、ガンを持つ動物における幾つかの分子種の欠損および同じガンを持つ動物における新規分子種（ガン由来と推定される）の出現を検出する際に使用できることを示す。これら当初の研究は動物で行ったが、当該結果はヒト患者から得た試料を用いた結果も示唆するものと考えられる。
【００７３】
【実施例】
実施例１
血清中での免疫系関連分子の検出
これまでの血清上の研究では、全てのＴ細胞由来糖脂質は硫酸デキストラン処理マウスの血清では約１００倍増加することを示した（Ｐａｒｉｓｈ他，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３４〜１４４，１９７７）。これに反して、そのような糖脂質はＴ細胞欠損ヌードマウスの血清には欠落している（Ｐａｒｉｓｈ他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３，１２９〜１３７，１９７６）。
Ｐａｒｉｓｈ他は同じように免疫系由来糖脂質は硫酸アンモニウム／ピリジン法で血清から抽出できることを報告した（Ｐａｒｉｓｈ他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３，４５５〜４６３，１９７６）。
従って、正常マウス、ヌードマウスおよび硫酸デキストランを注射した正常マウスから硫酸アンモニウム／ピリジンを用いて血清試料を抽出し、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳによりそれらの試料を分析し、質量分析が血清中の糖脂質およびオリゴ糖の分析に応用できるかどうか、およびこの方法がガン標識形質の同定に応用できるかどうか測定した。
材料および方法
１．血清試料
正常なＢＡＬＢ／ｃマウスおよび５００ｋＤａの硫酸デキストラン１ｍｇを４日前に腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスから血液を採取した。血液は同様にＴ細胞欠損スイスヌードマウスからも採取した。採取した後、血液は３７℃で３０分間インキュベートし、４℃で一夜保存し、遠心分離にて血清を集めた。
【００７４】
２．血清の分画‐硫酸アンモニウム／ピリジン法
血清蛋白質は飽和硫酸アンモニウムを用いて沈殿させ、次いで上澄み液を以前公表されたようにピリジンを用いて脱塩した（Ｐａｒｉｓｈ他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３，４５５〜４６３，１９７６）。当該ピリジンは蒸発で除去し、残留物はクロロホルム／メタノール／水に再懸濁した［２／４３／５５（ｖ／ｖ／ｖ）］。当該懸濁液は０．２μｍのろ紙でろ過し、ろ液は使用前に平衡化したＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ）に二回適用した。当該溶出液（非吸着画分または通過）を回収し、以下に記述したようにＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳを用いて分析した。当該カートリッジはそれから連続で２ｍｌのメタノール／水溶液、次いで２ｍｌのメタノール、次いで２ｍｌのクロロホルム／メタノール、次いで２ｍｌのクロロホルムで溶出させた。全ての画分を別々に集め、以下に記述するようにＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳを用いて分析した。
【００７５】
３．ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析
質量分析用の試料を調製するために当該画分は真空で乾燥した。通過画分およびメタノール／水の画分を水（２００μｌ）に溶かし、１ｋＤａ分子量カットオフ透析膜を用いて水に対して広範に透析し、蒸発で乾燥した。全ての画分を質量分析に装填するために適切な溶媒１０μｌで再溶解した。
上で説明したように調製（１μｌ）した画分を、マトリックス溶液［３．５ｍｇ／ｍｌの２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）メタノール溶液を１μｌ］と共に渦動で混合した。当該混合物（１μｌ）を９６個の装填位置を有する試料プレートに載せ、室温で乾燥した。当該試料プレートはそれからＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ（ＴｏｆＳｐｅｃ‐２ｅ；Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）に装着した。窒素レーザ（３３７ｎｍ）をイオン化に使用し、分析はリニアー負イオン法で実施した。データはＤａでの分子量プロフィールとして与えられ、ピーク高さは試料中で検出された最も多い分子種のパーセント高さとして描かれる。
結果
最初の研究ではＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳが、免疫系由来および／またはその発現に活性化Ｔ細胞機能が必要な分子種を検出する際に使用できるかどうかを試した。
硫酸デキストラン処理ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清から得た通過画分（即ち、Ｃ１８Ｓｅｐｐａｋカラムに吸着しない画分）は、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析すると約１０２２Ｄａの分子量を有する非常に顕著な種を含有していることを発見した（図１）。対照的に、本分子量種は非処理ＢＡＬＢ／ｃマウス（図２）由来の通過画分には検出できるが極く低いレベルでしか存在せず、ヌードマウスの血清中にはＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳでは全然検出できなかった（図３）。
図１から３で提示したデータは約１０２２ドルトン種が免疫系依存であることを示唆している。しかし、本種は本明細書に記述した条件ではＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジには結合しないという事実で、それは血清オリゴ糖であることを示している。
【００７６】
実施例２
ガンに罹った動物の血清中で減少したガン標識形質
材料および方法
１．血清試料
血液は、高転移性ラット乳腺ガン１３７６２ＭＡＴ（Ｐａｒｉｓｈ他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　４０，５１１〜５１８，１９８７）を持っているメスＦｉｓｈｅｒ系３４４ラットから採取した。動物に腫瘍を導入するのに、以前記載された（Ｐａｒｉｓｈ他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４０，５１１〜５１８，１９８７）ように生体外で腫瘍細胞を維持し、ラット（１０から１３週齢）に１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地０．６ｍｌ中にある２×１０５個の１３７６２ＭＡＴ細胞を静脈注射した。血液を腫瘍細胞注射から１３日目に採取した。この段階ではラットの肺には多くの小さな二次性腫瘍が見られたが、ラットは当該腫瘍による苦痛の徴候は見せなかった。血清は当該血液から実施例１で説明したように調製した。
【００７７】
２．血清の分画
腫瘍が存在するラットからの血清は実施例１で説明した硫酸アンモニウム／ピリジン法で分画した。
【００７８】
３．ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ分析
試料調製および装填およびデータ分析を含めて、質量分析は実施例１で説明したように実施した。
【００７９】
結果
図４Ａおよび図４Ｂで示したデータは、正常および腫瘍が存在するラットから得た血清のＣ１８Ｓｅｐｐａｋ通過画分の質量分析プロフィールを示している。分子量約８１４Ｄａおよび１０２１Ｄａの二つの分子種は正常動物に比べて腫瘍が存在する動物のほうで減少している（図４Ａと図４Ｂを比較する）。これらの種がＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジに本明細書で説明した条件では結合しないのは、これらが血清オリゴ糖であることを示している。当該１０２１ドルトン種は、上記実施例１で免疫系関連として同定した１０２２ドルトン種と同じものである。
【００８０】
実施例３
腫瘍が存在する動物の血清中で増加するガン標識形質
材料および方法
１．血清試料
実施例２で説明した正常および腫瘍が存在するラットから血液を採取した。
【００８１】
２．血清の分画‐クロロホルム：メタノール法
腫瘍が存在する動物から得た血清（１ｍｌ）を真空で乾燥した。クロロホルム：メタノール溶液（２ｍｌ）を各血清試料に加え、当該混合物を４℃で激しく振とうしながら一夜インキュベートして糖脂質を抽出した。当該混合物を遠心分離し、当該クロロホルム／メタノール相を集めた。当該抽出を４回以上繰返すが、各抽出は４℃で２時間であった。各抽出のクロロホルム／メタノール相を集めて、真空で乾燥した。残留物はクロロホルム／メタノール／水溶液［２／４３／５５（ｖ／ｖ／ｖ）］に再懸濁する。当該懸濁物は０．２μｍフィルターを通し、ろ過物は前もって平衡としたＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジに２回適用した。当該溶出液（非吸着画分または通過画分）を集めた。各カートリッジはその後連続でメタノール／水溶液２ｍｌ、次いでメタノール２ｍｌ、次いでクロロホルム／メタノール２ｍｌ、次いでクロロホルム２ｍｌで溶出した。全ての画分は別々に集めた。
【００８２】
３．ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳ分析
試料調製ならびに装填およびデータ分析を含めた質量分析は実施例１で説明したように実施した。
【００８３】
結果
腫瘍が存在するラットから得た血清画分のクロロホルム／メタノール抽出物（図５Ｂ）および血清画分のメタノール抽出物（図６Ｂ）中の腫瘍関連分子種を同定した。これらの画分はＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジに結合する分子種を含有するので、それらは糖脂質、好ましくはガングリオシドである。これらの種は腫瘍が存在する健常なラットの血清中には同じように非常に減少したレベルで存在するか、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳでは検出できない（図５Ａおよび図６Ａ）。
【００８４】
より詳しくは、腫瘍が存在する動物のクロロホルム／メタノール溶出物はＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで測定するとき１４５４Ｄａ、１５９２Ｄａ，１６２１Ｄａおよび１６８６Ｄａの分子量を其々有する４つの顕著な種を含有していたが、それらは対照血清試料中では検出できなかった（図５Ａ）。事実、正常ラットのクロロホルム／メタノール溶出物由来のスペクトル中には多数のバックグランドピークが観測された（図５Ａ）。これらのデータはＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳによれば腫瘍が存在する動物の血清中に存在するガン標識形質を検出できることを明らかに示している。
【００８５】
腫瘍が存在する動物のメタノール溶出物はＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳでは約１６７６Ｄａと決定した分子量を有する顕著な糖脂質／ガングリオシドを含有していた（図６Ｂ）。この種は同じように対照ラットの血清中に存在するが、腫瘍由来の試料におけるより相当低いレベルである（図６Ａ）。当該１６７６Ｄａ種のレベルの加減は、この種のピーク高さを１１８５Ｄａ糖脂質の高さと両スペクトルで比較すると特に明らかである（図６Ａおよび図６Ｂ）。従って、当該１６７６Ｄａ種は腫瘍が存在する動物の血清では増加している。
【００８６】
当該１６７６Ｄａ糖脂質は通常は増殖細胞が分泌するので、動物において増殖しているガン細胞の存在がこの分子の血清レベルにおいての増加を生じることになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は，硫酸デキストランを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスから得た血清の硫酸アンモニウム／ピリジン画分の分離により得られたＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。Ｃ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジに吸着しない血清画分をパルス電圧８３２ボルトにてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種（即ち、ｍ／ｚ＝８３９．９Ｄａ±５Ｄａ）の存在量に対するパーセントとした各分子種の相対比を示す。各ピーク先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示している。当該矢印はデキストラン硫酸処理で増加するレベルを有していて、約１０２２Ｄａ±５Ｄａの分子量を持つ化合物の位置を示す。
【図２】
図２は、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た血清の硫酸アンモニウム／ピリジン画分の分離で得たＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。Ｃ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジに吸着しない血清画分をパルス電圧８３５ボルトにおけるＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種（即ち、ｍ／ｚ＝８４０Ｄａ±５Ｄａ）の存在量に対するパーセントとして各分子種の相対比を示す。各ピーク先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示している。当該矢印は約１０２２Ｄａ±５Ｄａ（図１）の分子量を持つ化合物の位置を示す。
【図３】
図３は、ヌードマウスから得た血清の硫酸アンモニウム／ピリジン画分の分離で得たＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。Ｃ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジに吸着しない血清画分をパルス電圧９１０ボルトにてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種（即ち、ｍ／ｚ＝８３９．８Ｄａ±５Ｄａ）の存在量に対するパーセントとして各分子種の相対比を示す。各ピーク先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示している。この条件下ではヌードマウスの血清画分に約１０２２Ｄａ種（図１、図２）を検出できなかった。
【図４】
図４Ａは、正常ラットから得た血清の硫酸アンモニウム／ピリジン画分の分離で得たＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。Ｃ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジに吸着しない血清画分をパルス電圧８５０ボルトにてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種（即ち、ｍ／ｚ＝８６５Ｄａ±５Ｄａ）の存在量に対するパーセントとして各分子種の相対比を示す。各ピーク先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示している。当該矢印は腺ガンを患っている被験体においては減少するレベルを有していて（図４Ｂ）、約８１３．７Ｄａ±５Ｄａおよび１０２１．２Ｄａ±５　Ｄａの質量（ｍ／ｚ）を有する２つの化合物の位置を示す。後者の分子量は、図１、図２および図３で言及した１０２２Ｄａ種に相当する。
図４Ｂは、高転移性ラット乳房腺ガン１３７６２ＭＡＴを帯びたラットから得た血清の硫酸アンモニウム／ピリジン画分の分離で得たＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。Ｃ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジに吸着しない血清画分をパルス電圧８５０ボルトにてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種の存在量に対するパーセントとして各分子種の相対比を示す。各ピーク先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示す。図４Ａにおいて矢印で示した２つの化合物（約８１３．７Ｄａ±５Ｄａおよび１０２１．２Ｄａ±５Ｄａのｍ／ｚ値）は検出されなかった。
【図５】
図５Ａは、正常ラットから得た血清のクロロホルム／メタノール抽出物の分離で得たＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。クロロホルム／メタノールで展開したＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジから溶出した血清画分をパルス電圧９００ボルトにてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種の存在量に対するパーセントとして各分子種の相対比を示す。各ピークの先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示している。
図５Ｂは、高転移性ラット乳房腺ガン１３７６２ＭＡＴが存在するラットから得た血清のクロロホルム／メタノール抽出物の分離で得たＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。クロロホルム／メタノールで展開したＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジから溶出した血清画分をパルス電圧９００ボルトにてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。当該ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種（即ち、ｍ／ｚ＝１６２１．１Ｄａ±５Ｄａ）の存在量に対するパーセントとして各分子種の相対比を示す。各ピーク先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示している。矢印で示した４つの化合物（ｍ／ｚ値約１４５４Ｄａ±５Ｄａ、１５９２Ｄａ±５Ｄａ、１６２１Ｄａ±５Ｄａおよび１６８７Ｄａ±５Ｄａ）は、正常なラットの血清中にては増加したレベルでは検出されなかった。
【図６】
図６Ａは、正常ラットから得た血清のクロロホルム／メタノール抽出物の分離で得たＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。クロロホルム／メタノールで展開したＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジから溶出した血清画分をパルス電圧９００ボルトにてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種の存在量に対するパーセントとして各分子種の相対比を示す。各ピーク先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示している。２つの化合物を矢印で示した（約１１８５　Ｄａ±５　Ｄａおよび１６７６　Ｄａ±５　Ｄａのｍ／ｚ値）。
図６Ｂは、高転移性ラット乳房腺ガン１３７６２ＭＡＴが存在するラットから得た血清のクロロホルム／メタノール抽出物の分離で得たＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルのクロマトグラムのコピーである。クロロホルム／メタノールで展開したＣ１８Ｓｅｐｐａｋカートリッジから溶出した血清画分をパルス電圧９００ボルトにてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ　ＭＳで分析した。当該ｘ軸は分子量（ｍ／ｚ）を示し、縦軸は最も大きな種（即ち、ｍ／ｚ＝１６７６　Ｄａ±５　Ｄａ）の存在量に対するパーセントとして各分子種の相対比を示す。各ピーク先端にある数字はそのピークの分子量をＤａで示している。２つの化合物（ｍ／ｚ値約１１８５Ｄａ±５Ｄａ、および１６７６Ｄａ±５Ｄａ）を矢印で示したが、１１８５ドルトン種のレベルに対して標準化すると正常なラットの血清中のレベルと比較してガンを有するラットの血清では１６７６ドルトンの種が上昇している。
【図５】
2004504621.tif 000003
2004504621.tif 000004
【図６】
2004504621.tif 000005
2004504621.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004504621.tif 000007
2004504621.tif 000008
2004504621.tif 000009
2004504621.tif 000010
2004504621.tif 000011
2004504621.tif 000012
2004504621.tif 000013
2004504621.tif 000014
2004504621.tif 000015
2004504621.tif 000016
2004504621.tif 000017
2004504621.tif 000018
2004504621.tif 000019
2004504621.tif 000020
2004504621.tif 000021
2004504621.tif 000022
2004504621.tif 000023
2004504621.tif 000024
2004504621.tif 000025
2004504621.tif 000026
2004504621.tif 000027
2004504621.tif 000028
2004504621.tif 000029
2004504621.tif 000030
2004504621.tif 000031
2004504621.tif 000032
2004504621.tif 000033
2004504621.tif 000034
2004504621.tif 000035
2004504621.tif 000036
2004504621.tif 000037
2004504621.tif 000038
2004504621.tif 000039
2004504621.tif 000040
2004504621.tif 000041
2004504621.tif 000042
2004504621.tif 000043
2004504621.tif 000044
2004504621.tif 000045
2004504621.tif 000046
2004504621.tif 000047
2004504621.tif 000048
2004504621.tif 000049
2004504621.tif 000050
2004504621.tif 000051
2004504621.tif 000052
2004504621.tif 000053
2004504621.tif 000054
2004504621.tif 000055
2004504621.tif 000056
2004504621.tif 000057
2004504621.tif 000058
2004504621.tif 000059
2004504621.tif 000060
2004504621.tif 000061
2004504621.tif 000062
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004504621.tif 000063
【国際調査報告】
2004504621.tif 000064
2004504621.tif 000065
2004504621.tif 000066