(57)【要約】本発明は、転写因子ＩＲＦ−１の阻害剤と、治療薬としての用途と、経皮的血管形成後の再狭窄または静脈バイパスの狭窄のような循環器系合併症、慢性（移植動脈硬化または脈管障害）または急性移植拒絶、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、免疫学的過敏反応（アレルギー）、特に気管支喘息およびアトピー性皮膚炎、慢性再発性炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎およびクローン病、乾癬およびサルコイドーシス並びに自己免疫疾患、特に糖尿病、多発性硬化症、膠原病（ｃｏｌｌａｇｅｎｏｓｅｓ）（例えば、全身性エリテマトーデス）、関節リウマチおよびｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｓを予防および治療するためのそれらの用途とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用物質としてのＩＲＦ−１発現および／または活性阻害剤。
【請求項２】
２本鎖ＤＮＡ分子であり、ＩＲＦ−１活性を阻害する、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
配列番号１〜２２に記載の核酸配列を有する請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
２本鎖ＤＮＡ分子が改変されたヌクレオチド間結合を示す、請求項２または請求項３に記載の阻害剤。
【請求項５】
阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ＩＲＦ−１発現を阻害する、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項６】
配列番号２３〜２６に記載の核酸配列を有する請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが改変されたヌクレオチド間結合を示す、請求項５または６に記載の阻害剤。
【請求項８】
例えば、経皮的血管形成後の再狭窄または静脈バイパスの狭窄のような循環器系合併症、慢性（移植動脈硬化または脈管障害）または急性移植拒絶、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、免疫学的過敏反応（アレルギー）、特に気管支喘息およびアトピー性皮膚炎、慢性再発性炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎およびクローン病、乾癬およびサルコイドーシス並びに自己免疫疾患、特に糖尿病、多発性硬化症、膠原病（ｃｏｌｌａｇｅｎｏｓｅｓ）（例えば、全身性エリテマトーデス）、関節リウマチおよびｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｓを予防および治療するための製薬学的製剤を製造するためのＩＲＦ−１発現および／または活性阻害剤の使用。
【請求項９】
配列番号２３〜２６に記載の核酸配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
改変されたヌクレオチド間結合を示す、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２１に記載の核酸配列を有する２本鎖ＤＮＡ分子。
【請求項１２】
改変されたヌクレオチド間結合を示す、請求項１１に記載の２本鎖ＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、転写因子ＩＲＦ−１の阻害剤と、治療薬としての用途と、経皮的血管形成後の再狭窄または静脈バイパスの狭窄のような循環器系合併症、慢性（移植動脈硬化または脈管障害）または急性移植拒絶、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、免疫学的過敏反応（アレルギー）、特に気管支喘息およびアトピー性皮膚炎、慢性再発性炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎およびクローン病、乾癬およびサルコイドーシス並びに自己免疫疾患、特に糖尿病、多発性硬化症、膠原病（ｃｏｌｌａｇｅｎｏｓｅｓ）（例えば、全身性エリテマトーデス）、関節リウマチおよびｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｓを予防および治療するためのそれらの用途とに関する。
【０００２】
血管内皮は、循環液中の炎症適格細胞と組織の最初の相互作用部位となるので、炎症性疾患において主要な役割を果たす。急性または慢性炎症では、内皮細胞と単核細胞および多形核好中性顆粒細胞との多種多様の相互作用が記載されている。最近、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）、移植および静脈バイパス脈管障害並びに経皮的血管形成後の再狭窄を含む血管の動脈硬化病変、および慢性再発性炎症性疾患（例えば、クローン病、乾癬）における内皮細胞と前炎症性Ｔヘルパー細胞（ＴＨ１）との相互作用についての討論が増えている。リンパ球および内皮細胞はＣＤ４０／ＣＤ１５４受容体／リガンドシステム（ＴＮＦ受容体／リガンド−５−システムとしても周知）に通信し、続いて内皮のケモカインおよび接着分子の発現が増加する。さらに、単核細胞のような他の抗原提示細胞とは異なり内皮細胞は、ＣＤ４０シグナリング経路の活性化によってのみ、最大に刺激された単核細胞とほぼ同じ量の生物学的に活性なインターロイキン１２を放出すると思われる（これらは、一般に、インターロイキン１２の主な起源であると思われている）。インターロイキン１２は、細胞表面の、それぞれ、インターフェロンγの大量の産生およびＣＤ１５４の大量の発現と反応する未変性のＴヘルパー細胞の、それぞれ、主要な刺激因子および分化因子である（これらのＴヘルパー細胞は、次いで、ＴＨ１細胞と考えられている）。インターフェロンγは内皮細胞におけるＣＤ４０の発現を増加し、内皮細胞、Ｔ−ヘルパー細胞および動員された単核細胞が互いに刺激し、炎症反応を進行させる悪循環を生じる。
【０００３】
炎症を誘発するＣＤ４０／ＣＤ１５４の同時刺激特性は、クローン病および急性または慢性移植拒絶（脈管障害）を含む、疾患の動物モデルにおいて証明されている。ＣＤ４０／ＣＤ１５４による内皮白血球相互作用がここで何らかの役割を果たすだけでなく、例えば、単核細胞／マクロファージまたは樹状細胞と、それぞれ、ＴＨ１細胞および未変性のＴヘルパー細胞とのＣＤ４０／ＣＤ１５４媒介性相互作用も役割を果たす。さらに、ＣＤ４０は、例えば、血管内層における平滑筋細胞によって発現されることもあり、皮膚の表皮細胞または関節の滑膜の繊維芽細胞によっても発現されることがある。これらの細胞におけるＣＤ４０経路の活性化は、さらに、炎症反応に重要であるだけでなく、例えば、移植脈管障害における血管内層のリモデリング、乾癬における皮膚の変化または関節リウマチにおける関節軟骨の侵食のような、組織の再構築過程が生じる。それぞれ、糖尿病、多発性硬化症、サルコイドーシスおよびｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｓを含む、ＣＤ１５４誘導性、インターロイキン１２依存性およびＴＨ１媒介性の慢性炎症性疾患並びに自己免疫反応以外に、ＣＤ４０／ＣＤ１５４の同時刺激特性も、ＴＨ２細胞との接触によって誘発される抗体産生血漿細胞におけるＢリンパ球の分化に重要である。それによって、Ｂリンパ球はＣＤ４０を発現し、ＴＨ２細胞はＣＤ１５４を発現する。血漿細胞は、この同時刺激を生じることなく、ＩｇＭ型の抗体を主に産生し、まれに、ＩｇＥまたはＩｇＧ型の抗体を産生する。増強したＴＨ２応答、すなわち、ＩｇＥ型またはＩｇＧ型抗体の過剰産生は、気管支喘息、アトピー性皮膚炎および潰瘍性大腸炎のような主にアレルギーに起因する慢性再発性の炎症性疾患だけでなく、自己反応性自己抗体の産生が特に重要であり、従って、全身性自己免疫疾患と考えられる全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような膠原病（ｃｏｌｌａｇｅｎｏｓｅｓ）において重要な役割を果たす。一般に、自己免疫疾患と慢性再発性炎症性疾患は、共通の素因が、それぞれ、ＴＨ１およびＴＨ２媒介性細胞性および液性免疫反応の不均衡であると思われるので、その区別は疑わしい。
【０００４】
現在、ＣＤ１５４に対する遮断抗体とは別に、特にＣＤ４０／ＣＤ１５４シグナリング経路に関連する疾患を治療するための唯一の有用な治療方法は、ＣＤ１５４標的細胞におけるＣＤ４０発現の阻害である。抗ＣＤ１５４抗体による治療の欠点の１つは、特に反復適用による（抗体に対する）過敏反応のリスクおよび抗体を血中に適用しなければならないことによる、少なくとも組織に基づいたエピトープ（例えば、浸潤Ｔリンパ球）の接近の悪さである。しかし、多数の他のサイトカイン受容体と同様に、ＣＤ４０にも小分子受容体アンタゴニストがない。リガンド結合による受容体分子の３量体化により、ＣＤ４０抗体はＣＤ１５４標的細胞を活性化する傾向がある。炎症反応を普通に減少させることによる他の方法は、大多数のＴＨ２細胞応答におけるＴＨ１細胞応答の刺激（例えば、インターフェロンγのようなＴＨ１サイトカインの投与による）または逆に、大多数のＴＨ１細胞応答におけるＴＨ２細胞応答の刺激（例えば、インターロイキン−１０のようなＴＨ２サイトカインの投与による）からなる。Ｔヘルパー細胞反応は、サイトカイン媒介により互いに相殺するので（すなわち、大多数のＴＨ１細胞応答によりＴＨ２細胞応答が減少し、その逆が生じる）、これらの方法には、Ｔヘルパー細胞応答のそれぞれの他方の経路を脱抑制する危険がある。これにより、それぞれの他方の炎症反応の可能性が生じることがある。
【０００５】
従って、本発明の１つの問題は、特に、ＣＤ４０／ＣＤ１５４同時刺激に関連する炎症性疾患を予防および／または治療する薬剤を提供することである。
【０００６】
この問題は、特許請求の範囲に規定される内容によって解決される。
【０００７】
本発明は以下の図面によって例示される。
【０００８】
本明細書において使用する「デコイ−ＯＤＮ」または「シス−エレメントデコイ」または「２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド」という用語は、ゲノムに天然に存在するＩＲＦ−１コア結合配列に相当する配列またはＩＲＦ−１コア結合配列に類似した配列を有し、転写因子ＩＲＦ−１が細胞の前記配列に結合する２本鎖ＤＮＡ分子を意味する。従って、シス−エレメントデコイは、ＩＲＦ−１の競合的阻害分子として作用する。
【０００９】
本発明者らは、ヒト内皮細胞におけるＣＤ４０受容体発現の炎症依存性で、サイトカイン媒介性の増加に関与する転写因子を解明できた。驚くべきことに、転写因子核因子κＢ（ＮＦκＢ）およびシグナル伝達性転写因子（Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−１）（ＳＴＡＴ−１）は、げっ歯類の血管平滑筋細胞におけるように直接的ではなく、さらに別の転写因子、すなわち、インターフェロン調節因子−１（ＩＲＦ−１）を活性化することによって間接的に腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）／インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）媒介性ＣＤ４０発現をコントロールすることがわかった。ＩＲＦ−１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｌ０５０７８号、Ｘ１４４５４、ＮＭ００２１９８　ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｑｔ／ｇｅｔＥｎｔｒｙ．ｐｌ？ｔ００４２３）は、多数の他の転写因子とは異なり細胞に潜在的に存在しない転写因子であるが、実際には通常インターフェロン−γを提示し、転写因子ＳＴＡＴ−１の活性化により新規合成される必要がある。
【００１０】
また、インターフェロン−γは、単独またはヒト内皮細胞における腫瘍壊死因子αと併用して、ＣＤ４０の発現を刺激する。これに関しては、ＮＦκＢのＴＮＦα依存的活性化はわずかな役割しか果たさない。ＩＲＦ−１の新規発現を生じるＳＴＡＴ−１のＩＦＮ−γ依存的活性化は、さらに重要である。次いで、ＩＲＦ−１はＣＤ４０の発現を誘導する。２つのサイトカインの相乗作用は、本質的にはＩＲＦ−１発現の増幅に基づいている。本発明によるＳＴＡＴ−１およびＩＲＦ−１に対するデコイオリゴヌクレオチドを使用する場合には、（ＩＲＦ−γによる単独刺激およびＩＦＮ−γとＴＮＦαの併用のどちらにおいても）サイトカイン誘導性ＣＤ４０発現は、阻害される。従って、ＩＲＦ−１の誘導はＣＤ４０の誘導より前に生じ、その結果、ＩＲＦ−１発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド遮断因子は、デコイオリゴヌクレオチドと同じ量だけサイトカイン誘導性ＣＤ４０発現を阻害する。細胞のＩＲＦ−１活性が不活性化されると、これらの細胞におけるＣＤ４０発現はかなり有意に、選択的に阻害される。前炎症状態下におけるＣＤ４０発現の減少の結果として、内皮と白血球の相互作用、特にＴＨ１と内皮細胞の相互作用は抑制され、治療上の成功の基礎となる。同じことが同様に、未感作Ｔヘルパー細胞と抗原提示細胞（例えば、単核細胞、樹状細胞）、ＴＨ２細胞とＢリンパ球、並びに他のＣＤ４０発現細胞（例えば、平滑筋細胞、表皮細胞（ｃｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、線維芽細胞）とＣＤ１５４発現細胞（ＴＨ１細胞、活性化された血小板）とのＣＤ４０／ＣＤ１５４媒介性相互作用の減少に適用される。
【００１１】
従って、本発明の一態様は、治療用物質としての転写因子ＩＲＦ−１の活性の阻害剤を提供することに関する。ＩＲＦ−１も含むタンパク質は、活性が異なって阻害されることがある。例えば、ＤＮＡとのＩＲＦ−１相互作用を減少させる抗ＩＲＦ−１抗体、天然または合成物質、すなわち、トランス活性化作用を使用することができる。ＩＲＦ−１の新規合成は、それぞれ、ＳＴＡＴ−１の遮断因子およびＳＴＡＴ−１活性化を生ずるシグナリング経路（Ｊａｎｕｓ　Ｋｉｎａｓｅｎ）によってさらに阻害される。
【００１２】
ＩＲＦ−１活性を特異的に阻害する好ましい方法は、ＩＲＦ−１の結合部位を有するシス−エレメントデコイまたはデコイ−ＯＤＮとも名づけられる２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用することである。大量の転写因子結合部位を、特にゲノムに存在するようにはるかに大量を細胞に外因的投与すると、大多数の特定の転写因子がそれぞれのシス−エレメントデコイに特異的に結合するが、内因的標的結合部位には結合しないという状況が生じる。内因的結合部位への転写因子の結合を阻止するこの方法はまた、「抑制（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）」とも呼ばれる。シス−エレメントデコイの使用による転写の抑制（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）（中和とも呼ばれる）は、細胞の増殖を阻止するために使用され、成功している。細胞転写因子Ｅ２Ｆの特異的な転写因子結合部位を含むＤＮＡ断片を使用した（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、ＰＮＡＳ，（１９９５）９２，５８５５）。
【００１３】
転写因子ＩＲＦ−１の結合を防止するために使用される核酸配列は、例えば、ＩＲＦ−１が細胞内で自然の状態で結合する配列である。ＩＲＦ−１は、配列５’−ＳＡＡＡＡＧＹＧＡＡＡＣＣ−３’（式中、Ｓ＝ＣまたはＧであり、Ｙ＝ＣまたはＴである）を有するモチーフに特異的に結合する。ＩＲＦ−１の結合は、反復Ｇ／ＣＡＡＡ配列および特に３つのヌクレオチドであるこれらのモチーフ間の距離に依存する。従って、本発明のシス−エレメントデコイは、以下の１３ｍｅｒのコンセンサスコア結合配列：５’−ＳＡＡＡｎｎｎＳＡＡＡｙｙ−３’（配列番号１）（式中、Ｓ＝ＣまたはＧであり、ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ｙ＝ＣまたはＴである）を有してもよい。シス−エレメントデコイは、さらに、１３ｍｅｒより長いコア結合配列であってもよく、５’側および／または３’側末端が伸長されてもよい。コア結合配列のそれぞれの突然変異により、デコイオリゴヌクレオチドにＳＴＡＴ−１が結合しなくなる。
【００１４】
シス−エレメントデコイは２本鎖の核酸であるので、本発明によるＤＮＡオリゴヌクレオチドはセンスすなわち順方向の配列だけでなく、相補的なアンチセンスすなわち逆方向の配列を含む。本発明による好ましいＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＩＲＦ−１の以下の１３ｍｅｒの結合配列を含む：
５’−ＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号３）、
５’−ＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号５）、
５’−ＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号７）、
５’−ＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号９）が、
式中、それぞれの相補的配列は示していない。しかし、シス−エレメントデコイは上記配列とは異なる配列を含んでもよく、１３ｍｅｒより長くてもよい。
【００１５】
以下の配列がさらに好ましい：
（配列番号１１）：５’−ＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧ−３’、１８ｍｅｒ（パリンドロームでない、１つの結合部位）、
（配列番号１３）：５’−ＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＧ−３’、１９ｍｅｒ（ほぼパリンドローム、２つの結合部位）、
（配列番号１５）：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧ−３’、２０ｍｅｒ（パリンドロームでない、１つの結合部位）、
（配列番号１７）：５’−ＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣ−３’、２１ｍｅｒ（ほぼパリンドローム、２つの結合部位）、
（配列番号１９）：５’−ＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴ−３’、２２ｍｅｒ（使用される１次コンセンサス配列）、
（配列番号２１）：５’−ＧＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’、２３ｍｅｒ（ほぼパリンドローム、２つの結合部位）。
【００１６】
「２つの結合部位」という用語はセンス鎖およびアンチセンス鎖をいう。好ましい配列の掲載は限定することを意図するものではない。１３ｍｅｒのコンセンサスコア結合配列について先に掲載した条件およびＩＲＦ−１との親和性を有する限り、多数の配列をＩＲＦ−１の阻害剤として使用することができる。
【００１７】
ＩＲＦ−１に対する核酸配列の結合親和性は電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）で求めることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｚｅｓｚら（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５３，１９１）。このアッセイシステムは、本発明の方法に使用される核酸の品質管理に好適であり、または結合部位の最適な鎖長を決定するのに好適である。このアッセイシステムはまた、ＩＲＦ−１が結合するさらに別の配列を同定するのに好適である。数回の交互課程のＰＣＲ増幅およびＥＭＳＡによる選択に使用される精製または組み換え発現型ＩＲＦ−１は、新たな結合部位を単離するために使用するべきであるＥＭＳＡに最も好適である（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８，３２０３）。
【００１８】
プロモーターまたはエンハンサー領域にＩＲＦ−１結合部位を含むことが知られており、本発明の方法による特異的な抑制（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）の標的と推定されるものである遺伝子は、例えば、ＣＤ４０遺伝子およびさらに別の前炎症遺伝子、例えば、シクロオキシゲナーゼ−２、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのサブユニット（ｐ６７ｐｈｏｘおよびｇｐ９１ｐｈｏｘ）、誘導性アイソフォームの一酸化窒素（ＮＯ）シンターゼ、インターロイキン６、８および１２並びに接着分子ＲＡＮＴＥＳ（可溶性の形態でＴリンパ球から分泌される、正常Ｔ細胞に発現する遺伝子産物（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｕｐｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｐｒｅｓｕｍｅｄ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ））およびＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子−１、ＣＤ１０６とも呼ばれる）。
【００１９】
本発明の方法は、遺伝子または遺伝子群、例えば、ＣＤ４０が全く発現されないか、またはわずかにしか発現されないような方法で１つ以上の遺伝子の転写を調節する。本発明の意味における発現の減少または阻止は、本発明による２本鎖オリゴヌクレオチドで処理していない細胞と比較したとき、転写速度が低下されることを意味する。このような低下は、例えば、ノーザンブロット法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）またはＲＴ−ＰＣＲ分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって測定することができる。このような低下は、典型的には、少なくとも２倍であり、好ましくは少なくとも５倍であり、さらに好ましくは少なくとも１０倍の低下である。活性の損失は、例えば、ＩＲＦ−１がある種の遺伝子の転写活性化因子として作用する場合に生じ、従って、活性化因子のこのような抑制（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）により標的遺伝子が発現されなくなる。
【００２０】
また、発現が構成的に活性または（細胞の対応する刺激により）活性化された転写因子によって遮断されるならば、本発明の方法により、遺伝子の発現を脱抑制することができる。一例は、転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質に対するシス−エレメントデコイによる、未処理のウサギの頸静脈内皮細胞におけるプレプロ−エンドセリン−１遺伝子の発現の脱抑制である（Ｌａｕｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，（２０００），７８，４４１）。例えば、炎症性疾患に対する防御作用を示す遺伝子産物の発現はこのように脱抑制することができる。
【００２１】
本発明に使用するシス−エレメントデコイは、好ましい実施態様において、ＩＲＦ−１が特異的に結合する、１つ以上、好ましくは１、２、３、４または５、さらに好ましくは１つまたは２つの結合部位を含む。核酸は、合成によって、酵素的方法で、または細胞内において作製することができる。それぞれの方法は最新であり、当業者に周知である。
【００２２】
２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの鎖長は、少なくとも、ＩＲＦ−１に特異的に結合する使用配列の長さである。通常、使用される２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは約１３〜６５ｂｐであり、好ましくは約１３〜２６ｂｐであり、最も好ましくは１８〜２３ｂｐの鎖長である。
【００２３】
通常、オリゴヌクレオチドは、細胞のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、特にＤＮａｓｅｓおよびＲＮａｓｅｓによって迅速に分解される。従って、高濃度のオリゴヌクレオチドが細胞内に長時間維持されるように、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを改変して、分解に対して安定化することができる。典型的には、このような安定化は、改変されたヌクレオチド間結合を１つ以上導入することによって実施することができる。
【００２４】
安定化が成功したＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合ごとに改変されていなくてもよい。好ましくは、ヌクレオチド間結合は、シス−エレメントデコイの両方のオリゴヌクレオチドのそれぞれの端部が改変される。最後の６、５、４、３、２もしくは最後の１つまたは最後の６つのヌクレオチド間結合のなかの１つ以上のヌクレオチド間結合が改変されてもよい。さらに、ヌクレオチド間結合の異なる改変が核酸に導入されてもよい。このように作製される２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、通常のＥＭＳＡアッセイシステムを使用することによって、ＩＲＦ−１に対する配列特異的な結合について検討することができる。このアッセイシステムにより、シス−エレメントデコイの結合定数を求めることができ、従って親和性が改変によって変更されているかどうかを判定することができる。十分な結合を維持する改変シス−エレメントデコイを選択することができ、ここで、十分な結合は、未改変の核酸の結合の少なくとも約５０％または少なくとも約７５％であり、さらに好ましくは約１００％である。
【００２５】
十分は結合を維持する改変されたヌクレオチド間結合を有するシス−エレメントデコイは、未改変のシス−エレメントデコイより細胞内で安定であるかどうかについて検討することができる。本発明によるシス−エレメントデコイをトランスフェクトした細胞を異なる経過時間において、存在するシス−エレメントデコイ量について見当する。蛍光染料（例えば、テキサスレッド）で標識または放射性標識（例えば、３２Ｐ）したシス−エレメントデコイは、好ましくは、それぞれ、デジタル蛍光顕微鏡およびオートラジオグラフィーまたはシンチグラフィーと共に使用される。改変が成功しているシス−エレメントデコイは、細胞内の半減期が未改変のシス−エレメントデコイの半減期より長く、好ましくは少なくとも約４８時間であり、さらに好ましくは少なくとも約４日であり、最も好ましくは少なくとも約７日である。
【００２６】
好適な改変ヌクレオチド間結合はＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０，５４４）に要約されている。本発明の方法に使用する核酸の改変されたヌクレオチド間リン酸部分および／または非リン架橋は、例えば、ホスホン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホアミデート、リン酸エステルを含有するが、非リンヌクレオチド間類似物は、例えば、シロキサン架橋、炭酸架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセタミデート架橋および／またはチオエーテル架橋を含有する。
【００２７】
本発明のさらに別の実施態様は、核酸の半減期を延長する構造的特徴を核酸に導入することによって核酸を安定化することに関する。ＤＮＡのようなヘアピンおよびベルを含有するこのような構造は米国特許番号第５，６８３，９８５号に開示されている。改変されたヌクレオチド間リン酸部分および／または非リン架橋が上記構造と共に同時に導入されてもよい。このように作製された核酸は、上記のアッセイシステムを用いて、結合および安定性について検討することができる。
【００２８】
コア結合配列は、シス−エレメントデコイだけでなく、ベクターに存在してもよい。好ましい実施態様において、ベクターはプラスミドベクターであり、さらに好ましくは、常染色体的に複製し、それによって導入した２本鎖核酸の安定性を増すことができるプラスミドベクターである。
【００２９】
本発明のさらに別の態様は、配列特異的に転写因子ＩＲＦ−１に結合することができ、２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの一方の鎖だけを以下に示すが、相補鎖も含まれる、以下の配列の１つを好ましくは有する２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに関する。
５’−ＳＡＡＡｎｎｎＳＡＡＡｙｙ−３’（配列番号１）、
５’−ＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号３）、
５’−ＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号５）、
５’−ＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号７）、
５’−ＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号９）、
５’−ＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧ−３’（配列番号１１）、
５’−ＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＧ−３’（配列番号１３）、
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧ−３’（配列番号１５）、
５’−ＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣ−３’（配列番号１７）、
５’−ＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴ−３’（配列番号１９）、
５’−ＧＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’（配列番号２１）。
【００３０】
本発明の２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、上記に詳細に記載する鎖長、改変を示し、おそらく特異的な結合部位の反復を示す。シス−エレメントデコイの最適な鎖長は、ＩＲＦ−１との結合および細胞内への取り込みを最適化するように選択される。通常、１２ｂｐより短い２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは標的タンパク質に弱くしか結合しないが、２２ｂｐより長い２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは細胞による取り込み効率は低いが、強力に結合する。結合強度はＥＭＳＡで求めることができるが、２本鎖核酸の取り込みは、蛍光染料（例えば、テキサスレッド）で標識したシス−エレメントデコイまたは放射性標識（例えば、３２Ｐ）したシス−エレメントデコイによって、それぞれ、デジタル蛍光顕微鏡およびオートラジオグラフィーまたはシンチグラフィーを用いて分析することができる。本発明のシス−エレメントデコイは上記のように安定化することができる。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様は、パリンドロームな結合部位を含有し、従って、短い２本鎖の核酸に少なくとも２つの転写因子結合部位を含むシス−エレメントデコイに関する。パリンドローム配列は必ずしも高いＩＲＦ−１結合を必要とせず、前記シス−エレメントデコイは標的細胞によってより迅速に（より効率的に）取り込まれる。しかし、特に、本発明による短いシス−エレメントデコイは、長い（中心に配列された）コア結合配列および反復Ｇ／ＣＡＡＡモチーフにより、末端部分だけがパリンドロームである。より効率的な取り込みのために、好ましくはほぼ同じ数の単塩基（Ａ＝Ｃ＝Ｇ＝Ｔ）を使用することができるが、本発明によるシス−エレメントデコイの反復Ｇ／ＣＡＡＡモチーフのために、より効率的な取り込みを達成することは困難である。従って、少なくともＡ＝ＴおよびＣ＝Ｇである妥協が好ましい。さらに、好ましくは、好ましいシス−エレメントデコイ配列の一部を有する場合と同様に、コア結合配列をむしろ辺縁部に配列することができる。
【００３２】
本発明によるシス−エレメントデコイは細胞に速やかに取り込まれる。十分な取り込みは、ＩＲＦ−１によって調節することができる１つ以上の遺伝子の調節によって特徴付けられる。本発明によるシス−エレメントデコイは、好ましくは、細胞との接触の４時間後、さらに好ましくは約２時間後、約１時間後、約３０分後、最も好ましくは約１０分後に１つ以上の遺伝子の転写を調節する。このような実験に通常使用される混合物は、１０μｍｏｌ／Ｌのシス−エレメントデコイを含有する。
【００３３】
本発明は、さらにＣＤ４０発現細胞、特に、内皮細胞、単核細胞、樹状細胞、Ｂリンパ球、平滑筋細胞、表皮細胞（ｃｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）または繊維芽細胞において少なくとも１つの遺伝子の転写を調節する方法であって、前記細胞に、配列特異的に転写因子ＩＲＦ−１と結合することができる１つ以上の２本鎖核酸を含有する混合物を接触させるステップを含む方法に関する。好ましい方法は、移植物の一部である内皮細胞における用途に関する。本発明の方法は、通常、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける移植時または植え込み前にｅｘ　ｖｉｖｏにおいて使用される。
【００３４】
移植物はｅｘ　ｖｉｖｏにおいて本発明による方法を使用することによって植え込み前に処理しても、またはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて本発明の方法を使用することによって植え込み後に処理してもよい。処理される移植物は、好ましい実施態様において、（小）腸、心臓、肝臓、肺、腎臓および膵臓並びにいくつかの器官の組み合わせである。器官の処理は、さらに正確には、本発明によるシス−エレメントデコイを用いた血管の灌流／インキュベーションは、植え込みの直前に溶液で洗浄することによってｅｘ　ｖｉｖｏにおいて実施することができる。器官は、好適な保存溶液中（冷蔵）例えば、ウィスコンシン大学溶液、Ｂｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　ＨＴＫ溶液）に同時に保存することができる。
【００３５】
本発明のシス−エレメントデコイを含有する混合物に標的細胞（例えば、内皮細胞、単核細胞、樹状細胞、Ｂリンパ球、平滑筋細胞、表皮細胞（ｃｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）または繊維芽細胞）を接触させる。前記接触させるステップの目標は、シス−エレメントデコイ結合ＩＲＦ−１を標的細胞（すなわち、ＣＤ４０発現細胞）内に導入することである。従って、膜透過を亢進することが知られている核酸改変および／または添加剤または補助剤を本発明により使用することができる（ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ（１９９０）Ｃｈｅｍ．ＲＥｖ．９０，５４４）。
【００３６】
本発明による混合物は、好ましい実施態様において、核酸および緩衝液のみからなる。シス−エレメントデコイの好適な濃度は少なくとも０、１〜１００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌであり、１種以上の好適な緩衝液が添加される。このような緩衝液の一例は、１４４．３　ｍｍｏｌ／ＬのＮａ＋、４．０　ｍｍｏｌ／ＬのＫ＋、１３８．６　ｍｍｏｌ／ＬのＣｌ−、１．７　ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋、１．０　ｍｍｏｌ／ＬのＭｇ２＋、０．４　ｍｍｏｌ／ＬのＨＰＯ４２−、１９．９　ｍｍｏｌ／ＬのＨＣＯ３−、１０．０　ｍｍｏｌ／ＬのＤ−グルコースを含有するタイロード液である。
【００３７】
本発明のさらに別の実施態様において、混合物は、さらに少なくとも１種の添加剤および／または補助剤を含有する。脂質、陽イオン性脂質、ポリマー、リポソーム、ナノ粒子、核酸アプタマー、ＤＮＡに結合しているペプチドおよびタンパク質または合成ペプチドＤＮＡ分子のような添加剤および／または補助剤は、例えば、核酸の細胞内への導入を増加する、１サブグループの細胞だけに混合物を標的化する、細胞内の核酸の分解を防止する、使用前の核酸混合物の保存を容易にすることが意図されている。ペプチドおよびタンパク質の例は、合成ペプチドＤＮＡ分子、例えば、抗体、抗体断片、リガンド、接着分子であり、これらは全て改変されていても、改変されていなくてもよい。
【００３８】
細胞中でシス−エレメントデコイを安定化する添加剤は、例えば、陽イオンポリマー、ポリＬ−リジンまたはポリエチレンイミンのような核酸濃縮物質である。
【００３９】
本発明の方法に使用される混合物は、好ましくは、注射、カテーテル、座剤、エアゾール（それぞれ、鼻および口腔スプレー吸入）、トロカール、発射物（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ゲル、医薬を永久的に放出するポリマーまたは局所的なアクセスを可能にする任意の他の手段によって局所的に適用される。また、本発明の方法に使用される混合物のｅｘ　ｖｉｖｏにおける使用は局所的なアクセスを可能にする。
【００４０】
しかし、ＩＲＦ−１活性の阻害は上記の方法ではタンパク質レベルで阻害できるだけではなく、転写因子タンパク質の翻訳前または翻訳時に実施されうる。従って、本発明のさらに別の態様は、治療用物質としてのＩＲＦ−１発現阻害剤を提供することである。前記阻害剤は、好ましくは、１本鎖核酸、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３つの異なるレベル、転写（ｈｎＲＮＡ合成の防止）、ｈｎＲＮＡのｍＲＮＡへのプロセシング（スプライシング）およびリボソームにおけるｍＲＮＡのタンパク質への翻訳段階において、標的遺伝子の合成を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドによって遺伝子の発現を阻害する方法は最新であり、当業者に周知である。本発明の方法に使用されるＩＲＦ−１に対するアンチセンスは、好ましくは、配列５’−ＣＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号２３）を示し、開始コドンを架橋する。アンチセンスオリゴヌクレオチドのさらに別の好ましい配列は５’−ＧＡＴＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＣ−３’（配列番号２４）、５’−ＴＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＧＣＣＣ−３’（配列番号２５）および５’−ＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＧＧＣＴＧＧＴ−３’（配列番号２６）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは１本鎖ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ／ＲＮＡ−ハイブリッド分子であってもよい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合、例えば、シス−エレメントデコイの上記の配列を示してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート改変ヌクレオチド間結合によって安定化される場合には、これにより、好ましくは免疫適格細胞（例えば、内皮細胞）のＩＦＮγ様の活性化が生じ、望ましい治療効果を少なくとも一部阻害するので、塩基シトシンとグアニンとの間には、ホスホロチオエート改変ヌクレオチド間結合が導入されないと好ましくは考えられるべきである。
【００４１】
本発明のさらに別の態様は、ＩＲＦ−１発現を特異的に阻害し、好ましくは以下の配列の１つを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである：
５’−ＣＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号２３）、
５’−ＧＡＴＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＣ−３’（配列番号２４）、
５’−ＴＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＧＣＣＣ−３’（配列番号２５）、
５’−ＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＧＧＣＴＧＧＴ−３’（配列番号２６）。
【００４２】
本発明のさらに別の態様は、さらに、経皮的（ｐｅｒｃｕｔａｎ）血管形成後の再狭窄または静脈バイパスの狭窄のような循環器系合併症、慢性（移植動脈硬化または脈管障害）または急性移植拒絶、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、免疫学的過敏反応（アレルギー）、特に気管支喘息およびアトピー性皮膚炎、慢性再発性炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎およびクローン病、乾癬およびサルコイドーシス並びに自己免疫疾患、特に糖尿病、多発性硬化症、膠原病（例えば、全身性エリテマトーデス）、関節リウマチおよびｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｓを予防および／または治療するための医薬を製造するための、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または２本鎖ＤＮＡ分子の用途に関する。この治療方法の特定の利点は、さらに、ＣＤ４０／ＣＤ１５４シグナリング経路が同時刺激的に作用するＴＨ１−およびＴＨ２−細胞−応答の同時低下からなる。それによって、ＴＨ２細胞反応（例えば、アトピー性皮膚炎）が弱化しても、伴うＴＨ１細胞反応（例えば、乾癬）の脱抑制を生じないと思われ、その逆もいえる。
【００４３】
以下の実施例および図面は本発明を説明しているが、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【００４４】
１．　細胞培養
ｈｅｐｅｓ改良タイロード液中で１．６Ｕ／ｍｌのディスパーゼを用いて３７℃において３０分間処理することによって、ヒト内皮細胞を臍静脈から単離した。ゼラチンをコーティングした（２ｍｇ／ｍｌゼラチンの０．１Ｍ　ＨＣｌ溶液、室温において；ＲＴ、３０分間）６ウェル組織培養で、２０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍｌナイスタチン、５ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび５ｍＭ　ＴＥＳ、１μｇ／ｍｌヘパリンおよび４０μｇ／ｍｌ内皮増殖因子を含有する１．５ｍｌ　Ｍ１９９培地中で細胞を培養した。典型的な敷石形態、ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｔ−Ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）の陽性の免疫染色、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１の蛍光検出（ＦＡＣＳ）並びに平滑筋α−アクチンの陰性免疫染色によって細胞を同定した（Ｋｒｚｅｓｚら（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５３，１９１）。
【００４５】
２．　ＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｑｉａｇｅｎ　ＲＮｅａｓｙ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン，ドイツ）を用いて内皮総ＲＮＡを単離し、次に製造業者の指示により総容量２０μｌにおいて最大３μｇのＲＮＡおよび２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）　ＩＩ逆転写酵素（ｔｒａｎｓｋｒｉｐｔａｓｅ）（Ｇｉｂｃｏ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、カールスルーヘ、ドイツ）でｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液のｃＤＮＡ負荷量５μｌ（約７５ｎｇ　ｃＤＮＡ）および伸長因子１（ＥＦ−１）のプライマー対（Ｇｉｂｃｏ）を調節するために、１Ｕ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ）を用いたＰＣＲを総容量５０μｌにおいて使用した。ＥＦ−１をＰＣＲの内部標準として使用した。ＰＣＲ産物を、０．１％臭化エチジウムを含有する１．５％アガロースゲルで分離し、バンドの強度をＣＣＤカメラシステムおよびＳｃａｎａｌｙｔｉｃｓ（マサチューセッツ州ビレリカ、米国）社製のＯｎｅ　Ｄｓｃａｎ　Ｇｅｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅでデンシトメトリー的に測定し、その後のＰＣＲ分析におけるｃＤＮＡの容量を調整した。
【００４６】
Ｈｙｂａｉｄ　ＯｍｎＥ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＡＷＧ、ハイデルベルグ、ドイツ）において各プライマー対について全てのＰＣＲ反応を個々に実施した。ヒト臍静脈内皮のｃＤＮＡの個々のＰＣＲ条件は以下のようである：ＣＤ４０（アンプリコンサイズ３８１ｂｐ、２５サイクル、アニーリング温度６０℃、（順方向プライマー）５’−ＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧＧＡＡＴＧＣＣ−３’（配列番号２７）、（逆方向プライマー）５’−ＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号２８）、Ｅ−セレクチン（アンプリコンサイズ３０４ｂｐ、３３サイクル、アニーリング温度６０℃、（順方向プライマー）５’−ＡＧＣＡＡＧＧＣＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＣＣ−３’（配列番号２９）、（逆方向プライマー）５’−ＧＣＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣＡＧＡＧＣ−３’（配列番号３０）、ＩＲＦ−１（アンプリコンサイズ３１０ｂｐ、２９サイクル、アニーリング温度５５℃、（順方向プライマー）５’−ＴＴＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＧＴ−３’（配列番号３１）、（逆方向プライマー）５’−ＧＡＴＡＴＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＴＴＣＡ−３’（配列番号３２）、ＥＦ−１（アンプリコンサイズ２２０ｂｐ、２２サイクル、アニーリング温度５５℃、（順方向プライマー）５’−ＴＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧ−３’（配列番号３３）、（逆方向プライマー）５’−ＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号３４）。
【００４７】
３．　電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）
核抽出物および［３２Ｐ］−標識２本鎖コンセンサスオリゴヌクレオチド（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、ハイデルベルグ、ドイツ）非変性ポリアクリルアミド電気泳動、オートラジオグラフィーおよびスーパーシフト分析をＫｒｚｅｓｚら（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５３，１９１によって記載されているように実施した。オリゴヌクレオチドは以下の１本鎖配列と共に使用した（コア結合配列に下線をつけてある）：ＮＦ（Ｂ、５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号３５）、ＳＴＡＴ−１、５’−ＣＡＴＧＴＴＡＴＧＣＡＴＡＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＴ　Ｇ−３’（配列番号３６）、ＩＲＦ−１、５’−ＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴ−３’（配列番号１９）。
【００４８】
４．　デコイオリゴヌクレオチド（ｄＯＤＮ）技法
２本鎖ｄＯＤＮｓは、Ｋｒｚｅｓｚら（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５３，１９１によって記載されているように、相補的１本鎖ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、コログネ、ドイツ）から作製した。培養中のヒト内皮細胞を、１０μＭ濃度のそれぞれのｄＯＤＮと共に４時間事前インキュベーションした。これらは、ＥＭＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲ分析により以前に最適化したものと同じ条件であった。ｄＯＤＮを含有する培地は、通常、後に新鮮な培地と交換した。ｄＯＤＮｓの１本鎖配列を以下に示す（下線を付けた文字はホスホロチオエート結合塩基であり、全ての配列は５’−３’方向に書かれている）：
ＮＦ（Ｂ、ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ　（配列番号３５）、
ＳＴＡＴ−１、ＣＡＴＧＴＴＡＴＧＣＡＴＡＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧ　（配列番号３６）、
ＩＲＦ−１、ＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴ　（配列番号１９）、
ＩＲＦ−１ｎ　ｃｏｎｓ　ＣＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧ　（配列番号１１）、
ＩＲＦ−１ｎ　ｍｕｔ　　　ＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＡＣＣＣＴＧ　（配列番号３７）。
【００４９】
５．　アンチセンスオリゴヌクレオチド技法
３％リポフェクチン（ｖ／ｖ）（Ｇｉｂｃｏ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カールスルーヘ、ドイツ）をアンチセンス実験の培養培地１ｍｌに添加し、室温において３０分インキュベーションした。その後、それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ，コログネ、ドイツ）を添加して最終濃度０．２μＭとし、室温においてさらに１５分間インキュベーションした。実験の開始時に、それぞれの量のヘパリンおよび内皮増殖因子を添加し、内皮細胞培養の従来の細胞培養培地をアンチセンスリポフェクチン培地と交換した。５時間後アンチセンスリポフェクチン培地を除去し、新鮮な細胞培養培地と交換した。ＩＲＦ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（ＩＲＦ−１　ＡＳ）は５’−ＣＧＡＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号２３）であった。ミスセンスオリゴヌクレオチド（ＩＲＦ−１　ＭＳ，　５’−ＣＧＡＧＴＧＧＴＡＧＡＣＧＴＡＴＴＧＧＣ−３’（配列番号３８））およびスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）オリゴヌクレオチド（ＩＲＦ−１　ＳＣＲ，　５’−ＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号３９））を対照オリゴとして使用した。
【００５０】
６．　蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）
分析対象の内皮細胞を、最初に、１ｍｌ　ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ウシ胎仔血清ろ過滅菌）で３回洗浄し、その後各々２ｍｌ　ＦＡＣＳ緩衝液に再度懸濁させた。遠心（３００×ｇ、５分、＋４℃）および総細胞数を測定（Ｎｅｕｂａｕｅｒ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｃｈａｍｂｅｒ）後、蛍光標識抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、米国）を製造業者の指示により添加し（２０μｌ／１０６細胞）、遮光して＋４℃において３０分間インキュベーションした。その後、試料を２ｍｌ　ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、３００×ｇ、＋４℃において１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをＣｅｌｌ　Ｆｉｘ（ＰＢＳ，１％ホルムアルデヒド）に再度懸濁させ、測定時まで、＋４℃において遮光して保存した（ＥＰＩＣＳ（登録商標）ＸＬ　ＭＣＬ、Ｃｏｕｌｔｅｒ、クレフェルド、ドイツ）。以下の抗体を使用した：ＣＤ４０、Ｒ−フィコエリスリン（ＲＰＥ−）およびフルオロレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、フルオロレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合。非特異的な細胞抗体結合を測定するために、それぞれのＲＰＥ−およびＦＩＴＣ−結合イソタイプ対照を使用した。
【００５１】
７．ウェスタンブロット分析
液体窒素および３７℃（加熱ブロック、クレイフェルデン、ドイツ）において５回連続して凍結融解サイクルを実施することによって、内皮細胞を軟らかくした。Ｈｅｃｋｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　２９９，２４７によって記載されているように、タンパク質抽出物を作製した。標準的なプロトコールにより、ＳＤＳの存在下、変性条件下において１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で２０〜３０μｇのタンパク質を分離し、ＢｉｏＴｒａｃｅ（商標）ポリフッ化ビニリデンＴｒａｎｓｆｅｒｍｅｍｂｒａｎ（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏβｄｏｒｆ、ドイツ）に移した。ＣＤ４０タンパク質を検出するために、ＣＤ４０タンパク質のＣ−末端に対するポリクローナル一次抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ．，ニュージャージー州フランダー、米国）を使用した。ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（１：３０００、Ｓｉｇｍａ、デイセンホーフェン、ドイツ）を添加することによって、化学発光法（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔ、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、イリノイ州ロックフォード、米国）にその後オートラジオグラフィー（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＭＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，バッキンガムシャー、英国）を使用することによって、タンパク質バンドを検出した。同一タンパク質量の負荷および導入は、青色インクによるブロットの染色によって示される。
【００５２】
８．　統計分析
そうでないことを示さない場合には、図面および本文中の全てのデータはｎ回の実験の平均±ＳＤとして示す。統計分析は対応のないデータのスチューデントのｔ検定を用いて実施し、ｐ−値＜０．０５を統計学的に有意であると考えた。
【００５３】
９．　ＣＤ４０／ＣＤ１５４関連移植拒絶の動物における実験的証明
ＳＴＡＴ−１は、ヒトにおけるのと同様に、ラットにおいてＩＲＦ−１よりインターフェロン−γ誘導性ＣＤ４０発現を担当するので、ＳＴＡＴ−１デコイオリゴヌクレオチドを使用することによって、ラットにおける移植拒絶を動物において実験的に検討した（Ｋｒｚｅｓｚら（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５３，１９１）。
【００５４】
株の組み合わせ
株の組み合わせＢｒｏｗｎ　ＮｏｒｗａｙドナーをＬｅｗｉｓレシピエントへの同種移植に使用した。免疫抑制を生じることなく、移植は７日後に拒絶された。ＬｅｗｉｓからＬｅｗｉｓへの移植は同系の対照として実施した。
【００５５】
外植
動物の腹部を、エーテル吸入麻酔下において中線で開腹した。予定腸間膜動脈を有する長さ約１ｃｍの大動脈部分が調製されるように、最初に大動脈部分を全ての動脈部分から開放させた。次の段階において結腸全体を切除した。その後、膵臓が肝門部で開放されるように、門脈の全ての静脈血管を膵臓領域に結紮した。このように調製したドナー小腸は大動脈および門脈の躯幹にのみ接続した。大動脈は腸間膜動脈の近位および遠位に締結し、門脈は肝門から切断し、小腸の血管床は、肉眼的な血液残渣が血管床に残らないように、冷却したウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）（ＵＷ）溶液で洗浄した。最後の段階において、腸内腔を冷却したＵＷ溶液で同様に洗浄し、大動脈部分を有する腸を切除し、植え込みを実施するまで（１２０分以内）、冷却したＵＶ溶液中で保存した。移植物をＳＴＡＴ−１デコイオリゴヌクレオチド（配列ＣＡＴＧＴＴＡＴＧＣＡＴＡＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＴＧ；（配列番号３６）またはそれぞれの突然変異型対照ヌクレオチド（配列：ＣＡＴＧＴＴＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧ（配列番号４０）で処理する場合には、移植物はリンガー液（１４５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎａ＋、５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｋ＋、１５６　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃｌ−、２　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａ２＋、１　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｈｅｐｅｓ、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｄ−グルコース、ｐＨ　７，４、容量３　ｍｌ、最終濃度２０　（ｍｏｌ／Ｌを含有）中で腸間膜動脈に注入し、吻合直前にリンガー溶液で洗浄した。
【００５６】
植え込み
動物の腹部をエーテル吸入麻酔下において中線で開腹した。大動脈および大静脈を調製し、同時に締結した。血管の接続は８−０ナイロンステッチを用いて連続縫合技法において端側縫合で実施した。大動脈部分を有する腸間膜動脈はｉｎｆｒａｖｅｎａｌ動脈部位で吻合し、門脈はｉｎｆｒａｖｅｎａｌ大静脈部位で吻合した。循環を開放後、ドナー腸の回腸末端を６−０ナイロンステッチによってドナー腸の回腸末端に端側吻合で接続した。ドナー腸によって産生される粘液は動物の通常の通路に廃液した。ドナー腸の口腔側を結紮によって閉鎖し、腹部を２層状に開示した。鎮痛のために、Ｔｅｍｇｅｓｉｃを飲料水に混合して動物に術後に与えた。
【００５７】
生体内顕微鏡検査
炎症反応の白血球内皮相互作用の重要性の評価は、生体内顕微鏡分析によってのみ可能である。この方法により、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて内皮における白血球の「回旋運動および接着」を観察することができ、微細血管のパラメーター（組織の灌流、機能的毛細血管密度および血流）を定量的に分析することができた。
【００５８】
生体内顕微鏡は、エピ蛍光測定のためのＨＢＯ　１００水銀ランプを備えたＺｅｉｓｓ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）社製のＡｘｉｏｔｅｃｈ　Ｖａｒｉｏ　１００顕微鏡を用いて実施した。１０×、２０×および４０×（水浸実験）レンズを用いて、２４３×、４７６×および９３３×の解像（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得た。顕微鏡像はＣＣＤビデオカメラ（ＣＦ８／１、Ｋａｐｐａ）で撮影し、分析のためのビデオテープに記憶した。
【００５９】
移植の７日後に、深いジエチルエーテル麻酔下において、生体内顕微鏡を用いてラット（１群あたり６匹の動物）を検討した。呼吸をしやすくするために、気管内挿管した。血圧を永久的にモニターするため、染料の適用を簡単にするために、ポリウレタンカテーテルを頸動脈内に留置した。動物の体温は加熱式プレートを用いて一定に保った。腹側中央で動物を回復し、下行結腸の内容物を排泄させ、小腸の切断を抗腸間膜的（ａｎｔｉ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｉａｌｌｙ）に実施し、顕微鏡観察を容易にするために、腸を特殊な固定具に固定した。組織の乾燥を防ぐために、リンガー溶液で腸を永久的に湿らせた。０．５％ＦＩＴＣ（フルオロレセインイソチオシアネート）結合デキストラン０．８ｍｌを注射することによって、腸の微細循環を可視化した。測定値を統計的に捕らえるために、それぞれの腸部分について少なくとも１０箇所の異なる領域を検討した。異なるパラメーターは以下のように定量化した：灌流指数は、灌流した粘膜領域（％）＋不規則に灌流した粘膜領域全て×０．５（％）から得た。機能的毛細血管密度はコンピュータ支援式画像解析（ＣＡＰ−ＩＭＡＧＥソフトウェア、Ｚｅｉｎｔｌ、ハイデルベルグ、ドイツ）で測定した。白血球内皮相互作用を検討するために、０．１％ローダミン−６Ｇ（Ｓｉｇｍａ、ハイデルベルグ、ドイツ）０．２ｍｌを注射することによって白血球を標識し、後毛細管細静脈（ｖｅｎｏｌｅｓ）は粘膜下組織において顕微鏡観察した。そのような白血球は、接着性白血球（「粘着物（ｓｔｉｃｋｅｒ）」）と規定し、少なくとも２０秒で血管内皮部分の長さ１００μｍに接着した。粘着物（ｓｔｉｃｋｅｒ）数／内皮表面積ｍｍ２を算出した。内皮表面積は、円柱の表面積の算出から得た。
【００６０】
小腸移植結果
灌流の測定単位としての粘膜機能的毛細血管密度は、対照群および突然変異型対照オリゴヌクレオチド処理群において、拒絶を生じることなく、同系移植した小腸の値の１０％に低下した。一方、機能的毛細血管密度はＳＴＡＴ−１シス−エレメントデコイ処理した小腸では４倍増加した。血流（赤血球の流速）はこれらの動物では１０倍速く、灌流指数は３倍高かった。ｓｔａｓｅｉｎｄｅｘは６０％低下し、内皮に接着した白血球の数は２５％減少した。後者のパラメーターだけが統計学的に有意に変化しなかった。拒絶は腸灌流の低下を誘導し、従って、要約すると、シス−エレメントデコイ処理群では移植物の分解は有意に減少した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
９時間後の非刺激ＴＮＦα（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＴＮＦα（１００Ｕ／ｍｌ）プラスＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）−刺激培養ヒト内皮細胞におけるＣＤ４０ｍＲＮＡ発現（ＲＴ−ＰＣＲ分析）の結果をグラフで示す（非刺激内皮細胞における基底ＣＤ４０発現に対する％）（ｎ＝５〜９、＊Ｐ＜０．０５基底状態に対して、†Ｐ＜０．０５ＴＮＦαおよびＩＦＮγに対して）。
【図２】
それぞれ、ＴＮＦα（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＴＮＦα（１００Ｕ／ｍｌ）プラスＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）と共に０．５時間（ＮＦκＢおよびＳＴＡＴ−１）および３時間（ＩＲＦ−１）インキュベーションしたヒト内皮細胞におけるＳＴＡＴ−１およびＩＲＦ−１のｐ９１／ｐ９１ホモダイマーのＮＦκＢ（ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマー）の核転移の時間依存的増加の結果を略図で示す。シクロヘキシミド（Ｃｘ、１μＭ）と共に事前インキュベーション（１時間）することにより、ＩＲＦ−１は新規に発現されることが証明される。代表的な電気泳動移動度シフト分析による比較結果がさらに別の実験から得られている。
【図３】
それぞれ、ＴＮＦα（１００Ｕ／ｍｌ）／ＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）と共に９時間（ＲＴ−ＰＣＲ分析）および２４時間（ウェスタンブロット）インキュベーションしたヒト内皮細胞において、（ａ）ＣＤ４０のｍＲＮＡレベル（ｎ＝３〜５、最大値に対する％における統計学的要約、＊Ｐ＜０．０５ＴＮＦα／ＩＦＮγに対する）、（ｂ）ＣＤ４０およびＥ−セレクチンのｍＲＮＡ−レベル（代表的なＲＴ−ＰＣＲ分析の比較結果はさらに別の実験において得られている）、（ｃ）ＣＤ４０タンパク質レベル（代表的なウェスタンブロットの比較結果はさらに別の実験において得られている）に対するＳＴＡＴ−１ＮＦκＢおよびＩＲＦ−１（１０μＭ、４時間事前インキュベーション）のシス−エレメントデコイの特異的な影響の結果を略図で示す。（ｂ）および（ｃ）に示す実験において、デンシトメトリー分析（Ｏｎｅ−Ｄｓｃａｎ−Ｇｅｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ，マサチューセッツ州ビレリカ、米国）によって測定した相対強度（％）を、サイトカイン刺激における最大値と比較して示す。
【図４】
ＴＦＮα（１００Ｕ／ｍｌ）／ＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）と共に２４時間インキュベーションしたヒト内皮細胞における蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）および（ｂ）内皮細胞に特徴的な細胞表面タンパク質ＰＥＣＡＭ−１のアッセイによって測定したＣＤ４０タンパク質レベルに対するＳＴＡＴ−１、ＮＦκＢおよびＩＲＦ−１（１０μＭ、４時間事前インキュベーション）の異なるシス−エレメントデコイの影響を略図で示す。ＩｇＧイソタイプコントロールの元の測定値とＴＮＦα／ＩＦＮγ処理（ＣＤ４０）および非刺激（ＰＥＣＡＭ−１）細胞を重ねたものを、それぞれ、（ａ）および（ｂ）に示し、それぞれの平均蛍光強度の対数値を表に示す。代表的な実験の比較結果はさらに別の実験において得られている。
【図５】
９時間インキュベーション後のヒト内皮細胞における、それぞれ、ＣＤ４０およびＩＲＦ−１ｍＲＮＡレベルに対するＴＮＦα（２０００Ｕ／ｍｌ、ＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＴＮＦα／１００Ｕ／ｍｌ）プラスＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）の影響の結果を略図で示す。代表的な実験の比較結果はさらに別の実験において得られている。
【図６】
ＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）と共に０、０．５、１．５、３および９時間インキュベーションしたヒト内皮細胞における、それぞれ、ＣＤ４０およびＩＲＦ−１ｍＲＮＡ発現の時間依存的増加の結果を略図で示す。代表的な実験の比較結果はさらに別の実験において得られている。
【図７】
ヒト内皮細胞におけるＣＤ４０ｍＲＮＡ発現に対するシス−エレメントデコイ影響の特異性を略図で示す。シス−エレメントデコイ（ＩＲＦ−１ｎ、ｃｏｎｓ、１０μＭ）による事前インキュベーション（４時間）は、その後ＴＮＦα（１００Ｕ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）と共に９時間インキュベーションした細胞におけるＣＤ４０ｍＲＮＡ発現を阻害するが、それぞれの突然変異した対照オリゴヌクレオチド（ＩＲＦ−１ｎ、ｍｕｔ、１０μＭ）による事前インキュベーションは阻害しない。代表的なＲＴ−ＰＣＲ分析の比較結果はさらに別の実験において得られている。
【図８】
ＩＲＦ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ、配列番号２３）（濃度０．２μＭ）と共に５時間事前に処理したヒト内皮細胞におけるＩＲＦ−１タンパク質（３時間後）およびＣＤ４０ｍＲＮＡ（９時間後）のサイトカイン誘導性（１００Ｕ／ｍｌ）ＴＮＦα、（１０００Ｕ／ｍｌ）ＩＦＮγ発現の阻害を示す。（ａ）および（ｂ）の左側の部分は異なる細胞を負荷した３つの実験の統計学的要約を示し、それぞれの右側部分には代表的なウェスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、（ｂ）には、さらにデンシトメトリー的な解釈（「強度」）を、刺激した対照の％で示し、内部標準β−アクチンと比較している（＊Ｐ＜０．０５刺激した対照細胞と比較）。それぞれのミスセンス（ＭＳ）およびスクランブルした（ＳＣＲ）対照オリゴヌクレオチドは、それぞれ、ＩＲＦ−１の発現およびＣＤ４０の発現に影響を与えなかった。
【図９】
培養ＴＨＰ−１細胞における異なるＩＲＦ−１シス−エレメントデコイ（配列番号１３、１７、１９および２１）の取り込みの電気泳動移動度のシフト分析およびその後のＩＲＦ−１の中和を示す。ＴＨＰ−１細胞を異なるシス−エレメントデコイと共に１時間事前インキュベーションし、その後ＴＮＦα（１００Ｕ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１０００Ｕ／ｍｌ）でさらに３時間刺激した。試料の以下の処理および分析の結果を図の左側部分に示す。図の右側部分は、同一の実験条件下で調製した刺激対照細胞の核抽出物の電気泳動移動度シフト分析を示す。電気泳動移動度シフト分析（スーパーシフト分析）の前に、Ｋｒｚｅｓｚら（１９９９）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４５３，１９１に記載されているように、核抽出物を抗ＩＲＦ−１抗体と共にさらにインキュベーションした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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