(57)【要約】原核微生物の有無を検出するための装置および方法が提供され、特定の原核微生物の存在を特徴付け、それによりその微生物に対するマーカーを提供するタンパク質（例えば、微生物特異的プロテアーゼ）を同定する工程；特定の原核微生物の存在に対するマーカーであるプロテアーゼを、プロテアーゼが存在すると基質が切断されることによって検出する工程；および切断が起こった場合に、そのプロテアーゼの存在を表示する工程を包含する。より詳細には、この方法は、特定の微生物病原体（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対して独特で、かつ基質特性である少なくとも１つの外膜タンパク質または分泌タンパク質を同定する工程を含む。
2004504854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
ａ．　原核微生物に独特のプロテアーゼを同定する工程；
ｂ．　該プロテアーゼに特異的な消光された標識基質を提供する工程；
ｃ．　サンプルを提供する工程；および
ｄ．　検出可能な標識の有無を決定する工程
を含む、サンプル中の原核微生物の有無の検出方法。
【請求項２】
消光された標識が蛍光標識されたペプチドおよび比色標識されたペプチドからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
測定する手段が比色計または蛍光計である請求項２記載の方法。
【請求項４】
次の工程：
ａ．　原核微生物に独特のプロテアーゼを同定する工程；
ｂ．　該プロテアーゼに対する消光された標識された広いスペクトルの基質を提供する工程；
ｃ．　サンプルを提供する工程；および
ｄ．　検出可能な標識の有無を測定する工程
を含む、サンプル中の複数の病原性微生物の検出方法。
【請求項５】
比色計または蛍光計を用いて結合体化されたペプチドを検出することにより細菌種を認識するための、蛍光または比色標識された広いスペクトルのペプチドの使用方法。
【請求項６】
タンパク質カプセル化デンプンまたはタンパク質カプセル化スタイロフォームを含む、固体状または液状の抽出物から微生物を捕捉し、放出するための装置。
【請求項７】
ペレットおよび該ペレットの周囲のゼラチンに捕らえられた抗体の層を含む、サンプルから微生物を捕捉し、放出するための装置。
【請求項８】
サンプルに隣接する第１の側面と第２の側面とを持つ包装材料および染料標識した基質が該第１の側面に結合されている細菌用の染料標識基質を含む、サンプル中の細菌検出用センサー。
【請求項９】
以下の工程：
（ａ）組み換えα結晶型タンパク質を発現させて精製する工程、および
（ｂ）色素標識ペプチドを含む固相または液相アッセイにα結晶型タンパク質を該色素標識ペプチドのタンパク質分解を低減するのに十分な量で添加する工程
を含む、α結晶型タンパク質の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本件出願は、２０００年５月３日に出願された、米国仮出願第６０／２０１，４０５号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、原核微生物の検出に関する。特に、本発明は、食品および食品関連の作業場を汚染する原核微生物また病原体の有無を検出する方法ならびに装置に関する。
【０００３】
発明の背景
現在、食品安全性および査察局（Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ）（ＦＳＩＳ）の米国部門は、細菌汚染についての肉、鳥肉、および魚肉査察に毎年５億ドル以上を支出する。広く、査察を使用して、作業場の清潔さを調べ、食品材料中の病原性微生物を検出する。病原性微生物の摂取は、この微生物が不注意にスーパーマーケット商品内に包装される場合、食中毒を生じ得る。病原性微生物の１つの例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａである。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、世界中のヒト食品伝染疾患の主な原因であるグラム陰性細菌の種類である。毎年米国単独で４百万ケースに至るサルモネラ症が報告されている。多くの異なる血清型の病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが公知であり、最も一般的なのはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ およびＳ．ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ である。代表的に、サルモネラ症は、抗生物質で処置される。しかし、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの抗生物質耐性株が、現れている。ＬｉｓｔｅｒｉａおよびＥ．ｃｏｌｉもまた、一般的な微生物汚染菌である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、胃腸炎の一般的原因であるグラム陽性細菌である。Ｅ．ｃｏｌｉに対する試験は、食品および作業場の糞便汚染の指標として実施されている。
【０００４】
食品産業は、製造および卸しレベルのみで食品汚染について試験する傾向にある。しかし、食品材料が包装され、消費が生じる間、卸しチェックで検出不可能であった細菌性病原体は、増殖し得、従って健康状態が危険になり得る。汚染食品は、生産者にとって重要性が増大している。悪評および製品回収は、毎年食品産業に数百万ドルの費用をかける。
【０００５】
目下、卸しレベルおよび製造レベルで使用されるアッセイ系は、専門の訓練および器具が必要であり、時間を消費し、そして少数の病原性細菌の存在に対してあまり感度が高くない。疑われる細菌汚染についてアッセイするために、培養物を、汚染されていると疑われる食品のサンプルまたは作業場からのサンプルを用いて得て、検出可能な物質（疑われる細菌汚染物質）の量を増加する。培養は、４８時間まで必要とし得る。次いで、培養物中で増殖した細胞を溶解して、溶解物質を生成する。歴史的に、病原性細菌についてのアッセイは、溶解物質中の細菌性タンパク質を検出するための免疫アッセイにおける抗体を使用することでなされている。近年は、いくつかの会社が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）に基づく方法を使用して、検出アッセイに使用するための微生物の遺伝物質を複製している。単離された遺伝物質は、別々の工程で増やされ、そして同定される。このＰＣＲ 検出系はまた、実施するために分単位よりもむしろ時間単位を必要とする。試験は、スーパーマーケットへ製品を出荷すると同時または前に実施される。食品汚染を検出するための単純で、感度が高く、かつ迅速な方法は、卸しレベルでの試験および小売レベルでの試験の両方で必要とされる。
【０００６】
検出装置はまた、消費者を保護するため小売レベルで必要とされる。卸しレベルで有用な試験器具は、一般的に、種々の理由から小売レベルでは有用でない。第１に、ほとんどの卸しレベルの試験は、典型的な消費者によってはほとんど実施されない技術的な技能を必要とする。第２に、製品が購入前に棚に残っている場合、汚染レベルは、特に、製品の温度が適切に制御されていない場合、増加し得る。食品が輸送にある間、細菌増殖は起こり得る。小売レベルで食品中の微生物を検出するための方法および装置が示されている。小売マーケットのための試験が、開発されているが、それらは、採用されていない。食品製品を囲む液体または物質のイオン含有量（例えば、ｐＨ）における変化の比色検出器が、小売包装に使用されるか、または組み込まれている（例えば、米国特許第４，７４６，６１６ 号および同第５，０５３，３３９ 号（これらのそれぞれの開示は本明細書中に参考として援用される）に示される）。抗体がまた、汚染物質の検出のために比色標識へ結合されている（例えば、米国特許第５，３０６，４６６ 号および同第５，８６９，３４１ 号（これらのそれぞれの開示は本明細書中に参考として援用される）に示される）。前述のいずれも、現行の市場の必要性を満たすのに十分に特異的ではなく、そして感度も高くない。
【０００７】
小売レベルで潜在的に汚染されている食品製品中の少なくとも１つの病原性微生物の有無を特異的にかつ高い感度で検出する手段が、必要である。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、特定の原核微生物の存在を特徴付け、そしてそれによりその微生物に対するマーカーを提供する細菌特異的タンパク質（例えば、プロテアーゼ）を同定する工程；プロテアーゼが存在すると、基質が切断されることによって、特定の原核微生物の存在についてのマーカーであるこのプロテアーゼを検出する工程；および切断が生じた場合に、このプロテアーゼの存在を表示する工程を含む、原核微生物の有無を検出するための方法を提供する。より詳細には、この方法は、少なくとも１つの外膜タンパク質または特定の微生物病原体（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に独特であり、かつ基質特異性の分泌タンパク質を同定する工程を含む。
【０００９】
バイオインフォマティック（ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃ）アプローチを利用して、複数の一般的な病原性細菌種のプロテアーゼ補体のＢＬＡＳＴ 探索比較を行った；種に独特な１つ以上のプロテアーゼが同定された。次に、各プロテアーゼに特異的な基質が、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）を用いて同定された。次いで、独特な、同定された基質は、標識され、そして試験に必要なサンプル中の特定の微生物病原体の存在を検出するために使用された。同定されたプロテアーゼ基質は、細菌に特異的な基質を同定するために一般的な食品およびイーストで試験された。
【００１０】
別の局面において、本発明は、マーカータンパク質を検出するため、およびこのマーカータンパク質の存在を消費者に通知するための装置を提供する。微生物汚染についてモニターされるべき食品材料に隣接する包装材料に結合される特異的な基質を含む汚染食品を検出するために、小売店における使用または自宅使用用のバイオセンサーが、提供される。好ましくは、基質は、標識と共有結合しており、従って、基質標識結合のタンパク質分解時に汚染細菌の存在を示す検出シグナルを有する。バイオセンサーは、検出されるべき細菌に特有の特異的プロテアーゼの特異的基質を始めに決定することによって作製される。決定された特異的基質は、複数の色素生成（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｅｎｉｃ ）脱離基または蛍光脱離基で標識される。最も好ましくは、標識基は、シグナルが包装からタンパク質分解的に分離される場合のみに活性化される潜在シグナルを提供する。色素生成脱離基は、例えば、パラ−ニトロアナリド基である。好ましくは、標識された基質分子は、食品材料に隣接する包装材料の内表面に結合される。この食品材料が、万一汚染された場合、微生物病原体は、包装に結合された標識基質に作用する、プロテアーゼを産生し、脱離基を遊離する。視覚的に検出可能な比色シグナルが放出される場合、目的の部位で認識できる色変化を生じる。
【００１１】
別の実施形態において、病原性微生物種の中で一般的であるが、基質特異的であり、かつ共通の基質を共有するプロテアーゼが、細菌の存在を検出するための方法および装置に使用するために同定される。例えば、細菌は、肉製造工場およびレストランの作業面に集まり得る。複数の細菌によって切断され得る基質は、標識され、そして基質コレクター（ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ）（例えば、綿棒の先の綿繊維）に共有結合される。綿棒先端は、細菌によって汚染されていると疑われる表面を拭き取るために使用される。この綿棒先端を、培地に置き、そして結合された標識基質に特異的なプロテアーゼが存在する場合、標識基質のタンパク質分解を可能にする条件を使用してインキュベートする。タンパク質分解は、検出可能なシグナル（例えば、色変化）の生成を生じ、このシグナルが色素生成脱離基である場合、認識され得る。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態において、ストリップセンサーが提供される。好ましくは、ストリップセンサーは、潜伏検出シグナルを有する基質が共有結合されている不活性材料を含む。単一のプロテアーゼ基質または複数のプロテアーゼ基質が、利用され得る。複数のプロテアーゼ基質が利用される場合、各々は、別のものと区別するように標識され得、そして／または各々は、ストリップ支持材料上の特定の領域に局在化され得る。食品材料に応じて、期待される特定病原性微生物の出現の頻度を予測し得る。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、一般的な鳥肉製品の汚染菌であり、従って、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓプロテアーゼに特異的な色素生成脱離基で標識された基質が、鳥肉製品に隣接する包装の表面に組み込まれ得る。しかし、可能な限り多数の微生物病原体が存在し得る場合、これら全ての微生物によってタンパク質分解され得る基質が、これらの病原性微生物に特異的であるならば利用され得る。
【００１３】
本発明のさらに別の局面において、キットが、微生物性の食品汚染を検出するために提供される。このキットは、脱離基で標識されたタンパク質基質が結合される平坦な固体支持体（好ましくは、複数のウェルを有する）を含む。リン酸緩衝化溶液、陰性対照、および陽性対照を提供する手段が、提供される。疑わしい食品（ＳＦ）のサンプルが、リン酸緩衝液中で調製される。各ＳＦ、陰性対照、および陽性対照のアリコートを、それ自身のウェルに置き、反応させる。色変化が観察されるウェルは、陰性対照ウェルでも色が変わらなければ、微生物汚染を含む。陰性対照ウェルで色が変化する場合、次いでアッセイが繰り返され得る。
【００１４】
発明の詳細な説明
卸し試験キットを開発するために最も重要な事柄の１つは、食品中の微生物病原体を捕捉する能力である。生存微生物の全てが捕捉され、そして適切な回収培地で富化されるような方法で、食品マトリクスから微生物を確実に捕捉する手順を有することが必要である。多くの会社は、細菌を捕捉するために綿棒またはフィルターを使用するが、いくつかの独立した研究は、これらの多孔性の素材における微生物の封じ込めが低レベルの汚染を検出する精度を減少することを示している。標準的なフィルター捕捉方法はまた、細菌を閉じ込めるが、直送プレーティング（ｓｔｒａｉｇｈｔ−ｆｏｒｗａｒｄ ｐｌａｔｉｎｇ）よりも確実ではなく、そして培養方法は、結果が得られるまで１週間はかかる。磁性ビーズのような細菌捕捉装置は、より費用がかかり、そして磁石でチューブの壁にそって細菌を収集するためにさらなる工程を必要とする。
【００１５】
食品安全性試験において、食品サンプルは、滅菌されたストマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ）バッグが備えられたストマッカーブレンダーと呼ばれる特別なブレンダー中ですり砕かれる。本発明の捕捉方法の基本原理は、穏やかに振盪しながら、ブレンドされたサンプルへＰＥＳ 錠剤を数分間添加して細菌を捕捉することである。外皮は、室温でのこの短い曝露時間の間、インタクトなままである。細菌が捕捉された後、ＰＥＳ は、ストマッカーバッグの上部に浮上させ、滅菌ピンセットで除去する。錠剤は、増殖富化培地に置かれ、そして十分な細菌が確実に検出され得るまで３７℃にてインキュベートされる。３７℃にて十分な時間経過後、ゼラチンコーティングが溶け、そして細菌が、増殖培養培地へ効率的に放出される。
【００１６】
ＰＥＳ 錠剤を形成するため、ゼラチンは、６５℃まで加熱され、そして約５５℃まで放冷した。次いで、５０μｇ／ｍｌの抗体が、ゼラチンカプセルがペットの周りに形成される直前に添加された。ＰＥＳ 技術は、細菌を捕捉し、そして試験サンプルから富化培地中へ細菌を放出するために使用され得る。ゼラチンの剛性は、インキュベーション後、数時間まで抗体が放出されることを妨げる（図２を参照のこと）。
【００１７】
２つのＰＥＳ 錠剤は、室温にて力強く振盪しながらＰＢＳ 中でインキュベートされた（ＲＴ；シリーズ１および２）。各時点（０ 分、５ 分、１０分、２０分、６０分、１２０ 分、および７２０ 分）で、サンプルのアリコートを取り出し、ＨＲＰ 結合体化抗体の量が、ＴＭＢ ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ 、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて検出された。サンプルは、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ マイクロプレートリーダーで６５５ ｎｍにて読まれた。２０分後、ＰＥＳ 錠剤上の総抗体の１％未満が、ＰＢＳ 溶液へ溶解した。従って、この方法で抗体コーティングカプセルを用いて細菌を捕捉して、富化培地へ放出することが可能である。ブタ皮膚ゼラチン（３００ ブルーム）の剛性（高ブルーム数）は、この捕捉および放出手順を可能にする。より低ブルームのゼラチンを使用すると、細菌がより速やかに富化培地へ放出され得る。
【００１８】
本発明は、上記のタンパク質カプセル化スタイロフォーム（Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ ）（ＰＥＳ ）錠剤を利用して、食品サンプル中に存在する汚染細菌を定量的に捕捉して、そして放出する方法を提供する。ゼラチン中に閉じ込められた市販の抗体でコーティングされた１つ以上の錠剤が、ストマッカーバッグのホモジナイズされた食品試験サンプルに置かれ、そして室温にて穏やかに振盪しながらインキュベートされ得る。次いで、この錠剤は、滅菌ピンセットを用いて除去され、そしてゼラチンコーティングが溶けて、細菌を培地中へ放出するまでの短期間、３７℃にて増殖培地に置かれ得る。
【００１９】
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ 汚染の存在は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ の病原性種にのみ見出されるメタロプロテアーゼ（ｍｐｌ ）を測定することによって検出される（Ｄｏｍａｎｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． １９９１．Ｊａｎ； ５９（１）： ６５−７２； Ｍｅｎｇａｕｄ ら、１９９１）。ｍｐｌ に対する合成基質としての使用のための一連のペプチド、Ｍ１（ｌｏｔ ０３８−１３／１５ ）およびＰ１（ｌｏｔ ０３８−１０／１２ ）が、設計され、そしてその配列は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ（１９５ Ｋｉｍｂａｌｌ Ｓｔ．， Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ， ＭＡ）によって製造された。このペプチドは、活性部位がブロックされないような方法で、蛍光基（ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ ）を用いて合成された。Ｍ１ペプチドは、ｐＨ５．５ でＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ に対して特異的である。
【００２０】
【表１】
2004504854.tif 000003
【００２１】
予備的証拠は、ｐＨ ５．５でＭ１ペプチドがＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ に対して特異的であり、Ｅ．ｃｏｌｉの存在を有意に検出しないことを示す（図３を参照のこと）。このペプチドおよびこのペプチドの誘導体（１つまたは２つのアミノ酸置換を有する）は、食品中のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ に対する標準的なマイクロプレートアッセイ形式のために使用され得ることが期待される。
【００２２】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、少なくとも２つの特徴のあるプロテアーゼ（１つは、メタロプロテアーゼであり、そしてもう１つはセリンプロテアーゼである）を分泌することが発見された。微生物性プロテアーゼは、触媒部位に基づいて４つの主要なクラス（メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびアスパラギン酸プロテアーゼ）に分類され得る。特定の型の触媒部位は、触媒部位ブロッカーを用いて決定され得る。例えば、金属触媒部位を有するメタロプロテアーゼの存在は、ＴＡＰＩ［Ｎ− ｛Ｄ，Ｌ−［２−（ヒドロキシアミノカルボニル）ｍ−エチル］−４−メチルペンタノイル｝Ｌ−３−（２ イナフィル（ｉｎａｐｔｈｙｌ））アラニル−Ｌ− アラニン，２− アミノエチルアミド］ を用いた触媒反応を特異的にブロックすることによって示され得る。各プロテアーゼの触媒部位は、そのプロテアーゼおよびそれらのクラスに含まれる類似の新規なプロテアーゼを同定するために使用され得る特徴的なアミノ酸特性、モチーフ、またはアミノ酸配列を有する。さらに、多くのプロテアーゼは、２つの形態を有する：酵素のより小さな活性型を得るために部分的なタンパク質分解（限られたタンパク質分解）を必要とするより大きな不活性型。プロテアーゼは、タンパク質基質中のペプチド結合を破壊することが既知である。いくつかのプロテアーゼは、加水分解または破壊し得るペプチド結合の型に関して非常に特異的であることが既知である。プロテアーゼが破壊し得る結合に関して限定される場合、このプロテアーゼは、基質特異的であるといわれる。
【００２３】
特定の酵素またはその触媒部位に特徴的なアミノ酸配列は、遺伝コードから再生される。酵素またはその触媒部位のアミノ酸配列を知ることによって、その配列をコードするＤＮＡ またはＲＮＡ のヌクレオチド配列を推測し得る。次いで、このヌクレオチド配列は、細菌の遺伝コード内での位置を探すか、または合成され得る。該アミノ酸配列をコードする遺伝子配列のクローニングは、酵素またはその触媒部位のコピーを作製するための複数のテンプレートを提供するために使用され得る。酵素またはその触媒部位のこれらのコピーを使用することで、切断の正確な部位または加水分解される結合型が決定され得る。この情報を使用することで、酵素の特異的基質が規定され得る。この基質は、病原性細菌の存在についてアッセイするために使用され得る。基質には、病原性細菌の存在を表示するのに役に立つ標識が備えられる。好ましい標識は、色素生成型であり、そして切断された場合に可視シグナルを生成する。例えば、基質の特異的切断を決定する場合、基質には、２つの異なる色素が提供され得るが、色素が非常に近接し、ＦＲＥＴによって測定される場合、一方は、他方を消光するのに役に立つ。
【００２４】
蛍光共鳴エネルギー転位（ＦＲＥＴ）は、１つの蛍光分子の放出が別の蛍光分子の励起に共役する距離依存性の励起状態相互作用のプロセスである。共鳴エネルギー転移の典型的なアクセプターとドナーの組は、４−［［４−（ジメチルアミノ）フェニル］アゾ］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）および５−［（２−アミノエチルアミノ］ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）からなる。ＥＤＡＮＳは、３３６ｎｍの光の照射により励起され、波長４９０ｎｍで光子を放出する。ＤＡＢＣＹＬ部分がＥＤＡＮＳから２０オングストローム以内に位置すると、この光子は、効率的に吸収される。ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳは、ペプチド基質の反対の端に結合する。ペプチドが完全である場合、ＦＲＥＴは非常に効率的である。ペプチドがメタロプロテアーゼにより切断されていると、この２つの染料は、もはや接近した状態ではなく、ＦＲＥＴは非効率となる。切断反応後には、ＤＡＢＣＹＬ蛍光の減少またはＥＤＡＮＳ蛍光の増加（消光の低下）のいずれかが観察され得る。
【００２５】
可視シグナルを提供するための別の方法には、テキサス・レッドなどの食用安全染料（ＦＤ＆Ｃ）またはアミドブラックまたは４−ニトロアナリンもしくは７−アミノ−４−メチルクマリンなどの蛍光測定色素でプロテアーゼ基質を標識することが含まれる。小売用途のためには、標識された基質を食品包装に結合させうる。病原性微生物を特徴付けるプロテアーゼが存在すると、標識または標識された基質がパッケージから切断され、その結合部分から放散される。この結果、その部分での色変化がもたらされる。例えば、パッケージ上に赤で「食べてはいけません」と印刷されうる。標識された基質が存在する場合、字はマスクされる。標識が除去されると、警告が可視化される。
【００２６】
一態様において、所定の原核微生物の存在を検出し、表示するアッセイ系を提供する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検出を例示する。しかしながら、本発明を、この病原性種に限定することを意図しない。目的の所定の原核生物の存在は、プロテアーゼによって基質がタンパク質分解により切断され、シグナルの生成がもたらされることにより示される。好ましくは、シグナルは発色性である。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＤＰ−Ｌ１９５５）は、スタンフォード医科大学（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ） のジュリー・テリオット（Ｊｕｌｉｅ Ｔｈｅｒｉｏｔ） 博士より提供していただいた。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、細胞内運動に必要な遺伝子の欠失により無毒化した（ＡｃｔＡ， Ｓｍｉｔｈ ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９６ Ｎｏｖ； １３５ （３）： ６４７−６０）。
【００２７】
少なくとも１種の細胞外プロテアーゼを産生する病原性細菌を検出するためのアッセイを開発する方法、および該アッセイを用い、少なくとも１種の細胞外プロテアーゼを産生する病原性細菌を検出する方法は、以下の通りである。
【００２８】
ステップ１）　目的の原核微生物を唯一同定する触媒性マーカーアミノ酸配列を明確にする。
【００２９】
例えば、目的の病原性原核微生物により産生される細胞外プロテアーゼに特有のアミノ酸配列などの、目的の微生物の存在を唯一に特徴付けるか、または特色づけるアミノ酸配列（マーカー配列とも称する）を選択する。この選択は、バイオインフォマティクスによるアプローチを利用して行う。既知のアミノ酸配列に関して、一般的な病原性細菌種間のＢＬＡＳＴサーチ比較を行う。特定の原核性微生物に特有の１つ以上のアミノ酸配列が決定される。
【００３０】
ステップ２）　プロテアーゼによる至適タンパク質分解を促進する条件を決定するために十分なプロテアーゼを得る
【００３１】
アッセイ対象の病原性細菌が増殖している細胞外培地からプロテアーゼを単離する。
【００３２】
あるいはまた、プロテアーゼの遺伝子配列またはプロテアーゼの遺伝子配列の位置が未知であれば、ステップ１のマーカーアミノ酸配列の発現をもたらす遺伝子配列を単離し、クローニングするか、またはまず該遺伝子配列を決定し、次いで前述のとおり行なう。
【００３３】
ステップ３）　原核性生物の増殖、および細胞外プロテアーゼ産生の条件を決定する。
【００３４】
目的の特定の原核性微生物の増殖、および該微生物特有の活性プロテアーゼの培地内での発現に必要な培地を決定する。
【００３５】
該特定のプロテアーゼを不活性前駆体形態から活性形態に変換するために第２のプロテアーゼが必要であるか否かを調べる。
【００３６】
該プロテアーゼが活性形態で分泌されたか否かを調べるため、選択した候補（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ） 基質を含有する細菌培養物のサンプルを供給し、これらの基質の切断を測定する。例えば、ステップ３の細菌ペレットを、一般的な拡張基質（ミオシンＩＩ、ウシ血清アルブミン、コラーゲン、フィブロネクチンおよびヘモグロビン）の存在下で５００μｌのＤＭＥＭ中に静かに再懸濁する。ミオシンＩＩ（カゼインなどの乳由来タンパク質ではないが）は、乾燥保存処理したハムから単離されたグラム陽性菌のタンパク質分解活性を測定するのに好適な基質であることが示されている（Ｒｏｄｒｉｇｅｚラ、Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８．Ｎｏｖ；８５（５）：９０５−１２ ）。細菌および基質の懸濁液を静かに振とうしながら３７℃でインキュベートする。所定時間（０．１、０．３、１．０、３．０、５．０、２４および４８時間）に、サンプルを遠心分離して細菌をスピン・ダウンさせ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルサンプル用に少量のアリコートを取り出す。時間経過が終了した後、サンプルを１０〜１５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルに供する。次いで、Ｂｉｏ−Ｒａｄ半乾燥転移ブロッティング装置を用いてタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐｓｅｑ（転移バッファー、１０％ＣＡＰＳ、１０％メタノールｐＨ１１．０、１５Ｖで３０分間）に移す。タンパク質の転移後、ブロットをクーマシーブルーＲ−２５０（０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０、５０％メタノール、１０％酢酸）で染色し、脱染（５分間の強い脱染、５０％メタノール、１０％酢酸；脱染完了まで弱い脱染、１０％メタノール、１０％酢酸）した後、Ｎ−末端から配列解析する。あるいはまた、タンパク質分解による切断部位をマッピングするためＶｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ Ｍａｓｓ分光分析器（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてサンプルを質量分析器に供する。
【００３７】
例えば、細胞外メタロプロテアーゼはＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより産生され、ｍｐｌと称する。このプロテアーゼの遺伝子は、別の毒性因子であるリステロリジン（ｌｉｓｔｅｒｏｌｙｓｉｎ）遺伝子のすぐ下流にある（Ｄｏｍａｎｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． １９９１． Ｊａｎ； ５９（１）：６５−７２）。ｍｐｌは、活性と不活性の２つの形態を有する。限定的タンパク質分解によるｍｐｌの活性化または任意の不活性プロテアーゼの活性化について考えられうる３つの機構は、自己消化（自己触媒性プロセッシング）、該メタロプロテアーゼ以外の細菌プロテアーゼによる消化、および細胞外宿主細胞プロテアーゼによる消化である。メタロプロテアーゼ活性は、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの上清み液において間接的に測定可能であることがわかっている。ｍｐｌ活性は、ヒト単球の表面由来のＩＬ−６受容体の脱離（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を測定することによりモニターすることができる。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの前駆体メタロプロテアーゼの成熟形態へのプロセッシングは、単球の存在を必要とすることが確認された。
【００３８】
以下の方法は、他の病原性細菌の不活性プロテアーゼの活性化を試験するために使用することができる。目的の細菌を、メタノールで固定した全細胞、または単球のＮａＯＨで除却された膜調製物のいずれかとともにプレインキュ　ベートする。単球の固定は細菌が内在化するのを妨げる。簡単には、−２０℃の１００％メタノールで１０分間、または細胞骨格を保存する５．０％パラホルムアルデヒド含有緩衝液で固定した単球のほぼコンフルエントな皿に、１０，０００ＣＦＵのＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを添加する。２〜４時間のインキュベーション後、細菌を含む上清みを取り出し、遠心分離して細胞ペレットから上清みを分離する。選択したタンパク質基質とともに上清みを所定時間インキュベートし、その活性を測定する。
【００３９】
Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの活性メタロプロテアーゼの発現は、Ｔｒｉｖｅｔｔ およびＭｅｙｅｒ（１９７１） により開発された培地であるＤ１０培地などのタンパク質無含有培地中で原核細菌を増殖させることにより増強されることがわかった。細菌を一晩（２４時間）培養し、５Ｋ×ｇで１０分間遠心分離した後、組織培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地、「ＤＭＥＭ」、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ））中に再懸濁した。
【００４０】
ステップ４）　活性種特異的プロテアーゼの任意の特定のタンパク質および／またはペプチド基質を同定する。
【００４１】
ステップ５）　プロテアーゼの活性部位または結合部位を決定し、次いでその活性部位または結合部位を生じるのに有用な遺伝子配列を決定し、決定された遺伝子配列をクローニングすることにより、プロテアーゼ−基質相互作用（任意）の特異性を増大させる。
【００４２】
該プロテアーゼで切断される「活性部位」とも称する標的部位を同定する。
【００４３】
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いてプロテアーゼの活性部位のペプチド配列を決定する。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、１つの蛍光分子の放出が別の蛍光分子の励起に共役する距離依存性の励起状態相互作用のプロセスである。ＦＲＥＴは、特定のプロテアーゼの基質特異性を同定するための最も優れた方法の１つである（Ｌｉｕ ら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９． Ｆｅｂ １５； ２６７（２）：３３１−５ ）。共鳴エネルギー転移のための典型的なアクセプターとドナーの組は、４−［［４’−（ジメチルアミノ）フェニル］アゾ］安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）および５−［（２−アミノエチルアミノ（ｉａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ） ］−ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）からなる。ＥＤＡＮＳは、３３６ｎｍの光の照射により励起され、波長４９０ｎｍで光子を放出する。ＤＡＢＣＹＬ部分がＥＤＡＮＳから２０オングストローム以内に位置すると、この光子は、効率的に吸収される。ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳは、ペプチド基質の反対の端に結合する。ペプチドが完全である場合、ＦＲＥＴは非常に効率的である。ペプチドがメタロプロテアーゼにより切断されていると、この２つの染料は、もはや接近した状態ではなく、ＦＲＥＴは非効率となる。切断反応後には、ＤＡＢＣＹＬ蛍光の減少またはＥＤＡＮＳ蛍光の増加（消光の低下）のいずれかが観察され得る。
【００４４】
酵素がメタロプロテアーゼ（ｍｐｌ）である場合、強力な誘導性プロモーター（Ｎｏｖａｇｅｎ のｐＥＴ−２８ａのＴ７系など）を有する発現ベクター内にクローニングに有用な制限部位を含有してなるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によりｍｐｌの活性形態を増幅しうる。増幅に有用なプライマーは、ｃａｔｇｃｃａｔｇｇｇｔａｇａａｃｇｇｇｃｔｇａｔａｃｃｃａ（配列番号：４）およびｇｃｇｃｃｇｇａａｔｔｃｔｃａｇｔｔａａｃｃｃｃａａｃｔｇｃｔｔ（配列番号：５）である。各プライマーは、少なくとも１つの６塩基対の突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有する。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの溶菌コロニーまたはＬ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のゲノムＤＮＡの精製調製物のいずれかからＤＮＡを増幅する。フォワードプライマーは、開始メチオニン（ＣＡＴＡＴＧ）を含むＮｃｏＩ部位とともに提供される。リバースプライマーは停止コドン（ＴＧＡ）およびＥｃｏＲＩ制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含む。典型的な増幅プロトコルは、以下の条件下：９２℃初期融解４分（２５サイクル、５０℃アニーリング３０秒、７２℃伸長１．５分、９２℃融解３０秒）、７２℃最終伸長１０分および４℃保存、でのＴａｑポリメラーゼを用いる遺伝子配列の増幅を含む。アニーリング温度は、プライマーの予測される融解温度（Ｔｍ）を補う（ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ） ため、いくらか上下させてもよい。
【００４５】
活性メタロプロテアーゼの遺伝子配列をｐＥＴ２８ａにクローニングした後、ＡＢＩ３１０遺伝子解析装置で二本鎖プライマー歩行配列決定（ｗａｌｋ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ） により遺伝子の配列解析を行う。ｐＥＴ−２８ａベクター内のポリヒスチジンタグを利用することにより、ニッケル−ニトリロトリ酢酸クロマトグラフィーによって該メタロプロテアーゼの遺伝子配列の組換え活性形態を精製する。
【００４６】
ステップ６）　目的の病原性細菌のプロテアーゼに対する標識カルボキシ末端含有ペプチド基質（ステップ５のＦＲＥＴアッセイにより、その切断が特異的であると決定された）を有する装置を提供する。
【００４７】
例えば、発色性（ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃａｌｌｙ） 標識したペプチドを、疎水性領域を有するＰＶＤＦ膜に結合させ得た。ペプチドが切り取られると、染料は該疎水性領域に集中し、可視化される。あるいはまた、ペプチドを蛍光により標識し、ＵＶランプで可視化し得た。別の可能性は、脱離すると色が変化する発色性脱離基を有するペプチドである。ペプチドを青色染料で標識し、赤い表面に結合させ得た。該ペプチドを切断するプロテアーゼを供給する特定の細菌が存在しない限り、見た目には、表面が黒く見えるだろうが、ペプチドがタンパク質分解され、放散されるにつれて表面が赤くなる。４−ニトロアナリンまたは７−アミノ−４−メチル−クマリンなどの従来の脱離基は、分光測光的、および蛍光測定的（ｆｌｕｏｒｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ） により定量することができるが、強い青色を有するテキサス・レッドなどの脱離基を使用するのが最良でありうる。２つまたは３つのテキサス・レッド基をペプチドの末端付近に配置することにより、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓプロテアーゼ活性による基質のクリアランスを可視的に検出することが可能である。
【００４８】
アクチンの標識について記載した標準的手順を用い、ペプチドのカルボキシ末端のシステインをテキサス・レッドブロモアセトアミドで標識した。ＷａｎｇおよびＳａｎｄｅｒｓ， １９９０ を参照のこと。一例は、２〜３個のテキサス・レッド分子で標識した疎水性ペプチドである。別の可能性は、アミドブラックでペプチドを標識することである。基質がｍｐｌによりタンパク質分解されるにつれて、黒いペプチドが放散されて透明な領域が現れ、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの存在が示される。
【００４９】
ペプチドは、ガラス製マイクロタイタープレートまたはポリプロピレン製食品包装材料などの表面に正しい向きで結合させることができる。マイクロタイタープレートは、ペプチド基質に結合するための、複数の誘導体化結合部位（スクシミジルエステルで標識された第一級アミン部位など）を、誘導体化プレート（Ｘｅｎｏｂｉｎｄプレート、Ｘｅｎｏｐｏｒｅ社）上に提供するべきである。
【００５０】
中性ｐＨを維持することにより、ペプチドのアミノ末端を優先的に標識することができる。簡単には、ペプチド（１〜３ｍｇ／ｍｌの濃度で）とＸｅｎｏｂｉｎｄプレートで２時間、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中でインキュベートする。洗浄緩衝液でリンスした後、プレートを３％ウシ血清アルブミンで２時間、３７℃でブロックする。最後にプレートを洗浄緩衝液中で３回リンスし、使用時まで４℃で保存する。
【００５１】
任意で、マイクロタイタープレート上または食品パッケージ上の未結合（ｕｎｏｃｃｕｐｉｅｄ）の反応性部位を、ウシ血清アルブミンまたはｐ２６の活性ドメインを結合させることによりブロックする。ｐ２６は、非特異的タンパク質凝集を低減する場合に使用されるα−結晶型タンパク質である。食品包装の表面に結合させる前後に、ｐ２６タンパク質が熱変性クエン酸シンセターゼを再折り畳みする能力を、ｐ２６活性の測定のための対照として使用する。α−結晶型タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． １９８２）を用いて組換えにより作製した。簡単には、ｐ２６のβ−シート荷電コアドメインを含むプラスミドをエレクトロコンピテントＢ１２１（ＤＥ３）細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｅ． ｃｏｌｉ パルサー）内にエレクトロポレートする。細胞をＯＤ０．８まで増殖させ、次いで１ｍＭ　ＩＰＴＧで４時間誘導する。細胞をスピン・ダウンさせ、低緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール）中で超音波処理して溶解する（Ｖｉｒｓｏｎｉｃ， Ｖｉｒｔｉｓ， Ｇａｒｄｉｎｅｒ， ＮＹ）。溶解物を１３，０００×ｇで１０分間スピン・ダウンさせ、上清みを０．４５μｍおよび０．２μｍで濾過する。このろ液をＮｉ−ＮＴＡスーパーローズ（ｓｕｐｅｒｏｓｅ）カラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ， カタログ番号３０４１０ ）に装填する。高緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８．０、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を用いてタンパク質を溶出する。
【００５２】
実施例１
卸しレベルでの迅速Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ検出
そのまま食べられる食品製品への応用範囲を決定するために、食品を５連で（ｐｅｎｔｕｐｌｉｃａｔｅ）試験した。各固形食品サンプルを層流フード（ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ） で処理した。２５ｇの各食品製品をその包装から取り出し、計量した。計量した固形食品のサンプルを、１２５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム）の入った滅菌ストマッカーバッグ（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ｂａｇ） に入れた。固形食品をストマッカー・ブレンダー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ； Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ ）内でホモジナイズし、ろ過した上清みを試験に用いた。Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを捕捉し、複数のタンパク質カプセル化スチロフォーム錠（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ Ｔａｂｌｅｔ） を添加することにより効率的に放出させた。ＰＥＳ錠（上述）を食品抽出物とともに少なくとも３０分間のインキュベーション期間インキュベートした。ＰＥＳ錠を表面から除去し、富化培地に入れ、細菌を効率的に放出させた。３７℃で少なくとも４時間インキュベートした後、培地を５，０００×ｇで１０分間スピン・ダウンさせ、ペレットを５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。液をストマッキング（ｓｔｏｍａｃｈｉｎｇ）せずに液状食品のアリコートをＰＥＳ錠のうちの１つと混合することにより液状食品を調製した。３０分間の捕捉工程後、ＰＥＳ錠を回収し、ペレットを富化培地に入れた。
【００５３】
プロテアーゼベースのアッセイを各サンプルに関して実施した。バックグラウンドの正確な測定値を得て、ウェル間のばらつきを調整するためにアッセイを開始する前にマイクロタイタープレート内の各ウェルの目盛りを読んだ。プロテアーゼアッセイは、上述したＭ１などのＦＲＥＴ標識ペプチドを有するマイクロタイタープレートを用いて実施した。典型的には０．５μｇのペプチドを５０μｌの細菌培養抽出物とともに少なくとも２０分間３７℃でインキュベートした。細菌の存在下でＦＲＥＴペプチドは４９３ｎｍで蛍光を発する。陽性対照として、マイクロタイタープレートアッセイでのインキュベーションの前に、Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、または病原体特異的プロテアーゼの活性組換え形態のいずれかを、一部の食品サンプルに添加しうる。陰性対照は、既存の公表された方法（Ｃｕｒｔｉｓら、１９９５）に基づいて細菌病原体がないと決定された食品サンプルから構成される。
【００５４】
実施例２
家庭使用のための細菌の迅速なＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ検出
ＰＶＤＦは、メタノールに浸漬するまでは疎水性で、メタノールに浸漬すると親水性になる消滅膜である。メタノールをリング状にＰＶＤＦにスタンプし、風乾した。ＦＤ＆Ｃで認可された染料で標識したペプチド基質を該膜とともにインキュベートした。それは親水性のリングにのみ結合した。この膜を包装材料、例えば、食品と直接接触している食品包装内部に取り付けた。ペプチドが食品中の細菌プロテアーゼにより切断されると、染料分子が膜の疎水性領域に結合し、そこに集中し、リングの中心内での色または蛍光の形成により細菌が存在することが示される。一旦、特異的プロテアーゼ基質相互作用が目的の細菌に対して確認され、最適化されると、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ以外の細菌は、記載の方法および装置を用いることにより検出することができる。
【００５５】
ある種の細菌種では、基質−プロテアーゼ相互作用を最適化する方法を提供することが必要な場合がある。例えば、二価カチオンが、結合基質のプロテアーゼ切断を最適化するのに必要でありうる。この場合、例えば、ポリヒスチジンまたは亜鉛フィンガーモチーフなどの金属イオンで予備電荷（ｐｒｅｃｈａｒｇｅ） されうるタンパク質および／またはペプチドで食品包装の表面をブロックする。
【００５６】
当業者であれば、上述の態様に基づいて本発明のさらなる特徴および利点を理解するだろう。したがって、本発明は、特許請求の範囲に示されていることは別として、具体的に示し、記載したことによって限定されない。本明細書に引用したすべての文献および論文は参照によりその全てが本明細書に明白に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ のような細菌を捕捉するためのタンパク質カプセル化スタイロフォームの画像である。
【図２】
図２は、時間と共に放出される抗体の量によって測定されるＰＥＳ 錠剤の溶解時間を示すグラフである。
【図３】
図３は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ の存在下での基質の蛍光活性化を示す画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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