(57)【要約】本発明は、核移植法、及びそれにより発生した胚に関する。特に、本発明は、体細胞又は体細胞核を、透明帯のない除核卵母細胞へ移植する工程を含む核移植法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞又は体細胞核を透明帯のない除核卵母細胞へ移植する工程を含む、核移植の方法。
【請求項２】
遺伝子操作された、又はトランスジェニックの哺乳動物を作製するための方法であって、
（i）体細胞又は細胞核において、所望の1個または複数の遺伝子を挿入、除去、又は改変する段階；
（ii）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、体細胞又は細胞核を、透明帯のない除核卵母細胞内に挿入する段階；
（iii）胚を形成させるため、再構成された細胞を活性化する段階；
（iv）該胚を2細胞期を過ぎるまで培養する段階；及び
（v）該胚がトランスジェニック胎児へと発生するように、該培養された胚を宿主哺乳動物へ移植する段階
を含む方法。
【請求項３】
哺乳動物のクローニングのための方法であって、
（i）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、所望の体細胞又は細胞核を、透明帯のない除核卵母細胞へ挿入する段階；
（ii）胚を形成させるため、再構成された細胞を活性化する段階；
（iii）該胚を2細胞期を過ぎるまで培養する段階；及び
（iv）該胚が胎児へと発生するように、該培養された胚を宿主哺乳動物へ移植する段階
を含む方法。
【請求項４】
卵母細胞が、哺乳動物の卵管及び／又は卵巣より単離される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
卵母細胞が、卵管採取法又は経膣採取法により単離される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
卵母細胞が吸引によって単離される、請求項4又は請求項5に記載の方法。
【請求項７】
卵母細胞が前期I又は中期IIのものである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
卵母細胞が前期Iのものである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
卵母細胞が、インビトロ培養により中期IIにまで成熟する、請求項2から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
卵母細胞、再構成された細胞、胚、又は胎児を低温保存する工程をさらに含む、請求項2から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物が、ウシ科、ヒツジ科、シカ科、イノシシ科、ウマ科、及びラクダ科の代表的な家畜又は野生動物からなる群より選択される有蹄動物である、請求項2から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物が、雌ウシ又は雄ウシ、バイソン、ヤギュウ、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、又はブタである、請求項2から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ウシ科の種が、ボス・タウルス、ボス・インディクス、又はボス・バッファローズの雄ウシ又は雌ウシである、請求項6に記載の方法。
【請求項１４】
透明帯が、物理的操作、化学処理、及び酵素消化からなる群より選択される方法によって除去される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
透明帯が酵素消化によって除去される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
酵素消化が、プロテアーゼ、プロナーゼ、又はそれらの組み合わせへの曝露による、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
酵素消化がプロナーゼへの曝露による、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
プロナーゼが、0.1％から5％の濃度で使用される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
プロナーゼが、0.25％から2％の濃度で使用される、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
プロナーゼが、約0.5％の濃度で使用される、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
除核の工程が、吸引、物理的除去、DNA特異的蛍光色素の使用、及び紫外線照射からなる群より選択される方法による、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
除核が物理的除去による、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
物理的除去が、二分割である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
体細胞が、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Bリンパ球及びTリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、並びにその他の筋細胞からなる群より選択される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
体細胞が、皮膚細胞、肺細胞、膵細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、心細胞、生殖器細胞、膀胱細胞、腎細胞、尿道細胞、及びその他の泌尿器細胞からなる群より得られる、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
体細胞が繊維芽細胞又は顆粒膜細胞である、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
体細胞が、インビトロ培養された繊維芽細胞又は顆粒膜細胞である、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
体細胞がトランスジェニック細胞である、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
トランスジェニック細胞が、所望の1個または複数の遺伝子の挿入、欠失、又は修飾によって改変されている、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
体細胞又は核を移植する工程が融合による、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
融合の方法が、化学的融合、電気融合、及び生物学的融合からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
化学的融合又は生物学的融合が、透明帯のない除核卵母細胞と体細胞との組み合わせを融合剤に曝すことにより達成される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
融合剤が、体細胞ドナーを透明帯のない除核卵母細胞レシピエントに隣接させた場合に、異なる細胞の原形質膜の一部が融合する確率を増加させ得る、任意の化合物又は生物である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
融合剤が、ポリエチレングリコール（PEG）、トリプシン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、レクチン、凝集素、ウイルス、及びセンダイウイルスからなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
電気融合が、電気パルスの適用によって誘導される、請求項32に記載の方法。
【請求項３６】
電気融合が、透明帯のない除核卵母細胞と体細胞との組み合わせに、1つまたは複数の電気パルスを送る工程を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３７】
融合の前に、透明帯のない除核卵母細胞を体細胞に接着させる工程をさらに含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３８】
接着の工程が、透明帯のない除核卵母細胞を、細胞を凝集させる能力を有する化合物に曝曝することによる、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
化合物が、炭水化物と結合するか又は炭水化物を凝集させる能力を有するタンパク質又は糖タンパク質である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
化合物がレクチンである、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
レクチンが、コンカナバリンA、カナバリンA、リシン、ダイズ・レクチン、ミヤコグサ種子レクチン、及びフィトヘマグルチニン（PHA）からなる群より選択される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
化合物がPHAである、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
透明帯のない除核卵母細胞が、体細胞との接触の前にPHAに曝露される、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
透明帯のない除核卵母細胞が、50から400μg/mlの範囲の濃度のPHAに曝露される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
濃度が約200μg/mlである、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
透明帯のない除核卵母細胞が、1から60秒間PHAに曝露される、請求項42から45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
除核卵母細胞が、3秒間PHAに曝露される、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
1個または複数のさらなる透明帯のない卵母細胞を、再構成された細胞と融合させる工程をさらに含む、請求項2から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
さらなる工程が、請求項2の工程（ii）と連続して又は同時に開始される、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物のクローニングのための方法であって、
（i）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、所望の体細胞又は細胞核を、第一の透明帯のない除核哺乳動物卵母細胞へ挿入する段階；
（ii）第二又はそれ以上の卵母細胞を該再構成された細胞と融合させ、それにより細胞質の容積を増加させる段階；
（iii）胚を形成させるため、再構成された細胞を活性化する段階；
（iv）該胚を2細胞期を過ぎるまで培養する段階；及び
（v）該胚が胎児へと発生するように、該培養された胚を宿主哺乳動物へ移植する段階
を含む方法。
【請求項５１】
工程（i）及び工程（ii）が、連続して又は同時に開始される、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
工程（i）及び工程（ii）が同時に行われる、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
再構成された細胞を活性化する工程が、電気パルス、化学的誘導ショック、精子の侵入、細胞内二価陽イオンレベルの増加、及びリン酸化の減少からなる群より選択される、請求項2から52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
胎児が、同調させたレシピエントの子宮内に移植される、請求項2から52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
レシピエントが雌性哺乳動物である、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
再構成された細胞（胚）を培養する方法であって、
（i）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、所望の体細胞又は細胞核を、透明帯のない除核哺乳動物卵母細胞へ挿入する段階；
（ii）再構成された細胞を活性化する段階；
（iii）8から128細胞の間の胚が発生するまで、該細胞の1個または複数をインキュベートし培養する段階
を含む方法。
【請求項５７】
2個またはそれ以上の細胞が一緒に培養される、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
2個又は3個の細胞が一緒に培養される、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
単一の再構成された細胞が、8から128細胞の間の胚が生じるまで培養され、次いで2個またはそれ以上の胚を組み合わせ、凝集物として一緒に培養する、請求項56に記載の方法。
【請求項６０】
請求項1から59のいずれか一項に従って得られる哺乳動物。
【請求項６１】
請求項60に記載の哺乳動物より得られる、細胞、組織、又は器官。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核移植法、及びそれにより発生した胚に関する。胚を培養する方法、及び本発明の核移植法によって発生した胚から動物を再構成する方法も含まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
核移植の可能性のある利益は、最近、多数の出版物に概説されている（Galliら、1999；Colman、1999；Wells＆Powell、2000；Lewisら、2001；Trounson、2001）。核移植法は、過去20年間に本格的に探求され開発されており、多くの参照に記載されている（例えば、Campbellら、Theriogenology、43:181（1995）；Collasら、Mol.Report Dev.、38:264-267（1994）；Keeferら、Biol.Reprod.、50:935-939（1994）；Simsら、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、90:6143-6147（1993）；国際公開公報第97/07668号；第97/07669号；第94/26884号；第94/24274号；並びに米国特許第4,944,384号及び第5,057,420号（ウシ核移植を記載している）（これらは全て参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【０００３】
簡単に説明すると、核移植法は、典型的には、（1）卵母細胞を除核する工程；（2）除核卵母細胞と組み合わせるドナー細胞又はドナー核を単離する工程；（3）再構成された細胞が形成されるよう、細胞又は核を、除核卵母細胞へ挿入する工程；（4）胚を形成させるため、再構成された細胞を動物の子宮へ着床させる工程；及び（5）胚を発生させる工程を含む。
【０００４】
卵母細胞は、一般には、死亡した動物より回収されるが、生存動物の卵管及び／又は卵巣のいずれかより単離されてもよい。卵母細胞は、典型的には、除核前に、当業者に既知の多様な培地の中で成熟させられる。卵母細胞の除核は、当業者に周知の多数の様式で実施され得る。
【０００５】
再構成された細胞を形成させるための、除核卵母細胞へのドナー細胞又はドナー核の挿入は、通常、融合前の透明帯下へのドナー細胞のマイクロインジェクションによる。融合は、接触／融合面に対するDC電気パルスの適用（電気融合）、ポリエチレングリコールのような融合促進化学物質への細胞の曝露、又はセンダイウイルスのような不活化ウイルスによって誘導され得る。
【０００６】
再構成された細胞は、典型的には、核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、途中、及び／又は後に、電気的手段及び／又は非電気的手段によって活性化される。活性化法には、電気パルス、化学的誘導ショック、精子の侵入、卵母細胞内の二価陽イオンレベルの増加、及び卵母細胞内の（キナーゼ阻害剤等による）細胞タンパク質のリン酸化の減少を含む。活性化された再構成された細胞又は胚は、典型的には、当業者に周知の培地の中で培養され、次いで、動物の子宮へと移植される。
【０００７】
最近まで、ドナー核は、慣習的に、ほぼ完全に始原生殖細胞又は胚性細胞より単離されていた。実際、1990年代後期までは、胚性又は未分化の細胞型のみが、核移植後の任意の種類の胎児発生を指図することができると広く信じられていた。結果として、核移植法において使用されている今日の技術の大部分が、胚性細胞をドナー細胞として使用し、除核卵母細胞をレシピエント細胞として利用して開発された。
【０００８】
にもかかわらず、胚性ドナー細胞の単離及び使用は、専門的な技術を必要とし、極めて面倒である。より重要なこととして、胚性ドナー細胞は、核移植法のための限定された遺伝材料の起源であり、ゲノムが操作された（例えば、トランスジェニックの）細胞、胚、及び動物を作製するため、インビトロでそれらを操作することは不可能である。
【０００９】
1997年、培養細胞系をドナーとして使用した核移植の成功が報告され、この状況は変化した（例えば、Wilmutら、Nature（London）385、810-183参照）（1997）。従って、体細胞核移植の到来により、「伝統的な」胚性細胞核移植に関する問題のうちのいくつかは解決した。特に、限定された遺伝材料の起源は克服された。しかしながら、胚性細胞核移植において使用される技術は、必ずしも体細胞核移植にとって容易に利用可能ではないため、依然としていくつかの問題が残っている。例えば、胚細胞と比較して体細胞のサイズは極めて異なっているため、伝統的に使用されている技術のうちのいくつかは、容易には適合しない。
【００１０】
実際、前記の方法のインビトロの工程は、低い効率を有しており、従って低い妊娠率及び出産率、出生後の死亡、並びに発生上の異常をもたらす。Wilmutら（Wilmutら、Nature 385:810-183（1997））によって記載された方法を使用した体細胞核移植からの生産の効率は、およそ300分の1であると推定されており、即ち、核移植効率（即ち、クローニングされた仔ヒツジの数を、その数のクローニングされた仔ヒツジを作製するために使用された核移植の数で割ったもの）は、せいぜい0.4％である。より重要なこととして、文献に記載された方法は、全て、高度に熟練した技術者及び高価な装置を必要とする。核移植法の広範な実用化をより商業的に実行可能なものにするためには、クローニング効率を増加させ、方法に関連したコストを減少させ、かつ高度に熟練した技術者の必要性が克服されることが不可避である。
【００１１】
従って、体細胞核移植法の多くの見かけの確立にもかかわらず、これらの方法の広範な実用化を妨害する主要な技術的障害が、いくつか残っている。
【００１２】
クローニング効率を改良するための試みにおいて、多くの研究グループが核移植法を修飾しているが、これらの修飾は、依然として高価な装置及び／又は熟練を必要とする。例えば、上に概説された核移植法における決定的な工程は、工程3；ドナー細胞又はドナー核を除核卵母細胞へ挿入する工程である。前述のように、この工程は、典型的には、二つの手順（まず、除核卵母細胞の透明帯下へのドナー細胞のマイクロインジェクションを行い、次いで融合させること）を必要とする。しかしながら、マイクロインジェクション工程は、専門的な技術及び装置を必要とするため、これが、核移植の商業化の見込みを妨害している。
【００１３】
卵母細胞及び胚性ドナー細胞を用いたより伝統的なアプローチにおいて従来使用されていたマイクロインジェクションの使用を不要にした一つの技術は、透明帯の除去を含む。例えば、国際公開公報第98/29532号、Peuraら（1998）（いずれも参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい。残念ながら、完全な透明帯は、（1）除核のための適切な部位を示すための、卵母細胞の極体の中期板（metaphase plate）との近接の維持、（2）融合の前及び途中のドナー細胞の卵母細胞細胞質との近接の維持、（3）融合中の対の防護の提供、並びに（4）再構成及び活性化の後の胚発生の支持、を含むいくつかの理由のため、体細胞核移植において重要であると一般に見なされている。従って、体細胞を使用したPeuraらの技術は、未だ成功していない。
【００１４】
核移植中の透明帯の存在は、精巧なマイクロマニピュレーション・ツール及び高度の技術レベルが必要であることを意味する。透明帯を迂回するためには、再構成された細胞を作製するため、除核卵母細胞の卵黄周囲腔へドナー細胞を移植するためにマイクロマニピュレーターが使用される。
【００１５】
マイクロマニピュレーターは、キャピラリー・プーラー（capillary pullers）、研磨機（grinders）、及びマイクロフォージ（microforges）を含むツール作製装置を必要とする専門的な装置である。重要なこととして、マイクロマニピュレーター及びこれらを作製するための装置の使用は、熟練した技術者を必要とする。これらの要件は、核移植法の大規模適用にとって必要な単純化を大きく制限している。
【００１６】
以上に基づき、生存可能な動物へ発生することができる再構成された細胞を生ずる能力を保持しているドナー細胞の使用を提供し、かつマイクロマニピュレーターの必要なしに高いクローニング効率を提供する体細胞核移植法の利益及び期待は、相当なものであることが理解されよう。直接の結果には、装置及び労力の両方の減少したコストが含まれ、従って、より費用効果の高いクローン動物作製がもたらされるであろう。
【００１７】
この目標のため、出願人は、クローニング効率を維持するか又は増加させながら、マイクロマニピュレーターの使用を回避し、それによって標準的な融合技術を使用することを可能にする体細胞核移植法を開発した。一つの態様において、本法は、透明帯のない除核卵母細胞をレシピエントとして利用し、体細胞又は核をドナーとして利用する。計画されていない胚凝集を回避するため、従来の系はその目的にとって不適切であるため、再構成された透明帯のない胚は、専門的な系において、個々に、又は2個もしくは3個の再構成された核移植胚の「凝集物」として培養される。
【発明の開示】
【００１８】
発明の概要
本発明の最も広い面において、クローン哺乳動物細胞を作製するための新規の改良された方法が提供される。
【００１９】
従って、第一の面において、本発明は、体細胞又は体細胞核を透明帯のない除核卵母細胞へ移植する工程を含む核移植法を提供する。
【００２０】
第二の面において、本発明は、体細胞又は体細胞核を透明帯のない除核卵母細胞へ移植する前に、体細胞又は体細胞核において所望の遺伝子を挿入するか、除去するか、又は修飾する、遺伝子組換え又はトランスジェニックの哺乳動物を作製する方法を提供する。
【００２１】
本発明は、さらに、
（i）体細胞又は体細胞核において所望の1個以上の遺伝子を挿入するか、除去するか、又は修飾すること；
（ii）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、体細胞又は体細胞核を、透明帯のない除核卵母細胞へ挿入すること；
（iii）胚を形成させるため、再構成された細胞を活性化すること；
（iv）該胚を2細胞期を過ぎるまで培養すること；及び
（v）胚をトランスジェニック胎児へと発生させるため、該培養された胚を宿主哺乳動物へ移植することを含む、遺伝子組換え又はトランスジェニックの哺乳動物を作製するための方法を提供する。
【００２２】
第三の面において、本発明は、
（i）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、所望の体細胞又は体細胞核を、透明帯のない除核哺乳動物卵母細胞へ挿入すること；
（ii）胚を形成させるため、再構成された細胞を活性化すること；
（iii）該胚を2細胞期を過ぎるまで培養すること；及び
（iv）胚を胎児へと発生させるため、該培養された胚を宿主哺乳動物へ移植することを含む、哺乳動物のクローニングのための方法を提供する。
【００２３】
前記の方法に従い得られた哺乳動物、及びそれらの哺乳動物の子孫も、本発明により提供される。
【００２４】
卵母細胞は、既知の手法により任意の哺乳動物より単離され得る。例えば、卵母細胞は、当技術分野において周知の、本明細書に記載された卵管採取法又は経膣卵母細胞採取法により、生存動物の卵管及び／又は卵巣のいずれかより単離され得る。さらに、卵母細胞は、死亡した動物より単離されてもよい。例えば、屠殺場より卵巣を入手し、これらの卵巣より卵母細胞を吸引することが可能である。また、卵母細胞は、屠殺直後の動物より単離されてもよいし、又は卵巣を凍結させ、かつ／又は解凍した時点で単離されてもよい。好ましくは、卵母細胞は、卵管より新鮮に単離される。
【００２５】
卵母細胞又は細胞質体は、使用前に低温保存されてもよい。
【００２６】
本明細書に記載された方法は、任意の哺乳動物の核移植にとって有用であるが、特に有蹄動物にとって有用である。好ましくは、有蹄動物は、ウシ科、ヒツジ科（ovids）、シカ科、イノシシ科（suids）、ウマ科、及びラクダ科の代表的な家畜又は野生動物からなる群より選択される。そのような代表の例は、雌ウシ又は雄ウシ、バイソン、ヤギュウ、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、又はブタである。ウシ科種の中で特に好ましいのは、ボス・タウルス（Bos taurus）、ボス・インディクス（Bos indicus）、又はボス・バッファローズ（Bos buffaloes）の雄ウシ又は雌ウシである。
【００２７】
透明帯の除去は、任意の既知の手法により達成され得る。好ましくは、透明帯除去の工程は、物理的操作、化学処理、及び酵素消化からなる群より選択される。より好ましくは、透明帯は、酵素消化によって除去される、好ましくは、透明帯を消化するために使用される酵素は、プロテアーゼ、プロナーゼ、又はそれらの組み合わせである。より好ましくは、酵素はプロナーゼである。
【００２８】
好ましくは、プロナーゼは、0.1〜5％の濃度で使用される。より好ましくは、濃度は、0.25〜2％である。最も好ましくは、プロナーゼは、約0.5％の濃度である。
【００２９】
吸引、物理的除去、DNA特異的蛍光色素の使用、及び紫外線照射を含む、任意の卵母細胞除核法が実施され得ることが、当業者には認識されよう。好ましくは、除核は、物理的手段による。最も好ましくは、物理的除去は、二分割（bisection）である。
【００３０】
体細胞は、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Bリンパ球及びTリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、並びにその他の筋細胞からなる群より選択される。
【００３１】
これらは、種々の器官、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道、及びその他の泌尿器等より入手され得る。
【００３２】
好ましくは、体細胞は、繊維芽細胞又は顆粒膜細胞である。最も好ましくは、体細胞は、インビトロ培養された繊維芽細胞又は顆粒膜細胞である。
【００３３】
好ましくは、体細胞又は核を移植する工程は、融合による。より好ましくは、融合の方法は、化学的融合、電気融合、及び生物学的融合（biofusion）からなる群より選択される。好ましくは、化学的融合又は生物学的融合は、透明帯のない除核卵母細胞と体細胞との組み合わせを融合剤へと曝すことにより達成される。好ましくは、融合剤は、体細胞ドナーが透明帯のない除核卵母細胞レシピエントに隣接した場合に、異なる細胞の原形質膜の一部が融合するであろう確率を増加させ得る任意の化合物又は生物である。より好ましくは、融合剤は、ポリエチレングリコール（PEG）、トリプシン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、レクチン、凝集素、ウイルス、及びセンダイウイルスからなる群より選択される。
【００３４】
電気融合は、好ましくは、接触／融合面に対する電気パルスの適用によって誘導される。より好ましくは、電気融合は、透明帯のない除核卵母細胞と体細胞との組み合わせに1回以上の電気パルスを送る工程を含む。
【００３５】
好ましい態様において、本発明の方法は、再構成された細胞を1個以上の卵母細胞と融合させることにより、再構成された細胞の細胞質容積を増加させるさらなる工程を含む。
【００３６】
従って、第四の面において、本発明は、
（i）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、所望の体細胞又は体細胞核を、第一の透明帯のない除核哺乳動物卵母細胞へ挿入すること；
（ii）第二の卵母細胞を該再構成された細胞と融合させ、それにより細胞質の容積を増加させること；
（iii）胚を形成させるため、再構成された細胞を活性化すること；
（iv）該胚を2細胞期を過ぎるまで培養すること；及び
（v）胚を胎児へと発生させるため、該培養された胚を宿主哺乳動物へ移植することを含む、哺乳動物のクローニングのための方法を提供する。
【００３７】
工程（i）及び工程（ii）は、連続して又は同時に実施され得る。
【００３８】
又は、一つの態様において、
（i）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、所望の体細胞又は体細胞核を、透明帯のない除核哺乳動物卵母細胞へ挿入すること；
（ii）再構成された細胞を活性化すること；
（iii）2細胞を超えた胚が発生するまで、該細胞のうちの1個以上をインキュベートし培養することを含む、再構成された細胞（胚）を培養する方法が提供される。
【００３９】
好ましくは、細胞は、60細胞を超えるまで培養され、より好ましくは、60〜200細胞まで培養される。
【００４０】
好ましくは、2個以上の細胞が一緒に培養され、より好ましくは、2個又は3個の細胞が一緒に培養される。
【００４１】
別の態様において、単一の再構成された細胞が、8〜128細胞の胚が生じるまで培養され、次いで2個以上の胚が組み合わせられ、凝集物として一緒に培養される。
【００４２】
透明帯のない核移植胚の凝集物としての培養は、移植のための最終的な胚の細胞数を増加させ、妊娠率を増加させる。
【００４３】
前記の方法に従い入手された哺乳動物、及びそれらの哺乳動物の子孫も提供される。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明の実施においては、特記しない限り、当技術分野の技術の範囲にある従来の分子生物学、細胞生物学、及びクローニング技術が利用される。そのような技術は、当業者に周知であり、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook及びRussell「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」（2001）；Cloning:A Practical Approach」第I及びII巻（D.N.Glover編、1985）；「Antibodies:A Laboratory Manual」（Harlow＆Lane編、1988）；「Animal Cell Culture」（R.I.Freshney編、1986）；「Immobilised Cells and Enzymes」（IRL Press、1986）を参照されたい。
【００４５】
本発明の方法を記載する前に、本発明が、記載された特定の材料及び方法に制限されず、変動しうることが理解される。本明細書において使用された用語は、特定の態様を記載するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるであろう本発明の範囲を制限するものではないことも理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「一つの（a）」、「一つの（an）」、及び「その（the）」には、文脈より明らかである場合を除き、複数の言及が含まれる。従って、例えば、「体細胞（a somatic cell）」との言及には、複数個のそのような細胞が含まれ、「卵母細胞（a oocyte）」との言及は、1個以上の卵母細胞をさすものであり、その他も同様である。他に定義しない限り、本明細書において使用された技術用語及び科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は等価な任意の材料及び方法が、本発明を実施又は試行するために使用され得るが、好ましい材料及び方法を、以下に記載する。
【００４６】
本明細書において言及された全ての出版物は、出版物中に報告された、本発明に関して使用され得るプロトコル、試薬、及びベクターの記載及び開示の目的のため引用されている。本明細書の記載は、先行発明のため、本発明がそのような開示に先行している権利を有しないことの承認として解釈されるべきではない。
【００４７】
本発明は、核移植又は核転移によって哺乳動物をクローニングするための改良された手法を提供する。本願において、「核移植」又は「核転移」という用語は、交換可能に使用されるが、本明細書において使用されるように、これらの用語は、一つの細胞の核DNAを完全に除核細胞へと導入することをさす。
【００４８】
好ましい方法における第一工程は、適当な動物からのレシピエント卵母細胞の単離を含む。これに関して、卵母細胞は、任意の動物起源より、任意の成熟段階において入手され得る。適当な哺乳動物起源には、サル（Primates）目、ネズミ（Rodentia）目、ウサギ（Lagomorpha）目、クジラ（Cetasea）目、ネコ（Carnivora）目、ウマ（Perissodactyla）目、及びウシ（Artiodactyla）目のメンバーが含まれる。ウマ目及びウシ目のメンバーは、それらの類似した生物学、及び経済学的重要性のため、特に好ましい。
【００４９】
例えば、ウシ目は、9個の科に分布した、およそ150の生存種を含む:ブタ（Suidae）、ペッカリー（Tayassuidae）、カバ（Hippopotamidae）、ラクダ（Camelidae）、マメジカ（Tragulidae）、キリン及びオカピ（Giraffidae）、シカ（Cervidae）、プロングホーン（Antilocapridae）、並びにウシ、ヒツジ、ヤギ、及びアンテロープ（Bovidae）。これらの動物の多くは、様々な国で飼料動物として使用されている。より重要なこととして、本発明に関して、ヤギ、ヒツジ、ウシ、及びブタのような経済学的に重要な動物の多くは、極めて類似した生物学を有しており、高度のゲノム相同性を共有している。
【００５０】
ウマ目には、ウマ及びロバが含まれ、これらは、いずれも経済学的に重要であり、近縁関係にある。実際、ウマとロバとが異種交配することは周知である。
【００５１】
一つの態様において、卵母細胞は、有蹄動物、特にウシ科、ヒツジ科、シカ科、イノシシ科、ウマ科、及びラクダ科より得られるであろう。そのような代表の例は、雌ウシ又は雄ウシ、バイソン、ヤギュウ、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、及びブタである。ウシ種の中で特に好ましいのは、ボス・タウルス、ボス・インディクス、又はボス・バッファローズの雄ウシ又は雌ウシである。
【００５２】
卵母細胞の単離のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、卵母細胞は、当技術分野において周知の卵管採取法又は経膣卵母細胞採取法により、生存動物の卵管及び／又は卵巣のいずれかより単離され得る。例えば、Pieterseら、1988、「Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries（卵巣の経膣超音波スキャニング中のウシ卵母細胞の吸引）」、Theriogenology 30:751-762を参照されたい。さらに、卵母細胞は、死亡した動物の卵管又は卵巣より単離されてもよい。例えば、屠殺場より卵巣を入手し、これらの卵巣より卵母細胞を吸引することが可能である。また、卵母細胞は、屠殺直後の動物より単離されてもよいし、又は卵巣を凍結させ、かつ／又は解凍させた時点で単離されてもよい。
【００５３】
簡単に説明すると、一つの好ましい態様において、哺乳動物卵巣からの未熟な（前期Iの）卵母細胞が、吸引によって採集される。遺伝子組み換え、核移植、及びクローニングのような技術の使用の成功のため、これらの卵母細胞は、採集された後、核移植のためのレシピエント細胞として使用する前に、一般に、インビトロで成熟させられなければならない。
【００５４】
除核及び核移植の時点での卵母細胞の成熟段階は、核移植法の成功にとって重要であることが報告されている。（例えば、Pratherら、Differentiation、48、1-8、1991を参照されたい）。一般に、良好な哺乳動物胚クローニング実務においては、レシピエント卵母細胞として中期II段階の卵母細胞が使用されているが、それは、この段階においては、卵母細胞が、受精中の精子と同様に、導入された核を処理するために十分に活性化され得る、又は活性化されると信じられているためである。
【００５５】
卵母細胞のインビトロ成熟は、通常、卵母細胞が第一極体を押し出すまで、又は卵母細胞が中期II段階に到達するまで、成熟培地中で実施される。家畜、特にウシにおいては、卵母細胞成熟期間は、一般に、吸引後約16〜52時間、好ましくは約28〜42時間、より好ましくは約18〜24時間の範囲である。本発明の目的のため、この期間は、「成熟期間」として知られる。
【００５６】
卵母細胞は、多様な方式で、当業者に周知の多様な培地を使用して成熟させられ得る。例えば、米国特許第5,057,420号；ウシ生物に関するSaitoら、1992、Roux's Arch.Dev.Biol.201:134-141、及びヒツジ生物に関するWellsら、1997、Biol.Repr.57:385-393、及び「Unactivated Oocytes as Cytoplast Recipients for Nuclear Transfer（核移植のための細胞質体レシピエントとしての不活化された卵母細胞）」なる表題の国際公開公報第97/07668号（数値、表、及び図面を含め、全て参照として、その全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００５７】
卵母細胞の収集及び成熟のため使用されている最も一般的な培地のうちの一つは、組織培養培地（Tissue Culture Medium）-199（TCM-199）、及びウシ胎仔血清（FCS）、新生児血清、発情期もしくは非発情期の雌ウシ血清、仔ヒツジ血清、又は雄仔ウシ血清を含む1〜20％の血清補足物である。本願の実施例1は、好ましい維持培地の一例:15％雌ウシ血清が補足されており、10IU/ml妊娠雌ウマ血清ゴナドトロピン及び5IU/mlヒト絨毛性ゴナドトロピン（Suigonan（登録商標）Vet、Intervet、Australia）を含む、アール塩を含むTCM-199を示している。卵母細胞は、39℃で、5％CO2を含む環境で、この型の培地中で良好に成熟させられ得る。
【００５８】
新鮮に単離され成熟させられた卵母細胞が好ましいことが当業者には認識されるであろうが、採集後又は成熟後に卵母細胞を低温保存することも可能であることが認識されよう。従って、「低温保存」という用語は、本明細書において使用されるように、本発明の卵母細胞、細胞質体、細胞、胚、又は動物の凍結をさしうる。本発明の卵母細胞、細胞質体、細胞、胚、又は動物の一部は、好ましくは0℃より低く、より好ましくは-80℃より低く、最も好ましくは-196℃より低い温度で凍結させられる。本発明の卵母細胞、細胞、及び胚は、無期限に低温保存され得る。生物学的材料は、50年超にわたり低温保存され得ることが既知である。例えば、50年超にわたり低温保存された精液は、雌ウシ動物の人工受精に利用され得る。低温保存のための方法及びツールは、当業者に周知である。例えば、「Cryopreservation Process for Direct Transfer of Embryos（胚の直接移植のための低温保存法）」なる表題の米国特許第5,160,312号を参照されたい。
【００５９】
低温保存された卵母細胞を利用する際には、成熟培地中に卵母細胞を置く前に、まずこれらを解凍させなければならない。解凍過程の後に活性であるよう、低温保存された材料を解凍させる方法は、当業者に周知である。
【００６０】
さらなる好ましい態様において、インビボで成熟した成熟（中期II）卵母細胞が採集され、本明細書に開示された核移植法において使用される。本質的には、成熟中期II卵母細胞は、発情期の開始後、又はヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）もしくは類似ホルモンの注射後、35〜48時間目に、非過剰排卵哺乳動物又は過剰排卵哺乳動物のいずれかより外科的に収集される。
【００６１】
卵母細胞をインビトロ培養する場合には、除核にとってより適当な成熟段階にある卵母細胞を提供するため、蓄積している可能性のある卵丘細胞が除去され得る。卵丘細胞は、例えば0.5％ヒアルロニダーゼの存在下で、ピペッティング又はボルテックス処理により除去され得る。
【００６２】
前記のような成熟期間の後、次いで、透明帯が卵母細胞より除去され得るが、一つの特に好ましい態様において、透明帯の除去の前に、卵母細胞は、極体（PB）が卵母細胞に接着するよう、200μg/mlフィトヘマグルチニン（PHA）を含有しているリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の中に置かれる。染色体を含有している中期板は、90％超、PBと隣接していることが示されている（Peuraら、1998）。帯除去及び卵母細胞二分割の後、核体（二分割された卵母細胞の核を含有している「半分」）は、容易に同定され廃棄され得る。
【００６３】
透明帯除去の利点には、より単純で、より迅速で、かつより安価な核移植法の提供が含まれる。さらに、透明帯の除去は、核移植胚の大規模作製を可能にする。卵母細胞からの透明帯の除去は、物理的操作（機械的開裂）、化学処理、又は酵素消化（Wells及びPowell、2000）を含む、当技術分野において既知の任意の方法によって実施され得る。物理的操作は、マイクロピペット又は顕微手術用ブレードの使用を含みうる。好ましくは、酵素消化が使用される。
【００６４】
一つの特に好ましい態様において、透明帯は、プロテアーゼ又はプロナーゼの存在下で酵素消化によって除去される。簡単に説明すると、成熟卵母細胞を、0.1％〜5％、より好ましくは0.25％〜2％の範囲、最も好ましくは約0.5％の総濃度で、プロテアーゼ、プロナーゼ、又はそれらの組み合わせを含む溶液の中に置く。次いで、成熟卵母細胞を、1〜30分間、30℃〜約45℃、好ましくは約39℃で、インキュベートする。好ましくは、卵母細胞は約5分間酵素に曝露される。プロナーゼは、卵母細胞の膜にとって有害であり得るが、この効果は、FCS又は雄ウシ血清のような血清の添加によって最小限に抑えられ得る。プロナーゼによる透明帯除去の特有の利点は、個々の処理が必要でなく、100個という多数の卵母細胞で手法が実施され得る点である。透明帯を除去した後は、透明帯のない成熟卵母細胞を、20％FCS及び1Oμg/mlサイトカラシンBが補足された4mlのHepes緩衝TCM-199培地ですすぎ、次いで、除核することができる。
【００６５】
「除核」、「除核された」、及び「除核卵母細胞」という用語は、交換可能に本明細書において使用され、内容物の一部が除去された卵母細胞をさす。
【００６６】
卵母細胞の除核は、物理的に、核、前核、もしくは中期板（卵母細胞に依存する）の実際の除去によって、又は機能的に、紫外線照射もしくはもう一つの除核作用の適用によって、達成され得る。これらの方法は、全て、当業者に周知である。例えば、物理的手段には、吸引（Smith＆Wilmut、Biol.Reprod.、40:1027-1035（1989））が含まれ；機能的手段には、DNA特異的蛍光色素の使用（例えば、Tusnodaら、J.Reprod.Fertil.82:173（1988）参照）、及び紫外線照射（例えば、Gurdon,Q.J.Microsc.Soc.、101:299-311（1960）参照）が含まれる。除核は、当技術分野において既知のその他の方法によっても実行され得る。例えば、米国特許第4,994,384号；米国特許第5,057,420号；及びWilladsen、1986、Nature 320:63-65（全て、参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００６７】
好ましくは、卵母細胞は、手動の二分割によって除核される。卵母細胞二分割は、当業者に既知の任意の方法によって実施され得る。一つの好ましい態様において、二分割は、参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第98/29532号に記載されているような顕微手術用ブレードを使用して実施される。簡単に説明すると、卵母細胞は、ウルトラ・シャープ・スプリッティング・ブレード（ultra sharp splitting blade）（AB Technology、Pullman、WA、USA）を使用して、卵母細胞総容積のおよそ30％及び70％に相当する断片へと非対称的に分割される。次いで、卵母細胞は、除核に成功したものを同定するためスクリーニングされ得る。このスクリーニングは、極体が接着している二分割された「半分」を選択することにより、又は1ミリリットル当たり1マイクログラムのヘキスト蛍光色素33342が溶解している20％FCSが補足されたTCM-199培地により卵母細胞を染色し、次いで10秒未満、倒立顕微鏡を用いて紫外線照射下で卵母細胞を観察することによって、実行され得る。次いで、除核に成功した卵母細胞（半卵母細胞（demi-oocytes））を、適当な培地、例えば20％FCSが補足されたTCM-199培地の中に置くことができる。
【００６８】
本発明において、レシピエント卵母細胞は、好ましくはインビトロ成熟の開始後約10時間〜約40時間目、より好ましくはインビトロ成熟の開始後約16時間〜約24時間目、最も好ましくはインビトロ成熟の開始後約16〜20時間目の時点で除核されるであろう。
【００６９】
本明細書に記載された二分割技術は、その他の除核法よりはるかに少ない時間及び技術を必要とし、染色によるその後の選択は、高い精度をもたらす。従って、クローニング技術の大規模適用に関して、本発明の二分割技術は、その他の技術より効率的であり得る。
【００７０】
次いで、除核卵母細胞と同一種の単一の哺乳動物体細胞を、融合により、除核卵母細胞へと移植し、それにより再構成された細胞を作製することができる。
【００７１】
「体細胞」という用語は、本明細書において使用されるように、胚生細胞又は生殖細胞以外の、任意の発生段階の動物に由来する任意の細胞を意味するものとする。
【００７２】
本発明によると、分化した胎児又は成体の体細胞に由来する細胞核が、ドナー核と同一種の透明帯のない除核卵母細胞へと移植される。分化した体細胞とは、初期胚性段階を過ぎた細胞である。より具体的には、分化した細胞は、胚盤段階（ウシ胚形成の10日目）を少なくとも過ぎているものである。分化した細胞は、外胚葉、中胚葉、又は内胚葉に由来し得る。
【００７３】
哺乳動物体細胞は、周知の方法によって入手され得る。例えば、分化したドナー体細胞から除核卵母細胞への核移植を教示している米国特許第5,945,577号、及び成体耳パンチに由来する繊維芽細胞培養物からの繊維芽細胞が、核移植法において核ドナーとして使用され得ることを教示している米国特許第6,022,197号（これらの参照は、両方とも、参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００７４】
本発明のドナー体細胞は、レシピエントである透明帯のない除核卵母細胞との融合の前に、休止期へと誘導されることが好ましい。PCT/GB96/02099及び国際公開公報第97/07668号（いずれも、Roslin Institute（Edinburgh）に譲渡されている）の開示によると、ドナー核は、移植の時点で、細胞周期のG0期又はG1期のいずれかにあることが好ましい。ドナーは、再構成された細胞の正確な倍数性を維持するため、移植の時点で二倍体でなければならない。
【００７５】
本発明において有用な哺乳動物体細胞には、例えば、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Bリンパ球及びTリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、並びにその他の筋細胞等が含まれる。さらに、核移植に使用される哺乳動物細胞は、種々の器官、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道、及びその他の泌尿器等から入手され得る。これらは、適当なドナー細胞の例にすぎない。適当なドナー細胞、即ち本発明において有用な細胞は、任意の細胞又は身体器官より入手され得る。
【００７６】
特に好ましいドナー細胞は、繊維芽細胞又は繊維芽細胞様細胞である。繊維芽細胞は、発生中の胎児及び成体動物より大量に入手可能であるため、理想的な細胞型である。重要なこととして、これらの細胞は、迅速な倍加時間でインビトロで容易に繁殖可能であり、遺伝子ターゲティング法において使用するためクローン性に繁殖可能である。
【００７７】
繊維芽細胞は、耳皮膚生検材料より収集され、小片（3mm2）へと切断され、培養され得る。多様な細胞培養法が、当技術分野には存在する。例えば、「Culture of Animal Cells；A manual of Basic Technique」（第2版）、Freshney、copyright 1987、Alan R.Liss,Inc.、New Yorkを参照されたい。一つの特に好ましい態様において、皮膚生検材料からの外植細胞は、5％CO2及び95％空気の加湿雰囲気中、37℃で、TCM-199培地 + 20％FCS及び抗生物質の中で培養される。一週間の培養後、繊維芽細胞単層が、組織外植片の周囲に形成される。次いで、外植片が、新たな培養を開始するために除去され、繊維芽細胞が、5分間の0.05％トリプシンとのインキュベーションによって採集される。次いで、トリプシンが、800μlのTCM-199培地及び20％FCSの添加によって不活化される。長期保管のため、培養細胞は、トリプシン処理の後収集され、10％ジメチルスルホキシドの中で凍結させられ、液体窒素中で保管され得る。核移植のため使用する際には、細胞は、解凍させられ、継代のためコンフルエンシーにまで培養される。各継代（1継代当たり推定2回の細胞倍加）のため、細胞はコンフルエントになるまで培養され、37℃で1分間、0.1％（w/v）トリプシン及びEDTA溶液の中でのインキュベーションによって脱凝集させられ、さらなる継代のために3個の新たなフラスコに分配される。通常、各継代は約6日間である。
【００７８】
ドナー細胞の繊維芽細胞表現型の確認は、細胞骨格フィラメント・ビメンチン（繊維芽細胞のため）又はサイトケラチン（上皮細胞のため）に対するモノクローナル抗体による免疫細胞化学的染色によって実施され得る。好ましい確認プロトコルにおいては、細胞が、コンフルエンシーにまで増殖させられる。次いで、細胞がリン酸緩衝生理食塩水（PBS）により洗浄され、20分間4℃でメタノール固定される。固定後、細胞はPBSで洗浄され、37℃で15分間3％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSによりブロッキングされる。ブロックが除去され、1:40希釈抗ビメンチン・クローンV9（Sigma、カタログ番号6630）又は抗パンサイトケラチン（pan cytokeratin）クローン-11（Sigma、カタログ番号2931）の1:400希釈物のいずれかが100μl添加される。細胞は37℃で1時間インキュベートされ、PBSにより洗浄され、FITC標識抗マウスIgGの1:300希釈物100μlと共に1時間インキュベートされる。細胞はPBSで洗浄され、カバーグラスの下で50％グリセロールを含むPBSにより覆われ、蛍光顕微鏡検査によって観察される。自己蛍光に関する適切な対照及び二次抗体が含まれるべきである。
【００７９】
細胞周期段階の分析は、Kubotaら、PNAS 97:990-995（2000）に記載されているようにして実施され得る。簡単に説明すると、種々の継代数の細胞培養物がコンフルエンシーにまで増殖させられる。トリプシン処理の後、細胞は、TCM-199培地 + 10％FCSにより洗浄され、4℃でグルコース（6.1mM）を含むPBS 1mlに5×105細胞/mlの濃度で再懸濁させられる。細胞は、冷エタノールを3ml添加することにより一晩固定される。次いで、核染色のため、細胞はペレット化され、PBSにより洗浄され、30μg/mlヨウ化プロピジウム及び0.3mg/ml RNase Aを含有しているPBSに再懸濁させられる。細胞は、暗所で室温で1時間インキュベートされた後、30μmメッシュでろ過される。次いで、細胞が分析される。
【００８０】
様々な継代数における培養ドナー体細胞の倍数性を調査するため、種々の培養継代数において、中期スプレッド（spreads）の標準調製物を使用して、染色体数が決定され得る（例えば、Kubotaら、PNAS 97:990-995（2000）を参照）。
【００８１】
培養ドナー細胞は、当業者に周知のトランスジェニック法によって遺伝学的に改変されてもよい。例えば、Molecular Cloning a Laboratory Manual、第2版、1989、Sambrook、Fritsch及びManiatis、Cold Spring Harbor Laboratory Press；米国特許第5,612,205号；米国特許第5,633,067号；「Transgenic Animals Secreting Desired Proteins Into milk（所望のタンパク質を乳中に分泌するトランスジェニック動物）」なる表題の欧州特許第264 166号；「Isolation of Components of Interest From Milk（乳からの目的の成分の単離）」なる表題の国際公開公報第94/19935号；「Method for Identifying Transgenic Pre-implantation Embryos（トランスジェニック移植前胚の同定法）」なる表題の国際公開公報第93/22432号、及び「Transgenic Production of Antibodies in Milk（乳中のトランスジェニック抗体産生）」なる表題の国際公開公報第95/175085号（全ての数値、図面、及び表を含め、全て参照として、その全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。哺乳動物細胞の所望の遺伝子を挿入するか、欠失させるか、又は修飾するための任意の既知の方法が、核ドナーとして使用される分化した細胞の改変のために使用され得る。これらの手法は、遺伝子の全部又は一部を除去することができ、遺伝子は異種であってもよい。細胞ゲノムの1個以上の特異的な部位における1個以上の遺伝子の挿入、欠失、又は修飾を可能にする相同的組み換えの技術が含まれる。
【００８２】
欠失、挿入、及び／又は変異による標的DNAゲノムの修飾の例は、レトロウイルス挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターのランダム挿入、遺伝子ターゲティング、転移因子、及び／又は外来DNAの導入、もしくは修飾されたDNA／修飾された核DNAの作製のためのその他の方法である。その他の修飾技術には、ゲノムからのDNA配列の欠失、及び／又は核DNA配列の改変が含まれる。核DNA配列は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって改変され得る。
【００８３】
このように、本発明は、成体哺乳動物に所望の遺伝子型を供給するために使用され得る。トランスジェニック又は遺伝子組換えの動物、及びキメラ動物を含む、立証された遺伝学的な優位性又はその他の望ましい形質を有する成体有蹄動物の複製は、特に有用である。さらに、トランスジェニック胎児及び／又はキメラ胎児を含む核移植胎児に由来する細胞及び組織は、細胞、組織、及び器官の転移に使用され得る。
【００８４】
トランスジェニック細胞を生成させる方法は、典型的には、（1）細胞の核ゲノムへ特異的なDNA配列を挿入するのに有用な適当なDNA構築物を組み立てる工程；（2）DNA構築物を細胞へトランスフェクトする工程；（3）ランダム挿入及び／又は相同的組み換えが起こることを可能にする工程を含む。この過程に起因する修飾は、標的ゲノムへの適当な（1個以上の）DNA構築物の挿入；標的ゲノムからのDNAの欠失；及び／又は標的ゲノムの変異であり得る。
【００８５】
DNA構築物は、目的の遺伝子のみならず、制御性のプロモーター、インシュレーター、エンハンサー、及びリプレッサー、並びにDNA構築物より転写されたRNAへのリボソーム結合のためのエレメントを含む多様なエレメントを含み得る。
【００８６】
DNA構築物は、リボザイム及びアンチセンスDNA及び／又はPNAをコードしていてもよい。これらの例は、当業者に周知であり、制限的なものではない。
【００８７】
データベース及び商業的区域で容易に入手可能な制御性エレメント及び遺伝子のためのDNA配列と共に利用可能な効率的な組み換えDNA技術により、当業者であれば、本明細書に記載された材料及び方法を使用して、トランスジェニック細胞を確立するのに適切なDNA構築物を容易に生成させることができる。
【００８８】
トランスフェクション技術は、当業者に周知であり、細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを実施するための材料及び方法は、商業的に入手可能である。DNA構築物により細胞をトランスフェクトするために典型的に使用されている材料は、例えばリポフェクチン（Lipofectin）（商標）のような親油性化合物である。特定の親油性化合物は、細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを媒介するため、リポソームを形成するように誘導され得る。
【００８９】
DNA構築物からの標的配列は、DNA構築物の合理的設計により、核ゲノムの特異的な領域へと挿入され得る。これらの設計技術及び方法は、当業者に周知である。例えば、米国特許第5,633,067号；米国特許第5,612,205号、及び国際公開公報第93/22432号（全て、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。所望のDNA配列が核ゲノムへと挿入された後は、当業者に周知の方法により、挿入領域の位置、及び所望のDNA配列が核ゲノムへ挿入された頻度が同定され得る。
【００９０】
トランスジーンがドナー体細胞の核ゲノムへ挿入された後、その細胞は、本発明のその他のドナー体細胞と同様に、本明細書に開示された核移植法において核ドナーとして使用され得る。透明帯のない除核卵母細胞へ体細胞の核を移植する手段は、好ましくは、再構成された細胞を形成させるための細胞融合を含む。
【００９１】
融合は、典型的には、接触／融合面に対する直流（DC）電気パルスの適用によって誘導されるが、付加的な交流（AC）が、ドナー細胞とレシピエント細胞との整列を支援するために使用されてもよい。電気融合は、原形質膜の一過性の崩壊を引き起こすのに十分であり、かつ膜が迅速に再形成されるように十分に短い電気パルスを生成させる。従って、2個の隣接した膜が、崩壊し、脂質二重層の再形成時に混合されるよう誘導された場合、小さなチャンネルが2個の細胞間に開口するであろう。そのような小さな開口は、熱力学的な不安定性のため、2個の細胞が1個になるまで拡大する。この過程のさらなる考察については、Pratherらの米国特許第4,997,384号（参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。例えば、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、及びリン酸緩衝溶液を含む多様な電気融合媒体が、使用され得る。
【００９２】
融合は、融合剤としてセンダイウイルスを使用して達成されてもよい（Graham、Wister Inot.Symp.Monogr.、9、19、1969）。融合は、ポリエチレングリコールのような融合促進化学物質への細胞の曝露によって誘導されてもよい。
【００９３】
好ましくは、ドナー体細胞及び透明帯のない除核卵母細胞は、500μm融合チャンバーに置かれ、26℃〜27℃の融合媒体（0.3Mマンニトール、0.1mM MgS04、0.05mM CaCl2）4mlにより覆われる。次いで、細胞は、およそ1秒間隔の約15μ秒の70〜100Vの二重DC電気パルスの適用によって電気融合させられる。次いで、融合後、得られた融合した再構成された細胞は、活性化まで、適当な培地、例えばTCM-199培地の中に置かれる。
【００９４】
好ましい細胞融合法において、ドナー体細胞は、まず、透明帯のない除核卵母細胞に接着させられる。例えば、体細胞及び透明帯のない除核卵母細胞の膜の融合を可能にするため、体細胞を透明帯のない除核卵母細胞へ接着させる化合物が選択される。化合物は、細胞を凝集させる能力を有する任意の化合物であり得る。化合物は、炭水化物と結合するか又は炭水化物を凝集させる能力を有するタンパク質又は糖タンパク質であり得る。より好ましくは、化合物はレクチンである。レクチンは、コンカナバリンA、カナバリンA、リシン、ダイズ・レクチン、ミヤコグサ種子レクチン、及びフィトヘマグルチニン（PHA）からなる群より選択され得る。好ましくは、化合物はPHAである。
【００９５】
好ましくは、透明帯のない除核卵母細胞は、体細胞との接触の前にPHAに曝露される。好ましくは、透明帯のない除核卵母細胞は、50〜400μg/mlの範囲の濃度のPHAに曝露される。最も好ましくは、その濃度は約200μg/mlである。透明帯のない除核卵母細胞は、1〜60秒間、PHAに曝され得る。好ましくは、除核卵母細胞は、3秒間、PHAに曝露される。
【００９６】
PHAによる処理の後、体細胞を透明帯のない除核卵母細胞へ接着させるため、透明帯のない除核卵母細胞が、体細胞と接触させられ得る。透明帯のない除核卵母細胞は、当業者に既知の従来の方法により体細胞と接触させられ得る。好ましくは、透明帯のない除核卵母細胞は、マイクロピペットを使用した操作により、体細胞と接触させられる。次いで、透明帯のない除核卵母細胞及び接着させられた体細胞は、前記のようにして融合させられ得る。
【００９７】
一つの好ましい態様において、前記の電気融合の方法が、さらなる融合工程を含むか、又は前記の融合工程が、1個のドナー体細胞と2個以上の透明帯のない除核卵母細胞とを含む。二重融合法は、再構成された細胞の細胞質の容積を増加させるという有利な効果を有する。
【００９８】
再構成された細胞は、典型的には、核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、途中、及び／又は後に、電気的手段及び／又は非電気的手段によって活性化される（例えば、Susko-Parrishらの米国特許第5,496,720号を参照されたい）。活性化法には、以下のものが含まれる:
1）電気パルス；
2）化学的誘導ショック；
3）精子の侵入；
4）二価陽イオン、例えばマグネシウム、ストロンチウム、バリウム、又はカルシウムを、例えばイオノフォアの形態で、卵母細胞細胞質へ導入することによる、卵母細胞内の二価陽イオンレベルの増加（二価陽イオンレベルを増加させるその他の方法には、電気ショックの使用、エタノールによる処理、及びケージド・キレーター（caged chelators）による処理が含まれる）；並びに
5）既知の方法による、例えばキナーゼ阻害剤、例えば6-ジメチル-アミノプリン、スタウロスポリン、2-アミノプリン、及びスフィンゴシンのようなセリン-トレオニン・キナーゼ阻害剤の添加による、卵母細胞内の細胞タンパク質のリン酸化の減少（又は、細胞タンパク質のリン酸化は、ホスファターゼ、例えばホスファターゼ2A及びホスファターゼ2Bの卵母細胞への導入によって阻害され得る）。
【００９９】
再構成された細胞は、既知の方法によっても活性化され得る。そのような方法には、例えば、生理的温度未満の温度において再構成された細胞を培養すること、本質的には、冷たい、又は実際に低い温度のショックを再構成された細胞へ適用することが含まれる。これは、最も便利には、胚が通常曝されている生理的温度条件に比べて冷たい室温において、再構成された細胞を培養することにより実施され得る。適当な卵母細胞活性化法は、完全に参照として本明細書に組み入れられるSusko-Parrishらの米国特許第5,496,720号の主題である。
【０１００】
次いで、活性化された再構成された細胞は、細胞及び細胞コロニーの発生まで、適当なインビトロ培養培地の中で培養され得る。胚の培養及び成熟に適した培養培地は、当技術分野において周知である。ウシ胚の培養及び維持のために使用され得る既知の培地の例には、ハムF-10 + 10％FCS、TCM-199 + 10％FCS、タイロード-アルブミン-ラクテート-ピルベート（TALP）、ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、合成卵管液（「SOF」）、B2、CR1aa培地、及び高カリウム単純培地（「KSOM」）、イーグル培地、及びウィッテン（Whitten）培地が含まれる。卵母細胞の収集及び成熟のために使用される最も一般的な培地のうちの一つは、TCM-199、及びFCS、新生児血清、発情期雌ウシ血清、仔ヒツジ血清、又は雄仔ウシ血清を含む1〜20％血清補足物である。好ましい維持培地には、アール塩、10％FSC、0.2mMピルビン酸Na、及び50μg/mlゲンタマイシン硫酸を含むTCM-199が含まれる。上記のものは、いずれも、顆粒膜細胞、卵管細胞、BRL細胞、及び子宮細胞、並びにSTO細胞のような多様な細胞型との共培養物も含み得る。
【０１０１】
又は、一つの好ましい態様において、
（i）再構成された細胞の形成にとって適当な条件下で、所望の体細胞又は体細胞核を、透明帯のない除核哺乳動物卵母細胞へ挿入すること；
（ii）再構成された細胞を活性化すること；
（iii）2細胞を超えた胚が発生するまで、該細胞のうちの1個以上をインキュベートし培養することを含む、再構成された細胞（胚）を培養する方法が、提供される。
【０１０２】
好ましくは、胚は60細胞を超えるまで培養される。より好ましくは、60〜200細胞。
【０１０３】
簡単に説明すると、上記の方法は、ウェル・オブ・ウェル（Well of Well）（WOW）系として記載される。この方法は、（BLS Ltd.、Budapest、Hungary、カタログ番号DN-09によって製造され供給される「アグリゲーション・ニードル（Aggregation needles）」のような）「かがり針（darning）」型の針の研磨された先端部を、典型的には4穴「ヌンクロン（Nunclone）」ディッシュ（Vajtaら、2000）である培養ディッシュの底へ押し付けることにより、ディッシュの底に作成された小さなくぼみ（「V」形又は「U」形）の中で、再構成された細胞を個々に又は群として培養することを含む。これらのくぼみ（WOW）は、典型的には、深さ0.5〜2mm、頂部の直径0.5〜2mmである。活性化の後、胚が、これらのWOWくぼみの中に個々に置かれるか、又は2個もしくは3個の「再構成された」核移植胚が一緒に、各WOWの中に置かれ、活性化の後（この時点で、それらはまだ細胞分裂前の単細胞である）、凝集物として培養され得る。又は、再構成された単細胞核移植胚が、3〜4日間、WOWの中で個々に培養され（この時点で、それらは典型的には8〜128細胞である）、次いで2個又は3個のそのような胚が、「凝集物」としてのさらなる培養のため、単一のウェルで組み合わせられうる。そのような凝集物としての核移植胚の培養は、移植のための最終的な胚の細胞数を増加させ、妊娠率を増加させる（Peuraら、1998）。
【０１０４】
一つのさらなる態様において、
前記のような方法に従い再構成された細胞（胚）を培地中に準備すること；
少なくとも2個の開放端を有するチューブを入手すること（一端は、再構成された細胞（胚）を受容することができ、チューブは、チューブ内の培地中に再構成された細胞（胚）を取り込み、維持することができる直径を有する；
再構成された細胞（胚）をチューブへ取り込むこと；及び
チューブの中で再構成された細胞（胚）をインキュベートし培養することを含む、再構成された細胞（胚）を培養する方法が提供される。。
【０１０５】
チューブ内で培養する方法において、チューブは、好ましくは、胚に対して最小の毒性を示す等級のものである。最も好ましくは、それはコーティングされていないか、又は処理され、酸で洗浄されたホウケイ酸塩の実験用等級のガラスである。重要なこととして、チューブは、胚を囲む培地が一般に毛管作用によってチューブ内に保持されるような保持能力、及びチューブ内に胚を維持するための表面張力を有していなければならない。培地は、チューブの一端から、空気／培地界面により、時には小さな油プラグにより、チューブ内に保護される。
【０１０６】
培養系のチューブは、取り込まれた培地内で胚が発生するよう、胚を含む培地をチューブ内に保持し維持することができるのであれば、任意の直径を有し得る。従って、チューブは、培地をチューブ内に垂直に維持し、かつチューブ上方へ胚を取り込むために十分な毛管作用及び表面張力を、培地に提供することができなければならない。好ましくは、チューブは、200〜250mmの内部直径を有する。チューブは、キャピラリー・チューブであり得る。より狭い内部直径の範囲は、およそ200mm未満であってよく、胚のサイズが制限因子となる。200mm未満のようなより狭い範囲は、発生の完全な促進のため有益であるかもしれない。
【０１０７】
胚は、受動的な毛管作用の下で、又はチューブ上方へ液体を取り込む能動的な圧力により、チューブへと取り込まれるか又は引き込まれ得る。チューブが、チューブ内に培地及び胚を維持し保持するために十分な能力を有するのであれば、第二の方法が利用されてもよい。
【０１０８】
胚がチューブへ取り込まれた後、チューブは、空気／培地界面上にクッションを作出するため、水平ではなく垂直に保持されることが好ましい。垂直方向が最も好ましいが、水平のインキュベーションも利用され得る。
【０１０９】
培養チューブ系は、含有されている胚が、さらに進んだ発生段階、好ましくは成熟胚盤胞段階へと発生することができるよう設計される。しかしながら、初期卵割期又は桑実期のような任意の段階が、チューブ内の胚の発生を直接的に観察した後に選択されてもよい。胚は、所望の発生段階に依って、任意の時点において除去され得る。これは、胚が、培養系に含有され成熟させられた後、適当な発生段階で、最小の操作により動物への転移のため直ちに利用可能であるため、多くの利点を有している。
【０１１０】
その後、培養された再構成された細胞又は胚は、好ましくは洗浄され、次いで、好ましくは適当なコンフルエントなフィーダー層を含有しているウェル・プレートに含有されている適当な培地、例えば10％FCSを含有しているTCM-199培地の中に置かれる。適当なフィーダー層には、例えば、繊維芽細胞及び上皮細胞、例えば有蹄動物に由来する繊維芽細胞及び子宮上皮細胞、ニワトリ繊維芽細胞、ネズミ（例えば、マウス又はラット）繊維芽細胞、STO、及びSI-m220フィーダー細胞系、及びBRL細胞が含まれる。
【０１１１】
一つの態様において、フィーダー細胞は、マウス胚性繊維芽細胞を含む。適当な繊維芽細胞フィーダー層の調製は、当技術分野において周知である。
【０１１２】
再構成された細胞は、再構成された細胞が、レシピエント雌への移植、又は細胞もしくは細胞コロニーを作製するために使用され得る細胞の入手にとって適当なサイズに達するまで、フィーダー層上で培養される。好ましくは、これらの再構成された細胞は、少なくとも約2〜400細胞、より好ましくは約4〜128細胞、最も好ましくは少なくとも約50細胞にまで培養されるであろう。培養は、増殖を最適化するため、典型的には約2〜5日毎、好ましくは約3日毎に培地を交換しながら、適当な条件、即ち約39℃及び5％CO2の下で実行されるであろう。
【０１１３】
本発明における胚移植及びレシピエント動物管理のための方法は、胚移植産業において使用されている標準的な手段である。同調的な移植、即ち、核移植胚の段階がレシピエント雌の発情周期と同調していることは、本発明の成功にとって重要である。この利点、及びレシピエントを維持する方法は、Siedel,G.E.,Jr.（「Fertilization and Embryonic Development in Vitro」（1981）L.Mastroianni,Jr.and J.D.Biggers編、Plenum Press、New York、N.Y.323頁の「Critical review of embryo transfer procedures with cattle」）（この内容は参照として本明細書に組み入れられる）に概説されている。
【０１１４】
簡単に説明すると、胚盤胞は、同調させたレシピエントの子宮へと非外科的又は外科的に移植され得る。その他の培地も、当業者に周知の技術及び培地を使用して利用され得る。一つの手法において、クローニングされた胚は、新鮮なKSOMにより3回洗浄され、39℃で、5％CO2、5％O2、及び90％N2の下で、4日間、0.1％BSAを含むKSOMの中で培養され、続いてさらに3日間、1％BSAを含むKSOMの中で培養される。胚の発生は、当技術分野において既知の標準的な手法によって調査され類別される。卵割率が2日目に記録され、卵割胚が、7日間さらに培養される。7日目に、胚盤胞の発生が記録され、1個又は2個の胚が、胚及び／又は動物の利用可能性は未決定のまま、同調させた各代理母の子宮へと非外科的に移植される。
【０１１５】
代理母は、好ましくは、妊娠40日目、60日目、90日目、及び120日目のように定期的に、直腸触診又は超音波検査によって妊娠に関して検査される。好ましくは、様々な妊娠段階での胚喪失を評価するため、注意深い観察及び継続的な超音波モニタリング（毎月）が妊娠の間中実施される。可能であれば、任意の流産胎児が、クローンの状態を確認するためのDNAタイピング、及びルーチンの病理学的検査のため採集されるべきである。
【０１１６】
そのような方法の工程において作製された、再構成された細胞、活性化された再構成された細胞又は胚、胎児、及び動物、並びにそれらから採集され得る細胞、核、及びその他の細胞成分も、本発明の態様として主張される。
【０１１７】
本発明は、例えば、細胞、組織、及び器官の転移において使用され得る胚、胎児、又は子孫を作製するためにも使用され得る。動物から胎児又は成体の細胞を摘出し、クローニング法においてそれを使用することによって、それらが器官形成によって発生するにつれ、多様な細胞、組織、そしておそらくは器官が、クローニングされた胎児より入手され得る。細胞、組織、及び器官は、クローニングされた子孫からも単離され得る。この過程は、細胞治療及び遺伝子治療を含む多くの医学的及び獣医学的な療法のための「材料」の起源を提供することができる。細胞が、その細胞の起源動物へと戻し移植された場合には、免疫拒絶が防止される。また、多くの細胞型がこれらのクローンより単離され得るため、造血キメリズム（hematopoietic chimerism）のようなその他の方法論が、同一種の動物間、又は種間の免疫拒絶を回避するために使用され得る。
【０１１８】
この明細書の記載及び特許請求の範囲の全体において、「を含む（comprise）」という単語、並びに「を含む（comprising）」及び「を含む（comprises）」のような単語の語尾変化は、その他の添加剤、成分、整数、又は工程を除外するためのものではない。
【０１１９】
先行技術の文書、行為、装置等の考察は、本発明のための前後関係を提供する目的でのみこの明細書に含まれている。それは、これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成しているか、又は本願の出願日より前にオーストラリアに存在していたような本発明と関係のある領域における通常の一般知識であったとは、示唆又は意味しない。
【０１２０】
以下、非制限的な実施例を参照しつつ、本発明をさらに記載する。しかしながら、以下の実施例は、例示的なものであり、決して、前記の本発明の一般性に対する制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。例えば、実施例の大半がウシの卵母細胞及び顆粒膜細胞に関するものであるが、本発明は、例えばヒツジ、ヤギ、及びウマを含む、本明細書に開示されたようなその他の動物の卵母細胞にも適用され得ることを理解されたい。
【０１２１】
実施例1  ドナーとして顆粒膜細胞を使用した核移植法
特記しない限り、示された全ての化学物質を、Sigma Chemical Co.（St Louis、MO、USA）より入手した。
【０１２２】
小さな修飾を加えた以前の詳細な記載（Vajtaら、1996）に従い、ウシ卵母細胞（1日当たり計150個）のインビトロ成熟を実施した。簡単に説明すると、屠殺場由来の卵巣より卵母細胞を吸引し、4ウェル・ディッシュ（Nunc、Roskilde、Denmark）において、15％雌ウシ血清、10IU/ml妊娠雌ウマ血清ゴナドトロピン、及び5IU/mlヒト絨毛性ゴナドトロピン（Suigonan（登録商標）Vet、Intervet、Australia）が補足された重炭酸緩衝TCM-199培地（Gibco BRL、Paisley、UK）の中で24時間成熟させ、5％CO2を含む加湿空気中、39℃で鉱油の下でインキュベートした。
【０１２３】
成熟開始後19時間目に、卵丘細胞をボルテックス処理により除去した。（特記しない限り）この時点以降、全ての操作を、39℃に調整された加熱されたステージ上で実施した。第一極体の存在によって成熟卵母細胞（およそ110個）を選択し、細胞から透明帯を除去するため、0.5％プロナーゼ（Sigma protease）溶液の中に5分間置いた。透明帯のない卵母細胞（およそ50〜60個、全体の半分）を、20％FCS及び10μg/mlサイトカラシンBが補足されたHepes緩衝TCM-199培地（TCMH）4mlが充填された35mmペトリ皿（Falcon、Becton Dickinson Labware、Franklin Lakes、NJ、USA）に並べた（図1A参照）。
【０１２４】
ウルトラ・シャープ・スプリッティング・ブレード（Ultra sharp Splitting Blades）（AB Technology、Pullman、WA、USA）を用いて、実体顕微鏡の調節下で、手動で二分割を実施した（図1B参照）。次いで、二分割された卵母細胞（半卵母細胞）を旋回によりディッシュの中央に収集し、サイトカラシンを含まない同培地へ入れ、その手順を卵母細胞の残りで繰り返した。
【０１２５】
二分割の完了後、蛍光色素ヘキスト33342が溶解したTCMH及び30％FCSで全ての半卵母細胞を染色し、次いで、60mmファルコン（Falcon）ペトリ皿の底に形成され、油で覆われた同培地の3μlの滴の中に置いた（1滴当たり3個の半卵母細胞、全部でおよそ70滴）。倒立顕微鏡及び紫外線照射の下での調査の後、染色質染色（細胞質体）のない半卵母細胞を選択し、成熟のために記載された条件下で、最初の成熟ディッシュの1ウェルに実体顕微鏡下で収集し（全部でおよそ100〜120個）、融合までインキュベートした。
【０１２６】
成熟のため7〜10日前に使用された4穴ディッシュにおいて形成された顆粒膜細胞単層より、体細胞を調製した。0.05％トリプシン100μlの中での5分間のインキュベーションの後、ウェルにTCMH及び20％FCS 800μlを充填し、激しいピペッティングにより細胞を分離し、融合まで4℃で1.5mlエッペンドルフ・チューブ内に保管した。
【０１２７】
融合は、成熟開始後21〜22時間目に実施した。一次融合のため、2％FCSを含むTCMHへ15個の除核卵母細胞を移した。血清補足なしのTCMHが充填された4穴ディッシュの中央部の底へ顆粒膜細胞懸濁物5μlを沈降させた。口が微細に引き延ばされたガラス・ピペットを使用して、除核卵母細胞を個々に3秒間PHA（ICN Pharmaceuticals、Australia）200μg/mlへと曝し、次いでディッシュの底に置かれた単一顆粒膜細胞上に迅速に滴下した（図1C及び1D参照）。接着の後、除核卵母細胞-顆粒膜細胞対を再び拾い上げ、26〜27℃の融合媒体（0.3Mマンニトール、0.1mM MgS04、0.05mM CaCl2）4mlで覆われた融合チャンバーへと移した。融合チャンバーは、1mmの直径及び0.8mmの間隔を有する平行な白金ワイヤーを含有していた。15V及び700KHz（Genaust Electrofusion Machine、Australia）の交流（AC）を使用。対を1本のワイヤーに接着させ（ワイヤーから最も遠い体細胞-図1E参照）、次いで、01秒間隔の各々20μ秒間の85Vの二重DCパルスにより融合させた。次いで、対を注意深く除去し、15〜30分間、TCM-199及び20％FCSにおいてインキュベートした後、融合を評価した。15個の除核卵母細胞を全て顆粒膜細胞と融合させた後、融合媒体を交換し、新たな一連の一次融合のため、新たな除核卵母細胞及び顆粒膜細胞を調製した。
【０１２８】
二次融合のため、未融合の除核卵母細胞及び融合対（再構成された細胞）（各々5〜10個）をまず1〜2分間融合媒体中でインキュベートし、次いで同じACパルスを使用して対に整列させ、未融合の除核卵母細胞をワイヤーに接着させた（図1F参照）。45Vである以外は同じパラメーターの二重融合DCパルスを適用し、次いで2個の除核卵母細胞と1個の顆粒膜細胞との三つ組を、20分間、TCMH及び20％FCSの中でインキュベートした。次いで、融合した再構成された細胞（全部でおよそ40〜45個）を、成熟ディッシュのウェルへ移し、前記の条件下でさらにインキュベートした（Vajtaら、2002）。
【０１２９】
活性化は、成熟開始後24〜26時間目（融合後およそ3時間目）に開始された。再構成された細胞を、まず、10μMカルシウム・イオノフォアA23187を含有しているTCMHの中で空気中で5分間インキュベートし、次いで2mM 6-ジメチルアミノプリン（6-DMAP）が溶解している10％FCSが補足された重炭酸緩衝TCM-199の中で5時間、5％CO2を含む空気の中でインキュベートした。
【０１３０】
次いで、胚を、5％雌ウシ血清が補足されたSOFaaci培地（Holmら、1999）400μlで繰り返し洗浄し、鉱油で覆い、次いでランダムに三つの群へ分割し、各々を同培地中で保持した。第一群は、鉱油で覆われた1l滴の中で個々に培養した。第二群の胚は、ウェル・オブ・ウェル（WOW；Vajtaら、2000）の中に置いた。第三群は、個々に2μlドラモンド（Drummond）マイクロキャピラリー（Thouasら、2001）へロードした。全ての培養を、5％C02及び90％N2（加湿空気中）において39℃で実施した。
【０１３１】
再構成の2日後及び7日後に、実体顕微鏡下で、胚1個当たりの卵割率及び胚盤胞率についてそれぞれ評価した。図1（G）は、融合7日後のGO系で発生した胚盤胞を示している。図1（H）は、GO系からの除去後の同胚盤胞を示している。胚盤胞のうちのいくつかは、将来の免疫組織化学的研究及び超微細構造研究のため固定し；いくつかは将来の胚移植実験のためガラス状した。
【０１３２】
卵割率及び胚盤胞率の統計分析は、ピアソンのカイ二乗法を使用して実施した。P＞0.05を有意と見なした。
【０１３３】
実施例2
ドナーとして顆粒膜細胞を使用した核移植の結果
全部で1016個の未熟卵母細胞を使用した7回の反復核移植実験における、主要工程の平均効率、及びおよその所要時間を、表1に要約する。
【０１３４】
（表１）帯のない体細胞核移植の工程に関する、平均効率及びおおよその所要時間
2004529648.tif 000002
【０１３５】
良好に可視の極体を有しない卵母細胞（全部の28％）は、廃棄した。しかしながら、この損失は、核移植法自体に起因するものではあり得ず；従って、これらは効率の計算に含めなかった。二分割中の損失は、手順の完了後5分目に観察された溶解の結果である。除核卵母細胞選択の最終精度は、ほぼ100％であった。しかしながら、主として技術的な失敗に起因する9％の差が、計算値と実測値との間に生じた。融合中の損失は、ほぼ完全に溶解又は技術的な失敗の結果であり、不成功の融合（融合後15〜20分後に分離した対）は例外的であり、通常は反復融合工程により排除された。
【０１３６】
平均して、105個の成熟卵母細胞が使用され、実験1回当たり35個の除核卵母細胞（除核卵母細胞）体細胞の三つ組が作製され、作業のための所要時間は3時間を越えなかった。
【０１３７】
三つの培養系で達成された胚発生率を、表2に要約する。微小滴において培養された胚と、WOW系において培養された胚とを比較すると、卵割率（2細胞以上）を除く全ての値が有意に異なっていた。
【０１３８】
（表２）異なる培養群において達成された卵割率及び胚盤胞率
2004529648.tif 000003
a、b、c  同じカラムで異なる上付き文字が付いている値は、有意差を意味する。
【０１３９】
一般に、微小滴において培養された胚は、8〜16細胞期を越えては発生せず；コンパクションは、WOW系又はGO系でのみ起こった。胚盤胞形成は、通常、再構成後6日目に開始し、7日目に完了した。
【０１４０】
実施例に記載された好ましい二重融合核移植法の効率は、おそらく、融合する2個の細胞のサイズが近く（当実験において、細胞質体容積は最初の卵母細胞の半分のみである）、PHA粘着が比較的大きな面積で強力な膜接触を確立するためである。Peuraら（1998）の一工程（除核卵母細胞 + 除核卵母細胞 + 割球）融合法とは対照的に、実施例に記載された二重融合法（まず除核卵母細胞 + 体細胞により再構成された細胞を作製し、次いで第二の除核卵母細胞を再構成された細胞と融合させる）は、より簡便かつ効率的である。再構成のための2個の除核卵母細胞の使用は、従来の核移植の不可避の部分である細胞質容積損失を完全に償うことが可能であることも意味する。
【０１４１】
実施例に記載された好ましい方法の結果からは、本法が、農業におけるこれらの技術の大規模適用のための核移植の自動化のための要件を満たす細胞クローニング技術の開発の相当の可能性を有することが示唆される。特に、単純化された体細胞核移植法は、現在使用されている高価で、技術的に困難な顕微操作法への依存を大いに減少させる。さらに、これらの改良は、良好な核移植を実施するための全体時間を有意に減少させた。
【０１４２】
実施例3
単純化された帯のない体細胞クローニング技術
この実施例において使用されたプロトコルは、以下の例外を除き、実施例1に記載されたものと同様であった。
【０１４３】
再構成された核移植胚を単独で培養するか、又は2個の再構成された核移植胚の凝集物として培養し、培養を、ガラス・キャピラリー、又は4穴ヌンクロンディッシュ内のWOWのいずれかにおいて実施した。活性化の後、胚を、個々に、ガラス・チューブに取り込むかもしくはWOWくぼみの中に置くか、又は2個の「再構成された」核移植胚を、各ガラス・キャピラリーもしくは各WOWくぼみの中で培養し、活性化の後に凝集物として培養した。
【０１４４】
表3、4、及び5は、実施例1に記載された技術を使用して作製された核移植胚の培養及び移植からの胚盤胞発生率及び妊娠率を示す。再構成された核移植胚は、個々に（表3）、又は2個の再構成された核移植胚の凝集物として（表4及び5）、培養された。
【０１４５】
表3に報告された全ての実験が、胎児繊維芽細胞を使用した最後のものを除き、1週齢の顆粒膜細胞を使用して実施された。胚盤胞率は、単独で（即ち凝集物としてではなく）培養された核移植胚からのものだった。
【０１４６】
表4は、（ウシαS1カゼイン遺伝子によりトランスフェクトされた）トランスジェニック・ドナー細胞を使用した、単純化された帯のない核移植技術により達成された胚盤胞率を示す。胚は、2個の単一の再構成された核移植胚の凝集物として培養された。GO系又はWOW系のいずれかで培養された。データは、活性化に供された構築された胚に基づく。融合及び活性化の結果としての損失は、無視しうる程度であった。3.5時間（ + 活性化）で、20〜30個の胚盤胞が作製され得る。
【０１４７】
表5は、トランスジェニック・ドナー細胞（ウシαS1カゼイン遺伝子によりトランスフェクトされた繊維芽細胞）を使用した、単純化された帯のない核移植技術による凝集核移植胚の移植からの妊娠率を示す。再構成された核移植胚は、単独で、又は2個の凝集物として培養され、培養は、ガラス・キャピラリー（GO）、又は4穴ヌン（Nun）ディッシュ内のWOW（Lewisら、2002）のいずれかにおいて実施された。
【０１４８】
（表３）達成された胚盤胞率20001/2002
2004529648.tif 000004
【０１４９】
（表４）
2004529648.tif 000005
【０１５０】
（表５）（ウシαS1カゼイン遺伝子をトランスフェクトされた）トランスジェニック・ドナー細胞を使用した、単純化された帯のない核移植技術による妊娠率
2004529648.tif 000006
＊1  7.5ヶ月目に喪失した妊娠（胎児未回収）。
＊1  妊娠8ヶ月と1週目に喪失した妊娠。難産-獣医学的に補助された出産の後、胎児死亡。仔ウシ出生時体重35kg。VIAS、Attwoodにおける死後。P-Mにおいて有意な異常は検出されなかった。組織病理学において、脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、腎臓、骨格筋、又は胎盤に有意な傷害は観察されなかった（VIASレポート01-005483-MWを参照されたい）。
【０１５１】
実施例4  レシピエント雌ウシへの核移植胚の移植後の改良された着床
使用されたプロトコルは、以下の例外を除き、実施例1の記載と同様であった。
【０１５２】
再構成された単細胞核移植胚を、WOWにおいて個々に4日間培養し（この時点で、それらは典型的には30〜60細胞であった）、次いで2個のそのような胚を、「凝集物」としてのさらなる培養のため、単一のウェルで組み合わせた。そのような凝集物としての核移植胚の培養は、移植のための最終的な胚の細胞数を増加させ、妊娠率を増加させる（Peuraら、1998）。
【０１５３】
6個の7日目胚盤胞を、6頭のレシピエント雌ウシへ移植した。即ち、各レシピエントに1個の胚のみを移植した。6頭のレシピエント雌ウシのうちの5頭が、妊娠30日目頃（超音波検査法によって）妊娠していると診断された。対照的に、実施例3及び5においては、妊娠率を増加させるため、各レシピエントに複数個の胚が移植された。
【０１５４】
実施例5  融合のパラメーター及び条件の最適化
この実施例においては、融合のパラメーター及び条件の最適化の探求を行った。体細胞の2個の細胞質体との融合又は3個の細胞質体との融合を比較した。活性化の後、再構成された核移植胚を、単一の胚として、又は2個の胚の凝集物として培養した。
【０１５５】
この実施例において使用されたプロトコルは、以下の例外を除き、実施例1において使用されたものと同一であった。
【０１５６】
1.実施例1においてこの目標を達成するために使用された2つの融合工程の代わりに、体細胞と2個の細胞質体とを融合させる一工程融合を使用した。
【０１５７】
体細胞と細胞質体（体細胞1個当たり2個又は3個の細胞質体）とを同時に融合させた。繊維芽細胞を使用した。融合のための必要パラメーターは、繊維芽細胞のサイズに従い計算した（Teissieら、1998）。0.5mmのギャップを有する融合チャンバーを利用した、6μ秒間の繊維芽細胞表面に対する2V（112V＝2.22kV）（Genaust Electrofusion Machine、Australia）又は4μ秒間の繊維芽細胞表面に対する3V（166.8V＝.3kV）（BTX Electro Cell Manipulator 200、USA）のいずれか。誘導電位差は、繊維芽細胞における定常状態値であろうが、比較的大きな細胞質体を含むそれの極一部であり、従って、細胞質体の生存を保存するであろう。全ての融合を、単一パルスを使用して実施した。
【０１５８】
1個の半分の細胞質体をPHAに曝し、微細に引き延ばされたピペットを使用した操作により、1個の繊維芽細胞に接着させた。（三つ組を作成する場合には）繊維芽細胞／細胞質体対をもう1個の半分の細胞質体と一緒に、電気融合媒体中で平衡化した。
【０１５９】
2.再構成された核移植胚を形成させるため、2個又は3個いずれかの細胞質体を体細胞と融合させた。
【０１６０】
3.活性化の後、核移植胚を、単一の胚として、又は2個の再構成された核移植胚の凝集物として培養した。
【０１６１】
受容レシピエント16頭への全部で60個の胚の移植（即ち、各レシピエントに平均3.8個の胚を移植した）から、7例の妊娠が生じた。本明細書の執筆の時点で、3例の妊娠が進行中である。
【０１６２】
表6は、2個又は3個の細胞質体の体細胞との融合を比較したものである。単一の胚は、ガラス・キャピラリー（GO系）で培養した。凝集胚は、4穴ヌンク（Nunc）ディッシュ内のWOWの中で培養した（WOW1個当たり2個の再構成された核移植胚）。
【０１６３】
（表６）
2004529648.tif 000007
＊  融合が予測値（4μ秒間166V）によりBTX機を用いて実施され、その他はGA機を用いて実施され（6μ秒間112V）、再構成された。
【０１６４】
表7は、移植された胚の数及び妊娠率を示す。
【０１６５】
（表７）（単一の又は凝集された、再構成された核移植胚に由来する）移植された胚の数
2004529648.tif 000008
【０１６６】
過程のための所要時間はより少ないことが認められた。特に、効率を犠牲にすることなく、工程の数（SC-細胞質体複合体の再確認及び再融合、もう1個の卵母細胞との二次融合）が、最適化された融合のパラメータ及び条件により削減された。融合過程は、極めて短かい時間で完了しうるが、依然として、除核過程が、過程に費やされる時間のほぼ60〜70％を占めている。これは、系の自動化のための主要な標的となろう。
【０１６７】
予測された電圧及びパルス長は、同時融合にとって効率的であった。予測値（9μm繊維芽細胞に従い計算）が、体細胞 + 細胞質体の同時融合のため、BTX機を用いて試験され、融合率及び胚盤胞率が決定された。
【０１６８】
系を高速化するため、9月以降は、PB又は形態学的外観による卵母細胞の選択を行わなかった。同じ無選択基準を、移植される胚に適用した。
【０１６９】
PVAは、卵母細胞の固着及び膜崩壊を防止するため、融合媒体へ添加された。融合媒体は2週間毎に調製されるべきと示唆されているが、培地を等分して凍結させたところ、有害な効果は認められなかった。半卵母細胞は、融合チャンバーへの導入の前に、融合媒体を含有している別のウェルでインキュベートされた。
【０１７０】
一工程融合の導入により、既存の融合プロトコルが単純化され、改良された。既存の二工程プロトコル（体細胞 + 細胞質体、次いで細胞質体 + 細胞質体）と比較して、体細胞及び細胞質体は同時に融合させられる（同時に10〜12個の核移植）。既存のプロトコルのための所要時間が、大きく削減された。
【０１７１】
融合のパラメータも、既存の式に従い計算され試験された（Teissieら、1997）。体細胞と透明帯のない除核卵母細胞とを同時に融合させた（同時に10〜12個の核移植）。新たなパラメータ（4μ秒間、細胞表面に対し3V）では、誘導電位差が、繊維芽細胞における定常状態値となるであろうが、比較的大きい細胞質体を含むそれの極一部であると考えられ、これは、この比較的大きいパートナーの細胞生存率を保存するであろう。
【０１７２】
実施例6  ウシ卵母細胞と比較したマウス及びヒツジの卵母細胞を使用した核移植法
実施例1に示されたプロトコルを、ヒツジ及びマウスの卵母細胞を用いた実験において使用した。例えば、実施例1において言及されたウシ卵母細胞と同様にして、ヒツジ及びマウスの卵母細胞を採集し、透明帯を除去するために処理し、除核した。使用された体細胞は、繊維芽細胞であった。
【０１７３】
表8は、6μ秒間、55V（1.1kV）及び112V（2.2kV）での2個の細胞質体と1個の体細胞（繊維芽細胞）との同時融合後の、再構成されたヒツジ胚の融合率を示す。
【０１７４】
（表８）再構成された透明帯のないヒツジ胚の融合率
2004529648.tif 000009
【０１７５】
表9は、2回の反復実験における、6μ秒間、112V（2.2kV）での2個の細胞質体と1個のヒツジ体細胞（繊維芽細胞）との同時融合後の、再構成されたヒツジ胚の融合率を示す。各胚内の染色質の数を、蛍光顕微鏡下で融合後3時間目に確認した。
【０１７６】
（表９）再構成された透明帯のないヒツジ胚内の染色質
2004529648.tif 000010
【０１７７】
表10は、2回の反復実験における、6μ秒間、112V（2.2kV）での2個の細胞質体と1個の体細胞（繊維芽細胞）との同時融合後の、再構成されたヒツジ核移植胚の溶解率を示す。
【０１７８】
（表１０）再構成された透明帯のないヒツジ核移植胚の溶解率
2004529648.tif 000011
【０１７９】
（表１１）透明帯のないマウス卵母細胞の二分割後の溶解
2004529648.tif 000012
【０１８０】
（表１２）6μ秒間、V（2.2KV）での、2個の細胞質体と体細胞（繊維芽細胞）との同時融合後の、種間（ウシ細胞質体 + 齧歯類繊維芽細胞）再構成胚の胚盤胞率
2004529648.tif 000013
【０１８１】
参照
2004529648.tif 000014
2004529648.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】本発明に係る好ましい方法の結果を示す。透明帯のない卵母細胞-体細胞移植の手順及び結果が提供される。パネルAは、二分割前のペトリ皿に整列させた卵母細胞を示す。パネルBは、除核卵母細胞（細胞質体）及び核体を作製するための卵母細胞の手動の二分割を示す。パネルCは、接着前の、除核卵母細胞及び体細胞を示す。パネルDは、接着後、融合前の、除核卵母細胞-体細胞を示す。パネルEは、一次融合のため電気融合ワイヤー上に整列させた除核卵母細胞-体細胞対を示す。パネルFは、二次融合のため電気融合ワイヤー上に整列させた未融合の除核卵母細胞及び融合した除核卵母細胞-体細胞対を示す。パネルGは、融合後7日目のGO系で発生させられた胚盤胞を示す。パネルHは、GO系からの除去の後の同胚盤胞を示す。
【図１】
2004529648.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004529648.tif 000017
2004529648.tif 000018
2004529648.tif 000019
2004529648.tif 000020
2004529648.tif 000021
2004529648.tif 000022
2004529648.tif 000023
2004529648.tif 000024
2004529648.tif 000025
2004529648.tif 000026
2004529648.tif 000027
2004529648.tif 000028
2004529648.tif 000029
2004529648.tif 000030
2004529648.tif 000031
2004529648.tif 000032
2004529648.tif 000033
2004529648.tif 000034
2004529648.tif 000035
2004529648.tif 000036
2004529648.tif 000037
2004529648.tif 000038
2004529648.tif 000039
2004529648.tif 000040
2004529648.tif 000041
2004529648.tif 000042
2004529648.tif 000043
2004529648.tif 000044
2004529648.tif 000045
2004529648.tif 000046
2004529648.tif 000047
2004529648.tif 000048
2004529648.tif 000049
2004529648.tif 000050
2004529648.tif 000051
2004529648.tif 000052
2004529648.tif 000053
2004529648.tif 000054
2004529648.tif 000055
2004529648.tif 000056
2004529648.tif 000057
2004529648.tif 000058
2004529648.tif 000059
2004529648.tif 000060
2004529648.tif 000061
2004529648.tif 000062
2004529648.tif 000063
2004529648.tif 000064
2004529648.tif 000065
2004529648.tif 000066
2004529648.tif 000067
2004529648.tif 000068
2004529648.tif 000069
2004529648.tif 000070
2004529648.tif 000071
2004529648.tif 000072
2004529648.tif 000073
2004529648.tif 000074
2004529648.tif 000075
2004529648.tif 000076
2004529648.tif 000077
2004529648.tif 000078
2004529648.tif 000079
2004529648.tif 000080
2004529648.tif 000081
2004529648.tif 000082
2004529648.tif 000083
2004529648.tif 000084
2004529648.tif 000085
2004529648.tif 000086
【国際調査報告】
2004529648.tif 000087
2004529648.tif 000088
2004529648.tif 000089