(57)【要約】本発明は、移植寛容におけるドナー特異的増加及び損傷組織の修復の為に、初期胚芽段階由来細胞で、細胞株由来の細胞の使用に関するものである。本発明の出願の範囲は薬学、製薬業界を含むものである。本発明の目的は、移植組織の拒絶を防ぐ為に、免疫反応によるドナー特異的免疫寛容を提供し、それにより、免疫抑制剤の使用を制限することである。ドナー特異的免疫寛容を提供するために、胚性幹細胞様細胞株(ECL)を胚盤胞より得、MHCハプロタイプをコードするドナーの遺伝物質で形式転換する。このような方法で産生された該細胞は、移植前に移植される組織に対して免疫寛容を起こす為に又は既に損傷を受けた組織の再生の為に受容体に投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚の初期ステージ（ａｎ early stage of the embryo）、例えば胚盤胞（「肺性幹細胞様細胞株」、ECL）由来細胞が、移植前に受容者に投与されることを特徴とする移植組織に対するドナー特異的免疫寛容の生成方法。
【請求項２】
投与する細胞が、MHC遺伝子及び／又はレポーター遺伝子で形質転換されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該細胞が、ドナー特異的MHC遺伝子で形質転換されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ECLと該ドナー特異的MHC遺伝子を提示する体細胞又は体細胞株を融合することにより該形質転換されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
特定のMHCをコードするプラスミド(MHC-coding  plasmid)により該形質転換されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該形質転換が、新規MHCをコードするプラスミド(New  MHC-encording  Plasmid)を非ヒトトランスジェニック哺乳類に供給することでおこし、そしてこれらトランスジェニック動物からECLs産生によりなされることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
該形質転換が、クラスI MHCの特異抗原の高度に多型なα1へリックスをコードするクラスIのMHCアロペプチドで、該ECLのペプチドロードによりなされることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
投与される細胞がLacZプラスミドにより形質転換されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ヒト細胞株が使用されることを特徴する請求項１から８の何れか一に記載の方法。
【請求項１０】
該細胞が移植の３〜７日前に投与されることを特徴とする請求項１から９の何れか一に記載の方法。
【請求項１１】
該細胞が静脈内投与されることを特徴とする請求項１から１０の何れか一に記載の方法。
【請求項１２】
該細胞が門脈内投与されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該細胞が皮下投与されることを特徴とする請求項１から１０の何れか一に記載の方法。
【請求項１４】
該細胞が腹膜腔内投与されることを特徴とする請求項１から１０の何れか一に記載の方法。
【請求項１５】
該ECL細胞株が、特異な伝達機能をもつ神経細胞へと分化するための起始細胞(Starting Cell)としてプログラムされたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該ECL細胞株が、肝臓特異代謝をサポートする肝細胞へと分化するための起始細胞(Starting Cell)としてプログラムされたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該ECL細胞株が、心筋機能の再生のための心筋細胞へと分化するための起始細胞(Starting Cell)としてプログラムされたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
共培養の過程として認識される神経細胞（ドーパミン生成細胞）、肝細胞、心筋細胞のための特異な分化素質を提示する該シグナル蛋白質が組み換え蛋白質の形態として生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー特異的に増強する移植寛容及び損傷細胞治療のための、初期胚段階由来の細胞株の細胞の利用に関する。本発明の技術分野は医学、製薬産業を含むものである。
【背景技術】
【０００２】
移植薬におけるプレドニゾン、シクロスポリン、タクセリムス、マイコフェノレート、メフェチルといった免疫抑制剤や抗リンパ球抗体のめざましい発達は、年平均の患者の生存時間の増加及び移植片の生着期間の増加をもたらした。これらの薬物の繰り返しの使用により、臨床的移植が多くの心臓、腎臓、肝臓の非悪性末期疾患の為の標準的治療方法に選択されることとなった。
【０００３】
それにもかかわらず、移植片の初期残存期間の改善は、実質的な感染的症状や非免疫的副作用なしには達成できなかった（Gaber et al., Transplantation  66:29-37,1998）（非特許文献１）。さらに、初期の間の残存率が良くても移植片の長期の残存率が得られるわけではない、というのは、過去20年間本質的な改善がないが、１年経過後の移植片の慢性拒絶によりしばしばそれらの機能不全をもたらすからである（Cecka  and  Terasaki,  Clinical  Transplants  1997,  Los  Angels,  UCLA  Tissue  Typing  Laboratory,  1998）（非特許文献２）。さらに、移植の臨床管理の長期継続中に、さらなる非特異的な免疫抑制が必要となるために後遺症や死亡率が増加した（Pirsch  and  Friedman,  J.  Gen.  Intern.  Med.  9:29-37,  1994）（非特許文献３）。
【０００４】
特定抗原（AG）の投与後又は取り込み後に一般的に免疫反応の欠如として定義される免疫寛容（以下単に寛容という）の期間は、移植における医薬の中心的な役割を担っている。移植免疫学的視点から見ると、寛容とは、継続的な治療の介在なしに、危険な免疫反応なく永続的に組織が存続できることであると定義できる。ここで、寛容は個々の先天的性質ではなく後天的なものであるということが重要である（Owen,  Science  102:  400-401,  1945（非特許文献４）;  Billingham他  Nature  172:  603-606,  1953（非特許文献５））。さらに、出生時に現れた寛容状態というものは、絶えず変化し、体は一生を通じ新しい抗原と出会っていく。免疫システムは例えば思春期や妊娠中に放出される生理学的ホルモンといった特定の「異」抗原に対し寛容的である必要がある。胎児が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）不適合宿主において成長し生存できるという事実は、自然では異種・非異種だけではなく危険・非危険の識別が可能であるとのもう１つの例である（非特許文献６）。
【０００５】
同種異系造血幹細胞移植（CD34+）において、受容体が致死量の骨髄剥離又は照射をされた場合に、MHC非適合性宿主における移植が成功している。
【０００６】
現在の器官又は組織の移植における短所。
免疫反応による移植の拒絶反応を避けるために、近年強力な免疫抑制剤が投与されているが、それは代償として感染リスクの増加をもたらす。つまり、正常機能している免疫系においては危険性のない偏在する病原菌が、免疫抑制状態ではひどい疾患を引き起こしうる。例えば、造血幹細胞移植（CD34+）において、MHC非適合性宿主における移植は、骨髄にある受容体がＸ線照射によって先に除去されるか又は破壊された場合にのみ成功している。
【非特許文献１】Gaber  et  al.,Transplantation  66:29-3:7,1998-
【非特許文献２】Cecka  and  Terasaki,  Clinical  Transplants  1997,  Los  Angels,  UCLA  Tissue  Typing  Laboratory,  1998
【非特許文献３】Pirsch  and  Friedman,  J.  Gen.  Intern.  Med.  9:29-37,  1994
【非特許文献４】Owen,  Science  102:  400-401,  1945;
【非特許文献５】Billingham他  Nature  172:  603-606,  1953
【非特許文献６】Vacchio and Jiang, Crit. Rev. Immunol. 19:461-480, 1999)
【発明の開示】
【０００７】
（発明の目的）
本発明が解決しようとする課題は、免疫反応による移植組織の拒絶反応を防止するためにドナー特異的な免疫寛容をおこさせることであり、つまりは、免疫抑制剤の使用を制限させることである。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は請求項１によって実施され、各従属請求項は好ましい実施態様である。
【０００９】
ドナー特異免疫寛容の生成の為に、胚性幹細胞様細胞株（ECLs）が胚盤胞より得られ、そして、MHC-ハプロタイプをコードするドナーの遺伝物質で形質転換される。このようにして産生された細胞は、移植される組織に対する免疫寛容の生成の為に又は既に損傷した組織再生の為に、最終的に移植前に各々受容体に投与される。
【００１０】
「寛容性ベクター」としてのECLs由来細胞の使用は、ECLが関連するMHC抗原発現の欠損及び免疫原性の不活化により可能である。実験によって、ECLsの細胞は移植が可能であり、長期生着するので、それにより異起原の造血細胞を生成することが見出された。さらに、これらのECL由来の造血細胞は、永久混合キメラ現象（同宿主においてドナーと受容体の造血細胞が同時に存在する）を生成し、つまり同種異系移植の長期間受容の為の基礎を提供する。つまり、それらは寛容誘導の理想的な方法として使用でき、また代わりに、ある器官の組織損傷を治療せねばならない状況において使用することができる。
【００１１】
以下に本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
ECL分離の為にWister  Kyoto（WKY）、Sprague  Dawley（SD）、ACIの三系統のラットを選んだ。
【００１３】
それらより得た胚盤胞が、フィーダー（Feeder）としてのマウス（MEF）又はラット（REF）マイトマイシン不活化胚繊維芽細胞に接種された。MEF、REF共に明らかにゼラチンよりすぐれており、MEFはさらに優れていた。胚盤胞がフィーダーレイヤーへ付着した後に、内部細胞塊（ICM）のフィラメントが形成されない場合、それらは通常容易に10日ほどでES様細胞凝塊（一次凝塊）の群へと発達することができる。その後、細胞は異なる細胞の型の混合物に大きく分化し、すぐに丸くなりオーバーグローし、わずかに付着し、内肺葉様細胞になる。ほんのわずかの細胞が凝塊した細胞から生き残り、細胞株へと発達する。
【００１４】
WKY胚盤胞は非常にはやく付着し、非常に活発な一次成長を見せ、10％以上の胎芽が永久細胞株を産した。SD肺細胞は遅く付着し、ほどほどの一次凝塊を産し、細胞株の発現に対する影響は低かった。ACI胚盤胞は付着にもっとも時間を要し、ごく少数の一次凝塊しか産生せず、この種からは細胞株は産生されなかった。この結果は、胚盤胞の支持細胞層への付着速度および最大一次成長中の一次凝塊の数がECL由来（derivation)効果に明確に関係することを示唆している。ハイブリッド胚盤胞の場合、WKY遺伝子型がECLs産出においてACIを支配するが、SD遺伝子型は支配しないというのは興味深いものである。
【００１５】
ドナー特異的免疫寛容を引き起こすための「寛容性ベクター」として胚性幹細胞から生成される細胞株由来の細胞の使用は、さらに、ドナー特異的MHC抗原の発現を必要とする。この特質は、本発明のECLsの細胞を、ドナーのMHC抗原をコードする遺伝子で形質転換することにより得られる。これは次の（i）ECLを公知の重要なMHC遺伝子をもつ体細胞又は細胞株と融合すること、（ii）ECL にMHCをコードするプラスミドを形質転換すること、（iii）MHCをコードするプラスミドを用いてトランスジェニックマウスを産生すること、または（iv）ECLにMHC抗原の同種ペプチドであるクラスＩ、それはMHCクラスＩ抗原特異的に高度に多形性のアルファへリックス構造をコードするが、それをペプチドローディングすることによりなすことができる。形質転換された細胞の投与は、様々であるが、門脈経由、腹膜腔内注射、皮下注射、静脈内注射によって可能である。
【００１６】
器官移植の医療プロセスにおいて、ドナー特異的なMHC-抗原を発現するECLｓの投与により受容者の同種異系の反応を軽減させることができる。ECLから誘導された子孫の表現型や形態の正確な特性により、成長した宿主において幹細胞が有する性質と近似する細胞の捜索をすることができる。これは、フルに成長した組織から誘導された幹細胞、それはECLの代わりになるが、幹細胞の融通性をより理解することができるようになり、ECLの特質を共有し又同様の状態で使用することを可能とする。
【実施例１】
【００１７】
ラットECLの分離と培養
妊娠１３〜１４日目の動物より調製されたマウス胎芽繊維芽細胞（MEF）又はラット胎芽繊維芽細胞（REF）を、マイトマイシンC（10μg/ml）で２又は１時間、３〜５回処理し有糸的分裂を不活化し、それをリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、ヌンク（Nunc）の4-ウェル-ディッシュに播種した。妊娠４、５日目のラットの子宮から胚盤胞細胞を、PBS/20%FCS（胎児子ウシ血清）又は培養液により流出させ、不活化した胎児繊維芽細胞に播種し、サプリメント（Innaccone他,  Dev. Biol. 1994; 163: 288-292）と共にDMEM/15%  FCS/2,500μ/ml  LIF（白血病阻害因子、ESGRO、Life  Technologies）培地、6%CO2/Air中で３〜４日未処理で存置した。この間、胚盤胞細胞は成長し、支持体に付着し、ICMが成長を始める、そこでの効率は遺伝的背景に依存している。ES細胞様の外観をもつフィラメントを採取し、フィラメントよりわずかに小さい直径をもつドロウン−アウトグラス（drawn-out glass）キャピラリーによる吸着により幾つかの凝塊へ分画し、新しいフィーダープレートへと移動させた。採取と分画を毎日又は２日に一度行った。純粋な安定した成長ES様凝塊が得られるまで崩壊コロニーは連続してリセットされた。個体数が数ダースに増加した凝塊を35mm皿に保持し、及び単細胞と小凝集体の混合物を、軽くトリプシン処理した。生成されたラットES細胞をトリプシン処理（Ca/Mg-free  PBSにおいて、0.05%トリプシン、0.02%EDTA-4Na、1%ニワトリ血清）により毎日又は２日に一度継代した。結果的に得られた細胞株の種の同定は、マウスES細胞による汚染を防ぐために、レニン遺伝子プライマーを使用したPCR（Brenin他、Transplant.  Proc.  1997;29:1761-1765）によって検査された。
【実施例２】
【００１８】
同種異系ラット宿主におけるWKY誘導ECLの門脈内注射
第１段階の実験では、免疫抑制又は骨髄除去処理を行っていない同種異系DA(RT1.avl)ラット宿主に、1.0x106のWKY由来ECLを門脈内に単回投与したときの結果を調べた。実験では、これらの細胞はDAラット宿主において長期間（150日より長い）の生存がみられた。この期間、ECL及びその子孫は、継続的、恒久的な混合キメラ現象状態（同一宿主内におけるドナー及び受容体の造血細胞の並存）を生成できることが見出された。さらに、これらの細胞はクラスII (Ox-3)のMHC抗原及びB細胞誘導マーカー(Ox-45)を発現する造血細胞へと分化することが見出された。モノクローナル抗体(mAb)Ox-3は、(WKY)-MHCドナーのクラスII特異抗体であり、それはWKYに発現されるクラスIIのMHCエピトープに結合するが、DA 陽性MHC細胞のクラスIIには結合しない。フローサイトメトリーによる２重染色白血球(WBC)の測定では、DAラット（ECL注射より100日経過）から採取されたWBCの３〜５％でOx-3+細胞を発現し、脾臓リンパ球の15〜20％がOx-3+を含有する。これらの結果、ESLは造血細胞を生成できるという事実が確認された。つまり、Ox-3+細胞は、組織形態学的（10〜15％）に心臓受容体（ＤＡ）の間質細胞間隙、それは1.0x106のWKY由来ECLを１回門脈内注射して100日後に選択的に破壊されるのであるが、において確認される（図１参照）。
【００１９】
これらの動物の安定キメラ現象状態は、ECLの門脈内注射の７日後にWKYの心臓を同種異系移植体であるDAラットに移植したときの、WKYの心臓の成り行きを試験する基礎となる。カプラン・メイアー図(Kaplan  Meier  Diagrams)は、DAラットに1.0x106ECLを門脈内投与する前処理をして７日後に心臓移植(HTx)をすると、150日を越える長期にわたり、拒絶することなく同種異系移植を受容することを示し、一方、非処理DAラットではWKYの同種異系移植拒絶することを示す（図２参照）。同時に行われたWKY-ECLを注射したDAラットに対するCAPラットの心臓同種異系移植では12.4+/-1.4日以内で拒絶され、これらのラットの免疫力を証明している。
【実施例３】
【００２０】
体細胞とECLの共培養
一次的なin vitro試験において、前述のECL細胞がそれぞれ体細胞、神経、内胚葉起原との共培養によって、星状膠細胞、心筋細胞、肝細胞への分化を得ることがみられた。つまり、前述の胚性細胞株は中枢神経系の器官特異疾患の治療にも好適である（例えば、パーキンソン治療の為のドーパミン細胞、肝硬変治療の為の肝細胞又は、最近の心臓発作治療の為の心筋細胞）。現在、臨床的におおいに関係のあるこれらの特別の形状に分化するのに必要とされるシグナル蛋白質の単離に適用されるべきであり、それによりECLsを所望の細胞群にスムーズにプログラミングさせることができる。従って、機能的な蛋白質の正確な配列決定の目的は、それらの組換え生産物を可能とすることにある。さらに、ラットとヒト蛋白質間の大いなる配列の相同性もまた、ヒト機能蛋白質に類似物の生産物について重要な情報となるであろう。上記したECLから誘導された体細胞株及び、また誘導された機能性蛋白質を含むものの治療的使用は、器官置換、遺伝子治療そして中枢神経系、肝臓、心臓部位における代謝疾患の治療の為の組織工学の全レベルにおいて将来の臨床的使用の指標となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】DA宿主心臓におけるOx-3+細胞（APAAP染色）を示す図である。
【図２】ラットモデルにおける異所心臓移植後の生存曲線（カプラン・メイアーによる）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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