(57)【要約】本発明は、ＣＤ１４陽性であり、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約１５００未満のメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約５００未満のメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現する、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞に関するものである。
2004535819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１４陽性であり、
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約１５００未満のメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約５００未満のメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現する、
不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞。
【請求項２】
１０6細胞/mlについてＥｌｉｓａアッセイにより決定されるように、約３０００pg/ml未満のＩＬ−１２ｐ７０及び約５００pg/ml未満のＩＬ−１０を分泌する、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項３】
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約７００未満のメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約３００未満のメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現し、
１０6細胞/mlについてＥｌｉｓａアッセイにより決定されるように、約８０pg/ml未満のＩＬ−１２ｐ７０及び約３００pg/ml未満のＩＬ−１０を分泌する、請求項１又は２に記載の樹状細胞。
【請求項４】
ＣＤ８３陰性である、請求項１〜３のいずれか一項記載の樹状細胞。
【請求項５】
以下の特徴：
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるような、
約３〜約２０のメディアン蛍光強度のＣＤ８３発現、
約２０〜約１００のメディアン蛍光強度のＣＤ１４発現、
約４００〜約７００のメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ発現、
約１００〜約３００のメディアン蛍光強度のＣＤ８６発現：及び
計１０6細胞/mlについてＥＬＩＳＡアッセイにより決定されるような、
１〜約８０pg/mlのＩＬ−１２ｐ７０分泌、
約１５〜約３００pg/mlのＩＬ−１０分泌、
を示す、請求項３又は４に記載の樹状細胞。
【請求項６】
１〜１６時間、好ましくは６時間培養された血中単球由来の未熟樹状細胞より生ずる、請求項１〜５のいずれか一項記載の樹状細胞。
【請求項７】
成熟過程を阻止され、この阻止の後、適切な条件下で生育させられた場合に成熟を再開することができるという特性を有する、請求項１〜６のいずれか一項記載の樹状細胞。
【請求項８】
十分な培養時間で、成熟因子及びサイトカインを含有しない培養培地中でin vitroで成熟化するという特性を有する、請求項１〜７のいずれか一項記載の樹状細胞。
【請求項９】
患者への注射の後、in vivoで成熟化するという特性を有する、請求項１〜７のいずれか一項記載の樹状細胞。
【請求項１０】
薬物、核酸又は目的の抗原、例えば腫瘍抗原が負荷された、請求項１〜９のいずれか一項記載の樹状細胞。
【請求項１１】
腫瘍細胞、特に黒色腫腫瘍細胞系の溶解物が負荷された、請求項１０に記載の樹状細胞。
【請求項１２】
ＴヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の発生を促進し、ある抗原と貪食樹状細胞との事前の接触の後、該抗原に特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球を活性化する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の樹状細胞。
【請求項１３】
適切な凍結保存培地中で凍結形態にある、請求項１〜１２のいずれか一項記載の樹状細胞の組成物。
【請求項１４】
ＣＤ１４陽性であり、
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約１５００を下回るメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約５００を下回るメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現する、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を得るための方法であって、
血中単球由来の未熟樹状細胞を、２つの因子：
ａ  −  サイトカイン又はサイトカインのアゴニスト又はサイトカイン誘導因子、並びに
ｂ  −  細菌の膜画分及び／もしくはリボソーム画分の混合物、又はサイトカインとは異なるリガンドもしくはアゴニスト、
の組み合わせと接触させ、１〜１６時間、好ましくは６時間、それらをインキュベートするステップを含む方法。
【請求項１５】
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約７００を下回るメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約３００を下回るメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現し、
１０6細胞/mlについてＥｌｉｓａアッセイにより決定されるように、約８０pg/ml未満のＩＬ−１２ｐ７０及び約３００pg/ml未満のＩＬ−１０を分泌する、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を得るための、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
得られる樹状細胞がＣＤ８３陰性である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
サイトカインがＩＦＮγであるか、又はサイトカイン誘導因子がポリＩ：Ｃである、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
細菌の膜画分及び／又はリボソーム画分の混合物が、一つの株の細菌の膜亜画分である、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
膜亜画分が、該膜亜画分から得られた精製されたタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細菌の膜画分及び／又はリボソーム画分の混合物がリボムニル（登録商標）であり、膜亜画分がＦＭＫｐ（クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）膜画分）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
サイトカインがＩＦＮγであり、かつ膜亜画分がＦＭＫｐである、請求項１４〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
ＩＦＮγの使用濃度が約５００U/mlであり、かつＦＭＫｐの使用濃度が約１μg/mlである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リガンドが抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ４０リガンドである、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
リガンドが誘導性熱ショックタンパク質７０又はそれに由来する単離されたポリペプチド配列である、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
請求項１４〜２４のいずれか一項記載の方法により得られるような、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞。
【請求項２６】
ＩＬ−１０の分泌より高度のＩＬ−１２ｐ７０の分泌を有する、成熟樹状細胞。
【請求項２７】
少なくとも２４時間に（１０6細胞/mlについてＥｌｉｓａアッセイにより決定されるように）約１０００pg/ml超のＩＬ−１２ｐ７０、及び約１００pg/ml未満のＩＬ−１０を分泌し、かつＴｈ１免疫応答及び細胞傷害性免疫応答を刺激する、成熟樹状細胞。
【請求項２８】
請求項１〜１２又は請求項２５のいずれか一項記載の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞から成熟樹状細胞を調製する方法であって、
in vitro又はin vivoで、外因性の成熟因子及びサイトカインを添加せずに、該不可逆的に誘発された樹状細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法により得られるような、成熟樹状細胞。
【請求項３０】
薬学的に許容されうる媒体と共に、内在化抗原、好ましくはワクチン抗原を有する、請求項１〜１２又は請求項２５のいずれか一項記載の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有する医薬組成物。
【請求項３１】
１ワクチン用量当たり約１０4〜約１０9、好ましくは約１０5〜約１０7の量で、請求項１〜１２又は請求項２５のいずれか一項記載の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有する細胞ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の単離された樹状細胞、それらを調製する方法、及び医薬組成物におけるそれらの使用に関するものである。
【０００２】
樹状細胞とは、特異的な外因性抗原に対する一次免疫応答及び二次免疫応答の両方を刺激することができる最も強力な抗原提示細胞と定義される（Hart "Dendritic cells:unique leucocyte populations which control the primary immune response" Blood, 1997, vol.90, p3245）。in vivoでは、末梢で抗原を捕捉した未熟樹状細胞は、リンパ管を通ってリンパ系器官のＴ細胞領域へと遊走し、そこで、ＭＨＣ分子との関係においてこれらの抗原に由来するエピトープを提示し、抗原特異的ナイーブＴ細胞の活性化及び増殖を可能にする。
【０００３】
樹状細胞は、異なる組織源、又は血中もしくは骨髄に存在する前駆細胞より得ることができる。未熟樹状細胞は、定義された培養条件を使用して単球を分化させることにより血球より得ることができる。一例として、単球に由来する樹状細胞は、特許出願ＷＯ９４／２６８７５、ＷＯ９６／２２７８１又はＷＯ９７／４４４４１に従い調製され得る。未熟樹状細胞は、Boyerら（Exp. Hematol. 1999, vol. 27, pp751-761）又はBanchereauら（Annu. Rev.Immunol., 2000, 18:767-911）によっても調製され得る。
【０００４】
例えばＩＬ−１３の存在下で、血中単球から分化した後、樹状細胞は未熟表現型を示し、特に、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分泌しない（又は極微量にしか分泌しない）。
【０００５】
未熟樹状細胞はin vitroで自然には成熟しない。成熟剤が存在しない場合、それらは、死滅するか又はマクロファージ型細胞へと復帰する。
【０００６】
in vivoでは、樹状細胞は、遊走の間に、形態学及び表現型の変化をもたらす成熟化過程を経る。成熟化は、樹状細胞の抗原捕捉能の低下及び抗原提示能の上昇を誘導する。サイトカインの産生は、樹状細胞成熟の際に獲得される特性である。成熟した樹状細胞は、生物活性型のＩＬ−１２（ＩＬ−１２ｐ７０）及びＩＬ−１０のような免疫刺激性サイトカインを分泌することができる。ＩＬ−１２は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞傷害性応答へと免疫系を偏向させことができ、ＩＬ−１０は、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）応答を誘導する。
【０００７】
Ｔｈ１型応答は、抗原特異的Ｔリンパ球ＣＤ８＋の刺激を含む免疫応答と考えられており、Ｔｈ２型免疫応答は、むしろ、抗体応答の刺激を含み、おそらくは抗原に対する細胞傷害性リンパ球の非応答性を含む。
【０００８】
Ｔヘルパー１  ＣＤ４  Ｔ細胞は細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞応答を支援し、Ｔヘルパー２は抗体産生のためのＢ細胞を支援するであろう。二つの応答型の間には、包括的な平衡が存在する。ＩＬ−４、ＩＬ−５又はＩＬ−１０のようなＴｈ２サイトカインは、Ｔｈ１応答を妨害し、アナジー及びその他の様々な免疫抑制効果を引き起こし得る。一般に、癌又は感染性疾患において、最も有効な応答は、液性応答（抗体）ではなく、細胞傷害性応答（腫瘍細胞又は感染細胞を死滅させるＣＤ８  Ｔ細胞）であると信じられている。
【０００９】
癌及び感染性疾患の処置のための自己抗原負荷樹状細胞の使用は、安全で、忍容性が良好で、潜在的に有効な細胞療法であると考えられるため、現在、関心が高まりつつある。樹状細胞は、成熟の段階及び分泌されるサイトカインのパターンに依っては、Ｔ細胞応答の強力なモジュレーターであることが認識されている。
【００１０】
最近、ex vivoで大量の樹状細胞を調製する可能性が開発されて以来、免疫療法における、そして細胞ワクチンとしてのこれらの細胞の使用には、ますます関心が集まってきている。
【００１１】
本発明の目的の一つは、Ｔｈ１免疫応答にとって好都合な新規の樹状細胞を作製することである。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、容易に、かつ迅速に得ることができる新規の単離された樹状細胞を得ることである。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、最適な活性を保持しつつ、使用まで保存し、適切なタイミングで患者へ注射することができる新規の樹状細胞を提供することである。
【００１４】
本発明は、以下の特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞に関する。
−  ＣＤ１４陽性である。
−  免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように、約１５００未満のメディアン蛍光強度（median fluorescence intensity）のＭＨＣクラスＩ、及び約５００未満のメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現する。
【００１５】
「成熟化」という用語は、細胞の表現型及び機能の修飾をもたらす、未熟な高度に貪食性の樹状細胞の活性化と定義される。特に、細胞は、高レベルのサイトカインを産生するという特性を獲得し、貪食能を喪失する。
【００１６】
「不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞」という用語は、低いサイトカインの分泌及びＣＤ１４の発現のような未熟の特徴を有するが、任意の細胞培養培地中で成熟するであろう細胞と定義される。
【００１７】
「メディアン蛍光強度」という用語は、細胞試料中の各蛍光色素についての相対蛍光強度と定義される。検出のため使用されるモノクローナル抗体が、蛍光色素と直接カップリングされる（Boyerら、Exp. Hematol., 27, 751-761,1999）。
【００１８】
フローサイトメーターは、これらのパラメーターの相対差を検出するためのものであり、単位測定に関する絶対的なデータは提供しない。Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Computer Based Training、Volume I "Flow Cytometry and Immunology Basics"からのＦＡＣＳ（商標）Ａｃａｄｅｍｙによると：「フローサイトメーターは、粒子に関連したサイズ、相対粒度及び蛍光の差が存在すれば、それらを検出する。［．．．］レーザー光のビームが、セルを横切って投射される。同時に、レーザー光が粒子に当たり、粒子中又は粒子上に存在するあらゆる蛍光が蛍光を発するであろう。一度励起されると、放射される蛍光シグナルの強度は、粒子中の蛍光化合物の量に比例するはずである。」
【００１９】
本発明の誘発された樹状細胞は、ＣＤ１４陽性であり、約１５００未満のメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約５００未満のメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現する（これらの特性は、全て、未熟の特徴に相当する）。
【００２０】
本発明の樹状細胞は、未熟樹状細胞のように、低レベルのＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０を分泌する。本発明の特定の態様によると、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、１０6細胞/mlについてＥｌｉｓａアッセイにより決定されるように、約３０００pg/ml未満のＩＬ−１２ｐ７０及び５００pg/ml未満のＩＬ−１０を分泌する。
【００２１】
本発明のより具体的な態様によると、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、以下の特徴を示す。
−  ＣＤ１４陽性である。
−  （免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように）約７００未満のメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約３００未満のメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現する。
−  （１０6細胞/mlについてＥｌｉｓａアッセイにより決定されるように）約８０pg/ml未満のＩＬ−１２ｐ７０及び約３００pg/ml未満のＩＬ−１０を分泌する。
【００２２】
具体的な態様によると、本発明の不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、ＣＤ８３陰性である。この発現の欠如は、未熟表現型の特徴である。
【００２３】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、以下の特徴を示す。
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるような、
−  約３〜２０のメディアン蛍光強度のＣＤ８３発現
−  約２０〜１００のメディアン蛍光強度のＣＤ１４発現
−  約４００〜７００のメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ発現
−  約１００〜３００のメディアン蛍光強度のＣＤ８６発現：及び
計１０6細胞/mlについてＥＬＩＳＡアッセイにより決定されるような、
−  １〜約８０pg/mlのＩＬ−１２ｐ７０分泌
−  約１５〜３００pg/mlのＩＬ−１０分泌。
【００２４】
不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、成熟表現型及び未熟表現型の両方の特徴を示す。
【００２５】
ＣＤ８３の発現範囲、ＣＤ１４の欠如、及びＩＬ−１２の高度の分泌は、成熟表現型の特徴である。
【００２６】
ＣＤ１４の発現範囲及びＣＤ８３の欠如は、未熟表現型の特徴である（概説については、Banchereauら、2000, Ann. Rev. Immunol.を参照のこと）。
【００２７】
本発明の樹状細胞は、１〜１６時間、好ましくは６時間培養された血中単球由来の未熟樹状細胞より生ずる。
【００２８】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、成熟過程を阻止することができ、この阻止の後、適切な条件下で生育させられた場合に成熟を再開させることができるという特性を有する。
【００２９】
例えば癌の処置のため、該樹状細胞を患者へ注射することができるため、この特性は極めて興味深い。特に、患者から採取された自己細胞を成熟因子により処理して本発明の樹状細胞を得て、それらを注射まで保存することが可能である。それらは、患者の組織において完全に成熟する。
【００３０】
本発明のもう一つの態様によると、該樹状細胞は、十分な培養時間で、成熟因子及びサイトカインを含有しない培養培地中でin vitroで成熟化するという特性を有する。
【００３１】
「成熟因子及びサイトカインを含有しない」という表現は、培養培地が、ＩＦＮγ、ポリＩ：Ｃ、ＣＤ４０リガンド又はＣＤ４０抗体、多糖、ＴＮＦα、ＦＬＡＴ３リガンド等のような、一般に使用されている成熟因子及びサイトカインを欠いていてもよいことを意味する。
【００３２】
「十分な培養時間」という表現は、該細胞が成熟樹状細胞の特徴を獲得するのに十分な時間、実際には１６〜４０時間を意味する。一般的に述べると、それは、これらの細胞が、低下した抗原捕捉能及び増加した抗原提示能を示すことを意味する。特に、成熟した細胞は、約１０００pg/ml超のＩＬ−１２ｐ７０を分泌し、Ｔｈ１免疫応答を誘導する能力を獲得している。
【００３３】
本発明のもう一つの態様によると、該樹状細胞は、患者への注射の後、in vivoで成熟化するという特性を有する。
【００３４】
患者へin vivo注射された場合、該樹状細胞は、成熟を完了し、有効な特異的Ｔ細胞の刺激に必要なサイトカインを産生するであろう。患者の血清は、該細胞の成熟に適切な培地である。注射後、樹状細胞は、活性化の進行をたどりながら、Ｔ細胞エリアへ遊走する。本発明の目的は、実務者が、細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答の誘導のために最適に有効な樹状細胞を注射することを可能にする。
【００３５】
本発明は、薬物、核酸又は目的の抗原、例えば腫瘍抗原が負荷された樹状細胞にも関する。本発明の樹状細胞は、腫瘍細胞、特に黒色腫腫瘍細胞系の溶解物を負荷させることができる（実施例９参照）。
【００３６】
細胞は、当業者に既知の方法に従い、貧食作用、飲作用、親和性結合、融合、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）による導入又は受容体媒介取り込みにより、抗原を負荷させてもよい。
【００３７】
もう一つの態様によると、本発明の樹状細胞は、ＴヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の発生を促進し、ある抗原と貪食樹状細胞との事前の接触の後、該抗原に特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球を活性化する。
【００３８】
細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化は、これらの細胞によるＩＦＮγの分泌を誘導する。従って、Ｔｈ１応答の誘導は、ＩＦＮγ放出に関するＥｌｉｓｐｏｔアッセイにより追跡することができる。
【００３９】
機能的には、これらの樹状細胞は、未熟樹状細胞がＣＤ８  Ｔ細胞応答を生成させ持続させることができない条件である、ＣＤ４の支援の非存在下、そして付加的な外因性サイトカインが存在しない場合ですら、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞をin vitroで生成させる力が極めて強い（実施例５及び６参照）。
【００４０】
本発明は、適切な凍結保存培地中の凍結形態の、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の組成物にも関する。
【００４１】
適切な培地は、例えば１０％自己血清＋１０％ジメチルスルホキシドを含むリン酸緩衝食塩水から構成される（実施例９参照）。
【００４２】
本発明の細胞は、使用まで−８０℃未満の温度で凍結状態で維持することができ、このことは、産業上の有利な効果である。
【００４３】
本発明は、血中単球由来の未熟樹状細胞を、２個の因子：
ａ  −  サイトカイン又はサイトカインのアゴニスト又はサイトカイン誘導因子、並びに
ｂ  −  細菌の膜画分及び／もしくはリボソーム画分の混合物、又はサイトカインとは異なるリガンドもしくはアゴニスト、
の組み合わせと接触させ、１〜１６時間、好ましくは６時間、それらをインキュベートするステップを含む、ＣＤ１４陽性であり、（免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように）約１５００を下回るメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約５００を下回るメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現するという特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を得るための方法にも関する。
【００４４】
本発明の具体的な態様において、記載されたような方法によって、ＣＤ１４陽性であり、（免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー分析により決定されるように）約７００を下回るメディアン蛍光強度のＭＨＣクラスＩ、及び約３００を下回るメディアン蛍光強度のＣＤ８６を発現し、（１０6細胞/mlについてＥｌｉｓａアッセイにより決定されるように）約８０pg/ml未満のＩＬ−１２ｐ７０及び約３００pg/ml未満のＩＬ−１０を分泌するという特徴を示す、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞が得られる。
【００４５】
２個の因子の組み合わせは、好ましくは、ＩＦＮγのようなサイトカイン及び細菌膜画分より構成される。
【００４６】
カイネティクス研究によって、本発明者らは、未熟樹状細胞の成熟剤との短期in vitro接触が、成熟過程を誘発するのに十分であり、次いで、成熟剤の除去後、成熟化過程が自然に進行し、完全に成熟化を完了することを証明した。実施例６に示されるように、６時間のインキュベーションが、所定の抗原に特異的なＣＤ８細胞を生成させ得る樹状細胞を産生するための最適な時間である。実施例４及び８に示されるように、成熟剤との短時間インキュベーションは、高レベルのＩＬ−１０分泌を誘導するのに十分ではない。
【００４７】
１６時間のインキュベーションの後、得られる細胞は、成熟の特徴を示し、従って不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の定義を満たさない。
【００４８】
「細菌膜」という用語は、内側の細胞質膜と定義され、それには膜間空間が含まれ、外側の膜は除外される。膜の概略図は、"Drugs, 1997, Adis international limited"の３４頁の図２に示されている。
【００４９】
「膜抽出物」という用語は、同一膜画分に富んだ細菌抽出物と定義される。膜抽出物又は膜画分とは、細菌培養物から精製又は部分精製された、これらの膜を含有するあらゆる抽出物又は画分に相当する。そのような抽出物の調製の方法は、培養後に得られた細菌の溶解のステップ、及び具体的には遠心分離又はろ過による、細菌膜含有画分の分離のステップを少なくとも含む。
【００５０】
「リボソーム抽出物」という用語は、リボソーム画分、具体的には一本鎖及び／又は二本鎖のリボ核酸を含有する細菌抽出物と定義される。リボソーム抽出物又はリボソーム画分とは、細菌培養物から精製又は部分精製された、リボソームを含有するあらゆる抽出物に相当する。そのような抽出物の調製の方法は、培養後に得られた細菌の溶解のステップ、及び具体的には遠心分離又はろ過による、全溶解物からの細菌リボソーム含有画分の分離のステップを少なくとも含む。
【００５１】
ポリＩＣ、ＣＤ４０のリガンド、抗ＣＤ４０抗体、内毒素、生細菌、リポ多糖、培養上清、ＴＮＦαを含むアゴニスト性サイトカインのカクテルのような、樹状細胞の成熟化のため使用されるいくつかの既知の作用物質が存在する。インターフェロン−γは、樹状細胞の成熟特徴及び刺激性表現型を増大させるよう、成熟剤と相乗的に作用する。
【００５２】
リボムニル（Ribomunyl）（登録商標）（国際的な非登録名又は一般名称：細菌のリボソーム画分及び膜画分、膜プロテオグリカン）は、非特異的な天然の免疫刺激効果があることで知られている。それは、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）に由来するプロテオグリカン（凍結乾燥物の用量中０．０１５mg）、及び４つの異なる細菌株、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）（３５部）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（３０部）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ａ群（３０部）及びヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）（５部）に由来する７０％ＲＮＡを含有するリボソーム画分（凍結乾燥物の用量中０．０１mgのリボソーム抽出物）の両方を含有している。リボムニルは、多形核細胞（ＰＭＮ）及びマクロファージに作用することにより一般的な自然免疫応答を刺激すること、いくつかのサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＣＳＦ）の産生を増加させること、そしてナチュラルキラー細胞を活性化し得ることが示されている。
【００５３】
熱ショックタンパク質７０は、いくつかの単球のための潜在的な成熟因子として同定されている（Kuppnerら、2001）；それは、未熟樹状細胞を成熟化へと誘発するため、ポリＩ：Ｃ又はサイトカインと有効に組み合わせることができる。
【００５４】
本発明は、ＣＤ８３陰性である、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞の調製のための方法にも関する。
【００５５】
本発明の具体的な態様において、本法において使用されるサイトカインはＩＦＮγであってよく、使用されるサイトカイン誘導因子はポリＩ：Ｃであってもよい。
【００５６】
ポリＩ：ＣはＩＦＮγの分泌を誘導する。
【００５７】
本発明の具体的な態様において、使用される細菌の膜画分及び／又はリボソーム画分の混合物は、一つの細菌株の膜亜画分である。もう一つの態様において、膜亜画分は、該膜亜画分から得られた精製されたタンパク質であり得る。
【００５８】
本発明の具体的な態様において、使用される細菌の膜画分及び／もしくはリボソーム画分の混合物は、リボムニル（登録商標）（Inava Laboratory, Pierre Fabre）である。
【００５９】
リボムニルとＩＦＮγとの組み合わせは、リボムニル単独の使用より樹状細胞によるＩＬ−１２分泌を誘導する効果がより高い（実施例３参照）。
【００６０】
本発明の具体的な態様において、使用される膜亜画分は、ＦＭＫｐ（クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）膜画分）である。本発明の方法におけるリボムニルまでのＦＭＫｐの使用は、得られる樹状細胞によるサイトカインのより顕著な分泌をもたらす（実施例１Ｃ、３Ａ及び３Ｂの結果を、実施例７Ｃと比較すること）。
【００６１】
特に、方法において使用されるサイトカインはＩＦＮγであり、膜亜画分はＦＭＫｐである。好ましくは、ＩＦＮγの濃度は約５００U/mlであり、ＦＭＫｐの使用濃度は約１μg/mlである。
【００６２】
本発明の特定の態様において、使用されるリガンドは、抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ４０リガンドである。
【００６３】
本発明の具体的な態様において、使用されるリガンドは、誘導性熱ショックタンパク質７０又はそれに由来する単離されたポリペプチド配列である。
【００６４】
本発明は、本願に記載された方法に従って得られる、不可逆的に誘発された樹状細胞にも関する。本発明は、ＩＬ−１０の分泌より高度のＩＬ−１２ｐ７０の分泌を有する、即ち、ＩＬ−１２ｐ７０／ＩＬ−１０分泌比が１を上回っている成熟樹状細胞にも関する。特に、本発明は、少なくとも２４時間に（１０6細胞/mlについてＥｌｉｓａアッセイにより決定されるように）約１０００pg/ml超のＩＬ−１２ｐ７０、及び約１００pg/ml未満のＩＬ−１０を分泌し、かつＴｈ１免疫応答及び細胞傷害性免疫応答を刺激する成熟樹状細胞に関する。
【００６５】
関連した表現型の修飾は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の細胞表面発現の増加、並びにＣＤ１４の表面発現の減少である。機能的な変化は、貪食特性の喪失、遊走能の獲得、並びにサイトカイン及びケモカインの発現プロファイルの変化、特に増加したＩＬ−１２分泌である。
【００６６】
本発明は、in vitro又はin vivoで、外因性の成熟因子又はサイトカインを添加せずに、該不可逆的に誘発された樹状細胞を培養するステップを含む、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞から成熟樹状細胞を調製するための方法にも関する。
【００６７】
本発明は、本法により得られるような、前記定義の成熟樹状細胞にも関する。
【００６８】
本発明は、薬学的に許容される媒体と共に、内在化された抗原、好ましくはワクチン抗原を有する不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有している医薬組成物にも関する。
【００６９】
「ワクチン抗原」という用語は、免疫応答を誘導する抗原と定義される。
【００７０】
本発明に係る樹状細胞は、正確なＴ細胞亜集団に対して作用することができる。これは、本発明に係る樹状細胞が、Ｔｈ２／Ｔｈ１免疫応答を刺激又は調節し得ることを意味する。従来技術において記載された樹状細胞は、in vivoで抗原特異的なＴ細胞の増殖を誘導し、従って抗原特異的な細胞傷害性の増加及び免疫刺激をもたらすのみならず、in vivoで調節Ｔ細胞を誘導し、従って抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の阻害を誘導し、特異的抗原に対する非応答性をもたらすこともできる。
【００７１】
本発明の樹状細胞は、主としてＴｈ１免疫応答を介した強い免疫刺激特性のみを保有しており、臨床的なワクチン使用に適している。
【００７２】
誘導される免疫応答は、所定の病原体又は腫瘍の減少又は排除をもたらす、それらに対するin vivoの臨床的な免疫応答を特徴とし得る。in vitroでは、これは、樹状細胞の場合、抗原特異的なＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球の免疫刺激アッセイにおいて測定され得る。
【００７３】
本発明は、１ワクチン用量当たり約１０4〜１０9、好ましくは約１０5〜１０7の量で、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞を活性物質として含有している細胞ワクチン組成物にも関する。
【００７４】
「細胞ワクチン組成物」という用語は、ワクチン抗原のプロセシングを行い、それらを提示している樹状細胞と定義される。
【００７５】
使用された略語：
抗ＣＤ４０ｍＡｂ＝ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体
ＤＣ＝樹状細胞
ＦＭＫｐ＝クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）膜画分
ＨＬＡ−ＡＢＣ＝組織適合性クラスＩ分子
ｉＤＣ＝未熟樹状細胞
ＩＦＮγ＝インターフェロンガンマ
Ｉｓｏｔ  Ｃｔｒ＝アイソタイプコントロール
ＩＶＳ＝in vitro刺激
ＭＦＩ＝メディアン蛍光強度
ポリＩ：Ｃ＝ポリリボイノシン酸ポリリボシチジル酸
ＲＢＬ＝リボムニル（登録商標）
【００７６】
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ：
リボムニル（登録商標）及びＩＦＮγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【００７７】
未熟樹状細胞を、リボムニル（ＲＢＬ）＋ＩＦＮγと共に６時間インキュベートし、洗浄し、さらに３４時間培養した。
【００７８】
白抜き棒グラフは、６時間目の時点での測定を表し（ＲＢＬ＋ＩＦＮγによる６時間の誘発の後）、黒棒グラフは、４０時間目の時点での測定を表す（ＲＢＬ＋ＩＦＮγによる６時間の誘発、及び成熟因子なしの３４時間の培養の後）。
【００７９】
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体及び抗ＣＤ８６抗体で染色し、フローサイトメーターで蛍光を分析した。６時間目及び２４時間目の時点でのマーカーＣＤ１４、ＣＤ８３（１Ａ）、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＣＤ８６（１Ｂ）の発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている（Ｙ軸）。
【００８０】
培養上清中のＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の濃度を、ＥＬＩＳＡにより、６時間目及び４０時間目の時点で測定し（１Ｃ）、pg/ml/１０6細胞の単位で表した（Ｙ軸）。
【００８１】
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ：
ポリＩ：Ｃ及び抗ＣＤ４０抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【００８２】
未熟樹状細胞を、抗ＣＤ４０ｍＡｂ＋ポリＩ：Ｃと共に６時間インキュベートし、洗浄し、さらに３４時間培養した。
【００８３】
白抜き棒グラフは、６時間目の時点での測定を表し（ポリＩ：Ｃ＋抗ＣＤ４０ｍＡｂによる６時間の誘発の後）、黒棒グラフは、４０時間目の時点での測定を表す（ポリＩ：Ｃ＋抗ＣＤ４０ｍＡｂによる６時間の誘発、及び成熟因子なしの３４時間の培養の後）。
【００８４】
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体及び抗ＣＤ８６抗体で染色し、フローサイトメーターで蛍光を分析した。
【００８５】
マーカーＣＤ１４、ＣＤ８３（２Ａ）、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＣＤ８６（２Ｂ）の発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている（Ｙ軸）。
【００８６】
培養上清中のＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の濃度を、ＥＬＩＳＡにより、６時間目及び４０時間目の時点で測定し（２Ｃ）、pg/ml/１０6細胞の単位で表した（Ｙ軸）。
【００８７】
図３Ａ、３Ｂ：
リボムニル単独と、ＩＦＮγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟化効果の比較。
【００８８】
未熟樹状細胞を、ＲＢＬ単独又はＲＢＬ＋ＩＦＮγと共に６時間インキュベートし、洗浄し、さらに３４時間培養した。
【００８９】
白抜き棒グラフは、６時間目の時点での測定を表し（ＲＢＬ＋ＩＦＮγ又はＲＢＬによる６時間の誘発の後）、黒棒グラフは、４０時間目の時点での測定を表す（ＲＢＬ＋ＩＦＮγ又はＲＢＬによる６時間の誘発、及び成熟因子なしの３４時間の培養の後）。
【００９０】
培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０（３Ａ）及びＩＬ−１０（３Ｂ）の量を、ＥＬＩＳＡにより、６時間目及び４０時間目の時点で測定した。サイトカインの濃度は、pg/ml/１０6細胞の単位で表されている（Ｙ軸）。
【００９１】
図４：
ＩＬ−１０の分泌は、ＲＢＬ＋ＩＦＮγの存在下での比較的長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする。
【００９２】
未熟樹状細胞を、
−  ＲＢＬ＋ＩＦＮγと共に６時間インキュベートし、洗浄し、さらに３４時間培養するか、又は
−  ＲＢＬ＋ＩＦＮγと共に４０時間インキュベートした。
−  ＲＢＬ＋ＩＦＮγによる６時間の刺激の後（黒棒グラフ／白点）、
−  ＲＢＬ＋ＩＦＮγによる６時間の刺激を含む、４０時間の培養の後（白抜き棒グラフ／黒点）、
−  ＲＢＬ＋ＩＦＮγによる４０時間の刺激の後（白抜き棒グラフ／黒斜線）、
培養上清中の分泌されたＩＬ−１０の量を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ−１０の濃度は、pg/ml/１０6細胞の単位で表されている（Ｙ軸）。
【００９３】
図５：
ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、外因性サイトカインの非存在下ですら、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を生成させ得る。
【００９４】
未熟樹状細胞を、抗ＣＤ４０ｍＡｂ＋ポリＩ：Ｃ又はＲＢＬ＋ＩＦＮγの存在下で６時間インキュベートした。成熟時間の終了直前に細胞をペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、ＣＤ８  Ｔ細胞を刺激するために使用した。パルス処理樹状細胞によるin vitro刺激の後、ＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出を、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチドでパルス処理されたＴ２細胞を刺激剤として使用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりアッセイした。
【００９５】
異なる記号は、各ドナーを表す。棒グラフは、各条件についての平均値を示す。Ｙ軸は、特異的スポット形成細胞の数を示す。
【００９６】
図６：
ＲＢＬ＋ＩＦＮγとの６時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的エフェクターＣＤ８  Ｔ細胞の生成にとって最適である。
【００９７】
未熟樹状細胞を、成熟化刺激の非存在下（ｉＤＣ）、又はＲＢＬ＋ＩＦＮγの存在下で、３時間、６時間又は１６時間インキュベートした。細胞を成熟化時間の終了直前にペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、ＣＤ８  Ｔ細胞を刺激するために使用した。ペプチドパルス処理樹状細胞による２回の刺激の後、ＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＮＦγ放出を、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチドでパルス処理されたＴ２細胞を刺激剤として使用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりアッセイした。
【００９８】
異なる記号は、各ドナーを表す。棒グラフは、各条件についての平均値を示す。Ｙ軸は、特異的スポット形成細胞の数を示す。
【００９９】
図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ：
ＦＭＫｐ及びＩＮＦγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【０１００】
未熟樹状細胞を６時間ＦＭＫｐ及びＩＦＮγで処理した。細胞を６時間目に洗浄し、直ちに分析するか、又は２４時間目の時点まで成熟因子の非存在下でさらに培養した。
【０１０１】
白抜き棒グラフは、６時間の時点での測定を表し（ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγによる６時間の誘発の後）、黒棒グラフは、２４時間の時点での測定を表す（ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγによる６時間の誘発、並びに成熟因子なしの１８時間の培養の後）。
【０１０２】
成熟化を追跡するため、両方の時点で、樹状細胞をマーカーＣＤ１４及びＣＤ８３（７Ａ）、並びにＨＬＡ−ＡＢＣ及びＣＤ８６（７Ｂ）の発現に関して分析した。マーカーの発現が、メディアン蛍光強度任意の単位として表されている（Ｙ軸）。
【０１０３】
両方の時点で、培養上清中のＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＥＬＩＳＡにより測定し（７Ｃ）、pg/ml/１０6細胞の単位で表した（Ｙ軸）。
【０１０４】
図８：
樹状細胞によるＩＬ−１０分泌は、ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする。
【０１０５】
未熟樹状細胞を、３時間、６時間又は４０時間、ＦＭＫｐ及びＩＦＮγにより処理した。３時間目又は６時間目に刺激された細胞を洗浄し、３時間目又は６時間目の時点で分析するか、又は成熟因子なしの培地中でさらに生育させ、次いで２４時間目の時点でＩＬ−１０分泌を測定した。
【０１０６】
−  ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγによる３時間の刺激の後（白抜き棒グラフ）、
−  ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγによる６時間の刺激の後（白抜き棒グラフ／黒点）、
−  ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγによる３時間の刺激を含む２４時間の培養の後（黒棒グラフ）、
−  ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγによる６時間の刺激を含む２４時間の培養の後（黒棒グラフ／白点）、
−  ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγによる２４時間の刺激の後（白抜き棒グラフ／黒斜線）、
培養上清中の分泌されたＩＬ−１０をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１０７】
ＩＬ−１０の濃度が、pg/ml/１０6細胞の単位で表されている（Ｙ軸）。
【０１０８】
図９：
樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結／解凍ステップは、成熟過程を混乱させない。
【０１０９】
未熟樹状細胞に一夜インキュベーションによりＣｏｌｏ８２９溶解物を負荷させ、次いでＦＭＫｐ及びＩＦＮγにより６時間処理した。洗浄後、細胞を４％アルブミン／ＤＭＳＯ中で凍結させ、次いで解凍させた。
【０１１０】
新鮮に解凍させた細胞を、アルブミン４％に再懸濁させ、１mlシリンジ内で４℃で２時間インキュベートし、シリンジの振とう後に細胞を２５Ｇ針に通し、成熟刺激なしの完全ＡＩＭＶ培地中で１８時間培養した。
【０１１１】
−  Ｃｏｌｏ８２９溶解物の負荷、及びＦＭＫｐ＋ＩＦＮγとの６時間のインキュベーションの後（白抜き棒グラフ）、
−  Ｃｏｌｏ８２９溶解物の負荷、ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγとの６時間のインキュベーション、凍結、解凍、及びＡＩＭＶ培地中での１８時間の培養の後（黒棒グラフ）、
ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の分泌をＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０１１２】
培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の濃度が、pg/ml/１０6細胞の単位で表されている（Ｙ軸）。
【０１１３】
実施例：
使用された略語：
抗ＣＤ４０ｍＡｂ＝ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体
ＤＣ＝樹状細胞
ＦＭＫｐ＝クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）膜画分
ＨＬＡ−ＡＢＣ＝組織適合性クラスＩ分子
ＩＤＣ＝未熟樹状細胞
ＩＦＮγ＝インターフェロンガンマ
ＩＶＳ＝in vitro刺激
ＭＦＩ＝メディアン蛍光強度
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ポリＩ：Ｃ＝ポリリボイノシン酸ポリリボシチジン酸
ＲＢＬ＝リボムニル（登録商標）
【０１１４】
実施例１：リボムニル（登録商標）及びＩＦＮγにより誘発された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
樹状細胞：
未熟樹状細胞を、特許出願ＷＯ９７／４４４４１、及びBoyerら（Exp. Hematolo., 1999, 27, 751-761）に従って、末梢血単球の培養により調製し、水簸（elutriated）した。簡単に説明すると、５００U/ml  ＧＭ−ＣＳＦ（Leucomax, Novartis Pharma）及び５０ｎg/ml  ＩＬ−１３（Sanofi Synthelabo）が補足されたＡＩＭＶ培地（＝完全ＡＩＭＶ培地）中で樹状細胞を分化させ、７日間の培養後に水簸した。
【０１１５】
成熟化：
樹状細胞を、リボムニル（１ug/ml）及びＩＦＮγ（５００U/ml）の存在下で６時間、完全ＡＩＭＶ培地（Life Technologies, Paisley PA49RF, GB）中で培養した。凍結乾燥リボムニル（登録商標）（Inava Laboratory, Pierre Fabre, Paris, France）の各バイアルは、Ｋ．ニューモニエ（pneumoniae）、Ｓ．ニューモニエ（pneumoniae）、Ｓ．ピオゲネス（pyogenes）及びＨ．インフルエンザ（influenzae）に由来するリボソーム画分０．０１０mg及びＫ．ニューモニエ（pneumoniae）に由来する膜画分０．０１５mgを含有している。ＩＦＮγ（Imukin）は、ベーリンガーインゲルハイムフランス（Boehringer Ingelheim France）より入手した。６時間目に細胞を洗浄し、４０時間目の時点まで（成熟因子の非存在下で）完全ＡＩＭＶ培地中でさらに培養した。
【０１１６】
表現型分析：
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、６時間及び４０時間の時点で、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＡＢＣマーカーの発現に関して分析した。樹状細胞を、１％ウシ胎仔血清が補充されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた。細胞を、以下のＦＩＴＣ又はＰＥとコンジュゲートした特異的モノクローナル抗体又はアイソタイプマッチコントロール：抗ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ２ａ（Immunotech, Marseille, France）、抗ＣＤ１４（Becton Dickinson, St Jose, CA）と共に、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、３nMのＴＯ−ＰＲＯ３を含有するＰＢＳに再懸濁させ、分析から死細胞を排除した。
【０１１７】
フローサイトメトリー分析は、CellQuestソフトウェアと共にBecton Dickinsonサイトメーターを用いて実施した。結果は、メディアン蛍光強度（ＭＦＩ）値（任意の単位）として表される。
【０１１８】
サイトカイン検出：
６時間及び４０時間の時点で、製造業者の指示に従いＲ＆Ｄ  Systems Europe（Abingdon, UK）の抗体対を使用して実施された市販のＥＬＩＳＡにより、培養上清を、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の分泌に関してＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０１１９】
結果：
結果は、図１Ａ（ＣＤ１４及びＣＤ８３の発現）；１Ｂ（ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＣＤ８６の発現）；１Ｃ（サイトカイン分泌）に示される。ＦＡＣＳ分析に関するネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）が示される。
【０１２０】
成熟因子との６時間のインキュベーションの後、樹状細胞は、未熟細胞の特徴を示す：細胞は、ＣＤ１４を発現するが、ＣＤ８３は極少量しか発現しない。ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＣＤ８６は有意にアップレギュレートされない。ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０の分泌は極めて低い。
【０１２１】
洗浄及び４０時間目までのさらなる培養の後、細胞は成熟細胞の特徴を示す：それらは、ＣＤ１４陰性であり、蛍光強度４９のＣＤ８３（約９５％陽性細胞）、蛍光強度３４６０のＨＬＡ−ＡＢＣ、及び蛍光強度１６４０のＣＤ８６を発現する。ＩＬ−１２ｐ７０分泌は劇的に増加するが、ＩＬ−１０分泌は低いままである。
【０１２２】
結論として、樹状細胞は、ＲＢＬ＋ＩＦＮγとの６時間のインキュベーションの間に成熟化へと誘発された後、成熟因子の非存在下での培養中に成熟化する。
【０１２３】
実施例２：ポリＩ：Ｃ及び抗ＣＤ４０抗体により誘発化された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
実施例１に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【０１２４】
樹状細胞を、抗ＣＤ４０抗体（２μg/ml）及びポリＩ：Ｃ（１００μg/ml）の存在下で完全ＡＩＭＶ培地中で６時間インキュベートし、次いで洗浄し、さらに３４時間培養した。
【０１２５】
表現型及びサイトカイン分泌を、実施例１に記載されたようにして分析した。
【０１２６】
結果：
結果は、図２Ａ（ＣＤ１４及びＣＤ８３の発現）；２Ｂ（ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＣＤ８６の発現）；２Ｃ（サイトカイン分泌）に示される。ＦＡＣＳ分析に関するネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）が示される。
【０１２７】
組み合わせＲＢＬ＋ＩＦＮγについて示されたのと同様に、抗ＣＤ４０ｍＡｂ及びポリＩ：Ｃとの６時間のインキュベーションは、樹状細胞成熟化を誘発するのに十分であった。６時間目の時点で、細胞は未熟特徴を示すが、洗浄及び成熟因子なしでの３４時間の培養の後、樹状細胞は、高レベルのＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、ＩＬ−１２ｐ７０（８５pg/ml）を分泌するが、ＩＬ−１０は少量（２０pg/ml）しか分泌しない。
【０１２８】
実施例３：樹状細胞によるサイトカイン分泌に対するリボムニル単独と、ＩＦＮγと併用されたリボムニルの成熟化効果の比較
未熟樹状細胞を、（実施例１に記載されたような）ＲＢＬ＋ＩＦＮγ、又はＲＢＬ単独（１μg/ml）により６時間処理した。以前に記載されたようにして、６時間目及び４０時間目の時点でサイトカイン分泌をアッセイした。
【０１２９】
結果：
結果は、図３Ａ（ＩＬ−１２ｐ７０分泌）；３Ｂ（ＩＬ−１０分泌）に示される。
【０１３０】
０〜６時間目（白抜き棒グラフ）には、顕著なＩＬ−１２分泌は誘導されなかった。ＩＬ−１０分泌は、低いままである（未熟ＤＣは、通常少量のＩＬ−１０を分泌する）。成熟因子及びサイトカインを含まないさらなる３４時間の培養の間、ＲＢＬ単独と共にインキュベートされた未熟樹状細胞は、ＩＬ−１２ｐ７０（４００pg/ml/１０6細胞）及びＩＬ−１０（１４０pg/ml）を分泌し、樹状細胞を成熟化へと誘発するために使用されたＲＢＬとＩＦＮγとの組み合わせは、より高いＩＬ−１２ｐ７０（１５００pg/ml/１０6細胞）の分泌及び低下したＩＬ−１０分泌（３１pg/ml）をもたらす。２個の因子の組み合わせは、ＩＬ−１２ｐ７０分泌とＩＬ−１０分泌との間の高い比率を示す樹状細胞を得ることを可能にする。
【０１３１】
実施例４：ＩＬ−１０の分泌は、ＲＢＬ＋ＩＦＮγの存在下でのより長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする
未熟樹状細胞をＲＢＬ＋ＩＦＮγにより６時間処理し、次いで洗浄し、成熟因子及びサイトカインなしで３４時間さらに培養するか、又は同じ成熟因子により４０時間処理した。サイトカイン分泌を、ＥＬＩＳＡにより６時間目及び４０時間目にアッセイした。
【０１３２】
結果：
結果は、図４に示される；６時間の処理の後には、わずか２０pg/mlのＩＬ−１０が分泌され、洗浄後の３４時間の間にわずか３１pg/mlが分泌されたが、４０時間の間中、成熟刺激の存在下で細胞をインキュベートした場合には、１１５０pg/mlが分泌され得た。従って、本発明者らは、成熟刺激の存在下での長いインキュベーション時間は、より高いＩＬ−１０分泌をもたらすであろうとの結論を得た。樹状細胞の短時間のインキュベーションは、成熟化現象中の限定されたＩＬ−１０分泌をもたらす。この成熟の方法は、主としてＩＬ−１２を分泌する成熟樹状細胞を入手することを可能にする。
【０１３３】
実施例５：ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるようにＩＦＮγを放出するよう抗原特異的Ｔ細胞を刺激する
実施例１に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【０１３４】
樹状細胞を、ＲＢＬ＋ＩＦＮγ又は抗ＣＤ４０ｍＡｂ＋ポリＩ：Ｃの存在下で完全ＡＩＭＶ培地中で６時間生育させるか、又はそうしなかった。成熟化時間の終了前に細胞をペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、ＣＤ８  Ｔ細胞を刺激するために使用した。
【０１３５】
Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＴＬの生成
樹状細胞を、３７℃で、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド（１０μg/ml）及びβ２ミクログロブリン（５μg/ml）で２時間パルス処理し、パルス処理の最後の３０分間にマイトマイシンＣ（２５μg/ml）で処理し、３回洗浄した。精製された自己ＣＤ８  Ｔ細胞（１．５×１０5／ウェル）を、外因性サイトカインの非存在下で、完全培地（１０％自己血清、アルギニン、アスパラギン及びグルタミンが補充されたイスコブ（Iscove's）培地）中でマイクロウェル内でペプチドパルス処理ＤＣ（３×１０4／ウェル）と混合した。全ての実験において、各樹状細胞条件について８個のＣＤ８ミクロ培養物を刺激した。
【０１３６】
７日目、前日に解凍させ６時間成熟させた自己樹状細胞を、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチドでパルス処理し、やはり外因性サイトカインの非存在下でＣＤ８  Ｔ細胞を再刺激するために使用した。
【０１３７】
ＩＦＮγ放出に関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＤＣ−ペプチドによる２回のin vitro刺激（ＩＶＳ）により生成したＣＤ８  Ｔ細胞を、予め一次抗ＩＦＮγｍＡｂ（３００  ＣＤ８／ウェル）でコーティングされたニトロセルロース９６穴プレートに添加した。個々のミクロ培養物を、デュプリケートでテストした。Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド（又はコントロールペプチドとしてのＰＳＡ１）でパルス処理されたＨＬＡ−Ａ２  ｐｏｓ．刺激剤（Ｔ２又は自己ＥＢＶ-Ｂ細胞）を５×１０4／ウェルで添加した。ＰＨＡ−Ｌで刺激されたＴ細胞をポジティブコントロールとして使用した。３７℃における２０時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ＩＦＮγに対するビオチン化二次ｍＡｂと共にインキュベートし、Vectastain Eliteキットで染色した。スポット形成細胞をＥＬＩＳＰＯＴリーダーで計数した。標的細胞＋コントロールペプチドで刺激されたＴ細胞からのバックグラウンドは、分析のために差し引かれ、決して重要ではなかった。
【０１３８】
結果：
結果は図５に示され、ＣＤ８  Ｔ細胞３００個に関する「特異的スポット形成細胞」により表される。外因性サイトカインの非存在下では、未熟樹状細胞は、抗原特異的エフェクターＴ細胞を生成させることができない。しかしながら、成熟化へと誘発された樹状細胞は、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を感作することができる。ＲＢＬ＋ＩＦＮｇで誘発された樹状細胞は極めて効率的であるが、ポリＩ：Ｃ＋Ａｂ抗ＣＤ４０で誘発された樹状細胞は、適度の応答を誘導した。
【０１３９】
実施例６：ＲＢＬ＋ＩＦＮγとの６時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるように、最適に抗原特異的Ｔ細胞を刺激する
未熟樹状細胞を、ＲＢＬ＋ＩＦＮγで、異なる時間（０、３、６及び１６時間）処理し、実施例５に記載されたようにしてＭｅｌａｎ−Ａペプチドでパルス処理した。簡単に説明すると、細胞を成熟化時間の終了前にペプチドでパルス処理し、次いで採集し、洗浄し、外因性サイトカインの非存在下でＣＤ８  Ｔ細胞を刺激するために使用した。２回のＩＶＳの後のＣＤ８  Ｔ細胞によるＩＮＦγ放出を、実施例５に記載されたようにして、ＥＬＩＳＰＯＴによりアッセイした。
【０１４０】
結果：
この実験においては、最適な誘発時間を決定する目的で、異なる成熟化刺激とのインキュベーション時間を比較した。結果は図６に示される。ＲＢＬ＋ＩＦＮγの存在下での６時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を生成させる効果が最も高い。しかしながら、３時間又は１６時間誘発されたＤＣも、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【０１４１】
実施例７：ＦＭＫｐ及びＩＮＦγにより誘発された樹状細胞は、ex vivo培養後に完全に成熟化するよう方向付けられている
実施例１に記載されたようにして、未熟樹状細胞を調製した。
【０１４２】
成熟：
未熟樹状細胞を、完全ＡＩＭＶ培地（即ち、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１３が補充されたＡＩＭＶ）中で２×１０6細胞/ml/ウェルでインキュベートした。それらを、６時間、ＦＭＫｐ（１μg/ml、Pierre Fabre Medicament, France）及び５００U/mlのＩＦＮγで処理した。細胞を６時間目に洗浄し、直ちに分析するか、又は２４時間目の時点まで（成熟因子の非存在下で）完全ＡＩＭＶ培地中でさらに培養した。
【０１４３】
表現型分析：
成熟化を追跡するため、樹状細胞を、６時間目及び２４時間目の時点で、ＣＤ８３マーカー、ＣＤ８６マーカー、ＣＤ１４マーカー及びＨＬＡ−ＡＢＣマーカーの発現に関して分析した。細胞を、１％ウシ胎仔血清及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳに再懸濁させた。それらを、以下のモノクローナル抗体：ＨＬＡ−ＡＢＣ−ＦＩＴＣ、ＣＤ８６−ＰＥ、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ及びＣＤ８３−ＦＩＴＣ（Immunotech）で４℃で２０分間染色した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、３nM  ＴＯ−ＰＲＯ−３（Molecular Probes）を含有するＰＢＳに再懸濁させ、死細胞を排除した。取得は、ファックスキャリバー（FACSCalibur）フローサイトメーター（Becton Dickinson）で行った。結果はメディアン蛍光強度（ＭＦＩ）値（任意の単位）として表される。ＦＡＣＳ分析に関するネガティブコントロール（コントロールアイソタイプＰＥ及びＦＩＴＣ）：Ｉｓｏｔ  Ｃｔｒ  ＰＥ及びＦＩＴＣが示される。
【０１４４】
サイトカイン検出：
６時間目及び２４時間目の時点で、培養上清を収集し、−８０℃で保管した。解凍させた後、それらを、製造業者の指示に従いＲ＆Ｄ  Systems Europe（Abingdon, UK）の抗体対を使用して実施された市販のＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０分泌に関してＥＬＩＳＡによりアッセイした。検出下限は、ＩＬ−１２ｐ７０に関しては１６pg/ml、ＩＬ−１０に関しては３１pg/mlであった。
【０１４５】
結果：
結果は、図７Ａ（ＣＤ１４及びＣＤ８３の発現）；７Ｂ（ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＣＤ８６の発現）；７Ｃ（サイトカイン分泌）に示される。ＦＭＫｐ及びＩＦＮγとの６時間のインキュベーションの後（白抜き棒グラフ）、樹状細胞は、以下のような未熟細胞特徴を示す。
−  細胞はＣＤ１４陽性であり、この実施例においてはＣＤ８３陽性である（ＣＤ８３陰性である場合も存在する）。
−  ＨＬＡ−ＡＢＣの発現は１５００未満であり、ＣＤ８６の発現は５００未満である（任意の値）。
−  ＩＬ−１２ｐ７０の分泌は低く、６３５pg/ml/１０6細胞である。この時点で、ＩＬ−１０は検出されない。
【０１４６】
洗浄及び２４時間目までのさらなる培養の後（黒棒グラフ）、細胞は以下のような成熟特徴を示す。
−  ＣＤ１４発現はほぼ抑制され、ＣＤ８３発現はわずかにアップレギュレートされた。
−  １８時間の培養後、ＨＬＡ−ＡＢＣの発現は約３倍増大し（培養前の６７３から培養後の１９２８へ）、ＣＤ８６の発現は４倍超高くなった（培養前の２６７から培養後の１１６５へ）。
−  ＩＬ−１２ｐ７０分泌は培養前よりも劇的に約２０倍増加したが（６時間目の時点での６３５から２４時間目の時点での１３９５３pg/ml/１０6細胞）、ＩＬ−１０分泌は３０００pg/ml未満のままである。
【０１４７】
結論として、不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγと共に６時間インキュベートされ洗浄された後、成熟因子の非存在下ですら、２１時間の培養期間中に成熟特徴を獲得する。
【０１４８】
実施例８：樹状細胞によるＩＬ−１０分泌は、ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする
未熟樹状細胞を、３時間、６時間又は４０時間、ＦＭＫｐ（１μg/ml）及びＩＦＮγ（５００U/ml）により処理した。３時間目又は６時間目に刺激された細胞を洗浄し、３時間目又は６時間目の時点で分析するか、又は成熟因子なしの培地中でさらに生育させ、次いで２４時間目の時点でＩＬ−１０分泌を測定した。ＩＬ−１０分泌は、以前に記載されたようにして、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０１４９】
結果は図８に示される。
３時間の処理の後、ＩＬ−１０は検出されなかった。６時間後、２７１pg/ml/１０6細胞のＩＬ−１０が上清中に検出された。成熟因子又はサイトカインなしの培地中での２４時間目の時点までのさらなる培養の後、ＩＬ−１０分泌は低いままであり、いずれの例においても４０００pg/ml未満のままである。
反対に、ＦＭＫｐ及びＩＮＦγとの４０時間のインキュベーションは、ＩＬ−１０分泌の劇的な誘導をもたらす：４０時間の刺激の後、約９０００pg/mlが培養上清中に測定される。
【０１５０】
リボムニル（登録商標）＋ＩＦＮγに関する実施例４において以前に示されたのと同様に、ＦＭＫｐ及びＩＦＮγの存在下での短時間のインキュベーションは、成熟過程における限定されたＩＬ−１０分泌をもたらす。
【０１５１】
実施例９：樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結／解凍ステップは、成熟過程を混乱させない：
黒色腫細胞溶解物の作製：
ＣＯＬＯ８２９細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９７４）由来の黒色腫細胞を採集し、無菌ＰＢＳで２回洗浄し、５×１０7細胞/mlの濃度で無菌ＰＢＳに再懸濁させた。凍結及び解凍（Ｆ／Ｔ）のサイクル４回を適用し、溶解物をMisonix cup horn sonicator（登録商標）で超音波処理した（最大出力で２分間のパルス４回の後、５分間のサイクル１回）。次いで、溶解物をミクロチューブ内で５０００rpmで５分間遠心分離し、上清を等分し、−８０℃で保管した。
【０１５２】
細胞負荷：
未熟樹状細胞を、２×１０6細胞/mlの濃度で完全ＡＩＭＶ培地で希釈し、０．５腫瘍細胞相当量／ＤＣの比率で腫瘍溶解物を添加した。次いで、細胞を、３７℃でＥＶＡバッグ（Stedim）内で一夜インキュベートした。
【０１５３】
成熟は、６時間、ＦＭＫｐ（１μg/ml）及びＩＦＮγ（５００U/ml）を用いて、実施例７に記載されたようにして実施した。
【０１５４】
凍結及び解凍：
不可逆的に成熟化へと誘発された負荷樹状細胞を、バッグ内で水簸溶液（ＰＢＳ−グルコース、B.Braun Medical S.A.）で洗浄し（ブレーキなしの１６００rpm、４℃、２５分間の遠心分離）、ペレットをチューブ内で再懸濁させ、遠心分離した（１４００rpm、４℃、１０分間）。それらを、クリオバッグ（cryobags）内で５×１０6細胞/mlの濃度で４％アルブミン（９０％）／ＤＭＳＯ（１０％）中で凍結させた。
次いで、細胞凝集物を回避するため、細胞を０．９３％アルブミン及び３．５％ＡＣＤ−Ａ（B. Braun Medical S.A.）が補充された水簸溶液中で解凍させ、ブレーキなしで１６００rpm、４℃で２５分間遠心分離した。
【０１５５】
シリンジ内でのインキュベーション及び最終培養：
新鮮に解凍させた細胞を、チューブ内で遠心分離し、２０×１０6細胞/mlの濃度でアルブミン４％に再懸濁させ、及び１mlシリンジ内で４℃で２時間インキュベートした。
次いで、（細胞が沈殿物を形成したため）シリンジの振とう後に細胞を２５Ｇ針に通し、２４穴プレート内で２×１０6細胞/mlの濃度で完全ＡＩＭＶ培地中で一夜培養した。
【０１５６】
ＦＭＫｐ及びＩＦＮγとの６時間のインキュベーションの直後、及びＡＩＭＶ培地中での最終一夜培養の直後に、以前に記載されたようにして、ＥＬＩＳＡによりサイトカイン分泌をアッセイした。
【０１５７】
結果：
結果は図９に示される。成熟刺激との６時間のインキュベーションの後（白抜き棒グラフ）、負荷樹状細胞は、２２２２pg/ml/１０6細胞のＩＬ−１２ｐ７０及び５９pg/ml/１０6細胞のＩＬ−１０を分泌する。ＩＬ−１０分泌は未だ誘導されていないが、ＩＬ−１２分泌は既に開始している。
【０１５８】
凍結／解凍ステップの後、細胞を成熟刺激なしで一夜培養することにより、不可逆的に成熟へと誘発された樹状細胞は成熟過程を完了する（黒棒グラフ）。予想通り、ＩＬ−１０分泌は低く、実際１２００pg/ml未満のままであるが、ＩＬ−１２ｐ７０の分泌は、１８時間の培養の前に測定されたＩＬ−１２ｐ７０分泌より４倍顕著になっている（最終培養後は約１００００pg/ml/１０6細胞）。
【０１５９】
本発明者らは、事前に細胞へ抗原を負荷させた場合ですら、そしてその細胞を成熟刺激との６時間のインキュベーションの後に凍結させた場合ですら、細胞とＦＭＫｐ及びＩＦＮγとの６時間のインキュベーションによるＩＬ−１２ｐ７０の高分泌の誘導は有効である、と結論する。
不可逆的に成熟化へと誘発された樹状細胞は、成熟過程の阻止の後、適切な条件で生育させられた場合、成熟を再開するという特性を有している。
【０１６０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１Ａ】リボムニル（登録商標）及びＩＦＮγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図１Ｂ】リボムニル（登録商標）及びＩＦＮγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図１Ｃ】リボムニル（登録商標）及びＩＦＮγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図２Ａ】ポリＩ：Ｃ及び抗ＣＤ４０抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図２Ｂ】ポリＩ：Ｃ及び抗ＣＤ４０抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図２Ｃ】ポリＩ：Ｃ及び抗ＣＤ４０抗体により誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図３Ａ】リボムニル単独と、ＩＦＮγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟効果の比較。
【図３Ｂ】リボムニル単独と、ＩＦＮγと併用されたリボムニルの樹状細胞によるサイトカイン分泌に対する成熟効果の比較。
【図４】ＩＬ−１０の分泌は、ＲＢＬ＋ＩＦＮγの存在下での比較的長い樹状細胞のインキュベーション時間を必要とする。
【図５】ペプチド抗原でパルス処理された誘発された樹状細胞は、外因性サイトカインの非存在下ですら、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を生成させ得る。
【図６】ＲＢＬ＋ＩＦＮγとの６時間のインキュベーションにより誘発された樹状細胞は、抗原特異的エフェクターＣＤ８  Ｔ細胞の生成にとって最適である。
【図７Ａ】ＦＭＫｐ及びＩＮＦγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図７Ｂ】ＦＭＫｐ及びＩＮＦγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図７Ｃ】ＦＭＫｐ及びＩＮＦγにより誘発された樹状細胞は、完全に成熟化するよう方向付けられている。
【図８】樹状細胞によるＩＬ−１０分泌は、ＦＭＫｐ＋ＩＦＮγの存在下での細胞の長時間インキュベーションを必要とする。
【図９】樹状細胞への黒色腫細胞溶解物の負荷、及びその後の凍結／解凍ステップは、成熟過程を混乱させない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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