(57)【要約】エネジエン及び他の核酸切断剤によりヌクレオチドの切断を連続的に評価（ａｓｓｅｓｓ）するため、修飾されたヘヤーピン形状のオリゴヌクレオチドが提供される。「分子ブレーク・ライト（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）」として本明細書に言及されている、さらにオリゴヌクレオチド・プローブが、切断剤からヌクレオチドを保護する連続アセスメントに対しても有益である。本発明によるプローブが、アッセイにおいて、つまり分子又は成分のこうした対を利用して、複数のアッセイを含む改良されたアッセイ、及びこうした対を含むアッセイ・キットにおいて有益である。さらにプローブを使用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する核酸切断物質の活性を評価する方法において、
ａ、前記試料をプローブと共にインキュベートする工程、ここで前記プローブは、
ｉ）ステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）蛍光団、及び
ｉｉｉ）消光剤を含んで成り、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される；
ｂ、前記プローブの蛍光レベルを測定する工程；並びに
ｃ、核酸切断剤の活性と蛍光量とを関係付ける工程；
を含む前記方法。
【請求項２】
前記核酸切断物質が、酵素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記酵素がヌクレアーゼである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼが、エクソヌクレアーゼである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、制限酵素エンドヌクレアーゼである請求項Ａ５記載の方法。
【請求項７】
前記核酸切断物質が、小分子である請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記核酸切断物質が、エネジエン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の１本鎖部分のプローブを切断する請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の２本鎖部分のプローブを切断する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
蛍光団及び消光剤が、プローブと内部的に結合される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
蛍光団及び消光剤が、プローブの５’及び／又は３’に結合される請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸切断物質が、消光剤と蛍光団との間の部位でプローブを切断する請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブを固体表面に固定化する請求項１記載の方法。
【請求項１５】
試料中の核酸切断物質の存在を検出する方法において、
ａ、前記試料をプローブと共にインキュベートする工程、ここで前記プローブは、
ｉ）ステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）蛍光団、及び
ｉｉｉ）消光剤を含んで成り、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される；並びに
ｂ、前記プローブの蛍光レベルを測定する工程；
を含む前記方法。
【請求項１６】
前記核酸切断物質が酵素である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素がヌクレアーゼである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ヌクレアーゼが、エクソヌクレアーゼである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
酵素が制限酵素エンドヌクレアーゼである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
核酸切断物質が小分子である請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
核酸切断物質がエネジエンである請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
核酸切断物質が、ステムループ構造の１本鎖部分においてプローブを切断する請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
核酸切断物質が、２本鎖部分においてプローブを切断する請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
蛍光団及び消光剤が、プローブと内部的に結合される請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
蛍光団及び消光剤が、プローブの５’及び／又は３’の両末端に結合される請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
核酸切断物質が、蛍光団と消光剤との間の部位にてプローブを切断する請求項１５記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブが、固体表面に固定化される請求項１５記載の方法。
【請求項２９】
試料中に存在する核酸切断物質の活性を評価する方法において、
ａ、前記試料をプローブと共にインキュベートする工程、ここで前記プローブは、
ｉ）ステムループ構造を形成し、そしてヌクレオチド切断物質に対する認識部位を含むオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）蛍光団、及び
ｉｉｉ）消光剤を含んで成り、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される；
ｂ、前記プローブの蛍光レベルを測定する工程；並びに
ｃ、核酸切断剤の活性と蛍光量とを関係付ける工程；
を含む前記方法。
【請求項３０】
前記核酸切断物質が酵素である請求項２９記載による方法。
【請求項３１】
前記酵素がヌクレアーゼである請求項３０記載による方法。
【請求項３２】
前記ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼである請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記酵素が、制限酵素エンドヌクレアーゼである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸切断物質が、小分子である請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸切断物質が、エネジエンである請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
前記認識部位が、ステムループ構造の１本鎖部分において位置付けされる請求項２９記載の方法。
【請求項３８】
前記認識部位が、ステムループ構造の２本鎖部分において位置付けされる請求項２９記載の方法。
【請求項３９】
前記認識部位が、ステムループ構造の１本鎖部分と２本鎖部分との結合部の範囲にある請求項２９記載の方法。
【請求項４０】
前記蛍光団及び消光剤が、プローブに内部的に結合される請求項２９記載の方法。
【請求項４１】
前記蛍光団及び消光剤が、プローブの５’及び／又は３’の両末端に結合される請求項２９記載の方法。
【請求項４２】
前記認識部位が、消光剤と蛍光団との間に位置付けられる請求項２９記載の方法。
【請求項４３】
前記プローブが、固体表面に固定化される請求項２９記載の方法。
【請求項４４】
試料中の核酸切断物質の存在を検出する方法において、
ａ、前記試料をプローブと共にインキュベートする工程、ここで前記プローブは、
ｉ）ステムループ構造を形成し、そしてヌクレオチド切断物質に対する認識部位を含むオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）蛍光団、及び
ｉｉｉ）消光剤を含んで成り、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される；並びに
ｂ、前記プローブの蛍光レベルを測定する工程；
を含む前記方法。
【請求項４５】
前記核酸切断物質が、酵素である請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記酵素がヌクレアーゼである請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼである請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
前記酵素が、制限酵素エンドヌクレアーゼである請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
核酸切断物質が、小分子である請求項４４記載の方法。
【請求項５１】
核酸切断物質が、エネジエンである請求項４４記載の方法。
【請求項５２】
前記認識部位が、ステムループ構造の１本鎖部分に位置付けされる請求項４４記載の方法。
【請求項５３】
前記認識部位が、ステムループ構造の２本鎖部分に位置付けされる請求項４４記載の方法。
【請求項５４】
前記認識部位が、ステムループ構造の１本鎖部分と２本鎖部分との結合部の範囲にある請求項２９記載の方法。
【請求項５５】
前記蛍光団及び消光剤が、プローブに内部的に結合される請求項４４記載の方法。
【請求項５６】
蛍光団及び消光剤が、プローブの５’及び／又は３’の両末端に結合される請求項４４記載の方法。
【請求項５７】
前記認識部位が、消光剤と蛍光団との間の部位に位置付けられる請求項４４記載の方法。
【請求項５８】
前記プローブが、固体表面に固定化される請求項４４記載の方法。
【請求項５９】
核酸切断物質の活性を評価する方法において、
ａ、ヌクレオチド切断物質を第１のプローブと共にインキュベートする工程、ここで前記第１のプローブは、
ｉ）ステムループ構造を形成し、そして第１の配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）蛍光団、及び
ｉｉｉ）消光剤を含んで成り、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される；
ｂ、前記第１のプローブの蛍光レベルを測定する工程；
ｃ、ヌクレオチド切断物質を第２のプローブと共にインキュベートする工程、ここで前記第２のプローブは、
ｉ）ステムループ構造を形成し、そして第２の配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）蛍光団、及び
ｉｉｉ）消光剤を含んで成り、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される；
ｄ、前記第２のプローブの蛍光レベルを測定する工程；
ｅ、第２のプローブの蛍光レベルに第１のプローブの蛍光レベルを比較する工程；並びに
ｆ、核酸切断物質の活性と第１のプローブ及び第２のプローブの蛍光量とを関係付ける工程；
を含む前記方法。
【請求項６０】
前記工程（ａ）及び（ｃ）が、別々の反応容器にて行われる請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記工程（ａ）及び（ｃ）が、同一の反応容器にて行われる請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
前記第１のプローブが第１の蛍光団を含み、前記第２のプローブが第２の蛍光団を含み、そして前記第１及び第２のプローブがたがいに識別できる請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸切断物質が酵素である請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
前記酵素がヌクレアーゼである請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼである請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
前記酵素が制限酵素エンドヌクレアーゼである請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記核酸切断物質が小分子である請求項５９記載の方法。
【請求項６９】
前記核酸切断物質がエネジエンである請求項５９記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の１本鎖部分にプローブを切断する請求項５９記載の方法。
【請求項７１】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の２本鎖部分にプローブを切断する請求項５９記載の方法。
【請求項７２】
核酸切断物質の活性を評価する方法において、
ａ、ヌクレオチド切断物質を第１の組みの条件におけるプローブと共にインキュベートする工程、ここで前記第１の組みの条件におけるプローブは、
ｉ）ステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）蛍光団、及び
ｉｉｉ）消光剤を含んで成り、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される；
ｂ、第１の組みの条件における前記プローブの蛍光レベルを測定する工程；
ｃ、ヌクレオチド切断物質を第２の組みの条件における前記プローブと共にインキュベートする工程；
ｄ、第２の組みの条件における前記プローブの蛍光レベルを測定する工程、
ｅ、第２の組みの条件におけるプローブの蛍光レベルに第１の組みの条件におけるプローブの蛍光レベルを比較する工程；並びに
ｆ、核酸切断物質の活性に対して第１、及び第２の条件における蛍光レベルを関係付ける工程；
を含む前記方法。
【請求項７３】
前記核酸切断物質が酵素である請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記酵素がヌクレアーゼである請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
前記酵素が、制限酵素エンドヌクレアーゼである請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記核酸切断物質が、小分子である請求項７２記載の方法。
【請求項７９】
前記核酸切断物質が、エネジエンである請求項７２記載の方法。
【請求項８０】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の１本鎖部分にプローブを切断する請求項７２記載の方法。
【請求項８１】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の２本鎖部分にプローブを切断する請求項７２記載の方法。
【請求項８２】
ヌクレオチド保護物質の有効性を評価する方法において、
ａ、ヌクレオチド切断物質及びプローブをインキュベートする工程、前記プローブは、
ｉ）ステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）蛍光団、及び
ｉｉｉ）消光剤を含んで成り、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される；
ｂ、工程（ａ）においてインキュベートされた前記プローブの蛍光レベルを測定する工程；
ｃ、ヌクレオチド保護物質、ヌクレオチド切断物質、及びプローブをインキュベートする工程；
ｄ、工程（ｃ）においてインキュベートされた前記プローブの蛍光レベルを測定する工程；
ｅ、工程（ｂ）及び工程（ｄ）において測定された蛍光レベルを比較する工程、並びに
ｆ、工程（ｂ）及び工程（ｄ）にて測定された蛍光レベルの相違量と核酸保護物質の有効性とを関係付ける工程；
を含む前記方法。
【請求項８３】
前記核酸切断物質が、酵素である請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記酵素が、ヌクレアーゼである請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
前記酵素が、制限酵素エンドヌクレアーゼである請求項８４記載の方法。
【請求項８８】
前記核酸切断物質が、小分子である請求項８２記載の方法。
【請求項８９】
前記核酸切断物質が、エネジエンである請求項８２記載の方法。
【請求項９０】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の１本鎖部分にプローブを切断する請求項８２記載の方法。
【請求項９１】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の２本鎖部分にプローブを切断する請求項８２記載の方法。
【請求項９２】
オリゴヌクレオチド・プローブにおいては、
ａ、ステムループ構造を形成し、ヌクレオチト切断物質に対する認識部位を含むオリゴヌクレオチド、
ｂ、蛍光団、及び
ｃ、消光剤を含み、ここで前記蛍光団の蛍光が、プローブが切断されている場合よりプローブが無傷の場合に有意的に少なくなるよう、蛍光団及び消光剤が配置される、
ことを含む前記オリゴヌクレオチド・プローブ。
【請求項９３】
前記核酸切断物質が、酵素である請求項９２記載のプローブ。
【請求項９４】
前記酵素が、ヌクレアーゼである請求項９３記載のプローブ。
【請求項９５】
前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼである請求項９４記載のプローブ。
【請求項９６】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである請求項９４記載のプローブ。
【請求項９７】
前記酵素が、制限酵素エンドヌクレアーゼである請求項９６記載のプローブ。
【請求項９８】
前記核酸切断物質が、小分子である請求項９２記載のプローブ。
【請求項９９】
前記核酸分割物質が、エネジエンである請求項９２記載のプローブ。
【請求項１００】
請求項９２による少なくとも１つのプローブを含むキット。
【請求項１０１】
認識部位を認識する少なくとも１つの切断物質をさらに含む請求項１００記載のキット。
【請求項１０２】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の１本鎖部分にプローブを切断する請求項９２記載のプローブ。
【請求項１０３】
前記核酸切断物質が、ステムループ構造の２本鎖部分にプローブを切断する請求項９２記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景
発明の分野
本発明は、蛍光団及び消光剤を含む核酸切断プローブ、及びキット及びそれらを含むアッセイ及びそれらを用いるアッセイに関する。
【０００２】
発明の背景
蛍光共鳴エネルギー変換器、つまり「ＦＲＥＴ」アッセイが、多くの目的に使用されてきた。ＦＲＥＴアッセイにおける蛍光の変化が、第１の蛍光団と相互作用する共鳴エネルギー受容体である、別の蛍光団か消光剤のいずれかとを分離する距離の変化により引き起こされる。蛍光団と消光分子又は成分を含む相互作用する分子又は成分との組み合わせが、「ＦＲＥＴ対」として知られている。ＦＲＥＴ対の相互作用機構が、対における１方のメンバーの吸収スペクトルが、もう１方のメンバーである第１の蛍光団の発光スペクトルに重なる必要がある。相互作用する分子又は成分が消光剤であれば、その吸収スペクトルが、蛍光団の発光スペクトルに重なり合わなければならない。Ｓｔｒｙｅｒ、 Ｌ．、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｓ ａ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｒｕｌｅｒ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７８，４７：８１９−８４６（「Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．１９７８」）、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｐａｒｔ ＩＩ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ ａｎｄ Ｐ．Ｒ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，ｐａｇｅｓ ４４８−４５５（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８０）（「Ｃａｎｔｏｒ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ １９８０」）、ａｎｄ Ｓｅｌｖｉｎ，Ｐ．Ｒ．、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ」Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２４６：３００−３３５（１９９５）（「Ｓｅｌｖｉｎ，Ｐ．Ｒ．１９９５」）。
【０００３】
ある適切なＦＲＥＴ対が、Ｍａｔａｙｏｓｈｉら、１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：９５４−９５８に記載され、消光成分（又は消光標識）としてＤＡＣＣＹＬを、及び蛍光団（又は蛍光標識）としてＥＤＡＮＳを含んでいる。ＦＲＥＴ及びＦＲＥＴ対を利用する種々の標識化された核酸ハイブリダイゼーション・プローブ、及び検出アッセイが知られている。こうした構成（ｓｃｈｅｍｅ）の１つが、Ｃａｒｄｕｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ：８７９０−８７９４（１９８８）及びＨｅｌｌｅｒらＥＰ０ ０７０ ６８５Ａ２に記載されている。ＣａｒｄｕｌｌｏとＨｅｌｌｅｒに記載の構成（ｓｃｈｅｍｅ）では、標的ＤＮＡ鎖に隣接する領域に相補的な１対のオリゴデオキシヌクレオチドを含むプローブが使用される。１つのプローブ分子が、その５’端部に蛍光標識である蛍光団を含む、そしてもう１方のプローブ分子は、３’末端部に異なる蛍光標識である蛍光団も含む。そのプローブが標的配列にハイブリットされると、２つの標識（ｌａｂｅｌｓ）が、相互に著しい近接をもたらす。試料が適切な周波数の光で刺激されると、一方の標識からもう一方の標識に蛍光共鳴エネルギーの転換が生ずる。ＦＲＥＰが、標識からのスペクトル応答の測定可能な変化を形成し、標的の存在をシグナリングする。１方の標識が、「消光剤」にて可能であり、それが本願においては、受け入れたエネルギーを熱として放出する相互作用成分（又は分子）を意味する。
【０００４】
もう１つの液相の構成では、１対のオリゴデオキシヌクレオチド及びＦＲＥＴ対を含むプローブを利用する。しかしながら、その構成における２つのプローブ分子が、相互にも、標的ＤＮＡの相補鎖に対しても完全に相補的である。ＭｏｒｒｉｓｏｎとＳｔｏｌｓでは、「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，」 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：３０９−３１０４（１９９３）及びＭｏｒｒｉｓｏｎのＥＰ ０ ２３２ ９６７Ａ２がある。各プローブ分子が、その３’末端に結合される蛍光団、及びその５’末端に結合される消光剤の成分を含む。２つのオリゴヌクレオチド・プローブ分子が互いにアニールされると、各蛍光団が、もう一方の消光成分に非常に近接して保持される。この構成におけるプローブの場合、後に蛍光団が適切な周波数の光により刺激されると、蛍光が消光する成分により消光される。しかしながら、いずれかのプローブを標的分子と結合させると、相補的なプローブ分子の消光効果がなくなる。この構成におけるシグナルが生成される。その標的に結合される構造の時、プローブ分子は長すぎると、ＦＲＥＰにより自己消光することがない。ＦＲＥＴを利用する液相構成（ｓｃｈｅｍｅ）及び鎖の置換として知られる現象が、Ｄｉａｍｏｎｄらの米国特許第４，７６６，０６２、Ｃｏｌｌｉｎｓらの米国特許第４，７５２，５６６、Ｆｒｉｔｓｃｈらの米国特許第４，７２５，５３６、及び４，７２５，５３７に記載されている。典型的にこれらのアッセイが、２分子核酸複合体を含むプローブを含んでいる。標的配列のサブセットを含む有意的に短い１本鎖が、プローブの全標的結合領域を含む有意的に長い１本鎖にアニールされる。従ってこの構造におけるプローブが、１本鎖部分と、２本鎖部分との両方を含んでいる。これらのプローブが、有意的に短い鎖に結合された３２Ｐ標識か、あるいはプローブ構造がその複合体である場合、相互に近接した保持可能な蛍光団及び消光成分のいずれかを含むことが、Ｄｉａｍｏｎｄらにより提示されている。
【０００５】
ＦＲＥＴ対を利用する別の種類の分子プローブアッセイが、１９９４年６月１５日公開の欧州特許出願第０ ６０１ ８８９Ａ３に記載されている。
【０００６】
ＦＲＥＴ対を利用する別の種類の核酸ハイブリットプローブ・アッセイが、Ｇｅｌｆａｎｄらの米国特許第５，２１０，０１５，及びＬｉｖａｋらの米国特許第５，５３８，８４８に記載されているＴａｑＭａｎＴＭアッセイである。そのプローブが、ＦＲＥＴ対により標識化された１本鎖オリゴヌクレオチドである。ＴａｑＭａｎＴＭアッセイにおけるＤＮＡポリメラーゼは、これが標的鎖にハイブリッドされる場合、オリゴヌクレオチド・プローブの切断により、単一又は複数のヌクレオチドを放出する。この放出が、ＦＲＥＴ対の消光剤による標識と蛍光団による標識とを分離する１つの方法を提供する。Ｌｉｖａｋらによる末端標識化ＴａｑＭａｎＴＭプローブの「直線化（ｓｔｒａｉｇｔｅｎｉｎｇ）」がさらに消光を減少させる。
【０００７】
ＦＲＥＰ対を利用するさらに別の種類の核酸ハイブリダイゼーション・プローブアッセイが、現在Ｔｙａｇｉらの米国特許第５，９２５，５１７及びＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ９５／１３３９９において記載され、それが、標識化されたオリゴヌクレオチド・プローブを利用し、「分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）」として良く言及されている。Ｔｙａｇｉ，Ｓ．及びＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．，らの「分子ビーコンすなわちハイブリダイゼーションにより蛍光するプローブ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ：Ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８（１９９６）を参照。分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）プローブが、その末端領域が標的のない状態にて相互にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるが、プローブの中心部分がその標的配列にハイブリダイズされる場合に分離されるオリゴヌクレオチドである。プローブと標的とのハイブリットの剛性が、プローブと標的とのハイブリットと末端領域に形成される分子内のハイブリットとの両方を共存させることを阻害する。結果的にプローブが、末端領域により形成される有意的に小さいハイブリットを分離し、そしてその末端領域が、剛性のあるプローブと標的とのハイブリッドにより相互に分離する、という構造的な変化を受ける。
【０００８】
しかしながら、ＤＮＡｓｅに対するアッセイを除いて、本発明者の研究を行う前には、大部分の酵素及び小分子を触媒とするＤＮＡ切断事象のための連続アッセイが、利用できなかった。「分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）」アッセイが、ＰＣＲの適応及びＤＮＡ及びＲＮＡのハイブリット化にのみ有益である。
【０００９】
これまで、蛍光体にて修飾されたオリゴヌクレオチド／標識化されないオリゴヌクレオチドの相補対を用いる酵素切断アッセイにＦＲＥＴを適応することが、わずかしか記載されていなかった。しかしながら、これらの技術は、多くの制約を有する。たとえば、ハイブリダイズする鎖により悪い蛍光と消光との結果として、よく有意的な背景（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）蛍光が問題となる。
【００１０】
Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ種のカリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）由来のカリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）γ１Ｉ（図１Ａ）が、臨床的に利用可能な最も有益な抗腫瘍剤の１つであり、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）より１０００倍以上も強力である。エネジエン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）ファミリーの顕著なメンバーである、カリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）が、天然の生成した主要な例である。たとえば、Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．らのＣｕｒｒ．Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ６（１８）：１８４１−７９（２０００）；Ｔｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．らのＢｉｏｏｒｇａｎ．Ｃｈｅｍ．２７：１７２−１８８（１９９９）；Ｂｏｒｄｅｒｓ，Ｄ．Ｂ．らのｉｎ Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５）；Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｌ．，らのＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２１０３−２１１７（１９９６）；Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．，らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８８１−５８８８（１９９３）；Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．らのＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．３０：１３８７−１４１６（１９９１）を参照。
【００１１】
カリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）内部の２つの相違する構造領域のうち、アリルテトラサッカライドが、ＤＮＡの最小溝に代謝産物を部位特異的に誘導する炭水化物及び芳香族単位の特有の組から構成されが、アグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ），つまり「弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）」が、発生機構（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）として使用されるアリルトリサルファイドを伴う機能性の高いビシクロ［７．３．１］トリデカジエネン（ｔｒｉｄｅｃａｄｉｙｎｅｎｅ）から成る。７．Ｚｅｉｎ，Ｎ．，らのＳｃｉｅｎｃｅ ２４４：６９７−６９９（１９８９）； Ｚｅｉｎ，Ｎ．，らのＳｃｉｅｎｃｅ ２４０：１１９８−１２０１（１９８８）；Ｋｕｍａｒ，Ｒ．Ａ．らのＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６５：１８７−２０１（１９９７）を参照。
【００１２】
１，４−ジヒドロベンゼン−２遊離基を介してビシクロ［７．３．１］トリデカジエネン（ｔｒｉｄｅｃａｄｉｙｎｅｎｅ）のコアー構造を芳香族化することにより、標的ＤＮＡの部位特異的酸化による２本鎖の分離が起こり、この異常な反応性が医薬品工業に著しい関心を呼び起こした。Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｅ．Ｌ．，らのＢｌｏｏｄ ９３：３６７８−３６８４（１９９９）；Ｂｅｍｓｔｅｉｎ Ｉ．Ｄ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ １４：４７４−４７５（２０００）を参照。
【００１３】
一方でエネジエンが核酸を切断する機構を理解するための非常な努力が、行われてきたが、この現象に対する連続アッセイにはまだ欠陥がある。実際にＤＮＡｓｅに対するアッセイを除いた大部分の酵素及び小分子を触媒とする核酸切断事象に対する連続アッセイが、まだ利用することが出来ない。カリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）の生合成、自己耐性及び作用モードを理解する努力としては、大部分の酵素及び小分子を触媒とする核酸の切断事象のための連続アッセイにより容易になる研究例としてわずか１例にすぎない。
【００１４】
発明の要約
ヌクレオチドをエネジエン切断するための前のアッセイが、放射性ヌクレオチド・プローブを用い、電気泳動にかけ、その後ホスフォ画像解析（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を用いる非連続アッセイによった。対照的に、一方では、本発明の方法及び試薬（分子ブレーク・ライト）を用い、実時間における高い感度と低い背景（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）によるエネジエンなどの、特定核酸切断剤（又は「ヌクレオチド切断剤」）によってヌクレオチド切断の程度を直接追跡することができる。
【００１５】
本発明は、エネジエン及び他の核酸切断剤によるヌクレオチド切断を、連続アセスするための修飾されたヘアピン形状のオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書にも「分子ブレーク・ライト（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）」として言及されている、これらのオリゴヌクレオチド・プローブが、切断剤からヌクレオチドを保護するという連続評価法（ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）に対しても有益である。
【００１６】
本発明によるプローブが、アッセイ、多重アッセイを含むこうした分子又は成分の対を利用した改良アッセイ、及びこうした対を含むアッセイキットに有益である。
【００１７】
本発明は、試料に存在する核酸切断剤の活性を評価する方法を提供する。幾つかの特定する例における方法では、ａ、その試料をプローブと共にインキュベートする工程にて、そのプローブがステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチド、蛍光団、及び消光剤を含む、ここでそのブローブが切断された場合よりプローブが無傷の場合、蛍光団の蛍光が有意的に少なくなるように、蛍光団及び消光剤が配置される、ｂ、プローブの蛍光レベルを測定する工程、及びｃ、核酸切断剤の活性と蛍光量とを関係付ける工程、が含まれる。
【００１８】
本発明は、さらに試料中の核酸切断剤の存在を検出する方法を提供する。特定する例における方法では、ａ、その試料をプローブと共にインキュベートする工程にて、そのプローブがステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチド、蛍光団、及び消光剤を含む、ここでそのブローブが切断された場合よりプローブが無傷の場合、蛍光団の蛍光が有意的に少なくなるように、蛍光団及び消光剤が配置される、ｂ、プローブの蛍光レベルを測定する工程、が含まれる。
【００１９】
核酸切断剤は、たとえばヌクレアーゼなどの酵素にて可能である。ヌクレアーゼの例では、本発明の方法及びプローブを用いてアッセイすることのできるその活性及び存在では、エキソヌクレアーゼ及び制限酵素エンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼが含まれる。核酸切断剤の他の例では、本発明による方法及びプローブを用いアッセイすることのできる活性又は存在には、小分子、及びエネジエンが含まれる。
【００２０】
特定する例における核酸切断剤が、ステムループ構造の１本鎖部分にてプローブを切断する。別の例における核酸切断剤が、ステムループ構造の２本鎖部分にてプローブを切断する。さらに別の例における核酸切断剤が、ステムループ構造の１本鎖部分と２本鎖部分との接合部分にてプローブを切断する。
【００２１】
特定する例における蛍光団と消光剤が、プローブの内部に結合されている。他の特定する例における蛍光団及び消光剤が、プローブの５’及び／又は３’末端に結合される。
【００２２】
特定する例における核酸切断剤が、消光剤と蛍光団との間の部位にてプローブを切断する。
【００２３】
特定する例における本発明のプローブが、固形面に固定される。
【００２４】
特定する例におけるプローブが、核酸切断剤に特異的な認識部位を含む。特定する例における認識部位が、ステムループ構造の１本鎖部分に配置される。他の例における認識部位が、ステムループ構造の２本鎖部分に配置される。さらに他の例における認識部位が、ステムループ構造の１本鎖部分と２本鎖部分との接合部分にまたがって（ｓｐａｎｓ）いる。特定する例における認識部位が、消光剤と蛍光団との間の部位に配置される。
【００２５】
さらに本発明は、核酸切断剤の活性を評価する方法も提供する。特定する例におけるその方法（ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）は、以下を含む、すなわち、ａ、前記核酸切断剤と第１のプローブとのインキュベート工程、その第１のプローブが、ステム構造を形成し、そして第１の配列を有するオリゴヌクレオチド、蛍光団、及び消光剤を含む、ここでその蛍光団及び消光剤は、プローブが切断される時よりプローブが無傷の場合、蛍光団の蛍光が少ないように配置される、ｂ、第１のプローブの蛍光レベルを測定する工程、ｃ、前記核酸切断剤と第２のプローブとのインキュベート工程、その第２のプローブが、ステム構造を形成し、そして第２の配列を有するオリゴヌクレオチド、蛍光団、及び消光剤を含む、ここでその蛍光団が、プローブが無傷の場合蛍光せず、そしてプローブが切断される場合に蛍光するように、蛍光団及び消光剤が配置される、ｄ、第２のプローブの蛍光レベルを測定する工程、第１プローブの蛍光レベルと第２蛍光レベルを比較し、第１プローブの蛍光レベル及び第２プローブの蛍光レベルと核酸切断剤の活性とを関係付ける工程を含む。
【００２６】
特定する例における各プローブの切断が、別々の反応容器にて行われる。他の例における２以上のプローブの切断が、同じ反応容器にて行なわれ、そして好ましくはプローブのそれぞれの種類が異なる蛍光団に結合され、その蛍光団を相互に識別できることである。
【００２７】
さらに本発明が、核酸切断剤の活性を評価する方法を提供する。特定する例において、上記方法が、ａ、核酸切断剤を第１の組みの条件におけるプローブと共インキュベートする工程、ここで前記プローブが、ステムループを形成するオリゴヌクレオチド、蛍光団、及び消光剤を含む、ここで蛍光団及び消光剤が、前記プローブが切断される場合よりプローブが無傷の場合の蛍光団が、少ない蛍光となるように配置される、ｂ、第１の組みの条件におけるプローブの蛍光レベルを測定する工程、ｃ、核酸切断剤を第２の組みの条件におけるプローブと共にインキュベートする工程、ｄ、第２の組みの条件におけるプローブの蛍光レベルを測定する工程、第１の組み条件プローブの蛍光レベルと第２の組み条件のプローブの蛍光レベルとを比較する工程、及び核酸切断剤の活性に対する第１と第２プローブ条件の蛍光レベルとを関連付ける工程を含む。
【００２８】
さらに本発明が、核酸保護剤（又はヌクレオチド保護剤とも言われる）の有効性を評価する方法を提供する。特定する例におけるこの方法は、ａ、核酸切断剤及びプローブをインキュベートする工程、ここで前記プローブがステムループを形成するオリゴヌクレオチド、蛍光団及び消光剤を含む、ここで前記蛍光団及び消光剤が、前記プローブが切断される場合より前記プローブが無傷の場合における蛍光団の蛍光が、少ない蛍光となるように配置される、ｂ、工程（ａ）においてインキュベートされたプローブの蛍光レベルを測定する工程、ｃ、ヌクレオチド保護剤、核酸切断剤、及びプローブをインキュベートする工程、ｄ、工程（ｃ）においてインキュベートされたプローブの蛍光レベルを測定する工程、ｅ、工程（ｂ）及び（ｄ）における測定された蛍光レベルを比較する工程、及びｆ、工程（ｂ）及び（ｄ）にて測定された蛍光レベル量の差と、核酸保護剤の有効性とを関係付ける工程を含む。
【００２９】
本発明によるプロセス及びプローブを用いて研究可能な保護剤の例が、ヒストン及び転写因子、ならびに他のタンパク質、ペプチド、小分子、及び核酸と相互作用する他の分子を含む。
【００３０】
本発明は、活性、存在性、有効性を評価するための有効なオリゴヌクレオチド・プローブ、及び核酸切断剤及び保護剤などを提供する。特定する例における本発明によるプローブが、ａ、ステムループ構造を形成し、且つ核酸切断剤への認識部位を含むオリゴヌクレオチド及び、ｂ、蛍光団、及びｃ、消光剤を含む、ここでその蛍光団及び消光剤が、プローブが無傷の場合蛍光団が蛍光されず、プローブが切断された場合蛍光するように、配置される。
【００３１】
さらに本発明による少なくとも１つのプローブを含むキットが、提供される。さらにそのキットが、認識部位を認識する少なくとも１つの核酸切断剤を含むことができる。特定の例における切断剤及び認識部位が、結合又は相互作用することが知られている。特定の好ましい例における本発明は、バクテリアたとえばマイクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）などの醗酵におけるカリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）などの力価を、評価するための方法及び試薬（オリゴヌクレオチドなど）を提供する。
【００３２】
他の例においては、認識配列及び切断剤がいかに強く結合又は相互作用するかどうかが、知られていない。
【００３３】
好ましい例における切断剤と認識部位との相互作用が生ずると、オリゴヌクレオチドが分離される。好ましい例におけるこうした切断により、蛍光団と消光剤の対が、直ぐに分離を起こしその結果自然発生的な蛍光シグナルが形成され、ヌクレオチドの分離度が直接関連付けられる。
【００３４】
本発明の詳細な説明
エネジエンによるヌクレオチド切断の前のアッセイが、放射性ヌクレオチド・プローブ、電気泳動、及びその後のホスフォ画像解析（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いるによる非連続性アッセイによる。対照的に本発明の方法、及び試薬（分子ブレーク・ライト）を用いることにより、ヌクレオチドの切断の程度を、特定のエニジエンにより高い感度にて実時間的に直接たどることができる。
【００３５】
本発明は、エネジエン及び他の核酸切断剤によるヌクレオチド切断を連続的に評価するための修飾されたヘアピン形状のオリゴヌクレオチドを提供する。さらにこれらのオリゴヌクレオチドが、切断剤からヌクレオチドを保護する連続アセスメントに対しても有益である。オリゴヌクレオチドの切断を評価するための典型的な基質オリゴヌクレオチド・プローブ（又は分子ブレーク・ライト）が、ステム及びループ構造に適合する１本鎖オリゴヌクレオチドであり、５’−蛍光成分及び３’非蛍光の消光成分を携行（ｃａｒｒｉｅｓ）する（図２Ａ）。ステム構造の設計は、蛍光共鳴エネルギー誘導剤（ＦＲＥＴ）により消光する蛍光を提供し、さらに関係する核酸切断剤のためのヌクレオチド結合認識配列を含むよう、相互に極めて近接した状態にこれら２つの成分が維持される（図２Ａ）。従って消光は分子内にて生ずる。
【００３６】
核酸切断剤によってプローブ・ステム構造が分離されると、蛍光団と消光剤との対の２成分の分離が起こる。成分が分離することにより、ヌクレオチド切断の程度に直接に関係付ける自然発生的蛍光シグナルが生ずる。分離と蛍光が、実質的に分離すると同時に起こることが好ましい。本発明のヘアピン構造の形成オリゴヌクレオチド・プローブが、「分子ブレーク・ライト」（ヌクレオチド鎖「ブレーク」として）として言及することができる。
【００３７】
分子ブレーク・ライト・プローブの切断と同時に有意に見ることができるよう、蛍光シグナルを、切断の事象に対し実時間に観察することができる。したがって、本発明による分子ブレーク・ライト・プローブが、一連の酵素、及び小分子を触媒とするヌクレオチド切断事象を連続的に監視（ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）するには有益である。
【００３８】
分子ブレーク・ライトが、１本鎖及び２本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡを共に含むでいるため、その切断部位が、いずれかの種類のヌクレオチドに配置することができる。１本鎖の切断部位が、ループ構造に配置することができ、そして２本鎖の切断部位が、ステム構造に配置することができる。したがって、本発明の分子ブレーク・ライトが、１本鎖ヌクレオチドを切断する試薬、と２本鎖ヌクレオチドを切断する試薬の両方による切断のアセスメントとして提供される。一般的に分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）が働いて、蛍光団と消光剤との対を分離することによる結果として相当する蛍光シグナルとなる。図８に示される分子ブレーク・ライトが、酵素又は非酵素ヌクレアーゼ活性によりステム構造の切断を介し作用し、その結果蛍光団と消光剤との対を分離し、そして相当する蛍光シグナルとなる。図８における分子ブレーク・ライトが、好ましいカリキアマイシン認識部位（ボールド体、ＴＣＣＴ）かＢａｍＨＩ認識部位（ボールド体、ＧＧＡＴＣＣ）のいずれかを含んでいる。想定される切断部位が矢印により示されている。
【００３９】
ブレーク・ライト・アッセイが、広く全体的な有用性を有する。ブレーク・ライト・アッセイが、非限定試料として、無作為なヌクレアーゼ、配列に特異的なヌクレアーゼ、状況に特異的なヌクレアーゼ、及び小分子によるヌクレオチド切断の分析に有益である。たとえば、ブレーク・ライト・アッセイが、試薬の相違による切断効率の直接的な比較を提供することができる。図１における天然に生成するエネジエン（カリキアマイシン、Ａ、及びエスペルアミシン、Ｂ）、非エネジエン小分子剤（ブレオマイシン、Ｃ、メチジウムプロピル−Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｄ、及びＦｅ−ＥＤＴＡ、Ｅ）及び制限酵素エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの切断効率の比較が、さらに本明細書に記載される。
【００４０】
分子ブレーク・ライト・アッセイが、前のＦＲＥＴに基づくＤＮＡ切断アッセイより利点があり、それがオリゴヌクレオチド対によるアッセイに対し、ノイズに対するシグナル比が極めて低い（〜２）、単一のオリゴヌクレオチド基質と比較して、分子ブレーク・ライトによる、ノイズに対するシグナル比が有意的に高い値（〜４０）が実現できるという点である。例えば、Ｔｙａｇｉ，Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−３０８（１９９６）；Ｔｙａｇｉ，Ｓ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３（１９９８）を参照。
【００４１】
さらには、分子ブレーク・ライト・アッセイが、蛍光関係分光計（ＦＣＳ）によるアッセイの感受性を超え、１０培を超える極めて鋭敏な技術である。さらに、ＦＣＳは、非常に特殊な装置を必要とする。Ｋｅｔｔｌｉｎｇ， Ｕ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４１６−１４２０（１９９８）を参照。本発明のアッセイを行うには、こうした特別の装置を必要としない。
【００４２】
さらに本発明によるアッセイの感受性が、生化学誘導アッセイ（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（ＢＩＡ））として知られたＤＮＡ損傷剤を検出するための典型的な非連続アッセイとも競合する。本発明の新規な手法としての簡易性、速度、感度が与えられれば、方法としての新規な技術が、高いスループット・フォーマットを拡張し、そして新規のタンパク質を基礎と、又は小分子に誘導されるＤＮＡ切断剤のための選別すべき試薬の発見をモデムにおける新規の選択方法と成ることができる。
【００４３】
ヌクレオチド−保護剤（例えば転写因子、ヒストンなど）が、切断剤による切断を阻止するか、又は減少させる。先行アッセイと異なり、本発明の分子ブレーク・ライトが、切断からオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの種々のヌクレオチド保護剤による保護を評価するためにも使用することができる。たとえば、さらに本明細書に記載されているように、タンパク質ＣａｌＣにて与えられるカリキアマイシンよる切断からの保護が、本発明によるアッセイ及び試薬を用いて測定することができる。任意のヌクレオチドとの保護剤（タンパク質又はその他のもの）の保護作用が、同様に測定することができる。関係するヌクレオチド−保護剤が、関係する核酸切断剤による切断からオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをどの程度保護するかどうか、（ａ）関係するヌクレオチド−保護剤の存在下、関係する核酸切断剤により分子ブレーク・ライト・プローブの切断と、（ｂ） 関係するヌクレオチド−保護剤を追加することなく、関係する核酸切断剤による分子ブレーク・ライトの切断とを比較することにより観察及び測定することができる。関係する核酸切断剤、及び関係するヌクレオチド−保護剤の量を、変化させることができる。さらに分子ブレーク・ライトが、最も感受性が高く、そうしたシステムに対する第１の連続アッセイでも可能である。
【００４４】
関係する核酸切断剤に特異的な配列を結合するヌクレオチドを有する分子ブレーク・ライト・プローブが、技術的に周知な、たとえばヌクレオチドを操作するための技術を用いて行うことができる。分子ブレーク・ライトが、１本鎖と２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを共に含むよう、切断部位が、いずれかの種類のヌクレオチドに配置できる。１本鎖切断部位が、ループ構造に配置でき、そして２本鎖切断部位が、ステム構造に配置することができる。従って、１本鎖ヌクレオチドを切断する試薬と２本鎖ヌクレオチドを切断する試薬の両方によって切断するというアセスメントに、本発明の分子ブレーク・ライトが提供される。
【００４５】
本発明による分子ブレーク・ライト・プローブのオリゴヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はその組み合わせでも良い。修飾されたヌクレオチドが、たとえば、ニトロピロールに基づくヌクレオチド、又は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むことができる。さらに修飾された結合では、たとえばフォスフォロチオエイトを含む場合がある。したがって、分子ブレーク・ライト・プローブが、ヌクレオチドの広範囲のアレイを含むヌクレオチド部位に特異的な核酸切断剤による切断を評価するために設計され、そして使用することができる。
【００４６】
広い範囲の蛍光団が、本発明によるプローブ及びプライマーに使用することができる。利用可能な蛍光団が、クマリン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ルシファー・イエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ）、ロダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＯＤＩＰＹ、テトラメチルロダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、エロシン（ｅｏｓｉｎｅ）、テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）及びＲＯＸを含む。さらに、たとえばＬｅｅｔらによる（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：２８１６ 記載のフルオレセイン−ロダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）のダイマーなど、蛍光団の組み合わせも適切である。可視スペクトル又は紫外線又は赤外線範囲など可視スペクトルの範囲外に吸収及び発光させるよう、蛍光団を選択することができる。
【００４７】
本発明に使用する好ましい蛍光団が、利用可能な単色光源の波長範囲における強い吸収を有するいずれかの蛍光団を含む。たとえば、青色（４８８ｎｍ）を発光するアルゴンレザー又は青色の発光ダイオードが、励起光源として用いられると、フルオレセインが、卓越した蛍光団として利用することができる。青色範囲にて効果のある別の蛍光団が、３−（ｅ−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）である。これらの採集（ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）蛍光団として、発光蛍光団が、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−クロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシロダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ロダミン（ＲＯＸ）、テキサス・レッド、及び多くのシアニン染料でも可能であり、それらの吸収スペクトルがスペクトルを共有し、フルオレセイン及びＣＹＡの発光スペクトルと実質的に重合う。波長源が異なる場合、紫外線から赤外線までのスペクトルに沿うどの位置でも吸収及び発光するように、蛍光団を選択することができる。さらに化合物による蛍光団が、蛍光団として使用することも可能である。
【００４８】
消光剤は、励起された蛍光団に極めて近接して置かれると、ほとんど蛍光を起さないか、又は蛍光しない成分である。先行技術に記載されている適切な消光剤が、具体的にＤＡＢＳＹＬ、及びその変異体、たとえばＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＭＩ及びメチル・レッド（Ｍｅｔｈｌ  Ｒｅｄ）などを含む。さらに蛍光団が、別のある蛍光団に接触している時、蛍光状態を消光しやすいことから、消光剤として使用することも可能である。典型的な消光剤としては、ＤＡＢＣＹＬ又はマラカイト・グリーンなどの発色団、及びプローブが無傷の場合に検出範囲に蛍光しない蛍光団が含まれる。これら好ましい例における、蛍光団及び消光剤にて標識化されたこれらプローブは、無傷の場合「暗色」（つまり相対的にほとんど蛍光しないか、全く蛍光しない）であるが、切断した場合に蛍光するということである。無傷の場合の好ましいプローブの全蛍光量が、切断された場合のこれら全蛍光量の２０％より少ないことが好ましい。最も好ましくは、消光が完全であり、プローブが無傷の場合に蛍光団が、蛍光しないことである。
【００４９】
プローブが無傷の場合、ＦＲＥＴ対の成分が、密接な状態にて消光する相互関係である。最も好ましくは、２つの成分が互いに接触する。しかしながら、ステムの２重鎖に沿った単一塩基対により分離することは、ほぼ常に満足のいくものである。極めて大きな分離が、多くの例におけるつまり２−４塩基対又は５−６塩基対にて可能である。これら有意的に大きな分離に対し、ステム２重構造のラセン状の性質を、成分間の距離に及ぼす影響と考えるべきである。
【００５０】
蛍光団及び消光剤を、蛍光団が、プローブを形成する前に生体モノマー（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）上に提示されるか、又はこれらが適切なものとして、形成後のプローブに接合できるように適切な生体モノマー（（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）たとえばデオキシリボヌクレオチド）の機能形成によって、プローブに加えることができる。当業者に周知な種々の化学物質を使用し、蛍光団と消光剤との間の適切な間隔を確実に得ることができる。加えて蛍光団ホスホロアミダイト、たとえばフルオレセイン・ホスホロアミダイトを、ヌクレオシド・ホスホロアミダイトの換わりに使用することができる。こうした置換体を含むヌクレオチド配列が、置換にかかわらずその用語がこの開示及び添付の請求項に使用される「オリゴヌクレオチド」であると考えられる。
【００５１】
蛍光団と消光剤が、アルカリ・スペーサーを介してヌクレオチド上の異なる位置に結合することができる。その標識を、通常利用できるＤＮＡ合成試薬を用いて、オリゴヌクレオチドの内部、又は端末の位置に配置することができる。さらにその標識が、合成中の蛍光団成分に結合されたヌクレオチドを置換することによりオリゴヌクレオチドの内部の位置に、配置することも可能である。幾つかの炭素（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））のあるアルキル鎖を用いる通常利用可能なスペーサーを、上手く使用することができるが、さらに消光の程度及びエネルギー変換の規模を、スペーサーの長さを変えることにより最適にすることができる。
【００５２】
分子ブレーク・ライト・プローブは、多くの状況に有益である。たとえば、関係する切断剤が特異的である核酸の認識又は結合配列が知られている場合、その配列を有する分子ブレーク・ライト・プローブが、たとえば単独か又は核酸保護剤の存在下、切断剤の切断率を分析するために生成され、そして使用することができる。もう１つの例として、関係する切断剤が特異的である核酸の認識又は結合配列が知られている場合、その配列を有する分子ブレーク・ライト・プローブが、たとえば溶液、試料、又は生体における、たとえば切断剤の力価を評価するよう、生成及び使用することができる。
【００５３】
特定の試料として、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）などバクテイアの醗酵におけるカリキアマイシンなどの切断剤の存在又は力価が、本発明による分子ブレーク・ライト・プローブを用いて評価することができる。カリキアマイシンが、その試料中に存在するかどうか知りたい場合、カリキアマイシンに対する認識配列を有する分子ブレーク・ライト・プローブが、試料によりインキュベートすることができる。バックグラウンドを超えて蛍光が増大すれば、カリキアマイシンの存在を示すことになる。分子ブレーク・ライト切断の率が、切断剤の濃度に依存するために、試料中のカリキアマイシンのそうした濃度が、カリキアマイシン周知の濃度率、たとえば標準曲線に対する観察された率を比較することにより、評価することができる。
【００５４】
別な例として、特定の認識配列及び関係する切断剤が、結合又は相互作用することが知られているが、これらがどれほど強い相互作用か、又は切断が起こる率及び／又は効率であるか知られていない場合、相互作用する強度、効率及び／又は速度を評価するために、認識配列を有する分子ブレーク・ライト・プローブを、生成しそして使用することができる。
【００５５】
さらに本発明によるプローブ及び方法では、たとえば核酸切断剤の活性に対する最適条件の決定が所望される場合に、その使用が見出される。こうした例における関係する核酸切断剤により１本鎖型の分子ブレーク・ライト・プローブの切断が、異なる条件の基で評価される。変更できる条件として、温度、ｐＨ、緩衝液及び塩濃度、補因子の濃度などが含まれる。関係する他のパラメータが、当業者に対し容易に明らかになろう。
【００５６】
同様に本発明によるプローブ及び方法では、たとえば核酸切断剤に対する認識部位を決定すること、所定の認識部位に対する核酸切断剤の特異性を評価すること、又は異なる認識部位にて核酸切断剤による切断効率を比較することが所望される場合、その使用が見出だされる。さらに同じ配列を有する認識部位の切断であるが、プローブの位置の異なる場合も評価することができる。こうした例における関係する各認識部位又は有効な認識部位を含むプローブが、調製される。関係する切断剤によるプローブの切断効率及び切断率が決定されそして比較される。
【００５７】
一般的な核酸切断剤により複数の種類のプローブ切断を同時に評価することが、所望される場合、プローブが別々の容器における切断剤によりインキュベートすることができる。しかしながら、多くの異なった識別可能な蛍光団が、技術的に周知なことから、異なる蛍光団に対し各種類のプローブを結合させることを所望することができる。識別可能な蛍光団を使用することにより、単一の反応容器における共通の核酸切断剤により複数の種類のプローブ切断を同時に評価することができる。
【００５８】
特定の例における各プローブの切断が、別々の反応容器において行うことができる。別の例における複数のプローブの切断が、同じ反応容器にて行われ、そして好ましくは各種のプローブを異なる蛍光団に結合させ、そしてその蛍光団を、互いに識別できることである。
【００５９】
さらに別の例として、関係する切断剤の認識部位が解らない場合、切断剤は、それぞれが異なる認識配列を有する、多くの異なる分子ブレーク・ライト・プローブにて試験することができる。同様に、関係する認識配列を切断する切断剤を決定することが所望される場合、関係する認識配列を有する分子ブレーク・ライト・プローブを切断するための種々の切断剤を試験することができる。
【００６０】
複数の異なる分子ブレーク・ライト・プローブの切断が評価されるアッセイにおいて、幾つか異なるプローブが、使用可能な場合に異なる蛍光団に対し、それぞれ異なる分子ブレーク・ライト・プローブを結合させることによる複数のアッセイのための単一の反応チューブ又は他の容器を使用可能にし、そのそれぞれが、アッセイ条件下にて他と識別することのできるようにし、評価することができる。
【００６１】
さらに本発明による分子ブレーク・ライト・プローブが、基質に結合することができる。たとえば、マイクロアレイ技術を、基質上の周知の位置に分離すべき異なる種類のプローブを固定させるため使用することができる。マイクロアレイにより形成された位置データが、切断剤による複数種のプローブ切断のアセスメントを容易にする。異なる種類のプローブが、周知の位置に固定される場合、プローブの種類を識別すべき異なった蛍光団の使用が重要でないが、同時に研究できるプローブ種の数を有意的に増大させるために使用することができる。
【００６２】
分子ブレーク・ライト・プローブでは、酵素的と非酵素的核酸切断剤の比較における具体的な使用が見出される。カリキアマイシンなどの非酵素切断剤が、単一のターンオーバ事象（ｔｕｒｎｏｎｅｒ ｅｖｅｎｔｓ）に特に関与し、従って酵素触媒事象にこれらの直接的な比較が難しい。実際に実質的な論争が、一般に合成及び生物的触媒の最も簡単な比較に関して存在している。たとえばＪａｃｏｂｓｅｎ，Ｅ．Ｎ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：８５−９０（１９９４）を参照。
【００６３】
図１における天然に生成するエネジエン（カリキアマイシン，Ａ及びエスペラマイシン，Ｂ）、非エネジエン小分子剤（ブレオマイシン、Ｃ、メチジウムプロピル−Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｄ、及びＦｅ−ＥＤＴＡ、Ｅ）及び制限酵素エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの切断効率が評価され、そして比較された。
【００６４】
原理の証明として酵素的な切断：
酵素切断を介して設計された分子ブレーク・ライトの特異性が、ＢａｍＨＩを使用するアッセイにて実証された。ブレーク・ライトＢ （図２Ｂ、ＢａｍＨＩに対して特異的）だけは、制限酵素エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの存在下に切断すべきであるが、ブレーク・ライトＡ（図２Ｂ、カリキアマイシンに特異的）及びブレーク・ライトＢの両方が、非特異的ヌクレアーゼＤｎａｓｅＩにより消化されるべきである。予期されるように、図３ａは、Ｂによる蛍光だけの時間的依存性、及び［ＢａｍＨＩ］と依存性の増大を表しているが、Ａが３７℃で変化のないことを示している。（図３ｂ）が、［ＤｎａｓｅＩ］−依存性でもあるＤｎａｓｅＩにて消化される場合、ブレーク・ライトＡかブレーク・ライトＢのいずれかとの時間に対する蛍光強度の増大を表している。比較として、ブレーク・ライトのみ、又はＢＳＡの存在下におけるブレーク・ライトを含むコントロール試料では、３７℃にて２時間以上にわたり蛍光の変化が示されなかった。酵素のない状態にて蛍光の欠失を示すならば、指定されたブレーク・ライトが、指定されたアッセイ温度にて適切に溶融しないことを示している。さらに、これらの実験は、ブレーク・ライトＢに対しＢａｍＨＩによる特異的な切断を明らかに実証し、そしてＤＮＡの切断を評価すべき分子ブレーク・ライトの適用原理を表している。
【００６５】
興味深いことに、ＢａｍＨＩによる完全な切断により得られた蛍光の最大強度が、同じ濃度の分子ブレーク・ライトにてＤｎａｓｅＩの存在下に観察されたもののわずか７５％であった。さらに、ＢａｍＨＩ反応が完了した後にＢａｍＨＩを追加したが変化を示さなかったが、しかしＤｎａｓｅＩを追加するとさらに切断が生じ期待される１００％の蛍光最大値を与えた。この観察から、ＢａｍＨＩの消化によりＦＡＭに結合された状態のポリグアニジン尾部が、〜２５％だけ蛍光シグナルを消光することが示唆された。この知見に矛盾することなく、反応生成物のＰＡＧＥ分析を行うことで、ＤｎａｓｅＩの消化によって完全に変性されたＢａｍＨＩによる過剰処理後、３−塩基の突き出し（ｏｖｅｒｈａｎｇ）の存在が確認された。結果として、過剰なＢａｍＨＩにて観察される蛍光の最大値が、以下に記載のＢａｍＨＩの反応速度研究に関し１００％の切断を指摘した。
【００６６】
さらに定常状態におけるＢａｍＨＩの反応速度の決定及び感受性の限界が、評価された。非特異的ヌクレアーゼの連続アッセイが、遺伝子染色体のＤＮＡ（たとえば音波にて破砕されたニシンの精子ＤＮＡ）切断の関数としてΔＡ２６０に基づいているが、連続制限酵素エンドヌクレアーゼ・アッセイに関し、わずかな例しか報告されていなかった。従って、大部分の制限酵素エンドヌクレアーゼの定常状態における反応速度の決定が、放射性ＤＮＡプローブを用いる電気泳動、及びその後のホスフォ画像解析（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いる非連続性アッセイに依存していた。これを適応するための分子ブレーク・ライトの実用性を実証するために、商業的に利用できるＢａｍＨＩに定常状態における反応速度パラメータが決定された。本アッセイにおいて、基質濃度よるＢａｍＨＩの加水分解の依存性が、Ｂの固定した量、と広い基質濃度範囲にわたる類似する非標識化オリゴヌクレオチド（ＦＡＭとＤＡＢＣＹＬが共に存在せず）の変化させた量との混合物を用いて検討した。「担体希釈（ｃａｒｒｉｅｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）」の現象により観察された明らかな競合的な阻害化が、前の記載のように適切な反応速度パラメータを得るために補正された。たとえば、Ｒｏｙ，Ｋ．Ｂ．，らのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０：１６０−１６４（１９９４）を参照。
【００６７】
図４ａに示すように、速度の真値が実際的に増大しているが、速度曲線が、非標識化のオリゴヌクレオチドによる担体希釈（ｃａｒｒｉｅｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）の理由から、開始基質濃度の増大にともない減少する。観察速度（Ｖａｐｐ）が、実速度（式［Ｉ］によるＶａｃｔ、この場合［Ｓａｃｔ］と［Ｓ＊］は、それぞれ全基質濃度とＢの濃度である）に関係する。この現象のための補正後の逆数プロット（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｐｌｏｔ）が、図４ｂに示されている。
【００６８】
図４ｂから、決定されたＫｍ＝８．９±０．５ｎＭ、及びＶ  ｍａｘ＝０．０２４±０．００１ｎＭ ｓｅｃ−１である。一方でＫｍ＝０．４ｎＭ、及びＶ  ｍａｘ＝０．００９ｎＭ ｓｅｃ−１のＢａｍＨＩに対する前に記載された値とわずかに相違するが、制限酵素エンドヌクレアーゼの反応速度パラメータが、オリゴヌクレオチドの基質により有意的に変化する。なを３種の異なる商業的なＢａｍＨＩの資源の試験（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ａｎｄ ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）では、極めて明確に相違する特異的活性（（ほぼ１０倍の範囲内にて）ｒａｎｇｉｎｇ ｒｏｕｇｈｌｙ ａｎ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）が得られたことを、認識すべきである。従って記載の反応速度パラメータの差が、酵素の調製、及び商業的アッセイの緩衝液の相違を、単に反映している可能性がある。酵素ＤＮＡ切断の反応速度パラメータを評価するための最も重要な分子ブレーク・ライトの有用性が、実証された。さらにこうした手法が、分子ブレーク・ライト・ステム構造内に見出される認識配列の単なる変化による任意のエンドヌクレアーゼの方に向けられる可能性が期待される。
【００６９】
最近、０．８ｎＭの双方蛍光団と標識化されたｄｓＤＮＡ、及び非常に特殊化されたＦＣＳ分光計を用い、制限酵素エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩに向けた蛍光相関分光（ＦＣＳ）アッセイでは、１．６ｐＭのＥｃｏＲＩが検出限界であることが、記載されていた。Ｋｅｔｔｌｉｎｇ Ｕ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４１６−１４２０（１９９８）を参照。ほんのわずかのオリゴヌクレオチドしか含まない（０．８ｎＭの分子ブレーク・ライト）条件下での切断が、３．７ｐＭまでのＢａｍＨＩに容易に検出することができる。さらに、このアッセイのノイズに対するシグナルが有意に低いことにより、分子ブレーク・ライト濃度か増大するにつれ（３４ｎＭ），検出限界がｆＭ範囲（０．１２ｐＭのＢａｍＨＩ）に低下した。
【００７０】
さらにエネジエンを触媒とする切断が、アセスされた。ＤＮＡのエニジエン切断前のアッセイが、放射性ＤＮＡプローブ、電気泳動、その後のホスフォ画像解析（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いる非連続アッセイに依存した。対照的に、本発明の分子ブレーク・ライトを用いることによって、アッセイが、高い感度による実時間にて、特異的エネジエンによるＤＮＡ切断の程度を、直接たどることができる。実証のため図５ａ及び図５ｂでは、過剰な誘導活性剤ＤＴＴの存在下、カリキアマイシンかエスペラマイシンのいずれかを伴うエデノヂン濃度依存によるブレーク・ライトＡの切断が、示されている。記載の条件下このアッセイでは、ｐＭ範囲のカリキアマイシンの検出が可能である。この感度は、ＤＮＡ損傷剤の検出における選択方法である、生物化学誘発アッセイ（ＢＩＡ）の感度に匹敵する。たとえば、Ｒｏｙ，Ｋ．Ｂ．らのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０：１６０−１６４（１９９４）を参照。
【００７１】
さらに、鉄依存性試薬にて実証されているように、この感度が、アッセイにおける分子ブレーク・ライトの濃度を単に増大させること事により、有意に増強することができる。カリキアマイシンかエスペラマイシンのいずれかにより３．２ｎＭのブレーク・ライトＡを切断することにより得られた観察の最大蛍光値が、ＤｎａｓｅＩによる、観察の蛍光値と同一であり、オリゴヌクレオチドの完全な変性と矛盾していなかった。コントロールとして、ＤＴＴ又はエネジエンだけのいずれかにより分子ブレーク・ライトＡをインキュベーションすると、蛍光の変化が現れなかった。さらに、カリキアマイシンの「特異性」に関する幾つかの議論はあるが、ブレーク・ライトＢが、カリキアマイシンによって同じ率で切断された。このことは、カリキアマイシンの特異性が、この内容に有意に依存するが、おそらくそうしたＤＮＡ配列に依存性が少ないという見解を裏付けるものである。なを、カリキアマイシンが、顕著な２本鎖切断を引き起こし、他方エスペラマイシンが、１本鎖の切れ目（ｎｉｃｋｓ）を与えるが、現段階の分子ブレーク・ライト・アッセイでは、これら２つの現象を区別することができないということにも注意すべきである。
【００７２】
興味深いことに、エネジエン分子ブレーク・ライト・アッセイにおいて、２の異なる率が観察された。１番目（０−５０秒）が、エネジエンの活性化に帰属される最も可能性の高いラグ時間であり、２番目（５０−２００秒）が、ＤＮＡ切断の開始速度を示している。ＤＴＴとエネジエンを最初に１−５分間、プレインキュベートし、その後基質オリゴヌクレオチドを付加することにより開始することを、さらにこれを確認するためのアッセイを行った。これらプレインキュベーション実験における前に観察された活性化に帰属される「ラグ・タイム」が、もはや明示されないが、ＤＮＡ切断の開始速度が、標準アッセイに決定された速度と同一である。有意的に長い時間（３０分を超える）をプレインキュベーションすると、同様の現象が現れ、「活性化された」エネジエンが、おそらく前に推定されるよりも水溶性好気環境において有意的に安定であることを示唆している。たとえばＴｈｏｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，らのＢｉｏｏｒｒｇａｎ．Ｃｈｅｍ．２７：１７２−１８８（１９９９）を参照。
【００７３】
Ｆｅ＋２による依存性試薬によって触媒とされる切断が評価された。さらに分子ブレーク・ライトの有用性を実証するために、Ｆｅ＋２による依存性試薬によって触媒とされるＤＮＡ切断を評価できることが、研究された。選択される試薬には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓからの代謝産物、ブレオマイシン、図１ｃ、及び２種のＤＮＡフットプリンテング試薬であるメチジウムプロピル−Ｆｅ−ＥＤＴＡ（ＭＰＥ）、図１ｄ、及びＦｅ−ＥＤＴＡ、図１ｅが含まれる。ブレオマイシンによるＤＮＡ切断の明確な機構がまだ論争中であるが、ＭＰＥ及びＦｅ＋２−ＥＤＴＡが、最終的に酸化によるＤＮＡ切断に寄与する拡散可能なヒドロキシ・ラジカルの生成によりＤＮＡを切断する。さらにこれら３種のうちブレオマイシンが、強力な小溝結合構造を含むが、ＭＰＥが、ＤＮＡ介在物を携行（ｃａｒｒｉｅｓ）する。前のエネジエン・アッセイのように、これら試薬により切断するための記載のアッセイが、非連続系に全て依存していた、したがって分子ブレーク・ライトが、明らかな利点を提示すべきである。図６は、試薬濃度依存によるブレーク・ライトＡの切断を示している。記載された条件下にてこのアッセイでは、ブレオマイシンのｎＭ範囲の検出が可能であり、それが生化学誘導アッセイ（ＢＩＡ）に及ぼすわずかな感度の増大を表し、そして天然に形成されるＤＮＡ損傷試薬の生成を検出するための性能の高いこのアッセイを繰り返し行うことができる。
【００７４】
効率の低い試薬Ｆｅ＋２−ＥＤＴＡへの感度を増大させるために、オリゴの濃度を１０倍（３２ｎＭ）増大した、図６ｄ。さらに比較としてＭＰＥを、この分子ブレーク・ライト濃度を有意的に高くして試験した、図６ｃ。最後にＭＰＥ及びＦｅ＋２−ＥＤＴＡによってＤＮＡを効率よく切断するには、アスクロビン酸が必須であるが、アスクロビン酸を付加しても、ブレオマイシンによるＤＮＡ切断に影響を与えなかった。
【００７５】
カリキアマイシンによる切断の防止とＣａｌＣによる保護が評価された。
【００７６】
カリキアマイシンが、２本鎖ＤＮＡ切断をもたらし、そしてＣａｌＣがｉｎ ｖｉｖｏにおけるカリキアマイシンへの抵抗性を提供すれば、ｉｎ ｖｉｔｏｒｏにおけるカリキアマイシンによる誘導ＤＮＡ切断アッセイにＣａｌＣを加えると、ＤＮＡの切断を阻害することが期待された。この理論を試験するための予備アッセイが、鋳型としてスーパコイル状のｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡ（「ｐＢＳ」）、及び還元開始剤（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）としてデチオセリオール（「ＤＴＴ」）により行われた。典型的なアッセイにおける精製されたｍｂｐ−ＣａｌＣ（１５．０ｎＭ）（マルトース結合タンパク質−ＣａｌＣ融合タンパク質として生成されたＣａｌＣ）及び３０．０ｎＭのカリキアマイシンを、全量２５μＬ，４０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌにて、ｐＨ７．５，３７℃で１５分間プレインキュベートした。
【００７７】
次に２．５μ、１０ｍＭのＤＴＴストック溶液をアッセイ溶液に加え、そのアッセイ溶液をさらに１時間、３７℃にてインキュベートした。ＤＮＡ断片を、臭化エチジウムにて染色された１％のアガロース・ゲルを電気泳動にかけて評価した。このアッセイを用いたｍｂｐ−ＣａｌＣが、カリキアマイシンよりほぼ１０３倍近く過剰な濃度にて、カリキアマイシンにより誘発されるＤＮＡの切断を、完全に阻害できることが見出された。ｍｂｐ−ＣａｌＣ及びＤＴＴのプレインキュベーション、強制的透析によるタンパク質の除去、及びその後の還元剤としてＤＴＴ溶液の使用が、ＤＮＡ切断量に判別できるほど影響を与えなかった。
【００７８】
図７に示すように、ＤＮＡの切断が、ＤＴＴ又はカリキアマイシン（レーンａ及びｂ）のない状態で全く観察されなかったが、ＤＴＴ及びカリキアマイシン（レーンｃ）の存在下では、ＤＮＡの効率的な切断が実証された。予期されるように、ｍｂｐ−ＣａｌＣを付加すると、カリキアマイシンにより誘発されたＤＮＡ切断（レーンｆ）が完全に阻害されたが、コントロールとしてｍｂｐだけの付加（レーンｄ）した場合、カリキアマイシンにより誘発されたＤＮＡの切断を阻害することができなかった。さらには、ＤＴＴ（示されていない）を伴うｍｂｐ−ＣａｌＣ又はａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣ（Ｆｅ補因子の欠失）（レーンｅ）のプレインキュベーションが、カリキアマイシンにより誘発されたＤＮＡの切断を阻害することができなかった。しかしながらＦｅ＋２又はＦｅ＋３をａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣアッセイに加えると、ＣａｌＣ活性（レーンｇ）を再構築することができる。ａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣの再構築が、前に記載の活性化アッセイを行う前に、１ｍＭのＦｅＳＯ４（Ｆｅ２）又はＦｅＣｌ３（Ｆｅ＋３）によるプレインキュベーションにて行われた。
【００７９】
カリキアマイシンを介在するＤＮＡ切断のＣａｌＣによる阻害を試験した。実験のための２種の分子ブレーク・ライトを図２に示す。
【００８０】
ブレーク・ライトＡが、周知のカリキアマイシン認識配列５’−ＴＣＣＴ−３’を含む１０塩基対から成り、ブレーク・ライトＢが、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ認識配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を携行（ｃａｒｒｉｅｄ）した。さらにブレーク・ライトＢの長さは、ＢａｍＨＩ認識のため必要な３塩基対の突き出し（ｏｖｅｒｈａｎｇ）が要件と考えられ、ブレーク・ライトＡのステム構造が、比較可能な長さ及び溶融温度に調整された。両プローブのループが、非ハイブリダイズの相互作用を確実にするためにＴ４ループから成る。両プローブの５’蛍光団が、フルオレセイン（ＦＡＭ、吸収ＭＡＸ＝４８５ｎｍ、発光ＭＡＸ＝５１７ｎｍ）であり、対応する３’消光剤が、４−（４’−ジメチルアミノフェニラゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）であった。図８は、カリキアマイシンによりブレーク・ライトＡの、そしてＢａｍＨＩによりブレーク・ライトＢの切断を表している。
【００８１】
図９に示すように、ＣａｌＣが、ブレーク・ライト・アッセイにおけるカリキアマイシンが介在するＤＮＡの切断を直接阻害する。３．６ｐＭのブレーク・ライトＡを、ＣａｌＣの量を増大させながら３．５ｎＭのカリキアマイシンと共インキュベートした。カリキアマイシンの完全な阻害を、ＣａｌＣをほぼ２．５倍過剰にし実現した。ＣａｌＣは、エスペラマイシンにより誘発されるＤＮＡの切断（示されていない）に影響を与えなかった。
【００８２】
試験された種々の試薬による切断を比較した。カリキアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、ＭＰＥ、及びＦｅ＋２−ＥＤＴＡに対するターンオーバ（ｔｕｒｎｏｖｅｒ（Ｖａｐｐ／［切断剤］））の直接の関係により、［分子ブレーク・ライトＡ（図２Ｂ）］＝３．２ｎＭ（少なくとも７６．８ｎＭの切断部位を示している）の場合の最大ターンオーバ（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）が、エネジエンに対して０．７８−１．６ｎＭ、ブレオマイシンに対して２．５ｎＭ及びＭＰＥに対して１２５ｎＭの範囲にて生成されることが、明示されている。分子ブレーク・ライトの有意的に高い濃度、［Ａ］＝３２ｎＭの場合、最大ターンオーバ（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）が、ＭＰＥに対し５０ｎＭ及びＦｅ＋２−ＥＤＴＡに対し１．３μＭの範囲にて生成する。
【００８３】
これらの最大ターンオーバ（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）値を、オリゴヌクレオチドの両濃度でアッセイされたＭＰＥが、両組みの共通試薬として使用するＤＮＡ切断剤のこの極めて多様な群の切断効率を関連付けるために表１に一覧として記載した。
【００８４】
表１では、Ｆｅ＋２−キレート化領域に介在物（ＭＰＥ）を加えると、Ｆｅ＋２ＥＤＴＡ（図１Ｅ）と比較して切断効率がほぼ１０３倍増強し、特異的な小溝結合剤ブレオマイシンを加えると、その効率がさらに１０倍増大する。カリキアマイシン及びエスペラマイシンの切断効率が、ほぼ同じであるが、ブレオマイシンより約１０倍増強することが、最終的に酸化により切断に導くＤＮＡ骨格のラジカル形成における水素の分離（鉄依性存試薬から形成される分散可能な活性ラジカル種に対して）によるためと考えることができる。
【００８５】
ＢａｍＨＩのＫｃａｔが、エスペラマイシンの観察される最大ターンオーバ（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）に同一であるような、これら大型のエネジエンが、酵素と同程度の効率であることを、実質的には表１が表している。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
さらに定義されているものを除いて、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により通常に理解できるものと同じ意味を有する。
【００８８】
上記開示から理解できるものとして、本発明は、多様な適応例を有する。従って、以下の試料が図示された方法により提供され、限定を意図するものではない。
【００８９】
実施例
材料及び方法
材料：記載の研究に利用した全てのオリゴヌクレオチドを、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬより購入した。エスペラマイシンが、親切にもＫｉｎ Ｓｉｎｇ（Ｒａｙ）Ｌａｍ博士，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂからの贈答で、そしてブレオマイシン硫酸塩（ブレノキサン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ））が、親切にもＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓ， Ｂｅｎ Ｓｈｅｎ教授より提供された。Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから、カリキアマイシンが提供された。記載されている他の全ての試薬を商業的供給源より得た。
【００９０】
蛍光分光測定法： ＤａｔａＭａｘ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．；Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）を備えたフルオロマックス−２分光蛍光計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２ ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）にて、試料を分析し、温度をＨａａｋｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ ＤＣ１０にて制御（３０℃、さらに特記すべき点以外）した。分析する前に全試料を濾出させて、そして全容量２ｍＬにおいて、磁気攪拌棒を取り付けたＳｕｐｒａｓｉｌ ｑｕａｒｔｚ ｃｕｖｅｔｔｅ（１０ｍｍ ｐａｔｈ）におけるタイムベース・スキャン（λεｘ＝４９５ｎｍ，λｅｍ＝５１７ｎｍ）を介して分析した。１０分以上の定常状態の背景発光により明示されるように、反応を、ＤＮＡ切断の開始前のインキュベーション温度で平衡にした。ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により確認された標識化オリゴヌクレオチドの全切断を、飽和された切断条件下にて最大蛍光発光の可能性として定義した。発光単位が、手順内に用いられる標識オリゴヌクレオチドの量に変換され、これにより、蛍光発光の関数としての標識化オリゴヌクレオチド変性化と等しい。
【００９１】
実施例１：分子ブレーク・ライトの設計及び構造
２種の分子ブレーク・ライト・プローブが、記載の実験のため準備された。図２Ｂである。分子ブレーク・ライトＡは、周知のカリキアマイシン認識配列５’−ＴＣＣＴ−３’を含む１０塩基対のステム構造を含んだ。たとえば、Ｚｅｉｎ，ＮらのＳｃｉｅｎｃｅ ２４４：６９７−６９９（１９８９）を参照。分子ブレーク・ライトＢは、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ認識配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を誘導（ｃａｒｒｉｅｄ）した。たとえばＶａｎ ＤｙｋｅらのＮｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：５５５５−５５６７（１９８３）を参照。さらにブレーク・ライト・プローブＢの長さの設計は、ＢａｍＨＩ認識に必要とされる３塩基対の突き出し（ｏｖｅｒｈａｎｇ）の調製を考慮し検討した。ブレーク・ライトＡのステム構造を、ブレーク・ライトＢの構造と比較可能な長さ及び溶融温度に調整した。両プローブのループが、非ハイブリットの相互作用を確実に行うようＴ４ループから成る。さらに、Ａ及びＢのヌクレオチド配列を有するが、蛍光団又は消光剤を有しないコントロールを構成した。
【００９２】
両プローブの５’−蛍光団は、フルオレセイン（ＦＡＭ，吸光度ｍａｘ＝４８５ｎｍ、発光度ｍａｘ＝５１７ｎｍ）であるが、相当する３’消光剤は、４−（４’−ヂメチルアミノフェニラゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）であった。前の研究では、分子標識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）中恒常的消光剤として使用するＤＡＢＣＹＬが示され、そしてＦＡＭの発光スペクトルとＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルとの間に有意なスペクトルの重なり（１．０２ｘ１０−１５Ｍ−１ｃｍ３）がある。典型的な分子標識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）において、典型的な相補性オリゴヌクレオチド対のＦＲＥＴ−ｂａｓｅｄアッセイと比較されるように、ノイズに対するシグナル（ｓｉｇｎａｌ）比を有意に増強するならば、ＦＲＥＴを介するこの対の消光効率が、特に完全となる（９９．９％）ことが示された。たとえば、Ｔｙａｇｉ，Ｓ．らの（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−３０８、Ｔｙａｇｉ，Ｓ．，らの（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３を参照。
【００９３】
実施例２：ＢａｂＨＩによる消化：原理の証明として酵素による切断
ＢａｍＨＩによる分子ブレーク・ライト・プローブＡ及びＢの切断を研究した。最初のアッセイにおいて、分子ブレーク・ライトＡ及びブレーク・ライトＢを、１００ＵのＢａｍＨＩによりそれぞれインキュベートした。さらにコントロールとして、ブレーク・ライトＢを、酵素なしでインキュベートした。そのインキュベート化は、１０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのＤＴＴを含む溶液中、ｐＨ７．９、３７℃にて生じた。
【００９４】
第２のアッセイにおいて、分子ブレーク・ライトＡ及びブレーク・ライトＢを、１０ＵのＤｎａｓｅＩによりそれぞれインキュベートした。コントロールとして、さらにブレーク・ライトＡを、酵素なしでインキュベートした。そのインキュベート化は、４０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、及び１ｍＭのＣａＣｌ２を含む溶液中、ｐＨ８．０、３７℃にて起こった。
【００９５】
図３Ａは、Ｂによる蛍光だけの時間依存及び［ＢａｍＨＩ］依存の増大を表し、ＢａｍＨＩでインキュベートされたＡが、３７℃で変化しないことを示している。図３Ｂは、ブレーク・ライトＡがＤｎａｓｅによりインキュベートされた時、とブレーク・ライトＢがＤｎａｓｅによりインキュベートされた時の両方の時間に対する［ＤｎａｓｅＩ］依存の蛍光の増大を表している。
【００９６】
比較としてブレーク・ライトだけ、又はＢＳＡ存在下のブレーク・ライトを含むコントロール試料では、２時間を超える時間にわたり、３７℃で蛍光の変化がないことを示した。
【００９７】
試料３：ＢａｍＨＩ定常状態の反応速度の決定及び感度の限定
ＢａｍＨＩ（１０単位／μＬ）の特異的切断の決定が、６ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、１００ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＤＴＴ中、ｐＨ７．５、３７℃で、３．２ｎＭの分子ブレーク・ライトＢ（図２Ｂ）により、及び蛍光団及び消光成分の存在しないＢａｍＨＩに特異的なオリゴヌクレオチドの量を変えて行なわれた。全基質濃度（ブレーク・ライトを含む）が下記のよう、すなわち３８９ｎＭ、１９６ｎＭ、８１ｎＭ、４２ｎＭ、１１ｎＭ、７．５ｎＭ、及び３．４ｎＭであった。
【００９８】
反応が１０ＵのＢａｍＨＩ酵素にて開始され、そして蛍光分光法により１５分の時間経過にわたり監視した。ＤＮＡ切断の開始速度を、開始お最初の１００秒以内にてデータから、後で式１により調整し決定した。これらの調整値を、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ反応速度パラメータが決定される逆数プロット（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｐｌｏｔ）として利用した。
【００９９】
2004515229.tif 000003
商業的に利用できるＢａｍＨＩ用の定常状態の反応速度パラメータが決定された。ＢａｍＨＩ加水分解の基質濃度の依存が、広い基質濃度範囲にわたり、ブレーク・ライトＢの一定量と同様の非標識化オリゴヌクレオチド（ＦＡＭとＤＡＢＣＹＬが共にない）の量を変えた変動量との混合物を用いて研究した。「担体希釈（ｃａｒｒｉｅｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）」の現象により観察された見かけによる競合的な阻害を、適切な反応速度パラメータを与えるために修正した。例えばＲｏｙら（１９９４）を参照。
【０１００】
図４Ａに示されているように、真の速度が、非標識化オリゴヌクレオチドによる担体の希釈により実際に増大していたが、速度曲線による速度が、開始基質濃度の増大につれて減少する。観察された速度（Ｖａｐｐ）は、式［Ｉ］による実質速度（Ｖａｃｔ）に関係し、その場合［Ｓａｃｔ］及び［Ｓ＊］は、それぞれ全基質濃度及びＢ濃度である。この「担体希釈」現象のための補正後の逆プロットが、図４ｂに示されている。
【０１０１】
図４ｂから、決定値Ｋｍ＝８．９±０．５ｎＭ及びＶ最大（ｍａｘ）＝０．０２４±０．００１ｎＭｓｅｃ−１である。これらの値が、前に記載されたＢａｍＨＩのＫｍの値（Ｋｍ＝０．４ｎＭ及びＶ最大（ｍａｘ）＝０．０００９ｎＭ ｓｅｃ−１と僅かに相違するが、制限酵素エンドヌクレアーゼの反応速度パラメータが、オリゴヌクレオチド基質に有意的に依存し変化する。さらに３種類の異なる商業的な供給資源のＢａｍＨＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ及びＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）の試験では、顕著に相違する特異的活性（ほぼ１０倍までの範囲）が示された。従って、記載されている反応速度介在変数の相違すると、酵素の調製及び商業的なアッセイ緩衝液の相違にも単に反映する場合もあった。
【０１０２】
最近における０．８ｎＭの二重の蛍光団−標識化ｄｓＤＮＡ及び特殊性の高いＦＣＳ分光計を使用する制限酵素エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ用の蛍光相関分光学（ＦＣＳ）アッセイでは、１．６ｐＭのＥｃｏＲＩが検出限界であることを、Ｋｅｔｔｌｉｎｇ．Ｕらにより記載されている。極めて僅かのオリゴヌクレオチド（０．６８ｎＭの分子ブレーク・ライト）を含む条件下にて切断が、３．７ｐＭのＢａｍＨＩまで容易に検出することができる。さらにこのアッセイのノイズに対し有意的に低いシグナルにより、分子ブレーク・ライト濃度（３４ｎＭ）が増大すると、検出限界がｆＭ範囲（０．１２ｐＭのＢａｍＨＩ）まで低下した。このアッセイを、この試料における他のアッセイと同じ条件により行った。
【０１０３】
実施例４：エネジエンにて誘発される切断
本発明の分子ブレーク・ライト・プローブを、有意的に高い感受性により実時間における特異的エネジエンによるＤＮＡ切断の程度を直接に追跡するために使用した。濃度を変えた（０．３１、０．７８、１．６、１５．９及び３１．７ｎＭ） エネジエン抗生作用としてのカリキアマイシン及びエスペラマイシンを、４０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）中、３．２ｎＭのカリキアマイシン−特異的標識化分子ブレーク・ライト・オリゴヌクレオチド（Ａ）を伴いインキュベートした。ＤＮＡの切断を、５０μＭＤＴＴの最終濃度を生成すべき１μＭＬ，１００ｍＭのジチオセリオール（「ＤＴＴ」）をさらに加えて開始し、そして反応を分光蛍光法により１０分間にわたって監視した。２種のコントロールが使用された、すなわち分子ブレーク・ライトＡを、エネジエンの存在しない状態でＤＴＴによるか、ＤＴＴの存在しない状態でエネジエンによるかのいずれかでインキュベートした。
【０１０４】
擬似的な１次反応速度パラメータが、それぞれ所定のエネジエン濃度にて開始速度を決定するために使用された。特にデータの図式表示は式２に基づき、この場合、［Ａ］ｔは、所定時間（ｔ）にて切断されるオリゴヌクレオチドの濃度であり、そして［Ａ］０は、そのアッセイにおけるオリゴヌクレオチドの初期濃度である。最小二乗解析では、スロープ（ｋ）、又は速度が示され、式３における相互関係によりＶに変換される。次に達成される最大速度（Ｖｍａｘ）が、試験される濃度範囲から選択された。
【０１０５】
2004515229.tif 000004
図５Ａ及び図５Ｂは、過剰な還元性活性剤ＤＴＴの存在下、カリキアマイシン（図５Ａ）又はエスペラマイシン（図５Ｂ）のいずれかによるブレーク・ライトＡのエネジエン濃度依存切断を表している。記載の条件下このアッセイでは、カリキアマイシンをｐＭの範囲にて検出が可能である。蛍光の変化は、ＤＴＴかエネジエンだけのいずれかと、分子ブレーク・ライトＡとのインキュベーションしたコントロールにおいて全く観察されなかった。さらにブレーク・ライトＢを、カリキアマイシンによりブレーク・ライトＡの速度と同じ速度にて切断した。
【０１０６】
２種類の異なる速度が、エネジエン分子ブレーク・ライト・アッセイにおいて観察された。第一期（０−５０秒）は、極めてエネジエン活性に帰属される可能性のあるラグ時間であり、第二期（５０−２００秒）は、ＤＮＡ切断の開始速度を示している。これを確認するためにアッセイが確立され、さらにそれには、ＤＴＴ及びエネジエンを最初に１−５分間プレインキュベートし、次に基質オリゴヌクレオチドを加え開始することである。これらのプレインキュベーション実験において、前に観察された活性化に帰属される「ラグ・タイム」が、もはや明らかではないが、ＤＮＡ切断の開始速度が、標準アッセイで決定されるものと同一であった。有意的に長い期間（３０分以上）のプレインキュベーションが、同じ現象を示した。
【０１０７】
実施例５：ブレオマイシンにて誘発される切断
Ｆｅ＋２−依存核酸切断剤であるブレオマイシンは、スプレプトマイシン・バチシルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）からの天然の代謝産物である。ブレノキサン（約７０％のブレオマイシンＡ２及び３０％のブレオマイシンＢ２を含む混合物）を、水に溶解させ、所望により標準化（ε２９１＝１．７ｘ１０４Ｍ−１ｃｍ−１）させる。ブレオマイシン介在の切断を、ＧｉｌｏｎｉらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：８６０８−８６１６（１９８１）に記載されている方法から適用した。３．２ｎＭの分子ブレーク・ライトＡを用い、幾つか濃度の異なる（２００ｎＭ，１００ｎＭ，５０ｎＭ，２５ｎＭ，１２．５ｎＭ，５ｎＭ及び２．５ｎＭ）ブレオマイシンを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２．５ｍＭのアスクロビン酸中、ｐＨ７．５及び３７℃にて３．２ｎＭの分子ブレーク・ライトＡによりインキュベートした。
【０１０８】
その反応を、６５ｍＭのＦｅ（ＩＩ）を加えて開始し、５分間にわたり監視した。この手順を、上記条件による５ｍＭのアスクロビン酸ナトリウムを加えることにより繰り返した。擬似的な一次反応速度パラメータが、前の記載のようにそれぞれ所定のブレオマイシン濃度にて、開始速度を決定するために使用された。
【０１０９】
図６Ａは、ブレノキサンによる試薬濃度依存のブレーク・ライトＡの切断を表している。記載の件下にてこのアッセイでは、ブレオマイシンがｎＭ範囲にて検出することができる。アスクロビン酸が、ＭＰＥ及びＦｅ＋２−ＥＤＴＡによる有効なＤＮＡ切断に極めて重要であるが、ブレオマイシンによる効果的なＤＮＥ切断には、アスクロビン酸を加えも影響を及ぼさない。
【０１１０】
実施例６：鉄（ＩＩ）−キレータで誘発される切断
２種のＤＮＡ−フットプリント試薬であるメチジウムプロピル−Ｆｅ−ＥＤＴＡ（ＭＰＥ）（図１Ｄ）及びＦｅ＋２−ＥＤＴＡ（図１Ｅ）によるヌクレオチドの切断を、分子ブレーク・ライト・プローブを用いて評価した。ＭＰＥ及びＦｅ＋２−ＥＤＴＡが、酸化によるＤＮＡ切断に最終的に寄与する分散可能なヒドロキシ・ラジカルの生成を介しＤＮＡを切断する。
【０１１１】
加水分解及び酸化を防止するためＦｅ含有溶液の全てを、１ｍＭのＨ２ＳＯ４を伴う（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２により日々新鮮に調製した。ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）を介在するオリゴヌクレオチドの変性には、ＴｕｉｉｉｕｓらのＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：３８０−４１３（１９９１）に記載の方法が適応された。
【０１１２】
第１のアッセイにおいて、３．２ｎＭのブレーク・ライトＡを、４０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ及び２．５ｍＭのアスクロビン酸にて、３７℃及びｐＨ７．５でインキュベートした。
【０１１３】
種々の濃度に対する１．２：１モル比にてＭＰＥ／Ｆｅ（ＩＩ）を加えることにより、切断が開始された。最終的なＦｅ（ＩＩ）の濃度が、８μＭ、４μＭ、２μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、及び１２５ｎＭであった。結果を図６Ｂに示す。
【０１１４】
第２のアッセイにおいて、３２ｎＭの分子ブレーク・ライトＡを、４０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）及び２．５ｍＭのアスクロビン酸ナトリウムをｐＨ７．５及び３７℃にてインキュベートした。種々の濃度に対する１．２：１モル比にてＭＰＥ／Ｆｅ（ＩＩ）を加えることにより、切断が開始された。最終的なＦｅ（ＩＩ）の濃度が、５０ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、及び２μＭであった。結果を図６Ｃに示す。
【０１１５】
第３のアッセイにおいて、３２ｎＭの分子ブレーク・ライトＡ（カリキアマイシン特異的分子ブレーク・ライト・オリゴヌクレオチド）が、４０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）及び２．５ｍＭのアスクロビン酸ナトリウムをｐＨ７．５及び３７℃にてインキュベートした。種々の濃度に対する２：１のモル比にてＥＤＴＡ／Ｆｅ（ＩＩ）を加えることにより、切断が開始された。最終的なＦｅ（ＩＩ）の濃度が、１２．５μＭ、６．３μＭ、３．１μＭ及び１．３μＭであった。結果を図６Ｄに示す。ＭＰＥ−Ｆｅ（ＩＩ）を介在する変性には、Ｖａｎ Ｄｙｋｅ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：５５５５−５５６７（１０８３）に記載の方法が適応された。擬似的一次反応速度パラメータが、前の記載のようにそれぞれ所定の試薬濃度にて、開始速度を決定するために使用された。
【０１１６】
図６が、ブレーク・ライトＡの試薬濃度依存切断を示している。効率の有為的に少ない試薬Ｆｅ＋２−ＥＤＴＡに対し感受性を増大させるために、オリゴの濃度を１０倍（３２ｎＭ）、（図６Ｄ）増大させた。比較として、さらにＭＰＥもこの有意的に高い分子ブレーク・ライト濃度にて試験した（図６Ｃ）。
【０１１７】
実施例７：カリキアマイシンによる切断の防止−ＣａｌＣによる超コイル・プラスミドの保護
カリキアマイシン遺伝子クラスター内に見出され、カリキアマイシンによる変性からＤＮＡを保護するためのＣａＬＣが知られている。「Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ａｎｄ ｓｅｌｆ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｈｅｒｅｔｏ」という題名の公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ／００／３７６０８に記載されたように、ＣａＬＣが生成された。
【０１１８】
図７Ａが、精製されたｍｂｐ−ＣａｌＣのＵＶ−可視吸収スペクトラのグラフである。精製されたｍｐｂ−ＣａｌＣを、以下の溶液、すなわち５２μＭのｍｐｂ−ＣａｌＣ、１０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｐＨ７．５にて分析した。挿入図としては、ＣａｌＣのＸ−バンドＥＰＲ分析における低温（４．３Ｋ）の結果を示している。１モルのＣａｌＣ当り０．５モルのＦｅを含む２５０μのｍｐｂ−ＣａｌＣが、１０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｐＨ７．５にて分析した。分光計の設定は、以下のように、すなわちフィールドの設定＝２０５０Ｇ、走査範囲＝４，０００Ｇ、時間定数＝８２ｓ、モジュラス増幅＝１６Ｇ、マイクロ波電源＝３１μＷ，周波数＝９．７１Ｇｈｚ、ゲイン＝１０００、決定されたスピン計量化＝９０±１０μＭ Ｆｅであった。
【０１１９】
カリキアマイシンが２本鎖ＤＮＡの切断を生じさせ、そしてＣａｌＣが、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるカリキアマイシンへの耐性を提供するならば、ｉｎ ｖｉｔｏｒｏにおけるカリキアマイシンにて誘発されるＤＮＡ切断アッセイにＣａｌＣを加えると、ＤＭＡの切断を阻害するであろうと期待される。
【０１２０】
この理論を試験するために、アッセイが、鋳型として超コイル化されたｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｓｅｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡ（「ｐＢＳ」）、及び還元開始剤としてジチオセリオール（「ＤＴＴ」）により行われた。典型的なアッセイにおいて、精製された１５．０ｎＭのｍｂｐ−ＣａｌＣ（マルトース結合タンパク質−ＣａｌＣ融合タンパク質として生成されたＣａｌＣ）、及び３０．０ｎＭのカリキアマイシンを、全量２５μＬ、４０ｍＭのトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｐＨ７．５、３５℃にて１５分間プレインキュベートした。２．５μＬ、１０ｍＭのＤＴＴを、そのアッセイ溶液に加え、そしてそのアッセイをさらに３７℃にて１時間インキュベートした。ＤＮＡ断片を、エチジウムブロマイドにより染色された１％アガロース・ゲル上電気泳動にて評価した。このアッセイを用いて、ｍｂｐ−ＣａｌＣが、ほぼ１０３倍カリキアマイシンの過剰な濃度で、カリキアマイシンにより誘発されるＤＮＡの切断を完全に阻害できることが、見出された。Ｍｂｐ−ＣａｌＣ及びＤＴＴのプレインキュベーション、強制的な透析を介したタンパク質の除去、及びその後の還元剤としてのＤＴＴ溶液の使用が、ＤＮＡ切断量に知見できる程度の影響を与えなかった。
【０１２１】
図７Ｂに示されるように、ＤＮＡの切断が、ＤＴＴ又はカリキアマイシン（レーンａ及びｂ）のない状態で全く観察されなかったが、有効な切断が、ＤＴＴ及びカリキアマイシンの存在下で（レーンｃ）実証された。予期されたように、ｍｂｐ−ＣａｌＣを加えると、カリキアマイシンにて誘発されるＤＮＡの切断を完全に阻害したが（レーンｆ）、コントロールとしてｍｂｐだけ（レーンｄ）を加えると、カリキアマイシンにて誘発されるＤＮＡの切断を阻害することができなかった。さらに、ＤＴＴと共に（示されていない）ｍｂｐ−ＣａｌＣか又はａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣ（Ｆｅ補助因子のない）をプレインキュベーションしても、カリキアマイシンにて誘発されるＤＮＡの切断を阻害することができない。しかしながら、Ｆｅ＋２又はＦｅ＋３をａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣアッセイに加えると、ＣａｌＣ活性を再構成することができる（レーンｇ）。ａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣの再構成が、前に記載したように活性アッセイを行う前に、１ｍＭのＦｅＳＯ４（Ｆｅ＋２）又はＦｅＣｌ３（Ｆｅ＋３）によりプレインキュベーションすることによって実現した。
【０１２２】
実施例８：カリキアマイシンによる切断の防止−ＣａｌＣによる超コイル・プラスミドの保護
分子ブレーク・ライト・プローブＡが、カリキアマイシンにより分子切断のＣａｌＣ阻害を評価するために用いられた。図９に示されるように、ＣａｌＣが、ブレーク・ライト・アッセイにおけるカリキアマイシンにより介在されるＤＮＡの切断を直接阻害する。
【０１２３】
３．６ｐＭのブレーク・ライトＡを、ＣａｌＣの量を増大（０．０ｎｍ，１．３ｎｍ，２．６ｎｍ，３．９ｎｍ，５．２ｎｍ） させながら、３．５ｎＭのカリキアマイシンと共インキュベートした。
【０１２４】
図９に示されるように、カリキアマイシンの存在下、分子ブレーク・アッセイにＣａｌＣの増大する量の滴定が、切断、さらには蛍光シグナルを完全になくする。カリキアマイシンの完全な阻害が、ほぼ２倍過剰なＣａｌＣにより実現された。ＣａｌＣが、エスペラマイシンにて誘発されるＤＮＡの切断（示されていない）に影響を与えなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、非酵素ＤＮＡ切断剤、すなわちＭ．ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ（Ａ）からカリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）γ１Ｉ、Ａ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｏｓｐｏｒａ（Ｂ）からエスペラマイミシン（ｅｓｐｅｒｒａｍｉｃｉｎ）Ａ１、Ｓ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ（Ｃ）’からブレオマイシン、メチジウムプロピル−Ｆｅ＋２−ＥＤＴＡ（ＭＰＥ，Ｄ）及びＦｅ＋２−ＥＤＴＡ（Ｅ）を示す。
【図２】
図２．は、（Ａ）分子標識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）、分子ブレーク・ライト（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）、及び本研究に使用された特異的分子ブレーク・ライト（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）の概要図である。実線は共有結合を示し、破線は水素結合を示し、文字は、略語により示し、灰色の丸が蛍光団（ＦＡＭ）を示し、黒色の丸が、対応する消光剤（ＤＡＢＣＹＬ）を示し、破線の先が蛍光領域を示している。（Ｂ）分子ブレーク・ライト（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）の操作原理を表す。酵素又は非酵素ヌクレアーゼ活性によるステム構造の切断により、蛍光団と消光剤の対と対応する蛍光シグナルとの分離が生ずる。（Ｃ）試料に用いられる分子ブレーク・ライト（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）である。ブレーク・ライト（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）Ａのステム構造が、好ましいカリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）認識部位（太線で書かれた（ｂｏｌｄ−ｆａｃｅｄ））を含む、そしてブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）Ｂのステム構造では、ＢａｍＨＩ認識部位（太線で書かれた（ｂｏｌｄ−ｆａｃｅｄ））が携行されている。想定された切断部位を矢印により示す。
【図３】
図３．は、３．２ｎＭのブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）を含む、３７℃でアッセイにおける時間に対する観察された蛍光強度の変化を表す。（ａ）１００ＵのＢａｍＨＩ（白色四角）を用いるブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）Ａ、１００Ｕの ＢａｍＨＩ（白色丸）を用いるブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）Ｂ、及び酵素を用いないブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ） Ｂ（黒色丸）、（１０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、７．９のｐＨ、λＥｍ＝５１７ｎＭ）、（ｂ）１０ＵのＤｎａｓｅＩ（白色四角）を用いるブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）Ａ、１０ＵのＤｎａｓｅＩ（白色丸）を用いるブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）Ｂ、及び酵素を用いないブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ） Ａ（黒色丸） （４０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、８．０のｐＨ、λＥＸ＝４８５ｎｍ、λＥｍ＝５１７ｎＭ）、を示す。
【図４】
図４．は、ブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）Ｂを用い、ＢａｍＨＩにおける定常状態の反応速度パラメータの決定を表している。（ａ）は、３７℃にて３．２ｎＭのブレーク・ライトＢ（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ） （６ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、１００ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、７．５のｐＨ、λＥＸ＝４８５ｎｍ、λＥｍ＝５１７ｎＭ）、ＢａｍＨＩ（１０Ｕ）を一定にし、及び非標識化基質オリゴヌクレオチドを変えることを含む、アッセイ時間に対する観察された蛍光強度の変化を表し、全基質の濃度（ブレーク・ライト（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）を含む）、すなわち３８９ｎＭ（白色丸）、１９６ｎＭ（白色四角）、８１ｎＭ（白色菱形）、４２ｎＭ（白色三角）、１１ｎＭ（黒色丸）、７．５ｎＭ（黒色四角）及び３，４ｎＭ（黒色菱形）にて示され、（ｂ）は、担体の希釈効果のため収集した後の図４（ａ）からのラインウィーバー・バークのプロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ  ｐｌｏｔ）を示している。
【図５】
図５．は、カリキアマイシン及びエスペラマイシンによる、ブレーク・ライトＡ（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）の切断を示している。３．２ｎＭのブレーク・ライトＡ（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）を３７℃にて（４０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、７．５のｐＨ、λＥＸ＝４８５ｎｍ、λＥｍ＝５１７ｎＭ）、ＤＴＴ（５０μＭ）及びエニジエンを変えて、アッセイの時間に対する観察さたＤＮＡの切断を示し、（ａ）は、カリキアマイシンの濃度、すなわち３１．７ｎＭ（白色丸）、１５．９ｎＭ（白色四角）、３．２ｎＭ（白色菱形）、１．６ｎＭ（白色三角）、０．７８ｎＭ（黒色丸）及び０．３１ｎＭ（黒色四角）を示し、（ｂ）は、エスペラマイシンの濃度、すなわち３１．７ｎＭ（白色丸）、１５．９ｎＭ（白色四角）、３．２ｎＭ（白色菱形）、１．６ｎＭ（白色三角）、０．７８ｎＭ（黒色丸）及び０．１５ｎＭ（黒色菱形）を示す。
【図６】
図６は、Ｆｅ＋２−依存剤によるブレーク・ライトＡ（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ）の切断を示している。（ａ）は、３．２ｎＭのブレーク・ライトＡ（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ） （５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２．５ｍＭのアスクロビン酸、７．５のｐＨ、λＥＸ＝４８５ｎｍ、λＥｍ＝５１７ｎＭ）を３７℃にて一定にし、且つブレオマイシンを変えて、アッセイの時間に対する観察されたＤＮＡの切断を示す。前記ブレオマイシンの濃度は、２００ｎＭ（白色丸）、１００ｎＭ（白色四角）、５０ｎＭ（白色菱形）、２５ｎＭ（白色三角）、１２．５ｎＭ（黒色丸）、５ｎＭ（黒色四角）及び２．５ｎＭ（黒色三角）を示す。（ｂ）は、３．２ｎＭのブレーク・ライトＡ（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ） （４０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、２．５ｍＭのアスコルビン酸、７．５のｐＨ、λＥＸ＝４８５ｎｍ、λＥｍ＝５１７ｎＭ）を３７℃にて一定にし、且つ及びＭＰＥを変えてことを含む、アッセイの時間に対する観察されたＤＮＡの切断を示す。前記Ｆｅ（ＩＩ）の濃度は、８μＭ（白色丸）、４μＭ（白色四角）、２μＭ（白色菱形）、１μＭ（白色三角）、５００ｎＭ（黒色丸）、２５０ｎＭ（黒色四角） 及び１２５ｎＭ（黒色三角）を示し、（ｃ）は、３２ｎＭのブレーク・ライトＡ（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ） （４０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、２．５ｍＭのアスコルビン酸、７．５のｐＨ、λＥＸ＝４８５ｎｍ、λＥｍ＝５１７ｎＭ）を３７℃にて一定にし、且つＭＰＥを変えることを含む、アッセイの時間に対する観察されたＤＮＡの切断を示す。前記Ｆｅ（ＩＩ）の濃度は、５０ｎＭ（白色丸）、１２５ｎＭ（白色四角）、２５０ｎＭ（白色菱形）、５００ｎＭ（白色三角）、１μＭ（黒色丸）、及び２μＭ（黒色四角）を示す。（ｄ）は、３２ｎＭのブレーク・ライトＡ（ｂｒｅａｋ ｌｉｇｈｔｓ） （４０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、２．５ｍＭのアスコルビン酸、７．５のｐＨ、λＥＸ＝４８５ｎｍ、λＥｍ＝５１７ｎＭ）を３７℃にて一定にし、且つＦｅ＋２−ＥＤＴを変えることを含む、アッセイの時間に対するＤＮＡの観測された切断を示している。前記Ｆｅ（ＩＩ）の濃度は、１２．５μＭ（白色丸）、６．３μＭ（白色四角）、３．１μＭ（白色菱形）、１．３μＭ（白色三角）を示す。
【図７】
図７Ａは、精製ｍｐｂ−ＣａｌＣのＵＶ−可視光線の吸収スペクトルグラフである。前記精製ｍｐｂ−ＣａｌＣを以下の溶液、すなわち５２μＭのｍｐｂ−ＣａｌＣ、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、７．５のｐＨにて分析した。挿入された図は、ＣａｌＣのＸ−バンドＥＰＲ分析の低温（４．３Ｋ）による結果を示している。ＣａｌＣの１モルあたり０．５モルのＦｅを含む２５０μＭのｍｐｂ− ＣａｌＣを、１０ｍＭのトリス塩酸（ＴｒｉｓＨＣｌ）、７．５のｐＨにて分析した。分光計の設定を、以下のように行った、すなわちフィールドの設定＝２０５０Ｇ、走査範囲＝４，０００Ｇ、時定数＝８２秒、振幅変調＝１６Ｇ、マイクロ波電源＝３１μＷ、周波数＝９．７１Ｇｈｚ、ゲイン＝１０００、決定されたスピンの計量＝９０±１０μＭのＦｅである。
図７の（ｂ）は、臭化エチジウムにて染色されたアガロース・ゲルの表示図である。レーンＡ：カリキアマイシン、ＤＴＴなし、レーンＢ：ＤＴＴ、カリキアマイシンなし、レーンＣ：カリキアマイシン及びＤＴＴ、レーンＤ：カリキアマイシン、及びｍｂｐ、レーンＥ：カリキアマイシン、ＤＴＴ、及びａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣ（Ｆｅの補因子の欠損）、レーンＦ：カリキアマイシン、ＤＴＴ、及びｍｂｐ−ＣａｌＣ、及びレーンＧ：カリキアマイシン、ＤＴＴ、及びａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣを示し、活性化アッセイを行う前の１ｍＭのＦｅＳＯ４（Ｆｅ＋２）又はＦｅＣｌ３（Ｆｅ＋３）によるプレインキュベーションを表す。
【図８】
図８は、エネジエンにて誘発されるＤＮＡの切断、分子ブレーク・ライト （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅａｋ Ｌｉｇｈｔｓ）の第１の連続アッセイの概要図である。実線は共有結合を表し、破線は水素結合を表し、文字は略字を基に表し、灰色影状の丸は、蛍光団（ＦＡＭ：蛍光）を表し、黒丸は、対応する消光剤（ＤＡＢＣＹＬ：４−（４−‘ジメチルアミノフェニラゾ）−安息香酸）を表し、そして破線の両先端が蛍光性を表す。
【図９】
図９は、ブレーク・ライト・アッセイを使用するカリキアマイシンの介在するＤＮＡ切断のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける直接的な阻害を示している。ＣａｌＣ量を増大させながら、３．６ｐＭのブレーク・ライトＡを、３．５ｎＭのカリキアマイシンと共にインキュベートする。カリキアマイシンの完全な阻害化が、ＣａｌＣを約２倍過剰にして行われる。ＣａｌＣが、エスペラマイシンにより誘発されるＤＮＡの切断に影響を与えなかった。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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