(57)【要約】本発明は、一般的に、疎水性ポリマー物質へ、分子 または粒子を固定する方法に関する。該固定は、該表面に吸着させたムチン層によって媒介される。さらに詳しくいえば、本発明は、該方法に関し、該方法において、ポリマー物質は、in vivo での適用のために生体適合性である。本発明はまた、それに固定された選択された分子 および／または 粒子をムチン層を施された疎水性ポリマー支持体、および該方法で得られ、そしてムチン およびレクチンもしくはレクチンの機能性フラグメントを含む、生体適合性の高度に特異的な結合システムであって、該方法に用いられ得るシステムに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された分子 および/または 粒子を、疎水性ポリマー表面に固定する方法であって、下記の段階：
・ムチン層を疎水性ポリマー物質の支持体表面上に形成し；そして
・形成されたムチン層へ、該分子 および／または 粒子を、吸着させる および／または共有結合させる；
ことを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ポリマーが生体適合性であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ムチン層が、該疎水性表面への吸着によって形成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ムチン層のムチン分子の露出官能基の化学的な活性化を含むことを特徴とする、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
活性化が、穏やかな酸化によって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ムチンに対して親和性を有する分子 および/または 粒子を吸着させることを特徴とする、請求項１から５に記載の方法。
【請求項７】
該分子 および／または 粒子の、ムチンに親和性を有する分子またはその官能性フラグメントへの結合を含むことを特徴とする、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
分子またはその官能性フラグメントが、レクチン分子、またはその任意に修飾された官能性フラグメントであり、より好ましくはジャカリンまたはその官能性フラグメントであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該官能性フラグメントがジャカリンのアミノ酸残基８５から２１７の配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ムチン中の遊離アルブミンのレベルを減少させるのに効果的な精製段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１から９の何れかの方法。
【請求項１１】
該精製段階が、陰イオン交換およびゲルろ過の連続使用、ゲルろ過のみ、またはゲルろ過後にバッチ吸着を介した遊離アルブミンに特異的な親和性による除去、またはこれらの組み合わせの使用を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１−１１の何れかに記載の方法によって得られる、ムチンに固定化された選択された分子 および／または 粒子を有するムチン層を有する、疎水性ポリマー支持体。
【請求項１３】
ヒトの身体へ埋め込むための医薬品を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の疎水性ポリマー支持体。
【請求項１４】
ムチン、および レクチンまたはレクチンの官能性フラグメントを含む、生体適合性の高度に特異的な結合システム。
【請求項１５】
レクチンが、ジャカリンまたはその官能性フラグメントである、請求項１１に記載の 生体適合性の高度に特異的な結合システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、一般的に、疎水性ポリマー物質の表面へ、分子または粒子を固定する方法であって、該固定が該表面上に形成されたムチンの層によって媒介される方法に関する。１つの特定の具体的態様において、本発明は、in vivoへの適用のために、ポリマー物質が生体適合性物質である 該方法に関する。
【０００２】
今日の外科手術において、ポリマー物質は、一次的使用もしくは永久的使用のために、しばしばヒトの身体に埋め込まれる。これらの生体適合性物質の使用のための制限要素は、微生物のコロニー形成による感染の危険性である。Staphylococcus aureus、および コアグラーゼ陰性 staphylococcus (CNS) S. epidermidis は、最も頻繁に見られる生体適合性物質に関係する病原体である。別の制約は、拒絶反応および被包化(異物身体効果)であり、これは既知のコーティングされた支持体の in vivo での使用、特に長期の in vivo システムでの使用で頻繁に遭遇する問題である。
【０００３】
一般的に、疎水相互作用の程度に依存して、微生物は、通常広汎に増殖する 人工物の表面に多かれ少かれ接着しやすいと考えられている。相互作用が大きければ、それに応じて接着の可能性も増大する。
【０００４】
Lei Shi et al., Colloids and Surfaces B : Biointerfaces 17 (2000), 229-239 は、微生物の接着を抑制するための、ポリマー物質表面へのムチンのコーティングについて、ＰＭＭＡ、シリコン、Tecoflex (登録商標)(医療用ポリウレタン)、およびポリスチレンのような、異なるポリマー物質の表面への、ウシの顎下腺のムチン(ＢＳＭ)のコーティングを記載している。該物質のＢＳＭでコーティングされた表面での Staphylococcus aureus および CNS Staphylococcus epidermidis による微生物の接着の抑制が、報告されている。抑制と 吸着させたムチンの表面濃度の相関関係、すなわち これらの表面にコーティングされたムチンが多いほど、これらへのバクテリアの接着が少なくなることが、観察されている。ムチンをコーティングした後、表面の疎水性が大きく減少することも、観察されている。ポリマーの生体適合性物質での微生物の感染の危険を減少させるために、ムチンのコーティングが有益に用いられ得ることが提案されている。
【０００５】
US-A-5,516,703 は、低圧アフィニティ・クロマトグラフィーや 免疫アッセイのような生物学的分離の分野に関し、そして疎水性表面で遭遇する問題に関する。該明細書は、ポリスチレン表面のような疎水性表面が、疎水部分を有する生体分子やタンパク質などの様々な物質の吸着に、非特異的に活性であることを述べている。
【０００６】
該非特異的に活性な表面上に特異的に活性な表面を形成しようとする 先行技術の試みは、特異的な活性を有する 表面のリガンドへの共有結合、および酵素や抗体のような生物学的な分子を 固体表面に単純に吸着させることを含む。吸着された生物分子は、次に、特異的な酵素反応 または特異的な抗原抗体反応を提供する。これらのアプローチは、共に問題を伴っていると言われている。それゆえに、共有結合コーティングは、原則として、支持体から除去するのが難しく、完全に切断し得ないこともある。そのため、覆われていない領域で、タンパク質の望ましくない非特異的な吸着が起こり得る。
【０００７】
幾つかの生物学的な分子は、吸着することが難しく、幾つかの酵素や抗体は、疎水性表面へ吸着させた場合に 活性を失う。従って、本発明の主な目的は、前もって決定された濃度で特異的な反応部位を有する表面を提供する 疎水性支持体のためのコーティングを提供することであり、そしてバックグランドの非特異的反応性を有さないか、またはほとんど有さない疎水性支持体のための、親水性タンパク質適合性コーティングを提供することである。該目的は、疎水性表面をタンパク質に耐性があるが特異的なリガンドの共有結合を可能にするために、疎水性表面をＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ トリ−ブロック共重合体、すなわち Pluronic (登録商標) タイプのポリマーでコーティングする方法によって達成される。該発明に従って、疎水性ブロックに結合している親水性ペンダントブロックを有するブロック界面活性剤ポリマーの端が反応し、親水性ブロックの遊離端で、特異的に活性な部位と 界面活性剤ポリマーの誘導体を形成する。次に、該誘導体を疎水性支持体上に吸着させ、疎水性支持体の非特異的な活性を最少にし、かつブロック共重合体誘導体によって提供された特異的な活性を有する表面を作る。
【０００８】
しかし、上記のような多くの生物医学的適用において、分子または粒子を、in vivo での適用において使用することを意図した疎水性生物ポリマー表面に固定し得る方法によって、利用し得る方法を有することが望ましい。この場合における本質的な要請は、該方法が、十分に高いレベルの生体適合性を提供しなければならないことである。例えばインプラントの場合において、例えばインプラントの表面から医薬成分が徐々に放出されることを目的とした、または定方向性内皮投与のための インプラントの表面へ、特定の分子または粒子を固定し得ることが望ましい。前述のように、該インプラントは、しばしばポリマー性生体適合性物質で作られており、ポリマー物質の性質のために疎水性表面を示しており、従って、微生物がコロニー形成し易い。それゆえに、改善された生体適合性を有する疎水性ポリマー生体適合性物質の表面へ、選択された分子および粒子を固定し、微生物の感染の危険性を最少にした方法を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
該方法は、本発明の請求項１に従って提供される。該方法において、下記の段階：
・疎水性ポリマー物質の支持体表面へ ムチンの層を形成する；および
・形成されたムチンの層へ、選択された分子 および／または粒子を吸着させる および／または共有結合させる；
ことによって、該分子 および／または 粒子を、疎水性ポリマー物質の表面へ固定する。
【００１０】
別の具体的態様と利点は、下記の記載と従属項から明らかである。
別の態様に従って、本発明は、本発明の方法によって得られる、選択された分子 および／または粒子をそれに固定する、ムチンの層で提供される 疎水性ポリマー支持体を目的としている。
【００１１】
さらなる態様に従って、本発明は、本発明の方法で使用し得る、ムチン および レクチンもしくはレクチンの機能的フラグメントを含む、生体適合性の高度に特異的な結合システムを目的としている。
【００１２】
（本発明の要約）
本発明に従って、ポリマー支持体の疎水性表面へ形成されたムチンの層は、優れた結合マトリックスを該表面に提供し、先行技術のコーティングと比較して、支持体表面の生体適合性を著しく改善することが、予期しないことに見出されている。
【００１３】
それゆえに、本発明者は、ムチンのコーティングが、動物の体によって、内因性に近い または本質的に内因性であると認識されることを、そしてその結果、得られた本発明のムチンの表面のコーティングが、以前に知られていたコーティングされた支持体の in vivo での使用中に、特に長期間での in vivo システムでの使用中に、頻繁に遭遇した 拒絶反応および被包化の問題を著しく緩和することを見出している。
【００１４】
本発明に従って、疎水性表面へ形成されたムチンの層に対する、非常に高レベルの特異性を持って、分子または粒子を固定し得ることが見出されている。同時に、本発明に従うムチンの使用はまた、例えばＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ トリ−ブロック共重合体のような先行技術のコーティング系と比較して、コーティングされた表面への非特異的結合を非常に減少させることを見出している。この理由は、ムチンの層の形成後、疎水性表面の残余非特異的結合活性が低いこと、および露出した疎水性表面へ得られたムチンの層が、非常に低い非特異的吸着性を示すことの組み合わせのためであろう。
【００１５】
本発明の方法の１つの具体的態様において、ムチンの層は、支持体表面のアミノ化などによる、疎水性表面へ共有結合によって形成される。
別の具体的態様において、ムチンの層は、支持体表面への吸着によって形成される。
【００１６】
本発明の方法に従って、分子 および／または粒子の固定は、吸着、すなわち親和性によるマトリックスへの非共有結合、またはムチン分子の活性化された露出基への共有結合、またはその組み合わせの方法によって達成され得る。このことは、より詳細に以下に記載する。
【００１７】
本発明の発明者は、非常に高い特異性を持って露出したムチン表面へ結合する分子の特定の基を見出している。それゆえに、別の態様において、本発明は、系がムチンおよびレクチンを含む、粒子 もしくは分子を固定するための生体適合性の高度に特異的結合システムに関する。
【００１８】
得られたムチン層への非常に低い非特異的結合性、およびムチン・マトリックスへの分子または粒子に特異的な結合の可能性の組み合わせは、in vivo および ex vivo での両方の適用において、ムチンのコーティングを、望ましい分子 もしくは粒子の 注意深く制御された特異的結合のための、優れた結合マトリックスとする。ここで、巨大分子および粒子の非特異的吸着が非常に少ないことは、重要な要請である。
【００１９】
該 in vivo と ex vivo での適用の例は、フィブロネクチン、ラミニン、または同様のインテグリン受容体のような、ＲＧＤ接着モチーフを含むペプチド配列を含む細胞接着分子の結合／複合、および特定の成長因子の結合である。
【００２０】
精製したムチン、好ましくは高度に精製したムチンを用いた場合に、非特異的な結合は、さらに減少し得る。それゆえに、さらなる具体的態様において、本発明の方法はまた精製段階を含む。精製は、主にムチンから低分子量の化学物質を除くことを意図している。
【００２１】
従って、ムチンの精製は、非特異的結合を減少させるか、または低く保つことが重要である場合に特に望ましい。これは、例えば、一般的に、in vivo での適用における場合である。
さらに、ムチン・コーティングは、生物分解し得、多くの in vivo での適用において、またin vitroでのモデル研究においても望ましい。
【００２２】
当業者に容易に認識されるように、生体適合性が高いことはまた、疎水性支持体上のたんぱく質および細胞の研究のためのモデル表面を提供するのに非常に望ましい。
【００２３】
当業者が認識しているように、これらの性質は、非特異的結合性が低いことと共に、マルチ・アレイ方法、バイオセンサーへの適用、または質量分析の分野での 特にたんぱく質またはそのフラグメントを捕まえるマトリックスとして作用するムチン・マトリックスへの適用において、分析方法において非常に重要である。
【００２４】
本明細書中に用いた疎水性という用語は、水接触角が約６０°以上、好ましくは約７０°以上である表面を表すことを意図している。該物質の例は、ポリスチレン(ＰＳ)、ポリプロピレン(ＰＰ)、ポリエチレン(ＰＥ)、ポリ塩化ビニル(ＰＶＣ)、シリコンゴム、ポリカーボネート(ＰＣ)、ポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)、ポリメタクリル酸メチル(ＰＭＭＡ)、ポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ)、およびアミノ化ポリテトラフルオロエチレン(ＮＨ−ＰＴＦＥ)である。
【００２５】
（図面の簡単な説明）
図１は、天然型(ＡとＢ)とＳＤＳで変性させた(ＣとＤ)条件の下での 粗製のＢＳＭと精製したＢＳＭのポリアクリルアミド ゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)を示す。タンパク質(Ａ)とタンパク質／炭水化物(Ｂ−Ｄ)について、ゲルを染色した。図Ａでは 銀タンパク質染色を、図Ｂでは 銀−ＰＡＳタンパク質／炭水化物染色を、図Ｃでは 変性し かつ非還元条件下で、図Ｄでは 変性し かつ還元条件(２−メルカプトエタノール)下で行った。
ＢＳＭ：粗製のＢＳＭ；
ＱＳＩＡ：精製ＢＳＭ(ＢＳＭ−１)；
ＨＭＷ／ＬＭＷ：分子量標準.
【００２６】
図２は、抗−ＢＳＭ抗体系を用いたＰＡＧＥ８−２５のウェスタン・ブロットを示す。天然型ＰＡＧＥのウェスタン・ブロットＡは、濃度勾配８−２５のゲルと、抗ＢＳＡ抗体系を用いた。
レーン１＝粗製ＢＳＭ ０.５mg/ml；
レーン２＝粗製ＢＳＭ ０.２５mg/ml：
レーン３＝精製ＢＳＭ(ＢＳＭ−２) ０.５mg/ml；
レーン４＝精製ＢＳＭ ０.２５mg/ml；
レーン５＝ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ) ０.２５mg/ml；
レーン６＝高分子量標準Ｂ.
全試料の分析は、抗ＢＳＡ抗体系を用いた。数値は、各成分の濃度をμｇ／ｍｌで示している。試料は、２回分析した。
【００２７】
図３は、コーティングされていない支持体と、一晩接着によってコーティングした ムチンでコーティングされた支持体(せん断速度 ５０ｓ−１で１時間洗浄後)の水接触角を示す。
図４は、コーティングされていない支持体と、３７℃で乾燥することによってコーティングした ムチンでコーティングされた支持体の 水接触角を示す。
【００２８】
図５は、異なってコーティングされたポリスチレン(ＰＳ)表面による、ＨＳＡ、ＩｇＧ、フィブロネクチン、およびリソザイムのタンパク質取り込みを示す。
図６は、異なる洗浄時間(せん断速度 ２９ｓ−１)後の、Pseudomonas aeruginosa(研究室株 CCUG)の、ムチンでコーティングされたポリスチレン表面、およびコーティングされていないポリスチレン表面への接着を示す。コーティングされていないポリスチレン表面、およびムチンでコーティングされたポリスチレン表面の顕微鏡図が右図である。
【００２９】
図７は、６０分洗浄後(せん断速度 ２９ｓ−１)の、Pseudomonas aeruginosa(臨床株)の、ムチンでコーティングされたポリスチレン表面、およびコーティングされていないポリスチレン表面への接着を示す。
【００３０】
図８は、異なるムチンのサブタイプでコーティングされたＰＳ表面への、Pseudomonas aeruginosa の接着の比較を示している。
図９は、ヒトのフィブロネクチンに曝露した、精製ＢＳＭと Pluronic F108 でドロップ・コーティングした表面の顕微鏡図(２.５×)を表した。ヒトの末梢神経芽細胞(ＳＨ ４５Ｙ)と共に２４時間インキュベーションした結果を示した。
【００３１】
図１０は、ビオチン化したジャカリン(Ｂ−Ｊ)／ストレプトアビジン−ＨＲＰ(ＳＡ−ＨＲＰ)接合体、またはＴＢＳ／ＳＡ−ＨＲＰ コントロールと共に、１時間インキュベーションした後の、異なってコーティングされたポリスチレン表面の相対結合性を示す。ＴＢＳと裸のポリスチレンはネガティブ・コントロールである。
【００３２】
図１１は、異なって処理されたＮＨ−ＰＴＦＥ表面へのＩｇＧ相対結合性のダイアグラムを示す。
図１２は、ムチンおよびＩｇＡでコーティングされた後、ＡＢＴＳ支持体と組み合わせた抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体を用いて、ジャカリンの結合をスクリーニングされた マイクロタイターウェルの吸光度の測定値を示す。
図１３は、精製ＢＳＭ、Pluronic F108、およびフィブリノーゲンで、それぞれ前もってコーティングされたＰＵインプラントの組織株の４０×拡大の顕微鏡図を示す。
【００３３】
（本発明の詳細な説明）
ムチンは、巨大糖タンパク質族を代表し、粘液の主要な成分の１つを構成する。それは、表皮組織の管腔表面を覆い、細胞外環境と原形質膜の間の物理的な障壁となっている。分子は、密集した炭水化物の側鎖を備えた交互領域を有する糸状ペプチドのバックボーンからなる一般的構造を有する。タンパク質含量および炭水化物含量は、それぞれ約２０−６０％および４０−８０％である。
【００３４】
本発明の方法の具体的態様の１つに従って、疎水表面が示す非特異的な吸着性は、ムチン分子を吸着させるのに利用される。ムチンを水性環境で疎水性物質と接触させる場合、ムチンのタンパク質バックボーンの裸の部分は、その疎水性によって接着するが、炭水化物の側鎖は、表面から遠ざかるよう配向すると考えられる。
【００３５】
ムチンは、その炭水化物部分が、大部分Ｏ結合したオリゴ糖からなり、後者はペプチド・バックボーンに、そのセリン残基およびトレオニン残基を介して結合している点で、かなり独特である。オリゴ糖側鎖１つ当たりの糖基の数は、１−２０の範囲で変化し、その組成は、主にＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース、およびシアル酸である。本発明に従うムチン層への分子および粒子の固定は、吸着によって、すなわちオリゴ糖側鎖に含まれる何れかの基への または特定の配列への または基の組み合わせへの親和性によって、または該オリゴ糖側鎖の活性化された基への共有結合によって、達成されると考えられる。
【００３６】
ムチンは、例えば動物の表皮細胞被覆物や、動物の分泌液中、例えば唾液や涙中で見出される。具体的な例は、ウシの顎下腺ムチン(ＢＳＭ)である。
【００３７】
本発明の固定方法の１つの具体的態様に従って、市販されているムチンが用いられる。得られたムチン・マトリックスに対して、ムチン分子の露出部位への親和性を有する何れかの分子が、吸着によって固定され得る。該分子の適切な例は、レクチン類であり、以下により詳細に記載する。望ましい分子または粒子は、レクチン分子のような、ムチンの露出部位へ親和性を有する分子に、必要に応じてさらなるリンカー分子を含む 既知の結合方法またはカップリング方法によって、結合され得る。そのような望ましい分子または粒子は、吸着によってムチン・マトリックスに固定され得る。それゆえに、そのままではムチン層へ吸着しない粒子および分子は、吸着を起こすための ムチンへの必要な親和性を有する分子に結合させ得る。従って、疎水性の粒子および分子(疎水表面へ非特異的に吸着する)は、例えば該粒子または分子へ結合するレクチン分子などによってもたらされる特異性によって、疎水性ムチン層へ高い特異性を持って吸着させ得る。
【００３８】
ムチン・マトリックスへの固定化は、共有結合であってもよい。一般的に、このような場合において、ムチン・マトリックスは、望ましい反応性を提供するために活性化される。所望の、対応する官能基を呈示する分子または粒子は、ムチン分子の活性化された官能基と反応することによって、マトリックスに固定され得る。このようなムチン・マトリックスの活性化は、シアル酸基、例えば末端のシアル酸基あるいは核構造における別の炭水化物の酸化を介し得る。例として、シアル酸の穏やかな酸化、および過ヨウ素酸(１ｍＭ)での他の炭水化物のより低い程度の酸化は、アルデヒド官能基をもたらす。アルデヒドのための既知のカップリング化学は、下記の官能基の１つを含む、巨大分子または粒子（標的）と結合に用いられ得る。すなわち：アミン基(当業者に既知の、水素化シアノホウ素を用いた還元的アミノ化によるアミド形成)；ヒドラジド基(還元剤によって安定化されたヒドラゾン形成)。
【００３９】
上記の官能基の１つを持たない標的に使用するために、例えばヘテロ二官能性試薬のような試薬が、標的分子または粒子によって呈示される 他の官能基の活性化に用いられ得る。それゆえに、例として、好ましくは分子または粒子に特異的な部位に存在するメルカプト基またはその他の基が活性化され得る。適切な試薬の例は、メルカプト基のアミン活性化にはメルカプトアルキルアミンであり；そしてメルカプト基のヒドラジド活性化には４−(４−Ｎ−マレイミドフェニル)酪酸 ヒドラジド(ＭＰＢＨ)、または３−(２−ピリジルジチオ)プロピオニル ヒドラジド(ＰＤＰＨ)である。
【００４０】
上記の親和性結合は、好ましくはムチン分子の核構造における糖基の特異的親和性結合に基づく。本発明者は、レクチンとして、包括的に知られている 炭水化物結合タンパク質が、ムチン・マトリックスへの親和性結合という目的のための適切な化合物群であることを見出している。オリゴ糖に含まれるシアル酸などに対して、またはムチンにおける特異的な糖配列に対して、親和性を有するレクチンを用い得る。レクチンのソースの具体的な例、および該レクチンの対応する親和性を以下に挙げた。
【００４１】
【表１】
2004524878.tif 000003
表中、Neu は、ノイラミン酸(＝シアル酸)を意味する。
【００４２】
既知のムチン結合表面レクチンを有する細胞のような粒子は、当然、親和性結合によって、該マトリックスに結合し得るか、または該マトリックスに捕捉され得る。
【００４３】
免疫原性が重要な問題である in vivo への適用の場合のような幾つかの適用において、免疫原性が 一般的に特異的な分子の大きさの関数として増加すると予期され得るため、該親和性分子は、過度に大きくなく かつ嵩高くないことが望ましい。このような場合において、好ましくは、親和性分子の官能的に有効なフラグメントが用いられる。官能的に有効であるために、該フラグメントは、ムチン層に吸着を起こすのに十分な親和性を示し、また、該フラグメントは、当業者に既知の方法によって、特異的な分子または粒子に結合しなければならない。そのムチンへの親和性をさらに強めるために、該官能的に有効なフラグメントを修飾することも考えられる。該修飾は、例えば 該フラグメントの末端の１つにおける、特にムチン結合末端における、幾つかのアミノ酸残基の付加または変化であり得る。
【００４４】
ジャカリンの場合において、該官能的に有効なフラグメントは、適切には、１３３個のアミノ酸(アミノ酸残基８５から２１７)を含む、タンパク質モノマーユニットのα鎖を含む。
ジャカリン分子の官能的に有効なフラグメントは、ＢＬ２１ E. coli 株中で、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ ベクターを用いてα鎖を発現させることによって得られる。前述のように、該フラグメントは、ムチン層への親和性をさらに高めるために修飾され得る。
【００４５】
本発明の方法によって固定され得る分子の例として、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、またはペプチド核酸(ＰＮＡ)が挙げられ得る。ＤＮＡまたはＰＮＡは、分析の使用のためのマトリックスへの親和性リガンドとして固定され得、例えばマトリックスに共有結合したＤＮＡは、興味ある問題（例えば、証明用）あるいは生物学的に機能的な または薬学的に活性な薬剤としてのＤＮＡ またはＰＮＡの医学用徐放性インプラントのような送達の適用に使用するための、ＤＮＡ、またはＰＮＡを補完する。二本鎖ＤＮＡまたはＰＮＡは、当然に本発明に記載のマトリックスに結合され得る。
【００４６】
送達への適用において、リポソームをベースとしたリガンドもまた用いられ得る。リポソームは、マトリックスに固定された官能性分子に対するリガンドである。
【００４７】
ＤＮＡは、例えばＤＮＡのニック・トランスレーションの使用によって、すなわち二官能性リンカー分子を介した ムチンに対する特異性を有する誘導体、例えばビオチン化したジャカリンなどの二官能性を持たせたレクチンのような誘導体を挿入することによって、ムチン・マトリックスに結合され得る。ＤＮＡはまた、ビス−ヒドラジン またはジアミンのようなホモ二官能性試薬を使用することによって化学修飾され、次に活性化したムチンと反応させ得る。ＤＮＡをマトリックスに結合させる別の方法は、ＤＮＡ結合タンパク質をマトリックスの上に固定することによる方法である。ビオチンもまた、マトリックスへの親和性結合のための手段を提供するために、ＰＮＡ分子に組み込まれ得る。当業者に明らかなように、本発明のマトリックスに親和性を有するＤＮＡまたはＰＮＡ部位に組み込むために、数多くの方法が用いられ得る。
【００４８】
一般的に、巨大分子または粒子は、ビオチン化されたジャカリンのような二官能性レクチンを用いて、ビオチン−アビジン法を介して結合され得る。
【００４９】
本発明者は、市販のウシの顎下腺ムチンのようなムチンが、一般的に、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)のような、少量の他より低い分子量のタンパク質を含むことを見出している。該分子は、ムチン中で遊離分子の形態で存在すると考えられるが、ムチンと複合体の形態で存在する可能性もある。該複合体は、主に、疎水性相互作用およびイオン相互作用によって保持されると考えられる。遊離の比較的小さい分子は、よりゆっくりと拡散する、より大きなムチン分子より、溶媒から疎水表面に、よりたやすく拡散すると考えられる。従って、該小さい分子は、疎水性支持体に、より速く吸着し、それによってムチン分子の結合を阻害し得る。該不純物は、ムチン・マトリックスへのより高度の非特異的結合を導く。これらの不純物はまた、本発明におけるムチンの機能の望ましくない阻害を引き起こし得る。一般的に、本発明に従って用いられるムチン中に存在する低分子量不純物のレベルは、該不純物が支持体表面の結合部位に対してムチン分子と競合し易いためがた、低く保たれるべきである。
【００５０】
精製方法は重大ではなく、例えば超遠心分離、陰イオン交換樹脂、および／またはゲルクロマトグラフィーを用いることなどによる、当業界で一般的に用いられる 低分子量フラクションを除くための何れかの方法または該方法の組み合わせであり得る。それゆえに、好ましい具体的態様において、本発明の方法は、ムチンと アルブミン(例えばＢＳＡ)のような低分子量タンパク質の複合体を分解するための効果的なムチン精製方法、および 例えば特異的な親和性による、該低分子量分子の特異的な除去を含む。
【００５１】
本発明者らは、適切な精製方法が、陰イオン交換およびゲルろ過の連続使用、ゲルろ過のみ、またはゲルろ過後 Blue Sepharose (Amersham Biosciences)でのバッチ吸着によるＢＳＡの特異的親和性除去を含む方法であることを見出している。該精製方法を用いることによって、先行技術のムチンより高い純度のムチンが得られる。このムチンは、市販の先行技術のムチンを常法によって用いた場合と比較して、改善された性質を有し、そのために、本発明に従って得られる結果がよりよいことが見出されている。本発明の方法のより好ましい具体的態様に従って、本方法は、陰イオン交換とゲルろ過の連続使用、ゲルろ過のみ、またはゲルろ過後 Blue Sepharose でのバッチ吸着によるＢＳＡの特異的親和性除去を含む。
【００５２】
本発明のムチンは、好ましくは、市販のムチンと比べて減少したアルブミン含量を示し、より好ましくは、アルブミン含量が本質的に含まれておらず、最も好ましくは、ムチン中に何れのより小さいタンパク質 もしくはペプチドの存在量も可能な限り低く保たれている。
【００５３】
（実施例）
実施例１および３−１１を通して、ウシの顎下腺ムチン(ＢＳＭ)(Sigma product M3895 として市販されている)を、２種類の経路：陰イオン交換(Q Sepharose FF, Amersham Biosciences)と、ゲルろ過(Sepharose 6B-CL, Amersham Biosciences)の連続使用、またはゲルろ過(Sepharose 6B-CL)のみの何れかによって精製した後使用した。
【００５４】
実施例２および５において、ヒトの唾液のムチン(ＨＳＭ)を、ゲルろ過(Sephadex G-200 と Superose 6 との組み合わせ；共に Amersham Biosciences)によって精製した後用いた。
ＢＳＭとＨＳＭを実施例で用いたが、他のソースから得られたムチンもまた本発明に従って用い得ることを理解すべきであり、その具体的な例は、ヒトの口腔のムチン、ヒツジのムチン、ブタのムチンなどである。
【００５５】
実施例１：ウシの顎下腺ムチン(ＢＳＭ)の精製
方法１(ＢＳＭ−１)
ＢＳＭ(Sigma M3895)を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのピペラジン(ｐＨ５.０)(PipS)、４mg/mlに溶解した。未精製の試料を、PipS 緩衝液で前もって平衡化した、Q Sepharose FF カラム(HR 10/15)でクロマトグラフィーにかけ、吸着させた物質を勾配溶液によって、ＮａＣｌで溶出した。この物質を、さらに５０ｍＭの酢酸アンモニウム ｐＨ７.０で前もって平衡化した、Sepharose 6B-CL カラム(XK 40/26)で精製した。吸着されないフラクションを集め、凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で乾燥保存した。
【００５６】
方法２(ＢＳＭ−２)
ＢＳＭ(Sigma M3895)を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液(ｐＨ７.０)に、４mg/mlで溶解し、未精製の試料を、８℃で、前もって同じ緩衝液で平衡化した、Sepharose 6B-CL カラム(XK 40/26)で、クロマトグラフィーにかけた。吸着されない物質を、さらにSephadex G-25 M カラム(Amersham Biosciences; HR 10/30)で水によって脱塩し、凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で乾燥保存した。
【００５７】
方法３(ＢＳＭ−３)
ＢＳＭ(Sigma M3895)は、１７５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ７.４)に溶解し、同じ緩衝液で前もって平衡化した、Sephadex G-200 でクロマトグラフィーにかけた。吸着されない物質を Savant SpeedVac evaporator を用いて濃縮し、上記のＴｒｉｓ緩衝液で PD 10 カラム(Amersham Biosciences)で脱塩した。
【００５８】
実施例２：ヒトの唾液のムチン(ＨＳＭ)の精製
ヒトの唾液を一切の刺激なしに唾を吐くことによって集め、０.８Ｍのイミダゾールを含む １７５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ７.４)で、１：１に希釈した。希釈された唾液を１３,０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を取り、ランニング緩衝液で２倍に希釈し、１７５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ ７.４)で、Sephadex G-200 カラムでクロマトグラフィーにかけた。未吸着物質物質を集め、さらに Superose 6 カラムで精製し、吸着されない物質を集め、Savant SpeedVac evaporator を用いて濃縮し、PD-10 カラム(Amersham Biosciences)で脱塩した後、凍結乾燥した。精製したＨＳＭを、使用するまで−２０℃で乾燥保存した。
【００５９】
実施例３：ムチンの同定
精製したムチンを、勾配８−２５ゲルを用いた Phast System(Amersham Biosciences)で、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)によって、天然条件（native conditions)および変性条件でタンパク質を(銀染色)、そしてタンパク質／炭水化物を(銀／アルシアンブルー−過ヨウ素酸 プロトコル)染色して分析した。図１は、精製されたＢＳＭ−１フラクション QS 1A における、染色された 天然の および変性させたＰＡＧＥを示す。
【００６０】
さらなる同定は、静止光散乱、アミノ酸分析、および炭水化物アッセイを用いて行った。表１に、報告されたデータと比較して、精製したＢＳＭ−３の組成を要約した。
【表２】
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１：Gendler. S.; Spicer, A. Ann. Rev. Physiol. 1995,57,607
【００６１】
精製したＢＳＭ−２は、ＰＡＧＥ ゲルのウェスタン・ブロットによる、およびアルカリ性ホスファターゼ／ＢＣＩＰ−ＮＢＰ系によって増幅された、抗ＢＳＡ抗体を用いたニトロセルロース膜(全成分は Sigma より購入)での全試料の分析による、ＢＳＡに特異的なスクリーニングをした。図２および図３は、これらの試験の結果を示す。
【００６２】
銀／アルシアンブルー−過ヨウ素酸を組み合わせて染色したゲルの積分分析(BioRad Molecular Analysis version 1.3)をベースとしたＢＳＡの概算値は、精製ＢＳＭ−２が、約０.７％のＢＳＡを含むことを示す。その値は、粗製ＢＳＭの場合では、約６.４％に達する。ウェスタン・ブロットは、ＢＳＡがムチン製品の高分子量部分に見られ、よりいくらか高い全ＢＳＡ含量を導いていることを示す。
【００６３】
全試料のＢＳＡの体積分析(BioRad Molecular Analysis version 1.3)は、標準として、ＢＳＡ含量が約２.３％であると概算する。
【００６４】
実施例４：疎水表面のコーティング：接触角測定
約１ｃｍ２の大きさの、ポリスチレン(ＰＳ)、ポリプロピレン(ＰＰ)、ポリエチレン(ＰＥ)、ポリ塩化ビニル(ＰＶＣ)、ポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ(ＭＱとも言う))、ポリビスフェノール Ａ カーボネート(ＰＢＡＣ)、ポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)、ポリメタクリル酸メチル(ＰＭＭＡ)、ポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ)、およびアミノ化ポリテトラフルオロエチレン(ＮＨ−ＰＴＦＥ)の支持体を、それぞれ磨き、イソプロパノールで洗浄した後、同じ溶媒中で１０分間超音波処理した。超音波処理した支持体を、次いで十分に洗浄し、窒素ガスで乾燥した。
【００６５】
洗浄したポリマーを、ＴＢＳ(ｐＨ７.４)中の ０.５mg/mlのＢＳＭ−２で、３７℃で一晩コーティングし、下記：ＴＢＳ中に５回浸漬後、MilliQ 水ですすぎ、窒素で乾燥する；に従って洗浄した。
【００６６】
図３は、精製ＢＳＭ−２でコーティングする前および後の、ポリマーの水接触角測定の結果を示す。接触角は、ムチンでコーティングした支持体を、１時間せん断速度（shear rate）５０ｓ−１で制御ＴＢＳ洗浄した後にも測定した。ガラスを疎水性のコントロールとして用いた。ムチンをコーティングされた支持体は、シリコン支持体およびガラスのコントロール支持体の場合を除いて、コーティングしていないコントロールと比べて 非常に低い接触角を示すことが分かる。これらのデータは、ムチンの層が、該表面へ接着し、その結果、表面がより親水性の性質となったことを示す。さらに、コーティングは、高速での１時間の洗浄に耐える。
【００６７】
あるいは、ムチン・コーティングは、支持体上で、３７℃でインキュベートすることによって乾燥される。図４は、このコーティング方法によって得られた接触角のデータを示す。接触角は、塗布コーティング法による接着の場合と同様に、減少することが分かり得る。
【００６８】
実施例５：低下した タンパク質の非特異的結合
直径２８２nmのポリスチレン(ＰＳ)粒子を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むのリン酸緩衝液(ＰＢＳ)中の、約０.５mg/mlの精製ＢＳＭ−３ または精製ＨＳＭで、室温で２４時間で前もってコーティングした。Pluronic F108 および裸のＰＳ粒子を、コントロールとして用いた。前もってコーティングした粒子を、遠心分離／洗浄のサイクルを繰り返すことによって、ＴＢＳで二回洗浄し、そして４個のモデルタンパク質、すなわちヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、ヒト血漿フィブロネクチン、免疫グロブリン Ｇ(ＩｇＧ)、およびリソザイムを、０.５mg/mlで、室温で２４時間インキュベートした。粒子をＰＢＳで二回洗浄した後、SpeedVac evaporator (Savant)を用いて乾燥し、アミノ酸分析にかけ、タンパク質取りこみを図５に要約した。
【００６９】
ＢＳＭ−３でコーティングされた粒子、およびＨＳＭでコーティングされた粒子の場合において、タンパク質残量が、そのコーティング自体に由来することは、注目すべきである。
【００７０】
実施例６：バクテリア Pseudomonas aeruginosa の抑制
ポリスチレン支持体は、実施例４に従って乾燥することによって、ＢＳＭ−１でムチン・コーティングし、せん断速度２９ｓ−１で、異なる時間 流動セル中でＴＢＳ(ｐＨ ７.４)で洗浄した。洗浄した支持体を、その後ヒトの病原体 Pseudomonas aeruginosa の異なる株と共に３０分間インキュベートした。接着したバクテリアの数を、図６および７に示す。
【００７１】
さらに、バクテリア抑制能力を、３０分洗浄後に、粗製のＢＳＭと精製ＢＳＭの間で比較した。結果を図８に示す。
本発明のムチン・マトリックスは、予期しないことに、Pseudomonas aeruginosa(粘膜表面に特異的に結合することが周知である)による、コロニー形成を抑制することが見出された。
【００７２】
実施例７：減少した細胞接着
ポリスチレン マイクロタイター ウェルを、ＰＢＳ(ｐＨ ７.４)中、１mg/mlの精製ＢＳＭ−１で、室温で一晩コーティングした。ＰＢＳで３回洗浄後、それぞれ０.５mg/mlの ヒトのフィブロネクチン、ヒトのヒアルロン酸、およびＢＳＡと共に、ウェルを室温で１時間インキュベートした。ヒトの骨芽細胞株 ＭＧ ６３は、さらなる洗浄段階の後、植え付け、ＣＯ２雰囲気中、３７℃で２４時間置いた。ＰＢＳをコントロールとして用いた。相対細胞数は、図１０で要約した。
【表３】
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記号：
＋＋＝多くの細胞；
＋＝複数の細胞；
＋−＝細胞および死んだ細胞；
−＝細胞がない；
ＰＢＳは、コントロールとして用いた。
【００７３】
上記の表から、ムチンでコーティングされた表面は、コーティングされていないコントロールと比べて、細胞の接着が減少することがはっきりと分かる。さらに、実施例５に関して、細胞刺激タンパク質の特異的な結合が減少したことも分かる。
【００７４】
別の試験のセットアップにおいて、ヒトの末梢神経芽細胞(ＳＨ ４５Ｙ)を、０.２５mg/mlの精製ＢＳＭ−１と１mg/mlの Pluronic F108 をそれぞれドロップ・コーティングし、次に０.５mg/mlのヒトのフィブロネクチンをコーティングすることによって前処理してあるポリスチレン表面に接種した。図９は、ドロップ・コーティングした界面領域の光学顕微鏡図を示す。
【００７５】
実施例８：ジャカリン・システムを介した特異的な結合
ポリスチレン・マイクロタイターウェルをムチン(ＢＳＭ−２)で、３７℃で一晩コーティングした後、ＴＢＳで３回洗浄し、続いて２５０μｇ／ｍｌのビオチン化したジャカリン(Ｂ−Ｊ) (Pierce)、１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン―セイヨウワサビ ペルオキシダーゼ複合体(ＳＡ−ＨＲＰ)(Vector Laboratories)と共にインキュベートした。全てのインキュベーションは、振盪しながら、室温で１時間行った。ＴＢＳで最後に洗浄した後に、ＡＢＴＳ支持体(Boehringer Mannheim GmbH)で３分間展開し、４０５nmの吸光度を測定して、表面結合ＨＲＰを推定した。コーティングされていないポリスチレンをコントロールとし、Ｂ−ＪおよびＳＡ−ＨＲＰと共に ＴＢＳをコントロール成分とした。図１０は、ＨＲＰの相対結合性(４０５nmでの吸光度)を、それぞれ、各インキュベーション・セットアップで示す。
【００７６】
実施例９：化学修飾し、アミン化したＰＴＦＥに共有結合したムチン
０.２mmのポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ)ホイルを、下記：始めにポリマー物質を８ml／分のＯ２で、１４MHz／１００Ｗで３０秒間 前処理し、次に支持体をジアミノシクロヘキサン(ＤＡＣＨ)で、１８mTorr、１７０kHzで２分間アミン化する；に従ってプラズマ処理することによってアミン化した。アミン化したＰＴＦＥ(ＮＨ−ＰＴＦＥ)を、高湿度で８℃で保存した。
【００７７】
２mg/mlの精製ＢＳＭ−１を、氷上でＰＢＳ(ｐＨ ７.０)中１ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムと３０分間反応させることによって、過ヨウ素酸活性化した。活性化されたＢＳＭ−１は、次にＰＢＳ(ｐＨ ８.０)で、PD-10 カラムでゲルろ過し、アミン化したＰＴＦＥと共に８℃で６時間インキュベートした。ＰＢＳ(ｐＨ ８.０)で２回洗浄した後、得られたシッフ塩基を、ＰＢＳ(ｐＨ ８.０)中の５ｍＭのアスコルビン酸で、室温で１時間還元した。さらに洗浄し、１％の卵白アルブミンでブロックした後、化学修飾された ＢＳＭ結合 ＮＨ−ＰＴＦＥ表面を、アルカリ性ホスファターゼ／ＢＣＩＰ−ＮＢＰ系で増幅したＩｇＧ抗体系を用いて、低下した非特異的結合を試験した。吸着したＢＳＭ−１に対する化学結合の安定性は、さらに、抗体可視化の前に、１Ｍ ＮａＣｌ／１.２５％ ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)中で、３０秒間 超音波処理して試験した。図１１は、処理していないＮＨ−ＰＴＦＥと比較したＩｇＧの相対結合性の概要を示す。
【００７８】
実施例１０：最小化したジャカリンの生成と、そのムチンへの結合の証明
炭水化物結合能を有するメチオニン末端(５’末端)の１３３個のアミノ酸配列(α鎖；残基８５から２１７)からなる 最小化したジャカリンは、天然のジャカリンから標的配列をＰＣＲ増幅することによって構築した。天然のジャカリンの構築されたα鎖領域におけるアミノ酸配列は、下記の通り：
MGKAFDDGAFTGIREINLSYNKETAIGDFQVVYDLNGSPYVGQNHKSFITGFTPVKISLDFPSEYIMEVSGYTGNVSGYVVVRSLTFKTNKKTYGPYGVTNGTPFNLPIENGLIVGFKGSIGYWLDYFSMYLSL；
である。
【００７９】
ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー：
フォワード：５'−CACCATGGGTAAAGCTTTTGATGACGGTG−３'；
リバース：５'−AAGTGACAAGTACATACTAAAGTAG−３'；
を用いて行った。
【００８０】
構築物を配列決定し、Hui Yang and Thomas H. Czapla(JBC 1993, volume 268, pp. 5905-5910)で示された、ｃＤＮＡクローン ｐＳＫｃＪＡ １７の１８４番目の残基を１アミノ酸置換したもの(セリンをアスパラギンで置換した)と一致することが示された。
【００８１】
増幅されたα鎖配列は、ｐＥＴ １０１／Ｄ−ＴＯＰＯ ベクター系(ポリヒスチジン・フレーム)に挿入し、ＢＬ２１ E. coli 株を用いて発現した。バクテリアを、５０μｇ アンピシリン／mlを含むＬＢ培地中で、３７℃で培養した。タンパク質の発現は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘発した。
【００８２】
発現された 最小化されたジャカリンは、精製ＢＳＭを用いてさらに結合試験にかけた。ポリスチレン マイクロタイターウェルを、０.２５mg/ml および ０.５mg/mlの、ＰＢＳ(ｐＨ ７.４)中の精製ＢＳＭで、室温で一晩コーティングした。５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム(ｐＨ ９.６)で希釈した １μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの ヒトの免疫グロブリンＡ(ＩｇＡ)を、ポジティブ・コントロールとして用いた。
【００８３】
ＢＳＭでコーティングし、次にＰＢＳ中１％のＢＳＡ(ブロック緩衝液)で、３７℃で１時間ブロックした後、ウェルを発現させたジャカリンのα鎖フラグメントと共に、３７℃で３時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳ(ｐＨ７.４)で３回洗浄した。次の段階は、ブロック緩衝液で１：８００に希釈した 抗ヒスチジン(Ｃ末端)セイヨウワサビ ペルオキシダーゼ複合体(ａ−Ｈｉｓ−ＨＲＰ；Invitrogen)と共に、３７℃で１.５時間インキュベートすることを含む。さらに洗浄した後、ＡＢＴＳ支持体(Boehringer Mannheim GmbH)を用いて、ウェルを展開した。展開時間は、３７℃で４０分間であった。吸光度測定は、４０５ｎｍで行った。結果を図１２に示す。
【００８４】
実施例１１：フィブリノーゲンおよび Pluronic F108 を比較した生体適合性
埋め込まれたポリウレタン(ＰＵ)モデル表面の、異なるコーティングへの耐性を、ヒツジのモデルを用いて初期のスクリーニングで試験した。３０日後、隣接する組織の組織学的評価ができるように、試験中接触させておいた試験表面を分離した。この概略比較は、フィブリノーゲンや Pluronic F108 と接触させた組織と比べて、高分子量ＢＳＭ ムチン・フラクション(ＢＳＭ−３)でコーティングされた表面と接触させた組織において、驚くほど低いレベルの炎症性の細胞、および最少の被包形成を示した。
【００８５】
図１３は、当業界で既知のように除去し染色した後のインプラント表面を示す。ムチンでコーティングされたＰＵの場合において、被包は、不透明で十分血管形成されたコラーゲンからなることが分かる。さらに、形成された３０μｍの被包の内側の縁はよく組織化され、被包化相が溶解していることが示唆される。フィブリノーゲンでコーティングされたＰＵ、および  でコーティングされたＰＵと比較して、ムチンでコーティングされたＰＵのインプラントは、炎症の浸潤が著しく少ない。さらに、ムチンでコーティングされたインプラントの周りに血管新生の証拠が見られる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、天然の条件(ＡとＢ)と 変性させた条件(ＣとＤ)の下での粗製のＢＳＭと精製したＢＳＭのポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図２】抗−ＢＳＭ抗体系を用いたＰＡＧＥ８−２５のウェスタン・ブロットを示す。
【図３】図３は、コーティングされていない支持体と ムチンでコーティング(接着による)された支持体の接触角を示す。
【図４】図４は、コーティングされていない支持体と ムチンでコーティング(乾燥による)された支持体の接触角を示す。
【図５】図５は、異なる方法でコーティングされた支持体による、ＨＳＡ、ＩｇＧ、フィブロネクチン、およびリソザイムのタンパク質取りこみを示す。
【図６】図６は、異なる洗浄時間での ムチンでコーティングされたポリスチレン表面、およびコーティングされていないポリスチレン表面への、Pseudomonas aeroginosa の接着量を示す。
【図７】図７は、６０分間洗浄後の ムチンでコーティングされたポリスチレン表面、およびコーティングされていないポリスチレン表面への、Pseudomonas aeroginosa の接着量を示す。
【図８】図８は、異なるムチンのサブタイプでコーティングしたＰＳ表面への、Pseudomonas aeruginosa の接着の比較である。
【図９】図９は、ヒトのフィブロネクチンに曝露した、精製したＢＳＭと Pluronic F108 でドロップ・コーティングした表面の顕微鏡図(２.５×)を示す。
【図１０】図１０は、ビオチン化したジャカリン(Ｂ−Ｊ)／ストレプトアビジン接合体、またはＴＢＳ／ＳＡ−ＨＲＰ コントロールと共に、１時間インキュベーションした後の、異なる物質でコーティングされたポリスチレン表面の相対結合性を示す。
【図１１】図１１は、異なる方法でコーティングされた ＮＨ−ＰＴＦＥ表面への相対結合性を示す。
【図１２】図１２は、ムチンおよびＩｇＡでコーティングされた後、ＡＢＴＳ支持体と組み合わせた抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ抗体を用いて、ジャカリンの結合をスクリーニングされた マイクロタイターウェルの吸光度の測定値を示す。
【図１３】図１３は、それぞれ 精製ＢＳＭ、Pluronic F108、およびフィブリノーゲンで、前もってコーティングされたＰＵインプラントの組織株の４０×拡大の顕微鏡図を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004524878.tif 000049
2004524878.tif 000050
【国際調査報告】
2004524878.tif 000051
2004524878.tif 000052
2004524878.tif 000053