(57)【要約】組換えポリヌクレオチドをインビトロ製造するための新規な方法が開示されている。方法は、主としてニックトランスレーションに関与する酵素であるヌクレアーゼ（好ましくはＤＮアーゼＩ）とポリメラーゼ（好ましくはＤＮＡポリメラーゼＩ）とによるヘテロ二本鎖ＤＮＡ配列の処理を含む。このプロセスを使用して得られた結果は、特異的ＤＮＡ修復系を使用する従来のｉｎ　ｖｉｖｏ組換え試験によって得られた結果よりも優れている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）変異相同親配列を準備する段階と、
（ｂ）ヘテロ二本鎖形成を促進する条件下で前記配列をインキュベートする段階と、
（ｃ）本質的にヌクレアーゼとポリメラーゼとから成るヘテロ二本鎖修復系を含む混合物に前記ヘテロ二本鎖を接触させる段階と、
から成る組換えポリヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
更に、
（ｄ）産生された組換えポリヌクレオチドを同定する段階、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヌクレアーゼとポリメラーゼとから成るヘテロ二本鎖修復系を含む混合物にヘテロ二本鎖を接触させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
エンドヌクレアーゼがＤＮアーゼＩであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヌクレアーゼが制限酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヌクレアーゼがＤＮアーゼＩであり、ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレアーゼが制限酵素であり、ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
相同配列が２つ以上の異なる遺伝子に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
相同配列が同じ遺伝子に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
相同配列の少なくとも一方がＬａｃＺαの突然変異体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
相同配列がプラスミドに存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
方法が更に、段階（ｂ）の前にプラスミドを直鎖化する段階を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
混合物が更にＤＮＡリガーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
リガーゼがＴ４　ＤＮＡリガーゼであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
相同親配列がＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ヘテロ二本鎖形成が、相同親配列を加熱しアニーリングすることによって成し遂げられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ヘテロ二本鎖形成が、後でアニーリングされる相同親配列の相補鎖の一本鎖ＰＣＲによって成し遂げられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
一本鎖ＰＣＲが２つ以上のプライマーを用いて行われることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＣＲが、親配列の一方の鎖の順方向プライマーと他方の親配列の相補配列に対する逆方向プライマーとを用いて行われることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヘテロ二本鎖形成が相同親配列を増幅する段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ヘテロ二本鎖形成が一本鎖プラスミドＤＮＡ相同親配列を増幅する段階を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
増幅がＭ１３由来のベクター及びヘルパーファージによって行われることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
段階（ｄ）が、
（ａ）段階（ｃ）のポリヌクレオチド産物を精製し、
（ｂ）前記ポリヌクレオチド産物をベクターに挿入するために消化し、
（ｃ）消化したポリヌクレオチド産物をベクターに結合し、
（ｄ）前記ベクターを適当な宿主体内で発現させ、
（ｅ）親配列に比べて新しい特性または機能を表すポリヌクレオチドクローンを同定する処理から成り、前記新しいポリヌクレオチドクローンが組換えポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
方法が更に、新しいポリヌクレオチドクローンから組換えポリヌクレオチドを単離する段階を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）変異相同親配列を準備する段階と、
（ｂ）ニックされたヘテロ二本鎖が得られるようにヘテロ二本鎖形成を促進する条件下で前記配列をインキュベートする段階と、
（ｃ）本質的にポリメラーゼから成るヘテロ二本鎖修復系を含む混合物に前記ヘテロ二本鎖を接触させる段階と、
から成る組換えポリヌクレオチドの製造方法。
【請求項２９】
更に、
（ｄ）産生された組換えポリヌクレオチドを同定する段階、
を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
混合物がポリメラーゼから成ることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
相同親配列がＤＮＡであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
段階（ｄ）が、
（ａ）段階（ｃ）のポリヌクレオチド産物を精製すること、
（ｂ）前記ポリヌクレオチド産物をベクターに挿入するために消化すること、
（ｃ）消化したポリヌクレオチド産物をベクターに結合させること、
（ｄ）前記ベクターを適当な宿主体内で発現させること、
（ｅ）親配列に比べて新しい特性または機能を表すポリヌクレオチドクローンを同定することを含み、前記新しいポリヌクレオチドクローンが組換えポリヌクレオチドを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
更に、新しいポリヌクレオチドクローンから組換えポリヌクレオチドを単離する段階を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
本質的にポリメラーゼとヌクレアーゼとから成る混合物にミスマッチ分子を接触させる段階から成るミスマッチ核酸分子のインビトロ修復方法。
【請求項３６】
混合物がポリメラーゼとヌクレアーゼとから成ることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ヌクレアーゼがＤＮアーゼＩであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ヌクレアーゼが制限酵素であることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
ヌクレアーゼがＤＮアーゼＩであり、ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
ヌクレアーゼが制限酵素であり、ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
相同親配列がＤＮＡであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
ミスマッチ分子がニックされているときには、ミスマッチのヘテロ二本鎖を本質的にポリメラーゼから成る混合物に接触させる段階から成るミスマッチ核酸分子のインビトロ修復方法。
【請求項４６】
混合物がポリメラーゼから成ることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼＩであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
相同親配列がＤＮＡであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は組換えポリヌクレオチドの新規なインビトロ製造方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
組換えプロセスには改良された機能または望ましい機能をもつ新規な配列を産み出す能力があり、その重要性は測り知れない。自然の組換えプロセスは無差別のプロセスである。しかしながら、同じ目標に到達し得る手順をより計画的にかつ巧妙に設計することによって状況を変えることができるようになった。現在では、自然の組換えイベントを模倣する手順が開発され、これらの手順は、幾つかのニーズに応じた特定のタンパク質または配列を特異的に作製し選択するために使用されている。これらのプロセスを惹起するために当業者が使用できる多くの方法が存在している。
【０００３】
難点は、これらの方法の多くでは、対象となる特定タンパク質の配列と構造／機能との関係について詳細な理解が必要であり、従って、これらの方法が時間消費的及び情報集約的なことである。例えば、Ｓｈａｏ　ａｎｄ　Ａｒｎｏｌｄ，１９９６　Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：５１３−５１８参照。このような時間的及びエネルギー的な代価を回避できる別の方法を利用することは可能であるが、このような方法にもそれなりの費用がかかる。例えば、所望の有益な突然変異をもつ配列を追跡するために多数の選択及び突然変異のサイクルが必要であったり（例えば、Ｋｕｃｈｎｅｒ　ａｎｄ　Ａｒｎｏｌｄ，１９７７　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：５３０参照）、対象となる組換え配列を作製するためにＰＣＲサイクルの反復が必要であったりする（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号）。
【０００４】
ヘテロ二本鎖分子は、典型的な完全相補性（ホモ二本鎖化）二重鎖核酸分子の代替基質として当業界で使用されており、より指向性の組換え作用を行うことができるので、当業界で使用できる極めて情報集約的及び／または労働集約的な方法を回避できることが知見された。例えば、Ｌｕら，１９８３　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：４６３９−４６４３参照。これらのプロセスのヘテロ二本鎖分子は多数の方法によって創製できる。最も多い場合としては、二本鎖分子が出発（親）ホモ二本鎖核酸分子基質を加熱及びアニーリングすることによって創製される。
【０００５】
これらのヘテロ二本鎖中間体分子の修復は、特に新規な組換え配列を作製するために設計された方法で使用されてきた。例えば、国際特許ＷＯ９９／２９９０２；Ｖｏｌｋｏｖら，１９９９　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２ｌ７（１８）：ｅ１８ｉ−ｖｉ参照。ＷＯ９９／２９９０２に開示された手順は詳細には、配列組成の異なる二重鎖核酸分子（本文中では変異ホモ二本鎖親配列または変異ホモ二本鎖分子と呼ぶ）からヘテロ二本鎖分子をインビトロで製造する処理を含む。次に、このヘテロ二本鎖分子を細菌細胞（大腸菌）修復系に導入し、この修復系においてミスマッチ領域の修復を行って、二重鎖核酸出発材料とは異なる非反復二重鎖核酸分子（またはホモ二本鎖）を得る。
【０００６】
大腸菌細胞中でヘテロ二本鎖分子のｉｎ　ｖｉｖｏ修復がｍｕｔ　ＨＬＳ系を介して行われることは当業界で公知である。例えば、Ｌｕら，前出；ＷＯ９９／２９９０２；Ｖｏｌｋｏｖら，１９９９　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２ｌ７（１８）：ｉ−ｖｉ参照。Ｍｕｔ　ＨＬＳによるインビトロの修復は当業界で開示されている。例えば、Ｆａｎｇら，１９９７　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３６）：２２７１４−２２７２０参照。
【０００７】
ミスマッチのヘテロ二本鎖分子の修復を介して新規なポリヌクレオチドを作製し得る代替系、特に、細菌性Ｍｕｔ　ＨＬＳ系よりも恒常的にかつ効率的にヘテロ二本鎖を修復する系を同定することができれば有利であろう。修復機構を単離し、もっと綿密に分析し、最適化できるようにこの修復をインビトロで行い得る方法はいっそう有利であろう。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は組換えポリヌクレオチドをインビトロで製造する新規な方法に関する。本発明方法では、好ましくはヌクレアーゼの存在下の本質的にポリメラーゼから成るヘテロ二本鎖修復系を含む混合物にヘテロ二本鎖分子を接触させる。このプロセスを使用して得られた結果は、特異的ＤＮＡ修復系を利用する従来のｉｎ　ｖｉｖｏ組換え作用によって得られた結果よりも優れている。
【０００９】
（図面の簡単な説明）
図１は、野生型ＬａｃＺα（配列５）とＬａｃＺαの２つの構築突然変異体（それぞれＭ１及びＭ２；配列１及び２）との核酸配列を位置合せして示す。双方の突然変異体Ｍ１及びＭ２らは４個の終結コドンを含み、２個はインフレームであり、２個は読み枠から外れている。Ｍ１突然変異体は、ＬａｃＺα遺伝子の塩基５０を出発点（ＡＴＧ開始コドン）とする２７塩基の突然変異領域を含み、この領域に３塩基の欠失及び１６個のミスマッチ塩基が存在する。Ｍ２突然変異体は、該遺伝子の塩基１５６を出発点とする２２塩基の突然変異領域を含み、９個のミスマッチ塩基及び３塩基の挿入が存在する。Ｍ１変異体の最後のインフレーム終結コドンとＭ２変異体の最初のインフレーム終結コドンとの間の間隔は８１塩基である。
【００１０】
図２は、ニックトランスレーション反応後のＤＮＡ（クローニング前に制限酵素で切断しない場合及び切断した場合）及び制限酵素で消化した後の対照を表すゲルを示す。レーンは左から順に以下のサンプルを表す：５μＬの１ＫＢ　Ｌａｄｄｅｒ；２μＬの消化ｓｓＤＮＡヘテロ二本鎖対照；２μＬの消化ｄｓＤＮＡヘテロ二本鎖対照；ニックトランスレーション後の２μＬの消化ｓｓＤＮＡヘテロ二本鎖；リガーゼでニックトランスレーション後の２μＬの消化ｄｓＤＮＡヘテロ二本鎖；ニックトランスレーション後の２μＬの消化ｄｓＤＮＡヘテロ二本鎖；３．５μＬのＬａｃＺαインサートＤＮＡ；ニックトランスレーション後の３．μＬのｓｓＤＮＡヘテロ二本鎖；リガーゼでニックトランスレーション後の３．５μＬのｄｓＤＮＡヘテロ二本鎖；ニックトランスレーション後の３．５μＬのｄｓＤＮＡヘテロ二本鎖。
【００１１】
図３は、野生型ＬａｃＺα（配列５）とＬａｃＺαの追加の２つの構築突然変異体（それぞれＭ３及びＭ４；配列３及び４）との核酸配列を位置合せして示す。双方の突然変異体Ｍ３及びＭ４は４個の終結コドンを含み、２個はインフレームであり、２個は読み枠から外れている。双方の突然変異体は野生型ＬａｃＺα遺伝子に比べて塩基の挿入または欠失を含んでいない。Ｍ３は野生型に比べて１４塩基の突然変異領域を含み、１２個のミスマッチ塩基が存在しており、Ｍ４は１６塩基の突然変異領域及び８個のミスマッチ塩基を有している。また、Ｍ３の最後の終結コドンの終点とＭ４の最初の終結コドンの起点との間の間隔は８１塩基である。
【００１２】
図４は、突然変異体Ｍ１及びＭ２によるヘテロ二本鎖分子の形成を示す概略図である。
【００１３】
図５は、図４のヘテロ二本鎖分子をニックするプロトコルを示す。
【００１４】
図６は、図５のニックした分子に対するＤＮＡ　ＰｏｌＩの作用を示す概略図である。
【００１５】
図７は、後述するブルー／ホワイトスクリーニングアッセイを使用した予測結果を示す。
【００１６】
図８Ａ及び８Ｂは、開示した方法を使用して行う反応の全体図を示す。
【００１７】
（詳細な説明）
本文中及び特許請求の範囲では以下の用語を以下の定義で使用している。
【００１８】
“組換えポリヌクレオド”、“組換え配列”などは、組換え作用によって得られた配列を意味する。該配列は、出発親配列（変異相同親配列、以下に定義）とは異なる配列組成をもつ。
【００１９】
“組換え”は、親配列または親配列に由来の配列からキメラ配列を作製するプロセスを意味する。
【００２０】
特定ポリヌクレオドに関する“新規な”、“キメラ”という用語は、特定反応に使用した変異相同親配列（以下に定義）とは異なる配列組成をもつ配列を意味する。
【００２１】
“変異相同親配列”は、配列組成は親配列と異なっているが、親配列の相補ＤＮＡ鎖とハイブリダイゼーションできる十分な相同度を有している配列を意味する。相同性のレベルに基づいてハイブリダイゼーション条件が変更されることは平均的な当業者に周知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら，１９９４　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：１０７４７−１０７５１参照。該文献においては、平均で４．１塩基の長さしかない配列一致領域をもつヒト及びネズミのＩＬ−１β遺伝子からキメラを作製するためには極めて低い実効アニーリング温度に適応するように条件が変更されている。
【００２２】
“ヘテロ二本鎖形成を促進する条件”は、親相同配列の相補鎖間でヘテロ二本鎖を形成させ得る任意の条件を意味する。
【００２３】
“混合物”は、本発明において使用される試薬（例えば、酵素、バッファ、など）または材料の任意の組合せを意味する。
【００２４】
“二本鎖修復系”は、ヘテロ二本鎖分子の２個の変異鎖の間のミスマッチを除去することによってヘテロ二本鎖の組換えを行わせる１つまたは複数の酵素を意味しており、組換えポリヌクレオドを形成させるために使用される。
【００２５】
“ヌクレアーゼ”は、核酸配列内部のペプチド結合を加水分解し得る任意のタンパク質を意味する。
【００２６】
“ポリメラーゼ”は、核酸分子鎖の３′末端へのヌクレオチドの付加を触媒し得る任意のタンパク質を意味する。
【００２７】
“Ｐｏｌ　Ｉ”はＤＮＡポリメラーゼＩを表す。
【００２８】
“ヘテロ二本鎖”は、複合鎖が１００％相補性でない二重鎖核酸分子を意味する。好ましくは、複合鎖が実質的に相補性である（５０％、より好ましくは７０％、いっそう好ましくは８０％、最も好ましくは９０％を上回る相補性をもつ）。この分子に対してポリメラーゼを好ましくはヌクレアーゼと共に作用させる。これはＳｔｅｍｍｅｒで使用された方法（米国特許第５，６０５，７９３号）との重要な違いである。Ｓｔｅｍｍｅｒの方法で基幹となる中間体は、上述のようなヘテロ二本鎖分子でなく、親配列の多数のフラグメントから得られた特定の鎖を含む分子である。
【００２９】
“融解温度”または“Ｔｍ”は、規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下に平衡状態で１組の相補的プローブの約５０％±２％がターゲット配列にハイブリダイズする温度を表す。
【００３０】
本発明によれば出願人らは、ポリメラーゼと好ましくはヌクレアーゼとを使用するプロセスを使用して組換えポリヌクレオドをインビトロで製造し得る新規な方法を発見した。これらの酵素が変異ヘテロ二本鎖の鎖間のミスマッチを除去し、このプロセスで新規な配列、即ち、特定反応に使用される変異相同親配列とは異なる配列組成をもつ新規な配列が発生することが知見された。
【００３１】
好ましくはヌクレアーゼと併用されるポリメラーゼはヘテロ二本鎖修復系の主要なエフェクターである。しかしながらまた、実際の組換え効果（即ち、ヘテロ二本鎖中のミスマッチヌクレオチドの除去を経由した組換えポリヌクレオドの発生）がポリメラーゼの活性（ニックされたヘテロ二本鎖分子の場合）またはポリメラーゼとヌクレアーゼとの活性の直接結果として得られる限り、修復系はヘテロ二本鎖修復プロセスに関与することが判明した他のいかなる酵素を含んでもよい。
【００３２】
ニックトランスレーション酵素（特に、ＤＮアーゼＩのようなエンドヌクレアーゼ及びＰｏｌ　Ｉのようなポリメラーゼ）またはポリメラーゼ単独（ヘテロ二本鎖分子がニック済みの場合）を特異的に使用しこれらの酵素に依存してヘテロ二本鎖ＤＮＡから組換えポリヌクレオド配列を産生させる手段は新規である。ヘテロ二本鎖から組換え配列を作製するために当業界で使用されている主な方法は、大腸菌の酵素ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ及びｍｕｔＳを使用する系であった。例えば国際特許ＷＯ９９／２９９０２参照。
【００３３】
従って本発明は、変異相同親配列を準備する段階と、ヘテロ二本鎖形成を促進する条件下で該配列をインキュベートする段階と、本質的にヌクレアーゼ（好ましくはエンドヌクレアーゼ）とポリメラーゼとから成るヘテロ二本鎖修復系を含む混合物に該ヘテロ二本鎖を接触させる段階と、産生された組換えポリヌクレオドを同定する段階とを含む組換えポリヌクレオドの製造方法に関する。代替的または付加的に本発明は、変異相同親配列を準備する段階と、ヘテロ二本鎖形成を促進する条件下で該配列をインキュベートして、ニックされたヘテロ二本鎖を形成させる段階と、本質的にポリメラーゼから成るヘテロ二本鎖修復系を含む混合物に該ヘテロ二本鎖を接触させる段階と、産生された組換えポリヌクレオドを同定する段階とを含む組換えポリヌクレオドの製造方法に関する。付加的な方法は、本質的にポリメラーゼ（ミスマッチ分子がニックされている場合）から成る混合物またはポリメラーゼとヌクレアーゼとから成る混合物にミスマッチ分子を接触させる段階を含むミスマッチ核酸分子のインビトロ修復手段を提供する。
【００３４】
本発明の本質は、変異相同親配列に由来するヘテロ二本鎖ＤＮＡ間のミスマッチを除去するためにニックトランスレーション反応をインビトロで使用することである。ニックトランスレーションは当業界では主として、ＲＮＡプライマーを除去する手段、あるいは、高い比活性をもつ均一放射性のＤＮＡを製造する手段として知られており、従ってゲノムＤＮＡブロット及びＲＮＡブロットを得るための配列特異的プローブの調製に使用することが知られている。ミスマッチのヘテロ二本鎖分子から組換え配列を作製するためにニックトランスレーションメカニズムを使用するという考え方は新規である。出願人らはこの極めて特異的な反応を、潜在的にいっそう望ましい非反復配列を作製するという極めて有用な目的、即ち、改良された特性をもつタンパク質をコードするに違いない配列を作製するという目的で初めて採用したものである。
【００３５】
特異的反応を促進するためにヌクレアーゼ及びポリメラーゼ以外の要素（例えば、バッファ材料、ｄＮＴＰ、Ｈ２Ｏ、など）をヘテロ二本鎖修復系に添加できること、それ故に特許請求の範囲で混合物という用語を使用したことは本発明の開示によって理解されよう。しかしながらこの用語は、修復メカニズムがポリメラーゼの作用（ニックされたヘテロ二本鎖の場合）またはポリメラーゼとヌクレアーゼとの作用の直接結果として生じることを否定するものではない。従って、混合物は、上述のヘテロ二本鎖修復系（主として、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ／ヌクレアーゼの組合せ）を特定的に含んでいなければならないが、修復プロセスに刺激を与える別の試薬を所望に応じて添加できる。
【００３６】
開示された方法を使用して、ＬａｃＺαの２つの非機能性突然変異体に遺伝子材料を取り込ませる試験を行った。簡単に説明すると、Ｘ−Ｇａｌの存在下でブルー／ホワイトスクリーニングを行った。野生型ＬａｃＺαを生じるＬａｃＺα遺伝子の２つの突然変異体間の組換えを、インジゴブルー産物の遊離によって同定した。インジゴブルー産物の遊離は、野生型ＬａｃＺαによってコードされているβ−ガラクトシダーゼによるＸ−Ｇａｌの開裂に依存した。非機能性突然変異体コロニーはＸ−Ｇａｌの存在下で発現されると白色を呈する。これに反して、成功した実験（双方の突然変異をヘテロ二本鎖ＤＮＡから除去することに成功）では、得られたコロニーがＸ−Ｇａｌの存在下で青色の野生型表現型に復帰している。本文中で試験した野生型への復帰は特異的組換えイベントを容易に検出し報告するための１つの方法である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（米国特許第５，６０５，７９３号参照）。
【００３７】
本発明の方法を使用して以下のような結果が得られた。ニックトランスレーション反応の結果として５２４個のコロニー中に５個の青色コロニーが生じた。これは０．９５％の復帰頻度である。他方、ヘテロ二本鎖対照は１，０３２個のコロニー中に７個の青色コロニーを生じた。これは０．５４％の復帰頻度である（ニックトランスレーションしたＤＮＡのほぼ１／２の効率）。同様の実験を行うと、ニックトランスレーション処理したヘテロ二本鎖分子の復帰頻度は０．８％（１６／１，９１１）であり、ヘテロ二本鎖対照群の復帰頻度は０．２％（２／１，０１１）であった（ニックトランスレーションした形態のほぼ１／４の効率）。実施例に使用したヘテロ二本鎖対照はニックトランスレーション処理することなく制限酵素で消化しただけでベクターに結合し、大腸菌細胞の形質転換に使用した。即ち、ヘテロ二本鎖修復系（主として、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ／ヌクレアーゼ併用）に接触させない以外はニックトランスレーションしたヘテロ二本鎖分子と全く同じプロトコルで処理した。即ち、ミスマッチのヘテロ二本鎖対照に細胞性（大腸菌）修復プロセスだけが作用し、従って、Ａｒｎｏｌｄら，国際特許ＷＯ９９／２９９０２、に示されているように図式化できる。
【００３８】
本発明の組換えポリヌクレオチドは、変異相同親配列に由来するヘテロ二本鎖分子から作製される。本発明に有用な変異相同親配列は、配列組成が異なっているが（少なくとも１個のヌクレオチドが異なっている）、相補配列とハイブリダイゼーションし得る十分な相同度を保持している任意の配列でよい。変異相同親配列は、突然変異形態でもよくまたは同じ配列の異なる対立遺伝子でもよい。配列は、同じタンパク質をコードできるが、異なる生物体内に存在してもよく、あるいは、ハイブリダイゼーションし得る十分な相同度をもつ２個またはそれ以上の異なる遺伝子を有していてもよい。変異相同親配列は更に、ベクターＤＮＡに存在し得る。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、ＢＡＣ（細菌性人工染色体）及びＹＡＣ（酵母人工染色体）である。好ましくは変異相同親配列が５０−１５０，０００塩基対、より好ましくは５０−１０，０００塩基対、最も好ましくは３００−２０００塩基対である。また、配列が互いに異なる長さを有していてもよい。好ましくは配列の長さの違いが５０−５，０００塩基対である。最も好ましくは配列の長さの違いが０−２，０００塩基対である。この場合、真の目標は、ヘテロ二本鎖からユニークＤＮＡを発生させるべく、ポリメラーゼが好ましくはヌクレアーゼと協奏的に作用できるように、ヘテロ二本鎖形態において十分なハイブリダイゼーションを生じさせることである。
【００３９】
当業者には理解されるように、ハイブリダイゼーション条件は一般に配列依存性であり、所望の反応に応じて変更される。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件が配列に基づいて決定され、対象配列の融解温度（Ｔｍ）よりもほぼ２５℃低い温度、所定のイオン強度及びｐＨが使用される。これらの条件はいずれも当業者が容易に決定できる。また、変異配列間のヘテロ二本鎖形成に適応するようにアニーリング温度を変更できることも当業者に理解されよう。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら，前出、参照。該文献の記載では、平均で４．１塩基の長さしかない配列一致領域を有しているヒト及びネズミのＩＬ−１β遺伝子からキメラを作製するために極めて低い実効アニーリング温度に適応するように諸条件が変更されていた。
【００４０】
変異相同配列は二重鎖形態で存在してもよく一本鎖形態で存在してもよい。更に、これらは、ＤＮＡ（例えばＰＣＲ産物、ゲノムまたはｃＤＮＡ）でもよくまたはＲＮＡでもよくまたはそれらの類似体でもよい。ＲＮＡを使用する場合、別のＤＮＡまたはｃＤＮＡ産物とアニーリングさせるヘテロ二本鎖を形成する前にＲＮＡをｃＤＮＡに転写する。
【００４１】
最も好ましくは、反応に取り込まれる配列が高度の相同性を有している。好ましくは配列が少なくとも５０％相同、より好ましくは少なくとも７０％相同、最も好ましくは少なくとも９０％相同である。特に好ましい具体例は、少なくとも９９％の配列一致を有している変異相同配列を含む。組換えイベントによって非反復配列を発生させ得るためには、少なくとも２つの塩基対位置に違いを有する少なくとも２つの配列が存在するのが好ましい。
【００４２】
変異相同親配列がＬａｃＺα遺伝子、特にＬａｃＺαの突然変異体Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３及びＭ４（それぞれ配列１−４）に由来する系によって本発明を説明した。この系は当業界（米国特許第５，６０５，７９３号参照）で特定の遺伝子シャフリング法の実行可能性を証明する有効で信頼できる手段として使用されている。しかしながら、この系を本明細書に定義した多くの“変異相同配列”のいずれかに使用することに影響を及ぼすものではないことは当業者には理解されよう。異なる配列組成を有しているが異なる親配列の相補的ＤＮＡ鎖間のハイブリダイゼーションを可能にする十分な相同度を有している任意の数の配列をこの系と共に使用できることは容易に理解されよう。
【００４３】
本発明によれば変異相同親配列は幾つかの方法で作製することができ、または、自然変異体でもよい。変異体を産生させる幾つかの好ましい方法は、誤りがちのＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ）、カセット突然変異誘発、ＵＶ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、化学的突然変異誘発及びｉｎ　ｖｉｖｏ突然変異誘発などである。これらはすべて当業界で公知である。しかしながら、本文中に定義された変異相同配列を産生し得るいかなる手段も本発明での使用に適していることが当業者には理解されよう。
【００４４】
配列を選択し入手した後、該配列を、変異親配列からヘテロ二本鎖分子を形成し得る条件下に維持する。相同親配列からヘテロ二本鎖ＤＮＡを作製するために当業界には多くの手段が存在する。このような手段はすべて本発明に使用し得る。特定の配列セットのヘテロ二本鎖形成に適した条件の決定は平均的な当業者の技量の範囲内である。
【００４５】
好ましい実施態様では、変異相同配列の加熱及びアニーリングによってヘテロ二本鎖ＤＮＡを作製する。より好ましくは、所望の突然変異を含む２つの相同ＰＣＲ産物（増幅目的でＰＣＲした）を適当なバッファ中で加熱しアニーリングして会合させる。この場合には、出発基質である変異相同親配列を増幅する目的でＰＣＲを使用している。これは実際の組換えプロセスの必須段階ではない。本発明方法ではプライマーの使用が必須ではなく、また、Ｓｔｅｍｍｅｒの方法（米国特許第５，６０５，７９３号）のように３回以上のＰＣＲ処理に依存することもない。
【００４６】
ヘテロ二本鎖ＤＮＡを産生させる別の手段では、Ｍ１３由来ベクターとヘルパーファージとの使用によって一本鎖プラスミドＤＮＡを増幅させる。この実施態様では、このようにして増幅させた２つの相同遺伝子を含有する２つの相補的な一本鎖プラスミドを接合させてヘテロ二本鎖ＤＮＡを創製し、完全プラスミドを使用してニックトランスレーション反応を惹起する。
【００４７】
ヘテロ二本鎖ＤＮＡを産生させる別の好ましい方法では、相同遺伝子の各々を別々の一本鎖ＰＣＲ反応で処理する。この方法ではバックグラウンドの低いホモ二本鎖が産生する。一方の反応は親配列ＰＣＲ産物を鋳型として使用し順方向プライマーだけを用いて行い、他方の反応は逆方向プライマーと“変異相同親配列”（定義参照）ＰＣＲ鋳型とを用いて行う。次に、２つの相同親配列を含む順方向及び逆方向のＰＣＲ産物を接合してヘテロ二本鎖ＤＮＡを創製する。次にこのヘテロ二本鎖ＤＮＡをニックトランスレーション反応で処理する。得られた産物を次に切断し、適当なプラスミド発現ベクターにクローニングする。
【００４８】
代替的な好ましい実施態様では、一方の突然変異プラスミドを遺伝子の上流の非反復制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ）で消化し、他方の突然変異プラスミドを遺伝子の下流の異なる非反復制限酵素（例えばＥｃｏＲ０１０９１）で消化する。得られた直鎖状フラグメントを集めて、９４℃に加熱してＤＮＡ鎖を変性させ、冷却して室温に戻す。これらの条件下でヘテロ二本鎖ＤＮＡは環化し、ホモ二本鎖ＤＮＡは直鎖状に維持されている。その後、ヘテロ二本鎖ＤＮＡはホモ二本鎖ＤＮＡから容易に識別できるので、アガロースゲル電気泳動にかけ次いでアガロースゲルから環状ヘテロ二本鎖バンドを切り出すことによって物理的に分離できる。この精製したヘテロ二本鎖プラスミドＤＮＡをニックトランスレーションプロトコルで処理し、精製した後で直接に適当な発現宿主の形質転換に使用する。
【００４９】
それぞれ配列３及び配列４をもつ突然変異体Ｍ３及びＭ４にこの実施態様を使用すると以下の結果が得られた：ＸＬ−１青色細胞中ではニックトランスレーション反応の結果、２１２個の全コロニー中に２７個の青色コロニーが存在し、形質転換効率は１２．７４％であった；ヘテロ二本鎖対照では３６４個の全コロニー中に１８個の青色コロニーが存在し、形質転換効率は４．９５％であった；ＸＬ　ｍｕｔＳ細胞中ではニックトランスレーション反応の結果、３８５個の全コロニー中に５５個の青色コロニーが存在し、形質転換効率は１４．２９％であった；ヘテロ二本鎖対照では５１０個の全コロニー中に３８個の青色コロニーが存在し、形質転換効率は７．４５％であった。
【００５０】
以下に記載の段階は、好ましくはゲル電気泳動によって精製したＤＮＡフラグメントを用いて行うのが好ましいが、プラスミドまたはファージベクターのＤＮＡ配列に反応を行わせてもよい。
【００５１】
変異相同親配列によるヘテロ二本鎖の形成後、該ヘテロ二本鎖を、本質的にヌクレアーゼとポリメラーゼとから構成されるかまたはニックしたヘテロ二本鎖が存在する場合にはポリメラーゼから構成されるヘテロ修復系を含む混合物に接触させる。ヌクレアーゼとポリメラーゼ、特にＤＮアーゼＩとＰｏｌ　Ｉとによって惹起される反応はニックトランスレーション反応に酷似しており、従って本明細書ではニックトランスレーション反応と呼ぶ。
【００５２】
この反応を支援するために複数の酵素、ポリメラーゼとヌクレアーゼ、あるいは、得られたヘテロ二本鎖分子がニックされているときは１つの酵素（ポリメラーゼ）がこのプロセスに必須であること、詳細にはこれらの酵素が変異ヘテロ二本鎖分子の鎖間ミスマッチを除去し非反復二重鎖ホモ二本鎖分子を形成するために必要な転写を行うということに注目されたい。従って、これらの分子の組合せ（ポリメラーゼとヌクレアーゼ）あるいはポリメラーゼ（ヘテロ二本鎖がニックされているとき）をヘテロ二本鎖修復系と呼ぶ。
【００５３】
“ヘテロ二本鎖修復系”という用語は、特定的にはヘテロ二本鎖分子に対するヌクレアーゼ及びポリメラーゼのそれぞれの作用、あるいは、ニックされたヘテロ二本鎖分子に対するポリメラーゼの作用を承認するために新しく造られた用語であるが、この用語はまた詳細には、ミスマッチの修復を促進するためにこれらの酵素に添加されるが２つの酵素（即ち、ポリメラーゼとヌクレアーゼ）の本来の目的に影響を与えない他のすべての添加物を含意する。言い換えると、本文中に使用された“ヘテロ二本鎖修復系”という用語は、上述のヘテロ二本鎖修復活性を主としてポリメラーゼ及びポリメラーゼ／ヌクレアーゼの組合せが担当すると考えられるタンパク質または酵素の任意の組合せを含意する。従ってこの定義は、別の酵素またはタンパク質は観察された活性に貢献する本質的な要因とは考えられないという状態を説明するだけである。
【００５４】
有用なポリメラーゼは当業界で公知である。好ましくはポリメラーゼは以下から選択される：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメント；逆転写酵素；Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ；天然型Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ；化学的に修飾されたＴ７　ＤＮＡポリメラーゼ；遺伝的に修飾されたＴ７　ＤＮＡポリメラーゼ（Δ２８）；Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ；ＫｌｅｎＴａｑ（Ａｂ　ＰｅｐｔｉｄｅｓＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ；及びＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ。ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体、例えばＤＮＡポリメラーゼＩの突然変異体も本発明に有用である。従って、Ｐｏｌ　Ａ５も本発明に有用である。
【００５５】
最も好ましくは酵素がＤＮＡ　Ｐｏｌ　Ｉである。ポリメラーゼに関しては反応時間が重要である。ポリメラーゼによる一方の鎖の読み通し（リードスルー）が別のポリメラーゼ分子による他方の鎖の読み通しを消去しないように、遺伝子に沿ったヌクレオチド置換は最小に維持されなければならない。当業者には理解されるであろうが、反応時間を最適結果に適応させることができ、反応時間はニックトランスレーション反応中の酵素及び試薬の濃度に関連する。ニックトランスレーション反応は５分−２時間の範囲の処理時間にするのが最も好ましい。
【００５６】
分子がまだニックされていない場合には、ＤＮアーゼＩ、または、二重鎖ＤＮＡ分子を加水分解し得る他の任意のヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、例えば制限酵素）が、ニックトランスレーションプロセスのもう１つの重要部分である。好ましくは使用される酵素がＤＮアーゼＩ、より好ましくはＭｇ２＋の存在下のＤＮアーゼＩであり、これらは二本鎖ＤＮＡを無作為にニックする。ＤＮアーゼＩ（または使用される特定ヌクレアーゼ）の量は、特定用途に最適化され得る。例えば、短いＤＮＡフラグメント（＜５００塩基対）のニックトランスレーションには、全分子が少なくとも１回でニックされることを確保するためにより高い濃度のＤＮアーゼＩが必要である。好ましくは、５０％グリセロール中の１×ＮＴバッファの量２０−３００μＬあたり約１−３μＬのＤＮアーゼＩを含む予製液を調製する。１−１０μＬの範囲の種々の量のこの予製液を、例えば約１２５μＬのニックトランスレーション反応に使用できる。より好ましくは、ＤＮアーゼＩが、５０％グリセロール中の１×ＮＴバッファ１６９μＬで希釈した３μＬのＤＮアーゼＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　１００，０００Ｕ／ｍＬ）から成るＤＮアーゼＩ予製液の形態で使用される。しかしながらこれらの全ては行われる個々の反応に依存性であることが当業者に理解されよう。最終目的は、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを十分にニックしてポリメラーゼを侵入させＤＮＡミスマッチを修正することである。しかしながら、ＤＮＡの破壊が生じないように配慮しなければならない。最適化パラメーターを理解し管理することは当業界で容易であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９７）に詳細に記載されている。
【００５７】
（ヌクレアーゼとヘテロ二本鎖ＤＮＡとを使用する代りに）ニックされたヘテロ二本鎖ＤＮＡとポリメラーゼとを用いても上述の結果と同様の最終結果が得られるという観察は重要である。この場合、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ中に存在するニックがヌクレアーゼの非存在に適応する。
【００５８】
更に、本発明の上記の好ましい実施態様では、ヘテロ二本鎖分子に存在するニックをシールするためにＤＮＡリガーゼを使用する。このためには標準結合条件下でＤＮＡリガーゼによって処理する。特に好ましい実施態様では、使用されるＤＮＡリガーゼがＴ４　ＤＮＡリガーゼである。リガーゼはニックトランスレーション反応前、反応中または反応後に添加できる。
【００５９】
反応条件（例えば、反応容量、４つのｄＮＴＰの濃度及びＤＮＡの量）を変更できることが平均的な当業者には理解されよう。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，前出、参照。例えば、ニックトランスレーション反応を２０ｎｇのＤＮＡという少量で実行できること、５μＬという少ない容量まで小規模化できることも平均的な当業者の知る処である；同書、参照。更に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩに対してはｄＮＴＰが２μＭという低濃度で十分であるが、基質をもっと高い濃度で供給するとポリメラーゼの効率が上がる；同書。
【００６０】
平均的な当業者には理解されるように、反応の温度は使用される個々の反応基質、酵素及び条件に応じて調整される。
【００６１】
ニックトランスレーション反応が完了すると、反応産物を精製し、ユニーク制限酵素によって消化し、適切なプラスミドベクターに挿入する。インサートを含むプラスミドベクターを次に適当な宿主に挿入して発現させる。次に宿主細胞をスクリーニングして、所望の突然変異を含むクローンを同定する。
【００６２】
組換えポリヌクレオチドを発現させるために多様な発現ベクターのいずれかを使用し得ることは平均的な当業者の知る処である。特に好ましい発現ベクターはｐＵＣ１８及びその誘導体、ｐＵＣ１９及びその誘導体、ｐＢＲ３２２及びその誘導体、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ、ｐＧＥＭシリーズ（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）、ｐＥＴシリーズ（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）及びｐＥＳＰ−１（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）である。一般に、個々のベクターの選択は、使用される細胞の種類、所望の発現レベル、などに依存するであろう。
【００６３】
宿主細胞は原核細胞または真核細胞でよく、その非限定例としては、大腸菌のような細菌、酵母のような菌類細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起原の細胞系を非限定例とする哺乳類細胞、ショウジョウバエ及び蚕由来の細胞系を非限定例とする昆虫細胞がある。特に有益な細胞及び細胞系は大腸菌Ｋ１２、大腸菌Ｂ、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に由来する。
【００６４】
スクリーニング及び選択のプロセスに好ましくは当業界で公知の種々のマーカー、例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質を介在させるが、組換えポリヌクレオチドの新規な活性、機能または品質を検出するいかなる方法も適当である。スクリーニング及び選択は、組換えポリヌクレオチド中で特定的に探求される対象に応じて設計される。例えば、特定の機能または機能レベルを有している酵素は、組換えタンパク質の実際の機能（またはその指示物質）を測定または同定することによって試験できる。当業者は一連の特徴の探求を特定のスクリーニングに適応させることができる。例えば、特異的タンパク質に結合し得るヌクレオチド配列は標識タンパク質によって探求でき、発現産物の特異的特徴または品質は探求する品質の特徴に応じて試験できる。使用された親配列に比べて強化された特徴をもつ組換え配列を作製するために本発明を使用することが本文中に記載された最も有意義な用途である。
【００６５】
また別の実施態様では、ＰＣＲ突然変異誘発、及び、特定のターゲット配列に比べて変異を有している配列が増加するように設計された別のプロセス（例えば、誤りがちのＰＣＲ突然変異誘発）によって指向性進化を増進するために本発明方法を使用できる。例えば、１つの指向性進化サイクル中に発見された種々の有益な点突然変異を含む突然変異体を取り込ませて、ライブラリーの１つまたは複数の構成員が単一遺伝子上に突然変異の集合を含む配列ライブラリーを作製する。これらの突然変異体は所望の有益な活性に基づいてスクリーニングすることによって同定される。これによって、第一には配列情報と部位特異的ＰＣＲとを使用して１つの遺伝子に複数の突然変異を集めるために必要な時間及び労力、第二には追加のＰＣＲ突然変異誘発とスクリーニングとのサイクルを実行することによって多重突然変異を集めるために必要な時間及び労力がいずれも節減される。
【００６６】
この増進はまた、新規なポリヌクレオチド配列のランダム作製方法にも応用できる。
【００６７】
本発明をより十分に説明するために非限定例を以下に示す。
【００６８】
実施例１
ヘテロ二本鎖ＤＮＡ反応の基質となるＰＣＲ産物の調製
ＬａｃＺα遺伝子の突然変異体Ｍ１及びＭ２の双方を増幅させるために２つのＰＣＲ反応を行った。反応は、６０１．６μＬのＨ２Ｏ；８０μＬの２ｍＭのｄＮＴＰ；５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ９．１、１６ｍＭの硫酸アンモニウム、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１５０μｇ／ｍＬのＢＳＡから成る８０μＬの１０×ＰＣ２バッファ（Ａｂ　ＰＥＰＴＩＤＥＳＴＭ）；１６μＬのｐＵＣ１８　Ｆ１（４０μＭ）；（５′−ＴＧＡＧＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴ；配列６）；１６μＬのｐＵＣ１８　Ｒ１（４０μＭ）；（５′−ＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴ；配列７）；１５：１のＫｌｅｎｔａｑ（Ａｂ　ＰＥＰＴＩＤＥＳＴＭ）：ＰＦＵポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ）から成る２．４μＬのＰＯＬ　ＭＩＸ；及び４μＬの鋳型ＤＮＡ（ＰＲＯＭＥＧＡＴＭ、ｐＵＣ１８プラスミドＭ１またはＭ２（Ｍ１：配列１；Ｍ２：配列２）のミニプレップ、〜２００ｎｇ／μＬ）の存在下で行った。合計量８００μＬを０．６ｍＬ容の８個のＰＣＲ管に分け入れ、サーマルサイクラーに載せて以下のプログラムで処理した：９４℃で２分間；［９４℃で１分；５２℃で１分；７２℃で１分、１０秒］を２５サイクル、７２℃で７分間；６℃で精製されるまで。
【００６９】
ＰＲＯＭＥＧＡＴＭ　ＰＣＲ　ＰｒｅｐｓキットをＷｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎｓと共に使用してＰＣＲ産物を精製した。ミニカラムあたり２００μＬのＰＣＲ反応物を精製し、精製産物を５０μＬのＨ２Ｏで溶出させた。Ｍ１及びＭ２のｐＵＣ１８　Ｆ１Ｒ１　ＰＣＲ産物として合計量２００μＬが得られた。
【００７０】
ＤＮＡの濃度を測定するためにＰＣＲ産物のＡ２６０をＳｐｅｃｔｒａ　Ｍａｘ　Ｐｌｕｓ分光光度計（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＤＥＶＩＣＥＳＴＭ）を使用して測定した。以下の結果が得られた：Ｍ１　ｐＵＣ１８　Ｆ１Ｒ１＝１７５ｎｇ／μＬ；及びＭ２　ｐＵＣ１８　Ｆ１Ｒ１＝２０８．７５ｎｇ／μＬ。
【００７１】
実施例２
ヘテロ二本鎖ＤＮＡ形成
１７０μＬのＭ１　ｐＵＣ１８Ｆ１Ｒ１；１４３μＬのＭ２　ｐＵＣ１８Ｆ１Ｒ１；及び１６．４７μＬの２０×トリスＫＣｌヘテロ二本鎖バッファ（０．３Ｍのトリス，ｐＨ７．８３、１．２ＭのＫＣｌ）を混合し、これを３×０．６ｍＬ容のＰＣＲ管に分け入れた。次に管をサーマルサイクラーに据え、以下のヘテロ二本鎖形成プログラムで処理した：
９４℃で４分間；９０℃に温度を下げて１０分間維持；８５℃に温度を下げて１０分間維持；８０℃に温度を下げて１０分間維持；６０℃までは同様にして５℃ずつ温度を下げながら各温度で１０分間ずつ維持し、次いで４０℃に温度を下げて１０分間維持し；次いで４℃にして反応が精製されるまで維持する。
【００７２】
温度低下はすべて０．１℃／秒の勾配で行うことに注目されたい。３つのＰｒｏｍｅｇａ　ＷｉｚａｒｄカラムをＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓキットと共に使用してヘテロ二本鎖ＤＮＡを精製し、ＤＮＡをＨ２Ｏに溶出させ、ヘテロ二本鎖ＤＮＡと合わせた量を１５０μＬとした。
【００７３】
実施例３
ニックトランスレーション反応
氷上で以下の試薬を混合した：４０μＬのｐＵＣ１８Ｆ１Ｒ１精製ヘテロ二本鎖ＤＮＡ；４０μＬのＨ２Ｏ；１２．５μＬの１０×ＮＴバッファ（０．５ＭのトリスＨＣｌ　ｐＨ７．５；０．１ＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）；０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）；５μＬのＤＮＡ　Ｐｏｌ　Ｉ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）；２２．５μＬの２ｍＭのｄＮＴＰ；及び５μＬの１×ＤＮアーゼ予製液（５０％グリセロール中の１×ＮＴバッファ１６９μＬで３μＬのＤＮアーゼＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，１００，０００Ｕ／ｍＬ）を希釈）。
【００７４】
ニックトランスレーション反応を１４℃で１５分間行った。２μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ　ｐＨ８．０を加えて反応を停止させた。Ｐｒｏｍｅｇａ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓキットを使用してニックトランスレーション反応物を精製し、６０μＬのＨ２ＯでＤＮＡを溶出させた。
【００７５】
実施例４
ニックトランスレーションＤＮＡ及びヘテロ二本鎖対照の制限消化物
以下の試薬を合わせた：５２μＬのニックトランスレーションＤＮＡ；７μＬのＮＥＢ　４バッファ（ＮＥＢ；Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏｌａｂｓＴＭ）；０．７μＬの１０×ＢＳＡ（ＮＥＢ）；１μＬのＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）；４μＬのＥｃｏ０１０９１（ＮＥＢ）；４μＬのＳａｐＩ（ＮＥＢ）；及び２μＬのＨ２Ｏ。
【００７６】
以下の試薬を合わせることによってヘテロ二本鎖対照を調製した：２５μＬのｐＵＣ１８Ｆ１Ｒ１ヘテロ二本鎖ＤＮＡ（ニックトランスレーション反応に使用したものと同じ予製液）；７μＬのＮＥＢ　４（ＮＥＢ）；０．７μＬの１０×ＢＳＡ（ＮＥＢ）；１μＬのＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）；４μＬのＥｃｏ０１０９１（ＮＥＢ）；４μＬのＳａｐＩ（ＮＥＢ）；及び２８μＬのＨ２Ｏ。
【００７７】
以後の反応ではニックトランスレーションＤＮＡ及びヘテロ二本鎖対照の双方を別々に処理した。
【００７８】
制限反応は３７℃で５時間行った。
【００７９】
ニックトランスレーション及び対照のＬａｃＺαインサートバンドを０．８％アガロースゲルからカミソリの刃を使用して単離した。ゲル切片をＰｒｏｍｅｇａ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓキットで精製し、インサートを５０μＬのＨ２Ｏで溶出させた。
【００８０】
実施例５
結合反応
以下の試薬を合わせた：ＬａｃＺαインサートがＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ０１０９１で除去された０．５μＬのｐＵＣ１８ベクターＤＮＡ；５μＬのＦ１Ｒ１対照インサートＤＮＡまたは３μＬのニックトランスレーションインサートＤＮＡ；１μＬの１０×結合用バッファ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ）；０．７５μＬのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ）；及び、対照には２．７５μＬのＨ２Ｏ、ニックトランスレーション対照には４．７５μＬのＨ２Ｏ。
【００８１】
結合反応は１６℃で一夜行った。
【００８２】
実施例６
形質転換反応
ＸＬ−１　Ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を解凍し、各５０μＬのアリコートを０．６ｍＬ容の管に導入した。５μＬの結合反応物を各管に添加し、０．７５μＬのｐＵＣ１８（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミドを対照として加えた。ＤＮＡを大腸菌と共に氷上で３０分間インキュベートした。次に細胞／ＤＮＡ混合物をＰＣＲブロックに載せ、４２℃で１分３０秒間維持した。熱ショックを与えた細胞／ＤＮＡ混合物を直ちに氷に載せて２分間維持した。次に４５μＬのＳ．Ｏ．Ｃ．（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）／管を加えて、管の内容物を１５ｍＬの管（Ｆａｌｃｏｎｓ）に移し、３７℃で１時間振盪した。各２５０μＬの２つの形質転換アリコートと３０μＬの野生型ｐＵＣ１８対照のアリコートとをＬＢ　Ａｇａｒ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ及びＸ−Ｇａｌに３７℃で一夜維持することによって平板培養した。
【００８３】
実施例７
結果
プレートの半面でコロニー数をカウントし２倍すると１プレートあたりのコロニーの概数が得られた。各プレートの青色コロニーの総数をカウントした。ｐＵＣ１８対照プレートでは、全コロニーをカウントした。以下の結果が得られた：ニックトランスレーション反応物は５２４個の全コロニー中に５個の青色コロニーを含み、０．９５％の復帰頻度を示した；ヘテロ二本鎖対照は１，０３２個の全コロニー中に７個の青色コロニーを含み、０．５４％の復帰頻度を示した；ｐＵＣ１８対照は４７個の全コロニー中に４５個の青色コロニーを含み、９５．７４％の復帰頻度を示した。
【００８４】
実施例８
野生型ＬａｃＺαゲノムに比べて塩基の挿入または欠失を全く含まない２つのｐＵＣ１８突然変異体に対するニックトランスレーション
野生型ゲノムに比べて塩基の挿入または欠失を全く含まないＬａｃＺα　Ｍ３及びＭ４（Ｍ３：配列３；Ｍ４：配列４）の２つのｐＵＣ１８突然変異体を構築した。Ａｒｎｏｌｄらの国際特許ＷＯ９９／２９９０２に記載の方法に従ってヘテロ二本鎖ＤＮＡを作製した（Ｗｅｓｔｍｏｒｅｌａｎｄら，１９９７　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１４５：２９−３８参照）。双方の文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００８５】
簡単に説明すると、一方の突然変異プラスミドは遺伝子の上流の非反復酵素（ＥｃｏＲＩ）で消化し、他方の突然変異体は遺伝子の下流の異なる非反復制限酵素（Ｅｃｏ０１０９１）で消化した。直鎖状フラグメントを会合させ、９４℃に加熱してＤＮＡ鎖を変性し、室温に戻した。ヘテロ二本鎖ＤＮＡ（１つの鎖がＥｃｏＲＩでニックされ、第二鎖がＥｃｏ０１０９１でニックされた）は環化し、ホモ二本鎖ＤＮＡ（双方の鎖がＥｃｏＲＩまたはＥｃｏ０１０９１でニックされた）は直鎖状に維持された。このようにしてホモ二本鎖ＤＮＡから容易に識別できるヘテロ二本鎖は、ゲル電気泳動で処理しアガロースゲルからヘテロ二本鎖バンドを切り出すことによって直鎖状ホモ二本鎖から物理的に分離できる。次に、ＰｒｏｍｅｇａＴＭ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓキットを使用してヘテロ二本鎖ＤＮＡを精製できる。
【００８６】
上記の実験はヘテロ二本鎖プラスミドＤＮＡを作製するために行った。このヘテロ二本鎖プラスミドＤＮＡの幾つかを前出の実施例３に記載したようにニックトランスレーション酵素に接触させた。一部分のヘテロ二本鎖プラスミドはヘテロ二本鎖の陰性対照として使用できるようにニックトランスレーション酵素に接触させなかった。２つのプラスミド調製物を別々に使用して、ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ及びＸＬ　ｍｕｔＳ（ｍｕｔＳ遺伝子がノックアウトされた菌株）の双方を形質転換させた。ｍｕｔＳ細胞はＸＬ−１青色細胞よりも僅かにすぐれた結果を示し、これは、ｍｕｔＨＬＳ系が組換えに関与しないことを示唆する。これらの実験で寒天プレートの規定面積内の青色コロニー及び白色コロニーの総数をカウントした。
【００８７】
以下の結果が得られた：ＸＬ−１青色細胞では、ニックトランスレーションの結果として１，０３１個の全コロニー中に１２５個の青色コロニーが存在し、１２．１２％の復帰頻度を示す；他方、ヘテロ二本鎖対照の結果として、１，３１５個の全コロニー中に８２個の青色コロニーが存在し、６．４％の復帰頻度を示す；ＸＬ　ｍｕｔＳ細胞では、ニックトランスレーションの結果として３８５個の全コロニー中に５５個の青色コロニーが存在し、１４．２９％の復帰頻度を示す；他方、ヘテロ二本鎖対照の結果として、５１０個の全コロニー中に３８個の青色コロニーが存在し、７．４５％の復帰頻度を示す。
【００８８】
実施例９
Ｍ３及びＭ４突然変異体に対するニックトランスレーション（及びＰｏｌ　Ｉ単独処理）
野生型ゲノムに比べて塩基の挿入または欠失を全く含まないＬａｃＺα　Ｍ３及びＭ４（Ｍ３：配列３；Ｍ４：配列４）の２つのｐＵＣ１８突然変異体を構築した。Ａｒｎｏｌｄらの国際特許ＷＯ９９／２９９０２に記載の方法に従ってヘテロ二本鎖ＤＮＡを作製した。該文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００８９】
簡単に説明すると、一方の突然変異プラスミドは遺伝子の上流の非反復酵素で消化し、他方の突然変異体は遺伝子の下流の異なる非反復制限酵素で消化した。直鎖状フラグメントを会合させ、９４℃に加熱してＤＮＡ鎖を変性し、冷却して室温に戻した。ヘテロ二本鎖ＤＮＡは環化し、ホモ二本鎖ＤＮＡは直鎖状に維持された。このようにしてホモ二本鎖ＤＮＡから容易に識別できるヘテロ二本鎖は、ゲル電気泳動で処理しアガロースゲルからヘテロ二本鎖バンドを切り出すことによって直鎖状ホモ二本鎖から物理的に分離できる。次に、ＰｒｏｍｅｇａＴＭ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐｓキットを使用してヘテロ二本鎖ＤＮＡを精製できる。
【００９０】
ヘテロ二本鎖陰性対照、Ｐｏｌ　Ｉ単独で処理したヘテロ二本鎖、及び、ニックトランスレーション酵素（Ｐｏｌ　ＩとＤＮアーゼＩ）で処理したヘテロ二本鎖プラスミドの双方に上記の実験を行った。次にプラスミド調製物を使用してＸＬ−１青色細胞を形質転換させた。この実験では、Ｐｏｌ　Ｉ単独で処理したヘテロ二本鎖ＤＮＡがヘテロ二本鎖対照に比べて改善された組換え頻度を示すことが理解されよう。最良の結果を与えるのはやはりニックトランスレーション処理したヘテロ二本鎖分子である。これらの実験で寒天プレートの規定面積内の青色コロニー及び白色コロニーの総数をカウントした。
【００９１】
以下の結果が得られた：ニックトランスレーション反応の結果としては３９０個の全コロニー中に４６個の青色コロニーが存在し、１１．７９％の復帰頻度を示す；ヘテロ二本鎖をＰｏｌ　Ｉ単独で処理した結果としては８２９個の全コロニー中に７８個の青色コロニーが存在し、９．４１％の復帰頻度を示す；また、ヘテロ二本鎖対照の結果としては、６２６個の全コロニー中に４６個の青色コロニーが存在し、７．３５％の復帰頻度を表す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
野生型ＬａｃＺα（配列５）とＬａｃＺαの２つの構築突然変異体（それぞれＭ１及びＭ２；配列１及び２）との核酸配列を位置合せして示す。
【図２】
ニックトランスレーション反応後のＤＮＡ（クローニング前に制限酵素で切断しない場合及び切断した場合）及び制限酵素で消化した後の対照を表すゲルを示す。
【図３】
野生型ＬａｃＺα（配列５）とＬａｃＺαの追加の２つの構築突然変異体（それぞれＭ３及びＭ４；配列３及び４）との核酸配列を位置合せして示す。
【図４】
突然変異体Ｍ１及びＭ２によるヘテロ二本鎖分子の形成を示す概略図である。
【図５】
図４のヘテロ二本鎖分子をニックするプロトコルを示す。
【図６】
図５のニックした分子に対するＤＮＡ　ＰｏｌＩの作用を示す概略図である。
【図７】
後述するブルー／ホワイトスクリーニングアッセイを使用した予測結果を示す。
【図８Ａ】
開示した方法を使用して行う反応の全体図を示す。
【図８Ｂ】
開示した方法を使用して行う反応の全体図を示す。
【図１】
2004509628.tif 000002
【図２】
2004509628.tif 000003
【図３】
2004509628.tif 000004
【図４】
2004509628.tif 000005
【図５】
2004509628.tif 000006
【図６】
2004509628.tif 000007
【図７】
2004509628.tif 000008
【図８Ａ】
2004509628.tif 000009
【図８Ｂ】
2004509628.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004509628.tif 000011
2004509628.tif 000012
2004509628.tif 000013
2004509628.tif 000014
2004509628.tif 000015
2004509628.tif 000016
2004509628.tif 000017
2004509628.tif 000018
2004509628.tif 000019
2004509628.tif 000020
2004509628.tif 000021
2004509628.tif 000022
2004509628.tif 000023
2004509628.tif 000024
2004509628.tif 000025
2004509628.tif 000026
2004509628.tif 000027
2004509628.tif 000028
2004509628.tif 000029
2004509628.tif 000030
2004509628.tif 000031
2004509628.tif 000032
2004509628.tif 000033
2004509628.tif 000034
2004509628.tif 000035
2004509628.tif 000036
2004509628.tif 000037
2004509628.tif 000038
2004509628.tif 000039
2004509628.tif 000040
2004509628.tif 000041
2004509628.tif 000042
2004509628.tif 000043
2004509628.tif 000044
2004509628.tif 000045
2004509628.tif 000046
【国際調査報告】
2004509628.tif 000047